(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）真珠をナノレベルの真珠粉に研磨し、
２）脱イオン水でナノレベルの真珠粉を水浴して超高圧で均質化し、４０〜８０℃で０．２〜１ｈ均質化し、低温の０〜８℃で遠心して水溶性真珠抽出物ａと沈殿を取得し、且つ沈殿をエタノール溶液で２〜４回洗浄し、
３）上記取得された沈殿を弱酸によって３０〜５０℃の温度で溶解させ、低速度で攪拌して８０−１２０ｒｐｍで０．５〜３ｈ反応させ、低温の０〜８℃で遠心して上澄み液をとって、酸可溶性真珠抽出物ｂを得、
４）水溶性真珠抽出物ａ及び酸可溶性真珠抽出物ｂを別々に脱塩し、
５）脱塩後に水溶性真珠抽出物ａ及び酸可溶性真珠抽出物ｂを凍結し、水溶性真珠タンパク及び酸可溶性真珠タンパクを得る、
ことを特徴とする真珠タンパクの調製方法。
【請求項２】
ナノレベル真珠粉の粒径は１０〜１００ｎｍである、ことを特徴とする請求項１に記載の真珠タンパクの調製方法。
【請求項３】
弱酸は食用酢酸、クエン酸又は炭酸を採用する、ことを特徴とする請求項１に記載の真珠タンパクの調製方法。
【請求項４】
脱塩は透析脱塩であって、２〜１０℃環境下で３０００〜５０００Ｄａ分子量の透析バッグを用いて３〜５日透析して脱塩し、１体積のサンプルは１０〜２０体積の蒸留水を使用し、毎日１〜２回水を替える、ことを特徴とする請求項１に記載の真珠タンパクの調製方法。
【請求項５】
脱塩はクロマトグラフィー脱塩であって、デキストランゲルＧ−１５を用いてカラムに充填し、初回目に脱塩してサンプルを入れた直後に収集を開始し、１〜２分毎に１回収集し、複数のサンプルを収集し、それぞれに少量の硫酸アンモニウムを加え、沈殿がないかチェックし、どのサンプルから塩類析出が出たか検証し、この時刻までの溶液を収集してそれは脱塩されたタンパク溶液である、ことを特徴とする請求項１に記載の真珠タンパクの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は真珠抽出物の生産分野に関し、特に真珠タンパクの調製方法、該方法で調製される水溶性真珠タンパク及び酸可溶性真珠タンパクに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、真珠粉の応用過程において、粒サイズの安全上の問題、流動性が低いこと、水に溶けないこと及び効能成分が開放しにくい等の問題が生じてきており、これらは真珠粉の応用分野に直接影響する。上記の問題を解決するために、業界内では水溶性真珠粉及び真珠水解液への発展を求めてきた。しかし、この過程において、従来成分の配合又は粗放的な加水分解をするだけで、各成分の効能を分析できず、精密な分離精製を行うことは滅多にない。
【０００３】
現在の真珠抽出物は普通酵素分解によって生産されており、例えば特許文献１（中国特許出願番号：０１１３９１５７．Ｘ  出願日：２００１年１２月１９日）において真珠粉の生物の酵素分解による調製方法が開示され、その肝心なところは乳酸水溶液を溶剤とし、真珠を溶解させ、且つ溶液のｐＨ値を中性に近い値に調整後に酸で偏酸性に調整し、続いて適当な生物活性酵素を入れてそのタンパク質を触媒分解し、酵素分解された真珠グルー溶液を取得し、続いて噴霧乾燥を採用して酵素分解された真珠グルー溶液を迅速乾燥し、造粒固化し、触媒分解された超微真珠粉を得る。調製される真珠粉は、真珠の中にある複数のアミノ酸、微量元素等の有効成分が残り、且つ真珠にある炭酸カルシウムを人体に吸収しやすい活性カルシウムに転化し、胃酸に溶解されない角質タンパクが遊離アミノ酸に酵素分解される。
【０００４】
特許文献２（中国特許出願番号：２００７１０１４１５６９．Ｘ  出願日：２００７年８月７日）において、真珠活性ペプチドの調製方法が開示され、それは新鮮な真珠貝から真珠粒を取り出し、水で洗浄し、真珠粒と脱イオン水を混合した後、リン酸塩を徐々に入れて混合液のｐＨ値を偏酸に調整し、続いてセラペプターゼを用いて真珠粒の酵素加水分解反応を行う。そして、フィルタを用いて真珠粒と上澄み液を得て、続いて反応液を煮て酵素を消滅させる。続いて、得られた溶液を噴霧乾燥して真珠活性ペプチドを得る。
【０００５】
特許文献３（中国特許出願番号：２００９１０１１４４０９．５  出願日：２００９年９月１８日）において、真珠加水分解液の調製方法が開示され、そのステップは次のとおりである。１）真珠粉をとって塩酸水溶液に入れ、攪拌して、反応を完全にさせ、アンモニア水を用いて該混合液のｐＨ値を中性まで調整し、遠心し、沈殿Ａを得る。２）沈殿Ａを浄水で溶解させ、続いてアンモニア水を用いてそのｐＨ値を７．５〜８．５まで調整し、遠心し、沈殿Ｂを得る。３）沈殿Ｂを浄水で溶解させ、酵素を加えて酵素分解し、酵素分解液を遠心し、上澄み液と沈殿Ｃを得る。前記酵素はカタツムリプロテアーゼとパパイヤプロテアーゼの混合物であって、加入量は沈殿Ｂ重量の０．３〜１．０５％である。４）沈殿Ｃを浄水で溶解させて酵素を加えて二次酵素分解し、遠心し、上澄み液を集める。酵素はトリプシノーゲン、木瓜プロテアーゼ及び中性プロテアーゼの混合物であって、加入量は沈殿Ｂ重量の０．２〜０．４５％である。５）二回の上澄み液を合わせ、煮沸し、穴径が１〜３ｎｍのナノフィルタでろ過することで調製される。
【０００６】
上記の方法は酵素分解法を採用して低分子量のアミノ酸とポリペプチドを得ることができるが、酵素分解は活性タンパク質の破壊をもたらし、活性物の流失を引き起こす。
【０００７】
特許文献４（中国特許出願番号：２０１４１００５５７３０．１  出願日：２０１４年２月１９日）において、ナノ真珠タンパクの調製方法が開示され、真珠を粉砕して平均粒径が１〜４ミクロンの真珠微粉を作り、酸分解し、ろ過し、濾過ケーキを浄水で洗浄するだけで粗真珠タンパクを得て、粗真珠タンパクへ分散剤を加えて研磨し、その間に超音波で振動する。そして、研磨後の液体を濃縮し、続いて加熱で殺菌してナノ真珠タンパクを得る。該方法は分散剤を入れたため、後続の処理工程で除去することが難しく、製品の応用に制限をかける。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】中国特許出願公開第１４２５３８８号明細書
【特許文献２】中国特許出願公開第１０１１００６８９号明細書
【特許文献３】中国特許出願公開第１０２０１８７２７号明細書
【特許文献４】中国特許出願公開第１０３８０４４６８号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記の技術問題を解決するために、本発明の目的は真珠タンパクの調製方法を提供することであって、本方法はナノレベルの真珠粉を利用し、加水分解及び酸分解後に脱塩し、水溶性真珠タンパク及び酸可溶性真珠タンパクを得て、真珠スキンケア製品及び保健品に原材料を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の目的を実現するために、本発明は以下の技術的解決手段を採用する。
【００１１】
真珠タンパクの調製方法であって、該方法は次のステップを含む。
１）真珠をナノレベルの真珠粉に研磨する。
２）脱イオン水でナノレベルの真珠粉を水浴して超高圧で均質化し、４０〜８０℃で０．２〜１ｈ均質化し、低温の０〜８℃で遠心して水溶性真珠抽出物ａと沈殿を取得し、且つ沈殿をエタノール溶液で表面を洗浄し、続いて次のステップに入る。
３）上記取得された沈殿を弱酸によって３０〜５０℃の温度で溶解させ、低速度で攪拌して８０−１２０ｒｐｍで０．５〜３ｈ反応させる。低温の０〜８℃で遠心して上澄み液をとって、酸可溶性真珠抽出物ｂを得る。
４）水溶性真珠抽出物ａ及び酸可溶性真珠抽出物ｂを別々に脱塩する。
５）脱塩後に水溶性真珠抽出物ａ及び酸可溶性真珠抽出物ｂを凍結し、水溶性真珠タンパク及び酸可溶性真珠タンパクを得る。
【００１２】
好ましくは、前記ナノレベル真珠粉の粒径は１０〜１００ｎｍである。
【００１３】
好ましくは、前記弱酸は食用酢酸、クエン酸又は炭酸を採用する。
【００１４】
好ましくは、前記脱塩は透析脱塩である。２〜１０℃の環境下で３０００〜５０００Ｄａ分子量の透析バッグを用いて３〜５日透析して脱塩し、１体積のサンプルは１０〜２０体積の蒸留水を使用し、毎日１〜２回水を替える。
【００１５】
好ましくは、前記脱塩はクロマトグラフィー脱塩を採用する。デキストランゲルＧ−１５を用いてカラムに充填し、初回目に脱塩してサンプルを入れた直後に収集を開始し、１〜２分毎に１回収集し、複数のサンプルを収集し、それぞれに少量の硫酸アンモニウムを加え、沈殿がないかチェックし、どのサンプルから塩類析出が出たか検証し、この時刻までの溶液を収集し、それが脱塩されたタンパク溶液となる。
【００１６】
本発明の前記方法で調製される水溶性真珠タンパクであって、該水溶性真珠タンパクの主要分子量分布が１５ｋｄ以下である。本発明の「主要」というのは該タンパクの中の９０％以上のものを指す。
【００１７】
本発明の前記方法で調製される酸可溶性真珠タンパクであって、該酸可溶性真珠タンパクの主要分子量分布は１４ｋｄ〜５０ｋｄである。本発明の「主要」というのは該タンパクの中の９０％以上のものを指す。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は上記技術的解決手段を採用し、ナノレベルの真珠粉を利用し、加水分解及び酸分解後に脱塩し、水溶性真珠タンパク及び酸可溶性真珠タンパクを得て、真珠スキンケア製品及び保健品に原材料を提供する。そのうち、酸可溶性真珠タンパクは酸化安定性が高く、且つ遷移芽細胞の成長を促進し、同時にコラーゲンの分泌に役立ち、傷口の癒合に効き、化粧品分野における潜在力が見える。一方水溶性真珠タンパクは美白、保湿等の方面で高い効果が認められる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】酸可溶性真珠タンパクの分子量分布図である。
【図２】水溶性真珠タンパクの分子量分布図である。
【図３】異なる真珠タンパクの繊維芽細胞成長に対する影響図である。
【図４】異なる真珠タンパクのＤＰＰＨフリーラジカル除去率に対する影響図である。
【図５】酸可溶性真珠タンパクの繊維芽細胞のコラーゲン分泌に対する影響図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（実施例１）
真珠タンパクの調製方法であって、該方法は次のステップを含む。
【００２１】
１）真珠をナノレベルの真珠粉（１０〜１００ｎｍ）に研磨する。
２）１０倍重量の脱イオン水で水浴して超高圧で均質化し、６０℃で０．５ｈ均質化する。低温の４℃で遠心して水溶性真珠抽出物ａと沈殿を取得する。且つ沈殿をエタノール溶液で３回洗浄し、続いて次のステップに入る。
３）上記取得された沈殿を弱酸によって中温真空下で（４０℃、１０１３２５〜１３３３ｐａ）溶解させ、低速度で（１００ｒｐｍ）２ｈ反応させる。低温の４℃で遠心して上澄み液をとって、酸可溶性真珠抽出物ｂを得る。
４）真珠抽出物ａとｂは次の二つの方法で脱塩することができる。
ｉ）透析脱塩：４〜７℃の環境化で３５００Ｄａ分子量の透析バッグを用いて４日透析して脱塩し、１体積のサンプルは１０〜１５体積の蒸留水を使用し、毎日１回水を替える。
又はｉｉ）クロマトグラフィー脱塩：デキストランゲルＧ−１５を用いてカラムに充填し、初回目に脱塩してサンプルを入れた直後に収集を開始し、１分間毎に１回収集し、１５部のサンプルを収集し、それぞれに少量の硫酸アンモニウムを加え、沈殿がないかチェックする。このステップによってどのサンプルから塩類析出が出たか検証でき、この時刻までの溶液を収集し、それが脱塩されたタンパク溶液となる。そして、最終的に水溶性真珠タンパクａと酸可溶性真珠タンパクｂを得る。
５）ａ、ｂ溶液を真空凍結して収集し、水溶性真珠タンパク及び酸可溶性真珠タンパクを得る。
【００２２】
（実施例２）
異なる真珠タンパク分子量測定であって、試験方法は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ測定法である。
【００２３】
ａ）水溶性真珠タンパクと酸可溶性真珠タンパクを１倍希釈してそれぞれ２０μｌをとり、５倍濃縮サンプル緩衝液５μｌをそれぞれ加え、８０℃の水浴鍋で５ｍｉｎ煮る。
ｂ）上記配合に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを調製し、電気泳動装置を取り付け、槽に電極緩衝液を加える。
ｃ）一定の順序に従ってサンプル投入穴へサンプルを加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動パネルの隙間の厚さに基づき、サンプル投入量を決め、０．７５ｍｍ隙間の１５穴のサンプル投入量＜１０ｕＬ／穴にし、１ｍｍ隙間の１０穴のサンプル投入量＜２０ｕｌ／穴にするのが一般的である。サンプル投入量は実際の経験次第で決める。
ｄ）通電して電圧を８０ｖ（普通は１５ｍｉｎ前後）にし、サンプルが圧縮ゲルを通った後に、サンプル電気泳動がゲル底部になるまで電圧を１２０ｖに調整する。
ｅ）ゲルを慎重に取得して容器に入れ、染色液を加え、揺動テーブルを用いて２−３ｈ揺動する。
ｆ）ストリップが明瞭になった後に染色液を取り出し、脱色液を加えて一晩置く。
ｇ）脱色液を取り出し、Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｏｎｅ、又は該当するイメージングシステムを用いて撮影、分析、タンパク濃度を見積もることができる。
【００２４】
試験結果
図１は酸可溶性真珠タンパクであって、分子量が１４．４、３１と４３ｋｄの範囲内にあり、大分子タンパクに属する。図２は水溶性真珠タンパク分子量の測定図であって、分子量が主に１４．４に集中し、さらにより低い分子量範囲内にあり、小分子量タンパクに属する。
【００２５】
（実施例３）
１．異なる真珠タンパクの繊維芽細胞成長に対する影響についての研究
【００２６】
ａ）試験方法
細胞成長カーブグラフ試験
異なる真珠タンパクの繊維芽細胞増殖に対する影響は８日間の培養過程における細胞数量の測定によって反映される。酸可溶性真珠タンパクと水溶性真珠タンパクをそれぞれ１５．６μｇ／ｍｌに段階希釈された培養基を作り、１％の子ウシ血清を加える。１％子ウシ血清培養基をブランクとする。一日毎に、細胞計算板によって計算する。
【００２７】
ｂ）試験結果
図３のように、酸可溶性真珠タンパクは細胞の成長を促進でき、１％子ウシ血清のみを含んだブランクと比べ、顕著な差が見られ、それと同時に、水溶性真珠タンパクは同じく繊維芽細胞の有効成長数を顕著に向上させる役割を果たす。しかし酸可溶性タンパクと比べ、その作用が少し遅延する。要するに、両者は共に繊維芽細胞の成長速度を向上させる作用を有する。
【００２８】
２．異なる真珠タンパクのＤＤＰＨフリーラジカル除去能力についての研究
【００２９】
ａ）試験方法
ＤＰＰＨフリーラジカル抑制能力
試験ステップ：濃度が２×１０−４ｍｏｌ／ＬのＤＰＰＨ９５％エタノール溶液を調製し、直射日光の当たらないところに保管する。２ｍｌＤＰＰＨ溶液をとって、２ｍｌの異なる濃度の酸可溶性真珠タンパク又は水溶性真珠タンパク溶液にそれぞれ入れ、十分に混合し、２５℃で３０ｍｉｎ反応後に５１７ｎｍ（最大吸収波長）でその吸収値を測定し、除去率を計算する。それを対照する。
【００３０】
ＤＰＰＨフリーラジカル活性除去率の計算式：Ｐ＝［（１−（Ａｉ−Ａｊ）／Ａｃ）］×１００％
【００３１】
式中、Ａｉ＝２ｍｌＤＰＰＨ溶液＋２ｍｌサンプル溶液の吸光度になり、Ａｊ＝２ｍｌサンプル溶液＋２ｍｌ溶液の吸光度になり、Ａｃ＝２ｍｌＤＰＰＨ溶液＋２ｍｌ溶液の吸光度になる。
【００３２】
ｂ）試験結果
図４のように、酸可溶性真珠タンパクは水溶性真珠タンパクよりＤＰＰＨフリーラジカル除去能力がずっと高くなり、それにより、酸可溶性真珠タンパクは高い耐酸化能力を有することが判明した。
【００３３】
３．異なる真珠タンパクの細胞のコラーゲン生成に対する影響
【００３４】
ａ）試験方法
オキシプロリン試験
繊維芽細胞のコラーゲン生成物はオキシプロリンの含有量を測定することによって評価する。繊維芽細胞を２４穴板に接種し、酸可溶性真珠タンパク濃度が１５．６μｇ／ｍｌの条件下で７２時間作用する。１％の子ウシ血清培養基と１０％の子ウシ血清培養基をそれぞれブランクと陽性対照とする。クロラミン−Ｔを用いてオキシプロリンの含有量を測定する。データは１０６個の細胞の中にあるコラーゲンのマイクログラムになり、コラーゲンに１３．５％のオキシプロリンがあるとする。
【００３５】
ｂ）試験結果
図５のように、ブランク対照及び高い含有量の子ウシ血清対照と比べ、酸可溶性真珠タンパクはコラーゲン分泌を顕著に高めることができる。ブランク対照と比べ、水溶性真珠タンパクはコラーゲン分泌を顕著に促進できるが、１０％子ウシ血清の作用より低いことから、酸可溶性真珠タンパクは繊維芽細胞の促進作用により優位性を有する。
【００３６】
（付記）
（付記１）
１）真珠をナノレベルの真珠粉に研磨し、
２）脱イオン水でナノレベルの真珠粉を水浴して超高圧で均質化し、４０〜８０℃で０．２〜１ｈ均質化し、低温の０〜８℃で遠心して水溶性真珠抽出物ａと沈殿を取得し、且つ沈殿をエタノール溶液で２〜４回洗浄し、
３）上記取得された沈殿を弱酸によって３０〜５０℃の温度で溶解させ、低速度で攪拌して８０−１２０ｒｐｍで０．５〜３ｈ反応させ、低温の０〜８℃で遠心して上澄み液をとって、酸可溶性真珠抽出物ｂを得、
４）水溶性真珠抽出物ａ及び酸可溶性真珠抽出物ｂを別々に脱塩し、
５）脱塩後に水溶性真珠抽出物ａ及び酸可溶性真珠抽出物ｂを凍結し、水溶性真珠タンパク及び酸可溶性真珠タンパクを得る、
ことを特徴とする真珠タンパクの調製方法。
【００３７】
（付記２）
ナノレベル真珠粉の粒径は１０〜１００ｎｍである、ことを特徴とする付記１に記載の真珠タンパクの調製方法。
【００３８】
（付記３）
弱酸は食用酢酸、クエン酸又は炭酸を採用する、ことを特徴とする付記１に記載の真珠タンパクの調製方法。
【００３９】
（付記４）
脱塩は透析脱塩であって、２〜１０℃環境下で３０００〜５０００Ｄａ分子量の透析バッグを用いて３〜５日透析して脱塩し、１体積のサンプルは１０〜２０体積の蒸留水を使用し、毎日１〜２回水を替える、ことを特徴とする付記１に記載の真珠タンパクの調製方法。
【００４０】
（付記５）
脱塩はクロマトグラフィー脱塩であって、デキストランゲルＧ−１５を用いてカラムに充填し、初回目に脱塩してサンプルを入れた直後に収集を開始し、１〜２分毎に１回収集し、複数のサンプルを収集し、それぞれに少量の硫酸アンモニウムを加え、沈殿がないかチェックし、どのサンプルから塩類析出が出たか検証し、この時刻までの溶液を収集してそれは脱塩されたタンパク溶液である、ことを特徴とする付記１に記載の真珠タンパクの調製方法。
【００４１】
（付記６）
付記１〜５のいずれか１つに記載の方法で調製される水溶性真珠タンパクであって、該水溶性真珠タンパクの主要分子量分布は１５ｋｄ以下である、ことを特徴とする水溶性真珠タンパク。
【００４２】
（付記７）
付記１〜５のいずれか１つに記載の方法で調製される酸可溶性真珠タンパクであって、該酸可溶性真珠タンパクの主要分子量分布は１４ｋｄ〜５０ｋｄである、ことを特徴とする酸可溶性真珠タンパク。
【図１】
0006457654.tif 000002
【図２】
0006457654.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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