(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフィンゴシン−１−リン酸を有効成分とし、心筋傷害の治療のために非傷害部位に皮下注射又は筋肉注射により投与する、心筋傷害の治療のための製剤。
【請求項２】
多能性幹細胞の移植を伴わないで前記心筋傷害を治療する、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記心筋傷害は、急性心筋梗塞である、請求項１又は２に記載の製剤。
【請求項４】
１日投与量が１ｍｇ／ｋｇ以上１０ｍｇ／ｋｇ以下である、請求項１〜３のいずれかに記載の製剤。
【請求項５】
前記製剤は、内因性多能性幹細胞を血流に動員するための製剤であって、
前記内因性多能性幹細胞は、以下の特徴；（ａ）ＳＳＥＡ３及び／又はＣＤ１０５に関して陽性である、及び（ｂ）ＣＤ１１７及び／又はＣＤ１４６に関して陰性であるの１種又は２種を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、スフィンゴシン−１−リン酸受容体２活性化化合物含有非傷害部位投与製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系細胞画分に存在し、誘導操作なしに得られる、ＳＳＥＡ−３（Stage-Specific Embryonic Antigen -3）を表面抗原として発現している多能性幹細胞（Multilineage-differentiating Stress Enduring cells；Muse 細胞）が間葉系細胞画分の有する多能性を担っていることが知られている（特許文献１、非特許文献１、２）。また、経脈管的に投与されたMuse細胞が、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）受容体２（Ｓ１ＰＲ２）を活性化する化合物（例えば、ＳＩＰ自体）の投与部位に誘導されることから、当該化合物がMuse細胞の遊走因子であることが報告されている（特許文献２）。
【０００３】
また、ＳＩＰの投与部位にMuse細胞は、組織再生に基づく各種疾患の治療に適用できる可能性があることがわかってきている。なかでも、心筋梗塞に対して、Muse細胞を経静脈的に投与すると、疾患部位である心臓に集積して、当該部位において梗塞領域を低減することが報告されている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開WO2011/007900パンフレット
【特許文献２】国際公開WO2014/133170パンフレット
【特許文献３】国際公開WO2014/027684パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】: Ｄｅｚａｗａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，Ｖｏｌ．１１３，ｐ．１７０１−１７１０（２００４）:
【非特許文献２】Ｄｅｚａｗａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３０９，ｐ．３１４−３１７（２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
Muse細胞の疾患治療への使用形態としては、特許文献３に示すように、疾患に罹患している患者個体から採取し、あるいは採取・培養して、再び個体に移植するという、細胞移植の形態を採る使用形態が挙げられる。
【０００７】
しかしながら、細胞移植を伴うにあたっては、必要な細胞数まで増殖させること、培養細胞の品質管理などにおいて困難を伴う場合もある。
【０００８】
また、Ｓ１ＰＲ２活性化化合物が遊走因子であったとしても、当該化合物を傷害部位に投与する必要性がある。しかしながら、当該化合物の傷害部位への投与やデリバリーは必ずしも容易ではない。
【０００９】
以上のように、細胞治療はその有用性は高いものの、適切なMuse細胞の調製は依然として困難であり、治療へのハードルは低くはない。また、Ｓ１ＰＲ２活性化化合物の投与についても困難性があった。
【００１０】
本明細書は、上記問題に鑑みて、より実用的な形態でMuse細胞を利用できる製剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、Muse細胞は、ヒトなどにおいて内在する多能性幹細胞であるため、本来的に個体内に内在する又は傷害時に骨髄から誘導されるMuse細胞（以下、これらを内因性Muse細胞という。）を、そのまま傷害部位に一層効果的にデリバリーさせるのに好適な製剤を見出した。本明細書は、こうした知見に基づき以下の手段を提供する。
【００１２】
（１）スフィンゴシン−１−リン酸受容体２（Ｓ１ＰＲ２）を活性化する化合物を有効成分とする、心筋傷害の治療のための非傷害部位投与製剤。
（２）多能性幹細胞の移植を伴わないで前記心筋障害を治療する、（１）に記載の製剤。
（３）前記心筋傷害は、急性心筋梗塞である、（１）又は（２）に記載の製剤。
（４）経皮投与製剤である、（１）〜（３）のいずれかに記載の製剤。
（５）皮下注射剤又は筋肉注射剤である、（１）〜（４）のいずれかに記載の製剤。
（６）１日投与量が1mg/kg以上10mg/kg以下である、（１）〜（５）のいずれかに記載の製剤。
（７）前記化合物は、スフィンゴシン−１−リン酸受容体２に対するアゴニストである、（１）〜（６）のいずれかに記載の製剤。
（８）前記内因性多能性幹細胞は、以下の特徴；
（ａ）ＳＳＥＡ３及び／又はＣＤ１０５に関して陽性である、及び
（ｂ）ＣＤ１１７及び／又はＣＤ１４６に関して陰性である
の１種又は２種を有する、（１）〜（７）のいずれかに記載の製剤。
（９）Ｓ１ＰＲ２を活性化する化合物を有効成分とする、内因性多能性幹細胞を傷害部位へ送達するための非傷害部位投与製剤。
（１０）経皮投与製剤である、（９）に記載の製剤。
（１１）前記化合物は、スフィンゴシン−１−リン酸受容体２に対するアゴニストである、（１０）に記載の製剤。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ウサギ心筋梗塞モデルを用いたＳ１Ｐ投与試験のプロトコールの概要を示す図である。
【図２】ウサギ心筋梗塞モデルの血中のMuse細胞の測定結果を示す図である。
【図３】ウサギ心筋梗塞モデルに対するＳ１Ｐ投与の効果を示す図である。
【図４】血中のＳ１Ｐ量の評価結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書の開示は、心筋傷害の治療用の製剤及び内因性多能性幹細胞の傷害部位への送達用の製剤に関する。
【００１５】
本開示の製剤（以下、単に、本製剤という。）は、Ｓ１ＰＲ２活性化化合物（以下、単に、本化合物という。）を含有することができる。本製剤によれば、本化合物を非傷害部位に投与して血流中に含有させることにより、内因性Muse細胞などの多能性幹細胞を血流中に動員して傷害部位に送達することができる。
【００１６】
本製剤の投与部位は、個体において組織や細胞の傷害が生じている傷害部位とは異なる部位である。本製剤は、本化合物を、いわゆる遊走因子としてではなく、内因性Muse細胞等の多能性幹細胞を血流中に動員させるために用いている。このため、Muse細胞を集積させたい部位ではない部位に投与することによって、内因性Muse細胞を傷害部位に集積させることができる。
【００１７】
このため、本製剤は、細胞移植を伴うことなく、また、傷害部位に本化合物を投与することなく、内因性Muse細胞などの内因性多能性幹細胞を血流に動員し傷害部位に集積させて、傷害部位における組織や細胞の再生に寄与させることができる。
【００１８】
本製剤は、心筋障害治療に用いることができる。本製剤を心筋障害の傷害部位でない部位に投与することで、内因性多能性幹細胞を血流中に動員し、心筋傷害部位へと送達して梗塞領域の拡大を抑制又は梗塞領域を縮小させることができる。これにより、心筋障害を治療し又は改善することができる。
【００１９】
以下、本開示の実施形態について詳細に説明する。
【００２０】
（Ｓ１ＰＲ２活性化化合物を含有する、心筋障害の治療のための非傷害部位投与製剤）
本開示の心筋障害治療のための非傷害部位投与製剤（以下、本治療用製剤という。）は、Ｓ１ＰＲ２活性化化合物を有効成分として含有することができる。本治療用製剤は、内因性幹細胞を血流中に動員し、心筋障害部位に送達することができる。以下、まず、内因性多能性幹細胞について説明する。
【００２１】
（内因性多能性幹細胞）
本治療用製剤は、生体内に予め存在する内因性である多能性幹細胞に対して作用することができる。なお、本明細書において、「内因性多能性幹細胞」とは、移植によらないで、本来的に生体内に存在するか又は生体において生じた傷害に起因して誘導された多能性幹細胞を意味している。
【００２２】
内因性多能性幹細胞としては、本発明者らの一人である出澤が、ヒト生体内にその存在を見出し、「Ｍｕｓｅ（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｅｎｄｕｒｉｎｇ）細胞」と命名した細胞が挙げられる。Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄液や真皮結合組織等の皮膚組織から得ることができ、各臓器の結合組織にも散在する。また、この細胞は、多能性幹細胞と間葉系幹細胞の両方の性質を有する細胞である。
【００２３】
Muse細胞などの内因性多能性幹細胞は、少なくともＳＳＥＡ３陽性及びＣＤ１０５陽性のいずれかであることが好ましい。
【００２４】
例えば、Muse細胞は、それぞれの細胞表面マーカーである「ＳＳＥＡ−３（Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ−３）」と「ＣＤ１０５」のダブル陽性として同定される。したがって、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、これらの抗原マーカーを指標として生体組織から分離することができる。Ｍｕｓｅ細胞の分離法、同定法、及び特徴などの詳細は、国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号に開示されている。また、Ｗａｋａｏら（２０１１、上述）によって報告されているように、骨髄、皮膚などから間葉系細胞を培養し、それをＭｕｓｅ細胞の母集団として用いる場合、ＳＳＥＡ−３陽性細胞の全てがＣＤ１０５陽性細胞であることが分かっている。すなわち、生体の間葉系組織又は培養間葉系幹細胞からＭｕｓｅ細胞を分離する場合は、単にＳＳＥＡ−３を抗原マーカーとしてＭｕｓｅ細胞を精製し、使用することができる。
【００２５】
なお、本明細書においては、ＳＳＥＡ−３を抗原マーカーとして、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織から分離された多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を単に「ＳＳＥＡ−３陽性細胞」と記載することがある。また、本明細書においては、「非Ｍｕｓｅ細胞」とは、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織に含まれる細胞であって、「ＳＳＥＡ−３陽性細胞」以外の細胞を指す。
【００２６】
より具体的には、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、細胞表面マーカーであるＳＳＥＡ−３に対する抗体を単独で用いて、又はＳＳＥＡ−３及びＣＤ１０５に対するそれぞれの抗体を両方用いて、生体組織（例えば、間葉系組織）から分離することができる。ここで、「生体」とは、哺乳動物の生体をいう。本開示において、生体には、受精卵や胞胚期より発生段階が前の胚は含まれないが、胎児や胞胚を含む胞胚期以降の発生段階の胚は含まれる。哺乳動物には、限定されないが、ヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等のげっ歯類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、フェレット等が挙げられる。
【００２７】
なお、本開示においてＭｕｓｅ細胞は、生体の組織由来である点で、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）と明確に区別される。また、「間葉系組織」とは、骨、滑膜、脂肪、血液、骨髄、骨格筋、真皮、靭帯、腱、歯髄、臍帯などの組織及び各種臓器に存在する結合組織をいう。例えば、Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄や皮膚から得ることができる。例えば、生体の間葉系組織を採取し、この組織からＭｕｓｅ細胞を分離し、利用することが好ましい。また、上記分離手段を用いて、培養間葉系細胞からＭｕｓｅ細胞を分離してもよい。
【００２８】
また、Ｍｕｓｅ細胞などの内因性多能性幹細胞は、ＣＤ３４（ＥＰ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）（ＭＢのマーカー）、ＣＤ１４６（ＰＣ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＣＤ２７１（ＮＧＦＲ）（ＮＣＳＣのマーカー）、ＮＧ２（ＰＣのマーカー）、ｖＷＦ因子（フォンビルブランド因子）（ＥＰのマーカー）、Ｓｏｘ１０（ＮＣＳＣのマーカー）、Ｓｎａｉ１（ＳＫＰのマーカー）、Ｓｌｕｇ（ＳＫＰのマーカー）、Ｔｙｒｐ１（ＭＢのマーカー）、及びＤｃｔ（ＭＢのマーカー）からなる群から選択される１１個のマーカーのうち少なくとも１個、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又は１１個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。例えば、限定されないが、ＣＤ１１７及びＣＤ１４６の非発現を指標に分離することができ、さらに、ＣＤ１１７、ＣＤ１４６、ＮＧ２、ＣＤ３４、ｖＷＦ及びＣＤ２７１の非発現を指標に分離することができ、さらに、上記の１１個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。
【００２９】
上記のように、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、ＳＳＥＡ−３陽性又はＳＳＥＡ−３陽性とＣＤ１０５陽性の二重陽性を指標にして生体組織から分離することができる。ヒト成人皮膚等には、種々のタイプの幹細胞及び前駆細胞を含むことが知られている。しかしながら、Ｍｕｓｅ細胞は、これらの細胞と区別されるものである。すなわち、このような幹細胞及び前駆細胞には、皮膚由来前駆細胞（ＳＫＰ）、神経堤幹細胞（ＮＣＳＣ）、メラノブラスト（ＭＢ）、血管周囲細胞（ＰＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰ）、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）が挙げられる。したがって、これらの細胞に固有のマーカーの「非発現」を指標として、Ｍｕｓｅ細胞を分離することができる。
【００３０】
また、本発明において対象とされる上記特徴を有するＭｕｓｅ細胞は、以下：
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ
からなる群から選択される少なくとも１つの性質を有してもよい。好ましくは、２以上、より好ましくは３以上、さらに好ましくはすべての特徴を有している。
【００３１】
上記（ｉ）について、「テロメラーゼ活性が低いか又は無い」とは、例えば、ＴＲＡＰＥＺＥ ＸＬ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いてテロメラーゼ活性を検出した場合に、低いか又は検出できないことをいう。テロメラーゼ活性が「低い」とは、例えば、体細胞であるヒト線維芽細胞と同程度のテロメラーゼ活性を有しているか、又はＨｅｌａ細胞に比べて１／５以下、好ましくは１／１０以下のテロメラーゼ活性を有していることをいう。
【００３２】
上記（ｉｉ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、三胚葉（内胚葉系、中胚葉系、及び外胚葉系）に分化する能力を有し、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導培養することにより、肝細胞、神経細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、骨細胞、脂肪細胞等に分化し得る。また、ｉｎ  ｖｉｖｏで精巣に移植した場合にも三胚葉に分化する能力を示す場合がある。さらに、静注により生体に移植することで損傷を受けた臓器（心臓、皮膚、脊髄、肝、筋肉等）に遊走及び生着し、分化する能力を有する。
【００３３】
上記（ｉｉｉ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、浮遊培養では増殖速度約１．３日で増殖するが、１０日間程度で増殖が止まるという性質を有し、さらに精巣に移植した場合、少なくとも半年間は癌化しないという性質を有する。
【００３４】
上記（ｉｖ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、セルフリニューアル（自己複製）能を有する。ここで、「セルフリニューアル」とは、１個のＭｕｓｅ細胞を浮遊培養することにより得られる胚様体様細胞塊に含まれる細胞を培養し、再度胚様体様細胞塊を形成させることをいう。セルフリニューアルは１回又は複数回のサイクルを繰り返せばよい。
【００３５】
（Ｓ１ＰＲ２活性化化合物）
本治療用製剤は、Ｓ１ＰＲ２活性化化合物を有効成分とすることができる。Ｓ１ＰＲ２は、スフィンゴシン−１−リン酸（ＳＩＰ）に対する受容体の１つである。内因性多能性幹細胞であるMuse細胞において特異的に発現していることが報告されている（特許文献１等）。
【００３６】
Ｓ１ＰＲ２受容体活性化化合物としては、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）、スフィンゴシン−１−リン酸誘導体、並びにスフィンゴシン−１−リン酸受容体のアゴニストが挙げられる。ここで、「スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）」とは、下記式で表される。ＳＩＰは、細胞膜を構成するスフィンゴ脂質の代謝産物であり、ある種の酵素によって細胞膜から切り出されて遊離した後、細胞膜上に発現しているＧタンパク質共役受容体に結合することにより、細胞遊走などを引き起こす生理活性物質として知られている。また、Ｓ１Ｐに対する受容体としては、Ｇタンパク質共役受容体であるＳ１Ｐ受容体が知られ、これまでにＳ１ＰＲ１〜Ｓ１ＰＲ５の５種類が存在することが分かっている。
【００３７】
【化１】
0006570053.tif 000002
【００３８】
Ｓ１ＰＲ２活性化化合物としては、ＳＩＰのほか、内因性多能性幹細胞の血流への動員能を有している限り、そのＳ１Ｐ誘導体も使用可能である。Ｓ１Ｐ誘導体としては、特に限定されないが、スフィンゴシルコリン、ガラクトシルスフィンゴシン（サイコシン）、グルコシルスフィンゴシン（グルコサイコシン）、スルホガラクトシルスフィンゴシン（リゾスルファチド）、Ｎ，Ｎ−ジメチルスフィンゴシン１−リン酸、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルスフィンゴシン１−リン酸、セラミド１−リン酸、ジヒドロスフィンゴシン１−リン酸、フィトスフィンゴシン１−リン酸、及びデハイドロフィトスフィンゴシン１−リン酸、並びにそれらの塩を挙げることができる。
【００３９】
また、Ｓ１ＰＲ２活性化化合物としては、Ｓ１ＰＲ２に対するアゴニストを用いることができる。このようなアゴニストとしては、以下の化合物（１）〜（５）が挙げられる。
（１）１−（２−（１−ベンジル−２，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−イル）−２−オキソエチル）−５−（トリフルオロメチル）ピリジン−２（１Ｈ）−オン（例えば、Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，２３，ｐ．２６６−８０（２０１２）参照）
（２）１−（２−（１−ベンジル−２，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−イル）−２−オキソエチル）ピロリジン−２，５−ジオン
（３）１−（２−（１−ベンジル−２，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−イル）−２−オキソエチル）−３−メチルイミダゾリジン−２，４，５−トリオン
（４）１−（１−ベンジル−２，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−イル）−２−（（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）チオ）エタノン
（５）（Ｓ）−１−（２−（１−ベンジル−２，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−イル）−２−オキソエチル）−２’，３’−ジヒドロスピロ［イミダゾリジン−４，１’−インデン］−２，５−ジオン
【００４０】
【化２】
0006570053.tif 000003
【００４１】
Ｓ１ＰＲ２活性化化合物としては、脱リン酸化反応を担うＳ１Ｐリアーゼを阻害する物質が挙げられる。また、Ｓ１Ｐは、生体内において、小胞体に存在するスフィンゴシン−１−リン酸リアーゼにより脱リン酸化され、ｔｒａｎｓ−２−ヘキサデセナールとエタノールアミンリン酸に分解されるが、通常、この脱リン酸化反応と、ｔｒａｎｓ−２−ヘキサデセナールにリン酸を付加する反応とは平衡状態にあることが知られている。
【００４２】
こうした阻害剤としては、以下の化合物（６）〜（８）が挙げられる。
（６）（Ｅ）−１−（４−（（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ）−１，２，３，４−テトラヒドロキシブチル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）エタノンオキシム（例えば、Ｂａｇｄａｎｏｆｆ，Ｊ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．５３，ｐ．８６５０−８６６２（２０１０）を参照）
（７）（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ）−１−（２−（イソキサゾール−３−イル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）ブタン−１，２，３，４−テトラオール（Ｂａｇｄａｎｏｆｆら、上述）
（８）１−（５−（（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ）−１，２，３，４−テトラヒドロキシブチル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）エタノン（例えば、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｔｅｍ Ｎｕｍｂｅｒ １３２２２Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍ．，Ｍｉｃｈｉｇａｎ，ＵＳＡ）
【００４３】
【化３】
0006570053.tif 000004
【００４４】
本治療用製剤は、心筋障害治療のために用いることができる。本明細書において、心筋障害とは、心筋障害とは、冠動脈の狭窄や閉塞によって生じる、心筋への血流の減少又は停止に起因する傷害をいう。例えば、狭心症、不安定狭心症及び心筋梗塞が挙げられる。心筋梗塞は、特に、重症大型心筋梗塞、及びそれに伴う心不全を含む。ここで、「心筋梗塞」とは、冠動脈の閉塞によってもたらされる心筋壊死をいう。また、「心不全」とは、十分量の血流を押し出す心機能の不全に原因する症候群をいい、心拍出量の低下とそれに伴う静脈圧の増大、またその結果として生じる種々の臨床症状が含まれる。心筋梗塞は、急性心臓死及び慢性心臓死を引き起こす原因となる。
【００４５】
本治療用製剤の適用対象である心筋障害は、急性心筋梗塞とすることが有利である。本治療用製剤は、発症後迅速に処置するのに好適な製剤であるからである。急性心筋梗塞の場合、死亡率は３５〜５０％と高く、その死亡例の６０〜７０％は発症後１〜２時間以内の死亡である。また、初回発作の心筋壊死巣が大きい場合には、心筋梗塞を再発する危険性が高い。したがって、心筋梗塞の治療においては、発作が起きたときに迅速に処置することが求められ、壊死した心筋の大きさ、すなわち梗塞サイズを可及的小にとどめることが重要とされている。
【００４６】
また、本治療用製剤の適用対象である心筋障害は、重症大型心筋梗塞とすることが有利である。なかでも、心筋の左室リモデリングが進行する程度の心筋梗塞とすることが有利である。心筋梗塞の重症度判定には、種々の分類がある。そのような分類としては、例えば、時間的経過による分類、形態学的分類（心筋層内範囲、部位、壊死の大きさなど）、心筋の壊死形態、梗塞後の心室再構築、血行動態的分類（治療、予後などに関連する）、臨床的重症度による分類などが挙げられる。ここで、重症度が高く、より広範囲に心筋壊死に陥った心筋梗塞を特に「重症大型心筋梗塞」という。例えば、左冠動脈の近位部の完全閉塞が挙げられる。また、重症大型心筋梗塞では、心筋の左室リモデリングが進行し、心不全に陥るため生命予後は悪いことが知られている。心筋梗塞後の「左室リモデリング」とは、心筋梗塞後に生じる梗塞部位の非薄化による心機能低下の代償として起こる非梗塞部位の心筋細胞の肥大、間質（細胞外マトリックス）の増加、心内腔の拡大などの一連の変化を指す。心筋梗塞後の長期予後は、左室機能不全の程度と相関するため、左室リモデリングを抑制することは左室の機能を維持及び保存するために不可欠である。
【００４７】
本治療用製剤は、Ｓ１ＰＲ２活性化化合物を非傷害部位に投与する製剤である。ここで非傷害部位とは、心筋障害の傷害部位とな異なる部位をいう。本明細書において、心筋障害の傷害部位とは、心筋組織又は細胞において、外傷、炎症、疾患、虚血、壊死、腫瘍形成、又は加齢等を原因とした各種細胞及び組織との変性又は脱落によって失われた特定の部位を意味する。例えば、心筋における傷害部位は、心筋において血管の狭窄や閉塞によって血流が減少又は停止したことによって細胞や組織が損傷された部位が挙げられる。
【００４８】
本製剤は、傷害部位とは異なる部位、すなわち、非傷害部位に投与される。非傷害部位とは、上記した傷害部位以外の部位である。すなわち、本治療用製剤は、傷害部位とは異なる部位に投与することで、多能性幹細胞を移植することなく、傷害部位に対して内因性多能性幹細胞を集積させることができるものである。
【００４９】
投与部位としての非傷害部位は、特に限定するものではないが、心臓以外の部位であることが好ましい。したがって、例えば、一般的な製剤の投与経路に適用される投与部位であって局所としての心臓以外であればよい。
【００５０】
本治療用製剤は、経口投与のほか、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、髄腔内投与、舌下、経直腸、経膣、経鼻、吸入、経皮、口腔粘膜、インプラント等、非経口投与を意図した製剤形態を採ることができる。製剤形態としても、特に限定するものではないが、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、髄腔内投与については、注射剤などの注入剤等が挙げられる。また、経皮、口腔粘膜、インプラント等においては、パッチやフィルム等も可能である。
【００５１】
本治療用製剤は、静脈投与製剤以外の製剤形態が好適であり、例えば、皮下投与製剤、筋肉内投与製剤、経皮製剤が好適である。なかでも、皮下注射剤や筋肉注射剤などの経皮的投与製剤が好適である。これらの製剤は、Muse細胞を血流中に動員するのに好適な製剤形態であるからである。例えば、皮下注射剤や筋肉注射剤の場合には、特に限定するものではないが、上腕部や臀部を投与部位とすることができる。
【００５２】
本治療用製剤は、投与形態等に応じて、公知の製剤方法を利用して製造することができる。注射剤を調製する場合は、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法を利用して局所用注射剤を製造することができる。ｐＨ調製剤及び緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ（エデト酸ナトリウム）、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が挙げられる。
【００５３】
本治療用製剤に含めるＳ１ＰＲ２活性化化合物の濃度は、傷害部位における損傷の程度等によって適宜変更することができる。例えば、Ｍｕｓｅ細胞を血流に動員させ傷害部位に集積させるために有効なＳ１ＰＲ２活性化化合物の濃度は、特に限定するものではないが、例えば、１ｎＭ〜１００μＭである。
【００５４】
本治療用製剤の投与量は、心筋障害の重症度、発症経過日数、個体年齢等によっても異なるが、１ｍｇ／ｋｇ体重、日以上１０ｍｇ／ｋｇ体重、日以下とし、こうした投与を、例えば、１回から適数回（例えば、１０回以下程度、２回以上８回以下程度など）にわたって実施することができる。投与量は、３ｍｇ／ｋｇ体重、日以上８ｍｇ／ｋｇ体重、日以下であってもよいし、好ましくは４ｍｇ／ｋｇ体重、日以上６ｍｇ／ｋｇ体重、日以下であってもよい。また、例えば、急性心筋梗塞発症後においては、発症後２４時間以内に少なくとも１回投与することが好ましい。
【００５５】
本治療用製剤は、Ｓ１ＰＲ２活性化化合物を有効成分とし、心筋障害の非傷害部位に投与することにより、心筋障害を治療することができる。すなわち、本治療用製剤は、非傷害部位に投与しつつ、生体内に内在するMuse細胞及び／又は傷害時に生体内に誘導されるMuse細胞を傷害部位に集積させることができ、内因性のMuse細胞の再生能を利用して傷害部位を修復し、傷害の進行を抑制し又は傷害を低減させることができる。
【００５６】
推論であって本開示を拘束するものではないが、本治療用製剤は、Ｓ１ＰＲ２活性化化合物の血中濃度を増大させることにより、骨髄中のMuse細胞などの内因性多能性幹細胞を、血流中に動員することができる。一旦、血流中に動員されたMuse細胞は、その遊走能に基づいて障害部位に集積するものと考えられる。本発明者の一部は、既に、Ｓ１ＰＲ２活性化化合物を遊走因子として用いてMuse細胞を傷害部位に集積させることを見出している。しかしながら、遊走因子は、その因子の濃度勾配に応じて、遊走因子高濃度側に被遊走要素（ここではMuse細胞）を誘導するものである。
【００５７】
これに対して、本治療用製剤は、Ｓ１ＰＲ２活性化化合物を遊走因子として使用するものではない。その結果、本治療用製剤は、傷害部位でない非傷害部位にＳ１ＰＲ２活性化化合物を投与し、かつ内因性多能性幹細胞を傷害部位に集積させるものである。本治療用製剤は、Ｓ１ＰＲ２活性化化合物を傷害部位に投与しない点、非傷害部位に投与するのに内因性多能性幹細胞を傷害部位に集積させることができる点において、特許文献２に記載の医薬組成物によりも有利であるといえる。また、特許文献２等に接した当業者といえども、非傷害部位へのＳ１ＰＲ２活性化化合物によるMuse細胞の傷害部位への送達程度は、当業者といえども予測することができないものである。また、このような用法及び用量により心筋障害を治療できることも想到しえないものである。
【００５８】
（内因性多能性幹細胞を傷害部位へ送達するための非傷害部位投与製剤）
本開示の非傷害部位投与製剤（以下、単に本送達用製剤という。）は、スフィンゴシン−１−リン酸受容体２を活性化する化合物を有効成分とすることができる。本送達用製剤は、非傷害部位への投与により、内因性多能性幹細胞を傷害部位へ送達することができる。本送達用製剤における、Ｓ１ＰＲ２活性化化合物、非傷害部位については、既に本治療用製剤について説明した各種実施態様をそのまま適用できる。
【００５９】
本送達用製剤は、特に、疾患等の適用対象を想定するものではない。生体内において傷害部位が発生しているような疾患や、傷害が発生しているようなあるいはそのような障害が予見されるような状態に適用される。ここでいう、傷害部位は、上記した心筋障害に限定されないで、生体内における各種の臓器、器官、及び組織において、外傷、炎症、疾患、虚血、壊死、腫瘍形成、又は加齢等を原因とした各種細胞及び組織との変性又は脱落によって失われた特定の部位を意味する。
【００６０】
（生体における傷害の診断を補助する方法又は生体における傷害の検査方法）。
本明細書によれば、血中のＳ１Ｐ量を測定する工程を備える、生体における傷害の診断を補助する方法又は生体における傷害の検査方法を提供することができる。この方法によれば、血中Ｓ１Ｐ量を測定することによって、生体のいずれかの箇所における損傷の発生に対して肯定的に判断するか又は肯定的な判断を補助することができる。血中におけるＳ１Ｐ量の増大は、Muse細胞の動員を意味している。すなわち、生体における要修復箇所の発生を意味しているからである。
【００６１】
血中のＳ１Ｐ量は特に限定しないで、公知の方法、例えば、ＭＳ、ＨＰＬＣ、呈色（蛍光）法等の当業者に公知の方法により測定することができる。
【実施例】
【００６２】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００６３】
本実施例では、ウサギ心筋梗塞モデルについて、図１に示すプロトコールに基づき、Ｓ１Ｐを皮下注により投与し、血中Muse細胞及び梗塞領域について評価した。なお、本実施例におけるウサギを用いた実験プロトコールは、岐阜大学の動物実験に関する倫理委員会によって承認されたものであり、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって刊行された「実験動物の管理と使用に関する指針」（１９９６年改定版）に沿って実施された。
【００６４】
（ウサギ心筋梗塞モデルの作製）
日本白色種ウサギ（約２〜３ｋｇ／匹）は、３０ｍｇ／ｋｇペントバルビタールナトリウムを用いて麻酔された。ウサギにおいて、連続的に動脈ガス分析を行い、動脈ガスを生理学的範囲に維持するように換気条件を適宜調整した。左頸動脈及び頸静脈にカニュレートし、動脈圧を監視した。３番目の肋間腔において左開胸後、心臓を露出させ、左室の外側前面の中央を下行する大冠動脈枝下で４−０絹糸結紮を行った。縫合糸の両末端に細いビニルチューブを通し、その縫合糸を引くことによって冠動脈枝を閉塞した。次に、モスキート止血鉗子を用いてこのチューブをクランプすることによって固定した。心筋虚血は、局所的チアノーゼ及び心電図の変化によって確認した。閉塞（虚血）時間は適宜調整される。縫合糸を開放後、危険領域全体での心筋の赤色への変化によって確認した（Ｙａｓｕｄａら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ．Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２９６：Ｈ１５５８−１５６５，２００９を参照されたい）。
【００６５】
（Ｓ１ＰＲ２アゴニスト皮下投与による血中Ｍｕｓｅ細胞及び心筋梗塞サイズの縮小効果）
図１に示すプロトコールに基づき、ウサギにおいて、結紮による梗塞（虚血）時間を３０分間（ヒトにおいては虚血３時間に対応する）とし、その後、縫合糸を開放し、再還流を開始した。再還流２４時間後に、コントロール群は、生理食塩水を、Ｓ１Ｐ投与群は、スフィンゴシン−１−リン酸受容体２に対するアゴニストであるＳＩＤ46371153（既述の化合物（１））を５ｍｇ／ｋｇとなるようにウサギの背中に筋肉内に対して注射を実施した。
【００６６】
（血中Muse細胞の測定）
再灌流から４８時間後に、各群から血液を採取して、ＦＡＣＳによりＳＳＥＡ３及びＣＤ４４陽性細胞をカウントした。結果を図２に示す。
【００６７】
図２に示すように、Ｓ１Ｐ投与群は、コントロール群に対して約１．５倍のMuse細胞が血中に動員されていることがわかった。
【００６８】
（梗塞領域の評価）
再還流から１４日後に、各群における梗塞サイズの縮小効果を比較検討した。より具体的には、再灌流１４日後のウサギをヘパリン（５００Ｕ／ｋｇ）処理し、過剰量のペントバルビタールを静脈注射することによって安楽死させた。心臓を摘出し、心筋組織における梗塞サイズの縮小効果をまた、マッソントリクローム染色により、組織化学的に検討した。
【００６９】
摘出した心臓を１０％ホルマリン液中で固定し、パラフィン包埋後、房室輪が得られるように各標本から横断面方向に切片を作製した。その後、常法に従ってマッソントリクローム（ＭＴ）染色し、心筋梗塞領域を視覚化した。このＭＴ染色では、生細胞からなる組織では赤く染色され、一方、膠原線維化された組織は青白く、色が抜けたように観察される。結果を図３に示す。
【００７０】
図３上段に示すように、生理食塩水を投与されたコントロール群では、ＭＴに染色されない膠原線維化された組織（梗塞部位）が広がっていることがわかる。一方、Ｓ１Ｐ投与群の左室組織は、対照と比較して青白い部分が小さく、梗塞サイズが減少しているのがわかる。また、特徴的に、乳頭筋についても梗塞から回復していることが観察された。
【００７１】
また、図３の下段に示すように、コントロール群の梗塞領域は、３３．４６％であったのに対し、Ｓ１Ｐ投与群では１８．２６％であった。すなわち、約半分程度にまで梗塞領域が減少していることがわかった。
【００７２】
以上のことから、皮下から投与したＳ１ＰＲ２アゴニストは、Muse細胞を血中に動員して、心臓の傷害部位に到達して梗塞領域を低減できることがわかった。
【実施例２】
【００７３】
本実施例では、急性心筋梗塞発症後の血中Ｓ１Ｐの評価を行った。コントロール群（健常人群；６３人、平均年齢６２．４±１２．９、男性３８人、女性２２人）、冠動脈疾患（ＣＡＤ）（群（健常人群；６３人、平均年齢６２．４±１２．９、男性３８人、女性２２人）及び急性心筋梗塞（ＡＭＩ）発症群（健常人群；６３人、平均年齢６２．４±１２．９、男性３８人、女性２２人）のうち、コントロール群７名、ＣＡＤ群５名及びＡＭＩ群７人につき、血中濃度を測定した。ＡＭＩ群については、発症後２８日まで定期的に血液を採取し、その最大値を平均した。なお、Ｓ１Ｐは、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて一般的なプロトコールにより測定した。結果を図４に示す。
【００７４】
図４に示すように、ＡＭＩ群においては、血中Ｓ１Ｐ量が高値になっていることがわかった。したがって、血中Ｓ１Ｐは、生体における心筋梗塞などによる傷害部位の発生に対応して上昇することがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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