(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種核酸に機能可能に結合されているヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子を含んでなる発現カセットであって、前記ヌクレオチド配列が
（ａ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列、および
（ｂ）前記配列番号２に示される配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、前記配列が植物細胞において前記異種核酸の転写を開始する、ヌクレオチド配列、
からなる群から選択される、発現カセット。
【請求項２】
請求項１に記載の発現カセットを含んでなるベクター。
【請求項３】
植物細胞であって、そのゲノム中に請求項１に記載の発現カセットが安定に取り込まれており、前記ヌクレオチド配列が対象の異種核酸に機能可能に結合されている、細胞。
【請求項４】
前記植物細胞が双子葉植物に由来する、請求項３に記載の植物細胞。
【請求項５】
前記双子葉植物がダイズである、請求項４に記載の植物細胞。
【請求項６】
植物であって、そのゲノム中に請求項１に記載の発現カセットが安定に取り込まれていおり、前記ヌクレオチド配列が対象の異種核酸に機能可能に結合されている、植物。
【請求項７】
前記植物が双子葉植物である、請求項６に記載の植物。
【請求項８】
前記双子葉植物がダイズである、請求項７に記載の植物。
【請求項９】
請求項１に記載の発現カセットを含むトランスジェニック種子。
【請求項１０】
前記対象の異種核酸が、除草剤、塩、病原体、または有害生物に対する耐性を付与する遺伝子産物をコードする、請求項６に記載の植物。
【請求項１１】
植物において対象の異種核酸を発現させる方法であって、
対象の異種核酸に機能可能に結合されたプロモーターを含む発現カセットを植物細胞中に導入することであって、前記プロモーターが、
（ａ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列、および、
（ｂ）前記配列番号２に示される配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、前記ヌクレオチド配列が植物細胞において対象の異種核酸の転写を開始する、ヌクレオチド配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、導入することと、
前記植物細胞から形質転換植物を再生することであって、前記植物のゲノム中に前記発現カセットが安定に取り込まれている、再生することと、
を含む、方法。
【請求項１２】
前記植物が単子葉植物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記植物が双子葉植物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記単子葉植物がメイズである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記異種核酸が、除草剤耐性または有害生物に対する耐性を付与する遺伝子産物をコードする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
植物細胞において対象の異種核酸を発現させる方法であって、
対象の異種核酸に機能可能に結合されたプロモーターを含む発現カセットを植物細胞中に導入することを含み、前記プロモーターが、
（ａ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列、および
（ｂ）前記配列番号２に示される配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、前記配列が植物細胞において対象の異種核酸の転写を開始する、ヌクレオチド配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
【請求項１７】
前記植物細胞が単子葉植物細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記植物細胞が双子葉植物細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記単子葉植物がメイズである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記異種核酸が、除草剤耐性または有害生物に対する耐性を付与する遺伝子産物をコードする、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１５日出願の米国仮特許出願第６１／７９０，９０７号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
【０００２】
電子的に提出された配列リストの参照
配列リストのコピーは、４．１４キロバイトのサイズを有する２０１４年３月１０日作成のファイル名「２９１２９３９−２０１７９ＷＯ０１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」のＡＳＣＩＩ形式配列リストとしてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に送付され、本明細書と同時に提出されている。このＡＳＣＩＩ形式ドキュメントに含まれる配列リストは、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、植物分子生物学の分野、より特定的には、植物における調節エレメントの同定および使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
現在、バイオテクノロジー的に重要なタンパク質産物を高レベルまたは誘導可能レベルで発現するトランスジェニック植物に対する高い需要が存在する。表現型特性（たとえば、生産性または品質）を改変および／または改善するように作物植物を操作するには、植物組織において異種遺伝子を発現させる必要がある。そのような遺伝子操作は、２つの発見、すなわち、異種遺伝子材料を植物細胞に導入して形質転換可能であること、および異種遺伝子材料の発現を駆動可能なプロモーターが存在すること、により可能になってきた。
【０００５】
最も一般的に使用されるプロモーターとしては、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター（Ｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：５７４５−５７４９（１９８７））、オクタピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター、カリモウイルスプロモーター、たとえば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓプロモーター（Ｌａｗｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９：３１５−３２４（１９８７））、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−８１２（１９８５））、およびゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４：４３３−４３（１９９０））、ルビスコの小サブユニットの光誘導プロモーター（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｅｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２３（２）：２４７−２５０（１９９５））、Ａｄｈプロモーター（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：６６２４−６６２８０（１９８７））、スクロースシンターゼプロモーター（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：４１４４−４１４８（１９９０））、Ｒ遺伝子複合体プロモーター（Ｃｈａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：１１７５−１１８３（１９８９））、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロモーターなどが挙げられる。
【０００６】
微生物および植物における遺伝子の強力発現または誘導発現に有用な調節エレメントの同定および単離は、トランスジェニック植物の商業品種の開発に有益であろう。
【発明の概要】
【０００７】
植物において遺伝子発現を調節するための組成物および方法を提供する。組成物は、植物において転写を開始する、グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）およびその変異株に由来するヌクレオチド配列を含む。特定的には、グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）のγ液胞膜遺伝子および形質膜遺伝子から単離された転写開始領域を提供する。本発明に係るさらなる組成物は、配列番号１および２に示されるヌクレオチド配列ならびにそれらの変異体および断片を含む。本発明に係る組成物はまた、対象の異種ヌクレオチド配列に機能可能に結合された本発明に係るプロモーターを含む発現カセットを含む。本発明はさらに、発現カセットを含むベクター、ならびに以上に記載の発現カセットがゲノム中に安定に取り込まれている植物および植物細胞を提供する。その他に、組成物は、そのような植物のトランスジェニック種子を含む。
【０００８】
プロモーターに機能可能に結合されるのは、植物の表現型を修飾しうる対象の配列である。そのような修飾は、たとえば、植物において、内因性産物の産生を変調することを含みうるか、または外因性発現産物の産生により新規な機能または産物を提供することを含みうる。たとえば、除草剤または有害生物に対する耐性を付与する遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Ｐｂｄｃ６（配列番号１）プロモーターおよびＰｂｄｃ７（配列番号２）プロモーターの制御下にあるときのルシフェラーゼの高い発現レベルを示している。
【発明の具体的説明】
【００１０】
本発明は、植物または植物細胞において遺伝子発現を調節するための組成物および方法に関する。本発明に係る組成物は、ダイズプロモーターの新規なヌクレオチド配列を含む。特定的には、本発明は、配列番号１または２に示されるヌクレオチド配列さらにはそれらの断片および変異体を含む単離されたプロモーター核酸分子を提供する。それに加えて、形質転換された植物、植物細胞、および種子を提供する。
【００１１】
本発明に係るプロモーター配列は、プロモーターが対象のヌクレオチド配列に機能可能に結合されるようにＤＮＡ構築物内に集合されたときに、このＤＮＡ構築物を用いて安定に形質転換された生物の細胞、特に植物の細胞において、ヌクレオチド配列の発現を駆動する。プロモーター配列はまた、他のダイズプロモーター配列または遺伝子を単離するためのプローブとしても、分子マーカーなどとしても、有用である。
【００１２】
植物においてヌクレオチド配列を発現させる方法は、対象のヌクレオチド配列に機能可能に結合された本発明に係るプロモーターを含む発現カセットを植物細胞内に導入することと、植物細胞から形質転換植物を再生することと、を含む。
【００１３】
冠詞の「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、本明細書では、冠詞の文法上の目的語の１つ以上（すなわち少なくとも１つ）を意味するものとして用いられる。例として、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ（エレメント）」とは、１つ以上のエレメントを意味する。
【００１４】
本明細書で用いられる場合、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（たとえば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（たとえば、ｍＲＮＡ）ならびにヌクレオチドアナログを用いて生成されるＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖または二本鎖でありうるが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。
【００１５】
「単離された」もしくは「精製された」核酸分子またはその生物学的活性部分は、組換え技術により産生されたときに、他の細胞物質または培養培地を実質的に含まないか、または化学合成されたときに、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。好ましくは、「単離された」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中で核酸に天然でフランキングする配列（すなわち、核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）（好ましくは、タンパク質コード配列）を含まない。本発明の目的では、「単離された」とは、核酸分子を意味すべく用いられる場合、単離された染色体を除外したものである。たとえば、種々の実施形態では、プロモーター分子は、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中で核酸分子に天然でフランキングする約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有しうる。本発明の種々の態様を以下のサブセクションでさらに詳細に説明する。
【００１６】
単離された核酸分子ならびにその変異体および断片
本発明に係るヌクレオチド配列は、配列番号１および２に示されるプロモーター配列およびその変異体を含む。「プロモーター」とは、下流コード配列の転写を指令するように機能する核酸配列であることが意図される。プロモーターは、一般的には、転写開始（キャップ）部位の５’側にある約１０〜３０塩基対のコンセンサス５’−ＴＡＴＡＡＴ−３’（ＴＡＴＡボックス）と相同なＤＮＡ配列を含み、これによりＲＮＡポリメラーゼにＲＮＡ合成を開始するように指令可能である。プロモーターは、一般的にはＴＡＴＡボックスの上流または５’側に、上流プロモーターエレメントとして参照される転写開始速度に影響を及ぼす他の認識配列をさらに含みうる。これらは、ＣＡＡＴボックスを含み、これは、多くの場合、ＴＡＴＡボックスの５’側に約３０〜７０塩基対で見いだされ、カノニカル形５’−ＣＣＡＡＴ−３’に対する相同性を有する（Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ（１９８１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０：３４９−３８３）。植物では、ＣＡＡＴボックスは、トリプレットＧ（またはＴ）ＮＧに対称的にフランキングするアデニン残基を有する領域であるＡＧＧＡボックスとして知られる配列と置き換えられることがある（Ｍｅｓｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３），ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｔ．Ｋｏｓｕｇｅ，Ｃ．Ｍｅｒｅｄｉｔｈ  ａｎｄ  Ａ．Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ（ｅｄｓ．），Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２１１−２２７）。これらのエレメントは、他の転写および翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも称される）と共に、対象のＤＮＡ配列の発現に必要である。本明細書に記載されていない調節エレメント、たとえば、エンハンサーおよびコード領域の組織発現または時間発現に関与するエレメントを単離および同定する方法は、当技術分野で周知である。たとえば、米国特許第５，６３５，６１８号明細書、同第６，２１８，１４０号明細書、同第６，３０３，３７０号明細書、同第６，３１０，１９７号明細書、および同第６，３５５，８６４号明細書を参照されたい。
【００１７】
「コアプロモーター」とは、プロモーターエレメントを含まないプロモーターであることが意図される。コアプロモーターは、ＴＡＴＡボックスおよび転写開始部位を含めて、プロモーター機能に不可欠なヌクレオチド配列を含有する。そのような領域は、多少の差異を有して、通常、ほとんどのプロモーター中に存在する。コアプロモーター領域は、多くの場合、それ単独で基礎転写レベルを促進する機能があるため、最小プロモーター領域として参照される。種々の実施形態では、Ｐｂｄｃ６のコアプロモーター配列は、配列番号１の約ヌクレオチド２９〜３１８に対応し、ＴＡＴＡは、配列番号１の約ヌクレオチド２８８〜２９６に対応し、そして翻訳開始部位は、配列番号１のヌクレオチド位置３１８に対応する。他の実施形態では、Ｐｂｄｃ７のコアプロモーター配列は、配列番号２の約ヌクレオチド１３４１〜１６４３に対応し、ＴＡＴＡは、配列番号２の約ヌクレオチド１６０３〜１６０８に対応し、そして翻訳開始部位は、配列番号２のヌクレオチド位置１６４３に対応する。コアプロモーター領域が、以上で参照された位置から上流または下流に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ヌクレオチドまたはそれを超えて異なりうること、およびコアプロモーター配列内の変化が許容されうることは、当業者であれば理解されよう。
【００１８】
開示されたプロモーター配列の断片である核酸分子もまた、本発明に包含される。「断片」とは、プロモーター配列の一部分であることが意図される。ヌクレオチド配列の断片は、生物学的に活性でありうるため、植物において、機能可能に結合されたヌクレオチド配列の転写を開始可能であるか、または以下に開示された方法を用いてハイブリダイゼーションプローブもしくはＰＣＲプライマーとして使用可能な断片でありうる。そのような断片が発現レベルを減少させるか、または発現の性質、すなわち、構成発現もしくは誘導発現を改変するか、を決定するアッセイは、当技術分野で周知である。
【００１９】
プロモーター配列の断片である核酸分子は、意図される使用に依存して、少なくとも約２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００隣接ヌクレオチド、または本明細書に開示された全長プロモーター配列に存在するヌクレオチドの数（たとえば、配列番号１では１２３０ヌクレオチドまたは配列番号２では１６８８ヌクレオチド）までを含みうる。「隣接」ヌクレオチドとは、互いにすぐ隣にある核酸残基であることが意図される。本発明に係るプロモーターの生物学的活性断片は、プロモーター活性（すなわち、転写開始活性）を維持するであろう。「プロモーター活性を維持する」とは、断片が全長プロモーターのプロモーター活性の少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％を有することが意図される。プロモーターの生物学的活性部分は、本発明に係るプロモーターヌクレオチド配列の１つの一部分を単離して、プロモーターのその部分の活性を評価することにより、調製可能である。プロモーター活性を測定する方法は、当技術分野で周知である。好適な方法の例については、「プロモーター活性の評価」というタイトルのセクションを参照されたい。
【００２０】
そのような断片は、一般的には、特定のプロモーター配列のＴＡＴＡ認識配列を含むであろう。これらの断片は、制限酵素を用いて本明細書に開示された天然に存在するプロモーターヌクレオチド配列を切断することにより、プロモーターＤＮＡ配列の天然に存在する配列に基づいてヌクレオチド配列を合成することにより、またはＰＣＲ技術を使用することにより、取得されうる。特に、Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：３３５−３５０、およびＥｒｌｉｃｈ，ｅｄ．（１９８９）ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。これらのプロモーター断片の変異体、たとえば、部位指向突然変異誘発から得られるものもまた、本発明に係る組成物に包含される。
【００２１】
本明細書に開示されたプロモーター配列の変異体もまた、包含される。「変異体」とは、十分に同一の配列であることが意図される。本発明に包含されるプロモーター配列は、配列番号１または２のヌクレオチド配列と十分に同一である。「十分に同一」とは、本明細書に記載のアライメントプログラムの１つを用いて参照配列と比較して、少なくとも約７０％または７５％、約８０％または８５％の配列同一性、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％  ９８％、または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であることが意図される。
【００２２】
天然に存在する変異体は、周知の分子生物学技術、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および以下に概説されるハイブリダイゼーション技術を用いて、同定可能である。変異体ヌクレオチド配列はまた、たとえば、部位指向突然変異誘発を用いて生成された、ただし、依然として本明細書に定義されるプロモーター活性を有する、合成に由来するヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
本発明に包含される変異体は、生物学的に活性である。すなわち、天然配列の所望の生物学的活性を継続して有する。すなわち、プロモーター活性（すなわち、開始転写活性）を維持する。「プロモーター活性を維持する」とは、変異体が天然配列のプロモーター活性の少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％またはそれを超えて有することが意図される。プロモーター活性を測定する方法は、当技術分野で周知である。好適な方法の例については、「プロモーター活性の評価」というタイトルのセクションを参照されたい。
【００２４】
当業者であれば、さらに、植物細胞において、発現を駆動するプロモーターの能力を変化させることなく、本発明に係るヌクレオチド配列に突然変異により変化を導入可能であることは、理解するであろう。したがって、変異体の単離された核酸分子は、本明細書に開示された対応するヌクレオチド配列に１つ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失を導入することにより、形成可能である。突然変異は、部位指向突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの標準的技術により、導入可能である。そのような変異体ヌクレオチド配列もまた、本発明に包含される。
【００２５】
他の選択肢として、変異体ヌクレオチド配列は、プロモーター配列の全部または一部分に沿って突然変異をランダムに導入することにより、たとえば、飽和突然変異誘発により、作製可能であり、得られた突然変異体は、植物細胞において、機能可能に結合されたヌクレオチド配列の発現を駆動する能力に関してスクリーニング可能である。
【００２６】
「機能可能に結合された」とは、プロモーター配列が第２の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始および媒介する、プロモーターと第２の配列との機能的結合であることが意図される。常にではないが、一般的には、機能可能に結合されたとは、結合される核酸配列が、隣接すること、２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合は隣接して同一のリーディングフレーム内にあること、を意味する。
【００２７】
２つの核酸の同一性パーセントを決定するために、配列は、最適比較目的でアライメントされる。２つの配列間の同一性パーセントは、配列により共有される同一位置の数の関数である（すなわち、同一性パーセント＝同一位置の数／位置の全数（たとえば、オーバーラップ位置）×１００）。一実施形態では、２つの配列は、同一の長さである。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップを許容してまたは許容せずに、以下に記載のものに類似した技術を用いて、決定可能である。同一性パーセントを計算する場合、典型的には、完全一致がカウントされる。
【００２８】
２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成可能である。２つの配列を比較するために利用される数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７のように変更が加えられた、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＢＬＡＳＴＮプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いてＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行って、本発明に係るプロモーターと相同なヌクレオチド配列を取得することが可能である。比較目的でギャップ付きアライメントを取得するために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９に記載されるようにギャップ付きＢＬＡＳＴを利用することが可能である。他の選択肢として、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いて、分子間の遠縁関係を検出する繰返し検索を行うことが可能である。Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）（前掲）を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、ギャップ付きＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（たとえば、ＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトパラメーターを使用することが可能である。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。配列を比較するために利用される数学的アルゴリズムの他の非限定的な例は、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０）である。ＣｌｕｓｔａｌＷは、配列を比較してＤＮＡ配列の全体をアライメントするため、全ヌクレオチド配列の配列保存性に関するデータを提供することが可能である。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムは、いくつかの市販のＤＮＡ解析ソフトウェアパッケージ、たとえば、ベクターＮＴｉプログラムスイート（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ）のＡＬＩＧＮＸモジュールで使用される。ＣｌｕｓｔａｌＷアライメントの解析に有用なソフトウェアプログラムの非限定的な例は、ＧｅｎｅＤｏｃ（商標）である。Ｇｅｎｅｄｏｃ（商標）（Ｋａｒｌ  Ｎｉｃｈｏｌａｓ）は、複数の遺伝子間でＤＮＡの類似性および同一性の評価が可能である。配列を比較するために利用される数学的アルゴリズムの他の好ましい非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，９８６５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｄ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡから入手可能）の一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。
【００２９】
特に明記されていないかぎり、配列の同一性または類似性を決定するために、次のパラメーターを用いて、すなわち、ヌクレオチド配列の同一性％および類似性％では、ギャップ加重５０および長さ加重３およびｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコア行列を用いて、アミノ酸配列の同一性％または類似性％では、ギャップ加重８および長さ加重２およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングプログラムを用いて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８（３）：４４３−４５３のアルゴリズムを用いたＧＡＰバージョン１０が使用されるであろう。均等なプログラムを使用することも可能である。「均等なプログラム」とは、対象の任意の２つの配列に対して、ＧＡＰバージョン１０により生成された対応するアライメントと比較した場合、同一のヌクレオチド残基マッチおよび同一の配列同一性パーセントを有するアライメントを生成する任意の配列比較プログラムであることが意図される。
【００３０】
ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどの方法を用いて、他の生物、特に他の植物に由来する対応する配列を同定することが可能であり、そのような配列は、本発明に係る配列に対して実質的な同一性を有する。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）およびＩｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）を参照されたい。本明細書に示されるプロモーター配列に対する同一性により同定された配列は、本発明に包含される。
【００３１】
対象の植物に由来するｃＤＮＡまたゲノムＤＮＡから対応するＤＮＡ配列を増幅するＰＣＲ反応に使用するために、オリゴヌクレオチドプライマーを設計することが可能である。ＰＣＲプライマー設計およびＰＣＲクローニングの方法は、当技術分野で一般に知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）に開示されている。また、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、Ｉｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，ｅｄｓ．（１９９５）ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびＩｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，ｅｄｓ．（１９９９）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）も参照されたい。ＰＣＲの公知の方法としては、ペアプライマー、ネストプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、および部分ミスマッチプライマーを用いた方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
ハイブリダイゼーション法では、既知のヌクレオチド配列の全部または一部分を用いてｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることが可能である。そのようなｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーの構築方法は、当技術分野で一般に知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１（前掲）に開示されている。ハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、もしくは他のオリゴヌクレオチドでありうるか、または検出可能基、たとえば、３２Ｐ、任意の他の検出可能マーカー、たとえば、他の放射性同位体、蛍光性化合物、酵素、もしくは酵素補因子を用いて標識されうる。ハイブリダイゼーションプローブは、本明細書に開示された既知のプロモーター配列に基づいて合成オリゴヌクレオチドを標識することにより、作製可能である。ヌクレオチド配列中の保存ヌクレオチドに基づいて設計された縮重プライマーを追加的に使用することが可能である。プローブは、典型的には、本発明に係るプロモーター配列またはその断片もしくは変異体の少なくとも約１２、少なくとも約２５、少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、または４００連続ヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。ハイブリダイゼーションプローブの調製は、当技術分野で一般に知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１（前掲）（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【００３３】
たとえば、本明細書に開示された全プロモーター配列または１つ以上のその一部分は、対応するプロモーター様配列に特異的にハイブリダイズ可能なプローブとして使用されうる。さまざまな条件下で特異的ハイブリダイゼーションを達成するために、そのようなプローブは、ユニークなかつ少なくとも約１０ヌクレオチド長または少なくとも約２０ヌクレオチド長の配列を含む。そのようなプローブは、ＰＣＲにより所定の生物に由来する対応するプロモーター配列を増幅するために使用されうる。この技術は、所望の生物から追加のコード配列を単離するために、または生物においてコード配列の存在を決定する診断アッセイとして、使用されうる。ハイブリダイゼーション技術は、プレーティングされたＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングを含む（プラークまたはコロニーのいずれか、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい）。
【００３４】
そのような配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェント条件下で行われうる。「ストリンジェント条件」または「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」とは、プローブがその標的配列に他の配列よりも検出可能に高度に（たとえば、バックグラウンドの少なくとも２倍）ハイブリダイズする条件であることが意図される。ストリンジェント条件は、配列依存性であり、異なる状況では異なったものになるであろう。ハイブリダイゼーション条件および／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに対して１００％の相補性を有する標的配列を同定することが可能である（相同プロービング）。他の選択肢として、配列のミスマッチをいくらか許容してより低い類似度が検出されるように、ストリンジェンシー条件を調整することが可能である（非相同プロービング）。一般的には、プローブは、約１０００ヌクレオチド長未満または５００ヌクレオチド長未満である。
【００３５】
典型的には、ストリンジェント条件とは、ｐＨ７．０〜８．３において塩濃度が約１．５Ｍ未満のＮａイオン、典型的には約０．０１〜１．０ＭのＮａイオンの濃度であり（または他の塩）、かつ温度が短いプローブ（たとえば１０〜５０ヌクレオチド）に対しては少なくとも約３０℃、長いプローブ（たとえば５０ヌクレオチド超）に対しては少なくとも約６０℃である条件のことであろう。ストリンジェント条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することにより達成することも可能である。例示的な低ストリンジェンシー条件は、３７℃における３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液を用いたハイブリダイゼーションと、５０〜５５℃における１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中での洗浄と、を含む。例示的な中ストリンジェンシー条件は、３７℃における４０〜４５％ホルムアミド、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーションと、５５〜６０℃における０．５×〜１×ＳＳＣ中での洗浄と、を含む。例示的な高ストリンジェンシー条件は、３７℃における５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーションと、６０〜６５℃における０．１×ＳＳＣ中での洗浄と、を含む。任意選択で、洗浄緩衝液は、約０．１％〜約１％ＳＤＳを含みうる。ハイブリダイゼーションの持続時間は、一般的には約２４時間未満、通常は約４〜約１２時間である。任意選択で、洗浄緩衝液は、約０．１％〜約１％ＳＤＳを含みうる。
【００３６】
特異性は、典型的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、決定的因子は、イオン強度および最終洗浄溶液の温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドでは、Ｔｍは、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４の式、すなわち、Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌから近似可能である。式中、Ｍは、一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチドのパーセントであり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセントであり、かつＬは、塩基対中のハイブリッドの長さである。Ｔｍは、相補的標的配列の５０％が完全マッチプローブにハイブリダイズする温度である（規定のイオン強度およびｐＨの下で）。Ｔｍは、１％のミスマッチごとに約１℃低減されるため、所望の同一性の配列にハイブリダイズするように、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション条件、および／または洗浄条件を調整することが可能である。たとえば、≧９０％の同一性を有する配列は、Ｔｍが１０℃減少されうると考えられる。一般的には、ストリンジェント条件は、規定のイオン強度およびｐＨで特定の配列およびその相補体の熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。しかしながら、高ストリンジェント条件では、熱融解点（Ｔｍ）よりも１、２、３、または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することが可能であり、中ストリンジェント条件では、熱融解点（Ｔｍ）よりも６、７、８、９、または１０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することが可能であり、低ストリンジェンシー条件では、熱融解点（Ｔｍ）よりも１１、１２、１３、１４、１５、または２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することが可能である。式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の組成物、ならびに所望のＴｍを用いて、ハイブリダイゼーション溶液および／または洗浄溶液のストリンジェンシーの変化が本質的に記載されることは、当業者であれば理解されよう。所望のミスマッチ度で４５℃（水性溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）よりも低いＴｍになる場合、より高い温度を使用できるように、ＳＳＣ濃度を増加させうる。核酸のハイブリダイゼーションの広範な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に見いだされる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。
【００３７】
プロモーター活性を有しかつ本明細書に開示されたプロモーター配列またはその断片にストリンジェント条件下でハイブリダイズする単離された配列は、本発明に包含される。
【００３８】
使用方法
本発明に係る方法は、植物および植物細胞において本発明に係るプロモーター配列の制御下で異種ヌクレオチド配列を発現させることに関する。トランスジェニック植物は、病原体または虫類に対する防衛機構の改変、１種以上の除草剤に対する耐性の増加、ストレスを引き起こす環境条件に耐える能力の増加、デンプンを産生する能力の修飾、デンプン産生レベルの修飾、油の含有率および／または組成の修飾、窒素を利用、分配、および／または貯蔵する能力の修飾などを含めて、表現型の変化を有しうるが、これらに限定されるものではない。これらの結果は、植物において、異種遺伝子の発現を介してまたは内因性産物の発現の増加により、達成可能である。他の選択肢として、結果は、植物において、１種以上の内因性産物、特定的には、酵素、トランスポーター、もしくは補因子の発現を低減することにより、または養分吸収に影響を及ぼすことにより、達成可能である。
【００３９】
一般的には、本発明に係るプロモーターのヌクレオチド配列は、対象の植物における発現のために、対象のヌクレオチド配列、典型的には異種ヌクレオチド配列を有する発現カセットで提供される。「異種ヌクレオチド配列」とは、天然に存在するＤＮＡ配列の天然に存在しない複数のコピーを含めて、天然ではプロモーター配列に機能可能に結合されていない配列であることが意図される。このヌクレオチド配列は、プロモーター配列に対しては異種であるが、植物宿主に対しては同種または天然または異種または外来でありうる。プロモーターはまた、その相同ヌクレオチド配列または天然ヌクレオチド配列の発現を駆動しうると考えられる。いくつかの場合、形質転換植物は、表現型の変化を有しうる。異種核酸配列は、外因性のものまたは非形質転換植物細胞に存在しないもの、さらには内因性でありうるものまたは非形質転換植物細胞に存在しうるものを含む。「異種」とは、一般的には、存在する細胞または天然ゲノムの一部分に対して内因性でない、かつ感染、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、マイクロプロジェクションなどにより細胞に添加された、核酸配列を意味する。
【００４０】
対象の配列はいずれも、本発明に係るプロモーター配列により発現されうる。そのような異種ヌクレオチド配列としては、除草剤耐性コード配列、殺虫性コード配列、殺線虫性コード配列、抗微生物性コード配列、抗菌類性コード配列、抗ウイルス性コード配列、非生物ストレス耐性および生物ストレス耐性コード配列、または植物形質、たとえば、収穫量、子実品質、栄養素含有率、デンプンの品質および量、窒素の固定および／または利用、ならびに油の含有率および／または組成を修飾する配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
本発明の対象のより特定的な遺伝子としては、作物収穫量を改善する遺伝子、作物の望ましさを改善する遺伝子、乾燥、温度、塩分、毒性金属、微量元素などの非生物ストレスに対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子、または殺有害生物剤および除草剤などの毒素もしくは菌類、ウイルス、細菌、虫類、線虫などによる攻撃などの生物ストレスおよびこれらの生物に関連する病害の発生に対する耐性を付与する遺伝子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。対象の遺伝子はいずれも、本発明に係るプロモーター配列に機能可能に結合されて植物において発現されうると考えられる。
【００４２】
これらの異種ヌクレオチド配列は、病害耐性または有害生物耐性の提供に関与するタンパク質をコードしうる。「病害耐性」または「有害生物耐性」とは、植物−病原体相互作用の結果である有害症状を植物が回避することが意図される。病害耐性遺伝子および虫類耐性遺伝子、たとえば、抗細菌保護のためのリゾチームもしくはセクロピン、または抗菌類保護のためのデフェンシン、グルカナーゼ、キチナーゼなどのタンパク質、または線虫もしくは虫類を防除するためのバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）内毒素、プロテアーゼ阻害剤、コラゲナーゼ、レクチン、もしくはグリコシダーゼはすべて、有用な遺伝子産物の例である。対象の遺伝子の例は、たとえば、ｗｗｗ．ｎｂｉａｐ．ｖｔ．ｅｄｕ／ｃｆｄｏｃｓ／ｆｉｅｌｄｔｅｓｔｓ２．ｃｆｍに見いだされうる。
【００４３】
「有害生物」としては、虫類、菌類、細菌、ウイルス、線虫、ダニ、マダニなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。害虫としては、鞘翅目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）、膜翅目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）、ハジラミ目（Ｍａｌｌｏｐｈａｇａ）、同翅目（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ）、半翅目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）、直翅目（Ｏｒｔｈｒｏｐｔｅｒａ）、総翅目（Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ）、革翅目（Ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ）、等翅目（Ｉｓｏｐｔｅｒａ）、シラミ目（Ａｎｏｐｌｕｒａ）、隠翅目（Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ）、毛翅目（Ｔｒｉｃｈｏｐｔｅｒａ）など、特定的には、鞘翅目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）、および双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）から選択される虫類が挙げられる。ウイルスとしては、タバコモザイクウイルスまたはキュウリモザイクウイルス、リングスポットウイルス、壊死ウイルス、メイズ萎縮モザイクウイルスなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。線虫としては、ヘテロデラ属（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ）の種、メロイドギネ属（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）の種、およびグロボデラ属（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ）の種を含めて、ネコブセンチュウ、シストセンチュウ、クサレセンチュウなどの寄生性線虫、特定的には、限定されるものではないが、ヘテロデラ・グリシネス（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ）（ダイズシストセンチュウ）、ヘテロデラ・シャクチ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｓｃｈａｃｈｔｉｉ）（ビートシストセンチュウ）、ヘテロデラ・アベナエ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ａｖｅｎａｅ）（穀物シストセンチュウ）、ならびにグロボデラ・ロストキエンシス（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ  ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）およびグロボデラ・パリダ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ  ｐａｌｌｉｄａ）（ジャガイモシストセンチュウ）を含めて、シストセンチュウのメンバーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。クサレセンチュウとしては、ネグサレセンチュウ属（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）の種が挙げられるが、これらに限定されるものではない。菌類有害生物としては、葉銹病、黄銹病、および黒銹病を引き起こすものが挙げられる。
【００４４】
「除草剤耐性タンパク質」または「除草剤耐性コード核酸分子」の発現から生じるタンパク質としては、タンパク質を発現しない細胞よりも高濃度の除草剤に耐える能力、またはタンパク質を発現しない細胞よりも長期間にわたり特定濃度の除草剤に耐える能力、を細胞に付与するタンパク質が挙げられる。除草剤耐性形質は、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）の作用を阻害するように作用する除草剤、特定的には、スルホニル尿素系除草剤に対する耐性をコードする遺伝子、グルタミンシンターゼの作用を阻害するように作用する除草剤、たとえば、ホスフィノトリシンもしくはバスタ（たとえば、ｂａｒ遺伝子）、グリホセート（たとえば、ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子およびＧＡＴ遺伝子）に対する耐性をコードする遺伝子、または当技術分野で公知の他のそのような遺伝子により、植物に導入されうる。
【００４５】
作物収穫量を改善する遺伝子としては、Ｒｈｔ１およびＲｈｔ２などの矮性遺伝子（Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ４００：２５６−２６１）およびアンモニウム誘導グルタミン酸デヒドロゲナーゼなどの植物生長を増加させる遺伝子が挙げられる。作物の望ましさを改善する遺伝子としては、たとえば、植物が低減された飽和脂肪含有率を有するようにする遺伝子、植物の栄養価を高める遺伝子、および穀粒タンパク質を増加させる遺伝子が挙げられる。塩耐性を改善する遺伝子は、塩耐性遺伝子が導入された植物の天然環境よりも高い塩分の環境で植物生長を増加させるまたは可能にする遺伝子である。
【００４６】
また、調節エレメント（たとえば、プロモーター、ターミネーター、およびエンハンサー）を同定する方法も提供する。「調節エレメント」または「調節領域」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはＤＮＡとＲＮＡの両方のいずれかを含みうるとともに遺伝子発現に関与する、遺伝子の上流または下流に見いだされる核酸の一部分であることが意図される。調節エレメントは、器官特異性の媒介または発生遺伝子もしくは時間遺伝子の活性化の制御が可能でありうるとともに、プロモーターエレメント、コアプロモーターエレメント、外部刺激に反応して誘導可能なエレメント、構成的に活性化されるエレメント、転写ターミネーター、ポリアデニル化シグナル、およびプロモーター活性を減少または増加させるエレメント、たとえば、それぞれ、陰性調節エレメントまたは転写エンハンサーを含みうる。「シス作用」とは、転写配列に物理的に隣接する配列であることが意図される。シス作用配列は、典型的には、タンパク質または他の分子と相互作用して転写を行う（開始／停止、調節、変調するなど）。「転写エンハンサー」とは、プロモーターに近接して配置されて転写を支援可能な転写培地中に存在する場合、エンハンサーの不在下でプロモーターから得られるものと比較して増加した転写活性を与える核酸配列であることが意図される。エンハンサーは、遺伝子の上流、遺伝子内、または遺伝子の下流で、さらには転写開始部位から５０キロ塩基離れて、機能しうる。エンハンサーはまた、その配向に依存せずに機能しうる。「転写ターミネーター」とは、転写の低減または排除に必要なヌクレオチド塩基対配列を含むＤＮＡ配列であることが意図される。「ポリアデニル化シグナル」とは、転写および翻訳の終止を制御する配列であることが意図される。
【００４７】
植物で使用するための調節配列は、植物遺伝子または調節エレメントの配列に基づいて１つ以上のＰＣＲプライマーを設計することにより、ダイズからクローニングされうる。本方法は、植物に由来するヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能な少なくとも１つプライマーを設計することと、プライマーを用いてダイズ植物に由来するＤＮＡを増幅して増幅されたＤＮＡを形成することと、増幅されたＤＮＡを調節配列活性に関して試験することと、を含みうる。「調節配列活性」とは、遺伝子の転写または翻訳を行う能力であることが意図される。それは、プロモーター活性、転写エンハンサー活性、転写終止活性、およびポリアデニル化活性を含む。プロモーター活性に関して測定または試験する方法は、当技術分野で周知である（「プロモーター活性の評価」というタイトルのセクションを参照されたい）。エンハンサー活性に関して測定または試験する方法は、当技術分野で周知である（たとえば、米国特許第６，８０６，０６４号明細書、同第６，８１８，７５７号明細書、および同第６，７８４，２８９号明細書を参照されたい）。ターミネーター活性に関して測定または試験する方法は、当技術分野で周知である（たとえば、米国特許第５，０９３，２５２号明細書を参照されたい）。ポリアデニル化活性に関して測定または試験する方法は、当技術分野で周知である（たとえば、米国特許第６，６３２，６３７号明細書を参照されたい）。
【００４８】
他の選択肢として、調節エレメントを他の方法により同定およびクローニングしうる。たとえば、ＢＡＣ、コスミド、またはλベクターを用いて、ダイズゲノムライブラリーまたはダイズサブゲノムライブラリーを構築しうる。植物に由来するプロモーターエレメントを用いて、ライブラリーをプローブしうる。他の選択肢として、植物に由来する遺伝子コード領域を用いて、ライブラリーをプローブしうる。得られたクローンを配列決定し、ダイズコード領域の周りのシス作用エレメントを決定しうる。他の選択肢として、メイズに由来する保存領域などの植物遺伝子の保存領域から設計されたプライマーを用いて、種々のダイズ遺伝子のコード領域に由来する断片をＰＣＲによりゲノムＤＮＡから増幅しうる。次いで、ダイズコード領域断片を用いて、記載のゲノムライブラリーをプローブしうる。
【００４９】
逆ＰＣＲを用いて、シス作用エレメントをクローニングしうる。以上に記載したようにダイズ遺伝子コード領域の配列を取得し、次いで、ＰＣＲプライマーを設計し、そして逆ＰＣＲを用いて当技術分野で周知の技術によりコード領域にフランキングするＤＮＡをクローニングしうる。
【００５０】
アンチセンス
本明細書に開示されたダイズプロモーターに機能可能に結合された異種ヌクレオチド配列は、標的遺伝子のアンチセンスヌクレオチド配列でありうる。「アンチセンスヌクレオチド配列」とは、ヌクレオチド配列の５’側から３’側への通常の方向とは逆の方向の配列であることが意図される。植物細胞におけるアンチセンスＤＮＡ配列の発現は、標的遺伝子の正常発現を妨害する。アンチセンスヌクレオチド配列は、標的遺伝子の転写により産生された内因性メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に相補的なかつそれにハイブリダイズ可能なＲＮＡ転写物をコードする。このようにして、標的遺伝子によりコードされた天然タンパク質の産生が阻害され、所望の表現型反応が達成される。配列が対応するｍＲＮＡにハイブリダイズして発現を妨害するかぎり、アンチセンス配列の修飾を行いうる。対応するアンチセンス配列に対して約７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するアンチセンス構築物を使用しうる。さらに、アンチセンスヌクレオチドの一部分を用いて標的遺伝子の発現を撹乱しうる。一般的には、少なくとも５０隣接ヌクレオチド、１００隣接ヌクレオチド、２００隣接ヌクレオチド、またはそれ以上の配列を使用しうる。したがって、植物において、本明細書に開示されたプロモーター配列をアンチセンスＤＮＡ配列に機能可能に結合して、天然タンパク質の発現を低減または阻害しうる。
【００５１】
植物発現カセットおよび形質転換ベクター
当技術分野で公知のいくつかの技術の１つにより、植物細胞の形質転換を達成することが可能である。「植物」とは、全植物体、植物器官（たとえば、葉、茎、根など）、種子、植物細胞、繁殖体、胚、およびその後代であることが意図される。植物細胞は、分化または未分化でありうる（たとえば、カルス、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉細胞、根細胞、篩部細胞、花粉）。「トランスジェニック植物」または「形質転換植物」または「安定に形質転換された」植物もしくは細胞もしくは組織とは、外因性の核酸配列またはＤＮＡ断片が植物細胞に取り込まれたまたは一体化された植物を意味する。「安定な形質転換」とは、植物に導入されたヌクレオチド構築物が植物のゲノムに一体化されてその後代に遺伝可能であることが意図される。
【００５２】
本発明に係るプロモーター配列は、植物細胞において対象の異種配列の発現を駆動しうる発現カセットで提供されうる。「発現カセット」とは、細胞においてオープンリーディングフレームからタンパク質の発現を引き起こしうるＤＮＡ構築物であることが意図される。カセットは、５’−３’の転写方向に、対象の異種配列に機能可能に結合された本明細書に開示されたプロモーターヌクレオチド配列またはその変異体もしくは断片の１つを含む転写開始領域と、植物において機能的な翻訳および転写終止領域（すなわち、終止領域）と、を含むであろう。カセットは、生物に導入して共形質転換させる少なくとも１つの追加の遺伝子、たとえば、選択可能マーカー遺伝子を追加的に含有しうる。他の選択肢として、複数の発現カセット上に追加の遺伝子を提供可能である。そのような発現カセットは、調節領域の転写調節下に対象の異種配列を挿入するために、複数の制限部位を有して提供される。
【００５３】
多くの場合、そのような構築物はまた、５’および３’の非翻訳領域を含有するであろう。そのような構築物はまた、特定の細胞内構造物、たとえば、葉緑体（もしくは他の色素体）、小胞体、またはゴルジ装置への対象のペプチドの共翻訳輸送または翻訳後輸送を促進するために、あるいは分泌させるために、翻訳「シグナル配列」または「リーダー配列」を含有しうる。たとえば、小胞体へのペプチドの移動を促進するシグナルペプチドを含有するように、遺伝子を工学操作することが可能である。また、イントロンを含有させて発現のためにイントロンのｍＲＮＡプロセシングが必要になるように、植物発現カセットを工学操作することが好ましいこともありうる。「シグナル配列」とは、細胞膜を横切って共翻訳ペプチド輸送または翻訳後ペプチド輸送を引き起こすことが知られているまたは推測される配列であることが意図される。真核生物では、これは、典型的には、いくらかのグリコシル化を生じてゴルジ装置中への分泌に関与する。「リーダー配列」とは、翻訳時、細胞下のオルガネラへのペプチド鎖の共翻訳輸送をトリガーするのに十分なアミノ酸配列をもたらす任意の配列であることが意図される。したがって、これは、小胞体内への通過、空胞への通過、葉緑体、ミトコンドリアなどを含むプラスチドへの通過による、輸送および／またはグリコシル化を目的とするリーダー配列を含む。
【００５４】
「３’非翻訳領域」とは、コード配列の下流に位置するヌクレオチド配列であることが意図される。ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸領域の付加に影響を及ぼしうる調節シグナルをコードするポリアデニル化シグナル配列および他の配列は、３’非翻訳領域である。「５’非翻訳領域」とは、コード配列の上流に位置するヌクレオチド配列であることが意図される。他の上流または下流の非翻訳エレメントは、エンハンサーを含む。エンハンサーは、プロモーター領域の発現を増加させるように作用するヌクレオチド配列である。エンハンサーは、当技術分野で周知であり、ＳＶ４０エンハンサー領域および３５Ｓエンハンサーエレメントを含むが、これらに限定されるものではない。
【００５５】
終止領域は、本発明に係るプロモーターヌクレオチド配列を含む転写開始領域と共に天然のものでありうるか、対象のＤＮＡ配列と共に天然のものでありうるか、または他の供給源に由来しうる。好都合な終止領域、たとえば、オクトピンシンターゼ終止領域およびノパリンシンターゼ終止領域は、Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドから入手可能である。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１−１４４、Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６４：６７１−６７４、Ｓａｎｆａｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：１４１−１４９、Ｍｏｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１２６１−１２７２、Ｍｕｎｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ  ９１：１５１−１５８、Ｂａｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７８９１−７９０３、およびＪｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５：９６２７−９６３９もまた、参照されたい。
【００５６】
形質転換宿主細胞において発現を増加させるために、適宜、対象の遺伝子を最適化しうる。すなわち、発現を改善するために宿主細胞に有利なコドンを用いて遺伝子を合成可能であるか、または宿主に有利なコドン使用頻度のコドンを用いて合成しうる。一般的には、遺伝子のＧＣ含有率が増加されるであろう。たとえば、宿主に有利なコドン使用頻度に関する考察については、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｇｏｗｒｉ（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１−１１を参照されたい。植物に有利な遺伝子を合成する方法は、当技術分野で公知である。たとえば、米国特許第６，３２０，１００号明細書、同第６，０７５，１８５号明細書、同第５，３８０，８３１号明細書、および同第５，４３６，３９１号明細書、米国特許出願公開第２００４０００５６００号明細書および同第２００１０００３８４９号明細書、ならびにＭｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００５７】
一実施形態では、対象の核酸は、発現のために葉緑体を標的とする。この方法では、対象の核酸を葉緑体に直接挿入しない場合、発現カセットは、対象の遺伝子産物を葉緑体に方向付ける輸送ペプチドまたはシグナル配列をコードする核酸を追加的に含有するであろう。そのような輸送ペプチドは、当技術分野で公知である。たとえば、Ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４−１２６、Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７５４４−１７５５０、Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８、Ｒｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４−１４２１、およびＳｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：４７８−４８１を参照されたい。
【００５８】
葉緑体で発現させるために、植物の核とこのオルガネラとの間のコドン使用頻度の差を考慮して、葉緑体を標的とする対象の核酸を最適化しうる。この方法では、葉緑体に有利なコドンを用いて、対象の核酸を合成しうる。たとえば、米国特許第５，３８０，８３１号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００５９】
典型的には、この「植物発現カセット」は、「植物形質転換ベクター」に挿入されるであろう。「形質転換ベクター」とは、細胞の効率的形質転換に必要なＤＮＡ分子であることが意図される。そのような分子は、１つ以上の発現カセットからなりうるか、または２つ以上の「ベクター」ＤＮＡ分子中に組織化されうる。たとえば、バイナリーベクターは、植物細胞の形質転換に必要なすべてのシス作用機能およびトランス作用機能をコードする２つの非隣接ＤＮＡベクターを利用した植物形質転換ベクターである（Ｈｅｌｌｅｎｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５：４４６−４５１）。「ベクター」とは、異なる宿主細胞間の移動のために設計された核酸構築物を意味する。「発現ベクター」とは、異種ＤＮＡ配列または断片を外来細胞に取り込んで一体化させて発現させる能力を有するベクターを意味する。「導入」とは、構築物が生物の少なくとも１つの細胞の内部へのアクセスを取得するように、形質転換される生物にヌクレオチド構築物を提示することが意図される。
【００６０】
この植物形質転換ベクターは、植物の形質転換を達成するのに必要な１つ以上のＤＮＡベクターで構成されうる。たとえば、２つ以上の隣接ＤＮＡセグメントを含む植物形質転換ベクターを利用することが、当技術分野で慣例になっている。これらのベクターは、当技術分野では、多くの場合、「バイナリーベクター」として参照される。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換では、ほとんどの場合、バイナリーベクターと、さらにはヘルパープラスミドを有するベクターとが使用され、この場合、効率的形質転換を達成するのに必要とされるＤＮＡセグメントのサイズおよび複雑性は、かなり大きく、機能を個別のＤＮＡ分子上に分離することが有利である。バイナリーベクターは、典型的には、Ｔ−ＤＮＡ移動に必要とされるシス作用配列（たとえば、左境界領域および右境界領域）と、植物細胞において発現可能なように工学操作された選択可能マーカーと、「対象の遺伝子」（トランスジェニック植物の生成が望まれるは植物細胞において発現可能なように工学操作された遺伝子）と、を含有するプラスミドベクターを含む。また、このプラスミドベクター上に存在するのは、細菌複製に必要とされる配列である。
【００６１】
シス作用配列は、植物細胞内への効率的移動およびそこでの発現を可能にするように配置される。たとえば、選択可能マーカー遺伝子および対象の遺伝子は、左境界領域と右境界領域との間に位置する。多くの場合、第２のプラスミドベクターは、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から植物細胞へのＴ−ＤＮＡ移動を媒介するトランス作用因子を含有する。このプラスミドは、当技術分野で理解されているように、多くの場合、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）による植物細胞への感染と、境界配列の切断によるＤＮＡの移動と、ｖｉｒ媒介ＤＮＡ移動と、を可能にする病原機能（ｖｉｒ遺伝子）を含有する（Ｈｅｌｌｅｎｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，５：４４６−４５１）。いくつかのタイプのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株（たとえば、ＬＢＡ４４０４、ＧＶ３１０１、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５など）は、植物形質転換に使用可能である。第２のプラスミドベクターは、他の方法、たとえば、マイクロプロジェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコールなどによる植物形質転換には必要でない。
【００６２】
植物形質転換
本発明に係る方法は、植物中にヌクレオチド構築物を導入することを含む。「導入」とは、構築物が植物の細胞の内部へのアクセスを取得するように、植物にヌクレオチド構築物を提示することが意図される。本発明に係る方法は、植物にヌクレオチド構築物を導入する特定の方法を使用する必要はないが、ただし、ヌクレオチド構築物が植物の少なくとも１つの細胞の内部へのアクセスを取得する。植物中にヌクレオチド構築物を導入する方法は、限定されるものではないが、安定形質転換法、一過性形質転換法、およびウイルス媒介法を含めて、当技術分野で公知である。
【００６３】
「植物」とは、全植物体、植物器官（たとえば、葉、茎、根など）、種子、植物細胞、繁殖体、胚、およびその後代であることが意図される。植物細胞は、分化または未分化でありうる（たとえば、カルス、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉細胞、根細胞、篩部細胞、花粉）。
【００６４】
「トランスジェニック植物」または「形質転換植物」または「安定に形質転換された」植物もしくは細胞もしくは組織とは、外因性の核酸配列またはＤＮＡ断片が植物細胞に取り込まれたまたは一体化された植物を意味する。これらの核酸配列は、外因性のものまたは非形質転換植物細胞に存在しないもの、さらには内因性でありうるものまたは非形質転換植物細胞に存在しうるものを含む。「異種」とは、一般的には、存在する細胞または天然ゲノムの一部分に対して内因性でない、かつ感染、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、マイクロプロジェクションなどにより細胞に添加された、核酸配列を意味する。
【００６５】
本発明に係るトランスジェニック植物は、本明細書に開示された新規な毒素配列の１つ以上を発現する。種々の実施形態では、トランスジェニック植物は、虫類耐性のために１つ以上の追加の遺伝子をさらに含む（たとえば、Ｃｒｙ１、たとえば、Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｅ、およびＣｒｙ１Ｆファミリーのメンバー、Ｃｒｙ２、たとえば、Ｃｒｙ２Ａファミリーのメンバー、Ｃｒｙ９、たとえば、Ｃｒｙ９Ａ、Ｃｒｙ９Ｂ、Ｃｒｙ９Ｃ、Ｃｒｙ９Ｄ、Ｃｒｙ９Ｅ、およびＣｒｙ９Ｆファミリーのメンバーなど）。トランスジェニック植物が、対象の農業形質を付与する任意の遺伝子を含みうることは、当業者であれば理解されよう。種々の実施形態では、本発明に係るプロモーターは、表１（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に列挙された特許公開に記載の１つ以上の遺伝子の発現を駆動するために使用可能である。
【００６６】
【表１】
0006463724.tif 000002
【００６７】
【表２】
0006463724.tif 000003
【００６８】
【表３】
0006463724.tif 000004
【００６９】
【表４】
0006463724.tif 000005
【００７０】
【表５】
0006463724.tif 000006
【００７１】
【表６】
0006463724.tif 000007
【００７２】
【表７】
0006463724.tif 000008
【００７３】
【表８】
0006463724.tif 000009
【００７４】
【表９】
0006463724.tif 000010
【００７５】
【表１０】
0006463724.tif 000011
【００７６】
【表１１】
0006463724.tif 000012
【００７７】
【表１２】
0006463724.tif 000013
【００７８】
【表１３】
0006463724.tif 000014
【００７９】
当技術分野で公知のいくつかの技術の１つにより、植物細胞の形質転換を達成することが可能である。本発明に係る殺有害生物遺伝子は、植物細胞において発現を取得または増強するために修飾されうる。典型的には、そのようなタンパク質を発現する構築物は、遺伝子の転写を駆動するプロモーターと、さらには転写終止およびポリアデニル化を可能にする３’非翻訳領域と、を含有するであろう。そのような構築物の組織化は、当技術分野で周知である。いくつかの場合、得られたペプチドが分泌されるように、さもなければ植物細胞内を標的とするように、遺伝子を工学操作することが有用でありうる。たとえば、小胞体へのペプチドの移動を促進するシグナルペプチドを含有するように、遺伝子を工学操作することが可能である。また、イントロンを含有させて発現のためにイントロンのｍＲＮＡプロセシングが必要になるように、植物発現カセットを工学操作することが好ましいこともありうる。
【００８０】
典型的には、この「植物発現カセット」は、「植物形質転換ベクター」に挿入されるであろう。この植物形質転換ベクターは、植物の形質転換を達成するのに必要な１つ以上のＤＮＡベクターで構成されうる。たとえば、２つ以上の隣接ＤＮＡセグメントを含む植物形質転換ベクターを利用することが、当技術分野で慣例になっている。これらのベクターは、当技術分野では、多くの場合、「バイナリーベクター」として参照される。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換では、ほとんどの場合、バイナリーベクターさらにはヘルパープラスミドを有するベクターが使用され、この場合、効率的形質転換を達成するのに必要とされるＤＮＡセグメントのサイズおよび複雑性は、かなり大きく、機能を個別のＤＮＡ分子上に分離することが有利である。バイナリーベクターは、典型的には、Ｔ−ＤＮＡ移動に必要とされるシス作用配列（たとえば、左境界領域および右境界領域）と、植物細胞において発現可能なように工学操作された選択可能マーカーと、「対象の遺伝子」（トランスジェニック植物の生成が望まれるは植物細胞において発現可能なように工学操作された遺伝子）と、を含有するプラスミドベクターを含む。また、このプラスミドベクター上に存在するのは、細菌複製に必要とされる配列である。シス作用配列は、植物細胞内への効率的移動およびそこでの発現を可能にするように配置される。たとえば、選択可能マーカー遺伝子および殺有害生物遺伝子は、左境界領域と右境界領域との間に位置する。多くの場合、第２のプラスミドベクターは、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から植物細胞へのＴ−ＤＮＡ移動を媒介するトランス作用因子を含有する。このプラスミドは、当技術分野で理解されているように、多くの場合、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）による植物細胞への感染と、境界配列の切断によるＤＮＡの移動と、ｖｉｒ媒介ＤＮＡ移動と、を可能にする病原機能（ｖｉｒ遺伝子）を含有する（Ｈｅｌｌｅｎｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，５：４４６−４５１）。いくつかのタイプのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株（たとえば、ＬＢＡ４４０４、ＧＶ３１０１、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５など）は、植物形質転換に使用可能である。第２のプラスミドベクターは、他の方法、たとえば、マイクロプロジェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコールなどによる植物形質転換には必要でない。
【００８１】
一般的には、植物形質転換方法は、標的植物細胞（たとえば、未成熟胚または成熟胚、懸濁培養物、未分化カルス、プロトプラストなど）中に異種ＤＮＡを移動することと、続いて、最大閾値レベルの適切な選択を行って（選択可能マーカー遺伝子に依存する）、一群の非トランスフォーム細胞塊から形質転換植物細胞を回収することと、を含む。外植体は、典型的には、新たに供給された同一の培地に移され、慣例に従って培養される。続いて、形質転換細胞は、最大閾値レベルの選択剤が追加された再生培地上に配置した後、シュートに分化される。次いで、シュートは、発根シュートまたは幼植物を回収するために、選択発根培地に移される。次いで、トランスジェニック幼植物は、成熟植物に成長し、稔性種子を産生する（たとえば、Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：２７１−２８２、Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：７４５−７５０）。外植体は、典型的には、新たに供給された同一の培地に移され、慣例に従って培養される。トランスジェニック植物を生成するための技術および方法に関する一般的な説明は、Ａｙｒｅｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ（１９９４）Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １３：２１９−２３９およびＢｏｍｍｉｎｅｎｉ  ａｎｄ  Ｊａｕｈａｒ（１９９７）Ｍａｙｄｉｃａ  ４２：１０７−１２０に見いだされる。形質転換材料は多くの細胞を含有するため、形質転換細および非形質転換細胞は両方とも、対象の標的カルスまたは組織または細胞群のいずれの部分にも存在する。非形質転換細胞を死滅させて形質転換細胞の増殖を可能する能力により、形質転換植物培養物が得られる。多くの場合、非形質転換細胞を除去する能力は、形質転換植物細胞の迅速な回収およびトランスジェニック植物の発生の成功の制約要件である。
【００８２】
形質転換プロトコルならびにヌクレオチド配列を植物中に導入するためのプロトコルは、形質転換の標的となる植物または植物細胞のタイプ、すなわち、単子葉植物または双子葉植物に依存して、変化しうる。トランスジェニック植物の発生は、限定されるものではないが、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、遺伝子直接移入、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）による植物細胞内への異種ＤＮＡの導入（アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換）、粒子に接着された異種外来ＤＮＡによる植物細胞への照射、バリスティック粒子加速、エアロゾルビーム形質転換（米国特許出願公開第２００１００２６９４１号明細書、米国特許第４，９４５，０５０号明細書、国際公開第９１／００９１５号パンフレット、米国特許出願公開第２００２０１５０６６号明細書）、Ｌｅｃ１形質転換、およびＤＮＡを移入する種々の他の非粒子直接媒介方法を含めて、いくつかの方法の１つにより行われうる。
【００８３】
葉緑体の形質転換方法は、当技術分野で公知である。たとえば、Ｓｖａｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：８５２６−８５３０、Ｓｖａｂ  ａｎｄ  Ｍａｌｉｇａ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：９１３−９１７、Ｓｖａｂ  ａｎｄ  Ｍａｌｉｇａ（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：６０１−６０６を参照されたい。本方法は、選択可能マーカーを含有するＤＮＡの粒子銃送達および相同組換えを介する色素体ゲノムへのＤＮＡの標的化に依拠する。その他に、色素体形質転換は、核にコードされた色素体指向ＲＮＡポリメラーゼの組織優先的発現によるサイレント色素体媒介トランスジーンのトランス活性化により達成可能である。そのような系は、ＭｃＢｒｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：７３０１−７３０５に報告されている。
【００８４】
異種外来ＤＮＡを植物細胞内に組み込んだ後、次いで、培地で最大閾値レベルの適切な選択を行って、非形質転換細胞を死滅させ、新鮮な培地に規則的に移すことにより、この選択処理から生き残った推定上の形質転換細胞を分離および増殖する。適切な選択による連続継代およびチャレンジにより、プラスミドベクターを用いて形質転換された細胞を同定し増殖する。次いで、分子的および生化学的方法を用いて、トランスジェニック植物のゲノム中に対象の組込み異種遺伝子が存在するかを確認することが可能である。
【００８５】
形質転換された細胞は、従来の方法に従って植物に成長させうる。たとえば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５：８１−８４を参照されたい。次いで、これらの植物を成長させ、同一の形質転換株または異なる株のいずれかを用いて受粉させ、所望の表現型特性の構成発現を有する得られたハイブリッドを同定しうる。二世代以上成長させて、所望の表現型特性の発現が安定に維持されて遺伝することを保証し、次いで、種子を採取して、所望の表現型特性の発現が達成されたことを保証する。このようにして、本発明は、ゲノム中に安定に取り込まれた本発明に係るヌクレオチド構築物、たとえば、本発明に係る発現カセットを有する形質転換種子（「トランスジェニック種子」としても参照される）を提供する。
【００８６】
植物
本発明は、限定されるものではないが、単子葉植物および双子葉植物を含めて、任意の植物種の形質転換に使用されうる。対象の植物の例としては、トウモロコシ（メイズ）、ソルガム、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ、コショウ、ジャガイモ、ワタ、コメ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギ、およびセイヨウアブラナ、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種、アルファルファ、ライムギ、雑穀、サフラワー、ラッカセイ、サツマイモ、キャッサバ、コーヒー、ココヤシ、パイナップル、柑橘類、ココア、茶、バナナ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴー、オリーブ、パパイヤ、カシュー、マカダミア、アーモンド、エンバク、野菜、観賞植物、および針葉樹が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８７】
野菜としては、トマト、レタス、グリーンビーン、ライマメ、エンドウ、およびククミス属（Ｃｕｒｃｕｍｉｓ）のメンバー、たとえば、キュウリ、カンタループ、およびマスクメロンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。観賞植物としては、アザレア、アジサイ、ハイビスカス、バラ、チューリップ、ラッパズイセン、ペチュニア、カーネーション、ポインセチア、およびキクが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、本発明に係る植物は、作物植物（たとえばメイズ、ソルガム、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ、コショウ、ジャガイモ、綿、コメ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギ、セイヨウアブラナなど）である。
【００８８】
本発明は、限定されるものではないが、メイズ、コメ、オオムギ、エンバク、コムギ、ソルガム、ライムギ、サトウキビ、パイナップル、ヤムイモ、タマネギ、バナナ、ココヤシ、およびナツメヤシを含めて、単子葉植物科の任意のメンバーに特に好適である。
【００８９】
植物形質転換の評価
異種外来ＤＮＡを植物細胞内に導入した後、種々の方法により、たとえば、一体化ＤＮＡに関連する核酸またはタンパク質および代謝物の解析により、植物ゲノムにおける異種ＤＮＡによる形質転換または一体化が確認される。
【００９０】
ＰＣＲ解析は、土壌に移植する前のより初期の段階で、取り込まれたＤＮＡの存在に関して、形質転換された細胞、組織、またはシュートをスクリーニングする迅速な方法である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。ＰＣＲは、対象の遺伝子またはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ベクターバックグラウンドなどに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行われる。
【００９１】
植物形質転換は、ゲノムＤＮＡのサザンブロット解析により確認されうる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，前掲）。一般的には、形質転換株から全ＤＮＡを抽出し、適切な制限酵素を用いて消化し、ニトロセルロース膜またはナイロン膜に移す。次いで、たとえば、放射性標識３２Ｐ標的ＤＮＡ断片を用いて、膜または「ブロット」をプローブし、標準的技術に従って、植物ゲノム中への導入ＤＮＡの組込みを確認する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，前掲）。
【００９２】
ノーザンブロット解析では、ＲＮＡを形質転換株の特定の組織から単離し、ホルムアルデヒドアガロースゲル中で分画し、当技術分野で慣用される標準的手順に従って、ナイロンフィルター上にブロットする（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，前掲）。次いで、当技術分野で公知の方法により、異種遺伝子に由来する遺伝子プローブにフィルターをハイブリダイズすることにより、ＴｒｉｐＰｒｏ５プロモーターに機能可能に結合された異種遺伝子によりコードされたＲＮＡの発現を試験する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，前掲）。
【００９３】
プロモーター活性の評価
植物においてプロモーター活性を評価するための多くの方法が利用可能である。調節制御下での対象の遺伝子の発現時のプロモーター機能は、転写または翻訳の段階で試験されうる。転写の段階では、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションアッセイ（すなわち、ノーザンブロット解析）、競合逆転写酵素ＰＣＲ、およびＲＮアーゼ保護アッセイにより、ＲＮＡレベルを試験しうる。翻訳の段階では、合成タンパク質に特異的な機能アッセイを用いて（たとえば、酵素活性によりまたはタンパク質の免疫アッセイにより）、プロモーター活性を決定しうる。たとえば、レポーター遺伝子活性、たとえば、β−グルクロニダーゼ活性、ルシフェラーゼ活性、またはＧＦＰ蛍光を、形質転換後の種々の時間で、モニターしうる。レポーター遺伝子活性は、酵素活性により、レポーター遺伝子によりコードされた酵素に対する基質を用いて細胞または組織を染色することにより、または適切な波長の光の下で直接可視化することにより、モニターしうる（たとえば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５６：２０１−２１１を参照されたい）。タンパク質上に存在する１つ以上のエピトープに結合する抗体を用いた標準的手順により、トランスジェニック植物でウェスタンブロットを行って、ＴｒｉｐＰｒｏ５プロモーターに機能可能に結合された対象の遺伝子によりコードされたタンパク質の存在を確認しうる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，前掲）。全長プロモーター配列、プロモーター配列の欠失および突然変異をアッセイし、それらの発現レベルを比較しうる。たとえば、米国特許第６，０７２，０５０号明細書、およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００９４】
実例として以下の実施例を提供するが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【００９５】
実験
実施例１．ダイズに由来する構成プロモーターの同定
公共のダイズトランスクリプトームデータベースを用いて、異なる組織（葉、莢、花、根など）で高度に発現される遺伝子を同定した。これらの遺伝子のプロモーター領域（最初のＡＴＧの上流）をダイズゲノムＤＮＡ（Ｊａｃｋ）からＰＣＲ増幅し、ルシフェラーゼ遺伝子コード領域およびＰｉｎＩＩターミネーターに結合した。これらのプロモーター含有ベクターをアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に導入して形質転換させた。形質転換アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いて、幼少ダイズまたはインゲンマメ葉片を浸潤させた。１６時間の光の下、２５℃で２日間インキュベートした後、タンパク質抽出のために葉片をＰＢＳ緩衝液中でホモジナイズした。次いで、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＳＴＥＡＤＹ−ＧＬＯ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイシステムを用いて、ルシフェラーゼ活性に関して可溶性タンパク質をアッセイした。各ベクターに対して浸潤したダイズ葉片の３つの独立したセットの平均のルシフェラーゼ活性を図１に示す。Ｐｂｄｃ６およびＰｂｄｃ７は、アラビドプシスに由来するＰｕｂｉ３と同等の活性を呈した。Ｐｂｄｃ６（配列番号１）は、γ液胞膜内在性タンパク質をコードするＧｌｙｍａ０３ｇ３４３１０から取得した。Ｐｂｄｃ７（配列番号２）は、形質膜内在性タンパク質をコードするＧｌｙｍａ２３ｇ４２２２０から取得した。
【００９６】
実施例２．ｉｎ  ｐｌａｎｔａ解析
プロモーターＰｂｄｃ６およびＰｂｄｃ７をそれぞれ有するＤＮＡ配列をｐＳＺ８１３３中にクローニングし、これらのプロモーターをｇｒｇ２３Ａｃｅ５に結合した。得られたバイナリーベクターｐＳＺ８８０６およびｐＳＺ８８０７をアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＬＢＡ４４０４中に導入して形質転換させ、これを用いてトランスジェニックダイズ植物を生成した。４×グリホセートスプレーを用いて、各ベクターの約１５０のトランスジェニックイベントをアッセイした。スプレーの１週間後、４×グリホセートに対する耐性をスコア付けした（表２、０は耐性がないことを意味し、４は最も強い耐性を表す）。ＵＢＱ３を対照として使用した。この場合も、Ｐｂｄｃ６およびＰｂｄｃ７は、Ｐｕｂｉ３Ａｔと同等の強度を示した。
【００９７】
【表１４】
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【００９８】
本明細書に挙げた刊行物および特許出願はすべて、本発明が関係する技術分野の当業者の技術レベルを示唆するものである。刊行物および特許出願はすべて、あたかもそれぞれ個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることを具体的かつ個別的に明示されたのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９９】
以上の本発明は、明確に理解することを目的として図および例を挙げてある程度詳細に説明されているが、添付の特許請求の範囲内でいくらかの変更形態および修正形態をなしうることは明らかであろう。
【図１】
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【配列表】
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