(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原体感染に随伴する病害から非ヒト対象を保護する方法であって、第１のデフェンシンもしくはその前駆体および第２のデフェンシンもしくはその前駆体を前記非ヒト対象の細胞に与えることを含み、
前記第１のデフェンシンは、ＨＸＬ００８（配列番号２４）、ＨＸＬ００９（配列番号２７）、ＨＸＬ０１２（配列番号３６）、ＨＸＬ０１３（配列番号３９）、ＨＸＬ０１５（配列番号４５）、ＨＸＬ０２１（配列番号６３）、ホルドチオニン（γ１−Ｈ）、およびＲｓＡＦＰ２からなる群から選択され、
前記第２のデフェンシンは、ＮａＤ１、ＴＰＰ３、ＰｈＤ１Ａ、ＰｈＤ２、ＨＸＬ００１（配列番号３）、ＨＸＬ００２（配列番号６）、ＨＸＬ００４（配列番号１２）、ＨＸＰ４（配列番号７０）、ＨＸＰ３４（配列番号７１）、およびＨＸＰ３５（配列番号７２）からなる群から選択され、
前記病原体は真菌であり、
前記前駆体は、小胞体（ＥＲ）シグナル配列とそれに続く成熟デフェンシンドメインを含むか、または、ＥＲシグナル配列、成熟デフェンシンドメインとそれに続くＣ末端プロペプチド（ＣＴＰＰ）を含む、
方法。
【請求項２】
前記第１のデフェンシンもしくはその前駆体および前記第２のデフェンシンもしくはその前駆体の併用による病原体に対する阻害の程度は、併用による接触と同じ用量の各デフェンシンもしくはその前駆体を個々に前記病原体と接触させた阻害と比較して、相乗的である、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象は植物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記対象は非ヒト動物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のデフェンシンもしくはその前駆体および前記第２のデフェンシンもしくはその前駆体は、遺伝子改変植物細胞により産生され、遺伝子改変前はいずれも前記植物細胞により産生されない、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のデフェンシンもしくはその前駆体および前記第２のデフェンシンもしくはその前駆体を、
（ｉ）局所的経路を経由して；
（ｉｉ）前記植物の根系を経由して；
（ｉｉｉ）表面噴霧を用いて根を経由して；または
（ｉｖ）種子被覆として
前記植物に適用する、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のデフェンシンもしくはその前駆体および前記第２のデフェンシンもしくはその前駆体を前記対象に局所的に適用する、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のデフェンシンもしくはその前駆体および前記第２のデフェンシンもしくはその前駆体の一方は前記細胞により産生され、前記両デフェンシンもしくはその前駆体の他方を、
（ｉ）局所的経路を経由して；
（ｉｉ）前記植物の根系を経由して；
（ｉｉｉ）表面噴霧を用いて根を経由して；または
（ｉｖ）種子被覆として
前記植物に適用する、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
プロテイナーゼ阻害剤または、処理を受けて活性型となることで有効化されるその前駆体形態を与えることをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
プロテイナーゼ阻害剤が、セリンプロテイナーゼ阻害剤、システインプロテイナーゼ阻害剤、フィトシスタチン、シスタチン、およびプロテイナーゼ阻害剤を含む群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記真菌は糸状菌である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記糸状菌は、アルテルナリア種（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｐｐ）、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、ボトリチス種（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｓｐｐ）、セルコスポラ種（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐ）、コクリオボラス種（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｓｐｐ）、コレトトリカム種（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐｐ）、ジアポルテ種（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ  ｓｐｐ）、エリシフェ種（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｓｐｐ）、エキセロヒラム種（Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ  ｓｐｐ）、フザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、ガエウマンノマイセス種（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ）、レプトスフェリア種（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｓｐｐ）、マクロホミナ種（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ  ｓｐｐ）、ミコスフェレラ種（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｓｐｐ）、ファコプソラ種（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｓｐｐ）、フィアロホラ種（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ  ｓｐｐ）、ホーマ種（Ｐｈｏｍａ  ｓｐｐ）、フィマトトリコプシス種（Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ）、フィトフトラ種（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｐｐ）、プラスモジオホラ種（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ  ｓｐｐ）、プクキニア種（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｐｐ）、リゾクトニア種（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｐｐ）、スクレロチニア種（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｐｐ）、セプトリア種（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｓｐｐ）、ステノカルペラ種（Ｓｔｅｎｏｃａｒｐｅｌｌａ  ｓｐｐ）、サイレラビオプシス種（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ）、チレチア種（Ｔｉｌｌｅｔｉａ  ｓｐｐ）、ウスチラゴ種（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｓｐｐ）、およびバーティシリウム種（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ）からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記糸状菌は、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ：Ｆｇｒ）、ワタ萎凋病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．  ｓｐ．  ｖａｓｉｎｆｅｃｔｕｍ：Ｆｏｖ）、イネ科炭疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ：Ｃｇｒ）、レプトスフェリア・マクランス（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍａｃｕｌａｎｓ）、アブラナ科植物黒すす病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ）、アルテルナリア・アルテルナータ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、テンサイ褐斑病菌（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｂｅｔｉｃｏｌａ）、トウモロコシ斑点病菌（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｚｅａｅ  ｍａｙｄｉｓ）、トウモロコシごま葉枯病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ，）、エキセロヒラム・ツルシカム（Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ  ｔｕｒｃｉｃｕｍ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・オキシスポラム・エフ・エスピー・ディアンティ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．  ｓｐ．  ｄｉａｎｔｈｉ）、フザリウム・オキシスポラム・エフ・エスピー・リコペルシーシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．  ｓｐ．  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）、フザリウム・シュードグラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・バーティシリオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｏｉｄｅｓ：Ｆｖｅ）、コムギ立枯病菌（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．  ｔｒｉｔｉｃｉ）、根こぶ病菌（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、菌核病菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、ステノカルペラ（ディプロディア）マイディス（Ｓｔｅｎｏｃａｒｐｅｌｌａ  （Ｄｉｐｌｏｄｉａ）  ｍａｙｄｉｓ）、スミレ類根腐病菌（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ  ｂａｓｉｃｏｌａ）、バーティシリウム・ダーリエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ）、トウモロコシ黒穂菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｚｅａｅ）、プクキニア・ソルギ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｏｒｇｈｉ）、炭腐病菌（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ  ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）、落葉病菌（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ  ｇｒｅｇａｔａ）、ジアポルテ・ファセオロラム（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ  ｐｈａｓｅｏｌｏｒｕｍ）、セルコスポラ・ソイナ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｓｏｊｉｎａ）、茎疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）、リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、ファコプソラ・パキリジ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ）、アルテルナリア・マクロスポラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）、セルコスポラ・ゴシピナ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｎａ）、ホーマ・エクシグア（Ｐｈｏｍａ  ｅｘｉｇｕａ）、プクキニア・スケドナル��ィ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｃｈｅｄｏｎｎａｒｄｉｉ）、プクキニア・カカバタ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｃａｃａｂａｔａ）、フィマトトリコプシス・オムニボラ（Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｏｐｓｉｓ  ｏｍｎｉｖｏｒａ）、フザリウム・アベナシウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ａｖｅｎａｃｅｕｍ）、アルテルナリア・ブラシカエ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、アルテルナリア・ラファニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｒａｐｈａｎｉ）、エリシフェ・グラミニス（ブルメリア・グラミニス）（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  （Ｂｌｕｍｅｒｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ））、コムギ葉枯病菌（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉ）、コムギふ枯病菌（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ）、ミコスフェレラ・ゼアエ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）、リゾクトニア・セレアリス（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、裸黒穂病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｔｒｉｔｉｃｉ）、プクキニア・グラミニス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、プクキニア・トリチシナ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉｎａ）、チレチア・インディカ（Ｔｉｌｌｅｔｉａ  ｉｎｄｉｃａ）、（Ｔｉｌｌｅｔｉａ  ｃａｒｉｅｓ）、チレチア・カリエス（Ｔｉｌｌｅｔｉａ  ｃａｒｉｅｓ）、（Ｔｉｌｌｅｔｉａ  ｃａｒｉｅｓ）、およびチレチア・コントロベルサ（Ｔｉｌｌｅｔｉａ  ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ）を含む群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記真菌は、カンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ）、クリプトコッカス種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｕｓ  ｓｐｐ）、白癬菌種（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｓｐｐ）、およびアスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
前記真菌は、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、クリプトコッカス・ガッティ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｔｔｉｉ）、趾間白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ）、および紅色白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ）含む群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記植物は、
コーン（トウモロコシ）、ダイズ、ワタ、綿実、カノーラ、コムギ、アルファルファ、リンゴ、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、バナナ、オオムギ、トウゴマ、キク、クローバー、カカオ、コーヒー、ハマナ、クランベリー、キュウリ、デンドロビウム、ヤマノイモ、ユーカリ、フェストゥーカ、アマ、グラジオラス、ユリ科、アマニ、キビ、マスクメロン、カラシナ、エンバク、アブラヤシ、アブラナ（オイルシードレイプ（ｏｉｌｓｅｅｄ  ｒａｐｅ）、レイプ（ｒａｐｅ）、ラパ（ｒａｐａ））、パパイヤ、ラッカセイ、パイナップル、観賞用植物、インゲンマメ属（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、ジャガイモ、ナタネ、イネ、ライムギ、ライグラス、ベニバナ、ゴマ、モロコシ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、イチゴ、タバコ、トマト、シバ、および
レタス、セロリ、ブロッコリー、カリフラワー、ウリ科、およびタマネギ（ニンニク、エシャロット、リーキ、およびチャイブから選択される）から選択される野菜作物；
リンゴ、ナシ、モモ、オレンジ、グレープフルーツ、レモン、ライム、アーモンド、ペカン、クルミ、およびヘーゼルナッツから選択される果樹および堅果樹；
ブドウ、キウイフルーツ、およびホップから選択されるつる植物；
ラズベリー、ブラックベリー、およびグースベリーから選択される果樹低木およびキイチゴ；ならびに
トネリコ、マツ、モミ、カエデ、ナラ、クリ、およびポプラから選択される森林樹
からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
前記植物が、作物植物、飼料作物、油糧種子作物、穀物作物、果実作物、野菜作物、繊維作物、香味作物、堅果作物、芝作物、糖作物、飲料作物、および森林作物を含む群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記作物植物は、ダイズ、カノーラ、コーン、ワタ、およびコムギからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
病原体感染に随伴する病害から保護される能力を有することにより病原体感染に随伴する損傷を受けにくくなっている遺伝子改変植物の作製における、第１のデフェンシンもしくはその前駆体および第２のデフェンシンもしくはその前駆体の使用であって、
前記第１のデフェンシンは、ＨＸＬ００８（配列番号２４）、ＨＸＬ００９（配列番号２７）、ＨＸＬ０１２（配列番号３６）、ＨＸＬ０１３（配列番号３９）、ＨＸＬ０１５（配列番号４５）、ＨＸＬ０２１（配列番号６３）、ホルドチオニン（γ１−Ｈ）、およびＲｓＡＦＰ２からなる群から選択され、
前記第２のデフェンシンは、ＮａＤ１、ＴＰＰ３、ＰｈＤ１Ａ、ＰｈＤ２、ＨＸＬ００１（配列番号３）、ＨＸＬ００２（配列番号６）、ＨＸＬ００４（配列番号１２）、ＨＸＰ４（配列番号７０）、ＨＸＰ３４（配列番号７１）、およびＨＸＰ３５（配列番号７２）からなる群から選択され、
前記病原体は真菌であり、
前記前駆体は、ＥＲシグナル配列とそれに続く成熟デフェンシンドメインを含むか、または、ＥＲシグナル配列、成熟デフェンシンドメインとそれに続くＣＴＰＰを含む、
使用。
【請求項２０】
病原体感染に随伴する損傷から植物またはヒトまたは非ヒト動物対象を保護する組成物の作製における、第１のデフェンシンもしくはその前駆体および第２のデフェンシンもしくはその前駆体の使用であって、
前記第１のデフェンシンは、ＨＸＬ００８（配列番号２４）、ＨＸＬ００９（配列番号２７）、ＨＸＬ０１２（配列番号３６）、ＨＸＬ０１３（配列番号３９）、ＨＸＬ０１５（配列番号４５）、ＨＸＬ０２１（配列番号６３）、ホルドチオニン（γ１−Ｈ）、およびＲｓＡＦＰ２からなる群から選択され、
前記第２のデフェンシンは、ＨＸＰ４（配列番号７０）、ＨＸＬ００１（配列番号３）、ＨＸＬ００２（配列番号６）、ＨＸＬ００４（配列番号１２）、ＨＸＰ３４（配列番号７１）、ＨＸＰ３５（配列番号７２）、ＮａＤ１、ＴＰＰ３、ＰｈＤ２、およびＰｈＤ１Ａからなる群から選択され、
前記病原体は真菌であり、
前記前駆体は、ＥＲシグナル配列とそれに続く成熟デフェンシンドメインを含むか、または、ＥＲシグナル配列、成熟デフェンシンドメインとそれに続くＣＴＰＰを含む、
使用。
【請求項２１】
プロテイナーゼ阻害剤または、処理を受けて活性型となることで有効化されるその前駆体形態の使用をさらに含む、請求項１９または２０に記載の使用。
【請求項２２】
病原体感染に対して抵抗力のある遺伝子改変植物およびその子孫であって、前記植物は、第１のデフェンシンもしくはその前駆体および第２のデフェンシンもしくはその前駆体を産生するために遺伝子操作された細胞を含み、、
前記第１のデフェンシンは、ＨＸＬ００８（配列番号２４）、ＨＸＬ００９（配列番号２７）、ＨＸＬ０１２（配列番号３６）、ＨＸＬ０１３（配列番号３９）、ＨＸＬ０１５（配列番号４５）、ＨＸＬ０２１（配列番号６３）、ホルドチオニン（γ１−Ｈ）、およびＲｓＡＦＰ２からなる群から選択され、
前記第２のデフェンシンは、ＮａＤ１、ＴＰＰ３、ＰｈＤ１Ａ、ＰｈＤ２、ＨＸＬ００１（配列番号３）、ＨＸＬ００２（配列番号６）、ＨＸＬ００４（配列番号１２）、ＨＸＰ４（配列番号７０）、ＨＸＰ３４（配列番号７１）、およびＨＸＰ３５（配列番号７２）からなる群から選択され、
前記病原体は真菌であり、
前記前駆体は、ＥＲシグナル配列とそれに続く成熟デフェンシンドメインを含むか、または、ＥＲシグナル配列、成熟デフェンシンドメインとそれに続くＣＴＰＰを含む、
遺伝子改変植物およびその子孫。
【請求項２３】
プロテイナーゼ阻害剤または、処理を受けて活性型となることで有効化されるその前駆体形態を産生するためにさらに遺伝子操作された、請求項２２に記載の遺伝子改変植物およびその子孫。
【請求項２４】
第１のデフェンシンもしくはその前駆体および第２のデフェンシンもしくはその前駆体をコードするヌクレオチド配列を含む、人工的に作出された遺伝子コンストラクトであって、
前記第１のデフェンシンは、ＨＸＬ００８（配列番号２４）、ＨＸＬ００９（配列番号２７）、ＨＸＬ０１２（配列番号３６）、ＨＸＬ０１３（配列番号３９）、ＨＸＬ０１５（配列番号４５）、ＨＸＬ０２１（配列番号６３）、ホルドチオニン（γ１−Ｈ）、およびＲｓＡＦＰ２からなる群から選択され、
前記第２のデフェンシンは、ＮａＤ１、ＴＰＰ３、ＰｈＤ１Ａ、ＰｈＤ２、ＨＸＬ００１（配列番号３）、ＨＸＬ００２（配列番号６）、ＨＸＬ００４（配列番号１２）、ＨＸＰ４（配列番号７０）、ＨＸＰ３４（配列番号７１）、およびＨＸＰ３５（配列番号７２）からなる群から選択され、
前記病原体は真菌であり、
前記前駆体は、ＥＲシグナル配列とそれに続く成熟デフェンシンドメインを含むか、または、ＥＲシグナル配列、成熟デフェンシンドメインとそれに続くＣＴＰＰを含む、
遺伝子コンストラクト。
【請求項２５】
セグメントを２〜８個有するポリヌクレオチドを含む多重遺伝子発現ビヒクル（ＭＧＥＶ）の形態にあり、各ドメインは機能性タンパク質をコードし、少なくとも１つのドメインは前記第１のデフェンシンもしくはその前駆体をコードし、かつ少なくとも１つのドメインは前記第２のデフェンシンもしくはその前駆体をコードし、各ドメインは直鎖状配列においてリンカーセグメントにより隣と連結され、ここでリンカーセグメントは配列番号８６のアミノ酸配列を有するリンカーペプチドをコードし、前記ドメインおよびリンカーセグメントはすべて同一読み枠にある、請求項２４に記載の人工的に作出された遺伝子コンストラクト。
【請求項２６】
少なくとも１つの他のドメインは、プロテイナーゼ阻害剤または、処理を受けて活性型となることで有効化されるその前駆体形態をコードする、
請求項２５に記載の人工的に作出された遺伝子コンストラクト。
【請求項２７】
植物または非ヒト動物の真菌の蔓延の処置または予防に使用する、第１のデフェンシンもしくはその前駆体および第２のデフェンシンもしくはその前駆体を含む局所用組成物であって、
前記第１のデフェンシンは、ＨＸＬ００８（配列番号２４）、ＨＸＬ００９（配列番号２７）、ＨＸＬ０１２（配列番号３６）、ＨＸＬ０１３（配列番号３９）、ＨＸＬ０１５（配列番号４５）、ＨＸＬ０２１（配列番号６３）、ホルドチオニン（γ１−Ｈ）、およびＲｓＡＦＰ２からなる群から選択され、
前記第２のデフェンシンは、ＮａＤ１、ＴＰＰ３、ＰｈＤ１Ａ、ＰｈＤ２、ＨＸＬ００１（配列番号３）、ＨＸＬ００２（配列番号６）、ＨＸＬ００４（配列番号１２）、ＨＸＰ４（配列番号７０）、ＨＸＰ３４（配列番号７１）、およびＨＸＰ３５（配列番号７２）からなる群から選択され、
前記病原体は真菌であり、
前記前駆体は、ＥＲシグナル配列とそれに続く成熟デフェンシンドメインを含むか、または、ＥＲシグナル配列、成熟デフェンシンドメインとそれに続くＣＴＰＰを含む、
局所用組成物。
【請求項２８】
前記組成物は種子被覆または表面噴霧のための組成物である、請求項２７に記載の局所用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１２年１１月２３日出願の米国特許仮出願第６１／７２９，４６７号、発明の名称「抗病原体方法」に関連し、その優先権を主張する。本出願は、この米国特許仮出願の全体を参照して本明細書で援用する。
【０００２】
本開示は、病原体からの植物ならびにヒトおよび非ヒト対象の保護を教示する。本開示により、複数の効果、すなわち、植物ならびにヒトおよび非ヒト動物対象における病原体感染を阻害し、かつ感受性のある対象が受ける損傷を低減する多重的な手法が可能となる。
【背景技術】
【０００３】
本明細書中に著者により参照する刊行物の書誌の詳細は、本明細書末尾にアルファベット順にまとめる。
【０００４】
本明細書中の先行技術は、これら先行技術が任意国における一般常識の一部であることを確認するものでも、そのことを何ら示唆するものでもないし、そのように理解されることもあってはならない。
【０００５】
真菌病原体および昆虫病原体等の植物性病原体（植物病原体）への感染による作物被害は農産業において大きな問題であり、こうした被害を減らすための抗真菌剤の適用に毎年何百万ドルもの費用が費やされている（非特許文献１）。そこで、新たな抗植物病原体対策の発見が必要とされている。病原体が耐性を獲得する性質があることを考えると、こうした方策の発見は特に重要である。ヒトおよび非ヒト対象の真菌感染症は、著しい不快感や重大な健康問題をもたらす可能性もある。病原性真菌類は、人間の健康や経済にとって大きな懸念事項でもある。ヒト病原真菌類は、重症度の低い表在性感染症のみならず、死亡率が高く命にかかわる院内感染疾患を引き起こす。
【０００６】
植物は、進化により、病原体から保護するためのペプチドを生成する。おそらく、このペプチドの特異性は、進化の過程で多様な病原体に暴露されこれに反応してきたことによる影響を受けている。
【０００７】
植物デフェンシンは抗病原体分子の一種である。デフェンシンには多くの種類があり、それぞれ空間的および時間的な発現様式ならびに活性スペクトルが異なる。一般に、植物デフェンシンは大きく２つの型に分類される。Ｉ型（ｃｌａｓｓ  Ｉ）デフェンシンは、小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ：ＥＲ）配列とそれに続く成熟デフェンシンドメインからなる。ＩＩ型（ｃｌａｓｓ  ＩＩ）デフェンシンは、前記ＥＲシグナル配列および成熟ドメインに加えて、アミノ酸約３３個からなるＣ末端プロドメインまたはプロペプチド（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏ−ｄｏｍａｉｎまたはｐｒｏ−ｐｅｐｔｉｄｅ：ＣＴＰＰ）を有する、より大きな前駆体として産生される。
【０００８】
こうしたペプチドの特異性について、その根底をなす仕組みはいまだ十分には解明されていないが、おそらく細胞膜成分との相互作用が関与している。多くの抗病原体ペプチドが共通して有する活性の一つに膜透過促進活性があり、異なる細胞型の細胞はその膜組成も大きく異なることから、抗病原体ペプチドの効力は特定脂質の存在によるものではないかとも仮定される。
【０００９】
植物性病原体は植物の収穫量を著しく減らす。また、現行の病原体制御方策には費用がかかり、環境破壊の可能性もある。農業生産における経済性を改善する必要があるため、農学的および観賞目的において重要な植物を多様な病害、特に真菌性病害から保護する新たな方策が求められている。また、病原性真菌類は、人間の健康や経済にとって大きな懸念事項でもある。現行の療法では長期の治療計画が必要であり、随伴する肝毒性に患者が悩まされることも多い。さらに、現行の療法に対する耐性も生じており、新たな処置法を創出する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｏｅｒｋｅ  ａｎｄ  Ｄｅｈｎｅ（２００４）、Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ２３：２７５−２８５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書全体にわたって、本明細書中において別途規定のない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」またはこれが語尾変化したもの、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記載される要素もしくは整数もしくは方法ステップまたは要素群もしくは整数群もしくは方法ステップ群を含意すると理解され、要素もしくは整数もしくは方法ステップまたは要素群もしくは整数群もしくは方法ステップ群のいずれも除外されないと理解される。
【００１２】
本明細書において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、本明細書中において別途明瞭に指定されない限り、単数形および複数形の両方を含む。したがって、例えば、「透過促進性デフェンシン（ａ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｄｅｆｅｎｓｉｎ）」は透過促進性デフェンシン１種の場合および透過促進性デフェンシン２種以上の場合の両方を含み、「因子（ａｎ  ａｇｅｎｔ）」は因子１種の場合および因子２種以上の場合の両方を含み、「本発明（ｔｈｅ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」は本開示内容が教示する１つまたは複数の態様を含む。本明細書中に開示される態様は、用語「発明」に包含される。本発明のいずれの態様も請求項の範囲内で実現される。
【００１３】
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は配列識別番号（配列番号）によって示す。配列番号の数値は、配列識別名＜４００＞１（配列番号１）および＜４００＞２（配列番号２）等の数値に対応する。配列識別名を表１にまとめる。
【００１４】
本明細書は、真菌因子および昆虫因子等の病原体により作物および観賞用植物が受ける損傷を低減する方法を開示する。従来の制御方法では抗真菌化学物質を適用する。この費用は作物および花卉生産の費用に上乗せされる。本開示では、Ｉ型デフェンシンと透過促進性デフェンシンとの間に予期されていなかった相乗作用を発見し、この相乗作用によって、真菌および昆虫による植物の病害状態に対する予防および改良効力が増大した。本方法は、ヒトおよび非ヒト動物対象における病原体の蔓延の処置または予防にも適用できる。「Ｉ型」デフェンシンは、透過促進性デフェンシンおよび非透過促進性デフェンシンを含む。したがって、１種以上の透過促進性デフェンシンを使用してもよいということである。「透過促進性デフェンシン」は、Ｉ型デフェンシン、ＩＩ型デフェンシン、および変異型デフェンシンを含み、変異型デフェンシンは透過促進性デフェンシンである。「変異型」デフェンシンは、ＩＩ型デフェンシンに由来するループ１Ｂ領域がＩ型デフェンシンに由来するループ１Ｂ領域により置き換えられたデフェンシン、またはＩＩ型のループ１Ｂ領域において１つ以上のアミノ酸が置換、付加、もしくは欠失したデフェンシンを含む。ループ１Ｂ領域は、デフェンシンＮ末端部分の第１のβ鎖（β鎖１）とαヘリックスの間に位置する（第１のフレキシブルループとも称される）。
【００１５】
上述のように、植物デフェンシンは大きく２つの型に分類される。Ｉ型デフェンシンは、小胞体（ＥＲ）シグナル配列とそれに続く成熟デフェンシンドメインからなる。ＩＩ型デフェンシンは、前記ＥＲシグナル配列および成熟ドメインに加えて、アミノ酸約３３個からなるＣ末端プロドメインまたはプロペプチド（ＣＴＰＰ）を有する、より大きな前駆体として産生される。
【００１６】
相乗作用は、デフェンシン２種の併用により引き起こされる観察された真菌増殖阻害率％（Ｉｏ値）と、各デフェンシン単独による真菌増殖阻害率％の合計に基づく同デフェンシン２種による予想された真菌増殖阻害率％（Ｒｉｃｈｅｒら（１９８７）、Ｐｅｓｔｉｃ  Ｓｃｉ  １９：３０９−３１５で使用されるＬｉｍｐｅｌの式により計算されるＥｅ値）との差異として分類される。この差異Ｉｏ−Ｅｅが前記相乗作用を示す値である。前記相乗作用値が１５以下である場合は相乗作用が有意でないことを、１５〜３０である場合は相乗作用の程度が低いことを、３０〜６０である場合は相乗作用の程度が中程度であることを、６０を超える場合は相乗作用の程度が高いことを意味する。
【００１７】
したがって本開示は、病原体感染に随伴する病害から植物を保護する方法であって、Ｉ型植物デフェンシンおよび透過促進性デフェンシンまたはその一方もしくは両方の前駆体、機能的ホモログ、アナログ、誘導体、もしくは変異体を細胞に与えることを含む方法を教示する。一実施形態において、植物性病原体は真菌である。別の実施形態において、植物性病原体は昆虫である。一態様において、「植物」は、Ｉ型デフェンシンおよび透過促進性デフェンシンを産生する細胞を含む遺伝子改変植物を含み、前記細胞は遺伝子改変前は前記デフェンシンのいずれも産生しない。「植物」は、前記遺伝子改変植物の子孫を含み、前記子孫は、親が遺伝子改変されたために前記デフェンシンの一方または両方を産生する細胞を含む。親の遺伝子改変とその形質の前記子孫への遺伝により前記デフェンシン２種が産生されるが、これにより、真菌病原体または昆虫病原体に対する耐性が生じ、前記耐性の程度は両デフェンシンを産生しない植物では観察されない程度である。Ｉ型デフェンシンは透過促進性デフェンシンまたは非透過促進性デフェンシンであってよい。また、本開示は、病原体感染に随伴する疾患からヒトまたは非ヒト動物対象を保護する方法であって、Ｉ型植物デフェンシンおよび透過促進性デフェンシンまたはその一方もしくは両方の前駆体、機能的ホモログ、アナログ、誘導体、もしくは変異体を細胞に与えることを含む方法も教示する。一実施形態において、病原体は真菌である。非ヒト動物対象は、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ロバ、ラマ、アルパカ、鳥類動物）、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスター、非ヒト霊長類）、および捕獲された野生動物を含む。
【００１８】
用語「遺伝子改変」は、組換えＤＮＡ技術を用いて植物または植物細胞を遺伝子改変することによって両デフェンシンをコードする遺伝物質を導入することを意味する。あるいは、この技術により少なくとも１つのデフェンシンをコードする遺伝物質を導入し、従来の育種により別のデフェンシンの遺伝子を導入する。
【００１９】
一実施形態において、Ｉ型デフェンシンは透過促進性デフェンシンである。別の実施形態において、Ｉ型デフェンシンは非透過促進性デフェンシンである。一実施形態において、２つ目の透過促進性デフェンシンはＩ型、ＩＩ型、または変異型デフェンシンから選択される。
【００２０】
本開示により、真菌病原体または昆虫病原体による感染から植物を保護し、真菌病原体または昆虫病原体に随伴する重篤な病害の発病率を低減する方法が可能となる。また、本開示は、植物やその周囲の根系または土壌における真菌または昆虫の蔓延を許容可能な程度まで抑制するためにも有用である。前記方法は、Ｉ型デフェンシン少なくとも１種および透過促進性デフェンシン１種の併用による、複数の効果を有する手法を包含する。後者の透過促進性デフェンシンは、例えばＩ型、ＩＩ型、または変異型デフェンシンである。変異型デフェンシンはＰＣＴ／ＡＵ２０１２／０００１１２中に教示されており、ＰＣＴ／ＡＵ２０１２／０００１１２の内容を参照して本明細書で援用する。所与の真菌病原体または所与の昆虫病原体に対する所与のＩ型デフェンシンと所与の透過促進性デフェンシンとの併用作用の効果は、予想を超えて相乗的である。すなわち、前記（少なくとも）２種の成分を植物環境において併用した場合の抗病原体活性は、各デフェンシンを単独で作用させた場合の阻害効果の合計よりも大きい。前記相乗作用の程度は低レベルから高レベルまで変移する。
【００２１】
したがって本開示は、真菌病原体または昆虫病原体による感染に随伴する病害から植物を保護する方法であって、前記病原体による感染の抑制に対し相乗的に有効な量の、Ｉ型デフェンシンおよび透過促進性デフェンシン、またはその一方もしくは両方の前駆体、機能的ホモログ、アナログ、誘導体、もしくは変異体を、前記植物の細胞に与えることを含む方法を教示する。
【００２２】
本明細書中、「方法」は、植物管理システム、プロトコール、および手順を含む。上述のように、一実施形態において、病原体は病原真菌である。別の実施形態において、病原体は昆虫病原体である。
【００２３】
「前記植物の細胞に与える」は、前記デフェンシン２種を外部供給源から与えること、前記デフェンシン２種を前記細胞内において（遺伝子改変により）与えること、および前記デフェンシン２種のうち１種を外部から、１種を前記細胞内において与えることを含む。したがって、局所的適用および遺伝子操作を使用してよく、また前記に加えて、任意に、両デフェンシンに暴露された遺伝子組換え植物に対して従来の育種を施すことをさらに含んでもよい。また、本明細書においては、デフェンシン２種の併用を含む局所的種子被覆、または一方のデフェンシンを発現するよう操作された植物もしくは植物種子にもう一方のデフェンシンを局所的に適用することも可能である。
【００２４】
また、本明細書においては、真菌病原体または昆虫病原体による感染に随伴する疾患からヒトまたは非ヒト動物対象を保護する方法であって、前記病原体による感染の抑制に対し相乗的に有効な量の、Ｉ型デフェンシンおよび透過促進性デフェンシン、またはその一方もしくは両方の前駆体、機能的ホモログ、アナログ、誘導体、もしくは変異体を、前記ヒトまたは非ヒト動物の細胞に与えることを含む方法も可能である。
【００２５】
また、本開示は、真菌もしくは昆虫の蔓延に対してより抵抗力のあるまたは真菌もしくは昆虫の蔓延に随伴する損傷を受けにくい遺伝子改変植物の作製における、Ｉ型デフェンシンおよび透過促進性デフェンシン、またはその一方もしくは両方の前駆体形態の使用も意図する。
【００２６】
また、本開示は、ヒトまたは非ヒト動物対象における真菌の蔓延を処置するための薬物の作製における、Ｉ型デフェンシンおよび透過促進性デフェンシン、またはその一方もしくは両方の前駆体形態の使用も意図する。
【００２７】
一実施形態において、真菌または昆虫による攻撃から作物または観賞用植物を保護する方法であって、Ｉ型デフェンシンおよび透過促進性デフェンシンまたはこれらの機能的ホモログ、アナログ、変異体、もしくは等価物を前記植物に与えることを含む方法が提供される。この実施形態において、両成分による真菌または昆虫に対する阻害の程度は、各成分単独による個々の効果を合わせた場合と比較して、相乗的であると考えられる。一実施形態において、Ｉ型デフェンシン少なくとも１種および透過促進性デフェンシン少なくとも１種の併用により、フザリウム種が相乗的に阻害される。Ｉ型デフェンシンとしては、例えば、ホルドチオニン（γ１−Ｈ）、ゼアチオニン（γ−Ｚｅａ２）、ＰｓＤ１、ＤｍＡＭＰ１、ＳＢＩ６、ＶＰ４２、ＶＰ４５、ＶＰ１３５、ＲｓＡＦＰ２、ＭｓＤｅｆ１、ＭｔＤｅｆ２、ＭｔＤｅｆ４、ＨｓＡＦＰ１、ＶａＤ２、ＶｒＤ２、ＺｍＥＳＲ６、およびＨＸＬデフェンシンが挙げられる（表２参照）。透過促進性デフェンシンとしては、例えば、ＮａＤ１、ＴＰＰ３、ＰｈＤ１Ａ、ＰｈＤ２、ＨＸＬ００１、ＨＸＬ００２、ＨＸＬ００４、ＨＸＬ００７、ＨＸＬ００８、ＨＸＰ４、ＨＸＰ３４、ＨＸＰ３５、およびＮｏＤ１７３が挙げられる（表２参照）。また、本方法は、プロテイナーゼ阻害剤またはその前駆体形態、例えば、システインプロテイナーゼ阻害剤またはセリンプロテイナーゼ阻害剤（例えば、ジャガイモＳｔＰｉｎ１Ａ［Ｐｏｔ１Ａ（米国特許第７，４６２，６９５号）と以前に称されたもの］）、ＨｖＣＰＩ６、ＳＩＣｙｓ９、Ａｔ２ｇ３８８７０、ウシ膵トリプシン阻害剤（ＢＰＴＩ）、またはウシトリプシン阻害剤Ｉ−Ｐの使用をさらに含んでもよい。この系の成分のいずれかによる阻害に対して感受性のある真菌または昆虫の制御は、この系の成分を併用した場合、この系の成分を単独で使用した場合に比べてより効果的となり得る。特に有用な併用には、ＨＸＰ４、ＮａＤ１、ＨＸＬ００４、ＨＸＬ００１やＨＸＬ００８を透過促進性デフェンシンとして、ＨＸＬ０１２、ＨＸＬ０１５、ＳＢ１６、ＨＸＬ００９、ＨＸＬ００８やＨＸＬ０２１をＩ型デフェンシンとして使用する併用が含まれる。
【００２８】
また、本開示は、真菌病原体または昆虫病原体による感染に随伴する病害から植物を保護する方法も提供する。前記方法は、Ｉ型デフェンシンおよび透過促進性デフェンシン、ならびに任意にプロテイナーゼ阻害剤、または前記成分のいずれかもしくは全ての前駆体、機能的ホモログ、アナログ、誘導体、もしくは変異体を、植物の細胞に与えることを含む。
【００２９】
本方法が採用する複数の効果を有する手法は、相乗的に作用するＩ型デフェンシンおよび透過促進性デフェンシンを含む、またはプロテイナーゼ阻害剤またはその前駆体形態をさらに含む。これら成分は、組換え手段により植物細胞内において生成されてもよいし、スプレー剤、エアゾール剤、粉末、または肥料もしくは植物用栄養素の一部として植物細胞に局所的に与えてもよい。さらに別の態様においては、上述のように、成分１種を組換え手段により与え、別の成分を外部から与える。本明細書において、局所的種子被覆が可能である。両デフェンシンを種子被膜に適用してもよいし、デフェンシン１種を発現するよう操作された植物または種子に別のデフェンシンを局所的に適用してもよい。一実施形態においては、一方のデフェンシンを遺伝子操作的手段により与え、もう一方のデフェンシンを従来の育種により導入する。
【００３０】
本明細書中に教示する別の態様は、真菌または昆虫の増殖、複製、感染や維持を阻害する方法であって、前記真菌または昆虫をＩ型デフェンシンおよび透過促進性デフェンシンの組み合わせに暴露することを含む方法である。また、プロテイナーゼ阻害剤またはその前駆体形態を使用してもよい。植物ならびにヒトおよび非ヒト動物対象についても同様である。
【００３１】
繰り返しになるが、両デフェンシンの存在下における真菌または昆虫に対する阻害の程度は、併用による暴露時と同じ用量の各成分を個々に前記真菌と接触させてその阻害を合計したものと比較して、相乗的である。
【００３２】
前記系における各成分が真菌または昆虫に対する阻害活性をそれぞれ発揮すると示すことができる場合、または各成分を併用するとその併用阻害効果が相乗的であると示すことができる場合に、前記真菌または昆虫は前記系における個々の成分の各々による「阻害に対して感受性がある」とする。
【００３３】
また、抗真菌活性を有するキメラデフェンシン分子や変異型デフェンシンを、このキメラデフェンシンがＩ型デフェンシン、透過促進性デフェンシン、またはその両方のうちいずれとみなされるかに基づいて、植物を保護するための本方法において使用できる。
【００３４】
また、本明細書においては、ドメインセグメントを２〜８個有するポリヌクレオチドを含む多重遺伝子発現ビヒクル（ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｈｉｃｌｅ：ＭＧＥＶ）も可能であり、各ドメインは機能性タンパク質をコードし、少なくとも１つのドメインはＩ型デフェンシンをコードし、かつ少なくとも１つの他のドメインは透過促進性デフェンシンをコードし、各ドメインは直鎖状配列においてリンカー配列により隣に連結され、ここでリンカー配列は配列番号８６のアミノ酸配列を有するリンカーペプチドをコードする。ＭＧＥＶベクターは米国特許出願第２００７−０２７７２６３号中に開示され、米国特許出願第２００７−０２７７２６３号の内容を参照して本明細書で援用する。
【００３５】
一実施形態において、少なくとも１つの他のドメインはプロテイナーゼ阻害剤またはその前駆体形態をコードする。
【００３６】
前記リンカーペプチドはアミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５（配列番号８６）を含み、前記配列中、
Ｘ１＝ＥまたはＤ
Ｘ２＝ＥまたはＤ
Ｘ３＝ＫまたはＲ
Ｘ４＝ＫまたはＲ
Ｘ５＝ＮまたはＱである。
【００３７】
また、本開示は、Ｉ型デフェンシンおよび透過促進性デフェンシン、ならびに任意にプロテイナーゼ阻害剤または前記成分のいずれかもしくは全ての機能的ホモログ、アナログ、誘導体、もしくは変異体を、真菌病原体または昆虫病原体の蔓延に対して抵抗力のある遺伝子改変植物またはその子孫の作製において使用することをさらに教示する。
【００３８】
また、本開示は、Ｉ型デフェンシンおよび透過促進性デフェンシン、ならびに任意にプロテイナーゼ阻害剤または前記成分のいずれかもしくは全ての機能的ホモログ、アナログ、誘導体、もしくは変異体を、真菌病原体または昆虫病原体の蔓延に対して抵抗力のあるヒトまたは非ヒト動物対象またはその子孫において使用することをさらに教示する。
【００３９】
本方法の実施形態において有用なプロテイナーゼ阻害剤は、システインプロテイナーゼ阻害剤およびセリンプロテイナーゼ阻害剤を含むが、これらに限定されない。
【００４０】
本方法によって真菌または昆虫の蔓延からの保護を受け得る植物は、プロテイナーゼ阻害剤と前記植物中で導入遺伝子として発現可能な植物デフェンシンとに対して感受性のある真菌または昆虫に対して感受性がある植物、またはデフェンシンおよびプロテイナーゼ阻害剤を含有する組成物を適用可能な植物を含む。導入遺伝子および局所的適用手法の併用も本明細書において意図される。「局所的適用手法」は種子被覆を含む。前記プロテイナーゼ阻害剤は、一般的に、タンパク質またはペプチドまたはそのアナログ化学物質である。前記植物は単子葉植物または双子葉植物であり得る。特定の植物は、コーン（トウモロコシ）、ダイズ、ワタ、カノーラ、およびコムギ等、ならびにナス科、アブラナ科、アオイ科、およびマメ科の植物を含む。
【００４１】
多くの病原真菌類、特に糸状性の病原真菌類による感染および損傷は、多くの植物種において、本系を使用することによって制御できる。制御可能な病原真菌および病原卵菌としては、例えば、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、バーティシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピシウム属（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、リゾクトニア属（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）、スクレロチニア属（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）、レプトスフェリア属（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）、フィトフトラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）、コレトトリカム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）、セルコスポラ属（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）、アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）種、およびさび菌類（ｒｕｓｔ  ｆｕｎｇｉ）が挙げられるが、これらに限定されない。重要な用途としては、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ：Ｆｇｒ）、ワタ萎凋病菌（フザリウム・オキシスポラム・エフ・エスピー・バシンフェクタム）（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．  ｓｐ．  ｖａｓｉｎｆｅｃｔｕｍ：Ｆｏｖ）、イネ科炭疽病菌（コレトトリカム・グラミニコラ）（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ：Ｃｇｒ）、レプトスフェリア・マクランス（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍａｃｕｌａｎｓ）、アブラナ科植物黒すす病菌（アルテルナリア・ブラシシコラ）（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ）、アルテルナリア・アルテルナータ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、灰色かび病菌（ボトリチス・シネレア）（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、テンサイ褐斑病菌（セルコスポラ・ベチコラ）（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｂｅｔｉｃｏｌａ）、トウモロコシ斑点病菌（セルコスポラ・ゼアエ・マイディス）（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｚｅａｅ  ｍａｙｄｉｓ）、トウモロコシごま葉枯病菌（コクリオボラス・ヘテロストロファス）（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ）、エキセロヒラム・ツルシカム（Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ  ｔｕｒｃｉｃｕｍ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・オキシスポラム・エフ・エスピー・ディアンティ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．  ｓｐ．  ｄｉａｎｔｈｉ）、フザリウム・オキシスポラム・エフ・エスピー・リコペルシーシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．  ｓｐ．  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）、フザリウム・シュードグラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・バーティシリオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｏｉｄｅｓ：Ｆｖｅ）、コムギ立枯病菌（ガエウマンノマイセス・グラミニス・バー・トリチシ）（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．  ｔｒｉｔｉｃｉ）、根こぶ病菌（プラスモジオホラ・ブラシカエ）（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、菌核病菌（スクレロチニア・スクレ���チオラム）（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、ステノカルペラ（ディプロディア）マイディス（Ｓｔｅｎｏｃａｒｐｅｌｌａ  （Ｄｉｐｌｏｄｉａ）  ｍａｙｄｉｓ）、スミレ類根腐病菌（サイレラビオプシス・バシコラ）（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ  ｂａｓｉｃｏｌａ）、バーティシリウム・ダーリエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ）、トウモロコシ黒穂菌（ウスチラゴ・ゼアエ）（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｚｅａｅ）、プクキニア・ソルギ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｏｒｇｈｉ）、炭腐病菌（マクロホミナ・ファセオリナ）（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ  ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）、落葉病菌（フィアロホラ・グレガタ）（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ  ｇｒｅｇａｔａ）、ジアポルテ・ファセオロラム（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ  ｐｈａｓｅｏｌｏｒｕｍ）、セルコスポラ・ソイナ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｓｏｊｉｎａ）、茎疫病菌（フィトフトラ・ソヤエ）（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）、リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、ファコプソラ・パキリジ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ）、アルテルナリア・マクロスポラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）、セルコスポラ・ゴシピナ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｎａ）、ホーマ・エクシグア（Ｐｈｏｍａ  ｅｘｉｇｕａ）、プクキニア・スケドナルディ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｃｈｅｄｏｎｎａｒｄｉｉ）、プクキニア・カカバタ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｃａｃａｂａｔａ）、フィマトトリコプシス・オムニボラ（Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｏｐｓｉｓ  ｏｍｎｉｖｏｒａ）、フザリウム・アベナシウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ａｖｅｎａｃｅｕｍ）、アルテルナリア・ブラシカエ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、アルテルナリア・ラファニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｒａｐｈａｎｉ）、エリシフェ・グラミニス（ブルメリア・グラミニス）（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  （Ｂｌｕｍｅｒｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ））、コムギ葉枯病菌（セプトリア・トリチシ）（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉ）、コムギふ枯病菌（セプトリア・ノドラム）（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ）、ミコスフェレラ・ゼアエ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）、リゾクトニア・セレアリス（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、裸黒穂病菌（ウスチラゴ・トリチシ）（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｔｒｉｔｉｃｉ）、プクキニア・グラミニス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、プクキニア・トリチシナ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉｎａ）、チレチア・インディカ（Ｔｉｌｌｅｔｉａ  ｉｎｄｉｃａ）、チレチア・カリエス（Ｔｉｌｌｅｔｉａ  ｃａｒｉｅｓ）、およびチレチア・コントロベルサ（Ｔｉｌｌｅｔｉａ  ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ）から植物を保護するため等に使用されるプロテイナーゼ阻害剤および抗真菌性デフェンシンの相乗的な併用が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
昆虫病原体は、サウスウエスタンコーンボーラー（Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉａｌｉｓ）、アブラムシ種（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ  ｓｐｐ）、タバコガ種（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｓｐｐ）、コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）、およびメクラカメムシ種（Ｌｙｇｕｓ  ｓｐｐ）を含む。
【００４３】
また、Ｉ型デフェンシンおよび透過促進性デフェンシン、またはこれらの抗真菌性もしくは抗昆虫性ホモログ、アナログ、変異体、および機能的等価物、またはこれらの前駆体形態を含む農学組成物も、本明細書において意図される。また、前記組成物は、プロテイナーゼ阻害剤またはその前駆体形態を含んでもよい。農学組成物は種子被覆調製物を含む。
【００４４】
また、本明細書中において、植物の植物性病原体感染を扱うプロトコールとして、植物環境の操作によりＩ型デフェンシンおよび透過促進性デフェンシンを前記病原体を阻害する量にて提供することを含むことがさらに意図される。
【００４５】
特定の実施形態において、「植物性病原体」は、真菌および昆虫または関連する他の生物を含む。真菌はさび菌を含む。植物を遺伝学的に改変して両デフェンシンを発現させることを本方法が概して含む場合、用語「植物」はその子孫を含む。前記方法がデフェンシンの組み合わせを局所的に適用することを含む場合、その効果は一般的に特定の植物に対してのみ発揮される。
【００４６】
本開示は特に抗植物病原体方法に関するが、複数の効果を有するこの手法をヒト、ならびに家畜、愛玩動物、実験動物、および捕獲された野生動物を含む非ヒト対象において使用してもよい。一般的に、局所的手法はこのような状況において使用される。通常、ヒトおよび非ヒト対象において使用される複数の効果を有するこの手法は、とりわけ、カンジダ属およびクリプトコッカス属等の酵母、趾間白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ）および紅色白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ）を含む白癬菌属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）等の皮膚糸状菌、ならびにクロコウジカビ（アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ））等のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種を含む他の糸状菌類を対象とする。
【００４７】
また、本明細書においては、病原体感染に随伴する病害から植物を保護する方法であって、配列番号８１、８３、８５、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、および６９から選択されるアミノ酸配列を含む成熟ドメインを有するＩ型デフェンシン、ＮａＤ１、ＴＰＰ３、ＰｈＤ１Ａ、ＰｈＤ２、ＮｏＤ１７３、配列番号３、６、１２、２１、２４、７０、７１、および７２からなる群から選択される成熟ドメインを有する透過促進性デフェンシン、またはその一方もしくは両方の前駆体、機能的ホモログ、アナログ、誘導体、もしくは変異体をその場の細胞に与えることを含む方法も可能である。
【００４８】
また、本明細書においては、病原体感染に随伴する病害から植物を保護する方法であって、配列番号８１、８３、８５、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、および６９から選択されるアミノ酸配列を含む成熟ドメインを有するＩ型デフェンシン、配列番号３、６、１２、２１、２４、７０、７１、および７２からなる群から選択される成熟ドメインを有する透過促進性デフェンシン、またはその一方もしくは両方の前駆体、機能的ホモログ、アナログ、誘導体、もしくは変異体をその場の細胞に与えることを含む方法も可能である。
【００４９】
また、本明細書においては、病原体感染に随伴する疾患からヒトまたは非ヒト動物対象を保護する方法であって、配列番号８１、８３、８５、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、および６９から選択されるアミノ酸配列を含む成熟ドメインを有するＩ型デフェンシン、ＮａＤ１、ＴＰＰ３、ＰｈＤ１Ａ、ＰｈＤ２、ＮｏＤ１７３、配列番号３、６、１２、２１、２４、７０、７１、および７２からなる群から選択される成熟ドメインを有する透過促進性デフェンシン、またはその一方もしくは両方の前駆体、機能的ホモログ、アナログ、誘導体、もしくは変異体をその場の細胞に与えることを含む方法も可能である。
【００５０】
【表１−１】
0006457945.tif 000002
【００５１】
【表１−２】
0006457945.tif 000003
【００５２】
【表１−３】
0006457945.tif 000004
【００５３】
【表２−１】
0006457945.tif 000005
【００５４】
【表２−２】
0006457945.tif 000006
【００５５】
【表２−３】
0006457945.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、Ｆｏｖ菌糸に対する透過促進分析の結果を表すグラフであって、透過促進性デフェンシン（ＮａＤ１、ＨＸＰ４、ＨＸＬ００２、ＨＸＬ００７、およびＨＸＬ００８）および非透過促進性デフェンシン（ＤｍＡＭＰ１）の間の差異を示す。
【図２】図２は、Ｆｇｒ菌糸に対する透過促進分析の結果を表すグラフであって、透過促進性デフェンシン（ＮａＤ１、ＨＸＰ４、ＨＸＬ００２、ＨＸＬ００４、ＨＸＬ００８、およびＨＸＬ０１３）および非透過促進性デフェンシン（ホルドチオニン、ＲｓＡＦＰ２、ＨＸＬ００９、およびＨＸＬ０２１）の間の差異を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
植物病原性真菌は、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ：Ｆｇｒ）、ワタ萎凋病菌（フザリウム・オキシスポラム・エフ・エスピー・バシンフェクタム）（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．  ｓｐ．  ｖａｓｉｎｆｅｃｔｕｍ：Ｆｏｖ）、イネ科炭疽病菌（コレトトリカム・グラミニコラ）（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ：Ｃｇｒ）、レプトスフェリア・マクランス（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍａｃｕｌａｎｓ）、アブラナ科植物黒すす病菌（アルテルナリア・ブラシシコラ）（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ）、アルテルナリア・アルテルナータ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、灰色かび病菌（ボトリチス・シネレア）（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、テンサイ褐斑病菌（セルコスポラ・ベチコラ）（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｂｅｔｉｃｏｌａ）、トウモロコシ斑点病菌（セルコスポラ・ゼアエ・マイディス）（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｚｅａｅ  ｍａｙｄｉｓ）、トウモロコシごま葉枯病菌（コクリオボラス・ヘテロストロファス）（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ）、エキセロヒラム・ツルシカム（Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ  ｔｕｒｃｉｃｕｍ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・オキシスポラム・エフ・エスピー・ディアンティ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．  ｓｐ．  ｄｉａｎｔｈｉ）、フザリウム・オキシスポラム・エフ・エスピー・リコペルシーシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．  ｓｐ．  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）、フザリウム・シュードグラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・バーティシリオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｏｉｄｅｓ：Ｆｖｅ）、コムギ立枯病菌（ガエウマンノマイセス・グラミニス・バー・トリチシ）（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．  ｔｒｉｔｉｃｉ）、根こぶ病菌（プラスモジオホラ・ブラシカエ）（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、菌核病菌（スクレロチニア・スクレロチオラム）（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、ステノカルペラ（ディプロディア）マイディス（Ｓｔｅｎｏｃａｒｐｅｌｌａ  （Ｄｉｐｌｏｄｉａ）  ｍａｙｄｉｓ）、スミレ類根腐病菌（サイエレラビオプシス・バシコラ）（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ  ｂａｓｉｃｏｌａ）、バーティシリウム・ダーリエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ）、トウモロコシ黒穂菌（ウスチラゴ・ゼアエ）（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｚｅａｅ）、プクキニア・ソルギ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｏｒｇｈｉ）、炭腐病菌（マクロホミナ・ファセオリナ）（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ  ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）、落葉病菌（フィアロホラ・グレガタ）（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ  ｇｒｅｇａｔａ）、ジアポルテ・ファセオロラム（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ  ｐｈａｓｅｏｌｏｒｕｍ）、セルコスポラ・ソイナ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｓｏｊｉｎａ）、茎疫病菌（フィトフトラ・ソヤエ）（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）、リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、ファコプソラ・パキリジ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ）、アルテルナリア・マクロスポラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）、セルコスポラ・ゴシピナ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｎａ）、ホーマ・エクシグア（Ｐｈｏｍａ  ｅｘｉｇｕａ）、プクキニア・スケドナルディ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｃｈｅｄｏｎｎａｒｄｉｉ）、プクキニア・カカバタ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｃａｃａｂａｔａ）、フィマトトリコプシス・オムニボラ（Ｐｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｏｐｓｉｓ  ｏｍｎｉｖｏｒａ）、フザリウム・アベナシウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ａｖｅｎａｃｅｕｍ）、アルテルナリア・ブラシカエ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、アルテルナリア・ラファニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｒａｐｈａｎｉ）、エリシフェ・グラミニス（ブルメリア・グラミニス）（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  （Ｂｌｕｍｅｒｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ））、コムギ葉枯病菌（セプトリア・トリチシ）（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉ）、コムギふ枯病菌（セプトリア・ノドラム）（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ）、ミコスフェレラ・ゼアエ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）、リゾクトニア・セレアリス（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、裸黒穂病菌（ウスチラゴ・トリチシ）（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｔｒｉｔｉｃｉ）、プクキニア・グラミニス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、プクキニア・トリチシナ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉｎａ）、チレチア・インディカ（Ｔｉｌｌｅｔｉａ  ｉｎｄｉｃａ）、チレチア・カリエス（Ｔｉｌｌｅｔｉａ  ｃａｒｉｅｓ）、およびチレチア属（Ｔｉｌｌｅｔｉａ）を含むが、これらに限定されない。
【００５８】
ヒトおよび非ヒト対象に対する病原真菌は、カンジダ属およびクリプトコッカス属等の酵母、趾間白癬菌および紅色白癬菌等の白癬菌属を含む皮膚糸状菌、ならびにクロコウジカビ等のアスペルギルス属を含む他の糸状菌類を含む。
【００５９】
植物病原性昆虫は、サウスウエスタンコーンボーラー、ヨーロッパアワノメイガ、アブラムシ種、タバコガ種、コナガ、およびメクラカメムシ種を含む。
【００６０】
「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」は、特定の配列の変形物および多形変異体等の天然変異体を含む。また、「変異体」は合成変異体、例えば、ＰＣＴ／ＡＵ２０１２／０００１１２中に記載される、別のデフェンシンに由来するドメインまたはループのような異種ドメインまたは異種ループを含むデフェンシン等も含む。ＰＣＴ／ＡＵ２０１２／０００１１２は、その内容を参照して本明細書で援用する。
【００６１】
本明細書において、所与のデフェンシン対の阻害効果は相乗的であることが提案される。Ｇｒｅｃｏら（１９９５）、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ  ４７：３３１−３８５では、前記２種の成分のうち１種または両方が、それ以外の成分の非存在下で分析した場合に測定可能な活性を有しているか、それとも前記２種の成分のいずれも測定可能な活性を有していないかに従って、相乗作用の種類が定義された。本明細書における定義は、前記２種の成分を併用した際の併用効果が各成分を単独で作用させた際の効果の合計より大きいという前提において、前記状況を全て含む。当然のことながら、２種以上の成分を相乗的に併用した場合の活性が合算した活性より大きくなるのは、特定の条件下においてのみであってもよい。例えば、前記成分のうち１種以上の濃度が、その成分単独が最大の効力を発揮する濃度より低いという条件下においてのみであってもよい。成分の併用という用語が本明細書において意図する通り、前記成分を併用した際の併用効果が各成分を単独で作用させた際の効果の合計より大きくなる条件、例えば濃度を含むがこれに限定されない条件、が複数がある場合に、成分を併用した場合の併用効果は相乗的であると考えられる。上述したＲｉｃｈｅｒ（１９８７）は、相乗作用を立証する数学的手法を記載している。この手法はＬｉｍｐｅｌの式を使用している。Ｌｉｍｐｅｌの式は上述したＲｉｃｈｅｒ（１９８７）に定義され、また、Ｈａｒｍａｎらの米国特許第６，５１２，１６６号において、真菌細胞壁分解酵素と真菌細胞膜に影響を及ぼす化合物とが植物病原性真菌類の増殖において発揮する相乗作用を立証するために用いられている。同様の手法を昆虫に対して使用できる。
【００６２】
相乗作用は、デフェンシン２種の併用により引き起こされる観察された真菌増殖阻害率％（Ｉｏ値）と、各デフェンシン単独による真菌増殖阻害率％の合計に基づく同デフェンシン２種による予想された真菌増殖阻害率％（上述のＲｉｃｈｅｒら（１９８７）で使用されるＬｉｍｐｅｌの式により計算されるＥｅ値）との差異として分類される。この差異Ｉｏ−Ｅｅが前記相乗作用を示す値である。前記相乗作用値が１５以下である場合は相乗作用が有意でないことを、１５〜３０である場合は相乗作用の程度が低いことを、３０〜６０である場合は相乗作用の程度が中程度であることを、６０を超える場合は相乗作用の程度が高いことを意味する。
【００６３】
「真菌の阻害」は殺真菌活性および静真菌活性の両方を含み、その測定は、真菌の増殖の減少（または生存能の喪失）を対照と比較することによってなされる。真菌の増殖は、当技術分野において公知の多くの異なる方法によって測定できる。糸状菌の増殖の測定に一般的に使用される方法は、好適な増殖培地において胞子を発芽させ、増殖が測定可能となるまで十分な時間インキュベートし、指定インキュベーション時間の経過後に培養物の増加した光学濃度を測定する必要がある。前記光学濃度は増殖が進むにつれて増加する。典型的には、真菌の増殖は発病に必須である。したがって、真菌の増殖の阻害は、真菌性病害からの保護を示す好適な指標となる。すなわち、阻害が大きいほど保護効果が高い。同様に、「昆虫の阻害」は殺虫活性および制虫（ｉｎｓｅｃｔｉｓｔａｔｉｃ）活性の両方を含む。抗昆虫活性は、飼育試験において有効に測定できる。
【００６４】
本明細書中における「感染の予防」は、本発明の方法によって処置した植物またはヒトもしくは非ヒト動物対象において、前記対象と病原体が相互作用した自然の成り行きとして、前記デフェンシン２種の導入遺伝子を発現しないまたは前記デフェンシン２種で処置していない植物と比較して、病原体感染または疾患もしくは病害の症状またはそれら全てが回避されること、あるいは病原体感染または疾患もしくは病害の症状またはそれら全てが緩和、最小化、またはその頻度が減ることを意味する。すなわち、病原体により引き起こされる疾患または病害や疾患または病害の随伴症状が妨げられる、または抑制される。感染の抑制や症状の緩和は、本明細書中に教示する方法による前記処置を受けていない植物の場合の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％、またはそれを超える。一態様において、本明細書中に開示する方法は、両デフェンシンの存在下において病原性真菌の胞子形成を大きく抑制する。
【００６５】
したがって、前記デフェンシンの併用作用は、阻害活性の中でも特に真菌の増殖、複製、感染や維持を阻害する作用や、昆虫の蔓延を阻害する作用である。
【００６６】
植物の保護（病害に対する耐性または病害の抑制）は、当技術分野において公知の方法によって評価できる。Ｕｋｎｅｓ（１９９３）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ６：６８０−６８５；Ｇｏｒｌａｃｈら（１９９６）、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ８：６２９−６４３；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら（１９９３）、ＰｒｏｃＮａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ９０：７３２７−７３３１を参照。当業者によれば、植物性病原体による植物の感染および病害を決定する方法は試験対象の病原体および植物によって異なることが認識される。
【００６７】
「Ｉ型」デフェンシンは透過促進性デフェンシンおよび非透過促進性デフェンシンを含む。「透過促進性デフェンシン」はＩ型デフェンシン、ＩＩ型デフェンシン、および変異型デフェンシンを含み、変異型デフェンシンは透過促進性デフェンシンである。「変異型」デフェンシンは、ＩＩ型デフェンシンに由来するループ１Ｂ領域がＩ型デフェンシンのループ１Ｂ領域により置き換えられたデフェンシン、またはＩＩ型のループ１Ｂ領域において１つ以上のアミノ酸が置換、付加、もしくは欠失したデフェンシンを含む。ループ１Ｂ領域は、デフェンシンＮ末端部分の第１のβ鎖（β鎖１）とαヘリックスの間に位置する（第１のフレキシブルループとも称される）。上述のように、植物デフェンシンは大きく２つの型に分類される。Ｉ型デフェンシンは、小胞体（ＥＲ）配列とそれに続く成熟デフェンシンドメインからなる。ＩＩ型デフェンシンはより大きな前駆体として産生され、前記ＥＲシグナル配列および成熟ドメインに加えて、アミノ酸約３３個からなるＣ末端プロドメインまたはプロペプチド（ＣＴＰＰ）を有する。
【００６８】
透過促進性デフェンシンは、ＳＹＴＯＸ（登録商標）等のＤＮＡ結合色素が菌糸細胞内に侵入することを可能にする。例えば、菌糸をＤＮＡ結合色素と共に１０分間にわたってインキュベートして増殖させた後、透過促進能力を試験するペプチドを添加し、続いて、ＤＮＡ結合色素の取り込みを測定する。ＳＹＴＯＸの場合、測定は、励起波長および発光波長それぞれ４８８ｎｍおよび５３８ｎｍにおける蛍光に基づいて行う。便宜上、透過促進分析にはワタ萎凋病菌（Ｆｏｖ）を使用する。この分析において、透過促進性デフェンシンＮａＤ１の透過性指標を１．０とし、透過性指標が０．１２より大きい任意のデフェンシンペプチドを透過促進性デフェンシンとみなす。図１および表１２ａを参照。ＰＣＴ／ＡＵ２００９／０００１０６を参照すれば、より詳細な情報を得ることができる。
【００６９】
別の分析においては、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｇｒ）を使用し、前記と同様に陽性対照としてＮａＤ１を使用し、その透過性指標を１．０とする。図２および表１２ｂを参照。
【００７０】
Ｉ型デフェンシンは、ホルドチオニン（γ１−Ｈ）、ゼアチオニン（γ−Ｚｅａ２）、ＰｓＤ１、ＤｍＡＭＰ１、ＳＢＩ６、ＶＰ４２、ＶＰ４５、ＶＰ１３５、ＲｓＡＦＰ２、ＭｓＤｅｆ１、ＭｔＤｅｆ２、ＭｔＤｅｆ４、ＨｓＡＦＰ１、ＶａＤ２、ＶｒＤ２、ＺｍＥＳＲ６、またはＨＸＬデフェンシンを含む（表２を参照）。透過促進性デフェンシンは、ＮａＤ１、ＴＰＰ３、ＰｈＤ１Ａ、ＰｈＤ２、もしくはＮｏＤ１７３等のＩＩ型デフェンシン、ＨＸＬ００１、ＨＸＬ００２、ＨＸＬ００４、ＨＸＬ００７、もしくはＨＸＬ００８等のＩ型デフェンシン、またはＨＸＰ４、ＨＸＰ３４、もしくはＨＸＰ３５等の変異型デフェンシンを含む（表２を参照）。特に有用な併用としては、ＨＸＰ４、ＮａＤ１、ＨＸＬ００４、ＨＸＬ００１やＨＸＬ００８を透過促進性デフェンシンとして、ＨＸＬ０１２、ＨＸＬ０１５、ＳＢ１６、ＨＸＬ００９、ＨＸＬ００８やＨＸＬ０２１をＩ型デフェンシンとして使用する併用が含まれる。
【００７１】
また、本明細書においては、病原体感染に随伴する疾患から植物またはヒトもしくは非ヒト動物対象を保護する方法であって、配列番号８１、８３、８５、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、および６９から選択されるアミノ酸配列を含む成熟ドメインを有するＩ型デフェンシン、ＮａＤ１、ＴＰＰ３、ＰｈＤ１Ａ、ＰｈＤ２、ＮｏＤ１７３、配列番号３、６、１２、２１、２４、７０、７１、および７２からなる群から選択される成熟ドメインを有する透過促進性デフェンシン、またはその一方もしくは両方の前駆体、機能的ホモログ、アナログ、誘導体、もしくは変異体をその場の細胞に与えることを含む方法も可能である。
【００７２】
また、本明細書においては、病原体感染に随伴する病害から植物またはヒトもしくは非ヒト動物対象を保護する方法であって、配列番号８１、８３、８５、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、および６９から選択されるアミノ酸配列を含む成熟ドメインを有するＩ型デフェンシン、配列番号３、６、１２、２１、２４、７０、７１、および７２からなる群から選択される成熟ドメインを有する透過促進性デフェンシン、またはその一方もしくは両方の前駆体、機能的ホモログ、アナログ、誘導体、もしくは変異体をその場の細胞に与えることを含む方法も可能である。
【００７３】
本明細書中において、用語「プロテイナーゼ阻害剤」は、真菌プロテイナーゼまたは昆虫プロテイナーゼの活性を阻害するため、かつ真菌または昆虫による疾患または病害から植物またはヒトもしくは非ヒト動物対象を保護するために使用されるタンパク質またはペプチドを含む。また、前記プロテイナーゼ阻害剤のアナログ化学物質または機能的等価物も本明細書に包含される。
【００７４】
また、前記プロテイナーゼ阻害剤はその前駆体形態として与えられてもよく、前駆体形態は、処理を受けて活性型となることで有効化される。
【００７５】
システインプロテイナーゼ阻害剤、またはシスタチンは、システインプロテアーゼの阻害剤であり、システインプロテアーゼに強く可逆的に結合する。システインプロテイナーゼ阻害剤のスーパーファミリーは３つのファミリー、すなわちステフィン、シスタチン、およびキニノーゲンに分けられる（Ｔｕｒｋ  ａｎｄ  Ｂｏｄｅ（１９９１）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２８５：２１３−２１９）。
【００７６】
セリンプロテイナーゼ阻害剤、またはセリンエンドペプチダーゼは、求核性アミノ酸としてセリンを含むペプチド結合を切断する。セリンプロテイナーゼ阻害剤は一般的に、トリプシン様セリンプロテイナーゼ阻害剤、キモトリプシン様セリンプロテイナーゼ阻害剤、およびエラスターゼ様セリンプロテイナーゼ阻害剤を含むキモトリプシン様セリンプロテイナーゼ阻害剤と、サブチリシン様セリンプロテイナーゼ阻害剤と、の２つの群に分けられる（Ｍａｄａｌａら（２０１０）、Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  １１０（６）：１−３１）。
【００７７】
「相乗効果」は、前記方法において２種以上の成分が、各成分を単独で作用させた際の効果の合計より大きい併用効果をもたらす場合の効果である。前記効果は、効力、安定性、速度や毒性レベルのうち１つ以上であってよい。本明細書中に記載するように、Ｉ型デフェンシンおよび透過促進性デフェンシンの併存下において測定される、病原体の増殖に対する相乗的な阻害は、特定濃度範囲の各デフェンシン成分を存在させる以外は条件を同じくして測定された阻害の合計より大きい。当然のことながら、前記２種の成分の効果は、その濃度の全組み合わせにおいて各効果の合計より大きな効果が観察されなくても、相乗的であるとみなすことができる。２種の成分について、特定濃度で組み合わせた場合に相乗効果が観察されそれ以外の濃度で組み合わせた場合には相乗効果が観察されなくてもよい。例えば、真菌細胞に侵入できなければ毒性が限定されるのであれば、透過促進性デフェンシンが存在することによって、特にはデフェンシン濃度が阻害に要する最高濃度より低い場合に、第２のデフェンシンに対して相乗作用をもたらし得る。一実施形態において、一方または両方のデフェンシンの濃度は前記最高濃度より低い。同様の理由で、成分の一方または両方のレベルが観察可能上限の阻害をもたらす高レベル（最高レベル）で存在する場合に、相乗作用がなくなることもある。したがって、あらゆる条件下において相乗作用が観察されなくても相乗作用が発揮される可能性はあることから、デフェンシンとデフェンシンを併用する一般的な系は「相乗的」であるとする。少なくとも一部の投薬量について、２種の植物デフェンシンが相乗作用する場合の真菌に対する阻害は、各成分を単独で作用させた場合に得られる阻害より大きくなる。本開示は、真菌性病害および昆虫の蔓延からの植物の保護を改善し、抗真菌化学物質または抗虫化学物質に対する依存度を低減することを教示する。このことは、栽培者および飼育者にとっては投入原価の低減を意味し、また、植物性病原体に対する活性スペクトルが増大し、環境被害をもたらす可能性が低くなることを意味する。また、殺病原体剤に対して耐性を有する病原体株の生育選択圧が大幅に低くなり、これによって、商業寿命が長くなり、かつ耐性を有する真菌株の繁殖が抑制され、多耐性株が出現する可能性が低くなる。
【００７８】
したがって、本開示の方法は、真菌または昆虫による感染または蔓延によって生じる経済的喪失の低減に有用である。また、本開示の方法は、ヒトおよび非ヒト動物対象が病原体に暴露されて生じる疾患または疾患の症状の緩和を促進する。
【００７９】
本明細書中に教示する態様において、真菌因子または昆虫因子等の病原体に随伴する病害から植物を保護する方法が提供され、この方法による予防または処置によって、植物または植物の一部分を殺病原体剤により処置する必要性が減少し、したがって原料コスト、労力、および環境汚染が低減される、またはこうした植物の商品（例えば果実および種子等）としての品質保持期間が長くなる。
【００８０】
一実施形態において、病原体は真菌である。非ヒト動物対象は、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ロバ、ラマ、アルパカ、鳥類動物）、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスター、非ヒト霊長類）、および捕獲された野生動物を含む。
【００８１】
用語「植物」は植物全体および植物の一部分を含み、これらには、苗条、栄養器官や栄養構造（例えば葉、茎、および塊茎）、地下部、花卉、および花器官や花構造（例えば苞葉、萼片、花弁、雄しべ、心皮、葯、および胚珠）、種子（胚、胚乳、および種皮を含む）、果実（成熟子房）、植物組織（例えば維管束組織および基本組織等）、植物細胞（例えば孔辺細胞および卵細胞等）、およびその子孫が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中に記載する方法を使用して保護できる植物は、被子植物（単子葉植物および双子葉植物）、裸子植物、シダ、トクサ、古生マツバラン、リコフィテ（ｌｙｃｏｐｈｙｔｅ）、蘚苔類、および多細胞藻類を含む、高等植物および下等植物を含む。本方法において使用する植物はあらゆる維管束植物、例えば単子葉類または双子葉類または裸子植物を含み、コーン（およびトウモロコシ）、ダイズ、ワタ、綿実、カノーラ、コムギ、アルファルファ、リンゴ、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、バナナ、オオムギ、トウゴマ、キク、クローバー、カカオ、コーヒー、ハマナ、クランベリー、キュウリ、デンドロビウム、ヤマノイモ、ユーカリ、フェストゥーカ、アマ、グラジオラス、ユリ科、アマニ、キビ、マスクメロン、カラシナ、エンバク、アブラヤシ、アブラナ（オイルシードレイプ（ｏｉｌｓｅｅｄ  ｒａｐｅ）（レイプ（ｒａｐｅ）、ラパ（ｒａｐａ）））、パパイヤ、ラッカセイ、パイナップル、観賞用植物、インゲンマメ属（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、ジャガイモ、ナタネ、イネ、ライムギ、ライグラス、ベニバナ、ゴマ、モロコシ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、イチゴ、タバコ、トマト、シバ、野菜作物、例えばレタス、セロリ、ブロッコリー、カリフラワー、ウリ科、およびタマネギ（ニンニク、エシャロット、リーキ、およびチャイブを含む）；果樹および堅果樹、例えばリンゴ、ナシ、モモ、オレンジ、グレープフルーツ、レモン、ライム、アーモンド、ペカン、クルミ、およびヘーゼルナッツ；つる植物、例えばブドウ、キウイフルーツ、およびホップ；果樹低木およびキイチゴ、例えばラズベリー、ブラックベリー、およびグースベリー；ならびに森林樹、例えばトネリコ、マツ、モミ、カエデ、ナラ、クリ、およびポプラが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
本明細書中に意図される特定の植物は、コーン、ダイズ、ワタ、カノーラ、およびコムギを含む。
【００８３】
「昆虫病原体」は、サウスウエスタンコーンボーラー、ヨーロッパアワノメイガ、アブラムシ種、タバコガ種、コナガ、およびメクラカメムシ種の門の昆虫を含む。
【００８４】
「遺伝子組換え（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）植物」は、同じ種、品種、または栽培品種の野生型植物には見られない（すなわち「外因性の」）遺伝物質を含有する植物、またはその種子もしくはその子孫を指す。前記遺伝物質は、導入遺伝子、挿入突然変異誘発事象（トランスポゾンまたはＴ−ＤＮＡ挿入突然変異誘発によるものなど）、アクティベーション・タギング（ｔａｇｇｉｎｇ）配列、変異型配列、相同組換え事象、またはキメラ形成法により改変された配列を含んでもよい。典型的には、前記外来遺伝物質は、人間が操作することにより前記植物中に導入されたものであるが、当業者が認識する任意の方法を使用できる。用語「遺伝子改変（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ）植物」は、本明細書中の「遺伝子組換え植物」と同一の意味において使用されてもよい。一実施形態において、前記植物またはその一部分、例えば種子等は、遺伝子改変によりデフェンシン１種を発現し、第２のデフェンシンは、種子被覆または局所用調製物等により外部から供給される。
【００８５】
遺伝子組換え植物は、発現ベクターまたは発現カセットを含有してもよい。前記発現カセットは、典型的には、ポリペプチドの発現を可能とする適切な誘導用調節配列または構成調節配列に動作可能に連結した（すなわちその調節制御下にある）ポリペプチドコード配列を含む。前記発現カセットは、形質転換することによって、または親植物の形質転換後に育種することによって、植物中に導入できる。好適な発現カセットの一例が米国特許出願第１１／７５３，０７２号中（ＰＣＴ／ＡＵ２００７／０００７１２の等価物）に開示され、米国特許出願第１１／７５３，０７２号の内容を参照して本明細書で援用する。
【００８６】
本方法において使用する植物または植物の一部分は、任意の植物生育段階における植物を含む。便宜上、発芽、実生生長、栄養生長、および生殖生長の各段階において適用される。特に、本方法は栄養生長段階および生殖生長段階において適用される。栄養生長段階および生殖生長段階は、本明細書において「成長体」または「成熟」植物とも呼ぶ。植物の遺伝子操作とデフェンシンの局所的適用を併用することも本明細書中に教示される。また、前記デフェンシンの一方を遺伝子操作的手段により導入し、他方を従来の育種手法により導入してもよい。
【００８７】
本開示はＩ型デフェンシンおよび透過促進性デフェンシンの相乗的な作用を使用して真菌または昆虫による感染から植物を保護する方法を提供するが、当然のことながら、前記併用に更に材料を追加すれば植物の健康に対してさらに利益をもたらすことができ、これは、例えば、プロテイナーゼ阻害剤または殺菌性もしくは殺虫性タンパク質を組み込むことによって、あるいは前記デフェンシン２種の一方または両方のうち１種以上を使用することによってなすことができる。例えば、植物性病原体に対する活性スペクトルを、因子を追加することによって高めることができる可能性がある。
【００８８】
前記デフェンシン成分は便宜上、保護対象である植物に遺伝子改変後によって与えられるが、本方法は表面噴霧または種子被覆、さらには肥料および植物用栄養素への配合をも包含する。一実施形態において、前記植物は、当技術分野において公知の方法を用いた遺伝子改変により所望のデフェンシン２種を発現する。
【００８９】
植物の保護（病害に対する耐性または病害の抑制）は、当技術分野において公知の方法によって評価できる。Ｕｋｎｅｓ（１９９３）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ６：６８０−６８５、上述したＧｏｒｌａｃｈら（１９９６）、上述したＡｌｅｘａｎｄｅｒら（１９９３）を参照。当業者によれば、植物性病原体による植物の感染および病害を決定する方法は試験対象の病原体および植物によって異なることが認識される。
【００９０】
また、本明細書においては、真菌病原体または昆虫病原体による感染に随伴する疾患からヒトまたは非ヒト動物対象を保護する方法であって、前記病原体による感染の抑制に対し相乗的に有効な量の、Ｉ型デフェンシンおよび透過促進性デフェンシン、またはその一方もしくは両方の前駆体、機能的ホモログ、アナログ、誘導体、もしくは変異体を、前記ヒトまたは非ヒト動物の細胞に与えることを含む方法も可能である。
【００９１】
また、本開示は、ヒトまたは非ヒト動物対象における真菌の蔓延を処置するための薬物の製造における、Ｉ型デフェンシンおよび透過促進性デフェンシン、またはその一方もしくは両方の前駆体形態の使用も意図する。
【００９２】
上述のように、Ｉ型デフェンシンは透過促進性デフェンシンまたは非透過促進性デフェンシンであってよい。したがって、１種または２種の透過促進性デフェンシンを使用してもよい。
【００９３】
一実施形態において、核酸はプロモーターに動作可能に連結し、植物細胞のゲノムに導入される。適切な条件下において前記プロモーターにより核酸分子の発現が可能となり、ｍＲＮＡが生成され、このｍＲＮＡが翻訳されてデフェンシンタンパク質となる。前記植物細胞は植物を再生させるために使用され、この植物は「遺伝子改変植物」と称される。前記遺伝子改変とは、発現可能な核酸分子を導入することによってデフェンシンの生成を可能とし、これによって植物の細胞に、病原真菌の蔓延に対する耐性が与えられることを指す。
【００９４】
核酸配列は、植物細胞において発現させることができる。当業者であれば、デフェンシンタンパク質をコードする核酸の発現に使用できる発現系を多く知っていると考えられる。植物細胞においてタンパク質を発現させる既知の方法については詳細に記載はしない。
【００９５】
本明細書において、「異種」の核酸とは、前記核酸の供与先として意図される植物とは別の植物種または植物株に由来する核酸である。例えば、異種のヌクレオチド配列に動作可能に連結したプロモーターは、前記ヌクレオチド配列の起源である植物種とは別の植物種に由来し得る。
【００９６】
「遺伝子改変植物」は、異種の核酸配列を含む細胞を有する植物を意味する。「遺伝子改変植物」は、再生させた植物またはその子孫に直接由来してもよいし、遺伝子操作と従来の育種とを併用して得たものであってもよい。本明細書において、「異種」の核酸は、前記デフェンシンの一方または両方、および任意にプロテイナーゼ阻害剤またはその前駆体形態をコードする核酸を意味する。
【００９７】
前記デフェンシン配列は一般的に、目的の植物における発現を目的とした発現カセットまたはＤＮＡコンストラクト中に組み込まれる。前記カセットは、本発明のデフェンシン配列に動作可能に連結した５’調節配列および３’調節配列を有することができる。「動作可能に連結」により、プロモーターと第２の配列とが機能的に連結すること（前記プロモーターの配列が、前記第２の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始および媒介すること）が意図される。一般的に、動作可能に連結とは、前記連結した核酸配列が一続きであって、必要であれば、同一読み枠における一続きの２つのタンパク質コード領域を連結することを意味する。前記カセットは、前記生物中に同時形質転換させる少なくとも１つの更なる遺伝子をさらに含有してもよい。あるいは、複数の発現カセットに前記更なる遺伝子を与えることもできる。
【００９８】
こうした発現カセットは、前記調節領域による転写調節下においてデフェンシン配列を挿入するための制限部位を複数有する。前記発現カセットは、選択マーカー遺伝子をさらに有していてもよい。
【００９９】
前記発現カセットは、５’末端から３’末端へ転写される方向において、転写および翻訳開始領域、本発明のデフェンシンＤＮＡ配列、ならびに転写および翻訳終結領域を有し、これらはいずれも、植物中で機能する。前記転写開始領域、すなわちプロモーターは、宿主植物中にネイティブに存在するものであってもよいし、宿主植物と類似、または宿主植物に対して外来、または宿主植物に対して異種のものであってもよい。さらに、前記プロモーターは、天然の配列であってもよいし、合成の配列であってもよい。「外来」は、前記転写開始領域を導入したネイティブな植物において前記転写開始領域が存在しないことを指す。本明細書において、キメラ遺伝子は、前記コード配列とは異種の転写開始領域に動作可能に連結したコード配列を含む。
【０１００】
異種のプロモーターの使用が配列の発現に有用な場合もあるし、ネイティブなプロモーター配列をさらに使用してもよい。
【０１０１】
前記終結領域は、前記転写開始領域にネイティブであってもよいし、前記動作可能に連結した目的のＤＮＡ配列にネイティブであってもよいし、別の供給源に由来してもよい。簡便な終結領域がＡ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドから入手可能であり、例えばオクトピンシンターゼ終結領域およびノパリンシンターゼ終結領域等である。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕら（１９９１）、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１−１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）、Ｃｅｌｌ  ６４：６７１−６７４；Ｓａｎｆａｃｏｎら（１９９１）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：１４１−１４９；Ｍｏｇｅｎら（１９９０）、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１２６１−１２７２；Ｍｕｎｒｏｅら（１９９０）、Ｇｅｎｅ  ９１：１５１−１５８；Ｂａｌｌａｓら（１９８９）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７８９１−７９０３；Ｊｏｓｈｉら（１９８７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５：９６２７−９６３９も参照。
【０１０２】
必要に応じて、前記遺伝子を最適化することによって、形質転換後の植物細胞における発現を増大させてもよい。すなわち、植物に好適なコドンを使用して前記遺伝子を合成し、これによって発現を改善できる。宿主に好適なコドンの使用に関する議論は、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｇｏｗｒｉ（１９９０）、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１−１１を参照。植物に好適な遺伝子を合成する方法は当技術分野より入手できる。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号および第５，４３６，３９１号、ならびにＭｕｒｒａｙら（１９８９）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８を参照。
【０１０３】
上記以外にも、宿主細胞における遺伝子発現を増大させる配列の改変が知られる。こうした改変には、偽ポリアデニル化シグナルをコードする配列、エクソン−イントロンスプライス部位シグナルをコードする配列、およびトランスポゾン様リピートをコードする配列、ならびに遺伝子発現に悪影響を及ぼす可能性がある十分に特徴付けされた配列を取り除くことが含まれる。前記配列のＧＣ含量は、所与の宿主細胞における平均ＧＣ含量に適合するよう調節されてもよく、前記平均ＧＣ含量は、前記宿主細胞において発現する既知の遺伝子に関して計算される。可能であれば、予測されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を避けるよう前記配列を改変する。
【０１０４】
前記発現カセットは、前記発現カセットコンストラクト中における５’リーダー配列をさらに含有してもよい。こうしたリーダー配列の作用により、翻訳が促進され得る。翻訳リーダーは当技術分野において公知であり、ピコルナウイルスリーダー、例えばＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’非コード領域）（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎら（１９８９）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８６：６１２６−６１３０）、ポティウイルスリーダー、例えばＴＥＶリーダー（タバコエッチ病ウイルス）［Ａｌｌｉｓｏｎら（１９８６）、ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシ萎縮モザイクウイルス）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５４：９−２０］、およびヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）（Ｍａｃｅｊａｋら（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：９０−９４）、アルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ  ＲＮＡ  ４）のコートタンパク質ｍＲＮＡに由来する非翻訳リーダー［Ｊｏｂｌｉｎｇら（１９８７）、Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：６２２−６２５］、タバコモザイクウイルスリーダー（ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｌｅａｄｅｒ：ＴＭＶ）（Ｇａｌｌｉｅら（１９８９）、Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＲＮＡ，（編）Ｃｅｃｈ（Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ｐｐ．２３７−２５６）、ならびにトウモロコシ退緑斑紋ウイルスリーダー（ｍａｉｚｅ  ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ  ｌｅａｄｅｒ：ＭＣＭＶ）［Ｌｏｍｍｅｌら（１９９１）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８１：３８２−３８５］を含む。他にも、Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａら（１９８７）、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８を参照。上記以外にも、例えばイントロン等、翻訳を促進する既知の方法を使用できる。
【０１０５】
前記発現カセットを調製するにあたり、得られるＤＮＡ配列が好適に配向されるよう、また必要に応じて好適な読み枠内に収まるよう、前記種々のＤＮＡ断片を処理してもよい。そのために、ＤＮＡ断片を連結させるためにアダプターまたはリンカーを使用してもよいし、上記以外の操作を追加的に実施することによって、例えば、適当な制限部位の提供、不必要なＤＮＡの除去、制限部位の除去等をしてもよい。このために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける突然変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、ならびに例えば転移および転換等の再置換を追加的に実施してもよい。
【０１０６】
一般的に、前記発現カセットは、形質転換細胞を選択するための選択マーカー遺伝子を含むことができる。選択マーカー遺伝子は、形質転換細胞または形質転換組織の選択に使用する。マーカー遺伝子は、抗生物質耐性をコードする遺伝子、例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードする遺伝子、ならびにグリホサート、グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン、および２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）等の除草性化合物に対する耐性を与える遺伝子を含む。一般的には、Ｙａｒｒａｎｔｏｎ（１９９２）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：５０６−５１１；Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎら（１９９２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６３１４−６３１８を参照。
【０１０７】
選択マーカー遺伝子は前記に列記したものに限定されない。任意の選択マーカー遺伝子を使用できる。
【０１０８】
発現コンストラクトの作製には多数のプロモーターを使用できる。プロモーターは、どのような成果を目的とするかに基づいて選択できる。すなわち、核酸を、構成的プロモーター、組織に好適なプロモーター、または目的とする宿主細胞において発現させるための他のプロモーターと結合させることができる。このような構成的プロモーターは、例えば、Ｒｓｙｎ７プロモーターのコアプロモーターならびにＷＯ９９／４３８３８および米国特許第６，０７２，０５０号中に開示される他の構成的プロモーター、コアＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−８１２）、イネアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙら（１９９０）、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１６３−１７１）、ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら（１９８９）、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９−６３２、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら（１９９２）、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９）、ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔら（１９９１）、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１−５８８）、ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎら（１９８４）、ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７２３−２７３０）、およびＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号）等を含む。上記以外では、このような構成的プロモーターは、例えば、米国特許第５，６０８，１４９号、米国特許第５，６０８，１４４号、米国特許第５，６０４，１２１号、米国特許第５，５６９，５９７号、米国特許第５，４６６，７８５号、米国特許第５，３９９，６８０号、米国特許第５，２６８，４６３号、米国特許第５，６０８，１４２号、および米国特許第６，１７７，６１１号中に開示される構成的プロモーターを含む。これらの先行技術文献は参照して本明細書で援用する。
【０１０９】
また、本明細書においては、ドメインセグメントを２〜８個有するポリヌクレオチドを含む多重遺伝子発現ビヒクル（ＭＧＥＶ）も可能であり、各ドメインは機能性タンパク質をコードし、少なくとも１つのドメインはＩ型デフェンシンをコードし、かつ少なくとも１つの他のドメインは透過促進性デフェンシンをコードし、各ドメインは直鎖状配列においてリンカー配列により隣と連結され、前記リンカー配列は配列番号８６のアミノ酸配列を有するリンカーペプチドをコードする。
【０１１０】
一実施形態において、少なくとも１つの他のドメインはプロテイナーゼ阻害剤またはその前駆体形態をコードする。上述のように、ＭＧＥＶベクターはＵＳＳＮ  ２００７−０２７７２６３中に開示され、米国特許出願第２００７−０２７７２６３号の内容を参照して本明細書で援用する。
【０１１１】
前記リンカーペプチドはアミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５（配列番号８６）を含み、前記配列中、
Ｘ１＝ＥまたはＤ
Ｘ２＝ＥまたはＤ
Ｘ３＝ＫまたはＲ
Ｘ４＝ＫまたはＲ
Ｘ５＝ＮまたはＱである。
【０１１２】
形質転換やトランスフェクションの方法は本開示においては重要ではなく、種々の形質転換法またはトランスフェクション法が現在使用可能である。作物または他の宿主細胞を形質転換させる新たな方法も使用可能となってきており、これらを直接使用してもよい。このように、ＤＮＡ配列を宿主細胞のゲノムに挿入することにより前記配列を転写や翻訳させて前記宿主生物における表現型を変えることができる多種多様の方法が開発されている。したがって、効果的に形質転換やトランスフェクションを実施する任意の方法を使用してよい。
【０１１３】
形質転換のプロトコール、およびヌクレオチド配列を植物に導入するプロトコールは、形質転換の対象である植物または植物細胞の種類、すなわち単子葉植物または双子葉植物のいずれであるかによって選択してよい。ヌクレオチド配列を植物細胞に導入し続いて植物ゲノム中に挿入する好適な方法は、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙら（１９８６）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：３２０−３３４）、エレクトロポレーション（Ｒｉｇｇｓら（１９８６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：５６０２−５６０６）、アグロバクテリウム媒介形質転換（Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、米国特許第５，５６３，０５５号；Ｚｈａｏら、米国特許第５，９８１，８４０号）、直接遺伝子移入（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら（１９８４）、ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７１７−２７２２）、バリスティック粒子加速法（例えば、Ｓａｎｆｏｒｄら、米国特許第４，９４５，０５０号；Ｔｏｍｅｓら、米国特許第５，８７９，９１８号；Ｔｏｍｅｓら、米国特許第５，８８６，２４４号；Ｂｉｄｎｅｙら、米国特許第５，９３２，７８２号；ＭｃＣａｂｅら（１９８８）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９２３−９２６を参照）、およびＬｅｃ１形質転換（ＷＯ００／２８０５８）を含む。他にも、Ｗｅｉｓｉｎｇら（１９８８）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−４７７；Ｓａｎｆｏｒｄら（１９８７）、Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：２７−３７（タマネギ）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら（１９８８）、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ８７：６７１−６７４（ダイズ）；上述したＭｃＣａｂｅら（１９８８）（ダイズ）；Ｆｉｎｅｒ  ａｎｄ  ＭｃＭｕｌｌｅｎ（１９９１）、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  ２７Ｐ：１７５−１８２（ダイズ）；  Ｓｉｎｇｈら（１９９８）、Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ９６：３１９−３２４（ダイズ）；Ｄａｔｔａら（１９９０）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：７３６−７４０（イネ）；Ｋｌｅｉｎら（１９８８）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：４３０５−４３０９（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎら（１９８８）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：５５９−５６３（トウモロコシ）；Ｔｏｍｅｓ、米国特許第５，２４０，８５５号；Ｂｕｉｓｉｎｇら、米国特許第５，３２２，７８３号および米国特許第５，３２４，６４６号；Ｔｏｍｅｓら（１９９５）「Ｄｉｒｅｃｔ  ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｉｎｔａｃｔ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ」、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，（編）Ｇａｍｂｏｒｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ）（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎら（１９８９）、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ９１：４４０−４４４（トウモロコシ）；Ｆｒｏｍｍら（１９９０）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：８３３−８３９（トウモロコシ）；Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｎ  Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎら（１９８４）、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、３１１：７６３−７６４；Ｂｏｗｅｎら、米国特許第５，７３６，３６９号（穀類）；Ｂｙｔｅｂｉｅｒら（１９８７）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：５３４５−５３４９（ユリ科）；Ｄｅ  Ｗｅｔら（１９８５）、Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｖｕｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅｓ，（編）Ｃｈａｐｍａｎら（Ｌｏｎｇｍａｎ、Ｎ．Ｙ．）、ｐｐ．１９７−２０９（花粉）；Ｋａｅｐｐｌｅｒら（１９９０）、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ９：４１５−４１８、およびＫａｅｐｐｌｅｒら（１９９２）、Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ８４：５６０−５６６（ウィスカー媒介形質転換）；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら（１９９２）、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：１４９５−１５０５（エレクトロポレーション）；Ｌｉら（１９９３）、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １２：２５０−２５５  ａｎｄ  Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ａｎｄ  Ｆｏｒｄ（１９９５）、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ  ７５：４０７−４１３（イネ）；Ｉｓｈｉｄａら（１９９６）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：７４５−７５０（トウモロコシ、アグロバクテリウム・ツメファシエンス介在）を参照。これらの先行技術文献とＵＳＳＮ  ２０１０−００９５４０８とを参照して本明細書で援用する。
【０１１４】
必要であれば、精製したデフェンシンタンパク質を使用できるし、また任意に、精製したデフェンシンタンパク質とプロテイナーゼ阻害剤を一緒に配合可能な場合または異なる適用手段により逐次的に配合可能な場合には、精製したデフェンシンタンパク質をプロテイナーゼ阻害剤と組み合わせて混合物として使用できる。さらなる実施形態において、前記成分の１つが植物により産生されるよう操作し、もう一方の成分を外部から与える、という複合手法を使用する。これらは、種皮等の選択された部位または地下部組織の周辺もしくは周囲の土壌に対して、自由に適用または使用してよい。
【０１１５】
一態様において、本開示は、病原真菌に随伴する病害から植物を保護する方法を教示し、この方法による予防または処置によって、植物または植物の一部分を殺病原体剤により処置する必要性が減少し、したがって原料コスト、労力、および環境汚染が低減される、またはこうした植物の商品（例えば果実および種子等）としての品質保持期間が長くなる。前記方法においては、植物を遺伝学的に改変してＩ型デフェンシンおよび透過促進性デフェンシンを発現させること、またはこれらのデフェンシンを局所的に適用することが必要である。用語「植物」は植物全体および植物の一部分を含み、これらには、苗条、栄養器官や栄養構造（例えば葉、茎、および塊茎）、地下部、花卉、および花器官や花構造（例えば苞葉、萼片、花弁、雄しべ、心皮、葯、および胚珠）、種子（胚、胚乳、および種皮を含む）、果実（成熟子房）、植物組織（例えば維管束組織および基本組織等）、植物細胞（例えば孔辺細胞および卵細胞等）、およびその子孫が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
本明細書中に開示する系において好適に使用される農学的に有用な組成物は、意図する目的を達成できる有効量の前記有効成分を含有する組成物を含む。このような組成物は種子被覆を含む。前記有効量の測定は、特に本明細書中に提供する本開示内容に照らせば、当業者であれば十分に行うことができる。
【０１１７】
前記抗真菌方法において使用するこれらの組成物は、前記有効成分に加えて、農学的に許容できる好適な担体を含有してよい。前記農学的に許容できる好適な担体は、田畑、温室、または研究室内にて使用可能な配合物への有効化合物の加工を促進する賦形剤および補助剤を含む。
【０１１８】
抗真菌性調製物は、水溶解性形態にある前記有効化合物の水溶液を含む。また、前記有効化合物の懸濁液は、好適な油性懸濁液として調製されてよい。適切な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油等の脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。水性の懸濁注射液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストラン等の、懸濁液の粘度を増大させる物質を含有してもよい。任意に、前記懸濁液は、前記化合物の溶解度を増大させることによってより高濃度に濃縮された溶液を調製可能とする好適な安定剤または薬剤をさらに含有してもよい。さらなる成分は、とりわけ、増粘剤、ゲル剤、湿潤剤、耐紫外線保護剤を含むことができる。
【０１１９】
表面適用用の配合物は、前記有効化合物と固体賦形剤とを併用し、得られた混合物を任意に粉砕し、必要であれば好適な補助剤を添加した後で、得られた顆粒混合物を加工することによって、直接適用用の粉末または保護対象の植物に噴霧する前に溶解させる型の粉末として得ることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖、セルロースまたはデンプン配合物、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムやポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等の増量剤である。必要であれば、例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはそれらの塩、例えばアルギン酸ナトリウム等の崩壊剤を添加してもよい。
【０１２０】
本開示は特に抗植物病原体方法に関するが、複数の効果を有するこの手法をヒト、ならびに家畜および愛玩動物を含む非ヒト対象において使用してもよい。一般的に、局所的手法はこのような状況において使用される。通常、ヒトおよび非ヒト対象において使用される複数の効果を有するこの手法は、とりわけ、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）およびクリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）等の酵母、白癬菌属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）等の皮膚糸状菌、ならびにクロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）等のアスペルギルス種を含む他の糸状菌類を対象とする。
【０１２１】
また、本開示は、Ｉ型デフェンシンおよび透過促進性デフェンシン、ならびに任意にプロテイナーゼ阻害剤または前記成分のいずれか１つもしくは全ての機能的ホモログ、アナログ、誘導体、もしくは変異体を、真菌病原体または昆虫病原体の蔓延に対して抵抗力のあるヒトまたは非ヒト動物対象またはその子孫において使用することをさらに教示する。
【０１２２】
また、本明細書においては、病原体感染に随伴する疾患からヒトまたは非ヒト動物対象を保護する方法であって、配列番号８１、８３、８５、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、および６９から選択されるアミノ酸配列を含む成熟ドメインを有するＩ型デフェンシン、ＮａＤ１、ＴＰＰ３、ＰｈＤ１Ａ、ＰｈＤ２、ＮｏＤ１７３、配列番号３、６、１２、２１、２４、７０、７１、および７２からなる群から選択される成熟ドメインを有する透過促進性デフェンシン、またはその一方もしくは両方の前駆体、機能的ホモログ、アナログ、誘導体、もしくは変異体をその場の細胞に与えることを含む方法も可能である。
【０１２３】
また、本明細書においては、病原体感染に随伴する疾患からヒトまたは非ヒト動物対象を保護する方法であって、配列番号８１、８３、８５、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、および６９から選択されるアミノ酸配列を含む成熟ドメインを有するＩ型デフェンシン、配列番号３、６、１２、２１、２４、７０、７１、および７２からなる群から選択される成熟ドメインを有する透過促進性デフェンシン、またはその一方もしくは両方の前駆体、機能的ホモログ、アナログ、誘導体、もしくは変異体をその場の細胞に与えることを含む方法も可能である。
【０１２４】
植物ならびにヒトおよび非ヒト動物対象を処置するための、Ｉ型デフェンシンおよび透過促進性デフェンシン、またはその一方もしくは両方の前駆体、機能的ホモログ、アナログ、誘導体、もしくは変異体を含む局所用組成物が、本明細書において意図される。更なる賦形剤または担体がさらに含まれてもよい。
【実施例】
【０１２５】
本発明を下記例示中にさらに説明するが、本発明は下記実施例に限定されない。
【０１２６】
〔方法〕
〔ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）からのデフェンシンの精製〕
単一のｐＰＩＮＫデフェンシンＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰｉｃｈｉａＰｉｎｋ（商標）株１コロニーを、２５０ｍＬフラスコにおいてＢＭＧ培地（インビトロジェンのピキア発現マニュアル中に記載）２５ｍＬに接種し、３０℃の振とうインキュベーター（１４０ｒｐｍ）中において２〜３日間インキュベートした。得られた培養物を１Ｌバッフル付フラスコにおいてＢＭＧ  ２００ｍＬに接種し、３０℃の振とうインキュベーター（１４０ｒｐｍ）中にて一晩おいた。細胞を遠心分離（２，５００ｘｇ、１０分間、４℃）によって回収し、５Ｌバッフル付フラスコにおいてＢＭＭ培地１Ｌ中に再懸濁して、２８℃の振とうインキュベーター中において３日間インキュベートした。得られた培養物をｔ＝２４において４８時間誘導した。得られた発現培地を遠心分離（６０００ｒｐｍ、２０分間）によって細胞から分離した。前記培地をｐＨ３．０に調節した後、ｐＨ６．０の１００ｍＭリン酸カリウムバッファーによって予め平衡化させたＳＰセファロースカラム（１ｃｍｘ１ｃｍ、アマシャムバイオサイエンス社）に添加した。次いでカラムをｐＨ６．０の１００ｍＭリン酸カリウムバッファー１００ｍＬで洗浄し、結合タンパク質を、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１００ｍＭリン酸カリウムバッファー１０ｍＬにより、１０回かけて溶出させた。溶出させたタンパク質を、遠心カラムを使用して１ｍＬまで濃縮し、滅菌ミリＱ超純水を使用して５回洗浄した。ピキアにより発現させたデフェンシンのタンパク質濃度を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質分析（ピアースケミカル社）を使用しウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準タンパク質として使用して決定した。
【０１２７】
〔デフェンシンの抗真菌活性の分析〕
フザリウム・グラミネアラム（ギベレラゼア（Ｇｉｂｅｒｅｌｌａｚｅａ））（Ｆｇｒ、パイオニア・ハイブリッド・インターナショナル社（Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ：ＰＨＩ）単離株７３Ｂ１Ａ）、ワタ萎凋病菌（Ｆｏｖ、ワタより単離されたオーストラリア単離株ＶＣＧ０１１１１、オーストラリア国クイーンズランド州の農林水産部門  ファーミング・システム・インスティテュート（Ｆａｒｍｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）より入手）またはイネ科炭疽病菌（Ｃｇｒ、ＰＨＩ単離株Ｃａｒｒｏｌｌ−１Ａ−９）、ステノカルペラ・マイディス（ＤＡＲ５１５４９）（ニューサウスウェールズ州第一次産業省、農学コレクション保存機関委託（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  Ｔｒｕｓｔ）（ＡＳＣＵ））またはクロコウジカビ（オーストラリア国ニューサウスウェールズ州シドニー大学分子微生物生物科学学部（Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）より入手）の増殖に対する各デフェンシンの阻害効果を、Ｂｒｏｅｋａｅｒｔら（１９９０）、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  ６９：５５−５９の記載に本質的に従って測定した。
【０１２８】
胞子形成真菌を、低栄養合成寒天（Ｆｇｒ）、Ｖ８寒天（Ｃｇｒ、Ｆｖｅ）、１／２強度のジャガイモデキストロースブイヨン寒天（Ｆｏｖ、クロコウジカビ）、酵母抽出物ペプトンデキストロース寒天（カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、クリプトコッカス・ガッティ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｔｔｉｉ））、または１／２強度のサブロー（ｓａｂｏｕｒａｕｄ）・デキストロース寒天（趾間白癬菌、紅色白癬菌）上で増殖させることにより、胞子を単離した。１／２強度のジャガイモデキストロースブイヨン（ＰＤＢ）を添加することによって、プレートから胞子を取り出した。胞子の濃度を血球計により測定した。
【０１２９】
各デフェンシンの１０×保存液を滅菌水において調製した。テカン社製リキッドハンドリング機を使用することによって、各デフェンシンを段階希釈し、各濃度につき２０μｌずつ３通りを９６ウェルマイクロタイタープレートへ移した。各プレートに胞子を８０μｌずつ、１／２強度のＰＤＢにおいて、胞子５ｘ１０４個／ｍｌとなるように添加した。プレートを２５℃（Ｆｇｒ、Ｃｇｒ、Ｆｖｅ、Ｆｏｖ、Ｆ．ソラニ、Ｓ．マイディス、クロコウジカビ）または３０℃（Ｃ．アルビカンス、Ｃ．ガッティ、趾間白癬菌、紅色白癬菌）においてインキュベートした。５９５ｎｍ（Ａ５９５）における光学濃度をマイクロタイタープレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ＰｒｏＭ２、モレキュラーデバイス社）により測定して、真菌の増殖を分析した。試験デフェンシンの非存在下において真菌の光学濃度（ＯＤ）がＯＤ  ０．２になるまで、増殖を進行させた。各試験を４連で実施した。
【０１３０】
〔透過促進分析〕
１／２強度のＰＤＢにおいてワタ萎凋病菌（Ｆｏｖ）またはフザリウム・グラミネアラム（Ｆｇｒ）を、胞子５ｘ１０４個／ｍＬの濃度から開始して１８時間にわたって２５℃において増殖させた。次いで、菌糸の懸濁液（９０μＬ）を９６ウェルマイクロタイタープレートへ移し、ＳＹＴＯＸ（登録商標）グリーン（０．５μＭ）と共に１０分間インキュベートした。その後、ペプチド溶液１０μＬを添加し、最終タンパク質濃度１０μＭ（Ｆｏｖ）または５μＭ（Ｆｇｒ）とした。マイクロタイタープレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５ｅ、モレキュラーデバイス社）を使用し、励起波長および発光波長それぞれ４８８ｎｍおよび５３８ｎｍにおいて蛍光を測定することによって、ＳＹＴＯＸグリーンの取り込み（透過促進の指標）を定量した。２分毎に２時間にわたって読み取りを行った。透過促進分析の結果の例を図１および表１２ａ中に示す。
【０１３１】
本明細書中において、規定濃度のデフェンシンにより誘導された真菌株の透過促進の程度を、同一濃度のＮａＤ１についての値を１．０として換算したものを、相対的な透過性の指標として定義する。
【０１３２】
図１は、１０μＭのＮａＤ１、ＨＸＰ４、ＨＸＬ００２、ＨＸＬ００７、ＨＸＬ００８、およびＤｍＡＭＰ１により処置した後のＳＹＴＯＸグリーンのＦｏｖ菌糸への相対的な取り込みを示す。表１２ａも参照。デフェンシンＮａＤ１、ＨＸＰ４、ＨＸＬ００２、ＨＸＬ００７、およびＨＸＬ００８は、Ｆｏｖ菌糸への透過を促進できたが、デフェンシンＤｍＡＭＰ１は前記透過を促進できなかった。各デフェンシンの相対的な透過性の指標を表１２ａ中に示す。本発明の目的において、Ｆｏｖに対する相対的な透過性の指標が０．２より大きいデフェンシンは透過促進性であるとみなす。
【０１３３】
図２は、５μＭのＮａＤ１、ＨＸＰ４、ＨＸＬ００１、ＨＸＬ００２、ＨＸＬ００４、ＨＸＬ００８、ＨＸＬ００９、ＨＸＬ０１３、ＨＸＬ０２１、ホルドチオニン、およびＲｓＡＦＰ２により処置した後のＳＹＴＯＸグリーンのＦｇｒ菌糸への相対的な取り込みを示す。デフェンシンＮａＤ１、ＨＸＰ４、ＨＸＬ００２、ＨＸＬ００４、およびＨＸＬ００８が引き起こしたＦｇｒ菌糸への透過促進は、デフェンシンＨＸＬ００９、ＨＸＬ０２１、ホルドチオニン、およびＲｓＡＦＰ２が引き起こした同透過促進を有意に超えていた。各デフェンシンの相対的な透過性の指標を表１２ｂ中に示す。本発明の目的において、Ｆｇｒ中への相対的な透過性の指標が０．５より大きいデフェンシンは透過促進性であるとみなす。
【０１３４】
〔遺伝子組換え植物細胞や組織の作製〕
植物細胞や組織中における異種ＤＮＡを導入し、かつ、その存在を選択するために用いる技術および薬剤は周知である。植物細胞中における異種ＤＮＡを選択するための遺伝的マーカーは周知であり、例えば、カナマイシン、ハイグロマイシン、ゲンタマイシン、またはブレオマイシン等の抗生物質に対する耐性を有する遺伝子が挙げられる。前記マーカーによれば、適切な抗生物質を含有する培地中において、首尾よく形質転換された増殖性植物細胞を選択することができる。なぜならば、こうした形質転換植物細胞は対応する耐性遺伝子を持っているはずだからである。植物細胞中に挿入された異種ＤＮＡは抗生物質耐性マーカー等の選択マーカーをコードする遺伝子を含有する場合が多いが、必ずしも常にこれが当てはまるわけではない。薬剤耐性マーカーの一例は、発現するとカナマイシン耐性をもたらす遺伝子である。すなわち、Ｒｏｇｅｒｓら（１９８８）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙに記載の、ノパリンシンテターゼプロモーター、Ｔｎ５ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ、およびノパリンシンテターゼの３’非翻訳領域を含有するキメラ遺伝子である。
【０１３５】
異種コード配列および転写終結配列と融合させた誘導用プロモーターまたはキメラプロモーターを含む発現カセットを用いて植物細胞や組織を遺伝子操作する技術は、アグロバクテリウム媒介形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、微粒子銃、または先行技術により既知となっている他の技術によって植物細胞または組織中に導入されるべきである。前記発現カセットは、有利には、植物細胞において異種ＤＮＡを選択できるマーカー、例えば、カナマイシン、ハイグロマイシン、ゲンタマイシン、またはブレオマイシン等の抗生物質に対する耐性を有する遺伝子をさらに含有する。
【０１３６】
植物中において発現可能な遺伝子または目的とする他のＤＮＡを有するＤＮＡコンストラクトを、植物のゲノム中に任意の好適な方法によって挿入できる。こうした方法としては、例えば、リポソーム、エレクトロポレーション、拡散、微粒子銃、マイクロインジェクション、遺伝子銃、遊離ＤＮＡの取り込みを増大させる化学物質の使用、例えばリン酸カルシウム共沈、ウイルスベクター、および当技術分野において実施される他の技術が挙げられる。好適な植物形質転換ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミドに由来するベクター、例えば、Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら（１９８３）、ＥＭＢＯ  Ｊ  ２：９８７−９９５；Ｂｅｖａｎら（１９８３）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １１（２）：３６９−３８５；Ｋｌｅｅら（１９８５）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：６３７−６４２、および欧州公報第１２０，５１６号（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔら、欧州特許公報第１２０，５１６号）に開示されるもの等を含む。本発明のＤＮＡコンストラクトの植物細胞中への挿入にあたっては、アグロバクテリウム属のＴｉプラスミドまたは発根（ｒｏｏｔ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ：Ｒｉ）プラスミドに由来する植物形質転換ベクター以外の方法も使用できる。
【０１３７】
当技術分野において周知のように、目的とするＤＮＡが動作可能に連結したベクターの選択は、例えば複製、タンパク質発現、および形質転換されるべき宿主細胞（これらは、組換えＤＮＡ分子を構築するための当技術分野に固有の制限である）といった所望の機能的特性に直接依存する。前記ベクターは望ましくは、原核生物レプリコン、すなわち、細菌宿主細胞等の原核生物宿主細胞中に導入された場合に組換えＤＮＡ分子を染色体外において自律的に直接複製および維持できるＤＮＡ配列を含む。このようなレプリコンは当技術分野において周知である。また、原核生物レプリコンを含む好ましい実施形態は、形質転換細胞中に導入された場合、その発現が細菌宿主細胞に選択上の有利な特性（例えば薬剤耐性）を与える遺伝子をさらに含む。典型的な細菌薬剤耐性遺伝子は、選択的薬剤の中でも特にアンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を与える遺伝子である。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子は、真核細胞と原核細胞の両方において発現するという利点を有する。
【０１３８】
原核生物レプリコンを含むベクターは、典型的には、本発明の組換えＤＮＡ分子を挿入するのに都合のよい制限部位をさらに含む。こうしたベクタープラスミドの典型的な例として、バイオ・ラッド社（カリフォルニア州リッチモンド）より入手可能なｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、およびｐＢＲ３２９、ファルマシア社（ニュージャージー州ピスカタウェイ）より入手可能なｐＰＬ、ｐＫ、およびＫ２２３、ならびにストラタジーン社（カリフォルニア州ラホヤ）より入手可能なｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（ＴＭ）およびｐＢＳが挙げられる。本発明のベクターは、当技術分野において公知のラムダファージベクター、またはラムダＺＡＰベクター（カリフォルニア州ラホヤのストラタジーン社より入手可能）であってもよい。これら以外のベクターは、例えばｐＣＭＵ（Ｎｉｌｓｓｏｎら（１９８９）、Ｃｅｌｌ  ５８：７０７）を含む。他にも、適切なベクターを既知の方法により合成してもよい。例えば、本明細書における種々の用途に使用されるｐＣＭＵ／ＫｂベクターおよびｐＣＭＵＩＩベクターは、ｐＣＭＵＩＶ（上述したＮｉｌｓｓｏｎら（１９８９））を改変したものである。
【０１３９】
植物細胞中において組換え核酸配列を発現させることができ、かつ宿主植物細胞中への安定的な組込みを指向することができる典型的な発現ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの腫瘍誘発（ｔｕｍｏｒ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ：Ｔｉ）プラスミドに由来するベクターである。
【０１４０】
遺伝子組換え植物は、先行技術において既知である任意の標準的な手段によって作製できる。このような手段としては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介ＤＮＡ転移、アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介ＤＮＡ転移（好ましくはディスアーム型（ｄｉｓａｒｍｅｄ）Ｔ−ＤＮＡベクターを用いたもの）、エレクトロポレーション、直接ＤＮＡ転移、および微粒子銃を含むが、これらに限定されない。単子葉植物および双子葉植物にＤＮＡを導入する技術は先行技術において周知であり、また、こうした植物組織を培養しその組織を再生させる技術も周知である。
【０１４１】
〔相乗作用の分類〕
相乗作用は、デフェンシン２種の併用により引き起こされる観察された真菌増殖阻害率％（Ｉｏ値）と、各デフェンシン単独による真菌増殖阻害率％の合計に基づく同デフェンシン２種による予想された真菌増殖阻害率％（Ｒｉｃｈｅｒら（１９８７）、Ｐｅｓｔｉｃ  Ｓｃｉ  １９：３０９−３１５で使用されるＬｉｍｐｅｌの式により計算されるＥｅ値）との差異として分類される。この差異Ｉｏ−Ｅｅが前記相乗作用を示す値である。前記相乗作用値が１５以下である場合は相乗作用が有意でないことを、１５〜３０である場合は相乗作用の程度が低いことを、３０〜６０である場合は相乗作用の程度が中程度であることを、６０を超える場合は相乗作用の程度が高いことを意味する。
【０１４２】
〔Ｉｎ  ｐｌａｎｔａ研究のための生物検定法〕
〔イネ科炭疽病菌接種菌液の調製〕
イネ科炭疽病菌（米国単離株Ｃａｒｒｏｌｌ−１Ａ−９９）を、ゼアメイズ（Ｚｅａ  ｍａｉｚｅ）（米国アイオワ州ジョンストンのパイオニア・ハイブレッド・インターナショナル社）から単離する。Ｖ８寒天上で約２〜３週間増殖させた胞子形成培養物から胞子を単離する。滅菌水においてプレート表面を掻き取り、ティッシュペーパー（ｆａｃｉａｌ  ｔｉｓｓｕｅ）でろ過して菌糸物質から胞子を分離することによって、イネ科炭疽病菌の胞子を採取する。ろ液中の胞子の濃度を血球計により測定する。
【０１４３】
〔Ｆ．グラミネアラム接種菌液の調製〕
フザリウム・グラミネアラム単離株（７３Ｂ１Ａ）を、ゼアメイズ（米国アイオワ州ジョンストンのパイオニア・ハイブレッド・インターナショナル社）から単離する。ＳＮＰ寒天上で約２〜３週間増殖させた胞子形成培養物から胞子を単離する。滅菌水においてプレート表面を掻き取ることによって、Ｆ．グラミネアラムの胞子を採取する。胞子の濃度を血球計により測定する。
【０１４４】
〔トウモロコシ植物の接種〕
生物検定用の植物を、フラスコから出した後、ガラス温室内で約８〜１０週間栽培する。
【０１４５】
〔イネ科炭疽病菌の接種〕
長さ２．０ｍｍの傷を２か所、トウモロコシの葉鞘の対向する面に作製し、その上にイネ科炭疽病菌の胞子  １ｘ１０６個／ｍＬを載せる。続いて、この傷をグラッド社製プレス＆シールで３日間密閉する。接種して１０日後に、感染した領域をデジタル撮影により測定する。
【０１４６】
〔Ｆ．グラミネアラムの接種〕
長さ２．０ｍｍの傷を２か所、トウモロコシの葉鞘の対向する面に作製する。傷の上に、フザリウム・グラミネアラムの孔（ｐｏｒｅｓ）  １Ｘ１０６個／ｍＬに浸漬させた直径６ｍｍの円形の紙を載せる。続いて、この傷をグラッド社製プレス＆シールで３日間密閉する。接種して１０日後に、感染した領域をデジタル撮影により測定する。
【０１４７】
〔コーン植物における導入遺伝子の発現の分析〕
〔ＥＬＩＳＡ法〕
タンパク質抽出物：ガラス温室内で栽培した植物から葉鞘を切り取る。その組織（５０ｍｇ）を液体窒素中で凍結させ、ミキサーミル（Ｒｅｔｓｃｈ  ＭＭ３００）中において１５秒ずつ２回、振動数３０ｓ−１において粉砕する。２％不溶性ＰＶＰＰ（ポリクラー（Ｐｏｌｙｃｌａｒ））／ＰＢＳ／０．０５％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０を４５０μＬ添加し、２０秒間撹拌することによって、タンパク質抽出物を調製する。試料を１０分間にわたって遠心分離し、上清を採取する。
【０１４８】
ＥＬＩＳＡプレート（ＮｕｎｃＭａｘｉｓｏｒｐ＃４４２４０４）を、ＰＢＳ中で一次抗体１００μＬ／ウェル（抗デフェンシン抗体１００ｎｇ／ウェル）と共にインキュベートする。プレートを４℃で一晩、湿潤箱中においてインキュベートする。続いて、プレートをＰＢＳ／０．０５％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０によって２分間ずつ４回洗浄する。プレートを、ＰＢＳ中で３％ｗ／ｖＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ−７０３０：９８％ＥＬＩＳＡグレード）を２００μＬ／ウェル使用してブロッキングし、２５℃において２時間インキュベートする。次いで、プレートをＰＢＳ／０．０５％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０によって２分間ずつ４回洗浄する。
【０１４９】
続いて、コーン鞘タンパク質抽出物（ＰＢＳ／０．０５％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０中に希釈して１００μＬ／ウェル）を前記プレートに適用し、そのプレートを２５℃において２時間インキュベートする。次いで、プレートをＰＢＳ／０．０５％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０によって２分間ずつ４回洗浄し、続いて、ＰＢＳ中で二次抗体１００μＬ／ウェル（例えばビオチン標識デフェンシン抗体７５ｎｇ／ウェル）を適用する。前記ビオチン標識抗体は、ＥＺ結合Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン化キット（ピアース社）を使用して調製する。この際、タンパク質Ａ精製抗体２ｍＬおよびビオチン試薬２ｍｇを使用する。プレートを２５℃において１時間インキュベートし、次いでＰＢＳ／０．０５％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０により２分間ずつ４回洗浄し、ＰＢＳ中でＮｅｕｔｒｉＡｖｉｄｉｎ  ＨＲＰ−コンジュゲート（ピアース社＃３１００１；１０００希釈；０．１μＬ／ウェル）１００μＬ／ウェルを適用する。プレートを２５℃において１時間インキュベートし、次いでＰＢＳ／０．０５％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０により２分間ずつ２回洗浄し、続いてＨ２Ｏにより２分間ずつ２回洗浄する。使用直前に、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  ＯＰＤ錠剤（ピアース社製＃３４００６）１錠を９ｍＬ  Ｈ２Ｏ中に溶解させ、次いで安定過酸化物バッファー（１０倍、ピアース社製＃３４０６２）１ｍＬを添加して、基質を調製する。得られた基質を１００μＬ／ウェルにおいて適用し、プレートを２５℃においてインキュベートして、発色させる。２．５Ｍ硫酸５０μＬを適用して反応を停止させる。プレートリーダー（モレキュラーデバイス社）を用いて４９０ｎｍにおける吸光度を測定する。
【０１５０】
〔実施例１：ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける透過促進性デフェンシンおよびＩ型デフェンシンの存在下での病原真菌類の増殖の阻害〕
フザリウム・グラミネアラム（ギベレラゼア）（Ｆｇｒ、パイオニア・ハイブリッド・インターナショナル社（ＰＨＩ）単離株７３Ｂ１Ａ）、ワタ萎凋病菌（Ｆｏｖ、ワタより単離されたオーストラリア単離株ＶＣＧ０１１１１、オーストラリア国クイーンズランド州の農林水産部門  ファーミング・システム・インスティテュートより入手）、フザリウム・ソラニ（オーストラリア国ヴィクトリア州メルボルン大学植物学部より入手）、イネ科炭疽病菌（Ｃｇｒ、ＰＨＩ単離株Ｃａｒｒｏｌｌ−１Ａ−９）、ステノカルペラ・マイディス（ＤＡＲ５１５４９）（ニューサウスウェールズ州第一次産業省、農学コレクション保存機関委託（ＡＳＣＵ））、クロコウジカビ（オーストラリア国ニューサウスウェールズ州シドニー大学分子微生物生物科学学部より入手）、カンジダ・アルビカンス（単離株ＤＡＹ１８５、オーストラリア国ヴィクトリア州モナシュ大学生化学分子生物学部）、クリプトコッカス・ガッティ（単離株ＢＡＬ１１）、趾間白癬菌または紅色白癬菌（いずれも、オーストラリア国アデレードの婦人科小児科病院の南部オーストラリア病理学における国立菌学委託センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ，  Ｓｏｕｔｈ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  ａｎｄ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）より入手）の増殖に及ぼす透過促進性デフェンシンとＩ型デフェンシンの併用の阻害効果を、上述したＢｒｏｅｋａｅｒｔら（１９９０）の記載に本質的に従って測定した。
【０１５１】
胞子形成真菌を低栄養合成寒天（Ｆｇｒ）、Ｖ８寒天（Ｃｇｒ）、１／２強度のジャガイモデキストロースブイヨン寒天（Ｆｏｖ、クロコウジカビ）、酵母抽出物ペプトンデキストロース寒天（カンジダ・アルビカンス、クリプトコッカス・ガッティ）または１／２強度のサブロー・デキストロース寒天（趾間白癬菌、紅色白癬菌）上で増殖させ、胞子を単離した。１／２強度のジャガイモデキストロースブイヨン（ＰＤＢ）を添加することによって、プレートから胞子を除去した。胞子の濃度を血球計により測定した。
【０１５２】
抗真菌性分析を、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、前記詳細な記載（デフェンシンの抗真菌活性の分析）に本質的に従って実施した。各ウェルに、フィルター滅菌（ミリポア社０．２２μｍシリンジフィルター）したデフェンシン１（最終濃度に対する１０×保存液）または水１０μＬ、フィルター滅菌（ミリポア社０．２２μｍシリンジフィルター）したデフェンシン２（最終濃度に対する１０×保存液）または水１０μＬ、および１／２強度のＰＤＢ中の胞子５ｘ１０４個／ｍＬ  ８０μＬを添加した。プレートを２５℃（Ｆｇｒ、Ｃｇｒ、Ｆｏｖ、Ｆ．ソラニ、Ｓ．マイディス、クロコウジカビ）または３０℃（Ｃ．アルビカンス、Ｃ．ガッティ、趾間白癬菌、紅色白癬菌）においてインキュベートした。５９５ｎｍ（Ａ５９５）における光学濃度をマイクロタイタープレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ＰｒｏＭ２、モレキュラーデバイス社）により測定して、真菌の増殖を分析した。試験デフェンシンの非存在下において真菌の光学濃度（ＯＤ）がＯＤ０．２になるまで、増殖を進行させた。各試験を２連で実施した。
【０１５３】
相乗作用は、デフェンシン２種の併用により引き起こされる観察された真菌増殖阻害率％（Ｉｏ値）と、各デフェンシン単独による真菌増殖阻害率％の合計に基づく同デフェンシン２種による予想された真菌増殖阻害率％（Ｒｉｃｈｅｒら（１９８７）、Ｐｅｓｔｉｃ  Ｓｃｉ  １９：３０９−３１５で使用されるＬｉｍｐｅｌの式により計算されるＥｅ値）との差異として分類される。この差異Ｉｏ−Ｅｅが前記相乗作用を示す値である。前記相乗作用値が１５以下である場合は相乗作用が有意でないことを、１５〜３０である場合は相乗作用の程度が低いことを、３０〜６０である場合は相乗作用の程度が中程度であることを、６０を超える場合は相乗作用の程度が高いことを意味する。相乗作用の計算を表３〜１１中に示す。前記表中、上述のように、Ｅｅは、阻害百分率として表される、Ｌｉｍｐｅｌの式にしたがう加算的な応答から予想される効果であり、Ｉｏは、観察される阻害百分率である。相乗作用は、Ｉｏ値がＥｅ値より大きい場合に生じたとされる。
【０１５４】
〔結果〕
結果を表３〜１１に示す。
【０１５５】
〔実施例２：フザリウム・グラミネアラムおよびイネ科炭疽病菌に対するＨＸＰ４とＳＢＩ６のＩｎ  ｐｌａｎｔａ相乗作用〕
遺伝子組換えコーン植物を、アグロバクテリウム媒介形質転換または微粒子銃により、米国特許第５，９８１，８４０号、米国特許第７，５２８，２９３号、米国特許第７，５８９，１７６号、米国特許第７，７８５，８２８号、Ｆｒａｍｅら（２００２）、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２９：１３−２２中に記載されるもの等の標準的なプロトコールを使用して作製する。選択マーカーとしてのＧＡＴ、構成的発現のためのユビキチンプロモーター、およびＨＸＰ４、ＳＢＩ６、またはＨＸＰ４＋ＳＢＩ６（二重発現ベクターを介する）のいずれかをコードするコドン最適化配列を有するバイナリーベクターを、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウム・ツメファシエンス株に移入させる。未成熟コーン胚をアグロバクテリウム懸濁液に浸漬させて感染させ、その後、固形培地上で一定期間共培養する。次いで、前記胚を任意に「休ませ」、その間、前記胚を、アグロバクテリウムの増殖を阻害する少なくとも１つの抗生物質の存在下においてインキュベートする。次に、非形質転換細胞の増殖を阻害するグリホスフェートを含有する固形培地上において前記感染させた胚を培養することによって、形質転換カルスを得る。これにより、標準的な方法によって形質転換カルスを植物へと再生させることができる。ＨＸＰ４およびＳＢＩ６の両方を発現する植物は、個々の事象を組み合わせることによって発生させてもよい。
【０１５６】
ＰＣＲ陽性植物におけるＨＸＰ４およびＳＢＩ６の発現レベルを、例えばＥＬＩＳＡスクリーニングによって決定する（前記方法を参照）。１０ｐｐｍを超えるＨＸＰ４や０．９ｐｐｍを超えるＳＢＩ６を発現する植物を、フザリウム・グラミネアラムおよびイネ科炭疽病菌に対する耐性が増大したかどうかについて、前記方法中に記載される生物検定により評価する。
【０１５７】
当業者であれば、具体的に記載した変形および改変以外の変形および改変を本明細書中に記載する本発明が包含する可能性があることを理解する。当然のことながら、本発明はこのような変形および改変を全て包含する。本発明はまた、本明細書において参照または示す工程、特徴、組成物、および化合物の全てを個々にまたは合わせて包含し、前記工程または特徴のうち任意の２つ以上の組み合わせを全て包含する。
【０１５８】
【表３−１】
0006457945.tif 000008
【０１５９】
【表３−２】
0006457945.tif 000009
【０１６０】
【表４】
0006457945.tif 000010
【０１６１】
【表５】
0006457945.tif 000011
【０１６２】
【表６】
0006457945.tif 000012
【０１６３】
【表７】
0006457945.tif 000013
【０１６４】
【表８】
0006457945.tif 000014
【０１６５】
【表９】
0006457945.tif 000015
【０１６６】
【表１０】
0006457945.tif 000016
【０１６７】
【表１１】
0006457945.tif 000017
【０１６８】
【表１２ａ】
0006457945.tif 000018
【０１６９】
【表１２ｂ】
0006457945.tif 000019
【０１７０】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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