(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝細胞癌のリスクを評価する方法であって：
（１）亜硫酸水素塩処理された、被験体の肝臓組織由来のＤＮＡを増幅する工程であって、該ＤＮＡが、配列番号１で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる、ＭＧＲＮ１遺伝子のエクソン領域のＣｐＧサイトを含むＤＮＡである、工程；
（２）得られた増幅産物をアニオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
（３）該クロマトグラフィーの検出シグナルのピークの形状に基づいて、該ＤＮＡが肝細胞癌の発症リスクが高い被験体から得られたＤＮＡであるか否かを判定する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
肝細胞癌のリスクを評価する方法であって：
（１）亜硫酸水素塩処理された、被験体の肝臓組織由来のＤＮＡを増幅する工程であって、該ＤＮＡが、配列番号１で示されるヌクレオチド配列又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる、ＭＧＲＮ１遺伝子のエクソン領域のＣｐＧサイトを含むＤＮＡである、工程；
（２）得られた増幅産物をアニオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
（３）該クロマトグラフィーの検出シグナルのピークの形状に基づいて、該被験体の肝細胞癌の発症リスクが高いか否かを判定する工程、
を含む方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡが、配列番号１で示されるヌクレオチド配列、又は当該配列と少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるＤＮＡである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記（３）において、前記検出シグナルのピークの形状が一峰のメチル化ＤＮＡのピークである場合は、該ＤＮＡを、肝細胞癌の発症リスクが高い被験体から得られたＤＮＡとして選択し、前記検出シグナルのピークの形状が二峰性である場合は、該ＤＮＡを、肝細胞癌の発症リスクが低い被験体から得られたＤＮＡとして選択する、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記（３）が、前記検出シグナルのピークの保持時間を陽性対照又は陰性対照の検出シグナルのピークの保持時間と比較することで、前記メチル化ＤＮＡのピークが取得されたことを確認することを含み、
該陽性対照の検出シグナルが、前記被験体の肝臓組織由来のＤＮＡと同じ配列からなりかつ１００％メチル化しているＤＮＡが亜硫酸水素塩処理及び増幅されたときに得られるＤＮＡを、アニオン交換クロマトグラフィーにかけることによって得られたものであり、
該陰性対照の検出シグナルが、該被験体の肝臓組織由来のＤＮＡと同じ配列からなりかつメチル化していないＤＮＡが亜硫酸水素塩処理及び増幅されたときに得られるＤＮＡを、アニオン交換クロマトグラフィーにかけることによって得られたものである、
請求項４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチル化ＤＮＡの検出を利用した肝細胞癌のリスク評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞癌（ＨＣＣ）は世界的に知られている悪性腫瘍であり、その主要な発生要因は肝炎ウィルスの感染であることが明らかになっている。肝細胞癌の発生要因となる肝炎ウィルスは、主にＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）とＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）である。ＨＣＣは、肝炎ウィルス感染に関連した慢性肝炎又は肝硬変を患っている患者において通常発症する。しかも、その患者の殆どにおいて、ＨＣＣが発症した段階では既に肝機能が低下しているため、早期に癌と診断されない限り良好な治療成績は期待できない。ゆえに、慢性肝炎や肝硬変といった前癌状態のサーベイランス（経過観察）は優先して行われるべきである。特に、高いＨＣＣ発生リスクのある患者には、たとえ自覚症状がなくとも、密なサーベイランスをして早期にＨＣＣを発見し、治療を行うべきである。反面、ＨＣＣ発生リスクのない患者にとって、密なサーベイランスは過度な負担になる。そのため、慢性肝炎や肝硬変といった前癌状態の患者の適切な管理のために、ＨＣＣ発生のリスク評価は非常に重要である。【０００３】
ＤＮＡメチル化の変化は、最も一般的に観察される発癌に伴うエピジェネティックな変化の１つである。ＤＮＡメチル化の変化は、早期癌及び前癌段階にも関与していることが示唆されている。ＨＣＣ患者から得られた慢性肝炎又は肝硬変が見られる肝臓組織において、ＤＮＡメチル化転移酵素のスプライシング及び／又は発現の異常に関連したＤＮＡメチル化の変化が起こっていることが報告されている。【０００４】
さらに本発明者の研究により、これまでに、パイロシークエンシング、質量分析等によって肝臓組織のゲノムＤＮＡの特定のＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出し、検出したＤＮＡメチル化レベルを非癌肝臓組織サンプルと判別するためのカットオフ値と比較することによって、患者におけるＨＣＣのリスクを評価する方法が提案されている（特許文献１）。この方法は、感度及び特異性の高いＨＣＣリスク評価を実現する。しかしながら、感度及び特異性の高さを担保しながらも、より効率よく低コストにＨＣＣのリスクを評価することのできる方法が希求されている。【０００５】
最近、亜硫酸水素塩で処理したサンプルＤＮＡをイオン交換クロマトグラフィーにかけることで、メチル化ＤＮＡを検出する方法が開示された（特許文献２）。さらに本発明者らは、この原理を利用して、亜硫酸水素塩で処理したサンプルＤＮＡをイオン交換クロマトグラフィーにかけ、その保持時間に基づいて腎細胞癌の予後を判定する方法を提案している（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開公報第２０１２／１０２３７７号
【特許文献２】国際公開公報第２０１４／１３６９３０号
【特許文献３】国際公開公報第２０１５／１２９９１６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
パイロシークエンシング等を用いたＤＮＡメチル化レベルの検出に基づく肝細胞癌（ＨＣＣ）のリスク評価法（例えば特許文献１）は、感度及び特異性は高いが、ＤＮＡメチル化レベルの検出に時間と手間、コストがかかるという難点がある。本発明は、高い感度及び特異性がありつつも、簡便、迅速で低コストなＨＣＣのリスク評価方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、被験体の肝臓組織から得られたＣｐＧサイトを含むサンプルＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理し、ＤＮＡを増幅し、その増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーで分離することで、簡便かつ迅速に、該ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化を検出できることを見出した。さらに本発明者らは、該クロマトグラフィーによる検出シグナルのピーク形状が、ＨＣＣ高リスク群と低リスク群とで異なることを見出した。該クロマトグラフィーによる検出シグナルのピーク形状は、ＨＣＣのリスク評価の指標となる。【０００９】
さらに驚くべきことに、本発明者らは、上記イオン交換クロマトグラフィーを用いたＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化分析によるＨＣＣのリスク評価において、特定のＣｐＧサイトを分析対象としたときに、他のＣｐＧサイトと比べて顕著に高い感度及び特異性を達成できることを見出した。したがって、当該イオン交換クロマトグラフィーを用いたＤＮＡメチル化分析と、当該特定のＣｐＧサイトのサンプルとしての利用とを組み合わせることによって、簡便さ及び迅速さと、感度及び特異性の高さとを併せ持ったＨＣＣのリスク評価が実現される。【００１０】
したがって、本発明は、以下を提供する。
〔１〕肝細胞癌のリスクを評価する方法であって：
（１）亜硫酸水素塩処理された、被験体の肝臓組織由来のＤＮＡを増幅する工程であって、該ＤＮＡがＭＧＲＮ１遺伝子のエクソン領域のＣｐＧサイトを含む、工程；
（２）得られた増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
（３）該クロマトグラフィーの検出シグナルのピークの形状に基づいて、該ＤＮＡが肝細胞癌の発症リスクが高い被験体から得られたＤＮＡであるか否かを判定する工程、
を含む、方法。
〔２〕肝細胞癌のリスクを評価する方法であって：
（１）亜硫酸水素塩処理された、被験体の肝臓組織由来のＤＮＡを増幅する工程であって、該ＤＮＡがＭＧＲＮ１遺伝子のエクソン領域のＣｐＧサイトを含む、工程；
（２）得られた増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
（３）該クロマトグラフィーの検出シグナルのピークの形状に基づいて、該被験体の肝細胞癌の発症リスクが高いか否かを判定する工程、
を含む方法。
〔３〕前記ＤＮＡが、配列番号１で示されるヌクレオチド配列、又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるＤＮＡを含む、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕前記（３）において、前記検出シグナルのピークの形状が一峰のメチル化ＤＮＡのピークである場合は、該ＤＮＡを、肝細胞癌の発症リスクが高い被験体から得られたＤＮＡとして選択し、前記検出シグナルのピークの形状が二峰性である場合は、該ＤＮＡを、肝細胞癌の発症リスクが低い被験体から得られたＤＮＡとして選択する、〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔５〕前記（３）が、前記検出シグナルのピークの保持時間を陽性対照又は陰性対照の検出シグナルのピークの保持時間と比較することで、前記メチル化ＤＮＡのピークが取得されたことを確認することを含み、
該陽性対照の検出シグナルが、前記被験体の肝臓組織由来のＤＮＡと同じ配列からなりかつ１００％メチル化しているＤＮＡが亜硫酸水素塩処理及び増幅されたときに得られるＤＮＡを、イオン交換クロマトグラフィーにかけることによって得られたものであり、
該陰性対照の検出シグナルが、該被験体の肝臓組織由来のＤＮＡと同じ配列からなりかつメチル化していないＤＮＡが亜硫酸水素塩処理及び増幅されたときに得られるＤＮＡを、イオン交換クロマトグラフィーにかけることによって得られたものである、
〔４〕記載の方法。
〔６〕前記イオン交換クロマトグラフィーがアニオン交換クロマトグラフィーである、〔１〕〜〔５〕のいずれか１項記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、パイロシークエンシング等により検出されたＤＮＡメチル化レベルを指標とする従来の方法（例えば特許文献１）と比べて、検出の感度及び特異性の高さを維持しながらも、より簡便かつ迅速に肝細胞癌のリスクを評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＨＣＣ患者由来非がん肝臓組織サンプル（Ｎ群）のＬｉｖ２５領域から得られたクロマトグラムの例。各図は個々のサンプルからのデータを表し、各図中の記号はサンプルＩＤを表す。
【図２】図１のデータの一次微分値のプロット。
【図３】健常肝臓組織サンプル（Ｃ群）のＬｉｖ２５領域から得られたクロマトグラムの例。各図は個々のサンプルからのデータを表し、各図中の記号はサンプルＩＤを表す。
【図４】図３のデータの一次微分値のプロット。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において「肝細胞癌」（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ＨＣＣともいう）とは、肝臓の実質である肝細胞から発生する原発性肝癌を意味する。
【００１４】
本明細書において「肝細胞癌のリスク」とは、肝細胞癌の発生リスクを意味する。
【００１５】
本明細書において「ＣｐＧサイト」とは、ＤＮＡ配列上でシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との間がホスホジエステル結合（ｐ）している部位のことを意味する。
【００１６】
本明細書において、「ＤＮＡメチル化」とは、前記ＣｐＧサイトにおいて、シトシンの５位の炭素がメチル化されている状態のことを意味する。
【００１７】
本明細書において、ＤＮＡの「メチル化レベル」とは、該ＤＮＡのメチル化の割合（メチル化率ともいう）を意味する。
【００１８】
本明細書において、ヌクレオチド配列に関する「少なくとも９５％の同一性」とは、９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の同一性をいう。
【００１９】
一実施形態において、本発明は、以下の工程を含む、ＨＣＣのリスクを評価する方法を提供する：
（１）亜硫酸水素塩処理された、被験体の肝臓組織由来のＤＮＡを増幅する工程であって、該ＤＮＡがＭＧＲＮ１遺伝子のエクソン領域のＣｐＧサイトを含む、工程；
（２）得られた増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
（３）該クロマトグラフィーの検出シグナルのピークの形状に基づいて、該ＤＮＡがＨＣＣの発症リスクが高い被験体から得られたＤＮＡであるか否かを判定する工程。
【００２０】
別の一実施形態において、本発明は、以下の工程を含む、ＨＣＣのリスクを評価する方法を提供する：
（１）亜硫酸水素塩処理された、被験体の肝臓組織由来のＤＮＡを増幅する工程であって、該ＤＮＡがＭＧＲＮ１遺伝子のエクソン領域のＣｐＧサイトを含む、工程；
（２）得られた増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
（３）該クロマトグラフィーの検出シグナルのピークの形状に基づいて、該被験体がＨＣＣの発症リスクが高い被験体であるか否かを判定する工程。
【００２１】
本発明においては、被験体から得られた、肝臓組織由来のＭＧＲＮ１遺伝子のエクソン領域のＣｐＧサイトを含むＤＮＡ（以下の本明細書において、サンプルＤＮＡとも称する）は、亜硫酸水素塩処理され、次いで増幅される。
【００２２】
本発明における「被験体」としては、特に制限されることなく、例えば、健常者、ならびにＢ型肝炎感染者、Ｃ型肝炎感染者、慢性肝炎の患者、肝硬変の患者、肝細胞癌患者及びそれらの疑いがある者が挙げられる。好ましくは、該被験体は、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、慢性肝炎又は肝硬変を有するヒトであり、これらは一般的に肝細胞癌を発症する可能性が高い者として知られる。
【００２３】
本発明で用いられる「肝臓組織由来のＤＮＡ」を調製する方法としては、特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができる。ゲノムＤＮＡを調製する公知の手法としては、例えば、フェノールクロロホルム法（肝臓組織を、タンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ）、界面活性剤（ＳＤＳ）、及びフェノールで処理して該組織のタンパク質を変性させ、次いでクロロホルム、エタノール等で該組織からＤＮＡを沈殿させ抽出する方法）、市販のＤＮＡ抽出キット、例えばＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）、Ｃｌｅａｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＮｅｘＴｅｃ社製）、ＡｑｕａＰｕｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）、ＺＲ  Ｐｌａｎｔ／Ｓｅｅｄ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）、ｐｒｅｐＧＥＭ（ＺｙＧＥＭ社製）、ＢｕｃｃａｌＱｕｉｃｋ（ＴｒｉｍＧｅｎ社製）等を用いるＤＮＡ抽出方法、などが挙げられる。
【００２４】
かかる方法によりゲノムＤＮＡが調製される肝臓組織としては、特に制限はなく、例えば、生検等に際して採取したそのままの肝臓組織、凍結した肝臓組織、ホルマリン固定又はパラフィン包埋された肝臓組織、などが挙げられる。組織中のゲノムＤＮＡの分解を抑制する観点からは、凍結した肝臓組織を用いることが望ましい。本発明において、ゲノムＤＮＡの調製に使用される肝臓組織の状態（慢性肝炎及び肝硬変の段階、肝炎ウィルス感染、炎症もしくは線維化等）及び肝細胞癌の病巣からの距離には特に制限はない。
【００２５】
本発明における「ＭＧＲＮ１遺伝子のエクソン領域のＣｐＧサイト」とは、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２３２９５（[www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/23295]）で表されるヒトＭＧＲＮ１（mahogunin ring finger 1）遺伝子のエクソン領域のＣｐＧサイトをいう。
【００２６】
本発明で用いられるサンプルＤＮＡは、ＭＧＲＮ１遺伝子のエクソン領域のＣｐＧサイトを含むＤＮＡである。例えば、当該サンプルＤＮＡは、ＭＧＲＮ１遺伝子エクソンの上流領域に位置するＣｐＧサイトを含むＤＮＡである。そのようなサンプルＤＮＡの例としては、配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡが挙げられる。あるいは、ＭＧＲＮ１遺伝子のエクソン領域に由来し、配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるＤＮＡもまた、本発明のサンプルＤＮＡの例である。好ましくは、当該サンプルＤＮＡは、配列番号１で示されるヌクレオチド配列、又は当該配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるＤＮＡを含み、より好ましくは配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡである。
【００２７】
サンプルＤＮＡの亜硫酸水素塩処理の方法には、特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができる。亜硫酸水素塩処理のための公知の方法としては、例えば、後述するＥｐｉＴｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔ（４８）（Ｑｉａｇｅｎ社製）や、ＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  Ｐｔｙ社製）、Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣｐＧ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＣｐＧｅｎｏｍｅ  Ｔｕｒｂｏ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＭＥＲＣＫ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）などの市販のキットを用いる方法が挙げられる。
【００２８】
亜硫酸水素処理されたサンプルＤＮＡを増幅する方法としては、ＰＣＲ等の任意の核酸増幅方法が挙げられ、特に限定されない。増幅反応の条件にも特に制限はなく、増幅対象のＤＮＡの配列、長さ、量などに応じて、公知の手法を適宜選択して用いることができる。好ましくは、該ＤＮＡはＰＣＲにより増幅される。増幅産物の鎖長は、増幅反応の時間の短縮、ならびにイオン交換クロマトグラフィーでの分析時間の短縮や分離性能の維持等の要素を勘案して適宜調節することができる。例えば、ＰＣＲ増幅産物の鎖長は、１０００ｂｐ以下が好ましく、５００ｂｐ以下がより好ましく、３００ｂｐ以下がさらに好ましい。一方、非特異的増幅を避けるためにＰＣＲ用プライマー鎖長は１５ｍｅｒ以上であることが好ましいことから、ＰＣＲ増幅産物の鎖長は、３１ｂｐ以上が好ましく、４０ｂｐ以上がより好ましい。
【００２９】
本発明におけるＤＮＡのＰＣＲ増幅のためのプライマーセットの好ましい例としては、配列番号４及び５で示されるプライマーセットが挙げられる。該ＰＣＲの条件の好ましい例は、［９４℃１分→６４℃１分→７２℃１分］×５サイクル→［９４℃１分→６２℃１分→７２℃１分］×５サイクル→［９４℃１分→６０℃１分→７２℃１分］×５サイクル→［９４℃１分→５８℃１分→７２℃１分］×３５サイクル、であるが、これに限定されるものではない。
【００３０】
続いて、本発明においては、上記増幅工程で得られた、亜硫酸水素塩処理したサンプルＤＮＡの増幅産物を、イオン交換クロマトグラフィーにかける。本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーは、アニオン交換クロマトグラフィーが好適である。本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーに用いるカラムの充填剤としては、表面に強カチオン性基を有する基材粒子であれば特に限定されないが、国際公開公報第２０１２／１０８５１６号に示される、表面に強カチオン性基と弱カチオン性基の両方を有する基材粒子が好ましい。
【００３１】
本明細書において、強カチオン性基とは、ｐＨが１から１４の広い範囲で解離するカチオン性基を意味する。すなわち、該強カチオン性基は、水溶液のｐＨに影響を受けず解離した（カチオン化した）状態を保つことが可能である。
【００３２】
当該強カチオン性基としては、４級アンモニウム基が挙げられる。具体的には例えば、トリメチルアンモニウム基、トリエチルアンモニウム基、ジメチルエチルアンモニウム基等のトリアルキルアンモニウム基などが挙げられる。また、当該強カチオン性基のカウンターイオンとしては、例えば、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等のハロゲン化物イオンが挙げられる。
【００３３】
当該基材粒子の表面に存在する当該強カチオン性基量は、特に限定されないが、充填剤の乾燥重量あたりの好ましい下限は１μｅｑ／ｇ、好ましい上限は５００μｅｑ／ｇである。該強カチオン性基量が１μｅｑ／ｇ未満であると、保持力が弱く分離性能が悪くなることがある。該強カチオン性基量が５００μｅｑ／ｇを超えると、保持力が強くなり過ぎてＤＮＡを容易に溶出させることができず、分析時間が長くなりすぎる等の問題が生じることがある。
【００３４】
本明細書において、弱カチオン性基とは、ｐｋａが８以上のカチオン性基を意味する。すなわち、該弱カチオン性基は、水溶液のｐＨによる影響を受け、解離状態が変化する。すなわち、ｐＨが８より高くなると、該弱カチオン性基のプロトンは解離し、プラスの電荷を持たない割合が増える。逆にｐＨが８より低くなると、該弱カチオン性基はプロトン化し、プラスの電荷を持つ割合が増える。
【００３５】
当該弱カチオン性基としては、例えば、３級アミノ基、２級アミノ基、１級アミノ基などが挙げられる。なかでも、３級アミノ基であることが望ましい。
【００３６】
当該基材粒子の表面に存在する当該弱カチオン性基量は、特に限定されないが、充填剤の乾燥重量あたりの好ましい下限は０．５μｅｑ／ｇ、好ましい上限は５００μｅｑ／ｇである。該弱カチオン性基量が０．５μｅｑ／ｇ未満であると、少なすぎて分離性能が向上しないことがある。該弱カチオン性基量が５００μｅｑ／ｇを超えると、強カチオン性基と同様保持力が強くなり過ぎてＤＮＡを容易に溶出させることができず、分析時間が長くなりすぎる等の問題が生じることがある。
【００３７】
当該基材粒子表面の強カチオン性基又は弱カチオン性基の量は、基に含まれる窒素原子を定量することにより測定することができる。窒素を定量する方法として、例えばケルダール法が挙げられる。例えば、強カチオン性基と弱カチオン性基を有する基材粒子の場合、まず、疎水性架橋重合体と強カチオン性基の重合後に強カチオン性基に含まれる窒素を定量する。次いで、該重合体に弱カチオン性基を導入して、強カチオン性基と弱カチオン性基に含まれる窒素の合計量を定量する。求めた値から、弱カチオン性基に含まれる窒素量を算出することができる。このように基の窒素原子の定量値に基づいて、充填剤に含まれる強カチオン性基量及び弱カチオン性基量を上記範囲内に調整することができる。
【００３８】
当該基材粒子としては、例えば、重合性単量体等を用いて得られる合成高分子微粒子、シリカ系等の無機微粒子などを用いることができるが、合成有機高分子からなる疎水性架橋重合体粒子であることが望ましい。
【００３９】
当該疎水性架橋重合体は、少なくとも１種の疎水性架橋性単量体と少なくとも１種の反応性官能基を有する単量体を共重合して得られる疎水性架橋重合体、少なくとも１種の疎水性架橋性単量体と少なくとも１種の反応性官能基を有する単量体と少なくとも１種の疎水性非架橋性単量体とを共重合して得られる疎水性架橋重合体のいずれであってもよい。
【００４０】
当該疎水性架橋性単量体としては、単量体１分子中にビニル基を２個以上有するものであれば特に限定されず、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート等のジ（メタ）アクリル酸エステル、トリメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート等のトリ（メタ）アクリル酸エステル若しくはテトラ（メタ）アクリル酸エステル、又はジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルナフタレン等の芳香族系化合物が挙げられる。なお、本明細書において上記（メタ）アクリレートとは、アクリレート又はメタクリレートを意味し、（メタ）アクリルとは、アクリル又はメタクリルを意味する。
【００４１】
当該反応性官能基を有する単量体としては、グリシジル（メタ）アクリレート、イソシアネートエチル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００４２】
当該疎水性非架橋性単量体としては、疎水性の性質を有する非架橋性の重合性有機単量体であれば特に限定されず、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステルや、スチレン、メチルスチレン等のスチレン系単量体が挙げられる。
【００４３】
当該疎水性架橋重合体が、当該疎水性架橋性単量体と当該反応性官能基を有する単量体とを共重合して得られるものである場合、該疎水性架橋重合体における該疎水性架橋性単量体に由来するセグメントの含有割合の好ましい下限は１０重量％、より好ましい下限は２０重量％である。
【００４４】
本発明で用いるイオン交換クロマトグラフィー用充填剤は、当該基材粒子の表面に、当該強カチオン性基と当該弱カチオン性基とを有する重合体層を有するものであることが好ましい。また、該強カチオン性基と該弱カチオン性基とを有する重合体において、該強カチオン性基と該弱カチオン性基とはそれぞれ独立した単量体に由来するものであることが好ましい。具体的には、本発明で用いるイオン交換クロマトグラフィー用充填剤は、当該疎水性架橋重合体粒子と、該疎水性架橋重合体粒子の表面に共重合された該強カチオン性基を有する親水性重合体の層とからなる被覆重合体粒子の表面に、該弱カチオン性基が導入されたものであることが好適である。
【００４５】
当該強カチオン性基を有する親水性重合体は、該強カチオン性基を有する親水性単量体から構成されるものであり、１種以上の該強カチオン性基を有する親水性単量体に由来するセグメントを含有すればよい。すなわち、該強カチオン性基を有する親水性重合体を製造する方法としては、該強カチオン性基を有する親水性単量体を単独で重合させる方法、２種以上の該強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合させる方法、該強カチオン性基を有する親水性単量体と該強カチオン性基を有しない親水性単量体とを共重合させる方法、などが挙げられる。
【００４６】
当該強カチオン性基を有する親水性単量体としては、４級アンモニウム基を有するものであることが好ましい。具体的には、例えば、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド、メタクリル酸エチルトリエチルアンモニウムクロリド、メタクリル酸エチルジメチルエチルアンモニウムクロリド、メタクリル酸エチルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、アクリル酸エチルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、アクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド、アクリル酸エチルトリエチルアンモニウムクロリド、アクリル酸エチルジメチルエチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドエチルトリメチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドエチルトリエチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドエチルジメチルエチルアンモニウムクロリド、などが挙げられる。
【００４７】
当該疎水性架橋重合体の表面に該強カチオン性基を有する親水性重合体の層を形成させる方法としては、該疎水性架橋重合体の表面に該強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合させる方法が挙げられる。
【００４８】
当該被覆重合体粒子の表面に弱カチオン性基を導入する方法としては、公知の方法を用いることができる。具体的には例えば、該弱カチオン性基として３級アミノ基を導入する方法としては、グリシジル基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体粒子の表面に、該強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いで該グリシジル基に３級アミノ基を有する試薬を反応させる方法；イソシアネート基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体粒子の表面に、該強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いで、該イソシアネート基に３級アミノ基を有する試薬を反応させる方法；当該疎水性架橋重合体粒子の表面において該強カチオン性基を有する親水性単量体と３級アミノ基を有する単量体とを共重合する方法；３級アミノ基を有するシランカップリング剤を用いて該強カチオン性基を有する親水性重合体の層を有する被覆重合体粒子の表面に３級アミノ基を導入する方法；カルボキシ基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体粒子の表面に、該強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いで、該カルボキシ基と３級アミノ基を有する試薬とを、カルボジイミドを用いて縮合させる方法；エステル結合を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体粒子の表面に、該強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、該エステル結合部を加水分解し、次いで、該加水分解によって生成したカルボキシ基と３級アミノ基を有する試薬とを、カルボジイミドを用いて縮合させる方法、などが挙げられる。なかでも、グリシジル基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体粒子の表面に該強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いで、該グリシジル基に３級アミノ基を有する試薬を反応させる方法や、イソシアネート基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体粒子の表面に該強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いで、該イソシアネート基に３級アミノ基を有する試薬を反応させる方法が好ましい。
【００４９】
グリシジル基やイソシアネート基等の反応性官能基に反応させる、３級アミノ基を有する試薬としては、３級アミノ基と該反応性官能基に反応可能な官能基とを有する試薬であれば、特に限定されない。当該反応性官能基に反応可能な官能基としては、例えば、１級アミノ基、水酸基等が挙げられる。なかでも、末端に１級アミノ基を有している基が好ましい。当該官能基を有する具体的な３級アミノ基を有する試薬としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノペンチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジブチルアミノプロピルアミンなどが挙げられる。
【００５０】
当該強カチオン性基、好ましくは４級アンモニウム塩と、当該弱カチオン性基、好ましくは３級アミノ基との相対的な位置関係は、該強カチオン性基が該弱カチオン性基よりも基材粒子の表面から遠い位置、即ち外側にあることが好ましい。例えば、該弱カチオン性基は基材粒子表面から３０Å以内にあり、該強カチオン性基は基材粒子表面から３００Å以内で、かつ、弱カチオン性基よりも外側にあることが好ましい。
【００５１】
本発明で用いるイオン交換クロマトグラフィー用充填剤に使用される当該基材粒子の平均粒子径は、特に限定されないが、好ましい下限は０．１μｍ、好ましい上限は２０μｍである。当該平均粒子径が０．１μｍ未満であると、カラム内が高圧になりすぎて分離不良を起こすことがある。当該平均粒子径が２０μｍを超えると、カラム内のデッドボリュームが大きくなりすぎて分離不良を起こすことがある。なお本明細書において、平均粒子径とは体積平均粒子径を示し、粒度分布測定装置（ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ７８０／Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製など）を用いて測定することができる。
【００５２】
当該イオン交換クロマトグラフィーカラムへの試料注入量は、特に限定されず、カラムのイオン交換容量及び試料濃度に応じて適宜調整すればよい。流速は０．１ｍＬ／ｍｉｎから３．０ｍＬ／ｍｉｎが好ましく、０．５ｍＬ／ｍｉｎから１．５ｍＬ／ｍｉｎがより好ましい。流速が遅くなると分離の向上が期待できるが、遅くなりすぎると分析に長時間を要したり、ピークのブロード化による分離性能の低下を招く恐れがある。逆に流速が早くなると分析時間の短縮という面においてはメリットがあるが、ピークが圧縮されるため分離性能の低下を招く。よって、カラムの性能によって適宜調整されるパラメータではあるが、当該流速の範囲に設定することが望ましい。各サンプルの保持時間は、各サンプルについて予備実験を行うことによって予め決定することができる。送液方法はリニアグラジエント溶出法やステップワイズ溶出法など公知の送液方法を用いることができるが、本発明における送液方法としてはリニアグラジエント溶出法が好ましい。グラジエント（勾配）の大きさは、溶出に用いる溶離液を０％から１００％の範囲で、カラムの分離性能及び分析対象物（ここでは上記増幅工程で得られた増幅産物ＤＮＡ）の特性に合わせ適宜調整すればよい。
【００５３】
本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーに用いる溶離液の組成としては、公知の条件を用いることができる。
【００５４】
当該溶離液に用いる緩衝液としては、公知の塩化合物を含む緩衝液類や有機溶媒類を用いることが好ましい。具体的には、例えば、トリス塩酸緩衝液、トリスとＥＤＴＡからなるＴＥ緩衝液、トリスとホウ酸とＥＤＴＡからなるＴＢＡ緩衝液などが挙げられる。
【００５５】
当該溶離液のｐＨは特に限定されないが、好ましい下限は５、好ましい上限は１０である。この範囲に設定することで、当該弱カチオン性基も効果的にイオン交換基（アニオン交換基）として働くと考えられる。該溶離液のｐＨのより好ましい下限は６、より好ましい上限は９である。
【００５６】
当該溶離液に含まれる塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム等のハロゲン化物とアルカリ金属とからなる塩；塩化カルシウム、臭化カルシウム、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム等のハロゲン化物とアルカリ土類金属とからなる塩；過塩素酸ナトリウム、過塩素酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の無機酸塩、などを用いることができる。また、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、コハク酸ナトリウム、コハク酸カリウム等の有機酸塩を用いることもできる。当該塩は、いずれか単独又は組み合わせて使用され得る。
【００５７】
当該溶離液の塩濃度としては、分析条件に合わせ適宜調整すればよいが、好ましい下限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は２０００ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましい下限は１００ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は１５００ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００５８】
さらに、当該溶離液には、分離性能をさらに高めるためにアンチカオトロピックイオンが含まれている。アンチカオトロピックイオンは、カオロトピックイオンとは逆の性質を有し、水和構造を安定化させる働きがある。そのため、充填剤と核酸分子との間の疎水性相互作用を強める効果がある。本発明で用いるイオン交換クロマトグラフィーの主たる相互作用は静電的相互作用であるが、加えて、疎水性相互作用の働きも利用することにより分離性能が高まる。
【００５９】
当該溶離液に含まれるアンチカオトロピックイオンとしては、リン酸イオン（ＰＯ43-）、硫酸イオン（ＳＯ42-）、アンモニウムイオン（ＮＨ4+）、カリウムイオン（Ｋ+）、ナトリウムイオン（Ｎａ+）などが挙げられる。これらのイオンの組合せの中でも、硫酸イオン及びアンモニウムイオンが好適に用いられる。当該アンチカオトロピックイオンは、いずれか単独又は組み合わせて使用され得る。なお、当該アンチカオトロピックイオンの一部には、上記溶離液に含まれる塩や緩衝液の成分が含まれ得る。このような成分は、溶離液に含まれる塩としての性質又は緩衝能と、アンチカオトロピックイオンとしての性質の両方を具備するので、本発明には好適である。
【００６０】
当該溶離液に含まれるアンチカオトロピックイオンの濃度は、分析対象物に合わせて適宜調整すればよいが、アンチカオトロピック塩として２０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが望ましい。具体的には、アンチカオトロピック塩の濃度を０〜２０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲でグラジエント溶出させる方法を挙げることができる。従って、クロマトグラフィー分析開始時のアンチカオトロピック塩の濃度は０ｍｍｏｌ／Ｌである必要はなく、また、分析終了時のアンチカオトロピック塩の濃度も２０００ｍｍｏｌ／Ｌである必要はない。当該グラジエント溶出の方法は、低圧グラジエント法であっても高圧グラジエント法であってもよいが、高圧グラジエント法による精密な濃度調整を行いながら溶出させる方法が好ましい。
【００６１】
当該アンチカオトロピックイオンは、溶出に用いる溶離液のうちの１種のみに添加してもよいが、複数種の溶離液に添加してもよい。また当該アンチカオトロピックイオンは、充填剤とＤＮＡとの間の疎水性相互作用を強める効果又は緩衝能と、増幅産物ＤＮＡをカラムから溶出させる効果との両方の役割を備えていても良い。
【００６２】
本発明で用いるイオン交換クロマトグラフィーにおいて、上記増幅工程で得られた増幅産物ＤＮＡを分析する際のカラム温度は、好ましくは３０℃以上であり、より好ましくは４０℃以上であり、さらに好ましくは４５℃以上、なお好ましくは６０℃以上である。該カラム温度が３０℃未満であると、充填剤と該増幅産物ＤＮＡとの間の疎水性相互作用が弱くなり、所望の分離効果を得ることが難しくなる。一方、イオン交換クロマトグラフィーのカラム温度がより高くなると、メチル化ＤＮＡ由来の増幅産物と非メチル化ＤＮＡ由来の増幅産物とがより明瞭に分離される。該カラム温度が６０℃以上では、メチル化ＤＮＡ由来の増幅産物と非メチル化ＤＮＡ由来の増幅産物の間でのクロマトグラフィー検出シグナルのピークの保持時間の差が広がり、かつそれぞれのピークもより明瞭になるので、より精度のよいＤＮＡのメチル化の検出及びＨＣＣのリスクの評価が可能になる。
【００６３】
一方、イオン交換クロマトグラフィーのカラム温度が９０℃以上になると、増幅産物ＤＮＡの二本鎖が乖離するため分析上好ましくない。さらに、カラム温度が１００℃以上になると、溶離液の沸騰が生じる恐れがあるため分析上好ましくない。したがって、本発明で用いるイオン交換クロマトグラフィーにおいて、増幅産物ＤＮＡを分析する際のカラム温度は、３０℃以上９０℃未満であればよく、好ましくは４０℃以上９０℃未満であり、より好ましくは４５℃以上９０℃未満であり、さらに好ましくは５５℃以上９０℃未満であり、さらに好ましくは６０℃以上９０℃未満であり、さらに好ましくは５５℃以上８５℃以下であり、なお好ましくは６０℃以上８５℃以下である。
【００６４】
ＭＧＲＮ１遺伝子のエクソン領域のＣｐＧサイトのメチル化は、ＨＣＣのリスクを評価するための指標として用いることができる（特許文献１；特開２０１０−１４８４２６号公報； Int J Cancer, 2009, 125, 2854-2862； Int J Cancer, 2011, 129, 1170-1179）。したがって、該ＭＧＲＮ１遺伝子のエクソン領域のＣｐＧサイトを含むサンプルＤＮＡのメチル化レベルに基づいて、ＨＣＣのリスクを評価することができる。本発明において、サンプルＤＮＡのメチル化レベルは、上記イオン交換クロマトグラフィー分析で得られた検出シグナルのピーク形状の違いとして現れる。
【００６５】
ＤＮＡを亜硫酸水素塩処理した場合、該ＤＮＡ中の非メチル化・BR>Vトシンはウラシルに変換されるが、メチル化シトシンはシトシンのままである。該亜硫酸水素塩処理したＤＮＡを増幅すると、非メチル化シトシン由来のウラシルは、さらにチミンに置き換わるため、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの間で、シトシンとチミンの存在比率に差が生じる。そのため、増幅されたＤＮＡは、メチル化に応じた異なる配列を有する。当該異なる配列を有するＤＮＡをイオン交換クロマトグラフィーにかけると、その配列の違いに応じた異なるシグナルを示すクロマトグラムが得られる。
【００６６】
より詳細には、上記イオン交換クロマトグラフィー分析において、ＤＮＡのメチル化レベルの高さは、検出シグナルのピークの保持時間に反映される。例えば、該イオン交換クロマトグラフィー分析において、１００％メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡは、それぞれ独立のピークとして検出することができ、典型的には、メチル化ＤＮＡのピークは、非メチル化ＤＮＡのピークよりも短い保持時間で出現する（特許文献２参照）。したがって、サンプルＤＮＡ中にメチル化したＤＮＡが存在しないか又はその量が微量である場合、該クロマトグラフィーの検出シグナルのピークは、非メチル化ＤＮＡのピークのみが現れる一峰の形状となる。他方、サンプルＤＮＡ中でメチル化ＤＮＡの比率が増加した場合、より短い保持時間でメチル化ＤＮＡのピークが別途出現し、該検出シグナルは、メチル化ＤＮＡのピークと非メチル化ＤＮＡのピークとを有する二峰性の形状となる。このとき、サンプルＤＮＡ中のＤＮＡがメチル化している割合が低ければ、二峰目のメチル化ＤＮＡのピークは、一峰目の非メチル化ＤＮＡのピークの斜面上の膨らみ又は肩として現れ得る。さらにメチル化ＤＮＡの割合が上がると、二峰目のピークが明瞭に現れ得る。さらにメチル化ＤＮＡの割合が上がってメチル化ＤＮＡが優位になると、一峰目のピークは小さくなり、二峰目のピークの斜面上の膨らみ又は肩として現れ得る。さらにＤＮＡのメチル化が進み、サンプルＤＮＡがほぼ完全にメチル化されると、該検出シグナルのピークは、メチル化ＤＮＡのピークのみが現れる一峰の形状となる。このように、サンプルＤＮＡのイオン交換クロマトグラフィー分析で得られたシグナルのピーク形状は、該サンプルＤＮＡのメチル化レベルを表す。
【００６７】
当該サンプルＤＮＡのクロマトグラフィー分析で得られたシグナルのピーク形状は、そのＤＮＡメチル化レベルを反映し、ＨＣＣのリスクとの間に関連性を有する。したがって、本発明によるイオン交換クロマトグラフィーの検出シグナルのピークの形状に基づいて、被験体のＨＣＣの発症リスクを評価することができる。該検出シグナルのピークの中にメチル化ＤＮＡのピークの成分が多いほど、肝臓組織でがん化が進行し、被験体のＨＣＣのリスクがより高いことを表す。他方、該検出シグナルのピークの中に非メチル化ＤＮＡのピークの成分が多いほど、肝臓組織でがん化が進行しておらず、被験体のＨＣＣのリスクがより低いことを表す。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態においては、該イオン交換クロマトグラフィーの検出シグナルのピークの形状が一峰であるか二峰性であるかが判断される。ここで一峰とは、メチル化ＤＮＡのピークが一峰のピークとして現れていることをいう。ピークの形状が一峰であるか二峰性であるかの判断は、該検出シグナルを保持時間に対してプロットした曲線の形状から判断してもよく、あるいは、より精密な分析のために、該検出シグナルの微分値に基づいて判断してもよい。例えば、検出シグナルの一次微分値を保持時間に対してプロットしたときに、２つ以上の極大値を有する曲線で表される場合、該検出シグナルのピークの形状は二峰性であると判断される。
【００６９】
本発明の一実施形態においては、該クロマトグラフィーの検出シグナルのピークの形状に基づいて、該サンプルＤＮＡがＨＣＣの発症リスクが高い被験体から得られたＤＮＡであるか否かを判定する。好ましくは、該ピークが一峰である場合、該サンプルＤＮＡはＨＣＣの発症リスクが高い被験体から得られたＤＮＡであると判定され、該ピークが二峰性である場合、該サンプルＤＮＡはＨＣＣの発症リスクが低い被験体から得られたＤＮＡであると判定される。
【００７０】
本発明の別の一実施形態においては、該クロマトグラフィーの検出シグナルのピークの形状に基づいて、該被験体がＨＣＣの発症リスクが高い被験体であるか否かを判定する。好ましくは、該ピークが一峰である場合、該被験体はＨＣＣの発症リスクが高い被験体であると判定され、該ピークが二峰性である場合、該被験体はＨＣＣの発症リスクが低い被験体であると判定される。
【００７１】
該クロマトグラフィーによる検出シグナルのピークの有無を判定する方法としては、既存のデータ処理ソフトウェア、例えばＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎ（島津製作所）、ＧＲＡＭＳ／ＡＩ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、Ｉｇｏｒ  Ｐｒｏ（ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ社）などを用いたピーク検出が挙げられる。ＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎを用いたピークの有無の判定方法を例示する。具体的には、まずピークを検出させたい保持時間の区間を指定する。次に、ノイズなど不要なピークを除去するために、各種パラメータを設定する。例えば、パラメータ「ＷＩＤＴＨ」を不要なピークの半値幅よりも大きくする、パラメータ「ＳＬＯＰＥ」を不要なピークの立ち上り傾斜より大きくする、パラメータ「ＤＲＩＦＴ」の設定を変えることにより分離度の低いピークを垂直分割するかベースライン分割するか選択する、などが挙げられる。パラメータの値は、分析条件、分析するＤＮＡの種類や量などにより、異なるクロマトグラムが得られるため、クロマトグラムに応じて適切な値を設定すればよい。
【００７２】
検出シグナルの微分値は、上述したデータ処理ソフトウェアで自動的に計算することができる。あるいは、表計算ソフト（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｅｘｃｅｌ（登録商標））などにより、該微分値を計算することができる。
【００７３】
クロマトグラフィーの検出シグナルの微分値を算出する時間範囲は、適宜設定することができる。また一次微分値の極大値を検出する時間範囲も、適宜設定することができる。例えば、該検出シグナルのピーク曲線の立ち上がりから終わりまでの時間範囲で、その一次微分値の極大値を検出することができる。
【００７４】
本発明においては、上記サンプルＤＮＡについてのクロマトグラフィーの検出シグナルを、対照ＤＮＡについての検出シグナルと比較することができる。対照ＤＮＡには、サンプルＤＮＡと配列が同じでかつメチル化レベルが既知（例えば、０％又は１００％）であるＤＮＡが用いられる。
【００７５】
例えば、０％メチル化対照（陰性対照）についての検出シグナルは、サンプルＤＮＡと配列は同じであるがメチル化していないＤＮＡを用いて、上述した手順で亜硫酸水素塩処理、核酸増幅、及びイオン交換クロマトグラフィーを行うことよって獲得することができる。また例えば、１００％メチル化対照（陽性対照）についての検出シグナルは、サンプルＤＮＡと配列は同じでかつ１００％メチル化しているＤＮＡを用いて、上述した手順で亜硫酸水素塩処理、核酸増幅、及びイオン交換クロマトグラフィーを行うことによって獲得することができる。あるいは、陰性対照及び陽性対照についての検出シグナルは、それぞれ、メチル化率が０％及び１００％であるサンプルＤＮＡを亜硫酸水素塩処理及び核酸増幅させて得られるＤＮＡ配列を合成し、次いで、これをイオン交換クロマトグラフィーに供することによって獲得することができる。
【００７６】
サンプルＤＮＡ中に含まれる非メチル化ＤＮＡは、陰性対照と同等の保持時間を有するピークとして現れる。一方で、サンプルＤＮＡに含まれるメチル化ＤＮＡに由来するピークの保持時間は、そのメチル化レベルに応じて、陽性対照のピークの方へ移動するはずである。サンプルＤＮＡのピークの保持時間を、陰性対照又は陽性対照と比較することで、非メチル化ＤＮＡ又はメチル化ＤＮＡを含むサンプルＤＮＡからのシグナルが正しく取得されたことを確認することができる。この手順は、サンプルＤＮＡの調製やその後の処理工程における操作ミスに起因する判定エラーの防止のために有効であり得る。ただしこの手順は、特にサンプルＤＮＡから明瞭な一峰又は二峰性のピークが得られている場合、必ずしも必要ではない。
【００７７】
本発明によるＨＣＣのリスクを評価する方法は、ＤＮＡメチル化の検出にイオン交換クロマトグラフィーを用いているため、パイロシークエンシング等でＤＮＡメチル化を検出する従来法（例えば特許文献１）と比較して、非常に簡便かつ迅速な方法である。さらに驚くべきことに、本発明においては、ＭＧＲＮ１遺伝子のエクソン領域のＣｐＧサイトのメチル化を指標とすることで、顕著に高い感度及び特異性でのＨＣＣのリスクの評価を可能にした。後述の実施例に示すとおり、イオン交換クロマトグラフィーによるＤＮＡメチル化の検出を用いたＨＣＣのリスク評価では、メチル化を検出する標的ＤＮＡとしてＭＧＲＮ１遺伝子のエクソン領域のＣｐＧサイトを含むＤＮＡ（Ｌｉｖ２５領域；配列番号１）を選択した場合、その近傍のＣｐＧサイト（ＭＧＲＮ１遺伝子のイントロン領域のＣｐＧサイト）を含むＤＮＡ（Ｌｉｖ２７領域；配列番号２）、又は異なる遺伝子（ＫＤＭ４Ｂ）のＣｐＧサイトを含むＤＮＡ（Ｌｉｖ２８領域；配列番号３）と比べて、感度及び特異性が顕著に向上した。当該近傍のＣｐＧサイト及びＫＤＭ４Ｂ遺伝子のＣｐＧサイトは、パイロシークエンシングによるＨＣＣリスク評価では１００％の感度及び特異性を達成した部位である（特許文献１、表４を参照）。しかしながら、これらの２つの部位はいずれも、イオン交換クロマトグラフィーによる評価では感度又は特異性を大きく低下させた。これに対し、ＭＧＲＮ１遺伝子のエクソン領域ＣｐＧサイトを含むＤＮＡは、本発明によるイオン交換クロマトグラフィーによるＨＣＣリスク評価でも、パイロシークエンシングを用いた方法と同等の極めて高い感度及び特異性を達成した。したがって、本発明によるＨＣＣのリスク評価方法は、迅速さ、簡便さと、極めて高い感度及び特異性とを両立させることができる優れた方法である。
【実施例】
【００７８】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００７９】
〔方法〕
（１）患者及び検体
肝炎ウィルス（ＨＢＶ又はＨＣＶ）感染歴があり、ＨＣＣを有する患者から摘出された非がん肝臓組織（Ｎ群）３６サンプル、ならびに肝炎ウィルス感染歴及びＨＣＣを有さない患者から摘出された健常肝臓組織（Ｃ群）３６サンプルを検体とした。【００８０】
（２）ＤＮＡの調製
前記患者から得た新鮮凍結組織サンプルを、フェノール−クロロホルムにて処理し、次いで透析を施すことによって、高分子量ＤＮＡを抽出した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、モレキュラークローニング：実験マニュアル  第３版、コールドスプリングハーバー出版、ＮＹ、６．１４〜６．１５ページ  参照）。得られたＤＮＡ５００ｎｇを、ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ＧｏｌｄTMキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、亜硫酸水素塩処理に供した。【００８１】
（３）ＰＣＲ増幅
（２）で得られた亜硫酸水素塩処理ゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲでは、ゲノムＤＮＡ中のＣｐＧサイトを含む以下の３つの異なる領域を増幅した。
Ｌｉｖ２５領域：ＭＧＲＮ１遺伝子のエクソン領域のＣｐＧサイトを含むＤＮＡ領域
Ｌｉｖ２７領域：Ｌｉｖ２５領域の近傍のＣｐＧサイト（ＭＧＲＮ１遺伝子のイントロン領域のＣｐＧサイト）を含むＤＮＡ領域
Ｌｉｖ２８領域：異なる遺伝子（ＫＤＭ４Ｂ）のＣｐＧサイトを含むＤＮＡ領域
増幅された領域（亜硫酸水素塩処理前の配列）及び増幅に用いたプライマーのヌクレオチド配列を表１に示す。それぞれの領域について、同じ配列でメチル化率０％のＤＮＡ（陰性対照）及びメチル化率１００％のＤＮＡ（陽性対照）を調製し、同様の手順で亜硫酸水素塩処理の後ＰＣＲ増幅した。【００８２】
ＰＣＲ反応液（５０μＬ）の組成：鋳型ＤＮＡ  ７５ｎｇ、１×ＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、２００μｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、２．５Ｕ  ＨｏｔＳｔａｒｔＴａｑ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、０．２μｍｏｌ／Ｌ  ｆｏｒｗａｒｄ及びｒｅｖｅｒｓｅプライマー。ＰＣＲ条件は、以下のとおりとした：
Ｌｉｖ２５：
［９４℃１分→６４℃１分→７２℃１分］×５サイクル→［９４℃１分→６２℃１分→７２℃１分］×５サイクル→［９４℃１分→６０℃１分→７２℃１分］×５サイクル→［９４℃１分→５８℃１分→７２℃１分］×３５サイクル
Ｌｉｖ２７：
［９４℃１分→５６℃１分→７２℃１分］×５０サイクル
Ｌｉｖ２８：
［９４℃１分→５６℃１分→７２℃１分］×５０サイクル
ＰＣＲ終了後、予めｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅを添加した３％アガロースゲルに、反応液５μＬにｌｏａｄｉｎｇ  ｄｙｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １μＬを混ぜたものをアプライして電気泳動し、目的のＰＣＲ増幅産物が得られたことを確認した。【００８３】
【表１】
0006614630.tif 000002
【００８４】
（４）アニオン交換カラムの調製
攪拌機付き反応器中の３重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２０００ｍＬに、テトラエチレングリコールジメタアクリレート（新中村化学工業社製）２００ｇ、トリエチレングリコールジメタアクリレート（新中村化学工業社製）１００ｇ、グリシジルメタクリレート（和光純薬工業社製）１００ｇ及び過酸化ベンゾイル（キシダ化学社製）１．０ｇの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて８０℃で１時間重合した。次に、強カチオン性基を有する親水性単量体として、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド（和光純薬工業社製）１００ｇをイオン交換水に溶解した。これを同じ反応器に添加して、同様にして、攪拌しながら窒素雰囲気下にて８０℃で２時間重合した。得られた重合組成物を水及びアセトンで洗浄することにより、４級アンモニウム基を有する親水性重合体の層を表面に有する被覆重合体粒子を得た。得られた被覆重合体粒子について、粒度分布測定装置（ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ７８０／Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて測定したところ、平均粒子径は１０μｍであった。【００８５】
得られた被覆重合体粒子１０ｇをイオン交換水１００ｍＬに分散させ、反応前スラリーを準備した。次いで、このスラリーを撹拌しながら、弱カチオン性基を有する試薬であるＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミン（和光純薬工業社製）を１０ｍＬ加え、７０℃で４時間反応させた。反応終了後、遠心分離機（日立製作所社製、「Ｈｉｍａｃ  ＣＲ２０Ｇ」）を用いて上澄みを除去し、イオン交換水で洗浄した。洗浄後、遠心分離機を用いて上澄みを除去した。このイオン交換水による洗浄を更に４回繰り返し、基材粒子の表面に４級アンモニウム基と３級アミノ基とを有するイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を得た。【００８６】
得られたイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を液体クロマトグラフィーシステムのステンレス製カラム（カラムサイズ：内径４．６ｍｍ×長さ２０ｍｍ）に充填した。【００８７】
（５）ＨＰＬＣ分析
（４）で準備したアニオン交換カラムを用いて、以下の条件でイオン交換クロマトグラフィーを行い、（３）で得られた各ＰＣＲ増幅産物を分離検出した。
システム：ＬＣ−２０Ａシリーズ（島津製作所社製）
溶離液：溶離液Ａ  ２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
溶離液Ｂ  ２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
＋１ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム
分析時間：分析時間は１５分
溶出法：以下のグラジエント条件により溶離液Ｂの混合比率を直線的に増加させた。
０分（溶離液Ｂ４０％）→１０分（溶離液Ｂ１００％）
検体：（２）で得られたＰＣＲ増幅産物
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２６０ｎｍ
試料注入量：５μＬ、陰性対照及び陽性対照は２μＬ
カラム温度：７０℃【００８８】
（６）クロマトグラフィーを用いたＭＧＲＮ１遺伝子エクソン領域のＣｐＧサイトのメチル化解析によるＨＣＣリスク評価
ＨＣＣ患者由来非がん肝臓組織サンプル（Ｎ群）のＭＧＲＮ１遺伝子のエクソン領域のＣｐＧサイトを含むＤＮＡ（Ｌｉｖ２５領域）から得られたＨＰＬＣクロマトグラムのうち、典型的な例を図１に示す。図１の各図には、非メチル化ＤＮＡ（陰性対照）及び１００％メチル化ＤＮＡ（陽性対照）のクロマトグラムも重ねて表示されている。これらのＮ群サンプルでは、陽性対照のピークと重なる一峰性のピークのみが出現していた。またこれらのデータの一次微分値（図２）は、１つの極大値を有する曲線であった。クロマトグラムでピークに肩がでるなど、一峰でないサンプルは、一次微分値が２つの極大値を有する曲線となることで判別することができた（図示せず）。【００８９】
健常肝臓組織サンプル（Ｃ群）のＬｉｖ２５領域から得られたＨＰＬＣクロマトグラムのうち、典型的な例を図３に示す。図３には、非メチル化ＤＮＡ（陰性対照）及び１００％メチル化ＤＮＡ（陽性対照）のクロマトグラムも重ねて表示されている。これらのＣ群サンプルでは、二峰性のピークが出現していた。陰性対照及び陽性対照との比較から、これら二峰性のピークが、１００％メチル化ＤＮＡのピークと、よりメチル化率の低いＤＮＡのピークとを含むことが推定された。またこれらのデータの一次微分値（図４）は、２つの極大値を有する曲線であった。【００９０】
以上のとおり、イオン交換クロマトグラフィー分析により、ＨＣＣ患者の非がん肝臓組織におけるＭＧＲＮ１遺伝子のエクソン領域のＣｐＧサイトを含むＤＮＡ（Ｌｉｖ２５領域）のＤＮＡメチル化レベルの上昇を検出することができた。また、Ｌｉｖ２５領域についてのクロマトグラフィー分析のピークの形状は、Ｎ群とＣ群で明瞭に異なり、該ピークの形状に基づいてＨＣＣ患者の組織と健常組織とを区別することができた。【００９１】
（７）他領域のメチル化解析によるＨＣＣリスク評価
Ｌｉｖ２７領域から得られたＨＰＬＣクロマトグラムも、Ｌｉｖ２５領域と同様に、Ｎ群では一峰のピーク、Ｃ群では二峰性のピークを有する傾向がみられた。他方、Ｌｉｖ２８領域から得られたＨＰＬＣクロマトグラムは、Ｎ群では二峰性ピーク、Ｃ群では一峰のピークを有する傾向がみられた。しかしながら、Ｌｉｖ２７領域及びＬｉｖ２８領域では、Ｎ群、Ｃ群のいずれにも上記傾向と一致しないピークが得られる場合が少なくなく、ピークの形状だけではＨＣＣ患者の組織と健常組織とを精度よく区別できないことが示唆された。【００９２】
（８）ＨＣＣリスク評価の感度及び特異性の領域間比較
Ｌｉｖ２５領域、Ｌｉｖ２７領域及びＬｉｖ２８領域のクロマトグラムを用いてＨＣＣリスク評価を行い、その感度（陽性一致率）及び特異性（陰性一致率）を算出した。Ｌｉｖ２５及びＬｉｖ２７領域では、一峰のピークを有するクロマトグラムが得られたサンプルをＨＣＣリスク陽性、二峰性のピークを有するクロマトグラムが得られたサンプルをＨＣＣリスク陰性と判定した。Ｌｉｖ２８領域では、二峰性のピークを有するクロマトグラムが得られたサンプルをＨＣＣリスク陽性、一峰のピークを有するクロマトグラムが得られたサンプルをＨＣＣリスク陰性と判定した。各領域についてのＮ群とＣ群におけるＨＣＣリスク陽性及び陰性と判定されたサンプル数、ならびに評価の感度及び特異性を表２に示す。Ｌｉｖ２５領域での評価は、感度及び特異性ともに非常に高く、他の領域と比較して顕著に高精度であった。【００９３】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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