(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の化学式（化２）で表されるプレニル桂皮酸誘導体と、クルクミン又はその塩を有効成分として含む、褐色脂肪細胞分化誘導剤。
【化２】
0006488504.tif 000016
【請求項２】
請求項１に記載の褐色脂肪細胞分化誘導剤を含む、肥満の予防又は治療用組成物。
【請求項３】
医薬、医薬部外品、食品又は化粧料である、請求項２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は褐色脂肪細胞分化誘導剤及びその用途（肥満の予防・治療）に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の脂肪組織には、白色脂肪組織と「褐色脂肪組織」がある。白色脂肪組織がエネルギーの貯蔵庫であるのに対し、「褐色脂肪組織」は脂肪を消費して体熱産生を行い、体温維持を担う。従って「褐色脂肪組織」の増大は、エネルギー消費を促進する。しかし、ヒトの新生児では褐色脂肪組織が多数存在するが、成人には見出されなかったため、その生理的役割は無視されていた。ところが最近、（１）褐色脂肪組織が成人にもあること（但し個人差がある）、（２）加齢により低下し、肥満と相関する（中年太りの原因の一つ）こと、が明らかになり、褐色脂肪組織量の低下が肥満の一因であることが証明された（例えば、非特許文献１、２を参照）。更に驚くべきことに褐色脂肪細胞には、従来からある「既存型」と、「既存型」とは細胞起源の異なる脂肪前駆細胞から分化転換する「誘導型」の２種類があり、白色脂肪組織中に「誘導型」褐色脂肪細胞が多数出現し、熱産生によりエネルギー消費が継続的に増加して体脂肪が減少することも明らかになった。現在では、エネルギー消費を促進する「誘導型」褐色脂肪細胞を増やすこと（即ち、褐色脂肪細胞化を促す）が、有効かつ新しい抗肥満戦略と考えられている（例えば、非特許文献３〜５を参照）。このための方策として考えられるのは、（１）持続的寒冷刺激、（２）ヒトES/iPS細胞からの褐色脂肪細胞分化誘導・移植（非特許文献６を参照）である。しかし、いずれも非現実的であり、（２）は今後の成果も期待できるが、通常の肥満者には適用できず、食品機能学、栄養生化学的視点からは実用的な手段ではない。
【０００３】
これまでにも、幹細胞を褐色脂肪細胞へと分化誘導する方法がいくつか提案されている。しかしながら、効果が十分でないことや、内因性の微量なタンパク質を利用しており経口摂取に向かないこと等、主に実用面において問題があった（例えば特許文献１〜５を参照）。尚、本発明者はアルテピリンＣとその類縁化合物が糖尿病の予防・抑制に有効であること、クルクミンとその類縁化合物が同様に糖尿病の予防・抑制に有効であることを報告している（特許文献６、７、非特許文献７、８を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１４−６５６７２号公報
【特許文献２】特開２０１３−１５１４３７号公報
【特許文献３】特開２０１２−１３５２６１号公報
【特許文献４】特開２０１０−１３０９６８号公報
【特許文献５】国際公開第２０１４／０２７６０８号パンフレット
【特許文献６】特開２０１０−１５０１６１号公報
【特許文献７】特開２０１４−１４８４７４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Diabetes 2009,58:1526-31.
【非特許文献２】Obesity 2011, 19: 1755-1760.
【非特許文献３】Cell Metab. 2010,11:257-62.
【非特許文献４】Nat. Med. 2013,19:1252-63.
【非特許文献５】Cell 2012,150:366-76.
【非特許文献６】Cell Metab. 2012, 5: 394-406.
【非特許文献７】Biochim. Biophys. Acta 1810: 695-703 (2011). 2011.4.29
【非特許文献８】Biocheem. Biophys. Res. Commun. 435: 165-70 (2013). 2013.5.6
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
以上の背景の下、本発明は褐色脂肪細胞の分化誘導に有効な手段を提供し、肥満に対する新たな予防・治療法の確立に貢献することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は上記課題に鑑み研究を進める中で、プロポリスに含まれる成分のプレニル桂皮酸誘導体、及びウコン（ターメリック）の成分であるクルクミンに注目した。検討の結果、プレニル桂皮酸誘導体の一つである３，５−ビスプレニル−４−ヒロドキシ桂皮酸（「アルテピリンＣ」と呼ばれる）が褐色脂肪細胞化を誘導することが明らかになるとともに、クルクミンを併用すると相乗的な効果が得られ褐色脂肪細胞化が強く誘導されることが判明した。後者の事実において特に重要な点は、驚くべきことに、クルクミン単独では褐色脂肪細胞化作用を認めなかったものの、アルテピリンＣと併用することにより、褐色脂肪細胞化が大幅に促進されたことである。
以上の成果に基づき、以下の発明を提供する。尚、上記の通り、本発明者はアルテピリンＣとその類縁化合物、及びクルクミンとその類縁化合物が糖尿病の予防・抑制に有効であることを報告したが、本発明は新たな知見に基づき新規な用途（褐色脂肪細胞化及びそれを利用した抗肥満）を提供するものであり、過去の報告とは一線を画する。
［１］プレニル桂皮酸誘導体を有効成分として含む、褐色脂肪細胞分化誘導剤。
［２］プレニル桂皮酸誘導体が以下の化学式（化１）で表されることを特徴とする、［１］に記載の褐色脂肪細胞分化誘導剤、
【化１】
0006488504.tif 000002
但し、R1はO-R3であり、R3はR2とともに環構造を形成していてもよく、R3がHのときにはR2はプレニル基である。
［３］プレニル桂皮酸誘導体が、以下のいずれかの化学式で表される化合物である、［１］に記載の褐色脂肪細胞分化誘導剤。
【化２】
0006488504.tif 000003
【化３】
0006488504.tif 000004
【化４】
0006488504.tif 000005
【化５】
0006488504.tif 000006
［４］クルクミン若しくはクルクミン誘導体、又はその塩を有効成分として更に含む、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の褐色脂肪細胞分化誘導剤。
［５］［１］〜［４］のいずれか一項に記載の褐色脂肪細胞分化誘導剤を含む、肥満の予防又は治療用組成物。
［６］医薬、医薬部外品、食品又は化粧料である、［５］に記載の組成物。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】褐色脂肪細胞化の誘導作用を調べたアルテピリンＣ（ArtC）とクルクミンの化学構造を示す。
【図２】マウスC3H10t1/2細胞へArtCを最終濃度1μM、5μM又は10μMで投与し、8日後の褐色脂肪細胞化マーカー遺伝子（UCP1、Cidea、Cox8b、Elovl3）発現量を測定した結果を示す。各遺伝子において、グラフ上の異なるアルファベット間は有意差（p＜0.05)を示す。
【図３】マウスC3H10t1/2細胞へArtCを最終濃度10μM、クルクミンを最終濃度10μM、又はArtCとクルクミンをいずれも最終濃度10μM（併用投与）で投与し、8日後の褐色脂肪細胞化マーカー遺伝子（UCP1、Cidea（cell death-inducing DNA fragmentation factor α-like effector a）、Cox8b（Cytochrome c oxidase subunit 8b）、Elovl3（Elongation of very long chain fatty acids protein 3））発現量を測定した結果を示す。各遺伝子において、グラフ上の異なるアルファベット間は有意差（p＜0.05)を示す。
【図４】マウス鼠径部白色脂肪組織（iWAT）由来の間質血管画分（stromal vascular fraction：SVF画分）へArtCを最終濃度10μMで投与し、11日後の褐色脂肪細胞化マーカー遺伝子（UCP1、Cidea、Cox8b、Elovl3）発現量を測定した結果を示す。各遺伝子において、グラフ上の＊はコントロール群との間に有意差（p＜0.05)があることを示す。
【図５】マウス鼠径部白色脂肪組織（iWAT）由来の間質血管画分（stromal vascular fraction：SVF画分）へArtCを最終濃度10μM、クルクミンを最終濃度10μM、又はArtCとクルクミンをいずれも最終濃度10μM（併用投与）で投与し、11日後の褐色脂肪細胞化マーカー遺伝子（UCP1、Cidea、Cox8b、Elovl3）発現量を測定した結果を示す。各遺伝子において、グラフ上の異なるアルファベット間は有意差（p＜0.05)を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１．褐色脂肪細胞分化誘導剤
本発明の第１の局面は褐色脂肪細胞分化誘導剤（以下、説明の便宜上「分化誘導剤」とも呼ぶ）に関する。「褐色脂肪細胞分化誘導剤」とは、褐色脂肪細胞への分化能を有する細胞（即ち前駆細胞又は幹細胞。典型的には、筋・褐色脂肪前駆細胞又は脂肪前駆細胞）に作用し、褐色脂肪細胞に分化するように働きかける薬剤をいう。褐色脂肪細胞分化誘導剤を使用すると、褐色脂肪細胞への分化が促進される結果、褐色脂肪細胞数が増大する。
【００１０】
本発明の分化誘導剤ではプレニル桂皮酸誘導体を有効成分として用いる。プレニル桂皮酸誘導体はプロポリスに含まれる成分として知られている。プロポリスとは、ミツバチが樹木の特定部位（主として新芽や蕾、樹皮）から採取したガム質、樹液、植物色素系物質および香油などの集合体にミツバチ自身の分泌物、蜜蝋などを混ぜて作る、粘着性のある固形物である。特に、ブラジル産プロポリスはプレニル桂皮酸誘導体を多く含む。
【００１１】
褐色脂肪細胞へと分化誘導する作用を示す限り、プレニル桂皮酸誘導体は特に限定されない。二種類以上のプレニル桂皮酸誘導体を併用してもよい。好ましくは、本発明におけるプレニル桂皮酸誘導体は以下の化学式（化１）で表される。
【化１】
0006488504.tif 000007
但し、R1はO-R3であり、R3はR2とともに環構造を形成していてもよく、R3がHのときにはR2はプレニル基である。環構造の一例はピラン環であるが、これに限定されるものではない。
【００１２】
好ましい化合物の具体例を以下（化２〜化５）に示す。尚、化２の化学式で表される化合物（(E)-3-(4-hydroxy-3,5-bis(3-methylbut-2-enyl)phenyl)acrylic acid）は、アルテピリンＣ（Artepillin C）とも呼ばれる。
【化２】
0006488504.tif 000008
(E)-3-(4-hydroxy-3,5-bis(3-methylbut-2-enyl)phenyl)acrylic acid
【化３】
0006488504.tif 000009
(E)-3-(3-(3-methylbut-2-enyl)-4-(3-phenylpropanoyloxy)phenyl)acrylic acid
【化４】
0006488504.tif 000010
(E)-3-(4-(isobutyryloxy)-3-(3-methylbut-2-enyl)phenyl)acrylic acid
【化５】
0006488504.tif 000011
(E)-3-(3-hydroxy-2,2-dimethyl-8-(3-methylbut-2-enyl)chroman-6-yl)acrylic acid
【００１３】
後述の実施例に示す通り、化２の化合物（アルテピリンＣ）は高い活性を示した。そこで、更に好ましくは、アルテピリンＣを本発明の有効成分として用いる。
【００１４】
本発明に用いるプレニル桂皮酸誘導体は、プロポリス又はその起源植物（アレクリン（Baccharis dracunculifolia）など）からの抽出や化学合成によって調製することができる。また、アルテピリンＣは市販されており、容易に入手可能である。
【００１５】
プレニル桂皮酸誘導体の調製法の一例を以下に示す。まず、粉砕したプロポリス原塊に溶媒（アルコール、有機溶媒など）を添加した後、所定温度（例えば４０℃）で所定時間（例えば１０〜３０時間）攪拌する。次にろ過又は遠心処理によって不溶成分を除去する。このようにして得られた抽出液より、各種クロマトグラフィーなどを利用して目的のプレニル桂皮酸誘導体を精製する。尚、プレニル桂皮酸誘導体の調製法は公知である（例えば上掲の特許文献３〜６を参照）。
【００１６】
後述の実施例に示す通り、プレニル桂皮酸誘導体であるアルテピリンＣとクルクミンの併用によって、相乗的な効果が得られ、褐色脂肪細胞化が強く誘導された。クルクミン単独の使用では効果が認められなかったものの、アルテピリンＣと併用することで相乗的な効果を示したことは特筆に値する。本発明の一態様は、当該事実に基づき、プレニル桂皮酸誘導体と、クルクミン又はその誘導体とを併用し、より高い効果を発揮する分化誘導剤とする。クルクミンの構造を以下に示す。
【化６】
0006488504.tif 000012
【００１７】
本発明の有効成分として各種クルクミン誘導体を用いることができる。クルクミン誘導体として、クルクミンの構造の一部（原子又は原子団）が他の原子又は原子団で置換された誘導体を挙げることができる。このようなクルクミン誘導体は、最終生成物として当該誘導体が得られるように設計された任意の製造工程によって調製することができる。ここでの他の原子又は原子団としてヒドロキシル基、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等）、アルキル基（メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基等）、ヒドロキシアルキル基（ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基等）、アルコキシ基（メトキシ基、エトキシ基等）、アシル基（ホルミル基、アセチル基、マロニル基、ベンゾイル基等）等を例示することができる。
【００１８】
クルクミン誘導体の具体例を以下（化７〜９）に示す。
【化７】
0006488504.tif 000013
（デメトキシクルクミン）
【００１９】
【化８】
0006488504.tif 000014
（ビスデメトキシクルクミン）
【００２０】
【化９】
0006488504.tif 000015
（テトラヒドロクルクミン）
【００２１】
後述の実施例に示す通り、アルテピリンＣと併用した際、クルクミンは高い相乗効果をもたらした。そこで、好ましい態様では、プレニル桂皮酸誘導体と併用する成分としてクルクミンを採用する。
【００２２】
本発明の薬剤の有効成分としてクルクミン又はクルクミン誘導体の薬理学的に許容される塩を用いても良い。「薬理学的に許容される塩」は広義に解釈されるべきであり、酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等、各種の塩を含む用語である。酸付加塩の例としてはトリフルオロ酢酸塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩などの無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩が挙げられる。金属塩の例としてはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩が挙げられる。アンモニウム塩の例としてはアンモニウム、テトラメチルアンモニウムなどの塩が挙げられる。有機アミン付加塩の例としてはモルホリン付加塩、ピペリジン付加塩が挙げられる。アミノ酸付加塩の例としてはグリシン付加塩、フェニルアラニン付加塩、リジン付加塩、アスパラギン酸付加塩、グルタミン酸付加塩が挙げられる。
【００２３】
クルクミン及びクルクミン誘導体はウコン（ターメリック）に含有される成分である。従って、クルクミン及びクルクミン誘導体はウコンから抽出することができる。化学合成によってクルクミン及びクルクミン誘導体を調製することにしてもよい。また、ウコンから抽出・精製したクルクミンやクルクミン誘導体が市販されており、それらを用いることにしてもよい。
【００２４】
２．褐色脂肪細胞分化誘導剤を含む組成物
褐色脂肪細胞は中性脂肪を燃焼して過剰エネルギーを消費する特殊な細胞であり、その減少が肥満の原因となることが明らかとなってきた。従って、褐色脂肪細胞を増加させることは、肥満の予防・治療に有効な手段となる。そこで本発明の第２の局面は、肥満の予防又は治療用の組成物を提供する。本発明の組成物の形態は特に限定されないが、好ましくは医薬、医薬部外品、食品又は化粧料である。即ち、本発明は好ましい態様として、本発明の褐色脂肪細胞分化誘導剤を有効成分として含有する医薬組成物、医薬部外品組成物、食品組成物、及び化粧料組成物を提供する。
【００２５】
「肥満」とは一般的には体内に脂肪組織が過剰に蓄積した状態をいう。本明細書では用語「肥満」は広義に解釈されるものとし、その概念に肥満症を含む。「肥満症」とは肥満に起因ないし関連する健康障害（合併症）を有するか又は将来的に有することが予測される場合であって、医学的に減量が必要とされる病態をいう。肥満の判定法には、例えば、国際的に広く使用されているＢＭＩ（body mass index）を尺度としたものがある。ＢＭＩは、体重（ｋｇ）を身長（ｍ）の二乗で除した数値（ＢＭＩ＝体重（ｋｇ）／身長（ｍ）２）である。ＢＭＩ＜１８．５は低体重（underweight）、１８．５≦ＢＭＩ＜２５は普通体重（normal range）、２５≦ＢＭＩ＜３０は肥満１度（preobese）、３０≦ＢＭＩ＜３５は肥満２度（obese class I）、３５≦ＢＭＩ＜４０は肥満３度（obese class II）、４０≦ＢＭＩは肥満４度（obese class III）と判定される（WHO）。また、ＢＭＩを利用して、日本人の成人の標準体重（理想体重）を以下の式、標準体重（ｋｇ）＝身長（ｍ）２×２２から計算し、実測体重が標準体重（計算値）の１２０％を超える状態を肥満とする判定法もある。もっとも、標準体重（理想体重）は性別、年齢、又は生活習慣の差異などによって個人ごとに相違することから、肥満の判定をこの方法で一律に行うことは妥当でないと考えられている。
【００２６】
（１）医薬組成物・医薬部外品組成物
本発明における「医薬」及び「医薬部外品」は、標的疾患に対する治療的又は予防的効果を示す薬剤組成物である。治療的効果には、標的疾患に特徴的な症状又は随伴症状を緩和すること（軽症化）、症状の悪化を阻止ないし遅延すること等が含まれる。後者については、重症化を予防するという点において予防的効果の一つと捉えることができる。このように、治療的効果と予防的効果は一部において重複する概念であり、明確に区別して捉えることは困難であり、またそうすることの実益は少ない。尚、予防的効果の典型的なものは、標的疾患に特徴的な症状や病態の発現（発症）又は再発を阻止ないし遅延することである。尚、標的疾患に対して何らかの治療的効果又は予防的効果、或いはこの両者を示す限り、本発明の医薬組成物ないし医薬部外品組成物に該当する。
【００２７】
本発明の医薬組成物及び医薬部外品組成物の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。
【００２８】
製剤化する場合の剤型も特に限定されず、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、外用剤、及び座剤などとして本発明の医薬組成物又は医薬部外品組成物を提供できる。
【００２９】
本発明の医薬組成物には、期待される治療効果や予防効果を得るために必要な量（即ち治療上有効量）の有効成分が含有される。同様に本発明の医薬部外品組成物には、期待される改善効果や予防効果等を得るために必要な量の有効成分が含有される。本発明の医薬組成物又は医薬部外品組成物に含まれる有効成分量は一般に剤型や形態によって異なるが、所望の投与量を達成できるように有効成分量を例えば約０．１重量％〜約９９重量％の範囲内で設定する。
【００３０】
本発明の医薬組成物及び医薬部外品組成物はその剤型・形態に応じて経口又は非経口（静脈内、動脈内、皮下、筋肉、又は腹腔内注射、経皮、経鼻、経粘膜、塗布など）で対象に適用される。ここでの「対象」は特に限定されず、ヒト及びヒト以外の哺乳動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ニワトリ、ウズラ等である）を含む。好ましい態様では、適用対象はヒトである。
【００３１】
本発明の医薬組成物及び医薬部外品組成物の投与量・使用量は、期待される効果が得られるように設定される。有効な投与量の設定においては一般に適用対象の症状、年齢、性別、体重などが考慮される。尚、当業者であればこれらの事項を考慮して適当な投与量を設定することが可能である。投与スケジュールとしては例えば一日一回〜数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、適用対象の症状や有効成分の効果持続時間などを考慮することができる。
【００３２】
以上の記述から明らかな通り本出願は、肥満の患者又は潜在的患者（将来罹患するおそれのある者）に対して本発明の医薬組成物を治療上有効量投与することを特徴とする、肥満の予防法や治療法も提供する。
【００３３】
（２）食品組成物
上記の通り本発明の一態様は、本発明の分化誘導剤を含有する食品組成物である。本発明での「食品組成物」の例として一般食品（穀類、野菜、食肉、各種加工食品、菓子類、牛乳、清涼飲料水、アルコール飲料等）、栄養補助食品（サプリメント、栄養ドリンク等）、食品添加物、愛玩動物用食品、愛玩動物用栄養補助食品を挙げることができる。栄養補助食品又は食品添加物の場合、粉末、顆粒末、タブレット、ペースト、液体等の形状で提供することができる。食品組成物の形態で提供することによって、本発明の有効成分を日常的に摂取したり、継続的に摂取したりすることが容易となる。
【００３４】
本発明の食品組成物には、治療的又は予防的効果が期待できる量の有効成分が含有されることが好ましい。添加量は、それが使用される対象となる者の病状、健康状態、年齢、性別、体重などを考慮して定めることができる。
【００３５】
（３）化粧料
上記の通り本発明の一態様は、本発明の分化誘導剤を有効成分として含有する化粧料組成物である。本発明の化粧料組成物は、本発明の分化誘導剤と、化粧料に通常使用される成分・基材（例えば、各種油脂、ミネラルオイル、ワセリン、スクワラン、ラノリン、ミツロウ、変性アルコール、パルミチン酸デキストリン、グリセリン、グリセリン脂肪酸エステル、エチレングリコール、パラベン、カンフル、メントール、各種ビタミン、酸化亜鉛、酸化チタン、安息香酸、エデト酸、カミツレ油、カラギーナン、キチン末、キトサン、香料、着色料など）を配合することによって得ることができる。
【００３６】
化粧料組成物の形態として、フェイス又はボディー用の乳液、化粧水、クリーム、ローション、エッセンス、オイル、パック、シート、洗浄料などを例示できる。化粧料組成物における分化誘導剤の添加量は特に限定されない。例えば０．１重量％〜６０重量％となるように分化誘導剤を添加するとよい。
【実施例】
【００３７】
＜褐色脂肪細胞化誘導評価試験＞
（１）マウスC3H10t1/2細胞を用いた褐色脂肪細胞化誘導評価
C3H10t1/2細胞は10% FBS含有DMEM（Dulbecco’s modified eagle’s medium, high glucose、SIGMA）を用い、CO2インキュベーター内（37℃、CO2濃度5%）で培養した。細胞がハイパーコンフルエントになった時点で、コントロール群として、分化誘導剤として最終濃度がそれぞれ2μM インスリン（Insulin）（シグマ社）、1μM デキサメタソン（dexamethasone）（和光純薬）、0.5mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン（3-isobutyl-1-methylxanthine）（和光純薬）、3 nM T3 (トリヨードサイロニン;triiodothyronine)（和光純薬）を含む10% FBS含有DMEMに培地交換し（0日目とする）、2日間培養した。処理群は、コントロール群と同様の試薬添加培地にさらにアルテピリンＣ（ArtC）；（(E)-3-(4-hydroxy-3,5-bis(3-methylbut-2-enyl)phenyl)acrylic acid）あるいは、クルクミン、もしくはArtCとクルクミンを所定の最終濃度となるように添加しコントロールと同様に2日間培養した。その後コントロール群は2μM インスリン、3 nM T3含有10% FBS含有DMEMに培地交換して（3日目）培養を続け、2日間ごとに同様の培地に交換して6日間培養した（8日目）。処理群は、コントロール群と同様の試薬添加培地にさらにArtC又はクルクミン、或いはこれらの両者を所定の最終濃度となるように添加しコントロールと同様に2日間ごとに培地に交換して6日間培養した（8日目）。
【００３８】
（２）マウス鼠径部白色脂肪組織（iWAT）由来の間質血管画分（stromal vascular fraction：SVF画分）を用いた褐色脂肪細胞化誘導評価
C57BL/6Jマウス（雄、8〜9週齢、8匹：SLC）の鼠径部白色脂肪組織（iWAT）を採取した。採取したiWATをはさみで細かくした後、コラゲナーゼ溶液（TypeII, シグマ社）を加え37℃の恒温槽で30分間消化させた。その後遠心分離を行い、沈殿として得られるstromal vascular fraction：SVF画分を10％FBS-DMEMで懸濁し、細胞数が1.0×106 生細胞/wellになるように調製して12 wellコラーゲンコートプレート（コーニング社）に播き、CO2インキュベーター内に静置し培養した。細胞がハイパーコンフルエントになった時点で、（１）のC3H10t1/2細胞と同様に分化誘導を行い、コントロール群と処理群との間で褐色脂肪細胞化マーカー遺伝子発現量を比較した。但し分化誘導期間は11日間とした。
【００３９】
（３）核酸の回収
培養終了後、培地を取り除き、細胞をPBS(phosphate buffered saline)で洗浄した後に、1ウェルあたり1mLのQIAZOL（キアゲン社）を加え、セルスクレイパーで細胞を回収し、全量を滅菌済みの1.5 mL容チューブに加えてヴォルテックスミキサーでよく混合して5分間室温で静置した。その後、200μLのクロロホルムを加えてヴォルテックスミキサーでよく混合した後、そのまま室温で5分間静置した。次に、12000×g、4℃で15分間遠心分離し、水層を新しい1.5 mL容チューブに回収した。回収した液に同量のイソプロパノールを加えてよく混合し、室温で５分間静置した。次に、12000×g、4℃で15分間遠心分離し、上清を取り除いた。さらに1mLの冷70%エタノールを加えて軽く混合した後、12000×g、4℃で5分間遠心分離し、上清を取り除いた。そのまま沈殿を室温で５分間風乾させた。次に、沈殿にジエチルピロカーボネート（DEPC）で処理した水（DEPC処理水）20μLを加えてピペッティングを行い、よく混合した。分光光度計（NanoDrop ND-1000）を用いて、260nmにおける吸光度を測定し、RNA濃度を定量した。
【００４０】
（４）cDNA合成
ライフテクノロジー社のHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kitを用いて行った。得られたRNA 1μgを含む、13.2μLのDEPC処理水、2μLの10×reverse transcription buffer (ライフテクノロジー社）、0.8μLの100mM 25×dNTP Mixture (ライフテクノロジー社）、1μLの20U/μL ribonuclease inhibitor（ライフテクノロジー社）、1μLの50 U/μL MuLV reverse transcriptase（ライフテクノロジー社）、2μLの50μM 10×random primer（ライフテクノロジー社）を加え（計20μL）、25℃で10分間、37℃で120分間、85℃で5秒間反応させ、cDNAを合成した。
【００４１】
（５）リアルタイムPCRによるmRNAの定量
得られたcDNA 1μgを含む11.25μLのDEPC処理水、12.5μLのTakara premix Ex Taq（タカラバイオ社）、ROX reference dye（タカラバイオ社）及び1.25μLの褐色脂肪細胞化マーカー遺伝子発現定量用のマウス用Taqman (R) Gene expression Assays（ライフテクノロジー社）を加え（計25μL）、7300 real-time PCRシステム（アプライドバイオシステムズ社）のプロトコールに従ってリアルタイムPCRによる遺伝子発現量測定を行なった。各褐色脂肪細胞化マーカー遺伝子発現量のmRNA量と内因性コントロールとしてTATA box binding protein (TBP)遺伝子発現量のmRNA量を測定し、各褐色脂肪細胞化マーカー遺伝子発現量のmRNA量をTBP遺伝子発現量のmRNA量で割って補正した値を各褐色脂肪細胞化マーカー遺伝子発現量とし、コントロールの発現量を1.0とした時の各処理群の相対的発現量で表した。以下に使用したTaqman (R) Gene expression AssaysのAssayIDと測定した遺伝子を示す。
uncoupling protein 1 (UCP1)
Assay ID: Mm01244861_m1
cell death-inducing DNA fragmentation factor, alpha subunit-like effector A (Cidea)
Assay ID: Mm00432554_m1
cytochrome c oxidase subunit 8b (Cox8b)
Assay ID: Mm00432648_m1
elongation of very long chain fatty acids protein 3 (Elovl3)
Assay ID: Mm00468164_m1
TATA box binding protein (TBP)
Assay ID: Mm00446971_m1
【００４２】
統計処理は、Turkey-Kramer test（図２、３、５）あるいはStudent’s t test（図４）を用いた。コントロール群と試料投与群間においてp＜0.05を有意差ありとした。
【００４３】
＜結果＞
C3H10t1/2細胞において、ArtCの添加（1μM、5μM、10μM）は、コントロールと比較して濃度依存的に褐色脂肪細胞化マーカー（UCP1、Cidea、Cox8b、Elovl3）遺伝子発現量を有意に上昇させ、褐色脂肪細胞化を誘導した（図２）。同様の細胞系においてクルクミン単独の投与（10μM）は褐色脂肪細胞化マーカー遺伝子の発現量を有意に上昇させないが、ArtC（10μM）とクルクミン（10μM）の同時投与はArtC（10μM）単独投与の場合と比較して褐色脂肪細胞化マーカー（UCP1、Cidea、Elovl3）遺伝子発現量を有意に上昇させた（図３）。
【００４４】
マウス鼠径部白色脂肪組織（iWAT）由来のSVF画分を用いた褐色脂肪細胞化誘導評価において、ArtCの添加（10μM）は、C3H10t1/2細胞の時の結果と同様に、コントロールと比較して有意に褐色脂肪細胞化マーカー遺伝子発現（UCP1、Cidea、Cox8b、Elovl3）を有意に上昇させ、褐色脂肪細胞化を誘導した（図４）。同様の細胞系においてクルクミン単独の投与（10μM）は褐色脂肪細胞化マーカー遺伝子の発現量を有意に上昇させないが、ArtC（10μM）とクルクミン（10μM）の同時投与はArtC（10μM）単独投与の場合と比較して褐色脂肪細胞化マーカー（UCP1、Cidea、Cox8b、Elovl3）遺伝子発現量を有意に上昇させた（図５）。
【００４５】
以上の通り、ArtCに褐色脂肪細胞化を誘導する効果が認められた。また、クルクミンを併用すると、相乗的な効果が得られ、褐色脂肪細胞化が強く誘導された。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明の褐色脂肪細胞分化誘導剤は肥満の予防や治療に利用され得る。本発明の有効成分として用いられるアルテピリンＣやクルクミン等は天然由来成分（プロポリス、ウコンに由来する）である。天然由来成分が用いられることは安全性の点から有利且つ重要であり、日常的ないし継続的な摂取（投与）にも適する。
【００４７】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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