(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養用基材であって、表面の少なくとも一部がフッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物により構成され、
前記フッ素含有ポリマーが、下記式（ＩＩ−１）：
【化１】
0006488163.tif 000036
〔式中、Ｒ４２は以下の構造：
【化２】
0006488163.tif 000037
のいずれかである。〕
で表される繰り返し単位を含む含フッ素アリールエーテルケトンポリマーであることを特徴とする細胞培養用基材。
【請求項２】
前記樹脂組成物におけるフッ素含有量が１〜６０質量％である、請求項１に記載の細胞培養用基材。
【請求項３】
細胞培養用容器であって、
前記容器の少なくとも一部が請求項１又は２に記載の細胞培養用基材により構成されている
ことを特徴とする細胞培養用容器。
【請求項４】
細胞を培養する方法であって、
請求項１又は２に記載の細胞培養用基材の、前記樹脂組成物により構成される表面上で細胞を培養する工程を含む方法。
【請求項５】
細胞を培養する方法であって、
一方の表面の少なくとも一部がフッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物により構成される基材を用いて、前記基材の前記一方の表面に細胞及び培地が接し、前記基材の他方の表面が酸素含有ガスに接した状態で細胞を培養する工程を含み、
前記フッ素含有ポリマーが、下記式（ＩＩ−１）：
【化３】
0006488163.tif 000038
〔式中、Ｒ４２は以下の構造：
【化４】
0006488163.tif 000039
のいずれかである。〕
で表される繰り返し単位を含む含フッ素アリールエーテルケトンポリマーであることを特徴とする方法。
【請求項６】
前記培養工程が、細胞を三次元培養する工程である、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
細胞を三次元培養する前記工程が、前記細胞を培養してスフェロイド又は三次元細胞集合体を形成する工程である、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養用基材、該基材を備えた細胞培養用容器、該基材を用いて細胞を培養する方法、及び、該基材を用いて細胞から三次元的な組織を形成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓、膵臓、皮膚、血管等の各器官を形成する細胞は、生体内において、細胞同士が三次元的にネットワークを形成し機能を発現している。
【０００３】
そこでこれらの器官の機能を再生する再生医療の研究において、これらの器官の細胞を培養する場合には、細胞同士が三次元的にネットワークを形成できるような培養（すなわち三次元培養）が求められる。細胞同士が三次元的にネットワークを形成した最小の組織としてスフェロイドがある。しかしながら一般的な樹脂製の細胞培養基材の表面で細胞を培養する場合、細胞は平面状に広がって増殖し、三次元的なネットワークは形成されない。
【０００４】
三次元培養を行うための基材として従来から種々のものが開発されている。
例えば特許文献１では、熱可塑性の有機ポリマーから形成された基体と、該基体から延伸した柱状微小突起群とを備え、柱状微小突起群の突起に細胞を付着させて培養する細胞培養シートが開示されている。また特許文献２では、平面方向の形状が多角形であると共に最小内径が３μｍ以下である微小セルが複数連続して形成された、細胞接着面として機能する凹凸構造を有する細胞内容構造体が開示されている。
【０００５】
非特許文献１では、含フッ素ポリイミドが優れた生体適合性を有することに着目し、含フッ素ポリイミドの１種である６ＦＤＡ−６ＦＡＰの膜の表面上で細胞培養を行ったところ、表面が平坦な６ＦＤＡ−６ＦＡＰ膜上では細胞は二次元的に増殖してしまいスフェロイドが形成されないのに対して、ラビング処理により表面に微細な凹凸を形成するとスフェロイドが形成されたことを開示している。ここで６ＦＤＡ−６ＦＡＰとは、酸二無水物である２，２’−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）ヘキサフルオロプロパン二無水物（６ＦＤＡ）と、ジアミン化合物である２，２’−ビス（４−アミノフェニル）ヘキサフルオロプロパン（６ＦＡＰ）とを重合させたポリイミドである。非特許文献１の筆者らは、特許文献３において、ラビング処理していない平坦な６ＦＤＡ−６ＦＡＰ膜上で二次元的に血管内皮細胞を培養したのちにゲルに転写して血管組織を形成し、ラビング処理した凹凸表面の６ＦＤＡ−６ＦＡＰ膜上で三次元的に肝癌細胞を培養してスフェロイドを形成し、両者を組み合わせることを開示する。
【０００６】
特許文献４〜６は、凸凹形状の構造体を形成するための含フッ素ポリイミド、含フッ素ポリイミドを含む樹脂組成物から得られるフィルム及び膜を開示する。
【０００７】
特許文献７は、細胞培養用容器を、気体透過性プラスチック材料により形成する技術を開示する。特許文献７は酸素供給の装置を必要としない細胞培養用容器の提供を目的としている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第４８９７１９２号公報
【特許文献２】特許第４１５９１０３号公報
【特許文献３】特開２００９−２１３７１６号公報
【特許文献４】特開２０１４−８３７８３号公報
【特許文献５】特開２０１４−２１０４０４号公報
【特許文献６】特開２０１５−１７２３２号公報
【特許文献７】特許第３７６１６７６号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｎ．  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  １９，  １００２  （２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特許文献１及び２に開示されている三次元培養用の細胞培養基板はいずれも基材表面に微細な凹凸構造を形成することで三次元培養を可能にするものであった。このような基材は、微細な凹凸の作成が容易ではなく加工コストがかかるという問題があった。また微細な凹凸を有する基板の表面上で細胞培養を行う場合、液体培地を基材表面に適用したときに基材表面上に気泡が残り易いため、基材表面に液体培地を適用した後に脱泡処理が必要であるという問題もあった。
【００１１】
非特許文献１及び特許文献３に開示されている、含フッ素ポリイミドである６ＦＤＡ−６ＦＡＰのラビング処理された膜を備えた細胞培養用基材は、特許文献１及び２と比較して簡便に作成可能ではあるが、特許文献１及び２と同様の問題は有しており、なお改善の余地があった。
【００１２】
そこで本発明は、三次元的な組織培養が可能なフッ素含有ポリマーを表面に備えた細胞培養用基材を提供することを目的とする。
【００１３】
一方、特許文献７の容器は三次元組織の形成を目的としたものではなく、特許文献７の容器を用いて三次元組織の形成が可能であるか否かは一切検討されていない。
【００１４】
そこで本発明は、三次元的な組織培養が可能な細胞培養用基材、該基材を備えた細胞培養用容器、該基材を用いた細胞の培養方法を提供することをも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、フッ素含有芳香族環を有し、主鎖にエーテル結合を有するフッ素含有ポリマーを表面に含む基材上では、細胞がスフェロイド、三次元細胞集合体等の三次元的な組織を形成することができるという驚くべき知見を見出した。
【００１６】
したがって、第１の態様において、本発明は、
表面の少なくとも一部がフッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物により構成され、
前記フッ素含有ポリマーが、フッ素含有芳香族環を有し、主鎖にエーテル結合を有するポリマーである
ことを特徴とする細胞培養用基材に関する。
【００１７】
上記特徴を備える細胞培養用基材は、その表面上で細胞が三次元的な組織を形成することが可能となるものである。また、本発明の基材は、細胞の足場となる表面に立体的な構造を付与する必要がないため製造が容易である。
【００１８】
上記細胞培養用基材の好適な実施形態では、酸素ガス透過度が２１９ｃｍ３（ＳＴＰ）／（ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ）以上である。
【００１９】
上記細胞培養用基材の好適な実施形態では、前記樹脂組成物の酸素ガス透過係数が０．１０×１０−１０ｃｍ３（ＳＴＰ）・ｃｍ／（ｃｍ２・ｓ・ｃｍＨｇ）以上である。
【００２０】
上記実施形態によれば、細胞により多くの酸素が供給され易く、細胞の生育とスフェロイド、三次元細胞集合体等の三次元的な組織の形成が進み易い。
【００２１】
また上記細胞培養用基材の好適な実施形態では、前記樹脂組成物におけるフッ素含有量が１〜６０質量％である。
この実施形態によれば、基材表面上での三次元的組織が形成され易く好ましい。
【００２２】
上記細胞培養用基材の好適な実施形態では、前記フッ素含有ポリマーが、下記式（ＩＩ−１）：
【化１】
0006488163.tif 000002
〔式中、Ｒ４２は以下の構造：
【化２】
0006488163.tif 000003
のいずれかである。〕
で表される繰り返し単位を含む含フッ素アリールエーテルケトンポリマーである。
この実施形態によれば、透明で適度に細胞が付着した３次元的な組織が形成する足場となる。また、細胞により多くの酸素が供給され易く、細胞の生育と三次元的な組織の形成が進み易い。
【００２３】
また本発明者らは、フッ素含有ポリマーを表面に含む基材を用い、例えば、シングル若しくはマルチタイプのプレートやシャーレの底部に基材を設置して培養を行った時、さらに好ましくは、酸素ガス透過性の高い樹脂組成物を含む基材を用い、該基材のフッ素含有ポリマーを含む表面に細胞及び培地を接触させ、培地上面に加えて該基材の他方の表面を空気等の酸素含有ガスと接触させた状態で細胞培養を行うとき、細胞がスフェロイド、三次元細胞集合体等の三次元的な組織を形成することができるという驚くべき知見を見出し、本発明を完成するに至った。
【００２４】
したがって、第２の態様において、本発明は、
容器の少なくとも一部が前記細胞培養用基材により構成されている
ことを特徴とする細胞培養用容器に関する。
【００２５】
本発明の細胞培養用容器を用いると、適度な柔軟性と疎水性を備えた培養表面を有するため細胞の生育とスフェロイド、三次元細胞集合体等の三次元的な組織の形成が進み易い。更に、該基材のフッ素含有ポリマーを含む表面に細胞及び培地を接触させ、培地上面に加えて該基材の他方の表面を空気等の酸素含有ガスと接触させた状態で細胞培養を行うとき、細胞の生育とスフェロイド、三次元細胞集合体等の三次元的な組織の形成が進み易い。
【００２６】
本発明はまた、前記細胞培養用基材の、前記樹脂組成物により構成される表面上で細胞を培養する工程を含む、細胞を培養する方法に関する。
【００２７】
本発明はさらに、一方の表面の少なくとも一部がフッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物により構成される基材を用いて、前記基材の前記一方の表面に細胞及び培地が接し、前記基材の他方の表面が酸素含有ガスに接した状態で細胞を培養する工程を含み、
前記フッ素含有ポリマーが、フッ素含有芳香族環を有し、主鎖にエーテル結合を有するポリマーである
ことを特徴とする細胞を培養する方法に関する。
【００２８】
本発明の細胞培養方法では、細胞の足場となる表面を所定の樹脂組成物により構成することにより、細胞の三次元培養が可能となる。
【００２９】
上記方法の好適な実施形態では、前記培養工程は、細胞を三次元培養する工程である。
【００３０】
上記方法の好適な実施形態では、細胞を三次元培養する前記工程は、前記細胞を培養してスフェロイド又は三次元細胞集合体を形成する工程である。
【００３１】
本発明の方法によれば、簡便な操作により、細胞の培養と、スフェロイド等の三次元的な組織の形成が可能である。
【００３２】
本発明において「樹脂組成物」は「樹脂」と言い換えることもできる。フッ素含有ポリマーは通常は重合度が異なる多数のフッ素含有ポリマー分子からなることから、フッ素含有ポリマーを含有する樹脂を「樹脂組成物」と称する。本発明において「樹脂組成物」又は「樹脂」は、本発明の効果を損なわない範囲の量の他の成分を含んでいてもよいし、含んでいなくともよい。他の成分としては、本発明の効果を損なわない範囲の量の、重合反応に使用される成分や、通常の添加剤であることができる。
【発明の効果】
【００３３】
本発明の細胞培養用基材では、細胞の足場となる表面を所定の樹脂組成物により構成することにより、細胞の三次元培養が可能となる。
【００３４】
また本発明によれば細胞からスフェロイド、三次元細胞集合体等の三次元組織を形成することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、本発明の細胞培養用基材の実施形態１において、樹脂組成物により構成されるフィルム１を、フィルム１の主面に対して垂直な平面に沿って切った断面を模式的に示す図である。
【図２】図２は、本発明の細胞培養用基材の実施形態２において、樹脂組成物により構成されるフィルム１及び支持体２を、フィルム１の主面に対して垂直な平面に沿って切った断面を模式的に示す図である。
【図３】図３は、本発明の細胞培養方法での、基材１０と、培地２と、細胞３と、外気（酸素含有ガス）４との位置関係を説明する模式図である。
【図４−１】本発明の細胞培養用容器の一実施形態を示す。
【図４−２】本発明の細胞培養用容器の別の実施形態を示す。（ａ）細胞培養用容器１００の縦断面の模式図である。（ｂ）細胞培養用容器１００を用いて細胞培養を行う方法を説明するための図である。
【図５】本発明の細胞培養用容器の他の実施形態を示す。（ａ）細胞培養用容器１００の斜視図である。（ｂ）細胞培養用容器１００のＡ−Ａ断面の模式図である。（ｃ）別の実施形態の細胞培養用容器１００のＡ−Ａ断面の模式図である。
【図６】本発明の細胞培養用容器の更なる実施形態を示す。
【図７】ラット初代肝細胞の培養結果を示す写真である。（Ａ）は、蓋付きコラーゲンタイプＩコートマイクロプレート２４Ｗｅｌｌ（旭硝子社）での培養結果を示す。（Ｂ）は、本発明のＦＰＥＫ膜での培養結果を示す。
【図８】ラット初代肝細胞の培養５日目の培養液でのアルブミンの定量結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
１．フッ素含有ポリマー
本発明で用いるフッ素含有ポリマーは、フッ素含有芳香族環を有し、主鎖にエーテル結合を有するポリマーである。好ましくは、以下の式（Ｉ−１）：
【化３】
0006488163.tif 000004
〔式中、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３及びＲ３４のうち少なくとも１個がフッ素原子であり、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３及びＲ３４がフッ素原子ではない場合、それぞれ独立して、水素原子（Ｈ）、シアノ基（ＣＮ）、置換基を有してもよい炭素原子数１〜１２のアルキル基、置換基を有してもよい炭素原子数１〜１２のアルコキシ基、置換基を有してもよい炭素原子数１〜１２のアルキルアミノ基、置換基を有してもよい炭素原子数１〜１２のアルキルチオ基、置換基を有してもよい炭素原子数６〜２０のアリール基、置換基を有してもよい炭素原子数６〜２０のアリールオキシ基、置換基を有してもよい炭素原子数６〜２０のアリールアミノ基、又は置換基を有してもよい炭素原子数６〜２０のアリールチオ基である。〕
で表される構造を繰り返し単位中に含み、主鎖にエーテル結合を有するポリマーである。
【００３７】
式（Ｉ−１）において、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３及びＲ３４のうち少なくとも２個がフッ素原子であることが好ましい。あるいは、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３及びＲ３４のすべてがフッ素原子であってもよい。
【００３８】
本発明において使用する樹脂組成物中のフッ素含有量は、１〜６０質量％、好ましくは５〜６０質量％、より好ましくは１０〜６０質量％、さらに好ましくは１５〜５０質量％である。かかるフッ素含有量の樹脂組成物により構成される基材表面では細胞が三次元的な組織を形成し易い。
【００３９】
１．１．フッ素含有ポリマーの具体例（１）
本発明において使用するフッ素含有ポリマーの具体例は、下記式（ＩＩ−２）：
【化４】
0006488163.tif 000005
〔式中、ｎは重合度を表し、ｍは０又は１の整数であり、Ｒ４１は下記式（ＩＩ−３）：
【化５】
0006488163.tif 000006
（式中、ｐは０又は１の整数であり、Ｒ４２は以下の構造：
【化６】
0006488163.tif 000007
のいずれかである。）で表される基である。〕
で示される含フッ素アリールエーテルケトン重合体である。
【００４０】
式（ＩＩ−２）において、重合度ｎは、具体的には２〜５０００、好ましくは５〜５００である。さらに、本発明において、含フッ素アリールエーテルケトン重合体は、同一の繰り返し単位からなるものであっても又は異なる繰り返し単位からなるものであってもよく、後者の場合には、その繰り返し単位はブロック状又はランダム状のいずれでもよい。
【００４１】
なお、本発明において、上記式（ＩＩ−２）で示される含フッ素アリールエーテルケトン重合体の製造方法については詳述するが、この記載から、式（ＩＩ−２）で示される含フッ素アリールエーテルケトン重合体の末端は、フッ素原子を含むベンゼン環側がフッ素であり、Ｒ４１側が水素原子であると、即ち、式（ＩＩ−２）で示される含フッ素アリールエーテルケトン重合体は下記式（ＩＩ−１１）：
【化７】
0006488163.tif 000008
〔式中、ｎは重合度を表し、ｍは０又は１の整数であり、Ｒ４１は上で定義した通りである。〕
で示される含フッ素アリールエーテルケトン重合体であると考えられる。
【００４２】
上記式（ＩＩ−２）において、ｍが０の場合には、下記式（ＩＩ−４）：
【化８】
0006488163.tif 000009
〔式中、ｎは重合度を表す。〕
で示される含フッ素アリールエーテルケトン重合体となる。
【００４３】
また、上記式（ＩＩ−２）において、ｍが１でありかつｐが０である場合には、下記式（ＩＩ−５）：
【化９】
0006488163.tif 000010
〔式中、ｎは重合度を表す。〕
で示される含フッ素アリールエーテルケトン重合体となる。
【００４４】
さらに、上記式（ＩＩ−２）において、ｍが１でありかつｐが１である場合には、下記式（ＩＩ−６）：
【化１０】
0006488163.tif 000011
〔式中、ｎは重合度を表し、Ｒ４２は前記のとおりである。〕
で示される含フッ素アリールエーテルケトン重合体となる。なお、上記式（ＩＩ−６）では、ｎは、好ましくは２〜２０００、より好ましくは５〜２００である。
【００４５】
すなわち、好ましい実施形態において、式（ＩＩ−２）で示される含フッ素アリールエーテルケトン重合体は、下記式（ＩＩ−１）：
【化１１】
0006488163.tif 000012
〔式中、Ｒ４２は前記のとおりである。〕
で表される繰り返し単位を含むポリマーである。
【００４６】
特に好ましい実施形態において、式（ＩＩ−２）で示される含フッ素アリールエーテルケトン重合体は、下記式（ＩＩ−１２）：
【化１２】
0006488163.tif 000013
で表される繰り返し単位を含むポリマーである。
【００４７】
これらのうち、式（ＩＩ−３）及び（ＩＩ−４）で示される含フッ素アリールエーテルケトン重合体は、塩基性化合物の存在下で、有機溶媒中で、下記式（ＩＩ−９）：
【化１３】
0006488163.tif 000014
〔式中、ｑは０又は１の整数である。〕
で示される２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾイル化合物を加熱することにより得られる。
【００４８】
上記反応において、反応温度は、３０〜２５０℃、好ましくは５０〜２００℃である。
また、下記式（ＩＩ−６）：
【化１４】
0006488163.tif 000015
〔式中、Ｒ４２は前記のとおりであり、ｎは重合度である。〕
で示される含フッ素アリールエーテルケトン重合体は、塩基性化合物の存在下で、有機溶媒中で、下記式（ＩＩ−８）：
【化１５】
0006488163.tif 000016
で示される４，４’−ビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾイル）ジフェニルエーテル及び下記式（ＩＩ−１０）：
【化１６】
0006488163.tif 000017
〔式中、Ｒ４２は以下の構造：
【化１７】
0006488163.tif 000018
のいずれかである。〕
で示される２価のフェノール化合物を加熱することよって、得られる。
【００４９】
上記反応において、反応温度は、２０〜１５０℃、好ましくは５０〜１２０℃である。この際、このように低温度で反応することで副反応を抑制し、重合体のゲル化を防止することができる。また、重合時間は、他の反応条件や使用する原料などにより異なるが、好ましくは、１〜４８時間、より好ましくは２〜２４時間である。さらに、重合反応は、常圧下又は減圧下いずれで行ってもよいが、設備面から、常圧下で行うことが望ましい。
【００５０】
上記重合反応で使用される有機溶媒としては、例えば、Ｎ−メチルピロリジノン、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド及びメタノール等の極性溶媒やトルエンなどが挙げられる。これらの有機溶媒は、単独で又は２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。
【００５１】
また、有機溶媒におけるペンタフルオロベンゾイルジフェニルエーテル化合物の濃度は、５〜５０重量％、好ましくは１０〜３０重量％である。
【００５２】
トルエンや他の同様の溶媒を反応の初期段階に使用する際には、フェノキシド生成の際に副生する水を、重合溶媒に関係なく、トルエンの共沸物として除去できる。
【００５３】
本発明において使用される塩基性化合物は、重縮合反応によって生成するフッ化水素を捕集することにより重縮合反応を促進するよう作用し、さらに２価のフェノール化合物による重縮合反応の場合には、フェノール化合物をより反応性の高いアニオンに変える作用がある。
【００５４】
このような塩基性化合物としては、例えば、炭酸カリウム、炭酸リチウム及び水酸化カリウムが挙げられる。
【００５５】
また、本発明において、塩基性化合物の使用量は、式（ＩＩ−３）及び（ＩＩ−４）の重合体の場合では、使用されるペンタフルオロベンゾイルジフェニルエーテル化合物１モルに対して、０．５〜１０モル、好ましくは０．５〜５モルであり、又は、式（ＩＩ−５）の重合体の場合では、使用されるペンタフルオロベンゾイルジフェニルエーテル化合物１モルに対して、１〜２０モル、好ましくは１〜１０モルである。
【００５６】
本発明において使用される２価のフェノール化合物としては、例えば、２，２−ビス（４−ビドロキシフェニル）−１，１，１，３，３，３−へキサフルオロプロパン（以下、「６ＦＢＡ」という）、ビスフェノールＡ（以下、「ＢＡ」という）、９，９−ビス（４−ヒドロキシフェニル）フルオレン（以下、「ＨＦ」という）、ビスフェノールＦ（以下、「ＢＦ」という）、ハイドロキノン（以下、「ＨＱ」という）及びレゾルシノール（以下、「ＲＳ」という）が挙げられる。２価のフェノール化合物の使用量は、４，４’−ビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾイル）ジフェニルエーテル１モルに対して、０．８〜１．２モル、好ましくは０．９〜１．１モルである。
【００５７】
例えば、塩基性化合物の存在下で、有機溶媒中で、４，４’−ビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾイル）ジフェニルエーテルと、２価のフェノール化合物として６ＦＢＡとを反応させることにより、上記式（ＩＩ−１２）で表される繰り返し単位を含む含フッ素アリールエーテルケトンポリマーを生成することができる。
【００５８】
重合反応終了後は、反応溶液より蒸発等により溶媒の除去を行ない、必要により留出物を洗浄することによって、所望の重合体が得られる。又は、反応溶液を重合体の溶解度が低い溶媒中に加えることにより、重合体を固体として沈殿させ、沈殿物を濾過により分離することによって、重合体を得てもよい。
【００５９】
１．２．フッ素含有ポリマーの具体例（２）
フッ素含有ポリマーの別の具体例は、下記式（ＩＩＩ−１）：
【００６０】
【化１８】
0006488163.tif 000019
〔式中、ｍ’及びｎ’は、同一又は異なって、ベンゼン環に付加しているフッ素原子の数を表し、１〜４の整数である。Ｒ５１及びＲ５２は、同一又は異なって、炭素数１〜１５０の２価の有機基を表す。ｐは、重合度を表す。〕
で表される繰り返し単位を必須とする含フッ素アリールエステル重合体である。
【００６１】
本発明において使用する含フッ素アリールエステル重合体は、上記式（ＩＩＩ−１）で表される繰り返し単位を必須とするものである限り、その他の繰り返し単位を含んでいてもよいが、上記式（ＩＩＩ−１）で表される繰り返し単位が含フッ素アリールエステル重合体を構成する繰り返し単位の主成分であることが好ましい。なお、含フッ素アリールエステル重合体においては、上記式（ＩＩＩ−１）で表される繰り返し単位の構造は、同一であっても異なっていてもよく、異なる繰り返し単位により構成される場合には、ブロック状、ランダム状等のいずれの形態であってもよい。
【００６２】
上記式（ＩＩＩ−１）で表される繰り返し単位において、（−Ｏ−Ｒ５２−Ｏ−）の部分は、ベンゼン環のエステル結合している炭素に対して、オルト位、メタ位、パラ位のいずれの炭素に結合していてもよいが、オルト位又はパラ位に結合しているものが好ましい。本発明において使用する含フッ素アリールエステル重合体においては、フッ素原子を有するベンゼン環は、４つの水素原子の一部又は全部がフッ素原子に置換された形態となっており、また、ベンゼン環の水素原子がフッ素原子以外のハロゲン原子や、アルキル鎖を有する置換基等のその他の置換基により置換された形態となっていてもよい。したがって、１つのベンゼン環において水素原子とフッ素原子、及び、フッ素原子以外のハロゲン原子や、その他の置換基との合計は４である。
【００６３】
Ｒ５１、Ｒ５２は、同一又は異なって、炭素数１〜１５０の２価の有機基を表すが、２価の有機基としては、炭素数１〜５０の有機基であることが好ましい。より好ましくは、下記式（８−１）〜（８−１９）で表される基のいずれかである。
【００６４】
【化１９】
0006488163.tif 000020
【００６５】
上記式（８−１）〜（８−１９）中、Ｙ１、Ｙ１’、Ｙ２、Ｙ２’、Ｙ３及びＹ４は、同一若しくは異なって、置換基を表し、１つのベンゼン環は、０〜４個のＹ１、Ｙ２、Ｙ３及びＹ４、０〜３個のＹ１’及びＹ２’を置換基として有する。Ｙ１、Ｙ１’、Ｙ２、Ｙ２’、Ｙ３及びＹ４で表される置換基としては、例えば、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいアルキル基、アルコキシ基、アルキルアミノ基、アルキルチオ基、アリール基、アリールオキシ基、アリールアミノ基、アリールチオ基等が挙げられる。
【００６６】
本発明において使用する含フッ素アリールエステル重合体においては、上記式（８−１）〜（８−１９）で表される基のベンゼン環が置換基を1つ以上有し、その置換基が炭素数１〜３０であって、置換基を有していてもよいアルキル基、アルコキシ基等であること、又は、ベンゼン環が置換基を有しないことが好ましい。より好ましくは、ベンゼン環は置換基を有しない。すなわち、下記式（９−１）〜（９−１９）で表される基であることが好ましい。
【００６７】
【化２０】
0006488163.tif 000021
【００６８】
本発明において使用する含フッ素アリールエステル重合体においては、上記式（ＩＩＩ−１）中、Ｒ５１の構造が上記（９−６）又は（９−１８）のいずれかであって、かつベンゼン環が置換基を有さないものであることが好ましい。すなわち、本発明の含フッ素アリールエステル重合体は、下記式（ＩＩＩ−２）：
【化２１】
0006488163.tif 000022
〔式中、ｍ’及びｎ’は、同一又は異なって、ベンゼン環に付加しているフッ素原子の数を表し、１〜４の整数である。Ｒ５２は、同一又は異なって、炭素数１〜１５０の２価の有機基を表す。ｐは、重合度を表す。〕
で表される繰り返し単位及び／又は下記式（ＩＩＩ−３）；
【化２２】
0006488163.tif 000023
〔式中、ｍ’及びｎ’は、同一又は異なって、ベンゼン環に付加しているフッ素原子の数を表し、１〜４の整数である。Ｒ５２は、同一又は異なって、炭素数１〜１５０の２価の有機基を表す。ｐは、重合度を表す。〕
で表される繰り返し単位を必須とするものであることが好ましい。
【００６９】
含フッ素アリールエステル重合体の数平均分子量（Ｍｎ）としては、要求される特性等に合わせて適宜設定すればよいが、１０００以上、１００００００以下であることが好ましい。より好ましくは、３０００以上、５０００００以下である。数平均分子量は、ＧＰＣ（東ソー社製、ＨＬＣ−８１２０ＧＰＣ）を用いて、標準サンプルにポリスチレン、展開溶媒にＴＨＦを用いて測定することができる。
【００７０】
上記式（ＩＩＩ−１）で表される含フッ素アリールエステル重合体の製造方法は、特に制限されないが、含フッ素エステル化合物とジヒドロキシ化合物とを重合する工程を含む製造方法が好ましい。また、反応効率の点から、この工程は、塩基性触媒存在下で行われることが好ましい。
【００７１】
すなわち、上記式（ＩＩＩ−１）で表される含フッ素アリールエステル重合体は、下記式（ＩＩＩ−４）：
【化２３】
0006488163.tif 000024
〔式中、ｍ及びｎは、同一又は異なって、ベンゼン環に付加しているフッ素原子の数を表し、１〜５の整数である。Ｒ５１は、炭素数１〜１５０の２価の有機基を表す。〕
で表される含フッ素エステル化合物と下記式（ＩＩＩ−５）：
【化２４】
0006488163.tif 000025
〔式中、Ｒ５２は、炭素数１〜１５０の２価の有機基を表す。〕
で表されるジヒドロキシ化合物とを塩基性触媒存在下で重合する工程を含む製造方法により製造されることが好ましい。
【００７２】
上記式（ＩＩＩ−４）で表される含フッ素エステル化合物は、反応性が高いことから、上記製造方法のように、この含フッ素エステル化合物を原料として重合体を製造する場合には、均一系での重合、界面重合等、重合方法を選ばず様々な重合方法を用いることができ、また、従来の含フッ素化合物を用いた重合反応に比べて低温である１５０℃以下の条件下でも重合することが可能である。
【００７３】
上記製造方法においては、ジヒドロキシ化合物由来の構造（−Ｏ−Ｒ５２−Ｏ−）の部分がベンゼン環のエステル基が結合している炭素に対して、オルト位、メタ位、パラ位のいずれの炭素に結合していてもよいが、オルト位又はパラ位に結合したものが好ましい。また、１つのベンゼン環にジヒドロキシ化合物由来の部分が２つ以上結合すると、架橋構造を形成することになる場合があるが、架橋構造を有すると生成する重合体がゲル化することから、架橋構造が少ないものが好ましい。上記製造方法においては、反応温度と反応時間、用いる溶媒や塩基性触媒の種類と濃度、原料の仕込み順序や反応系中の水分量等によって架橋構造の生成しやすさが異なるため、それぞれを最適化することにより、架橋構造の生成を抑制することが可能となる。
【００７４】
上記製造方法における重縮合反応においては、反応原料の有効利用及び生成物の収率の向上の点から、原料として使用されるジヒドロキシ化合物と含フッ素エステル化合物との比率を適宜設定することが好ましく、含フッ素エステル化合物１モルに対して、ジヒドロキシ化合物を０．８〜１．２モル使用することが好ましい。より好ましくは、ジヒドロキシ化合物を０．９〜１．１モル使用することである。
【００７５】
上記製造方法における重縮合反応の反応温度としては、０〜１００℃とすることが好ましく、より好ましくは１０〜８０℃である。また、反応時間は、１〜４０時間とすることが好ましく、より好ましくは１〜３０時間である。更に、上記反応は、減圧下、常圧下又は加圧下のいずれで行われてもよいが、設備面等を考慮すると、常圧下で反応を行うことが好ましい。
【００７６】
上記製造方法における重縮合反応においては、含フッ素エステル化合物が溶媒への溶解性に優れていることに起因して様々な溶媒を用いることができ、アセトニトリル、ベンゾニトリル等のニトリル類；ニトロベンゼン、ニトロメタン等のニトロ類；アセトン、メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、シクロヘキサノン等のケトン類；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、クロロエタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、テトラクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類；ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン等の炭化水素類；ジエチルエーテル、イソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ジフェニルエーテル、ベンジルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルエーテル等のエーテル類；蟻酸メチル、蟻酸エチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル等のエステル類；Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）等を用いることができる。これらは、単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、アセトン、アセトニトリル、メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）が好ましい。溶媒の量としては、上記反応を効率良く進行できる量であればよいが、含フッ素エステル化合物が溶媒中に１〜５０質量％となるような量とすることが好ましく、より好ましくは１〜３０質量％存在するような量である。
【００７７】
上記製造方法における重縮合反応において用いられる塩基性化合物としては、重縮合反応によって生成するフッ化水素を捕集することにより重縮合反応を促進するよう作用し、更に上述したようなジヒドロキシ化合物をより反応性の高いアニオンに変える作用があるものが好適であり、例えば、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、フッ化カリウム、トリブチルアミン、ピリジン、炭酸カリウム、炭酸リチウム、水酸化カリウム、トリエチルアミン等の１種又は２種以上が好適である。このような塩基性化合物の使用量としては、使用される含フッ素エステル化合物１モルに対して、０．５〜２０モルが好ましい。より好ましくは０．８〜１０モルである。
【００７８】
上記重縮合反応終了後は、蒸発等により反応溶液中の溶媒の除去を行い、必要により留出物を洗浄することによって、上記式（ＩＩＩ−１）で表される繰り返し単位を有する含フッ素アリールエステル重合体が得られることになる。また、反応溶液を重合体の溶解度が低い溶媒中に加えることにより、含フッ素アリールエステル重合体を固体として沈殿させ、沈殿物を濾過により分離することによって得ることもできる。
【００７９】
本発明の含フッ素アリールエステル重合体は、溶剤への溶解性に優れることから、フィルム状、ファイバー状等の様々な形状の成形体に成形して用いることが可能である。本発明の含フッ素アリールエステル重合体を含む成形体は、溶剤溶解性に優れることに起因して成形加工性が高いことに加え、耐熱性、低吸湿性、透明性、耐候性、撥水性及び電気的特性に優れたものである。
【００８０】
１．３．フッ素含有ポリマーの具体例（３）
本発明において使用することができるフッ素含有ポリマーの別の具体例は、下記式（ＩＶ−１）：
【化２５】
0006488163.tif 000026
〔式中、Ｒ３１は、置換基を有してもよい炭素原子数１〜１２のアルキル基、置換基を有してもよい炭素原子数１〜１２のアルコキシ基、置換基を有してもよい炭素原子数１〜１２のアルキルアミノ基、置換基を有してもよい炭素原子数１〜１２のアルキルチオ基、置換基を有してもよい炭素原子数６〜２０のアリール基、置換基を有してもよい炭素原子数６〜２０のアリールオキシ基、置換基を有してもよい炭素原子数６〜２０のアリールアミノ基又は置換基を有してもよい炭素原子数６〜２０のアリールチオ基を表し；Ｒ６１は、２価の有機基を表し；並びにｎは重合度を表す。〕
で示されるポリシアノアリールエーテルである。
【００８１】
前記式（ＩＶ−１）において、Ｒ３１は、置換基を有してもよい炭素原子数１〜１２のアルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル及び２−エチルヘキシル、好ましくはメチル、エチル、プロピル及びブチル；置換基を有してもよい炭素原子数１〜１２のアルコキシ基、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、２−エチルヘキシルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、フルフリルオキシ及びアリルオキシ、好ましくはメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ及びブトキシ；置換基を有してもよい炭素原子数１〜１２のアルキルアミノ基、例えば、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、プロピルアミノ、ｎ−ブチルアミノ、ｓｅｃ−ブチルアミノ及びｔｅｒｔ−ブチルアミノ、好ましくはメチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ及びジエチルアミノ；置換基を有してもよい炭素原子数１〜１２のアルキルチオ基、例えば、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ及びｎ−ブチルチオ、ｓｅｃ−ブチルチオ、ｔｅｒｔ−ブチルチオ及びｉｓｏ−プロピルチオ、好ましくは、メチルチオ、エチルチオ及びプロピルチオ；置換基を有してもよい炭素原子数６〜２０のアリール基、例えば、フェニル、ベンジル、フェネチル、ｏ−，ｍ−若しくはｐ−トリル、２，３−若しくは２，４−キシリル、メシチル、ナフチル、アントリル、フェナントリル、ビフェニリル、ベンズヒドリル、トリチル及びピレニル、好ましくはフェニル並びにｏ−，ｍ−及びｐ−トリル；置換基を有してもよい炭素原子数６〜２０のアリールオキシ基、例えば、フェノキシ、ベンジルオキシ、ヒドロキシ安息香酸及びそのエステル類（例えば、メチルエステル、エチルエステル、メトキシエチルエステル、エトキシエチルエステル、フルフリルエステル及びフェニルエステルなど；以下、同様）由来の基、ナフトキシ、ｏ−，ｍ−若しくはｐ−メチルフェノキシ、ｏ−，ｍ−若しくはｐ−フェニルフェノキシ、フェニルエチニルフェノキシ、並びにクレソチン酸及びそのエステル類由来の基、好ましくはフェノキシ及びナフトキシ；置換基を有してもよい炭素原子数６〜２０のアリールアミノ基、例えば、アニリノ、ｏ−，ｍ−若しくはｐ−トルイジノ、１，２−若しくは１，３−キシリジノ、ｏ−，ｍ−若しくはｐ−メトキシアニリノ並びにアントラニル酸及びそのエステル類由来の基、好ましくはアニリノ及びｏ−，ｍ−若しくはｐ−トルイジノ；又は置換基を有してもよい炭素原子数６〜２０のアリールチオ基、例えば、フェニルチオ、フェニルメタンチオ、ｏ−，ｍ−若しくはｐ−トリルチオ並びにチオサリチル酸及びそのエステル類由来の基、好ましくはフェニルチオを表す。これらのうち、置換基を有してもよいアリールオキシ基、アリールチオ基及びアリールアミノ基が好ましく、さらに、フェノキシ、フェニルチオ及びアニリノがＲ３１として最も好ましい。
【００８２】
また、上記式（ＩＶ−１）において、Ｒ３１が置換基を有するアルキル基、アルコキシ基、アルキルアミノ基、アルキルチオ基、アリール基、アリールオキシ基、アリールアミノ基又はアリールチオ基を表す際に使用できる置換基としては、目的物の所望の特性に応じて適宜選択でき、特に制限されるものではないが、例えば、炭素原子数１〜１２のアルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル及びドデシル；ハロゲン原子、例えば、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素；シアノ基、ニトロ基並びにカルボキシエステル基などが挙げられる。これらのうち、好ましくはメチル及びカルボキシエステル基である。
【００８３】
さらに、上記式（ＩＶ−１）において、Ｒ６１は、２価の有機基を表し、例えば、下記式で示される基が挙げられる。
【化２６】
0006488163.tif 000027
【００８４】
これらのうち、下記式：
【化２７】
0006488163.tif 000028
で示される２価の有機基がＲ６１として好ましく、特に下記式：
【化２８】
0006488163.tif 000029
で示される２価の有機基がＲ６１として好ましい。
【００８５】
さらに、上記式（ＩＶ−１）において、ｎは重合度を表し、具体的には、５〜１０００、好ましくは１０〜５００である。なお、本発明において使用するポリシアノアリールエーテルは、上記式（ＩＶ−１）の構成単位の同一の繰り返し単位からなるものであっても又は異なる繰り返し単位からなるものであってもよく、後者の場合には、その繰り返し単位はブロック状又はランダム状のいずれでもよい。
【００８６】
また、本発明のポリシアノアリールエーテルの製造方法については以下に詳述するが、この記載から、式（ＩＶ−１）で示されるポリシアノアリールエーテルの末端は、フッ素原子を含むベンゼン環側がフッ素であり、酸素原子（Ｒ６１）側が水素原子であると、即ち、式（ＩＶ−１）で示されるポリシアノアリールエーテルは下記式（ＩＶ−４）：
【化２９】
0006488163.tif 000030
で示されるポリマーであると考えられる。
【００８７】
本発明のポリシアノアリールエーテルは、下記式（ＩＶ−２）：
【化３０】
0006488163.tif 000031
で示されるテトラフルオロベンゾニトリル誘導体を、下記式（ＩＶ−３）：
【化３１】
0006488163.tif 000032
で示されるジヒドロキシ化合物と塩基性触媒の存在下で重合することによって、製造される。この際、上記式（ＩＶ−２）におけるＲ３１及び上記式（ＩＶ−３）におけるＲ６１の定義は、上記式（ＩＶ−１）におけるＲ３１及びＲ６１の定義と同様である。
【００８８】
本発明において、式（ＩＶ−２）のテトラフルオロベンゾニトリル誘導体は、公知の方法によって製造できるが、例えば、式：Ｒ３１Ｈ［式中、Ｒ３１は上記式（ＩＶ−１）における定義と同様である］で示される化合物を有機溶媒中で塩基性化合物の存在下で２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾニトリル（本明細書中、「ＰＦＢＮ」とも称する）と反応させることによって得られる。
【００８９】
上記反応において、式：Ｒ３１Ｈで示される化合物及びＰＦＢＮは、それぞれ、単一の化合物として使用されてもあるいは２種以上の式：Ｒ３１Ｈで示される化合物及び／又はＰＦＢＮの混合物の形態で使用されてもよいが、精製工程やポリマーの物性などを考慮すると、単一の化合物として使用されることが好ましい。なお、後者の場合には、使用される複数又は単一のＰＦＢＮのモル数の合計が、複数又は単一の式：Ｒ３１Ｈで示される化合物のモル数の合計に等しい又はほぼ等しいことが好ましいが、具体的には、式：Ｒ３１Ｈで示される化合物の使用量が、ＰＦＢＮ １モルに対して、好ましくは０．１〜５モル、より好ましくは０．５〜２モルである。
【００９０】
上記反応において使用できる有機溶媒としては、例えば、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、ベンゾニトリル、ニトロベンゼン、ニトロメタン及びメタノール等の極性溶媒；並びにこれらの極性溶媒とトルエンやキシレン等の非極性溶媒との混合溶媒などが挙げられる。これらの有機溶媒は、単独で又は２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。また、有機溶媒におけるＰＦＢＮの濃度は、１〜４０質量％、好ましくは、５〜３０質量％である。この際、トルエンや他の同様の溶媒を反応の初期段階に使用する際には、反応中に副生する水を、重合溶媒に関係なく、トルエンの共沸物として除去できる。
【００９１】
また、上記反応において使用される塩基性化合物は、反応を促進させるために生成するフッ化水素を捕集するよう作用するものであることが望ましい。このような塩基性化合物としては、例えば、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、フッ化カリウム、トリエチルアミン、トリブチルアミン及びピリジンなどが挙げられる。この際、塩基性化合物の使用量は、使用されるＰＦＢＮ １モルに対して、０．１〜５モル、好ましくは０．５〜２モルである。
【００９２】
さらに、上記反応における反応条件は、Ｒ1Ｈで示される化合物とＰＦＢＮとの反応が効率よく進行するものであれば特に制限されるものではないが、例えば、反応は、好ましくは反応系を撹拌状態に保ちながら、通常、２０〜１８０℃、好ましくは４０〜１６０℃の温度で行なわれる。また、反応時間は、他の反応条件や使用する原料などにより異なるが、通常、１〜４８時間、好ましくは２〜２４時間である。さらに、反応は、常圧下又は減圧下いずれで行ってもよいが、設備面から、常圧下で行うことが望ましい。このような反応によって得られる生成物は、反応混合物に蒸留水を注加し、ジクロロメタン、ジクロロエタン又は四塩化炭素等の抽出剤で抽出した後、有機層を抽出物から分離し、抽出剤を留去することにより得られる。さらに、この生成物を、必要であれば、メタノール又はエタノール等で再結晶化することによって、結晶として得てもよい。
【００９３】
このようにして合成された式（ＩＶ−２）のテトラフルオロベンゾニトリル誘導体は、上述したように、さらに式（ＩＶ−３）のジヒドロキシ化合物と塩基性触媒の存在下で重合に供されることによって、目的の式（ＩＶ−１）のポリシアノアリールエーテルが製造される。この際、式（ＩＶ−２）のテトラフルオロベンゾニトリル誘導体は、上記したような抽出、再結晶化、クロマトグラフィー及び蒸留等の精製工程を経た後使用されても又は精製工程を行なわずにそのまま使用してもよいが、次工程の収率などを考慮すると精製された後使用することが好ましい。
【００９４】
上記反応において使用される式（ＩＶ−３）のジヒドロキシ化合物は、目的産物である式（ＩＶ−１）のポリシアノアリールエーテルの構造に従って選択される。好ましく使用される式（ＩＶ−３）のジヒドロキシ化合物としては、以下に示されるように、２，２−ビス（４−ビドロキシフェニル）−１，１，１，３，３，３−へキサフルオロプロパン（以下、「６ＦＢＡ」という）、４，４’−ジヒドロキシジフェニルエーテル（以下、「ＤＰＥ」という）、ハイドロキノン（以下、「ＨＱ」という）、ビスフェノールＡ（以下、「ＢＡ」という）、９，９−ビス（４−ヒドロキシフェニル）フルオレン（以下、「ＨＦ」という）、フェノールフタレイン（以下、「ＰＰ」という）、９，９−ビス（３−メチル−４−ヒドロキシフェニル）フルオレン（以下、「ＭＨＦ」という）、１，４−ビス（ヒドロキシフェニル）シクロヘキサン（以下、「ＣＨＢ」という）、及び４，４’−ジヒドロキシビフェニル（以下、「ＢＰ」という）が挙げられる。
【００９５】
【化３２】
0006488163.tif 000033
【００９６】
上記反応において、式（ＩＶ−２）のテトラフルオロベンゾニトリル誘導体及び式（ＩＶ−３）のジヒドロキシ化合物は、それぞれ、単一の化合物として使用されてもあるいは２種以上の式（ＩＶ−２）のテトラフルオロベンゾニトリル誘導体及び／又は式（ＩＶ−３）のジヒドロキシ化合物の混合物の形態で使用されてもよいが、精製工程やポリマーの物性などを考慮すると、単一の化合物として使用されることが好ましい。なお、後者の場合には、使用される複数又は単一の式（ＩＶ−２）のテトラフルオロベンゾニトリル誘導体のモル数の合計が、複数又は単一の式（ＩＶ−３）のジヒドロキシ化合物のモル数の合計に等しい又はほぼ等しいことが好ましいが、具体的には、式（ＩＶ−３）のジヒドロキシ化合物の使用量は、式（ＩＶ−２）のテトラフルオロベンゾニトリル誘導体１モルに対して、０．１〜５モル、好ましくは１〜２モルである。
【００９７】
上記反応は、有機溶剤中で行なわれて又は無溶剤下で行なわれてもよいが、有機溶剤中に行われることが好ましい。前者の場合、使用できる有機溶剤としては、例えば、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、ベンゾニトリル、ニトロベンゼン、ニトロメタン及びメタノール等の極性溶媒；並びにこれらの極性溶媒とトルエンやキシレン等の非極性溶媒との混合溶媒などが挙げられる。これらの有機溶剤は、単独で又は２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。また、有機溶剤における式（ＩＶ−２）のテトラフルオロベンゾニトリル誘導体の濃度は、１〜５０質量％、好ましくは５〜２０質量％である。この際、トルエンや他の同様の溶剤を反応の初期段階に使用する際には、反応中に副生する水を、重合溶剤に関係なく、トルエンの共沸物として除去できる。
【００９８】
また、本発明において、式（ＩＶ−２）のテトラフルオロベンゾニトリル誘導体及び式（ＩＶ−３）のジヒドロキシ化合物の反応は、塩基性触媒の存在下で行なうことを必須とする。塩基性触媒は、式（ＩＶ−３）のジヒドロキシ化合物による重縮合反応を促進するよう、式（ＩＶ−３）のジヒドロキシ化合物をより反応性の高いアニオンに変える作用を有するものが好ましく、具体的には、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム又はフッ化カリウムなどが挙げられる。また、塩基性触媒の使用量は、式（ＩＶ−２）のテトラフルオロベンゾニトリル誘導体と式（ＩＶ−３）のジヒドロキシ化合物との反応が良好に進行できる量であれば特に制限されるものではないが、式（ＩＶ−２）のテトラフルオロベンゾニトリル誘導体１モルに対して、通常、０．１〜５モル、好ましくは０．５〜２モルである。
【００９９】
さらに、上記重合反応における反応条件は、式（ＩＶ−２）のテトラフルオロベンゾニトリル誘導体と式（ＩＶ−３）のジヒドロキシ化合物との反応が効率よく進行するものであれば特に制限されるものではないが、例えば、重合温度は、好ましくは２００℃以下、より好ましくは２０〜１５０℃、最も好ましくは４０〜１００℃である。このように低温度で反応することで、特別の設備を必要とすることなく、副反応を抑制し、ポリマーのゲル化を防止することができる。また、重合時間は、他の反応条件や使用する原料などにより異なるが、好ましくは、１〜４８時間、より好ましくは２〜２４時間である。さらに、重合反応は、常圧下又は減圧下いずれで行ってもよいが、設備面から、常圧下で行うことが望ましい。
【０１００】
上記重合反応終了後は、反応溶液より蒸発等により溶媒の除去を行ない、必要により留出物を洗浄することによって、所望のポリマーが得られる。又は、反応溶液をポリマーの溶解度が低い溶媒中に加えることにより、ポリマーを固体として沈殿させ、沈殿物を濾過により分離することによって、ポリマーを得てもよい。
【０１０１】
１．４．ポリマー含有樹脂組成物の化学的、物理的特徴
１．４．１．酸素ガス透過係数
本発明の細胞培養用基材が高い酸素ガス透過性を有するためには、高い酸素ガス透過係数を有するフッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物を使用することが好ましい。具体的には、樹脂組成物の酸素ガス透過係数は、好ましくは０．１０×１０−１０ｃｍ３（ＳＴＰ）・ｃｍ／（ｃｍ２・ｓ・ｃｍＨｇ）以上であり、より好ましくは０．５０×１０−１０ｃｍ３（ＳＴＰ）・ｃｍ／（ｃｍ２・ｓ・ｃｍＨｇ）以上、より好ましくは１．０×１０−１０ｃｍ３（ＳＴＰ）・ｃｍ／（ｃｍ２・ｓ・ｃｍＨｇ）以上、より好ましくは１．５×１０−１０ｃｍ３（ＳＴＰ）・ｃｍ／（ｃｍ２・ｓ・ｃｍＨｇ）以上、より好ましくは２．０×１０−１０ｃｍ３（ＳＴＰ）・ｃｍ／（ｃｍ２・ｓ・ｃｍＨｇ）以上、より好ましくは２．５×１０−１０ｃｍ３（ＳＴＰ）・ｃｍ／（ｃｍ２・ｓ・ｃｍＨｇ）以上、より好ましくは３．０×１０−１０ｃｍ３（ＳＴＰ）・ｃｍ／（ｃｍ２・ｓ・ｃｍＨｇ）以上である。フッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物の酸素ガス透過係数が高いほど、培養細胞への酸素供給が進み易く好ましい。該樹脂組成物の酸素ガス透過係数の上限値は特に限定されないが、通常は２．０×１０−８ｃｍ３（ＳＴＰ）・ｃｍ／（ｃｍ２・ｓ・ｃｍＨｇ）以下、好ましくは１．５×１０−８ｃｍ３（ＳＴＰ）・ｃｍ／（ｃｍ２・ｓ・ｃｍＨｇ）以下である。
【０１０２】
１．４．２．水接触角
本発明の細胞培養用基材においてフッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物（フィルム状、膜状、板状等の形状に加工された状態）により構成される表面の水接触角は、好ましくは７０°以上、より好ましくは７３°以上、更に好ましくは７５°以上であり、好ましくは１１５°以下、より好ましくは１１２°以下、更に好ましくは１１０°以下である。水接触角がこの範囲内であるとき、細胞が基材表面に適度な強度で付着し易く、該表面を足場として細胞が三次元的な組織を形成することが可能となる。なお、接触角は自動接触角計（協和界面科学製：ＤＭ−５００）を用いて温度２５℃において水による接触角測定を行うことにより算出できる。
【０１０３】
１．４．３．引張弾性率
前記フッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物はまた、柔軟性に優れるものであることが好ましい。一実施形態では、前記フッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物は、前記フッ素含有ポリマーの重合単位がエーテル結合を有することに起因して、柔軟性に優れるものである。柔軟性は、引張弾性率によって評価することができる。例えば、引張弾性率が２ＧＰａ以下とすることができる。このように前記樹脂組成物が引張弾性率が２ＧＰａ以下である形態もまた、本発明の好適な形態の１つである。引張弾性率がこの範囲である柔軟性を有する樹脂組成物により構成される表面上において細胞は三次元組織を形成し易い。前記樹脂組成物の引張弾性率は、より好ましくは１．８ＧＰａ以下、更に好ましくは１．５ＧＰａ以下である。引張弾性率の下限は特に限定されないが、好ましくは０．３ＧＰａ以上、より好ましくは０．５ＧＰａ以上である。引張弾性率（ＧＰａ）は、当技術分野において公知の動的粘弾性測定方法により測定することができる。
【０１０４】
２．細胞培養用基材
本発明の細胞培養用基材は、表面の少なくとも一部が前記フッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物により構成されていることを特徴とする。
【０１０５】
細胞培養用基材とは、細胞培養に用いられる、細胞の増殖の足場となる表面を有する部材である限り形態は特に限定されない。例えばフィルム状又は板状の形態である細胞培養用基材は、その一方の表面に細胞を含む培地を載せて細胞培養を実施することや、該基材をシングル若しくはマルチウェルプレートなどの培養用のプレート、シャーレ、ディッシュ、フラスコ、培養バック等の各種細胞培養用容器に収容して固定し、該容器に細胞を含む培地を加えて細胞培養を実施することができる。また、細胞培養用基材は、それ自体が、シングル若しくはマルチウェルプレートなどの培養用のプレート、培養シャーレ、培養ディッシュ、フラスコ、培養バック等の各種細胞培養用容器の形態であってもよい。培養バックは浮遊細胞や幹細胞等を浮遊状態で培養する等の際に用いることが可能である。
【０１０６】
前記樹脂組成物により構成される表面は、細胞培養用基材の表面のうち、細胞培養時に細胞を含む培地と接触する表面の一部又は全部であり、好ましくは、細胞培養用基材の表面のうち、細胞培養時に細胞を含む培地の鉛直方向下方に位置する表面の一部又は全部である。細胞培養用基材の表面の全体が前記樹脂組成物から構成されていてもよい。細胞培養用基材の、前記樹脂組成物により表面が構成されている部分では、培養時に細胞が足場として利用する最表面が前記樹脂組成物により構成されていればよく、該部分の厚さ方向に沿って前記最表面から離れた位置の材料は特に限定されない。すなわち本発明の細胞培養用基材は、少なくとも、細胞培養時に細胞を含む培地と接触する表面の一部又は全部に、前記樹脂組成物により構成される層を備えていればよい。例えば、図１に示す実施形態１のように、細胞培養用基材の、前記樹脂組成物を表面Ｓに含む部分は、表面だけでなく、厚さ方向の全体にわたって前記樹脂組成物により構成されていてもよく、或いは、図２に示す実施形態２のように、培養時に細胞にとっての足場となる最表面Ｓ及びその近傍に前記樹脂組成物のフィルム１が形成され、フィルム１の前記最表面Ｓと反対の側には任意の材料からなる支持体２が配置されていてもよい。
【０１０７】
本発明の細胞培養用基材の好ましい実施形態は、前記樹脂組成物により構成されるフィルム状の細胞培養用基材（実施形態１）、又は、支持体と、該支持体に一体化され表面の少なくとも一部を覆う、前記樹脂組成物により構成されるフィルムとを備える細胞培養用基材（実施形態２）である。すなわち、図１に示すように、実施形態１に係る細胞培養用基材１０は前記樹脂組成物により構成されるフィルム１を備える。図２に示すように、実施形態２に係る細胞培養用基材１０は前記樹脂組成物により構成されるフィルム１と支持体２とを備える。どちらの実施形態においても、前記樹脂組成物により構成されるフィルムは同様の方法で形成することができる。実施形態２において支持体は、フィルム状、多孔質の支持体や、メッシュ状の支持体等を使用してもよく、板状、培養ディッシュ、シャーレ、シングル若しくはマルチウェルプレート、フラスコ等の各種細胞培養用容器の形状等の、細胞培養用途に用いることができる任意の形状とすることができる。
【０１０８】
一実施形態において、本発明の細胞培養用基材は、表面の少なくとも一部に前記フッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物により構成されたフィルムを備えた細胞培養用基材であることが好ましい。
【０１０９】
本発明において「酸素ガス透過係数」及び「酸素ガス透過度」は、それぞれ、ＪＩＳ  Ｋ７１２６−１（差圧法）付属書２に準拠した方法により測定した値を指す。「酸素ガス透過係数」及び「酸素ガス透過度」はどちらも２５℃、相対湿度ほぼ０％の乾燥条件で測定した値を０℃、１気圧の標準状態に換算した値で示す。具体的には以下の測定条件を採用することができる。
試験方法：差圧法（ＪＩＳ  Ｋ７１２６−１付属書２に準拠）
検知器：ガスクロマトグラフ（熱伝導検出器：ＴＣＤ）
試験差圧：１ａｔｍ
試験気体：酸素ガス（乾燥状態（相対湿度ほぼ０％））
試験条件：２５℃±２℃
透過面積：１．５２×１０−３ｍ２
装置：差圧式ガス・蒸気透過率測定装置（ＧＴＲ−３０ＸＡＤ２，Ｇ２７００Ｔ・Ｆ）
ＧＴＲテック（株）・ヤナコテクニカルサイエンス（株）製
【０１１０】
図３に示す例のように、細胞培養用基材が複数の層から構成される場合は、細胞培養用基材の全体の酸素ガス透過度を直接測定により求めてもよいし、各層の酸素ガス透過度から基材全体の酸素ガス透過度を算出してもよい。
【０１１１】
本発明で用いる細胞培養用基材は、酸素ガス透過度が２１９ｃｍ３（ＳＴＰ）／（ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ）以上である。本発明の細胞培養用基材が２１９ｃｍ３（ＳＴＰ）／（ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ）以上という高い酸素ガス透過度を有する場合、該基材の、前記樹脂組成物を含む表面上で細胞を培養するとき酸素の供給がされ易く、細胞の生育と、細胞による三次元組織の形成と組織の生育が進み易い。本発明の細胞培養用基材の酸素ガス透過度は、より好ましくは１０９４ｃｍ３（ＳＴＰ）／（ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ）以上、より好ましくは２１８９ｃｍ３（ＳＴＰ）／（ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ）以上、より好ましくは３２８３ｃｍ３（ＳＴＰ）／（ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ）以上、より好ましくは４３７８ｃｍ３（ＳＴＰ）／（ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ）以上、より好ましくは５４７２ｃｍ３（ＳＴＰ）／（ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ）以上、より好ましくは６５６６ｃｍ３（ＳＴＰ）／（ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ）以上である。本発明の細胞培養用基材の酸素ガス透過度が高いほど、培養細胞への酸素供給が進み易く好ましい。本発明の細胞培養用基材の酸素ガス透過度の上限値は特に限定されないが、通常は４３７７６０ｃｍ３（ＳＴＰ）／（ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ）以下、好ましくは３２８３２０ｃｍ３（ＳＴＰ）／（ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ）以下の値である。
【０１１２】
本発明の細胞培養用基材における、フッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物により構成される層（「フィルム」或いは「膜」ともいう）の厚さ（支持体の厚さを含まない）は、基材全体として適度な酸素ガス透過度となるように適宜調整することができるが、典型的には０．１μｍ以上、５ｍｍ以下とすることが好ましく、０．５μｍ以上、３ｍｍ以下とすることがより好ましく、１μｍ以上、２ｍｍ以下とすることが更に好ましく、５μｍ以上、１ｍｍ以下とすることが特に好ましい。
【０１１３】
本発明の細胞培養用基材が、図２の実施形態２のように、フッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物により構成されるフィルム１と、支持体２とから構成される場合、支持体２は、フィルム１と組み合わされた基材１０全体として酸素ガス透過度が上記の範囲となるように適宜選択することが好ましい。支持体２としては特に、多孔質の支持体や、メッシュ状の支持体等の、フィルム１の酸素ガス透過性を実質的に妨げない支持体を使用することが好ましい。
【０１１４】
フィルムを形成する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、溶液流延法、溶液キャスト法などの溶液製膜法；カレンダー法；プレス成形法などが挙げられる。これらの方法のなかでは、生産性に優れていることから、溶液製膜法が好ましい。
【０１１５】
フィルム形成のための溶液としては、前記ポリマーの溶液や、前記ポリマーの溶液が利用できる。一実施形態において、前記ポリマーの溶液が好ましいことがある。
【０１１６】
フィルムを形成する典型的な方法としては、前記樹脂（ポリマー）溶液を製膜用支持体の表面に、例えば、スピンコーティング法、キャスティング法、ロールコーティング法、ダイコーティング法、グラビアコーティング法、スプレイコーティング法、バーコーティング法、フレキソ印刷法、ディップコーティング法等の通常の方法で塗布して塗膜を形成する方法が挙げられる。前記樹脂（ポリマー）溶液を製膜用支持体に塗布する際の塗布量は、乾燥膜厚が０．１μｍ以上、１ｍｍ以下となるようにすることが好ましく、０．５μｍ以上、５００μｍ以下となるように調整することがより好ましい。その後、溶媒を除去し、必要に応じて焼成することで前記ポリマーを含むフィルムを得ることができる。
【０１１７】
製膜用支持体を構成する材料としては、例えば、石英；ガラス、ホウ珪酸ガラス、ソーダガラス等の無機ガラス；カーボン；金、銀、銅、シリコン、ニッケル、チタン、アルミニウム、タングステン等の金属；ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリオレフィン；ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等のポリエステル；環状オレフィン開環重合／水素添加体（ＣＯＰ）、環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ）等の環状オレフィン系樹脂；ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）等のアクリル系樹脂；エポキシ樹脂；ＡＳ樹脂（アクリロニトリル−スチレン共重合体）、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン（ＰＳＴ）、ポリスチレン樹脂、ポリ酢酸ビニル、ＡＢＳ樹脂、ポリカーボネート樹脂、ビニルエーテル、ポリアセタール（ＰＯＭ）、ポリアミド、ポリフェニレンエーテル（ＰＰＥ）、ポリアリールエーテル、ポリフェニレンスルファイド（ＰＰＳ）、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリエーテルサルフォン（ＰＥＳ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリアリールエーテルケトン（ＰＥＫ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリアミド酸（ＰＡＡ）、ポリアミドイミドアクリル樹脂、フェノール樹脂、ポリエーテルケトン樹脂、ポリエーテルニトリル（ＰＥＮ）樹脂等の樹脂；上記金属、又はその酸化物若しくは混合酸化物等を表面に有するガラス、金属、樹脂；木材等が挙げられる。前記混合酸化物としては、例えば、ＩＴＯ（酸化インジウムスズ）等の透明導電性酸化物、ＳｉＯ２等が挙げられる。混合酸化物等を表面に有する金属としては、ＳｉＯ２／Ｓｉ基材等が挙げられる。製膜用支持体は、それ自体が実施形態２における「支持体」であることができ、この場合は、フィルムと該支持体との組み合わせによって本発明の細胞培養用基材が形成される。この実施形態２において、該支持体は、板状、フィルム状等の任意の形態であることができ、細胞培養用容器の形態を有していてもよい。また、製膜用支持体上で形成されたフィルムは、フィルム形成後に剥離され、フィルム単体で前記実施形態１の細胞培養用基材として用いられてもよい。或いは、製膜用支持体から剥離されたフィルムを他の支持体の表面に貼付して一体化し、フィルムと支持体とを備える前記実施形態２の細胞培養用基材としてもよい。フィルムと支持体とを一体化する手段としては接着剤等の任意の手段を採用することができる。この場合の支持体の材料及び形状は、実施形態２において支持体として製膜用支持体を用いる場合の製膜用支持体の材料及び形状と同様である。
【０１１８】
さらに、前記樹脂組成物のフィルムは、延伸されていてもよい。該フィルムの延伸は、一軸延伸であってもよく、二軸延伸であってもよい。一軸延伸は、縦延伸（フィルムの巻取り方向の延伸）であってもよく、横延伸（フィルムの幅方向の延伸）であってもよい。縦延伸の場合、フィルムの幅方向の変化を自由とする自由端一軸延伸であってもよく、フィルムの幅方向の変化を固定とする固定端一軸延伸であってもよい。二軸延伸は、縦延伸後に横延伸を行なう逐次二軸延伸であってもよく、縦横延伸を同時に行なう同時二軸延伸であってもよい。また、フィルムの厚さ方向の延伸又はフィルムのロールに対して斜め方向の延伸を行なってもよい。延伸方法、延伸温度及び延伸倍率は、目的とする前記フッ素含有ポリマーフィルムの光学特性、機械的強度などに応じて適宜選択することが好ましい。
【０１１９】
フッ素含有ポリマーを含有する樹脂組成物から構成されるフィルムの全体厚み（支持体を含まない）は、０．１μｍ以上、１ｍｍ以下とすることが好ましく、０．５μｍ以上、５００μｍ以下とすることがより好ましく、１μｍ以上、３００μｍ以下とすることがさらに好ましい。
【０１２０】
なお前記樹脂溶液は、当該溶液の塗膜を、溶媒が抜ける温度と時間で加熱することが好ましく、例えば、窒素雰囲気下、好ましくは５０〜４００℃、より好ましくは１００〜３００℃、好ましくは１０分〜５時間、より好ましくは３０分〜３時間の条件下で焼成して前記樹脂組成物から構成されるフィルムとすることができる。
【０１２１】
本発明の細胞培養用基材における、前記フッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物により構成される表面は、平滑な表面であることが好ましい。平滑な表面としては、例えば表面粗さ（中心線平均粗さ：Ｒａ）が０．５μｍ以下である表面が好ましい。好ましくは、０．１μｍ以下、さらに好ましくは０．０１μｍ以下であることが好ましい。本発明において中心線平均粗さ（Ｒａ）はレーザー法で測定した値であり、例えば菱化システム製表面粗さ計Ｒ５３００ＧＬ−Ｌ−Ａ１００−ＡＣを用いて測定することができる。本発明によれば、作製が容易な平滑な表面上で細胞を三次元的に培養することが可能となる。ただし、本発明の細胞培養用基材でのポリマーを含む樹脂組成物により構成される表面は目的に応じて適切な粗さとなるよう加工されていてもよく、例えば、非特許文献１に記載されているようなラビング処理により微細な凹凸を形成することも可能である。また、本発明の細胞培養用基材に直径５０〜５００μｍ、深さ５０〜５００μｍ以下（例えば３００μｍ以下）の円柱又は円錐の穴（キャビティ）を付与することで大きさが均一な三次元培養基（例えばスフェロイド、三次元細胞集合体など）を形成することが可能となる。さらにキャビティ構造を付与することで、培地除去時に培地ととともにスフェロイド、三次元細胞集合体等が基材から除かれることも回避することができる。
【０１２２】
本発明の細胞培養用基材は、これまでに述べた効果に加えて、好ましくは更に以下の効果を有する。本発明の基材は好ましくは高い耐熱性を有するため高圧蒸気滅菌が可能である。高圧蒸気滅菌を行うことで、γ線滅菌時にみられる基材の品質の変化がなく、またＥＯＧ滅菌時の残存ガスの除去等が不要となり、簡便な滅菌処理により、細胞培養時の雑菌混入のリスク及び培養細胞の増殖を抑制する成分が混入するリスクが低減できる。なお、一般的なポリスチレン製細胞培養用基材は耐熱性が低いため高圧蒸気滅菌を行うことはできない。上記滅菌方法以外にも、本発明の細胞培養用基材は一般的な滅菌方法での滅菌が可能である上述の高圧蒸気滅菌の他、γ線滅菌、電子線滅菌、エタノールなどのアルコール滅菌、ＥＯＧ滅菌などの方法により滅菌することができるが、これらは一例であり他の滅菌方法を採用しても良い。また、本発明の基材は一般的に免疫染色等で使用されている蛍光色素の励起波長、蛍光波長付近に自家蛍光がないため、蛍光色素を用いた免疫染色にも利用することができる。さらに、本発明の基材は好ましくは透明で、高い酸素透過性を有しており、培地中の溶存酸素濃度が高く保たれることで細胞への酸素供給性が向上し、生存率が高くかつ各種細胞の機能を高く維持しながら培養を行うことが可能となる。本発明の細胞培養用基材が前記樹脂組成物により構成されるフィルム状の細胞培養用基材である場合、一般的に本段落で述べた効果を有する。
【０１２３】
３．細胞培養用容器
本発明また、酸素透過性を有する前記細胞培養用基材を少なくとも一部に備える細胞培養用容器を提供する。好ましい実施形態では、本発明の細胞培養用容器は、一方の表面が、細胞及び培地の収容部の底面を形成し、他方の表面が容器外に露出するように配置された細胞培養用基材、を少なくとも一部に備えるものである。
【０１２４】
一実施形態において、本発明の細胞培養用容器は、図４−１に示すような、細胞培養用基材を容器内部又は底部に設置したり、一方の表面が、細胞及び培地の収容部の底面を形成し、他方の表面が容器外に露出するように配置された細胞培養用基材、を少なくとも一部に備えるものであっても良い。
【０１２５】
本発明の細胞培養用容器では、フッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物により構成される表面が培養される細胞の足場として機能する為、細胞の生存率が高く、細胞の機能を高く維持しながらの細胞培養、特に三次元的な細胞培養が可能となる。
【０１２６】
本発明の細胞培養用容器は、本発明の細胞培養用基材を備えていればよく、全体としてどのような形状であってもよい。例えば、シングル若しくはマルチウェルプレートなどの培養用のプレート、シャーレ、ディッシュ、フラスコ、バッグ等の各種容器の形状であることができる。本発明の細胞培養用容器はまた、大量培養装置や潅流培養装置などの培養装置における細胞培養用容器の形態であってもよい。
【０１２７】
別の実施形態において、本発明の細胞培養用容器では、前記細胞培養用基材が、該基材のフッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物により構成される表面が、細胞及び培地の収容部の底面を形成し、該基材の他方の表面が容器外に露出するように配置されていることが好ましい。すなわち、図１に示すように、細胞培養用基材１０がフッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物により構成されるフィルム１のみからなる場合、細胞培養用基材１０は、どちらか一方の主面が細胞及び培地を収容する区画の底面を形成し、他方の主面が容器外に露出して容器外の空気等に接するように配置される。図２に示すように、細胞培養用基材１０がフッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物により構成されるフィルム１と支持体２とを備える場合、細胞培養用基材１０は、フィルム１が配置されたほうの表面Ｓが細胞及び培地を収容する区画の底面を形成し、支持体２が配置されたほうの表面が容器外に露出して容器外の空気等に接するように配置される。本発明の細胞培養用容器は、細胞培養のための使用状態において、前記細胞培養用基材の前記他方の面が容器外に露出して容器外の空気等の酸素含有ガスに接触するように構成されている。
【０１２８】
上記実施形態の本発明の細胞培養用容器では、フッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物により構成される表面が培養される細胞の足場として機能する。そして、前記基材は酸素透過性を有しているため、容器外に露出して空気等の酸素含有ガスと接する表面から前記基材を通じて細胞及び培地へ酸素が供給される。この組み合わせにより、細胞の生存率が高く、細胞の機能を高く維持しながらの細胞培養、特に三次元的な細胞培養が可能となる。
【０１２９】
本発明の細胞培養用容器は、本発明の細胞培養用基材と他の部材とが組み合わされて構成されていてもよいし、本発明の細胞培養用基材と他の部材とが一体化されて構成されていてもよいし、本発明の細胞培養用基材のみにより構成されていてもよい。本発明の細胞培養用基材がフィルム状等の柔軟な基材である場合は、剛性を有する適当な支持部材（フレーム等）を用いて張設した状態で細胞培養用容器の底を形成することも可能である。
【０１３０】
図４−１には、本発明の細胞培養用容器の一実施形態である細胞培養用容器１００を示す。図４−１に示す細胞培養用容器１００は、容器底部及びその縁から起立した容器側壁を形成する壁部材２０を備え、容器底部に細胞培養用基材１０が載せられて、収容部１０１が形成される。細胞培養用基材１０の構成は上記の通りである。壁部材２０を、開口した側から平面視したときの内郭形状及び外郭形状はそれぞれ例えば円、多角形（四角形、三角形等）などの任意の形状であることができる。
【０１３１】
図４−２（ａ）には、本発明の細胞培養用容器の一実施形態である細胞培養用容器１００を示す。図４−２（ａ）に示す細胞培養用容器１００は、容器底部を形成する細胞培養用基材１０と、細胞培養用基材１０の縁から起立した容器側壁を形成する壁部材２０とを備え、細胞培養用基材１０と壁部材２０とにより収容部１０１が形成される。細胞培養用基材１０の構成は上記の通りであり、フッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物により構成される表面Ｓは容器内（収容部１０１）に臨むように配置される。壁部材２０を、開口した側から平面視したときの内郭形状及び外郭形状はそれぞれ例えば円、多角形（四角形、三角形等）などの任意の形状であることができる。
【０１３２】
図５（ａ）、５（ｂ）及び５（ｃ）に示す細胞培養用容器１００は、本発明の細胞培養用容器の他の実施形態である、マルチウェルプレートである。図５（ａ）、５（ｂ）及び５（ｃ）に示す細胞培養用容器１００は、細胞培養用基材１０と、細胞培養用基材１０のフッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物により構成される表面Ｓを覆うように配置された、厚さ方向に貫通する複数（図では２４）の貫通孔が形成されたプレート状の壁部材２０とを備える。壁部材２０の各貫通孔を囲う部分と細胞培養用基材１０とにより細胞及び培地を収容する収容部１０１が複数形成される。細胞培養用基材１０の構成は上記の通りであり、フッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物により構成される表面Ｓは容器内（収容部１０１）に臨むように配置される。ここで図５（ｃ）では、フッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物により構成される表面Ｓが容器内（収容部１０１）に臨み、且つ、細胞培養用基材１０の表面Ｓと反対側の面が、平坦面上に細胞培養用容器１００を置いた時に前記平坦面に接触せず、前記表面Ｓと反対側の面と前記平坦面との間に空隙４が形成されるように壁部材２０に接続されている。
【０１３３】
図６に示す細胞培養用容器１００は、本発明の細胞培養用容器の更なる実施形態である。図６に示す細胞培養用容器１００は、容器底部を形成する細胞培養用基材１０と、容器側壁を形成する壁部材２０とを備え、細胞培養用基材１０と壁部材２０とにより収容部１０１が形成される。ここで細胞培養用基材１０は、フッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物により構成される表面Ｓが容器内（収容部１０１）に臨み、且つ、細胞培養用基材１０の表面Ｓと反対側の面が、平坦面上に細胞培養用容器１００を置いた時に前記平坦面に接触せず、前記表面Ｓと反対側の面と前記平坦面との間に空隙４が形成されるように壁部材２０に接続されている。
【０１３４】
図４−２（ａ）、図５（ａ）、５（ｂ）及び５（ｃ）、並びに図６に記載されている各実施形態の細胞培養用容器１００ではいずれにおいても、壁部材２０と細胞培養用基材１０とがどのような手段で接続されていてもよく、例えば感圧式の両面テープ等の接着性材料又は接着性部材を介して接続することができる。
【０１３５】
以上のように容器内の底面にフッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物により構成される表面Ｓが配置され、他方の面が容器外に露出した細胞培養用基材を有する細胞培養用容器を製造することができる。本発明の細胞培養用容器はこの形態には限定されず、任意の形態であることができる。
【０１３６】
４．培養方法
本発明はまた、細胞を培養する方法であって、前記細胞培養用基材の、前記フッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物により構成される表面上で細胞を培養する工程を含む方法を提供する。
【０１３７】
本発明の細胞培養用基材の、前記フッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物により構成される表面上において、三次元的な組織を形成可能な細胞を適当な時間培養することにより、三次元培養することができる。しかしながら、本発明の細胞培養方法は必ずしもこのような形態に限定されず、三次元的な組織を形成しない細胞を培養する形態や、三次元的な組織を形成可能な細胞を三次元的な組織が形成される前の段階まで培養する形態なども包含される。
【０１３８】
具体的には図４−１に示すように、細胞培養用基材１０（図１又は図２に示す構造を有する）を容器に入れて設置し、フッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物により構成された表面Ｓ（図１、２参照）に細胞及び培地が接した状態で細胞を培養しても良い。
【０１３９】
別の実施形態において、本発明はまた、細胞を培養する方法であって、前記細胞培養用基材のフッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物により構成された表面に細胞及び培地が接し、前記細胞培養用基材の他方の表面が空気等の酸素含有ガスに接した状態で細胞を培養する工程を特徴とする方法を提供する。
【０１４０】
具体的には図３に示すように、細胞培養用基材１０（図１又は図２に示す構造を有する）の、フッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物により構成された表面Ｓ（図１、２参照）に細胞３及び培地２が接し、細胞培養用基材１０の他方の表面が空気等の酸素含有ガスに接した状態で細胞を培養してもよい。この方法では、基材１０の、フッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物により構成される表面Ｓは培養される細胞の足場として機能する。そして、基材１０は酸素透過性を有しているため、空気等の酸素含有ガスと接する表面から基材１０を通じて細胞３及び培地２へ酸素が供給される。この方法によれば、細胞の生存率が高く、細胞の機能を高く維持しながらの細胞培養、特に三次元的な細胞培養が可能である。例えば上述した図４−２（ａ）に示す細胞培養用容器１００を用いる場合、細胞培養用容器１００の下面（細胞培養用基材１０の表面Ｓとは反対側の表面）の少なくとも一部が空気等の酸素含有ガスと接触するように細胞培養用容器１００を配置して細胞培養を行うことで、上記の細胞培養方法を実現することができる。例えば図４−２（ｂ）に示すように、平坦面３００上に幅の狭い適当なスペーサー２００を配置し、スペーサー２００上に細胞培養用容器１００を載せれば、培養用基材１０の容器外に露出した表面は酸素含有ガス（空気）と接触することができる。このように配置された細胞培養用容器１００を用いて上記の細胞培養を行うことができる。なお、スペーサー２００を介さず細胞培養用容器１００を直接平坦面３００に置いた場合でも、通常は、培養用基材１０の容器外に露出した表面と平坦面３００との間には部分的には酸素含有ガス（空気）が介在しており本発明の細胞培養方法を行うことができる。図５（ａ）（ｂ）（ｃ）に示す細胞培養用容器１００も同様に使用することができる。図５（ｃ）及び図６に示す細胞培養用容器１００は、壁部材２０の底側の端部が、細胞培養用基材１０よりも下に突出しているため、平坦面上に置いたとき、壁部材２０の前記端部がスペーサーとして機能し、細胞培養用基材１０の表面Ｓとは反対側の表面と平坦面との間には空隙４が形成され、該空隙４に酸素含有ガス（空気等）が存在できるため、本発明の細胞培養方法を容易に行うことができる。
【０１４１】
本発明の細胞培養方法で培養される細胞の種類は特に限定されないが、例えば、ヒト正常肝細胞、ラット正常肝細胞、マウス正常肝細胞、ヒト肝臓癌細胞、ヒト肝芽腫細胞、ラットヘパトーマ細胞、マウスヘパトーマ細胞、人工多能性幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞等の一般的に三次元培養を行うことが求められている細胞や、各種前駆細胞及び幹細胞を含む、脂肪細胞、肝細胞、腎細胞、膵臓細胞、乳腺細胞、内皮細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、心筋細胞、神経細胞、グリア細胞、樹状細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞、線維芽細胞、各種血液系細胞、その他間葉系前駆細胞、各種癌細胞等の他の細胞が挙げられる。
【０１４２】
細胞は適当な培地中で培養することができる。培地の種類は特に限定されないが、例えば、任意の細胞培養基本培地や分化培地、初代培養専用培地等を用いることができる。具体的にはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、グラスゴーＭＥＭ（ＧＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０、ハムＦ１２、ＭＣＤＢ培地、ウィリアムス培地Ｅ等が挙げられるが、これらには限定されず、細胞が増殖や分化に必要な成分が含まれる培地であれば利用可能である。さらに、血清や各種増殖因子、分化誘導因子を添加した培地を使用してもよい。
【０１４３】
５．三次元培養
本発明はまた、細胞を三次元培養する方法であって、前記細胞培養用基材の、前記フッ素含有ポリマーを含む樹脂組成物により構成される表面上で細胞を三次元培養する工程を含む方法を提供する。すなわち、本発明の細胞培養方法を用いて、細胞を三次元培養し、組織を形成することも可能である。
【０１４４】
ここで三次元培養により形成される組織としては、スフェロイドや、三次元細胞集合体が挙げられる。スフェロイド又は三次元細胞集合体はラット正常肝細胞のような単一な細胞で形成されたスフェロイド又は三次元細胞集合体でも、各種線維芽細胞や血管内皮細胞等とラット正常肝細胞のような２種以上の異なる細胞種が混在したスフェロイド又は三次元細胞集合体でも良い。使用できる細胞としては、上記の各種細胞が挙げられる。
【０１４５】
三次元培養する際の培地の種類は特に限定されないが、例えば任意の細胞培養基本培地や分化培地、初代培養専用培地等を用いることができる。具体的にはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、グラスゴーＭＥＭ（ＧＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０、ハムＦ１２、ＭＣＤＢ培地、ウィリアムス培地Ｅ等が挙げられるが、これらには限定されず、細胞が増殖や分化に必要な成分が含まれる培地であれば利用可能である。さらに、血清や各種増殖因子、分化誘導因子を添加した培地を使用してもよい。
【実施例】
【０１４６】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。なお、以下においては、特に断りのない限り、「部」は「質量部」を、「％」は「質量％」を意味する。
【０１４７】
＜水接触角の測定＞
装置：自動接触角計（協和界面科学製：ＤＭ−５００）
測定方法：２５℃の温度での水２μｌの滴下直後の液滴の付着角度を測定した。
【０１４８】
＜動的粘弾性測定方法＞
装置：ティー・エイ・インスツルメント社製
動的粘弾性 ＲＳＡ ＩＩＩ
測定方法：厚さ６０μｍのフィルムを５×４０ｍｍの短冊状に作製し、２５℃での伸びと応力を測定し、引っ張り弾性率を算出した。
【０１４９】
＜酸素ガス透過度及び酸素ガス透過係数の測定＞
酸素ガス透過度（単位：ｃｍ３（ＳＴＰ）／（ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ））及び酸素ガス透過係数（単位：ｃｍ３（ＳＴＰ）・ｃｍ／（ｃｍ２・ｓ・ｃｍＨｇ））はＪＩＳ  Ｋ７１２６−１（差圧法）付属書２に準拠した方法により測定した。具体的には以下の条件のもと行った。
試験方法：差圧法（ＪＩＳ  Ｋ７１２６−１付属書２に準拠）
検知器：ガスクロマトグラフ（熱伝導検出器：ＴＣＤ）
試験差圧：１ａｔｍ
試験気体：酸素ガス（乾燥状態（相対湿度はほぼ０％））
試験条件：２５℃±２℃
透過面積：１．５２×１０−３ｍ２
装置：差圧式ガス・蒸気透過率測定装置（ＧＴＲ−３０ＸＡＤ２，Ｇ２７００Ｔ・Ｆ）
ＧＴＲテック（株）・ヤナコテクニカルサイエンス（株）製
【０１５０】
≪調製例１≫含フッ素ポリアリールエーテルケトン樹脂（ＦＰＥＫ）
２２５ｍｌ容の三つ口フラスコに、４，４’−ビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾイル）ジフェニルエーテル（略称ｐ，ｐ−ＢＰＤＥ）１６．７４ｇ、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）ヘキサフルオロプロパン（６ＦＢＡ）１０．１４ｇ、炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）４．１４ｇ及びＮ−メチルピロリジノン９０ｇを仕込んだ。この混合物を６０℃に加熱し５時間加熱した。反応終了後、冷却し、この溶液をブレンダーで激しく攪拌しながら、１％酢酸水溶液中に注加した。析出した重合体を濾別し、蒸留水及びメタノールで洗浄した後、減圧乾燥した。
【０１５１】
得られた粉末状含フッ素ポリアリールエーテルケトンを１５％濃度になるよう２−ブタノン溶液に溶解させて、以下の構造を有する含フッ素ポリアリールエーテルケトン（ＦＰＥＫ）溶液を得た。
【化３３】
0006488163.tif 000034
【０１５２】
≪実施例１≫ＦＰＥＫ膜
調製例１において得られたＦＰＥＫ溶液を、硝子基材上に、ダイコーターを用いて、焼成後のポリマーフィルムの厚みが６０μｍとなるようにフィルム状に製膜し、１５０℃で１時間加熱し、焼成を行った後、硝子より剥離し、含フッ素ポリアリールエーテルケトン膜（ＦＰＥＫ膜）を得た。
【０１５３】
得られたＦＰＥＫ膜は６０μｍの厚みであり、水の接触角は８９°、引っ張り弾性率は１．２ＧＰａ、酸素透過係数は３．２１×１０−１０ｃｍ３（ＳＴＰ）ｃｍ／（ｃｍ２・ｓ・ｃｍＨｇ）であった。
【０１５４】
≪実施例２≫細胞培養によるスフェロイドの形成
１．ラット初代肝細胞の取得
Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｖｉｒａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｆｒｅｅのＷｉｓｔａｒラット、オス、９週齢、体重２００ｇを日本エスエルシー株式会社より購入した。ラット初代肝細胞の取得は培養細胞実験ハンドブック (羊土社) 第１０章、肝細胞記載の方法を参考に実施した。具体的には、Ｗｉｓｔａｒラットをイソフルラン麻酔下で開腹し、門脈にカテーテルを挿入して以下記載の組成の前かん流液を注入した。同時に肝臓下部の下大静脈を切開して血液を放出させた。次に胸腔を開き、右心房に入る下大静脈を切開し、肝臓下部の下大静脈をかん止で止めてかん流を行った。肝臓からの脱血が十分になされたことを確認した後にかん流を止め、かん流液を以下の表１に示す組成のコラゲナーゼ溶液に換えて、かん流を行った。細胞間組織がコラゲナーゼにより消化されたことを確認した後、かん流を止めた。肝臓を切り離し、ガラスシャーレに移した後、冷したハンクス溶液を添加して、ピペッティングにより細胞を分散させた。次に１５０ｍｍ濾過器により未消化の組織を除去した。細胞懸濁液は、５０Ｇ、１分の遠心分離を数回繰り返して非実質細胞を除去した。得られた肝細胞の生存率はトリパンブルー排除法で計測し、生存率７０％以上の肝細胞をラット初代肝細胞として培養試験に使用した。
【０１５５】
【表１】
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【０１５６】
２．ラット初代肝細胞の培養
前述の方法で取得したラット初代肝細胞を、以下組成の培地で懸濁し、２．６６×１０４細胞／ｃｍ２となるように、１．２５×１０５細胞／ｍＬのラット初代肝細胞懸濁液０．４ｍＬを、蓋付きコラーゲンタイプＩコートマイクロプレート２４Ｗｅｌｌ（旭硝子社）及びＦＰＥＫ膜に添加し、３７℃，５％ＣＯ２条件下で培養を行った。なお、実施例１で調製したＦＰＥＫ膜は高圧蒸気滅菌処理後に細胞培養に使用した。培地交換は播種後３時間、培養１日目、３日目、５日目に実施した。
【０１５７】
培地組成
Ｗｉｌｌｉａｍ'ｓ  Ｅ  ｍｅｄｉｕｍ（和光純薬）＋１０％ＦＢＳ（和光純薬）＋８．６ｎＭインスリン＋２５５ｎＭデキサメサゾン＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ＋５ＫＩＵ／ｍＬアプロチニン＋抗生物質（ペニシリン（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）／アムホテリシンＢ（０．２５μｇ／ｍＬ））
【０１５８】
培養５日目の蓋付きコラーゲンタイプＩコートマイクロプレート２４Ｗｅｌｌ（旭硝子社）及びＦＰＥＫ膜の位相差顕微鏡写真を、それぞれ図７の（Ａ）及び（Ｂ）に示す。
【０１５９】
一般的に付着細胞の培養で使用される蓋付きコラーゲンタイプＩコートマイクロプレート２４Ｗｅｌｌ（旭硝子社）では単層状に細胞が基材に付着し細胞凝集塊の形成はほとんど見られなかったが、ＦＰＥＫ膜では単層状に付着した細胞は観察されず、３次元的な構造の細胞凝集塊が形成された。この細胞凝集塊の大きさは均一で、適度なサイズであり、基材全面に均一にスフェロイドが分布していた。
【０１６０】
培養２４時間毎に０．２５％トリプシン／５０ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液で処理後、０．４ｗ／ｖ％トリパンブルー溶液（和光純薬）及び血球計算盤を用いて総細胞数の測定を行った。また、培養２４時間毎に培養液をサンプリングし、−２０℃で保存した。
【０１６１】
３．アルブミン定量
培養５日目の各試験区の培養液を用いてアルブミンの定量を実施した。アルブミンの定量にはRat Albumin ELISA Quantitation Set（Bethyl Laboratories社）を使用し、添付されているプロトコールに従ってアルブミンの定量実験を行った。各試験区のアルブミン定量の結果を図８に示す。
【０１６２】
図８に示されたように、ＦＰＥＫ膜では蓋付きコラーゲンタイプＩコートマイクロプレート２４Ｗｅｌｌ（旭硝子社）よりも多量のアルブミン生成が確認された。ＦＰＥＫ膜上で形成された適切な大きさの細胞凝集塊では高い肝機能を発現したと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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