(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
青色光を用いて生体分子に被覆される金および銀ナノ粒子を調整する方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）６０〜３００μＭの範囲におけるＡｇＮＯ３またはＨＡｕＣｌ４の溶液を、ｐＨ５から８の緩衝液中で、調製する；
（ｂ）ＡｇＮＯ３と生体分子とのモル比が５０：１であり、ＨＡｕＣｌ４と生体分子とのモル比が３００：１となるように、生体分子を工程（ａ）で調製する溶液に添加する、ここで、生体分子は、ペプチド、抗体、タンパク質、アプタマー、オリゴヌクレオチドおよび７００ダルトン未満の有機小分子からなる群から選択される；
（ｃ）工程（ｂ）の混合物を４０Ｗから２００Ｗの範囲のワット数の青色光に３０℃の温度で０．１から６０時間さらし、生体分子に被覆される金および銀ナノ粒子を得る。
【請求項２】
緩衝液がＨＥＰＥＳ、トリス、リン酸またはクエン酸三ナトリウム緩衝液から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
青色光の波長が３５０ｎｍから４５０ｎｍの範囲内である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
生体分子がゲルゾリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
生体分子がインスリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
生体分子に被覆される金および銀ナノ粒子の形成を、反応混合物の色の変化を観察することによって、または銀および金ナノ粒子それぞれにおいて４２０ｎｍから５５０ｎｍでの単一波長における溶液の吸光度を測定することによって、モニターする、請求項１記載の方法。
【請求項７】
無色から淡黄色、淡黄色から暗黄色への反応混合物の色の変化が、生体分子に被覆される銀ナノ粒子の形成を示す、請求項１記載の方法。
【請求項８】
無色から明るいピンク色、明るいピンク色から紫色への反応混合物の色の変化が、生体分子に被覆される金ナノ粒子の形成を示す、請求項１記載の方法。
【請求項９】
工程（ａ）における溶液を、０．１から３００ｍＭ ＮａＣｌを含む水中で、調製する、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、青色光を用いて生物有機的に被覆される金および銀ナノ粒子を調製するための方法に関する。特に本発明は、反応速度の増加および金属ナノ粒子上に様々な生体分子を係留する(tethering)範囲の拡大に関する。従って、ナノ粒子上に固定化された生体分子は、それらがそれらの天然の結合パートナーと結合できる構造上の要素の多くの態様を未だ保持し、および／またはそれらに特異的な抗体によってそれらを同定できる構造上のエピトープを未だ保持する。こうして、生物医学の技術、エレクトロニクスおよびコミュニケーション、金属成分の濃縮および回収ならびにバイオセンサーにおける機能的および特異的な応用のために、そのような被覆されるナノ粒子を使用する範囲を拡大する。
【背景技術】
【０００２】
バイオイメージング、ドラッグデリバリーまたは遺伝子デリバリー、バイオセンサー(Cardoso, Quelemes et al. 2014; Krishnamurthy, Vaiyapuri et al. 2015)などにおける金属ナノ粒子の様々な応用にもかかわらず、化学的または物理的手法による、迅速で、非毒性で、環境に優しく、および安定なナノ粒子の開発または考案には課題が残っている。既知の手法は良く最適化されており、短時間での種々のサイズのナノ粒子の形成が可能であるが、生成物は、形成において含まれる化学物質のために、毒性を示す。
【０００３】
最近二十年において、微生物全体、微生物の抽出液、植物の抽出液を用いて、被覆される金属ナノ粒子を調製するための生物学的な方法が実施されている。最近、タンパク質(BSA (Xie, Zheng et al. 2009)、リゾチーム(Eby, Schaeublin et al. 2009)、トランスフェリン(Le Guevel, Daum et al. 2011)、ペプチド(Tan, Lee et al. 2010)、ＤＮＡ(Berti, Alessandrini et al. 2005)および炭水化物(Filippo, Serra et al. 2010)など、少数の純粋な生体起源の材料もまた用いられてきた。しかしながら、ナノ粒子を形成するためのそれらの形成速度はかなり遅く、非常に高濃度の生体材料を必要とする。主に、通常利用できるまたはいわゆるモデルのタンパク質がこの種の研究の対象となり、新奇なタンパク質は前記目的のために調査されてこなかった。さらに、あるタンパク質において最適化された条件は他のタンパク質に適用できるかもしれないし、できないかもしれない。そのため、タンパク質を用いるナノ粒子のワンポット合成は今日まで成功していない。
【０００４】
拡大する技術の統合に伴い、生体材料で被覆されるナノ粒子（特に金および銀ナノ粒子（ＡｕおよびＡｇナノ粒子））の役割はますます検討されているが、観察される下記のような制限にその橋渡しは妨げられている：
１）前記ナノ粒子の合成は少なくとも２つの工程を必要とする：ａ）化学的還元に基づく被覆されていないベースのナノ粒子を形成する、ｂ）接着するまたは係留する物質によってナノ粒子を被覆する、ｃ）タンパク質性の分子をテザー(tether)上に結合する。後者は永久に繋留され(anchored)てもよく、またはその表面からタンパク質分子を放出してもよい。
２）同時形成(co-formation)すると、生体材料が封入され得、生体分子の機能的な実体(functional entity)の効率的な使用ができない場合がある。
３）生物有機分子は、キレートおよび還元を同時に行うために必要な還元ポテンシャルをもたないため、直接の機能化または係留は反応時間の延長を必要とする。多くの例において、これらのタイムラインの延長は生体材料の機能的な形状に有害であるとわかる。
４）生物有機材料は短時間の熱によってでさえ変性するため、ＡｇおよびＡｕナノ粒子を加速するために適用されてきた温度の上昇は、使用または使用が意図される生物有機材料とともに行わない。
【０００５】
結果として、今までに報告された先行技術の欠点を常に考えながら、生物有機的に被覆されるＡｇおよびＡｕＮＰを調製するために青色光を使用する先行文献がなく、被覆された／機能化したＮＰを調製するための青色光の使用および関連するプロトコルには、今日直面している欠点がないことの概要を述べ得る。先行技術の欠点を踏まえて、例えばナノ粒子上に被覆される生体分子がそれらの構造上の要素の多くの態様および機能的な態様を未だ保持することなどの、精製され特徴付けられた生体分子を用い、制御された様式で金属ナノ粒子の形成／合成／生合成に関連する問題を解決する方法を提供する、直接的な必要がある。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の主な実施態様は、青色光を用いて生物有機的に被覆される金および銀ナノ粒子を調製するための方法を提供することであり、この方法は以下の工程を含む：
（ａ）６０〜３００μＭの範囲のＡｇＮＯ３またはＨＡｕＣｌ４の溶液を、場合によってｐＨ５から８の緩衝液または０．１から３００ｍＭ ＮａＣｌを含む水中において調製する；
（ｂ）ＡｇＮＯ３と生体分子とのモル比が５０：１であり、ＨＡｕＣｌ４と生体分子とのモル比が３００：１となるように、純粋な生体分子を工程（ａ）で調製する溶液に添加する；
（ｃ）生物有機的に被覆される金および銀ナノ粒子を得るため、工程（ｂ）の混合物を、４０Ｗから２００Ｗの範囲のワット数の青色光に０．１から６０時間、３０℃の温度でさらす。
【０００７】
本発明の別の実施態様は本明細書に記述する方法において、緩衝液はＨＥＰＥＳ、トリス、リン酸またはクエン酸三ナトリウム緩衝液から選択される、方法を提供する。
本発明の別の実施態様は本明細書に記述する方法において、青色光の波長は３５０から４５０ｎｍであり、４０から２００Ｗのワット数である、方法を提供する。
本発明の別の実施態様は本明細書に記述する方法において、使用する生体分子は、ペプチド、抗体、タンパク質、アプタマー、オリゴヌクレオチドおよび７００ダルトン未満の有機小分子からなる群から選択される、方法を提供する。
本発明の別の実施態様は本明細書に記述する方法において、生体分子はゲルゾリンである、方法を提供する。
本発明の別の実施態様は本明細書に記述する方法において、生体分子はインスリンである、方法を提供する。
本発明の別の実施態様は本明細書に記述する方法において、生物有機的に被覆される金および銀ナノ粒子の形成を、反応混合物の色の変化を観察することによって、または銀および金ナノ粒子それぞれにおいて４２０ｎｍから５５０ｎｍでの単一波長における溶液の吸光度を測定することによって、モニターする、方法を提供する。
本発明の別の実施態様は本明細書に記述する方法において、無色から淡黄色、淡黄色から暗黄色への反応混合物の色の変化は生物有機的に被覆された銀ナノ粒子の形成を示す、方法を提供する。
本発明の別の実施態様は本明細書に記述する方法において、無色から明るいピンク色、明るいピンク色から紫色への反応混合物の色の変化は生物有機的に被覆された金ナノ粒子の形成を示す、方法を提供する。
【０００８】
使用する略称のリスト
【表１】
0006488406.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ヒト全長ゲルゾリン存在下で、青色光がＡｇおよびＡｕナノ粒子の形成を特異的に加速することを説明する。
【図２】図２は、広範な生体材料を用いる、青色光に基づくＡｇナノ粒子の形成を説明する。
【図３】図３は、青色光を用いるゲルゾリンおよびインスリンを介するＡｇまたはＡｕナノ粒子の形成が、使用する光源の強さ（ワット数）に依存することを説明する。（ａ）無色から黄色およびピンクがかった色への変化はそれぞれ、Ａｇナノ粒子およびＡｕナノ粒子の形成を示す。（ｂ）同じ実験時間（２から６０時間）における光源のワット数の関数としての４２０または５５０ｎｍでの吸光度の値の増加は、それぞれＡｇまたはＡｕナノ粒子の形成量の増加を支持する。（ｃ）２００Ｗの青色光へ２または６０時間暴露した後の、ゲルゾリンおよびインスリンに基づくそれぞれＡｇまたはＡｕナノ粒子のＴＥＭ像。
【図４】図４は、ナノ粒子表面のキャッピングを確認するための、３つの異なる生体分子、すなわちタンパク質、アプタマーおよび抗体を用いて形成したナノ粒子のＥＬＩＳＡを説明する。（ａ）ＡｇおよびＡｕナノ粒子の表面上のタンパク質の存在を確認するための間接ＥＬＩＳＡ。（ｂ）アプタマー結合性によってＡｇ上に被覆されるゲルゾリンの機能性の、間接ＥＬＩＳＡに基づく評価。（ｃ）ゲルゾリン結合性によってＡｇナノ粒子上に被覆されるアプタマーの機能性の、間接ＥＬＩＳＡに基づく評価。（ｄ）Ａｇナノ粒子上に被覆される抗Ｈｉｓ抗体の機能性を確認するための、抗Ｈｉｓ抗体(anti-His-antibody)および抗Ｈｉｓ抗体＿Ａｇナノ粒子(anti-His-antibody_Ag nanoparticle)のサンドウィッチＥＬＩＳＡ。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の詳細な説明
本発明は様々な改変および／または代替の方法および／または構成が可能であり、その特徴的な実施態様は、図および表において例示として示されており、下記で詳細に記述される。しかしながら、開示される特別な方法および／または構成は本発明を限定することを意図しておらず、逆に、本発明は、添付の特許請求の範囲によって明示される本発明の精神及び範囲内の、全ての改変、相当するもの、および代替物を包含することを理解すべきである。
【００１１】
図中のグラフ、表、画像及びプロトコルは従来の表現で適切に表され、本明細書の記述の利益を得る当業者に明白な細部の記載によって本開示を不明瞭にしないよう、本発明の実施態様の理解に適切な特定の詳細のみを示す。
下記の記述は代表的な実施態様に過ぎず、いかなる方法においても本発明の範囲、適用性または形態を限定することを意図していない。むしろ下記の記述は、本発明の代表的な実施態様を実行するための簡便な説明を提供する。本発明の範囲を逸脱せずに、記述される要素の機能及び配置について、記述される実施態様への様々な変化が施され得る。
【００１２】
用語「含む」、「含んでいる」またはそれらのあらゆる変化形は、例えば一以上の方法または構成物またはシステムまたは手法、に続く「含む」が、さらなる制限なしに、他の方法、サブプロセス、構成物、副構成物(sub-composition)、主要でないもしくは主要な構成物または他の要素または他の構造または追加の方法もしくは構成物または追加の要素または追加の特色または追加の特徴または追加の特性の存在を排除しないように、非排他的な含有を包含することを意図している。
本発明は、入射青色光の適用によって、タンパク質、抗体、ＤＮＡおよび有機小分子を含む種々の生体分子を用いて、塩類溶液から生物有機的に被覆された銀および金の金属ナノ粒子を生合成するための方法を提供する。
【００１３】
一つの態様において、本発明は、機能化または被覆された金属ナノ粒子、特に銀および金の金属ナノ粒子を調整するための費用および時間上効率的な方法を提供する。従って、本発明の方法は、ｐＨが５から８のＨＥＰＥＳ、トリス、リン酸もしくはクエン酸三ナトリウム含む緩衝液または０．１〜３００ｍＭ ＮａＣｌを含む水中において、２つの構成要素（生体材料およびＡｇＮＯ３またはＨＡｕＣｌ４）を混合し、次に定義されたワット数および３０℃に制御した温度において青色光に反応混合物を暴露することを含む、単一の工程の方法である。
【００１４】
本発明の方法は温度またはｐＨのいかなる厳しい反応条件も使用しないため、本明細書で使用する生体分子の性質は元のままである。従って、本方法は、生物有機的に被覆された金属ナノ粒子（特に、例えばコミュニケーションのためのレポーター／トラッキングエレクトロニクス(reporter/tracking electronics)、および／または生物医学への応用、医薬および／またはターゲティングカプセル封入、および／またはバイオセンサーにおける形成もしくは使用、および／または鉱石もしくは溶液からの貴金属の濃縮における使用などの、直接使用でき、様々な応用ができる、銀及び金などの不活性または天然の金属の金属ナノ粒子）の作成において直面する問題を克服する。本研究のある実施態様において、緩衝液は、ＨＥＰＥＳ、トリス、リン酸またはクエン酸三ナトリウム緩衝液から選択される。
【００１５】
本発明のある実施態様は、小分子、ペプチド、アプタマー、タンパク質（抗体を含む）からオリゴヌクレオチドまでの範囲の、本明細書で開示される生物有機分子または生体分子を提供する。
本発明の別の態様は銀ナノ粒子を形成する性質を持つゲルゾリンの実例を示し、他の精製したタンパク質、抗体、ＤＮＡおよび有機小分子から再現性のある様式でナノ粒子の生合成を達成するための、方法条件の広範な並べ替えの探索を行った。同様に、インスリンを別の生体分子の実例として示す。
【００１６】
本発明の別の実施態様は、どの異なるパラメータがナノ粒子の生合成速度に影響を与えるかを調査するため、タンパク質と金属塩との比（１：１０００から１：４０）、緩衝液（リン酸、トリス−ＨＣｌ／グリシン／トリシン、酢酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳなど様々）、温度（２５〜４５℃）、および実験時間（３０分から９０時間）、緩衝液のｐＨ（５〜８）、緩衝液中のＮａＣｌの濃度（０．１〜３００ｍＭ）、ならびに光強度および波長などの種々の条件を様々に変えたことを報告する。金属ナノ粒子のサイズおよび形状を確認するため、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）の追跡実験を行った。後に実験の結果は、ナノ粒子の表面上に繋留または係留または固定化された生物有機分子が、それらのパートナー分子と結合でき、および／またはそれらの抗体によって検出できるため、未だそれらの機能的構造を保持できていることを示す。
【００１７】
従って、本発明のある態様は、全体として金属前駆体の金属への還元がなされる、金属製ナノ粒子を形成する方法を提供する、ここでこの方法は以下の工程を含む：
（ａ）生体分子を、還元されることになる金属前駆体（ＡｇＮＯ３またはＨＡｕＣｌ４）と共に混合し、混合物を形成する；
（ｂ）ＡｇＮＯ３と生体分子の前記混合物を、３０℃に制御された温度、２００ワットの青色光に約２時間暴露する；
（ｃ）ＨＡｕＣｌ４と生体分子の前記混合物を、３０℃に制御された温度、２００ワットの青色光に約６０時間、暴露する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、あらゆる化学もしくは生化学における修飾、生物有機分子のキメラ型、Ｃ末端とＮ末端のどちらかもしくはＮおよびＣ末端への、または結果として得られるタンパク質の精製、トラッキング、特徴付け、分割もしくはフォールディングのために用いるタンパク質配列内への、タグおよび／または配列の付加を用い得る方法を提供する。
別の態様において、本発明は、生体分子で被覆された銀および金ナノ粒子の生合成の方法を提供し、反応条件は以下を含む：
（ａ）様々なタンパク質：金属イオンの比は１：１０００から１：４０であり、０〜９５℃の温度、緩衝液構成物、ｐＨ２〜１０の緩衝液中の可溶性の塩。
（ｂ）ナノ粒子の形成を開始するため、白色または青色光または緑色光または黄色光または赤色光またはＵＶ光（一定または可変）に暴露する。
（ｃ）生物有機分子によるナノ粒子の生合成を開始するための、光および／またはレーザー（一定または可変）のグレーティングした(grated)またはコリメートした(collimated)または特定の、波長の適用。
（ｄ）生物有機分子および／またはそのあらゆる形態による金属ナノ粒子の生合成を開始または制御するため、マイクロ波または赤外線（一定または可変）に暴露する。
（ｅ）生物有機分子および／またはそのあらゆる形態による金属ナノ粒子の生合成を開始または制御するため、磁場（一定または可変）に暴露する。
（ｆ）生物有機分子および／またはそのあらゆる形態による金属ナノ粒子の生合成を開始または制御するため、電場または電圧（ＡＣおよび／またはＤＣ；一定または可変）に暴露する。
【００１９】
別の態様において、本発明は、新規のアッセイの開発、診断、電子光学／バイオセンサーの構成要素、鉱石／溶液からの金属の濃縮、天然または人工の構成物からの天然の金属の回収および医薬品の製剤に有用な、生物有機的に被覆された金属ナノ粒子の生合成の方法を提供する。
別の態様において、本発明は、好ましい光の波長は青であるが、暴露する時間を延長すると、緑色および黄色の光もまた同様の結果を導き得る、方法を提供する。
別の態様において、本発明は、３５０〜４５０ｎｍの波長および４０から２００Ｗのワット数の青色光が支配的な要素である方法を提供する。本方法では、タンパク質または生物有機分子または金属イオン濃度、インキュベーション温度などの従属的な要素は、最終生成物または結果を達成するためにあまり重要ではない。
【００２０】
別の態様において、本発明は、反応混合物の色の変化を観察することによって反応の進行をモニターできることを提供する：無色から淡黄色、淡黄色から暗黄色への変化は生物有機的に被覆された銀ナノ粒子の形成を示し、無色から明るいピンク色、明るいピンク色から紫色への変化は生物有機的に被覆された金ナノ粒子の形成を示す。
別の態様において、本発明は、銀および金ナノ粒子においてそれぞれ４２０ｎｍおよび５５０ｎｍの単一波長における溶液の吸光度を測定することによって、反応の進行をモニターできる代替の手段を提供する。別の態様において、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度法のスキャンは、反応をモニターする本発明の別の形態となり得る。さらに、ナノ粒子の形状およびサイズはＴＥＭ像から計測できる。
【００２１】
本発明の利点
既知の治療用タンパク質およびその変異体を用いる銀および金ナノ粒子の生合成は：
・再現性のあるプロトコルを導く。
・プロトコルの加工(tinkering)は特定の形状およびサイズのナノ粒子を導く。
・この方法はグリーンケミストリー(Green Chemistry)を含む。
必要に応じて、合成後、インビボでの適用の前に、粒子は大規模なプロセッシングを必要とし得らない。
【００２２】
従って、本発明の主要な実施態様は青色光を用いて生物有機的に被覆される金および銀ナノ粒子を調製する方法を提供し、この方法は以下の工程を含む：
（ａ）６０〜３００μＭの範囲のＡｇＮＯ３またはＨＡｕＣｌ４の溶液を、場合によってｐＨ５から８の緩衝液中または０．１から３００ｍＭ ＮａＣｌを含む水中において調製する；
（ｂ）ＡｇＮＯ３と生体分子とのモル比が５０：１であり、ＨＡｕＣｌ４と生体分子とのモル比が３００：１となるように、純粋な生体分子を（ａ）の工程で調製した溶液に添加する；
（ｃ）生物有機的に被覆された金および銀ナノ粒子を得るため、工程（ｂ）の混合物を、４０Ｗから２００Ｗの範囲のワット数の青色光に０．１から６０時間、３０℃の温度でさらす。
【００２３】
本発明の別の実施態様は本明細書に記述する方法において、緩衝液はＨＥＰＥＳ、トリス、リン酸またはクエン酸三ナトリウム緩衝液から選択される、方法を提供する。
本発明の別の実施態様は本明細書に記述する方法において、青色光の波長は３５０から４５０ｎｍであり、４０から２００Ｗのワット数を有する、方法を提供する。
本発明の別の実施態様は本明細書に記述する方法において、使用する生体分子は、ペプチド、抗体、タンパク質、アプタマー、オリゴヌクレオチドおよび７００ダルトン未満の有機小分子からなる群から選択される、方法を提供する。
本発明の別の実施態様は本明細書に記述する方法において、生体分子はゲルゾリンである、方法を提供する。
本発明の別の実施態様は本明細書に記述する方法において、生体分子はインスリンである、方法を提供する。
本発明の別の実施態様は本明細書に記述する方法において、生物有機的に被覆される金および銀ナノ粒子の形成を、反応混合物の色の変化を観察することによって、または銀および金ナノ粒子において、それぞれ４２０ｎｍから５５０ｎｍでの単一波長における溶液の吸光度を測定することによって、モニターする、方法を提供する。
本発明の別の実施態様は本明細書に記述する方法において、無色から淡黄色、淡黄色から暗黄色という反応混合物の色の変化は生物有機的に被覆された銀ナノ粒子の形成を示す、方法を提供する。
【００２４】
別の態様において、本発明は、銀および金ナノ粒子を、本明細書に開示する方法によって、種々の生体分子および有機小分子化合物を用いて作製できることを提供する。
生物有機的に被覆された金属粒子を調整する方法は、以下の工程を含む：
（ａ）タンパク質、ＤＮＡまたは有機小分子を含む溶液への青色光（光源に基づく、または白色光へのいくつかのバンドパスフィルターの適用、または青いレーザー光源の使用のいずれか）の適用。
（ｂ）緩衝液（ｐＨ５〜８の、ＨＥＰＥＳ、トリス、リン酸またはクエン酸三ナトリウム）中または０．１〜３００ｍＭのＮａＣｌを含む水中で作製した、ＡｇＮＯ３またはＨＡｕＣｌ４溶液への、生体分子（タンパク質、ＤＮＡまたは有機小分子）の添加、ここで金属ナノ粒子を形成するための、生体分子：金属塩の比は１：１０００から１：４０である。
【００２５】
別の態様において、本発明は、本発明の方法で用いる種々の生体分子および有機化合物を提供する。
別の態様において、本発明は本発明の方法を行う際の条件を提供する。
下記の例は、説明の目的で与えられ、したがっていかなる様式においても発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。
【実施例】
【００２６】
実施例１：青色光は、全長ゲルゾリン存在下において、ＡｇおよびＡｕナノ粒子の形成を特異的に加速する。
ＡｇＮＯ３またはＨＡｕＣｌ４(Sigma)とゲルゾリン(Sigma)とのモル比を一定（溶液中において銀ナノ粒子とは５０：１であり金ナノ粒子とは３００：１であったが、ＡｇＮＯ３またはＨＡｕＣｌ４の濃度は６０〜３００μＭであった）として、全ての実験を行った。ＡｇおよびＡｕナノ粒子を形成するため、５９．７または９．９μｌのゲルゾリン（原濃度５ｍｇ／ｍｌ）を、それぞれ３６μｌのＡｇＮＯ３またはＨＡｕＣｌ４（５ｍＭの原液濃度）を含むトリス緩衝液（５０ｍＭトリス、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＧＴＡ ｐＨ８）各１ｍｌの反応体積に添加することによって、反応混合物を調製した。この方式では、ＡｇイオンまたはＡｕイオンとゲルゾリンとの最終的なモル比はそれぞれ５０：１および３００：１で一定に保たれた。無色から黄色への色の変化および４００〜５００または５００〜６００ｎｍの波長における特徴的な吸光度のピークは、ＡｇＮＯ３またはＨＡｕＣｌ４の、それぞれＡｇまたはＡｕナノ粒子への変換の特徴である。反応混合物に供給された光の光源は、１５０Ｗ−タングステン−ハロゲンを備えるコールド光源(150W-Tungsten-Halogen equipped Cold light)(LB-150 Cold Light Illumination, COSLAB)であった。反応混合物への異なる波長の入射光を得るため、種々の有色で広範囲のバンドパスフィルター（青、緑、黄色および赤）を用いた。同様に、種々の条件で形成するナノ粒子について研究を行った：温度（２０〜４５℃）、ｐＨ（５〜８）、緩衝液中のＮａＣｌ（０．１〜３００ｍＭ）、ここで形成速度のみが、様々な条件下で有意に異なることがわかった。図１Ａおよび１Ｂは、青、緑、黄、赤および白色光などの種々の波長の光の存在下における、ゲルゾリンを用いるＡｇおよびＡｕナノ粒子形成を表す。
【００２７】
図１に示す結果は、ＡｇＮＯ３の濃度が１８０μＭで、ＡｇＮＯ３とゲルゾリンとの比が５０：１の反応、およびＨＡｕＣｌ４の濃度が１８０μＭで、ＨＡｕＣｌ４とゲルゾリンとの比が３００：１の反応を説明する。前記結果から明白なように、青色光は、緑および黄色の光と比較して、ナノ粒子の最大の収率を与える一方で、赤色光は、暴露する時間や反応時間に依存せず、全くナノ粒子の形成のきっかけとならなかった。二つのグラフは、３６０〜４５０ｎｍの波長の青色光が、ゲルゾリンに基づくＡｇおよびＡｕナノ粒子の形成の特異的なきっかけとなることを明らかに示す。全ての光学的な吸収測定を、１ｃｍの光路長の石英キュベットを備えるＵＶ−可視分光光度計(model CECIL CE7500 7000 series)で行った。
【００２８】
実施例２：広範な生体材料を用いる、青色光に基づくＡｇナノ粒子の形成
青色光を適用することによって、広範な生物および有機化合物をＡｇおよびＡｕナノ粒子の形成に使用できる。反応混合物の吸光度を表し、言い換えると形成したナノ粒子の量である、青色光の存在下での値を光なしの値で割った倍率変化(fold change)として、結果を報告する。この値は、入射青色光によるナノ粒子形成の効率を示す。これら全ての実験において、ワット数２００Ｗで一定の白色光を３６０〜４５０ｎｍの光学的なバンドパスフィルターと共に用いた。これらの結果を与える生体分子の種における相違を強調するため、また主張しているこのプロトコルの一般的な性質を支持するため、等電点（ｐＩ）およびタンパク質、抗体、ペプチド、小分子、およびＤＮＡの分子量を下記の各グラフで言及する。生物有機分子／化合物の名前は倍率変化を示すバー上に記載される。
【００２９】
実施例２［Ａ］：タンパク質に基づく銀および金ナノ粒子の形成
ＡｇまたはＡｕナノ粒子を形成するため、５９．７または９．９μｌのゲルゾリン（５ｍｇ／ｍｌ原液）を、それぞれ３６μｌのＡｇＮＯ３またはＨＡｕＣｌ４（５ｍＭ原液）を含むトリス緩衝液（５０ｍＭトリス、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＧＴＡ ｐＨ８）各１ｍｌの反応体積に添加することによって、ゲルゾリン(Sigma)に基づくＡｇまたはＡｕナノ粒子の反応混合物を調製した。銀イオンおよび金イオンとゲルゾリンとの最終的なモル比は５０：１および３００：１で一定に保たれた。ＡｇおよびＡｕナノ粒子を形成するため、４９．８μｌまたは８．３μｌのＢＳＡ（５ｍｇ／ｍｌ）、１０．４μｌまたは１．７μｌのリゾチーム（５ｍｇ／ｍｌ）、２０．５μｌまたは３．４μｌのウシインスリン（１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ２で水中で調製した）、７５．５μｌまたは１２．６μｌのｔ−ＰＡ（３ｍｇ／ｍｌ、商業的に供給される水中で調製した）、１５．１μｌまたは２．５μｌのＣａＭ（４ｍｇ／ｍｌ）、８．７μｌまたは１．５μｌのＰＤＺ１−ＺＯ１（５ｍｇ／ｍｌ）、１６．４μｌまたは２．７μｌのストレプトアビジン（５ｍｇ／ｍｌ）、および１６．４μｌまたは２．７μｌのウシＲＮａｓｅＡ（３ｍｇ／ｍｌ）を、それぞれ３６μｌのＡｇＮＯ３およびＨＡｕＣｌ４（５ｍＭの原液濃度）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）各１ｍｌの反応体積に混合することによって、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）(Sigma)、ニワトリ卵白リゾチーム(Sigma)、ウシインスリン(Sigma)、遺伝子組換えヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）(Actilyse, Boehringer Ingelheim GmbH & Co.KG, Germany)、カルモジュリン（ＣａＭ、Sigma）、遺伝子組換えＰＤＺ１−閉鎖帯 ＺＯＩ（配列番号１）、ストレプトアビジン(Thermo scientific)、およびウシＲＮａｓｅＡ(Sigma)に基づくＡｇまたはＡｕナノ粒子の同様の反応混合物を調製した。銀イオンおよび金イオンと上記のタンパク質との最終的なモル比は、それぞれ５０：１（Ａｇナノ粒子）および３００：１（Ａｕナノ粒子）で一定に保たれた。
【００３０】
実施例２［Ｂ］：ペプチドに基づく銀および金ナノ粒子の形成
同様に、ペプチドにおいて、トリス緩衝液（２５ｍＭトリスおよび４０ｍＭ ＮａＣｌｐＨ８）中に３ｍｇ／ｍｌの原液を調製した。要素なしの水(Q-pod、水の抵抗率が１８ΩＭ)中に２ｍＭ ＡｇＮＯ３またはＨＡｕＣｌ４を新たに調製する。表１記載のペプチドは、Ｆ−ｍｏｃ固相クリックケミストリー(solid phase F-moc click chemistry)を用いて合成するランダムな２０アミノ酸長の、Ｐｅｐ−２（配列番号２）、Ｐｅｐ−４（配列番号３）、Ｐｅｐ−９（配列番号４）、Ｐｅｐ−１３（配列番号５）、Ｐｅｐ−１４（配列番号６）およびＰｅｐ−１５（配列番号７）を含む。それぞれＡｇＮＯ３またはＨＡｕＣｌ４の２ｍＭ原液９０μｌからなるトリス緩衝液各１ｍｌ中に、Ｐｅｐ−２（５７２．４μｌまたは３５．８μｌ）、Ｐｅｐ−４（５６４．７μｌまたは３５．８μｌ）、Ｐｅｐ−９（３９１．４μｌまたは２４．５μｌ）、Ｐｅｐ−１３（５４３．３μｌまたは３４μｌ）、Ｐｅｐ−１４（５６４μｌまたは３５．２μｌ）およびＰｅｐ−１５（５７８．１μｌまたは３６．１μｌ）の体積のペプチド（３ｍｇ／ｍｌ）を混合した。銀イオンおよび金イオンと各ペプチドとの最終的なモル比は、それぞれ１：４および４：１で一定に保たれた。
【００３１】
表１：本発明で用いる配列の表
【表２】
0006488406.tif 000003
【００３２】
実施例２［Ｃ］：有機小分子に基づく銀および金ナノ粒子の形成
小分子に基づくＡｇおよびＡｕナノ粒子の形成について、０．５Ｍの各原液１８０μｌまたは７．２μｌ（グリシン、スクロースおよび尿素）を、それぞれ５ｍＭ ＡｇＮＯ３またはＨＡｕＣｌ４ ３６μｌを含む水（ｐＨ７）に添加した。銀イオンおよび金イオンと各小分子との最終的なモル比は、それぞれ２：１（Ａｇナノ粒子）および５０：１（Ａｕナノ粒子）で一定に保たれた。
【００３３】
実施例２［Ｄ］：オリゴヌクレオチドに基づく銀および金ナノ粒子の形成
同様に、オリゴヌクレオチドにおいて、ｐＧＥＭＴベクター(Promega)および７６塩基のアプタマー１０．１０Ｒ（配列番号８）などを用いた。ＡｇまたはＡｕナノ粒子を形成するため、１１３．７μｌまたは２．２８μｌのｐＧＥＭＴベクター（２５．７ｎｇ／μｌ）を、それぞれ９μｌのＡｇＮＯ３またはＨＡｕＣｌ４（１０ｍＭ原液）を含む各０．５ｍｌの反応体積（水、ｐＨ７）中に混合することによって、反応混合物を調製した。銀イオンまたは金イオンとｐＧＥＭＴベクターとの最終的なモル比はそれぞれ１：１および５０：１で一定に保たれた。一方、アプタマー１０．１０Ｒにおいて、ＡｇまたはＡｕナノ粒子を形成するため、１８μｌまたは０．９μｌのアプタマー（４．８６μｇ／μｌ）を、それぞれ７．２μｌのＡｇＮＯ３またはＨＡｕＣｌ４（５ｍＭ原液）を含む各０．２ｍｌの反応体積の緩衝液（２５ｍＭトリス ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％ ｔｗｅｅｎおよび２ｍＭ ＣａＣｌ２）中に添加することによって、反応混合物を調製した。銀イオンまたは金イオンとアプタマーとの最終的なモル比はそれぞれ１０：１および２００：１で一定に保たれた。
【００３４】
実施例２［Ｅ］：抗体に基づく銀および金ナノ粒子の形成
抗Ｈｉｓ抗体(Thermo scientific)において、ＡｇまたはＡｕナノ粒子を形成するため、１３．５μｌまたは３．４μｌの抗Ｈｉｓ抗体（１ｍｇ／ｍｌ）を、それぞれ４．５μｌのＡｇＮＯ３またはＨＡｕＣｌ４（１０ｍＭ原液）を含む各０．２５ｍｌの反応体積のＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に添加することによって、反応混合物を調製した。銀イオンまたは金イオンと抗Ｈｉｓ抗体との最終的なモル比はそれぞれ５００：１または２０００：１で一定に保たれた。一方、ヒツジ抗ウサギＨＲＰ抗体(Goat anti-rabbit-HRP antibody)(Thermo scientific)において、ＡｇまたはＡｕナノ粒子を形成するため、各０．２ｍｌの反応体積のＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に、それぞれ３．６μｌのＡｇＮＯ３またはＨＡｕＣｌ４（１０ｍＭ原液）と共に、８．７μｌまたは３．５μｌのヒツジ抗ウサギＨＲＰ抗体（０．４ｍｇ／ｍｌ）を添加することによって、反応混合物を調製した。銀イオンまたは金イオンと抗Ｈｉｓ抗体との最終的なモル比はそれぞれ２０００：１または５０００：１で一定に保たれた。
【００３５】
２［Ａ］から２［Ｅ］の上記全ての実験において、２組の各サンプルは、３０℃の温度に制御されたインキュベーター内で、２００Ｗの青色光存在下および光なしの２つの条件に暴露された。生体分子なしの反応混合物を含む対照試料もまた保持した。さらに、６０分および６０時間暴露された後、４２０ｎｍおよび５５０ｎｍにおいてコロイド溶液を読み取るＵＶ−可視分光光度計を用いて、種々の生体分子で作製したＡｇまたはＡｕナノ粒子の各試料をトラック(track)し、両反応を光ありおよび光なしで行った。図２は、各場合での、光ありおよびなしにおけるＡｇおよびＡｕナノ粒子の最大波長での測定値の倍率変化として得られた結果を説明する。
【００３６】
実施例３：青色光を用いるゲルゾリンおよびインスリンを介するＡｇまたはＡｕナノ粒子の形成は、使用する光源の強度（ワット数）に依存する。
光源(Philips bulb)として種々のワットの電球（２５Ｗ、４０Ｗ、６０Ｗ、１００Ｗおよび２００Ｗ）を用いた。ＡｇまたはＡｕナノ粒子を形成するため、５９．７μｌまたは９．９μｌのゲルゾリン（５ｍｇ／ｍｌ）を、それぞれ３６μｌのＡｇＮＯ３またはＨＡｕＣｌ４（５ｍＭ原液）を含む各１ｍｌの反応体積のトリス緩衝液（５０ｍＭトリス、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＧＴＡ ｐＨ８）中に添加することによって、ゲルゾリン(Sigma)に基づくＡｇナノ粒子またはＡｕナノ粒子の反応混合物を調製した。ＡｇまたはＡｕナノ粒子を形成するため、各１ｍｌの反応体積のＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に、それぞれ３６μｌのＡｇＮＯ３またはＨＡｕＣｌ４（５ｍＭ原液）と共に、２０．５μｌまたは３．４μｌのウシインスリン（１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ２の水中で調製した）を添加することによって、ウシインスリン(Sigma)に基づくＡｇまたはＡｕナノ粒子の反応混合物を調製した。銀イオンまたは金イオンとゲルゾリンまたはインスリンとの最終的なモル比は、それぞれ５０：１（Ａｇナノ粒子）または３００：１（Ａｕナノ粒子）で一定に保たれた。さらに、反応物を種々のワット数の光に暴露し、３０℃でインキュベートした。
【００３７】
実施例３［Ａ］：無色から黄色およびピンクがかった色への色の変化は、それぞれＡｇナノ粒子およびＡｕナノ粒子の形成を示す。
各場合におけるナノ粒子形成の最初の徴候を、ＡｇおよびＡｕナノ粒子において、それぞれ無色から黄色がかったおよびピンクがかった色への反応混合物の色の変化を用いてトラックした。ＵＶ−可視分光光度計を用いて実行した光学的な吸収測定によって、ナノ粒子の収率をトラックした。青色光から離れると、光強度もまた、励起され、金属イオンに電子を供与し、結果として金属ナノ粒子を形成するタンパク質の効率に寄与する。図３Ａの結果は、２５Ｗの光強度存在下では色の変化がないことを示し、このことはこの光強度がＡｇおよびＡｕナノ粒子の両方を誘導するのに十分ではないことを示す。しかしながら、他の全てのワット数（４０Ｗ、６０Ｗ、１００Ｗおよび２００Ｗ）においては、明らかな色の変換があり、その強さは光の強度が増すにつれて増大する。
【００３８】
実施例３［Ｂ］：同じ実験時間（２または６０時間）における光源のワット数の関数としての、４２０または５５０ｎｍでの吸光度の値の増加は、ＡｇまたはＡｕナノ粒子の形成量の増加を支持する
種々のワット数の光で形成したゲルゾリンおよびインスリンに基づくＡｇまたはＡｕナノ粒子を、２００Ｗ青色光の存在下で２または６０時間暴露した後、４２０ｎｍ／５５０ｎｍにおいてコロイド溶液を読み取るＵＶ−可視分光光度計を用いて、さらに確認した。光のワット数の増加に伴う吸光度の値の変化は、上述の反応混合物の色の変化と非常によく相関した。図３Ｂ（左部（Ａｇナノ粒子）および右部（Ａｕナノ粒子））もまた、２５Ｗにおいて４２０ｎｍまたは５５０ｎｍでの吸光度の値は対照試料と同等であることを明らかに示し、このことはこの条件ではナノ粒子が形成しないことを示唆する。しかしながら、他の全ての光のワット数（４０Ｗ〜２００Ｗ）においては、特徴的な波長における吸光度の値に有意な変化があり、このことはゲルゾリンおよびインスリンの両方におけるＡｇまたはＡｕナノ粒子の形成を示す。
【００３９】
実施例３［Ｃ］：２００Ｗの青色光で２から６０時間暴露した後のゲルゾリンおよびインスリンに基づくＡｇまたはＡｕナノ粒子のＴＥＭ像
透過型電子顕微鏡(TEM, model JOEL 1200Ex II)によって、光存在下で形成したゲルゾリンおよびインスリンに基づくＡｇまたはＡｕナノ粒子のさらなる確認を行った。ここで我々は、２００Ｗの青色光で形成したゲルゾリンおよびインスリンに基づくＡｇまたはＡｕナノ粒子のみを考慮した。このカーボンで被覆された銅のグリッドを、１０μｌのゲルゾリンおよびインスリンで被覆されたＡｇナノ粒子およびＡｕナノ粒子に１０分間浸し、空気乾燥し、さらにＴＥＭのサンプルホルダー上にマウントした。マルチプル(multiple)ＴＥＭ像を得た後、尺度（ｎｍ中）とともに示す試料の像として、最も均一なサイズの粒子を選択した。ゲルゾリンに基づくＡｇナノ粒子の試料は不均一な形状および２０〜６０ｎｍのサイズの粒子を示したが、Ａｕナノ粒子においては、粒子はより大きく、１００〜４００ｎｍのサイズの均一な形状（四角／四角形）であったことを、図３Ｃは説明する。一方、インスリンに基づくＡｇおよびＡｕナノ粒子については、両方が不均一で、４０〜８０ｎｍのサイズ範囲内であった（図３Ｃ）。
【００４０】
実施例４：ナノ粒子表面上のキャッピングを確かめるための、３つの異なるタンパク質、アプタマーおよび抗体を用いて形成したナノ粒子のＥＬＩＳＡ
実施例４［Ａ］：ＡｇおよびＡｕナノ粒子の表面上のタンパク質の存在を確認するための間接ＥＬＩＳＡ
ナノ粒子形成の方法完了後、特異的な抗体に対する結合の保持を調べるための抗体の有用性にしたがって、ゲルゾリン(Sigma)、インスリン(Sigma)およびＰＤＺ１−ＺＯ１(Mallik, Arif et al. 2012)（配列番号１）を含むタンパク質を考慮した。ＡｇまたはＡｕナノ粒子を形成するため、５９．７μｌまたは９．９μｌのゲルゾリン（５ｍｇ／ｍｌ）を、それぞれ３６μｌのＡｇＮＯ３またはＨＡｕＣｌ４（５ｍＭ原液）を含む各１ｍｌの反応体積のトリス緩衝液（５０ｍＭトリス、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＧＴＡ ｐＨ８）中に添加することによって、ゲルゾリンに基づくＡｇまたはＡｕナノ粒子の反応混合物を調製した。さらにＡｇまたはＡｕナノ粒子のため、それぞれの反応混合物を３０℃および２００Ｗの青色光で２から６０時間インキュベートした。ゲルゾリンの終濃度がそれぞれ３．６μＭまたは０．６μＭとなるように、各１ｍｌの反応体積のトリス緩衝液（５０ｍＭトリス、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＧＴＡ ｐＨ８）中に、５９．７μｌ（Ａｇナノ粒子の対照）または９．９μｌ（Ａｕナノ粒子の対照）のゲルゾリン（５ｍｇ／ｍｌ）を添加することによって、ゲルゾリンのみの対照試料を調製した。同様に、ウシインスリン(Sigma)に基づくＡｇまたはＡｕナノ粒子において、ＡｇまたはＡｕナノ粒子を形成するため、ウシインスリンの終濃度がそれぞれ３．６または０．６μＭとなるように、２０．５μｌまたは３．４μｌのウシインスリン（１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ２の水中で調製した）を、３６μｌのＡｇＮＯ３またはＨＡｕＣｌ４（５ｍＭ原液）を含む各１ｍｌの反応体積のＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に添加することによって、反応混合物を調製した。ウシインスリンの終濃度がそれぞれ３．６または０．６μＭとなるように、各１ｍｌの反応体積のＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に、２０．５μｌまたは３．４μｌのウシインスリン（１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ２の水中で調製した）を添加することによって、ウシインスリンのみの対照試料を調製した。同様に、ＡｇまたはＡｕナノ粒子を形成するため、ＰＤＺ１−ＺＯ１（配列番号１）の終濃度がそれぞれ３．６または０．６μＭとなるように、８．７μｌまたは１．５μｌのＰＤＺ１−ＺＯ１（配列番号１）（５ｍｇ／ｍｌ）を、３６μｌのＡｇＮＯ３またはＨＡｕＣｌ４（５ｍＭ原液）を含む各１ｍｌの反応体積のＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に添加することによって、ＰＤＺ１−ＺＯ１(Mallik, Arif et al. 2012)（配列番号１）に基づくＡｇまたはＡｕナノ粒子の反応混合物を調製した。ＰＤＺ１−ＺＯ１（配列番号１）の終濃度がそれぞれ３．６μＭまたは０．６μＭとなるように、各１ｍｌの反応体積のＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に、８．７μｌまたは１．５μｌのＰＤＺ１−ＺＯ１（配列番号１）（５ｍｇ／ｍｌ）を添加することによって、ＰＤＺ１−ＺＯ１（配列番号１）のみの対照試料を調製した。さらに、ＡｇまたはＡｕナノ粒子がそれぞれ生物有機的に被覆されるナノ粒子を形成するように、３つ全てのタンパク質において、それぞれ反応混合物を３０℃および２００Ｗの青色光で２から６０時間インキュベートした。ナノ粒子のみの対照試料をクエン酸に基づく方法で調整した。ＡｇまたはＡｕナノ粒子を形成するため、２０μｌまたは１μｌのクエン酸三ナトリウム（１Ｍ��を５μｌまたは１μｌのＡｇＮＯ３またはＨＡｕＣｌ４を含む水５ｍｌ中に添加し、５分間８０℃で加熱し、クエン酸に基づくＡｇまたはＡｕナノ粒子を形成するため、さらにその溶液を１５分間煮沸した。
【００４１】
試料１は、１）ゲルゾリン＿Ａｇナノ粒子（３．６μＭゲルゾリン）、２）ゲルゾリン＿Ａｕナノ粒子（０．６μＭゲルゾリン）、ならびに３）３．６μＭおよび４）０．６μＭのゲルゾリンのみを含む対照試料を含む。
試料２は、１）インスリン＿Ａｇナノ粒子（３．６μＭインスリン）、２）インスリン＿Ａｕナノ粒子（０．６μＭインスリン）、ならびに３）３．６μＭおよび４）０．６μＭのインスリンを含む対照試料を含む。
試料３は、１）ＰＤＺ１−ＺＯ１＿Ａｇナノ粒子（３．６μＭ ＰＤＺ１−ＺＯ１）、２）ＰＤＺ１−ＺＯ１＿Ａｕナノ粒子（０．６μＭ ＰＤＺ１−ＺＯ１）、ならびに３）３．６μＭおよび４）０．６μＭのＰＤＺ１−ＺＯ１を含む対照試料を含む。
【００４２】
同様に、クエン酸に基づくＡｇまたはＡｕナノ粒子の対照試料を、それぞれ４２５ｎｍおよび５３３ｎｍの吸光度に起因するＵＶ−可視分光光度計の測定値によって特徴付けた。クエン酸＿ナノ粒子のナノ粒子の濃度をタンパク質＿ナノ粒子に規格化するため、クエン酸＿ナノ粒子を、タンパク質＿ナノ粒子の吸光度の値に従って希釈した。被覆された試料は５０μｌ、２５μｌ、１２．５μｌおよび６．２５μｌ（タンパク質＿Ａｇナノ粒子）、１００μｌ、５０μｌ、２５μｌおよび１２．５μｌ（タンパク質＿Ａｕナノ粒子）ならびに、それぞれの正（タンパク質のみ）および負（クエン酸＿ナノ粒子のみ）両方の対照試料であり、コーティング(coating)緩衝液（１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３ ｐＨ９．２）で体積の追加を行った。マキシソープ(Maxisorp)９６ウェルプレート中の試料をさらに４℃で一晩インキュベートした。被覆された物質上の余剰の結合部位を飽和させるため、ＰＢＳ中の３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングし、室温で２時間放置した。その後ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、１：３０００で希釈した１００μｌのウサギポリクローナル抗ゲルゾリンまたはポリクローナルウサギ抗インスリンＩｇＧまたは６ｘ−Ｈｉｓエピトープタグマウスモノクローナル抗体を、それぞれゲルゾリンまたはインスリンまたはＨｉｓタグされたＰＤＺ１−ＺＯ−１（配列番号１）のウェルに添加し、さらに２時間インキュベートした。ウェルを上述のように洗浄し、１：８０００で希釈したニワトリ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰと共に１時間室温でインキュベートし、次に基質（ＴＭＢ）溶液(Pierce)を添加し、発色すると２Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を止めた。Multiskan ＥＬＩＳＡリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４３】
３つ全てのタンパク質（図４Ａ、左部（Ａｇナノ粒子）および右部（Ａｕナノ粒子））における、各試料のタンパク質対照の濃度の減少に伴う４５０ｎｍの吸光度の値の減少傾向は、個々のタンパク質によって形成したＡｇおよびＡｕナノ粒子の希釈と非常に良く相関した。ここで表すデータは、クエン酸に基づくナノ粒子において得られたバックグラウンドの吸収を引いた後の吸収の値を示す。この結果は、ナノ粒子の表面上に、ナノ粒子の形成にも関わる機能的なタンパク質が存在することを明らかに示す。
【００４４】
実施例４［Ｂ］：ＡｇまたはＡｕナノ粒子上に被覆するゲルゾリンの機能性の、アプタマー結合性による間接ＥＬＩＳＡに基づく評価
ＡｇまたはＡｕナノ粒子を形成するため、５９．７μｌまたは９．９μｌのゲルゾリン（５ｍｇ／ｍｌ）を、それぞれ３６μｌのＡｇＮＯ３またはＨＡｕＣｌ４（５ｍＭ原液）を含む各１ｍｌの反応体積のトリス緩衝液（５０ｍＭトリス、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＧＴＡ ｐＨ８）中に添加することによって、ゲルゾリンに基づくＡｇまたはＡｕナノ粒子の反応混合物を調製した。さらにＡｇまたはＡｕナノ粒子のため、それぞれの反応混合物を３０℃および２００Ｗの青色光で２から６０時間インキュベートした。ゲルゾリンの終濃度がそれぞれ３．６または０．６μＭとなるように、各１ｍｌの反応体積のトリス緩衝液（５０ｍＭトリス、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＧＴＡ ｐＨ８）中に、５９．７μｌ（Ａｇナノ粒子の対照）または９．９μｌ（Ａｕナノ粒子の対照）のゲルゾリン（５ｍｇ／ｍｌ）を添加することによって、ゲルゾリンのみの対照試料を調製した。ナノ粒子の対照試料をクエン酸に基づく方法で調整した。ＡｇまたはＡｕナノ粒子を形成するため、２０μｌまたは１μｌのクエン酸三ナトリウム（１Ｍ）を、５μｌまたは１μｌのＡｇＮＯ３またはＨＡｕＣｌ４を含む水５ｍｌ中に添加し、５分間８０℃で加熱し、クエン酸に基づくＡｇまたはＡｕナノ粒子を形成するため、さらにその溶液を１５分間煮沸した。ゲルゾリンＡｇまたはＡｕナノ粒子を、２００Ｗ青色光の存在下においてそれぞれ２または６０時間暴露した後、４２０ｎｍまたは５５０ｎｍにおいてコロイド溶液を読み取るＵＶ−可視分光光度計を用いて特徴付けた。同様に、クエン酸に基づくＡｇまたはＡｕナノ粒子の対照試料を、それぞれ４２５ｎｍおよび５３３ｎｍの吸光度を得るためのＵＶ−可視分光光度計の測定によって特徴付けた。試料は、ゲルゾリン＿Ａｇナノ粒子（３．６μＭゲルゾリン）、ゲルゾリンのみ（３．６μＭ）、ゲルゾリン＿Ａｕナノ粒子（０．６μＭゲルゾリン）、およびクエン酸に基づくＡｇまたはＡｕナノ粒子（ゲルゾリンＡｇまたはＡｕナノ粒子に規格化するため、希釈によって吸光度の値を１．２および０．６５とした）を含む。マキシソープ(Maxisorp)９６ウェルプレート中の三通りの１００μｌの試料を被覆した後、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、各ウェルに９０μｌのコーティング緩衝液と共に１０μｌのアプタマー１０．１０Ｒ（配列番号８）を添加し、室温でさらに２時間インキュベートした。さらに、ＰＢＳＴでの洗浄工程後、ＨＲＰ−ストレプトアビジン(Thermo Fisher)を被覆し、再度室温で１時間インキュベートした。インキュベーションの時間経過後、再度洗浄を行い、その後１００μｌの基質（ＴＭＢ）溶液(Pierce)を添加し、発色すると２Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を止めた。Multiskan ＥＬＩＳＡリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。図４Ｂは、３．６μＭの同濃度のゲルゾリンのみおよびゲルゾリン＿Ａｇナノ粒子において、４５０ｎｍでの同等の吸光度の値を明白に示す。ゲルゾリン＿Ａｕナノ粒子における吸光度の値もまたタンパク質の濃度（０．６μＭ）と良く相関している。加えて、クエン酸に基づくＡｇまたはＡｕナノ粒子の対照試料はアプタマーと結合しないことを示した。この結果は、ナノ粒子上に被覆するゲルゾリンがアプタマーとの結��性を完全に維持していることを明らかに示す。
【００４５】
実施例４［Ｃ］：Ａｇナノ粒子上に被覆するアプタマーの機能性の、ゲルゾリン結合性による間接ＥＬＩＳＡに基づく評価
アプタマーに基づくＡｇナノ粒子形成において、Ａｇナノ粒子を形成するため、１８μｌのアプタマー１０．１０Ｒ（配列番号８）（４．８６μｇ／μｌまたは１８ピコモル／μｌ）を、７．２μｌのＡｇＮＯ３（５ｍＭ原液）を含む各０．２ｍｌの反応体積の緩衝液（２５ｍＭトリス ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％ ｔｗｅｅｎおよび２ｍＭ ＣａＣｌ２）中に添加することによって、反応混合物を調製した。銀イオンとアプタマー１０．１０Ｒとの最終的なモル比は１０：１で一定に保たれた。ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ウェルのストレプトアビジン（１ｍｇ／ｍｌ）で処理し、４℃で一晩インキュベートした。アプタマーに基づくＡｇナノ粒子のため、ストレプトアビジンの被覆を用いなかった。余剰の結合部位を飽和させるため、ウェルをＰＢＳ中の３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックし、室温で２時間放置した。その後、ウェルをＰＢＳＴで三回洗浄し、さらに５、１０および２０μｌのアプタマーのみおよびアプタマー＿Ａｇナノ粒子（１８ピコモル／μｌ）を添加し、９０、１８０、３６０μＭの濃度でアプタマーを機能させた。次の工程におけるゲルゾリンありおよびなしの二条件のために、全ての被覆を二通りで行った。室温、２００ｒｐｍで２時間のインキュベーションの時間経過後、１Ｘ ＰＢＳＴで三回洗浄を行った。さらに、二通りの内の一組にはウェルにゲルゾリン（２μｇ／ウェル）を加え、もう一組には緩衝液（５０ｍＭトリス、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ ｐＨ８）のみを加え、再度室温、２００ｒｐｍで２時間インキュベートした。その後ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、１：３０００で希釈した１００μｌのウサギポリクローナル抗ゲルゾリン抗体を添加し、２時間インキュベートした。ウェルを上述のように洗浄し、１：８０００で希釈したニワトリ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ(Thermo Fisher)と共に室温でさらに１時間インキュベートし、次に基質（ＴＭＢ）溶液(Pierce)を添加した。発色すると２Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を止めた。Multiskan ＥＬＩＳＡリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４６】
被覆したアプタマーまたはアプタマー＿Ａｇナノ粒子をゲルゾリンによって捕捉し、さらに間接ＥＬＩＳＡに基づく方法を用いて抗ゲルゾリン抗体で検出した（図４Ｃ）。対照試料はコーティング緩衝液（ゲルゾリンありまたはなし）、アプタマー＿Ａｇナノ粒子またはアプタマー上清＿Ａｇナノ粒子（ゲルゾリンありまたはなし）およびアプタマーのみ（正の対照、ゲルゾリンあり／なし）であった。さらに、「ゲルゾリンなしの試料」において得られた測定値を全試料における「ゲルゾリンありの試料」から引いた。結果は、Ａｇナノ粒子上に被覆したアプタマー１０．１０Ｒ（配列番号８）の、アプタマーのみに対する、３倍以上のゲルゾリン結合能を明白に示した。
【００４７】
実施例４［Ｄ］：Ａｇナノ粒子上に被覆した抗Ｈｉｓ抗体の機能性を確かめるための、抗Ｈｉｓ抗体および抗Ｈｉｓ抗体Ａｇナノ粒子のサンドウィッチＥＬＩＳＡ
Ａｇナノ粒子を形成するため、１３．５μｌの抗Ｈｉｓ抗体（１ｍｇ／ｍｌ）を、４．５μｌのＡｇＮＯ３（１０ｍＭ原液）を含む各０．２５ｍｌの反応体積のＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に添加することによって、抗Ｈｉｓ抗体(Thermo scientific)の反応混合物を調製した。銀イオンと抗Ｈｉｓ抗体との最終的なモル比は５００：１で一定に保たれた。各０．２５ｍｌの反応体積のＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に、１３．５μｌの抗Ｈｉｓ抗体（１ｍｇ／ｍｌ）を添加することによって、抗Ｈｉｓ抗体のみを調製した。全ての場合において、１８．５倍に希釈した０．０５４ｍｇ／ｍｌの抗体を用いた。使用する前に、抗体に基づくＡｇナノ粒子をＰＢＳで三回洗浄し、使用するナノ粒子のみのペレットおよび残渣のナノ粒子としての上清の両方は有色であった。最後に、１：４００、１：８００および１：１０００の３つの希釈における、抗体＿Ａｇナノ粒子および抗体のみ両方の、被覆した抗体の濃度を検査し、４℃で一晩インキュベートした。余剰の結合部位を飽和させるため、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で室温で２時間ブロックした後、二組二通りの各試料（次の工程におけるゲルゾリンありの組となしのもう一組）を放置した。その後、ウェルをＰＢＳＴで三回洗浄し、一組にゲルゾリン（２μｇ／ウェル）を添加し、もう一組に緩衝液（５０ｍＭトリス、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＧＴＡ ｐＨ８）のみを添加し、再度室温、２００ｒｐｍで２時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで三回洗浄し、１：３０００で希釈した１００μｌのウサギポリクローナル抗ゲルゾリン抗体を添加し、２時間インキュベートした。ウェルを上述のように洗浄し、１：８０００で希釈したニワトリ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ(Thermo Fisher)で室温でさらに１時間インキュベートし、次に基質（ＴＭＢ）溶液(Pierce)を添加した。発色すると２Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を止めた。Multiskan ＥＬＩＳＡリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４８】
被覆した抗Ｈｉｓ抗体および抗Ｈｉｓ抗体に基づくＡｇナノ粒子によってゲルゾリンを捕捉し、さらに抗ゲルゾリン抗体を用いて検出した。対照試料はコーティング緩衝液（ゲルゾリンありまたはなし）、抗Ｈｉｓ抗体＿Ａｇナノ粒子または抗Ｈｉｓ抗体＿Ａｇナノ粒子の上清（ゲルゾリンありまたはなし）および抗Ｈｉｓ抗体のみ（正の対照、ゲルゾリンあり／なし）であった。さらに、「ゲルゾリンなしの試料」において得られた測定値を全試料における「ゲルゾリンありの試料」から引いた。非結合、または非常に小さいＡｇナノ粒子を有する抗Ｈｉｓ抗体＿Ａｇナノ粒子の上清がゲルゾリンとの結合の徴候を示したため、結果（図４Ｄ）は、Ａｇナノ粒子上に被覆した抗Ｈｉｓ抗体の、抗Ｈｉｓ抗体のみに対する、より高いゲルゾリン結合能を明白に示す。
【００４９】
参考文献
Berti, L., A. Alessandrini, et al. (2005). "DNA-templated photoinduced silver deposition." Journal of the American Chemical Society 127(32): 11216-11217.
Cardoso, V. S., P. V. Quelemes, et al. (2014). "Collagen-based silver nanoparticles for biological applications: synthesis and characterization." Journal of nanobiotechnology 12(1): 36.
Eby, D. M., N. M. Schaeublin, et al. (2009). "Lysozyme catalyzes the formation of antimicrobial silver nanoparticles." ACS nano 3(4): 984-994.
Filippo, E., A. Serra, et al. (2010). "Green synthesis of silver nanoparticles with sucrose and maltose: Morphological and structural characterization." Journal of Non-Crystalline Solids 356(6): 344-350.
Krishnamurthy, S., R. Vaiyapuri, et al. (2015). "Lipid-coated polymeric nanoparticles for cancer drug delivery." Biomaterials science 3(7): 923-936.
Le Guevel, X., N. Daum, et al. (2011). "Synthesis and characterization of human transferrin-stabilized gold nanoclusters." Nanotechnology 22(27): 275103.
Mallik, L., E. Arif, et al. (2012). "Solution structure analysis of cytoplasmic domain of podocyte protein Neph1 using small/wide angle x-ray scattering (SWAXS)." Journal of Biological Chemistry 287(12): 9441-9453.
Tan, Y. N., J. Y. Lee, et al. (2010). "Uncovering the design rules for peptide synthesis of metal nanoparticles." Journal of the American Chemical Society 132(16): 5677-5686.
Xie, J., Y. Zheng, et al. (2009). "Protein-directed synthesis of highly fluorescent gold nanoclusters." Journal of the American Chemical Society 131(3): 888-889.
Ashish et al, Aptamers for purifying and quantifying gelsolin and its variants. Indian Appl No. 2852DEL2014,07/10/2014 (PATENT FILED)
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【配列表】
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