(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
チアゾビビン（Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ）、バルプロ酸（Ｖａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）、パルモルファミン（Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ）、Ａ８３０１、ＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ９９０２１、ＤＺＮｅｐ（Ｄｅａｚａｎｅｐｌａｎｏｃｉｎ  Ａ）、及び５−ＡＺＡを含む培地でヒト線維芽細胞を培養する段階を含む神経幹細胞の製造方法。
【請求項２】
前記培地は、ＰＤ０３２５９０１、アスコルビン酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＳ４８、ホルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）及びトラニルシプロミン（Ｔｒａｎｙｌｃｙｐｒｏｍｉｎｅ）で構成された群から選択された１種以上の小分子化合物をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の神経幹細胞の製造方法。
【請求項３】
前記培地は、Ｎ２、Ｂ２７、ｂＦＧＦ及びＥＧＦが含まれたＤＭＥＭ／Ｆ１２であることを特徴とする請求項１に記載の神経幹細胞の製造方法。
【請求項４】
前記培養は、１０〜１５日間行われることを特徴とする請求項１に記載の神経幹細胞の製造方法。
【請求項５】
前記ヒト線維芽細胞を継代培養した後、浮遊培養してスフィアを形成する段階；及び形成された前記スフィアを付着培養した後、再び浮遊培養する段階をさらに含むこと特徴とする請求項１に記載の神経幹細胞の製造方法。
【請求項６】
前記浮遊培養及び付着培養は、それぞれ７〜１０日間行われることを特徴とする請求項５に記載の神経幹細胞の製造方法。
【請求項７】
形成された前記スフィアを付着培養した後、再び浮遊培養する段階を２〜４回繰り返すことを特徴とする請求項５に記載の神経幹細胞の製造方法。
【請求項８】
前記神経幹細胞は、ネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）、ｓｏｘ１またはｍｕｓａｓｈｉ  １を発現することを特徴とする請求項１に記載の神経幹細胞の製造方法。
【請求項９】
前記神経幹細胞は、星状細胞（ａｓｔｏｃｙｔｅ）、乏突起膠細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）、ニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）、ドーパミン神経細胞、ＧＡＢＡ性神経細胞、運動神経細胞およびコリン作動性ニューロンで構成された群から選択されるいずれか一つ以上に分化することを特徴とする請求項１に記載の神経幹細胞の製造方法。
【請求項１０】
前記神経幹細胞は、染色体安定性を維持させることを特徴とする請求項１に記載の神経幹細胞の製造方法。
【請求項１１】
前記神経幹細胞は、１０継代以上未分化状態を維持することを特徴とする請求項１に記載の神経幹細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト線維芽細胞を神経幹細胞に転換する方法に関し、より詳細には外部遺伝子の導入なしに小分子化合物の組み合わせだけを利用してヒト線維芽細胞を神経幹細胞に直接転換させる方法及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト線維芽細胞を人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）に誘導させた研究が２００７年進行されるにつれ細胞のリプログラミング（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）に対する関心が高まっている。従来の幹細胞研究に利用されたヒト胚性幹細胞の場合、ヒトの胚使用による倫理的問題と、免疫拒否反応問題、そして分化されなかった胚性幹細胞が移植される場合、テラトーマ（ｔｅｒａｔｏｍａ）形成の問題があって、成体幹細胞の場合には細胞の確保が難しく、分化能に制限があるとの問題点を有している。しかし、人工多能性幹細胞は倫理的問題から回避されて免疫拒否反応問題はないが、分化されなかった幹細胞が移植される場合、テラトーマ形成の問題を起こすことがある。人工多能性幹細胞は、胚性幹細胞と類似する性質を有しているが、人工多能性幹細胞を形成するのに主に利用される方法であるウイルスシステムは遺伝子の無作為的な挿入によって突然変異を形成させ得る。ウイルスの問題点を解決しようとプラスミド、タンパク質、ＲＮＡなどを利用しているが、効率が低く癌遺伝子を利用する点から確認されなかった新しい問題が発生する可能性がある。
【０００３】
このような人工多能性幹細胞の問題点を解決する方案として、直接交差分化方法を利用したヒト線維芽細胞を所望の細胞に直接分化（ｄｉｒｅｃｔ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）させる研究が報告された。中でも難治性脳疾患の治療を目的とする線維芽細胞を利用した神経細胞への直接分化研究が盛んに行われて、ヒトの線維芽細胞に様々な組み合わせの神経細胞関連転写因子を導入して、これにより神経細胞を形成する研究を成功させた。これは、難治性脳疾患の細胞治療剤として使用の可能性を示したが、神経細胞へはすでに分化された細胞であるため、細胞治療に利用する程の十分量の細胞を確保するのが困難である。
【０００４】
このような問題から、近年線維芽細胞を利用して神経幹細胞に直接分化させる方法が研究されていて、ウイルスシステムを利用した様々な転写因子を導入して線維芽細胞から神経幹細胞を誘導する方法であるが、最近ではただ一つの転写因子だけを利用して神経幹細胞を誘導できる水準にまで至っている。神経幹細胞は、自己再生（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗ）が可能であるため、必要なだけの細胞が得られて、神経細胞への分化が可能である。また、直接交差分化方法で各個人の線維芽細胞から誘導された神経幹細胞は、倫理的な問題と免疫拒否反応、そして移植後腫瘍形成の問題がないため、難治性脳疾患の細胞治療剤として利用するのに非常に有用な細胞である。
【０００５】
細胞治療は、人体内損傷された細胞及び組織を代替するため、実験的に誘導した健康な細胞を移植して治療する方法である。遺伝的要因による疾病を有する患者の場合には、皮膚細胞を利用して所望の細胞に直接転換して、遺伝子操作で正常遺伝子を代替した後、移植に利用することができる。しかし、従来から研究されてきた直接交差分化方法は、外部遺伝子を導入する方式であるため、実質的な細胞治療剤として使用するのは困難である。
【０００６】
そこで、本発明者等は、外部遺伝子導入なしに小分子化合物だけを利用して線維芽細胞を神経幹細胞に誘導しようと鋭意努力した結果、移植に必要な十分量に増殖が可能で、腫瘍形成なしに遺伝的にも安定した（ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）神経幹細胞を製造できることを確認して本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、小分子化合物を含む培地でヒト線維芽細胞を培養して神経幹細胞を製造する方法及び前記製造された神経幹細胞を有効性分として含有する脳疾患治療用細胞治療剤を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明は、チアゾビビン（Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ）、バルプロ酸（Ｖａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）、パルモルファミン（Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ）、Ａ８３０１、ＳＢ４３１５４２及びＣＨＩＲ９９０２１を含む培地でヒト線維芽細胞を培養する段階を含む神経幹細胞の製造方法を提供する。
【０００９】
本発明はまた、前記方法によって製造された神経幹細胞を含有する脳疾患治療用細胞治療剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】１３種小分子物質の添加による細胞の形態学的変化を確認した結果である。
【図２】１３種小分子物質の添加による遺伝子発現を確認した結果である。
【図３】小分子化合物４種、６種、８種の使用による細胞の形態学的変化を確認した結果である。
【図４】誘導された神経幹細胞の形態学的確認、マーカー遺伝子及びタンパク質の発現を確認した結果である。
【図５】誘導された神経幹細胞の初期段階と後期段階の形態学的確認、マーカー遺伝子及びタンパク質の発現を確認した結果である。
【図６】誘導された神経幹細胞の染色体分析を介した染色体を確認した結果である。
【図７】誘導された神経幹細胞の時期別細胞増殖率を分析した結果である。
【図８】バイサルファイト（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）ＰＣＲ分析を利用した誘導された神経幹細胞の後成遺伝的変化を確認した結果である。
【図９】誘導された神経幹細胞の３神経系細胞への分化を確認した結果である。
【図１０】誘導された神経幹細胞の種々の神経細胞への分化を確認した結果である。
【図１１】誘導された神経幹細胞が移植されたマウスの脳を分析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する實驗方法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００１２】
本発明では、小分子物質を利用してヒト線維芽細胞を神経幹細胞に誘導するための最適な小分子物質の組み合わせを構築して、様々な小分子物質の各機能を確認した。これにより小分子物質の組み合わせからなる培養液でヒト神経幹細胞を誘導して、染色体異常のない遺伝的安定性を確保して、誘導された神経幹細胞を長期間増殖及び維持するための最適化された培養条件を確立した。以後、ヒト神経幹細胞の基本的特性確認及び３神経系細胞と種々の神経細胞への分化能を確認して、誘導されたヒト神経幹細胞は移植後腫瘍形成なしに３神経系細胞に分化することを確認した。また、小分子物質の一部が内胚葉及び中胚葉関連遺伝子の発現を調節することにより、内胚葉と中胚葉関連細胞の誘導可能性を確認した。
【００１３】
したがって、一観点において、本発明は、チアゾビビン（Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ）、バルプロ酸（Ｖａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）、パルモルファミン（Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ）、Ａ８３０１、ＳＢ４３１５４２及びＣＨＩＲ９９０２１を含む培地でヒト線維芽細胞を培養する段階を含む神経幹細胞の製造方法に関する。
【００１４】
本発明で「チアゾビビン（Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ：Ｎ−ｂｅｎｚｙｌ−２−（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−４−ｙｌａｍｉｎｏ）ｔｈｉａｚｏｌｅ−４−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）」とは、神経細胞と神経幹細胞の細胞死滅を誘導するＲｈｏ／ＲＯＣＫ信号を防いで、神経幹細胞の増殖を抑制するＰＴＥＮ信号を防ぐと知られていて、神経幹細胞の細胞死滅抑制と自己再生能力と自己増殖能力を増加させることができると予想される（Ｍａｔｔｈｉａｓ  Ｇｒｏｓｚｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：２１８６，２００１）。前記チアゾビビン（Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ）は、ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ）を選択的に抑制する役割をする物質であるＲＯＣＫ抑制剤として、チアゾビビン以外にＹ−２７６３２などを使用することができる。前記チアゾビビンを培地に処理して有効濃度で含まれるようにして、培地の種類及び培養方法など当分野で周知の要素により有効濃度は影響を受け得る。
【００１５】
本発明で「ＶＰＡ（ｖａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ，２−プロピルペンタン酸）」とは、ヒストンデアセチラーゼ抑制剤（ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）として、ヒストンデアセチラーゼを抑制する物質を意味して、クロマチンを高アセチル化状態で作って細胞増殖抑制因子及び分化誘導に必須的な遺伝子の発現を促進して細胞（癌細胞）の分化を誘導して血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を抑制して、細胞周期をＧ１状態に固定させて癌細胞（ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ）のアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘発して強い細胞増殖抑制（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ）坑癌活性を示すことが知られている。ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）は、ｐＲＢ／Ｅ２Ｆを媒介に遺伝子転写（ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を抑制して、ヒストンアセチル化（ｈｉｓｔｏｎｅ  ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）の破壊が種々の癌発生と関連していて、ＨＤＡＣは低酸素症、低糖、細胞癌化など劣悪な環境条件で高発現されて細胞増殖抑制因子の発現を阻害して、細胞増殖を促進させる役割をして、ＨＤＡＣは細胞癌化及び分化調節に重要調節因子として認識されていると知られている。特に、前記ＶＰＡは、イノシトール（ｉｎｏｓｉｔｏｌ）減少を誘発して、ＧＳＫ−３βを阻害して、ＥＲＫｐａｔｈｗａｙを活性化させて、ＰＰＡＲ活性を刺激すると知られている。
【００１６】
前記ヒストンデアセチラーゼ抑制剤（ＨＤＡＣ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）ＶＰＡ（ｖａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ，２−プロピルペンタン酸）の他にもトリコスタチン（ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ、ＴＳＡ）またはその誘導体などを使用することができ、前記誘導体は、薬剤学的に許容可能な各種無機塩または有機塩を含む。処理濃度は低すぎると効果を得にくく、濃度が高すぎると毒性を有するようになるため、細胞の種類に応じて適正な濃度を確認しなければならない。
【００１７】
本発明で「パルモルファミン（ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ）」とは、プリン化合物（ｐｕｒｉｎｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）として、Ｓｈｈ信号体系に関与すると知られている。前記パルモルファミンは、Ｓｈｈシグナルを誘導できるなら特に制限はなく様々な誘導体が使用されることができる。例えば、２−（１−Ｎａｐｈｔｈｏｘｙ）−６−（４−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏａｎｉｌｉｎｏ）−９−ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｐｕｒｉｎ）等の市販中のものを購入して使用することができる。前記パルモルファミンは、神経幹細胞様細胞に逆分化を誘導するために通常使用される培地に処理すれば良い。このようにＳｈｈ類似体であるパルモルファミンを処理すると、ヒト線維芽細胞から神経幹細胞を製造するために遺伝子を導入する必要がないメリットがある。前記パルモルファミンは、前記培地に有効濃度で含まれるようにして、培地の種類及び培養方法など当分野で周知の要素によりパルモルファミンの有効濃度は影響を受け得る。
【００１８】
本発明で「Ａ−８３０１」とは、ＴＧＦ−βタイプＩレセプター抑制剤（ＴＧＦ−βｔｙｐｅ  Ｉ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）として、ＴＧＦ−βタイプＩレセプターに結合してＴＧＦ−βタイプＩの正常な信号伝達過程を妨害する物質を意味する（Ｔｏｊｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．９６：７９１−８００，２００５）。ＴＧＦ−βタイプＩ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−βｔｙｐｅ  Ｉ）は、細胞増殖、分化及び種々の細胞に様々な作用をする多機能性ペプチドであって、このような多機能性は脂肪細胞形成、筋細胞形成、骨細胞形成、上皮細胞分化などの様々な組織の成長及び分化で中枢的な役割をして、神経幹細胞の増殖を抑制すると知られている。前記ＴＧＦ−βタイプＩレセプター抑制剤Ａ−８３０１の他にも、ＳＢ４３１５４２を含むすべてのＴＧＦ−βタイプＩレセプター抑制剤が使用されることができ、前記低分子物質ＴＧＦ−βタイプＩレセプター抑制剤Ａ−８３０１は、市販されているものを購入して使用するか、製造して使用することができ、前記抑制剤の処理によって神経幹細胞増殖が促進される。前記ＴＧＦ−βタイプＩレセプター抑制剤Ａ−８３０１は、培地に処理して有効濃度で含まれるようにして、培地の種類及び培養方法など当分野で周知の要素により有効濃度は影響を受け得る。
【００１９】
本発明で、「ＳＢ４３１５４２」は、ＡＬＫ５（Ａｃｔｉｖｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｋｉｎａｓｅ−５）抑制剤として、迅速な逆分化を誘導して染色体安定性を向上させる役割を果たす。
【００２０】
本発明で「ＣＨＩＲ９９０２１」とは、ＧＳＫ（ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ）抑制剤として、ＧＳＫ信号伝達過程に関与するＧＳＫ１／２のアップストリーム（ｕｐｓｔｒｅａｍ）分子であるＧＳＫ１／２を標的にする物質である。前記ＣＨＩＲ９９０２１は、アミノピリミジン（ａｍｉｎｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）と表示されて、ＣＨＩＲ９９０２１の他にも、すべてのＧＳＫ抑制剤が使用されることができる。
【００２１】
本発明において、前記培地は、ＤＺＮｅｐ（Ｄｅａｚａｎｅｐｌａｎｏｃｉｎ  Ａ）または５−ＡＺＡをさらに含むことが好ましいが、これに限定されない。また、前記培地は、ＰＤ０３２５９０１、アスコルビン酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＳ４８、ホルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）及びトラニルシプロミン（Ｔｒａｎｙｌｃｙｐｒｏｍｉｎｅ）で構成された群から選択された１種以上の小分子化合物をさらに含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００２２】
本発明で、「５−アザシチジン（５−Ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ，５−ＡＺＡ）」とは、４−アミノ−１−β−Ｄ−リボフラノシル−１，３，５−トリアジン−２（１Ｈ）−オン（４−ａｍｉｎｏ−１−β−Ｄ−ｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎ−２（１Ｈ）−ｏｎｅ）に命名されて、ＤＮＡ脱メチル化作用を有すると知られる化合物である。また、５−アザシチジンは、白血病、リンパ腫及び様々な固形腫瘍に対して活性を示す抗腫瘍性薬剤としても知られている。前記５−アザシチジンは、当業界に知られた一般的な化学的合成方法によって合成して収得したり、市販されているものを購入して使用することができる（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ、ＵＳＡ））。
【００２３】
本発明で、ＰＤ０３２５９０１は、ＭＥＫ／ＥＲＫ信号伝達経路阻害剤中一つであり、アスコルビン酸は、水溶性ビタミンの一つとして強い坑酸化効果を有する。
【００２４】
本発明で、ホルスコリンは、アデニル酸シクラーゼの触媒サブユニットを直接活性化して細胞内ｃＡＭＰの濃度を上昇させる作用をして、トラニルシプロミンは神経末端で正常にノルエピネフリンを分解する酵素であるモノアミン酸化酵素（ＭＡＯ）を抑制する作用をする。
【００２５】
本発明において、培養培地は、神経幹細胞培養に汎用的に使用される培地を全て含む。培養に使用される培地は、一般に炭素源、窒素源及び微量元素成分を含む。これに限定されるのではないが、前記培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ２、Ｂ２７、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）及びＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）からなるのが好ましい。
【００２６】
本発明の誘導された神経幹細胞の培養のための培地は、当業界に知られた基本培地を制限なしに用いることができる。基本培地は人為的に合成して製造することができ、商業的に製造された培地を用いることもできる。商業的に製造される培地としては、例えば、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ  １６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、α−ＭＥＭ（α−Ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｇ−ＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）及びＩｓｏｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍなどが挙げられるが、これらに限定されず、ＤＭＥＭ培地であってもよい。本発明の具体的な実施例ではＤＭＥＭ培地に培養させた。
【００２７】
本発明において、培養期間は、１０〜１５日であることが好ましいか、これに限定されない。
【００２８】
本発明において、前記細胞を継代培養した後、浮遊培養してスフィアを形成する段階；及び前記形成されたスフィアを付着培養した後、再び浮遊培養する段階をさらに含むことが好ましいが、これに限定されない。前記浮遊培養及び付着培養は、それぞれ７〜１０日間行われることが好ましく、前記形成されたスフィアを付着培養した後、再び浮遊培養する段階は２〜４回繰り返すことが好ましいが、これに限定されない。
【００２９】
本発明において、「神経幹細胞」は、自己複製能力を有すると共に、ニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）および／またはグリア（ｇｌｉａ）、例えば、星状細胞（ａｓｔｏｃｙｔｅ）、乏突起膠細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）および／またはシュワン細胞（Ｓｃｈｗａｎｎ  ｃｅｌｌ）などに分化する多分化能力を有する未分化細胞である。神経幹細胞は、特定の神経系細胞に分化する神経前駆細胞やグリア前駆細胞を介して神経細胞、例えば、ニューロンやグリアに分化する。
【００３０】
本発明において、前記神経幹細胞は、ネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）、ｓｏｘ１またはｍｕｓａｓｈｉ  １を発現することを特徴とし、星状細胞（ａｓｔｏｃｙｔｅ）、乏突起膠細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）、ニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）、ドーパミン神経細胞、ＧＡＢＡ性神経細胞、運動神経細胞およびコリン作動性ニューロンで構成された群から選択されるいずれか一つ以上に分化することを特徴とするが、これに限定されない。
【００３１】
本発明において、前記神経幹細胞は、染色体安定性を維持させることを特徴とし、１０継代以上未分化状態を維持することを特徴とするが、これに限定されない。
【００３２】
ヒト線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）を直接転換（Ｄｉｒｅｃｔ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）方法を利用して神経幹細胞に誘導する多くの方法は、神経幹細胞の形成に関連した外部遺伝子を導入する方式で行われている。この時、様々な方法を介して外部遺伝子を導入するが、主に利用される方法は、ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌまたはｒｅｔｒｏｖｉｒａｌベクターシステムを利用するものである。ウイルスを利用して遺伝子を導入するのは、外部遺伝子の無作為的なインテグレーション（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）による遺伝的不安定性（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）を引き起こして、その後患者に臨床適用時癌が発生する可能性がある。このような理由から、徐々に外部遺伝子を注入せず小分子物質（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を利用する方法が提示されているのが現状である。しかし、近年様々な小分子化合物を利用して直接転換を誘導する研究が盛んに行われているにも関わらず少なくとも一つの遺伝子は利用されていて、遺伝子導入なしでは依然としてヒト体細胞から所望の神経幹細胞に転換することはできない状態である。
【００３３】
しかし、本発明技術は、外部遺伝子の導入なしにヒト線維芽細胞から神経幹細胞を誘導する遺伝的安定性が確保された方法で、従来の遺伝子を利用した遺伝的欠損を誘導する方法を解決しようと考案されたものである。
【００３４】
本発明では、小分子物質の組み合わせだけを利用してヒト線維芽細胞を神経幹細胞に直接転換した。そこで、従来の技術が有する多くの問題点、例えば、胚性幹細胞と関連した倫理的な問題と免疫拒否問題、胚性幹細胞と人工多能性幹細胞が有している腫瘍形成問題などを克服することによって、患者のための細胞治療剤としての活用の可能性が非常に高い。それだけでなく、脳疾患患者体細胞を利用した直接的に神経幹細胞への製作は神経細胞の損傷または死滅による脳疾患の発病機序研究のための新しい細胞モデルとして活用できる。このような方法で製作された神経幹細胞は、人工多能性幹細胞と比較時非常に速く、経済的である。人工多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞に製作する過程と、これをさらに神経細胞へ分化させるのに要する時間とコストが２倍以上掛かる。
【００３５】
また、成体神経幹細胞と本発明に係る交差分化神経幹細胞を比較すると、交差分化神経幹細胞は、胎児または成体脳から神経幹細胞を確保する必要がないため、倫理的な問題がなく、成体幹細胞は自己再生能力が制限されているが、交差分化神経幹細胞は、自己再生能力に限界がなく必要なだけの十分な細胞を産生することができる長所がある。さらには、交差分化神経幹細胞は、患者本人の細胞を利用して製作可能であるため、免疫拒否反応がなく、疾病研究のための患者カスタム型細胞モデリングが可能で、開発された薬物の患者カスタム型毒性評価及び新薬開発に利用できる。特に、本発明の交差分化神経幹細胞は、外部遺伝子を使用しないため、外部遺伝子の無分別な挿入により発生する腫瘍形成の可能性がなく、細胞治療剤として活用可能性が高いといえる。
【００３６】
従って、他の観点において、本発明は、小分子化合物を含む培地でヒト線維芽細胞を培養する段階を含む方法によって製造された神経幹細胞を含有する脳疾患治療用細胞治療剤に関する。
【００３７】
本発明において、前記脳疾患は、脳卒中、脳溢血、脳梗塞、アルツハイマー病、痴呆、ハンチントン病、パーキンソン病、多発性硬化症、多発性神経萎縮症、テンカン、ピック病およびクロイツフェルト−ヤコブ病で構成された群から選択されることを特徴とするが、これに限定されない。
【００３８】
本発明は、脳疾患治療のための臨床適用可能な神経幹細胞として活用が可能で、遺伝性脳軽疾患患者由来疾病神経幹細胞を製作する場合、発病機序研究に直接的に活用できる脳疾患細胞モデルとして使用できて、遺伝子操作を利用した突然変異遺伝子を正常遺伝子に代替できれば、遺伝性脳疾患患者治療のための細胞治療剤として使用できる。
【００３９】
本発明で、「細胞治療剤」とは、ヒトから分離、培養および特殊な操作を介して製造された細胞および組織で疾病の治療、診断および予防の目的で使用される医薬品（米国ＦＤＡ規定）として、細胞または組織の機能を復元させるために生きている自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）、同種（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）、異種（ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）細胞を体外で増殖・選別したり、その他の一方法で細胞の生物学的特性を変化させるなどの一連の行為を介して疾病の治療、診断および予防の目的で使用される医薬品をいう。
【００４０】
本発明で、用語「治療」とは、前記細胞治療剤の投与によって疾病の症状が好転するか、有利に変更されているいずれの行為を意味する。
【００４１】
本発明の細胞治療剤組成物の投与経路は、目的組織に到達することができるのであれば、いかなる一般的な経路を通じて投与してもよい。非経口投与経路は、例えば、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下内投与、内皮投与などを含むが、これらに制限されない。
【００４２】
前記組成物は、細胞治療に一般に使用される薬剤学的に許容される担体と共に適切な形態で剤形化されることができる。「薬学的に許容される組成物」とは、生理学的に許容され、ヒトに投与される時、通常胃腸障害、めまいのようなアレルギー反応またはこれと類似する反応を起こさない組成物のことをいう。薬学的に許容される担体としては、例えば水、適切なオイル、食塩水、水性グルコースおよびグリコールなどといった非経口投与用担体などがあって、安定化剤および保存剤をさらに含むことができる。適切な安定化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。適切な保存剤としては、ベンザルコニウムクロリド、メチル−または、プロピル−パラベンおよびクロロブタノールがある。その他の薬学的に許容される担体としては、次の文献に記載されているものを参考にすることができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５）。
【００４３】
また、前記組成物は、細胞治療剤が標的細胞に移動することができる任意の装置によって投与されてもよい。
【００４４】
本発明の細胞治療剤組成物は、疾患の治療のために治療学的に有効な量の細胞治療剤を含んでもよい。
【００４５】
「治療学的に有効な量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」とは、研究者、獣医師、医師またはその他臨床によって考えられる組織系、動物またはヒトで生物学的または医学的反応を誘導する有効成分または薬学的組成物の量を意味するもので、これは治療される疾患または障害の症状の緩和を誘導する量を含む。
【００４６】
本発明の組成物に含まれる細胞治療剤は、所望の効果により変わることは当業者に明らかである。従って、最適な細胞治療剤含有量は、当業者によって容易に決定され、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含まれた他の成分の含有量、剤形の種類、および患者の年齢、体重、一般健康状態、性別および食餌、投与時間、投与経路および組成物の分泌率、治療期間、同時使用される薬品をはじめとする種々の因子により調節され得る。前記要素を全て考慮して副作用なしに最小限の量で最大効果を得ることができる量を含むことが重要である。例えば、本発明の幹細胞の１日投与量は１．０×１０４〜１．０×１０１０細胞／ｋｇ体重、好ましくは１．０×１０５〜１．０×１０９細胞／ｋｇ体重を１回または数回に分けて投与することができる。しかし、有効性分の実際の投与量は、治療しようとする疾患、疾患の重症度、投与経路、患者の体重、年齢及び性別などの様々な関連因子に照らして決定されなければならないものと理解されるべきで、したがって、前記投与量はどの面からでも本発明の範囲を限定するものではない。
【００４７】
また、本発明の治療方法で、本発明の細胞治療剤を有効性分として含む組成物は、直腸内、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内、経皮、局所、眼内または皮内経路を介して通常の方式で投与することができる。
【００４８】
本発明は、哺乳動物に治療学的に有効な量の本発明の前記細胞治療剤を投与することを含む脳疾患治療法を提供する。本明細書において使用された用語「哺乳動物」とは、治療、観察または実験の対象である哺乳動物をいい、好ましくはヒトをいう。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００５０】
実施例１：小分子化合物の機能確認及び組み合わせ
１−１：小分子化合物の機能確認
ヒト線維芽細胞を神経幹細胞に誘導するため、リプログラミング（Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）に関連した様々な小分子化合物中１３種を選択的に選別して使用した（表１）。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
小分子物質それぞれの機能を確認して最適な組み合わせを探すために、ヒト線維芽細胞１×１０５個を６０ｍｍ  ｄｉｓｈに準備して翌日ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ２、Ｂ２７、ｂＦＧＦ及びＥＧＦで構成されたｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍに小分子物質１３個（ＰＤ０３２５９０１、ＳＢ４３１５４２、Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、Ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ、ＰＳ４８、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｄｅａｚａｎｅｐｌａｎｏｃｉｎ  Ａ、Ｖａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ、Ｔｒａｎｙｌｃｙｐｒｏｍｉｎｅ、Ａ８３０１、５−ＡＺＡ及びＰｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ）を一つずつそれぞれ添加して処理した。以後２〜３日毎に培養液を取り替えながら細胞の形態学的変化を確認した（図１）。５日毎に継代培養を進めて、この段階で遺伝子発現パターンを確認するために、一部の細胞を確保した。このように時期別に得られた細胞で線維芽細胞マーカー（Ｔｈｙ１）、神経幹細胞マーカー（ネスチン、ｓｏｘ１、ｓｏｘ２、ｐａｘ６）、ＭＥＴまたはＥＭＴマーカー（ｓｎａｉｌ．Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）、内胚葉と中胚葉形成に関連したマーカー（ＡＦＰ、ＧＡＴＡ４）、染色体安定性維持と関連したマーカー（Ｚｓａｃｎ４）の遺伝子発現パターンをｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲを利用して確認した（図２）。
【００５３】
その結果、８種の小分子物質（Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、Ｖａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、Ａ８３０１、ＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｄｅａｚａｎｅｐｌａｎｏｃｉｎ  Ａ及び５−ＡＺＡ）が神経幹細胞マーカー遺伝子の発現を明確に増加させたことが確認された。
【００５４】
１−２：小分子化合物の組み合わせ
最も効率的な神経幹細胞製作条件のために、実施例１−１で確認した８個の小分子物質を一度に添加した条件から小分子物質１個ずつを引いた様々な条件の培養液を利用して線維芽細胞が神経幹細胞に変化するか否かを確認した。ヒト線維芽細胞１×１０５個を６０ｍｍ  ｄｉｓｈに準備して翌日から下記の表２の様々な条件の培養液を２〜３日毎に取り替えながら細胞の形態学的変化を確認した。また、継代培養をしながら得られた細胞を介して様々な遺伝子の発現パターンの変化を観察した。
【００５５】
【表２】
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【００５６】
その結果、神経幹細胞マーカーの遺伝子発現を増加させる６個（Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、Ｖａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、Ａ８３０１、ＳＢ４３１５４２及びＣＨＩＲ９９０２１）から８個（Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、Ｖａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、Ａ８３０１、ＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｄｅａｚａｎｅｐｌａｎｏｃｉｎ  Ａ及び５−ＡＺＡ）の小分子物質の組み合わせを選定した。これにより６〜８個の小分子物質だけを利用してヒト線維芽細胞を神経幹細胞に誘導する可能性があることを確認した。また、同じヒト線維芽細胞にもかかわらず細胞が由来した根源の種類によって神経幹細胞と類似の形態を有する細胞が発見される時期が異なることを確認した。
【００５７】
実施例２：ヒト線維芽細胞から神経幹細胞の誘導及び培養
ヒト線維芽細胞を神経幹細胞に変換するのに必要とする小分子物質の組み合わせが定まるにつれ、安定的に誘導と培養する条件を確立しよう試みた。また、神経幹細胞に誘導される効率を確認するために、最小４個の小分子化合物が添加された培養液を利用して比較した。まず、１×１０５個の線維芽細胞を準備した後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ２、Ｂ２７、ｂＦＧＦ、ＥＧＦで構成されたｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍに４種（Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、Ｖａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ及びＡ８３０１）、６種（Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、Ｖａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、Ａ８３０１、ＳＢ４３１５４２及びＣＨＩＲ９９０２１）、８種（Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、Ｖａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、Ａ８３０１、ＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｄｅａｚａｎｅｐｌａｎｏｃｉｎ  Ａ及び５−ＡＺＡ）の小分子化合物がそれぞれ添加されている３つの条件の培養液を処理した。
【００５８】
その結果、誘導を始めて３日頃から細胞の形態が徐々に変わり始めた。７〜１０日頃４個の小分子化合物が添加された培養液条件の場合、細胞の形態が線維芽細胞の時と大きく変わりはなかったが、６個と８個の小分子化合物が添加された培養液条件では、神経幹細胞と類似する形態の細胞が形成された。
【００５９】
以後、継代培養を進めて幹細胞の性質を増加させるための目的でｐｅｔｒｉ−ｄｉｓｈを利用してｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎで培養した。Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ方法で培養した後、７〜１０日が過ぎると、６個と８個の小分子化合物が添加された培養液条件では多くの細胞が小さいｓｐｈｅｒｅを形成するようになる。一方、４個の小分子化合物が添加された条件ではｓｐｈｅｒｅがさほど形成されないことを確認した。このように形成された小さいｓｐｈｅｒｅは、ＰＬＯ／ＦＮがコートされているｄｉｓｈに付着させて再び７〜１０日程度培養する。この段階の細胞の形態は、より神経幹細胞の形態と似ていることを確認することができた（図３）。Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ培養と付着培養を２〜４回繰り返して進めると、６個と８個の小分子化合物が添加された培養液条件で細胞の形態がより明確に変わることを確認することができた。しかし、４個の小分子化合物が添加された培養液では継続的な培養にもかかわらず、細胞の形態が変わらないことを確認した。このように６個または８個の小分子化合物を添加した培養液を介して誘導された神経幹細胞は、継続的な継代培養と共に長い間培養しても神経幹細胞の形態を維持した。
【００６０】
実施例３：小分子化合物で誘導されたヒト神経幹細胞の特性確認
ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｎ２Ｂ２７に６個の小分子化合物で誘導及び維持したヒト神経幹細胞が神経幹細胞の一般的な特性を示すのか否かを確認した。まず、神経幹細胞が神経幹細胞のマーカーを発現するか否かを確認しようとＰＣＲとｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＩＣＣ）を進めた。その結果、免疫細胞化学（ＩＣＣ）染色を介して神経幹細胞がネスチンを発現するのを確認して、ＰＣＲを介して神経幹細胞マーカー（ネスチン、ｓｏｘ１、ｍｕｓａｓｈｉ  １）の遺伝子発現がヒト胚性幹細胞で由来した神経幹細胞と似たような発現程度を示すことを確認した（図４）。
【００６１】
長期培養の間に神経幹細胞の性質が維持されるか否かを確認しようと誘導された神経幹細胞の初期段階及び後期段階それぞれで細胞の形態を観察した。また、免疫細胞化学（ＩＣＣ）染色を介したネスチンの発現確認とＰＣＲを利用した神経幹細胞マーカー（ネスチン、ｓｏｘ１、ｍｕｓａｓｈｉ  １）の遺伝子発現を確認した（図５）。また、染色体分析を介して誘導された神経幹細胞の初期段階及び後期段階に染色体異常有無を確認して（図６）、ヒト胚性幹細胞で由来した神経幹細胞と増殖及び維持培養の間に細胞の成長速度を比較した（図７）。その結果、誘導された神経幹細胞は、長期間培養の間にも神経幹細胞の形態と性質を維持すると同時に染色体異常なしに継続的な培養が可能であることを確認した。
【００６２】
以後、後成遺伝的変化を確認するために、神経幹細胞マーカーであるネスチンのｐｒｏｍｏｔｅｒ地域のｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ／ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ有無をｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ＰＣＲで進めた結果、線維芽細胞の特性が神経幹細胞の特性に完全に変わったことを確認することができた（図８）。
【００６３】
実施例４：誘導されたヒト神経幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化能力確認
実施例１〜３を介して小分子物質を利用してヒト線維芽細胞から神経幹細胞を誘導することが成功的に行われたことを確認した。より具体的に、神経幹細胞の特性及び利用の可能性を確認するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ上での分化能力を確認した。まず、３神経細胞であるアストロサイト（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）、オリゴデントロサイト（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）及びニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）に分化を進めた。
その結果、小分子化合物によって誘導された神経幹細胞は成功的に３神経細胞に分化されることを確認した（図９）。
【００６４】
以後、種々の神経細胞に分化されるか否かを確認してみた結果、ドーパミン神経細胞、ＧＡＢＡ神経細胞、運動神経細胞、コリン神経細胞及びグルタメート神経細胞に分化されることを確認した（図１０）。これにより本発明で誘導されたヒト神経幹細胞は種々の神経細胞への分化が可能であることを確認した。
このようなヒト線維芽細胞を利用したヒト神経幹細胞への誘導、増殖及び種々の機能性神経細胞への分化能力は、ヒトの脳疾患治療のための細胞治療剤への活用の可能性が非常に高いことを示している。
【００６５】
実施例５：誘導されたヒト神経幹細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ分化能力確認
実施例３及び４では、小分子物質を利用してヒト線維芽細胞から誘導された神経幹細胞が成功的に３神経細胞に分化が可能であることをｉｎ  ｖｉｔｒｏ上で確認した。
【００６６】
そこで、小分子物質を利用してヒト線維芽細胞から誘導された神経幹細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの分化能力と腫瘍形成有無を観察するために、マウス（オリエントバイオ、Ｂａｌｂ／ｃ）の脳に誘導されたヒト神経幹細胞を移植した。以後、３ヶ月〜７ヶ月の間誘導されたヒト神経幹細胞が移植されたマウスを持続観察した。
【００６７】
その結果、小分子化合物によって誘導された神経幹細胞が移植されたマウスの脳は３ヶ月〜７ヶ月の間外形的に腫瘍形成が観察されず（図１１Ａ）、Ｈ＆Ｅ（Ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  Ｅｏｓｉｎ）染色法で脳組織を確認した時も腫瘍形成が観察されないことを確認した（図１１Ｂ）。また、誘導された神経幹細胞は神経幹細胞マーカー発現を介して成功的に移植されたことを確認して（図１１Ｃ）、移植３ヶ月〜７ヶ月後誘導された神経幹細胞は、ヒト細胞−特異マーカー及び神経細胞−特異マーカーの発現を介して移植された細胞が神経細胞に分化されたことを確認した（図１１Ｄ）。これは、小分子化合物によって誘導されたヒト神経幹細胞が移植後腫瘍形成なしに神経細胞に分化が可能であることを示す。
【００６８】
このような誘導神経幹細胞は、神経細胞の発生学的研究及び脳疾患発病機序を研究するための最適なモデル細胞として活用が可能で、腫瘍を発生させない長所によってヒトの脳疾患治療のための細胞治療剤への活用の可能性が非常に高い。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明に係る遺伝子導入なしに小分子物質だけを利用してヒト線維芽細胞を神経幹細胞に直接転換する方法は、遺伝的に安定した神経幹細胞の誘導を介して細胞治療に利用する程十分量の細胞の確保及び種々の機能性神経細胞に分化が可能で、また腫瘍を発生させないため、脳疾患細胞治療剤としての活用に有用である。
【００７０】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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