(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスまたはそのエプトープに特異的な切断キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸分子を含有するベクターにより形質導入された幹細胞を含み、機能性エフェクター細胞に分化することができる、組み換え前駆細胞であって、
前記切断ＣＡＲが切断ＣＤ４を有し、
前記切断ＣＤ４が、ＣＤ４膜貫通ドメイン及びＤ１細胞外ドメインを有し、Ｄ２、Ｄ３及びＤ４から選択される少なくとも一つの細胞外ドメインを欠いており、ＣＤ３複合体ζ鎖のシグナル伝達ドメインに融合している、
組み換え前駆細胞。
【請求項２】
前記核酸分子が、ＣＡＲ構築物内に含有される、請求項１に記載の組み換え前駆細胞。
【請求項３】
前記幹細胞が、造血幹細胞または造血前駆細胞である、請求項１または請求項２に記載の組み換え前駆細胞。
【請求項４】
前記幹細胞が、メモリーＴ幹細胞（例えば、中枢メモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞または幹細胞メモリーＴ細胞）である、請求項３に記載の組み換え前駆細胞。
【請求項５】
前記ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組み換え前駆細胞。
【請求項６】
前記切断ＣＡＲが、ＨＩＶに感染した細胞の表面に発現するｇｐ１２０に結合する細胞外ドメインを有する、請求項１から５のいずれか１項に記載の組み換え前駆細胞。
【請求項７】
前記ウイルスがレンチウイルスである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組み換え前駆細胞。
【請求項８】
前記レンチウイルスがヒト免疫不全ウイルスである、請求項７に記載の組み換え前駆細胞。
【請求項９】
前記機能性エフェクター細胞がＴ細胞である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組み換え前駆細胞。
【請求項１０】
前記Ｔ細胞が、その細胞表面に前記切断ＣＡＲを発現する、請求項９に記載の組み換え前駆細胞。
【請求項１１】
前記ベクターが、前記組み換え前駆細胞を前記ウイルスの感染から保護する１つ以上の遺伝子配列を更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組み換え前駆細胞。
【請求項１２】
前記遺伝子配列が、ｓｈ１００５、ｓｈ５１６及びＣ４６をコードする核酸分子から選択され、前記ウイルスがヒト免疫不全ウイルスである、請求項１１に記載の組み換え前駆細胞。
【請求項１３】
機能性エフェクター細胞を産生する方法であって、
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組み換え前駆細胞を分化または発生させること、次にそれを前記機能性エフェクター細胞に成熟させることを含む、前記方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法により作製される改変機能性エフェクター細胞。
【請求項１５】
その細胞表面に切断ＣＡＲを発現する、請求項１４に記載の改変機能性エフェクター細胞。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組み換え前駆細胞及び／または請求項１４または１５に記載の改変機能性エフェクター細胞を含む、
対象においてウイルス感染を阻害、低減または治療するための治療薬。
【請求項１７】
前記細胞が、ＨＬＡ拘束性Ｔ細胞受容体を欠いている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組み換え前駆細胞。
【請求項１８】
前記細胞が、ＨＬＡ拘束性Ｔ細胞受容体を欠いている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、ＨＬＡ拘束性Ｔ細胞受容体を欠いている、請求項１４または１５に記載の改変機能性エフェクター細胞。
【請求項２０】
切断キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする配列を含む、核酸分子であって、
前記切断ＣＡＲが切断ＣＤ４を有し、
前記切断ＣＤ４が、ＣＤ４膜貫通ドメイン及びＤ１細胞外ドメインを有し、Ｄ２、Ｄ３及びＤ４から選択される少なくとも一つの細胞外ドメインを欠いており、
前記切断ＣＤ４がＣＤ３複合体ζ鎖のシグナル伝達ドメインに融合している、
核酸分子。
【請求項２１】
前記核酸分子が、切断二重ＣＡＲ、切断三重ＣＤ４ζ  ＣＡＲ、ＣＤ４Ｄ１Ｄ２Ｄ３ＣＡＲ、ＣＤ４Ｄ１Ｄ２ＣＡＲまたはＣＤ４Ｄ１ＣＡＲをコードする、請求項２０に記載の核酸分子。
【請求項２２】
前記核酸分子が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を含有する、請求項２０または２１に記載の核酸分子。
【請求項２３】
前記核酸分子が、Ｃ４６融合阻害性抗ウイルスペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２０から２２のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項２４】
前記核酸分子が、抗ウイルスｓｈＲＮＡをさらに含む、請求項２０から２３のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項２５】
前記幹細胞がヒト幹細胞である、請求項１から１２のいずれか１項に記載の組み換え前駆細胞。
【請求項２６】
改変機能性エフェクター細胞であって、その細胞表面に、切断キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現しており、
前記切断ＣＡＲが切断ＣＤ４を有し、
前記切断ＣＤ４が、ＣＤ４膜貫通ドメイン及びＤ１細胞外ドメインを有し、Ｄ２、Ｄ３及びＤ４から選択される少なくとも一つの細胞外ドメインを欠いており、
前記切断ＣＤ４がＣＤ３複合体ζ鎖のシグナル伝達ドメインに融合しており、
前記ＣＡＲが、ウイルスまたはそのエピトープに特異的である、
改変機能性エフェクター細胞。
【請求項２７】
改変機能性エフェクター細胞であって、その細胞表面に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現しており、
前記ＣＡＲが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する単鎖抗体を含む、
改変機能性エフェクター細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許出願第６１／８６１，６８４号、２０１３年８月２日出願の利益を主張し、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＥＦＳ−ＷＥＢにより提出された配列リストに対する参照
サイズが１６．７ＫＢある「２０１４０７３１＿０３４０４４＿１２８ＷＯｌ＿ｓｅｑ＿ＳＴ２５」と呼ばれる配列リストのＡＳＣＩＩテキストファイルの内容は、２０１４年７月３１に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂにより電子的に提供されており、この提出は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【０００３】
政府支援の確認
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）により認められた政府支援ＡＩ０２８６９７、ＡＩ０７００１０及びＡＩ０７８８０６により行われた。政府は本発明に対して特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
１．発明の分野
本発明は、一般に、組み換えヒト前駆細胞、改変ヒト胸腺細胞及び改変ヒトＴ細胞を含む改変された機能性エフェクター細胞、並びにこれらを用いる対象の治療方法に関する。
【０００５】
２．関連技術の説明
ＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、ほぼ全ての感染者においてヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を部分的に制御するが、ウイルスの突然変異、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の下方制御、ＣＤ４＋Ｔ細胞のヘルプの欠如及びＣＴＬクローンの消耗に起因して最終的に失敗する。ＨＩＶ感染は、多くの個体において抗レトロウイルス薬によって制御されうるが、これらは高価であり有意な毒性と関連する。ウイルス貯蔵所に起因して、治療が中止されるとウイルス複製及び疾患の進行が再開するので、患者はこれらの投薬を永久的に必要とする。現在まで、大部分のＨＩＶ株が細胞に感染するために必要とする細胞受容体であるＣ−Ｃケモカイン受容体５型（ＣＣＲ５）に正常な遺伝子を欠いているドナーからの骨髄移植によって、成人の慢性ＨＩＶ感染が治癒したと報告された症例は１件だけである。しかし、この処置の死亡率は約４０％であり、この遺伝子プロファイルと適合した骨髄は、大部分の民族集団においてほぼ存在せず、この手法を広範囲な臨床適用にとって実用的ではないものにしている。幾つかの最近の研究は、ヒトにおいて、ＣＣＲ５を造血幹細胞から除去すること及び／または細胞をＨＩＶ感染から保護するために、抗ＨＩＶ遺伝子を送達することを試みているが、これらの研究は、ＨＩＶ抵抗性免疫系を生成するために必要な形質導入細胞移植のレベルに関する未知な点に起因して限界に直面している。
【発明の概要】
【０００６】
幾つかの実施形態において、本発明は、ウイルスまたはそのエプトープに特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸分子を含有するベクターにより形質導入された幹細胞を含む組み換え前駆細胞を対象とし、組み換え前駆細胞は、機能性エフェクター細胞に分化することができる。幾つかの実施形態において、核酸分子は、本発明のＣＡＲ構築物内に含有される。幾つかの実施形態において、幹細胞は、造血幹細胞または造血前駆細胞である。幾つかの実施形態において、幹細胞は、メモリーＴ幹細胞（例えば、中枢メモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞または幹細胞メモリーＴ細胞）である。幾つかの実施形態において、ベクターは、レンチウイルスベクターである。幾つかの実施形態において、キメラ抗原受容体は、ＣＤ４細胞外及び膜貫通ドメイン、並びにＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン（ＣＤ４ζ）を含む、から実質的に成る、またはから成る。幾つかの実施形態において、ＣＤ４細胞外ドメインは、ＨＩＶに感染した細胞の表面に発現するｇｐ１２０に結合する。幾つかの実施形態において、ウイルスは、ＨＩＶまたはＳＩＶのような免疫不全ウイルスである。幾つかの実施形態において、ウイルスは、レンチウイルスである。幾つかの実施形態において、レンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルスである。幾つかの実施形態において、機能性エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、その細胞表面にＣＤ４ζ  ＣＡＲを発現する。幾つかの実施形態において、ベクターは、組み換え前駆細胞をウイルスの感染から保護する及び／またはウイルスによる感染を阻害する１つ以上の遺伝子配列を更に含む。幾つかの実施形態において、遺伝子配列は、ｓｈ１００５、ｓｈ５１６及びＣ４６をコードする核酸分子から選択される。
【０００７】
幾つかの実施形態において、本発明は、機能性エフェクター細胞を産生する方法であって、本発明の組み換え前駆細胞を分化または発生させること、次にそれを機能性エフェクター細胞に成熟させることを含む方法を対象とする。幾つかの実施形態において、核酸分子は、本発明のＣＡＲ構築物内に含有される。幾つかの実施形態において、組み換え前駆細胞は、ウイルスまたはそのエプトープに特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸分子を含有するベクターにより形質導入された幹細胞を含む。幾つかの実施形態において、幹細胞は、造血幹細胞または造血前駆細胞である。幾つかの実施形態において、幹細胞は、メモリーＴ幹細胞（例えば、中枢メモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞または幹細胞メモリーＴ細胞）である。幾つかの実施形態において、ベクターは、レンチウイルスベクターである。幾つかの実施形態において、キメラ抗原受容体は、ＣＤ４細胞外及び膜貫通ドメイン、並びにＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン（ＣＤ４ζ）を含む、から実質的になる、またはからなる。幾つかの実施形態において、ＣＤ４細胞外ドメインは、ＨＩＶに感染した細胞の表面に発現するｇｐ１２０に結合する。幾つかの実施形態において、ウイルスは、ＨＩＶまたはＳＩＶのような免疫不全ウイルスである。幾つかの実施形態において、ウイルスは、レンチウイルスである。幾つかの実施形態において、レンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルスである。幾つかの実施形態において、機能性エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、その細胞表面にＣＤ４ζ  ＣＡＲを発現する。幾つかの実施形態において、ベクターは、組み換え前駆細胞をウイルスの感染から保護する及び／またはウイルスによる感染を阻害する１つ以上の遺伝子配列を更に含む。幾つかの実施形態において、遺伝子配列は、ｓｈ１００５、ｓｈ５１６及びＣ４６をコードする核酸分子から選択される。幾つかの実施形態において、組み換え前駆細胞は、対象に投与または移植される。幾つかの実施形態において、対象は、哺乳類である。幾つかの実施形態において、対象は、マウスまたは非ヒト霊長類のような動物モデルである。幾つかの実施形態において、対象は、ヒト被験者である。幾つかの実施形態において、組み換え前駆細胞は、対象の胸腺組織に付される。幾つかの実施形態において、本発明は、本発明の方法により作製された改変機能性エフェクター細胞を対象とする。幾つかの実施形態において、改変機能性エフェクター細胞は、その細胞表面にＣＤ４ζ  ＣＡＲを発現する。
【０００８】
幾つかの実施形態において、本発明は、対象においてウイルス感染を阻害、低減または治療する方法であって、本発明の組み換え前駆細胞及び／または本発明の改変機能性エフェクター細胞を対象に投与することを含む方法を対象とする。幾つかの実施形態において、対象は、哺乳類である。幾つかの実施形態において、対象は、マウスまたは非ヒト霊長類のような動物モデルである。幾つかの実施形態において、対象は、ヒト被験者である。
【０００９】
幾つかの実施形態において、本発明の組み換え前駆細胞及び改変機能性エフェクター細胞は、ＨＬＡ拘束性Ｔ細胞受容体を欠いている。
【００１０】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＣＡＲ構築物、すなわち、ＣＤ３複合体ζ鎖のシグナル伝達ドメインに融合しているＣＤ４、好ましくはヒトＣＤ４をコードする配列を含む核酸分子を対象とする。幾つかの実施形態において、核酸分子は、ＣＡＲ構築物、二重ＣＡＲ構築物、三重ＣＡＲ構築物、切断ＣＡＲ構築物、切断二重ＣＡＲ構築物、切断三重ＣＡＲ構築物及び第二世代ＣＡＲ構築物からなる群から選択される。幾つかの実施形態において、核酸分子は、ＣＤ４ζ  ＣＡＲ、二重ＣＡＲ  Ｃ４６、三重ＣＤ４ζ  ＣＡＲ、ＣＤ４Ｄ１Ｄ２Ｄ３ＣＡＲ、ＣＤ４Ｄ１Ｄ２ＣＡＲまたはＣＤ４Ｄ１ＣＡＲである。1幾つかの実施形態において、核酸分子は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を含有する。
【００１１】
前述の一般的な記載及び以下の詳細な記載は、両方とも例示及び説明のためだけのものであり、特許請求される本発明の更なる説明を提供することが意図される。添付の図面は、本発明の更なる理解を提供するために含まれ、本明細書に組み込まれ、その一部を構成し、本発明の幾つかの実施形態を例示し、記載と一緒になって、本発明の原理を説明するために役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
本発明は、図面を参照することによって更に理解される。
【図１】ＣＤ４ζ  ＣＡＲが幹細胞からのＴ細胞の分化を可能にすることを示すグラフである。
【図２】Ｔ細胞を含有するＨＩＶ−ＴＣＲによるＨＩＶ複製の抑制を示すグラフである。
【図３】ＣＤ４ζキメラ抗原受容体の概略図である。
【図４Ａ】ＣＤ４ζ  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の、ＨＩＶ感染Ｔ１細胞を死滅させる能力を示すグラフである。
【図４Ｂ】ＨＬＡ−Ｉ適合または不適合ＣＴＬクローン及びＣＤ４ζ  ＣＡＲ形質導入ＣＤ８＋  Ｔ細胞の、ウイルス複製を抑制する能力を示すグラフである。
【図５】ＣＤ４ζ形質導入ＣＤ８＋  Ｔ細胞抗ウイルス活性のＨＬＡ−Ｉ非依存性を示すグラフである。
【図６】ＣＤ４ζを介したＣＤ４＋  Ｔ細胞からのＨＩＶ−１特異性サイトカイン産生を示すグラフである。
【図７】ＣＤ４ζ  ＣＡＲ構築物及び三重ＣＤ４ζ構築物により形質導入された細胞の、ＨＩＶ感染への感受性を示すグラフである。
【図８】保護的ＣＤ４ζ  ＣＡＲ構築物の概略図である。
【図９Ａ】ヒト化マウスにおけるＣＤ４ζ  ＣＡＲにより遺伝子修飾されたＨＳＣからのＴ細胞の発生を示すグラフである。
【図９Ｂ】ＨＩＶ感染非修飾Ｔ細胞及びＣＤ４ζ  ＣＡＲを発現しているものの率を示すグラフである。
【図１０】二重ＣＤ４６−ＣＤ４ζ  ＣＡＲレンチウイルスベクター（二重ＣＡＲ構築物）を概略的に表す。
【図１１Ａ】健康なドナーから精製され、かつＧＦＰ対照ベクターまたはＣＤ４ζ  ＣＡＲもしくは三重ＣＤ４ζ  ＣＡＲ構築物のいずれかにより形質導入されたＣＤ８細胞を示す。
【図１１Ｂ】ＣＣＲ５発現が、ＧＦＰまたはＣＤ４ζ  ＣＡＲ対照と比較して、保護的ＣＤ４ζ  ＣＡＲにより下方制御されていることを示す。
【図１１Ｃ】ＣＤ４ζ  ＣＡＲまたは三重ＣＤ４ζ  ＣＡＲ構築物により形質導入された、ＨＩＶ−１曝露ＣＤ８細胞を、ＧＦＰ対照ベクターと比較したＨＩＶ感染の倍増を示す。
【図１１Ｄ】感染Ｔ２細胞による刺激の後の、ＧＦＰまたは三重ＣＤ４ζ  ＣＡＲ形質導入ＣＤ８細胞のサイトカイン産生を示す。
【図１２Ａ】感染ＣＤ４ζ  ＣＡＲマウスのＣＤ４５＋及びＣＤ４５＋ＧＦＰ＋  ＣＤ４ζ  ＣＡＲ細胞におけるＥＭ＆ＣＭ％の比をまとめたグラフである。
【図１２Ｂ】感染ＣＤ４ζ  ＣＡＲマウスのＣＤ４５＋及びＣＤ４５＋ＧＦＰ＋  ＣＤ４ζ  ＣＡＲ細胞を比較したＣＤ３８平均蛍光強度（ＭＦＩ）のまとめである。
【図１３Ａ】ＣＤ４ζ  ＣＡＲ発現細胞におけるＴＲＥＣレベルの有意な減少を示すグラフである。
【図１３Ｂ】高い、または低いＧＦＰ発現により別々に分析された、ＣＤ４ζ  ＣＡＲ発現細胞におけるＣＤ３発現を示すグラフである。
【図１４Ａ−Ｂ】ＨＩＶ  ｐ２４Ｇａｇ抗原を発現する細胞の百分率を示すグラフである。
【図１５Ａ】感染の前及び５週間後の末梢血液におけるＧＦＰ＋ＣＤ４＋  ＣＤ４ζ  ＣＡＲ発現細胞の百分率を示す。
【図１５Ｂ】対照及びＨＩＶ−１が感染したＣＤ４ζ  ＣＡＲマウスを比較した、血液ＨＩＶ  ＤＮＡ負荷及びＣＤ４／ＤＣ８比を示す。
【図１５Ｃ】末梢血液におけるＣＤ４ζ  ＣＡＲ発現細胞増殖とウイルス負荷の相関関係を示す。
【図１６】ＣＡＲベクター修飾及び本発明のＣＡＲ構築物を発生させる戦略を概略的に示す。
【図１７】作製された様々な切断変異体を概略的に示す。示示されているように、ＣＤ４ζ構築物は、最上段から最下段へ、ＣＤ４ζ  ＣＡＲ、ＣＤ４Ｄ１Ｄ２Ｄ３ＣＡＲ、ＣＤ４Ｄ１Ｄ２ＣＡＲ及びＣＤ４Ｄ１ＣＡＲである。
【図１８】三重ＣＤ４Ｄ１Ｄ２ＣＡＲが、ＨＩＶ感染に対して三重ＣＤ４ζ  ＣＡＲよりもさらに抵抗性があることを示すグラフである。ジャーカット細胞に形質導入し次にＮＬ４−３を３日間にわたって感染させた。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、幹細胞をプログラムして、ＨＩＶ感染に向けて抵抗性があり、かつ通常はＨＩＶが免疫応答を回避するために用いる機構を迂回する、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋の両方のＨＩＶ標的Ｔ細胞の自己再生個体群をもたらす方法を提供する。本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を使用してＨＩＶに対する抗原特異的Ｔ細胞を形成する、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞（ＨＰＣ）または造血幹及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）の遺伝子修飾を伴う。
【００１４】
アルファ及びベータ鎖（ＨＬＡ分子の文脈においてＨＩＶペプチドに結合する）を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いるヒトＨＳＣの修飾は、ヒト化マウスにおいてＨＩＶ特異的Ｔ細胞をインビボで分化することを可能にする。Ｋｉｔｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．８（４）：ｅ１００２６４９を参照し、また、２０１１年３月１０日出願のＵＳ１３／０４５，０７３も参照すること（両方ともその全体が参照として本明細書に組み込まれる）。しかし、改変Ｔ細胞は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）限定的である。
【００１５】
本発明は、ＨＩＶに特異的なＣＡＲをＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の代わりに利用する。ＣＡＲは、ＨＩＶに特異的な抗原結合ドメイン及び内部ＴＣＲシグナル伝達ドメインを有する。これらが標的抗原に結合し、このことがＨＬＡを用いることなく直接的に生じると、ＴＣＲのような細胞を誘発する。天然のＴ細胞受容体と異なり、ＣＡＲは、抗原を検出するためにＨＬＡ分子を認識する必要がない。したがって、本発明の改変Ｔ細胞は、ＨＬＡ拘束性ではない。したがって、本発明のＣＡＲ構築物及び改変細胞は、対象を有効に治療するために対象の遺伝子ＨＬＡプロファイルと適合する必要がない。したがって、本発明の治療は、任意のＨＬＡ型のＨＩＶ感染者に使用することができる。
【００１６】
本明細書に例として使用されるＣＡＲは、Ｔ細胞受容体（Ｔ細胞活性化を媒介する）のＣＤ３ゼータシグナル伝達領域に融合しているヒトＣＤ４外部ドメインを含む。本発明の以前は、発生しているＴ細胞の表面にＣＤ４ゼータを人工的に発現させることは、異常なシグナル伝達を引き起こし、そのことが、ＣＤ４及びゼータ鎖構成要素が幹細胞からのＴ細胞の正確な発生に関与するため、細胞の発生過程に失敗を引き起こすと考えられた。図１に示されているように、Ｔ細胞受容体のＣＤ３ゼータシグナル伝達領域に融合しているヒトＣＤ４を含むＣＡＲ構築物により形質導入されたＨＳＰＣは、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞のインビボでの分化を可能にし、ヒト化マウスにおいて正常な機能を示す。具体的には、ヒトＣＤ３４＋  ＨＳＣに、ＣＤ４ζ  ＣＡＲ及びｅＧＥＦレポーターを含有するレンチウイルスを形質導入し、これらの細胞をヒト化マウスに移植した（ＮＳＧ株）。移植の１２週間後、末梢血液を、ヒトＣＤ４５及びｅＧＦＰレポーター遺伝子の発現（左側カラム）について、ベクターを受けなかったマウス（対照）（上段パネル）及び形質導入された細胞を受けたマウス（中段及び下段パネル）のいずれかにおいて分析した。ベクター形質導入細胞を受けたマウスでは、ベクター発現細胞（中段パネル）及びベクターを発現しない細胞（下段パネル）を、ヒトＴ細胞マーカーＣＤ３、ヒト分化マーカーＣＤ４５  ＲＯ（中間カラム）について分析した。ＣＤ３を発現するヒトＴ細胞を、ＣＤ４及びＣＤ８の発現（右側カラム）について更に分析した。これらの結果は、ＣＤ４ζ  ＣＡＲを発現する細胞が、幹細胞から成熟Ｔ細胞への分化を起こすことができることを示している。驚くべきことに、ＣＡＲ発現は、発生しているＴ細胞の分化または系列決定を実質的に変更しなかった。
【００１７】
したがって、幾つかの実施形態において、本発明は、ＨＩＶに特異的なＣＡＲを使用して、ＨＩＶ、好ましくはヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）に対するヒト細胞免疫応答を遺伝子的に改変及び増強する方法を対象とする。これらのＣＡＲは、ＨＩＶ、好ましくはＨＩＶ−１エンベロープ認識ドメイン、膜貫通ドメイン及びＨＩＶ感染細胞を死滅させるようにＴ細胞を向ける細胞外シグナル伝達ドメインを含む、またはからなる改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。このように、本発明のＣＡＲは、遺伝子療法における天然ＴＣＲの欠点であるＨＬＡ拘束性ということから自由である。
【００１８】
本発明の治療は、１回投与、または幹細胞動員、精製、培養、レンチウイルス形質導入及び注入を伴う低頻度の処置を含む。治療は、本発明のＣＡＲをコードする遺伝子を含有する遺伝子送達ベクター、例えばレンチウイルスの投与及び／または１個以上の本発明のＣＡＲを発現するように遺伝子修飾された幹細胞の投与でありうる。幾つかの実施形態において、遺伝子送達ベクターは、遺伝子を幹細胞に送達するように設計される。幾つかの実施形態において、幹細胞は、ＨＳＣ、ＨＰＣまたはその両方である。幾つかの実施形態において、本発明の治療は、低い頻度の幹細胞移植であっても、ＣＡＲ含有Ｔ細胞が、ＨＩＶ、好ましくはＨＩＶ−１抗原に応答して末梢において繁殖すると予測されるという事実によって他の幹細胞治療手法を制限する、低レベルの形質導入細胞移植よって損なわれない。このことは、幹細胞及び成熟Ｔ細胞後代が、主要な抗ウイルスエフェクター細胞を生成する天然の繁殖能力を利用している。
【００１９】
本発明の方法を使用して、高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）により安定して抑制されるＨＩＶを有する及び／または明確な潜在型ウイルス貯蔵所を有するものを含む任意の感染対象、好ましくは哺乳類の対象、より好ましくはヒト被験者を治療することができる。幾つかの実施形態において、治療される対象は、薬物抵抗性、合併症もしくは抗レトロウイルス薬の副作用に耐えることができないこと及び／または生涯にわたる抗レトロウイルス療法を受ける意欲もしくは物流的可能性がないことに起因して、標準的な抗レトロウイルス療法に失敗した対象である。
【００２０】
本発明によると、幹細胞へのＣＡＲの送達は、クローン消耗に直面する天然の細胞免疫と対照的に、ＨＩＶ、好ましくはＨＩＶ−１に特異的なＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ、並びにＮＫ細胞の非消耗源を提供して、ＨＩＶに感染した細胞をインビボで認識し、死滅させる。更に、本発明の方法により作製されたＴ細胞は、当該技術の他の方法を使用して得られたＴ細胞より優れており、それは、ＣＡＲがＨＬＡ非依存性であり、したがって任意の者に広範囲に適用可能であり、ＨＩＶ感染細胞による主要な免疫回避戦略のＨＬＡ下方制御に付されないからである。
【００２１】
対象におけるＣＡＲによるＨＳＣの遺伝子修飾は、感染対象においてウイルス負荷を低下し、ウイルスの根絶を促進することができる成熟エフェクター細胞の産生をもたらす。本発明の様々な実施態様を試験及びスクリーンするために用いることができる当該技術に既知の様々なモデルが存在するが、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）及びキメラサル−ヒト免疫不全ウイルス（ＳＨＩＶ）感染の非ヒト霊長類モデル（ＮＨＰ）は、ＨＩＶの病因、疾患の進行の理解における、並びに抗レトロウイルス治療薬及びワクチン戦略の開発における重要な代替系であり、本明細書に記載されているように用いることができる。
【００２２】
ＳＨＩＶキメラは、ＨＩＶ−１遺伝子、例えば、ｅｎｖ、ｒｅｖ、ｔａｔ及びｖｐｕをＳＩＶｍａｃのバックグラウンドに挿入することによって作り出される。そのような「ｅｎｖ−ＳＨＩＶ」は、マカクに容易に感染し、ＳＩＶｍａｃ／マカクモデルの全て利点を提供する。ＳＨＩＶキメラの例は、ＣＣＲ５熱帯サブタイプＣのＳＨＩＶ−１１５７ｉｐｄ３Ｎ４（ＳＨＩＶ−Ｃと呼ばれる）である。感染マカクは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞欠損を通常数週間で発生し、ＡＩＤＳを数週間から２年間の範囲の間隔で発生する。リンパ及び他の組織における組織学的変化は、ヒトＡＩＤＳにおいて見られるものと酷似している。したがって、ＳＨＩＶ／マカクモデルは、新規ＨＩＶ／ＡＩＤＳ治療戦略を研究するための優れたモデルである。
【００２３】
本発明は、現行の治療様式に対して幾つかの利点を提供する。第一には、長寿命の幹細胞を伴うので、治療は単回投与のみを必要とするはずである。望ましくないＴ細胞反応の危険性は、幹細胞由来Ｔ細胞が胸腺選択を通るので最小限である。ＣＤ４及びＣＤ８細胞が両方ともＣＡＲ形質導入幹細胞から生じるので、抗ＨＩＶ  ＣＤ４−（ヘルパー）及びＣＤ８−（ＣＴＬ）Ｔ細胞の両方が機能する。最後に、新たなＨＩＶ／ＳＨＩＶ特異的細胞が幹細胞から絶えず再生されるので、ＨＩＶ／ＳＨＩＶ貯蔵所細胞の活性化によるＨＩＶ産生を封じ込め、全身に拡散することを予防できる。
【００２４】
予備研究
代替ヒト化骨髄、胎児肝臓及び胸腺（ＢＬＴ）マウスモデルを使用して、ヒトＣＤ３４＋  ＨＳＣを、ＨＩＶに特異的な分子的にクローンされたＴＣＲ（ＨＩＶ−ＴＣＲ構築物）を含有するレンチウイルスベクターにより遺伝子修飾することができ、続いて当該技術に既知の方法を使用して成熟完全機能ＣＴＬに進化できることを実証した。ＨＩＶ−ＴＣＲ構築物（ＳＬ−９）または対照ＴＣＲを含有するヒト化マウスに、ＨＩＶレポーターウイルスを感染させ、遺伝子ゲノムでコードしたＨＳＡ−ＨＡマーカー遺伝子のフローサイトメトリーにより、ＨＩＶを発現するヒトＣＤ４５＋細胞について評価した。図２に示されているように、ＨＩＶ−ＴＣＲ構築物は、ＨＩＶ発現細胞をインビボにおいて有意に抑制する。
【００２５】
ＨＩＶに特異的なＣＡＲ（ＣＡＲ構築物）を含有するベクターにより形質導入された幹細胞が、機能性エフェクター細胞に進化できるかを決定するため、ＣＤ４ζ  ＣＡＲを使用した。図３は、ＣＤ４ζ  ＣＡＲを概略的に示し、これはヒトＣＤ４とＣＤ３複合体ζ鎖のシグナル伝達ドメインとの融合分子である。これは、感染細胞の表面のＨＩＶ  ｇｐ１２０エンベロープの認識受容体としてＣＤ４を利用し、ＣＤ４の会合は、ζ鎖シグナル伝達を介して感染細胞のＴ細胞認識を誘発する。
【００２６】
ＨＩＶ感染Ｔ１細胞を、ＣＤ４ζ  ＣＡＲ構築物が形質導入されたＴ細胞による死滅に対する感受性について試験した。ＨＩＶ感染Ｔ１細胞を、ＨＬＡ−Ｉ適合もしくは不適合ＣＴＬクローン（すなわち、ＨＩＶ−ＴＲＣ構築物を有するもの）またはＣＤ４ζ形質導入ＣＤ８＋  Ｔ細胞（すなわち、ＣＡＲ構築物を有するもの）による死滅について試験した。図４Ａ及び図４Ｂに示されているように、ＣＤ４ζ  ＣＡＲが形質導入されたＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＨＩＶ感染細胞を死滅させること（図４Ａ、ＣＤ８−ＣＡＲ）及びウイルス複製を抑制すること（図４Ｂ、ＣＤ８−ＣＡＲ）ができる。驚くべきことに、ＣＤ４ζ  ＣＡＲ構築物は、ＣＴＬクローンが適合した場合であっても、ＨＩＶ−ＴＣＲ構築物と比較して劇的に優れた抑制活性をもたらした。
【００２７】
Ｔ１細胞または誘導体のＴ２細胞を、ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢに感染させ、ＣＤ４ζ  ＣＡＲ構築物を形質移入したＣＤ８＋  Ｔ細胞と共に、または逆転写酵素（ｐｏｌ）のエピトープを認識する一次ＨＩＶ−Ｉ特異的ＨＬＡ−Ｉ限定ＣＤ８＋  Ｔ細胞クローンと同時培養した。図２のＨＩＶ特異的ＴＣＲ細胞と異なり、図５のデータは、ＣＤ４ζ  ＣＡＲ構築物を有する細胞の死滅及び抑制活性がＨＬＡ−Ｉ分子に非依存性であることを示す。したがって、本発明の方法及び改変細胞は、ＨＬＡ拘束性ではない。
【００２８】
ＣＤ４＋  Ｔ細胞に、ＥＧＦＰ（ＥＧＦＰ、対照）またはＥＧＦＰ−２Ａ−ＣＤ４ζ（ＣＤ４ζ）のいずれかをコードするレンチウイルスベクターを形質導入した。次に細胞をＨＩＶ−１感染Ｔ１細胞と共にインキュベートした。細胞内ＩＬ−２及びＩＦＮ−γをフローサイトメトリーにより分析した。図６のデータは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞がＨＩＶ−１特異的ヘルパー細胞として作用するように、ＣＡＲが機能できることも示している。
【００２９】
残念なことに、ＣＤ４ζ  ＣＡＲによる形質導入を介してＣＤ４を発現するＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＨＩＶ感染に感受性を持つようになることが見出された。具体的には、図７に示されているように、精製された一次ＣＤ８＋  Ｔ細胞に、ＣＤ４ζ  ＣＡＲ（ＣＤ４ζ）またはＥＧＦＰ対照ベクター（ＥＧＦＰ）を形質導入し、Ｒ５熱帯ＨＩＶ−１ＪＲ−ＣＳＦ（ＪＲＣＳＦ）を感染させた。結果は、ＣＤ４ζ  ＣＡＲを形質導入したＣＤ８＋細胞は、ＨＩＶ感染に感受性があり、一方、対照ベクターを形質導入したＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＨＩＶによって有意に感染されなかった（ＥＧＦＰ）。
【００３０】
したがって、ＣＤ４ζ  ＣＡＲを他の抗ＨＩＶ試薬と組み合わせてＨＩＶ感染からの保護を付与することができるかを決定するために、１個がＣＣＲ５を下方制御し、１個がＬＴＲ領域の標的化によりＨＩＶ発現を下方制御する２個のｓｈＲＮＡを、ＣＤ４ζ  ＣＡＲを含有する遺伝子送達ベクターに導入した。１番目のｓｈＲＮＡであるｓｈ１００５は、Ｒ５熱帯ＨＩＶを、ＣＣＲ５補助受容体の下方制御によって侵入時点で阻害する。２番目のｓｈＲＮＡであるｓｈ５１６は、ｓｈ１００５と異なってＨＩＶそれ自体に向けられており、Ｒ５−及びＸ４−熱帯ＨＩＶの両方に対して保護的であることが見出されている。
【００３１】
単一ベクターにおけるｓｈ１００５及びｓｈ５１６の同時発現は、ＣＣＲ５発現を効率的に下方制御し、ＰＢＭＣにおいてＸ４−及びＲ５−熱帯ＨＩＶ複製の両方をインビトロで阻害する。細胞生存に対して何も影響が見られず、ＰＢＭＣにおけるインターフェロン誘発性ＯＡＳ１発現の上方制御が見られず、ＦＬ−ＣＤ３４＋細胞の形質導入後のコロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイにおいて何も影響が見られなかった。移植ＢＬＴマウスの造血は、標識した細胞個体群において正常であった。最も重大なことには、標識した細胞は、Ｒ５及びＸ４熱帯ＨＩＶの両方から保護されている。したがって、幾つかの実施形態において、この基本ベクターを使用して、他のＣＡＲの発現及び機能性を試験することができる。例えば、Ｒ５及びＸ４熱帯ＨＩＶ感染からの保護は、上澄み及び細胞内ｇａｇ  ｐ２４アッセイによって評価することができる。
【００３２】
ｓｈ１００５／ｓｈ５１６発現カセットを、ＥＧＦＰ−２Ａ−ＣＤ４ζベクターに導入した。図８は、ＣＤ４ζ  ＣＡＲ構築物を概略的に示す。ｓｈ１００５、ｓｈ５１６及びＣＤ４ζを有するこのＣＡＲ構築物（三重ＣＡＲ構築物）は、成熟ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞の産生を可能にしたが、元のＥＧＦＰ−２Ａ−ＣＤ４ζベクターと比較して、低減した移植率（５〜６％対１１％、示されず）を有した。三重ＣＡＲ構築物は、ＣＣＲ５を下方制御する及びｓｈ１００５／ｓｈ５１６と類似したレポーター遺伝子としてｍＣｈｅｒｒｙを持つＨＩＶベクターを下方制御する能力を維持する（データ示されず）。図７に示されているように、三重ＣＡＲ構築物を使用すると、ＣＤ４ζ  ＣＡＲは、ＨＩＶ−１感受性を成功裏に減少させる（三重ＣＤ４ζ）。
【００３３】
したがって、幾つかの実施形態において、当該技術に既知の阻害性ＲＮＡを同様に用いることができる。そのような阻害性ＲＮＡには、ＵＳ７，７３７，１２４、ＵＳ７，７３２，２０７、ＵＳ７，１９５，９１６及びＵＳ７，９１９，３０９に開示されているものが含まれ、これらはその全体が参照として本明細書に組み込まれる。幾つかの実施形態において、膜貫通融合阻害剤であるＣ４６をコードする配列のような他の配列を付加することができる、またはｓｈＲＮＡの代わりに使用することができる。他の抗ウイルス配列をｓｈＲＮＡ及び本明細書に記載されているＣ４６の代わりに、またはそれらに加えて使用できること、並びにそのような抗ウイルス配列の選択が、当業者の技能の範囲内であり、治療される対象に基づいたものでありうることに、留意するべきである。当該技術に既知のアッセイを使用して、本発明のベクター及び構築物の活性を評価することができる。例えば、ＣＦＣアッセイを使用して、ＣＡＲ構築物処理ＣＤ３４＋  ＨＳＰＣの造血可能性を、総コロニー形成単位（ＣＦＵ）及び様々な造血系列型（赤血球、脊髄及び赤血球／脊髄）の条件毎に精製されたＣＦＵを測定して、対照ベクター及び偽形質導入細胞とインビトロで比較することによって決定することができる。簡潔には、形質導入ＣＤ３４＋細胞をＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  Ｈ４０３４に再懸濁し、５００個の細胞を複製毎に平板培養する。１２〜１４日後に、ＣＦＵを顕微鏡によりスコア付けする。個別のコロニーもＰＣＲによりベクターコピー数について評価することができ、３個未満のコピー数を維持することを目標とすることができる。一般的に、対照ベクターまたは偽形質導入条件と比較して、総ＣＦＵ及びサブタイプコロニーに０．５倍を超える変動がないことが望ましい。
【００３４】
ＣＡＲを形質導入したＨＳＣが、胸腺リンパ球新生を介して成功裏に進行するかを決定するため、ＣＤ４ζ  ＣＡＲを含有するレンチウイルスベクターで修飾されたＨＳＣを、ヒト化マウスモデルに移植した。ヒト化マウスは、ＣＤ４ζ  ＣＡＲにより作製した、または非修飾のままにした（対照）。図９Ａに示されているように、レンチウイルスベクターマーカー遺伝子（ＥＧＦＰ）及びＣＤ４ζ  ＣＡＲを発現している、末梢血液の成熟Ｔ細胞は、ＨＩＶの感染後に効率的に発生し、増殖することが見出された。加えて、図９Ｂに示されているように、ＣＤ４ζ  ＣＡＲを発現しているＴ細胞のＨＩＶ感染は、対照と比較して抑制された。
【００３５】
ＣＡＲ＋Ｃ４６構築物
Ｃ４６は、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において抗ウイルス活性を示すことが知られている。したがって、レンチウイルスに基づいたベクターを開発して、ＨＩＶ特異的ＣＡＲをＣ４６融合阻害性抗ウイルスペプチドと共に発現させて、ＣＡＲ構築物が、ＮＨＰにおいてＣＡＲ発現エフェクター細胞の感染を予防または阻害するかを決定した。Ｃ４６及びＣＤ４ζ  ＣＡＲの両方、並びにｅＧＦＰレポーターを発現するベクターを生成して、ブタオザル（Ｍ．ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａ）モデルにおいてＳＨＩＶ感染への抗ウイルス効果を検査した。具体的には、図１０が、本明細書に例示されているＣＤ４６−ＣＤ４ζ  ＣＡＲ構築物を概略的に表している。ＣＡＲ構築物はＦＧ−１２由来主鎖を有する。挿入断片は、中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）、ＥＦ１αプロモーター（ＥＦ１α）、Ｃ４６、ユビキチンＣプロモーター（ＵｂｉＣ）、ＥＧＦＰ−２Ａ−ＣＤ４ζ  ＣＡＲ及びｗＰＲＥである。２Ａペプチド配列を有するＣＤ４ζ  ＣＡＲが融合したＥＧＦＰは、形質導入マーカーとして機能する。 
【００３６】
標的細胞を形質導入し、かつサル末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）及びＨＳＣの修飾後にＣＡＲ及びＣ４６分子を発現するレンチウイルスベクターの能力を、当該技術に既知の方法を使用してスクリーンした。ベクター修飾サル末梢血球におけるＳＨＩＶ感染の阻害及びＣＡＲ媒介ポリクローナル応答を、当該技術に既知の方法を使用してアッセイすることができる。Ｃ４６及びｅＧＦＰ（ＣＡＲなし）またはＣＤ４ζ  ＣＡＲ及びｅＧＦＰ（Ｃ４６なし）を発現するベクターを、対照として使用した。
【００３７】
例えば、新たに合成されたレンチウイルスベクター、例えば、Ｃ４６及び／またはＣＡＲを含有する単一及び二重ベクターの両方の、標的細胞に効率的に形質導入及び発現する能力を試験するため、対応するベクターを使用して、ＰＨＡ及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）による刺激の後で限界希釈法によりサルＰＢＭＣに形質導入することができる。ベクター発現は、ｅＧＦＰ及びサル宿主細胞においてフローサイトメトリーにより決定することができ、サルＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８の発現について検査することができる。ベクター発現細胞を、ゲーティングによりＣＡＲ  ＣＤ４発現について評価することができる。加えて、Ｃ４６及びＣＡＲ発現を、形質導入細胞溶解産物の対応するタンパク質について、抗体プローブを使用するウエスタンブロットによって検査することができる。形質導入の効率及びウイルス感染価を、ベクター発現細胞の限界希釈分析により決定することができる。
【００３８】
これらのベクターが、ＨＳＣ及びこれらの分化後に得られた継代に形質導入及び発現する能力を決定するため、サルＨＳＣに、Ｃ４６及び／又はＣＡＲ含有ベクターを、Ｔｒｏｂｒｉｄｇｅ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（Ｂｌｏｏｄ  １１１，５５３７−５５４３（２００８））により記載されたものと同様の５〜２５の感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入した。次に細胞をメチルセルロースの中に入れ、造血コロニー形成活性をモニターした。得られたコロニーを、赤血球または骨髄／顆粒球系列への進化について評価し、ベクター発現を、ｅＧＦＰ及びＣＤ４についてフローサイトメトリーにより個別のコロニーで検査した。各系列における細胞の百分率を決定し、造血性進化における任意の変化を、非形質導入細胞、Ｃ４６及びＣＡＲのみを形質導入した細胞、並びにＣ４６及びＣＡＲ二重ベクター（二重ＣＡＲ  Ｃ４６構築物）形質導入細胞において注目する。
【００３９】
Ｃ４６含有ベクターの保護的高ウイルス効果を確認するため、サルＰＢＭＣの群を、ＰＨＡ及びＩＬ−２による刺激の後に、非形質導入のままにする、あるいはＣ４６もしくはＣＡＲのみの対照ベクター、または二重ＣＡＲ  Ｃ４６構築物を形質導入する。形質導入の３日後に、細胞をＭＯＩの１で感染性ＳＨＩＶに曝露する。ウイルス曝露の後、細胞培養物の上澄みを、ＳＨＩＶ  ｇａｇ  ｐ２７産生について評価して、ウイルス複製をモニターした。Ｃ４６分子を発現する細胞を含有する培養物において、ＳＨＩＶ複製の低減または遮断が予測される。
【００４０】
新たに発現したＣＡＲ分子の、ＳＨＩＶ感染細胞への曝露に応答してインビトロで多機能性Ｔ細胞応答を刺激する能力を、当該技術に既知の方法を使用してアッセイすることができる。模擬サルＰＢＭＣは、非形質導入であるか、あるいはＣ４６もしくはＣＡＲのみの対照ベクター、または二重ＣＡＲ  Ｃ４６構築物により上記に記載されたように形質導入される。形質導入の３日後、細胞を、照射した同系の以前にＳＨＩＶ感染されたＰＢＭＣと混合する。曝露した後、細胞を、ＣＤ４、ＣＤ８及びインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−２、腫瘍壊死因子アルファ、ＣＤ１０７ａ、並びにＭＩＰ−１βの発現についてフローサイトメトリーにより評価する。加えて、細胞溶解活性を、標準的なクロム５１放出アッセイにおいて標的細胞としてＳＨＩＶ感染細胞を利用して、ＣＡＲ含有及び対照ＰＢＭＣにおいて評価する。感染細胞に発現したＨＩＶ  ｇｐ１２０へのＣＡＲ連結は、Ｔ細胞活性化を誘発し、受容体の機能が確認されるはずである。
【００４１】
三重ＣＡＲ構築物−インビボ研究
ヒトＨＳＣを、三重ＣＡＲ構築物（ｓｈ１００５／ｓｈ５１６／ＣＤ４ζ  ＣＡＲ、本明細書において三重ＣＡＲ、三重ＣＤ４ζまたは三重ＣＤ４ζ  ＣＡＲと呼ばれる）により形質導入し、ヒト胎児肝臓及び胸腺組織を含有する免疫不全非肥満糖尿病（ＮＯＤ）、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、共通ガンマ鎖遮断（γｃ−／−）（ＮＳＧ）マウスに移植し、当該技術に既知の方法を使用してアッセイした。具体的には、ＣＤ３４＋細胞を肝臓から生成し、保護的ＣＤ４ζ  ＣＡＲを含有するレンチウイルスを形質導入し、次にマトリゲル中の胎児肝臓間質要素及び胎児胸腺をＮＳＧマウスに移植した。移植の３週間後、移植マウスを亜致死的に照射し（３Ｇｙ）、予め凍結させたＣＤ３４＋細胞を解凍し、形質導入し、マウスに注入し、ここで細胞は骨髄に移植されている。６〜１２週間後、末梢血液を収集し、ヒト細胞の再構成について分析し、マウスをＨＩＶ−１に感染させた。
【００４２】
移植組織及び遺伝子修飾細胞の発生後、異なる臓器におけるベクター発現細胞を評価した。細胞を単離し、それらのヒト白血球、ＧＦＰ、ＣＤ４及びＣＣＲ５の発現について分析した。ＣＤ４ζ  ＣＡＲ  ｈｕ−ＢＬＴマウスの脾細胞を、フローサイトメトリーにより分析し、ヒトＣＤ４５＋及びＣＤ４＋ＧＦＰ＋  ＣＤ４ζ  ＣＡＲ発現細胞でゲートした。これらの細胞を、Ｔ細胞（ＣＤ５＋）、Ｂ細胞（ＣＤ３−ＣＤ１９＋）、マクロファージ／単球（ＣＤ１４＋）及びＮＫ細胞（ＣＤ５６＋ＴＣＲａｂ−ＣＤ３３７）のような表面マーカーについて評価した。
【００４３】
ＣＤ４ζ  ＣＡＲは、ベクター修飾ＨＳＣを受けた動物の血液、脾臓、胸腺及び骨髄の有意な数の細胞において発現したことが見出され、そのことは、これらの細胞が移植動物において造血していることを示している。加えて、ＣＣＲ５発現のノックダウンが、これらの動物のベクター発現細胞において観察され、そのことは、ＣＣＲ５に特異的なｓｈＲＮＡが機能していること示す。Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞及び骨髄細胞におけるＣＤ４ζ  ＣＡＲ構築物の発現が移植動物において観察され、そのことは、遺伝子修飾ＨＳＣがインビボで多系列造血の能力があることを示している。
【００４４】
新たな抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離された選別ＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＣＤ４ζ  ＣＡＲの形質導入及び発現を検査した。三重ＣＡＲ構築物が形質導入された細胞を、ＣＤ４ζ  ＣＡＲのみを含有するベクターまたはｅＧＦＰのみを含有するベクターが形質導入された細胞と比較した。図１１Ａ及び図１１Ｂに示されているように、ベクターの形質導入及び発現は、三重ＣＡＲ構築物を発現する細胞において細胞外ＣＤ４発現およびＣＣＲ５ノックダウンをもたらした。
【００４５】
図１１Ｃに示されているように、抗ウイルスｓｈＲＮＡの存在は、細胞を感染から保護した。加えて、図１１Ｄに示されているように、これらの細胞とＨＩＶ感染細胞の同時インキュベーションは、非形質導入細胞と比較して、ＩＬ−２及びインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）の誘発をもたらし、このことは、ＣＤ４ζ  ＣＡＲがＣＤ８＋  Ｔ細胞に発現されると抗ウイルス応答を機能的に誘発できることを示している。したがって、三重ＣＡＲ構築物は、形質導入細胞をＨＩＶ感染から保護し、ならびにＣＤ４ζ  ＣＡＲを発現する。
【００４６】
新たなＣＤ４ζ  ＣＡＲ発現細胞の機能性を評価するため、ＣＤ４ζ  ＣＡＲ細胞が移植されたヒト化マウスに、次にＨＩＶを５週間感染させた。この感染期間の後、ウイルス学的パラメーター及び免疫応答を評価した。ＨＩＶ−１感染ＣＤ４ζ  ＣＡＲマウスの脾細胞を、未処置（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋）、エフェクターメモリー（ＥＭ）（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ−）、中枢メモリー（ＣＭ）（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋）及びエフェクターメモリーＲＡ（ＥＭＲＡ）（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ−）の発生について評価した。ＨＩＶ−１感染ＣＤ４ζ  ＣＡＲマウスの脾細胞を、活性化マーカーＣＤ３８＋の発現について評価した。図１２Ａに示されているように、ＨＩＶ感染は、非ＣＡＲ発現細胞に現れていない、エフェクター表現型（ＣＤ４＋ｅＧＦＰ＋ＣＤ２７−ＣＤ４５ＲＡ＋／−）を有するＣＤ４ζ  ＣＡＲ発現細胞の出現をもたらした。このことは、分子的にクローンされたＴＣＲをＨＩＶに対して用いる、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答を検査した研究において観察された応答の種類と類似していた。加えて、図１２Ｂに示されているように、これらのＣＤ４ζ  ＣＡＲ発現細胞は、より大きなレベルのＣＤ３８活性化分子を有し、このことは、ＨＩＶへの抗原特異的Ｔ細胞応答におけるこれらの細胞の機能的動員を示している。次に細胞を、ＨＩＶ感染の際の抗ウイルス応答のウイルス特異的活性化について評価した。細胞を感染動物から取り出し、次にウイルス感染細胞系または非感染細胞と共に培養した。曝露の後まもなく、ＣＤ４ζ  ＣＡＲ発現細胞は、ＩＮＦ−γ及びＴＮＦ−αを、ＨＩＶ感染細胞への応答によって産生し、非感染細胞には応答しなかった。これらの結果は、ＣＤ４ζ  ＣＡＲ修飾細胞がエフェクター表現型に進化し、ＨＩＶ感染後に活性化されること及びＣＤ４ζ  ＣＡＲを担持する細胞が、インビボで予備刺激されて、抗原と遭遇した後にＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答を誘発することを示す。
【００４７】
ＣＤ４ζマウスの脾細胞を入手し、ＣＤ４＋ＧＦＰ＋  ＣＤ４ζ  ＣＡＲ発現細胞でゲートした。ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７及びＴ細胞受容体αβの発現を評価し、フローサイトメトリーにより分析した。ＣＤ４ζ  ＣＡＲマウス及び対照ＧＦＰマウスの胸腺細胞を、これらのＣＤ５及びＣＤ３発現についてフローサイトメトリーにより評価した。ＣＤ４ζ  ＣＡＲ及び対照マウスの胸腺細胞を、ＣＤ５＋及びＧＦＰ発現に基づいて選別した。ＤＮＡを選別細胞から精製し、ＴＣＲ再編成切除サークル（ＴＲＥＣ）を、リアルタイムＰＣＲにより測定した。ＣＤ４ζ  ＣＡＲ発現細胞におけるＣＤ３発現を、高い、または低いＧＦＰ発現により別々に分析した。興味深いことに、インビボで発生するＣＤ４ζ  ＣＡＲベクターを発現する大多数の細胞は、ＣＤ５、ＣＤ７またはＣＤ２の発現により決定されるようにＴ細胞であるが、細胞表面ＣＤ３ε発現を欠いている細胞の有意な個体群が存在する。この個体群の更なる表現型分析は、これらの細胞が、ＣＤ３の細胞表面発現に必要である内因性ＴＣＲαβ受容体発現を低レベルで有することを示している。ＣＤ４ζ  ＣＡＲ含有ベクターまたはＣＤ４ζ  ＣＡＲを欠失し、ｅＧＦＰマーカータンパク質のみを発現するベクターにより修飾されたヒトＨＳＣが移植された動物からのこれらの細胞を、検査した。移植動物の胸腺において、ｅＧＦＰ対照ベクターを発現する細胞と比較して、ＣＤ４ζ  ＣＡＲ／ｅＧＦＰを発現する細胞の細胞表面ＣＤ３ε発現の減少が、観察された。これらの胸腺細胞を選別し、Ｔ細胞受容体切除サークル（ＴＲＥＣ）のレベルを検査すると、図１３Ａに示されているように、対照ベクター発現細胞と比較して、ＣＤ４ζ  ＣＡＲベクター発現細胞のＴＲＥＣレベルに有意な減少があり、ＴＲＥＣレベルにおよそ５０％の低減をもたらした。このことは、内因性Ｔ細胞再編成が、ＣＤ４ζ  ＣＡＲ発現により停止されることを示している。図１３Ｂは、最大レベルのベクターを発現するこれらの細胞におけるＣＤ３発現の低減を示し、このことは、これらの発生細胞の表面における高いレベルのＣＤ４ζ  ＣＡＲが、内因性ＴＣＲ再編成をより効果的に停止させることを示唆している。まとめると、これらのデータは、ＣＤ４ζ  ＣＡＲによるヒトＨＳＣの遺伝子修飾が、多系列造血及びＨＩＶ特異的Ｔ細胞の個体群をもたらし、有意な個体群が内因性Ｔ細胞受容体を下方制御し、ＣＤ４ζ  ＣＡＲ分子のみを発現させることを示している。
【００４８】
次にマウスを、ＣＤ４ζ  ＣＡＲ発現細胞の感染について、ＨＩＶ  ｐ２４Ｇａｇ抗原の細胞内染色によって検査した。具体的には、ＨＩＶ−１感染ＣＡＲ形質導入ＢＬＴマウスの脾細胞を、ヒトＣＤ４５＋細胞またはＣＤ４５＋ＧＦＰ＋ＣＤ４ζ  ＣＡＲ細胞における細胞内ｇａｇ発現について分析した。図１４に示されているように、有意に低減されたレベルのｐ２４Ｇａｇ発現が、三重ＣＡＲ構築物を発現する細胞において、該構築物を発現しない細胞よりも観察された。このことは、これらの細胞が、構築物における抗ウイルス遺伝子の発現を介して感染から保護され、存続し、ＨＩＶに対して応答することを示している。
【００４９】
ＨＩＶウイルス負荷を、ＰＢＭＣにおいて評価し、三重ＣＡＲ構築物を受けているマウスにおけるウイルス抑制を観察した。感染の前及び５週間後の末梢血液におけるＧＦＰ＋ＣＤ４＋  ＣＤ４ζ  ＣＡＲ発現細胞の百分率を、フローサイトメトリーにより評価した。図１５Ａに示されているように、異なるレベルのＣＤ４ζ  ＣＡＲ発現細胞により再構成されたマウスを分析したとき、ＣＤ４ζ  ＣＡＲベクターを発現する細胞の大きな増殖（高い増殖）を有したマウスは、ほぼ完全なＨＩＶ抑制を有したが、一方、低いレベルの増殖を有した動物は、ウイルスの有意な抑制を有さなかった。図１５Ｂに示されているように、低いウイルス負荷に加えて、より良好なＣＤ４＋  Ｔ細胞比の保存が、ＣＤ４ζ  ＣＡＲベクターを発現するＰＢＭＣの大きなレベルの細胞増殖を有した動物において観察された。図１５Ｃは、細胞増殖のレベルがウイルスの抑制と相関したことを示している。まとめると、ＣＤ４ζ  ＣＡＲ細胞は、ＨＩＶ複製をインビボで成功裏に抑制している。したがって、幾つかの実施形態において、本発明は、ＨＳＣ、ＨＰＣまたはＨＳＰＣを、ＣＤ４ζ  ＣＡＲをコードする配列のみ、またはｓｈＲＮＡ（例えばｓｈ１００５及び／もしくはｓｈ５１６）のような１つ以上の抗ウイルス配列と組み合わせて含有する遺伝子送達ベクターにより遺伝子修飾して、ＨＩＶへの曝露後に、インビボでＨＩＶ感染から保護される及び／またはウイルス負荷を低下させるＨＩＶ特異的細胞の多系列再構成をもたらすことを対象とする。
【００５０】
手順
ヒト胎児組織をＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＲｅｓｏｕｒｃｅｓまたはＳｔｅｍＥｘｐｒｅｓｓから購入し、特定情報を伴わないで得て、その使用にＩＲＢの承認を必要としなかった。本書類に記載された動物研究は、全ての連邦政府及び地方政府の指針に従ったＵＣＬＡ動物研究委員会Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承諾書に基づいて実施された。具体的には、これらの研究は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の実験動物のケア及び使用のガイド（Ｔｈｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）の指針、並びに国際実験動物ケア評価認証協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ（ＡＡＬＡＣ）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の認証及び指針に厳密に従い、ＵＣＬＡ  ＡＲＣプロトコール番号２０１０−０３８−０２Ｂに基づいて実施した。全ての外科的手術は、ケタミン／キシラジン及びイソフルランの麻酔によって実施され、全ての労力は、動物の疼痛及び不快感を最小限することに注がれた。
【００５１】
１．抗体及びフローサイトメトリー
以下の抗体をフローサイトメトリーに使用した。ＣＤ４５、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ３８、ＣＤ１９、ＣＤ１４、ＣＤ３３７、ＣＤ５６、ＴＣＲａＰαβ  （ｅＢｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び抗ＨＩＶ−１コア抗原クローンＫＣ５７（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）。細胞表面マーカーを、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ７、ＥＶＤ、ＡＰＣ、ＡＰＣ−ｅｆｌｏｕ７８０、ａｌｅｘａ７００、ｅｆｌｏｕｒ４０５、パシフィックオレンジまたはパシフィックブルーと適切な組み合わせで抱合した。細胞は、ＬＳＲｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＦＡＣＳＤｉｖａソフトウエアを使用して取得した。データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアを使用して分析した。
【００５２】
２．レンチウイルスベクター産生
レンチウイルＧＦＰ対照ベクター、ＣＤ４ζ  ＣＡＲ構築物及び三重ＣＤ４ζ  ＣＡＲ構築物を、ｐＣＭＶ．ΔＲ８．２．Δｖｐｒパッケージングプラスミド及びｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質プラスミドを用いるＩｎｖｉｔｏｒｏｇｎ  ＶｉｒａＰｏｗｅｒ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ系を、以前に記載された（Ｄ．Ｍ．Ｂｒａｉｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８３，７３０５−７３２１（２００９））ように使用して２９３ＦＴ細胞で産生した。
【００５３】
４．ＴＣＲ再編成切除サークルの定量化
ＣＤ４ζ  ＣＡＲまたはＧＦＰベクター修飾マウスからの胸腺細胞を、これらのＧＦＰ及びＣＤ５発現に基づいてＦＡＣＳａｒｉａによって選別した。ＤＮＡを、フェノール／クロロホルムの使用により選別細胞から抽出した。リアルタイムＰＣＲを使用して、β−グロビンに正規化したＴＲＥＣ発現レベルを定量化した。オリゴ、プローブ及び条件は、以前に記載されている（Ｄｏｕｅｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｌａｎｃｅｔ  ３５５，１８７５−１８８１（２０００））。
【００５４】
新規ＣＡＲ産生
本明細書に使用されるとき、「ＣＡＲ構築物」は、ＣＤ３複合体ζ鎖のシグナル伝達ドメインに融合しているＣＤ４、好ましくはヒトＣＤ４を含む核酸分子を指す。ＣＡＲ構築物には、切断ＣＡＲ構築物、二重ＣＡＲ構築物及び三重ＣＡＲ構築物が含まれる。本明細書に使用されるとき、「切断ＣＡＲ構築物」は、ＣＤ３複合体ζ鎖のシグナル伝達ドメインに融合している切断ＣＤ４を含む（例えば、Ｄ１のみ、Ｄ１＋Ｄ２またはＤ１＋Ｄ２＋Ｄ３のＣＤ４、好ましくはヒトＣＤ４を含む）核酸分子を指す。切断ＣＡＲ構築物には、切断二重ＣＡＲ構築物及び三重ＣＡＲ構築物が含まれる。本明細書に使用されるとき、「二重ＣＡＲ構築物」は、ＣＤ３複合体ζ鎖のシグナル伝達ドメイン及び１つの抗ウイルス配列に融合しているＣＤ４、好ましくはヒトＣＤ４を含む核酸分子を指す。本明細書に使用されるとき、「三重ＣＡＲ構築物」は、ＣＤ３複合体ζ鎖のシグナル伝達ドメイン及び２つの抗ウイルス配列に融合しているＣＤ４、好ましくはヒトＣＤ４を含む核酸分子を指す。本明細書に使用されるとき、「切断二重ＣＡＲ構築物」は、ＣＤ３複合体ζ鎖のシグナル伝達ドメイン及び１つの抗ウイルス配列に融合している切断ＣＤ４を含む（例えば、Ｄ１のみ、Ｄ１＋Ｄ２またはＤ１＋Ｄ２＋Ｄ３のＣＤ４、好ましくはヒトＣＤ４を含む）核酸分子を指す。本明細書に使用されるとき、「切断三重ＣＡＲ構築物」は、ＣＤ３複合体ζ鎖のシグナル伝達ドメイン及び２つの抗ウイルス配列に融合している切断ＣＤ４を含む（例えば、Ｄ１のみ、Ｄ１＋Ｄ２またはＤ１＋Ｄ２＋Ｄ３のＣＤ４、好ましくはヒトＣＤ４を含む）核酸分子を指す。ＣＡＲ構築物は、以下の配列の１つ以上を更に含むことができる。調節タンパク質に結合するウイルスプロモーター（例えば、５’の長い末端反復（ＬＴＲ））、１つ以上の抗ウイルス配列（例えば、ｓｈ１００５、ｓｈ５１６、Ｃ４６）、転写の調節を助ける配列（例えば、７ＳＫ）、遺伝子プロモーター（例えば、ユビキチンＣプロモーター（ＵｂＣ））、レポーター遺伝シ（例えば、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ））、並びにＨ１、２Ａ、ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）、伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）、ウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（ｗＰＲＥ）及びＡＬＴＹＲのような他の転写及び発現配列。本発明のＣＡＲ構築物の例には、ＣＤ４ζ  ＣＡＲ、二重ＣＡＲ  Ｃ４６、三重ＣＤ４ζ  ＣＡＲ、ＣＤ４Ｄ１Ｄ２Ｄ３ＣＡＲ、ＣＤ４Ｄ１Ｄ２ＣＡＲ、ＣＤ４Ｄ１ＣＡＲ及び第二世代ＣＡＲ構築物が含まれる。
【００５５】
本発明のＣＡＲ構築物は、プロトタイプＣＤ４ζ  ＣＡＲ構築物におけるｇｐ１２０結合ドメイン及び／またはシグナル伝達ドメインの遺伝子交換により産生されうる。図８を参照すること。改善された機能性を有する追加のＣＡＲを産生することができる。例えば、第二世代ＣＡＲ構築物は、ＣＤ４ドメインをＥｎｖ結合単鎖広範囲中和抗体に交換することによって産生され、この単鎖抗体手法は、ＣＤ４ζ  ＣＡＲと並行して機能することが初期研究において示されており、癌を標的にするために使用される標準的なＣＡＲ手法である。幾つかの広範囲中和抗体の遺伝子には、ｂ１２、Ｘ５、２Ｇ１２、４Ｅ１０及びＶＲＣ０１を使用することができる。単鎖型は、重及び軽鎖の間に可動性リンカーを導入する標準的な方法によって産生されうる。単鎖抗体の、ＨＩＶへの結合を、標準的な方法により親抗体と比較する。加えて、本発明のＣＡＲのＣＤ４構成要素の切断及び突然変異を生じ、ＩＬ−１６及びＭＨＣＩＩのようなＣＤ４受容体の他の天然リガンドとの結合を排除して、ＣＤ４ζ  ＣＡＲの潜在的な非特異的活性化を低減することができる。これらの新規受容体のそれぞれを、２つの型で産生することができ、一方は、ＣＤ３ζ鎖シグナル伝達ドメインを有し、他方はＣＤ３ζ鎖とＣＤ２８シグナル伝達ドメインとの融合体を有する。この「第二世代ＣＡＲ」戦略は、一次Ｔ細胞受容体シグナルに加えて「二次シグナル」の同時刺激を提供することによって、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の生存及び繁殖を改善することができる。
【００５６】
第二世代単鎖抗体ＣＡＲを、ＣＤ２８または４−１ＢＢシグナル伝達ドメインとＣＤ３ζ鎖とを共に有する型で含有するベクターを修飾して、単鎖ドメインの、新たな単鎖遺伝子による好都合な置換を可能にする。簡潔には、Ｘｂａ  Ｉ−Ｓｍａ  Ｉ制御部位（単鎖抗体の直ぐ上流から開始し、ヒンジ領域内で終止する）を含む部分を、点突然変異（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ,Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により二次ベクター（ｐＵＣ１９）において修飾し、サイレント突然変異を介してヒンジ領域内のＡｐａ  Ｉ部位を作り出した。正確な配列を確認下後、Ｘｂａ  Ｉ−Ｓｍａ  Ｉ制御フラグメントをベクター（ＣＤ３ζ鎖のみの第一世代型も含む）に交換した。
【００５７】
図１６は、ＣＡＲベクター修飾及び本発明のＣＡＲ構築物を発生させる戦略を概略的に示す。ＣＡＲ構築物のマップが示されている。Ｘｂａ  Ｉ−Ｓｍａ  Ｉフラグメント内に、サイレント突然変異をヒンジ領域に導入して、Ａｐａ  Ｉ部位を導入し（ＧＧＣＣＣＴ→ＧＧＧＣＣＣ（配列番号１））、このフラグメントをベクターに再導入した。１個のプラスミドを、異なるシグナル伝達ドメインを有する型（ＣＤ２８−ζ、４−１ＢＢ−ζ及びζ）毎に生成した。新たなＣＡＲを、単鎖抗体、並びにＸｂａ  Ｉ及びＡｐａ  Ｉ部位を含む部分ヒンジ配列を合成することによって生成し、これらの酵素を使用して、新たな構築物を切断及び連結して、ベクターにした。
【００５８】
上記に記載された３つのベクター（シグナル伝達ドメイン：ζ、ＣＤ２８−ζ及び４−１ＢＢ−ζ）を使用して、７個の十分に確定された広範囲中和抗体の配列から設計された新規単鎖抗体（表１）を挿入した。したがって、幾つかの実施形態において、本発明の第二世代ＣＡＲ構築物は、以下の表１に記載されているような単鎖抗体配列の１つをコードする配列を含む。
0006516740.tif 000002
0006516740.tif 000003
【００５９】
Ｘｂａ  Ｉ−Ａｐａ  Ｉ挿入物は、軽鎖可変領域を有するリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１６））により、連鎖状重鎖可変領域として特別仕様で合成し（ＧｅｎｅＡｒｔ）、次に３つのベクターに交換した。これらの２１個のＣＡＲ構築物を使用して、本発明に使用するため、例えば細胞、例えば幹細胞、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球などを機能性の試験のために形質導入するために遺伝子送達ベクターを生成することができる。
【００６０】
ＣＤ４ζ  ＣＡＲの切断は、元のＣＡＲ構築物のＣＤ４、Ｄ４ドメイン、Ｄ３−Ｄ４ドメイン、Ｄ２−Ｄ４ドメインを連続的に欠失させる突然変異誘発性ＰＣＲにより生成される。ＣＤ４のＤ１ドメインでの突然変異誘発も、突然変異誘発性ＰＣＲにより生成される。図１７は、作製された様々な切断変異体を概略的に描写する。図１８は、図１７に記載されているＣＤ４のＤ１及びＤ２ドメインを含有する切断変異体が、このＣＡＲの能力をどのように低減して、ＣＣＲ５特異的ｓｈＲＮＡ及びＨＩＶ−ＬＴＲ−特異的ｓｈＲＮＡを含む他の保護的遺伝子の文脈においてＨＩＶ感染を可能にできるかを実証している。これらのＣＡＲ構築物を使用し、遺伝子送達ベクターを生成して、ＣＤ４構成要素のＭＨＣＩＩへの結合を低減することができる。これらのＣＡＲ構築物を使用して、上記に記述された本発明のために使用される遺伝子送達ベクターを生成することができる。
【００６１】
追加実施例
幹細胞型の選択
ＣＤ３４＋造血幹細胞は、造血系列を完全に再構成することが示されている。ヒトＨＳＰＣは、ヒトＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ及び骨髄系列を高度ヒト化マウスモデル（骨髄、胎児肝臓、胎児胸腺−ＢＬＴマウス）において完全に再構成することができる。ＨＩＶ特異的ＣＡＲのＨＳＰＣへの導入は、受容体を発現するＣＤ４及びＣＤ８成熟Ｔ細胞型の両方において、これらの細胞のインビボでの分化を可能にする。本明細書に開示されているように、代替ヒト化骨髄、胎児肝臓及び胸腺（ＢＬＴ）マウスモデルは、最初の実験において、ヒトＣＤ３４＋  ＨＳＰＣを、ＨＩＶに特異的な分子的にクローンされたＴＣＲを含有するレンチウイルスベクターにより遺伝子修飾することができ、続いて成熟完全機能ＣＴＬに進化できることを実証するために用いられた。重要なことは、これらの成熟エフェクター細胞が、標的細胞を攻撃するために任意の特定のＨＬＡ分子必要としなかったことである。
【００６２】
メモリーＴ細胞は、中枢メモリーＴ（ＴＣＭ）細胞及びエフェクターメモリーＴ（ＴＥＭ）細胞を含む、異種表現型を有する。幹細胞メモリーＴ（ＴＳＣＭ）細胞の新たな個体群が確認されており、自己再生、並びにメモリー及びエフェクターＴ細胞サブセットへの多能性分化という幹細胞様の特性を示す。ヒトＴＳＣＭ細胞は、メモリーＴ細胞サブセットであるが、ＴＣＭ及びＴＥＭと区別される表現型及び遺伝子発現プロファイルを有する。これらを、抗原刺激の後、繁殖及び再構成する増強された能力を伴ってクローン的に増殖することができ、重要なことには、免疫不全マウスに連続的に移植することができる。これらの細胞は、ＴＣＭ及びＴＥＭ細胞サブセットをインビトロで生成する多能性である。したがって、これらの細胞は、増強された自己再生及び多能性を連続移植実験において示すマウスＴＳＣＭ細胞の特性と一致する幹細胞様挙動を示す。長期自己再生特性及び多能性分化特性のため、ＴＳＣＭは、T細胞エフェクター活性の遺伝子改変にとって理想的である。Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ，ｅｔ．ａｔの方法を使用して、ＴＳＣＭ細胞（ＣＤ８＋／ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ４５ＲＯ−／ＣＣＲ７＋／ＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ９５＋／ＣＤ５８＋）のインビトロ繁殖。６７％のＴＳＣＭが、ＴＥＭ（ＣＤ８＋／ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＣＲ７−／ＣＤ６２Ｌ−）及びＴＣＭ（ＣＤ８＋／ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＣＲ７＋／ＣＤ６２Ｌ＋）サブセットを含む他のサブセットへの分化を達成した（データ示されず）。
【００６３】
ＴＳＣＭは、胸腺発育を必要としないＴ細胞の個体群を表し、導入遺伝子発現は、Ｔ細胞系列のみに限定される。ＴＳＣＭ細胞の誘導は、当該技術に既知の方法を使用して確認することができる。例えば、ＣＤ４５ＲＡ＋未処置Ｔ細胞を、ヒト末梢血液から陽性単離し、ＧＳＫ−３β阻害剤のＴＷＳ１１９の存在下で抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体により刺激して、Ｔ細胞分化及びＩＬ−２を１４日間にわたって阻害する。ＴＳＣＭ細胞を、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の約５％において誘発させることができる。ＴＳＣＭ個体群を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体刺激の後、低用量のＩＬ−７及びＩＬ−１５（それぞれ、５ｎｇ／ｍｌ）の存在下で未処置前駆体から増殖させることができる。望ましい場合、遺伝子修飾ＴＳＣＭ細胞の両方の増殖プロトコールを比較することができる。ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ６２Ｌ未処置Ｔ細胞を、ＦＡＣＳ選別し、ＩＬ−２及びＴＷＳ１１９の存在下（条件Ａ）または不在下（条件Ｂ）で抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体により２日間にわたって刺激する。次に細胞にＤＣ  ＣＡＲを形質導入し、ＩＬ２−及びＴＷＳ１１９（条件Ａ）またはＩＬ−７及びＩＬ−１５（条件Ｂ）の存在下で１２日間にわたって培養する。形質導入ＴＳＣＭの機能を、例えば６日間の抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体及びＣＴＬによるＴＥＭ細胞への分化の後、サイトカイン産生及びＨＩＶに対する繁殖活性を当該技術に既知の方法を使用して特徴決定することができる。
【００６４】
インビトロで繁殖したＴＳＣＭの、ＨＩＶ感染細胞を死滅させる能力を、標準的なＣＴＬクロム放出アッセイを使用して試験した（Ｙａｎｇ  Ｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２００９；４８５：４０７−１５）。表１にまとめた結果は、ＨＩＶに感染されたＴ２細胞が、形質導入されなかった、またはＥＧＦＰ対照により形質導入されたＴＳＣＭ細胞よりも有意に大きなレベルで、ＣＤ４ζ  ＣＡＲ（三重ＣＡＲ）により形質導入されたＴＳＣＭによって死滅させられたことを示す。
0006516740.tif 000004
ＣＤ４ζ  ＣＡＲ形質導入ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  ＴＳＣＭ細胞も、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γを産生することによってＨＩＶ−１感染細胞に応答する（データ示されず）。
【００６５】
非Ｔ細胞のＣＡＲ発現が望ましくない場合、ＣＡＲ構築物を、Ｔ細胞特異的発現に修飾することができ、例えば、ユビキチンＣプロモーターの代わりにＣＤ３δプロモーターを含有させることができる（図８を参照すること）。
【００６６】
ヒト化ＢＬＴマウスにおけるＣＡＲｓにより形質導入されたＨＳＰＣ及びＴＳＣＭの移植及び分化
ＨＳＰＣ及びＴＳＣＭ細胞から誘導されたＴ細胞のインビボ再増殖を、当該技術に既知の方法の使用によりアッセイすることができる。例えば、ＴＳＣＭ誘導では、Ｔ細胞をＢＬＴマウスの脾臓、胸腺オルガノイド及び／または末梢血液から単離し、ＴＳＣＭ細胞を以前に記載されたように培養する。抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体による２日間の刺激の後、細胞に、ＥＧＦＰで標識された、ＣＡＲ含有ベクターまたは別個にＥＧＦＰのみを含有する対照ベクターを形質導入し、次に更に１２日間培養する。胎児肝臓のＣＤ３４＋  ＨＳＰＣにも、ＣＡＲ含有ベクターを形質導入する、または別個にＥＧＦＰのみを含有する対照ベクターを形質導入する。百万個のＣＡＲベクター形質導入細胞またはＨＳＰＣの細胞及びＴＳＣＭ細胞を含有する対照ベクターを、別々に、照射ＢＬＴマウスに静脈注入する。ＨＳＰＣまたはＴＳＣＭ細胞を受けたマウスの移植の６〜８週間後に、末梢血液をＥＧＦＰ発現、並びにＣＤ３＋ＣＤ４＋及びＣＤ３＋ＣＤ８＋  Ｔ−細胞、ＣＤ１９＋  Ｂ細胞、ＣＤ３−ＣＤ５６＋  ＮＫ細胞、ＣＤ１４＋単球、ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞の細胞系列マーカー発現について２週間毎に１８週間にわたって（移植後２４週間）分析することを始めて、形質導入細胞の維持を決定することができる。
【００６７】
ＣＡＲベクター発現も、フロサイトメトリーを使用すること、またはＥＧＦＰ＋細胞を選別し、次に目的のＣＡＲタンパク質についてウエスタンブロットを実施することによって評価することができる。抗ウイルスｓｈＲＮＡ遺伝子発現を、ｓｈＲＮＡ配列に特異的な定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により、発生細胞及びベクター発現細胞において評価することができる。加えて、当該技術に既知のアッセイ方法を使用して、治療対象のそれぞれの細胞サブセットの末梢血試料における絶対細胞計数を定量化することができる。内因性ＴＣＲレパートリーに対する効果を評価して、ＥＧＦＰ＋選別Ｔ細胞のスペクトラタイピング（ｓｐｅｃｔｒａｔｙｐｉｎｇ）によりＴ細胞発生の歪みについてモニターすることもできる。非修飾細胞と比べたベクター修飾細胞における造血発生のあらゆる変化に注目し、更に評価することができる。
【００６８】
抗ＨＩＶ活性及び機能性免疫応答の生成
抗ウイルス効力及び免疫機能を、ＨＳＰＣ及びＴＳＣＭ細胞から誘導されたＣＡＲベクター修飾及び非修飾細胞を含有するＢＬＴマウスにおいて評価することができる。例えば、ベクター修飾細胞または対照ＥＧＦＰベクター修飾細胞のいずれかを含有するマウスを、ＨＩＶ（２００ｎｇ、ｐ２４）の感染後または非感染動物において評価する。細胞表現型、特にＣＤ３＋ＣＤ４＋及びＣＤ３＋ＣＤ８＋の細胞の比、並びにＨＩＶ  ｇａｇ  ｐ２４発現を、感染後の２週間毎にフローサイトメトリーにより評価する。ベクター修飾細胞の、ＴＥＭ表現型への分化を、当該技術に既知の方法の使用によりモニターする。血漿ウイルスＲＮＡを、ｑＲＴ−ＰＣＲによりＨＩＶ配列についてモニターする。ＣＤ４＋  Ｔ細胞及びＣＡＲベクター発現細胞におけるＨＩＶ感染を、ＥＧＦＰ＋個体群の選別及びＨＩＶ配列のｑＰＣＲの後に評価する。ウイルス突然変異及び潜在的な免疫回避を、直接配列決定により血漿ウイルスＲＮＡにおいてモニターする。連続的に、マウスの群を、脾臓、骨髄、ヒト胸腺、リンパ節及び腸において細胞表現型及びウイルス学的要因についてこれらのパラメーターを評価する。
【００６９】
ウイルス貯蔵に対するＣＡＲの効果
潜在型貯蔵がＢＬＴマウスに確立されている（Ｍａｒｓｄｅｎ  Ｍ，Ｋｏｖｏｃｈｉｃｈ  Ｍ，Ｓｕｒｅｅ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０１２；８６（ｌ）：３３９−４７）。予備データは、抗ｇａｇ  ＴＣＲをコードする遺伝子が形質導入されている末梢血Ｔ細胞は、ＰＫＣ活性化剤（示されず）の添加により、ウイルスを産生するために誘発された潜伏感染細胞を死滅できることを示唆している。したがって、ＣＡＲ発現細胞は、活性化貯蔵細胞を同様に排除することができる。ＣＡＲを発現しているＢＬＴマウスのＴ細胞の、貯蔵細胞をエキソビボで死滅させる能力を、活性化潜伏感染Ｕ１細胞を標的として使用して評価することができるＣＡＲ形質導入ＨＳＰＣを受けている感染動物及び対照動物から脾細胞を得て、脾細胞を同時刺激に付し、続いて細胞内ｇａｇ  ｐ２４発現を分析することによって、活性化誘発性（すなわち、潜伏性）感染のレベルを決定することができる。相対的潜伏感染レベルの定量化を、エキソビボで同時刺激された脾細胞に実施したＨＩＶ−１  ＲＮＡ特異的ｒｑＲＴ−ＰＣＲを使用して達成することもできる。
【００７０】
ＢＬＴマウスにおける再増殖のクローン追跡
ベクター組み込み部位（ＶＩＳ）をモニターすることによる再増殖細胞の追跡は、例えば、クローンの数、頻度、寿命、系列表現及び異常クローン増殖を列挙するために、個別の再増殖ＨＳＰＣクローンの挙動をモニターする強力な方法である。当該技術に既知のハイスループット方法を使用することができる。例えば、個別のＨＳＰＣクローンの系列可能性は、十分な数の細胞をＦＡＣＳ選別のために得ることができる脾臓、骨髄のＴ細胞（ＣＤ３＋）、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）及び単球（ＣＤ１４＋）の分画、続くＶＩＳ追跡のためのＰＱＣＴアッセイによって決定することができる。ＣＡＲベクター及び対照を移植した後に２０〜２５週間経過した少なくとも５匹の移植動物を利用した。クローンの総対数、頻度及び系列分布をＰＱＣＴアッセイの使用により決定することができる。抗原由来免疫細胞繁殖に起因して、正常な遺伝子導入Ｔ細胞の単一または微量クローンの成長が生じることがある。この種類の増殖は、芽細胞分析、核型及びマーカー分析、癌遺伝子活性化におけるＶＩＳのゲノム位置、並びに遺伝子プロファイル分析を含む詳細な調査によって、潜在的な悪性形質転換と区別することができる。ベクター及びＨＩＶ組み込み部位は、ＬＴＲ内の符号突然変異によって区別することができる。同様の文系を、ＴＳＣＭ移植において実施して、ＴＳＣＭクローンの、継代ＴＥＭ及びＴＣＭへの分化をモニターすることができる。
【００７１】
生物情報学的分析
ウイルス組み込み部位（ＶＩＳ）配列データは、Ｂｌａｓｔソフトウエアにより全ての配列読み取りデータを比較して、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  ＡｌｉｇｎｅｒまたはＢＬＡＴ（ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）によりヒト参照ゲノム（ｈｇ１９）に整列させることによって分析することができる。ホモポリマー誤差修正（４５４の読み取りデータ）、配列フィルタリング、選別及び列挙を、特別仕様のスクリプト、多と言えば以前に記載されたもの（Ｋｉｍ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０１０；８４（２２）：１１７７１−８０）によって実施することができる。ＶＩＳ組み込み部位を介した挿入突然変異誘発は、Ｂａｙｅｓｉａｎ  Ｃｈａｎｇｅ−Ｐｏｉｎｔモデルの方法をｚスコアに適用して分析することができる（Ｐｒｅｓｓｏｎ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１１；１２（１）：３６７）。
【００７２】
ＮＨＰモデルにおけるインビトロ活性
ＣＡＲ形質導入ＨＳＣの移植を、当該技術に既知の方法の使用によりＮＨＰにおいてアッセイすることができる。
【００７３】
例えば、本発明のＣＡＲ構築物が形質導入された自己由来ＨＳＣの、１）ブタオザルへに移植する及び２）ＳＨＩＶ投与後の血漿ウイルス負荷に測定可能な減少を生じる能力を、当該技術に既知の方法の使用により検査することができる。
【００７４】
最適化ＣＡＲまたは対照ベクターを全ての造血系列に発現する細胞を生成するため、動員骨髄から自己由来ＨＳＣを収集、導入及び再注入することができる。簡潔には、骨髄造血細胞を、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）及び幹細胞因子（ＳＣＦ）の投与によって動員することができる。次に骨髄吸引液を収集し、ＣＤ３４＋  ＨＳＣを濃縮し、ＣＡＲまたは対照レンチウイルスベクターにより形質導入する。エキソビボでのＨＳＣの操作の際に、各動物は、１０２０ｃＧｙの全身照射からなる骨髄破壊的条件付けレジメンを受ける。条件付けの後、形質導入ＨＳＣを動物に再注入する。
【００７５】
移植及び動物回復を、移植の２０〜３０日後の好中球及び血小板計数の予測される再構成、並びに最初の３か月間にわたるＣＤ４／ＣＤ８  Ｔ細胞再構成に注目して、移植後にモニターする。サイトカインレベルまたはクローン細胞増殖における任意の変化を示す任意の臨床症状を含む任意の有害事象を、動物において注意深くモニターする。末梢Ｔ細胞におけるレンチウイルスベクターの５００人を超える患者年の使用における患者において安全であるので、これらのことは予想されない。確立されたマーカーを、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ５６及びＣＤ１９を含む造血サブセットのそれぞれに使用して、ＣＡＲまたはベクター対照含有細胞の造血系列のそれぞれへの移植を実証することができる。
【００７６】
リンパ球回復は、移植のおよそ３か月後に観察されると予測される。造血サブセットにおける移植及びＣＡＲ標識による実証の後、ＣＡＲ発現動物及びベクター対照動物の両方に、ＳＨＩＶＣ−Ｃの１０，０００個のＴＣＩＤ５０を投与する。ＣＡＲ発現及び対照動物におけるウイルス負荷を比較し、それぞれの条件における遺伝子標識細胞の陽性選択をモニターする。
【００７７】
ＣＡＲ含有及び対照動物のＰＢＭＣを、感染細胞への多機能性応答について上記に記載されたように評価する。ＰＢＭＣを照射ＳＨＩＶ感染または非感染細胞で刺激し、ＣＤ４、ＣＤ８及びインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−２、腫瘍壊死因子アルファ、ＣＤ１０７ａ、並びにＭＩＰ−１βの発現についてフローサイトメトリーにより評価する。
【００７８】
ｇｐ１２０エンベロープタンパク質のＣＤ４結合ドメインにおける突然変異について、末梢血液中の優勢なウイルス疑似種をモニターする。回避突然変異の有意な発生は、ＳＨＩＶがＣＤ４結合を細胞侵入のために必要とするので予測されない。ウイルス回避は、血漿中の優勢なウイルス疑似種の直接ＲＴ−ＰＣＲに基づいた配列決定によってモニターする。
【００７９】
濃縮ＨＳＣを上記に記載されたように形質導入した後、大量の白血球及び造血サブセットのＣＡＲ又は対照遺伝子標識の効率を、フローサイトメトリー及び当該技術のＰＣＲに基づいた方法によってアッセイする。マカクＣＤ３４＋  ＨＳＣのレンチウイルス形質導入による過去の結果に基づいて、大量の白血球において５％を超える遺伝子標識が予測される。移植後の１〜３か月間において、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球／マクロファージ、顆粒球及びＮＫ細胞を含む、再構成造血サブセットにおける遺伝子標識に関するより詳細な決定を行うことができる。過去の結果から、ＣＡＲ発現は、検査されるそれぞれのサブセットにおいて定量的に同等であると予測される。
【００８０】
移植のおよそ３か月後、動物にＳＨＩＶ−Ｃを静脈注射により投与する。非保護動物における過去の知見は、投与の２週間後に、血漿１ｍＬあたり１〜２×１０７個のウイルスＲＮＡコピーのピークウイルス血症を実証している、１０５  コピー／ｍＬのウイルスセットポイントは通常８〜１０週間の投与を受ける。本発明のＣＡＲ構築物は、成功裏に発現すると、ＳＨＩＶ投与後にピークウイルス負荷及び／又はウイルスセットポイントに有意な減少をもたらすはずである。加えて、非保護のものが感染に失われるので、投与後のＣＡＲ保護Ｔ細胞の濃縮が観察されるはずである。
【００８１】
治療薬
本発明のウイルス特異的ＣＡＲを使用して、ＨＩＶに対するヒト細胞免疫応答を遺伝子的に改変及び増強することができる。幾つかの実施形態において、これらのＣＡＲは、ＨＩＶエンベロープ認識ドメイン、膜貫通ドメイン及びＨＩＶ感染細胞を死滅させるようにＴ細胞を向ける細胞外シグナル伝達ドメインを含む、またはからなる改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。幾つかの実施形態において、ＣＡＲは、２つのｓｈＲＮＡであるｓｈ１００５及びｓｈ５１６、並びに／またはＨＩＶ感染から形質導入細胞を保護する他の遺伝子試薬と一緒に、レンチウイルスベクター内に発現される。
【００８２】
望ましい用量、経路及びレジメン
幾つかの実施形態において、投与は、幹細胞動員、精製、培養、レンチウイルス形質導入及び注入を伴う１回処置を必要とする。形質導入は、ＨＳＰＣまたはＴＳＣＭのいずれか、または両方に対して行われる。この療法は、ＣＡＲ含有Ｔ細胞が、百万回に１回の頻度で開始する正常なＴ細胞のようにＨＩＶ抗原に応答して末梢で繁殖すると予測されるという事実によって、他の幹細胞治療手法を制限する低レベル形質導入細胞移植において良好に機能する。このことは、幹細胞及び成熟Ｔ細胞後代が、主要な抗ウイルスエフェクター細胞を生成する天然の繁殖能力を利用している。移植を、ｓｈＲＮＡのみを発現するレンチウイルスベクターによるＨＳＰＣの改変と更に組み合わせて、ＨＩＶ抵抗性免疫系及びＣＡＲエフェクターＴ細胞からなるキメラ造血系を再増殖させることができる。
【００８３】
本発明を使用して、抗ＨＩＶ効力を最適化するために以下の治療ベクター及び細胞送達ビヒクルの組み合わせを介して、抗ＨＩＶ導入遺伝子の臨床使用の多面的手法を設計することができる。ＨＳＰＣではＣＡＲ／ｓｈＲＮＡ、ＴＳＣＭではＣＡＲ／ｓｈＲＮＡ及びＨＳＰＣではｓｈＲＮＡ。各幹細胞型に関する情報は、下記に提供されている。
【００８４】
予備的な前臨床安全性プロファイル研究
幹細胞療法は、治療遺伝子を潜在的に個体の寿命の全期間にわたって導入することを伴う。そのため、細胞障害性または遺伝子障害性は回避されるべきである。ＣＡＲの新たなシグナル伝達活性またはｓｈＲＮＡのオフターゲット効果は、正常な造血及び／または免疫機能を歪めることがある。以下のアッセイを安全性／毒性の評価に使用することができる。
【００８５】
細胞に対するインビトロ毒性及びインターフェロン応答
インターフェロン応答がウイルス及び二重鎖ＲＮＡにより誘発さえることがあり、それが細胞死及び炎症によって有害作用を引き起こす可能性がある。細胞死の証拠を、例えばＰｒｏｍｅｇａ  ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏアッセイ（細胞内プロテアーゼ放出）を使用して測定することができ、インターフェロン応答遺伝子ＯＡＳ１の誘発の証拠を、例えばＳＢＩインターフェロン応答検出キット（ＩＦＮ誘発性遺伝子の定量化ＲＴ−ＰＣＲ分析）を使用して測定することができる。
【００８６】
遺伝子障害性−挿入突然変異の可能性
レンチウイルスベクターは、２６５人を超える患者年のデータを有する臨床試験における強力な安全性プロファイルを実証しており、治療関連の重篤な有害事象は報告されていない（ｖｉｒｘｓｙｓ．ｃｏｍ／ｐａｇｅｓ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−ｐｌａｔｆｏｒｍｓ／ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ−ｖｅｃｔｏｒ−ｐｌａｔｆｏｒｍ．ｐｈｐ）。それにもかかわらず、遺伝子発現及び細胞機能へのベクター組み込みの影響を、当該技術に既知の方法の使用によりアッセイすることができる。加えて、当該技術に既知の方法、例えば上記に記載されたＶＩＳの使用により、クローンの再増殖をモニターすることができる。一般に、異常なクローンが優性ではない、ポリクローナル多系列多組織再増殖が望ましい。
【００８７】
遺伝子発現に対する有害作用
オフターゲット及びシグナル伝達の欠損は、ｓｈＲＮＡ及びＣＡＲ導入遺伝子発現によってもたらされることがある。ｓｈＲＮＡのオフターゲット効果を最小限にするため、転写的に弱いプロモーター（Ｈ１及び７ＳＫ）を使用して、可能性のあるｓｈＲＮＡを特異的にスクリーンすることができる。インビトロにおける二重ｓｈ１００５／ｓｈ５１６形質導入Ｔ細胞またはＢＬＴのインビボ多系列造血分化におけるＨＳＰＣには、有害作用は観察されなかった。
【００８８】
遺伝子プロファイル分析を、望ましい場合、例えば異常な表現型がマウスに観察される場合に実施することができる。過剰または過小発現している遺伝子は、遺伝子組み込み部位を用いる生物情報学的分析、フローサイトメトリーによりアッセイされる細胞表面マーカー、正準経路分析（独創性）、並びにＢＬＡＳＴプログラム（／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）により分析されるｓｈ１００５及びｓｈ５１６と過小発現している遺伝子内の配列との相同性を介して相関させることができる。ＥＧＦＰレポーター遺伝子を有さないベクターを使用して、臨床研究に適したベクターを利用することができる。ベクター形質導入細胞を、フローサイトメトリーまたは細胞標化による、例えば、特定の免疫グロブリン細胞外ドメインをＨＩＶ認識ドメインに含有するＣＡＲを特徴決定する場合、特定の免疫グロブリン細胞外ドメインのためのフローサイトメトリーにより、特定のＣＡＲの確認を介して追跡することができる。
【００８９】
文献
１．Ａｎ Ｄ， ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２００６； １４ （４）：４９４−５０４．
２．Ａｎ Ｄ， ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ．２００７； １０４ （３２）：１３１ １０−５．
３．Ｂａｒｏｎｃｅｌｌｉ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２００８； ７：１４１９−１４３４．
４．Ｂｅａｒｄ， Ｂ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．２０１０； １２０：２３４５−２３５４．
５．Ｂｅｒｒｙ Ｃ， ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１２； ２８ （６）：７５５−６２．
６．Ｂｉｆｆｉ Ａ， ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１１； １１７ （２０）：５３３２−９．
７．Ｂｒａｄｙ Ｔ， ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１１； ３９ （１ １）： ｅ７２．
８．Ｂｒａｉｎａｒｄ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．２００９； ８３：７３０５−７３２１．
９．Ｂｕｓｈｍａｎ Ｆ， ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００５； ３ （１ １）：８４８−５８．
１０．Ｃａｒｔｉｅｒ Ｎ， ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００９； ３２６ （５９５４）：８１８−２３．
１１．Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ Ｍ， ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１０； ４６７ （７３１３）：３１８−２２．
１２．Ｃｉｅｒｉ Ｎ， ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１３； １２１ （４）：５７３−８４．
１３．Ｄｅｅｋｓ Ｓ， ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２００２； ５ （６）：７８８−９７．
１４．Ｄｅｅｒｅ， Ｊ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ＨＩＶ ａｎｄ ＡＩＤＳ．２０１１：６； ５７−６１．
１５．ＤｉＧｉｕｓｔｏ Ｄ， ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１０； ２ （３６）：３６ｒａ４３．
１６．Ｄｏｕｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ．２０００； ３５５：１８７５−１８８１．
１７．Ｅｇｅｌｈｏｆｅｒ Ｍ， ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００４； ７８ （２）：５６８−７５．
１８．Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ Ｌ， ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００９； １５ （７）：８０８−１３．
１９．Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ Ｌ， ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１１； １７ （１０）：１２９０−７．
２０．Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ Ｌ， Ｒｅｓｔｉｆｏ Ｎ． Ｂｌｏｏｄ．２０１３； １２１ （４）：５６７−８．
２１．Ｇｅｒｒｉｔｓ Ａ， ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１０； １１５ （１３）：２６１０−８．
２２．Ｇｏｒｉ， Ｊ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．１２０， ｅ３５−４４ （２０１２）．
２３．Ｈａｒｏｕｓｅ， Ｊ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００１； ７５：１９９０−１９９５．
２４．Ｈｉｌｄｉｎｇｅｒ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００１； ７５：３０３８−３０４２．
２５．Ｈｏ， Ｏ．， ｅｔ ａｌ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００９； ６：６５．
２６．Ｈｕｍｂｅｒｔ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００８； ５：９４．
２７．Ｊｉ ＨＢ ＧＡ， ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００２； ２７７ （４９）：４７８９８−９０６．
２８．Ｋａｌａｍｓ Ｓ， ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９９９； ７３ （８）：６７１５−２０．
２９．Ｋｉｅｍ， ＫＲ， ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１２； １０：１３７−１４７．
３０．Ｋｉｌｂｙ， Ｊ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１９９８； ４：１３０２−１３０７．
３１．Ｋｉｍ Ｓ， ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０１０； ８４ （２２）：１１７７１−８０．
３２．Ｋｉｍｐｅｌ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１０； ５： ｅｌ２３５７．
３３．Ｋｉｔｃｈｅｎ Ｓ， ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２００９； ４ （１２）： ｅ８２０８．
３４．Ｋｉｔｃｈｅｎ Ｓ， ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．２０１２； ８ （４）： ｅｌ００２６４９．
３５．Ｋｉｔｃｈｅｎ Ｓ， ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ．２００４； １０１ （２３）：８７２７−３２．
３６．Ｋｉｔｃｈｅｎ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９８； ７２：９０５４−９０６０．
３７．Ｋｏｎｇ Ｓ， ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１２； １８ （２１）：５９４９−６０．
３８．Ｌａｌｅｚａｒｉ， Ｊ．Ｐ．， ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ．２００３； ８：２７９−２８７．
３９．Ｌａｌｅｚａｒｉ， Ｊ．Ｐ．， ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００３； ３４８：２１７５−２１８５．
４０．Ｌａｚｚａｒｉｎ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００３； ３４８：２１８６−２１９５．
４１．Ｌｉ Ｈ， Ｄｕｒｂｉｎ Ｒ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００９； ２５ （１４）：１７５４−６０．
４２．Ｌｉｐｏｗｓｋａ−Ｂｈａｌｌａ Ｇ， ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．２０１２； ６１ （７）：９５３−６２．
４３．Ｌｕ Ｒ， ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１１； ２９ （１０）：９２８−３３．
４４．Ｌｕｇｌｉ Ｅ， ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ．２０１３； ８ （１）：３３−４２．
４５．Ｍａｒｓｄｅｎ Ｍ， ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０１２； ８６ （１）：３３９−４７．
４６．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ／Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１０； ７２：１０５７−１０６１．
４７．Ｍｉｔｓｕｙａｓｕ， Ｒ．Ｔ．， ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０００； ９６：７８５−７９３．
４８．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｓ． Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１９９２； １０：２３９−６５．
４９．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０１０； ８４：４７６９−４７８１．
５０．Ｎｏｒｒｉｓ Ｐ， ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００４； ７８ （１６）：８８４４−５１．
５１．Ｐａｈａｒ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００７； ３６３：３６−４７．
５２．Ｐａｈａｒ， Ｂ．， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００６； ３６：５８３−５９２．
５３．Ｐａｌ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ．２００３； ３３：３００− ３０７．
５４．Ｐｏｌａｃｉｎｏ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｉｍａｔｏｌｏｇｙ．２００８； ３７ Ｓｕｐｐｌ ２：１３−２３．
５５．Ｐｒｅｓｓｏｎ Ａ， ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１１； １２ （１）：３６７．
５６．Ｐｕｒｃｅｌｌ ＤＦ， Ｍａｒｔｉｎ ＭＡ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９３； ６７ （１１）：６３６５−７８．
５７．Ｒｅｓｔｉｆｏ Ｎ， ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１２； １２ （４）：２６９−８１．
５８．Ｒｉｎｇｐｉｓ Ｇ， ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１２； ７ （１２）： ｅ５３４９２．
５９．Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｍ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．１９９４； ８４：２８７８−２８８９．
６０．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ Ｅ， ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９７； ２７８ （５３４２）：１４４７−５０．
６１．Ｓａｄｅｌａｉｎ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１３； ３：３８８−３９８． 
６２．Ｓａｋｕｍａ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ．２０１２； ４４３：６０３−６１８．
６３．Ｓａｖｏｌｄｏ Ｂ， ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．２０１１； １２１ （５）：１８２２−６．
６４．Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｍ， ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００７； ４ （１２）：１０５１−７．
６５．Ｓｅｖｅｒｉｎｏ， Ｍ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００３； ３０６：３７１−３７５．
６６．Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｓ， ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１０； １１５ （８）：１５３４−４４．
６７．Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｓ， ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ．２００９； ７：８．
６８．Ｓｈｉｒａｓｕ Ｎ， Ｋｕｒｏｋｉ Ｍ． Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１２； ３２ （６）：２３７７−８３．
６９．Ｓｃｈｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１２； ４：１３２ｒａ５３−１３２ｒａ５３．
７０．Ｓｏｎｇ， Ｒ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００６； ８０：８７２９−８７３８．
７１．Ｓｔａｕｓｓ Ｈ， ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２００７； １５ （１０）：１７４４−５０．
７２．Ｔｒｏｂｒｉｄｇｅ Ｇ， ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２００９； ４ （１１）： ｅ７６９３．
７３．Ｔｒｏｂｒｉｄｇｅ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２００８； １１１：５５３７−５５４３．
７４．Ｔｒｏｂｒｉｄｇｅ， Ｇ．Ｄ．＆ Ｋｉｅｍ， Ｈ．Ｐ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１０； １７：９３９−９４８．
７５．Ｔｓａｉ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００７：３６２； ２０７−２１６．
７６．Ｖａｎ Ｌｕｎｚｅｎ Ｊ， ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２００７； １５ （５）：１０２４−３３．
７７．Ｖａｎ Ｒｏｍｐａｙ， Ｋ．Ｋ．ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．２０１２：２８； １６−３５．
７８．Ｖａｔａｋｉｓ Ｄ， ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ．２０１１； １０８ （５１）： ｅｌ４０８−１６．
７９．Ｖｌａｓａｋ， Ｊ． ＆ Ｒｕｐｒｅｃｈｔ， Ｒ．Ｍ．Ａｉｄｓ．２００６； ２０：２１３５−２１４０．
８０．Ｗａｌｋｅｒ Ｒ， ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０００； ９６ （２）：４６７−７４．
８１．Ｗａｎｇ， Ｘ．， ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２００８； １１２：４９８１−４９９０．
８２．Ｗａｔｔｓ， Ｋ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１１； ２２：１４７５−１４８２．
８３．Ｗｉｌｄ， Ｃ．Ｔ．， ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ．１９９４； ９１：９７７０−９７７４．
８４．Ｗｉｌｋｉｅ Ｓ， ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１２； ３２ （５）：１０５９−７０．
８５．Ｗｕ Ｃ， ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１３； ２４ （１）：３８−４７．
８６．Ｙａｎｇ Ｏ， ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ．１９９７； ９４ （２１）：１１４７８−８３．
８７．Ｙａｎｇ Ｏ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２００９； ４８５：４０７−１５．
８８．Ｚｈａｎｇ Ｙ， ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００５； １１ （１２）：１２９９−３０５．
【００９０】
本発明の開示を理解する、または完全にするために必要な程度に、本明細書に記述されている全ての出版物、特許及び特許出願は、それぞれが個別に組み込まれるのと同じ程度に参照として本明細書に組み込まれる。明細書の全体にわたる学術誌の記事への参考文献の包含は、本発明の方法及び組成物が新規性がないこと及び／または自明であることの承認と解釈されるべきではないことに留意するべきである。
【００９１】
このように記載された本発明の例示的な実施形態を有することによって、開示の範囲内のものは例示のためだけであること及び様々な他の変更、適合及び改変を本発明の範囲内で行えることが、当業者に留意されるべきである。したがって、本発明は、本明細書に説明されている特定の実施形態に限定されず、以下の特許請求の範囲によってのみ制限される。
【図１】
0006516740.tif 000005
【図２】
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【図３】
0006516740.tif 000007
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
0006516740.tif 000017
【図１１Ｂ】
0006516740.tif 000018
【図１１Ｃ】
0006516740.tif 000019
【図１１Ｄ】
0006516740.tif 000020
【図１２Ａ】
0006516740.tif 000021
【図１２Ｂ】
0006516740.tif 000022
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
0006516740.tif 000024
【図１４Ａ】
0006516740.tif 000025
【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
0006516740.tif 000027
【図１５Ｂ】
0006516740.tif 000028
【図１５Ｃ】
0006516740.tif 000029
【図１６】
0006516740.tif 000030
【図１７】
0006516740.tif 000031
【図１８】
0006516740.tif 000032
【配列表】
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