(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子であって、
a) 当該分子はポリヌクレオチドセンス鎖及びポリヌクレオチドアンチセンス鎖を有し、
b) 当該分子のそれぞれの鎖は15〜30ヌクレオチド長であり、
c) 当該アンチセンス鎖における15〜30ヌクレオチドの連続領域はmRNAの配列に対して相補的であり、
d) 当該センス鎖における少なくとも一部は当該アンチセンス鎖の少なくとも一部に対して相補的であり、当該分子は15〜30ヌクレオチド長の二本鎖領域を有し、
e) 前記アンチセンス鎖は、以下(1)〜(5)に示すいずれかの位置のみがデオキシヌクレオチドであることを特徴とする核酸分子。
(1)前記アンチセンス鎖の5’末端からの位置4、6及び8のそれぞれの位置
(2)前記アンチセンス鎖の5’末端からの位置3、5及び7のそれぞれの位置
(3)前記アンチセンス鎖の5’末端からの位置1、3、5及び7のそれぞれの位置
(4)前記アンチセンス鎖の5’末端からの位置3〜8のそれぞれの位置
(5)前記アンチセンス鎖の5’末端からの位置5〜8のそれぞれの位置
【請求項２】
mRNAの発現を調節する活性を有するRNAi分子であることを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
タンパク質コード遺伝子、癌原遺伝子、癌遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子及び細胞シグナル伝達遺伝子から選択される遺伝子の発現を阻害する活性を有することを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
【請求項４】
前記mRNAはヒトmRNAであることを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
【請求項５】
前記mRNAは、SRY、β-グロビン、RAS、細胞質ゾルGST、ミトコンドリアGST、MAPEG GST、GST-π、p16、p21、p53、血清アルブミン、VII型コラーゲン、補体C3、アポリポタンパク質B、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、第VIII因子、ハンチンチン、RB1網膜芽細胞腫タンパク質、CFTR、タイチン、ウトロフィン及びジストロフィンから選ばれるタンパク質をコードするヒトmRNAであることを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
【請求項６】
mRNAノックダウンについて100pM未満のIC50を有することを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
【請求項７】
mRNAノックダウンについて50pM未満のIC50を有することを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
【請求項８】
mRNAノックダウンについて10pM未満のIC50を有することを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
【請求項９】
前記分子の単回投与はインビボにおいてmRNAを少なくとも25%阻害することを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記各鎖は、18〜22ヌクレオチド長であることを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記二本鎖領域は、19ヌクレオチド長であることを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドセンス鎖及び前記ポリヌクレオチドアンチセンス鎖は、単一の鎖として連結されており、ループによって一端部で結合した二本鎖領域を形成していることを特徴とする請求項1記載の核酸分子。
【請求項１３】
平滑末端を有することを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
【請求項１４】
１以上の3’オーバーハングを有することを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
【請求項１５】
二本鎖領域内の１以上のヌクレオチドが修飾又は化学修飾されていることを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
【請求項１６】
前記修飾又は化学修飾ヌクレオチドは、2'-O-アルキル置換ヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ置換ヌクレオチド、ホスホロチオエートヌクレオチド、ロックドヌクレオチド又はそれらの任意の組み合わせであることを特徴とする請求項１５記載の核酸分子。
【請求項１７】
前記アンチセンス鎖の塩基配列が配列番号１５７であり、前記センス鎖の塩基配列が配列番号１３１であることを特徴とする請求項１記載の核酸分子。 
【請求項１８】
前記アンチセンス鎖の塩基配列が配列番号１８２であり、前記センス鎖の塩基配列が配列番号１５６であることを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
【請求項１９】
前記アンチセンス鎖の塩基配列が配列番号１９５であり、前記センス鎖の塩基配列が配列番号１８３であることを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
【請求項２０】
前記アンチセンス鎖の塩基配列が配列番号２０５であり、前記センス鎖の塩基配列が配列番号１９３であることを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
【請求項２１】
前記アンチセンス鎖の塩基配列が配列番号３５７であり、前記センス鎖の塩基配列が配列番号３４３であることを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
【請求項２２】
前記アンチセンス鎖の塩基配列が配列番号３５６であり、前記センス鎖の塩基配列が配列番号３４２であることを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか一項記載の核酸分子と薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物。
【請求項２４】
前記担体が脂質分子又はリポソームを含むことを特徴とする請求項２３記載の医薬組成物。
【請求項２５】
悪性腫瘍、癌、突然変異KRASを発現する細胞に起因する癌、肉腫及び癌腫から選ばれる少なくとも一種に対する治療のための請求項２３記載の医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１〜２２のいずれか一項記載の核酸分子を含むベクター又は細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を基礎とする分子からなる生物医薬品及び治療剤の分野に関する。より詳細には、本発明は、遺伝子発現を調節するためのRNA干渉（RNAi）を利用した化合物の構造及びその利用に関する。
【０００２】
ND6122770WO_SL.txtと名付けられた2016年1月2日に作成された170,872バイトのサイズであるASCIIファイルとして電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
RNA干渉（RNAi）は、短い干渉RNA（siRNA）によって媒介される動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングを意味する。例えば、Zamoreら、Cell、2000、Vol. 101、25〜33頁; Fireら、Nature、1998、Vol. 391、806811頁; Sharp、Genes＆Development、1999、Vol. 13、pp. 139-141参照。 
【０００４】
細胞内のRNAi応答は、二本鎖RNA（dsRNA）によって誘発することができるが、メカニズムはまだ完全には理解されていない。一般的に、siRNAは約21〜約23ヌクレオチドの長さとすることができ、約19ヌクレオチド長の塩基対二本鎖領域を含むことができる。
【０００５】
RNAiは、RNA誘発サイレンシング複合体（RISC）として知られているエンドヌクレアーゼ複合体に関与する。siRNAは、RISC複合体に入るアンチセンス又はガイド鎖であって、siRNA二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖RNA標的の切断を媒介するアンチセンス又はガイド鎖を有する。siRNAの他方の鎖はパッセンジャー鎖である。標的RNAの切断は、siRNA二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で起こる（例えば、Elbashirら、Genes＆Development、2001、Vol. 15、188〜200頁参照）。
【０００６】
医薬品として使用されるsiRNA化合物の特性を改善するため、siRNA化合物の構造を様々な方法で改変することで、安定性を改善し、オフターゲット効果を削減している。siRNAのオフターゲット活性には、様々な機序を介して起こり得る標的RNA以外の細胞核酸の調節が関与している。
【０００７】
siRNA化合物の修飾には、いずれかのヌクレオチドにおける塩基、糖及び/又は骨格の構造的変異が含まれる。siRNAヌクレオチドを改変する1つの方法として、siRNA中の特定のリボヌクレオチドをデオキシヌクレオチドで置き換えることがある。特に、デオキシヌクレオチドは、siRNA構造のオーバーハング又は末端ヌクレオチドにおいてしばしば利用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、siRNA構造にデオキシヌクレオチドを使用することの難点としては、デオキシヌクレオチドをsiRNAのシード領域に使用できないことが挙げられる。これは、遺伝子サイレンシング活性が低下するため、このようなsiRNAの改変が好ましくないという理由である。
【０００９】
活性を失うことなくオフターゲット作用を低減できる、遺伝子発現を調節するためのRNAi構造について、緊急の必要性が存在する。 
【００１０】
特に、癌遺伝子及び癌関連遺伝子のRNAi抑制に基づく治療薬には、高度に強力且つ安定なsiRNA配列及び構造が必要とされる。
【００１１】
遺伝子発現を調節するための高活性な構造を有するsiRNA化合物が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、RNA干渉を用いて標的遺伝子の発現を調節するための化合物、組成物及び方法に関する。本開示に係るsiRNA化合物及び構造は、遺伝子発現を調節するために高活性とすることができる。 
【００１３】
本発明に係るRNAi構造は、驚くほど高いレベルの活性を有し、且つオフターゲット作用が低下し、遺伝子発現を調節するために使用することができる。
【００１４】
ある実施形態において、本発明は、活性を失うことなくオフターゲット作用を低減した、RNA干渉による遺伝子サイレンシングのための分子を提供する。
【００１５】
更なる実施形態において、本発明は、予測できないほど高い遺伝子サイレンシング活性を有し、オフターゲット作用を低減したRNA干渉による遺伝子サイレンシングのための分子を提供する。
【００１６】
本発明のRNAi分子は、遺伝子のRNAi抑制に基づく治療に使用することができる非常に強力で安定なsiRNA構造を提供することができる。
【００１７】
更なる実施形態において、本発明の構造、分子及び組成物は、疾患を予防又は治療する方法、若しくは1つ又は複数の遺伝子に関連する状態又は障害の症状を改善する方法に使用することができる。
【００１８】
本発明の実施形態は以下を包含する。
【００１９】
核酸分子であって、
a) 当該分子はポリヌクレオチドセンス鎖及びポリヌクレオチドアンチセンス鎖を有し、
b) 当該分子のそれぞれの鎖は15〜30ヌクレオチド長であり、
c) 当該アンチセンス鎖における15〜30ヌクレオチドの連続領域はmRNAの配列に対して相補的であり、
d) 当該センス鎖における少なくとも一部は当該アンチセンス鎖の少なくとも一部に対して相補的であり、当該分子は15〜30ヌクレオチド長の二本鎖領域を有し、ここで当該アンチセンス鎖の5’末端から3〜8位の当該二本鎖領域における1以上のヌクレオチドがデオキシヌクレオチドである。当該mRNAはヒトmRNAとすることができる。
【００２０】
ある実施形態において、当該核酸分子アンチセンス鎖は、複数の位置にデオキシヌクレオチドを有することができ、当該複数の位置としては、以下から選ばれる1つである：
前記アンチセンス鎖の5’末端からの位置4、6及び8のそれぞれ；
前記アンチセンス鎖の5’末端からの位置3、5及び7のそれぞれ；
前記アンチセンス鎖の5’末端からの位置1、3、5及び7のそれぞれ；
前記アンチセンス鎖の5’末端からの位置3〜8のそれぞれ；及び
前記アンチセンス鎖の5’末端からの位置5〜8のそれぞれ 
【００２１】
当該核酸分子は、mRNAの発現を調節するために活性であるRNAi分子とすることができる。
【００２２】
ある実施形態において、核酸分子は、タンパク質コード遺伝子、癌原遺伝子、癌遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子及び細胞シグナル伝達遺伝子から選択される遺伝子の発現を阻害するために活性とすることができる。
【００２３】
さらなる実施形態において、当該mRNAは、SRY、β-グロビン、RAS、細胞質ゾルGST、ミトコンドリアGST、MAPEG GST、GST-π、p16、p21、p53、血清アルブミン、VII型コラーゲン、補体C3、アポリポタンパク質B、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、第VIII因子、ハンチンチン、RB1網膜芽細胞腫タンパク質、CFTR、タイチン、ウトロフィン及びジストロフィンを含むヒトタンパク質ファミリーに含まれる任意のメンバー又はサブメンバーを発現するヒトmRNAとすることができる。
【００２４】
核酸分子は、mRNAのノックダウンについて、100pM未満、又は50pM未満、又は10pM未満のIC50を有することができる。特定の実施形態では、核酸分子は、当該分子の単回投与後においてインビボでmRNAを少なくとも25％阻害することができる。 
【００２５】
ある実施形態において、当該分子のそれぞれの鎖は18〜22ヌクレオチド長とする。二本鎖は19ヌクレオチド長とすることができる。ある実施形態において、ポリヌクレオチドセンス鎖及びポリヌクレオチドアンチセンス鎖は１つの鎖として連結していても良く、ループによって一方の末端で結合して二本鎖を形成していても良い。 
【００２６】
核酸分子は平滑末端を有していても良い。ある実施形態において、核酸分子は１以上の3’オーバーハングを有していても良い。 
【００２７】
本発明の実施形態は、二重鎖領域内に修飾又は化学修飾された1つ以上のヌクレオチドを有する核酸分子を含んでいる。修飾ヌクレオチド又は化学修飾ヌクレオチドは、2'-O-アルキル置換ヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ置換ヌクレオチド、ホスホロチオエートヌクレオチド、ロックドヌクレオチド又はそれらの任意の組み合わせとすることができる。
【００２８】
本発明はさらに、当該核酸分子及び薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物を企図している。当該担体としては、脂質分子又はリポソームとすることができる。
【００２９】
本発明の実施形態は更に、当該核酸分子を含むベクター又は細胞を含んでいる。
【００３０】
本発明はまた、当該核酸分子を含む組成物を被験体に投与することによって、遺伝子サイレンシングにより必要とする被験体における疾患を予防、治療又は改善する方法を企図している。疾患は、悪性腫瘍、癌、肉腫又は上皮性悪性腫瘍とすることができる。
【００３１】
本発明の実施形態は、必要とする被験体における疾患又は状態を予防、改善又は治療するための核酸分子の組成物の使用を含んでいる。
【００３２】
ある実施形態において、本発明の組成物は、医学的治療に使用するためのものとすることができる。
【００３３】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、ヒト又は動物の体の治療に使用するためのものとすることができる。
【００３４】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、必要とする被験体における疾患又は状態を予防、改善又は治療するための医薬を調製又は製造するためのものとすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図1は、GST-πを標的とする本発明のsiRNAがインビボにおいて同所性肺癌腫瘍を著しく減少させたことを示している。GST-πsiRNAを、A549同所性肺癌腫瘍を提示する無胸腺ヌードマウスに2mg/kgの用量でリポソーム製剤として投与した。最終原発腫瘍重量は、処置群及びビヒクル対照群の剖検時に測定した。GST-πsiRNAは、この6週間の研究において肺癌腫瘍の阻害に対して有意な効力を示した。図1に示すように、43日後、GST-πsiRNAは著しく有利な腫瘍阻害を示し、最終原発腫瘍平均重量は対照と比較して2.8倍有意に減少した。
【図２】図2は、GST-πsiRNAについてインビボにおける腫瘍阻害効力を示している。A549細胞を用いた癌異種移植モデルを、0.75mg/kgで比較的低用量のsiRNAで使用した。GST-πsiRNAは、数日以内に有利な腫瘍阻害を示した。36日後、GST-πsiRNAは著しく有利な腫瘍阻害を示し、最終腫瘍平均体積は対照と比較して約2倍有意に減少した。
【図３】図3は、図2のエンドポイントにおけるGST-πsiRNAのインビボでの腫瘍阻害効力を示している。GST-πsiRNAは、平均腫瘍重量が2倍以上減少するといった有利な腫瘍阻害を示した。
【図４】図4は、本発明のGST-πsiRNAがインビトロにおいてアポトーシスにより癌細胞死を大幅に増加させたことを示している。GST-πsiRNAは、細胞生存率の低下に関連するアポトーシスのバイオマーカーであるPUMAのアップレギュレーションを引き起こした。図4に示すように、PUMAの発現は、GST-πsiRNAのトランスフェクションの2〜6日後に大きく増加した。
【図５】図5は、本発明のGST-πsiRNAがA549異種移植片腫瘍に対するインビボにおけるノックダウン効果を呈することを示している。GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンが、胸腺欠損ヌード（nu/nu）雌マウス（Charles River）において、GST-πを標的とするsiRNAを用いることで観察された。図5に示すように、4mg/kgの用量では、注入後24時間でGST-πmRNAにおいて約40％の有意な減少が検出された。
【図６】図6は、本発明のGST-πsiRNAがin vivoで膵臓癌異種移植片腫瘍を阻害したことを示している。GST-πsiRNAは、6〜8週齢の胸腺欠損ヌード雌マウスの膵臓癌異種移植片腫瘍にリポソーム製剤で投与した場合、インビボで遺伝子サイレンシング効力をもたらした。図6に示すように、用量応答は、GST-πを標的とするsiRNAの0.375mg/kg〜3mg/kgの範囲の用量で得られた。GST-πsiRNAは投与後数日以内に有利な腫瘍阻害を示し、腫瘍体積はエンドポイントで約2倍減少した。
【図７】図7は、本発明のGST-πsiRNAにおける血清安定性が増加したことを示している。図7に示すように、GST-πsiRNAのセンス鎖（図7、上部）及びアンチセンス鎖（図7、下部）の血清中の半減期（t1/2）は約100分であった。
【図８】図8は、血漿中において、本発明のGST-πsiRNAが製剤として安定性が向上したことを示している。図8は、50％ヒト血清中のGST-πsiRNAのリポソーム製剤のPBS中でのインキュベーション及び様々な時点での残存するsiRNAの検出を示している。図8に示すように、GST-πsiRNAの製剤の血漿中半減期（t1/2）は100時間より有意に長かった。
【図９】図9は、GST-πsiRNAのガイド鎖のインビトロノックダウンを示す。図9に示すように、GST-πsiRNAのガイド鎖ノックダウンは、効果を示さないスクランブル配列を有する対照と比較して、ほぼ指数関数的であった。
【図１０】図10は、図9のGST-πsiRNAにおけるパッセンジャー鎖についてのインビトロノックダウンを示している。図10に示すように、GST-πsiRNAについてパッセンジャー鎖のオフターゲットノックダウンは緩やかに低減しており、本質的に効果が無いことを示している。
【図１１】図11は、いくつかの高活性GST-πsiRNAのガイド鎖についてインビトロノックダウンを示している。図11に示すように、GST-πsiRNAのガイド鎖ノックダウン活性はほぼ指数関数的であった。
【図１２】図12は、図11のGST-πsiRNAのパッセンジャー鎖についてインビトロノックダウンを示している。図12に示すように、GST-πsiRNAのパッセンジャー鎖のオフターゲットノックダウン活性は、約500pM未満に有意に低下した。
【図１３】図13は、高活性GST-πsiRNAのガイド鎖についてのインビトロノックダウンを示している。図13に示すように、GST-πsiRNAのガイド鎖ノックダウン活性はほぼ指数関数的であった。
【図１４】図14は、図13のGST-πsiRNAのパッセンジャー鎖についてのインビトロノックダウンを示している。図14に示すように、GST-πsiRNAのパッセンジャー鎖のオフターゲットノックダウン活性は有意に減少した。
【図１５】図15は、p21 siRNAについてインビボでの腫瘍阻害効力を示している。A549細胞を用いた癌異種移植モデルを、0.75mg/kgで比較的低用量のsiRNAで利用した。p21 siRNAは、数日以内に有利な腫瘍阻害を示した。30日後、GST-π siRNAは著しく有利な腫瘍阻害を示し、最終腫瘍平均体積は対照と比較して有意に2倍以上減少した。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明は遺伝子発現を調節するための核酸を基礎とする治療薬のための化合物、組成物及び方法に関する。 
【００３７】
ある実施形態において、本発明は、RNA干渉において活性な分子、ならびに遺伝子の発現をサイレンシングできる構造及び組成物を提供する。
【００３８】
本開示に係る当該構造及び組成物は、様々な疾患を予防又は治療する際に使用することができる。
【００３９】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明の1つ以上の治療用RNAi分子の送達及び摂取のための組成物、ならびにその使用方法を提供する。本発明のRNAに基づく組成物は、悪性腫瘍、例えば癌を予防又は治療するための方法において使用することができる。
【００４０】
本発明の治療組成物は、RNA干渉において活性である核酸分子を含んでいる。治療用核酸分子は、遺伝子サイレンシングのための種々の遺伝子を標的とすることができる。
【００４１】
様々な実施形態において、本発明は、低分子干渉RNA（siRNA）として活性であり、遺伝子発現を調節又はサイレンシングすることができる分子の範囲を提供する。
【００４２】
本発明の実施形態はさらに、疾患の予防又は治療を必要とする被験体に本発明のsiRNAを送達するためのビヒクル、製剤又は脂質ナノ粒子製剤を提供する。本発明はさらに、siRNAを治療剤として哺乳動物に投与するための方法を企図している。
【００４３】
本発明の治療用分子及び組成物は、必要とする被験体に化合物又は組成物を投与することによって、疾患の予防又は治療を目的とするRNA干渉に使用することができる。
【００４４】
本発明は一定の範囲のRNAi分子を提供する。ここで、それぞれの分子はポリヌクレオチドセンス鎖及びポリヌクレオチドアンチセンス鎖を有し；当該分子の各鎖は15〜30ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域はmRNAの配列に対して少なくとも一部が相補的であり；及び、センス鎖の少なくとも一部がアンチセンス鎖の少なくとも一部と相補的であり、且つ、当該分子は15〜30ヌクレオチド長の二本鎖領域を有する。
【００４５】
本発明のRNAi分子は、ヒトmRNAの配列に対して相補的である、アンチセンス鎖における15〜30ヌクレオチドの連続領域を有することができ、これは当該分子における二本鎖領域に位置する。
【００４６】
ある実施形態において、RNAi分子は、ヒトmRNAの配列に対して相補的である、アンチセンス鎖における15〜30ヌクレオチドの連続領域を有することができる。
【００４７】
本発明の実施形態は、更に、疾患又は状態の1つ以上の症状を予防、治療又は緩和する方法、疾患又は状態を発症するリスクを低下させる方法、若しくは、それを必要とする哺乳動物において疾患又は状態の発症を遅延させる方法を提供する。
【００４８】
ユニバーサルゲノムサイレンシグのためのRNAi構造
本発明の実施形態は、任意の遺伝子を標的とし、当該遺伝子の発現をサイレンシグする活性に優れたRNAi分子を提供する。
【００４９】
本開示のRNAi分子は、遺伝子の発現をサイレンシングする活性が驚くほど高く、オフターゲット効果を低減することができる。
【００５０】
ある実施形態において、本発明のRNAi分子は１以上の2'-デオキシヌクレオチドを含んでいる。これらの実施形態において、１以上の2'-デオキシヌクレオチドは、siRNAのシード領域に位置することができる。
【００５１】
１以上の2'-デオキシヌクレオチドはモノデオキシヌクレオチドとすることができる。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、デオキシヌクレオチドは、モノ-2'-デオキシヌクレオチドを指す。
【００５３】
2'-デオキシヌクレオチドは、2’位をハロゲンで置換したものであってもよい。
【００５４】
ある実施形態において、本発明のRNAi分子は、siRNAのアンチセンス又はガイド鎖に１以上の2'-デオキシヌクレオチドを含んでいる。より具体的に、１以上のデオキシヌクレオチドは、siRNAのアンチセンス鎖の5’末端から位置1〜8に位置することができる。ある実施形態において、１以上のデオキシヌクレオチドは、siRNAのアンチセンス鎖の5’末端から位置2〜8に位置することができる。更なる実施形態において、１以上のデオキシヌクレオチドは、siRNAのアンチセンス鎖の5’末端から位置3〜8に位置することができる。
【００５５】
本発明は、複数の位置にデオキシヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を有することができるsiRNA構造を企図している。
【００５６】
ある実施形態において、siRNA構造は、アンチセンス鎖の5’末端から位置4、6、及び8のそれぞれにデオキシヌクレオチドを含んでいるアンチセンス鎖を有することができる。
【００５７】
さらなる実施形態において、siRNA構造は、アンチセンス鎖の5’末端から位置3、5、及び7のそれぞれにデオキシヌクレオチドを含んでいるアンチセンス鎖を有することができる。
【００５８】
さらなる実施形態において、siRNA構造は、アンチセンス鎖の5’末端から位置1、3、5、及び7のそれぞれにデオキシヌクレオチドを含んでいるアンチセンス鎖を有することができる。
【００５９】
ある実施形態において、siRNA構造は、アンチセンス鎖の5’末端から位置3〜8のそれぞれにデオキシヌクレオチドを含んでいるアンチセンス鎖を有することができる。
【００６０】
ある実施形態において、siRNA構造は、アンチセンス鎖の5’末端から位置5〜8のそれぞれにデオキシヌクレオチドを含んでいるアンチセンス鎖を有することができる。
【００６１】
これらの構造のいずれも、１以上の修飾又は化学修飾ヌクレオチドを他の位置に組み合わせることができる。 
【００６２】
本発明のRNAi分子は、約200pM未満の有利なIC50で遺伝子のmRNAの発現を阻害することができる。ある実施形態において、本発明のRNAi分子は、約100pM未満又は約50pM未満又は約30pM未満又は約20pM未満又は約10pM未満又は約5pM未満又は約1pM未満の有利なIC50で遺伝子のmRNAの発現を阻害することができる。
【００６３】
さらなる実施形態において、本発明のRNAi分子は、単回投与で、インビボで少なくとも25％の遺伝子のmRNAレベルの発現を阻害することができる。
【００６４】
本発明のsiRNAは、任意の遺伝子を標的とすることができる。
【００６５】
本発明のsiRNAが標的とすることができる遺伝子としては、HUGO Gene Nomenclature CommitteeのGene Families Indexに記載されている遺伝子を挙げることができる。
【００６６】
本発明のsiRNAが標的とすることができる遺伝子としては、核遺伝子、ミトコンドリア遺伝子、タンパク質コード遺伝子、癌原遺伝子、癌遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子及び細胞シグナル伝達遺伝子を挙げることができる。
【００６７】
本発明のsiRNAが標的とすることができる遺伝子としては、SRY、β-グロビン、RAS、細胞質ゾルGST、ミトコンドリアGST、MAPEG GST、GST-π、p16、p21、p53、血清アルブミン、VII型コラーゲン、補体C3、アポリポタンパク質B、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、第VIII因子、ハンチンチン、RB1網膜芽細胞腫タンパク質、CFTR、タイチン、ウトロフィン及びジストロフィンを含むヒトタンパク質ファミリーに含まれる任意のメンバー又はサブメンバーを発現する遺伝子を挙げることができる。
【００６８】
修飾及び化学修飾siRNAs
本発明の実施形態は、遺伝子サイレンシングに対する活性及び効力の増加といった治療用途に則った特性を強化するように、修飾又は化学修飾されたsiRNA分子を包含する。本発明は、遺伝子調節及び遺伝子サイレンシングに関するsiRNA分子の活性及び効力を失うことなく、血清安定性が増大し、さらにオフターゲット活性効果が減少した、修飾又は化学的に修飾されたsiRNA分子を提供する。いくつかの局面では、本発明は、siRNAの安定性及び効力を増強する様々な組み合わせの修飾又は化学修飾を有するsiRNAを提供する。
【００６９】
本明細書で使用される、修飾及び化学修飾されたという用語は、1つ又は複数のヌクレオチド類似体、改変ヌクレオチド、非標準的ヌクレオチド天然に存在しないヌクレオチド及びこれらの組み合わせを有するsiRNAにおける天然に存在する核酸の構造又は核酸構造に対してなされる改変を意味する。
【００７０】
ある実施形態においてsiRNA中の修飾又は化学修飾構造の数は、siRNA分子のすべての構造要素及び/又は全てのヌクレオチドを含むことができる。
【００７１】
修飾及び化学修飾されたsiRNAとしては、例えば、ヌクレオチドの糖基の修飾、ヌクレオチドの核酸塩基の修飾、核酸骨格又は結合部分の修飾、siRNA鎖の末端におけるヌクレオチド構造又はヌクレオチドの修飾及びそれらの組み合わせを有するsiRNAを挙げることができる。
【００７２】
修飾及び化学修飾されたsiRNAとしては、例えば、上記糖の2’炭素位における置換修飾を有するsiRNAを挙げることができる。
【００７３】
修飾及び化学修飾されたsiRNAとしては、例えば、鎖の5’末端、3’末端又は両端部における修飾を有するsiRNAを挙げることができる。 
【００７４】
修飾及び化学修飾されたsiRNAとしては、例えば、鎖間の相補的ミスマッチを形成する修飾を有するsiRNAを挙げることができる。
【００７５】
修飾及び化学修飾されたsiRNAとしては、例えば、5'-プロピルアミン末端、5'-リン酸化末端、3'-ピューロマイシン末端又は3'-ビオチン末端基を有するsiRNAを挙げることができる。
【００７６】
修飾及び化学修飾されたsiRNAとしては、例えば、2'-フルオロ置換リボヌクレオチド、2'-OMe置換リボヌクレオチド、2'-デオキシリボヌクレオチド、2'-アミノ置換リボヌクレオチド、2'-チオ置換リボヌクレオチドを有するsiRNAを挙げることができる。
【００７７】
修飾及び化学修飾されたsiRNAとしては、例えば、1以上の5-ハロウリジン、5-ハロシチジン、5-メチルシチジン、リボチミジン、2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、4-チオウリジン又は5-アミノアリルウリジンを有するsiRNAを挙げることができる。
【００７８】
修飾及び化学修飾されたsiRNAとしては、例えば、1以上のホスホロチオエート基を有するsiRNAを挙げることができる。
【００７９】
修飾及び化学修飾されたsiRNAとしては、例えば、1以上の2'-フルオロ置換リボヌクレオチド、2'-フルオロウリジン、2'-フルオロシチジン、2'-デオキシリボヌクレオチド、2'-デオキシアデノシン又は2'-デオキシグアノシンを有するsiRNAを挙げることができる。
【００８０】
修飾及び化学修飾されたsiRNAとしては、例えば、1以上のホスホロチオエート結合を有するsiRNAを挙げることができる。
【００８１】
修飾及び化学修飾されたsiRNAとしては、例えば、1以上のアルキレンジオール結合、オキシ-アルキルチオ結合又はオキシカルボニルオキシ結合を有するsiRNAを挙げることができる。
【００８２】
修飾及び化学修飾されたsiRNAとしては、例えば、1以上のデオキシ脱塩基、イノシン、N3-メチル-ウリジン、N6,N6-ジメチル-アデノシン、シュードウリジン、プリン-リボヌクレオチド及びリバビリンを有するsiRNAを挙げることができる。
【００８３】
修飾及び化学修飾されたsiRNAとしては、例えば、1以上の3’又は5’逆方向末端基を有するsiRNAを挙げることができる。
【００８４】
修飾及び化学修飾されたsiRNAとしては、例えば、1以上の5-(2-アミノ)プロピルウリジン、5-ブロモウリジン、アデノシン、8-ブロモグアノシン、7-デアザ-アデノシン又はN6-メチルアデノシンを有するsiRNAを挙げることができる。
【００８５】
GST-π及びRNAi分子
様々なヒト癌組織が突然変異KRAS遺伝子の出現と相関することが見出されている。いくつかの場合において、当該組織においては、グルタチオンS-トランスフェラーゼPi（GST-π）の発現レベルが上昇する(Miyanishi et al., Gastroenterology, 2001, Vol. 121:865-874, Abstract)。例えば、種々の消化器系悪性腫瘍を有する患者において、血清GST-πレベルの上昇が観察されている(Niitsu et al., Cancer, 1989, Vol.63, No. 2, pp. 317-323, Abstract)。
【００８６】
GST-πは、疎水性化合物と還元型グルタチオンを有する求電子性化合物との結合を触媒することによって解毒に役割を果たす酵素のGSTファミリーのメンバーである。GST-π発現は、インビトロにおいてsiRNAで減少させることができる(Niitsu et al., US 2014/0315975 A1)。しかしながら、既存のsiRNA剤には、不十分な活性、オフターゲット効果、血清安定性の欠如及びインビボにおける効力又は有効性の欠如といった多くの欠点がある。
【００８７】
例示する標的ヒトグルタチオンS-トランスフェラーゼpi（ヒトGST-π）mRNAの核酸配列はGenBank アクセッション番号NM_000852.3 (hGSTP1)に開示され、 986ヌクレオチド長である。
【００８８】
当業者は、報告された配列が経時的に変化することがあり、それに応じて本明細書中の核酸分子に必要な変化を組み込むことができることを理解するであろう。
【００８９】
本発明の実施形態は、小核酸分子を用いたGST-π発現の遺伝子サイレンシングのための組成物及び方法を提供することができる。核酸分子としては、例えば、RNA干渉（RNAi分子）、短鎖干渉RNA（siRNA）、二本鎖RNA（dsRNA）、マイクロRNA（miRNA）及び短鎖ヘアピンRNA（shRNA）分子、並びにDNA指向性RNA（ddRNA）、Piwi相互作用RNA（piRNA）及び反復関連RNA（rasiRNA）を挙げることができる。そのような分子は、GST-π遺伝子発現に対するRNA干渉を媒介することができる。
【００９０】
本明細書に開示される組成物及び方法はまた、被験体における様々な種類の悪性腫瘍の治療において使用することができる。
【００９１】
本発明の核酸分子及び方法は、GST-πをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートするために使用される。
【００９２】
本発明の組成物及び方法は、１以上の核酸分子を含むことができ、単独で或いは組み合わせて、GST-πタンパク質及び/又はGST-πタンパク質をコードする遺伝子、例えば、悪性腫瘍等の疾患、並びにGST-πに関連する状態又は疾病の維持及び/又は発症に関与するタンパク質及び/又はGST-πをコードする遺伝子の発現を調節又は制御することができる。
【００９３】
本発明の組成物及び方法は、GST-πの例示的な配列を参照して記載される。当業者は、本発明の様々な態様及び実施形態が、関連するGST-π遺伝子、配列、又はホモログ遺伝子及び転写変異体といった変異体、並びにGST-π遺伝子に関連する一塩基多型（SNP）を含む多型を対象とすることを理解するであろう。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、GST-π遺伝子、例えばヒトGST-πの発現をダウンレギュレートする二本鎖短干渉核酸（siRNA）分子を提供することができる。
【００９５】
本発明のRNAi分子は、GST-πを標的とすることができ、及び、例えば相補的配列を用いて、又は非標準塩基対、例えばミスマッチ及び/又はウォブル塩基対を組み込むことによって更なる標的配列を提供できる任意の相同配列を標的とすることができる。
【００９６】
ミスマッチが同定される場合、非標準的な塩基対、例えば、ミスマッチ及び/又はウォブル塩基を用いて、2つ以上の遺伝子配列を標的とする核酸分子を生成することができる。 
【００９７】
例えば、UU及びCC塩基対などの非標準塩基対を使用して、配列相同性を有する異なるGST-π標的のための配列を標的にできる核酸分子を生成できる。したがって、RNAi分子は、相同遺伝子間で保存されているヌクレオチド配列を標的とすることができ、単一のRNAi分子を用いて2つ以上の遺伝子の発現を阻害することができる。
【００９８】
いくつかの態様では、本発明の組成物及び方法は、GST-πmRNAに対して活性であるRNAi分子を含み、RNAi分子はGST-π配列をコードする任意のmRNAに相補的な配列を含む。
【００９９】
いくつかの実施形態では、本開示のRNAi分子は、GST-πRNAに対して活性を有することができ、RNAi分子は、変異体GST-πをコードする配列を有するRNA、例えば、悪性腫瘍に関連することが当該分野で公知の突然変異GST-π遺伝子のRNAに相補的な配列を含んでいる。
【０１００】
さらなる実施形態では、本発明のRNAi分子は、GST-π遺伝子に相互作用することができ、GST-π遺伝子発現のサイレンシングを媒介することができるヌクレオチド配列を含むことができる。
【０１０１】
GST-πの発現を阻害するための核酸分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有することができ、ここで鎖は二本鎖領域を形成する。核酸分子は、当技術分野で知られているような修飾を含む、二本鎖領域内において修飾又は化学修飾された1以上のヌクレオチドを有することができる。siRNAのオーバーハング内の任意のヌクレオチドも修飾又は化学修飾されていてもよい。
【０１０２】
ある実施形態において、修飾又は化学修飾ヌクレオチドは、好ましくは、2'-デオキシヌクレオチドである。さらなる実施形態において、修飾又は化学修飾されたヌクレオチドとしては、2'-O-アルキル置換ヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ置換ヌクレオチド、ホスホロチオエートヌクレオチド、ロックドヌクレオチド又はそれらの任意の組み合わせとすることができる。
【０１０３】
ある実施形態において、アンチセンス鎖が複数の位置においてデオキシヌクレオチドを有する構造が好ましい。この複数の位置としては、以下のうち１つである：アンチセンス鎖の5’末端から位置4、6及び8のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置3、5及び7のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置1、3、5及び7のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置5〜8のそれぞれ。これらの構造のいずれも二本鎖領域において、1つ以上の2'-デオキシ-2'-フルオロ置換ヌクレオチドと組み合わせることができる。
【０１０４】
本発明の核酸分子は、約200pM未満の有利なIC50でGST-π mRNAの発現を阻害することができる。さらに、核酸分子は、単回投与にてインビボにおいて少なくとも25％GST-π mRNAレベルの発現を阻害することができる。
【０１０５】
本発明においては、薬学的に許容される担体と組み合わせて、本明細書に記載の1つ以上のsiRNAを含有することができる医薬組成物を意図している。当技術分野で公知のものを含む任意の適切な担体、並びに脂質分子、ナノ粒子、又はリポソーム（いずれもsiRNA分子をカプセル化できる）を使用してもよい。
【０１０６】
本発明は、GST-π発現に関連する疾患を治療する方法を開示し、この方法は、1以上のsiRNAを含有する組成物を必要とする被験者に投与することを含む。治療される疾患には、悪性腫瘍、癌、突然変異KRASを発現する細胞に起因する癌、肉腫及び上皮性悪性腫瘍を含むことができる。
【０１０７】
GST-π mRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表1に示す。
【０１０８】
【表１】
0006457704.tif 000002
0006457704.tif 000003
0006457704.tif 000004
【０１０９】
表1の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味する。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びデオキシチミジンを意味する。
【０１１０】
GST-π mRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表2に示す。
【０１１１】
【表２】
0006457704.tif 000005
【０１１２】
表2の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味する。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びデオキシチミジン(dT=T=t)を意味する。下線は、2'-OMe置換体を意味する、例えばU。小文字のfは、2'-デオキシ-2'-フルオロ置換を意味し、例えばfUは2'-デオキシ-2'-フルオロ-Uである。Nは、A、C、G、U、U、a、c、g、u、t、又は修飾ヌクレオチド、逆方向（inverted）ヌクレオチド又は化学修飾ヌクレオチドである。
【０１１３】
GST-π mRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表3に示す。
【０１１４】
【表３】
0006457704.tif 000006
【０１１５】
表3の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味する。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びデオキシチミジン(dT=T=t)を意味する。下線は、2'-OMe置換体を意味する、例えばU。小文字のfは、2'-デオキシ-2'-フルオロ置換を意味し、例えばfUは2'-デオキシ-2'-フルオロ-Uである。Nは、A、C、G、U、U、a、c、g、u、t、又は修飾ヌクレオチド、逆方向（inverted）ヌクレオチド又は化学修飾ヌクレオチドである。
【０１１６】
GST-π mRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表4に示す。
【０１１７】
【表４】
0006457704.tif 000007
【０１１８】
表4の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味する。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びデオキシチミジン(dT=T=t)を意味する。下線は、2'-OMe置換体を意味する、例えばU。小文字のfは、2'-デオキシ-2'-フルオロ置換を意味し、例えばfUは2'-デオキシ-2'-フルオロ-Uである。Nは、A、C、G、U、U、a、c、g、u、t、又は修飾ヌクレオチド、逆方向（inverted）ヌクレオチド又は化学修飾ヌクレオチドである。
【０１１９】
GST-π mRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表5に示す。
【０１２０】
【表５】
0006457704.tif 000008
【０１２１】
表5の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味する。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びデオキシチミジン(dT=T=t)を意味する。下線は、2'-OMe置換体を意味する、例えばU。小文字のfは、2'-デオキシ-2'-フルオロ置換を意味し、例えばfUは2'-デオキシ-2'-フルオロ-Uである。Nは、A、C、G、U、U、a、c、g、u、t、又は修飾ヌクレオチド、逆方向（inverted）ヌクレオチド又は化学修飾ヌクレオチドである。
【０１２２】
GST-π mRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表6に示す。
【０１２３】
【表６】
0006457704.tif 000009
【０１２４】
表6の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味する。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びデオキシチミジン(dT=T=t)を意味する。下線は、2'-OMe置換体を意味する、例えばU。小文字のfは、2'-デオキシ-2'-フルオロ置換を意味し、例えばfUは2'-デオキシ-2'-フルオロ-Uである。Nは、A、C、G、U、U、a、c、g、u、t、又は修飾ヌクレオチド、逆方向（inverted）ヌクレオチド又は化学修飾ヌクレオチドである。
【０１２５】
ある実施形態において、本発明は、ある範囲の核酸分子を提供し、ここで、a）当該分子は、ポリヌクレオチドセンス鎖及びポリヌクレオチドアンチセンス鎖を有し；b）当該分子の各鎖は15〜30ヌクレオチド長であり；c）アンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域は、GST-πをコードするmRNAの配列に相補的であり；d）センス鎖の少なくとも一部はアンチセンス鎖の少なくとも一部に相補的であり、当該分子は15〜30ヌクレオチド長の二本鎖領域を有している。
【０１２６】
ある実施形態において、核酸分子は、当該分子の二本鎖領域に位置する、GST-πをコードするmRNAの配列に相補的なアンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域を有することができる。
【０１２７】
更なる実施形態において、核酸分子は、GST-πをコードするmRNAの配列に相補的なアンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域を有することができる。
【０１２８】
特定の実施形態において、核酸分子の各鎖は、18〜22ヌクレオチド長とすることができる。核酸分子における二本鎖領域は、19ヌクレオチド長とすることができる。
【０１２９】
代替の形態において、核酸分子は、単一の鎖として連結されたポリヌクレオチドセンス鎖とポリヌクレオチドアンチセンス鎖とを有することができ、ループによって一端部において結合した二本鎖領域を形成することができる。
【０１３０】
本開示に係る核酸分子のある実施形態としては、平滑末端を有することができる。特定の実施形態において、核酸分子は、1以上の3’オーバーハングを有することができる。
【０１３１】
本発明は、遺伝子サイレンシグに活性なRNAi分子である所定の範囲の核酸分子を提供する。本発明に係る核酸分子は、遺伝子サイレンシグに活性なdsRNA、siRNA、マイクロRNA又はshRNAとすることができ、同様にDNA指向性RNA（ddRNA）、Piwi相互作用RNA（piRNA）又は反復関連RNA（rasiRNA）とすることができる。当該核酸分子は、GST-π発現を阻害する活性を有することができる。
【０１３２】
本発明に係る実施形態は、更にGST-πノックダウンに対するIC50が100pM未満の核酸分子を提供する。
【０１３３】
本発明の更なる実施形態は、更にGST-πノックダウンに対するIC50が50pM未満の核酸分子を提供する。
【０１３４】
本発明は、更に、1以上の本発明の核酸分子、薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物を企図している。特定の実施形態において、当該担体としては、脂質分子又はリポソームとすることができる。
【０１３５】
本発明の化合物及び組成物は、必要とする被験者に化合物又は組成物を投与することによって、GST-πに関連する疾患を予防又は治療する方法に使用可能である。
【０１３６】
本発明の方法は、悪性腫瘍を予防又は治療するための本発明の化合物を利用することができる。悪性腫瘍は、種々の疾患、例えば、GST-π発現に関連する癌、突然変異KRASを発現する細胞に起因する癌、肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、上皮性悪性腫瘍、脳腫瘍、頭頸部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、虫垂癌、結腸直腸癌、直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、胆管癌、肛門癌、腎臓癌、尿道癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、皮膚癌、白血病、悪性リンパ腫、上皮悪性腫瘍および非上皮悪性腫瘍に提示される。
【０１３７】
P21及びRNAi分子
p21は、CDKN1A遺伝子によってコードされ、CIP/KIPファミリーに属する細胞周期調節タンパク質である。このタンパク質は、サイクリン-CDK複合体の効果を当該複合体へ結合することにより阻害することで、G1期及びG2/M期における細胞周期の進行を阻害する機能を有する。具体的には、p21遺伝子は腫瘍抑制遺伝子の1つであるp53によって活性化される。DNA損傷等によるp53の活性化により、p53がp21を活性化し、細胞周期がG1期及びG2/M期に停止することが報告されている。
【０１３８】
p21は、前立腺癌、子宮頸癌、乳癌及び扁平上皮癌を含む様々なヒト癌において過剰発現されており、多くの場合、p21のアップレギュレートは腫瘍等級、侵襲性及び攻撃性に対して正に相関する。例えば、Changら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、2000、Vol. 97、8号、4291〜96頁参照。また、p21のアップレギュレーションは、脳、前立腺、卵巣、乳癌及び食道細胞癌を含む多くの形態の癌において、腫瘍原性及び予後不良と関連することが報告されている。例えば、Wintersら、Breast Cancer Research、2003、Vol. 5、No.6、pp. R242-R249参照。また、疾患は、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、アミロイドーシス及び関節炎を含む加齢性疾患であっても良い。例えば、Changら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、2000、Vol. 97、8号、4291〜96頁参照。
【０１３９】
p21はヒトを含む種々の動物に存在し、その配列情報は、NM_000389.4、NM_078467.2、NM_001291549.1、NM_001220778.1、NM_001220777.1（NP_001207707.1、NP_001278478 NP_001207706.1、NP_510867.1、NP_000380.1）で見つけられる。  
【０１４０】
標的ヒトp21 mRNAは、GenBankアクセッション番号NM_000389.4（CDKN1A）に開示され、2175ヌクレオチド長である。
【０１４１】
当業者は、報告された配列が経時的に変化することがあり、それに応じて本明細書中の核酸分子に必要な変化を組み込むことができることを理解するであろう。
【０１４２】
本発明の実施形態は、小核酸分子を用いたp21発現の遺伝子サイレンシングのための組成物及び方法を提供することができる。核酸分子としては、例えば、RNA干渉（RNAi分子）、短鎖干渉RNA（siRNA）、二本鎖RNA（dsRNA）、マイクロRNA（miRNA）及び短鎖ヘアピンRNA（shRNA）分子、並びにDNA指向性RNA（ddRNA）、Piwi相互作用RNA（piRNA）及び反復関連RNA（rasiRNA）を挙げることができる。そのような分子は、p21遺伝子発現に対するRNA干渉を媒介することができる。
【０１４３】
本明細書に開示される組成物及び方法はまた、被験体における様々な種類の悪性腫瘍の治療において使用することができる。
【０１４４】
本発明の核酸分子及び方法は、p21をコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートするために使用される。
【０１４５】
本発明の組成物及び方法は、１以上の核酸分子を含むことができ、単独で或いは組み合わせて、p21タンパク質及び/又はp21タンパク質をコードする遺伝子、例えば、悪性腫瘍等の疾患、並びにp21に関連する状態又は疾病の維持及び/又は発症に関与するタンパク質及び/又はp21をコードする遺伝子の発現を調節又は制御することができる。
【０１４６】
本発明の組成物及び方法は、p21の例示的な配列を参照して記載される。当業者は、本発明の様々な態様及び実施形態が、関連するp21遺伝子、配列、又はホモログ遺伝子及び転写変異体といった変異体、並びにp21遺伝子に関連する一塩基多型（SNP）を含む多型を対象とすることを理解するであろう。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、p21遺伝子、例えばヒトCDKN1Aの発現をダウンレギュレートする二本鎖短干渉核酸（siRNA）分子を提供することができる。
【０１４８】
本発明のRNAi分子は、p21を標的とすることができ、及び、例えば相補的配列を用いて、又は非標準塩基対、例えばミスマッチ及び/又はウォブル塩基対を組み込むことによって更なる標的配列を提供できる任意の相同配列を標的とすることができる。
【０１４９】
ミスマッチが同定される場合、非標準的な塩基対、例えば、ミスマッチ及び/又はウォブル塩基を用いて、2つ以上の遺伝子配列を標的とする核酸分子を生成することができる。
【０１５０】
例えば、UU及びCC塩基対などの非標準塩基対を使用して、配列相同性を有する異なるp21標的のための配列を標的にできる核酸分子を生成できる。したがって、RNAi分子は、相同遺伝子間で保存されているヌクレオチド配列を標的とすることができ、単一のRNAi分子を用いて2つ以上の遺伝子の発現を阻害することができる。
【０１５１】
いくつかの態様では、本発明の組成物及び方法は、p21mRNAに対して活性であるRNAi分子を含み、RNAi分子はp21配列をコードする任意のmRNAに相補的な配列を含む。 
【０１５２】
いくつかの実施形態では、本開示のRNAi分子は、p21RNAに対して活性を有することができ、RNAi分子は、変異体p21をコードする配列を有するRNA、例えば、悪性腫瘍に関連することが当該分野で公知の突然変異p21遺伝子のRNAに相補的な配列を含んでいる。
【０１５３】
さらなる実施形態では、本発明のRNAi分子は、p21遺伝子に相互作用することができ、p21遺伝子発現のサイレンシングを媒介することができるヌクレオチド配列を含むことができる。
【０１５４】
p21の発現を阻害するための核酸分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有することができ、ここで鎖は二本鎖領域を形成する。核酸分子は、当技術分野で知られているような修飾を含む、二本鎖領域内において修飾又は化学修飾された1以上のヌクレオチドを有することができる。siRNAのオーバーハング内の任意のヌクレオチドも修飾又は化学修飾されていてもよい。
【０１５５】
ある実施形態において、修飾又は化学修飾ヌクレオチドは、好ましくは、2'-デオキシヌクレオチドである。さらなる実施形態において、修飾又は化学修飾されたヌクレオチドとしては、2'-O-アルキル置換ヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ置換ヌクレオチド、ホスホロチオエートヌクレオチド、ロックドヌクレオチド又はそれらの任意の組み合わせとすることができる。
【０１５６】
ある実施形態において、アンチセンス鎖が複数の位置においてデオキシヌクレオチドを有する構造が好ましい。この複数の位置としては、以下のうち１つである：アンチセンス鎖の5’末端から位置4、6及び8のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置3、5及び7のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置1、3、5及び7のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置5〜8のそれぞれ。これらの構造のいずれも二本鎖領域において、1つ以上の2'-デオキシ-2'-フルオロ置換ヌクレオチドと組み合わせることができる。
【０１５７】
本発明の核酸分子は、約200pM未満の有利なIC50でp21 mRNAの発現を阻害することができる。さらに、核酸分子は、単回投与にてインビボにおいて少なくとも25％p21 mRNAレベルの発現を阻害することができる。
【０１５８】
本発明においては、薬学的に許容される担体と組み合わせて、本明細書に記載の1つ以上のsiRNAを含有することができる医薬組成物を意図している。当技術分野で公知のものを含む任意の適切な担体、並びに脂質分子、ナノ粒子、又はリポソーム（いずれもsiRNA分子をカプセル化できる）を使用してもよい。
【０１５９】
本発明は、p21発現に関連する疾患を治療する方法を開示し、この方法は、1以上のsiRNAを含有する組成物を必要とする被験者に投与することを含む。治療される疾患には、悪性腫瘍、癌、突然変異KRASを発現する細胞に起因する癌、肉腫及び上皮性悪性腫瘍を含むことができる。
【０１６０】
P21 mRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表7に示す。
【０１６１】
【表７】
0006457704.tif 000010
【０１６２】
表7の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味する。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びデオキシチミジンを意味する。mUは2’-メトキシUである。
【０１６３】
p21 mRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表8に示す。
【０１６４】
【表８】
0006457704.tif 000011
【０１６５】
表8の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味する。小文字a、u、g、c、tはそれぞれ2'-デオキシ-A、2'-デオキシ-U、2'-デオキシ-G、2'-デオキシ-C及びデオキシチミジン(dT=T=t)を意味する。下線は、2'-OMe置換体を意味する、例えばU。Nは、A、C、G、U、U、a、c、g、u、t、又は修飾ヌクレオチド、逆方向（inverted）ヌクレオチド又は化学修飾ヌクレオチドである。
【０１６６】
本発明の実施形態として、上記例示に従って修飾又は化学修飾された、表1〜8のsiRNA分子が包含される。
【０１６７】
ある実施形態において、本発明は、ある範囲の核酸分子を提供し、ここで、a）当該分子は、ポリヌクレオチドセンス鎖及びポリヌクレオチドアンチセンス鎖を有し；b）当該分子の各鎖は15〜30ヌクレオチド長であり；c）アンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域は、p21をコードするmRNAの配列に相補的であり；d）センス鎖の少なくとも一部はアンチセンス鎖の少なくとも一部に相補的であり、当該分子は15〜30ヌクレオチド長の二本鎖領域を有している。
【０１６８】
ある実施形態において、核酸分子は、当該分子の二本鎖領域に位置する、p21をコードするmRNAの配列に相補的なアンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域を有することができる。
【０１６９】
更なる実施形態において、核酸分子は、p21をコードするmRNAの配列に相補的なアンチセンス鎖の15〜30ヌクレオチドの連続領域を有することができる。
【０１７０】
特定の実施形態において、核酸分子の各鎖は、18〜22ヌクレオチド長とすることができる。核酸分子における二本鎖領域は、19ヌクレオチド長とすることができる。
【０１７１】
ある実施形態において、核酸分子は、単一の鎖として連結されたポリヌクレオチドセンス鎖とポリヌクレオチドアンチセンス鎖とを有することができ、ループによって一端部において結合した二本鎖領域を形成することができる。
【０１７２】
本発明の核酸分子は、平滑末端を有することができ、及び1以上の3’オーバーハングを有することができる。
【０１７３】
本発明の核酸分子は、遺伝子サイレンシグに活性なRNAi分子、例えば、遺伝子サイレンシグに活性なdsRNA、siRNA、マイクロRNA又は遺伝子サイレンシグに活性なshRNAとすることができ、同様にDNA指向性RNA（ddRNA）、Piwi相互作用RNA（piRNA）及び反復関連RNA（rasiRNA）とすることができる。
【０１７４】
本発明は、p21の発現を抑制する活性を有する一定の範囲の核酸分子を提供する。ある実施形態において、核酸分子は、p21ノックダウンに対する100pM未満のIC50を有することができる。
【０１７５】
更なる実施形態において、核酸分子は、p21ノックダウンに対する50pM未満のIC50を有することができる。
【０１７６】
本発明は、更に、1以上の本発明の核酸分子、薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物を企図している。特定の実施形態において、当該担体としては、脂質分子又はリポソームとすることができる。
【０１７７】
本発明の化合物及び組成物は、必要とする被験者に化合物又は組成物を投与することによって、p21に関連する疾患を予防又は治療する方法に使用可能である。
【０１７８】
更なる態様において、本発明は、1つ以上の本発明の核酸分子を含む組成物を必要とする被験者に投与することによって、p21発現に関連する疾患を治療するための方法を含む。疾患は、とりわけ、p21発現に関連する癌などの疾患に提示され得る悪性腫瘍とすることができる。
【０１７９】
本発明の方法は、悪性腫瘍を予防又は治療するための本発明の化合物を利用することができる。悪性腫瘍は、種々の疾患、例えば、p21発現に関連する癌、突然変異KRASを発現する細胞に起因する癌、肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、上皮性悪性腫瘍、脳腫瘍、頭頸部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、虫垂癌、結腸直腸癌、直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、胆管癌、肛門癌、腎臓癌、尿道癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、皮膚癌、白血病、悪性リンパ腫、上皮悪性腫瘍および非上皮悪性腫瘍に提示される。
【０１８０】
本発明の実施形態は、遺伝子及び/又はタンパク質の発現をダウンレギュレート又は抑制するのに使用できるRNAi分子を提供することができる。
【０１８１】
本開示のRNAi分子は、単独で又は他のsiRNAと組み合わせて、1以上の遺伝子の発現を調節するために使用できる。
【０１８２】
本開示のRNAi分子は、単独で又は組み合わせて若しくは他の公知の薬剤と併用して、疾患を予防又は治療するため、若しくは状態又は障害の症状を改善するために使用することができる。
【０１８３】
本発明のRNAi分子は、配列特異的な方法によって遺伝子の発現を調節又は抑制するために使用することができる。
【０１８４】
本開示のRNAi分子は、一連の連続したヌクレオチドがヒトmRNAに少なくとも部分的に相補的であるガイド鎖を含むことができる。
【０１８５】
本発明の実施形態は、それを必要とする被験者における疾患又は状態の症状を予防、治療又は改善するための方法を含むことができる。
【０１８６】
ある実施形態において、被験体における悪性腫瘍の症状を予防、治療又は改善するための方法は、被験体に、本発明のRNAi分子を投与して、被験体又は生物における遺伝子の発現を調節することを含むことができる。
【０１８７】
ある実施形態において、本発明は、細胞又は生物を本発明のRNAi分子と接触させることによって、細胞又は生物における遺伝子の発現をダウンレギュレートする方法を企図している。
【０１８８】
Hsp47を標的とするRNAi分子
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞内輸送及び成熟のためのコラーゲン特異的分子シャペロンである熱ショックタンパク質47（Hsp47）の発現を調節するための一連のRNAi分子及び組成物を提供することができる。
【０１８９】
Hsp47のsiRNAのいくつかの例は、米国特許第8,710,209号に記載されており、これは、参照によりその全体がすべての目的のために本明細書に組み込まれる。
【０１９０】
Hsp47又はその相同遺伝子配列は、例えば、GenBankアクセッション番号AB010273（ヒト）、X60676（マウス）又はM69246（ラット、gp46）として開示されている。
【０１９１】
Hsp47を抑制する薬剤は、線維症を阻害するためのもとして開示されている。例えば、米国特許第8,173,170 B2号参照。これは、その全体が参照により全ての目的のために本明細書に組み込まれる。しかし、悪性腫瘍の発症、進行、及び増殖におけるHsp47の阻害効果に関する情報は限られている。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、本発明のsiRNA分子の各鎖は、15〜60ヌクレオチド長、又は15〜40ヌクレオチド長、又は19〜25ヌクレオチド長とすることができる。
【０１９３】
特定の実施形態では、本発明は、Hsp47を標的とするRNAi分子である悪性腫瘍を治療するためのRNAi分子を含有する医薬組成物を提供する。
【０１９４】
Hsp47 mRNAを標的とする本発明のRNAi分子の例を表9に示す。
【０１９５】
【表９】
0006457704.tif 000012
【０１９６】
表9の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味する。小文字のdは「デオキシ」を表す。
【０１９７】
表9において、Hsp47を標的とする任意のRNAi分子のアンチセンス鎖が複数の位置においてデオキシヌクレオチドを代替的に有することが好ましい。この複数の位置としては、以下のうち１つである：アンチセンス鎖の5’末端から位置4、6及び8のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置3、5及び7のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置1、3、5及び7のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置5〜8のそれぞれ。
【０１９８】
Hsp47 mRNAを標的とする、本開示のRNAi分子の更なる例示を表10に示す。
【０１９９】
【表１０】
0006457704.tif 000013
【０２００】
表10の要点：記号：rXはリボヌクレオチドを表し、mXは2'-O-メチルリボヌクレオチドを表し、25rXは2’-5’結合を有するリボヌクレオチドを表し、C3は1,3-プロパンジオールスペーサーを表し、idABは逆位1,2-ジデオキシ-D-リボースを表し、Pは、3’末端のリン酸基を表す。
【０２０１】
表10において、Hsp47を標的とする任意のRNAi分子のアンチセンス鎖が複数の位置においてデオキシヌクレオチドを代替的に有することが好ましい。この複数の位置としては、以下のうち１つである：アンチセンス鎖の5’末端から位置4、6及び8のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置3、5及び7のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置1、3、5及び7のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置5〜8のそれぞれ。
【０２０２】
MCL1を標的とするRNAi分子
ある実施形態において、本発明は、ヒト骨髄細胞白血病１（MCL1）遺伝子、転写変異体２、mRNAの発現を調節する、一定の範囲のRNAi分子及び組成物を提供することができる。
【０２０３】
例えば、MCL1はアクセッション番号NM_182763.2（ヒト）に開示されている。
【０２０４】
MCL1 mRNAを標的とする、本開示のRNAi分子の例示を表11に示す。
【０２０５】
【表１１】
0006457704.tif 000014
【０２０６】
表11の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味する。小文字のdは「デオキシ」を表す。
【０２０７】
表11において、MCL1を標的とする任意のRNAi分子のアンチセンス鎖が複数の位置においてデオキシヌクレオチドを代替的に有することが好ましい。この複数の位置としては、以下のうち１つである：アンチセンス鎖の5’末端から位置4、6及び8のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置3、5及び7のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置1、3、5及び7のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置5〜8のそれぞれ。
【０２０８】
ARAFを標的とするRNAi分子
ある実施形態において、本発明は、A-Raf癌原遺伝子、セリン/スレオニンキナーゼ（ARAF）、転写変異体１、mRNAの発現を調節する、一定の範囲のRNAi分子及び組成物を提供することができる。
【０２０９】
ARAFは、例えば、アクセッション番号NM_001654.4（ヒト）に開示されている。
【０２１０】
ARAF mRNAを標的とする、本開示のRNAi分子の例示を表12に示す。
【０２１１】
【表１２】
0006457704.tif 000015
【０２１２】
表12の要点：大文字のA、G、C及びUはそれぞれリボA、リボG、リボC及びリボUを意味する。小文字のdは「デオキシ」を表す。 
【０２１３】
表12において、ARAFを標的とする任意のRNAi分子のアンチセンス鎖が複数の位置においてデオキシヌクレオチドを代替的に有することが好ましい。この複数の位置としては、以下のうち１つである：アンチセンス鎖の5’末端から位置4、6及び8のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置3、5及び7のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置1、3、5及び7のそれぞれ；アンチセンス鎖の5’末端から位置5〜8のそれぞれ。
【０２１４】
RNA干渉
一般に、siRNAは、約21〜約23ヌクレオチドの長さとすることができ、約19ヌクレオチド長の塩基対二本鎖領域を含むことができる。
【０２１５】
RNAiは、RNA誘発サイレンシング複合体（RISC）として知られているエンドヌクレアーゼ複合体に関与する。siRNAは、RISC複合体に入るアンチセンス又はガイド鎖であって、siRNA二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖RNA標的の切断を媒介するアンチセンス又はガイド鎖を有する。siRNAの他方の鎖はパッセンジャー鎖である。標的RNAの切断は、siRNA二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で起こる（例えば、Elbashirら、Genes＆Development、2001、Vol. 15、188〜200頁参照）。
【０２１６】
本明細書で使用する「センス鎖」という用語は、siRNA分子の対応するアンチセンス鎖の少なくとも一部に部分的又は完全に相補的なsiRNA分子のヌクレオチド配列を指す。siRNA分子のセンス鎖は、標的核酸配列と相同性を有する核酸配列を含むことができる。
【０２１７】
本明細書で使用される「アンチセンス鎖」という用語は、標的核酸配列の少なくとも一部に部分的又は完全に相補的なsiRNA分子のヌクレオチド配列を指す。siRNA分子のアンチセンス鎖は、siRNA分子の対応するセンス鎖の少なくとも一部に相補的な核酸配列を含むことができる。
【０２１８】
RNAi分子は、配列特異的様式でRNA干渉を媒介することによって遺伝子発現をダウンレギュレート又はノックダウンすることができる。例えば、Zamoreら、Cell、2000、Vol. 101、25〜33頁; Elbashirら、Nature、2001、Vol. 411、494〜498頁; Kreutzerら、WO2000/044895; Zernicka-Goetzら、WO2001/36646; Fireら、WO1999/032619; Plaetinckら、WO2000/01846; Melloら、WO2001/029058参照。
【０２１９】
本明細書中で使用される場合、遺伝子発現に関して「阻害する」、「ダウンレギュレートする」又は「縮小する」という用語は、遺伝子の発現又は1つ以上のタンパク質をコードするmRNA分子のレベル、若しくは1つ又は複数のコードされたタンパク質の活性が、本発明のRNAi分子又はsiRNAの非存在下で観察される活性よりも低下することを意味している。例えば、発現のレベル、mRNAのレベル又はコードされたタンパク質活性のレベルが、本発明のRNAi分子又はsiRNAの非存在下で観察される活性よりも、少なくとも1％、又は少なくとも10％、又は少なくとも20％、又は少なくとも50％、又は少なくとも90％、又はそれ以上で低下すれば良い。
【０２２０】
RNAi分子はまた、ウイルス遺伝子発現をノックダウンするために使用することができ、よってウイルス複製に影響を及ぼす。
【０２２１】
RNAi分子は、別個のポリヌクレオチド鎖：センス鎖又はパッセンジャー鎖と、アンチセンス鎖又はガイド鎖とから作製することができる。ガイド鎖とパッセンジャー鎖とは、少なくとも部分的に相補的である。ガイド鎖及びパッセンジャー鎖は、約15〜約49塩基対を有する二本鎖領域を形成することができる。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、siRNAの二重鎖領域は、17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,又は49個の塩基対を含むことができる。
【０２２３】
特定の実施形態において、RNAi分子は、RISC複合体において活性であり、RISCに対して活性な二本鎖領域の長さを有することができる。
【０２２４】
さらなる実施形態において、RNAi分子は、RISC複合体において活性であるRNAi分子に変換されるダイサー基質として活性とすることができる。
【０２２５】
いくつかの態様では、RNAi分子は、長い分子の対向する末端に相補的なガイドとパッセンジャー配列部分とを有することができ、その結果、分子は相補配列部分において二本鎖領域を形成することができ、各鎖はヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカーのいずれかによって当該二本鎖領域の一端で結合する。例えば、ヘアピン配列ステム及びループ配列である。各鎖とリンカー相互作用は、共有結合又は非共有相互作用とすることができる。
【０２２６】
本開示のRNAi分子は、核酸のセンス領域を核酸のアンチセンス領域に結合するヌクレオチド、非ヌクレオチド又はヌクレオチド/非ヌクレオチド混合リンカーを含んでいてもよい。ヌクレオチドリンカーは、長さが2ヌクレオチド以上、例えば約3, 4, 5, 6, 7, 8, 9又は10ヌクレオチドのリンカーとすることができる。ヌクレオチドリンカーは、核酸アプタマーとしても良い。本明細書で使用する「アプタマー」又は「核酸アプタマー」は、標的分子に特異的に結合する核酸分子を意味し、ここで核酸分子はその天然の状況において標的分子によって認識される配列を含む配列を有する。あるいは、アプタマーは、標的分子に結合する核酸分子であってもよく、ここで標的分子は核酸に天然に結合しなくてよい。例えば、アプタマーは、タンパク質のリガンド結合ドメインに結合し、それにより天然に存在するリガンドとタンパク質との相互作用を防止するために使用することができる。例えば、Goldら、Annu Rev Biochem、1995、Vol. 64、763-797頁; Brodyら、J.Biotechnol., 2000、Vol. 74、5〜13頁; Hermannら、Science、2000、Vol. 287、pp. 820-825参照。
【０２２７】
非ヌクレオチドリンカーの例は、無塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素又は他の高分子化合物、例えば2〜100個のエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコールなどの高分子化合物を挙げることができる。いくつかの例は、Seelaら、Nucleic Acids Research、1987、Vol. 15、3113〜3129頁; Cloadら、J. Am. Chem. Soc., 1991、Vol. 113、6324-6326頁; Jaeschkeら、Tetrahedron Lett.,1993、Vol. 34、301頁; Arnoldら、WO1989/002439; Usmanら、WO1995/006731; Dudyczら、WO1995/011910; 及びFerentzら、J. Am. Chem. Soc., 1991、Vol. 113、pp. 4000-4002に記載されている。
【０２２８】
RNAi分子は、二重鎖領域から1つ以上のオーバーハングを有することができる。オーバーハングは、塩基対形成されていない一本鎖領域であり、長さが1〜8ヌクレオチド又はそれ以上としても良い。オーバーハングは、鎖の3'末端が1〜8ヌクレオチドの一本鎖領域を有する3'末端オーバーハングとしても良い。オーバーハングは、鎖の5'末端が1〜8ヌクレオチドの一本鎖領域を有する5'末端オーバーハングとしても良い。 
【０２２９】
RNAi分子のオーバーハングは、同じ長さを有していても良いし、異なる長さとしても良い。  
【０２３０】
RNAi分子は、二本鎖領域がオーバーハングなしで終わり、鎖が二本鎖領域の末端と塩基対合する、一つ以上の平滑末端を有するものとすることができる。 
【０２３１】
本開示のRNAi分子は、1つ以上の平滑末端を有することができ、又は1つ以上のオーバーハングを有することができ、若しくは平滑末端とオーバーハングとの組み合わせを有することができる。
【０２３２】
RNAi分子の鎖の5'末端は、平滑末端にあってもよく、オーバーハングにあってもよい。RNAi分子の鎖の3'末端は、平滑末端にあってもよく、オーバーハングにあってもよい。 
【０２３３】
RNAi分子の鎖の5'末端は平滑末端にあり、3'末端はオーバーハングにあってもよい。RNAi分子鎖の3'末端は平滑末端にあり、5'末端はオーバーハングにあってもよい。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、RNAi分子の両端は平滑末端である。
【０２３５】
さらなる実施形態において、RNAi分子の両端はオーバーハングを有する。
【０２３６】
5'-及び3'-末端のオーバーハングは、異なる長さであってもよい。
【０２３７】
特定の実施形態では、RNAi分子は、アンチセンス鎖の5'末端及びセンス鎖の3'末端がオーバーハングヌクレオチドを有さない平滑末端を有するものでもよい。
【０２３８】
さらなる実施形態では、RNAi分子は、アンチセンス鎖の3'末端及びセンス鎖の5'末端がオーバーハングヌクレオチドを有さない平滑末端を有するものでもよい。
【０２３９】
RNAi分子は、二本鎖領域における塩基対合においてミスマッチを有していてもよい。
【０２４０】
RNAi分子のオーバーハングにおける任意のヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドとすることができる。
【０２４１】
1つ以上のデオキシリボヌクレオチドは5'末端に存在してもよい、ここでRNAi分子の他方の鎖の3'末端がオーバーハングを有さなくてもよいし、デオキシリボヌクレオチドオーバーハングを有さなくてもよい。
【０２４２】
1つ以上のデオキシリボヌクレオチドは3'末端に存在してもよい、ここでRNAi分子の他の鎖の5'末端がオーバーハングを有さなくてもよく、デオキシリボヌクレオチドオーバーハングを有さなくてもよい。
【０２４３】
いくつかの実施形態において、RNAi分子のオーバーハングヌクレオチドの1つ以上又は全てを2'-デオキシリボヌクレオチドとしてもよい。
【０２４４】
ダイサー基質RNAi分子
いくつかの態様において、RNAi分子は、RISC活性RNAi分子を生成するようにプロセシングされるダイサー基質として適した長さにすることができる。例えば、Rossiら、US2005/0244858参照。
【０２４５】
ダイサー基質dsRNAは、活性RNAi分子を生成するためにダイサーによって処理されるのに十分な長さとすることができ、さらに以下の特性の1つ以上を含んでいてもよい：（i）ダイサー基質dsRNAは、例えば、アンチセンス鎖上に3'オーバーハングを有するような非対称とすることができ、（ii）ダイサー基質dsRNAはダイサー結合の配向を指示し、dsRNAを処理して活性なRNAi分子とするためにセンス鎖上に改変された3'末端を有していてもよい。
【０２４６】
特定の実施形態では、ダイサー基質dsRNA中の最も長い鎖を24〜30ヌクレオチドの長さとすることができる。
【０２４７】
ダイサー基質dsRNAは、対称又は非対称とすることができる。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、ダイサー基質dsRNAは、22〜28ヌクレオチドのセンス鎖及び24〜30ヌクレオチドのアンチセンス鎖を有することができる。
【０２４９】
特定の実施形態では、ダイサー基質dsRNAは、アンチセンス鎖の3’末端にオーバーハングを有していてもよい。
【０２５０】
さらなる実施形態では、ダイサー基質dsRNAは、長さが25ヌクレオチドのセンス鎖及び2塩基の3’-オーバーハングを含む長さが27ヌクレオチドのアンチセンス鎖を有することができる。オーバーハングは、1、2又は3ヌクレオチドの長さとすることができる。センス鎖はまた5’リン酸を有していてもよい。
【０２５１】
非対称ダイサー基質dsRNAは、2つのリボヌクレオチドの代わりにセンス鎖の3’末端に2つのデオキシリボヌクレオチドを有することができる。
【０２５２】
ダイサー基質dsRNAのセンス鎖は、約22〜約30、又は約22〜約28、又は約24〜約30、又は約25〜約30、又は約26〜約30、又は約26及び29、又は約27〜約28ヌクレオチドの長さとすることができる。
【０２５３】
ダイサー基質dsRNAのセンス鎖は、22、23、24、25、26、27、28、29又は30ヌクレオチドの長さとすることができる。
【０２５４】
特定の実施形態では、ダイサー基質dsRNAは、長さが少なくとも約25ヌクレオチドであり、長さが約30ヌクレオチドを超えないセンス及びアンチセンス鎖を有していてもよい。
【０２５５】
特定の実施形態では、ダイサー基質dsRNAは、26〜29ヌクレオチドの長さのセンス及びアンチセンス鎖を有していてもよい。
【０２５６】
特定の実施形態では、ダイサー基質dsRNAは、長さが27ヌクレオチドであるセンス鎖及びアンチセンス鎖を有していてもよい。
【０２５７】
ダイサー基質dsRNAのセンス及びアンチセンス鎖は、平滑末端であって同じ長さとすることができ、又はオーバーハングを有するように異なる長さであってもよく、又は平滑末端と突出とを有していてもよい。
【０２５８】
ダイサー基質dsRNAは、長さが19、20、21、22、23、24、25、26又は27ヌクレオチドの二本鎖領域を有していてもよい。
【０２５９】
ダイサー基質dsRNAのアンチセンス鎖は、真核細胞の細胞質内などの生物学的条件下でセンス鎖の配列の少なくとも一部にアニールする任意の配列を有することができる。
【０２６０】
センス鎖及びアンチセンス鎖を有するダイサー基質は、リンカー基又はリンカーオリゴヌクレオチドのような第3の構造によって連結することができる。リンカーは、例えばdsRNAの2つの鎖を連結し、アニーリングの際にヘアピンを形成することができる。
【０２６１】
ダイサー基質のセンス及びアンチセンス鎖は一般に相補的であるが、塩基対形成においてミスマッチを有していてもよい。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、ダイサー基質dsRNAは、センス鎖が22〜28ヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖が24〜30ヌクレオチドを有するように非対称であってもよい。
【０２６３】
ダイサー基質dsRNAの鎖の1つ、特にアンチセンス鎖の領域は、少なくとも19ヌクレオチドの配列長を有してもよく、これらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の3’末端に隣接している21塩基領域内であり、標的遺伝子から産生されたRNAのヌクレオチド配列と十分に相補的となる。
【０２６４】
ダイサー基質dsRNAのアンチセンス鎖は、22〜28ヌクレオチドの長さとなるように、5’末端に1〜9個のリボヌクレオチドを有することができる。アンチセンス鎖の長さが21ヌクレオチドである場合、1〜7個のリボヌクレオチド、又は2〜5個のリボヌクレオチド、又は4個のリボヌクレオチドを3’末端に付加することができる。付加されるリボヌクレオチドは、任意の配列とすることができる。
【０２６５】
ダイサー基質dsRNAのセンス鎖は、24〜30ヌクレオチドを有していてもよい。センス鎖は、アンチセンス鎖と実質的に相補的であってもよく、生物学的条件下でアンチセンス鎖にアニールする。
【０２６６】
RNAi分子の使用方法
本発明の核酸分子及びRNAi分子は、分子の直接的な適用によって、又は担体若しくは希釈剤と組み合わせた分子を用いて、細胞又は組織に送達することができる。
【０２６７】
本発明の核酸分子及びRNAi分子は、担体又は希釈剤若しくは、ウイルス配列、ウイルス物質又は脂質若しくはリポソーム製剤などの細胞への侵入を補助又は促進するように機能する他の送達ビヒクルを用いた分子の直接的な適用によって、細胞、組織、器官又は被験体に送達又は投与することができる。
【０２６８】
本発明の核酸分子及びRNAi分子は、カチオン性脂質と複合体を形成するか、リポソーム内にパッケージするか、或いは標的細胞又は組織に送達することができる。核酸又は核酸複合体は、直接皮膚適用、経皮適用又は注射によって生体外又は生体内の関連する組織に局所投与することができる。
【０２６９】
送達系は、例えば、水性及び非水性ゲル、クリーム、エマルジョン、マイクロエマルジョン、リポソーム、軟膏、水性及び非水性溶液、ローション、エアロゾル、炭化水素ベース及び粉末を含んでいても良く、そして可溶化剤及び浸透増強剤等の添加物を含んでいても良い。
【０２７０】
本開示の組成物及び方法は、核酸分子の発現を可能にするように、少なくとも1つの本発明のRNAi分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含むことができる。
【０２７１】
本発明の核酸分子及びRNAi分子は、DNA又はRNAベクターに挿入された転写単位から発現させることができる。組換えベクターは、DNAプラスミド又はウイルスベクターとすることができる。核酸分子の一過性発現を提供するウイルスベクターを使用することができる。
【０２７２】
例えば、ベクターは、二重鎖のRNAi分子の両方の鎖をコードする配列、又は自己相補的であってRNAi分子を形成する単一の核酸分子を含んでいても良い。発現ベクターは、2つ以上の核酸分子をコードする核酸配列を含んでいても良い。
【０２７３】
核酸分子は、真核生物のプロモーターから細胞内で発現することができる。当業者は、任意の核酸が、適切なDNA/RNAベクターから真核細胞において発現できることを理解している。
【０２７４】
いくつかの態様では、発現コンストラクトを細胞に導入するためにウイルスコンストラクトを使用することができ、これは当該発現コンストラクトによりコードされるdsRNA構築物の転写のためである。
【０２７５】
脂質製剤は、静脈内、筋肉内又は腹腔内注射によって、若しくは経口的に又は吸入によって、若しくは当該分野で公知の他の方法によって動物に投与することができる。
【０２７６】
オリゴヌクレオチドを投与するための薬学的に許容される製剤は公知であり、使用することができる。
【０２７７】
疾患治療方法
疾患としては、例えば、癌、肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫及び上皮性悪性腫瘍を挙げることができる。
【０２７８】
ある態様において、本発明の方法は、任意の臓器又は組織における悪性腫瘍及び癌を予防又は治療するため、本発明の化合物を利用することができる。悪性腫瘍及び癌としては、例えば、脳腫瘍、頭頸部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、結腸直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、胆管癌、腎臓癌、尿道癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、皮膚癌、白血病、悪性リンパ腫、上皮悪性腫瘍及び非上皮性悪性腫瘍を挙げることができる。
【０２７９】
インビトロノックダウンのためのプロトコル例
トランスフェクションの1日前に、10％FBSを含む100μlのDMEM（HyCloneカタログ番号SH30243.01）を96ウェルプレートに2×103細胞/ウェルでプレートし、5％CO2の空気中で加湿雰囲気を含む37℃インキュベーターで培養する。トランスフェクションの前に、培地を、2％FBSを含む90μlのOpti-MEM I還元血清培地（Life Technologiesカタログ番号31985-070）に変更する。0.2μlのLipofectamine RNAiMax（Life Technologies Cat。＃13778-100）を4.8μlのOpti-MEM Iと室温で5分間混合する。1μlのsiRNAと4μlのOpti-MEM Iを混合し、LF2000溶液と混合し、ボルテックスせずに静かに混合する。室温で5分間待ち、混合物を室温で10分間インキュベートし、RNA-RNAiMax複合体を形成させる。さらに、10μlのRNA-RNAiMax複合体をウェルに添加し、プレートを手で静かに振盪する。細胞を5％CO2の空気中で加湿雰囲気を含む37℃のインキュベーター中で2時間インキュベートする。2％FBSを含む培地を新鮮な-MEM I Reduced Serum Medium（Life Technologiesカタログ番号31985-070）に交換する。トランスフェクションの24時間後、細胞を氷冷PBSで1回洗浄する。室温で5〜30分間、50μlのCell-to-Ct溶解緩衝液（Life Technologiesカタログ番号4391851C）で細胞を溶解する。停止液5μlを加え、室温で2分間インキュベートする。直ちにTAQMANを用いてRT-qPCRによりmRNAレベルを測定する。あるいは、サンプルを-80℃で凍結させ、後でアッセイすることもできる。
【０２８０】
血清安定性のためのプロトコル例
0.2mg/mlのsiRNAを37℃で10％ヒト血清とともにインキュベートした。特定の時点（0、5、15及び30分）で、200μlの試料を等分し、抽出溶媒（クロロホルム：フェノール：イソアミルアルコール=24：25：1）200μlで抽出した。サンプルをボルテックスし、室温で10分間、13,000rpmで遠心分離し、次いで、上層溶液を移し、0.45μmのフィルターで濾過した。濾液を300μlのHPLC注入バイアルに移した。LCMSの場合、移動相はMPA：H2O中100mM HFIP＋7mM TEA、MPB：50％メタノール＋50％アセトニトリルとした。カラム：Waters Acquity OST 2.1×50mm、1.7μmを使用した。
【実施例】
【０２８１】
実施例１：GST-πを標的とする本発明のsiRNAは、インビトロで遺伝子サイレンシングに活性であることが見出された。遺伝子ノックダウンのためのGST-πsiRNAの用量依存的活性は、約250ピコモル（pM）未満のIC50、及び1pM程度の低いIC50を示すことが判明した。
【０２８２】
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で行い、siRNAノックダウン効率を決定した。表13に示すように、GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンが、表1のsiRNAで観察された。
【０２８３】
【表１３】
0006457704.tif 000016
【０２８４】
表13に示すように、表1のGST-πsiRNAの活性は、17〜235pMの範囲であり、インビボで使用される薬物剤を含む多くの用途に適している。
【０２８５】
実施例２：siRNAのアンチセンス鎖のシード領域に位置するデオキシヌクレオチドを有する本発明のGST-πsiRNAの構造は、インビトロにおける遺伝子ノックダウン活性を予想外に且つ有利に増加させることが示された。
【０２８６】
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で行い、構造BU2’（配列番号131及び157）に基づくGST-πsiRNAのノックダウン効率を決定した。表14に示すように、構造BU2’に基づくGST-πsiRNAを用いて、GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンが観察された。
【０２８７】
【表１４】
0006457704.tif 000017
【０２８８】
表14に示すように、アンチセンス鎖のシード領域に3つのデオキシヌクレオチドを有する構造BU2’に基づくGST-πsiRNAの活性は、二重鎖領域のデオキシヌクレオチドを有しないGST-πsiRNAと比較して、驚くべきことに予想外に6倍まで増加した。
【０２８９】
これらのデータは、アンチセンス鎖のシード領域の位置3、5及び7、又は位置4、6及び8に3つのデオキシヌクレオチドを有する構造を有するGST-πsiRNAが、二重鎖領域のデオキシヌクレオチドを有しないGST-πsiRNAと比較して驚くほど高い遺伝子ノックダウン活性を有することを示している。
【０２９０】
アンチセンス鎖のシード領域に3つのデオキシヌクレオチドを有するGST-πsiRNAについて表14に示される活性は、5〜8pMの範囲であり、インビボで使用される薬物剤を含む多くの用途に非常に適していた。
【０２９１】
実施例３：siRNAのアンチセンス鎖のシード領域に位置するデオキシヌクレオチドを有する本発明のGST-πsiRNAの構造は、インビトロで遺伝子ノックダウン活性を予想外に且つ有利に増加させることが示された。
【０２９２】
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で行い、構造A9’（配列番号183及び195）に基づくGST-πsiRNAのノックダウン効率を決定した。表15に示すように、GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンが、構造A9’に基づくGST-πsiRNAで観察された。
【０２９３】
【表１５】
0006457704.tif 000018
【０２９４】
表15に示すように、アンチセンス鎖のシード領域に3〜6個のデオキシヌクレオチドを有する構造A9’に基づくGST-πsiRNAの活性は、驚くべきことに、二重鎖領域にデオキシリボヌクレオチドを有しないGST-πsiRNAと比較して24倍まで増加した。
【０２９５】
これらのデータは、アンチセンス鎖のシード領域における位置4、6及び8、又は位置1、3、5及び7、又は位置3〜8、又は位置5〜8位、又は位置3、5及び7に3〜6個のデオキシヌクレオチドを有する構造を有するGST-πsiRNAが、二重鎖領域にデオキシヌクレオチドを有しないGST-πsiRNAと比較して予想外に高い遺伝子ノックダウン活性を有することを示している。
【０２９６】
アンチセンス鎖のシード領域に3〜6個のデオキシヌクレオチドを有するGST-πsiRNAについて表15に示す活性は、1〜15pMの範囲であり、これは、インビボで使用される薬物剤を含む多くの用途に非常に適していた。
【０２９７】
実施例４：siRNAのアンチセンス鎖のシード領域に位置するデオキシヌクレオチドを有するGST-πsiRNAの構造は、インビトロにおける遺伝子ノックダウン活性を予想外に且つ有利に増加させることが示された。
【０２９８】
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で行い、構造B13’（配列番号207及び222）に基づくGST-πsiRNAのノックダウン効率を決定した。表16に示すように、GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンが、構造B13’に基づくGST-πsiRNAで観察された。
【０２９９】
【表１６】
0006457704.tif 000019
【０３００】
表16に示すように、アンチセンス鎖のシード領域に3つのデオキシヌクレオチドを有する構造B13’に基づくGST-πsiRNAの活性は、二重鎖領域のデオキシヌクレオチドを有しないGST-πsiRNAと比較して予想外に増加した。
【０３０１】
これらのデータは、アンチセンス鎖のシード領域の位置4、6及び8に3つのデオキシヌクレオチドを有する構造を有するGST-πsiRNAが、二重鎖領域にデオキシヌクレオチドを含まないGST-πsiRNAと比較して予想外に高い遺伝子ノックダウン活性を有することを示している。
【０３０２】
アンチセンス鎖のシード領域に3つのデオキシヌクレオチドを有するGST-πsiRNAについて表16に示す活性は、11pMのピコモルの範囲であり、インビボで使用される薬物剤を含む多くの用途に非常に適していた。
【０３０３】
実施例５：siRNAのアンチセンス鎖のシード領域に位置するデオキシヌクレオチドを有するGST-πsiRNAの構造は、インビトロで遺伝子ノックダウン活性を予想外に且つ有利に増加させた。
【０３０４】
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で行い、構造B4’（配列番号261及び273）に基づくGST-πsiRNAのノックダウン効率を決定した。表17に示すように、GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンが構造B4’に基づくGST-πsiRNAで観察された。
【０３０５】
【表１７】
0006457704.tif 000020
【０３０６】
表17に示すように、アンチセンス鎖のシード領域に6個のデオキシヌクレオチドを有する構造B4’に基づくGST-πsiRNAの活性は、二重鎖領域にデオキシヌクレオチドを有しないGST-πsiRNAと比較して予想外に2倍以上増加した。
【０３０７】
これらのデータは、アンチセンス鎖のシード領域内の位置3〜8に位置する6個のデオキシヌクレオチドを有する構造を有するGST-πsiRNAが、二重鎖領域にデオキシヌクレオチドを有しないGST-πsiRNAと比較して驚くほど高い遺伝子ノックダウン活性を有することを示している。
【０３０８】
アンチセンス鎖のシード領域に6個のデオキシヌクレオチドを有するGST-πsiRNAの表17に示す活性は、113pMのピコモルの範囲であり、インビボで使用される薬物剤を含む多くの用途に非常に適していた。
【０３０９】
実施例６：siRNAのアンチセンス鎖のシード領域に位置するデオキシヌクレオチドを有するGST-πsiRNAの構造は、インビトロで遺伝子ノックダウン活性を予想外に且つ有利に増加させた。
【０３１０】
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で行い、構造B2’（配列番号237及び249）に基づくGST-πsiRNAのノックダウン効率を決定した。表18に示すように、構造B2’に基づくGST-πsiRNAを用いて、GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンが観察された。
【０３１１】
【表１８】
0006457704.tif 000021
【０３１２】
表18に示すように、アンチセンス鎖のシード領域内に3〜4個のデオキシヌクレオチドを有する構造B2’に基づくGST-πsiRNAの活性は、二重鎖領域にデオキシリボヌクレオチドを有しないGST-πsiRNAと比較して驚くべきことに4倍まで増加した。
【０３１３】
これらのデータは、アンチセンス鎖のシード領域の位置5〜8、又は位置1、3、5及び7、又は位置3、5及び7に位置する3〜4個のデオキシヌクレオチドを有する構造を有するGST-πsiRNAが、二重鎖領域にデオキシヌクレオチドを含まないGST-πsiRNAと比較して予想外に高い遺伝子ノックダウン活性を有することを示している。
【０３１４】
アンチセンス鎖のシード領域に3〜4個のデオキシヌクレオチドを有するGST-πsiRNAについて表18に示す活性は、30〜100pMの範囲であり、これは、インビボで使用される薬物剤を含む多くの用途に非常に適している。
【０３１５】
実施例７：1つ以上の2'-デオキシ-2'-フルオロ置換ヌクレオチドを含むGST-πsiRNAの構造は、インビトロで予想外に増加した遺伝子ノックダウン活性を示した。
【０３１６】
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で行い、構造BU2’（配列番号131及び157）に基づくGST-πsiRNAのノックダウン効率を決定した。表19に示すように、構造BU2’に基づくGST-πsiRNAを用いて、GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンが観察された。
【０３１７】
【表１９】
0006457704.tif 000022
【０３１８】
表19に示すように、1つ以上の2'-Fデオキシヌクレオチドを有する構造BU2’に基づくGST-πsiRNAの活性は、2'-Fデオキシヌクレオチドを有しないGST-πsiRNAと比較して、驚くべきことに10倍まで増加した。
【０３１９】
これらのデータは、1つ以上の2'-Fデオキシヌクレオチドを有する構造を有するGST-πsiRNAが、2'-Fデオキシヌクレオチドを有しないGST-πsiRNAと比較して予想外に高い遺伝子ノックダウン活性を有することを示している。
【０３２０】
1つ以上の2'-Fデオキシヌクレオチドを有するGST-πsiRNAについて表19に示す活性は、3〜13pMの範囲であり、インビボで使用される薬物剤を含む多くの用途に非常に適していた。
【０３２１】
実施例８：1つ以上の2'-デオキシ-2'-フルオロ置換ヌクレオチドを含むGST-πsiRNAの構造は、インビトロで意外にも増加した遺伝子ノックダウン活性を示した。
【０３２２】
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で行い、構造B13’（配列番号207及び222）に基づくGST-πsiRNAのノックダウン効率を決定した。表20に示すように、GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンが構造B13'に基づくGST-πsiRNAで観察された。
【０３２３】
【表２０】
0006457704.tif 000023
【０３２４】
表20に示すように、非オーバーハング位置に3つの2'-Fデオキシヌクレオチドを有する構造B13’に基づくGST-πsiRNAの活性は、驚くべきことに、2'-Fデオキシヌクレオチドを有しないGST-πsiRNAと比較して約3倍増加した。
【０３２５】
これらのデータは、1つ以上の2'-Fデオキシヌクレオチドを有する構造を有するGST-πsiRNAが、2'-Fデオキシヌクレオチドを有しないGST-πsiRNAと比較して予想外に高い遺伝子ノックダウン活性を有することを示している。
【０３２６】
1つ以上の2'-Fデオキシヌクレオチドを有するGST-πsiRNAについて表20に示される活性は、6pMのピコモルの範囲であり、インビボで使用される薬物剤を含む多くの用途に非常に適していた。
【０３２７】
実施例９：同所性A549肺癌マウスモデル。本発明のGST-πsiRNAは、インビボで同所性肺癌腫瘍の顕著な減少を示すことができる。この実施例において、GST-πsiRNAは、無胸腺ヌードマウスの同所性肺癌腫瘍にリポソーム製剤で投与された場合、in vivoで遺伝子ノックダウン効力をもたらした。
【０３２８】
一般に、同所性腫瘍モデルは、薬効及び効力、ならびに改善された予測能力に関して直接の臨床的関連性を示すことができる。同所性腫瘍モデルにおいて、腫瘍細胞は、細胞が由来する同種の器官に直接移植される。
【０３２９】
ヒト肺癌A549に対するsiRNA製剤の抗腫瘍有効性を、処置群及びビヒクル対照群の剖検時に測定した最終原発腫瘍重量を比較することによって評価した。
【０３３０】
図1は、構造BU2（配列番号61及び126）に基づくGST-πsiRNAのインビボでの同所性肺癌腫瘍阻害を示している。同所性A549肺癌マウスモデルを、GST-πを標的とするsiRNAの2mg/kgで比較的低用量で使用した。
【０３３１】
GST-πsiRNAは、この6週間の研究において有意で予想外に有利な肺腫瘍阻害効力を示した。図1に示すように、43日後、GST-πsiRNAは著しく有利な腫瘍阻害効力を示し、最終腫瘍平均重量は対照と比較して2.8倍有意に減少した。
【０３３２】
この研究のために、5〜6週齢の雄NCr nu/nuマウスを使用した。実験期間中、実験動物をHEPA濾過環境に維持した。使用前にsiRNA製剤を4℃で保存し、マウスに注射する10分前に室温に温めた。
【０３３３】
外科的同所移植（SOI）の日に、このA549ヒト肺癌同所性モデルについて、ストック腫瘍を、A549腫瘍異種移植片を有する動物の皮下部位から採取し、RPMI-1640培地に入れた。壊死組織を除去し、生存組織を1.5〜2mm3に切断した。動物をイソフルラン吸入で麻酔し、手術領域をヨウ素及びアルコールで滅菌した。約1.5cmの横断切開を、マウスの左胸壁に、一対の外科用ハサミを用いて行った。3番目と4番目の肋間に肋間切開を行い、左肺を露出させた。1つのA549腫瘍断片を8-0の外科的縫合糸（ナイロン）で肺の表面に移植した。胸壁は6-0の外科用縫合糸（シルク）で閉じられた。肺は、胸腔内の残りの空気を引き出すために、25G×1 1/2針の3ccシリンジを使用して胸腔内穿刺により再膨張させた。胸壁は6-0の外科用絹縫合糸で閉じられた。上記操作の全ての手順は、HEPA濾過層流フードの下で7倍の倍率顕微鏡を用いて行った。
【０３３４】
腫瘍移植の3日後、モデル担癌マウスを、群当たり10匹のマウスの群に無作為に分けた。目的の群については、腫瘍移植の3日後に10匹のマウスの治療を開始した。
【０３３５】
目的の群について、処方物は、（イオン化可能な脂質：コレステロール：DOPE：DOPC：DPPE-PEG-2K：DSPE-PEG-2K）のリポソーム組成物とした。リポソームはGST-πsiRNAをカプセル化した。
【０３３６】
試験エンドポイントについては、処置開始後42日で実験マウスを屠殺した。原発腫瘍を切除し、その後の分析のために電子天秤で秤量した。
【０３３７】
化合物の毒性の評価について、処置群及び対照群におけるマウスの平均体重は、実験期間全体にわたって正常範囲内に維持された。毒性の他の症状はマウスにおいて観察されなかった。
【０３３８】
実施例１０：本発明のGST-πsiRNAは、インビボで癌異種移植片腫瘍の顕著な減少を示した。GST-πsiRNAは、リポソーム製剤で癌異種移植片腫瘍に投与された場合、インビボで遺伝子ノックダウン効力をもたらした。
【０３３９】
図2は、GST-πsiRNA（配列番号156及び182）の腫瘍阻害効力を示す。癌異種移植モデルを、GST-πを標的とするsiRNAの0.75mg/kgで比較的低用量で使用した。
【０３４０】
GST-πsiRNAは、投与後数日以内に有意で予想外に有利な腫瘍阻害効力を示した。36日後、GST-πsiRNAは著しく有利な腫瘍阻害効力を示し、腫瘍体積は対照と比較して2倍減少した。
【０３４１】
図3に示すように、GST-πsiRNAは、最終日に有意で予想外に有利な腫瘍阻害効力を示した。特に、腫瘍重量は2倍以上減少した。
【０３４２】
組成物（イオン化可能な脂質：コレステロール：DOPE：DOPC：DPPE-PEG-2K）（25：30：20：20：5）を有するリポソーム製剤としてGST-πsiRNAを2回の注射（1日目及び15日目）で投与した。
【０３４３】
癌異種移植モデルのため、A549細胞株をATCCから得た。10％ウシ胎仔血清及び100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンを補充した培養培地中で細胞を維持した。接種の48時間前に細胞を分割して、回収時に対数増殖期になるようにした。細胞をトリプシン-EDTAで軽くトリプシン処理し、組織培養から回収した。生存細胞の数を計数し、トリパンブルーの存在下で血球計算盤で測定した（生存細胞のみを数える）。細胞を、血清を含まない培地中で5×107/mlの濃度に再懸濁した。次いで、細胞懸濁液を、氷解凍したBDマトリゲルと1：1の比率でよく混合して注射に使用した。
【０３４４】
マウスは、チャールズ・リバー・ラボラトリーの胸腺ヌードマウス（nu/nu）雌マウス、免疫不全、6〜8週齢、1群当たり7〜8匹のマウスとした。
【０３４５】
腫瘍モデル調製のために、マウス1匹につき1接種量の25G針及びシリンジを用いて、2.5×106個のA549細胞の接種物0.1mlを右脇腹に皮下接種した。マウスは接種のために麻酔をかけられなかった。
【０３４６】
腫瘍体積の測定及び無作為化のために、腫瘍サイズを最も近い0.1mmまで測定した。腫瘍体積は、式：腫瘍体積=長さ×幅2/2を用いて計算した。確立された腫瘍が約120〜175mm3に達すると、平均腫瘍体積は約150mm3であり、処置群の平均腫瘍体積がビヒクル対照群の平均腫瘍体積の10％以内になるように、マウスを様々なビヒクル対照及び処置群に割り当てた。理想的には、腫瘍体積のCV％を25％未満とした。同じ日に、試験品及び対照ビヒクルを投薬レジメンに従って投与した。腫瘍体積を第1週に3回、研究終了の日を含む残りの週に2回モニターした。
【０３４７】
投薬投与のために、投与日に、試験品を-80℃の冷凍庫から取り出し、氷上で解凍した。注射器にアプライする前に、処方剤を含むボトルを手で数回反転した。全ての試験品は、IVにより0.75mg/kg、q2wX2、10ml/kgで投与した。
【０３４８】
体重については、マウスを最も近い0.1gまで秤量した。体重をモニターし、初回投与の7日以内に毎日記録した。研究の終了日を含む残りの数週間、体重を数週間監視し、週に２回記録した。
【０３４９】
最初の投薬の28日後に腫瘍を採取するために、腫瘍体積を測定し、重量測定のために腫瘍を切開し、PDバイオマーカー研究のために保存した。腫瘍重量を記録した。
【０３５０】
実施例１１：本発明のGST-πsiRNAは、in vitroで癌細胞のアポトーシスにより癌細胞死の増加を示した。GST-πsiRNAはGST-πノックダウンをもたらし、アポトーシスのバイオマーカーであるPUMAのアップレギュレーションをもたらし、細胞生存率の低下を伴った。
【０３５１】
シード領域におけるデオキシヌクレオチド、2'-F置換デオキシヌクレオチド及び2'-OMe置換リボヌクレオチドの組合せを含むGST-πsiRNA配列番号156及び182は、予期せず癌細胞のアポトーシスを増加させた。
【０３５２】
GST-πsiRNA配列番号156及び182に対するPUMAの発現レベルを図4に示した。図4に示すように、PUMAの発現は、GST-πsiRNAのトランスフェクションの2〜4日後に大きく増加した。
【０３５３】
これらのデータは、シード領域におけるデオキシヌクレオチド、2'-F置換デオキシヌクレオチド及び2'-OMe置換リボヌクレオチドの組み合わせを含むGST-πsiRNAの構造が、予想外に癌細胞のアポトーシスを増加させることを示している。
【０３５４】
PUMAバイオマーカーに関するプロトコルは以下の通りとした。トランスフェクションの1日前に、10％FBSを含む100μlのDMEM（HyCloneカタログ番号SH30243.01）を96ウェルプレートに2×103細胞/ウェルで播種し、5％CO2の空気中で加湿雰囲気を含む37℃インキュベーターで培養した。翌日、トランスフェクションの前に、培地を、2％FBSを含む90μlのOpti-MEM I還元血清培地（Life Technologiesカタログ番号31985-070）と交換した。次いで、0.2μlのLipofectamine RNAiMAX（Life Technologiesカタログ番号13778-100）を4.8μlのOpti-MEM Iと室温で5分間混合した。1μlのsiRNA（ストック濃度1μM）を4μlのOpti-MEM Iと混合し、RNAiMAX溶液と混合し、次いで穏やかに混合した。混合物を室温で10分間インキュベートし、RNA-RNAiMAX複合体を形成させた。10μlのRNA-RNAiMAX複合体をウェル当たりに添加し、siRNAの最終濃度を10nMとした。細胞を2時間インキュベートし、培地を2％FBSを含む新鮮なOpti-MEM I還元血清培地に交換した。トランスフェクションの1、2、3、4及び6日後、細胞を氷冷PBSで1回洗浄し、次いで50μlのCell-to-Ct溶解緩衝液（Life Technologiesカタログ番号4391851C）を用いて室温で約5〜30分溶解した。5μlの停止溶液を添加し、室温で2分間インキュベートした。PUMA（BBC3、Cat＃Hs00248075、Life Technologies）のmRNAレベルをTAQMANを用いてqPCRにより測定した。
【０３５５】
実施例１２：本発明のGST-πsiRNAは、インビボで癌異種移植片腫瘍の顕著な減少を示すことができた。GST-πsiRNAは、リポソーム製剤で癌異種移植腫瘍に投与された場合、インビボで遺伝子ノックダウン効力を提供することができる。
【０３５６】
図5は、GST-πsiRNA（配列番号61及び126）の腫瘍阻害効力を示している。GST-πmRNAの用量依存的ノックダウンは、GST-πを標的とするsiRNAでインビボで観察された。癌異種移植片モデルを、GST-πを標的とするsiRNAの0.75mg/kgで比較的低用量と共に使用した。
【０３５７】
GST-πsiRNAは、投与後数日以内に有意で予想外に有利な腫瘍阻害効力を示した。図5に示すように、GST-πsiRNAで処理すると、脂質製剤に注射してから4日後にGST-πmRNA発現が有意に減少した。4mg/kgの高用量では、注入後24時間で約40％の有意な減少が検出された。
【０３５８】
GST-πsiRNAを、組成物（イオン化可能な脂質：コレステロール：DOPE：DOPC：DPPE-PEG-2K）（25：30：20：20：5）を有する10mL/kgのリポソーム製剤として単回注射で投与した。
【０３５９】
癌異種移植片モデルのため、A549細胞株をATCCから得た。細胞を、10％ウシ胎仔血清及び100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンを補充したRPMI-1640中で維持した。接種の48時間前に細胞を分割して、回収時に対数増殖期になるようにした。細胞をトリプシン-EDTAで軽くトリプシン処理し、組織培養から回収した。生存細胞の数を計数し、トリパンブルーの存在下で血球計算盤で測定した（生存細胞のみを数える）。血清を含まないRPMI培地中で細胞を4×107/mlの濃度に再懸濁した。次いで、細胞懸濁液を、氷解凍したBDマトリゲルと1：1の比率でよく混合して注射に使用した。
【０３６０】
マウスは、チャールズ・リバー・ラボラトリー胸腺ヌード（nu/nu）雌マウス、免疫不全、6〜8週齢、1群当たり3匹のマウスであった。
【０３６１】
腫瘍モデル調製のために、マウス1匹につき1接種量の25G針及び注射器を用いて、2×106のA549細胞の接種材料0.1mlを右脇腹に皮下接種した。マウスは接種のために麻酔をかけられなかった。
【０３６２】
腫瘍体積の測定及び無作為化のために、腫瘍サイズを最も近い0.1mmまで測定した。腫瘍体積は、式：腫瘍体積=長さ×幅2/2を用いて計算した。腫瘍容積を週2回モニターした。確立された腫瘍が約350〜600mm3に達すると、マウスを様々な時点で群に割り当てた。同じ日に、試験品を投与レジメンに従って投与した。
【０３６３】
投薬投与のために、確立された腫瘍が約350〜600mm3に達した日に、試験品を4℃の冷蔵庫から取り出した。シリンジにアプライする前に、処方剤を含むボトルを手で数回反転して均一な溶液を作製した。
【０３６４】
体重については、マウスを最も近い0.1gまで秤量した。研究の終了日を含む残りの数週間、体重を数週間監視し、週2回記録した。
【０３６５】
腫瘍の収集のために、動物を過量のCO2で犠牲にし、投与後0、24、48、72及び96（任意）及び168時間で腫瘍を解剖した。腫瘍を最初に湿潤し、KD、分布及びバイオマーカー分析のために3つの部分に分けた。試料を液体窒素中で急速冷凍し、処理する準備が整うまで-80℃で保存した。
【０３６６】
実施例１３：本発明のGST-πsiRNAは、インビボで膵臓癌異種移植片腫瘍を阻害した。GST-πsiRNAは、リポソーム製剤で膵臓癌異種移植片腫瘍に投与された場合、インビボで遺伝子ノックダウン効力をもたらした。
【０３６７】
この異種移植モデルでは、各マウスに、2.5×106のPANC-1細胞接種物0.1mlを右脇腹に皮下接種した。胸腺欠損ヌード雌マウス（6〜8週齢、Charles River）を用いた。腫瘍の大きさは、最も近い0.1mmまで測定した。確立された腫瘍が約150〜250mm3（平均腫瘍体積約200mm3）に達すると、マウスを、処置群の平均腫瘍体積がビヒクル対照群における平均腫瘍体積の10％以内になるように、様々なビヒクル対照及び処置群に割り当てた。同じ日に、試験品及び対照ビヒクルを投薬レジメンに従って投与した。腫瘍容積を第1週に3回、研究終了日を含めて残りの週では2回モニターした。
【０３６８】
図6は、GST-πsiRNA（配列番号61及び126）の腫瘍阻害効力を示している。図6に示すように、用量応答は、GST-πを標的とするsiRNAの0.375mg/kg〜3mg/kgの範囲の用量で得られた。GST-πsiRNAは、投与後数日以内に有意で、且つ予想外に有利な腫瘍阻害効力を示した。したがって、GST-πsiRNAは、エンドポイントで有意で、且つ予想外に有利な腫瘍阻害効力を示した。
【０３６９】
GST-πsiRNAを、組成物（イオン化可能な脂質：コレステロール：DOPE：DOPC：DPPE-PEG-2K）（25：30：20：20：5）を有するリポソーム製剤で投与した。
【０３７０】
実施例１４：本発明のGST-πsiRNAは、増加した血清安定性を示した。
【０３７１】
図7は、ヒト血清中でのインキュベーション及びHPLS/LCMSによる様々な時点での残りのsiRNAの検出を示している。図7に示すように、GST-πsiRNA（配列番号61及び126）のセンス鎖（図7、上段）及びアンチセンス鎖（図7、下段）の両方の血清中の半減期（t1/2）は約100分であった。
【０３７２】
実施例１５：本発明のGST-πsiRNAは、血漿中での製剤中の安定性の向上を示した。
【０３７３】
図8は、血漿中での製剤のインキュベーション及び様々な時点での残りのsiRNAの検出を示している。図8に示すように、GST-πsiRNA製剤（配列番号61及び126）の血漿中半減期（t1/2）は100時間よりも有意に長かった。
【０３７４】
GST-πsiRNAを、組成物（イオン化可能な脂質：コレステロール：DOPE：DOPC：DPPE-PEG-2K）（25：30：20：20：5）を有するリポソーム製剤で調製した。リポソームナノ粒子のz平均サイズは40.0nmであり、siRNAは91％カプセル化されていた。
【０３７５】
製剤をPBS中の50％ヒト血清中で40分、1.5時間、3時間、24時間及び96時間インキュベートした。GST-πsiRNAの量は、ELISAベースのアッセイによって決定した。
【０３７６】
実施例１６：本発明のGST-πsiRNAは、パッセンジャー鎖によるオフターゲット効果の低下を示した。
【０３７７】
GST-πsiRNA（配列番号156及び182）について、図9は、効果を示さなかったスクランブル配列を有する対照と比較して、ガイド鎖についてのインビトロノックダウンがほぼ指数関数的であったことを示している。このsiRNAのIC50を5pMで測定した。図10は、同じGST-πsiRNAのパッセンジャー鎖のインビトロノックダウンを示している。図10に示すように、GST-πsiRNAについてパッセンジャー鎖のオフターゲットノックダウンは100倍以上大きく減少した。
【０３７８】
GST-πsiRNA（配列番号187及び199）、（配列番号189及び201）及び（配列番号190及び202）に関して、図11は、ガイド鎖のインビトロノックダウンはおよそ指数関数的であったことを示している。これらのsiRNAのIC50を、それぞれ6、7及び5pMで測定した。図12に示すように、これらのGST-πsiRNAのパッセンジャー鎖のインビトロノックダウンは、少なくとも10倍まで有意に減少した。これらのGST-πsiRNAはすべて、二重鎖領域のシード領域にデオキシヌクレオチドを有し、当該二重鎖領域には他の修飾はなかった。
【０３７９】
GST-πsiRNA（配列番号217及び232）について、図13は、この高活性なGST-πsiRNAのガイド鎖についてのインビトロノックダウンがほぼ指数関数的であったことを示している。このsiRNAのIC50を11pMで測定した。図14に示すように、このGST-πsiRNAのパッセンジャー鎖に対するインビトロノックダウンは、100倍を超えて有意に減少した。このGST-πsiRNAは、二重鎖領域のシード領域にデオキシヌクレオチドを有し、当該二重鎖領域には他の修飾はなかった。
【０３８０】
オフターゲット効果は、Renillaルシフェラーゼ遺伝子をコードする発現レポータープラスミドpsiCHECK-2を用いて決定した（二重ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム、Promega、カタログ番号：E1960）。siRNA濃度は典型的には50pMであった。プロトコル：1日目、HeLa細胞を5〜7.5×103/100μl/ウェルで播種した。2日目、約80％の細胞コンフルエンスでの同時トランスフェクション。3日目に、細胞を採取してルシフェラーゼ活性測定を行った。ルシフェラーゼ活性を、プロメガ社のルシフェラーゼアッセイシステム（E4550）を用いて、製造業者のプロトコルに従って測定した。
【０３８１】
psiCHECK-2ベクターは、Renillaルシフェラーゼのレポーター遺伝子に融合した標的遺伝子の発現の変化をモニタリングすることができる。siRNA構築物を多重クローニング領域にクローニングし、ベクターをHeLa細胞にsiRNAとともに同時トランスフェクションした。特定のsiRNAが標的mRNAに結合し、RNAiプロセスを開始する場合、融合Renillaルシフェラーゼ：構築mRNAは切断され、続いて分解され、Renillaルシフェラーゼシグナルを減少させる。
【０３８２】
例えば、BU2’構造を有するsiRNAのためのプラスミド挿入物は以下の通りとした：
PsiCHECK-2（F）プラスミド挿入物：
配列番号451
ctcgag gggcaacTGAAGCCTTTTGAGACCCTGcTgTcccag gcggccgc
PsiCHECK-2（R）プラスミド挿入物：
配列番号452
ctcgag cTgggacagCAGGGTCTCAAAAGGCTTCagTTgccc gcggccgc
【０３８３】
実施例１７：本発明のGST-πsiRNAは、シード依存性の意図しないオフターゲット遺伝子サイレンシングである、miRNA様オフターゲット効果が有利に減少したことを示した。
【０３８４】
GST-πsiRNA（配列番号156及び182）、（配列番号187及び199）、（配列番号189及び201）、（配列番号190及び202）及び（配列番号217及び232）に関して、miRNAを模倣するオフターゲット活性は、本質的に無視できることが判明した。これらのGST-πsiRNAのシード依存性の意図しないオフターゲット遺伝子サイレンシングは、ガイド鎖の標的活性よりも少なくとも10倍〜100倍小さかった。
【０３８５】
miRNA関連オフターゲット効果を試験するために、アンチセンス鎖の5’末端の1〜8位の位置である、シード含有領域全体に相補的ではあるが残りの非シード領域（位置9〜21）相補的ではない、1〜4回反復のシード適合標的配列を、ルシフェラーゼmRNAの3'UTRに対応する領域に導入して、シード依存性の意図しないオフターゲット効果の効率を決定した。プラスミド挿入物を用いて、シード領域における完全なマッチング及び非シード領域におけるミスマッチ（バルジ）を有するmiRNAを模倣した。
【０３８６】
例えば、BU2’構造を有するsiRNAについてのプラスミド挿入物は以下の通りとした：
PsiCHECK-2（Fmi1）プラスミド挿入物：
配列番号453
ctcgag gggcaacTCTACGCAAAACAGACCCTGcTgTcccag gcggccgc
PsiCHECK-2（Fmi2）プラスミド挿入物：
配列番号454
ctcgag gggcaacTCTACGCAAAACAGACCCTGcT CTACGCAAAACAGACCCTGcT gTcccag gcggccgc
PsiCHECK-2（Fmi3）プラスミド挿入物：
配列番号455
ctcgag gggcaacTCTACGCAAAACAGACCCTGcT CTACGCAAAACAGACCCTGcT CTACGCAAAACAGACCCTGcT gTcccag gcggccgc
PsiCHECK-2（Fmi4）プラスミド挿入物：
配列番号456
ctcgag gggcaacTCTACGCAAAACAGACCCTGcT CTACGCAAAACAGACCCTGcT CTACGCAAAACAGACCCTGcT CTACGCAAAACAGACCCTGcT gTcccag gcggccgc
【０３８７】
本明細書に記載された実施形態は限定されず、当業者は、改良されたRNAi活性を有する核酸分子を同定するための過度の実験をすることなく、本明細書に記載の修飾の特定の組み合わせを試験できることを容易に理解できる。
【０３８８】
実施例１８：p21を標的とする本発明のsiRNAは、インビトロで遺伝子サイレンシング活性を有することが見出された。遺伝子ノックダウンのためのp21 siRNAの用量依存的活性は、約3ピコモル（pM）未満のIC50、及び1pM程度の低いIC50を示すことが判明した。
【０３８９】
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で実施し、siRNAノックダウン効果を決定した。表21に示すように、p21 mRNAに対する用量依存的ノックダウンが表7のsiRNAで観察された。
【０３９０】
【表２１】
0006457704.tif 000024
【０３９１】
表21に示すように、表7のp21 siRNAの活性は0.3〜10pMの範囲であり、インビボで使用される薬物剤を含む多くの用途に適している。
【０３９２】
実施例１９：siRNAのアンチセンス鎖のシード領域に位置するデオキシヌクレオチドを有する本発明のp21 siRNAの構造は、予想外に且つ有利に遺伝子ノックダウン活性を増加させた。
【０３９３】
インビトロトランスフェクションをA549細胞株で実施し、構造1735’（配列番号341及び355）に基づくp21 siRNAのノックダウン効力を決定した。p21 mRNAの用量依存的ノックダウンは、表22に示すように、構造1735’に基づくp21 siRNAで観察された。
【０３９４】
【表２２】
0006457704.tif 000025
【０３９５】
表22に示すように、デオキシヌクレオチドを含まないp21 siRNAと比較して、アンチセンス鎖のシード領域に3つのデオキシヌクレオチドを有する構造1735’に基づくp21 siRNAの活性は、二重鎖領域にデオキシリボヌクレオチドを有しないp21 siRNAと比較して、驚くほどかつ予想外に300倍まで増加した。
【０３９６】
これらのデータは、アンチセンス鎖のシード領域にデオキシヌクレオチドを有する構造を有するp21 siRNAが、二重鎖領域にデオキシヌクレオチドを有さないp21 siRNAと比較して驚くほど高い遺伝子ノックダウン活性を提供することを示している。
【０３９７】
アンチセンス鎖のシード領域に3つのデオキシヌクレオチドを有するp21 siRNAについて、表22に示される活性は、0.001から0.1pMの範囲であり、インビボで使用される薬物剤を含む多くの用途に非常に適していた。
【０３９８】
実施例２０：本発明のp21 siRNAは、インビボにおいて、癌異種移植腫瘍を顕著に減少させることが示された。p21 siRNAは、リポソーム製剤で癌異種移植片腫瘍に投与された場合、インビボでの遺伝子ノックダウン効力を示すことができる。
【０３９９】
図１５は、p21 siRNA（配列番号341及び355、ここでNはU）の腫瘍抑制効果を示している。癌異種移植モデルに対して、p21を標的とするsiRNAを比較的低用量0.75mg/kgで利用した。
【０４００】
p21 siRNAは、有意で、且つ予測を上回る程に有利な腫瘍抑制効果を投与後数日以内に示した。30日後、p21 siRNA は、コントロールと比較して2倍以上に腫瘍体積が減少するといった著しく有利な腫瘍抑制効果を示した。
【０４０１】
p21 siRNAを、組成物(イオン化可能な脂質：コレステロール：DOPE：DOPC：DPPE-PEG-2K) (25：30：20：20：5)を含むリポソーム製剤（10mL/kg）を4回注射して0.75mg/kgの用量で投与した（1日目、8日目、15日目及び22日目）。
【０４０２】
癌異種移植モデルについては、ATCCよりA549細胞ラインを入手した。細胞は10％ウシ胎仔血清及び100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンを添加した培養培地で維持した。接種の48時間前に細胞を分割して、収穫時に対数増殖期になるようにした。細胞をトリプシン-EDTAを用いて軽くトリプシン処理し、組織培養から収穫した。生存細胞の数を計数し、トリパンブルーの存在下で血球計算盤で測定した（生存細胞のみを数える）。細胞を、血清を含まない培地中で5×107/mlの濃度に再懸濁した。次いで、細胞懸濁液を氷解凍したBDマトリゲルと1：1の比率でよく混合して注射した。
【０４０３】
マウスは、チャールズ・リバー・ラボラトリーの無胸腺ヌード（nu/nu）・メスの免疫不全マウスであり、6〜8週齢で1群当たり7〜8匹としたた。
【０４０４】
腫瘍モデル調製のために、25G針およびシリンジを用いて、2.5×106個のA549細胞の接種物0.1mlを右脇腹に皮下接種した（マウス1匹につき1接種量）。マウスは接種のために麻酔をかけられなかった。
【０４０５】
腫瘍体積の測定及び無作為化のために、腫瘍サイズを最も近い0.1mmの位まで測定した。腫瘍体積は次式を用いて計算した：腫瘍体積＝長さ×深さ２/２。樹立した腫瘍が約120〜175mm3に達したら、平均腫瘍体積は約150mm3であり、マウスを様々なビヒクル対照群と処置群とに割り当て、処置群の平均腫瘍体積がビヒクル対照群における平均腫瘍体積の10％以内になるようにした。理想的には、腫瘍体積のCV％は25％未満であった。同じ日に、試験品及び対照ビヒクルを投薬レジメンに従って投与した。腫瘍体積を、第1週に3回、試験終了日を含めて残りの週は2回モニターした。
【０４０６】
用量投与のために、投与日に、試験品を-80℃の冷凍庫から取り出し、氷上で解凍した。 注射器にアプライする前に、製剤を含むボトルを手で数回反転した。全ての試験品はIVにより0.75mg/kgで投与した。
【０４０７】
体重について、マウスは0.1ｇの位まで測定された。体重をモニターし、初回投与から7日以内は毎日記録した。試験終了日を含む残りの数週間については週に2回、体重をモニターし、記録した。
【０４０８】
腫瘍の採取のため、最初の投与の28日後に、腫瘍体積を測定し、腫瘍を重量測定のために切開し、PDバイオマーカー研究のために保存した。腫瘍重量を記録した。
【０４０９】
明細書に記載された実施形態は限定されず、当業者は、改良されたRNAi活性を有する核酸分子を同定するための過度の実験をすることなく、本明細書に記載の修飾の特定の組み合わせを試験できることを容易に理解できる。
【０４１０】
実施例２１：MCL1を標的とする本発明のsiRNAを調製し、インビトロにおいて遺伝子サイレンシグ活性を有することが見いだされた。遺伝子ノックダウンに対するMCL1 siRNAにおける用量依存的活性が、約100ピコモル（pM）以下のIC50を示すことがわかった。
【０４１１】
A549細胞ラインを用いてインビトロトランスフェクションを実施し、siRNAノックダウン効果を決定した。 MCL1 mRNAに対する用量依存的ノックダウンは、表11に示したsiRNAにおいて観察された。
【０４１２】
実施例２２：ARAFを標的とする本発明のsiRNAを調製し、インビトロにおいて遺伝子サイレンシグ活性を有することが見いだされた。遺伝子ノックダウンに対するARAF siRNAにおける用量依存的活性が、約100ピコモル（pM）以下のIC50を示すことがわかった。
【０４１３】
A549細胞ラインを用いてインビトロトランスフェクションを実施し、siRNAノックダウン効果を決定した。 MCL1 mRNAに対する用量依存的ノックダウンは、表12に示したsiRNAにおいて観察された。
【０４１４】
本明細書中で具体的に言及される全ての刊行物、特許及び文献は、あらゆる目的のためにその全体が参考として援用される。
【０４１５】
本発明は、記載された特定の方法論、プロトコル、材料、及び試薬に限定されず、これらは変化し得ることが理解される。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではないことも理解されたい。説明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書に開示された説明に様々な置換及び変更を加えることができ、これらの実施形態はこの説明及び添付の特許請求の範囲内にあることは、当業者にとって極めて明らかである。
【０４１６】
単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈上他に明確に指示されていない限り、複数の言及を含むことに留意されたい。同様に、用語「a」（又は「an」）、「1つ以上」及び「少なくとも1つの」は、本明細書では交換可能に使用することができる。用語「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含有する（containing）」、「含む（including）」及び「有する」は、互換的に使用することができ、広範かつ制限なしに読まれるべきである。
【０４１７】
本明細書中の値の範囲の記載は、本明細書中に別段の指示がない限り、範囲内の各別個の値を個々に参照する簡略方法として役立つことを意図しており、それぞれの個別値は個々に記載されているかのように組み入れられる。ここで、マーカッシュグループについては、当業者は、この説明が個々のメンバーならびにマーカッシュグループのメンバーのサブグループを含むことを認識するであろう。
【０４１８】
それ以上の詳述なしに、当業者は、上記の説明に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単なる例示として解釈されるものであり、決して本開示の残りの部分を限定するものではない。
【０４１９】
本明細書に開示される特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書で開示された各特徴は、同じ、等価の目的、又は同様の目的を果たす代替の特徴と置き換えることができる。
【図１】
0006457704.tif 000026
【図２】
0006457704.tif 000027
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0006457704.tif 000033
【図９】
0006457704.tif 000034
【図１０】
0006457704.tif 000035
【図１１】
0006457704.tif 000036
【図１２】
0006457704.tif 000037
【図１３】
0006457704.tif 000038
【図１４】
0006457704.tif 000039
【図１５】
0006457704.tif 000040
【配列表】
0006457704000001.app