(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロタウイルス、パピローマウイルス、及びライノウイルスから成る群から選択される裸のウイルスにより引き起こされる感染の治療における又は予防における使用のための、式(I)：
【化１】
0006599453.tif 000017
[式中、R1は、H及びOHから成る群から選択され、R2は、H及びOHから成る群から選択され、R4は、H、OHから成る群から選択され、Yは、CHR3及びC=Oから成る群から選択され、R3は、H及びOHから成る群から選択され、
但し、R1=R2=R3=R4=Hである化合物を除く]
のオキシステロールを含む医薬組成物。
【請求項２】
前記感染が、胃腸炎、鼻咽腔炎(感冒)、喘息増悪、慢性閉塞性肺疾患増悪、生殖器コンジローマ、子宮頸癌、外陰癌、膣癌、陰茎癌、肛門癌、肛門周囲癌、頭部癌、頚部癌、疣贅、乳頭腫、再発性呼吸器乳頭腫症から成る群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記オキシステロールが27-ヒドロキシコレステロールである、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記オキシステロールが7β-ヒドロキシコレステロールである、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記オキシステロールが7-ケトコレステロールである、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記オキシステロールが25-ヒドロキシコレステロールである、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記オキシステロールが7α-ヒドロキシコレステロールである、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記オキシステロールが24-ヒドロキシコレステロールである、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記オキシステロールが7アルファ,25-ジヒドロキシコレステロールである、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ロタウイルス、パピローマウイルス、及びライノウイルスから成る群から選択される裸のウイルスにより引き起こされる感染の治療又は予防における使用のための、式(I)：
【化２】
0006599453.tif 000018
[式中、R1は、H及びOHから成る群から選択され、R2は、H及びOHから成る群から選択され、R4は、H、OHから成る群から選択され、Yは、CHR3及びC=Oから成る群から選択され、R3は、H及びOHから成る群から選択され、
但し、R1=R2=R3=R4=Hである化合物を除く]
のオキシステロール及び少なくとも1種の医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス、特に裸のウイルスにより引き起こされる感染の治療及び予防における使用のための、オキシステロールに関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスは、偏性細胞内寄生体であり、ヒトの病原性感染因子の重要なカテゴリーを占める。ビリオンの構造に基づいて、ウイルスは2つのカテゴリー：エンベロープウイルス及び裸の(naked)ウイルスに分類される。前者は、(核酸、すなわちDNA又はRNAから成る)ウイルスゲノムを包含するタンパク質の殻(カプシド又はヌクレオカプシド)を覆うリポタンパク質性の膜(ウイルスエンベロープ)を特徴とし；後者は、カプシド及び核酸(DNA又はRNA)のみから成る。子孫(progeny)を作り出すために、ウイルスは必然的に宿主細胞に寄生しなければならないが、これは高分子合成及びエネルギーの産生に関し宿主細胞に依存しているためである。
【０００３】
裸のウイルスには、ロタウイルス、ライノウイルス、及びパピローマウイルス等の、ヒト及び動物に蔓延している感染性疾患の重要な病原因子が含まれる。
【０００４】
ヒトロタウイルスは、乳幼児及び小児に最も蔓延しているウイルス性胃腸炎の病原因子である。ロタウイルスにより引き起こされる急性下痢は、世界的な健康問題の典型である：ロタウイルスは、1億1400万の下痢の症例の原因となっており、これにより毎年2400万件の医療受診及び240万件の入院が生じている(1)。世界的に見て、ロタウイルス感染は、およそ500,000人の死亡につながっている；5歳未満の小児における死亡の5%は、下痢関連疾患に原因がある可能性がある(2)。現在、2種類の予防的ワクチンが上市されている(3,4)：Rotarix (GlaxoSmithKline)及びRotaTeq (Merck)である。米国の乳幼児ワクチン接種プログラムにおける2006年のRotaTeq及び2008年のRotarixの導入により、ロタウイルスに関連した入院に関して相当数の減少がもたらされた。臨床試験の結果は、重篤な胃腸炎に対してRotarix及びRotaTeqの85%の有効性を示している。一方、臨床試験は、未だ完全に明らかになっていない理由により、発展途上国ではワクチンの効果がはるかに弱いことを示している。今日、特異的な抗ウイルス薬剤は上市されていないが、これはウイルスにより誘導される下痢の根底にある分子機構についての理解が欠如していることに主に起因する。これらの考察により、ヒト並びにウシ、ウマ、及びブタ等の家畜の両方において、胃腸炎を予防及び/又は治療することができる特異的阻害剤を開発する喫緊の必要性が指摘される。
【０００５】
ヒトライノウイルスは、ピコナウイルス科の、一本鎖のプラス鎖RNAを有するウイルスである。普通感冒の症例の少なくとも50%を占める(5,6)。普通感冒は、最も頻発するヒトの疾患であり、世界中の全ての集団が罹患する。この疾患に関連する障害は重篤ではないが、経済的及び社会的な影響は大きい(5,6,8)。さらに、ライノウイルス感染は、喘息及び慢性閉塞性肺疾患(COPD)等のより重篤な下気道の疾患の増悪と関連付けられることが多い(9,10)。150種類を超える異なるライノウイルスの血清型が存在し、これらにより誘導される抗体交差反応性は低いので(11)、ワクチンの生産及び投与に基づく予防的ストラテジーは実行可能ではない。したがって、とりわけ、経済的及び社会的影響、並びに喘息又はCOPDの患者におけるライノウイルス感染の発症を減少させるために、ライノウイルスに対して有効な薬剤の開発が、緊急に必要である(12)。
【０００６】
パピローマウイルスは、裸のDNAウイルスであり、主に多重層(polystratified)扁平上皮の細胞に感染することができ、ヒト及び動物の両方において増殖性病変を引き起こす。ヒトでは、低リスクと規定されるHPVサブタイプ(90%の症例においてHPVサブタイプ6及び11)が、肛門性器及び口腔咽頭領域での広範囲の良性増殖性病変(コンジローマ及び乳頭腫(パピローマ))を占める(13)。しかし、ある群のヒトパピローマウイルスによる感染は、高リスクと規定されているが、肛門性器癌及び頭頸部癌に関連している。このうち、子宮頸癌は、世界中で高い有病率を有する悪性腫瘍である。実際、50万件の新たな症例及びおよそ250,000人の死亡が毎年記録されている(14)。これらの症例の大部分は、HPV 16、18、31、33、及び45を含む1種以上の腫瘍形成性HPVサブタイプと関連している(15)。また、高リスクHPVは、外陰部、膣、陰茎、肛門、及び肛門周囲領域の腫瘍、並びにおよそ20%の頭頸部腫瘍の原因にもなる可能性がある(16)。現在、高リスクHPV16及び18の感染の予防には2種類のワクチンが利用可能である。他のサブタイプに対するワクチンの一定の交差反応性は観察されているが、全ての腫瘍形成性サブタイプに対して完全な干渉効果(cross protection)を与えるほどには十分ではない(17)。しかし、ワクチンの高いコスト及びその配布及び投与に関与する運搬上の問題は、子宮頸癌の有病率が高い発展途上国におけるワクチン接種活動にとっての重要な制限要素を占める。さらに、ワクチン接種を受けた集団において活性があるこの予防法の長期的有効性に関する入手可能なデータは現在無い(17-19)が、これはこのワクチンがほんの最近導入されただけであり、かつその人が性交経験を持つようになる前に投与されるためである。これらの理由により、予防的ワクチンが投与されていない広範囲の女性が、未だHPVに対して曝露され脆弱な状態のままである。全体として、これはHPVに対するワクチン接種の時代でも、特にスメア検査の結果が異常若しくは陽性の、又は腫瘍形成性HPV感染が確認されている女性に使用するための、HPV感染の有効な阻害剤の同定が非常に望ましいことを意味する。
【０００７】
EP2522350は、A型肝炎の治療のための7ベータ-ヒドロキシコレステロールの使用を記述する。
【０００８】
Moogらは、HIV感染の治療のための7ベータ-ヒドロキシコレステロール、25-ヒドロキシコレステロール、及び7,25-ジヒドロキシコレステロールの使用を記述する。
【０００９】
WO2013166503は、エンベロープウイルスにより引き起こされる感染の治療のための25-ヒドロキシコレステロールの使用を記述する。しかし、この公報は、25-ヒドロキシコレステロールが裸のウイルス、例えばアデノウイルス5(Liu SY et al. Immunity 38, 92-105, 2013)には有効でないことを例示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】EP2522350
【特許文献２】WO2013166503
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Liu SY et al. Immunity 38, 92-105, 2013
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本発明の目的は、ロタウイルス、ライノウイルス、及びパピローマウイルス等の裸のウイルスにより引き起こされる感染の予防及び治療に適用することができる抗ウイルス化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記目的は、請求項1に記載の化合物に関連する、本発明により達成される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図1は、定量的リアルタイムRT-PCRの結果を示す。
【図２】図2は、MA104細胞について、細胞生存アッセイの結果を示す。
【図３】図3は、CaCo2細胞について、細胞生存アッセイの結果を示す。
【図４】図4は、HeLa細胞について、細胞生存アッセイの結果を示す。
【図５】図5は、MA104細胞についての前処理アッセイの結果を示す。
【図６】図6は、CaCo2細胞についての前処理アッセイの結果を示す。
【図７】図7は、ロタウイルス収量低減アッセイの結果を示す。
【図８】図8は、ライノウイルス収量低減アッセイの結果を示す。
【図９】図9は、ロタウイルスの細胞表面への接着に関するアッセイの結果を示す。
【図１０】図10は、ロタウイルス細胞侵入動態試験において、各時点において細胞に侵入したウイルス粒子の量の結果を示す。
【図１１】図11は、ロタウイルス細胞侵入動態試験において、検出した細胞内のウイルス抗原を示す。
【図１２】図12は、パピローマウイルスの細胞表面への接着に関するアッセイにおけるウエスタンブロット解析の結果を示す。
【図１３】図13は、ヒトロタウイルスの感染力に対するOSBP及びVAP-Aのサイレンシングの効果を示す。
【図１４】図14は、ヒトパピローマウイルスの感染力に対するOSBP及びVAP-Aのサイレンシングの効果を示す。
【図１５】図15は、U18666Aを用いた抗ウイルスアッセイの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の対象であるオキシステロールは、コレステロールの酵素的及び非酵素的酸化に由来する27個の炭素原子を有する分子のファミリーに属し、コレステロールに関して、ステロールの核及び/又は側鎖のヒドロキシル基に追加的な基、すなわちヒドロキシル基又はエポキシ基又はケトン基を含む(20,21)。
【００１６】
長年、オキシステロールは主にその生理学的役割、例えば胆汁酸の合成、ステロイドホルモンの生合成、ステロールの輸送、そしてより一般的には遺伝子制御の点から考察されてきた。より最近では、炎症に関連する主要な慢性ヒト疾患の発病及び進行における特定のオキシステロールの潜在的な寄与が研究されている(22)。
【００１７】
本発明の第一の態様によれば、式(I)のオキシステロール：
【００１８】
【化１】
0006599453.tif 000002
【００１９】
[式中、R1は、H及びOHから成る群から選択され、R2は、H及びOHから成る群から選択され、R4は、H、OHから成る群から選択され、Yは、CHR3及びC=Oから成る群から選択され、R3は、H及びOHから成る群から選択される]
が提供され；これらは、特にロタウイルス、ライノウイルス、及びパピローマウイルスから成る群から選択される、裸のウイルスにより引き起こされる感染の治療又は予防に有効である。より好ましくは、感染は、胃腸炎、鼻咽腔炎(感冒)、喘息増悪、慢性閉塞性肺疾患増悪、生殖器コンジローマ、子宮頸癌、外陰癌、膣癌、陰茎癌、肛門癌、肛門周囲癌、頭頚部癌、疣贅(いぼ)、乳頭腫、再発性呼吸器乳頭腫症から選択される。
【００２０】
特に、本発明の一実施態様において、オキシステロールは、24-ヒドロキシコレステロール、25-ヒドロキシコレステロール、27-ヒドロキシコレステロール、7アルファ-ヒドロキシコレステロール、7ベータ-ヒドロキシコレステロール、7,25-ジヒドロキシコレステロール、及び7-ケトコレステロールから成る群から選択される。
【００２１】
驚くべきことに、特定のオキシステロールが、ウイルス性因子による細胞及び組織の感染に対する先天性免疫応答を活性化し、適応免疫応答を誘導できることが見出され、生物の抗ウイルス免疫応答の調整において主人公的役割を担う分子である、Toll様受容体(Toll Like Receptors) (TLR)として定義される受容体のファミリーの構成要素の一部の高発現を決定する(23)。すなわち、27-ヒドロキシコレステロール(27OHC)及び25-ヒドロキシコレステロール(25OHC)は、CaCo2腸細胞において、RNAウイルスの受容体であるTLR3の著しい高発現を誘導する(図1a〜1b)。DNAウイルス、特にパピローマウイルスに関しては、27-ヒドロキシコレステロール(27OHC)及び7β-ヒドロキシコレステロール(7βOHC)が、SH-SY5Y神経芽腫細胞において、これらが特異的に活性化する受容体であるTLR4の誘導に活性があること(24)、及び27OHCがマクロファージ細胞株において活性があることが証明されている。
【００２２】
TLRの刺激は、核因子-kB(NF-kB)転写因子及び様々なインターフェロン(IFN)を活性化して終了する分子事象のカスケードを生み出し、結果として生物の炎症応答の増幅を生じる(25)。上述の全てのオキシステロールが様々な細胞型におけるNFkBの公知の活性化因子であることは注目に値する(26)。
【００２３】
ウイルス活性が証明された本発明のオキシステロールの中で、25OHC及び27OHCは、LXR(様々な細胞シグナル伝達経路を活性化するので、生理学の分野において最も重要な核受容体)の最適なリガンドであり、一方で7-ケトコレステロール等の他のオキシステロールは、リガンド活性を有していない；このことは、本発明のオキシステロールの抗ウイルス作用は、前記核受容体の関与に必ずしも依存しない、又は少なくとも完全には依存していないことを実証する。
【００２４】
したがって、本願明細書において得られ報告された実験結果に基づけば、本発明のオキシステロールの抗ウイルス作用は、単なる表面効果、すなわち標的細胞の細胞膜に限定されているのではなく、これらの化合物が多数の細胞シグナル伝達経路を活性化する能力にも依存していると考えるのが妥当である。本発明の第二の態様において、特にロタウイルス、パピローマウイルス、及びライノウイルスから成る群から選択される、裸のウイルスにより引き起こされる感染の治療及び予防における使用のための、式(I)のオキシステロール：
【００２５】
【化２】
0006599453.tif 000003
【００２６】
[式中、R1は、H及びOHから成る群から選択され、R2は、H及びOHから成る群から選択され、R4は、H、OHから成る群から選択され、Yは、CHR3及びC=Oから成る群から選択され、R3は、H及びOHから成る群から選択される]
と、少なくとも1種の医薬的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物がさらに提供される。特に、感染は、胃腸炎、鼻咽腔炎(感冒)、喘息増悪、慢性閉塞性肺疾患増悪、生殖器コンジローマ、子宮頸癌、外陰癌、膣癌、陰茎癌、肛門癌、肛門周囲癌、頭部癌、頚部癌、疣贅、乳頭腫、再発性呼吸器乳頭腫症から成る群から選択される。
【００２７】
特に、本発明の一実施態様において、オキシステロールは、24-ヒドロキシコレステロール、25-ヒドロキシコレステロール、27-ヒドロキシコレステロール、7アルファ-ヒドロキシコレステロール、7ベータ-ヒドロキシコレステロール、7,25-ジヒドロキシコレステロール、及び7-ケトコレステロールから成る群から選択される。
【００２８】
当業者は、医薬組成物を製剤化するために適した担体、希釈剤、又は賦形剤のような多種多様な化合物を認識する。
【００２９】
本発明の化合物は、通常用いられるアジュバント、担体、希釈剤、又は賦形剤と共に、医薬組成物及びそれらの単位用量の形態で調製することができ、前記形態において、固形剤として、充填錠剤若しくはカプセルとして、又は液剤として、溶液、懸濁液、エマルジョン、エリキシル剤(elisir)、若しくはそれらを充填したカプセルとして、全て経口用途で、又は注射用無菌溶液の形態で、皮下及び静脈内投与を含む非経口投与用途で、用いることができる。前記医薬組成物及びこれらの単位剤形は、成分を通常の比率で含むことができ、他の化合物又は活性成分を含んでも又は含まなくてもよく、前記単位剤形は、予定された用いられる日用量の範囲に応じて、任意の適切な有効量の有効成分を含むことができる。
【００３０】
本発明の化合物を含有する医薬組成物は、製薬技術の分野で公知の方法で調製することができ、少なくとも一種の活性化合物を含むことができる。一般的に、本発明の化合物は、医薬的に有効な量で投与される。実際に投与される化合物の量は、治療される疾患、選択された投与方法、投与される有効化合物、個々の患者の年齢、体重、及び応答、患者の症状の重篤さ等を含む状況に応じて、典型的には医師によって定められる。
【００３１】
本発明の医薬組成物は、経口、直腸、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、鼻腔内、及び経肺投与を含む、様々な方法によって投与することができる。経口投与のための組成物は、液体母(マスター)溶液若しくは懸濁液、又は母(マスター)粉体の形態をとることができる。しかし、より一般的には、組成物は、正確な投与を容易にするために、単位剤形で与えられる。表現「単位剤形」は、ヒト及び他の哺乳類のための単位投与として適した、物理的に分離した単位を指し、各単位は、所望の治療効果が出るように計算された所定の量の活性物質を、適切な医薬賦形剤と共に含む。典型的な単位剤形には、予め充填され計量された液体組成物のバイアル若しくはシリンジ、又は固体組成物の場合は丸薬、錠剤、カプセル等が含まれる。
【００３２】
経口投与に適した液体剤形は、緩衝剤、懸濁液、及び送達剤、着色剤、香味剤等と共に、適切な水性又は非水性担体を含むことができる。固形剤形は、例えば、任意の以下の成分又は同様の性質の化合物を含むことができる：微結晶セルロース、トラガカント、若しくはゼラチン等の結合剤；デンプン若しくは乳糖等の賦形剤、アルギン酸、Primogel、若しくはトウモロコシデンプン等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素等の流動化剤；スクロース若しくはサッカリン等の甘味剤；又はペパーミント、サリチル酸メチル、若しくはオレンジ香味料等の香味剤。注射用組成物は、典型的には、注射用無菌生理食塩水又はリン酸塩若しくは当業者に周知の他の注射用担体で緩衝化した生理食塩水に基づく。
【００３３】
医薬組成物は、錠剤、丸薬、カプセル、溶液、懸濁液、エマルジョン、粉末、座薬、及び持続放出製剤の形態にすることができる。
【００３４】
望ましい場合は、錠剤は、標準的な水性又は非水性手法を用いてコーティングすることができる。特定の実施態様において、前記組成物及び製剤は、少なくとも0.1パーセントの活性化合物を含むことができる。これらの組成物中の活性化合物のパーセンテージは、当然ながら変動させることができ、便宜的には単位あたりおよそ1質量パーセント〜およそ60質量パーセントの間であり得る。前記治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、治療的有効用量が得られるような量である。また、活性化合物は、例えば点鼻剤(液滴)として又は噴霧器により、鼻腔内投与することもできる。
【００３５】
また、錠剤、丸薬、カプセル等は、トラガカント、アカシアガム、トウモロコシデンプン、又はゼラチン等の結合剤；リン酸二カルシウムのような賦形剤；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、アルギン酸等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；及びスクロース、乳糖、又はサッカリン等の甘味剤を含有することもできる。単位剤形がカプセルの場合、上述の種類の物質に加えて、脂肪油等の液体担体を含むことができる。コーティングとして、又は投与単位の物理的形態を改変するための、様々な他の材料が存在してもよい。例えば、錠剤をセラック、糖、又は両方でコーティングすることができる。シロップ剤又はエリキシル剤は、上述の成分に加えて、甘味剤としてスクロース、防腐剤としてメチルパラベン及びプロピルパラベン、着色剤、及びチェリー又はオレンジ香味料等の香味剤を含むことができる。胃腸管の上部を通過する際の崩壊を防ぐために、組成物はコーティングされた腸溶製剤であってもよい。
【００３６】
局所投与用の組成物には、軟膏、クリーム、ローション、溶液、ペースト、ゲル、スティック、リポソーム、ナノ粒子、パッチ、バインディング(binding)、及び創傷用包帯が含まれるが、これに限定されない。特定の実施態様において、局所製剤は浸透性改良剤(penetration improver)を含む。
【００３７】
経肺投与用の組成物には、式(I)を有する化合物又はその塩の粉末と適切な担体及び/又は滑沢剤の粉末とから成る無水の粉末の組成物が含まれるが、これに限定されない。経肺投与用の組成物は、当業者に周知の任意の適切な乾燥粉末(ドライパウダー)吸入器により吸入することができる。
【００３８】
組成物は、患者の炎症及び疼痛を低減するのに十分なプロトコル及び用量に従って投与される。ある実施態様において、本発明の医薬組成物では、単一又は複数の有効成分は、一般的に投与単位に製剤化される。投与単位は、連日投与用の投与単位あたり0.1〜1,000 mgの式(I)を有する化合物を含有することができる。
【００３９】
ある実施態様において、局所製剤のための有効量は、治療前の疾患、障害、又は状態の重大さ、個体の健康状態、及び薬剤への反応に依存する。ある実施態様において、用量は、製剤の0.001質量%〜およそ60質量%の範囲である。
【００４０】
1種以上の有効成分と組み合わせて使用する場合、本発明の化合物及び他の有効成分は、各々が個別に用いられる場合の用量よりも低い用量で用いることができる。
【００４１】
製剤及び様々な投与経路に関して、薬剤の投与のための方法及び処方は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th Edition、Gennaro et al. Eds., Mack Publishing Co., 1985、及びRemington’s Pharmaceutical Sciences, Gennaro AR ed. 20th Edition, 2000, Williams & Wilkins PA, USA、及びRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams & Wilkins Eds. , 2005；並びにAnsel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 8th Edition, Lippincott Williams & Wilkins Eds., 2005に記述されている。
【００４２】
注射用組成物又は経口投与用の上述の成分は、純粋に代表的なものである。
【００４３】
また、本発明の化合物は、持続放出形態で、又は持続放出を伴う薬剤の投与のための系(システム)により、投与することもできる。
【００４４】
単なる例示的な非限定的な例に過ぎない以下の説明から、本発明のさらなる特徴が明らかになる。
【実施例】
【００４５】
「材料と方法」
（細胞株及びウイルス）
ヒト胚性腎臓細胞由来で、サルウイルス40(SV40)ラージT抗原をコードするプラスミドベクターを用いて形質転換された、細胞株293TTを、10%熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)、Glutamax-I (Invitrogen, Carlsbad, CA)、及び非必須アミノ酸と統合したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM) (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)を用いて、単層として培養した。Siha細胞、C33a細胞、及びヒト上皮腺癌のHeLa細胞(ATCC(登録商標) CCL-2(商標))、アフリカミドリザル腎臓上皮細胞(MA104)、並びにヒト結腸直腸腺癌上皮細胞(Caco-2)を、最少必須培地(MEM)中、又は10%熱不活性化FBS及び1% Zell Shieldを補ったDMEM中、37℃、5% CO2雰囲気で培養した。
【００４６】
ヒトロタウイルスの株、Wa (ATCC(登録商標) VR-2018)、WI61 (ATCC(登録商標) VR-2551)、HRV 408 (ATCC(登録商標) VR-2273)、HRV 248 (ATCC(登録商標) VR-2274)、及びDS-1 (ATCC(登録商標) VR-2550)は、American Tissue Culture Collection (ATCC)より入手した；以前記述したとおり、ウイルスを5μg/mlのタイプIXブタ膵臓トリプシン (Sigma, St. Louis, Mo)を用いて30分間、37℃で活性化し、1mlあたり0.5 μgのトリプシンを含むMEMを用いてMA104細胞中で増殖させた(27)。
【００４７】
ヒトライノウイルス1A (ATCC(登録商標) VR-1559)は、ATCCより入手した。このウイルスを、HeLa細胞中、33℃、5%のCO2で増殖させた。細胞変性効果(CPE)が完全に発達したときに、細胞及び上清を回収し、凍結及び解凍を3回行い、清澄化させて一定分量ずつ分注した。ウイルスを-70℃で保存した。ライノウイルス力価を、標準的なプラークアッセイにより決定した。簡潔に言うと、HeLa細胞を感染の2日前に96ウェルのプレートに播種し、感染時には60%〜70%コンフルエンスに達した。ウイルス懸濁液を2%のウシ胎児血清を補ったDMEMで段階希釈し、接種した；感染させたウェルを、33℃で1時間インキュベートし、ウイルスを細胞に接着及び侵入させた。細胞を続いて培地で洗浄し、1.6% SeaPlaqueアガロース(BioWhittaker Molecular Applications)とDMEM 2X [26.76g DMEM (Gibco BRL)、20 mlのL-グルタミン(Gibco BRL)、4.4gの重炭酸ナトリウム(Sigma, St. Louis, Mo)、FBS 40ml (Sigma, St. Louis, Mo)及び1000 mlの水]との1:1混合液で覆った。プレートを33℃で3日間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、プレートを7.5%ホルムアルデヒド(Fluka)で固定し、クリスタルバイオレット(Sigma, St. Louis, Mo)で着色した。その後、形成されたプラークの数を計数した；ウイルス力価は、1mlあたりのプラーク形成単位(PFU/ml)で表された。
【００４８】
（HPV PsVの生産）
偽ウイルス(シュードウイルス)(PsV)の生産用に用いたプラスミド及び細胞293TTは、John Schiller (National Cancer Institute, Bethesda, MD)のご厚意により提供頂いた。詳細なプロトコル及びプラスミドマップは、ウェブサイトhttp://home.ccr.cancer.gov/lco/default.aspで見ることができる。HPV-16 PsVを、以前記述した方法に従って生産した。簡潔に言うと、細胞293TTを、パピローマウイルスの主要カプシドタンパク質と微量カプシドタンパク質(それぞれL1及びL2)とを発現するプラスミドと、GFPを発現するレポータープラスミドとを一緒に用いてコトランスフェクションした。バイシストロン性の発現プラスミドL1/L2 (p16sheLL)を用いて、HPV-16 PsVを生産した。カプシドを、細胞ライセート中に1晩置いておき成熟させた；その後、清澄化させた上清を、室温で3時間、27〜39%のOptiPrep (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)の密度勾配にロードした。これをSW41.1ローター(Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA)中28000 rpm、16時間、4℃で遠心分離し、その後、試験管の底に穴を開けることにより回収した。画分を、10%のアクリルアミドゲル及びトリス-グリシンドデシル硫酸ナトリウム(SDS)中で純度を検査し、細胞293TTで力価試験してGFP検出により感染力を検証し、その後使用時まで-80℃で冷凍した。生産されたPsVのタンパク質L1含有量を、クマシーで着色したSDS-ポリアクリルアミドゲル中で、ウシ血清アルブミン標準と比較することにより決定した。
【００４９】
（細胞生存アッセイ）
細胞を、96ウェルのプレート中に、5 x 103/ウェルの密度で播種し、翌日、様々な希釈の25OHC、27OHC、7αOHC、7βOHC、及び7κCを用いて処理し、対照として等量のエタノール(オキシステロールに用いた溶媒)とインキュベートしたウェルを用いた。インキュベーションの24時間後、細胞生存率を、CellTiter 96 Proliferation Assayキット(Promega, Madison, WI, USA)を用いて、メーカーの取扱説明書に従って決定した。吸光度を、プレートリーダー(Model 680, BIORAD)を用いて、490nmの波長で測定した。種々の濃度のオキシステロールの細胞生存率に対する作用を、それぞれの対照で処理したサンプルの吸光度と比較し、パーセンテージとして表した。各細胞についての結果を、図2a〜2e (MA104細胞)、図3a〜3e (CaCo2細胞)、及び図4a〜4e (HeLa細胞)に報告する。これらの試験から、オキシステロールが抗ウイルス活性を示す濃度は細胞傷害性(cytotoxic)ではないことが明らかになる。
【００５０】
（ロタウイルスの感染力アッセイ）
本発明のオキシステロールの抗ウイルス有効性を、感染力阻害アッセイによって決定した。アッセイは、以前述べたとおり、96ウェルのプレートに播種したコンフルエントな単層のMA104細胞を用いて行った(28)。細胞を、37℃で20時間、0.07〜16.7 μMの間の濃度の25OHC、27OHC、又は24OHCで処理した。対照サンプルを、等量のエタノールを加えた培養培地で細胞を処理することにより調製した。その後、細胞を培地で洗浄し、0.02の感染多重度(MOI)でロタウイルス感染を行った。感染後、細胞を培地で洗浄し、5% (vol/vol) CO2-95% (vol/vol)空気の加湿したインキュベーター中、37℃でインキュベートした。16時間後、感染した細胞を冷アセトン-メタノール混合液(50:50)で固定し、ウイルス力価を、間接的免疫細胞化学により決定した。ウイルス感染力の阻害は、処理サンプルと無処理サンプルとの平均感染事象数±標準偏差を比較し、パーセンテージとして表した。可能な場合は、50%又は90%の抗ウイルス作用(それぞれEC50及びEC90)を決定することができるオキシステロール濃度の値を、PRISM 5.00 (GraphPad Software, San Diego, California, USA)を用いて、試験データから作製した用量反応曲線を用いた回帰分析により計算した。MA104細胞で得られた結果を表1に報告する。
【００５１】
【表１】
0006599453.tif 000004
【００５２】
25OHC及び27OHCで処理して行った抗ウイルスアッセイの結果を、CaCo2細胞で感染力アッセイを繰り返して確認した。そのようにして得たデータを、表2に報告する。
【００５３】
【表２】
0006599453.tif 000005
【００５４】
結果は、25OHC及び27OHCがどちらもロタウイルスに対する抗ウイルス活性を有することを示す；この有効性は、ただ一つの細胞モデルにも、ただ一つのヒトロタウイルス株にも、限定されない。さらに、脳組織レベルで存在する酵素由来のオキシステロール、すなわち24OHCも、ヒトロタウイルスに対して抗ウイルス活性を有する。
【００５５】
（ロタウイルス収量低減アッセイ）
本発明のオキシステロールが複数のウイルス複製サイクルを阻害する能力を検証するために、MA104細胞を、コンフルエントに達するまで24ウェルのプレートに播種した。細胞を、37℃で、5.6 μMの25-、27-、7α-、7β-ヒドロキシコレステロール又は7-ケトコレステロールを用いて、20時間処理し、その後培地で洗浄し、トリプシンで活性化させたヒトロタウイルス(株Wa)を0.02のMOIで感染させた。1時間後、細胞を洗浄し、新しい培地を、0.5 μg/mlのブタトリプシンを補って、加えた。感染した細胞及び上清を感染48時間後に回収し、定量した。アッセイは三重(triplicate)で行い、結果をCaCo2細胞で確認した。代替的なプロトコルでは、MA104細胞を、ウイルス接種後、(上に示した濃度の)オキシステロールで処理した。一元配置分散分析(ANOVA)、その後にボンフェローニ検定を用いて、処理サンプルと無処理サンプルとの間のウイルス力価の差の統計学的有意性を評価した。有意性を95%に固定した。
【００５６】
前処理アッセイの結果を、図5 (MA104細胞)及び図6(CaCo2細胞)に示す。
【００５７】
25OHC、27OHC、及び7κCは、解析したどちらの細胞株においても、ウイルスの子孫の生産を有意に制限する(p <0.05)。7βOHCは、MA104細胞でのみ、有意な(P<0.05)抗ウイルス活性を示す。感染後処理アッセイの結果により、25OHC及び27OHCのインビトロでの有効性が確認され、またオキシステロール7αOHC、7βOHC、及び7κCの抗ウイルス活性も強調される(図7)。しかし、注目すべきは、7αOHC、7βOHC、及び7κCにより誘導された阻害の実体が、 25OHC及び27OHCのそれよりも有意に低いということである。
【００５８】
（ライノウイルスを用いた感染力アッセイ）
10% FBS及び1% Zell Shieldを補ったDMEM中に維持していたHeLa細胞を、24ウェルのプレートに(8 × 104 細胞/ウェルで)播種した。培地を除去し、およそ30 PFUのヒトライノウイルス1Aのストックを含有する200マイクロリットル/ウェルに細胞を感染させた。感染した細胞を、33℃で1時間インキュベートし、ウイルスを細胞に接着及び侵入させた。インキュベーション後、細胞を培地で洗浄し、種々の濃度の25OHC及び27OHC(5.6 μM〜0.07 μM)を含有する、1.6%のSeaPlaqueアガロースとDMEM 2Xとの1:1溶液で覆った。プレートを33℃で3日間インキュベートした。代替的なプロトコルでは、細胞をプレーティングし、感染前に同一のスカラー濃度の25OHC、27OHC、又は24OHCで20時間処理した。プレートを、33℃で5日間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを7.5%のホルムアルデヒド(Fluka)で固定し、クリスタルバイオレット(Sigma, St. Louis, Mo)で着色し、形成されたプラークの数を計数した。50%又は90%の抗ウイルス作用(それぞれEC50及びEC90)を決定することができるオキシステロール濃度の値を、PRISM 5.00 (GraphPad Software, San Diego, California, USA)を用いて、試験データから作製した用量反応曲線を用いた回帰分析により計算した。これらの結果を感染後処理アッセイについて及び前処理アッセイについて、それぞれ表3及び表4に示す。
【００５９】
【表３】
0006599453.tif 000006
【００６０】
結果は、25OHC、27OHC、又は24OHCを用いた細胞の処理が、細胞のライノウイルス感染に対する感受性を低減できるだけでなく、接種後の複製を阻害することもできることを示す。
【００６１】
（ライノウイルス収量低減アッセイ）
本発明のオキシステロールが、複数の複製サイクルの結果である、ウイルス子孫の生産を制限する能力を検証するために、HeLa細胞を24ウェルのプレートに播種した。各ウェルに、ウェルあたりおよそ30 PFUを含有する200 μlのヒトライノウイルス1Aのストックを接種し、1時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を培地で洗浄し、5.6 μMの濃度のオキシステロール25OHC、27OHC、7αOHC、7βOHC、及び7κCを含有する新しい培地を加えた(2% FBSを補ったDMEM)。感染した細胞及び上清を、感染5日後(完全なCPEが視認できたとき)に回収し、上述のとおりに標準的なプラークアッセイにより力価測定した。結果を図8に示す：25OHC及び27OHCを用いた処理により、ウイルス子孫の生産を完全に阻害することができるが、一方で残りのオキシステロールは、子孫の生産を有意に(p<0.05)制限することができるものの比較的低い有効性を有する。
【００６２】
（HPV偽ビリオンを用いた中和アッセイ）
HeLa細胞(又はC33A若しくはSiha細胞)を、100 μl中8000細胞/ウェルの密度で、96ウェルの平底プレートに24時間前に播種した。翌日、細胞を25OHC及び27OHCの連続希釈液で処理した。16時間後、オキシステロールを取り除き、およそ1ng/mlのL1に相当する用量のHPV-16のPsVを加えた。混合物を37℃で72時間インキュベートし、GFP発現感染細胞を倒立型蛍光顕微鏡Zeiss LSM510(Zeiss, Oberkochen, Germany)で観察した。HeLa細胞での結果を表5に示す：25OHC、27OHC、及び24OHCは、HPVに対して抗ウイルス活性を示し、マイクロモル濃度のEC50を特徴とする。25OHCは27OHC及び24OHCよりも有効であることが分かった。
【００６３】
【表４】
0006599453.tif 000007
【００６４】
他の細胞株で測定した25OHC及び27OHCのEC50値を表6に報告する。
【００６５】
【表５】
0006599453.tif 000008
【００６６】
25OHC及び27OHCは、SiHa細胞及びC33A細胞においても阻害活性を示し、したがって、これらの阻害活性は、単一の細胞モデルに限定されない。
【００６７】
（定量的リアルタイムRT-PCR）
CaCo2細胞を、10%血清を含有するDMEM培地で培養し、25 cm2フラスコに播種した(800万コンフルエンス細胞)。翌日、細胞を、2%血清含有DMEM中、1.9 μMの25OHC又は27OHC(エタノールに溶解)で30分間、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、又は6時間、処理した。全RNAの抽出を、TRIzol Reagent (Applied Biosystems, Monza, Italy)を用いて行い、抽出されたRNAの量及び純度(A260/A280比)を分光光度法で測定した。続いて、2 μgのRNAを、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)を用いて逆転写した。TLR-3及びβ-アクチンについて「TaqMan Gene Expression Assay kit」、TaqMan Fast Universal PCR Master Mix、及び7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems)を使用して、定量的RT-PCRを30 ngのcDNAを用いて行った。検討した各遺伝子について、閾値サイクル(Ct)を決定し、結果を、β-アクチンを参照遺伝子として用いて正規化した。以前公開された数学的方法(29)を用いて相対定量を行った。図1a〜1bでは、結果を、対照に対する処理サンプルの遺伝子発現の増分(変化の倍数、Fc)として報告する。
【００６８】
（統計解析）
オキシステロールの存在下及び非存在下での感染力阻害及びウイルス収量についての試験で得られた結果を、GraphPad Prism 5.00 (GraphPad Software)を用いて、分散分析(ANOVA)及びその後のボンフェローニ事後検定(post-test)に供した。
【００６９】
「作用機序」
（ロタウイルスの細胞表面への接着に関するアッセイ）
ロタウイルスのMA104細胞の表面への結合についてのアッセイ用に、24ウェルのプレート中のコンフルエント細胞の単層を、37℃で、1.9 μM及び5.6 μMの25-又は27-ヒドロキシコレステロールで20時間処理した。その後、細胞を洗浄し氷上で20分間冷却した。ウイルスの感染力を、5 μgのブタトリプシン(Sigma)/mlを用いて、30分間、37℃で活性化した。活性化されたウイルスは、予め4℃に冷却しておき、氷中で1時間、3のMOIで放置し細胞に接着させた。最後に、細胞を冷MEMで洗浄した；その後冷MEMを細胞に加え、細胞表面に結合したウイルス粒子を引き離すために、2回の凍結-解凍サイクルを行った；細胞ライセートを37℃で30分間、10 mgのブタトリプシン/mlの存在下でインキュベートし、続いて遠心分離(1200 rpm、10分間)により清澄化させた。
【００７０】
細胞に結合したウイルス集団の力価を、回収したウイルスの連続希釈液を感染させたMA104細胞の単層で行った間接的免疫細胞化学により決定した。結果を図9に示す；グラフにおいて、処理した細胞の表面に結合したウイルス集団の力価を、無処理対照に対してのパーセンテージで表し、エラーバーは標準偏差を表す。ウイルス-細胞の結合の差の統計学的有意性を評価するために、二元配置分散分析(two-way ANOVA)を使用し、その後ボンフェローニ検定を行った。有意性を95%のレベルに固定した。結果は、25OHCのみが(5.6 μMの用量で)ウイルスの細胞表面に接着する能力を統計学的に有意に(p<0.05)低減できることを示す。
【００７１】
（ロタウイルス細胞侵入動態）
ロタウイルスの細胞内への侵入速度を測定するために、(96ウェルのプレートで培養した)MA104細胞のコンフルエントな単層を、1.9 μMの25OHC、27OHC、又は7κCを用いて37℃で処理した；20時間後、細胞を冷培地で広範囲に洗浄し、氷上で冷却した。活性化されたウイルスは、予め4℃に冷却しておき、氷中で1時間、0.02の感染多重度(MOI)で放置し細胞に接着させた。その後、非結合ウイルスを洗浄により除去し、培地を37℃で加え、プレートを加湿雰囲気中、37℃でインキュベートした。一定の時刻に(すなわちウイルス-細胞接着の0、15、30、45、60、75、及び90分後)、培地をウェルから抽出し、まだ細胞の表面に存在しているウイルス粒子を、PBS中EGTA 3 mMを用いた2回の短時間の洗浄操作により除去し、その後、温培地中でインキュベーションした。最後の時点(ウイルス-細胞接着から90分)に達した後、96ウェルのプレートをインキュベーター(37℃、5%CO2)に設置し、感染をさらに16時間継続させた。その後、細胞を上述のとおり固定及び着色した。各時点において細胞に侵入したウイルス粒子の量を、EGTAでの洗浄を行わなかった場合に侵入したウイルスの量(100%侵入)と比較した。分散分析、及びその後ボンフェローニ検定を用いて、処理サンプルと無処理サンプルとの差の統計学的有意性を評価した。有意性を95%のレベルに固定した。
【００７２】
結果を図10に示し、処理した細胞と、培養培地でインキュベートした細胞とを比較したパーセンテージとして表す：25OHCを用いた処理により、ロタウイルスが宿主細胞に浸透する能力を完全に阻害することができる；27OHCは、ウイルス粒子の細胞内への侵入を制限することはできるものの、比較的低い有効性を示す。最後に、7κCを用いた処理は、感染事象の数の有意な低減(p>0.05)を引き起こさない。対照試験として、同様の処理及び感染プロトコルを、6ウェルのプレートで培養したMA104細胞で行った。この試験では、侵入測定の最後の時点(90分)に達した後、細胞を溶解し、抽出したタンパク質を5分間煮沸することにより変性させ、その後、12%ポリアクリルアミド含有ドデシル硫酸ナトリウムゲルでの電気泳動(SDS-12%PAGE)により分離し、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜にトランスファーした。中間体カプシドVP6のタンパク質を、1:750希釈のマウスモノクローナル抗体2B4 (mab0036-P, CovalAb)、続いて二次抗体IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology Inc.)を用いて、検出した。アクチンを、抗アクチンマウスモノクローナル抗体MAB1501R (Millipore)、及びその後抗体IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology Inc.)を用いて検出した。ImageJソフトウェアを用いてバンドの密度を比較し、アクチンバンドの強度を値の正規化に用いた。分散分析、及びその後ボンフェローニ検定を用いて、処理サンプルと無処理サンプルとの差の統計学的有意性を評価した。有意性を95%のレベルに固定した。結果を図11に報告し、処理した細胞と、培養培地でインキュベートした細胞とを比較したパーセンテージとして表す。この方法により、25OHC及び27OHCで処理した細胞内において、ウイルス抗原が無処理の対照よりも有意に(p<0.05)低い量で同定される；この事実により、2種の分子がロタウイルスの宿主細胞内への侵入率を低減させる能力が確認される。
【００７３】
（パピローマウイルスの細胞表面への接着に関するアッセイ：ウエスタンブロット解析）
HeLa細胞を、25OHC、27OHC、及び7αOHC(後者はHPVの感染力を阻害することができないため、陰性対照として用いた)を用いて16時間処理し、続いてPsVと共に4℃で4時間インキュベートした；その後、細胞を溶解して、抽出したタンパク質をSDS-PAGEにより分離し、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜にトランスファーした。L1を、1:2000希釈のマウスモノクローナル抗体(Ab30908, Abcam, Cambridge, UK)、続いて二次抗体IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology Inc.)を用いて、検出した。アクチンを、抗アクチンマウスモノクローナル抗体(MAB1501R, Millipore)、及びその後二次抗体IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology Inc.)を用いて検出した。
【００７４】
得られた結果を図12に示す。25OHC及び27OHCはPsVの細胞表面への接着を阻害できないことがわかる：HPVのタンパク質L1は、処理細胞と無処理細胞の両方の表面に特定され、したがって、25OHC及び27OHCを介した阻害は、細胞接着の後の段階で起こる。試験に用いたパピローマウイルスの偽ビリオン(シュードビリオン)は、宿主細胞中で複製することはできず、宿主細胞に接着し、中に浸透することができるのみである；偽ビリオンが宿主細胞の表面に接着する能力が25OHC又は27OHCでの処理によって阻害されないので、阻害される複製サイクルの段階は、細胞侵入段階であると結論付けられた。
【００７５】
（siRNA感作(TISS)アッセイによる標的同定）
オキシステロールにより阻害されるロタウイルス及びパピローマウイルスの複製サイクル段階として、宿主細胞への侵入を同定した後、25OHC及び27OHCの抗ウイルス活性に関与する細胞標的が何であるかを評価した。この点において、2つのタンパク質、小胞関連膜タンパク質関連タンパク質A(vesicle-associated membrane protein-associated protein A)(VAPA)及びオキシステロール結合タンパク質(oxysterol binding protein)(OSBP)が、試験したオキシステロールの作用機序に関与しているのではないかという仮説を立てた。VAPA及びOSBPは、裸の及びエンベロープの両方の多数のウイルスの複製の基礎となる細胞内コレステロールの恒常性を制御している。侵入の際、ウイルス又はウイルスを包含する小胞は、エンドソームの膜と融合して、ビリオンの細胞質内への放出を媒介することができ、エンドソームのコレステロールの量を変化させることにより、複製サイクルのこの段階を阻害することができる。この点において、インターフェロンにより誘導される膜貫通タンパク質3(transmembrane protein 3 induced by interferon) (IFITM3)がVAPAと相互作用してOSBPとの相互作用を阻害し、細胞内コレステロールの恒常性を変化させ、宿主細胞内へのウイルスの侵入を阻害することが示されている(30)。VAPA-OSBP複合体の機能を変化させることにより、IFITM3は後期エンドソームの膜へのコレステロールの有意な蓄積を誘導し、ウイルスをこれらの小胞内に捕捉して宿主細胞内への侵入を阻害する。オキシステロールはOSBPの主要な相互作用因子(interactor)であるため、またロタウイルス及びパピローマウイルスの宿主細胞内への侵入を阻害することができるため、IFITM3に対し類似(アナログ)的に作用する、すなわちOSBPとVAPAとの間の相互作用を阻害するのではないかという仮説が立てられた。したがって、このロタウイルスに対する作用機序を、短鎖干渉RNA(short interfering RNA) (siRNA)による感作を用いて、標的同定アッセイを行うことにより調査した。Caco2細胞(ヒトロタウイルスを用いた試験について)又はHeLa細胞(ヒトパピローマウイルスを用いた試験について)を24ウェルのプレートに播種した；播種の際、細胞をOSBP及びVAPAに特異的なsiRNAと共に(20nMの濃度で)トランスフェクションした。72時間後、siRNAを含んだ培地を取り除き、細胞をそれぞれのEC50に等しい濃度の25OHC又は27OHCで処理した。1日後、培地を取り除き、感染力アッセイ又は中和アッセイのプロトコルにおいて説明した条件と同一の時間、温度、及びMOI条件で、細胞にそれぞれのウイルスを接種した。感染した細胞の数を、以前の段落で説明したとおりに評価した。図13及び図14に示した結果により、OSBP及びVAPAの発現がサイレンシングされた細胞において、ヒトロタウイルス及びパピローマウイルスの感染力が部分的に阻害されることが示される。
【００７６】
特に、図13は、ヒトロタウイルスの感染力に対するOSBP及びVAP-Aのサイレンシングの効果を示す。25OHC及び27OHCの抗ウイルス活性は、OSBP (25HC OSBP-siRNA；27HC OSBP-siRNA)又はVAP-A (25HC VAPA-siRNA; 27HC VAPA-siRNA)の発現がサイレンシングされた細胞においてより高い(パネルA、B、D、E)。さらに、OSBP又はVAP-Aのサイレンシングのみ(NT-OSBP siRNA及びNT-VAPA siRNA)で、無処理対照(NT-no siRNA)に比してヒトロタウイルスの感染力の阻害を引き起こす(パネルC及びF)。
【００７７】
図14は、ヒトパピローマウイルスの感染力に対するOSBP及びVAP-Aのサイレンシングの効果を示す。25OHCの抗ウイルス活性は、OSBP (25HC+siRNA OSBP)又はVAP-A (25HC+siRNA VAPA)の発現がサイレンシングされた細胞においてより高い(パネルA及びB)。さらに、OSBP又はVAP-Aのサイレンシングのみ(siRNA OSBP及びsiRNA VAPA)で、無処理対照(nt)に比して、ヒトパピローマウイルスの感染力の阻害を引き起こす(パネルA及びB)。
【００７８】
さらに、トランスフェクションにより、細胞を処理に対してより感受性にして、パピローマウイルスに対する25OHCの、並びにロタウイルスに対する25OHC及び27OHCの、インビトロの有効性を向上させることができる。
【００７９】
（U18666Aを用いた抗ウイルスアッセイ）
以前に立てられた仮説によれば、オキシステロールは、エンドソームレベルで細胞内コレステロールの蓄積を決定し、ロタウイルスの侵入を阻害する。この仮説を確固たるものにするために、化合物U18666A (VWR INTERNATIONAL PBI SRL)の抗ウイルス活性をヒトロタウイル及びパピローマウイルスに対して評価した。U18666Aは、両親媒性ステロイドであり、コレステロールの細胞内輸送をブロックするために広く用いられ、その結果としてエンドソーム膜のレベルでこの物質の蓄積が起こる(31)。簡潔に言うと、抗ウイルスアッセイは、MA104細胞(ロタウイルスについて)又はHeLa細胞(パピローマウイルスについて)を、スカラー濃度のU18666A (0.07〜50μM)を用いて20時間処理し、その後それぞれのウイルスを1時間感染させて行った。2つのウイルスモデルの感染力に対する処理の効果を前述のとおり評価した。結果は、U18666Aがヒトパピローマウイルスに対して抗ウイルス活性を有し、マイクロモル濃度のEC50を有することを示す(表7)。したがって、記述した試験は、提唱した作用機序の原理の確実な証拠を構成する。
【００８０】
【表６】
0006599453.tif 000009
【００８１】
また、ヒトロタウイルスに対しても、U18666Aによる処理は、感染力の阻害を決定する；これらの試験では、抗ウイルス活性が非常に高いので、EC50の計算は不可能である。したがって、結果を図15に示す。全体として、これらのデータは、コレステロール細胞恒常性に対する作用が文献において公知である分子、U18666Aが、ロタウイルス及びパピローマウイルスに対して抗ウイルス活性を有することを実証し、最初に立てた仮説を確認する。
【００８２】
得られた結果に基づいて、25OHC及び27HCの抗ウイルス活性が、コレステロールの細胞内恒常性を変化させる(しかし細胞生存率を損なわない)能力に関連しており、VAPA及びOSBPにより媒介されるシグナル伝達経路に干渉し、ロタウイルス及びパピローマウイルスの宿主細胞への侵入をブロックすると結論付けることができる。したがって、これらの結果は、裸のウイルスに対するオキシステロールの全く新しい作用機序を提唱する。例えば、Roulinと仲間ら(32)は、25OHCが裸のウイルス(ライノウイルス)のゲノムの複製を阻害することができるが、宿主への侵入は阻害できないことを示している。これらのデータは、オキシステロールが異なるウイルスの科に対して異なる作用機序を有していることを示す；この肯定は、抗ウイルス剤の研究及び上市されている抗ウイルス薬の現在の概観にあてはめた場合、特に重要である：現在のところ、広い活性のスペクトルを有する(すなわち、エンベロープウイルス及び裸のウイルスのどちらに対しても活性である)、及び異なるウイルスに対して異なる作用機序を有する分子は存在しない。
【００８３】
【表７−Ａ】
0006599453.tif 000010
【表７−Ｂ】
0006599453.tif 000011
【表７−Ｃ】
0006599453.tif 000012
【表７−Ｄ】
0006599453.tif 000013
【表７−Ｅ】
0006599453.tif 000014
【表７−Ｆ】
0006599453.tif 000015
【表７−Ｇ】
0006599453.tif 000016
【図１】
0006599453.tif 000019
【図２】
0006599453.tif 000020
【図３】
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【図４】
0006599453.tif 000022
【図５】
0006599453.tif 000023
【図６】
0006599453.tif 000024
【図７】
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【図８】
0006599453.tif 000026
【図９】
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【図１０】
0006599453.tif 000028
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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