(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＰＲ８１のリガンドであるＬ−乳酸の単独重合体を有効成分として含み、
前記単独重合体は、生体内において分解されてＬ−乳酸を放出する単独重合体であり、
前記単独重合体は、次の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を満たす：
（ａ）ゲル浸透クロマトグラフィー法により測定されるポリスチレン換算の数平均分子量が３００〜１０００の範囲内である；
（ｂ）ゲル浸透クロマトグラフィー法による測定で得られるクロマトグラムにおいて、全面積に対する、ポリスチレン換算の分子量２５０〜２０００の範囲の面積の割合が７０％〜１００％の範囲内である；
（ｃ）ゲル浸透クロマトグラフィー法により測定される、ポリスチレン換算の数平均分子量に対するポリスチレン換算の重量平均分子量の比率として算出される分子量分布が、１．１〜３．０の範囲内である；
ことを特徴とする骨形成促進剤（ただし、ステレオコンプレックスを形成する液状のＬ−オリゴ乳酸及び液状のＤ−オリゴ乳酸と、リン酸カルシウム粉末または顆粒とを混合してなる骨補填材を除き、（Ｉ）乳酸及び／又はグリコール酸の重合体又は共重合体、（ＩＩ）乳酸及び／又はグリコール酸の重合体又は共重合体（Ａ）とポリエチレングリコール（Ｂ）との共重合体であって、当該成分（Ａ）の数平均分子量が４００〜５０００の範囲にあり、且つ成分（Ｂ）の数平均分子量が１５０〜２０００の範囲にある共重合体、（ＩＩＩ）骨形成因子を使用し、当該（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）を（Ｉ）／（ＩＩ）（重量比）で０．１５〜７．０の範囲で混合してなる医用組成物を除く。）。
【請求項２】
有効成分として前記Ｌ−乳酸の単独重合体のみを含む、
請求項１に記載の骨形成促進剤。
【請求項３】
流動性組成物である
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の骨形成促進剤。
【請求項４】
注入用組成物である
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の骨形成促進剤。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の骨形成促進剤を収容するリザーバ部と、
前記リザーバ部の前記骨形成促進剤を患者の患部に注入する注入部と、
を備えたことを特徴とする骨形成促進装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品として有用な骨形成促進剤及び当該骨形成促進剤を利用する骨形成促進装置に関し、とりわけＧＰＲ８１のリガンド、アゴニスト及びこれらの前駆体からなる群より選択される１以上を有効成分として含有する骨形成促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨再生が必要な骨疾患の治癒には、骨形成を促進させることが重要である。骨形成の四大要素は、（１）細胞、（２）基質、（３）ミネラルイオン、（４）制御因子であり、このうち制御因子として、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、デキサメタゾン、β−グリセロフォスフェート等が知られている（非特許文献１、２）。
【０００３】
従来、担体に担持された制御因子を含む組成物により骨形成を促進させるための技術が開発されてきた。例えば、特許文献１には、ＢＭＰ、グリセリルトリアセテートに代表されるグリセロールエステル類、及び担体からなる組成物が開示され、当該担体としてポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）等の生分解性ポリマーが列挙されている。また、特許文献２には、骨芽細胞増進分子としてＮ−アセチルシステイン、及び担体からなる組成物が開示され、当該担体としてポリ乳酸、ＰＬＧＡ等の生分解性ポリマーが列挙されている。
【０００４】
また、ポリ乳酸以外のポリマーを担体として用いた技術としては、例えば、特許文献３が挙げられる。特許文献３では、制御因子としてケイ素を、担体として延伸性を備えた３−ヒドロキシ酪酸（β−ヒドロキシ酪酸）と４−ヒドロキシ酪酸（γ−ヒドロキシ酪酸）との共重合体を用いている。
【０００５】
一方、整形外科や歯科口腔外科分野における骨折部の整復用材料として、高い強度を有し、骨接合用プレート、ピン、ビス、スクリュー等に加工できる高分子量のポリ乳酸又はＰＬＧＡが開示されている（特許文献４）。また、特許文献５には、βリン酸三カルシウム多孔体からなる微小顆粒を保持する膜部材としてポリ乳酸、ＰＬＧＡ等が用いられている。
【０００６】
近年、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）群が同定され、その中の１つであるＧＰＲ（Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）８１は脂肪細胞において特に多く認められるレセプターである。ＧＰＲ８１のリガンドが乳酸（特にはＬ−乳酸）であることは一般に知られているが、非特許文献３及び特許文献６によれば、ＧＰＲ８１のリガンドとしてＬ−乳酸以外にも多数の化合物が報告されている。非特許文献３及び特許文献６に記載のそれら化合物をまとめて列挙すると、Ｄ−乳酸、α−ヒドロキシ酪酸、γ−ヒドロキシ酪酸、α−ヒドロキシイソ酪酸、グリコール酸、α−ヒドロキシカプロン酸、マレイン酸、酒石酸、プロピオン酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、クロロフルオロジ酢酸、２−クロロプロピオン酸である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−３１６０５７号公報
【特許文献２】特表２００９−５４４４１１号公報
【特許文献３】特開２０１４−５０４４１号公報
【特許文献４】特開平１−１９８５５３号公報
【特許文献５】特開２０１２−２２３４４４号公報
【特許文献６】国際公開第２００８／０６３３２１号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】日本口蓋裂学会雑誌  Vol.16, No.4, p.169-179, 1991
【非特許文献２】日本再生歯科医学会誌  Vol.6, No.1, p.21-34, 2008
【非特許文献３】J.Biol.Chem.:Vol.284, No.5, p.2811-2822, 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、従来、担体に担持された制御因子を含む組成物による骨形成促進方法は、制御因子に適合する担体の選択、制御因子の放出特性の制御、担体の生分解性等の技術的課題が多いものであった。
【００１０】
特に、乳酸に注目した場合に、従来の乳酸の利用方法は、上述のように、制御因子の担体又は骨整復用の部材としての利用であった。そして、本願の出願人が知る限り、乳酸そのものの作用に着目して、骨形成の促進について検討した事例は未だ報告されていない。
【００１１】
また、特許文献３においても、担体であるβ−ヒドロキシ酪酸とγ−ヒドロキシ酪酸との共重合体は骨形成には関与しないことが比較例１において示されている。
【００１２】
本発明は、上記課題に鑑みて為されたものであり、骨形成を効果的に促進する骨形成促進剤及び骨形成促進装置を提供することをその目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る骨形成促進剤は、下記のとおりである。
［１］ＧＰＲ８１のリガンド、アゴニスト及びこれらの前駆体からなる群より選択される１以上を有効成分として含むことを特徴とする骨形成促進剤。
［２］前記リガンドは、乳酸、α−ヒドロキシ酪酸、γ−ヒドロキシ酪酸、α−ヒドロキシイソ酪酸、グリコール酸、α−ヒドロキシカプロン酸、マレイン酸、酒石酸及びプロピオン酸からなる群より選択される１以上である上記［１］記載の骨形成促進剤。
［３］前記リガンドは、乳酸である上記［１］又は［２］記載の骨形成促進剤。
［４］前記前駆体は、前記リガンド又は前記アゴニストを含む成分の重合体である上記［１］乃至［３］のいずれかに記載の骨形成促進剤。
［５］前記重合体は、次の（ａ）及び／又は（ｂ）を満たす：（ａ）ゲル浸透クロマトグラフィー法により測定されるポリスチレン換算の数平均分子量が３００〜２０００の範囲内である；（ｂ）ゲル浸透クロマトグラフィー法による測定で得られるクロマトグラムにおいて、全面積に対する、ポリスチレン換算の分子量２５０〜２０００の範囲の面積の割合が５０％〜１００％の範囲内である；上記［４］記載の骨形成促進剤。
［６］流動性組成物である上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の骨形成促進剤。
［７］注入用組成物である上記［１］乃至［６］のいずれかに記載の骨形成促進剤。
【００１４】
上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る骨形成促進装置は、下記のとおりである。
［８］上記［６］又は［７］に記載の骨形成促進剤を収容するリザーバ部と、前記リザーバ部の前記骨形成促進剤を患者の患部に注入する注入部と、を備えたことを特徴とする骨形成促進装置。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、骨形成を効果的に促進する骨形成促進剤及び骨形成促進装置が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】骨芽細胞におけるＧＰＲ８１の検出結果を示す（ウェスタンブロット法）。
【図２Ａ】試験１においてＬ−乳酸による石灰化促進効果をAlizarin Red S染色で確認した結果を示す（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）。
【図２Ｂ】試験１においてＬ−乳酸による石灰化促進効果を定量的に評価した結果を示す（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）。
【図３Ａ】試験２においてα−ヒドロキシ酪酸による石灰化促進効果をAlizarin Red S染色で確認した結果を示す（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）。
【図３Ｂ】試験２においてα−ヒドロキシ酪酸による石灰化促進効果を定量的に評価した結果を示す（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）。
【図４Ａ】試験３においてＬ−乳酸及びα−ヒドロキシ酪酸によるコラーゲン合成促進効果をウェスタンブロットで確認した結果を示す（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）。
【図４Ｂ】試験３においてＬ−乳酸及びα−ヒドロキシ酪酸によるＩ型コラーゲン合成促進効果を定量的に評価した結果を示す（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）。
【図４Ｃ】試験３においてＬ−乳酸及びα−ヒドロキシ酪酸によるＩＩＩ型コラーゲン合成促進効果を定量的に評価した結果を示す（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）。
【図５Ａ】試験４においてＬ−乳酸による石灰化促進効果をAlizarin Red S染色で確認した結果を示す（ＳＴ２細胞）。
【図５Ｂ】試験４においてＬ−乳酸による石灰化促進効果を定量的に評価した結果を示す（ＳＴ２細胞）。
【図６Ａ】試験５においてＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞におけるＭＣＴ１の存在を確認した結果を示す。
【図６Ｂ】試験５においてＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞におけるＭＣＴ１の存在を定量的に評価した結果を示す。
【図７Ａ】試験５においてＣＨＣ存在下でのＬ−乳酸による石灰化促進効果をAlizarin Red S染色で確認した結果を示す（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）。
【図７Ｂ】試験５においてＣＨＣ存在下でのＬ−乳酸による石灰化促進効果を定量的に評価した結果を示す（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）。
【図８Ａ】試験６−１においてｃＡＭＰ濃度を増加させたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に対するＬ−乳酸の石灰化促進効果をAlizarin Red S染色で確認した結果を示す。
【図８Ｂ】試験６−１においてｃＡＭＰ濃度を増加させたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に対するＬ−乳酸の石灰化促進効果を定量的に評価した結果を示す。
【図９Ａ】試験６−２においてGPR81-shRNA細胞に対するＬ−乳酸の石灰化促進効果をAlizarin Red S染色で確認した結果を示す。
【図９Ｂ】試験６−２においてGPR81-shRNA細胞に対するＬ−乳酸の石灰化促進効果を定量的に評価した結果を示す。
【図１０Ａ】試験７においてα−ヒドロキシイソ酪酸による石灰化促進効果をAlizarin Red S染色で確認した結果を示す（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）。
【図１０Ｂ】試験７においてα−ヒドロキシイソ酪酸による石灰化促進効果を定量的に評価した結果を示す（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）。
【図１１Ａ】試験８においてグリコール酸による石灰化促進効果をAlizarin Red S染色で確認した結果を示す（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）。
【図１１Ｂ】試験８においてグリコール酸による石灰化促進効果を定量的に評価した結果を示す（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）。
【図１２Ａ】試験９においてマレイン酸による石灰化促進効果をAlizarin Red S染色で確認した結果を示す（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）。
【図１２Ｂ】試験９においてマレイン酸による石灰化促進効果を定量的に評価した結果を示す（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）。
【図１３Ａ】試験１０においてＬ−乳酸及びα−ヒドロキシ酪酸による石灰化促進効果をAlizarin Red S染色で確認した結果を示す（ＳａＭ−１細胞）。
【図１３Ｂ】試験１０においてＬ−乳酸及びα−ヒドロキシ酪酸による石灰化促進効果を定量的に評価した結果を示す（ＳａＭ−１細胞）。
【図１４】試験１１においてゲル浸透クロマトグラフィー法による測定で得られたクロマトグラムを示す。
【図１５】試験１１における重合体を用いた動物実験で得られたＣＴ画像を示す。
【図１６】試験１１における重合体を用いた動物実験でＣＴ画像の骨再生部分のＣＴ値を評価した結果を示す。
【図１７】試験１２において用いた重合体のポリスチレン換算の数平均分子量（Ｍｎ）、重量平均分子量（Ｍｗ）及び分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）を示す。
【図１８】試験１２における重合体を用いた動物実験でｐＱＣＴ解析により算出されたＢＶ／ＴＶ値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下に、本発明の一実施形態について説明する。なお、本発明は本実施形態に限られるものではない。また、以下の説明において、ゲル浸透クロマトグラフィー法（以下、「ＧＰＣ法」という。）によって得られる分子量、数平均分子量（Ｍｎ）及び重量平均分子量（Ｍｗ）は、特に指摘しない限り、ポリスチレン換算のものを意味する。
【００１８】
本発明の発明者らは、骨形成促進に関わる種々の制御因子について研究する中で、骨芽細胞等の細胞培養試験において、ヒトの静脈血中における正常値の上限より高い濃度の乳酸又はα−ヒドロキシ酪酸の存在下で、石灰化が促進すること及びコラーゲンの産生量が増加することを見出した。そして、これら石灰化促進及びコラーゲン産生量増加の作用が、乳酸及びα−ヒドロキシ酪酸がリガンドとして作用するＧＰＲ８１を介在したものであることを突き止めた。さらに研究を進めた結果、ＧＰＲ８１のリガンドが骨形成における制御因子として作用することを見出した。本発明は、これら独自の知見に基づき為されたものである。すなわち、本発明は、骨形成促進に関し、ＧＰＲ８１のリガンド、アゴニスト及びこれらの前駆体が有する未知の属性・機能・作用を見出したことに基づく発明である。
【００１９】
次に、骨芽細胞においてＧＰＲ８１が存在することを確認した実験を紹介する。この実験では、骨芽細胞としてマウス骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を用い、１次抗体として抗マウスＧＰＲ８１抗体（ＳＩＧＭＡ社製、Anti-Mouse Gpr81-s296）を用い、ウェスタンブロット法で検出した。
【００２０】
まず、通常の方法でＧＰＲ８１の検出を試みたが、非特異的なバンドが多数検出された。そこで、ＧＰＲ８１をノックアウトしたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を対照として再度実験を行った。その結果、図１に示すように、３９．５ｋＤａ付近において、Wild Typeのレーン１ではバンドが検出されたのに対して、ノックアウト（GPR81 Knockout）のレーン２ではバンドが検出されなかった。この結果より、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞においてＧＰＲ８１が存在することが確認された。なお、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞においてＧＰＲ８１が存在することは、後述の実施例で説明する各種試験によっても直接・間接的に確認された。
【００２１】
本実施形態に係る骨形成促進剤（以下、「本剤」という。）は、ＧＰＲ８１のリガンド、アゴニスト及びこれらの前駆体からなる群より選択される１以上を有効成分として含む。すなわち、本剤は、患者の骨形成が必要な患部に投与されることにより、上記有効成分の作用によって、当該患部において骨形成を促進する。
【００２２】
このため本実施形態は、ＧＰＲ８１のリガンド、アゴニスト及びこれらの前駆体からなる群より選択される１以上の、骨形成促進剤の有効成分としての使用を含む。このように、本剤は、骨形成が必要な骨疾患を治療するために使用される。すなわち、本実施形態は、本剤を、患者の骨形成が必要な患部（例えば、骨欠損部）に投与することにより、当該患部における骨形成を促進することを含む、骨疾患の治療方法をも含む。
【００２３】
本剤に含まれるＧＰＲ８１のリガンドは、本剤が投与される生体内（例えば、血液中）に本来的に存在し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞のＧＰＲ８１に作用して骨形成効果を示す物質である。すなわち、このリガンドは、例えば、培養骨芽細胞に投与されることで、当該培養骨芽細胞における石灰化を促進する物質である。より具体的に、例えば、ヒト又はマウスの骨芽細胞培養系において、１ｍＭ〜８０ｍＭの範囲内の所定濃度で当該骨芽細胞における石灰化を促進する物質である。本剤は、１種のリガンドを含むこととしてもよいし、２種以上のリガンドを含むこととしてもよい。
【００２４】
ＧＰＲ８１のリガンドは、上述のとおり、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞のＧＰＲ８１に作用して骨形成効果を示す物質であれば特に限られないが、例えば、乳酸、α−ヒドロキシ酪酸、γ−ヒドロキシ酪酸、α−ヒドロキシイソ酪酸、グリコール酸、α−ヒドロキシカプロン酸、マレイン酸、酒石酸及びプロピオン酸からなる群より選択される１以上であることが好ましく、乳酸、α−ヒドロキシ酪酸、γ−ヒドロキシ酪酸、α−ヒドロキシイソ酪酸、グリコール酸及びα−ヒドロキシカプロン酸からなる群より選択される１以上であることがより好ましい。リガンドとしては、乳酸が好ましく用いられ、生体内に存在するＬ−乳酸が特に好ましく用いられる。なお、本実施形態において、「乳酸」との用語は、特に断らない限り、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、及びＤＬ−乳酸を総称する用語として使用される。
【００２５】
本剤に含まれるＧＰＲ８１のアゴニストは、当該ＧＰＲ８１のリガンドではないが、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞のＧＰＲ８１に作用して骨形成効果を示す、上記リガンドの類似体である。リガンドの類似体は、例えば、ＧＰＲ８１に作用するための分子構造（具体的には、例えば、ＧＰＲ８１に対する結合部分の分子構造）として、当該リガンドの分子構造に類似した構造を有する物質である。より具体的に、リガンドの類似体は、例えば、当該リガンドの分子構造に１以上の原子又は化学基が付加された分子構造、又は当該リガンドの分子構造に含まれる１以上の原子又は化学基が置換又は欠失された分子構造を有する物質である。リガンドの類似体は、当該リガンドの分子構造に化学修飾（例えば、当該リガンドの分子構造に対する、１以上の原子又は化学基の付加、置換又は欠失を含む化学修飾）を施すことにより合成された物質（リガンドの誘導体）であることとしてもよい。本剤は、１種のアゴニストを含むこととしてもよいし、２種以上のアゴニストを含むこととしてもよい。
【００２６】
本剤に含まれる前駆体は、ＧＰＲ８１のリガンド又はアゴニストの前駆体である。この前駆体は、生体内（具体的には、患者の患部）においてリガンド又はアゴニストを放出する物質である。前駆体は、例えば、生体内で分解されてリガンド又はアゴニストを放出する物質である。この場合、前駆体は、加水分解されてリガンド又はアゴニストを放出する物質であってもよい。これらの前駆体は、生体内において、リガンド又はアゴニストを徐放することにより、骨形成を効果的に促進する。リガンドの前駆体は、当該リガンドを放出するものであれば特に限られず、さらにアゴニスト等の他の成分を放出するものであってもよい。また、アゴニストの前駆体は、当該アゴニストを放出するものであれば特に限られず、さらにリガンド等の他の成分を放出するものであってもよい。
【００２７】
前駆体は、リガンド又はアゴニストを含む成分の重合体であることとしてもよい。この重合体は、単独重合体であってもよいし、共重合体であってもよい。すなわち、重合体は、１種のリガンド又はアゴニストから構成される成分の重合体（単独重合体）であってもよいし、１種のリガンド又はアゴニストと他の１種以上の成分との共重合体であってもよい。共重合体は、２種以上のリガンド及び／又はアゴニストを含む成分の重合体であってもよい。
【００２８】
具体的に、共重合体は、２種以上のリガンドを含む成分の重合体であってもよいし、２種以上のアゴニストを含む成分の重合体であってもよいし、１種以上のリガンドと１種以上のアゴニストとを含む成分の重合体であってもよい。共重合体は、その構成成分の全てがＧＰＲ８１のリガンド及び／又はアゴニストであることが好ましい。共重合体の種類は特に限られず、例えば、ランダム共重合、交互共重合、ブロック共重合、グラフト共重合のいずれであってもよい。
【００２９】
より具体的に、共重合体は、２種以上のリガンド及び／又はアゴニストを含む成分の重合体であれば特に限られないが、例えば、乳酸−グリコール酸共重合体、乳酸とポリエチレングリコールとの共重合体、乳酸−グリコール酸共重合体とポリエチレングリコールとの共重合体、乳酸−εカプロラクトン共重合体、乳酸−εカプロラクトン共重合体とポリエチレングリコールとの共重合体、乳酸−グリコール酸−εカプロラクトン共重合体、乳酸−グリコール酸−εカプロラクトン共重合体とポリエチレングリコールとの共重合体、及びグリコール酸−εカプロラクトン共重合体からなる群より選択される１以上であってもよい。
【００３０】
重合体としては、乳酸を含む成分の重合体が好ましく使用され、上述のような乳酸を含む成分の共重合体や、単独重合体であるポリ乳酸が好ましく使用される。Ｌ−乳酸は生体内に存在するため、当該Ｌ−乳酸を含む成分の重合体（例えば、ポリＬ−乳酸及び／又はＬ−乳酸を含む成分の共重合体）が特に好ましく使用される。
【００３１】
リガンド又はアゴニストを含む成分の重合体は、上述のとおり、生体内（具体的には、患者の患部）において分解されて当該リガンド又はアゴニストを放出する重合体であることが好ましい。すなわち、重合体は、加水分解されてリガンド又はアゴニストを放出する重合体であってもよい。分解可能（例えば、加水分解可能）な重合体は、生体内において、リガンド又はアゴニストを徐放することにより、骨形成を効果的に促進する。したがって、重合体は、患者の患部において、リガンド又はアゴニストを持続的に放出する分解能を有することが好ましい。すなわち、上述のとおり、骨芽細胞等の細胞培養試験において、ヒトの静脈血中における正常値の上限より高い濃度で、ＧＰＲ８１のリガンドである乳酸又はα−ヒドロキシ酪酸が存在することによって、石灰化及びコラーゲン産生が促進されることから、生体内、すなわち患者の患部においては、当該リガンドを恒常的に比較的高い局所濃度で存在させることが効果的と考えられる。なお、リガンド及びアゴニストは、その種類によって、十分な骨形成促進効果を示す濃度が異なるため、重合体の組成や、本剤の患部への投与量等を適宜調整することが好ましい。リガンドを含む成分の重合体は、分解されて当該リガンドを放出するものであれば特に限られず、さらにアゴニスト等の他の成分を放出するものであってもよい。また、アゴニストを含む成分の重合体は、分解されて当該アゴニストを放出するものであれば特に限られず、さらにリガンド等の他の成分を放出するものであってもよい。
【００３２】
重合体の重合度は２以上であれば特に限られない。すなわち、重合体は、重合度が２〜２０程度のオリゴマーであってもよいし、重合度が２０超のポリマーであってもよい。重合度が比較的小さい重合体は、生体内において比較的分解されやすいため、リガンド及び／又はアゴニストを効果的に徐放することができる。
【００３３】
重合体における、ＧＰＲ８１のリガンド及び／又はアゴニストに由来する構成成分の含有量（当該重合体がリガンドに由来する構成成分とアゴニストに由来する構成成分とを含む場合は、当該リガンドに由来する構成成分の含有量と、当該アゴニストに由来する構成成分の含有量との合計）は、本剤による骨形成促進効果が得られる範囲であれば特に限られないが、例えば、７０モル％以上であることとしてもよく、８０モル％以上であることが好ましく、９０モル％以上であることがより好ましい。
【００３４】
上述のように重合体が、ＧＰＲ８１のリガンド及び／又はアゴニストに由来する構成成分を主要構成成分として含む場合、当該重合体を有効成分として含む本剤を、患者の骨形成の促進が必要な骨疾患等の部位又はその近傍に投与することによって、骨形成を促進し、効果的な骨再生を図ることができる。
【００３５】
重合体は、次の（ａ）及び／又は（ｂ）を満たすこととしてもよい：（ａ）ＧＰＣ法により測定される数平均分子量が３００〜２０００の範囲内である；（ｂ）ゲル浸透クロマトグラフィー法による測定で得られるクロマトグラムにおいて、全面積に対する、分子量２５０〜２０００の範囲の面積の割合が５０％〜１００％の範囲内である。
【００３６】
また、上記（ａ）の条件は、ＧＰＣ法により測定される数平均分子量が３００〜１５００の範囲内であり、上記（ｂ）の条件は、ＧＰＣ法による測定で得られるクロマトグラムにおいて、全面積に対する、分子量２５０〜２０００の範囲の面積の割合が６０％〜１００％の範囲内であることが好ましい。
【００３７】
また、上記（ａ）の条件は、ＧＰＣ法により測定される数平均分子量が３００〜１０００の範囲内であり、上記（ｂ）の条件は、ＧＰＣ法による測定で得られるクロマトグラムにおいて、全面積に対する、分子量２５０〜２０００の範囲の面積の割合が７０％〜１００％の範囲内であることが特に好ましい。
【００３８】
上記（ａ）及び／又は（ｂ）を満たす重合体を有効成分として含む本剤は、骨形成促進が必要な部位又はその近傍に設置された場合において、当該重合体の分解によって、骨形成に資するリガンド及び／又はアゴニストを持続的に供給する（徐放する）ことができるという点で好ましい。
【００３９】
また、重合体は、ＧＰＣ法により測定される数平均分子量（Ｍｎ）に対する重量平均分子量（Ｍｗ）の比率として算出される分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）が、１．１〜３．０の範囲内であることが好ましい。
【００４０】
なお、本実施形態において、ＧＰＣ法による測定は、以下の条件で行う。
・測定装置：高速ＧＰＣ装置  ＨＬＣ−８１２０（東ソー株式会社製）
・ＧＰＣカラム：TSKgel G6000HXL、G5000HXL、G4000HXL、G2500HXL、G1000HXL、TSK guard column HXL-H（いずれも東ソー株式会社製、TSK guard column HXL-H以外は7.8mmI.D.×30cmL）
・ポリスチレン基準物質：F-128（1.09×106）、F-80（7.06×105）、F-40（4.27×105）、F-20（1.90×105）、F-10（9.64×104）、F-4（3.79×104）、F-2（1.81×104）、F-1（1.02×104）、A-5000（5.97×103）、A-2500（2.63×103）、A-1000（1.01×103）、A-500（5.0×102）（いずれも東ソー株式会社製）  ※（  ）内は分子量の代表的値
・カラム温度：４０℃付近の一定温度
・移動相：ＴＨＦ
・流量：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
【００４１】
本剤の形状は特に限られず、固形状、ゲル状、液状等、どのような形状であってもよいが、本剤は、流動性組成物であることが好ましい。すなわち、この場合、本剤は、流動性を有するため、患者の患部に投与する際の操作性に優れ、その結果、当該患部における骨形成を効果的に促進する。流動性組成物である本剤は、例えば、有効成分として、流動性を有する、ＧＰＲ８１のリガンド、アゴニスト及びこれらの前駆体からなる群より選択される１以上を含み、全体としても流動性を有する組成物であることとしてもよいし、有効成分として、流動性を有しない、ＧＰＲ８１のリガンド、アゴニスト及びこれらの前駆体からなる群より選択される１以上を含み、全体としては流動性を有する組成物（例えば、当該流動性を有しない有効成分と、流動性を有する他の成分（溶媒等）との混合物）であることとしてもよい。
【００４２】
具体的に、本剤は、例えば、リガンド又はアゴニストを含む成分の重合体を有効成分として含む流動性組成物であることとしてもよい。この場合、本剤は、患者の患部に投与する際の操作性に優れ、且つ当該患部において、リガンド及び／又はアゴニストを効果的に徐放することにより、骨形成を効果的に促進する。
【００４３】
さらに、本剤は、上記（ａ）及び／又は（ｂ）を満たす、リガンド又はアゴニストを含む成分の重合体等、それ自身が流動性を有する重合体を有効成分として含む流動性組成物であることとしてもよい。
【００４４】
ただし、本剤は、上述のとおり、それ自身が流動性を有しない重合体を有効成分として含む流動性組成物であってもよい。具体的に、本剤は、固形状の重合体の微粒子を有効成分として含む流動性組成物（例えば、当該固形状の重合体の微粒子と、他の液状成分（例えば、溶媒）とを含む懸濁液である流動性組成物）であってもよい。
【００４５】
本剤は、本発明の効果を損なわない範囲内において、上述した有効成分以外の成分を含むこととしてもよい。具体的に、本剤は、薬理学的に許容される各種の材料、例えば、担体、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤及び骨補填材からなる群より選択される１以上をさらに含んでもよい。骨補填材は特に限られないが、例えば、ハイドロキシアパタイト、リン酸カルシウムセメント及びβ−リン酸三カルシウムからなる群より選択される１以上が使用されてもよい。
【００４６】
本剤の剤形は、当該本剤に含まれる有効成分の特性や、当該本剤の投与方法等の条件に応じて適宜設計されれば特に限られず、例えば、液剤（溶液、懸濁液、エマルジョン等を含む）、注射剤、散剤、顆粒剤、錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、カプセル剤、徐放剤、リポソーム製剤であることとしてもよい。
【００４７】
本剤を患者の骨形成の促進が必要な部位に投与する方法として、例えば、注射器等の注入器具を使用して当該部位に本剤を注入する方法、及び／又は切開された当該部位に本剤を埋め込む方法が挙げられる。また、状況に応じて、骨形成の促進が必要な部位の近傍に投与してもよい。患者に対する負担を軽減する観点からは、切開を伴わない注入による投与方法を用いることが望ましい。
【００４８】
この点、本剤は、注入用組成物であることが好ましい。注入用組成物である本剤の剤形は、ゲル状、液状又は懸濁液が好ましい。すなわち、本剤は、注入用の流動性組成物であることが好ましい。この場合、本剤は、上述した流動性組成物であって、且つ患者の患部に注入される組成物である。具体的に、本剤は、例えば、それ自身が流動性を有する重合体を有効成分として含む、ゲル状又は液状の注入用流動性組成物であることとしてもよい。また、本剤は、例えば、固形状の重合体（それ自身は流動性を有しない重合体）の微粒子を含む懸濁液である、注入用流動性組成物であることとしてもよい。
【００４９】
また、本実施形態は、流動性組成物又は注入用組成物である本剤を収容するリザーバ部と、当該リザーバ部の当該本剤を患者の患部に注入する注入部と、を備えた骨形成促進装置（以下、「本装置」という。）を含む。すなわち、この場合、本装置を用いた注入により、本剤を患者の患部に投与する。
【００５０】
本装置を用いた投与における本剤の供給方法は、患部における骨形成が促進される限りにおいて、連続的供給であってもよいし、間欠的供給であってもよい。すなわち、本装置が、本剤を収容するタンク又はバッグを含むリザーバ部と、一方端が当該リザーバ部に接続され、他方の先端部に注射針等の挿入部を備えた送液管を含む注入部とを備える場合、当該注射針を患部に挿入して、重力を利用した自然落下により、本剤を連続的に当該患部に供給することとしてもよい。
【００５１】
また、本装置が、さらに輸液ポンプ等の送液機器を含む注入部を備える場合には、当該送液機器を作動させることにより、本剤を連続的に又は間欠的に当該患部に供給することとしてもよい。
【００５２】
注入部は、患部における本剤の拡散度、本剤の供給方法等の諸条件を考慮して、形状、材質等を適宜選択することが望ましい。例えば、ノズルの先端にスポンジ状のものを取り付けてもよい。先端部を長期に体内に留置するときは、生分解性の材質のものを用いてもよい。本装置に用いる各機器は、医療用のものから選択することが好ましい。また、注入時に必要に応じて適度に加温することも好ましい。
【００５３】
本剤の作用機序の詳細は明らかではないが、後述の実施例で示すように、ＧＰＲ８１のリガンド、アゴニスト又はこれらの前駆体が骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用することによって、石灰化が促進されるものと推定される。したがって、本剤は、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、石灰化を促進する化合物を有効成分として含有する骨形成促進剤であって、当該化合物がＧＰＲ８１のリガンド、アゴニスト及びこれらの前駆体からなる群より選択される１以上であることを特徴とするものである、ともいえる。骨芽細胞に分化し得る細胞に関しては、ＧＰＲ８１のリガンド、アゴニスト又はこれらの前駆体が当該細胞の分化・成熟にも関与している可能性が考えられる。ここで、骨芽細胞に分化し得る細胞としては、骨芽細胞への分化能を有する細胞であれば特に限られず、例えば、骨芽前駆細胞、間葉系幹細胞、間質細胞及び筋芽細胞からなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。
【実施例】
【００５４】
次に、本実施形態に係る具体的な実施例について説明する。なお、本発明は、以下に示す実施例に限定されるものではない。また、以下の実施例においては、特に断らない限り％は全て質量％を示す。また、以下に示すグラフにおいて、「*」は有意水準５％未満、「**」は有意水準１％未満、「***」は有意水準０．１％未満での有意差を示す（Studentのt検定）。以下に示すグラフにおいて比較対象の図示が無い場合は、Control群との間に有意差があったことを示す。
【００５５】
［試験１：細胞培養試験／石灰化促進／Ｌ−乳酸／ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞］骨芽細胞として、マウス骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を用いて、Ｌ−乳酸が石灰化に及ぼす影響について検討した。試験には、２４ウェルプレートを用い、１ウェル当たりの細胞数は、１×１０４個とした。
【００５６】
培地として、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸と、１０ｍＭのβ-グリセロリン酸と、１０ｍＭのＨＥＰＥＳとを添加したα−ＭＥＭを用いた。この培地に、Ｌ−乳酸を終濃度が４０ｍＭとなるように添加するとともに、ｐＨを、インキュベーター内での５％ＣＯ２の気相下で平衡化した時に、血中の正常範囲である７．４になるように１０Ｎ水酸化ナトリウムで調整後、１０％ウシ胎児血清を添加して使用した（以下の試験でも同様）。なお、Ｌ−乳酸の４０ｍＭという濃度は、ヒトの静脈血中におけるＬ−乳酸の正常値上限である２ｍＭ（１８ｍｇ／ｄＬ）よりも高濃度である。
【００５７】
マルチウエル培養プレート（24well）の各ウェル内の骨芽細胞における石灰化部分を、培養２１日後にはAlizarin Red S染色により、また、培養２４日後にはvon Kossa染色により、それぞれ１ウェルあたりの染色強度で評価した。一方、比較例として、Ｌ−乳酸以外の有機酸の作用を調べるため、乳酸脱水素酵素によって乳酸と相互変換の関係にあるピルビン酸（終濃度４０ｍＭ）をＬ−乳酸に代えて添加した以外は同様にして調製された培地も使用した。また、他の比較例として、Ｌ−乳酸及びピルビン酸のいずれも添加しない以外は同様にして調製された培地（Control）も使用した（以下の試験でも同様）。
【００５８】
図２Ａには、石灰化部分を染色した結果を示す。図２Ｂには、図２Ａに示すAlizarin Red S染色された石灰化部分における染色の強さを定量化した結果を示す（各群の試験数は３個）。この定量化は、染色後のウェルをデジタルカメラで撮影して得られた写真を、デンシトメーターで数値化することにより行った。図２Ｂにおいて、縦軸は、Controlを１としたときの相対値である（以下の同様のグラフにおいても同じ）。
【００５９】
図２Ａ及び図２Ｂより、Ｌ−乳酸添加群（ＬＡ）ではControl群に比べて有意に高い石灰化促進が認められた。すなわち、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞において、Ｌ−乳酸が石灰化を促進することが確認された。これに対し、ピルビン酸添加群（ＰＡ）ではむしろ石灰化が抑制された。
【００６０】
［試験２：細胞培養試験／石灰化促進／α−ヒドロキシ酪酸／ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞］培地にＬ−乳酸に代えてα−ヒドロキシ酪酸を添加した以外は、試験１と同様の条件でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を培養した。培地におけるα−ヒドロキシ酪酸の終濃度は、１０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭとした。また、ポジティブコントロールとして、試験１と同様に、Ｌ−乳酸を終濃度４０ｍＭで添加した培地を使用してＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を培養した（Ｌ−乳酸添加群）。培養２１日後に石灰化部分をAlizarin Red S染色にて評価した（以下の試験では、同様に、石灰化の評価として、Alizarin Red S染色を用いた。）。
【００６１】
図３Ａには、石灰化部分を染色した結果を示す。図３Ｂには、図２Ｂと同様に、図３Ａに示す石灰化部分における染色の強さを定量化した結果を示す。図３Ａ及び図３Ｂより、α−ヒドロキシ酪酸（α−ＨＢ）の４０ｍＭ添加群では、Ｌ−乳酸添加群（ＬＡ）と同等の高い石灰化促進が認められた。すなわち、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞において、Ｌ−乳酸及びα−ヒドロキシ酪酸が石灰化を促進することが確認された。
【００６２】
［試験３．細胞培養試験／コラーゲン合成／Ｌ−乳酸及びα−ヒドロキシ酪酸／ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞］ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞において、Ｌ−乳酸及びα−ヒドロキシ酪酸がコラーゲン合成に及ぼす影響について検討した。試験には、６ウェルプレートを用い、１ウェル当たりの細胞数を４×１０４個とした以外は、試験１と同様の条件で試験を行った。なお、Ｌ−乳酸及びα−ヒドロキシ酪酸の終濃度はそれぞれ４０ｍＭとした。
【００６３】
Ｌ−乳酸又はα−ヒドロキシ酪酸の添加１２日後のコラーゲン発現量をウェスタンブロット法により調べた。なお、ＧＡＰＤＨをloading controlとして用いた。
【００６４】
図４Ａには、ウェスタンブロット法で得られたバンドの画像を示す。図４Ｂには、図４Ａに示すＩ型コラーゲンのバンドを定量化した結果を示す。図４Ｃには、図４Ａに示すＩＩＩ型コラーゲンのバンドを定量化した結果を示す。
【００６５】
図４Ａ、図４Ｂ及び図４Ｃより、Ｌ−乳酸添加群（ＬＡ）及びα−ヒドロキシ酪酸添加群（α−ＨＢ）のいずれにおいても、Control群に比べて、Ｉ型コラーゲン、及びＩ型コラーゲン線維形成の足場として先行して合成されるＩＩＩ型コラーゲンの発現量が有意に高かった。この結果より、Ｌ−乳酸及びα−ヒドロキシ酪酸がそれぞれ骨芽細胞によるコラーゲン合成を促進することが確認された。
【００６６】
骨組織においては特にＩ型コラーゲンが多く存在し、コラーゲンが石灰化の基質になるなど骨形成においてコラーゲンが重要な役割を果たしていることが知られている。上述の結果より、Ｌ−乳酸及びα−ヒドロキシ酪酸による石灰化機序の１つとして、コラーゲン合成の促進が寄与しているものと考えられた。
【００６７】
［試験４：細胞培養試験／石灰化促進／Ｌ−乳酸／ＳＴ２細胞］ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に代えて、当該ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞より未分化なマウス骨髄間質細胞株ＳＴ２を用いた以外は試験１と同様の条件で試験を行った。ただし、ピルビン酸添加の試験例は設けなかった。また、ＳＴ２細胞は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に比べると石灰化速度が遅いため、添加４０日後に石灰化を評価した。
【００６８】
図５Ａには、石灰化部分をAlizarin Red S染色した結果を示す。図５Ｂには、図５Ａに示す石灰化部分における染色の強さを定量化した結果を示す。図５Ａ及び図５Ｂより、ＳＴ２細胞においても、Ｌ−乳酸添加群（１０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭ）において、Control群に比べて有意に高い石灰化促進が認められた。この結果より、骨芽細胞だけでなく、骨芽細胞に分化し得る細胞においても、Ｌ−乳酸によって石灰化が促進されることが確認された。
【００６９】
［試験５＆６：細胞培養試験／骨芽細胞における石灰化促進の作用機序の検証］骨芽細胞に乳酸が作用する経路として、ＭＣＴ１（Monocarboxylate Transporter 1)とＧＰＲ８１とがある。そこで、ＭＣＴ１及びＧＰＲ８１のいずれが石灰化促進に関与しているかについて検証した。
【００７０】
［試験５：ＭＣＴ１に関する検証］まず、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞におけるＭＣＴ１の存在を確認するために、ウェスタンブロットを行った。図６Ａには、ウェスタンブロット法で得られたバンドの画像を示す。図６Ｂには、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞におけるＭＣＴ遺伝子発現量を逆転写後にリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）にて定量化した結果を示す。図６Ａ及び図６Ｂに示すように、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞においてＭＣＴ１の存在が確認された。
【００７１】
次に、ＭＣＴ１のインヒビターであるＣＨＣ(α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid)をＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に作用させた以外は、試験１と同様の条件でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を培養し、Ｌ−乳酸添加２１日後にAlizarin Red S染色を行った。なお、Ｌ−乳酸の終濃度は４０ｍＭとした。
【００７２】
図７Ａには、Ｌ−乳酸添加２１日後に石灰化部分をAlizarin Red S染色した結果を示す。図７Ｂには、図７Ａに示す石灰化部分における染色の強さを定量化した結果を示す。図７Ａ及び図７Ｂより、Ｌ−乳酸による石灰化促進効果のＣＨＣ添加による阻害は小さかった。よって、Ｌ−乳酸による石灰化促進効果は、ＭＣＴ１を介したものである可能性が小さいことが示唆された。
【００７３】
［試験６−１：ｃＡＭＰを用いたＧＰＲ８１に関する検証］ＧＰＲ８１に乳酸が作用すると、細胞内ではAdenylyl Cyclase活性の低下によりＡＴＰからのｃＡＭＰへの代謝が抑制され、その結果として細胞内ｃＡＭＰ濃度が低下することが知られている。そこで、ｃＡＭＰとしてｃＡＭＰの細胞膜透過型アナログであるＣＰＴ−ｃＡＭＰを用いることにより細胞内ｃＡＭＰ濃度を維持させた場合に、乳酸による石灰化促進作用が減弱される可能性について検証した。すなわち、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞内にＣＰＴ−ｃＡＭＰを導入した後、試験１と同様の条件でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を培養した。なお、Ｌ−乳酸及びα−ヒドロキシ酪酸の終濃度は、それぞれ４０ｍＭとした。
【００７４】
図８Ａには、Ｌ−乳酸又はα−ヒドロキシ酪酸の添加２１日後に石灰化部分をAlizarin Red S染色した結果を示す。図８Ｂには、図８Ａに示す石灰化部分における染色の強さを定量化した結果を示す。
【００７５】
図８Ａ及び図８Ｂより、ＣＰＴ−ｃＡＭＰを導入した系において、Ｌ−乳酸添加群（ＬＡ）及びα−ヒドロキシ酪酸添加群（α−ＨＢ）の石灰化促進効果はControl群よりも有意に低かった。
【００７６】
［試験６−２：ＧＰＲ８１の発現減少による検証］試験５及び試験６−１によって、Ｌ−乳酸による石灰化促進効果はＧＰＲ８１を介したものである可能性が示唆されたが、さらにＧＰＲ８１の関与を確かめるため、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）により制御されるＲＮＡ干渉法を用いて検証した。すなわち、ＤｏｘによってＧＰＲ８１に対するｓｈＲＮＡを発現させるためのｓｈＲＮＡ発現ベクターを構築し、これをＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に導入し、ｓｈＲＮＡが安定発現するクローン細胞株（ＧＰＲ８１−ｓｈＲＮＡ細胞）を作製した。得られたＧＰＲ８１−ｓｈＲＮＡ細胞は、Ｄｏｘ添加時にのみＧＰＲ８１の発現が低下する反応を示すことも確認した。
【００７７】
ＧＰＲ８１−ｓｈＲＮＡ細胞を用いて、Ｄｏｘの存在下又は非存在下におけるＬ−乳酸による石灰化促進効果について、試験１と同様の条件で試験を行った。なお、Ｌ−乳酸の終濃度は４０ｍＭとした。
【００７８】
図９Ａには、Ｌ−乳酸の添加２１日後に石灰化部分をAlizarin Red S染色した結果を示す。図９Ｂには、図９Ａに示す石灰化部分における染色の強さを定量化した結果を示す。
【００７９】
図９Ａ及び図９Ｂより、Ｄｏｘ非存在下のＬ−乳酸添加群（Ｄｏｘ：−、ＬＡ：＋）では有意な石灰化促進効果が認められた。これに対し、Ｄｏｘ存在下のＬ−乳酸添加群（Ｄｏｘ：＋、ＬＡ：＋）では石灰化促進効果が認められなかった。
【００８０】
試験５、試験６−１及び試験６−２の結果より、Ｌ−乳酸による石灰化促進は、ＭＣＴ１を介したＬ−乳酸の細胞内への取り込みではなく、Ｌ−乳酸がＧＰＲ８１に作用して起こったものであることが確認された。
【００８１】
［試験７：細胞培養試験／石灰化促進／α−ヒドロキシイソ酪酸／ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞］Ｌ−乳酸に代えてα−ヒドロキシイソ酪酸を使用した以外は試験１と同様の条件でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を培養した。α−ヒドロキシイソ酪酸の終濃度は、１０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭ又は８０ｍＭとした。また、ポジティブコントロールとして、Ｌ−乳酸添加群（終濃度：４０ｍＭ）についても試験を行った。
【００８２】
図１０Ａには、α−ヒドロキシイソ酪酸又はＬ−乳酸の添加２１日後に石灰化部分をAlizarin Red S染色した結果を示す。図１０Ｂには、図１０Ａに示す石灰化部分における染色の強さを定量化した結果を示す。
【００８３】
図１０Ａ及び図１０Ｂより、２０ｍＭ〜８０ｍＭのα−ヒドロキシイソ酪酸添加群（α−Ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ  Ａｃｉｄ）において、Ｌ−乳酸添加群（ＬＡ）と同様、Control群よりも有意な石灰化促進効果が認められ、当該石灰化促進効果は、特に４０ｍＭにおいて顕著であった。
【００８４】
［試験８：細胞培養試験／石灰化促進／グリコール酸／ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞］Ｌ−乳酸に代えてグリコール酸を使用した以外は試験１と同様の条件でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を培養した。グリコール酸の終濃度は、１０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭ又は８０ｍＭとした。また、ポジティブコントロールとして、Ｌ−乳酸添加群（終濃度：４０ｍＭ）についても試験を行った。
【００８５】
図１１Ａには、グリコール酸又はＬ−乳酸の添加２１日後に石灰化部分をAlizarin Red S染色した結果を示す。図１１Ｂには、図１１Ａに示す石灰化部分における染色の強さを定量化した結果を示す。
【００８６】
図１１Ａ及び図１１Ｂより、１０ｍＭ及び２０ｍＭのグリコール酸添加群（Ｇｌｙｃｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ）において、Ｌ−乳酸添加群（ＬＡ）と同様、Control群よりも有意な石灰化促進効果が認められ、当該石灰化促進効果は、特に２０ｍＭにおいて顕著であった。
【００８７】
［試験９．細胞培養試験／石灰化促進／マレイン酸／ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞］Ｌ−乳酸に代えてマレイン酸を使用した以外は試験１と同様の条件でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を培養した。マレイン酸の終濃度は、０．６３ｍＭ、１．２５ｍＭ、２．５ｍＭ又は５ｍＭとした。また、ポジティブコントロールとして、Ｌ−乳酸添加群（終濃度：４０ｍＭ）についても試験を行った。
【００８８】
図１２Ａには、マレイン酸又はＬ−乳酸の添加２１日後に石灰化部分をAlizarin Red S染色した結果を示す。図１２Ｂには、図１２Ａに示す石灰化部分における染色の強さを定量化した結果を示す。図１２Ａ及び図１２Ｂより、１．２５ｍＭ、２．５ｍＭ及び５ｍＭのマレイン酸添加群（Ｍａｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）において、Ｌ−乳酸添加群（ＬＡ）と同様、Control群よりも有意な石灰化促進効果が認められた。
【００８９】
［試験１０：細胞培養試験／石灰化促進／Ｌ−乳酸及びα−ヒドロキシ酪酸／ＳａＭ−１細胞］骨芽細胞として、ヒト骨芽細胞株ＳａＭ−１を用いて、Ｌ−乳酸及びα−ヒドロキシ酪酸がヒト骨芽細胞における石灰化に及ぼす影響について検討した。試験には、２４ウェルプレートを用い、１ウェル当たりの細胞数は、３×１０４個とした。
【００９０】
なお、ＳａＭ−１細胞は、東京都老人総合研究所の腰原康子氏が樹立したヒト骨芽細胞株である。本試験では、愛知学院大学歯学部薬理学の戸苅彰史氏より分与されたＳａＭ−１細胞を使用した。
【００９１】
培地として、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸と、１０ｍＭのβ-グリセロリン酸と、１０ｍＭのＨＥＰＥＳとを添加したα−ＭＥＭを用いた。この培地に、Ｌ−乳酸又はα−ヒドロキシ酪酸を終濃度が２０ｍＭ又は４０ｍＭとなるように添加するとともに、ｐＨを、インキュベーター内での５％ＣＯ２の気相下で平衡化した時に、血中の正常範囲である７．４になるように１０Ｎ水酸化ナトリウムで調整後、１０％ウシ胎児血清を添加して使用した。
【００９２】
図１３Ａには、石灰化部分をAlizarin Red S染色した後の培養ＳａＭ−１細胞の位相差顕微鏡写真を示す。図１３Ｂには、図１３Ａに示す位相差顕微鏡画像において石灰化部分を示すノズール（nodule）の数をウェルあたりでカウントした結果を示す。図１３Ａ及び図１３Ｂより、Ｌ−乳酸（ＬＡ）及びα−ヒドロキシ酪酸（α−ＨＢ）のいずれもが、ヒト骨芽細胞における石灰化を促進することが確認された。
【００９３】
［細胞培養試験のまとめ］以上の骨芽細胞を用いた細胞培養試験によって、ＧＰＲ８１の様々なリガンドが、当該骨芽細胞における石灰化及びコラーゲン合成を促進することが確認された。
【００９４】
［試験１１：動物実験（１）／重合体を用いた骨再生試験］まずＬ−乳酸の重合体を作製した。すなわち、温度計、窒素導入管を備えた内容積１００ｍＬの反応容器に、Ｌ−乳酸（Ｐｕｒａｃ製）６０ｇを加え、２００ｍＬ／分の窒素気流下、１８５℃で１時間重合化反応させた。その後、得られた重合体を、その濃度が１０ｗ／ｖ％となるようにアセトンに溶解し、体積比で約４倍量のヘキサン中で析出させることにより精製処理を行い、ポリＬ−乳酸（以下「ＰＬ１」という）４８ｇを得た。ＰＬ１をＧＰＣ法によって測定したところ、数平均分子量は５１０（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．２）であった。ＰＬ１は、粘性のあるゲル状であり、流動性を有する組成物であった。
【００９５】
図１４には、ＧＰＣ法による測定で得られたＰＬ１のクロマトグラムを示す。ＰＬ１について、図１４に示すクロマトグラムにおける、全面積に対する、分子量２５０〜２０００の範囲の面積の割合は、９９．６％であった。この面積の割合は、ＧＰＣ測定装置に内蔵の方法によって求めた。すなわち、ＧＰＣ測定装置による上記面積の割合の算出方法の概要は次のとおりである：（ｉ）まず、ポリスチレン基準物質により作成された校正曲線において、分子量２５０に該当する溶出時間及び分子量２０００に該当する溶出時間を取得する；、及び（ｉｉ）次いで、測定対象のポリマーについて得られたクロマトグラムにおいて、上記（ｉ）で取得した２つの溶出時間の各々と一致する溶出時間を取得し、（ｉｉｉ）さらに、当該クロマトグラム上の当該２つの溶出時間の垂線で区切られた部分の面積を全面積で除することにより、上記面積の割合を算出する。
【００９６】
また、反応時間を１．５時間とした以外は、ＰＬ１の場合と同様にして、ポリＬ−乳酸（以下「ＰＬ２」という）４９ｇを得た。ＰＬ２の数平均分子量は９７０（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．４）であった。また、ＧＰＣ法による測定で得られたＰＬ２のクロマトグラムにおける、全面積に対する、分子量２５０〜２０００の範囲の面積の割合は、８１．１％であった。ＰＬ２は、脆い固体であった。
【００９７】
なお、数平均分子量が１５７０（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．５）のポリＬ−乳酸も作製したが、当該ポリＬ−乳酸は硬い固体であったため、投与する上で必ずしも好ましくないとの判断により、使用しなかった。ただし、このように硬い固体のポリＬ−乳酸であっても、例えば、粉砕して微粒子とすることにより、投与することが可能である。
【００９８】
動物実験は、奥羽大学動物実験規程に従って実施した。エストロゲンの影響をできるだけ排除するために、閉経後の高齢雌ラット（ＳＤラット（日本クレア株式会社）  平均体重：４５５．９±９．５ｇ）を用いた。また、荷重負荷による骨形成の影響をできるだけ排除するために、頭蓋骨で試験を行った。
【００９９】
ラット９頭を用い、各ラットの頭蓋骨に歯科用ドリルで孔径２ｍｍの孔を空けた。３頭はControl群としてそのまま切開部を縫合して閉じた。残り６頭については、３頭の孔の近傍に０．１ｇのＰＬ１を埋め込み、他の３頭の孔の近傍に０．１ｇのＰＬ２を埋め込んだ後、それぞれ切開部を縫合して閉じた。なお、ＰＬ１は流動性を有していたが、注射器は使用せず、孔の近傍に埋め込んだ。固体の粒子であったＰＬ２は、そのまま孔の近傍に埋め込んだ。３０日後にラットを屠殺し、試験部位を肉眼及びＣＴ（東芝ＩＴコントロールシステム株式会社製  Ｘ線ＣＴ装置  TOSCANER  32251μhd）で評価した。
【０１００】
肉眼による評価では、Control群のラットでは孔の大きさにほとんど変化が無く、骨形成、骨再生の痕跡がほとんど認められなかった。これに対し、ＰＬ１群とＰＬ２群のラットでは孔が粗造な石灰化物（新生骨の可能性も考えられた）によって塞がれており、また、孔の大きさも外周部からの骨形成、骨再生によって小さくなっていた。また、ＰＬ１群及びＰＬ２群において、ＰＬ１及びＰＬ２による切開部周辺組織の損傷は認められなかった。すなわち、例えば、ＰＬ１及びＰＬ２の分解によって周辺組織の局所ｐＨが急激に低下して細胞が損傷を受けたといった問題は認められなかった。
【０１０１】
図１５には、Control群、ＰＬ１を使用した例、及びＰＬ２を使用した例のそれぞれについて、ＣＴによる画像を示す。図１６には、図１５に示す画像における再生部分のＣＴ値をグラフ化した結果を示す。なお、Control群のＣＴ値は約７５であったが、これは軟組織等が埋入したためであった。図１６には、参考として、Control群、ＰＬ１を使用した例、及びＰＬ２を使用した例に加え、軟組織（Soft Tissue）及び骨（Bone）のそれぞれのＣＴ値も示す。
【０１０２】
以上の動物実験の結果より、分解能の高い乳酸ポリマーによる骨形成、骨再生の作用効果が生体において認められた。
【０１０３】
［試験１２：動物実験（２）／重合体を用いた骨再生試験］まずＬ−乳酸の重合体を作製した。すなわち、試験１１と同様にして、図１７に示すように、ＧＰＣ法により測定される数平均分子量が異なる７種類のポリＬ−乳酸を得た。なお、図１７には、各ポリＬ−乳酸サンプルについて、数平均分子量（Ｍｎ）、重量平均分子量（Ｍｗ）、当該数平均分子量（Ｍｎ）に対する当該重量平均分子量（Ｍｗ）の比率（Ｍｗ／Ｍｎ）、及びＧＰＣ法による測定で得られたクロマトグラムにおける、全面積に対する、分子量２５０〜２０００の範囲の面積の割合（％）を示す。
【０１０４】
なお、図１７において、「Ｌ−１００−０．５」は、上述の試験１１で使用したＰＬ１と同一のポリＬ−乳酸であった。また、「Ｌ−１００−０．５」、「ＯＬＡ−１００１」、「ＯＬＡ−１００２」及び「ＯＬＡ−１００４」は、粘性のあるゲル状であり、流動性を有する組成物であった。「ＯＬＡ−１００１」は、分子量が２５０未満の割合が大きかったため、ＧＰＣ法による測定で得られたクロマトグラムにおける、全面積に対する、分子量２５０〜２０００の範囲の面積の割合が比較的小さくなった。
【０１０５】
動物実験は、試験１１と同様、奥羽大学動物実験規程に従って実施した。エストロゲンの影響をできるだけ排除するために、閉経後の高齢雌ラット（ＳＤラット（日本クレア株式会社）  平均体重：５３９．１±１１．２ｇ）を用いた。また、荷重負荷による骨形成の影響をできるだけ排除するために、頭蓋骨で試験を行った。
【０１０６】
ラット４０頭を用い、各ラットの頭蓋骨に歯科用ドリルで孔径２ｍｍの孔を空けた。５頭はControl群としてそのまま切開部を縫合して閉じた。残り３５頭については、５頭ずつの７つのグループに分け、各グループにおいて、図１７に示す７種類のポリＬ−乳酸のそれぞれを、上述の試験１１と同様、５頭の孔の近傍に０．１ｇずつ投与した後、それぞれ切開部を縫合して閉じた。
【０１０７】
３０日後にラットを屠殺し、試験部位をｐＱＣＴ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｄ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）装置（ＳＴＲＡＴＥＣ社製、ＸＣＴ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＳＡ＋）で解析した。
【０１０８】
具体的に、各試験部位について、計測領域の体積（ＴＶ）に対する、当該計測領域における石灰化物の体積（ＢＶ）の割合（％）をＢＶ／ＴＶ値として算出した。試験部位が完全に閉塞された場合、ＢＶ／ＴＶ値は１００％となる。
【０１０９】
なお、計測領域の体積（ＴＶ）は、試験部位における直径２．００ｍｍ、高さ１．７２ｍｍのシリンダー状領域の体積とした。また、ｐＱＣＴ解析においては、軟組織由来のバックグラウンドを考慮して、計測を行った。
【０１１０】
図１８には、ｐＱＣＴ解析により算出されたＢＶ／ＴＶ値を示す。図１８において、「Ｃｏｎｔ」は、ポリＬ−乳酸を使用しなかったControl群の結果を示し、「Ｌ−１００−０．５」は、数平均分子量が５１０のポリＬ−乳酸を使用した例の結果を示し、「ＯＬＡ−１００１」は、数平均分子量が３２０のポリＬ−乳酸を使用した例の結果を示し、「ＯＬＡ−１００２」は、数平均分子量が４２０のポリＬ−乳酸を使用した例の結果を示し、「ＯＬＡ−１００４」は、数平均分子量が５６０のポリＬ−乳酸を使用した例の結果を示し、「ＯＬＡ−１００６」は、数平均分子量が７１０のポリＬ−乳酸を使用した例の結果を示し、「ＯＬＡ−１００７」は、数平均分子量が７７０のポリＬ−乳酸を使用した例の結果を示し、「ＯＬＡ−１００８」は、数平均分子量が８３０のポリＬ−乳酸を使用した例の結果を示す。
【０１１１】
図１８に示すように、ポリＬ−乳酸を投与しなかったControl群において、ＢＶ／ＴＶ値は、１．８７％〜６．２０％であった。これに対し、ポリＬ−乳酸を投与した例のＢＶ／ＴＶ値は、「Ｌ−１００−０．５」において１００％が１頭及び９８．９３％が１頭、「ＯＬＡ−１００１」において１００％が３頭、「ＯＬＡ−１００６」において１００％が２頭、「ＯＬＡ−１００８」において１００％が１頭であった。
【０１１２】
このように、増殖因子やスキャッホールドを投与することなく、ポリＬ−乳酸を投与するだけで、重力等のメカニカルストレスを受けにくい頭蓋骨において、ＢＶ／ＴＶ値が９８％〜１００％であったことは、驚くべき結果であった。
【０１１３】
また、ポリＬ−乳酸を投与した他の例についても、「ＯＬＡ−１００６」において１９．５３％〜２８．０５％が２頭、「ＯＬＡ−１００７」において１６．９２％〜３２．４６％が３頭、「ＯＬＡ−１００８」において１０．９６％〜１３．９６％が２頭であり、Control群に比べて高いＢＶ／ＴＶ値が得られた。
【０１１４】
なお、「ＯＬＡ−１００２」及び「ＯＬＡ−１００４」においては、Control群との差異が認められなかった。この結果は、動物実験に特有の手技的な難しさに起因するものと考えられた。すなわち、例えば、頭蓋骨に孔を開けるために、比較的広い範囲で切開を行い、重合体を埋め込むが、その後の縫合時に当該重合体の位置がずれる等、予期しない不都合が生じることがある。そして、この予期しない不都合の発生により、一部の条件では、正確な評価ができなかった可能性が考えられた。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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