(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
0006463366.tif 000206
の化合物、またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマー：
式中、Ｒ１はメトキシであり；
Ｒ２はＨであり；
Ｒ３は、２−ベンゾチアゾール、４−メチル−２−ベンゾチアゾール、６−フルオロ−２−ベンゾチアゾール、６−メトキシ−２−ベンゾチアゾール、２−ベンゾキサゾール、２−ベンズイミダゾール、２−チオフェン、４−メチル−２−チアゾール、５−メチル−２−チアゾール、４，５−メチル−２−チアゾール、４−フェニル−２−チアゾール、３−キノリン、８−イソキノリン、フェニル、１，４−ビフェニル、１−ナフタレン、２−ナフタレン、３−ピペラジン−フェニル、４−ピペリジン−フェニル、３−ピペリジン−フェニル、２−ピリジン、３−ピリジン、４−ピペラジン−３−ピリジン、３−ｔｅｒｔ−ブチル−フェニル、３−モルホリン−フェニル、４Ｎ−tert-ブトキシカルボニル（ｂｏｃ）−ピペリジン−３−フェニル、および３−イソプロピル−フェニルからなる群から選択される。
【請求項２】
式（Ｉ）
0006463366.tif 000207
の化合物、またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマー：
式中、Ｒ１はＣｌまたはＨであり、Ｒ２はＢｒまたはＨであり、Ｒ１がＣｌのときＲ２はＨであり、Ｒ１がＨのときＲ２はＢｒであり；
Ｒ３は、フェニル、４−ビフェニル、２−チアゾール、１−ナフタレン、２−ナフタレン、２−ベンゾチアゾール、３−キノリン、８−イソキノリン、および４−ピペリジン−フェニルからなる群から選ばれ、
Ｒ３が、８−イソキノリンのとき、Ｒ１がＣｌであり、Ｒ２はＨであり、
Ｒ３が、４−ピペリジン−フェニルのとき、Ｒ１がＣｌであり、Ｒ２はＨである。
【請求項３】
Ｒ３が、１−ナフタレン、２−ナフタレン、および２−ベンゾチアゾールからなる群から選ばれる、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ３が、２−ベンゾチアゾール、２−ベンゾキサゾール、２−ベンズイミダゾール、４−メチル−２−ベンゾチアゾール、２−チオフェン、４−フェニル−２−チアゾール、３−キノリン、８−イソキノリン、フェニル、１−ナフタレン、２−ナフタレン、３−ｔｅｒｔ−ブチル−フェニル、４Ｎ−ｂｏｃ−ピペリジン−３−フェニル、６−メトキシ−２−ベンゾチアゾール、および３−イソプロピル−フェニルからなる群より選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ３が、２−ベンゾチアゾール、２−ベンゾキサゾール、２−ベンズイミダゾール、および３−イソプロピル−フェニルからなる群より選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
0006463366.tif 000208
である化合物、またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマー。
【請求項７】
0006463366.tif 000209
である化合物、またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマー。
【請求項８】
0006463366.tif 000210
である化合物、またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマー。
【請求項９】
請求項１に記載の化合物、その塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、またはそのジアステレオマーを含む、１２−リポキシゲナーゼ媒介性の疾患または障害を処置または予防するための薬学的組成物。
【請求項１０】
前記１２−リポキシゲナーゼがヒト１２−リポキシゲナーゼである、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記１２−リポキシゲナーゼ媒介性の疾患または障害が、１型糖尿病、２型糖尿病、糖尿病性腎疾患、糖尿病性神経疾患、心血管疾患、アルツハイマー病、非アルコール性脂肪性肝炎、血小板性血流遮断、皮膚疾患、ヘパリン起因性血小板減少症、血栓症、抗リン脂質抗体症候群、敗血症症候群、治療用または診断用モノクローナル抗体に関連する血栓症、および血栓性血小板減少性紫斑病、ならびに癌からなる群より選択される、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記癌が、前立腺癌、直腸結腸癌、乳癌、および肺癌からなる群より選択される、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記心血管疾患が、うっ血性心不全、心筋梗塞、および脳卒中からなる群より選択される、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記１２−リポキシゲナーゼ媒介性の疾患または障害が、１型糖尿病および２型糖尿病からなる群より選択される、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記１２−リポキシゲナーゼ媒介性の疾患または障害が、血栓症、ヘパリン起因性血小板減少症、抗リン脂質抗体症候群、敗血症症候群、治療用または診断用モノクローナル抗体に関連する血栓症、および血栓性血小板減少性紫斑病からなる群より選択される、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記化合物が、
0006463366.tif 000211
またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマーである、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
前記化合物が、
0006463366.tif 000212
またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマーである、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記化合物が、
0006463366.tif 000213
またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマーである、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
前記化合物が、
0006463366.tif 000214
またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマーである、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
請求項１に記載の化合物、その塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、またはそのジアステレオマーを含む、ＰＡＲ４−ＡＰ誘導性血小板凝集を減少させるための薬学的組成物。
【請求項２１】
請求項１に記載の化合物、その塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、またはそのジアステレオマーを含む、ＰＡＲ４−ＡＰ誘導性カルシウム動員を減少させるための薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、2013年10月10日提出の米国特許仮出願第61/889,396号、および2014年5月1日提出の米国特許仮出願第61/987,129号の恩典を主張し、これらはいずれも参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦政府支援の研究における政府の権利に関する言明
本発明は、米国立先進トランスレーショナル科学センター（National Center for Advancing Translational Sciences）の施設内研究プログラムならびに医学研究のための米国立衛生研究所ロードマップ（National Institutes of Health Roadmap for Medical Research）主導の分子ライブラリ助成金番号U54MH084681、米国立衛生研究所助成金番号R01 GM56062、医学研究のための米国立衛生研究所ロードマップ主導の分子ライブラリ助成金番号R03 MH081283、NIH助成金番号S10-RR20939、米国立心肺血液研究所（National Heart, Lung, and Blood Institute（NHBLI））助成金番号HL114405、および米国立一般医科学研究所（National Institute of General Medical Sciences（NIGMS））助成金番号GM105671の下での政府支援により行った。政府は本発明においてある特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
リポキシゲナーゼは、アラキドン酸（AA）およびリノール酸（LA）などの多価不飽和脂肪酸基質を位置特異的および立体特異的に酸化する、非ヘム鉄含有酵素の1つのクラスである。（Solomon, et al. Chem. Biol. 1997, 4, 795-808；Brash, J. Biol. Chem. 1999, 274, 23679-23682。）これらのcis,cis-1,4-ペンタジエン基質が酸化される位置は、必須のリポキシゲナーゼと一致しており、3つの主要なヒトリポキシゲナーゼ：5-LOX、12-LOX、および15-LOX-1はそれぞれC5、C12、およびC15位を酸化する。リポキシゲナーゼは代謝経路のカスケードにおいて重要な第一段階に関与し、これらの酵素の生成物（エイコサノイド）は、ロイコトリエンおよびリポキシンなどのホルモンの前駆体であり、これらは多くの細胞機能を媒介する。（Serhan, et al. Chem. Rev. 2011, 111, 5922-5943。）したがって、リポキシゲナーゼ酵素およびそれらの生物活性代謝産物（例えば、ヒドロキシエイコサテトラエン酸（HETE）およびロイコトリエンA4）は、様々な炎症性疾患および癌に関与している。
【０００４】
特に5-LOXは、癌および喘息などの炎症性疾患に関与しており、いまだ唯一のリポキシゲナーゼ酵素であり、この酵素に関してはFDA認可阻害物質（ジロートン（Zilueton））が市販されている。
【０００５】
網状赤血球15-LOX-1は、アテローム発生、神経変性疾患、および急性虚血発作事象に随伴する神経損傷において役割を有している。
【０００６】
12-LOXは、3つのアイソザイムの血小板型、白血球型、および表皮型として存在するが、白血球12-LOXは、ラット、マウス、ブタ、およびウシでは見られるが、ヒトでは見られない。（Yamamoto Biochim. Biophys. Acta. 1992, 1128, 117-131；Funk et al. FEBS Lett. 1997, 402, 162-166）。
【０００７】
皮膚疾患および血小板性血流遮断：さらに、12-LOXは皮膚疾患および血小板性血流遮断において役割を明示している。
【０００８】
移植：12-LOX阻害物質は、移植/異物移植のシナリオにおいても有用であり、例えば、移植前に膵島をエクスビボで処置して生存率を向上することができる。
【０００９】
癌：血小板型12-(S)-LOX（12-LOX）は、前立腺癌、結腸直腸癌、乳癌、および肺癌を含む、様々な腫瘍組織において過剰発現することが明らかにされている。（Catalano et al. Histol. Histopathol. 2005, 20, 969-975；Nie, D et al. Cancer Res. 1998, 58, 4047-4051；Natarajan et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1997, 82, 1790-1798；Kamitani et al. Adv. Exp. Med. Biol. 1999, 469, 593-598；Soriano et al. Cancer Res. 1999, 59, 6178-6184）。さらに、12-HETEレベルは、腫瘍細胞運動性および血管形成を促進することにより、癌細胞代謝増大に関連付けられている。（Nappez et al. Cancer Lett. 1995, 96, 133-140；Timar et al. Int. J. Cancer, 1993, 55, 1003-1010；Honn et al. Exp. Cell. Res. 1994, 214, 120-130；Nie et al. Blood 2000, 95, 2304-2311）。
【００１０】
糖尿病：1型および2型糖尿病は、重大な合併症および寿命短縮につながりうる重篤な障害である。これらの代謝障害においてβ細胞を保護するための新しいやり方を同定することが、いまだ医学的に必要とされている。12-LOXは、ヒト膵島で発現し、これは炎症サイトカインによって上方制御および活性化され、12-LOX転位置の増大を引き起こす。得られた12-HETE生成物は、炎症応答の増幅を通じて、インスリン分泌の減少、代謝活性の低下および膵臓β細胞死を引き起こす。（Chen et al. Diabetologia 2005, 48, 486-495）。非肥満糖尿病（NOD）12-LOXおよび12-LOXノックアウト（「KO」）マウスはいずれも、対照群に比べて糖尿病発生に対する有意な抵抗性を示し、12-LOXはこの疾患における制御因子であることを示した。
【００１１】
糖尿病性腎疾患：さらに、試験は、12-LOX経路の活性化が、糸球体P-カドヘリンの発現減少を含む、複数の発症メカニズムによる糖尿病性腎疾患（糖尿病性腎症）の発生において役割を果たすことを示している。（Guo, Q. et al. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2011, 300, E708-E716）。
【００１２】
糖尿病性神経疾患：ソルビトール経路の最初の酵素であるアルドースレダクターゼ活性の増大が、末梢神経および脊髄における糖尿病関連12/15-LOX活性化において重要な役割を果たすことも明らかにされている。（Stavniichuk, R. et al Biochem Pharmacol. 2012, 83, 932-940）。したがって、12-LOXの阻害は糖尿病性神経疾患を処置する際に魅力的である。
【００１３】
糖尿病および心血管疾患：選択的な12-LOX阻害物質は、糖尿病のいずれかの型（I型およびII型）を予防および/または処置するための新しい治療アプローチを提供すると考えられる。12-hLOX阻害物質の開発は、血管傷害または凝固経路の活性化に反応して大きい凝血塊を形成する血小板の能力低下に対する強力な細胞内アプローチを提供する。したがって、12-hLOX阻害は、糖尿病および/または心血管疾患によって引き起こされる血小板媒介性凝血塊形成を減弱し、心筋梗塞、うっ血性心不全、および脳卒中の発生を有意に減少させる能力を有する。加えて、試験は、タンパク質12-LOXおよび15-LOXをコードする遺伝子Alox15が心不全において上方制御されることを示している。したがって、12-LOXの阻害は、心不全のための1つの処置となりうる。（Kayama, Y. et al. J.Exp.Med. 2009, 206, 1565-1574）。
【００１４】
血栓症：12-LOXおよびその生成物12-HETEは、血小板機能（反応性、凝血塊形成、カルシウム動員）の制御におけるそれらの役割を介した血流遮断および血栓症の調節に関与している。（Brash, A. R. Circulation 1985, 72, 702-707）。加えて、FcγRllaはヘパリン起因性血小板減少症（HIT）の原因であるヒト血小板上の受容体である。12-LOXは、カルシウム動員の活性化、Rap 1およびPKC活性化、ならびにその後のインテグリンαllbβ3の活性化につながる、FcγRIIa誘発性PLCγ2活性に必須であることが明らかにされており、これはHIT処置における12-LOX阻害物質の役割を示す。（Yeung, J. et al. Blood 2014, (DOI 10.1182/blood-2014-05-575878)）。さらに、12-LOXは皮膚疾患および血小板性血流遮断における役割を示している。
【００１５】
アルツハイマー病：12-LOXおよび15-LOXは、中枢神経系において広く発現し、アミロイドβおよびAPP処理を調節するため、アルツハイマー病の神経生物学に関与すると報告されている。12-LOXおよび15-LOXは、内因性タウ代謝を調節することも明らかにされており、アルツハイマー病および関連疾患を処置するための魅力的な治療法となっている。（Giannopoulos, P.F., et al. Aging Cell 2013, 12, 1082-1090）。
【００１６】
非アルコール性脂肪性肝炎：12-LOXをコードする遺伝子、Alox15の崩壊は、代謝起源の実験的肝疾患における脂肪肝、インスリン抵抗性、および炎症に対してマウスを保護することが明らかにされている。（Martinez-Clemente, M. et al. Hepatology 2010, 52, 1980-1991；Tanaka, N. et al. Hepatology 2012, 56, 118-129も参照）。
【００１７】
これらの系における12-LOXの役割を明白に規定しうることの1つの難点は、強力かつ選択的な12-LOX小分子阻害物質がないことであった。
【００１８】
以前に報告された12-LOX阻害物質、8-ヒドロキシキノリン系の化合物（ML127）は、すぐれた選択性、すなわち、関連するリポキシゲナーゼおよびシクロオキシゲナーゼの＞50〜100倍のすぐれた選択性を示した。以前に報告された阻害物質の多くとは対照的に、動態学的実験によりML127は非競合的および非還元的阻害物質であることが判明した。プローブ分子のキラルHPLC分離により、(-)-鏡像異性体が(+)-鏡像異性体よりもはるかに強力である（それぞれ＜0.5μMと＞25μM）、活性のキラル優先性が明らかとなった。（Kenyon, V. et al. J. Med. Chem. 2011, 54, 5485-5497。）しかし、わずかな構造修飾が活性減弱につながることを考慮すると、化学系統をさらに最適化することは困難であった。
【００１９】
12-LOX媒介性の疾患および障害を処置または予防するために、活性の低下なしで最適化されうる強力で選択的な12-LOX小分子阻害物質が必要とされている。小分子阻害物質は、可溶性であり、好適なADME特性を有し、かつ良好なインビボPK特性を有するべきである。
【００２０】
血小板は、膜貫通受容体を含む3つの免疫受容活性化チロシンベースモチーフ（ITAM）（糖タンパク質VI（GPVI）/FcRy複合体、C型レクチン様受容体2（CLEC-2）、および低親和性免役グロブリンγFc領域受容体II-a（FcγRIIa））を発現する。血小板表面の受容体を含むITAMの連結は、下流のシグナル伝達経路の共有につながり、その結果血小板活性化を引き起こす。これらの受容体は様々な程度の血流遮断および血栓症に関与するが；しかし、これらは非重複性の（病態）生理学的機能を有する。ヒト血小板の表面に存在するがマウス血小板の表面には存在しない広範囲に発現する免疫受容体の、FcγRIIaは、免疫媒介性血小板減少症および血栓症；すなわち免疫性血小板減少症、敗血症を伴う血小板減少症、およびヘパリン起因性血小板減少症（HIT）を含む障害のファミリーにおけるその病態生理学的役割が最もよく知られている。免疫媒介性血小板減少症および血栓症の予防のために、血小板におけるFcγRIIaシグナル伝達経路を選択的に阻害することは、HITの予防のために長い間探し求められてきたアプローチであった（Reilly et al, Blood 2011, 111, 2241-2246）。
【００２１】
ヘパリンは、血栓症を処置するために診療所で広く使用されている。しかし、ヘパリンを投与されている患者の3〜5％超がヘパリンに対する免疫応答を発生し、免疫系によって媒介される重篤な血栓性事象を引き起こしうる、ヘパリン起因性血小板減少症（HIT）のリスクが高くなる。HITの処置に対する現行の治療アプローチは、ヘパリン処置の取りやめ、および、重篤な出血のリスクが本質的に高く、かつ、診療所でモニターしなければならない、直接的トロンビン阻害物質（DTI）による置き換えである。この致死的となる可能性がある合併症があってもなお、ヘパリンは血栓症の予防および処置のための標準的抗凝固薬のままである。
【００２２】
したがって、HITの病因を直接標的とする新規治療アプローチも必要とされている。
【発明の概要】
【００２３】
本発明は、12-LOX阻害物質として有用な化合物および化合物を含む方法を提供する。
【００２４】
本発明は、12-LOXの強力かつ選択的な阻害物質である化合物を提供する。加えて、本発明は、12-リポキシゲナーゼ媒介性の疾患および障害の処置または予防における治療用物質として、これらの化合物を含む組成物、およびこれらの化合物の使用法を提供する。12-LOX媒介性の疾患および障害には、12-LOXが疾患および障害の直接的媒介物質であるもの、ならびに12-LOXは、おそらくは直接的媒介物質ではないが、その阻害が疾患および障害の処置または予防において治療的価値をもたらすものが含まれる。これらの疾患および障害には、1型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病性腎疾患、糖尿病性神経疾患、心血管疾患、うっ血性心不全、心筋梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、非アルコール性脂肪性肝炎、血小板性血流遮断、皮膚疾患、ヘパリン起因性血小板減少症、血栓症、前立腺癌、直腸結腸癌、乳癌、および肺癌が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００２５】
本発明は、式（I）：
0006463366.tif 000002
の化合物、またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマーを提供し、
式中、R1およびR2は独立して、C1〜C6アルキル、C1〜C6アルケニル、C1〜C6アルキニル、F、Cl、Br、ヒドロキシル、アミン、メトキシからなる群より選択される1つまたは複数の置換基でそれぞれ置換されていてもよい、H、アルキル、アルケニル、アルキニル、F、Cl、Br、アミン、二酸化窒素、インドール、アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリールからなる群より選択され；
R3は、C1〜C6アルキル、C1〜C6アルケニル、C1〜C6アルキニル、F、Cl、Br、ヒドロキシル、アミン、アルコキシ、フェニル、シクロアルキル、アリール、ピペラジン、ピペリジン、ピリジン、モルホリン、ピロリジン、ピラゾリジン、イミダゾリジン、およびチオモルホリンからなる群より選択される1つまたは複数の置換基でそれぞれ置換されていてもよい、フェニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、チアゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾキサゾール、イミダゾール、ベンズイミダゾール、チオフェン、1-ナフタレン、2-ナフタレン、ピリジン、キノリン、イソキノリン、4N-boc-ピペリジン-3-フェニル、オキサゾール、ベンゾチオフェン、パラチアジン、フラン、ピラン、クロメン、ベンゾフラン、ピロール、ピラゾール、ピラジン、ピリミジン、トリアジン、インドール、プリン、フタラジンからなる群より選択され、
ただし、化合物は、
0006463366.tif 000003
ではない。
【００２６】
本発明は、本発明の化合物、塩、鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、またはジアステレオマーおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物も提供する。
【００２７】
本発明は、哺乳動物に、本発明の化合物の化合物、その塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、またはそのジアステレオマーの治療的または予防的に有効な量を投与する段階を含む、12-リポキシゲナーゼ媒介性の疾患または障害を処置または予防するための方法をさらに提供する。
[本発明1001]
式（I）
0006463366.tif 000004
の化合物、またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマー：
式中、R1およびR2は独立して、C1〜C6アルキル、C1〜C6アルケニル、C1〜C6アルキニル、F、Cl、Br、ヒドロキシル、アミン、メトキシからなる群より選択される1つまたは複数の置換基でそれぞれ置換されていてもよい、H、アルキル、アルケニル、アルキニル、F、Cl、Br、アミン、二酸化窒素、インドール、アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリールからなる群より選択され；
R3は、C1〜C6アルキル、C1〜C6アルケニル、C1〜C6アルキニル、F、Cl、Br、ヒドロキシル、アミン、アルコキシ、フェニル、シクロアルキル、アリール、ピペラジン、ピペリジン、ピリジン、モルホリン、ピロリジン、ピラゾリジン、イミダゾリジン、およびチオモルホリンからなる群より選択される1つまたは複数の置換基でそれぞれ置換されていてもよい、フェニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、チアゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾキサゾール、イミダゾール、ベンズイミダゾール、チオフェン、1-ナフタレン、2-ナフタレン、ピリジン、キノリン、イソキノリン、4N-boc-ピペリジン-3-フェニル、オキサゾール、ベンゾチオフェン、パラチアジン、フラン、ピラン、クロメン、ベンゾフラン、ピロール、ピラゾール、ピラジン、ピリミジン、トリアジン、インドール、プリン、フタラジンからなる群より選択され、
ただし、該化合物は、
0006463366.tif 000005
ではない。
[本発明1002]
R2がHである場合、R1が、メトキシおよびClからなる群より選択され；
R1がHである場合、R2が、BrおよびClからなる群より選択され；かつ
R3が、チアゾール、2-ベンゾチアゾール、2-ベンゾキサゾール、2-ベンズイミダゾール、4-メチル-2-ベンゾチアゾール、チオフェン、4-メチル-2-チアゾール、5-メチル-2-チアゾール、4,5-メチル-2-チアゾール、フェニル、1-ナフタレン、2-ナフタレン、1,4-ビ-フェニル、3-ピペラジン-フェニル、4-ピペリジン-フェニル、4-ピペラジン-3-ピリジン、6-メチル-3-ピリジン、3-キノリン、8-イソキノリン、2-ピリジン、3-ピリジン、3-tertブチル-フェニル、6-メトキシ-2-ベンゾチアゾール、6-フルロ（fluro）-2-ベンゾチアゾール、4-フェニル-2-チアゾール、3-モルホリン-フェニル、4N-boc-ピペリジン-3-フェニル、3-ピペリジン-フェニル、3-イソプロピル-フェニル、および4-ビ-フェニルからなる群より選択される、
本発明1001の化合物、またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマー。
[本発明1003]
R1がメトキシであり、かつR2がHである、本発明1002の化合物。
[本発明1004]
プロドラッグである、本発明1001の化合物。
[本発明1005]
R3が、2-ベンゾチアゾール、2-ベンゾキサゾール、2-ベンズイミダゾール、4-メチル-2-ベンゾチアゾール、3-キノリン、8-イソキノリン、フェニル、および3-イソプロピル-フェニルからなる群より選択される、本発明1003の化合物。
[本発明1006]
R3が、2-ベンゾチアゾール、2-ベンゾキサゾール、2-ベンズイミダゾール、4-メチル-2-ベンゾチアゾール、チオフェン、フェニル、1-ナフタレン、2-ナフタレン、3-キノリン、8-イソキノリン、3-tertブチル-フェニル、6-メトキシ-2-ベンゾチアゾール、6-フルロ-2-ベンゾチアゾール、4-フェニル-2-チアゾール、4N-boc-ピペリジン-3-フェニル、および3-イソプロピル-フェニルからなる群より選択される、本発明1003の化合物。
[本発明1007]
R3が、2-ベンゾチアゾール、2-ベンゾキサゾール、2-ベンズイミダゾール、4-メチル-2-ベンゾチアゾール、チオフェン、フェニル、1-ナフタレン、2-ナフタレン、3-キノリン、8-イソキノリン、3-tertブチル-フェニル、4N-boc-ピペリジン-3-フェニル、および3-イソプロピル-フェニルからなる群より選択される、本発明1003の化合物。
[本発明1008]
R3が、2-ベンゾチアゾール、2-ベンゾキサゾール、2-ベンズイミダゾール、および3-イソプロピル-フェニルからなる群より選択される、本発明1003の化合物。
[本発明1009]
R3が、2-ベンゾチアゾール、2-ベンゾキサゾール、2-ベンズイミダゾール、4-メチル-2-ベンゾチアゾール、チオフェン、フェニル、6-メトキシ-2-ベンゾチアゾール、6-フルロ-2-ベンゾチアゾール、および4-フェニル-2-チアゾールからなる群より選択される、本発明1003の化合物。
[本発明1010]
R3が、2-ベンゾチアゾール、2-ベンゾキサゾール、2-ベンズイミダゾール、4-メチル-2-ベンゾチアゾール、チオフェン、およびフェニルからなる群より選択される、本発明1003の化合物。
[本発明1011]
R3が、2-ベンゾチアゾール、2-ベンゾキサゾール、2-ベンズイミダゾール、4-メチル-2-ベンゾチアゾール、チオフェン、フェニル、1-ナフタレン、2-ナフタレン、3-キノリン、8-イソキノリン、2-ピリジン、および3-ピリジンからなる群より選択される、本発明1003の化合物。
[本発明1012]
0006463366.tif 000006
である化合物、またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマー。
[本発明1013]
0006463366.tif 000007
である化合物、またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマー。
[本発明1014]
0006463366.tif 000008
である化合物、またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマー。
[本発明1015]
式（II）
0006463366.tif 000009
の化合物、またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマー：
式中、Xは、O、S、NH、およびCからなる群より選択され；
R1およびR2は独立して、H、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、およびアルキルからなる群より選択され；
R3からR6は独立して、H、ハロゲン、アルコキシ、およびアルキルからなる群より選択される。
[本発明1016]
式（III）
0006463366.tif 000010
の化合物、またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマー：
式中、R1およびR2は独立して、H、ハロゲン、およびアルコキシからなる群より選択され、かつさらにR1およびR2は両方ともHであることはなく；
R4およびR5は独立して、H、アルキル、フェニル、および置換されていてもよいフェニルからなる群より選択され；
ただし、該化合物は、
0006463366.tif 000011
ではない。
[本発明1017]
式（IV）
0006463366.tif 000012
の化合物、またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマー：
式中、R1およびR2は独立して、H、ハロゲン、およびアルコキシからなる群より選択され；
R3およびR4は独立して、H、フェニル、置換されていてもよいフェニル、tert-ブチル、イソプロピル、および
0006463366.tif 000013
からなる群より選択され；
Xは、NH、O、および
0006463366.tif 000014
からなる群より選択される。
[本発明1018]
哺乳動物に、本発明1006の化合物、その塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、またはそのジアステレオマーの治療的または予防的に有効な量を投与する段階を含む、12-リポキシゲナーゼ媒介性の疾患または障害を処置または予防するための方法。
[本発明1019]
前記12-リポキシゲナーゼがヒト12-リポキシゲナーゼである、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記12-リポキシゲナーゼ媒介性の疾患または障害が、1型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病性腎疾患、糖尿病性神経疾患、心血管疾患、アルツハイマー病、非アルコール性脂肪性肝炎、血小板性血流遮断、皮膚疾患、ヘパリン起因性血小板減少症、血栓症、抗リン脂質抗体症候群、敗血症症候群、治療用または診断用モノクローナル抗体に関連する血栓症、および血栓性血小板減少性紫斑病、ならびに癌からなる群より選択される、本発明1018の方法。
[本発明1021]
前記癌が、前立腺癌、直腸結腸癌、乳癌、および肺癌からなる群より選択される、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記心血管疾患が、うっ血性心不全、心筋梗塞、および脳卒中からなる群より選択される、本発明1020の方法。
[本発明1023]
前記12-リポキシゲナーゼ媒介性の疾患または障害が、1型糖尿病および2型糖尿病からなる群より選択される、本発明1020の方法。
[本発明1024]
前記12-リポキシゲナーゼ媒介性の疾患または障害が、血栓症、ヘパリン起因性血小板減少症、抗リン脂質抗体症候群、敗血症症候群、治療用または診断用モノクローナル抗体に関連する血栓症、および血栓性血小板減少性紫斑病からなる群より選択される、本発明1020の方法。
[本発明1025]
前記化合物が、
0006463366.tif 000015
またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマーである、本発明1018の方法。
[本発明1026]
前記化合物が、
0006463366.tif 000016
またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマーである、本発明1020の方法。
[本発明1027]
前記化合物が、
0006463366.tif 000017
またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマーである、本発明1020の方法。
[本発明1028]
前記化合物が、
0006463366.tif 000018
またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマーである、本発明1020の方法。
[本発明1029]
哺乳動物に、本発明1006の化合物、その塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、またはそのジアステレオマーの治療的または予防的に有効な量を投与する段階を含む、PAR4-AP誘導性血小板凝集を減少させるための方法。
[本発明1030]
哺乳動物に、本発明1006の化合物、その塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、またはそのジアステレオマーの治療的または予防的に有効な量を投与する段階を含む、PAR4-AP誘導性カルシウム動員を減少させるための方法。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図1A〜1Dは、本発明の類似体の合成のための反応スキームを示す。
【図２】ヒト血小板におけるPAR4-AP-誘導性カルシウム動員（A）および血小板凝集（B）。
【図３】マウスβ細胞（A）およびヒト膵島（B、C）における12-HETEの阻害。ヒト膵島におけるグルコース刺激インスリン分泌（D、E）。
【図４】化合物35（ML355）による12-LOXのKiの決定のための定常状態動態学データ。KM/Vmax（x切片、KM/Vmaxの単位はμM/μmol/分/mg）対[阻害物質]（μM）は阻害データの二次再プロットであり、Ki 0.35+/-0.08μMを得た。
【図５】化合物35（ML355）による12-LOXのKi'の決定のための定常状態動態学データ。1/Vmax（y切片、1/Vmaxの単位は1/μmol/分/mg）対[阻害物質]（μM）は阻害データの二次再プロットであり、Ki 0.72+/-0.1μMを得た。
【図６】化合物36による12-LOXのKiの決定のための定常状態動態学データ。KM/Vmax（x切片、KM/Vmaxの単位はμM/μmol/分/mg）対[阻害物質]（μM）は阻害データの二次再プロットであり、Ki 0.53+/-0.2μMを得た。
【図７】化合物36による12-LOXのKi'の決定のための定常状態動態学データ。1/Vmax（y切片、1/Vmaxの単位は1/μmol/分/mg）対[阻害物質]（μM）は阻害データの二次再プロットであり、Ki 0.63+/-0.1μMを得た。
【図８】ヒト血小板におけるPAR4-AP-誘導性カルシウム動員（A）および血小板凝集（B）。Aについて：洗浄ヒト血小板（1×106血小板/mL）を200μM PAR4-APにより漸増濃度の化合物36非存在下または存在下で刺激した。カルシウム動員は化合物36の濃度が上がるにつれて減少した。カルシウムをC6 Accuriフローサイトメーターを用いてリアルタイムで測定した。実験は三つ組で実施した。Bについて：ヒト血小板の血小板凝集（3×108血小板/mL）を、PAR4-AP添加後に、Chronolog Lumi-Aggregometer（モデル700D）を用いてリアルタイムで測定した。
【図９】マウスβ細胞における化合物36による12-HETEの阻害。マウスβ細胞（BTC3）をアラキドン酸およびカルシウムイオノフォア（AA/IONO）単独または化合物36存在下で処理した。AA/IONO単独で刺激した細胞中で検出された12-HETEのレベルのパーセンテージとして表された12-HETEのレベルをグラフ化している。図3Aにおいてグラフ化したデータは、三つ組で実施した各プロットデータ点による代表的実験である。これらのプロットデータは、より低い用量範囲を対象として実施した4つの別々の実験的測定の代表である。グラフ化したデータは平均±SEM、n＝3である。いくつかの点の誤差バーは記号によって隠れている。データは、可変または制限hillスロープ、R2＞0.81を用いて、用量反応曲線阻害についての非線形回帰により分析した。この分析はPrism 5ソフトウェアにより促進された。化合物に加えて、DMSO（保存溶媒）を各条件で含めた。DMSOはカルシウムイオノフォア（刺激物質）の溶媒でもある。
【図１０】（A）pH2緩衝液（pH7.4）中で、（B）pH10緩衝液中で、（C）PBS緩衝液（pH7.4）中で、（D）リポキシゲナーゼUV-Visアッセイ緩衝液（1M HEPES緩衝液、pH7.3）中で、（E）5mMグルタチオン（還元型）存在下で、室温において表示の期間にわたって水溶液（20％アセトニトリル含有）中のプローブ分子の組成パーセントとして測定した化合物35（ML355）の安定性。
【図１１】図11Aおよび11Bは、12-LOXがFcγRIIa媒介性血小板凝集を調節することを示す。洗浄ヒト血小板をDMSO（ビヒクル対照）またはML355（20μM）で15分間前処理し、（図11A）抗CD9によるまたは（図11B）FcγRIIaマウスモノクローナル抗体、IV.3、およびヤギ抗マウスFab2の架橋（IV.3＋GAM）によるFcγRIIa刺激後に、血小板凝集を測定した。左図は、ML355またはDMSOで前処理した、抗CD9抗体刺激血小板の代表的凝集トレーシングを示す。右図は、ML355（n＝7）またはDMSO（n＝4）で処理した、抗CD9刺激血小板の最終血小板凝集を示す。**P＜0.01。
【図１２】図12A〜12Cは、マウス血小板が正常なFcγRIIa誘導性血小板凝集のために12-LOXを必要とすることを示す。抗CD9誘導性血小板凝集の用量反応を、hFcR/ALOX12+/+またはhFcR/ALOX12-/-マウス由来の洗浄血小板で実施した。凝集前に、フィブリノゲン（75μg/mL）およびCaCl2（1mM）を血小板に添加した。（図12A）0.25、0.5、および1μg/mLの抗CD9で刺激した血小板の代表的トレーシング。挿入図：12-LOX、FcγRIIa、およびGAPDHのウェスタンブロットを、hFcR/ALOX12+/+またはhFcR/ALOX12-/-マウス由来の血小板溶解物で実施した。（図12B）遅延時間および（図12C）最終凝集をhFcR/ALOX12+/+またはhFcR/ALOX12-/-マウスで測定した（n＝3〜6/群）。*P＜0.05。
【図１３】図13Aおよび13Bは、FcγRIIa媒介性Rap1およびインテグリンαIIbβ3活性化が12-LOXによって強化されることを示す。ML355またはDMSOで前処理した洗浄ヒト血小板をIV.3およびGAM架橋で刺激し、（図13A）αIIbβ3インテグリン活性化および（図13B）Rap1活性化を評価した。PAC1-FITCを用いて、フローサイトメトリーによりαIIbβ3活性化を測定した。非刺激PAC1-FITC蛍光に対するPAC1-FITC変化倍率の複合棒グラフ。活性化Rap1を、Ra1-GDSを用いてプルダウンし、Rap1抗体と共にブロットした。活性Rap1をLI-CORを用いて測定し、次いでRap1活性の変化倍率について全Rap1および非刺激に対し規準化した。**P＜0.01。
【図１４】図14Aおよび14Bは、FcγRIIa活性化により媒介される密顆粒分泌が12-LOXによって制御されることを示す。DMSOまたはML355で前処理した洗浄ヒト血小板をFcγRIIa架橋（IV.3＋GAM）で刺激し、（図14A）α顆粒分泌をフローサイトメ−ターでP-セレクチン-PE結合抗体を用いて測定し、その一方で（図14B）ATP分泌を血小板凝集計で密顆粒分泌の代用マーカーとして測定した。ML355またはDMSOで処理したP-セレクチン染色血小板の複合グラフ（n＝4）。FcγRIIa架橋後のATP分泌を測定したDMSOまたはML355処理血小板の棒グラフ（n＝4）。
【図１５】図15Aおよび15Bは、FcγRIIaシグナル複合体を制御する際の12-LOXの役割を示す。洗浄ヒト血小板をML355（20μM）またはビヒクル対照で前処理した後、IV.3およびGAMで刺激した。（図15A）架橋後15、30、および60秒でFcγRIIaを免疫沈降させ、ウェスタンブロットによりリン酸化を測定した。（図15B）ML355またはDMSO存在下でのFcγRIIa架橋後に血小板を溶解し、活性（pY323）および全Sykについて免疫ブロットした。
【図１６】図16A〜16Cは、12-LOXがヒト血小板におけるFcγRIIa経路の早期シグナル構成要素を調節することを示す。洗浄ヒト血小板をML355（20μM）またはビヒクル対照で前処理した後、IV.3およびGAMで刺激した。（図16A）抗体架橋により刺激した血小板が15、30、60、および300秒で停止した、PLCγ2活性化ウェスタンブロットの時間経過。活性PLCγ2活性化の試料を、ウェスタンブロッティングによりY759リン酸化について分析した。すべての試料を全PLCγ2に対して規準化し、変化倍率を非刺激状態に対して定量した。（図16B）IV.3およびGAMによる架橋後、カルシウム動員をフローサイトメトリーにより測定した。代表的曲線を、4分間にわたる非刺激状態に対する遊離カルシウムの変化倍率で定量した。棒グラフはカルシウム動員変化倍率の比を表す。（図16C）12-LOX阻害ありまたはなしの刺激した洗浄ヒト血小板を、PKC活性について分析した。PKC活性化およびプレクストリンの代用としてPKC基質をブロットした。プレクストリンリン酸化の定量を右図に示す。データは平均±S.E.M.を表す。*P＜0.05；**P＜0.01。
【図１７】FcγRIIa経路の制御における12-LOXの役割の概略モデルである。12-LOXは、FcγRIIa刺激により媒介される早期PLCγ2活性化を制御し、これは血小板における完全なカルシウム放出のために必須である。アラキドン酸（AA）などの遊離脂肪酸を生成するためのcPLA2活性にはカルシウム流が必要とされる。続いて、血小板凝集のためのインテグリンαIIbβ3を活性化するようにRap1活性も12-LOX活性に依存する。
【図１８】化合物ML355の1H NMRデータ（図18A）および化合物ML-355の13C NMR（図18B）を示す。
【図１９】化合物ML355の220nm（上図）および254nm（下図）におけるLC/MS特徴決定を示す。
【図２０】化合物36の1H NMRデータ（図20A）および化合物36の13C NMR（図20B）を示す。
【図２１】化合物36の220nm（上図）および254nm（下図）におけるLC/MS特徴決定を示す。
【図２２】化合物37の1H NMRデータ（図22A）および化合物37の13C NMR（図22B）を示す。
【図２３】化合物37の220nm（上図）および254nm（下図）におけるLC/MS特徴決定を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
発明の詳細な説明
本明細書に記載の特定の方法論などは変動し得るため、本発明は、これらに限定されないことが理解される。本明細書において用いられる用語は、特定の態様を記載するために用いられるにすぎず、本発明の範囲を限定する意図はないことも理解されるべきである。
【００３０】
説明において以下の用語を用いる。LOXはリポキシゲナーゼであり；15-LOX-1はヒト網状赤血球15-リポキシゲナーゼ-1であり；15-LOX-2はヒト上皮15-リポキシゲナーゼ-2であり；12-LOXはヒト血小板12-リポキシゲナーゼであり；COXはシクロオキシゲナーゼであり；NDGAはノルジヒドログアヤレチン酸であり；AAはアラキドン酸であり；12-HPETEは12-(S)-ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸であり；12-HETEは12-(S)-ヒドロキシエイコサテトラエン酸であり；LAはリノール酸であり；Vmaxは最大速度（mmol/分）であり；KMはアンリ・ミカエリス・メンテン定数であり；[E]は全活性酵素濃度であり；IC50は50％阻害の阻害物質定数であり；HTSはハイスループットスクリーニングであり；qHTSは定量的ハイスループットスクリーニングであり；PAR-4はプロテアーゼ活性化受容体-4であり；EtOHはエタノールであり；MeOHはメタノールであり；EtOAcは酢酸エチルであり；AcOHは酢酸であり；MWはマイクロ波であり；キサントホスは4,5-ビス(ジフェニルホスフィノ)-9,9-ジメチルキサンテンであり；かつSDは標準偏差である。
【００３１】
治療的使用のために、本発明の化合物の「塩」は生理的に許容され、すなわち、塩は生理的に許容される酸または塩基から得られる。しかし、生理的に許容されない酸または塩基の塩も、生理的に許容される化合物の調製または精製において使用されうる。したがって、生理的に許容される酸または塩基から得られようともそうでなかろうとも、すべての塩は本発明の範囲内である。
【００３２】
「ジアステレオマー」とは、2つまたはそれ以上のキラリティ中心を有し、その分子は互いに鏡像ではない、立体異性体を指す。ジアステレオマーは異なる物理的性質、例えば、融点、沸点、スペクトル特性、および反応性を有する。ジアステレオマーの混合物は、電気泳動およびクロマトグラフィなどの、高分解能分析法の下で分離し得る。
【００３３】
「鏡像異性体」とは、互いに重ね合わせ不可能な鏡像である、化合物の2つの立体異性体を指す。
【００３４】
本明細書において用いられる「薬学的に許容される担体」なる用語は、当技術分野において周知の薬学的活性物質のための任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤を指す。任意の通常の媒質または作用物質が化合物と不適合である限りを除き、治療用組成物におけるその使用が企図される。補助化合物も組成物中に組み込むことができる。
【００３５】
「治療的に有効な量」なる表現は、疾患または状態を予防するため、改善するため、処置するため、またはその発症を遅延させるために有効な、本明細書に開示の化合物の量を指す。「予防的に有効な量」なる表現は、障害の発症または進行を阻害するために有効な、本明細書に開示の化合物の量を指す。
【００３６】
「アルキル」は、ノルマル、二級、三級または環式炭素原子を含む、C1〜C6炭化水素である。例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、tert-ブチルなどが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００３７】
「アルケニル」は、少なくとも1つの不飽和部位、すなわち、炭素-炭素、sp2二重結合を有する、ノルマル、二級、三級または環式炭素原子を含む、C2〜C6炭化水素である。例には、エチレンまたはビニル（--CH=CH2）、アリル（-CH2CH=CH2）、シクロペンテニル（-C5H7）、および5-ヘキセニル（-CH2CH2CH2CH2CH=CH2）などが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００３８】
「アルキニル」は、少なくとも1つの不飽和部位、すなわち、炭素-炭素、sp三重結合を有する、ノルマル、二級、三級または環式炭素原子を含む、C2〜C6炭化水素である。例には、アセチレン（-C=--CH）およびプロパルギル（--CH2C=CH）などが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００３９】
「シクロアルキル」は、例えば、3〜8個の炭素原子、好ましくは3〜7個の炭素原子、およびより好ましくは3〜6個の炭素原子を含む、飽和、不飽和、または芳香族環系である。例には、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニルが含まれるが、それらに限定されるわけではない。環式アルキル基は無置換でもよいか、またはさらに置換されていてもよい。
【００４０】
「ヘテロシクロアルキル」とは、少なくとも1つのN、O、S、またはPを含む、飽和、不飽和、または芳香族環系を意味する。したがって、複素環はヘテロアリール基を含む。本明細書において用いられる複素環には、PAQUETTE、PRINCIPLES OF MODERN HETEROCYCLIC CHEMISTRY（W. A. Benjamin, New York, 1968）、特に第1、3、4、6、7、および9章；THE CHEMISTRY OF HETEROCYCLIC COMPOUNDS, A SERIES OF MONOGRAPHS（John Wiley & Sons, New York, 1950〜現在）、特に第13、14、16、19、および28巻；KATRITZKY ET AL., COMPREHENSIVE HETEROCYCLIC CHEMISTRY（Pergamon Press, 1996）；ならびに82 J. AM. CHEM. SOC. 5566 (1960)に記載の複素環が含まれるが、それらに限定されるわけではない。複素環にはピリジル、ジヒドロイピリジル、テトラヒドロピリジル（ピペリジル）、ツビアゾリル（tbiazolyl）、テトラヒドロチオフェニル、硫黄酸化テトラヒドロツビオフェニル（tetrahydrotbiophenyl）、ピリミジニル、フラニル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、テトラゾリル、ベンゾフラニル、チアナフタレニル、インドリル、インドレニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ピペリジニル、4-ピペリドニル、ピロリジニル、2-ピロリドニル、ピロリニル、テトラヒドロツラニル（tetrahydroturanyl）、ビス-テトラヒドロルラニル（bis-tetrahydroruranyl）、テトラヒドロピラニル、ビス-テトラヒドロピラニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オクタヒドロイソキノリニル、アゾシニル、トリアジニル、6H-1,2,5-チアジアジニル、2H,6H-1,5,2-ジチアジニル、チエニル、チアントレニル、ピラニル、イソベンゾフラニル、クロメニル、キサンテニル、フェノキサチニル（phenoxathinyl）、2H-ピロリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、3H-インドリル、1H-インダゾリ（indazoly）、プリニル、4H-キノリジニル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、4aH-カルバゾリル、カルバゾリル、β-カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、ピリミジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、ルラザニル（rurazanyl）、フェノキサジニル、イソクロマニル、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペラジニル、インドリニル、イソインドリニル、キミクリジニル（quimiclidinyl）、モルホリニル、オキサゾリジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンズイソキサゾリル、オキシインドリル、ベンゾキサゾリニル、およびイサチノイル（isatinoyl）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００４１】
「アリール」とは、親芳香環系の単一の炭素原子から1個の水素原子の除去により誘導される、6〜20個の炭素原子の一価芳香族炭化水素ラジカルを意味する。典型的なアリール基には、ベンゼン、置換ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニルなどから誘導されるラジカルが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００４２】
「ヘテロアリール」とは、親芳香環系の単一の炭素原子から1個の水素原子の除去により誘導される、1つまたは複数の炭素原子およびN、O、S、またはPから選択される1つまたは複数の原子の一価芳香族ラジカルを意味する。ヘテロアリール基は、3〜7員（2〜6個の炭素原子ならびにN、O、P、およびSから選択される1〜3個のヘテロ原子）を有する単環であってもよいか、または7〜10員（4〜9個の炭素原子ならびにN、O、P、およびSから選択される1〜3個のヘテロ原子）を有する二環であってもよい。ヘテロアリール二環は、ビシクロ[4,5]、[5,5]、[5,6]、もしくは[6,6]系として配列された7〜10個の環原子（6〜9個の炭素原子ならびにN、O、およびSから選択される1〜2個のヘテロ原子）；またはビシクロ[5,6]もしくは[6,6]系として配列された9〜10個の環原子（8〜9個の炭素原子ならびにNおよびSから選択される1〜2個のヘテロ原子）を有する。ヘテロアリール基は、安定な共有結合により、炭素、窒素、硫黄、リンまたは他の原子を通じて薬物骨格に結合されてもよい。ヘテロアリール基には、ピリジル、ジヒドロピリジル異性体、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、s-トリアジニル、オキサゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、イソキサゾリル、ピラゾリル、イソチアゾリル、フラニル、チオフラニル、チエニル、およびピロリルが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００４３】
特に記載がないかぎり、本明細書において用いられるすべての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。好ましい方法および組成物を記載するが、本発明の実施または試験において、本明細書において記載するものと類似または等価の任意の方法および組成物を用いることができる。
【００４４】
1つの局面において、本発明は、式（I）：
0006463366.tif 000019
の化合物、またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマーを含み、
式中、R1およびR2は独立して、C1〜C6アルキル、C1〜C6アルケニル、C1〜C6アルキニル、F、Cl、Br、ヒドロキシル、アミン、メトキシからなる群より選択される1つまたは複数の置換基でそれぞれ置換されていてもよい、H、アルキル、アルケニル、アルキニル、F、Cl、Br、アミン、二酸化窒素、インドール、アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリールからなる群より選択され；
R3は、C1〜C6アルキル、C1〜C6アルケニル、C1〜C6アルキニル、F、Cl、Br、ヒドロキシル、アミン、アルコキシ、フェニル、シクロアルキル、アリール、ピペラジン、ピペリジン、ピリジン、モルホリン、ピロリジン、ピラゾリジン、イミダゾリジン、およびチオモルホリンからなる群より選択される1つまたは複数の置換基でそれぞれ置換されていてもよい、フェニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、チアゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾキサゾール、イミダゾール、ベンズイミダゾール、チオフェン、1-ナフタレン、2-ナフタレン、ピリジン、キノリン、イソキノリン、4N-boc-ピペリジン-3-フェニル、オキサゾール、ベンゾチオフェン、パラチアジン、フラン、ピラン、クロメン、ベンゾフラン、ピロール、ピラゾール、ピラジン、ピリミジン、トリアジン、インドール、プリン、フタラジンからなる群より選択され、
ただし、化合物は、
0006463366.tif 000020
ではない。
【００４５】
1つの態様において、R2がHである場合、R1は、メトキシおよびClからなる群より選択され；R1がHである場合、R2は、BrおよびClからなる群より選択され；かつR3は、チアゾール、2-ベンゾチアゾール、2-ベンゾキサゾール、2-ベンズイミダゾール、4-メチル-2-ベンゾチアゾール、チオフェン、4-メチル-2-チアゾール、5-メチル-2-チアゾール、4,5-メチル-2-チアゾール、フェニル、1-ナフタレン、2-ナフタレン、1,4-ビ-フェニル、3-ピペラジン-フェニル、4-ピペリジン-フェニル、4-ピペラジン-3-ピリジン、6-メチル-3-ピリジン、3-キノリン、8-イソキノリン、2-ピリジン、3-ピリジン、3-tertブチル-フェニル、6-メトキシ-2-ベンゾチアゾール、6-フルロ（fluro）-2-ベンゾチアゾール、4-フェニル-2-チアゾール、3-モルホリン-フェニル、4N-boc-ピペリジン-3-フェニル、3-ピペリジン-フェニル、3-イソプロピル-フェニル、および4-ビ-フェニルからなる群より選択される；またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマー。
【００４６】
前述の式（I）の態様のいずれかにおいて、R1はメトキシであり、かつR2はHである。
【００４７】
前述の式（I）の態様のいずれかにおいて、化合物はプロドラッグである。
【００４８】
式（I）の1つの態様において、R3は2-ベンゾチアゾール、2-ベンゾキサゾール、2-ベンズイミダゾール、4-メチル-2-ベンゾチアゾール、3-キノリン、8-イソキノリン、フェニル、および3-イソプロピル-フェニルからなる群より選択される。
【００４９】
式（I）の1つの態様において、R3は2-ベンゾチアゾール、2-ベンゾキサゾール、2-ベンズイミダゾール、4-メチル-2-ベンゾチアゾール、チオフェン、フェニル、1-ナフタレン、2-ナフタレン、3-キノリン、8-イソキノリン、3-tertブチル-フェニル、6-メトキシ-2-ベンゾチアゾール、6-フルロ-2-ベンゾチアゾール、4-フェニル-2-チアゾール、4N-boc-ピペリジン-3-フェニル、および3-イソプロピル-フェニルからなる群より選択される。
【００５０】
式（I）の1つの態様において、R3は2-ベンゾチアゾール、2-ベンゾキサゾール、2-ベンズイミダゾール、4-メチル-2-ベンゾチアゾール、チオフェン、フェニル、1-ナフタレン、2-ナフタレン、3-キノリン、8-イソキノリン、3-tertブチル-フェニル、4N-boc-ピペリジン-3-フェニル、および3-イソプロピル-フェニルからなる群より選択される。
【００５１】
式（I）の1つの態様において、R3は2-ベンゾチアゾール、2-ベンゾキサゾール、2-ベンズイミダゾール、および3-イソプロピル-フェニルからなる群より選択される。
【００５２】
式（I）の1つの態様において、R3は2-ベンゾチアゾール、2-ベンゾキサゾール、2-ベンズイミダゾール、4-メチル-2-ベンゾチアゾール、チオフェン、フェニル、6-メトキシ-2-ベンゾチアゾール、6-フルロ-2-ベンゾチアゾール、および4-フェニル-2-チアゾールからなる群より選択される。
【００５３】
式（I）の1つの態様において、R3は2-ベンゾチアゾール、2-ベンゾキサゾール、2-ベンズイミダゾール、4-メチル-2-ベンゾチアゾール、チオフェン、およびフェニルからなる群より選択される。
【００５４】
式（I）の1つの態様において、R3は2-ベンゾチアゾール、2-ベンゾキサゾール、2-ベンズイミダゾール、4-メチル-2-ベンゾチアゾール、チオフェン、フェニル、1-ナフタレン、2-ナフタレン、3-キノリン、8-イソキノリン、2-ピリジン、および3-ピリジンからなる群より選択される。
【００５５】
1つの態様において、式（I）の化合物は、
0006463366.tif 000021
またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマーである。これはML355（化合物35）である。
【００５６】
1つの態様において、式（I）の化合物は、
0006463366.tif 000022
またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマーである。
【００５７】
1つの態様において、式（I）の化合物は、
0006463366.tif 000023
またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマーである。
【００５８】
別の局面において、本発明は、式（II）：
0006463366.tif 000024
の化合物、またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマーを含み、
式中、Xは、O、S、NH、およびCからなる群より選択され；
R1およびR2は独立して、H、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、およびアルキルからなる群より選択され；
R3からR6は独立して、H、ハロゲン、アルコキシ、およびアルキルからなる群より選択される。
【００５９】
別の局面において、本発明は、式（III）：
0006463366.tif 000025
の化合物、またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマーを含み、
式中、R1およびR2は独立して、H、ハロゲン、およびアルコキシからなる群より選択され、かつさらに、R1およびR2は両方ともHであることはなく；
R4およびR5は独立して、H、アルキル、フェニル、および置換されていてもよいフェニルからなる群より選択され；
ただし、化合物は
0006463366.tif 000026
ではない。
【００６０】
1つの態様において、R1はハロゲンではない。
【００６１】
1つの態様において、R1はFではない。
【００６２】
1つの態様において、R1はBrではない。
【００６３】
1つの態様において、R1がHである場合、R2はメトキシではない。
【００６４】
1つの態様において、R5はフェニルではない。
【００６５】
1つの態様において、R4がHである場合、R5はフェニルではない。
【００６６】
別の局面において、本発明は、式（IV）：
0006463366.tif 000027
の化合物、またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマーを含み、
式中、R1およびR2は独立して、H、ハロゲン、およびアルコキシからなる群より選択され；
R3およびR4は独立して、H、フェニル、置換されていてもよいフェニル、tert-ブチル、イソプロピル、および
0006463366.tif 000028
からなる群より選択され；
Xは、NH、O、および
0006463366.tif 000029
からなる群より選択される。
【００６７】
1つの態様において、R4が
0006463366.tif 000030
である場合、XはNHではない。
【００６８】
1つの態様において、R3はフェニルではない。
【００６９】
1つの態様において、R4がHである場合、R3はフェニルではない。
【００７０】
別の局面において、本発明は、式（V）：
0006463366.tif 000031
の化合物、またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマーを含み、
式中、Xは、N、C、S、およびOからなる群より選択され；
R1からR6は独立して、H、アルキル、およびアルコキシからなる群より選択される。
【００７１】
1つの態様において、XはCであり、かつR1からR6はHである。
【００７２】
1つの態様において、XはNであり、かつR1からR6はHである。
【００７３】
別の局面において、本発明は、式（VI）：
0006463366.tif 000032
の化合物、またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマーを含み、
式中、Xは、N、C、S、およびOからなる群より選択され；
R1からR6は独立して、H、アルキル、およびアルコキシからなる群より選択される。
【００７４】
1つの態様において、XはCであり、かつR1からR6はHである。
【００７５】
1つの態様において、XはNであり、かつR1からR6はHである。
【００７６】
別の局面において、本発明は、式（VII）：
0006463366.tif 000033
の化合物、またはその薬学的に許容される塩、その鏡像異性体、その鏡像異性体の混合物、もしくはそのジアステレオマーを含み、
式中、Xは、N、C、S、およびOからなる群より選択され；
R1からR3は独立して、H、アルキル、およびアルコキシからなる群より選択される。
【００７７】
1つの態様において、XはSであり、かつR1からR3はHである。
【００７８】
前述の態様のいずれかにおいて、式（I）〜（VII）の化合物または塩は、それぞれのジアステレオマー、光学異性体、鏡像異性体、およびラセミ混合物を含む。
【００７９】
前述の化合物および塩は溶媒和物を形成しうるかまたは無水型などの実質的に非複合型で存在しうることがさらに理解される。溶媒和物に組み込まれた溶媒が水である場合、分子複合体は水和物である。薬学的に許容される溶媒和物には、水和物、メタノラートおよびエタノラートなどのアルコラート、アセトニトリラートなどが含まれる。これらの化合物は多形体で存在することもできる。
【００８０】
本発明は、薬学的に許容される担体および本明細書に記載の式（I）〜（VII）の少なくとも1つの化合物を含む薬学的組成物をさらに目的とする。
【００８１】
化合物を含む薬学的組成物の投与経路および有効量の用量も開示する。本発明の化合物は、疾患の有効な処置のための様々なプロトコールにおいて他の薬剤と併用して投与することができる。
【００８２】
本発明の薬学的組成物は、本発明の化合物の有益な効果を経験しうる任意の動物に投与することができる。そのような動物には、ヒトならびにペットおよび農場動物などの非ヒトが含まれる。
【００８３】
本発明の薬学的組成物を対象に、当技術分野において公知の様式で投与する。投薬量は、受容者の年齢、健康、および体重、同時処置があればその種類、処置の頻度、ならびに所望の効果の性質に依存する。
【００８４】
本明細書に開示の化合物に加えて、本発明の薬学的組成物は、希釈剤、結合剤、安定化剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存剤、佐剤などを含むがそれらに限定されるわけではない、任意の適切な補助剤の少なくとも1つをさらに含んでもよい。薬学的に許容される補助剤が好ましい。そのような無菌溶液の例および調製法は当技術分野において周知であり、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES（Gennaro, Ed., 18th Edition, Mack Publishing Co. (1990)）などであるがそれに限定されるわけではない周知のテキスト中に見出すことができる。化合物の投与様式、溶解性、および/または安定性のために適切な、薬学的に許容される担体は日常的に選択することができる。
【００８５】
本発明において有用な薬学的賦形剤および薬学的添加剤には、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、および炭水化物（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、およびオリゴ糖；アルジトール、アルドン酸、エステル化糖などの誘導体化糖；ならびに多糖または糖ポリマーを含む糖類）も含まれ得るがそれらに限定されるわけではなく、これらは、単独または1〜99.99重量％または体積％の範囲での組み合わせを含んで単一または組み合わせで存在することができる。例示的なタンパク質賦形剤には、ヒト血清アルブミン（HSA）などの血清アルブミン、組換えヒトアルブミン（rHA）、ゼラチン、カゼインなどが含まれる。緩衝能において機能することもできる代表的アミノ酸構成要素には、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどが含まれる。
【００８６】
本発明における使用に適した炭水化物賦形剤には、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、D-マンノース、ソルボースなどの単糖；ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなどの二糖；ラフィノース、メレチトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなどの多糖；およびマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ミオイノシトールなどのアルジトールが含まれる。
【００８７】
組成物は、着色剤、乳化剤、懸濁化剤、エタノール、EDTA、クエン酸緩衝液、着香剤、および水などの薬学的に許容される担体をさらに含むことができるが、それらに限定されるわけではない。
【００８８】
本発明の組成物は、保存剤メチルパラベン（4-ヒドロキシ安息香酸メチルエステル、p-ヒドロキシ安息香酸メチル；またはMETHYL CHEMOSEPTとしても公知）、エチルパラベン（4-ヒドロキシ安息香酸エチルエステル；p-ヒドロキシ安息香酸エチル；またはETHYL PARASEPTとしても公知）、プロピルパラベン（4-ヒドロキシ安息香酸プロピルエステル；p-ヒドロキシ安息香酸プロピル；NIPASOL；またはPROPYL CHEMOSEPTとしても公知）および/またはブチルパラベン（4-ヒドロキシ安息香酸プロピルエステル；p-ヒドロキシ安息香酸プロピル；またはBUTYL CHEMOSEPTとしても公知）を含むこともできる。いくつかの態様において、組成物はメチルパラベンおよび/またはプロピルパラベンを含む。
【００８９】
本発明の乳化剤には、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにその混合物が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００９０】
本発明の化合物を含む薬学的組成物は、緩衝剤またはpH調節剤を含むこともできる。典型的には、緩衝剤は有機酸または塩基から調製した塩である。代表的緩衝剤には、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、もしくはフタル酸の塩などの有機酸塩；トリス、塩酸トロメタミン、またはリン酸緩衝剤が含まれる。
【００９１】
加えて、本発明の薬学的組成物は、ポリビニルピロリドン、フィコール（ポリマー糖）、デキストレート（例えば、2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンなどのシクロデキストリン）、ポリエチレングリコール、着香剤、抗菌剤、甘味料、抗酸化剤、帯電防止剤、界面活性剤（例えば、「ツイーン20」および「ツイーン80」などのポリソルベート）、脂質（例えば、リン脂質、脂肪酸）、ステロイド（例えば、コレステロール）、およびキレート化剤（例えば、EDTAまたはEGTA）などのポリマー賦形剤/添加剤を含むことができる。本発明における使用に適したこれらおよび追加の公知の薬学的賦形剤および/または薬学的添加剤は、例えば、REMINGTON：THE SCIENCE & PRACTICE OF PHARMACY（19th ed., Williams & Williams (1995)）およびPHYSICIAN'S DESK REFERENCE（52nd ed., Medical Economics (1998)）に挙げられるとおり、当技術分野において公知であり、その開示は参照により本明細書に明確かつ完全に組み入れられる。
【００９２】
本発明は、薬学的または獣医学的使用に適し、薬学的に許容される組成物中に本明細書に開示の少なくとも1つの化合物を含む、安定な薬学的組成物ならびに保存剤を含む保存溶液および組成物ならびに多用途保存組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は、少なくとも1つの公知の保存剤を任意で含んでもよい。保存剤には、水性希釈剤中のフェノール、m-クレゾール、p-クレゾール、o-クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、亜硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム（例えば、六水和物）、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサール、またはその混合物が含まれるが、それらに限定されるわけではない。0.001〜5％、またはその中の任意の範囲もしくは値などの、当技術分野において公知の任意の適切な濃度または混合物を用いることができる。非限定例には、保存剤なし、0.1〜2％m-クレゾール、0.1〜3％ベンジルアルコール、0.001〜0.5％チメロサール、0.001〜2.0％フェノ（pheno）、0.0005〜1.0％アルキルパラベンなどが含まれる。
【００９３】
他の賦形剤、例えば、等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、保存剤増強剤を、希釈剤に任意で添加することができる。グリセリンなどの等張剤は、公知の濃度で一般に用いられる。生理学的に耐容される緩衝剤は、好ましくはpH制御の改善を提供するために添加する。薬学的組成物は、pH約4〜pH約10などの広いpH範囲、具体的にはpH約5〜pH約9の範囲、より具体的には約6.0〜約8.0の範囲を対象とする。1つの局面において、本発明の製剤は約6.8〜約7.8のpHを有する。適切な緩衝剤には、リン酸緩衝剤、リン酸ナトリウムおよびリン酸緩衝化食塩水（PBS）が含まれる。
【００９４】
ツイーン20（モノラウリン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタン）、ツイーン40（モノパルミチン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタン）、ツイーン80（モノオレイン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタン）、プルロニックF68（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー）、およびPEG（ポリエチレングリコール）のような薬学的に許容される可溶化剤、あるいはポリソルベート20もしくは80またはポロキサマー184もしくは188などの非イオン性界面活性剤、PLURONIC(登録商標)ポリル（polyl）、他のブロックコポリマー、ならびにEDTAおよびEGTAなどのキレート化剤などの他の添加剤を薬学的組成物に任意で添加して、凝集を減少させることができる。これらの添加剤は、薬学的組成物を投与するためにポンプまたはプラスティック容器を使用する場合に特に有用である。薬学的に許容される界面活性剤の存在は、組成物が凝集する傾向を緩和する。
【００９５】
本発明の組成物は、保存剤メチルパラベン（4-ヒドロキシ安息香酸メチルエステル；p-ヒドロキシ安息香酸メチル；またはMETHYL CHEMOSEPTとしても公知）、エチルパラベン（4-ヒドロキシ安息香酸エチルエステル；p-ヒドロキシ安息香酸エチル；またはETHYL PARASEPTとしても公知）、プロピルパラベン（4-ヒドロキシ安息香酸プロピルエステル；p-ヒドロキシ安息香酸プロピル；NIPASOL；またはPROPYL CHEMOSEPTとしても公知）および/またはブチルパラベン（4-ヒドロキシ安息香酸プロピルエステル、p-ヒドロキシ安息香酸プロピル；またはBUTYL CHEMOSEPTとしても公知）を含むこともできる。いくつかの態様において、組成物はメチルパラベンおよび/またはプロピルパラベンを含む。
【００９６】
本発明の組成物は、リポソームの形態で投与することもできる。当技術分野において公知のとおり、リポソームは一般にはリン脂質または他の脂質物質由来である。リポソームは、水性媒質中に分散された単層状または多層状水和液晶により形成される。リポソームを形成できる任意の非毒性で生理的に許容されかつ代謝可能な脂質を用いることができる。リポソーム形態の本発明の組成物は、本発明の化合物に加えて、安定化剤、保存剤、賦形剤などを含むことができる。好ましい脂質は、天然および合成両方のリン脂質およびホスファチジルコリン（レシチン）である。リポソームを形成するための方法は当技術分野において公知である（Prescott, ed., METH. CELL BIOL. 14:33 (1976)参照）。リポソーム、作製法および使用法は、米国特許第4,089,8091号（リポソームの調製工程）、同第4,233,871号（脂質小胞中の生物活性材料に関する方法）、同第4,438,052号（混合ミセルを産生する工程）、同第4,485,054号（大きい多層状小胞）、同第4,532,089号（巨大サイズのリポソームおよびその方法）、同第4,897,269号（リポソーム薬物送達系）、同第5,820,880号（リポソーム製剤）などに記載されている。
【００９７】
本発明の化合物の調製のための任意の工程中に、関係する任意の分子上の感受性または反応性基を保護することが必要および/または望ましいことがある。これは、PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC CHEMISTRY (1973)；およびGREENE AND WUTS, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS (1991)に記載のものなどの、通常の保護基によって達成してもよい。保護基は、簡便なその後の段階で、当技術分野において公知の方法を用いて除去してもよい。
【００９８】
本発明の化合物は、前濃縮物（希釈剤による希釈前）に可溶化もしくは懸濁する、希釈前に前濃縮物に添加すること、希釈した前濃縮物に添加すること、または前濃縮物との混合前に希釈剤に添加することができる。本発明の化合物は、治療的効果のために、独立の剤形の一部として同時投与することもできる。任意で、本発明の化合物は、第一の可溶化量および第二の非可溶化（懸濁）量で存在することができる。
【００９９】
薬学的製剤は、本明細書に記載のとおり、動物に投与しうる調製物への活性化合物の加工を容易にする、賦形剤および補助剤を含む適切な薬学的に許容される担体を含むこともできる。
【０１００】
錠剤またはカプセル剤の形態での経口投与のために、化合物をエタノール、グリセロール、水などの、経口用、非毒性の薬学的に許容される不活性担体と組み合わせてもよい。さらに、望まれる場合または必要な場合、適切な結合剤、滑沢剤、崩壊剤、および着色剤を混合物に組み込んでもよい。適切な結合剤には、デンプン；ゼラチン；グルコースまたはβ-ラクトースなどの天然糖；コーン甘味料；アカシア、トラガカント、またはアルギン酸ナトリウムなどの天然および合成ゴム、カルボキシメチルセルロース；ポリエチレングリコール；ワックスなどが含まれるが、それらに限定されるわけではない。これらの剤形において用いられる滑沢剤には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが含まれるが、それらに限定されるわけではない。崩壊剤には、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１０１】
経口投与のために、組成物は任意で甘味料も含む。甘味料には、スクロース、フルクトース、サッカリンナトリウム、スクラロース（SPLENDA(登録商標)）、ソルビトール、マンニトール、アスパルテーム、サイクラミン酸ナトリウムなど、およびその組み合わせが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１０２】
本発明の経口投与のための水性懸濁剤、乳剤および/またはエリキシル剤は、本明細書に記載の、水、グリセリンおよび様々な組み合わせなどの希釈剤に加えて、様々な甘味料、オレンジまたはレモン香料などであるが、それらに限定されるわけではない着香剤、染料、天然着色剤または色素などの着色剤と組み合わせることができる。
【０１０３】
経口投与に適した本発明の薬学的組成物は、所定の量の化合物をそれぞれ含む、カプセル剤、糖衣錠、カシェ剤、もしくは錠剤などの別々の単位として；散剤もしくは顆粒剤として；水性液体もしくは非水性液体中の液剤もしくは懸濁剤として；または水中油液体乳剤もしくは油中水乳剤として、およびボーラスなどとして与えられてもよい。
【０１０４】
錠剤は、任意で1つまたは複数の補助成分と共に圧縮または成形することにより作製してもよい。圧縮錠は、任意で結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、界面活性剤または分散剤と混合した、粉末または顆粒などの流動性の形態の化合物を、適切な機械で圧縮することにより調製してもよい。成形錠は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を、適切な機械で成形することにより作製してもよい。錠剤は、任意でコーティングしてもまたは溝をつけてもよく、その中の化合物の徐放または制御放出を提供するように製剤化されてもよい。
【０１０５】
加えて、化合物を含む組成物を、化合物の持続放出を可能にする、生分解性ポリマーに組み込んでもよい。生分解性ポリマーおよびそれらの使用は、Brem et al., 74 J. NEUROSURG. 441-46 (1991)に詳細に記載されている。持続放出組成物の適切な例には、本発明の化合物を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、そのマトリックスは成形品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール)を含む）、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号）、L-グルタミン酸とy L-グルタミン酸エチルとのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(登録商標)（Tap Pharmaceuticals, Inc., Chicago, Ill.）（乳酸グリコール酸コポリマーおよび酢酸リュープロリドからなる注射用ミクロスフェア）などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、およびポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸が含まれる。
【０１０６】
非経口投与に適した薬学的組成物には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および製剤を所期の受容者の血液と等張にする溶質を含んでいてもよい、水性および非水性滅菌注射液剤；ならびに懸濁化剤および増粘剤を含んでいてもよい、水性および非水性滅菌懸濁剤が含まれる。組成物は、単一用量または多用量容器中、密封したアンプルおよびバイアル中で与えられてもよく、使用直前に滅菌液体担体、注射用水の添加のみを必要とする、凍結乾燥（凍結乾燥した（lyophilized））状態で保存してもよい。即時注射液剤および懸濁剤を、前述の種類の滅菌散剤、顆粒剤および錠剤から調製してもよい。
【０１０７】
非経口投与のためには滅菌懸濁剤および液剤が望しい。静脈内投与が望まれる場合、一般に適切な保存剤を含む等張製剤を用いる。薬学的組成物を、不活性液体担体中に溶解した化合物を含む薬学的組成物の注射を介して、非経口投与してもよい。本明細書において用いられる「非経口」なる用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、腹膜内注射、または注入技術を含むが、それらに限定されるわけではない。許容される液体担体には、落花生油、綿実油、ゴマ油などの植物油、ならびにソルケタール、グリセロールホルマールなどの有機溶媒が含まれる。薬学的組成物は、最終製剤が約0.005重量％〜30重量％の化合物を含むように、化合物を液体担体に溶解または懸濁することにより調製してもよい。
【０１０８】
本発明の組成物は、親水性薬物、疎水性薬物、親水性高分子、サイトカイン、ペプチド様物質、ペプチド、タンパク質、トキソイド、血清、抗体、ワクチン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオシド類似体、遺伝子材料および/またはその組み合わせなどであるが、それらに限定されるわけではない、追加の治療用物質を含むこともできる。
【０１０９】
追加の治療用物質は、前濃縮物（希釈剤による希釈前）に可溶化もしくは懸濁する、希釈前に前濃縮物に添加すること、希釈した前濃縮物に添加すること、または前濃縮物との混合前に希釈剤に添加することができる。追加の治療用物質は、治療的効果のために、独立の剤形の一部として同時投与することもできる。任意で、追加の治療用物質は、第一の可溶化量および第二の非可溶化（懸濁）量で存在することができる。そのような追加の治療用物質は、動物、特に哺乳動物に投与した場合、薬物、栄養分、および診断用物質などの、治療的価値または他の価値を有する任意の作用物質であり得る。
【０１１０】
本発明の化合物および組成物、ならびに追加の薬学的活性物質に加えて、薬学的製剤は、本明細書に記載のとおり、動物に投与しうる調製物への活性化合物の加工を容易にする、賦形剤および補助剤を含む適切な薬学的に許容される担体を含むこともできる。
【０１１１】
本発明において有用な薬学的製剤は、処置中の対象の状態、障害または疾患を処置または予防するのに有効な量の、本発明の化合物の量を含むことができる。
【０１１２】
本発明はさらに、経口、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、腔内（intracavitary）、腔内（intracelial）、小脳内（intracelebellar）、脳室内、結腸内、子宮頸内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹膜内、胸膜内、前立腺内、肺内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、口腔、舌下、鼻内、イオン導入手段、または経皮手段を含むが、それらに限定されるわけではない経路により、本明細書に開示の少なくとも1つの化合物の投与に関する。
【０１１３】
本発明の化合物を対象に長期間、1回の投与から1週間〜1年間の期間にわたって送達することが望ましい場合もある。患者の持続的で間欠的な投薬または要求に応じた投薬を提供するために、ある特定の医用装置を用いてもよい。装置は、散布器具のポンプであってもよいか、または、薬物の貯蔵器および任意で薬物の送達を制御するための診断構成要素もしくはモニタリング構成要素を備える他の装置であってもよい。様々な徐放性、デポーまたは植え込み剤形を用いることができる。剤形は、体液中の溶解性が低い本明細書に開示の化合物の薬学的に許容される非毒性塩、すなわち（a）リン酸、硫酸、クエン酸、酒石酸、タンニン酸、パモ酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンモノまたはジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などの多塩基酸との酸付加塩；（b）亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなどの多価金属カチオン、または、例えば、N,N'-ジベンジル-エチレンジアミンもしくはエチレンジアミンから生成される有機カチオンとの塩；または（c）（a）および（b）の組み合わせ、例えば、タンニン酸亜鉛塩を含むことができる。加えて、本発明の化合物または直前に記載したものなどの比較的不溶性の塩を、注射に適した、例えば、ゴマ油とのゲル、モノステアリン酸アルミニウムゲルに製剤化することもできる。塩には、亜鉛塩、タンニン酸亜鉛塩、パモ酸塩などが含まれるが、それらに限定されるわけではない。注射用徐放性デポー製剤の別の型は、米国特許第3,773,919号に記載の製剤を含む、ポリ乳酸/ポリグリコール酸ポリマーなどのゆっくり分解する非毒性非抗原性ポリマー中に分散または封入された塩の化合物を含む。前述のものなどの化合物またはその比較的不溶性の塩を、特に動物における使用のための、コレステロールマトリックスシラスティックペレットに製剤化することもできる。さらなる徐放性、デポーまたは植え込み製剤、例えば、ガスまたは液体リポソームは、文献中で公知である。例えば、米国特許第5,770,222号；SUSTAINED AND CONTROLLED RELEASE DRUG DELIVERY SYSTEMS (1978)参照。
【０１１４】
他の例には、生分解性組成物を含む、持続放出送達系により投与される本発明の化合物を提供することが含まれる。生分解性組成物は、生分解性水溶性非ポリマー材料、および、水性媒質に混和性から分散性の生体適合性非毒性有機溶媒から構成されてもよい。送達系を植え込み部位で植え込んで、溶媒を得られる微孔性マトリックスを通して組成物から周囲組織中に放散、分散、または浸出させてもよい。
【０１１５】
「植え込み部位」なる用語は、その中または上に非ポリマー組成物を適用する部位を含むことを意味する。植え込みまたは植え込み部位は、少なくとも1つの本発明の化合物を固体装置と共に含む薬学的組成物の組込みを含むこともできる。薬学的組成物は、対象に植え込むステント状のコーティング中に組み込むことができる。加えて、薬学的組成物を適用する基体として、他の固体または生分解性材料を用いることもできる。次いで、薬学的組成物を含むコーティングした材料を、対象または患者に植え込むか、挿入するか、または隣接させる。「生分解性」なる用語は、非ポリマー材料および/または植え込み物のマトリックスが、酵素の作用により、単純な加水分解作用もしくは酵素触媒された加水分解作用により、および/またはヒト体内の他の類似のメカニズムにより、経時的に分解することを意味する。「生体侵食性」とは、植え込みマトリックスが、少なくとも部分的には、周囲の組織液中に見られる物質との接触、細胞作用などにより、経時的に侵食または分解されることを意味する。「生体吸収性」とは、非ポリマーマトリックスが、細胞、組織などにより、分解され、ヒト体内に吸収されることを意味する。
【０１１６】
組成物中で使用し得る非ポリマー材料は一般に、生体適合性であり、水および体液に実質的に不溶性であり、かつ生分解性および/または生体侵食性であるものである。非ポリマー材料は、水溶性有機溶媒中で、少なくとも部分的に可溶化することが可能である。非ポリマー材料は、凝固または固化して、固体植え込みマトリックスを形成することも可能である。非ポリマー材料を適合性でかつ適切な有機溶媒と組み合わせて、展性のあるパテまたはペーストへの水様から粘性の範囲の所望の稠度を有する組成物を生成する。
【０１１７】
適切な有機溶媒は、生体適合性であり、薬学的に許容されるものであり、少なくとも部分的に非ポリマー材料を溶解する。有機溶媒は、混和性から分散性の範囲の水中での溶解性を有する。任意で、細孔形成剤を組成物中に含めて、植え込みマトリックス中にさらなる細孔を生成することもできる。細孔形成剤は、水または体液に実質的に可溶性であり、凝固している非ポリマー材料および/または植え込み物の固体マトリックスから植え込み部位の周囲の体液中に放散する、任意の有機または無機の薬学的に許容される物質であり得る。
【０１１８】
本発明の化合物は、動物の体内で局所的なまたは全身性の生物学的、生理的、または治療的効果を提供することができる。本明細書に記載のいくつかの薬学的組成物を製剤化する際に、均質な混合物を生成するために化合物は、好ましくは非ポリマー組成物中で可溶性または分散性であり、植え込まれると植え込み物マトリックス中に組み込まれることになる。固体マトリックスが経時的に分解するにつれて、化合物は、マトリックスから隣接組織液中に、そして、植え込み部位に隣接しているかまたは植え込み部位から離れている関連する体組織または器官に、好ましくは制御された速度で放出され得る。化合物のマトリックスからの放出は、水性媒質中の化合物の溶解性、マトリックス内の化合物の分布、固体マトリックスのサイズ、形状、多孔度、ならびに溶解性および生分解性によって変動し得る。例えば、米国特許第5,888,533号参照。患者に投与する組成物中の成分の量および濃度は、一般には所期の課題を達成するために有効である。
【０１１９】
他の態様において、本発明の化合物は、ポリマーマトリックス中に懸濁した微小粒子を含む生物活性剤送達系により投与してもよい。微小粒子は、現在当技術分野において公知のマイクロカプセル、ミクロスフェア、またはナノスフェアであってもよい。微小粒子は、いったん生物環境内に入ればゲルであるかまたはゲルになるポリマー内で完全なままで同伴され得るべきである。微小粒子は生分解性または非生分解性であり得る。生物活性剤を微小粒子担体中に組み込むために用いる多くのマイクロカプセル化技術は、当技術分野において教示されている。例えば、米国特許第4,652,441号；同第5,100,669号；同第4,438,253号；および同第5,665,428号参照。
【０１２０】
好ましいポリマーマトリックスは生分解性であり、低温で水溶性を示し、哺乳動物の生理的体温で可逆的熱ゲル化を起こす。ポリマーマトリックスは、そのマトリックス内で同伴された物質を経時的かつ制御された様式で放出することが可能である。ポリマーは水性環境または生理的環境で酵素的加水分解または非酵素的加水分解により徐々に分解される。例えば、米国特許第6,287,588号参照。
【０１２１】
ある特定の量の活性成分を含む様々な薬学的組成物を調製する方法は、当業者には公知であるか、または本開示に鑑みて明らかにであると考えられる。該薬学的組成物を調製する方法は、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Martin, E.W., ed., Mack Publishing Company, 19th ed. (1995)に記載のとおり、他の適切な薬学的賦形剤およびそれらの製剤を組み込むことができる。
【０１２２】
本発明の薬学的調製物を調製する方法は、通常の混合、溶解、または凍結乾燥法を含む公知の様式で製造する。したがって、液体薬学的調製物を、活性化合物を固体賦形剤と組み合わせ、得られた混合物を任意で粉砕し、望まれる場合または必要な場合、適切な補助剤を添加した後に、顆粒の混合物を加工することにより得ることができる。
【０１２３】
当業者であれば、それを必要としている患者に本発明の組成物の薬学的有効量を投与する方法は、経験的に、または医学分野で現在認められている標準により、決定し得ることを理解すると考えられる。作用物質を患者に、1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤との組み合わせで、薬学的組成物として投与することができる。ヒト患者に投与する場合、本発明の組成物の作用物質の1日の総使用量は、主治医が健全な医学的判断の範囲内で決定することが理解されると考えられる。任意の特定の患者のための特定の治療的に有効な用量レベルは、様々な因子：すなわち達成される細胞応答の種類および程度；用いる特定の作用物質または組成物の活性；用いる特定の作用物質または組成物；患者の年齢、体重、全身の健康、性別、および食事；投与時間、投与経路、および作用物質の排出速度；処置の持続時間；特定の作用物質との組み合わせでまたは該作用物質と同時に用いる薬物；および医学の技術分野において周知の同様の因子に依存する。所望の治療的効果を達成するために必要とされるものよりも低いレベルで作用物質の投与を開始すること、および所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることは、十分に当技術分野の技術の範囲内である。
【０１２４】
投薬は、当技術分野において許容されかつ日常的である技術によって決定された所定の血中の濃度の作用物質を提供する患者特有の様式で行われることができる。
【０１２５】
一般に、最適な効果を得る一方で、任意の可能な毒性を最小限にするために、本明細書に開示の化合物を日常的な試験により規定した適切な用量で単独でまたは他の治療用物質と共に用いてもよい。本発明の化合物を用いる投薬レジメンは、患者の体型、人種、年齢、体重、性別、医学的状態；処置する状態の重症度；投与経路；患者の腎および肝機能；ならびに用いる特定の化合物を含む様々な因子に応じて選択してもよい。通常の技術を有する医師または獣医師であれば、状態を予防するため、該状態を阻止するため、または該状態の進行を停止するために必要な薬物の有効量を容易に決定および処方することができる。
【０１２６】
最小限の毒性で最大の効果を生じる範囲内の薬物濃度を達成する際の最適な精度は、1つまたは複数の標的部位に対する化合物の利用率の動態学に基づいたレジメンを必要とし得る。処置レジメンの最適濃度を決定する場合、薬物の分布、平衡、および排出を考慮してもよい。所望の効果を達成するために組み合わせる場合、本明細書に開示の化合物の用量を調節してもよい。一方、これらの様々な治療用物質の用量を別々に最適化し、組み合わせて、それぞれの作用物質を単独で用いた場合よりも病態が軽減される、相乗的結果を達成してもよい。
【０１２７】
特に、本明細書に開示の化合物の毒性および治療的効果は、例えば、LD50（集団の50％に対して致死的な用量）およびED50（集団の50％で治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養物または実験動物において標準の薬学的手順により判定してもよい。毒性効果と治療的効果との間の用量比は、治療指数であり、LD50/ED50の比として表してもよい。化合物の細胞毒性が、望ましい活性または治療的転帰である場合を除き、大きい治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用することもあるが、非感染細胞への可能な損傷を最小限にし、それにより副作用を軽減するために、送達系はそのような化合物に患部組織の部位を標的とさせることができる。一般に、本発明の化合物を、効果を最大にし、毒性を最小にする様式で投与してもよい。
【０１２８】
細胞培養アッセイ法および動物試験から得たデータを、ヒトにおいて用いる用量の範囲を策定する際に用いてもよい。そのような化合物の用量は、好ましくは、毒性がほとんどまたはまったくない、ED50を含む循環濃度の範囲内である。用量は、用いる剤形および用いる投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本発明の方法において用いる任意の化合物のために、治療的に有効な用量は最初細胞培養アッセイ法から推定してもよい。細胞培養において決定したIC50（症状の最大半減阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、用量を動物モデルで策定してもよい。そのような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量を正確に決定してもよい。血漿中のレベルは、高性能液体クロマトグラフィによって測定してもよい。
【０１２９】
さらに、本発明の薬学的組成物の用法用量は、薬物動態学的/薬力学的モデリングシステムを用いて最適化してもよい。1つまたは複数の投薬レジメンを選択してもよく、1つまたは複数の投薬レジメンの薬物動態学的/薬力学的プロファイルを決定するために薬物動態学的/薬力学的モデルを用いてもよい。次に、特定の薬物動態学的/薬力学的プロファイルに基づいて所望の薬物動態学的/薬力学的反応を達成する、投与のための投薬レジメンの1つを選択してもよい。米国特許第6,747,002号を参照されたく、これは完全に明確に参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３０】
同じ組成物中に製剤されようともそうでなかろうとも、開示の薬学的組成物または開示の薬物組み合わせについての治療的および予防的目的のための有効用量を決定するための方法は、当技術分野において公知である。治療的目的のために、本明細書において用いられる「共同で有効な量」なる用語は、研究者、獣医師、医師、または他の臨床家が探し求めている組織系、動物、またはヒトにおける生物学的または医学的応答を誘発する、それぞれの活性化合物または薬学的作用物質の単独または組み合わせでの量を意味し、該応答には処置中の疾患または障害の症状の軽減が含まれる。予防的目的（すなわち、障害の発生または進行を阻害すること）のために、「共同で有効な量」なる用語は、研究者、獣医師、医師、または他の臨床家が探し求めている障害の発生または進行を対象において阻害するそれぞれの活性化合物または薬学的作用物質の単独または組み合わせでの量を指す。したがって、本発明は、2つまたはそれ以上の治療用物質の組み合わせをさらに提供し、（a）各治療用物質を独立して治療的または予防的に有効な量で投与するか；（b）組み合わせ中の少なくとも1つの治療用物質を、単独で投与すると治療量以下または予防量以下であるが、第二または追加の本発明の治療用物質との組み合わせで投与すると治療的または予防的である量で投与するか；または（c）両方の治療用物質を、単独で投与すると治療量以下または予防量以下であるが、一緒に投与すると治療的または予防的である量で投与する。3つまたはそれ以上の治療用物質の組み合わせも同様に可能である。併用療法の方法には、すべての活性作用物質を含む単一の製剤の同時投与；複数の製剤の本質的に同時の投与；および別々に製剤化された2つまたはそれ以上の活性作用物質の投与が含まれる。
【０１３１】
より具体的には、薬学的組成物を1日1回用量で投与してもよいか、または1日の総用量を1日に2、3、または4回の分割用量で投与してもよい。1週間、1ヶ月間、または、数ヶ月、3、6、9、もしくは12ヶ月の間に、または当技術分野において公知の臨床上適切であると判定された間隔で、用量を投与してもよい。用量を患者の生涯持続してもよいか、または、臨床的判断が正当とする場合には中止する。組成物の1日用量は、患者1人につき、1日あたり約0.0001〜約1.000mgの広い範囲で変動してもよい。範囲は特に1日あたり約0.001mg/kg〜10mg/kg体重、成人（約60kg）では1日あたり約0.1〜100mg、約1.0〜50mgまたは約1.0〜20mgであってもよい。加えて、用量は、臨床上適切な血清濃度を達成するために、1日あたり約0.5〜10mg/kg、1日あたり約1.0〜5.0mg/kg、1日あたり5.0〜10mg/kg、または医師により決定された等価の用量であってもよい。
【０１３２】
注射の場合、成人（約60kg）に1日あたり約0.01〜30mg、約0.1〜20mg、または約0.1〜10mgの量で静脈内経路により投与することが通常は好都合である。静脈内用量はボーラス投薬または緩徐投薬を含み得る。他の動物の場合、60kgに対して算出した用量を同様に投与してもよい。
【０１３３】
非限定例として、ヒトまたは動物の処置は、患者1人につき、1日あたり0.0001〜約1.000mgの本発明の化合物の1回または定期的用量で提供されることができる。範囲は特に1日あたり約0.001mg/kg〜10mg/kg体重、成人（約60kg）では1日あたり約0.1〜100mg、約1.0〜50mg、または約1.0〜20mgであってもよい。加えて、用量は、臨床上適切な血清濃度を達成するために、1日あたり約0.5〜10mg/kg、1日あたり約1.0〜5.0mg/kg、1日あたり5.0〜10mg/kg、または医師により決定された等価の用量であってもよい。
【０１３４】
具体的には、本発明の薬学的組成物を数週間の間に少なくとも1週間に1回投与してもよい。1つの態様において、薬学的組成物を数週間から数ヶ月の間に少なくとも1週間に1回投与してもよい。別の態様において、薬学的組成物を4〜8週間の間に1週間に1回投与する。さらに別の態様において、薬学的組成物を4週間の間に1週間に1回投与する。
【０１３５】
本発明は、12-リポキシゲナーゼ媒介性の疾患または障害を処置または予防するための方法をさらに提供する。方法は、哺乳動物に本発明の化合物の治療的または予防的に有効な量を投与する段階を含む。
【０１３６】
処置または予防される12-リポキシゲナーゼ媒介性の疾患または障害は、典型的には、12-ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸（12(S)-HPETE）および/または12-ヒドロキシエイコサテトラエン酸（12(S)-HETE）の産生が疾患または障害の発生または進行に関係があるとされる疾患または障害である。12-LOX媒介性の疾患または障害には、12-LOXが疾患および障害の直接的媒介物質であるもの、ならびに12-LOXの阻害が疾患および障害の処置または予防において治療的価値をもたらすものが含まれる。
【０１３７】
1つの態様において、本発明は、哺乳動物に、式（I）〜（VII）の化合物、またはその塩、鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、もしくはジアステレオマーのいずれかの治療的または予防的に有効な量を投与する段階を含む、12-リポキシゲナーゼ媒介性の疾患または障害を処置または予防する方法を提供する。
【０１３８】
1つの態様において、12-リポキシゲナーゼはヒト12-リポキシゲナーゼである。
【０１３９】
1つの態様において、12-リポキシゲナーゼ媒介性の疾患または障害は、1型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病性腎疾患、糖尿病性神経疾患、心血管疾患、アルツハイマー病、非アルコール性脂肪性肝炎、血小板性血流遮断、皮膚疾患、ヘパリン起因性血小板減少症、血栓症、および癌からなる群より選択される。
【０１４０】
1つの態様において、癌は前立腺癌、直腸結腸癌、乳癌、および肺癌からなる群より選択される。
【０１４１】
1つの態様において、心血管疾患は、うっ血性心不全、心筋梗塞、および脳卒中からなる群より選択される。
【０１４２】
1つの態様において、本発明は、哺乳動物に、式（I）〜（VII）の化合物、またはその塩、鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、もしくはジアステレオマーのいずれかの治療的または予防的に有効な量を投与する段階を含む、1型および/または2型を処置または予防する方法を提供する。
【０１４３】
1つの態様において、本発明は、哺乳動物に、式（I）〜（VII）の化合物、その塩、鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、またはジアステレオマーのいずれかの治療的または予防的に有効な量を投与する段階を含む、血栓症を処置または予防する方法を提供する。
【０１４４】
1つの態様において、本発明は、哺乳動物に、式（I）〜（VII）の化合物、その塩、鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、またはジアステレオマーのいずれかの治療的または予防的に有効な量を投与する段階を含む、PAR4-AP誘導性血小板凝集を減少させるための方法を提供する。
【０１４５】
1つの態様において、本発明は、哺乳動物に、式（I）〜（VII）の化合物、その塩、鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、またはジアステレオマーのいずれかの治療的または予防的に有効な量を投与する段階を含む、PAR4-AP誘導性カルシウム動員を減少させるための方法を提供する。
【０１４６】
1つの態様において、12-LOX阻害物質は、移植/異物移植のシナリオにおいて有用であり、例えば、移植前に生存率を向上するために膵島をエクスビボで処置する。
【０１４７】
本発明は、部分的には、ヒト血小板において高度に発現するオキシリピン産生酵素の血小板12(S)-リポキシゲナーゼ（12-LOX）がFcγRIIa媒介性血小板活性化の必須の構成要素であるとの驚くべき発見に基づいている。例えば、図11は、12-LOXがいかにしてFcγRIIa媒介性血小板凝集を調節するかを示す。理論に縛られたくはないが、血小板は血管に対する炎症または損傷の後のホメオスタシスを維持する上で必須である。FcγRIIa受容体の活性化は免疫媒介性血小板活性化をもたらし、これは心筋梗塞および脳卒中につながる血栓性合併症を引き起こし得る。血小板におけるFcγRIIa媒介性活性化の阻害は、血栓症を制限することが明らかにされており、免疫媒介性血小板活性化の予防の主な標的である。しかし、12-LOXは、本発明者らの発見までは、FcγRIIa媒介性血栓症の病因に関係するとは当技術分野において知られていなかった。したがって、本明細書に開示の技術は、この驚くべき発見を利用し、FcγRIIa媒介性経路が関与する疾患または障害を処置または予防する新規方法を提供することを目的とする。そのような疾患または障害は、免疫媒介性血小板減少症および血栓症障害であり得る。本発明のいくつかの局面において、本明細書に開示するのは、血小板活性化を阻害して、血栓症を予防または処置する新規方法である。
【０１４８】
本発明の1つの局面は、血小板を12-リポキシゲナーゼ阻害物質と接触させる段階を含む、血小板活性化を阻害するかまたは低下させる方法に関する。いくつかの態様において、血小板活性化は免疫媒介性である。いくつかの態様において、免疫媒介性血小板活性化はFcγRIIa受容体の活性化に起因する。
【０１４９】
化合物または作用物質は、12-LOXの機能または活性を少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも95％低下させる場合には12-LOX阻害物質と考えられる。12-LOX阻害物質は、有機化合物、無機化合物、生物学的化合物（例えば、タンパク質もしくはその断片、抗体もしくはその断片、核酸、核酸類似体、糖質、またはペプチド）、またはその任意の組み合わせであり得る。12-LOX阻害物質は、合成または天然でもあり得る。12-LOX阻害物質の非限定例には、ETYA（CAS No.：1191-85-1）、バイカレイン（CAS No.：491-67-8）、15(S)-HETrE（CAS No.：13222-49-6）、カフェイン酸（CAS No.：331-39-5）、CDC（CAS No.：132465-11-3）、エスクレチン（CAS No.：305-01-1）、3,4-ジヒドロキシベンジリデンシアノ酢酸エチル（CAS No.：132464-92-7）、ETI（CAS No.：13488-22-7）、フェルラ酸（CAS No.：1135-24-6）、ゴシポール（CAS No.：303-45-7）、2-TEDC（CAS No.：132465-10-2）、ヒノキチオール（CAS No.：499-44-5）、8,11,14-エイコサトリイン酸（CAS No.：34262-64-1）、ダフノドリンA、ML355、およびその組み合わせが含まれる。ML355の化学構造はLuci et al.（J Med Chem. 2014, 57, 495-506）に記載されており、その内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５０】
12-LOX阻害物質は、例えば、US20130096159、WO1990012008、US6217875、US4605669、US4623661、CA1327204、US20070111965、US4897422、US20060193797、US5120752、US5112848、US5574062、EP0416609、US4822811、EP0456760、US4761403に開示されており、それらのそれぞれの内容は12-LOX阻害物質のその教示のために参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５１】
いくつかの態様において、本明細書に開示の方法のために用いる12-LOX阻害物質は、12-LOX阻害物質の組み合わせであり得る。これらの態様のいくつかにおいて、最大の治療的効果を提供するように12-LOX阻害物質の混合比を最適化する。
【０１５２】
12-LOX阻害物質の少なくともいくつか（例えば、ML355）は、低毒性、および体からの良好なクリアランスを示すことが明らかにされており（Luci et al., J Med Chem. 2014, 57, 495-506）、本明細書に開示の方法の治療的価値を示している。
【０１５３】
いくつかの態様において、12-LOX阻害物質はインビトロで血小板と接触する。例えば、血小板を対象から得、次いで容器（例えば、96穴プレートまたはペトリ皿）内で培養することができる。インビトロでの接触は、12-LOX阻害物質の効果の評価などの適用のために使用することができる。
【０１５４】
いくつかの態様において、12-LOX阻害物質はインビボで血小板と接触する。これらの態様において、インビボでの接触は、ヘパリンを摂取している対象においてであり得る。対象は、免疫媒介性血小板減少症および血栓症障害の処置または予防を必要としていてもよい。
【０１５５】
血小板活性化を、様々な方法によって評価または測定することができる。例えば、血小板活性化を、形状の変化および凝集傾向などの因子によって定量することができる。血小板の形状変化は、フローサイトメトリーまたは電子顕微鏡によって評価することができる。血小板凝集は、血小板凝集計で測定することができる。血小板活性化は、関連する血小板代謝産物またはバイオマーカー（例えば、α顆粒構成要素、βトロンボグロブリンおよび血小板因子4、トロンボキサンB2、または接着分子P-セレクチンの可溶型）の血中または尿中レベルを測定することによって定量することもできる。血小板活性化を測定するためのいくつかの方法が、US7011938、WO1996012956、およびUS6391568に開示されており、それらのそれぞれの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５６】
12-LOX阻害物質は免疫媒介性血小板活性化を阻害するかまたは低下させることができるため、本発明の別の局面は、それを必要としている対象に12-リポキシゲナーゼ阻害物質の有効量を投与する段階を含む、免疫媒介性血小板減少症および血栓症障害を処置または予防する方法に関する。免疫媒介性血小板減少症および血栓症障害の例には、ヘパリン起因性血小板減少症（HIT）；抗リン脂質抗体症候群；敗血症症候群；治療用または診断用モノクローナル抗体に関連する血栓症；および血栓性血小板減少性紫斑病が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１５７】
いくつかの態様において、免疫媒介性血小板減少症および血栓症障害は、対象において1つまたは複数のヘパリンまたはその誘導体の使用によって誘発され得る。これらの態様において、免疫媒介性血小板減少症および血栓症障害はヘパリン起因性血小板減少症（HIT）である。
【０１５８】
HITは、ヘパリン療法の投与に起因する障害であり、低血小板数（例えば、血液1ミリリットルあたり血小板＜100,000）の発生の結果である。本明細書において用いられる「HIT」および「ヘパリン起因性血小板減少症および血栓症（HITT）」なる用語は交換可能に用いられる。逆説的なことに、抗凝固薬物治療および血小板減少症は、出血としてではなく、むしろ重篤な血栓症として現れる。血栓性事象は、例えば、静脈、動脈、および微小血管系に波及する、多病巣性である。いくつかのHIT症例において、血栓は大血管床で生じ、DVT/PE、心筋梗塞、脳卒中、または四肢虚血などの明白な臨床症状を伴う。他の症例では、血栓は、微小血管系で生じ、明白に臨床的な作用（例えば、副腎血栓症と、続く出血、皮膚壊死）を伴うか、または無症状のままである。
【０１５９】
HITは、未分画ヘパリンを投与された患者の1％〜3％、および低分子量ヘパリンを投与された患者の0.1％で発生することが判明した。現在、HITに対する標準の診断法はない。HITに対するいくつかの診断法が、例えば、WO2001004159およびWO2013165969に開示されており、それらのそれぞれの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。様々な状況におけるHIT発症の確率を予測するために、臨床採点システムも開発されている（Elalamy I, et al., Ann. Med. 2000, 32, 60-67；.Samama M, et al., Bull Acad Natl Med. 1998, 182, 1517-1533）。例えば、1つの臨床採点システムにおいて、点数を血小板数の変化、血栓症の発生、および他の血小板減少症の原因などの因子に与える。
【０１６０】
例えば、最初は細胞培養アッセイ法または動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌ、もしくはブタのいずれかで、治療的に有効な量を推定することができる。動物モデルを用いて、所望の濃度範囲および投与経路を達成することもできる。次いで、そのような情報を用いて、他の対象における有用な用量および投与経路を決定することもできる。一般に、治療的に有効な量は所望の治療的効果に依存する。
【０１６１】
12-LOX阻害物質の投薬レジメンは、最適な所望の反応（例えば、治療的または予防的反応）を提供するように調節することができる。例えば、単一のボーラスを投与することもでき、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよいか、または用量を治療状況の緊急性によって示されるのに比例して減少または増加させてもよい。非経口組成物を、投与の容易さおよび用量の均一性のために単位剤形に製剤化することが有利であり得る。
【０１６２】
当技術分野において通常の技術を有する医師または獣医師であれば、必要な薬学的組成物の有効量を容易に決定および処方することができる。例えば、医師または獣医師は、12-LOX阻害物質の用量を所望の治療的効果を達成するために必要とされるよりも低いレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増やすことができる。
【０１６３】
当技術分野において通常の技術を有する医師または獣医師であれば、12-LOX阻害物質を含む薬学的組成物の投与をいつ開始するかを容易に決定することもできる。投与のタイミングは一般には診断結果に依存することに留意すべきである。例えば、12-LOX阻害物質を含む薬学的組成物を、HITの1つまたは複数の症状が起こった（例えば、血小板数の低下）場合に投与することができる。
【０１６４】
本明細書に開示の方法を、免疫媒介性血小板減少症および血栓症障害（例えば、HIT）を処置するための他の方法または治療法との組み合わせで用いることができる。例えば、HITを処置するための1つの治療的アプローチは、ヘパリン処置の廃止および直接的トロンビン阻害物質（例えば、ダナパロイド、アルガトロバン、またはレピルジン）での置き換えである。ヘパリンの単純な中止は免疫媒介性血小板減少症および血栓症障害を終結させないことに留意すべきである。別の例において、第Xa因子阻害物質（例えば、フォンダバリヌクス）をHIT処置のために用いることができる。他の治療法には、血栓溶解療法（例えば、ストレプトキナーゼまたはウロキナーゼ）、血栓塞栓除去術、血漿交換、高用量IV IgG、およびGPIIb/IIIa阻害物質が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１６５】
本発明のさらに別の局面は、それを必要としている対象に12-LOX阻害物質の有効量を投与する段階を含む、血栓性事象、心筋梗塞、または脳卒中を処置または予防する方法に関する。免疫媒介性血小板活性化は血栓形成に至ることがあり、これは動脈を凝固させて、脳卒中、心筋梗塞、臓器梗塞、四肢壊疽、または他の重篤な合併症を引き起こしうる。
【０１６６】
すべての態様のいくつかの局面において、対象は哺乳動物である。すべての態様のいくつかの局面において、対象はヒトである。
【０１６７】
すべての態様のいくつかの局面において、対象は免疫媒介性血小板減少症および血栓症障害の1つまたは複数の危険因子を示すものであり得る。すべての態様のいくつかの局面において、対象はヘパリン療法を受けている。すべての態様のいくつかの局面において、対象は整形外科手術を受ける。当技術分野において、整形外科患者は他の医学的理由でヘパリンを投与されている患者よりもHITを発生する危険度が高いことが公知である。
【０１６８】
本明細書に記載のものと類似または等価の方法および材料を、本開示の実施または試験において使用し得るが、適切な方法および材料を以下に記載する。「含む（comprise）」なる用語は「含む（include）」を意味する。略語「e.g.」はラテン語のexempli gratiaに由来し、本明細書において非限定例を示すために用いる。したがって、略語「e.g.」は「例えば」なる用語と同義である。
【０１６９】
本明細書において好ましい態様を示し、詳細に記載してきたが、当業者には、本発明の精神から逸脱することなく、様々な改変、追加、置換などを行い得ることが明白であり、したがってこれらは添付の特許請求の範囲に規定する本発明の範囲内であると考えられる。さらに、まだ示していない程度にまで、当業者であれば、本明細書に記載し、例示する様々な態様の任意の1つをさらに改変して、本明細書に開示の任意の他の態様に示す特徴を組み込み得ることを理解するであろう。
【０１７０】
本出願の全体を通して引用する、参照文献、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属中の特許出願を含む、すべての特許および他の出版物は、例えば、本明細書に記載の技術に関連して用い得る、そのような出版物に記載の方法論を記載および開示する目的のために、参照により本明細書に明白に組み入れられる。これらの出版物は、本出願の出願日よりも前にそれらが開示されたことによってのみ提供される。これに関して、先行発明のため、または任意の他の理由のために、そのような開示に先行する権利を本発明者らに与えられないということを承認することと解釈されるべきではない。日付に関する言明またはこれらの文書の内容に関する表示はすべて、本出願者らが入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さについてのいかなる承認をなすものではない。
【０１７１】
本開示の態様の記載は、徹底的であること、または本開示を開示した厳密な形に限定することを意図するものではない。本開示の具体的な態様、および例を本明細書において例示のために記載するが、当業者であれば理解するとおり、本開示の範囲内で様々な等価の改変が可能である。例えば、方法の段階または機能を所与の順で示すが、別の態様は機能を異なる順で実施してもよいか、または機能は実質的に同時に実施されてもよい。本明細書において提供する開示の教示は、適宜、他の手順または方法に適用することができる。本明細書に記載の様々な態様を組み合わせて、さらなる態様を提供することができる。本開示の局面は、必要があれば、前述の参照文献および出願の組成物、機能、および概念を用いるために改変して、本開示のさらなる態様を提供することができる。
【０１７２】
任意の前述の態様の具体的な要素を、他の態様における要素と組み合わせることまたは置換することができる。さらに、本開示の特定の態様に関連する利点を、これらの態様の文脈において記載してきたが、他の態様もそのような利点を示すこともあり、すべての態様が本開示の範囲内に入るために必ずしもそのような利点を示す必要はない。
【実施例】
【０１７３】
以下の実施例は本発明のいくつかの態様および局面を例示する。当業者には、本発明の精神または範囲を変えることなく、様々な改変、追加、置換などを実施することができ、そのような改変および変動は添付の特許請求の範囲において規定する本発明の範囲内に含まれることが明らかであろう。以下の実施例はいかなる様式でも本発明を限定することはない。
【０１７４】
本明細書に記載の技術を、以下の実施例によってさらに例示し、これらは決してさらに限定的であると解釈されるべきではない。
【０１７５】
以下の記載は、4-((2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジル)アミノ)ベンゼンスルホンアミド化学型の物質の組成物および使用法を提供する。本明細書に開示の12-LO阻害のための新規化学型は、可溶性であり、好適なADME特性を有し、かつ良好なインビボPK特性を有する。
【０１７６】
化合物1の合成は、4-アミノベンゼスルホンミド（4-aminobenzesulfonmide）および2-ヒドロキシ-3-メトキシベズアルデヒド（2-hydroxy-3-methoxybezaldehyde）による還元的アミノ化を含んでいた。4-アミノ-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（2）および必須のベンズアルデヒドを100℃で終夜による、イミンの事前生成を含む段階的アプローチが必要であった。続くイミンの水素化ホウ素ナトリウムによる還元により、所望の化合物1、8〜10、および14〜33を得た（スキーム1、方法A）。この経路は大多数の類似体にとってうまくいったが、いくつかの類似体（11〜13および34）は代替経路を必要とし、ここでブッフバルト-ハートウィッグ型カップリングを市販の4-ブロモ-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（3）および2-メトキシ置換ベンジルアミンにより用いて、所望の生成物を25〜40％の収率で得た（スキーム1、方法B）。分子のチアゾール部分の改変のために、本発明者らは合成の最終段階で多様性を導入したいと考えた（スキーム1、方法C）。したがって、エタノール中、還流温度で18時間の、市販の4-アミノベンゼンスルホンアミド（4）と2-ヒドロキシ-3-メトキシベンズアルデヒドとの反応と、続く水素化ホウ素ナトリウムでの処理により、化合物5を収率95％で得た。次いで、得られたスルホンアミド誘導体を、適切な臭化ヘテロアリールを用いたCu触媒N-アリール化条件に供して、化合物35、38、44〜48、52、53、56〜59、61〜69、71、74、および75を良好な収率で得た。（Wang, X. et al. Tetrahedron Lett. 2012, 53, 7-10.）この方法の一般的汎用性にもかかわらず、Cu触媒反応が所望の生成物を生じない（例えば、化合物77〜83）、または臭化ヘテロアリールが容易に入手できない、少数の他に類のない場合があった。これらの化合物のために、塩化4-ニトロベンゼン-1-スルホニル（6）および必要なヘテロアリールアミンを100℃で、アミンの反応性に応じて1.5〜8時間加熱して、4-ニトロフェニル-スルホンアミド誘導体7を得る（スキーム1、方法D）ことによる、より間接的な経路を開発した。ニトロ基の還元を、H-Cube(登録商標)Proフロー反応器を用い、10％Pd担持炭素により、50℃および50barの圧で達成した。または、フロー化学に変更できなかった、溶解性の低い化合物のために、Zn/AcOH還元をメタノール中、60℃で実施した。所望のアニリンが得られれば、還元的アミノ化を対応するベンジルアミン誘導体で実施して、化合物36、37、39〜43、49〜51、54、55、60、70、72、73、および76〜83を得た。図1に示すスキーム1の各段階の具体的条件は以下のとおりである：（i）RCHO（1.5等量）、EtOH、3〜18時間、100℃、NaBH4（3.0等量）、0.5〜0.6時間；（ii）RCH2NH2（1.2等量）、キサントホス（0.06等量）、Pd2dba3（0.02等量）、NaOtBu（2.5等量）、1,4-ジオキサン、MW、30分、100℃。（iii）2-ヒドロキシ-3- メトキシベンズアルデヒド（1.2等量）、EtOH、6時間、100℃、NaBH4（1.5等量）、30分、92％。（iv）R'Br（1.2等量）、K2C03（2.5等量）、80℃、6〜8時間。（v）R'NH2、ピリジン、100℃、1.5〜18時間。（vi）10％Pd/C、MeOH/EtOAc、50bar、50℃または亜鉛（4.0等量）、AcOH（4.0等量）、メタノール、60℃、30分〜2時間。（vii）2-ヒドロキシ-R-ベンズアルデヒド（1.2等量）、EtOH、18時間、100℃、NaBH4（3.0等量）。
【０１７７】
一般合成手順。（スキーム1、方法A）：4-アミノ-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（0.39mmol）（2）、および必要なベンズアルデヒド（0.67mmol）を、密封チューブ内のエタノール（2mL）中で混合し、100℃で4〜18時間加熱した。固体を室温まで冷却し、水素化ホウ素ナトリウム（0.80mmol）を添加して、30分間撹拌し、この間に反応混合物は澄明になり、次いで混濁した。得られた固体をろ過し、エタノールで洗浄し、分取HPLC（10〜100％アセトニトリル+0.1％TFA/水+0.1％TFAの勾配）を用いて精製して、所望の生成物を得た。
【０１７８】
（スキーム1、方法B）ジオキサン（1mL）中の4-ブロモ-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（0.31mmol）（3）の溶液を、ジオキサン（1mL）中のナトリウムtert-ブトキシド（0.78mmol）、4,5-ビス(ジフェニルホスフィノ)-9,9-ジメチルキサンテン（キサントホス）（0.02mmol）およびトリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム(0)（Pd2dba3）（6.27μmol）の混合物に添加した。得られた混合物をアルゴンで15分間脱気し、次いで必須のベンジルアミン（0.38mmol）を添加し、容器を密封し、Biotage(登録商標)マイクロ波反応器内、100℃で30分間加熱した。反応混合物を室温まで冷却し、セライトを通してろ過した。Silicycle(登録商標)シリカ結合チオールを添加して終夜撹拌し、再度セライトのパッドを通してろ過し、濃縮し、分取HPLC（10〜100％アセトニトリル+0.1％TFA/水+0.1％TFAの勾配）により精製して、所望の生成物を得た。
【０１７９】
（スキーム1、方法C）EtOH（29mL）中の4-アミノベンゼンスルホンアミド（4）（1.00g、5.81mmol）、2-ヒドロキシ-3-メトキシベンズアルデヒド（1.00g、7.00mmol）を、反応混合物が橙色混濁混合物になるまで、4時間加熱還流した。反応混合物を室温まで冷却した後、水素化ホウ素ナトリウム（0.33g、8.71mmol）を添加し、さらに30分間撹拌した。30分後、白色固体が生成し、これをろ取し、大量のエタノールで洗浄し、減圧下で乾燥し、続く反応においてそのままで用いた。
0006463366.tif 000034
一般手順：（段階iv）1,4-ジオキサン（1.5mL）中の4-(2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジルアミノ)ベンゼンスルホンアミド（5）（0.58mmol）、臭化アリール（0.70mmol）、K2CO3（1.45mmol）、N,N'-ジメチルエチレンジアミン（0.29mmol）、およびヨウ化銅(I)（0.03mmol）をN2雰囲気下におき、5mL密封チューブに入れて密封した。反応混合物を70℃で6〜8時間加熱し、LC/MS分析によりモニターした。完了後、不均質混合物を室温まで冷却し、ろ過し、ジオキサンで洗浄した。溶液をチオールカートリッジ（金属捕捉）に通し、AcOEtで希釈し、NH4Cl（2×）、水、および食塩水で洗浄した。粗製材料を分取HPLC（10〜100％アセトニトリル+0.1％TFA/水+0.1％TFAの勾配）により精製して、所望の生成物を得た。
【０１８０】
（スキーム1、方法D：例）N-(ベンゾ[d]チアゾル-2-イル)-4-ニトロベンゼンスルホンアミド（7）：（段階V）ピリジン（1.60mL、20.08mmol）中のベンゾ[d]チアゾル-2-アミン（0.50g、3.35mmol）の撹拌溶液に、塩化4-ニトロベンゼンスルホニル（6）（0.82g、3.68mmol）を3等分して添加した。反応混合物を100℃で75分間加熱し、室温まで冷却し、その後黄色沈澱が生じた。反応混合物を室温で2時間放置し、次いで黄色固体をろ取し、エタノールで洗浄し、減圧下で終夜乾燥して、1.10の所望の生成物を得た。
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【０１８１】
4-アミノ-N-(ベンゾ[d]チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド：（段階VI）N-(ベンゾ[d]チアゾル-2-イル)-4-ニトロベンゼンスルホンアミド（0.20g、0.60mmol）、亜鉛（0.16g、2.39mmol）、酢酸（0.14mL、2.39mmol）をMeOH（3mL）に溶解し、混合物を60℃で2時間加熱した。不均質混合物をセライトのパッドを通してろ過し、熱メタノールで洗浄し、濃縮し、分取HPLC（10〜100％アセトニトリル+0.1％NH4OH/水+0.1％NH4OHの勾配）を用いて精製して、所望の生成物を得た。別のニトロ還元：N-(ベンゾ[d]チアゾル-2-イル)-4-ニトロベンゼンスルホンアミドをMeOH/EtOAc/THF（1：1：1）に溶解して0.05M溶液とし、10％Pd/C、70mm CatCart(登録商標) を50barおよび50℃で用いて、H-Cube Pro(登録商標)フロー反応器を0.9mL/分で2サイクル通過させた。溶液を濃縮して、淡黄色固体を定量的収率で得た。
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【０１８２】
N-(ベンゾ[d]チアゾル-2-イル)-4-((2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジル)アミノ)ベンゼンスルホンアミド（段階VII、代表例）（35、ML355）：4-アミノ-N-(ベンゾ[d]チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（0.10g、0.33mmol）、2-ヒドロキシ-3-メトキシベンズアルデヒド（0.075g、0.491mmol）をEtOH（1.5mL）中、90℃で18時間加熱した。反応混合物を室温まで冷却した後、NaBH4（0.04g、0.98mmol）を添加し、さらに6時間撹拌した。この後、反応混合物をメタノールおよび水で反応停止し、次いで20分間撹拌し、セライトを通して固体をろ過し、ろ液を回収し、減圧下で濃縮して、黄色固体を得た。粗製材料を分取HPLC（10〜100％アセトニトリル+0.1％TFA/水+0.1％TFAの勾配）により精製して、所望の生成物を得た。
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【０１８３】
化学のための一般的方法。空気または水分に感受性の反応はすべて、乾燥器で乾燥したガラス器具により、窒素陽圧下で実施した。化学試薬および無水溶媒は商業的供給元から入手し、そのまま使用した。分取的精製はWaters半分取HPLCで実施した。流速45mL/分で用いたカラムはPhenomenex Luna C18（5マイクロメートル、30×75mm）であった。移動相はアセトニトリルおよび水（それぞれ0.1％トリフルオロ酢酸を含む）からなっていた。精製中、8分間で10％〜50％アセトニトリルの勾配を用いた。分取はUV検出（220nm）により起動した。純度の分析は最終QC法1および2として示す2つの異なる方法で測定した。方法1：分析をAgilent 1290 Infinity Series HPLCで実施した。4分間のうちの3.5分間の実行時間でUHPLC Long Gradient Equivalent 4％〜100％アセトニトリル（0.05％トリフルオロ酢酸）/水、流速0.8mL/分。Phenomenex Kinetex 1.7マイクロメートルC18カラム（2.1×100mm）を50℃の温度で用いた。方法2：分析をAgilent 1260により、8分間の実行時間のうち7分間の4％〜100％アセトニトリル（0.025％トリフルオロ酢酸を含む）/水（0.05％トリフルオロ酢酸を含む）の勾配、流速1mL/分で実施した。Phenomenex Luna C18カラム（3マイクロメートル、3×75mm）を50℃の温度で用いた。純度測定は方法1および方法2共にAgilent Diode Array Detectorを用いて行った。質量測定はAgilent 6130質量分析計およびポジティブモードのエレクトロスプレーイオン化を用いて行った。アッセイ法のための類似体はすべて、両方の分析法に基づき95％よりも高い純度を有していた。1Hおよび13C NMRスペクトルはVarian 400（100）MHz分析計で記録した。高分解能質量分析はAgilent 6210 Time-of-Flight LC/MSシステムで記録した。
【０１８４】
本発明の態様の説明：
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4-(2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジルアミノ)-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（1）：方法A：2-ヒドロキシ-3-メトキシベンズアルデヒドを使用。
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【０１８５】
0006463366.tif 000040
4-(ベンジルアミノ)-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミドTFA（8）：方法A：ベンズアルデヒドを使用。
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【０１８６】
0006463366.tif 000042
4-(2-ヒドロキシベンジルアミノ)-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（9）：方法A：2-ヒドロキシベンジアルデヒド（2-hydroxybenzyaldehyde）を使用。
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【０１８７】
0006463366.tif 000044
4-(3-メトキシベンジルアミノ)-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（10）：方法B：(3-ジメトキシフェニル)メタンアミンを使用。
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【０１８８】
0006463366.tif 000046
4-(2-メトキシベンジルアミノ)-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミドTFA（11）：方法B：2-ジメトキシフェニル)メタンアミンを使用。
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【０１８９】
0006463366.tif 000048
4-(2,3-ジメトキシベンジルアミノ)-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（12）：方法B：2,3-ジメトキシフェニル)メタンアミンを使用。
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【０１９０】
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4-(2-アミノベンジルアミノ)-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（13）：方法A：(2-ホルミルフェニル)カルバミン酸tert-ブチルを使用してからカルバミン酸エステルをジオキサン中4M HClにより30分間で除去。
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【０１９１】
0006463366.tif 000052
4-(3-ヒドロキシベンジルアミノ)-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（14）：方法A：3-ヒドロキシベンズアルデヒドを使用。
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【０１９２】
0006463366.tif 000054
4-(2-アミノ-3-メトキシベンジルアミノ)-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミドTFA（15）：方法A：3-メトキシ-2-ニトロベンズアルデヒドを使用し；MeOH（1.8mL）中の4-(3-メトキシ-2-ニトロベンジルアミノ)-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（0.075g、0.178mmol）の不均質溶液、AcOH（0.102mL、1.784mmol）および亜鉛（0.023g、0.357mmol）を30分間撹拌し、セライトを通してろ過し、MeOHで洗浄した。ろ液を濃縮し、分取HPLC（10〜100％アセトニトリル+0.1％TFA/水+0.1％TFAの勾配）を使用して精製して、所望の生成物を得た。
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【０１９３】
0006463366.tif 000056
4-(3-ヒドロキシ-4-メトキシベンジルアミノ)-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（16）：方法A：3-ヒドロキシ-4-メトキシベンズアルデヒドを使用。
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【０１９４】
0006463366.tif 000058
4-((1H-インドル-7-イル)メチルアミノ)-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（17）：方法A：1H-インドール-7-カルバルデヒドを使用。
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【０１９５】
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4-(2,3-ジクロロベンジルアミノ)-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（18）：方法A：2,3-ジクロロベンズアルデヒドを使用。
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【０１９６】
0006463366.tif 000062
4-(3-クロロ-2-ヒドロキシベンジルアミノ)-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（19）：方法A：3-クロロ-2-ヒドロキシベンズアルデヒドを使用。
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【０１９７】
0006463366.tif 000064
4-(3-フルオロ-2-ヒドロキシベンジルアミノ)-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（20）：方法A：3-フルオロ-2-ヒドロキシベンズアルデヒドを使用。
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【０１９８】
0006463366.tif 000066
4-(3-ブロモ-2-ヒドロキシベンジルアミノ)-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド、（21）：方法A：3-ブロモ-2-ヒドロキシベンズアルデヒドを使用。
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【０１９９】
0006463366.tif 000068
4-(4-ブロモ-2-ヒドロキシベンジルアミノ)-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（22）：方法A：4-ブロモ-2-ヒドロキシベンズアルデヒドを使用。
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【０２００】
0006463366.tif 000070
4-(2-ヒドロキシ-3-メチルベンジルアミノ)-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（23）：方法A：2-ヒドロキシ-3-メチルベンズアルデヒドを使用。
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【０２０１】
0006463366.tif 000072
4-(3-アミノ-2-ヒドロキシベンジルアミノ)-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（24）：方法A：2-ヒドロキシ-3-ニトロベンズアルデヒドを使用してからニトロ基を亜鉛および酢酸条件で還元（詳細については化合物15参照）。
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【０２０２】
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4-(2-ヒドロキシ-3-ニトロベンジルアミノ)-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（25）：方法1A：2-ヒドロキシ-3-ニトロベンズアルデヒドを使用。
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【０２０３】
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4-(3-アリル-2-ヒドロキシベンジルアミノ)-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミドTFA（26）：方法A：3-アリル-2-ヒドロキシベンズアルデヒドを使用。
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【０２０４】
0006463366.tif 000078
4-(4-クロロ-2-ヒドロキシベンジルアミノ)-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（27）：方法A：4-クロロ-2-ヒドロキシベンズアルデヒドを使用。
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【０２０５】
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4-(2-ヒドロキシ-4-メトキシベンジルアミノ)-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（28）：方法A：2-ヒドロキシ-4-メトキシベンズアルデヒドを使用。
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【０２０６】
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4-(5-クロロ-2-ヒドロキシベンジルアミノ)-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（29）：方法A：5-クロロ-2-ヒドロキシベンズアルデヒドを使用。
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【０２０７】
0006463366.tif 000084
4-(2-ヒドロキシ-5-メトキシベンジルアミノ)-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（30）：方法A：2-ヒドロキシ-5-メトキシベンズアルデヒドを使用。
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【０２０８】
0006463366.tif 000086
4-(5-アミノ-2-ヒドロキシベンジルアミノ)-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（31）：方法A：2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジルアルデヒドを使用してからニトロ基を亜鉛および酢酸条件で還元（詳細については化合物15参照）。
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【０２０９】
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4-(5-フルオロ-2-ヒドロキシベンジルアミノ)-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（32）：方法A：5-フルオロ-2-ヒドロキシベンズアルデヒドを使用。
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【０２１０】
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4-(2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジルアミノ)-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（33）：方法A：2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジルアルデヒドを使用。
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【０２１１】
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4-(2-ヒドロキシ-6-メトキシベンジルアミノ)-N-(チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（34）：方法B：2-ヒドロキシ-6-メトキシベンズアルデヒドを使用。
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【０２１２】
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N-(ベンゾ[d]オキサゾル-2-イル)-4-((2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジル)アミノ)ベンゼンスルホンアミド（36）：方法C：2-ブロモベンゾキサゾールを使用。
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【０２１３】
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N-(1H-ベンゾ[d]イミダゾル-2-イル)-4-((2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジル)アミノ)ベンゼンスルホンアミド（37）：方法D：2-アミノベンズイミダゾールおよび2-ヒドロキシ-3-メトキシベンズアルデヒドを使用。
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【０２１４】
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4-(2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジルアミノ)-N-(チオフェン-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（38）：方法C：2-ブロモチオフェンを使用。
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【０２１５】
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4-((2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジル)アミノ)-N-(4-メチルベンゾ[d]チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミドTFA（39）：方法D：2-アミノ-4-メチルベンズチアゾールおよび2-ヒドロキシ-3-メトキシベンズアルデヒドを使用。
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【０２１６】
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4-(2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジルアミノ)-N-(4-メチルチアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミドTFA（40）：方法C：2-ブロモ-4-メチルチアゾールを使用。
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【０２１７】
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4-(2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジルアミノ)-N-(5-メチルチアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミドTFA（41）：方法D：2-アミノ-5-メチルチアゾールおよび2-ヒドロキシ-3-メトキシベンズアルデヒドを使用。
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【０２１８】
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4-((2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジル)アミノ)-N-(5-フェニルチアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミドTFA（42）：方法D：2-アミノ-5-フェニルチアゾールおよび2-ヒドロキシ-3-メトキシベンズアルデヒドを使用。
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【０２１９】
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N-(4,5-ジメチルチアゾル-2-イル)-4-(2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジルアミノ)ベンゼンスルホンアミドTFA（43）：方法C：2-ブロモ-4,5-ジメチルチアゾールを使用。
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【０２２０】
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4-(2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジルアミノ)-N-(5-メチルイソキサゾル-3-イル)ベンゼンスルホンアミドTFA（44）：方法D：3-アミノ-5-メチルイソキサゾールおよび2-ヒドロキシ-3-メトキシベンズアルデヒドを使用。
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【０２２１】
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4-((2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジル)アミノ)-N-(3-メトキシフェニル)ベンゼンスルホンアミド（45）：方法C：1-ブロモ-3-メトキシベンゼンを使用。
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【０２２２】
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4-(2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジルアミノ)-N-(キノリン-3-イル)ベンゼンスルホンアミドTFA（46）：方法C：3-ブロモキノリンを使用。
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【０２２３】
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4-(2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジルアミノ)-N-(イソキノリン-8-イル)ベンゼンスルホンアミド（47）：方法C：8-ブロモイソキノリンを使用。
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【０２２４】
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4-(2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジルアミノ)-N-フェニルベンゼンスルホンアミドTFA（48）：方法C：ブロモベンゼンを使用。
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【０２２５】
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4-((2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジル)アミノ)-N-(ナフタレン-1-イル)ベンゼンスルホンアミド（49）：方法D：ナフタレン-1-アミンおよび2-ヒドロキシ-3-メトキシベンズアルデヒドを使用。
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【０２２６】
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4-((2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジル)アミノ)-N-(ナフタレン-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（50）：方法D：ナフタレン-2-アミンおよび2-ヒドロキシ-3-メトキシベンズアルデヒドを使用。
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【０２２７】
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N-([1,1'-ビフェニル]-4-イル)-4-((2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジル)アミノ)ベンゼンスルホンアミド（51）：方法D：ビフェニル-4-アミンおよび2-ヒドロキシ-3-メトキシベンズアルデヒドを使用。
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【０２２８】
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N-([1,1'-ビフェニル]-3-イル)-4-((2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジル)アミノ)ベンゼンスルホンアミド（52）：方法C：3-ブロモ-1,1'-ビフェニルを使用。
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【０２２９】
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4-((2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジル)アミノ)-N-(3-(ピペラジン-1-イル)フェニル)ベンゼンスルホンアミド（53）：方法1C：4-(3-ブロモフェニル)ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルを使用してから、Boc基をジオキサン中4M HClによる30分間の還元的アミノ化後に除去した。
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【０２３０】
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4-(2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジルアミノ)-N-(4-(ピペラジン-1-イル)フェニル)ベンゼンスルホンアミド（54）：方法D：4-(4-アミノフェニル)ピペリジン-1-カルボン酸tert-ブチルおよび2-ヒドロキシ-3-メトキシベンズアルデヒドを使用。Boc基を4M HCl/ジオキサンによる室温で1時間の還元的アミノ化後に除去した。
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【０２３１】
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4-((2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジル)アミノ)-N-(4-(ピペリジン-4-イル)フェニル)ベンゼンスルホンアミド（55）：方法D：4-(4-アミノフェニル)ピペリジン-1-カルボン酸tert-ブチルおよび2-ヒドロキシ-3-メトキシベンズアルデヒドを使用。Boc基をジオキサン中4M HClによる室温で1時間の還元的アミノ化後に除去した。
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【０２３２】
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4-(2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジルアミノ)-N-(6-(ピペラジン-1-イル)ピリジン-3-イル)ベンゼンスルホンアミド（56）：方法C：4-(5-ブロモピリジン-2-イル)ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルを使用してから、Boc基を4M HCl/ジオキサンによる1時間の還元的アミノ化後に除去した。
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【０２３３】
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4-(2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジルアミノ)-N-(6-メチルピリジン-3-イル)ベンゼンスルホンアミド（57）：方法C：5-ブロモ-2-メチルピリジンを使用。
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【０２３４】
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4-(2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジルアミノ)-N-(ピリジン-2-イル)ベンゼンスルホンアミド（58）：方法C：2-ブロモピリジンを使用。
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【０２３５】
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4-(2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジルアミノ)-N-(ピリジン-3-イル)ベンゼンスルホンアミド（59）：方法C：3-ブロモピリジンを使用。
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【０２３６】
0006463366.tif 000142
4-(2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジルアミノ)-N-(ピリミジン-2-イル)ベンゼンスルホンアミドTFA（60）：方法C：2-ブロモピリミジンを使用。
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【０２３７】
0006463366.tif 000144
N-(3-(tert-ブチル)フェニル)-4-((2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジル)アミノ)ベンゼンスルホンアミド、TFA（61）：方法C：1-ブロモ-3-(tert-ブチル)ベンゼンを使用。
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【０２３８】
0006463366.tif 000146
4-((2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジル)アミノ)-N-(6-メトキシベンゾ[d]チアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド、TFA（62）：方法C：2-ブロモ-6-メトキシベンゾ[d]チアゾールを使用。
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【０２３９】
0006463366.tif 000148
4-((2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジル)アミノ)-N-(4-フェニルチアゾル-2-イル)ベンゼンスルホンアミド、TFA（63）：方法C：2-ブロモ-4-フェニルチアゾールを使用。
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【０２４０】
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4-((2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジル)アミノ)-N-(3-モルホリノフェニル)ベンゼンスルホンアミド、TFA（64）：方法C：4-(3-ブロモフェニル)モルホリンを使用。
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【０２４１】
0006463366.tif 000152
4-(3-(4-((2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジル)アミノ)フェニルスルホンアミド)フェニル)ピペリジン-1-カルボン酸tert-ブチル（65）：方法C：4-(3-ブロモフェニル)ピペリジン-1-カルボン酸tert-ブチルを使用。
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【０２４２】
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4-((2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジル)アミノ)-N-(3-(ピペリジン-4-イル)フェニル)ベンゼンスルホンアミド、TFA（66）：方法1C：4-(3-ブロモフェニル)ピペリジン-1-カルボン酸tert-ブチルを使用し、Boc基を4M HCl/ジオキサンによる30分間の還元的アミノ化後に除去した。
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【０２４３】
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4-((2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジル)アミノ)-N-(3-イソプロピルフェニル)ベンゼンスルホンアミド、TFA（67）：方法C：1-ブロモ-3-イソプロピルベンゼンを使用。
0006463366.tif 000157
【０２４４】
0006463366.tif 000158
N-(6-フルオロベンゾ[d]チアゾル-2-イル)-4-((2-ヒドロキシ-3-メトキシベンジル)アミノ)ベンゼンスルホンアミド、TFA（68）：方法C：2-ブロモ-6-フルオロベンゾ[d]チアゾールを使用。
0006463366.tif 000159
【０２４５】
0006463366.tif 000160
4-(3-クロロ-2-ヒドロキシベンジルアミノ)-N-フェニルベンゼンスルホンアミド、TFA（69）：方法C：3-クロロ-2-ヒドロキシベンズアルデヒドおよびブロモベンゼンを使用。
0006463366.tif 000161
【０２４６】
0006463366.tif 000162
4-(3-クロロ-2-ヒドロキシベンジルアミノ)-N-(ナフタレン-1-イル)ベンゼンスルホンアミド、TFA（70）：方法D：ナフタレン-1-アミンおよび3-クロロ-2-ヒドロキシベンズアルデヒドを使用。
0006463366.tif 000163
【０２４７】
0006463366.tif 000164
N-(ベンゾ[d]チアゾル-2-イル)-4-(3-クロロ-2-ヒドロキシベンジルアミノ)ベンゼンスルホンアミド、TFA（71）：方法C：3-クロロ-2-ヒドロキシベンズアルデヒドおよび2-ブロモベンズチアゾールを使用。
0006463366.tif 000165
【０２４８】
0006463366.tif 000166
4-(3-クロロ-2-ヒドロキシベンジルアミノ)-N-(ナフタレン-2-イル)ベンゼンスルホンアミド、TFA（72）：方法D：ナフタレン-2-アミンおよび3-クロロ-2-ヒドロキシベンズアルデヒドを使用。
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【０２４９】
0006463366.tif 000168
N-([1,1'-ビフェニル]-4-イル)-4-((3-クロロ-2-ヒドロキシベンジル)アミノ)ベンゼンスルホンアミド、TFA（73）：方法D：ビフェニル-4-アミンおよび3-クロロ-2-ヒドロキシベンズアルデヒドを使用。
0006463366.tif 000169
【０２５０】
0006463366.tif 000170
4-(3-クロロ-2-ヒドロキシベンジルアミノ)-N-(イソキノリン-8-イル)ベンゼンスルホンアミド、TFA（74）：方法C：3-クロロ-2-ヒドロキシベンズアルデヒドおよび8-ブロモイソキノリンを使用。
0006463366.tif 000171
【０２５１】
0006463366.tif 000172
4-(3-クロロ-2-ヒドロキシベンジルアミノ)-N-(キノリン-3-イル)ベンゼンスルホンアミド、TFA（75）：方法C：3-クロロ-2-ヒドロキシベンズアルデヒドおよび3-ブロモキノリンを使用。
0006463366.tif 000173
【０２５２】
0006463366.tif 000174
4-(3-クロロ-2-ヒドロキシベンジルアミノ)-N-(4-(ピペリジン-4-イル)フェニル)ベンゼンスルホンアミド、TFA（76）：方法D：4-(4-アミノフェニル)ピペリジン-1-カルボン酸tert-ブチルおよび3-クロロ-2-ヒドロキシベンズアルデヒドを使用。Boc基をジオキサン中4M HClによる30分間の還元的アミノ化後に除去した。
0006463366.tif 000175
【０２５３】
0006463366.tif 000176
4-(4-ブロモ-2-ヒドロキシベンジルアミノ)-N-フェニルベンゼンスルホンアミド、TFA（77）：方法D：4-ブロモ-2-ヒドロキシベンズアルデヒドおよびベンジルアミンを使用。
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【０２５４】
0006463366.tif 000178
4-(4-ブロモ-2-ヒドロキシベンジルアミノ)-N-(ナフタレン-1-イル)ベンゼンスルホンアミド（78）：方法D：1-アミノ-ナフタレンおよび4-ブロモ-2-ヒドロキシベンズアルデヒドを使用。
0006463366.tif 000179
【０２５５】
0006463366.tif 000180
N-(ベンゾ[d]チアゾル-2-イル)-4-(4-ブロモ-2-ヒドロキシベンジルアミノ)ベンゼンスルホンアミド、TFA（79）：方法D：2-アミノベンゾチアゾールおよび4-ブロモ-2-ヒドロキシベンズアルデヒドを使用。
0006463366.tif 000181
【０２５６】
0006463366.tif 000182
4-(4-ブロモ-2-ヒドロキシベンジルアミノ)-N-(キノリン-3-イル)ベンゼンスルホンアミド、TFA（80）：方法D：3-アミノ-キノリンおよび4-ブロモ-2-ヒドロキシベンズアルデヒドを使用。
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【０２５７】
0006463366.tif 000184
4-(4-ブロモ-2-ヒドロキシベンジルアミノ)-N-(ナフタレン-2-イル)ベンゼンスルホンアミド、TFA（81）：方法D：2-アミノ-ナフタレンおよび4-ブロモ-2-ヒドロキシベンズアルデヒドを使用。
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【０２５８】
0006463366.tif 000186
N-([1,1'-ビフェニル]-4-イル)-4-((4-ブロモ-2-ヒドロキシベンジル)アミノ)ベンゼンスルホンアミド、TFA（82）：方法D：4-アミノ-ビフェニルおよび4-ブロモ-2-ヒドロキシベンズアルデヒドを使用。
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【０２５９】
0006463366.tif 000188
4-(4-ブロモ-2-ヒドロキシベンジルアミノ)-N-(キノリン-8-イル)ベンゼンスルホンアミド、TFA（83）：方法D：8-アミノ-イソキノリンおよび4-ブロモ-2-ヒドロキシベンズアルデヒドを使用。
0006463366.tif 000189
【０２６０】
表1〜3に示す系統的構造活性相関（SAR）調査を行った。表1に示すとおり、フェノール基（8）、3-OMe基（9）、または2-OH基（10）の除去は、活性の完全な消失をきたした。2-OH部分のメチルエーテルとしての保護（化合物11〜12）またはアミンによる置き換え（化合物13および15）も、すべての12-LOX阻害活性を打ち消した。カテコール部分のインドールでの生物学的等価な置き換え（17）も不活性であった。2,3-ジクロロ誘導体（18）は化合物1と同等の活性を有していた。同様に、3-Cl（19、IC50＝6.1μM）も同等の活性を有していたが、3-フルオロおよび3-ブロモ（20、IC50＝19μMおよび21、IC50＝13μM）はそれぞれ約4〜約2.5分の1の活性であった。興味深く、予想外の結果は、4-ブロモ（22、IC50=2.2μM）および4-クロロ（27）誘導体で観察された活性の2倍の改善であった。4-メトキシ（28）などの他の4-置換誘導体は、化合物1に比べると活性が低下した。2-OHは活性にとって重要であり、3位はメトキシ基が最適であった。この予備的SARは、化合物1に比べて改善はされないまでも、同等の活性を維持しながら、3-OMeをクロロ基（19）および4-ブロモ（22）で置き換え得ることを示唆していた。
【０２６１】
（表１）類似体1、8〜34の12-LOX阻害a
0006463366.tif 000190
aIC50値は三つ組のUV-visキュベットベースのアッセイ法で測定した最大半減（50％）阻害濃度を表す。
【０２６２】
次のSARプロファイルは、表2に示すとおり、チアゾール基の修飾に焦点を合わせた。分子のこの領域への変更は、有効性が改善された類似体をもたらした。チアゾール部分を2-ベンゾチアゾールで置き換える（35、ML355）ことにより、選択性を保持しながら、12-LOX活性の18倍の改善が得られた。ベンゾキサゾール（36）およびベンズイミダゾール（37）は、良好〜優秀な活性を有し、ベンゾチアゾール環（39）の4位へのメチル基の導入は、優秀な12-LOX活性を維持した（IC50＝0.24μM）。チアゾールをチオフェンで置き換えた（38）場合も、12-LOXに対する有効性は10倍以上に改善されたが、置換チアゾール/イソキサゾール誘導体（40〜43）はこの有効性増大を示すことはなかった。これは、公知のチオフェン生物学的等価体であるフェニル誘導体（48）の場合にもあてはまり、この誘導体は12-LOXに対して強力な活性を有していた（IC50＝0.5μM）。一般に、より大きい芳香族［1-ナフタレン（49）および2-ナフタレン（50）］およびヘテロ芳香族化合物［3-キノリン（46）、8-イソキノリン（47）、2-ピリジン（58）および3-ピリジン（59）］はよく耐容され、チアゾール誘導体（1）よりも良好な有効性を有していた。可溶化官能基を付加することにより溶解性を改善しようとして、アリール環周りの異なる位置にピペラジン部分を有するいくつかのフェニル誘導体を合成した（53〜55）。これらの変化は耐容されたが、最も活性が高いもの（例えば、化合物35、ML355）に比べて活性は低下した。
【０２６３】
これらの類似体の多くを、選択性が維持されていることを確認するために、15-LOX-1に対する活性についても試験した。これらの化合物を最初は単一濃度（25μM）で15-LOX-1に対して試験し、IC50は興味対象の化合物でのみ決定した。これらの試験により、チアゾールのベンゾチアゾールによる置き換え、およびその誘導体は選択性を維持し、15/12-LOX比は29倍（35）、18倍（39）、19倍（62）、および20倍（68）であることが判明した。15-LOX/12-LOX選択性比は、ベンゾチアゾールのベンゾキサゾール（36）、ベンズイミダゾール（37）およびm-iPr置換フェニル（67）への変換によって100超に改善された。フェニル置換（48）は選択性比 15を有するにとどまった。化合物が同様の構造を有するにもかかわらず、15-LOX-1のほぼ完全な阻害（例えば、38および62）から最小の阻害（例えば、55、58、および66）に及ぶ広範な選択性が観察された。分子のこの部分における12-LOXと15-LOX-1との間の選択性に対する劇的な影響は、LOX活性部位の下部が以前に基質特異性を制御すると明らかにされているため、これが結合に関与していることを示唆している。
【０２６４】
（表２）類似体35〜68の12-LOX阻害a
0006463366.tif 000191
aIC50値は三つ組のUV-visキュベットベースのアッセイ法で測定した最大半減（50％）阻害濃度を表す。
b25μMでの阻害を表す。
【０２６５】
前述（表1）のとおり、分子の「右手」部分の3-クロロ-2-フェノール（19）または4-ブロモ-2-フェノール（22）による置き換えは、1と同等の有効性をもたらし、IC50値はそれぞれ6.2および2.2μMであった。これらの基を、初期のSARの取り組みの一部として見出されたスルホンアミド誘導体のいくつかと組み合わせた（表3参照、化合物69〜83）。化合物はどれも有効性が改善されず、ほとんどすべての場合に、活性が低下した。一般に、2-ベンゾチアゾール部分は3-クロロ-2-フェノール（71；IC50＝1.6μM）および4-ブロモ-2-フェノール（79；IC50＝1.7μM）の両方で最良の活性を示したが、1-ナフタレン誘導体78は同等の有効性を有していた（IC50＝1.3μM）。
【０２６６】
（表３）類似体69〜83の12-LOX阻害a
0006463366.tif 000192
aIC50値は三つ組のUV-visキュベットベースのアッセイ法で測定した最大半減（50％）阻害濃度を表す。
b25μMでの阻害を表す。
【０２６７】
他のヒトLOXアイソザイム（5-LOXおよび15-LOX-2）に対する類似体（35、36、および37）の選択性に焦点を合わせた、さらなる試験を実施した。加えて、化合物をシクロオキシゲナーゼ-1（COX-1）および/またはCOX-2に対して試験した。表4に示すとおり、15-LOX-1に対して比較的低い有効性（29分の1の活性）を有するML355を除いて、これらの関連する酵素のいずれに対しても有意な阻害は見られなかった。文献中で報告された化合物には、12-LOXに対するnMレベルの有効性と、他のアイソザイムに対する選択性との両方を達成したものはほとんどなかった。
【０２６８】
（表４）代表的な類似体の選択性および酸化還元活性a
0006463366.tif 000193
a1、35、36、および37の選択性プロファイリング。bIC50値はμMで報告している。c化合物を15μMで試験し、10％を超える阻害を示す化合物はなかった。dUV-vis偽ペルオキシダーゼ（pseudoperoxidase）活性アッセイ法を35および36で実施し、234nmでヒドロペルオキシド生成物の分解は観察されず、非還元的阻害メカニズムを示した；NI＝阻害なし、およびNT＝未試験。
【０２６９】
LOX阻害物質は様々な阻害メカニズムを示すことが公知であり；したがって、UV偽ペルオキシダーゼアッセイ法を用いて、阻害が本質的に還元的かどうかを調べた。アッセイ法を35および36で12-LOXにより実施し、234nmでヒドロペルオキシド生成物の分解は観察されず、非還元的阻害メカニズムを示した（表4）。阻害メカニズムをさらに調査するために、定常状態動態は、35および36の両方を用いて、0.01％トリトンX-100存在下で基質および阻害物質濃度の関数としての12-HPETEの生成をモニターすることにより行われた。Km/Vmaxおよび1/Vmax対阻害物質濃度の再プロットは、35および36の両方に対して直線傾向をもたらした。Km/Vmaxグラフから、Kiは35では0.35±0.08μMおよび36では0.53±0.2μMであった（図4および6）。1/Vmaxグラフから、Ki'は35では0.72±0.1μMおよび36では0.62±0.1μMであった（図5および7）。35および36両方についてのデータはそれらのIC50値に相関し（表2）、両方の分子が混合阻害物質であることを示し、これは一般に12-LOXおよび15-LOX-1阻害物質両方に共通の特性である。
【０２７０】
関連する細胞ベースの系におけるML355の活性を調べた。前述のとおり、12-LOXは、一次止血および動脈血栓症の制御において中心的役割を果たす、血小板活性化に関連づけられている。その結果、血小板活性化を減弱させることができなければ、過度の血餅形成を引き起こし、心筋梗塞および脳卒中などの有害な心血管事象につながる。以前の試験により、ヒト血小板中の12-LOXは、プロテアーゼ活性化受容体-4（PAR4）のPAR4活性化ペプチド（PAR4-AP）による刺激後に高度に活性化されることが明らかにされている。さらに、アラキドン酸（AA）の立体特異的酸化およびペルオキシダーゼによる還元に起因する12-LOXの生物活性代謝産物（12-HETE）は、ヒト血小板において血栓形成促進効果を示す。したがって、PAR4-AP誘導性ヒト血小板の小分子12-LOX阻害物質による処理は、血小板凝集を用量依存的様式で減弱させる。これを確認するために、洗浄ヒト血小板（1×106個 血小板/ml）を、漸増濃度のML355非存在下または存在下、200μM PAR4-APで刺激した（図2A）。カルシウム動員はML355の濃度が上昇するにつれて減少した。カルシウムをC6 Accuriフローサイトメーターを用いてリアルタイムで測定した。実験は三つ組で行った。加えて、ヒト血小板（3×108個血小板/ml）の血小板凝集を、PAR4-APの添加後に、Chronolog Lumi-Aggregometer（model 700D）を用いてリアルタイムで測定した（図2B）。10μM ML355は血小板凝集を阻害しなかったが、25μM ML355は洗浄ヒト血小板において80％の血小板凝集を阻害した。図2Bの結果は、ML355が実際にPAR4-AP誘導性血小板凝集を有意に減少させることを示している。さらに、12-LOXはヒト血小板におけるカルシウム動員において役割を果たすことが明らかにされており、12-LOXの阻害は血小板中の遊離カルシウムの濃度低下につながる。これを試験するために、ヒト血小板を200μM PAR4-APで刺激し、血小板中の遊離カルシウムを、C6 Accuriフローサイトメーターを様々な濃度のML355と共に用いて測定した（図2A）。これらのデータは、250nMという低い濃度のML355において、カルシウム動員が有意に減少し（変化倍率で測定）、カルシウム動員の完全阻害は約5μMで起こることを示している。同様の結果が、図8に示す別の最高活性物（化合物36）でも得られた。
【０２７１】
糖尿病性疾患に関連する細胞ベースモデルにおけるML355の12-LOXを阻害する能力も評価した。前述のとおり、12-LOXは膵β細胞中で発現し、その代謝産物、12-HETEはサイトカイン誘導性細胞死に関連づけられている。特に、12(S)-HETEは、ヒト膵島において代謝活性を低下させ、インスリン分泌を阻害し、最終的に細胞死を誘導することが明らかにされている。ML355をマウス由来β細胞株（BTC3）およびヒト一次供与体膵島の両方において試験して、12-HETEのAA/カルシウムイオノフォア誘導性刺激を阻害するその能力を判定した。ML355は、ELISAにより測定して、BTC3細胞において12-HETEを約1μMのIC50で強力に阻害することができた（図3A）。供与組織から一次ヒト膵島を得るのが困難であるため、ヒト膵島における試験は単一濃度で実施した。図3Bに示すデータは、10μM ML355において、AA/IONO誘導性12-HETE産生の有意な阻害を示している。同様の結果が、図9に示す別の最高活性物（化合物36）でも得られた。
【０２７２】
マウスβ細胞（BTC3）を、アラキドン酸およびカルシウムイオノフォア（AA/IONO）単独でまたはML355存在下で処理した（図3A）。AA/IONO単独で刺激した細胞中で検出された12-HETEのレベルのパーセンテージとして表された12-HETEのレベルをグラフ化している。図3Bにおいて、グラフは、アラキドン酸およびカルシウムイオノフォア（AA/IONO）単独でまたは10μMのML355存在下で刺激したヒト一次供与体膵島の12-HETEの増加（対照/未刺激に比べて）を表す。12-HETEはELISAにより測定した。図3Cにおいて、グラフは、ヒト供与体膵島をアラキドン酸およびカルシウムイオノフォア（AA/IONO）単独でまたは異なる濃度の化合物35もしくは36存在下で処理した場合に検出された12-HETEのレベルを表す。図3Cにおいてグラフ化したデータは、三つ組で実施した各プロットデータ点による代表的実験である。これらのプロットデータは、それぞれ別々のヒト供与体膵島調製物で実施した3つの別々の実験測定の代表である。グラフ化したデータは平均±SEM、n＝3である。いくつかの点の誤差バーは記号によって隠れている。
【０２７３】
図3Dおよび3Eは、対照（未処理）膵島に対し3mMグルコース（低）または18mMグルコース（高）に反応した、ヒト供与体膵島調製物におけるグルコース刺激インスリン分泌の結果を示す。膵島をサイトカイン（TNFα、IL-1β、IFNγ）とインキュベートし、膵島をサイトカインおよび化合物35または36と同時インキュベートした。図3Dおよび3Eは、異なるヒト供与体膵島調製物で得た結果を表す。グルコース刺激インスリン分泌のサイトカインによる脱共役は化合物35または36によって阻害される。
【０２７４】
前述のデータは疾患関連細胞ベースモデルにおける活性を示すが、概念証明動物モデルにおいてML355の使用の可能性を検証するために、そのインビトロADME特性およびインビボPK特性の両方を決定した。これらのデータをそれぞれ表5および6にまとめている。ML355はラット（T1/2＞30分）およびマウス（T1/2＞300分）の両方ですぐれたミクロソーム安定性を示し、マウス血漿に対して2時間にわたって安定であることが判明した（100％残存）。さらに、ML355は様々な水性緩衝液（pH2〜9）中で分解を示さず、5mMグルタチオンに対して安定であり、すぐれた安定性が示唆された（補足図S5）。改善された溶解性がアッセイ緩衝液中で観察された（定性分析）。加えて、ベンゾキサゾール誘導体（36）は緩衝液中ではるかに改善された溶解性（＞10倍）を有していたが、12-LOXに対してはわずかに弱い有効性を有していた。
【０２７５】
（表５）35に関するインビトロADMEプロファイル
0006463366.tif 000194
aこれらの実験はPharmaron Inc.で行った。他の試験はすべてNCATSで行った。bNADPH存在下での安定性を表す。NADPHなしの35および36は1時間の間に分解を示さなかった。cpH7.4での人工膜透過性試験法（Parallel Artificial Membrane Permeability Assay）（PAMPA）における透過性を表す。
【０２７６】
（表６）35に関する3mpk（静脈内）および30mpk 経口におけるインビボPK（マウス）a
0006463366.tif 000195
aすべての実験はPharmaron Inc.で雄CD1マウス（6〜8週齢）を用いて行った。データは24時間にわたり8つの時点において三つ組で収集した。b溶液（5％DMSO、10％Solutol、20％PEG400、65％水）として製剤化。c静脈内用量の63.2％を排出する時間を表す。
【０２７７】
ML355は、Caco-2アッセイ法において中等度の細胞透過性（1.5×10-6cm/s）を示し、＜2の流出比とすると、Pgpの基質ではないと考えられる。分子のインビボPK（マウス）特性も調査した（表6）。調査のための製剤試験により適切なビヒクル（DMSO：Solutol：PEG400：水；5/10/20/65 v/v/v/v）が判明し、これによりML355を溶液として静脈内（3mpk）および経口（30mpk）により投与した。これらの試験は、ML355が経口により生物利用可能（F％＝約20）であり、中等度の半減期（T1/2＝2.9時間）を有することを示している。30mpkの投薬において、ML355はインビトロIC50の135倍を超えるCmaxを達成し、12時間超の間、IC50を超えたままであった。この化合物は低いクリアランス（3.4mL/分/kg）および38μMの良好な全曝露（AUCinf）を有する。分布の量（Vd）は0.55L/kgであり、これは低いが、組織と血液との間の妥当な分布を示唆するものである。ミクロソーム安定性（第I相代謝）は好適であるが、インビボT1/2は依然として中ぐらいの程度であることを考慮すると、フェノール部分はグルクロン酸抱合（第II相代謝）されて、予想以上に高いクリアランスをもたらしうると考えられた。事実、NADPHの代わりにUDPGA補助因子と共にインキュベートすると、約8分（NADPHの場合は＞30分）のT1/2をもたらした。2-OHの立体障害環境はおそらくグルクロン酸抱合が起こるのを妨害するとさらに考えられたが、このデータはそうではないことを示唆している。グルクロン酸抱合を回避するために用いられてきた別の戦略は、関心対象のフェノール部分の隣に電子吸引基を導入することである。この戦略を用いて、類似体71（2-OH、3-Cl）を合成したが、これはグルクロン酸抱合の割合を変えなかった。他の電子吸引基を環に導入することに加えて、別のアプローチはプロドラッグアプローチを用いてフェノールヒドロキシルを修飾することである。理想的には、プロドラッグは、初回通過代謝を迂回した後、ゆっくり加水分解されて遊離フェノールとなる。このアプローチは、フェノール基を含むいくつかの市販の薬物においてうまく用いられた。（Ettmayer, P.; Amidon, G. L.; Clement B.; Testa, B. Lessons learned from marketed and investigational prodrugs. J. Med. Chem. 2004, 47, 2393-2404）
【０２７８】
前述のとおり、バイカレインおよびノルジヒドログアイレチン酸（nordihydroguairetic acid）（NDGA）、「ブロモフェノール」または「ピラゾール誘導体」（図1参照）などの以前に報告された12-LOXの阻害物質は、有効性および選択性が低いだけでなく、さらなる最適化に対して容易に修正することができない。本発明者らの以前に記載した12-LOX阻害物質（ML127）は強力な阻害（＜500nM）およびすぐれた選択性を示したが、緊密で平坦なSARを示し、したがってさらなる修飾の機会はほとんどないことが判明した。すべての以前に報告された阻害物質とは異なりかつ薬物様骨格を有する、構造的に別個の新しい化学型が発見された。ML355、および関連する最高の類似体は、12-LOXに対する強力な（＜500nM）阻害および関連酵素（15-LOX-1、5-LOX、15-LOX-2、COX 1/2）に対するすぐれた選択性を示す。この一連の類似体は、構造的修飾に対して容易に修正可能であり、明瞭で扱いやすいSARを示す。ML355は、好適なインビトロADME特性およびインビボPK特性を、血栓症（血小板凝集およびカルシウム動員）および糖尿病（β細胞における12-HETE減少）などの疾患関連細胞ベースの系における活性と共に示す。
【０２７９】
生物学的試薬：すべての市販の脂肪酸（Sigma-Aldrich Chemical Company）はHiggins HAIsil Semi-Preparative（5μm、250×10mm）C-18カラムを用いて再精製した。溶液Aは99.9％MeOHおよび0.1％酢酸であり；溶液Bは99.9％H2Oおよび0.1％酢酸であった。85％A：15％Bの定組成溶出を用いて、すべての脂肪酸を精製し、これらを-80℃で最大6ヶ月間保存した。
【０２８０】
ヒト血小板：ヒト血小板はThomas Jefferson Universityの集団およびPhiladelphia地域内の健常志願者から得た。これらの試験は、Thomas Jefferson University Institutional Review Boardによって認可され、採血前にすべての供与者から告知に基づく同意を得た。血液を室温、200gで13分間遠心分離した。血小板を多く含む血漿を、10％クエン酸デキストロース溶液（39mMクエン酸、75mMクエン酸ナトリウム、および135mMグルコース、pH7.4）を含む三角フラスコに移し、室温、2000gで15分間遠心分離した。血小板をタイロード緩衝液（12mM NaHCO3、127mM NaCl、5mM KCl、0.5mM NaH2PO4、1mM MgCl2、5mMグルコース、および10mM HEPES）に再懸濁し、ZI Coulter粒子計数器（Beckman Coulter, Fullerton. CA）で計数した後に、最終血小板濃度を3×108血小板/mLに調節した。報告結果は少なくとも3名の異なる対象からの血小板を用いて得た。アゴニストおよび阻害物質を図および図の説明に示す濃度で用いた。
【０２８１】
12-ヒトリポキシゲナーゼ、5-ヒトリポキシゲナーゼ、12/15-マウスリポキシゲナーゼ、および15-ヒトリポキシゲナーゼの過剰発現および精製：ヒト血小板12-リポキシゲナーゼ（12-LOX）、ヒト網状赤血球15-リポキシゲナーゼ-1（15-LOX-1）、およびヒト上皮15-リポキシゲナーゼ-2（15-LOX-2）を、N-末端、His6標識タンパク質として発現させ、SDS-PAGE分析により評価して、90％超の純度まで精製した。以前に報告されたとおり、ヒト5-リポキシゲナーゼを、非標識タンパク質として発現させ、粗製硫酸アンモニウムタンパク質画分として用いた。12-LOXの鉄含有量を、Finnigan誘導結合プラズマ質量分析計（ICP-MS）により、内部標準としてコバルト-EDTAを用いて決定した。鉄濃度を標準化鉄溶液と比較して、酵素濃度を規準化するために用いた。
【０２８２】
ハイスループットスクリーニング材料：ジメチルスルホキシド（DMSO）ACS等級はFisherからであったが、硫酸鉄(II)アンモニウム、キシレノールオレンジ（XO）、硫酸、およびトリトンX-100はSigma-Aldrichから得た。
【０２８３】
12-リポキシゲナーゼqHTSアッセイ法（AID：1452）：すべてのスクリーニング操作は完全統合ロボットシステム（Kalypsys Inc, San Diego, CA）で実施した。（Inglese, J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2006, 103, 11473-11478.）3μLの酵素（約80nM 12-LOX、最終濃度）を1536穴Greiner黒色透明底アッセイプレートに分配した。1536ピンアレイを備えたKalypsys PinToolにより、化合物および対照（23nL）を移動させた。プレートを室温で15分間インキュベートし、次いで1μLのアリコートの基質溶液（50μMアラキドン酸最終濃度）を添加して反応を開始した。6.5分後に4μL FeXO溶液（50mM流酸中の最終濃度200μMキシレノールオレンジ（XO）および300μM硫酸鉄(II)アンモニウム）を添加して反応を停止した。短時間の回転（1000rpm、15秒）後、アッセイプレートを室温で30分間インキュベートした。405および573nmの吸光度を、ViewLuxハイスループットCCD撮像装置（Perkin-Elmer, Waltham, MA）を用い、標準の吸光度プロトコール設定を用いて記録した。分配中、酵素および基質ボトルは分解を最小限にするために+4℃の再循環冷却浴に沈めたままにした。DMSOだけ（化合物溶液の代わりに）を含むプレートを、スクリーニング全体で約50枚のプレートごとに含め、試薬ディスペンサーの変動に関連するかまたは酵素特異的活性の低下に関連するアッセイシグナルにおける任意の系統的傾向をモニターした。データは対照に対して規準化し、プレートに基づくデータ補正を適用して、バックグラウンドノイズを除去した。データ分析に関するさらなる詳細は、本明細書において提供されている。
【０２８４】
リポキシゲナーゼUV-Visアッセイ法：阻害物質化合物を、最初は25μMの1つの濃度点を用い、Perkin-Elmer Lambda 40 UV/Vis分光光度計でスクリーニングした。阻害パーセントを、234nmで共役ジエン生成物の生成（ε＝25,000M-1cm-1）を追跡することにより、対照（DMSO溶媒）および阻害物質試料の酵素速度を比較して決定した。反応を、30nM 12-LOX、40nM 15-LOX-1、200nM 15-LOX-2、または5〜10μLの5-LOX粗製抽出物のいずれかを、室温（22℃）で磁気撹拌子を用いて絶えず撹拌している2mL反応緩衝液を含むキュベットに添加することにより開始した。様々なリポキシゲナーゼのために用いた反応緩衝液は以下のとおりであった：粗製の硫酸アンモニウム沈降した5-LOXに対しては、25mM HEPES（pH7.3）、0.3mM CaCl2、0.1mM EDTA、0.2mM ATP、0.01％トリトンX-100、10μM AA；ならびに12-LOX、15-LOX-1および15-LOX-2に対しては、25mM HEPES（pH 7.5）、0.01％トリトンX-100、10μM AA。基質濃度は、酵素反応を15-LOX-2存在下で完了まで進行させることにより、定量的に決定した。1点スクリーニングで50％を超える阻害を示した阻害物質について、IC50値を、様々な阻害物質濃度において、溶媒ビヒクルのみと比べた阻害％を決定することにより求めた。次いで、データを阻害物質濃度に対してプロットし、続いて双曲型飽和曲線のフィッティングを行った（全酵素濃度[E]＜＜Kiapp、と仮定し、したがってIC50〜Kiapp）。表に記載するものを除いて、強力な阻害物質はすべて、80％を超える最大阻害を示すことに留意すべきである。阻害物質はDMSO中、-20℃で保存した。
【０２８５】
定常状態阻害動態学：定常状態動態学実験をML355で実施して、阻害の様式を決定した。0、0.1、0.2、および0.35μMの阻害物質濃度を用いた。反応を、基質（1〜5μM AAの範囲）を、0.01％トリトンX-100存在下で、25mM HEPES緩衝液（pH7.5）を含む絶えず撹拌している2mLキュベットに約30nM 12-LOXまで添加することにより開始した。リポキシゲナーゼ速度を、Perkin-Elmer Lambda 45 UV/Vis分光光度計により、234nmで共役生成物、12-HPETEの生成（ε＝25000M-1cm-1）をモニターすることにより決定した。分光光度計の限界のため、12-LOXは低い基質濃度（＜1μM）でKM値においてより高い誤差を示すことに留意すべきである。この固有の誤差を最小限にするためには、12-LOXをまず添加し、次いで適切な量の基質を添加することにより反応を速やかに開始することが最良であり、これは有意に再現性が高い結果を生じた。基質濃度は、酵素反応を15-LOX-2を用いて完了まで進行させることにより、定量的に測定した。動態学的データは、様々な基質および阻害物質濃度において初期酵素速度を記録することにより得て、続いてKaleidaGraph（Synergy）を用いてアンリ・ミカエリス・メンテンの式に当てはめて、微視的速度定数、Vmax（μmol/分/mg）およびVmax/KM（μmol/分/mg/μM）を決定した。続いて、動態学的速度定数を1/Vmax、KM/Vmaxおよび1/KM対阻害物質濃度により再プロットし、Kiを得た。
【０２８６】
偽ペルオキシダーゼアッセイ法：偽ペルオキシダーゼ活性速度を、以前に記載したとおり25、陽性対照としてのBWb70c、酸化生成物としての13-(S)-HPODEおよび12-LOXまたは15-LOX-1により、Perkin-Elmer Lambda 40 UV/Vis分光光度計で測定した。活性を、緩衝液（50mMリン酸ナトリウム（pH7.4）、0.3mM CaCl2、0.1mM EDTA、0.01％トリトンX100、および20μM 13-(S)-HPODE）中、234nmでの低下（生成物分解）をモニターすることにより測定した。約60nM 12-LOXを、回転撹拌子で絶えず撹拌していた、20μM 13-(S)-HPODEを含む2mL緩衝液に添加した（22℃）。反応を、20μM阻害物質（生成物に対して1：1比）の添加により開始した。13-(S)-HPODEの消費パーセントを記録し、20％未満の生成物の消失は存続可能な酸化還元活性とは考えなかった。酵素単独および生成物ならびにML355単独および酵素からなる、個々の対照実験を行った。これらの陰性対照は、アッセイ法の基準線を形成し、非偽ペルオキシダーゼ依存性のヒドロペルオキシド生成物の分解を反映していた。偽ペルオキシダーゼ循環からの酵素の自己不活化を排除するために、12-LOX残存活性をアッセイ法が完了した後に測定した。阻害物質はそれ自体で本質的に酸素化の速度を低下させるため、20μM AAを反応混合物に添加し、残存活性を、阻害物質および13-(S)-HPODEの初期速度と、阻害物質単独の初期速度とを比較することにより測定した。活性を、234nmの吸光度の上昇による生成物生成の直接的な測定によって特徴決定する。
【０２８７】
シクロオキシゲナーゼアッセイ法：おおよそ2〜5μgのCOX-1またはCOX-2のいずれかを、0.1Mトリス-HCl緩衝液（pH8.0）、5mM EDTA、2mMフェノール、および1μMヘマチンを含む緩衝液に37℃で添加した。選択した阻害物質を反応セルに添加し、続いてCOX酵素のいずれかと共に5分間インキュベートした。次いで、反応セルに100μM AAを添加することにより反応を開始した。データをHansatech DW1酸素電極を用いて収集し、酸素の消費を記録した。インドメタシンおよび溶媒DMSOを、それぞれ陽性対照および陰性対照として用い、試料および対照からの速度を比較することにより、酵素の阻害パーセントを算出した。
【０２８８】
血小板凝集：洗浄血小板を3×108血小板/mLの最終濃度に調節した。必要な場合には、血小板をML355で10分間示した濃度において1分間前処理した。PAR4-APに対する凝集反応を、37℃において1100RPMで撹拌しながら、血小板凝集計を用いて測定した。
【０２８９】
カルシウム動員：血小板を1mMの最終濃度に再石灰化し、続いてFluo-4 AMと共に10分間プレインキュベートした。次いで、血小板を示した濃度のML355で10分間処理した後、示したアゴニストで刺激した。カルシウム動員をAccuri C6フローサイトメーターを用いて測定した。
【０２９０】
マウスβ細胞（12-HETE阻害）アッセイ法：細胞を24穴プレートでDMEM（Cat# 11885092, Life Technologies Grand Island, NY）＋10％FBS中、90％の培養密度まで成長させた。ヒト膵島と同様に、細胞をML355で前処理してから刺激した。4時間後、培地を除去し、1000RPMで5分間回転させた。澄明上清を分析まで-80℃で保存した。分析のために、上清をSepPak cl8 SPEカラム（Cat# WAT054945, Waters Corporation, Milford, MA）で抽出し、窒素ガス下で乾燥した後、500μＬの12-HETE ELISA緩衝液で再構成し、製造者の推奨に従って分析した（Cat# 901-050, Enzo Life Sciences, Plymouth Meeting, PA）。
【０２９１】
ヒト膵島（12-HETE阻害）アッセイ法：統合膵島分布プログラム（www.iidp.coh.org）から得たヒト供与者膵島を、10％ウシ胎仔血清、1Uペニシリン1μgストレプトマイシン（pen/strep）を含むCMRL培地（Cat# 15-110-CV MediaTech, Inc. Manassas, VA）中で終夜インキュベートした。膵島を無血清培地、（pen/Strepおよび1％無脂肪酸血清アルブミンを含むCMRL（Cat# A1887 Sigma, St. Louis, MO））中で1時間平衡化した後、10μM ML355と共に30分間前処理した。12-HETE誘導のために、膵島を100μMアラカチドン酸（arachachidonic acid）（Cat# BML-FA003-0100, Enzo Life Sciences Plymouth Meeting, PA）、および5μM A23187（Cat# C7522, Sigma, St. Louis, MO）により37℃で4時間処理した。膵島を回収し、1000RPMで5分間遠心分離し、澄明上清および膵島ペレットを-80℃で保存した。上清の抽出のために、試料を1N HClで30分間、pH3まで酸性化し、1000RPMで5分間回転させた。試料を準備したカラム（3mL EtOHと、続いて3mL H2Oで予備洗浄）に添加し、3mL H2Oと、続いて3mL 15％EtOH、および3mLヘキサンで洗浄した。試料を3mLの酢酸エチルで溶出し、窒素ガス下で乾燥した後、500mLの12-HETE ELISA試料緩衝液（Enzo Life Sciences, Plymouth Meeting, PA）で再構成した。細胞ペレットをCHCl3/MeOHを用いて抽出し、試料を窒素ガス下で乾燥した後、250μLのELISA試料緩衝液で再構成した。試料中の12-HETEレベルを、12-HETE ELISAキット（Cat# 901-050, Enzo Life Sciences, Plymouth Meeting, PA）を用いて測定した。
【０２９２】
血小板活性化および血栓症の処置における12-リポキシゲナーゼ阻害物質の使用に関連する実施例
実施例：血小板12-LOXはFcγRIIa媒介性血小板活性化のために必須である
ヒト血小板における12-LOXの薬理学的阻害は、FcγRIIa媒介性凝集の有意な減弱をもたらした。12-LOXは、FcγRIIa誘導性PLCγ2活性のために必須であり、カルシウム動員の活性化、Rap1およびPKC活性化、ならびに続くインテグリンαIIbβ3活性化につながることが判明した。加えて、ヒトFcγRIIaを発現するが血小板12-LOXを欠損しているトランスジェニックマウス由来の血小板は、FcγRIIa受容体の刺激後に、正常な血小板凝集塊を形成することができず、Rap1およびαIIbβ3活性化の欠損を示した。これらの結果は、FcγRIIa媒介性血小板機能を制御する際の12-LOXの必須の役割を裏付け、免疫媒介性血栓症を制限するための治療標的として12-LOXを同定している。
【０２９３】
血小板12(S)-リポキシゲナーゼ（12-LOX）、すなわち血小板中で高度に発現するオキシゲナーゼは、プロテアーゼ活性化受容体4（PAR4）およびITAM含有受容体複合体（GPVI-FcRy）を含む、選択したシグナル伝達経路の活性化を強化することが明らかにされている。12-LOXの最もよく理解されている機能は、オキシリピンの産生であり、最も注目に値するのは、GPCR媒介性および非GPCR媒介性経路の両方による血小板のアゴニスト刺激後の、アラキドン酸（AA）の12-ヒドロキシエイコサトレトラエン酸（12-hydroxyeicosatretraenoic acid）（12-HETE）への変換である。12-HETEは血小板中で血栓形成促進性であることが判明しているオキシリピンである。頸動脈内膜剥離術患者において、手術中のヘパリンは、エクスビボでADPに対する患者の血小板反応性に相関する血漿12-HETEのレベルを上昇させる。12-LOXが血小板活性を制御するメカニズムは今後完全に解明しなければならないが、以前の出版物は、Rap1、Ca2+動員、αIIbβ3活性化、および密顆粒分泌を含む血小板活性化の重要なシグナル伝達構成要素を増加させる、12-LOX活性の能力を示している。12-LOX活性は最近、正常なGPVI媒介性血小板活性化に必要であることが明らかにされ、FcγRIIaはGPVIと共通のシグナル伝達構成要素を共有するため、本発明者らは、12-LOXがFcγRIIaシグナル伝達経路の非常に重要な構成要素であるかどうかを同定しようとした。
【０２９４】
この試験において、ヒト血小板をFcγRIIa刺激前に12-LOX阻害物質、ML355、またはビヒクル対照で処理して、12-LOXがFcγRIIaシグナル伝達経路において役割を果たすかどうかを調べた。ヒト血小板における12-LOX活性の薬理学的阻害は、FcγRIIa媒介性血小板凝集を減弱した。ヒト試験と一致して、12-LOXを欠損しているhFcRトランスジェニックマウスから分離したマウス血小板は、野生型hFcRトランスジェニックマウスに比べて、FcγRIIa刺激に反応した凝集が減弱していた。12-LOXの活性は、早期PLCγ2活性化ならびにカルシウム動員、Rap1、PKC、αIIbβ3活性化、および密顆粒分泌などの他の下流エフェクターのために必須であることがさらに明らかにされたが、FcγRIIa自体のリン酸化に直接影響することはなかった。本試験は、12-LOX活性を血小板における正常なFcγRIIaシグナル伝達の必須の構成要素として同定した最初のものである。さらに、本試験の結果は、12-LOXが、免疫媒介性血小板減少症および血栓症を処置するための新規治療標的であり得ることを初めて示唆するものである。
【０２９５】
12-LOXはFcγRIIa媒介性血小板凝集を制御する
12-LOXは以前、GPVI媒介性血小板凝集を制御することが示された。血小板において、FcγRIIaはGPVI-FcRγと同じ下流シグナル伝達エフェクターの多くを用いる（4）。12-LOXがFcγRIIa媒介性血小板凝集において役割を果たすかどうかを調べるために、洗浄ヒト血小板をML355、選択的な12-LOX阻害物質、またはDMSO（ビヒクル対照）で処理した後、FcγRIIaにより凝集を誘導した。血小板12-LOX活性の阻害は、抗CD9刺激（図11A）またはFcγRIIa抗体架橋（図11B）を介したFcγRIIa媒介性血小板凝集を減弱した。FcγRIIa媒介性血小板凝集の減少が12-LOXの薬理学的阻害によるものであり、ML355の非特異的効果ではないことを確認するために、エクスビボでの血小板凝集を、12-LOXを発現する（ALOX12+/+）または12-LOXを欠損している（ALOX12-/-）ヒト化FcγRIIa（hFcR）トランスジェニックマウスにおいて抗CD9刺激後に測定した。12-LOXを欠損しているマウス（hFcR/ALOX12-/-）からの血小板は、機能的12-LOXを発現するマウス（hFcR/ALOX12+/+）からの血小板と比べると、抗CD9刺激（0.125および0.25μg/mL）に反応した凝集の遅延（図12B）および減弱（図12C）を示した。これらのデータは、薬理学的または遺伝的除去を通じて12-LOX活性を欠いている血小板は、FcγRIIa活性化に反応した凝集の有意な減弱を示すことを示唆している。
【０２９６】
12-LOXはFcγRIIa刺激血小板においてαIIbβ3およびRap1の活性を制御する
図11および12は、12-LOXが正常なFcγRIIa媒介性血小板凝集のために必須であると示唆しているが；12-LOXによって制御されるFcγRIIa経路における構成要素は不明のままである。インテグリンαIIbβ3の活性化は血小板凝集に必要とされるため、FcγRIIa刺激血小板におけるαIIbβ3活性化を媒介する際の12-LOXの可能な役割を調査し、ML355で処理したFcγRIIa刺激血小板においてαIIbβ3活性化をフローサイトメトリーにより測定した。Rap1は、その活性化がαIIbβ3の活性化のために必須である、小さいGTPアーゼである。したがって、Rap1活性化をML355での処置または非処置後の血小板におけるFcγRIIa刺激後に測定した。図13Bに示すとおり、前処理非存在下（対照）の血小板の刺激は、Rap1-GTPの有意な増大をもたらし、ML355で処理した血小板はRap1を活性化することができなかった。DMSO処理した血小板凝は、対照に比べて活性Rap1の減弱を示さなかった。
【０２９７】
12-LOXはFcγRIIa活性化血小板において密顆粒分泌を制御するがα顆粒分泌は制御しない
活性化血小板からのα顆粒および密顆粒の放出は、血小板凝集を増幅するのに役立つ。P-セレクチンの表面発現を、FcγRIIa刺激血小板におけるα顆粒分泌を測定するための代替マーカーとして用いた。ML355による処理は、対照条件に比べて、P-セレクチンのアゴニスト誘導性表面発現の減弱を引き起こさなかった（図14A）。しかし、ML355で処理したFcγRIIa刺激血小板は、DMSO処理血小板に比べて、ATP放出の有意な減少を示した（図14B）。これらのデータは、12-LOXが血小板におけるFcγRIIa刺激の下流の密分泌の制御因子であることを示唆している。
【０２９８】
12-LOXはヒト血小板におけるFcγRIIa経路の近位シグナル伝達構成要素を制御する
図13に示すとおり、12-LOX活性は、FcγRIIa経路の正常な遠位シグナル伝達構成要素（Rap1、αIIbβ3、および血小板活性化）のために必要である。FcγRIIaの免役グロブリンとの架橋も、最終的に血小板凝集につながる近位シグナル伝達構成要素の活性化を開始する。FcγRIIaはITAMリン酸化を開始し、Syk活性化をもたらす。Syk活性化は、ホスホリパーゼγ2（PLCγ2）の活性化につながり、カルシウム放出およびPKC活性化をもたらし、これらはいずれも血小板活性化にとって非常に重要である。この複雑なシグナル伝達環境のどこで12-LOXが血小板中のFcγRIIaシグナル伝達において必須の役割を果たすかを調べるために、FcγRIIa開始の直接的に下流にある個々のシグナル伝達構成要素をML355存在下または非存在下で評価した。
【０２９９】
12-LOXがFcγRIIaリン酸化を直接制御するかどうかを調べるために、FcуRIIaをML355またはDMSOで処理したIV.3＋GAM刺激血小板から免疫沈降させ、FcγRIIaのリン酸化について免疫ブロットした。対照またはML355処理条件では、FcγRIIa刺激血小板におけるFcγRIIaリン酸化の違いは検出されなかった（図15A）。このデータは、12-LOX活性がFcγRIIa自体のリン酸化のために必要ではないことを示唆している。
【０３００】
FcγRIIaのリン酸化は、LATシグナロソームの形成のために非常に重要な、チロシンキナーゼSykの動員および活性化をもたらす。Sykのリン酸化を、ML355存在下または非存在下での血小板のFcγRIIa刺激後に測定した。ML355存在下でのFcγRIIa架橋に反応したSykリン酸化の程度は、試験した対象において変動し、これは個人間の変動性によるものであろう。したがって、ML355存在下で観察されたSykリン酸化の減弱は小さかったが、試験した対象の数は12-LOXによる制御の中心点としてSykを決定的に同定するには小さすぎた（図15B）。12-LOXがFcуRIIaの下流のPLCγ2活性化を制御するかどうかを評価するために、PLCу2リン酸化をML355存在下または非存在下での洗浄ヒト血小板中で測定した。FcγRIIa抗体架橋によって刺激された血小板は、刺激後15秒以内にリン酸化された。しかし、ML355で処理した血小板は、対照条件に比べて15および30秒の時点でPLCу2リン酸化の減弱を示した（図16A）。
【０３０１】
12-LOXはFcγRIIa媒介性PLCу2活性化を減弱したため、細胞内カルシウム放出に対するその影響を測定した。洗浄ヒト血小板を、ML355またはビヒクル対照存在下でFcγRIIa媒介性抗体架橋によって刺激し、カルシウム放出を測定した。ML355で処理した血小板は、DMSO処理した血小板に比べて、血小板刺激後に細胞内Ca2+の減少を示した（図16B）。PLCу2活性化は、一部にはカルシウム動員を通じて、血小板中のPKCの活性化につながるため、FcγRIIa媒介性PKC活性の12-LOXによる可能な制御も評価した。ML355で処理した血小板中の30および60秒の時点でのPKC活性化の有意な低下を、ビヒクル対照で処理した血小板と比べて観察した（図16C）。直接的PKC活性化因子であるPMAによるPKC活性化は、対照またはML355処理血小板のいずれかにおいてPKCを活性化するその能力に違いを示さなかったため、このPKCの制御は間接的であると判定された。
【０３０２】
考察
12-LOXは最近、GPVI媒介性血小板活性化の重要な制御因子であることが明らかにされた。FcγRIIaおよびGPVIは保存経路を介してシグナル伝達するとされているため、12-LOXはヒト血小板におけるFcγRIIaシグナル伝達の制御において必須の役割を果たしうる。本試験は、12-LOXがFcγRIIa免疫媒介性血小板活性化の必須の構成要素であることを示す最初のものである。12-LOX阻害物質、ML355で処理したヒト血小板、または12-LOXを欠損しているFcγRIIaトランスジェニックマウス血小板は、FcγRIIa媒介性活性化に反応した凝集の有意な減弱を示した。12-LOXがFcγRIIa媒介性血小板活性化を制御する根元的メカニズムを調査するために、FcγRIIa経路における複数のシグナル伝達中間体の活性を、12-LOX阻害物質ML355存在下で評価した。刺激後、ML355で処理した血小板は、αIIbβ3、Rap1、Ca2+、PLCγ2、PKC、および密顆粒分泌を含む免疫媒介性FcγRIIa活性化経路における複数のシグナル伝達段階に沿って有意に減弱した（図17）。
【０３０３】
12-LOXの主な公知の機能は、血小板活性化後に、血小板中の主な脂肪酸である、脂肪酸基質AAからオキシリピン（12(S)-HETEなどの）を産生することである。以前の出版物は、選択的な12-LOX阻害物質が12-HETE産生を有意に減少させたことを示している。12-HETE産生の遮断は血小板媒介性の反応性低下に関連づけられているが、血小板活性化における12-HETEの直接の役割は不明のままである。血小板中の別のオキシゲナーゼであるCOX-1から生成したオキシリピンは、一般には血小板表面上のGPCRを通じてシグナル伝達メディエーターとして作用する。12-HETEの場合、発表された研究は、それがGPR31、GPCRを通じてシグナル伝達することを示しているが；最近の遺伝子スクリーニングはヒト血小板中のGPR31の発現を示している一方で、血小板の表面上ではGPR31タンパク質発現の直接の証拠はない。GPR31を介する可能な自己分泌シグナル伝達またはパラ分泌シグナル伝達に加えて、血小板中で産生された12-LOXオキシリピンは、膜中に再度組み込まれて、それらの制御効果を誘導しうる。12-HETEは血小板活性化後に血漿膜のリン脂質中にエステル化されることが示されているため、オキシリピンの膜中への統合は先例がある。12-LOXがFcγRIIa媒介性シグナル伝達を制御するメカニズムの第三の可能な説明は、細胞内の直接的または間接的12-LOX骨格形成を通じてであり得る。下流シグナル伝達を制御する手段としての12-LOX複合体形成は、以前に細胞成長および腫瘍形成の制御に関与している。これらの制御メカニズムはすべてもっともらしいが、12-LOXがFcγRIIa経路に影響をおよぼす急速な速度により、12-LOXおよび12-LOXではないオキシリピンがFcγRIIa経路の直接的制御構成要素として作用し得る可能性が支持される。
【０３０４】
12-LOX活性は正常なFcγRIIa媒介性血小板活性化のために必要であるが、12-LOX活性が必要とされる直接的分子構成要素は、これから決定されなければならない。12-LOXは、FcγRIIaリン酸化には必要とされず、Sykリン酸化に部分的に影響をおよぼすにすぎず、12-LOX活性がSrcファミリーキナーゼ活性を直接制御していないことが示唆された。しかし、12-LOX活性は早期PLCу2活性化のために重要であることが判明し、12-LOXは下流エフェクターに影響をおよぼすPLCу2活性化の動態学における重要な制御因子であり得ることを示していた。12-LOX阻害によるPLCу2活性化の遅延は、PLCу2の直接的制御またはLATもしくはBTKなどの上流エフェクターの制御に起因し得る。本明細書に示すデータは、12-LOXがFcγRIIa経路に影響をおよぼす範囲を、受容体とPLCу2との間のシグナル伝達経路における近位点に限定する。
【０３０５】
方法
マウスおよび血小板調製：FcγRIIAトランスジェニックマウス（hFcR/ALOX12+/+）を血小板12-リポキシゲナーゼノックアウト（ALOX12-/-）マウスと繁殖させて、血小板12-リポキシゲナーゼを欠損しているFcγRIIAトランスジェニックマウス（hFcR/ALOX12-/-）を作製した。すべてのマウスをThomas Jefferson University（TJU）のマウス施設に収容した。実験手順はAnimal Care and Use Committee of TJUによって認可された。血液を12週齢の麻酔したマウスの下大静脈からクエン酸ナトリウムを含むシリンジを用いて採取した。マウス血小板調製物を（Yeung et al., 2012）に記載のとおりに調製した。マウス血小板を、フィブリノゲン（75μg/mL）およびCaCl2（1mM）を含むタイロード緩衝液に再懸濁した。
【０３０６】
洗浄ヒト血小板の調製：採血前に、書面での告知に基づく同意をすべての志願者から得た。洗浄血小板を、以前に記載されたとおり（14）、健常志願者の血液から分離した。特に記載がないかぎり、洗浄血小板をタイロード緩衝液に3.0×108個 血小板/mLで再懸濁した。ヒト血小板を用いて実施したすべての試験は、Thomas Jefferson University Institutional Review Boardによって認可された。
【０３０７】
FcγRIIa媒介性血小板活性化：FcγRIIa媒介性血小板活性化を、以下の2つの異なるモデルのいずれかにより開始した：（1）FcγRIIa抗体架橋、または（2）CD9モノクローナル抗体刺激。FcγRIIaを架橋するために、洗浄血小板をFcγRIIaマウスモノクローナル抗体であるIV.3と共に1分間インキュベートし、続いてヤギ抗マウス（GAM）IgG抗体を添加して、FcγRIIaを架橋した。各実験に用いたFcγRIIa架橋抗体の濃度は本文中に示す。または、洗浄ヒト血小板を抗CD9モノクローナル抗体で刺激して、FcγRIIa媒介性シグナル伝達を活性化した。抗CD9応答における個人間の変動性により、ある範囲の抗CD9濃度（0.25〜1ug/ml）を用いてEC80の凝集を達成した。12-LOX阻害物質（ML355）を用いた試験において、洗浄血小板を、FcγRIIa刺激前に、ML355（20μM）またはDMSO（ビヒクル対照）のいずれかと共に15分間インキュベートした。
【０３０８】
血小板凝集：血小板凝集をlumi-aggregometer（Chronolog Corp, Model 700D）により、37℃の撹拌条件下で測定した。
【０３０９】
PLCγ2リン酸化：洗浄ヒト血小板を5×108個 血小板/mLに調節し、血小板凝集計においてFcγRIIaの抗体架橋により刺激し、指定の時間に5×還元緩衝液で溶解して反応を停止した。試料を7.5％SDS-PAGEゲルにおいて分離した。PLCy2およびPLCy2活性化のマーカーであるホスホ-Y759 PLCy2の抗体を用いて、それぞれ全PLCy2および活性PLCy2の相対レベルを評価した。
【０３１０】
カルシウム動員：細胞内カルシウム放出を以前に記載されたとおりに測定した。簡単に言うと、洗浄ヒト血小板を、1mMカルシウムを含むタイロード緩衝液に1.0×106個 血小板/mLで再懸濁した。血小板を、細胞透過性カルシウム感受性色素であるFluo-4 amと共に10分間インキュベートした後、刺激した。血小板をFcγRIIa抗体架橋により刺激し、蛍光強度をフローサイトメトリーによりリアルタイムで測定した。データは、血小板刺激前の蛍光強度に対して最大蛍光強度を比較する蛍光強度の変化倍率で報告している。
【０３１１】
Rap1活性化：洗浄ヒト血小板をFcγRIIa抗体架橋により5分間刺激し、凝集を2×血小板溶解緩衝液で停止した。以前に記載されたとおり、RalGDS-RBDを用いて、血小板溶解産物からRap1の活性高次構造を選択的に沈澱させた。全血小板溶解産物およびRap1プルダウン試料をSDS-PAGEゲルにおいて泳動させ、Rap1抗体を用いたウェスタンブロットにより同定した。活性Rap1のレベルを、各試料中に含まれる全Rap1の量に対して規準化した。
【０３１２】
PKC活性化アッセイ法：洗浄血小板を、血小板凝集計において、37℃、撹拌条件（1100rpm）下で、FcγRIIa抗体架橋により刺激した。反応を、示した時間に5×レムリー試料緩衝液を添加して停止した。陽性対照として、血小板を、直接的PKCアゴニストのPMA（1mM）で1分間処理した。試料をSDS-PAGEゲル上で泳動させ、PKC基質リン酸化およびプレクストリンに特異的な抗体を用いてウェスタンブロットを実施した。
【０３１３】
密顆粒分泌：ATP放出を、密顆粒分泌の代用として、洗浄血小板から測定した。活性化前に、洗浄血小板を、ATP感受性色素のChronolume Reagentと共に1分間インキュベートした。血小板を、撹拌条件下でFcγRII抗体架橋により刺激し、蛍光をlumi-aggregometerを用いてリアルタイムで測定した。
【０３１４】
α顆粒放出およびαIIbβ3活性化：刺激前に、洗浄血小板を、FITC結合P-セレクチン抗体またはαIIbβ3の活性高次構造に特異的な抗体であるFITC結合PAC-1のいずれかと共にプレインキュベートした。血小板をFcγRIIa抗体架橋により刺激し、示した時間に2％ホルムアルデヒドを添加して反応を停止した。蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した。結果は平均蛍光強度として報告している。
【０３１５】
ウェスタンブロッティング：Rap1活性化、PKC基質、およびPLCγ2リン酸化の標準ウェスタンブロットを用い、バンド強度をOdyssey Infrared Imaging System（LIC-OR Biosystems）により定量した。
【０３１６】
統計分析：該当する場合、データは平均±S.E.Mを表す。統計学的有意性はGraphPad Prismソフトウェアを用いて判定した。0.05未満のP値を有意と考えた。
【０３１７】
参照文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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