(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトボカウイルスキャプシドタンパク質および組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムを含んでなる単離されたキメラウイルス。
【請求項２】
ゲノムが異種遺伝子産物をコードする発現カセットを含んでなる、請求項１に記載のウイルス。
【請求項３】
遺伝子産物が治療的タンパク質をコードする、請求項２に記載のウイルス。
【請求項４】
ｒＡＡＶゲノムがｒＡＡＶ−１、ｒＡＡＶ−２、ｒＡＡＶ−３、ｒＡＡＶ−４、ｒＡＡＶ−５、ｒＡＡＶ−６、ｒＡＡＶ−７、ｒＡＡＶ−８若しくはｒＡＡＶ−９ゲノムである、請求項１ないし３のいずれか１つに記載のウイルス。
【請求項５】
遺伝子産物がウイルス、細菌、腫瘍、寄生生物若しくは真菌抗原である、請求項２ないし４のいずれか１つに記載のウイルス。
【請求項６】
遺伝子産物が、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子、β−グロビン、γ−グロビン、チロシンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィン、α１−アンチトリプシン、サーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｄ、ＳＰ−Ａ若しくはＳＰ−Ｃ、エリスロポエチン、ＨＢｏＶタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＲＳＶタンパク質、中和抗体若しくはその抗原結合フラグメント、ＳＡＲＳウイルスタンパク質、またはサイトカイン例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−１７若しくはＩＬ−６である、請求項２ないし４のいずれか１つに記載のウイルス。
【請求項７】
請求項２ないし６のいずれか１つに記載のウイルスを提供すること；および異種遺伝子産物を発現するのに有効な量のウイルスに細胞を試験管内で感染させることを含んでなる、哺乳動物細胞中での異種遺伝子産物の発現方法。
【請求項８】
遺伝子産物が、治療的遺伝子産物、触媒ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＲＮＡプレトランスプライシング分子（ＰＴＭ−ＲＮＡ）、中和抗体若しくはその抗原結合フラグメント、予防的遺伝子産物、ポリペプチド若しくはペプチドである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物細胞を、ヒトボカウイルスキャプシドタンパク質と、異種遺伝子産物をコードするトランスジーンを含んでなるｒＡＡＶゲノムとを含んでなる単離されたキメラウイルス、ならびにｒＡＡＶ形質導入を相加的若しくは相乗的に高めるのに有効な量の最低１種の剤と試験管内で接触させることを含んでなる、哺乳動物細胞のキメラウイルス形質導入を高める方法。
【請求項１０】
哺乳動物細胞が哺乳動物鼻上皮細胞、気管気管支細胞若しくは肺細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
剤が、プロテアソーム阻害剤、化学療法剤、脂質低下薬、粘液溶解薬、抗生物質若しくは食品添加物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
内因性遺伝子産物の異常な発現を伴う状態の危険がある若しくはそれを有する哺乳動物における該状態を阻害又は処置する医薬組成物であって、ヒトボカウイルスキャプシドタンパク質およびｒＡＡＶゲノムを含んでなる有効量の単離されたキメラウイルスを含み、該ｒＡＡＶゲノムは機能的遺伝子産物の少なくとも一部分をコードするトランスジーンを含んでなり、哺乳動物中でのその発現が該状態の最低１種の症状を阻害若しくは処置する、医薬組成物。
【請求項１３】
前記トランスジーンが、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子、β−グロビン、γ−グロビン、α−アンチトリプシン、チロシンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィンまたはエリスロポエチンをコードする、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記哺乳動物が、形質導入を高める量のプロテアソーム阻害剤、化学療法剤、脂質低下薬、粘液溶解薬、抗生物質または食品添加物を含む最低１種の剤とさらに接触される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記最低１種の剤が、ＬＬｎＬ、Ｚ−ＬＬＬ、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ）、エポキソミシン、ドキソルビシン、ドキシル、ダウノルビシン、イダルビシン、エピルビシン、アクラルビシン、シンバスタチン、タンニン酸、カンプトテシン若しくはシスプラチンである、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
哺乳動物細胞を、ヒトボカウイルスキャプシドタンパク質およびｒＡＡＶゲノムを含んでなるキメラウイルス、ならびに剤と接触されない哺乳動物細胞に関してウイルスの形質導入を高めるのに有効な量の剤を含み、該剤がプロテアソーム阻害剤である、哺乳動物細胞のウイルス形質導入を高める医薬組成物。
【請求項１７】
プロテアソーム阻害剤のある量の剤と、ヒトボカウイルスキャプシドタンパク質およびトランスジーンを含んでなるｒＡＡＶゲノムを含んでなるキメラウイルスのある量を含む医薬組成物とを含み、前記プロテアソーム阻害剤のある量はｒＡＡＶの形質導入を高め、それにより前記剤と接触されない哺乳動物細胞に関してトランスジーンの発現を高める、哺乳動物細胞中のトランスジーンの発現を高める医薬組成物。
【請求項１８】
前記哺乳動物は、ボカウイルスキャプシドタンパク質およびｒＡＡＶゲノム（該ゲノムは哺乳動物中のその発現が治療的であるトランスジーンを含んでなる）を含んでなる単離されたキメラウイルスとともにウイルス遺伝子治療にかけられ、プロテアソーム阻害剤である最低１種の剤を投与され、該剤は、該剤と接触されない哺乳動物中の細胞に関して該哺乳動物の細胞中のトランスジーンの発現を高めるのに有効な量が投与される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記ｒＡＡＶが治療的ペプチド若しくは治療的ポリペプチドをコードする、請求項１６ないし１８のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記細胞若しくは哺乳動物が、該細胞若しくは哺乳動物がウイルスと接触される前に前記プロテアソーム阻害剤と接触される、請求項１６ないし１９のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記細胞若しくは哺乳動物が、該細胞若しくは哺乳動物が前記プロテアソーム阻害剤と接触される前にウイルスと接触される、請求項１６ないし１９のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記細胞若しくは哺乳動物が前記ウイルスおよび前記プロテアソーム阻害剤と同時に接触される、請求項１６ないし１９のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記プロテアソーム阻害剤および前記ウイルスが肺、鼻上皮、消化管若しくは血液に投与される、請求項１６ないし２２のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記ウイルスが経口若しくは非経口投与される、請求項１６ないし２２のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項２５】
哺乳動物に、微生物の感染若しくは複製を予防若しくは阻害するのに有効な量の、ヒトボカウイルスキャプシドタンパク質および予防的遺伝子産物をコードするｒＡＡＶゲノムを含んでなる単離されたキメラウイルスを含んでなる、哺乳動物の免疫化医薬組成物。
【請求項２６】
前記遺伝子産物がウイルス若しくは細菌の抗原である、請求項２５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の交差引用
本出願は、２０１３年４月８日に出願された米国特許出願第６１／８０９，７０２号明細書（その開示は本明細書に組み込まれる）の出願日の利益を主張する。
【０００２】
政府の権利の声明
本発明は、米国立保健研究所により授与されたＨＬ１０８９０２の下での政府の援助を伴いなされた。政府は本発明においてある種の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子治療は１９９０年代以降臨床試験で広範に使用されており、多くの成功裏の症例が、治療的遺伝子を送達するためのウイルス若しくはウイルス以外のベクターを使用して報告されている。肺は、嚢胞性線維症（ＣＦ）、α１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）欠損症のような固有の遺伝子欠損、若しくは喘息および肺癌のような他の慢性後天性呼吸障害を伴う患者に対する遺伝子治療処置のための重要な器官である。これらの肺疾患のうち、１タンパク質、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）をコードすることにおける単一遺伝子欠損により引き起こされるＣＦは、最も普遍的な生命を脅かす遺伝子欠損固有の疾患であり、約４億５千万ドルが米国単独で患者治療に毎年費やされている。臨床処置は最近数十年にＣＦ患者の生活の質および寿命を改善したとは言え、この単一遺伝子欠損固有の疾患について、遺伝子治療は、不完全なＣＦＴＲ遺伝子を置換することにより該障害を永続的に修正するための最良の治療法のようである（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。
【０００４】
ＣＦは、ＣＦＴＲ遺伝子コーディング中の突然変異により引き起こされる常染色体劣性遺伝障害である（非特許文献４）。それは多臓器疾患であるが、しかしＣＦ肺疾患は最も生命を脅かす（非特許文献５）。組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、現在、肺ＣＦ遺伝子治療のため追求されている１種の遺伝子治療剤である（非特許文献３；非特許文献６；非特許文献７）。
【０００５】
肺ＣＦ遺伝子治療のためのｒＡＡＶベクターはほぼ２０年間開発中であり、そして、大部分の血清型は、形質導入（すなわちコードされるトランスジーンの発現）の変動する程度にもかかわらず、気道上皮の頂端膜側から効果的に形質膜陥入されるようである。これらのベクターはＣＦの臨床試験で良好な安全性プロファイルを示している（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）とは言え、それらは２つの重大な理由上ｉｎ  ｖｉｖｏの補完を達成することに失敗している。第一に、感染後のビリオンのプロセシングにおける侵入後障壁が、核移行および従ってトランスジーン発現をプロテアソーム依存性の様式で制限するようである（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５）。ｒＡＡＶ２のこの特徴は、ウイルスゲノムがトランスジーン由来ＣＦＴＲ  ｍＲＮＡの検出若しくは肺機能の臨床改善を伴わずに試験被験者の気道上皮に持続したＣＦの臨床試験で反映されている（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。これらの制限を迂回した適切なｒＡＡＶ血清型を同定することは、動物モデルとヒトの間の種特異的差違により困難と判明した（非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８）。ｒＡＡＶ１はヒト気道の頂端感染のための最も効率的な血清型であると判明している（非特許文献１６；非特許文献１９；非特許文献２０）一方、他者は、頂端ヒト上皮（ＨＡＥ）形質導入に対するｒＡＡＶの高められた向性への定方向キャプシド進化を使用して成功を見出した（非特許文献２１；非特許文献２２）。しかしながら、ＣＦのＨＡＥにおける効果的なＣＦＴＲ補完はなお、形質導入を高めるためのプロテアソーム
阻害剤の使用を必要とする（非特許文献２１；非特許文献２３）。
【０００６】
ｒＡＡＶベクターからの効率的なＣＦＴＲ発現に対する第二の大きな障壁は、小型の弱いプロモーターの使用および／若しくはＣＦＴＲミニ遺伝子の使用を必要とするそれらの制限されたパッケージング容量（約４．９ｋｂ）である（非特許文献２４）。臨床試験で試験された第一世代のｒＡＡＶ−ＣＦＴＲは、完全長のＣＦＴＲ  ｃＤＮＡの発現を駆動するためにＡＡＶ２  ＩＴＲ内の潜在性プロモーターを利用し（非特許文献８）、そしてこれは後に短い８３ｂｐの合成プロモーターの組み込みにより改良された（非特許文献２３）。ｒＡＡＶベクターの小さいパッケージング容量を回避するための他の試みは、短縮されたＣＭＶプロモーターのようなコアプロモーター領域のための余地を拡張するための（Ｒドメインでの部分的欠失のような）重要でない配列の欠失によりＣＦＴＲ  ｃＤＮＡのサイズを縮小することを包含した（非特許文献２１；非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６）。これら戦略はＣＦＴＲの発現を改良したとは言え、ｒＡＡＶのパッケージングの限界を押し広げることがｒＡＡＶゲノムの５’端の一貫しない欠失につながり得（非特許文献２７）、従ってゲノムの安定性および発現をさらに危うくすることが明らかである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍｕｅｌｌｅｒら、２００８
【非特許文献２】Ｄｒｉｓｋｅｌｌら、２００３
【非特許文献３】Ｇｒｉｅｓｅｎｂａｃｈら、２０１０
【非特許文献４】Ｒｏｍｍｅｎｓら、１９８９
【非特許文献５】Ｒｏｗｅら、２００５
【非特許文献６】Ｆｌｏｔｔｅ、２００７
【非特許文献７】Ｃａｒｔｅｒ、２００５
【非特許文献８】Ａｉｔｋｅｎら、２００１
【非特許文献９】Ｍｏｓｓら、２００７
【非特許文献１０】Ｗａｇｎｅｒら、２００２
【非特許文献１１】Ｄｕａｎら、２０００
【非特許文献１２】Ｄｉｎｇら、２００５
【非特許文献１３】Ｙａｎら、２００２
【非特許文献１４】Ｚｈｏｎｇら、２００８
【非特許文献１５】Ｚｈｏｎｇら、２００７
【非特許文献１６】Ｆｌｏｔｔｅら、２０１０
【非特許文献１７】Ｌｉｕら、２００７ａ
【非特許文献１８】Ｌｉｕら、２００７ｂ
【非特許文献１９】Ｙａｎら、２０１２
【非特許文献２０】Ｙａｎら、２００６
【非特許文献２１】Ｌｉら、２００９
【非特許文献２２】Ｅｘｃｏｆｆｏｎら、２００９
【非特許文献２３】Ｚｈａｎｇら、２００４
【非特許文献２４】Ｚｈａｎｇら、１９９８
【非特許文献２５】Ｏｓｔｅｄｇａａｒｄら、２００５
【非特許文献２６】Ｏｓｔｅｄｇａａｒｄら、２００２
【非特許文献２７】Ｋａｐｒａｎｏｖら、２０１２
【発明の概要】
【０００８】
本明細書に記述されるとおり、ヒト気道上皮（ＨＡＥ）を頂端膜側から効率的に形質導入する組換えヒトボカウイルスウイルス１（ＨＢｏＶ−１）を、ＯＲＦが破壊されたｒＨ
ＢｏＶ１ゲノムから生成した。ＨＢｏＶ１のより大きいゲノムおよび高い気道向性は、遺伝性および後天性肺疾患のような遺伝病および後天性疾患、癌の遺伝子治療、ならびに例えば呼吸疾患に対するワクチンを包含する遺伝子導入例えば気道遺伝子導入のためのウイルスベクターを創成するために理想的である。本明細書にさらに記述されるとおり、ＨＢｏＶ１キャプシドが過大なｒＡＡＶ２ゲノムをパッケージングしたｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１キメラウイルス（例えば約５．５ｋｂゲノム）を創成した。臨床試験は、肺嚢胞性線維症（ＣＦ）疾患のための遺伝子治療の状況でｒＡＡＶ２ゲノムを適用することの安全性を裏付けている。該キメラベクターは、ＨＢｏＶ１キャプシドの気道頂端向性もまた提供しつつ、ｒＡＡＶ２ゲノムの高い安全性プロファイルを保持する。ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１は、ｒＡＡＶ１若しくはｒＡＡＶ２（４．７ｋｂゲノム）よりそれぞれ５．６および７０倍より大きい効率でＨＡＥを頂端で形質導入することが可能であることが示された。分子研究は、気道上皮細胞の分極がＨＢｏＶ１キャプシドに媒介される遺伝子導入に必要とされたことを示した。さらに、完全長のＣＦＴＲコーディング配列および強いＣＢＡプロモーターを含有するｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１−ＣＦＴＲウイルスは、嚢胞性線維症のＨＡＥ中のＣＦＴＲ依存性塩素イオン輸送を効率的に修正した。従って、キメラＡＡＶ／ＨＢｏＶウイルスベクターは、嚢胞性線維症および他の肺疾患の遺伝子治療、ならびにＨＢｏＶ１感染症およびインフルエンザウイルスのような他の呼吸器ウイルスに対するワクチンの開発に有用である。感染期中のプロテアソーム阻害剤の同時投与もまた、ＡＡＶ／ＨＢｏＶ１キメラベクター形質導入を１０００倍だけ大きく高める。
【０００９】
本発明は、従って、例えばヒト肺疾患遺伝子治療およびワクチンのための遺伝子導入ベクターを提供する。該ベクターは、ヒト気道に対し高度に向性であり、ＨＢｏＶキャプシドの大きなパッケージ容量を有し、そしてｒＡＡＶゲノムを効率的にキャプシドで包む（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｅ）。高度に効率的な気道形質導入ベクターとして、該ベクターは、ＣＦ遺伝子治療戦略、ならびにＡＡＴ欠損症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、肺癌のような他の肺疾患に対する遺伝子治療遺伝子治療、ならびに例えば乳児、幼児、年少者若しくは成人における野生型ＨＢｏＶ感染症ならびに（インフルエンザウイルスおよびＲＳウイルス（ＲＳＶ）感染症のような）他の呼吸器感染症に対するワクチン接種に使用しうる。
【００１０】
本発明はまた、限定されるものでないが肺疾患を挙げることができるヒト、愛玩動物および家畜での使用のためのｒＡＡＶゲノムを含むボカウイルス（ＢｏＶ）に基づく遺伝子導入ワクチンの開発のための基盤も提供する。遺伝子導入ベクター例えば組換えボカウイルスベクター（ｒＢｏＶ）およびキメラアデノ随伴／ボカウイルスパルボウイルスベクター（ｒＡＡＶ／ＢｏＶ）のためのボカウイルスキャプシドは、多様な株のヒトボカウイルスおよびヒト以外のボカウイルスからであり得る。ヒトボカウイルス１（ＨＢｏＶ１）は気道を感染させるための向性の呼吸器ウイルスであり、そしてヒトボカウイルス２ないし４（ＨＢｏＶ２、ＨＢｏＶ３およびＨＢｏＶ４）は消化管を感染させるための向性の腸ウイルスである。ブタボカウイルス、イヌボカウイルスおよびネコボカウイルスのようなヒト以外のボカウイルスがヒト以外の哺乳動物から単離されている。
【００１１】
一態様において、本発明は、ボカウイルスキャプシドタンパク質例えばヒトボカウイルスキャプシドタンパク質および組換え異種パルボウイルスゲノム例えば組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムを含んでなる単離されたキメラウイルスを提供する。例えば、ｒＡＡＶゲノムは、例えば嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子、α−アンチトリプシン、β−グロビン、γ−グロビン、チロシンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィン若しくはエリスロポエチンのような治療的タンパク質、ウイルス、細菌、腫瘍若しくは真菌抗原のような抗原、またはヒト呼吸器ウイルス例えばインフルエンザウイルス若しくはＲＳＶからのもののような抗原の１エピトープを標的とする中和抗体若しくはそのフラグメントである異種遺伝子
産物をコードする発現カセットを包含しうる。一態様において、遺伝子産物は治療的遺伝子産物である。一態様において、遺伝子産物は予防的遺伝子産物である。一態様において、遺伝子産物は触媒ＲＮＡである。一態様において、遺伝子産物はポリペプチド若しくはペプチドである。一態様において、キャプシドタンパク質はＨＢｏＶ１、ＨＢｏＶ２、ＨＢｏＶ３若しくはＨＢｏＶ４キャプシドタンパク質である。一態様において、ボカウイルスキャプシドタンパク質は、肺若しくは他の器官の感染症についての独特の向性を付与するヒト以外の種から単離されたボカウイルス、例えばブタボカウイルスからである。一態様において、ワクチン接種のため使用されるｒＡＡＶ／ＨＢｏＶ若しくはｒＡＡＶ／ＢｏＶベクターは家畜若しくは愛玩動物を保護するため動物で使用される。一態様において、ＡＡＶゲノムはＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２若しくはＡＡＶ−５ゲノムである。一態様において、ＡＡＶゲノムはＡＡＶ−１、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８若しくはＡＡＶ−９ゲノムである。
【００１２】
本発明の範囲内のＢｏＶ配列は、限定されるものでないが、例えば配列番号９、１７−１８、３９若しくは４２−４３の１種を有する連続した配列に対する最低８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％若しくは１００％の核酸配列同一性を有する核酸配列またはその相補物を挙げることができる。本発明の範囲内のＢｏＶキャプシド配列は、限定されるものでないが、例えば配列番号２１−２４、３９−４１若しくは４４−４５の１種を有する配列に対する最低８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を挙げることができる。
【００１３】
本発明は、ボカウイルス（ＢｏＶ）キャプシドタンパク質および組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムのような組換え異種パルボウイルスゲノムを含んでなるキメラウイルスの製造方法を提供する。該方法は、組換えＡＡＶゲノムの核酸配列を含んでなる第一のベクター；ＡＡＶ複製のための１種若しくはそれ以上のアデノウイルス遺伝子、例えばＥ４ｏｒｆ６遺伝子、Ｅ２Ａタンパク質遺伝子およびＶＡ  ＲＮＡ遺伝子の１種若しくはそれ以上の核酸配列を含んでなる第二のベクター；１種若しくはそれ以上のＲｅｐタンパク質例えばＲｅｐ４０、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ６８若しくはＲｅｐ７８をコードする核酸配列を含んでなる第三のベクター；ならびにＢｏＶ１キャプシドおよびキャプシド形成のための遺伝子産物（１種若しくは複数）をコードする欠失されたボカウイルスゲノムである末端配列を含んでなる第四のベクターを提供することを包含する。細胞例えば哺乳動物若しくは昆虫細胞を、キメラウイルスを生じるのに有効な量のベクターでトランスフェクトする。一態様において、昆虫細胞への導入のためのベクターは、ＡＡＶ２  Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ５２を発現するＡＡＶ２  Ｒｅｐヘルパーバキュロウイルス（Ｂａｃ−ＡＡＶ２Ｒｅｐ）、ＨＢｏＶ１キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰｘおよびＶＰ２を発現するＨＢｏＶ１  Ｃａｐヘルパーウイルス（Ｂａｃ−ＨＢｏＶＣａｐ）；ならびに目的遺伝子（ＧＯＩ）を担持するｒＡＡＶ２ゲノムを含有する導入ベクター（Ｂａｃ−ｒＡＡＶ）を包含する。昆虫細胞を、キメラウイルスを生じるのに有効な量のこれらバキュロウイルスベクターに感染させる。
【００１４】
一態様において、キメラウイルスはトランスジーンを包含しなくてもよいが、しかしＩＴＲおよび非コーディング配列（「スタッファ（ｓｔｕｆｆｅｒ）」配列）を有する。こうしたウイルスは体液性応答を誘発するキャプシド（例えばＨＢｏＶキャプシド）を有し、そして従ってワクチンとして有用である。一態様において、キメラウイルスは肺に送達される。一態様において、キメラウイルスは鼻、気管気管支道および／若しくは肺に送達される。一態様において、キメラウイルスは、消化管のような他の器官を感染させるＢｏＶ株を用いて生成される。一態様において、キメラウイルスはヒトを感染させるのに使用される。一態様において、キメラウイルスは家畜若しくは愛玩動物のような動物を感染させるのに使用される。
【００１５】
一態様において、キメラウイルスは、その遺伝子産物がＢｏＶに対する体液性若しくは細胞性応答を高めるトランスジーンを包含しかつＩＴＲを有する。こうしたウイルスは、ＢｏＶキャプシドに対する体液性応答ならびに該トランスジーンの発現により高められる免疫応答（体液性および／若しくは細胞性）の結果として、ワクチンとして有用である。一態様において、キメラウイルスは肺に送達される。一態様において、キメラウイルスは鼻、気管気管支道および／若しくは肺に送達される。一態様において、キメラウイルスは他の器官を感染させるＢｏＶ株を用いて生成される。一態様において、キメラウイルスはヒトを感染させるのに使用される。一態様において、キメラウイルスは家畜若しくは愛玩動物のような動物を感染させるのに使用される。
【００１６】
一態様において、キメラＡＡＶ／ＢｏＶウイルスはトランスジーンを包含しかつＩＴＲを有する。トランスジーンは、いずれかの抗原例えば腫瘍抗原、ＢｏＶタンパク質（しかしＢｏＶ複製を見込むタンパク質でない）、インフルエンザウイルスタンパク質例えばＨ１若しくはＮ１タンパク質、またはキャプシド遺伝子のようなＳＡＲＳウイルス遺伝子）、あるいは免疫応答調節物質、例えば限定されるものでないがＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−１７若しくはＩＬ−６を挙げることができるサイトカイン、あるいは細胞性若しくは体液性免疫応答を高める他の遺伝子産物をコードしうる。一態様において、キメラウイルスは肺に送達される。一態様において、キメラウイルスは鼻、気管気管支道および／若しくは肺に送達される。一態様において、キメラウイルスは他の器官を感染させるＢｏＶ株を用いて生成される。一態様において、キメラウイルスはヒトを感染させるのに使用される。一態様において、キメラウイルスは家畜若しくは愛玩動物のような動物を感染させるのに使用される。
【００１７】
一態様において、トランスジーンは、例えば、呼吸器ウイルス感染症に対する（例えば多様なインフルエンザウイルス株の間で保存されているエピトープを標的とされた広範に中和する抗体）、若しくはＲＳウイルス（ＲＳＶ）およびＳＡＲＳウイルスのような他の呼吸器ウイルスに対する受動免疫のための抗体をコードしうる。一態様において、キメラウイルスは気道以外の器官を感染させるＢｏＶ株を用いて生成される。一態様において、キメラウイルスはヒトを感染させるのに使用される。一態様において、キメラウイルスは家畜若しくは愛玩動物のような動物を感染させるのに使用される。
【００１８】
哺乳動物細胞のキメラウイルス形質導入を高める方法がさらに提供される。該方法は、哺乳動物細胞例えばヒト細胞を、ボカウイルスキャプシドタンパク質および異種遺伝子産物をコードするｒＡＡＶゲノムを含んでなる単離されたキメラウイルス、ならびにｒＡＡＶ形質導入を相加的若しくは相乗的に高めるのに有効な量の最低１種の剤と接触させることを包含する。一態様において、哺乳動物細胞は哺乳動物肺細胞である。一態様において、剤は化学療法剤、脂質低下薬、粘液溶解薬、抗生物質若しくは食品添加物である。一態様において、哺乳動物細胞は、それについて代替株のボカウイルス（ヒト若しくは他の動物から単離される）が効率的感染を可能にする肺以外の哺乳動物細胞である。一態様において、剤はプロテアソーム調節物質例えばプロテアソーム阻害剤である。
【００１９】
本発明は、哺乳動物細胞例えば哺乳動物肺細胞のウイルス形質導入を高める方法を包含する。例えば、哺乳動物肺細胞を、ボカウイルスキャプシドタンパク質およびｒＡＡＶゲノムを含んでなるキメラウイルス、ならびに剤と接触されない哺乳動物細胞に関してウイルスの形質導入を高めるのに有効な量の剤と接触させ、ここで該剤はプロテアソーム阻害剤である。
【００２０】
一態様において、本発明は哺乳動物肺細胞のような哺乳動物細胞中のトランスジーンの発現を高める方法を提供する。該方法は、哺乳動物細胞を、プロテアソーム阻害剤であるある量の剤、ならびにヒトボカウイルスキャプシドタンパク質およびトランスジーンを含
んでなるｒＡＡＶゲノムを含んでなるキメラウイルスと接触させることを包含し、ここで該量はｒＡＡＶの形質導入を高め、それにより該剤と接触されない哺乳動物細胞に関してトランスジーンの発現を高める。
【００２１】
一態様において、本発明は哺乳動物の免疫化方法を提供する。該方法は、ボカウイルスキャプシドタンパク質、および、抗原例えばウイルス、細菌、寄生生物若しくは真菌のような微生物抗原または腫瘍抗原に対する保護的免疫応答を誘発するのに有用なトランスジーン、あるいは限定されるものでないがウイルス、細菌、真菌若しくは寄生生物を挙げることができる病原体による感染を予防するのに有用な中和抗体若しくはそのフラグメントを含んでなる組換え異種パルボウイルスゲノム例えばｒＡＡＶゲノムを含んでなるキメラウイルスと哺乳動物を接触させることを包含する。一態様において、哺乳動物はプロテアソーム阻害剤ともまた接触される。一態様において、トランスジーンは中和抗体若しくはその抗原結合フラグメントをコードする。従って、キメラウイルスはワクチン例えば受動ワクチンとして使用しうる。
【００２２】
内因性遺伝子産物の異常な発現を伴う状態の阻害若しくは処置方法もまた提供される。該方法は、該状態の危険がある若しくはそれを有する哺乳動物を、形質導入を高める有効量の最低１種のプロテアソーム阻害剤、化学療法剤、脂質低下薬、粘液溶解薬、抗生物質若しくは食品添加物、ならびにボカウイルスキャプシドタンパク質およびｒＡＡＶゲノムを含んでなる有効量の単離されたキメラウイルスと接触させることを包含し、ここで該ゲノムは、哺乳動物中のその発現が該状態の最低１種の症状を阻害若しくは処置する機能的遺伝子産物の少なくとも一部分をコードするトランスジーンを含んでなる。一態様において、トランスジーンは、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子、α−１アンチトリプシン、β−グロビン、γ−グロビン、チロシンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィン若しくはエリスロポエチンをコードする。
【００２３】
一態様において、ボカウイルスキャプシドタンパク質およびｒＡＡＶゲノムを含んでなる単離されたキメラウイルスを用いるウイルス遺伝子治療にかけられる哺乳動物は、剤と接触されない哺乳動物中の細胞に関して該哺乳動物の細胞中のｒＡＡＶ中のトランスジーンの発現を高めるのに有効な量のプロテアソーム阻害剤である剤を投与される。
【００２４】
ｒＨＢｏＶウイルスがさらに提供される。一態様において、ｒＨＢｏＶウイルスはトランスジーンを包含しなくてもよいが、しかし同一でない末端パリンドローム配列（ＴＰＳ）および非コーディング配列（「スタッファ」配列）を有する。すなわちそれは複製能力がない。こうしたウイルスは体液性応答を誘発するキャプシド（ＢｏＶ）を有しそして従ってワクチンとして有用である。一態様において、キメラウイルスは肺に送達される。一態様において、キメラウイルスは、ＢｏＶキャプシド配列が感染に対し向性である他の肺以外の細胞型に送達される。
【００２５】
ｒＢｏＶを製造するため、一態様において２種若しくはそれ以上のベクターを使用する。一方のベクターは、ＴＰＳを包含する複製およびパッケージングのためのシスエレメント、および場合によっては異種配列（トランスジーン）を有する。他方のベクターはトランス作用因子の配列を有するがしかし該シスエレメントを欠く（それらは欠失されている）。該２種のベクターは１種のプラスミド若しくは２種の異なるプラスミド上にあることができる。さらに、トランス作用因子は異なるプラスミド上にあることができる。例えば、非構造タンパク質例えばＮＳおよびＮＰ１の配列が１プラスミド上にあることができ、そして別のプラスミドがキャプシドタンパク質の配列を有しうる。ｒＢｏＶをパッケージングするのに必要とされる構造タンパク質は、野生型ＢｏＶの生成を回避するために複数のベクター中に分割してもまたよい。
【００２６】
一態様において、ＡＡＶ／ＢｏＶウイルスは培養された昆虫細胞中で産生される。この方法は、組換えバキュロウイルスベクター（ＢＥＶ）すなわちＡＡＶ  Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ５２を発現するＡＡＶ  Ｒｅｐヘルパーバキュロウイルス（Ｂａｃ−ＡＡＶＲｅｐ）、ＢｏＶ１キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰｘおよびＶＰ２を発現するＢｏＶ１  Ｃａｐヘルパーウイルス（Ｂａｃ−ＢｏＶＣａｐ）；ならびに目的遺伝子（ＧＯＩ）を担持するｒＡＡＶゲノムを含有する導入ベクター（Ｂａｃ−ｒＡＡＶ）の利用性を包含する。昆虫細胞を、キメラウイルスを生じるのに有効な量のこれらバキュロウイルスベクターで感染させる。
【００２７】
一態様において、ｒＢｏＶウイルスは、その遺伝子産物がＢｏＶに対する体液性若しくは細胞性応答を高めるトランスジーンを包含しかつＴＰＳを有する。例えば、それは独力で複製能力がないか若しくは感染性ＢｏＶを産生し得る。こうしたウイルスは、ＢｏＶキャプシドに対する体液性応答ならびにトランスジーンの発現により高められる免疫応答（体液性および／若しくは細胞性）の結果としてワクチンとして有用である。一態様において、ｒＨＢｏＶは肺に送達される。ｒＢｏＶをパッケージングするのに必要とされる構造タンパク質は、野生型ＢｏＶの生成を回避するために複数のベクター中に分割してもまたよい。一態様において、キメラウイルスは、ＢｏＶキャプシド配列が感染に対し向性である他の肺以外の細胞型に送達される。
【００２８】
一態様において、ＡＡＶ／ＢｏＶウイルスは培養された昆虫細胞中で製造される。この方法は、組換えバキュロウイルスベクター（ＢＥＶ）すなわちＡＡＶ  Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ５２を発現するＡＡＶ  Ｒｅｐヘルパーバキュロウイルス（Ｂａｃ−ＡＡＶＲｅｐ）、ＢｏＶ１キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰｘおよびＶＰ２を発現するＢｏＶ１  Ｃａｐヘルパーウイルス（Ｂａｃ−ＢｏＶＣａｐ）；ならびに目的遺伝子（ＧＯＩ）を担持するｒＡＡＶゲノムを含有する導入ベクター（Ｂａｃ−ｒＡＡＶ）の利用性を包含する。昆虫細胞を、キメラウイルスを生じるのに有効な量のこれらバキュロウイルスベクターで感染させる。
【００２９】
一態様において、ｒＨＢｏＶウイルスはトランスジーンを包含しかつＨＢｏＶ  ＴＰＳを有する。トランスジーンは、いずれかの抗原例えば腫瘍抗原、ＨＢｏＶタンパク質（しかしＨＢｏＶ複製を可能にするタンパク質でない）、インフルエンザウイルスタンパク質例えばＨ１若しくはＮ１タンパク質、またはキャプシド遺伝子のようなＳＡＲＳウイルス遺伝子））、あるいは免疫応答調節物質、例えば限定されるものでないがＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−１７若しくはＩＬ−６を挙げることができるサイトカイン、または細胞性若しくは体液性免疫応答を高める他の遺伝子産物をコードしうる。一態様において、ｒＢｏＶは鼻、気管気管支道および／若しくは肺に送達される。一態様において、ウイルス産生のためのベクターはＴＰＳおよびＮＳ配列を包含し、そして、キャプシド配列を、細胞中の複製を可能にするがしかしトランスに提供される他の配列なしで子孫を生成しないトランスジーンで置換している。一態様において、ウイルス産生のためのベクターはＴＰＳおよびＮＳ配列を包含し、そして、キャプシド配列を、腫瘍細胞のためのプロドラッグまたはＢｏＶに対する免疫応答を高めるためのサイトカイン例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＴＮＦ若しくはＩＬ−１７のトランスジーンで置換している。
【００３０】
哺乳動物細胞のｒＢｏＶ形質導入を高める方法がさらに提供される。該方法は、哺乳動物細胞例えばヒト細胞を、ボカウイルスキャプシドタンパク質および異種遺伝子産物をコードするｒＢｏＶゲノムを含んでなる単離されたｒＨＢｏＶと接触させることを包含し、ならびに、一態様においては、形質導入を相加的若しくは相乗的に高めるのに有効な量の最低１種の剤を包含する。一態様において、哺乳動物細胞は哺乳動物肺細胞である。一態
様において、剤はプロテアソーム調節物質例えばプロテアソーム阻害剤である。一態様において、剤は化学療法剤、脂質低下薬、抗生物質、粘液溶解薬若しくは食品添加物である。
【００３１】
本発明は、哺乳動物細胞例えば哺乳動物肺細胞のウイルス形質導入を高める方法を包含する。例えば、哺乳動物肺細胞を、ボカウイルスキャプシドタンパク質およびｒＢｏＶゲノムを含んでなるｒＢｏＶ、ならびに場合によっては、剤と接触されない哺乳動物細胞に関してウイルスの形質導入を高めるのに有効な量の剤と接触させ、ここで該剤はプロテアソーム阻害剤である。
【００３２】
一態様において、本発明は哺乳動物肺細胞のような哺乳動物細胞中のトランスジーンの発現を高める方法を提供する。該方法は、哺乳動物細胞を、プロテアソーム阻害剤であるある量の剤、ならびにボカウイルスキャプシドタンパク質およびトランスジーンを含んでなるｒＢｏＶゲノムを含んでなるｒＢｏＶと接触させることを包含し、ここで該量はｒＢｏＶの形質導入を高め、それにより該剤と接触されない哺乳動物細胞に関してトランスジーンの発現を高める。
【００３３】
一態様において、本発明は哺乳動物の免疫化方法を提供する。該方法は、哺乳動物を、ボカウイルスキャプシドタンパク質例えばヒトボカウイルスキャプシドタンパク質および抗原例えばウイルス、細菌、寄生生物若しくは真菌のような微生物抗原または腫瘍抗原に対する保護的免疫応答を誘発するのに有用なトランスジーンまたはその中和抗体若しくは抗原結合フラグメントを含んでなるｒＢｏＶゲノムを含んでなる、ｒＢｏＶと接触させることを包含する。一態様において、哺乳動物はプロテアソーム阻害剤ともまた接触される。従って、ｒＢｏＶはワクチン例えば受動ワクチンとして使用しうる。
【００３４】
内因性遺伝子産物の異常な発現を伴う状態の阻害若しくは処置方法もまた提供される。該方法は、該状態の危険がある若しくはそれを有する哺乳動物を、形質導入を高める有効量の最低１種のプロテアソーム阻害剤、化学療法剤、脂質低下薬、抗生物質、粘液溶解薬若しくは食品添加物、ならびにヒトボカウイルスキャプシドタンパク質およびｒＢｏＶゲノムを含んでなる有効量の単離されたｒＢｏＶと接触させることを包含し、ここで該ゲノムは、哺乳動物中でのその発現が該状態の最低１種の症状を阻害若しくは処置する機能的遺伝子産物の少なくとも一部分をコードするトランスジーンを含んでなる。一態様において、トランスジーンは、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子、α１−アンチトリプシン、β−グロビン、γ−グロビン、チロシンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィン若しくはエリスロポエチンをコードする。
【００３５】
一態様において、ヒトボカウイルスキャプシドタンパク質およびｒＨＢｏＶゲノムを含んでなる単離されたｒＨＢｏＶを用いるウイルス遺伝子治療にかけられる哺乳動物は、剤と接触されない該哺乳動物中の細胞に関して該哺乳動物のｒＨＢｏＶゲノム細胞中のトランスジーンの発現を高めるのに有効な量のプロテアソーム阻害剤である剤を投与される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ｒＨＢｏＶ１ベクター製造および初代分極ＨＡＥの感染。（Ａ）本研究で使用されたＨＢｏＶ１ゲノムおよびプロウイルスプラスミドの図解構造。ｐＨＢｏＶ１ＫＵｍ６３０はＨＢｏＶ１ウイルスタンパク質のトランス補完のためのヘルパープラスミドであり、ｐＩＨＢｏＶ１はＨＢｏＶ１の完全なゲノムの感染性クローンであり、そしてｐｒＨＢｏＶ１−ＣＢＡｌｕｃはｒＨＢｏＶ１シス導入プロウイルスプラスミドである。クローニングに使用されたきわめて重要な制限酵素切断部位もまた示され、そしてＮＳおよびＶＰ遺伝子内の小さな欠失が印を付けられる（Δ）。（Ｂ）ＨＥＫ２９３細胞中のｒＨＢｏＶ１プロウイルスプラスミドの複製補完アッセイ。ｐＩＨＢｏＶ１（レーン１）、ｐｒＨＢｏＶ１−ＣＢＡｌｕｃ（レーン２）若しくはｐｒＨＢｏＶ１−ＣＢＡｌｕｃ＋ｐｒＨＢｏＶ１ＫＵｍ６３０（レーン３）プラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。Ｈｉｒｔ  ＤＮＡをトランスフェクション後４８時間に抽出し、そしてアガロースゲル上で分離する前にＤｐｎＩにより消化した。ＨＢｏＶ１複製中間体（矢印により示される）を、32Ｐ標識ＨＢｏＶ１プローブを用いるサザンブロッティングにより可視化した。ＨＢｏＶ１感染性クローンでトランスフェクトされた細胞からのＨｉｒｔ  ＤＮＡ（ｐＩＨＢｏＶ１、レーン１）を陽性対照として使用した。短いおよび長い曝露を図のそれぞれ左および右に示す。（Ｃ）ｒＨＢｏＶ１−ＣＢＡｌｕｃおよびｐｒＨＢｏＶ１ＫＵｍ６３０でコトランスフェクトされたＨＥＫ２９３からのＤＮアーゼＩ消化された細胞ライセートを、ＣｓＣｌ平衡超遠心分離法により分画した。プロットは勾配の観察された密度（白色点）に対するｒＨＢｏＶ１．ＣＢＡｌｕｃ（黒色点）ゲノムの分布を示す。各画分（約７５０μＬ）中のゲノムコピーをＴａｑＭａｎ  ＰＣＲにより測定した。（Ｄ）ＨＥＫ２９３細胞、ＩＢ３細胞、未分化（ＵＤ）ＣｕＦｉ８細胞単層、ＡＬＩ培養物中の分極されたＣｕＦｉ８細胞、および初代ＨＡＥ  ＡＬＩ培養物のｒＨＢｏＶ１．ＣＢＡｌｕｃ感染後の形質導入アッセイ。データは感染後２日のウェルあたりの平均（±ＳＥＭ）相対ルシフェラーゼ活性を表す（ｎ＝４）。（Ｅ）感染後多様な時点のｒＨＢｏＶ１．ＣＢＡｌｕｃに感染させたＨＡＥ  ＡＬＩ培養物からのトランスジーン発現。データはウェルあたりの平均（±ＳＥＭ）相対ルシフェラーゼ活性を表す（ｎ＝３）。
【図２】ＨＢｏＶ１キャプシド中のｒＡＡＶ２ゲノムのシュードパッケージング（ｐｓｅｕｄｏｐａｃｋａｇｉｎｇ）。（Ａ）示されるＨＥＫ２９３細胞のプラスミドトランスフェクションからのＤＮアーゼＩ消化された細胞ライセートをＣｓＣｌ平衡超遠心分離法により分画した。各画分中のウイルスゲノム数をＴａｑＭａｎ  ＰＣＲにより測定した。（Ｂ）ＨＥＫ２９３細胞を、ＡｄヘルパーｐＡｄ４．１と一緒になってプラスミドの示される組合せ（Ｍ：分子量マーカー；レーン１：ｐＡＶ２−Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃ＋ｐＡＶ−Ｒｅｐ２；レーン２：ｐＡＶ２−Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃ＋ｐＡＶＲＣ２．３；レーン３：ｐＡＶ２−ＣＦ５ｔｇ８３ｌｕｃ＋ｐＡＶ−Ｒｅｐ２；ランド（ｌａｎｄ）４：ｐＡＶ２−ＣＦ５ｔｇ８３＋ｐＡＶ−Ｒｅｐ２＋ｐＨＢｏＶ１ＫＵｍ６３０）でトランスフェクトした。低分子量（Ｈｉｒｔ）ＤＮＡを、トランスフェクトされた細胞から４８時間後に抽出し、そしてＤｐｎＩで消化し、次いで32Ｐ標識ルシフェラーゼプローブを使用してサザンブロッティングした。ｒＡＶ２．Ｆ５ｔｇ８３ＬｕｃおよびｒＡＶ２．ＣＦ５ｔｇ８３Ｌｕｃゲノムの４．８ｋｂおよび５．４ｋｂ複製型（ＲＦ）ＤＮＡを矢印により示す。（Ｃ）キメラベクターｒＡＶ２／ＨＢｃ．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃの陰性に染色された透過型電子顕微鏡写真（棒＝１５０００倍画像中で１００ｎｍおよび５００００倍画像について５０ｎｍ）。不完全にパッケージングされたウイルスＤＮＡを含むウイルス様粒子（全ビリオンの１％未満）が挿入図中で白色矢印により印を付けられる。（Ｄ）２色ウエスタンブロット（赤色：ＡＡＶ；緑色：ＨＢｏＶ１）を、示されるウイルス調製物で赤外画像装置を使用して実施した。変換された単一チャネル画像もまた示し、黒い矢印はそれぞれ左および右図中でＡＡＶ２ならびにＨＢｏＶ１  ＶＰタンパク質（ＶＰ１およびＶＰ２）を指し示す。灰色矢印および白色矢印はＨＢｏＶ１  ＶＰｘタンパク質からのタンパク質に印を付ける。
【図３】ｒＨＢｏＶ１およびｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターのパッケージ極性および容量。（Ａ）ウイルスＡＶ２／２．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃ、ＡＶ２／ＨＢｃ．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃおよびｒＨＢｏＶ１．ＣＢＡｌｕｃをスロットブロッティングによりナイロンメンブレンに負荷し、そしてルシフェラーゼ遺伝子の−および＋鎖に対する32Ｐ標識３２−ｍｅｒオリゴヌクレオチドプローブを用いて可視化した（左図）。各ウイルス調製物中の−および＋鎖の比率を、ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量化されたシグナル密度に基づき計算した（右図）。（Ｂ）２×１０8ＤＲＰのｒＡＡＶベクターＡＶ２／２．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃ、キメラウイルスＡＶ２／ＨＢｃ．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃおよびＡＶ２／ＨＢｃ．ＣＦ５ｔｇ８３ｌｕｃを、アルカリ性ゲル負荷緩衝液中９５℃で１０分間加熱し、そしてその後０．９％アルカリ性アガロースゲル中で分離した。ナイロンメンブレンに転写された後、サザンブロッティングを、32Ｐ標識ルシフェラーゼプローブを用いて実施した。黒色および白色矢印はそれぞれ、より短いｒＡＶ２．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃ（４．８ｋｂ）およびより長いｒＡＶ２．ＣＦ５ｔｇ８３ｌｕｃ（５．４ｋｂ）ゲノムに印を付ける。（Ｃ）左図は、ルシフェラーゼ遺伝子（１．７ｋｂ）を認識する32Ｐ標識フラグメントでプロ−ビングされたＡＶ２／ＨＢｃ．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃおよびｒＨＢｏＶ１．ＣＢＡｌｕｃウイルス調製物（ルシフェラーゼトランスジーンについてのＴａｑＭａｎ  ＰＣＲに基づき約１０9ＤＲＰ）、若しくはヘルパープラスミドに独特のＨＢｏＶ１ゲノム領域（ＮＰ１コーディング領域を包括する２．６４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｇｌＩＩフラグメント）のスロットブロットを描く。右図は、プラスミド標準に関するシグナル強度に基づくルシフェラーゼ若しくはＮＰ１遺伝子フラグメントの相対的コピーを描く。ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、示されるｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１およびｒＨＢｏＶ１ウイルス調製物についての平均（±範囲）シグナル密度を定量化した。
【図４】ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１およびｒＡＡＶベクターの間の形質導入比較。（Ａ）ＡＶ２／２．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃ（ＭＯＩ＝２，５００ＤＲＰ／細胞）若しくはＡＶ２／ＨＢｃ．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃ（ＭＯＩ＝５０，０００ＤＲＰ／細胞）でのＨＥＫ２９３細胞の感染後２日のルシフェラーゼ発現。結果は２４ウェルプレートのウェルあたりの平均（±ＳＥＭ、Ｎ＝４）相対ルシフェラーゼ活性を示す。（Ｂ）初代ＨＡＥ  ＡＬＩ培養物をＡＶ２／２．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃ、ＡＶ２／１．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃ若しくはＡＶ２／ＨＢｃ．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃに頂端若しくは側底膜側から感染させた。接種物中のベクター量は各Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌインサートについて１０10ＤＲＰすなわちおよそ５，０００ないし１０，０００ＤＲＰ／細胞であった。データは３名のドナー由来のＨＡＥ  ＡＬＩ培養物のＮ＝６の独立した感染について感染後７日に測定された平均（±ＳＥＭ）相対ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／ウェル）を表す。（Ｃ、Ｄ）ビリオン内部移行および細胞内分布分析を、初代ＨＡＥ  ＡＬＩ培養物をＭｉｌｌｉｃｅｌｌインサートあたり１０10ＤＲＰのｒＡＡＶ２／１、ｒＡＡＶ２／２およびｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターで頂端感染させた後１８時間に実施した。細胞質および核画分中のウイルスゲノムをＴａｑＭａｎ  ＰＣＲにより定量した。各培養物中で検出された全ウイルスゲノムを（Ｃ）に提示し、黒色棒は核画分を表しかつ間の（ｗｈｉｌｅ）棒は細胞質画分を表す。各画分中のウイルスゲノムの比率を（Ｄ）に提示する。データはＮ＝３の独立した感染についての平均（±ＳＥＭ）ウイルスゲノムコピー（ウェルあたり）を表す。
【図５】ヒト気道上皮細胞の分極されたおよび分極されない培養物中のｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１形質導入に対するプロテアソーム阻害剤の影響。（Ａ、Ｂ）初代ＨＡＥ  ＡＬＩ培養物を、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌインサートあたり１０10ＤＲＰで、（Ａ）ＡＶ２／２．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃ若しくは（Ｂ）ＡＶ２／ＨＢｃ．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃに頂端で１６時間の期間感染させた。示される場合、プロテアソーム阻害剤（ＰＩ）ＬＬｎＬ（４０ｎＭ）およびドキソルビシン（５μＭ）を感染期間中のみ適用した。ルシフェラーゼ発現を、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ２００  ＩＶＩＳを使用する生存細胞の生物光工学（ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃ）画像法により１１日にわたり監視した。データは感染後第３、７および１１日の３時点のウェルあたりの平均（±ＳＥＭ、ｎ＝６）相対ルシフェラーゼ活性を表す。（Ｃ）分極された上皮としてＡＬＩで培養されたＣｕＦｉ８細胞（ＣｕＦｉ−ＡＬＩ；ａ：頂端感染、ｂ：側底感染）若しくはプラスチック上の分極されない未分化単層（ＣｕＦｉ−ＵＤ）およびＨＥＫ２９３細胞を、１．５×１０9ＤＲＰのＡＶ２／ＨＢｃ．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃとともに３７℃で４時間インキュベートした。全部の培養物は感染の時点で約５×１０5細胞を含有した。感染後、結合されないウイルスを洗い落とし、そして細胞は、トリプシンを用いて培養物支持体からはがしかつウイルスゲノムのＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ定量化のため溶解したか、若しくは細胞ライセートを使用する感染後２４時間でのルシフェラーゼ発現アッセイのためインキュベーターに戻したかのいずれかであった。示される場合（＋ＰＩ）、ＣｕＦｉ８細胞は、４時間の感染期間中プロテアソーム阻害剤ドキソルビシン（１μＭ）およびＬＬｎＬ（８ｎＭ）で処理した。データは、感染後４時間の平均（±ＳＥＭ）全ベクターゲノム（ｎ＝４）および感染後２４時間の相対ルシフェラーゼ活性（ｎ＝３）を表す。
【図６】ＡＶ２／ＨＢｃ．ＣＢＡｈＣＦＴＲでの感染後の初代ＣＦ  ＨＡＥ  ＡＬＩ培養物によるＣＦＴＲ依存性塩素イオン輸送の部分的修正。２名のＣＦ患者ドナー（遺伝子型：ΔＦ５０８／ΔＦ５０８ホモ接合性）由来のＣＦ  ＨＡＥ  ＡＬＩ培養物を、プロテアソーム阻害剤ＬＬｎＬ（４０ｎＭ）およびドキソルビシン（５μＭ）の存在下、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌインサートあたり１０10ＤＲＰのＡＶ２／ＨＢｃ．ＣＦ５ｔｇ８３ｌｕｃ若しくはＡＶ２／ＨＢｃ．ＣＢＡｈＣＦＴＲ（５０００ないし１０００ＤＲＰ／細胞のＭＯＩ）に感染させた。感染させない非ＣＦ  ＨＡＥもまた電気生理学的比較のため培養し、そして実験培養物を感染後１０日に評価した。（Ａ）示されるところの多様な阻害剤およびアゴニストの順次添加後のＣＦ  ＨＡＥの経上皮短絡電流（Ｉｓｃ）の代表的トレース。アミロライドおよびＤＩＤＳを使用して、ｃＡＭＰアゴニスト（フォルスコリンおよびＩＢＭＸ）誘導ならびにＣＦＴＲ電流のＧｌｙＨ１０１阻害前に、ＥＮａＣに媒介されるナトリウム電流および非ＣＦＴＲクロライドチャネルを阻害した。ΔＩｓｃ(cAMP)はｃＡＭＰアゴニスト誘導後のＣＦＴＲに媒介される塩素イオン電流の活性化を反映し、およびΔＩｓｃ(glyH)はＧｌｙＨ１０１の添加後のＣＦＴＲに媒介される塩素イオン電流の阻害を反映する。（Ｂ）ＣＦの感染させた培養物および非ＣＦ対照双方のΔＩｓｃ(cAMP)およびΔＩｓｃ(glyH)の要約データ（平均±ＳＥＭ、ｎ＝６個の独立したトランスウェル）。（Ｃ）ＡＶ２／ＨＢｃ．ＣＢＡｈＣＦＴＲ（左図）若しくはＡＶ２／ＨＢｃ．ＣＦ５ｔｇ８３ｌｕｃ（右図）への感染後のＣＦ  ＨＡＥ中のＣＦＴＲ発現（緑色）の免疫蛍光検出。
【図７】ヒト気道上皮細胞の分極がＨＢｏＶ１ビリオンの感染および形質導入にどのように影響するかについての１つの潜在的モデル。（Ａ）分極されたＨＡＥはＨＢｏＶ１の複数の結合および／若しくは共受容体を含有しうる。この具体的に説明されるシナリオにおいて、単一の結合受容体が頂端膜に存在し、そして側底膜で大きく低下されるか若しくは非存在である。頂端膜上の効率的な共受容体１および側底膜上のより豊富な非効率的な共受容体２を包含する２種の異なる共受容体が存在する。共受容体１によるエンドサイトーシスは、プロテアソームの活性による高度に影響である機能的に効率的な（形質導入の観点から）ビリオンプロセシングに至る一方、共受容体２による内部移行はビリオンをプロセシングすることにおいて無効でありかつプロテアソーム機能により影響されない。このモデルは、頂端膜と比較して側底膜からの大きくより少ないウイルス取り込みおよび形質導入と矛盾しない。示されない他のモデルは、共受容体１若しくは共受容体２で非効率的に形質膜陥入される側底膜側の第二の種類の結合受容体を包含しうる。（Ｂ）分極されていないヒト気道細胞において、主結合受容体すなわち共受容体１および共受容体２が同一膜に存在する。双方の共受容体は同一結合受容体と相互作用し得るが、しかしながら共受容体２は共受容体１より大きく豊富である。従って、共受容体２によるＨＢｏＶ１ビリオンのエンドサイトーシスが優勢であり、そしてこの経路は生産的形質導入のためＨＢｏＶ１ビリオンを非効率的にプロセシングするため、トランスジーン発現は低い。これらの知見は、分極されていないヒト気道細胞における高レベルのＨＢｏＶ１ビリオンのエンドサイトーシス、しかし乏しい形質導入および弱いプロテアソーム阻害剤応答性と矛盾しない。
【図８】完全長ヌクレオチド配列（ＪＱ９２３４２２、ＨＢｏＶ１の複製およびパッケージングのためのシスエレメントであるｎｔ１−１４０の左５’ヘアピンおよびｎｔ５３４４−５５４３の右３’ヘアピンを含む）、双方の端の末端ヘアピンを伴わないヌクレオチド配列（例えばＧＱ９２５６７５）ならびにそれらによりコードされるタンパク質を包含する例示的ＨｏＢＶ配列。本発明のウイルスで有用なタンパク質は、図８。配列番号９−３６のＨＢｏＶタンパク質の配列に対する最低８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは最低９９％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を包含する。
【図９】２９３細胞中のｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクター産生の最適化。（Ａ）ＨＢｏＶ１  Ｃａｐヘルパープラスミド。（１）ｐＨＢｏＶ１ＮＳＣａｐは原型ＨＢｏＶ１ヘルパーであり；（２）ｐＣＭＶＨＢｏＶ１ＮＳＣａｐは該原型ヘルパーすなわちＰ５プロモーターの前のＣＭＶプロモーター由来であり；および（３）ｐＣＭＶＨＢｏＶ１ＮＳ１（−）ＣａｐはｐＣＭＶＨＢｏＶ１ＮＳＣａｐ由来であり、ＮＳ１  ＯＲＦが早期に終止されている。（Ｂ）ＣＦの感染させた培養物および非ＣＦ対照双方についての、４プラスミドでトランスフェクトされた（ｐＡＶ２．ＣＭＶＧＦＰ（５．４ｋｂ）、ｐＡｄ４．１、ｐＡＶ２−Ｒｅｐ、およびＣａｐヘルパーに依存しないトランスウェルの１種でトランスフェクトされた）２９３細胞産生系中のＨＢｏＶ１  ＶＰ１、ＶＰｘおよびＶＰ２のウエスタンブロット分析。（Ｃ）改良されたｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１産生系（ｐＡＶ２．ＣＭＶＧＦＰ（５．４ｋｂ）、ｐＡｄ４．１、ｐＡＶ２−ＲｅｐおよびｐＣＭＶＨＢｏＶ１ＮＳ１（−）Ｃａｐヘルパーでトランスフェクトされた）からのｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１の収量は、２９３細胞中のｒＡＡＶ２／２産生系（ｐＡＶ２．ＣＭＶＧＦＰ（５．４ｋｂ）、ｐＡｄ４．１、ｐＡＶ２−ＲｅｐＣａｐヘルパーでトランスフェクトされた）のものに匹敵した。比較は２０枚の１４５ｍｍプレートのスケールの並べた調製物からプロットした。
【図１０】Ｓｆ９細胞中のｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１産生。（Ａ）ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１産生のためのＢＥＶの構築。示される３種のＢＥＶはＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して生成した。Ｂａｃ−ＣａｐはＫｏｔｉｎ法に従い設計したが、しかしサイレント点変異を、ＶＰ１：ＶＰｘ：ＶＰ２の適切な比を確実にするためにＶＰ１コーディング配列のｎｔ２７３（ＧからＡ）に導入した。Ｂａｃ−ＲｅｐもまたＫｏｔｉｎ法に従って構築し；Ｐｈ：ポリへドリンプロモーター。（Ｂ）ウイルスタンパク質発現およびｒＡＡＶ２  ＤＮＡ複製の分析。ｐ．ｉ．７２時間に、３種のＢＥＶに感染させたＳｆ９細胞を、ウエスタンブロッティングによりＨＢｏＶ１  ＣａｐおよびＡＡＶ２  Ｒｅｐの発現について、ならびにサザンブロッティングによりｒＡＡＶ２ゲノムの複製について分析した。ＨＢｏＶ１  Ｃａｐタンパク質（ＶＰ１、ＶＰｘおよびＶＰ２）がｐＨＢｏＶ１ＮＳＣａｐでトランスフェクトされた２９３細胞でのものに類似の比で効率的に産生され、そしてそれらの発現は、共感染させたＳｆ９細胞中のＡＡＶ２  Ｒｅｐ７８／５２の発現若しくはｒＡＡＶ２ゲノム複製のレスキューを妨害しなかった。複製型（ＲＦ）およびｒＡＡＶ２  ＤＮＡの二重ＲＦを示す。（Ｃ）ベクター精製。２００ｍＬ培養物からの感染させたＳｆ９細胞を使用してＣｓＣｌ勾配上でベクターを精製した。画分を収集しかつＤＲＰについて定量した。精製されたベクターは陰性染色を使用して電子顕微鏡下に可視化した。ピクトグラフは直径約２５ｎｍの完全にパッケージングされたビリオンを示す。（Ｄ）Ｓｆ９細胞（２００ｍＬのＳｆ９細胞培養物から）中のｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１およびｒＡＡＶ２／２ベクター産生の並べた比較。ｒＡＡＶ２を生成するのに使用されたＢＥＶはＢａｃ−（ＩＴＲ）ＧＦＰおよびＢａｃ−Ｒｅｐ／（ＡＡＶ２）Ｃａｐ（Ｋｏｔｉｎ研究室により恵与された）であった。ベクターはＣｓＣｌ勾配を使用して精製し、そしてＧＦＰプローブを使用してＤＲＰ／調製物として定量した。（Ｅ）Ｓｆ９細胞中で産生されたｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターの機能性は、２９３細胞から産生されたものと同じくらい活性であった。データは、Ｓｆ９若しくは２９３細胞中で産生されたベクターに頂端で感染させたＣｕＦｉ−ＡＬＩ培養物中のＲＬＵを表す。１０ＫのＭＯＩを適用し、そして細胞をｐ．ｉ．４８時間でルシフェラーゼアッセイのため溶解した。
【図１１】ＨＢｏＶ１はＨＢｏＶ１キャプシド中への５．９ｋｂのＡＡＶ２ゲノムの５．５ｋｂのパッケージングより大きい組換えパルボウイルスゲノムをキャプシドで包むことができる。ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターを、示されるとおりそれぞれ異なるサイズのゲノムを用いて３種の導入プラスミドから製造した。ベクター収量は、８枚の１５０ｍｍプレート中のトランスフェクトされた２９３細胞からのＣｓＣｌ勾配超遠心分離後の産生を表す。ウイルスＤＮＡを抽出し、０．９％アルカリ性ゲル上で分離し、そして32Ｐ標識ＣＦＴＲプローブを使用して可視化した。
【図１２】ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターはＨＡＥ−ＡＬＩ培養物中の繊毛性かつＫ１８陽性上皮細胞を効率的に形質導入する。示されるベクターを１０ｋのＭＯＩで頂端で適用し；ｍＣｈｅｒｒｙレポータータンパク質の発現（赤色）は形質導入された気道細胞を同定する。ｐ．ｉ．１０日で、ＨＡＥを、繊毛性および非繊毛性双方の円柱細胞について、（Ａ）固定しかつ繊毛細胞のマーカー抗β−チューブリンＩＶ（緑色）で染色し、そして（Ｂ）トリプシン処理し、スライド上にサイトスパンし（ｃｙｔｏｓｐｕｎ）、固定しかつ抗Ｋ１８（緑色）で染色した。共焦点画像を１００倍で撮影した。ＤＡＰＩ：核。
【図１３】ＣＦＴＲ遺伝子送達のためのｒＡＡＶ２ゲノム構築物。（Ａ）ｔｇ８３合成プロモーターのための短い合成エンハンサーについてのスクリーニング。ＨＡＥ−ＡＬＩを、ｔｇ８３に駆動されるルシフェラーゼカセットおよび多様なエンハンサーを担持するｒＡＡＶ２／２ベクターに感染させた。ｐ．ｉ．３日に、感染させたＨＡＥをルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）について分析した。（Ｂ）ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターによるＣＦ  ＨＡＥ−ＡＬＩ中のＣｌ-輸送の修正（３０％）はｒＡＡＶ２／２で達成されるものより効果的である。ＣＦ  ＨＡＥ−ＡＬＩ培養物を偽似感染させたか、若しくは描かれるベクターに頂端側からかつ示されるＭＯＩで感染させた（各条件についてｎ＝６）。ｐ．ｉ．１０日に、感染させたＣＦ  ＨＡＥを、上皮電位固定および自己含有されるＵｓｓｉｎｇチャンバー系を使用して、経上皮短絡電流（ｉｓｃ）の変化に基づきＣＦ表現型の修正について評価した。１０ｋのＭＯＩで、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１（ＡＶ２／ＨＢｃ）は、正常ＨＡＥのもののとおり、ＣＦＴＲに媒介される経上皮Ｃｌ-輸送の約３０％を復帰した（ｎ＝１３）。ｒＡＡＶ２／２−ＣＦＴＲベクターは５０ｋのＭＯＩででさえＣＦ表現型の修正で非効率的であった。（Ｃ）ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターのためのｒＡＡＶ２ゲノム構築物。繊毛細胞特異的プロモーター（ＦＯＸＪ１）若しくは合成プロモーター／エンハンサー（Ｆ５ｔｇ８３）を包含するかまたは転写後エレメント（ｍｉＲ）を組み込むｒＡＡＶ２−ＣＦＴＲゲノム構築物が示され、そしてＨＢｏＶ１キャプシド中にパッケージングされることができる。
【図１４】ＳＭａＲＴベクターを使用して欠損ＣＦＴＲ  ｍＲＮＡを修正するための図解アプローチ。（Ａ）ＨＢｏＶ１キャプシド中にシュードタイプされるｒＡＡＶ２ゲノムＡＶ２．ＣＭＶ−ＰＴＭ２４ＣＦ、そしてＳＭａＲＴの有効性はＣＦ  ＨＡＥの頂端感染により試験することができる。（Ｂ）内因性枝分かれ部位（赤色のＢＰ）、ポリピリミジン領域（緑色のＰＰＴ）および３’ＳＳ（ＣＡＧ）で続く１３３ｎｔのＰＴＭ２４結合配列（青色の、イントロン９の１３３ｎｔのＢＤ  ＲＮＡ配列に相補的）よりなるＡＶ２．ＣＭＶ−ＰＴＭ２４ＣＦのトランススプライシングドメインの配列（配列番号４６）。（Ｃ）ＣＦＴＲのプレｍＲＮＡの構造およびターゲッティング機構の図解。ＣＦＴＲタンパク質中の欠陥若しくはその欠如を引き起こすいくつかのきわめて重要な突然変異は、示されるとおりエクソン１０中およびその下流にある。（Ｄ）提案される新たなｒＡＡＶ２ゲノムＡＶ２．ＣＢＡ−ＰＴＭ２４ＣＦ−３ＵＴＲ。
【図１５】新生フェレットにおけるｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１形質導入。３日齢のフェレット仔を４×１０10ＤＲＰのＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃに気管内注入により感染させた。接種物の容量は２５０μＭの最終濃度のドキソルビシンを含む３００μＬである。動物を感染１週後に殺し、気道カセットを収集しかつ解剖した。２００μＬのレポーター溶解緩衝液（組織の各片について）を使用して気管および肺葉（大きさおよび重量が異なる６葉）からタンパク質を抽出した。ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）をタンパク質抽出液から測定しかつ組織１ｍｇ（湿重量）あたりに対し正規化した。各組織サンプルの１００ｎｇのゲノムＤＮＡを、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲによるベクターゲノムコピー（ＶＧＣ）の量を探るために使用した。１フェレット仔からの未感染の肺を陰性対照として示す。
【図１６】例示的なブタ、ネコおよびイヌのボカウイルスゲノムおよびＶＰ配列（配列番号３７−４５）。
【００３７】
発明の詳細な記述
定義
本明細書で使用されるところの「ベクター」は、ポリヌクレオチドを含んでなるか若しくはそれと会合しかつｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏいずれかで細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介するのに使用し得る巨大分子若しくは巨大分子の会合を指す。具体的に説明するベクターは、例えばプラスミド、ウイルスベクター、リポソームおよび他の遺伝子送達ベヒクルを包含する。ときに「標的ポリヌクレオチド」若しくは「トランスジーン」と称される送達されるべきポリヌクレオチドは、遺伝子治療における目的のコーディング配列（治療的若しくは目的のタンパク質をコードする遺伝子のような）、ワクチン開発における目的のコーディング配列（哺乳動物において免疫応答を導き出すのに適するタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドを発現するポリヌクレオチドのような）および／または選択可能若しくは検出可能なマーカーを含みうる。
【００３８】
「ＡＡＶ」はアデノ随伴ウイルスであり、そして天然に存在する野生型ウイルスそれ自体若しくはその誘導体を指すのに使用しうる。該用語は、別の方法で必要とされる場合を除き、全部のサブタイプ、血清型およびシュードタイプならびに天然に存在するおよび組換えの双方の形態を包括する。本明細書で使用されるところの「血清型」という用語は、定義される抗血清とのキャプシドタンパク質の反応性により同定されかつそれに基づき他のＡＡＶと識別されるＡＡＶを指し、例えば霊長類ＡＡＶの８種の血清型ＡＡＶ−１ないしＡＡＶ−８が存在する。例えば、血清型ＡＡＶ２は、ＡＡＶ２のｃａｐ遺伝子からコードされるキャプシドタンパク質ならびに同一のＡＡＶ２血清型からの５’および３’ＩＴＲ配列を含有するゲノムを含有するＡＡＶを指すのに使用される。本明細書で具体的に説明される各例について、ベクターの設計および製造の記述は、キャプシドおよび５’−３’ＩＴＲ配列の血清型を記述する。「ｒＡＡＶ」という略語は、組換えＡＡＶベクター（若しくは「ｒＡＡＶベクター」）ともまた称される組換えアデノ随伴ウイルスを指す。
【００３９】
ＢｏＶはボカウイルスであり、そして天然に存在する野生型ウイルスそれ自体若しくはその誘導体を指すのに使用しうる。該用語は、別の方法で必要とされる場合を除き、全部のサブタイプ、血清型およびシュードタイプならびに天然に存在するおよび組換えの双方の形態を包括する。本明細書で使用されるところの「血清型」という用語は、定義される抗血清とのキャプシドタンパク質の反応性により同定されかつそれに基づき他のＢｏＶと識別されるＢｏＶを指し、例えばヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ）の４種の既知の血清型ＨＢｏＶ１、ＨＢｏＶ２、ＨＢｏＶ３およびＨＢｏＶ４が存在する。しかしながら、ブタＢｏＶのような他のヒト以外の哺乳動物由来の血清型がＢｏＶに包含される。ＡＡＶについてと同様、異なる血清型のＨＢｏＶおよびＢｏＶは異なる細胞型および器官を感染させる異なる向性を有し得る。
【００４０】
ｒＡＡＶ／ＨＢｏＶはＨＢｏＶキャプシドおよびｒＡＡＶゲノムから構成されるキメラベクターである。こうしたキメラウイルスにおいてはゲノム内にＨＢｏＶからの遺伝情報が存在しない。ｒＡＡＶゲノムはいずれの血清型のＡＡＶからでもありうる。
【００４１】
ｒＡＡＶ／ＢｏＶはヒト以外のＢｏＶキャプシドおよびｒＡＡＶゲノムから構成されるキメラベクターである。こうしたキメラウイルスにおいてはゲノム内にＢｏＶからの遺伝
情報が存在しない。ｒＡＡＶゲノムはいずれの血清型のＡＡＶからでもありうる。
【００４２】
本明細書で使用されるところの向性は、それらの遺伝情報を核に送達するために異なる表現型若しくは器官の細胞を生産的に感染させる特定のウイルス血清型の能力を指す用語である。
【００４３】
本明細書で使用されるところの「形質導入」若しくは「形質導入すること」は、細胞中のポリヌクレオチド例えばトランスジーンの発現につながる宿主細胞中への外因性ポリヌクレオチド例えばｒＡＡＶベクター中のトランスジーンの導入のための方法を指す用語である。該方法は、１）キメラウイルスのエンドサイトーシス、２）エンドソーム若しくは他の細胞内区画から細胞のサイトゾル中への逃避、３）ウイルス粒子若しくはウイルスゲノムの核へのトラフィッキング、４）ウイルス粒子の脱コート、および環状中間体を包含する発現可能な二本鎖ＡＡＶゲノムの形態の生成の１つ若しくはそれ以上を包含する。ｒＡＡＶの発現可能な二本鎖の形態は核エピソームとして持続しうるか、若しくは場合によっては宿主ゲノム中に組込みうる。それが細胞表面受容体に結合した後のキメラウイルスのエンドサイトーシス、エンドソーム若しくは他の細胞内区画から細胞のサイトゾルへの逃避、ウイルス粒子若しくはウイルスゲノムの核へのトラフィッキング、またはウイルス粒子の脱コート、および本発明の剤例えばプロテオソーム阻害剤による環状中間体を包含する発現性二本鎖ＡＡＶゲノムの形態の生成のいずれか若しくは組合せの変化は、変えられた発現レベル若しくは発現の持続、または核への変えられたトラフィッキング、または導入されるポリヌクレオチドを発現する宿主細胞若しくは細胞集団の変えられた種類若しくは相対数をもたらしうる。キメラウイルスを介して導入されるポリヌクレオチドの変えられた発現若しくは持続性は、限定されるものでないが、例えばＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーおよびウエスタンブロットによるタンパク質発現、ハイブリダイゼーションアッセイ例えばノーザンブロット、サザンブロットおよびゲルシフト移動度アッセイによるならびにＤＮＡおよびＲＮＡ産生の測定を挙げることができる当該技術分野で公知の方法により測定し得る。本発明の剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏで、導入されたポリヌクレオチド例えばｒＡＡＶベクター中のトランスジーンの発現を変えるように、ウイルスのエンドサイトーシス、エンドソーム若しくは他の細胞内サイトゾル区画からの逃避、および核中若しくは核へのトラフィッキング、核でのウイルス粒子の脱コート、ならびに／または核中の二本鎖の発現可能な形態のｒＡＡＶゲノムのコンカタマー化（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）若しくは生成を増大させることを変え、高め、若しくは増大させうる。外因性ポリヌクレオチドの導入に使用される方法は、トランスフェクション、リポフェクション、ウイルス感染、形質転換および電気穿孔法のような公知の技術、ならびにウイルス以外の遺伝子送達技術を包含する。導入されるポリヌクレオチドは宿主細胞中で安定に若しくは一過性に維持されうる。
【００４４】
「増大された形質導入若しくは形質導入頻度」、「変えられた形質導入若しくは形質導入頻度」、または「高められた形質導入若しくは形質導入頻度」は、処理されない細胞に関して処理された細胞中の上述された活性の１種若しくはそれ以上の増大を指す。形質導入効率を増大させる本発明の剤は、トランスジーンの発現を測定すること、トランスジーンの機能を測定すること、若しくは該剤で処理されない宿主細胞と比較して同一のトランスジーンの影響を生じさせるのに必要な粒子の数を決定することを包含しうる１種若しくはそれ以上の形質導入活性に対する影響を測定することにより決定しうる。
【００４５】
「プロテアソーム調節物質」は、プロテアソームと相互作用すること、それに結合すること、あるいはその機能および／またはトラフィッキング若しくは場所を変えることによりキメラウイルス形質導入若しくは形質導入頻度を包含するｒＡＡＶを変える若しくは高める剤若しくは剤の分類を指す。例えば抗生物質ドキソルビシンのようなプロテアソーム調節物質は、当該技術分野で記述されるところの他の細胞機能を有しうる。プロテアソー
ム調節物質は、例えばトリペプチジルアルデヒド（ＭＧ１３２すなわちＺ−ＬＬＬ若しくはＭＧ１０１すなわちＬＬｎＬ）、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ）、プロテアソームのカルパイン、カテプシン、システインプロテアーゼおよび／若しくはキモトリプシン様プロテアーゼ活性を阻害する剤のようなプロテアソーム阻害剤を包含する（Ｗａｇｎｅｒら、２００２；Ｙｏｕｎｇら、２０００；Ｓｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒら、２００１）。
【００４６】
「遺伝子送達」は遺伝子導入のための外因性ポリヌクレオチドの細胞中への導入を指し、そしてターゲッティング、結合、取り込み、輸送、局在化、レプリコン組込みおよび発現を包含しうる。
【００４７】
「遺伝子導入」は、ターゲッティング、結合、取り込み、輸送、局在化およびレプリコン組込みを包含しうる細胞中への外因性ポリヌクレオチドの導入を指すが、しかし遺伝子のその後の発現と異なりかつそれを意味しない。
【００４８】
「遺伝子発現」若しくは「発現」は遺伝子の転写、翻訳および翻訳後修飾の過程を指す。
【００４９】
「検出可能なマーカー遺伝子」は、該遺伝子を担持する細胞が特異的に検出される（例えば該マーカー遺伝子を担持しない細胞と識別される）ことを可能にする遺伝子である。多様なこうしたマーカー遺伝子が当該技術分野で既知である。
【００５０】
「選択可能なマーカー遺伝子」は、該遺伝子を担持する細胞が対応する選択剤の存在下でそれについて若しくはそれに対して特異的に選択されることを可能にする遺伝子である。具体的説明として、抗生物質耐性遺伝子を、宿主細胞が対応する抗生物質の存在下でそれについて陽性に選択されることを可能にする陽性選択可能なマーカー遺伝子として使用し得る。多様な陽性および陰性選択可能なマーカーが当該技術分野で既知であり、それらのいくつかを下述する。
【００５１】
本明細書で使用されるところの「ｒＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ起源のものでないポリヌクレオチド配列（すなわちＡＡＶに異種のポリヌクレオチド）、典型的には細胞の遺伝情報の目的の配列を含んでなるＡＡＶベクターを指す。本発明の好ましいベクター構築物において、異種ポリヌクレオチドは１若しくは２個のＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）により隣接されている。ｒＡＡＶベクターという用語はｒＡＡＶベクター粒子およびｒＡＡＶベクタープラスミド双方を包含する。
【００５２】
「キメラウイルス」若しくは「キメラウイルス粒子」は、異なるウイルスからである最低１種のキャプシドタンパク質およびキャプシドで包まれたポリヌクレオチドから構成されるウイルス粒子を指す。
【００５３】
ＡＡＶのための「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ（例えば野生型ＡＡＶ）が哺乳動物細胞により複製かつパッケージングされることを可能にするウイルスを指す。アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびワクシニアのようなポックスウイルスを包含するＡＡＶのための多様なこうしたヘルパーウイルスが当該技術分野で既知である。アデノウイルスは多数の異なるサブグループを包含するとは言え、サブグループＣのアデノウイルス５型が最も普遍的に使用される。ヒト、ヒト以外の哺乳動物およびトリ起源の多数のアデノウイルスが既知でありかつＡＴＣＣのような寄託所から入手可能である。
【００５４】
「感染性」ウイルス若しくはウイルス粒子は、それが該ウイルス種が向性である細胞中に送達することが可能であるポリヌクレオチド成分を含んでなるものである。該用語は必ずしも該ウイルスの何らかの複製能力を意味しない。
【００５５】
「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドまたはそれらのアナログを包含するいずれかの長さのポリマーの形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドはメチル化若しくはキャッピングされたヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログのような修飾ヌクレオチドを含むことができ、そしてヌクレオチド以外の成分により中断されていることができる。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾はポリマーの集成の前若しくは後に付与されうる。本明細書で使用されるところのポリヌクレオチドという用語は二本および一本鎖分子を互換性に指す。別の方法で指定され若しくは必要とされない限り、ポリヌクレオチドである本明細書に記述される本発明のいかなる態様も、二本鎖の形態および二本鎖の形態を構成することが既知の若しくは予測される２本の相補的一本鎖の形態のそれぞれの双方を包含する。
【００５６】
本明細書で使用されるところの「転写制御配列」若しくは「ＴＲＳ」は、それが作動可能に連結されている遺伝子若しくはコーディング配列の転写を制御するゲノム領域を指す。本発明で有用な転写制御配列は、一般に最低１個の転写プロモーターを包含し、そして１個若しくはそれ以上のエンハンサーおよび／若しくは転写ターミネーターもまた包含しうる。
【００５７】
「作動可能に連結されている」は、そのように記述される成分が協調された様式でそれらが機能することを可能にする関係にある２個若しくはそれ以上の成分の配置を指す。具体的説明として、転写制御配列若しくはプロモーターは、ＴＲＳ若しくはプロモーターがコーディング配列の転写を促進する場合にコーディング配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されているＴＲＳは一般にコーディング配列とシスで結合されているが、しかしそれは必ずしもそれに直接隣接しない。
【００５８】
「異種の」は、それが比較される実体の残りのものと遺伝子型が異なる実体に由来することを意味している。例えば、異なる細胞型に遺伝子工学技術により導入されたポリヌクレオチドは異種ポリヌクレオチドである（および発現される場合は異種ポリペプチドをコードし得る）。同様に、その本来のコーディング配列から取り出されかつ異なるコーディング配列に作動可能に連結されているＴＲＳ若しくはプロモーターは、異種ＴＲＳ若しくはプロモーターである。
【００５９】
本明細書で使用されるところの「パッケージング」は、ウイルスベクターの集成およびキャプシド形成をもたらす一連の細胞内事象を指す。従って、適するベクターが適切な条件下でパッケージング細胞株中に導入される場合、それはウイルス粒子中に集成され得る。ウイルスベクターのパッケージングと関連する機能が本明細書および当該技術分で記述されている。
【００６０】
「ターミネーター」は、リードスルー転写を弱める若しくは予防する傾向があるポリヌクレオチド配列を指す（すなわち、それはターミネーターの一側で発する転写を弱めるか若しくはそれがターミネーターの他側にまで継続することを予防する）。転写が破壊される程度は典型的に、塩基配列および／若しくはターミネーター配列の長さの関数である。とりわけ、多数の分子生物学的系で公知であるとおり、一般に「転写終止配列」と称される特定のＤＮＡ配列は、おそらくＲＮＡポリメラーゼ分子が停止するおよび／若しくは転写されているＤＮＡから遊離することを引き起こすことにより、ＲＮＡポリメラーゼによるリードスルー転写を破壊する傾向がある特別の配列である。こうした配列特異的ターミネーターの典型的な例はポリアデニル化（「ポリＡ」）配列例えばＳＶ４０  ポリＡを包含する。こうした配列特異的ターミネーターに加え若しくはその代わりに、プロモーターとコーディング領域の間の比較的長いＤＮＡ配列の挿入もまた、一般に介在配列の長さに比例してコーディング領域の転写を破壊する傾向がある。この影響はおそらく、ＲＮＡポ
リメラーゼ分子が転写されているＤＮＡから遊離されたようになる若干の傾向が常に存在し、かつ、コーディング領域に達する前に横断されるべき配列の長さを増大させることが、コーディング領域の転写が完了する若しくはおそらく開始される前でさえ遊離が起こるであろう見込みを一般に増大させるであろうために生じる。ターミネーターは、従って、一方向のみ（「一方向」ターミネーター）若しくは双方の方向（「双方向」ターミネーター）からの転写を予防することができ、そして配列特異的終止配列若しくは配列非特異的ターミネーターまたは双方から構成されうる。多様なこうしたターミネーター配列が当該技術分野で既知であり；そして本発明の状況内のこうした配列の具体的に説明する使用を下に提供する。
【００６１】
「宿主細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、「パッケージング細胞株」および他のこうした用語は、本発明で有用な高等真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞、こうしたヒト細胞を示す。これら細胞は組換えベクター、ウイルス若しくは他の導入ポリヌクレオチドのためのレシピエントとして使用し得、そして形質導入された元の細胞の子孫を包含する。単一細胞の子孫は元の親細胞に必ずしも完全に同一（形態若しくは遺伝子補完（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）において）でなくてもよいことが理解される。
【００６２】
「治療的遺伝子」、「予防的遺伝子」、「標的ポリヌクレオチド」、「トランスジーン」、「目的遺伝子」などは、全般として、ベクターを使用して導入されるべき遺伝子（１種若しくは複数）を指す。典型的に、本発明の状況において、こうした遺伝子はｒＡＡＶベクター（このベクターは末端逆位配列（ＩＴＲ）領域により隣接されそして従って複製されかつｒＡＡＶ粒子中にキャプシドで包まれ得る）内に配置される。標的ポリヌクレオチドは、本発明において、多数の異なる応用のためのｒＡＡＶベクターを生成するのに使用し得る。こうしたポリヌクレオチドは、限定されるものでないが（ｉ）欠けている、欠陥のある若しくは最適以下のレベルの構造タンパク質若しくは酵素により引き起こされる欠損症を軽減するための他の形態の遺伝子治療で有用なタンパク質をコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）アンチセンス分子に転写されるポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）転写若しくは翻訳因子を結合するデコイに転写されるポリヌクレオチド；（ｉｖ）サイトカインのような細胞性調節物質をコードするポリヌクレオチド；（ｖ）ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子のような、レシピエント細胞を特定の薬物に感受性にすることができるポリヌクレオチド；および（ｖｉ）多様な癌の処置のためのＥ１Ａ癌抑制遺伝子若しくはｐ５３癌抑制遺伝子のような癌治療のためのポリヌクレオチドを挙げることができる。レシピエント宿主細胞中でのトランスジーンの発現を遂げるため、それはそれ自身の若しくは異種プロモーターいずれかのプロモーターに作動可能に連結されている。多数の適するプロモーターが当該技術分野で既知であり、その選択は、標的ポリヌクレオチドの発現の所望のレベル；構成的発現、誘導可能な発現、細胞特異的若しくは組織特異的発現を欲するかどうか、などに依存する。ｒＡＡＶベクターは選択可能なマーカーもまた含有しうる。
【００６３】
「遺伝子」は、転写および翻訳された後に特定のタンパク質をコードすることが可能である最低１個のオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを指す。
【００６４】
ポリヌクレオチドに適用されるところの「組換えの」は、該ポリヌクレオチドが、クローニング、制限および／若しくは連結段階、ならびに天然に見出されるポリヌクレオチドと異なる構築物をもたらす他の処置の多様な組合せの産物であることを意味している。組換えウイルスは組換えポリヌクレオチドを含んでなるウイルス粒子である。該用語はそれぞれ、元のポリヌクレオチド構築物の複製物および元のウイルス構築物の子孫を包含する。
【００６５】
「調節エレメント」若しくは「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、
スプライシング、翻訳若しくは分解を包含するポリヌクレオチドの機能調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。調節は過程の頻度、速度若しくは特異性に影響することがあり、また、性質が高める若しくは阻害性でありうる。当該技術分野で既知の調節エレメントは、例えばプロモーターおよびエンハンサーのような転写制御配列を包含する。プロモーターは、ある種の条件下で、ＲＮＡポリメラーゼを結合しかつ通常は該プロモーターから下流（３’の方向に）に配置されるコーディング領域の転写を開始することが可能なＤＮＡ領域である。プロモーターはＡＡＶプロモーター例えばＰ５、Ｐ１９、Ｐ４０およびＡＡＶ  ＩＴＲプロモーターならびに異種プロモーターを包含する。
【００６６】
「発現ベクター」は目的のポリペプチドをコードする領域を含んでなるベクターであり、そして意図している標的細胞中のタンパク質の発現を遂げるのに使用される。発現ベクターは、標的中のタンパク質の発現を助長するためコーディング領域に機能的に連結されている調節エレメントもまた含んでなる。調節エレメントおよびそれらが発現のため作動可能に連結されている遺伝子（１種若しくは複数）の組合せは、ときに「発現カセット」と称され、その多数は当該技術分野で既知かつ入手可能であるか、若しくは当該技術分野で入手可能である成分から容易に構築し得る。
【００６７】
「遺伝子変化」は、遺伝要素が有糸分裂若しくは減数分裂による以外で細胞中に導入される過程を指す。該要素は細胞にとって異種でありうるか、またはそれは該細胞に既に存在している要素の付加的なコピー若しくは改良されたバージョンでありうる。遺伝子変化は例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、若しくはポリヌクレオチド−リポソーム複合体と接触させることのような当該技術分野で既知のいずれかの方法により組換えプラスミド若しくは他のポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることにより遂げることができる。遺伝子変化は、例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡウイルスまたはウイルスベクターでの形質導入若しくは感染によってもまた遂げることができる。遺伝要素は細胞中の染色体若しくはミニ染色体中に導入しうるが；しかし、細胞およびその子孫の表現型および／若しくは遺伝子型を変えるいかなる変化もこの用語に包含される。
【００６８】
細胞は、遺伝子配列がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の長期培養中にその機能を実施するために利用可能である場合に、該遺伝子配列で「安定に」変えられている、形質導入されている若しくは形質転換されていると言われる。いくつかの例において、こうした細胞は、変えられた細胞の子孫によってもまた遺伝可能である遺伝子変化が導入されていることにおいて「遺伝性に」変えられている。
【００６９】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、いずれかの長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で互換性に使用される。該用語は、修飾されている（例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、脂質付加若しくは標識成分との複合）アミノ酸ポリマーもまた包含する。「ＣＦＴＲ」などのようなポリペプチドは、遺伝子治療およびそのための組成物の状況で論考される場合に、それぞれの無傷のポリペプチド、または無傷のタンパク質の所望の生化学的機能を保持するそのいずれかのフラグメント若しくは遺伝子改変された誘導体を指す。同様に、ＣＦＴＲおよび遺伝子治療での使用のための他のこうした遺伝子（典型的にレシピエント細胞に送達されるべき「トランスジーン」と称される）への言及は、無傷のポリペプチドまたは所望の生化学的機能を所有するいずれかのフラグメント若しくは遺伝子改変された誘導体をコードするポリヌクレオチドを包含する。
【００７０】
「単離された」プラスミド、ウイルス若しくは他の物質は、該物質若しくは類似の物質が天然に存在する若しくは最初にそれから製造される場合にまた存在しうる他成分の少なくともいくつかを欠く物質の調製物を指す。従って、例えば、単離された物質は供給源混
合物からそれを濃縮するための精製技術を使用することにより製造しうる。濃縮は、溶液の容量あたり重量のような絶対基準で測定し得るか、若しくはそれは供給源混合物中に存在する第二の潜在的に妨害する物質に関して測定し得る。
【００７１】
ＡＡＶの調製物は、感染性ヘルパーウイルス粒子に対する感染性ＡＡＶ粒子の比が最低約１０2：１；例えば最低約１０6：１若しくは最低約１０8：１を包含する最低約１０4：１である場合に、ヘルパーウイルスを「実質的に含まない」と言われる。調製物は、同等な量のヘルパーウイルスタンパク質（すなわち、上で示されたヘルパーウイルス粒子不純物が破壊された形態で存在した場合のヘルパーウイルスのこうしたレベルの結果として存在するであろうようなタンパク質）を含まないこともまたできる。ウイルスおよび／若しくは細胞性タンパク質汚染は、一般に、ＳＤＳゲル上のクマシー染色バンドの存在（例えばＡＡＶキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３に対応するもの以外のバンドの出現）として観察され得る。
【００７２】
ウイルスの産生、複製若しくはパッケージングを記述することにおいて使用される場合の「効率」は、該方法の有用な特性、すなわち、具体的には、増殖速度および細胞あたりで産生されるウイルス粒子の数を指す。「高効率」産生は、指定される培養期間の経過にわたり細胞あたり最低１００ウイルス粒子；例えば細胞あたり最低約１０，０００若しくは最低約１００，０００粒子の産生を示す。
【００７３】
本発明により処置される「個体」若しくは「被験体」は、脊椎動物、具体的には哺乳動物種のメンバーを指し、そして限定されるものでないが家畜、スポーツ動物（ｓｐｏｒｔｓ  ａｎｉｍａｌ）およびヒトを包含する霊長類を挙げることができる。
【００７４】
個体若しくは細胞の「処置」は、処置が開始される時点での該個体若しくは細胞の自然経過を変えるための試みにおけるいずれかの種類の介入、例えば個体における予防的、治療的若しくは他の有益な効果を導き出すことである。例えば、個体の処置は、（限定されるものでないが）遺伝性若しくは誘発された遺伝子欠損症、ウイルス、細菌若しくは寄生生物体による感染症、腫瘍性若しくは無形成性の状態、または自己免疫若しくは免疫抑制のような免疫系機能不全を挙げることができるいずれかの病理学的状態により引き起こされる病態を減少若しくは制限するために開始しうる。処置は、（限定されるものでないが）製薬学的組成物のような組成物の投与および組成物で処理された適合性細胞の投与を挙げることができる。処置は予防的若しくは治療的のいずれでも；すなわち、病理学的事象の開始若しくは病原体との接触の前若しくは後いずれでも実施しうる。
【００７５】
本発明の実務は、別の方法で示されない限り、当該技術分野の熟練内にある分子生物学、ウイルス学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の慣習的技術を使用することができる。こうした技術は文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９；Ｇａｉｔ、１９８４；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、１９８７；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｍｉｌｌｅｒら、１９８７；Ｗｅｉｒら、１９９６；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９８；Ｃｏｌｉｇａｎら、１９９１；Ｃｏｌｉｇａｎら、１９９５；およびＳｃｏｐｅｓ  １９９４を参照されたい。
【００７６】
Ｉ．キメラウイルス
ヒト気道上皮細胞は、臨床試験で最も広範に使用されている遺伝子治療ベクター、アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を包含される大部分のウイルスベクターによる感染に高度に耐性である。乳幼児および若年小児における喘鳴を伴う急性気道感染症（ＡＲＴＩ）の病原体でありそうである（Ａｌｌａｎｄｅｒら、２００７；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、２０１０；Ｄｅｎｇら、２０１２；Ｄｏｎら、２０１０）自律性ヒトパルボウイルス、ヒト
ボカウイルス１（ＨＢｏＶ１）は、頂端膜からＨＥＡを効率的に感染させ、子孫ウイルスの複製および細胞病理をもたらす（Ｈｕａｎｇら、２０１２ａ）。印象的には、細胞あたり１０-3ＤＮアーゼ耐性粒子（ＤＲＰ）というきわめて低い感染多重度（ＭＯＩ）でのＨＡＥのＨＢｏＶ１感染が増殖性感染をもたらす（実施例２を参照されたい）。最近、完全長の５５４３ｎｔのＨＢｏＶ１の完全なゲノム（双方の端の末端パリンドローム配列を包含する）がクローン化され、そしてＨＢｏＶ１産生のための細胞培養物系が確立された（実施例１）。ＨＡＥの頂端膜側からのＨＢｏＶ１感染の高い効率を考え、ＨＢｏＶ１はヒト気道遺伝子治療のための組換えベクターを操作するのに適することが仮定された。
【００７７】
ＨＢｏＶ１はＡＡＶおよび他のパルボウイルス科メンバーの近縁種である。ＨＢｏＶ１はボカウイルス属に属する一方、ＡＡＶはデペンドウイルス属にある（Ｔｉｊｓｓｅｎら、２０１１）。ＨＢｏＶ１およびＡＡＶは双方とも小型一の本鎖ＤＮＡウイルスであるが、しかしキャプシドに包まれたＨＢｏＶ１ゲノムの９０％が−鎖のものである一方、ＡＡＶについては等しい比の＋および−鎖がキャプシドに包まれている（Ｓｃｈｉｌｄｇｅｎら、２０１２）。これら２種のウイルスはそれらの溶解期の生活環が大きく異なり；ＡＡＶはヘルパーウイルスとの共感染を必要とする一方、ＨＢｏＶ１は許容細胞中で子孫を自律的に複製する（Ｈｕａｎｇら、２０１２ａ；Ｄｉｊｋｍａｎら、２００９）。ＨＢｏＶ１ゲノムのサイズは５５４３ｎｔであり、ＡＡＶ２のもの（４６７９ｎｔ）より１８．５％（８６３ｎｔ）大きく、そしてその構造的特徴は、複製およびキャプシド形成に関与する５’（１４０ｎｔ）および３’（２００ｎｔ）末端の独特のパリンドローム配列を伴う非対称ヘアピン、ならびにすべてのウイルス構造および非構造タンパク質を転写する単一のＰ５プロモーターを包含する（Ｈｕａｎｇら、２０１２；Ｃｈｅｎら、２０１０）。これはＡＡＶゲノムに見出される末端逆位配列および複数の内部プロモーターと対照的である。ＨＢｏＶ１ゲノムは３個の主要なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする。それらの２個はウイルス複製に不可欠である非構造タンパク質ＮＳ１／ＮＳ２およびＮＰ１をコードする。第三のＯＲＦは２種の構造キャプシドタンパク質ＶＰ１およびＶＰ２をコードする。対照的に、ＡＡＶ  ｃａｐ  ＯＲＦは３種のキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする（Ｓｃｈｉｄｇｅｎら、２０１２）。ＨＢｏＶ１キャプシド表面の形態は他のパルボウイルスと共通の特徴を所有し（正二十面体キャプシド）、そしてヒトパルボウイルスＢ１９に最も緊密に類似している（Ｇｕｒｄａら、２０１０）。クローン化されたＡＡＶゲノム同様、ＨＢｏＶ１プロウイルスゲノムをコードするプラスミドは感染性であり、そしてヘルパーウイルス共感染に対する必要性を伴わずにＨＥＫ２９３細胞中へのトランスフェクションにより感染性粒子を製造するのに使用し得る（実施例１）。
【００７８】
パルボウイルス科間の属を超える（ｃｒｏｓｓ−ｇｅｎｅｒａ）シュードパッケージングは、ｒＡＡＶゲノムがヒトパルボウイルスＢ１９中キャプシドに包まれた場合に最初に確立された（Ｐｏｎｎａｚｈａｇａｎら、１９９８）。この結果として生じる属を超えるキメラは、ｒＡＡＶ感染に耐性であるヒト骨髄細胞中にｒＡＡＶゲノムを送達することが可能であった（Ｐｏｎｎａｚｈａｇａｎら、１９９８）。従って、ｒＡＡＶゲノムをＨＢｏＶ１キャプシド中にシュードタイピングすることは、ＣＦおよび他の肺疾患の遺伝子治療のための独特の特性をもつ新規キメラベクターを創成しうることが仮定された。
【００７９】
ｒＨＢｏＶ１ベクターおよびキメラｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターの製造を本明細書に下述する。第一のウイルスは慣習的組換えベクター（ｒＨＢｏＶ１ベクター）であった。外来遺伝子を担持するオープンリーディングフレームが破壊若しくはすっかり破壊されたＨＢｏＶゲノムを、ＨＢｏＶ１キャプシドの内側にパッケージングする。ｒＨＢｏＶ１ベクターを、ｒＨＢｏＶ１プロウイルスプラスミドおよびＨＢｏＶ１ヘルパープラスミドのコトランスフェクションからのトランス補完によりＨＥＫ２９３細胞中で産生する。ｒＨＢｏＶ１プロウイルスプラスミドは、（外来遺伝子のオープンリーディングフレームに
作動可能に連結されている異種プロモーター例えば強いプロモーターを収容し得る長さ約５．２ｋｂ若しくはそれ以上の）外来遺伝子、ならびに複製およびパッケージのための全部のシスエレメントを内部に持ち、該ヘルパープラスミドはＨＢｏＶウイルスタンパク質のための発現カセットのみをコードする。ＨＢｏＶ１ウイルスの１つの重要な特徴は、依存性パルボウイルスでありかつ複製のためにヘルパーウイルス共感染を必要とするｒＡＡＶと対照的に、そのゲノムが許容細胞中で自律的に複製することである。
【００８０】
ｒＨＢｏＶ１ベクター製造のためのトランス補完における成功を伴い、いわゆる複製ｒＨＢｏＶ１ベクターを、ＨＢｏＶ１  ｒｅｐ遺伝子のコーディング配列を保持することしかし構造遺伝子をトランスジーンにより置換することにより開発した。この種類のベクターは、ＣＦ、ＡＡＴ欠損症、ＣＯＰＤ若しくは肺癌のような治療のために気道細胞中の高レベルの治療的遺伝子発現を送達し得る。こうした複製するＨＢｏＶ１ベクターはＷＴ  ＨＢｏＶ１感染に対するワクチンとして高い利用性を有し得る。
【００８１】
開発された別のベクターは、ｒＡＡＶゲノムをＨＢｏＶ１キャプシド粒子中にパッケージングするＡＡＶ２−ＨＢｏＶ１キメラウイルスであった。該ベクターもまたｒＡＡＶベクターについて類似の手順でＨＥＫ２９３細胞中で製造されたが、しかしキャプシド遺伝子はＨＢｏＶ１キャプシドにより置換されている。このＡＡＶ／ＨＢｏＶ１ベクターは、ＡＡＶおよびＨＢｏＶ１双方の形質導入生物学の利点を、ｒＨＢｏＶ１ベクターより少ない安全性の懸念（ｒＡＡＶベクターのゲノムが多くの前臨床研究および臨床試験で広範囲に研究されているため）しかしｒＡＡＶより高い気道細胞向性と組み合わせる。より重要なことに、大きなＨＢｏＶ１パッケージ容量は、約５．５ｋｂ若しくは約６．０ｋｂまでの過大のｒＡＡＶゲノムをキャプシドで包むことを可能にする。ｒＡＡＶより２０％より大きい容量は効果的遺伝子発現のための強い発現カセットを収容するのに十分である。ｒＡＡＶゲノムは、安定な環状形質導入中間体および二本鎖ゲノムコンカテマーによる持続的遺伝子発現の利点を提供する。事実、ＡＡＶ／ＨＢｏＶ１ベクターはｒＨＢｏＶ１ベクターより持続的なトランスジーン発現を特徴とした。さらに、ＨＥＫ２９３細胞中のｒＡＡＶゲノムのレスキューおよび複製は非常に効率的であり、その結果、ＡＡＶ／ＨＢｏＶ１ベクターの産生収量もまたｒＨＢｏＶ１ベクターより良好であった。
【００８２】
ＨＢｏＶ１のより大きいパッケージング容量を利用して、ヒトＣＭＶ即時遺伝子エンハンサー（ｈｕｍａｎ  ＣＭＶ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）およびニワトリβ−アクチンプロモーター（ＣＢＡプロモーター）を包含した強いキメラプロモーターを有する５．２ｋｂのＣＦＴＲ発現カセットとともに５．５ｋｂの過大のｒＡＡＶゲノムを内部に持つ、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１−ＣＦＴＲベクターを製造した。そのベクターは頂端感染後にＣＦ  ＨＡＥ中のＣＦＴＲに媒介される塩素イオン電流の約３０％の復帰を示した。従って、該ベクターは気道上皮細胞の表面上の正常なＣＦＴＲタンパク質発現を効率的に送達し得かつＣＦ  ＨＡＥ中の欠陥のあるＣＦＴＲ特異的塩素イオン輸送を修正し得る。加えて、該ＨＢｏＶ１ゲノムは、長さ約２．７ｋｂないし約２．８ｋｂの自己相補型二本鎖の形態のｒＡＡＶゲノムをキャプシドで包むことができ、このベクターはゲノム転換を迂回し得かつ高められた若しくはより迅速なトランスジーン発現を可能にし得る。該ＡＡＶ／ＨＢｏＶキメラベクターは、α−アンチトリプシン欠損症、喘息および肺癌のような他の肺疾患の他の治療薬、ならびに乳幼児における野生型ＨＢｏＶ感染に対するワクチン接種にもまた拡大し得る。
【００８３】
本発明のウイルスのキャプシドおよび／若しくはゲノムは例えば定向進化の結果としてキメラでありうる（例えばＬｉら、２００９を参照されたい）。
【００８４】
ＩＩ．ｒＡＡＶベクター
予防的若しくは治療的遺伝子産物は別にして、組換えＡＡＶベクターおよび／若しくは
ウイルスは、例えば、それと二重鎖を形成することにより正常なｍＲＮＡの翻訳を阻害するのに使用し得るアンチセンスｍＲＮＡ（ｍＲＮＡの相補物）をコードするポリヌクレオチドおよびリボザイム（ＲＮＡ触媒）をコードするポリヌクレオチドを包含する、タンパク質をコードしないポリヌクレオチドもまた含み得る。加えて、適切に配置されたスプライスアクセプター部位および／若しくはスプライスドナー部位により隣接されている、または異種エンハンサー、異種プロモーター若しくは異種エンハンサーおよびプロモーターのような転写制御配列を有するオープンリーディングフレームの部分を有するｒＡＡＶベクターの選択された対を使用しうる。例えば米国特許第６，４３６，３９２号明細書（その開示は本明細書に引用することにより組み込まれる）を参照されたい。例えば、第一のＡＡＶベクターは、ＡＡＶの５’末端逆位配列を含んでなる第一のＤＮＡセグメント；遺伝子の１エクソンおよびスプライスドナー部位を含んでなるＤＮＡフラグメントに作動可能に連結されているプロモーターを含んでなる第二のＤＮＡセグメントであって、該第二のＤＮＡセグメントは完全長ポリペプチドをコードせず；およびＡＡＶの３’末端逆位配列を含んでなる第三のＤＮＡセグメントを包含することができ；ならびに、第二のＡＡＶベクターは、連結された：ＡＡＶの５’末端逆位配列を含んでなる第一のＤＮＡセグメント；スプライスアクセプター部位、および第一のＡＡＶベクターのＤＮＡセグメントと一緒になって完全長ポリペプチドをコードする最低１個の他のエクソンを含むＤＮＡフラグメントを含んでなる第二のＤＮＡセグメント；ならびにＡＡＶの３’末端逆位配列を含んでなる第三のＤＮＡセグメントを含んでなる。一例において、第一のＡＡＶベクターは、以下、すなわちＡＡＶの５’末端逆位配列を含んでなる第一の核酸セグメント；転写制御領域を包含する遺伝子の一部分を含んでなる第二の核酸セグメント；スプライスドナー部位を含んでなる第三の核酸セグメント；およびＡＡＶの３’末端逆位配列を含んでなる第四の核酸セグメントを包含し；ならびに、第二のＡＡＶベクターは、連結された：ＡＡＶの５’末端逆位配列を含んでなる第一の核酸セグメント；スプライスアクセプター部位を含んでなる第二の核酸セグメント；第一のＡＡＶベクターの核酸セグメントと一緒になって機能的ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含んでなる遺伝子を含んでなる遺伝子の一部分を含んでなる第三の核酸セグメント；およびＡＡＶの３’末端逆位配列を含んでなる第四の核酸セグメントを含んでなる。さらなる一例において、第一のＡＡＶベクターは、以下、すなわちＡＡＶの５’末端逆位配列を含んでなる第一の核酸セグメント；スプライスアクセプター部位を含んでなる第二の核酸セグメント；遺伝子の一部分を含んでなる第三の核酸セグメント；およびＡＡＶの３’末端逆位配列を含んでなる第四の核酸セグメントを包含し；ならびに、第二の組成物は：ＡＡＶの５’末端逆位配列を含んでなる第一の核酸セグメント；該部分を有する上の核酸セグメントと一緒になって機能的ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含んでなる遺伝子を含んでなる遺伝子の一部分を含んでなる第二の核酸セグメントであって、該遺伝子の該部分は転写制御領域を包含し；スプライスドナー部位を含んでなる第三の核酸セグメント；ＡＡＶの３’末端逆位配列を含んでなる第四の核酸セグメントを含んでなる第二のＡＡＶベクターを含んでなり；このベクターは宿主細胞中で、第二のＡＡＶベクターからの配列に連結されている第一のＡＡＶベクターからの配列を含んでなるＲＮＡ転写物を生じ、この配列はスプライスドナー部位がスプライスアクセプター部位に対し５’であるように配置され、ならびにこの転写物は機能的タンパク質をコードするｍＲＮＡにスプライスされる。
【００８５】
いずれの血清型のアデノ随伴ウイルスも、多様な血清型が遺伝子レベルででさえ機能的かつ構造的に関係しているため、ｒＡＡＶを製造するのに適する（例えばＢｌａｃｋｌｏｗ、１９８８；およびＲｏｓｅ、１９７４を参照されたい）。全部のＡＡＶ血清型は明らかに相同ｒｅｐ遺伝子により媒介される類似の複製特性を表し；そして全部が一般に、ＡＡＶ２中で発現されるもののような３種の関連するキャプシドタンパク質を持つ。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の広範囲の交差ハイブリダイゼーションを示すヘテロ二重鎖分析；およびＩＴＲに対応する末端の類似の自己アニーリングセグメントの
存在によりさらに示唆される。類似の感染性パターンもまた、各血清型における複製機能が類似の調節制御下にあることを示唆する。多様なＡＡＶ血清型のなかでＡＡＶ２が最も普遍的に使用される。
【００８６】
本発明のＡＡＶベクターは、典型的に、ＡＡＶに対し異種であるポリヌクレオチドを含んでなる。該ポリヌクレオチドは、ある種の表現型の発現の上方若しくは下方制御のような遺伝子治療の状況で標的細胞にある機能を提供する能力のため典型的に興味深い。こうした異種ポリヌクレオチドすなわち「トランスジーン」は一般に、所望の機能若しくはコーディング配列を提供するのに十分な長さのものである。
【００８７】
異種ポリヌクレオチドの転写が意図している標的細胞中で望ましい場合、それは、当該技術分野で既知であるとおり、例えば標的細胞内の転写の所望のレベルおよび／若しくは特異性に依存して、それ自身若しくは異種のプロモーターに作動可能に連結し得る。多様な種類のプロモーターおよびエンハンサーがこの状況での使用に適する。構成的プロモーターは継続的レベルの遺伝子転写を提供し、そして治療的若しくは予防的ポリヌクレオチドが継続的に発現されることが望ましい場合に好ましいことができる。誘導可能なプロモーターは一般に誘導因子の非存在下で低い活性を表し、そして誘導因子の存在下で上方制御される。それらは、発現がある時間で若しくはある場所でのみ望ましい場合、または誘導剤を使用して発現のレベルを滴定することが望ましい場合に、好ましいことができる。プロモーターおよびエンハンサーは、組織特異的でもまたありうる。すなわち、それらは、おそらくそれらの細胞中で独特に見出される遺伝子調節エレメントにより、ある細胞型中でのみそれらの活性を表す。
【００８８】
プロモーターの具体的に説明する例は、ＳＶ４０からのＳＶ４０後期プロモーター、バキュロウイルスポリへドリンエンハンサー／プロモーターエレメント、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＫ  ｔｋ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からの前初期プロモーター、およびＬＴＲエレメントを包含する多様なレトロウイルスプロモーターである。誘導可能なプロモーターは、重金属イオンで誘導可能なプロモーター（マウス乳癌ウイルス（ｍＭＴＶ）プロモーター若しくは多様な成長ホルモンプロモーターのような）、およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの存在下で活性であるＴ７ファージからのプロモーターを包含する。具体的説明として、組織特異的プロモーターの例は、多様なサーファクチンプロモーター（肺中の発現のため）、ミオシンプロモーター（筋中の発現のため）およびアルブミンプロモーター（肝中の発現のため）を包含する。多様な他のプロモーターが当該技術分野で既知かつ一般に入手可能であり、そして多くのこうしたプロモーターの配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースのような配列データベースで入手可能である。
【００８９】
翻訳が、意図している標的細胞中でもまた望ましい場合、異種ポリヌクレオチドは、好ましくは、（リボソーム結合部位すなわち「ＲＢＳ」およびポリアデニル化シグナルのような）翻訳を助長する調節エレメントもまた含むことができる。従って、異種ポリヌクレオチドは一般に、適するプロモーターに機能的に連結されている最低１個のコーディング領域を含んでなり、そして、例えば機能的に連結されているエンハンサー、リボソーム結合部位およびポリＡシグナルもまた含みうる。異種ポリヌクレオチドは、１個のコーディング領域、または同一若しくは異なるプロモーターの制御下の１個以上のコーディング領域を含みうる。調節エレメントおよびコーディング領域の組合せを含有するユニット全体はしばしば発現カセットと称される。
【００９０】
異種ポリヌクレオチドは、ＡＡＶゲノムのコーディング領域中に若しくはその代わりに（すなわちＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の代わりに）組換え技術により組込まれるが、しかし一般にＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）領域によりいずれかの側で隣接されている。これは、ＩＴＲが、複製能力のあるＡＡＶゲノムを再生しうる組換えの見込みを低下
させるために、例えば（必ずしもでないとは言え）ＡＡＶ起源のいかなる介在配列も伴わずにいずれかの直接近位でコーディング配列から上流および下流双方に現れることを意味している。しかしながら、単一のＩＴＲが２個のＩＴＲを含んでなる配置と通常関連する機能を実行するのに十分であることができ（例えば第ＷＯ  ９４／１３７８８号明細書を参照されたい）、そして１個のみのＩＴＲをもつベクター構築物を、従って本発明のパッケージングおよび製造方法とともに使用し得る。
【００９１】
ｒｅｐの本来のプロモーターは自己制御性であり、そして産生されるＡＡＶ粒子の量を制限し得る。ｒｅｐ遺伝子はまた、ｒｅｐがベクター構築物の一部として提供されようが別個に提供されようが、異種プロモーターに作動可能に連結され得る。ｒｅｐ遺伝子発現により強く下方制御されないいかなる異種プロモーターも適するが；しかし、ｒｅｐ遺伝子の構成的発現が宿主細胞に対する負の影響を有し得るため、誘導可能なプロモーターが好ましいことができる。具体的説明として、重金属イオンで誘導可能なプロモーター（メタロチオネインプロモーターのような）；ステロイドホルモンで誘導可能なプロモーター（ＭＭＴＶプロモーター若しくは成長ホルモンプロモーターのような）；およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの存在下で活性であるＴ７ファージからのもののようなプロモーターを包含する、多様な誘導可能なプロモーターが当該技術分野で既知である。誘導可能なプロモーターの１下位分類は、ｒＡＡＶベクターの複製およびパッケージングを補完するのに使用されるヘルパーウイルスにより誘導されるものである。アデノウイルスＥ１Ａタンパク質により誘導可能であるアデノウイルス初期遺伝子プロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター；ＶＰ１６若しくは１ＣＰ４のようなヘルペスウイルスタンパク質により誘導可能であるヘルペスウイルスプロモーター；ならびにワクシニア若しくはポックスウイルスで誘導可能なプロモーターを包含する、多数のヘルパーウイルスで誘導可能なプロモーターもまた記述されている。
【００９２】
ヘルパーウイルスで誘導可能なプロモーターの同定および試験方法が記述されている（例えば第ＷＯ  ９６／１７９４７号明細書を参照されたい）。従って、候補プロモーターがヘルパーウイルスで誘導可能であるかどうか、およびそれらが高効率パッケージング細胞の生成で有用であることができるかどうかの決定方法が当該技術分野で既知である。簡潔には、１つのこうした方法は、推定のヘルパーウイルスで誘導可能なプロモーター（当該技術分野で既知、若しくはプロモーターなし「レポーター」遺伝子への連結のような公知の技術を使用して同定されるかのいずれか）でＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子のｐ５プロモーターを置換することを必要とする。例えば抗生物質耐性遺伝子のような陽性選択可能なマーカーに連結されているＡＡＶ  ｒｅｐ−ｃａｐ遺伝子（ｐ５が置換されている）は、その後、（下で例示されるＨｅＬａ若しくはＡ５４９細胞のような）適する宿主細胞中に安定に組込まれる。選択条件下で（例えば抗生物質の存在下で）比較的良好に増殖することが可能である細胞をその後、ヘルパーウイルスの添加に際してｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現するそれらの能力について試験する。ｒｅｐおよび／若しくはｃａｐ発現の初期試験として、細胞をＲｅｐおよび／若しくはＣａｐタンパク質を検出するための免疫蛍光を使用して容易にスクリーニングし得る。パッケージングの能力および効率の確認をその後、入ってくるｒＡＡＶベクターの複製およびパッケージングについての機能試験により確認し得る。この方法論を使用して、マウスメタロチオネイン遺伝子由来のヘルパーウイルスで誘導可能なプロモーターがｐ５プロモーターについての適する置換物と同定されており、そして（第ＷＯ  ９６／１７９４７号明細書に記述されるとおり）ｒＡＡＶ粒子の高力価を生じるために使用されている。
【００９３】
１種若しくはそれ以上のＡＡＶ遺伝子の除去は、複製能力のあるＡＡＶ（「ＲＣＡ」）を生成する見込みを低下させるためにいかなる場合でも望ましい。従って、ｒｅｐ、ｃａｐ若しくは双方のコーディング若しくはプロモーター配列を除去しうる。これら遺伝子により提供される機能をトランスに提供し得るためである。
【００９４】
結果として生じるベクターはこれらの機能が「欠損」であると称される。ベクターを複製およびパッケージングするために、欠けている機能を、多様な欠けているｒｅｐおよび／若しくはｃａｐ遺伝子産物の必要な機能を一緒になってコードするパッケージング遺伝子若しくは多数のそれで補完する。該パッケージング遺伝子若しくは遺伝子カセットは、一態様においてＡＡＶ  ＩＴＲにより隣接されず、また、一態様においてはｒＡＡＶゲノムといかなる実質的相同性も共有しない。従って、ベクター配列と別個に提供されるパッケージング遺伝子との間の複製中の相同的組換えを最低限にするために、該２種のポリヌクレオチド配列の重複を回避することが望ましい。相同性のレベルおよび組換えの対応する頻度は、相同的配列の増大する長さおよび共有される同一性のそれらのレベルとともに増大する。所定の系において懸念を提起することができる相同性のレベルは、当該技術分野で既知であるとおり理論的に決定しかつ実験的に確認し得る。しかしながら、典型的には、組換えは、重複配列が、それがその長さ全体にわたり最低８０％同一である場合は約２５ヌクレオチド配列未満である場合、若しくはそれがその長さ全体にわたり最低７０％同一である場合は約５０ヌクレオチド配列未満である場合に、実質的に低下若しくは排除され得る。もちろん、それらが組換えの見込みをさらに低下させることができるため、より低レベルの相同性さえ好ましい。いかなる重複する相同性も伴わずにさえ、ＲＣＡを生成する若干の残余の頻度が存在するようである。（例えば相同的組換えにより）ＲＣＡを生成する頻度のなおさらなる低下は、Ａｌｌｅｎら、第ＷＯ  ９８／２７２０４号明細書に記述されるとおり）、ＡＡＶの複製およびキャプシド形成機能を「分割すること」により得ることができる。
【００９５】
ｒＡＡＶベクター構築物および補完パッケージング遺伝子構築物は、多数の異なる形態で本発明で実行し得る。ウイルス粒子、プラスミド、および安定に形質転換された宿主細胞は全部、一過性に若しくは安定にのいずれかでこうした構築物をパッケージング細胞中に導入するのに使用し得る。
【００９６】
本発明のある態様において、ＡＡＶベクターおよび補完パッケージング遺伝子（１個若しくは複数）は、あれば、細菌プラスミド、ＡＡＶ粒子若しくはそのいずれかの組合せの形態で提供される。他の態様において、ＡＡＶベクター配列、パッケージング遺伝子（１個若しくは複数）または双方のいずれも、遺伝子的に変えられた（好ましくは遺伝性に変えられた）真核生物細胞の形態で提供される。ＡＡＶベクター配列、ＡＡＶパッケージング遺伝子若しくは双方を発現するよう遺伝性に変えられている宿主細胞の開発は、確実なレベルで発現される物質の確立された供給源を提供する。
【００９７】
多様な異なった遺伝子的に変えられた細胞を、従って本発明の状況で使用し得る。具体的説明として、安定に組込まれたｒＡＡＶベクターの最低１個の無傷のコピーを含む哺乳動物宿主細胞を使用しうる。プロモーターに作動可能に連結されている最低１個のＡＡＶ
ｒｅｐ遺伝子を含んでなるＡＡＶパッケージングプラスミドを、複製機能を供給するのに使用し得る（米国特許第５，６５８，７７６号明細書に記述されるとおり）。あるいは、プロモーターに作動可能に連結されているＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子を含む安定な哺乳動物細胞株を、複製機能を供給するのに使用し得る（例えば、Ｔｒｅｍｐｅら、第ＷＯ  ９５１３３９２号明細書）；Ｂｕｒｓｔｅｉｎら（第ＷＯ  ９８／２３０１８号明細書）；およびＪｏｈｎｓｏｎら（米国特許第５，６５６，７８５号明細書）を参照されたい。上述されたところのキャプシド形成タンパク質を提供するＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子と一緒に若しくは別個に提供し得る（例えば上で引用される明細書および特許、ならびにＡｌｌｅｎら（第ＷＯ  ９８／２７２０４号明細書）を参照されたい。他の組合せが可能でありかつ本発明の範囲内に包含される。
【００９８】
ＩＩＩ．キメラウイルス若しくはｒＢｏＶの用途
キメラウイルス若しくはｒＢｏＶは遺伝子治療若しくはワクチン接種の目的上個体への投与のため使用し得る。治療のための適する疾患は、限定されるものでないが、ウイルス、細菌若しくは寄生生物感染により誘発されるもの、多様な悪性病変および過剰増殖状態、自己免疫状態、ならびに先天性欠損症を挙げることができる。
【００９９】
遺伝子治療は、細胞内若しくはそれにより分泌されるかのいずれの特定のタンパク質の発現のレベルを高めるためにも実施し得る。本発明のベクターは、遺伝子マーキング、欠けている若しくは欠陥のある遺伝子の置換、または治療的遺伝子の挿入のいずれかのために細胞を遺伝的に変えるために使用しうる。あるいは、発現のレベルを低下させるポリヌクレオチドを細胞に提供しうる。これを、悪性病変の経過中に増幅若しくは過剰発現される遺伝子または微生物感染の経過中に導入若しくは過剰発現される遺伝子の産物のような、望ましくない表現型の抑制のため使用しうる。発現レベルは、例えば、標的遺伝子若しくはＲＮＡ転写物（アンチセンス療法）いずれかと安定なハイブリッドを形成することが可能な、関連するｍＲＮＡを切断するためのリボザイムとして作用することが可能な、または標的遺伝子の産物のためのデコイとして作用することが可能な配列を含んでなる治療的若しくは予防的ポリヌクレオチドを供給することにより低下させうる。
【０１００】
ワクチン接種は感染性病原体による感染から細胞を保護するために実施し得る。伝統的ワクチン法として、本発明のベクターは、ウイルス、細菌、腫瘍若しくは真菌抗原をコードするトランスジーンおよび宿主細胞中のそれらのその後の発現を送達するのに使用しうる。免疫系に対し露出して免疫応答を惹起する抗原は、ウイルス様粒子ワクチン若しくはウイルスをコードするタンパク質のサブユニットワクチンの形態にあり得る。あるいは、受動免疫化（ｐａｓｓｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｉｚａｔｉｏｎ）の方法として、本発明のベクターは、中和抗体をコードする遺伝子および宿主の造血以外の組織でのそれらのその後の発現を送達するのに使用しうる。病原体感染に対するワクチン様保護は、ベクターに媒介されるトランスジーン発現からの中和抗体の直接の提供により実施し得、所望の体液性免疫応答を開始するための自然免疫系への依存を迂回する。
【０１０１】
本発明の方法によるキメラ若しくはｒＢｏＶベクターの導入は、利用可能かつ当該技術分野で公知であるいずれかの数の送達技術（外科的および非外科的双方）の使用を必要としうる。こうした送達技術は例えば血管カテーテル挿入、カニューレ挿入（ｃａｎｎｕｌｉｚａｔｉｏｎ）、注入、吸入、気管内、皮下、塗布、局所、経口、経皮、動脈内、静脈内および／若しくは腹腔内投与を包含する。ベクターは、具体的説明として血管移植片（ＰＴＦＥおよびダクロン（ｄａｃｒｏｎ））、心臓弁、血管内ステント、血管内ペービング（ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｐａｖｉｎｇ）ならびに他の血管以外のプロテーゼを包含するバイオプロテーゼとしてもまた導入し得る。ベクター溶液の送達、頻度、組成物および投薬量範囲に関する全般的技術は当該技術分野の熟練内にある。
【０１０２】
具体的には、本発明のベクターの組織への送達のために、ベクターを宿主動物に導入することができるいかなる物理的若しくは生物学的方法も使用し得る。ベクターは、投与について公知であるとおり、裸の組換えベクターおよびウイルスコートタンパク質中にパッケージングされたベクターＤＮＡの双方を意味している。キメラ若しくはｒＨＢｏＶベクターをリン酸緩衝生理的食塩水に単純に溶解することは、筋組織発現に有用なベヒクルを提供するのに十分であることが示されており、そして担体若しくはベクターと同時投与し得る他成分についての既知の制限はない（とは言えＤＮＡを分解する組成物はベクターを伴う通常の様式で回避すべきである）。製薬学的組成物は経皮輸送により筋に送達されるべき注入可能な製剤として若しくは局所製剤として製造し得る。筋肉内注入および経皮輸送の双方のための多数の製剤が以前に開発されており、そして本発明の実務で使用し得る。該ベクターは、投与および取り扱いの容易さのため、いずれかの製薬学的に許容できる担体とともに使用し得る。
【０１０３】
筋肉内注入の目的上、ゴマ若しくはラッカセイ油のような補助物質中または水性プロピレングリコール中の溶液ならびに無菌水性溶液を使用し得る。こうした水性溶液は、所望の場合は緩衝することができ、そして液体希釈剤は最初に塩水若しくはグルコースで等張にされることができる。遊離酸（ＤＮＡは酸性のリン酸基を含有する）若しくは薬理学的に許容できる塩としてのキメラ若しくはｒＨＢｏＶベクターの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適して混合された水中で製造し得る。ウイルス粒子の分散系もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物ならびに油中で製造し得る。保存および使用の通常の条件下で、これらの製剤は微生物の増殖を予防するための保存剤を含有する。これに関連して、使用される無菌水性媒体は全部、当業者に公知の標準的技術により容易に得ることができる。
【０１０４】
注入可能な使用に適する製薬学的形態は、無菌水性溶液若しくは分散系、および無菌の注入可能な溶液若しくは分散系の即座の調製のための無菌粉末を包含する。全部の場合で該形態は無菌でなければならず、そして容易な注入可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流動性でなければならない。それは製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の汚染する作用に対し保存されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、多価アルコール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適する混合物および植物油を含有する溶媒若しくは分散媒であり得る。適正な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散系の場合は必要とされる粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により維持し得る。微生物の作用の予防は、多様な抗菌および抗真菌剤例えばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらすことができる。多くの場合、等張剤例えば糖若しくは塩化ナトリウムを包含することが好ましいことができる。注入可能な組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる剤例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によりもたらすことができる。
【０１０５】
無菌の注入可能な溶液は、必要とされる量のキメラ若しくはｒＨＢｏＶベクターを上で挙げられた多様な他成分を含む適切な溶媒中に必要とされるとおり組み込むこと、次いで濾過滅菌により製造する。一般に、分散系は、滅菌された有効成分を、基礎的分散媒および上で挙げられたものからの必要とされる他成分を含有する無菌ベヒクル中に組み込むことにより製造する。無菌の注入可能な溶液の製造のための無菌粉末の場合、製造方法は、限定されるものでないが、その事前に滅菌濾過された溶液から有効成分およびいずれかの付加的な所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥技術を挙げることができる。
【０１０６】
局所投与の目的上、それ以外は上の非経口溶液に類似の希薄な無菌の水性溶液（通常約０．１％ないし５％濃度の）を経皮パッチへの組み込みに適する容器中で製造し、そして製薬学的等級ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような既知の担体を包含し得る。
【０１０７】
適正に機能する嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）を気道上皮に供給することによる嚢胞性線維症の遺伝子欠損の修正が興味深い。従って、天然のＣＦＴＲタンパク質ならびにその変異体およびフラグメントをコードするキメラ若しくはｒＨＢｏＶベクターの使用が予見される。
【０１０８】
本発明の組成物はｉｎ  ｖｉｖｏならびにｅｘ  ｖｉｖｏで使用しうる。ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子治療は本発明のベクターを被験者に直接投与することを含んでなる。製薬学的組成物は、液体の溶液若しくは懸濁剤として、乳剤として、または使用前の液体中の溶解若しくは懸濁に適する固体の形態として供給し得る。気道中への投与のため、投与の一様式は、適切なエアロゾル化装置（ａｅｒｏｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｒ）装置とともに使用され
る場合に固体若しくは液体いずれかのエアロゾルを提供する組成物を使用するエアロゾル剤による。気道中への別の投与様式は、ベクターを滴下するための軟性光ファイバー気管支鏡を使用することである。典型的に、ウイルスベクターはリンゲル平衡塩類溶液（ｐＨ７．４）のような製薬学的に適するパイロジェンフリー緩衝液中にある。必要とされないとは言え、製薬学的組成物は、場合によっては、正確な量の投与に適する単位剤形で供給されうる。
【０１０９】
処置の目的に依存する有効量のウイルスを投与する。有効量は単一若しくは分割用量で与えることができる。低い比率の形質導入が遺伝子欠損を治癒し得る場合には、処置の目的は一般に、形質導入のこのレベルに一致するか若しくはこれを超えることである。いくつかの場合に、形質導入のこのレベルは標的細胞のわずか約１ないし５％の形質導入により達成し得るが、しかしより典型的には所望の組織型の細胞の２０％、通常は所望の組織型の細胞の最低約５０％、最低約８０％、最低約９５％若しくは最低約９９％である。手引きとして、気管支鏡検査法により与えられる単一用量中に存在するベクター粒子の数は、一般に、ＤＮアーゼ耐性およびＤＮアーゼ感受性双方の粒子を包含する最低約１×１０12、例えば約１×１０13、１×１０14、１×１０15若しくは１×１０16粒子であることができる。ＤＮアーゼ耐性粒子に関して、用量は一般に１×１０12と１×１０16粒子の間、より一般的には約１×１０12と１×１０15粒子の間であることができる。処置は必要とされるとおり２若しくは３週ごとと同じくらい頻繁に反復し得るとはいえ、１８０日に１回の処置が十分でありうる。
【０１１０】
宿主細胞中での所望のＤＮＡ配列の存在を確認するために多様なアッセイを実施しうる。こうしたアッセイは、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲのような当業者に公知の「分子生物学的」アッセイ；例えば免疫学的手段（免疫沈降、免疫親和性カラム、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット）によるかまたは本発明の範囲内にある特定の核酸分子の存在および／若しくは発現を同定するのに有用ないずれかの他のアッセイによりベクター中に存在する遺伝子から発現されるポリペプチドの存在を検出することのような「生化学的」アッセイを包含する。
【０１１１】
導入されたＤＮＡセグメントから産生されるＲＮＡを検出および定量するためにＲＴ−ＰＣＲを使用しうる。ＰＣＲのこの応用において、逆転写酵素のような酵素を使用してＲＮＡをＤＮＡに逆転写すること、およびその後慣習的ＰＣＲ技術の使用により該ＤＮＡを増幅することが最初に必要である。ほとんどの場合、ＰＣＲ技術は有用である一方でＲＮＡ産物の完全性を示さないことができる。ＲＮＡ産物の性質についてのさらなる情報はノーザンブロッティングにより得ることができる。この技術はあるＲＮＡ種の存在を示しかつそのＲＮＡの完全性についての情報を与える。あるＲＮＡ種の存在若しくは非存在は、ドット若しくはスロットブロットノーザンハイブリダイゼーションを使用してもまた決定し得る。これらの技術はノーザンブロッティングの変法であり、そしてあるＲＮＡ種の存在若しくは非存在を示すのみである。
【０１１２】
サザンブロッティングおよびＰＣＲを使用して問題のＤＮＡセグメントを検出しうる一方、それらは該ＤＮＡセグメントが発現されているかどうかに関する情報を提供しない。発現は、導入されたＤＮＡ配列のポリペプチド産物を特異的に同定すること、若しくは宿主細胞中の導入されたＤＮＡセグメントの発現によりもたらされる表現型の変化を評価することにより評価しうる。
【０１１３】
従って、遺伝子変化の有効性は、生理学的液体サンプル例えば尿、血漿、血清、血液、脳脊髄液または鼻若しくは肺洗浄液の分析を包含するいくつかの基準により監視し得る。生検若しくは外科的切除により取り出されるサンプルを、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ベクター特異的プローブを使用するＰＣＲ増幅、ＲＮアーゼ保護、免疫組織学
、若しくは免疫蛍光細胞計数により分析しうる。ベクターを気管支鏡検査法により投与する場合、肺機能検査を実施することができ、また、気管支肺胞洗浄液を炎症性サイトカインの存在について評価しうる。処置された被験者もまた、臨床特徴について、および該細胞が該治療的若しくは予防的ポリヌクレオチドにより運搬されることを意図している機能を発現しているかどうかを決定するために監視しうる。
【０１１４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ治療を使用するかｅｘ  ｖｉｖｏ治療を使用するかの決定、ならびに特定の組成物、用量および投与経路の選択は、限定されるものでないが処置されている状態および被験者の特徴を挙げることができる多数の異なる要因に依存することができる。こうした特徴の評価および適切な治療若しくは予防計画の設計は、究極的には処方する医師の責任である。
【０１１５】
前述の記述は、とりわけ、ヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス）および細胞性タンパク質を実質的に含まない組換えキメラウイルス若しくはｒＨＢｏＶの高力価製剤の生成方法を提供する。変形が、本発明の技術思想から離れることなく当業者によりこれら方法に適用されうることが理解される。
【０１１６】
ＩＶ．本発明の実務で有用な剤
本発明で有用な剤の分類は、限定されるものでないが抗生物質、化学療法剤例えばアントラサイクリン類、プロテアソーム調節物質、脂質低下薬、粘液溶解薬および食品添加物を挙げることができる。例示的剤は、プロテアソーム阻害剤（Ｗａｇｎｅｒら、２００２；Ｙｏｕｎｇら、２０００；Ｓｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒら、２００１）、ならびにプロテアソームおよびユビキチン経路を調節する、例えばプロテアソームに結合しかつ／若しくはプロテアソーム、ユビキチン、ユビキチン担体タンパク質若しくはユビキチンリガーゼの活性を調節する剤を包含する。これらの剤の例は、抗生物質例えばエポキソミシン、脂質低下薬例えばシンバスタチン、食品添加物例えばタンニン酸、および化学療法剤例えばシスプラチン、ドキソルビシンのようなアントラサイクリン、ならびにカンプトテシンを制限なしに包含する。一態様において、該剤は、
ＬＬｎＬ（ＭＧ１０１）、Ｚ−ＬＬＬ（ＭＧ１３２）、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ）、エポキソミシン、ドキソルビシン、ドキシル、ダウノルビシン、イダルビシン、エピルビシン、アクラルビシン、シンバスタチン、タンニン酸、カンプトテシン若しくはシスプラチン
である。
【０１１７】
一態様において、該剤は式（Ｉ）：Ｒ1−Ａ−（Ｂ）n−Ｃの化合物であって、式中Ｒ1はＮ末端アミノ酸封鎖基であり；各ＡおよびＢは独立に１アミノ酸であり；Ｃは末端カルボキシ基がホルミル（ＣＨＯ）基により置換されているアミノ酸であり；そしてｎは０、１、２若しくは３であるか；またはその製薬学的に許容できる塩である。一態様において、Ｒ1は（Ｃ1Ｃ10）アルカノイルである。一態様において、Ｒ1はアセチル若しくはベンジルオキシカルボニルである。一態様において、ａｃｈ  ＡおよびＢは独立にアラニン、アルギニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、ノルロイシン若しくはノルバリンである。一態様において、各ＡおよびＢはイソロイシンである。一態様において、Ｃは、末端カルボキシ基がホルミル（ＣＨＯ）基により置換されているアラニン、アルギニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、ノルロイシン若しくはノルバリンである。一態様において、Ｃは、末端カルボキシ基がホルミル（ＣＨＯ）基により置換されているノルロイシン若しくはノルバリンである。一態様において、Ｒ1は（Ｃ1Ｃ10）アルカノイル若しくはベンジルオキシカルボニルであり；ＡおよびＢはそれぞれイソロイシンであり；Ｃは末端カルボキシ基がホルミル（ＣＨＯ）基により置換されているノルロイシン若しくはノルバリンであり；そしてＮは１である。
【０１１８】
１剤の別の例は式（ＩＩ）：
【０１１９】
【化１】
0006516725.tif 000002
【０１２０】
の化合物
（式中
Ｒ2はＮ末端アミノ酸封鎖基であり；
Ｒ3、Ｒ4およびＲ5はそれぞれ独立に水素、（Ｃ1−Ｃ10）アルキル、アリール若しくはアリール（Ｃ1Ｃ10）アルキルであり；ならびに
Ｒ6、Ｒ7およびＲ8はそれぞれ独立に水素、（Ｃ1−Ｃ10）アルキル、アリール若しくはアリール（Ｃ1Ｃ10）アルキルであり）；またはその製薬学的に許容できる塩
である。
【０１２１】
なお別の例において、該方法で有用な剤は式（ＩＩＩ）：
【０１２２】
【化２】
0006516725.tif 000003
【０１２３】
の化合物
（式中、Ｒは水素、アミノ酸若しくはペプチドであり、Ｎ末端アミノ酸は場合によってはアミノ基でアセチル、アシル、トリフルオロアセチル若しくはベンジルオキシカルボニルで保護されていることができ；Ａはアミノ酸若しくは直接結合であり；Ａ1は１アミノ酸であり；ならびに
Ｒ1はヒドロキシ若しくはアミノ酸であり、ここでＣ末端アミノ酸は場合によってはカルボキシ基で（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、フェニル、ベンジルエステル若しくはアミド（例えば各Ｒが独立に水素若しくは（Ｃ1−Ｃ6）アルキルであるＣ（＝Ｏ）ＮＲ2）で保護されていることができ）；
またはその製薬学的に許容できる塩
である。
【０１２４】
一態様において、該剤はＨ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｈ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−ＯＨ若しくはそれらの組合せである。
【０１２５】
Ｖ．本発明の剤の投薬量、製剤および投与経路
本発明により同定される剤の投与は、例えばレシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療的であるか若しくは予防的であるか、および当業者に既知の他の要因に依存して連続的若しくは間歇的でありうる。本発明の剤の投与は、予め選択された時間の期間にわたり本質的に連続的でありうるか、若しくは一連の間隔を空けられた用量でありうる。局所および全身双方の投与を企図している。本発明の剤が予防目的上使用される場合、本発明の剤は例えば全身投与による慢性の使用に従う。
【０１２６】
下述されるところの場合によっては徐放のため調合されうる本発明の剤を含んでなる１種若しくはそれ以上の適する単位剤形は、経口、若しくは直腸、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸腔内、肺内および鼻内経路によるを包含する非経口を包含する多様な経路により投与し得る。例えば、肝への投与のためには静脈内投与が好ましいことができる
。肺への投与のためには気道投与が好ましいことができる。該製剤は、適切な場合、別個の単位剤形で便宜的に提示されることができ、そして薬局に公知の方法のいずれかにより調製しうる。こうした方法は、剤を液体担体、固体マトリックス、半固形担体、微細に粉砕された固体担体若しくはそれらの組合せとの会合にもたらす段階、およびその後必要な場合は生成物を所望の送達系に導入若しくは成形する段階を包含しうる。
【０１２７】
本発明の剤を経口投与のため調製する場合は、それらを製薬学的に許容できる担体、希釈剤若しくは賦形剤と組合せて製薬学的製剤若しくは単位剤形を形成しうる。こうした製剤中の全有効成分は製剤の０．１から９９．９重量％までを含んでなる。「製薬学的に許容できる」により、担体、希釈剤、賦形剤および／若しくは塩が製剤の他成分と適合性でなければならずかつその受領者に有害であってはならないことを意味している。経口投与のための有効成分は、散剤として若しくは顆粒剤として；溶液、懸濁剤若しくは乳剤として、またはチューインガムからの有効成分の摂取のための合成樹脂のような達成可能な基剤中に存在しうる。有効成分はボーラス、舐剤若しくはペーストとしてもまた提示しうる。
【０１２８】
本発明の剤を含有する製薬学的製剤は、公知のかつ容易に入手可能な成分を使用して当該技術分野で既知の手順により製造し得る。例えば、該剤を普遍的な賦形剤、希釈剤若しくは担体と調合しかつ錠剤、カプセル剤、懸濁剤、散剤などに成形し得る。こうした製剤に適する賦形剤、希釈剤および担体の例は、デンプン、糖類、マンニトールおよびケイ酸誘導体のような以下の増量剤および展延剤；カルボキシメチルセルロース、ＨＰＭＣおよび他のセルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチンおよびポリビニルピロリドンのような結合剤；グリセロールのような湿潤剤；炭酸カルシウムおよび重炭酸ナトリウムのような崩壊剤；パラフィンのような溶解を遅延させるための剤；四級アンモニウム化合物のような吸収促進剤；セチルアルコール、モノステアリン酸グリセロールのような界面活性剤；カオリンおよびベントナイトのような吸着性担体；ならびにタルク、ステアリン酸カルシウムおよびマグネシウムならびに固体ポリエチルグリコールのような滑沢剤を包含する。
【０１２９】
例えば、本発明の剤を含有する錠剤若しくはカプレット剤は、炭酸カルシウム、酸化マグネシウムおよび炭酸マグネシウムのような緩衝剤を包含し得る。カプレット剤および錠剤は、セルロース、アルファ化デンプン、二酸化ケイ素、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、結晶セルロース、デンプン、タルク、二酸化チタン、安息香酸、クエン酸、コーンスターチ、鉱物油、ポリプロピレングリコール、リン酸ナトリウムおよびステアリン酸亜鉛などのような不活性成分もまた包含し得る。本発明の剤を含有する硬若しくは軟ゼラチンカプセル剤は、ゼラチン、結晶セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、タルクおよび二酸化チタンなどのような不活性成分、ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および植物油のような液体ベヒクルを含有し得る。さらに、本発明の剤の腸溶カプレット剤若しくは錠剤は、胃中の崩壊に抵抗しかつ十二指腸のより中性ないしアルカリ性の環境で溶解するよう設計されている。
【０１３０】
本発明の剤は、便宜的な経口投与のためのエリキシル剤若しくは溶液として、または例えば筋肉内、皮下若しくは静脈内経路による非経口投与に適切な溶液としてもまた調合し得る。
【０１３１】
本発明の剤の製薬学的製剤は、水性若しくは無水の溶液若しくは分散系の形態、または、あるいは乳剤若しくは懸濁剤の形態もまたとることができる。
【０１３２】
従って、該治療的剤は、非経口投与（例えば、注入例えばボーラス注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）若しくは連続注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）による）のため調合することができ、そして添加された保存剤を含むアンプル、充填済みシリンジ、小容量注入容器若しくは複数
用量容器中の単位投与形態で提示しうる。有効成分は、油性若しくは水性ベヒクル中の懸濁剤、溶液若しくは乳剤のような形態をとることができ、そして懸濁化剤、安定化剤および／若しくは分散助剤のような調合剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）を含有しうる。あるいは、有効成分は、使用前に適するベヒクル例えば無菌のパイロジェンフリー水での構成のため、無菌固形物の無菌的単離若しくは溶液からの凍結乾燥により得られる粉末の形態にあることができる。
【０１３３】
これら製剤は従来技術で公知である製薬学的に許容できるベヒクルおよび補助物質を含有し得る。例えば、１種若しくはそれ以上の、アセトン、エタノール、イソプロピルアルコールのような溶媒から水に加えて選ばれる生理学的観点から許容できる有機溶媒、名称「Ｄｏｗａｎｏｌ」で販売される製品のようなグリコールエーテル、ポリグリコールおよびポリエチレングリコール、短鎖酸のＣ1−Ｃ4アルキルエステル例えば乳酸エチル若しくはイソプロピル、名称「Ｍｉｇｌｙｏｌ」で市販されている製品のような脂肪酸トリグリセリド、ミリスチン酸イソプロピル、動物、鉱物および植物油ならびにポリシロキサンを使用して、溶液を製造することが可能である。
【０１３４】
本発明の組成物はセルロースおよび／若しくはセルロース誘導体のような増粘剤もまた含有し得る。それらは、キサンタン、グアール若しくはカルボガム（ｃａｒｂｏ  ｇｕｍ）またはアラビアゴムのようなガム、あるいは、あるいはポリエチレングリコール、ベントン（ｂｅｎｔｏｎｅｓ）およびモントモリロナイトなどもまた含有し得る。
【０１３５】
必要な場合は、抗酸化剤、界面活性剤、他の保存剤、膜形成、角質溶解若しくは面皰溶解（ｃｏｍｅｄｏｌｙｔｉｃ）剤、香料および着色剤から選ばれる補助物質を添加することが可能である。また、記述される状態のためであれ何らかの他の状態のためであれ、他の有効成分を添加しうる。
【０１３６】
例えば、抗酸化剤のなかでも、ｔ−ブチルヒドロキノン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンならびにα−トコフェロールおよびその誘導体を挙げることができる。主に局所適用のため調整されたガレヌス製剤の形態は、クリーム、乳液、ゲル、分散系若しくはマイクロエマルション、より大きい若しくは少ない程度まで増粘されたローション、含浸パッド、軟膏若しくはスティックの形態、または、あるいはスプレー若しくは泡の形態のエアロゾル製剤の形態、あるいは、あるいは１塊の石鹸の形態をとる。
【０１３７】
加えて、該剤は徐放剤形などのような製剤に十分に適する。該製剤は、それらが有効成分のみ、または例えばおそらくある時間の期間にわたり腸管若しくは気道の特定の部分で有効成分を放出するように構成し得る。コーティング、外皮および保護マトリックスを、例えばポリアクチド−グリコレート、リポソーム、マイクロエマルション、微小粒子、ナノ粒子若しくは蝋のようなポリマー物質から作成しうる。これらコーティング、外皮および保護マトリックスは、留置装置例えばステント、カテーテル、腹膜透析チューブなどを被覆するのに有用である。
【０１３８】
本発明の剤は経皮投与のための貼付剤を介して送達し得る。剤の経皮送達に適する貼付剤の例については米国特許第５，５６０，９２２号明細書を参照されたい。経皮送達のための貼付剤は、裏打ち層、および１種若しくはそれ以上の皮膚浸透増強剤と一緒に該剤をその中に分散若しくは溶解しているポリマーマトリックスを含み得る。裏打ち層は該剤に不透性であるいずれの適する物質からも作成し得る。裏打ち層はマトリックス層の保護カバーとしてはたらきかつ支持機能もまた提供する。裏打ちは、それがポリマーマトリックスと本質的に同一の大きさの層であるように成形し得るか、あるいは、それは、それがポリマーマトリックスの側を超えて伸張し得るかまたはポリマーマトリックスの側（１つ若
しくは複数）を覆いかつその後裏打ち層の伸張の表面が接着手段のための基部となり得る様式で外側に伸張し得るように、より大きな寸法のものであり得る。あるいは、ポリマーマトリックスはポリアクリレート若しくはアクリレート／ビニルアセテートコポリマーのような接着性ポリマーを含有し得るか若しくはそれから構築され得る。長期適用のため、微孔性かつ／若しくは呼吸可能な裏打ち積層を使用することが望ましいことができ、その結果皮膚の水和若しくは解離が最低限にされ得る。
【０１３９】
裏打ち層を作成するのに適する素材の例は、高および低密度ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリ（エチレンフタレート）のようなポリエステルの薄膜、金属箔、こうした適するポリマー薄膜の金属箔積層などである。裏打ち層に使用される素材はアルミ箔のような金属箔を伴うこうしたポリマー薄層の積層でありうる。こうした積層中で、積層のポリマー薄膜は通常、接着性ポリマーマトリックスと接触していることができる。
【０１４０】
裏打ち層は、所望の保護および支持機能を提供することができるいずれの適切な厚さでもあり得る。適する厚さは約１０から約２００ミクロンまでであることができる。
【０１４１】
一般に、生物学的に許容できる接着性ポリマー層を形成するのに使用されるポリマーは、剤が制御された速度でそれを通過し得る成形体、薄壁若しくはコーティングを形成することが可能なものである。適するポリマーは、生物学的および製薬学的に適合性、非アレルゲン性、ならびに該装置が接触される体液若しくは組織に不溶性かつそれと適合性である。溶解性ポリマーの使用は、皮膚水分によるマトリックスの溶解若しくは腐食が該剤の放出速度ならびに除去の便宜さのため正しい場所に留まる投薬単位の能力に影響を及ぼすとみられるため、回避すべきである。
【０１４２】
接着性ポリマー層を製作するための例示的素材は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、エチレン／プロピレンコポリマー、エチレン／エチルアクリレートコポリマー、エチレン／ビニルアセテートコポリマー、シリコーンエラストマー、具体的には医学等級ポリジメチルシロキサン、ネオプレンゴム、ポリイソブチレン、ポリアクリレート、塩素化ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、塩化ビニル−ビニルアセテートコポリマー、架橋ポリメタクリレートポリマー（ヒドロゲル）、ポリ塩化ビニリデン、ポリ（エチレンテレフタレート）、ブチルゴム、エピクロロヒドリンゴム、エチレンビニルアルコールコポリマー、エチレン−ビニルオキシエタノールコポリマー；シリコーンコポリマー例えばポリシロキサン−ポリカーボネートコポリマー、ポリシロキサン−ポリエチレンオキシドコポリマー、ポリシロキサン−ポリメタクリレートコポリマー、ポリシロキサン−アルキレンコポリマー（例えばポリシロキサン−エチレンコポリマー）、ポリシロキサン−アルキレンシランコポリマー（例えばポリシロキサン−エチレンシランコポリマー）など；セルロースポリマー例えばメチル若しくはエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびセルロースエステル；ポリカーボネート；ポリテトラフルオロエチレン；などを包含する。
【０１４３】
生物学的に許容できる接着性ポリマーマトリックスは室温より下のガラス転移温度をもつポリマーから選択しうる。ポリマーは室温である結晶化度を有してよいがしかし必ずしもその必要はない。架橋モノマー単位若しくは部位をこうしたポリマー中に組み込み得る。例えば、架橋モノマーをポリアクリレートポリマーに組み込み得、これは該剤を該ポリマー中に分散した後にマトリックスを架橋するための部位を提供する。ポリアクリレートポリマーのための既知の架橋モノマーは、ブチレンジアクリレートおよびジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレートなどのような多価アルコールのポリメタクリル酸エステルを包含する。こうした部位を提供する他のモノマーはアリルアクリレート、アリルメタクリレート、ジアリルマレエートなどを包含する。
【０１４４】
可塑剤および／若しくは湿潤剤を接着性ポリマーマトリックス内に分散しうる。水溶解性多価アルコールは一般にこの目的上適する。製剤中の湿潤剤の組み込みは、投薬単位が皮膚の表面上で水分を吸収することを可能にし、それは順に皮膚刺激を低下させかつ送達系の接着性ポリマー層が脱落することを予防するのを助ける。
【０１４５】
経皮送達系から放出される剤は皮膚の各層を透過することが可能でなければならない。剤の透過の速度を増大させるため、経皮薬物送達系は、分子の透過に対する最大の抵抗性を提供する皮膚の最外層すなわち角質層の透過性をとりわけ増大させることが可能でなければならない。剤の経皮送達のための貼付剤の製作は当該技術分野で公知である。
【０１４６】
上部（鼻）若しくは下部気道への吸入による投与のため、本発明の剤は便宜的に、ガス注入器、ネブライザー若しくは加圧パック、またはエアロゾルスプレー剤を送達する他の便宜的手段から送達される。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素若しくは他の適するガスのような適する噴射剤を含みうる。加圧エアロゾル剤の場合、投薬単位は計量された量を送達するためのバルブを提供することにより決定しうる。
【０１４７】
あるいは、吸入若しくはガス注入による投与のために、該組成物は乾燥粉末、例えば該剤および乳糖若しくはデンプンのような適する粉末基剤の粉末混合物の形態をとることができる。粉末組成物は、例えばカプセル若しくはカートリッジ、または粉末を吸入器、ガス注入器若しくは定量噴霧式吸入器の助けを借りてそれから投与しうる例えばゼラチン若しくはブリスターパック中の単位剤形で提示されうる。
【０１４８】
鼻内投与のために、該剤は、点鼻薬、プラスチック瓶噴霧器若しくは定量噴霧式吸入器を介するような液体スプレーを介して投与しうる。噴霧器の典型的なものはＭｉｓｔｏｍｅｔｅｒ（Ｗｉｎｔｒｏｐ）およびＭｅｄｉｈａｌｅｒ（Ｒｉｋｅｒ）である。
【０１４９】
本発明の剤の局所送達は、疾患の部位若しくはその近くに該剤を投与する多様な技術によることもまたできる。部位特異的すなわち標的を定められた局所送達技術の例は制限することを意図していないが、しかし利用可能な技術の具体的説明であることを意図している。例は、注入若しくは留置カテーテル例えば針注入カテーテルのような局所送達カテーテル、シャントおよびステント若しくは他の埋め込み可能な装置、部位特異的担体、直接注入または直接適用を包含する。
【０１５０】
局所投与のため、該剤は標的領域への直接適用のため当該技術で既知であるとおり調合しうる。この目的上慣習的な形態は、創傷包帯材、被覆された包帯若しくは他のポリマー被覆剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ペースト剤、ゼリー剤、スプレー剤およびエアロゾル剤を包含する。軟膏剤およびクリーム剤は、例えば、適する増粘および／若しくはゲル化剤の添加を伴い水性若しくは油性基剤を用いて調合しうる。ローション剤は水性若しくは油性基剤を用いて調合することができ、そして、一般に１種若しくはそれ以上の乳化剤、安定化剤、分散助剤、懸濁化剤、増粘剤若しくは着色剤もまた含有することができる。有効成分は、例えば米国特許第４，１４０，１２２号；同第４，３８３，５２９号；若しくは同第４，０５１，８４２号明細書に開示されるところのイオントフォレーシスを介してもまた送達し得る。局所製剤中に存在する本発明の剤の重量パーセントは多様な要因に依存することができるが、しかし一般に製剤の総重量の０．０１％から９５％まで、および典型的には０．１〜２５重量％であることができる。
【０１５１】
点眼薬若しくは点鼻薬のような滴剤は、１種若しくはそれ以上の分散助剤、可溶化剤若しくは懸濁化剤もまた含んでなる水性若しくは非水性基剤を用いて調合することができる
。液体スプレー剤は便宜的に加圧パックから送達される。滴剤は、単純な点眼用スポイトで蓋をされた瓶（ｅｙｅ  ｄｒｏｐｐｅｒ−ｃａｐｐｅｄ  ｂｏｔｔｌｅ）を介して、若しくは液体内容物を一滴ずつ送達するように適合されたプラスチック瓶を介して、特別に造形された閉鎖を介して送達し得る。
【０１５２】
該剤は口若しくは喉中の局所投与のためさらに調合することができる。例えば、有効成分を、風味を付けられた基剤通常はショ糖およびアラビアゴム若しくはトラガカントをさらに含んでなる舐剤；ゼラチンおよびグリセリン若しくはショ糖およびアラビアゴムのような不活性基剤中に組成物を含んでなる香錠；ならびに適する液体担体中に本発明の組成物を含んでなる口腔洗浄薬として調合しうる。
【０１５３】
本明細書に記述される製剤および組成物は、抗菌薬若しくは保存剤のような他成分もまた含有しうる。さらに、有効成分は他の剤例えば気管支拡張薬とともにもまた使用しうる。
【０１５４】
本発明の剤は、単独で若しくは製薬学的に許容できる担体とともに哺乳動物に投与しうる。上で示されたとおり、有効成分および担体の相対比率は、化合物の溶解性および化学的性質、選ばれた投与経路ならびに標準的製薬学的実務により決定される。
【０１５５】
本剤の投薬量は、投与形態、選ばれた特定の化合物、および処置中の特定の患者の生理学的特徴とともに変動することができる。一般に、小投薬量を当初使用することができ、そして必要な場合は、該環境下の最適の効果が達せられるまで小さい増分だけ増大させることができる。
【０１５６】
ＶＩ．例示的態様
一態様において、本発明は、ボカウイルスキャプシドタンパク質およびｒＡＡＶゲノムを含んでなる単離されたキメラウイルスを提供する。一態様において、ボカウイルスキャプシドはＨＢｏＶキャプシドである。一態様において、ＨＢｏＶキャプシドはＨＢｏＶ１、ＨＢｏＶ２、ＨＢｏＶ３若しくはＨＢｏＶ４キャプシドである。一態様において、ゲノムは異種遺伝子産物例えば治療的タンパク質をコードする発現カセットを含んでなる。一態様において、ｒＡＡＶゲノムはｒＡＡＶ−２ゲノムである。一態様において、ｒＡＡＶゲノムはｒＡＡＶ−１、ｒＡＡＶ−３、ｒＡＡＶ−４、ｒＡＡＶ−５、ｒＡＡＶ−６、ｒＡＡＶ−７、ｒＡＡＶ−８若しくはｒＡＡＶ−９ゲノムである。一態様において、ｒＡＡｖゲノムはヒト以外の種のＡＡＶ由来である。一態様において、発現カセットは繊毛気道上皮細胞で発現されるプロモーター例えばＦＯＸＪ１プロモーターを包含する。一態様において、ゲノムはトランススプライシングドメインを包含する。ウイルスゲノムによりコードされる遺伝子産物は、ウイルス、細菌、腫瘍若しくは真菌抗原でありうる。一態様において、トランスジーンは中和抗体若しくはその抗原結合フラグメントをコードする。一態様において、遺伝子産物は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子、β−グロビン、γ−グロビン、チロシンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィン、α１−アンチトリプシン、サーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｄ、ＳＰ−Ａ若しくはＳＰ−Ｃ、エリスロポエチン、ＲＳＶタンパク質、ＨＢｏＶタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＳＡＲＳタンパク質、サイトカイン例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−１７若しくはＩＬ−６である。異種遺伝子産物例えば治療的遺伝子産物、触媒ＲＮＡ、予防的遺伝子産物、ポリペプチド若しくはペプチドを発現するのに有効な量で細胞を感染させるのに単離されたキメラウイルスを使用する、哺乳動物細胞中での異種遺伝子産物の発現方法もまた提供される。一態様において、ウイルスは昆虫細胞若しくは哺乳動物細胞から単離される。哺乳動物細胞のキメラウイルス形質導入を高める方法がさらに提供される。該方法は、ヒトボカウイルスキャプシドタンパク質および異種遺伝子産物をコードするトランスジーンを
含んでなるｒＡＡＶゲノムを含んでなる単離されたキメラウイルス、ならびにｒＡＡＶ形質導入を相加的若しくは相乗的に高めるのに有効な量の最低１種の剤と哺乳動物細胞を接触させることを包含する。一態様において、哺乳動物細胞は哺乳動物肺細胞である。一態様において、剤はプロテアソーム阻害剤、化学療法剤、脂質低下薬、粘液溶解薬、抗生物質若しくは食品添加物である。
【０１５７】
単離されたキメラウイルスは、内因性遺伝子産物の異常な発現を伴う状態の阻害若しくは処置方法で使用しうる。該方法は、該状態の危険がある若しくはそれを有する哺乳動物を、ヒトボカウイルスキャプシドタンパク質およびｒＡＡＶゲノムを含んでなる有効量の単離されたキメラウイルスと接触させることを包含し、ここでｒＡＡＶゲノムは機能的遺伝子産物の少なくとも一部分をコードするトランスジーンを含んでなり、哺乳動物におけるその発現が該状態の最低１種の症状を阻害若しくは処置する。一態様において、遺伝子産物は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子、β−グロビン、γ−グロビン、チロシンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィン、α１−アンチトリプシン、サーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｄ、ＳＰ−Ａ若しくはＳＰ−Ｃ、エリスロポエチン、ＲＳＶタンパク質、ＨＢｏＶタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＳＡＲＳタンパク質、サイトカイン例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−１７若しくはＩＬ−６である。一態様において、哺乳動物は、形質導入を高める量の最低１種のプロテアソーム阻害剤、化学療法剤、脂質低下薬、抗生物質若しくは食品添加物とさらに接触される。一態様において、該最低１種の剤は、ＬＬｎＬ（ＭＧ１０１）、Ｚ−ＬＬＬ（ＭＧ１３２）、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ）、エポキソミシン、ドキソルビシン、ドキシル、ダウノルビシン、イダルビシン、エピルビシン、アクラルビシン、シンバスタチン、タンニン酸、カンプトテシン若しくはシスプラチンである。剤は哺乳動物細胞のウイルス形質導入を高める方法で使用しうる。哺乳動物細胞は、ヒトボカウイルスキャプシドタンパク質およびｒＡＡＶゲノムを含んでなるキメラウイルス、ならびに剤と接触されない哺乳動物細胞に関してウイルスの形質導入を高めるのに有効な量の剤と接触される。一態様において、該剤はプロテアソーム阻害剤である。哺乳動物細胞が、プロテアソーム阻害剤であるある量の剤、ならびにヒトボカウイルスキャプシドタンパク質およびトランスジーンを含んでなるｒＡＡＶゲノムを含んでなるキメラウイルスと接触される、哺乳動物細胞中のトランスジーンの発現を高める方法がさらに提供される。該剤の該量がｒＡＡＶの形質導入を高め、それにより該剤と接触されない哺乳動物細胞に関してトランスジーンの発現を高める。
【０１５８】
ヒトボカウイルスキャプシドタンパク質およびｒＡＡＶゲノム（ここで該ゲノムは哺乳動物中のその発現が治療的であるトランスジーンを含んでなる）を含んでなる単離されたキメラウイルスを用いるウイルス遺伝子治療にかけられる哺乳動物が、剤と接触されない哺乳動物中の細胞に関して哺乳動物の細胞中の該トランスジーンの発現を高めるのに有効な量のプロテアソーム阻害剤である剤を投与される方法もまた提供される。一態様において、ｒＡＡＶは治療的ペプチド若しくは治療的ポリペプチドをコードする。一態様において、細胞若しくは哺乳動物は該細胞若しくは哺乳動物がウイルスと接触される前に該剤と接触される。一態様において、細胞若しくは哺乳動物は該細胞若しくは哺乳動物が該剤と接触される前にウイルスと接触される。一態様において、細胞若しくは哺乳動物はウイルスおよび剤と同時に接触される。一態様において、該剤およびウイルスは肺に投与される。一態様において、ウイルスは経口投与される。一態様において、ウイルスは鼻に投与される。一態様において、ウイルスは血管に投与される。
【０１５９】
哺乳動物の免疫化方法がさらに提供される。該方法は、ヒトボカウイルスキャプシドタンパク質および予防的遺伝子産物をコードするｒＡＡＶゲノムを含んでなる単離されたキメラウイルスを、微生物の感染若しくは複製を予防若しくは阻害するのに有効な量で哺乳動物に投与することを包含する。一態様において、遺伝子産物はウイルス、細菌、真菌若
しくは寄生生物の抗原である。一態様において、遺伝子産物はウイルス、細菌、真菌若しくは寄生生物に対する中和抗体である。
【０１６０】
本発明は、ヒトボカウイルスキャプシドタンパク質および組換えＨＢｏＶゲノムを含んでなる単離されたｒＨＢｏＶを提供する。一態様において、該ゲノムは異種遺伝子産物をコードする発現カセットを含んでなる。一態様において、遺伝子産物は治療的タンパク質をコードする。一態様において、遺伝子産物はウイルス、細菌、腫瘍若しくは真菌抗原である。一態様において、遺伝子産物は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子、β−グロビン、γ−グロビン、チロシンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィン、α１−アンチトリプシン、サーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｄ、ＳＰ−Ａ若しくはＳＰ−Ｃ、エリスロポエチン、ＨＢｏＶタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＲＳＶタンパク質、ＳＡＲＳタンパク質、またはサイトカイン例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮγ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−１７若しくはＩＬ−６である。単離されたｒＨＢｏＶを、哺乳動物細胞中で異種遺伝子産物を発現させるのに使用しうる。細胞を、異種遺伝子産物例えば治療的遺伝子産物、触媒ＲＮＡ、予防的遺伝子産物、ポリペプチド若しくはペプチドを発現するのに有効な量のウイルスに感染させる。哺乳動物細胞のキメラウイルス形質導入を高める方法もまた提供される。該方法は、ヒトボカウイルスキャプシドタンパク質および異種遺伝子産物をコードするトランスジーンを含んでなるｒＨＢｏＶゲノムを含んでなる単離されたｒＨＢｏＶ、ならびに形質導入を相加的若しくは相乗的に高めるのに有効な量の最低１種の剤と哺乳動物細胞を接触させることを包含する。一態様において、哺乳動物細胞は哺乳動物肺細胞である。一態様において、該剤はプロテアソーム阻害剤、化学療法剤、脂質低下薬、抗生物質若しくは食品添加物である。
【０１６１】
内因性遺伝子産物の異常な発現を伴う状態の阻害若しくは処置方法がさらに提供される。該方法は、該状態の危険がある若しくはそれを有する哺乳動物を、ヒトボカウイルスキャプシドタンパク質およびｒＨＢｏＶゲノム（該ｒＨＢｏＶゲノムは、哺乳動物中でのその発現が該状態の最低１種の症状を阻害若しくは処置する機能的遺伝子産物の少なくとも一部分をコードするトランスジーンを含んでなる）を含んでなる有効量の単離されたｒＨＢｏＶと接触させることを包含する。一態様において、遺伝子産物は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子、β−グロビン、γ−グロビン、チロシンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィン、α１−アンチトリプシン、サーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｄ、ＳＰ−Ａ若しくはＳＰ−Ｃ、エリスロポエチン、ＨＢｏＶタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＲＳＶタンパク質、ＳＡＲＳタンパク質、ＩＦＮ−α、ＩＦＮγ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−１７若しくはＩＬ−６である。一態様において、形質導入を高める量の最低１種のプロテアソーム阻害剤、化学療法剤、脂質低下薬、粘液溶解薬、抗生物質若しくは食品添加物と哺乳動物を接触させることをさらに含んでなること。一態様において、該ａｔ剤は、ＬＬｎＬ（ＭＧ１０１）、Ｚ−ＬＬＬ（ＭＧ１３２）、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ）、エポキソミシン、ドキソルビシン、ドキシル、ダウノルビシン、イダルビシン、エピルビシン、アクラルビシン、シンバスタチン、タンニン酸、カンプトテシン若しくはシスプラチンである。
【０１６２】
加えて、本発明は、哺乳動物細胞が、ヒトボカウイルスキャプシドタンパク質およびｒＨＢｏＶゲノムを含んでなるｒＨＢｏＶ、ならびに剤と接触されない哺乳動物細胞に関してウイルスの形質導入を高めるのに有効な量の剤と接触される、哺乳動物細胞のウイルス形質導入を高める方法を提供し、例えば該剤はプロテアソーム阻害剤である。該剤およびｒＨＢｏＶは、哺乳動物細胞中のトランスジーンの発現を高める方法に使用しうる。該方法は、哺乳動物細胞を、プロテアソーム阻害剤であるある量の剤、ならびにヒトボカウイルスキャプシドタンパク質およびトランスジーンを含んでなるｒＨＢｏＶゲノムを含んで
なるｒＨＢｏＶと接触させることを包含し、ここで該量は形質導入を高め、それにより該剤と接触されない哺乳動物細胞に関してトランスジーンの発現を高める。剤は、ヒトボカウイルスキャプシドタンパク質およびｒＨＢｏＶゲノムを含んでなる単離されたｒＨＢｏＶを用いるウイルス遺伝子治療にかけられる哺乳動物に投与することができ、ここで該ゲノムは哺乳動物におけるその発現が治療的であるトランスジーンを含んでなる。該剤はプロテアソーム阻害剤であることができ、そして該剤と接触されない哺乳動物中の細胞に関して哺乳動物の細胞中のトランスジーンの発現を高めるのに有効な量で投与される。一態様において、ｒＨＢｏＶは治療的ペプチド若しくは治療的ポリペプチドをコードする。一態様において、細胞若しくは哺乳動物は細胞がウイルスと接触される前に該剤と接触される。一態様において、細胞若しくは哺乳動物は細胞が剤と接触される前にウイルスと接触される。一態様において、細胞若しくは哺乳動物はウイルスおよび剤と同時に接触される。一態様において、剤およびウイルスは肺に投与される。一態様において、ウイルスは経口投与される。一態様において、ウイルスは鼻に投与される。一態様において、ウイルスは血管に投与される。
【０１６３】
ヒトボカウイルスキャプシドタンパク質および予防的遺伝子産物をコードするｒＨＢｏＶゲノムを含んでなる単離されたｒＨＢｏＶを、哺乳動物の免疫化方法で使用しうる。該ウイルスは、微生物の感染若しくは複製を予防若しくは阻害するのに有効な量で哺乳動物に投与される。
【０１６４】
ＨＢｏＶの感染若しくは複製を予防若しくは阻害するのに有効な量の、ヒトボカウイルスキャプシドタンパク質およびｒＡＡＶゲノムを含んでなる単離されたキメラウイルスを哺乳動物に投与することを包含する哺乳動物の免疫化方法がさらに提供される。一態様において、キメラウイルスは肺に投与される。該キメラウイルスを含んでなるワクチンもまた提供される。
【０１６５】
ＨＢｏＶの感染若しくは複製を予防若しくは阻害するのに有効な量の、ヒトボカウイルスキャプシドタンパク質およびｒＨＢｏＶゲノムを含んでなる単離されたｒＨＢｏＶを哺乳動物に投与することを含んでなる哺乳動物の免疫化方法がさらに提供される。一態様において、キメラウイルスは肺に投与される。該ウイルスを含んでなるワクチンもまた提供される。
【０１６６】
本発明は以下の制限しない実施例によりさらに記述されることができる。
【実施例１】
【０１６７】
材料および方法
細胞培養
細胞株および初代細胞。ヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞（ＣＲＬ−１５７３）、ＨｅＬａ（ＣＣＬ−２）、ＭＤＣＫ（ＣＣＬ−３４）、ＭＲＣ−５（ＣＣＬ−１７１）、ＬＬＣ−ＭＫ２（ＣＣＬ−７）およびＶｅｒｏ−Ｅ６（ＣＲＬ−１５８６）はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、ヴァージニア州マナサス）から得、そして１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。ヒト気道上皮細胞から発する細胞株は、Ａ５４９（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８５）、ＢＥＡＳ−２Ｂ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９６０９）、１６ＨＢＥ１４ｏ−（Ｄｉｅｔｅｒ  Ｇｒｕｅｎｅｒｔ博士から得た）ならびにＮｕＬｉ−１およびＣｕＦｉ−８（Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｒｅ、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ）である。ＮｕＬｉ−１およびＣｕＦｉ−８は、ｈＴＥＲＴおよびＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７遺伝子を発現することによりそれぞれ正常および嚢胞性線維症ヒト初代気道細胞から不死化した（Ｚａｂｎｅｒら、２００３）。初代Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ正常ヒト気管支／気管
上皮細胞（ＮＨＢＥ）はＬｏｎｚａ（メリーランド州ウォーカーズビル）から購入した。細胞は供給元により提供される説明書に従って培地中で培養した。
【０１６８】
ヒト気道上皮培養物。初代Ｂ−ＨＡＥと命名された分極された初代ＨＡＥは、単離されたヒト気道（気管気管支）上皮細胞（３種のＨＡＥ培養物を異なるドナーから生成した）を、コラーゲン被覆された半透性メンブレンインサート（０．６ｃｍ２、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＰＣＦ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ビレリカ）上で増殖させること、およびその後空気−液体界面（ＡＬＩ）でそれらが分化することを可能にすることにより生成し；これはＴｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａで実施した（Ｚａｂｎｅｒら、２００３；Ｋａｒｐら、２００２；Ｙａｎら、２００４；Ｙａｎら、２００６）。ＡＬＩで３〜４週間の培養後に、ＨＡＥの極性を、上皮ボルトオームメータ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用した経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）に基づき決定し、そして感染可能性との関係を評価し；１，０００Ｖ．ｃｍ２を上回る値がＨＢｏＶ１感染に必要とされた。ＣｕＦｉ−およびＮｕＬｉ−ＨＡＥは、上と同一の方法に従いしかし不死化気道上皮細胞株ＣｕＦｉ−８およびＮｕＬｉ−１をそれぞれ使用して生成した。初代Ｂ−、ＣｕＦｉ−およびＮｕＬｉ−ＨＡＥを培養し、分化させ、そして２％Ｕｌｔｒｏｓｅｒ  Ｇ（Ｐａｌｌ  ＢｉｏＳｅｐｒａ、仏国セルジー・サン・クリストフ）を含有する（５０％：５０％）ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地中で維持した。
【０１６９】
ウイルスの単離およびウイルスＤＮＡの抽出
鼻咽頭吸引液を、急性ＨＢｏＶ１感染（抗体陽転、ウイルス血症、および吸引液１ｍｌあたり１０４ｇｃを上回るＨＢｏＶ１）を有したブラジル・サルヴァドールの市中肺炎を伴う小児から得た（Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏ−Ｃａｒｖａｌｈｏら、２０１２）。ウイルスＤＮＡをＫａｎｔｏｌａら（２０１０）に記述される方法に従って抽出した。
【０１７０】
使用されるプライマーおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による配列増幅
ＨＢｏＶ１エピソームのヘッドトゥーテイル結合の配列は、ＨＢｏＶのＬＥＨおよびＲＥＨがそれぞれＢＰＶのＬＥＨおよびＭＶＣのＲＥＨのもの（Ｓｕｎら、２００９；Ｌｕｓｅｂｒｉｎｋら、２０１１）と構造および配列双方の類似性を共有していることを示唆する。ＰｈｕｓｉｏｎハイフィディリティーＰＣＲキット（ＮＥＢ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）を製造元の説明書に従って使用して、ＨＢｏＶ１の左端ヘアピン（ＬＥＨ）および右端ヘアピン（ＲＥＨ）を増幅した。簡潔には、９８℃で３０秒間のＤＮＡ変性に、３５サイクルの：９８℃で１０秒間の変性；５５℃で１５秒間のアニーリング；および７２℃で３０秒間の伸張が続いた。最終サイクルの後に伸張を７２℃で１０分間継続した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル中の電気泳動により分析した。ＤＮＡバンドをＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を使用して抽出し、そして抽出されたＤＮＡを、フォワードおよびリバース増幅プライマー上の伸張された配列に相補的なプライマーを使用して、ＭＣＬＡＢ（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）で直接配列決定した。ＰＣＲで生成されたＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）にクローン化し、そして個々のクローンの培養物から単離されたＤＮＡをその後配列決定した。
【０１７１】
完全長ＨＢｏＶ１クローンおよびその変異体の構築
ｐＢＢベクターの構築。ｐＢＢＳｍａＩベクターを、Ｂ１９Ｖ感染性クローンｐＭ２０（Ｚｈｉら、２００４）からＢ１９Ｖ配列の全部を除去することにより（ＳａｌＩ消化）生成されたベクターバックボーン（ｐＰｒｏＥＸ  ＨＴｂベクター；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に５９−ＳａｌＩ−ＳａｃＩＩ−ＫｐｎＩ−ＳｍａＩＡｐａＩ−ＳｐｈＩ−ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ−３９のリンカーを挿入することにより構築した。全部のクローン化作業はＳｕｒｅ  ２（Ａｇｉｌｅｎｔ、カリフォルニア州ラホヤ）の大腸菌（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株で実施した。ＨＢｏＶ１の全部のヌクレオチド番号はＨＢｏＶ１完全長ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＪＱ９２３４２２）を指す。
【０１７２】
左端ヘアピンのクローン化。ＤＮＡフラグメントＳａｌＩ−ＢｇｌＩＩ−ｎｔ９３−５１８（ＢｓｐＥＩ）−５７６−ＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ（ＨＢｏＶ１配列のｎｔ９３−５７６を含有する）をウイルスＤＮＡから増幅し、そしてＳａＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化されたｐＢＢＳｍａＩに挿入してｐＢＢ２．１を製造した。別のＤＮＡ、ＳａｌＩ−ｎｔ１−８６−ＢｃｌＩ（ＨＢｏＶ１のｎｔ１−８６配列を含有する）を、得られたＬＥＨ配列に従って合成し、そしてｐＢＢ２．１中のＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩ部位の間に置き、ＢｃｌＩおよびＢｇｌＩＩ部位の連結がＨＢｏＶ１配列のｎｔ８７−９２を再生した。無傷のＬＥＨとともに５９  ＨＢｏＶ１  ｎｔ１−５７６配列を内部に持つ結果として生じるプラスミドをｐＢＢ−ＬＥＨと呼称する。
【０１７３】
右端ヘアピンのクローン化。ＤＮＡフラグメントＳａｌＩ−ｎｔ４０９７−４１３９（ＢｇｌＩＩ）−５４２７（ＫａｓＩ）−ＡｐａＩ（ＨＢｏＶ１のｎｔ４０９７−５４２７配列を含有する）をウイルスＤＮＡから増幅し、そしてＳａＩＩ／ＡｐａＩ消化されたｐＢＢＳｍａＩ中に挿入してｐＢＢ２．２をもたらした。別のＤＮＡフラグメントＡｐａＩ−ｎｔ５４６０（ＫａｓＩ）−５５４３−ＸｈｏＩ（ＨＢｏＶ１のｎｔ５４６０−５５４３配列を含有する）をＲＥＨ配列に基づいて合成し、そしてｐＢＢ２．２中のＡｐａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ配列の間に置き、ｐＢＢＲＥＨ（Ｄ５４２８−５４５９）をもたらした。ｎｔ５４２８−５４５９を包含する２個のＫａｓＩ部位の間の欠けている短いフラグメントを、ＲＥＨ配列に基づく合成されたＫａｓＩリンカーにより回復し、そしてＫａｓＩ消化されたｐＢＢ−ＲＥＨ（Ｄ５４２８−５４５９）中に挿入した。無傷のＲＥＨとともに３９  ＨＢｏＶ１  ｎｔ４０９７−５５４３配列を内部に持つ結果として生じるプラスミドをｐＢＢ−ＲＥＨと呼称する。
【０１７４】
ｐＩＨＢｏＶ１のクローン化。ｐＢＢ−ＬＥＨのＳａｌＩ／ＸｈｏＩ消化から得られたＨＢｏＶ１  ＤＮＡフラグメントＳａｌＩ−ｎｔ１−５１８（ＢｓｐＥＩ）−５７６−ＸｈｏＩを、ＳａｌＩ消化されたｐＢＢ−ＲＥＨ中に連結してｐＢＢ−ＬＥＨ（ＢｓｐＥＩ／ＢｇｌＩＩ）ＲＥＨをもたらした。ＢｓｐＥＩ／ＢｇｌＩＩでのこのプラスミドの消化により生じられたより大きいフラグメントを、ウイルスＤＮＡから増幅したＨＢｏＶ１  ＤＮＡフラグメントｎｔ５１８（ＢｓｐＥＩ）−４１３９（ＢｇｌＩＩ）に連結した。完全長ＨＢｏＶ１（ｎｔ１−５５４３）を含有する最終構築物をｐＩＨＢｏＶ１と呼称した。
【０１７５】
ｐＩＨＢｏＶ１変異体の構築。ｐＩＨＢｏＶ１ＮＳ１（２）およびｐＩＨＢｏＶ１ＮＰ１（２）は、それぞれＮＳ１およびＮＰ１のＯＲＦの早期終止につながる終止コドンをもたらす、ＨＢｏＶ１のｎｔ５４２をＴからＡに、およびｎｔ２５８８をＧからＡに突然変異することにより構築した。同様に、ｐＩＨＢｏＶ１ＶＰ１（２）およびｐＩＨＢｏＶ１ＶＰ２（２）は、それぞれＶＰ１およびＶＰ２のＯＲＦを破壊する、ＨＢｏＶ１のｎｔ３２０５をＴからＡに、およびｎｔ３５４０をＴからＧに突然変異することにより生成した。
【０１７６】
トランスフェクション
６０ｍｍ皿中で増殖された細胞を２ｍｇのプラスミドでトランスフェクトし；Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  Ｐｌｕｓ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールズバッド）をＱｉｕら（２００２）に記述されるとおり使用した。トランスフェクション実験のいくつかについて、ＨＥＫ２９３細胞を、アデノウイルス５（Ａｄ５）Ｅ２ａ、Ｅ４ｏｒｆ６およびＶＡ遺伝子を含有する２ｍｇのｐＨｅｌｐｅｒプラスミド（Ａｇｉｌｅｎｔ）とコトランスフェクトしたか、若し
くはＱｉｕら（２００２）に記述されるとおり５のＭＯＩのアデノウイルス５型に感染させた。
【０１７７】
サザンブロット分析
低分子量（Ｈｉｒｔ）ＤＮＡをトランスフェクトされた細胞から抽出し、ＤｐｎＩで消化し（若しくは消化されないままにし）そしてＱｉｕら（２００６）に記述されるとおりサザンブロッティングにより分析した。
【０１７８】
ウエスタンブロット分析
細胞を溶解し、ＳＤＳ−８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離し、そしてＬｉｕら（２００４）に記述されるとおり示されるところの抗体を用いてブロッティングした。
【０１７９】
ＨＢｏＶ１の製造および精製
ＨＥＫ２９３細胞をＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳ中１５枚の１５０ｍｍプレート上で培養し、そしてＬｉｐｏＤ２９３（ＳｉｇｎａＧｅｎ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）を使用して皿あたり１５ｍｇのｐＩＨＢｏＶ１でトランスフェクトした。５％ＣＯ2および３７℃で４８時間維持された後に細胞を収集し、１０ｍＬのリン酸緩衝生理的食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）に再懸濁し、そしてそれらを４凍結（−１９６℃）および解凍（３７℃）サイクルにかけることにより溶解した。細胞ライセートをその後１０，０００ｒｐｍで３０分間回転した。上清を収集しかつ連続的ＣｓＣｌ勾配で評価した。簡潔には、密度をＣｓＣｌを添加することにより１．４０ｇ／ｍＬに調整し、そしてサンプルを１１ｍｌ遠心管中に負荷しかつＳｏｒｖａｌｌ  ＴＨ６４１ローターで３６，０００ｒｐｍで２０℃で３６時間回転した。
【０１８０】
５５０ｍＬの画分（２０画分）をピストン・クラジェント・フラクショネーター（ＢｉｏＣｏｍｐ、カナダ・ニューブランズウィック州フレデリクトン）を用いて収集し、そしてそれぞれの密度をアッベ屈折計により測定した。ウイルスＤＮＡを各画分から抽出し、そして下述されるところのＨＢｏＶ１特異的ｑＰＣＲを使用して、ＨＢｏＶ１  ｇｃの数に関して定量化した。最高数のＨＢｏＶ１  ｇｃを含有する画分をＰＢＳに対し透析し、そしてその後電子顕微鏡により観測しかつＨＡＥ培養物を感染させるのに使用した。
【０１８１】
電子顕微鏡検査法（ＥＭ）による観察
最終の精製されたウイルス調製物を約５倍だけ濃縮し、そして炭素膜で被覆された３００メッシュの銅ＥＭグリッドに１分間吸着させ、次いで脱イオン水で５秒間洗浄しかつ１％酢酸ウラニルで１分間染色した。グリッドを風乾し、そして電界放出銃を装備された２００ｋＶのＴｅｃｎａｉ  Ｆ２０  Ｇ２透過型電子顕微鏡で検査した。
【０１８２】
ウイルス感染
完全に分化した初代Ｂ−（３種の異なるサブタイプのそれぞれ）、ＣｕＦｉ−およびＮｕＬｉ−ＨＡＥをＭｉｌｌｉｃｅｌｌインサート（０．６ｃｍ2；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で培養し、そして１５０μＬの精製されたＨＢｏＶ１（リン酸緩衝生理的食塩水、ｐＨ７．４；ＰＢＳ中１×１０7ｇｃ／ｍＬ）を頂端膜側から（約７５０ｇｃ／細胞の感染多重度すなわちＭＯＩで；インサートあたり２×１０6細胞の平均）接種した。ＨＡＥのそれぞれについて、２時間インキュベーション、次いで頂端チャンバー（ａｐｉｃａｌ  ｃｈａｍｂｅｒ）からウイルスを吸引し、そして２００ｍＬのＰＢＳで細胞を３回洗浄して結合されないウイルスを除去した。ＨＡＥをその後ＡＬＩでさらに培養した。
【０１８３】
慣習的単層細胞について、チャンバースライド（Ｌａｂ−Ｔｅｋ  ＩＩ；Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）で培養された細胞を、精製されたＨＢｏＶ１に１，０００ｇｃ／細胞のＭＯＩ
で感染させた。
【０１８４】
免疫蛍光分析
ＨＢｏＶ１感染後、ＡＬＩメンブレンをＰＢＳ中３．７％パラホルムアルデヒドで室温にて１５ｍｉｎ固定した。固定されたメンブレンを数個の小片に切断し、ＰＢＳで５分間３回洗浄し、そして０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で室温で１５分間透過処理した。メンブレンをその後、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中１００倍希釈の一次抗体と３７℃で１時間インキュベートした。これに次いでフルオレセインイソチオシアネート若しくはローダミン結合二次抗体とインキュベートした。共焦点画像を、Ｎｉｋｏｎ  ＥＺ−Ｃ１ソフトウェアにより制御されるＥｃｌｉｐｓｅ  Ｃ１  Ｐｌｕｓ共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、ニューヨーク州メルビル）を用いて撮影した。使用された一次抗体はＣｈｅｎら（２０１０）に報告されたところの抗（ＨＢｏＶ１）ＮＳ１、ＮＰ１およびＶＰ１／２であった。
【０１８５】
チャンバースライド中で培養された感染させた細胞について、ＩＦ分析をＣｈｅｎら（２０１０）に以前に記述されたとおり実施した。
【０１８６】
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析
ウイルスサンプルを頂端および側底双方の膜側から複数の時点で収集した。頂端の洗浄および収集は、２００ｍＬのＰＢＳを頂端チャンバーに添加すること、サンプルを３７℃および５％ＣＯ2で１０分間インキュベートすること、ならびに２００ｍＬのＰＢＳを頂端チャンバーから取り出しかつ保存することにより実施した。その後５０ｍＬの培地を各側底チャンバーから収集した。
【０１８７】
サンプルのアリコート（１００ｍＬの頂端若しくは５０ｍＬの測底）を２５単位のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）とともに３７℃で２時間インキュベートし、そしてその後２０ｍＬのプロテイナーゼＫ（１５ｍｇ／ｍＬ）で５６℃で１０分間消化した。ウイルスＤＮＡをＱＩＡａｍｐ血液ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出し、そして１００ｍＬ若しくは５０ｍＬの脱イオンＨ2Ｏで溶出した。抽出されたＤＮＡを、以前に使用されたｑＰＣＲ法によりＨＢｏＶ１  ｇｃの数に関して定量化した（Ｌｉｎら、２００７を参照されたい）。簡潔には、ＨＢｏＶ１配列（ｎｔ１−５２９９）を含有するｐｓｋＨＢｏＶ１プラスミド（Ｃｈｅｎら、２０１０）を対照として使用して（１ｇｃ＝５．４６１０２１２ｍｇ）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ装置（カリフォルニア州フォスターシティ）での絶対的定量のための標準曲線を確立した。アンプリコンプライマーおよびＰｒｉｍｅＴｉｍｅ二重標識プローブをＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（バージョン２．０．０；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により設計し、そしてＩＤＴ  Ｉｎｃ．（アイオワ州コーラルビル）で合成した。それらの配列は後に続くとおりである（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＱ４１１２５１）。すなわち、フォワードプライマー、５’−ＧＣＡ  ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＣＧＴ  ＧＡＣ  ＧＡＡ−３’（配列番号１；ｎｔ２３９１ないし２４０８）；リバースプライマー、５’−ＴＧＧ  ＡＣＴ  ＣＣＣ  ＴＴＴ  ＴＣＴ  ＴＴＴ
ＧＴＡ  ＧＧＡ−３’（配列番号２；ｎｔ２４６６ないし２４４３）；およびＰｒｉｍｅＴｉｍｅプローブ、５’  ６ＦＡＭ−ＴＧＡ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＡＴＡ  ＴＧＡ  ＡＡＧ  ＡＣＡ  ＡＧＣ  ＡＴＣ  Ｇ−３’  Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＦＱ（配列番号３；ｎｔ２４１１ないし２４４１）。Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  ＵＳＡ、ウィスコンシン州マディソン）を標準的プロトコルに従いｑＰＣＲのため使用した。２．５ｍＬの抽出されたＤＮＡを２５ｍＬの反応容量で使用した。
【０１８８】
組織学分析
感染の最後の日に、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌインサート上のＨＡＥをＰＢＳで洗浄しかつ４％パラホルムアルデヒド中で約３０分間固定した。固定されたメンブレンを数個の小片に
切断しそしてＰＢＳで３回洗浄した。各メンブレン断片を１５ｍＬ円錐管中の２０％ショ糖に移しかつ底部に滴下させ；それをその後、刃に直角なメンブレンの切り出しを可能にした方向で凍結保護物質ＯＣＴ中に垂直に埋め込んだ。クライオスタット切片を１０ｍｍの厚さで切断し、スライド上に置きそしてヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。画像を６０倍の倍率でＮｉｋｏｎ  ８０ｉ蛍光顕微鏡で撮影した。
【０１８９】
結果
ＨＢｏＶ１ゲノムの末端ヘアピンはボカウイルス属のものに典型的である  ＨＢｏＶ１に感染させたＨＡＥ中で同定されたＨＢｏＶ１エピソームのヘッドトゥーテイル結合（Ｓｃｈｉｌｄｇｒｅｎら、２０１２；Ｌａｓｅｂｒｉｎｋら、２０１１）は、ＢＰＶ１の左端ヘアピン（ＬＥＨ）の部分に同一の２配列（３’−ＣＧＣＧＣＧＴＡ−５’および３’−ＧＡＴＴＡＧ−５’）を所有することが見出された（Ｓｕｎら、２００９；Ｃｈｅｎら、１９８６）。この知見はヘッド配列がＨＢｏＶ１  ＬＥＨの一部であることを示唆した。ヘッド配列をリバースプライマー（ＲＨＢｏＶ１＿ＬＥＨ）の３９端として使用した。ＢＰＶ１  ＬＥＨから予測されるＨＢｏＶ１ゲノムの３９端を固定するフォワードプライマー（ＦＨＢｏＶ１＿ｎｔ１）と一緒になって、ＬＥＨのヘアピンを、ＨＢｏＶ１に感染した患者から採取された鼻咽頭吸引物（ＨＢｏＶ１  Ｓａｌｖａｄｏｒ１単離物）（Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏ−Ｃａｒｖａｌｈｏら、２０１２）から調製されたウイルスＤＮＡ抽出液（１．２６１０８ｇｃ／ｍＬ）から増幅した。ただ１本の特異的ＤＮＡバンドがおよそ１５０ｂｐに検出された。
【０１９０】
このＤＮＡの配列決定がＨＢｏＶ１  ＬＥＨの新規配列を示した。原型ボカウイルスＢＰＶ１およびＭＶＣのＬＥＨは非対称である（Ｓｕｎら、２００９；Ｃｈｅｎら、１９８６）ため、別のＰＣＲ反応を、ヘアピン中に位置するフォワードプライマー（ＦＨＢｏＶ１＿ＬＥＨ）およびｎｔ５７６のＬＥＨの下流の配列を標的とするリバースプライマー（ＲＨＢｏＶ１＿ｎｔ５７６）を用いて設定した。約６００ｂｐのバンドとして期待されたとおり検出されたＤＮＡフラグメントの配列決定が、新規結合配列およびＬＥＨの存在を確認した。
【０１９１】
ＨＢｏＶ１のヘッドトゥーテイル結合のテイルは、他の原型ボカウイルスＭＶＣの右端ヘアピン（ＲＥＨ）のもの（Ｓｕｎら、２００９）に同一の配列（５’−ＧＣＧ  ＣＣＴ
ＴＡＧ  ＴＴＡ  ＴＡＴ  ＡＴＡ  ＡＣＡ  Ｔ−３’；配列番号４）を含有することが見出された。従って、ＨＢｏＶ１  ＲＥＨ全体がそのＭＶＣ対蹠物に構造が類似であることが推測された。この配列を標的とされたリバースプライマー（ＲＨＢｏＶ１＿ｎｔ５４６４）およびＲＥＨの上流に位置するフォワードプライマー（ＦＨＢｏＶ１＿ｎｔ５２０１）を使用して、特異的な約３００ｂｐ長のＤＮＡフラグメントを増幅した。配列決定は、予測されたＲＥＨのパリンドロームヘアピンの存在を確認し、そしてヘアピンの端の２個の新規ヌクレオチドを示した。
【０１９２】
これらの結果は、ＨＢｏＶ１ゲノム構造がボカウイルス属に典型的であることを示す。
【０１９３】
完全長ＨＢｏＶ１クローン（ｐＩＨＢｏＶ１）はＨＥＫ２９３細胞中で複製かつ子孫ウイルスを産生することが可能である
ＨＢｏＶ１  Ｓａｌｖａｄｏｒ１単離物の非構造（ＮＳ）およびキャプシド（ＶＰ）タンパク質コーディング（ＮＳＶＰ）遺伝子を、患者で抽出されたウイルスＤＮＡからクローン化および配列決定した。その後、ＬＥＨ、ＮＳＶＰ遺伝子およびＲＥＨをｐＢＢＳｍａＩ中に連結した。該単離物の完全長ゲノムのこの配列をＧｅｎＢａｎｋに寄託し（ＪＱ９２３４２２）、これは本明細書に引用することにより組み込まれる。
【０１９４】
アデノウイルスヘルパー機能がＨＥＫ２９３細胞中のｐＩＨＢｏＶ１複製に必要である
かどうかを検討した。具体的には、ｐＩＨＢｏＶ１をＨＥＫ２９３細胞（処理されない若しくはアデノウイルスに感染させた）に単独で若しくはｐＨｅｌｐｅｒとともにトランスフェクトした。興味深いことに、ｐＩＨＢｏＶ１がヘルパーウイルスの非存在下で良好に複製したことが見出された。事実、全３種の代表的形態の複製されたボカウイルスＤＮＡ（Ｓｕｎら、２００９；Ｌｕｏら、２０１１）（ＤｐｎＩ消化耐性ｄＲＦ  ＤＮＡ、ｍＲＦ  ＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ）が、各テストケースでかつ同様のレベルで検出された。ＤｐｎＩ消化は、ダム部位（ｄａｍ  ｓｉｔｅ）でメチル化されている原核生物細胞から調製されたプラスミドＤＮＡのみを切断する（Ｗｏｈｂｅら、１９８５）ため、ＤｐｎＩ消化耐性ＤＮＡのバンドは細胞中で新たに複製されたＤＮＡである。対照的に、これらＤＮＡの形態のウイルスゲノムはｐＩＨＢｏＶ１でトランスフェクトされた初代気道上皮細胞（ＮＨＢＥ）中で非存在であり、かつ、ｐＩＨＢｏＶ１でトランスフェクトされたヒト気道上皮細胞株ＢＥＡＳ−２Ｂ、Ａ５４９および１６ＨＢＥ１４ｏ−中で、アデノウイルスの存在下であっても非常に低レベル（ｐＩＨＢｏＶ１でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞中より２０倍超より低い）で存在した。従って、これらの細胞中での複製はこれらの状況で非存在であるか若しくは乏しいようである。
【０１９５】
ＤＮＡ複製の特異性およびＤｐｎＩ耐性ＤＮＡのバンドの同一性を確認するため、ｐＩＨＢｏＶ１中のウイルスタンパク質ＮＳ１、ＮＰ１、ＶＰ１およびＶＰ２をコードするＯＲＦを破壊し；対応するウイルスタンパク質の発現のノックアウトをウエスタンブロット分析により確認した。ＮＳ１  ＯＲＦを破壊した場合、ＤｐｎＩ消化耐性ＤＮＡは検出されず、このＤＮＡの複製がＮＳ１を必要とすることを確認した。特に、ＮＰ１  ＯＲＦを破壊した場合、ＲＦ  ＤＮＡバンドが検出されたがしかしそれは非常に弱く、ＮＰ１もまた関与していることを示唆した。ＶＰ２  ＯＲＦをノックアウトした場合はｓｓＤＮＡのバンドが消失したが、しかしこれはＶＰ１を破壊した（ＶＰ２はなお発現された）場合に真実でなく、これらの知見は、パルボウイルスのｓｓＤＮＡゲノムのパッケージングでのキャプシド形成のための役割（Ｃｏｔｍｏｒｅら、２００５；Ｃｈｅｎｇら、２００９；Ｐｌｅｖｋａら、２０１１）と矛盾しない。
【０１９６】
ｐＩＨＢｏＶ１でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞中のｓｓＤＮＡバンドの存在は、子孫ビリオンが産生されたことを示唆した。大スケールのｐＩＨＢｏＶ１トランスフェクションおよびＣｓＣｌ平衡遠心分離法を実施して、生成物であったウイルスを精製した。ＣｓＣｌ勾配を分画し、そして最高のＨＢｏＶ１  ｇｃ（１〜５×１０8ｇｃ／ｍＬ）が、パルボウイルスビリオンに典型的である１．４０ｍｇ／ｍＬの密度で見出された。電子顕微鏡検査法分析は、精製されたウイルスが約２６ｎｍの直径をもつ典型的な正二十面体構造を表したことを示した。
【０１９７】
集合的に、これらの知見は、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞中で複製しかつ子孫ウイルスを産生することが可能なＨＢｏＶ１の完全長クローンが得られたことを確認する。
【０１９８】
ｐＩＨＢｏＶ１でトランスフェクトされた細胞から産生されるＨＢｏＶ１子孫ウイルスは感染性である
ｐＩＨＢｏＶ１でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から精製されたＨＢｏＶ１ビリオンの感染性を、ＨＢｏＶ１感染に対し許容性であることが既知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物モデルである（Ｄｉｊｋｍａｎら、２００９）分極された初代ＨＥＡで検査した。３組（異なるドナー、培養物ロット＃Ｂ２９−１１、Ｂ３１−１１およびＢ３３−１１）のＢ−ＨＡＥを生成し、そしてこれらをＨＢｏＶ１に頂端側から感染させた。最初に、Ｂ−ＨＡＥ培養物を多様な量のウイルスに感染させ、そして約７５０ｇｃ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）を使用した場合、細胞の大部分（約８０％）が感染後（ｐ．ｉ．）５日に抗ＮＳ１染色（ウイルスゲノムが複製したことおよびそれによりコードされる遺伝子が発現
されたことを示す）について陽性であった。このＭＯＩをその後頂端感染に使用した。特に、Ｂ２９−１１、Ｂ３１−１１およびＢ３３−１１  ＨＡＥがそれぞれ生産的ＨＢｏＶ１感染を支援した。ｐ．ｉ．１２日の感染させたＢ３１−１１  ＨＡＥの免疫蛍光（ＩＦ）分析は、事実上全部の細胞がＮＳ１およびＮＰ１を発現したこと、ならびに感染させた細胞のかなりの部分がキャプシドタンパク質（ＶＰ１／２）を発現したことを示した。
【０１９９】
ＨＢｏＶ１感染後の子孫ウイルスの産生を、ＨＡＥ培養物の頂端および側底双方のチャンバーからサンプルを収集すること、ならびにＨＢｏＶ１特異的定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を実施することにより毎日監視した。Ｂ３３−１１  Ｂ−ＨＡＥの場合、頂端放出はｐ．ｉ．３日に明らかに開始し、その後ｐ．ｉ．５〜７日に約１０8ｇｃ／ｍＬのピークまで増大することを継続し、その後ｐ．ｉ．第１０日までわずかに減少し、そしてｐ．ｉ．第２２日まで約１０7ｇｃ／ｍＬのレベルで維持された。２４時間間隔にわたる０．６ｃｍ2の１個のＭｉｌｌｉｃｅｌｌインサートからの総ウイルス収量は２×１０10ｇｃ以上であった。この結果は初代Ｂ−ＨＡＥの生産的ＨＢｏＶ１感染が持続性であることを示唆した。特に、双方のドナーからのＢ−ＨＡＥ培養物中で、ウイルスは、頂端膜側からの放出より約１対数より低いレベルでとは言えずっと頂端分泌と同じペースで側底側からもまた継続的に放出された。感染させたＢ−ＨＡＥから放出される子孫ビリオンのゲノムを増幅および配列決定した。該結果はＨＢｏＶ１  Ｓａｌｖａｄｏｒ単離物（Ｇｅｎｂａｎｋ
ＪＱ９２３４２２）のものと同一の配列を示した。加えて、偽似感染させたＢ−ＨＡＥ中でウイルスは検出されなかった。
【０２００】
一緒にすれば、これらの結果は、ｐＩＨＢｏＶ１トランスフェクションにより産生されるＨＢｏＶ１ビリオンが、多様なドナー由来の細胞からの分極された初代ＨＡＥ培養物を感染させ、および感染させた初代ＨＡＥから同一の子孫ビリオンを放出することが可能であることを示す。より重要には、われわれは生産的ＨＢｏＶ１感染が持続的であったことを見出した。
【０２０１】
初代Ｂ−ＨＡＥのＨＢｏＶ１感染は気道傷害の特徴を特徴とする
肉眼的細胞変性効果は（ｇｒｏｓｓ  ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）ＨＢｏＶ１に感染させたＢ−ＨＡＥで観察されなかったとは言え、偽似対ＨＢｏＶ１感染上皮（Ｂ３３−１１）の組織学分析は形態学的差違を示した。すなわち、感染させたＢＨＡＥはｐ．ｉ．７日に明白な繊毛を特徴とせず、また、平均してｐ．ｉ．２２日に、偽似感染させたものよりかなりより薄かった。経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）をＢ−ＨＡＥの感染中に監視し、そして、ｐ．ｉ．６日にそれが約１，２００の値から約４００(．ｃｍ2まで低下した一方、偽似感染させたＢ−ＨＡＥは初期ＴＥＥＲを維持したことを見出した。特に、感染させたＢ−ＨＡＥ中のＴＥＥＲの低下はＨＢｏＶ１分泌の増大により伴われた。
【０２０２】
上皮の障壁機能の破壊においてＨＢｏＶ１感染が果たす役割を確認するため、タイトジャンクション構成タンパク質ＺＯ−１（Ｚｏｎａ  ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ−１）の分布を検査した（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｍａｒｉｓｃａｌら、２００３）。感染させたＢ−ＨＡＥは、偽似感染させたＢ−ＨＡＥと比較してｐ．ｉ．７日から開始される細胞の周縁からのＺＯ−１の解離を示し、これはＴＥＥＲを低下させることにおいてある役割を演じていることがありそうである。累積的に、これらの結果は、ＨＢｏＶ１感染がＨＡＥの完全性を破壊すること、およびこれがタイトジャンクション構成タンパク質ＺＯ−１の極性および再分布の破壊を伴いうることを示す。繊毛の喪失におけるＨＢｏＶ１感染の役割を確認するため、われわれは繊毛のマーカーである（Ｍａｔｒｏｓｏｖｉｃｈら、２００４；Ｖｉｌｌｅｎａｖｅら、２０１２）ｂ−チューブリンＩＶの発現を検査した。ＨＢｏＶ１に感染させたＢ−ＨＡＥにおいて、β−チューブリンＩＶの発現は、偽似感染させたＢ−ＨＡＥ中のものと対照的に、ｐ．ｉ．７日に劇的に減少しそしてｐ．ｉ．２２日に検出されなかった。これらの結果は、ＨＢｏＶ１感染が感染させたＢ−ＨＡ中の繊毛の喪失を引き起こ
したことを確認した。特に、感染させたＢ−ＨＡＥはｐ．ｉ．２２日に明らかになった核増大の変化を示し、気道上皮細胞肥大を示している。
【０２０３】
集合的に、生産的ＨＢｏＶ１感染がタイトジャンクション障壁を破壊したことが見出され、繊毛の喪失および気道上皮細胞肥大につながる。これらは、上皮細胞の極性の喪失が起こる場合の気道傷害の特徴である。
【０２０４】
不死化ヒト気道上皮細胞株は細胞が分極される場合にＨＢｏＶ１感染を支援する
初代ＨＡＥ培養物はＨＢｏＶ１感染を支援するとは言え、それらの有用性は、ドナー間の変動性、組織の入手可能性および高い費用により制限される。ＨＢｏＶ１感染を支援するそれらの能力についての代替の細胞培養物モデルを探求した。精製されたＨＢｏＶ１を使用し、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＭＲＣ−５、ＬＬＣ−ＭＫ２およびＶｅｒｏ−Ｅ６を包含する普遍的呼吸器ウイルスに対し許容性の他の普遍的上皮細胞株（Ｒｅｉｎａら、２００１）、ならびに数種の形質転換若しくは不死化されたヒト気道上皮細胞株（Ａ５４９、ＢＥＡＳ−２Ｂ、１６ＨＢＥ１４ｏ−（Ｃｏｚｅｎｓら、１９９４）、ＮｕＬｉ−１およびＣｕＦｉ−８（Ｚａｂｎｅｒら、２０１３）、ならびに初代ＮＨＢＥ細胞を包含する他の細胞を、感染を支援する能力について慣習的単層培養物中で検査した。全部が、ＩＦ分析により決定されるところのＨＢｏＶ１感染について陰性であった。数種の呼吸器ウイルスは分極されたＨＡＥを感染させるがしかし未分化細胞はしない（Ｐｙｒｃら、２０１０）ため、分極された上皮のいくつかの特徴がＨＢｏＶ１感染に決定的に重要でありうることが推測された。従って、不死化された細胞（ＮｕＬｉ−１およびＣｕＦｉ−８）を空気−液体界面（ＡＬＩ）で１か月間分極させた。分極が５００Ω．ｃｍ2より大きいＴＥＥＲの検出により一旦確認されれば、培養物を、初代Ｂ−ＨＡＥ培養物について使用されたと同一の条件下でＨＢｏＶ１に感染させた。特に、ＩＦ分析は、ｐ．ｉ．１０日に、ＨＢｏＶ１に感染させたＣｕＦｉ−ＨＡＥ（ＣｕＦｉ−８細胞から分化した）がＮＳ１について均一に陽性であった一方、ＨＢｏＶ１に感染させたＮｕＬｉ−ＨＡＥ（ＮｕＬｉ−１細胞から分化した）はそうでなかったことを示した。さらに、ＣｕＦｉ−ＨＡＥはＨＢｏＶ１のＮＳ１、ＮＰ１およびＶＰ１／ＶＰ２タンパク質を発現した。頂端膜側からのウイルス放出のキネティクスは、同様の力価（最高で２６１０７ｇｃ／ｍＬ）でウイルスに感染させた初代Ｂ−ＨＡＥのものと同様であったとは言え、側底膜側からのウイルス放出は検出不可能であった。ＨＢｏＶ１感染は、上皮の厚さの減少、およびタイトジャンクション構成タンパク質ＺＯ−１の上皮細胞周縁からの解離もまたもたらした。
【０２０５】
集合的に、これらの知見は、不死化細胞株ＣｕＦｉ−８（Ｚａｂｎｅｒら、２００３）が、ＡＬＩで培養かつ分極される場合に、ＨＢｏＶ１感染を支援し、および気道上皮構造の破壊を包含する初代ＨＡＥで観察される感染の表現型を反復することを示す。
【０２０６】
考察
完全長ＨＢｏＶ１ゲノムをクローン化しそしてその末端ヘアピンを同定した。このクローンのＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクションから産生されるビリオンは、分極されたＨＡＥ培養物を感染させることが可能である。かように、ＨＡＥのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物モデル系を使用して、ＨＢｏＶ１の分子生物学および病態形成を研究することに対するきわめて重要な障壁を克服するリバースジェネティックス系が確立された。
【０２０７】
ＨＢｏＶ１末端ヘアピンは、ＬＥＨで原型ボカウイルスＢＰＶ１の、しかしＲＥＨでＭＶＣのハイブリッド残存種であるようである（Ｓｃｈｉｌｄｇｒｅｎら、２０１２）ことは注目に値する。ＨＥＫ２９３細胞中のＨＢｏＶ１  ＤＮＡの複製はパルボウイルスＤＮＡの典型的な複製中間体を示した。ヘッドトゥーテイル結合は自律性パルボウイルスの複製で予期されないとは言え、それらがローリングヘアピン依存性ＤＮＡ複製のサイクル中に生成されることがありそうであった（Ｃｏｔｍｏｒｅら、１９８７）。従って、ＨＢｏ
Ｖ１  ＤＮＡの複製は基本的に、ＲＥＨおよびＬＥＨでそれぞれ末端および連結の解離を伴う自律性パルボウイルスのローリングヘアピン依存性ＤＮＡ複製のモデル（Ｃｏｔｍｏｒｅら、１９８７）に従うことが考えられる。パルボウイルスＤＮＡの複製は細胞周期のＳ期への進入若しくはヘルパーウイルスの存在に依存する（Ｃｏｔｍｏｒｅら、１９８７；Ｂｅｒｎｓら、１９９０）。この点に関して、成熟した傷害されていない気道上皮は、（細胞周期のＧ０期の）分極されたＨＡＥ中の細胞の大多数がそうであるように、有糸分裂が静止状態である（細胞分裂の１％未満）（Ｗａｎｇら、１９９９；Ｌｅｉｇｈら、１９９５；Ａｘｅｒｓら、１９８８）ことは困惑させる。しかしながら、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ；パルボウイルス科のデペンドウイルス属の）はＨＡＥを頂端で感染させかつレポーター遺伝子を発現する。組換えＡＡＶによる遺伝子発現は、転写されることが可能である二本鎖ＤＮＡの形態へのｓｓＤＮＡウイルスゲノムの転換を必要とする。この転換はＤＮＡ合成を必要とする。これゆえ、ＨＢｏＶ１はその複製可能な形態のＤＮＡを合成するために類似のアプローチを使用することが仮定された。特に、野生型ＡＡＶは初代ＨＡＥを頂端で感染させ、そしてアデノウイルスを共感染させた場合に複製した。ＨＢｏＶ１が正常ＨＡＥ中でどのように複製するかの正確な機構はさらなる検討のための興味深いトピックとなるであろう。
【０２０８】
繊毛性の偽重層円柱状上皮である気道上皮は吸入された微生物に対する最初の障壁となり、そして呼吸器病原体の進入を積極的に予防する。それは、粘膜の免疫系と一緒になって、吸入された微生物の粘液繊毛クリアランスのための局所防御機構を提供する、繊毛細胞、基底細胞および分泌性杯細胞よりなる。単離された気管気管支上皮細胞をＡＬＩで平均１か月間増殖させることにより生成される分極された繊毛性初代ＨＡＥは、偽重層粘液繊毛性上皮を形成し、そして肺のｉｎ  ｖｉｖｏヒト軟骨性気道上皮のものに似ている形態学的および表現型の特徴を表す。最近の研究は、このモデル系が呼吸器ウイルスとそれらの宿主細胞の間の相互作用の重要な特徴を反復していることを示した。
【０２０９】
本研究において、３名の異なるドナーから得られた初代Ｂ−ＨＡＥ培養物を検査した。初代Ｂ−ＨＡＥのＨＢｏＶ１感染は持続性であり、そして上皮の形態学的変化すなわち密着障壁結合（ｔｉｇｈｔ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）の破壊、繊毛の喪失および上皮細胞肥大を引き起こした。前者すなわち単層の分極された上皮細胞の周囲長を封止する原形質膜構造の喪失は、方向性の分泌、吸収および輸送を維持するのに必要な細胞障壁を損傷することが既知である。ここで監視されたＺＯ−１はタイトジャンクションと特異的に会合し、そしてこれらの構造の標準的マーカーを存続する。同様に、繊毛は、それらが杯細胞により外側に分泌される粘液に接着する吸入された粒子を駆動することにおいて、気道上皮で重要な役割を演じている。ＨＢｏＶ１感染は障壁機能を損ない、そして従ってアレルゲンに対する気道上皮の透過性および微生物による二次感染に対する感受性を潜在的に増大させる。感染させた初代ＨＡＥの側底膜側からのウイルスの観察された排出は、たとえより低レベル（頂端膜側からのものより約１対数より低い）であっても、ＨＢｏＶ１感染が偽重層上皮障壁の極性を破壊しかつ側底チャンバーへの漏出をもたしたという事実と矛盾しない。この説明は、タイトジャンクション構造の破壊がより小さくひどくかつウイルスが頂端膜からのみ放出されたＣｕＦｉ−ＨＡＥのＨＢｏＶ１感染によってもまた裏付けられる。ＨＢｏＶ１による漏出の誘発は、ＨＢｏＶ１に感染した患者で観察されるウイルス血症を説明する機構もまた示唆する。さらなる疾患病理学が、気道上皮の繊毛の感染に誘発される喪失により説明されることができ；繊毛の喪失はしばしば気管支炎の原因である。従って、該データは、ＨＢｏＶ１が、肺のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルとしてはたらく分極されたＨＡＥに対し病原性であるという直接の証拠を提供する。ＨＢｏＶ１は急性喘鳴のため入院させられた乳幼児で他の呼吸器ウイルスとともに頻繁に検出されるため、ＨＢｏＶ１に感染させたＨＡＥで観察される明白な病理学的変化は、ＨＢｏＶ１の以前の感染が該患者での共感染に駆動される病因の進行を助長することがありそうであることを示唆している。
【０２１０】
ｐＩＨＢｏＶ１（臨床Ｓａｌｖａｄｏｒ１単離物からクローン化された）の子孫ウイルスに感染させたＨＡＥの頂端チャンバーからのウイルス放出のキネティクスは、臨床検体ＨＩＢｏＶ１  Ｂｏｎｎ１単離物への感染後のもの（Ｄｉｊｋｍａｎら、２００９）と同様であった。初代ＨＡＥのＨＢｏＶ１感染の本研究が臨床検体からのウイルスの感染を再現していることが考えられる。加えて、ウイルスは、原型ＨＢｏＶ１  ｓｔ２単離物（Ａｌｌａｎｄｅｒら、２００５）からのＮＳＶＰ遺伝子を含有するｐＩＨＢｏＶ１−ｂクローンから生成された。このｓｔ２ウイルスへの初代Ｂ−ＨＡＥの感染は、Ｓａｌｖａｄｏｒ１単離物を使用してここで観察されたものに類似のウイルス産生のレベルをもたらした。実験室で製造されたＨＢｏＶ１  Ｓａｌｖａｄｏｒ１を用いる研究はＨＡＥ中で臨床検体のＨＢｏＶ１の感染を表すことが考えられる。本研究で感染のため使用されたＭＯＩは高かった。しかしながら、ＨＢｏＶ１調製物の感染力価を決定するための実際的方法が存在しないため、この力価はビリオン粒子の物理的数に基づくことに注意すべきである。広範囲のパルボウイルス不活性化が精製過程すなわちＣｓＣｌ平衡超遠心分離法中に発生する（ＭｃＣｌａｒｅら、２０１１）こともまた考慮に入れるべきである。ＨＡＥのウイルス感染が、呼吸器分泌物中の高いウイルス量を伴う患者における肺気道のＨＢｏＶ１感染を反映していることが最もありそうである（Ｊａｒｔｉｉら、２０１１）。
【０２１１】
ｐＩＨＢｏＶ１が分化していないヒト気道上皮細胞中で十分に複製しなかったという事実は、ＨＡＥの分極および分化がＨＢｏＶ１  ＤＮＡの複製に決定的に重要であることを示す。にもかかわらず、正常ヒト気道上皮細胞由来である分極されたＮｕＬｉ−ＨＡＥはＨＢｏＶ１感染を支援しなかったが、しかし嚢胞性線維症患者から単離された気道上皮細胞由来のＣｕＦｉ−ＨＡＥは支援した。ＣｕＦｉ−ＨＡＥは、それがＮａ＋で積極的に輸送するがしかし嚢胞性線維症遺伝子中の突然変異のためＣｌ２はしない上皮を発生させる能力を保持している（Ｚａｂｎｅｒら、２００３）ため、他者に関して独特である。気道上皮の高度の複雑さを考え、われわれは、ＨＢｏＶ１感染の許容性が、ウイルス感染の多様な段階例えばウイルスの付着、侵入、細胞内トラフィッキングおよびＤＮＡ複製に依存すると推測する。にもかかわらず、ＣｕＦｉ−８細胞株由来の分極されたＣｕＦｉ−ＨＡＥモデルは、ＨＢｏＶ１の感染の特徴への予期されない洞察を提供している新規の安定な細胞培養物モデルを表す。ＣｕＦｉ−ＨＡＥのＨＢｏＶ１感染は初代Ｂ−ＨＡＥでもまた見られるもののような障壁タイトジャンクションの破壊を再現したとは言え、側底側でのウイルスの非存在は、ＨＡＥ中でＨＢｏＶ１の分泌が頂端で分極されていることを意味している。これらの細胞中のタイトジャンクションのより軽度の損傷が、感染させたＣｕＦｉ−ＨＡＥの側底側からのウイルス放出を予防しうることが推測される。さらなる研究は、ＨＢｏＶ１感染に対するＣｕＦｉ−ＨＡＥの許容性を理解すること、およびある嚢胞性線維症表現型をもつＨＡＥの感染の容易さの理由に集中するであろう。
【０２１２】
ＨＢｏＶ１が数週間および数か月間、半年までさえ、患者の上気道で検出可能なままであることが示されている（Ｂｌｅｓｓｉｎｇら、２００９；Ｍａｒｔｉｎら、２０１０；Ｂｒｉｅｕら、２００８；Ｌｅｈｔｏｒａｎｔａら、２０１０）。しかしながら、この持続性の裏にある機構、すなわちそれが持続的複製および排出、一次感染後の受動的持続性、若しくは繰り返す粘膜表面汚染によるのかどうかは、未知のままである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＨＡＥ培養物での本結果は、ＨＢｏＶ１が複製しかつ頂端および側底双方の膜側から最低３週間排出することが可能であることを示し、気道からのウイルスの排出が長期持続する過程であるという概念を裏付けている。これは、ＨＢｏＶ１と他の呼吸器ウイルスの間の共感染若しくは共検出の高い比率がなぜ報告されているかをさらに説明しうる。組換えＡＡＶは、遺伝子発現を延長する形質導入された組織中のエピソームとして持続するため、ＨＢｏＶ１ゲノムもまた長期の発現および複製のためのエピソームとして提示され得ることが可能である。見たところ、ＨＢｏＶ１感染のこの機能の根底にある機構はさらなる検討を正当化する。しかしながら、他のヒト病原性Ｂ１９Ｖと対照的に、ＨＢｏＶ１
は長年ヒト組織中に持続するようではない（Ｎｏｒｊａら、２０１０）。
【０２１３】
結論として、ＨＢｏＶ１のリバースジェネティクス系は、ｉｎ  ｖｉｖｏのヒト軟骨性気道上皮の自然のＨＢｏＶ１感染を模倣する。他の呼吸器ウイルスとの共感染および肺疾患の状態におけるＨＢｏＶ１の病態形成が今後の研究の１焦点である。
【実施例２】
【０２１４】
感染させたＨＡＥの頂端洗浄液中の子孫ＨＢｏＶ１ビリオンは分極された初代ＨＡＥ中で高度に感染性である。
【０２１５】
実施例１において、ＨＢｏＶ１ビリオンをＨＢｏＶ１の感染性クローンでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から製造し、これを塩化セシウム平衡超遠心分離法によりさらに濃縮かつ精製した。この過程中にかなりのウイルス不活性化が発生し（ＭｃＣｌｕｒｅら、２０１１）、そしてウイルスの正確な感染性は決定することが困難であった。しかしながら、子孫ビリオンは、感染させたＨＡＥの頂端膜側から高力価（約１．０×１０7ｖｇｃ／μＬ）で持続的に分泌された（Ｈｕａｎｇら、２０１２）。これゆえ、頂端膜側から洗浄された子孫ビリオンは、ＨＢｏＶ１に感染した肺気道からの天然に分泌されるビリオンを模倣し、そして従って高度に伝染性であることが仮定された。
【０２１６】
この仮説を試験するため、分極された初代ＨＡＥ培養物を、Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａから０．６ｃｍ2のＭｉｌｌｉｃｅｌｌTMインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で得た。これら培養物は、以前に記述された（Ｋａｒｐら、２００２；Ｙａｎら、２００４；Ｚａｂｎｅｒら、１９９６）とおり単離されたヒト気道（気管気管支）上皮細胞をＡＬＩで増殖させることにより作成した。インサートを１ｍＬのＡＬＩ培地を含む６ウェル組織培養プレートのウェル中で保管した。精製されたＨＢｏＶ１に感染させた初代ＨＡＥ培養物の頂端洗浄液から収集された（Ｈｕａｎｇら、２０１２）ＨＢｏＶ１子孫ビリオンの感染を、頂端膜側から１００から０．００１ｖｇｃ／細胞までの範囲にわたられたＭＯＩで初代ＨＡＥ培養物中で分析した。１５０μＬのＡＬＩ培地で希釈されたＨＢｏＶ１ビリオン（Ｈｕａｎｇら、２０１２）を頂端チャンバーに適用した。ＨＡＥ培養物を３７℃および５％ＣＯ2で２時間インキュベートした。接種物を除去しかつ頂端膜側を０．４ｍＬのリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した後に、培養物をインキュベーターに戻した。頂端感染後の子孫ビリオンの産生を、ＨＡＥ培養物の頂端および側底双方のチャンバーからサンプルを収集することにより毎日監視した。特に、ＨＢｏＶ１ビリオンは全部のこれらの接種されたＨＡＥ培養物から放出された。しかしながら、ピークウイルス分泌までの時間はより低いＭＯＩでより長かった。これらの時間は、１００、１０、１、０．１、０．０１および０．００１ｖｇｃ／細胞のＭＯＩについてそれぞれ感染後（ｐ．ｉ．）６、９、１２、１５、２３および２４日であった。ピークでの放出されるビリオンの収量は低下されたＭＯＩと一緒にわずかに減少したとは言え、約１０8ｖｇｃ／μＬの収量が１００〜０．１ｖｇｃ／細胞からのＭＯＩでの感染で一貫して検出され、また、約１０7ｖｇｃ／μＬの収量が０．０１および０．００１ｖｇｃ／細胞のＭＯＩで検出された。偽似感染させたＨＡＥは双方の表面からのウイルス放出を有しなかった（定量的ＰＣＲにより検出不可能）。これらの結果は、ＨＢｏＶ１がＨＡＥ中でゆっくり若しくは持続的に複製することを示唆する。
【０２１７】
次に、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を多様なＭＯＩでの感染の経過中に監視した。感染させたＨＡＥ培養物の全部のＴＥＥＲは、入力ＭＯＩと相関した減少の開始（１００、１０、１、０．１、０．０１および０．００１ｖｇｃ／細胞からのＭＯＩについてそれぞれｐ．ｉ．３、５、７、７、９、１１日に）を伴い劇的に減少した。ある程度まで、ＴＥＥＲの減少する曲線はウイルス放出の増大された傾向と相関した。にもかかわらず、全部の
接種されたＨＡＥ培養物の最終ＴＥＥＲは、感染の終了までに４００Ω・ｃｍ2未満の値に減少し、偽似感染させたＨＡＥのものと比較して約２〜３倍の減少であった。気道上皮の破壊は組織学的にもまた観察された。偽似感染させたＨＡＥと比較して、上皮の厚さおよび繊毛の存在として示される感染の終了時の気道上皮損傷の程度は、入力ウイルスのＭＯＩと相関した。特に、１００ｖｇｃ／細胞のＭＯＩを接種されたＨＡＥは漸進的な組織学的変化を示した。ｐ．ｉ．１２日に、１００ｖｇｃ／細胞のＭＯＩで接種されたＨＡＥの平坦化は、０．１ないし０．００１ｖｇｃ／細胞のＭＯＩを接種されたＨＡＥについてｐ．ｉ．２６〜２８日に観察されたものに似ていた。さらに、ＨＢｏＶ１感染により引き起こされる上皮損傷は、以下のアッセイ、すなわち１）ＭＯＩ  １００〜０．１ｖｇｃ／細胞で感染させたＨＡＥ中で非存在でありかつ０．０１および０．００１ｖｇｃ／細胞のＭＯＩできわめて低かった、有意に低下されたβ−チューブリンＩＶ（繊毛のマーカー（Ｍａｔｒｏｓｏｖｉｃｈら、２００４；Ｖｉｌｌｅｎａｖｅら、２０１０））とのＨＢｏＶ１  ＮＳ１の共検出；２）タイトジャンクション構成タンパク質ＺＯ−１（Ｚｏｎａ  ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ−１）（１１）の解離；ならびに３）後期感染での核増大により実証された。感染後早期に、ＮＳ１を発現する細胞は優勢にβ−チューブリンＩＶをほとんど若しくは全く含有せず、かつ、解離されたＺＯ−１染色を有し（ＭＯＩ＝１００ｖｇｃ／細胞、ｐ．ｉ．５日）、ウイルスが非繊毛細胞を最初に感染させること若しくは繊毛がウイルス複製の経過中早期に脱落されることのいずれも示唆している。
【０２１８】
集合的に、ＡＬＩ頂端膜側から洗浄された分泌された子孫ＨＢｏＶ１ビリオンは、分極された初代ＨＡＥ中で高度に感染性であり、そして０．００１ｖｇｃ／細胞と同じくらい低いＭＯＩででさえ感染させた偽重層気道上皮の重度の損傷を引き起こすことが示された。
【０２１９】
ＨＢｏＶ１は分極された初代ＨＡＥを側底膜側から感染させることが可能である。
【０２２０】
初代ＨＡＥのＨＢｏＶ１頂端感染は持続性であり、そしてその子孫ビリオンは頂端および側底双方の膜側から分泌された（実施例１）。しかしながら、ＨＢｏＶ１が側底膜側から初代ＨＡＥを感染させるかどうかはわかりにくいままである。この疑問に対処するため、ナイーブな初代ＨＡＥに、上で使用されたところの頂端で洗浄されたＨＢｏＶ１ビリオンを１ｖｇｃ／細胞のＭＯＩの側底で接種した。
【０２２１】
側底感染のため、ＨＢｏＶ１ビリオンをＨＡＥ培養物の側底チャンバー中で１ｍＬのＡＬＩ培地で希釈した。培養物を３７℃かつ５％ＣＯ2で２時間インキュベートした。その後側底接種物を除去しかつ１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。新鮮培地の添加後に培養物をインキュベーターに戻した。側底接種後の子孫ビリオンの産生を、頂端および側底双方のチャンバーからサンプルを収集することにより毎日監視した。側底接種後、頂端ウイルス分泌はゆっくりとしかしｐ．ｉ．１６日の約５×１０7ｖｇｃ／μＬのピークまで増大した。ビリオン放出は感染の経過を通じて１０6ｖｇｃ／μＬを上回るレベルで維持された。子孫ビリオンは側底接種後に側底膜側からもまた放出されたが、しかし感染の経過にわたり頂端膜側からのものより約１対数より少ないレベルでであり、これは頂端感染後に観察されたものと同様である。この結果は、側底膜側からのＨＡＥのＨＢｏＶ１感染もまた、頂端感染後に観察されたものと同様に持続性に生産的であることを示唆する。
【０２２２】
ＴＥＥＲもまた側底感染中に監視した。偽似感染させたＨＡＥ培養物のＴＥＥＲは実験期間中一貫して約１０００Ω・ｃｍ2のレベルであった一方、側底で接種されたＨＡＥのＴＥＥＲは、徐々にそして頂端で接種されたＨＡＥ（ＭＯＩ＝１）でわずかにより早く（ｐ．ｉ．１３日）見られた約４００Ω・ｃｍ2の値にｐ．ｉ．１５日に下落した。この結果はウイルス放出のキネティクスと一致し、ＨＢｏＶ１感染が上皮障壁を破壊することを示す。側底で接種されたＨＡＥは、偽似感染させたＨＡＥ中のものと比較してタイトジャ
ンクションの明瞭な解離を示した。
【０２２３】
感染の終了までに、ｐ．ｉ．２２日に、側底で接種されたＨＡＥの組織学分析を実施した。偽似対照と対照的に、感染させたＨＡＥは繊毛の非存在および明らかにより薄い上皮を示した。この観察結果はβ−チューブリンＩＶ発現の非存在によりさらに確認された。感染させたＨＡＥは後期感染で核増大もまた示した（ＤＡＰＩ）。
【０２２４】
一緒にすれば、これらの結果は、ＨＢｏＶ１が分極された初代ＨＡＥを側底膜側から感染させることが可能であることを示す。それらは、側底感染が持続性に生産的であり、繊毛の喪失を引き起こし、そして究極的には上皮のタイトジャンクション障壁を破壊することもまた示す。しかしながら、頂端ＨＢｏＶ１感染と比較すると、側底感染はより少なく効率的であり、ＨＢｏＶ１感染がより強い頂端向性を有することを示唆する。側底感染は、ＨＢｏＶ１ウイルス血症（Ｋａｎｔｏｌａら、２００８；Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏ−Ｃａｒｖａｌｈｏら、２０１２）が患者の肺気道全体でウイルス感染を助長しうることを示唆する。
【０２２５】
全体として、本研究は、ＨＢｏＶ１が、分極された初代ＨＡＥを低いＭＯＩで頂端および側底双方の膜側で増殖性に感染させることを示す。成熟かつ傷害されない気道上皮は有糸分裂的に静止状態（細胞分裂の１％未満）である（Ａｙｅｒｓら、１９８８；Ｌｅｒｇｈら、１９９５；Ｗａｎｇら、１９９９）。
【実施例３】
【０２２６】
材料および方法
プラスミド。ｐＩＨＢｏＶ１は５５４３ｂｐの完全長ＨＢｏＶ１ゲノムを含有する感染性クローンプラスミドである（Ｈｕａｎｇら、２０１２）。ｐｒＨＢｏＶ１−ＣＢＡｌｕｃは、ｐＩＨＢｏＶ１由来の組換えＨＢｏＶ１（ｒＨＢｏＶ１）導入プラスミドであり、そして、ＨＢｏＶ１ゲノムの２．６４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントを、ＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ−アクチンプロモーターに駆動されるルシフェラーゼ遺伝子を含有する２．７４ｋｂのフラグメントにより置換することにより構築した。ＨＢｏＶ１  ＤＮＡ複製において不可欠の役割を演じるＮＰ１遺伝子を、生じるｐｒＨＢｏＶ１−ＣＢＡｌｕｃプラスミド中で完全に除去した。組換えによるレスキューされた野生型ウイルスの可能性を低下させるため、５’存続された（５’  ｒｅｍａｉｎｅｄ）ＮＳ遺伝子コーディング領域を、平滑末端ライゲーションを使用するＢｓｐＥ１部位の排除によりさらに破壊し、そして３’ＶＰ部分的コーディング領域を、１４５ｂｐのＰｓｔＩないしＥｃｏＲＩフラグメントの除去によりさらに欠失した。ヘルパープラスミドｐＨＢｏＶ１ＫＵｍ６３０は末端反復を伴わない５２９９ｂｐのＨＢｏＶ１ゲノム（９９ないし５３９５ｎｔ）（Ｃｈｅｎら、２０１０）を内部に持ち、Ｐ５プロモーターおよび３’ポリＡシグナルがウイルス遺伝子の発現のため保持されている。ｐＡＶ−Ｒｅｐ２およびｐＡＤ４．１は、以前に記述されたところの２９３細胞中のプロウイルスプラスミドからのｒＡＡＶ２ゲノムのレスキューおよび複製を支援するヘルパープラスミドである。ｐＡＶ２−Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を駆動する１８０ｂｐの合成プロモーターを伴う４．８５ｋｂのｒＡＡＶプロウイルスゲノムを含有するｒＡＡＶ２シス導入プラスミドである。ｐＡＶ２−ＣＦ５ｔｇ８３ｌｕｃはｐＡＶ２−Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃのより長い形態であり、そして１８０ｂｐの合成プロモーターの上流に６００ｂｐのスタッファ配列を挿入してｒＡＡＶ２プロウイルスゲノム長さ５．４ｋｂを生成することにより派生された。ｐＡＶ２−ＣＢＡｈＣＦＴＲは、５８０ｂｐのＣＭＶ  ＩＥエンハンサーおよびβ−アクチンプロモーター（ＣＢＡプロモーター）、５０ｂｐの合成ポリＡシグナル、ならびに５６ｂｐの５’ＵＴＲおよび４５ｂｐの３’ＵＴＲを含有する４４４３ｂｐのヒトＣＦＴＲ  ｃＤＮＡを含むヒトＣＦＴＲ発現カセットを含有する、過大な５．５ｋｂのｒＡＡＶ２プロウイルスゲノムを内部に持つ。
【０２２７】
組換えウイルス製造。ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶ２／２．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃおよびＡＶ２／１．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃは、Ｙａｎら（２００６）に記述されるところのアデノウイルスを含まない系をＨＥＫ２９３細胞中で使用する三重プラスミドコトランスフェクションにより生成し；この系は、それぞれ２：３：１の比でトランスフェクトされるｒＡＡＶトランスヘルパープラスミドｐＡＶＲＣ２．３、アデノウイルスヘルパープラスミドｐＡＤ  Ｈｅｌｐｅｒ  ４．１およびｒＡＡＶ２プロウイルスプラスミドｐＡＶ２−Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃを使用する。ｒＨＢｏＶ１ベクターストック（ＨＢｃ．ＣＢＡｌｕｃ）は、それぞれ３：１の比のヘルパーｐＨＢｏＶ１ＫＵｍ６３０およびプロウイルスプラスミドｐｒＨＢｏＶ１−ＣＢＡｌｕｃのＨＥＫ２９３細胞中へのコトランスフェクションにより生成した。キメラｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターは、ｒＡＡＶシスプロウイルスプラスミドと一緒になったｐＡＶ−Ｒｅｐ２、ｐＡｄ４．１、ｐＨＢｏＶ１ＫＵｍ６３０のそれぞれ１．５：３：３：１の比でのＨＥＫ２９３細胞中へのコトランスフェクション後にｒＡＡＶゲノムをＨＢｏＶ１キャプシド内にシュードタイピングすることにより生成した。キメラベクター製造に使用されたｒＡＡＶプロウイルスプラスミドは、ｐＡＶ２−Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃ（４．８ｋｂ）、ｐＡＶ２−ＣＦ５ｔｇ８３ｌｕｃ（５．４ｋｂ）およびｐＡＶ２−ＣＢＡｈＣＦＴＲ（５．５ｋｂ）であった。全部のウイルスをトランスフェクション後７２時間に細胞ペレットから回収し、そして細胞粗ライセートをＹａｎら（２０１３）に記述されるところのｒＡＡＶベクター製造についてのとおり処理した。ＤＮアーゼＩ消化後に全部のウイルスを２回のＣｓＣｌ超遠心分離法により精製し、そしてＰＢＳに対し透析した。ＤＮアーゼＩ耐性粒子（ＤＲＰ）としてのウイルス調製物の力価をＴａｑＭａｎリアルタイム定量化ＰＣＲにより測定し、そしてルシフェラーゼ遺伝子に対する32Ｐ標識プローブを使用するスロットブロットアッセイ（Ｙａｎら、２０１３）で確認した。
【０２２８】
ウエスタンブロッティング。５×１０9ＤＲＰのｒＡＡＶ２およびキメラｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ニトロセルロースメンブレンへの転写後に、２色ウエスタンを、マウス抗ＡＡＶキャプシドモノクローナル抗体Ｂ１（１：１０００）およびラット抗ＨＢｏＶ１  ＶＰ２抗血清（ＶＰ１およびＶＰ２双方のタンパク質を認識する）（Ｃｈｅｎら、２０１０）（１：２００）を用いて実施した。赤外検出は１０，０００倍希釈の二次抗体ヤギ抗マウスＩＲＤｙｅ７００（赤色、ＡＡＶについて）およびヤギ抗ラットＩＲＤｙｅ８００（緑色、ＨＢｏＶ１について）を使用した。画像をその後、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外画像装置を使用して走査した。
【０２２９】
細胞培養およびウイルス感染条件。ＨＥＫ２９３およびＩＢ３細胞を、１０％ウシ胎児血清およびペニシリン−ストレプトマイシンを補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で単層として培養し、そして３７℃のインキュベーター中５％ＣＯ2で維持した。未分化の不死化ＣＦヒト気道細胞（ＣｕＦｉ８）を気管支上皮細胞増殖培地（ＢＥＧＭ、Ｌｏｎｚａ）（Ｚａｂｎｅｒら、２００３）中で単層として培養した。分極された初代ヒト気道上皮は肺移植片気道組織から以前に記述された（Ｙａｎら、２００４；Ｋａｒｐら、２００２）とおり生成し、そしてＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＩｏｗａのＴｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｒｅ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ
ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙから得た。上皮を１２ｍｍのＭｉｌｌｉｃｅｌｌメンブレンインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で増殖させ、そして使用前に空気−液体界面で２％ＵＳＧ培地で分化させた。ＣｕＦｉ８細胞のＡＬＩでの分極は初代ＨＡＥに類似の条件を使用して実施した。分極された気道上皮を頂端で感染させるため、１×１０10ＤＲＰのウイルスをＵＳＧ培地で５０μｌの最終容量に希釈し、そしてＭｉｌｌｉｃｅｌｌインサートの上部チャンバーに適用した。側底感染のため、１×１０10ＤＲＰのウイルスを底部チャンバー中の培地に直接添加した。ウイルスは典型的に上皮に１６ｈｒ曝露しそしてその後除去した。この時点でＭｉｌｌｉｃｅｌｌインサートを少量のＵＳＧ培地で手
早く洗浄し、そして底部チャンバー中にのみ新鮮ＵＳＧ培地を供給した。およそ１〜２×１０6細胞が各Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌインサート中にあり、そして従って感染多重度（ＭＯＩ）は約５，０００ないし１０，０００ＤＲＰ／細胞と推定される。形質導入は、細胞ライセート若しくはＩＶＩＳ生物光工学画像法を使用する感染後多様な時点のルシフェラーゼレポーターアッセイにより評価した。
【０２３０】
ルシフェラーゼレポーター発現の測定。細胞ライセート中のルシフェラーゼ酵素活性を、自動注入器を装備された２０／２０ルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。生存細胞中のルシフェラーゼ活性の定量化を、製造元の説明書に従ってＩＶＩＳ生物光工学画像化装置を使用して実施した。画像はＶｉｖｏＧｌｏルシフェリン基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を側底培地にのみ添加した１５分後に撮影し、そして画像の定量化をＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ２．５１ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いて処理した。
【０２３１】
内部移行されたウイルスゲノムの分析。完全に分化したヒト分極気道上皮を１×１０10粒子のｒＡＡＶもしくはキメラｒＡＡＶ／ＨＢｏＶ１ベクターに感染させた。４ｈｒの感染期間後にウイルスを除去し、そして上皮をＰＢＳで広範囲に洗浄した。Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌインサートにその後底部チャンバー中に新鮮培地を供給し、そして３７℃のインキュベーター中に１８時間置いた。全部のウイルス内部移行アッセイのため細胞を収集する前に、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌインサートを５０ｍＬ円錐管中４０ｍＬのＰＢＳで３回徹底的に洗浄した。細胞をその後、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌインサートの支持メンブレンからトリプシン消化によりはがした。細胞ペレットをその後、細胞内分画およびウイルスゲノム定量前に１ｍＬのＰＢＳでさらに３回洗浄した。４℃で１時間結合されたウイルスを利用する対照実験は、この洗浄およびトリプシン消化法を使用して細胞表面からのウイルスの９８％超の除去を示した（データは示されない）。核を、Ｃｈｅｎら（２０１１）に記述されるところのＮｕｃｌｅｉ  ＥＺ  ｐｒｅ  ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いて単離した。細胞質画分を核調製中に合わせそして１／１０をＳｐｅｅｄＶａｃで乾燥した。核ペレットおよび乾燥された細胞質画分を５０μＬの消化緩衝液（５０ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭトリス  ｐＨ８．０、０．５％ＮＰ４０、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０および４００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）に溶解した。５６℃で４５分間の消化および９５℃で１５分間の熱不活性化後に、０．１μＬの核および１μＬの細胞質消化をＴａｑＭａｎ  ＰＣＲのため使用して、ウイルスゲノムを定量した。全ウイルス内部移行アッセイをＣｕＦｉ  ＡＬＩ培養物、分極されないＣｕＦｉおよびＨＥＫ２９３細胞単層物で実施した場合、同一の洗浄およびトリプシン処理手順を使用して、細胞表面結合されたビリオンを除去した。しかしながら、洗浄された細胞ペレットは上の消化緩衝液で直接溶解しそしてウイルスゲノム定量に使用した。
【０２３２】
ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲによるｒＡＡＶゲノムの定量分析。ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲを使用して、Ｙａｎら（２００６）に記述されるとおり、ウイルスストックの物理的力価およびＡＡＶに感染させた細胞からの細胞ライセート中のウイルスゲノムのコピーを定量した。使用されたＰＣＲプライマーは、５’−ＴＴＴＴＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＧＴＴＧＴＧＧ−３’（配列番号６）（フォワード）および５’−ＣＡＣＡＣＡＣＡＧＴＴＣＧＣＣＴＣＴＴＴＧ−３’（配列番号７）（リバース）であり、そしてｒＡＡＶ２．Ｌｕｃゲノムの７３ｂｐフラグメントを増幅する。Ｔａｑｍａｎプローブ（５’−ＡＴＣＴＧＧＡＴＡＣＣＧＧＧＡＡＡＡＣＧＣＴＧＧＧＣＧＴＴＡＡＴ−３’）（配列番号８）はＩＤＴ（アイオワ州コーラルビル）により合成された。このプローブは、レポーターとして５’端で６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）およびクエンチャーとして３’端でＤａｒｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １（ＢＨＱ１）でタグを付けた。ＰＣＲ反応を実施し、そしてＢｉｏ−Ｒａｄ  ＭｙＩＱTMリアルタイムＰＣＲ検出系およびソフトウェアを
使用して分析した。
【０２３３】
短絡電流測定。経上皮短絡電流（Ｉｓｃ）を、Ｌｉｎら（２００７）に記述されるとおり、上皮電位固定（型式ＥＣ−８２５）および自己含有されるＵｓｓｉｎｇチャンバー系（双方Ｗａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、コネティカット州ハムデンから購入された）を使用して測定した。実験を通じチャンバーは３７℃で保ち、そしてチャンバー溶液に通気した。チャンバーの側底側を、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．２ｍＭ  ＣａＣｌ2、１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２．４ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、０．２ｍＭ  Ｋ2ＨＰＯ4および５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４を含有する緩衝リンゲル液で満たした。チャンバーの頂端側は、１３５ｍＭグルコン酸ＮａをＮａＣｌの代わりに用いた低塩化物リンゲル液で満たした。経上皮電位を５秒ごとの電流パルスでゼロに固定して、Ｑｕｉｃｋ  ＤａｔａＡｃｑソフトウェアを伴うＶＣＣ  ＭＣ８マルチチャネル電位／電流固定（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して短絡電流を記録した。以下の化学物質を頂端チャンバー中に順次添加した。すなわち（１）ＥＮａＣによる上皮ナトリウムコンダクタンスの阻害のためのアミロライド（１００μＭ）；（２）非ＣＦＴＲクロライドチャネルを阻害するための４，４’−ジイソチオシアナト−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸（ＤＩＤＳ）（１００μＭ）；（３）ＣＦＴＲクロライドチャネルを活性化するためのｃＡＭＰアゴニストフォルスコリン（１０μＭ）／３−イソブチル−ｌ−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）（１００μＭ）；および（４）ＣＦＴＲによるＣｌ-分泌を阻害するための１０μＭのＣＦＴＲｉｎｈ−ＧｌｙＨ−１０１（Ｎ−（２−ナフタレニル）−［（３，５−ジブロモ−２，４−ジヒドロキシフェニル）メチレン］グリシンヒドラジド）。ΔＩｓｃ計算は、各実験条件（化学的刺激）の前および後の４５秒にわたるプラトー測定値平均の差違を得ることにより行った。
【０２３４】
ＣＦＴＲ免疫染色。短絡電流測定後に、支持メンブレン上のＨＡＥをＭｉｌｌｉｃｅｌｌインサートから切り離しそしてＯＣＴ媒体中に埋め込んだ。１０μｍの凍結切片を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、次いでブロッキングし、そして等量（２００倍希釈で）の３種のマウス抗ＣＦＴＲ抗体（クローンＭＭ１３−４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、クローンＭ３Ａ７（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびクローン１３−１（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ））よりなる抗ＣＦＴＲ抗体カクテルを使用して免疫蛍光染色し、そして最後にロバ抗マウスＦＩＴＣ標識二次抗体とともにインキュベートした。
【０２３５】
結果
組換えＨＢｏＶ１（ｒＨＢｏＶ１）ベクターの製造およびＨＡＥモデル系におけるその形質導入特性。完全長ＨＢｏＶ１ゲノムのプラスミドクローン（ｐＩＨＢｏＶ１）を使用して、ヘルパーウイルス機能に対する必要性を伴わずにＨＥＫ２９３細胞中でトランスフェクション後に感染性ＨＢｏＶ１ビリオンを産生し得る（Ｈｕａｎｇら、２０１２）。最初に、ＨＢｏＶ１ウイルスタンパク質がＨＥＫ２９３細胞中でトランス補完しかつｒＨＢｏＶ１ゲノムの複製およびパッケージングをレスキューし得るかどうかを試験することにより、ｒＨＢｏＶ１を生成することを試みた。感染性プラスミド（ｐＩＨＢｏＶ１）、ｒＨＢｏＶ１プロウイルスプラスミド（ｐｒＨＢｏＶ１−ＣＢＡｌｕｃ）およびトランスヘルパープラスミド（ｐＨＢｏＶ１ＫＵｍ６３０）中で見出される野性型ＨＢｏＶ１ゲノムの構造を図１Ａに図解で示す。ｐｒＨＢｏＶ１−ＣＢＡｌｕｃは、ＣＢＡプロモーターに駆動されるルシフェラーゼ遺伝子をコードする５．５ｋｂのｒＨＢｏＶ１プロウイルスゲノムを含有した。ｐｒＨＢｏＶ１−ＣＢＡｌｕｃからのｒＨＢｏＶ１ゲノムのレスキューおよび複製を支援するｐＨＢｏＶ１ＫＵｍ６３０の能力を、これらのプラスミドをＨＥＫ２９３細胞中にコトランスフェクトすることにより確認した。トランスフェクトされた細胞から抽出されたＨｉｒｔ  ＤＮＡを、メチル化されたプラスミドのバックグラウンドシグナルを排除するためのＤｐｎＩ消化後のサザンブロットにより評価した。図１Ｂに示されるとおり、ｒＨＢｏＶ１複製中間体は、ｐｒＨＢｏＶ１−ＣＢＡＬｕｃおよびｐＨＢｏ
Ｖ１ＫＵｍ６３０でコトランスフェクトされた細胞でのみ観察されたが、しかしｐｒＨＢｏＶ１−ＣＢＡＬｕｃ単独ではされなかった。コトランスフェクションからの検出された複製中間体は野生型ＨＢｏＶ１プロウイルスプラスミドｐＩＨＢｏＶ１からのレベルより低かったとは言え、われわれは、ｐＨＢｏＶ１ＫＵｍ６３０プラスミドが、ｒＨＢｏＶ１ゲノム複製を支援するための必要なヘルパー機能をトランスで提供すると結論づける（図１Ｃ）。組換えウイルスを生成するため、ｐｒＨＢｏＶ１−ＣＢＡｌｕｃおよびｐＨＢｏＶ１ＫＵｍ６３０をＨＥＫ２９３にコトランスフェクトし、次いでＣｓＣｌ平衡超遠心分離法を用いて細胞ライセートから精製した。この勾配からの画分をＴａｑＭａｎ  ＰＣＲによりウイルスゲノムについて評価し、そして１．４５ないし１．４０ｇ／ｍＬの密度でピークを示し（図１Ｃ）、ウイルスＤＮＡの成功裏のキャプシド形成を示唆した。３０枚の１５０ｍｍプレートからのウイルス収量は合計１．２５×１０11ｒＨＢｏＶ１ゲノムコピー（ｖｃ）若しくはＤＮアーゼＩ耐性粒子（ＤＲＰ）を生じた。これはＨＥＫ２９３細胞中のｐＩＨＢｏＶ１のトランスフェクションから得られる野生型ＨＢｏＶ１の収量（１０枚の１５０ｍｍ皿あたり約２×１０11ＤＲＰ）（Ｈｕａｎｇら、２０１２）のおよそ２０％である。
【０２３６】
２回ＣｓＣｌバンド形成されたｒＨＢｏＶ１．ＣＢＡｌｕｃをその後、ＨＥＫ２９３細胞、ＩＢ３細胞（ＣＦヒト気道細胞株）、ＣｕＦｉ８細胞（条件付き形質転換された（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）ＣＦ気道細胞株（Ｚａｂｎｅｒら、２００３））の単層、ならびにＣｕＦｉ細胞および初代ヒト気道上皮細胞由来のＡＬＩ培養物の感染後のその形質導入特性について評価した（図１Ｄ）。結果は、ｒＨＢｏＶ１．ＣＢＡｌｕｃのみが、初代若しくはＣｕＦｉいずれかの気道細胞由来の分極されかつ分化したＡＬＩ培養物を形質導入する（すなわちそのコードされるトランスジーンを発現する）ことが可能であったことを示した。これらの知見は野生型ＨＢｏＶ１で増殖性感染に必要とされる条件（Ｈｕａｎｇら、２０１２）に同様である。ｒＨＢｏＶ１．ＣＢＡｌｕｃでの分極されたＨＡＥの頂端感染後、最大のトランスジーン発現は感染後３日に発生し、そして感染後１１日までに徐々に減少した（図１Ｅ）。
【０２３７】
属を超えるパルボウイルスシュードタイピングによるＨＢｏＶ１ビリオン中の組換えＡＡＶ２ゲノムのキャプシド形成。野生型ＨＢｏＶ１およびｒＨＢｏＶ１ビリオンはプラスミド（１種若しくは複数）トランスフェクション後にＨＥＫ２９３細胞中で集成され得るとは言え、ウイルス収量は比較的低い。対照的に、ｒＡＡＶベクター複製は、適正なヘルパープラスミドを伴いＨＥＫ２９３中で非常に効率的である。われわれは、ＨＢｏＶ１複製を支援するＨＥＫ２９３細胞の機械装置は、ＨＥＫ２９３細胞がＨＢｏＶ１の増殖性感染のための生物学的に許容性の細胞株でないため、より少なく効率的であり得ると推論した。従って、ＨＢｏＶ１キャプシドでｒＡＡＶ２ゲノムをシュードタイピングすることがこれら細胞中でより高い収量を伴いｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１キメラベクターを生成するかどうかを探求した。このアプローチを使用して、シスｒＡＡＶプロウイルスプラスミド（ｐＡＶ２−Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃ）からの４．８５ｋｂのｒＡＡＶゲノムが、ｐＡＤ４．１（アデノウイルスからのＡＡＶ複製のための全部の必要なヘルパー機能をコードする）、ｐＡＶ−Ｒｅｐ２（ＡＡＶ２  Ｒｅｐ遺伝子をコードする）およびｐＨＢｏＶ１ＫＵｍ６３０（ＨＢｏＶ１キャプシドおよびＮＳ遺伝子をコードする）でのコトランスフェクション後にＨＢｏＶ１ビリオン中に成功裏にパッケージングされた。ｒＡＡＶ２ゲノムのキャプシド形成を支援するための全部のＨＢｏＶ１ウイルスタンパク質を発現したヘルパープラスミドを使用することに対するいくつかの理由が存在した。第一に、パッケージングを支援するために必要とされるＨＢｏＶ１遺伝子の一時的調節および転写プロファイルが未知のままである。第二に、キャプシド集成におけるＨＢｏＶ１のＮＳおよびＮＰ１タンパク質の機能的役割が不明である。最後に、ＮＳタンパク質がＡＡＶ２  ＩＴＲと会合しそしてこれがＨＢｏＶ１キャプシド中へのＡＡＶ２ゲノムのパッケージングを助長するのに潜在的に役立つことができることが可能である。コトランスフェクション３日後に、実質
的なＤＮアーゼＩ耐性ウイルス粒子が粗ライセートからＣｓＣｌバンド形成により回収された（図２Ａ）。トランスフェクションカクテルからｐＡＶ−Ｒｅｐ２を省くことはＤＮアーゼ１耐性ウイルス粒子を産生することに失敗した。注目すべきは、キメラｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ビリオンの密度が約１．４３５ｇ／ｍＬで、ｒＨＢｏＶ１ビリオンのものに類似であった（図１Ａ）。この密度はｒＡＡＶ２／２ビリオンの１．４１４ｇ／ｍｌの密度よりわずかにより重かった（図１Ａ）。キメラｒＡＡＶ／ＨＢｏＶ１ベクターの典型的な収量はｒＡＡＶ２ベクターより１０ないし２０倍より小さかったが、しかし類似のスケールで生成される場合にｒＨＢｏＶ１ベクターより２ないし４倍より大きかった。対照的に、ヒトパルボウイルスＢ１９キャプシド中へのｒＡＡＶゲノムのシュードパッケージングは、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１についてわれわれが観察したものよりはるかにより少なく効率的である（Ｐｏｎｎａｚｈａｇａｎら、１９９８）。
【０２３８】
ｒＡＡＶ２ゲノムのレスキューおよび複製の検査は、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１産生系中のＤＮＡ（ＲＦ  ＤＮＡ）からのｒＡＡＶ２複製が、ｒＡＡＶ２産生中のものより約２ないし３倍より少なく豊富であったことを示した（図２Ｂ、レーン２および４を比較されたい）。これは、パルボウイルスキャプシドがビリオン形成においてフィードバックの役割を演じていることを記述する以前の報告（Ｃｈｅｎｇら、２０１０；Ｈｕａｎｇら、２０１２）と矛盾しない。これを裏付け、ｐＡＶ２．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃおよびＡＡＶ２  Ｒｅｐ−ＣａｐヘルパープラスミドｐＡＶＲＣ２．３のコトランスフェクション（図２Ｂ、レーン２）後より、より少ないｒＡＡＶ２  ＲＦ  ＤＮＡが、ＡＡＶ２プロウイルスプラスミド（ｐＡＶ２．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃおよびｐＡＶ２．ＣＦ５ｔｇ８３ｌｕｃ）ならびにｐＡＶ２−Ｒｅｐヘルパー（無傷のＡＡＶキャプシド遺伝子を欠く）のコトランスフェクション後に存在した（図２Ｂ、レーン１およびレーン３）ことが観察された。注目すべきことに、ＨＢｏＶ１ウイルスタンパク質の発現はｒＡＡＶ２ゲノムのレスキューおよび複製を妨害しないようであった（図２Ｂ、レーン４対レーン１若しくは３を比較されたい）。透過型電子顕微鏡検査法（ＥＭ）は、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ビリオンが、野生型ＨＢｏＶ１ビリオン（Ｈｕａｎｇら、２０１２）と同様、直径が２６ｎＭであった典型的なパルボウイルスの正二十面体構造を有した（図２Ｃ）ことを示した。ＥＭによるビリオンの内部の密度は、ビリオンの９９％超がＤＮＡを伴い完全にパッケージングされたこともまた示唆した。抗ＨＢｏＶ１  ＶＰ２抗血清を用いたウエスタンブロットによるキメラｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ビリオンの検査はＨＢｏＶ１  ＶＰ１およびＶＰ２タンパク質の存在を示したが、しかし、ＡＡＶ２  ＶＰタンパク質は、抗ＡＡＶ２キャプシドモノクローナル抗体Ｂ１を使用してｒＡＡＶ／ＨＢｏＶ１ストック中で検出されなかった（図２Ｄ）。
【０２３９】
ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ビリオンのウイルスゲノムの極性および容量の特徴づけ。野生型ＡＡＶ２およびＨＢｏＶ１ビリオンの間の１つの重大な差違は、パッケージングされたゲノムの極性である−ＡＡＶビリオンの約５０％が＋ＤＮＡ鎖を含有する一方、他の半分は−ＤＮＡ鎖を含有し、一方で、ＨＢｏＶ１は時間の９０％以上で−ＤＮＡ鎖を選択的にキャプシドで包む（Ｓｃｈｉｌｄｇｒｅｎら、２０１２）。ＨＢｏＶ１の２個の末端パリンドローム配列は非対称であり（大きさ、一次構造および予測される構造が異なる（Ｈｕａｎｇら、２０１２））一方、ＡＡＶについて、末端パリンドローム配列は同一の逆方向反復である。パルボウイルスゲノム中の末端配列は、コンカタマー二重鎖複製中間体の形成およびパッケージングのための一本鎖子孫ゲノムの除去に非常に重要である（Ｃｏｔｍｏｒｅら、１９９６）。ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターゲノムがそのゲノムの端に同一の逆方向反復を有することを考え、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１が＋および−双方の鎖の不偏のパッケージングを採用するであろうことが仮定された。これは実際に真実であった。ルシフェラーゼトランスジーンに対するセンスおよびアンチセンスプローブを使用して、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ビリオンＤＮＡは＋および−鎖のほぼ等しい比率を示した一方、ｒＨＢｏＶ１ベクターＤＮＡは−鎖をパッケージングすることに対する好み（約８７％）を
示した。これらの差違は、部分的に、ｒＨＢｏＶ１のものを上回るｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１の生成における２〜３倍より高い収率を説明しうる。
【０２４０】
ＡＡＶおよびＨＢｏＶ１ゲノムの間の第二の大きな差違はそれらのサイズである−ＡＡＶゲノムは長さ４６７９ｎｔである一方、ＨＢｏＶ１は長さ５５４３ｎｔである。ｒＡＡＶベクターのパッケージング容量は広範囲に研究され、そして４．９ないし５．０ｋｂの限界を有する（Ｄｏｎｇら、１９９６；Ｗａら、２０１０）。これはｒＡＡＶによる送達ＣＦＴＲ遺伝子のための重大な障害であり、そしてｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターで潜在的に克服されうるものである。かように、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１粒子は、ｒＨＢｏＶ１で観察されたとおり、５．５ｋｂまでの過大なｒＡＡＶゲノムをパッケージングするその能力によってＣＦＴＲ送達のための重大な利点を提供しうることが仮定された（図１Ｄ）。この可能性を探究するため、長さが６００ｂｐだけ異なった同一のルシフェラーゼ発現カセット（４．８ｋｂのｐＡＶ２／ＨＢｃ．Ｆ５ｔｇ８３Ｌｕｃおよび５．４ｋｂのｐＡＶ２／ＨＢｃ．ＣＦ５ｔｇ８３Ｌｕｃ）を伴う２種のｒＡＡＶプロウイルスゲノムを生成した。これらプロウイルスプラスミドのそれぞれを使用してｒＡＡＶ２／２（４．８ｋｂ）ならびに／若しくはｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１（４．８および５．４ｋｂ）ウイルスを生成し、そして該ウイルスＤＮＡを、アルカリ変性アガロースゲル電気泳動、次いでサザンブロット分析により評価した。５．４ｋｂのｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１のウイルス収量は４．８ｋｂのｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１と同様であった。ウイルスＤＮＡのサザンブロット分析は、明らかな切断型を伴わない適切なサイズのゲノムのみを示した（図３Ｂ）。これらの知見は、ＨＢｏＶ１シュードタイピングが、ゲノムの完全性を変えることなく短いおよび長いの双方のｒＡＡＶゲノムを正確にプロセシングおよびパッケージングすることを示す。
【０２４１】
ウイルスゲノム組換えは多くのウイルスの進化で重要な役割を演じており、そして鎖の組換えは一本鎖ウイルスの複製中でもまた発生する（Ｍａｒｔｉｎら、２０１１）。腸ヒトボカウイルス感染は高レベルのウイルスゲノム組換えともまた関連している（Ｋａｐｏｏｒら、２０１０）。ヘルパーおよびプロウイルスプラスミドの間の組換え産物がｒＨＢｏＶ１およびｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ビリオン中にパッケージングされたかどうかを評価した。精製されたｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１およびｒＨＢｏＶ１からのウイルスゲノムのスロットブロット分析を、ルシフェラーゼトランスジーンプローブおよびＨＢｏＶ１ヘルパー特異的ウイルスプローブ（すなわち、ｒＨＢｏＶ１ベクター中でルシフェラーゼカセットにより置換されているＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｇｌＩＩの２．６４ｋｂフラグメント）を使用して実施した。この分析からの結果は、精製されたｒＨＢｏＶ１ストック中のウイルスゲノムの１７％がヘルパープラスミド中でのみ見出されるＨＢｏＶ１配列を含有したことを示した（図３Ｃ）。ｒＨＢｏＶ１．ＣＢＡｌｕｃゲノム中でルシフェラーゼカセットに隣接する１．４ｋｂおよび１．１ｋｂのＨＢｏＶ１ゲノムフラグメントの包含は、これらの組換え事象の最もありそうな原因である。ＮＳおよびＶＰ双方のタンパク質コーディングドメインがｒＨＢｏＶ１．ＣＢＡｌｕｃゲノム中で突然変異された（図１Ａ）とは言え、組換えが二重交差事象においてこれら突然変異の外側で発生した場合、複製能力のあるｒＨＢｏＶ１ゲノムがｒＨＢｏＶ１ウイルスストック中で予期されるとみられる。複製能力のあるウイルスの存在は、ｒＨＢｏＶ１に感染させたＨＡＥ  ＡＬＩ培養物のトランスジーン発現の時間依存性の減少の理由の１つであり得る（図１Ｅ）。ｒＨＢｏＶ１と対照的に、ＨＢｏＶ１ヘルパーゲノムは、プロウイルスおよびヘルパーウイルスプラスミドの間に配列相同性が存在しないため、予期されるであろうとおり、精製されたｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ウイルス中で検出されなかった。従って、ｒＨＢｏＶ１のためのパッケージング戦略のさらなる開発が、複製能力のあるＨＢｏＶ１を生成する機会を排除するために必要とされる（すなわち、ＮＳおよびＶＰ遺伝子の別個のヘルパープラスミド上での発現ならびにプロウイルスゲノム中のパッケージングのための最小のシスエレメント）。しかしながら、ＮＳ／ＶＰウイルス遺伝子およびＨＢｏＶ１ゲノムパッケージングの調節の改良
された知識が、ｒＡＡＶの生成において複製能力のあるウイルスを排除する同様の戦略を適用し得る前に必要とされるであろう。
【０２４２】
キメラｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターはヒト分極気道上皮の頂端膜からの高度に効率的な形質導入を媒介するがしかし側底膜からはしない。次に、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１キメラベクターの形質導入の特徴を検査した。ルシフェラーゼトランスジーンをコードするｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターは高いＭＯＩ（５０，０００ＤＲＰ／細胞）ででさえＨＥＫ２９３細胞を形質導入することに失敗した一方、類似のｒＡＡＶ２／２ベクターははるかにより低いＭＯＩ（２，５００ＤＲＰ／細胞）でルシフェラーゼを効率的に発現した（図４Ａ）。初代ＨＡＥ中およびＣｕＦｉ  ＡＬＩ培養物での実験は、ＡＶ２／ＨＢｃ．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃ（４．８ｋｂゲノム）およびＡＶ２／ＨＢｃ．ＣＦ５ｔｇ８３ｌｕｃ（５．４ｋｂゲノム）双方が頂端感染後に同様のレベルのルシフェラーゼ発現を生じたことを確認し（データは示されない）、この範囲内のベクターサイズが形質導入に影響しなかったことを示唆した。次に、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１の形質導入を同一感染条件下のｒＡＡＶベクターのものと比較した。この直接比較は、ｐＡＶ２−ＣＦ５ｔｇ８３ｌｕｃゲノム（５．４ｋｂ）がＡＡＶキャプシド中にパッケージングされるには大きすぎたため、ＡＶ２／ＨＢｃ．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃ、ＡＶ２／１．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃおよびＡＶ２／２．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃ（ｐＡＶ２−Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃ由来の同一プロウイルスゲノムをもつ）でのみ可能であった。ＡＶ２／ＨＢｃ．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃおよびＡＶ２／２．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃでの頂端および側底感染後の初代ＨＡＥについての形質導入パターンは著しく異なった（図４Ｂ）。以前に観察されたとおり、ｒＡＡＶ２／２はＨＡＥを強い側底の好みを伴い形質導入した（Ｙａｎら、２００６；Ｙａｎら、２００４）−頂端感染後のルシフェラーゼ発現は側底感染後のものより２１０倍より低かった（図４Ｂ）。対照的に、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１は側底感染と比較して初代ＨＡＥの頂端感染後の２０６倍より大きいレベルの形質導入を示した（図４Ｂ）。重要なことに、ＡＶ２／ＨＢｃ．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃでの頂端感染後に達成されるトランスジーン発現のレベルは、ＡＶ２／２．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃからのものより７０倍より大きく、また、ＡＶ２／１．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃより５．６倍より大きかった。以前に示されたとおり、ｒＡＡＶ２／１は分極されたＨＡＥ中の形質導入について極性の偏りを欠き、そしてｒＡＡＶ２より良好な頂端形質導入効率を有した（Ｙａｎら、２００６）。
【０２４３】
ＨＢｏＶ１は最近発見されたウイルスであるため、ＨＡＥ中のＨＢｏＶ１と細胞の相互作用についてほとんど知られていない。野生型ＨＢｏＶ１は０．００１ＤＲＰ／細胞と同じくらい低いＭＯＩでＨＡＥを感染させ得（Ｄｅｎｇら、２０１３）、ＨＡＥの頂端膜側からのウイルス侵入がきわめて効率的であることを示唆する。しかしながら、ウイルス複製の追加された変数で、ＨＢｏＶ１の内部移行および核への細胞内トラフィッキングの効率は直接評価することが困難である。複製欠損ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１キメラウイルスの創成は、これらの過程を直接評価しかつｒＡＡＶベクターでの形質導入におけるこれらの段階の効率をさらに比較するための機会を提供する。この目的のため、ビリオンの取り込みおよびウイルスゲノム分布を頂端感染後１８時間にＨＡＥの初代ＡＬＩ培養物中で比較した。対照として、われわれは、異なる効率で頂端膜からＨＡＥを形質導入することが既知である（Ｙａｎら、２００６）２種のｒＡＡＶシュードタイプされたベクター、ｒＡＡＶ２／１（ＡＶ２／１．ＣＭＶｌｕｃ）およびｒＡＡＶ２／２（ＡＶ２／２．ＣＭＶｌｕｃ）を包含した。ｒＡＡＶ１はこれまで、ＨＡＥの形質導入のための最も効率的なＡＡＶ血清型の１つであることが示されており、頂端感染後のより大きなビリオン取り込みおよびより速い核移行を伴う（Ｙａｎら、２０１３；Ｙａｎら、２００６）。加えて、同一ウイルスゲノムを含有するＡＶ２／ＨＢｃ．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃおよびＡＶ２／２．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃ双方のウイルスを評価した。これらの比較からの結果は、ＡＶ２／１．ＣＭＶｌｕｃおよびＡＶ２／ＨＢｃ．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃが、ｒＡＡＶ２／２ベクター（ＡＶ２／２．ＣＭＶｌｕｃおよびＡＶ２／２．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃ）よりも初代ＨＡＥの頂端
膜からのそれぞれ約１４倍および約３２倍より多いウイルス取り込みを示した（図４Ｃ）ことを示した。ＡＶ２／ＨＢｃ．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃのウイルス取り込みはまたＡＶ２／１．ＣＭＶｌｕｃより２．３倍より効率的でもあった（Ｐ＝０．０２６）。さらに、核へのｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１の侵入後プロセシングはｒＡＡＶ２／２についてより迅速であるようであり、ｒＡＡＶ２／２についての約７％と比較して、約１５％の内部移行されたＡＶ２／ＨＢｃ．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃゲノムが、感染後１８時間までに核画分中で検出された（図４ＣおよびＤ）。興味深いことに、ウイルスゲノムの細胞質／核分布はｒＡＡＶ２／１（８６．４／１３．６％）およびｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１（８５．０／１５．０％）について同様であった（図４ＣおよびＤ）。試験された双方のｒＡＡＶ血清型と対照的に、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１は側底膜からＨＡＥを乏しく形質導入した（図４Ｂ）。全体として、これらの知見は、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ウイルス取り込みおよび核移行が初代分化ＨＡＥの頂端感染後に高度に効率的であることを示唆する。
【０２４４】
感染期間中のプロテアソーム活性を調節することはｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１での頂端感染後の形質導入を大きく高める。ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１がＨＡＥ  ＡＬＩ中の頂端感染後に高い形質導入効率を示すという事実にもかかわらず、内部移行されたｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ビリオンの大多数（８５％）が感染後１８時間に細胞質中に保持されている。これは、ＨＡＥのｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ１形質導入について観察された（Ｄｕａｎら、２０００；Ｄｕａｎら、１９９８）ところのウイルスの効果的な核輸送を制限する細胞内障壁が、ＨＢｏＶ１についてもまた存在しうることを示唆した。かように、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１の形質導入効率はこれら障壁を克服することによりさらに改良し得る。損なわれたエンドソームプロセシング／細胞内トラフィッキングは、頂端感染後の分極されたＨＡＥのｒＡＡＶベクター形質導入を制限する主要な障壁の１つである。この障壁は、感染の時点で若しくは感染後ある期間内のプロテアソーム阻害剤の適用により部分的に克服し得る（Ｄｕａｎら、２０００；Ｚｈａｎｇら、２００８；Ｙａｎら、２００４）。これらの研究は、トリペプチジルアルデヒドＮ−アセチル−ｌ−ロイシル−ｌ−ロイシル−ｌ−ノルロイシン（ＬＬｎＬ）およびアントラサイクリン誘導体ドキソルビシン（Ｄｏｘ）双方が、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ５およびｒＡＡＶ１ウイルスプロセシングならびに核への移行を高めることができ、より高レベルの形質導入につながることを示した。これら２種の異なる分類のプロテアソーム活性調節剤の併用投与は、初代ＨＡＥの頂端ｒＡＡＶ２／２感染後に１０００倍を上回る形質導入を誘導し得る（Ｙａｎら、２００６；Ｙａｎら、２００４）。ＨＢｏＶ１およびＡＡＶ２のキャプシドタンパク質間に一次配列レベルで重大な相違が存在するとは言え、これら２種のウイルスはいくつかの保存されたコアキャプシド配列を保持し、そしてまた類似の表面正二十面体の形態も他のパルボウイルス粒子と共有する（Ｇｕｒｄａら、２０１０）。かように、プロテアソーム阻害剤での処理はｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１によるＨＡＥの形質導入もまた高めうることが仮定され、そしてＬＬｎＬおよびＤｏｘの存在および非存在下でｒＡＡＶ２／２とｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１の間の形質導入のキネティクスを研究することが試みられた。ｒＡＡＶ２／２をｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１と比較する結果（図５ＡおよびＢ）は、感染後７〜１１日にプラトーを伴い感染後３〜７日の間にトランスジーン発現の同様の上昇を示した。双方のベクターについて、感染の時点でのプロテアソーム阻害剤での処理が全部の時点で形質導入を１０００倍以上高め、また、１１日の期間でトランスジーン発現の減少は存在しなかった。これらの知見は、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１が、大部分の他のｒＡＡＶ血清型で観察されるところの形質導入に対する類似のプロテアソーム依存性の障壁を共有することを示す。
【０２４５】
ヒト気道上皮の分極はＨＢｏＶ１キャプシドに媒介される遺伝子導入に必要とされる。ＨＢｏＶ１が分極ヒト気道上皮の頂端膜を増殖性に感染させる機構は不明確なままである。以前の研究で、われわれは、野生型ＨＢｏＶ１でのＣｕＦｉ細胞の単層の感染がウイルス複製および子孫ビリオンの産生を支援しないことを観察し（Ｈｕａｎｇら、２０１２）、ルシフェラーゼを発現するｒＨＢｏＶ１での単層ＣｕＦｉ細胞の形質導入の欠如に類似
の知見である（図１Ｄ）。対照的に、分極される場合、ＣｕＦｉ細胞は、野生型ＨＢｏＶ１での頂端（しかし側底でない）感染後に子孫ウイルスを効率的に産生する（Ｈｕａｎｇら、２０１２）。これらの知見は、分極が、ウイルス受容体／共受容体の発現若しくはＨＢｏＶ１ビリオンの細胞内プロセシングに関与する因子の発現のような増殖性感染に必要とされる細胞性因子（１種若しくは複数）に影響することを示唆する。ウイルス複製はキメラｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクター内で発生しないため、これは分極により影響されるＨＢｏＶ１感染後の段階（１若しくは複数）を定義するための機会であった。この目的のため、実験をｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１を用いて実施して、気道上皮細胞の分極が、ビリオンの受容体結合／取り込み若しくは侵入後細胞内プロセシングを伴う段階によりＨＢｏＶ１キャプシドに媒介される形質導入に影響するかどうかに取り組んだ。ユビキチン−プロテアソーム経路はＨＡＥ  ＡＬＩ培養物中のｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１形質導入に影響を及ぼすため、われわれは、感染のこれら２段階に対するプロテアソーム阻害剤の影響もまた検査した。
【０２４６】
単層（すなわち分極されない）若しくは分極されたＡＬＩ培養条件下の同等数のＣｕＦｉ細胞を、等量のＡＶ２／ＨＢｃ．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃウイルスと３７℃で４時間インキュベートした。結合されないベクターの除去後に、感染させた細胞を、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲによる内部移行されたベクターゲノムの定量のため溶解したか、若しくはトランスジーン発現を評価する前に追加の２０時間培養したかのいずれかであった（図５Ｃ）。この分析からの結果は、分極されたＣｕＦｉ  ＡＬＩ培養物のＡＶ２／ＨＢｃ．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃでの頂端形質導入が側底形質導入より７２倍より効率的であったことを示し、初代ＨＡＥ  ＡＬＩ培養物のＡＶ２／ＨＢｃ．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃ感染（図４Ｂ）と矛盾しない知見である。これらの条件下で、側底感染に比較して約４０倍より多いウイルスが４時間の頂端感染後にＣｕＦｉ上皮により取り込まれ（図５Ｃ）、分極が頂端膜上のＨＢｏＶ１受容体／共受容体の豊富さを高めることを示唆した。興味深いことに、ＡＶ２／ＨＢｃ．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃは、分極されていないＣｕＦｉ培養物の大きく低下された形質導入（図４Ｂ）にもかかわらず、分極されたＣｕＦｉ上皮の頂端感染後に観察されたものに類似の効率でＣｕＦｉ細胞単層に侵入した（図５Ｃ）。加えて、ＨＢｏＶ１感染に対し許容性でないＡＶ２／ＨＢｃ．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃに感染させたＨＥＫ２９３細胞のウイルス取り込みおよび形質導入の分析は、トランスジーン発現を伴わない実質的なウイルス取り込みを示した（図５Ｃ）。ＣｕＦｉおよびＨＥＫ２９３単層培養物におけるこれら２つの観察結果は、受容体に媒介される取り込みよりはむしろ侵入後障壁がｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１形質導入でもまた重要な役割を演じていることを示唆する。
【０２４７】
ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１形質導入に対する侵入後障壁をさらに検討するため、プロテアソーム阻害剤の影響を評価した。全体として、プロテアソーム阻害剤は、評価された全部の条件（分極されたＣｕＦｉ  ＡＬＩの頂端若しくは側底感染または分極されていないＣｕＦｉ単層の感染）下で感染後のウイルス取り込みにほとんど影響を有しなかった（図５Ｃ）。対照的に、４時間の感染期間中のプロテアソーム阻害剤適用は、分極されたＣｕＦｉ上皮の側底感染（５倍）若しくはＣｕＦｉ単層の感染（４．３倍）後の形質導入をわずかにのみ高めつつ、分極されたＣｕＦｉ上皮の頂端感染後に形質導入を４５倍高めた（図５Ｃ）。これらの結果は、ＨＢｏＶ１ビリオンの細胞内プロセシングに対するプロテアソーム依存性の障壁が、分極されたＣｕＦｉ上皮の頂端膜からより大きいことを示唆する。さらに、ＣｕＦｉ単層は、またより少なくプロテアソーム依存性であるＨＢｏＶ１ビリオンプロセシングに対する最大の侵入後阻害を有するようである。累積的に、これらの結果は、気道上皮細胞の分極／分化がＨＢｏＶ１ビリオンの受容体に媒介される取り込みおよび細胞内プロセシングの双方を変えることを示唆する。
【０２４８】
強いＣＢＡ−ｈＣＦＴＲ発現カセットとともに５．５ｋｂゲノムを内部に持つｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターはＣＦ  ＨＡＥ中のＣＦＴＲに媒介される塩素イオン電流を修正
し得る。ＣＦ遺伝子治療のためのｒＡＡＶベクターの適用は、該ウイルスの比較的小さいパッケージング容量および完全長ＣＦＴＲ  ｃＤＮＡの大きなサイズ（４４４３ｂｐのコーディング配列）により妨げられていた。これは、非常に小さい合成のより弱いプロモーターの使用および／若しくはクロライドチャネル機能に決定的に重要ではないＣＦＴＲドメインの欠失を必要としていた（Ｚｈａｎｇら、１９９８）。これらアプローチの双方はＣＦＴＲに媒介される遺伝子治療について最適に及ばない。ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターは、ヒトＣＦＴＲ遺伝子発現のための強い転写調節エレメントを収容する十分な空間を有するとみられる。このアプローチについての概念実証を提供するため、強いＣＢＡプロモーターにより駆動される５．２ｋｂのヒトＣＦＴＲ発現カセットを含有する５．５ｋｂのゲノムを内部に持ったｒＡＡＶ２プロウイルスプラスミドを構築した。このプロウイルスプラスミドがＨＢｏＶ１ビリオン中にパッケージングされた場合、結果として生じるウイルス収量（ＡＶ２／ＨＢｃ．ＣＢＡｈＣＦＴＲ）は、１０枚の１５０ｍｍ皿のトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から平均１．５×１０11ＤＲＰであり、ルシフェラーゼレポーターをもつｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターについて類似レベルの産生であった。ＡＶ２／ＨＢｃ．ＣＢＡｈＣＦＴＲ内の５．５ｋｂのｒＡＡＶゲノムの完全性をアルカリ性アガロースゲル分析により確認した（データは示されない）。
【０２４９】
ＡＶ２／ＨＢｃ．ＣＢＡｈＣＦＴＲウイルスの機能を検証するため、初代分化ＣＦ  ＨＡＥを、プロテアソーム阻害剤の存在下に頂端膜側から１０10ＤＰＲ（５，０００〜１０，０００ＤＲＰ／細胞）で感染させ、そして感染後１０日にＣＦＴＲ機能を評価した。ＣＦＴＲ機能は、ＩＢＭＸおよびフォルスコリンでの刺激ならびにＧｌｙＨ１０１（ＣＦＴＲ阻害剤）での阻害後のｃＡＭＰに媒介される短絡電流（Ｉｓｃ）の変化として評価した。ＤＩＤＳおよびアミロライドを使用して、ｃＡＭＰ誘導前に非ＣＦＴＲクロライドチャネルおよびＥＮａＣに媒介されるナトリウム電流を遮断した。ＡＶ２／ＨＢｃ．ＣＦ５ｔｇ８３Ｌｕｃ（対照ベクター）およびＡＶ２／ＨＢｃ．ＣＢＡｈＣＦＴＲでの頂端感染後のＣＦＴＲに媒介される塩素イオン電流の補完を比較する結果を図６Ａに示す。ｃＡＭＰで誘導可能なＩｓｃの大きな変化が、対照のＡＶ２／ＨＢｃ．ＣＦ５ｔｇ８３Ｌｕｃに感染させたサンプルに比較してＡＶ２／ＨＢｃ．ＣＢＡｈＣＦＴＲ感染後に観察され、そしてこの電流はＣＦＴＲ阻害剤ＧｌｙＨ１０１の添加により遮断された。図６Ｂは、２種の感染条件およびＣＦ以外の対照についてのｃＡＭＰアゴニスト誘導後のΔＩｓｃ(cAMP)およびＧｌｙＨ１０１阻害後のΔＩｓｃ(glyH)を要約する。ＡＶ２／ＨＢｃ．ＣＢＡｈＣＦＴＲ感染後の修正のレベル（ΔＩｓｃ(cAMP)＝２．６０±０．９６μＡ／ｃｍ2およびΔＩｓｃ(glyH)＝２．９８±０．７３μＡ／ｃｍ2）は、ＣＦ以外のＨＡＥで観察されたΔＩｓｃ(cAMP)およびΔＩｓｃ(glyH)の約３０％を反映する。ＡＶ２／ＨＢｃ．ＣＢＡｈＣＦＴＲに感染させたＣＦ  ＨＡＥの頂端膜側のｈＣＦＴＲタンパク質の発現もまた、免疫蛍光染色により確認した（図６Ｃ）。ΔＦ５０８−ＣＦＴＲは初代ＣＦ  ＨＡＥ中で効率的に分解される（Ｆｌｏｔｔｅ、２００１）ため、ほとんどない免疫反応性が、期待されうるとおり、ＡＶ２／ＨＢｃ．Ｆ５ｔｇ８３Ｌｕｃに感染させたサンプル中で観察された。
【０２５０】
考察
新たに発見されかつ部分的に特徴づけられたＨＢｏＶ１は、ＣＦ気道遺伝子治療ベクターの設計のためのいくつかの潜在的な魅力的利点を提供する。第一に、野生型ＨＢｏＶ１はきわめて低いＭＯＩで頂端膜側からＨＡＥを効率的に感染させ、そのキャプシドタンパク質が気道感染に高度に適合されていることを示唆している。第二に、野生型ＨＢｏＶ１は５５００ｎｔのゲノムを有し、より大きいＣＦＴＲ発現カセットが組換えＨＢｏＶ１ウイルス中に効率的にパッケージングされ得ることを示唆する。これらの理由上、われわれは、複製欠損ｒＨＢｏＶ１およびシュードタイプされたｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１双方のベクターを成功裏に生成し、そしてＨＡＥ中のそれらの形質導入プロファイルを研究した。われわれの知見は、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターが実際にＣＦの遺伝子治療のための
ｒＡＡＶベクターに対する魅力的な一代替となりうることを示す。加えて、これらの新たな組換えのＨＢｏＶ１に基づくベクターを評価するわれわれの研究は、分極／分化がＨＡＥの頂端および側底膜からのＨＢｏＶ１キャプシドに媒介される感染および形質導入にどのように影響するかに関する興味深い生物学を明らかにした。
【０２５１】
属を超えるパルボウイルスのシュードパッケージングはしばらくの間可能であることが知られているとは言え、効率はＨＢｏＶ１に基づくベクターについてはるかにより高いようである。例えば、パルボウイルスＢ１９キャプシド中のｒＡＡＶ２ゲノムのキャプシド形成の効率は約１０9ＤＲＰ／ｍｌのウイルス価を生じる（Ｐｏｎｎａｚｈａｇａｎら、１９９５）一方、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターの収量は約２×１０11ＤＰＲ／ｍｌである。ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１の収量はｒＨＢｏＶ１についてのものよりわずかにより高かった（約２〜４倍）が、しかし感染性クローンｐＩＨＢｏＶ１のトランスフェクション後のＨＥＫ２９３細胞中の野生型ＨＢｏＶ１産生のものに同様であった（Ｈｕａｎｇら、２０１２）。しかしながら、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターの収量がｒＡＡＶ２のレベルの約１０％のままであるため、ウイルスパッケージングの改良がなお必要とされることは明確なままである。
【０２５２】
ＨＢｏＶ１キャプシドの１つの独特の面は、それが分極された気道上皮を側底膜側に比較して頂端膜側からより効率的に形質導入する（１００倍超）事実である。ＨＡＥ形質導入のこの膜極性は、今日までに研究された全部の他のｒＡＡＶ血清型と異なる。例えば、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ５およびｒＡＡＶ６は、約１００倍の好みを伴い側底膜からＨＡＥを優先的に形質導入する（Ｙａｎら、２０１３；Ｙａｎら、２００６；Ｄｕａｎら、１９９８）一方、ｒＡＡＶ１は頂端および側底双方の膜からの形質導入に対する等しい好みを示す（Ｙａｎら、２００６）。ＨＢｏＶ１キャプシドの状況で、分極は、頂端膜からの効率的形質導入に必要とされるウイルス受容体および／若しくは共受容体を誘導するために重要であるようである。事実、分極されたＣｕＦｉ上皮の側底に比較して頂端膜からの高められたウイルスゲノム取り込みは、ＨＢｏＶ１受容体（１種若しくは複数）の発現が分極により調節されることがありそうであることを示唆する。頂端（しかし側底でない）膜からのｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１形質導入を効率的に高めるプロテアソーム阻害剤の能力は、これら２種の膜からの感染が内部移行されたＨＢｏＶ１ビリオンのキャプシドプロセシングの生物学に関して異なることもまた示唆する。
【０２５３】
興味深いことに、分極されていないＣｕＦｉ細胞のＨＢｏＶ１感染の過程は、分極された細胞の頂端若しくは側底感染のものと独特に異なる生物学的過程を表す。この状況で、ＣｕＦｉ単層は、ＣｕＦｉ  ＡＬＩ培養物の頂端感染後に見られるところのｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１の効率的取り込みを表すが、しかし、ＣｕＦｉ  ＡＬＩ培養物の側底感染後に観察されるところのプロテアソーム応答性をほとんど欠く。これらの知見に対する１つの潜在的説明は、生産的にプロセシングされるべきウイルスをプロテアソームと相互作用する経路で送る頂端膜でのある種の結合受容体および共受容体の対の分配でありうる（図７）。例えば、分極後に、内部移行されたウイルスを効率的にプロセシングする結合受容体／共受容体が頂端膜に往復されることができ、側底膜からの低いウイルス取り込みをもたらす（図７Ａ）。ＣｕＦｉ単層の場合、効率的な結合受容体が表面上に留まることができ、そして形質導入についてより少なく効率的かつプロテアソーム阻害に非応答性である細胞内区画にウイルスを往復する、より豊富な第二の共受容体と相互作用しうる（図７Ｂ）。この第二の非効率的な共受容体は分極された細胞の側底膜中に隔絶されていることができ、かように頂端感染の妨害を予防する（図７Ａ）。これは多くのうちの１つのシナリオにすぎず、そして結合受容体および共受容体の発現が分極後に変化しないと想定している。３種のＣｕＦｉモデルの間の形質導入の生物学の差違についての代替の説明は、分極および分化による影響である独特に発現される結合受容体および／若しくは共受容体を必要としうる。
【０２５４】
大部分のｒＡＡＶ血清型のように、頂端膜からの初代ＨＡＥのｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１形質導入は、頂端感染の時点のプロテアソーム阻害剤の添加により大きく高められた（１０００倍超）（図５Ｂ）。プロテアソーム阻害剤は、キャプシドのユビキチン化を促進することによりｒＡＡＶビリオンの核へのトラフィッキングを高めることが示されており（Ｙａｎら、２００２）、そして、プロテアソーム阻害剤処理後のｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ウイルス取り込みの変化なしを示すわれわれの結果は、感染後の侵入後点（ｐｏｓｔ−ｅｎｔｒｙ  ｐｏｉｎｔ）での作用と矛盾しない。しかしながら、プロテアソーム感受性の侵入後障壁の機構がｒＡＡＶおよびＨＢｏＶ１ビリオンについて同様であるかどうかは不明なままである。例えば、われわれは初代ＨＡＥの頂端感染後にｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１とｒＡＡＶ２／１の間で細胞質および核の分布の同様のパターンを観察したとは言え、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１は、ｒＡＡＶ１について以前観察された（Ｙａｎら、２００６）よりプロテアソーム阻害剤による形質導入の増強に対し約１０倍より感受性であった。ｒＡＡＶとＨＢｏＶ１の間のビリオンのプロセシングおよび脱コートの機構の差違がこれらの観察結果の原因であることができ、そしてさらなる検討を正当化する。
【０２５５】
ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１およびｒＡＡＶベクターの間の最も重要な差違の１つはトランスジーンカセットのパッケージング容量である。ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターは、ｒＡＡＶベクターについての４．９ｋｂと比較して５．５ｋｂまでのゲノムを担持し得る。ＨＢｏＶ１キャプシド内のゲノムパッケージングの上限は本研究で評価しなかったとは言え、ゲノムサイズの１２％の増加（６００ｂｐ）はＣＦＴＲ発現カセットの送達に非常に重要である。ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１パッケージングは、強いＣＢＡプロモーターに駆動されるＣＦＴＲ発現カセットの使用を可能にし、そしてＣＦ  ＨＡＥ中のＣＦＴＲ依存性塩素イオン電流の非常に合理的な修正をもたらした。野生型ゲノムより約５％より多いＤＮＡを効果的にパッケージングするｒＡＡＶの能力に基づけば、ＨＢｏＶ１に基づくベクターが長さ５．８ｋｂまでのゲノムを効率的にパッケージングすることが可能でありうることを期待することは合理的である。加えて、自己相補的な（ｓｃ）二本鎖の形態のｒＡＡＶゲノム（長さ２．７ないし２．８ｋｂ）をＨＢｏＶ１キャプシド中に包むことが可能でありうる。
【０２５６】
結論として、２つの新たな種類の組換えのＨＢｏＶ１に基づくベクターをヒト気道に対する効率的遺伝子治療のため開発した。しかしながら、キメラｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターは、ヒト遺伝子治療のための真正のｒＨＢｏＶ１ベクターを上回る３つの明確な利点を有する。第一に、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターの収量は、ＨＥＫ２９３細胞産生系でｒＨＢｏＶ１についてのものより有意により大きかった。第二に、ｒＡＡＶ２ゲノムは臨床試験で既に使用されており、そして新たなウイルスゲノムの使用に付随して起こりうる潜在的な安全性の懸念を回避する。第三に、ｒＨＢｏＶ１ベクターの応用は、ヘルパープラスミドの相同的組換えにより生成され得るベクターストック中の複製能力のあるウイルスの汚染についての可能性により妨げられ得る。われわれはｒＨＢｏＶ１での感染後のＨＡＥ中の細胞病理を観察しなかったため、後者の懸念は仮定的でありそうである。にもかかわらず、さらなるベクター開発が、複製能力のあるウイルスについての可能性を最低限にしかつベクター収量を改良するの双方のためのｒＨＢｏＶ１の応用のために必要とされる。
【０２５７】
この新たなｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクター系の見込みにもかかわらず、いくつかの未知のものが臨床応用を考慮する前にさらなる検討を必要とする。例えば、大部分のＣＦ患者においてＨＢｏＶ１キャプシドに対する既存の気道体液性免疫が存在するか、そしてそうである場合、これがｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１感染に影響するか？研究は、出生から４１歳までの範囲にわたるヒトのおよそ７１％がＨＢｏＶに対する循環抗体を含有することを示唆している（Ｓｃｈｉｌｄｇｒｅｎら、２００５）が、しかしながら、気道中のこのウ
イルスに対する中和抗体に関して何も知られていない。ＨＢｏＶ１感染は主に生涯の最初の１年以内に発生することを考えれば、こうした免疫は二次感染に対し保護的であることが推定される。しかしながら、健康な小児および成人双方からの糞便中のＨＢｏＶの頻繁な検出ならびに血清疫学研究は、ウイルス排出が長期間起こり得かつ／若しくは患者が頻繁な再発性感染症を有し得ることを示唆する（Ｋａｐｏｏｒら、２０１０）。二次感染若しくは既往性免疫応答もまた普遍的に起こるようであり、そして、ＨＢｏＶ１一次感染は呼吸器疾病と強く関連する一方、ＨＢｏＶ１による二次的免疫活性化はしない（Ｍｅｒｉｌｕｏｔｏら、２０１２）。こうした体液性免疫が気道表面からの感染を予防し得るか、若しくはＨＢｏＶ１の複製および拡散を制限するよう作用するかどうかは、不明なままである（Ｋｏｒｎｅｒら、２０１１）。野生型ＨＢｏＶ１が一次感染後に気道中の長期かつ低レベルの持続性を示す（Ｍａｒｔｉｎら、２０１０；Ａｌｌａｎｄｅｒら、２００５）という事実は、このウイルスが免疫検出を逃れる方法を有しうることを示唆する。ｒＨＢｏＶ１およびｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターの開発は、こうした疑問が、組換えレポーターウイルスをＨＢｏＶ１に感染した患者からの血清若しくは気管支肺胞洗浄液サンプルと組み合わせるＨＡＥ再構成実験を使用して取り扱われることを可能にするはずである。これらの未知のものにもかかわらず、ＨＢｏＶ１に基づく組換えベクターの開発は、ＣＦ遺伝子治療および／若しくは野生型ＨＢｏＶ１感染から保護するための乳幼児のワクチン接種に対する独特の利用性を有しうる。
【０２５８】
興味深いことに、分極されていないＣｕＦｉ細胞のＨＢｏＶ１感染の過程は、分極された細胞の頂端若しくは側底感染のものと独特に異なる生物学的過程を表す。この状況で、ＣｕＦｉ単層は、ＣｕＦｉ  ＡＬＩ培養物の頂端感染後に見られるところのｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１の効率的取り込みを表すが、しかし、ＣｕＦｉ  ＡＬＩ培養物の側底感染後に観察されるところのプロテアソーム応答性をほとんど欠く。これら知見に対する１つの潜在的説明は、生産的にプロセシングされるべきウイルスをプロテアソームと相互作用する経路で送る頂端膜でのある種の結合受容体および共受容体の対の分配でありうる（図７）。例えば、分極後に、内部移行されたウイルスを効率的にプロセシングする結合受容体−共受容体が頂端膜に往復されることができ、側底膜からの低いウイルス取り込みをもたらす(図７Ａ）。ＣｕＦｉ単層の場合、効率的な結合受容体が表面上に留まることができ、そして形質導入についてより少なく効率的かつプロテアソーム阻害に非応答性である細胞内区画にウイルスを往復する、より豊富な第二の共受容体と相互作用しうる（図７Ｂ）。この第二の非効率的な共受容体は分極された細胞の側底膜中に隔絶されていることができ、かように頂端感染の妨害を予防する（図７Ａ）。これは多くのうちの１つのシナリオにすぎず、そして結合受容体および共受容体の発現が分極後に変化しないと想定している。３種のＣｕＦｉモデルの間の形質導入の生物学の差違についての代替の説明は、分極および分化による影響である独特に発現される結合受容体および／若しくは共受容体を必要としうる。
【０２５９】
大部分のｒＡＡＶ血清型のように、頂端膜からの初代ＨＡＥのｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１形質導入は、頂端感染の時点のプロテアソーム阻害剤の添加により大きく高められた（１０００倍超）（図５Ｂ）。プロテアソーム阻害剤は、キャプシドのユビキチン化を促進することによりｒＡＡＶビリオンの核へのトラフィッキングを高めることが示されており（Ｙａｎら、２００２）、そして、プロテアソーム阻害剤処理後のｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ウイルス取り込みの変化なしを示すわれわれの結果は、感染後の侵入後点での作用と矛盾しない。しかしながら、プロテアソーム感受性の侵入後障壁の機構がｒＡＡＶおよびＨＢｏＶ１ビリオンについて同様であるかどうかは不明なままである。例えば、細胞質および核の分布の同様のパターンが、初代ＨＡＥの頂端感染後にｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１とｒＡＡＶ２／１の間で観察されたとは言え、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１は、ｒＡＡＶ１について以前観察された（Ｙａｎら、２００６）よりプロテアソーム阻害剤による形質導入の増強に対し約１０倍より感受性であった。ｒＡＡＶとＨＢｏＶ１の間のビリオンのプロセシン
グおよび脱コートの機構の差違がこれらの観察結果の原因であることができ、そしてさらなる検討を正当化する。
【０２６０】
ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１およびｒＡＡＶベクターの間の最も重要な差違の１つはトランスジーンカセットのパッケージング容量である。ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターは、ｒＡＡＶベクターについての４．９ｋｂと比較して５．５ｋｂまでのゲノムを担持し得る。ＨＢｏＶ１キャプシド内のゲノムパッケージングの上限は本研究で評価しなかったとは言え、ゲノムサイズの１２％の増加（６００ｂｐ）はＣＦＴＲ発現カセットの送達に非常に重要である。ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１パッケージングは、強いＣＢＡプロモーターに駆動されるＣＦＴＲ発現カセットの使用を可能にし、そしてＣＦ  ＨＡＥ中のＣＦＴＲ依存性塩素イオン電流の非常に合理的な修正をもたらした。野生型ゲノムより約５％より多いＤＮＡを効果的にパッケージングするｒＡＡＶの能力に基づけば、ＨＢｏＶ１に基づくベクターが長さ５．８ｋｂまでのゲノムを効率的にパッケージングすることが可能でありうることを期待することは合理的である。
【０２６１】
結論として、２つの新たな種類の組換えのＨＢｏＶ１に基づくベクターをヒト気道に対する効率的遺伝子治療のため開発した。しかしながら、キメラｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターは、ヒト遺伝子治療のための真正のｒＨＢｏＶ１ベクターを上回る３つの明確な利点を有する。第一に、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターの収量は、ＨＥＫ２９３細胞産生系でｒＨＢｏＶ１についてのものより有意により大きかった。第二に、ｒＡＡＶ２ゲノムは臨床試験で既に使用されており、そして新たなウイルスゲノムの使用に付随して起こりうる潜在的な安全性の懸念を回避する。第三に、ｒＨＢｏＶ１ベクターの応用は、ヘルパープラスミドの相同的組換えにより生成され得るベクターストック中の複製能力のあるウイルスの汚染の可能性により妨げられ得る。ＨＡＥ中の細胞病理がｒＨＢｏＶ１での感染後に観察されなかったため、後者の懸念は仮定的でありそうである。
【実施例４】
【０２６２】
その中で強いＣＭＶプロモーターが使用されかつＮＳ１  ＯＲＦが早期終止された、最適化されたＨＢｏＶ１キャプシドヘルパーｐＣＭＶＨＢｏＶ１ＮＳ１（−）Ｃａｐ（図１０Ａ）は、産生の大きな増大（トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の２０枚の１４５ｍｍプレートあたり約１．５×１０12ＤＲＰまで）を生じ、ｒＡＡＶ２／２のものに匹敵するレベルであった（図９Ｃ）。バキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）を用いるＳｆ９昆虫細胞中のｒＡＡＶベクター産生が高度に効率的かつ直線的に拡大縮小可能であるため、ＢＥＶに基づくｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクター産生系を、収量をさらに増大させるために確立した。具体的には、以下のＢＥＶベクターを構築した（図１０Ａ）。すなわちＡＡＶ２  Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ５２を発現するＡＡＶ２  Ｒｅｐヘルパーバキュロウイルス（Ｂａｃ−Ｒｅｐ）；ＨＢｏＶ１キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰｘおよびＶＰ２を発現するＨＢｏＶ１  Ｃａｐヘルパーウイルス（Ｂａｃ−Ｃａｐ）；ならびにｒＡＡＶ２ゲノムを含有する導入ベクター（Ｂａｃ−ｒＡＡＶ）。これらのベクターの発現およびｒＡＡＶ２ゲノムの複製を促進するそれらの能力を確認した（図１０Ｂ）。等しいＭＯＩ（５ｐｆｕ／細胞）の各ウイルスとの２００ｍＬのＳｆ９細胞培養物（２×１０6細胞／ｍＬ）の共感染は１×１０12ＤＲＰの収量でベクターを産生し（図１０ＣおよびＤ）、そしてＳｆ９および２９３細胞から産生されたベクターはＣｕＦｉ−ＡＬＩを形質導入する類似の能力を有した（図１０Ｅ）。これらの結果は、感染性ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターが、最適化された４種のプラスミドでコトランスフェクトされた２９３細胞系でと同じくらい効率的にＢＥＶ−Ｓｆ９細胞系で産生され得ることを示す（図９）。最適化前でさえ、Ｓｆ９細胞からのｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターの産生はＳｆ９細胞からのｒＡＡＶ２／２ベクターの収量の１０％を達成した（図１０Ｄ）。Ｓｆ９細胞中のｒＡＡＶベクター産生はバイオリアクターを使用してスケールアップすることができ、また、ｒｅｐおよびｃａｐを発現するＳｆ９細胞株を使用してさらに増大させ得るため、バイオリアク
ター中でのｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１産生は、Ｓｆ９細胞培養物１リットルあたり１０14ＤＲＰより上の収量までさらなる１０倍増大させ得ることが仮定された。
【０２６３】
増大されたパッケージング能力は、特にＨＡＥ中のＣＦＴＲ遺伝子の発現を調節することに関してｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターの重要な利点の１つである。過大なｒＡＡＶ２ゲノム（５．５ｋｂ）を、強いＣＢＡプロモーターの制御下のＦＬ−ＣＦＴＲ  ＯＲＦの効果的発現を可能にするためにＨＢｏＶ１キャプシド中に包むことができるとは言え、さらなる５％だけの拡張は、気道上皮の繊毛細胞中の発現を駆動するＦＯＸＪ１プロモーター（ＶｅｒｄｉｅｖとＤｅｓｃｏａｔｅｓ、１９９９）を利用すること、およびまたＣＦＴＲ発現の適切な調節のためＣＦＴＲ  ３’ＵＴＲの重要な配列（マイクロＲＮＡターゲッティング部位）の大部分をｒＡＡＶ２ゲノム中に組込むことも可能にするとみられる。
【０２６４】
ＨＢｏＶ１キャプシドは、大きな喪失ベクター産生を伴わず５．９ｋｂのより大きいｒＡＡＶ２ゲノムをパッケージングした（図１１）。ならびに、図１２に示されるとおり、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターはＨＡＥ  ＡＬＩ培養物中の繊毛およびＫ１８陽性上皮細胞を効率的に形質導入した。
【実施例５】
【０２６５】
ヒト完全長ＣＦＴＲ  ＯＲＦをコードするｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクター。ｒＡＡＶのパッケージング容量の制限により、８３ｂｐの合成プロモーター（ｔｇ８３）を、ＡＶ２／２．ｔｇ８３−ＣＦＴＲ中のＦＬ−ＣＦＴＲ  ＯＲＦの発現を駆動するのに使用した（図１３Ｂ）。短いエンハンサーについて５０，０００種超のユニーク配列の合成オリゴヌクレオチド（約１００ｂｐ）ライブラリー（Ｓｃｈａｌａｂａｃｈら、２０１０）のスクリーニングは、Ｆ５エンハンサーが、ｔｇ８３プロモーター活性をＨＡＥ−ＡＬＩ中で強いＣＭＶプロモーターのものの６０％と同じくらい高いレベルに上げることを示した（図１３Ａ）。このプロモーターを、ＡＶ２／ＨＢｃ．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃおよびＡＶ２．ＨＢｃ．Ｆ５ｔｇ８３ｌｕｃ−ＣＭＶｍｃｈｅｒｒｙ（図１２）ベクター中に操作した。ｒＡＡＶ２／２ベクター中のＣＦＴＲ発現のための短い（１８５ｎｔ）しかし効率的なＦ５ｔｇ８３プロモーターの組込みは、短縮されたＣＦＴＲ  ＯＲＦ、例えばＲドメインでの部分的欠失（１５９ｂｐ）［ＣＦＴＲ（ΔＲ）］の使用を必要とし（Ｏｓｔｅｄｇａａｒｄら、２００２；Ｇｉｌｌｅｎら、２０１１）、これはＡＡＶ２／２ベクターの天然の（低くはあるが）頂端向性のほかにＣＦＴＲ機能を損ないうる（図１３Ｂ）。しかしながら、Ｆ５ｔｇ８３は、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクター中でＦＬ−ＣＦＴＲ  ＯＲＦの発現を駆動するための理想的なプロモーターとしてはたらき得る。ＡＶ２／ＨＢｃ．Ｆ５ｔｇ８３ｈＣＦＴＲベクターは、調節性のＣＦＴＲ発現のさらなる最適化のため最低６００ｂｐの空隙を有する。ＣＦＴＲ発現を調節することが報告されているマイクロＲＮＡ例えばｍｉＲ１０１、ｍｉＲ−１４５およびｍｉＲ−４９４（Ｇｉｌｌｅｎら、２０１１；Ｍｅｇｉｏｒｎｉら、２０１１）のためのターゲッティング部位を含有する短いＣＦＴＲ  ３’ＵＴＲ配列を組込むことにより、転写（後）調節戦略はＣＦＴＲ発現の自律的調節を可能にすることができ、そして従って内因性のレベルのＣＦＴＲ発現およびより生理学的な補完パターンをもたらすことができる  １ｋｂの繊毛細胞特異的プロモーターのようなより長い調節エレメントを組込むため、５．８ｋｂのＡＶ２／ＨＢｃ．ＦＯＸＪ１ｈＣＦＴＲベクターからの部位特異的ＣＦＴＲ発現のためのＦＯＸＪ１（Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉら、２００３）（図１３Ｃ）は、ＨＢｏＶ１キャプシドの拡張可能なパッケージング容量を必要とする。
【０２６６】
ＨＢｏＶ１キャプシド中にシュードタイプされるべき新たなｒＡＡＶ２構築物（ＡＶ２．Ｆ５ｔｇ８３ｈＣＦＴＲ、ＡＶ２．Ｆ５ｔｇ８３ｈＣＦＴＲ（＋）およびＡＶ２．ＦＯＸＪ１ｈＣＦＴＲ）（図１３Ｃ）を生成するため、ならびにＣＦＴＲ特異的Ｃｌ-欠損を
ＡＶ２／ＨＢｃ．ＣＢＡｈＣＦＴＲで修正することにおけるそれらの有効性を比較するため、不死化ヒトＣＦ気道細胞株ＣｕＦｉ８（遺伝子型：ΔＦ５０８／ΔＦ５０８）由来のＣｕＦｉ−ＡＬＩ中の新たなベクターの機能性を試験する。ｃＡＭＰに調節されるＣｌ-チャネル活性の補完についての短絡電流（Ｉｓｃ）の変化を測定し、そしてｐ．ｉ．１０日の頂端膜側の完全にプロセシングされたＣＦＴＲタンパク質のレベルを検査する。より生理学的なレベルのＣＦＴＲの発現がＣＦＴＲ活性を復帰させることができるという仮説を試験するため、５０倍範囲にわたる４種のベクター用量でこれらのベクターを使用して感染させたＣＦ異種移植片中のＣＦＴＲ発現レベルおよび機能の並べた比較評価を実施する。経上皮電位差（ＴＥＰＤ）を測定してＣＦＴＲ補完のレベルを評価する。その後、気道液を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細菌死滅アッセイならびに（実験の終了での）細菌クリアランスを評価するｉｎ  ｖｉｖｏ細菌攻撃実験のため収集する。表面上皮でのＣＦＴＲの発現は、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアおよび／若しくは完全にプロセシングされたＢおよびＣについての免疫沈降キナーゼアッセイを使用して、頂端膜でのＩＦ染色により定量することができる。移植片サンプル中のベクター由来ＣＦＴＲ  ｍＲＮＡおよび細胞内ベクターゲノムコピー（ｖｇｃ）の数は、以前にわれわれの実験室により記述されたとおりｑＰＣＲにより定量することができる。
【０２６７】
重度肺ＣＦ疾患に関連するＣＦＴＲ突然変異の大部分はエクソン１０の下流に位置する（図１４Ｃ）。ＳＭａＲＴアプローチはｍＲＮＡレベルでＣＦＴＲ機能不全を修復するとみられ、また、ＣＦＴＲを内因性に発現する細胞のみに影響を及ぼすとみられる。この修復技術は、突然変異のないＣＦＴＲ  ｍＲＮＡを再構成するトランススプライシング過程を誘発するために、ベクター由来のプレｍＲＮＡおよび内因性ＣＦＴＲプレｍＲＮＡ中のイントロンドメインのハイブリダイゼーションに頼る。ベクターＡＶ２．ＣＭＶ−ＰＴＭ２４ＣＦ（図１４Ａ）は、最適化されたトランススパイシング（ｓｐｉｃｉｎｇ）ドメイン（図１４Ｂ）およびＣＦＴＲエクソン１０−２６よりなる治療前ＲＮＡ分子（ＰＴＭ）をコードする。該トランススパイシングドメインは、イントロン９の３’スプライス部位（ＳＳ）近くのＰＴＭ２４相補／結合ＲＮＡ配列（結合ドメイン＝ＢＤ）を標的とし、内因性の（欠損）ＣＦＴＲプレｍＲＮＡのイントロン９の５’ＳＳからＰＴＭ  ＲＮＡの３’ＳＳまで、およびその後機能的ＣＦＴＲ  ｍＲＮＡの産生までのトランススプライシングをもたらす（図１４Ｃ）。ＡＶ２．ＣＭＶ−ＰＴＭ２４ＣＦ中のＰＴＭの有効性はＣＦ（ΔＦ５０８／ΔＦ５０８）ＨＡＥ−ＡＬＩで検証されている（Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉら、２００３）。ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１ベクターの頂端形質導入の高い効率および拡大されたゲノム容量は、ＳＭａＲＴアプローチによりＣＦＴＲ発現を修正することに関するｒＡＡＶベクターの固有の弱点の問題を克服することができ、そして、無傷の３’ＵＴＲ（１，５５７ｂｐ）を伴う完全に再構成されたＣＦＴＲ  ｍＲＮＡ（Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉら、２００３）は、転写後調節例えばｍｉＲＮＡによる調節により、内因性のレベルの正確に調節されたＣＦＴＲタンパク質発現を提供すること。
【０２６８】
ＣＦＴＲ機能をレスキューすることにおける５．５５ｋｂのｒＡＡＶ２  ＰＴＭゲノム、ＡＶ２．ＣＢＡ−ＰＴＭ２４ＣＦ−３ＵＴＲの有効性を試験する（図１４Ｄ）。第一世代のベクター（ＡＶ２．ＣＭＶ−ＰＴＭ２４ＣＦ）からの既に最適化されたＰＴＭトランススプライシングドメインを保持しつつ、このゲノムはＣＦＴＲ  ｃＤＮＡの１．５ｋｂの３’ＵＴＲもまた包含し、そしてＣＭＶプロモーターの代わりにＣＢＡプロモーターを使用する。３’ＵＴＲを転写しないＡＶ２．ＣＢＡ−ＰＴＭ２４ＣＦが対照としてはたらくことができる。ｒＡＡＶ２ゲノムＡＶ２．ＣＢＡ−ＰＴＭ２４ＣＦ−３ＵＴＲおよびＡＶ２．ＣＢＡ−ＰＴＭ２４ＣＦは、その高いパッケージング容量および効率的な頂端形質導入のためにＨＢｏＶ１キャプシドを使用してシュードタイプされる。これらｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１  ＰＴＭベクターを５ｋのＭＯＩでＣＦ  ＨＡＥ−ＡＬＩ培養物に頂端で適用し、そしてＣＦＴＲ発現の機能の修正をｐ．ｉ．３日および１週に評価することができる。ｐ．ｉ．４週で実験を終了することができ、そしてｉｎ  ｖｉｖｏ細菌攻撃アッセイ
を実施して移植片中の細菌クリアランスを評価することができる。
【０２６９】
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Ｚｈａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１０：９９０（２００４）。
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Ｚｈｉら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３１８：１４２（２００４）。
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Ｚｈｏｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３８１：１９４（２００８）。
【０２７０】
全部の刊行物、特許および特許出願は引用することにより本明細書に組み込まれる。前述の明細で、本発明はそのある種の好ましい態様に関して記述され、そして多くの詳細が
具体的説明の目的上示された一方、本発明は付加的な態様の影響を受けやすいこと、および本明細書の詳細のあるものは本発明の基本原則から離れることなくかなり変えられてよいことが、当業者に明らかであろう。
【図１】
0006516725.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0006516725.tif 000010
【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図８−８】
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【図８−９】
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【図８−１０】
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【図８−１１】
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【図８−１２】
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【図８−１３】
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【図８−１４】
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【図８−１５】
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【図８−１６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１６−５】
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【図１６−６】
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【図１６−７】
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【配列表】
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