(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＲ５受容体に特異的に結合する少なくとも１又は２のポリペプチド、並びに医薬用担体、希釈剤又は賦形剤を含む組成物であって、ここで少なくとも１又は２のポリペプチドが：
−ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む第一の結合ドメインであって、当該ＶＨ鎖が、配列番号１３の配列のＣＤＲ１、配列番号１４の配列のＣＤＲ２、配列番号：１５の配列のＣＤＲ３を含み、かつ当該ＶＬ鎖が、配列番号１６の配列のＣＤＲ１、ＦＡＳ配列のＣＤＲ２、配列番号１７の配列のＣＤＲ３を含む、前記第一の結合ドメイン、並びに
−ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む第二の結合ドメインであって、当該ＶＨ鎖が、配列番号１８の配列のＣＤＲ１、配列番号１４の配列のＣＤＲ２、配列番号１９の配列のＣＤＲ３を含み；かつ当該ＶＬ鎖が、配列番号２０の配列のＣＤＲ１、ＲＴＳ配列のＣＤＲ２、配列番号２１の配列のＣＤＲ３を含む、前記第二の結合ドメイン
を含む、２つの免疫グロブリン結合ドメインを含み、ここで
−少なくとも１つのポリペプチドが、第一及び第二の免疫グロブリン結合ドメインの両方を含むか、又は
−少なくとも２つのポリペプチドが、ヒトを含む哺乳動物への同時投与のための第一の結合ドメインを含む第一のポリペプチドと、第二の結合ドメインを含む第二のポリペプチドとを含む、組成物。
【請求項２】
−配列番号２と４のアミノ酸配列対、
−配列番号６と８のアミノ酸配列対、又は
−配列番号２と４及び配列番号６と８である両方のアミノ酸配列対；又は
−配列番号３５と３７のアミノ酸配列対、
−配列番号３９と４１のミノ酸配列対、又は
−配列番号３５と３７及び配列番号３９と４１である両方のアミノ酸配列対
を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
ＤＲ５受容体に特異的に結合するポリペプチドであって、配列番号２と４のアミノ酸配列対を含むポリペプチド、並びにＤＲ５受容体に特異的に結合する別のポリペプチドであって、配列番号６と８のアミノ酸配列対を含むポリペプチドを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
ＤＲ５受容体に特異的に結合するポリペプチドであって、配列番号３５と３７のアミノ酸配列対を含むポリペプチド、並びにＤＲ５受容体に特異的に結合する別のポリペプチドであって、配列番号３９と４１のアミノ酸配列対を含むポリペプチドを含む請求項１記載の組成物。
【請求項５】
ＤＲ５受容体に特異的に結合するポリペプチドであって、配列番号２と４及び配列番号６と８である両方のアミノ酸配列対を含むポリペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
ＤＲ５受容体に特異的に結合するポリペプチドであって、配列番号３５と３７及び配列番号３９と４１である両方のアミノ酸配列対を含むポリペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記１又は複数のポリペプチドが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、ｓｃＦｖ、抗体、好ましくはモノクローナル抗体である、請求項１〜６のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８】
腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し、及び／又は癌、好ましくは固形癌を治療するための、医薬品としての使用のための、請求項１〜７のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９】
別の抗癌剤と組合せて使用するための、請求項１〜８のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０】
ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む１又は２の結合ドメインを含む、ＤＲ５受容体に特異的に結合するポリペプチドであって、ここで当該ＶＨ鎖が、配列番号１３の配列のＣＤＲ１、配列番号１４の配列のＣＤＲ２、配列番号１５の配列のＣＤＲ３を含み；並びに、当該ＶＬ鎖が、配列番号１６の配列のＣＤＲ１、ＦＡＳ配列のＣＤＲ２、配列番号１７の配列のＣＤＲ３を含む、ポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、ＶＨ鎖のＣＤＲ１として配列番号１８、ＣＤＲ２として配列番号１４、及びＣＤＲ３として配列番号１９の配列、並びにＶＬ鎖のＣＤＲ１として配列番号２０、ＣＤＲ２としてＲＴＳ、及びＣＤＲ３として配列番号２１の配列を含む抗体が結合するＤＲ５−０５エピトープに結合する抗体と併用される、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む１又は２の結合ドメインを含む、ＤＲ５受容体に特異的に結合するポリペプチドであって、ここで当該ＶＨ鎖が、配列番号１８の配列のＣＤＲ１、配列番号１４の配列のＣＤＲ２、配列番号１９の配列のＣＤＲ３を含み；並びに、当該ＶＬ鎖が、配列番号２０の配列のＣＤＲ１、ＲＴＳ配列のＣＤＲ２、配列番号２１の配列のＣＤＲ３を含む、ポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、ＶＨ鎖のＣＤＲ１として配列番号１３、ＣＤＲ２として配列番号１４、及びＣＤＲ３として配列番号１５の配列、並びにＶＬ鎖のＣＤＲ１として配列番号１６、ＣＤＲ２としてＦＡＳ、及びＣＤＲ３として配列番号１７の配列を含む抗体が結合するＤＲ５−０１エピトープに結合する抗体と、併用される、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
ＤＲ５受容体に特異的に結合する二重パラトピックの、二重特異性の、又は多価のポリペプチドであって：
−ＶＨ鎖が、配列番号１３の配列のＣＤＲ１、配列番号１４の配列のＣＤＲ２、配列番号１５の配列のＣＤＲ３を含み；及び、ＶＬ鎖が、配列番号１６の配列のＣＤＲ１、ＦＡＳ配列のＣＤＲ２、配列番号１７の配列のＣＤＲ３を含む、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む第一の結合ドメイン、並びに
−ＶＨ鎖が、配列番号１８の配列のＣＤＲ１、配列番号１４の配列のＣＤＲ２、配列番号１９の配列のＣＤＲ３を含み；及び、ＶＬ鎖が、配列番号２０の配列のＣＤＲ１、ＲＴＳ配列のＣＤＲ２、配列番号２１の配列のＣＤＲ３を含む、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む第二の結合ドメイン：
を含むポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号１、３、５、７、３４、３６、３８又は４０のヌクレオチド配列を含む、単離されたヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１５記載のヌクレオチドを含む、発現ベクター又は宿主細胞。
【請求項１７】
２種のポリペプチド又は抗体若しくはその断片を含む組成物であって、その両方がＤＲ５に結合する能力を有しており、当該ＤＲ５の第一のエピトープへ結合する第一のポリペプチド又は抗体が、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖の対を含む結合ドメインを含み、ここで当該ＶＨ鎖が、配列番号１３の配列のＣＤＲ１、配列番号１４の配列のＣＤＲ２、配列番号１５の配列のＣＤＲ３を含み；及び、ＶＬ鎖が、配列番号１６の配列のＣＤＲ１、ＦＡＳ配列のＣＤＲ２、配列番号１７の配列のＣＤＲ３を含むものであり、並びに
第二のポリペプチド又は抗体が、当該ＤＲ５の第二のエピトープに結合するＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む結合ドメインを含み、ここでＶＨ鎖が、配列番号１８の配列のＣＤＲ１、配列番号１４の配列のＣＤＲ２、配列番号１９の配列のＣＤＲ３を含み；及び、ＶＬ鎖が、配列番号２０の配列のＣＤＲ１、ＲＴＳ配列のＣＤＲ２、配列番号２１の配列のＣＤＲ３を含むものである、ヒトを含む哺乳動物への同時投与のための前記組成物。
【請求項１８】
ＤＲ５へ結合する能力を有する二重特異性抗体、又はその結合性断片であって、該抗体が該ＤＲ５の第一のエピトープに結合する、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む結合ドメインを含み、ここでＶＨ鎖が、配列番号１３の配列のＣＤＲ１、配列番号１４の配列のＣＤＲ２、配列番号１５の配列のＣＤＲ３を含み；及び、ＶＬ鎖が、配列番号１６の配列のＣＤＲ１、ＦＡＳ配列のＣＤＲ２、配列番号１７の配列のＣＤＲ３を含み、並びに
該ＤＲ５の第二のエピトープに結合する、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む結合ドメインを含み、ここでＶＨ鎖が、配列番号１８の配列のＣＤＲ１、配列番号１４の配列のＣＤＲ２、配列番号１９の配列のＣＤＲ３を含み；及び、ＶＬ鎖が、配列番号２０の配列のＣＤＲ１、ＲＴＳ配列のＣＤＲ２、配列番号２１の配列のＣＤＲ３を含む第二の異なる抗原−結合部位を含む、二重特異性抗体、又はその結合性断片。
【請求項１９】
癌、自己免疫疾患、炎症状態の治療又は予防のための、請求項１〜９のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２０】
請求項１０に記載のポリペプチド及び請求項１２に記載のポリペプチドを含む、癌、自己免疫疾患、炎症状態の治療又は予防のための組成物。
【請求項２１】
ＤＲ５−０１エピトープに特異的に結合する、VH及びVL鎖を含むポリペプチドであって、ＶＨ鎖のＣＤＲ１として配列番号１３、ＣＤＲ２として配列番号１４、及びＣＤＲ３として配列番号１５の配列、並びにＶＬ鎖のＣＤＲ１として配列番号１６、ＣＤＲ２としてＦＡＳ、及びＣＤＲ３として配列番号１７の配列を含む、前記ポリペプチド；及び
ＤＲ５−０５エピトープに特異的に結合する、VH及びVL鎖を含むポリペプチドであって、ＶＨ鎖のＣＤＲ１として配列番号１８、ＣＤＲ２として配列番号１４、及びＣＤＲ３として配列番号１９の配列、並びにＶＬ鎖のＣＤＲ１として配列番号２０、ＣＤＲ２としてＲＴＳ、及びＣＤＲ３として配列番号２１の配列を含む、前記ポリペプチド
を含む併用医薬。
【請求項２２】
癌、自己免疫疾患、又は炎症状態の治療又は予防のための、請求項２１に記載の併用医薬。
【請求項２３】
癌、自己免疫疾患、又は炎症状態の治療又は予防のためのキットであって、以下の：
ＤＲ５−０１エピトープに特異的に結合する、VH及びVL鎖を含むポリペプチドであって、ＶＨ鎖のＣＤＲ１として配列番号１３、ＣＤＲ２として配列番号１４、及びＣＤＲ３として配列番号１５の配列、並びにＶＬ鎖のＣＤＲ１として配列番号１６、ＣＤＲ２としてＦＡＳ、及びＣＤＲ３として配列番号１７の配列を含む前記ポリペプチド；及び
ＤＲ５−０５エピトープに特異的に結合する、VH及びVL鎖を含むポリペプチドであって、ＶＨ鎖のＣＤＲ１として配列番号１８、ＣＤＲ２として配列番号１４、及びＣＤＲ３として配列番号１９の配列、並びにＶＬ鎖のＣＤＲ１として配列番号２０、ＣＤＲ２としてＲＴＳ、及びＣＤＲ３として配列番号２１の配列を含む前記ポリペプチド
を含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、免疫学、腫瘍学の分野に関し、より詳細にはＤＲ５抗原を発現する様々な癌、自己免疫疾患、感染症の治療に有利に使用することができる単一特異性、二重特異性又は多価の抗体分子に関する。本発明は、ＴＲＡＩＬ受容体２とも称されるＤＲ５受容体に特異的に結合する新規ポリペプチドに関する。本発明は特に、ＤＲ５受容体の異なるエピトープに結合し、これによりアポトーシスが誘導される、２つの異なる結合ドメインを有するポリペプチド又はこれらの異なる結合ドメインを有するポリペプチドの組合せに関する。本発明はまた、これらのポリペプチドを含む医薬組成物、並びにこれらのポリペプチド及び組成物を使用する癌、自己免疫疾患及びウイルス感染症の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
アポトーシス、又はプログラムされた細胞死は、多細胞生物の正常な発達及びホメオスタシスに必須の生理的プロセスである。アポトーシスの攪乱は、癌、神経変性障害、及び獲得免疫不全症候群を含むいくつかのヒト疾患の発症の一因となっている。
【０００３】
サイトカインＴＮＦスーパーファミリーの一員である腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−関連アポトーシス−誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）は、主に正常組織において発現される２型膜タンパク質であり、これはプロテアーゼ切断を受け、ＴＲＡＩＬ受容体に結合することができる可溶型を生じることができる（Wiley SR.ら、Immunity. 1995; 3:673-682；Daniel PTら、J Immunol. 1994; 152:5624）。
【０００４】
このファミリーのリガンドは一般に、細胞表面上のコグネイト受容体の限定されたサブセットを認識し且つ結合し、その受容体の下流のシグナル伝達カスケードに繋がり、ＮＦ−κＢ又はカスパーゼ活性化を含むシグナル伝達経路の巨大なパネルの活性化を可能にする。ＴＲＡＩＬは、数多くの異なる型の癌細胞に加え、ウイルス感染細胞を含む、ある種の形質転換された細胞のアポトーシスを誘導するが、数多くの正常細胞型のアポトーシスは誘導せず、従って癌療法の開発において特に興味深い（Walczakら、Nature Medecine. 1999; 5/157-163；Ashkenazi A.ら、J Clin Invest. 1999; 104:155）。
【０００５】
ＴＲＡＩＬに関して４種の既知の細胞表面受容体が存在する。ＴＲＡＩＬ受容体１（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＤＲ４）及びＴＲＡＩＬ受容体２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＤＲ５、Ａｐｏ−２、ＴＲＩＣＫ２、Ｋｉｌｌｅｒ、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ−６３）は、細胞質デスドメインを有し、且つ下流のカスパーゼ活性化を介して、腫瘍細胞におけるアポトーシスを惹起することができる。他の２種の受容体であるＴＲＡＩＬ受容体３（ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＤｃＲ１、ＴＲ５、ＴＲＩＤＤ、ＬＩＴ）及びＴＲＡＩＬ受容体４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＤｃＲ２、ＴＲＵＮＤＤ）は、細胞質デスドメインを欠いており、アポトーシスを媒介しない。加えてタンパク質のＴＮＦ受容体ファミリーの可溶型（分泌型）の一員であるオステオプロテジェリン（ＯＰＧ）も、ＴＲＡＩＬに結合する。
【０００６】
ＤＲ４及びＤＲ５の各々の細胞質内ドメインは、いわゆるデスドメインを含む。その受容体ＤＲ４及びＤＲ５の活性化後、Ｆａｓ−結合したデスドメインアダプター分子は、その受容体へ動員され、自己タンパク質分解性切断及びイニシエーターのカスパーゼ−８の活性化に繋がる。ＤＲ４及びＤＲ５は、ＴＲＡＩＬの結合時に、アポトーシスシグナルをＴＲＡＩＬ感受性癌細胞へ伝達することが報告されている。次に活性型カスパーゼ−８は、カスパーゼ−３を含む、下流のカスパーゼのタンパク質分解性活性化を惹起する。下流のカスパーゼは、最終的には広範な細胞タンパク質を分解し、アポトーシスが終結する。
【０００７】
ＤＲ４又はＤＲ５のいずれかの発現は、結腸癌、胃癌、膵癌、卵巣癌、乳癌、及び非小細胞肺癌を含む、ヒト癌において頻繁に検出され、正常組織においては、発現は低いか又は発現されない。
【０００８】
多くの疾患の発症又は進行において、細胞が欠損されない場合が多い。多くの自己免疫疾患及び炎症状態において、生存している活性化された細胞は、正常な組織又は細胞を攻撃する。更に腫瘍形成の進行及び関節リウマチの増殖性パンヌス形成は、チェックされない細胞の増殖を特徴としている。従って不充分なアポトーシスは、疾患の発症に繋がり、且つアポトーシスを増強するためのアポトーシス−誘導性リガンド又はアゴニスト性ＭＡｂの使用は、それらの望ましくない細胞を除去するための可能性のある治療戦略であると考えられる。
【０００９】
ＴＲＡＩＬは、広範な造血細胞及び固形腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導する一方で、ほとんどの正常細胞を残す(sparing)。ＴＲＡＩＬは、インビトロにおいて癌細胞に対する強力なアポトーシス−誘導活性を、及びインビボにおいて様々な癌の腫瘍異種移植片に対する強力な抗腫瘍活性を有する。
【００１０】
ＴＲＡＩＬ、及びＴＲＡＩＬ受容体を標的とするアゴニスト抗体を含むその誘導体は、著しい副作用を伴わずに腫瘍退縮を誘導するそれらの能力のために、癌療法の魅力的化合物である。
【００１１】
特許文献において、癌性細胞に対する治療としてのＴＲＡＩＬリガンドから誘導されるポリペプチドの使用を研究する多くの事例が存在する（US20090131317；US 6,469,144；US 6,740,739；US20070026000；US 6,444,640；US20050244857；US20050233958；US 7,736,637）。
【００１２】
ＴＲＡＩＬポリペプチドは、ＴＲＡＩＬアポトーシス経路を誘導するツールとして最初に研究されたが、それには短い半減期という欠点があった。
【００１３】
現在、癌の治療に関する新規免疫療法戦略の開発に、大きな注目が集まっている。そのような戦略の一つは、抗体−ベースの癌療法である。
【００１４】
前述の標的化特性の最も顕著な決定因子は、特異性の程度に関連する抗体−ベースの分子のサイズ、腫瘍における保留及びそれらのクリアランスである。有意に大きい腫瘍の保留は標的への多価結合に関連しているので、抗体−ベースの分子の別の重要な特徴は、抗体結合価である（Adamsら、Cancer Res. 1993; 51:6363-6371；Wolfら、Cancer Res. 1993; 53:2560-2565）。
【００１５】
先に言及されたように、ＤＲ４又はＤＲ５に対するアゴニスト抗体が作製され、且つ癌療法の新たな世代を表している。ＴＲＡＩＬアポトーシス経路を誘導するために、ＴＲＡＩＬ受容体に対して向けられたアゴニスト抗体の使用についての研究も行われている。
【００１６】
ＤＲ４又はＤＲ５へ特異的に結合するアゴニストモノクローナル抗体は、標的化された腫瘍細胞のアポトーシスを直接誘導できることが想定されている（Buchsbaum DJら、Future Oncol. 2006; 2:493；Rowinsky EKら、J Clin Oncol. 2005; 23:9394）。
【００１７】
他の特許は、ＤＲ４、又はＤＲ５、又はＤＲ４とＤＲ５に対して向けられたアゴニスト抗体の使用、或いはＤＲ５に対する抗体と別の化学療法薬の併用に関連している：US20040147725；US 20090022707；US20080248037；US20020155109；US 6,461,823；US 6,872,568；US 7,064,189；US 6,521,228；US 7,704,502。
【００１８】
異なるＴＲＡＩＬ受容体、例えばＤＲ４及びＤＲ５に対して向けられたアゴニスト抗体による組合せ治療もまた、開発されている。調製のために、ＤＲ４又はＤＲ５に結合するアゴニスト二重特異性抗体（又はそのようなアゴニストＭＡｂを産生するハイブリドーマ）が、様々な手法における出発材料として利用され得る（WO 2002/0155109）。
【００１９】
これらは、抗−ＤＲ５ＭＡｂレクサツムマブ（Plummer R.ら、Clin Cancer Res. 2007; 13:6187）、抗−ＤＲ５ＭＡｂアポマブ（Adams C.ら、Cell Death Differ. 2008; 15:751）、抗−ＤＲ５ＭＡｂ  ＬＢｙ１３５（Li J.ら、AACR Meeting Abstracts. 2007. Abstract 4874）、抗−ＤＲ５ＭＡｂ  ＷＤ−１（Wang J.ら、Cell Mol Immunol. 2008; 5:55）及び抗−ＤＲ５ＭＡｂ  ＡＭＧ６５５（Wall J.ら、AACR Meeting Abstracts. 2008. Abstract 1326, Kaplan-Lefko P.ら、AACR Meeting Abstracts. 2008. Abstract 399）を含む。これらの研究全てからの一貫した知見は、抗−ＤＲ５−媒介性細胞傷害作用に対する様々な腫瘍細胞株の感受性にはかなり変動があることである。
【００２０】
各々マパツムマブ又はレクサツムマブを含む、抗−ＤＲ４又は抗−ＤＲ５アゴニスト抗体もまた、患者における忍容性が良好である（Herbst R.S.ら、J Clin Oncol. 2006; 24(18S)/3013；Hotte S.J.ら、Clin Cancer Res. 2008; 14/3450-3455；Wakelee H.Aら、Ann Oncol. 2010; 21/376-381；Fox N.L.ら、 Expert Opin Biol Ther. 2010; 10/1-18）。
【００２１】
レクサツムマブ（ＥＴＲ２−ＳＴ０１としても公知）は、癌治療において使用されるＤＲ５に対するアゴニストヒトモノクローナル抗体である。ＨＧＳ−ＥＴＲ２抗体は、Cambridge Antibody Technologyとの共同作業を通じ、ＨＧＳにより作製された。
【００２２】
ティガツズマブ（ＣＳ−１００８）は、ｍＴＲＡ−８のＣＤＲ領域で構成されたヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。マウスの抗−ＤＲ５モノクローナル抗体であるＴＲＡ−８（ｍＴＲＡ−８）は、その特異性、架橋試薬を使用せずにインビトロにおいてアポトーシスを惹起する能力、及びヒト肝細胞に対し毒性がないことを基に、一連の抗−ＤＲ５モノクローナル抗体から選択された（Buchsbaum DJら、Clin Cancer Res. 2003; 9:3731；Ichikawa K.ら、Nat Med. 2001; 7:954）。
【００２３】
ティガツズマブは、インビトロにおける細胞傷害作用及びインビボにおける抗腫瘍能のｍＴＲＡ−８と非常に類似したパターンを媒介する。これは、様々なヒト腫瘍細胞株に対する強力なインビトロにおける細胞傷害作用、及びヒト癌のマウス異種移植モデルにおいて、インビボにおける抗腫瘍能を有することが示された。そのインビトロにおける細胞傷害作用及びインビボにおける抗腫瘍能は、様々な化学療法薬及び／又は放射線との組合せにより実質的に増強され得る（Buchsbaum DJら、Clin Cancer Res. 2003; 9:3731；DeRosier LCら、Clin Cancer Res. 2007; 13:5535s）。
【００２４】
抗−ＤＲ４抗体及び抗−ＤＲ５抗体は、他の化学療法薬又は療法と関連して、これらと一緒に又はこれらにより試験されている。２種のアゴニスト抗体ＨＧＳ−ＥＴＲ１（抗−ＤＲ４）及びＨＧＳ−ＥＴＲ２（抗−ＤＲ５）並びに放射線治療による結腸直腸癌の組合せ治療は、インビトロにおける増強された効果、及びインビボにおける用量−依存的な成長遅延をもたらしている（Marini Pら、Oncogene, 2006; 25 (37):5145-54）。ＤＲ４及びＤＲ５に対する完全ヒトアゴニスト抗体は、原発性及び培養されたリンパ腫細胞のアポトーシスの誘導、並びにドキソルビシン−及びボルテゾミブ−誘導した細胞死の増強を明らかにした（Georgakis GVら、Oncogene, 2006; 25(37): 5145-54）。乳癌細胞のＤＲ５の発現及びＴＲＡＩＬ−誘導性アポトーシスに対する感受性は、放射線により増強されることが認められ、このことは放射線と組合せられたＴＲＡＩＬの効能は、癌療法において増強されることを示唆している（Chinnaiyan A.Mら、PNAS. 2000; 97/1754-1759）。
【００２５】
抗体と化学療法の組合せは、通常アポトーシスの程度を増強し、且つ一部の細胞株において抵抗性を部分的に逆行する（Buchsbaum DJら、J Clin Cancer Res. 2003; 9:3731；DeRosier LCら、Clin Cancer Res. 2007; 13:5535s；Oliver PGら、Clin Cancer Res. 2008; 14:2180；Derosier LCら、Mol Cancer Ther. 2007; 6:3198；Long JW.ら、J Surg Res. 2007; 137:167）。
【発明の概要】
【００２６】
発明の概要
本発明者らは今回、予想外に、ＤＲ５受容体の少なくとも２つの異なるエピトープに対して向けられた２種の抗体を使用することにより、ＤＲ５アポトーシス経路を誘導することが可能であることを発見した。同じ受容体上の両方のエピトープへの結合は、受容体上でアゴニスト作用を有し、且つ効率的な様式でアポトーシスを誘導する。本明細書に開示されたような抗体ＤＲ５−０１とＤＲ５−０５の組合せは、リガンドそれ自身よりもより強力なアゴニスト作用を明らかにした。
【００２７】
ＤＲ５受容体上の異なるエピトープの各々に対し向けられた２種の抗体を使用することにより、単独のエピトープに対する１種の抗体に比べ、予想外の相乗的作用が認められた。理論に結びつけられることを欲するものではないが、ＤＲ５の２つのエピトープに対する結合は、相乗的アゴニスト性機能を可能にし、予想外の上昇したアポトーシス誘導に繋がることが想定される。予想外の相乗的作用は、治療的処置に又は治療的プロトコールの統合に有益であることがわかった。従って本抗体の組合せは、癌細胞、特に神経膠腫における、増殖の阻害の相乗的増強に繋がることがわかった。本抗体と化学療法薬の組合せは、化学療法薬に対しより多く又はより少なく抵抗性である神経膠腫、肺癌及び乳癌などの治療が困難である癌の症例において、癌細胞増殖の阻害の相乗的増強に繋がることもわかった。同じく、この抗体と薬物の組合せは、細胞増殖の阻害などの治療効果の獲得を可能にし、このことは薬物及び／又は抗体の広い範囲の用量にわたり安定して認められることもわかった。
【００２８】
従って今回、ＤＲ５上の２つの異なるエピトープに結合することにより、アゴニストとして作用する２種のポリペプチド若しくは抗体を含有する医薬組成物、又はＤＲ５上の２つの異なるエピトープに結合することによりアゴニストとして作用する二重特異性抗体、並びにこれを含有する医薬組成物を提供することが可能である。
【００２９】
天然の受容体に関する「アゴニスト」又は「アゴニスト性ポリペプチド又は抗体」は、この受容体に結合し、受容体−アゴニスト複合体を形成する化合物、並びに、該受容体を活性化し、シグナル伝達経路及び更なる生物学的プロセスを開始する化合物である。本発明の文脈において、アゴニスト機能は、本発明のポリペプチド又は抗体とＤＲ５受容体の２つの異なるエピトープの間の、同時又は逐次相互作用の結果として得られ、これはＤＲ５アポトーシス経路を開始する。
【００３０】
従って本発明の目的は、両方共ＤＲ５に結合する能力を有する、２種のポリペプチド、又は抗体若しくはそれらの断片を含有する組成物であり、第一のポリペプチド又は抗体は、該ＤＲ５の第一のエピトープに結合する第一の抗原−結合部位を含み、並びに第二のポリペプチド又は抗体は、該ＤＲ５の第二のエピトープに結合する第二の異なる抗原−結合部位を含む。該第一及び第二の抗原−結合部位は各々、同じＤＲ５分子上の異なるエピトープに結合する。これら２種のポリペプチド、又は抗体若しくはそれらの断片は、ヒトを含む哺乳動物へ、同時、個別又は連続投与される。
【００３１】
本組成物又は医薬組成物は更に、医薬として許容し得る担体、希釈剤、又は賦形剤を含有することができる。本ポリペプチド又は抗体は、組合せで相乗的アゴニスト性であり、このことはこれらが、ＤＲ５分子の両方のエピトープへの結合時に、ＤＲ５アポトーシス経路を誘導する能力を有することを意味する。
【００３２】
本発明の目的はまた、ＤＲ５へ結合する能力を有する、二重特異性又は二重パラトピックの抗体、又はそれらの断片であり、該抗体は、該ＤＲ５の第一のエピトープへ結合する第一の抗原−結合部位、及び該ＤＲ５の第二のエピトープへ結合する第二の異なる抗原−結合部位を含む。該第一及び第二の抗原−結合部位は各々、同じＤＲ５分子上の異なるエピトープへ結合する。本ポリペプチド又は抗体は、組合せで相乗的アゴニスト性であり、このことはこれらが、ＤＲ５分子のそれらの特異的エピトープの両方への結合時に、ＤＲ５アポトーシス経路を誘導する能力を有することを意味する。
【００３３】
本発明は、１種の二重特異性抗体の、同じＤＲ５分子の２つの異なるエピトープへの結合、又は２種の二重特異性抗体の同じＤＲ５分子の２つのエピトープへの結合、つまり１種の抗体の第一のエピトープへの、第二の抗体の同じＤＲ５分子の第二のエピトープへの結合を包含している。
【００３４】
本二重特異性抗体は、医薬として許容し得る担体、希釈剤、又は賦形剤を更に含有する医薬組成物中に製剤されてよい。
【００３５】
理論に結びつけられることを欲するものではないが、作用機序に関して、本発明の抗体組合せ又は二重特異性抗体は、ＤＲ５クラスタリングを促進し得ると考えられる。これらの成分は、単一特異性抗体と比べ、より高い濃度でＤＲ５蓄積(amassing)を促進することができる。
【００３６】
抗体組合せ又は二重特異性抗体はまた、アポトーシスシグナリングを惹起すること又は癌細胞のアポトーシスに対する抵抗性を逆行することの発生率をより高くする高次構造の変化を促進することができる。これらの成分は、単一特異性抗体と比べ、より高い濃度のＤＲ５蓄積を促進することができる。
【００３７】
別の本発明の目的は、両方共ＤＲ５へ結合する能力を有する、少なくとも２、３、４、５又はそれよりも多い一価の結合ポリペプチド、又は抗体若しくはそれらの断片の結合を包含しており、第一のポリペプチド又は抗体は、該ＤＲ５の第一のエピトープへ結合する第一の抗原−結合部位を含み、並びに第二のポリペプチド又は抗体は、該ＤＲ５の第二のエピトープへ結合する第二の異なる抗原−結合部位を含む。
【００３８】
従って別の本発明の目的は、少なくとも１種の化学療法薬、及び両方共ＤＲ５へ結合する能力を有する、２種のポリペプチド、又は抗体若しくはそれらの断片を含有する組成物であり、第一のポリペプチド又は抗体は、該ＤＲ５の第一のエピトープへ結合する第一の抗原−結合部位を含み、並びに第二のポリペプチド又は抗体は、該ＤＲ５の第二のエピトープへ結合する第二の異なる抗原−結合部位を含む。該第一及び第二の抗原−結合部位の各々は、同じＤＲ５分子上の異なるエピトープへ結合する。この薬物と２種のポリペプチド、又は抗体若しくはそれらの断片は、ヒトを含む哺乳動物へ、同時、個別又は連続投与される。この目的において、これら２種のポリペプチドは、本明細書に開示されたように二重特異性又は二重パラトピックの抗体、若しくはそれらの断片により置き換えることができる。
【００３９】
本発明のポリペプチド、特に抗体は、マウス抗体ＤＲ５−０１及びＤＲ５−０５のＶＨ及びＶＬ領域のＣＤＲにより、又はそれらの完全なＶＨ及びＶＬ領域により、更に規定することができる。
【００４０】
本発明の目的は、ヒトを含む哺乳動物へ、同時、個別又は連続投与のために、ＤＲ５受容体に特異的に結合する少なくとも１又は２種のポリペプチド、並びに医薬用担体、希釈剤又は賦形剤を含有する組成物であり、ここでこの少なくとも１又は２種のポリペプチドは、以下を含む２種の免疫グロブリン結合ドメインを含み：
−ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む第一の結合ドメインであって：
・ここで、ＶＨ鎖は、配列が配列番号：１３を含む又はからなるＣＤＲ１、配列が配列番号：１４  ＣＤＲ１を含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：１５を含む又はからなるＣＤＲ３を含み；並びに、ＶＬ鎖は、配列が配列番号：１６を含む又はからなるＣＤＲ１、配列ＦＡＳを含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：１７を含む又はからなるＣＤＲ３を含むか；又は、
・ここで、ＶＨ鎖は、配列が配列番号：２２を含む又はからなるＣＤＲ１、配列が配列番号：２３を含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：２４を含む又はからなるＣＤＲ３を含み；並びに、ＶＬ鎖は、配列が配列番号：２５を含む又はからなるＣＤＲ１、配列が配列番号：２６を含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：１７を含む又はからなるＣＤＲ３を含むか；又は、
・ここで、ＶＨ鎖は、配列が配列番号：３２を含む又はからなるＣＤＲ１、配列が配列番号：１４を含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：２４を含む又はからなるＣＤＲ３を含み；並びに、ＶＬ鎖は、配列が配列番号：１６を含む又はからなるＣＤＲ１、配列ＦＡＳを含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：１７を含む又はからなるＣＤＲ３を含む；であるもの、並びに
−ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む第二の結合ドメインであって：
・ここで、ＶＨ鎖は、配列が配列番号：１８を含む又はからなるＣＤＲ１、配列が配列番号：１４を含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：１９を含む又はからなるＣＤＲ３を含み；並びに、ＶＬ鎖は、配列が配列番号：２０を含む又はからなるＣＤＲ１、配列ＲＴＳを含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：２１を含む又はからなるＣＤＲ３を含むか；又は
・ここで、ＶＨ鎖は、配列が配列番号：２７を含む又はからなるＣＤＲ１、配列が配列番号：２８を含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：２９を含む又はからなるＣＤＲ３を含み；並びに、ＶＬ鎖は、配列が配列番号：３０を含む又はからなるＣＤＲ１、配列が配列番号：３１を含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：２１を含む又はからなるＣＤＲ３を含むか；又は
・ここで、ＶＨ鎖は、配列が配列番号：３３を含む又はからなるＣＤＲ１、配列が配列番号：１４を含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：２９を含む又はからなるＣＤＲ３を含み；並びに、ＶＬ鎖は、配列が配列番号：２０を含む又はからなるＣＤＲ１、配列ＲＴＳを含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：２１を含む又はからなるＣＤＲ３を含む；であるもの、
ここで、
−少なくとも１種のポリペプチドは、両方の免疫グロブリン結合ドメインを含むか、又は
−少なくとも２種のポリペプチドは、第一の結合ドメインを含む第一のポリペプチド及び第二の結合ドメインを含む第二のポリペプチドを含む。実施態様において、この組成物は、ヒトを含む哺乳動物への、同時、個別又は連続投与のために、化学療法薬を更に含有する。
【００４１】
本発明の他の目的は、本発明の個別のポリペプチド又は抗体及びそれらの様々な組合せ、少なくとも２種のポリペプチド又は抗体を含むキット、並びに少なくとも１種のポリペプチド又は抗体及び少なくとも１種の薬物を含むキットであり、ここで抗体又はポリペプチド及び薬物は、個別であるか又は個別ではない。
【００４２】
本発明のポリペプチド又は抗体は、１種又は数種の、好ましくは２種の結合部位又はドメイン又はパラトープを含むことができる。本発明の目的は、１種以上の、好ましくは１又は２種の、免疫グロブリン結合ドメインを含む、ＤＲ５受容体へ特異的に結合するポリペプチドであり、これは以下を含む：
−ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む結合ドメインであって、ここで：
ＶＨ鎖は、配列が配列番号：１３を含む又はからなるＣＤＲ１、配列が配列番号：１４を含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：１５を含む又はからなるＣＤＲ３を含み；及び、ＶＬ鎖は、配列が配列番号：１６を含む又はからなるＣＤＲ１、配列ＦＡＳを含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：１７を含む又はからなるＣＤＲ３を含むか（ＤＲ５−０１型ＣＤＲ）、又は
ＶＨ鎖は、配列が配列番号：２２を含む又はからなるＣＤＲ１、配列が配列番号：２３を含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：２４を含む又はからなるＣＤＲ３を含み；及び、ＶＬ鎖は、配列が配列番号：２５を含む又はからなるＣＤＲ１、配列が配列番号：２６を含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：１７を含む又はからなるＣＤＲ３を含むか（ＤＲ５−０１型ＣＤＲ）、又は
ＶＨ鎖は、配列が配列番号：３２を含む又はからなるＣＤＲ１、配列が配列番号：１４を含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：２４を含む又はからなるＣＤＲ３を含み；及び、ＶＬ鎖は、配列が配列番号：１６を含む又はからなるＣＤＲ１、配列ＦＡＳを含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：１７を含む又はからなるＣＤＲ３を含む（ＤＲ５−０１型ＣＤＲ）：であるもの、並びに／又は
−ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む結合ドメインであって、ここで：
ＶＨ鎖は、配列が配列番号：１８を含む又はからなるＣＤＲ１、配列が配列番号：１４を含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：１９を含む又はからなるＣＤＲ３を含み；及び、ＶＬ鎖は、配列が配列番号：２０を含む又はからなるＣＤＲ１、配列ＲＴＳを含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：２１を含む又はからなるＣＤＲ３を含むか（ＤＲ５−０５型ＣＤＲ）、又は
ＶＨ鎖は、配列が配列番号：２７を含む又はからなるＣＤＲ１、配列が配列番号：２８を含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：２９を含む又はからなるＣＤＲ３を含み；及び、ＶＬ鎖は、配列が配列番号：３０を含む又はからなるＣＤＲ１、配列が配列番号：３１を含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：２１を含む又はからなるＣＤＲ３を含むか（ＤＲ５−０５型ＣＤＲ）、又は
ＶＨ鎖は、配列が配列番号：３３を含む又はからなるＣＤＲ１、配列が配列番号：１４を含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：２９を含む又はからなるＣＤＲ３を含み；及び、ＶＬ鎖は、配列が配列番号：２０を含む又はからなるＣＤＲ１、配列ＲＴＳを含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：２１を含む又はからなるＣＤＲ３を含む（ＤＲ５−０５型ＣＤＲ）：であるもの。この結合ドメインは、ＩＭＧＴ（登録商標）、Ｋａｂａｔ（登録商標）又は共通番号付けシステムのいずれかで、同じ方法を基に規定されたＣＤＲを含むＶＨ及びＶＬ鎖により、最良に規定される。下記ＣＤＲの表参照。
【００４３】
ＶＨ及びＶＬ鎖は一緒に、単独の結合部位を規定する。これらの結合ドメインはそれぞれ、ＤＲ５受容体上の異なるエピトープへ特異的に結合する。これらのポリペプチドは、相乗的アゴニスト性であり、このことはこれらがＤＲ５分子の両方のエピトープへの結合時に、ＤＲ５アポトーシス経路を誘導する能力を有することを意味する。
【００４４】
「免疫グロブリン結合ドメイン」又は「結合ドメイン」により、２つの可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）で形成された免疫グロブリンのパラトープを意味する。パラトープは、標的化されたエピトープへ特異的に結合することができる。
【００４５】
本発明に従い、ＶＬ及びＶＨ鎖は、フレームワーク領域ＦＲを伴う、免疫グロブリンの軽鎖又は重鎖の通常の構造を有する。この構造は、構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４として規定することができる。好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドは、ｍＤＲ５−０１のＶＨ＋ＶＬ領域、及び／又はｍＤＲ５−０５のＶＨ＋ＶＬ領域を含む、１又は複数の、好ましくは１種以上の免疫グロブリン結合ドメインを含む。ある実施態様において、このポリペプチドは、ｍＤＲ５−０１のＶＨ＋ＶＬ領域を含む１又は２個の結合ドメインを含む。ある実施態様において、このポリペプチドは、ｍＤＲ５−０５のＶＨ＋ＶＬ領域を含む１又は２個の結合ドメインを含む。ある実施態様において、このポリペプチドは、一方にｍＤＲ５−０５のＶＨ＋ＶＬ領域を含み、他方にｍＤＲ５−０１のＶＨ＋ＶＬ領域を含む、２個の結合ドメインを含む。好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドは、ＨｚＤＲ５−０１のＶＨ＋ＶＬ領域及び／又はＨｚＤＲ５−０５のＶＨ＋ＶＬ領域を含む、１個以上の、好ましくは１又は２個の免疫グロブリン結合ドメインを含む。ある実施態様において、このポリペプチドは、ＨｚＤＲ５−０１のＶＨ＋ＶＬ領域を含む１又は２個の結合ドメインを含む。ある実施態様において、このポリペプチドは、ＨｚＤＲ５−０５のＶＨ＋ＶＬ領域を含む１又は２個の結合ドメインを含む。ある実施態様において、このポリペプチドは、一方にＨｚＤＲ５−０５のＶＨ＋ＶＬ領域を、他方にＨｚＤＲ５−０１のＶＨ＋ＶＬ領域を含む、２個の結合ドメインを含む。
【００４６】
従って抗−ＤＲ５ポリペプチドは、１又は２個の結合ドメインを含む。ある実施態様において、結合ドメインは、ＤＲ５受容体上の同じエピトープに特異的である。これらの結合ドメインは、開示され且つそこに提供されたように、ＶＨ及びＶＬ上に３つのＣＤＲの同じセットを含み、並びにこれらは標的化されたエピトープへの結合特異性に影響を及ぼさない限りは(as soon as)、フレームワーク領域において同一であるか又はわずかに異なってよい。
【００４７】
抗−ＤＲ５ポリペプチドは、特に抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体、又はＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）などの、好適な抗体断片であることができる。
【００４８】
本発明はまた、本発明により明らかにされた２つのエピトープへの結合に結びつけられた相乗的活性を使用することができる、ポリペプチド若しくは抗体の、又は二重特異性ポリペプチド若しくは抗体若しくは断片などの組合せ使用を包含している。この使用は更に、本明細書に明らかにされたように化学療法薬の投与と組み合わせることができる。
【００４９】
別の本発明の目的は、両方共ＤＲ５へ結合する能力を有する、少なくとも２、３、４、５又はそれよりも多い一価の結合ポリペプチド、又は抗体若しくはそれらの断片の結合を包含しており、第一のポリペプチド又は抗体は、該ＤＲ５の第一のエピトープへ結合する第一の抗原−結合部位を含み、並びに第二のポリペプチド又は抗体は、該ＤＲ５の第二のエピトープへ結合する第二の異なる抗原−結合部位を含む。
【００５０】
従って別の本発明の目的は、ヒトを含む哺乳動物へ、同時、個別又は連続投与するための、両方共ＤＲ５へ結合する能力を有する、２種のポリペプチド、又は抗体若しくはそれらの断片を含有する組成物であり、第一のポリペプチド又は抗体は、該ＤＲ５の第一のエピトープへ結合する第一の抗原−結合部位を含み、この第一のエピトープは、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む結合ドメインに特異的に結合するものであり、ここでＶＨ鎖は、配列が配列番号：１３のＣＤＲ１、配列が配列番号：１４  ＣＤＲ１のＣＤＲ２、配列が配列番号：１５のＣＤＲ３を含み；及び、ＶＬ鎖は、配列が配列番号：１６のＣＤＲ１、配列ＦＡＳのＣＤＲ２、配列が配列番号：１７のＣＤＲ３を含み、並びに第二のポリペプチド又は抗体は、該ＤＲ５の第二のエピトープへ結合する第二の異なる抗原−結合部位を含み、このエピトープは、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む結合ドメインに特異的に結合するものであり、ここでＶＨ鎖は、配列が配列番号：１８のＣＤＲ１、配列が配列番号：１４のＣＤＲ２、配列が配列番号：１９のＣＤＲ３を含み；及び、ＶＬ鎖は、配列が配列番号：２０のＣＤＲ１、配列ＲＴＳのＣＤＲ２、配列が配列番号：２１のＣＤＲ３を含む。代案として、表１及び表２に則って、Ｋａｂａｔ（登録商標）又は共通番号付けシステムに従うものにより、本明細書における先のＣＤＲの規定を置き換えることができる。
【００５１】
別の本発明の目的は、ＤＲ５に結合する能力を有する、二重特異性抗体又はそれらの断片であり、該抗体は、該ＤＲ５の第一のエピトープへ結合する第一の抗原−結合部位であって、この第一のエピトープが、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む結合ドメインに特異的に結合するものであり、ここでＶＨ鎖は、配列が配列番号：１３のＣＤＲ１、配列が配列番号：１４  ＣＤＲ１のＣＤＲ２、配列が配列番号：１５のＣＤＲ３を含み；及び、ＶＬ鎖は、配列が配列番号：１６のＣＤＲ１、配列ＦＡＳのＣＤＲ２、配列が配列番号：１７のＣＤＲ３を含むもの、並びに、該ＤＲ５の第二のエピトープへ結合する第二の異なる抗原−結合部位であって、このエピトープが、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む結合ドメインに特異的に結合するものであり、ここでＶＨ鎖は、配列が配列番号：１８のＣＤＲ１、配列が配列番号：１４のＣＤＲ２、配列が配列番号：１９のＣＤＲ３を含み；及び、ＶＬ鎖は、配列が配列番号：２０のＣＤＲ１、配列ＲＴＳのＣＤＲ２、配列が配列番号：２１のＣＤＲ３を含むものを含む。代案として、表１及び表２に則って、Ｋａｂａｔ（登録商標）又は共通番号付けシステムに従うものにより、本明細書における先のＣＤＲの規定を置き換えることができる。
【００５２】
別の本発明の目的は、本明細書に開示された少なくとも２種のポリペプチド又は抗体の、若しくは本明細書に開示された少なくとも１種の二重特異性又は二重パラトピックのポリペプチド又は抗体の、或いは本明細書に開示された少なくとも２種のポリペプチド又は抗体及び少なくとも１種の薬物の、若しくは本明細書に開示された少なくとも１種の二重特異性又は二重パラトピックのポリペプチド又は抗体及び少なくとも１種の薬物の、有効量又は十分量を投与することを含む、治療方法である。治療とは特に、ＤＲ５抗原を発現する様々な癌、自己免疫疾患、感染症の治療を意味する。
【００５３】
定義
用語「アポトーシス」及び「アポトーシス活性」は、広範な意味で使用され、且つ典型的には、細胞質の凝縮、細胞膜微絨毛の喪失、核の断片化、染色体ＤＮＡの分解又はミトコンドリア機能の喪失を含む１種以上の特徴的細胞変化を随伴する、哺乳動物における細胞死の秩序のある形又は制御された形を指す。この活性は、例えば、細胞生存度アッセイ、ＦＡＣＳ分析又はＤＮＡ電気泳動により、並びにより詳細にはアネキシンＶの結合、ＤＮＡ断片化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞断片化、及び／又は膜小胞（アポトーシス小体と称される）の形成により、決定し且つ測定することができる。
【００５４】
本明細書において使用される用語「相乗作用(synergy)」又は「相乗効果(synergism)」又は「相乗的に」とは、２種以上の物質の組合せ効果が、それら個々の効果の合計よりもより大きいような、それらの相互作用を指す。
【００５５】
本明細書において使用される用語「アゴニスト」及び「アゴニスト性」とは、ＤＲ５生物活性又は活性化を、直接又は間接に、実質的に誘導、促進又は増強することが可能である分子を指すか又は説明する。任意に、「アゴニストＤＲ５抗体」は、Ａｐｏ−２リガンド（ＴＲＡＩＬ）として公知のＤＲ５のリガンドに少なくとも匹敵する活性を有する抗体か、又はカスパーゼ３、カスパーゼ８、カスパーゼ１０若しくはＦＡＤＤの活性化を含み得る、もう一つの細胞内シグナル伝達経路の活性化を生じる、ＤＲ５受容体を活性化することが可能である抗体である。
【００５６】
本明細書において使用される用語「アンタゴニスト」及び「アンタゴニスト性」とは、ＤＲ５生物活性又は(of)ＤＲ５活性化を、直接又は間接に、実質的に対抗、減少又は阻害することが可能である分子を指すか又は説明する。任意に、アンタゴニストは、ＤＲ５活性化、又はＤＲ５とＡｐｏ−２リガンドなどのそのリガンドの間の複合体形成から生じる、生物活性を中和する分子である。
【００５７】
用語「抗体」は、最も広範な意味で使用され、且つ具体的には無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２種の無傷の抗体から形成された多価抗体（例えば、二重特異性抗体）、及びそれらが所望の生物活性を示す限りは抗体断片に及ぶ。
【００５８】
「未変性の抗体」及び「未変性の免疫グロブリン」は、通常、２本の同一軽（Ｌ）鎖及び同一の重（Ｈ）鎖で構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１個の共有ジスルフィド結合により重鎖へ連結される一方、ジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変動する。重鎖及び軽鎖の各々はまた、規則的に間隔を空け配置された鎖間ジスルフィド橋を有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶH）を有する。
【００５９】
本明細書において使用される「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子の断片により実質的にコードされた１以上のポリペプチドからなるタンパク質を指す。認められた免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常領域遺伝子に加え、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、κ又はλのいずれかに分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ又はεとして分類され、これは各々順に、免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを規定する。
【００６０】
本発明の抗体に関して、用語「免疫学的に特異的」又は「特異的に結合する」とは、関心対象のタンパク質（例えば、ＤＲ５／ＴＲＡＩＬ  Ｒ２）の１つ以上のエピトープへ結合するが、抗原性の生物学的分子の混合集団を含有する試料中の他の分子は実質的に認識も結合もしない、抗体を指す。
【００６１】
「エピトープＤＲ５−０１」及び「エピトープＤＲ５−０５」は、各々、ＤＲ５−０１抗体及びＤＲ５−０５抗体が結合する、ＤＲ５の細胞外ドメイン内の領域である。
【００６２】
本明細書において使用される用語「二重特異性抗体」とは、第一の結合部位が、第一の抗原又はエピトープに親和性を有し、且つ第二の結合部位が、第一のものとは異なる第二の抗原又はエピトープに結合親和性を有する、２つの抗原−結合部位を含む抗体を指す。
【００６３】
「二重特異性抗体」又は「二重パラトピックの抗体」は、２つの異なる特異的抗原結合部位を有する、単独の二価抗体である。本発明に従い、これらの抗体は、各々ＤＲ５分子上の特異的で異なるエピトープに対して向けられた、２つの異なる結合部位を有する。この定義はまた、それらの結合部位の各々が、ＤＲ５上の対応するエピトープに結合する能力を有する、両方の結合部位を含む二重特異性抗体又は二重パラトピックの抗体の断片を包含している。そのような断片は、例えば、Ｆ（ａｂ’）2抗体断片であることができる。
【００６４】
本明細書において使用される用語「二価の二重特異性抗体」とは、２対の重鎖及び軽鎖（ＨＣ／ＬＣ）の各々が、異なるエピトープへ特異的に結合している、すなわち、第一の重鎖及び軽鎖が一緒に第一のエピトープへ特異的に結合し、且つ第二の重鎖及び軽鎖が一緒に第二のエピトープへ特異的に結合している、先に記載した抗体を指し；そのような二価の二重特異性抗体は、同時に又は同時でなく、２つの異なるエピトープに特異的に結合することが可能である。
【００６５】
本発明に従い、望ましくない副産物と比べた、所望の二価の二重特異性抗体の割合は、重鎖及び軽鎖（ＨＣ／ＬＣ）の唯一の対におけるあるドメインの交換により改善することができる。２つのＨＣ／ＬＣ対の第一のものは、第一のエピトープに特異的に結合する抗体から生じ、且つ本質的に未変化であるのに対し、この２つのＨＣ／ＬＣ対の第二のものは、第二のエピトープに特異的に結合する抗体から生じ、且つ下記の交換により変更される：
・軽鎖：可変軽鎖ドメインＶＬの、第二のエピトープへ特異的に結合する該抗体の可変重鎖ドメインＶＨによる交換、及び定常軽鎖ドメインＣＬの、第二のエピトープに特異的に結合する該抗体の定常重鎖ドメインＣＨによる交換、並びに
・重鎖：可変重鎖ドメインＶＨの、第二のエピトープへ特異的に結合する該抗体の可変軽鎖ドメインＶＬによる交換、及び定常重鎖ドメインＣＨの、第二のエピトープに特異的に結合する該抗体の定常軽鎖ドメインＣＬによる交換。
【００６６】
２種以上の抗原又はエピトープに結合することが可能な二価又は多価の抗体などの操作されたタンパク質が、当該技術分野において公知である。そのような多価の結合タンパク質は、細胞融合、化学的複合、又は組換えＤＮＡ技術を用い、作製することができる。
【００６７】
一つのアプローチにおいて、天然の抗体に非常に類似している二重特異性抗体は、二重特異性抗体の所望の特異性を持つマウスモノクローナル抗体を発現している２つの異なるハイブリドーマ細胞株の体細胞融合を基にした、クアドローマ技術（Milstein C.ら、Nature. 1983; 305:537-40）を用い、作製されている。得られるハイブリッド−ハイブリドーマ（又はクアドローマ）細胞株内の２種の異なる抗体の重鎖及び軽鎖のランダム対合のために、最大１０種の異なる抗体種が作製され、そのただ一つが、望ましい機能性二重特異性抗体である。誤対合された副産物の存在、及び著しく低下した生成収率のために、洗練された精製手法が必要とされることを意味する（Morrison S.L.、Nature Biotech. 2007; 25:1233-1234）。概して、誤対合された副産物の同じ問題点が、組換え発現技術を使用する場合にも存在する。
【００６８】
「ノブ−イントゥ−ホール」として公知である、誤対合された副産物の問題点を回避するアプローチは、接触境界面を改変するための、ＣＨ３ドメインへの変異の導入により、２本の異なる抗体の重鎖の対合を強制することを目的としている。１本の鎖上で、嵩高なアミノ酸は、短い側鎖を持つアミノ酸により交換され、「ホール」を形成する。逆に大きい側鎖を持つアミノ酸は、他方のＣＨ３ドメインへ導入され、「ノブ」を形成する。これらの２本の重鎖（及び両方の重鎖について適切であるはずの２本の同一軽鎖）の同時発現により、ホモ二量体形成（「ホール−ホール」又は「ノブ−ノブ」）に対するヘテロ二量体形成（「ノブ−ホール」）の高い収率が認められる（Ridgway, JBら、Protein Eng. 1996; 9:617-621；及び、WO 96/027011）。
【００６９】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合領域又は可変領域を含む。好適な「抗体断片」は、ＤＲ５エピトープに結合し、アポトーシス経路を開始する能力を有する、抗体の断片である。
【００７０】
抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、及びＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体（Zapataら、Protein Eng. 1995; 8(10):1057-1062）；単鎖抗体分子；及び、抗体断片から形成された多価抗体を含む。
【００７１】
「無傷の」抗体は、抗原−結合可変領域に加え、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と称される、２つの同一の抗原−結合断片を生じ、各々は、単独の抗原−結合部位とＣＬ及びＣＨ１領域、並びに残りのＦｃ断片を含む。ペプシン処理は、２つの抗原−結合部位を有し、依然抗原に架橋することが可能である「Ｆ（ａｂ’）2」断片を生じる。
【００７２】
「Ｆｖ」は、完全抗原−認識及び抗原−結合部位を含む、最小の抗体断片である。この領域は、緊密な非共有的会合の、１本の重鎖及び１本の軽鎖可変ドメインの二量体からなる。これは、各可変ドメインの３つの超可変領域（ＣＤＲ）は相互作用し、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原−結合部位を規定する立体配置にある。集合的に、６つの超可変領域又はＣＤＲは、抗体に抗原−結合特異性をもたらす。
【００７３】
「Ｆａｂ」断片はまた、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）を含み、且つ１つの抗原−結合部位のみを有する。
【００７４】
「Ｆａｂ’」断片は、抗体ヒンジ領域由来の１個以上のシステインを含み、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端への２、３の残基の付加によりＦａｂ断片とは異なる。
【００７５】
Ｆ（ａｂ’）2抗体断片は当初、それらの間にヒンジシステインを有する、Ｆａｂ’断片の対として作製された。その他の抗体断片の化学的カップリングも公知である（Hermansonら、Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996, US 4 342 566）。
【００７６】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、ここでこれらのドメインは、１本鎖ポリペプチドで存在する。好ましくは、ｓｃＦｖは、ＶＨドメインとＶＬドメインの間に、ポリペプチドリンカーを含み、これはｓｃＦｖが抗原結合のために望ましい構造を形成することを可能にする。
【００７７】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、天然のアミノ酸ポリマーに加え、１個以上のアミノ酸残基が、対応する天然に生じるアミノ酸の人工的化学類似体であるアミノ酸ポリマーに適用される。この用語はまた、ポリペプチドを作製するためアミノ酸を連結する、従来のペプチド連結についての変種を含む。好ましい「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、その炭素がペプチド結合を介して連結されているアミノ酸の鎖である。
【００７８】
従って、鎖の一端（アミノ末端）の末端アミノ酸は、遊離アミノ基を有するが、その鎖の他端（カルボキシ末端）の末端アミノ酸は、遊離カルボキシル基を有する。本明細書において使用される用語「アミノ末端」（Ｎ−末端と略される）は、ペプチドのアミノ末端のアミノ酸上の遊離のα−アミノ基、又はそのペプチド内の任意の他の位置のアミノ酸のα−アミノ基（ペプチド結合に参加している場合は、アミノ基）を指す。同様に、用語「カルボキシ末端」は、ペプチドのカルボキシ末端上の遊離のカルボキシル基、又はそのペプチド内の任意の他の位置のアミノ酸のカルボキシル基を指す。ペプチドはまた本質的に、非限定的に、アミン結合とは対照的にエーテルにより連結されたアミノ酸などのペプチド模倣体を含む、任意のポリアミノ酸を含む。
【００７９】
用語「可変」とは、可変ドメインのある部分が、抗体間で配列が極めて異なる、という事実を指し、且つその特定の抗原に関する各特定の抗体の結合及び特異性に使用される。しかし可変性は、抗体の可変ドメインを通じて均等には分布されない。これは、軽鎖及び重鎖の両方の可変ドメイン中の、相補性−決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域と称される３つのセグメントに集中される。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と称される。未変性の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、各々、３つのＣＤＲにより接続された、主にβ−シート配置を採用している、４つのＦＲ領域で構成され、これはループ結合を形成し、並びに場合によってはβ−シート構造の一部を形成している。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域により、他方の鎖由来のＣＤＲと共に、密に近接して一緒に保持され、抗体の抗原−結合部位の形成に寄与している（Kabatら、NIH Publ. 1991; No. 91-3242, Vol.1, 647-669）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接は関与していないが、抗体−媒介性細胞毒性作用における抗体の参加などの、様々なエフェクター機能を発揮する。
【００８０】
本明細書においてモノクローナル抗体は具体的には、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体又は特定の抗体のクラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同であるが、その鎖の残りは、別の種に由来する抗体又は別の抗体のクラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、更にはそれらが所望の生物活性を示す限りは、そのような抗体の断片を含む（米国特許第4,816,567号；Morrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)）。
【００８１】
本発明に包含される「キメラ抗体」の他の好ましい形は、定常領域が、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、本発明の特性を生じるように、当初の抗体の定常領域から改変若しくは変更されているものである。
【００８２】
そのようなキメラ抗体はまた、「クラススイッチ抗体」とも称される。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードしているＤＮＡセグメント及び免疫グロブリン定常領域をコードしているＤＮＡセグメントを含む、発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。キメラ抗体の作製方法は、従来の組換えＤＮＡ技術及び遺伝子トランスフェクション技術に関連し、これらは当該技術分野において周知である。例えば、Morrison, S. Lらの論文(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984; 81:6851-6855)；米国特許第５，２０２，２３８号及び米国特許第５，２０４，２４４号を参照されたい。国際公開公報ＷＯ  ２００６／０９３７９４は、ヘテロ二量体性タンパク質結合組成物に関連している。国際公開公報ＷＯ  ９９／３７７９１は、多目的の抗体誘導体を開示している。Morrisonらの論文(J. Immunolog. 1998; 160:2802-2808)は、可変領域ドメイン交換の、ＩｇＧの機能特性に及ぼす影響に言及している。
【００８３】
非ヒト（例えばマウスの）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含む、キメラの免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそれらの断片（抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、又は他の抗原−結合する部分配列）である。そのほとんどの部分に関して、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性−決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット又はウサギなどの、非ヒト種のＣＤＲ（ドナー抗体）由来の残基により交換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基が、対応する非ヒト残基により交換される。
【００８４】
好ましい実施態様において、マウスのＣＤＲは、ヒト抗体のフレームワーク領域においてグラフティングされ、「ヒト化抗体」を調製する。例えば、Riechmann, L.らの論文(Nature. 1988; 332: 323-327)；及び、Neuberger, MSらの論文(Nature. 1985; 314: 268-270)を参照されたい。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体に関して先に注記した抗原を認識するそれらの代表的配列に対応している。本発明に包含された「ヒト化抗体」の別の形は、定常領域が、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、本発明の特性を生じるように、当初の抗体の定常領域から追加的に改変又は変更されているものである。
【００８５】
更にヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲ若しくはフレームワーク配列にも認められない残基を含むことができる。これらの改変は、抗体の性能を更に精緻化し且つ最大化するために、行われる。概して、ヒト化抗体は、全て又は実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、且つ全て又は実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域に対応している、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを、実質的に全て含むであろう。ヒト化抗体は最適にはまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も含むであろう。更なる詳細については、Jonesらの論文(Nature. 1986; 321:522-525)；Reichmannらの論文(Nature. 1988; 332:323-329)；及び、Prestaらの論文(Curr. Op. Struct. Biol. 1992; 2:593-596)を参照されたい。
【００８６】
抗体−依存性細胞傷害作用に寄与することが示されている免疫エフェクター機能は、抗体−依存性細胞−媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、抗体−依存性細胞−媒介性食作用（ＡＤＣＰ）、及び補体−依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を含む。
【００８７】
細胞傷害作用はまた、抗増殖効果を介して媒介されることができる。腫瘍細胞増殖の抗体調節の機序は、余りわかっていない。しかし、抗体の免疫エフェクター細胞上のＦｃｇ受容体（ＦｃｇＲ）との相互作用の理解の進歩は、著しく改善されたエフェクター機能を持つ抗体の操作を可能にしている。
【００８８】
ＭＡｂの作用機序は、複雑であり、且つ異なるＭＡｂに関して変動するように見える。それによりＭＡｂが標的細胞死を引き起こす複数の機序が存在する。これらは、アポトーシス、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ及びシグナル伝達の阻害を含む。
【００８９】
ＣＤＣ及びＡＤＣＣなどのエフェクター機能は、ＭＡｂの臨床効能に重要であることができるエフェクター機能である。これらのエフェクター機能は全て、抗体Ｆｃ領域により媒介され、且つ著者らに、より巧い又は余り巧くないアミノ酸改変を試みさせる。Ｆｃ領域のグリコシル化、特にフコシル化は、抗体の効能に劇的な影響を及ぼす。これは、著者らに、再度より巧い又は余り巧くない、一部のエフェクター機能を改善する再度の試みにおいて、グリコシル化プロファイルを変更するために、ＣＨＯ細胞における抗体産生の条件を改変させる。
【００９０】
先行する研究は、ＦｃｇＲＩＩＩａ遺伝子の多型は、アミノ酸１５８に、フェニルアラニン（Ｆ）又はバリン（Ｖ）のいずれかをコードしていることを示している。バリンアイソフォームの発現は、ＭＡｂへの増大した親和性及び結合に相関している（Rowland AJ,ら、1993. Cancer Immunol Immunother. 37(3):195-202；Sapra P, Allen TM. 2002. Cancer Res 62: 7190-4；Molhoj M,ら、2007. Mol Immunol. 44(8): 1935-43）。いくつかの臨床研究は、この知見を裏付けており、Ｖ／Ｖ多型を示す非ホジキンリンパ腫患者において、リツキシマブに対する臨床反応はより大きい（Bargou R,ら、2008. Science. 321:974-7；Bruenke J, 2005. Br J Haematol. 130(2):218-28；Cartron G, Blood. 2002 Feb 1 ;99(3):754-8；Hekman A,ら、1991. Cancer Immunol Immunother 32:364-72）。
【００９１】
国際公開公報ＷＯ１９９９０５１６４２は、２７０位若しくは３２９位に、又は２７０、３２２、３２９及び３３１位の２以上にアミノ酸置換を含む、変種ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域を説明している。これらの改変は、ＣＤＣ及びＡＤＣＣエフェクター機能の増大を目的としている。
【００９２】
「治療」又は「療法」とは、治療的処置及び予防的又は防御的手段の両方を指す。
【００９３】
治療又は療法の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家畜及び牧畜、並びに動物園の、競技用の、又は愛玩用の動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む、哺乳動物として分類された任意の動物を指す。哺乳動物は、ヒトが好ましい。
【００９４】
用語「癌」及び「癌性の」とは、典型的には、調節されない細胞増殖により特徴付けられる、哺乳動物における生理的状態を指すか又は説明している。癌の例は、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病を含むが、これらに限定されるものではない。そのような癌のより特定される例は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、消化管癌、腎臓(renal)癌、膵臓癌、膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓(kidney)癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌及び様々な型の頭頸部癌を含む。
【００９５】
用語「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」又は本明細書における文法上の等価物は、一緒に共有結合された少なくとも２個のヌクレオチドを指す。本発明の核酸は、好ましくは１本鎖又は２本鎖であり、且つ一般にホスホジエステル結合を含むであろう。
【００９６】
抗体のアミノ酸配列「変種」（又は変異体）は、抗体ＤＮＡへ好適なヌクレオチド変更を導入することにより、又はヌクレオチド合成により、調製される。しかしそのような改変は、例えば前述のように、非常に限定的な範囲においてのみ行うことができる。例えば、この改変は、ＩｇＧアイソタイプ及び抗原結合などの前述の抗体の特徴は変更しないが、組換え生成の収率、タンパク質安定性を改善するか、又は精製を促進することができる。
【発明を実施するための形態】
【００９７】
発明の詳細な説明  
ＣＤＲ配列は、ＩＭＧＴ（登録商標）、Ｋａｂａｔ（登録商標）、又はＩＭＧＴ（登録商標）とＫａｂａｔ（登録商標）の間の共通配列を保持する共通番号付けシステムに従い規定することができる。
【００９８】
本発明の抗−ＤＲ５抗体であるｍＤＲ５−０１（マウスのＶＨ及びＶＬ及びヒトＦｃによるキメラ抗体）及びＨｚＤＲ５−０１（マウスＣＤＲ及びヒトの戻し変異を伴う又は伴わないＦＲ及び最適化された又はされないＦｃによるヒト化抗体）に関するＣＤＲは、下記ＣＤＲを含む：
【００９９】
【表１】
0006457386.tif 000002
【０１００】
本発明の抗−ＤＲ５抗体であるｍＤＲ５−０５及びＨｚＤＲ５−０５に関するＣＤＲは、下記ＣＤＲを含む：
【０１０１】
【表２】
0006457386.tif 000003
【０１０２】
定義により、これらのＣＤＲは、１個以上のアミノ酸の欠失、置換又は付加による、変種ＣＤＲを含み、この変種は、当初のＣＤＲの特異性を維持している。共通番号付けシステムは、最も短いアミノ酸配列を有するＣＤＲ規定又は最小ＣＤＲ規定を提供する。
【０１０３】
ｍＤＲ５−０１、ｍＤＲ５−０５、ＨｚＤＲ５−０１及びＨｚＤＲ５−０５は、ＶＨ及びＶＬアミノ酸配列及び核酸配列を有し、これらは下記表に示されている：
【０１０４】
【表３】
0006457386.tif 000004
【０１０５】
【表４】
0006457386.tif 000005
ＤＲ５−０１及びＤＲ５−０５は、ＣＨ及びＣＬアミノ酸配列及び核酸配列を有し、これらは下記表に示されている：
【表５】
0006457386.tif 000006
【０１０６】
ある実施態様において、本ポリペプチドは、ＶＨ鎖は、配列が配列番号：１３のＣＤＲ１、配列が配列番号：１４のＣＤＲ２、又は配列が配列番号：１５のＣＤＲ３を含み；並びに、ＶＬ鎖は、配列が配列番号：１６のＣＤＲ１、配列がＦＡＳのＣＤＲ２、配列が配列番号：１７のＣＤＲ３を含む、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む１又は２の結合ドメインを含む。このポリペプチドは、ＤＲ５受容体上の第一のエピトープへ特異的に結合する。ある実施態様において、本ポリペプチドは、そのような結合ドメインを２つ含む。
【０１０７】
ある実施態様において、本ポリペプチドは、ＶＨ鎖は、配列が配列番号：２２のＣＤＲ１、配列が配列番号：２３のＣＤＲ２、又は配列が配列番号：２４のＣＤＲ３を含み；並びに、ＶＬ鎖は、配列が配列番号：２５のＣＤＲ１、配列が配列番号：２６のＣＤＲ２、配列が配列番号：１７のＣＤＲ３を含む、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む１又は２の結合ドメインを含む。このポリペプチドは、ＤＲ５受容体上の第一のエピトープへ特異的に結合する。ある実施態様において、本ポリペプチドは、そのような結合ドメインを２つ含む。
【０１０８】
ある実施態様において、本ポリペプチドは、ＶＨ鎖は、配列が配列番号：３２のＣＤＲ１、配列が配列番号：１４のＣＤＲ２、又は配列が配列番号：２４のＣＤＲ３を含み；並びに、ＶＬ鎖は、配列が配列番号：１６のＣＤＲ１、配列ＦＡＳのＣＤＲ２、配列が配列番号：１７のＣＤＲ３を含む、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む１又は２の結合ドメインを含む。このポリペプチドは、ＤＲ５受容体上の第一のエピトープへ特異的に結合する。ある実施態様において、本ポリペプチドは、そのような結合ドメインを２つ含む。
【０１０９】
別の実施態様において、本ポリペプチドは、ＶＨ鎖は、配列が配列番号：１８のＣＤＲ１、配列が配列番号：１４のＣＤＲ２、又は配列が配列番号：１９のＣＤＲ３を含み；並びに、ＶＬ鎖は、配列が配列番号：２０のＣＤＲ１、配列ＲＴＳのＣＤＲ２、配列が配列番号：２１のＣＤＲ３を含む、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む１又は２の結合ドメインを含む。このポリペプチドは、ＤＲ５受容体上の第二の異なるエピトープへ特異的に結合する。ある実施態様において、本ポリペプチドは、そのような結合ドメインを２つ含む。
【０１１０】
別の実施態様において、本ポリペプチドは、ＶＨ鎖は、配列が配列番号：２７のＣＤＲ１、配列が配列番号：２８のＣＤＲ２、又は配列が配列番号：２９のＣＤＲ３を含み；並びに、ＶＬ鎖は、配列が配列番号：３０のＣＤＲ１、配列が配列番号：３１のＣＤＲ２、配列が配列番号：２１のＣＤＲ３を含む、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む１又は２の結合ドメインを含む。このポリペプチドは、ＤＲ５受容体上の第二の異なるエピトープへ特異的に結合する。ある実施態様において、本ポリペプチドは、そのような結合ドメインを２つ含む。
【０１１１】
別の実施態様において、本ポリペプチドは、ＶＨ鎖は、配列が配列番号：３３のＣＤＲ１、配列が配列番号：１４のＣＤＲ２、又は配列が配列番号：２９のＣＤＲ３を含み；並びに、ＶＬ鎖は、配列が配列番号：２０のＣＤＲ１、配列ＲＴＳのＣＤＲ２、配列が配列番号：２１のＣＤＲ３を含む、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む１又は２の結合ドメインを含む。このポリペプチドは、ＤＲ５受容体上の第二の異なるエピトープへ特異的に結合する。ある実施態様において、本ポリペプチドは、そのような結合ドメインを２つ含む。
【０１１２】
別の実施態様において、抗−ＤＲ５ポリペプチドは、２つの結合ドメインを含み、且つこれらの２つの結合ドメインは各々、ＤＲ５受容体上の異なるエピトープに特異性がある。これらの結合ドメインは、本明細書に開示され且つ提供されるように、ＶＨ及びＶＬ上に３つのＣＤＲの特異的セットを含み、且つフレームワーク領域内で同一であるか又はわずかに異なることができる。
【０１１３】
抗−ＤＲ５ポリペプチドは、特にＦ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆｖ、二価単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、抗体、好ましくはモノクローナル抗体、断片、ナノボディ、多量体性ｓｃＦｖであることができる。
【０１１４】
この実施態様において、抗−ＤＲ５ポリペプチド、好ましくは抗体は、二重特異性又は二重パラトピックであり、且つ以下を含む：
−ＶＨ鎖が、配列が配列番号：１３を含む又はからなるＣＤＲ１、配列が配列番号：１４を含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：１５を含む又はからなるＣＤＲ３を含み；及び、ＶＬ鎖が、配列が配列番号：１６を含む又はからなるＣＤＲ１、配列がＦＡＳを含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：１７を含む又はからなるＣＤＲ３を含む、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む第一の結合ドメイン、並びに
−ＶＨ鎖が、配列が配列番号：１８を含む又はからなるＣＤＲ１、配列が配列番号：１４を含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：１９を含む又はからなるＣＤＲ３を含み；及び、ＶＬ鎖が、配列が配列番号：２０を含む又はからなるＣＤＲ１、配列がＲＴＳを含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：２１を含む又はからなるＣＤＲ３を含む、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む第二の結合ドメイン。
【０１１５】
ある実施態様において、抗−ＤＲ５ポリペプチド、好ましくは抗体は、二重特異性又は二重パラトピックであり、且つ以下を含む：
−ＶＨ鎖が、配列が配列番号：２２を含む又はからなるＣＤＲ１、配列が配列番号：２３を含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：２４を含む又はからなるＣＤＲ３を含み；及び、ＶＬ鎖が、配列が配列番号：２５を含む又はからなるＣＤＲ１、配列が配列番号：２６を含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：１７を含む又はからなるＣＤＲ３を含む、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む第一の結合ドメイン、並びに
−ＶＨ鎖が、配列が配列番号：２７を含む又はからなるＣＤＲ１、配列が配列番号：２８を含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：２９を含む又はからなるＣＤＲ３を含み；及び、ＶＬ鎖が、配列が配列番号：３０を含む又はからなるＣＤＲ１、配列が配列番号：３１を含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：２１を含む又はからなるＣＤＲ３を含む、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む第二の結合ドメイン。
【０１１６】
ある実施態様において、抗−ＤＲ５ポリペプチド、好ましくは抗体は、二重特異性又は二重パラトピックであり、且つ以下を含む：
−ＶＨ鎖が、配列が配列番号：３２を含む又はからなるＣＤＲ１、配列が配列番号：１４を含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：２４を含む又はからなるＣＤＲ３を含み；及び、ＶＬ鎖が、配列が配列番号：１６を含む又はからなるＣＤＲ１、配列がＦＡＳを含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：１７を含む又はからなるＣＤＲ３を含む、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む第一の結合ドメイン、並びに
−ＶＨ鎖が、配列が配列番号：３３を含む又はからなるＣＤＲ１、配列が配列番号：１４を含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：２９を含む又はからなるＣＤＲ３を含み；及び、ＶＬ鎖が、配列が配列番号：２０を含む又はからなるＣＤＲ１、配列がＲＴＳを含む又はからなるＣＤＲ２、配列が配列番号：２１を含む又はからなるＣＤＲ３を含む、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む第二の結合ドメイン。
【０１１７】
この二重特異性又は二重パラトピックの抗−ＤＲ５ポリペプチド又は抗体は、本発明の２つの異なるドメインを含み、且つ２つの異なるエピトープのいずれか一つに又は同時に両方の異なるエピトープに、特異的に結合することができる。
【０１１８】
一部の実施態様において、本発明の抗−ＤＲ５ポリペプチド、好ましくは抗体は、以下を含む：
−配列番号：２及び４（ＤＲ５−０１由来のＶＬ及びＶＨ）、及び配列番号：６及び８（ＤＲ５−０５由来のＶＨ及びＶＬ）の１以上のアミノ酸配列の対、
−配列番号：２及び４（ＤＲ５−０１由来のＶＬ及びＶＨ）のアミノ酸配列の対、
−配列番号：６及び８（ＤＲ５−０５由来のＶＬ及びＶＨ）のアミノ酸配列の対、若しくは
−配列番号：２及び４（ＤＲ５−０１由来のＶＬ及びＶＨ）及び配列番号：６及び８（ＤＲ５−０５由来のＶＬ及びＶＨ）の両方のアミノ酸配列対；若しくは
−配列番号：３５及び３７（ＨｚＤＲ５−０１由来のＶＨ及びＶＬ）及び配列番号：３９及び４１（ＨｚＤＲ５−０５由来のＶＨ及びＶＬ）の１以上のアミノ酸配列対、
−配列番号：３５及び３７（ＨｚＤＲ５−０１由来のＶＨ及びＶＬ）のアミノ酸配列の対、
−配列番号：３９及び４１（ＨｚＤＲ５−０５由来のＶＨ及びＶＬ）のアミノ酸配列の対、若しくは
−配列番号：３５及び３７（ＨｚＤＲ５−０１由来のＶＨ及びＶＬ）及び配列番号：３９及び４１（ＨｚＤＲ５−０５由来のＶＬ及びＶＨ）の両方のアミノ酸配列対。
【０１１９】
一部の実施態様において、本発明の抗−ＤＲ５ポリペプチド、好ましくは抗体は、以下を含む：
−配列番号：４、１０、２及び１２の各アミノ酸配列２つ（例えば、全体又は無傷のＤＲ５−０１抗体）；
−配列番号：４、１０、２及び１２のアミノ酸配列（ＤＲ５−０１を基にした単鎖Ｆｖ）；
−配列番号：８、１０、６及び１２の各アミノ酸配列の２つ（例えば、全体又は無傷のＤＲ５−０５抗体）；
−配列番号：８、１０、６及び１２のアミノ酸配列（ＤＲ５−０５を基にした単鎖Ｆｖ）；
−配列番号：４、８、２、６、１０及び１２のアミノ酸配列（二重特異性抗体）、特に配列番号：４、８、２、６（各々の一つ目）及び１０、１２（各々の二つ目）を含む二重特異性抗体；
−配列番号：２及び１２のアミノ酸配列（軽鎖）；
−配列番号：６及び１２のアミノ酸配列（軽鎖）；
−配列番号：４及び１０のアミノ酸配列（重鎖）；
−配列番号：８及び１０のアミノ酸配列（重鎖）；
−配列番号：３５、１０、３７及び１２の各アミノ酸配列の２つ（例えば、全体又は無傷のＨｚＤＲ５−０１抗体）；
−配列番号：３５、１０、３７及び１２のアミノ酸配列（ＨｚＤＲ５−０１を基にした単鎖Ｆｖ）；
−配列番号：３９、１０、４１及び１２の各アミノ酸配列の２つ（例えば、全体又は無傷のＨｚＤＲ５−０５抗体）；
−配列番号：３９、１０、４１及び１２のアミノ酸配列（ＨｚＤＲ５−０５を基にした単鎖Ｆｖ）；
−配列番号：３５、３９、３７、４１、１０及び１２のアミノ酸配列（二重特異性抗体）、特に配列番号：３５、３９、３７、４１（各々の一つ目）及び１０、１２（各々の二つ目）を含む二重特異性抗体；
−配列番号：３７及び１２のアミノ酸配列（軽鎖）；
−配列番号：４１及び１２のアミノ酸配列（軽鎖）；
−配列番号：３５及び１０のアミノ酸配列（重鎖）；
−配列番号：３９及び１０のアミノ酸配列（重鎖）。
【０１２０】
本発明の抗−ＤＲ５ポリペプチド、好ましくは抗体は、完全にマウスであってよく、例えば（ｓａｙ）これらは、母親抗体又は当初のマウス抗体のアミノ酸配列と対合するアミノ酸配列を含む。本発明のポリペプチドはまた、キメラ又はヒト化であってよく、例えばこれらは、ヒト−由来のアミノ酸配列を含むことができる。具体的には、このポリペプチドは、ヒト−由来の抗体のフレームワーク領域及び／又は定常領域を含むことができる。
【０１２１】
別の本発明の目的は、先に開示され且つ本明細書に提供されるような、１、２又はそれよりも多い本発明のポリペプチド、及び医薬として許容し得る担体、希釈剤又は賦形剤を含有する組成物又は医薬組成物である。これらの組成物の実施態様は、ＩＭＧＴ（登録商標）に従うＣＤＲ規定を使用することにより、規定される。しかし本発明は、先に示された配列を使用し、ＩＭＧＴ（登録商標）番号付けが、Ｋａｂａｔ（登録商標）番号付け又は共通番号付けシステムのいずれかにより置き換えられる、等価の又は代替の組成物を包含し且つこれらに関連している。従って以下の組成物の実施態様において、前掲の表に従い、Ｋａｂａｔ（登録商標）番号付けにより、ＩＭＧＴ（登録商標）番号付けで規定されたＣＤＲを置き換える他の実施態様は、本発明の一部である。同じく以下の組成物の実施態様において、前掲の表に従い、共通番号付けシステムにより、ＩＭＧＴ（登録商標）番号付けで規定されたＣＤＲを置き換える他の実施態様は、本発明の一部である。
【０１２２】
第一の実施態様において、本組成物は、ＶＨ鎖は、配列が配列番号：１３のＣＤＲ１、配列が配列番号：１４のＣＤＲ２、配列が配列番号：１５のＣＤＲ３を含み；並びに、ＶＬ鎖は、配列が配列番号：１６のＣＤＲ１、配列がＦＡＳのＣＤＲ２、配列が配列番号：１７のＣＤＲ３を含む、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む、１又は２の結合ドメインを有する、ポリペプチド、好ましくは抗体を含む。第二の実施態様において、本組成物は、ＶＨ鎖は、配列が配列番号：１８のＣＤＲ１、配列が配列番号：１４のＣＤＲ２、配列が配列番号：１９のＣＤＲ３を含み；並びに、ＶＬ鎖は、配列が配列番号：２０のＣＤＲ１、配列がＲＴＳのＣＤＲ２、配列が配列番号：２１のＣＤＲ３を含む、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む、１又は２の結合ドメインを有する、ポリペプチド、好ましくは抗体を含む。第三の実施態様において、本組成物は、混合物中にこれら２種のポリペプチド又は抗体を含む。代案として、表１及び表２に則って、Ｋａｂａｔ（登録商標）又は共通番号付けシステムに従うものにより、ＣＤＲの規定を置き換えることができる。
【０１２３】
別の実施態様において、本組成物は、ＶＨ鎖は、配列が配列番号：１３のＣＤＲ１、配列が配列番号：１４のＣＤＲ２、配列が配列番号：１５のＣＤＲ３を含み；並びに、ＶＬ鎖は、配列が配列番号：１６のＣＤＲ１、配列がＦＡＳのＣＤＲ２、配列が配列番号：１７のＣＤＲ３を含む、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む、第一の結合ドメイン；並びに、ＶＨ鎖は、配列が配列番号：１８のＣＤＲ１、配列が配列番号：１４のＣＤＲ２、配列が配列番号：１９のＣＤＲ３を含み；並びに、ＶＬ鎖は、配列が配列番号：２０のＣＤＲ１、配列がＲＴＳのＣＤＲ２、配列が配列番号：２１のＣＤＲ３を含む、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む、第二の結合ドメインを含む、抗−ＤＲ５二重特異性ポリペプチド、好ましくは抗体を含む。代案として、表１及び表２に則って、Ｋａｂａｔ（登録商標）又は共通番号付けシステムに従うものにより、ＣＤＲの規定を置き換えることができる。
【０１２４】
ある実施態様において、本組成物は、配列番号：２及び４のアミノ酸配列対を含む抗−ＤＲ５ポリペプチド、好ましくは抗体、配列番号：６及び８のアミノ酸配列対を含む抗−ＤＲ５ポリペプチド、好ましくは抗体、並びに医薬用担体、希釈剤又は賦形剤を含有する。ある実施態様において、本組成物は、配列番号：３５及び３７のアミノ酸配列対を含む抗−ＤＲ５ポリペプチド、好ましくは抗体、配列番号：３９及び４１のアミノ酸配列対を含む抗−ＤＲ５ポリペプチド、好ましくは抗体、並びに医薬用担体、希釈剤又は賦形剤を含有する。
【０１２５】
本発明はまた、ヒトを含む、哺乳動物への同時、個別又は連続投与のための、少なくとも２種のポリペプチド、好ましくは抗体を含有するこれらの組成物に関する。
【０１２６】
特定の目的は、配列番号：２及び４のアミノ酸配列対並びに配列番号：６及び８のアミノ酸配列対を含むか、又は配列番号：３５及び３７のアミノ酸配列対並びに配列番号：３９及び４１のアミノ酸配列対を含む、二重特異性の抗−ＤＲ５抗体、並びに医薬として許容し得る担体を含有する組成物である。
【０１２７】
本発明の目的は特に、ヒトを含む、哺乳動物への同時、個別又は連続投与のための、ＤＲ５受容体と特異的に結合する少なくとも１又は２のポリペプチド、並びに医薬用担体、希釈剤又は賦形剤を含有する、組成物であって、ここでこの少なくとも１又は２のポリペプチドが：
−ＶＨ鎖が、配列が配列番号：１３のＣＤＲ１、配列が配列番号：１４  ＣＤＲ１のＣＤＲ２、配列が配列番号：１５のＣＤＲ３を含み；及び、ＶＬ鎖が、配列が配列番号：１６のＣＤＲ１、配列がＦＡＳのＣＤＲ２、配列が配列番号：１７のＣＤＲ３を含む、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む第一の結合ドメイン；並びに
−ＶＨ鎖が、配列が配列番号：１８のＣＤＲ１、配列が配列番号：１４のＣＤＲ２、配列が配列番号：１９のＣＤＲ３を含み；及び、ＶＬ鎖が、配列が配列番号：２０のＣＤＲ１、配列がＲＴＳのＣＤＲ２、配列が配列番号：２１のＣＤＲ３を含む、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む第二の結合ドメイン；を含む、２つの免疫グロブリン結合ドメインを含み、ここで
−少なくとも１つのポリペプチドは、両方の免疫グロブリン結合ドメインを含むか、又は
−少なくとも２つのポリペプチドは、第一の結合ドメインを含む第一のポリペプチド及び第二の結合ドメインを含む第二のポリペプチドを含む。代案として、前述のように、表１及び表２に則って、Ｋａｂａｔ（登録商標）又は共通番号付けシステムに従うものにより、ＣＤＲの規定を置き換えることができる。
【０１２８】
一部の実施態様において、本発明の組成物は、以下を含む、抗−ＤＲ５ポリペプチド、好ましくは抗体を含有する：
−配列番号：４、１０、２及び１２の各アミノ酸配列の２つ（例えば、全体又は無傷のＤＲ５−０１抗体）；
−配列番号：４、１０、２及び１２のアミノ酸配列（ＤＲ５−０１を基にした単鎖Ｆｖ）；
−配列番号：８、１０、６及び１２の各アミノ酸配列の２つ（例えば、全体又は無傷のＤＲ５−０５抗体）；
−配列番号：８、１０、６及び１２のアミノ酸配列（ＤＲ５−０５を基にした単鎖Ｆｖ）；
−配列番号：４、８、２、６、１０及び１２のアミノ酸配列（二重特異性抗体）、特に配列番号：４、８、２、６（各々の一つ目）及び１０、１２（各々の二つ目）を含む二重特異性抗体；
−配列番号：２及び１２のアミノ酸配列（軽鎖）；
−配列番号：６及び１２のアミノ酸配列（軽鎖）；
−配列番号：４及び１０のアミノ酸配列（重鎖）；
−配列番号：８及び１０のアミノ酸配列（重鎖）；
−配列番号：３５、１０、３７及び１２の各アミノ酸配列の２つ（例えば、全体又は無傷のＨｚＤＲ５−０１抗体）；
−配列番号：３５、１０、３７及び１２のアミノ酸配列（ＨｚＤＲ５−０１を基にした単鎖Ｆｖ）；
−配列番号：３９、１０、４１及び１２の各アミノ酸配列の２つ（例えば、全体又は無傷のＨｚＤＲ５−０５抗体）；
−配列番号：３９、１０、４１及び１２のアミノ酸配列（ＨｚＤＲ５−０５を基にした単鎖Ｆｖ）；
−配列番号：３５、３９、３７、４１、１０及び１２のアミノ酸配列（二重特異性抗体）、特に、配列番号：３５、３９、３７、４１（各々の一つ目）及び１０、１２（各々の二つ目）を含む二重特異性抗体；
−配列番号：３７及び１２のアミノ酸配列（軽鎖）；
−配列番号：４１及び１２のアミノ酸配列（軽鎖）；
−配列番号：３５及び１０のアミノ酸配列（重鎖）；
−配列番号：３９及び１０のアミノ酸配列（重鎖）。
【０１２９】
これらの組成物は、ヒトを含む、哺乳動物への、本発明のポリペプチド（複数可）又は抗体（複数可）との同時、個別又は連続投与のための、別の標的に対して向けられた少なくとも１種の追加のポリペプチド若しくは抗体及び／又は少なくとも１種の化学療法薬（例えば小型分子）を含有することができる。追加の有効成分として、ドキソルビシン、ゲムシタビン、カンプトテシン、パクリタキセルを挙げることができる。本組成物は、両方が、ＤＲ５へ結合する能力を有し、変種ヒト最適化されたＩｇＧ  Ｆｃ領域、好ましくはＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含むように改変された、２種のポリペプチド、又は抗体若しくはそれらの断片を含有することができ、ここでこの変種領域は、ＰＤＣＣ、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣを調節するためのアミノ酸置換を含む。特に、２種のポリペプチド、又は抗体若しくはそれらの断片は、ＤＲ５に結合し、且つ細胞傷害性成分（ＡＤＣ）に複合する能力を有する。
【０１３０】
本発明の組成物又は医薬組成物は、特に腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するための、医薬品として使用することが意図されている。本発明の組成物又は医薬組成物は、特に癌、好ましくは固形癌を治療するための、医薬品として使用することが意図されている。
【０１３１】
本明細書に開示され且つ提供される単離された核酸配列もまた、本発明の目的である。
【０１３２】
従って本発明はまた、下記ヌクレオチド配列を含む、単離されたヌクレオチド配列：配列番号：１、３、５、若しくは７、又は一緒に連結されたヌクレオチド配列の組合せ；配列番号：９及び７、又は９及び３、配列番号：１１及び１、又は１１及び５に関する。本発明はまた、下記ヌクレオチド配列を含む、単離されたヌクレオチド配列：配列番号：３４、３６、３８若しくは４０、又は一緒に連結されたヌクレオチド配列の組合せ；配列番号：９及び３４、又は９及び３８、配列番号：１１及び３６、又は１１及び４０に関する。
【０１３３】
本発明はまた、防御又は治療（治療的又は予防的）に関して、一部の細胞のアポトーシスの誘導が、哺乳動物、特にヒトに有益である疾患の防御及び／又は治療の方法に関する。それらの疾患は、とりわけ癌、特に前掲の「定義」の項に列挙されたものの一種、自己免疫疾患、炎症状態、ウイルス感染症及びウイルス性疾患である。この方法は、本明細書に開示され且つ提供される組成物の有効量の、ヒトを含む哺乳動物への投与を含む。本方法は、本発明の２つの異なるエピトープに対して向けられた、２つのポリペプチド、好ましくは抗体の投与、又は本発明の２つの異なるエピトープに対して向けられた、二重特異性ポリペプチド、好ましくは抗体の投与を含む。これらの組成物の実施態様は、ＩＭＧＴ（登録商標）に従うＣＤＲ規定を使用することにより規定される。しかし本発明は、前掲の配列を使用し、ＩＭＧＴ（登録商標）番号付けが、Ｋａｂａｔ（登録商標）番号付け又は共通番号付けシステムのいずれかにより置き換えられる、等価の又は代替の方法を包含し且つこれに関連している。従って下記の方法の実施態様において、前掲の表に則って、Ｋａｂａｔ（登録商標）番号付けにより、ＩＭＧＴ（登録商標）番号付けにより規定されたＣＤＲを置き換えている他の実施態様は、本発明の一部である。同じく下記の方法の実施態様において、前掲の表に則って、共通番号付けシステムにより、ＩＭＧＴ（登録商標）番号付けにより規定されたＣＤＲを置き換えている他の実施態様は、本発明の一部である。
【０１３４】
第一の実施態様において、本方法は、ＶＨ鎖が、配列が配列番号：１３のＣＤＲ１、配列が配列番号：１４のＣＤＲ１のＣＤＲ２、配列が配列番号：１５のＣＤＲ３を含み；及び、ＶＬ鎖が、配列が配列番号：１６のＣＤＲ１、配列がＦＡＳのＣＤＲ２、配列が配列番号：１７のＣＤＲ３を含む、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む、１又は２の結合ドメイン（複数可）を有する、ポリペプチド、好ましくは抗体を含有する組成物の投与を含む。第二の実施態様において、本方法は、ＶＨ鎖が、配列が配列番号：１８のＣＤＲ１、配列が配列番号：１４のＣＤＲ２、配列が配列番号：１９のＣＤＲ３を含み；及び、ＶＬ鎖が、配列が配列番号：２０のＣＤＲ１、配列がＲＴＳのＣＤＲ２、配列が配列番号：２１のＣＤＲ３を含む、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む、１又は２の結合ドメイン（複数可）を有する、ポリペプチド、好ましくは抗体を含有する組成物の投与を含む。第三の実施態様において、本方法は、混合物中にこれら２種のポリペプチド又は抗体を含有する組成物、或いは一方が第一の言及されたポリペプチド又は抗体を含み、及び第二のものが第二の言及されたポリペプチド又は抗体を含む、２種の組成物の投与を含む。代案として、前記のように、表１及び表２に則って、ＣＤＲの規定を、Ｋａｂａｔ（登録商標）又は共通番号付けシステムに従うものにより、置き換えることができる。
【０１３５】
別の実施態様において、本方法は、ＶＨ鎖が、配列が配列番号：１３のＣＤＲ１、配列が配列番号：１４  ＣＤＲ１のＣＤＲ２、配列が配列番号：１５のＣＤＲ３を含み；及び、ＶＬ鎖が、配列が配列番号：１６のＣＤＲ１、配列がＦＡＳのＣＤＲ２、配列が配列番号：１７のＣＤＲ３を含む、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む第一の結合ドメイン、並びにＶＨ鎖が、配列が配列番号：１８のＣＤＲ１、配列が配列番号：１４のＣＤＲ２、配列が配列番号：１９のＣＤＲ３を含み；及び、ＶＬ鎖が、配列が配列番号：２０のＣＤＲ１、配列がＲＴＳのＣＤＲ２、配列が配列番号：２１のＣＤＲ３を含む、ＶＨ及びＶＬ鎖の対を含む第二の結合ドメインを含む、二重特異性ポリペプチド、好ましくは抗体を含有する組成物の投与を含む。代案として、前記のように、表１及び表２に則って、Ｋａｂａｔ（登録商標）又は共通番号付けシステムに従うものにより、ＣＤＲの規定を置き換えることができる。
【０１３６】
ある実施態様において、本方法は、配列番号：２及び４のアミノ酸配列対を含む抗−ＤＲ５ポリペプチド、好ましくは抗体、並びに、配列番号：６及び８のアミノ酸配列対を含む抗−ＤＲ５ポリペプチド、好ましくは抗体、並びに医薬用担体、希釈剤又は賦形剤を含有する組成物の投与を提供する。別の実施態様において、本方法は、配列番号：２及び４のアミノ酸配列対を含む抗−ＤＲ５ポリペプチド、好ましくは抗体を含有する組成物、並びに配列番号：６及び８のアミノ酸配列対を含む抗−ＤＲ５ポリペプチド、好ましくは抗体を含有する別の組成物の、２種の組成物の投与を提供する。ある実施態様において、本方法は、配列番号：３５及び３７のアミノ酸配列対の抗−ＤＲ５ポリペプチド、好ましくは抗体、並びに配列番号：３９及び４１のアミノ酸配列対の抗−ＤＲ５ポリペプチド、好ましくは抗体、並びに医薬用担体、希釈剤又は賦形剤を含有する組成物の投与を提供する。別の実施態様において、本方法は、配列番号：３５及び３７のアミノ酸配列対を含む、抗−ＤＲ５ポリペプチド、好ましくは抗体を含有する組成物、並びに配列番号：３９及び４１のアミノ酸配列対を含む、抗−ＤＲ５ポリペプチド、好ましくは抗体を含有する別の組成物の、２種の組成物の投与を提供する。
【０１３７】
別の実施態様において、本方法は、配列番号：２及び４のアミノ酸配列対並びに配列番号：６及び８のアミノ酸配列対を含む二重特異性抗−ＤＲ５抗体、並びに医薬として許容し得る担体を含有する組成物の投与を提供する。別の実施態様において、本方法は、配列番号：３５及び３７のアミノ酸配列対並びに配列番号：３９及び４１のアミノ酸配列対を含む二重特異性抗−ＤＲ５抗体、並びに医薬として許容し得る担体を含有する組成物の投与を提供する。
【０１３８】
別の実施態様において、本方法は、ＤＲ５−０１に関して配列番号：９、３、１１及び１、若しくは配列番号：９、３４、１１及び３６の、並びにＤＲ５−０５に関して配列番号：９、７、１１及び５、若しくは配列番号：９、３８、１１及び４０のヌクレオチド配列を基にした、本明細書に開示され且つ提供されたＤＲ５−０１及びＤＲ５−０５抗体、又は本明細書に記載の遺伝子操作により作製された類似した抗体を含有する組成物の投与を提供し；それらのアミノ酸配列により規定され、且つＤＲ５−０１に関して配列番号：４、１０、２及び１２を、及びＤＲ５−０５に関して配列番号：８、１０、６及び１２を、又はＨｚＤＲ５−０１に関して配列番号：３５、１０、３７及び１２を、及びＨｚＤＲ５−０５に関して配列番号：３９、１０、４１及び１２を含む、これらの抗体を含有する組成物を使用することができる。
【０１３９】
従って、医薬組成物、使用及び治療方法は、癌の防御及び／又は治療のために意図されている。本発明による恩恵があり得る癌のリストは、「定義」の項において先に記されている。
【０１４０】
従って、医薬組成物、使用及び治療方法はまた、自己免疫疾患及び炎症状態の防御及び／又は治療のために意図されている。下記の疾患が、特に関係している。
【０１４１】
従って、本医薬組成物、使用及び治療方法はまた、ウイルス感染症又はウイルス性疾患の防御及び／又は治療のために意図されている。ウイルス感染症及び疾患としては、サイトメガロウイルス、インフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、肝炎、アデノウイルス−２、牛ウイルス性下痢ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びエプスタイン・バーウイルスによる感染症が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１４２】
特定の実施態様において、本発明のポリペプチド、抗体又は二重特異性抗体はまた、癌細胞、固形腫瘍などを特異的に標識するために、より一般には、任意の複合された又はそうでなければ結合されたエフェクター（例えば、放射性同位元素、標識物、細胞毒素、薬物、リポソーム、抗体、核酸、デンドリマーなど）を、単離された癌細胞、転移性細胞、固形腫瘍細胞などを含むが、これらに限定されるものではない癌細胞へ特異的に標的化／送達するために、使用することができる。
【０１４３】
従って、別の発明の目的は、本発明のポリペプチドと、その機能が該ポリペプチドによるＤＲ５受容体の標的化から恩恵があるエフェクター分子である分子との複合体である。そのようなエフェクター分子は、放射性同位元素、標識物、細胞毒素、薬物、リポソーム、抗体、核酸、デンドリマーであることができる。本発明はまた、この複合体及び医薬として許容し得るビヒクル、希釈剤又は賦形剤を含有する医薬組成物に関係している。
【０１４４】
本発明はまた、「定義」の項において先に列挙されたものの一つなどの、癌の防御又は治療のための、そのような組成物の使用、更には方法に関係している。
【０１４５】
本発明の１又は複数のポリペプチドを使用し、ＤＲ５−０１及びＤＲ５−０５がそれに対して向けられたエピトープの一つに結合する他のポリペプチド又は抗体を同定することができる。従って、いくつかの実施態様において、一つのエピトープに対して向けられた本発明のポリペプチド又は抗体は、他のエピトープＤＲ５に対する結合特異性を伴う別の抗体と共に使用するか又はこれと対合することができる。
【０１４６】
本発明の１又は複数のポリペプチドは、ＤＲ５上の別のエピトープへ結合する他のポリペプチド又は抗体を同定するために使用することができ、これは、ＤＲ５上のこれらの様々なエピトープ上のポリペプチド又は抗体の結合時に、アポトーシスを誘導する。ＤＲ５−０１及び／又はＤＲ５−０５が、指定されている。従っていくつかの実施態様において、一つのエピトープ（ＤＲ５−０１又はＤＲ５−０５）に対して向けられた本発明のポリペプチド又は抗体、若しくは両方のエピトープ（ＤＲ５−０１及びＤＲ５−０５）に対して向けられた本発明のポリペプチド又は抗体は、ＤＲ５上の別のエピトープに関する結合特異性を持つ別の抗体と共に使用することができる。
【０１４７】
本発明の１以上のポリペプチド、抗体、二重特異性抗体、及び／若しくは機能化された二重特異性抗体、及び／若しくはキメラ部分、又はこれらを含有する医薬組成物は、注射により、すなわち静脈内、筋肉内、皮内、皮下、十二指腸内又は腹腔内へ、投与することができる。またいくつかの実施態様において、本化合物は、吸入により、例えば鼻腔内投与することができる。例えばリポソームなどの、他の医薬送達システムも、利用することができる。
【０１４８】
現存する化学療法による治療と組合せた本発明のポリペプチド又は抗体によるＤＲ５の標的化は、腫瘍細胞の死滅において、化学療法単独よりも、より効果的であろう。多種多様な薬物が、癌の化学療法において利用されている。例として、シスプラチン、タキソール、エトポシド、ミトキサントロン、アクチノマイシンＤ、カンプトテシン、メトトレキセート、ゲムシタビン、マイトマイシン、ダカルバジン、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン及びダウノマイシンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１４９】
一つのアプローチにおいて、抗体組合せ又は二重特異性抗体の抗−ＤＲ５ＭＡｂは、癌患者の治療において、標準化学療法レジメンに加えられる。抗体と追加の抗癌剤が癌細胞に対し相乗効果を発揮するこれらの組合せに関して、追加薬剤の用量は、単独で投与される場合の第二の薬剤の標準用量と比べ、減少することができる。本抗体は、本抗体組合せ又は二重特異性抗体に対する癌細胞の感受性を増強することに効果がある量の抗癌剤と、同時投与することができる。
【０１５０】
本発明の一つの方法において、抗体組合せ又は二重特異性抗体によるＤＲ５の標的化は、第二の抗癌剤の投与の前に、患者へ投与される。一つの代替方法は、本抗体組合せ又は二重特異性抗体及び別のスケジュールでの第二の薬剤の投与前に、第二の抗癌剤を投与することを含む。別の実施態様において、本抗体組合せ又は二重特異性抗体及び第二の薬剤は、同時に投与される。
【０１５１】
本発明の方法は、放射線照射、小型分子又は抗体による化学療法などの、少なくとも１種の他の治療方法の使用が関与している治療レジメンを含むことを提供する。本発明の方法は、ヒトを含む哺乳動物への、本発明のポリペプチド（複数可）又は抗体（複数可）の同時、個別又は連続投与のために、別の標的及び／又は少なくとも１種の化学療法薬（小型分子など）に対して向けられた少なくとも１種の追加のポリペプチド又は抗体の十分量を投与することを直接含むことができる。追加の有効成分として、ドキソルビシン、ゲムシタビン、カンプトテシン、パクリタキセル又は前述の他の薬物を挙げることができる。ある実施態様において、肺癌及び乳癌は、そのような組合せを用い、治療される。この組合せは、より一般的に、該薬物単独によるか又は本発明の１若しくは複数の抗体単独による治療に良く反応せず、且つこの組合せが相乗効果に繋がるような、癌（特に侵襲性の癌）に関して有用である。
【０１５２】
本発明の一つの方法において、抗体組合せ又は二重特異性抗体又は多価の抗体断片によるＤＲ５の標的化は、ウイルス感染症及びウイルス感染症から生じる関連病態の治療において利用することができる。ウイルス感染症としては、サイトメガロウイルス、インフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、肝炎、アデノウイルス−２、牛ウイルス性下痢ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びエプスタイン・バーウイルスによる感染症が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１５３】
哺乳動物細胞のヒト適用のための最も適合した形態であるタンパク質をグリコシル化するという能力のために、哺乳動物細胞は、治療用糖タンパク質の生成のための好ましい宿主である。細菌は、滅多にタンパク質をグリコシル化せず、並びに類似の一般宿主の他の型、例えば酵母、糸状菌、昆虫及び植物の細胞は、血流からの迅速なクリアランスに関連したグリコシル化パターンを生じる。
【０１５４】
哺乳動物細胞の中で、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が、最も一般的に使用される。これらの細胞は、好適なグリコシル化パターンをもたらすことに加え、遺伝的に安定した、高度に生産的なクローン細胞株の一貫した生成を可能にする。これらは、簡単なバイオリアクターにおいて、無血清培地を使用し、高密度で培養することができ、且つ安全且つ再現可能なバイオプロセスの開発を可能にする。他の通常使用される動物細胞は、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ＮＳＯ−及びＳＰ２／０−マウス骨髄腫細胞を含む。
【０１５５】
ある実施態様において、本発明のポリペプチド及び抗体は、哺乳動物細胞において、好ましくは野生型哺乳動物細胞において、好ましくは齧歯類起源のもの、特にＣＨＯ細胞において産生又は発現される。
【０１５６】
改変及び変更を、本発明のポリペプチドの構造に行い、且つ依然同様の特徴を有する分子を得ることができる。例えば、ある種のアミノ酸は、活性の認知可能な喪失を伴わずに、配列内で他のアミノ酸と置換することができる。ポリペプチドの相互作用的な能力及び性質は、ポリペプチドの生物学的機能活性を規定するので、ある種のアミノ酸配列置換を、ポリペプチド配列（又は当然、その基礎となるＤＮＡコード配列）において行い、それにもかかわらず同様の特性を伴うポリペプチドを得ることができる。
【０１５７】
そのような変更を行うに当たり、アミノ酸の疎水親水指数が考慮され得る。ポリペプチドに対する相互作用的生物学的機能を付与する上でのアミノ酸の疎水親水指数の重要性は、当該技術分野において一般に理解されている。ある種のアミノ酸は、類似の疎水親水指数又はスコアを有する他のアミノ酸と置換され、且つ依然類似の生物活性を持つポリペプチドを生じることができることは知られている。各アミノ酸は、その疎水性及び帯電特性を基に、疎水親水指数に割り当てられている。
【０１５８】
アミノ酸の相対的疎水親水性の特徴は、得られるポリペプチドの二次構造を決定し、これは次に、そのポリペプチドの他の分子、例えば酵素、基質、受容体、抗体、抗原などとの相互作用を規定すると考えられる。アミノ酸は、類似の疎水親水指数を有する別のアミノ酸により置換され、依然生物学的機能について同等のポリペプチドを得ることができることは、当該技術分野において公知である。そのような変更において、その疎水親水指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内の置換が特に好ましく、且つ±０．５以内の置換が更により特に好ましい。
【０１５９】
特にそれにより作製された生物学的機能が同等のペプチド又はポリペプチドが、免疫学的実施態様における使用のために意図されている場合、類似のアミノ酸の置換はまた、親水性を基に行うこともできる。引用により本明細書中に組み込まれるか、又は当業者が言及する米国特許第４，５５４，１０１号は、その隣接するアミノ酸の親水性により支配される、ポリペプチドの最大の局所的平均親水性は、その免疫原性及び抗原性と、すなわちそのポリペプチドの生物学的特性と相関していることを開示している。
【０１６０】
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、下記の親水値が、アミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；プロリン（−０．５±１）；トレオニン（−０．４）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸は、類似の親水値を有する別のアミノ酸と置換され、生物学的に同等な、及び特に免疫学的同等な、ポリペプチドを依然得ることができることが理解される。そのような変更において、その親水値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、且つ±０．５以内のものが更により特に好ましい。
【０１６１】
先に概略したように、アミノ酸置換は、従って一般にアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えばそれらの疎水性、親水性、帯電、サイズなどを基にしている。
【０１６２】
【表６】
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【０１６３】
アミノ酸置換は、異なるように選ぶか又は選択することができる。可能な置換は、Ｗ０９９／５１６４２、ＷＯ２００７０２４２４９及びＷＯ２００７１０６７０７において記されている。
【０１６４】
規定により、本発明のＣＤＲは、１個以上のアミノ酸（複数可）の欠失、置換又は付加による、変種ＣＤＲを含み、この変種は、当初のＣＤＲの特異性を維持している。共通番号付けシステムは、最短のアミノ酸配列を有するＣＤＲ規定又は最小のＣＤＲ規定を提供する。
【０１６５】
本抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、二重特異性抗体、抗体薬物複合体又は抗体断片であることができる。「ヒト化抗体」又は「キメラヒト化抗体」は、親の抗体の抗原−結合特性を保持しているか又は実質的に保持しているが、ヒトにおいて免疫原性が少ない、非ヒト抗体、典型的にはマウス抗体由来の抗体を意味しなければならない。
【０１６６】
ポリペプチド及び抗体の作製方法は、当業者に公知である。哺乳動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞などの齧歯類細胞、好ましくは野生型細胞は、１種又は数種の発現ベクターによりトランスフェクションされる。好ましくは、これらの細胞は、軽鎖の発現ベクター及び重鎖の発現ベクターにより、同時トランスフェクションされる。
【０１６７】
細胞トランスフェクションも、当業者に公知である。実行することができるトランスフェクションとして、非限定的に、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介型トランスフェクション、電気穿孔法、マグネトフェクション、ヌクレオフェクション（ＡＭＡＸＡ社、独国）、リポソーム−媒介型トランスフェクション（例えば、ドリームフェクト(dreamfect)（登録商標）、リポフェクチン（登録商標）又はリポフェクタミン（登録商標）技術を使用する）又は微量注入などの、当業者に周知の標準トランスフェクション手法に言及することができる。
【０１６８】
発現ベクターは公知である。使用することができるベクターとして、非限定的に、以下に言及することができる：ｐｃＤＮＡ３．３、ｐＯｐｔｉＶＥＣ、ｐＦＵＳＥ、ｐＭＣＭＶＨＥ、ｐＭＯＮＯ、ｐＳＰＯＲＴ１、ｐｃＤＶ１、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＥＣ。単独の発現ベクター又はポリペプチド若しくは抗体の異なる部分を発現しているいくつかの発現ベクターを使用することができる。
【０１６９】
ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３のための発現ベクターは、配列番号：９を含むか、又は配列番号：１０のアミノ酸配列をコードしている核酸配列を含む。
【０１７０】
発現ベクターは、本発明の可変領域ＶＨをコードしている核酸配列を含む。ある実施態様において、ベクターは、配列番号：３を含むか、又は配列番号：４のアミノ酸配列をコードしている核酸配列を含む。別の実施態様において、これは、配列番号：７を含むか、又は配列番号：８のアミノ酸配列をコードしている核酸配列を含む。ある実施態様において、ベクターは、配列番号：３４を含むか、又は配列番号：３５のアミノ酸配列をコードしている核酸配列を含む。別の実施態様において、これは、配列番号：３８を含むか、又は配列番号：３９のアミノ酸配列をコードしている核酸配列を含む。
【０１７１】
重鎖をコードしている発現ベクターのセットは、配列番号：９を含む（又は配列番号：１０のアミノ酸配列をコードしている核酸配列を含む）、及び配列番号：３（又は、配列番号：４のアミノ酸配列をコードしている核酸配列）又は配列番号：７（又は、配列番号：８のアミノ酸配列をコードしている核酸配列）のいずれかを含む、発現ベクターを含む。重鎖をコードしている発現ベクターのセットは、配列番号：９を含む（又は配列番号：１０のアミノ酸配列をコードしている核酸配列を含む）、及び配列番号：３４（又は、配列番号：３５のアミノ酸配列をコードしている核酸配列）又は配列番号：３８（又は、配列番号：３９のアミノ酸配列をコードしている核酸配列）のいずれかを含む、発現ベクターを含む。
【０１７２】
重鎖の単独の発現ベクターは、ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２、ＣＨ３をコードしている核酸配列を含む。ある実施態様において、このベクターは、配列番号：３及び９を含むか、又は配列番号：４及び１０のアミノ酸配列をコードしている核酸配列を含む。別の実施態様において、これは、配列番号：７及び９を含むか、又は配列番号：８及び１０のアミノ酸配列をコードしている核酸配列を含む。ある実施態様において、このベクターは、配列番号：３４及び９を含むか、又は配列番号：３５及び１０のアミノ酸配列をコードしている核酸配列を含む。別の実施態様において、これは、配列番号：３８及び９を含むか、又は配列番号：３９及び１０のアミノ酸配列をコードしている核酸配列を含む。
【０１７３】
定常軽鎖の発現ベクターは、配列番号：１１を含むか、又は配列番号：１２のアミノ酸配列をコードしている核酸配列を含む。
【０１７４】
発現ベクターは、本発明の可変領域ＶＬをコードしている核酸配列を含む。ある実施態様において、このベクターは、配列番号：１、又は配列番号：２のアミノ酸配列をコードしている核酸配列を含む。別の実施態様において、これは、配列番号：５、又は配列番号：６のアミノ酸配列をコードしている核酸配列を含む。ある実施態様において、このベクターは、配列番号：３６、又は配列番号：３７のアミノ酸配列をコードしている核酸配列を含む。別の実施態様において、これは、配列番号：４０、又は配列番号：４１のアミノ酸配列をコードしている核酸配列を含む。
【０１７５】
発現ベクターは、本発明の軽鎖をコードしている核酸配列を含む。ある実施態様において、ベクターは、配列番号：１及び１１、又は配列番号：２及び１２のアミノ酸配列をコードしている核酸配列を含む。別の実施態様において、これは、配列番号：５及び１１、又は配列番号：６及び１２のアミノ酸配列をコードしている核酸配列を含む。ある実施態様において、ベクターは、配列番号：３６及び１１、又は配列番号：３７及び１２のアミノ酸配列をコードしている核酸配列を含む。別の実施態様において、これは、配列番号：４０及び１１、又は配列番号：４１及び１２のアミノ酸配列をコードしている核酸配列を含む。
【０１７６】
完全抗体を作製するための発現ベクターのセットは、いくつかのベクター、例えば２又は３種を含む。
【０１７７】
配列番号：３、９、１及び１１（又は配列番号：４、１０、２及び１２のアミノ酸配列をコードしている核酸配列）、又は配列番号：７、９、５及び１１（又は配列番号：８、１０、６及び１２のアミノ酸配列をコードしている核酸配列）のいずれかを含む、単独の発現ベクターも使用することができる。配列番号：３４、９、３６及び１１（又は配列番号：３５、１０、３７及び１２のアミノ酸配列をコードしている核酸配列）、又は配列番号：３８、９、４０及び１１（又は配列番号：３９、１０、４１及び１２のアミノ酸配列をコードしている核酸配列）のいずれかを含む、単独の発現ベクターも使用することができる。
【０１７８】
この発現ベクターは、望ましい可変領域をコードしている１又は複数の核酸配列を含む。ベクターにより発現され得る可変領域の様々な実施態様は、以下に提示されている。これらのベクターの実施態様は、ＩＭＧＴ（登録商標）に従うＣＤＲ規定を用い、規定される。しかし本発明はまた、ＩＭＧＴ（登録商標）番号付けが、前掲の配列を使用し、Ｋａｂａｔ（登録商標）番号付け又は共通番号付けシステムのいずれかにより置き換えられる、等価又は代替のベクターを包含し且つこれに関連している。従って、下記のベクターの実施態様において、前掲の表に従い、Ｋａｂａｔ（登録商標）番号付けにより、ＩＭＧＴ（登録商標）番号付けにより規定されたＣＤＲを置き換えている他の実施態様は、本発明の一部である。同じく下記のベクターの実施態様において、前掲の表に従い、共通番号付けシステムにより、ＩＭＧＴ（登録商標）番号付けにより規定されたＣＤＲを置き換えている他の実施態様は、本発明の一部である。
【０１７９】
発現ベクターは、配列が配列番号：１３のＣＤＲ１、配列が配列番号：１４  ＣＤＲ１のＣＤＲ２、配列が配列番号：１５のＣＤＲ３を含むＶＨをコードしている。
【０１８０】
発現ベクターは、配列が配列番号：１６のＣＤＲ１、配列がＦＡＳのＣＤＲ２、配列が配列番号：１７のＣＤＲ３を含むＶＬをコードしている。
【０１８１】
発現ベクターのセットは、配列が配列番号：１３のＣＤＲ１、配列が配列番号：１４  ＣＤＲ１のＣＤＲ２、配列が配列番号：１５のＣＤＲ３を含むＶＨをコードしている発現ベクター、並びに配列が配列番号：１６のＣＤＲ１、配列がＦＡＳのＣＤＲ２、配列が配列番号：１７のＣＤＲ３を含むＶＬをコードしている発現ベクターを含む。  
【０１８２】
発現ベクターは、配列が配列番号：１３のＣＤＲ１、配列が配列番号：１４  ＣＤＲ１のＣＤＲ２、配列が配列番号：１５のＣＤＲ３を含むＶＨをコードしている核酸配列、並びに、配列が配列番号：１６のＣＤＲ１、配列がＦＡＳのＣＤＲ２、配列が配列番号：１７のＣＤＲ３を含むＶＬをコードしている核酸配列を含む。
【０１８３】
発現ベクターは、配列が配列番号：１８のＣＤＲ１、配列が配列番号：１４のＣＤＲ２、配列が配列番号：１９のＣＤＲ３を含むＶＨをコードしている。
【０１８４】
発現ベクターは、配列が配列番号：２０のＣＤＲ１、配列がＲＴＳのＣＤＲ２、配列が配列番号：２１のＣＤＲ３を含むＶＬをコードしている。
【０１８５】
発現ベクターのセットは、配列が配列番号：１８のＣＤＲ１、配列が配列番号：１４のＣＤＲ２、配列が配列番号：１９のＣＤＲ３を含むＶＨをコードしている発現ベクター、並びに配列が配列番号：２０のＣＤＲ１、配列がＲＴＳのＣＤＲ２、配列が配列番号：２１のＣＤＲ３を含むＶＬをコードしている発現ベクターを含む。
【０１８６】
発現ベクターは、配列が配列番号：１８のＣＤＲ１、配列が配列番号：１４のＣＤＲ２、配列が配列番号：１９のＣＤＲ３を含むＶＨをコードしている核酸配列、並びに配列が配列番号：２０のＣＤＲ１、配列がＲＴＳのＣＤＲ２、配列が配列番号：２１のＣＤＲ３を含むＶＬをコードしている核酸配列を含む。
【０１８７】
従って本発明は、本発明のポリペプチド又は抗体を作製するための、ひとつの単独のベクター又はベクターのセットの使用を含む。これらのベクターはまた、単独の又はセットのベクターとして、本発明の目的である。
【０１８８】
別の本発明の目的は、本発明のあるベクター又はベクターのセットを含む宿主細胞である。宿主細胞は、哺乳動物細胞、好ましくは齧歯類細胞、より好ましくはＣＨＯ細胞であることができる。更により好ましくは、宿主細胞は、野生型の哺乳動物細胞、好ましくは野生型の齧歯類細胞、最も好ましくは野生型のＣＨＯ細胞である。
【０１８９】
当業者は、そのような１又は複数のベクター、並びにＣＨＯ細胞などの細胞を使用し、本発明の抗体を作製する方法を完全に所有している。
【図面の簡単な説明】
【０１９０】
図面の簡単な説明
本発明はここで、図面を参照する実施例により、更に詳細に説明される。ブロック図において、ブロックは、凡例がボックス内に示されている図面において、凡例に記されたものと同じ順番で、左側から右側へ表示されることに留意されたい。
【０１９１】
【図１】図１は、ヒト神経膠腫細胞株（Ｈ４、ＨＳ６８３、Ａ１７２、Ｔ９８Ｇ、Ｕ８７ＭＧ）における抗−ＤＲ５抗体パネルのＦＡＣＳ分析を示している。
【０１９２】
【図２】図２は、ヒト腎腺癌（Ａ７０４、ＡＣＨＮ，  Ｃａｋｉ１）、ヒト結腸癌（ＳＷ９４８、ＨＣＴ  １１６）、ヒト膀胱癌（５６３７）及びヒト乳腺癌（ＭＣＦ７）などのいくつかの癌細胞株における、抗−ＤＲ５発現のＦＡＣＳ分析を示している。
【０１９３】
【図３】図３は、ＭＡｂ（１μｇ／ｍＬ）の、Ｆａｓ（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＦａｓＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）への、及びＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１又はＤｃＲ２（５０ｎｇ／ｍＬ）への結合を評価する、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである（平均±ＳＤ、ｎ＝２）。
【０１９４】
【図４】図４は、Ｔ９８Ｇ細胞（１×１０6個細胞／ｍＬ）を使用する、他の非複合型抗体である抗−ＤＲ５（５μｇ／ｍＬ）の存在下での、ビオチニル化された抗−ＤＲ５ＭＡｂ結合の阻害（１μｇ／ｍＬ、ＦＡＣＳ分析）の割合（％）を示す棒グラフである（平均±ＳＤ、ｎ＝２）。
【０１９５】
【図５】図５は、Ｈ４細胞（５×１０5個細胞／ｍＬ）を使用する、異なる濃度で試験した抗体（ＭＡｂ抗−ＴＲＡＩＬ、ＭＡｂ抗−ＤＲ５ＭＡｂ）の存在下での、ＴＲＡＩＬ結合の阻害（１００ｎｇ／ｍＬ、ＦＡＣＳ分析）の割合（％）を示す棒グラフである（平均±ＳＤ、ｎ＝２）。
【０１９６】
【図６】図６は、Ｈ４細胞（５×１０4個細胞／ｍＬ）を使用する、ＴＲＡＩＬ（１０ｎｇ／ｍＬ）と比較した、１μｇ／ｍＬで試験した抗−ＤＲ５抗体単独又は組合せの細胞増殖阻害（ＡＴＰバイオルミネセントバイオアッセイ、７２時間）の割合（％）を示す棒グラフである（平均±ＳＤ、ｎ＝２）。
【０１９７】
【図７】図７は、Ｈ４細胞（５×１０4個細胞／ｍＬ）を使用し、異なる濃度で試験した、選択的抗−ＤＲ５アゴニスト抗体組合せ（ｍＤＲ５−０１＋ｍＤＲ５−０５）、対、中和抗体組合せ（ｍＤＲ５−０５＋ｍＤＲ５−０４）の細胞増殖阻害（ＢｒＤＵバイオアッセイ、７２時間）の割合（％）を示す棒グラフである（平均±ＳＤ、ｎ＝２）。
【０１９８】
【図８】図８は、Ｈ４細胞（１×１０5個細胞／ｍＬ）を使用し、ＴＲＡＩＬ（１０ｎｇ／ｍＬ）とも比較した、１μｇ／ｍＬで試験した、選択的抗−ＤＲ５アゴニスト抗体組合せ（ｍＤＲ５−０１＋ｍＤＲ５−０５）、対、中和抗体組合せ（ｍＤＲ５−０５＋ｍＤＲ５−０４）のアポトーシス（ヨウ化プロピジウム染色、７２時間）の割合（％）を示す棒グラフである（平均±ＳＤ、ｎ＝２）。
【０１９９】
【図９】図９は、Ｈ４細胞（１×１０5個細胞／ｍＬ）を使用し、ＴＲＡＩＬとも比較した、選択的抗−ＤＲ５アゴニスト抗体組合せ（ｍＤＲ５−０１＋ｍＤＲ５−０５）、対、中和抗体組合せ（ｍＤＲ５−０５＋ｍＤＲ５−０４）の切断型カスパーゼ３（ＦＡＣＳ分析、４８時間）の割合（％）を示す棒グラフである（代表的実験、ｎ＝２）。
【０２００】
【図１０】図１０は、Ｈ４細胞（２×１０5個細胞／ｍＬ、５時間）を使用する、選択的抗−ＤＲ５アゴニスト抗体組合せ（ｍＤＲ５−０１＋ｍＤＲ５−０５）、対、中和抗体組合せ（ｍＤＲ５−０５＋ｍＤＲ５−０４）の存在により誘導された又は誘導されない切断されたＰＡＲＰを示すウェスタンブロットである。
【０２０１】
【図１１】図１１は、Ｈ４細胞（５×１０4個細胞／ｍＬ）を使用し、抗−ＤＲ５ＭＡｂ（ｍＤＲ５−０１、ｍＤＲ５−０２、ｍＤＲ５−０４又はｍＤＲ５−０５、１μｇ／ｍＬ）の存在又は非存在下での、選択的抗−ＤＲ５アゴニスト抗体組合せ（１０μｇ／ｍＬのｍＤＲ５−０５＋０．１μｇ／ｍＬのｍＤＲ５−０１）による細胞増殖阻害（ＡＴＰバイオルミネセントバイオアッセイ、７２時間）の割合（％）を示す棒グラフである（平均±ＳＤ、ｎ＝２）。
【０２０２】
【図１２】図１２は、Ｈ４、ＨＳ６８３、Ａ１７２、Ｔ９８Ｇ又はＵ８７ＭＧ神経膠腫細胞（５×１０4個細胞／ｍＬ）を使用し、ＴＲＡＩＬ（２０ｎｇ／ｍＬ）及びその後１／２希釈したものと比較した、選択的抗体抗−ＤＲ５アゴニスト抗体組合せ（１０μｇ／ｍＬのｍＤＲ５−０５＋０．１μｇ／ｍＬのｍＤＲ５−０１）及びその後１／２希釈したものの、細胞増殖阻害（ＡＴＰバイオルミネセントバイオアッセイ、７２時間）の割合（％）を示す棒グラフである（平均±ＳＤ、ｎ＝２）。
【０２０３】
【図１３】図１３は、神経膠腫Ｈ４細胞（５×１０4個細胞／ｍＬ）を使用し、キメラ抗体（ｃｈＤＲ５−０１又はｃｈＤＲ５−０５ＭＡｂ）５μｇ／ｍＬ単独で試験し、その後１／２希釈したもの、対、抗体組合せ（５μｇ／ｍＬ  ｃｈＤＲ５−０５＋０．０５μｇ／ｍＬ  ｃｈＤＲ５−０１）のその後１／２希釈したものの、増殖阻害（ＡＴＰバイオルミネセントバイオアッセイ、７２時間）の割合（％）を示す棒グラフである（平均±ＳＤ、ｎ＝２）。
【０２０４】
【図１４】図１４は、エクスビボにおいてヒト神経膠腫細胞（５×１０4個細胞／ｍＬ）を使用する、ＴＲＡＩＬ（５０ｎｇ／ｍＬ）と比較した、１０μｇ／ｍＬ（比１／１０）で試験した抗−ＤＲ５抗体単独又は組合せによる細胞増殖阻害（ＡＴＰバイオルミネセントバイオアッセイ、７２時間）の割合（％）を示す棒グラフである（平均±ＳＤ、ｎ＝３、３回の独立したエクスビボＧＢＭ細胞）。
【０２０５】
【図１５】図１５−１８は、ＨＳ６８３、Ａ１７２、４２ＭＧＢＡ又はＴ９８Ｇ神経膠腫細胞（５×１０4個細胞／ｍＬ）を使用する、１０μｇ／ｍＬで試験し１／１０希釈した組合せマウス抗−ＤＲ５抗体の存在下、薬物単独の存在下（１μｇ／ｍＬ、１／１０希釈）、又は組合せたマウス抗−ＤＲ５抗体と薬物の会合下での、細胞増殖阻害（ＡＴＰバイオルミネセントバイオアッセイ、７２時間）の割合（％）を示す棒グラフである（平均±ＳＤ、ｎ＝２）。
【０２０６】
【図１６】図１５−１８は、ＨＳ６８３、Ａ１７２、４２ＭＧＢＡ又はＴ９８Ｇ神経膠腫細胞（５×１０4個細胞／ｍＬ）を使用する、１０μｇ／ｍＬで試験し１／１０希釈した組合せマウス抗−ＤＲ５抗体の存在下、薬物単独の存在下（１μｇ／ｍＬ、１／１０希釈）、又は組合せたマウス抗−ＤＲ５抗体と薬物の会合下での、細胞増殖阻害（ＡＴＰバイオルミネセントバイオアッセイ、７２時間）の割合（％）を示す棒グラフである（平均±ＳＤ、ｎ＝２）。
【０２０７】
【図１７】図１５−１８は、ＨＳ６８３、Ａ１７２、４２ＭＧＢＡ又はＴ９８Ｇ神経膠腫細胞（５×１０4個細胞／ｍＬ）を使用する、１０μｇ／ｍＬで試験し１／１０希釈した組合せマウス抗−ＤＲ５抗体の存在下、薬物単独の存在下（１μｇ／ｍＬ、１／１０希釈）、又は組合せたマウス抗−ＤＲ５抗体と薬物の会合下での、細胞増殖阻害（ＡＴＰバイオルミネセントバイオアッセイ、７２時間）の割合（％）を示す棒グラフである（平均±ＳＤ、ｎ＝２）。
【０２０８】
【図１８】図１５−１８は、ＨＳ６８３、Ａ１７２、４２ＭＧＢＡ又はＴ９８Ｇ神経膠腫細胞（５×１０4個細胞／ｍＬ）を使用する、１０μｇ／ｍＬで試験し１／１０希釈した組合せマウス抗−ＤＲ５抗体の存在下、薬物単独の存在下（１μｇ／ｍＬ、１／１０希釈）、又は組合せたマウス抗−ＤＲ５抗体と薬物の会合下での、細胞増殖阻害（ＡＴＰバイオルミネセントバイオアッセイ、７２時間）の割合（％）を示す棒グラフである（平均±ＳＤ、ｎ＝２）。
【０２０９】
【図１９】図１９−２２は、ヒト乳房細胞株（ＭＣＦ７、ＭＤＡＭＢ２３１）又はヒト肺腺癌細胞株（ＮＣＩＨ１７０３、Ａ５４９）（５×１０4個細胞／ｍＬ）を使用する、１０μｇ／ｍＬで試験し１／１０希釈した組合せマウス抗−ＤＲ５抗体の存在下、薬物単独の存在下（１μｇ／ｍＬ、１／１０希釈）、又は組合せたマウス抗−ＤＲ５抗体と薬物の会合下での、細胞増殖阻害（ＡＴＰバイオルミネセントバイオアッセイ、７２時間）の割合（％）を示す棒グラフである（平均±ＳＤ、ｎ＝２）。
【０２１０】
【図２０】図１９−２２は、ヒト乳房細胞株（ＭＣＦ７、ＭＤＡＭＢ２３１）又はヒト肺腺癌細胞株（ＮＣＩＨ１７０３、Ａ５４９）（５×１０4個細胞／ｍＬ）を使用する、１０μｇ／ｍＬで試験し１／１０希釈した組合せマウス抗−ＤＲ５抗体の存在下、薬物単独の存在下（１μｇ／ｍＬ、１／１０希釈）、又は組合せたマウス抗−ＤＲ５抗体と薬物の会合下での、細胞増殖阻害（ＡＴＰバイオルミネセントバイオアッセイ、７２時間）の割合（％）を示す棒グラフである（平均±ＳＤ、ｎ＝２）。
【０２１１】
【図２１】図１９−２２は、ヒト乳房細胞株（ＭＣＦ７、ＭＤＡＭＢ２３１）又はヒト肺腺癌細胞株（ＮＣＩＨ１７０３、Ａ５４９）（５×１０4個細胞／ｍＬ）を使用する、１０μｇ／ｍＬで試験し１／１０希釈した組合せマウス抗−ＤＲ５抗体の存在下、薬物単独の存在下（１μｇ／ｍＬ、１／１０希釈）、又は組合せたマウス抗−ＤＲ５抗体と薬物の会合下での、細胞増殖阻害（ＡＴＰバイオルミネセントバイオアッセイ、７２時間）の割合（％）を示す棒グラフである（平均±ＳＤ、ｎ＝２）。
【０２１２】
【図２２】図１９−２２は、ヒト乳房細胞株（ＭＣＦ７、ＭＤＡＭＢ２３１）又はヒト肺腺癌細胞株（ＮＣＩＨ１７０３、Ａ５４９）（５×１０4個細胞／ｍＬ）を使用する、１０μｇ／ｍＬで試験し１／１０希釈した組合せマウス抗−ＤＲ５抗体の存在下、薬物単独の存在下（１μｇ／ｍＬ、１／１０希釈）、又は組合せたマウス抗−ＤＲ５抗体と薬物の会合下での、細胞増殖阻害（ＡＴＰバイオルミネセントバイオアッセイ、７２時間）の割合（％）を示す棒グラフである（平均±ＳＤ、ｎ＝２）。
【０２１３】
【図２３】図２３は、Ｈ４神経膠腫細胞（５×１０4個細胞／ｍＬ）を使用する、１μｇ／ｍＬで試験し（組合せにおける比１／１）、その後１／２希釈し試験した、マウス抗−ＤＲ５抗体の単独又は組合せの、ヒト化抗−ＤＲ５抗体の単独又は組合せと比較した、細胞増殖阻害（ＡＴＰバイオルミネセントバイオアッセイ、７２時間）の割合（％）を示す棒グラフである（平均±ＳＤ、ｎ＝２）。
【０２１４】
【図２４】図２４は、マウス抗−ＤＲ５抗体の組合せで処置された又は処置されない、ＳＣ２ヒト神経膠腫で同所移植されたヌードマウスの生存曲線である。ＭＡｂ処置は、体重減少のためにマウスが安楽死するまで、マウス１匹につき５ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射（ＩＰ）により投与し、これは最大３６日間適用した。カプラン・マイヤー法及びウィルコクソン統計検定（ＪＭＰソフトウェア）を使用し、対照群で得られた生存時間を、処置群（ｍＤＲ５−０１＋ｍＤＲ５−０５、対、ｍＤＲ５−０４＋ｍＤＲ５−０５）で得られた生存時間と比較した。
【０２１５】
【図２５】図２５は、ＩＭＧＴ（登録商標）に従い規定されるＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３の説明を伴うＶＨ  ＨｚＤＲ５−０１のアミノ酸及び核酸配列である。
【０２１６】
【図２６】図２６は、ＩＭＧＴ（登録商標）に従い規定されるＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３の記述を伴うＶＬ  ＨｚＤＲ５−０１のアミノ酸及び核酸の配列である。
【０２１７】
【図２７】図２７は、ＩＭＧＴ（登録商標）に従い規定されるＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３の記述を伴うＶＨ  ＨｚＤＲ５−０５のアミノ酸及び核酸の配列である。
【０２１８】
【図２８】図２８は、ＩＭＧＴ（登録商標）に従い規定されるＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３の記述を伴うＶＬ  ＨｚＤＲ５−０５のアミノ酸及び核酸の配列である。
【実施例】
【０２１９】
実施例
下記実施例は、請求された本発明を限定するためではなく、例示するために提示している。
【０２２０】
実施例１：マウス抗−ＤＲ５ＭＡｂの調製
本実施例は、抗−ＤＲ５抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株の調製を例示している。
【０２２１】
抗体。ＤＲ５に特異的なマウスモノクローナル抗体である抗−ＤＲ５抗体を、標準ハイブリドーマ技術（Zolaら、Aust J. Exp Biol Med Sci. 1981; 59:303-6）を用い、作製した。簡単に述べると、マウスに、組換えＤＲ５（１０μｇ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、リリー、仏国）を、０、２及び４週目に腹腔内注射した。コレに続けて、組換えＤＲ５（１０μｇ）を静脈内注射し、脾細胞を、マウス骨髄腫系列Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と融合させた。ハイブリドーマ上清を、ＤＲ５陽性細胞株上でのＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーによりＤＲ５結合に関してスクリーニングした。ｍＤＲ５−０１、ｍＤＲ５−０２、ｍＤＲ５−０４及びｍＤＲ５−０５と記される、マウスＭＡｂのパネル抗−ＤＲ５が得られた。
【０２２２】
実施例２：細胞培養
様々な腫瘍−由来の細胞株を、そのようなアッセイ手順において、ＴＲＡＩＬ、抗−ＤＲ５ＭＡｂ単独、ＭＡｂ組合せと接触させることができる標的細胞とした。
【０２２３】
細胞株。樹立されたヒト神経膠腫細胞Ｈ４、ＨＳ６８３又はＡ１７２（ＡＴＣＣから入手可能）及び樹立されたヒト肺腺癌細胞Ａ５４９を、１０％熱失活したウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）、４ｎＭ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）及び１００Ｕ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）を補充した、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）において増殖した。樹立されたヒト神経膠星状細胞腫細胞Ｕ８７ＭＧ又はＴ９８Ｇ、ヒト腎腺癌細胞Ａ７０４、ヒト腎腺癌細胞ＡＣＨＮ及びヒト乳腺癌細胞ＭＣＦ７（ＡＴＣＣから入手可能）を、１０％熱失活したウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）、４ｎＭ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）及び１００Ｕ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）を補充した、イーグル最小必須培地（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）において増殖した。樹立されたヒト結腸腺癌細胞ＳＷ９４８及びヒト乳腺癌細胞ＭＤＡＭＢ２３１（ＡＴＣＣから入手可能）は、１０％熱失活したウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）、４ｎＭ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）及び１００Ｕ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）を補充した、レイボビッツＬ−１５（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）において増殖した。樹立されたヒト腎臓癌細胞Ｃａｋｉ−１及びヒト結腸直腸癌細胞ＨＣＴ−１１６（ＡＴＣＣから入手可能）は、１０％熱失活したウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）、４ｎＭ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）及び１００Ｕ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）を補充した、改変マッコイ５Ａ培地（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）において増殖した。樹立されたヒト膀胱癌細胞５６３７及び樹立されたヒト肺腺癌細胞ＮＣＩＨ１７０３（ＡＴＣＣより入手可能）は、１０％熱失活したウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）、４ｎＭ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）及び１００Ｕ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）を補充した、ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）において増殖した。樹立されたヒト神経膠腫細胞４２ＭＧＢＡ（ＤＳＭＺから入手可能）は、２０％熱失活したウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）、４ｎＭ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・��ァラヴィエ、仏国）及び１００Ｕ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）を補充した、ＲＰＭＩ−１６４０培地及びイーグル最小必須培地の１：１（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）の８０％混合物において増殖した。
【０２２４】
実施例３：抗体結合アッセイ（ＦＣＭ，  ＥＬＩＳＡ）
この実施例は、コートされた抗原を伴うＥＬＩＳＡにより、抗−ＤＲ５ＭＡｂ特異性を決定し、細胞表面のＤＲ５細胞発現を調べ、及びエピトープを決定し、その後ＭＡｂをフローサイトメトリーにより競合分析する方法を説明している。
【０２２５】
ＤＲ５細胞発現に関するフローサイトメトリー実験。簡単に述べると、９６ウェル当たり２×１０5個細胞を、１０μｇ／ｍＬの非複合型抗−ＤＲ５ＭＡｂの希釈物と一緒に、インキュベーションし、その後１／１０希釈した。未結合の抗体を、１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）を補充した、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ヴィルボン・シュル・イヴェット、仏国）により、洗浄除去した。引き続き、細胞を遠心分離し（４００ｇ×５分間）、結合した抗体を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）複合したヤギ（Ｆａｂ’）2ポリクローナル抗マウス（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社、イルキルシュ、仏国）により、４℃で３０分間検出した。検出試薬を洗浄除去し、細胞を遠心分離し（４００ｇ×５分間）、ＰＢＳ  ３００μＬ中に再懸濁した。結合した検出抗体を、ＦＡＣＳＣＡＮ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ランジス、仏国）において定量した（ＦＬ１チャンネル、２０００事象／捕捉）。この実験時には、何らかの非特異的結合事象を除去するために、各アイソタイプ対照を含んだ。
【０２２６】
実験結果を、図１（１０μｇ／ｍＬ）、図２に示し、及び表６（５μｇ／ｍＬ）は、例えば、ＭＡｂ濃度又は５μｇ／ｍＬによる細胞染色を示している。様々な癌細胞株は、ＴＲＡＩＬ受容体の異なるサブセットを発現している。発現パターンは、細胞株毎に異なった。本試験において、ＤＲ５は、試験した全ての細胞株において発現された。いずれのＭＡｂ試験した抗−ＤＲ５（ｍＤＲ５−０１、ｍＤＲ５−０２、ｍＤＲ５−０４又はｍＤＲ５−０５）であっても、類似した細胞パターンが認められた。表６は、他の固形腫瘍細胞株（１×１０6個細胞／ｍＬ）、すなわち、ヒト乳腺癌細胞株（ＭＣＦ７、ＭＤＡＭＢ２３１）及びヒト肺腺癌細胞株（ＮＣＩＨ１７０３、Ａ５４９）における、抗−ＤＲ５抗体５μｇ／ｍＬを使用する、ＤＲ５発現のＦＡＣＳ分析を示している。
【０２２７】
【表７】
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【０２２８】
コートされた抗原を使用するＭＡｂ特異性のＥＬＩＳＡ分析。抗体の特異的結合特性は、ＥＬＩＳＡにおいて、コートされたＦａｓ抗原（５０ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、リール、仏国）、ＦａｓＬ抗原（１００ｎｇ／ｍＬ）（Ｔｅｂｕ−ｂｉｏ社、ル・ペレ・アン・イヴリーヌ、仏国）、ＴＲＡＩＬ抗原（１００ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、リール、仏国）、ＤＲ４抗原（５０ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、リール、仏国）、ＤＲ５抗原（５０ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、リール、仏国）、ＤｃＲ１抗原（５０ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、リール、仏国）又はＤｃＲ２抗原（５０ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、リール、仏国）により、評価した。抗−ＤＲ５ＭＡｂパネルは、１μｇ／ｍＬで試験し、且つホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合したヤギポリクローナル抗マウスＩｇＧ１（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ社、コルマール、仏国）を用いて明らかにした。
【０２２９】
実験結果は、図３に示している。ｍＤＲ５−０１、ｍＤＲ５−０２、ｍＤＲ５−０４及びｍＤＲ５−０５抗体（１μｇ／ｍＬ）は、ＤＲ５コートされた抗原（５０ｎｇ／ｍＬ）とのみ反応した。他のアポトーシス関連抗原（ＦＡＳ、ＦＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２）との反応性は、認められなかった（２つの独立した実験について平均±ＳＤ）。
【０２３０】
ＭＡｂ競合結合に関するフローサイトメトリー実験。簡単に述べると、９６ウェル当たり２×１０5個のＴ９８Ｇ細胞を、参照としてビオチニル化されたマウス抗−ＤＲ５抗体の希釈物（１０μｇ／ｍＬ、その後１／１０希釈）と共にインキュベーションし、並びに非複合型抗体５μｇ／ｍＬを含むか又は含まずに、４℃で３０分間インキュベーションした。ビオチニル化抗体１μｇ／ｍＬにより得られたデータのみ示した。未結合の抗体は、１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）を補充した、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ヴィルボン・シュル・イヴェット、仏国）により、洗浄除去した。引き続き、細胞を遠心分離し（４００ｇ×５分間）、結合した抗体を、フィコエリトリン複合したストレプトアビジン（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ社、モンリュソン、仏国）により、４℃で３０分間検出した。検出試薬を洗浄除去し、且つ細胞を遠心分離し（４００ｇ×５分間）、ＰＢＳ  ３００μＬ中に再懸濁した。結合した検出抗体を、ＦＡＣＳＣＡＮ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ランジス、仏国）において定量した（ＦＬ２チャンネル、２０００事象／捕捉）。この実験時には、何らかの非特異的結合事象を除去するために、各アイソタイプ対照を含んだ。
【０２３１】
実験結果は、図４に示す。例えば、非複合型ｍＤＲ５−０２及びｍＤＲ５−０５抗体（５ｇ／ｍＬ）は、ビオチニル化されたｍＤＲ５−０１抗体（１μｇ／ｍＬ）と競合しない。対照的に、非複合型ｍＤＲ５−０１及びｍＤＲ５−０４は、ビオチニル化されたｍＤＲ５−０１抗体と競合している。従って、エピトープＤＲ５−０１及びＤＲ５−０４は、共通であるか又は隣接しているのに対し、エピトープＤＲ５−０２及びＤＲ５−０５は、２つの個別のエピトープである。更にエピトープＤＲ５−０１は、エピトープＤＲ５−０５とも異なる（２つの独立した実験について平均±ＳＤ）。
【０２３２】
実施例３：インビトロにおける生物学的ＭＡｂ活性
この実施例は、癌細胞に対する細胞の細胞傷害作用を惹起するそれらの能力に関する、ＴＲＡＩＬ細胞結合に対する抗−ＤＲ５ＭＡｂの影響を評価する方法を例証している。これらの成分は、非限定的に、インビトロにおける腫瘍成長を遅延する能力又は癌細胞を死滅する能力に関するアッセイを含む、数多くの好適なアッセイのいずれかを使用し、抗−腫瘍活性に関してアッセイすることができる。そのようなアッセイ手法において、ＭＡｂ組合せと接触させた様々な腫瘍−由来の細胞株は、標的細胞である。
【０２３３】
アポトーシスを誘導する抗−ＤＲ５抗体組合せを同定又は選択するために、例えばＰＩにより示されるような膜の完全性の喪失を、対照（未処理細胞）に対して評価し、且つ組換えＴＲＡＩＬと比較した（図８）。腫瘍成長を遅延する能力は、ＡＴＰ又はＢｒＤＵ定量により評価した（図６、図７）。アポトーシス反応は、切断型カスパーゼ３（図９）又は切断型ポリ−（ＡＤＰ−リボース）−ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）（図１０）の定量により評価した。
【０２３４】
生化学試薬。アポトーシス試験に使用した生化学試薬は、以下であった：ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）、カスパーゼ３抗体（Ｏｚｙｍｅ社、サン・カンタン・イヴリーヌ、仏国）、細胞増殖ＥＬＩＳＡ−ＢｒｄＵ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、メラン、仏国）、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧＬｏ−ＡＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、シャボニエール・レ・バン、仏国）、及びポリクローナル抗ポリ−（ＡＤＰ−リボース）−ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、メラン、仏国）。
【０２３５】
ＴＲＡＩＬ結合に対するＭＡｂの影響のフローサイトメトリー実験。Ｈ４細胞株を、９６−ウェル当たり１×１０5個の密度で播種した。細胞を、１μｇ／ｍＬで試験し、その後１／１０希釈した抗−ＴＲＡＩＬＭＡｂ又は抗−ＤＲ５ＭＡｂ（ｍＤＲ５−０１、ｍＤＲ５−０２、ｍＤＲ５−３及びｍＤＲ５−４）を含む又は含まずに、４℃で３０分間インキュベーションした。未結合の抗体は、１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）を補充した、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ヴィルボン・シュル・イヴェット、仏国）により、洗浄除去した。引き続き、細胞を、組換えＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、リール、仏国）と一緒に、４℃で３０分間インキュベーションした。未結合の抗体は、１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）を補充した、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ヴィルボン・シュル・イヴェット、仏国）により、洗浄除去した。結合した組換えＴＲＡＩＬを、ビオチニル化された複合型抗ＴＲＡＩＬ  ＭＡｂ  Ｂ−Ｓ２３（ｉＤＤ  ｂｉｏｔｅｃｈ社、ダルディリー、仏国）により検出した。洗浄後、フィコエリトリン複合したストレプトアビジン（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ社、モンリュソン、仏国）を、４℃で３０分間添加した。検出試薬を洗浄除去し、細胞を遠心分離し（４００ｇ×５分間）、ＰＢＳ  ３００μＬ中に再懸濁した。結合した検出抗体を、ＦＡＣＳＣＡＮ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ランシス、仏国）において定量した（ＦＬ２チャンネル、２０００事象／捕捉）。この実験時には、何らかの非特異的結合事象を除去するために、各アイソタイプ対照を含んだ。
【０２３６】
細胞表面にＤＲ５を発現するヒトＨ４を使用し、ｍＤＲ５−０１、ｍＤＲ５−０２、ｍＤＲ５−０４及びｍＤＲ５−０５と記される４種の抗−ＤＲ５抗体の、アゴニスト活性又はアンタゴニスト活性を決定した。実験の結果は、図５に示している。細胞表面の組換えＴＲＡＩＬ結合は、アンタゴニスト抗ＴＲＡＩＬ  ＭＡｂ  Ｂ−Ｔ２４（ｉＤＤ  ｂｉｏｔｅｃｈ社、ダルディリー、仏国）により阻害された。試験した抗−ＤＲ５ＭＡｂパネルの中で、ＭＡｂ  ｍＤＲ５−０１、ｍＤＲ５−０４及びｍＤＲ−５−０５は、組換えＴＲＡＩＬ結合を阻害し、ｍＤＲ５−０２  ＭＡｂはいかなる影響も伴わなかった。
【０２３７】
ＡＴＰレベル決定後の細胞生存度分析。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）ルミネセント細胞生存度アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、シャボニエール・レ・バン、仏国）を使用し、代謝活性のある細胞の指標としての存在するＡＴＰの定量を基に、培養物中の生存細胞の数を決定した。検出は、生存細胞からのＡＴＰ量を測定する、ルシフェラーゼ反応使用を基にしている。膜完全性の喪失後数分以内に、細胞は、ＡＴＰを合成する能力を喪失し、且つ内在性ＡＴＰａｓｅは、残存するＡＴＰを破壊し；結果的に、ＡＴＰレベルは、急激に下降する。細胞培養物（５×１０4個細胞／ｍＬ）を、単独で、又は抗−ＤＲ５ＭＡｂ単独（１μｇ／ｍＬ）と一緒に、又は各ＭＡｂの２つの組合せＭＡｂの１μｇ／ｍＬと一緒に、７２時間インキュベーションした（図６）。ＴＲＡＩＬリガンド濃度は、１０ｎｇ／ｍＬを使用した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を、培養物中の細胞へ、培養培地２００μＬに対し試薬５０μＬの比で、直接添加した。これらのアッセイプレートを、室温で１０分間インキュベーションし、且つバイオルミネセントシグナルを、標準のマルチウェル蛍光光度計Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ９４０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社、トワリー、仏国）を使用し、記録した。
【０２３８】
４種の抗−ＤＲ５抗体のアゴニスト活性を決定する実験の結果は、図６に示している。試験した抗−ＤＲ５ＭＡｂ単独では、Ｈ４細胞において細胞の細胞傷害作用を誘導することは不可能であった。対照的に、抗−ＤＲ５ＭＡｂ組合せｍＤＲ５−０１とｍＤＲ５−０５のみは、Ｈ４細胞においてアポトーシスを惹起した。この限定された抗−ＤＲ５ＭＡｂ組合せ（１／１０）の能力は、ＭＡｂ染色のレベルと無関係であった（図１）。興味深いことに、ＭＡｂ  ｍＤＲ５−０１及びｍＤＲ５−０５は、２つの異なるエピトープを認識する（図４）。しかし、ｍＤＲ５−０５の、同じく異なるエピトープを認識するｍＤＲ５−０２などの他のｍＤＲ５ＭＡｂとのＭＡｂ組合せは、Ｈ４アポトーシスを惹起することができなかった（図６）。
【０２３９】
ＢｒＤＵ取込み決定後の細胞生存度分析。Ｈ４標的細胞（５×１０4個細胞／ｍＬ）を、ＭＡｂ組合せｍＤＲ５−０５及びｍＤＲ５−０１と、又はＭＡｂ組合せｍＤＲ５−０５及びｍＤＲ５−０４と共に、様々なＭＡｂ濃度範囲で培養した。細胞増殖は、細胞増殖ＥＬＩＳＡ−ＢｒｄＵ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、メラン、仏国）を製造業者の指示に従って使用し、決定した。この方法は、増殖している細胞のＤＮＡへの、チミジンの代わりにピリミジンアナログＢｒｄＵの取込みを基にしている。そのＤＮＡへの取込みの後、ＢｒｄＵは、抗−ＢｒｄＵ  ＭＡｂにより検出される。曝露(revelation)の最後に、バイオルミネセンスシグナルを、標準マルチウェル蛍光光度計Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ９４０  （Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社、トワリー、仏国）を用いて記録する。
【０２４０】
実験の結果は、図７に示している。特異的ＭＡｂ組合せｍＤＲ５−０１及びｍＤＲ５−０５は、ＢｒＤＵ定量により示されるように、Ｈ４細胞株においてアポトーシスを相乗的誘導した（２つの独立した実験について平均±ＳＤ）。ＭＡｂ組合せｍＤＲ５−０５及びｍＤＲ５−０４については、有意な影響は、認められなかった。
【０２４１】
ＭＡｂ誘導されたアポトーシスを測定するためのフローサイトメトリーによるヨウ化プロピジウム取込み。Ｈ４細胞株を、９６−ウェル当たり２×１０4個の密度で播種した。細胞を、抗−ＤＲ５ＭＡｂを含むか又は含まずに、３日間インキュベーションした。各抗−ＤＲ５ＭＡｂは、１μｇ／ｍＬで、単独で、又はその後ＭＡｂと組合せて試験した（図８）。ＴＲＡＩＬリガンド濃度は、１０ｎｇ／ｍＬを使用した。その後細胞を、２０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離し、透過性向上のために、ペレットを７０％エタノール（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）中に再懸濁した。新たな遠心分離後、細胞を、１ウェル当たりＰＩ（１００ｇ／ｍＬ）の１００μＬ及びＲＮａｓｅ（１００μｇ／ｍＬ）の１００μＬ（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）と共に、１５分間インキュベーションした。細胞を遠心分離し（２０００ｒｐｍで５分間）、ＰＢＳ  ３００μＬ中に再懸濁した。結合した検出抗体を、ＦＡＣＳＣＡＮ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ランジス、仏国）において定量した（ＦＬ２チャンネル、３０００事象／捕捉）。
【０２４２】
実験の結果を、図８に示している。ＰＣＤは、単独で試験したＭＡｂでは得られなかったが、特異的ＭＡｂ組合せｍＤＲ５−０１及びｍＤＲ５−０５は、ＰＩ取込みにより示されるように、Ｈ４細胞株において、アポトーシスを相乗的に誘導した（２つの独立した実験について平均±ＳＤ）。ＭＡｂの交差結合は、必要とされなかった。ＰＣＤは、ＭＡｂ組合せｍＤＲ５−０５及びｍＤＲ５−０４では得られなかった。
【０２４３】
ＭＡｂ誘導されたアポトーシスを測定するためのフローサイトメトリーによる切断型カスパーゼ−３の定量。Ｈ４細胞株は、９６−ウェル当たり２×１０4個の細胞密度で播種した。細胞を、ＭＡｂ抗−ＤＲ５を含む又は含まずに、４８時間インキュベーションした。各抗−ＤＲ５ＭＡｂは、単独で又はＭＡｂ組合せの存在下で、ｍＤＲ５−０５について１μｇ／ｍＬで、ｍＤＲ５−０１若しくはｍＤＲ５−０４について０．０１μｇ／ｍＬで試験した（図９）。ＴＲＡＩＬリガンド濃度は、１０ｎｇ／ｍＬを使用した。その後細胞を、２０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離し、透過性向上のために、ペレットを９０％メタノール（Ｓｉｇｍａ社、サン・カンタン・ファラヴィエ、仏国）中に再懸濁した。その後細胞を、２０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離し、ＭＡｂアレクサ蛍光色素４８８複合型抗−活性カスパーゼ−３抗体（Ｏｚｙｍｅ社、サン・カンタン・イヴリーヌ、仏国）と一緒に、４℃で３０分間インキュベーションした。細胞を遠心分離し（２０００ｒｐｍで５分間）、ＰＢＳ  ３００μＬ中に再懸濁した。結合した検出抗体を、ＦＡＣＳＣＡＮ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ランジス、仏国）において定量した（ＦＬ２チャンネル、３０００事象／捕捉）。
【０２４４】
アポトーシスが活性化された時点で、カスパーゼは、複数のタンパク質基質を切断し、これは細胞構造及び機能の喪失に繋がり、最終的には細胞死をもたらす。特に、カスパーゼ−８、−９、及び−３は、アポトーシスに関与している：ミトコンドリア経路においてカスパーゼ−９、Ｆａｓ／ＣＤ９５経路においてカスパーゼ−８、及びより下流のカスパーゼ−３は、複数の経路により活性化される。特異的ＭＡｂ組合せｍＤＲ５−０１及びｍＤＲ５−０５は、切断型カスパーゼ３の定量により示されるように、Ｈ４細胞株において、アポトーシスを相乗的に誘導した（図９）（２つの独立した実験について平均±ＳＤ）。ＴＲＡＩＬ（Ａｐｏ２Ｌとも称される）と比べたように、ＭＡｂ組合せｍＤＲ５−０１及びｍＤＲ５−０５のみが、ＭＡｂ組合せｍＤＲ５−０４及びｍＤＲ５−０５と比べ、細胞アポトーシスを惹起した。
【０２４５】
ＰＡＲＰウェスタンブロット。Ｈ４細胞株は、フラスコＴ  ２５ｃｍ2当たり１×１０6個の細胞密度で播種した。細胞を、抗−ＤＲ５ＭＡｂを含む又は含まずに、５時間インキュベーションした。細胞抽出物を、トリスＨＣｌ  ５０ｍＭ、ＫＣｌ  １５０ｍＭ（ｐＨ７）中に再懸濁し、音波処理に供し、且つ６５℃で１５分間インキュベーションした。標準方法を用い、試料（１０μｇ）を、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦメンブレンに転写した。５％ミルクでブロックした後、ブロットを、抗−ポリ−（ＡＤＰ−リボース）−ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、メラン、仏国）の１／２０００中でインキュベーションした。洗浄後、メンブレンを、ＰＡｂヒツジ抗−ウサギＩｇＧホースラディッシュペルオキシダーゼ複合型抗体の１／１００００（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ社、コルマール、仏国）中でインキュベーションした。ブロットを、ホースラディッシュペルオキシダーゼの検出用の増強されたルミノール−ベースの化学発光基質（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、サン・シル・オー・モン・ドール、仏国）を用い、ＥＣＬ  Ａｄｖａｎｃｅ  ウェスタンブロットにより呈色した。
【０２４６】
カスパーゼに関する多くの標的−特異的基質が同定されており、これはＤＡＮ修復酵素ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）を含む。ＰＡＲＰ切断のウェスタンブロット検出は、アポトーシスの指標として広範に使用されている。ＰＡＲＰは、ヒト配列中のＡｓｐ２１３とＧｌｙ２１４の間で切断され、みかけの分子量２４ｋＤａと８９ｋＤａの２つの断片を生じる。ＭＡｂ組合せｍＤＲ５−０１及びｍＤＲ５−０５で処理したＨ４細胞から、切断されたＰＡＲＰの断片が検出されたのに対し、未処理の細胞から、又はＭＡｂ組合せｍＤＲ５−０５及びｍＤＲ５−０４で処理した細胞からは、同様の作用は認められなかった（図１０）。
【０２４７】
図１１に示されるように、ＭＡｂ  ｍＤＲ５−０２（１μｇ／ｍＬ）は、試験したＭＡｂ組合せｍＤＲ５−０１及びｍＤＲ５−０５の比１／１００（１０μｇ／ｍＬ＋０．１μｇ／ｍＬ）により惹起されるアポトーシスをブロックした。他の抗−ＤＲ５ＭＡｂ（ｍＤＲ５−０１、ｍＤＲ５−０４又はｍＤＲ５−０５）では、有意な影響は、認められなかった。細胞生存度は、代謝活性細胞の指標である、存在するＡＴＰの定量を基に評価した。
【０２４８】
５種の神経膠腫細胞株Ｈ４、ＨＳ６８３、Ａ１７２、Ｔ９８Ｇ及びＵ８７ＭＧの、ＴＲＡＩＬに対する、又は試験した抗−ＤＲ５ＭＡｂ組合せ（ｍＤＲ５−０１＋ｍＤＲ５−０５、対、ｍＤＲ５−０５＋ｍＤＲ５−０４）の比１／１００（１０μｇ／ｍＬ＋０．１μｇ／ｍＬ）に対する感受性を、代謝活性細胞の指標である、存在するＡＴＰの定量を基に評価した（図１２）。４種の細胞株（ＨＳ６８３、Ａ１７２、Ｔ９８Ｇ及びＵ８７ＭＧ）は、ＴＲＡＩＬ−誘導したアポトーシスに対し抵抗性であるか又は非常に低い感受性であったが、抗−ＤＲ５ＭＡｂ組合せｍＤＲ５−０１及びｍＤＲ５−０５の使用は、この調節機序を迂回した。
【０２４９】
エクスビボにおいて、患者由来の神経膠腫細胞の、試験したマウス抗−ＤＲ５ＭＡｂ組合せ（ｍＤＲ５−０１＋ｍＤＲ５−０５）の１０μｇ／ｍＬ（比１／１０）に対する感受性を、代謝活性細胞の指標である、存在するＡＴＰの定量を基に評価した（図１４）。
【０２５０】
４種の神経膠腫細胞株（ＨＳ６８３、Ａ１７２、４２ＭＧＢＡ、Ｔ９８Ｇ）の、試験したマウス抗−ＤＲ５ＭＡｂ組合せ（ｍＤＲ５−０１＋ｍＤＲ５−０５）の１０μｇ／ｍＬ、その後１／１０希釈した（比１／１）ものに対する感受性を、単独で、又はカンプトテシンとの会合において評価した（図１５−１８）。これらの細胞株は、マウス抗−ＤＲ５ＭＡｂ組合せにより誘導されるか、又はカンプトテシンの存在下で誘導される、異なるレベルのアポトーシスを示した。カンプトテシンと会合した抗−ＤＲ５ＭＡｂ組合せの使用は、この調節機序を迂回し、且つアポトーシスのレベルを増強した。
【０２５１】
ヒト乳腺癌細胞株（ＭＣＦ７、ＭＤＡＭＢ２３１）及びヒト肺腺癌細胞株（ＮＣＩＨ１７０３、Ａ５４９）上などのＤＲ５を発現している他の固形腫瘍細胞株の、試験したマウス抗−ＤＲ５ＭＡｂ組合せ（ｍＤＲ５−０１＋ｍＤＲ５−０５）の１０μｇ／ｍＬ、その後１／１０希釈した（比１／１）ものに対する感受性を、単独で、又はパクリタキセル、ゲムシタビン若しくはドキソルビシンとの会合で評価した（図１９−２２）。これらの細胞株は、マウス抗−ＤＲ５ＭＡｂ組合せにより誘導されるか、又は試験した異なる薬物の存在下で誘導される、異なるレベルのアポトーシスを示した。これらの薬物と会合した抗−ＤＲ５ＭＡｂ組合せのでの使用は、この調節機序を迂回し、且つアポトーシスのレベルを増強した。
【０２５２】
実施例４：ＤＲ５に対して向けられたキメラモノクローナル抗体の調製
本モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、通常の手順を用い（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブの使用により）、容易に単離され、且つ配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい給源として役立つ。
【０２５３】
マウスＭＡｂの未変性キメラＭＡｂへの変換：ハイブリドーマの可変領域に対応するｃＤＮＡを、２つのアプローチを用いて入手し、ここで第一のアプローチは、Ｎ−末端配列決定から生じる、縮重Ｎ−末端アミノ酸に関連したプライマーセットの、ＰＣＲにおける利用からなり、並びに第二のアプローチは、ＩＭＧＴ（登録商標）プライマーデータベース、及び先に説明された特異的プライマーにより作製された縮重プライマーセットの、ＰＣＲにおける利用からなる（Essonoら、J Immunol Methods. 2003; 203: 279:25-66；Wangら、Mol Immunol. 1991; 28:1387-97）。Ｎ−末端可変領域の配列は、エドマン分解により決定した。総ＲＮＡ抽出は、Ｔｒｉ試薬キットを供給業者Ｓｉｇｍａ社により説明されたプロトコールに従い使用し、実行した。増幅されたＶＬ断片及びＶＨ断片を、ジデオキシターミネーション法による配列解析のために、ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へクローニングした（Sangerら、Nature. 1977; 265:687-95）。その後抗体変種構築体を、ＰＣＲにより増幅し、発現ベクターへクローニングした。
【０２５４】
ＩＭＧＴ（登録商標）及びＫａｂａｔ（登録商標）指標に従い位置を番号付けした（異なる特異性の抗体における同一Ｖ領域アミノ酸配列及び配列セグメント）。抗体−組合せ部位の結合への、ＶＨ及びＶＬの遺伝子、ミニ遺伝子、及び相補性決定領域の相対的寄与を、分析した（Kabatら、NIH Publ. 1991; No. 91-3242, Vol. 1, 647-669）。
【０２５５】
図１３に示したように、キメラＭＡｂ組合せｃｈＤＲ５−０１及びｃｈＤＲ５−０５は、比１／１００（５μｇ／ｍＬ＋０．０５μｇ／ｍＬ）で、試験したＨ４細胞のアポトーシスを惹起した。単独で試験したキメラＭＡｂでは、有意なＭＡｂの影響は認められなかった。細胞生存度は、代謝活性細胞の指標である、存在するＡＴＰの定量を基に評価した。
【０２５６】
キメラＭＡｂ  ＤＲ５−０１及びＤＲ５−０５に関する核酸配列又はアミノ酸配列を、配列表に示している：
−ＤＲ５−０１の抗−ＤＲ５抗体の可変マウス軽鎖のヌクレオチド配列（配列番号：１）及びそれ由来のアミノ酸配列（配列番号：２）、
−ＤＲ５−０１の抗−ＤＲ５抗体の可変マウス重鎖のヌクレオチド配列（配列番号：３）及びそれ由来のアミノ酸配列（配列番号：４）、
−ＤＲ５−０５の抗−ＤＲ５抗体の可変マウス軽鎖のヌクレオチド配列（配列番号：５）及びそれ由来のアミノ酸配列（配列番号：６）、
−ＤＲ５−０５の抗−ＤＲ５抗体の可変マウス重鎖のヌクレオチド配列（配列番号：７）及びそれ由来のアミノ酸配列（配列番号：８）、
−ＤＲ５−０１又はＤＲ５−０５の抗−ＤＲ５抗体の定常ヒト重鎖のヌクレオチド配列（配列番号：９）及びそれ由来のアミノ酸配列（配列番号：１０）、
−ＤＲ５−０１又はＤＲ５−０５の抗−ＤＲ５抗体の定常ヒト軽鎖のヌクレオチド配列（配列番号：１１）及びそれ由来のアミノ酸配列（配列番号：１２）。
【０２５７】
実施例５：ＭＡｂ産生及びプロテインＡ精製
哺乳動物細胞の、ヒト適用に最も適合性のある形状でタンパク質をグリコシル化する能力のために、それらは治療用糖タンパク質の作製にとって好ましい宿主である（Jenkinsら、Nat Biotech. 1996; 14:975-81）。使用することができる哺乳動物宿主細胞は、ヒトＨｅｌａ、２８３、Ｈ９及びＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３及びＣ１２７細胞、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７及びＣＶ１アフリカミドリザル細胞、ウズラのＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞及びチャイニーズハムスター卵巣細胞が挙げられる。細菌は非常に稀に、タンパク質をグリコシル化し、酵母、糸状菌、昆虫及び植物の細胞などの、同様の他の型の一般的宿主は、血流からの迅速なクリアランスに関連したグリコシル化パターンを生じる。
【０２５８】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、遺伝的に安定した、高度に生産的なクローン細胞株の一貫した生成を可能にする。これらは、簡単なバイオリアクターにおいて、無血清培地を使用し、高密度で培養することができ、且つ安全で再現可能なバイオプロセスの開発を可能にする。他の通常使用される動物細胞は、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ＮＳＯ−及びＳＰ２／０−マウス骨髄腫細胞を含む。トランスジェニック動物からの作製も、試験されている（Jenkinsら、Nat Biotech. 1996; 14:975-81）。
【０２５９】
典型的哺乳動物の発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介するプロモーターエレメント（ＳＶ４０由来の初期及び後期プロモーター、ＲＳＶ、ＨＴＬＶ１、ＨＩＶ１などのレトロウイルス由来の末端反復配列（ＬＴＲ）、並びにサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ、ｈＣＭＶ）の初期プロモーター）、タンパク質コード配列、並びに転写の終結及び転写物のポリアデニル化に必要なシグナル（ＢＧＨポリＡ、単純ヘルペスウイルスポリＡのヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫｐａ）、後期ＳＶ４０ポリＡ及び３’ＵＴＲ＿Ｂｅｔａ＿Ｇｌｏｂｉｎ＿ｐｏｌｙＡ）を含む。追加のエレメントは、エンハンサー（Ｅμ、ｈｌＥ１）、コザック配列、シグナルペプチド、並びにＲＮＡスプライシングのためのドナー及びアクセプター部位に隣接した介在配列が挙げられる。本発明の実践において(in practise in practising)使用するのに適した発現ベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３．３、ｐＯｐｔｉＶＥＣ、ｐＲＳＶ、ｐＥμＭＣＭＶ、ｐＭＣＭＶＨＥ−ＵＴＲ−ＢＧ、ｐＨＣＭＶＨＥ−ＵＴＲ−ＢＧ、ｐＭＣＭＶ−ＵＴＲ−ＢＧ、ｐＨＣＭＶ−ＵＴＲ−ＢＧ、ｐＭＣＭＶＨＥ−ＳＶ４０、ｐＨＣＭＶＨＥ−ＳＶ４０、ｐＭＣＭＶ−ＳＶ４０、ｐＨＣＭＶ−ＳＶ４０、ｐＭＣＭＶＨＥ−ＴＫ、ｐＨＣＭＶＨＥ−ＴＫ、ｐＭＣＭＶ−ＴＫ、ｐＨＣＭＶ−ＴＫ、ｐＭＣＭＶＨＥ−ＢＧＨ、ｐＨＣＭＶＨＥ−ＢＧＨ、ｐＭＣＭＶ−ＢＧＨ、ｐＨＣＭＶ−ＵＴＲ−ＢＧＨなどのベクターが挙げられる。
【０２６０】
エンプティＣＨＯ  Ｅａｓｙ  Ｃ細胞（ＣＣＴコレクションにより購入）を、軽鎖及び重鎖のＭＡｂ発現ベクターにより同時トランスフェクションし、その後の一過性又は安定したトランスフェクション手順を、本発明者らの研究室において確立した。Ｈ鎖及びＬ鎖の分泌は、各ヒトＩｇＨリーダー配列により可能であった。抗−ＤＲ５ＭＡｂの軽鎖及び重鎖のためのコード領域を、複数のクローニング部位で、ＭＡｂ発現ベクターへ導入した。この形質転換体を、正確な配向及びリーディングフレームに関して分析し、この発現ベクターを、ＣＨＯ細胞株へトランスフェクションすることができる。
【０２６１】
マウス腹水由来のプロテインＡクロマトグラフィー。マウス腹水を、０．１Ｍトリス及び１．５Ｍ硫酸アンモニウムの平衡緩衝液により、ｐＨ８．３に調節し、次にｒＰｒｏｔｅｉｎＡセファロースファストフローカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、サン・シル・オー・モン・ドール、仏国）上に装加した。結合していないタンパク質は、通り抜けて流れ、平衡緩衝液による数回の洗浄により除去された。抗−ＤＲ５ＭＡｂは、溶離緩衝液０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．５）を使用し、プロテインＡカラムから溶離した。カラム溶離液は、Ａ２８０でモニタリングした。抗−ＤＲ５ＭＡｂピークを、プールした。
【０２６２】
収集したＣＨＯ細胞培養液からのプロテインＡクロマトグラフィー。ＣＨＯ細胞から生成された収集した細胞培養液を、リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）により平衡とした、Ｈｉ  Ｔｒａｐ  ｒＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、サン・シル・オー・モン・ドール、仏国）上に装加した。結合していないタンパク質は、通り抜けて流れ、引き続きのＰＢＳ緩衝液による数回の洗浄により除去された。抗−ＤＲ５ＭＡｂは、０．１Ｍクエン酸（ｐＨ３．０）の溶離工程を使用し、プロテインＡカラムから溶離した。カラム溶離液は、Ａ２８０でモニタリングした。抗−ＤＲ５ＭＡｂピークを、プールした。
【０２６３】
実施例６：ＤＲ５に対して向けられたヒト化モノクローナル抗体の調製
抗体ＣＤＲ領域及びＦＲ領域を、ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）、Ｋａｂａｔ又は共通番号付けシステムなどの、様々な番号付け法に従い、決定した。しかし、所与の抗体に関して、ＩＭＧＴ決定したＣＤＲは、他の番号付けシステムにより規定されたＣＤＲと必ずしも同一ではない。可変ドメインＣＤＲ領域及びフレームワーク領域は、ＩＭＧＴ番号付けシステムのおかげで本発明者らにより同定されている。
【０２６４】
キメラＭＡｂのヒト化ＭＡｂへの変換：ヒト化ＤＲ５抗体Ｈ鎖及びＬ鎖は、ＰＣＲ法による、ＣＤＲ−グラフティングを用いて、作製した。マウスモノクローナル抗体のＣＤＲがヒト抗体上にグラフティングされているヒト化抗体を作製するためには、マウスモノクローナル抗体の可変領域とヒト抗体の可変領域の間に、高い相同性が存在することが好ましい。従って、マウス抗−ヒトＤＲ５モノクローナル抗体のＨ鎖及びＬ鎖のＶ領域は、ソフトウェアＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎを使用し、全ての公知のヒト抗体のＶ領域と比較した。マウス抗体が通常の技術によりヒト化される場合、ＣＤＲを支持するマウス抗体のＶ領域ＦＲの一部のアミノ酸配列は、所望のように、ヒトＶ領域のＦＲ上にグラフティングされることができる。
【０２６５】
ヒト化Ｈ鎖及びＬ鎖の両方のＶ領域に関して、Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ領域及びＪ領域を選択することが可能であり、ＩＧＫＶ３−Ｄ−１５*０１、ＩＧＨＶ１−３*０１、ＩＧＫＪ２*０１及びＩＧＨＪ４*０１らは各々、ｍＤＲ５抗体のＨ鎖及びＬ鎖のＶ領域及びＪ領域と高い相同性を有し、並びにＩＧＫＶ１−１６*０１、ＩＧＨＶ１−３*０１、ＩＧＫＪ４*０１及びＩＧＨＪ４*０１は、ｍＤＲ５−０５抗体のＨ鎖及びＬ鎖のＶ領域及びＪ領域と高い相同性を有する。
【０２６６】
配列決定後、ＨｚＤＲ５−０１及びＨｚＤＲ５−０５のヒト化可変領域が決定される。ＨｚＤＲ５−０１及びＨｚ−ＤＲ５−０５のＨ鎖及びＬ鎖の可変領域は、ＰＣＲにより増幅され、且つヒトＩｇＧ１定常領域を含む発現ベクターｐ３Ｕへクローニングされる。
【０２６７】
ヒトＣＤＲ−グラフティング抗体の場合、結合活性は、マウス抗体単独におけるＣＤＲのアミノ酸配列のグラフティングにより低下される。この低下を避けるために、ヒト抗体とマウス抗体の間で異なるＦＲ中のアミノ酸残基の中で、結合活性に影響を及ぼすと考えられるアミノ酸残基を、ＣＤＲのアミノ酸配列と一緒にグラフティングする。従って、結合活性に影響を及ぼすと考えられるＦＲ中のアミノ酸残基を同定する試みも、この実施例において行った。
【０２６８】
神経膠腫細胞株Ｈ４の、マウス又はヒト化抗−ＤＲ５ＭＡｂ組合せ（ｍＤＲ５−０１＋ｍＤＲ５−０５）の１μｇ／ｍＬ、その後１／２希釈したもの（比１／１）に対する感受性を、代謝活性細胞の指標である、存在するＡＴＰの定量を基に評価した（図２３）。ヒト化ＭＡｂ組合せ（ｈｚＤＲ５−０１及びｈｚＤＲ５−０５）は、マウスＭＡｂ組合せ（ｍＤＲ５−０１及びｍＤＲ５−０５）と比べ、より高いレベルで、細胞アポトーシスを惹起した。
【０２６９】
実施例７：インビボにおける生物学的ＭＡｂ活性
同所性ヒト神経膠腫異種移植マウスモデルを、異型ヒト神経膠腫異種移植マウスモデルＳｃ２から生じた１０００００個の単離された細胞の、ヌードマウスにおける大脳内注射により得た。ＭＡｂ処置は、体重減少のためにマウスが安楽死するまで、マウス１匹につき５ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射（ＩＰ）により投与し、これは最大３６日間適用した。カプラン・マイヤー法及びウィルコクソン統計検定（ＪＭＰソフトウェア）を使用し、対照群で得られた生存時間を、処置群（ｍＤＲ５−０１＋ｍＤＲ５−０５、対、ｍＤＲ５−０４＋ｍＤＲ５−０５）で得られた生存時間と比較した（図２４）。この試験は、大脳内神経膠腫に対するマウス抗−ＤＲ５ＭＡｂ組合せ（ｍＤＲ５−０１＋ｍＤＲ５−０５）の抗−腫瘍活性を明らかにした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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