(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＳＰ９０α、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはこれらの組合せを含む、リポソーム封入ポリペプチド組成物。
【請求項２】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの断片が、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１に記載のリポソーム封入ポリペプチド組成物。
【請求項３】
前記リポソームが、約５０〜５００ｎｍ、約５０〜３５０ｎｍ、または約１００〜２５０ｎｍの粒径を有するナノリポソームである、請求項１に記載のリポソーム封入ポリペプチド組成物。
【請求項４】
前記ポリペプチドがＨＳＰ９０αである、請求項１に記載のリポソーム封入ポリペプチド組成物。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１に記載のリポソーム封入ポリペプチド組成物。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１に記載のリポソーム封入ポリペプチド組成物。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組み合わせである、請求項１に記載のリポソーム封入ポリペプチド組成物。
【請求項８】
リポソーム封入ポリペプチド組成物を調製する方法であって、前記ポリペプチドが、リポソーム封入されたＨＳＰ９０α、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはこれらの組合せを含み、
（ａ）リポソームを形成できるリン脂質を、ＨＳＰ９０α、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、と共に塩の緩衝水溶液に溶解し、ここで、前記リン脂質が黄色卵黄レシチンまたは大豆レシチンを含むものである；そして、
（ｂ）前記水溶液を高圧ホモジナイザーに通し、その間、通す回数が増すにつれて前記リン脂質の含有量および前記高圧ホモジナイザーの圧力を徐々に増加させて、ＨＳＰ９０α、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはこれらの組合せを含有する、リポソーム封入ポリペプチド組成物を得る
ことを含む前記方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドがＨＳＰ９０αである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組み合わせである、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記リポソーム封入ポリペプチド組成物がナノリポソーム封入ポリペプチド組成物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
ＨＳＰ９０α、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはこれらの組合せを含む、リポソーム封入ポリペプチド組成物を含有し、そして、皮膚状態を処置するための、局所用製剤であって、前記皮膚状態がアトピー性皮膚炎、シワ、シミ、肌のハリまたは肌老化であり、前記組成物が約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの濃度の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの断片を含む、前記局所用製剤。
【請求項１５】
ＨＳＰ９０α、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはこれらの組合せを含む、リポソーム封入ポリペプチド組成物を含有し、そして、皮下脂肪蓄積を処置するための、局所用製剤であって、前記組成物が約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの濃度の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの断片を含む、前記局所用製剤。
【請求項１６】
アトピー性皮膚炎、シワ、シミ、肌のハリまたは肌老化である皮膚状態を処置するための調製物の製造における、ＨＳＰ９０α、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはこれらの組合せを含む、リポソーム封入ポリペプチド組成物の使用。
【請求項１７】
肥満、セルライト、潰瘍を伴う下肢静脈瘤、下体肢浮腫、静脈瘤、皮膚変色、静脈性湿疹、強皮症、炎症性血栓、皮膚潰瘍または慢性疼痛を処置するための調製物の製造における、ＨＳＰ９０α、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはこれらの組合せを含む、リポソーム封入ポリペプチド組成物の使用であって、ここにおいて、セルライト、潰瘍を伴う下肢静脈瘤、下体肢浮腫、静脈瘤、皮膚変色、静脈性湿疹、強皮症、炎症性血栓、皮膚潰瘍および慢性疼痛は、肥満に起因するものである、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[00001]本願は、２０１４年８月９日に大韓民国受理官庁に出願された国際出願である。本ＰＣＴ出願は、２０１３年８月９日に出願された大韓民国特許出願１０−２０１３−００９４９３０の優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
[00002]本発明は、リポソームおよび／またはナノリポソームに封入されている薬理活性ポリペプチドを含む局所投与に好適な組成物に関する。本発明は、リポソームおよび／またはナノリポソーム製剤の製造方法にも関する。さらに、本発明は、皮膚状態を改善および／または処置する方法、創傷治癒を増進する方法、ならびに皮下脂肪形成を阻害する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
[00003]熱ショックタンパク質９０ａ（以降、ＨＳＰ９０ａと略記する）は、リン酸基を含有する２つのモノマーから構成される９０ＫＤの分子量を有するダイマーである。その２つのモノマーは、ある条件下で、例えば水溶液中に存在するとき、容易にオリゴマー化される傾向がある。大部分の熱ショックタンパク質は細胞内で機能することが知られている。他の報告では一部の熱ショックタンパク質が細胞外で作用することを示しており、別の代替的な生理的役割が示唆される。免疫調節におけるＨＳＰ９０ａの役割が示唆されている１０、１２。しかし、ＨＳＰ９０ａに関して系統的研究は行われておらず、アトピー性皮膚炎もしくは肌老化などの皮膚状態に影響を及ぼす何らかの活性を有するという記載はなく、皮下脂肪形成もしくは蓄積に影響を及ぼすという記載もない。ＨＳＰ９０ａ断片の比較的大きいサイズが局所用調製物におけるこの分子の使用を妨げてきた、皮膚真皮層に浸透することができないからである６。
【０００４】
[00004]アトピー性皮膚炎（ＡＤ）は、角質層の異常によって引き起こされる慢性皮膚疾患であり、一般に特発性と考えられる９。ＡＤは小児に影響を及ぼすが成人にも影響を及ぼす。ＡＤの疫学が遺伝的因子４または環境的因子７、および免疫学的因子９と関連することは知られている。
【０００５】
[00005]処置によって再燃の重症度および頻度が低減されることもあるが、ＡＤの公知治療法は今のところない。アトピー性皮膚炎の処置に一般に用いられる組成物としては、抗ヒスタミン、ステロイドまたは免疫抑制の特性を有する、小分子ベース化合物が挙げられる。あるいは、全身性免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、メトトレキサート、インターフェロンγ−１ｂ、ミコフェノール酸モフェチルおよびアザチオプリンが試されることもある４。しかし、これらの小分子ベース化合物は長期間使用すると免疫機能低下などの深刻な有害作用を伴うので、そのような障害を克服するための新規材料がこれらおよび他の状態の処置に必要とされる。
【０００６】
[00006]小分子ベース薬物とは異なり、皮膚疾患の処置および／または皮膚用化粧品の調製のための活性成分としてのポリペプチドの使用には有意な利点がある。例えば、ポリペプチドは免疫系および細胞との相互作用への適合性が一般に高く、体内でプロ生理的（ｐｒｏ−ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ）様式で一般に分解するので、小分子（化学物質）含有調製物と比較して生じさせる副作用が、特に長期使用中に少ない。さらに、薬用化粧品調製物での使用に関連して、小分子含有化粧品は、短期間しか化粧効果を一般に生じさせないが、ポリペプチド含有薬用化粧品調製物は、総合的な皮膚状態のより長期の改善およびさらには肌の若返りをもたらすと記載されている３。しかし、多くの潜在的に有用なポリペプチドの全体的なサイズおよび嵩高さがこれらの成分の皮膚組織への浸透を妨げる。
【０００７】
[00007]旧来、皮膚角質バリアのため、５００ダルトン以上の分子量を有する高分子は大きすぎて皮膚表皮を通過できないと考えられる６。たとえ化学的浸透増進剤と併用しても、２０００ダルトンより大きい分子量を有する高分子は、皮膚表皮に浸透できないので、局所使用は事実上ありえないと考えられる。それ故、医薬／化粧料成分として開発されたペプチドは、皮膚真皮へのこの活性成分の送達を最適にするために、はるかに小さいサイズ、例えば１０アミノ酸未満（概して約１１００ダルトンＭＷ）のサイズを有するものに限定されている。したがって、１０アミノ酸以上のサイズを有する多くの潜在的に有用なポリペプチドが局所用調製物に利用されていない。ポリペプチドなどの活性成分の皮膚真皮層への送達は、機能性医薬／化粧料調製物で最も薬学的に有意義な成果をもたらすために不可欠である。
【０００８】
[00008]２２，１２４ダルトンのＭＷ（１９１アミノ酸サイズ）を有するヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）についてのリポソームベースの送達が報告されている１−３。しかし、他の薬理学的に異なるペプチド／タンパク質、例えば熱ショックタンパク質Ｈｓｐ９０ａ、の有効な局所送達に関連した課題は残存する。
【０００９】
[00009]ＨＰｆと呼ばれる、熱ショックタンパク質の１１５アミノ酸断片は、ネイティブの内因性ＨＳＰ配列のリンカーと中間ドメインの間にわたるアミノ酸配列によってコードされる（図１）。この断片は、糖尿病性潰瘍によって引き起こされる皮膚壊死を改善すると報告されている８。しかし、これらおよび関連ポリペプチドのより完全な使用および形成を促すには送達製品の改善が足りない。
【００１０】
[00010]皮下脂肪は、最も広く分布している、主として脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）から構成される、皮下組織の層である。脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）の数は身体部位によって異なり、その上、それらのサイズは身体の栄養状態によって異なる（Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｔｉｓｓｕｅ、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｕｂｊｅｃｔ  Ｈｅａｄｉｎｇｓ（ＭｅＳＨ）、２０１３年６月５日ＮＬＭ検索）。脂肪細胞（ｆａｔ  ｃｅｌｌ）のサイズを低減させることがインスリンへの脂肪細胞（ｆａｔ  ｃｅｌｌ）の感受性を改善し得ることを示唆する報告もある５。脂肪の蓄積を抑制するために非常に多くの小分子ベース経口送達薬が開発され、市販されている。しかし、これらのタイプの調製物の経口投与は有害副作用を随伴する。局所用調製物は、そのような適用に有効であるだろうし、局所用調製物には、他の利点の中でも特に、問題の脂肪沈着身体部位を標的にする利点があるだろう。
【００１１】
[00011]皮膚組織の構造のため、皮膚に十分に浸透して体内に有益な薬理および生理効果をもたらすことができないこれらのポリペプチドおよびタンパク質分子のサイズおよび嵩高は、依然として、局所用調製物でのポリペプチドの使用における多くの障害の１つである。この問題に対する従来のアプローチは、メソセラピーデバイス、例えばマイクロニードル、エレクトロポレーションデバイス、レーザー処置、および赤外線照射の使用である。様々な理由のため、これらのアプローチは、ペプチド含有調製物の局所投与の十分に有効かつ便利なアプローチになっていない。十分な保存可能期間および製品の生物学的安定性に関連した問題も、ポリペプチド／ペプチド／タンパク質ベースの局所および他の調製物の使用を制限する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
[00012]改善された局所用調製物であって、同定されたポリペプチド／タンパク質ベース分子の生物活性が保存され、保存可能期間が増された局所用調製物への要求が医療技術分野において存続している。加えて、患者に対する最大の生理的恩恵を達成するために皮膚組織深部へのこれらおよび他の強力なポリペプチド／タンパク質剤の有効な送達を達成する要求が存続している。本発明は、局所および他の送達製剤適用および処置方法でのポリペプチドおよび／またはタンパク質ベース分子の使用についての医療技術分野におけるこれらおよび他の技術的問題に対する解決策を与える。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
[00013]本発明は、リポソームおよびナノリポソーム封入熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）調製物、ならびにＨＳＰのより小さいポリペプチド断片、すなわちＨＰｆ（１１５ａａ）、ならびに新規ポリペプチドＨＰｆΔＣ１（１０１ａａ）およびＨＰｆΔＣ２（８７ａａ）を含む調製物も、初めて提供する。これらのリポソーム調製物が、皮膚表面に局所送達されたとき、創傷治癒の増進、脂肪細胞分化（ｆａｔ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）の阻害、（アトピー性皮膚炎、シワ、肌のハリおよびシミを含み、全般的な肌の若返りの促進する）皮膚状態の改善および皮膚毛包への有効な送達を含む多数の新規かつ有利な生理的効果を有することをさらに実証する。
【００１４】
[00014]ポリペプチド組成物および調製物をナノリポソーム封入調製物としてさらに提供してもよい。これらの調製物が長期保存安定性および溶液中で保持される生物活性を有することを実証する。これらの調製物を局所、メソセラピーまたは全身投与に好適
な送達形態で提供してもよい。
【００１５】
[00015]驚くべきことに、本発明は、ＨＳＰ９０ａの１１５アミノ酸断片であるＨＰｆの無傷の皮膚と創傷をおった皮膚両方の角質層への有効な送達を、リポソームベースの送達調製物でのこのポリペプチドの局所製剤を使用して達成した。
【００１６】
[00016]本発明のいくつかの態様に従って、熱ショックタンパク質、およびＨＰｆポリペプチドまたはその断片を活性成分として含むリポソーム（特にナノリポソーム）封入ポリペプチド組成物を提供する。前記ＨＰｆポリペプチド断片は、１１５ａａ配列（ＨＰｆと呼ばれる）（配列番号１）、１０１ａａ配列（ＨＰｆΔＣ１）（配列番号２０）、８７ａａ配列（ＨＰｆΔＣ２）（配列番号２１）、ＨＳＰ９０ａ  ａａ配列（配列番号２）またはこれらの組合せを有するポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、前記組成物を皮膚への局所塗布に好適であるようにおよび特に薬用化粧品調製物（化粧料、スキンコンディショナーなど）の調製における使用に好適であるように製剤化する。
【００１７】
[00017]特定の実施形態において、ナノリポソームは、５０〜５００ｎｍ、５０〜３５０ｎｍ、または１００〜２５０ｎｍの粒径を有する。
[00018]本発明は、ＨＰｆなどのＨＳＰ９０ａ断片、ならびにネイティブ配列とは異なる合成ポリペプチド配列、例えばＨＰｆΔＣ１（１０１ａａ）およびＨＰｆΔＣ２（８７ａａ）が、表皮と真皮両方の皮膚細胞の分化を促進するが、真皮下層での前脂肪細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ）の分化を阻害するという発見を含む。この活性により、次に、アトピー性湿疹および／またはアトピー性皮膚炎の進行および重症化が阻害される。この特徴は、本発明のさらに別の目的をもたらす。
【００１８】
[00019]本発明の別の実施形態では、皮下脂肪蓄積および脂肪細胞分化を抑制する医薬品に使用するための組成物を提供する。
[00020]別の態様において、本発明は、皮下脂肪の蓄積を低減および／もしくは阻害するならびに／または皮下脂肪細胞分化を抑制する方法であって、熱ショックタンパク質の断片に対応する配列を有するポリペプチドを含むナノリポソーム組成物を局所塗布することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、１１５ａａ配列（ＨＰｆと呼ばれる）（配列番号１）、１０１ａａ配列（ＨＰｆΔＣ１）（配列番号２０）、８７ａａ配列（ＨＰｆΔＣ２）（配列番号２１）、またはＨＳＰ９０ａ  ａａ配列（配列番号２）によって定義され、そのポリペプチドがナノリポソームに封入される。
【００１９】
[00021]別の態様において、本発明は、肥満、セルライト、潰瘍を伴う下肢静脈瘤、下体肢浮腫、静脈瘤、皮膚変色、静脈性湿疹、強皮症、炎症性血栓、皮膚潰瘍または慢性疼痛を処置するための医薬品に使用するためのナノリポソーム調製物を提供する。
【００２０】
[00022]本発明のさらに別の態様は、組換えＨＳＰ９０ａおよびＨＰｆポリペプチド（ＨＳＰ９０ａ、ＨＰｆ、ＨＰｆΔＣ１、ＨＰｆΔＣ２）の生産および／または製造に有用な形質転換細胞系を提供する。例として、これらの形質転換細胞系の調製に使用することができる細胞系としては、ＴＯＰ１０細胞系、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ細胞系、ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）細胞系、およびＲＺ４５００細胞系が挙げられる。融合パートナータンパク質／ペプチドと共に、ＨＳＰ９０ａｍ  ＨＰｆおよび／またはＨＰｆポリペプチド断片を含む融合タンパク質をコードする配列を含む発現ベクターも開示し、前記ベクターは、これらの有用な治療用ポリペプチドの大規模で経済的な生産に有用である。融合タンパク質構築物も本発明の一部として定義される。
【００２１】
[00023]本発明の別の態様は、ＨＳＰ９０ａ、ＨＰｆ、ＨＰｆΔＣ１およびＨＰｆΔＣ２ポリペプチドを含む、組換えＨＳＰ９０ａおよびＨＰｆポリペプチドを製造する方法を提供する。
【００２２】
[00024]本発明のさらに別の態様は、ＨＳＰ９０ａ、ＨＰｆポリペプチド（ＨＳＰ９０ａ、ＨＰｆ、ＨＰｆΔＣ１、ＨＰｆΔＣ２）またはこれらの組合せを含有する、皮膚状態の処置に使用するための局所用リポソームポリペプチド製剤であって、前記皮膚状態がアトピー性皮膚炎、シワ、シミ、肌のハリまたは肌老化であり、前記組成物が約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの濃度のＨＰｆポリペプチドまたはＨＰｆポリペプチド断片を含むものである前記製剤を提供する。
【００２３】
[00025]本発明のさらに別の態様は、ＨＳＰ９０ａ、ＨＰｆポリペプチド（ＨＳＰ９０ａ、ＨＰｆ、ＨＰｆΔＣ１、ＨＰｆΔＣ２）またはこれらの組合せを含有する、皮下脂肪蓄積の処置に使用するための局所用リポソームポリペプチド製剤であって、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの濃度のポリペプチドを含む製剤を提供する。
【００２４】
[00026]本発明は、アトピー性皮膚炎、シワ、シミ、肌のハリまたは肌老化である皮膚状態を処置するための調製物の製造におけるＨＳＰ９０ａ、ＨＰｆポリペプチドもしくはその断片（ＨＰｆΔＣ１、ＨＰｆΔＣ２）またはこれらの組合せの使用も提供する。
【００２５】
[00027]本発明は、肥満、セルライト、潰瘍を伴う下肢静脈瘤、下体肢浮腫、静脈瘤、皮膚変色、静脈性湿疹、強皮症、炎症性血栓、皮膚潰瘍または慢性疼痛を処置するための調製物の製造におけるＨＳＰ９０ａ、ＨＰｆポリペプチドもしくはその断片（ＨＰｆΔＣ１、ＨＰｆΔＣ２）またはこれらの組合せの使用も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】[00028]  図１は、内因性ＨＳＰ９０ａポリペプチドの三（３）つの断片、すなわちＨＰｆという名称の１１５アミノ酸断片（Ｇｌｕ２３６ａａ〜Ａｓｐ３５０ａａ）、ＨＰｆΔＣ１という名称の１０１アミノ酸断片（Ｇｌｕ２３６〜Ｇｌｕ３３６）およびＨＰｆΔ２という名称の８７アミノ酸断片（Ｇｌｕ２３６〜Ａｓｐ３２２）、の配列を示す。ＨＰｆおよびＨＰｆΔＣ２を本調製物／製剤の活性成分として使用する。
【図２−１】[00029]  図２−１は、ＨＰｆ（Ａ）と融合パートナーチオレドキシンＡ（ＴＲＸ）の組換え融合タンパク質構築物であって、ＨＰｆの容易な切断および精製のために必要とされるヒドロキシルアミンおよびＴＥＶプロテアーゼ認識部位がその２つの間にそれぞれ挿入されている組換え融合タンパク質構築物、ＴＲＸ（ＮＧｃ）−ＨＰｆ（Ｂ）およびＴＲＸ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆ（Ｃ）を示す図である。
【図２−２】図２−２は、ＨＰｆΔＣ１（Ａ）、ＴＲＸ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆΔＣ１（Ｂ）、ＨＰｆΔＣ２（Ｃ）およびＴＲＸ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆΔＣ２（Ｄ）の構造を示す図である。ＨＰｆΔＣ１またはＨＰｆΔＣ２とカップリングされるＴＲＸの後にＴＥＶプロテアーゼ認識部位を挿入して、融合タンパク質の切断およびＨＰｆΔＣ１またはＨＰｆΔＣ２の精製を促進した。
【図２−３】図２−３は、Ｈｉｓｘ６を含む融合パートナーマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）とＴＥＶの組換え融合タンパク質構築物、ＭＢＰ（ＴＥＶｃ）−Ｈｉｓ−ＴＥＶ（Ａ）、およびＨｉｓｘ６のないＭＢＰとＨＰｆの組換え融合構築物、ＭＢＰ（ＴＥＶｃ）−Ｈｐｆ（Ｂ）を示す図である。各融合構築物間に挿入されたＴＥＶプロテアーゼ認識部位は、ＴＥＶまたはＨＰｆの容易な切断および精製に必要とされる。
【図２−４】図２−４は、ＨＰｆと融合パートナーヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）の組換え融合タンパク質構築物であって、ＨＰｆの容易な切断および精製に必要とされるＴＥＶプロテアーゼ認識部位がその２つの間に挿入されている組換え融合タンパク質、ＨＧＨ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆを示す図である。
【図２−５】図２−５は、ＨＳＰ９０ａ遺伝子をクローニングするために使用したプライマーの位置（Ｂ）および前記プライマーによって増幅されたＰＣＲ産物の結果（Ａ）を示す図である。
【図３−１】[00030]  図３−１は、組換えタンパク質ＨＰｆ、ＴＲＸ（ＮＧｃ）−ＨＰｆおよびＴＲＸ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆであって、それらの組換え発現ベクターによって生産されたものである組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果の図である。組換え発現ベクター構築物をＲＺ４５００、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙＳおよびＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）細胞系において発現させて、これらの発現ベクター構築物の発現レベルを定量した。
【図３−２】図３−２は、ＨＰｆΔＣ２、ＴＲＸ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆΔＣ１およびＴＲＸ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆΔＣ２に関する小規模（５ｍｌ）タンパク質発現実験のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果の図である。
【図３−３】図３−３は、組換えタンパク質ＭＢＰ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆであって、その組換え発現ベクターの発現によって生産されたものである組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果の図である。
【図３−４】図３−４は、組換えタンパク質ＨＧＨ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆであって、その組換え発現ベクターの発現によって生産されたものである組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果の図である。
【図３−５】図３−５は、ＨＳＰ９０ａ発現ベクターにより形質転換された大腸菌（ｅ．ｃｏｌｉ）細胞によって生産されたＨＳＰ９０ａタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果の図である。
【図４Ａ】[00031  ]図４Ａは、ＴＲＸ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆ融合タンパク質（１．対照、２．ＨＰｆ、３．対照、４．ＴＲＸ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆ）でのＨＰｆペプチド生産の結果のゲルの図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＨＧＨ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆ融合構築物（１．ＨＰｆ、ＨＧＨ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆ、３．完全ＨＳＰ９０ａタンパク質）でのＨＰｆペプチド生産の結果のゲルの図である。
【図５Ａ】[00032]  図５Ａは、タンパク質を調製するための大規模発酵（５０リットル）におけるＴＲＸ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆ融合タンパク質生産の漸増培養時間に伴う変化を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、溶存酸素の変化を示す図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ｐＨの変化を示す図である（５Ｃ）。
【図５Ｄ】図５Ｄは、光学密度の変化を示す図である。
【図６】[00033]  図６は、組換えＴＲＸ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆ融合タンパク質からのＨＰｆの単離、封入体としての分離、および付加させたＴＥＶの量に依存するそのＴＥＶ切断効率の結果を実証する図である。１．タンパク質マーカー、２．コンピテント細胞（陰性対照）、３．全細胞溶解物、４．均質化後の上清画分、５．超音波処理後のペレット（封入体）、６．ペレットの洗浄溶液、７．可溶化された封入体。８〜１１．可溶化された封入体＋ＴＥＶプロテアーゼ。
【図７Ａ】[00034]  図７Ａは、精製されたＨＰｆの純度が確認されるＨＰＬＣの結果の図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、精製されたＨＰｆの純度が確認されるＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である。
【図８】[00035]  図８は、ＨＰｆタンパク質についての、ＨＳＰ９０ａとのそのａａ配列同一性が確認される、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を記載する図である。
【図９−１】[00036]  図９−１は、精製されたＨＰｆ１についての、その精製中に形成された異なるＨＰｆ１凝集物の質量、サイズおよび数を推定する、ＥＬＳおよびＧＦＣ分析結果の図である。図９−１（Ａ）は、光散乱強度分布（ＩＳ）を示す図である。図９−１（Ｂ）は、重量換算分布（ＷＴ）を示す図である。図９−１（Ｃ）は、個数換算分布（ＮＯ）を示す図である。図９−１（Ｄ）は、ＧＦＣ（ゲル濾過クロマトグラフィー）プロファイルを示す図である。
【図９−２】図９−２は、ＴＥＭ電子顕微鏡写真（ＥＦ−ＴＥＭ；エネルギーフィルタ型透過型電子顕微鏡、ＫＢＳＩ、Ｋｏｒｅａ）を使用するＨＰｆの粒径分析の図である。
【図１０Ａ】[00037]  図１０Ａ−１は、ケラチノサイト細胞系（ＨａＣａＴ）の２４時間インキュベーション生存率に対する様々なＨＰｆ濃度の効果を示す図である。図１０Ａ−２は、胚性線維芽細胞（ＨＥＦ）の２４時間インキュベーション生存率に対する様々なＨＰｆ濃度の効果を示す図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂ−１は、胚性線維芽細胞（ＨＥＦ）の４８時間インキュベーション生存率に対する様々なＨＰｆ濃度の効果を示す図である。図１０Ｂ−２は、胚性線維芽細胞（ＨＥＦ）の１２０時間インキュベーション生存率に対する様々なＨＰｆ濃度の効果を示す図である。図１０Ｂ−３は、胚性線維芽細胞（ＨＥＦ）の１６８時間インキュベーション生存率に対する様々なＨＰｆ濃度の効果を示す図である。
【図１１Ａ】[00038]  図１１Ａは、温度および保存時間を変動させながらゲル状態で保持したＨＰｆタンパク質の安定性を示す図である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、温度および保存時間を変動させながら緩衝溶液状態で保持したＨＰｆタンパク質の安定性を示す図である。
【図１２】[00039]  図１２は、β−ヘキソアミニダーゼ分泌活性によって測定してＲＢＬ−２Ｈ３細胞系における脱顆粒を阻害するＨＰｆの能力を実証する図である。
【図１３Ａ】[00040]  図１３Ａは、タイムラインおよび検査したＨＰｆ処置を示す図である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂ−１は、ＤＮＦＢなしでのアトピー性皮膚炎の状態を示す図である。図１３Ｂ−２は、ＤＮＦＢのみでのアトピー性皮膚炎の状態を示す図である。図１３Ｂ−３は、ＤＮＦＢ＋対照でのアトピー性皮膚炎の状態を示す図である。図１３Ｂ−４は、ＮＣ／Ｎｇａマウス皮膚にＤＮＦＢを塗布することによって誘導した創傷に対するＨＰｆの局所投与によって改善されたアトピー性皮膚炎の状態を示す（ｄｈｏｗｓ）図である。
【図１４Ａ】[00041]  図１４Ａ−１は、無処置での皮膚組織構造の変化を実証する図である。図１４Ａ−２は、ＤＮＦＢのみによる処置での皮膚組織構造の変化を実証する図である。図１４Ａ−３は、ＤＮＦＢ＋対照−１での皮膚組織構造の変化を実証する図である。図１４Ａ−４は、ＤＮＦＢ＋ＨＰｆ−１処置での皮膚組織構造の変化を実証する図である。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、別の対応する組織標本（ｈｙｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ）セットでの同じ結果を単に示す図である。ＮＣ／Ｎｇａマウス皮膚にＤＮＦＢを塗布することによって誘導した創傷にＨＰｆを局所塗布した。
【図１５Ａ】[00042]  図１５Ａは、表皮細胞系（ＨａＣａＴ）（ケラチノサイト）におけるＫＲＴ１０（ケラチン１０）、ＴＧＭ１（トランスグルタミナーゼ１）またはＩＶＬ（インボルクリン）遺伝子の発現レベルを示す図である。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ＨＰｆまたはＰＢＳ（対照）で処置した真皮細胞系（ＣＣＤ９８６−ｓｋ）（線維芽細胞）におけるＫＲＴ１０、ＴＧＭ１またはＩＶＬ遺伝子の発現レベルを示す図である。皮膚表皮幹細胞分化の過程で、ケラチノサイトはケラチン１０、トランスグルタミナーゼ１およびインボルクリンに関連した遺伝子の発現を増加させる。それ故、ケラチノサイト細胞における細胞分化度を表すマーカーとしてＫＲＴ１０、ＴＧＭ１またはＩＶＬ遺伝子を使用する。
【図１６Ａ】[00043]  図１６Ａは、レッドＯ染色によって確認された皮下脂肪細胞分化に対するＨＰｆの効果を示す図である。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、その効果のグラフ表示を示す図である。
【図１７Ａ】[00044]  図１７Ａ（Ｃ−１、Ｃ−２、Ｃ−３）は、対照についての図である。
【図１７Ｂ】図１７Ｂ（Ｈ−１、Ｈ−２、Ｈ−３、Ｈ−４）は、ヒト人工皮膚へのＨＰｆ局所塗布についての図である。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、ＨＰｆ局所塗布がヒト人工皮膚の構造における真皮層の肥厚を促進することを示すグラフの図である。
【図１８Ａ】[00045]  図１８Ａは、１００μｇ／ｍｌ  ＨＰｆの塗布後の細胞生存率についての図である。ＨＰｆは細胞生存率に影響を及ぼさない。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、１００μｇ／ｍｌ  ＨＰｆの塗布後のメラニン含有量についての図である。ＨＰｆはメラニン生合成を阻害する。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
[00046]本発明者らは、インビボで強力な薬理活性を有する局所用リポソーム封入ＨＰｆポリペプチドおよびＨＰｆポリペプチド断片組成物の同定および製造に関する本発明の研究を行ってきた。これらの局所用調製物は、配列番号１のアミノ酸によってコードされるポリペプチドまたはその断片を活性成分として含む。前記組成物の薬理活性としては、アトピー性皮膚炎、シワ、シミを含む皮膚状態の改善、肌のハリの改善、および肌の若返り、ならびに創傷治癒の増進が挙げられる。加えて、前記組成物が皮下脂肪細胞分化（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｆａｔ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を阻害することおよび皮下脂肪の蓄積を抑制することも実証する。
【００２８】
[00047]用語「ヒト熱ショックタンパク質９０ａ断片」または「ＨＳＰ９０ａ断片」は、部分配列が生化学的またはＤＮＡ組換え技法によって除去されたＨＳＰ９０ａを表す。ＨＳＰ９０ａのポリペプチド断片を本明細書ではＨＰｆと記載する。ＨＰｆは、内因性ＨＳＰ９０ａの１１５アミノ酸断片であり、「リンカー」領域を含むアミノ酸（ａａ）２３６からａａ３５０にわたる配列によってコードされる（図１参照）。ＨＰｆΔＣ１は、ＨＳＰ９０ａの完全アミノ酸配列（配列番号２）のａａ２３６からａａ３３６にわたる配列によってコードされる内因性ＨＳＰ９０ａの１０１アミノ酸断片であり、ＨＰｆΔＣ２は、ａａ２３６からａａ３２２にわたる配列によってコードされる内因性ＨＳＰ９０ａの８７アミノ酸断片である（図１参照）。
【００２９】
[00048]ＨＰｆタンパク質は図９のＥＬＳおよびＧＦＣ分析によって特性評価して凝集物を形成する非常に強い傾向を示したので、そのａａ配列および３Ｄ構造をＨＰｆ凝集の理由について調査し、本発明者らは、この凝集問題を克服する方法を考案しようと努めた。本発明者らは、ＨＰｆ中のａａ配列の疎水性ストレッチがこの凝集の原因ではないかと推測した。それ故、ＨＰｆの疎水性ストレッチを削除した２つの他の構築物、ＨＰｆΔＣ１およびＨＰｆΔＣ２、を設計し、新規ポリペプチドを提示した。結果として得たＨＰｆΔＣ１およびＨＰｆΔＣ２は、ＨＰｆよりはるかに良好な凝集プロファイルを示し、したがってＨＰｆΔＣ１またはＨＰｆΔＣ２のほうが分離および精製面でＨＰｆより有利であった。ＨＰｆΔＣ１およびＨＰＦΔＣ２各々の過発現を試みると、ＨＰｆΔＣ１構築物は可溶性ＨＰｆΔＣ１タンパク質形態を示し、その一方でＨＰｆΔＣ２は封入体形態を示した。分離収量を増加させ、精製効率を促進させるために、最小断片ＨＰｆΔＣ２をさらなる研究に選択した。驚くべきことに、ＨＰｆΔＣ２ポリペプチドは、ＨＰｆと少なくとも同様の活性であること、およびいくつかのパラメーターに関してはＨＰｆより活性が高いことさえあることが判明した。
【００３０】
[00049]ＨＰｆおよびＨＰｆΔＣ２の生化学的／生物学的特性は、次の３つの要因に基づいて判定することができる：１）ＨＰｆまたはＨＰｆΔＣ２との９０％を超えるアミノ酸配列同一性、２）内因性ＨＳＰ９０ａの受容体または他の結合タンパク質に対する各断片の結合、および３）ＨＰｆまたはＨＰｆΔＣ２の生物学的活性。
【００３１】
[00050]いくつかの実施形態によると、本発明による組成物は、リン脂質またはリポソーム組成物であり、好ましくはリポソームまたはナノリポソーム組成物である。いくつかの実施形態では、（配列番号１によってコードされる）ＨＰｆをリポソームまたはナノリポソームに封入し、皮膚に塗布する。いくつかの実施形態によると、本発明の組成物は、局所投与用に製剤化されたナノリポソーム組成物である。
【００３２】
[00051]本明細書において用いる場合、用語「ナノリポソーム」は、従来のリポソームの形態および２０〜１０００ｎｍの平均粒子径を有するリポソームを指す。いくつかの実施形態によると、ナノリポソームの平均粒子径は、５０〜５００ｎｍ、さらに好ましくは５０〜３５０ｎｍ、および最も好ましくは１００〜２５０ｎｍである。
【００３３】
[00052]本明細書において用いる場合、用語「リポソーム」は、互いに会合している複数のコロイド粒子の球状リン脂質小胞を指し、リポソームは、水溶性頭部（親水性基）と水不溶性尾部（疎水性基）を各々が有する両親媒性分子から構成され、それらの間の相互作用に起因する自然発生的結合によって整列された構造を示す。リポソームは、そのサイズおよびラメラリティに従って、ＳＵＶ（小型単層小胞）、ＬＵＶ（大型単層小胞）およびＭＬＶ（多層小胞）に分類される。上に記載したような様々なラメラリティを示すリポソームは、細胞膜に類似した二重膜構造を有する。
【００３４】
[00053]本発明のナノリポソームおよびリポソームは、リン脂質、ポリオール、界面活性剤、脂肪酸、塩および／または水を使用して調製することができる。
[00054]リポソームおよびナノリポソームの調製に使用する成分であるリン脂質を両親媒性脂質として使用する。例として、そのような両親媒性脂質としては天然リン脂質（例えば、卵黄レシチン、大豆レシチン、およびスフィンゴミエリン）および合成リン脂質（例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリンまたは水添レシチン）が挙げられ、レシチンが好ましい。さらに好ましくは、前記レシチンは、大豆または卵黄から抽出された天然由来の不飽和または飽和レシチンである。
【００３５】
[00055]本発明のナノリポソームの調製に使用することができるポリオールは特に限定されず、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、メチルプロパンジオール、イソプレングリコール、ペンチレングリコール、エリトリトール、キシリトールおよびソルビトールを含み得る。
【００３６】
[00056]本発明のナノリポソームの調製に使用することができる界面活性剤は、当技術分野において公知のいずれの界面活性剤であってもよく、それらの例としては、アニオン性界面活性剤（例えば、アルキルアシルグルタマート、アルキルホスファート、アルキルラクタート、ジアルキルホスファートおよびトリアルキルホスファート）、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤および非イオン性界面活性剤（例えば、アルコキシ化アルキルエーテル、アルコキシ化アルキルエステル、アルキルポリグリコシド、ポリグリセリルエステルおよび糖エステル）が挙げられる。
【００３７】
[00057]本発明のナノリポソームの調製に使用することができる脂肪酸は、高級脂肪酸、好ましくは、Ｃ１２〜２２アルキル鎖を有する飽和または不飽和脂肪酸であり、それらの例としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸およびリノール酸が挙げられる。
【００３８】
[00058]本発明のナノリポソームの調製に使用する水は、一般に脱イオン蒸留水である。
[00059]いくつかの実施形態によると、本発明のナノリポソームは、下の実施例において詳細に説明するように、リン脂質、塩および水のみで調製する。
【００３９】
[00060]いくつかの実施形態によると、ＨＰｆ含有ナノリポソームは、（ａ）ＨＰｆを含有する塩の緩衝水溶液にリポソームを形成できるリン脂質（好ましくは、黄色卵黄レシチンまたは大豆レシチン）を溶解し、そして（ｂ）ＨＰｆとリン脂質とを含有する前記水溶液を高圧ホモジナイザーに通し、この間、通す回数が増すにつれて前記リン脂質の含有量および前記高圧ホモジナイザーの圧力を徐々に増加させ、そのようにしてＨＰｆ含有ナノリポソームを調製する、ステップを含む製法によって調製する。
【００４０】
[00061]ＨＰｆを含有する水溶液は、好ましくは６〜８、さらに好ましくは約７のｐＨを有する緩衝溶液、例えばリン酸ナトリウム緩衝溶液である。リン酸ナトリウム緩衝溶液を使用する場合、その濃度は、好ましくは５〜１００ｍＭ、さらに好ましくは５〜６０ｍＭ、さらにより好ましくは１０〜３０ｍＭ、および最も好ましくは約２０ｍＭである。
【００４１】
[00062]リン脂質とＨＰｆ含有水溶液の混合物を高圧ホモジナイザーに数回通し、このとき、通す回数が増すにつれてリン脂質の量およびホモジナイザーの圧力を徐々に増加させる。本発明の好ましい実施形態によると、ホモジナイザーの圧力を０〜１０００ｂａｒに、好ましくは０〜８００ｂａｒに徐々に増加させる。圧力を各サイクルで５０ｂａｒまたは１００ｂａｒ、好ましくは１００ｂａｒ増加させてもよい。本発明の好ましい実施形態によると、リン脂質の量を各サイクルで５〜４０ｗ／ｖ（％）、さらに好ましくは５〜３０ｗ／ｖ（％）に徐々に増加させる。リン脂質含有量および圧力の漸増を含むこの高圧均質化法によって、ＨＰｆ含有ナノリポソームを調製し、好ましくは液体ＨＰｆ含有ナノリポソームを調製する。
【００４２】
[00063]本発明がアトピー性皮膚炎の処置に有効であることを本明細書の中で示す。いずれの特定の理論または作用機序にも限定されることを望まないが、この効果は、アトピー性皮膚炎に旧来使用されている抗ヒスタミン剤またはステロイド剤含有組成物が免疫機能の抑制のみによって作用し、創傷治癒活性がないのに対して、影響された領域周囲の免疫機能を抑制し、同時に創傷を治癒させる結果であり得ると考えられる。
【００４３】
[00064]本発明の組成物が様々な他の皮膚状態の改善をもたらすことも示す。例えば、本組成物は、シワ、シミを含む様々は皮膚状態の有効な処置、肌のハリの改善、肌老化の低減、および肌の潤いの改善をもたらす。
【００４４】
[00065]さらに、本発明の組成物は、皮下脂肪細胞分化の抑制に有効であり、それ故、皮下脂肪蓄積の低減に有効である。したがって、本発明のリポソーム封入ＨＰｆは、肥満、および付随する難事、例えば、セルライト、潰瘍を伴う下肢静脈瘤、静脈瘤に起因する下肢浮腫、皮膚変色、静脈性湿疹、強皮症、炎症性血栓、皮膚潰瘍、慢性疼痛、下肢機能障害、または肥満に起因する上記症状の任意に組合せの処置に有効である。
【００４５】
[00066]本組成物を化粧料組成物または医薬組成物として提供してもよい。したがって、活性および有効成分は、ＨＰｆおよび封入するナノリポソームに加えて、化粧品の調製に一般に使用される組成物、例えば安定剤、乳化剤、ビタミン、着色剤、香料、助剤、ならびに担体、またはこれらのうちのいずれかのものの組合せを含む。この製品をリポＨＳＰ９０ａと呼ぶ。
【００４６】
[00067]皮膚状態を改善するための本発明の化粧料組成物は、例えば溶液、懸濁液、エマルジョン、ペースト、軟膏、ゲル、クリーム、ローション、粉末、石鹸、界面活性剤含有クレンザー、オイル、パウダーファンデーション、エマルジョンファンデーション、ワックスファンデーションおよびスプレーを含む多種多様な形態で製剤化してもよい。
【００４７】
[00068]本化粧料組成物に含有される化粧料的に許容される担体は、製剤のタイプに依存して様々であり得る。例えば、軟膏、ペースト、クリームまたはゲルの製剤は、動物および植物脂肪、蝋、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルク、酸化亜鉛またはこれらの物質の混合物を含み得る粉末またはスプレーの製剤において、その製剤は、ラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、ポリアミド粉末およびこれらの物質の混合物を含み得る。スプレーは、通常の噴射剤、例えばクロロフルオロ炭化水素、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルをさらに含み得る。
【００４８】
[00069]溶液およびエマルジョンの製剤は、溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコール、油、特に綿実油、落花生油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ種子油、グリセロール脂肪エステル、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、またはこれらの物質の混合物を含み得る。懸濁液の製剤は、液体希釈剤、例えば水、エタノールもしくはプロピレングリコール、懸濁化剤、例えばエトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステルおよびポリオキシエチレンソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、またはこれらの物質の混合物を含み得る。
【００４９】
[00070]石鹸の製剤は、脂肪酸のアルカリ金属塩、脂肪酸ヘミエステルの塩、脂肪酸タンパク質加水分解物、イソチオナート、ラノリン、脂肪アルコール、植物油、グリセロール、糖、またはこれらの物質の混合物を含み得る。
【００５０】
[00071]加えて、本発明の化粧料組成物は、助剤ならびに担体を含有し得る。助剤の非限定的な例としては、保存薬、酸化防止剤、安定剤、可溶化剤、ビタミン、着色剤、臭気改良剤、またはこれらの物質の混合物が挙げられる。
【００５１】
[00072]当業者に公知の従来の技法に従って、上に記載したような薬学的に許容される担体および／またはビヒクルを用いて本発明の医薬組成物を製剤化して、単位剤形を含む幾つかの形態を最終的に提供することができる。最も好ましくは医薬組成物は、ナノリポソームを含む溶液である。
【００５２】
[00073]医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含む。許容される担体としては、炭水化物（例えば、ラクトース、アミロース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、セルロース）、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギナート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、塩溶液、アルコール、アラビアゴム、シロップ、植物油（例えば、コーン油、綿実油、ピーナッツ油、オリーブ油、ヤシ油）、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物は、湿潤剤、甘味剤、乳化剤、緩衝剤、懸濁化剤、保存薬、香味料、香料、滑沢剤、安定剤、またはこれらの物質の混合物をさらに含み得る。好適な薬学的に許容される担体および製剤の詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１９版、１９９５）において見つけることができ、この参考文献は参照により本明細書に組み込まれている。
【００５３】
[00074]本発明の医薬組成物は、皮膚への局所投与用に開発したものである。本発明の医薬組成物の的確な投与は、その特定の製剤、塗布の仕方、患者の年齢、体重および性別、食事、投与回数、患者の状態、薬の組合せ、反応感受性および疾患の重症度に従って変更される。通常の技能を有する医師がこの医薬組成物の的確な投与量を容易に決定でき、処方できることが理解される。本発明の好ましい実施形態によると、好適な投与単位は、１日１回、ＨＰｆ  １０ｐｇ／（影響された領域ｃｍ２）〜１ｍｇ／ｃｍ２、１ｎｇ／ｃｍ２〜１０μｇ／ｃｍ２、最も好ましくは１０ｎｇ／ｃｍ２〜１μｇ／ｃｍ２での投与である。
【実施例】
【００５４】
[00075]以下の特定の実施例は、本発明の例示を意図したものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものとみなすべきではない。
実施例１  ＨＳＰ９０ａの断片（ＨＰｆ）の獲得
１−１）ＨＳＰ９０ａ断片（ＨＰｆ）ｃＤＮＡの増幅
[00076]本発明において使用する１１５アミノ酸ポリペプチド（配列番号１）は、ＨＳＰ９０ａ（ＵｎｉＰｒｏｔ  ｉｄ：Ｐ０７９００）の断片であり、その配列は前記内因性タンパク質のアミノ酸（ａａ）番号２３６からａａ番号３５０にわたる。この断片を断片ＨＰｆと呼ぶ。大規模にＨＰｆを生産するために、ＨＰｆ遺伝子をクローニングし、大腸菌において発現させた。
【００５５】
[00077]より具体的には、ヒトｃＤＮＡライブラリーから遺伝子をクローニングするために、ＨＥＫ（ヒト胎児肝臓）２９３細胞系（ＣＲＬ−１５３７、ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）を６ウェルプレートで３日間インキュベートした。培養培地の除去後、ＴＲｉｚｏｌ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）１ｍｌを添加して細胞を溶解し、次いでそれを２００μｌ  クロロホルムと１０秒間の強力ボルテックスによって混合した。その混合物を１２，０００ｘｇ（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４１８、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ＵＳＡ）で１５分間遠心した。上清を回収し、新たなＥチューブに移した後、０．５ｍｌ  イソプロピルを添加し、１２，０００ｘｇで１０分間遠心して全ＲＮＡを沈殿させた。全ＲＮＡを７０％エタノールで１回洗浄し、次いでＲＮＡｓｅおよびＤＮＡｓｅ不含の水に溶解した。このような精製ＲＮＡを使用してｃＤＮＡライブラリーを構築した。Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）をその製造者のマニュアルに提供されている指示に従って使用して、ｃＤＮＡを合成した。先ず、全ＲＮＡ  １μｇ、１Ｘ  ＲＴ緩衝液、ｄＮＴＰミックス、オリゴ−ｄＴプライマー、ＲＮＡｓｅ阻害剤およびＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを混合し、次いでＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ不含水を添加して体積を２０μｌに調整し、次いでそれを３７℃で６０分間インキュベートしてｃＤＮＡライブラリーを得た。そのｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして使用して、クローニングすべき遺伝子をＰＣＲによる増幅によって調製した。このＰＣＲ混合物は、１００μｌの全体積に１Ｘ  ＰＣＲ緩衝液、６．４μｌ  ２．５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス、テンプレート（上で調製したｃＤＮＡ）、０．８μｌ  １００ｐｍｏｌ  プライマーストック（配列番号４および５）および０．４μｌ  プルーフリーディングＴａｑポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ、日本）を含有する。ＰＣＲを、変性のために９５℃で３０秒、アニーリングのために６０°で３０秒、増幅のために７２°で４５秒行い、これを３５サイクル反復してＨＰｆ遺伝子を増幅させた。その後、アガロースゲル電気泳動を用いて産物を分析して、ＨＰｆ遺伝子の増幅を検証した。ＨＰｆヌクレオチド配列は、配列番号３と、配列番号１の配列によるアミノ酸とによってコードされる。
【００５６】
[00078]１−２）組換えＨＰｆタンパク質の調製
[00079]２つのプライマー（配列番号４および配列番号５）を用いる増幅によって調製した、上記実施例手順１−１から得たＨＰｆ  ｃＤＮＡ（配列番号３のｃＤＮＡ）を、制限酵素ＮｄｅｌおよびＫｐｎＩを使用してｐＮＫｍｕｔプラスミド（韓国特許１０−０９８５７４６）にクローニングした（図２−１Ａ）。
【００５７】
[00080]ＨＰｆの安定性および生産を増加させるために、ＴＲＸ（チオレドキシンＡ、ｐＥＴ−３２ａ、Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ、ＵＳＡ）またはＨＧＨ（ヒト成長ホルモン、ＤＮＡ配列番号ＮＭ＿０００５１５．３）をＨＰｆの前に融合させる融合パートナーとして使用してＨＰｆの融合タンパク質を発現させた。
【００５８】
[00081]ＴＲＸとの融合タンパク質からのＨＰｆの精製を促進するために、ヒドロキシルアミン（Ａｓｎ／Ｇｌｙ；Ｎ／Ｇ）またはＴＥＶ（タバコエッチウイルス）のいずれかための切断部位を融合構築物のＴＲＸとＨＰｆの間に挿入した。
【００５９】
[00082]内部ヒドロキシルアミン切断部位を有する、融合パートナーＴＲＸにカップリングしたＨＰｆのキメラ構築物である、融合タンパク質ＴＲＸ（ＮＧｃ）−ＨＰｆを調製するために、プライマー（配列番号８および配列番号９）とｐＥＴ−３２ａ（０．１μｇ）をテンプレートとして使用して上記実施例１−１に従ってＰＣＲを行うことによりＴＲＸ  ＤＮＡ部分ＴＲＸ（ＮＧｃ）（配列番号１８）を得た。同様に、プライマー（配列番号５および配列番号１１）を使用して実施例１−１の場合と同様の手順に従ってＰＣＲを行うことにより、ＨＰｆ  ＤＮＡ部分を得た。ＴＲＸ（ＮＧｃ）とＨＰｆ  ＤＮＡを結合させるために、プライマー（配列番号５および配列番号８）を採用して、ＴＲＸ（ＴＥＶｃ）とＨＰｆの１：１混合物をテンプレートとして使用してＰＣＲを行った。その後のＰＣＲ産物を、ＤＮＡ制限酵素ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩを使用して、発現ベクターｐＮＫｍｕｔ（韓国特許１０−０９８５７４６）にサブクローニングした（図２−１Ｂ）。
【００６０】
[00083]同様に、内部ＴＥＶ切断部位を有する、融合パートナーＴＲＸにカップリングしたＨＰｆのキメラ構築物である、融合タンパク質ＴＲＸ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆを調製するために、プライマー（配列番号８および配列番号１０）とｐＥＴ−３２ａ（０．１μｇ）をテンプレートとして使用して上記実施例１−１に従ってＰＣＲを行うことによりＴＲＸ  ＤＮＡ部分ＴＲＸ（ＴＥＶｃ）（配列番号１９）を得た。同様に、プライマー（配列番号５および配列番号１２）を使用して実施例１−１の場合と同じ手順に従ってＰＣＲを行うことによりＨＰｆ  ＤＮＡ部分を得た。後のクローニング操作を容易にするためにＴＲＸとＨＰｆの間にＢａｍＨＩ制限部位も作成した。ＴＲＸ（ＴＥＶｃ）とＨＰｆ  ＤＮＡを結合させるために、プライマー（配列番号５および配列番号８）を使用して、ＴＲＸ（ＴＥＶｃ）とＨＰｆの１：１混合物をテンプレートとして使用してＰＣＲを行った。その後のＰＣＲ産物を、ＤＮＡ制限酵素ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩを使用して、発現ベクターｐＮＫｍｕｔ（韓国特許１０−０９８５７４６）にサブクローニングした（図２−１Ｃ）。
【００６１】
[00084]形質転換大腸菌細胞においてこのようにして生産されたＴＲＸ（ＮＧｃ）−ＨＰｆまたはＴＲＸ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆ融合タンパク質は、ＴＲＸ融合パートナーなしで生産されたＨＰｆと比較してはるかに大きい発現レベルを示した（図３−１Ａおよび３−１Ｂ）。
【００６２】
[00085]ＨＰＦタンパク質のｃ末端欠失突然変異体−ＨＰｆΔＣ１およびＨＰＦΔＣ２を構築した。ＨＰｆΔＣ１は、ＨＳＰ９０ａタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ：Ｐ０７９０）のＧｌｕ２３６〜Ｇｌｕ３３６を含む合計１０１のアミノ酸からなるＨＳＰ９０ａの断片（ＨＳＰ９０ａの一部）であって、ＨＰｆからカルボキシル末端の１４アミノ酸が削除されたものであるＨＳＰ９０ａ断片（配列番号２０）である。また、ＨＰｆΔＣ２は、（ＨＳＰ９０ａの）Ｇｌｕ２３６〜Ａｓｐ３２２を含む合計８７のアミノ酸から構成されるＨＳＰ９０ａの断片であって、ＨＰｆの２８のカルボキシル末端アミノ酸がなく、その結果、本発明の最小タンパク質となるＨＳＰ９０ａ断片（配列番号２１）である（図１）。
【００６３】
[00086]ＨＰｆΔＣ１組換えタンパク質を発現させるために、実施例手順１−１から得たＨＰｆ  ｃＤＮＡをテンプレートとしてならびに配列番号４および６をプライマーとして、実施例１−１に記載したＰＣＲ法により使用した。そのようにして配列番号２２と同一の配列を有するＨＰｆΔＣ１遺伝子を得、ＤＮＡ制限酵素ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩを使用してタンパク質発現ベクターｐＮＫｍｕｔ（韓国特許１０−０９８５７４６）にさらにクローニングした（図２−２Ａ）。
【００６４】
[00087]ＴＥＶプロテアーゼ認識部位とカップリングしたチオレドキシンＡから構成されるＴＲＸ（ＴＥＶｃ）−ＨｐｆΔＣ１融合タンパク質をクローニングするために、上の実施例１−１に記載したのと同じＰＣＲ法に従うことによりＨＰｆ  ｃＤＮＡをテンプレートとしてならびに配列番号６および１２をプライマーとして使用してＰＣＲを実行することによってＨＰｆΔＣ１遺伝子を得た。ＴＲＸ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆ融合タンパク質発現プラスミドとＰＣＲによって生産されたＨＰｆΔＣ１遺伝子とをＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ  ＤＮＡ制限酵素によって消化し、次いでＨＰｆΔＣ１を置換によりＨＰｆ遺伝子除去プラスミドにクローニングして、ＨＧＨ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆΔＣ１融合タンパク質発現プラスミドを得た。（図２−２Ｂ）。
【００６５】
[00088]ＨＰｆΔＣ２組換えタンパク質を発現させるために、実施例１−１から得たＨＰｆ  ｃＤＮＡをテンプレートとして使用し、配列番号４および７についてのプライマーを使用して、上の実施例１−１に記載したＰＣＲ法に従うことにより、配列番号２３を有するＨＰｆΔＣ２を得た。このようにして得た、結果として生じたＰＣＲ産物を、ＤＮＡ制限酵素ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩを使用してタンパク質発現ベクターｐＮＫｍｕｔ（韓国特許１０−０９８５７４６）にクローニングした。（図２−２Ｃ）。
【００６６】
[00089]ＴＥＶプロテアーゼ認識部位とカップリングしたチオレドキシンＡから構成されるＴＲＸ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆΔＣ２融合タンパク質をクローニングするために、上の実施例１−１に記載したのと同じＰＣＲ法に従うことにより実施例１−１で得たＨＰｆ  ｃＤＮＡをテンプレートとしてならびに配列番号７および１２をプライマーとして使用してＰＣＲを実行することによってＨＰｆΔＣ２遺伝子を得た。ＴＲＸ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆ融合タンパク質発現プラスミドとＰＣＲによって生産されたＨＰｆΔＣ２遺伝子とをＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ  ＤＮＡ制限酵素によって消化し、次いでＨＰｆΔＣ２を置換によりＨＰｆ遺伝子除去プラスミドにクローニングして、ＨＧＨ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆΔＣ２融合タンパク質発現プラスミドを得た。（図２−２Ｄ）。
【００６７】
[00090]ＴＲＸ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆΔＣ１およびＴＲＸ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆΔＣ２を大規模発酵のために大腸菌株に形質転換し、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用することによりそれらそれぞれのタンパク質発現を判定した。意外にも、これら２つのより小さいバージョンのタンパク質、ＨＰｆΔＣ１およびＨＰＦΔＣ２は細胞質において可溶性タンパク質形態として発現されたが、すべてのＨＰｆ含有融合タンパク質は封入体形態として発現される（図３−２Ｃ）。
【００６８】
[00091]すべてのＰＣＲ手順に使用したプライマーを下の表１に列挙される。
【００６９】
【表１】
0006516742.tif 000002
【００７０】
[00092]ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）融合パートナーにカップリングした融合タンパク質としてＨＰｆおよびＨＰｆΔＣ２を発現させるために、Ｐａｕｌら（２００７）（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ、ＵＳＡ）において参照した通りにＭＢＰ−ＴＥＶ融合構築物を合成した。発現させるべき他の遺伝子を有するＭＢＰのクローニングを促進するために、ＭＢＰ遺伝子〜ＴＥＶ遺伝子の始点、終点および間にそれぞれＤＮＡ制限酵素部位ＮｄｅＩ、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩを導入することによってＭＢＰ−ＴＥＶを修飾した（図２−３Ａ）。
【００７１】
[00093]修飾されたＭＢＰ−ＴＥＶ遺伝子をタンパク質発現ベクターｐＮＫｍｕｔ（韓国特許１０−０９８５７４６）プラスミドに、ＤＮＡ制限酵素ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩを使用することによってクローニングした。
【００７２】
[00094]ｐＮＫｍｕｔプラスミド含有ＭＢＰ−ＴＥＶ融合構築物を回収し、ＤＮＡ制限酵素ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩによって消化して内部ＴＥＶ遺伝子を除去した。その一方で、配列番号５および１２をプライマーとして使用して、上で実施例１−１に記載したＰＣＲ法に従うことにより、ＨＰｆ遺伝子を得た。そのようにして得たＨＰｆ遺伝子をＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩによって消化し、次いでＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ消化ｐＮＫｍｕｔプラスミド含有ＢＭＰに挿入して、配列番号２４と同一の配列を有するＭＢＰ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆ融合タンパク質発現プラスミドを得た（図２−３Ｂ）。
【００７３】
[00095]ＴＥＶ認識部位を使用することにより、ＭＢＰおよびそのカップリングＨＰｆプラスミドを、大腸菌発酵宿主、ＲＺ４５００（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｋｏｒｅａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓ．Ｋｏｒｅａ）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）およびＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）細胞系に形質転換した。それぞれの形質転換体のＭＢＰ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆ融合タンパク質発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して確認した。結果は、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙＳ形質転換体が大腸菌において最も高いＭＢＰ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆ融合タンパク質発現レベルを示すことを示した。（図３−３）。
【００７４】
[00096]ＨＧＨ（ヒト成長ホルモン）遺伝子にカップリングしたＨＰｆ融合構築物を発現させるために、ＨＧＨ遺伝子（ＤＮＡ配列番号ＮＭ＿０００５１５．３）をテンプレートとしてならびに配列番号１３および１４をプライマーとして使用して、上で実施例１−１に記載したのと同じＰＣＲ法に従うことによってＰＣＲを実行することにより、ＨＧＨ遺伝子を得た。
【００７５】
[00097]ＭＢＰ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆ融合タンパク質発現プラスミドとＰＣＲによって得られたＨＧＨ遺伝子とをＤＮＡ制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩによって消化し、次いでＨＧＨを置換によってＭＢＰ除去プラスミドにクローニングして、配列番号２５と同一の配列を有するＨＧＨ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆ融合タンパク質発現プラスミドを得た（図２−４）。そのクローニングされたＨＧＨ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆ融合タンパク質発現プラスミドを大規模発酵のためにＲＺ４５００大腸菌細胞系（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｋｏｒｅａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓ．Ｋｏｒｅａ）に形質転換した。大量の融合タンパク質が発現されることが観察された（図３−４Ａ）。ＨＧＨ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆ融合タンパク質が大腸菌内で封入体形態として発現されることも確認された（図３−４Ｂ）。
【００７６】
[00098]図３−４Ｂの各ラインについての説明／記載。
１：ＲＺ４５００株（陰性対照群）、２：ＨＧＨ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆ過発現大腸菌株、３：超音波処理によって均質化されたＨＧＨ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆ過発現大腸菌、４．超音波処理によって均質化された大腸菌の遠心からの上清、５：洗浄溶液によって再懸濁された封入体の遠心によって回収された上清。
【００７７】
[00099]完全ＨＳＰ９０ａタンパク質（７３２アミノ酸）の発現を大腸菌において試みた。完全ＨＳＰ９０ａ遺伝子（完全コード領域、ＤＮＡ配列番号ＮＭ＿００１０１７９６３）を含有するＥＳＴ（発現配列タグ、クローンｉｄ：ＩＲＣＭＰ５０１２Ａ０８３４Ｄ）クローンをテンプレートとしてならびに配列番号１６および１７をプライマーとして使用して、上で実施例１−１に記載したのと同じ方法に従うことによってＰＣＲを実行することにより、完全ＨＳＰ９０ａ遺伝子の部分カルボキシ末端断片を得た（図２−５Ａ）。ＤＮＡ制限酵素ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩを使用することにより、その完全ＨＳＰ９０ａの部分カルボキシ末端断片をプラスミドｐＮＫｍｕｔ（韓国特許１０−０９８５７４６）タンパク質発現ベクターにサブクローニングした。完全ＨＳＰ９０ａ遺伝子のサブクローニングを完了するために、ＥＳＴクローンをテンプレートとしてならびに配列番号１５および１６をプライマーとして使用して、上で実施例１−１に記載したのと同じ方法に従うことにより、別のＰＣＲをさらに実行した（図２−５Ａ）。このようにして得たＰＣＲ産物を、ＨＳＰ９０ａのｃ末端部分を含有するプラスミドのＮｄｅＩ  ＤＮＡ制限酵素消化部位に導入し、その結果、配列番号２６と同一のＨＳＰ９０ａ配列をコードする完全ＨＳＰ９０ａタンパク質発現プラスミドの構築物を得た（図２−５Ｂ）。
【００７８】
[000100]これらの配列をＤＮＡシークエンシングを用いて分析して、元のＴＲＸ、ＭＢＰ、ｈＧＨおよびＨＰｆ配列との１００％同一性を確認した。組換えｃＤＮＡ構築物をＲＺ４５００細胞系（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｋｏｒｅａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓ．Ｋｏｒｅａ）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）およびＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）において発現させて形質転換を得、その後、それを５ｍｌ  ＬＢ（ルリア−ベルターニ）培地中、３７℃で１６時間培養した。
【００７９】
[000101]発現されたＨＰｆ、ＴＲＸ（ＮＧｃ）−ＨＰｆ、ＴＲＸ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆ、ＭＢＰ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆおよびｈＧＨ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆのタンパク質量をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、その結果をＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙＳにおけるＴＲＸ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆ遺伝子の卓越した発現によって再確認した。したがって、この形質転換体は組換えＴＲＸ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆ融合タンパク質を大規模に生産することが実証される（図３−１、３−２、３−３、および３−４）。
【００８０】
実施例２  免疫ブロットによる組換えＨＰｆタンパク質の発現の確認。
[000102]実施例１に記載の発現された組換えタンパク質がＨＰｆであるか、およびＨＳＰ９０ａに由来するかをさらに確認するために、免疫ブロットを行った（図４）。
【００８１】
[000103]組換えＨＰｆ、ＴＲＸ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆ、ＨＧＨ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆおよび完全ＨＳＰ９０ａ遺伝子を発現する形質転換体を、アンピシリンを含有する５ｍｌ  ＬＢ培地において３７℃で１６時間振盪することによって培養した。培養物を遠心し、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。得られた電気泳動ゲルを、先ず、１２Ｖで１５０分間、電気泳動によってゲル上のタンパク質をＰＶＤＦフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）に転写することによって分析した。転写が完了したら、フィルターをブロッキング用緩衝液（１０％無脂肪乳および０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０およびＴｒｉｓ食塩水緩衝液）に１時間浸漬して一切の非特異的結合を阻害した。次いで、ＨＰｆ特異的抗体（ウサギ抗ＨＳＰ９０抗体、ＣａｌｂｉｏＣｈｅｍ、ＵＳＡ）を含有する溶液に室温で９０分間、ＰＶＤＦフィルターを浸漬した。そのフィルターを洗浄用緩衝液（０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０およびＴｒｉｓ食塩水緩衝液）中で１０分間、３回洗浄することによって、非特異的結合を除去した。その後、二次抗体、ヤギ抗免疫グロブリン抗体（ＨＲＰ結合型、ＫＯＭＡ、Ｋｏｒｅａ）を反応溶液に添加し、１時間インキュベートした後、フィルターを洗浄用緩衝液で３回洗浄した。化学発光を用いる最終染色によるＬＡＳ−４０００（Ｆｕｊｉ、日本）免疫ブロットの結果によって、発現されたタンパク質がＨＰｆであることを再確認した。図４Ａから分かるように、組換えＨＰｆのみおよび組換えＴＲＸ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆタンパク質は前記抗体によって認識され、それによってそれらの同一性を確認した。ＨＧＨ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆおよび完全ＨＳＰ９０ａ組換えタンパク質も特異的抗体抗ＨＳＰ９０ａによって認識された（図４Ｂ）。
【００８２】
実施例３  ＨＰｆの大規模調製
[000104]上の実施例１に記載のＨＰｆ遺伝子を含有するベクター構築物ＴＲＸ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆで形質転換した宿主細胞系ＲＸ４５００を使用して、この組換えタンパク質の最大発現のための最適条件を決定した。具体的には、上記ＲＺ４５００形質転換体を１リットルフラスコ内で最初は７リットル発酵タンク（ＦＭＴ−０７／Ｃ−Ｂ、Ｆｅｒｍｅｎｔｅｃ、Ｋｏｒｅａ）において培養し、それを最終５０Ｌ発酵タンク（ＦＭＴ−５０、Ｆｅｒｍｅｎｔｅｃ、Ｋｏｒｅａ）まで徐々に大きくした。５０リットル発酵タンクの培養混合物は、下の表２に記載する組成物を含有する。
【００８３】
【表２】
0006516742.tif 000003
【００８４】
[000105]ＴＲＸ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆで形質転換された１ｍｌ  ＲＺ４５００を用いて調製した種培養物（グリセロールストック）を２リットルフラスコ内の５００ｍｌ  ＬＢ培地（ｐＨ７．４）に、ＯＤ６００が０．５〜０．６に達するまで６時間、３７℃で振盪することによって添加した。５０リットル発酵のために、種培養物と培養培地を１：１００の比で混合することにより継代培養物を調製した。
【００８５】
[000106]培養時間が増加するにつれて、５０リットル培養物中の溶存酸素の濃度は徐々に低下した。１５時間後、培養物中に残存する溶存酸素濃度は、種培養物添加直後に測定した濃度の１０％であった（図５）。その時点で１００〜２００ｍｌ加圧滅菌１００％グリセロールを培養物に添加して、宿主細胞の炭素源を補充した。
【００８６】
[000107]１５時間の発酵中、１時間ごとに培養物の一部をサンプリングしてｐＨ、溶存酸素およびＯ．Ｄ．値を分析して、宿主細胞の増殖曲線を決定した（図５）。Ｏ．Ｄ．が３５〜４０に達したとき、発酵を終了した。また、培養物の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびクマシーブリリアントブルーでの染色によって分析した。
【００８７】
[000108]その後、濃度計（Ｔｏｔａｌ  Ｌａｂ  Ｑｕａｎｔ、Ｔｏｔａｌｌａｂ、ＵＳＡ）を使用して濃度を事前に判定したＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）に対して培養物のタンパク質濃度を測定することにより、発現レベルを定量的に判定した。組換えタンパク質の濃度は１ｇ／Ｌであった。
【００８８】
実施例４  ＨＰｆタンパク質の精製および最適化
[000109]大量発酵から採取した組換え細胞を、ホモジナイザーを使用して均質化し、超遠心機（Ｈａｎｉｌ、Ｋｏｒｅａ）を使用して０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で洗浄した。上清を除去した後に沈殿物を回収することによって封入体を採取した。次いでそれを２５ｍＭ  ＮａＯＨに溶解し、１％酢酸で変性させ、遠心した。上清だけを回収して不純物を除去した。これらの精製ステップを通して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブリリアントブルーによる分析のために溶液の一部を除去した。
【００８９】
[000110]図６から分かるように、ＨＰｆは、宿主細胞のサイトゾルではなく封入体中でＴＲＸ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆとして発現された（レーン４および５）。そのタンパク質構造は、ＮａＯＨでの変性および酢酸での再変性中、無傷のままであった（レーン７）。その後、ＴＥＶプロテアーゼを添加し（ＴＲＸ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆ：プロテアーゼ＝１０：１）、４℃で２４時間インキュベートして、ＴＲＸ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆキメラタンパク質からＨＰｆを単離した。レーン８〜１１に示す通りＴＥＶプロテアーゼによるキメラの切断をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。そのＨＰｆタンパク質をゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＦＣ）によって単離した。
【００９０】
[000111]図６の電気泳動結果のレーンは、次のタンパク質を示す：１．マーカータンパク質、２．コンピテント細胞（陰性対照）、３．全細胞溶解物、４．均質化後の上清画分（サイトゾル画分）、５．均質化後に得られたペレット（封入体画分）、６．ペレットを洗浄した後の上清、７．溶解封入体、８〜１１．ＴＥＶプロテアーゼで処置した可溶化封入体。精製されたＨＰｆの純度は、ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判定して９５％より高かった。精製後の収量は、０．１〜０．２ｇ／リットルであると判定した（図７）。
【００９１】
実施例５  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによるＨＰｆの分析
[000112]最終精製ステップからのＨＰｆタンパク質がＨＰＳ９０ａに由来することを保証するために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析（Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＳＴＲ、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を行った。精製されたＨＰｆの電気泳動（図７ｂ）後、ＨＰｆに対応するバンド（ｂｅｎｄ）を鋭利なカミソリでゲルから切り取った。次いでそのゲルを０．１Ｍ（ＮＨ４）ＨＣＯ３溶液に１時間浸漬した。上清を除去した後、ゲルを１時間、０．１Ｍ（ＮＨ４）ＨＣＯ３溶液中の５０％アセトニトリルに、次いで１５分間、１００％アセトニトリルに移した。次いで２５ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３中のタンパク質シークエンシンググレードトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）とそのゲルを１６時間、３７℃で混合することにより、ゲル内トリプシン消化を行った。その後、６０％アセトニトリルを含有する５％ＴＦＡ溶液を添加して反応を停止させ、その混合物を遠心した。上清を回収して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析により分子量を決定した。タンパク質質量データベースを使用するその分析によると、精製されたタンパク質ＨＰｆはＨＳＰ９０ａの断片である（図８）。
【００９２】
実施例６−１  ＨＰｆ粒径の分析
[000113]医薬／化粧料製剤のためのナノリポソーム封入ＨＰｆを調製するために、電気泳動光散乱分光光度計、ＥＬＳ−８０００を使用してＨＰｆ粒径を測定した。
【００９３】
[000114]最終精製ステップからのＨＰｆをリン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．２中、１ｍｇ／ｍｌ（またはより高い濃度）に希釈し、ＥＬＳ８０００を使用して粒子の光散乱強度、重量および数を判定した。図９Ａ〜９Ｃに示すように、粒子の直径はおおよそ１０〜１４ｎｍであると測定された。ＨＰｆモノマーの三次元構造の直径は、ソフトウェアＵＣＳＦ  Ｃｈｅｍｅｒａプログラムを使用する分析に基づきおおよそ４．４ｎｍであった。
【００９４】
[000115]溶液中のモノマーおよびＨＰｆのサイズは、溶液中でオリゴマー化するその傾向のため異なり得るので、溶液中でのそのサイズをゲル濾過クロマトグラフィーによって測定した。ブルーデキストラン（２００ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）直後のＨＰｆのピークを示す結果は、ＨＰｆが溶液中にオリゴマー形態として存在することを示した（図９−１Ｄ）。
【００９５】
実施例６−２  [000116]電子顕微鏡法によるＨＰｆタンパク質サイズ分析
[000117]透過型電子顕微鏡（ＥＦ−ＴＥＭ；エネルギーフィルタ型透過型電子顕微鏡、ＫＢＳＩ、Ｋｏｒｅａ）を使用することにより、ＨＰｆタンパク質粒子のサイズおよび画像を分析した。２．５％グルタルアルデヒドおよび４％パラホルムアルデヒド溶液を使用することによって第一の固定プロセスを完了し、それをリン酸緩衝溶液で洗浄した。次いで、１％四酸化オスミウムと共に使用して第二の固定プロセスを行い、６０％エタノールを用いて開始し、昇順で７０％、８０％、９０％、９５％および１００％エタノールを用いる脱水ステップに付した。エポキシ樹脂での包埋後、サンプル切片を薄いマイクロスライサーによって作製した。切片プラットフォーム用のグリッドを用意し、電子染色ステップ後にサンプルを観察した（図９−２）。
【００９６】
実施例７  皮膚細胞系を使用するＨＰｆの安全性評価
[000118]ＨＰｆがヒトへの適用に安全であるかどうかを判定するために、ヒト表皮細胞系（ＨａＣａＴ）（Ｓｃｈｏｏｐ、Ｖｅｒｏｎｉｋａ  Ｍ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ．、１１２（３）：３４３−３５３、１９９９）および真皮細胞系（ＨＥＦ）（ＣＲＬ−７０３９、ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）をＨＰｆと共にインキュベートした。毒性を試験するために使用したＨＰｆの濃度は、Ｒｅｇｅｒｏｎ  Ｉｎｃ．によって製造および販売されている化粧品に使用されている表皮増殖因子の濃度（Ｃｌａｉｒｅｓｏｍｅ−ＥＦ製品ラインに使用されている１〜１０μｇ／ｍｌ  ＥＧＦ）より１０〜１００倍高かった。具体的には、９６ウェルプレートに各細胞系の２〜１０ｘ１０３細胞をプレーティングし、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清アルブミン、Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳＡ）を含有するＤＭＥＭ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳＡ）で培養した。次いでＨＰｆを各細胞に０、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、０．５、１、５、５０および１００μｇ／ｍｌの濃度で添加し、そのプレートをＣＯ２インキュベーター内で１週間、３７℃でインキュベートした。１０μｌ  培養培地を５ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）と混合し、ＣＯ２インキュベーター内で４時間、３７℃でインキュベートすることによって、細胞の増殖率（％）を判定した。不溶性ＭＴＴ沈殿を１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．１Ｎ  ＨＣｌに溶解した後、分光光度計、ｓｐｅｃｔｒａ  ＭＡＸ  １９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳＡ）を使用して５９５ｎｍでＯ．Ｄ．を測定した。１００  ｇ／ｍｌのＨＰｆと混合した細胞は、２４時間のインキュベーション後に９０％生存率（図１０Ａ）、７日インキュベーション後に８５％生存率（図１０Ｂ）を維持していた。これらの結果は、ＨＰｆを化粧料成分または医薬成分として安全に使用できることを示した。
【００９７】
実施例８  水溶液中でのＨＰｆの安定性
[000119]水溶液中でのＨＰｆの物理的／化学的不安定性および生物活性喪失を防止する方法を見つけるために、ｐＨ７．２リン酸緩衝溶液に溶解したときのまたはゲル状態で保持したときのＨＰｆの安定性を測定した。この分析に使用したゲルは、下記の化合物を混合することによって調製した。ＨＰｆタンパク質の安定性に影響を及ぼす一切の潜在的干渉因子を排除するように注意した。
【００９８】
【表３】
0006516742.tif 000004
【００９９】
[000120]安定性を次のように評価した：先ず、ＨＰｆをリン酸緩衝液中１０μｇ／ｍｌに、またはゲル状態での試験時には１ｍｇ／ｍｌに希釈した。その溶液またはゲルを４℃または３７℃で１カ月間放置した。実験初日から３、７、１４および３０日目に回収したサンプルに関して、クマシーブリリアントブルーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してタンパク質の量および／または変性を分析した。タンパク質安定性は、濃度計（ＴｏｔａｌＬａｂＱｕａｎｔ、Ｔｏｔａｌｌａｂ、ＵＳＡ）を使用して測定した。図１１から分かるように、ＨＰｆは、リン酸緩衝液中またはゲル状態で４℃および３７℃で１カ月間保持している間、一貫して安定していた。
【０１００】
実施例９  細胞系モデルを使用するアトピー性皮膚炎の処置に対するＨＰｆの有効性（脱顆粒を抑制することによるＨＰｆの抗炎症効果）の評価
[000121]ＩｇＥによって媒介される肥満細胞の脱顆粒は、アトピー性皮膚炎の典型的な症状の１つである。ＨＰｆの抗炎症効果を評価するために、脱顆粒のバイオマーカーであるβヘキソサミニダーゼ（ｈｅｘｏｓａｍｉｎａｓｅ）の分泌を阻害するその活性を、好塩基性細胞系ＲＢＬ−２Ｈ３（ＣＲＬ−２２５６、ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）を使用して測定した。先ず、２．５ｘ１０５個のＲＢＬ−２Ｈ３細胞を４８ウェルプレートの各ウェルにプレーティングし、ＣＯ２インキュベーター内で３時間、３７℃でインキュベートした。ＩｇＥを１．０μｇ／ｍｌまで添加することにより細胞を感作し、２４時間インキュベートした。次いで、細胞をＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水）で４回洗浄することにより未結合ＩｇＧを除去した。次いで、８００〜１０００ｎｇ／２，４−ジニトロフェニルハプテン−ヒト血清アルブミン（ＤＮＰ−ＨＳＡ、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）での処置により細胞を刺激した。次いで、５０  ｌの上清を、１ｍＭ  ｐ−ニトロフェニルＮ−アセチル−β−グルコサミンを含有する２００  ｌの０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）と混合し、１時間放置した。５００  ｌの０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）を添加することにより反応を停止させた。分光光度計を使用して４０５ｎｍでＯ．Ｄを測定した。結果は、１００μｇ／ｍｌ  ＨＰｆが、その阻害効果を（ＰＢＳで処置した）対照のものと比較したとき、βヘキソサミニダーゼ（ｈｅｘｏｓａｍｉｎａｓｅ）の分泌を６０％阻害することを明示した（図１２）。これは、ＨＰｆがβヘキソサミニダーゼ（ｈｅｘｏｓａｍｉｎａｓｅ）分泌の阻害によって脱顆粒を抑制することによりアトピー性皮膚炎の症状を有意に改善できることを示す。
【０１０１】
実施例１０  動物モデルを使用するアトピー性皮膚炎の処置に対するＨＰｆの有効性の評価
１０−１）創傷治癒に対する効果
[000122]１５０μｌの０．１５％２，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）（アセトン：オリーブ油＝３：１に溶解したもの）を週１回、４週間にわたって局所投与することにより、ＮＣ／Ｎｇａマウスの皮膚にアトピー性皮膚炎を誘導した。ＨＰｆの創傷治癒効果を次のように判定した：先ず、マウスを２群に分け、一方の群は１００μｌ  ＨＰｆの局所投与を週３回、４週間にわたって受け、これに対して対照群はＨＰｆを受けなかった。（処置計画については図１３Ａを参照されたい）。皮膚損傷（創傷）度は肉眼で判定した（図１３Ｂ）が、炎症細胞の浸潤およびそれらの回復は、真皮組織染色によって測定した（図１４）。局所投与に使用したＨＰｆを含有するまたは含有しない組成物は、塗布領域でのＨＰｆ停留を保持するためにゲルとして調製した。
【０１０２】
【表４】
0006516742.tif 000005
【０１０３】
[000123]動物試験期間を通して、ＤＮＦＢによって誘導される皮膚疾患は、アトピー性皮膚炎を除いて発症しなかった。Ｎｃ／Ｎｇａマウスの皮を剥がれた背部へのＤＮＦＢの局所投与は、創傷による角質層分離および炎症を誘導した（図１３Ｂ−２）。４週間の処置後、処置群、すなわちＤＮＦＢ＋ＨＰｆを受けた群、の皮膚（図１３Ｂ−４）は、角化症のわずかな痕跡があり創傷は殆どないように見えたが、対照群は、炎症および重篤な角化症の目に見える徴候が残る重篤な創傷を示した（図１３Ｂ−３）。これらの結果は、アトピー性皮膚炎の症状の改善に対するＨＰｆの有効性を示す。
【０１０４】
１０−２）動物モデルで証明される、創傷治癒に対するおよびアトピー性皮膚炎に
影響された皮膚領域への免疫細胞浸潤抑制に対するＨＰｆの効果
[000124]アトピー性皮膚炎を有するＮｃ／Ｎｇａマウスの創傷を治癒するＨＰｆの能力をさらに評価するために、皮膚組織片（ａ  ｐｅａｃｅ  ｏｆ  ｓｋｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ）を処置から４週間後に切り取り、Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリンおよびエオシン）で染色した（図１４）。結果は、ＤＮＦＢのみを受けた群（図１４Ａ−２、１４Ｂ−２）またはＨＰｆで処置していない対照群（図１４Ａ−３、１４Ｂ−３）において角質層の顕著な分離を示したが、ＨＰｆで処置した群（図１４Ａ−４、１４Ｂ−４）における皮膚損傷は最小限であった（対照群に対して使用した組成物については表４を参照されたい）。アトピー性皮膚炎が影響された領域周囲に免疫細胞の浸潤を生じさせることは公知であり、それは様々な走化性サイトカインを分泌させる傾向があるからである。Ｈ＆Ｅ染色実験によると、ＤＮＦＢのみを受けた群およびＨＰｆなしの対照群は免疫細胞の浸潤を示す（図１４Ａ−２、１４Ｂ−２および１４Ａ−３、１４Ｂ−３）が、ＨＰｆで処置した群ではそのような浸潤が最小限であった（図１４Ａ−４、１４Ｂ−４）。これらの結果は、ＨＰｆが、影響された領域への過剰な免疫細胞の浸潤を抑制できることはもちろん、創傷を治癒することもできることを強く示唆する。
【０１０５】
実施例１１  皮膚細胞分化に対するＨＰｆの効果
[000125]ケラチノサイトおよび線維芽細胞の細胞分化に対するＨＰｆの効果を、ヒト表皮細胞系ＨａＣａＴ（Ｓｃｈｏｏｐ、Ｖｅｒｏｎｉｋａ  Ｍ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ．、１１２（３）：３４３−３５３）および線維芽細胞系ＣＣＤ−９８６ｓｋ（ＳＣＲＬ−１９４７、ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）を使用して評価した。各細胞系をＨＰｆ（１００μｇ／ｍｌ）で２４時間処置した後、ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ−ＰＣＲ（サイバーグリーン）を行った。
【０１０６】
[000126]具体的には、０．３ｘ１０６細胞／ｍｌを６ウェルプレートにプレーティングし、それを、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳＡ）中、３７℃で、ＣＯ２インキュベーター内で、細胞が集密度７０〜８０％に達するまでインキュベートした。上記細胞を、最終濃度として１００  ｇ／ｍｌを達成するようにＨＰｆで処置し、２４時間インキュベートした。上清を除去した後、１ｍｌ  ＴＲｉｚｏｌ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＵＳＡ）を添加して細胞を溶解した。次いで、２００  ｌのクロロホルムを添加し、その後、１０秒間ボルテックスし、１２，０００ｘｇ（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４１８、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ＵＳＡ）で１５分間遠心した。上清を新たなｅチューブに回収し、０．５ｍｌ  イソプロピルアルコールと混合し、１０分間、再び遠心して全ＲＮＡを沈殿させた。その全ＲＮＡを７０％エタノールで１回洗浄し、次いで、ＲＮＡｓｅおよびＤＮＡｓｅ不含の水に溶解した。このような精製ＲＮＡを使用して、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）をその製造者のマニュアルに提供されている指示に従って使用してｃＤＮＡを合成した。
【０１０７】
[000127]先ず、全ＲＮＡ  １μｇ、１Ｘ  ＲＴ緩衝液、ｄＮＴＰミックス、オリゴ−ｄＴプライマー、ＲＮＡｓｅ阻害剤およびＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを混合し、次いでＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ不含の水を添加して体積を２０μｌに調整し、次いでそれを３７℃で６０分間インキュベートしてｃＤＮＡを得た。
【０１０８】
[000128]細胞分化度を表す、マーカー遺伝子、例えばケラチン１０（ＫＲＴ１０）、トランスグルタミナーゼ１（ＴＧＭ１）およびインボルクリン（ＩＶＬ）、の発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲ（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０、Ｒｏｃｈｅ、ＵＳＡ）によって判定した。ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーの配列を表５に示す。ＲＴ−ＰＣＲ用の試薬は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍから購入したサイバーグリーンＰＣＲマスターミックスであった。ＰＣＲを９５℃で１０秒の変性によって開始し、その後、６０℃で１０秒アニーリングし、７２℃で１０秒増幅した。このサイクルを４５回にわたって繰り返した。
【０１０９】
[000129]融解曲線分析をＲＴ−ＰＣＲの最終サイクルで行って、非特異的バンドの不在を確認した。ＲＴ−ＰＣＲ産物をｄｄＣｔアルゴリズム（Δ−Δ−Ｃｔ）で分析した。結果を図１５に示す。それらは、ＨａＣａＴ細胞をＨＰＦで処置したとき、細胞分化のマーカー遺伝子の発現レベルが対照細胞のものより２０〜２５０高かったことを示す（図１５Ａ）。ＣＣＤ９８６−ｓｋ細胞の場合、マーカー遺伝子の発現レベルは、ＨＰｆで処置したとき対照細胞のものより２０倍高かった（図１５Ｂ）。
【０１１０】
[000130]これらの結果は、ＨＰｆが皮膚細胞分化の制御に重要な役割を果たすこと、それ故、ＨＰｆを創傷治癒薬および／または化粧品の活性成分として有効に使用することができることを示唆している。
【０１１１】
【表５】
0006516742.tif 000006
【０１１２】
実施例１２  インビトロでの皮下脂肪細胞分化に対するＨＰｆの効果
[000131]皮下脂肪細胞（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｆａｔ  ｃｅｌｌ）は、それらの構造を適切に維持するために必要な様々な因子を分泌し、これから分化される細胞、例えば前脂肪細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ）および脂肪幹細胞、を含有する。本発明者らは、ＨＰｆが脂肪細胞分化を促進するのか、または抑制するのかを調べるための実験を行った。３Ｔ３−Ｌ１細胞系（ＣＬ−１７３、ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）をＨＰｆ（１００ｕｇ／ｍｌ）で、または対照についてはＰＢＳ（ｐＨ７．２）で処置し、細胞をオイルレッドＯ染料で染色して、脂肪細胞分化に対するＨＰｆの効果を判定した。図１６から分かるように、本発明者らは、この研究分野において初めて、ＨＰｆで処置した細胞が対照細胞のものと比較して４０％脂肪細胞分化低減を提示することを立証できた。
【０１１３】
実施例１３  人工皮膚を使用するＨＰｆの皮膚状態改善効果の評価
[000132]本発明者らは、ヒトの皮膚に非常に類似した３Ｄ構造を有する人工皮膚を使用して皮膚コンディショニングに対するＨＰｆの効果を調査した。３Ｄ人工皮膚培養は、Ｎｅｏｄｅｒｍ  ＥＤ製品（ＴＥＧＯ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、Ｋｏｒｅａ）を使用して、その製造者によって提供されたプロトコルに従うことによって行った。Ｎｅｏｄｅｒｍ  ＥＤ製品は、ヒトに類似した表皮および真皮組織構造を有し、それ故、皮膚用の新規医薬はもちろん化粧品の開発にもよく利用されている。
【０１１４】
[000133]コラーゲンマトリックスおよび線維芽細胞を細胞培養容器の表面の培地で増殖させた後、ケラチノサイトをその表面にプレーティングし、４日間培養して単層細胞を得た。細胞を１６〜２０日間、空気に曝露することによって真皮細胞の単層を誘導した。その後、その人工真皮層を１００μｇ／ｍｌ  ＨＰｆでまたはリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）で７日間処置した。次いで、表皮および真皮をＨ＆Ｅ染料で染色した。図１７は、対照群（図１７Ａ−Ｃ１〜Ｃ３）およびＨＰｆ処置群（図１７Ｂ−Ｈ１〜Ｈ４）では表皮層の厚さの変化がないが、ＨＰｆ処置群は対象群と比較して真皮層の厚さの２倍増加を提示したことを示す。この結果は、ＨＰｆが真皮層の細胞分化および増殖を促進することを明確に示しており、これは、コラーゲンおよびエラスチンなどの主要皮膚組織成分の発現がＨＰｆによって誘導され得ることを含意する。それ故、本発明者らは、ＨＰｆをシワまたはハリを改善するためのおよび皮膚状態改善用化粧品を開発するための活性成分として使用することができることを提案する。
【０１１５】
実施例１４  メラニン生合成の阻害に対するＨＰｆの効果
[000134]ＨＰｆがホワイトニングに有効であり得るかどうかを判定するために、メラニン生合成に対するＨＰｆの阻害効果を検査した。Ｂ１６Ｆ１０細胞系（ＣＲＬ−６４７５、ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）をＨＰｆ（１００μｇ／ｍｌ）またはＰＢＳで４８時間処置した後、細胞生存率およびメラニン生合成を図１８に示すようにＭＴＴアッセイによって測定した。１００μｇ／ｍｌ  ＨＰｆの培養物への添加は、メラニン生合成を対照と比較して７０％低減させた。これは、ＨＰｆにはホワイトニングに対する強力な効果があることを示唆している。安全性試験では、１００μｇ／ｍｌ  ＨＰｆは細胞の生存に影響されなかった。これは、この濃度でのＨＰｆに毒性がないことを示す。
【０１１６】
実施例１５  ナノリポソームに封入されたＨＰｆであるリポ−ＨＰｆの製造
[000135]次の材料をリポ−ＨＰｆの製造に使用した：リン脂質としての大豆レシチン（Ｓｈｉｎｄｏｎｇｂａｎｇ  Ｉｎｃ．、Ｋｏｒｅａ）、Ｍｅｔａｒｉｎ  Ｐ（Ｄｅｇｕｓｓａ  Ｔｅｘｔｕｒａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧ）、Ｎｕｔｒｉｐｕｒ  Ｓ（Ｄｅｇｕｓｓａ  Ｔｅｘｔｕｒａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧ）またはＥｍｕｌｔｏｐ（Ｄｅｇｕｓｓａ  Ｔｅｘｔｕｒａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧ）。
【０１１７】
[000136]高圧ホモジナイザー（最大排出量  ５Ｌ／時、最高圧力  １２００ｂａｒ、モデルＨＳ−１００２、製造会社Ｈｗａｓｕｎｇ  Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）の熱交換器を氷水の中に配置して、ホモジナイザーの排出口温度が３０℃を超えないようにした。そうしながら、次いでホモジナイザーの内部を蒸留水で洗浄して、作動準備を整えた。次いで、ＨＰｆを緩衝溶液（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ６．５〜７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、リン脂質を１０ｗ／ｖ％の比率で添加し、十分に水和させ、撹拌した。その撹拌溶液をホモジナイザーに室温および０ｂａｒの低圧で３回以上通した。ホモジナイザーに通した溶液にリン脂質を１４ｗ／ｖ％の比率になるように添加し、十分に水和させ、撹拌した。その撹拌溶液をホモジナイザーに１００ｂａｒで３回以上通した。次いで、この溶液にリン脂質を１８ｗ／ｖ％の比率になるように添加し、十分に水和させ、撹拌し、ホモジナイザーに２００ｂａｒで３回以上通した。次いで、この溶液にリン脂質を２０ｗ／ｖ％の比率になるように添加し、十分に水和させ、撹拌し、ホモジナイザーに３００ｂａｒで３回以上通した。次いでこの溶液にリン脂質を２２ｗ／ｖ％の比率になるように添加し、十分に水和させ、撹拌し、ホモジナイザーに４００ｂａｒで３回以上通した。次いで、その４００ｂａｒ条件でホモジナイザーに通した溶液にリン脂質を２４ｗ／ｖ％の比率になるように添加し、十分に水和させ、撹拌し、ホモジナイザーに５００ｂａｒで３回以上通した。次いで、その５００ｂａｒ条件でホモジナイザーに通した溶液にリン脂質を２６ｗ／ｖ％の比率になるように添加し、十分に水和させ、撹拌し、ホモジナイザーに６００ｂａｒで３回以上通した。次いで、その６００ｂａｒ条件でホモジナイザーに通した溶液にリン脂質を２８ｗ／ｖ％の比率になるように添加し、十分に水和させ、撹拌し、ホモジナイザーに７００ｂａｒで３回以上通した。次いでこの溶液をホモジナイザーに８００ｂａｒで３回以上通し、その後、１５，０００ｘｇで３０分間遠心した。次いでその上清をゲルクロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）に通して、リポソームによって封入されなかったＨＰｆを除去し、このようにしてＨＰｆ含有リポソーム（リポ−ＨＰｆ）液体製剤を調製した。
【０１１８】
[000137]局所用調製物については、製品が約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの有効用量推定量のＨＰｆポリペプチド、ポリペプチド断片またはその混合物の各々を含むと予想される。
【０１１９】
[000138]本発明の特定の実施例を記載したことで、本発明の趣旨の範囲内に収まるその変形形態および修飾形態が当業者に明らかになり得ると理解される。本発明の範囲を実施例に提供した実施形態に限定する意図はない。添付の特許請求の範囲およびその均等物が本発明の範囲を決定する。
非限定的に、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］
ＨＳＰ９０ａ、ＨＰｆポリペプチド、ＨＰｆΔＣ１、ＨＰｆΔＣ２またはこれらの組合せを含む、リポソーム封入ポリペプチド組成物。
［態様２］
ＨＰｆポリペプチド断片がＨＰｆΔＣ１またはＨＰｆΔＣ２である、態様１に記載のリポソーム封入ポリペプチド組成物。
［態様３］
前記リポソームが、約５０〜５００ｎｍ、約５０〜３５０ｎｍ、または約１００〜２５０ｎｍの粒径を有するナノリポソームである、態様１に記載のリポソーム封入ポリペプチド組成物。
［態様４］
前記ポリペプチドがＨＳＰ９０ａである、態様１に記載のリポソーム封入ポリペプチド組成物。
［態様５］
ＨＳＰ９０ａ、ＨＰｆポリペプチド、ＨＰｆΔＣ１もしくはＨＰｆΔＣ２ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸配列と、融合パートナーペプチドをコードする核酸配列とを含む、融合タンパク質をコードするキメラ構築物。
［態様６］
前記融合パートナーペプチドが、チオレドキシン（ｔｈｅｏｒｅｄｏｘｉｎ）Ａ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）またはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）である、態様５に記載のキメラ構築物。
［態様７］
前記ＨＰｆペプチドをコードする核酸配列と前記融合パートナーペプチドをコードする核酸配列との間に位置するタンパク質切断酵素認識部位をさらに含む、態様６に記載のキメラ構築物。
［態様８］
前記タンパク質切断酵素認識部位が、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ認識部位またはヒドロキシルアミン認識部位である、態様７に記載のキメラ構築物。
［態様９］
前記ＨＰｆポリペプチドが配列番号１の核酸配列を有する、態様５に記載のキメラ構築物。
［態様１０］
ＨＰｆΔＣ１またはＨＰｆΔＣ２ポリペプチドを含む、態様５に記載のキメラ構築物。
［態様１１］
ＴＯＰ１０細胞系、ＺＲ４５００細胞系、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙＳ細胞系またはＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）細胞系を含む、ＨＰｆ融合パートナーキメラタンパク質を発現するように形質転換された形質転換細胞系。
［態様１２］
前記ＨＰｆ融合パートナーキメラタンパク質が、ＴＲＸ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆ融合タンパク質、ＭＢＰ（ＴＥＶｃ）−ＨＰｆ融合タンパク質、またはＴＲＸ（ＮＧｃ）−ＨＰｆ融合タンパク質である、態様１１に記載の形質転換細胞系。
［態様１３］
ナノリポソーム封入ＨＳＰ９０ａ、ＨＰｆ、ＨＰｆΔＣ１またはＨＰｆΔＣ２ポリペプチド組成物を調製する方法であって、
（ａ）リポソームを形成できるリン脂質をＨＳＰ９０ａ、ＨＰｆ、ＨＰｆΔＣ１またはＨＰｆΔＣ２ポリペプチドと共に塩の緩衝水溶液に溶解し、ここで、前記リン脂質が黄色卵黄レシチンまたは大豆レシチンを含むものである；そして、
（ｂ）前記水溶液を高圧ホモジナイザーに通し、その間、通す回数が増すにつれて前記リン脂質の含有量および前記高圧ホモジナイザーの圧力を徐々に増加させて、ＨＳＰ９０ａ、ＨＰｆ、ＨＰｆΔＣ１またはＨＰｆΔＣ２ポリペプチド含有ナノリポソーム封入ＨＰｆポリペプチド組成物を得る
ことを含む前記方法。
［態様１４］
前記ポリペプチドがＨＳＰ９０ａである、態様１３に記載の方法。
［態様１５］
皮膚状態を処置するための態様１に記載の組成物を含有する局所用製剤であって、前記皮膚状態がアトピー性皮膚炎、シワ、シミ、肌のハリまたは肌老化であり、前記組成物が約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの濃度のＨＰｆポリペプチドまたはＨＰｆポリペプチド断片を含む、前記局所用製剤。
［態様１６］
皮下脂肪蓄積を処置するための態様１に記載の組成物を含有する局所用製剤であって、前記組成物が約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの濃度のＨＰｆポリペプチドまたはＨＰｆポリペプチド断片を含む、前記局所用製剤。
［態様１７］
アトピー性皮膚炎、シワ、シミ、肌のハリまたは肌老化である皮膚状態を処置するための調製物の製造における態様１に記載の組成物の使用。
［態様１８］
肥満、セルライト、潰瘍を伴う下肢静脈瘤、下体肢浮腫、静脈瘤、皮膚変色、静脈性湿疹、強皮症、炎症性血栓、皮膚潰瘍または慢性疼痛を処置するための調製物の製造における態様１に記載の組成物の使用。
（配列表）
【０１２０】
【表６−１】
0006516742.tif 000007
【０１２１】
【表６−２】
0006516742.tif 000008
【０１２２】
【表６−３】
0006516742.tif 000009
【０１２３】
【表６−４】
0006516742.tif 000010
【０１２４】
【表６−５】
0006516742.tif 000011
【０１２５】
【表６−６】
0006516742.tif 000012
【０１２６】
【表６−７】
0006516742.tif 000013
【０１２７】
【表７】
0006516742.tif 000014
【図１】
0006516742.tif 000015
【図２−１】
0006516742.tif 000016
【図２−２】
0006516742.tif 000017
【図２−３】
0006516742.tif 000018
【図２−４】
0006516742.tif 000019
【図２−５】
0006516742.tif 000020
【図３−１】
0006516742.tif 000021
【図３−２】
0006516742.tif 000022
【図３−３】
0006516742.tif 000023
【図３−４】
0006516742.tif 000024
【図３−５】
0006516742.tif 000025
【図４Ａ】
0006516742.tif 000026
【図４Ｂ】
0006516742.tif 000027
【図５Ａ】
0006516742.tif 000028
【図５Ｂ】
0006516742.tif 000029
【図５Ｃ】
0006516742.tif 000030
【図５Ｄ】
0006516742.tif 000031
【図６】
0006516742.tif 000032
【図７Ａ】
0006516742.tif 000033
【図７Ｂ】
0006516742.tif 000034
【図８】
0006516742.tif 000035
【図９−１】
0006516742.tif 000036
【図９−２】
0006516742.tif 000037
【図１０Ａ】
0006516742.tif 000038
【図１０Ｂ】
0006516742.tif 000039
【図１１Ａ】
0006516742.tif 000040
【図１１Ｂ】
0006516742.tif 000041
【図１２】
0006516742.tif 000042
【図１３Ａ】
0006516742.tif 000043
【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【配列表】
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