(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸管出血性大腸菌の有無及び大腸菌（腸管出血性大腸菌を含む）の有無を同時に検出する大腸菌の検出方法であって、
試料から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、大腸菌のウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子（pyrH）を増幅するための第１のプライマーセット、ベロ毒素１型遺伝子（vtx1）を増幅するための第２のプライマーセット、及びベロ毒素２型遺伝子（vtx2）を増幅するための第３のプライマーセットを用いたマルチプレックスＰＣＲにより同時に増幅反応を行い、それぞれの増幅産物の有無を検出することによって、試料中における腸管出血性大腸菌の有無及び大腸菌の有無を同時に検出する大腸菌の検出方法。
【請求項２】
前記pyrHを含むＤＮＡ断片を増幅して得られた増幅産物と相補的に結合する第１のプローブ、前記vtx1を含むＤＮＡ断片を増幅して得られた増幅産物と相補的に結合する第２のプローブ、及び前記vtx2を含むＤＮＡ断片を増幅して得られた増幅産物と相補的に結合する第３のプローブを固定化した大腸菌検出用担体を用いて、前記それぞれの増幅産物の有無を同時に検出する
ことを特徴とする請求項１記載の大腸菌の検出方法。
【請求項３】
前記第１のプライマーセットは、前記pyrHを含むＤＮＡ断片を増幅するための配列番号１に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号２に示す塩基配列からなるプライマーとからなり、
前記第２のプラマーセットは、前記vtx1を含むＤＮＡ断片を増幅するための配列番号３に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号４に示す塩基配列からなるプライマーとからなり、
前記第３のプライマーセットは、前記vtx2を含むＤＮＡ断片を増幅するための配列番号５に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号６に示す塩基配列からなるプライマーとからなり、
前記第１のプローブが、以下の（１ａ）、（１ｂ）、（１ｃ）及び（１ｄ）に含まれるプローブからなるプローブ群から選択された少なくともいずれか二以上のプローブであり、
前記第２のプローブが、以下の（２ａ）、（２ｂ）、（２ｃ）及び（２ｄ）に含まれるプローブからなるプローブ群から選択された少なくともいずれか一以上のプローブであり、
前記第３のプローブが、以下の（３ａ）、（３ｂ）、（３ｃ）及び（３ｄ）に含まれるプローブからなるプローブ群から選択された少なくともいずれか一以上のプローブである
ことを特徴とする請求項２記載の大腸菌の検出方法。
（１ａ）：前記pyrHから選択された配列番号７〜９に示す塩基配列からなるプローブ。
（１ｂ）：配列番号７〜９に示す塩基配列において、１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブ。
（１ｃ）：配列番号７〜９に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
（１ｄ）：（１ｂ）又は（１ｃ）のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。
（２ａ）：前記vtx1から選択された配列番号１０〜１７に示す塩基配列からなるプローブ。
（２ｂ）：配列番号１０〜１７に示す塩基配列において、１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブ。
（２ｃ）：配列番号１０〜１７に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
（２ｄ）：（２ｂ）又は（２ｃ）のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。
（３ａ）：前記vtx2から選択された配列番号１８〜２２に示す塩基配列からなるプローブ。
（３ｂ）：配列番号１８〜２２に示す塩基配列において、１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブ。
（３ｃ）：配列番号１８〜２２に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
（３ｄ）：（３ｂ）又は（３ｃ）のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。
【請求項４】
腸管出血性大腸菌の有無及び大腸菌（腸管出血性大腸菌を含む）の有無を同時に検出するための大腸菌検出用担体であって、
大腸菌のウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子（pyrH）を含むＤＮＡ断片を増幅して得られた増幅産物と相補的に結合する第１のプローブと、
大腸菌のベロ毒素１型遺伝子（vtx1）を含むＤＮＡ断片を増幅して得られた増幅産物と相補的に結合する第２のプローブと、
大腸菌のベロ毒素２型遺伝子（vtx2）を含むＤＮＡ断片を増幅して得られた増幅産物と相補的に結合する第３のプローブと、を固定化したことを特徴とする大腸菌検出用担体。
【請求項５】
前記第１のプローブが、以下の（１ａ）〜（１ｄ）に含まれるプローブからなるプローブ群から選択された少なくともいずれか二以上のプローブであり、
前記第２のプローブが、以下の（２ａ）、（２ｂ）、（２ｃ）及び（２ｄ）に含まれるプローブからなるプローブ群から選択された少なくともいずれか一以上のプローブであり、
前記第３のプローブが、以下の（３ａ）、（３ｂ）、（３ｃ）及び（３ｄ）に含まれるプローブからなるプローブ群から選択されたすくなくともいずれか一以上のプローブである
ことを特徴とする請求項４記載の大腸菌検出用担体。
（１ａ）：前記pyrHから選択された配列番号７〜９に示す塩基配列からなるプローブ。
（１ｂ）：配列番号７〜９に示す塩基配列において、１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブ。
（１ｃ）：配列番号７〜９に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
（１ｄ）：（１ｂ）又は（１ｃ）のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。
（２ａ）：前記vtx1から選択された配列番号１０〜１７に示す塩基配列からなるプローブ。
（２ｂ）：配列番号１０〜１７に示す塩基配列において、１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブ。
（２ｃ）：配列番号１０〜１７に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
（２ｄ）：（２ｂ）又は（２ｃ）のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。
（３ａ）：前記vtx2から選択された配列番号１８〜２２に示す塩基配列からなるプローブ。
（３ｂ）：配列番号１８〜２２に示す塩基配列において、１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブ。
（３ｃ）：配列番号１８〜２２に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
（３ｄ）：（３ｂ）又は（３ｃ）のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食中毒菌などの微生物を検出するための技術に関し、特に大腸菌の検出方法、及び大腸菌検出用担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食品や環境などの公衆衛生の分野における衛生水準の向上により、食中毒の発生には減少傾向が見られるものの、現在でもなお日本国内で毎年２万人以上が食中毒に罹患している。この中には、腸管出血性大腸菌などの病原性の大腸菌を原因とするものも少なからず含まれており、その発生を防止するために、食中毒菌等の検査において、食品や環境中の病原性大腸菌を精度高く検出することが重要になっている。
【０００３】
病原性大腸菌を検出する方法としては、例えば特許文献１，２に記載のように、ベロ（Ｖｅｒｏ）毒素遺伝子を増幅可能なプライマーを用いて、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法により当該遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅し、その増幅産物のサイズを電気泳動法で分析することによって行う方法がある。また、本出願人による特許文献３に記載の発明のように、ＰＣＲの増幅産物と相補的に結合するプローブを固定化したＤＮＡチップを用いて、病原性大腸菌などの検出を行う方法もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第２９０５９４５号公報
【特許文献２】特許第２７７５６６３号公報
【特許文献３】国際公開第２０１１／１４２１１９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、公衆衛生の分野においては、食中毒の原因となる病原性大腸菌の有無の検査のみならず、糞便汚染などの衛生学的指標として、病原性に拘わらず、大腸菌の有無を同時に検査できることが望ましい。
しかしながら、上述した従来の技術では、病原性を持たないものを含む大腸菌を、病原性大腸菌と同時に検出することはできなかった。
また、大腸菌検査を行う実際の現場においては、検査試料に食物の遺伝子など様々なＤＮＡが混入することから、特異性に優れた検出精度が求められていた。
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、病原性を持たないものを含む大腸菌と、食中毒の原因となる腸管出血性大腸菌の検出を同時にかつ高い特異性で行うことが可能な大腸菌の検出方法、及び大腸菌検出用担体の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明の大腸菌の検出方法は、腸管出血性大腸菌の有無及び大腸菌（腸管出血性大腸菌を含む）の有無を同時に検出する大腸菌の検出方法であって、試料から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、大腸菌のウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子（pyrH）を増幅するための第１のプライマーセット、ベロ毒素１型遺伝子（vtx1）を増幅するための第２のプライマーセット、及びベロ毒素２型遺伝子（vtx2）を増幅するための第３のプライマーセットを用いたマルチプレックスＰＣＲにより同時に増幅反応を行い、それぞれの増幅産物の有無を検出することによって、試料中における腸管出血性大腸菌の有無及び大腸菌の有無を同時に検出する方法としてある。
【０００７】
また、本発明の大腸菌検出用担体は、腸管出血性大腸菌の有無及び大腸菌（腸管出血性大腸菌を含む）の有無を同時に検出するための大腸菌検出用担体であって、大腸菌のウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子（pyrH）を含むＤＮＡ断片を増幅して得られた増幅産物と相補的に結合する第１のプローブと、大腸菌のベロ毒素１型遺伝子（vtx1）を含むＤＮＡ断片を増幅して得られた増幅産物と相補的に結合する第２のプローブと、大腸菌のベロ毒素２型遺伝子（vtx2）を含むＤＮＡ断片を増幅して得られた増幅産物と相補的に結合する第３のプローブと、を固定化した構成としてある。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、病原性を持たないものを含む大腸菌と、食中毒の原因となる腸管出血性大腸菌の検出を同時にかつ高い特異性で行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の実施形態に係る大腸菌の検出方法及び大腸菌検出用担体の試験１，３で用いた菌株の毒素遺伝子保有状況を示す図である。
【図２】本発明の実施形態に係る大腸菌の検出方法において用いられる３種類のプライマーセットの塩基配列（プライマー配列）を示す図である。
【図３】本発明の実施形態に係る大腸菌の検出方法におけるマルチプレックスＰＣＲによる増幅産物の電気泳動の結果を示す図である。
【図４】本発明の実施形態に係る大腸菌の検出方法におけるウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子領域を増幅するためのプライマーセット（pyrHプライマーセット）を用いて得られた検証菌種のＰＣＲ増幅産物の電気泳動の結果を示す図である。
【図５】本発明の実施形態に係る大腸菌の検出方法及び大腸菌検出用担体におけるウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子領域から選択された各プローブ（pyrHプローブ）による検証菌種の検出結果（蛍光強度，Ｓ／Ｎ比値）を示す図である。
【図６】本発明の実施形態に係る大腸菌検出用担体におけるプローブの塩基配列（プローブ配列）を示す図である。
【図７】本発明の実施形態に係る大腸菌の検出方法及び大腸菌検出用担体における各プローブによる大腸菌の検出結果（蛍光強度）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の実施形態に係る大腸菌の検出方法、及び大腸菌検出用担体について、詳細に説明する。
本実施形態に係る大腸菌の検出方法は、腸管出血性大腸菌及び大腸菌（腸管出血性大腸菌を含む）を同時に検出する大腸菌の検出方法であって、試料から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、大腸菌のウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子（pyrH）を含むＤＮＡ断片と、ベロ毒素１型遺伝子（vtx1）を含むＤＮＡ断片と、ベロ毒素２型遺伝子（vtx2）を含むＤＮＡ断片と、をマルチプレックスＰＣＲにより同時に増幅させ、それぞれの増幅産物の有無を検出することによって、試料中における腸管出血性大腸菌の有無及び大腸菌の有無を同時に検出することを特徴とする。
【００１１】
大腸菌（Escherichia  coli）は、グラム陰性で通性嫌気性の桿菌である。腸内細菌の一種であり、多くのものは病原性を持っておらず、ヒトに対して無害である。しかしながら、公衆衛生の分野においては、衛生学的指標として、このような病原性の有無に拘わらず、大腸菌を幅広く検出可能にすることが好ましい。
そこで、本実施形態に係る大腸菌の検出方法では、大腸菌のゲノムＤＮＡに共通して保有されるウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子（pyrH）を増幅対象領域（増幅対象遺伝子領域、標的遺伝子領域）としてＰＣＲ法により増幅し、その増幅産物を検出することによって、試料中における、病原性のあるものとないものとを含む大腸菌の有無を検出可能にしている。
【００１２】
また、大腸菌には、腹痛や下痢等を引き起こすものが存在し、これらを一般的に病原性大腸菌と呼ぶ。特に、Ｏ１５７などで有名な腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ，enterohemorrhagic  E.coli）には、毒素を産生する遺伝子として、ベロ毒素１型遺伝子（vtx1）及び／又はベロ毒素２型遺伝子（vtx2）を有するものが存在する。
具体的には、例えば図１に示すように、ベロ毒素遺伝子の保有状況が分っている菌株が存在している。後述する実施例では、これらの菌株を使用して、pyrH、vtx1、及びvtx2の３つの遺伝子を同時に検出している。
【００１３】
本実施形態に係る大腸菌の検出方法では、上記のウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子（pyrH）と、ベロ毒素遺伝子（vtx1，vtx2）を増幅対象領域としてＰＣＲ法により同時に増幅し、その増幅産物を検出することによって、試料中における、腸管出血性大腸菌を含む大腸菌の有無と、腸管出血性大腸菌の有無とを同時に検出可能にしている。
これによって、本実施形態に係る大腸菌の検出方法によれば、大腸菌について、従来の方法ではなし得なかった衛生指標菌及び食中毒危害菌の２種類の指標を同時に識別することが可能となっている。
【００１４】
本実施形態に係る大腸菌の検出方法において、図２に示すように、大腸菌のウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子（pyrH）領域をＰＣＲ法により増幅するためのプライマーセット（pyrHプライマーセット）として、配列番号１に示す塩基配列からなるプライマー（Ｆ：フォワードプライマー）と、配列番号２に示す塩基配列からなるプライマー（Ｒ：リバースプライマー）とからなるものを用いることが好ましい。
また、腸管出血性大腸菌のベロ毒素１型遺伝子（vtx1）領域をＰＣＲ法により増幅するためのプライマーセット（vtx1プライマーセット）として、配列番号３に示す塩基配列からなるプライマー（Ｆ：フォワードプライマー）と、配列番号４に示す塩基配列からなるプライマー（Ｒ：リバースプライマー）とからなるものを用いることが好ましい。
また、腸管出血性大腸菌のベロ毒素２型遺伝子（vtx2）領域をＰＣＲ法により増幅するためのプライマーセット（vtx2プライマーセット）として、配列番号５に示す塩基配列からなるプライマー（Ｆ：フォワードプライマー）と、配列番号６に示す塩基配列からなるプライマー（Ｒ：リバースプライマー）とからなるものを用いることが好ましい。
【００１５】
本実施形態に係る大腸菌の検出方法において、ＰＣＲ反応液は、上記のpyrHプライマーセット、vtx1プライマーセット、及びvtx2プライマーセットを含有し、それ以外の成分には、一般的なものを用いることができる。具体的には、緩衝液、核酸合成基質、Ex  Taq等の核酸合成酵素、Cy5等の標識成分、試料のＤＮＡ、及び水を含むものなどを用いることができる。
そして、このようなＰＣＲ反応液を用いてサーマルサイクラーなどの核酸増幅装置により、試料中のゲノムＤＮＡの一部が増幅される。すなわち、上記プライマーセットによる増幅対象領域を有するゲノムＤＮＡが試料中に存在している場合、その対象領域が増幅される。
【００１６】
本実施形態に係る大腸菌の検出方法において用いるプライマーは、上記の塩基配列に限定されるものではなく、それぞれの塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたものを用いることができる。また、それぞれの塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるものを用いることもできる。
【００１７】
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、配列番号１〜６で表される配列からなるＤＮＡに対し高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡが、配列番号１〜６で表される配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ハイブリダイズする条件が挙げられる。通常、完全ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）より約５℃〜約３０℃、好ましくは約１０℃〜約２５℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特に11.45節「Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ」に記載されている条件等を使用することができる。
【００１８】
次に、ＰＣＲ法により得られた増幅産物（ＰＣＲ増幅産物）を用いて、例えば電気泳動を行うことにより、本実施形態における上記各プライマーセットによる増幅産物が得られているか否かを確認して、試料中における大腸菌及び腸管出血性大腸菌の有無を検出することが好ましい。電気泳動は、アガロースゲル電気泳動やポリアクリルアミドゲル電気泳動、マイクロチップ電気泳動など一般的な方法により行うことができる。
【００１９】
また、ＰＣＲ増幅産物を本実施形態に係る大腸菌検出用担体（ＤＮＡチップ）上に滴下して、当該担体に固定化されたプローブにハイブリダイズした増幅産物の標識を検出することにより、試料中における大腸菌及び腸管出血性大腸菌の有無を検出することも好ましい。
標識の検出は、蛍光スキャニング装置など一般的な標識検出装置を用いて行うことができ、例えば東洋鋼鈑株式会社のＢＩＯＳＨＯＴ（Ｒ）を用いて、増幅産物の蛍光強度を測定することにより行うことができる。また、測定結果として、蛍光強度の他に、Ｓ／Ｎ比値（Signal  to  Noise  ratio，（メディアン蛍光強度値−バックグラウンド値）÷バックグラウンド値）を算出することも好ましい。Ｓ／Ｎ比値にもとづいて、測定結果が陽性であるか陰性であるかを、精度高く判定することができるためであり、一般にＳ／Ｎ比値が３以上の場合、陽性と判定することができる。なお、標識は、蛍光に限定されず、その他のものを用いてもよい。
【００２０】
本実施形態に係る大腸菌検出用担体は、大腸菌のウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子（pyrH）領域から選択されたプローブ（pyrHプローブ）として、配列番号７〜９に示す塩基配列からなる少なくともいずれかを固定化したものとすることが好ましい。また、特異性の観点から、配列番号８又は９に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブを固定化したものとすることがより好ましく、配列番号７〜９に示す塩基配列からなる少なくとも二以上のプローブを固定化したものとすることがさらに好ましい。このように、特異性に優れたプローブを組み合わせることによって、偽陽性の判定がなされる可能性を低減させることが可能となる。
【００２１】
また、本実施形態に係る大腸菌検出用担体は、腸管出血性大腸菌のベロ毒素１型遺伝子（vtx1）領域から選択されたプローブ（vtx1プローブ）として、配列番号１０〜１７に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブを固定化したものとすることが好ましく、腸管出血性大腸菌のベロ毒素２型遺伝子（vtx2）領域から選択されたプローブ（vtx2プローブ）として、配列番号１８〜２２に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブを固定化したものとすることが好ましい。
本実施形態に係る大腸菌検出用担体に、pyrHプローブのみならず、このようなvtx1プローブとvtx2プローブを固定化することによって、大腸菌（腸管出血性大腸菌を含む）と共に、ベロ毒素１型遺伝子及び／又はベロ毒素２型遺伝子を有する腸管出血性大腸菌を同時に特異的に検出することが可能になる。
【００２２】
本実施形態に係る大腸菌検出用担体において用いるプローブも、上記の塩基配列に限定されるものではなく、それぞれの塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたものを用いることができる。また、それぞれの塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるものを用いることもできる。さらに、これらのようなプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブを用いることもできる。
【００２３】
このような大腸菌検出用担体を用いて、具体的には、ＰＣＲ増幅産物に所定の緩衝液を混合し、当該担体に滴下する。次に、当該担体を４５℃で１時間静置し、その後、所定の緩衝液によりハイブリダイズしなかったＰＣＲ増幅産物等を当該担体から洗い流す。そして、当該担体を標識検出装置にかけて標識の検出を行うことにより、試料中に腸管出血性大腸菌及び大腸菌（腸管出血性大腸菌を含む）が存在するか否かを同時に検出することができる。
【００２４】
以上説明したように、本実施形態に係る大腸菌の検出方法、及び大腸菌検出用担体によれば、病原性を持たないものを含む大腸菌と、食中毒の原因となる腸管出血性大腸菌の検出を同時にかつ高い特異性で行うことが可能である。
【実施例】
【００２５】
＜試験１：３種類のプライマーセットを用いた同時増幅の検証＞
図１に示すベロ毒素遺伝子の保有状況が既知の６種類の大腸菌の菌株を用いて、これらの大腸菌から常法によりＤＮＡを抽出した。同図において、(1)〜(5)は、大阪大学微生物病研究所からの分譲由来のものであり、(6)は、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  生物遺伝資源センター（ＮＢＲＣ）からの分譲由来のものである。
次いで、図２に示すpyrHプライマーセット、vtx1プライマーセット、及びvtx2プライマーセットを用いて、菌株毎に、それぞれの増幅対象領域をマルチプレックスＰＣＲにより同時に増幅し、得られた増幅産物を検出できるか否かを検証した。具体的には、以下のように行った。
【００２６】
上記６種類の大腸菌の菌株を、それぞれトリプティックソイブロス（日本ＢＤ製）に接種して、３７℃で一晩培養を行ったのち、培養液をそれぞれ１ｍＬずつ回収し、５０００×ｇで、１０分間の遠心分離を行った。
次に、上清を廃棄し、得られた沈殿に、２０ｍｇ／ｍＬ濃度のリゾチーム溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０／２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を加えて、３７℃で３０分間溶菌処理を行った。さらに、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）を用いて、カラム精製を行うことにより、ＤＮＡ抽出液を得た。このＤＮＡ抽出液を１０ｐｇ／μＬ濃度に調製したものをＰＣＲにおいて使用する試料とした。
【００２７】
次に、ＰＣＲ反応液を以下の組成で調製した。プライマーはシグマアルドリッチジャパン合同会社に合成委託し、それ以外の試薬はタカラバイオ株式会社製のものを使用した。
・緩衝液（10×Ex  Taq  buffer）                       (2.0μl）
・核酸合成基質（dNTP  Mixture）                      （1.6μl）
・大腸菌pyrH増幅用Ｆプライマー（5’末端Cy5修飾）    (0.2μl）
・大腸菌pyrH増幅用Ｒプライマー                      （0.2μl）
・大腸菌vtx1増幅用Ｆプライマー                       (0.2μl）
・大腸菌vtx1増幅用Ｒプライマー（5’末端Cy5修飾）    (0.2μl）
・大腸菌vtx2増幅用Ｆプライマー                       (0.2μl）
・大腸菌vtx2増幅用Ｒプライマー（5’末端Cy5修飾）    (0.2μl）
・TaKaRa  Ex  Taq  Hot  Start  Version               （0.2μl）
・試料のＤＮＡ                                       （1.0μl）
・滅菌水                                             （14.0μl）
（全量  20μl）
【００２８】
ＰＣＲによる遺伝子の増幅には、サーマルサイクラーｅｐグラジエント（エッペンドルフ株式会社）を使用した。反応条件は、以下の通りである。
（１）９５℃  ２分
（２）９５℃  １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）６８℃  ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃  ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃  ２分
（２）〜（４）を４０サイクル
【００２９】
次に、このようにして得られたＰＣＲ増幅産物を含むＰＣＲ反応液をマイクロチップ電気泳動装置ＭｕｌｔｉＮＡ（株式会社島津製作所）に供し、ＰＣＲ増幅産物のサイズ分析を行った。その結果を図３に示す。
同図に示すように、電気泳動の結果、pyrHプライマーセットによる増幅産物（推定サイズ１５８ｂｐ）は、６種類の菌株の全てについて検出された。
一方、vtx1プライマーセットによる増幅産物（推定サイズ３５１ｂｐ）は、vtx1遺伝子を有する菌株(3)、(4)、(5)についてのみ検出され、vtx2プライマーセットによる増幅産物（推定サイズ１２８ｂｐ）は、vtx2遺伝子を有する菌株(1)、(2)、(5)についてのみ検出された。
【００３０】
以上のことから、本実施形態に係る大腸菌の検出方法におけるpyrHプライマーセット、vtx1プライマーセット、及びvtx2プライマーセットによって、これらの領域をそれぞれ特異的に同時に検出できたことがわかる。このように、本実施形態に係る大腸菌の検出方法によれば、大腸菌と腸管出血性大腸菌の検出を同時に行えることが確認された。
【００３１】
＜試験２：大腸菌のpyrHプローブの検証＞
大腸菌のpyrH領域を増幅するためのプライマーセット（配列番号１，２）を用いてＰＣＲを行う場合において、試料中に大腸菌の類縁種であるエンテロバクター（Enterobacter）属菌やサイトロバクター（Citrobacter）属菌の一部の菌種が含まれている場合、図４に示すように、その菌種のゲノムＤＮＡにもとづく増幅産物が得られることがわかった。
このような場合、大腸菌と腸管出血性大腸菌の有無の判定を電気泳動によって行うと、これらの類縁種との区別がつかずに、偽陽性の判定が行われる可能性がある。
そこで、本実施形態に係る大腸菌検出用担体を用いることにより、大腸菌とこれらの類縁種とを識別できるかを検証した。具体的には以下のように行った。
【００３２】
図４に示す検証菌種の菌株を、試験１と同様に培養して得られたＤＮＡ抽出液１０ｎｇ／μＬと図２に示すpyrHプライマーセットを用いて、菌株毎に、増幅対象領域をＰＣＲにより増幅した。本試験では、ＰＣＲ反応液を以下の組成で調製し、その他の点については試験１と同様にして、ＰＣＲ増幅産物を含むＰＣＲ反応液を得た。
【００３３】
・緩衝液（10×Ex  Taq  buffer）                       (2.0μl）
・核酸合成基質（dNTP  Mixture）                      （1.6μl）
・大腸菌pyrH増幅用Ｆプライマー（5’末端Cy5修飾）    (0.2μl）
・大腸菌pyrH増幅用Ｒプライマー                      （0.2μl）
・TaKaRa  Ex  Taq  Hot  Start  Version               （0.2μl）
・試料のＤＮＡ                                       （1.0μl）
・滅菌水                                             （14.8μl）
（全量  20μl）
【００３４】
また、予め、図６に示す配列番号７〜９の塩基配列からなる各プローブを固定化したＤＮＡチップを作製した。そして、菌株毎に、ＰＣＲ反応液４μＬとハイブリダイゼーション用の緩衝液２μＬ（3×SSC／0.3%SDS  クエン酸−生理食塩水−ドデシル硫酸ナトリウム）を混合したものを、上記ＤＮＡチップに滴下して、４５℃で１時間反応させた。
反応後、ＤＮＡチップを室温下で洗浄液（2×SSC／0.2%SDS溶液、2×SSC溶液の順に）に浸して洗浄を行い、カバーガラスを載せて蛍光検出器Ｂｉｏｓｈｏｔ(東洋鋼鈑株式会社製)により各プローブのスポット領域の蛍光を検出した。
【００３５】
具体的には、プローブにハイブリダイズした増幅産物の標識成分（Cy5）をレーザー光により励起して発光させ、その光量を検出器内に取り付けたＣＣＤカメラにより検出した。また、光量を電気信号に置換して数値化し、蛍光強度を得た。この蛍光強度は、当該装置での強度指標であり、単位はなく、バックグラウンドの数値が０になるように補正して算出した。また、併せてＳ／Ｎ比値を算出した。その結果を図５に示す。
【００３６】
同図に示すように、配列番号７の塩基配列からなるプローブは、検出対象菌であるEscherichia  coliについて高い蛍光強度を示し、非対象菌のEnterobacter  kobei、及びCitrobacter  freundiiについても比較的高い蛍光強度を示している。特に、Citrobacter  freundiiについては、Ｓ／Ｎ比値が３以上であり、偽陽性反応が生じている。
また、配列番号８の塩基配列からなるプローブは、検出対象菌であるEscherichia  coliについて高い蛍光強度を示し、非対象菌であるCitrobacter  sp.についても比較的高い蛍光強度を示しているが、Ｓ／Ｎ比値は３未満であり、偽陽性反応は生じていない。
また、配列番号９の塩基配列からなるプローブは、検出対象菌であるEscherichia  coliについて高い蛍光強度を示し、非対象菌であるEnterobacter  kobeiについても比較的高い蛍光強度を示しているが、Ｓ／Ｎ比値は３未満であり、偽陽性反応は生じていない。
【００３７】
したがって、本実施形態に係る大腸菌検出用担体は、配列番号８又は９に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブを固定化したものとすることが好ましい。
また、配列番号７〜９の塩基配列からなるプローブは、それぞれ異なる菌について高い蛍光強度を示していることから、これらを組み合わせることによって、偽陽性の判定を抑制する効果を得ることが可能となる。このため、本実施形態に係る大腸菌検出用担体は、配列番号７〜９に示す塩基配列からなる少なくとも二以上のプローブを固定化したものとすることがより好ましく、配列番号７〜９に示す塩基配列からなるプローブを全て固定化したものとすることがさらに好ましい。
【００３８】
＜試験３：ＤＮＡチップによる同時検出の検証＞
本実施形態に係る大腸菌検出用担体によって、大腸菌におけるpyrH、vtx1、vtx2の３種類の遺伝子を、同時に特異的に検出できるか否かを検証した。
具体的には、図６に示す配列番号７〜２２の塩基配列からなる各プローブを固定化したＤＮＡチップを作製した。
そして、図１に示す６種類の大腸菌の菌株を用いて、菌株毎に、試験１と同様にして得られたＰＣＲ反応液４μＬと、ハイブリダイゼーション用の緩衝液２μＬ（3×SSC／0.3%SDS  クエン酸−生理食塩水−ドデシル硫酸ナトリウム）を混合したものを、このＤＮＡチップに滴下して、４５℃で１時間反応させた。
反応後、試験２と同様に、ＤＮＡチップを室温下で洗浄液（2×SSC／0.2%SDS溶液、2×SSC溶液の順に）に浸して洗浄を行い、カバーガラスを載せて蛍光検出器Ｂｉｏｓｈｏｔ(東洋鋼鈑株式会社製)により各プローブのスポット領域の蛍光を検出した。その結果を図７に示す。
【００３９】
同図に示すように、配列番号７〜９のpyrH検出用プローブは、６種類全ての大腸菌の菌株について、高い蛍光強度を示した。
これに対して、配列番号１０〜１７のvtx1検出用プローブは、vtx1遺伝子を保有する菌株(3)、(4)、(5)のみについて高い蛍光強度を示し、vtx1遺伝子を保有しない菌株(1)、(2)、(6)については、高い蛍光強度を示さなかった。また、配列番号１８〜２２のvtx2検出用プローブはvtx2を保有する菌株(1)、(2)、(5)のみについて高い蛍光強度を示し、vtx2を保有しない菌株(3)、(4)、(6)については、高い蛍光強度を示さなかった。
以上のことから、本実施形態に係る大腸菌検出用担体によれば、試料中にpyrH、vtx1、vtx2の３種類の遺伝子を含むＤＮＡ断片が存在するか否かを同時に特異的に判定できることが明らかとなった。
【００４０】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能である。例えば、本実施形態に係る大腸菌の検出方法において、ＰＣＲ反応液にその他の成分を含有させたり、あるいは大腸菌検出用担体に、上記以外のプローブをさらに追加して固定化したりするなど適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明は、食品検査、疫学的環境検査、環境検査、臨床試験、及び家畜衛生等において、大腸菌を検出する場合に好適に利用することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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