(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取された試料を分析して、スペルミン、Ｎ−アセチルスペルミン、スペルミジン、Ｎ１−アセチルスペルミジン、Ｎ８−アセチルスペルミジン及びカダベリン（ＣＡＤ）を含むポリアミン類を定量し、得られた分析結果を次式：
Ｙ＝ＡＸＳＰＭ＋ＢＸＮ−ＡｃＳＰＭ＋ＣＸＳＰＤ＋ＤＸＮ８−ＡｃＳＰＤ＋ＥＸＮ１−ＡｃＳＰＤ＋ＦＸＣＡＤ
（式中、Ｙは判別得点を表し、Ｘは前記６種のポリアミン類の合計を１００％としたときの各ポリアミン類の割合を表し、Ａは係数「０．５」、Ｂは係数「−３」、Ｃは係数「−０．１５」、Ｄは係数「−３．５」、Ｅは係数「０．５」、Ｆは係数「０．０４」を表し、ＳＰＭはスペルミン、Ｎ−ＡｃＳＰＭはＮ−アセチルスペルミン、ＳＰＤはスペルミジン、Ｎ１−ＡｃＳＰＤはＮ１−アセチルスペルミジン、Ｎ８−ＡｃＳＰＤはＮ８−アセチルスペルミジン、ＣＡＤはカダベリンを表す。）
で示される判別式に代入し、判別得点Ｙに基づいて、乳がんか否かを判定する乳がんの検査方法。
【請求項２】
判別得点Ｙに基づいて、健常者又は乳がん初発患者のいずれかと判別する請求項１記載の検査方法。
【請求項３】
判別得点Ｙが負であれば健常者、正であれば乳がん初発患者と判別する請求項２記載の検査方法。
【請求項４】
被験者から採取された試料が唾液試料である請求項１〜３のいずれか１項に記載の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料を用いる乳がんの検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳がんは年々罹患率が増加している疾患である。乳がんの検査として触診、ＭＲＩ、マンモグラフィー、生検が一般的である。これらはいずれも患者への負担が大きく、現状ではステージが進行し症状が現れてから発見されるケースが多い。そのため、より簡便な早期診断法の開発が求められている。
【０００３】
一方、いくつかのポリアミン類はがん患者の血清、尿、唾液中で増加するとの報告がされている（非特許文献１及び２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】J. Cancer Res. Clin. Oncol. 1997, 123, 593-545
【非特許文献２】Anal. Chem. 2013, 85, 11835-11842
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、乳がんの簡便な早期診断法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記課題を解決すべく、本発明者らは、試料として採取が容易で、患者に負担をかけない唾液に注目し、乳がん患者の唾液を用いたメタボローム解析により、代謝物を網羅解析しマーカー探索を行ったところ、ほとんど全てのポリアミン類が患者群で高くなっている傾向が見られ、特にスペルミン系、スペルミジン系の代謝物にはｔ検定において有意な差があることが明らかになった。
【０００７】
しかしながら、詳細に検討していくと、総量の個人差がかなり大きく、絶対的な濃度でカットオフ値を設定してしまうと、誤判定を引き起こすことが考えられた。そこで、総量の個人差の影響が最小化されるよう、割合によるパターン差を比較したところ、Ｎ１−アセチルスペルミジンを含む複数種類のポリアミン類の割合を用いれば、高精度で乳がんを判定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）被験者から採取された試料を分析して、ポリアミン及びそのモノ又はジアセチル体から選ばれるポリアミン類であって、Ｎ１−アセチルスペルミジン（Ｎ１−ＡｃＳＰＤ）を含む複数種類のポリアミン類の割合から乳がんか否かを判定する乳がんの検査方法。
（２）前記ポリアミン類が、少なくともスペルミン（ＳＰＭ）、Ｎ−アセチルスペルミン（Ｎ−ＡｃＳＰＭ）、スペルミジン（ＳＰＤ）、Ｎ１−アセチルスペルミジン（Ｎ１−ＡｃＳＰＤ）、Ｎ８−アセチルスペルミジン（Ｎ８−ＡｃＳＰＤ）及びカダベリン（ＣＡＤ）を含む前記（１）に記載の検査方法。
（３）被験者から採取された試料が唾液試料である前記（１）又は（２）に記載の検査方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、簡便にかつ高精度で乳がんを判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は主成分分析の結果を示す。
【図２】図２はＯＰＬＳ−ＤＡ分析のＳ−プロットの結果を示す。
【図３】図３はヒットしたマーカー候補数を示す。
【図４】図４はマーカーのデータベース検索結果を示す。
【図５】図５は測定対象として用いたポリアミン類の構造を示す。
【図６】図６は唾液中ポリアミン類の定量法の概略を示す。
【図７】図７はポリアミン類の選択反応検出（ＳＲＭ；selected reaction monitoring）クロマトグラム及び測定条件を示す。
【図８】図８は健常者群及び乳がん患者初発群の各群の唾液中ポリアミン類の定量平均値を示す。
【図９】図９は健常者群及び乳がん患者初発群の各群における各ポリアミン類の唾液中定量値の平均値の割合を示す。
【図１０】図１０は代表的な４種のＲＯＣ曲線を示す。
【図１１】図１１はＲＯＣ解析の結果を示す。
【図１２】図１２は判別分析で得られた結果を示す。
【図１３】図１３は本発明の検査方法を用いた場合の乳がんとの一致率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明に用いる試料としては、被験者から採取された試料であって、ポリアミン及びそのモノ又はジアセチル体から選ばれるポリアミン類を含有する試料であれば特に制限はなく、例えば、唾液、尿、血清等の血液試料、毛髪等が挙げられるが、採取が容易で、患者に負担をかけない点で唾液が好ましい。
【００１２】
本発明において、被験者からの試料の採取方法は特に制限はなく、例えば、唾液の場合、採取管、検体採取用濾紙、スワブ等を用いる方法が挙げられる。
試料は使用前にそれぞれの試料に応じて前処理をすることが好ましい。具体的には、唾液試料は使用前に前処理、例えば、アセトニトリル等の有機溶媒による希釈、遠心分離による除タンパクをすることが好ましい。通常、除タンパク後の上清を分析に用いる。
【００１３】
本発明において、ポリアミンとは、１分子中にアミノ基を二つ以上有する脂肪族化合物をいう。
本発明の対象となるポリアミン類としては、Ｎ１−アセチルスペルミジン（Ｎ１−ＡｃＳＰＤ）を含む複数種類のポリアミン類であれば特に制限はなく、Ｎ１−アセチルスペルミジン（Ｎ１−ＡｃＳＰＤ）以外のポリアミン類としては、例えばジアミノプロパン（ＤＡＰ）、プトレシン（ＰＵＴ）、Ｎ−アセチルプトレシン（Ｎ−ＡｃＰＵＴ）、カダベリン（ＣＡＤ）、スペルミジン（ＳＰＤ）、Ｎ８−アセチルスペルミジン（Ｎ８−ＡｃＳＰＤ）、ジアセチルスペルミジン（ＤＡｃＳＰＤ）、スペルミン（ＳＰＭ）、Ｎ−アセチルスペルミン（Ｎ−ＡｃＳＰＭ）、ジアセチルスペルミン（ＤＡｃＳＰＭ）が挙げられる。
【００１４】
前記ポリアミン類は、少なくともスペルミン（ＳＰＭ）、Ｎ−アセチルスペルミン（Ｎ−ＡｃＳＰＭ）、スペルミジン（ＳＰＤ）、Ｎ１−アセチルスペルミジン（Ｎ１−ＡｃＳＰＤ）、Ｎ８−アセチルスペルミジン（Ｎ８−ＡｃＳＰＤ）及びカダベリン（ＣＡＤ）を含むことが好ましい。
【００１５】
また、Ｎ１−アセチルスペルミジン（Ｎ１−ＡｃＳＰＤ）の割合は乳がん患者初発群で多く、プトレシン（ＰＵＴ）の割合は健常者群で多いので、これらの２種を少なくとも含むポリアミン類の割合を求めることも効果的である。
【００１６】
ポリアミン類の定量方法としては、正確な測定結果が得られるものであれば特に制限はなく、例えばＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法、ＥＬＩＳＡ法が挙げられ、好ましくはAnal. Chem. 2013, 85, 11835-11842（非特許文献２）に記載の４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−７−フルオロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＤＢＤ−Ｆ）を用いる誘導体化によるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Ｘｅｖｏ  ＴＱ−Ｓ；Ｗａｔｅｒｓ）法が挙げられる。
【００１７】
前記ＤＢＤ−Ｆを用いる誘導体化によるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Ｘｅｖｏ  ＴＱ−Ｓ；Ｗａｔｅｒｓ）法としては、例えば、有機溶媒（例えば、アセトニトリル）、唾液試料及び内部標準（例えば、１，６−ジアミノヘキサン）の混合液を遠心分離して得られる除タンパク後の上清を溶媒留去し、得られた残渣をホウ砂水溶液やトリエチルアミン等の塩基に溶解し、４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−７−フルオロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＤＢＤ−Ｆ）と反応させて誘導体化した後、ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳで分析する方法が挙げられる。
【００１８】
通常、得られた分析結果を判別式に代入することによって、乳がんの診断を行う。ここで用いる判別式は、高い一致率となるように作成したものであれば特に制限はない。
【００１９】
前記ポリアミン類として、スペルミン（ＳＰＭ）、Ｎ−アセチルスペルミン（Ｎ−ＡｃＳＰＭ）、スペルミジン（ＳＰＤ）、Ｎ１−アセチルスペルミジン（Ｎ１−ＡｃＳＰＤ）、Ｎ８−アセチルスペルミジン（Ｎ８−ＡｃＳＰＤ）及びカダベリン（ＣＡＤ）からなる６種のポリアミン類を選択する場合の判別式の一例を以下に示す。
【００２０】
Ｙ＝ＡＸＳＰＭ＋ＢＸＮ−ＡｃＳＰＭ＋ＣＸＳＰＤ＋ＤＸＮ８−ＡｃＳＰＤ＋ＥＸＮ１−ＡｃＳＰＤ＋ＦＸＣＡＤ
（Ｙは判別得点を表し、Ｘは６種のポリアミン類の合計を１００％としたときの各ポリアミン類の割合を表し、Ａは係数「０．５」、Ｂは係数「−３」、Ｃは係数「−０．１５」、Ｄは係数「−３．５」、Ｅは係数「０．５」、Ｆは係数「０．０４」を表す。）
【００２１】
前記の判別式では、判別得点Ｙが負であれば健常者、正であれば乳がん初発患者と判別する。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
個人間の差が小さくなるよう、健常者及び乳がん患者の唾液（初発群、再発群）各２０検体を５検体ずつプールしたサンプルを用意し、２倍量のアセトニトリルを加え、遠心分離して除タンパク後の上清を０．４５μｍフィルターでろ過した。この上清１０μＬをＬＣ−ＴＯＦ−ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ）にインジェクションし、分析した。カラムには逆相（ＲＰ）系のＤｉｓｃｏｖｅｒｙＴＭＨＳ  Ｆ５（ＳＵＰＥＬＣＯ）、ＨＩＬＩＣ系のＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ８０（東ソー）を用い、ＥＳＩポジティブ及びネガティブモードの計４系列で測定した。質量範囲はｍ／ｚ１００〜１０００、保持時間はＲＰ→０〜２０分、ＨＩＬＩＣ→０〜２５分とした。得られたクロマトグラムをＭａｒｋｅｒＬｙｎｘ（Ｗａｔｅｒｓ）で解析した。ポリアミン類の測定には、Anal. Chem. 2013, 85, 11835-11842（非特許文献２）に記載の４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−７−フルオロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＤＢＤ−Ｆ）を用いる誘導体化によるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Ｘｅｖｏ  ＴＱ−Ｓ；Ｗａｔｅｒｓ）法を用いた。
【００２３】
主成分分析の結果を図１に示す。図１において、一点は一サンプルを表し、成分の違いの具合が縦軸横軸に表される。測定した全ての系で視覚的かつ寄与率の観点で明確な差が健常者、初発群、再発群間で得られた。従って、全ての群の成分に差があると判断し、検出された数百から数千の化合物の内、有用なマーカーの絞込みを行う目的でＯＰＬＳ−ＤＡ分析を行った。結果を図２に示す。
【００２４】
ＯＰＬＳ−ＤＡ分析とは主成分分析（ＰＣＡ）の情報に更に群情報を与えた解析である。図２に示したものがＯＰＬＳ−ＤＡ分析によるＳ−プロットであり、一点は一化合物を示している。縦軸は検出された化合物強度の相関が示されており、１に近くなるほどばらつきなく増加、−１に近くなるほどばらつきなく減少したという意味を示している。横軸は強度の違いがとられており、絶対値が増加するほど変化が大きいという意味になっている。従って、有用性のあるマーカーは右上、左下に位置すると判断できる。本実施例では、縦軸で絶対値０．９以上のマーカーを詳しく検証した。
【００２５】
図２に示されたプロットを全ての系で描き、図２の左下及び右上の黒枠にはいる化合物の数を図３に示した。いずれの系でもおよそ二桁の化合物数をピックアップできた。本発明では特に健常者−初発患者間でのマーカー発見を期待したので、これらについての検索を行った。
【００２６】
データベース検索の結果に関しては、特に有益な情報が得られた、ＨＩＬＩＣ系のＥＳＩｐｏｓｉｔｉｖｅモードの結果を例として挙げる。
【００２７】
ピックアップされた５４種の増加化合物のうちピーク形状、強度などの観点から有用性が高いであろうと判断したマーカーのデータベース検索結果を図４に示した。特にＮ１−アセチルスペルミジンは血清、尿中で増加するという癌との関連の報告がなされており、有用ではないかと考えた。従って、標品を用意し保持時間、ＭＳの挙動が同様のものか確認することで、同定試験を行った。
【００２８】
結果として、図４に示したスペクトルのように標品のものと唾液中のものが一致したことからＮ−アセチルスペルミジンと同定した。
従って、他のポリアミン類の増減を定量分析することにより更なる情報が得られるのではないかと考え、これらも含んだ一斉分析に着手した。
【００２９】
マーカー候補としてピックアップできたＮ１−アセチルスペルミジン（Ｎ１−ＡｃＳＰＤ）のほか１１種のポリアミン類を用意した。それぞれのポリアミン類の構造を図５に示した。また図５に記載はしていないが、１，６−ジアミノヘキサン（ＤＡＨ）を内部標準（ＩＳ）として用いた。
【００３０】
唾液中ポリアミン類の定量には、Anal. Chem. 2013, 85, 11835-11842（非特許文献２）に記載の４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−７−フルオロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＤＢＤ−Ｆ）を用いる誘導体化によるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Ｘｅｖｏ  ＴＱ−Ｓ；Ｗａｔｅｒｓ）法を用いた。
【００３１】
唾液中ポリアミン類の定量法の概略を図６に示す。
唾液試料３０μＬ、内部標準（ＩＳ）としての１，６−ジアミノヘキサン（ＤＡＨ）、及びアセトニトリル１２０μＬの混合液を３０００ｇで１０分間遠心分離して除タンパクした上清１２０μＬを溶媒留去した。残渣を０．１Ｍホウ砂水溶液やトリエチルアミン等の塩基に溶解し、４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−７−フルオロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＤＢＤ−Ｆ）と反応させて誘導体化した後、ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳで分析した。
【００３２】
測定結果のクロマトグラム及び測定条件を図７に示す。カラムには逆相系のＯＤＳのカラムを用いた。図７に示す移動相条件で測定したところ、１０分以内に内部標準（ＩＳ）としての１，６−ジアミノヘキサン（ＤＡＨ）を含む１３種全てのポリアミン類を分離検出できた。
【００３３】
健常者群（６１例）及び乳がん患者初発群（１１１例）の各群の定量平均を取ったグラフを図８に示す。濃度はいずれもｎｍｏｌ／１ｍｌの唾液にそろえてある。
ほとんど全てのポリアミン類が患者群で高くなっている傾向が見られ、特にスペルミン系、スペルミジン系の代謝物にはｔ検定において有意な差があることが明らかになった。
【００３４】
しかしながら、詳細に検討していくと、総量の個人差がかなり大きく、絶対的な濃度でカットオフ値を設定してしまうと、誤判定を引き起こすことが考えられた。そこで、総量の個人差の影響が最小化されるよう、割合によるパターン差を比較することにした。
【００３５】
上段に健常者群、下段に乳がん患者初発群の各群における各ポリアミン類の唾液中定量値の平均値の割合を図９に示す。図より、視覚的な差が認められる。
例えば、Ｎ１−アセチルスペルミジン（Ｎ１−ＡｃＳＰＤ）の割合は乳がん患者初発群で多く、プトレシン（ＰＵＴ）の割合は健常者群で多い。
従って、割合の値を用いたＲＯＣ解析を行い、診断指標としてのカットオフ値を設定することとした。
【００３６】
ＲＯＣ解析の結果を図１０及び１１に示す。図１０に示された四つの曲線は代表的なものを例示したものである。また、図１１には、１２種類のＲＯＣ解析の結果を示した。
視覚的には十分差があったように見えたが、いずれのポリアミン類も軒並み６５％程度とマーカーとしては信頼に値しないものであった。
この結果を受け、特に感度、特異度の和が大きかったものにしぼり、判別分析を行い、精度の高い診断が可能とならないかと検討した。
判別分析で得られた結果を図１２に示す。
【００３７】
判別式を統計的に最適化した結果、個々に示すような多元一次方程式を得た。算出条件は図１２に示したように健常者なら−１０点、初発患者であれば１０点がＹとして与えられる。従って、Ｙが負であれば健常者、正であれば初発患者寄りのポリアミン類組成が唾液から得られたことになる。
この判別式が母集団に近いモデルなのかを回帰統計値で確かめた結果、重相関係数は０．５以上またこれに関する分散分析のＰ値は０．１％程度と十分有用性が得られる結果となった。
【００３８】
図１２に示した判別式に作成に用いたセットを代入するとその一致率は全体で８２％、更にほかの検体セットに代入した結果は８８％と約８５％程度の一致率を示した（図１３）。
以上より、本発明の検査方法は生体試料を用いる乳がん診断に適用できると考えられる。
【図１】
0006614435.tif 000002
【図２】
0006614435.tif 000003
【図３】
0006614435.tif 000004
【図４】
0006614435.tif 000005
【図５】
0006614435.tif 000006
【図６】
0006614435.tif 000007
【図７】
0006614435.tif 000008
【図８】
0006614435.tif 000009
【図９】
0006614435.tif 000010
【図１０】
0006614435.tif 000011
【図１１】
0006614435.tif 000012
【図１２】
0006614435.tif 000013
【図１３】
0006614435.tif 000014