(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵臓前駆細胞群を製造する方法であって、以下を含む方法：
ｉ）多能性細胞群を供給し；
ｉｉ）該多能性細胞群を胚体内胚葉（ＤＥ）誘導培地中で培養して、胚体内胚葉（ＤＥ）細胞群を作製し、
ただし、該胚体内胚葉（ＤＥ）誘導培地は、ＴＧＦβリガンド、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびＰＩ３Ｋインヒビターを含有しており；
ｉｉｉ）該胚体内胚葉細胞群を、アクチビンアンタゴニスト；ＦＧＦ；レチノイン酸；およびＢＭＰインヒビターを含有する第１の膵臓誘導培地中で培養して、背側前腸細胞群を作製し；
ｉｖ）該背側前腸細胞を、ＦＧＦ、レチノイン酸、ＢＭＰインヒビターおよびヘッジホッグシグナル伝達インヒビターを含有する第２の膵臓誘導培地中で培養し；
ｖ）上記ｉｖ）で調製された細胞を、ＦＧＦを含有する第３の膵臓誘導培地中で培養する；
ことによって、膵臓前駆細胞群を製造する。
【請求項２】
胚体内胚葉（ＤＥ）誘導培地が、ＴＧＦβリガンド、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＰＩ３Ｋインヒビター、及びＧＳＫ３βインヒビターを含有する既知組成培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
胚体内胚葉（ＤＥ）誘導培地が、基本培地、アクチビン、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびＬＹ２９４００２からなる既知組成培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
胚体内胚葉（ＤＥ）誘導培地が、基本培地、アクチビン、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＬＹ２９４００２、及びＧＳＫ３βインヒビターからなる既知組成培地である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
上記細胞を、上記培地中で２〜４日間培養して、ＤＥ細胞群を作製する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１または請求項２に記載の方法であって、ステップ（ｉｉ）が、以下を含む方法：
（ａ）上記多能性細胞群を、上記ＤＥ誘導培地中で培養し、ただし、上記ＤＥ誘導培地が、さらにＧＳＫ３βインヒビターを含有し、
（ｂ）上記細胞群を、ＧＳＫ３βインヒビターを含有しない胚体内胚葉誘導培地中でさらに培養し；及び、
（ｃ）上記細胞群を、ＴＧＦβリガンドおよび線維芽細胞成長因子を含有する前方胚体内胚葉（ＡＤＥ）誘導培地中でさらに培養して、胚体内胚葉（ＤＥ）細胞群を作製する。
【請求項７】
前方胚体内胚葉（ＡＤＥ）誘導培地が、基本培地、アクチビンおよび線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）からなる既知組成培地である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記細胞群を（ａ）〜（ｃ）の各ステップにおいて２４時間培養する、請求項６または請求項７に記載の方法。
【請求項９】
胚体内胚葉細胞が、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４およびＧＳＣを発現する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
第１の膵臓誘導培地が、アクチビン／ＴＧＦβアンタゴニスト、ＦＧＦ、レチノイン酸、およびＢＭＰアンタゴニストを含有する既知組成培地である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
第１の膵臓誘導培地が、基本培地、ＳＢ−４３１５４２、ＦＧＦ、レチノイン酸、およびノギンからなる既知組成培地である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
背側前腸細胞が、ＲＦＸ６、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ１ｂ、ＳＯＸ２、ＨＮＦ４ａおよびＨＬＸＢ９を発現する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
第２の膵臓誘導培地が、ＦＧＦ、ＢＭＰアンタゴニスト、レチノイン酸およびヘッジホッグシグナル伝達インヒビターを含有する既知組成培地である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
第２の膵臓誘導培地が、基本培地、ＦＧＦ、レチノイン酸、ノギン、およびＫＡＡＤ−シクロパミンからなる既知組成培地である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
第３の膵臓誘導培地が、ＦＧＦを含有する既知組成培地である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
第３の膵臓誘導培地が、基本培地、及びＦＧＦからなる既知組成培地である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
第３の膵臓誘導培地がさらにレチノイン酸を含有する、請求項１５または請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
膵臓前駆細胞が、ＰＤＸ１、ＳＯＸ９、ＨＮＦ６、ＮＫＸ６．１およびＰＴＦ１ａを発現する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
膵内分泌細胞群を製造する方法であって、
請求項１〜１８のいずれかに記載の方法によって膵臓前駆細胞群を生成し、
該膵臓前駆細胞群を成熟させて膵内分泌細胞群を作製することを含む、方法。
【請求項２０】
該膵臓前駆細胞群を、ｉ）第１の内分泌誘導培地中で培養し、及びｉｉ）第２の内分泌誘導培地で培養することによって成熟させて、膵内分泌細胞群を作製する、請求項１９に記載の方法であって、
ただし、第１の内分泌誘導培地は、ノッチシグナル伝達インヒビターを含有する既知組成培地であり；及び第２の内分泌誘導培地は、分化因子を含有しない既知組成培地である、方法。
【請求項２１】
第１の内分泌誘導培地が補充基本培地およびＮ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェンアセチル）−１−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）からなる既知組成培地であり；及び第２の内分泌誘導培地が補充基本培地からなる既知組成培地である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
膵臓前駆細胞を、ｉ）第１の内分泌誘導培地中で培養し、及びｉｉ）第２の内分泌誘導培地で培養することによって成熟させて、膵内分泌細胞群を作製する、請求項１９に記載の方法であって、
ただし、第１の内分泌誘導培地は、ノッチシグナル伝達インヒビターおよびレチノイン酸を含有する既知組成培地であり；及び第２の内分泌誘導培地は、レチノイン酸以外の分化因子を含有しない既知組成培地である、方法。
【請求項２３】
第１の内分泌誘導培地が、補充基本培地、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェンアセチル）−１−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）およびレチノイン酸からなる既知組成培地であり；及び第２の内分泌誘導培地が、補充基本培地およびレチノイン酸からなる既知組成培地である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
膵内分泌細胞が、ＮＧＮ３、ＩＮＳ、ＳＳＴおよびＧＬＵを発現する、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
分化細胞群において１つまたは複数の細胞マーカーの発現をモニターおよび／または検出することを含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
膵臓前駆細胞群または膵内分泌細胞群を増大させることを含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
膵臓前駆細胞群または膵内分泌細胞群を、培養または維持することを含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
膵臓前駆細胞群または膵内分泌細胞群を、貯蔵することを含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
膵臓前駆細胞群を、治療上許容可能な賦形剤と混合することを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
膵内分泌細胞群を、治療上許容可能な賦形剤と混合することを含む、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
多能性細胞がヒト多能性細胞である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
多能性細胞がＥＳＣまたはｉＰＳＣである、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
多能性細胞が、膵臓異常に関連する遺伝的背景を有する個体由来のｉＰＳ細胞である、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
多能性細胞が、膵臓異常に関連する遺伝性疾患を有する個体由来のｉＰＳ細胞である、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類多能性細胞の、膵臓へのインビトロ分化誘導に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医学の主要な目的は、膵ベータ細胞の作製である。実際、大量の膵ベータ細胞の供給が可能になれば、現在、臓器提供の不足やインスリン分泌細胞をインビトロで増やすことの困難性のために制限されている、糖尿病の細胞療法を開発することが可能になる。胚由来（ヒト胚幹細胞またはｈＥＳＣ）［１］、または初期化された体細胞（ヒト人工多能性幹細胞またはｈＩＰＳＣ）［２］により生成された、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、これらの制約を迂回する可能性を提供する。実際、上述の細胞は、膵臓前駆体細胞を含む、多数の細胞種に分化する能力を維持しながら、インビトロにて無制限に増殖することができる［３−６］。しかし、培養条件を定義し、これらの細胞の均質な個体群を産生できる確固としたプロトコルは、未だ構築されていない。実際に、利用可能な方法は、フィーダー、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、マトリゲルなどの未定義の動物産物を含有する。
【０００３】
さらに、そのような方法は、不均質な細胞群を産生することができるだけであるので、移植後の奇形腫形成の可能性が高まる［７、８］。また、そのような方法は、限られた数のｈＰＳＣ系［３］に対してのみ効率よく働くように見えるため、数多くの試験室での使用には至っていない。
【０００４】
ｈＰＳＣを直接分化させるために現在使用されている培養系の多くは、完全に機能し得る細胞型の生成を促進することができたことから、正常な発生を模している。したがって、マウスまたは他の脊椎動物モデルを使っての研究により得られた知識は、ヒトｈＰＳＣを特定の分化系列に動因する戦略のための知識として使用されてきた。
【０００５】
膵臓および肝臓は、胎齢約８．５〜９．５日で、発達中の原始前腸に隣接する領域から、近くの中胚葉により分泌される誘導シグナルの影響下に、発生する［９］。これらのシグナルは、膵臓特定化に必要な、ＨＸＬＢ９やＰＤＸ１などの転写因子の発現を指令しているようである。ＨＸＬＢ９は、膵芽の形成に先立ち背側前腸を特徴付けし［１０、１１］、ＰＤＸ１は、腹側および背側膵芽が発生する、前腸の領域を特徴付けする［１２、１３］。
【０００６】
新規に特定された膵臓前駆細胞は、ＰＴＦ１Ａ、ＮＫＸ６．１およびＳＯＸ９などの、その他のマーカーを迅速に発現し、これらの前駆細胞は、膵臓の内分泌（ランゲルハンス島）および外分泌（腺房および腺管細胞）細胞の両者を形成する。同様のメカニズムにより肝臓の特定化も制御されるが、ＨＥＸ、ＧＡＴＡ６、ＰＲＯＸ１およびＨＮＦ４αなどの異なる転写因子［１４］やＢＭＰやＦＧＦなどのシグナル伝達経路が関与する［１５］。この幅広い知識にもかかわらず、細胞外シグナル伝達経路を膵臓または肝臓前駆細胞を特徴付ける転写制御ネットワークに編成する分子メカニズムは、特にヒトにおいて、明確になっていない。ｈＰＳＣは、この大仕事を完成するための独特な利点を提供することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】[1] Thomson JA et al (1998) Science 282: 1145-1147
【非特許文献２】[2] Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, et al. (2007) Cell 131: 861-872
【非特許文献３】[3] D'Amour KA, et al. (2006) Nat Biotechnol 24: 1392-1401
【非特許文献４】[4] Jiang W, et al. (2007). Cell Res 17: 333-344
【非特許文献５】[5] Maehr R, et al. (2009) Proc Natl Acad Sci U S A 106: 15768-15773
【非特許文献６】[6] Zhang D, Jiang W, Liu M, et al. (2009) Cell Res 19:429-438
【非特許文献７】[7] Kroon E,et al. (2008)  Nat Biotechnol 26: 443-452
【非特許文献８】[8] Kelly OG, et al. (2011) Nat Biotechnol 29: 750-756
【非特許文献９】[9] Zaret KS, Grompe M (2008) Science 322: 1490-1494
【非特許文献１０】[10] Harrison KA, et al (1999) Nat Genet 23: 71-75
【非特許文献１１】[11] Li H, et al (1999) Nat Genet 23: 67-70
【非特許文献１２】[12] Jonsson J, et al (1994) Nature 371: 606-609
【非特許文献１３】[13] Offield MF,et al. (1996) Development 122:983-995
【非特許文献１４】[14] Sherwood RI, et al (2009) Dev Dyn 238: 29-42
【非特許文献１５】[15] Wandzioch E, Zaret KS (2009). Science 324: 1707-1710
【非特許文献１６】[16] Rashid ST et al. (2010) J Clin Invest 120: 3127-3136
【非特許文献１７】[17] Brons IG et al. (2007) Nature 448: 191-195
【非特許文献１８】[18] Touboul T, et al. (2010) Hepatology 51: 1754-1765
【非特許文献１９】[19] Vallier L, et al (2004) Stem Cells 22: 2-11
【非特許文献２０】[20] Teo AK, , et al. (2011) Genes Dev 25: 238-250
【非特許文献２１】[21] Mfopou JK et al (2010) Gastroenterology 138: 2233-2245
【非特許文献２２】[22] Cai J, et al. (2010) J Mol Cell Biol 2:50-60
【非特許文献２３】[23] Wells JM, Melton DA (2000) Development 127: 1563-1572
【非特許文献２４】[24] Spence JR et al. (2011) Nature 470: 105-109
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【非特許文献２６】[26] Habener JF, et al (2005) Endocrinology 146: 1025-1034
【非特許文献２７】[27] Ameri J,et al. (2010) et al. Stem Cells 28: 45-56
【非特許文献２８】[28] Nostro MC, et al, et al. (2011) Development 138: 861-871
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【非特許文献３０】[30] Brown S et al. (2011) Stem Cells 29: 1176-1185
【非特許文献３１】[31] Inamura M et al. Mol Ther 19: 400-407
【非特許文献３２】[32] Bort R et al (2004) Development 131: 797-806
【非特許文献３３】[33] Kubo A, et al. (2009) Hepatology 51: 633-641
【非特許文献３４】[34] Ramos-Mejia V et al. (2010) Mol Ther 18: 2173-2181
【非特許文献３５】[35] Vallier L et al. (2009) Development 136: 1339-1349
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、多能性細胞を高効率で膵臓前駆細胞および膵内分泌細胞にインビトロ分化させる方法に関する。この方法は、例えば、細胞療法または疾患モデリングのための膵臓細胞の作製に有用である。
【０００９】
本発明の一態様は、膵臓前駆細胞群を作製する方法を提供する。該方法は、
ｉ）多能性細胞群を供給し、
ｉｉ）該細胞群を胚体内胚葉（ＤＥ）誘導培地中で培養して胚体内胚葉細胞群を作製し、ここで、該ＤＥ誘導培地は、ＴＧＦβリガンド、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびＰＩ３Ｋインヒビター、さらに必要に応じてＧＳＫ３βインヒビターを含有し、
ｉｉｉ）該胚体内胚葉細胞群を、アクチビンアンタゴニスト、ＦＧＦ、レチノイン酸およびＢＭＰインヒビターを含有する第１の膵臓誘導培地内で培養して背側前腸細胞群を作製し、
ｉｖ）該背側前腸細胞群をＦＧＦ、レチノイン酸、ＢＭＰインヒビターおよびヘッジホッグシグナル伝達インヒビターを含有する第２の膵臓誘導培地内で培養し、
ｖ）該内胚葉細胞群をＦＧＦを含有する第３の膵臓誘導培地内で培養する、
ことにより、膵臓前駆細胞群を作製することを有する、膵臓前駆細胞群を作製する方法である。
【００１０】
該膵臓前駆細胞はさらに膵内分泌細胞に分化してもよく、例えば、さらに
（ｖｉ）該膵臓前駆細胞群を第１の内分泌誘導培地および第２の内分泌誘導培地内で培養し、膵内分泌細胞群を作製することを有する、方法であってもよい。
【００１１】
多能性細胞は、未分化の表現型を発現する細胞であり、潜在的に多分化能を有する。すなわち、３種の胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）のいずれかの胎児または成人細胞型のいずれにも分化することができる。多能性細胞は、全能細胞とは異なり、胚外細胞分化系列を引き起こすことはできない。多能性細胞は、多能性関連マーカー、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼ、ＰＯＵ５ｆ１、ＳＳＥＡ−３、ナノグ、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、ＫＬＦ−４およびｃ−ｍｙｃ、好ましくはＰＯＵ５ｆ１、ナノグおよびＳＯＸ２の１つまたは複数を発現してよい。ヒト多能性細胞は、Ｂｒａ、Ｓｏｘ１７、ＦｏｘＡ２、αＦＰ、Ｓｏｘ１、ＮＣＡＭ、ＧＡＴＡ６、ＧＡＴＡ４、Ｈａｎｄ１およびＣＤＸ２などの特定の分化死関連マーカーを欠いていてよい。
【００１２】
多能性細胞は、哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞であってよい。
【００１３】
多能性細胞群は、クローン性、例えば、単一の共通祖先細胞に由来する遺伝的に同一の細胞であってよい。
【００１４】
本方法の使用に適する多能性細胞群は、１つまたは複数の他の細胞型を実質的に有さなくてよい。多能性細胞は、例えば、ＳＳＥＡ４などの幹細胞上に見出される分子の細胞外領域に対する抗体を使用する、抗体および磁性ビーズまたは蛍光活性化細胞選別（ＭＡＣＳまたはＦＡＣＳ）による細胞外エピトープの認識に基づく方法などの当業者に公知の方法により、他の細胞型から分離されてよい。
【００１５】
多能性細胞として、胚幹細胞（ＥＳＣ）、胎児および成人体性幹細胞およびｉＰＳ細胞などであってよい。
【００１６】
好適な胚幹細胞を従来の方法により取得してよい。例えば、ＥＳＣ細胞を、ｈＥＳＣ株などの培養ＥＳＣ細胞株から取得してよい。ＣＨＢ−１〜ＣＨＢ−１２、ＲＵＥＳ１〜ＲＵＥＳ３、ＨＵＥＳ１〜ＨＵＥＳ２８、ＨＵＥＳ４５、ＨＵＥＳ４８、ＨＵＥＳ４９、ＨＵＥＳ５３、ＨＵＥＳ６２〜ＨＵＥＳ６６、ＷＡ０１（Ｈ１）、ＷＡ０７（Ｈ７）、ＷＡ０９（Ｈ９）、ＷＡ１３（Ｈ１３）、ＷＡ１４（Ｈ１４）、ＮＹＵＥＳ１〜ＮＹＵＥＳ７、ＭＦＳ５およびＵＣＬＡ１〜ＵＣＬＡ３などの多くの培養ｈＥＳＣ株が、寄託所（例えば、ＮＩＨヒト胚幹細胞登録所）から公に入手可能である。さらに、好適なヒト胚幹細胞株は、例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：  １１４５−１１４７  （１９９８）；  Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８：３９９−４０４  （２０００）；  Ｃｏｗａｎ，  Ｃ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３５０，  １３５３−１３５６（２００４），  Ｇａｇｅ，  Ｆ．Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １８  １５９−１９２  （１９９５）；およびＧｏｔｌｉｅｂ  （２００２）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２５  ３８１−４０７）；  Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  ５（１）：  ７９−８８  （２００３）に記載されている。臨床応用可能な程度のｈＥＳＣはＫｌｉｍａｎｓｋａｙａ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｌａｎｃｅｔ  ３６５，  １６３６−１６４１  （２００５）およびＬｕｄｗｉｇ，Ｔ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２４，  １８５−１８７  （２００６）に記載されている。
【００１７】
好適なｈＥＳＣは、ヒト胚を破壊せずに取得してよい。
【００１８】
他の実施形態では、多能性細胞はｈＥＳＣではなく、例えば、胎児もしくは成人体性幹細胞またはｉＰＳ細胞、好ましくはヒトｉＰＳ細胞である。
【００１９】
ｉＰＳ細胞は、非多能性の完全に分化した祖先細胞に由来する、多能性細胞である。好適な祖先細胞としては、成人線維芽細胞および末梢血液細胞などが挙げられる。祖先細胞は、一般的には、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１などの多能性遺伝子またはタンパク質を細胞に導入して初期化する。該遺伝子またはタンパク質は、プラスミド、より好ましくはウイルストランスフェクションまたは直接的タンパク質送達を含む好適な方法により分化させた細胞に導入してよい。他の遺伝子、例えば、Ｋｉｆ−１、−２、−４および−５などのＫｉｆ遺伝子、Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃおよびＮ−ｍｙｃなどのＭｙｃ遺伝子、ナノグおよびＬｉｎ２８も細胞に導入して、誘導効率を上げてもよい。多能性遺伝子またはタンパク質の導入後に祖先細胞を培養してよい。多能性マーカーを発現する細胞は、分離および／または精製し、ｉＰＳ細胞群を作製してよい。ｉＰＳ細胞は、当技術分野で周知の方法により作製される（Ｙａｍａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  ２００７；  ４４８：３１３−７；  Ｙａｍａｎａｋａ  ６  ２００７  Ｊｕｎ  ７；  １（１）：３９−４９；  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ．  ２００８  Ｊｕｌ  ３１；  ４５４（７２０４）：６４６−５０；  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｃｅｌｌ．  ２００７  Ｎｏｖ  ３０；  １３１（５）：８６１−７２．  Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ．  ２００８  Ｊａｎ  １０；  ４５１（７１７５）：１４１−６；  Ｋｉｍｅｔ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．  ２００９  Ｊｕｎ  ５；４（６）：４７２−６；  Ｖａｌｌｉｅｒ，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，  ２００９．  ９９９９（９９９Ａ）：  ｐ．  Ｎ／Ａ））。
【００２０】
ｉＰＳ細胞は、遺伝性疾患のない個体から得られた、線維芽細胞などの細胞に由来してよい。遺伝性疾患のない個体由来のｉＰＳ細胞は、正常（すなわち、非疾患関連）遺伝子型を有する膵臓前駆細胞および膵内分泌細胞を作製するために、ここに記載されるように、使用されてよい。
【００２１】
ｉＰＳ細胞は、異なる遺伝的背景を有する個体から得られた、線維芽細胞などの細胞に由来してよい。例えば、ｉＰＳ細胞は、１型および２型糖尿病などの糖尿病状態などの膵臓異常を有する個体、高リスクの膵臓異常を有する個体および／または低リスクの膵臓異常を有する個体の細胞から作製されてよい。ここに記載されるように、異なる遺伝的背景を有する個体から作製された膵臓細胞は、糖尿病などの膵臓異常のメカニズムの研究や、治療標的の確認に使用されてよい。
【００２２】
ｉＰＳ細胞は、例えば、１型および２型糖尿病などの糖尿病状態、膵臓非形成、遺伝性膵炎、家族性膵炎、シュワッハマン・ダイアモンド症候群および膵臓癌あるいは膵臓症状または合併症を有する遺伝性疾患を含む、膵臓発生に影響を及ぼす遺伝性疾患および／または膵機能障害に関連する遺伝性疾患を有する個体から得られた、繊維芽細胞などの細胞に由来してよい。遺伝性疾患には単一遺伝子障害を含んでよい。
【００２３】
真皮線維芽細胞などの線維芽細胞の検体を簡便に取得してもよいが、遺伝子突然変異または欠陥などの障害の遺伝子型を有する細胞を、ｉＰＳ細胞の作製に使用してもよい。
【００２４】
膵臓発生に影響を及ぼす遺伝性疾患および／または膵機能障害に関連する遺伝性疾患などを有する個体の細胞から作製されたｉＰＳ細胞は、ここに記載されるように、遺伝性疾患の遺伝子型を有する膵臓細胞を作製するために使用されてよい。該膵臓細胞は、一般的に遺伝性疾患に関連する遺伝子突然変異または欠陥を有する。これらの細胞は、上述のような遺伝性疾患を有する患者の治療または糖尿病状態などの膵臓疾患のモデリングに有用である。
【００２５】
多能性細胞は、従来の方法により多能性細胞株から取得してよい（Ｖａｌｌｉｅｒ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  ２７５，  ４０３−４２１  （２００４），  Ｃｏｗａｎ，  Ｃ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３５０，  １３５３−１３５６  （２００４），  Ｊｏａｎｎｉｄｅｓ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２４，  ２３０−２３５  （２００６）  Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｌａｎｃｅｔ  ３６５，  １６３６−１６４１  （２００５），  Ｌｕｄｗｉｇ，Ｔ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２４，  １８５−１８７  （２００６））。本方法に使用される多能性細胞は、限定条件下またはフィーダー細胞上で成長させてよい。例えば、多能性細胞を、従来のように、適当な濃度の照射（例えば、１０5〜１０6個／６０ｍｍディッシュ）を受けたマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）などのフィーダー細胞層上またはフィーダー条件付けまたは限定された培地を有する適当な基質上の培養皿中で培養してもよい。本方法に使用される多能性細胞は、酵素的または機械的手段により継代培養されてよい。多能性細胞の好適な培養媒体としては、２０％の血清代替物、１％の非必須アミノ酸、１ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノールおよび４ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２が補充されたノックアウト・ダルベッコ変法イーグル培地（ＫＯ−ＤＭＥＭ）が挙げられる。
【００２６】
その他の好適な多能性細胞の培養培地としては、４ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２が補充されたノックアウト（ＫＳ）培地、２０％の血清代替物、１％の非必須アミノ酸、１ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノールおよび４ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬのヒトＦＧＦ２が補充されたノックアウト・ダルベッコ変法イーグル培地（ＫＯ−ＤＭＥＭ）および２０％のノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）、６ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、１ｍＭのＬ−Ｇｌｎ、１００μｍの非必須アミノ酸、１００μＭの２−メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび５０ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２が挙げられる。
【００２７】
好ましい実施形態では、本方法に使用される多能性細胞群は、後述のように分化が誘導される前に、アクチビンＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍＬ）を含有する既知組成培地（ＣＤＭ）で培養し、多分化能を維持してよい（Ｖａｌｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。多能性細胞は、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）（ＢｉｏＷｅｓｔ）などのコラゲナーゼ不含試薬を用いて回収してもよい。
【００２８】
いくつかの実施形態では、多能性細胞は、組織特異的プロモーター（すなわち、膵臓特異的プロモーター）に操作可能に連結されたレポーター、好ましくは蛍光性レポーターを有してよい。膵臓前駆細胞または膵内分泌細胞に分化させた後、ここに記載されるように、レポーターを発現する細胞を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などにより、その他の細胞から分離または／または精製してよい。
【００２９】
多能性細胞は、４ステップの工程で膵臓前駆細胞に分化させてよい。まず、多能性細胞群を胚体内胚葉（ＤＥ）細胞群に分化誘導する。次いで、ＤＥ細胞を背側前腸細胞に分化誘導する。背側前腸細胞は、２ステップで膵臓前駆細胞に分化誘導される。
【００３０】
各ステップにおける細胞群の分化の広がりは、分化細胞群中の１つまたは複数の細胞マーカーの発現をモニターおよび／または検出することにより、細胞培養中に測定してよい。例えば、分化の進んだ細胞型に特有のマーカーの発現の増加、または未分化の状態の細胞型に特有のマーカーの発現の減少を測定してよい。細胞マーカーの発現は、免疫細胞化学、免疫蛍光法、ＲＴ−ＰＣＲ、免疫ブロット法、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）および酵素学的分析などの適当な方法により測定してよい。
【００３１】
各ステップの後、各ステップにより作製された部分的に分化した細胞群は、他の細胞型を実質的に有さないものとできる。例えば、細胞群は、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上の部分的に分化した細胞を含有して、次の培地中での培養を行う。細胞群は、精製の必要がないように、他の細胞型を実質的に含まないことが好ましい。精製が必要な場合には、部分的に分化した細胞群をＦＡＣＳなどの便利な方法により精製してよい。
【００３２】
ここに記載した方法の一ステップにより作製された部分的に分化した細胞群を、次の分化ステップ前に、培養、維持または増大させてよい。部分的に分化させた細胞は、適当な方法により増大させてよい。
【００３３】
各ステップの分化誘導は、既知組成培地（ＣＤＭ）、好ましくは分化ステップを行うために細胞を誘導する一連の分化因子が補充されたヒト化ＣＤＭ中で細胞を培養することを有する。各培地に含まれる一連の分化因子は、好ましくは消耗性であり、培地は他の分化因子を欠いていてよい。
【００３４】
既知組成培地（ＣＤＭ）（合成培地）（化学特定培地）は、特定の成分、好ましくは化学構造が既知の成分のみを含有する、細胞培養用栄養液である。ＣＤＭは、フィーダー細胞、間質細胞、血清、マトリゲル、血清アルブミンおよび細胞外マトリックス複合体などの未定義の成分または構成要素を含有しない。好ましくは、既知組成培地はヒト化されている。ヒト化既知組成培地は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、マウスフィーダー細胞などの非ヒト動物由来の成分または補足物を含有しない。馴化培地は、培養細胞由来の未定義の成分を含有し、化学的に定義されていない。
【００３５】
好適な既知組成基本培地には、高度ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ  Ｆｏｃｕｓ  （２００３）  ２５  ３−６）が含まれる。高度ＤＭＥＭは、当技術分野で周知であり、商業的供給源（例えば、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）から容易に入手可能である。高度ＤＭＥＭの成分を表１に示す。いくつかの好ましい実施形態では、高度ＤＭＥＭを、ここに記載される膵臓誘導培地における基礎培地として使用してよい。
【００３６】
他の好適な既知組成基本培地としては、ポリビニルアルコール、インスリン、トランスフェリンおよび確定した脂質が補充されたＣＤＭ−ＰＶＡ（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｓ  （１９９５）  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５，  １４１−１５１）が挙げられる。ヨハンソン・ワイルズ（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ＆Ｗｉｌｅｓ）ＣＤＭは、５０％のＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ）及び５０％のＦ１２  ＮＵＴ−ＭＩＸ（Ｇｉｂｃｏ）；７μｇ／ｍＬのインスリン；１５μｇ／ｍＬのトランスフェリン；１ｍｇ／ｍＬのポリビニルアルコール（ＰＶＡ：１％の既知組成の脂質濃縮物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；および４５０μＭの１−チオグリセロールからなる。いくつかの好ましい実施形態では、ＣＤＭ−ＰＶＡをここに記載した内胚葉誘導培地に使用してよい。
【００３７】
他の好適な既知組成基本培地としては、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｍｏｏｒｅ，  Ｇ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ  Ｌ．Ｋ．，  （１９７６）  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ．  ３，  ５０３−５０８）が挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、ＲＰＭＩ−１６４０をここに記載される前方胚体内胚葉誘導培地として使用してよい。
【００３８】
他の好適な既知組成基本培地が当技術分野で公知であり、商業的供給源（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＭＩ  ＵＳＡ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＵＳＡ）から入手可能である。
【００３９】
使用に適当な既知組成基本培地は、ここに記載されるように、無血清培地補充物（例えば、補充基本培地）を有してよい。好適な無血清培地補充物としては、後述するＢ２７およびＮＳ２１が挙げられる。ここでの培地は、好ましくは無血清である。無血清状態および動物産物不含とすることにより、臨床応用のためのスケールアップが促進される。
【００４０】
ＣＤＭ／ＰＶＡ、ＲＰＭＩ−１６４０、高度ＤＭＥＭなどの既知組成基本培地は、ここに記載されるように、特定の一連の分化因子を補い、内胚葉または膵臓誘導培地とするか、または内分泌誘導してよい。
【００４１】
分化因子は、哺乳動物細胞における分化を仲介するシグナル伝達経路を、例えば、促進または抑制するように調節する因子である。分化因子には、成長因子およびアクチビン／ノダル（Ｎｏｄａｌ）、ＦＧＦ、ＷｎｔまたはＢＭＰシグナル伝達経路の１つまたは複数を調節するインヒビターが含まれる。タンパク質である分化因子は、好ましくは、組換えヒト因子である。
【００４２】
分化因子としては、例えば、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、レチノイン酸、ＴＧＦ、ＧＤＦ３、ＬＩＦ、ＩＬ、アクチビンおよびホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）インヒビターが挙げられる。
【００４３】
ここに記載される１つまたは複数の培地に使用される分化因子には、ＴＧＦβリガンド、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＰＩ３Ｋインヒビター、アクチビン／ＴＧＦβアンタゴニスト、レチノイン酸、ＢＭＰアンタゴニスト、ヘッジホッグシグナル伝達インヒビター、ノッチシグナル伝達インヒビターおよびＧＳＫ３βインヒビターが含まれる。
【００４４】
ＴＧＦβリガンドは、哺乳動物細胞内でＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３を介する細胞内シグナル伝達経路を刺激するＴＧＦβスーパーファミリーのペプチドである。ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーは、特徴的な構造を有し、当技術分野において公知である。
【００４５】
ＴＧＦβリガンドは、アクチビン、ＴＧＦβ、ノダルまたはＧＤＦ３でよく、アクチビンが好ましい。
【００４６】
アクチビン（アクチビンＡ：ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ：３６２４核酸参照配列ＮＭ＿００２１９２．２  ＧＩ：６２９５３１３７、アミノ酸参照配列ＮＰ＿００２１８３．１  ＧＩ：４５０４６９９）は、アクチビン／ノダル経路の刺激を介する細胞効果の範囲に影響を与える二量体ポリペプチドである（Ｖａｌｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１８：４４９５−４５０９  （２００５））。アクチビンは、商業的供給源（例えば、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ  Ｉｎｃ．  ＭＡ  ＵＳＡ）から容易に入手できる。簡便には、ここに記載される培地中のアクチビンの濃度は、１０〜１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
【００４７】
ＴＧＦβ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：７０４０核酸参照配列ＮＭ＿０００６６０．４  ＧＩ：２６０６５５６２１、アミノ酸参照配列ＮＰ＿０００６５１．３  ＧＩ：６３０２５２２２）は、増殖と分化を制御するホモ二量体ポリペプチドである（Ｗａｔａｂｅ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ  （２００９）．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  １９：１０３−１１５）。組換えヒトＴＧＦβは、商業的供給源（例えば、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ  Ｉｎｃ．ＭＡ  ＵＳＡ）から容易に入手できる。好適には、培地中のＴＧＦβの濃度は、１０〜１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
【００４８】
ノダル（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ４８３８核酸配列参照配列ＮＭ＿０１８０５５．４  ＧＩ：２２２３５２０９７、アミノ酸参照配列ＮＰ＿０６０５２５．３  ＧＩ：２２２３５２０９８）は、分化を制御するＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーである（Ｈａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．  ３  （２）：  １０３−１３）。ノダルは、商業的供給源（例えば、Ａｂｃａｍ  Ｌｔｄ，ＵＫ）から容易に入手できる。好適には、培地中のノダルの濃度は、１０〜１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
【００４９】
ＧＤＦ３（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ９５７３核酸参照配列ＮＭ＿０２０６３４．１  ＧＩ：１０１９０６６９、アミノ酸参照配列ＮＰ＿０６５６８５．１  ＧＩ：１０１９０６７０）は、多塩基タンパク質分解プロセシング部位の開裂による、７つの保存システイン残基を有する成熟ＧＤＦ３タンパク質の作製により特徴付けられる、ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーである。好適には、培地中のＧＤＦ３の濃度は、１０〜１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
【００５０】
線維芽細胞成長因子は、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）に結合することにより、細胞の成長、増殖、分化を刺激するタンパク質因子である。好適な線維芽細胞成長因子には、ＦＧＦ１〜ＦＧＦ１４およびＦＧＦ１５〜ＦＧＦ２３など、ＦＧＦファミリーのメンバーが含まれる。
【００５１】
好ましくは、線維芽細胞成長因子は、ＦＧＦ２（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２２４７、核酸配列ＮＭ＿００２００６．３  ＧＩ：４１３５２６９４、アミノ酸配列ＮＰ＿００１９９７．４  ＧＩ：４１３５２６９５）、ＦＧＦ７（ケラチノサイト成長因子（またはＫＧＦ）としても知られている）ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２２４７、核酸配列ＮＭ＿００２００６．３  ＧＩ：４１３５２６９４、アミノ酸配列ＮＰ＿００１９９７．４  ＧＩ：４１３５２６９５）またはＦＧＦ１０（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２２４７、核酸配列ＮＭ＿００２００６．３  ＧＩ：４１３５２６９４、アミノ酸配列ＮＰ＿００１９９７．４  ＧＩ：４１３５２６９５）である。最も好ましくは、線維芽細胞成長因子は、ＦＧＦ１０（Ａｍｉｔ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２２７：２７１−２７８  （２０００））である。通常、ここに記載の培地中のＦＧＦの濃度は、１〜５００ｎｇ／ｍＬ、例えば、１０〜１５０ｎｇ／ｍＬ、１０〜５０ｎｇ／ｍＬ又は５〜２５ｎｇ／ｍＬであり、好ましくは約２０ｎｇ／ｍＬである。
【００５２】
ＦＧＦ２、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０などの線維芽細胞成長因子は、通常の組換え技術により作製してもよく、または市販業者（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ  Ｉｎｃ，ＵＳＡ）から入手してもよい。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ＦＧＦは、表皮成長因子（ＥＧＦ：ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１９５０，核酸配列ＮＭ＿００１１７８１３０．１  ＧＩ：２９６０１１０１２；アミノ酸配列ＮＰ＿００１１７１６０１．１  ＧＩ：２９６０１１０１３）に置き換えられてもよい。表皮成長因子は、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合することにより、細胞の成長、増殖、分化を刺激するタンパク質因子である。ＥＧＦは、通常の組換え技術により作製してもよく、または市販業者（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ  Ｉｎｃ，ＵＳＡ）から入手してもよい。
【００５４】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、骨形成タンパク質受容体（ＢＭＰＲ）に結合し、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５およびＳＭＡＤ９により仲介される経路を介して細胞内シグナル伝達を刺激する。好適な骨形成タンパク質は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６またはＢＭＰ７などのＢＭＰファミリーのメンバーである。好ましくは、第２のＴＧＦβリガンドは、ＢＭＰ２（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：６５０，核酸配列ＮＭ＿００１２００．２  ＧＩ：８０８６１４８４；アミノ酸配列ＮＰ＿００１１９１．１  ＧＩ：４５５７３６９）またはＢＭＰ４（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：６５２，核酸配列ＮＭ＿００１２０２．３  ＧＩ：１５７２７６５９２；アミノ酸配列ＮＰ＿００１１９３．２  ＧＩ：１５７２７６５９３）である。好適なＢＭＰには、ＢＭＰ４が含まれる。通常、ここに記載の培地中のＢＭＰ２やＢＭＰ４などの骨形成タンパク質の濃度は、１〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬである。
【００５５】
骨形成タンパク質は、通常の組換え技術により作製してもよく、または市販業者（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ  Ｉｎｃ，ＵＳＡ）から入手してもよい。
【００５６】
ＰＩ３Ｋインヒビターは、ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸３−キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１５３）などのホスファチジルイノシトール３−キナーゼの活性を抑制する。
【００５７】
好適なＰＩ３Ｋインヒビターには、ウォルトマンニン；ＬＹ３０１４９７（１７−ｂ−ヒドロキシウォルトマンニン）；ＬＹ２９４００２（２−モルフォリン−４−イル−８−フェニルクロメン−４−オン：Ｍａｃｌｅａｎら、（２００７）、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２５：２９−３８）；ＣＬＢ１３０９（ＫＮ３０９：（±）−２−（｛１−［７−メチル−２−（モルフォリン−４−イル）−４−オキソ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−９−イル］エチル｝アミノ）安息香酸）；ＰＸ−８６６（（１Ｅ，４Ｓ，４ａＲ，５Ｒ，６ａＳ，９ａＲ）−５−（アセチルオキシ）−１−［（ジ−２−プロペン−１−イルアミノ）メチレン］−４，４ａ，５，６，６ａ，８，９，９ａ−オクタヒドロ−１１−ヒドロキシ−４−（メトキシメチル）−４ａ，６ａ−ジメチルシクロペンタ［５，６］ナフト［１，２−ｃ］ピラン−２，７，１０（１Ｈ）−トリオン）；ＩＣ８７１１４（キノロンピロロピリミジン）；ＧＤＣ−０９４１（２−（１Ｈ−インダゾル−４−イル）−６−［［４−（メチルスルフォニル）−１−ピペラジニル］メチル］−４−（４−モルフォリニル）−チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン）；ＴＧＸ−２２１（７−メチル−２−（４−モルフォリニル）−９−［１−（フェニルアミノ）エチル］−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン）、クエルセチン；ＢＥＺ２３５；ＸＬ１４７；Ｘｌ７６５；ＰＸ−８６６；ＺＳＴＫ４７４（２−（２−ジフルオロメチルベンズイミダゾル−１−イル）４，６−ジモルフォリノ−１，３，５−トリアジン）；およびＳＦ１１２６（２−［２−メトキシエチルアミノ］−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）が含まれる。その他のＰＩ３Ｋインヒビターも当技術分野において利用できる。
【００５８】
いくつかの好ましい実施形態では、ＰＩ３Ｋインヒビターは、ＬＹ２９４００２である。
【００５９】
好適なＰＩ３Ｋインヒビターは、市販業者（例えば、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ＣＡ  ＵＳＡ）から入手してよい。
【００６０】
例えば、培地は、ＬＹ２９４００２などのＰＩ３Ｋインヒビターを１〜１００μＭ、好ましくは約１０μＭ含有してよい。
【００６１】
アクチビン／ＴＧＦβアンタゴニストは、アクチビン／ノダルシグナル伝達を抑制し、前腸細胞を肝ではなく、膵の分化系列に特定することを促進する。
【００６２】
好適なアクチビン／ＴＧＦβアンタゴニストとしては、ＳＢ４３１５４２（４−（５−ベンゾル［１，３］ジオキソール−５−イル−４−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾル−２−イル）−ベンズアミド水和物；Ｓｉｇｍａ，Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ；（Ｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  （２００２）  ６２  １  ６５−７４）、ネリンゲニン（５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）クロマン−４−オン）、ＳＩＳ３（６，７−ジメトキシ−２−（（２Ｅ）−３−（１−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル−プロポ−２−エノイル））−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン）、Ａ８３−０１（３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド）およびレフティ（ｌｅｆｔｙ）（例えば、ヒトレフティ２：ＮＰ＿００３２３１．２  ＧＩ：２７４３６８８１）、ケルベロス（例えば、ヒトケルベロス１：ＮＰ＿００５４４５．１  ＧＩ：４８８５１３５）またはホリスタチン（例えば、ヒトホリスタチン：ＮＰ＿００６３４１．１  ＧＩ：５４５３６５２）などの可溶タンパク質因子が挙げられる。好ましいアクチビン／ＴＧＦβアンタゴニストは、ＳＢ−４３１５４２である。
【００６３】
通常、培地中のアクチビン／ＴＧＦβアンタゴニストの濃度は、１〜１００μＭであり、好ましくは約１０μＭである。
【００６４】
レチノイン酸（（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチルシクロヘキセン−１−イル）ノナ−２，４，６，８−テトラエン酸）は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）への結合により転写を調節し、細胞型の範囲で分化を調節する、ビタミンＡの代謝物である。好ましくは、全トランス型レチノイン酸がここで記載の媒体中に使用される。
【００６５】
通常、培地中のレチノイン酸の濃度は、１〜１０μＭであり、好ましくは約２μＭである。
【００６６】
レチノイン酸は市販業者（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ  Ｉｎｃ，ＵＳＡ）から入手可能である。
【００６７】
ＢＭＰアンタゴニストは、細胞中のＢＭＰシグナル伝達を抑制する。ＬＤＮ−１９３１８９（４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリン；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ  （２００８）  Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ４  ３３−４１）、ＧＤＦ３，ノギン，およびドルソモルフィン（６−［４−［２−（１−ピペリジニル）エトキ］フェニル］−３−（４−ピリジニル）−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ  （２００８）  Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ４  ３３−４１）など、種々のＢＭＰアンタゴニストが、本技術分野において公知である。好ましいＢＭＰアンタゴニストは、ノギンである。
【００６８】
通常、培地中のＢＭＰアンタゴニストの濃度は、１〜１０００ｎｇ／ｍＬ、例えば、１０〜１０００ｎｇ／ｍＬであり、好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
【００６９】
ヘッジホッグシグナル伝達インヒビターは、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）およびスムーズンド（ＳＭＯ）により仲介されるヘッジホッグシグナル伝達経路を介してシグナル伝達を抑制する。好適なヘッジホッグシグナル伝達インヒビターは、当技術分野で公知であり、３−ケト−Ｎ−（アミノエチル−アミノカプロイル−ジヒドロシナモイル）シクロパミン（ＫＡＡＤ−シクロパミン）、サリデギブ、ビスモデギブおよびエリスモデギブなどがある。好ましいヘッジホッグシグナル伝達インヒビターは、ＫＡＡＤ−シクロパミンである。好適には、培地中のヘッジホッグシグナル伝達インヒビターの濃度は、１〜１００ｎｇ／ｍＬであり、好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
【００７０】
ノッチシグナル伝達インヒビターは、哺乳動物細胞内のノッチ−１〜ノッチ−４のようなノッチ受容体に仲介されるノッチシグナル伝達経路を介してシグナルの経路を抑制する。好適なノッチシグナル伝達インヒビターとしては、当技術分野で公知であり、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−１−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）などがある。
【００７１】
通常、培地中のノッチシグナル伝達インヒビターの濃度は、１〜１０ｍＭであり、好ましくは約１ｍＭである。
【００７２】
ＧＳＫ３βインヒビターは、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（遺伝子ＩＤ２９３２：ＥＣ２．７．１１．２６）の活性を抑制する。好ましいインヒビターとしては、ＣＨＩＲ９９０２１（６−（（２−（（４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）ピリミジン−２−イル）アミノ）エチル）アミノ）ニコチノニトリル；Ｒｉｎｇ，Ｄ．Ｂ．ら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５２：５８８−５９５（２００３））、アルステルパウロン、ケンパウロン、ＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）およびＳＢ４１５２８６（３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）が挙げられる。例えば、内胚葉誘導培地は、ＣＨＩＲ９９０２１などのＧＳＫ３βインヒビターを０．３〜３０μＭ、好ましくは約３μＭ含有してよい。
【００７３】
好適なヘッジホッグシグナル伝達インヒビター、ノッチシグナル伝達インヒビターおよびＧＳＫ３βインヒビターは市販業者（例えば、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ  Ｉｎｃ．ＭＡ，ＵＳＡ；Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．ＭＩ，ＵＳＡ）から入手可能である。
【００７４】
多能性細胞群は、内胚葉誘導培地中で培養し、ＤＥ細胞への分化を誘導する。ｈＥＳＣおよびｈＩＰＳＣを胚体内胚葉（ＤＥ）細胞の略均一な個体群に分化させる好適な方法は、当技術分野で公知である（Ｔｅｏ  ＡＫ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２５：  ２３８−２５０；  ＷＯ２００８／０５６１６６；  ＷＯ２０１２／０２５７２５）。
【００７５】
内胚葉誘導培地は、ＴＧＦβリガンド、好ましくはアクチビン、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＰＩ３Ｋインヒビターおよび必要に応じてグリコーゲンシンターゼキナーゼ３βインヒビター、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１を含有する既知組成培地（ＣＤＭ）である。いくつかの実施形態では、これらの成分だけが、培地中の分化因子であってよい。
【００７６】
いくつかの実施形態では、１段階の工程で、ＥＳ細胞などの多能性細胞を胚体内胚葉（ＤＥ）細胞へ分化誘導してよい。該工程は、内胚葉誘導培地中で細胞を培養することを有してよい。好適な方法および培地については、ＷＯ２００８／０５６１６６に記載されている。内胚葉誘導培地は、ＴＧＦβリガンド、好ましくはアクチビン（例えば、５〜２５ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ２（例えば、５〜２５ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２０ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ−４（例えば、５〜２０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼインヒビター、好ましくはＬＹ２９４００２（例えば、５〜３０μＭ、好ましくは５〜１０μＭ）が補充されたＣＤＭ−ＰＶＡまたは高度ＤＭＥＭなどの既知組成基本培地でよい。
【００７７】
多能性細胞群は、内胚葉誘導培地中で、２〜４日間、最も好ましくは、３日間培養し、胚体内胚葉細胞群を作製してよい。
【００７８】
いくつかの実施形態では、３段階の工程で、ｉＰＳ細胞などの多能性細胞を胚体内胚葉（ＤＥ）細胞へ分化誘導してよい。該工程は、内胚葉誘導培地中で細胞を培養することを有してよい。該工程は、ＧＳＫ３βインヒビターの存在、次いで非存在の内胚葉誘導培地で細胞を培養し、その後ＤＥ誘導培地中で培養を行う。好適な方法及び培地は、ＷＯ２０１２／０２５７２５に記載されている。例えば、多能性細胞群のＤＥ細胞への分化は、
（ａ）多能性細胞群を、上述のようにグリコーゲンシンターゼキナーゼ３βインヒビター、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１が補充された内胚葉誘導培地内で培養し、
（ｂ）該細胞群を、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３βインヒビター不含の内胚葉誘導培地でさらに培養し、
（ｃ）該細胞群を、ＴＧＦβリガンドおよび線維芽細胞成長因子活性を有するＡＤＥ誘導培地でさらに培養し、胚体内胚葉（ＤＥ）細胞群を作製する、ことを有してよい。
【００７９】
細胞は、各培地において、例えば、１２〜３６時間、好ましくは約２４時間培養してよい。
【００８０】
グリコーゲンシンターゼキナーゼ３βインヒビターは、ステップ（ａ）の培地に、０．３〜３０μＭ、好ましくは約３μＭ含有されてよい。
【００８１】
前方胚体内胚葉（ＡＤＥ）誘導培地は、ＴＧＦβリガンド、好ましくはアクチビンおよび線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）を含有する既知組成培地（ＣＤＭ）でよい。いくつかの実施形態では、これらの成分だけが、培地中の分化因子であってよい。
【００８２】
例えば、好適なＡＤＥ培地は、既知組成基本培地、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０；ＴＧＦβリガンド、好ましくはアクチビン（例えば、１０〜２５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬ）；およびＦＧＦ２などのＦＧＦ（例えば、５〜５００ｎｇ／ｍＬ，好ましくは約４０ｎｇ／ｍＬ）、からなっていてよい。既知組成基本培地は、Ｂ２７またはＮＳ２１などの無血清培地補充物が補充されていてよい。
【００８３】
胚体内胚葉細胞群は、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４およびＧＳＣなどの内胚葉マーカーを発現してよく、多能性マーカーまたは外胚葉または中胚葉分化系列に関連するマーカーの発現を欠いてよい。例えば、胚体内胚葉細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ−３、ナノグ、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０およびＫＬＦ−４の１つまたは複数、好ましくは全てを検出可能レベルでは発現しない。
【００８４】
胚体内胚葉細胞群を、一連の膵臓誘導培地中で培養し、膵臓前駆細胞へ分化誘導する。
【００８５】
第１の膵臓誘導培地を使用して、胚体内胚葉細胞を背側前腸細胞に分化誘導する。
【００８６】
第１の膵臓誘導培地は、アクチビン／ＴＧＦβアンタゴニスト、ＦＧＦ、レチノイン酸およびＢＭＰアンタゴニストを有する既知組成培地（ＣＤＭ）である。いくつかの実施形態では、これらの成分だけが、培地中の分化因子であってよい。
【００８７】
例えば、第１の膵臓誘導培地は、アクチビン／ＴＧＦβアンタゴニスト、好ましくはＳＢ−４３１５４２（例えば、５〜２５μＭ、好ましくは約１０μＭ）、ＦＧＦ、好ましくはＦＧＦ１０（例えば、５〜１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬ）、レチノイン酸（例えば、０．５〜２０μＭ、好ましくは約２μＭ）およびＢＭＰアンタゴニスト、好ましくはノギン（例えば、１００〜５００ｎｇ／ｍＬ）が補充された、高度ＤＭＥＭなどの既知組成基本培地からなる。
【００８８】
好ましくは、胚体内胚葉細胞群を２〜４日間、最も好ましくは３日間培養し、背側前腸細胞群を作製する。
【００８９】
背側前腸細胞群は、マーカー：Ｈｅｘ、ＲＦＸ６、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ１ｂ、ＳＯＸ２、ＨＮＦ４ａおよびＨＬＸＢ９を発現していてもよい。背側前腸細胞群は、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４およびＧＳＣなどの未分化細胞に関連するマーカーの発現を欠いていてよい。
【００９０】
第２および第３の膵臓誘導培地を使用して、背側前腸細胞を膵臓前駆細胞に分化誘導する。
【００９１】
第２の膵臓誘導培地は、ＦＧＦ、ＢＭＰインヒビター、レチノイン酸およびヘッジホッグシグナル伝達インヒビターを含有する既知組成培地（ＣＤＭ）である。いくつかの実施形態では、これらの成分だけが、培地中の分化因子であってよい。
【００９２】
例えば、第２の膵臓誘導培地は、ＦＧＦ、好ましくはＦＧＦ１０（例えば、５〜１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬ）；レチノイン酸（例えば、０．５〜２０μＭ、好ましくは約２μＭ）；ヘッジホッグシグナル伝達インヒビター、好ましくはＫＡＡＤ−シクロパミン（例えば、０．１〜１μＭ、好ましくは０．２５μＭ）；およびＢＭＰアンタゴニスト、好ましくはノギン（例えば、５〜５００ｎｇ／ｍＬまたは１００〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬ）が補充された、高度ＤＭＥＭなどの既知組成基本培地からなる。
【００９３】
背側前腸細胞は、第２の膵臓誘導培地中で２〜４日間、最も好ましくは３日間培養する。
【００９４】
第２の膵臓誘導培地での培養に次いで、分化細胞を第３の膵臓誘導培地で培養してよい。
【００９５】
第３の膵臓誘導培地は、ＦＧＦを含有する既知組成培地（ＣＤＭ）である。いくつかの実施形態では、ＦＧＦおよび必要に応じてレチノイン酸だけが、培地中の分化因子であってよい。
【００９６】
例えば、第３の膵臓誘導培地は、ＦＧＦ、好ましくはＦＧＦ１０またはＦＧＦ７（ＫＧＦ）（たとえば、５〜１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬ）が補充された高度ＤＭＥＭなどの既知組成基本培地からなってよい。いくつかの好ましい実施形態では、既知組成基本培地は、さらにレチノイン酸を含有してもよい。
【００９７】
細胞は、第３の膵臓誘導培地中で２〜４日間、最も好ましくは３日間培養し、膵臓前駆細胞群を作製する。
【００９８】
膵臓前駆細胞群は、マーカーＰＤＸ１、ＳＯＸ９、ＨＮＦ６、ＮＫＸ６．１およびＰＴＦ１ａを発現してよい。膵臓前駆細胞は、ＨＬＸＢ９などの未分化細胞に関与するマーカーの発現を欠いていてよい。
【００９９】
いくつかの実施形態では、膵臓前駆細胞は、さらに分化および／または成熟し、膵内分泌細胞群を作製してもよい。膵内分泌細胞を成熟させるための好適なプロトコルは、当技術分野において入手可能である（Ｋｒｏｏｎ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２６：  ４４３−４５２）。例えば、膵臓前駆細胞は、第１および第２内分泌誘導培地中で培養してよい。
【０１００】
第１の内分泌誘導培地は、ノッチシグナル伝達インヒビターを含有する既知組成培地（ＣＤＭ）である。いくつかの実施形態では、第１の内分泌誘導培地は、さらにレチノイン酸を含有してよい。いくつかの実施形態では、ノッチシグナル伝達インヒビターおよび必要に応じてレチノイン酸だけが、培地中の分化因子であってよい。ノッチシグナル伝達インヒビターおよび必要に応じて含まれるレチノイン酸に加えて、第１の内分泌誘導培地は、無血清培地補充物、好ましくはＢ２７が補充された基本培地、好ましくは高度ＤＭＥＭを有してよい。
【０１０１】
例えば、第１の内分泌誘導培地は、Ｂ２７およびノッチシグナル伝達インヒビター、好ましくはＤＡＰＴ（例えば、０．１〜１０ｍＭ、好ましくは約１ｍＭ）が補充された高度ＤＭＥＭなどの既知組成基本培地からなってよい。いくつかの実施形態では、第１の内分泌誘導培地は、さらにレチノイン酸を含有してよい。
【０１０２】
好適な無血清培地補充物としては、Ｂ２７（Ｂｒｅｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  （１９８９）  ４９４  ６５−７４；  Ｂｒｅｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ３５  ５６７−５７６  （１９９３）；  Ｂｒｅｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｆｏｃｕｓ  １６  １  ６−９；  Ｂｒｅｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ  （１９９５）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｒｅｓ．  ４２：６７４−６８３；  Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  （２０１０）  ２４  １３０−１３７）およびＮＳ２１（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｓ  （２００８）  １７１  ２３９−２４７）が挙げられる。Ｂ２７およびＮ２１などの無血清培地補充物は、当技術分野で公知であり、広く市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ）。
【０１０３】
膵臓前駆細胞は、第１の内分泌誘導培地中で２〜４日間、最も好ましくは３日間培養してよい。
【０１０４】
第２の内分泌誘導培地は、追加の分化因子を含有しない既知組成培地（ＣＤＭ）でも、レチノイン酸を含有してもよい。第２の内分泌誘導培地は、無血清培地補充物、好ましくはＢ２７が補充された基本培地、好ましくは高度ＤＭＥＭを含有してよい。いくつかの実施形態では、第２の内分泌誘導培地は、さらにレチノイン酸を含有してよい。
【０１０５】
膵臓前駆細胞は、第２の内分泌誘導培地中で２〜４日間、最も好ましくは３日間培養してよい。
【０１０６】
膵内分泌細胞群は、マーカーＮＧＮ３、ＩＮＳ、ＳＳＴおよびＧＬＵを発現してよい。
【０１０７】
好ましくは、膵内分泌細胞群は、グルコース刺激によりインスリンを分泌してよい。
【０１０８】
膵内分泌細胞は、ＰＤＸ１、ＳＯＸ９、ＨＮＦ６、ＮＫＸ６．１およびＰＴＦ１ａなどの未分化膵または内胚葉細胞に特有のマーカーの発現を欠いていてよい。
【０１０９】
哺乳動物細胞の培養は、当技術分野で公知である（例えば、Ｂａｓｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｃ．  Ｈｅｌｇａｓｏｎ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．  Ｕ．Ｓ．  （１５  Ｏｃｔ  ２００４）  ＩＳＢＮ：  １５８８２９５４５１；  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｓ．）  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，  Ｕ．Ｓ．  （９  Ｄｅｃ  ２００４）  ＩＳＢＮ：  １５８８２９２２２３；  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，  Ｒ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ  （２  Ａｕｇ  ２００５）  ＩＳＢＮ：  ０４７１４５３２９３，  Ｈｏ  ＷＹ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  （２００６）  ３１０：４０−５２，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  （ｅｄ．  Ｒ．  Ｌａｎｚａ）  ＩＳＢＮ：  ０１２４３６６４３０参照）。その培地および成分は、商業的供給源（例えば、Ｇｉｂｃｏ，Ｒｏｃｈｅ，Ｓｉｇｍａ，Ｅｕｒｏｐａ  ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）から入手してよい。上記培養ステップでは、標準的な哺乳動物細胞培養条件、例えば、３７℃、酸素２１％、二酸化炭素５％を採用してよい。培地は、好ましくは２日毎に交換し、細胞は重力により沈殿させる。
【０１１０】
細胞群は、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上の膵臓前駆細胞を、成熟した場合には膵内分泌細胞を含有し、次の培地中での培養を行う。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、膵臓前駆細胞群または膵内分泌細胞群は、さらに精製する必要がない程度に実質的に他の細胞型を含まないとよい。例えば、細胞群は、均一または実質的に均一でよい。
【０１１２】
ここに記載の方法のいずれかのステージで作製された、膵臓前駆細胞または膵内分泌腺は、単離および／または精製されてよい。
【０１１３】
膵臓前駆細胞または内分泌細胞は、上述のように、マーカーに特徴的な細胞外領域に対する抗体を使用する、抗体および磁性ビーズまたは蛍光活性化細胞選別（ＭＡＣＳまたはＦＡＣＳ）による細胞外エピトープの認識に基づく方法などの当業者に公知の方法を使用して、細胞群中の他の細胞型から分離してよい。
【０１１４】
ここに記載したように作製された膵臓前駆細胞群または膵内分泌細胞群は、標準的な哺乳動物細胞培養方法により増大、増殖または維持してよい。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、膵臓前駆細胞群または膵内分泌細胞群を、３次元（３Ｄ）の培養系で増殖または維持してよい。好適な３Ｄ系は、例えば、人工または天然ポリマーの骨格は、当技術分野で公知であり、市販業者（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）から入手可能である。
【０１１６】
１つまたは複数の膵臓細胞機能を遂行する細胞群中の膵臓前駆細胞または内分泌細胞の能力は、モニターおよび／または決定されてよい。例えば、インスリンの発現、インスリンの分泌、グルコース反応性（グルコース応答性）および動物モデルへの生着の１つまたは複数を遂行する細胞の能力は、モニターおよび／または決定されてよい。
【０１１７】
膵臓細胞の機能を決定するための好適な方法は、当技術分野で公知である。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、ここに記載されるように作製された膵臓前駆細胞群または膵内分泌細胞群は、例えば、凍結乾燥および／または冷凍保存により貯蔵されてよい。本発明の他の態様は、上述の方法により作製された単離された膵臓前駆細胞群または膵内分泌細胞群を提供する。
【０１１９】
該細胞群は、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上の膵臓前駆細胞または膵内分泌細胞を含有してよい。
【０１２０】
該細胞は、未定義の培地成分または他の潜在的な汚染に暴露されていない臨床応用可能な細胞であってよい。
【０１２１】
該細胞は、成熟膵臓細胞の機能または機能的特徴の１つまたは複数を発揮してよく、または哺乳類宿主への生着または移植後にそのような機能または機能的特徴の１つまたは複数を発揮してよい。例えば、該細胞は、生着せずにまたは哺乳類宿主への生着後に、インスリンの発現、インスリンの分泌およびグルコース反応性の１つまたは複数を発揮してよい。膵臓前駆細胞群または膵内分泌細胞群は、糖尿病などの膵臓異常を有する患者の治療などの治療方法に使用してよい。細胞群はまた、糖尿病などの膵臓異常の治療に使用する薬剤の製造に使用してよい。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、個体に投与される膵臓前駆細胞または膵内分泌細胞は、薬品や成長因子などの治療用分子を作製するために、遺伝的に操作してよい（Ｂｅｈｒｓｔｏｃｋ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００６  Ｍａｒ；１３（５）：３７９−８８，  Ｋｌｅｉｎ  ＳＭ  ｅｔ  ａｌ，  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００５  Ａｐｒ；１６（４）：５０９−２１）。
【０１２３】
本発明の他の態様は、単離された膵臓前駆細胞群または膵内分泌細胞群を、治療または治療用の成熟膵臓細胞の作製に使用する方法に関する。
【０１２４】
膵臓異常を治療する方法は、
ここに記載されるように作製し、単離した膵臓前駆細胞群または膵内分泌細胞群を、その必要がある個体に投与することを有してよい。
【０１２５】
治療対象として好適な膵臓異常には、遺伝性および家族性膵炎および１型および２型糖尿病などの糖尿病状態が挙げられる。
【０１２６】
膵臓前駆細胞または膵内分泌細胞は、個体の膵臓に移植、注入または投与されてよい。好適な方法は、当技術分野で公知である。
【０１２７】
治療の方法に使用される細胞を、治療用組成物に処方してよい。
【０１２８】
本発明の態様は、ここで記載されるように作製された膵臓前駆細胞または膵内分泌細胞を有する治療用組成物、薬剤または他の組成物、そのような膵臓前駆細胞または膵内分泌細胞を例えば上述のように膵臓異常の（予防的治療を含む）治療などのために患者に投与することを有する方法、およびこのような膵臓前駆細胞または膵内分泌細胞を治療上許容可能な添加剤（賦形剤）、ビヒクルまたは担体、および必要に応じて１つまたは複数の他の成分と混合することを有する治療用組成物を作成する方法、に及ぶ。
【０１２９】
本発明による治療用組成物は、本発明による使用のために、該細胞に加えて、薬学的に許容される添加剤、担体、緩衝剤、防腐剤、安定化剤、抗酸化剤または当業者に既知の他の物質を含有してよい。そのような物質は、毒性がなく、該細胞の活性を妨げないものでなければならない。担体や他の物質の正確な特徴は、投与法に依存する。
【０１３０】
治療用の液体組成物は、一般的に、水、油、動物または植物油、鉱油または合成油などの液体担体を有する。生理食塩水、組織または細胞培養溶媒、ブドウ糖または他の糖類溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのグリコールを含んでよい。
【０１３１】
該組成物は、発熱性物質を含まず、適切なｐＨ、等張力および安定性を有する、非経口的に許容される水性溶液の形であってよい。本技術分野に関連する技術により、例えば、塩化ナトリウム、リンガー液または乳酸加リンガー液などの等張ビヒクルを使用して、好適な溶液を良好に調製することができる。人工髄液を使用して組成物を調製してもよい。
【０１３２】
膵臓前駆細胞または膵内分泌細胞は、本技術分野で公知の方法により患者に移植または注入してよい（例えば、Ｌｉｎｄｖａｌｌ，  Ｏ．  （１９９８）  Ｍｏｖ．  Ｄｉｓｏｒｄ．  １３，  Ｓｕｐｐｌ．  １：８３−７；  Ｆｒｅｅｄ，  Ｃ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，  ６，  ２０１−２０２；  Ｋｏｒｄｏｗｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ３３２，  １１１８−１１２４；  Ｆｒｅｅｄ，  Ｃ．Ｒ．，（１９９２）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ３２７，  １５４９−１５５５，  Ｌｅ  Ｂｌａｎｃ  ｅｔ  ａｌ，  Ｌａｎｃｅｔ  ２００４  Ｍａｙ  １；３６３（９４１９）：１４３９−４１）。特に、細胞の懸濁液を患者の膵臓または隣接部位に注射または注入あるいは患者の門脈に注射してよい。膵臓前駆細胞または膵内分泌細胞は、単独で注射しても、または内皮細胞などの他の細胞と組み合わせとして注射してもよい。いくつかの実施形態では、細胞を移殖前に体外で血管形成組織を形成するために使用してよい。
【０１３３】
本発明による組成物は、好ましくは、個体に利益をもたらすに十分である「予防的に有効な量」または「治療的に有効な量」で投与される（場合によっては、予防は治療と考えられる）。実際の投与量および投与の速度、経時変化は、治療される者の性質と重症度による。治療の処方、例えば、投与量の決定などは、一般医や他の医師の責任範囲である。
【０１３４】
組成物は、治療対象の状態に合わせて、単独で、または他の治療と同時もしくは順次組み合わせて、投与されてよい。
【０１３５】
いくつかの好ましい実施形態では、ここに記載されるように作製された膵臓前駆細胞および内分泌細胞は、１型および２型糖尿病などの糖尿病状態の治療に有用である。
【０１３６】
本発明の他の態様は、疾患モデルおよび／またはスクリーニングにおいて、単離した膵臓前駆細胞群または膵内分泌細胞群を使用する方法に関する。
【０１３７】
例えば、単離した膵臓前駆細胞群または膵内分泌細胞群は、膵臓異常のモデリングに有用である。膵臓異常としては、膵発生に影響する遺伝性疾患や、１型および２型糖尿病などの糖尿病状態を含む非遺伝性疾患が挙げられる。
【０１３８】
上述のように、膵臓前駆細胞または膵内分泌細胞は、遺伝性疾患、好ましくは、単一遺伝子障害を有する個体のｉＰＳ細胞から生成してよい。遺伝性疾患の遺伝子型を有する膵臓前駆細胞または膵内分泌細胞は、膵臓異常およびその影響のモデリングまたは特徴付けに有用であろう。遺伝性疾患の遺伝子型を有する膵臓前駆細胞または膵内分泌細胞は、膵臓異常に伴う表現型または膵臓異常に伴う１つまたは複数の病状を表示するであろう。これは、疾患モデルおよび治療化合物のスクリーニングに有用であろう。
【０１３９】
遺伝性疾患としては、膵臓非形成、遺伝性および家族性膵炎、シュワッハマン・ダイアモンド症候群、１型および２型糖尿病ならびに膵臓癌などの、膵機能障害または発生に伴う疾病が挙げられる。
【０１４０】
遺伝性疾患遺伝子型を有する膵臓前駆細胞群または膵内分泌細胞群を作製する方法は、
遺伝性疾患を有する個体からｉＰＳ細胞を供給し、
上述のようにｉＰＳ細胞から膵臓前駆細胞群または膵内分泌細胞群を作製することを有し、
該膵臓前駆細胞または膵内分泌細胞は、遺伝性疾患遺伝子型を有する。
一旦作製された、遺伝性疾患遺伝子型を有する膵臓前駆細胞群または膵内分泌細胞群は、例えば、疾患モデルまたはスクリーニングに使用するために培養、増大、維持してよい。
【０１４１】
化合物のスクリーニング方法は、
ここで記載した方法により作製し、単離した膵臓前駆細胞または膵内分泌細胞を試験化合物と接触させ、
該試験化合物の膵臓前駆細胞または膵内分泌細胞に対する効果および／または該細胞の試験化合物に対する効果を測定すること、を有する。
【０１４２】
該試験化合物存在下における膵臓前駆細胞または膵内分泌細胞の増殖、成長または生存能力、または該細胞の１つまたは複数の細胞機能を遂行する能力を、該試験化合物不存在におけるそれとの比較において決定する。増殖、成長または生存能力または１つまたは複数の細胞機能を遂行する能力の低下は、該化合物が毒作用を有することを示し、成長または生存能力または１つまたは複数の細胞機能を遂行する能力の増加は、該化合物が改良作用を有することを示す。
【０１４３】
細胞機能としては、膵臓前駆細胞または膵内分泌細胞のインスリンの発現、インスリンの分泌またはグルコース反応性が挙げられる。
【０１４４】
例えば、インスリンの分泌を増加する、および／または膵臓前駆細胞または膵内分泌細胞の増殖を刺激する、試験化合物の能力を、ここで記載されるように、決定してよい。
【０１４５】
試験化合物存在下における細胞中の遺伝子の発現を、該試験化合物不存在下におけるそれとの比較において決定してよい。例えば、ＮＧＮ３、ＩＮＳ、ＳＳＴ、ＧＬＵ，ＰＤＸ１、ＳＯＸ９、ＨＮＦ６、ＮＫＸ６．１およびＰＴＦ１ａなどの膵マーカーの発現を測定する。発現の低下は、該化合物が細胞毒性効果を有することを示す。遺伝子発現は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲのように核酸レベルで決定しても、あるいはＥＬＩＳＡなどの免疫手法や活性測定法によるタンパク質レベルで決定してもよい。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、膵臓前駆細胞または膵内分泌細胞の表現型状態は、ハイコンテントスクリーニングにより決定してよい。ハイコンテントスクリーニングに好適な方法および装置としては、当技術分野で公知であり、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｕｌｔｒａ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）やＯｐｅｒａ（商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．ＭＡ．ＵＳＡ）、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  ３０００(商標)（ＧＥ  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＫ）などの共焦点像プラットホームおよびＡｒｒａｙｓｃａｎ  ＶＴＩ（商標）（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）およびＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＮＪ  ＵＳＡ）などの高視野イメージングプラットホームが挙げられる。
【０１４７】
スクリーニングまたはモデリング方法に使用する膵臓前駆細胞または膵内分泌細胞は、正常な遺伝子型または遺伝性疾患遺伝子型を表示してよい。
【０１４８】
ここに記載される方法は、膵臓異常の治療に有用な活性を有する化合物の同定またはそのような治療のための治療化合物の開発に有用である。例えば、方法は、膵臓前駆細胞または膵内分泌細胞の病状または膵臓障害の１つまたは複数の膵臓表現型または症状を低減または改善する試験化合物を同定するステップを有してよい。病徴または表現型を低減する化合物は、膵臓異常またはその症状の治療の方法開発に有用であろう。
【０１４９】
１つまたは複数の一次スクリーニングにより膵臓前駆細胞または膵内分泌細胞に対する薬効を有するとして同定された試験化合物は、１つまたは複数の二次スクリーニングによりさらに評価してもよい。
【０１５０】
二次スクリーニングは、生物学的機能または活性をインビトロおよび／またはインビボ、例えば、動物モデルを使って試験することを有してよい。例えば、障害の進行または疾病動物モデルの膵臓障害に伴う１つまたは複数の症状または病態を低減または改善する、試験化合物の能力を測定してもよい。
【０１５１】
膵臓前駆細胞または膵内分泌細胞の膵臓障害の１つまたは複数の症状を低減または改善し、および／またはインスリンの分泌および／または増殖を刺激する試験化合物の同定に続いて、該化合物を単離および／または精製、あるいは組換え発現または化学合成の従来方法により合成してもよい。さらに、該化合物は製造されてもおよび／または調剤に使用されてもよい、すなわち、薬剤、治療用組成物または薬品などの組成物の製造または製剤に使用されてよい。これらは、膵臓異常または症状の治療のために個々人に投与されてよい。
【０１５２】
いくつかの好ましい実施形態では、ここで記載されたように作製された膵臓前駆細胞および内分泌細胞は、１型および２型糖尿病などの糖尿病状態のモデリングや糖尿病状態の治療に有用な活性を発揮する化合物の同定に有用であろう。
【０１５３】
本発明の他の態様および実施形態は、上述の態様および実施形態における用語「有する」を「からなる」に置き換え、上述の態様および実施形態における用語「有する」を「から実質的になる」に書き換えたものである。
【０１５４】
上記実施形態の変更、さらにその実施形態と変更は、本明細書から当業者にとって明らかであり、それ自体、本発明の範囲内である。
【０１５５】
本明細書に記載した全ての文献および配列データベース記載項目の全ては、あらゆる目的のために参照により本明細書に援用される。
【０１５６】
ここで使用されている「および／または」は、２つの特定された特徴または構成要素について、他方の有無にかかわらず、それぞれの特異的な開示と見なされるべきである。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、丁度それぞれがここで個々に提示されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂおよび（ｉｉｉ）ＡとＢのそれぞれの特異的な開示と見なされる。
【０１５７】
本出願は、文脈上他の解釈がされない限り、上述の態様および実施形態のいずれかの組み合せの全てを開示していると理解すべきである。同様に、本出願は、文脈上他の解釈がされない限り、単独または他の態様と共に、好ましいおよび／または任意の特徴の組み合せの全てを開示している。
【０１５８】
次に、本発明のいくつかの態様および実施形態を、以下に示す実施例および図面を参照しながら説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】図１は、ｈＥＳＣおよびｈＩＰＳＣから肝臓および膵臓前駆細胞を生成するプロトコルを示す。
【図２】図２は、ｈＥＳＣから生成されたＤＥ細胞の膵臓分化に対するＲＡ、ＢＭＰ、ＦＧＦ１０およびアクチビン／ＴＧＦβの機能を示す。
【図３】図３は、胚体内胚葉が前腸および続いて膵臓前駆細胞およびホルモン発現細胞に連続的に分化するパターンを示すマーカーの連続的発現を示す。
【図４】図４は、ＤＥ細胞（３日目）でのＣＸＣＲ４および膵臓前駆細胞（１２日目）でのＰＤＸ１の発現を示すＦＡＣＳ分析を示す。
【図５】図５は、グルコース刺激による、膵臓前駆細胞（１８日目）から生成された内分泌細胞培養培地中へのＣ−ペプチドの分泌を示す。
【図６】図６は、膵臓前駆細胞（１２日目）を移植したマウスに移植後２０週間後にグルコースを腹腔内投与した結果を示す。
【図７】図７は、アクチビンの存在下５日間生育したＤＥ細胞でのＶＦおよび肝芽マーカーの発現を示す。
【図８】図８は、ＳＢ４３１５４２（ＳＢ）によるアクチビンシグナル伝達、ノギン（Ｎｏｇ）によるＢＭＰ、およびＳＵ５４０２によるＦＧＦの抑制により、ＤＥ細胞における肝マーカーの発現が低下することを示しているＱ−ＰＣＲ分析結果を示す。
【図９】図９は、肝臓分化を誘導する条件下に２５日間成長させたＤＥ細胞中の肝細胞マーカーの発現を示す。
【図１０】図１０は、ｈＥＳＣ由来胎児肝細胞（２５日目）でのアルブミン（ＡＬＢ）、α−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）およびα−１−フェトプロテイン（ＡＦＰ）の共発現を示しているＦＡＣＳ分析結果を示す。
【図１１】図１１は、ｈＥＳＣ由来胎児肝細胞の培養培地中のα−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）およびアルブミン分泌を示すＥＬＩＳＡ分析結果を示す。
【図１２】図１２は、ｈＥＳＣ由来胎児肝細胞でのデキサメタゾン（ＤＥＸ）によるＣＹＰ３Ａ４の誘導性活性を示す。
【図１３】図１３は、肝臓内胚葉に分化するＳｈＨＥＸ−ｈＥＳＣ（ｓｈＨＥＸ９８およびｓｈＨＥＸ０２）におけるＨＥＸのノックダウンを示すＱ−ＰＣＲ分析結果を示す。
【図１４】図１４は、腹側前腸細胞の肝臓特定化に対するＨＥＸノックダウンの効果を示すＱ−ＰＣＲ分析結果を示す。
【図１５】図１５は、ＳｈＳｃｒａｍｂｌｅ  ｈＥＳＣおよび肝臓内胚葉へ分化するＳｈＨＥＸ−ｈＥＳＣにおけるアポトーシス性細胞の分画を示す。
【図１６】図１６は、膵臓前駆細胞に分化するＳｈＨＥＸ−ｈＥＳＣにおける膵マーカーの発現を示す。
【図１７】図１７は、膵臓分化に対するｈＨＬＸＢ９ノックダウンの効果を示すＱ−ＰＣＲ分析結果を示す。
【図１８】図１８は、肝臓分化中におけるＨＬＸＢ９の発現を示す。
【０１６０】
図１は、ｈＥＳＣおよびｈＩＰＳＣから肝臓および膵臓前駆細胞を生成するプロトコルを示す。
【０１６１】
図２〜４は、定義された培養条件での、胚体内胚葉由来のｈＥＳＣの膵臓前駆細胞への分化を示す。
【０１６２】
図２は、ｈＥＳＣから生成されたＤＥ細胞の膵臓分化に対するＲＡ、ＢＭＰ、ＦＧＦ１０およびアクチビン／ＴＧＦβの機能を示す。ＱＰＣＲ分析は、レチノイン酸（ＲＡ）、ＳＢ４３１５４２（ＳＢ）または１０ｎｇ／ｍＬのアクチビン（Ａｃｔ）、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０（ＦＧＦ）または１０μＭのＳＵ５４０２（ＳＵ）および１００ｎｇ／ｍＬのノギン（Ｎｏｇ）または１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４の多様な組み合わせの存在下に３日間成長させたＤＥ細胞中のＰＤＸ１／ＨＬＸＢ９／ＨＮＦ６／ＣＤＸ２／ＡＦＰ／ＳＯＸ９／ＰＴＦ１Ａの発現を示している。
【０１６３】
図３は、胚体内胚葉が前腸および続いて膵臓前駆細胞およびホルモン発現細胞に連続的に分化するパターンを示すマーカーの連続的発現を示す。
【０１６４】
図４は、ＤＥ細胞（３日目）でのＣＸＣＲ４および膵臓前駆細胞（１２日目）でのＰＤＸ１の発現を示すＦＡＣＳ分析を示す。複合アイソタイプコントロールは、陽性群に対する陰性コントロールとして使用した。
【０１６５】
図５および６は、背側前腸から生成された膵臓前駆細胞がインビトロおよびインビボでホルモン発現細胞に分化できることを示す。
【０１６６】
図５は、グルコース刺激による、膵臓前駆細胞（１８日目）から生成された内分泌細胞培養培地中へのＣ−ペプチドの分泌を示す。データは３つの生物学的に同型のものの平均であり、エラーバーは標準偏差を示す。低グルコース（２．２ｍＭ）中で成長した細胞を陰性コントロールとして使用した。
【０１６７】
図６は、膵臓前駆細胞（１２日目）を移植したマウスに移植後２０週間後にグルコースを腹腔内投与した結果を示す。血液検体は、ＥＬＩＳＡでＣ−ペプチドを測定する際に採取した。ＮＤは検出不可、破線は分析限界を示す。
【０１６８】
図７および８は、アクチビンが胚体内胚葉を腹側前腸へ特定誘導することを示す。
【０１６９】
図７は、アクチビンの存在下５日間生育したＤＥ細胞でのＶＦおよび肝芽マーカーの発現を示す。
【０１７０】
図８は、ＳＢ４３１５４２（ＳＢ）によるアクチビンシグナル伝達、ノギン（Ｎｏｇ）によるＢＭＰ、およびＳＵ５４０２によるＦＧＦの抑制により、ＤＥ細胞における肝マーカーの発現が低下することを示しているＱ−ＣＰＲ分析結果を示す。
【０１７１】
図９〜１２は、胚体内胚葉由来のｈＥＳＣが定義された培養条件下で胎児肝細胞に分化することを示す。
【０１７２】
図９は、肝臓分化を誘導する条件下に２５日間成長させたＤＥ細胞中の肝細胞マーカーの発現を示す。
【０１７３】
図１０は、ｈＥＳＣ由来胎児肝細胞（２５日目）でのアルブミン（ＡＬＢ）、α−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）およびα−１−フェトプロテイン（ＡＦＰ）の共発現を示しているＦＡＣＳ分析結果を示す。
【０１７４】
図１１は、ｈＥＳＣ由来胎児肝細胞の培養培地中のα−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）およびアルブミン分泌を示すＥＬＩＳＡ分析結果を示す。
【０１７５】
図１２は、ｈＥＳＣ由来胎児肝細胞でのデキサメタゾン（ＤＥＸ）によるＣＹＰ３Ａ４の誘導性活性を示す。
【０１７６】
図１３〜１６は、腹側前腸のインビトロでの肝臓特定化にはＨＥＸが必要であることを示す。
【０１７７】
図１３は、肝臓内胚葉に分化するＳｈＨＥＸ−ｈＥＳＣ（ｓｈＨＥＸ９８およびｓｈＨＥＸ０２）におけるＨＥＸのノックダウンを示すＱ−ＰＣＲ分析結果を示す。陰性コントロールとしてはＳｈＳｃｒａｍｂｌｅ−ｈＥＳＣを使用した。
【０１７８】
図１４は、腹側前腸細胞の肝臓特定化に対するＨＥＸノックダウンの効果を示すＱ−ＰＣＲ分析結果を示す。
【０１７９】
図１５は、ＳｈＳｃｒａｍｂｌｅ  ｈＥＳＣおよび肝臓内胚葉へ分化するＳｈＨＥＸ−ｈＥＳＣにおけるアポトーシス性細胞の分画を示す。
【０１８０】
図１６は、膵臓前駆細胞に分化するＳｈＨＥＸ−ｈＥＳＣにおける膵マーカーの発現を示す。
【０１８１】
図１７および１８は、背側前腸のインビトロでの膵臓特定化にはＨＬＸＢ９が必要であることを示す。
【０１８２】
図１７は、膵臓分化に対するｈＨＬＸＢ９ノックダウンの効果を示すＱ−ＰＣＲ分析結果を示す。
【０１８３】
図１８は、肝臓分化中におけるＨＬＸＢ９の発現を示す。ｈＥＳＣを２５日間育成して肝臓分化を誘導し、６日毎（１２日目：Ｄ１２、１８日目：Ｄ１８、２５日目：Ｄ２５）にＨＸＬＢ９の発現をＱ−ＰＣＲで分析した。ｈＥＳＣを陰性コントロールとして使用し、９日間（膵臓Ｄ９）分化させた膵臓前駆細胞を陽性コントロールとして使用した。
【実施例】
【０１８４】
［ｈＥＳＣおよびｈＩＰＳＣの培養条件］
【０１８５】
ｈＥＳＣ（Ｈ９、ＷｉＣｅｌｌより入手）およびｈＩＰＳＣ（ＢＢＨＸ８、Ａ１ＡＴＤ−１、ＪＲＯ１Ｄ）（Ｒａｓｈｉｄ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）    Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２０：  ３１２７−３１３６）を定義された培養（Ｂｒｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ｎａｔｕｒｅ  ４４８：  １９１−１９５）により育成した。細胞はコラゲナーゼＩＶを使用して週毎に継代培養し、上述のようにアクチビンＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＦＧＦ２（１２ｎｇ／ｍＬ）が補充された既知組成培地（ＣＤＭ）中に維持した（Ｂｒｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ  （２００７））。分化を、図１に記載のように行った。毎日の培地交換は、分化プロトコル工程全体にわたって行った。ＤＥステージ（ステージ１）の後、細胞をＳＢ−４３１５４２（１０μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ；ＡｕｔｏｇｅｎＢｉｏｃｌｅａｒ）、全トランス型レチノイン酸（ＲＡ、２μＭ；Ｓｉｇｍａ）およびノギン（５０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）が補充された高度ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で３日間培養した。ステージ３では、高度ＤＭＥＭにヒトＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ；ＡｕｔｏｇｅｎＢｉｏｃｌｅａｒ）、全トランス型レチノイン酸（ＲＡ、２μＭ；Ｓｉｇｍａ）、ＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ；Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）およびノギン（５０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を加えた培地中で細胞を３日間培養した。ステージ４では、細胞をヒトＫＧＦ（ＦＧＦ７）またはＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）中で３日間培養した。膵臓前駆細胞の成熟には、細胞を高度ＤＭＥＭに１体積％のＢ２７およびＤＡＰＴ（１ｍＭ）を加えた培地中で３日間成長させ、続いて高度ＤＭＥＭに１体積％のＢ２７を加えた培地中でさらに３日間成長させた。あるいは、ステージ４では、ヒトＫＧＦ（ＦＧＦ７）またはＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および全トランス型レチノイン酸（ＲＡ、２μＭ；Ｓｉｇｍａ）中で細胞を３日間培養した。あるいは、膵臓前駆細胞の成熟では、高度ＤＭＥＭに１体積％のＢ２７、全トランス型レチノイン酸（ＲＡ、２μＭ；Ｓｉｇｍａ）およびＤＡＰＴ（１ｍＭ）を加えた培地中で細胞を３日間成長させ、続いて高度ＤＭＥＭに１体積％のＢ２７および全トランス型レチノイン酸（ＲＡ、２μＭ；Ｓｉｇｍａ）を加えた培地中でさらに３日間成長させた。
【０１８６】
［ＲＴ−ＱＰＣＲ、免疫染色およびＦＡＣＳ分析］
ＲＴ−ＱＰＣＲの方法は、Ｔｏｕｂｏｕｌ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５１：  １７５４−１７６５に記載されている。全てのデータとしては生物学的に３回独立して繰り返した平均を示し、エラーバーは標準偏差を示す。
【０１８７】
［チトクロームＰ４５０活性］
Ｃｙｐ３Ａ４活性アッセイは、Ｐ４５０−Ｇｌｏアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の指示書にしたがって使用し、三重測定で行った。その後チトクローム活性を、Ｐ４５０−ＧｌｏＭａｘ９６マイクロプレートルミノメーターを使用して測定した。
【０１８８】
［過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色］
細胞のＰＡＳ染色を、キット（Ｓｉｇｍａ，３９５Ｂ−１ＫＴ）を製造業者の指示書にしたがって使用し、三重測定で行った。続いてジアスターゼ消化を行い、グリコーゲンの存在による陽性染色を行った。
【０１８９】
［ＬＤＬの摂取］
Ｄｉｌ−ＬＤＬ染色キットを（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＭＡ）から購入し、アッセイは製造業者の指示書にしたがって行った。
【０１９０】
［ＨＥＸおよびＨＬＸＢ９のノックダウン］
リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（Ｖａｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ  （２００４）  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２２：  ２−１１）を使用して、ｈＥＳＣ（Ｈ９）をＨＥＸおよびＨＬＸＢ９（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）に対するＳｈＲＮＡ発現ベクターで安定的にトランスフェクトした。その後、安定にトランスフェクトされた細胞をピューロマイシンで選択し、得られたコロニーを個別に選択し、さらに分析を行った。１００個のｈＥＳＣ亜系（各ＳｈＲＮＡ発現ベクターに対して１０個のｈＥＳＣ亜系）について、肝臓または膵臓前駆細胞に分化した後のＨＥＫおよびＨＬＸＢ９のそれぞれのノックダウンを分析した。さらに、異なるＳｈＲＮＡ配列を発現する少なくとも２つのｈＥＳＣ亜系に対して、体系的に分析を行った。
【０１９１】
［動物研究］
分化細胞（５×１０6）を容積式ピペットに取り付けた２４Ｇカテーテルを使用してＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの腎臓被膜下に移植した。Ｃ−ペプチド分析用に血液検体を種々の時間間隔で尾部から採取した。腎臓を指示された時点で摘出し、移植した細胞を含有する部分を４％パラホルムアルデヒド中に固定し、ワックスに包埋し、免疫組織化学用に加工した。抗体結合は、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を使用して可視化した。
【０１９２】
［マイクロアレイプロファイリング］
全ＲＮＡの抽出は、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉキットを製造業者（Ｑｉａｇｅｎ）のプロトコルにしたがって使用して行った。ＲＮＡ検体は、マイクロアレイ上でハイブリダイゼーションを行う前に、ＲＮＡの完全性について最初に評価した。４．５日目および４．５日目−アクチビン＋ＳＢの各条件で分化させたｈＥＳＣの生物学的に同型の５検体を、ＩｌｌｕｍｉｎａヒトＨＴ−１２  ｖ４．０Ｒ１発現ＢｅａｄＣｈｉｐｓに、製造業者の標準プロトコルにしたがってハイブリダイズさせた。少なくとも１つの検体グループの全ての検体複製において、閾値ｐ＜０．０１でＩｌｌｕｍｉｎａシグナル検出統計値に合格しなかったＢｅａｄＣｈｉｐプローブセットは、その後の分析から除外した。全ての検体に対して、残ったプローブセットのバックグラウンドを、ＲＭＡモデル２３のデフォルトパラメータを使用して補正し、基準化し、要約した。アレイ処理は、Ｒ統計プログラミング言語のためのソフトウェアであるＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ一式のビーズアレイパッケージを使用して行った。プローブセットは、製造業者から入手可能な転写情報を使用して注釈を加えた。記述された生のマイクロアレイデータは、ＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓリポジトリ（ＥＢＩ）にアップロードした（実験名：Ｖａｌｌｉｅｒ  ｈＥＳＣ内胚葉、ＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ登録：Ｅ−ＭＥＸＰ−２３７３、分化制御の分析）。Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒのｌｉｍｍａパッケージで実現できる、中程度のｔ統計値２４を、検体グループ間で差異的遺伝子（プローブセット）発現の有意性を評価するために採用した。そのような規模での試験における複数の仮説によるエラーを低減するために、得られた有意性ｐ値を、ＦＤＲ法の２５を使用して補正ｑ値に変換した。ｑ＜０．００１（ＦＤＲ：０．１％）でのプローブセットは、検体グループ間に有意な発現差異が現れると考えられる。データの可視化は、ＲＭＡ加工マイクロアレイ遺伝子発現データの適切なサブセットをＪａｖａ  Ｔｒｅｅｖｉｅｗデータ可視化パッケージにインポートすることにより遺伝子発現のヒートマップを作成して行った。遺伝子がアレイ上の２つ以上のプローブセットに代表される場合には、単一のプローブセットを選択し、検体全体にわたって最高の中間の発現によるヒートマップにおける遺伝子発現とした（すなわち、グループの構成員を問わない、最も信頼できる検体のハイブリダイゼーション）。記述された生のマイクロアレイデータをＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓリポジトリ（ＥＢＩ）にアップロードした。
【０１９３】
［酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）］
膵臓特定化を誘導する培養条件下で１８日間成長したｈＥＳＣを、グルコース刺激に先立ちインスリンを含有しない分化培地で２４時間培養した。その後、細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、２．２ｍＭのグルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＤＭＥＭ中で６０分、３７℃でプレインキュベートした。グルコース誘導インスリン分泌を見積もるために、プレインキュベートした細胞を、２２ｍＭのグルコースが補充されたＤＭＥＭまたは２．２ｍＭのグルコース中で、１５〜６０分間成長させた。その上清を集めて、放出されたＣ−ペプチドを測定した。ＥＬＩＳＡ分析は、以下のように行った。高結合表面ＣＯＳＴＡＲ９６−ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）を、アフィニティー精製されたα−１−アンチトリプシン（Ａｂｃａｍ  ３１６５７，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）に対するウサギポリクローナル抗体およびアルブミン（Ａｂｃａｍ  ８７５６４，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を２μｇ／ｍＬで、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（Ｎａ2ＣＯ3／ＮＡＨＣＯ3，ｐＨ９．５）中、一晩コートした。洗浄（０．９％ｗ／ｖＮａＣｌ，０．０５％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０）後、プレートをブロッキング緩衝液（ＰＢＳ，０．２５％ｗ／ｖＢＳＡ，０．０５％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０）中で２時間ブロックした。培養培地をブロッキング緩衝液で希釈して、その５０μＬを各ウェルに添加し、２時間インキュベートした。洗浄後、ウェルを対応するモノクローナル抗体（１μｇ／ｍＬにブロッキング緩衝液で希釈）と２時間インキュベートした。結合したモノクローナル抗体をＨＲＰ標識ウサギ抗−マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｈａｖｅｒｈｉｌｌ，ＵＫ，１：２０，０００）で１時間検出した。反応をＴＭＢ液基質（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｈａｖｅｒｈｉｌｌ，ＵＫ）で１０分間、暗所で進行させた後、反応を１ＭのＨ2ＳＯ4で停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をＴｈｅｒｍｏ−ｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）で測定した。
【０１９４】
［免疫染色］
ｈＥＳＣまたはその分化した前駆細胞を４％パラホルムアルデヒド中で２０分間、４℃で固定した後、ＰＢＳ中で３回洗浄した。細胞を１０％ロバ血清（Ｓｅｒｏｔｅｃ  Ｌｔｄ．）を含有するＰＢＳＴ（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ）中で２０分間、室温でインキュベートし、続いて１％ロバ血清を含むＰＢＳＴで希釈した一次抗体（表１１）と４℃で一晩、インキュベートした。細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、１％ロバ血清を含むＰＢＳＴ中で二次抗体（表１１）と２時間、室温でインキュベートした。未結合の二次抗体をＰＢＳ中で５分間、３回洗浄して除去した。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８を最初の洗浄（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；１：１０，０００）に添加した。脂質の可視化のために、脂質特異的染色ＢＯＤＩＰＹ（ボロンジピロメテン；ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）４９３／５０３  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｄ−３９２２）を使用した。
【０１９５】
［フローサイトメトリー］
膵臓分化プロトコルの特定のステージでの付着性細胞をＰＢＳ中で２回洗浄した後、細胞解離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で２０分間、３７℃でインキュベートした。細胞を優しくピペットで引き離し、０．１％アジド（Ｓｅｒｏｔｅｃ  Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）を含有するＰＢＳＴ＋３％正常ロバ血清（ＮＤＳ）の１ｍＬ当たりに約０．１〜１×１０5個の細胞を有するように再度懸濁した。その後、細胞を４％パラホルムアルデヒド中で２０分間、４℃で固定したのち、ＰＢＳ中で３回洗浄した。細胞を沈殿させ、２ｍＬのＳＡＰ緩衝液（０．１％（ｗ／ｖ）サポニンを含有するハンクス平衡塩類溶液）に再懸濁した。細胞をＳＡＰ緩衝液中一次抗体（表１１）と２時間、室温でインキュベートした。その後、細胞をＰＢＳ＋３％ＮＤＳ中で３回洗浄した後、ＳＡＰ緩衝液中二次抗体（表１１）と２時間、室温でインキュベートした。未結合の二次抗体をＰＢＳ中で３回洗浄して除去した。その後、細胞をＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ機（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用して分析した。３回の独立した実験の平均を陽性細胞の数として記録した。
【０１９６】
［結果］
［レチノイン酸存在下におけるアクチビンおよびＢＭＰシグナル伝達の抑制は、完全に定義された培養条件で成長したｈＥＳＣ由来内胚葉細胞のＰＤＸ１発現を誘導する。］
我々は、近年、ｈＥＳＣおよびｈＩＰＳＣを胚体内胚葉（ＤＥ）細胞の略均一な個体群に分化させるために定義された培養系を構築した（Ｔｅｏ  ＡＫ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２５：  ２３８−２５０）。重要なことには、この培養系は、ＢＳＡ、血清、マトリゲル（商標）などの錯体細胞外マトリックスまたはフィーダー細胞などの動物産物を含まず、既知組成培地（ＣＤＭ）だけに頼っているため、実験結果に影響するような未知の因子の存在を回避できる。さらにこのプロトコルを拡げるために、成長因子とシグナル伝達経路のインヒビターの組合せを多数スクリーンして、ＤＥ細胞を膵臓前駆細胞に分化させる定義された培養条件を特定した。これらの分析は、ＲＡ、ＦＧＦ１０、ノギン（ＢＭＰインヒビター）およびＳＢ４３１５４２（アクチビン／ＴＧＦβ受容体アンタゴニスト）の組合せは、ｈＥＳＣ由来ＤＥ細胞の腸（ＣＤＸ２）および肝マーカー（ＡＦＰ）の発現を抑制しながら、膵臓マーカーＰＤＸ１、ＨＮＦ６、ＰＴＦ１Ａ、Ｓｏｘ９およびＨＬＸＢ９の発現を誘導できることを明らかにした（図２）。重要なことには、この因子の混合物は、特定の基本培地（高度ＤＭＥＭ）中でＰＤＸ１を誘導するだけで、血清、マトリゲル（商標）またはフィーダーの存在が膵臓前駆細胞分化を抑制したとはいえ、種々さまざまな因子がＤＥ分化に影響を与えることができることを確認した。次いで、我々はこれらの添加物のそれぞれの役割を立証、最適化しようとした。ノギン、ＦＧＦ１０およびＳＢ４３１５４２（ＳＢ）の存在下におけるＲＡの不存在は、膵臓マーカーの発現を抑制し（図２）、ＲＡが膵臓特定化の誘導に不可欠であることを確認した（Ｍｆｏｐｏｕ  ＪＫ  ｅｔ  ａｌ  （２０１０）  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３８：  ２２３３−２２４５，  ２２４５  ｅ２２３１−２２１４）。ノギンの不存在または分化工程中のＢＭＰ４の添加（図２）は、腸（ＣＤＸ２）および肝マーカー（ＡＦＰ）を誘導しながら、膵臓前駆細胞マーカーの発現を著しく低下させるため、ＢＭＰシグナル伝達が膵臓特定化を抑制し、別の細胞の運命を推進することを示す以前の研究を補強した（Ｃａｉ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２：  ５０−６０）。ＳＵ５４０２（ＦＧＦ受容体アンタゴニスト）の使用またはＦＧＦ２／７／１０の使用量の増加によるＦＧＦシグナル伝達の抑制は、ＰＤＸ１、ＳＯＸ９およびＨＬＸＢ９などの膵臓前駆細胞マーカーの発現に影響しなかった（図２）。しかし、ＰＴＦ１Ａの発現はＦＧＦシグナル伝達の不存在により強く低下したにもかかわらず、腸マーカーＣＤＸ２（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ  （２０００）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７：  １５６３−１５７２）の発現が増加した。これは、膵芽特定化の間に、ＦＧＦ１０がＰＤＸ１発現細胞の十二指腸への特定化を阻止できる（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ  （２０００），  Ｓｐｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ  （２０１１）  Ｎａｔｕｒｅ  ４７０：  １０５−１０９）ことを示している。さらに、ＦＧＦ抑制は顕著な細胞死を引き起こし、ＦＧＦはまた、インビトロでの膵臓前駆細胞の増殖および生存に必要であることが示唆された。さらに重要なことには、我々は、��クチビンの添加が膵臓マーカーの発現を破壊するのに対し、ＳＢによるアクチビン／ＴＧＦβシグナル伝達の抑制は反対の効果を示すことを観察した（図２）。これは、アクチビン／ＴＧＦβシグナル伝達がインビトロでの膵臓特定化を抑制することを最初に示したものである。
【０１９７】
興味深いことに、ＳＢの存在は、分化の最初の３日間だけ必要であって、アクチビン／ＴＧＦβシグナル伝達がＰＤＸ１発現に先立つ膵臓特定化の初期段階に作用することを示している。同時に、これらの結果は、ＴＧＦβシグナル伝達経路（例えば、アクチビン＋ＢＭＰ）はこの細胞の運命の選択の強力なインヒビターとして作用するのに対して、ＲＡがＤＥ細胞の分化を膵臓分化系列に向ける誘導シグナルとして作用することを示している。
【０１９８】
［アクチビン／ＴＧＦβの抑制は、内胚葉を膵臓前駆細胞の略均一な個体群へと分化させ、本来の発生経路に導く。］
上述の結果に基づき、定義された培養培地（Ｄｅｆ−Ｐａｎｃ，図１）を使用して、ｈＥＳＣを膵臓前駆細胞に分化させる４段階からなるプロトコルを構築した。第一のステップ（１〜３日目）では、ｈＥＳＣをアクチビン／ＢＭＰ／ＦＧＦ２／ＬＹ２９４００２（ＰＩ３Ｋインヒビター）が補充されたＣＤＭ中で成長させた（Ｔｅｏ  ｅｔ  ａｌ  （２０１１））。得られた細胞はＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＨＥＸ、ＦＯＸＡ２およびＥＯＭＥＳなどのＤＥマーカーの発現陽性であったが、多能性マーカーＯＣＴ−４、ナノグおよびＳＯＸ２ならびに原始線条マーカーＴ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）およびＭｉｘｌ１の両者が発現陰性であった（図３）。Ｄｅｆ−Ｐａｎｃプロトコルの第二のステップは、ＲＡ／ノギン／ＦＧＦ１０／ＳＢ４３１５４２の存在下に、ＤＥ細胞を３日間成長させることを有する（４〜６日目）。得られた細胞は、ＨＮＦ１β、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４、ＲＦＸ６およびＨＬＸＢ９を発現し（図４）、その全てが初期哺乳類発生の間に前腸を特徴付けする（図３）。特に、ＨＬＸＢ９の発現およびＨＥＸの非発現は、これら前腸細胞の背側独自性の指示を与え、ＣＤＸ２の不存在が、中腸または後腸細胞の存在を排除する（図３）。プロトコルの第三のステップでは、背側前腸細胞をＲＡ／ノギン／ＦＧＦ１０／シクロパミン存在下にさらに３日間成長させた（７〜９日目）。得られた細胞は、前腸マーカー（ＨＮＦ１β、ＳＯＸ２、ＦＯＸＡ２およびＨＬＸＢ９）および膵臓前駆細胞マーカー（ＳＯＸ９、ＨＮＦ６、ＰＴＦ１ＡおよびＰＤＸ１）の組合せを発現した（図３）。膵臓前駆細胞マーカーの発現は、ＦＧＦ１０の添加による３日間のプロトコルの第四ステップにおいてさらに再強化された（１０〜１２日目）。得られた細胞は、ＮＫＸ６．１、ＳＯＸ９、ＨＮＦ６、ＰＴＦ１Ａ、ＰＤＸ１、ＨＮＦ１β、ＳＯＸ２およびＦＯＸＡ２を発現したが、ＨＬＸＢ９の発現を強く抑制した（図３）。ステップ１の最後に行ったＦＡＣＳ分析は、ＤＥ濃縮細胞が均一にＣＸＣＲ４陽性であることを示し、プロトコルの第四ステップ後（１２日目）には、８０％の細胞がＰＤＸ１を発現した（図４）。免疫染色分析は、同じ細胞中でＰＤＸ１がＳＯＸ９、ＨＮＦ６、ＨＮＦ４、ＮＫＸ６．１およびＧＡＴＡ４と共発現されたことを示した。同時に、これらの結果は、Ｄｅｆ−ＰａｎｃプロトコルがｈＥＳＣを膵臓前駆細胞の略均一な個体群に分化させ、それに続く膵臓発生中に起こる事象によく似ているその後の特定化の事象を引き起こすことを示していた。
【０１９９】
［定義された培養条件下で生成されたＰＤＸ１内胚葉は、インビトロおよびインビボでインスリン分泌細胞に分化できる。］
膵臓前駆細胞がさらに内分泌分化系列に分化する能力の確認のために、ステージ４の最後に取得したＰＤＸ１発現細胞を、先に示した培養条件下でさらに６日間成長させ、内分泌細胞分化を刺激した（Ｋｒｏｏｎ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２６：  ４４３−４５２）。Ｑ−ＰＣＲ分析は、ＰＤＸ１発現が３日後に減少し、ＮＧＮ３およびホルモンマーカー（インスリン、グルカゴンおよびソマトスタチン）の発現は徐々に増加することを示した（図３）。１８日目までに、１０％の細胞がＣ−ペプチド陽性に染色された。
【０２００】
興味深いことに、これらのｈＥＳＣ誘導インスリン発現細胞は、β細胞によるインスリン放出を模倣したグルコース刺激によりＣ−ペプチドを放出することができた（図５）。それでもなお、膵内分泌に特異的なマーカー（ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３およびＳｏｘ９）の発現は維持されたが、ホルモンマーカー（インスリン、ＳＳＴおよびＧＳＣ）の発現は、ヒト成人膵島細胞に比べて、比較的低かった。
【０２０１】
さらに、Ｃ−ペプチド発現細胞の画分は、グルカゴンまたはソマトスタチン陽性であることも見出された。複数のホルモンの発現は、胚起源β細胞を特徴付けることができ（Ｐｏｌａｋ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ  （２０００）  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４９：  ２２５−２３２）、我々のインビトロ培養条件は、完全に機能し得る内分泌細胞を生成するには十分ではないことを示している。インビトロシステムにおけるこの制限を克服するためには、分化の１２日目以降に取得した膵臓前駆細胞をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの腎臓被膜下に注射し、内分泌細胞への分化に好都合であると知られている環境を与えた（Ｋｒｏｏｎ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２６：  ４４３−４５２）。移植後１２週間目には、移殖動物８匹中、３匹の血流中に低濃度のヒトＣ−ペプチドが検出された（陰性コントロール：０．０２１ｎｇ／ｍＬ；マウス１：０．１ｎｇ／ｍＬ、マウス２：０．４３ｎｇ／ｍＬ、マウス３：０．１６３５ｎｇ／ｍＬ）。加えて、膵臓前駆細胞を移植されたマウスの腎臓被膜中の膵臓マーカーの組織学的分析を分化の２０週間目にインビボで行った結果、グルカゴンおよびＣ−ペプチドを発現する細胞の塊のように見える膵島の存在を明らかにされた。
【０２０２】
同時に、これらの結果は、Ｄｅｆ−Ｐａｎｃプロトコルにしたがって生成した膵臓前駆細胞は、さらに内分泌細胞に分化する能力を有しており、初期膵臓前駆細胞に相当することを示す。最後に、同等の結果が３つのｈＩＰＳＣ系において得られ、Ｄｅｆ−Ｐａｎｃプロトコルを多様なｈＰＳＣから膵臓前駆細胞を作製するためにうまく使用できることが示された。
【０２０３】
［アクチビン／ＴＧＦβは、内胚葉細胞を胎児肝細胞に分化できる肝臓前駆細胞へ分化させる。］
上述の培養条件のスクリーニングにおいて、我々は、アクチビンの存在下に成長させたＤＥ細胞は、大きな暗い細胞質空間と小管様構造を有する胎児肝細胞の外観を取得したことに気付いた。さらに、分析により、アクチビンの存在下に５日間成長させたＤＥ細胞は、肝芽形成の部位である、腹側前腸を特徴付ける遺伝子を発現することが確認された（図７中のＨＥＸ、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ４、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＴＢＸ３）。反対に、ＳＢによるアクチビンの抑制は、ＨＮＦ４α、ＳＯＸ１７、ＨＥＸおよびＴＢＸ３の発現を低下させたが、ＦＧＦシグナル伝達などの公知の肝誘導因子の阻止は、ＨＥＸ、Ｓｏｘ１７およびＴＢＸ３などの肝芽遺伝子の発現も低下させた（図８）。驚いたことに、ノギンだけはＨＮＦ４発現の僅かな低下を誘導し、ＢＭＰシグナル伝達はインビトロの肝臓特定化に限定的な機能を有していることを示した。あるいは、未知のシグナル伝達経路が分化の同じプログラムを活性化しているのかも知れない。合わせて考えると、これらの結果は、アクチビン、ＢＭＰおよびＦＧＦの効果の組合せがインビトロでのＤＥ細胞の肝臓特定化を十分に促進するために必要であることを示唆している。
【０２０４】
この観察に基づいて、定義された培養条件でｈＰＳＣから肝細胞を生成する３ステップのプロトコルを開発した（Ｄｅｆ−Ｈｅｐ、図１）。Ｄｅｆ−Ｈｅｐプロトコルの第一のステップは、上述のようにｈＥＳＣをＤＥ細胞に分化させることから成るが、第二のステップは、最初にアクチビンのみを３日間使用し、次いでアクチビンをＢＭＰ４およびＦＧＦ１０と組み合わせて肝臓分化系列へのＤＥの特定化を促進することを有する。Ｄｅｆ−Ｈｅｐプロトコルの第三のステップは、肝臓内胚葉細胞を肝芽細胞の肝細胞への分化をコントロールすることが知られている２つの成長因子、オンコスタチンＭおよびＨＧＦ、の存在下にさらに１５日間成長させた。
【０２０５】
したがって、Ｄｅｆ−Ｈｅｐプロトコルにしたがって生成された細胞は、アルブミン（ＡＬＢ）、α−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、αＡＰＯＦ、ＴＡＴ、ＴＤＯ２、ＴＴＲ、ＨＮＦ４αおよびＨＥＸなどの肝細胞マーカーを発現する（図９）。これらの観察は、ＡＬＢ、サイトケラチン１８、ＡＡＴおよびＡＦＰの均一な共発現を示した免疫染色およびＦＡＣＳ分析により確認された（図１０）。これらの細胞はまた、肝細胞の機能的特徴、すなわち、（ｉ）ＡＬＢおよびＡＡＴの分泌（図１１）、（ｉｉ）デキサメタゾンによるＣｙｐ３Ａ４活性誘導（図１２）、（ｉｉｉ）コレステロールの取り込み（ＤＩＬアッセイにより示される）および（ｉｖ）グリコーゲン貯蔵（ＰＡＳ染色により示される）を示した。同時に、これらのデータは、アクチビンはＶＦ様細胞へのＤＥ特定化、その後、胎児肝細胞の特徴を表示する細胞へ分化できる能力を有する肝内胚葉へのＤＥ特定化を推進することを示すものである。
【０２０６】
［ｈＥＳＣの膵臓および肝臓分化におけるＨＥＸおよびＨＬＸＢ９ノックダウンはそれぞれ肝臓および膵臓分化を妨げる。］
次いで、我々は、Ｄｅｆ−ＰａｎｃおよびＤｅｆ−Ｈｅｐ培養系の利点を生かして、アクチビンが膵臓および肝臓分化系列間の細胞の運命の選択を制御できるメカニズムを研究した。そのために、膵臓特定化においてアクチビンの存在により上方または下方制御された遺伝子を同定するための遺伝子発現プロファイリング実験を行った。アクチビン／ＲＡ／Ｎｏｇ／ＦＧＦ（Ｄ４５Ａ）またはＳＢ／ＲＡ／Ｎｏｇ／ＦＧＦ（Ｄ４５ＳＢ）の存在下に３６時間成長させたＤＥ細胞についてのこれらの分析は、前腸発生に必要であることが知られているＨＥＸおよびＨＬＸＢ９などの広範囲の遺伝子の発現を、アクチビンが活性化または妨害することを明らかにした。従って、我々はアクチビンがこれらの転写因子の発現を制御してＤＥ特定化を管理する、という仮説をたてた。この仮説を試験するために、ＳｈＲＮＡの安定な発現を使ってｈＥＳＣでのＨＥＸまたはＨＬＸＢ９の発現をノックダウンした。次いで、得られたｈＥＳＣ亜系（ＳｈＨＥＸ−ｈＥＳＣおよびＳｈＨＬＸＢ９−ｈＥＳＣ）を図１に示すように分化した。Ｑ−ＰＣＲ分析は、ＤＥ分化におけるＨＥＸ発現のノックダウン（図１３）が、ＡＦＰやＡＬＢなどの肝臓マーカーの下方制御に体系的に関連付けられたことを示した（図１４）。同様の低下は、ＳｈＨＬＸＢ９−ｈＥＳＣ由来のＤＥ細胞または非対象物であるＳｈＲＮＡ（ＳｈＳｃｒａｍｂｌｅ−ｈＥＳＣ）を安定に過剰発現するｈＥＳＣ由来のＤＥ細胞では観察されなかった。しかし、低下したＨＥＸ発現が、ＶＦ分化中の細胞死を増加することが認められた（図１５）。従って、ＨＥＸ発現は、ＶＦ様細胞がインビトロで生存および肝臓分化系列に分化するために必要であると思われる。最後に、ＳｈＨＥＸ−ｈＥＳＣは、引き続いてＨＬＸＢ９およびＰＤＸ１を発現する膵臓前駆細胞に分化することができた（図１６）。
【０２０７】
ＳｈＨＬＸＢ９−ｈＥＳＣで行った同様の実験は、前腸分化におけるＨＬＸＢ９発現のノックダウンはＰＤＸ１／ＳＯＸ９などの膵臓前駆細胞マーカーの発現を強く抑えるということを示した（図１７）。興味深いことに、ＨＬＸＢ９発現の低下は、ＨＮＦ４α、ＦｏｘＡ２およびＨＮＦ１βなどの前腸マーカーの発現に影響を与えず（図１７）、ＨＬＸＢ９は背側前腸の特定化には必要ないが、その膵臓分化系列への分化には必要であるということを示している。重要なことには、ＨＬＸＢ９は肝臓分化では発現されず（図１８）、したがって、ＳｈＨＬＸＢ９−ｈＥＳＣから生成されたＤＥ細胞はＶＦ様細胞に分化でき、アクチビン存在下での成長では肝臓内胚葉に分化できた。まとめると、これらの結果は、マウス胚で行った研究が、ＨＥＸの非存在は、背側膵臓特定化を影響することなく、肝芽発生を妨害するが、ＨＬＸＢ９は膵臓でのＰＤＸ１発現の誘導に必要である、ということを要約している（Ｈａｂｅｎｅｒ  ＪＦ，  ｅｔ  ａｌ    （２００５）  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４６：  １０２５−１０３４）。したがって、結果は、ＤＥ発生のモデリングや膵臓および肝臓の初期器官形成のインビトロ研究への我々の培養系の一般的な適用を明示している。
【０２０８】
臨床応用に対応している培養条件下でｈＰＳＣから肝臓および膵臓前駆細胞の均質な個体群を作製することが可能な、確固としたプロトコルは、未だ構築されていなかった。実際、使用可能な方法は、フィーダーやウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの未定義の動物産生物を含有することが多い。このような問題に対処するため、我々は、複数のｈＰＳＣ系から、ヒト胚体内胚葉（ＤＥ）を膵臓および肝臓内胚葉の略均一な個体群に分化させるための定義された培養条件を同定した。
【０２０９】
ＲＡは膵臓特定化を促進するために不可欠な機能を有することが見出されたが、ＢＭＰシグナル伝達は膵臓マーカーＰＤＸ１の発現を妨げ、先の研究結果を補強していた（Ｍｆｏｐｏｕ  ｅｔ  ａｌ  （２０１０）  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３８：  ２２３３−２２４５，  ２２４５  ｅ２２３１−２２１４；  ［Ｃａｉ  ｅｔ  ａｌ  （２０１０  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２：  ５０−６０）。しかし、ＦＧＦは膵臓特定化の誘導シグナルというよりは、むしろ許容シグナルとして作用するということを示した、ＦＧＦシグナル伝達の機能に関する我々の結果は、先の研究（Ａｍｅｒｉ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２８：  ４５−５６）を否定するものである。この明白な相違は、我々の培養条件は、フィーダー、血清およびマトリゲル（商標）、これらの全てがＦＧＦシグナル伝達を妨げやすい未知の成分を含有している、を含有していないことで説明できるかも知れない。
【０２１０】
さらに、我々は、ＦＧＦシグナル伝達の抑制は膵臓前駆細胞の生存を低減させることを観察し、それにより我々のプロトコルでのＦＧＦの使用を正当化した。さらに重要なことは、我々の分析は、アクチビン／ＴＧＦβは、肝臓分化系列を促進しながら、背側前腸（ＤＦ）特定化を抑制することにより膵臓分化系列へのＤＥ細胞の運命の選択を制御していることも明らかにしたことである。先の研究はＴＧＦｂシグナル伝達がマウス胚で腹側膵芽の誘導を制御していることを示しており（Ｗａｎｄｚｉｏｃｈ  Ｅ，  Ｚａｒｅｔ  ＫＳ  （２００９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４：  １７０７−１７１０）、したがって、我々のデータは同様のメカニズムが背側膵臓で起こるということを最初に示したものであり、インビトロで前腸発生を作る際の我々の培養系の利点を確証している。
【０２１１】
最後に、ｈＰＳＣから膵細胞を生成するために現在使用可能なプロトコルは、フィーダー、マトリゲル（商標）および血清、これらは全てＴＧＦβシグナル伝達の発生源である可能性がある、に頼っていることが多く、膵臓特定化を障害する能力を持っているので、上述の結果は重要な実際的意義を有している。さらに、近年の研究により、ノダル発現の内因性レベルが特定のｈＩＰＳＣ系の中胚葉誘導体に分化する能力を決定することができることを示している（Ｒａｍｏｓ−Ｍｅｊｉａ  Ｖ，  Ｍｅｌｅｎ  ＧＪ，  Ｓａｎｃｈｅｚ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １８：  ２１７３−２１８１）。そのようなノダル／ＴＧＦβ成長因子の内因性レベルの相違が、種々のｈＰＳＣ系の膵臓前駆細胞に分化する能力に影響を与えことができ、この制限はこのシグナル伝達経路をＳＢにより抑制することにより回避できた。したがって、我々は最近、我々の４ステッププロトコルを使用して１０のｈＩＰＳＣ系を膵臓前駆細胞に分化し、ＤＥへ分化できなかったｈＩＰＳＣ系（１０のうち、２）だけが膵臓細胞へ分化する能力を持っていなかったことも観察した。ＤＥ分化においてＴＧＦβシグナル伝達を抑制することの他の利点は、多能性細胞の汚染を避けることが可能な点である。実際、我々と他の研究者は、アクチビン／ノダル／ＴＧＦβシグナル伝達の抑制がｈＰＳＣの分化を誘導した、ということを広範に示した（Ｖａｌｌｉｅｒ  Ｌｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３６：  １３３９−１３４９）。このように、ＤＥ特定化においてアクチビンを抑制することにより、未分化細胞による汚染を低減することができた。したがって、我々は膵臓前駆細胞を移植されたマウスに奇形腫形成を観察することは一度もなかった。したがって、膵臓特定化においてアクチビンシグナル伝達を抑制することにより、可能な細胞療法のための「より安全に」膵臓前駆細胞を生産することができるであろう。
【０２１２】
結論として、我々の研究は、臨床応用のために、定義された培養条件での膵臓および肝臓細胞の均質な個体群の作製を大いに促進した。しかし、この培養系はまた、ヒト内胚葉分化を研究するために開発の確固とした効率的なインビトロモデルを提供する。
【０２１３】
【表１−１】
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【表１−２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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