(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３からなる群より選択された配列からなる、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
該オリゴヌクレオチドが、野生型形のＦＧＦＲ３の発現と比較して、突然変異型のＦＧＦＲ３の発現を優先的に調節する、請求項１のオリゴヌクレオチドであって、突然変異型のＦＧＦＲ３遺伝子産物又はｍＲＮＡの発現に対する野生型のＦＧＦＲ３遺伝子産物又はｍＲＮＡの発現の割合が増加する、オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
ロックド核酸（ＬＮＡ）単位；２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、及び２’−フルオロ−ＤＮＡ単位からなる群より選択される１つ以上のヌクレオチド類似体を含む、請求項１又は２のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
該オリゴヌクレオチドが、２つ以上のＬＮＡ単量体単位を含む、請求項１〜３のいずれか一項のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
該オリゴヌクレオチドが、以下の配列：
0006463687.tif 000021
からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号２１からなる、請求項１〜５のいずれか一項のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
癌又は軟骨無形成症などのＦＧＦＲ３の異常発現に関連した容態の処置のための請求項１〜６のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド及び薬学的に許容される希釈剤、担体、溶媒、塩又は補助剤を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本出願は、線維芽細胞増殖因子受容体３型（ＦＧＦＲ３）をコードする核酸を標的化しかつハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び関連する医薬組成物、並びに、該オリゴヌクレオチドを使用してＦＧＦＲ３の発現を調節する方法に関する。特に、特定の実施態様は、ＦＧＦＲ３をコードするｍＲＮＡなどの核酸とハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び、このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてＦＧＦＲ３の発現を調節するための方法に関する。ＦＧＦＲ３の発現の低減は、軟骨無形成症などの一連の内科的疾患にとって有益である。
【０００２】
背景
線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）は、線維芽細胞増殖因子に対する高親和性の受容体である。これらの因子は、細胞増殖、分化、及び他の生物学的プロセスにおいて多様な役割を有し、その正確な機能は、標的細胞及び発達段階に依存する。ＦＧＦＲ遺伝子の突然変異は、多種多様な疾患を引き起こすことが判明した。例えば、ＦＧＦＲ１及びＦＧＦＲ２の突然変異は頭蓋縫合早期癒合症において起こり、ＦＧＦＲ３の突然変異は骨格形成異常、例えば軟骨無形成症、軟骨低形成症、及び致死性骨異形成症（Ｉ型及びＩＩ型）に関与している。
【０００３】
軟骨無形成症などの形成異常の処置のための現在の療法としては、整形外科手術、例えば人工股関節置換術又は脚延長術及び成長ホルモン療法が挙げられる。脚延長術は、１０歳又はそれ以後の年齢で骨を切断し、約６か月間の数クールを通じて特殊な脚延長装置を使用して身長を次第に延ばすことを含む。しかしながら、この手順は、患者に大きな痛みを与える。成長ホルモン療法は、小児期から開始する定期的な成長ホルモンの注射を用いて身長を伸ばす。しかしながら、注射を止めると成長は停止する。前記の療法のいずれも治癒的ではなく、患者の生活の質の観点から理想的とも考えられない。ヒトにおける軟骨無形成症を治癒、又は少なくとも軟骨無形成症に関連した生存率及び罹患率を改善する手段として、軟骨無形成症の処置、例えばＦＧＦＲ３の発現を調節する処置のための新規な療法を同定するためにさらなる開発が必要とされる。
【０００４】
要約
本出願は、ＦＧＦＲ３の異常発現に関連した疾病（例えば、形成異常、例えば軟骨無形成症）の処置に有用な、新規なオリゴヌクレオチド、特にロックド核酸（ＬＮＡ）アンチセンスオリゴヌクレオチド、及び治療的介入を提供する。本明細書において開示された本発明は、ＦＧＦＲ３を異常発現している細胞又は組織を、本発明のオリゴヌクレオチドと接触させることは、ＦＧＦＲ３（特に、ＦＧＦＲ３の突然変異した又は天然の変異体）の発現を調節するという発見に関する。特定の実施態様において、ＦＧＦＲ３の発現の調節は、例えば、正常な軟骨細胞の機能を回復する。本発明のオリゴヌクレオチド及びこのようなオリゴヌクレオチドを使用してＦＧＦＲ３の異常発現を調節する方法は、例えば軟骨無形成症などのＦＧＦＲ３の異常発現に関連した生存率及び罹患率を改善する、又はさらには治癒する手段を提供する。
【０００５】
１つの態様において、本発明は、ＦＧＦＲ３標的配列、例えば哺乳動物ＦＧＦＲ３遺伝子又はｍＲＮＡ配列（例えば、天然のＦＧＦＲ３遺伝子又はｍＲＮＡ）にハイブリダイズする、約８〜約５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに関する。特定の態様において、このようなオリゴヌクレオチドは、十分な安定性で（例えば、十分なハイブリダイゼーション強度及び十分な期間の間）ＦＧＦＲ３標的配列にハイブリダイズし、ＦＧＦＲ３遺伝子産物（例えばＦＧＦＲ３タンパク質）の発現を阻害する。この目的及びその他に特に適したオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されている。
【０００６】
本明細書において使用されるハイブリダイズという用語は、ハイブリダイズすることができると理解される。
【０００７】
１つの態様において、本発明は、哺乳動物ＦＧＦＲ３遺伝子のコード領域の逆相補体又はＦＧＦＲ３をコードするｍＲＮＡの相補体に対応する領域に対して少なくとも８０％の同一率（例えば少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一率）を有する約８〜約３０ヌクレオチド（例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチド長）の連続ヌクレオチド配列（第一領域）を含む、約８〜約５０ヌクレオチド長（例えば、約８〜３０、８〜２０、１２〜１８、又は１４〜１６ヌクレオチド長）のオリゴヌクレオチドを提供する。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＦＧＦＲ３をコードする核酸（例えばＦＧＦＲ３ ＤＮＡ、プレｍＲＮＡ、又はｍＲＮＡ）の一部に対して少なくとも８０％相補的である連続ヌクレオチド配列を含み得る。本明細書において開示されたオリゴヌクレオチドは、突然変異したＦＧＦＲ３遺伝子領域又は対応するｍＲＮＡに対して相補的である核酸配列を含み得る。同様に、本明細書において開示されたオリゴヌクレオチドは、ＦＧＦＲ３遺伝子の遺伝子産物（例えばＦＧＦＲ３遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ）、又は、例えば配列番号４若しくはその天然の変異体（例えばＳＮＰ ＩＤ番号ｒｓ２８９３１６１４、ｒｓ１１９４３８６３又はｒｓ１７８８１６５６）によってコードされるような、ＦＧＦＲ３遺伝子産物の３８０位におけるグリシンからアルギニンへの置換などの突然変異（本明細書においてはＧ３８０Ｒと称される）をコードするその多形若しくは天然の変異体の遺伝子産物に対して相補的である配列を含み得る。特に、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、ＦＧＦＲ遺伝子の突然変異領域をコードする核酸配列又はｍＲＮＡ、例えばＧ３８０Ｒ突然変異をコードする領域及びＧ３８０Ｒ突然変異をコードする領域の上流及び／又は下流の直近に位置する領域（例えば、Ｇ３８０Ｒ突然変異の位置から約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０又はそれ以上のヌクレオチドだけ上流及び／又は下流）に対して少なくとも８０％相補的（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上相補的）であり得る。
【０００８】
別の態様において、本発明は、約８〜約２０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを提供し、該オリゴヌクレオチドは、ＦＧＦＲ３（例えばＦＧＦＲ３ｍＲＮＡ）をコードする核酸の少なくとも８核酸塩基部分にハイブリダイズする。例えば、いくつかの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、Ｇ３８０Ｒ突然変異をコードする核酸（すなわちｍＲＮＡ）に、又は、コドン３８０の１１３８位におけるＦＧＦＲ３ Ｇ３８０Ｒ突然変異をコードする核酸に直近の周囲及び／又は隣接した領域にハイブリダイズする。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、ＦＧＦＲ３をコードする一本鎖核酸分子の領域、例えば、配列番号４又はその天然の変異体（例えばＳＮＰ ＩＤ番号ｒｓ２８９３１６１４、ｒｓ１１９４３８６３又はｒｓ１７８８１６５６）の一部の配列を有する核酸分子の領域に対して相補的である。
【０００９】
いくつかの実施態様において、特許請求されたオリゴヌクレオチドは、ＦＧＦＲ３ｍＲＮＡ又はその一部をコードするＤＮＡ配列に対して相補的である配列を含むか、あるいは、代替的には特許請求されたオリゴヌクレオチドは、それによりコードされるＲＮＡ配列（例えばプレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ）又はその一部にハイブリダイズする。標的細胞又は組織（例えば、軟骨無形成症に罹患した又は苦しむ患者の長骨の成長板における軟骨細胞）と接触させると、本明細書において開示されたオリゴヌクレオチドは、ＦＧＦＲ３（及び特に突然変異した又は異常発現したＦＧＦＲ３）の発現を選択的に低減させることができ、これにより、正常な軟骨細胞の機能を回復させることができる。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、突然変異した又は異常発現したＦＧＦＲ３をコードする核酸（例えばｍＲＮＡ）、例えば、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９及び／若しくは配列番号２０、又は前記のいずれかの特定の部分若しくは領域（例えばＧ３８０Ｒ突然変異をコードする領域）を含む又はそれによってコードされるｍＲＮＡに標的化することができ、これにより、ＦＧＦＲ３の発現を調節することができ、よって、その発現は、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３５％、４０％、５０％、又は好ましくは少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％低減及び／又は阻害される。
【００１０】
さらに別の態様において、本発明は、本明細書に記載のようなオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施態様において、該組成物は、本明細書に記載の１つ以上のオリゴヌクレオチドを、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、補助剤、又は、該組成物の送達若しくは安定性を促進若しくは改善する他の分子と共に含む、医薬組成物を含み得る。いくつかの実施態様において、本発明は、本明細書に記載の１つ以上のオリゴヌクレオチド、及び該オリゴヌクレオチドに付着した、例えば共有結合的に又は非共有結合的に付着した少なくとも１つの非ヌクレオチド又は非ポリヌクレオチド部分を含むコンジュゲートを提供する。また本明細書において開示されているのは、ＦＧＦＲ３の異常発現に関連した疾病（例えば形成異常、例えば軟骨無形成症）の処置のためなどの医薬品として使用するための、オリゴヌクレオチド及びコンジュゲート並びにそれを含む医薬組成物、並びに、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート及び／又は医薬組成物を哺乳動物被験体に、例えばヒト被験者、例えば小児ヒト被験者（生誕前又は生誕後）又は成人ヒト被験者に投与することによってこのような疾病を処置する方法である。
【００１１】
別の態様において、本発明は、軟骨無形成症の処置のための医薬品の製造のためのオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートの使用を提供する。本発明はまた、軟骨無形成症などのＦＧＦＲ３の異常発現に関連した疾病又は容態を処置する方法を提供し、該方法は、有効量の本発明によるオリゴヌクレオチド、コンジュゲート及び／又は医薬組成物を軟骨無形成症に患っている、患っているようである、又はさもなくば罹患している又は苦しんでいる患者（例えば軟骨無形成症に患っているか又は罹り易いヒト小児又は成人患者）に投与する工程を含む。いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ３の異常発現に関連した疾病、疾患又は容態は、ＦＧＦＲ３の過剰発現、特に突然変異したＦＧＦＲ３（例えば、Ｇ３８０Ｒミスセンス突然変異を含むＦＧＦＲ３）の過剰発現に関連する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート及び医薬組成物は、ＦＧＦＲ３突然変異体又は多形又は天然の変異体、例えば、３８０位においてグリシンからアルギニンへの置換を含む（Ｇ３８０Ｒ）（配列番号４又はＳＮＰ ＩＤ番号ｒｓ２８９３１６１４、ｒｓ１１９４３８６３又はｒｓ１７８８１６５６によってコードされるような）ＦＧＦＲ３突然変異体、多形又は天然の変異体の発現を優先的に調節する。本発明のオリゴヌクレオチドによる、このようなＦＧＦＲ３突然変異体、多形又は天然の変異体の優先的な調節は、野生型ＦＧＦＲ３（例えば配列番号１によってコードされるような）の発現と比較して部分的又は全体的であり得る。例えば、ヘテロ接合性軟骨無形成症患者に投与される場合、本発明のオリゴヌクレオチドは、野生型ＦＧＦＲ３をコードするｍＲＮＡ及び突然変異したＦＧＦＲ３多形又は天然の変異体をコードするｍＲＮＡの両方に標的化し得るが、このようなオリゴヌクレオチドは、各標的の発現を様々な程度で、例えば、突然変異したＦＧＦＲ３多形又は変異体の発現が、野生型ＦＧＦＲ３の発現より大きな程度で調節されるように調節し得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｇ３８０Ｒ置換（例えば、配列番号４又はＳＮＰ ＩＤ番号ｒｓ２８９３１６１４、ｒｓ１１９４３８６３又はｒｓ１７８８１６５６によってコードされるような）を含む突然変異したＦＧＦＲ３多形を標的化及びその発現を２、４、８、１０、１５、２５、５０、７５、１００倍又はそれ以上低減させ得；一方、同オリゴヌクレオチドはそれぞれ、野生型ＦＧＦＲ３（例えば配列番号１によってコードされるような）の発現を１、２、４、５、１０、１５、２５、５０、７５、１００倍又はそれ以上低減させる。同様に、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｇ３８０Ｒ突然変異（例えば配列番号４又はＳＮＰ ＩＤ番号ｒｓ２８９３１６１４、ｒｓ１１９４３８６３又はｒｓ１７８８１６５６によってコードされるような）を含む突然変異したＦＧＦＲ３多形又は変異体を標的化及びその発現を約１％、２．５％、５％、１０％、２０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％又はそれ以上低減させ得；一方、同オリゴヌクレオチドは、野生型ＦＧＦＲ３（例えば配列番号１によってコードされるような）の発現を約１％、２．５％、５％、１０％、２０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％低減させる。また本明細書において開示されているのは、機能的又は野生型ＦＧＦＲ３をコードする核酸と比較して差別的に、突然変異したＦＧＦＲ３をコードする核酸に標的化及び／又はハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。例えば、ヘテロ接合性軟骨無形成症又は癌、例えば膀胱癌を有する患者において、本発明のオリゴヌクレオチドは、機能的又は野生型ＦＧＦＲ３対立遺伝子の発現と比較して、突然変異したＦＧＦＲ３対立遺伝子に標的化し、その発現を、約１％、２．５％、５％、１０％、２０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％又はそれ以上低減させ得る。あるいは、本発明のオリゴヌクレオチドは、野生型ＦＧＦＲ３遺伝子産物又はｍＲＮＡの発現（例えば、ヘテロ接合性軟骨無形成症に罹患した小児患者における）と、突然変異したＦＧＦＲ３遺伝子産物又はｍＲＮＡの発現との比を増加させ得る。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチド、コンジュゲート及び医薬組成物は、突然変異をコードしないＦＧＦＲ３の発現に影響を及ぼすことなく又は最小限に影響を及ぼしつつ、突然変異したＦＧＦＲ３の発現を（例えば、ヘテロ接合性軟骨無形成症患者の対立遺伝子におけるＦＧＦＲ３ Ｇ３８０Ｒ突然変異をコードする核酸（例えばｍＲＮＡ）に優先的に標的化及びハイブリダイズすることによって）低減又はさもなくば阻害する。
【００１２】
いくつかの実施態様において、本明細書において開示されたオリゴヌクレオチドは、ＦＧＦＲ３の遺伝子産物（すなわちｍＲＮＡ）、例えば、３８０位においてグリシンからアルギニンへの置換を含む（例えば配列番号４によってコードされるような）突然変異したＦＧＦＲ３多形又は変異体によってコードされるｍＲＮＡ遺伝子産物にハイブリダイズする。他の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、突然変異したＦＧＦＲ３多形又は変異体をコードする核酸の遺伝子産物（例えばｍＲＮＡ）にハイブリダイズし、このようなＦＧＦＲ３多形をコードするヌクレオチドは、コドン３８０の１３９４位におけるグアニンからアデニンへのトランジション置換を含む。他の実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、突然変異したＦＧＦＲ３ Ｇ３８０Ｒ多形又は変異体（例えば配列番号４によってコードされるような）をコードする核酸の遺伝子産物（すなわちｍＲＮＡ）に特異的にハイブリダイズし、同オリゴヌクレオチドは、野生型ＦＧＦＲ３（例えば配列番号１によってコードされるような）をコードする核酸の遺伝子産物（すなわちｍＲＮＡ）にはハイブリダイズしない。突然変異したＦＧＦＲ３ Ｇ３８０Ｒ多形をコードする核酸への該オリゴヌクレオチドのこのような優先的な又は差別的なハイブリダイゼーションは、突然変異遺伝子産物の発現を調節することができるが、野生型ＦＧＦＲ３遺伝子産物の発現は保存されるか又はさもなくば不変のままである。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１５〜２０を含む核酸（又はそのフラグメント）を含む又はそれによってコードされるｍＲＮＡに標的化及び優先的にハイブリダイズし得、よって、このようなｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現は、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３５％、４０％、５０％、又は好ましくは少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、又は最も好ましくは少なくとも９０％、９５％、９９％、又は１００％低減及び／又は阻害される。
【００１３】
いくつかの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ヒトＦＧＦＲ３をコードする核酸（例えばｍＲＮＡ）（例えば、アクセッション番号ＮＭ＿０００１４２によってコードされるＦＧＦＲ３ ｍＲＮＡ、これにはその任意の変異体及び多形が包含される）にハイブリダイズするが、このようなオリゴヌクレオチドは、他の種のＦＧＦＲ３をコードする核酸には交差ハイブリダイズしない。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、ヒトＦＧＦＲ３ｍＲＮＡ（例えば配列番号１及び／又は配列番号４によってコードされるような）に標的化及びハイブリダイズし得、かつマウスＦＧＦＲ３ｍＲＮＡ（例えば配列番号７によってコードされるような）又はラットＦＧＦＲ３ｍＲＮＡ（例えば配列番号８によってコードされるような）にはハイブリダイズしない。また、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９又は配列番号２０を含むまたはそれによってコードされる１つ以上のＦＧＦＲ３ｍＲＮＡ標的配列に優先的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドも考えられる。本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、Ｇ３８０Ｒ突然変異をコードするヒトＦＧＦＲ３ｍＲＮＡ又はそのフラグメント（例えば、アクセッション番号ＮＭ＿０００１４２によってコードされるＦＧＦＲ３ｍＲＮＡ）にハイブリダイズし得るが、マウス又はラットＦＧＦＲ３遺伝子のＦＧＦＲ３ｍＲＮＡには交差ハイブリダイズせず、従って、標的化ヒトＦＧＦＲ３の発現を調節し得る。あるいは、同オリゴヌクレオチドは、Ｇ３８０Ｒ突然変異をコードするＦＧＦＲ３多形をコードする核酸に特異的にハイブリダイズし得るが、同じ又は類似したストリンジェンシーな条件下でＧ３８０Ｒ突然変異を欠失した又はさもなくばコードしていない野生型のヒト、マウス又はラット種をコードする核酸にはハイブリダイズしないだろう。
【００１４】
また、ＦＧＦＲ３の異常発現を阻害する方法、特に、突然変異したＦＧＦＲ３を発現している細胞（例えば軟骨細胞又は膀胱細胞）における突然変異したＦＧＦＲ３遺伝子の遺伝子産物（例えばＦＧＦＲ３をコードするｍＲＮＡ）の異常発現を阻害する方法が提供される。いくつかの実施態様において、該方法は、本発明によるオリゴヌクレオチド、コンクゲート若しくは医薬組成物を患者に投与するか、又はさもなくば、細胞若しくは組織をこのようなオリゴヌクレオチド、コンジュゲー若しくは医薬組成物と接触させ、よってこのような患者若しくは細胞におけるＦＧＦＲ３（例えばＧ３８０Ｒ突然変異を含むＦＧＦＲ３）の発現を阻害することを含む。
【００１５】
また、約８〜５０の連続モノマー（例えばヌクレオチド）の第一領域を含む約８〜５０モノマーのオリゴヌクレオチドが開示され、このような第一領域の配列は、１つ以上の選択された標的配列（例えば、突然変異したＦＧＦＲ３をコードするｍＲＮＡを含む標的配列）に対して少なくとも８０％同一である（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％同一）。いくつかの実施態様において、選択された標的配列は、哺乳動物ＦＧＦＲ３をコードする核酸領域（例えばｍＲＮＡ）又はそのフラグメントを含み得る。さらには、例えば８〜５０、１２〜３０、又は１２〜２０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。例えば、いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）残基又はモノマー単位（例えば配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４又は配列番号２５）を含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、２つ以上のＬＮＡモノマー単位（例えば２つ以上のβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡモノマー単位）を含み、このようなＬＮＡモノマー単位は、互いに連続して位置し得るか、又は代替的にはこのようなＬＮＡモノマー単位は互いに非連続的に位置し得る。例えば、本明細書において、配列番号１４を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが開示されており、該オリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ３の発現を調節し、該オリゴヌクレオチドは、（ａ）１位におけるグアニンヌクレオチドはオキシ−ＬＮＡである；（ｂ）２位及び３位の１つ以上におけるアデニンヌクレオチドはオキシ−ＬＮＡである；（ｃ）１０位及び１１位の１つ以上におけるシトシンヌクレオチドはオキシ−ＬＮＡである；及び（ｄ）１２位におけるチミンヌクレオチドはオキシ−ＬＮＡである、からなる群より選択された１つ以上の位置において少なくとも１つのロックド核酸を含む。
【００１６】
場合により、このようなロックドアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の糖置換、例えば２’−Ｏ−メトキシエチル糖置換を含み得る。また本明細書において、本発明による１つ以上のオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートが提供され、このようなオリゴヌクレオチドは、本発明のオリゴヌクレオチドに共有結合的に付着した少なくとも１つの非ヌクレオチド又は非ポリヌクレオチド部分を含む。
【００１７】
また、本発明による１つ以上のオリゴヌクレオチド又はコンジュゲート、及び薬学的に許容される希釈剤、担体、溶媒、塩又は補助剤を含む、医薬組成物が提供される。また、本発明の１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物が提供される。このような医薬組成物は、例えば、注射若しくは点滴によって非経口的に、標的作用部位に直接投与されても、又は、吸入、腹腔内、局所若しくは経口によって投与されてもよい。
【００１８】
さらに、異常発現したＦＧＦＲ３の発現を（例えばｍＲＮＡレベルで）ダウンレギュレートする方法、特に、細胞又は組織におけるＦＧＦＲ３の突然変異体又は天然の変異体（例えばＧ３８０Ｒ、又は癌、例えば膀胱癌を特徴付ける突然変異）の発現をダウンレギュレートする方法が提供される。このような方法は、細胞又は組織をインビトロ又はインビボで、有効量の本発明の１つ以上のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート又は組成物と接触させることを含む。いくつかの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチド及び組成物は、哺乳動物（例えば、癌、例えば膀胱癌又はヘテロ接合性軟骨無形成症を患っている又はさもなくば罹患しているヒト患者）における突然変異した又は異常発現したＦＧＦＲ３の発現をダウンレギュレートすることができるが、正常に機能している又は野生型の対立遺伝子の発現は調節しない又はさもなくば影響を及ぼさない。
【００１９】
また、動物に、治療有効量又は予防有効量の本明細書に記載の１つ以上のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート又は医薬組成物を投与することによって、ＦＧＦＲ３の異常発現又は過剰発現に関連した疾病又は容態を有することが疑われるか又は罹り易い動物（例えば非ヒト動物又はヒト）を処置する方法が開示される。さらに、本明細書において、オリゴヌクレオチドを使用して、突然変異した又は異常発現したＦＧＦＲ３（例えばＦＧＦＲ３の突然変異した又は天然の変異体）の発現を阻害する方法、及び、ＦＧＦＲ３の異常発現又は活性に関連した疾病の処置のための方法が提供される。
【００２０】
また、ＦＧＦＲ３の異常発現に関連した容態（例えば、癌又は形成異常、例えば軟骨無形成症）を処置する方法が提供される。また、ＦＧＦＲ３を異常発現している軟膏細胞に、本発明の１つ以上のオリゴヌクレオチドを送達するか、又は該軟骨細胞を本発明の１つ以上のオリゴヌクレオチドと接触させることを含む、軟骨細胞の機能を回復させる方法が提供される。特許請求された方法が該オリゴヌクレオチドを軟骨細胞に導入する条件は、軟骨細胞における異常なＦＧＦＲ３の発現を低減させ、これにより正常な細胞機能が回復するのに十分なものである。いくつかの実施態様において、このような方法は、コドン３８０の１１３８位（これは、配列番号４によってコードされる配列の１３９４位のヌクレオチドに相当する）におけるグアニンからアデニンへのトランジション置換を含む、ＦＧＦＲ３突然変異体、多形又は天然の変異体の発現をｍＲＮＡレベルで優先的に低減させる。本発明は、癌、例えば膀胱癌又は軟骨無形成症などの疾病を処置する方法を提供し、該方法は、有効量の１つ以上のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート又はその医薬組成物を、それを必要とする患者（例えば、軟骨無形成症に罹患したヒト小児患者）に投与することを含む。本発明は、細胞又は組織における突然変異した又は異常発現したＦＧＦＲ３の発現を阻害（例えばダウンレギュレートすることによって）する方法を提供し、該方法は、細胞又は組織を、有効量の本明細書に記載の１つ以上のオリゴヌクレオチド又はコンジュゲート又はその医薬組成物と接触させ、これにより突然変異した又は異常発現したＦＧＦＲ３の発現をダウンレギュレート（例えばｍＲＮＡレベルで）することを含む。
【００２１】
考察された上記、並びに本発明の多くの他の特徴及び付随する利点は、添付の実施例と併せて、以下の本発明の詳細な説明を参照することによってより良く理解されるようになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】図１Ａ及び１Ｂは、ＦＧＦＲ３ Ｇ３８０Ｒ突然変異をコードするヌクレオチドを含む及びその周囲の領域の部分に対して相補的である２１個の異なるオリゴヌクレオチドを用いてトランスフェクトされたＡ５４９細胞におけるｆｌａｇでタグ化された野生型（ＷＴ）及び突然変異型（ＭＵＴ）レポーターレベルを示す。ヒトＡ５４９細胞を、各オリゴヌクレオチドと、ＷＴ又はＭＵＴレポーター構築物のいずれかとを用いて共トランスフェクトした。その後、細胞をトランスフェクションから２４時間後に収集し、ｆｌａｇでタグ化されたレポーター転写物のレベルを、レポーター特異的定量ＰＣＲアッセイを使用して決定した。結果を、偽処置試料に対する比率として表現する。結果は、１つのオリゴヌクレオチドあたり３回の独立した研究の平均として報告され、エラーバーは標準偏差を示す。図１Ａ及び１Ｂの両方において示されているように、２１個の各試験オリゴヌクレオチドは、ＷＴレポーター構築物と比較して、ＭＵＴレポーター構築物の低下した発現及び優先的な標的化を示した。
【図１Ｂ】図１Ａ及び１Ｂは、ＦＧＦＲ３ Ｇ３８０Ｒ突然変異をコードするヌクレオチドを含む及びその周囲の領域の部分に対して相補的である２１個の異なるオリゴヌクレオチドを用いてトランスフェクトされたＡ５４９細胞におけるｆｌａｇでタグ化された野生型（ＷＴ）及び突然変異型（ＭＵＴ）レポーターレベルを示す。ヒトＡ５４９細胞を、各オリゴヌクレオチドと、ＷＴ又はＭＵＴレポーター構築物のいずれかとを用いて共トランスフェクトした。その後、細胞をトランスフェクションから２４時間後に収集し、ｆｌａｇでタグ化されたレポーター転写物のレベルを、レポーター特異的定量ＰＣＲアッセイを使用して決定した。結果を、偽処置試料に対する比率として表現する。結果は、１つのオリゴヌクレオチドあたり３回の独立した研究の平均として報告され、エラーバーは標準偏差を示す。図１Ａ及び１Ｂの両方において示されているように、２１個の各試験オリゴヌクレオチドは、ＷＴレポーター構築物と比較して、ＭＵＴレポーター構築物の低下した発現及び優先的な標的化を示した。
【図２Ａ】図２Ａ及び２Ｂは、ＦＧＦＲ３ Ｇ３８０Ｒ突然変異をコードするヌクレオチドを含む及びその周囲の領域の一部に対して相補的である、オリゴヌクレオチドを用いての４８時間のジムノティック（gymnotic）処置を受けた後、ヒトＡ５４９細胞におけるｆｌａｇでタグ化された野生型（ＷＴ）及び突然変異型（ＭＵＴ）レポーター構築物レベルを示す。ヒトＡ５４９細胞を、オリゴヌクレオチドを用いてのジムノティック処置後に、ＷＴ又はＭＵＴレポーター構築物のいずれかを用いてトランスフェクトした。その後、細胞をトランスフェクションから２４時間後に収集し、ｆｌａｇでタグ化されたレポーター転写物のレベルを、レポーター特異的定量ＰＣＲアッセイを用いて決定した。結果は、偽処置試料に対する比率として報告され、１つのオリゴヌクレオチドあたり３回の独立した研究の平均として報告される。示されたエラーバーは標準偏差を示す。図２Ａ及び２Ｂの両方において示されているように、２１個のオリゴヌクレオチドが、ＷＴレポーターと比較して顕著な用量反応と、ＭＵＴレポーター構築物の頑強なノックダウンを示した。
【図２Ｂ】図２Ａ及び２Ｂは、ＦＧＦＲ３ Ｇ３８０Ｒ突然変異をコードするヌクレオチドを含む及びその周囲の領域の一部に対して相補的である、オリゴヌクレオチドを用いての４８時間のジムノティック（gymnotic）処置を受けた後、ヒトＡ５４９細胞におけるｆｌａｇでタグ化された野生型（ＷＴ）及び突然変異型（ＭＵＴ）レポーター構築物レベルを示す。ヒトＡ５４９細胞を、オリゴヌクレオチドを用いてのジムノティック処置後に、ＷＴ又はＭＵＴレポーター構築物のいずれかを用いてトランスフェクトした。その後、細胞をトランスフェクションから２４時間後に収集し、ｆｌａｇでタグ化されたレポーター転写物のレベルを、レポーター特異的定量ＰＣＲアッセイを用いて決定した。結果は、偽処置試料に対する比率として報告され、１つのオリゴヌクレオチドあたり３回の独立した研究の平均として報告される。示されたエラーバーは標準偏差を示す。図２Ａ及び２Ｂの両方において示されているように、２１個のオリゴヌクレオチドが、ＷＴレポーターと比較して顕著な用量反応と、ＭＵＴレポーター構築物の頑強なノックダウンを示した。
【図３】図３は、ＦＧＦＲ３ Ｇ３８０突然変異を含む及びその周囲の領域の種々の部分に対して相補的である１０個の各オリゴヌクレオチドを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞におけるｆｌａｇでタグ化された野生型（ＷＴ）及び突然変異型（ＭＵＴ）レポーターレベルを示す。該オリゴヌクレオチドを、０．２nM、１．０nM、及び５．０nMの最初のスクリーニング濃度で評価した。ＨｅＬａ細胞を、オリゴヌクレオチドと、ＷＴ又はＭＵＴレポーター構築物のいずれかを用いて共トランスフェクトした。その後、細胞をトランスフェクションから２４時間後に収集し、レポーター構築物のレベルを、レポーター特異的定量ＰＣＲアッセイを用いて決定した。結果は、１つのオリゴヌクレオチドあたり３回の独立した研究の平均として報告され、エラーバーは標準偏差を示す。図３に示されているように、１０個の全てのオリゴヌクレオチドが、ＷＴレポーター構築物と比較して、評価された濃度範囲においてＭＵＴレポーター構築物の用量依存的なノックダウンを生じることが判明した。
【図４−１】図４は、ＦＧＦＲ３ Ｇ３８０突然変異をコードするヌクレオチドを含む及びその周囲の領域の部分に対して相補的であるように設計された選択されたオリゴヌクレオチドについての５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を示す。ｆｌａｇでタグ化された野生型（ＷＴ）又は突然変異型（ＭＵＴ）レポーター構築物のいずれか及び１０個中１個のオリゴヌクレオチドを、ヒトＡ５４９細胞において共トランスフェクトした。その後、細胞を収集し、ＲＮＡを、トランスフェクションから２４時間後にレポーター特異的定量ＰＣＲのために抽出した。プロットされたデータ点は、３回の独立した実験の平均レポーターシグナルを示し、エラーバーは標準偏差を示す。灰色の曲線は、ＷＴレポーターのあてはめた反応曲線を示し、黒い曲線は、ＭＵＴレポーターのあてはめた反応曲線を示す。各曲線についての対応するＩＣ５０値が各グラフ上に及びまた表２にも示されている。
【図４−２】図４は、ＦＧＦＲ３ Ｇ３８０突然変異をコードするヌクレオチドを含む及びその周囲の領域の部分に対して相補的であるように設計された選択されたオリゴヌクレオチドについての５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を示す。ｆｌａｇでタグ化された野生型（ＷＴ）又は突然変異型（ＭＵＴ）レポーター構築物のいずれか及び１０個中１個のオリゴヌクレオチドを、ヒトＡ５４９細胞において共トランスフェクトした。その後、細胞を収集し、ＲＮＡを、トランスフェクションから２４時間後にレポーター特異的定量ＰＣＲのために抽出した。プロットされたデータ点は、３回の独立した実験の平均レポーターシグナルを示し、エラーバーは標準偏差を示す。灰色の曲線は、ＷＴレポーターのあてはめた反応曲線を示し、黒い曲線は、ＭＵＴレポーターのあてはめた反応曲線を示す。各曲線についての対応するＩＣ５０値が各グラフ上に及びまた表２にも示されている。
【図５Ａ】図５Ａ及び５Ｂは、それぞれ非関連ＳＣＡ３及びＰＴＥＮ標的に対する、ＦＧＦＲ３ Ｇ３８０突然変異をコードするヌクレオチドを含む及びその周囲の領域の部分に対して相補的である１０個の各オリゴヌクレオチドの特異性を示す。１０個の各オリゴヌクレオチドは、トランスフェクションによってヒトＡ５４９細胞に送達された。その後、ヒトＡ５４９細胞を収集し、ＳＣＡ３又はＰＴＥＮｍＲＮＡのいずれかのノックダウンについて定量ＰＣＲによって試験した。結果は、１つのプレリードオリゴヌクレオチドあたり３回の独立した研究の平均として提示される。エラーバーは１つのオリゴヌクレオチドあたり３回の研究の標準偏差を示す。図５Ａ及び５Ｂに示されているように、非特異的ＳＣＡ３及びＰＴＥＮ標的に対する１０個の各オリゴヌクレオチドの効果は、ＦＧＦＲ３標的に対する効果よりも有意に低い。
【図５Ｂ】図５Ａ及び５Ｂは、それぞれ非関連ＳＣＡ３及びＰＴＥＮ標的に対する、ＦＧＦＲ３ Ｇ３８０突然変異をコードするヌクレオチドを含む及びその周囲の領域の部分に対して相補的である１０個の各オリゴヌクレオチドの特異性を示す。１０個の各オリゴヌクレオチドは、トランスフェクションによってヒトＡ５４９細胞に送達された。その後、ヒトＡ５４９細胞を収集し、ＳＣＡ３又はＰＴＥＮｍＲＮＡのいずれかのノックダウンについて定量ＰＣＲによって試験した。結果は、１つのプレリードオリゴヌクレオチドあたり３回の独立した研究の平均として提示される。エラーバーは１つのオリゴヌクレオチドあたり３回の研究の標準偏差を示す。図５Ａ及び５Ｂに示されているように、非特異的ＳＣＡ３及びＰＴＥＮ標的に対する１０個の各オリゴヌクレオチドの効果は、ＦＧＦＲ３標的に対する効果よりも有意に低い。
【図６】図６は、ＦＧＦＲ３ Ｇ３８０突然変異をコードするヌクレオチドを含む及びその周囲の領域の部分に対して相補的である１０個の各オリゴヌクレオチドの血漿中の安定性を示す。１０個の各オリゴヌクレオチドを、３７℃のマウス血漿中で９６時間までインキュベートした。試料を２４時間毎に採取し、ＰＡＧＥによって分析した。１０個の各オリゴヌクレオチドの血漿中の安定性は、十分に予想された範囲内であることが判明し、特に１０個の全てのオリゴヌクレオチドが、全体的に９６時間を超える半減期を有することが判明した。図６において示されているように、１０個の中の大半のオリゴヌクレオチドは、はっきりと認識できる分解産物を全く生成しなかった。
【図７】図７は、ＦＧＦＲ３ Ｇ３８０突然変異をコードするヌクレオチドを含む及びその周囲の領域の部分に対して相補的であるオリゴヌクレオチドが１４日目まで３日毎にマウスに投与された１６日間のインビボにおける耐容能の研究の結果を示す。マウスを屠殺し、１６日目に評価した。対照には、食塩水の対照を投与されたマウスが含まれた。５個の選択されたオリゴヌクレオチド（それぞれ配列番号２１、２２、２３、２４及び２５に相当するＳＨ０２、ＳＨ１３、ＳＨ１９、ＳＨ２０及びＳＨ２１）により、肝酵素アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の許容可能な上昇が起こった。
【００２３】
詳細な説明
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、ＦＧＦＲ３の発現を調節することのできる特異的な治療ツールを提供する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の短い（例えば、通常、およそ５０、４０、３０、２０、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１０、８またはそれ以下のヌクレオチド長）一本鎖の合成オリゴヌクレオチドは、ＦＧＦＲ３ＲＮＡ標的配列（例えばプレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ）に対して相補的である塩基配列を有し、水素結合による塩基対形成によってハイブリッド二本鎖を形成する。例えば、いくつかの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＦＧＦＲ３をコードする核酸（例えばＦＧＦＲ３をコードするｍＲＮＡ）又はそのフラグメント（例えば配列番号５又は６）に標的化し得るか又はそれに対して相補的であり得、これにより、ＦＧＦＲ３の発現を調節し得る。他の実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、一般的に、切断作用機序、又は、プレｍＲＮＡのプロセシング若しくはｍＲＮＡの翻訳に関与する酵素を立体的に遮断することによって作用し得る。このハイブリダイゼーションは、発現（すなわち、標的ｍＲＮＡコードを、そのタンパク質産物へと翻訳）を妨げると予想され得、従って、その後のタンパク質産物の作用を妨げる。従って、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド及び方法を使用して、ＦＧＦＲ３の異常発現に関連した１つ以上の容態（例えば疾病又は症候群）、例えば癌、例えば膀胱癌、骨格形成異常、例えば軟骨無形成症、軟骨低形成症、及び致死性骨異形成症（Ｉ型及びＩＩ型）を寛解又は処置することができる。
【００２４】
ヒト低身長症の最も一般的な形態である軟骨無形成症は、ＦＧＦＲ３遺伝子の膜貫通ドメインの点突然変異によって引き起こされる。軟骨低形成症及び致死性骨異形成症（Ｉ型及びＩＩ型）もまた、ＦＧＦＲ３遺伝子の単一の突然変異に起因する。罹患患者においては、人体比率及び身体的な特徴が生誕時に異常であり、これは大半の場合、通常生誕時に又は生誕直後に診断の基礎を成す。低身長症の兆候は、年齢と共に着実により明らかとなる。全体的に、大半の患者は比較的通常の生活を送り、心血管合併症、脊髄閉塞、及び上気道閉塞が最も重篤な作用である。軟骨無形成症の発生率は、およそ１１０，０００人の出生数あたり１人から、１３０，０００人の出生数あたり１人である。
【００２５】
ヘテロ接合性軟骨無形成症の臨床特徴は、患者間で非常に一貫しており、これには近位四肢短縮、顔面中部の低形成、脊柱の狭窄、及び相対的な巨頭症が挙げられる。最終的な軟骨無形成症の成人の身長は、１１２〜１４５cmの範囲である。組織学的には、軟骨無形成症患者の骨端及び成長板軟骨は正常である。しかしながら、このような患者の形態計測学的検査により、成長板は正常よりも短く、短縮はヘテロ接合性軟骨無形成症よりもホモ接合性軟骨無形成症においてより大きいことが判明し、このことは、遺伝子量の作用を示唆する。軟骨無形成症患者の柱間マトリックスは正常よりも豊富であり、血管新生病巣及び軟骨の横断トンネリング（血管の内殖）がいくつかの症例において観察されている。さらに、顕著な骨膜の骨形成が観察されている。軟骨無形成症の根底にある機序は、長骨の成長板の軟骨細胞の成熟における異常と考えられている。
【００２６】
成長板におけるＦＧＦＲ３遺伝子の役割は、内的成長速度の負の調節の１つであるようである。特に、ＦＧＦＲ３ヌル対立遺伝子についてホモ接合性であるマウスは（例えば遺伝子ノックアウトによって）、円背、脊柱側湾症、長骨の過成長、及び成長板の肥大帯の拡大を示す。この表現型は、長管骨の成長板及び頭蓋骨縫合における軟骨細胞の増殖（高肥大細胞）及び最終的な分化（低肥大細胞）の調節におけるＦＧＦＲ３の役割と一致する。
【００２７】
軟骨無形成症は常染色体優性で遺伝し、ＦＧＦＲ３の発現における機能獲得型突然変異によって引き起こされ得る。報告は、軟骨無形成症患者が、ＦＧＦＲ３の染色体４ｐ１６．３に位置する突然変異を有し得ることを示した。ＦＧＦＲ３遺伝子における２つの突然変異が、軟骨無形成症の症例の９９％超を引き起こすことが示された。これらの２つの突然変異の中で、約９７％が、ＦＧＦＲ３遺伝子のエキソン８におけるＧ１１３８Ａ突然変異に関連し、約２．５％がＦＧＦＲ３遺伝子のエキソン８におけるＧ１１３８Ｃ突然変異に関連する。Ｇ１１３８Ａ突然変異はまた、ＦＧＦＲ３についての現在の遺伝子バンクエントリーＮＭ＿０００１４２．４（配列番号１）にマッピングされた場合には１３９４Ｇ＞Ａ突然変異と称されるか、又は、陳旧遺伝子バンクエントリーＮＭ＿０００１４２．１にマッピングされた場合には１１３８Ｇ＞Ａと称される。後者の命名法は、陳旧であるが、今日の刊行物を含む多くの文献に維持されている。１３９４位及び１１３８位は本明細書において互換的に使用される。Ｇ１１３８Ａ及びＧ１１３８Ｃ突然変異の両方により、ＦＧＦＲ３アミノ酸配列のコドン３８０位におけるアミノ酸のグリシンからアルギニンへの変化が起こり得る（時に「Ｇ３８０Ｒ」突然変異と称される）。ＦＧＦＲ３における他の疾病を引き起こす突然変異としては、ＦＧＦＲ３の膜貫通ドメインにあるＧｌｙ３７５からＣｙｓへの突然変異、及び、ＦＧＦＲ３のＩｇ３−ＴＭリンカー領域内のＧｌｙ３４６からＧｌｕへの突然変異が挙げられる。
【００２８】
軟骨無形成症に加えて、ＦＧＦＲ３の突然変異及びその発現レベルの変化は、膀胱癌に強く相関することが示された。低悪性度で筋層非浸潤性の乳頭状膀胱腫瘍の約７５％が、ＦＧＦＲ３の活性化突然変異を含むことが示された。筋層浸潤性腫瘍においては、ＦＧＦＲ３における活性化突然変異の普及率は低いが（２０％）、ＦＧＦＲ３の発現レベルは腫瘍の５０％において増加しており、これにより、より高いＦＧＦＲ３活性がもたらされる。ＦＧＦＲ３の活性化突然変異又は増加した発現レベルのいずれかと、腫瘍形成との間の相関は、癌細胞増殖がＦＧＦＲ３活性の増加によって駆動されるモデルを支持する。これは、ＦＧＦＲ３に対して指向される小分子阻害剤及び抗体が、インビトロの膀胱癌モデルにおいて細胞増殖を低減させ得、かつ、げっ歯類の膀胱癌モデルにおいて腫瘍サイズを有意に低減させ得る、インビトロ及びインビボの実験によって支持される。
【００２９】
膀胱癌の処置は、現在、腫瘍の切除に基づき、この方法は高い再発率に悩まされ、これは癌の進行及び転移に至る。切除の後にしばしば化学療法が行なわれ、癌が筋層浸潤性となれば、膀胱の除去が行なわれる。ＦＧＦＲ３に指向された療法による癌の膀胱内処置は、腫瘍切除の必要性を低下又は排除し得、癌の進行及び転移の速度を低下させ得る。
【００３０】
以下の表に示されているような多くの特異的なＦＧＦＲ３突然変異が、膀胱癌の臨床単離株において同定されている。一般的に、これらの突然変異は、ＦＧＦＲ３の二量体化、活性化、又はＦＧＦＲ３によるシグナル伝達に影響を及ぼし、しばしばその結果、リガンド非依存的な腫瘍細胞の増殖をもたらす、活性化突然変異である。ＦＧＦＲ３に指向されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定の突然変異に対して使用され得、これにより、野生型ＦＧＦＲ３機能の欠失を通して媒介される副作用を最小限とし得るか、又は、突然変異から遠位にある転写物の部位に対して使用され得、突然変異により癌が小分子若しくは抗体に対して抵抗性となっている癌の処置を可能とする。
【００３１】
表：ヒト膀胱腫瘍における公知のヌクレオチド及びアミノ酸の変化。ヌクレオチド及びアミノ酸は、ＮＭ＿０００１４２．１配列上にマッピングされている。括弧内のアミノ酸は、文献に報告された同アミノ酸の変化を指すが、以前のバージョンの転写物にマッピングされ、これは２アミノ酸だけ長さが異なる。
【表１】
0006463687.tif 000002
【００３２】
本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、医薬組成物及び方法を使用して、異常なＦＧＦＲ３核酸分子の発現又は機能を低減させることによって、癌、例えば膀胱癌又は骨格形成異常、例えば軟骨無形成症を寛解又は処置することができる。
【００３３】
オリゴヌクレオチド
いくつかの実施態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、異常に発現したＦＧＦＲ３をコードする核酸（例えば、配列番号４に提供されるようなＦＧＦＲ３をコードするｍＲＮＡ並びに／又は配列番号５及び配列番号６に提供されるようなそのフラグメント）及びこのような核酸の天然の変異体に標的化し、これにより、ＦＧＦＲ３の発現を調節する。本明細書において使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上のヌクレオチドの共有結合によって形成される分子を指す。オリゴヌクレオチドという用語は、一般的に、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣体、及びこれらのキメラ組合せを含む。本発明の脈絡において、単一のヌクレオチド単位はまた、モノマー又は単位とも称され得る。いくつかの実施態様において、「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」、「単位」及び「モノマー」という用語は互換的に使用される。ヌクレオチド又はモノマーの配列を言及する場合、言及されるのは塩基配列、例えばＡ、Ｔ（又はＵ）、Ｇ又はＣであると認識される。
【００３４】
いくつかの実施態様において、本明細書において開示されたオリゴヌクレオチドは、アンチセンス作用機序を介して、核酸分子の発現を調節するのに（例えば異常発現したＦＧＦＲ３の発現を調節するのに）有用である。この調節は、例えば、１つ以上の標的核酸分子、例えばｍＲＮＡ（配列番号４）に対して相補的である及び／又はハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供することによって達成され得る。いくつかの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸の特定の領域（例えば、Ｇ３８０Ｒ突然変異をコードするＦＧＦＲ３ｍＲＮＡの領域）に対して相補的である。いくつかの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸の特定の領域（例えば、Ｇ３８０Ｒ突然変異をコードするＦＧＦＲ３ｍＲＮＡの領域）にハイブリダイズすることができる。
【００３５】
本明細書において使用される「標的核酸」という語句は、ＤＮＡ及びこのようなＤＮＡから転写されたＲＮＡ（プレｍＲＮＡ及びｍＲＮＡ又はその一部を含む）、並びにまた、このようなＲＮＡから得られたｃＤＮＡを包含することを意味する。例えば、いくつかの実施態様において、「標的核酸」という語句は、ＦＧＦＲ３をコードする核酸（例えばｍＲＮＡ）、又は特に、突然変異した又は異常発現したＦＧＦＲ３をコードする核酸を指すために使用される。本明細書において使用される「遺伝子産物」という用語は、遺伝子又は核酸（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）の発現から生じた任意の生化学的材料を指し、これにはｍＲＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質が含まれるがこれらに限定されない。例えば、いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ３遺伝子に関して使用される場合、遺伝子産物という語句は、ＦＧＦＲ３によってコードされるｍＲＮＡを指す。特定の実施態様において、標的核酸は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０からなる群より選択された核酸配列を含む。他の実施態様において、本明細書において開示されたオリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、及び／又は配列番号２０の１つ以上を含む核酸配列に対して相補的である及び／又はハイブリダイズする。
【００３６】
いくつかの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチド化合物は、１つ以上の標的核酸（例えばＦＧＦＲ３をコードするｍＲＮＡ）に対して相補的であり、標的核酸の正常な機能に干渉する（例えばアンチセンス作用機序によって）。標的核酸に特異的にハイブリダイズする本発明のオリゴヌクレオチドによる、標的核酸の機能のこのような干渉又は調節は、一般的に「アンチセンス」と称される。干渉しようとするＤＮＡの機能は、複製及び転写を含み得る。干渉しようとするＲＮＡの機能は、例えば、タンパク質翻訳部位へのＲＮＡの転位、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、ＲＮＡのスプライシングによる１つ以上のｍＲＮＡ種の生成、及びＲＮＡに関与し得る又はＲＮＡによって促進され得る触媒活性などの、機能を含み得る。いくつかの実施態様において、標的核酸機能の全体的な干渉の効果は、このような標的核酸（例えばＦＧＦＲ３）産物の発現の調節である。
【００３７】
語句が本明細書において使用されているように、「アンチセンス化合物」又は「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、核酸分子の領域、特に標的核酸、例えば異常発現したタンパク質又は酵素をコードするｍＲＮＡに対して少なくとも部分的に相補的である（例えば、１００％、約９９％、９８％、９７．５％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、又は５０％相補的）オリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施態様において、アンチセンス化合物又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸にハイブリダイズすることができ、これによりその発現を調節することができる。結果として、全てのアンチセンス化合物がオリゴヌクレオチドであると言うことができるが、全てのオリゴヌクレオチドがアンチセンス化合物であるわけではない。
【００３８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、約８〜５０ヌクレオチド長、例えば８〜３０ヌクレオチド長の連続的なヌクレオチド配列からなるか又は含む。様々な実施態様において、本発明の化合物は、ＲＮＡ単位又はモノマーを含まず、むしろ、例えば、ＤＮＡ単位又はモノマー及び／又はいくつかの場合においてはＬＮＡ単位又はモノマーを含む。本発明による化合物は鎖状分子であるか、又は鎖状分子として合成されることが好ましい。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは一本鎖分子であり、同オリゴヌクレオチド内の等価な領域に対して相補的である、例えば少なくとも３、４又は５つ連続したヌクレオチドの短い領域（すなわち二本鎖）を好ましくは含まない。これに関して、該オリゴヌクレオチドは実質的に二本鎖ではない。
【００３９】
標的配列
特定の実施態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、ＦＧＦＲ３の発現を調節することができるか、又はいくつかの実施態様においてダウンレギュレート（例えば低減又は消失）させることができる（例えば、ｍＲＮＡレベルで異常発現したＦＧＦＲ３をダウンレギュレート）。これに関して、本発明のオリゴヌクレオチドは、典型的には哺乳動物細胞、例えばヒト細胞（例えばＡ５４９細胞、ＨｅＬａ細胞、膀胱細胞又は軟骨細胞）において、ＦＧＦＲ３の阻害を及ぼすことができる。いくつかの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸（例えば突然変異した又は異常発現したＦＧＦＲ３ｍＲＮＡ）にハイブリダイズし、正常な発現レベル（例えば、該オリゴヌクレオチド又はコンジュゲートの非存在下における発現レベルなど）と比較して少なくとも１０％又は２０％の発現の阻害又は低減を及ぼす。例えば、本明細書において開示されたオリゴヌクレオチドは、ＦＧＦＲ３突然変異対立遺伝子を有する個体に見られるＦＧＦＲ３の正常な発現レベルと比較して、ＦＧＦＲ３の発現の少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％又は１００％の低減又は阻害を及ぼし得る。いくつかの実施態様において、このような調節は、約０．０４nM〜２５nMの濃度（例えば約０．８nM〜２０nMの濃度）の本発明の化合物に標的細胞又は組織を曝すと明白である。同じ又は異なる実施態様において、標的核酸（例えば突然変異したＦＧＦＲ３をコードするｍＲＮＡ）の発現阻害は、１００％未満である（例えば、約９８％未満の阻害、約９５％未満の阻害、約９０％未満の阻害、約８０％未満の阻害、又は約７０％未満の阻害）。いくつかの実施態様において、本明細書において開示されたオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡレベルでＦＧＦＲ３の発現を（例えば、突然変異した又は異常発現したＦＧＦＲ３をコードするｍＲＮＡに標的化及びハイブリダイズすることによって）調節することができる。発現の調節（例えばｍＲＮＡレベルでの）は、タンパク質のレベル又は濃度を測定することによって（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて標的タンパク質に対して生じた適切な抗体を使用してのウェスタンブロットによって）決定され得る。あるいは、発現の調節（例えばｍＲＮＡレベルでの）は、ｍＲＮＡのレベル又は濃度を測定することによって（例えば、ノザンブロット又は定量ＲＴ−ＰＣＲによって）決定され得る。ｍＲＮＡのレベル又は濃度の評価を介して発現を測定する場合、適切な用量又は濃度のオリゴヌクレオチド（例えば、約０．０４nM〜２５nM、又は約０．８nM〜２０nM）を使用した場合のダウンレギュレーションの程度は、本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート又は組成物の非存在下で観察された正常なレベル又は濃度と比較して、約１０％超、約１０〜２０％、約２０％超、約２５％超、又は約３０％超であり得る。
【００４０】
本発明の脈絡において、「調節する」又は「調節」という用語は、遺伝子の発現又は遺伝子産物（例えばＦＧＦＲ３ｍＲＮＡ）の増加（例えば刺激又はアップレギュレーション）、遺伝子の発現又は遺伝子産物（例えばＦＧＦＲ３ｍＲＮＡ）の減少（例えばダウンレギュレーション又は阻害）、及び、２つ以上の遺伝子産物間の相対的発現の変化（例えば、野生型ＦＧＦＲ３の発現と比較した突然変異ＦＧＦＲ３の発現の減少）の１つ以上を意味し得る。本明細書に記載のいくつかの脈絡において、ダウンレギュレーション及び阻害は、特にそれが突然変異ＦＧＦＲ３の発現の調節に関連するので、好ましい形態の調節である。本明細書に記載のいくつかの脈絡において、「発現」という用語は、遺伝子又は核酸（例えばＤＮＡ）からの情報が遺伝子産物（例えばｍＲＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質）の合成に使用されるプロセスを意味し、これは、複製、転写及び翻訳の工程の１つ以上を含むがこれらに限定されない。本発明のオリゴヌクレオチドによって調節され得る発現工程は、例えば、転写、スプライシング、翻訳、及びタンパク質の翻訳後修飾を含み得る。
【００４１】
それは標的化、調節及び発現に関するので、「ＦＧＦＲ３」という用語は広く、線維芽細胞増殖因子受容体３型遺伝子又はその遺伝子産物（例えばプレｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、又はタンパク質）を指し得、これは突然変異型及び野生型形の両方、そのアイソフォーム、及び変異体（例えばヒトＦＧＦＲ３をコードし、ＦＧＦＲ３タンパク質をコードする核酸）を含み得る。本明細書において使用される「ＦＧＦＲ３」というイタリック体の用語は、典型的には、ＦＧＦＲ３遺伝子を指す。「野生型」という用語はＦＧＦＲ３と記載されるが、これは、被験体又は個体群において最も頻繁に観察されるＦＧＦＲ３対立遺伝子、ヌクレオチド配列、アミノ酸配列、又は表現型を指す。例えば、ヘテロ接合性軟骨無形成症患者におけるＧ３８０Ｒの突然変異したＦＧＦＲ３対立遺伝子と比較して、「野生型」という用語は、Ｇ３８０Ｒ突然変異を含まない残りの対立遺伝子を指す。「突然変異」という用語はＦＧＦＲ３のことを記載するが、これは、被験体又は個体群において変化した対立遺伝子、ヌクレオチド配列、アミノ酸配列、又は表現型、例えば、トランジション及びトランスバージョン点突然変異（これにより１塩基ヌクレオチドが別の遺伝子材料のヌクレオチド（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）で置換される）を指す。突然変異の一例は、ヒトＦＧＦＲ３のコード領域の１１３８位におけるＧからＡへのトランジション置換であり（ヒトＦＧＦＲ３（ＮＭ＿０００１４２）の１３９４位に相当し、同じＧからＡへのトランジション置換を含む任意の変異体及び多形を包含する）、この結果、コドン３８０位はＧＧＧ（アルギニンすなわちＲをコードする）からＡＧＧ又はＣＧＧ（グリシンすなわちＧをコードする）に変化し、従って、突然変異を記載するために「Ｇ３８０Ｒ」という言及が使用される。この突然変異についてのＳＮＰ ＩＤは、ＳＮＰｒｓ２８９３１６１４である。
【００４２】
「発現を調節する」という語句は、特にＦＧＦＲ３に関するので、ＦＧＦＲ３遺伝子の遺伝子産物（例えば、野生型及び／又は突然変異ＦＧＦＲ３の遺伝子産物）の刺激、アップレギュレーション、ダウンレギュレーション、及び／又は阻害を意味する。例えば、異常発現したＦＧＦＲ３をコードする核酸（例えばｍＲＮＡ）に標的化し、このような核酸（例えばＦＧＦＲ３をコードするｍＲＮＡ）に特異的にハイブリダイズする本発明のオリゴヌクレオチドは、ＦＧＦＲ３の発現を調節することができる。本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、ヘテロ接合性軟骨無形成症患者における野生型及び突然変異ＦＧＦＲ３の両方の発現を調節することができる。あるいは、好ましい実施態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、突然変異ＦＧＦＲ３の発現を優先的にダウンレギュレート又は阻害することができる（例えば、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、ＦＧＦＲ３ Ｇ３８０Ｒ突然変異によって引き起こされたヘテロ接合性軟骨無形成症患者におけるＧ３８０Ｒ突然変異ＦＧＦＲ３の発現を調節し得る）。
【００４３】
いくつかの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、特定の核酸を標的化することができる。特定の核酸への、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの脈絡における標的化は、多段階プロセスであり得る。該プロセスは、通常、その機能を調節しようとする核酸配列の同定から始まる。これは、例えば、その発現が特定の疾患又は疾病状態（例えば軟骨無形成症）に関連している核酸（例えばｍＲＮＡ）であり得る。いくつかの実施態様において、標的核酸（例えばｍＲＮＡ）はＦＧＦＲ３をコードする。例えば、標的核酸は、Ｇ３８０Ｒ ＦＧＦＲ３突然変異をコードする核酸遺伝子の領域又はフラグメントを含み得、このような領域を標的化するオリゴヌクレオチドは、ＦＧＦＲ３ｍＲＮＡをコードする核酸に対して相補的である及び／又はハイブリダイズする。あるいは、いくつかの実施態様において、標的核酸は、Ｇ３８０Ｒ突然変異をコードするＦＧＦＲ３遺伝子（又は対応するそのｍＲＮＡ遺伝子産物）の特定の領域をコードする。標的化プロセスはまた、１つ以上の所望の効果が得られるようなアンチセンス相互作用が起こる標的遺伝子内の部位又は部位群の決定を含み得る。１つ以上の所望の効果は、例えば、遺伝子産物（例えば野生型及び／又は突然変異ｍＲＮＡ又はタンパク質）の発現の調節、同じ遺伝子若しくはｍＲＮＡ又は他の遺伝子若しくはｍＲＮＡ上の他の部位と比較して標的部位に対する選択的結合（例えば増加した結合親和性）、標的への十分な又は増強された送達、及び最小限の副作用若しくは皆無の副作用を含み得る。いくつかの実施態様において、好ましい標的化核酸又はｍＲＮＡ部位は、ＦＧＦＲ３ Ｇ３８０Ｒ突然変異及び／又はこのようなＧ３８０Ｒ突然変異の周囲又は隣接した領域をコードする。特に、好ましい部位は、ＦＧＦＲ３のコドン３８０の１１３８位におけるグアニンからアデニンへのヌクレオチド突然変異を含む。
【００４４】
Ｇ３８０Ｒ突然変異は、軟骨無形成症の発症に関与する最も一般的な突然変異を示す。上記されているような「Ｇ３８０Ｒ」とう用語は、ＦＧＦＲ３タンパク質のコドン３８０におけるアルギニン（Ｒ）のグリシン（Ｇ）による置換をもたらす点突然変異を指す。本発明のいくつかの脈絡において、「Ｇ３８０Ｒ領域」という語句は、Ｇ３８０Ｒ突然変異の上流及び／又は下流であるコドン、例えば、Ｇ３８０Ｒ突然変異から約２、５、１０、１２、２０、３０、５０、６０、７５、８０、１００又はそれ以上のコドンだけ上流及び／又は下流にある領域を含み得る。Ｇ３８０Ｒ突然変異（３８０位のコドンにおけるＧＧＧはＡＧＧ又はＣＧＧに変化）はＧ３８０Ｒ受容体タンパク質の膜貫通ドメイン内で起こり、その結果、受容体の過剰活性化が起こる。ＦＧＦＲ３の延長された活性化により、軟骨細胞増殖の中途停止、及び未熟な軟骨細胞の分化が起こる。Ｇ３８０Ｒ突然変異型のＦＧＦＲ３は、疾病を引き起こす機能を獲得し、従って、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、突然変異したＦＧＦＲ３の発現を選択的にダウンレギュレートし、よって、残りの野生型対立遺伝子が長骨における成長板の適切な増殖を誘導することを可能とすることによって、正常な軟骨細胞の機能を回復することができる。特に、ヘテロ接合性軟骨無形成症患者においては、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、差別的又は選択的に、Ｇ３８０Ｒの突然変異したＦＧＦＲ３をコードする核酸（すなわちｍＲＮＡ）（例えば、配列番号４を含む配列によってコードされる核酸）に標的化及びハイブリダイズし、よって、突然変異したＦＧＦＲ３の対立遺伝子の発現はダウンレギュレート又は阻害されるが、同化合物は、野生型ＦＧＦＲ３（例えば配列番号１）には標的化又はハイブリダイズしないか、又はより低い程度で標的化又はハイブリダイズし、従って、残りの野生型対立遺伝子の機能は保存され、これにより、正常な軟骨細胞の機能は回復し、長骨の成長板の適切な増殖が誘導される。
【００４５】
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、動物、哺乳動物、ヒト、又は細胞の１つ以上に送達され得る。標的化細胞は、いくつかの実施態様において、軟骨細胞、ＨｅＬａ細胞、又はＡ５４９細胞を含み得る。特定の実施態様において、使用されるオリゴヌクレオチドの濃度（例えばＡ５４９細胞における）は、約０．２５nM、０．５nM、１nM、５nM、４０nM、１００nM、２００nM、２５０nM又はそれ以上であり得る。使用されるオリゴヌクレオチドの濃度は、いくつかの実施態様において、２５nM（例えば軟骨細胞において）であり得る。使用されるオリゴヌクレオチドの濃度は、いくつかの実施態様において、１nM（例えば軟骨細胞において）であり得る。トランスフェクション試薬の非存在下において（例えばジムノティック送達を使用して）、約１μM〜２５μM（例えば約５μM）のオリゴヌクレオチド濃度が標的遺伝子のダウンレギュレートのために使用され得る。
【００４６】
特定の実施態様において、本明細書において開示されたオリゴヌクレオチドは、被験体に定期的に（例えば、ヒトに１日１回、１週間に１回、１か月に１回、年４回、年２回、又は年１回、静脈内又は皮下に投与）、約０．２〜約２０mg/kgの用量で（例えば、少なくとも約０．２mg/kg、０．２５mg/kg、０．５mg/kg、１．０mg/kg、１．５mg/kg、２．０mg/kg、２．５mg/kg、３．０mg/kg、３．５mg/kg、４．０mg/kg、４．５mg/kg、５．０mg/kg、６．０mg/kg、７．５mg/kg、８．０mg/kg、１０mg/kg、１２．５mg/kg、１５mg/kg、又は２０mg/kgの１日量又は１週間の用量の投与）投与され得る。いくつかの実施態様において、細胞を標的化するために使用されるオリゴヌクレオチドの適切な濃度の決定は、トランスフェクション試薬（例えばリポフェクチン）を使用してインビトロの細胞アッセイにおいて実施され得ることを注意すべきである。
【００４７】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、ＦＧＦＲ３の強力な阻害剤である（すなわち、細胞又は組織が比較的低濃度のオリゴヌクレオチドに曝された時に、このような細胞又は組織におけるＦＧＦＲ３の発現を調節することができる）。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、このようなオリゴヌクレオチドの比較的低濃度で、ＦＧＦＲ３の発現（例えば突然変異したＦＧＦＲ３の発現）を低減又はさもなくば阻害することができる。例えば、いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、比較的低濃度で（例えば、トランスフェクションアッセイによって決定されたところ約５nM未満のＩＣ５０、又は約４nM未満、例えば２nM未満のＩＣ５０）で細胞によるＦＧＦＲ３の発現を阻害し得る。本明細書において使用される「ＩＣ５０」という用語は、対象のパラメーター（例えばＦＧＦＲ３タンパク質発現）を約５０％阻害するのに十分であるオリゴヌクレオチドの濃度を指す。特定の実施態様において、本明細書において開示されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、野生型ＦＧＦＲ３タンパク質の発現と比べて、突然変異ＦＧＦＲ３タンパク質の発現を選択的に阻害することで特徴付けられる。従って、オリゴヌクレオチドは、野生型ＦＧＦＲ３タンパク質の発現を阻害するのに必要とされる濃度と比べて、より低い濃度で（例えば約２倍低い）突然変異ＦＧＦＲ３のタンパク質の発現を阻害することで特徴付けられ得る。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、突然変異及び野生型ＦＧＦＲ３タンパク質についてのＩＣ５０の少なくとも２倍の差異を示し得る（例えば、ヘテロ接合性軟骨無形成症を有する哺乳動物における正常又は野生型タンパク質と比べて、ＦＧＦＲ３突然変異タンパク質の発現を阻害するのに必要とされるＩＣ５０の少なくとも約２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は１０倍の差異）。
【００４８】
それ故、本発明は、このようなＦＧＦＲ３タンパク質及び／又はｍＲＮＡを異常に発現している細胞（例えば、Ｇ３８０Ｒ突然変異ＦＧＦＲ３タンパク質及び／又はｍＲＮＡを発現している軟骨細胞）における、異常発現したＦＧＦＲ３タンパク質及び／又はＦＧＦＲ３ｍＲＮＡ、特にＧ３８０Ｒ突然変異ＦＧＦＲ３遺伝子によってコードされるＦＧＦＲ３ｍＲＮＡの発現を調節（例えばダウンレギュレート又は阻害）する方法を提供する。このような方法は、本発明によるオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートを、細胞に投与（又はさもなくば、このような細胞をこのようなオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートと接触させる）して、該細胞におけるＦＧＦＲ３タンパク質及び／又はｍＲＮＡの発現をダウンレギュレート又は阻害することを含む。いくつかの実施態様において、該細胞はインビトロ又はインビボの哺乳動物細胞、例えばヒト細胞であり得る。例えば、突然変異ＦＧＦＲ３遺伝子に標的化しその遺伝子産物（例えば突然変異したＦＧＦＲ３ｍＲＮＡ）に特異的にハイブリダイズすることのできる本発明のオリゴヌクレオチドは、突然変異したＦＧＦＲ３の発現を調節し得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、ヘテロ接合性軟骨無形成症患者における野生型及び／又は突然変異ＦＧＦＲ３対立遺伝子の発現を調節し得る。患者（例えばヒト又は哺乳動物）、被験体（例えばヒト又は哺乳動物）、及び／又は細胞（例えばヒト又は哺乳動物）への投与は、インビボ、エクスビボ、又はインビトロで行なわれ得る。例えば、いくつかの実施態様において、薬学的に許容される製剤中及び／又は薬学的に許容される担体若しくは送達ビヒクル中のオリゴヌクレオチドは、患者又は被験体の身体に本明細書に記載の方法によって直接投与されてもよい。あるいは、いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、細胞が取り出された後、かつそれらが患者又は被験体の身体に戻される前に投与されてもよい。いくつかの実施態様において、該細胞は、該細胞が取り出された後、かつそれらが患者又は被験体の身体に戻される前に、培養条件下で維持され得る。
【００４９】
本明細書において使用される「標的核酸」という語句は、哺乳動物ＦＧＦＲ３をコードする核酸（例えばｍＲＮＡ）を指し、特に、突然変異した又は異常発現したＦＧＦＲ３をコードする核酸（例えばｍＲＮＡ）を指す。例えば、本明細書において開示されているのは、Ｇ３８０Ｒ突然変異ＦＧＦＲ３をコードする標的核酸（例えば、配列番号４によってコードされるような、Ｇ３８０Ｒ突然変異ＦＧＦＲ３をコードするｍＲＮＡ）である。適切な標的核酸としては、ＦＧＦＲ３をコードする核酸又はその天然の変異体、及び、それから得られたＲＮＡ核酸（例えば、配列番号１５〜２０を含む又はそれに相当するｍＲＮＡ標的配列）、好ましくはｍＲＮＡ、例えばプレｍＲＮＡが挙げられるが、好ましくは成熟ｍＲＮＡである。いくつかの実施態様において（例えば、研究又は診断に使用される場合）、「標的核酸」は、上記のＤＮＡ又はＲＮＡ核酸標的から得られたｃＤＮＡ又は合成オリゴヌクレオチであり得る。本発明によるオリゴヌクレオチドは、標的核酸又はこのような標的核酸の遺伝子産物にハイブリダイズすることができる。いくつかの実施態様において、標的核酸配列はｃＤＮＡ配列であり、従って、成熟ｍＲＮＡ標的配列に相当するが、ｃＤＮＡ配列中のウラシルはチミジンで置換されていてもよいと認識されている。
【００５０】
「その天然の変異体」という用語は、規定の分類学的な群、例えば、哺乳動物、例えばマウス、サル、及び好ましくはヒトに天然に存在するＦＧＦＲ３ポリペプチド又は核酸配列の変異体を指す。典型的には、ポリヌクレオチドの「天然の変異体」に言及する場合、該用語はまた、染色体転座又は複製によって染色体４ｐ１６．３に見られるＦＧＦＲ３をコードするゲノムＤＮＡ、及びＲＮＡ、例えばそれから導かれたｍＲＮＡの任意の対立遺伝子変異体を包含し得る。例えば、ＦＧＦＲ３の天然の変異体は、例えば配列番号４によってコードされるようなＧ３８０Ｒ突然変異体、又はその天然の変異体（例えばＳＮＰ ＩＤ番号ｒｓ２８９３１６１４、ｒｓ１１９４３８６３、又はｒｓ１７８８１６５６）を含み得る。天然の変異体はまた、ＦＧＦＲ３ｍＲＮＡの選択的スプライシングから得られた変異体を含み得る。特定のポリペプチド配列に言及する場合、該用語はまた、天然形のタンパク質（これらはそれ故、例えば、同時翻訳又は翻訳後修飾（例えば、シグナルペプチド切断、タンパク質分解による切断、グリコシル化など）によってプロセシングされていてもよい）を含み得る。
【００５１】
配列
いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、配列番号１若しくは配列番号４のヌクレオチド配列、又は配列番号１若しくは配列番号４のフラグメントの逆相補体に相当する、連続ヌクレオチド配列を含む又はからなる。従って、該オリゴヌクレオチドは、配列番号９、１０、１１、１２、１３又は１４からなる群より選択された配列を含む又はからなり得、該オリゴヌクレオチド（又はその連続ヌクレオチド部分）は、場合により、選択された標的配列に対して１つ、２つ又は３つのミスマッチを有し得る。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、Ｇ３８０Ｒ突然変異を含むＦＧＦＲ３配列領域をコードするヌクレオチド配列、及びこのような突然変異の周囲のヌクレオチドの逆相補体に相当する、連続ヌクレオチド配列を含む又はからなり得る。例えば、いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、表１において同定された配列を含み得る（すなわち、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３又は配列番号１４）。該オリゴヌクレオチドは、Ｇ３８０Ｒ突然変異を含むＦＧＦＲ３をコードする核酸（例えばｍＲＮＡ）の領域（例えば、Ｇ３８０Ｒ突然変異から約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上のヌクレオチドだけ上流及び／又は下流にある領域）、例えば表１において同定された標的配列に対して相補的であり得る。例えば、いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、表１において同定されたｍＲＮＡ標的配列（例えば、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、又は配列番号２０）に対して相補的であり得る。いくつかの実施態様において、このような相補的オリゴヌクレオチドは、ＦＧＦＲ３の遺伝子産物（すなわちＦＧＦＲ３ｍＲＮＡ）に、特に、Ｇ３８０Ｒ突然変異をコードするＦＧＦＲ３の遺伝子産物にハイブリダイズすることができる。
【００５２】
【表２】
0006463687.tif 000003
【００５３】
該オリゴヌクレオチドは、哺乳動物ＦＧＦＲ３（例えば配列番号１、配列番号４又はそのフラグメント）をコードする核酸の等価な領域に対して完全に相補的である（完璧に相補的である）連続ヌクレオチド配列を含む又はからなり得る。従って、該オリゴヌクレオチドは、ＦＧＦＲ３をコードする核酸（すなわちＦＧＦＲ３ｍＲＮＡ）にハイブリダイズすることのできるアンチセンスヌクレオチド配列を含む又はからなり得る。
【００５４】
しかしながら、いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズする場合に１、２、３又は４個の（またはそれ以上の）ミスマッチに耐え得、依然として標的に十分に結合して所望の効果（例えば標的ｍＲＮＡのダウンレギュレーション）を示し得る。ミスマッチは、例えば、オリゴヌクレオチド配列の延長された長さ、及び／又は、ヌクレオチド配列内に存在するロックド核酸（ＬＮＡ）などのヌクレオチド類似体の増加した数によって補われ得る。いくつかの実施態様において、連続ヌクレオチド配列は、標的配列に、例えば哺乳動物ＦＧＦＲ３ｍＲＮＡをコードする核酸の対応する領域にハイブリダイズさせる場合に、３つ以下のミスマッチを含む（例えば１つ以下又は２つ以下のミスマッチ）。いくつかの実施態様において、連続ヌクレオチド配列は、標的配列に、例えば哺乳動物ＦＧＦＲ３ｍＲＮＡをコードする核酸の対応する領域にハイブリダイズさせる場合に、１つ以下のミスマッチを含む。
【００５５】
本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列又は連続ヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号１５、１６、１７、１８、１９又は２０からなる群より選択された配列に対して少なくとも８０％相補的、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、例えば少なくとも１００％相補的である。
【００５６】
本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列又は連続ヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号４に存在する対応する配列の逆相補体に対して少なくとも８０％相同、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％相同、少なくとも９７％相同、少なくとも９８％相同、少なくとも９９％相同、例えば１００％相同（同一）である。
【００５７】
本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列又は連続ヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号４に存在するサブ配列に対して少なくとも８０％相補的、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％相補的、少なくとも９７％相補的、少なくとも９８％相補的、少なくとも９９％相補的、例えば１００％相補的（完璧に相補的）である。
【００５８】
いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチド（又はその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号９、１０、１１、１２、１３若しくは１４からなる群より選択された配列の１つ、又は少なくとも約６〜１０連続したそのヌクレオチドのサブ配列から選択されるか又はこれを含む。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチド（又はその連続ヌクレオチド部分）は、場合により、配列と比較した場合、１つ、２つ又は３つのミスマッチを含み得る。
【００５９】
いくつかの実施態様において、サブ配列は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８又は２９個の連続ヌクレオチド、例えば約１２〜２２個、例えば約１２〜１８個のヌクレオチドからなり得る。適切には、いくつかの実施態様において、サブ配列は、本発明のオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列と同じ長さである。
【００６０】
しかしながら、いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、標的配列に対して相補的ではない、追加の５’又は３’ヌクレオチド又は修飾、例えば独立して１、２、３、４又は５つの追加のヌクレオチド５’及び／又は３’を含んでいてもよいと認識される。これに関して、本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施態様において、追加のヌクレオチドによって５’及び又は３’にフランキングされた連続ヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施態様において、追加の５’又は３’ヌクレオチドは、天然のヌクレオチド、例えばＤＮＡ又はＲＮＡである。いくつかの実施態様において、追加の５’又は３’ヌクレオチドは、本明細書において開示されたギャップマーオリゴヌクレオチドの脈絡で言及されているような領域Ｗを示し得る。
【００６１】
いくつかの実施態様において、本発明によるオリゴヌクレオチドは、配列番号９、１０、１１、１２、１３又は１４によるヌクレオチド配列又はそのサブ配列からなる又は含む。
【００６２】
いくつかの実施態様において、本発明によるオリゴヌクレオチドは、配列番号９によるヌクレオチド配列又はそのサブ配列からなる又は含む。
【００６３】
いくつかの実施態様において、本発明によるオリゴヌクレオチドは、配列番号１０によるヌクレオチド配列又はそのサブ配列からなる又は含む。
【００６４】
いくつかの実施態様において、本発明によるオリゴヌクレオチドは、配列番号１１によるヌクレオチド配列又はそのサブ配列からなる又は含む。
【００６５】
いくつかの実施態様において、本発明によるオリゴヌクレオチドは、配列番号１２によるヌクレオチド配列又はそのサブ配列からなる又は含む。
【００６６】
いくつかの実施態様において、本発明によるオリゴヌクレオチドは、配列番号１３によるヌクレオチド配列又はそのサブ配列からなる又は含む。
【００６７】
いくつかの実施態様において、本発明によるオリゴヌクレオチドは、配列番号１４によるヌクレオチド配列又はそのサブ配列からなる又は含む。
【００６８】
本発明のオリゴヌクレオチド（又はその領域）と核酸の標的領域（例えば哺乳動物ＦＧＦＲ３タンパク質をコードするｍＲＮＡ）との間の相補度の決定において、相補度（又は相同度又は同一度）は、オリゴヌクレオチド配列（又はその領域）と、それと最善にアラインさせた標的領域の配列（又は標的領域の逆相補体）との間の同一率（又は相同率）として表現される。比率は、２つの配列間で同一であるアラインさせた塩基の数を計測し、オリゴヌクレオチド中の連続モノマーの総数で割り、これに１００をかけることによって計算される。このような比較においては、ギャップが存在する場合、このようなギャップは、ギャップ内のモノマーの数が、本発明のオリゴヌクレオチドと標的領域との間で異なっている領域ではなくむしろ単なるミスマッチであることが好ましい。本明細書において使用される「相同な」及び「相同性」という用語は、「同一性」及び「同一」という用語と互換可能である。
【００６９】
「対応している」及び「対応する」という語句は、該オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列（すなわち核酸塩基又は塩基配列）又は連続ヌクレオチド配列と、（ｉ）核酸標的の逆相補体のサブ配列、例えばＦＧＦＲ３タンパク質をコードするｍＲＮＡ、及び／又は（ｉｉ）配列番号１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０からなる群などの本明細書において提供されるヌクレオチド配列又はそのサブ配列のいずれかから選択されたさらなる配列の等価な連続ヌクレオチド配列との比較を指す。ヌクレオチド類似体を、その等価な又は対応するヌクレオチドと直接比較する。（ｉ）又は（ｉｉ）のさらなる配列に対応する第一配列は、典型的には、第一配列（例えば連続ヌクレオチド配列）の長さにおよぶその配列に対して同一であるか、又は本明細書に記載されているように、いくつかの実施態様において、対応する配列に対して少なくとも８０％相同、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％相同、例えば１００％相同（同一）であり得る。
【００７０】
一旦１つ以上の標的部位が同定されたら、標的に対して十分に相補的である（すなわち、十分に良好にかつ十分な特異性でハイブリダイズして所望の効果を与える）オリゴヌクレオチドを選択する。例えば、標的に対するＦＧＦＲ３ｍＲＮＡ領域を同定する際に、オリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ標的に対する相補性、又は代替的にはこのようなｍＲＮＡ標的をコードするＤＮＡに対する相補性に基づいて選択され得る。この脈絡において、「ハイブリダイゼーション」は相補的ヌクレオシド又はヌクレオチド塩基間の水素結合を意味し、これはワトソンクリック、フーグスティーン、又は逆フーグスティーン水素結合であり得る。例えば、アデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）は、水素結合の形成を通して対を形成する相補的核酸塩基である。本明細書において使用される「相補性」は、２つのヌクレオチド間で正確な対を形成する能力を指す。例えば、オリゴヌクレオチドの特定の位置におけるヌクレオチドが、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子の同じ位置にあるヌクレオチドと水素結合をすることができるならば、オリゴヌクレオチド及びＤＮＡ又はＲＮＡは互いにその位置において相補的であると考えられる。オリゴヌクレオチド及びＤＮＡ又はＲＮＡは、各分子における十分な数の対応する位置が、互いに水素結合することのできるヌクレオチドによって占有されている場合、互いに相補的である。従って、「特異的にハイブリダイズすることができる」及び「相補的」は、オリゴヌクレオチドとＤＮＡ又はＲＮＡ標的との間で安定かつ特異的な結合が起こるような、十分な相補度又は正確な対形成を示すために使用される用語である。アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能なその標的核酸に対して１００％相補的である必要はないと当技術分野において理解される。アンチセンス化合物の配列は、例えば、特異的にハイブリダイズ可能なその標的配列に対して約４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９７．５％、９９％又は１００％相補的であり得る。アンチセンス化合物は、標的ＤＮＡ又はＲＮＡ分子への該化合物の結合が、標的ＤＮＡ又はＲＮＡの正常な機能に干渉し、機能又は有用性の低下を引き起こす場合に、及び、特異的結合が望まれる条件下で（例えば、インビボにおけるアッセイ又は治療処置の場合には生理学的条件下で、及びインビトロアッセイの場合には、アッセイが実施される条件下で）非標的配列に対するアンチセンス化合物の非特異的結合が回避される十分な相補度が存在する場合に、特異的にハイブリダイズすることができる。本明細書において使用される「逆相補体」、「逆相補的」及び「逆相補性」という語句は、「相補体」、「相補的」及び「相補性」という用語と互換可能である。
【００７１】
標的核酸（例えば、突然変異ＦＧＦＲ３タンパク質をコードするｍＲＮＡ）にハイブリダイズし、標的核酸の発現を阻害する、本発明のアンチセンス及び他のオリゴヌクレオチドは、実験を通して同定され、これらの化合物の配列は、本明細書において本発明の好ましい実施態様として同定される（例えば、表１において同定された配列）。標的核酸又は部位（これに対してこれらの好ましい配列は相補的である）は、本明細書において、「活性部位」と称され、それ故、標的化のための好ましい部位である（例えば、表１において同定された標的配列）。本発明によって考えられる活性部位の一例は、ＦＧＦＲ３のコドン３８０におけるグリシンからアルギニンへの突然変異の周囲の領域、例えばＧ３８０Ｒ領域を含む。それ故、本発明の別の実施態様は、この活性部位領域（これは活性部位から直近の上流及び／又は下流のヌクレオチドを含み得る）にハイブリダイズする、化合物を包含する。例えば、この領域は、Ｇ３８０Ｒ突然変異から約１、２、５、１０、１２、２０、３０、５０、６０、７５、８０、１００又はそれ以上のコドンだけ上流及び／又は下流にある。
【００７２】
「対応するヌクレオチド類似体」及び「対応するヌクレオチド」という語句は、ヌクレオチド類似体におけるヌクレオチド及び天然のヌクレオチドが同一であることを示すことを意味する。例えば、ヌクレオチドの２−デオキシリボース単位がアデニンに連結されている場合、対応するヌクレオチド類似体は、アデニンに連結されたペントース単位（２−デオキシリボースとは異なる）を含む。
【００７３】
長さ
該オリゴヌクレオチドは、全部で５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０連続ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む又はからなり得る。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、全部で約８〜２５、例えば約１０〜２２、例えば約１２〜１８、例えば約１３〜１７、又は１２〜１６、例えば約１３、１４、１５、１６連続ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む又はからなる。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、全部で８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４連続ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む又はからなる。いくつかの実施態様において、本発明によるオリゴヌクレオチドは、２２個以下のヌクレオチド、例えば２０個以下のヌクレオチド、例えば１８個以下のヌクレオチド、例えば１５、１６、又は１７個のヌクレオチドからなる。いくつかの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、２０個未満のヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列長についての範囲が示される場合、それは、例えば１０〜３０（又はその間）（１０及び３０の両方を含む）の範囲で与えられる上限及び下限の長さを含むことが理解されるべきである。
【００７４】
ヌクレオシド及びヌクレオシド類似体
ヌクレオチド類似体
本明細書において使用される「ヌクレオチド」という用語は、糖部分、塩基部分、及び共有結合で連結された基（例えばリン酸基又はホスホロチオエートヌクレオチド間連結基）を含むグリコシドを指し、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの天然のヌクレオチド、並びに、修飾された糖及び／又は塩基部分を含む非天然ヌクレオチド（これはまた本明細書において「ヌクレオチド類似体」とも称される）の両方を網羅する。本明細書において、単一のヌクレオチド（単位）はまた、モノマー又は核酸単位とも称され得る。
【００７５】
生化学の分野においては、「ヌクレオシド」という用語は、糖部分及び塩基部分を含むグリコシドを指すために一般的に使用され、それ故、オリゴマーのヌクレオチド間のヌクレオチド間の連結によって共有結合で連結されたヌクレオチド単位を指す場合に使用され得る。
【００７６】
当業者が認識しているように、オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドは、５’末端基を含んでいても含んでいなくてもよいが、５’ヌクレオチド間連結基を含まない。
【００７７】
非天然ヌクレオチドとしては、糖部分が修飾されたヌクレオチド、例えば二環式ヌクレオチド又は２’修飾ヌクレオチド、例えば２’置換ヌクレオチドが挙げられる。
【００７８】
「ヌクレオチド類似体」は、糖及び／又は塩基部分の修飾による、ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオチドなどの天然ヌクレオチドの変異体である。類似体は、原則的に、オリゴヌクレオチドに関して天然ヌクレオチドに対して単に「サイレント」又は「等価」であり得、すなわち、オリゴヌクレオチドが標的遺伝子発現を阻害する作用様式に対して機能的な作用を全く及ぼさない。このような「等価な」類似体は、それにも関わらず、例えばそれらが製造がより簡単でより安価であるか、又は保存若しくは製造条件に対してより安定であるか、又はタグ若しくは標識を示すならば有用であり得る。しかしながら、好ましくは、類似体は、オリゴマーが発現を阻害する作用様式に対して、例えば、標的に対する増加した結合親和性及び／又は細胞内ヌクレアーゼに対する増加した抵抗性、及び／又は細胞への向上した輸送し易さを生じることによって機能的な効果を及ぼす。ヌクレオシド類似体の具体例が、例えば、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 and Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213、及び以下によって記載されている。
【００７９】
【化１】
0006463687.tif 000004
【００８０】
従って、オリゴマーは、天然ヌクレオチド、好ましくは２’−デオキシヌクレオチド（ここでは一般的に「ＤＮＡ」と称される）、しかしまたおそらくリボヌクレオチド（ここでは一般的に「ＲＮＡ」と称される）、又はこのような天然ヌクレオチドと１つ以上の非天然ヌクレオチド、すなわちヌクレオチド類似体との組合せのシンプルな配列を含む又はからなり得る。このようなヌクレオチド類似体は、標的配列に対するオリゴマーの親和性を適切に増強させ得る。
【００８１】
適切かつ好ましいヌクレオチド類似体の例は、ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２によって提供されるか、又はそこに参照されている。
【００８２】
オリゴマーへの親和性増強ヌクレオチド類似体、例えばＬＮＡ又は２’−置換糖の取り込みは、特異的に結合するオリゴマーのサイズの低減を可能とし、また、非特異的又は異常な結合が起こる前のオリゴマーのサイズに上限を低減させ得る。
【００８３】
いくつかの実施態様において、該オリゴマーは、少なくとも２つのヌクレオチド類似体を含む。いくつかの実施態様において、該オリゴマーは、３〜８つのヌクレオチド類似体、例えば６又は７つのヌクレオチド類似体を含む。圧倒的に最も好ましい実施態様において、該ヌクレオチド類似体の少なくとも１つはロックド核酸（ＬＮＡ）であり；例えば、ヌクレオチド類似体の少なくとも３つ又は少なくとも４つ、又は少なくとも５つ、又は少なくとも６つ、又は少なくとも７つ、又は８つがＬＮＡであり得る。いくつかの実施態様において、全てのヌクレオチド類似体がＬＮＡであり得る。
【００８４】
ヌクレオチドのみからなる、好ましいヌクレオチド配列モチーフ又はヌクレオチド配列に言及する場合、その配列によって定義される本発明のオリゴマーは、該配列に存在する１つ以上のヌクレオチドの代わりに対応するヌクレオチド類似体、例えばＬＮＡ単位又は他のヌクレオチド類似体（これは、オリゴマー／標的の二本鎖の二本鎖安定性／Ｔｍを高める）（すなわち、親和性増強ヌクレオチド類似体）を含み得る。
【００８５】
ＬＮＡ
「ＬＮＡ」という用語は、Ｃ２＊−Ｃ４＊ビラジカル（橋）を含み、「ロックド核酸」又は「ＢＮＡ」（二環式核酸（Bicyclic Nucleic Acid）又は「架橋核酸（Bridged Nucleic Acid）」）としても知られる、二環式ヌクレオシド類似体を指す。それはＬＮＡモノマーを指し得るか、又は「ＬＮＡオリゴヌクレオチド」の脈絡で使用される場合には、ＬＮＡは、１つ以上のこのような二環式ヌクレオチド類似体を含有するオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの態様において、二環式ヌクレオシド類似体はＬＮＡヌクレオチドであり、それ故、これらの用語は互換的に使用され得、このような実施態様において、どちらも、リボース糖環のＣ２’とＣ４’との間のリンカー基（例えば橋）の存在によって特徴付けられる。
【００８６】
いくつかの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチド化合物に使用されるＬＮＡは、好ましくは、一般式Ａ：
【化２】
0006463687.tif 000005
（式中、Ｙは、−Ｏ−、−ＣＨ２Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、Ｎ（Ｒｅ）及び／又は−ＣＨ２−からなる群より選択され；Ｚ及びＺ＊は、独立して、ヌクレオチド間連結、ＲＨ、末端基、又は保護基から選択され；Ｂは、天然又は非天然ヌクレオチド塩基部分（核酸塩基）を構成し、ＲＨは、水素及びＣ１−４−アルキルから選択され；Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅは、場合により独立して、水素、場合により置換されているＣ１−１２−アルキル、場合により置換されているＣ２−１２−アルケニル、場合により置換されているＣ２−１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１−１２−アルコキシ、Ｃ２−１２−アルコキシアルキル、Ｃ２−１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１−１２−アルコキシカルボニル、Ｃ１−１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ及びジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ及びジ（Ｃ１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１−６−アルキルアミノカルボニル、モノ及びジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１−６−アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１−６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ１−６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１−６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、及びリガンドからなる群より選択され、アリール及びヘテロアリールは、場合により置換されていてもよく、２つのジェミナルな置換基Ｒａ及びＲｂは一緒に、場合により置換されているメチレン（＝ＣＨ２）を示し得；ＲＨは、水素及びＣ１−４−アルキルから選択される）
で示される構造を有する。いくつかの実施態様において、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅは、場合により独立して、水素及びＣ１−６−アルキル、例えばメチルからなる群より選択される。全ての不斉中心について、非対称の基はＲ又はＳのいずれかの配向で見られ得、例えば、２つの例示的な立体化学的異性体はβ−Ｄ及びα−Ｌアイソフォームを含み、これは、以下のように示され得る；
【化３】
0006463687.tif 000006
【００８７】
具体的な例示的なＬＮＡ単位が、以下に示されている：
【化４】
0006463687.tif 000007
【００８８】
「チオ−ＬＮＡ」という用語は、上記の一般式中のＹが、Ｓ又は−ＣＨ２−Ｓから選択されたロックドヌクレオチドを含む。チオ−ＬＮＡは、β−Ｄ及びα−Ｌ立体配置の両方であり得る。
【００８９】
「アミノ−ＬＮＡ」という用語は、上記の一般式中のＹが、−Ｎ（Ｈ）−、Ｎ（Ｒ）−、ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−、及び−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−から選択され、Ｒは水素及びＣ１−４−アルキルから選択される、ロックドヌクレオチドを含む。アミノ−ＬＮＡは、β−Ｄ及びβ−Ｌ立体配置の両方であり得る。
【００９０】
「オキシ−ＬＮＡ」という用語は、上記の一般式中のＹが−Ｏ−を示す、ロックドヌクレオチドを含む。オキシ−ＬＮＡは、β−Ｄ及びβ−Ｌ立体配置の両方であり得る。
【００９１】
「ＥＮＡ」という用語は、上記の一般式中のＹが−ＣＨ２−Ｏ−（−ＣＨ２−Ｏ−の酸素原子は、塩基Ｂに対して２’位に付着している）である、ロックドヌクレオチドを含む。Ｒｅは水素又はメチルである。
【００９２】
いくつかの例示的な実施態様において、ＬＮＡはβ−Ｄ−Ｘ−ＬＮＡ又はα−Ｌ−Ｘ−ＬＮＡ（Ｘはオキシ、アミノ又はチオである）から選択されるか、又は本明細書において開示された他のＬＮＡは、（Ｒ／Ｓ）ｃＥＴ、ｃＭＯＥ、又は５’−Ｍｅ−ＬＮＡ、特にβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡを含むがこれらに限定されない。
【００９３】
本明細書において使用される「二環式ヌクレオシド」は、二環式糖部分を含む修飾されたヌクレオシドを指す。二環式ヌクレオシドの例は、４’と２’のリボシル環原子の間に橋を含むヌクレオシドを含むがこれらに限定されない。いくつかの実施態様において、本明細書に提供された化合物は、１つ以上の二環式ヌクレオシドを含み、橋は４’から２’二環式ヌクレオシドを含む。このような４’から２’二環式ヌクレオシドの例は、式：４’−（ＣＨ２）−Ｏ−２’（ＬＮＡ）；４’−（ＣＨ２）−Ｓ−２’；４−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’（ＥＮＡ）；４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’及び４’−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−Ｏ−２’及びその類似体（２００８年７月１５日に発行された米国特許第７，３９９，８４５号を参照されたい）；４’−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）−Ｏ−２’及びその類似体（２００９年１月８日に公開された公開ＰＣＴ国際出願国際公開公報第２００９／００６４７８号を参照されたい）；４’−ＣＨ２−Ｎ（ＯＣＨ３）−２’及びその類似体（２００８年１２月１１日に公開された公開ＰＣＴ国際出願国際公開公報第２００８／１５０７２９号を参照されたい）；４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−２’（２００４年９月２日に公開された公開米国特許出願ＵＳ２００４／０１７１５７０を参照されたい）：４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’（Ｒは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、又は保護基である）（２００８年９月２３日に発行された米国特許第７，４２７，６７２号を参照されたい）；４’−ＣＨ２−Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）−２’（Chattopadhyaya, et al, J. Org. Chem.,2009, 74, 118-134を参照されたい）；及び４’−ＣＨ２−Ｃ（＝ＣＨ２）−２’及びその類似体（２００８年１２月８日に公開された公開ＰＣＴ国際出願国際公開公報第２００８／１５４４０１号を参照されたい）の１つを含むがこれらに限定されない。また、例えば、Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc, 129(26) 8362-8379 (Jul. 4, 2007); Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol, 2001, 8, 1-7; Oram et al, Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; 米国特許第６，６７０，４６１号、第７，０５３，２０７号、第６，２６８，４９０号、第６，７７０，７４８号、第６，７９４,４９９号、第７，０３４，１３３号、第６，５２５，１９１号、第７，３９９，８４５号；公開ＰＣＴ国際出願国際公開公報第２００４／１０６３５６号、国際公開公報第９４／１４２２６号、国際公開公報第２００５／０２１５７０号及び国際公開公報第２００７／１３４１８１号；米国特許公開公報ＵＳ２００４／０１７１５７０、ＵＳ２００７／０２８７８３１、及びＵＳ２００８／００３９６１８；及び米国特許出願第１２／１２９，１５４号、第６０／９８９，５７４号、第６１／０２６，９９５号、第６１／０２６，９９８号、第６１／０５６，５６４号、第６１／０８６，２３１号、第６１／０９７，７８７号及び第６１／０９９，８４４号；及び、ＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４５９１、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６１５４、及���ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６８９２２を参照されたい。例えばα−Ｌ−リボフラノース及びβ−Ｄ−リボフラノースを含む１つ以上の立体化学的な糖立体配置を有する、前記の各二環式ヌクレオシドを調製することができる（国際公開公報第９９／１４２２６号として１９９９年３月２５日に公開されたＰＣＴ国際出願ＰＣＴ ＤＫ９８／００３９３を参照されたい）。
【００９４】
いくつかの実施態様において、二環式糖部分ヌクレオシドは、ペントフラノシル糖部分の４’位と２’位の間に少なくとも１つの橋を有する化合物を含むがこれらに限定されず、このような橋は、独立して、−［ＣｉＲａＸＲｂ］］，，−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｃ（＝ＮＲａ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−Ｓ（＝Ｏ）ｘ−、及び−Ｎ（Ｒａ）−から独立して選択された１つ、又は２〜４つの連結基を含み；ｘは０、１又は２であり；ｎは１、２、３又は４であり；各Ｒａ及びＲｂは、独立して、Ｈ、保護基、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃｉ２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃｉ２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ５−Ｃ２０アリール、置換Ｃ５−Ｃ２０アリール、ヘテロ環基、置換ヘテロ環基、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ５−Ｃ７脂環式基、置換Ｃ５−Ｃ７脂環式基、ハロゲン、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＣＯＯＪ１、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、ＣＮ、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）２−Ｊ１）、又はスルホキシル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｊ１）であり；各Ｊ１及びＪ２は、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ５−Ｃ２０アリール、置換Ｃ５−Ｃ２０アリール、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、ヘテロ環基、置換ヘテロ環基、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル、又は保護基である。
【００９５】
いくつかの実施態様において、二環式糖部分の橋は、−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−、−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−又は−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−である。いくつかの実施態様において、橋は、４’−ＣＨ２−２’、４’−（ＣＨ２）２−２’、４’−（ＣＨ２）３−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’、４＊−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’、及び４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’−であり、各Ｒは、独立して、Ｈ、保護基、又はＣ１−Ｃ１２アルキルである。
【００９６】
いくつかの実施態様において、二環式ヌクレオシドは、異性体立体配置によってさらに規定される。例えば、４’−２’メチレン−オキシ橋を含むヌクレオシドは、α−Ｌ立体配置又はβ−Ｄ立体配置であり得る。以前に、α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ’が、アンチセンス活性を示したアンチセンスオリゴヌクレオチドに取り込まれた（Frieden et al, Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365- 6372）。
【００９７】
いくつかの実施態様において、二環式ヌクレオシドは、以下に示されているような、（Ａ）α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｂ）β−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｃ）エチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｄ）アミノオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、（Ｅ）オキシアミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｆ）メチル（メチレンオキシ）（４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｇ）メチレン−チオ（４’−ＣＨ２−Ｓ−２’）ＢＮＡ、（Ｈ）メチレン−アミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、（Ｉ）メチル炭素環（４’−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−２’）ＢＮＡ、及び（Ｊ）プロピレン炭素環（４’−（ＣＨ２）３−２’）ＢＮＡを含むがこれらに限定されない。
【化５】
0006463687.tif 000008
【００９８】
Ｂｘは塩基部分であり、Ｒは、独立して、Ｈ、保護基、又はＣ１−Ｃ２アルキルである。いくつかの実施態様において、二環式ヌクレオシドは式Ｉ：
【化６】
0006463687.tif 000009
（式中、
Ｂｘはヘテロ環塩基部分であり；
−Ｑａ−Ｑｂ−Ｑｃ−は−ＣＨ２−Ｎ（Ｒｃ）−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｃ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒｃ）−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒｃ）−Ｏ−、又は−Ｎ（Ｒｃ）−Ｏ−ＣＨ２であり；
Ｒｃは、Ｃ１−Ｃ１２アルキル又はアミノ保護基であり；
Ｔａ及びＴｂは、各々独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合的付着である）
を有する。
【００９９】
いくつかの実施態様において、二環式ヌクレオシドは、式ＩＩ：
【化７】
0006463687.tif 000010
（式中、
Ｂｘはヘテロ環塩基部分であり；
Ｔａ及びＴｂは、各々独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合的付着であり；Ｚａは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルキニル、アシル、置換アシル、置換アミド、チオール、又は置換チオである）
を有する。
【０１００】
いくつかの実施態様において、各置換基は、独立して、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪｃ、ＮＪｄ、ＳＪｃ、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊｃ及びＮＪｅＣ（＝Ｘ）ＮＪｃＪｄから独立して選択された置換基で一置換又は多置換され、各Ｊｃ、Ｊｄ及びＪｅは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、又は置換Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、ＸはＯ又はＮＪｃである。
【０１０１】
いくつかの実施態様において、二環式ヌクレオシドは、式ＩＩＩ：
【化８】
0006463687.tif 000011
（式中、
Ｂｘはヘテロ環塩基部分であり；
Ｔａ及びＴｂは、各々独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合的付着であり；
Ｚｂは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルキニル、又は置換アシル（Ｃ（＝Ｏ）−）である）
を有する。
【０１０２】
いくつかの実施態様において、二環式ヌクレオシドは、式ＩＶ：
【化９】
0006463687.tif 000012
（式中、
Ｂｘはヘテロ環塩基部分であり；
Ｔａ及びＴｂは、各々独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合的付着であり；
Ｒｄは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルキニルであり；各ｑｂ、ｑｃ及びｑｄは、独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃｅアルケニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、又は置換Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、置換Ｑ−Ｃ６アルコキシ、アシル、置換アシル、Ｃ１−Ｃ６アミノアルキル、又は置換Ｃ１−Ｃ６アミノアルキルである）
を有する。
【０１０３】
いくつかの実施態様において、二環式ヌクレオシドは、式Ｖ：
【化１０】
0006463687.tif 000013
（式中、
Ｂｘはヘテロ環塩基部分であり；
Ｔａ及びＴｂは、各々独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合的付着であり；ｑａ、ｑｂ、ｑｃ及びｑｆは各々独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、ＯＪｊ、ＳＪｊ、ＳＯＪｊ、ＳＯ２Ｊｊ、ＮＪｊＪｋ、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪｊ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｃ（＝Ｏ）Ｊｊ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ又はＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪｊＪｋであるか；又は、ｑｅ及びｑｆ一緒に、＝Ｃ（ｑｇ）（ｑｈ）であり；ｑｇ及びｑｈは、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、又は置換Ｃ１−Ｃ１２アルキルである）
を有する。
【０１０４】
メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡモノマーアデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミン、及びウラシルの合成及び調製が、そのオリゴマー化と共に、並びに、核酸認識特性が記載されている（例えば、Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630を参照されたい）。ＢＮＡ及びその調製は、国際公開公報第９８／３９３５２号及び国際公開公報第９９／１４２２６号にも記載されている。
【０１０５】
メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、及び２’−チオ−ＢＮＡの類似体も調製された（例えば、Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222を参照されたい）。核酸ポリメラーゼの基質としてオリゴデオキシリボヌクレオチド二本鎖を含むロックドヌクレオシド類似体の調製も記載されている（例えば、Wengel et al., 国際公開公報第９９／１４２２６号を参照されたい）。さらに、新規なコンフォメーション的に拘束された高親和性オリゴヌクレオチド類似体である２’−アミノ−ＢＮＡの合成が当技術分野において記載されている（例えばSingh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039を参照されたい）。さらに、２’−アミノ−及び２’−メチルアミノ−ＢＮＡが調製され、相補的ＲＮＡ及びＤＮＡ鎖を有するその二本鎖の熱的安定性が以前に報告されている。
【０１０６】
いくつかの実施態様において、二環式ヌクレオシドは式ＶＩ：
【化１１】
0006463687.tif 000014
（式中、
Ｂｘはヘテロ環塩基部分であり；
Ｔａ及びＴｂは、各々独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合的付着であり；各々ｑｉ、ｑｊ、ｑｋ及びｑｌは各々独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、置換Ｃ２−Ｃ１２アルコキシ、ＯＪｊ、ＳＪｊ、ＳＯＪｊ、ＳＯ２Ｊｊ、ＮＪｊＪｋ、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪｊ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｃ（＝Ｏ）Ｊｊ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ又は（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪｊＪｋであり；ｑｉ及びｑｊ又はｑｌ及びｑｋは一緒に＝Ｃ（ｑｇ）（ｑｈ）であり；ｑｇ及びｑｈは、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、又は置換Ｃ１−Ｃ６アルキルである）
を有する。
【０１０７】
４’−（ＣＨ２）３−２’橋及びアルケニル類似体の橋４’−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−２’を有する１つの炭素環二環式ヌクレオシドが記載されている（例えば、Freier et al, Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429- 4443及びAlbaek et al, J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-77 '40を参照されたい）。炭素環二環式ヌクレオシドの合成及び調製がまた、そのオリゴマー化及び生化学的研究と共に記載されている（例えば、Srivastava et al, J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379を参照されたい）。
【０１０８】
本明細書において使用される「４’−２’二環式ヌクレオシド」又は「４’から２’二環式ヌクレオシド」は、２’炭素原子と４’炭素原子とを接続する橋を含む、フラノース環を含む、二環式ヌクレオシドを指す。
【０１０９】
本明細書において使用される「単環式ヌクレオシド」は、二環式糖部分ではない、修飾された糖部分を含むヌクレオシドを指す。いくつかの実施態様において、ヌクレオシドの糖部分、又は糖部分類似体は、任意の位置において修飾又は置換されていてもよい。
【０１１０】
本明細書において使用される「２’−修飾糖」は、２’位において修飾されたフラノシル糖を意味する。いくつかの実施態様において、このような修飾は、置換及び非置換アルコキシ、置換及び非置換チオアルキル、置換及び非置換アミノアルキル、置換及び非置換アルキル、置換及び非置換アルキル、並びに置換及び非置換アルキニルを含むがこれらに限定されない、ハロゲン化物から選択された置換基を含む。いくつかの実施態様において、２’修飾は、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）,,ＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）,,ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）,,ＯＮＨ２、ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）ＣＨ３、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２を含むがこれらに限定されない置換基から選択され、ｎ及びｍは１〜約１０である。他の２’置換基もまた、Ｃ１−Ｃ１２アルキル；置換アルキル；アルケニル；アルキニル；アルカリール；アラルキル；Ｏ−アルカリール又はＯ−アラルキル；ＳＨ；ＳＣＨ３；ＯＣＮ；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；Ｒ；切断基；レポーター基；インターカレーター；薬物動態特性を改善するための基；及びアンチセンス化合物の薬力学的特性を改善するための基、及び類似の特性を有する他の置換基から選択され得る。いくつかの実施態様において、修飾されたヌクレオシドは２’−ＭＯＥ側鎖を含む（例えば、Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 1 1944-12000を参照されたい）。このような２’−ＭＯＥ置換は、非修飾ヌクレオシド及び他の修飾ヌクレオシド、例えば２’−Ｏ−メチル、Ｏ−プロピル、及びＯ−アミノプロピルと比較して、改善された結合親和性を有するとして記載されている。２−ＭＯＥ置換基を有するオリゴヌクレオチドはまた、インビボにおける使用のための見込みある特徴を有する遺伝子発現アンチセンス阻害剤であることが示された（例えば、Martin, P., He/v. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637;及びAltmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926を参照されたい）。本明細書において使用される「修飾テトラヒドロピランヌクレオシド」又は「修飾ＴＨＰヌクレオシド」は、通常のヌクレオシド中のペントフラノシル残基が６員環のテトラヒドロピラン「糖」で置換されているヌクレオシドを意味する（代用糖）。修飾ＴＨＰヌクレオシドは、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、アニトール核酸（ＡＮＡ）、マニトール核酸（ＭＮＡ）（Leumann, CJ. Bioorg. and Med. Chem. (2002) 10:841-854を参照）、フルオロＨＮＡ（Ｆ−ＨＮＡ）、又は式Ｘ：
【化１２】
0006463687.tif 000015
（式中、式Ｘの各々の少なくとも１つの該テトラヒドロピランヌクレオシド類似体とは独立して、
Ｂｘはヘテロ環塩基部分であり；
Ｔ３及びＴ４は、各々独立して、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に連結しているヌクレオシド間連結基であるか、又はＴ３及びＴ４の一方は、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に連結しているヌクレオシド間連結基であり、Ｔ３及びＴ４の他方はＨ、ヒドロキシル保護基、連結されたコンジュゲート基、又は５’若しくは３’末端基であり；ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６及びｑ７は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、又は置換Ｃ２−Ｃ６アルキニルであり；Ｒ１及びＲ２の一方は水素であり、他方はハロゲン、置換又は非置換アルコキシ、ＮＪ、Ｊ２、ＳＪ、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２及びＣＮから選択され、ＸはＯ、Ｓ、又はＮＪ１であり、各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立して、Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキルである）
を有する化合物として当技術分野において言及されているものを含むがこれらに限定されない。
【０１１１】
いくつかの実施態様において、式Ｘで示される修飾ＴＨＰヌクレオシドが提供され、ｑｍ、ｑｎ、ｑｐ、ｑｒ、ｑｓ、ｑｔ及びｑｕは各々Ｈである。いくつかの実施態様において、ｑｍ、ｑｎ、ｑｐ、ｑｒ、ｑｓ、ｑｔ及びｑｕの少なくとも１つは、Ｈ以外である。いくつかの実施態様において、ｑｍ、ｑｎ、ｑｐ、ｑｒ、ｑｓ、ｑｔ及びｑｕの少なくとも１つはメチルである。いくつかの実施態様において、式Ｘで示されるＴＨＰヌクレオシドが提供され、Ｒ１及びＲ２の一方はＦである。いくつかの実施態様において、Ｒ１はフルオロであり、Ｒ２はＨであり、Ｒ１はメトキシであり、Ｒ２はＨであり、Ｒ１はメトキシエトキシであり、Ｒ２はＨである。
【０１１２】
本明細書において使用される「２’修飾」又は「２’置換」は、２’位にＨ又はＯＨ以外の置換基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。２’修飾ヌクレオシドは、架橋していない２’置換基、例えばアリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１−Ｃ１０アルキル、−ＯＣＦ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）又はＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）を有するヌクレオシドを含むがこれらに限定されず、各Ｒｍ及びＲｎは、独立して、Ｈ又は置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルである。２’修飾ヌクレオシドはさらに、他の修飾を、例えば糖の他の位置に及び／又は核酸塩基に含み得る。
【０１１３】
本明細書において使用される「２’−Ｆ」は、２’位にフルオロ基を含む糖を指す。
【０１１４】
本明細書において使用される「２’−ＯＭｅ」又は「２’−ＯＣＨ３」又は「２’−Ｏ−メチル」は各々、糖環の２’位に−ＯＣＨ３基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。
【０１１５】
本明細書において使用される「オリゴヌクレオチド」は、複数の連結されたヌクレオシドを含む化合物を指す。
【０１１６】
いくつかの実施態様において、１つ以上の複数のヌクレオシドが修飾されている。いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、１つ以上のリボヌクレオシド（ＲＮＡ）及び／又はデオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ）を含む。
【０１１７】
多くの他のビシクロ及びトリシクロ代用糖環系もまた、当技術分野において公知であり、これは、アンチセンス化合物への取り込みのためにヌクレオシドを修飾するために使用され得る（例えば、概説論文：Leumann, J. C, Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854を参照されたい）。このような環系は、活性を増強させるために様々な追加の置換を受け得る。修飾された糖の調製のための方法は当業者には周知である。修飾された糖部分を有するヌクレオシドにおいて、核酸塩基部分（天然、修飾、又はその組合せ）は、適切な核酸標的とのハイブリダイゼーションのために維持される。
【０１１８】
いくつかの実施態様において、アンチセンス化合物は、修飾された糖部分を有する１つ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、修飾された糖部分は２’−ＭＯＥである。いくつかの実施態様において、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオチドは、ギャップマーモチーフで配置されている。いくつかの実施態様において、修飾された糖部分はｃＥｔである。いくつかの実施態様において、ｃＥｔ修飾ヌクレオチドは、ギャップマーモチーフの羽を通して配置されている。
【０１１９】
いくつかの実施態様において、ＢＮＡ（ＬＮＡ）におけるＲ４＊及びＲ２＊は一緒に、Ｒ又はＳ立体配置のいずれかの、ビラジカル−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−（２’Ｏ−メトキシエチル二環式核酸）（Seth at al., 2010, J. Org. Chem）を示す。
【０１２０】
いくつかの実施態様において、ＢＮＡ（ＬＮＡ）におけるＲ４＊及びＲ２＊は一緒に、Ｒ又はＳ立体配置のいずれかの、ビラジカル−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−（２’Ｏ−エチル二環式核酸）（Seth at al., 2010, J. Org. Chem）を示す。
【０１２１】
いくつかの実施態様において、ＢＮＡ（ＬＮＡ）におけるＲ４＊及びＲ２＊は一緒に、ビラジカル−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−を示す。いくつかの実施態様において、Ｒ４＊及びＲ２＊は一緒に、ビラジカル−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−を示す（Seth at al., 2010, J. Org. Chem）。
【０１２２】
いくつかの実施態様において、ＢＮＡ（ＬＮＡ）におけるＲ４＊及びＲ２＊は一緒に、ビラジカル−Ｏ−ＮＲ−ＣＨ３−を示す（Seth at al., 2010, J. Org. Chem）。
【０１２３】
いくつかの実施態様において、ＬＮＡ単位は、以下の群から選択された構造を有する：
【化１３】
0006463687.tif 000016
【０１２４】
オリゴマー中への親和性増強ヌクレオチド類似体、例えばＢＮＡ、（例えば）ＬＮＡ又は２’置換糖などの取り込みは、特異的に結合するオリゴマーのサイズを低減を可能とし、また、非特異的又は異常な結合が起こる前のオリゴマーのサイズに上限を低減させ得る。
【０１２５】
いくつかの実施態様において、該オリゴマーは、少なくとも１つのヌクレオシド類似体を含む。いくつかの実施態様において、該オリゴマーは、少なくとも２つのヌクレオチド類似体を含む。いくつかの実施態様において、該オリゴマーは、３〜８個のヌクレオチド類似体、例えば６又は７個のヌクレオチド類似体を含む。圧倒的に最も好ましい実施態様において、該ヌクレオチド類似体の少なくとも１つはＢＮＡ、例えばロックド核酸（ＬＮＡ）であり；例えば、ヌクレオチド類似体の少なくとも３つ又は少なくとも４つ、又は少なくとも５つ、又は少なくとも６つ、又は少なくとも７つ、又は８つがＢＮＡ、例えばＬＮＡであり得る。いくつかの実施態様において、全てのヌクレオチド類似体がＢＮＡ、例えばＬＮＡであり得る。
【０１２６】
ヌクレオチドのみからなる、好ましいヌクレオチド配列モチーフ又はヌクレオチド配列に言及する場合、その配列によって定義される本発明のオリゴマーは、該配列に存在する１つ以上のヌクレオチドの代わりに対応するヌクレオチド類似体、例えばＢＮＡ単位又は他のヌクレオチド類似体（これは、オリゴマー／標的の二本鎖の二本鎖安定性／Ｔｍを高める）（すなわち、親和性増強ヌクレオチド類似体）を含み得る。
【０１２７】
好ましいヌクレオチド類似体はＬＮＡ、例えばオキシ−ＬＮＡ（例えばβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ及びα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ）、及び／又はアミノ−ＬＮＡ（例えばβ−Ｄ−アミノ−ＬＮＡ及びα−Ｌ−アミノ−ＬＮＡ）及び／又はチオ−ＬＮＡ（例えばβ−Ｄ−チオ−ＬＮＡ及びα−Ｌ−チオ−ＬＮＡ）及び／又はＥＮＡ（例えばβ−Ｄ−ＥＮＡ及びα−Ｌ−ＥＮＡ）である。
【０１２８】
いくつかの実施態様において、本発明のオリゴマー、例えば領域Ａは、ＢＮＡ又はＬＮＡ単位、及び他のヌクレオチド類似体を含み得る。本発明のオリゴマー内に存在するさらなるヌクレオチド類似体は、独立して、例えば：２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、ＢＮＡ単位、例えばＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位、２’−フルオロ−ＡＮＡ単位、ＨＮＡ単位、ＩＮＡ（インターカレーティング核酸、Christensen, 2002. Nucl. Acids. Res. 2002 30: 4918-4925、これは参照により本明細書に組み入れられる）単位及び２’ＭＯＥ単位から選択される。いくつかの実施態様において、本発明のオリゴマー、例えば第一領域、又はその連続ヌクレオチド配列には、上記のタイプのヌクレオチド類似体が唯１つ存在する。
【０１２９】
いくつかの実施態様において、本発明によるオリゴマー（領域Ａ）は、それ故、少なくとも１つのＢＮＡ、例えばロックド核酸（ＬＮＡ）単位、例えば１、２、３、４、５、６、７、若しくは８つのＢＮＡ／ＬＮＡ単位、例えば３〜７又は４〜８つのＢＮＡ／ＬＮＡ単位、又は３、４、５、６、若しくは７つのＢＮＡ／ＬＮＡ単位を含む。いくつかの実施態様において、全てのヌクレオチド類似体はＢＮＡ、例えばＬＮＡである。いくつかの実施態様において、該オリゴマーは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡと、以下のＬＮＡ単位の１つ以上との両方を含む：β−Ｄ若しくはα−Ｌ立体配置又はその組合せのいずれかの、チオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡ、及び／又はＥＮＡ。いくつかの実施態様において、全てのＢＮＡ、例えばＬＮＡ、シトシン単位は５’メチル−シトシンである。本発明のいくつかの実施態様において、該オリゴマー（例えば第一領域及び場合により第二領域）は、ＢＮＡ及びＬＮＡとＤＮＡ単位の両方を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＡ及びＤＮＡ単位の合計は１０〜２５、例えば１０〜２４、好ましくは１０〜２０、例えば１０〜１８、例えば１２〜１６である。本発明のいくつかの実施態様において、オリゴマーのヌクレオチド配列、その第一領域のヌクレオチド配列、例えば連続ヌクレオチド配列は、少なくとも１つのＢＮＡ、例えばＬＮＡからなり、残りのヌクレオチド単位はＤＮＡ単位である。いくつかの実施態様において、該オリゴマー又はその第一領域は、場合によりホスホロチオエートなどの修飾されたヌクレオチド間連結を有する、ＢＮＡのみ、例えばＬＮＡ、ヌクレオチド類似体、及び天然のヌクレオチド（例えばＲＮＡ又はＤＮＡ、最も好ましくはＤＮＡヌクレオチド）を含む。
【０１３０】
リボヌクレアーゼの動員
オリゴヌクレオチドは、リボヌクレアーゼによって媒介されない標的ｍＲＮＡの分解を介して、例えば翻訳の立体障害、又は他の方法によって機能し得ると認識されているが、本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは、リボヌクレアーゼＨなどのエンドリボヌクレアーゼ（リボヌクレアーゼ）を動員することができる。
【０１３１】
該オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、相補的標的ＲＮＡと二本鎖を形成する場合、リボヌクレアーゼを動員することができる、少なくとも６つ、例えば少なくとも７つ連続したヌクレオチド単位、例えば少なくとも８つ又は少なくとも９つ連続したヌクレオチド単位（７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６個連続したヌクレオチドを含む）の領域を含むことが好ましい。リボヌクレアーゼを動員することのできる連続配列は、本明細書に記載のようなギャップマーの脈絡で言及されているような領域Ｂであり得る。いくつかの実施態様において、リボヌクレアーゼを動員することのできる連続配列（例えば領域Ｂ）のサイズは、より大きくあり得、例えば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０ヌクレオチド単位であり得る。
【０１３２】
欧州特許第１２２２３０９号は、リボヌクレアーゼＨ活性を決定するためのインビトロにおける方法を提供し、これを使用して、リボヌクレアーゼＨを動員する能力を決定し得る。オリゴヌクレオチドは、相補的ＲＮＡ標的と共に与えられた場合、同じ塩基配列を有するが、ＤＮＡモノマーしか含有せず、２’置換を全く有さず、オリゴヌクレオチド中の全てのモノマー間にホスホロチオエート連結基を有する、ＤＮＡのみのオリゴヌクレオチドを使用して、欧州特許第１２２２３０９号の実施例９１〜９５によって提供された方法を使用して決定された初期速度の少なくとも１％、例えば少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、又は２０％超の、pmol/l/分で測定された初期速度を有するならば、リボヌクレアーゼＨを動員することができると考えられる。
【０１３３】
いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、相補的ＲＮＡ標的及びリボヌクレアーゼＨと共に与えられた場合、pmol/l/分で測定されたリボヌクレアーゼＨ初期速度が、２’置換を全く有さず、オリゴヌクレオチド中の全てのヌクレオチド間にホスホロチオエート連結基を有する、等価なＤＮＡのみのオリゴヌクレオチドを使用して、欧州特許第１２２２３０９号の実施例９１〜９５によって提供された方法を使用して決定された初期速度の１％未満、例えば５％未満、例えば１０％未満、又は２０％未満であるならば、リボヌクレアーゼＨを実質的に動員することができないと考えられる。
【０１３４】
他の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、相補的ＲＮＡ標的及びリボヌクレアーゼＨと共に与えられた場合、pmol/l/分で測定されたリボヌクレアーゼＨ初期速度が、２’置換を全く有さず、オリゴヌクレオチド中の全てのヌクレオチド間にホスホロチオエート連結基を有する、等価なＤＮＡのみのオリゴヌクレオチドを使用して、欧州特許第１２２２３０９号の実施例９１〜９５によって提供された方法を使用して決定された初期速度の少なくとも２０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも８０％であるならば、リボヌクレアーゼＨを動員することができると考えられる。
【０１３５】
典型的には、相補的標的ＲＮＡと二本鎖を形成する場合、リボヌクレアーゼを動員することのできる連続ヌクレオチド単位を形成するオリゴヌクレオチド領域は、ＲＮＡ標的とＤＮＡ／ＲＮＡ様の二本鎖を形成するヌクレオチド単位からなり、これには、ＤＮＡ単位及びＬＮＡ単位（これはα−Ｌ立体配置であり、特に好ましいのはα−Ｌ−オキシＬＮＡである）の両方が含まれる。
【０１３６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体の両方を含むヌクレオチド配列を含み得、ギャップマー、ヘッドマー（headmer）又はミックスマー（mixmer）の形態であり得る。
【０１３７】
「ヘッドマー」は、領域Ｘ及びそれと連続的である領域Ｙを含むオリゴヌクレオチドとして定義され、領域Ｙの５’先端モノマーは領域Ｘの３’先端モノマーに連結されている。領域Ｘは、リボヌクレアーゼを動員しないヌクレオシド類似体の連続区間を含み、領域Ｙは、リボヌクレアーゼによって認識及び切断可能なＤＮＡモノマー又はヌクレオシド類似体モノマーの連続区間（例えば少なくとも７つ連続したモノマー）を含む。
【０１３８】
「テイルマー（tailmer）」は、領域Ｘ及びそれと連続的である領域Ｙを含むオリゴヌクレオチドとして定義され、領域Ｙの５’先端モノマーは領域Ｘの３’先端モノマーに連結されている。領域Ｘは、リボヌクレアーゼによって認識及び切断可能なＤＮＡモノマー又はヌクレオシド類似体モノマーの連続区間（例えば少なくとも７つ連続したモノマー）を含み、領域Ｘは、リボヌクレアーゼを動員しないヌクレオシド類似体の連続区間を含む。
【０１３９】
「ミックスマー」と呼ばれる他の「キメラ」オリゴヌクレオチドは、（ｉ）リボヌクレアーゼによって認識及び切断可能なＤＮＡモノマー又はヌクレオシド類似体モノマーと、（ｉｉ）リボヌクレアーゼを動員しないヌクレオシド類似体モノマーとの交互の組成からなる。
【０１４０】
いくつかの実施態様において、標的領域に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増強することに加えて、いくつかのヌクレオシド類似体もまた、リボヌクレアーゼ（例えばリボヌクレアーゼＨ）の結合及び切断も媒介する。α−Ｌ−ＬＮＡモノマーは、リボヌクレアーゼＨの活性をある程度まで動員するので、いくつかの実施態様において、α−Ｌ−ＬＮＡモノマーを含有するオリゴヌクレオチドのギャップ領域（例えば本明細書において称される領域Ｙ’）は、リボヌクレアーゼＨによって認識及び切断可能な僅かなモノマーからなり、より高い柔軟性がミックスマー構築物に導入される。
【０１４１】
ギャップマー設計
いくつかの実施態様において、本発明のオリゴマー、例えば第一領域はギャップマーを含むか又はギャップマーである。ギャップマーオリゴマーは、リボヌクレアーゼ、例えばリボヌクレアーゼＨを動員することのできる連続ヌクレオチド区間、例えば少なくとも６又は７つのＤＮＡヌクレオチド領域（本明細書においては領域Ｙ’（Ｙ’）と称される）を含むオリゴマーであり、領域Ｙ’は、リボヌクレアーゼを動員することのできる連続ヌクレオチド区間に対して５’及び３’にある１〜６つのヌクレオチド類似体（これらの領域はそれぞれ領域Ｚ’（Ｚ’）及びＺ’（Ｚ’）と称される）などの、親和性増強ヌクレオチド類似体領域によって５’及び３’の両方がフランキングされている。ギャップマーの例は、国際公開公報第２００４／０４６１６０号、国際公開公報第２００８／１１３８３２号及び国際公開公報第２００７／１４６５１１号に開示されている。
【０１４２】
いくつかの実施態様において、リボヌクレアーゼを動員することのできるモノマーは、ＤＮＡモノマー、α−Ｌ−ＬＮＡモノマー、Ｃ４’アルキル化ＤＮＡモノマー（ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５０３４９及びVester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300を参照されたい、これは参照により本明細書に組み入れられる）及びＵＮＡ（非連結核酸）ヌクレオチド（Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039を参照、これは参照により本明細書に組み入れられる）からなる群より選択される。ＵＮＡはアンロックド核酸であり、典型的にはリボースのＣ２−Ｃ３のＣ−Ｃ結合が除去され、アンロックド「糖」残基が形成されている。好ましくはギャップマーは、式（５’から３’へ）Ｚ’−Ｙ’−Ｚ’で示される（ポリ）ヌクレオチド配列を含み、領域Ｚ’（Ｚ’）（５’領域）は、少なくとも１つのヌクレオチド類似体、例えば少なくとも１つのＢＮＡ（例えばＬＮＡ）単位、例えば１〜６つのヌクレオチド類似体、例えばＢＮＡ（例えばＬＮＡ）単位からなる又は含み；領域Ｙ’（Ｙ’）は、リボヌクレアーゼを動員することのできる（相補的ＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡ標的と二本鎖が形成される場合）少なくとも５つ連続したヌクレオチド、例えばＤＮＡヌクレオチドからなる又は含み；領域Ｚ’（Ｚ’）（３’領域）は、少なくとも１つのヌクレオチド類似体、例えば少なくとも１つのＢＮＡ（例えばＬＮＡ単位）、例えば１〜６つのヌクレオチド類似体、例えばＢＮＡ（例えばＬＮＡ）単位からなる又は含む。
【０１４３】
いくつかの実施態様において、領域Ｚ’は、１、２、３、４、５、又は６つのヌクレオチド類似体、例えばＢＮＡ（例えばＬＮＡ）単位、例えば２〜５つのヌクレオチド類似体、例えば２〜５つのＬＮＡ単位、例えば３又は４つのヌクレオチド類似体、例えば３又は４つのＬＮＡ単位からなり；及び／又は、領域Ｚは、１、２、３、４、５又は６つのヌクレオチド類似体、例えばＢＮＡ（例えばＬＮＡ）単位、例えば２〜５つのヌクレオチド類似体、例えば２〜５つのＢＮＡ（例えばＬＮＡ単位）、例えば３又は４つのヌクレオチド類似体、例えば３又は４つのＢＮＡ（例えばＬＮＡ）単位からなる。
【０１４４】
いくつかの実施態様において、Ｙ’は、リボヌクレアーゼを動員することのできる５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２個の連続ヌクレオチド、又は、リボヌクレアーゼを動員することのできる６〜１０、又は７〜９、例えば８つの連続ヌクレオチドからなる又は含む。いくつかの実施態様において、領域Ｙ’は、少なくとも１つのＤＮＡヌクレオチド単位、例えば１〜１２個のＤＮＡ単位、好ましくは４〜１２個のＤＮＡ単位、より好ましくは６〜１０個のＤＮＡ単位、例えば７〜１０個のＤＮＡ単位、最も好ましくは８、９又は１０個のＤＮＡ単位からなる又は含む。
【０１４５】
いくつかの実施態様において、領域Ｚ’は、３又は４つのヌクレオチド類似体、例えばＢＮＡ（例えばＬＮＡ）からなり、領域Ｚ’は７、８、９又は１０個のＤＮＡ単位からなり、領域Ｚ’は３又は４つのヌクレオチド類似体、例えばＢＮＡ（例えばＬＮＡ）からなる。このような設計は（Ｚ’−Ｙ’−Ｚ’） ３−１０−３、３−１０−４、４−１０−３、３−９−３、３−９−４、４−９−３、３−８−３、３−８−４、４−８−３、３−７−３、３−７−４、４−７−３を含む。
【０１４６】
さらなるギャップマー設計が国際公開公報第２００４／０４６１６０号に開示され、これは参照により本明細書に組み入れられる。参照により本明細書に組み入れられた米国仮出願第６０／９７７，４０９号の優先権を主張する国際公開公報第２００８／１１３８３２号は、「ショートマー（shortmer）」ギャップマーオリゴマーに言及する。いくつかの実施態様において、ここに提示されたオリゴマーはこのようなショートマーギャップマーであり得る。
【０１４７】
いくつかの実施態様において、該オリゴマー、例えば領域Ｚ’は、全部で１０、１１、１２、１３又は１４つのヌクレオチド単位の連続ヌクレオチド配列からなり、連続ヌクレオチド配列は、式（５’−３’）Ｚ’−Ｙ’−Ｚ’を含むかまたは式（５’−３’）Ｚ’−Ｙ’−Ｚ’で示され、Ｚ’は１、２又は３つのヌクレオチド類似体単位、例えばＢＮＡ（例えばＬＮＡ）単位からなり、Ｙ’は相補的ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ標的）と二本鎖が形成される場合にリボヌクレアーゼを動員することのできる７、８又は９つの連続ヌクレオチド単位からなり；Ｚ’は、１、２又は３つのヌクレオチド類似体単位、例えばＢＮＡ（例えばＬＮＡ）単位からなる。
【０１４８】
いくつかの実施態様において、Ｚ’は、１つのＢＮＡ（例えばＬＮＡ）単位からなる。いくつかの実施態様において、Ｚ’は２つのＢＮＡ（例えばＬＮＡ）単位からなる。いくつかの実施態様において、Ｚ’は、３つのＢＮＡ（例えばＬＮＡ）単位からなる。いくつかの実施態様において、Ｚ’は１つのＢＮＡ（例えばＬＮＡ）単位からなる。いくつかの実施態様において、Ｚ’は２つのＢＮＡ（例えばＬＮＡ）単位からなる。いくつかの実施態様において、Ｚ’は３つのＢＮＡ（例えばＬＮＡ）単位からなる。いくつかの実施態様において、Ｙ’は７つのヌクレオチド単位からなる。いくつかの実施態様において、Ｙ’は８つのヌクレオチド単位からなる。いくつかの実施態様において、Ｙ’は９つのヌクレオチド単位からなる。特定の実施態様において、領域Ｙ’は１０個のヌクレオシドモノマーからなる。特定の実施態様において、領域Ｙ’は１〜１０個のＤＮＡモノマーからなる又は含む。いくつかの実施態様において、Ｙ’は１〜９個のＤＮＡ単位、例えば２、３、４、５、６、７、８又は９個のＤＮＡ単位を含む。いくつかの実施態様において、Ｙ’はＤＮＡ単位からなる。いくつかの実施態様において、Ｙ’はα−Ｌ立体配置である少なくとも１つのＢＮＡ単位、例えばα−Ｌ立体配置の２、３、４、５、６、７、８又は９個のＬＮＡ単位を含む。いくつかの実施態様において、Ｙ’は少なくとも１つのα−Ｌ−オキシＢＮＡ／ＬＮＡ単位を含むか、又はα−Ｌ立体配置の全てのＬＮＡ単位はα−Ｌ−オキシＬＮＡ単位である。いくつかの実施態様において、Ｚ’−Ｙ’−Ｚ’に存在するヌクレオチドの数は、（ヌクレオチド類似体単位−領域Ｙ’−ヌクレオチド類似体単位）１−８−１、１−８−２、２−８−１、２−８−２、３−８−３、２−８−３、３−８−２、４−８−１、４−８−２、１−８−４、２−８−４、又は１−９−１、１−９−２、２−９−１、２−９−２、２−９−３、３−９−２、１−９−３、３−９−１、４−９−１、１−９−４、又は１−１０−１、１−１０−２、２−１０−１、２−１０−２、１−１０−３、３−１０−１からなる群より選択される。いくつかの実施態様において、Ｚ’−Ｙ’−Ｚ’に存在するヌクレオチドの数は、２−７−１、１−７−２、２−７−２、３−７−３、２−７−３、３−７−２、３−７−４及び４−７−３からなる群より選択される。特定の実施態様において、領域Ｚ’及びＹ’の各々は、３つのＢＮＡ（例えばＬＮＡ）モノマーからなり、領域Ｙ’は８又は９又は１０個のヌクレオシドモノマー、好ましくはＤＮＡモノマーからなる。いくつかの実施態様において、Ｚ’及びＺ’の両方は、各々２つのＢＮＡ（例えばＬＮＡ）単位からなり、Ｙ’は８又は９個のヌクレオチド単位、好ましくはＤＮＡ単位からなる。様々な実施態様において、他のギャップマー設計は、領域Ｚ’及び/又はＺ’が３、４、５又は６個のヌクレオシド類似体からなるもの、例えば２’−Ｏ−メトキシエチル−リボース糖（２’−ＭＯＥ）を含有するモノマー又は２’−フルオロ−デオキシリボース糖を含有するモノマーを含み、領域Ｙ’は、８、９、１０、１１又は１２個のヌクレオシド、例えばＤＮＡモノマーからなり、領域Ｚ’−Ｙ’−Ｚ’は３−９−３、３−１０−���、５−１０−５、又は４−１２−４モノマーを有する。さらなるギャップマー設計が、国際公開公報第２００７／１４６５１１Ａ２号に開示され、これは参照により本明細書に組み入れられる。
【０１４９】
ヌクレオチド間連結
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのモノマーを連結基を介して一緒に結合させる。適切には、各モノマーを連結基を介して３’隣接モノマーに連結させる。当業者は、本発明の脈絡において、オリゴヌクレオチド末端における５’モノマーは、５’末端基を含んでいても含んでいなくてもよいが、５’連結基を含まないことを理解しているだろう。
【０１５０】
「連結基」及び「ヌクレオチド間連結」という語句は、２つのヌクレオチドを互いに共有結合することのできる基を意味することを意図する。具体的かつ好ましい例としては、リン酸基及びホスホロチオエート基が挙げられる。特定の実施態様において、本明細書において開示されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチド間連結においてホスホロチオエートヌクレオチド間連結を有する（例えば配列番号２１、２２、２３、２４及び２５）。本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、連結基を介して一緒に結合される。適切には各ヌクレオチドは、連結基を介して３’隣接ヌクレオチドに連結される。
【０１５１】
適切なヌクレオチド間連結としては、国際出願国際公開公報第２００７／０３１０９１号内に列挙されたもの、例えば、国際公開公報第２００７／０３１０９１号の３４頁の第一段落に列挙されたヌクレオチド間連結が挙げられる。
【０１５２】
いくつかの実施態様において、ヌクレオチド間連結を、その通常のホスホジエステルから、よりヌクレアーゼによる攻撃に抵抗性であるもの、例えばホスホロチオエート又はボラノホスフェート（これら２つは、リボヌクレアーゼＨによって切断可能であり、また、標的遺伝子の発現を低減させる際のそのアンチセンス阻害経路を可能とする）へと修飾することが好ましい。
【０１５３】
本明細書において提供される適切な硫黄（Ｓ）含有ヌクレオチド間連結が好ましくあり得る。ホスホロチオエートヌクレオチド間連結もまた、特にギャップマーのギャップ領域（Ｙ’）にとって好ましい。ホスホロチオエート連結はまた、フランキング領域（Ｚ’及びＺ’）にも使用され得る。
【０１５４】
しかしながら、領域Ｚ’、Ｙ’及びＺ’は、ホスホロチオエート以外のヌクレオチド間連結、例えばホスホジエステル連結を含み得、特に、例えばヌクレオチド類似体の使用が領域Ｚ’及びＺ’内のヌクレオチド間連結を、エンドヌクレアーゼによる分解から保護する場合、例えば領域Ｚ’及びＺ’がＬＮＡヌクレオチドを含む場合に含み得る。
【０１５５】
オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド間連結は、標的ＲＮＡのリボヌクレアーゼＨによる切断を可能とするように、ホスホジエステル、ホスホロチオエート又はボラノホスフェートであり得る。ホスホロチオエートが、向上したヌクレアーゼ抵抗性及び他の理由、例えば製造のし易さのために好ましい。
【０１５６】
本発明のオリゴヌクレオチドの１つの態様において、ヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体は、互いにホスホロチオエート基によって連結されている。
【０１５７】
ホスホジエステル連結、例えば１又は２つの連結を、別のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに、特にヌクレオチド類似体単位（典型的にはＺ’及び又はＺ’における）の間又は隣に包含させることにより、オリゴヌクレオチドのバイオアベイラビリティ及び／又は体内分布を改変することができると認識されている（国際出願国際公開公報第２００８／０５３３１４号を参照）。
【０１５８】
いくつかの実施態様において、上記に参照した実施態様のように、ここでは適切ではあるが具体的には指摘されていないが、全ての残りの連結基は、ホスホジエステル又はホスホロチオエート、又はその混成体のいずれかである。いくつかの実施態様において、全てのヌクレオチド間連結基はホスホロチオエートである。
【０１５９】
本明細書に提供されているような、特定のギャップマーオリゴヌクレオチド配列に言及する場合、様々な実施態様において、連結がホスホロチオエート連結である場合、本明細書に開示されているような代替的な連結が使用され得、例えばリン酸（ホスホジエステル）連結が、特にヌクレオチド類似体、例えばＬＮＡ単位間の連結に使用され得ると理解される。同様に、本明細書に提供されているような、特定のギャップマーオリゴヌクレオチド配列に言及する場合、Ｃ残基が５’メチル修飾シトシンと注釈を付けられる場合、様々な実施態様において、オリゴヌクレオチドに存在する１つ以上のＣは非修飾Ｃ残基であり得る。
【０１６０】
オリゴヌクレオチド
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号９、１０、１１、１２、１３及び１４からなる群より選択された配列を含み得る。特定の実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５からなる群より選択された配列を含み得る。いくつかの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、表１又は４に同定された配列からなる群より選択され得る。
【０１６１】
コンジュゲート
本発明の脈絡において、「コンジュゲート」という用語は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの、１つ以上の非ヌクレオチド、又は非ポリヌクレオチド部分への共有結合的な付着によって形成された異種分子を示すことを意図する。非ヌクレオチド又は非ポリヌクレオチド部分の例としては、巨大分子物質、例えばタンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー、又はその組合せが挙げられる。典型的には、タンパク質は標的タンパク質に対する抗体であり得る。典型的なポリマーはポリエチレングリコールであり得る。
【０１６２】
それ故、様々な実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、典型的には連続ヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド領域と、さらなる非ヌクレオチド領域との両方を含み得る。連続ヌクレオチド配列からなる本発明のオリゴヌクレオチドに言及する場合、該化合物は非ヌクレオチド成分、例えばコンジュゲート成分を含み得る。
【０１６３】
本発明の様々な実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、例えばオリゴヌクレオチドの細胞への取り込みを増加させるために使用され得るリガンド／コンジュゲートに連結されている。国際出願国際公開公報第２００７／０３１０９１号は、適切なリガンド及びコンジュゲートを提供する。
【０１６４】
本発明はまた、本明細書に記載のような本発明に記載の化合物と、該化合物に共有結合的に付着した少なくとも１つの非ヌクレオチド又は非ポリヌクレオチド部分とを含むコンジュゲートを提供する。それ故、本発明の化合物が、本明細書において開示されているような特定の核酸又はヌクレオチド配列からなる様々な実施態様において、該化合物はまた、該化合物に共有結合的に付着した少なくとも１つの非ヌクレオチド又は非ポリヌクレオチド部分（例えば１つ以上のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含まない）を含み得る。
【０１６５】
コンジュゲーションは、本発明のオリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布又は細胞への取り込みを増強させ得る。このような部分としては、抗体、ポリペプチド、脂質部分、例えばコレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えばヘキシル−ｓ−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオール又はウンデシル残基、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２−ジ−ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−ｈ−ホスホネート、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミン又はヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１６６】
本発明のオリゴヌクレオチドをまた、活性薬物、例えばアスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤又は抗生物質にコンジュゲートさせ得る。
【０１６７】
特定の実施態様において、コンジュゲート部分はステロール、例えばコレステロールである。
【０１６８】
様々な実施態様において、コンジュゲート部分は、正に荷電したポリマー、例えば約１〜５０、例えば２〜２０、例えば３〜１０のアミノ酸残基長の、例えば正に荷電したペプチド、及び／又はポリアルキレンオキシド、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリプロピレングリコール（例えば国際出願国際公開公報第２００８／０３４１２３号参照）を含む又はからなる。適切には正に荷電したポリマー、例えばポリアルキレンオキシドを、国際公開公報第２００８／０３４１２３号に記載の遊離可能なリンカーなどのリンカーを介して、本発明のオリゴヌクレオチドに付着させ得る。
【０１６９】
例えば、以下のコンジュゲート部分を本発明のコンジュゲートに使用し得る：
【化１４】
0006463687.tif 000017
【０１７０】
いくつかの実施態様において、オリゴマー化合物は、アンチセンスオリゴマー、例えばＬＮＡアンチセンスオリゴマー（これは本明細書において領域Ａと称され得る）、場合により切断可能なリンカー（領域Ｂ）、及び炭水化物コンジュゲート（これは領域Ｃと称され得る）を含む。いくつかの実施態様において、領域Ｂは、リン酸ヌクレオチドリンカーであり得る。いくつかの実施態様において、領域Ｂは１〜６つのヌクレオチドを含み、Ａ領域の５’又は３’ヌクレオチドに共有結合的に、例えばホスホジエステル連結などのヌクレオチド間連結基を介して連結されている。
【０１７１】
いくつかの実施態様において、炭水化物部分は、鎖状炭水化物ポリマーではない。しかしながら、炭水化物部分は多価であり得、例えば、２、３、４又は４つの同一又は同一ではない炭水化物部分が、オリゴマーに、場合によりリンカー又はリンカー群を介して共有結合的に接続され得る。いくつかの実施態様において、本発明は、本発明のオリゴマーと炭水化物コンジュゲート部分とを含むコンジュゲートを提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、本発明のオリゴマーと、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分コンジュゲート部分、例えばＧａｌＮＡｃ部分（これはさらなる領域の一部を形成し得る）（領域Ｃと称される）とを含むコンジュゲートを提供する。
【０１７２】
活性化オリゴヌクレオチド
本明細書において使用される「活性化オリゴヌクレオチド」という用語は、オリゴヌクレオチドが１つ以上のコンジュゲート部分（すなわちそれ自体核酸又はモノマーではない部分）に共有結合的に連結して本明細書に記載のコンジュゲートを形成することを許容する、少なくとも１つの機能的部分に共有結合的に連結（すなわち官能基化）された本発明のオリゴヌクレオチドを指す。典型的には、機能的部分は、アデニン塩基の３’−ヒドロキシル基又は環外ＮＨ２基を介して、オリゴヌクレオチドに共有結合することのできる化学基、好ましくは親水性であるスペーサー、及びコンジュゲート部分（例えばアミノ、スルフヒドリル、又はヒドロキシル基）に結合することのできる末端基を含む。いくつかの実施態様において、この末端基は保護されていない（例えばＮＨ２基）。他の実施態様において、末端基は、例えば、Theodora W Greene and Peter G M Wuts, 3rd edition (John Wiley & Sons, 1999)による「Protective Groups in Organic Synthesis」に記載の基などの任意の適切な保護基によって保護される。適切なヒドロキシル保護基の例としては、エステル、例えば酢酸エステル、アラルキル基、例えばベンジル、ジフェニルメチル、又はトリフェニルメチル、及びテトラヒドロピラニルが挙げられる。適切なアミノ保護基の例としては、ベンジル、α−メチルベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、及びアシル基、例えばトリクロロアセチル又はトリフルオロアセチルが挙げられる。いくつかの実施態様において、機能的部分は自己切断性である。他の実施態様において、機能的部分は生分解性である（例えば米国特許第７，０８７，２２９号参照）。
【０１７３】
いくつかの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、５’末端が官能基化され、オリゴヌクレオチドの５’末端へのコンジュゲート部分の共有結合的な付着が可能となっている。他の実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、３’末端において官能基化されていてもよい。さらに他の実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、骨格に沿って又はヘテロ環塩基部分上で官能基化されていてもよい。さらに他の実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、５’末端、３’末端、骨格、及び塩基から独立して選択された１つを超える位置において官能基化されていてもよい。
【０１７４】
いくつかの実施態様において、本発明の活性化オリゴヌクレオチドは、合成中に機能的部分に共有結合的に付着した１つ以上のモノマーを取り込むことによって合成される。他の実施態様において、本発明の活性化オリゴヌクレオチドは、官能基化されていないモノマーを用いて合成され、該オリゴヌクレオチドは、合成完了時に官能基化される。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、アミノアルキルリンカーを含有する立体障害を有するエステルを用いて官能基化され、アルキル部分は式（ＣＨ２）ｗを有し、ｗは１〜１０の範囲の整数、好ましくは約６であり、アルキルアミノ基のアルキル部分は直鎖又は分岐鎖であり得、官能基はエステル基（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｗＮＨ）を介して該オリゴヌクレオチドに付着している。
【０１７５】
他の実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、（ＣＨ２）ｗ−スルフヒドリル（ＳＨ）リンカーを含有する立体障害を有するエステルを用いて官能基化され、ｗは１〜１０の範囲の整数、好ましくは約６であり、アルキルアミノ基のアルキル部分は直鎖又は分岐鎖であり、官能基はエステル基（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｗＳＨ）を介して該オリゴヌクレオチドに付着している。
【０１７６】
いくつかの実施態様において、スルフヒドリル活性化オリゴヌクレオチドは、ポリエチレングリコール又はペプチドなどのポリマー部分とコンジュゲートしている（ジスルフィド結合の形成を介して）。
【０１７７】
上記のような立体障害を有するエステルを含有する活性化オリゴヌクレオチドは、当技術分野において公知の任意の方法によって、特に国際出願国際公開公報第２００８／０３４１２２号及びその中の実施例に開示された方法によって合成され得る。
【０１７８】
さらに他の実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、米国特許第４，９６２，０２９号及び第４，９１４，２１０号に実質的に記載された官能基化試薬（すなわち、保護された又は保護されていないスルフヒドリル、アミノ又はヒドロキシル基を含む、一方の末端のホスホルアミダイトが親水性スペーサーを通して逆の末端に連結された、実質的に鎖状の試薬）を用いて、該オリゴヌクレオチドにスルフヒドリル、アミノ又はヒドロキシル基を導入することによって官能基化される。このような試薬は、主に、該オリゴヌクレオチドのヒドロキシル基と反応する。いくつかの実施態様において、このような活性化オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドの５’−ヒドロキシル基に結合した官能基化試薬を有する。他の実施態様において、活性化オリゴヌクレオチドは、３’−ヒドロキシル基に結合した官能基化試薬を有する。さらに他の実施態様において、本発明の活性化オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドの骨格上のヒドロキシル基に結合した官能基化試薬を有する。またさらなる実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、米国特許第４，９６２，０２９号及び第４，９１４，２１０号に記載の１つを超える官能基化試薬を用いて官能基化される。このような官能基化試薬を合成し、それらをモノマー又はオリゴヌクレオチドに取り込む方法は、米国特許第４，９６２，０２９号及び第４，９１４，２１０号に開示されている。
【０１７９】
いくつかの実施態様において、固相結合オリゴヌクレオチドの５’末端は、ジエニルホスホルアミダイト誘導体を用いて官能基化され、続いて、脱保護されたオリゴヌクレオチドを、例えばアミノ酸又はペプチドと、ディールスアルダー環化付加反応を介してコンジュゲートする。
【０１８０】
様々な実施態様において、２’−糖置換、例えば２’−カルバメート置換糖、又は２’−（Ｏ−ペンチル−Ｎ−フタルイミド）−デオキシリボース糖を含有するモノマーの、該オリゴヌクレオチドへの取り込みは、オリゴヌクレオチドの糖へのコンジュゲート部分の共有結合的な付着を促進する。他の実施態様において、１つ以上のモノマーの２’位にアミノ含有リンカーを有するオリゴヌクレオチドを、例えば５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（ｅ−フタルイミジルアミノペンチル）−２’−デオキシアデノシン−３’−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルーシアノエトキシホスホルアミダイトなどの試薬を使用して調製される（例えば、Manoharan, et al., Tetrahedron Letters, (1991) 34:7171参照）。
【０１８１】
またさらなる実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、Ｎ６プリンアミノ基上、グアニンの環外Ｎ２上、又はシトシンのＮ４又は５位上を含む、核酸塩基上にアミン含有官能基部分を有し得る。様々な実施態様において、このような官能基化は、オリゴヌクレオチド合成ですでに官能基化された市販の試薬を使用することによって達成され得る。
【０１８２】
いくつかの官能基部分は市販されており、例えば、ヘテロ二官能基及びホモ二官能基連結部分は、Pierce Co. (Rockford, Ill.)から入手できる。他の市販されている連結基は、５’−アミノ−モディファイアＣ６及び３’−アミノ−モディファイア試薬であり、どちらもGlen Research Corporation (Sterling, Va.)から入手できる。５’−アミノ−モディファイアＣ６は、アミノリンク−２としてABI (Applied Biosystems Inc., Foster City, Calif.)からも入手でき、３’−アミノ−モディファイアはClontech Laboratories Inc. (Palo Alto, Calif.)からも入手できる。
【０１８３】
医薬組成物
本発明のオリゴヌクレオチドは、医薬製剤及び組成物に使用され得る。適切には、このような組成物は、薬学的に許容される溶媒、例えば水又は食塩水、希釈剤、担体、塩又は補助剤を含む。ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２は、適切かつ好ましい薬学的に許容される希釈剤、担体、溶媒、及び補助剤を提供する。適切な投与量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療剤との組合せ、プロドラッグ製剤も、ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２に提供される。
【０１８４】
本発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物及び製剤を含む。本発明の医薬組成物は、局所的処置若しくは全身的処置が望まれるかどうか、及び処置する領域に依存して、多くの方法で投与され得る。投与は、局所（眼内及び粘膜（膣及び直腸への送達を含む）、肺内（例えば粉末又はエアゾール（例えば噴霧器による）の吸収又はガス注入による）；気管内、鼻腔内、上皮、及び経皮を含む）、経口、又は非経口であり得る。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、若しくは筋肉内への注射若しくは点滴；又は、頭蓋内（例えばくも膜下腔内又は脳室内投与）を含む。少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル置換又は修飾を有するオリゴヌクレオチドが経口投与のために特に有用であり得る。
【０１８５】
適用
本発明のオリゴヌクレオチドは、研究試薬として、例えば、診断、治療及び予防のために使用され得る。研究では、このようなオリゴヌクレオチドは、細胞及び実験動物におけるＦＧＦＲ３の合成を特異的に阻害するために使用され得（典型的には、ｍＲＮＡを分解又は阻害し、これによりタンパク質の形成を妨げることによって）、これにより、標的の機能的分析、又は、治療的介入の標的としてのその有用性の評価を容易にし得る。
【０１８６】
診断において該オリゴヌクレオチドは、ノザンブロット、インサイツハイブリダイゼーション又は類似の技術による細胞及び組織におけるＦＧＦＲ３の発現を検出及び定量するために使用され得る。
【０１８７】
治療のために、ＦＧＦＲ３の発現を調節することによって処置され得る、疾病又は疾患を有することが疑われる、動物又はヒトは、本発明に従ってオリゴヌクレオチドを投与することによって処置される。さらに、治療有効量又は予防有効量の１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチド又は組成物を投与することによって、ＦＧＦＲ３の発現に関連した、疾病又は容態を有することが疑われる又は有しがちである、哺乳動物を処置する、例えばヒトを処置する方法が提供される。本発明によるオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、又は医薬組成物は、典型的には有効量で投与される。
【０１８８】
本発明はまた、本明細書に言及される疾患の処置のための医薬品の製造のために記載されているような本発明の化合物若しくはコンジュゲートの使用、又は、本明細書に言及される疾患を処置する方法を提供する。
【０１８９】
本発明はまた、本明細書に言及される疾患を処置するための方法を提供し、該方法は、本明細書に記載された本発明による化合物、及び／又は本発明によるコンジュゲート、及び／又は本発明による医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む。
【０１９０】
医療適用
本発明によるオリゴヌクレオチド及び他の組成物は、ＦＧＦＲ３の過剰発現又は突然変異型のＦＧＦＲ３の発現に関連した容態（例えば軟骨無形成症）の処置のために使用され得る。本発明はさらに、本明細書に言及される疾病、疾患又は容態の処置のための医薬品の製造における本発明の化合物の使用を提供する。
【０１９１】
一般的に言って、本発明の１つの態様は、ＦＧＦＲ３の異常なレベル又は異常な発現（例えば突然変異したＧ３８０Ｒ ＦＧＦＲ３の発現に関連している）に関連した容態を患っている又は罹り易い哺乳動物を処置する方法に関し、これは、１つ以上のＬＮＡ単位を含むＦＧＦＲ３の突然変異した又は天然の変異体の遺伝子産物（例えば、突然変異したＦＧＦＲ３、例えばＧ３８０Ｒ突然変異をコードするｍＲＮＡ）に標的化されたオリゴヌクレオチドの治療有効量を哺乳動物に投与することを含む。本明細書に言及される疾病又は疾患は、いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ３遺伝子の突然変異、又はそのタンパク質産物がＦＧＦＲ３と関連する又はそれと相互作用する遺伝子の突然変異に関連し得る。それ故、いくつかの実施態様において、標的ｍＲＮＡは、突然変異型のＦＧＦＲ３ ｍＲＮＡである。
【０１９２】
本発明の１つの態様は、本明細書に言及される疾病、疾患又は容態の処置のための医薬品の調製のためのオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートの使用に関する。
【０１９３】
本発明の方法は、好ましくは、異常なレベルのＦＧＦＲ３によって引き起こされる疾病に対する処置又は予防のために使用される。別の言葉で言えば、いくつかの実施態様において、本発明はさらに、異常なレベルのＦＧＦＲ３を処置するための方法に関し、該方法は、本発明のオリゴヌクレオチド、又は本発明のコンジュゲート、又は本発明の医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む。
【０１９４】
本発明はまた、医薬品として使用するための本明細書に定義されたようなオリゴヌクレオチド、組成物又はコンジュゲートに関する。
【０１９５】
本発明はさらに、異常なレベルのＦＧＦＲ３又は突然変異型のＦＧＦＲ３（例えば対立遺伝子変異体、例えば本明細書に言及された疾病の１つに関連したもの）の発現の処置のための医薬品の製造のための本明細書に定義されたような化合物、組成物又はコンジュゲートの使用に関する。
【０１９６】
さらに、本発明は、本明細書に言及されるような疾病又は容態を患っている被験体を処置する方法に関する。
【０１９７】
処置の必要な患者は、疾病又は疾患を患っている又は患いそうである患者である。
【０１９８】
いくつかの実施態様において、本明細書において使用される「処置」という用語は、既存の疾病（例えば本明細書において言及されているような疾病又は疾患）の処置、又は、疾病の防止（すなわち予防）の両方を指す。それ故、本明細書に言及される処置は、いくつかの実施態様において、予防的であり得ると認識される。
【０１９９】
本発明のアンチセンス化合物は、診断、治療、予防のために、並びに研究試薬及びキットとして使用され得る。治療のために、ＦＧＦＲ３の発現を調節することによって処置され得る疾病又は疾患を有することが疑われる動物、好ましくはヒトを、本発明によるオリゴヌクレオチドを投与することによって処置する。本発明のオリゴヌクレオチドは、有効量のオリゴヌクレオチドを適切な薬学的に許容される希釈剤又は担体に加えることによって医薬組成物中に使用され得る。
【０２００】
本発明のアンチセンス化合物は、研究及び診断に有用である。なぜなら、これらの化合物はＦＧＦＲ３をコードする核酸にハイブリダイズし、この事実を活用してサンドイッチアッセイ及び他のアッセイを容易に構築することを可能とするからである。本発明のオリゴヌクレオチドと、ＦＧＦＲ３をコードする核酸とのハイブリダイゼーションは、当技術分野において公知の手段によって検出され得る。適切な手段としては、酵素とオリゴヌクレオチドとのコンジュゲーション、オリゴヌクレオチドの放射標識、又は任意の他の適切な検出手段が挙げられ得る。試料中のＦＧＦＲ３タンパク質又はｍＲＮＡのレベルを検出するためのこのような検出手段を使用したキットも調製され得る。
【０２０１】
本発明の特定の化合物、組成物及び方法は、特定の実施態様に応じて特異的に記載されているが、以下の実施例は本発明の化合物を説明するためだけに役立ち、これを制限するものではない。本発明の背景を説明するために及びその実践に関する追加の詳細を提供するために本明細書に参照された刊行物、参考資料、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号などの各々は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２０２】
ここで明細書及びクレームに使用される「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は、明瞭にそうではないと特記されない限り、複数の指示対象を含むと理解されるべきである。１群の１つ以上のメンバー間に「又は」を含むクレーム又は明細書は、そうではないと特記されない限り又はさもなくば内容から明白でない限り、群のメンバーの１つ、１つ超、又は全部が、所与の産物又はプロセスに存在、それに使用される、又はさもなくばそれに関連しているならば満たされていると考えられる。本発明は、群の正確に１つのメンバーが、所与の産物又はプロセスに存在、それに使用、又はさもなくば関連している実施態様を含む。本発明はまた、群のメンバーの１つ超、又は全部が、所与の産物又はプロセスに存在、それに使用、又はさもなくば関連している実施態様を含む。さらに、本発明は、列挙されたクレームの１つ以上からの１つ以上の制約、要素、条項、記述用語などが、特記されない限り又は矛盾若しくは不一致が生じると当業者に明白でない限り、同じ基本クレームとは独立した別のクレームに（又は関連した任意の他のクレームとして）導入された、全ての変化形、組合せ、及び並べ替えを包含すると理解される。要素がリストとして、例えばマーカッシュ群又は他の形式に提示されている場合、要素の各々の亜群も開示され、任意の要素（群）は群から除去され得ることが理解される。一般的に、本発明又は本発明の態様は特定の要素、特徴などを含むと言われている場合、本発明の特定の実施態様又は本発明の態様は、このような要素、特徴などからなるか、又は実質的にそれからなることが理解されるべきである。単純化の目的で、そうした実施態様は、あらゆる場合において、そのように多くの用語で本明細書において具体的に示されていない。また、本発明の任意の実施態様又は態様は、具体的な排除が明細書に列挙されているかどうかに関わらず、クレームから明瞭に排除され得ることが理解されるべきである。
【０２０３】
本発明の実施態様
１．配列番号４を含む核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ３の発現を調節する。
２．該オリゴヌクレオチドは、配列番号４のヌクレオチド１３９４位を含む配列番号４の領域にハイブリダイズする、実施態様１のオリゴヌクレオチド。
３．該オリゴヌクレオチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５からなる群より選択される、実施態様１のオリゴヌクレオチド。
４．該オリゴヌクレオチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４からなる群より選択されたオリゴヌクレオチドに対して少なくとも８０％同一である、実施態様１のオリゴヌクレオチド。
５．該オリゴヌクレオチドは１４ヌクレオチド長である、実施態様１のオリゴヌクレオチド。
６．該オリゴヌクレオチドは少なくとも１５ヌクレオチド長である、実施態様１のオリゴヌクレオチド。
７．該オリゴヌクレオチドは少なくとも１６ヌクレオチド長である、実施態様１のオリゴヌクレオチド。
８．該オリゴヌクレオチドは少なくとも１８ヌクレオチド長である、実施態様１のオリゴヌクレオチド。
９．該オリゴヌクレオチドは、Ｇ３８０Ｒ突然変異をコードする配列番号４の領域に特異的にハイブリダイズする、実施態様１のオリゴヌクレオチド。
１０．該オリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ３の発現を少なくとも約５０％低減させる、実施態様１のオリゴヌクレオチド。
１１．該オリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ３の発現を少なくとも約７５％低減させる、実施態様１のオリゴヌクレオチド。
１２．該オリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ３の発現を少なくとも約９０％低減させる、実施態様１のオリゴヌクレオチド。
１３．該オリゴヌクレオチドは突然変異型のＦＧＦＲ３の発現を調節する、実施態様１のオリゴヌクレオチド。
１４．該オリゴヌクレオチドは野生型形のＦＧＦＲ３の発現と比較して、突然変異型のＦＧＦＲ３の発現を優先的に調節する、実施態様１のオリゴヌクレオチド。
１５．該オリゴヌクレオチドは突然変異型のＦＧＦＲ３の発現を阻害する、実施態様１のオリゴヌクレオチド。
１６．該オリゴヌクレオチドは、突然変異型のＦＧＦＲ３の発現をダウンレギュレートする、実施態様１のオリゴヌクレオチド。
１７．該オリゴヌクレオチドは、突然変異型のＦＧＦＲ３の発現と比較して、野生型形のＦＧＦＲ３の発現をアップレギュレートする、実施態様１のオリゴヌクレオチド。
１８．該オリゴヌクレオチドは配列番号１を含む核酸にハイブリダイズしない、実施態様１のオリゴヌクレオチド。
１９．該オリゴヌクレオチドは、配列番号７又は配列番号８を含む核酸にハイブリダイズしない、実施態様１のオリゴヌクレオチド。
２０．該オリゴヌクレオチドは配列番号５又は配列番号６を含む核酸にハイブリダイズする、実施態様１のオリゴヌクレオチド。
２１．該オリゴヌクレオチドは配列番号４を含む核酸のコドン３８０にハイブリダイズする、実施態様１のオリゴヌクレオチド。
２２．該オリゴヌクレオチドは配列番号４を含む核酸のＧ３８０Ｒ領域にハイブリダイズする、実施態様１のオリゴヌクレオチド。
２３．該オリゴヌクレオチドは配列番号４を含む核酸のコドン３８０の１１３８位にハイブリダイズする、実施態様１のオリゴヌクレオチド。
２４．該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施態様１のオリゴヌクレオチド。
２５．該オリゴヌクレオチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５からなる群より選択される、実施態様２３のオリゴヌクレオチド。
２６．該オリゴヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）単位；２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、及び２’−フルオロ−ＤＮＡ単位からなる群より選択された１つ以上のヌクレオチド単位を含む、実施態様１のオリゴヌクレオチド。
２７．該オリゴヌクレオチドは２つ以上のＬＮＡモノマー単位を含む、実施態様１のオリゴヌクレオチド。
２８．２つ以上のＬＮＡモノマー単位は互いに隣接して位置する、実施態様２７のオリゴヌクレオチド。
２９．２つ以上のＬＮＡモノマー単位は、互いに対して連続的に位置する、実施態様２７のオリゴヌクレオチド。
３０．ＦＧＦＲ３の発現の調節は軟骨細胞の機能を回復させる、実施態様１のオリゴヌクレオチド。
３１．ＦＧＦＲ３の異常発現に関連した容態の処置のための実施態様１のオリゴヌクレオチドの使用。
３２．軟骨無形成症の処置のための実施態様１のオリゴヌクレオチドの使用。
３３．該オリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ３の発現を調節する、配列番号９を含むオリゴヌクレオチド。
３４．該オリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ３の発現を調節する、配列番号１０を含むオリゴヌクレオチド。
３５．該オリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ３の発現を調節する、配列番号１１を含むオリゴヌクレオチド。
３６．該オリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ３の発現を調節する、配列番号１２を含むオリゴヌクレオチド。
３７．該オリゴヌクレオチドはＦＧＲＲ３の発現を調節する、配列番号１３を含むオリゴヌクレオチド。
３８．配列番号１を含む核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドは、１つ以上のＬＮＡモノマー単位を含み、該オリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ３の発現を調節する。
３９．該オリゴヌクレオチドは８ヌクレオチド長である、実施態様３８のオリゴヌクレオチド。
４０．該オリゴヌクレオチドは１５ヌクレオチド長である、実施態様３８のオリゴヌクレオチド。
４１．該オリゴヌクレオチドは１８ヌクレオチド長である、実施態様３８のオリゴヌクレオチド。
４２．該オリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ３の発現を少なくとも約５０％低減させる、請求項３８のオリゴヌクレオチド。
４３．該オリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ３の発現を少なくとも約７５％低減させる、請求項３８のオリゴヌクレオチド。
４４．該オリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ３の発現を少なくとも約９０％低減させる、請求項３８のオリゴヌクレオチド。
４５．該オリゴヌクレオチドは突然変異型のＦＧＦＲ３の発現を調節する、請求項３８のオリゴヌクレオチド。
４６．該オリゴヌクレオチドは突然変異型のＦＧＦＲ３の発現を阻害する、請求項３８のオリゴヌクレオチド。
４７．該オリゴヌクレオチドは突然変異型のＦＧＦＲ３の発現をダウンレギュレートする、請求項３８のオリゴヌクレオチド。
４８．該オリゴヌクレオチドは野生型形のＦＧＦＲ３の発現をアップレギュレートする、請求項３８のオリゴヌクレオチド。
４９．該オリゴヌクレオチドは、配列番号４を含む核酸にハイブリダイズする、実施態様３８のオリゴヌクレオチド。
５０．該オリゴヌクレオチドは、配列番号４を含む核酸のコドン３８０の１１３８位にハイブリダイズする、実施態様３８のオリゴヌクレオチド。
５１．該オリゴヌクレオチドは配列番号４を含む核酸のＧ３８０Ｒ領域にハイブリダイズする、実施態様３８のオリゴヌクレオチド。
５２．該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施態様３８のオリゴヌクレオチド。
５３．該オリゴヌクレオチドは２つ以上のＬＮＡモノマー単位を含む、実施態様３８のオリゴヌクレオチド。
５４．２つ以上のＬＮＡモノマー単位は互いに隣接して位置する、実施態様５３のオリゴヌクレオチド。
５５．２つ以上のＬＮＡモノマー単位は互いに対して連続的に位置する、実施態様５３のオリゴヌクレオチド。
５６．ＦＧＦＲ３の発現の調節は軟骨細胞の機能を回復させる、実施態様３８のオリゴヌクレオチド。
５７．ＦＧＦＲ３の異常発現に関連した容態の処置のための実施態様３８のオリゴヌクレオチドの使用。
５８．軟骨無形成症の処置のための実施態様３８のオリゴヌクレオチドの使用。
５９．軟骨無形成症の処置のために有用なオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドは、配列番号１又は配列番号４を含む核酸にハイブリダイズし、該オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのＬＮＡモノマー単位を含む。
６０．該オリゴヌクレオチドは８ヌクレオチド長である、実施態様５９のオリゴヌクレオチド。
６１．該オリゴヌクレオチドは１５ヌクレオチド長である、実施態様５９のオリゴヌクレオチド。
６２．該オリゴヌクレオチドは１８ヌクレオチド長である、実施態様５９のオリゴヌクレオチド。
６３．該オリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ３の発現をダウンレギュレートする、実施態様５９のオリゴヌクレオチド。
６４．該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施態様５９のオリゴヌクレオチド。
６５．癌又は軟骨無形成症の処置に有用なオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドは、配列番号５を含む核酸のＧ３８０Ｒ領域にハイブリダイズし、該オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのＬＮＡモノマー単位を含む。
６６．ＦＧＦＲ３ｍＲＮＡを、実施態様１のオリゴヌクレオチドに、該ＦＧＦＲｍＲＮＡと該オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに適切な条件下で送達し、これにより、ＦＧＦＲ３ｍＲＮＡの発現を調節することを含む、ＦＧＦＲ３ｍＲＮＡの発現を調節する方法。
６７．ＦＧＦＲ３の発現の調節により、ＦＧＦＲ３の発現は低減する、実施態様６６の方法。
６８．ＦＧＦＲ３を実施態様１のオリゴヌクレオチドと、該ＦＧＦＲ３と該オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに適切な条件下で接触させ、これによりＦＧＦＲ３の発現を調節することを含む、ＦＧＦＲ３の発現を調節する方法。
６９．ＦＧＦＲ３の発現の調節により、ＦＧＦＲ３の発現は低減する、実施態様６８の方法。
７０．ＦＧＦＲ３の異常発現に関連した容態を処置する方法であって、該容態と診断された患者を選択し、該患者に実施態様１のオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。
７１．ＦＧＦＲ３の異常発現に関連した容態を処置する方法であって、該容態と診断された患者を選択し、該患者に実施態様３８のオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。
７２．配列番号４を含む核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのＬＮＡモノマー単位を含み、該オリゴヌクレオチドは、配列番号１を含む核酸にハイブリダイズしない。
７３．癌、例えば膀胱癌又は軟骨無形成症の処置に有用なオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物であって、該オリゴヌクレオチドは、配列番号１又は配列番号４を含む核酸にハイブリダイズし、該オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのＬＮＡモノマー単位を含む。
７４．該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施態様７３の医薬組成物。
７５．該組成物は肺内投与のために製剤化される、実施態様７３の医薬組成物。
７６．該組成物は非経口投与のために製剤化される、実施態様７３の医薬組成物。
７７．該オリゴヌクレオチドは、配列番号４を含む核酸にハイブリダイズすることによってＦＧＦＲ３の発現を調節する、実施態様７３の医薬組成物。
７８．該オリゴヌクレオチドは配列番号１を含む核酸にハイブリダイズしない、実施態様７７の医薬組成物。
７９．該オリゴヌクレオチドは配列番号１を含む核酸にハイブリダイズすることによってＦＧＦＲ３の発現を調節する、実施態様７３の医薬組成物。
８０．該オリゴヌクレオチドは配列番号４を含む核酸にハイブリダイズしない、実施態様７９の医薬組成物。
８１．該オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのＬＮＡモノマー単位を含む、ＦＧＦＲ３の発現を調節するオリゴヌクレオチド。
８２．該オリゴヌクレオチドは、逆相補体配列番号４又はその天然変異体に対して少なくとも８０％相同であるヌクレオチド配列を含む、約１４〜２０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド。
８３．連続ヌクレオチド配列は、配列番号４の逆相補体と１つ以下のミスマッチを含む、実施態様８２のオリゴヌクレオチド。
８４．ヌクレオチド配列は１つ以上のヌクレオチド類似体を含む、実施態様８２のオリゴヌクレオチド。
８５．１つ以上のヌクレオチド類似体は、野生型オリゴヌクレオチド中の野生型ヌクレオチドと比較して、化学的に改変された糖部分を含む、実施態様８４のオリゴヌクレオチド。
８６．１つ以上のオリゴヌクレオチド類似体は、ロックド核酸（ＬＮＡ）単位、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、及び２’−フルオロ−ＤＮＡ単位からなる群より選択される、実施態様８５のオリゴヌクレオチド。
８７．１つ以上のヌクレオチド類似体はＬＮＡである、実施態様８４のオリゴヌクレオチド。
８８．該オリゴヌクレオチドは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５からなる群より選択される、実施態様８２のオリゴヌクレオチド。
８９．該オリゴヌクレオチドはギャップマーである、実施態様８２によるオリゴヌクレオチド。
９０．該オリゴヌクレオチドは、ＦＧＦＲ３ｍＲＮＡを発現している細胞におけるＦＧＦＲ３ｍＲＮＡの発現を阻害する、実施態様８２のオリゴヌクレオチド。
９１．ＦＧＦＲ３ｍＲＮＡは突然変異を含む、実施態様９０のオリゴヌクレオチド。
９２．突然変異はＧ３８０Ｒ突然変異である、実施態様９１のオリゴヌクレオチド。
９３．実施態様８２のオリゴヌクレオチドと該オリゴヌクレオチドに共有結合的に付着した少なくとも１つの非ヌクレオチド部分とを含むコンジュゲート。
９４．実施態様８２のオリゴヌクレオチド及び薬学的に許容される希釈剤、担体、溶媒、塩、又は補助剤を含む、医薬組成物。
９５．軟骨無形成症の処置のための実施態様８２のオリゴヌクレオチドの使用。
９６．癌、例えば膀胱癌、軟骨無形成症に罹患した被験体を処置する方法であって、該方法は、実施態様８２のオリゴヌクレオチドを被験体に、軟骨無形成症の１つ以上の他覚的な症状が改善されるように投与する工程を含む。
９７．他覚的な症状は、増加した筋緊張、腕の延長、脚の延長、及び伸びた身長からなる群より選択される、実施態様９６の方法。
９８．異常発現したＦＧＦＲ３を発現している細胞におけるＦＧＦＲ３の異常発現を低減させる方法であって、該方法は、該細胞を、実施態様８２のオリゴヌクレオチドと接触させ、よってＦＧＦＲ３の発現を低減させることを含む。
９９．ＦＧＦＲ３はＧ３８０Ｒ突然変異を含む、実施態様９８の方法。
１００．癌、例えば膀胱癌、軟骨無形成症を患う哺乳動物を処置する方法であって、該方法は、哺乳動物に、治療有効量のＦＧＦＲ３に標的化されたオリゴヌクレオチドを投与することを含み、該オリゴヌクレオチドは１つ以上のＬＮＡ単位を含む。
１０１．該オリゴヌクレオチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５からなる群より選択された配列を含む、実施態様１００の方法。
１０２．該オリゴヌクレオチドは非経口投与される、実施態様１００の方法。
１０３．該オリゴヌクレオチドは静脈内投与される、実施態様１００の方法。
１０４．該オリゴヌクレオチドは標的器官又は組織にボーラス注射によって投与される、実施態様１００の方法。
１０５．該オリゴヌクレオチドは腹腔内投与される、実施態様１００の方法。
１０６．該オリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ３の発現を調節する、配列番号２１を含むオリゴヌクレオチド。
１０７．該オリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ３をコードする核酸にハイブリダイズして、少なくとも約６０℃の解離Ｔｍを有する二本鎖構造を形成する、実施態様１０６のオリゴヌクレオチド。
１０８．該ＦＧＦＲ３はＧ３８０Ｒ突然変異を含み、ＦＧＦＲ３の発現の該調節は、ＦＧＦＲ３の発現を阻害することを含む、実施態様１０６のオリゴヌクレオチド。
１０９．該オリゴヌクレオチドは、約０．０５から約０．７５nMのＩＣ５０濃度でＦＧＦＲ３の該発現を阻害する、実施態様１０８のオリゴヌクレオチド。
１１０．該オリゴヌクレオチドは血漿中３７℃で少なくとも約９６時間安定である、実施態様１０６のオリゴヌクレオチド。
１１１．該オリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ３の発現を調節する、配列番号２２を含むオリゴヌクレオチド。
１１２．該オリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ３をコードする核酸にハイブリダイズし、少なくとも約７０℃の解離Ｔｍを有する二本鎖構造を形成する、実施態様１１１のオリゴヌクレオチド。
１１３．該ＦＧＦＲ３はＧ３８０Ｒ突然変異を含み、ＦＧＦＲ３の発現の該調節はＦＧＦＲ３の発現の阻害を含む、実施態様１１１のオリゴヌクレオチド。
１１４．該オリゴヌクレオチドは約０．０５から約０．７５nMのＩＣ５０濃度でＦＧＦＲ３の該発現を阻害する、実施態様１１３のオリゴヌクレオチド。
１１５．該オリゴヌクレオチドは血漿中３７℃で少なくとも約９６時間安定である、実施態様１１１のオリゴヌクレオチド。
１１６．該オリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ３の発現を調節する、配列番号２３を含むオリゴヌクレオチド。
１１７．該オリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ３をコードする核酸にハイブリダイズし、少なくとも約７０℃の解離Ｔｍを有する二本鎖構造を形成する、実施態様１１６のオリゴヌクレオチド。
１１８．該ＦＧＦＲはＧ３８０Ｒ突然変異を含み、ＦＧＦＲ３の発現の該調節はＦＧＦＲ３の発現の阻害を含む、実施態様１１６のオリゴヌクレオチド。
１１９．該オリゴヌクレオチドは約０．０５から約０．７５nMのＩＣ５０濃度でＦＧＦＲ３の該発現を阻害する、実施態様１１８のオリゴヌクレオチド。
１２０．該オリゴヌクレオチドは血漿中３７℃で少なくとも約９６時間安定である、実施態様１１６のオリゴヌクレオチド。
１２１．該オリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ３の発現を調節する、配列番号２４を含むオリゴヌクレオチド。
１２２．該オリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ３をコードする核酸にハイブリダイズし、少なくとも約７０℃の解離Ｔｍを有する二本鎖構造を形成する、実施態様１２１のオリゴヌクレオチド。
１２３．該ＦＧＦＲ３はＧ３８０Ｒ突然変異を含み、ＦＧＦＲ３の発現の該調節はＦＧＦＲ３の発現の阻害を含む、実施態様１２１のオリゴヌクレオチド。
１２４．該オリゴヌクレオチドは約０．０５から約０．７５nMのＩＣ５０濃度でＦＧＦＲ３の該発現を阻害する、実施態様１２３のオリゴヌクレオチド。
１２５．該オリゴヌクレオチドは血漿中３７℃で少なくとも約９６時間安定である、実施態様１２１のオリゴヌクレオチド。
１２６．該オリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ３の発現を調節する、配列番号２５を含むオリゴヌクレオチド。
１２７．該オリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ３をコードする核酸にハイブリダイズし、少なくとも約７０℃の解離Ｔｍを有する二本鎖構造を形成する、実施態様１２６のオリゴヌクレオチド。
１２８．該ＦＧＦＲ３はＧ３８０Ｒ突然変異を含み、ＦＧＦＲ３の発現の該調節はＦＧＦＲ３の発現の阻害を含む、実施態様１２７のオリゴヌクレオチド。
１２９．該オリゴヌクレオチドは約０．０５から約０．７５nMのＩＣ５０濃度でＦＧＦＲ３の該発現を阻害する、実施態様１２８のオリゴヌクレオチド。
１３０．該オリゴヌクレオチドは血漿中３７℃で少なくとも約９６時間安定である、実施態様１２６のオリゴヌクレオチド。
１３１．該オリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ３の発現を調節する、配列番号２０を含む核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
１３２．該オリゴヌクレオチドは配列番号１４を含む、実施態様１３１のオリゴヌクレオチド。
１３３．該オリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ３の発現を調節する、配列番号１４を含むオリゴヌクレオチド。
１３４．該オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含み、該ヌクレオチド類似体はロックド核酸である、実施態様１３３のオリゴヌクレオチド。
１３５．該オリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ３の発現を調節し、該オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのヌクレオチド類似体を、
（ａ）１位のグアニジンヌクレオチドはオキシ−ＬＮＡである；
（ｂ）２位及び３位の１つ以上におけるアデニンヌクレオチドはオキシ−ＬＮＡである；
（ｃ）１０位及び１１位の１つ以上におけるシトシンヌクレオチドはオキシ−ＬＮＡである；及び
（ｄ）１２位におけるチミンヌクレオチドはオキシ−ＬＮＡである
からなる群より選択された１つ以上の位置において含む、配列番号１４を含むオリゴヌクレオチド。
１３６．１１位の該シトシンヌクレオチドはＣ５−メチルシトシンであり、該Ｃ５−メチルシトシンはβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡであり、１２位の該チミンヌクレオチドはβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡであり、全てのヌクレオチド間連結基はホスホロチオエートヌクレオチド間連結基である、実施態様１３５のオリゴヌクレオチド。
１３７．１位の該グアニンヌクレオチドはβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡであり、２位及び３位の該アデニンヌクレオチドはβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡであり、全てのヌクレオチド間連結基はホスホロチオエートヌクレオチド間連結基である、実施態様１３５のオリゴヌクレオチド。
１３８．１位の該グアニンヌクレオチドはβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡであり、１０位及び１１位の該シトシンヌクレオチドは両方共Ｃ５−メチルシトシンであり、該Ｃ５−メチルシトシンはβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡであり、１２位の該チミンヌクレオチドはβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡであり、全てのヌクレオチド間連結基はホスホロチオエートヌクレオチド間連結基である、実施態様１３５のオリゴヌクレオチド。
１３９．１０位及び１１位の該シトシンヌクレオチドは両方共Ｃ５−メチルシトシンであり、該Ｃ５−メチルシトシンはβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡであり、１２位の該チミンヌクレオチドはβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡであり、全てのヌクレオチド間連結基はホスホロチオエートヌクレオチド間連結基である、実施態様１３５のオリゴヌクレオチド。
１４０．少なくとも１つのヌクレオチドは、５−メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、及び２−クロロ−６−アミノプリンシトシンからなる群より独立して選択された修飾された核酸塩基である、実施態様１３５のオリゴヌクレオチド。
１４１．１０位及び１１位の該シトシンヌクレオチドの各々は、修飾核酸塩基である、実施態様１３５のオリゴヌクレオチド。
１４２．該修飾核酸塩基はＣ５−メチルシトシンである、実施態様１４１のオリゴヌクレオチド。
１４３．該オキシ−ＬＮＡはβ−Ｄ−オキシＬＮＡである、実施態様１３５のオリゴヌクレオチド。
１４４．少なくとも１つのヌクレオチド間連結基はホスホロチオエートヌクレオチド間連結基である、実施態様１３５のオリゴヌクレオチド。
１４５．全てのヌクレオチド間連結基はホスホロチオエートヌクレオチド間連結基である、実施態様１３５のオリゴヌクレオチド。
【０２０４】
実施例
以下の実施例は、突然変異ＦＧＦＲ３ Ｇ３８０Ｒ ｍＲＮＡ転写物を標的化するいくつかのオリゴヌクレオチド、並びに、これらのオリゴヌクレオチドの様々な優れた特性を記載する。特に、実施例１は、２１個のオリゴヌクレオチドが突然変異Ｇ３８０Ｒ ＦＧＦＲ３発現をノックダウンする効力、及び、そうした２１個のオリゴヌクレオチドの選択性（例えば、野生型ＦＧＦＲ３発現の阻害と比較した、突然変異Ｇ３８０Ｒ ＦＧＦＲ３発現の阻害）を実証する。実施例２は、ＩＣ５０値として測定された、１０個の各オリゴヌクレオチドが突然変異Ｇ３８０Ｒ ＦＧＦＲ３発現を阻害する強度、及び、野生型ＦＧＦＲ３発現と比較した突然変異Ｇ３８０Ｒ ＦＧＦＲ３発現を阻害する強度の差を実証する。実施例３は、２つの関連していない標的に対する各オリゴヌクレオチドの阻害作用を比較することによる、そうした１０個のオリゴヌクレオチドの非特異的作用の調査を記載する。実施例４は、そうした１０個の各オリゴヌクレオチドと、突然変異Ｇ３８０Ｒ ＦＧＦＲ３（完璧な相補体）又は野生型ＦＧＦＲ３（突然変異部位における１つの相補性ミスマッチ）のいずれかとの間の、融解温度（Ｔｍ）として測定された、結合エネルギーを記載する。実施例５は、そうした１０個のオリゴヌクレオチドの、血漿中の安定性として測定された、ヌクレアーゼに対する感受性を示す。実施例６は、標準的な１６日間のマウス試験における、選択されたオリゴヌクレオチドに対するインビボでの耐容性の評価を記載する。
【０２０５】
実施例１  −  ２１個のオリゴヌクレオチドに対する効力及び選択性の試験
全部で２１個のアンチセンスオリゴヌクレオチド（各々、ロックド核酸（ＬＮＡ）骨格を有する）を、ヒトＦＧＦＲ３ Ｇ３８０Ｒ突然変異及び該突然変異の周囲又は隣接する領域を選択的に標的化するように設計した。特に、２１個のＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＦＧＦＲ３ｍＲＮＡの１３９４位の「Ａ」（すなわち、ＮＭ＿０００１４２．３の１３９４位のＧＧＧ→ＡＧＧミスセンス突然変異）並びに１３８０位から１４０８位の範囲の１３９４位の上流及び／又は下流のヌクレオチドを含む、領域にハイブリダイズするように設計した。
【０２０６】
Ｇ３８０Ｒ突然変異を有する完全長ＦＧＦＲ３又は対応する野生型ＦＧＦＲ３のいずれかのＦＬＡＧタグ化配列を含有するベクターで一過性にトランスフェクトされたヒト細胞を、２１個の各オリゴヌクレオチドの効力の最初の特徴付けのために使用した。アッセイに使用されたヒトＡ５４９細胞株が、その相対的に低い内因性ＦＧＦＲ３発現のために選択された。定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイを、ＦＬＡＧ配列を標的化することによってベクター発現産物を特異的に認識するように設計した。さらに、ｑＰＣＲアッセイを、ベクター発現系の一部ではないＦＧＦＲ３の３’ＵＴＲを標的化することによって、内因性発現産物を特異的に認識するように設計した。
【０２０７】
２１個の各オリゴヌクレオチドの効力及び選択性を、ヒトＡ５４９細胞を、各オリゴヌクレオチドと、野生型（ＷＴ）又は突然変異型（ＭＵＴ）ＦＬＡＧタグ化ベクター構築物のいずれかを用いて共トランスフェクトすることによって評価した。オリゴヌクレオチドの濃度は、０．２５nM、０．５nM及び１．０nMにおいて評価された。細胞をトランスフェクションから２４時間後に収集し、発現されたＦＬＡＧ−タグレポーターのレベルを、レポーター特異的ｑＰＣＲアッセイを用いて決定した。内因性ＧＡＰＤＨレベルに対して標準化された結果を、偽処置試料に対する％として図１Ａ及び１Ｂに示す。２１個のオリゴヌクレオチドは、各々「ＳＨ」で始まる識別子を用いて同定されるが、ＰＣＯＮと命名されたオリゴヌクレオチドは、１３９４突然変異部位とは離れた領域における野生型及び突然変異型ＦＧＦＲ３転写物の両方を標的化する陽性対照を示す。偽処置試料を、水で置換された、試験オリゴヌクレオチドの非存在下で、上記のＦＬＡＧタグ化レポーター構築物を用いてトランスフェクトした。さらに、ＮＣＯＮと命名されたランダムな混合オリゴヌクレオチドを陰性対照として使用した。
【０２０８】
図１Ａ及び１Ｂに示されているように、特定のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの濃度（０．２５nM、０．５nM、又は１nM）に依存して、偽試料のＦＧＦＲ３発現と比較して、野生型ＦＧＦＲ３及び／又は突然変異型ＦＧＦＲ３発現を８０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、さらには１０％以下だけ消失させた。さらに、特定のオリゴヌクレオチドは、実質的かつ優先的に、野生型ＦＧＦＲ３発現と比較して、突然変異型ＦＧＦＲ３の発現を低減させた（すなわち発現をダウンレギュレートした）。例えば、ＳＨ１３（配列番号２２）と命名されたオリゴヌクレオチドは０．２５nMの濃度で、対応する野生型ＦＧＦＲ３レベルのほぼ半分まで突然変異型ＦＧＦＲ３のレベルを消失させた。ＰＣＯＮと命名された陽性対照は、突然変異型及び野生型の両方のＦＧＦＲ３レベルの実質的な阻害を示し、突然変異部位に指向されていないので殆ど又は全く特異性を示さなかった。
【０２０９】
２１個のオリゴヌクレオチドはまた、Ａ５４９細胞へのオリゴヌクレオチドの導入手段として、ジムノーシス（gymnosis）（すなわち支援を受けない取り込み）を使用して効力及び選択性について試験した。具体的には、該オリゴヌクレオチドを、ジムノーシスによって４８時間かけて送達し、その後、Ａ５３９細胞を十分に洗浄して、細胞の表面に依然として付着しているか又はさもなくば培養容器に残っているあらゆるオリゴヌクレオチドを排除した。その後、突然変異型又は野生型構築物を、標準的なトランスフェクションによって送達し、Ａ５４９細胞を収集し、ｑＰＣＲによって２４時間後にアッセイした。
【０２１０】
図１Ａ及び１Ｂに提示されたトランスフェクションデータでは、顕著な用量反応と頑強なノックダウンが、図２Ａ及び２Ｂに示されているように、試験された大半のオリゴヌクレオチドについて見られ、明瞭なランキングを確立することができた。事実、トランスフェクション及びジムノーシス研究の両方においてオリゴヌクレオチドのランク順の間に有意な対応が認められた。しかしながら、突然変異型レポーターと野生型レポーターの間の区別は、トランスフェクション研究と比べてジムノーシス研究においてあまり顕著ではなかった。トランスフェクション実験で回収されたデータと本明細書に記載のジムノーシス実験の間の順位付けに有意な矛盾は見られなかった。
【０２１１】
トランスフェクション及びジムノーシスデータは、２１個の各オリゴヌクレオチドが、１つ以上の濃度で効力及び選択性を示したことを示した。評価された２１個のオリゴヌクレオチドの特異性及び／又は効力を決定するために使用されたその回収データから、１０個のオリゴヌクレオチドをさらなる特徴付けのために同定した。
【０２１２】
１０個の選択されたオリゴヌクレオチドがＦＧＦＲ３発現をノックダウンする能力を確認するために、ヒトＡ５４９細胞において上記されたのと類似した共トランスフェクション実験をＨｅＬａ細胞において実施した。具体的には、１０個の各オリゴヌクレオチドについて、ＨｅＬａ細胞を、該オリゴヌクレオチドと、野生型（ＷＴ）又は突然変異型（ＭＵＴ）レポーター構築物のいずれかを用いて共トランスフェクトした。評価された最初のスクリーニング濃度は０．２nM、１．０nM、及び５．０nMであった。細胞をトランスフェクションから２４時間後に収集し、転写物のレベルを、レポーター特異的ｑＰＣＲアッセイを用いて決定した。結果を内因性ＧＡＰＤＨレベルに対して標準化し、偽処置試料に対する％として表現した。
【０２１３】
図３に示されているように、１０個全てのオリゴヌクレオチドは、評価された濃度で用量依存的なノックダウンを示した。オリゴヌクレオチドの効果は、Ａ５４９細胞で観察されたのと類似していたが、僅かな差が明白であった。これらの差異は、Ａ５４９細胞においてレポーター標的に対して有意により効果的であった陽性対照（ＰＣＯＮと命名された）は、ＨｅＬａ細胞における突然変異特異的オリゴヌクレオチドのそれと類似した効力を有していたという観察を含んだ。第二のマイナーな差異は、以前に最善の性能を示したオリゴヌクレオチド（ＳＨ０２と命名され、配列番号２１に相当する）は、ＨｅＬａ細胞において残りの選択よりも認められ得る程に良好には機能しなかったという観察であった。しかしながら、これらのマイナーな観察は、即席の研究の全体的な結論を変化させず、試験されたオリゴヌクレオチドは効果的であり、ＨｅＬａ細胞及びＡ５４９細胞の両方において突然変異型レポーター構築物と野生型レポーター構築物の間に選択性を示したことを確認した。
【０２１４】
実施例２  −  １０個のオリゴヌクレオチドについてのＩＣ５０の試験
実施例１に記載された研究の結果として選択された１０個のオリゴヌクレオチドを、各オリゴヌクレオチドについてのＩＣ５０値を評価することによってその阻害強度についてさらに評価した。特に、トランスフェクトされたオリゴヌクレオチドは、５nM未満のＩＣ５０値を有するものと、５nMを超えるＩＣ５０値を有するものにさらに分類された。各オリゴヌクレオチドについての第二の特徴付け基準は、野生型レポーターのＩＣ５０値と突然変異型レポーターのＩＣ５０値との間におおよそ３倍の差異を示したかどうかであった。
【０２１５】
１０個の各オリゴヌクレオチドについてのＩＣ５０値を確立するために、各オリゴヌクレオチドを、野生型（ＷＴ）又は突然変異型（ＭＵＴ）レポーター構築物のいずれかを用いてＡ５４９細胞において共トランスフェクトした。該オリゴヌクレオチドを、２．５nM、１nM、０．４nM、０．１６nM、０．０６４nM、及び０．０２５６nMの濃度でトランスフェクトした。細胞を収集し、２４時間後にＲＮＡをｑＰＣＲのために抽出した。研究を３回繰り返し、数値を非線形回帰を使用してシグモイド反応曲線に対してグラフパッドプリズムにプロットした。回帰から、レポーターアッセイにおけるＩＣ５０値の推定値を決定した。回帰曲線を図４に提示し、対応するＩＣ５０値を以下の表２に作表する。
【０２１６】
【表３】
0006463687.tif 000018
【０２１７】
表２に示されているように、（完璧に相補的な）突然変異Ｇ３８０Ｒ ＦＧＦＲ３標的に対する５個の選択されたオリゴヌクレオチドについてのＩＣ５０値は、５nM未満、さらには０．５nM未満に下降した。０．２nMより良好なＩＣ５０を示した選択されたオリゴヌクレオチドは、ＳＨ０２（配列番号２１）と命名されたヌクレオチドであり、これは０．０６８nMのＩＣ５０値を示した。突然変異部位から離れた部位において両方のレポーター転写物を標的化するＰＣＯＮと命名された陽性対照は、突然変異型レポーター構築物及び野生型レポーター構築物の両方について約０．０４nMのＩＣ５０を示した。野生型ＦＧＦＲ３レポーターと比較して、突然変異型Ｇ３８０Ｒ ＦＧＦＲ３レポーターに対する選択されたオリゴヌクレオチドの選択性に関して、どのオリゴヌクレオチドも、野生型レポーターと比べて突然変異レポーターに対して約２．５倍、より良好な選択性を示した。
【０２１８】
実施例３  −  １０個のオリゴヌクレオチドに対する標的の特異性
実施例２に記載の１０個のオリゴヌクレオチドを、２５nMの濃度で非標的化転写物を非特異的にノックダウンするその能力についてさらに評価した。１０個の各オリゴヌクレオチドの１つを、トランスフェクションによって同じＡ５４９細胞に送達した。細胞を収集し、内因性ＳＣＡ３ｍＲＮＡ（図５Ａ）又はＰＴＥＮｍＲＮＡ（図５Ｂ）のノックダウンについてｑＰＣＲによって試験した。提示された結果を内因性ＧＡＰＤＨレベルに標準化し、偽処置試料に対する％として表現した。
【０２１９】
図５Ａ及び５Ｂによって示されているように、即座の研究の結果は、いくつかのオリゴヌクレオチドによるＳＣＡ３及びＰＴＥＮ転写物の両方の僅かなノックダウンを示したが、上記の実施例１に記載のＦＧＦＲ３野生型又は突然変異型転写物のノックダウンよりも有意に低かった。従って、非特異的標的に対する１０個の各オリゴヌクレオチドの効果は、特異的なＦＧＦＲ３標的に対する効果よりも有意に低かった。
【０２２０】
実施例４  −  野生型又は突然変異型ＦＧＦＲ３にアニーリングした１０個のオリゴヌクレオチドについての融解温度
上記の実施例２及び３に記載されたオリゴヌクレオチド候補の特徴付けの一部として、相補的突然変異ＲＮＡ（ｃＭＵＴと命名された）からの各オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）を評価した。１０個の各オリゴヌクレオチドもまた、Ｇ３８０Ｒ突然変異部位における各オリゴヌクレオチドに対する単一の相補性ミスマッチを含んだ、野生型対立遺伝子（ｃＷＴと命名された）を示すＲＮＡに対して試験した。
【０２２１】
１０個の各オリゴヌクレオチドについてのＴｍ値を２回決定し、Ｔｍの変化（ΔＴｍ）は、各オリゴヌクレオチドに対する融解温度及びアニーリング温度の平均を示す。５個の選択されたオリゴヌクレオチド候補を示すＴｍデータを表３に提示し、ΔＴｍは、ｃＭＵＴ（完璧な相補体）値とｃＷＴ（突然変異部位における１つの相補性ミスマッチ）値の間の差異として定義された。
【０２２２】
【表４】
0006463687.tif 000019
【０２２３】
ＦＧＦＲ３のＷＴ対立遺伝子に対する１０個のオリゴヌクレオチドを標的化する場合に、１つのミスマッチはＧ−Ｔミスマッチである。この特定のミスマッチは、結合エネルギーに関して特に特徴的なものではなく、これはΔＴｍから明白な事実である。ΔＴｍは、高くて４．８℃から低くて−１．１℃までの範囲であり；後者は、オリゴヌクレオチドの２つが、完璧に相補的なＲＮＡよりも単一ミスマッチＲＮＡに対してより良好にアニーリングすることを示す。これらの観察は、上記の実施例２に記載のような、野生型レポーターと突然変異型レポーターとの間の１０個のオリゴヌクレオチドのいくつかのＩＣ５０値から見られる比較的低い程度の相違に対応する。
【０２２４】
実施例５  −  １０個の各オリゴヌクレオチドについての血漿中の安定性
実施例２、３及び４に記載の１０個のオリゴヌクレオチドの特徴付けの一部として、１０個の各オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼに対する感受性を評価した。具体的には、１０個の各オリゴヌクレオチドを、３７℃で９６時間マウス血漿中でインキュベートし、試料を２４時間毎に採取し、分析した。試料を、完全長オリゴヌクレオチドの消失及び分解産物の発生についてゲル電気泳動によって評価した。試料を不安定な対照オリゴヌクレオチド（Ｃｏｎと命名された）と比較した。
【０２２５】
全てのオリゴヌクレオチドの血漿中の安定性は、予想された範囲内であることが判明した。図６に示されているように、１０個全てのオリゴヌクレオチドが、９６時間を超える全体的な半減期を有することが判明した。
【０２２６】
実施例６  −  １０個の各オリゴヌクレオチドについてのインビボにおける耐容性研究
１０個の各オリゴヌクレオチドのインビボにおける耐容性を、標準的な１６日間のマウス研究で試験した。１０個の各オリゴヌクレオチドを、雌ＮＭＲＩマウスにおいてインビボにおける耐容性について試験し、主に、肝臓に対するあらゆる望ましくない作用を評価した。被験体動物に、１４日目まで３日毎に１５mg/kgを静脈内投与し、その後、１６日目に屠殺した。血清をサンプリングし、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の濃度について分析した。
【０２２７】
図７に示されているように、オリゴヌクレオチドＳＨ１３（配列番号２２）は肝酵素レベルの中程度の、しかし許容される上昇を示し、ＳＨ０２（配列番号２１）、ＳＨ１９（配列番号２３）、ＳＨ２０（配列番号２４）及びＳＨ２１（配列番号２５）と命名されたオリゴヌクレオチドは、肝酵素の無視できる上昇を示した。
【０２２８】
実施例１〜６に同定された特徴に基づいて、５個のオリゴヌクレオチド（すなわち、ＳＨ０２、ＳＨ１３、ＳＨ１９、ＳＨ２０及びＳＨ２１と命名されたオリゴヌクレオチド）は、（突然変異体）Ｇ３８０Ｒ ＦＧＦＲ３の発現を消失させるために被験者への投与に使用するための優れた特性を有することが示された。上記されているように、選択されたオリゴヌクレオチドは、非選択オリゴヌクレオチドの個体群と比較して優れているとして選択された。これらの５個のオリゴヌクレオチドの配列を以下の表４に示し、β−Ｄ−オキシＬＮＡは、右上付き「ｏ」を有する太文字で示され、小文字はデオキシリボースを示し、「ｓ」及び「ｍ」はホスホロチオエート及びＣ５−メチルシトシンにそれぞれ相当する。
【０２２９】
【表５】
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【０２３０】
実施例７  −  軟骨無形成症のマウスモデルにおけるオリゴヌクレオチドの治療効果の実証
ＳＨ０２、ＳＨ１３、ＳＨ１９、ＳＨ２０及びＳＨ２１（配列番号２１、２２、２３、２４及び２５にそれぞれ対応する）と命名されたオリゴヌクレオチドがＧ３８０Ｒ突然変異ＦＧＦＲ３の発現に関連した疾病病態を低減させる能力は以下のように決定される。動物モデルは、いくつかの公知の軟骨無形成症動物モデルから選択される。好ましいマウスモデルは、ヒト突然変異ＦＧＦＲ３−Ｇ３８０Ｒに相関する。ＦＧＦＲ３−Ｇ３８０Ｒは、ヒト軟骨無形成症患者の約９７％に見られる天然の突然変異であり、マウスでは、ヒト軟骨無形成症を模倣する表現型がもたらされる。生存中の効力についての主要評価項目としては、例えば、成長速度、長骨比率の正常化、及び骨端成長板の過増殖領域の組織病理学的評価が挙げられ得る。疾病の表現型、及び各オリゴヌクレオチドによるその逆転は、当技術分野において公知の様々な方法によって、例えば骨端成長板の組織学的検査によって確認され得る。
【０２３１】
調べられるパラメーターとしては、とりわけ、オリゴヌクレオチドにより処置されたＧ３８０Ｒマウスにおける大腿骨の長さの増加（これはオリゴヌクレオチドで処置されていないＧ３８０Ｒマウスよりも統計学的に長い）、及び／又は、オリゴヌクレオチドにより処置されたＧ３８０Ｒマウスにおける過増殖帯の厚さの増加（これはオリゴヌクレオチドで処置されていないＧ３８０Ｒマウスよりも統計学的に大きい）が挙げられ得る。
【０２３２】
この実施例に記載の研究は、（１）Ｇ３８０ＦＧＦＲ３突然変異に関連した疾病の有効的な処置としての、突然変異Ｇ３８０Ｒ ＦＧＦＲ３に対して指向されたアンチセンスロックド核酸オリゴヌクレオチド、（２）特定の軟骨無形成症モデルに使用するための、及び、薬物動態及び毒性学研究の候補としてのオリゴヌクレオチド、並びに（３）本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの臨床投与のための投薬及び投与スケジュール、のさらなる特徴付けを与え得る。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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