(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内成分が除去された細胞脂質膜に由来し、前記細胞より小さいナノ小胞であって、前記ナノ小胞は、細胞内成分が除去されて内部が空いていることを特徴とするナノ小胞。
【請求項２】
前記細胞は、特異細胞または組織に誘導されるように形質転換された細胞であることを特徴とする請求項１に記載のナノ小胞。
【請求項３】
前記細胞は、細胞接合分子、抗体、標的誘導タンパク質、細胞膜融合タンパク質、及びこれらの融合タンパク質よりなる群から選択される一つ以上を発現するように形質転換された細胞であることを特徴とする請求項１に記載のナノ小胞。
【請求項４】
前記細胞は、成長因子、サイトカイン、受容体、蛍光タンパク質、及びこれらの融合タンパク質よりなる群から選択される一つ以上を発現するように形質転換された細胞であることを特徴とする請求項１に記載のナノ小胞。
【請求項５】
前記ナノ小胞の膜は、前記細胞の細胞膜以外の成分をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のナノ小胞。
【請求項６】
前記細胞膜以外の成分は、シクロデキストリン、及び、ポリエチレングリコールよりなる群から選択されることを特徴とする請求項５に記載のナノ小胞。
【請求項７】
疾病治療用または診断用物質がローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）された請求項１に記載のナノ小胞を含む医薬組成物。
【請求項８】
前記治療用または診断用物質は、抗癌剤、抗炎症剤、血管新生阻害剤、ペプチド、タンパク質、毒素、核酸、ビーズ、マイクロ粒子、ナノ粒子、及び蛍光放出物質よりなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、及びモルフォリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）よりなる群から選択されることを特徴とする請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ナノ粒子は、酸化鉄、金、炭素ナノチューブ、及び磁気ビーズよりなる群から選択されることを特徴とする請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
下記段階を含む、疾病治療用または診断用物質がローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）された細胞脂質膜由来ナノ小胞の製造方法：
（ａ）細胞にｐＨ９〜１４のアルカリ溶液を処理し、細胞内物質を除去する段階と、
（ｂ）前記細胞内物質が除去された細胞脂質膜を含む懸濁液に治療用または診断用物質を追加する段階と、
（ｃ）前記治療用または診断用物質が追加された懸濁液を、超音波分解方法を用いてナノ小胞を製造する段階と、
（ｄ）前記懸濁液から製造されたナノ小胞を分離する段階。
【請求項１２】
下記段階を含む、疾病治療用または診断用物質がローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）された細胞脂質膜由来ナノ小胞の製造方法：
（ａ）細胞にｐＨ９〜１４のアルカリ溶液を処理し、細胞内物質を除去する段階と、
（ｂ）前記細胞内物質が除去された細胞脂質膜を含む懸濁液を、超音波分解方法を用い
てナノ小胞を製造する段階と、
（ｃ）前記ナノ小胞を含む懸濁液に治療用または診断用物質を添加し、培養する段階と、
（ｄ）前記懸濁液から培養されたナノ小胞を分離する段階。
【請求項１３】
前記超音波分解方法を用いて製造されたナノ小胞に押出段階をさらに含むことを特徴とする請求項１１または１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記細胞は、特異細胞または組織に誘導されるように形質転換された細胞であることを特徴とする請求項１１または１２に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記細胞は、細胞接合分子、抗体、標的誘導タンパク質、細胞膜融合タンパク質、及びこれらの融合タンパク質よりなる群から選択される一つ以上を発現するように形質転換された細胞であることを特徴とする請求項１１または１２に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記細胞は、成長因子、サイトカイン、受容体、蛍光タンパク質、及びこれらの融合タンパク質よりなる群から選択される一つ以上を発現するように形質転換された細胞であることを特徴とする請求項１１または１２に記載の製造方法。
【請求項１７】
前記ナノ小胞の膜は、前記細胞の細胞膜以外の成分をさらに含むことを特徴とする請求項１１または１２に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記細胞膜以外の成分は、シクロデキストリン、及び、ポリエチレングリコールよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
前記治療用または診断用物質は、抗癌剤、抗炎症剤、血管新生阻害剤、ペプチド、タンパク質、毒素、核酸、ビーズ、マイクロ粒子、ナノ粒子、及び蛍光放出物質よりなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項１１または１２に記載の製造方法。
【請求項２０】
前記核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、及びモルフォリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１９に記載の製造方法。
【請求項２１】
前記ナノ粒子は、酸化鉄、金、炭素ナノチューブ、及び磁気ビーズよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１９に記載の製造方法。
【請求項２２】
疾病治療用または診断用物質がローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）された請求項１に記載のナノ小胞を含む、疾病治療用または診断用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の脂質膜（ｃｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）に由来するナノ小胞（ｎａｎｏｖｅｓｉｃｌｅｓ）、その製造方法、前記ナノ小胞を利用した薬剤学的組成物、及び診断キットなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
疾病治療のために薬物を個体に投与する場合、投与される薬物が最適の効力を発揮するように、細胞、組織、臓器及び器官への伝達及び放出を制御する薬物伝達システム（ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ；ＤＤＳ）が重要である。薬物伝達システムは、薬物の血中濃度を適切に維持させて、最大の治療効果を発揮でき、これを利用して医薬品の薬効及び安定性の極大化、薬物製剤の時間延長、生物学的利用度の増加、副作用を最小化し、必要な身体部位に伝達できるようにする医薬技術であって、医薬品自体に劣らず重要である。１９６０年代初期から注射及び注入形態、座薬式形態、鼻腔及び口腔投与、そして皮膚や肺を介した薬物伝達システム開発が行われたが、最近、患者及び使用目的によって吸収促進及び制御型ＤＤＳ（経口、経皮、粘膜）、薬効持続型ＤＤＳ（注射剤、経口、経皮）、標的部位ターゲット型ＤＤＳ（経口、注射など）及び人工知能（ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ）ＤＤＳ（ｏｎ  ｄｅｍａｎｄ型）など、その類型がさらに多様になっている。
【０００３】
そのうち、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）は、１９６０年代に初めて使用されて以来、薬物伝達システムとして広く研究されて来た。リポソームは、多様なリン脂質成分よりなる細胞膜と類似した人口膜であって、粒子のサイズ範囲がナノ型、すなわちコロイド性半固形分散製剤と認められる。リポソーム製剤は、毒性が少なくて、処方によってサイズ、電荷、膜構成、膜の透過性などの調節が可能であるため、応用可能性が非常に大きい。最近、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ；ＰＥＧ）のようなポリマーをリポソームと接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）させて、薬物を内包したリポソームが血液から容易に除去されないようにして、薬物の血液内維持時間（ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を増加させたステルスリポソーム（ｓｔｅａｌｔｈ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）が開発されていて、この方法で抗癌剤であるドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）を伝達するドキシル（ＤＯＸＩＬ）が商用化された。しかし、リポソームとステルスリポソームは、特定の細胞を認識する能力がないため、特定の細胞や特定の組織に薬物を伝達する目的には使用できない。特定の標的に結合できるように、単一標的抗体などを接合したリポソームも開発されているが、まだ臨床試験を通過して商用化されたものはない。
【０００４】
したがって、人工的に合成した脂質よりなるリポソームの代わりに、自然的な細胞膜を利用した伝達システムが開発されている。細胞に由来する伝達システムは、細胞の自然的ターゲッティング（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）システムをそのまま利用するので、従来のリポソームなどの伝達システムとは異なって、容易にターゲッティングを誘導できる。代表的な例として、細胞で自然的に分泌される細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）を利用して薬物を伝達する研究が進行中にある。また、哺乳類の有核細胞で人工的に製造されたナノ小胞（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）を利用して抗癌薬物など多様な薬物をローディングし、癌組織に伝達した研究が報告された。
【０００５】
しかし、前記細胞外小胞及び細胞で人工的に製造されたナノ小胞は、ターゲッティングに必要な物質以外に、遺伝物質（ＤＮＡ及びＲＮＡ）だけでなく、ターゲッティングに不要な細胞内タンパク質（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）など細胞内物質を含んでいる。ターゲッティングに不要な物質は、薬物ローディングの効率性を低下させるか、体内に投与される場合、副作用を誘導できる潜在的能力を持っていて、管内物質を除去したシステム開発が必須である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、前述したような従来の問題点を解決するために研究した結果、細胞にｐＨ９〜１４のアルカリ溶液を処理する場合、細胞内遺伝物質及び細胞内タンパク質が除去された脂質膜（ｃｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）のみを抽出でき、抽出された脂質膜を利用してナノ小胞を製造できることを知見し、本発明を完成した。
【０００７】
これより、本発明は、細胞にｐＨ９〜１４のアルカリ溶液を処理し、細胞内成分が除去された細胞の脂質膜に由来し、前記細胞より小さいナノ小胞及びこれを利用した薬物伝達方法を提供することに目的がある。
【０００８】
また、本発明は、疾病治療用または診断用物質がローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）された細胞脂質膜由来ナノ小胞の製造方法を提供することを目的とする。
【０００９】
しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されない他の課題は、以下の記載から当業者に明確に理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の前記目的を達成するために、本発明は、細胞内成分が除去された細胞の脂質膜に由来し、前記細胞より小さいナノ小胞であって、細胞内成分は、細胞にｐＨ９〜１４のアルカリ溶液を処理して除去されたナノ小胞を提供する。
【００１１】
本発明の一具現例において、前記アルカリ溶液は、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、アンモニア（ＮＨ３）、水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、及び水酸化マグネシウム（Ｍｇ（ＯＨ）２）よりなる群から選択される一つ以上で製造されるものであることができる。
【００１２】
本発明の他の具現例において、前記細胞は、哺乳類の有核細胞であって、単核球、大食細胞、樹状細胞、及び幹細胞よりなる群から選択されるものであることができる。
【００１３】
本発明のさらに他の具現例において、前記細胞は、特異細胞または組織に誘導されるように形質転換された細胞であることを特徴とする。
【００１４】
本発明のさらに他の具現例において、前記細胞は、細胞接合分子、抗体、標的誘導タンパク質、細胞膜融合タンパク質、及びこれらの融合タンパク質よりなる群から選択される一つ以上を発現するように形質転換された細胞であることを特徴とする。
【００１５】
本発明のさらに他の具現例において、前記細胞は、成長因子、サイトカイン、受容体、蛍光タンパク質、及びこれらの融合タンパク質よりなる群から選択される一つ以上を発現するように形質転換された細胞であることを特徴とする。
【００１６】
本発明のさらに他の具現例において、前記ナノ小胞の膜は、前記細胞の細胞膜以外の成分をさらに含むことができる。
【００１７】
本発明のさらに他の具現例において、前記細胞膜以外の成分は、シクロデキストリンまたはポリエチレングリコールであることができる。
【００１８】
本発明のさらに他の具現例において、前記ナノ小胞は、膜成分が化学的に変形されたものであることができる。
【００１９】
本発明のさらに他の具現例において、前記ナノ小胞は、その起源になる細胞の細胞膜タンパク質のトポロジーが維持されることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明は、前記ナノ小胞に疾病治療用または診断用物質がローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）されたものを含む、物質伝達用薬剤学的組成物を提供する。
【００２１】
本発明の一具現例において、前記治療用または診断用物質は、外部から注入されたものであることができる。
【００２２】
本発明の他の具現例において、前記治療用または診断用物質は、抗癌剤、抗炎症剤、血管新生阻害剤、ペプチド、タンパク質、毒素、核酸、ビーズ、マイクロ粒子、及びナノ粒子よりなる群から選択される一つ以上のものであることができる。
【００２３】
本発明のさらに他の具現例において、前記核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、及びモルフォリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）よりなる群から選択されるものであることができる。
【００２４】
本発明のさらに他の具現例において、前記ナノ粒子は、酸化鉄、金、炭素ナノチューブ、及び磁気ビーズよりなる群から選択されるものであることができる。
【００２５】
本発明のさらに他の具現例において、前記治療用または診断用物質は、蛍光を放出する物質であることができる。
【００２６】
本発明のさらに他の具現例において、前記蛍光を放出する物質は、蛍光タンパク質または量子点であることができる。
【００２７】
また、本発明は、下記段階を含む、疾病治療用または診断用物質がローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）された細胞脂質膜由来ナノ小胞の製造方法を提供する。
（ａ）細胞にｐＨ９〜１４のアルカリ溶液を処理し、細胞内物質を除去する段階と、
（ｂ）前記細胞内物質が除去された細胞脂質膜を含む懸濁液に治療用または診断用物質を追加する段階と、
（ｃ）前記治療用または診断用物質が追加された懸濁液を、超音波分解方法を用いてナノ小胞を製造する段階と、
（ｄ）前記懸濁液から製造されたナノ小胞を分離する段階。
【００２８】
また、本発明は、下記段階を含む、疾病治療用または診断用物質がローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）された細胞脂質膜由来ナノ小胞の製造方法を提供する。
【００２９】
（ａ）細胞にｐＨ９〜１４のアルカリ溶液を処理し、細胞内物質を除去する段階と、
（ｂ）前記細胞内物質が除去された細胞脂質膜を含む懸濁液を、超音波分解方法を用いてナノ小胞を製造する段階と、
（ｃ）前記ナノ小胞を含む懸濁液に治療用または診断用物質を添加し、培養する段階と、
（ｄ）前記懸濁液から培養されたナノ小胞を分離する段階。
【００３０】
本発明の一具現例において、前記超音波分解方法を用いて製造されたナノ小胞に押出段階をさらに含むことを特徴とする。
【００３１】
本発明の他の具現例において、前記アルカリ溶液は、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、アンモニア（ＮＨ３）、水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、及び水酸化マグネシウム（Ｍｇ（ＯＨ）２）よりなる群から選択される一つ以上で製造されたものであることができる。
【００３２】
本発明のさらに他の具現例において、前記細胞は、哺乳類の有核細胞であって、単核球、大食細胞、樹状細胞、及び幹細胞よりなる群から選択されるものであることができる。
【００３３】
本発明のさらに他の具現例において、前記細胞は、特異細胞または組織に誘導されるように形質転換された細胞であることを特徴とする。
【００３４】
本発明のさらに他の具現例において、前記細胞は、細胞接合分子、抗体、標的誘導タンパク質、細胞膜融合タンパク質、及びこれらの融合タンパク質よりなる群から選択される一つ以上を発現するように形質転換された細胞であることを特徴とする。
【００３５】
本発明のさらに他の具現例において、前記細胞が、成長因子、サイトカイン、受容体、蛍光タンパク質、及びこれらの融合タンパク質よりなる群から選択される一つ以上を発現するように形質転換された細胞であることを特徴とする。
【００３６】
本発明のさらに他の具現例において、前記ナノ小胞の膜は、前記細胞の細胞膜以外の成分をさらに含むことができる。
【００３７】
本発明のさらに他の具現例において、前記細胞膜以外の成分は、シクロデキストリンまたはポリエチレングリコールであることができる。
【００３８】
本発明のさらに他の具現例において、前記ナノ小胞は、膜成分が化学的に変形されたものであることができる。
【００３９】
本発明のさらに他の具現例において、前記ナノ小胞は、その起源になる細胞の細胞膜タンパク質のトポロジーが維持されることを特徴とする。
【００４０】
本発明のさらに他の具現例において、前記治療用または診断用物質は、前記細胞以外の外部で注入されたものであることができる。
【００４１】
本発明のさらに他の具現例において、前記治療用または診断用物質は、抗癌剤、抗炎症剤、血管新生阻害剤、ペプチド、タンパク質、毒素、核酸、ビーズ、マイクロ粒子、及びナノ粒子よりなる群から選択される一つ以上であることができる。
【００４２】
本発明のさらに他の具現例において、前記核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、及びモルフォリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）よりなる群から選択されるものであることができる。
【００４３】
本発明のさらに他の具現例において、前記ナノ粒子は、酸化鉄、金、炭素ナノチューブ、及び磁気ビーズよりなる群から選択されるものであることができる。
【００４４】
本発明のさらに他の具現例において、前記治療用または診断用物質は、蛍光を放出する物質であることができる。
【００４５】
本発明のさらに他の具現例において、前記蛍光を放出する物質は、蛍光タンパク質または量子点であることができる。
【００４６】
また、本発明は、前記ナノ小胞に疾病の診断に必要なプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）、プローブ（ｐｒｏｂｅ）、アンチセンス核酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、または抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）がローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）されたものを含む、疾病診断用組成物を提供する。
【００４７】
また、本発明は、前記組成物を含む、疾病診断用キットを提供する。
【００４８】
また、本発明は、前記ナノ小胞を使用して治療用または診断用物質を特異細胞または組織に伝達する段階を含む、物質伝達方法を提供する。
【００４９】
また、本発明は、前記ナノ小胞を使用して治療用または診断用物質を特異細胞または組織に伝達する段階を含む、疾病の治療または診断方法を提供する。
【００５０】
また、本発明は、前記ナノ小胞の疾病治療または診断用途を提供する。
【発明の効果】
【００５１】
本発明による細胞脂質膜由来ナノ小胞は、治療用または診断用物質の伝達に不要な細胞内物質（遺伝物質及び細胞内タンパク質）が除去され、潜在的副作用を無くすことができ、細胞または組織ターゲッティングが可能であるため、目標とする細胞または組織に主に治療用または診断用物質を伝達し、他の部位への治療用または診断用物質の伝達を抑制することによって、薬物など治療用物質の副作用を低減し、疾病治療過程で患者の苦痛と不便を減少させることができ、治療効果を増大させることができる。また、疾病治療用または診断用物質がローディングされた本発明の細胞脂質膜由来ナノ小胞及びその製造方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで治療または診断用、または実験用に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、哺乳類の有核細胞または形質転換された哺乳類の有核細胞でナノ小胞と標的誘導物質、治療用物質、診断用物質など多様な物質がローディングされたナノ小胞を製造する方法に対する模式図である。
【図２ａ】図２ａは、アルカリ溶液処理法、超音波分解法、及び密度勾配法で製造した哺乳類の有核細胞由来ナノ小胞の透過電子顕微鏡写真である。
【図２ｂ】図２ｂは、アルカリ溶液処理法、超音波分解法、及び密度勾配法で製造した哺乳類の有核細胞由来ナノ小胞のサイズを示すグラフである。
【図３】図３は、形質転換された哺乳類の有核細胞由来ナノ小胞のサイズを示すグラフである。
【図４】図４は、有核細胞由来ナノ小胞内に細胞質タンパク質と核タンパク質がなく、膜タンパク質が多く存在することを示すＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ結果である。
【図５】図５は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲを通じて哺乳類の有核細胞由来ナノ小胞内にＤＮＡとＲＮＡが存在しないことを確認した結果である。
【図６】図６は、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）処理時、哺乳類の有核細胞由来ナノ小胞のＩＣＡＭ１と内部にローディングされたＥＧＦＰタンパク質の発現可否の確認を通じて哺乳類の有核細胞由来ナノ小胞トポロジー（ｔｏｐｏｌｏｇｙ）が正常であることを示す結果である。
【図７】図７は、哺乳類の有核細胞由来ナノ小胞の二重膜にコレステロール−ポリエチレングリコール−ビオチンが結合されたことを示す結果である。
【図８】図８は、蛍光顕微鏡の観察を通じて哺乳類の有核細胞由来ナノ小胞にＦＩＴＣ−ｓｉＲＮＡがローディングされたことを示す結果である。
【図９】図９は、蛍光顕微鏡の観察を通じて哺乳類の有核細胞由来ナノ小胞にＱｄｏｔ７０５がローディングされたことを示す結果である。
【図１０】図１０は、オプティプレップ溶液を利用した密度勾配法を用いて哺乳類の有核細胞由来ナノ小胞に酸化鉄（ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅ）ナノ粒子がローディングされたことを示す写真である。
【図１１】図１１は、哺乳類の有核細胞由来ナノ小胞を利用してＴＮＦ−α処理によってドキソルビシンを標的細胞特異的に伝達することによって、細胞死滅を誘導することを示す結果である。
【図１２】図１２は、哺乳類の有核細胞由来ナノ小胞を利用してＴＮＦ−α処理によってＲＮａｓｅＡ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ａ）を標的細胞特異的に伝達することによって、細胞死滅を誘導することを示す結果である。
【図１３】図１３は、形質転換有核細胞由来ナノ小胞を利用してドキソルビシンまたはＲＮａｓｅＡを細胞に特異的に伝達することによって、細胞死滅を誘導することを示す結果である。
【図１４】図１４は、形質転換有核細胞由来ナノ小胞を利用してドキソルビシンをヒト肺癌細胞に特異的に伝達することによって、細胞死滅を誘導することを示す結果である。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
本発明は、細胞内成分が除去された細胞の脂質膜に由来し、前記細胞より小さいナノ小胞であって、細胞内成分は、細胞にｐＨ９〜１４のアルカリ溶液を処理して除去されたものであるナノ小胞を提供する。
【００５４】
本発明の前記ナノ小胞は、起源になる細胞の細胞膜成分よりなる脂質二重膜により内部と外部が区分され、細胞の細胞膜脂質と細胞膜タンパク質を含み、同一のトポロジー（ｔｏｐｏｌｏｇｙ）を有するが、核酸などの遺伝物質及び細胞内タンパク質など細胞内物質が除去されており、元々の細胞よりサイズが小さいことを意味するが、これに制限されるものではない。
【００５５】
本発明の前記アルカリ溶液は、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、アンモニア（ＮＨ３）、水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、及び水酸化マグネシウム（Ｍｇ（ＯＨ）２）よりなる群から選択される一つ以上で製造されるものであることができるが、これに制限されるものではない。
【００５６】
本発明の前記細胞は、哺乳類の有核細胞であって、単核球、大食細胞、樹状細胞、及び幹細胞よりなる群から選択されるものであることができ、また、幹細胞から分化した細胞よりなる群から選択されるものであることができ、特異細胞または組織で誘導される形質転換された細胞を含む。具体的に、前記形質転換された細胞は、治療、診断、標的誘導物質、または標的細胞との細胞膜融合に必要な物質を発現するように形質転換された細胞及びこれらの２個以上の組合よりなる形質転換された細胞を含むが、これに制限されるものではない。
【００５７】
前記哺乳類の有核細胞は、物質処理または遺伝子導入により形質転換されたものであることができ、２回以上形質転換されたものであることができ、一つ以上の特定タンパク質の発現を抑制するように形質転換されたものであることができる。
【００５８】
本発明において使用される用語「形質転換」は、細胞に刺激を与えて、タンパク質など物質発現を増加または抑制など変化させる方法と遺伝子導入を通じてタンパク質の発現を変化させる方法であって、当業界において通常利用される方法を使用できる。遺伝子導入を用いた特定タンパク質の発現を増加または抑制させる方法としては、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）、ウイルス媒介、リン酸カルシウム沈殿法（ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、微量注射法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、超音波誘導（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｍｅｄｉａｔｅｄ）などを含んで一般的に知られたすべての方法を利用できる。
【００５９】
本発明の前記細胞は、細胞接合分子、抗体、標的誘導タンパク質、細胞膜融合タンパク質、及びこれらの融合タンパク質よりなる群から選択される一つ以上を発現するように形質転換されたものであることができ、また、成長因子、サイトカイン、受容体、蛍光タンパク質、及びこれらの融合タンパク質よりなる群から選択される一つ以上を発現するように形質転換された細胞であることができるが、これに制限されるものではない。
【００６０】
本発明の前記ナノ小胞膜は、起源になる細胞の細胞膜以外の成分として、標的誘導物質（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、標的細胞との細胞膜融合に必要な物質（ｆｕｓｏｇｅｎ）、シクロデキストリン、またはポリエチレングリコールなどを含むことができ、前記細胞膜以外の成分は、多様な方法によって追加され得、細胞膜の化学的変形などを含むことができる。
【００６１】
また、本発明は、前記ナノ小胞に疾病治療用または診断用物質がローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）されたものを含む物質伝達用薬剤学的組成物を提供する。
【００６２】
本発明において前記ナノ小胞のサイズは、診断用または治療用物質が必要な組織によって多様なサイズに製造され得、好ましくは、１０ｎｍ以上１０μＭ以下であることができる。
【００６３】
本発明のナノ小胞にローディングされる物質は、特に制限されず、治療用または診断用物質であることができ、細胞外部で用意した物質をローディングすることができ、ローディングされる物質は、１個または２個以上であることができる。
【００６４】
前記診断用または治療用物質は、抗癌剤、抗炎症剤、血管新生阻害剤、ペプチド、タンパク質、毒素、核酸、ビーズ、マイクロ粒子、及びナノ粒子よりなる群から選択される一つ以上であることができるが、これに制限されるものではない。
【００６５】
前記核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、及びモルフォリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）よりなる群から選択されるものであることができ、前記ナノ粒子は、酸化鉄、金、炭素ナノチューブ、及び磁気ビーズよりなる群から選択されるものであることができるが、これに制限されるものではない。
【００６６】
本発明の前記診断用または治療用物質は蛍光を放出する物質であることができ、好ましくは、蛍光タンパク質または量子点であることができるが、これに制限されるものではない。
【００６７】
本発明の前記薬剤学的組成物は、前記抗癌剤、抗炎症剤、血管新生阻害剤、ペプチド、タンパク質、毒素、核酸、ビーズ、マイクロ粒子またはナノ粒子のうち１種以上の有効成分以外に、薬剤学的に許容可能な担体、すなわち食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、シクロデキストリン、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、リポソーム及びこれら成分のうち１種以上を混合して使用し得、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液など他の通常の添加剤をさらに含むことができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、または潤滑剤を付加的に添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸剤、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。ひいては、当該技術分野においての適正な方法、またはレミングトンの文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ）に開示されている方法を利用して各成分によって好適に製剤化することができる。本発明の薬剤学的組成物は、剤形に特別な制限はないが、注射剤または吸入剤に製剤化することが好ましい。
【００６８】
本発明の薬剤学的組成物の投与方法は、特に制限されるものではないが、目的する方法によって静脈内、皮下、腹腔内、吸入または局所適用のように、非経口投与するか、経口投与することができる。投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄量及び疾患の重症度などによってその範囲が多様である。一日投与量は、治療を必要とする個体に投与されることによって、軽減された疾病状態に対する治療に十分な本発明の治療用物質の量を意味する。治療用物質の効果的な量は、特定の化合物、疾病状態及びその深刻度、治療を必要とする個体によって変わり、これは、当業者により通常的に決定され得る。非制限的な例として、本発明による組成物の人体に対する投与量は、患者の年齢、体重、性別、投与形態、健康状態及び疾患程度によって変わることができ、体重が７０ｋｇの大人患者を基準にするとき、一般的に、０．１〜１０００ｍｇ／日、好ましくは、１〜５００ｍｇ／日であり、一定時間間隔で１日１回〜数回に分割投与することもできる。
【００６９】
また、本発明は、細胞にｐＨ９〜１４のアルカリ溶液を処理し、細胞内物質を除去する段階と、前記細胞内物質が除去された細胞脂質膜を含む懸濁液に治療用または診断用物質を追加する段階と、前記治療用または診断用物質が追加された懸濁液を超音波分解方法を用いてナノ小胞を製造する段階と、前記懸濁液から製造されたナノ小胞を分離する段階とを含む疾病治療用または診断用物質がローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）された細胞脂質膜由来ナノ小胞の製造方法を提供する。
【００７０】
また、本発明は、細胞にｐＨ９〜１４のアルカリ溶液を処理し、細胞内物質を除去する段階と、前記細胞内物質が除去された細胞脂質膜を含む懸濁液を、超音波分解方法を用いてナノ小胞を製造する段階と、前記ナノ小胞を含む懸濁液に治療用または診断用物質を添加し、培養する段階と、前記懸濁液から培養されたナノ小胞を分離する段階とを含む疾病治療用または診断用物質がローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）された細胞脂質膜由来ナノ小胞の製造方法を提供する。
【００７１】
本発明の前記超音波分解方法を用いて製造されたナノ小胞に押出段階をさらに含むことができる。
【００７２】
本発明では、前記ナノ小胞の製造方法、すなわちアルカリ溶液処理法、超音波分解法、及び密度勾配方法を利用して単核球細胞であるＵ９３７と形質転換細胞であるＨＥＫ２９３、ＨＴ１０８０細胞からナノ小胞を製造した（実施例１参照）。
【００７３】
本発明の一実施例において、単核球と形質転換細胞から製造されたナノ小胞の形態及びサイズを確認した結果、脂質二重層よりなる球形の形態であり、単核球由来ナノ小胞は、１００〜２００ｎｍであり、平均的に１８０ｎｍのサイズであり、形質転換細胞由来ナノ小胞のサイズは、７０〜１５０ｎｍであり、平均的に１００ｎｍであることを確認した。
【００７４】
また、前記単核球由来ナノ小胞を単核球細胞とともにウェスタンブロッティングを行うことによって、細胞質タンパク質であるベータ−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）、核タンパク質であるＨ２Ｂ、細胞膜タンパク質であるＧＭ１３０、ＬＦＡ１、ＩＣＡＭ１の発現を確認した結果、ナノ小胞は、細胞質及び核タンパク質を含まず、細胞膜タンパク質のみを発現することを確認した。また、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを行うことによって、前記ナノ小胞は、単核球細胞とは異なって、ＤＮＡとＲＮＡ、すなわち核酸を含まないものと確認され、ナノ小胞のトポロジー（ｔｏｐｏｌｏｇｙ）分析結果、ナノ小胞の膜に結合された膜タンパク質が単核球細胞の細胞膜と同様に、細胞外に位置し、同様のポロジーを維持することを確認した（実施例２参照）。
【００７５】
本発明の他の実施例において、前記実施例１の方法によって製造した単核球由来ナノ小胞の製造過程でコレステロール−ポリエチレングリコール−ビオチンを添加し、ポリエチレングリコールを含むナノ小胞を製造した。その後、前記ナノ小胞にストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）−ＨＲＰを入れ、培養した後、ＢＭ−ＰＯＤ基質を入れた後、発色量を測定した結果、ポリエチレングリコールを含むナノ小胞にコレステロール−ポリエチレングリコール−ビオチンが結合されたことを確認した（実施例３参照）。
【００７６】
本発明のさらに他の実施例において、前記実施例１の方法のアルカリ溶液処理法、超音波分解法、密度勾配方法過程のうち超音波分解法段階でＦＩＴＣ−ｓｉＲＮＡ、Ｑｄｏｔ７０５、または酸化鉄ナノ粒子をローディングし、各々を含むナノ小胞を製造した後、その結果を分析した。蛍光顕微鏡の観察を通じてＦＩＴＣ−ｓｉＲＮＡとＱｄｏｔ７０５がそれぞれのナノ小胞に良好にローディングされたことが分かり、オプティプレップ溶液を利用した密度勾配法を用いて酸化鉄ナノ粒子もナノ小胞にローディングされたことを確認した（実施例４〜６参照）。
【００７７】
本発明のさらに他の実施例では、単核球由来ナノ小胞を利用して細胞水準で薬物伝達及び細胞特異的伝達能を検証した。化学的薬物としてドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）と、タンパク質薬物としてＲＮａｓｅＡ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ａ）を利用して各薬物をローディングした単核球由来ナノ小胞を製造し、ヒト血管細胞であるＨＵＶＥＣ（Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ）にＴＮＦ−αを処理することによって、細胞を活性化させて、細胞膜にＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎなどの細胞接合分子の発現を増加させて、単核球由来ナノ小胞がこれを認識し、特異的に薬物が伝達されるようにした。その結果、ＴＮＦ−αが処理された場合、前記  ナノ小胞処理濃度に依存的にドキソルビシン及びＲＮａｓｅＡ薬物の両方がＨＵＶＥＣ細胞に伝達され、細胞死滅を誘導することを確認した（実施例７参照）。
【００７８】
本発明のさらに他の実施例において、形質転換細胞由来ナノ小胞の薬物伝達を細胞水準で検証した。ＩＣＡＭ１が過発現されたＨＴ１０８０形質転換細胞においてドキソルビシンまたはＲＮａｓｅＡがローディングされたナノ小胞を製造した後、Ｕ９３７単核球細胞に前記ナノ小胞を濃度別に処理し、２４時間培養後、トリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）溶液で単核球細胞を染色し、細胞死滅程度を測定した。その結果、ナノ小胞により単核球細胞に薬物が伝達され、ドキソルビシンがローディングされたナノ小胞を処理した場合、５μｇ／ｍｌから細胞死滅が誘導され、ＲＮａｓｅＡの場合、１０μｇ／ｍｌから細胞死滅が誘導された（実施例８参照）。
【００７９】
本発明のさらに他の実施例において、ヒト肺癌細胞株であるＡ５４９の細胞膜に発現されたＥＧＦＲに結合できるＥＧＦとＧＥ１１接合分子を細胞膜に発現する形質転換細胞由来ナノ小胞を製造し、細胞特異的薬物伝達を検証した。ドキソルビシンがローディングされた前記ナノ小胞をＡ５４９細胞が接種されたプレートに処理し、培養した後、蛍光顕微鏡で観察した結果、細胞死滅が誘導されたことを確認した。前記結果を通じてＥＧＦ及びＧＥ１１の細胞膜発現形質転換細胞に由来し、抗癌薬物がローディングされたナノ小胞に存在するＧＥ１１及びＥＧＦがＥＧＦＲを表面に発現している細胞と特異的に結合でき、ローディングされた抗癌薬物を細胞に伝達し、 細胞死滅を起こすことができることを確認した（実施例９参照）。
【００８０】
また、本発明は、前記ナノ小胞に疾病の診断に必要なプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）、プローブ（ｐｒｏｂｅ）、アンチセンス核酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、または抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）がローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）されたものを含む、疾病診断用組成物を提供する。
【００８１】
また、本発明は、前記組成物を含む、疾病診断用キットを提供する。
【００８２】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をさらに容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例】
【００８３】
実施例１．アルカリ溶液処理法及び超音波分解法によるナノ小胞（ｎａｎｏｖｅｓｉｃｌｅ）の製造
哺乳類の有核細胞または形質転換された哺乳類の有核細胞において細胞内成分が除去されたナノ小胞（ｎａｎｏｖｅｓｉｃｌｅ）を製造するために、単核球または形質転換された細胞からアルカリ溶液処理法、超音波分解法、及び密度勾配方法を利用してナノ小胞を製造し、図１に模式図を示した。
【００８４】
単核球は、８×１０７個のＵ９３７細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１５９３．２）を使用し、形質転換細胞としては、４×１０７個のＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１５７３）またはＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−１２１）を使用した。各細胞にアルカリ溶液（２００ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、１×ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ｐＨ１１．５）８ｍｌを処理し、前記溶液をｃｙｃｌｅ０．５とａｍｐｌｉｔｕtｅ５０の条件で超音波発生器で３０回超音波分解を行った後、１００，０００×ｇで１５分間超遠心分離（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）を行い、ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を得た。ペレットにさらに前記アルカリ溶液８ｍｌを処理し、懸濁した後、４℃ローター（ｒｏｔｏｒ）で３０分間保管した後、１００，０００×ｇで１５分間超遠心分離（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）し、ペレットを得た。得られたペレットにＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒｄ  ｓａｌｉｎｅ）溶液１０ｍｌを処理し、懸濁した後、もう一度１００，０００×ｇで１５分間超遠心分離（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）し、ペレットを得た。前記ペレットをＨＢＳ溶液０．４ｍｌに懸濁した後、超音波発生器で３０回超音波分解を行った後、さらにウォーターバス超音波発生器（ｗａｔｅｒ  ｂａｔｈ  ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）で３０分間超音波分解を行い、前記溶液にＨＢＳ溶液６．６ｍｌを入れ、懸濁した。その後、１１ｍｌ容量の超遠心分離チューブ（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ｔｕｂｅ）にそれぞれ５０％オプティプレップ（Ｏｐｔｉｐｒｅｐ）１ｍｌ、１０％オプティプレップ２ｍｌ、懸濁液７ｍｌを順に収納し、１００，０００×ｇで２時間超遠心分離し、５０％オプティプレップと１０％オプティプレップと間の層でナノ小胞を得た。
【００８５】
実施例２．ナノ小胞の特性分析
２−１．ナノ小胞の形態及びサイズ確認
前記実施例１の方法で製造した単核球及び形質転換細胞由来ナノ小胞の形態及びサイズを分析するために、まず、単核球から製造したナノ小胞を透過電子顕微鏡を用いて観察した。単核球から製造したナノ小胞をグロー放電炭素コーティング銅グリッド（ｇｌｏｗ−ｄｉｓｃｈａｒｇｅｄ  ｃａｒｂｏｎ−ｃｏａｔｅｄ  ｃｏｐｐｅｒ  ｇｒｉｄ）で３分間吸着させた。前記グリッドを蒸留水で洗浄し、２％ウラニルアセテート（ｕｒａｎｙｌａｃｅｔａｔｅ）で１分間染色（ｓｔａｉｎｉｎｇ）した後、ＪＥＭ１０１（Ｊｅｏｌ、Ｊａｐａｎ）電子顕微鏡で観察した。
【００８６】
その結果、図２ａに示されたように、単核球からアルカリ溶液処理法で製造したナノ小胞が脂質二重層よりなり、サイズが１００〜２００ｎｍであり、略球形よりなることが分かった。また、単核球から製造されたナノ小胞を、０．５μｇ／ｍｌの濃度でＨＢＳ１ｍｌに希釈（ｄｉｌｕｔｉｏｎ）した後、ナノ小胞が入っているＨＢＳ１ｍｌをチャンバ（ｃｈａｍｂｅｒ）に入れ、ナノ粒子追跡分析機で分析した結果、図２ｂに示されたように、ナノ小胞のサイズは、１００〜２００ｎｍであり、平均サイズは、１８０ｎｍであることを確認した。
【００８７】
また、ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）及びＧＥ１１ペプチド（ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ）を発現するように形質転換された細胞から製造されたナノ小胞を、５μｇ／ｍｌの濃度でＨＢＳ１ｍｌに希釈した後、ナノ小胞が入っているＨＢＳ１ｍｌをキュベット（ｃｕｖｅｔｔｅ）に入れ、動的光散乱粒度分析機で分析した。
【００８８】
その結果、図３に示されたように、形質転換細胞から製造されたナノ小胞のサイズは、７０〜１５０ｎｍであり、平均サイズは、１００ｎｍであることを確認した。
【００８９】
２−２．単核球由来ナノ小胞の細胞質タンパク質及び核タンパク質有無検証
前記実施例１の方法によって単核球からアルカリ溶液処理法で製造されたナノ小胞内の細胞質タンパク質及び核タンパク質の有無を検証するために、単核球細胞とともにＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。
【００９０】
前記ナノ小胞と単核球細胞をそれぞれ５μｇ用意した後、５×ローディング染色剤（ｌｏａｄｉｎｇ  ｄｙｅ、２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％  ＳＤＳ、０．５％  ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ、５０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を最終的に１×になるように入れ、１００℃で５分間処理した。１２％ポリアクリルアミドゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ）を用意し、サンプルをローディングした後、８０Ｖで２時間ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ゲル上のタンパク質が電気的な流れによってＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）ｍｅｍｂｒａｎｅに移動するように、４００ｍＡで２時間トランスファー（ｔｒａｎｓｆｅｒ）過程を行った。その後、ｍｅｍｂｒａｎｅに０．０５％ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｗｅｅｎ−２０）にとかした３％脱脂乳（Ｎｏｎ−ｆａｔ  ｍｉｌｋ）溶液を処理し、２時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）を行った後、ｍｅｍｂｒａｎｅにベータ−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）、Ｈ２Ｂ、ＧＭ１３０、ＬＦＡ１、ＩＣＡＭ１タンパク質に特異的に結合する１次抗体を処理し、常温で２時間反応させた。０．０５％ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｗｅｅｎ−２０）でｍｅｍｂｒａｎｅを３回洗浄した後、それぞれペロキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が付いている２次抗体を処理し、常温で１．５時間反応させた。さらに、０．０５％ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｗｅｅｎ−２０）でｍｅｍｂｒａｎｅを３回洗浄した後、ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏ．Ｎｏ．ＲＰＮ２１０６）、ＷＥＳＴ−ＺＯＬ（ｉＮｔＲＯＮ．Ｎｏ．１６０２４）、またはＦｅｍｔｏ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．Ｎｏ．３７０７４）を使用して各タンパク質の発現を確認した。
【００９１】
その結果、図４に示されたように、単核球（ｃｅｌｌ）の場合、細胞骨格を成す主な構成要素として細胞質に存在するベータ−アクチン（ＡＣＴＢ）、核内のヒストンの構成タンパク質であるＨ２Ｂが発現される一方で、アルカリ溶液処理法で製造したナノ小胞（ＭＮＶ）の場合には、ベータ−アクチン（ＡＣＴＢ）、Ｈ２Ｂが発現されなかった。また、アルカリ溶液処理法で製造したナノ小胞では、単核球細胞と比べて細胞膜タンパク質であるＬＦＡ−１、ＩＣＡＭ１、ＧＭ１３０が多く発現されることを確認した。前記結果を通じて、アルカリ処理法で製造したナノ小胞には、ベータ−アクチン、Ｈ２Ｂのような細胞質由来タンパク質及び核タンパク質が存在せず、ＬＦＡ−１、ＩＣＡＭ１、ＧＭ１３０のような細胞膜タンパク質を細胞に比べてさらに多く有していることが分かる。
【００９２】
２−３．単核球由来ナノ小胞の核酸有無検証
前記実施例１の方法によって単核球からアルカリ溶液処理法で製造されたナノ小胞の核酸の有無を検証するために、単核球細胞とともにリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）とリアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を行った。
【００９３】
単核球で製造した１００ｎｇのナノ小胞と１×１０５個の単核球細胞を９５℃で１０分間培養し、ナノ小胞と細胞を破裂させて、内部に存在するすべての核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）が放出されるようにした後、ＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ）を処理するか、または処理することなく、ＧＡＰＤＨに対するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）とリアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を行った。
【００９４】
その結果、図５に示されたように、単核球で製造したナノ小胞に核酸が存在するか否かを確認するために、ＤＮａｓｅ処理なしに、ＧＡＰＤＨに対するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った結果、単核球細胞には核酸が存在する一方で、単核球で製造したナノ小胞には核酸が存在しなかった。ＲＮＡが存在するか否かを確認するために、ナノ小胞または単核球細胞を破裂した溶液にＤＮａｓｅを処理し、ＤＮＡを除去した後、ＤＮａｓｅ抑制剤を通じてＤＮａｓｅ活性を阻害した。ＲＮＡを鋳型にしてＧＡＰＤＨに対するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った結果、単核球細胞にはＲＮＡが存在する一方で、単核球で製造したナノ小胞にはＲＮＡが存在しなかった。ＤＮＡが存在するか否かを確認するために、ナノ小胞または単核球細胞を破裂した溶液にＤＮａｓｅ処理過程なしに、ＧＡＰＤＨに対するリアルタイムＰＣＲを行った結果、単核球細胞にはＤＮＡが存在する一方で、単核球で製造したナノ小胞にはＤＮＡが存在しなかった。ひいては、ナノ小胞または単核球細胞を破裂した溶液にＤＮａｓｅ処理した後、ＧＡＰＤＨに対するリアルタイムＰＣＲを行った結果、単核球細胞でもＤＮＡが存在しないことを通じてＤＮａｓｅの活性を確認した。これは、単核球細胞にはＤＮＡとＲＮＡが共に存在する一方で、単核球細胞由来ナノ小胞内には、ＤＮＡとＲＮＡが共に存在しないことを意味する。
【００９５】
２−４．ナノ小胞のトポロジー（ｔｏｐｏｌｏｇｙ）分析
単核球から製造されたナノ小胞のトポロジーを分析するために、前記実施例１の方法のアルカリ溶液処理法、超音波分解法、密度勾配方法過程のうち超音波分解法段階でＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を添加し、ナノ小胞にローディングした。
【００９６】
より具体的に、前記実施例１に示した単核球であるＵ９３７細胞を利用したナノ小胞製造過程中にペレットにＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒｄ  ｓａｌｉｎｅ）溶液１０ｍｌを処理して懸濁し、１００，０００×ｇで１５分間超遠心分離（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）し、ペレットを得た後、前記ペレットをＨＢＳに懸濁し、次の段階で、ＥＧＦＰを５０μｇ／ｍｌ濃度になるように入れ、最終０．４ｍｌ溶液を作った。以後の過程は、実施例１の過程と同様に進行し、ＥＧＦＰがローディングされた単核球由来ナノ小胞を得た。ＥＧＦＰがローディングされたナノ小胞１０μｇとＥＧＦＰタンパク質３０ｎｇを用意した後、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）１μｇを３７℃で４時間処理し、トリプシンを処理したものと処理しないサンプルを用意し、前記実施例２−２と同様の方法でＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。１次抗体は、ＩＣＡＭ１とＥＧＦＰ特異的抗体を使用し、「＋」で表示したものは、トリプシンを処理した結果を示し、「−」で表示したものは、トリプシンを処理しない結果を示す。
【００９７】
その結果、図６に示されたように、トリプシンを処理しない場合、ナノ小胞（ＭＮＶＥＧＦＰ）の場合、ＩＣＡＭ１とＥＧＦＰタンパク質が検出され、ＥＧＦＰの場合にも、ＥＧＦＰタンパク質が検出された。しかし、トリプシンを処理したとき、ＥＧＦＰの場合トリプシン処理によって分解されて検出されない一方で、ナノ小胞では、ＩＣＡＭ１の細胞外領域が消えて検出されず、ナノ小胞内にローディングされたＥＧＦＰは消えないものと確認された。もし細胞膜が一部でも内外が変わって、一部のＩＣＡＭ１の細胞外領域がナノ小胞の内部に向ける場合、これは、トリプシンにより分解されないため、抗体反応を誘発しなければならない。トリプシンを処理したナノ小胞においては、ＩＣＡＭ１抗体反応が現われないため、存在していたＩＣＡＭ１の細胞外領域は、ナノ小胞の外部に向けていることが分かる。また、ナノ小胞内にローディングされたタンパク質の場合、ナノ小胞の二重膜により保護されていることが分かる。
【００９８】
前記結果からアルカリ溶液処理法で製造したナノ小胞の場合、ＩＣＡＭ１以外の他の細胞膜タンパク質も、同様に元々細胞膜で細胞の外部に向けた部分が、すべてナノ小胞の外部に向けていることを推論することができ、これは、ナノ小胞膜が細胞の細胞膜と同様のトポロジーを維持していることを意味する。
【００９９】
実施例３．ポリエチレングリコールを含むナノ小胞の製造
前記実施例１の方法によって製造した単核球由来ナノ小胞にポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）をローディングし、ポリエチレングリコールを含むナノ小胞を製造した。
【０１００】
超音波分解法後、ＨＢＳを入れて懸濁し、溶液を１μＭフィルター（ｔｗｏ−ｓｔａｃｋ）に通過させて押出過程を進行した。超遠心分離チューブ（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ｔｕｂｅ）にそれぞれ５０％オプティプレップ（Ｏｐｔｉｐｒｅｐ）０．５ｍｌ、１０％オプティプレップ１ｍｌ、懸濁液３ｍｌを順に収納した。その後、１００，０００×ｇで２時間超遠心分離（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）し、５０％オプティプレップと１０％オプティプレップとの間の層でナノ小胞を得た。その後、５μｇ／ｍｌの濃度でコレステロール−ポリエチレングリコール−ビオチン（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−ｂｉｏｔｉｎ）を入れ、室温で１時間保管した。もう一度５ｍｌ容量の超遠心分離チューブ（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｔｕｂｅ）にそれぞれ５０％オプティプレップ０．５ｍｌ、１０％オプティプレップ１ｍｌ、懸濁液３ｍｌを順に収納した後、１００，０００×ｇで２時間超遠心分離し、５０％オプティプレップと１０％オプティプレップとの間の層でポリエチレングリコールを含むナノ小胞を得た。
【０１０１】
次に、１０μｇ／ｍｌのポリエチレングリコールを含むナノ小胞を用意し、９６ウェルプレートに用意したナノ小胞１００μｌを入れ、常温で１２時間以上保管し、コーティングした。ＰＢＳで３回洗浄した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳを１００μｌ入れ、１時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）し、さらにＰＢＳで３回洗浄した後、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）−ＨＲＰを入れ、２０分間培養した。その後、ＢＭ−ＰＯＤ基質を入れた後、発色量を測定した。
【０１０２】
その結果、図７に示されたように、発色後、ＲＬＵ（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｕｎｉｔｓ）値を測定したとき、ポリエチレングリコールを含むナノ小胞（ＭＮＶＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）の場合、コレステロール−ポリエチレングリコール−ビオチンがナノ小胞に結合（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）され、高いＲＬＵ値を示すことが分かる。なお、コレステロール−ポリエチレングリコール−ビオチンを処理しないナノ小胞（ＭＮＶｃｏｎｔｒｏｌ）では、低いＲＬＵ値を示すことを確認した。
【０１０３】
実施例４．ＦＩＴＣ−ｓｉＲＮＡを含むナノ小胞の製造
ＦＩＴＣ−ｓｉＲＮＡを含む単核球由来ナノ小胞を製造するために、前記実施例１の方法のアルカリ溶液処理法、超音波分解法、密度勾配方法過程のうち超音波分解法段階でＦＩＴＣ−ｓｉＲＮＡを入れ、ナノ小胞にローディングした。
【０１０４】
より具体的に、前記実施例１に示した単核球であるＵ９３７細胞を利用したナノ小胞製造過程中にペレットにＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒｄ  ｓａｌｉｎｅ）溶液１０ｍｌを処理して懸濁し、１００，０００×ｇで１５分間超遠心分離し、ペレットを得た後、前記ペレットをＨＢＳに懸濁した後、ＦＩＴＣ−ｓｉＲＮＡを１０μＭ濃度になるように入れ、最終０．４ｍｌ溶液を作った。その後、超音波発生器で３０回超音波分解を行い、さらにウォーターバス超音波発生器（ｗａｔｅｒ  ｂａｔｈ  ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）で３０分間超音波分解を行った後、前記溶液にＨＢＳ０．６ｍｌを入れ、懸濁した。溶液を１μｍフィルター（ｔｗｏ−ｓｔａｃｋ）に通過させて押出過程を進行した後、さらにＨＢＳ２．０ｍｌを入れ、懸濁した。５ｍｌ容量の超遠心分離チューブ（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ｔｕｂｅ）にそれぞれ５０％オプティプレップ０．５ｍｌ、１０％オプティプレップ１ｍｌ、懸濁液３ｍｌを順に収納した。その後、１００，０００×ｇで２時間超遠心分離し、５０％オプティプレップと１０％オプティプレップとの間の層でＦＩＴＣ−ｓｉＲＮＡがローディングされたナノ小胞を得た。
【０１０５】
前記方法で製造されたナノ小胞がＦＩＴＣ−ｓｉＲＮＡを含むかを検証するために、２０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−ｓｉＲＮＡがローディングされたナノ小胞５０μｌを用意し、１０μＭ  ＤｉＩ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを入れ、懸濁した。溶液をカバーグラスに載置した後、湿気があるチャンバ（ｃｈａｍｂｅｒ）に入れ、４℃で１２時間以上保管した。スライドガラスにマウンティング溶液（ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を５μｌ載置した後、その上にカバーグラスを載置し、蛍光顕微鏡で観察した。ナノ小胞は、ＤｉＩ（１、１’ −ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ−３、３、３’ ３’ −ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ）の赤色蛍光で観察し、ｓｉＲＮＡは、ＦＩＴＣの緑色蛍光で観察し、結果を図８に示した。
【０１０６】
その結果、図８に示されたように、ＦＩＴＣ−ｓｉＲＮＡがローディングされないナノ小胞は、ＤｉＩで標識され、赤色蛍光を示すが、ＦＩＴＣ−ｓｉＲＮＡの緑色蛍光は認められないことが分かる。一方、ＦＩＴＣ−ｓｉＲＮＡがローディングされたナノ小胞は、緑色蛍光だけでなく、ＤｉＩの赤色蛍光まで示すことを確認し、緑色蛍光と赤色蛍光が同じ位置にあることを通じて、ＦＩＴＣ−ｓｉＲＮＡがナノ小胞にローディングされたことを確認した。
【０１０７】
実施例５．Ｑｄｏｔがローディングされたナノ小胞の製造
Ｑｄｏｔ７０５がローディングされたナノ小胞を製造するために、前記実施例４のＦＩＴＣ−ｓｉＲＮＡがローディングされたナノ小胞製造と同一の方法を利用し、超音波分解法段階でＦＩＴＣ−ｓｉＲＮＡの代わりに、Ｑｄｏｔ７０５を２０ｎＭになるように入れ、製造した。
【０１０８】
前記方法で製造されたナノ小胞がＱｄｏｔ７０５を含むかを検証するために、２０μｇ／ｍｌのＱｄｏｔ７０５がローディングされたナノ小胞５０μｌを用意し、前記実施例４のような方法でサンプルを用意した後、蛍光顕微鏡で観察し、ナノ小胞は、ＤｉＩの赤色蛍光で、Ｑｄｏｔ７０５は、青色の人為的な色相（ｐｓｅｕｄｏ  ｃｏｌｏｒ）で観察した。
【０１０９】
その結果、図９に示されたように、Ｑｄｏｔ７０５がローディングされないナノ小胞は、ＤｉＩで標識され、赤色蛍光を示すが、Ｑｄｏｔ７０５の青色蛍光は認められないことが分かる。一方、Ｑｄｏｔ７０５がローディングされたナノ小胞は、青色蛍光だけでなく、ＤｉＩの赤色蛍光まで示すことを確認し、青色蛍光と赤色蛍光が同じ位置にあることを通じて、Ｑｄｏｔ７０５がナノ小胞にローディングされたことを確認した。
【０１１０】
実施例６．酸化鉄（ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅ）ナノ粒子がローディングされたナノ小胞の製造
酸化鉄（ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅ）ナノ粒子がローディングされたナノ小胞を製造するために、前記実施例４のＦＩＴＣ−ｓｉＲＮＡがローディングされたナノ小胞製造と同一の方法を利用し、超音波分解法段階でＦＩＴＣ−ｓｉＲＮＡの代わりに、酸化鉄ナノ粒子を２０μｇ／ｍｌになるように入れ、製造した。その後、オプティプレップ溶液を利用した密度勾配法で酸化鉄ナノ粒子がローディングされたナノ小胞（ＭＮＶｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅ）とローディングされないナノ小胞（ＭＮＶｃｏｎｔｒｏｌ）を比較した。
【０１１１】
その結果、図１０に示されたように、酸化鉄ナノ粒子がローディングされないナノ小胞の場合、白色のバンドが現われ、酸化鉄ナノ粒子がローディングされたナノ小胞の場合、暗褐色のバンドが現われた。これを通じて、酸化鉄ナノ粒子がナノ小胞にローディングされていることを確認した。
【０１１２】
実施例７．単核球由来ナノ小胞を利用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物伝達及び細胞特異的伝達検証
７−１．単核球由来ナノ小胞を利用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ化学薬物伝達及び細胞特異的伝達確認
本発明のナノ小胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏ水準で化学薬物を細胞特異的に伝達するかを検証するために、抗癌剤であるドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）をローディングした単核球由来ナノ小胞を製造した後、蛍光顕微鏡を通じて薬物が細胞特異的に伝達されるかどうかを検証した。
【０１１３】
２４ウェルプレートを０．１％ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）でコーティングし、ヒト血管細胞であるＨＵＶＥＣ（Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ）を３×１０４個接種した後、１２時間培養した。従来の培地を除去し、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを付加した培地を入れた後、１６時間培養した。ヒト血管細胞であるＨＵＶＥＣにＴＮＦ−αを処理すると、細胞が活性化され、細胞膜にＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎのような細胞接合分子の発現が増加し、単核球及び大食細胞に存在するＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１のような細胞接合分子と結合し、単核球及び大食細胞が血管内皮細胞に結合できる。
【０１１４】
このために、実施例１の方法によって単核球からドキソルビシンがローディングされたナノ小胞を製造した。超音波分解法段階で８００μｇ／ｍｌのドキソルビシンを入れ、超音波分解を行い、ドキソルビシンがローディングされたナノ小胞を製造した。
【０１１５】
次に、ＨＵＶＥＣに０、１、２、５μｇ／ｍｌのドキソルビシンがローディングされたナノ小胞を２０分間処理し、新しい培地に交替した後、３６時間培養した。その後、ＨＵＶＥＣに２μＭセルトラッカー（Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．Ｎｏ．Ｃ２９２５）を処理し、１時間培養した後、４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）を１０分間処理し、細胞を固定した。４％パラホルムアルデヒドを除去し、ＰＢＳを入れた後、蛍光顕微鏡で細胞を観察し、細胞の個数を測定した。
【０１１６】
その結果、図１１に示されたように、ＴＮＦ−αを処理しないＨＵＶＥＣでも、ある程度細胞数が減少したことから見て、一部非特異的に薬物が伝達されたことを確認した。しかし、ＴＮＦ−αを多様な濃度で処理した場合、ナノ小胞の処理濃度に依存的に細胞数が顕著に減少したことから見て、ＨＵＶＥＣにさらに多いドキソルビシンが伝達されたことが分かった。これを通じて、ナノ小胞を利用して化学薬物を細胞特異的に伝達できることを確認した。
【０１１７】
７−２．単核球由来ナノ小胞を利用したｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質薬物伝達及び細胞特異的伝達確認
本発明のナノ小胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏ水準でタンパク質薬物を細胞特異的に伝達するかを検証するために、ＲＮａｓｅＡ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ａ）をローディングした単核球由来ナノ小胞を製造した後、蛍光顕微鏡を通じて薬物が細胞特異的に伝達されるを検証した。
【０１１８】
実施例１の方法によって単核球からＲＮａｓｅＡがローディングされたナノ小胞を製造し、超音波分解法段階で８００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを入れて超音波分解を行い、ＲＮａｓｅＡがローディングされたナノ小胞を製造した。前記実施例７−１と同一の原理と実験方法でサンプルを用意し、蛍光顕微鏡で細胞を観察した後、細胞の個数を測定した。
【０１１９】
その結果、図１２に示されたように、ＲＮａｓｅＡがローディングされたナノ小胞を様々な濃度で処理したとき、ＴＮＦ−αを処理しないＨＵＶＥＣにも、一部非特異的に薬物が伝達された。しかし、ＴＮＦ−αを処理した場合、細胞数が顕著に減少したことから見て、ＨＵＶＥＣにさらに多くのＲＮａｓｅＡが伝達されることが分かった。これを通じて、ナノ小胞を利用してタンパク質薬物を細胞特異的に伝達できることが分かる。
【０１２０】
実施例８．形質転換細胞由来ナノ小胞を利用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物伝達検証
前記実施例７の単核球由来ナノ小胞のように、形質転換細胞から製造したナノ小胞が細胞特異的に薬物を伝達するかを検証するために、抗癌剤であるドキソルビシンまたはＲＮａｓｅＡがローディングされた単核球由来ナノ小胞を製造した後、これを単核球細胞に処理した後、生きている細胞数を測定した。
【０１２１】
ＩＣＡＭ−１が過発現されたＨＴ１０８０形質転換細胞においてドキソルビシン、ＲＮａｓｅＡがローディングされたナノ小胞を実施例１の方法によって製造した。超音波分解法段階でドキソルビシン、ＲＮａｓｅＡをそれぞれ８００μｇ／ｍｌずつ入れ、超音波分解を行い、ドキソルビシンまたはＲＮａｓｅＡがローディングされたナノ小胞を製造した。
【０１２２】
その後、単核球であるＵ９３７細胞を２４ウェルプレートに１×１０５個の細胞を５００μｌの培地に接種した後、ＨＴ１０８０細胞で得たナノ小胞を０、１、２、５、１０μｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ処理し、２４時間培養した。２４時間後、細胞溶液５０μｌを９６ウェルプレートに入れ、トリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）溶液５０μｌを処理した。生きている細胞では、トリパンブルーがさらに細胞外に分泌されるため、トリパンブルーで染色されない。混合した溶液１０μｌを血球計算器（ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）に入れ、光学顕微鏡でトリパンブルーがない細胞の個数をカウントした。
【０１２３】
その結果、図１３に示されたように、ＩＣＡＭ−１が発現される形質転換されたＨＴ１０８０細胞から得た、薬物がローディングされないナノ小胞と薬物がローディングされたナノ小胞を比較したとき、薬物がローディングされないナノ小胞の場合、高い濃度を処理しても、細胞死滅を誘導しない一方で、ドキソルビシンがローディングされたナノ小胞を処理した場合、５μｇ／ｍｌから細胞死滅を誘導し、ＲＮａｓｅＡの場合、１０μｇ／ｍｌから細胞死滅が誘導された。
【０１２４】
実施例９．ＧＥ１１及びＥＧＦ細胞膜発現形質転換細胞由来ナノ小胞を利用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物伝達及び細胞特異的伝達検証
１２ウェルプレートにＥＧＦＲを発現するヒト肺癌細胞株Ａ５４９を５×１０４の量で接種した後、１６時間培養した。Ａ５４９にあるＥＧＦＲは、ＥＧＦとＧＥ１１のような接合分子と結合できる。
【０１２５】
Ａ５４９細胞が接種されたプレートをＰＢＳで洗浄した後、培地１ｍｌを入れ、０．１、１、１０×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌの濃度で、実施例１の方法によってＥＧＦ及びＧＥ１１細胞膜発現形質転換細胞から製造されたドキソルビシンがローディングされたナノ小胞を添加して処理した後、２０分間培養した。さらにＰＢＳで洗浄した後、培地１ｍｌを入れ、３６時間培養した後、ＰＢＳで洗浄した後、血清がない培地５００μｌを入れ、セルトラッカー（Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．Ｎｏ．Ｃ２９２５）を５μＭになるように入れた後、３０分間培養した。その後、４％パラホルムアルデヒド５００μｌを入れ、室温で１０分間固定した後、蛍光顕微鏡で観察した。
【０１２６】
その結果、図１４に示されたように、濃度が増加するにつれて、生きている細胞の数が減少することを確認した。結論的に、ＥＧＦ及びＧＥ１１細胞膜発現形質転換細胞に由来し、抗癌薬物がローディングされたナノ小胞に存在するＧＥ１１及びＥＧＦがＥＧＦＲを表面に発現している細胞と特異的に結合でき、ローディングされた抗癌薬物を細胞に特異的に伝達し、細胞死滅を起こすことができることを確認した。
【０１２７】
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須な特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることを理解できる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解すべきである。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
0006463493.tif 000014
【図１３】
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【図１４】
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