(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビニル化合物の産生能を有する微生物のスクリーニング方法であって、
測定試料に、ハロゲン原子の他に置換基を有していてもよいハロゲン化ベンゼン（当該置換基は、Ｃ1-4アルキル基、Ｃ1-4アルコキシ基、アミノ基、ヒドロキシ基、メルカプト基、ニトロ基、カルボキシ基およびスルホ基からなる群より選択される１以上の置換基をいう）とパラジウム触媒とを加え、Ｍｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応を行う工程、
上記Ｍｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応の反応液を、クロマトグラフィにより分析する工程、および、
上記Ｍｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応の反応液と上記測定試料のクロマトグラフィによる分析結果を比較する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
上記測定試料として、単離微生物の培養液またはその菌体破砕液を用いる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記クロマトグラフィとして薄層クロマトグラフィを用いる請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記薄層クロマトグラフィにおいて、上記Ｍｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応の反応液を薄層クロマトグラフィプレートにスポットした後、分析する前に、当該薄層クロマトグラフィプレートを加熱することにより未反応の上記ハロゲン化ベンゼンを除去する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記パラジウム触媒として、二価パラジウム触媒とホスフィン配位子を併用するか、または、０価パラジウム−トリフェニルホスフィン錯体を用いる請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビニル化合物の産生能を有する微生物をスクリーニングするための方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アクリル酸系ポリマーは、透明性など優れた特性を有するプラスチック材料、オムツなどに利用される超吸収性樹脂、接着剤などのみならず、食品添加物としても用いられている。（メタ）アクリル酸やそのエステル以外にも、ビニル基を有する化合物は、重合が可能である。また、２以上のビニル化合物を共重合させ、単独重合物の性質を改善することも行われている。
【０００３】
ビニル化合物は、通常、石油由来の化合物などから製造されているが、例えばプラスチック材料としてのアクリル酸系ポリマーは再利用が難しい。また、超吸収性樹脂は焼却が可能であるが、それでは大気中の二酸化炭素濃度を増加させることになる。よって、重合可能なビニル化合物を石油以外から製造する技術が望まれている。
【０００４】
植物には、β−ピネンやリモネンといったビニル化合物を産生するものがある。しかしその産生量は微量であるため、ポリマー原料として工業的に利用することは困難である。
【０００５】
ビニル化合物の一種であるイタコン酸は、かつてクエン酸の濃厚水溶液を２００℃以上に加熱して熱分解し、イタコン酸とシトラコン酸またはそれらの無水物の混合物を得、それから精製されており、非常に高価なものであった。しかし、特許文献１のように微生物を用いた発酵法による製造方法が確立されて製造コストが低下し、モノマーとしての利用が検討されるようになった。例えば、イタコン酸ジメチルとスチレンとの共重合体が製品化されている。
【０００６】
このように、ビニル化合物を産生する微生物が見出せれば、産業上価値があるといえる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平６−３１９５７３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したように、ビニル化合物を産生する微生物を見出すための技術が望まれている。しかし、天然由来のビニル化合物の産生量は微量であり、その検出が難しく、結果としてビニル化合物を産生する微生物のスクリーニングは難しくなる。
【０００９】
そこで本発明は、ビニル化合物を産生する微生物を簡便かつ高感度にスクリーニングできる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、測定試料に対してＭｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応を行い、試料中のビニル化合物をハロゲン化ベンゼンとカップリングさせて生成化合物を検出すれば、試料中におけるビニル化合物の有無を容易に判断できることを見出して、本発明を完成した。
【００１１】
以下、本発明を示す。
【００１２】
［１］  ビニル化合物の産生能を有する微生物のスクリーニング方法であって、
測定試料に、ハロゲン原子の他に置換基を有していてもよいハロゲン化ベンゼン（当該置換基は、Ｃ1-4アルキル基、Ｃ1-4アルコキシ基、アミノ基、ヒドロキシ基、メルカプト基、ニトロ基、カルボキシ基およびスルホ基からなる群より選択される１以上の置換基をいう）とパラジウム触媒とを加え、Ｍｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応を行う工程、
上記Ｍｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応の反応液を、クロマトグラフィにより分析する工程、および、
上記Ｍｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応の反応液と上記測定試料のクロマトグラフィによる分析結果を比較する工程を含むことを特徴とする方法。
【００１３】
［２］  上記測定試料として、単離微生物の培養液またはその菌体破砕液を用いる上記［１］に記載の方法。
【００１４】
［３］  上記クロマトグラフィとして薄層クロマトグラフィを用いる上記［１］または［２］に記載の方法。
【００１５】
［４］  上記薄層クロマトグラフィにおいて、上記Ｍｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応の反応液を薄層クロマトグラフィプレートにスポットした後、分析する前に、当該薄層クロマトグラフィプレートを加熱することにより未反応の上記ハロゲン化ベンゼンを除去する上記［３］に記載の方法。
【００１６】
［５］  上記パラジウム触媒として、二価パラジウム触媒とホスフィン配位子を併用するか、または、０価パラジウム−トリフェニルホスフィン錯体を用いる上記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明方法によれば、微生物が産生するビニル化合物をハロゲン化ベンゼンとカップリングさせ、その生成化合物をベンゼン環に特有の光吸収性により検出することで、ビニル化合物を産生する微生物をスクリーニングすることが可能になる。自然界においてはビニル化合物を産生する微生物は少なく、また、ビニル化合物の産生能を有する微生物であっても、通常の培養条件ではその産生量は少ないことが考えられる。しかし本発明方法は、このように検出し難く微量なビニル化合物をより検出し易い化合物に変換した上で検出するので感度が高く、産業上有用な微生物のスクリーニングに極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、アクリル酸を基質化合物として用いたＭｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応における反応時間と反応率との関係を示すグラフである。
【図２】図２は、アクリル酸を基質化合物として用いたＭｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応における反応温度と反応率との関係を示すグラフである。
【図３】図３は、イタコン酸産生菌の培養液上清とイタコン酸水溶液をＭｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応に付した反応液と、反応に付さない同培養液上清を薄層クロマトグラフィにより分析した結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明方法を工程毎に説明する。
【００２０】
１．  反応工程
本工程では、測定試料に、ハロゲン原子の他に置換基を有していてもよいハロゲン化ベンゼン（当該置換基は、Ｃ1-4アルキル基、Ｃ1-4アルコキシ基、アミノ基、ヒドロキシ基、メルカプト基、ニトロ基、カルボキシ基およびスルホ基からなる群より選択される１以上の置換基をいう）とパラジウム触媒とを加えＭｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応を行う。
【００２１】
本工程で処理する測定試料は、ビニル化合物の産生能を有する微生物が含まれている可能性があるものであれば特に制限されない。例えば、土壌、その懸濁液、さらにその濾液、海水、河川水、湖水などを挙げることができる。
【００２２】
しかし、上記の直接採取試料には、含有微生物自体が少なく、含まれるビニル化合物がさらに少ないことから本発明方法であっても検出が難しい場合があり得る。そこで、自然界から採取した測定試料は、予備培養することが好ましい。
【００２３】
例えば、上記の直接採取試料やその濾液を固体培地に塗布し、形成されたコロニーを分離してさらに液体培地で培養した培養液や、予備培養した菌体の菌体破砕液を用いることが好ましい。これら培養液や菌体破砕液であれば、含まれる微生物は一種類であり、複数の微生物からビニル化合物の産生能を有するものを分離特定する必要は無いし、ビニル化合物の産生能を有するものであれば、その濃度は上記の直接採取試料よりも高く、検出し易いと考えられる。
【００２４】
本工程では、測定試料にパラジウム触媒とハロゲン化ベンゼンを加えて反応させる。一般的に、自然界から直接採取された試料や培養液に含まれる主な液体は水である一方で、ハロゲン化ベンゼンは水に対して難溶である。そこで、溶媒として、測定試料に含まれている水と混和できる程度に水への親和性を有する親水性有機溶媒を用いることが好ましく、水に対して無制限に混和する水混和性有機溶媒を用いることがより好ましい。かかる水混和性有機溶媒としては、ジメチルスルホキシドなどの低級アルキルスルホキシド溶媒；メタノール、エタノール、イソプロパノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなどの低級アルコール溶媒；アセトンなどの低級ケトン溶媒；ジメチルホルムアミドやジメチルアセトアミドなどのアミド溶媒；プロピレンカーボネート、ジメチルカーボネート、ジエチルカーボネートなどのカーボネート溶媒；酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチルなどのエステル溶媒を挙げることができる。さらに具体的には、溶媒１Ｌに対し水を５０ｇ以上溶解でき、且つ、ハロゲン化ベンゼンを溶媒１Ｌに対し５０ｇ以上溶解できる溶媒が好ましい。その他、親水性有機溶媒として、ジエチルエーテルやテトラヒドロフランなどの低級エーテル溶媒も用いることができる。これらの溶媒の中から、化学反応に対して反応阻害などの悪影響を与えないことを事前に確認することで、適宜選択して用いればよい。
【００２５】
溶媒の使用量は適宜調整すればよいが、例えば、反応系における水の量に対して０．５容量倍以上、５０容量倍以下程度とすることができる。
【００２６】
パラジウム触媒は、Ｍｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応を促進するために用いる。Ｍｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応では０価パラジウム触媒を用いることが好ましいといえるが、二価パラジウム触媒も用いることは可能である。パラジウム触媒としては、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム、パラジウム（０）−ＢＩＮＡＰ錯体、酢酸パラジウム、塩化パラジウムを挙げることができる。また、酢酸パラジウムなどの二価パラジウム触媒を用いる場合には、パラジウムを０価に還元するためトリフェニルホスフィンなどのホスフィン配位子を併用することが好ましい。
【００２７】
パラジウム触媒の使用量は触媒量でよく、適宜調整すればよいが、例えば、パラジウム換算で、測定試料１ｍＬあたり０．０１ｍｇ以上、２ｍｇ以下程度用いることができる。
【００２８】
本工程では、測定試料中に含まれるビニル化合物と、ハロゲン原子の他に置換基を有していてもよいハロゲン化ベンゼン（当該置換基は、Ｃ1-4アルキル基、Ｃ1-4アルコキシ基、アミノ基（−ＮＨ2、モノ（Ｃ1-4アルキル）アミノ基またはジ（Ｃ1-4アルキル）アミノ基）、ヒドロキシ基、メルカプト基（−ＳＨ）、ニトロ基、カルボキシ基およびスルホ基（−ＳＯ3Ｈ）からなる群より選択される１以上の置換基をいう）とをカップリングさせる。
【００２９】
本発明において「Ｃ1-4アルキル基」とは、炭素数１以上４以下の直鎖状または分枝鎖状の一価飽和脂肪族炭化水素基をいう。例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル基などである。好ましくはＣ1-2アルキル基であり、より好ましくはメチル基である。
【００３０】
「Ｃ1-4アルコキシ基」とは、炭素数１以上４以下の直鎖状または分枝鎖状の脂肪族炭化水素オキシ基をいう。例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｔ−ブトキシなどであり、好ましくはＣ1-2アルコキシ基であり、より好ましくはメトキシ基である。
【００３１】
置換基がジ（Ｃ1-4アルキル）アミノ基である場合、２つのＣ1-4アルキル基は互いに同一であってもよいし異なっていてもよい。また、カルボキシ基やスルホ基は、アルカリ金属イオンなどのカチオンと塩を形成していてもよい。塩であれば、ハロゲン化ベンゼンの水溶性は向上すると考えられる。
【００３２】
置換基の数は、ハロゲン化ベンゼン上で置換可能であれば特に制限されないが、１以上、４以下が好ましく、１以上、３以下がより好ましく、１または２がよりさらに好ましく、１が好ましい。置換基数が２以上である場合は、それら置換基は互いに同一であってもよいし、異なっていてもよい。勿論、ハロゲン化ベンゼンは、ハロゲン原子の他に置換基を有さなくてもよい。
【００３３】
本発明方法で用いるハロゲン化ベンゼンとしては、クロロベンゼン、ブロモベンゼン、ヨウ化ベンゼンが挙げられる。これらハロゲン化ベンゼンは、さらに上記置換基を有していてもよい。
【００３４】
本発明で用いるハロゲン化ベンゼンとしては、揮発性のものを用いることが好ましい。揮発性のハロゲン化ベンゼンであれば、例えば薄層クロマトグラフィにおいてプレートを加熱することにより容易に除去できるため、未反応分が残存していても反応生成物の分析を阻害することはない。
【００３５】
ハロゲン化ベンゼンの使用量は、測定試料に含まれるビニル化合物と十分にカップリングできる量とすることができ、実際には予備実験などで決定すればよいが、例えば、測定試料１ｍＬあたり０．００１μｍｏｌ以上、１μｍｏｌ以下程度とすることができる。
【００３６】
Ｍｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応においては、塩基を用いることが好ましい。かかる塩基としては、例えば、炭酸ナトリウムや炭酸カリウムなどのアルカリ金属炭酸塩；炭酸水素ナトリウムや炭酸水素カリウムなどのアルカリ金属炭酸水素塩；酢酸ナトリウムや酢酸カリウムなど弱酸とアルカリ金属との塩；トリエチルアミンやトリブチルアミンなどの有機アミンを挙げることができる。
【００３７】
塩基の使用量は、反応が有効に進行する範囲で適宜調整すればよいが、例えば、０．００５μｍｏｌ以上、５μｍｏｌ以下程度とすることができる。
【００３８】
反応条件も、反応が十分に進行する範囲で適宜調整すればよく、予備実験で決定してもよいが、例えば、２０℃以上、１２０℃以下で、１０分間以上、１８０分間以下程度とすることができる。
【００３９】
ビニル基とは、一般的にＣＨ2＝ＣＨ−をいうが、本発明で検出すべきビニル化合物は、置換されるべき水素原子がある炭素−炭素二重結合が構造中に含まれるものであれば、厳密な意味でのビニル基を有さないものであってもよい。すなわち、本発明方法におけるＭｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応は、以下のとおりである。
【００４０】
【化１】
0006554746.tif 000002
【００４１】
［式中、Ｘは塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を示し、Ｒ1とＲ2は独立して水素原子または有機基を示し、Ｒ3は有機基を示す］
【００４２】
２．  反応液の分析工程
本工程では、上記工程１で得られたＭｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応の反応液をクロマトグラフィにより分析する。
【００４３】
クロマトグラフィは、上記工程１におけるＭｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応の生成物が検出可能であれば高速液体クロマトグラフィなどでも可能である。しかし、より簡便であることから、本発明方法では薄層クロマトグラフィ（以下、「ＴＬＣ」と略記する）を用いることが好ましい。以下、ＴＬＣを用いる場合について説明する。
【００４４】
２−１．  反応液のスポット
先ず、ガラス基板上にシリカゲルなどの薄層を形成したＴＬＣプレートの端部に、上記反応液をスポットする。かかる操作は当業者にとり公知であるが、ＴＬＣプレートの周端から数ミリの距離を空けて、反応液を同じ部分に、できれば溶媒がある程度留去されるよう時間を空けて数回に分けて滴下する。その際、例えばシリンジを用い、所定量を滴下することが好ましい。
【００４５】
２−２．  乾燥
反応液のスポットの後には、揮発性化合物が留去されるようにＴＬＣプレートを加熱することが好ましい。かかる揮発性化合物は、溶媒のみならず、少なくとも反応液中のハロゲン化ベンゼンを含む。特に過剰に使用したハロゲン化ベンゼンが残留していると、Ｍｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応の生成物と区別できないおそれがあり得る。
【００４６】
加熱条件は適宜調整すればよいが、例えば、６０℃以上、１２０℃以下で１０分間以上、１．５時間以下加熱することが好ましい。
【００４７】
なお、加熱乾燥は、反応液をスポットした後で且つ分析前であれば、以下に示す展開後に行ってもよい。
【００４８】
２−３．  展開
次に、スポットにかからないようＴＬＣプレートの端部を展開溶媒に浸漬し、展開する。
【００４９】
展開溶媒は、観察されるスポットが分離されるよう適宜選択すればよく、実際には予備実験などで決定すればよいが、例えば、酢酸エチル、ヘキサン、メタノール、クロロホルム、酢酸、水、およびこれら２以上の混合溶媒を挙げることができる。例えば、最もＲｆ値の高いスポットの移動量ができるだけ大きくなる一方で、Ｒｆが１にならないように展開溶媒の極性を調整することが好ましい。また、カルボキシ基やアミノ基など極性基を有する化合物が含まれるとスポットが尾を引くことがあるので、このような場合には、展開溶媒に酢酸やトリエチルアミンなどの酸や塩基を添加することが好ましい。酸または塩基の添加も、予備実験などで決定することができる。
【００５０】
２−４．  分析
次に、展開されたＴＬＣプレートを分析する。
【００５１】
本発明方法におけるＭｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応で生成する化合物は、ハロゲン化ベンゼン由来のベンゼン環を含むので、ベンゼン環に起因して紫外線の吸収性を示す。また、上記のとおり、試料に含まれるビニル化合物に対して使用したハロゲン化ベンゼンが過剰であっても、ハロゲン化ベンゼンは揮発性であり加熱により除去可能である。よって、展開後、波長２５４ｎｍの光を含む紫外線を照射して、スポットを可視化することにより、Ｍｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応による生成物の有無を検出することができる。或いは、発色試薬を用いてもよい。また、ＴＬＣプレートとしては、マンガン活性化ケイ酸亜鉛などの蛍光指示薬を含有するものを用いてもよい。
【００５２】
３．  反応液の分析工程
本工程では、上記工程１でＭｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応に付した測定試料であって、Ｍｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応に付する前のものを、上記工程２で行ったクロマトグラフィと同様の条件のクロマトグラフィで分析する。
【００５３】
本工程に付する測定試料の量を、上記工程２において使用した溶媒の量などを考慮して、上記工程２で分析に付した反応液に含まれる測定試料の量と同一にすれば、反応生成物の検出はより容易になり得る。或いは、上記工程２で分析に付した反応液と同量にしてもよい。
【００５４】
４．  比較工程
本工程では、上記工程２で得られた、上記工程１におけるＭｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応の反応液の分析結果と、上記工程３で得られた測定試料の分析結果を比較する。
【００５５】
例えば、クロマトグラフィによる分析結果において、Ｍｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応の反応液には見られないスポットやピークが、測定試料には見られる場合には、測定試料中にビニル化合物が存在することになるので、測定試料に関係する微生物はビニル化合物の産生能を有すると判断することができる。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００５７】
実施例１：  Ｍｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応の条件の検討
１ｍＭアクリル酸水溶液（２５０μＬ）、ヨードベンゼンの５０ｍＭ  ＤＭＳＯ溶液（２５０μＬ）、酢酸パラジウム触媒（和光純薬工業社製「ＦｉｂｒｅＣａｔ１００１」）の５０ｍｇ／ｍＬ  ＤＭＳＯ溶液（５０μＬ）、および７５０ｍＭ炭酸カリウム水溶液（５０μＬ）を、ガラス瓶中で混合し、２０℃、４０℃、６０℃、８０℃または１００℃で、５分、１０分、３０分、６０分、９０分、１２０分または１８０分間、Ｍｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応を行った。なお、上記酢酸パラジウム触媒は、酢酸パラジウムとトリフェニルホスフィンをポリエチレン繊維に固定化したものである。
【００５８】
また、反応条件の検討のため、触媒として酢酸パラジウム、塩基として水酸化カリウムまたはトリエチルアミン、溶媒としてメタノール、エタノールまたはアセトンを用い、同様の条件で実験を行った。
【００５９】
反応後、５ｍＭ  ３−ヒドロキシ桂皮酸（５０μＬ）を内部標準物質として添加し、フィルター（φ０．４５μｍ、ＰＴＦＥ）を用いてパラジウム触媒を除去した。得られた濾液に１．５Ｎ  ＨＣｌ（１００μＬ）を添加してｐＨを１とした。得られた反応液のうち５０μＬに、水（２５０μＬ）と酢酸エチル（１５０μＬ）を添加混合後、有機相を分取し、そのうちの９μＬをＴＬＣプレート（Ｍｅｒｃｋ社製「ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ254」）にスポットし、ＴＬＣで分析した。また、上記反応液をそのままＯＤＳカラムを有するＨＰＬＣに供して分析した。ＨＰＬＣでは０．０１％  ＴＦＡを含む３０％アセトニトリル水溶液を移動相とした。試薬から調整した既知濃度のｔｒａｎｓ−桂皮酸を用いて作成した検量線を用いて反応率を算出した。また、反応液から生成物をクロロホルムで抽出後に乾燥させ、重水素化クロロホルムに溶解した。当該溶液を1Ｈ−ＮＭＲおよびＬＤＩ−ＭＳに供し分析した。
【００６０】
反応時間と反応率との関係を図１に、反応時間を３０分間に固定した場合における反応温度と反応率との関係を図２に示す。図１および図２に示す結果のとおり、反応温度６０℃、反応時間３０分間で反応率９８．２％を得ることができた。また、用いるアクリル酸濃度を０．０１〜１０ｍＭにした場合の平均反応率は９６．０％であったことから、用いるアクリル酸に濃度差があっても反応率はほぼ１００％となることがわかった。
【００６１】
また、反応温度６０℃、反応時間３０分間で、触媒、塩基および溶媒を変更した場合の反応率を表１に示す。
【００６２】
【表１】
0006554746.tif 000003
【００６３】
表１より、反応率が最も良い組み合わせは、触媒として二価パラジウムとホスフィン配位子との組み合わせ、塩基として炭酸カリウム、溶媒としてＤＭＳＯであることがわかった。また、1Ｈ−ＮＭＲおよびＬＤＩ−ＭＳの結果、生成物はｔｒａｎｓ−桂皮酸であることが確認された。従って、本反応により目論見通りの反応が進行することが確認された。
【００６４】
実施例２
イコタン酸産生菌であるＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ  ＮＢＲＣ６１２３株をポテトデキストロース培地に接種し、３０℃で４日間培養した。得られた培養液の上清およびイコタン酸水溶液を、ポジティブコントロールとして以下の実験に供した。また、ネガティブコントロールとして、上記上清にヨードベンゼンを添加しない以外は同様の条件で反応を行った。
【００６５】
上記培養液上清または１０ｍＭイタコン酸水溶液（１０μＬ）、ヨードベンゼンの５０ｍＭ  ＤＭＳＯ溶液（１０μＬ）、酢酸パラジウム触媒（和光純薬工業社製「ＦｉｂｒｅＣａｔ１００１」）の５０ｍｇ／ｍＬ  ＤＭＳＯ溶液（２μＬ）、および７５０ｍＭ炭酸カリウム水溶液（２μＬ）を、マイクロチューブ中で混合し、６０℃で３０分間、Ｍｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応を行った。反応液に濃塩酸（４μＬ）、水（８４μＬ）、および酢酸エチル（５６μＬ）を添加混合し、酢酸エチル層を分取後、当該酢酸エチル層（６μＬ）をＴＬＣプレート（Ｍｅｒｃｋ社製「ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ254」）にスポットした。次いで、過剰なヨードベンゼンなどの揮発性物質を除去するために、ＴＬＣプレートを８０℃で１時間加熱した。クロロホルム／メタノール／酢酸＝９０／１０／１（ｖ／ｖ／ｖ）の混合液を展開溶媒として用いて展開した後、紫外線照射（２５４ｎｍ）してＴＬＣプレート上のスポットを可視化した。結果を図３に示す。
【００６６】
図３に示す結果のとおり、イタコン酸水溶液のＭｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応液には、イタコン酸とヨードベンゼンの反応物であるベンジリデンコハク酸に由来するスポットをＴＬＣプレート上に確認することができた（図３Ｃ）。当該スポットは、イタコン酸産生菌培養液の上清であっても反応を行っていない場合では認められない一方で（図３Ｂ）、反応を行った場合には確認できた（図３Ａ）。
【００６７】
よって、例えば未知の微生物であってもその培養液を本発明に係るＭｉｚｏｒｏｋｉ−Ｈｅｃｋ反応に付すことにより、ビニル化合物の産生能を有する微生物の存在を特定できることが明らかになった。
【図１】
0006554746.tif 000004
【図２】
0006554746.tif 000005
【図３】
0006554746.tif 000006