(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
精巣において生殖細胞増殖の刺激に使用するための、ならびに/または哺乳動物において男性不妊の治療および/もしくは予防に使用するための、ならびに/または哺乳動物において男性受精能の誘導もしくは改善に使用するための組成物であって、
ここで前記組成物は化合物を含み、
該化合物はオステオプロテジェリン結合タンパク質（OPGbp）/NFκB活性化受容体リガンド（RANKL）のNFκB活性化受容体（RANK）との結合のアンタゴニストもしくは阻害剤となる化合物であり、
前記化合物は、RANKLもしくはRANKペプチドと免疫反応する抗体、当該抗体の抗原結合ドメイン、当該抗体の抗体断片、もしくは当該抗体の抗原結合断片からなる1群から選択されるものであるか、または、OPG（オステオプロテジェリン）、OPGを含む融合タンパク質、もしくはFc-OPGであり、
前記抗体断片は、RANKLまたはRANKペプチドと免疫反応するものである、
前記組成物。
【請求項２】
前記化合物が、OPG、OPG（オステオプロテジェリン）を含む融合タンパク質、Fc-OPG、およびヒト免疫グロブリンG1からなる1群から選択される、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記化合物が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、重鎖および軽鎖が可動性リンカーによって連結された抗体、Fv分子、抗原結合断片、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2 分子、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびキメラ抗体からなる1群から選択される、請求項1または2に記載の組成物。
【請求項４】
前記化合物がRANKLシグナル伝達の阻害剤である、請求項1または2に記載の組成物。
【請求項５】
前記の抗体、抗原結合ドメイン、抗体断片、または抗原結合断片が、
i) 配列番号2または配列番号4に記載のアミノ酸配列；
ii) 配列番号3のヌクレオチド1から951に示すヌクレオチド配列を含有するDNA分子によってコードされるアミノ酸配列；
iii) 配列番号11に記載のアミノ酸配列；
iv) i)-ii)に記載の配列のうちいずれか1つの部分配列であって、配列番号11に記載のRANKポリペプチドに結合することができる前記部分配列；ならびに
v) i)-iii)に記載の配列のいずれかに対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列； からなる1群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれらで構成される、ペプチドもしくはポリペプチドと免疫反応する、請求項4に記載の組成物。
【請求項６】
前記部分配列のアミノ末端アミノ酸残基が、配列番号4のアミノ酸残基番号1-162のいずれか1つである、請求項5に記載の組成物。
【請求項７】
前記部分配列のカルボキシ末端アミノ酸残基が、配列番号4のアミノ酸残基番号313-317のいずれか1つである、請求項5または6に記載の組成物。
【請求項８】
前記部分配列が、配列番号3のヌクレオチド484-951に示すヌクレオチド配列を含むDNAによってコードされるアミノ酸配列である、請求項5または6に記載の組成物。
【請求項９】
前記の抗体もしくは抗原結合ドメインが、
i) 配列番号5に記載のアミノ酸配列；および
ii) i)のアミノ酸配列の部分配列であって、当該部分配列もしくはバリアントが配列番号6に記載の配列を含んでなる、前記部分配列
からなる1群から選択されるアミノ酸配列と免疫反応する、請求項3〜5のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記の抗体もしくは抗原結合ドメインが、ヒトモノクローナル抗体もしくは抗原結合ドメインである、請求項3〜9のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗体が全長ヒトモノクローナルIgG2である、請求項3〜10のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗体が、
i) 配列番号7に記載のアミノ酸配列；
ii) 配列番号7に記載のアミノ酸配列の部分配列；ならびに
iii) i)およびii)に記載のアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなる1群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を有する、請求項3〜11のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記の、配列番号7に記載のアミノ酸配列の部分配列が、配列番号8に記載の配列を含んでなる、請求項12に記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗体が、
i) 配列番号9に記載のアミノ酸配列；
ii) i)に記載のアミノ酸配列の部分配列；ならびに
iii) i)およびii)に記載のアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなる1群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する、請求項3〜13のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記の、配列番号9に記載のアミノ酸配列の部分配列が、配列番号10に記載の配列を含んでなる、請求項14に記載の組成物。
【請求項１６】
前記化合物がデノスマブである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が、精子減少症の予防および/または治療のための組成物である、請求項1〜16のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が、無精子症の予防および/または治療のための組成物である、請求項1〜17のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記化合物が、静脈内または皮下に投与される、請求項1〜18のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記化合物が、皮下に、投与される、請求項1〜19のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記化合物が、皮下に、４週間に1回、60-120 mgの用量で投与される、請求項20に記載の組成物。
【請求項２２】
前記化合物が、精巣内または性器部に投与される、請求項1〜21のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記化合物が陰嚢部に投与される、請求項1〜22のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項２４】
当該被験者の精巣組織サンプルの組織学的分析によって検出することができる、いかなるステージの精巣がんにも罹っていない男性被験者、または当該被験者の精巣組織サンプルの組織学的分析によって検出することができる、いかなるステージの精巣がんにも罹っていない年齢15-55歳のヒト男性被験者に投与されるためのものである、請求項1〜23のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物が医薬組成物である、請求項1〜24のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物が、1つもしくは複数の生理的に許容される基剤、賦形剤、および/または希釈剤を含有する、請求項1〜25のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物が、1つもしくは複数の安定化剤、および/または1つもしくは複数の緩衝剤を含有する、請求項1〜26のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記1つもしくは複数の安定化剤が界面活性剤である、請求項27に記載の組成物。
【請求項２９】
界面活性剤が、ポリソルベートおよびポリオキシプロピレン-ポリエチレンエステルから選択される、請求項28に記載の組成物。
【請求項３０】
界面活性剤が、ポリソルベート、または、ポリソルベート20およびポリソルベート80から選択されるポリソルベートである、請求項28に記載の組成物。
【請求項３１】
界面活性剤が、0.001-1%の濃度、0.002-0.5%、0.004%、または0.01%の濃度で存在する、請求項28〜30のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記組成物が、ソルビトール、酢酸塩、水酸化ナトリウム、および注射用水を含有する、請求項1〜31のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記組成物のpHが、5.2から6.5までの間である、請求項1〜32のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記組成物が、カルシウムおよびビタミンDから選択される1つもしくは複数の成分を含有する、請求項1〜33のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項３５】
精巣において生殖細胞増殖の刺激に使用するための、ならびに/または哺乳動物において男性不妊の治療および/もしくは予防および/もしくは軽減に使用するための、ならびに/または哺乳動物において男性受精能の誘導もしくは改善に使用するための組成物であって、OPG（オステオプロテジェリン）、またはOPGを含む融合タンパク質を含む前記組成物。
【請求項３６】
精巣において生殖細胞増殖の刺激に使用するための、ならびに/または哺乳動物において男性不妊の治療および/もしくは予防および/もしくは軽減に使用するための、ならびに/または哺乳動物において男性受精能の誘導もしくは改善に使用するための組成物であって、デノスマブを含む前記組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、RANKL/OPGbpに選択的に結合し、RANKL/OPGbpとRANK/OPGとの間の相互作用を制御する、アンタゴニストもしくは阻害剤に関する。具体的には、本発明は、精子減少症または無精子症などの男性不妊もしくは男性受精能低下の、治療、予防、または軽減に使用するための、RANKL/OPGbpペプチドと免疫反応する抗体もしくは抗原結合ドメイン、その断片または誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
NFκB活性化受容体リガンド（RANKL）系は、骨の恒常性に重要とされ、3つの重要な要素を含んでなる。RANKLは、隣接細胞上の特異的受容体（NFκB活性化受容体(RANK)）に結合する膜貫通リガンドであって、前記特異的受容体は、その後NFκBを活性化し、細胞周期、すなわち増殖、分化、およびアポトーシスの制御を通じて細胞活性化を制御するものである。OPGは、RANKLと結合し、そのシグナル伝達を阻害する内在性分泌タンパク質である。
【０００３】
RANK/RANKLは、破骨細胞分化を促進する、TRAF経由キナーゼカスケードのネットワークの引き金を引く。RANKLは骨芽細胞上に発現し、その受容体RANKは前破骨細胞上に発現する。RANKL発現は、IL-1、IL-6、IL-11、IL-17、TNF-α、ビタミンD、Ca2+、副甲状腺、グルココルチコイド、プロスタグランジンE2、および免疫抑制薬などの数多くの要因によって刺激され、TGF-αによってダウンレギュレートされる。RANK/RANKL相互作用は、多核成熟破骨細胞の分化および形成を誘導し、骨吸収を引き起こす。第3のタンパク質作動薬、オステオプロテジェリン（OPG）も骨芽細胞によって産生されるが、これは前破骨細胞分化プロセスに阻害作用を及ぼすことが知られている。オステオプロテジェリン結合タンパク質（OPGbp）としても知られるRANKLに結合することによって、OPGはRANK/RANKL相互作用およびそれに続く破骨細胞形成を阻害する。したがってOPGは非常に効率的な再吸収阻害剤である。OPGはまた腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）のデコイ受容体としても機能し、このリガンドのアポトーシス効果をブロックすることによって細胞生存を高める。マウスにおけるOPGの過剰発現が結果的に重篤な大理石骨病をもたらすこと、ならびにOPGゼロのマウスは骨粗鬆症であるという事実は、OPGの生理学的重要性の証拠である。RANKもしくはRANKLの欠損はマウスでは大理石骨病を引き起こす。
【０００４】
したがって、RANK/RANKL系は骨吸収細胞（破骨細胞）の活性化にきわめて重要である。骨において、造骨細胞（骨芽細胞）はRANKLを発現し、そのRANKLは未熟な破骨細胞上のRANKにシグナルを伝える。これがその細胞の増殖および活性化を引き起こし、それが骨増殖および骨吸収を開始する。OPGは骨の体細胞によって産生されるが、この産生は性ホルモン、TGF-βおよび他のさまざまな物質によって制御される。現在では、骨粗鬆症を治療するために、人工的に作製された、RANKLに対する組換え抗体デノスマブが使用されるが、それは、デノスマブがRANKLシグナル伝達を阻害し、それによってヒトにおいて生じる骨吸収が減るからである。RANKLシグナル伝達は健康なヒトにおいて他に2つだけ既知の追加的機能を有するが、それはこのシグナル伝達が乳汁分泌および免疫細胞に関与するからである。
【０００５】
近年、神経筋疾患、遺伝性ミオパチーおよび/もしくは非遺伝性ミオパチーを治療するために、ならびに/または、骨格筋および心筋の廃用、疾患および老化を制御するためにRANK/RANKLアンタゴニストを使用することも、報告されている（WO 2013/067639 A1）。
【０００６】
精液特性の低下が男性不妊の主な要因である。精液特性は受精を達成することができる精液の能力の指標である。男性受精能力の評価は今日では、基本的に精液分析によって行われる。精液分析は、男性の精液の一定の性質、および精液中に含まれる精子を評価する。精子の特性を評価するために測定される、もっとも一般的な変量は、精子数、運動性、および形態である。
【０００７】
しかしながら、現在は、射精液中に精子のない男性に対する治療法はなく、精子数を増やすことができる薬物もない。
【発明の概要】
【０００８】
上皮内がんを伴う精子形成不全もしくは重篤な精巣発育不全の生検において、精細管周囲細胞におけるOPGの産生はなくなっているようである。これは、生殖細胞の増殖およびアポトーシスに影響を及ぼす可能性のある、拮抗的な抗RANKL抗体などのRANKLアンタゴニストもしくは阻害剤を用いて、ヒトを治療することが可能であることを示す。したがって、デノスマブなどの拮抗的抗RANKL抗体は、精子はないが精巣に生殖細胞は存在する男性の治療として新たな効能を有する可能性がある。あるいはまた、対応するもう一方（RANKL）を使用して、反対の効果である男性避妊法を得ることができる。
【０００９】
本発明者らは最近、ヒトおよびマウスの精巣において、RANKL、RANK、およびOPGがRNAレベルでもタンパク質レベルでも発現していることを示した。セルトリ細胞はRANKLを発現するのに対して、生殖細胞はRANKを発現し、精細管周囲細胞はOPGを発現する。通常、RANKLはNFκBを活性化するが、男性生殖腺におけるこの経路の活性化は、精巣において精巣細胞が増殖するかアポトーシスを受けるかを決定する。したがって、この経路は、生殖細胞増殖の新たな制御要素となるように思われる。このことは、実施例3-5においてさらに実証されたが、特異的化合物（OPGで示される）および特異的抗体（デノスマブ）がいずれも精液特性にプラスの影響を及ぼすことができることを示している。
【００１０】
アンタゴニストもしくは阻害剤を提供することが本発明の目的であるが、それはたとえば、RANKLとRANKとの相互作用を制御する抗体もしくは抗原結合ドメインであり、より詳細には、RANKLとRANKとの相互作用をブロックする、および/またはRANKLの少なくとも1つの活性を阻害する抗体もしくは抗原結合ドメインであって、この活性は男性不妊もしくは男性受精能低下をもたらすものである。男性不妊もしくは男性受精能低下の治療、予防、または軽減に用いられる、抗体もしくは抗原結合ドメイン、その断片または誘導体を提供することが本発明のもう1つの目的である。精巣においてRANKLとRANKとの相互作用を制御し、RANKLの少なくとも1つの活性を中和する抗体もしくは抗原結合ドメイン、またはその断片もしくはバリアントを提供することが、本発明のもう1つの目的である。抗体もしくは抗原結合ドメイン、その断片、または誘導体は、精子減少症または無精子症などの男性不妊もしくは男性受精能低下の治療、予防または軽減に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、1〜23で表されるヒト検体から選択された転写物のRT-PCRを示す。2つの異なるプライマーセットは、正常な精巣検体および病的な精巣検体において2つの異なるRANKLアイソフォームを検出した。正常な精巣検体および病的な精巣検体において、RANKおよびOPGも発現されるが、正常な精巣と比べてCISおよびセミノーマではOPG発現が薄れている。興味深いことに、RANKLの1つのアイソフォームだけが、セルトリ細胞唯一症候群の検体において発現されるが、このアイソフォームは卵巣では発現されておらず、性別に特異的なRANKLアイソフォームを意味する。このアイソフォームはNTera2細胞では発現されないがTCAM2細胞では発現される。RANKはセミノーマ以外では存在しないか発現が弱く、NFκBおよびRELa+bはすべての検体で発現される。
【図２Ａ】図2Aは、正常なビタミンD受容体を有するSwissマウス（Vdr wt）または変異して不活性のビタミンD受容体を有する同マウス（Vdr KO）から選択された転写物のRT-PCRを示す。プライマーセットはRANKLを検出したが、その発現はVdr KOマウスでは低いかまたはみられない。RANK、OPG、RELaは全動物で発現されるが、NFκBはVdr KOマウスのほうが発現が弱いように見える。
【図２Ｂ】図2Bは、正常なVdrを有するマウス(wt)、一方のアレルが不活性なマウス(+/-)、または2つのアレルが不活化されたマウス(-/-)由来のRANKLの定量的PCRを示す。ヘテロ接合体およびホモ接合体変異マウスにおけるRANKLの著しいダウンレギュレーションから、主要なアイソフォームは、ビタミンDにより制御されるRANKL1であって、アイソフォーム3ではないことは明らかである。
【図３】図3は、ヒトから得られた正常な精巣および上皮内がん細管におけるRANKLおよびRANKの免疫組織化学的発現に加えて正常なマウスにおける発現をしめす。RANKは生殖細胞で発現されるが、RANKLはセルトリ細胞において、ならびに生殖細胞の後期に発現される。
【図４】図4：20時間処理後のNT2細胞の生存率/増殖、通常培地中14時間培養 + レサズリン色素とともに4時間。すべての処理は100 ng/mlの濃度とする。値は平均 ± 標準偏差(n = 8)であり、* はt検定後の有意差p<0.05を示す。
【図５】図5：4時間および20時間処理後のTCam-2細胞の生存率/増殖、通常培地中10時間培養 + レサズリン色素とともに6.5時間。すべての処理は100 ng/mlの濃度とする。値は平均 ± 標準偏差(n = 8)であり、* はt検定後の有意差p<0.05を示す。
【図６】図6は、ヒトex vivoモデルにおける生殖細胞増殖を示す。生殖細胞増殖は、ヒト精巣検体（N=3）を溶媒（DMSO）、100 ng/ml RANKLまたは100 ng/mlデノスマブで48時間処理した後のBrdU取り込みによって評価し、50 ng/ml OPG、100 ng/ml CSF-1、および100 ng/ml PTHrPで処理した精巣と比較した。データは増殖の平均変化 + 標準誤差として提示され、データは溶媒処理サンプルに対して標準化される。
【図７】図7は、上皮内がん細胞を管内に含有するex vivoヒト精巣モデルにおいて、増殖（上図）およびアポトーシス（下図）に及ぼす、RANKL、CSF-1、デノスマブ、および対照処理の影響を示す。BrdUもしくはカスパーゼ3を発現する生殖細胞の平均数をカウントして、処理の間で効果を比較した。
【図８】図8は、溶媒、OPG、またはRANKLで処理されたマウスの全精巣重量を示す。精巣重量は、マウス15匹の14日処理後に評価した（5匹が溶媒、RANKL、またはOPGの各処理に無作為に割り付けられた）。データは平均 + 標準誤差として提示され、データは溶媒処理サンプルに対して標準化される。* はp<0.05、*** はp<0.001を示す。
【図９】図9は、溶媒、OPG、またはRANKLで処理されたマウスの精巣上体の全重量を示す。精巣重量は、マウス15匹の14日処理後に評価した（5匹が溶媒、RANKL、またはOPGの各処理に無作為に割り付けられた）。データは平均 + 標準誤差として提示され、データは溶媒処理サンプルに対して標準化される。NSはp>0.05、* はp<0.05を示す。
【図１０】図10は、10週齢マウスの精巣の形態を示す。10週齢マウスの精巣をブアン（Bouin）液で固定し、生殖細胞上皮（ステージ6-12）を有する精細管を評価した（各処理群からN=3）。溶媒もしくはOPGで14日間処理したマウスの、細管直径（上図）および生殖細胞上皮の厚さ（下図）の比較。棒グラフは平均±標準誤差を表す。
【図１１】図11は、溶媒（ビヒクル）もしくはOPGで処理したマウスの精子数を示す。精子数は、1ml PBS中で精巣上体尾部を細かく刻んだ後、評価した（5匹が溶媒またはOPGの各処理に無作為に割り付けられた）。データは平均 + 標準誤差として提示される。* はp<0.05を示す。
【００１２】
これより本発明を下記においてより詳細に説明する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
定義
本発明をさらに詳細に検討する前に、次の用語および手法を最初に定義する：
本発明の抗体および抗原結合ドメインは、RANKL/OPGbpに選択的に結合するが、すなわち、それらは、他の抗原に対するよりも強い結合親和性によってRANKL/OPGbpに優先的に結合する。抗体はヒトRANKL/OPGbpに選択的に結合するが、非ヒトRANKL、たとえばマウスRANKLにも検出できるほど結合する可能性がある。あるいはまた、抗体はもっぱらヒトRANKLまたはRANKに結合するが、それぞれ非ヒトRANKLまたはRANKには検出可能な結合をしないこともある。
【００１４】
「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体を指すが、この個々のモノクローナル抗体は典型的には、抗原上の単一のエピトープを認識する。「モノクローナル」という用語は、いかなる個別の抗体作製法にも限定されない。たとえば、本発明のモノクローナル抗体は、Kohler et al. Nature 256, 495 (1975)に記載のハイブリドーマ法によって作製することができるが、たとえば本明細書に記載の技術を用いてファージライブラリーから単離することもできる。
【００１５】
「抗原結合ドメイン」または「抗原結合領域」または「その断片もしくは誘導体」という表現は、選択的結合物質（たとえば抗体分子など）の一部分を指しており、この一部分は、抗原と相互作用し、結合物質に、抗原に対するその特異性および親和性を与えるアミノ酸残基を含有する。抗原結合領域はヒト由来であることが好ましい。他の実施形態において、抗原結合領域は他の動物種由来であってもよく、具体的には家畜および齧歯動物、たとえばウサギ、ラットもしくはハムスター由来とすることができる。
【００１６】
「有効な量」および「治療上有効な量」という表現は、RANKLペプチドと免疫反応する抗体もしくは抗原結合ドメイン、その断片または誘導体に関連して用いられる場合、RANKLの1つもしくは複数の生物活性レベルの観測可能な変化を支えるために有用な、または必要な、選択的結合物質の量を指しているが、前記の変化はRANKL活性レベルの増加であることも減少であることもある。
【００１７】
本発明に関連して「配列同一性」という用語は、2つのアミノ酸配列の間の、または2つの核酸配列の間の、相同性の程度の定量的尺度を示す。比較すべき2つの配列が同じ長さでない場合、可能な限り最高の一致を与えるようにそろえて並べなければならず、ギャップの挿入、あるいはポリペプチド配列もしくはヌクレオチド配列の末端におけるトランケーションを許容する。配列同一性は、(Nref - Ndif)100/Nrefとして計算することができるが、このNdifは、アラインしたときに2つの配列において同一でない残基の数であり、Nrefは一方の配列の残基数である。したがって、DNA配列AGTCAGTCは、配列AATCAATCに対して75%の配列同一性を有することになる（Ndif=2およびNref=8）。ギャップは、その特定残基（1つもしくは複数）が同一でないとしてカウントされるので、言い換えれば、DNA配列AGTGTCは、DNA配列AGTCAGTCに対して75%の配列同一性を有することになる（Ndif=2およびNref=8）。
【００１８】
アミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列に関する本発明のあらゆる実施形態について、1つもしくは複数の配列間の配列同一性のパーセンテージは、ClustalWソフトウェア（http:/www.ebi.ac.uk/clustalW/index.html）をデフォルト設定で用いたアライメントに基づいていてもよい。ヌクレオチド配列アライメントについて、これらの設定は次の通りである：Alignment=3Dfull, Gap Open 10.00, Gap Ext. 0.20, Gap separation Dist. 4, DNA weight matrix: identity (IUB)。アミノ酸配列について、設定は次のとおりである：Alignment=3Dfull, Gap Open 10.00, Gap Ext. 0.20, Gap separation Dist. 4, Protein weight matrix: Gonnet。
【００１９】
あるいはまた、ヌクレオチド配列はプログラムDNASIS Maxを用いて分析してもよく、配列比較はhttp://www.paralign.org/において行うことができる。このサービスはSmith-Waterman (SW)およびParAlignと称される2つの比較アルゴリズム基づいている。最初のアルゴリズムはSmithおよびWatermanにより公開されたが(1981)、2つの配列の最適ローカルアライメントを見いだす確立された方法である。もう一方のアルゴリズム、ParAlignは、配列アライメントのためのヒューリスティックな方法である；その方法に関する詳細はRognes (2001)に発表されている。スコア行列およびギャップペナルティならびにE値についてデフォルト設定を用いた。
【００２０】
医学的用途の化合物
第1の態様において、本発明は化合物を提供するが、その化合物は、オステオプロテジェリン結合タンパク質（OPGbp）/NFκB活性化受容体リガンド（RANKL）のNFκB活性化受容体（RANK）との結合のアンタゴニストもしくは阻害剤であって、精巣において（生殖）細胞増殖を刺激するのに使用するため、ならびに/または、哺乳動物において男性不妊の治療および/もしくは予防に使用するため、ならびに/または、哺乳動物において男性受精能を誘導もしくは改善するのに使用するためのものである。
【００２１】
化合物はより詳細には、RANKLに結合することができる作用物質とすることができる。
【００２２】
さらに、化合物はタンパク質性結合物質とすることができるが、これはRANKLとの結合に対して選択的である。
【００２３】
したがって、本発明の特定の実施形態によれば、上記のように使用するための化合物は、OPG、OPGを含む融合タンパク質、たとえばFc-OPGなど、およびヒト免疫グロブリンG1からなる1群から選択される。実施例4および図6において、生殖細胞増殖に及ぼすOPGの影響を示すデータが与えられる。実施例5および図8-11では、マウスin vivo実験において精巣パラメーターに及ぼすOPGの影響を示すデータが与えられる。
【００２４】
本発明の具体的な態様において、本発明は、精巣において（生殖）細胞増殖の刺激に使用するための、ならびに/または、哺乳動物において男性不妊、たとえば精子減少症または無精子症の治療および/もしくは予防に使用するための、ならびに/または、哺乳動物において男性受精能を誘導もしくは改善するのに使用するための、OPG、OPGを含む融合タンパク質、たとえばFc-OPGなど、およびヒト免疫グロブリンG1に関する。
【００２５】
マウスおよびヒトRANKLのヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号1および3に示す。マウスおよびヒトRANKLアミノ酸配列はさらに、それぞれ配列番号2および4に示される。
【００２６】
RANKL配列のコンピューター解析は、RANKLが2型膜貫通タンパク質であることを示した。したがって、マウスRANKLタンパク質は、予想されるように、47アミノ酸の細胞内ドメイン、21アミノ酸の膜貫通ドメイン、および247アミノ酸の細胞外ドメインを含有する。ヒトRANKLは、予想されるように、47アミノ酸の細胞内ドメイン、21アミノ酸の膜貫通ドメイン、および249アミノ酸の細胞外ドメインを含有する。
【００２７】
可溶性RANKLは、シグナルペプチドおよび細胞外ドメインまたはその断片を含有する。
【００２８】
RANKLは、膜貫通ドメインと受容体結合ドメインの間に、生物活性に必要ないと思われるアミノ酸領域を有する、TNFファミリーの他のメンバーに類似している。アミノ酸配列のアライメントに基づいて、ヒトRANKLの受容体結合ドメインは、多くのファミリーメンバーの間で高度に保存されているAla残基、すなわち配列番号4のアミノ酸162から始まる、配列番号4のほぼアミノ酸162からアミノ酸317までであると考えられる。マウス受容体結合ドメインは、配列番号2のほぼアミノ酸138からアミノ酸294までである。
【００２９】
しかしながら、当業者は、実際の受容体結合ドメインがアライメントおよびコンピューター解析によって予測されたものとは異なる可能性があることに気付くであろう。
【００３０】
可溶性RANKLポリペプチドのN-末端アミノ酸は、両側で保存されたAla残基から約5残基以内にあると予想される。あるいはまた、結果として生じる可溶性RANKLが膜結合性でない場合、スペーサー領域の全部もしくは一部は、膜貫通および/または細胞内ドメインの全部もしくは一部がそうであるように、可溶性RANKLペプチドのN末端に含まれる可能性がある。
【００３１】
したがって、可溶性RANKLポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸1から139に相当する、配列番号4の番号1から162までのアミノ酸からなる1群から選択されるN末端アミノ酸を有することになる。あるいはまた、N末端アミノ酸は配列番号2（マウスRANKL）のアミノ酸48から139に相当する、配列番号4（ヒトRANKL）の番号69から162の間である。
【００３２】
同様に、C末端アミノ酸は配列番号4のアミノ酸313から317の間とすることができる。
【００３３】
OPG-RANK-RANKLシグナル伝達経路の発見以来、RANKL機能およびシグナル伝達の阻害剤がいくつか、臨床用の候補として評価および/または開発されてきた。RANKL阻害剤開発の総説は、Lacey et al.,Nature Reviews, (2012), Vol. 11, 401-419に示されている。これらの阻害剤は、組換え型の全長OPGおよびRANK-Fcを含んでいるが、これはRANKの4つの細胞外CRD、およびヒトIgGのFcタンパク質を含有する融合タンパク質である。
【００３４】
RANKLに結合することができる抗体もしくはその断片
本発明の他の実施形態によれば、上記のように使用するための化合物は、OPGbp/RANKLペプチド、特にヒトOPGbp/RANKLペプチドと免疫反応する化合物である。あるいはまた、抗体はRANKペプチド、特にヒトRANKペプチドと免疫反応することができる。免疫反応性化合物は、具体的には、抗体、抗原結合ドメイン、抗体もしくは抗原結合ドメインの断片、または抗体もしくは抗原結合ドメインの誘導体からなる1群から選択することができる。
【００３５】
OPGbp/RANKLペプチドと免疫反応する化合物、たとえば、本発明の、前記抗原結合ドメイン、抗体もしくは前記結合ドメインの前記断片、または抗体もしくは抗原結合ドメインの前記誘導体などは、アンタゴニスト化合物とすることができるが、それはRANKLの少なくとも1つの生物活性のレベルを低下させる。RANKLのアンタゴニスト抗体は、RANKLの抑制抗体もしくは中和抗体とも呼ぶことができる。
【００３６】
同様に、RANKペプチドと免疫反応する化合物、たとえば、本発明の、前記抗原結合ドメイン、抗体もしくは前記結合ドメインの前記断片、または抗体もしくは抗原結合ドメインの前記誘導体などは、アンタゴニスト化合物とすることができるが、それはRANKの少なくとも1つの生物活性のレベルを低下させる。RANKのアンタゴニスト抗体は、RANKの抑制抗体もしくは中和抗体とも呼ぶことができる。
【００３７】
具体的には、本発明にしたがって使用するための化合物は、RANKLシグナル伝達の阻害剤であってもよい。本発明に関連して、前記抗原結合ドメイン、抗体もしくは前記結合ドメインの前記断片、または抗体もしくは抗原結合ドメインの前記誘導体などの化合物は、実質的にリガンドと受容体との結合、たとえばRANKLとRANKとの結合を阻害する能力を有する可能性がある。
【００３８】
過剰な抗体が、対抗受容体もしくはリガンドと結合する受容体量を、少なくとも約20%、40%、60%、80%、85%、90%、またはそれ以上減少させる場合、抗体は実質的にリガンドと受容体との結合を阻害する（in vitro競合的結合アッセイで測定）。
【００３９】
本発明にしたがって使用される化合物は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、重鎖および軽鎖が可動性リンカーによって連結された抗体、Fv分子、抗原結合断片、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2 分子、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびキメラ抗体からなる1群から選択される化合物とすることができる。
【００４０】
前記抗体の「重鎖」および「軽鎖」という用語はそれぞれ、OPGbp/RANKLペプチドに対する特異性を与えるのに十分な可変領域配列を有する、任意のポリペプチドを含む。全長重鎖には、可変領域ドメイン、VH、ならびに3つの定常領域ドメイン、CH1、CH2、およびCH3が含まれる。VHドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にあり、CH3ドメインはカルボキシ末端にある。本明細書で使用される「重鎖」という用語は、全長重鎖およびその断片を含む。全長重鎖は可変領域ドメイン、VL、および定常領域ドメイン、CLを含有する。重鎖と同様に、軽鎖の可変領域ドメインはポリペプチドのアミノ末端にある。本明細書で使用される「軽鎖」という用語は、全長軽鎖およびその断片を含む。Fabフラグメントは、1本の軽鎖およびCHおよび1本の重鎖の可変領域からなる。Fab分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。Fab'フラグメントは1本の軽鎖、およびCH1とCH2の間に定常領域をより多く含む1本の重鎖を含有するので、鎖間ジスルフィド結合を2本の重鎖の間に形成することが可能であり、F(ab')2分子を形成する。Fv領域は重鎖および軽鎖の双方の可変領域を含むが、定常領域を欠く。一本鎖抗体は、重鎖および軽鎖の可変領域を柔軟なリンカーで結んで、抗原結合領域を形成する一本のポリペプチド鎖となったFv分子である。一本鎖抗体はWO 88/01649ならびに米国特許第4,946,778号および第5,260,203号において詳細に検討されている。
【００４１】
上記のように、抗RANKL/OPGbp抗体および抗原結合ドメインは、OPGbp/RANKLの少なくとも1つの活性を阻害するものであるが、それが同定された。本発明の実施形態は、重鎖Fabを含有し、κもしくはλ軽鎖配列をさらに含有する抗体を含む。本発明の抗体はさらに、IgG、IgM、IgA、IgE、もしくはIgDのいずれかの、任意のアイソタイプのヒトFc領域を含有する。Fc領域はヒトIgG、たとえば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4などのものであることが好ましい。
【００４２】
本発明はまた、本明細書に記載のFab配列の断片、バリアントもしくは誘導体を含有する、抗体または抗原結合ドメインを提供する。断片は、軽鎖もしくは重鎖のFab配列の可変ドメインを含有することができるが、これらは典型的には軽鎖もしくは重鎖の定常ドメインに結合している。抗体は、典型的には、重鎖および軽鎖の定常領域を伴って、全長抗体を形成することができる。
【００４３】
本発明の抗体および抗原結合ドメイン、ならびにその断片、バリアント、および誘導体は、RANKLポリペプチド、好ましくはヒトRANKLポリペプチドに選択的に結合する能力を保持しているものとする。ある実施形態において、抗体および抗原結合ドメイン、ならびにその断片、バリアント、および誘導体は、約≦1 nM、もしくは≦0.1 nM、もしくは≦10 pM、もしくは≦10 pMの解離定数(KD)をもってRANKLポリペプチドと結合するものとする。
【００４４】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、単一特異性ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、一本鎖抗体、および/または二重特異性抗体を含む。抗体断片は、抗RANKL抗体の、RANKLポリペプチド上のエピトープに結合する部分を含有する。このような断片の例には、fab (ab')、F(ab')、Fv、およびsFvフラグメントがある。抗体は、全長抗体の酵素的切断によって作製することができるが、たとえば抗体可変領域をコードする核酸配列を含有する組換えプラスミドの発現などの、組換えDNA技術によって作製することもできる。
【００４５】
ポリクローナル抗体は、抗原で免疫した動物の血清に由来する、抗体分子の不均一集団である。抗原は、抗体による結合を受ける能力を有する分子またはその一部分であって、それはさらに、動物に、その抗原のエピトープに結合することができる抗体の産生を引き起こす能力も有している。抗原は1つもしくは複数のエピトープを有する可能性がある。上記の特異的な反応は、抗原がそれに対応する抗体と、高い選択性をもって反応し、他の抗原によって惹起される他の多数の抗体とは反応しないことを示すものである。
【００４６】
RANKLポリペプチドに対するポリクローナル抗体は一般に、動物（たとえばウサギもしくはマウス）において、RANKLおよびアジュバントを複数回皮下注入もしくは腹腔内注入することによって生じる。本発明にしたがって、RANKLポリペプチド、またはそのバリアント、断片、もしくは誘導体を、免疫化すべき動物種において免疫原性であるキャリアタンパク質、たとえば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターなどにコンジュゲートすることは、有用であると考えられる。また、免疫反応を増強するためにミョウバンなどの凝集剤が使用される。免疫化後、動物から採血し、抗RANKL抗体の力価について血清をアッセイする。
【００４７】
モノクローナル抗体(nAb)は、抗原に特異的な抗体の実質的に均一な集団を含むが、その集団は、実質的に類似したエピトープ結合部位を含有する。そのような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgD、およびそれらの任意のサブクラスを含めた、任意の免疫グロブリンクラスのものであってよい。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、in vitro、in situ、またはin vivoで培養することができる。in vivoまたはin situで高力価を生じることが、好ましい生産方法である。
【００４８】
OPGbp/RANKLに対するモノクローナル抗体は任意の方法によって生産されるが、その方法は、培養下の連続継代細胞株による抗体分子の生産をもたらす。モノクローナル抗体を調製するために適した方法の例には、Kohlerらによるハイブリドーマ法、Kohler et al., Nature 256, 495-497 (1975)、ならびに、ヒトB細胞ハイブリドーマ法、Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); およびHarlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)がある；これらの文献の内容は、参考としてその全体を本明細書に含めるものとする。
【００４９】
OPGbp/RANKLに対するモノクローナル抗体を作製するための特に好ましい方法は、Green, LL, J. Immunol. Methods (1999), Vol. 231, 11-25に記載のXenoMouseを、たとえば全長ヒトRANKLタンパク質などのOPGbp/RANKLペプチドによって免疫化することを含む。
【００５０】
好ましい抗RANKLまたは抗RANK抗体としては、ヒトRANKL受容体、RANK、に対するヒトRANKLの結合を、部分的に、または完全に阻害するモノクローナル抗体、または実質的にそれと同じ特異的結合特性を有する抗体、ならびにその断片および領域が挙げられる。モノクローナル抗体の特異性および親和性を競合阻害によって測定する好ましい方法は、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988 ), Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)、およびMuller, Meth. Enzymol., 92:589-601 (1983)に見いだすことができる。
【００５１】
キメラ抗体は、異なる部分が別々の動物種に由来する分子であって、たとえば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域、およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなどである。キメラ抗体は基本的に、適用において免疫原性を減らすために、そして製造での収率を上げるために使用され、たとえば、マウスモノクローナル抗体はハイブリドーマから高い収率を示すが、ヒトにおいて高い免疫原性を示す場合には、ヒト/マウスキメラモノクローナル抗体が使用される。
【００５２】
キメラ抗体およびそれらの製造方法は当業者に知られている。Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3273-3277 (1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature, 312:643-646 (1984); Neuberger et al., Nature, 314:268-270 (1985); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:3439-3443 (1987); およびHarlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)を参照されたい。
【００５３】
たとえば、本発明のキメラモノクローナル抗体は、治療用物質として使用することができる。こうしたキメラ抗体において、重鎖および/または軽鎖の一部分は、特定の種に由来する抗体、または特定の1つの抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の、対応する配列と同一または相同であるが、鎖の残りの部分は、別の種に由来する抗体、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の、対応する配列と同一または相同であって、望ましい生物活性を示す限りそうした抗体の断片も同様である（U.S. Patent No. 4, 816, 567 ; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , 81, 6851-6855 (1985)を参照されたい）。
【００５４】
本明細書で使用される「キメラ抗体」という用語は、1価、2価または多価免疫グロブリンを含む。1価キメラ抗体は、ジスルフィド橋を通じてキメラL鎖と結合したキメラH鎖により形成された二量体（HL）である。2価キメラ抗体は、少なくとも1つのジスルフィド橋を通じて結合した2つのHL二量体により形成された四量体（H2L2）である。多価キメラ抗体も、たとえば、凝集したCH領域を使用することよって作製することができる（たとえばIgM H鎖、または[マイクロ]鎖から）。
【００５５】
本発明のマウスおよびキメラ抗体、断片、ならびに領域は、個別の免疫グロブリン重(H)鎖および/または軽(L)鎖を含有することができる。キメラH鎖は、RANKLに特異的な非ヒト抗体のH鎖に由来する抗原結合領域を含有し、それはヒトH鎖C領域（CR）の少なくとも一部分、たとえばCH1もしくはCH2に連結されている。
【００５６】
本発明のキメラL鎖は、RANKL特異的な非ヒト抗体のL鎖由来の抗原結合領域を含有するが、それはヒトL鎖C領域（CL）の少なくとも一部分に連結されている。
【００５７】
同一の、または異なる可変領域結合特異性をもつキメラH鎖およびL鎖を有する選択的結合物質、たとえば抗体、断片、もしくは誘導体などは、たとえばAusubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, N.Y. (1993 )、およびHarlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988 )などによる既知の方法ステップにしたがって、個別のポリペプチド鎖を適切に結合することによって調製することもできる。これらの文献の内容は、参考としてその全体を本明細書に組み入れる。このアプローチによって、キメラH鎖（またはその誘導体）を発現する宿主は、キメラL鎖（またはその誘導体）を発現する宿主とは別々に培養され、免疫グロブリン鎖は別々に回収された後、連結される。あるいはまた、宿主を共培養し、培養培地中で鎖が自然発生的に結合するようにして、その後、アセンブルされた免疫グロブリン、断片、または誘導体を回収することもできる。
【００５８】
一例として、本発明の選択的結合物質（たとえばキメラ抗体など）の抗原結合領域は、ヒトRANKLに特異的な非ヒト抗体に由来することが好ましい。このような非ヒト抗体をコードするDNAの好ましい起源には、抗体を産生する細胞株、たとえばハイブリドーマとして一般に知られているハイブリッド細胞株などがある。
【００５９】
本発明はまた、抗RANKL抗体の断片；バリアントおよび誘導体、ならびに融合物を与えるが、この「断片」、「バリアント」、「誘導体」および「融合物」という用語は、上記で定義されている。本発明は、抗RANKL抗体の断片、バリアント、誘導体、および融合物を提供するが、これらは未改変抗RANKL抗体に機能的に類似しており、すなわち、未改変抗体の活性のうち少なくとも1つを保持している。上記の改変に加えて、細胞毒性タンパク質、たとえば植物および微生物毒素をコードする追加の遺伝子配列も含有する。抗RANKL抗体の断片、バリアント、誘導体、および融合物は、本発明のいかなる宿主からも作製することができる。
【００６０】
適当な断片には、たとえば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、およびscFvが含まれる。これらの断片は、インタクトな抗体のFcフラグメントを欠き、血液循環から急速に排除されるので、インタクトな抗体よりも非特異的組織結合を減らすことができる。Wahl et al., J. Nucl. Med., 24:316-325 (1983)を参照されたい。こうした断片は、当技術分野で周知の方法を用いて、たとえば、パパイン（Fabフラグメントを生成する）またはペプシン（F(ab')2フラグメントを生成する）などの酵素によるタンパク質分解的切断によってインタクトな抗体から作製される。上記の抗原結合領域、および/または本発明のモノクローナル抗体によって認識されるエピトープの同定は、本出願の実施形態に匹敵する、類似した結合特性ならびに治療上もしくは診断上の有用性を有する追加のモノクローナル抗体を作製するために必要な情報を提供する。
【００６１】
具体的な実施形態において、本発明の抗体または抗原結合ドメイン、その断片もしくは誘導体は、下記からなる1群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれらで構成される、ペプチドもしくはポリペプチドと免疫反応する：
i) 配列番号2または配列番号4に記載のアミノ酸配列；
ii) 配列番号3のヌクレオチド1から951に示すヌクレオチド配列を含有するDNA分子によりコードされるアミノ酸配列；
iii) 配列番号11に記載のアミノ酸配列；
iv) i)-iii)に記載の配列のうちいずれか1つの部分配列であって、配列番号11に記載のRANKポリペプチドに結合することができる前記部分配列；ならびに
v) i)-iii)に記載の配列のいずれかに対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列；たとえば、i)-iii)に記載の配列のいずれかに対して少なくとも91、92、93、94、95、96、97、98、99または99.5%の配列同一性を有する配列。
【００６２】
特定の実施形態において、上記部分配列のアミノ末端アミノ酸残基は、配列番号4のアミノ酸残基番号1-162のいずれか1つである。
【００６３】
さらに他の実施形態によれば、前記部分配列のカルボキシ末端アミノ酸残基は、配列番号4のアミノ酸残基番号313-317のいずれか1つである。
【００６４】
それに加えて、部分配列は、配列番号3のヌクレオチド484-951に示すヌクレオチド配列を含むDNAによってコードされるアミノ酸配列とすることができる。
【００６５】
本発明は抗RANKL/OPGbp抗体、または抗原結合ドメインを提供するが、それらはRANKL/OPGbp上のエピトープを認識して結合し、阻害および/または中和する。この結合の結果として、抗RANKL抗体は、RANKLとその受容体との結合を部分的または完全に阻害することができるが、その結果、精子形成を部分的または完全に増加させることができる。より詳細には、本発明は抗RANKL抗体を提供するが、それはRANKL/OPGbpのDEドメイン（「DEエピトープ」）のアミノ酸配列の一部を含むエピトープを認識して結合する。RANKLのDE領域は、概ねDおよびEβシート領域、ならびに間に介在するループ配列（「DEループ」）に及ぶ。ヒトRANKLのDEドメインは、アミノ酸残基約212からアミノ酸残基約250まで（両端含む）を含有する。ヒトRANKL/OPGbpのDEドメインを配列番号5に示す。しかしながら、ヒトRANKLのDEドメインのアミノ酸配列および終端は、単なる一例にすぎず、当然のことながら、DEドメインはヒトRANKLのものとは異なる配列および終端を有することができる。本発明は、このような変化しうるDEドメインに結合する抗体を包含する。
【００６６】
抗RANKL/OPGbp抗体、または抗原結合ドメインはDEドメイン内の任意の位置に結合しうると考えられるが、好ましい実施形態は、次のような抗RANKL/OPGbp抗体であって、それはDEループの少なくとも一部に結合する。ヒトRANKLのDEループは、概ね5アミノ酸に及んでおり、おおよそ残基230-234（両端含む）に位置する。ヒトRANKL/OPGbpのDEループは、配列DLATEを有する。しかしながら、ヒトRANKL/OPGbpのDEループのアミノ酸配列および終端は、単に一例であって、当然のことながら、DEループは、ヒトRANKL/OPGbpのものとは異なる配列および終端を有することができる。本発明はこのような変化しうるDEループに結合する抗体に関する。
【００６７】
本発明の抗体は、それが結合するRANKL/OPGbp上のアミノ酸配列によってある程度は特徴付けられるが、当業者には当然のことながら、抗体によって認識されるRANKL/OPGbp上のDEエピトープは典型的には3次元構造を含んでおり、それはDEドメインの外側のアミノ酸を巻き込んでいる可能性がある。RANKL/OPGbp配列を直線で表現した場合、DEエピトープを構成するアミノ酸は、DEドメインから離れていてもよいが、RANKL/OPGbpの3次元構造では、DEエピトープのアミノ酸は、DEドメインにきわめて近接して存在する可能性が高い。したがって、抗RANKL/OPGbp抗体のDEエピトープとの結合は、DE領域にあるアミノ酸以外のアミノ酸が関与する可能性があると考えられる。それでもやはり、DEループのアミノ酸残基、特に配列DLATEの残基の一部またはすべてが、RANKL/OPGbpとの結合およびRANKL/OPGbp活性の阻害に関与することが示された。
【００６８】
選択的結合物質のバリアントも提供される。ある実施形態において、抗体および抗原結合ドメインのバリアントは、軽鎖および/または重鎖アミノ酸配列に変化を有し、その変化は自然発生的であるか、または組換えDNA技術を用いた天然配列のin vitro操作によって導入されるものである。自然発生バリアントには「体細胞」バリアントがあるが、これは外来抗原に対して抗体反応を生じる時に、対応する生殖細胞系列ヌクレオチド配列においてin vivoで生じる。
【００６９】
抗RANKL/OPGbp抗体および抗原結合ドメインのバリアントは、当技術分野で知られている変異誘発技術によって調製することもできる。一例を挙げると、アミノ酸の変化は、抗体コード領域のあらゆる場所にランダムに導入することができ、その結果得られたバリアントは、望ましい活性、たとえばRANKL/OPGbpへの結合親和性、を求めてスクリーニングすることができる。あるいはまた、アミノ酸の変化は、抗RANKL/OPGbp抗体の選ばれた領域、たとえば軽鎖および/または重鎖CDRおよびフレームワーク領域に導入してもよく、その結果得られた抗体は、RANKLとの結合または何か他の活性を求めてスクリーニングすることができる。アミノ酸の変化は、CDRにおける1つもしくは複数のアミノ酸置換を包含するが、それは、たった1つのアミノ酸の相違から、たとえばCDR3など所定のCDR内におけるアミノ酸の可能な限りあらゆる並べ替えの導入にまで及ぶ。別の方法において、CDR内の少なくとも1残基をアラニンで置換することによって、CDR内の各残基の、RANKL/OPGbp結合への寄与を評価することができる（Lewis et al., Mol. Immunol. 32. 1065-1072 (1995)）。そこで、RANKLとの結合に最適ではない残基を、もっとよい配列を決定するために変更することができる。CDR、たとえばCDR3などのサイズを大きくするためにアミノ酸を挿入することによって作製されたバリアントも含まれる。たとえば、ほとんどの軽鎖CDR3配列は、9アミノ酸の長さである。9残基より短い抗体軽鎖CDR3配列は、CDRの長さを伸ばすように適当なアミノ酸を挿入することによって、RANKL/OPGbpとの結合に最適化することができる。
【００７０】
ある実施形態において、抗体または抗原結合ドメインのバリアントは、重鎖または軽鎖CDR1、CDR2またはCDR3の1つもしくは複数において、ならびに、場合によっては、重鎖または軽鎖フレームワーク領域FR1、FR2またはFR3の1つもしくは複数において、1つもしくは複数のアミノ酸の変化を有する。アミノ酸の変化は、アミノ酸残基の置換、欠失、および/または挿入を含む。前記"AT"重鎖および軽鎖可変領域バリアントは、フレームワーク領域内にさらに1つもしくは複数のアミノ酸の変化を含む。一例を挙げると、体細胞変異したフレームワーク残基をその位置で生殖細胞系列残基で置き換えるために、1つもしくは複数のアミノ酸の変化を導入することができる。前記アミノ酸変化が置換である場合、その変化は保存的置換であっても非保存的置換であってもよい。
【００７１】
具体的な実施形態において、本発明の抗体もしくは抗原結合ドメインは、下記からなる1群から選択されるアミノ酸配列と免疫反応する：
i) 配列番号5（ヒトRANKL D-Eドメイン：GFYYLYANICFRHHETSGDLATEYLQLMVYVTKTSIKIP）に記載のアミノ酸配列；および
ii) i)のアミノ酸の部分配列であって、当該部分配列もしくはバリアントが配列番号6（ヒトDEエピトープDLATE）に記載の配列を含んでなる、前記部分配列。
【００７２】
別の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、ヒトモノクローナル抗体もしくは抗原結合ドメインである。抗体は全長ヒトモノクローナルIgG2であってもよい。
【００７３】
概して、IgG2アイソタイプの抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害などの関連エフェクター機能がほとんどないので、このアイソタイプの抗体は好ましい。
【００７４】
特定の実施形態において、本発明の抗体は、下記からなる1群から選択されるアミノ酸を含む重鎖を有する：
i) 配列番号7（αRANKL-1の重鎖）に記載のアミノ酸；
ii) 配列番号7に記載のアミノ酸配列の部分配列；ならびに
iii) i)およびii)に記載のアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも90%の配列同一性、たとえばi)およびii)に記載の配列のいずれかに対して少なくとも91、92、93、94、95、96、97、98、99、または99.5%の配列同一性、を有するアミノ酸配列。
【００７５】
別の実施形態によれば、配列番号7に記載のアミノ酸配列の部分配列は、配列番号8(重鎖の可変領域)に記載の配列を含んでなる。
【００７６】
他の具体的な実施形態において、本発明の抗体は、下記からなる1群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する：
i) 配列番号9（αRANKL-1の軽鎖）に記載のアミノ酸；
ii) i)に記載のアミノ酸配列の部分配列；ならびに
iii) i)およびii)に記載のアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも90%の配列同一性、たとえばi)およびii)に記載の配列のいずれかに対して少なくとも91、92、93、94、95、96、97、98、99、または99.5%の配列同一性、を有するアミノ酸配列。
【００７７】
前記の、配列番号9に記載のアミノ酸配列の部分配列は、配列番号10(軽鎖の可変領域)に記載の配列を含んでなる。
【００７８】
好ましい実施形態において、本発明にしたがって使用するための抗体は、デノスマブである。実施例4に加えて図6および7において、生殖細胞増殖に及ぼすデノスマブの影響を示すデータが与えられる。これらの結果は、OPGについて明らかになった結果と一致する。
【００７９】
したがって、本発明の具体的な態様はデノスマブに関するものであって、それは、精巣における(生殖)細胞増殖の刺激に用いるため、ならびに/または、哺乳類において男性不妊の治療および/もしくは予防に用いるため、ならびに/または、哺乳類において男性受精能の誘導もしくは改善に用いるため、たとえば精子減少症または無精子症などに用いるためのものである。
【００８０】
デノスマブは、144.7 kDaのモル質量を有するRANKLに対する完全ヒトモノクローナル抗体の一般名である（同義のAMG162の名称でも知られている）。デノスマブはProlia、Xgeva、およびRanmark XGEVAの商標名で販売されている。デノスマブはさらに、次の識別子によっても特定することができる：デノスマブのCAS登録番号は615258-40-7であり、解剖治療化学（ATC）分類法コードはM05BX04であり、ChEMBL化合物IDはCHEMBL1237023であり、UNique Ingredient Identifier（UNII）は4EQZ6YO2HIであり、KEGG（京都遺伝子ゲノム百科事典）コードはD03684である。
【００８１】
本発明の化合物は、精子減少症の予防および/もしくは治療、または無精子症の予防および/もしくは治療に使用される。
【００８２】
さらに、本発明の化合物は、静脈内または皮下に投与することができる。具体的には、化合物は皮下、精巣内、または性器部に、2-8週間に1回、好ましくは4週間に1回、20-120 mgの用量で、好ましくは60-120 mgの用量で、投与することができる。本発明の化合物は陰嚢部に投与することもできる。
【００８３】
具体的には、男性被験者は、精巣から採取された組織生検で精細管周囲細胞において精子形成不全および/またはOPG発現低下のある被験者とすることができる。
【００８４】
したがって、具体的な実施形態において、本発明の化合物は、当該被験者の精巣組織サンプルの組織学的分析によって検出することができるいかなるステージの精巣がんにも罹っていない男性被験者、たとえば年齢15-55歳のヒト男性被験者など、に投与することができる。
【００８５】
本発明はまた、哺乳類において男性不妊の治療および/もしくは予防に用いるため、ならびに/または、哺乳類において男性受精能を改善するための、本発明の化合物を含有する組成物に関する。
【００８６】
本発明の化合物は、医薬組成物とすることができるが、これは1つもしくは複数の生理的に許容される基剤、賦形剤、および/または希釈剤を含有する。組成物はそれに加えて、1つもしくは複数の安定化剤、および/または1つもしくは複数の緩衝剤を含んでいてもよい。
【００８７】
さらに、本発明の組成物は、少なくとも1つの安定化剤、たとえば界面活性剤、具体的には、ポリソルベートおよびポリオキシプロピレン-ポリエチレンエステル（Pluronic（登録商標））から選択される界面活性剤、を含有することができる。界面活性剤はポリソルベート20およびポリソルベート80から選択することもできる。
【００８８】
界面活性剤は、0.001-1%の濃度、たとえば0.002-0.5%、たとえば0.004%、または0.01%の濃度で存在することができる。
【００８９】
本発明の組成物は、さらにその上、ソルビトール、酢酸塩、水酸化ナトリウム、および注射用水を含有することができる。前記組成物のpHは、好ましくは、5.2から6.5までの間、たとえば5.5から6.5までの間、たとえば4.5から5.5までの間、たとえば6.3、または、たとえば5.2である。
【００９０】
最後に、組成物はカルシウムおよびビタミンDから選択される1つもしくは複数の成分を追加して含有することができる。
【００９１】
本発明はまた、哺乳動物において男性不妊を治療および/もしくは予防する、ならびに/または、哺乳動物において男性受精能を改善するための方法を提供するが、前記方法は、治療上有効な量の本発明の化合物または組成物を投与することを含む。
【００９２】
哺乳動物は、当該被験者の精巣組織サンプルの組織学的分析によって検出することができる、いかなるステージの精巣がんにも罹っていない男性（ヒト）被験者、たとえば、年齢15-55歳のヒト男性被験者とすることができる。
【００９３】
ある実施形態において、哺乳動物は、ヒト、ブタ、サル、ウシ、ヒツジ、マウス、およびウマからなる1群から選択される。
【００９４】
本発明の方法は、本発明の化合物または組成物の静脈内もしくは皮下への投与を含む。具体的には、本発明の化合物または組成物は、皮下、精巣内、または性器部に、2-12週間に1回、好ましくは4週間に1回、20-120 mgの用量で、好ましくは60-120 mgの用量で、投与することができる。本発明の化合物または組成物は陰嚢部に投与することもできる。
【００９５】
本発明の態様もしくは実施形態のうち1つの文脈に記載された実施形態および特徴は、本発明の他の態様もしくは実施形態にも適用できることに注目すべきである。
【００９６】
本出願に引用されたすべての特許文献および非特許文献は、参考としてその全体が本明細書に組み入れられる。
【００９７】
下記の非限定的な実施例において、本発明をさらに詳細に説明する。
（実施例）
【実施例１】
【００９８】
この実施例は、RANKLに対するモノクローナル抗体の調製を明らかにする。
【００９９】
従来法、たとえば米国特許第4,411,993号に記載の方法を用いてRANKLに対するモノクローナル抗体を作製するために、精製組換えRANKL標品、または、たとえば、高レベルRANKLを発現するTransFix処理細胞、を使用する。RANKLをコードするDNAも免疫原として使用することも可能であって、たとえばPardoll and Beckerleg in Immunity 3:165, 1995で概説されている。このような抗体はRANKLシグナル伝達を妨げるのに有用である可能性が高い（アンタゴニスト抗体もしくは遮断抗体）。
【０１００】
齧歯動物を免疫化するために、RANKL免疫原をアジュバント（たとえば完全または不完全フロイントアジュバント、ミョウバン、または他のアジュバント、たとえばRibiアジュバントR700（Ribi, Hamilton, MT））中に乳化させ、10-100 μg（pig）の量を選択された齧歯動物、たとえばBALB/cマウスまたはLewisラットに皮下注射する。DNAは皮内（Raz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9519, 1994）または筋肉内（Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4156, 1993）に投与することができる；生理食塩水は、DNAベースの抗原に適した希釈剤であると判明した。10日から3週間後に、免疫化した動物を追加の免疫原によって追加免役し、その後定期的に、毎週、隔週、3週間ごとの免疫化スケジュールで追加免疫する。
【０１０１】
ドットブロットアッセイ（抗体サンドイッチ）、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、免疫沈降、または他の適当なアッセイ、FACS分析など、による検査のために、眼窩後方採血または尾端切開によって血清サンプルを定期的に採取する。
【０１０２】
適当な抗体価を検出した後、陽性の動物は、生理食塩水中の抗原の静脈注射をを受ける。3-4日後、その動物を屠殺し、脾細胞を採取して、マウス骨髄腫細胞株（たとえばNS 1、または、好ましくは、Ag 8.653 [ATCC CRL 1580]）と融合させる。非融合細胞、骨髄腫-骨髄腫ハイブリッド、および脾細胞-脾細胞ハイブリッドの増殖を抑制するために、この手順で作製されたハイブリドーマ細胞株を複数のマイクロタイタープレートにおいて選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン、またはHATを含有するもの）に蒔く。
【０１０３】
このようにして作製されたハイブリドーマクローンは、RANKLとの反応性についてELISAでスクリーニングすることが可能であり、たとえば、Engvall et al., Immunochem. 8:871 (1971) および米国特許第4,703,004号に記載の技術の適用によってスクリーニングすることができる。好ましいスクリーニング法は、Beckman et al., J. Immunol. 144:4212 (1990)により記載された抗体捕捉法である。次に陽性クローンを同系齧歯動物の腹腔内に注入して、高濃度（> 1 mg/ml）の抗RANKLモノクローナル抗体を含有する腹水を生じさせる。得られたモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿後、ゲル排除クロマトグラフィーによって精製することができる。あるいはまた、RANKLタンパク質との結合に基づくアフィニティクロマトグラフィーを使用することができるように、抗体とプロテインAもしくはプロテインGとの結合に基づくアフィニティクロマトグラフィーも使用することができる。mAbの活性をモニターするために本明細書に記載の方法を用いて、遮断抗体（すなわち、RANKLに結合してRANKとの結合を阻害する抗体）および非遮断抗体（すなわち、RANKLと結合するがRANKとの結合を阻害しない抗体）がいずれも単離される。
【実施例２】
【０１０４】
序論
RANKLシグナル伝達は、骨の恒常性、免疫系、および乳汁分泌に重要である。RANKLは、隣接細胞の膜にある受容体RANKと特異的に結合する細胞外リガンド-ドメインを有する、膜貫通タンパク質である。RANKの結合および活性化は、多くの場合NFκB活性化を介して細胞内シグナル伝達を引き起こし、それは細胞周期に影響を及ぼす。OPGはRANKLの細胞外ドメインに結合してRANKの活性化を妨げるため、RANKLとRANKとの相互作用は、近傍の細胞からのOPG分泌によって調節される。したがって、RANKLの生物学的影響は、RANKL、RANKおよびOPGの存在および存在量に左右される。さらに複雑なことに、RANKLは3つの異なるアイソフォーム1、2、および3として存在する。1つは膜貫通型、また1つは細胞質型であり、もう1つは分泌型である。異なるアイソフォームは必ずしも同じ影響を及ぼすとは限らないと考えられ、細胞質非分泌型は概してRANKL発現の阻害物質である。これは、RANKLの阻害がモデルにおける個別アイソフォームの発現に応じて反対の影響を与える可能性があることを意味する。
【０１０５】
RANKLの下流シグナル制御は、TRAF1-6の存在およびその活性によって影響を受ける。どのコファクターが存在するかに応じて、RANKは異なるシグナルを伝達し、したがって、同じ外部刺激に対して異なる反応を仲介する。TRAFの他に、RANKは、REL aおよびbによっても影響され、さらに重要な下流シグナル制御メカニズムNFκBの存在によって影響を受ける。
【０１０６】
本発明者らは、ビタミンD受容体（VDR）、およびすべてのビタミンD代謝酵素が雄の射精管、生殖細胞、および成熟精子において発現されていることをすでに明らかにした。RANKLはビタミンD応答エレメントをそのプロモーター中に含有し、ビタミンDはRANKL遺伝子の転写を引き起こすので、RANKLは古典的なビタミンD調節遺伝子である。RANKLはこれまで精巣機能および男性受精能と関連づけられたことはなく、性腺において発現されることは証明されていない。マウスにおけるRANKL、RANK、またはOPGの消失は男性不妊を引き起こさないようであるが、これまで受精能の研究も精液の質に関する報告も行われたことはない。
【０１０７】
デノスマブは、マウスRANKLもしくはTRAILシグナル伝達を阻害しないので、ヒトRANKLシグナル伝達の人工的な特異的阻害剤である。サルにおいて、通常使用されるより10倍高用量のデノスマブは、主立った精巣の組織学的異常も、精子の運動性低下も引き起こさなかったが、受精能検査は実施されなかった。VDRを用いた本発明者らの研究中に、本発明者らは、RANKLがRNAレベルで発現されることを見いだしたので、ここでRANKL、RANK、およびOPGがマウスおよびヒトの性腺において発現されるかどうかを調べた。
【０１０８】
材料および方法
ヒト組織サンプル
地方倫理委員会からの承認後、ヘルシンキ宣言にしたがって、コペンハーゲン大学病院（Rigshospitalet）、デンマーク、の男性病クリニックから患者を募集した。TGCTのために実施された精巣摘除術の検体から成人精巣サンプルを得た。腫瘍周囲の組織は、CIS細胞または正常な/低下した精子形成のいずれかを有する精細管を含んでいた。各サンプルを断片に分割し、その断片をRNA抽出のために急速凍結して-80℃で保存するかまたは、ホルマリンもしくはパラホルムアルデヒド中で4℃にて一晩固定した後パラフィンに包埋した。熟達した病理学者が全サンプルを評価し、TGCTのための免疫組織化学（IHC）マーカーを使用して、腫瘍の組織学的サブタイプを確認した。
【０１０９】
マウス組織サンプル
Leuven Vdr-/-マウスおよび対照を作製し、標準的な齧歯動物飼料(1.0% カルシウム、0.7% リン、Sniff R/M-H)を用いて飼育した。すべての動物は、国立衛生研究所（National Institutes of Health）「実験動物の管理と使用に関する指針」（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）にしたがって取り扱われ、すべての実験はルーヴェン・カトリック大学（KU Leuven）の「動物実験倫理委員会」（Ethical Committee Animal Tests）によって承認された。代表的なマウス群をそれぞれ10または15週齢で屠殺した。マウスを麻酔下で失血させて、ホルモン測定用に血清を採取した。それぞれの精巣を断片に分割し、その断片をRNAもしくはタンパク質抽出のために急速凍結して-80℃で保存するかまたは、パラホルムアルデヒド（PFA）もしくはブアン(Bouin)溶液中で4℃にて一晩固定してからパラフィンに包埋した。
【０１１０】
組織調製、定量的RT-PCR（qRT-PCR）、ならびにウェスタンブロットRNAおよびcDNA調製とその後のqRT-PCRを行った。qRT-PCRは、各mRNAを標的とする特異的プライマーを用いて実施した。それぞれのプライマーの組み合わせからの代表的なバンドを検証のために配列決定した（Eurofins MWG GmbH, Germany）。遺伝子発現の変化は、RPS20またはB2m （β2-ミクログロブリン）と比較することにより判定した。
【０１１１】
免疫組織化学（IHC）
RANKL、OPG、およびRANKについて、免疫組織化学的に全組織を染色した。手短に述べると、免疫組織化学（IHC）染色は、標準的な間接ペルオキシダーゼ法にしたがって実施し、マイヤーヘマトキシリンで対比染色した。すべての実験は、一次抗体なしで染色した陰性対照とともに実施した。連続切片を使用して、RANKL、RANK、およびOPGの同時発現を調べた。抗原回復は、切片を15分間TEGバッファー（5 L中にTris 6.06 g、EGTA 0.95 g、pH 9.0）中でマイクロウェーブ処理することによって達成された。切片を2%過酸化水素中で洗浄して内在性ペルオキシダーゼをブロックした。その後、すべての切片を2%非免疫ヤギ血清もしくはマウス血清（Zymed Histostain kit, San Francisco,CA, USA）と共にTris緩衝食塩水（TBS）中でインキュベートし、交差反応を最小限にした。一次抗体はSanta Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CAから購入した。ウェスタンブロッティングによってすべての抗体をテストしたが、最初の実験は、さまざまな抗体希釈度（1:50から1:500）、さまざまなバッファー（TEG、クエン酸、尿素）、およびさまざまな固定液（ホルマリン、エタノール、および、なし）を用いて行った。4℃にて16時間のインキュベーション後、切片を、ビオチン標識ヤギ抗ウサギIgG（Zymed Histostain kit）とともに、またはビオチン標識ロバ抗ヤギIgGとともに（1:400）インキュベートしてから、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン複合体（Zymed Histostain kit）を第3段階として使用した。アミノエチルカルバゾール（Zymed Histostain kit）を用いて可視化を行った。インキュベーションステップの間にスライドをTBSで洗浄した。
【０１１２】
結果
ヒト
RNAレベルで、本発明者らは、完全な精子形成を有する正常な精細管を含む精巣において、RANKL、RANK、およびOPGの顕著な発現を見いだした（図1）。RANKLのすべてのアイソフォームが精巣において発現された。セルトリ細胞単独においてはただ1つのアイソフォームが発現されたが、それは卵巣で発現されているアイソフォームとは異なっていた。タンパク質レベルでは、成人セルトリ細胞および雄生殖細胞においてRANKLの発現が見いだされた（図3）。発現は細胞質型および膜貫通型であった。
【０１１３】
染色強度は、非常に弱いものから正常までさまざまであったが、RANKL発現はセルトリ細胞の大半および多くの生殖細胞において検出可能であった。セルトリ細胞だけの精細管にRANKLが存在することから、1つのアイソフォームがセルトリ特異的であって、他のアイソフォームは生殖細胞にも存在する可能性があることがわかる。
【０１１４】
RANKはもっぱら生殖細胞において発現され、精原細胞および精母細胞において顕著に発現された。やはり発現は、細胞質性と膜性の混合であった。OPGは主として精細管周囲細胞において発現され、発現はおもに細胞質性であった。興味深いことに、OPGの発現は、CISを有する組織において低下していたが、それはCIS細胞をさらに高いRANKLの暴露に触れさせる可能性がある。
【０１１５】
マウス
RNAレベルで、本発明者らは、10週齢および15週齢動物の精巣において、RANKL、RANK、およびOPGの顕著な発現を見いだした（図2）。RANKLのすべてのアイソフォームが精巣において発現された。タンパク質レベルでは、2つの異なるマウス系統の成体セルトリ細胞においてRANKLの発現が見いだされた。発現は細胞質型および膜貫通型の混合であった。染色強度は、非常に弱いものから正常までさまざまであったが、RANKL発現はセルトリ細胞の大半において検出可能であった。RANKLはVdr KOマウスにおいてダウンレギュレートされているとみられたことから、RANKLが精巣においてもビタミンDによって制御されていることがわかる。このことから、存在する主要なRANKLアイソフォームはアイソフォーム1であることがわかるが、それは、RANKLアイソフォーム3が骨においてビタミンDで制御されておらず、Vdr消失後にRANKLが10分の1に減少する事実があるためである。
【０１１６】
特異的受容体タンパク質RANKはもっぱら生殖細胞で発現されたが、精原細胞および精母細胞において顕著な発現であった。やはり発現は、細胞質性と膜性の混合であった。OPGは主として精細管周囲細胞において発現され、発現はおもに細胞質性であった。RNAレベルで、TRAf1-6およびNFκBがやはりマウス性腺において発現されたことは、その細胞がRANK下流シグナル制御に関与する能力を有することを示す。
【０１１７】
考察
本明細書では、RANKL、RANK、およびOPGが精巣において発現されることを示している。もっぱらセルトリ細胞において発現されるRANKLのアイソフォームがあると思われるが、一方RANKは生殖細胞で発現され、OPGは精細管周囲細胞において発現される。この発現パターンはマウスからヒトまで保存されており、それはRANKLシグナル伝達が精子形成に関与する可能性を示唆する。精細管周囲細胞およびセルトリ細胞からのシグナル伝達が生殖細胞の運命を決定することが知られており、本発明者らの知る限り、これが、精細管周囲細胞、セルトリ細胞、および生殖細胞に関する最初のシグナル伝達である。
【０１１８】
RANKL系は骨の恒常性のために重要である。関連するファクターには、破骨細胞の特異的受容体RANKと結合してこれを活性化する、骨芽細胞の膜貫通型RANKLタンパク質があるが、これは未熟骨芽細胞の分化を誘導し、結果として骨吸収を生じる。OPGは、RANKLのリガンドドメインと結合することによってRANK活性化を阻害し、次いで破骨細胞の分化および活性化を阻害する内在性分泌型シグナル伝達分子であって、これは骨吸収を損なう。アメリカの製薬会社Amgenは、半減期の長い合成OPGアナログ（デノスマブ）を開発したが、EMEAおよびFDAはその薬を骨粗鬆症の治療用として承認した。デノスマブは現在臨床的に使用されており、副作用はほとんどないが、それはRANKLが、骨以外には、免疫細胞、歯、および乳房にのみ発現されると考えられるからである。FDAまたはEMEAはその薬が臨床的に使用される前に男性受精能の研究を要請しなかったが、それは骨粗鬆症患者が一般に女性高齢者であるからである。
【０１１９】
RANKLの1つのアイソフォームが男性の性腺において発現されているが、対応する女性の性腺では発現されていないことを示す新たなデータがある。このRANKLアイソフォームはセルトリ細胞において発現されていると思われるが、特異的受容体RANKは精原細胞で発現されており、OPGは精細管周囲細胞で発現されている。これらのタンパク質の発現は、マウスでもヒトでも認められ、RANKLおよびRANKは異発生性精細管のセルトリ細胞および生殖細胞、ならびに前がん状態の精巣細胞（CIS）においても発現されているが、CIS精細管は弱いOPG発現を示す。RANKシグナル伝達のすべての下流メディエーター（TRAf1-6およびNFκB）も、齧歯類およびヒトの精巣において発現されており、NFκBは雄の性腺において増殖-アポトーシススイッチのために重要であることが知られている。したがってRANKLシグナル伝達は生殖細胞増殖の重要な制御因子になる可能性がある。正常な精巣においてRANKLの阻害が主にセルトリ細胞に特異的な型であると考えられるのは、それが血液-精巣関門の近位部に接近可能であるためであり、一方、精子形成の後期に発現される推定細胞質型は、おそらく血液中のデノスマブに到達しにくいであろう。デノスマブの影響は、OPG処理による実験から直接当てはめることはできないが、それは、AmgenによればデノスマブがOPGとは違って、雄生殖細胞アポトーシスにとって重要であるTRAILをブロックせずにRANKLだけをブロックするからである。
【０１２０】
マウスにおいて、RANKL、RANK、およびOPGの発現は保存されており、Vdr KOマウスから教示されたのは、精巣のRANKLがビタミンDによって制御されることである。RANKL遺伝子は2つのVDREを有しており、RANKLのダウンレギュレーションが精子形成の大きな減少を引き起こしそうにないことは、Vdr KOマウスでの著しいダウンレギュレーションが裏付けているが、それは、これらのマウスがやや損なわれた受精能を有しているが、正常な精巣組織を有しているからであって、それはRANKLに起因する可能性があるが、むしろ他の原因によるかもしれない（Blomberg Jensen M et al. Characterization of the testicular, epididymal and endocrine phenotypes in the Leuven Vdr-deficient mouse model: targeting estrogen signalling, Mol Cell Endocrinol. 2013 Jul 11;377(1-2):93-102を参照されたい）。さらに、骨において、アイソフォーム1はビタミンDによって制御されるのに対してアイソフォーム3は制御されないが、これによって、Vdr変異体における大きなダウンレギュレーションは、RANKLアイソフォーム1が、主として存在するアイソフォームであることの証拠であるとみなされる。
【０１２１】
結論として、性腺におけるRANKL、RANK、およびOPGの存在は、かつて証明されたことがなく、これらの発現は、NFκBを介したRANKLシグナル伝達が生殖細胞増殖の制御に関与しうることを示している。このことから、RANKL系の制御は、精子の生成を増減することができるので、臨床的関連性を有する可能性があることがうかがえる。
【実施例３】
【０１２２】
序論
RANKLシグナル伝達は骨の恒常性、免疫系、および乳汁分泌にとって重要である。RANKLは、隣接する細胞の膜にある受容体、RANKに特異的に結合する、細胞外リガンドドメインを有する膜貫通タンパク質である。RANKの結合および活性化は、多くの場合NFκBの活性化を介して細胞内シグナル伝達を誘導するが、それは細胞周期に影響を及ぼす。RANKLとRANKとの相互作用は、近くの細胞からのOPG分泌によって調節されているが、それは、OPGがRANKLの細胞外ドメインに結合してRANKの活性化を妨げるからである。したがって、RANKLの生物学的影響は、RANKL、RANK、およびOPGの存在および存在量に左右される。さらに複雑なことには、RANKLは3つの異なるアイソフォーム1、2、3として存在する。1つは膜貫通型、また1つは細胞質型であり、もう1つは分泌型である。異なるアイソフォームは必ずしも同じ影響を及ぼすとは限らないと考えられ、細胞質非分泌型は概してRANKL発現の阻害物質である。これは、RANKLの阻害がモデルにおける個別アイソフォームの発現に応じて反対の影響を与える可能性があることを意味する。2つの細胞株TCAM2およびNTERA2はRANKLの2つの異なるアイソフォームを発現し、これらの生殖細胞由来細胞におけるこのシグナル伝達の調節は、精巣におけるRANKLの影響を示すと考えられる。
【０１２３】
デノスマブは、マウスRANKLもしくはTRAILシグナル伝達を阻害しないので、ヒトRANKLシグナル伝達の人工的な特異的阻害剤である。サルにおいて、通常使用されるより10倍高用量のデノスマブは、主立った精巣の組織学的異常も、精子の運動性低下も引き起こさなかったが、受精能検査は実施されなかった。
【０１２４】
材料および方法
ヒト細胞株
生殖細胞の特性をあまり保っていない、EC由来細胞株NTera2、ならびに生殖細胞の特性を保持している、セミノーマ由来TCam-2細胞株を本研究に使用した。細胞は、グルタミン (58.5 mg/ml)、ペニシリン (100 U/ml)およびストレプトマイシン (100 mg/ml) (すべてGibco)を添加したDMEM (NTera2) またはRPMI 1640 (TCam-2)中で標準条件下37℃にて5% CO2雰囲気において増殖させた。増殖への影響を調べるために、RANKL (100 ng/ml)、CSF-1 (100 ng/ml)、デノスマブ(100 ng/ml)を、単独で、または組み合わせて、培地に添加した。溶媒としてDMSOを使用したので、すべての対照サンプルはDMSO処理した。細胞を25-cm2 フラスコに蒔き、37℃にて5分間0.05%トリプシン-EDTAを用いて剥離した。一部を遠心沈降させ、その細胞ペレットを、RNA精製およびRT-PCR用のcDNA合成のために瞬間凍結した。それぞれのmRNAを標的とする特異的プライマーを用いてqRT-PCRを行った。それぞれのプライマーの組み合わせから得られた代表的なバンドを評価のために配列決定した（Eurofins MWG GmbH,、ドイツ）。
【０１２５】
生存分析
生存分析は、レサズリンの酸化型の減少、ならびに同時に起こる蛍光中間体の増加を測定することによって、生細胞の代謝活性を判定する。細胞はビルケルチュルク（Buerker-Tuerk）計算盤（Tiefe 0.100 mm、0.0025 mm2）にて手作業で計数し、5 × 103 細胞/ウェルを96ウェルプレートのウェルに蒔いて一晩インキュベートしてから処理した。同時処理実験のために、1 × 103 細胞/ウェルを96ウェルプレートに蒔き、一晩インキュベートしてから、選択された化合物100 ng/mlを用いて20時間の最初の処理を行った。陰性対照（培地のみ）および陽性対照（標準培地中1 × 103 細胞）は、すべてのプレート上でインキュベートされた。細胞の生存はTOX-8 in vitro毒性アッセイ(Sigma Aldrich)を用いてメーカーの説明書にしたがって測定した。処理の終了時点でアッセイキットのレサズリン色素を培地に添加した後4-6時間インキュベートした。次にプレートをELISAマイクロプレートリーダー（Tecan, Sunrise）で測定した。パーセント生存率を計算するために、未加工の吸光度値は、基準波長およびブランクサンプル（培地のみ）からの差し引き値とした。その結果得られた値を平均し（それぞれの処理についてn=8）、最終的な吸光度値を生成した。未処理細胞を100%生存とみなし、それを用いて処理細胞のパーセント生存率を算出した。各実験は、独立した実験として少なくとも3回繰り返した。
【０１２６】
結果：
NTera2細胞は、TCAM2細胞とは異なるRANKLの1つのアイソフォームを発現する。TCAM2細胞で発現されるアイソフォームは、セルトリ細胞唯一症候群（SCO）のセルトリ細胞特異的アイソフォームに類似しており、これは卵巣で発現されているものとは異なる。しかしながら、このアイソフォームは正常な精巣のセルトリ細胞において発現する可能性があり、正常なセルトリ細胞およびSCOのセルトリ細胞が異なるRANKLアイソフォームを有することを除外することはできない。RANKおよびその下流のシグナル伝達機構は2つの細胞株のいずれでも発現されているが、それは、2つの細胞株ともRANKL処理に反応することを意味する（図1）。OPGはもっぱらNTera2細胞で発現されるが、それは、この細胞がRANKLの天然の阻害剤を有し、暴露の増加に適応して感受性が低下している可能性があることを意味するが、一方TCAM2はOPGを発現しない。
【０１２７】
NTera2細胞において（図4）、デノスマブおよびRANKL処理が両方とも4時間後および20時間後に細胞増殖を引き起こすので、異常な反応であると見られる。デノスマブはもっとも強い影響を及ぼすが、なぜ2つの化合物がともに増殖を引き起こすのかは不明である。1つの可能性は、デノスマブがNTera2細胞上のRANKLの特異的膜貫通型アイソフォームをブロックすることによって増殖を引き起こすということである。外来RANKLは細胞質型アイソフォームとしてRANKを刺激し、それによってこの受容体を専有するが、そのことが内在する膜貫通型RANKLに隣接細胞上のRANKを活性化させないようにする。その結果、内在性RANKLの反応は、分泌型アイソフォームの作用に類似する可能性があり、したがってそれはアンタゴニストとなり、増殖を引き起こす。OPGの生成は内在性RANKLを阻害し、この阻害は外来RANKLが添加されると低下する可能性があるので、OPGの生成もデータに影響を与える可能性がある。
【０１２８】
TCAM2細胞において（図5）、もう1つのアイソフォームが発現しており、ここでRANKL処理は予想通り増殖を低下させるが、デノスマブはやはり、4時間後にわずかだけではあるが増殖を刺激する。RANKLを含むすべての処理は、20時間後に有意に増殖を低下させるのに対して、デノスマブは20時間後に増殖を高めるわずかな有意でない傾向を示すが、4時間後は有意である。相違に対するもう1つの理由は、TCAM2細胞がOPGを発現せず、したがって外来RANKL処理の影響をなくすことができないということであるが、そのことは処理に対する高い感受性に影響を及ぼす可能性がある。
【０１２９】
考察
上記のデータは、RANKL経路の調節が生殖細胞腫瘍に由来するがん細胞の細胞生存に影響を及ぼすことを明確に示す。RANKLおよびデノスマブ処理はいずれも、細胞生存に顕著な変化を引き起こす。観察された反応の相違の一部は、二つの細胞における異なるRANKLアイソフォームに起因する可能性がある。OPGの存在も異なっているが、これは明らかに結果に影響を与える。生殖細胞増殖の変化はきわめて早く引き起こされ、RANKLとデノスマブの両方が生殖細胞生存に強力で急速な影響を及ぼすことができるという事実を裏付ける。
【０１３０】
CISおよび正常生殖細胞の懸滴培養から得られた結果は、セルトリ細胞と生殖細胞との間のRANKLシグナル伝達が、生殖細胞の生存および増殖に重要であることを明白に示している。RANKLはアポトーシスの誘導によって増殖を低下させるが、デノスマブは反対の作用をもたらす。これらの結果を正常な精巣に当てはめて推定することができるが、精原細胞はほとんどのCIS細胞のような強いRANKL発現を示さず、それは正常な生殖細胞において結果に影響を及ぼす可能性がある。しかしながら、結果は、正常な体細胞環境において生殖細胞のデノスマブおよびRANKL処理が生殖細胞の増殖を制御することを明確に示している。
【０１３１】
結論として、異なるRANKLアイソフォーム、内在性OPGの存在または非存在、異なる細胞株による2つの異なるモデルを使用することによって、デノスマブが生殖細胞増殖を制御することが示された。
【実施例４】
【０１３２】
デノスマブおよびRANKLによるヒト精巣のex vivo処理
序論
RANKLシグナル伝達は、骨の恒常性、免疫系、および乳汁分泌にとって重要である。RANKLは、隣接する細胞の膜にある受容体、RANKに特異的に結合する、細胞外リガンドドメインを有する膜貫通タンパク質である。RANKの結合および活性化は、多くの場合NFκBの活性化を介して細胞内シグナル伝達を誘導するが、それは細胞周期に影響を及ぼす。RANKLとRANKとの相互作用は、近くの細胞からのOPG分泌によって調節されているが、それは、OPGがRANKLの細胞外ドメインに結合してRANKの活性化を妨げるからである。したがって、RANKLの生物学的影響は、RANKL、RANK、およびOPGの存在および存在量に左右される。さらに複雑なことには、RANKLは3つの異なるアイソフォーム1、2、3として存在する。1つは膜貫通型、また1つは細胞質型であり、もう1つは分泌型である。異なるアイソフォームは必ずしも同じ影響を及ぼすとは限らないと考えられ、細胞質の非分泌型は概してRANKL発現の阻害物質である。これは、RANKLの阻害がモデルにおける個別アイソフォームの発現に応じて反対の影響を与える可能性があることを意味する。本発明者らは、RANKがもっぱら生殖細胞において発現されることを見いだしたが、したがって生殖細胞は、RANKLおよびデノスマブ処理に直接的に反応することができる唯一の細胞である。RANKLはセルトリ細胞と生殖細胞の両方で発現されるが、OPGは精細管周囲細胞において発現される。本発明者らは最近、器官培養モデルを確立したが、そのモデルにおいて、小さな組織断片を、最適化された培地の「懸滴」中で培養する。この培養法は、ヒト精巣組織、精巣がん患者の精巣摘除検体から得られたCISおよび精巣がん腫瘍を含む組織に適用することができる。本発明者らは、正常な精巣、CISおよびTGCTを含む組織を最大で2週間までの間、よくない変化を観察することなしに培養することに成功した。この器官培養モデルは、動態的および機能的な方法でRANKLシグナル伝達経路のメカニズムについて研究することを可能にするが、そのモデルは組織の完全性を保つので、生殖細胞が体細胞ニッチ（セルトリおよび精細管周囲細胞）に維持されるという利点を有しており、処理実験の間、体細胞との持続的な相互作用を可能にする。デノスマブは、内在的に生成されたOPGのようにマウスRANKLもしくはTRAILシグナル伝達を阻害しないので、ヒトRANKLシグナル伝達の人工的な特異的阻害剤である。サルにおいて、通常使用されるより10倍高用量のデノスマブは、主立った精巣の組織学的異常も、精子の運動性低下も引き起こさなかったが、受精能検査は実施されなかった。
【０１３３】
材料および方法
ヒト組織サンプル採取および調製
ヘルシンキ宣言にしたがって、地方倫理委員会からの承認後、コペンハーゲン大学病院（デンマーク）の発達生殖研究部門（Department of Growth and Reproduction）の男性病クリニックから患者を募集した（認可番号H-1-2012-007）。すべての参加者は、精巣がん治療のための精巣摘除術に先だって、説明を受けて同意を与えた。TGCTのために実施された精巣摘除術の検体から成人精巣サンプルを得た。外科的切除後ただちに精巣摘除検体を病理研究部門に送り、腫瘍と肉眼的に正常な部分に分けた。組織の大部分は診断分析のために割り当てられ、残りを研究用とした。研究用に割り当てられたサンプル部分をただちに培地（下記を参照されたい）に入れ、実験室に運んだ。外科的切除から2時間以内に、検体を〜1mm3片にカットし（平均的な精細管は直径150μmである）、DMEM F12、ペニシリン（100U/ml-1）、ストレプトマイシン（100mg/ml-1）、インスリン、トランスフェリン、およびセリン（× 1）を10%ウシ胎仔血清（FBS）または0.1%ウシ血清アルブミン（BSA）のいずれか一方とともに含有する培地での懸滴培養の中に入れた。培養条件最適化の初期段階において、DMEM、RPMI-1640、およびMEMαを含めていくつかの異なる基本培地をテストしたが、生存もしくは組織形態に明白な相違は見られなかった（データ示さず）。すべての細胞培地および追加成分は、BSA (Sigma-Aldrich, Broendby, Denmark)を除いてGibco (Naerum, Denmark)から購入した。培養を始めるために、30μLの培地の液滴をペトリ皿（NUNC細胞培養ペトリディッシュ）の蓋の上に準備した。個々の組織片をそれぞれの液滴中に置いた後、ディッシュを注意深く裏返し、液滴をそのままに維持して組織が浮遊するようにした。脱水乾燥を防ぐためにディッシュの底にDPBS (10ml)を添加した。組織は、5% CO2 中34℃にて最大14日間培養し、培地は48時間ごとに交換した。実験準備には、次に行う：固定、RNA精製、および生存アッセイ用にそれぞれ同じ起源の組織片から切り取った少なくとも3回分の組織片を含めた。培養期間が終了したら、サンプルを、4%パラホルムアルデヒド（PFA）固定液中に集めた後（室温にて30分、4℃にて一晩）組織学的分析および免疫組織化学法のためにパラフィン包埋し、RNA精製およびリアルタイムPCR分析のためにRNAlater（Ambion, Austin, TX, USA）に入れ、または生存分析に備えた。
【０１３４】
生存分析
組織片が生きた細胞を含んでいるかを評価するために、生存分析を使用し、TOX-8 in vitro毒性アッセイ(Sigma Aldrich)を用いてメーカーの説明書にしたがって全代謝活性を測定した。手短に述べると、組織片を90μL培地および10μLレサズリン色素（Sigma-Aldrich）とともに96ウェルディッシュに移し、すべてのプレートに含められた陰性実験対照（培地+レサズリン色素、組織なし）とともに34℃にて5時間インキュベートした。そこで、レサズリン（青）の酸化型の減少、および同時に起こる蛍光中間体（赤）の増加を、メーカーの説明書（Sigma-Aldrich）にしたがってELISAマイクロプレートリーダー（Tecan Sunrise, Maennedorf, Switzerland）で測定した。
【０１３５】
免疫組織化学
簡単に述べると、パラフィン切片を脱パラフィンして再水和した。抗原回復は、切片を15分間、回復バッファー中でマイクロウェーブ処理することによって達成された。次に切片をTris緩衝食塩水（TBS）で希釈した2%非免疫ヤギ血清（Zymed Histostain kit, San Francisco,CA, USA）または0.5%粉乳と共にインキュベートし、交差反応を最小限にした。一次抗体、希釈剤、および回復バッファー。4℃にて16時間および室温で1時間のインキュベーション後、切片を、ビオチン標識ヤギ抗ウサギIgG（Zymed Histostain kit）とともに、またはビオチン標識ヤギ抗マウスIgGとともに（1:400）インキュベートしてから、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン複合体（Zymed Histostain kit）を第3段階として使用した。アミノエチルカルバゾール（AEC）（Zymed Histostain kit）を用いて可視化を行い、深紅色を生じた。インキュベーションステップの間にスライドをTBSで洗浄した。陰性対照用に連続切片を処理したが、一次抗体を希釈バッファーのみで置き換えた。対照スライドはいずれも染色を示さなかった。マイヤーヘマトキシリンを用いて対比染色した。連続切片を用いて、PLAP（CISおよびセミノーマ細胞で検出されるシグナル）、KI-67、BrdU取り込み、切断されたカスパーゼ、KIT、およびAP2γの発現を調べた。2人の研究者が独自にすべての染色を評価した。すべての切片はNikon Microphot-FXA顕微鏡（東京、日本）で手動で検査した後、NanoZoomer 2.0 HT (Hamamatsu Photonics, Herrsching am Ammersee, Germany)でスキャンし、ソフトウェアNDPview version 1.2.36 (Hamamatsu Photonics)を用いて解析した。より定量的に免疫組織化学（IHC）染色を評価するために、KI-67-、BrdU-、KIT-、およびAP2γ-染色細胞のパーセンテージを細胞計数によって求めた。増殖マーカーKI-67およびBrdUは、正常な生殖細胞および悪性生殖細胞でのみ発現され、KI-67で薄く染色されたセルトリ細胞はごくまれにしか見られなかった。完全な精子形成を伴う正常な精巣サンプルにおいて、本発明者らは、精原細胞および精母細胞だけを計数した；CISを含有するサンプルにおいて、本発明者らは染色されたCIS細胞の割合も求めた。すべてを数量化するために（KI-67、BrdU、KIT、およびAP2γ）、各患者から得られた、処理あたり3つの組織断片のそれぞれにおいて、最低3.5 mm2の組織を2人の別の研究者が評価した。少なくとも3人の異なる患者から得られた組織片を、溶媒、RANKL、およびデノスマブ処理のために含めた。陽性細胞および陰性細胞をいずれも計数して、染色細胞のパーセンテージを計算した。
【０１３６】
増殖アッセイ
培養期間の終了直前にBrdU取り込みアッセイを用いて、増殖する生殖細胞の存在を判定した。BrdU標識試薬（Invitrogen, Camarillo, CA, USA）を培地で1:100に希釈し、組織片はBrdU含有培地で3時間懸濁培養として準備された。次に組織片をPBSで5分間2回洗浄した後、上記のように固定してパラフィン包埋した。BrdUは、免疫組織化学切片において記載したようにBrdU抗体を用いて、免疫組織化学法によって可視化し、陽性染色細胞は増殖していると見なした。
【０１３７】
結果
完全な精子形成を含む領域を有する、正常な精巣組織と呼ばれる組織（NT）、およびCIS細胞を含有する精細管を有する精巣組織の全体的な形態は、懸滴組織培養において最大14日間まで維持された。NT組織のヘマトキシリン・エオシン（HE）による染色は、すべての生殖細胞型の存在を実証し、CISマーカーPLAPによる染色は、CIS細胞が存在するかどうかを確認した。7-10日間の培養後、分化の進んだ細胞、特に分裂終了精子細胞、の減少が、一部の患者の組織で観察されたが、これは一貫性のある知見ではなかった。CIS細胞を有する精細管を含む組織において、HEおよびPLAPによる染色は、精細管がおもにCIS細胞（PLAPに陽性）およびセルトリ細胞を含有すること、ならびに組織の形態が最大14日までの培養の間、保存されることを示した。
【０１３８】
本研究において、細胞増殖を測る2つの基準：KI-67を用いたIHC染色、およびBrdU取り込みアッセイを適用した。増殖の尺度を直接比較するために、KI-67染色およびBrdU染色を組織片の連続切片に対して実施した。概して、BrdUよりも有意に（P<0.05）多数の標識細胞がKI-67の検出によって認められた。これらのデータはまた、BrdUの取り込みとその後の抗体検出が、KI-67染色よりも特異的な細胞増殖マーカーであることを示す。BrdUは培養期間の最後の3時間に、細胞周期のS期にのみチミジンアナログとしてDNAに取り込まれるので、上記は当然予想される。これに対して、KI-67は、G0/G1停止の期間を除いて、細胞周期の全期において発現されるが、次の結果はBrdU取り込みについてのみ提示される。
【０１３９】
懸滴培養におけるヒト精巣検体の処理から得られた結果は、生殖細胞増殖における著しい変化を明らかにした。全部で4人の男性の精巣を使用したが、そのうち3人だけは検体中に精巣組織が存在した。それぞれの処理に使用された各検体の大きさは、平均で5.92mm2であった。それぞれの処理は48時間持続したが、すべての精巣から2つの対照検体を使用して、連続切片における組織構造の相違によるバイアスを回避した。このアプローチによって、本発明者らは、生殖細胞がセルトリ細胞に接して、その正常な精細管内ニッチに保持されていることを確認する。これは、生殖細胞がセルトリ細胞に特異的な型のRANKLに暴露されていることを意味する。2つの検体は正常な組織と前がん状態のCIS細胞をともに含んでいたが、1つは正常な精子形成を含有しておらず、認められた生殖細胞はCIS細胞だけであった。デノスマブおよびOPGによる処理は生殖細胞の増殖を著しく増加させたが、RANKLならびに他の、骨においてRANKLシグナル伝達に影響を及ぼすことが知られている物質、CSF-1およびPTHrPは同様の影響は及ぼさず、BrdU取り込みによる評価として、処理は生殖細胞増殖に有意な変化を引き起こすことはできなかった（図6）。デノスマブは患者のうち2人において70%を越える生殖細胞の増殖割合の増加を引き起こしたのに対して、最後に残った1人ではデノスマブは11倍の増加を引き起こしたが、この患者は組織学的に非常に重度の精巣表現型を有していた。デノスマブのプラス効果はOPG-FCに匹敵したが、それはRANKL阻害に加えてTRAILもブロックする。
【０１４０】
CIS細胞は、それ自体RANKLを発現するものがあるので、胎児生殖細胞に類似しており、精原細胞とは異なる。しかしながら、CIS細胞が精原細胞として正しいニッチにあって、正常な生殖細胞と同様に反応するのは、RANKLがカスパーゼ依存性アポトーシスを誘導することによって増殖を低下させるからであり、一方デノスマブはカスパーゼ依存性アポトーシスの阻害により増殖を増大させる（図7）。その影響は急速で顕著であり、外来RANKL処理の逆の影響は、細胞が天然の環境に暴露されているので、再現性のあるin vivo処理の影響を示す強力な指標となる。
【０１４１】
考察
理論にとらわれず、上記データは、RANKL経路の調節が生殖細胞の生存および増殖に影響を及ぼすことを明確に示している。RANKLおよびデノスマブ処理はいずれも、細胞生存に顕著な変化を引き起こす。観察された反応の相違点の一部は、精巣中に存在するRANKLアイソフォームの違いに起因する可能性がある。生殖細胞増殖の変化は、予想される通りきわめて早く引き起こされ、RANKLとデノスマブの両方が生殖細胞の生存に強力で迅速な影響を及ぼすことができるという事実を裏付ける。
【０１４２】
CISおよび正常生殖細胞の懸滴培養の結果は、セルトリ細胞と生殖細胞との間のRANKLシグナル伝達が生殖細胞の生存および増殖に重要であることを明確に示す。その結果は、正常な体細胞環境において生殖細胞のデノスマブおよびRANKL処理が生殖細胞増殖を制御しているが、骨においてRANKLシグナル伝達に影響を及ぼすことが知られている他の物質CSF-1およびPTHrPは同様の影響を及ぼさないことを明白に示している（図6）。
【０１４３】
結論として、正常な環境的ニッチにある生殖細胞を使用することによって、本発明者らは、デノスマブおよびOPGが生殖細胞増殖を引き起こすことを明らかにした。
【実施例５】
【０１４４】
ヒトOPG-FC、RANKL、ならびに溶媒を14日間マウスに注入することによる精巣RANKL阻害のin vivoでの影響
マウスは、薬物治療の薬力学および薬物動態作用を研究するためのモデルとみなされる。残念ながら、デノスマブはマウスRANKLをブロックすることができないので、本発明者らはデノスマブの影響を調べることができなかった。代わりにヒトOPGを使用したが、これは効果的にマウスRANKLの作用をブロックし、すでに実施例4で示したようにデノスマブと同様に作用することができる。
【０１４５】
材料および方法
動物
C57BL/6Jマウス、15匹の雄、7-8週齢、Taconic Europe A/Sより。マウスは欧州標準ケージII型のケージに入れた。床敷Jeluxyl HW 300/500 (Jelu, J.Ehrler GmbH & Co KG, Ludwigsmuehle, D-73494 Rosenberg, Germany)。床敷は層流ユニット内で週1回交換した。動物舎では1時間に約12回換気した。温度は20℃から24℃とし、外界換気系によって制御した。光サイクルは12時間の暗期および12時間の明期（6:00に点灯）とした。飼料はAltromin 1324、Altromin（Im Seelenkamp 20, 32791 Lage, Germany）製。水はUV殺菌し、水ボトルは馴化および実験の間、必要なときに補充した。
【０１４６】
飼料は無制限に投与された。
【０１４７】
以下の被験物質を使用した。
【０１４８】
【表１】
0006599861.tif 000002
【０１４９】
以下の投与溶液を使用した。
【０１５０】
【表２】
0006599861.tif 000003
【０１５１】
実験計画
15匹のマウス（グループ1-3）は無作為に、5匹からなる3群とした。マウスの処理は以下の表に示すように行う。マウスは異常な臨床症状についてモニターした。各投与回の前に体重を測定する。マウスは14日間の投与後に終了した。終了時に動物は頸椎脱臼によって安楽死させた。300μl血液を各動物から採取し、100-150 μl血清を調製する。腎臓および精巣を摘出して秤量する。サンプルは次のように保存した：腎臓サンプル：1つは急速凍結し、1つは緩衝化したホルマリンもしくはPFA中に入れる；精巣サンプル：1つはホルマリンもしくはPFAに入れ、1/2精巣はブアン固定液に入れ、また1/2の精巣は急速凍結する。精巣上体は急速凍結。
【０１５２】
【表３】
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【０１５３】
臨床的観察
すべての動物は、全身状態について毎日検査する。いかなる臨床的兆候も行動異常も記録する。
【０１５４】
精巣上体尾部を1 ml PBS 1X中で細かく分割し、1時間後に遊離された細胞の数を計数した。血球計を用いて、最終懸濁液において総精子数を評価した。
【０１５５】
動物愛護的エンドポイントおよび早期終了
軽い痛みや中等度の苦痛を越える臨床的兆候を示す動物はいずれも、苦痛を抑えて安楽死させる。これには、動物愛護的（人道的）エンドポイントの限界を超える臨床的兆候を示す動物を含める。動物が研究中に死んでいるのが見つかったり、時期を早めて安楽死させたりした場合、死亡時期をできるだけ正確に記録する。安楽死の前、または死んだ動物を発見した時点で、体重を測定する。できれば、その動物について剖検を実施する。動物の外観および内観、ならびに重要臓器は、剖検計画（‘Post Mortem Examination Schedule’）にしたがって検査して記述し、臓器の重量を記録する。重要臓器は動物ごとに1つのバイアル中でホルマリンに入れて保存する。対照群の動物の終了時に、同じ剖検を対照群の動物に実施する。これはさらなる検討を可能にするはずである。
【０１５６】
結果
体重および苦痛
溶媒、RANKL、およびOPGによる処理後に体重の大きな相違はなかった。動物は苦痛の兆候を示さなかった。
【０１５７】
精巣サイズおよび精巣上体
男性受精能力の総合評価は行われなかったが、生殖器官（精巣および精巣上体）の重量は、溶媒およびRANKLでそれぞれ処理したマウスよりOPG処理マウスにおいて有意に重かった（図8および9）。それに加えて、RANKLおよび溶媒で処理された10週齢マウスよりOPG処理マウスにおいて、いっそう多くの精細管がより太く見えて（図10上図）、生殖細胞上皮の幅は、OPG処理マウスにおいて精子形成段階と無関係に有意に広かった（図10下図）。OPG処理細胞における生殖細胞の増加は、精巣上体の重量の相違を説明することができるが、それはRANKL処理マウスと比べてOPG処理マウスにおいて多数の精子が蓄積することによって引き起こされると考えられる。
【０１５８】
精子数
これを確認するために、溶媒処理マウスおよびOPG処理マウスの両方から得られた精巣上体尾部から精子を放出させたが、それは、これらの精子が完全に成熟していて、すぐに射精できる状態であるからであり、したがってこうした精子はその受精能力の間接的なマーカーとなる。本発明者らは、精子濃度に顕著な相違を見いだした。OPG処理マウスは、溶媒処理マウスの13.4 x 106/mlと比べて有意に高い（p=0.02）平均精子濃度25. 3 x 106/mlを示した（図11）。OPG処理マウスと溶媒処理マウスの精子数の著しい相違は、精巣および精巣上体の臓器重量および精巣における生殖細胞層の厚さの有意な相違と合致し、それは、OPG処理マウスの精液の質がより良好であり、その結果としてすぐれた受精能力を有することを強く裏付ける。
【０１５９】
考察
理論にとらわれることなく、外来RANKL、OPG、もしくは溶媒で2週間処理されたマウスの生殖器官に関するこの包括的な研究において、本発明者らは、OPG処理によるRANKLシグナル伝達の阻害が精巣および精巣上体の重量および組織に有意な変化をもたらすことを示した。これは、RANKLが精巣において発現されていることを示す上記の先行結果と合致する。それに加えて、上記のin vivoおよびex vivoデータは、デノスマブおよびOPGによるRANKL阻害が結果として生殖細胞の増殖をもたらすことを示す。同様に、OPG処理マウスにおける生殖細胞層は、溶媒処理マウスおよびRANKL処理マウスと比べて有意に厚くなっており、このことは、精巣重量の増加が生殖細胞数の増加に起因することを示している。特に精巣上体重量は、RANKL処理マウスとOPG処理マウスの間で有意差があり、それは、OPG処理マウスと比べてRANKL処理マウスの精巣上体にある精子数が減少していることに起因する可能性がある。こうした結果はやはり、溶媒処理マウスよりOPG処理マウスにおいて精子数が有意に高いことを示す結果と合致し、OPG処理がマウスにおいて受精能力を向上させることを強く裏付ける。
【０１６０】
結論として、OPG処理マウスと溶媒処理マウスとの間の精子数の著しい相違は、精巣および精巣上体の臓器重量、ならびに精巣の生殖細胞層の厚さの有意差と合致し、そのことは、OPG処理マウスがよりよい精子の質を保持し、結果として優れた受精能力を有することを強く裏付ける。
【０１６１】
したがって、マウス精巣におけるRANKL、RANK、およびOPGの存在が臨床的に重要であること、ならびにOPGおよび/またはデノスマブによる外因性の処理が受精能改善薬として使用できることを示す証拠が与えられる。
[１]  オステオプロテジェリン結合タンパク質（OPGbp）/NFκB活性化受容体リガンド（RANKL）のNFκB活性化受容体（RANK）との結合のアンタゴニストもしくは阻害剤となる化合物であって、精巣において（生殖）細胞増殖の刺激に使用するための、ならびに/または哺乳動物において男性不妊の治療および/もしくは予防に使用するための、ならびに/または哺乳動物において男性受精能の誘導もしくは改善に使用するための、前記化合物。    
[２]  前記化合物がRANKLと結合することができる作用物質である、１に記載の使用のための化合物。    
[３]  前記化合物がタンパク質性選択的結合物質である、1に記載の使用のための化合物。    
[４]  前記化合物が、OPG、OPG（オステオプロテジェリン）を含む融合タンパク質、たとえばFc-OPGなど、およびヒト免疫グロブリンG1からなる1群から選択される、1〜3のいずれか1つに記載の使用のための化合物。    
[５]  前記化合物が、RANKLまたはRANKペプチドと免疫反応するものであって、抗体もしくは抗原結合ドメイン、その断片または誘導体からなる1群から選択される、1〜4のいずれか1つに記載の使用のための化合物。    
[６]  前記化合物が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、重鎖および軽鎖が可動性リンカーによって連結された抗体、Fv分子、抗原結合断片、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2 分子、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびキメラ抗体からなる1群から選択される、1〜5のいずれか1つに記載の使用のための化合物。    
[７]  前記化合物がRANKLシグナル伝達の阻害剤である、1〜6のいずれか1つに記載の使用のための化合物。    
[８]  前記の抗体もしくは抗原結合ドメイン、その断片または誘導体が、
i) 配列番号2または配列番号4に記載のアミノ酸配列；
ii) 配列番号3のヌクレオチド1から951に示すヌクレオチド配列を含有するDNA分子によってコードされるアミノ酸配列；
iii) 配列番号11に記載のアミノ酸配列；
iv) i)-iii)に記載の配列のうちいずれか1つの部分配列であって、配列番号11に記載のRANKポリペプチドに結合することができる前記部分配列；ならびに
v) i)-iii)に記載の配列のいずれかに対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列； からなる1群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれらで構成される、ペプチドもしくはポリペプチドと免疫反応する、5に記載の使用のための化合物。    
[９]  前記部分配列のアミノ末端アミノ酸残基が、配列番号4のアミノ酸残基番号1-162のいずれか1つである、8に記載の使用のための化合物。    
[１０]  前記部分配列のカルボキシ末端アミノ酸残基が、配列番号4のアミノ酸残基番号313-317のいずれか1つである、8または9に記載の使用のための化合物。    
[１１]  前記部分配列が、配列番号3のヌクレオチド484-951に示すヌクレオチド配列を含むDNAによってコードされるアミノ酸配列である、8または9に記載の使用のための化合物。    
[１２]  前記の抗体もしくは抗原結合ドメインが、
i) 配列番号5に記載のアミノ酸配列；および
ii) i)のアミノ酸の部分配列であって、当該部分配列もしくはバリアントが配列番号6に記載の配列を含んでなる、前記部分配列
からなる1群から選択されるアミノ酸配列と免疫反応する、5〜8のいずれか1つに記載の使用のための化合物。    
[１３]  前記の抗体もしくは抗原結合ドメインが、ヒトモノクローナル抗体もしくは抗原結合ドメインである、5〜12のいずれか1つに記載の使用のための化合物。    
[１４]  前記抗体が全長ヒトモノクローナルIgG2である、5〜13のいずれか1つに記載の使用のための化合物。    
[１５]  前記抗体が、
i) 配列番号7に記載のアミノ酸；
ii) 配列番号7に記載のアミノ酸配列の部分配列；ならびに
iii) i)およびii)に記載のアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなる1群から選択されるアミノ酸を含む重鎖を有する、5〜14のいずれか1つに記載の使用のための化合物。    
[１６]  前記の、配列番号7に記載のアミノ酸配列の部分配列が、配列番号8に記載の配列を含んでなる、15に記載の使用のための化合物。    
[１７]  前記抗体が、
i) 配列番号9に記載のアミノ酸；
ii) i)に記載のアミノ酸配列の部分配列；ならびに
iii) i)およびii)に記載のアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなる1群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する、5〜16のいずれか1つに記載の使用のための化合物。    
[１８]  前記の、配列番号9に記載のアミノ酸配列の部分配列が、配列番号10に記載の配列を含んでなる、17に記載の使用のための化合物。    
[１９]  デノスマブである、5〜18のいずれか1つに記載の使用のための化合物。    
[２０]  前記使用が、精子減少症の予防および/または治療のためである、1〜19のいずれか1つに記載の使用のための化合物。    
[２１]  前記使用が、無精子症の予防および/または治療のためである、1〜19のいずれか1つに記載の使用のための化合物。    
[２２]  前記化合物が、静脈内または皮下に投与される、1〜21のいずれか1つに記載の使用のための化合物。    
[２３]  前記化合物が、皮下に、たとえば4週間に1回、60-120 mgの用量で投与される、1〜22のいずれか1つに記載の使用のための化合物。    
[２４]  前記化合物が、精巣内または性器部に投与される、1〜23のいずれか1つに記載の使用のための化合物。    
[２５]  前記化合物が陰嚢部に投与される、1〜23のいずれか1つに記載の使用のための化合物。    
[２６]  当該被験者の精巣組織サンプルの組織学的分析によって検出することができる、いかなるステージの精巣がんにも罹っていない男性被験者、たとえば年齢15-55歳のヒト男性被験者など、に投与される、1〜25のいずれか1つに記載の化合物。    
[２７]  哺乳動物において男性不妊の治療および/もしくは予防に使用するための、ならびに/または、哺乳動物において男性受精能を改善するための、1〜19のいずれか1つに記載の化合物を含有する組成物。    
[２８]  前記組成物が医薬組成物である、27に記載の組成物。    
[２９]  前記組成物が、1つもしくは複数の生理的に許容される基剤、賦形剤、および/または希釈剤を含有する、27または28に記載の使用のための組成物。    
[３０]  前記組成物が、1つもしくは複数の安定化剤、および/または1つもしくは複数の緩衝剤を含有する、27〜29のいずれか1つに記載の使用のための組成物。    
[３１]  少なくとも1つの安定化剤が界面活性剤である、30に記載の使用のための組成物。    
[３２]  界面活性剤が、ポリソルベートおよびポリオキシプロピレン-ポリエチレンエステル（Pluronic（登録商標））から選択される、31に記載の使用のための組成物。    
[３３]  界面活性剤が、ポリソルベート、たとえば、ポリソルベート20およびポリソルベート80から選択されるポリソルベートである、31に記載の使用のための組成物。    
[３４]  界面活性剤が、0.001-1%の濃度、たとえば0.002-0.5%、たとえば0.004%、または0.01%の濃度で存在する、31〜33のいずれか1つに記載の使用のための組成物。    
[３５]  前記組成物が、ソルビトール、酢酸塩、水酸化ナトリウム、および注射用水を含有する、27〜34のいずれか1つに記載の組成物。    
[３６]  前記組成物のpHが、5.2から6.5までの間、たとえば5.5から6.5までの間、たとえば4.5から5.5までの間、たとえば6.3、または、たとえば5.2である、27〜35のいずれか1つに記載の組成物。    
[３７]  前記組成物が、カルシウムおよびビタミンDから選択される1つもしくは複数の成分を含有する、27〜36のいずれか1つに記載の組成物。    
[３８]  哺乳動物において男性不妊を治療および/もしくは予防する、ならびに/または、哺乳動物において男性受精能を改善するための方法であって、その方法が、治療上有効な量の、1〜18のいずれか1つに記載の化合物、または26〜36のいずれか1つに記載の組成物を投与することを含む、前記方法。    
[３９]  前記哺乳動物が、26に記載の被験者である、38に記載の方法。    
[４０]  前記化合物または組成物が静脈内もしくは皮下に投与される、38または39に記載の方法。    
[４１]  前記化合物が、皮下に、たとえば4週間に1回、60-120 mgの用量で投与される、38〜40のいずれか1つに記載の方法。    
[４２]  前記化合物が精巣内に投与される、38〜40のいずれか1つに記載の方法。    
[４３]  精巣において（生殖）細胞増殖の刺激に使用するための、ならびに/または哺乳動物において男性不妊の治療および/もしくは予防および/もしくは軽減に使用するための、ならびに/または哺乳動物において男性受精能の誘導もしくは改善に使用するための、OPG（オステオプロテジェリン）、OPGを含む融合タンパク質、たとえばFc-OPG、およびヒト免疫グロブリンG1。    
[４４]  精巣において（生殖）細胞増殖の刺激に使用するための、ならびに/または哺乳動物において男性不妊の治療および/もしくは予防および/もしくは軽減に使用するための、ならびに/または哺乳動物において男性受精能の誘導もしくは改善に使用するための、デノスマブ。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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