(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患の進行に関連する立体構造の変換を経ている候補バイオマーカータンパク質の量および二次構造の直接解析のための赤外線センサー素子であって、
台形または平行四辺形の形状であり、赤外線内で透明であり、アミドＩバンドを検出するのに十分なシグナル対ノイズ比を有するゲルマニウム内反射体と、
前記バイオマーカータンパク質に対応する少なくとも１つの受容体であって、前記候補バイオマーカータンパク質への特異的且つ立体構造的に独立した結合が可能な抗体であり、並びに、前記少なくとも１つの受容体の自由にアクセス可能なアミン基を短いシラン／チオールリンカー上のアミン反応基と反応させ、及び前記短いシラン／チオールリンカー上の残留するアミン反応基を前記候補バイオマーカータンパク質と交差反応しないブロッキング物質でブロックする、短いシランリンカーを用いたシラン化または短いチオールリンカーを用いたチオール化によって、前記ゲルマニウム内反射体の少なくとも１つの表面と直接グラフト結合する前記受容体と
を含む前記赤外線センサー素子。
【請求項２】
異なる波長での蛍光の検出を含む別の光学的方法による並行解析にさらに適する、請求項１に記載の赤外線センサー素子。
【請求項３】
前記内反射体が、
（ｉ）ゲルマニウム単結晶であり、および／または
（ｉｉ）前記内反射体を通じて、２つ以上の赤外光の通過を可能にする、請求項１または２に記載の赤外線センサー素子。
【請求項４】
前記シランリンカーおよびチオールリンカーが、均質なシランおよびチオールリンカー、シランリンカーの混合物、ならびにチオールリンカーの混合物を含み、かつ、原子２０個以下または原子１５個以下の鎖長を有し、
前記シランリンカーが、以下の式：
Ｘ３Ｓｉ−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−（ＣＨ２）ｎ’−Ｚ、
Ｘ２Ｒ１Ｓｉ−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−（ＣＨ２）ｎ’−Ｚ、または
Ｘ（Ｒ１）２Ｓｉ−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−（ＣＨ２）ｎ’−Ｚ、
のうちの１つを有し、
前記チオールリンカーが、以下の式：
ＨＳ−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−（ＣＨ２）ｎ’−Ｚ
を有し、
式中、出現毎にＸは、ハロゲンおよびＣ１〜６アルコキシより独立して選択され、ｎは１〜１０の整数であり、ｎ’は１〜５の整数であり；出現毎にＲ１は、Ｃ１〜６アルキルより独立して選択され、Ｙは、化学結合、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＳＯ２−、−ＮＲ２−、−Ｓ−、−ＳＳ−、−ＮＲ２ＣＯ−、−ＣＯＮＲ２−、−ＮＲ２ＳＯ２−、および−ＳＯ２ＮＲ２−より選択され（Ｒ２はＨまたはＣ１〜６アルキル）、Ｚは、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、およびそのエステル誘導体を含むアミン反応基である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の赤外線センサー素子。
【請求項５】
請求項４に記載の赤外線センサー素子が、
（ｉ）シラン化により取得可能である、ここで、前記リンカー中、ＸはＣ１〜６アルコキシ基より独立して選択され、Ｙは−ＮＨＣＯ−であり、Ｚは−ＣＯ２Ｈまたはそのエステル誘導体であり、ｎは１〜５の整数であり、ｎ’は１〜３の整数であり、または
（ｉｉ）チオール化により取得可能である、ここで、前記リンカー中、Ｙは化学結合であり、Ｚは−ＣＯ２Ｈまたはそのエステル誘導体であり、ｎは１〜８の整数であり、ｎ’は１〜５の整数である、前記赤外線センサー素子。
【請求項６】
（ｉ）疾患の進行に関連する立体構造の変換を経ている前記候補バイオマーカータンパク質が、アミロイド−βペプチド（アルツハイマー病と関連）、α−シヌクレイン（パーキンソン病と関連）を含む、アミロイド形成ペプチドまたは健康状態依存性の、特徴的な二次構造組成を有する（ポリ）ペプチドであり、および／または
（ｉｉ）前記候補バイオマーカータンパク質と交差反応しない前記ブロッキング物質が、カゼイン、エタノールアミン、Ｌ−リジン、ポリエチレングリコール、アルブミン、およびそれらの誘導体より選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の赤外線センサー素子。
【請求項７】
（ｉ）前記候補バイオマーカータンパク質が、アミロイド−βペプチドであり、前記抗体が、抗体Ａ８９７８を含む、前記アミロイド−βペプチドのセントラルエピトープと特異的に結合する抗体であり、または
（ｉｉ）前記候補バイオマーカータンパク質が、α−シヌクレインであり、前記抗体が、抗体４Ｂ１２またはＳ５５６６を含む、立体構造的特異性を有さない、α−シヌクレインペプチドと特異的に結合する抗体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の赤外線センサー素子。
【請求項８】
請求項１〜７に記載の前記赤外線センサーを含む、疾患の進行に関連する立体構造の変換を経ている候補バイオマーカータンパク質の量および二次構造を直接解析するためのデバイス。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の短いシランリンカーを用いた赤外線センサー素子の調製方法であって、
（ａ）酸化により、内反射体の少なくとも１つの表面を表面活性化するステップと、
（ｂ）短いシランリンカーを、ステップ（ａ）で得られた活性化表面にグラフト結合させるステップと、
（ｃ）前記短いシランリンカーのアミン反応基を介して、前記受容体を前記内反射体に共有結合によりカップリングさせるステップと、
（ｄ）前記短いシランリンカー上の残留するアミン反応基を、前記候補バイオマーカータンパク質と交差反応しない前記ブロッキング物質でブロックするステップと
を含む、方法。
【請求項１０】
（ｉ）前記酸化が、Ｈ２Ｏ２／シュウ酸により実施され、および／または
（ｉｉ）前記シランリンカーが、請求項４または５で定義される通りであり、そのアミン反応基にエステル誘導体を有し、および／または
（ｉｉｉ）前記ブロッキング物質が、カゼインである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の短いチオールリンカーを用いて前記赤外線センサー素子を調製する方法であって、
（ａ）ＨＦとの反応により、前記ゲルマニウム内反射体の少なくとも１つの表面を表面活性化するステップと、
（ｂ）短いチオールリンカーを、ステップ（ａ）で得られた活性化表面にグラフト結合させるステップと、
（ｃ）前記短いチオールリンカーのアミン反応基を介して、前記受容体を前記内反射体に共有結合によりカップリングさせるステップと、
（ｄ）前記短いチオールリンカー上の残留するアミン反応基を、前記ブロッキング物質でブロックするステップと
を含む、方法。
【請求項１２】
（ｉ）前記表面活性化が、ＨＦ（４９％）により実施され、および／または
（ｉｉ）前記チオールリンカーが、請求項４または５で定義される通りであり、そのアミン反応基にエステル誘導体を有し、および／または
（ｉｉｉ）前記ブロッキング物質が、カゼインである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
体液を含む複合的な液体中の、疾患の進行に関連する立体構造の変換を経ている候補バイオマーカータンパク質の二次構造を測定するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の赤外線センサー素子、または請求項８に記載のデバイスの使用。
【請求項１４】
（ａ）請求項１〜７に記載の前記赤外線センサー素子を含むＩＲセル中に、前記赤外線センサーの表面上の前記受容体に対応する潜在的な候補バイオマーカータンパク質を流動させるステップと、
（ｂ）前記セルを通じてＩＲビームを照射し、そこから赤外スペクトルを取得するステップと、
（ｃ）得られた赤外スペクトルを解析して、前記候補バイオマーカータンパク質の二次構造を測定するステップと
を含む、複合的な液体中の、疾患の進行に関連する立体構造の変換を経ている候補バイオマーカータンパク質の二次構造を測定する方法。
【請求項１５】
（ｉ）前記方法が、ステップ（ａ）の前に、請求項１〜７に記載の赤外線センサー素子を、ＩＲセル内に据付けるステップをさらに含み、および／または
（ｉｉ）前記方法が、得られた赤外スペクトルを解析して、前記候補バイオマーカータンパク質の二次構造組成に基づき、統計的手法を用いてサンプルを分類するステップ（ｄ）をさらに含み、および／または
（ｉｉｉ）前記方法が、前記受容体に対応する遊離リガンドの溶液を適用することにより、赤外線素子の表面を再生するステップ（ｅ）をさらに含み、および／または
（ｉｖ）ステップ（ｂ）で得られた前記スペクトルが、アミドＩバンドを解像するのに十分なシグナル対ノイズ比を有し、および／または
（ｖ）ステップ（ｃ）が、前記バイオマーカータンパク質のアミドＩバンド最大値のシフトを解析して、前記候補バイオマーカータンパク質の二次構造を測定するステップを含み、および／または
（ｖｉ）ステップ（ｃ）が、前記得られた赤外スペクトルを、二次構造が公知および／もしくは濃度が公知の候補バイオマーカータンパク質のスペクトルと比較するステップを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ｉ）赤外線解析と並行して、異なる波長での、ＵＶ／Ｖｉｓ−蛍光を含む別の光学的方法による検出をさらに含み、および／または
（ｉｉ）免疫−ＡＴＲ−ＩＲ振動分光法を、並行してなされる蛍光分光法と組み合わせ、および／または
（ｉｉｉ）前処理せずに、脳脊髄液、血液、もしくは血清を含む体液中の候補バイオマーカータンパク質を直接測定するのに適し、および／または
（ｉｖ）前記候補バイオマーカータンパク質の別個の（ｉｎ−ｖｉｔｒｏの）、またはオンラインの測定に適する、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
疾患の進行を判定する方法であって、
候補バイオマーカータンパク質の立体構造の変換が疾患の進行と関連しており、前記バイオマーカータンパク質のアミドＩバンド最大値のシフトが、前記疾患の進行を示唆する分類指標であり、
前記進行の判定が、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法により実施され、および／または１６３８〜１６４８ｃｍ−１の値を有する分類指標閾値が、前記疾患の進行を示唆する分類指標である、前記方法。
【請求項１８】
候補バイオマーカータンパク質としてアミロイド−βを用いて、アルツハイマー病の進行を判定する場合、アミロイド−βペプチドのアミドＩバンド最大値の下方シフトが、１６３８〜１６４８ｃｍ−１の閾値を有する場合、アルツハイマー病の進行を示唆する、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
候補バイオマーカータンパク質としてα−シヌクレインを用いて、パーキンソン病の進行を判定する場合、α−シヌクレインペプチドのアミドＩバンド最大値の下方シフトが、１６３８〜１６４８ｃｍ−１の閾値を有する場合、パーキンソン病の進行を示唆する、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ゲルマニウム単結晶が、台形に切断されたゲルマニウム単結晶である、請求項３に記載の赤外線センサー素子。
【請求項２１】
前記（ｉ）の場合、Ｘはメトキシ基およびエトキシ基より独立して選択され、ｎは３、ｎ’は２であり、
前記（ｉｉ）の場合、ｎは８であり、ｎ’は４である、請求項５に記載の赤外線センサー素子。
【請求項２２】
前記エステル誘導体が、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジルエステルの活性なエステルである、請求項１０または１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、立体構造（conformation）および二次構造解析（secondary structure analysis）のための、特に振動分光法により、例えば体液のような複合的な混合物内の単一の選択されたタンパク質について直接的で非侵襲的な二次構造定性解析を行うためのバイオセンサーを提供する。解析する場合、選択された物質を単離、濃縮する必要、または特別な調製手順により前処理する必要がない。
【背景技術】
【０００２】
体液中のバイオマーカー候補を検出するための定量的な方法は、酵素結合免疫吸着測定法（Enzyme-Linked Immune-Sorbent Assays：ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴分光法（Surface Plasmon Resonance spectroscopy：ＳＰＲ）、表面蛍光強度分布解析法（surface Fluorescence Intensity Distribution Analysis：ｓＦＩＤＡ）、または質量分析技法（mass spectroscopy techniques）である。これらの技法は、分析物の二次構造について直接的な情報を提供しない。ＥＬＩＳＡまたはＳＰＲのような抗体に基づく方法は、特定の１つの立体構造の構造情報が間接的に導かれるように、立体構造感受性抗体で補完され得る（I. Morgado et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 109(31) : 12503-12508 (2012); Venkataramani et al., JAD 29(2) : 361-371 (2012)）。このような立体構造感受性抗体を用いた場合、特定の二次構造のみが検出されることが、本発明者らの試験で実証された。したがって、分析対象化合物の特定の構造的組成に基づき、サンプルを識別するのは不可能である。検出可能な立体構造は、いずれも天然のサンプル中に存在するが、例えば疾患において、組成は変化する。以下に記載する識別では、記録されるシグナルは、認められた構造の濃度差を反映しなければならないので、構造独立型抗体を必要とする。ｓＦＩＤＡは、同様の固定化および検出抗体を用いることにより、候補バイオマーカーのダイマーまたはオリゴマーを検出する。しかし、ｓＦＩＤＡは、構造情報を検出しない（S. Funke et al., Rejuvenation Res., 13(2-3) : 206-209 (2010)）。フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光法によるタンパク質の二次構造解析、および特別な減衰全反射（ＡＴＲ）センサー表面上に固定化後の組換えタンパク質または精製タンパク質の解析について頻繁に記載されている（J. Ollesch et al., Appl. Spectrosc, 61(10) : 1025-1031 (2007) ; K. Elfrink, J. Ollesch et al., Proc Natl Acad Sci, 105(31) : 10815-10819 (2008) ; Frost et al., J. Biol. Chem., 284(6) : 3546-3551 (2009); S. Funke et al., J. Biol. Chem., 280(10) : 8912-7 (2005)）。ＲＮＡのような核酸のＦＴＩＲ−分光学的二次構造解析はすでに公表されている（E. Brauns and R. B. Dyer, Biophys. J., 89(5) : 3523-3530 (2005)）。科学的および技術的知識の現状では、事前に単離しないで行われる、血清、血漿、または脳脊髄液のような複合的な液体に由来する成分の二次構造解析は、今日までに報告されていない。ＡＴＲフロースルーセンサーを適用することにより、複合的な体液から特定の成分を選択的に検出することは、革新的な新規開発に当たる。これまで、このような技法は、単離後のタンパク質にのみ適用された。ＡＴＲセンサーの内反射体（ＩＲＥ）は、屈折率が高い赤外線透過物質から一般的に構成される。このような物質として、ダイヤモンド、ゲルマニウム、シリコン、またはセレン化亜鉛が挙げられる。タンパク質は、繋留型脂質（K. Elfrink, L. Nagel-Steger and D. Riesner, Biol. Chem., 388(1) : 79-89 (2007); K. Elfrink, J. Ollesch et al., PNAS 2008; J. Guldenhauptet al., The FEBS Journal, 275(23) : 5910-5918 (2008); C. Kotting et al., Chemical Physics, 396: 72-83 (2012); P. Pinkerneil et al., Chemphyschem, 13(11) : 2649-2653 (2012))、蒸着型または化学的隔離型金表面上のチオールケミストリー（Ataka et al., J. Am. Chem. Soci., 126(49) : 16199-16206 (2004); A. Badura et al., Photochem. and Photobiol., 82(5): 1385-1390 (2006)）、またはシラン（B. M. Smith et al., Langmuir, 20(4): 1184-1188 (2004); S. Devouge et al., Bioorg. & Med. Chem. Lett., 15(13): 13252-13256 (2005); P. W. Loscutoff and S. F. Bent, Ann. Rev. Physical Chemistry, 57(l):467-495 (2006); J. Matijasevic et al., Langmuir, 24(6): 2588-2596 (2008); S. Devouge et al., Journal of Colloid and Interface Science, 332(2):408-415 (2009); J. Schartner et al., J. Am. Chem. Soci., 135(10):4079-4087 (2013)）を介して、これらの表面上に固定化される。このプロセスでは、ゲルマニウム以外のその他の半導体上への抗体またはその他のタンパク質の固定化について記載されている（P. Hofer and Fringeli, Biophysics of Structure and Mechanism, 6(l): 67-80 (1979); S. Lofas and B. Johnsson, J. Chem. Soc, Chem. Comm. (21): 1526 (1990); B. Byrne et al., Sensors (Basel, Switzerland), 9(6):4407-4445 (2009); M. Punzet et al., Nanoscale, 4(7): 2431 (2012)）。本発明に関連する試薬は、本発明者らにより合成された。塩基性シランが公表された（J. Schartner et al.、J. Am. Chem. Soc、135 (10) :4079-4087 (2013)）が、主要な用途、すなわち遊離リジン残基および短鎖トリエトキシシランを介した抗体の固定化について、これまで記載されていない。タンパク質を構成するリジンを介した、その他のスクシンイミジルエステル上への抗体の固定化が報告されている（Lofas and B.Johnsson, J. Chem. Soci., Chem. Comm. (21): 1526 (1990)、欧州特許第１２１４５９４号明細書、および国際公開第２００００７０３４５号パンフレット）。しかし、解析は、ＩＲ分光法では実施されず、したがってタンパク質の二次構造解析は実施されなかった。共有結合によるタンパク質の固定化を目的とする機能化された短鎖トリアルコキシシラン（Ｎ−（４，４，４−トリエトキシシランブチル）スクシンアミド酸２，５−ジオキソピロリジン（dioxopyrrolidine）−１−イルエステル等）の使用が報告されている。
【０００３】
さらなるアプローチでは、ＡＴＲ−ＩＲＥはシラン化され、ビオチンとカップリングされ、その結果、二次構造解析を一切行わないアビジン／ストレプトアビジンセンサーを実現した（M. Voue et al., Langmuir, 23(2):949-955 (2007)）。ここでは、センサー表面は、より複雑なワークフローにおいて、腐食性の化学薬品を通じて修飾されたが、この場合分析物の二次構造に影響を及ぼし、変化させる可能性がある。提示された調製法は、生理学的条件下で、複合的な体液中の選択されたタンパク質について解析するための提案されたセンサーを生み出すのに適さないことが判明した（Kleiren et al., Spectroscopy- An International Journal, 24 (1-2, SI): 61-66. (2010)）。Voue（M. Voue et al., Langmuir, 23(2):949-955 (2007); S. Devouge et al., Journal of Colloid and Interface Science, 332(2):408-415 (2009)）とは別に、国際公開第０２／０５６０１８号パンフレットおよび欧州特許第Ａ−１８０６５７４号明細書は、リガンド−受容体相互作用の解析に適する光学素子について開示する。
【０００４】
国際公開第０２／０５６０１８号パンフレットは、受容体とのリガンド相互作用を研究するためのデバイスについて明示的に言及しているが、同デバイスは、赤外線内で透明な減衰型内部全反射体からなり、その少なくとも１つの表面が、酸化、ヒドロキシル化、または還元により化学的に活性化され、受容体を固定化する能力を有する長鎖シラン誘導体と共有結合によりグラフト結合している。減衰型内部全反射要素は、ゲルマニウム、シリコン、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、およびＡＭ−ＴＩＲより選択される物質から作製される。デバイスは、リガンド−受容体相互作用を試験するのに適する。さらに、国際公開第０２／００１２０２号パンフレットは、ＡＴＲ−ＩＲ−分光法と偏光照射法および屈折率測定法との併用について記載する。
【０００５】
欧州特許第Ａ−１８０６５７４号明細書は、リガンド−受容体相互作用の研究、特に分析物−標的物相互作用の研究、例えば生体分子および化学的分子および有機成分と表面とのそれらの相互作用等の研究に適するデバイスについて開示するが、同デバイスは、赤外線内で透明な減衰型内部全反射要素からなり、その少なくとも１つの表面が還元され、受容体を固定することができるアルケンと共有結合によりグラフト結合しており、この場合、前記アルケンは、アルキル、ハロアルキル、ハロ、アルケニル、シアノ、エポキシ、チオ、アミノ、ヒドロキシル、イソシアノ、イソチオシアノ、カルボキシ、ポリアルコキシ、アルキルアリールスルホキシ−ポリアルコキシ、またはヘテロアリールオキシ−カルボニルアルキル（carbonylalkyl）−ポリアルコキシより選択される、１つまたは複数の置換基により任意選択で置換される。減衰型内部全反射要素は、ゲルマニウム、特に台形、半円筒形、ファイバー状、またはロッド状の幾何学的形状、または多面体の形状を有する結晶から作製される。デバイスは、リガンド−受容体相互作用、特に生体分子または有機成分、あるいはグラフト結合した有機分子における、または同分子内における、生体分子または有機成分または水溶性分子とのそれらの相互作用または錯体形成または反応を試験するのに適する。
【０００６】
国際公開第０２／００１２０２号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１２／０３０９９４３号明細書は、例えばシランによる抗体−サポートの主要生成法について開示する。
【０００７】
国際公開第０７／１３１９９７号パンフレットは、ＡＴＲ−ＩＲ−測定装置について言及しており、この場合、サンプルは、ＡＴＲ表面に対して所定の距離で、直接接触することなく保持される。分光学的に不活性な媒体がスペーサーとして意図される。
【０００８】
従来型の分光法は、単一の分析物を解析用に高濃度で単離するために、複合的なサンプルの多段階調製を必要とする。二次構造は、調製期間中に変化する可能性がある。
【０００９】
ＳＰＲおよびＥＬＩＳＡ法は、複合的な媒体に含まれる特定の成分を高感度で定量化するが、二次構造情報を集めることはできない。これらの方法は高感度であるが、純粋に定量的な方法である。立体構造感受性（立体構造特異性を意味する）抗体は、分析物の構造の遷移状態について感度は一般的に劣るが（S. A. Funke, International Journal of Alzheimer's Disease, 2011: 1-8 (2011); K. A. Bruggink et al., Analytical Biochemistry, 433(2): 112-120 (2013)）、それにもかかわらず疾患と関連性を有する（I. Benilova et al., Nature Neuroscience, 15(3): 349-357 (2012)）。
【００１０】
抗体結合について報告されたＩＲ適合物質は、シリコン、ダイヤモンド、およびゲルマニウムを含む。シリコンは、分析対象となるスペクトルのフィンガープリント範囲内でＩＲ照射を吸収する。ダイヤモンドは高価な物質であり、感度向上のためにより大きな検出器領域を確保したくても、その実現を妨げる。シリコンおよびダイヤモンドの屈折率は、ゲルマニウムの屈折率よりも低いが、これは後者と比較してシグナル／ノイズ比の低下を反映する。
【００１１】
捕捉および検出用に、同一の抗体を選択することにより、ｓＦＩＤＡはダイマーまたはオリゴマー凝集物に対して高感度となる（L. Wang-Dietrich et al., JAD, 34(4):985-994 (2013))。二次構造は直接解析されない。
【００１２】
タンパク質の二次構造解析は、一連の技法（ＵＶ／Ｖｉｓ円偏光二色性分光法、ＩＲ分光法、ＮＭＲ分光法）の標準的な応用である。いずれも、高純度の濃縮したタンパク質を解析に必要とする。
【００１３】
シランによるタンパク質の固定化は、もっぱら受容体−リガンド相互作用の解析について、欧州特許第Ａ−１８０６５７４号明細書および国際公開第０２／０５６０１８号パンフレットに開示されている。したがって、繋留型タンパク質の反応およびこれとの反応が検討された。繋留型タンパク質のさらなるリガンドの二次構造解析については検討されなかった。
【００１４】
最も重要な公知のタンパク質ミスフォールディング疾患であるアルツハイマー病の信頼性のある診断は、現在のところ、疾患が進行した状態を前提とする。現在のバイオマーカー解析法は、定量的ＥＬＩＳＡに基づく。例えば、疾患進行期間中に生じるアミロイドβ（Ａβ）ペプチドの構造変換は、患者に臨床症状が現れるはるか前に開始すると考えられる。このような検討から、バイオマーカー候補について構造解析を行えば、確立した診断を補完する可能性を提供するだけでなく、これよりも重要でさえあるが、診断時期をより早めることを可能にし得る。したがって、治療をより早期に開始することができ、より長期にわたり生活の質を確保できる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の簡単な説明
本発明は、事前の単離または濃縮を行わない、複合的な体液に由来する選択成分の二次構造直接解析法を提供する。この解析法は、短いシランまたはチオールリンカーを介してセンサー素子上に直接固定化された抗体を有するセンサー素子、特に、固定化されたトリエトキシシランまたはチオールリンカーに、抗体がペプチド結合を介して共有結合したゲルマニウム表面に基づく。免疫学的結合は、ＥＬＩＳＡ法と同様に、ゲルマニウム表面に高い選択物質特異性を付与する。捕捉された物質は、特定の二次構造について、赤外分光法により解析される。予測可能なミスフォールディングが定量可能である。この方法により、複合的な体液中のバイオマーカー二次構造が、特定可能である。センサー設計は、代替的分光技術、例えば蛍光分光法との並行制御を可能にする。物質に対する免疫学的に確認済みの特異性が高ければ、前処理を行わずに、複合的な液体、例えば脳脊髄液（ｃｓｆ）または血液に由来する選択されたバイオマーカーの二次構造直接解析が可能となる。
【００１６】
したがって、本発明は、下記事項を提供する:
（１）高分子化合物の量および二次構造を直接解析するための光学センサー素子であって、前記赤外線センサー素子が、赤外線内で透明なゲルマニウム内反射体と、短いシランリンカーを用いたシラン化、または短いチオールリンカーを用いたチオール化により、および受容体の自由にアクセス可能なアミン基を短いシラン／チオールリンカー上のアミン反応基と反応させて、前記内反射体の少なくとも１つの表面と直接グラフト結合した、高分子化合物に対応する少なくとも１つの受容体とを含む光学センサー素子。
（１’）疾患の進行に関連する立体構造の変換を経ている候補バイオマーカータンパク質の量および二次構造の直接解析のための赤外線センサー素子であって、前記赤外線センサー素子が、台形または平行四辺形の形状であり、赤外線内で透明なゲルマニウム内反射体と、候補バイオマーカータンパク質への特異的で立体構造的に独立した結合が可能な抗体であり、短いシランリンカーを用いたシラン化または短いチオールリンカーを用いたチオール化、前記少なくとも１つの受容体の自由にアクセス可能なアミン基を、短いシラン／チオールリンカー上のアミン反応基と反応させること、および短いシラン／チオールリンカー上の残留するアミン反応基を、候補バイオマーカータンパク質と交差反応しないブロッキング物質でブロックすることにより、前記ゲルマニウム内反射体の少なくとも１つの表面と直接グラフト結合したバイオマーカータンパク質に対応する前記少なくとも１つの受容体とを含む赤外線センサー素子。
（２）上記（１）または（１’）の光学センサーを含む、高分子化合物の量および二次構造を直接解析するためのデバイス。
（３）下記ステップを含む、上記（１）の短いシランリンカーを用いた光学センサー素子の調製法：
（ａ）酸化により、ゲルマニウム内反射体の少なくとも１つの表面を表面活性化するステップ、
（ｂ）短いシランリンカーを、ステップ（ａ）で得られた活性化表面にグラフト結合させるステップ、および
（ｃ）短いシランリンカーのアミン反応基を介して、受容体を内反射体に共有結合によりカップリングさせるステップ。
（３’）下記のステップを含む、上記（１’）のいずれか１つに記載の短いシランリンカーを用いて赤外線センサー素子を調製する方法：
（ａ）酸化により、内反射体の少なくとも１つの表面を表面活性化するステップ、
（ｂ）短いシランリンカーを、ステップ（ａ）で得られた活性化表面にグラフト結合させるステップ、
（ｃ）短いシランリンカーのアミン反応基を介して、受容体を内反射体に共有結合によりカップリングさせるステップ、および
（ｄ）短いシランリンカー上の残留するアミン反応基を、候補バイオマーカータンパク質と交差反応しないブロッキング物質でブロックするステップ。
（４）下記ステップを含む、上記（１）の短いチオールリンカーを用いて、光学センサー素子を調製する方法：
（ａ）ＨＦとの反応により、ゲルマニウム内反射体の少なくとも１つの表面を表面活性化するステップ、
（ｂ）短いチオールリンカーを、ステップ（ａ）で得られた活性化表面にグラフト結合させるステップ、および
（ｃ）短いチオールリンカーのアミン反応基を介して、受容体を内反射体に共有結合によりカップリングさせるステップ。
（４’）下記のステップを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の短いチオールリンカーを用いて赤外線センサー素子を調製する方法：
（ａ）ＨＦとの反応により、ゲルマニウム内反射体の少なくとも１つの表面を表面活性化するステップ、
（ｂ）短いチオールリンカーを、ステップ（ａ）で得られた活性化表面にグラフト結合させるステップ、および
（ｃ）短いチオールリンカーのアミン反応基を介して、受容体を内反射体に共有結合によりカップリングさせるステップ、および
（ｄ）短いチオールリンカー上の残留アミン反応基を、ブロッキング物質でブロッキングするステップ。
（５）体液を含む複合的な液体中の、高分子化合物の二次構造および任意選択でその量を測定するための、上記（１）の光学センサー素子または上記（２）のデバイスの使用。
（５’）体液を含む複合的な液体中の、疾患の進行に関連する立体構造の変換を経ている候補バイオマーカータンパク質の二次構造および任意選択でその量を測定するための、上記（１’）の赤外線センサー素子または上記（２）のデバイスの使用。
（６）下記のステップを含む、複合的な液体中の高分子化合物の二次構造および任意選択でその量を測定する方法：
（ａ）上記（１）の光学センサー素子を含むＩＲセル中に、前記光学センサーの表面上の受容体に対応する潜在的な高分子リガンドを流動させるステップ；
（ｂ）前記セルを通じてＩＲビームを照射し、そこから赤外スペクトルを得るステップ；ならびに
（ｃ）得られた赤外スペクトルを解析して、高分子化合物の二次構造および任意選択でその量を測定するステップ。
（６’）下記ステップを含む、複合的な液体中に含まれる、疾患の進行に関連する立体構造の変換を経ている候補バイオマーカータンパク質の二次構造および任意選択でその量を測定する方法：
（ａ）上記（１’）の赤外線センサー素子を含むＩＲセル中に、前記赤外線センサーの表面上の受容体に対応する潜在的な候補バイオマーカータンパク質を流動させるステップ；
（ｂ）前記セルを通じてＩＲビームを照射し、そこからアミドＩバンドを解像するのに十分なシグナル対ノイズ比を有する赤外スペクトルを得るステップ；ならびに
（ｃ）得られた赤外スペクトルを解析して、候補バイオマーカータンパク質の二次構造および任意選択でその量を測定するステップ。
（７）疾患の進行を判定する方法であって、候補バイオマーカータンパク質の立体構造の変換が、疾患の進行と関連し、バイオマーカータンパク質のアミドＩバンドの最大値がシフトした場合、そのようなシフトが疾患の進行を示唆する分類指標である方法。前記方法（７）では、疾患の進行の判定が、上記（６’）の方法により実施され、および／または閾値として１６３８〜１６４８ｃｍ−１の値を有する分類指標が、疾患の進行を示唆する分類指標であるのが好ましい。
【００１７】
本発明の光学センサー素子は、少なくとも赤外分光法および任意選択で蛍光分光法による、特定の物質、特にタンパク質の二次構造の直接解析を可能にし、物質／タンパク質を単離または濃縮する必要がない。これは、特に疾患バイオマーカー候補が定量的に解析されるだけでなく、特に二次構造についても解析されることを意味する。例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、またはハンチントン舞踏病のようなタンパク質ミスフォールディング型疾患を考慮すれば、この情報は、疾患の進行と決定的な関連性を有する。
【００１８】
本発明の方法の長所は、無処理の複合的な液体、特に天然の体液に由来するバイオマーカー候補分子の二次構造の直接検出である。検出対象物質の単離および濃縮は不要であり、それはセンサーおよび検出技法の一部である。対照的に、その他の技法で用いられる立体構造感受性抗体は、二次構造組成について定量的に測定することができない。さらに、立体構造感受性抗体は、単一の二次構造要素に対して有する特異性が低い。本発明のセンサー素子は、例えば蛍光技法を用いる並行制御実験に適する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＩＲ分光光度計（Ａ）のサンプルチャンバー内にあるセンサーデバイスの概略図、サンプルチャンバー（Ｂ）の詳細図、およびフロースルーキュベット（Ｃ）の模式図である。
【図２】最適化したフロースルーキュベットを詳細に示した図である。デバイスは、カバー内の石英ウィンドウを経由する代替的光学技法と共に、並行解析用として調製される。ガスケット要素、入口、および出口を、安定性および流動性に関して最適化した。
【図３】ゲルマニウムと共有結合させた、短鎖トリエトキシシラン（Ｎ−（４，４，４−トリエトキシシランブチル）スクシンアミド酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イルエステル）を示す図である（Ａ）。スクシンイミジルエステルは、例えばタンパク質を構成するリジンの遊離アミンと反応して、所望のタンパク質、例えば抗体の安定的結合をもたらすが、その結合したリジン側鎖を示す図である（Ｂ）。代替的リンカーとして、やはりゲルマニウムに共有結合した、１２−メルカプトドデカン酸ＮＨＳエステルを示す図である（Ｃ）。ＮＨＳエステルは、例えばタンパク質を構成するリジンの遊離アミンと反応して、やはり共有結合を形成する（Ｄ）。
【図４】蛍光顕微鏡解析実験を示す図である。反応性シラン上（Ａ）では、蛍光は検出されない（Ｂ）が、８Ｇ７−ＦＩＴＣ抗体が結合した（Ｃ）。検出抗体１Ｅ８が結合しても（Ｄ）、蛍光は増加しない（Ｅ）。カゼインでブロックした表面（Ｆ）は、蛍光を示さない（Ｇ）他に、検出抗体８Ｇ７−ＦＩＴＣとも結合しない（Ｈ）。特異的に固定化されたＡβ−ペプチド（ここでは：Ａβ１〜４２、Ｉ）のみが、抗体８Ｇ７−ＦＩＴＣを捕捉する（Ｊ）。
【図５】本発明と共に、非神経変性対照患者をアルツハイマー病患者から識別するのに用いられるＡβペプチドの赤外線吸収のアミドＩマーカーバンドを示す図である。「健常」であるモノマー（実線）、「疾患性」オリゴマー（破線）、および「疾患性」線維型（点線）の各立体構造内の単離された合成Ａβペプチド（Ａ）を抗体１Ｅ８により、ＡＴＲ表面に捕捉した。二次構造の構成は明確に異なる。抗体ＫＷ１で捕捉されたヒトｃｓｆ由来のオリゴマーＡβ分画のアミドＩバンド（Ｂ、破線）は、抗体Ｂ１０で捕捉された天然の線維型分画（Ｃ、点線）と異なる。両者は、合成サンプルと比較して天然の立体構造多様性を反映する。立体構造的に独立した抗体Ａ８９７８で捕捉された、対照患者１４例（実線）およびアルツハイマー病患者９例（点線）の未処理ｃｓｆに由来するＡβ分画（Ｄ）は異なるが、定義された立体構造をとる合成ペプチドほどではない。それにもかかわらず、分離は一意的である：すべての対照アミドＩ最大値は、１６４３ｃｍ−１を上回り、すべてのアルツハイマー病患者は下回る（分離線）。より顕著なこととして、クラススペクトルの算術平均は、異なるバンド位置を示す（Ｅ）。
【図６】アミドＩバンド位置は、対照患者をアルツハイマー病患者から一意的に識別することを可能にすることを示す図である（Ａ）。１６４７および１６４０ｃｍ−１における吸光係数を用いて計算した二次分離関数によるＬＤＡ分類において、これらの知見が確認された（Ｂ）。
【図７】対照患者およびアルツハイマー病患者から得られたＥＤＴＡ安定化血漿のＡβペプチド分画のアミドＩバンド最大値も、ｃｓｆのＡβと同様に区別する（図５Ｅ）。抗体Ａ８９７８は、１２−メルカプトドデカン酸ＮＨＳエステルを介してＧｅ−ＩＲＥに連結させた。
【図８】合成ＡβペプチドのアミドＩ（黒色の四角）およびアミドＩＩバンド（灰色の丸）のシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）比を示す図である。
【図９】ＣＳＦから検出された、ＡＤ患者３７例および非神経変性対照患者６３例の平均アミドＩバンド（Ａ）は、ＡＤ患者サンプルにおいて、頻度の明確な下方シフトを示すことを表す図である。判定基準として頻度の閾値を用いた場合、ＲＯＣ曲線は、ＡＵＣとして０．９３を示した（Ｂ）。
【図１０】血漿から検出された、ＡＤ患者３５例および非神経変性対照患者６１例の平均アミドＩバンド（Ａ）は、ＣＳＦで検出された場合と同様に、ＡＤ患者サンプルにおいて頻度の下方シフトを示すことを表した図である。判定基準として頻度の閾値を用いた場合、ＲＯＣ曲線は、ＡＵＣとして０．８５を示した（Ｂ）。
【図１１】ＣＳＦ（Ａ）および血漿サンプル（Ｂ）について記録されたアミドＩバンド最大値の位置の分布を示す図である。塗りつぶした菱形は、対照患者サンプル、白抜きの菱形はＡＤ症例を表す。ガウシアン正規分布は、表示のヒストグラムデータと十分な近似を示した。２５／５０／７５％分位点を箱ヒゲ図に示す。これらの図は、平均バンド位置（四角）、±標準偏差（ＳＤ、ヒゲの部分）、および認められた最低／最大値（ｘ）をさらに示す。破線は、判定閾値の位置１６４３ｃｍ−１を示す。
【図１２】ｍＡＢ  Ａ８９７８のシランリンカーの代わりにチオールリンカーで調製したセンサーを用いて、患者２例のＣＳＦから検出されたアミドＩバンドは、疾患クラス分離（一点鎖線）について同一のバンド特性を示すことを表す図である。
【図１３】（Ａ）ブロックされないセンサーは、純粋サンプルに由来するα−シヌクレインまたはアルブミンに容易に結合し（別のセンサー素子）、これらのタンパク質を連続適用した際に、純粋溶液に由来するＡβペプチドに対して受容的な状態に留まった（点線：アルブミンとα−シヌクレインのシグナルの組み合せ）。（Ｂ）ブロックされたセンサーは、α−シヌクレインおよびアルブミンについて、検出可能な結合を示さなかった。Ａβペプチドのみが、連続適用後に検出された。
【図１４】確認されたＡＤ患者のＣＳＦと共にインキュベートした後、ブロックされた（破線、灰色）およびブロックされないセンサー素子（実線、黒色）を用いて得られたアミドＩおよびＩＩバンドを示す図である。
【図１５】調整後の細胞培養培地を用いてインキュベートし、連続的にすすいだ後の、センサーを用いて得られたアミドＩおよびＩＩバンドを示す図である。カゼインで表面をブロックすると、主にαヘリックス型Ａβペプチド（Ａ）について、期待されたバンドパターンおよび強度が得られた。カゼインの代わりにアルブミンを用いた場合、シグナル強度が高まり、バンドパターンが不規則となるが、それは、望ましくない物質の重複するスペクトルの寄与を示唆する（Ｂ）。
【図１６】ブロックされたセンサー上で、異なる抗体を用いて得られた、対照患者（実線、黒色）およびＡＤ患者（破線、灰色）のＣＳＦに含まれるＡβ分画に由来するアミドＩバンドを示す図である。１Ｅ８は、Ｎ末端エピトープを認識した（Ａ）。ＫＷ１は、オリゴマーＡβペプチドを捕捉した（Ｂ）。Ｂ１０は線維を選択した（Ｃ）。
【図１７】抗体４Ｂ１２を用いて捕捉した血清中α−シヌクレイン分画は、対照患者（黒色、実線）およびＰＤ患者（灰色、破線）の血液サンプル中において、閾値（一点鎖線）により区別可能な類似した立体構造の変換を示したことを表した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、最適化され、単純化されたプロトコールを用いて、分析対象となる高分子化合物に対応する受容体、すなわち抗体を、ゲルマニウム表面上に、シランまたはチオールケミストリーを介して、直接、緊密に固定化することに基づく。液体（例えば、血液またはｃｓｆ）を解析するために、液体は流通系内のセンサーに供給される。高分子化合物は、機能化されたセンサー表面上の抗体により固定化される。
【００２１】
本発明の態様（１）および（１’）の光学センサー素子は、特に赤外線解析に適するが、任意選択で、さらに異なる波長での蛍光の検出を含む別の光学的方法による並行解析にも適する。さらに、センサー素子は、ペプチドやタンパク質だけでなく、ヌクレオチド含有ポリマー、例えばＤＮＡおよびＲＮＡ等を含む、高分子化合物の光学解析に適する。
【００２２】
本発明の光学センサー素子の好ましい実施形態では、内反射体は、台形または平行四辺形の形状、ファイバー状またはロッド状の幾何学的形状を有するゲルマニウム結晶である。ゲルマニウム結晶は、ゲルマニウム単結晶であるのが好ましいが、ただし台形に切断されたゲルマニウム単結晶が特に好ましい。
【００２３】
ゲルマニウム結晶は、反射体を通過する１つを超える赤外光の通路を可能にするのがさらに好ましいが、５つを超える通路が特に好ましい。かかる複数の通路内での候補バイオマーカータンパク質との接触を可能にするために、バイオマーカータンパク質に対応する受容体が、適する数の前記ゲルマニウム内反射体の表面にグラフト結合する。
【００２４】
受容体、したがって高分子をゲルマニウム内反射体にカップリングするのに利用されるシランおよびチオールリンカーとして、均質なシランおよびチオールリンカー、シランリンカーの混合物、およびチオールリンカーの混合物が挙げられる。受容体／高分子の堅固で緊密な連結を可能にするために、短鎖リンカー、好ましくは原子２０個を超えない、または原子１５個を超えない鎖長を有するリンカーが利用される。
【００２５】
かかる短鎖リンカーとして、下記の式のうちの１つを有するシランリンカーが挙げられ、
Ｘ３Ｓｉ−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−（ＣＨ２）ｎ’−Ｚ、
Ｘ２Ｒ１Ｓｉ−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−（ＣＨ２）ｎ’−Ｚ、または
Ｘ（Ｒ１）２Ｓｉ−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−（ＣＨ２）ｎ’−Ｚ、
およびチオールリンカーは下記の式を有し：
ＨＳ−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−（ＣＨ２）ｎ’−Ｚ、
式中、出現毎にＸは、ハロゲンおよびＣ１〜６アルコキシより独立して選択され、ｎは１〜１０の整数であり、ｎ’は１〜５の整数であり；出現毎にＲ１は、Ｃ１〜６アルキルより独立して選択され、Ｙは、化学結合、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＳＯ２−、−ＮＲ２−、−Ｓ−、−ＳＳ−、−ＮＲ２ＣＯ、−ＣＯＮＲ２−、−ＮＲ２ＳＯ２−、および−ＳＯ２ＮＲ２−より選択され（Ｒ２は、ＨまたはＣ１〜６アルキル）、およびＺは、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、およびそのエステル誘導体を含むアミン反応基である。
【００２６】
本発明の範囲内のハロゲンとして、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素原子が挙げられる。Ｃ１〜６アルキルおよびＣ１〜６アルコキシとして、飽和または不飽和であり得る１〜６個の炭素原子を有する直鎖状、分岐状、または環状のアルキルまたはアルコキシ基が挙げられる。環状のアルキルおよびアルコキシ基の場合、これは３〜６個の炭素原子を有する基を意味する。適するＣ１〜６アルキルおよびＣ１〜６アルコキシ基として、とりわけ、メチルおよびメトキシ、エチルおよびエトキシ、ｎ−プロピルおよびｎ−プロポキシ、イソ−プロピルおよびイソ−プロポキシ、シクロプロピルおよびシクロプロポキシ、ｎ−ブチルおよびｎ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブトキシ、シクロブチルおよびシクロブトキシ、ｎ−ペンチルおよびｎ−ペントキシ、シクロペンチルおよびシクロペントキシ、ｎ−ヘキシルおよびｎ−ヘキソキシ、シクロヘキシルおよびシクロヘキソキシ等が挙げられる。アミン反応基Ｚとして、遊離アミノ基と反応するあらゆる種類の官能基が挙げられる。とりわけ、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、およびそれらのエステル誘導体（活性なエステルを含む）が特に好ましい。
【００２７】
上記式内の−（ＣＨ２）ｎ−および−（ＣＨ２）ｎ’−の構造的要素は、１つまたは複数の二重結合および／または三重結合も含み得るが、１つまたは複数のハロゲン原子、例えばフッ素等で置換され得る。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態では、光学センサー素子は、シラン化により取得可能であり、リンカー中、ＸはＣ１〜６アルコキシ基より、好ましくはメトキシ基およびエトキシ基より独立して選択され、Ｙは−ＮＨＣＯ−であり、Ｚは−ＣＯ２Ｈまたはそのエステル誘導体であり、ｎは１〜５の整数であり、ｎ’は１〜３の整数であり、好ましくは、ｎは３であり、ｎ’は２である。
【００２９】
別の実施形態では、光学センサー素子は、チオール化により取得可能であり、リンカー中、Ｙは化学結合であり、Ｚは−ＣＯ２Ｈまたはそのエステル誘導体であり、ｎは１〜８の整数であり、ｎ’は１〜５の整数であり、好ましくは、ｎは８であり、ｎ’は４である。１２−メルカプトドデカン酸ＮＨＳエステルが特に好ましい。
【００３０】
光学センサー素子の別の好ましい実施形態では、高分子化合物に対応する少なくとも１つの受容体は、特異抗体である。さらに、高分子化合物が、例えばアルツハイマー病（Ａβペプチドおよびτタンパク質）、パーキンソン病（（α）−シヌクレイン）、クロイツフェルト−ヤコブ病（プリオンタンパク質）、またはハンチントン舞踏病（ハンチンチンタンパク質）等の、ただしこれらに限定されないタンパク質ミスフォールディング型疾患に特徴的なタンパク質であるのが好ましく、高分子化合物が、健康状態依存性の、特徴的な二次構造組成を有するアミロイド形成ペプチドまたは（ポリ）ペプチドであるのが好ましい。
【００３１】
候補バイオマーカータンパク質と交差反応しないブロッキング物質として、カゼイン、エタノールアミン、Ｌ−リジン、ポリエチレングリコール、アルブミン、およびそれらの誘導体が挙げられるが、カゼインが好ましい。
【００３２】
候補バイオマーカータンパク質がＡβペプチドであるとき、抗体は、抗体Ａ８９７８（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）等の、アミロイド−βペプチドのセントラルエピトープに特異的に結合する抗体であり、候補バイオマーカータンパク質がα−シヌクレインであるとき、抗体は、抗体４Ｂ１２（Ｃｏｖａｎｃｅ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  Ｉｎｃ．社）またはＳ５５６６（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）等の、立体構造特異性を有さない、α−シヌクレインペプチドに特異的に結合する抗体である。
【００３３】
本発明の態様（２）のデバイスは、適するＩＲセル（チャンバー）に組み込まれた、本発明の態様（１）または（１’）のセンサー素子を有する。デバイスは、光（ＩＲ）放射素子、光（ＩＲ）検出素子、およびデータ処理ユニットをさらに備え得る。追加の光学的方法により並行検出する場合、デバイスは、異なる波長の、かかる追加の光学的方法のための光源および検出器要素、例えばＵＶ／Ｖｉｓ−蛍光用の光源および検出器要素等をさらに備え得る。
【００３４】
本発明の態様（３）および（３’）の方法では、Ｈ２Ｏ２／シュウ酸を用いた処理により、酸化処理が実施される。さらに、本方法では、短いシランリンカーを用いたシラン化が、下記の式を有するシラン誘導体を用いて実施されるのが好ましく、
Ｘ３Ｓｉ−（ＣＨ２）ｎ−（ＣＨ２）ｎ’−Ｙ、
Ｘ２（Ｒ１）Ｓｉ−（ＣＨ２）ｎ−（ＣＨ２）ｎ’−Ｙ、または
Ｘ（Ｒ１）（Ｒ２）Ｓｉ−（ＣＨ２）ｎ−（ＣＨ２）ｎ’−Ｙ、
式中、変数は上記定義の通りである。Ｙの定義では、ＣＯ２ＨまたはＳＯ３Ｈ部分のエステル誘導体が用いられるのが特に好ましく、これは、単純なＣ１〜６アルキルエステルであり得るが、活性化エステル、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたは任意のその他の活性化エステル誘導体等であってもよい。また、本方法では、受容体が抗体であるのがやはり好ましい。ブロッキング物質がカゼインであるのがさらに好ましい。
【００３５】
本発明の態様（４）および（４’）の方法では、表面の活性化は、ＨＦ（４９％）を用いた処理により実施される。さらに、本方法では、短いチオールリンカーを用いたチオール化は、下記の式を有するチオールリンカーを用いて実施されるのが好ましく、
ＨＳ−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−（ＣＨ２）ｎ’−Ｚ、
式中、変数は上記定義の通りである。Ｙの定義では、ＣＯ２ＨまたはＳＯ３Ｈ部分のエステル誘導体が用いられるのが特に好ましく、これは、単純なＣ１〜６アルキルエステルであり得が、活性化エステル、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたは任意のその他の活性化エステル誘導体等であってもよい。本方法では、受容体が抗体であるのがやはり好ましい。ブロッキング物質は、カゼインであるのがさらに好ましい。
【００３６】
態様（３）／（３’）および（４）／（４’）のいずれにおいても、光学センサー素子の方法は、腐食性の化学薬品を用いずに、室温下で構築される。単一ステップは、いずれもＩＲ−スペクトルに基づいて評価され得る。このバリデーションステップは、分析物の特異的検出および正確な二次構造の測定にとって必要不可欠である。
【００３７】
本発明の態様（６）および（６’）の方法は、
（ａ）これまでに本明細書で定義したような光学センサー素子を含むＩＲセル中に、前記光学センサー表面上の受容体に対応する潜在的な高分子リガンドを流動させるステップ、
（ｂ）前記セルを通じてＩＲビームを照射し、そこから赤外スペクトルを得るステップ；ならびに
（ｃ）得られた赤外スペクトルを解析して、高分子化合物の二次構造および任意選択でその量を測定するステップ
を含む。
【００３８】
ステップ（ｄ）：得られた赤外スペクトルを解析して、高分子化合物の二次構造組成に基づき、統計的手法を用いてサンプルを分類するステップをさらに含む場合もある。
【００３９】
好ましい実施形態では、本方法は、ステップ（ａ）の前に、前記光学センサー素子を、ＩＲセル内に据付けるステップをさらに含む。さらに／あるいは、本方法は、ステップ（ｅ）：受容体に対応する遊離リガンドの溶液を適用することにより、光学素子の表面を再生するステップをさらに含み得る。
【００４０】
さらに好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）で得られたスペクトルは、アミドＩバンドを解像するのに十分なシグナル対ノイズ比を有する。このシグナル対ノイズ比は、ステップ（ｃ）が、好ましくは、バイオマーカータンパク質のアミドＩバンド最大値のシフトを解析して、候補バイオマーカータンパク質の二次構造を判定するステップを含むことを可能にする；および／または
【００４１】
さらなる実施形態では、本方法のステップ（ｃ）は、得られた赤外スペクトルを、二次構造が公知および／または濃度が公知の高分子リガンドのスペクトルと比較するステップをさらに含む。
【００４２】
別の実施形態では、本方法は、赤外線解析と並行して、異なる波長での、ＵＶ／Ｖｉｓ−蛍光を含む、別の光学的方法により検出するステップをさらに含む。特に、免疫−ＡＴＲ−ＩＲ振動分光法を、並行してなされる蛍光分光法と組み合わせる方法が好ましい。
【００４３】
態様（６）、（６’）、および（７）の方法は、前処理せずに（すなわち、富化または精製ステップに先行する分離を行わないで）、体液中の高分子を測定する、特に哺乳動物（ヒト、動物）起源の、脳脊髄液、血液、または血清を含む体液中に含まれる候補バイオマーカータンパク質を直接測定するのを可能にする／直接測定するのに適する。本方法は、候補バイオマーカータンパク質の別個の（ｉｎ−ｖｉｔｒｏの）、またはオンラインの（患者上での体液の直接測定）測定に適する。いずれの方式でも、本方法は、疾患進行の評価をさらに含み得る。
【００４４】
態様（６）、（６’）、および（７）の方法は、アミロイド−βを候補バイオマーカータンパク質として用いてアルツハイマー病の進行を判定するのに特に適するが、この場合、好ましくは閾値を１６４３ｃｍ−１±５ｃｍ−１、（または１６４３ｃｍ−１±３ｃｍ−１、または１６４３ｃｍ−１±１ｃｍ−１、または約１６４３ｃｍ−１）として、アミロイド−βペプチドのアミドＩバンドの最大値が１６４７ｃｍ−１から１６４０ｃｍ−１にシフトすれば、それはアルツハイマー病を示唆する。また、このような方法は、α−シヌクレインを候補バイオマーカータンパク質として用いてパーキンソン病の進行を判定するのにも特に適するが、この場合、好ましくは閾値を１６４３ｃｍ−１±５ｃｍ−１（または１６４３ｃｍ−１±３ｃｍ−１、または１６４３ｃｍ−１±１ｃｍ−１、または約１６４３ｃｍ−１）として、α−シヌクレインペプチドのアミドＩバンドの最大値が１６４６ｃｍ−１から１６４１ｃｍ−１に下方シフトすれば、それはパーキンソン病の進行を示唆する。
【００４５】
本出願の本発明は、高分子基質に対応する受容体、例えば機能的抗体等の光学素子表面上への直接的で緊密な特異的固定化を実現する。上記国際公開第０２／０５６０１８号パンフレットおよび欧州特許第Ａ−１８０６５７４号明細書は、受容体の固定化または受容体とリガンドとの相互作用を解析するための、長鎖シランおよび炭化水素を用いた光学素子の化学的機能化について開示するが、これらとは対照的に、極めて特異的な抗体等の、高分子に対応する受容体を緊密に固定化すれば、複合的な液体の一成分として、所与の高分子について、その立体構造解析を可能にする。
【００４６】
本発明のセンサーを用いた場合、アルツハイマー病の主たるバイオマーカー候補であるＡβ−ペプチドの検出限界は、ｃｓｆ中の通常濃度と比較して、それよりも２桁低く、血液中の通常濃度と比較して、それよりも約１桁低かった。アルツハイマー病の進行過程では、Ａβペプチドの立体構造は変化する。従来型のアッセイ法には、ｃｓｆ中の様々な鎖長を有するＡβ−ペプチドの濃度および比が含まれるに過ぎない。本発明のセンサーを用いた場合、異なるＡβ−立体構造がリアルタイムで検出可能であり、測定された吸収は、存在する二次構造の平均シグナルを提示する。アルツハイマー患者の場合、対照患者と比較して、立体構造感受性スペクトル領域に生じる有意で特異的な変化が識別可能であった。これにより、本技法の感度および実用性が示された。
【００４７】
本発明のセンサー素子に、電磁放射を組み合わせる必要がある。使用可能な波長は、紫外〜テラヘルツを含む。プロトタイプ開発の場合、中赤外線（ＭＩＲ）領域が利用された。抗体結合物質は、特定の波長において照射を吸収し、吸収スペクトルを生成する。吸収シグナルの強度は、物質濃度の定量的解釈を可能にする。吸収波長は、タンパク質の場合、例えば二次構造の直接的で定性的な解釈を可能にする。さらに、本発明のセンサー素子は、同時適用される少なくとも２つの異なる分光法、例えば分析物の赤外線吸収測定法および蛍光測定法を用いて、少なくとも２つの波長範囲における並行検出が行えるように設計される。
【００４８】
全体的なプロセスは、概ね自動化され得る。したがって、本発明のデバイスおよび方法は、科学に関係のない者にとっても操作可能である。診断目的で、本方法を分類統計学と組み合わせることも考えられる。
【００４９】
確立されたセンサー技法を用いた場合、所望の物質に対応する抗体が入手可能であれば、定義された物質を、複合的な溶液において、定性的および定量的に直接解析可能である。したがって、未処理体液中のタンパク質の二次構造直接解析が実現可能となる。センサーの特異性は、抗体の特異性に基づく。基礎研究の場合、本発明は、特に低濃度溶液からのタンパク質の構造解析を可能にする。
【００５０】
バイオインフォマティクスに関する分類指標を適用することにより、結合した物質のいくつかの状態が、自動的に区別可能である。識別の感度および特異性は、ケース毎にバリデーションされなければならない。
【００５１】
本センサーは、立体構造的分類を用いて新規バイオマーカーを探索するための新規分野を開拓する。臨床用途で本発明を使用することは、体液が抽出後に直接解析可能であるので特に意義深い。事前に定義された成分のみが検出され、量と共にその構造の両方が、診断情報を得るために解析される。
【００５２】
具体的な例として、アルツハイマー病等の神経変性疾患が挙げられるが、同疾患は、ｃｓｆに含まれる、これまでに識別されたバイオマーカー候補分子のＡβおよびτについて、その量および構造の変化を示す。本出願の本発明を用いた場合、両方のパラメーターが同時検出される。
【００５３】
本発明は、複合的な液体中の特定のタンパク質について、タンパク質のアミドＩバンドの二次構造解析を実現する。二次構造は、疾患状態のバイオマーカーとして用いられる。対応するバイオマーカーの存在下で、アミドＩの構造感受性の頻度が、本明細書で定義する閾値未満であれば、それは疾患状態を示唆する。閾値は、Ａβペプチドにつき図９、１０、および１１、ならびにα−シヌクレインにつき図１６に記載されている。下記の詳細な考察は、アルツハイマー病のＡβペプチド、およびパーキンソン病のα−シヌクレインに重点が置かれている。この閾値は、新たな知見である。閾値を決定するために、体液中に認められるアミドＩバンドについて、十分なシグナル対ノイズ比を提供する実験装置を発明した。測定条件に対して非常に敏感であるので、体液中のバイオマーカーの二次構造について測定することが重要である。例えば、Ａβの二次構造は、測定条件に応じてαヘリックスとランダムコイルの間で変化する。本出願の例として、Ａβペプチドが用いられる。分析物の濃度が生理学的濃度未満であっても（図８）、アミドＩバンドについて優れたＳ／Ｎが得られた。Ａβペプチドは、ヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）では、約１０〜１５ｎｇ／ｍｌに濃縮される。実証された検出限界は、この数値を少なくとも１桁下回る。
【００５４】
Ａβペプチドの例に示す通り、意図したタンパク質が検出される：定義され、緩衝化された溶液からの、および複合的な調整後の細胞培養培地からの合成Ａβペプチドの捕捉が、任意選択的な蛍光制御解析により確認された（図１１）。
【００５５】
実施例２および３の結果に基づき、１６３８〜１６４８ｃｍ−１の値の閾値分類指標が、本発明の特徴である。
【００５６】
本発明の好ましい光学材料はゲルマニウムである。単一の反射配置を唯一備えた、いわゆる「ＢｉａＡＴＲ」装置は、生理学的濃度のＡβペプチドの二次構造解析には不十分なシグナル品質を有することが判明した。Ａβペプチドが、純粋で重水素化された溶液内に５倍を超えて過剰に提供されたとしても、二次構造解析は、実現したＳ／Ｎスペクトル低く、実施することはできなかった［Kleiren et al. Spectroscopy 2010］。したがって、疾患マーカーとしての閾値は、このアプローチにより決定することはできない。本発明の好ましい実施形態は、台形の形状をした多重反射結晶型ＩＲＥを特徴とする。平行四辺形の形状も密接に関連しており、同様に可能である。閾値を決定するためには、機能化された表面において、少なくとも５つの内反射を利用して、十分なシグナル対ノイズ比を実現することが重要と思われる。
【００５７】
抗体飽和表面をブロックするステップが、分析物の意図するようなアミドＩバンド解析を行うのに重要である。分析物と反応しないが、シランまたはチオールリンカーとは反応する、球形タンパク質からなる界面活性剤を含まない溶液が、センサー素子の非特異的結合部位の化学的クエンチング／ブロッキングに用いられる（実施例５および６を参照）。
【００５８】
カゼイン等の非交差反応性のブロッキング物質が、立体構造解析、特にアミドＩバンド解析に必要とされるという知見が、本発明にとって重要である。免疫学的ブロッキングの標準的物質であるアルブミンは、Ａβペプチドの特異的検出には不向きである（実施例７を参照）。
【００５９】
免疫学プロトコールでは、多くの場合乾燥ミルク粉末が緩衝化溶液に適用される。緩衝化乾燥ミルク溶液は、アルブミンを含有するのでＡβ検出には適用できない。界面活性剤は、センサーシステムにとって不要である。すべての実施例は、界面活性剤を含まない溶液を用いて実施された。本発明との複合した問題は、免疫学プロトコールで用いられるような、一般的低濃度の界面活性剤を用いる場合、予想されない。
【００６０】
サンプル中のＡβペプチドの二次構造を解析する場合、抗体は、セントラルペプチドエピトープに対して感受性（特異性）を有さなければならないが、ペプチドのエピトープ構造に対して感受性を有してはならない（実施例８を参照）。
【００６１】
本発明の態様（６）および（７）の方法は、タンパク質ミスフォールディング型疾患、またはプロテオパシーとしても知られている様々な立体構造的疾患に適用可能であるが、同疾患は、下記のペプチド／タンパク質のミスフォールディングにより引き起こされる：アミロイド−β（Ａβ）ペプチドおよびτタンパク質（アルツハイマー病（ＡＤ））；α−シヌクレイン（パーキンソン病（ＰＤ））、プリオンタンパク質（クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、狂牛病として一般的に知られているウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、ハンチンチンタンパク質（ハンチントン舞踏病）。
【００６２】
Ａβ（実施例１〜８）およびα−シヌクレイン（実施例９）の解析を目的とした使用について、特に示す。
【００６３】
本発明は、下記の非限定的な実施例でさらに説明される。
【実施例】
【００６４】
材料および方法
本発明は、Ｓｐｅｃａｃ社製（Ｓｐｅｃａｃ  Ｌｔｄ．社、Ｓｌｏｕｇｈ、英国）の市販サンプルコンパートメント「ＧＳ１１０００−２５回反射型入射角可変式ＡＴＲ」を備えたＩＲ分光光度計を用いて直接利用可能である（図１Ａ、光路は図１Ｂ）。光学素子のゲルマニウムＡＴＲ−結晶（５２×２０×２ｍｍ、Ｋｏｒｔｈ  Ｋｒｉｓｔａｌｌｅ  ＧｍｂＨ社、Ａｌｔｅｎｈｏｌｚ（Ｋｉｅｌ）、ドイツ）を、最適化したブラケット内に組み込んだ（図１Ｂ、図２）。その後、結晶表面について所定の化学修飾を行い、特異的センサー特性を生み出した（図３）。別途記載しない限り、すべての化学薬品は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｍｕｎｉｃｈ、ドイツ）から購入した。バッファーおよび水は、超音波バス内で脱気した。
【００６５】
サンプルセット：フィージビリティー試験には、患者２３例、すなわちアルツハイマーの可能性が最も高いと確定診断された患者９例、および非神経変性対照患者１４例が、最初に含まれた。継続募集を行い、ＡＤ患者３７例および対照患者６３例のｃｓｆサンプル、およびＡＤ患者３５例および対照患者６１例の血漿サンプルを用いて解析を実施した。患者の診断は、心理学報告書、ＭＲＴ画像データ、ｃｓｆおよび血液解析の結果、および計量的心理テスト診断に基づく。入手可能性に応じて、ＰＥＴ（陽電子放出型コンピュータ断層撮影法）、またはＳＰＥＣＴ（単光子放射型コンピュータ断層撮影法）所見が検討された。追加報告は、近親者が関わる経過観察に起因する。
【００６６】
サンプリングおよび前処理：Ｃｓｆは腰椎穿刺により取り出し、Ｅｓｓｅｎ大学病院で一定量分取し、液体窒素内で急速凍結し、−８０℃で搬送および保管した。サンプルは、測定前に前処理せず、３７℃で３０秒間解凍を行うのみであり、用いられるまで氷上で保持した。
【００６７】
リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳバッファー）：１３７ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、２．７ｍＭ塩化カリウム（ＫＣｌ）、１２ｍＭ総ホスフェート（Ｎａ２ＨＰＯ４およびＮａＨ２ＰＯ４の形態の）、ｐＨ７．４。
【００６８】
反応−リン酸バッファー：５０ｍＭのＮａ２ＨＰ０４／ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０。
【００６９】
カゼインブロッキング溶液：２００ｍＭ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、ウシミルク（粉末）由来の１％（ｗ／ｖ）カゼイン、ｐＨはＨ３ＰＯ４で７．４に調整。
【００７０】
シラン化溶液：用いられるシラン（Ｎ−（４，４，４−トリエトキシシランブチル）スクシンアミド酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イルエステル）を合成し、記載に従い特徴づけした（J. Schartner et al., Journal of the American Chemical Society, 135(10):4079-4087 (2013)）。
【００７１】
抗体：捕捉分子として２つの抗体、１Ｅ８（Ｎａｎｏｔｏｏｌｓ  Ａｎｔｉｋｏｒｐｅｒｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ社、Ｔｅｎｉｎｇｅｎ、ドイツ）およびＡ８９７８（ロット番号：０６１Ｍ４７７３、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて本方法を試験した。１Ｅ８は、アミロイド−βペプチドのＮ末端アミノ酸１〜１１に結合し、Ａ８９７８はアミノ酸１３〜２８に結合する。蛍光検出は、ＦＩＴＣ−標識８Ｇ７抗体（Ｎａｎｏｔｏｏｌｓ社）を通じて行い、同抗体はＡβ１〜４２ペプチドのＣ末端を認識する。さらに、Ａβ−ペプチドのオリゴマー状態に対する立体構造感受性抗体（ＫＷ１）（Morgado et al., PNAS, 109(31): 12503-12508 (2012)）および線維状態に対する立体構造感受性抗体（Ｂ１０）を利用した（G. Habicht et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104(49): 19232-19237 (2007)）。
【００７２】
シランによるセンサー表面の調製：Ｇｅ−ＩＲＥを、０．１μｍの粒子化ダイヤモンドの研磨用懸濁液を用いて、５分間、両側研磨した（Ｓｔｒｕｅｒｓ  Ａ／Ｓ社、Ｂａｌｌｅｒｕｐ、デンマーク）。結晶を、過酸化水素／シュウ酸混合物（９：１）中で５分間、３回インキュベートし、各インキュベーションステップ間において水洗し、窒素ガスを用いて乾燥した。さらに、結晶を、フロースルーセル内の最適化されたシリコーンウエハを用いて、速やかに据付けた。ペリスタポンプ（ＩＤＥＸ  Ｈｅａｌｔｈ＆Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ社、Ｗｅｒｔｈｅｉｍ、ドイツ）により、流速を１ｍｌ／分に制御した。システムの総容積を６５０μｌとした。
【００７３】
センサー表面を、２−プロパノール中３００μΜのシラン溶液と共に６０分間インキュベートし（図３）、非特異的に連結されたシランを２−プロパノールで３０分間すすいだ。反応バッファーに培地変更後、抗体のアミドＩＩバンドの固定化動力学によりモニタリングして、２５μｇ／ｍｌの抗体溶液を、活性化シラン表面上に、飽和するまでフラッシュした。アミドＩＩ吸収が平衡に達するまで、非特異的に結合した抗体を、ＰＢＳバッファーですすいだ。センサー表面の自由反応部位を、カゼインブロッキング溶液で飽和させ、その後ＰＢＳバッファーですすいだ。
【００７４】
チオールによるセンサー表面の調製：Ｇｅ−ＩＲＥを、シラン化に関する記載と同様に調製した。結晶を記載に従い調製した（S.M. Han et al., JACS, 123(10): 2422-2425 (2001)）。ＨＦ処理後、結晶を、１ｍＭの１２−メルカプトドデカン酸ＮＨＳエステルを含有するイソプロパノール溶液中に速やかに浸漬した。２４時間後に単層が形成され、結晶を、Ｎ２ガスで乾燥させ、速やかにＡＴＲ装置に据付けた。未結合のチオールを、イソプロパノールで３０分間洗浄して除去した。さらなる調製は、シラン化プロトコールと同一であった．
【００７５】
測定の実施：ＩＲ測定を、液体窒素で冷却したテルル化カドミウム水銀（ＭＣＴ）検出器を備えたＶｅｒｔｅｘ  ７０Ｖ分光光度計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｏｐｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ社、Ｅｔｔｌｉｎｇｅｎ、ドイツ）上で実施した。両面インターフェログラムを、インターフェロメーターの前後方向の動きの中で、データレート６０ｋＨｚにて、スペクトル解像度２ｃｍ−１、ブラックマン−ハリス−３項−アポディゼーション、メルツ相補正、および４回ゼロ充填で記録した。参照スペクトルを、１０００回のインターフェログラムの平均値として、サンプルスペクトルを、２００回のインターフェログラムの平均値として記録した。ブランクセンサーの参照単一チャンネルスペクトル、２−プロパノールを含むセンサー、シラン化表面、バッファー、平衡状態の抗体またはカゼインコーティング表面を記録することにより、ランベルト−ベールの法則（Ｅ＝−ｌｏｇ（Ｉ／Ｉ０）に基づく、高感度差スペクトロスコピーが可能となった。状態変化の吸収は、変化前後における強度の比率の１０を底とする対数をマイナス１倍したものである。５０μｌのｃｓｆを、Ａβ−ペプチド分画の二次構造解析用として、循環フロー内のＰＢＳ緩衝系に添加した。結合平衡に達した後、スペクトル変化が認められなくなるまで、ＰＢＳバッファーで、未結合の物質を系からすすぎ落とした。したがって、Ａβ吸収スペクトルは、この状態と、カゼインでブロックし、ＰＢＳですすいだセンサー表面との間の差異から計算した。
【００７６】
スペクトルの前処理：大気中の水蒸気のスペクトル痕跡を、参照スペクトルのスケールドサブトラクションにより除去した。半値幅（ＦＷＨＨ）が４波数未満である高周波ノイズを、フーリエローパスフィルターを介して除去した。記載に従い、スペクトルをベースライン補正し（J. Ollesch et al., The Analyst, 138(14) :4092 (2013)）、分類前に、１７３０〜１６２０ｃｍ−１の間で、同一のアミドＩシグナル強度に標準化した。
【００７７】
分類：スペクトルデータの次元数を減らすために、両患者群の平均スペクトルについて、そのアミドＩ最大値の位置を、分類関連データポイントとして選択した。データの分類は、ｍａｔｌａｂのプログラミング環境、バージョン２０１２ａによる、線形判別分析法（ＬＤＡ）に起因した。プログラムインターン機能（「分類する」）を用いた。すべての計算は、Ｉｎｔｅｌ  Ｃｏｒｅ２Ｑｕａｄ  ＣＰＵ  Ｑ９６５０＠３．０ＧＨｚ、８ＧＢ  ＲＡＭを備えたオフィスＰＣ（Ｄｅｌｌ  Ｏｐｔｉｐｌｅｘ  ７８０）上で行った。
【実施例１】
【００７８】
シランがカップリングされたリンカーを用いたＡβ内アミドＩバンドの解析
確立したセンサー装置の特異性感度（図１、２）は、抗体により定義される。蛍光顕微鏡検査法を用いることにより、ＦＩＴＣがカップリングされた抗体８Ｇ７が表面上に結合したときに限り、蛍光を測定することができた。対照は、蛍光を一切発しなかった（図４）。抗体８Ｇ７−ＦＩＴＣは、表面上のアミン反応性シランに共有結合しており（図３Ａ、Ｂ）、バッファーによる洗浄では除去することはできなかった（図４Ｃ）。別の試験抗体１Ｅ８は、蛍光を一切示さなかった（図４Ｅ）。露出した、カゼインとの非特異的結合部位をブロッキングした後は、８Ｇ７のさらなる結合は認められず、これは、８Ｇ７は、カゼインの他、１Ｅ８とも結合しないことを示している。８Ｇ７−ＦＩＴＣをタンパク質として一般的に見るならば、シラン表面は、サンプル中の含有タンパク質との非特異的相互作用から保護されていることを、この実験は示している。
【００７９】
Ａβ１〜４２ペプチドと共にインキュベートした後に限り、蛍光シグナルが、後続する８Ｇ７−ＦＩＴＣ標識表面から検出されたが（図４Ｊ）、これは、Ａβの固定化に成功したことの証しである。さらに、設計されたセンサーは、異なる光学的技法を用いて並行実験を可能にすることが判明した。
【００８０】
解析したアミドＩバンドの立体構造感受性は、モノマー、オリゴマー、および線維型のＡβ１〜４２ペプチドを用いて証明された（図５Ａ）。線維型およびオリゴマーの状態は、非凝集状態のペプチドとはかなり異なり、それはβシートの量がより多いことにより判別可能である。これは、アミド−Ｉ−最大値が１６２４ｃｍ−１および１６３０ｃｍ−１に向かってシフトすることにより明白となり得る。１６６５ｃｍ−１の高頻度成分は、線維型の特徴である。オリゴマー化したＡβ−ペプチドは、アルツハイマー患者では、アミロイドプラークの形成における毒性中間体として議論されている（I. Benilova et al., Nature Neuroscience, 15(3): 349-357 (2012)）。オリゴマーは、モノマーおよび線維型と比較して異なるβシート構造を有する。考え得る説明として、逆平行シートの量がより多いことが挙げられる（Cerf et al., The Biochemical Journal, 421(3):415-423 (2009); Yu et al., Biochemistry, 48(9): 1870-1877 (2009); Laganowsky et al., Science, 335(6073): 1228-1231 (2012)）（図５Ａ、約１６８２ｃｍ−１における緑色のバンド内のショルダー部）。これは、モノマーおよび線維型においてアミドＩバンドが異なることを示唆する。
【００８１】
立体構造感受性抗体Ｂ１０（線維型）およびＫＷ１（オリゴマー）を用いて、本発明者らは、対照患者の同一の通常ヒトｃｓｆ内において、両方の対応するＡβ−ペプチド分画を検出することができた（図５Ｂ、Ｃ）。単離されたＡβペプチドの合成溶液では、定義された立体構造をとる、単離されたペプチドの二次構造のみが明らかにされているが、これと比較して、図５ＢおよびＣのデータは、通常の体液中に認められる、期待される二次構造組成を示す。
【００８２】
したがって、立体構造感受性抗体は、疾患関連の構造的変化の検出に適さない。これらの抗体は、所望の立体構造のみを特異的に検出するが、重要な特性は、モノマー、オリゴマー、およびアミロイド線維の比例的組成である。立体構造独立抗体Ａ８９７８を用いた場合、検出されたアミドＩバンドは、Ａβ−ペプチド分画の構造的組成と定量的に類似した。これは、患者を区別するための本発明者らのセンサー技法に高い特異性をもたらす可能性がある（図５Ｄ、Ｅ）。
【００８３】
対照患者とアルツハイマー患者とは、アミドＩ最大値の位置に基づき、１００％の正確度で識別可能である（図６Ａ）。
【００８４】
代替的分類指標である、１６４７および１６４０ｃｍ−１におけるアミドＩ強度に基づくＬＤＡは、モンテカルロ交差検証を１０００回反復して、データの３分の１を分類指標のバリデーションから除外する方法に基づき、９４±１１％の感度、および１００±０％の特異性で、９７±６％の平均正確度を実現する（図６Ｂ）。
【００８５】
チオールリンカーとして１２−メルカプトドデカン酸ＮＨＳエステルを介してゲルマニウムＩＲＥ上に共有結合により連結された抗体を用いた場合（図３Ｃ、Ｄ）、ＥＤＴＡ安定化血漿中Ａβ−ペプチド分画の二次構造に基づき、対照患者からＡＤ患者の同様の識別を実現した（図７）。
【実施例２】
【００８６】
ＡＤ３７例および対照６３例からなる拡張データセットにおける、アルツハイマー病（ＡＤ）患者および対照群のＣＳＦ内Ａβペプチド構造解析
サンプル２０例の当初の代表的な解析を、患者１００例まで拡張した。ＣＳＦ中に存在するＡβペプチドの平均的な立体構造は、対照群の方がＡＤ群よりも高いアミドＩバンドの頻度を示した（図９Ａ）。これは、対照群ではα−ヘリックス型フォールドが支配的であるのに対し、ＡＤ群はすでにβシート成分の富化を示していることを示唆した。指標としてアミドＩバンドの頻度を用いる場合、１６４３ｃｍ−１は、これまで９２％の正確度、９５％の感度、および９０％の特異性でクラスを識別するための最適な閾値に該当する。対応する受信者操作特性（Receiver Operating Characteristics：ＲＯＣ）曲線は、曲線下面積（ＡＵＣ）として０．９３を示す（図９Ｂ）。
【実施例３】
【００８７】
ＡＤ患者３５例および対照患者６１例における、ＥＤＴＡ安定化血漿中Ａβペプチド構造解析の応用
ＣＳＦと同様に、血漿中で検出されるＡβペプチドの平均的な立体構造は、対照群の方がＡＤ群よりも高いアミドＩバンドの頻度を示した（図１０Ａ）。これは、血中Ａβペプチド分画に対する同様の疾患の影響を示唆した。やはり、１６４３ｃｍ−１は、８９％の正確度、８０％の感度、および９３％の特異性でクラスを識別するための最適な頻度の閾値に該当する。対応するＲＯＣ曲線は、ＡＵＣとして０．８５を示す（図１０Ｂ）。
【００８８】
実施例２および３では、ＡＤ患者３７例および対照患者６３例からなるＣＳＦサンプル、およびＡＤ患者３５例および対照患者６１例からなる血漿サンプルについて解析した。
【００８９】
対応するヒストグラムおよび箱ヒゲ図により、分布の最大値が十分に区別されるという知見が確認された（図１１）。すべてのクラスは、ガウシアン正規分布に十分に近似された。ＣＳＦ対照クラスおよびＡＤクラスの平均バンド位置は、±１標準偏差の場合重複しなかった。両側ｔ検定により、両サンプル群、ＣＳＦおよび血漿について、ｐ＜０．００１の有意なクラス差が示された。
【００９０】
Ａβペプチド分画の最大アミドＩバンドの位置は、単純な分類閾値により十分に分離可能であった：１６４３ｃｍ−１未満のバンド最大値は、ＡＤクラスに該当し、１６４３ｃｍ−１以上は、対照患者に該当する。この閾値は、ＣＳＦについて９２％、および血漿サンプルについて８９％の最適正確度を有する分類指標を代表する。
【００９１】
９９．９％信頼水準におけるｔ検定統計学に基づけば、一般化分類閾値は、１６３８〜１６４８ｃｍ−１の範囲内にあると予測可能である。
【実施例４】
【００９２】
ＡＤ患者および対照患者のＣＳＦからチオールリンカーを介して捕捉されたＡβペプチド
装置のゲルマニウムＩＲＥを、研磨、アセトン洗浄し、ＨＦ中でインキュベーションを行い（４０％、室温で１０分間）、蒸留水で洗浄し、Ｎ２中で風乾し、チオールリンカー（１２−メルカプト−ウンデカン酸−ＮＨＳ−エステル、図３Ｃ、３Ｄ）によりオーバーナイトで修飾し、バッファーですすいだ後、抗体Ａ８９７８で機能化し、カゼインで脱感作した。ＡＤ患者１例および対照患者１例のＣＳＦサンプルのＡβ分画は、シランリンカーで検出された場合と同様の識別特性を示し、１６４３ｃｍ−１の分類閾値の有効性が証明された（図１２）。
【実施例５】
【００９３】
ブロックされないセンサー素子は、Ａβペプチドおよび２つの選択された血液／ＣＳＦ成分について受容性である。
３つのセンサー素子を、研磨、シラン化し、Ａβペプチドに対する１Ｅ８抗体で飽和させた。２つは、非特異的結合抗体分子をすすぎ落とした後に用い、１つは、カゼイン溶液でブロック後、すすいだ。１つのブロックされないセンサー上において、α−シヌクレインを２０ｎｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした後、すすぎ、Ａβ１〜４０ペプチドを１５ｎｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした後、すすいだ。他方のブロックされないセンサーを、２５μｇ／ｍｌの濃度のアルブミンと共にインキュベートした後、すすぎ、Ａβ１〜４０ペプチドを１５ｎｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした後、すすいだ。センサー素子は、体液中で予想されるような濃度において、α−シヌクレインおよびアルブミンに対して受容性であった（図１３Ａ）。Ａβペプチドに対する結合部位は、いずれのケースにおいてもフリーであったので、結合は非特異的であり、規定のＡβペプチドシグナルが記録された。
【００９４】
ブロックされたセンサーを２０ｎｇ／ｍｌのα−シヌクレイン溶液と共にインキュベートした後、すすいだが、センサー表面への結合は観測されなかった（図１３Ｂ）。連続して、センサーを２５μｇ／ｍｌのアルブミンと共にインキュベートした後、すすいだが、やはりアルブミンシグナルは観測されなかった。１５ｎｇ／ｍｌのＡβ１〜４０ペプチド溶液と共にインキュベートしたときに限り、すすぎ後に規定のシグナルが得られた（図１３Ｂ）。
【実施例６】
【００９５】
ブロッキングステップを経ないセンサーは診断に適用できない。
２つのセンサー素子を調製した：カゼインブロッキングステップを経たセンサーと経ないセンサー。ＡＤ患者のＣＳＦの一定分量を、ＡβアミドＩバンド解析を目的として、センサー上でインキュベートした。ブロックされない表面で記録されたアミドＩバンド強度は、はるかに高い、したがってより非特異性の結合を示した（図１４）。ブロックされない場合、バンド位置は、もはや疾患状態と相関関係を有さない：ブロックされないセンサーの読み取り値は、１６４９ｃｍ−１におけるα−ヘリックス型の立体構造が支配的であることを示した一方、ブロックされたセンサーの読み取り値は、βシートの富化を示し、Ａβの最大アミドＩの頻度は、１６３９ｃｍ−１であった。したがって、より高い最大頻度は、ＣＳＦ内のヘリックス型タンパク質の支配的なバックグラウンドが、非特異的に検出されたことに起因する。
【実施例７】
【００９６】
シラン化、抗体の機能化、カゼインを用いたブロック、調整後の細胞培養培地を用いたインキュベーション、および非特異的結合タンパク質のすすぎ落としにより調製されたセンサー素子を用いた場合、規定のアミドバンドパターンが認められた：アミドＩＩバンドの方が、アミドＩバンドよりも、その強度は弱かった（図１５Ａ）。蛍光制御解析により、Ａβペプチド結合が確認された（図４）。
【００９７】
対照的に、ブロッキング用としてカゼインの代わりにアルブミンを用いたとき、同一サンプルの別の一定分量を用いて記録されたアミドバンドパターンは、より高いアミドＩＩ強度を示した。全体的なアミドＩ強度は、約１００％まで高まった。したがって、アルブミンが、さらに定義することのできないタンパク質、および１６００〜１５００ｃｍ−１の間の吸収により特徴づけられるその他の物質に対する追加の非特異的結合部位をもたらしたことは明白である（図１５Ｂ）。
【実施例８】
【００９８】
１Ｅ８ならびにオリゴマーおよび線維型に対して特異的な抗体のＣＳＦ解析への適用
例示的に示された抗体１Ｅ８およびＡ８９７８は、モノマー型および線維型のＡβペプチドの両方を感知する（図６Ａ）。診断を目的とした場合、複合的な体液を分析したとき、セントラルＡβエピトープを感知するＡ８９７８抗体の特異性を強化すれば、１Ｅ８抗体よりも有利であることが証明された。１Ｅ８は、ｓＡＰＰａｌｐｈａ（α−セクレターゼによるプロセッシング後の、アミロイド前駆体タンパク質のＮ末端フラグメント（ＡＰＰ））と、そのＮ末端Ａβエピトープに起因して交差反応することが公知である。ＡＰＰａｌｐｈａの疾患関連の立体構造はまだ報告されておらず、シグナルの重複が、明確なセンサー読み取りを妨げている（図１６Ａ）。ＡＤを対照のＡβペプチド立体構造から厳密に分離するには、Ａ８９７８のように、セントラルエピトープ抗体の特異性強化を必要とする（図９、１０、および１１）。
【００９９】
オリゴマー（図１６Ｂ）または線維型（図１６Ｃ）に対する立体構造特異的抗体を用いても、疾患特異的サンプル特性を示さなかった。両立体構造は、ＡＤ患者および対照患者のＣＳＦサンプル中に存在した。したがって、意図するような診断システムは、エピトープの立体構造に対して非特異的な抗体を用いて調製されなければならない。
【実施例９】
【０１００】
血清内に存在するα−シヌクレイン解析用センサーのパーキンソン病（ＰＤ）への適用
センサー素子を、一般的に調製、研磨、およびシラン化した。α−シヌクレイン特異的機能化の場合、４Ｂ１２モノクロナール抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  Ｉｎｃ．社）をセンサー上に固定化し、その後カゼインでブロックした。血清中に存在するα−シヌクレインについて記録されたスペクトルでは、ＰＤサンプルのアミドＩバンド最大値頻度は１６４１ｃｍ−１であり、対照患者サンプルについて記録された１６４６ｃｍ−１と比較して、明らかな下方シフトを示した。これにより、血液サンプルを対象とする、ラベルフリーのＰＤ診断用のセンサーの適用可能性が示される（図１７）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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