(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍溶解性ウイルス製剤を調製するための方法であって、腫瘍溶解性ウイルスと腫瘍細胞とを、1:1〜20:1の比率で混合して腫瘍細胞を感染させる工程、感染させた腫瘍細胞を37℃及び5%の酸素含有量で培養してアポトーシスを誘導する工程、アポトーシスを起こした腫瘍細胞から放出された微粒子を48〜72時間以内に回収する工程を含み、微粒子が、細胞小胞が腫瘍溶解性ウイルスを被覆した後に生成する腫瘍溶解性ウイルス製剤であり、前記腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍溶解性アデノウイルスである、方法。
【請求項２】
腫瘍細胞が、卵巣癌、乳癌、肺癌、胃癌、結腸癌、肝臓癌、膵臓癌、又は前立腺癌の細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アポトーシスを起こした腫瘍細胞から放出された微粒子を回収する工程が、1000〜50000gの遠心力での超遠心分離により微粒子を回収する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アポトーシスを起こした腫瘍細胞から放出された微粒子を回収する工程が、最大5000gの遠心力での超遠心分離により腫瘍細胞及びデブリを除去する工程、及び1000〜50000gの遠心力での超遠心分離により微粒子を回収する工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
アポトーシスを起こした腫瘍細胞に由来する細胞小胞と、細胞小胞に被覆された有効成分としての腫瘍溶解性ウイルスとを含み、請求項１に記載の方法により調製される、腫瘍溶解性ウイルス製剤。
【請求項６】
腫瘍溶解性ウイルスを被覆している細胞小胞から生成される腫瘍溶解性ウイルス製剤が、100〜1000 nmの粒子径を有する、請求項５に記載の腫瘍溶解性ウイルス製剤。
【請求項７】
腫瘍細胞が、卵巣癌、乳癌、肺癌、胃癌、結腸癌、肝臓癌、膵臓癌、又は前立腺癌の細胞を含む、請求項５に記載の腫瘍溶解性ウイルス製剤。
【請求項８】
注射製剤を含む、請求項５に記載の腫瘍溶解性ウイルス製剤。
【請求項９】
単位製剤の形態である、請求項５に記載の腫瘍溶解性ウイルス製剤。
【請求項１０】
単位製剤が、1×107〜1×108個の微粒子を含む、請求項９に記載の腫瘍溶解性ウイルス製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍溶解性ウイルス製剤及びその調製方法に関し、より特定すると、腫瘍溶解性ウイルス製剤及びその調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍は、ヒトの生命及び健康を深刻に脅かす疾患であり、中毒性副作用がより少ない効果的な治療法の探索は、近年最も重要な医学研究になっている。エナンチオパシー（enantiopathy）の原理によれば、ウイルスを使用して腫瘍細胞を殺すことは、がん治療の理想的な戦略である。しかしながら、この戦略は、2つの問題に直面する：どのようにしてウイルスを腫瘍部位に選択的に到達させるか、そしてどのようにしてウイルスを身体の免疫系攻撃から逃れさせるか、である。
【０００３】
ウイルスDNA又はRNAは、タンパク質及び他の生体分子と共にアセンブルされてウイルス粒子を形成し、このウイルス粒子は腫瘍細胞に感染し、腫瘍細胞中で大量に複製して新たなウイルス粒子を生成し、最終的には腫瘍細胞の溶解を引き起こすことができ、すなわちこれはいわゆる腫瘍溶解性ウイルス、すなわち複製することができる殺腫瘍ウイルスである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】CN102302784A
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】HUANG Jihan, et al., equivalent dose conversion between different animals and between animal and human in pharmacological experiment, Chinese Journal of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 2004 Sep; 9 (9): 1069-1072
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、腫瘍溶解性ウイルスは、異種成分として、体内に侵入すると身体から免疫的に拒絶され、特に、抗ウイルス抗体の生産は、ウイルスの除去（クリアランス）により腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍作用を制限する可能性がある。加えて、遊離の腫瘍溶解性ウイルスは、正常な組織に容易にアクセスし、それによってウイルスの腫瘍細胞に対する効果的な殺作用が減弱されるだけでなく、正常な組織に損傷を与え、中毒性副作用を生じる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、腫瘍溶解性ウイルス製剤を提供し、治療有効成分としての腫瘍溶解性ウイルスは、アポトーシスを起こした腫瘍細胞から得られた細胞小胞に被覆され、腫瘍溶解性ウイルス製剤は、腫瘍疾患の処置（治療）のための標的化生物学的剤として用いることができ、腫瘍溶解性ウイルスの殺腫瘍作用を効果的に促進し、身体への中毒性副作用を低減する。
【０００８】
本発明は、腫瘍溶解性ウイルス製剤を調製するための方法を提供し、方法は、治療有効成分としての腫瘍溶解性ウイルスを、アポトーシスを起こした腫瘍細胞に由来する細胞小胞中に被覆し、細胞小胞が腫瘍溶解性ウイルスを被覆した後に生成する微粒子の回収に成功することを実現し、微粒子は、本発明の腫瘍溶解性ウイルス製剤である。
【０００９】
本発明は、腫瘍溶解性ウイルス製剤を提供し、製剤は、腫瘍細胞に感染してアポトーシスを誘導する腫瘍溶解性ウイルスから生産される、腫瘍溶解性ウイルスを被覆する担体としての、細胞小胞を用いることにより形成される。
【００１０】
本発明により提供される腫瘍溶解性ウイルス製剤は、腫瘍溶解性ウイルスを被覆する細胞小胞により形成され、腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍処置部位への到達を容易にし抗腫瘍作用を向上させるための標的生物学的剤として用いられ、一方で腫瘍細胞自身に由来する細胞小胞を利用して腫瘍溶解性ウイルスを被覆し、腫瘍溶解性ウイルスが身体の免疫系攻撃を回避することができる。
【００１１】
当該技術分野における基本知識として、細胞がアポトーシスシグナル又は刺激シグナルを受けると、局地的な細胞膜の構造が変化し、外側に拡張し、細胞内容物を被覆し、細胞の外側に、細胞小胞の形態で放出され、その直径は100〜1000ナノメートル(nm)の間であり、これが、本発明において記述される「細胞小胞」(すなわち微粒子)である。加えて、アポトーシスの種々の段階において、細胞は、1〜3 μmの直径を有するアポトーシス小体、及び30〜100 nmの直径を有するエクソソームを放出することもある。アポトーシス小体又はエクソソームと細胞小胞との間には著しい違いがあり、これらは本発明に含まれない。腫瘍細胞はアポトーシスの過程でアポトーシス小体、エクソソーム等を生産するというだけで、本発明の技術的解決手段は、細胞小胞が腫瘍溶解性ウイルスを被覆した後に生成する腫瘍溶解性ウイルス製剤を得るために、特定の工程及び条件を必要とする。
【００１２】
本願出願人は、標的化投与を達成するように細胞小胞を用いて化学療法薬を被覆した医薬調製物を開示しており、具体的にはCN102302784Aを参照している。本発明の技術的解決手段は、化学療法薬を被覆する小胞の技術的解決手段とは異なる設計及び応用特性を有している。腫瘍細胞に進入した後、化学療法薬は、物理的空間梱包（ラッピング）の原理により、アポトーシスを起こした腫瘍細胞から放出された細胞小胞により被覆されて、化学療法薬を積み込んだ微粒子製剤を生成する。本発明の技術的解決手段において、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞に進入し、腫瘍細胞中のアミノ酸、ヌクレオチド、及び脂質分子等の原料を用いて、大量の生合成が行われる。このプロセスの間、ウイルスは活性状態にあり、複製活動の能力を有し、腫瘍細胞の細胞骨格又は細胞膜と相互作用することができ、このことにより、結果的に腫瘍細胞が小胞を放出し、腫瘍溶解性ウイルスが被覆された細胞粒子を形成するが、細胞粒子は微粒子としても知られる。化学療法薬を被覆することと異なっているのは、腫瘍溶解性ウイルス及び腫瘍細胞の数が適切な比率に達する場合のみ、治療効果を有する微粒子製剤の取得を促進することができることであり、すなわち、腫瘍溶解性ウイルスが少なすぎると複製効果を得ることができず、腫瘍溶解性ウイルスが多すぎると腫瘍細胞を死なせてしまい、放出される小胞の劇的な減少をもたらす。加えて、化学療法薬は、小型分子性物質として、典型的には1 nm未満の粒子径を有しており、一方でウイルスの直径は、50〜200 nmであり得、細胞小胞の直径は、100〜1000 nmの間であり、したがって、放出が進行している間に細胞小胞がウイルスを被覆することができるか否かは、化学療法薬を被覆する能力から容易に推測することはできず、ウイルスが腫瘍細胞中で特定の数までコピーされる場合のみ、細胞小胞がウイルスを被覆する可能性が増加し、数が増加する。したがって、化学療法薬を被覆する細胞小胞と比較すると、ウイルスを被覆する細胞小胞は、ウイルスの生物学的複製及びウイルスの粒子径という因子を考慮する必要がある。
【００１３】
本発明により提供される技術的解決手段によれば、細胞小胞が腫瘍溶解性ウイルスを効果的に被覆する微粒子を得るために、調製系中の腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍細胞に対する比率は、好ましくは1：1〜20：1の間である。さらに、比率は10：1であってもよい。
【００１４】
本発明は、腫瘍溶解性ウイルス製剤を調製するための方法を提供し、方法は、腫瘍溶解性ウイルスと腫瘍細胞とを、1：1〜20：1の比率で混合して、腫瘍細胞を感染させる工程、及び感染させた腫瘍細胞を培養して37℃、5%の酸素含有量でアポトーシスを誘導する工程、アポトーシスを起こした腫瘍細胞から放出された微粒子を48〜72時間以内に回収する工程を含み、微粒子は、細胞小胞が腫瘍溶解性ウイルスを被覆した後に生成される腫瘍溶解性ウイルス製剤である。本願の技術的解決手段において、腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍細胞に対する比率は、量比を指す。
【００１５】
本発明の技術的解決手段において用いられる腫瘍溶解性ウイルスは、任意の市販の腫瘍溶解性ウイルスであってよい。例えば、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性アデノウイルスである。アデノウイルスは、ヒトを感染させるための一般的なウイルスであり、強力な免疫原性を有し、身体の免疫系によって迅速に除去することができ、ゲノムDNA分子に組み込まれず、ゲノムDNA変異を起こさない。したがって、このウイルスの使用は、非常に良好な安全性を有する。
【００１６】
さらに、腫瘍細胞は、卵巣癌、乳癌、肺癌、胃癌、結腸癌、肝臓癌、膵臓癌、又は前立腺癌等の細胞を含む。
【００１７】
本発明の技術的解決手段において、微粒子の回収に関して、低温又は室温での分離のために超遠心分離を用いることができる。特定の実施形態において、微粒子を、低温（約4℃）、かつ1000〜50000gの遠心力での超遠心分離により、回収することができる。例えば、腫瘍細胞及びそのデブリを、最大5000 gの遠心力で除去することができ、10000g〜50000gの遠心力で回収される、得られた沈殿物が、微粒子である。さらに、腫瘍細胞及びそのデブリを、最大5000 gの遠心力で除去することができ、10000 gの遠心力で回収される、得られた沈殿物が、微粒子である。
【００１８】
本発明により提供される腫瘍溶解性ウイルス製剤は、アポトーシスを起こした腫瘍細胞に由来する細胞小胞と、細胞小胞中に被覆され、有効成分として使用される腫瘍溶解性ウイルスとを含み、腫瘍溶解性ウイルス製剤は、上述の方法のいずれかに従って調製される。
【００１９】
本発明により提供される腫瘍溶解性ウイルス製剤は、アポトーシスを起こした腫瘍細胞由来の上述の細胞小胞を、腫瘍溶解性ウイルスを被覆するための担体として使用することにより、一種の微粒子となる。遊離の腫瘍溶解性ウイルスとは対照的に、細胞小胞中に被覆された腫瘍溶解性ウイルスは、免疫系が認識することができず、そのため腫瘍部位に安全かつ効果的に到達することができる。一般的な遊離の腫瘍溶解性ウイルスは、細胞膜上の特別な受容体分子の仲介により細胞に侵入するが、一部の腫瘍細胞は、それ自身が受容体を発現しないか、又は能動的に受容体の発現を負に制御し、したがって腫瘍溶解性ウイルスの侵入を防ぐことができる。しかしながら、本願の技術的解決手段において、腫瘍細胞に由来する細胞小胞は、腫瘍細胞の細胞膜と非常に容易に融合するので、細胞小胞中に被覆された腫瘍溶解性ウイルスは、仲介されて腫瘍細胞に侵入する。
【００２０】
本発明の技術的解決手段において、腫瘍溶解性ウイルスを被覆する細胞小胞から生成される腫瘍溶解性ウイルス製剤は、100〜1000 nmの粒子径を有する。
【００２１】
本発明において腫瘍溶解性ウイルスを被覆するために用いられる細胞小胞は、通常の毛細管を通して正常な組織に侵入することができないことが理解される。なぜならば、細胞小胞の大きさが正常な組織毛細管の透過性（5〜10 nm）よりもはるかに大きいからである。これにより、従来技術の遊離の腫瘍溶解性ウイルスの直接注入により引き起こされる、身体の他の正常な組織に対する中毒性副作用を防いでいる。
【００２２】
本発明は、標的化腫瘍溶解性ウイルス製剤を得るための新たな着想及び新たな技術的解決手段を提供することが理解され、標的化腫瘍溶解性ウイルス製剤は、卵巣癌、乳癌、肺癌、胃癌、結腸癌、肝臓癌、膵臓癌、及び前立腺癌等の異なる種類の臨床的悪性腫瘍を標的化することができる。腫瘍溶解性ウイルスを被覆するために用いられる細胞小胞（担体）は、好ましくは、患者の腫瘍と同一の型の腫瘍細胞、又は腫瘍溶解性ウイルスを複製させることができる他の型の細胞に由来する。
【００２３】
本発明において記述する、腫瘍細胞に感染し腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する腫瘍溶解性ウイルスは、当業者に周知の基準により判断することができ、例えば、腫瘍細胞が観察を通してより小さくぼんやりとしてきた（薄暗くなってきた）場合、細胞はアポトーシスを起こした細胞であるとみなされる。
【００２４】
本発明により提供される技術的解決手段において、腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍細胞に感染する前に、方法は腫瘍細胞を培養する工程をさらに含む。上述の細胞を培養するための方法は、当該技術分野における従来の培養方法であってよい。
【００２５】
当業者は、従来の方法に従って腫瘍溶解性ウイルス製剤、特に注射製剤を調製することができる。例えば、注射液は、回収した微粒子を生理食塩水に懸濁することにより、製造することができる。
【００２６】
本発明の腫瘍溶解性ウイルス製剤は、単位製剤であってもよい。単位製剤は、有効成分を単回投与、例えば1単位（1針分の）注入に必要な量で、提供することができる製剤を指す。患者への単回投与に必要な医薬の量は、患者の体重に、患者の体重1単位当たりの用量を掛けることで容易に計算することができる。例えば、医薬の調製中、成人の体重は、一般的には50〜70 kgと想定され、これを用いて患者への単回投与に必要な医薬の量を計算する。実験動物及びヒトの単位体重当たりの用量は、等価用量換算関係により計算してもよい。例えば、ヒトの有効用量は、実験動物についての用量から、当業者に周知の、実験動物とヒトとの間の等価用量換算関係に従って、算出することができる(例えば、FDA、SFDA、及び他の医薬品規制当局の手引き、又はHUANG Jihan, et al., equivalent dose conversion between different animals and between animal and human in pharmacological experiment, Chinese Journal of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 2004 Sep; 9 (9): 1069-1072を参照)。本発明の実施形態において、ヒト及びマウスについての体表面積換算係数0.0026を用いて、マウスからヒトの用量を算出することができる。
【００２７】
さらに、出願人によるマウス実験によれば、ヒト用の腫瘍溶解性ウイルス製剤の単位製剤は、1x107〜1x108個の微粒子を含んでいてもよい。
【００２８】
また、本発明は、腫瘍を処置（治療）又は予防するための方法も提供し、方法は、腫瘍溶解性ウイルス製剤を、腫瘍を有する個体に、又は腫瘍を発症する傾向がある個体に投与するプロセスを含む。
【００２９】
本発明の技術的解決手段は、以下の技術的作用を有する：
1. 本発明により提供される調製方法により、細胞小胞が腫瘍溶解性ウイルスを被覆した後に形成される微粒子を得ることができ、これは、エクソソーム又はアポトーシス小体というよりはむしろ腫瘍溶解性ウイルス製剤である；使用する腫瘍溶解性ウイルスの用量を制御することにより、95%より多い細胞小胞が、腫瘍溶解性ウイルスを被覆することができ、本願の腫瘍溶解性ウイルス製剤を効率的に得ることができる。
2. アポトーシスを起こした腫瘍細胞に由来する細胞小胞は、腫瘍溶解性ウイルスが体内に侵入した際のこれらへの免疫系の攻撃が回避されるような、本発明の腫瘍溶解性ウイルスの担体とみなされ、腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍処置部位に到達するのにより有益であり、殺腫瘍の作用が改善される。
3. 本願の技術的解決手段において、腫瘍細胞に由来する細胞小胞の担体としての使用に起因して、そこに被覆されている腫瘍溶解性ウイルスは、容易に腫瘍細胞に侵入することができる。
4. 本発明において腫瘍溶解性ウイルスを被覆する微粒子は、微粒子の大きさが正常な組織毛細管の透過性（5〜10 nm）よりもはるかに大きいため、通常の毛細管を通して正常な組織に侵入することができず、遊離の腫瘍溶解性ウイルスの直接注入により引き起こされる、身体の他の正常な組織に対する中毒性副作用を防いでいる。
5. 腫瘍細胞は、無限増殖特性を有し、その培養方法は十分に開発されており、本発明において記述される技術的解決手段によれば、多数の細胞小胞を腫瘍細胞から得て腫瘍溶解性ウイルス製剤を調製することができ、費用は低く、操作は単純である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図1aは、腫瘍溶解性アデノウイルスで処理された後の、培養されたA549ヒト肺癌腫瘍細胞から放出された微粒子の電子顕微鏡写真を示す。図1bは、腫瘍溶解性アデノウイルスにより誘導されたヒト肺癌細胞のアポトーシスから生成した微粒子の粒度分布グラフを示す。図1bにおいて、y軸は、測定する微粒子サンプル中の粒子の数密度を表し、赤い曲線のピークに相当するx軸の値は、サンプル中の大部分の微粒子の直径範囲を表す。
【図２】図2aは、培養された腫瘍細胞を腫瘍溶解性アデノウイルスで処理した後に生成した微粒子を示し、腫瘍溶解性アデノウイルスDNAを含む。図2bは、腫瘍細胞を腫瘍溶解性アデノウイルスで処理した後の、腫瘍溶解性アデノウイルスを被覆する微粒子を示す。
【図３】図3は、様々なヒト腫瘍細胞を殺す腫瘍溶解性アデノウイルス被覆微粒子の作用の図を示す。図中、a、b、c、及びdは、A2780ヒト卵巣癌細胞株、MCF-7ヒト乳癌細胞株、A549ヒト肺癌細胞株、及びSNU1ヒト胃癌細胞株をそれぞれ表す；g、h、i、及びjは、Caco2ヒト結腸癌細胞株、HepG2ヒト肝癌細胞株、ASCP-1ヒト膵臓癌細胞株、LINCapヒト前立腺癌細胞株をそれぞれ表す。
【図４】図4a及び図4bは、各群のマウスの血清中のアラニンアミノ基転移酵素（アラニントランスアミナーゼ）(ALT)及びクレアチニン(CRE)の含有量を示し、これは腫瘍溶解性アデノウイルス被覆微粒子が身体に対して明白な中毒性副作用を有さないことを示す。
【図５−１】図5aは、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、細胞小胞 (MP)、腫瘍溶解性アデノウイルス(OA)、及び腫瘍溶解性アデノウイルス被覆微粒子(OA-MP)でそれぞれ処置した後、5日目及び21日目のA549担腫瘍マウスの腫瘍体積を示す；図5bは、A549担腫瘍マウスをPBS、MP、OA、OA-MPでそれぞれ処置した後、種々の時点で検出されたマウスの腫瘍体積を示す。
【図５−２】図5cは、PBS、MP、OAでそれぞれ処置した後の、A549担腫瘍マウスの生存率を示す。図5dは、PBS、MP、OA、及びOA-MPでそれぞれ処置した後の、ヌードマウスにおけるA2780腫瘍の成長を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
腫瘍細胞由来の細胞小胞が腫瘍溶解性アデノウイルスを被覆することができ、腫瘍細胞を効果的に殺すことができ、インビボで明らかな中毒性副作用を有さないことを確認するために、図面及び実施例を参照して本発明を以下にさらに説明する。
【実施例】
【００３２】
以下の実施例において用いた、各種腫瘍細胞、腫瘍溶解性アデノウイルス及び試験動物：
A2780ヒト卵巣癌細胞株、MCF-7ヒト乳癌細胞株、A549ヒト肺癌細胞株、SNU1ヒト胃癌細胞株、Caco2ヒト結腸癌細胞株、HepG2ヒト肝癌細胞株、ASCP- 1ヒト膵臓癌細胞株、LINCapヒト前立腺癌細胞株は、全てAmerican ATCC Centerより、又はChina Center for Type Culture Collection (CCTCC)より、市販されている。
【００３３】
腫瘍溶解性アデノウイルスは、Shanghai Sanwei Biotechnology Co., Ltd.より入手可能であり、組換えヒトタイプ5アデノウイルス(H101)の名称を有する。200匹のメスヌードマウスは、各々が体重18グラムであり、Experimental Animal Center of the Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical Collegeより購入される。
【００３４】
実施例１：腫瘍溶解性アデノウイルスを用いて、ヒト肺癌細胞のアポトーシスを誘導し、微粒子を生産した
1. 実験工程
A549ヒト肺癌細胞を、DMEM細胞培養液中で、細胞数が1×107個に達するように培養した；1×108個の腫瘍溶解性アデノウイルスを培養液に加えてヒト肺癌細胞に感染させた；37℃、5%の酸素含有量で、感染させた腫瘍細胞を培養した；腫瘍溶解性アデノウイルスの投与後48時間目に、腫瘍細胞が小さくぼんやりとしてきたので、ヒト肺癌細胞培養液の上清を1000 g及び5000 gの遠心力で各10分間、連続して遠心分離し、細胞及びデブリを除去し、遠心分離後の上清をさらに10000 gの遠心力で2時間遠心分離し、沈殿物を回収して、腫瘍溶解性アデノウイルスを被覆する、アポトーシスを起こしたA549ヒト肺癌細胞に由来する細胞小胞から生成した微粒子を得た。
【００３５】
2. 実験結果
上で調製した微粒子を、1 mlの0.9% (g/ml)生理食塩水に再懸濁した。ガラス上に固定した後、微粒子を透過型電子顕微鏡下で観察した(図1a参照)。同時に、微粒子の粒子径を、Mastersizer 2000粒子径分析器により検出し、粒度分布の結果を得た(図1b参照)。サンプル中の微粒子の大部分についての粒度分布は、100〜1000nmの範囲であった。
【００３６】
実施例２：腫瘍溶解性アデノウイルス誘導ヒト肺癌細胞のアポトーシスから生成した細胞小胞は腫瘍溶解性アデノウイルスDNAを被覆する
1. 実験工程
A549ヒト肺癌細胞を、細胞数が1×107個になるように培養した；1×108個の腫瘍溶解性アデノウイルス粒子を培養液に加えた；腫瘍溶解性アデノウイルスの投与後48時間目に、腫瘍細胞が小さくぼんやりとしてきたので、ヒト肺癌細胞培養液の上清中のアポトーシスを起こしたA549ヒト肺癌細胞から生成した（アポトーシスを起こしたA549ヒト肺癌細胞に由来する細胞小胞が腫瘍溶解性アデノウイルスを被覆した後に生成した）微粒子を、実施例１の工程に従って回収した。
【００３７】
一方で、微粒子をプロテイナーゼKで処理し、膜を溶解させてDNA分子を分離し、同時に腫瘍溶解性アデノウイルスを処理及び分離して、中に含まれるDNA分子を調製した。
【００３８】
他方で、上で得られた微粒子をPKH67(緑色で示す)で染色し、同時に微粒子中のアデノウイルスを、PE蛍光標識抗アデノウイルス抗体(赤色で示す)で染色し、これらを共焦点蛍光顕微鏡下で観察した。
【００３９】
対比として、上述のA549ヒト肺癌細胞から得られた細胞小胞を、PKH67(緑色で示す)で染色し、細胞小胞を、PE蛍光標識抗アデノウイルス抗体(赤色で示す)で染色し、これらを共焦点蛍光顕微鏡下で観察した。
【００４０】
上述の細胞小胞の調製方法は、以下の工程を含んでいた：腫瘍細胞を培養する工程、細胞に紫外線を30分間照射する工程、UV照射後48時間で腫瘍細胞が著しく小さくぼんやりとしてきたら、マウス肝癌細胞の培養液の上清を段階的な遠心分離、すなわち500 g、1000 g、及び5000 gの遠心力で各10分間、順番に遠心分離にかけて、その後、14000 gの遠心力で1分間遠心分離して細胞及びデブリを除去し、遠心分離した上清を、14000 gの遠心力で1時間、さらに遠心分離し、沈殿物を回収して細胞小胞を得た。
【００４１】
2. 実験結果
上でそれぞれ調製したDNAに対して、電気泳動を行い、電気泳動の結果を図2aに示した。図2aにおいて、OAは腫瘍溶解性アデノウイルスDNAを表し、OA-MPは腫瘍溶解性アデノウイルスを被覆する微粒子のDNAを表し、DNA分子量標準マーカーは左端のレーンであった。腫瘍溶解性アデノウイルスゲノムは、約23 kbのサイズであることが知られており、一方で微粒子サンプル中に含まれるDNA電気泳動マーカーは、既知の腫瘍溶解性アデノウイルスゲノムと同一のサイズを有していた。同時に、蛍光顕微鏡観察の結果を図2bに示し、PKH67を染色に使用し、MP群(細胞小胞群)及びOA-MP群(微粒子群)はどちらも緑色を示した；PE蛍光標識を用いて抗アデノウイルス抗体を染色し、MP群は赤色を示さず、OA-MP群は赤色を示した；２つの群の染色写真を重ね合わせた後に与えられる写真から、OA-MP群では緑色と赤色が共局在していることがわかり、これは本発明の微粒子が腫瘍溶解性アデノウイルスを被覆することを示している。
【００４２】
実施例３
A549ヒト肺癌細胞を、細胞数が1×107個に達するようにDMEM細胞培養液中で培養した；1×107個の腫瘍溶解性アデノウイルスを培養液に加えてヒト肺癌細胞に感染させた；37℃、5%の酸素含有量で、感染させた腫瘍細胞を培養した；腫瘍溶解性アデノウイルスの投与後48時間目に、腫瘍細胞が小さくぼんやりとしてきたので、ヒト肺癌細胞培養液の上清を1000 g、5000 gの遠心力で各10分間、連続して遠心分離し、細胞及びデブリを除去し、遠心分離後の上清をさらに10000 gの遠心力で2時間の遠心分離に供し、沈殿物を回収して、腫瘍溶解性アデノウイルスを被覆する、アポトーシスを起こしたA549ヒト肺癌細胞に由来する細胞小胞から微粒子を得た。
【００４３】
上で調製した微粒子を、1 mlの0.9% (g/ml)生理食塩水に再懸濁した。ガラス上に固定した後、微粒子を透過型電子顕微鏡下で観察し、微粒子の粒子径を、Mastersizer 2000粒子径分析器により検出した。結果は実施例１と同様であった。蛍光染色を用い、この結果も、この実施例の微粒子が腫瘍溶解性アデノウイルスを被覆することを示した。
【００４４】
実施例４
A549ヒト肺癌細胞を、DMEM細胞培養液中で、細胞数が1×107個に達するように培養した；2×108の腫瘍溶解性アデノウイルスを培養液に加えてヒト肺癌細胞に感染させた；37℃、5%の酸素含有量で、感染させた腫瘍細胞を培養した；腫瘍溶解性アデノウイルスの投与後48時間目に、腫瘍細胞が小さくぼんやりとしてきたので、ヒト肺癌細胞培養液の上清を1000 g及び5000 gの遠心力で各10分間、連続して遠心分離し、細胞及びデブリを除去し、遠心分離後の上清をさらに10000 gの遠心力で2時間の遠心分離に供し、沈殿物を回収して、腫瘍溶解性アデノウイルスを被覆する、アポトーシスを起こしたA549ヒト肺癌細胞に由来する細胞小胞から生成した微粒子を得た。
【００４５】
上で調製した微粒子を、1 mlの0.9% (g/ml)生理食塩水に再懸濁した。ガラス上に固定した後、微粒子を透過型電子顕微鏡下で観察し、微粒子の粒子径を、Mastersizer 2000粒子径分析器により検出した。結果は実施例１と同様であった。蛍光染色を用い、この結果も、この実施例の微粒子が腫瘍溶解性アデノウイルスを被覆することを示した。
【００４６】
実施例５：種々の腫瘍細胞に対する腫瘍溶解性アデノウイルス被覆微粒子の殺作用
1. 実験工程
調製した腫瘍溶解性アデノウイルス被覆微粒子を、腫瘍溶解性アデノウイルス被覆微粒子処置群として、A2780ヒト卵巣癌細胞株、MCF-7ヒト乳癌細胞株、A549ヒト肺癌細胞株、SNU1ヒト胃癌細胞株、Caco2ヒト結腸癌細胞株、HepG2ヒト肝癌細胞株、ASCP-1ヒト膵臓癌細胞株、LINCapヒト前立腺癌細胞株を含む異なる型のヒト腫瘍細胞株と共にそれぞれ培養した。48時間後、細胞の死滅状態を観察した。腫瘍細胞を通常の生理食塩水で処理する群が対照群であり、腫瘍細胞を細胞小胞のみで処理する群を細胞小胞投与群として用いた。
【００４７】
腫瘍溶解性アデノウイルス被覆微粒子の調製：上記の様々な腫瘍細胞の微粒子を、実施例１の方法に従って得た。実施例３〜４の方法に従って得た上記の様々な腫瘍細胞の微粒子も、以下の類似の殺腫瘍作用を有していた。
【００４８】
細胞小胞の調製：腫瘍細胞を培養する工程及び紫外線を30分間照射する工程。UV照射後48時間後に、腫瘍細胞が明らかに小さくぼんやりとしてきたので、マウス肝癌細胞培養液の上清を500 g、1000 g、及び5000 gの遠心力で各10分間、連続して遠心分離し、続いて14000 gの遠心力で1分間遠心分離して細胞及びデブリを除去し、遠心分離後の上清を10000 gの遠心力で1時間の更なる遠心分離に供し、沈殿物を回収して細胞小胞を得た。
【００４９】
2. 実験結果
腫瘍細胞を上述のように処理し、48時間後、各群の細胞を位相差顕微鏡下で観察した。対照群及びMP群(細胞小胞の投与のみ)の細胞は、接着成長状態を示した；一方OA-MP処理群(腫瘍溶解性アデノウイルス被覆微粒子の投与)の細胞は、接着から引き離されており、死状態を示しており(図3)、これは、腫瘍溶解性アデノウイルスを被覆する微粒子が、腫瘍細胞に対して認識可能な細胞傷害作用を有することを示している。
【００５０】
実施例６：腫瘍溶解性アデノウイルスを被覆する微粒子は身体に対して中毒性副作用を有さない
1. 実験工程
マウスに、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、細胞小胞(MP)、腫瘍溶解性アデノウイルス(OA)、及び腫瘍溶解性アデノウイルス被覆微粒子(OA-MP)をそれぞれ1日1回、合計5回、尾静脈注射し、マウスを6日目に屠殺し、その後グルタミン酸-ピルビン酸転移酵素(ALT)及びクレアチニン(CRE)の含有量を、マウスの血清中で検出した。この実施例で用いた微粒子及び細胞小胞は、実施例２のものと同一である。実施例３〜４で用いた微粒子も、身体に対して中毒性副作用が無かった。
【００５１】
2. 実験結果
図4a及び図4bからわかるとおり、対照群のPBS又は単一の細胞小胞を注射したマウスと比較すると、処置群において、腫瘍溶解性アデノウイルスを被覆する細胞小胞から生成した微粒子を注射したマウスについて、グルタミン酸-ピルビン酸転移酵素及びクレアチニンの含有量に明白な変化は無かった。
【００５２】
実施例７：腫瘍溶解性アデノウイルスを被覆する微粒子は腫瘍成長を阻害し担腫瘍マウスの生存時間を延長する
1. 実験工程
ヌードマウスに1×106個のA549ヒト肺癌細胞を皮下注射した。5日後、細胞小胞(MP)、腫瘍溶解性アデノウイルス(OA)、及び腫瘍溶解性アデノウイルス被覆微粒子(OA-MP)を3日間で1回、合計5回、腫瘍接種部位に直接注射した。皮下腫瘍成長の作用を観察する。各注射についての細胞小胞及び微粒子の数は、同一の2×106個であり、アデノウイルスの量は、2×106個であった。
【００５３】
ヌードマウスに5 × 106個のA549ヒト肺癌細胞を腹腔内注射した。3日後、PBS溶液、単一の腫瘍溶解性アデノウイルス(OA)、単一の細胞小胞(MP)、及び腫瘍溶解性アデノウイルス被覆微粒子(OA-MP)を、3日間で1回、合計で5回、それぞれ直接腹腔内注射した。マウスの生存時間を観察する。各注射についての細胞小胞及び微粒子の数は、同一の3×106個であり、アデノウイルスの量は、3×106個であった。
【００５４】
ヌードマウスに5×106個のA2780ヒト卵巣癌細胞を腹腔内注射した。3日後、細胞小胞(MP)、腫瘍溶解性アデノウイルス(OA)、及び腫瘍溶解性アデノウイルス被覆微粒子(OA-MP)を3日間で1回、合計で7回、それぞれ腹腔内注射した。腹腔内腫瘍成長を観察する。各注射についての細胞小胞及び微粒子の数は、同一の3×106個であり、アデノウイルスの量は、3×106個であった。
【００５５】
この実施例において、微粒子及び細胞小胞を調製するための方法は、実施例２と同一である。また、実施例３〜４の調製方法を使用することによっても、以下の同様の作用が得られる。
【００５６】
2. 実験結果
ヌードマウスにA549腫瘍細胞を皮下注射し、腫瘍小結節は5日目に成長し始めた。しかしながら、腫瘍溶解性アデノウイルス被覆微粒子の処置後、腫瘍成長は著しく阻害され、腫瘍体積は他の対照群のものよりも著しく小さく(図5aは、5日目及び21日目の腫瘍体積の大きさを示し、図5bは、種々の時点で検出した腫瘍体積を示した)、すなわち、腫瘍溶解性アデノウイルスのみが投与された群及び単一の細胞小胞が投与された群と比較して、腫瘍溶解性アデノウイルス被覆微粒子が投与された群におけるヌードマウスのA549腫瘍の皮下成長は、著しく阻害され得る。
【００５７】
ヌードマウスにA549腫瘍細胞を腹腔内注射した後、腫瘍溶解性アデノウイルス被覆微粒子の処置により、担腫瘍マウスの生存期間は著しく引き延ばされた。単一の腫瘍溶解性アデノウイルスが投与された群と比較して、p <0.05(図5cは、PBS、MP、OA、及びOA-MPで処置した後の、担腫瘍マウスの生存率を示した)であり、すなわち、単一の腫瘍溶解性アデノウイルスを投与された群及び単一の細胞小胞を投与された群と比較すると、腫瘍溶解性アデノウイルス被覆微粒子を投与された群の担腫瘍マウスの生存期間は著しく引き延ばされ得る。
【００５８】
ヌードマウスにA2780腫瘍細胞を腹腔内注射し、それからリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、単一の細胞小胞(MP)、単一の腫瘍溶解性アデノウイルス(OA)、及び腫瘍溶解性アデノウイルス被覆微粒子(OA-MP)でそれぞれ処置した後、30日後に、腫瘍の大きさ及び重量を検出し、結果を図5dに示した。すなわち、腫瘍溶解性アデノウイルスのみが投与された群及び単一の細胞小胞を投与された群と比較すると、腫瘍溶解性アデノウイルス被覆微粒子が投与された群の処置により、卵巣腫瘍の成長を著しく阻害することができる。単一の腫瘍溶解性アデノウイルス群(図5d参照)と比較して、p<0.05。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５−１】
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【図５−２】
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