(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グアニン、２’―デオキシリボース、グアニンのＮ２でジチオラン誘導体、および、デオキシリボースの３’―Ｏでホスホラミダイト誘導体またはデオキシリボースの３’―Ｏで固相担体を含む、ヌクレオシドであって、
下記の構造１または構造２で表されるヌクレオシド。
0006463750.tif 000039
〔構造式中、ＤＭＴｒは、ジメトキシトリチルを表す。〕
【請求項２】
ピリミジン、リボース、および、ピリミジンのＣ５でジチオラン誘導体を含む、ヌクレオシドであって、
下記の構造３または構造４で表されるヌクレオシド。
0006463750.tif 000040
〔構造式中、Ｒ１はＨ，ＯＨ，Ｆ又はＯ−アルキルであり、
Ｒ２はＡｃ（アセチル）又はＢｚ（ベンゾイル）であり、
ｎは１−２０カーボン原子である。また、ＤＭＴｒはジメトキシトリチルを表す。〕
【請求項３】
プリン、リボース、および、プリンのＣ８でジチオラン誘導体、を含む、ヌクレオシドであって、
下記の構造５または構造６で表されるヌクレオシド。
0006463750.tif 000041
〔構造式中、Ｒ１はＨ，ＯＨ，Ｆ又はＯ−アルキルであり、
Ｒ２はＡｃ（アセチル），Ｂｚ（ベンゾイル）又はＤＭＦ（ジメチルホルムアミジン）であり、
Ｒ３はシアノエチル又はエチルトリメチルシリルであり、
ｎは１−２０カーボン原子である。また、ＤＭＴｒはジメトキシトリチルを表す。〕
【請求項４】
ピリミジン、リボース、および、リボースの２’―Ｏでジチオラン誘導体を含む、ヌクレオシドであって、
下記の構造７または構造８で表されるヌクレオシド。
0006463750.tif 000042
〔構造式中、ＲはＡｃ（アセチル）、Ｂｚ（ベンゾイル）又はＤＭＦ（ジメチルホルムアミジン）であり、
ｎは１−２０カーボン原子である。また、ＤＭＴｒはジメトキシトリチルを表す。〕
【請求項５】
プリン、リボース、および、リボースの２´Ｏでジチオラン誘導体を含む、ヌクレオシドであって、
下記の構造９または構造１０で表されるヌクレオシド。
0006463750.tif 000043
〔構造式中、Ｒ１はＢｚ（ベンゾイル）、Ａｃ（アセチル）又はＤＭＡ（ジメチルアセトアミジン）であり、
Ｒ２はエチルトリメチルシリル又はシアノエチルであり、
ｎは１−２０カーボン原子である。また、ＤＭＴｒはジメトキシトリチルを表す。〕
【請求項６】
ピリミジン、リボース、ピリミジンのＣ５でジチオラン誘導体、および、リボースの３’―Ｏでホスホラミダイト基を含む、ヌクレオシドであって、
下記の構造１１または構造１２で表されるヌクレオシド。
0006463750.tif 000044
〔構造式中、Ｒ１はＨ，ＯＨ，Ｆ又はＯ−アルキルであり、
Ｒ２はＡｃ（アセチル）又はＢｚ（ベンゾイル）であり、
ｎは１−２０カーボン原子である。また、ＤＭＴｒはジメトキシトリチルを表す。〕
【請求項７】
プリン、リボース、プリンのＣ８でジチオラン誘導体、および、リボースの３’―Ｏでホスホラミダイト基を含む、ヌクレオシドであって、
下記の構造１３または構造１４で表されるヌクレオシド。
0006463750.tif 000045
〔構造式中、Ｒ１はＨ，ＯＨ，Ｆ又はＯ−アルキルであり、
Ｒ２はＡｃ（アセチル），Ｂｚ（ベンゾイル）又はＤＭＦ（ジメチルホルムアミジン）であり、
Ｒ３はシアノエチル又はエチルトリメチルシリルであり、
ｎは１−２０カーボン原子である。また、ＤＭＴｒはジメトキシトリチルを表す。〕
【請求項８】
ピリミジン、リボース、リボースの２’―Ｏでジチオラン誘導体、および、リボースの３’―Ｏでホスホラミダイト基を含む、ヌクレオシドであって、
前記ヌクレオシドは、下記の構造１５または構造１６で表されるヌクレオシド。
0006463750.tif 000046
〔構造式中、ＲはＡｃ（アセチル），Ｂｚ（ベンゾイル）又はＤＭＦ（ジメチルホルムアミジン）であり、
ｎは１−２０カーボン原子である。また、ＤＭＴｒはジメトキシトリチルを表す。〕
【請求項９】
プリン、リボース、リボースの２’―Ｏでジチオラン誘導体、および、リボースの３’―Ｏでホスホラミダイト基を含む、ヌクレオシドであって、
前記ヌクレオシドは、下記の構造１７または構造１８で表されるヌクレオシド。
0006463750.tif 000047
〔構造式中、Ｒ１はＢｚ（ベンゾイル）、Ａｃ（アセチル）又はＤＭＡ（ジメチルアセトアミジン）であり、
Ｒ２はエチルトリメチルシリル又はシアノエチルであり、
ｎは１−２０カーボン原子である。また、ＤＭＴｒはジメトキシトリチルを表す。〕
【請求項１０】
リボース、リボースの３’―Ｏで琥珀酸エステル群、および、ピリミジンまたはプリンを含む、ヌクレオシドであって、
前記ピリミジンはＣ５でジチオラン誘導体を有して、構造１９または構造２０で表され、そして、前記プリンは、Ｃ８でジチオラン誘導体を有して、下記の構造２１または構造２２で表されるヌクレオシド。
0006463750.tif 000048
〔構造式中、Ｒ１はＨ，ＯＨ，Ｆ又はＯ−アルキルであり、
Ｒ２はオリゴヌクレオチド合成に適合する核酸塩基保護基であり、
ｎは１−２０カーボン原子である。また、ＤＭＴｒはジメトキシトリチルを表す。〕
【請求項１１】
核酸塩基、リボース、リボースの２’―Ｏでジチオラン誘導体、および、リボースの３’―Ｏで琥珀酸エステル群を含む、ヌクレオシドであって、
前記核酸塩基は、ピリミジンまたはプリンであり、
前記ピリミジンは、下記の構造２３または構造２４で表されるか、または
前記プリンは、下記の構造２５または構造２６で表されるヌクレオシド。
0006463750.tif 000049
〔構造式中、Ｒ１はＨ，ＯＨ，Ｆ又はＯ−アルキルであり、
Ｒ２はＢｚ（ベンゾイル），Ａｃ（アセチル），ＤＭＦ（ジメチルホルムアミジン）又はＤＭＡ（ジメチルアセトアミジン）であり、
ｎは１−２０カーボン原子である。また、ＤＭＴｒはジメトキシトリチルを表す。〕
【請求項１２】
核酸塩基、リボース、リボースの２’―Ｏでジチオラン誘導体、および、リボースの３´Ｏ―で固相担体を含む、ヌクレオシドであって、
前記核酸塩基は、ピリミジンまたはプリンであり、
前記ピリミジンは、下記の構造２７または構造２８で表されるか、または
前記プリンは、下記の構造２９または構造３０で表されるヌクレオシド。
0006463750.tif 000050
〔構造式中、Ｒ１はＨ，ＯＨ，Ｆ又はＯ−アルキルであり、
Ｒ２はＢｚ（ベンゾイル），Ａｃ（アセチル），ＤＭＦ（ジメチルホルムアミジン）又はＤＭＡ（ジメチルアセトアミジン）であり、
ｎは１−２０カーボン原子である。また、ＤＭＴｒはジメトキシトリチルを表す。〕
【請求項１３】
請求項１乃至１２のいずれか一項に記載のジチオラン誘導体を含むヌクレオシドであって、
前記構造１〜構造３０のいずれか１つにより表されるヌクレオシド。
【請求項１４】
複数のオリゴヌクレオチドと固相担体とを含む抱合体であって、
前記オリゴヌクレオチドのそれぞれは更に請求項１３に記載のヌクレオシドを含み、 前記固相担体は金または量子ドットであることを特徴とする抱合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本特許協力条約出願は２０１３年１０月２３日に出願された、米国仮特許出願第６１／８９４，８７２号の利点に基づき、主張する。これらの特許の開示内容は、参照することによって本願に組み込まれるものとする。
【０００２】
本発明は核酸化学に関し、そして、新規な１，２―ジチオラン官能化ヌクレオシドホスホラミダイト（１、チャート１）および対応する固相担体（２、チャート１）について説明する。
【０００３】
これらの誘導体は、固相担体（例えば金、銀および量子ドット）上のオリゴヌクレオチドの３’−または５’末端のどちらかで、反応性チオール基を導入するのに役立つ。更にこのプローブのおかげでそれらは比較的長いリンカーアームを有し、そして、固体表面上でモノマーをきれいに形成することができ、固相担体からの最適距離に自己組織化モノマーを保つ。
【０００４】
本発明のヌクレオシドは、鎖伸長のためのＤＭＴｒ（４、４’−ジメトキシトリチル）官能基のための一級水酸を担持する。さらにまた、ホスホラミダイト官能基は、ヌクレオシドの３’―ヒドロキシルに付着される。これにより、標準ＤＮＡおよびＲＮＡ合成化学条件および技術下で、オリゴヌクレオチド鎖伸長を可能にし、結果として高品質なオリゴヌクレオチドにつながる。
【０００５】
対のオリゴヌクレオチド―金ナノ粒子抱合体（ジチオランユニットによる）は、新規構造、バイオ診断法およびナノ技術ベースの治療を組み立てる基礎単位として、ＤＮＡ断片の特定の配列を認識するためのユニークなプローブとして役立つ。
【背景技術】
【０００６】
近年、ナノメートルサイズ構造の開発にはさまざまな分子生物学的応用があり、注目を集めている。金は、高い化学的安定性を示し（貴金属）、ある波長で強く可視光を吸収する能力を特徴とし、本質的に毒性がないため、おそらく最も適している元素である。チオール（Ｒ−ＳＨ）修飾オリゴヌクレオチドは、核酸化学の分野で非常に多くの用途が見込まれる魅力的なツールとして役立ち、例えば、（ａ）α、β―不飽和ケトン、（ｂ）マレイミド、（ｃ）他のマイケル受容体群、または、（ｄ）ジスルフィド結合を作るタンパク質のシステイン、を含むさまざまな配位子の共有付着（結合）を可能にする。これに加えて、チオールは、金と可逆共有結合を形成するために、金の表面との強い特定の相互作用を有する。
【０００７】
オリゴヌクレオチド合成の間、硫化修飾ホスホラミダイトモノマーを組み込むことによって、反応性チオール基をオリゴヌクレオチドに導入できる。上記を達成するために、通常２つの異なるタイプの硫化修飾モノマー（つまりはジスルフィド ストラテジ）［Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｓ．，Ｈａｃｈａｍａｎｎ，Ｊ．Ｐ．，Ｃｏｎｒａｄ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｏｕｔｔｓ，Ｓ．，Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ａ．米国特許第５，３９１，７８５号（１９９５）］または、Ｓ−トリチル保護［Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｂ．Ａ．；Ｒｉｄｅｒ，Ｐ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８５  １３、４４８５］が非常に普及している。
【０００８】
オリゴヌクレオチドを還元剤（例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ））で処理することによって、ジスルフィドから反応性チオール基を発生させる。ところが、他のＳ−トリチルストラテジでは、硝酸銀でトリチル基を切断することによって発生する。しかしながら、このストラテジには硝酸銀を有するトリチル基の複雑な開裂過程という明らかなデメリットがあり、そして、最終的にオリゴヌクレオチドの収率を相対的に低くする。
【０００９】
従って、ジスルフィド修飾ホスホラミダイトは、チオール基を生成するための優れたプローブとして役立つ。最も人気のあるジスルフィドプローブは、ＲがＣ３またはＣ６スペーサーアームである場合、一般式ＤＭＴ−Ｏ−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ−Ｏ−Ｐ（ＣＥ）（ＮｉＰｒ２）で表される。
［Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｓ．，Ｈａｃｈａｍａｎｎ，Ｊ．Ｐ．，Ｃｏｎｒａｄ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｏｕｔｔｓ，Ｓ．，Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ａ．米国特許第５，３９１，７８５号（１９９５）］
【００１０】
その興味深い特性により、我々は、商業的、研究開発のための、高純度の非環式ジスルフィドホスホラミダイト（ＲがＣ３スペーサである）を生み出す新規な合成および精製方法を開発するために、詳細な調査を行った。我々の最適化合成プロトコルには再現性があり、マルチグラムスケールに適しており、３１Ｐ  ＮＭＲ（＞９４％）により高純度のターゲット ホスホラミダイトを産生する。
［Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｓ．Ｃ．；Ｔａｔｉｋｏｎｄａ，Ｓ．Ｋ．；Ｓｒｉｖａｓｔａｖ，Ｓ．Ｋ．Ｓｈｕｋｌａ，Ｐ．米国特許出願公開第２０１２／０００１０３号，２０１２］
【００１１】
ＮｕｚｚｏおよびＡｌｌａｒａは、反応性チオール基が金の表面に吸着して、秩序ある単分子膜を形成するということを発見した。
［Ｎｕｚｚｏ，Ｒ．Ｇ．，Ａｌｌａｒａ，Ｄ．Ｌ．Ｊｏｕｒ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８３，１０５，４４８１］
この後、チオール基を有するオリゴヌクレオチドは、金の表面上に自己集合単分子膜（ＳＡＭ）を生成するために非常によく利用されている。
【００１２】
異なる分子（シラン、カルボン酸、ピリジン、亜硫酸エステルおよびチオール）を異なる表面（金、銀、プラチナ、銅、水銀およびガラス）に固定することは可能であるが、金上へのチオールの化学吸着は、表面上のプローブを固定するための共通した簡易な手順である。
【００１３】
ＤＮＡ官能化金ナノ粒子は、後にキー核酸ベースの組立戦略で広く使用される基礎単位となっており、ＤＮＡ断片の特定の配列［Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．，Ｅｌｇｈａｎｉａｎ，Ｒ．，Ｍｕｃｉｃ，Ｒ．Ｃ．，Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．，およびＬｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８  １２０  １９５９］を認識するためのユニークなプローブとして、以下として、役立つ。
新規構造および材料を組み立てるための基礎単位［Ｍｕｃｉｃ，Ｒ．Ｃ．，Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．，Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．，Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８  １２０，１２６７４］として、そして、
生物学診断法およびナノ技術ベースの治療［Ｍｅｒｋｉｎｓ，Ｃ．Ａ．，Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｍｕｃｉｃ，Ｒ．Ｃ．，Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ，１９９６，３８２、６０７；  Ｈｕｒｓｔ，Ｓ．Ｊ．，Ｈｉｌｌ，Ｈ．Ｄ．Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，１２１９２］として。
これらの単分子膜の形成は、いくつかの要因（例えば温度、溶媒、緩衝液濃度、吸着質の鎖長、基質の清潔さ、および、表面との反応速度および単分子膜の成分の吸着の可逆性）の影響を受けるということが証明されている。これらの応用は、付着のオリゴヌクレオチドおよびナノ粒子間の、金と硫黄との結合の可逆的会合次第である。
【００１４】
単一チオール基に付着のオリゴヌクレオチドは、洗浄段階の間は不安定であり、そして、オリゴヌクレオチドの安定付着の形成は、例えばＤＮＡチップ技術への応用で成功するためには非常に重要な特性である。金と硫黄間の共有結合は３０〜４０Ｋｃａｌ／ｍｏｌまでの大きさであり、それは表面上へ生体高分子をとどめるためには相対的に弱い。
［Ｄｕｂｏｉｓ  Ｌ．Ｈ．，Ｚｅｇａｒｓｋｉ  Ｂ．Ｒ．，Ｎｕｚｚｏ  Ｒ．Ｇ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８７  ８４  ４７３９；  Ｌｉｅｐｏｌｄ，Ｐ．，Ｋｒａｔｚｍuｌｌｅｒ，Ｔ．，Ｐｅｒｓｉｋｅ，Ｎ．，Ｂａｎｄｉｌｌａ，Ｍ．，Ｈｉｎｚ，Ｍ．，Ｗｉｅｄｅｒ，１５  Ｈ．，Ｈｉｌｌｅｂｒａｎｄｔ，Ｈ．，Ｆｅｒｒｅｒ，Ｅ．，Ｈａｒｔｗｉｃｈ，Ｇ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，２００８、３９１、１７５９−１７７２］
一官能チオール基と抱合するオリゴヌクレオチドは、より高い温度で、また、高塩濃度緩衝液[Ｌｉ，Ｚ．，Ｊｉｎ，Ｒ．，Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．，Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００２，３０，１５５８]が存在する場合にも、ゆっくり失われると報告された。モノチオール基によって金の表面に抱合するオリゴヌクレオチドのＳＡＭ上のＬｅｔｓｉｎｇｅｒ他による安定性研究で、これらはＤＴＴを含む緩衝液で処理すると完全に変位することが分かった。
［Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｅｌｇｈａｎｉａｎ，Ｒ．，Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｍ，Ｇ．，Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０００，１１，２８９］
この特徴は、チオールを含む溶液（例えばポリメラーゼ酵素のためのスタビライザとしてＤＴＴを有するＰＣＲ溶液）において、これらのプローブの応用を制限する。
【００１５】
よって、より広い生物学的応用のために、オリゴヌクレオチドの安定したＳＡＭを形成可能である新規なジスルフィド化合物を開発する必要が大いにある。単分子膜の安定性は、１つのオリゴヌクレオチドに対する複数の金硫黄結合によって向上させることができると予想できる。１つのオリゴヌクレオチドに対して複数のチオール基を生成することができる新規なチオールモディファイア（Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ）を導入した報告はほとんどない。
［Ｌｅｔｓｉｎｇｅ，Ｒ．Ｌ．，Ｅｌｇｈａｎｉａｎ，Ｒ．，Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｍ，Ｇ．，Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０００，１１，２８９−２９１；  Ｈａｒｔｗｉｃｈ，Ｇ．，Ｆｒｉｓｃｈｍａｎｎ，Ｐ．，Ｆｅｒｒｅｄ，Ｅ．，米国特許出願公開第２００５／００５９７２８，２００４］
これらの修飾によって作られるＳＡＭが、ＤＴＴを含む緩衝液でモノチオールモディファイア（Ｍｏｎｏ  Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ）によって発生する対応するＳＡＭより、非常に安定しているということが証明された。
［Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｅｌｇｈａｎｉａｎ，Ｒ．，Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｍ，Ｇ．，Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０００，１１，２８９］
【００１６】
しかしながら、開示された技術において、側鎖に付着するＤＭＴ基は二級水酸に付着し、そして、固体表面に付着のオリゴヌクレオチドの質に影響しうる。
【００１７】
本発明は、オリゴヌクレオチド成長帯域のために、ヌクレオシド５’−ＤＭＴ基を利用し、それにより、高品質なジチオランオリゴヌクレオチドを合成する。
【００１８】
チャート１：化学構造
Ｎ２―グアノシン（Ｏ６保護）官能化ジチオランホスホラミダイト１、固相担体２、先行開示のジチオランホスホラミダイト３、および、それらの固相担体４
0006463750.tif 000002
【００１９】
先に我々は、２つのチオール基の導入のための五員ジスルフィド（ジチオラン）ベースの定着基３（チャート１）について説明した。
［Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｓ．Ｃ．，Ｔｈａｔｉｋｏｎｄｒａ，Ｓ．Ｋ．，Ｓｒｉｖａｓｔａｖ，Ｓ．Ｋ．，Ｓｈｕｋｌａ，Ｐ．Ｋ．，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ａ，米国仮特許出願第６１／７９５，８５１号（２０１２年１０月２７日出願）；  米国非仮特許出願第１４／０６５，３８５（２０１３年１０月２８日出願）］
このジチオラン修飾は、オリゴヌクレオチド合成の目的でＤＭＴ基を付着するために一級水酸基を提供し、高品質なオリゴヌクレオチドを提供し、そして、高い安定性を示す金−オリゴヌクレオチド抱合体を産出する可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】米国特許第７，６０１，８４８号
【特許文献２】米国特許第５，３９１，７８５号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／００５９７２８号
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１２／０００１０３号
【特許文献５】米国仮特許出願第６１／７９５，８５１号
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Ｃａｏ，Ｈ．，Ｙｏｎｇ，Ｊ．，Ｙｉｎｓｈｅｎｇ  Ｗ．Ｊｏｕｒ．ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００７，１２９，１２１２３−１２１３０
【非特許文献２】Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｂ．Ａ．，Ｒｉｄｅｒ，Ｐ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８５  １３，４４８５
【非特許文献３】Ｄｕｂｏｉｓ  Ｌ．Ｈ．，Ｚｅｇａｒｓｋｉ  Ｂ．Ｒ．，Ｎｕｚｚｏ  Ｒ．Ｇ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８７  ８４  ４７３９−４７４２
【非特許文献４】Ｈｕｒｓｔ，Ｓ．Ｊ．，Ｈｉｌｌ，Ｈ．Ｄ．，Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，１２１９２
【非特許文献５】Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｅｌｇｈａｎｉａｎ，Ｒ．，Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｍ，Ｇ．，Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｂｉｏｃｏｎｊ．ｃｈｅｍ．２０００，１１，１５２８９−２９１
【非特許文献６】Ｌｉ，Ｚ．，Ｊｉｎ，Ｒ．，Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．，Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００２，３０，１５５８−６２
【非特許文献７】Ｌｉｅｐｏｌｄ，Ｐ．，Ｋｒａｔｚｍｕｌｌｅｒ，Ｔ．，Ｐｅｒｓｉｋｅ，Ｎ．，Ｂａｎｄｉｌｌａ，Ｍ．，Ｈｉｎｚ，Ｍ．，Ｗｉｅｄｅｒ，Ｈ．，Ｈｉｌｌｅｒａｎｄｔ，Ｈ．，Ｆｅｒｒｅｒ，Ｅ．，Ｈａｒｔｗｉｃｈ，Ｇ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，２００８，３９１，１７５９−１７７２
【非特許文献８】Ｍｅｒｋｉｎｓ，Ｃ．Ａ．，Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｍｕｃｉｃ，Ｒ．Ｃ．，Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ，１９９６，３８２，６０７．２０
【非特許文献９】Ｍｕｃｉｃ，Ｒ．Ｃ．，Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．，Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．，Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８  １２０，１２６７４−１２６７５
【非特許文献１０】Ｎｕｚｚｏ，Ｒ．Ｇ．，Ａｌｌａｒａ，Ｄ．Ｌ．Ｊｏｕｒ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８３，１０５，４４８１
【非特許文献１１】Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．，Ｅｌｇｈａｎｉａｎ，Ｒ．，Ｍｕｃｉｃ，Ｒ．Ｃ．，Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．，および  Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８  １２０，１９５９−１９６４
【発明の概要】
【００２２】
構造１のホスホラミダイト誘導体、および構造２の固相担体
0006463750.tif 000003
【００２３】
構造３、４に記載される、Ｃ５―ジチオラン官能化ピリミジンヌクレオシド
0006463750.tif 000004
【００２４】
構造５、６に記載される、Ｃ８―ジチオラン官能化プリンヌクレオシド
0006463750.tif 000005
【００２５】
構造７、８に記載される、２’―Ｏジチオラン官能化ピリミジンヌクレオシド
0006463750.tif 000006
【００２６】
構造９、１０に記載される、２’―Ｏジチオラン官能化プリンヌクレオシド
0006463750.tif 000007
【００２７】
構造１１、１２に記載される、Ｃ５ジチオラン官能化ピリミジンヌクレオシドアミダイト
0006463750.tif 000008
【００２８】
構造１３、１４に記載される、Ｃ８ジチオラン官能化プリンヌクレオシドアミダイト
0006463750.tif 000009
【００２９】
構造１５、１６に記載される、２’―Ｏジチオラン官能化ピリミジンヌクレオシドアミダイト
0006463750.tif 000010
【００３０】
構造１７、１８に記載される、２’―Ｏジチオラン官能化プリンヌクレオシドアミダイト
0006463750.tif 000011
【００３１】
構造１９〜２２に示す、Ｃ―５官能化ピリミジンおよびＣ８官能化プリン琥珀酸エステル
0006463750.tif 000012
【００３２】
構造２３〜２６に示す、２’−Ｏ−官能化ピリミジンおよびプリン琥珀酸エステル
0006463750.tif 000013
【００３３】
構造２７〜３０に示す、Ｃ５官能化ピリミジンおよびプリン固相担体
0006463750.tif 000014
【００３４】
上記のように、Ｃ５および２’―Ｏジチオラン官能化構造１〜構造３０に含まれるオリゴリボヌクレオチドまたはオリゴデオキシリボ核酸
【００３５】
固相担体（例えば、下に図示する金、量子ドット）を用いて、上記にあるような、オリゴリボヌクレオチドまたはオリゴデオキシリボ核酸の抱合体
0006463750.tif 000015
【００３６】
チオール修飾オリゴヌクレオチドは、例えば様々な配位子の共有付着（結合）を可能にし、核酸化学の分野において非常に幅広く応用されており、更に、金の表面で比較的強い結合を形成する能力を有する。よって、チオール基を有するオリゴヌクレオチドは金の表面上へ化学吸着することができ、そして、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を生成する。ＤＮＡ官能化金ナノ粒子は、キー核酸ベースの組立戦略において広く使用される基礎単位となり、そして、新規構造および材料、生物学診断法およびナノ技術ベースの治療を組み立てるための基礎単位として、ＤＮＡ断片の特定の配列を認識するためのユニークなプローブとして役立つ。
【００３７】
チオール基が元素金（約３０〜４０Ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ）と比較的強い結合を形成する場合であっても、高塩濃度緩衝液および他のチオールが存在する場合に、より高い温度で置換えられる。これらの抱合体への応用は数多くあるため、オリゴヌクレオチドを金ナノ粒子に強く結合することが必要である。しかしながらチオールの置換を回避するために、複数のチオール基を導入することができるいくつかの環状ジスルフィド修飾子が先行技術で紹介されている。その安定性の研究では、対応するモノチオール誘導体と比較して、これらのマルチチオール官能化オリゴヌクレオチドが比較的安定したＳＡＭを形成することが分かった。
【課題を解決するための手段】
【００３８】
本発明において我々は、環式のジチオラン官能化ホスホラミダイト誘導体１（チャート１）および対応するジチオランサクシニル固相担体２（チャート１）の設計および効果的な合成について説明する。先に我々は、２つのチオール基の導入のための五員ジスルフィド（ジチオラン）ベースの定着基３および４（チャート１）について説明した。
［Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｓ．Ｃ，Ｔｈａｋｉｋｏｎｄａ，Ｓ．Ｋ．，Ｓｒｉｖａｓｔａｖ，Ｓ．Ｋ．，Ｓｈｕｋｌａ，Ｐ．Ｋ．Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ａ．米国仮特許出願第６１／７９５，８５１号（２０１２年１０月２７日出願）；  米国非仮特許出願第１４／０６５，３８５（２０１３年１０月２８日出願）］
このジチオラン修飾は、合成しやすく、広く役立ち、更に大きな安定性を示す金−オリゴヌクレオチド抱合体を産出する可能性がある。本発明の作業は、このジチオラン技術をヌクレオシドまで更に広げることである。合成されたジチオラン官能化誘導体１（チャート１）に加え、我々は、スキーム１〜８から、さまざまな他の官能基化誘導体化合物を想定している。リンカーアームで、核酸塩基または糖部にジチオラン部分を抱合すると、非常に興味深い官能化チオールオリゴヌクレオチドが生成される。リンカーアームが比較的長いおかげで、固体表面上でモノマーをきれいに形成させることができ、固相担体からの最適距離に自己組織化モノマーを保つ。
【００３９】
新規構造、生物学診断法およびナノ技術ベースの治療を組み立てるための基礎単位として、対のオリゴヌクレオチド―金ナノ粒子抱合体は、ＤＮＡ断片の特定の配列を認識するためのユニークなプローブとして役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】２―（１２―アミノドデカニル）―２’―デオキシ―５’―Ｏ―（４，４’―ジメトキシトリチル）―Ｏ６―（２―トリメチルシリルエチル）―グアノシン（５４）のＨＰＬＣ純分分析。化合物の分析純度を、ＣｈｒｏｍＳｅｐ  ＳＳ  カラム（４．６×２５０ｍｍ）１０およびＣｈｒｏｍＳｅｐ  ガード−カラム  ＯｍｎｉＳｐｈｅｒ５Ｃ１８を備えるＶａｒｉａｎ  Ｐｒｏｓｔａｒ  ＨＰＬＣを使用して確認した。移動相：Ａ  ０．１Ｍのトリエチルアンモニウム酢酸塩（ＴＥＡＡ）；Ｂ  ＣＨ３ＣＮ。分析は６５％〜９８％までのＢの増加の直線勾配で行った（２０分）。ピークが、２５４ナノメートルで紫外吸収により検出された。
【図２】２―（１２―アミノドデカニル）―２’―デオキシ―５’―Ｏ―（４，４’―ジメトキシトリチル）―Ｏ６―（２―トリメチルシリルエチル）―グアノシン（５４）のＨＰＬＣテーブルピーク。
【図３】２―（１２―アミノドデカニル）―２’―デオキシ―５´―Ｏ―（４、４’―ジメトキシトリチル）―Ｏ６―（２―トリメチルシリルエチル）―グアノシン（５４）のＥＳＩ／ＭＳスペクトル。ＭＳｍ／ｚ（Ｃ４８Ｈ６８Ｎ６Ｏ６Ｓｉ）［Ｍ―Ｈ］−８５２．４、ｃａｌｃｄ８５３．１８。ＥＳＩ／ＭＳ分析は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ３０  ＰＥ―ＳＣＩＥＸ  ＡＰＩ―１５０質量分析計で行った。
【図４】２―（１２―アミノドデカニル）―２’―デオキシ―５’―Ｏ―（４，４’―ジメトキシトリチル）―Ｏ６―（２―トリメチルシリルエチル）―グアノシン（５４）の１ＨのＮＭＲ。１ＨのＮＭＲは、［０００１．］Ｂｒｕｋｅｒ  ５００  ＭＨｚのＮＭＲ分光光度計に記録した。化学シフトは、重水素化溶媒ＣＤＣｌ３（δ７．２６ｐｐｍ）を用いて測定される。
【図５】２’―デオキシ―５’―Ｏ―（４、４’―ジメトキシトリチル）―２―（１２―（５―（１，２―ジチオラン―３―イル）バレルアミド）―ドデシル）―Ｏ６―（２―トリメチルシリルエチル）―グアノシン（５５）のＨＰＬＣ純分分析。ＣｈｒｏｍＳｅｐ  ＳＳ  カラム（４．６×２５０ｍｍ）１０およびＣｈｒｏｍＳｅｐ  ガード−カラムＯｍｎｉＳｐｈｅｒ  Ｃ１８を備えるＶａｒｉａｎ  Ｐｒｏｓｔａｒ  ＨＰＬＣを使用して、化合物の分析純度を確認した。移動相：Ａ  ０．１  Ｍのトリエチルアンモニウム酢酸塩（ＴＥＡＡ）；Ｂ  ＣＨ３ＣＮ。分析は、０％から５０％までのＢの増加の直線勾配で行った（２０分間）。ピークが２５４ナノメートルで紫外吸収により検出された。
【図６】２’―デオキシ―５´―Ｏ―（４、４’―ジメトキシトリチル）―２―（１２―（５―（１、２―ジチオラン―３―イル）バレルアミド）―ドデシル）―Ｏ６―（２―トリメチルシリルエチル）―グアノシン（５５）のＨＰＬＣテーブルピーク。
【図７】２’―デオキシ―５’―Ｏ―（４、４’―ジメトキシトリチル）―２―（１２―（５―（１、２―ジチオラン―３―イル）バレルアミド）―ドデシル）―Ｏ６―（２―トリメチルシリルエチル）―グアノシン（５５）のＥＳＩ／ＭＳスペクトル。ＭＳｍ／ｚ  Ｃ５６Ｈ８０Ｎ６Ｏ７Ｓ２Ｓｉ（［Ｍ＋Ｈ］＋１０４２．２、ｃａｌｃｄ  １０４１．１８）。ＥＳＩ／ＭＳ分析は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ３０  ＰＥ―ＳＣＩＥＸ  ＡＰＩ―１５０質量分析計で行った。
【図８】２’―デオキシ―５’―Ｏ―（４,４’―ジメトキシトリチル）―２―（１２―（５―（１、２―ジチオラン―３―イル）バレルアミド）―ドデシル）―Ｏ６―（２―トリメチルシリルエチル）―グアノシン（５５）の１ＨのＮＭＲ。１ＨのＮＭＲは、Ｂｒｕｋｅｒ  ５００  ＭＨｚのＮＭＲ分光光度計に記録した。化学シフトは、重水素化溶媒ＣＤＣｌ３（δ７．２６ｐｐｍ）を利用して測定される。
【図９】３’−（２―シアノエチルジイソプロピルホスホロアミジト）―２’―デオキシ―５’―Ｏ―（４、４’―ジメトキシトリチル）―２―（１２―（５―（１、２―ジチオラン―３―イル）バレルアミド）―ドデシル）―Ｏ６―（２―トリメチルシリルエチル）―グアノシン（１）のＨＰＬＣ純分分析。ＣｈｒｏｍＳｅｐ  ＳＳ  カラム（４．６×２５０ｍｍ）１０およびＣｈｒｏｍＳｅｐ  ガード−カラムＯｍｎｉＳｐｈｅｒ  Ｃ１８を備えるＶａｒｉａｎ  Ｐｒｏｓｔａｒ  ＨＰＬＣを使用して、化合物の分析純度は点検した。移動相：Ａ  ０．１  Ｍのトリエチルアンモニウム酢酸塩（ＴＥＡＡ）；Ｂ  ＣＨ３ＣＮ。分析は、０％〜３０％のＢの増加の直線勾配によって行った（２０分間）。ピークは２５４ナノメートルで紫外吸収によって検出された。
【図１０】３’−（２―シアノエチルジイソプロピルホスホロアミジト）―２’―デオキシ―５’―Ｏ―（４、４’―ジメトキシトリチル）―２―（１２―（５―（１、２―ジチオラン―３―イル）バレルアミド）―ドデシル）―Ｏ６―（２―トリメチルシリルエチル）―グアノシン（１）のＨＰＬＣテーブルピーク。
【図１１】３’−（２―シアノエチルジイソプロピルホスホロアミジト）―２’―デオキシ―５’―Ｏ―（４、４’―ジメトキシトリチル）―２―（１２―（５―（１、２―ジチオラン―３―イル）バレルアミド）―ドデシル）―Ｏ６―（２―トリメチルシリルエチル）―グアノシン（１）のＥＳＩ／ＭＳスペクトル。ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ６５Ｈ９７Ｎ８Ｏ８ＰＳ２Ｓｉ［０００２．］（［Ｍ＋Ｈ］＋１２４２．３、ｃａｌｃｄ  １２４１．５８）。ＥＳＩ／ＭＳ分析は、パーキンエルマー３０  ＰＥ―ＳＣＩＥＸ  ＡＰＩ―１５０質量分析計で行った。
【図１２】３’−（２―シアノエチルジイソプロピルホスホロアミジト）―２’―デオキシ―５’―Ｏ―（４、４’―ジメトキシトリチル）―２―（１２―（５―（１、２―ジチオラン―３―イル）バレルアミド）―ドデシル）―Ｏ６―（２―トリメチルシリルエチル）―グアノシン（１）の３１Ｐ  ＮＭＲスペクトル。３１Ｐ  ＮＭＲは、Ｂｒｕｋｅｒ  ２０２  ＭＨｚのＮＭＲ分光光度計に記録した。ＮＭＲ分析のために使用する溶媒はＣＤＣｌ３であった。
【図１３】３’−（２―シアノエチルジイソプロピルホスホロアミジト）―２’―デオキシ―５’―Ｏ―（４、４’―ジメトキシトリチル）―２―（１２―（５―（１、２―ジチオラン―３―イル）バレルアミド）―ドデシル）―Ｏ６―（２―トリメチルシリルエチル）―グアノシン（１）のＵＶ吸収スペクトル。ＵＶ吸収スペクトルは、３２０〜２４０ナノメートルの範囲でＣａｒｙ５０バイオ紫外線可視分光光度計に記録した。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明は、このジチオラン技術を更にヌクレオシドまで広げる。リンカーアームで、核酸塩基または糖部にジチオラン部分を抱合すると、非常に興味深い官能化チオールオリゴヌクレオチドが生成される。リンカーアームが比較的長いおかげで、固体表面上でモノマーをきれいに形成させることができ、自己組織化モノマーを固相担体からの最適距離に保つ。新規構造、生物学診断法およびナノ技術ベースの治療を組み立てるための基礎単位として、対のオリゴヌクレオチド―金ナノ粒子抱合体は、ＤＮＡ断片の特定の配列を認識するためのユニークなプローブとして役立つ。
【００４２】
本発明の一様態はヌクレオシドを対象とする。そして、グアニン、２’―デオキシリボース、グアニンのＮ２でジチオラン誘導体、そして、デオキシリボースの３’―Ｏでホスホラミダイト誘導体、またはデオキシリボースの３’―Ｏで固相担体を含み、ヌクレオシドは構造１または構造２で表される。
0006463750.tif 000016
【００４３】
本発明の一様態は、ヌクレオシドを対象とする。そして、ピリミジン、リボース、ピリミジンのＣ５でジチオラン誘導体を含み、ヌクレオシドは構造３または構造４で表される。
0006463750.tif 000017
【００４４】
本発明の一様態は、ヌクレオシドを対象とする。そして、プリン、リボース、プリンのＣ８でジチオラン誘導体を含み、ヌクレオシドは構造５または構造６で表される。
0006463750.tif 000018
【００４５】
本発明の一様態は、ヌクレオシドを対象とする。そして、ピリミジン、リボース、リボースの２’―Ｏでジチオラン誘導体を含み、ヌクレオシドは構造７または構造８で表される。
0006463750.tif 000019
【００４６】
本発明の一様態は、ヌクレオシドを対象とする。そして、プリン、リボース、リボースの２’Ｏでジチオラン誘導体を含み、ヌクレオシドは構造９または構造１０で表される。
0006463750.tif 000020
【００４７】
本発明の一様態は、ヌクレオシドを対象とする。そして、ピリミジン、リボース、ピリミジンのＣ５でジチオラン誘導体、そして、リボースの３’―Ｏでホスホラミダイト基を含み、ヌクレオシドは構造１１または構造１２で表される。
0006463750.tif 000021
【００４８】
本発明の一様態は、ヌクレオシドを対象とする。そして、プリン、リボース、プリンのＣ８でジチオラン誘導体、リボースの３’―Ｏでホスホラミダイト基を含み、ヌクレオシドは構造１３または構造１４で表される。
0006463750.tif 000022
【００４９】
本発明の一様態は、ヌクレオシドを対象とする。そして、ピリミジン、リボース、リボースの２’―Ｏでジチオラン誘導体、リボースの３’―Ｏでホスホラミダイト基を含み、ヌクレオシドは構造１５または構造１６で表される。
0006463750.tif 000023
【００５０】
本発明の一様態は、ヌクレオシドを対象とする。そして、プリン、リボース、リボースの２’―Ｏでジチオラン誘導体、リボースの３’―Ｏでホスホラミダイト基を含み、ヌクレオシドは、構造１７または構造１８で表される。
0006463750.tif 000024
【００５１】
本発明の一様態は、ヌクレオシドを対象とする。そして、リボース、リボースの３’―Ｏで琥珀酸エステル群、そして、ピリミジンまたはプリンを含み、そこで、ピリミジンはＣ５でジチオラン誘導体を有し、そして、ピリミジンは構造１９または構造２０で表される。プリンは、Ｃ８でジチオラン誘導体を有して、構造２１または構造２２で表される。
0006463750.tif 000025
【００５２】
本発明の一様態は、ヌクレオシドを対象とする。そして、核酸塩基、リボース、リボースの２’―Ｏでジチオラン誘導体、リボースの３’―Ｏで琥珀酸エステル群を含み、そこで、核酸塩基は、構造２３または構造２４で表されるピリミジンであるか、または構造２５または構造２６で表されるプリンである。
0006463750.tif 000026
【００５３】
本発明の一様態は、ヌクレオシドを対象とする。そして、核酸塩基、リボース、リボースの２’―Ｏでジチオラン誘導体、リボースの３´Ｏ―で固相担体を含み、そこで、核酸塩基は、構造２７または構造２８で表されるピリミジンであり、そして構造２９または構造３０で表されるプリンである。
0006463750.tif 000027
【００５４】
本発明の一様態は、ヌクレオシドを対象とする。そして、上述のヌクレオシドの１つに従いジチオラン誘導体を含み、そこで、ヌクレオシドは構造１〜構造３０のうちの１つにより表される。
本発明の一様態は、抱合体（前述のヌクレオシドを含む）および固相担体（固相担体が金または量子である）を対象とし、そこで、抱合体は下図で示される。
0006463750.tif 000028
【００５５】
このことを示すために、我々は、Ｎ２―官能化デオキシ―グアノシンアミダイト（１、チャート１）の合成に成功し、固相担体（２、チャート１）を有する対応する化合物のためのスキームを提唱した。これに加えて我々は、さまざまなジチオラン官能化ＤＮＡおよびＲＮＡアミダイト、および固相担体（スキーム１〜８）を提唱した。これらのモノマーは、オリゴヌクレオチドの３’−または５’−末端でチオール官能性を生じさせるのに役立つ。これらの改良によって、我々は、このプローブがジチオラン部分からなる良質なプローブの応用に理想的に適合するよう設計されていると強く確信している。
【００５６】
チオール修飾オリゴヌクレオチドにおいては、様々な配位子の共有付着（結合）を可能にし、更に金の表面に比較的強い結合を形成する能力を有するといった、核酸化学分野における膨大な数の応用がある。ＤＮＡ官能化金ナノ粒子は、キー核酸ベースの組立戦略および治療において広く使用される基礎単位となった。チオール基が元素金（約３０〜４０Ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ）と比較的強い結合を形成する場合であっても、高塩濃度緩衝液および他のチオールが存在する場合に、より高い温度で置換えられる。これらの抱合体への応用は数多くあるため、オリゴヌクレオチドを金ナノ粒子に強く結合することが必要である。しかしながらチオールの置換を回避するために、複数のチオール基を導入することができるいくつかの環状ジスルフィド修飾子が先行技術で紹介されている。その安定性の研究では、対応するモノチオール誘導体と比較して、これらのマルチチオール官能化オリゴヌクレオチドが比較的安定したＳＡＭを形成すると分かった。
【００５７】
本出願において、我々は、Ｎ２環式のジチオラン官能化ホスホラミダイト誘導体１（チャート１）の設計および効果的な合成および、対応するジチオランサクシニルＣＰＧ担体２（チャート１）の提唱された合成について解説する。合成されたジチオラン官能化誘導体１（チャート１）に加えて、我々は、スキーム１〜８から、さまざまな他の官能化誘導体化合物を想定する。
【００５８】
リンカーアームで、核酸塩基または糖部にジチオラン部分を抱合すると、非常に興味深い官能化チオールオリゴヌクレオチドが生成される。リンカーアームが比較的長いおかげで、固体表面上でモノマーをきれいに形成させることができ、自己組織化モノマーを固相担体からの最適距離に保つ。
【００５９】
新規構造、生物学診断法およびナノ技術ベースの治療を組み立てるための基礎単位として、対のオリゴヌクレオチド―金ナノ粒子抱合体は、ＤＮＡ断片の特定の配列を認識するためのユニークなプローブとして役立つ。
【００６０】
ヌクレオシド５３の２−フルオロ［Ｃａ．，Ｈ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．，Ｙｉｎｓｈｅｇ  Ｗ．Ｊｏｕｒ．ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００７，１２９，１２１２３−１２１３０]は、７９％の収率のアミノヌクレオシド５４を産出するために、１、１２―ジアミノドデカンと置き換えられた。ヌクレオシド５４は、Ｎ２―ジチオラン結合物５５を獲得するために、チオクト酸を使用して、ＥＤＣ．ＨＣｌにカップリングされた。最終的に、化合物５５は、Ｎ，Ｎ’―（ジイソプロピル）ホスホルアミドクロリダイト試薬および６７％の収率の無水ＴＨＦのＮ、Ｎ’―ジイソプロピルエチルアミンを使用して、目的アミダイト１に変化した。（スキーム９）化合物５５は、化合物２（スキーム１０）を獲得するために適切な固相担体に結合させることが続く対応する琥珀酸エステル５７（スキーム１０）に、変化することもできる。スキーム９および１０にて図示するように、これらの目標化合物１および２は、オリゴヌクレオチド配列の３’−または５’末端でジチオラン修飾を得るために、オリゴヌクレオチド配列に組み込むことができる。
【００６１】
スキーム１：Ｃ５―ジチオラン官能化ウリジンアミダイトおよび担体のための合成スキーム。
0006463750.tif 000029
【００６２】
試薬および条件：
（ａ）対応するジアミン、ＭｅＯＨ
（ｂ）チオクト酸、ＥＤＣ．ＨＣｌ、Ｎ，Ｎ’―ジメチルホルムアミド、ｒｔ（室温）
（ｃ）２―シアノエチルＮ，Ｎ’―（ジイソプロピル）ホスホルアミドクロリダイト、Ｎ，Ｎ’―ジイソプロピルエチルアミン、無水ＴＨＦ
（ｄ）無水コハク酸、４―ジメチルアミノピリジン、無水ピリジン
（ｅ）ＨＢＴＵ、Ｎ，Ｎ’―ジイソプロピルエチルアミン、アミン官能性を有する固相担体
【００６３】
提唱されたスキーム１では、ジチオラン官能基が付着される末端での、ウリジンＣ―５スペーサ部分の合成の概略を示す。Ｃ―５での固体鎖の他の修飾が想定される（例えばＣ―５の更なる伸びおよび、最終的にはジチオラン官能基を付着するために、例えばアルキルカルボキシ官能基の導入）。２’−デオキシヌクレオシドの他に、２’−修飾ヌクレオシドも想定される（例えば２’―Ｆ、２’―Ｏメチル、２’―Ｏアルキル、２’−Ｏ―アミノ（保護））。さらに良好で多様な検出の応用のために、さまざまな発色団を、このヌクレオシドならびにチオオリゴヌクレオチド鎖に付着することができる。ホスホラミダイトおよび琥珀酸エステルが想定される。後の官能基は、さまざまな固相担体に化合物（９）を付着するために利用することができる。
【００６４】
スキーム２：Ｃ５―ジチオラン官能化シチジンアミダイトおよび担体のための合成スキーム
0006463750.tif 000030
【００６５】
試薬および条件：
（ａ）対応するジアミン、ＭｅＯＨ
（ｂ）チオクト酸、ＥＤＣ．ＨＣｌ、Ｎ，Ｎ’―ジメチルホルムアミド、ｒｔ（室温）
（ｃ）２―シアノエチルＮ，Ｎ’―（ジイソプロピル）ホスホルアミドクロリダイト、Ｎ，Ｎ’―ジイソプロピルエチルアミン、無水ＴＨＦ
（ｄ）無水コハク酸、４―ジメチルアミノピリジン、無水ピリジン
（ｅ）ＨＢＴＵ、Ｎ，Ｎ’―ジイソプロピルエチルアミン、アミン官能性を有する固相担体
【００６６】
提唱されたスキーム２では、ジチオラン官能基が付着される末端の、シチジンＣ―５スペーサ部分の合成の概略を示す。Ｃ―５の固体鎖の他の修飾が想定される（例えばＣ―５の更なる伸びおよび、最終的にはジチオラン官能基を付着するために、例えばアルキルカルボキシ官能基の導入）。２’−デオキシヌクレオシドの他に、２’−修飾ヌクレオシドも想定される（例えば２’―Ｆ、２’―Ｏメチル、２’―Ｏアルキル、２’−Ｏ―アミノ（保護））。さらに良好で多様な検出の応用のために、さまざまな発色団を、このヌクレオシドならびにオリゴヌクレオチド鎖に付着することができる。ホスホラミダイトおよび琥珀酸エステルが想定される。後の官能基は、さまざまな固相担体に化合物（１５）を付着するために利用することができる。
【００６７】
スキーム３：Ｃ８―ジチオラン官能化アデノシンアミダイトおよび担体のための合成スキーム
0006463750.tif 000031
【００６８】
試薬および条件：
（ａ）対応するジアミン、ＭｅＯＨ
（ｂ）チオクト酸、ＥＤＣ．ＨＣｌ、Ｎ，Ｎ’―ジメチルホルムアミド、ｒｔ（室温）
（ｃ）２―シアノエチルＮ，Ｎ’―（ジイソプロピル）ホスホルアミドクロリダイト、Ｎ，Ｎ’―ジイソプロピルエチルアミン、無水ＴＨＦ
（ｄ）無水コハク酸、４―ジメチルアミノピリジン、無水ピリジン
（ｅ）ＨＢＴＵ、Ｎ，Ｎ’―ジイソプロピルエチルアミン、アミン官能性を有する固相担体
【００６９】
提唱されたスキーム３では、ジチオラン官能基が付着される末端の、デオキシアデノシンＣ―８スペーサ部分の合成の概略を示す。Ｃ―８での固体鎖の他の修飾が想定される（例えば、Ｃ―８の更なる伸びおよび、最終的にジチオラン官能基を付着するために、Ｃ―８―Ｏ―アルキル官能基の導入）。２’−デオキシヌクレオシドの他に、２’−修飾ヌクレオシドも想定される（例えば２’―Ｆ、２’―Ｏメチル、２’―Ｏアルキル、２’−Ｏ―アミノ（保護））。さらに良好で多様な検出の応用のために、さまざまな発色団を、このヌクレオシドならびにオリゴヌクレオチド鎖に付着することができる。ホスホラミダイトおよび琥珀酸エステルが想定される。後の官能基は、さまざまな固相担体に化合物（２１）を付着するために利用することができる。
【００７０】
スキーム４：Ｃ８―ジチオラン官能化グアノシンアミダイトおよび担体のための合成スキーム
0006463750.tif 000032
【００７１】
試薬および条件：
（ａ）対応するジアミン、ＭｅＯＨ
（ｂ）チオクト酸、ＥＤＣ．ＨＣｌ、Ｎ，Ｎ’―ジメチルホルムアミド、ｒｔ（室温）
（ｃ）２―シアノエチルＮ，Ｎ’―（ジイソプロピル）ホスホルアミドクロリダイト、Ｎ，Ｎ’―ジイソプロピルエチルアミン、無水ＴＨＦ
（ｄ）無水コハク酸、４―ジメチルアミノピリジン、無水ピリジン
（ｅ）ＨＢＴＵ、Ｎ，Ｎ’―ジイソプロピルエチルアミン、アミン官能性を有する固相担体
【００７２】
提唱されたスキーム４では、ジチオラン官能基が付着される末端で、グアノシンＣ―８スペーサ部分の合成の概略を示す。Ｃ―８の固体鎖の他の修飾が想定される（例えば、Ｃ―８の更なる伸びおよび、最終的にジチオラン官能基を付着させるために、８―Ｏ―アルキル官能基の導入）。２’−デオキシヌクレオシドの他に、２’−修飾ヌクレオシドも想定される（例えば２’―Ｆ、２’―Ｏメチル、２’―Ｏアルキル、２’−Ｏ―アミノ（保護））。更に良好で多様な検出の応用のために、さまざまな発色団を、オリゴヌクレオチド鎖にと同様にこのヌクレオシドに付着することができる。ホスホラミダイトおよび琥珀酸エステルが想定される。後の官能基は、さまざまな固相担体に化合物（２７）を付着するために利用されることができる。提唱されたスキーム４において、Ｏ６は保護基に保護されており、グアノシンの遊離Ｏ６カルボニル官能基を生じさせるために、穏和な条件で取り除くことができる。
【００７３】
スキーム５：２’―Ｏジチオラン官能化ウリジンアミダイトおよび担体のための合成スキーム
0006463750.tif 000033
【００７４】
試薬および条件：
（ａ）、（ｂ）チオクト酸、ＥＤＣ．ＨＣｌ、Ｎ，Ｎ’―ジメチルホルムアミド、ｒｔ（室温）
（ｃ）２―シアノエチルＮ，Ｎ’―（ジイソプロピル）ホスホルアミドクロリダイト、Ｎ，Ｎ’―ジイソプロピルエチルアミン、無水ＴＨＦ
（ｄ）無水コハク酸、４―ジメチルアミノピリジン、無水ピリジン
（ｅ）ＨＢＴＵ、Ｎ，Ｎ’―ジイソプロピルエチルアミン、アミン官能性を有する固相担体
【００７５】
提唱されたスキーム５では、ジチオラン官能基が付着される末端で、ウリジン２’―Ｏ―アルキルスペーサ部分の合成の概略を示す。２’−Ｏ−の固体鎖の他の修飾が想定される（例えばＯ―２’−の更なる伸びおよび最終的にジチオラン官能基を付着するために、アルキルカルボキシ官能基の導入）。オリゴヌクレオチド鎖を合成するために、さまざまな発色団を、更に良好で多様な検出の応用のためにこのヌクレオシドに付着することができる。ホスホラミダイトおよび琥珀酸エステルが想定される。後の官能基は、さまざまな固相担体に化合物（３３）を付着するために利用することができる。
【００７６】
スキーム６：２’―Ｏジチオラン官能化シチジンアミダイトおよび担体のための合成スキーム
0006463750.tif 000034
【００７７】
試薬および条件：
（ａ）、（ｂ）チオクト酸、ＥＤＣ．ＨＣｌ、Ｎ，Ｎ’―ジメチルホルムアミド、ｒｔ（室温）
（ｃ）２―シアノエチルＮ，Ｎ’―（ジイソプロピル）ホスホルアミドクロリダイト、Ｎ，Ｎ’―ジイソプロピルエチルアミン、無水ＴＨＦ
（ｄ）無水コハク酸、４―ジメチルアミノピリジン、無水ピリジン
（ｅ）ＨＢＴＵ、Ｎ，Ｎ’―ジイソプロピルエチルアミン、アミン官能性を有する固相担体
【００７８】
提唱されたスキーム６では、ジチオラン官能基が付着される末端の、シチジン２’―Ｏ―アルキルスペーサ部分の合成の概略を示す。２’−Ｏ−の側鎖の他の修飾が想定される（例えば、Ｏ―２’−の更なる伸びおよび、最終的にジチオラン官能基を付着するための、２’−Ｏ−アルキルカルボキシ官能基の導入）。更に良好で多様な検出の応用のために、さまざまな発色団を、オリゴヌクレオチド鎖を合成するために、このヌクレオシドに付着することができる。ホスホラミダイトおよび琥珀酸エステルが想定される。後の官能基は、さまざまな固相担体に化合物（３９）を付着するために利用することができる。
【００７９】
スキーム７：２’―Ｏジチオラン官能化アデノシンアミダイトおよび担体のための合成スキーム
0006463750.tif 000035
【００８０】
試薬および条件：
（ａ）、（ｂ）チオクト酸、ＥＤＣ．ＨＣｌ、Ｎ，Ｎ’―ジメチルホルムアミド、ｒｔ（室温）
（ｃ）２―シアノエチルＮ，Ｎ’―（ジイソプロピル）ホスホルアミドクロリダイト、Ｎ，Ｎ’―ジイソプロピルエチルアミン、無水ＴＨＦ
（ｄ）無水コハク酸、４―ジメチルアミノピリジン、無水ピリジン
（ｅ）ＨＢＴＵ、Ｎ，Ｎ’―ジイソプロピルエチルアミン、アミン官能性を有する固相担体
【００８１】
提唱されたスキーム７では、ジチオラン官能基が付着される末端の、アデノシン２’―Ｏ―アルキルスペーサ部分の合成の概略を示す。２’−Ｏ−の側鎖の他の修飾が想定される（例えば、Ｏ―２’−の更なる伸びおよび、最終的にジチオラン官能基を付着するための、２’−Ｏ−アルキルカルボキシ官能基の導入）。更に良好で多様な検出の応用のために、さまざまな発色団を、オリゴヌクレオチド鎖を合成するためにこのヌクレオシドに付着することができる。ホスホラミダイトおよび琥珀酸エステルが想定される。後の官能基は、さまざまな固相担体に化合物（４５）を付着するために利用されることができる。
【００８２】
スキーム８：２’―Ｏジチオラン官能化グアノシンアミダイトおよび担体のための合成スキーム
0006463750.tif 000036
【００８３】
試薬および条件：
（ａ）、（ｂ）チオクト酸、ＥＤＣ．ＨＣｌ、Ｎ，Ｎ’―ジメチルホルムアミド、ｒｔ（室温）
（ｃ）２―シアノエチルＮ，Ｎ’―（ジイソプロピル）ホスホルアミドクロリダイト、Ｎ，Ｎ’―ジイソプロピルエチルアミン、無水ＴＨＦ
（ｄ）無水コハク酸、４―ジメチルアミノピリジン、無水ピリジン
（ｅ）ＨＢＴＵ、Ｎ，Ｎ’―ジイソプロピルエチルアミン、アミン官能性を有する固相担体
【００８４】
提唱されたスキーム８では、ジチオラン官能基が付着される末端の、グアノシン２’―Ｏ―アルキルスペーサ部分の合成の概略を示す。２’−Ｏ−の側鎖の他の修飾は、想定される（例えば、Ｏ―２’−の更なる伸びおよび、最終的にジチオラン官能基を付着するための、２’−Ｏ−アルキルカルボキシ官能基の導入）。更に良好で多様な検出の応用ために、さまざまな発色団を、オリゴヌクレオチド鎖を合成するためにこのヌクレオシドに付着することができる。ホスホラミダイトおよび琥珀酸エステルは想定される。後の官能基は、さまざまな固相担体に化合物（５１）を付着するために利用されることができる。
【００８５】
提唱されたスキーム８において、Ｏ６は保護基によって保護される。そして、グアノシンの遊離Ｏ６カルボニル機能を生じさせるために、穏和な条件で取り除くことができる。
【００８６】
スキーム９：Ｎ２−グアノシン官能化ジチオランホスホラミダイトおよび対応するオリゴヌクレオチドの合成
0006463750.tif 000037
【００８７】
試薬および条件：
（ａ）ＭｅＯＨの1,12―ジアミノドデカン、４０℃、１８ｈ、７９％
（ｂ）チオクト酸、ＥＤＣ．ＨＣｌ、Ｎ，Ｎ’―ジメチルホルムアミド、ｒｔ（室温）、６７％
（ｃ）２―シアノエチルＮ，Ｎ’−（ジイソプロピル）ホスホルアミドクロリダイト、Ｎ，Ｎ’―ジイソプロピルエチルアミン、無水ＴＨＦ、０℃〜ｒｔ（室温）、６６％
（ｄ）オリゴヌクレオチド合成
【００８８】
スキーム１０：Ｎ２―グアノシン官能化ジチオラン固相担体の合成およびオリゴヌクレオチドの続く合成
0006463750.tif 000038
【００８９】
試薬および条件：
（ａ）無水コハク酸、４―ジメチルアミノピリジン、無水ピリジン
（ｂ）ＨＢＴＵ、Ｎ，Ｎ’―ジイソプロピルエチルアミン、ＣＰＧ―長鎖アルキルアミンスペーサ
【００９０】
オリゴヌクレオチド（例えば５６および５８）は、合成され、配列中に対象の異なるヌクレオシドを有することできる。Ｂは、天然または修飾ヌクレオシド、プリンまたはピリミジン修飾であることができ、例えば、５−フルオロ−Ｕ、５−フルオロｄＵ、５−フルオロ−ｄＣ、５―フルロ―ｒＣ、プソイドウリジン、５−メチル−ｄＵ、５―メチル―ｒＵ、５―メチル―ｄＣ、５―メチル―ｒＣ、５−ブロモ−ｄＵ、５―ブロモ―ｒＵ、５―ブロモ―ｄＣ、５―ブロモ―ｒＣ、５−ヨード−ｄＵ、５―ヨード―ｒＵ、５−ビニル−ｄＵ、５―ビニル―ｒＵ、５―ビニルチミジン、Ｎ―３メチルデオキシウリジン、Ｎ―３メチルリボウリジン、Ｎ―３メチルチミジン、４−チオウリジン、４−チオ−２’−デオキシウリジン、２,６―ジアミノプリンデオキシリボシド、Ｎ―３メチルリボチミジン、２、６―ジアミノプリンリボシド、８―ブロモ２’−デオキシアデノシン、８―ブロモ―ｒ―アデノシン、８−オキソデオキシアデノシン、８−オキソリボアデノシン、８−オキソ２’−デオキシ−アデノシン、８−オキソリボアデノシン、８―オキソ―デオキシイノシン、８−オキソリボイノシン、８―ブロモ―デオキシイノシン、８―ブロモ―リボ―イノシン、Ｎ―１メチルリボアデノシン、Ｎ―１メチル２’−デオキシアデノシン、Ｎ―１メチル２’―デオキシイノシン、Ｎ―１メチルリボアデノシン、Ｎ―１メチルデオキシグアノシン、Ｎ−１−メチル−リボグアノシン、エテノアデノシン、エテノ２’−デオキシアデノシン、プリン２’−デオキシリボシド、プリンヌクレオシド、２―アミノプリン―２’―デオキシリボシド、２―アミノプリン―リボヌクレオシドだが、これに限定されない。
【００９１】
この方法によって合成されるＤＮＡの内部位置の標識は、発色団によって達成可能であり、例えば、フルオレセイン―Ｃ―５ｄＴ、ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）−Ｃ−５チミジン、内部カルボキシル基５―ｄＵ―メチルアクリレート、ビオチンｄＴ（ｄＵのＣ―５にスペーサを介して付着されるビオチン）、アミノ−ｄＴ（Ｃ―５  ｄＵにＣ―６スペーサを介して付着される末端アミノ）だが、これに限定されない。
【００９２】
修飾ヌクレオシドの糖修飾は、本発明の方法により合成されるＲＮＡまたはＤＮＡ塩基配列の一つ以上の位置において、２’−デオキシ―２’―フルオロリボヌクレオシド（２’―Ｆ−ＡＮＡ）（例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）、イノシン、および２’−フルオロを含む修飾ヌクレオシドから成ることができる。
【００９３】
修飾ヌクレオシドの糖修飾は、この方法により合成されるＲＮＡまたはＤＮＡ塩基配列の一つ以上の位置において、２’−デオキシ―２’―メトキシリボヌクレオシド（２’―ＯＭｅ−）（例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）、イノシン、および２’−メトキシを含む修飾ヌクレオシドから成ることができる。
【００９４】
修飾ヌクレオシドの糖修飾は、この方法により合成されるＲＮＡまたはＤＮＡ塩基配列の一つ以上の位置において、２’−デオキシ―２’―アミノリボヌクレオシド（２’―ＮＨ２）（例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）、イノシン、および２’−アミノを含む修飾ヌクレオシドから成ることができる。
【００９５】
修飾ヌクレオシドの糖修飾は、この方法により合成されるＲＮＡまたはＤＮＡ塩基配列の一つ以上の位置において、ヌクレオシド（例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）、イノシン、および２’−末端アミノを含む修飾ヌクレオシドの、２―１０の原子からスペーサを介して付着される、２’−デオキシ―２’―末端アミノリボヌクレオシド（２’―末端ＮＨ２）から成ることができる。
【００９６】
修飾ヌクレオシドの糖修飾は、この方法により合成されるＲＮＡまたはＤＮＡ塩基配列の一つ以上の位置において、２’−デオキシ―２’―メトキシエトキシリボヌクレオシド（２’―ＭＯＥ）（例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）、イノシンおよび２’−ＭＯＥを含む修飾ヌクレオシドから成ることができる。
【００９７】
修飾ヌクレオシドの糖修飾は、この方法により合成されるＲＮＡまたはＤＮＡ塩基配列の一つ以上の位置において、他の２’−Ｏ―アルキル基（例えば２’−デオキシ−２’−エトキシ）、プロパルギル、ブチンリボヌクレオシド（２’―ＯＥｔ、Ｏ―プロパルギル、２’―Ｏ―ブチン）（例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）、イノシン、および、２’−２’―ＯＥｔ、Ｏ―プロパルギル、２’―Ｏ―ブチンを含む修飾ヌクレオシドから成ることができる。
【００９８】
実験例１
２―（１２―アミノドデカニル）―２’―デオキシ―５’―Ｏ―（４、４’―ジメトキシトリチル）―Ｏ６―（２―トリメチルシリルエチル）―グアノシン（５４）
【００９９】
２―フルオロ―２’―デオキシグアノシンヌクレオシド（５ｇ、７．９ｍｍｏｌ）は、ＭｅＯＨ（７９ｍｍｏｌ、１０：９０、ｖ／ｖ）の新たに用意された１，１２−ジアミノドデカンで溶解した。反応混合物を１８時間４０℃で撹拌した後、それは、白い固形物として化合物５４（５ｇｒ、７９％）を産出するために、ＣＨＣｌ３：トリエチルアミン：ＭｅＯＨ（９５：５：０〜９１：５：４、ｖ／ｖ／ｖ）を使用して、シリカゲルカラムクロマトグラフィによって、蒸発乾固および精製された。
Ｒｆ＝０．５（クロロホルム：メタノール：ＴＥＡ；９０：０５：０５）
ＭＳｍ／ｚ（［Ｍ＋Ｈ］＋８５４．２、ｃａｌｃｄ  ８５３．１８）、ＭＳｍ／ｚ（Ｃ４８Ｈ６８Ｎ６Ｏ６Ｓｉ）［Ｍ―Ｈ］−８５２．４（ｃａｌｃｄ  ８５３．１８））；
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，ｄ６）７．９１（ｓ、１  Ｈ）、７．３２―７０３１（ｄ、２Ｈ）、７．２２―７．１５（ｍ、７Ｈ）、６．８０―６．７４（ｍ、５Ｈ）、６．２５―６．２２（ｔ、１Ｈ）、４．５１（ｓ、２Ｈ）、４．４２（ｓ、１Ｈ）、３．９４―３．９１（ｑ、１Ｈ）、３．７１―３．７０（ｄ、６Ｈ）、３．２８―２．８３（ｍ、１３Ｈ）、２．４２―２．３９（ｑ、１Ｈ）、２．２９―２．２６（ｑ、１Ｈ）,1.４６（ｓ、２Ｈ）、１．３１―０．９１（ｍ、２３Ｈ）、
１１．２５７ｍｉｎでＨＰＬＣ分析シングルピーク（６５〜９８％のアセトニトリル（０．１Ｍ  ＴＥＡＡ緩衝液））、そして、純度は９８．５４％である。
【０１００】
実施例２
２’―デオキシ―５’―Ｏ―（４、４’―ジメトキシトリチル）―２―（１２―（５―（１、２―ジチオラン―３―イル）バレルアミド）―ドデシル）―Ｏ６―（２―トリメチルシリルエチル）―グアノシン（５５）
【０１０１】
化合物５４（２．５ｇ、２．９３ｍｍｏｌ）は無水Ｎ，Ｎ’―ジメチルホルムアミド（２５ｍｌ）で溶解した。そして、ＥＤＣ．ＨＣＬ（３．１ｇ、１６．１１ｍｍｏｌ）がこれに加えられた。反応混合物を３０分間撹拌した後、チオクト酸（３．０ｇ、１４．６５ｍｍｏｌ）を室温で加えた。反応混合物を１６時間室温で撹拌した後に、それは、白い固形物として化合物５５（２．４ｇ、６７％）を産出するために、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（ＣＨＣｌ３：ヘキサン：アセトン：トリエチルアミン：ＭｅＯＨ、４７：３０：２０：１：２、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）によって蒸発乾固および精製された。
Ｒｆ＝０．６（ＣＨＣｌ３：ヘキサン：アセトン：トリエチルアミン：ＭｅＯＨ（４７：３０：２０：１：２、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）；
ＭＳｍ／ｚ  Ｃ５６Ｈ８０Ｎ６Ｏ７Ｓ２Ｓｉ  （［Ｍ＋Ｈ］＋１０４２．２、ｃａｌｃｄ  １０４１．１８）  ［Ｍ―Ｈ］−１０４０．３（ｃａｌｃｄ  １０４１．１８））；
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ―ｄ６／Ｄ２Ｏ）８．２３（ｓ、１Ｈ）、７．９２（ｓ、１Ｈ）、７．９２（ｓ、１Ｈ）、７．７３―７．７５（ｔ、１Ｈ）、７．２８―７．２９（ｔ、２Ｈ）、７．１３―７．１９（ｍ、７Ｈ）、６．７１―６．７７（ｄｄ、４Ｈ）、６．２１―６．２３（ｔ、１Ｈ）,４．４３―４．４９（ｑ、３Ｈ）、３．９２―３．９３（ｄ、１Ｈ）、３．６８―３．６９（ｄ、６Ｈ）、３．５２―３．５６（ｑ、８Ｈ）、２．９６―３．１６（ｍ、８Ｈ）、２．８７（ｓ、１２Ｈ）、２．７１（ｓ、１１Ｈ）、２．２６―２．３６（ｍ、１Ｈ）、２．０１―２．０６（ｍ  １Ｈ）、２．０１―２．０４（ｔ、２Ｈ）、１．１８―１．８２（ｍ  １Ｈ）、１．４６―１．４８（ｍ、５Ｈ）、１．１０―１．４８（ｍ  ２３Ｈ）
６．５２７ｍｉｎでＨＰＬＣ分析シングルピーク（０〜５０％のアセトニトリル（０．１Ｍ  ＴＥＡＡ緩衝液））、そして、純度は、９７．２１％である。
【０１０２】
実施例３
３’−（２―シアノエチルジイソプロピルホスホロアミジト）―２’―デオキシ―５’―Ｏ―（４、４’―ジメトキシトリチル）―２―（１２―（５―（１、２―ジチオラン―３―イル）バレルアミド）―ドデシル）―Ｏ６―（２―トリメチルシリルエチル）―グアノシン（１）
【０１０３】
ＤＭＴ―ジチオラン連結（共役）ヌクレオシド５５（２．４ｇ、２．３ｍｍｏｌ）を、無水ＣＨ３ＣＮ（１×２５ｍＬ）で共蒸着により乾燥し、高真空ポンプで一夜乾燥させ、それから無水ＴＨＦ（２５ｍＬ）で溶解した。これを、Ｎ、Ｎ’―ジイソプロピルエチルアミン（１．２ｍＬ、６．９ｍｍｏｌ）に加え、そして、氷で冷やした水で冷却した。アルゴンを２５分間泡立たせた後に、２―シアノエチルＮ，Ｎ’―（ジイソプロピル）ホスホルアミドクロリダイト（０．５６５ｍＬ、２．５３ｍｍｏｌ）が、完全なアルゴン雰囲気下で加えられ、そして、反応混合物は氷で冷やした水で１時間撹拌され、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈された。有機相は、飽和水性ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）および飽和水性ＮａＣｌ（１００ｍｌ）で洗浄された。コンバイン水相はＥｔＯＡｃ（２５０ｍＬ）で逆抽出された。複合有機相は、蒸発乾固され、そして、無色油として目的アミダイト１（１．５ｇ、６６％）を産出するために、結果の残渣は、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（２９：７０：０１  Ｈｅａｎｅ：ＥｔＯＡｃ：トリエチルアミン、ｖ／ｖ／ｖ）により精製された。
Ｒｆ＝０．５（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン：トリエチルアミン（７０：２９）：０１（ｖ／ｖ／ｖ））
ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ６５Ｈ９７Ｎ８Ｏ８ＰＳ２Ｓｉ（［Ｍ＋Ｈ］＋１２４２．３、ｃａｌｃｄ  １２４１．５８）
３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）１４９．５２７および１４９．１９６ｐｐｍ
１４．９２４および１６．２７１ｍｉｎでＨＰＬＣ分析ダブルピーク（０〜３０％のアセトニトリル（０．１Ｍ  ＴＥＡＡ緩衝液））、そして、純度は、９９．３３％である。
【図１】
0006463750.tif 000051
【図２】
0006463750.tif 000052
【図３】
0006463750.tif 000053
【図４】
0006463750.tif 000054
【図５】
0006463750.tif 000055
【図６】
0006463750.tif 000056
【図７】
0006463750.tif 000057
【図８】
0006463750.tif 000058
【図９】
0006463750.tif 000059
【図１０】
0006463750.tif 000060
【図１１】
0006463750.tif 000061
【図１２】
0006463750.tif 000062
【図１３】
0006463750.tif 000063