(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
MMP-9タンパク質の酵素活性を阻害することができるG四重鎖構造化アプタマーであって、配列番号12、32、33、35〜38、40、46、及び48の配列から成る群から選択される少なくとも1個のヌクレオチド配列を含む、アプタマー。
【請求項２】
MMP-9タンパク質の酵素活性を阻害するために十分な量で請求項１に記載のアプタマーを活性剤として含み、1種以上の化粧料的又は医薬的に許容される賦形剤を含む、化粧料組成物又は医薬組成物。
【請求項３】
組成物の0.000001質量%〜10質量%、好ましくは0.000002質量%〜5質量%、より好ましくは0.000005質量%〜1質量%の1つ以上の請求項１に記載のアプタマーを含むことを特徴とする、請求項２に記載の化粧料組成物又は医薬組成物。
【請求項４】
顕在性であるか否かに関わらず、内因性の及び/若しくは外因性の肌の老化の兆候の出現を処置する若しくは防止するための、又はその影響を遅延させる若しくは軽減させるための、好ましくは肌のリモデリングを制御するための、肌を再構築させるための、肌の調子を高めるための、並びに/又はしわを予防する若しくはしわを滑らかにすること若しくは吸収させることを促進するための、請求項１に記載のアプタマーの美容的使用。
【請求項５】
医薬品としての、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項６】
MMP-9の過剰発現及び/又は機能亢進に関連する病態の治療及び/又は予防に用いるための、請求項１又は５に記載のアプタマー。
【請求項７】
前記病態が、乾癬等の皮膚の炎症疾患、基底細胞癌等の皮膚腫瘍、慢性的な傷などの皮膚病変、瘢痕性病態、水疱性類天疱瘡等の水疱性皮膚疾患、皮膚のサルコイドーシス等の非感染性肉芽腫疾患、環状肉芽腫及び類壊死脂肪性浮腫、並びに紫外線に関する皮膚損傷から好ましくは選択される皮膚疾患であることを特徴とする、請求項６に記載のアプタマー。
【請求項８】
前記病態が、腫瘍病態、喘息、肺気腫、珪肺、気管支拡張症、アナフィラキシー様紫斑病、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、慢性関節リウマチ、歯周炎、炎症性腸疾患、ループス腎炎、シェーグレン症候群、巨細胞性動脈炎、動脈瘤、末梢神経損傷、アルツハイマー病、ギラン・バレー症候群、嚢胞性線維症、及び髄膜炎から成る群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載のアプタマー。
【請求項９】
・オリゴヌクレオチドライブラリー中でSELEX法を用いてMMP-9タンパク質の触媒部位に対するアプタマーを選抜する工程、
・前工程において同定したアプタマーについてMMP-9タンパク質の酵素活性を阻害するポテンシャルを評価する工程、
・そうして選抜したアプタマーをクローニング及びシーケンシングする工程
を含む、請求項１に記載のアプタマーを選抜する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の高度に特異的なマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、及び、特に表皮の及び/又は真皮の及び/又は皮下の細胞外マトリックスの分解を阻害することにより、外因性及び/若しくは内因性の肌の老化、並びに/又は脂肪組織の発達に対処するための活性剤としての、化粧料組成物又は医薬組成物におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
紫外線、日光、熱ストレス、酸化ストレス、及び水分ストレス；並びに生体異物性物質等の外部からの攻撃は、特にマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)の生産を誘導するサイトカインの放出を介した炎症反応を引き起こすことにより、肌のリモデリング及び肌の老化のプロセスに関与する因子である。
【０００３】
MMPは、細胞外マトリックスタンパク質の分解及び再構成に関連するプロテアーゼである。少なくとも11種類のヒトMMPが知られている。これらには、コラゲナーゼ(MMP-1、MMP-8、及びMMP-13)及びゼラチナーゼ(MMP-2及びMMP-9)が含まれる。MMPは、基質及び発現部位に関して異なる。
【０００４】
ゼラチナーゼMMP-2及びMMP-9は、肌の構造の維持に重要な役割を担う、コラーゲンIV、コラーゲンV、ラミニン、及びエラスチン等の基底膜成分を破壊することが知られている。これらのメタロプロテイナーゼの生産は、TGF-β等のサイトカインにより引き起こされるが、細胞外マトリックスの減少及び変性という、肌の物理的特徴の変化における重要な要因であると考えられている現象をもたらす(Inomataら、2003、120)。この損傷の蓄積は、しわの形成、肌のきめ(質感)の喪失、及び肌の弾力性の減少の主要な原因の一つである。
【０００５】
したがって、顕在性であるか否かに関わらず、肌の老化の兆候の出現を予防するために、及びその進行を軽減させるために、肌でのこれらのメタロプロテイナーゼの活性を制御することが重要である。
【０００６】
角化細胞(ケラチノサイト)は、UV及び他の外部炎症誘因に曝露される表皮を構成するものであるが、MMP-9を発現する。したがって、特異的MMP-9阻害剤を開発することが構想された。
【０００７】
MMP阻害剤は公知であるが、その利益及び肌への使用を制限する不利な点を有している。
【０００８】
EDTA及びo-フェナントロリン等の特定のキレート剤は、MMPの活性金属中心を阻害するが、低い特異性を有し、細胞毒性である。したがってそのような剤は、肌に直接適用することができない。
【０００９】
ペプチド等の他の低分子量の阻害剤が用いられてきた。しかし、化粧品へのそれらの使用により、肌に副作用が生じ得ることが示された(Bertinら、2005)。
【００１０】
また、レチノイン酸もMMP-9阻害剤として用いられてきた(Lateefら、2004)が、この化合物には多くの望ましくない作用がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Inomata Sら、J. Invest. Dermatol.、2003、120、128-134.
【非特許文献２】Bertinら、Journal of Medicinal Chemistry、2005、Vol. 48、No. 24.
【非特許文献３】Lateefら、American Journal of Pathology、Vol. 165、No. 1、July 2004.
【非特許文献４】Williamsonら、Cell、1989、59(5): 871-80.
【非特許文献５】Sundquist及びKlug、Nature、1989、342(6251): 825-9.
【非特許文献６】Tuckerら、Curr Pharm Des.、2012、18(14):2014-26.
【非特許文献７】Folguerasら、Int. J. Dev. Biol.、2004、48: 411 - 424.
【非特許文献８】Chaussain-Miller et al、J Dent Res.、2006、85、22-32.
【非特許文献９】Knightら、Biochem J.、1991 Feb 15;274 (Pt 1):45-8.
【非特許文献１０】Knightら、FEBS Lett.、1992 Jan 27;296(3):263-6.
【非特許文献１１】Williams及びBartel、Nucleic Acids Res. 1995; (20) 4220-21.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
これらの阻害剤の使用に続いて起こる不利な点に直面しているので、化粧品業界にとって、アンチエイジングの分野において用いることができ、組成物中に用いて肌へ適用する場合に、関係する標的に有効であって、かつまた望ましくない作用を制限するのに十分特異的である化粧剤を手元に置いておくことは特に有益である。
【００１３】
老化した肌等の弱った肌は特に敏感で前記組成物の適用に対し負に反応しやすいことが分かっているので、これは一層重要である。
【００１４】
本発明の目的は、肌の外観及び特性の老化関連変化、特に外部からの攻撃に関連するものを予防する又は軽減させるために肌のリモデリングを効果的に制御するため、上述した従来技術の問題及び不利な点を解決し、細胞外マトリックス成分の分解を制御するための特に有利なソリューションを提案することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、細胞外マトリックス成分の分解を制御し、それにより肌のリモデリングを制御するため及び/又は肌の老化の兆候の出現を予防する若しくはその進行を軽減させるために局所的に用いられる、メタロプロテイナーゼ9 (MMP-9)阻害剤を対象として有する。
【００１６】
驚くべきことに、本願発明者らは、MMP-9タンパク質に特異的に結合し前記タンパク質の全酵素活性を阻害することができるDNAアプタマーがこれら全ての基準を満たすことを観察した。特に、このアプタマーは、G四重鎖構造を有するので、皮膚細胞に浸透することができる。
【００１７】
MMP-9阻害アプタマーを選抜及び単離するために、本願発明者らは、ホスホトリエステルオリゴヌクレオチド配列(天然のDNAと同じ組成)のライブラリーを用いた。選抜は、特異的にメタロプロテイナーゼ9と相互作用し、細胞外マトリックスへのその酵素活性を阻害することができる配列を同定、単離、及びキャラクタライズするように方向付けられた方法で実行した。
【００１８】
その後、これらのアプタマーを、合成基質、細胞、及び皮膚モデルで、MMP-9の酵素活性を阻害する能力について試験した。
【００１９】
したがって、本発明の第一の対象は、MMP-9タンパク質の酵素活性を阻害することができるG四重鎖構造化アプタマーに関する。
【００２０】
本発明の第二の対象は、MMP-9タンパク質の酵素活性を阻害するための本発明のアプタマーの使用に関する。
【００２１】
本発明の第三の対象は、MMP-9タンパク質の酵素活性を阻害するのに十分な量の、活性剤としての本発明のアプタマー、及び1種以上の化粧料的又は医薬的に許容される賦形剤を含む、化粧料組成物又は医薬組成物に関する。
【００２２】
本発明の第四の対象は、本発明のアプタマーの美容的使用に関する。
【００２３】
本発明の第五の対象は、医薬品としての本発明のアプタマーに関する。
【００２４】
本発明の第六の対象は、MMP-9の過剰発現若しくは機能亢進に関連する病態の治療及び/又は皮膚細胞における使用のための本発明のアプタマーに関する。
【００２５】
本発明の第七の対象は、以下の
・オリゴヌクレオチドライブラリー中で、SELEX法を用いて、MMP-9タンパク質の触媒部位に対するアプタマーを選抜する工程、
・前工程において選抜したアプタマーについてMMP-9タンパク質の酵素活性を阻害するポテンシャルを評価する工程、
・そうして選抜したアプタマーをクローニング及びシーケンシングする工程
を含む、本発明のアプタマーの選抜方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図1は、MMP-9の触媒ドメインに対して選抜されたDNAアプタマーの配列を示す。最も代表的なアプタマー配列を、ボックスで囲んだヌクレオチドにより表されるランダム領域に含まれるコンセンサスモチーフに基づいて分類した。プライマーに対応する共通の領域(すなわち定常領域)は表していない。ラウンド8及び11で得た配列及び候補(すなわちアプタマー参照)の群を左側に示し、同一の群に属する配列の数を右側に示す。灰色で示したヌクレオチドは、Gカルテットに寄与している可能性が高い。
【図２】図2は、短縮型DNAアプタマーの配列を示す。配列の名称を左側に表示する。MMP-9タンパク質の触媒ドメインと相互作用するために必要な最小限の領域を規定するために、配列を短縮化した。
【図３】図3は、配列相同性解析 - Gカルテットを示す。Gカルテット形成に関与することができる配列11F46、8F27、8F14、8F11、及び8F21のGダブレット(G-doublet)を灰色で表示する。円偏光二色性法及びTm実験により、配列11F46、8F27、及び8F14がGカルテット構造化されていることが確認された。
【図４】図4は、MMP-9活性を示す。このグラフは、対照MMP-9(黒いバー)によって表された最大活性に関して、選抜された様々なアプタマーのMMP-9酵素活性阻害を表す。
【図５】図5は、MMP-9活性に対する用量依存的効果を示す。このグラフは、用いられた用量に従って同定された様々なアプタマーの、メタロプロテイナーゼMMP-9の酵素活性を阻害する能力を表す。用量は、横軸上に、アプタマーの名称の後に表示する。
【図６】図６は、このグラフは、用いられた用量に従って同定された様々なアプタマーの、メタロプロテイナーゼMMP-9の酵素活性を阻害する能力を表す。用量は、横軸上に、アプタマーの名称の後に表示する。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
したがって、本発明の第一の対象は、メタロプロテイナーゼMMP-9の酵素活性を阻害することができるG四重鎖構造化アプタマーに関する。
【００２８】
「アプタマー」とは、タンパク質に対する高い親和性を有するリガンド特異的なDNA又はRNA分子を意味する。結果的に、この意味は、「天然の」アプタマー及び化学修飾されたアナログを含む。
【００２９】
本発明による「G四重鎖(G-quadruplex)〜」、「Gカルテット(G-quartet)〜」、又は「Gテトラッド(G-tetrad)構造化された」とは、フーグスティーン(Hoogsteen)型結合を介して環状に配置された4個のグアニンを含む二次構造を意味する。この構造において、各グアニンは、N1、N7、O6、及びN2分子を介した4つの水素結合に関与している(Williamsonら、1989；Sundquist及びKlug、1989；Tuckerら、2012)。
【００３０】
MMP-9タンパク質に関する「酵素活性」とは、コラーゲンの変性形態であるゼラチン、アグリカン、エンタクチン、エラスチン、コラーゲンII、III、IV、V、XIV及びXVII、ミエリン、エンドスタチン、プラスミノーゲン、セリンプロテアーゼインヒビター、サブスタンスP、CBP30及びCBP35タンパク質、インターロイキン2(IL2)受容体アルファ、組織因子経路インヒビター(TFPI)、アミロイドベータペプチド、プロTNFアルファ又はプロTGFベータ、並びにCXCケモカイン等の、このタンパク質のマトリックス又は生物活性基質の分解をもたらす、タンパク質分解活性を意味する(Van den Steenら、2002；Folguerasら、2004；Chaussain-Millerら、2006)。本発明によるMMP-9タンパク質の酵素活性は、好ましくはゼラチナーゼ活性である。本発明との関連において、MMP-9タンパク質分解活性の測定は、実施例3において以下に記述する方法に従って確認することができる：MMPの酵素活性の測定は、共鳴エネルギー移動すなわちRET、又は蛍光共鳴エネルギー移動すなわちFRETの原理に基づく。基質は、蛍光基(F)すなわちエネルギードナー及び消光(クエンチング)基(Q)すなわちエネルギーアクセプターを含むオリゴペプチドから成る。加水分解後、消光基が放出され、それにより蛍光の増加を測定することが可能になる。多数の蛍光色素/クエンチャーの対がMMPの酵素活性を測定するために開発されており、7-メトキシクマリン-4-アセチル(Mca)/ジニトロフェニル-ジアミノプロピオニル(Dnp)が含まれる(Knightら、1991； Knightら、1992)。
【００３１】
アプタマーは、選抜と増幅の交互により選抜されるが、これにより集団の進化をダーウィン的様式に向かわせることが可能となる：集団中、最も「アプト(適切)」な分子が選抜されるので、故にこれが選抜によって生じる所望の特徴を有するヌクレオチドに与えられる「アプタマー」という名称の語源である。標準的な遺伝子工学的手法(クローニング、シーケンシング、発現)を用いてこれらのアプタマーを個別に同定し、これらをキャラクタライズし、それからこれらを大量に生産することができる。
【００３２】
アプタマー選抜は、国際出願WO 91/19813に特に記述される、指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化(SELEX)として公知の、最適化されたインビトロ選抜プロトコルを用いて行うことができる。
【００３３】
SELEXプロセスにより、非常に高い親和性及び特異性を有するリガンドを大量に作製することが可能となる。このアプローチは、潜在的リガンドのライブラリーへの標的分子の曝露に基づく。脱着/選抜サイクルの系により、標的分子と最も特異的に相互作用するリガンドの集団を濃縮することができる。その後、得られた最終的な集団を、単離及びキャラクタライズし、これによりその大規模な再合成ができる。
【００３４】
SELEXプロセスはアプタマーを選抜するための一般的な手法として確立されてきたが、それにも関わらず、いかなる標的についても予測的でなく、また標準化されていない。それどころか、SELEXプロセスは各々の特定の標的について最適化され適合されなければならない。SELEXプロセスは、あらゆる標的について保障されている訳ではない。
【００３５】
アプタマーを選抜する際には、複数の因子が重要である。例えば、標的分子は各SELEXサイクルにおいて安定かつ容易に再生可能でなくてはならない。なぜならば、SELEXプロセスには複数のサイクルの結合、選抜、及び増幅が関与するからである。加えて、標的への特異的結合を示す核酸が初期ライブラリーに存在していなければならない。したがって、高度に多様化した初期核酸ライブラリーを生産することが必要である。
【００３６】
これらの決定的な因子を考慮すれば、SELEXプロセスを用いたアプタマーの選抜は、予測的でも明白でもない。たとえ全ての因子がアプタマーの選抜に最適であっても、SELEXプロセスによって常に各標的についての実行可能なアプタマーを得ることができる訳ではない。
【００３７】
初期候補ライブラリーは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチド配列で構成され、各々が、3′末端及び5′末端にライブラリーの全候補について同一の定常領域が隣接している、n個のヌクレオチドの長い可変領域を含む。これらの定常領域により、SELEX中に、特にPCRによって、中央部分を操作することができる。可変部分の長さによりライブラリーの多様性が決定され、これは4nに等しい。各位置は4つのヌクレオチドA、T(又はU)、G、又はCの1つにより占められるからである。大型のウインドウについては、莫大な複雑性が生じる：n = 50の場合、理論的多様性は450 (1030)であるが、これは各配列が1度ずつ表されているライブラリーに対して105トン超に相当するので、実際には到達不可能な値である。実験的限界は、およそ1015個の異なる配列であり、これは25ヌクレオチドの可変領域を有する全ての候補が表されているライブラリーの多様性である。もし理論的多様性が約1018である30ヌクレオチドのウインドウを含むライブラリーを操作することを選択するならば、従ってたった1/1000の可能性しか探索されない。 
【００３８】
加えて、使用されるポリメラーゼは信頼性に欠け、10-4のオーダーの割合でエラーを導入するので、SELEXプロセス全体にわたって配列プールの多様性を有意に強化するのに貢献する：100ヌクレオチドの長さのランダム領域を有するライブラリーについて、100個中1個の候補が各増幅サイクル中に改変され、したがってライブラリー全体で1013個の新たな候補の出現がもたらされる。
【００３９】
各ラウンドにおける選抜は、標的と会合している分子の遊離分子からの物理的分離によって生じる。多数の手法を適用してもよい(クロマトグラフィー、フィルターリテンション、電気泳動等)。選抜条件を調節し(標的/候補の相対濃度、イオン濃度、温度、洗い流し等)、候補間で標的結合の競合が起こるようにする。一般的に、最も高い親和性を有する候補の獲得を促進するために、ラウンドが進行するにつれてストリンジェンシーが高められる。加えて、カウンターセレクションを行い、支持体(フィルター、ビーズ等)を認識する候補を除外する。
【００４０】
オリゴヌクレオチドは、オリゴアニオンであり、各単位が中性のpHでの電荷、水素結合供与体/受容体部位、及びスタッキング相互作用を生成することができる芳香族複素環(核塩基)を有する。塩基対の形成に続いて、これらのオリゴマーは折り畳まれて、ステムループ(又はヘアピン)構造、シュードノット構造、又はG四重鎖構造等の2次構造及び3次構造を生成する。したがって、初期配列ライブラリーは、3次元形状のライブラリーであり、各々が静電相互作用を引き起こしたり、H結合を作ったりすること等ができるユニットの分布に対応している。選抜は、ライブラリー中での、標的に適した形状、すなわち、最も多くの数の相互作用、及び最も安定なアプタマー-標的複合体の形成をすることができる形状の同定の問題になる。小型の標的(染料、抗体等)に関しては、同定されるアプタマーは、マイクロモルの範囲での平衡解離定数によってキャラクタライズされ、一方タンパク質の標的に関しては、10-9 M未満のKd値が珍しくない。
【００４１】
アプタマーの最も顕著な特性は、そのリガンドと関わり合う相互作用の特異性であり、このため標的認識に理想的な物質である。
【００４２】
したがって、好ましくは、本発明のアプタマーはMMP-9タンパク質に特異的に結合する。「特異的結合」とは、アプタマーの標的との特異的であり、異なる配列を有する異質な標的とのあらゆる相互作用を排除する。
【００４３】
より好ましくは、前記アプタマーは、高い親和性で前記MMP-9タンパク質に結合する。「高親和性での特異的結合」とは、本発明の意味において、標的酵素の触媒活性を有意に阻害するために十分に低い解離定数(Kd)を伴う、アプタマーのその標的との特異的相互作用を意味する。
【００４４】
本発明との関連において、MMP-9タンパク質から単離された触媒部位を用いて本発明のアプタマーを作製した。当業者であれば、当該分野において十分確立された分子生物学的手法を用いて前記触媒部位を単離し発現させることができる。好ましくは、ヒトMMP-9タンパク質のペプチド断片Phe88-Pro438は、この酵素の触媒部位を含んでいるが、これを用いて本発明のアプタマーを作製した(UniProtKB/Swiss-ProtデータベースによるヒトMMP-9タンパク質のアクセッション番号：P14780)。
【００４５】
アプタマーは、オリゴデオキシヌクレオチド(DNA)又はオリゴリボヌクレオチド(RNA)であり得る。後者の場合、第一のSELEX工程は、候補の5′定常領域のプロモーター配列を介した初期DNAライブラリーの転写であり得る。選抜後、候補を逆転写によりDNAに変換しその後増幅する。同等の特徴を有するRNAアプタマー及びDNAアプタマーを同一の標的に対して選抜した。加えて、どちらの化合物も互いの競合的阻害剤であり、相互作用部位が重複していることが示唆される。これが、化学修飾されたアプタマーの製造の主要な結果である。
【００４６】
アンチセンスアプローチの開発により、多数のアナログの合成がもたらされ、これらには、例えば、ヌクレアーゼに耐性があるオリゴマーを与えるものが含まれるが、これは生物学的環境(細胞培養培地又はインビボ)において有用な特性である。ホスホジエステル結合の修飾、2′-O-メチル等の糖骨格若しくは糖-リン酸骨格の修飾、「ロックド」核酸の修飾、又はボラノリン酸誘導体の修飾により、ヌクレアーゼ耐性のオリゴマーがもたらされる。この特性は、アプタマーにとって有利である可能性がある。しかし、上述のとおり、RNA又はDNAの形態で選抜されたアプタマーの化学構造のその後の完全な変化により、一般的に、目的として選抜された特性が低下するか又は失われる。これは、特定の位置に修飾を導入することが可能でないということを意味しない。しかし、修飾が忍容される位置を同定することが賢明である。これは、特定のバリアントを試験することにより、又はフットプリンティングの一種であるいわゆる化学的干渉(chemical interference)という体系的なアプローチにより、行うことができる。
【００４７】
好ましくは、本発明のアプタマーは、DNAアプタマーである。
【００４８】
本発明との関連において、非天然のオリゴヌクレオチドの選抜を直接行うことが好ましい。これは、修飾ヌクレオシド三リン酸が効率的に組み込まれ、修飾されたマトリックスがSELEXで用いられるポリメラーゼによって正確に読み取られることを前提としている。非常に少数のアナログが要求を満たす。ヌクレアーゼへの耐性を付与する誘導体については、可能性は、ホスホロチオエート、ボラノホスフェート、又は2'-メチルピリミジン、2'-アミノピリミジン、若しくは2'-フルオロピリミジンのアナログに限定され、後者が圧倒的に最も一般的に用いられる。この場合に同定されるアプタマーは、修飾ピリミジンヌクレオシド及び未修飾プリン残基(2′-ヒドロキシル)を有する。これらの分子は、ヌクレアーゼに対するより高い耐性を有する。必要であれば、上述のとおり、修飾プリン残基を後に導入することができる。さらに、ピリミジンのC(5)位置に、又はプリンのN(7)、C(8)位置に置換基を含むオリゴヌクレオチドを選択することができる。これはヌクレアーゼへの感受性に対し何の影響も有さないが、これにより新たな機能性(疎水性、光反応性等)を加えることが可能となる。非常に異なったアプローチは、光学異性体の使用に関する。天然の核酸は、D異性体である。L-アナログは、ヌクレアーゼに耐性があるが、ポリメラーゼにより製造することができない。光学異性の法則によれば、L系のアプタマーはその標的(T)と共に、D系の異性体と標的(T)のエナンチオマー(T′)とにより形成される複合体と同様の性質を有する複合体を形成する。結果的に、化合物T′を化学的に合成することができるならば、それを天然のアプタマー(D)の選抜を行うために用いることができる。ひとたび同定されれば、このアプタマーはL系で化学的に合成される。このL-アプタマーは天然の標的(T)のリガンドである。
【００４９】
別のアプローチは、近年2次元SELEXとして記述されるが、インビトロオリゴヌクレオチド選抜と動的コンビナトリアル化学(DCC)とを同時に適用する、すなわち、特定のオリゴヌクレオチドの基(アミン基)とアルデヒド化合物のライブラリーとの間の可逆反応である。反応によりイミンオリゴヌクレオチドを生成し、これを従来のSELEXと同様の原理により選抜する。このようにして、天然のアプタマーと異なる標的ヘアピンRNA修飾アプタマーを同定することができた。
【００５０】
構造を変えることがあり、またアプタマー-標的相互作用特性の喪失を回避するために導入前に事前注意を必要とする骨格修飾と異なり、その特徴を破壊することなくオリゴヌクレオチドをツール、プローブ、又はセンサーに変換するために、様々な基をその3′末端又は5′末端の一方にコンジュゲートすることが可能である。この汎用性は、特に診断の観点から、アプタマーの有意な利点をさらに構成する。
【００５１】
「アプタマーアナログ」という表現は、本願明細書において上述の1つ以上の修飾を意味する。
【００５２】
本発明の好ましい実施態様によれば、アプタマーはヌクレアーゼに耐性がある。
【００５３】
好ましくは、本発明のアプタマーは、ホスホジエステル結合の修飾、糖の2′-アルキル誘導体、2′-アミノ誘導体、及び2′-フルオロ誘導体の群、骨格のホスホロチオエート誘導体、メチルリン酸誘導体、若しくはボラノリン酸誘導体から選択される糖骨格若しくは糖-リン酸骨格の修飾、又はロックド核酸(LNA)若しくはペプチド核酸(PNA)の少なくとも1つの修飾を含む。
【００５４】
本発明の好ましい実施態様によれば、アプタマーは、以下に規定する配列番号1〜配列番号10の配列から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む：
・5′X1X2X3X4TTTGGTGGGTYTGGGGTWGYKX5X63′、式中Xは0個又は1個のGヌクレオチドを表す(配列番号1)；
・5′TGGCRCGGGGTTGGTGTYGGGTT3′ (配列番号2)；
・5′GGGWTTGGCTTX7CGGYGCCTGGCG3′、式中Xは0個又は1個のAヌクレオチドを表す(配列番号3)；
・5′GTGGTTGGX8GSKRTRGWKGKT3′、式中Xは0個又は1個のTヌクレオチドを表す(配列番号4)；
・5′GGGTGGGGGGGTGG3′ (配列番号5)；
・5′TTGGTGGGATGGGGGGGGGGTTGTTCGGCT3′ (配列番号6)；
・5′CTGGGGGTGTGTYGCGATTGTGTGGGTGGG3′ (配列番号7)；
・5′SCSCGGTGGAYTGGTTGGGTTTGGATCCCC3′ (配列番号8)；
・5′TGAGGGGGGTGGATGGGAGGGTTCCGCACG3′ (配列番号9)；及び
・5′TGGACGGTGGGTTGGGGCGGGGGGTGTCCA3′ (配列番号10)。
【００５５】
前記配列は、ヌクレオチドを表示するために一般的に用いられるIUPAC命名法に従ったコンセンサス配列である(表1)。
【００５６】
【表１】
0006599874.tif 000002
【００５７】
好ましくは、本発明のアプタマーは、配列番号6〜配列番号29の配列から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００５８】
より好ましくは、前記ヌクレオチド配列は、5′末端に隣接した配列番号30の配列の少なくとも1〜24個の連続したヌクレオチド、及び/又は3′末端に隣接した配列番号31の配列の少なくとも1〜23個の連続したヌクレオチドを含む。
【００５９】
より好ましくは、前記ヌクレオチド配列は、
配列番号6〜配列番号10、配列番号12〜配列番号17、配列番号19〜配列番号20、配列番号22〜配列番号25、及び配列番号27〜配列番号29
の配列から成る群から選択され、
5′末端に隣接した配列番号30の配列の少なくとも1〜24個の連続したヌクレオチド、及び/又は3′末端に隣接した配列番号31の配列の少なくとも1〜23個の連続したヌクレオチドを含む。
【００６０】
したがって、例えば、配列番号32〜配列番号39の配列、及び好ましくは配列番号40〜配列番号59の配列に言及することができる。
【００６１】
本発明による特に好ましい配列は、配列番号12、配列番号32〜配列番号40、配列番号46、及び配列番号48の配列から選択される。
【００６２】
以下の表2は、これらの配列を要約したものであり、10個の主要な相同性の高い配列の群(すなわちグループI〜X)に配列を分類した。当業者であれば、以下の表2から、以下のことが容易に理解できる：
・配列番号11〜17、32〜34、及び40〜45の配列は、配列番号1のコンセンサス配列に含まれる(グループI)；
・配列番号18〜20、35〜37、並びに46及び47の配列は、配列番号2のコンセンサス配列に含まれる(グループII)；
・配列番号21〜23、38、39、48、及び49の配列は、配列番号3のコンセンサス配列に含まれる(グループIII)；
・配列番号24〜27及び50〜52の配列は、配列番号4のコンセンサス配列に含まれる(グループIV)；
・配列番号28、29、53、及び54の配列は、配列番号5のコンセンサス配列に含まれる(グループV)；
・配列番号55の配列は、配列番号6のコンセンサス配列に含まれる(グループVI)；
・配列番号56の配列は、配列番号7のコンセンサス配列に含まれる(グループVII)；
・配列番号57の配列は、配列番号8のコンセンサス配列に含まれる(グループVIII)；
・配列番号58の配列は、配列番号9のコンセンサス配列に含まれる(グループIX)；及び
・配列番号59の配列は、配列番号10のコンセンサス配列に含まれる(グループX)。
【００６３】
【表２】
0006599874.tif 000003
【表３】
0006599874.tif 000004
【表４】
0006599874.tif 000005
【００６４】
本発明の別の対象は、MMP-9タンパク質の酵素活性を阻害するための、前記のいずれかによるアプタマーの使用に関する。
【００６５】
酵素活性は、上述の方法に従って、特に以下の実施例3の方法に従って測定することができる。
【００６６】
本発明の別の対象は、活性剤としての本発明のアプタマーを、MMP-9タンパク質の酵素活性を阻害するのに十分な量で含み、1種以上の化粧料的又は医薬的に許容される賦形剤を含む、化粧料組成物又は医薬組成物に関する。
【００６７】
好ましくは、本発明の組成物は、組成物の0.000001質量%〜10質量%、好ましくは0.000002質量%〜5質量%、より好ましくは0.000005質量%〜1質量%の本発明のアプタマーを含む。
【００６８】
一般的に、任意の本発明の組成物を肌に適用することができる。
【００６９】
肌への局所適用に通常用いられる全ての医薬形態で提供することができる。
【００７０】
本発明の組成物は、特に水溶液若しくは油性溶液の形態、又はローション(化粧水)タイプ若しくは美容液(セラム)タイプの分散液の形態、水相のシリコーン相への分散(W/Si)、脂肪相の水相への分散(O/W：水中油型エマルジョン)、若しくは逆に水相の脂肪相への分散(W/O：油中水型エマルジョン)により得られる、液体若しくは半液体の稠度を有する乳液(ミルク)タイプのエマルジョン、又はクリームタイプ若しくはゲルタイプの軟らかい稠度を有する水性若しくは無水の懸濁液若しくはエマルジョンの形態、又はマイクロカプセル若しくは微粒子の形態、又はイオン性タイプ若しくは非イオン性タイプの小胞分散液の形態、又はフォーム(泡)の形態をとることができる。これらの組成物は、従来の方法を用いて調製される。本発明による組成物の様々な成分の量は、対象とする分野において典型的に用いられるものである。
【００７１】
化粧品の分野において、これらの組成物は、特に、顔、手、足、若しくは身体を洗浄(クレンジング)する、保護する、処置する、若しくは手入れするためのクリーム(例えば、日中用クリーム、夜用クリーム、メイクアップリムーバークリーム、ファンデーションクリーム、日焼け止めクリーム)、リキッドファンデーション、メイクアップリムーバー乳液、身体の保護用若しくは手入れ用乳液、日焼け止め乳液、クレンジングローション、日焼け止めローション、人工日焼けローション等のスキンケアローション、ゲル、若しくはフォーム、浴用組成物、殺菌剤を含むデオドラント組成物、アフターシェーブゲル若しくはローション、脱毛クリームを構成する。
【００７２】
また、本発明の組成物は、粉末の又は非粉末の固体製剤から構成され、例えば、スティック、圧縮粉末、クレンジング石鹸又はバーの形態である。また、パッチ、ペンシル、ブラシ、及び顔又は手の点へ局所的に適用することができるアプリケーターとして提供することもできる。ケア製品又はメイクアップ製品として用いることができる。
【００７３】
組成物がエマルジョンである場合、脂肪相の比率は、組成物の合計質量に対して約5質量%〜80質量%、及び好ましくは約5質量%〜50質量%で変動してもよい。エマルジョン形態の組成物中に用いられる油、ワックス、乳化剤、及び共乳化剤は、化粧品の分野で典型的に用いられるものから選択される。乳化剤及び共乳化剤は、組成物の合計質量に対して0.3質量%〜30質量%、及び好ましくは0.5質量%〜20質量%の比率で組成物中に存在する。加えて、エマルジョンは脂質小胞を含むことができる。
【００７４】
組成物が油性溶液又はゲルである場合、脂肪相は、組成物の合計質量の90%よりも多くを占めることができる。
【００７５】
また、公知の様式で、本発明の化粧料組成物又は医薬組成物は、親水性若しくは親油性のゲル化剤、親水性若しくは親油性の活性剤、保存料、抗酸化剤、溶媒、香料、充填剤、フィルター、顔料、臭気吸収剤、及び着色料等の化粧品又は医薬の分野で一般的に用いられるアジュバントを含有することもできる。これらの様々なアジュバントの量は、対象とする分野において典型的に用いられるものであり、例えば、組成物の合計質量の約0.01%〜10%変動し得る。これらのアジュバントを、その性質に応じて、脂肪相に、水相に、及び/又は脂質小球体(lipid spherule)に加えることができる。
【００７６】
本発明に採用することができる例示的な油又はワックスには、鉱物油(流動パラフィン)、植物油(シアバターの液体画分、ヒマワリ油)、合成油、シリコーン油若しくはワックス(シクロメチコン)、ビーズワックス、カルナウバワックス、又はパラフィンワックスが含まれる。これらの油に、脂肪アルコール及び脂肪酸(ステアリン酸)を加えることができる。本発明に採用することができる例示的な乳化剤には、例えば、ステアリン酸グリセリル、ポリソルベート60、及びGattefosse社によりTefose 63の名称で販売されている、PEG-6/PEG-32/ステアリン酸グリコールの混合物が含まれる。
【００７７】
本発明に採用してもよい例示的な溶媒には、低級アルコール、特にエタノール及びイソプロパノール、並びにプロピレングリコールが含まれる。
【００７８】
本発明に採用してもよい例示的な親水性ゲル化剤には、カルボキシビニルポリマー(カルボマー)、アクリレート/アルキルアクリレートコポリマー等のアクリルコポリマー、ポリアクリルアミド、ヒドロキシプロピルセルロース等の多糖、天然ゴム、及びクレイが含まれ、例示的な親油性ゲル化剤には、ベントン等の改質クレイ(modified clay)、ステアリン酸アルミニウム等の脂肪酸の金属塩、疎水性シリカ、エチルセルロース、及びポリエチレンが含まれる。
【００７９】
また、本発明の組成物は、例えば、肌の老化の兆候の出現を防ぐ又はこれに対抗するための(化粧料組成物)、又はMMP-9の過剰発現及び/又は機能亢進に関連する病態を予防する及び/又は治療するための(医薬組成物)、1つ以上の活性剤を含むこともできる。MMP-9の過剰発現及び/又は機能亢進に関連する病態は、例えば、皮膚疾患であり、乾癬等の皮膚の炎症疾患、基底細胞癌等の皮膚腫瘍、慢性的な傷などの皮膚病変、瘢痕性病態、水疱性類天疱瘡等の水疱性皮膚疾患、皮膚のサルコイドーシス等の非感染性肉芽腫疾患、環状肉芽腫及び類壊死脂肪性浮腫、並びに黒色腫等の紫外太陽光線への曝露に関する皮膚病態から好ましくは選択される。MMP-9の過剰発現及び/又は機能亢進に関連する病態の他の非限定的な例は、腫瘍病態、喘息、肺気腫、珪肺、気管支拡張症、アナフィラキシー様紫斑病、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、慢性関節リウマチ、歯周炎、炎症性腸疾患、ループス腎炎、シェーグレン症候群、巨細胞性動脈炎、動脈瘤、末梢神経損傷、アルツハイマー病、ギラン・バレー症候群、嚢胞性線維症、及び髄膜炎である。
【００８０】
肌の老化の兆候の出現を防ぐ又はこれに対処するために、純粋な状態で用いられるか、又はこれらの分子を含む抽出物由来の、本発明のアプタマーと組み合わせて採用することができる前述の活性剤は、特に以下の化合物であるが、これに限定されない：UVフィルター(物理的又は化学的)、レチノール、プロピオン酸レチノール若しくはパルミチン酸レチノール等のレチノールエステル、β-エクジソン、アスコルビン酸又はアスコルビル-2-グルコシド若しくは3-O-エチルアスコルビン酸等のアスコルビン酸の誘導体、トコフェリルリン酸若しくはアスコルビルトコフェリルリン酸カリウム等のトコフェロール誘導体等の酸化防止剤又は抗炎症剤、グリチルリチン酸二カリウム、及びアシアチコシド(asiaticoside)。
【００８１】
また、本発明は、顕在性であるか否かに関わらず、内因性の及び/若しくは外因性の肌の老化の兆候の出現を処置する若しくは防止するための、又はその影響を遅延させる若しくは軽減させるための、特に肌のリモデリングを制御する、表皮を再構築させる、肌の調子を高める、並びに/又はしわを滑らかにする若しくは吸収させることを促進するための、化粧料組成物中での少なくとも1つの本発明のアプタマーの使用を対象として有する。
【００８２】
「肌の老化」という表現は、本願明細書においてはその最も広い意味で考慮される。コラーゲン線維束構造の崩壊、しわの形成、皮膚の弾力性の喪失、肌のきめの変化、及び肌表面の皮溝(furrow)と皮丘(rise)との差の減少から選択される少なくとも1つの状態と関連する。
【００８３】
より具体的には、「内因性老化」とは、「通常の」又は時間生物学的な老化としても知られるが、本願明細書においては、内因性の因子が関与するプログラムされた老化(programmed senescence)に関連する、対象の分子レベル、細胞レベル、及び/又は組織レベルでの生理学的変化を意味する。この内因性老化は、皮下脂肪組織の減少及び小じわ又はしわの出現等の臨床的変化の出現に、並びに弾性繊維の数及び厚みの増加、弾性組織の膜の垂直繊維の喪失、及びこの弾性組織の細胞における大型の不規則な線維芽細胞の存在等の病理組織学的変化に主に反映される、皮膚細胞すなわち角化細胞の再生の遅延を特に引き起こす。
【００８４】
「外因性老化」とは、本願明細書においては、過剰な化学的刺激及び物理的刺激等の外部刺激に関連する、対象の分子レベル、細胞レベル、及び/又は組織レベルでの生理学的変化を意味する。肌の正常な機能を低下させ、肌の老化を誘導し得る化学的刺激及び物理的刺激には、特に太陽、光、UVへの曝露、ストレス、及び栄養不良が含まれる。この外因性老化は、深いしわ、並びに硬さ、柔軟性、及び弾力性を失った肌の形成等の臨床的変化をもたらす。これらの変化は、真皮上層の弾性組織の過度の変化、並びにコラーゲン繊維の量的及び質的変性等の病理組織学的変化に主に起因する。
【００８５】
「肌のリモデリング」又は肌の再構築とは、表皮、真皮、及び/又は皮下組織の細胞等の皮膚細胞の細胞外マトリックスの分解及び合成に関与する酵素の協調作用を意味する。実際、細胞外マトリックス分解に関与する酵素は、細胞を分化、増殖、及び遊走させるために適した環境を作るために、細胞外マトリックスの分解だけでなくその合成も両方制御している。本発明のアプタマーは、本願明細書において、表皮の及び/又は真皮の及び/又は皮下の細胞外マトリックスを保護することにより、この肌のリモデリングを制御することを可能にする。
【００８６】
また、本発明は、MMP-9阻害剤としての、化粧料組成物又は医薬組成物の製造における又は製造のための、少なくとも1つの本発明のアプタマーの使用にも関する。
【００８７】
また、本発明は、抗しわ化粧料組成物中での少なくとも1つの本発明のアプタマーの使用にも関する。
【００８８】
さらに、本発明は、抗しわ皮膚科組成物の製造のための、少なくとも1つの本発明のアプタマーの使用に関する。
【００８９】
本発明の別の対象は、好ましくは、顕在性であるか否かに関わらず、内因性の及び/若しくは外因性の肌の老化の兆候の出現を処置する若しくは防止するための、又はその影響を遅延させる若しくは軽減させるための、特に肌のリモデリングを制御するための、肌を再構築させるための、肌の調子を高めるための、並びに/又はしわを予防する若しくはしわを滑らかにする若しくは吸収させることを促進するための、本発明のアプタマーの美容的使用に関する。
【００９０】
特に、本発明の美容的使用には、小じわ及びしわ、特に顔、首、デコルテ、又は手に現れるものを滑らかにする目的がある。
【００９１】
また、本発明は、顕在性であるか否かに関わらず、内因性の及び/若しくは外因性の肌の老化の兆候の出現を治療する若しくは予防するための、又はその影響を遅延させる若しくは軽減させるための、特に肌のリモデリングを制御するための、肌を再構築させるための、肌の調子を高めるための、及び/若しくはしわを予防する若しくはしわを滑らかにする若しくは吸収させることを促進するための、並びに/又は脂肪組織の発達を制限するための、美容的処置又は皮膚科的治療の方法であって、少なくとも1つの本発明のアプタマーを含む化粧料組成物又は皮膚科組成物を身体又は顔の皮膚の関連する領域に適用することを含む、方法にも関する。
【００９２】
好ましくは、本発明の組成物は、1日1回、肌の関連する領域に適用される。有利には、組成物は最初に適用され、夜に同一の領域に再び適用される。
【００９３】
また、本発明は、1つ以上の他の活性剤、例えば上述の活性剤と組み合わせた、同時の、別個の、又は逐次の投与のための医薬品の製造のための、少なくとも1つの本発明のアプタマーの使用にも関する。
【００９４】
また、本発明は、MMP-9の過剰発現及び/又は機能亢進に関連する病態を治療する及び/又は予防するための医薬品の製造のための、少なくとも1つの本発明のアプタマーの使用であって、前記病態が好ましくは上述のものから選択される、使用に関する。より好ましくは、前記病態は、上述されるもの等の皮膚疾患である。
【００９５】
本発明の別の対象は、好ましくはMMP-9の過剰発現及び/又は機能亢進に関連する病態を治療する及び/又は予防するための、医薬品としての本発明のアプタマーであって、前記病態が好ましくは上述のものから選択される、アプタマーに関する。より好ましくは、前記病態は、上述されるもの等の皮膚疾患である。
【００９６】
本発明の別の対象は、MMP-9の過剰発現及び/又は機能亢進に関連する病態の治療及び/又は予防における使用のための本発明のアプタマーであって、前記病態が好ましくは上述のものから選択される、アプタマーに関する。より好ましくは、前記病態は、上述されるもの等の皮膚疾患である。
【００９７】
本発明のアプタマーは、特に皮膚細胞への浸透を容易にするために、ベクター化形態で、すなわちベクターに連結されるか又はベクターと組み合わせて、用いることができる。この種のベクターは、当業者に周知である。そのようなベクターの例には、リポソーム、特にカチオン性リポソーム、コレステロール、デンドリマー、特にポリカチオン性デンドリマー等の疎水性残基、ナノ粒子、マイクロカプセル化、ペプチド形質導入ドメイン(transduction domains) (PTD)等の細胞透過性ペプチド、ポリエチレンイミン(PEI)等の核酸凝縮剤、又はポリ-L-リジンが含まれるが、これに限定されない。
【００９８】
また、本発明のアプタマーは、2つのアプタマーの二量体の形態、又は複数のアプタマーのコンジュゲートの形態で使用することもできる。
【００９９】
また、本発明のアプタマーは、肌の老化を予防する若しくはこれに対処するための活性剤、又はMMP-9の過剰発現及び/若しくは機能亢進に関連する皮膚疾患を治療する及び/若しくは予防するための活性剤、例えば上述の活性剤と、カップリングすることもできる。
【０１００】
本発明の別の対象は、以下の：
・オリゴヌクレオチドライブラリー中でSELEX法を用いてMMP-9タンパク質の触媒部位に対するアプタマーを選抜する工程、
・前工程において同定したアプタマーについてMMP-9タンパク質の酵素活性を阻害するポテンシャルを評価する工程、
・そうして選抜したアプタマーをクローニング及びシーケンシングする工程
を含む、本発明のアプタマーを選抜するための方法に関する。
【０１０１】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記アプタマーライブラリーはDNAライブラリーである。
【０１０２】
本発明は、以下の実施例に照らしてより良く理解される。それでもなお、当業者であれば、上記の記述は限定的でないこと、並びに本発明の範囲を離れることなく様々な改変、置換、削除、及び変更を行うことができることを認識する。
【実施例】
【０１０３】
「実施例１：抗MMP9アプタマーの選抜」
［1.1. タンパク質］
C末端の6-Hisタグを含む組換えヒトMMP-9の触媒ドメインは、Biomol(登録商標) Internationalより入手した；MMP-9タンパク質及びMMP-2タンパク質は、Calbiochemより入手した。
【０１０４】
［1.2. オリゴヌクレオチド及びライブラリー］
Sigmaより供給されたDNAライブラリー及びプライマーをHPLCにより精製した。プライマー配列(P3) 5′ GGGAGACAAGAATAAACGCTCAA 3′ (配列番号60)及び(P5) 5′ GCCTGTTGTGAGCCTCCTGTCGAA 3′ (配列番号30)を、無作為に選択した30ヌクレオチドウインドウを含むライブラリーの増幅に用いた。5′ ACTGACTGACTGACTGACTA-6C3-GGGAGACAAGAATAAACGCTCAA 3′ (配列番号61)の配列を用いて、文献(Williams及びBartel、1995)に記述されるとおりに一本鎖を作製した。5′ビオチン化プライマー(P3)を用いて、一本鎖の候補DNAを作製した。候補DNAを合成し、EurogentecのHPLCにより精製した(図1及び図2)。各実験の前に、DNAの集団及び候補を75℃で5分間加熱し、氷上に5分間静置し、その後室温に少なくとも5分間静置した。
【０１０５】
［1.3. インビトロ選抜］
選抜の前に、第一のラウンド及び第二のラウンドについては2回、他の全てのラウンドについては1回、DNAライブラリー(1ナノモル)を、PBS (50 mM Tris-HCl、pH 7.4、50 mM NaCl、100 mM KCl、5 mM CaCl2、1 mM (CH3COO)2Mg)中、20分間、室温で、フィルター(0.45 μM HAWP、Millipore)で処理しインキュベートした。各ラウンドにおいて、追加のカウンターセレクションを6-His-GSTタグに対して行った。次に、カウンターセレクションされたライブラリーをMMP-9の触媒ドメイン(20ピコモル)と20分間混合し、フィルターリテンション法を用いて、未結合の候補を分離した。濾過後、MMP-9の触媒ドメインに結合している候補を、500 μlの7 Mフェノール/尿素中、20分間、65℃でのインキュベーションにより溶出し、沈殿させてPCRにより増幅し、選抜のその後のラウンドに用いるための一本鎖を作製した。選抜中、候補及び標的の量を減少させて、それぞれ25ピコモル及び1ピコモルに達し、11回目のラウンドでは選抜のストリンジェンシーが増加した。クローニングの前に、MMP-9活性を阻害する能力について、選抜の各ラウンドの集団を評価した。
【０１０６】
［1.4. クローニング及びシーケンシング］
11ラウンドの選抜後、ラウンド8及びラウンド11から選抜された配列を、メーカーの取り扱い説明書に従い、TOPO MT Cloning Kit (Invitrogen)を用いてクローニングし、BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)を用いてシーケンシングした。
【０１０７】
［1.5. DNAアプタマーの熱変性］
DNAアプタマーを、20 mMカコジル酸ナトリウム緩衝液(140 mM塩化カリウム、20 mM塩化ナトリウム、及び3 mM塩化マグネシウム含有)、pH 7.3、20℃中に調製した。DNAのサンプルを、全長の候補及び短縮された候補についてそれぞれ終濃度3 μM又は10 μMに調製した。サンプルを75℃で5分間変性させ、氷上に5分間静置し、室温で20分間インキュベートした。サンプルの変性は、0.4℃/分、4℃〜90℃の加熱により行い、260 nm及び295 nmでモニタリングした。熱変性は、温度を±0.1℃で制御するペルチェ効果装置をインターフェース接続したUvikon分光光度計を用いてモニタリングした。
【０１０８】
［1.6. DNAアプタマーの円偏光二色性］
光学ピッチ10 mmの石英セルを用いて、JASCO J-815円偏光二色性分光計でCDスペクトルを得た。スキャンを23℃、レスポンスタイム0.5秒、スキャンスピード500 nm/分、及び波長範囲230 nm〜320 nmで実行した。緩衝液のシグナルへの寄与分のベースラインを各スペクトルから差し引いた。
【０１０９】
オリゴヌクレオチドを、全長のアプタマー及び短縮されたアプタマーについてそれぞれ0.5 μM及び1 μMで調製した。これらを70℃の水中で5分間変性させ、4℃で4分間冷却し、室温で15分間、カコジル酸緩衝液(20 mMカコジル酸ナトリウム、140 mM KCl、20 mM NaCl、3 mM MgCl)中に分析するまで保存した。
【０１１０】
［1.7. 抗MMP-9 アプタマーの選抜の結果］
酵素活性を特異的に阻害するDNA アプタマーを同定するために、MMP-9の触媒ドメインに対してSELEX法を用いた。11ラウンドのインビトロ選抜を実行した。クローニング及びシーケンシングの前に、MMP-9活性を阻害する能力について、(ラウンド11のライブラリーから始まる)集団を評価した。
【０１１１】
これらの活性試験に基づいて、ラウンド8及びラウンド11由来の集団をクローニング及びシーケンシングした。
【０１１２】
大部分の配列は、Gカルテットを生成することができるGのクラスターを有している。候補を5つの主要なファミリー(I、II、III、IV、V)に分類し、各ファミリーはコンセンサスモチーフを有する配列を含んでいる(図1のボックスで囲まれているヌクレオチドを参照)。他の配列(8F5、8F9、8F60、8F65、及び11F2) (グループVI〜X)は、Gが豊富なこと以外は先のファミリーと類似性を有さない。
【０１１３】
「実施例２：MMP-9活性測定」
［2.1. 原理］
酵素は、1つ又は2つの基質の転換を特異的に触媒することができるタンパク質である。単純化された酵素反応モデル：
【０１１４】
【数１】
0006599874.tif 000006
【０１１５】
を用いれば、反応速度は：
【０１１６】
【数２】
0006599874.tif 000007
【０１１７】
と書かれる。
【０１１８】
(P) = f(t)曲線をプロットするために、酵素(E)は基質(S)に作用する；ゼロ時点は反応の開始に相当する。生成物(P)の発生を、時間の関数として測定する。
【０１１９】
反応速度
【０１２０】
【数３】
0006599874.tif 000008
【０１２１】
は、初期条件中、一定である。曲線のこの部分については、原点を通る接線が曲線と同化する：この速度は、接線の傾きであるが、初速度と呼ばれる。その後、速度は減少し、ゼロになる。基質の1つが消費されるか、平衡が成立すると、この速度はゼロになる。
【０１２２】
酵素反応の速度が決定すると、初速度が常に計算される。したがって、速度の測定は、10%未満の量の基質が加水分解されている初期条件下で行われる。
【０１２３】
【数４】
0006599874.tif 000009
【０１２４】
の間、初速度は酵素濃度に比例する：したがって、酵素単位(ユニット)で表される酵素調製物の活性を反映する。国際単位(IU又はU)は、1分間当たり1マイクロモルの基質の転換を触媒する酵素の量を表す。
【０１２５】
［2.2. 酵素活性測定］
MMPの酵素活性の測定は、共鳴エネルギー移動すなわちRET、又は蛍光共鳴エネルギー移動すなわちFRETの原理に基づく。基質は、蛍光基(F)すなわちエネルギードナー、及び消光基(Q)すなわちエネルギーアクセプターを含むオリゴペプチドから成る。加水分解後、消光基が放出され、それにより蛍光の増加を測定することが可能になる。
【０１２６】
多数の蛍光色素/クエンチャーの対がMMPの酵素活性を測定するために開発されており、7-メトキシクマリン-4-アセチル(Mca)/ジニトロフェニル-ジアミノプロピオニル(Dnp)の対が含まれる(Knightら、1991)。
【０１２７】
（条件培地(conditioned medium)中のMMP活性測定）
様々な候補又は対照の存在下での細胞又は3次元モデルのインキュベーション後、条件培地を取り出し、細胞の破片を除去するために10,000 gで10分間、+4℃で遠心分離し、同じタンパク質濃度に調整する。10 kDaカットオフの膜を備えたNanosep(登録商標)微量濃縮器(microconcentrator)を用いて、培養培地に含まれるフェノールレッドを透析濾過により除去する。50 μlの条件培地を14,000 gで6分間、+4℃で遠心分離する。リテンテートを 50 μlの50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、5 mM CaCl2緩衝液(pH 7.5)に懸濁し、同条件下で再度遠心分離する。この工程を3回繰り返し、それにより完全にフェノールレッドを除去する。
【０１２８】
50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、5 mM CaCl2緩衝液(pH 7.5)中、0.1% (w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)溶液を用いて非特異的結合部位をブロックしてある黒色96ウェルプレートにおいて、フェノールレッドを含まないように調整した培地20 μlを、170 μlの50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、5 mM CaCl2培養液(pH 7.5)に加える。10 μlのMca-Pro-Leu-Gly-Leu-(Dnp)-Ala-Arg-NH2基質を加えて、終濃度2 μM、最終反応液量200 μlにすることにより、反応を開始させる。経時的な蛍光(励起波長：326 nm、放射波長：465 nm)の変動を、+20℃でBMG Polarstarプレートリーダー蛍光光度計を用いてモニタリングする。蛍光(RFU)を時間(分)の関数として表す曲線をプロットする。
【０１２９】
反応の初速度を、原点を通る接線の傾きを計算することにより決定する。Vi/V0の比を計算する。
【０１３０】
［2.3. エフェクター存在下でのMMP活性の調節］
（プロMMP-9の活性化）
プロMMP-9は、18時間、+4℃で、0.1 Mソーダ中10 mMの濃度に調製した1 mM 酢酸フェニル水銀(PMAA)の存在下でのインキュベーションにより活性化される。
【０１３１】
（活性測定）
50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、5 mM CaCl2緩衝液(pH 7.5)中の様々な候補の非存在下又は存在下で、同じ緩衝液中の0.1% (w/v)BSA溶液を用いて非特異的結合部位をブロックしてある黒色96ウェルプレートにおいて、200 pM MMP-9を+20℃で5分間予備インキュベートする。10 μlの特異的基質を加えて、終濃度2 μM、最終反応液量200 μlにすることにより、反応を開始させる。経時的な蛍光(励起波長：326 nm、放射波長：465 nm)の変動を、+20℃でBMG Polarstarリーダー蛍光光度計を用いてモニタリングする。蛍光(RFU)を時間(分)の関数として表す曲線をプロットする。蛍光(RFU)を時間(分)の関数として表す曲線をプロットする。
【０１３２】
反応の初速度を、原点を通る接線の傾きを計算することにより決定する。Vi/V0の比を計算する。
【０１３３】
［2.4. 結果］
結果を図4〜図6に表す。図5及び図6において、用量依存的効果を観察することができ、用量はナノモル濃度で、横軸上に、アプタマーの名称の後に表示する。
【０１３４】
「実施例３：本発明の組成物」
【０１３５】
【表５】
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【０１３６】
この粉末は二重の作用を有している。肌を洗浄し、さらに、数日間常用することにより、顔の色艶(complexion)を明るくする。顔の肌に、1日1回又は2回適用することができる。
【０１３７】
【表６】
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【０１３８】
比較的強い昼光の放射に、又は直射日光にまでも曝露されている人の中には、それらから自身を保護し、日光弾性線維症を避けたいと望む人がいる。実施例Bのエマルジョン-ゲルの使用により、この目的を達成することが可能になる。この組成物は、好ましくは朝、顔に適用する。均一であるかないかに関わらず、光による顔の老化の予防及び治療の両方をするように作用する。
【０１３９】
【表７】
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【０１４０】
この組成物は強い日光への曝露の前に用いられるべきである。しわの出現が起こりやすい人々において、この現象を予防する。
【０１４１】
【表８】
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【０１４２】
このクリームの使用により、コラーゲン合成、抗酸化作用、及び細胞外マトリックスの保護によって小じわ及びしわが滑らかになる。また、このクリームは、加齢とともに現れる肌の色の明暗差を軽減させる。
【０１４３】
【表９】
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【０１４４】
このローションは、肌の老化及びたるみに対抗するものであるが、肌のメイクアップの除去及び洗浄の後に用いられる。
【０１４５】
【表１０】
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【０１４６】
この高濃縮美容液組成物を、好ましくはフェイスクリームを適用する前に、顔に一滴適用する。この美容液は、好ましくは、顔の色艶を若返らせ滑らかにするための1週間又は2週間の処置において用いられる。
【０１４７】
【表１１】
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【０１４８】
この抗UVハンドクリームは、しわの出現を予防し、肌の表面を滑らかにする。
【０１４９】
【表１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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