(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相担体G-1とリンカー分子L-1とを反応させた後、分離、精製し、L-G-1を得るステップaと、
0006554180.tif 000065
DNAとリンカー分子L-0とを反応させた後、分離、精製し、L-2を得るステップbと、
0006554180.tif 000066
L-G-1とL-2とを反応させた後、分離、精製し、L-G-2を得るステップcと、
0006554180.tif 000067
L-G-2の保護基を脱離させ、L-G-2-1を得るステップdと、
方法1、方法2、方法3若しくは方法4、又はそれらの任意の組合せを採用するステップeと、
L-G-3-I、L-G-3-1及び/又はL-G-3-2の固相担体を除去し、DNAコード化した化合物ライブラリーであるL-D-Tを得るステップfと、を含み、
前記方法1は、L-G-2-1とR1とを反応させ、分離、精製し、L-G-2-1-1を得た後、L-G-2-1-1をDNAコード化し、L-G-3-Iを得るステップを含み、
0006554180.tif 000068
前記方法2は、
L-G-2-1と骨格分子とを反応させ、分離、精製し、L-G-2-2を得るステップiと、
0006554180.tif 000069
L-G-2-2又はL-G-2-2の保護基を脱離させた後、R1と反応させ、分離、精製し、L-G-2-2-1を得、L-G-2-2-1をDNAコード化し、L-G-3-1を得るステップiiと、を含み、
0006554180.tif 000070
前記方法3は、
L-G-2-1と骨格分子とを反応させ、分離、精製し、L-G-2-2を得るステップとi、
L-G-2-2又はL-G-2-2の保護基を脱離させた後、R1と反応させ、分離、精製し、L-G-2-2-1を得、L-G-2-2-1をDNAコード化し、L-G-3-1を得るステップiiと、
L-G-3-1又はL-G-3-1の保護基を脱離させた後、R2と反応させ、分離、精製し、L-G-3-1-1を得、L-G-3-1-1をDNAコード化し、L-G-3-2を得るステップiiiと、を含み、
0006554180.tif 000071
前記方法4は、
L-G-2-1と骨格分子とを反応させ、分離、精製し、L-G-2-2を得、L-G-2-2をDNAコード化し、L-G-3-1を得るステップiと、
L-G-3-1又はL-G-3-1の保護基を脱離させた後、R2と反応させ、分離、精製し、L-G-3-1-1を得、L-G-3-1-1をDNAコード化し、L-G-3-2を得るステップiiと、を含み、
ここで、R1、R2は、ビルディングブロックであり、
前記固相担体が
0006554180.tif 000072
であり、
前記リンカー分子L-1は、
0006554180.tif 000073
であり、
前記ステップaにおいて、前記L-G-1は、
0006554180.tif 000074
であり、
前記リンカー分子L-0は、
0006554180.tif 000075
であり、
前記ステップbにおいて、前記L-2は、
0006554180.tif 000076
であり、
前記ステップcにおいて、前記L-G-2は、
0006554180.tif 000077
であり、
前記ステップdにおいて、前記L-G-2-1は、
0006554180.tif 000078
であり、
前記ステップeにおいて、
前記L-G-3-Iは、
0006554180.tif 000079
であり、
前記L-G-2-2は、
0006554180.tif 000080
又は
0006554180.tif 000081
であり、
前記L-G-3-1は、
0006554180.tif 000082
又は
0006554180.tif 000083
であり、Rjは、イソシアネートを形成できる基であり、
前記ステップfにおいて、前記L-D-Tは、
0006554180.tif 000084
又は
0006554180.tif 000085
であり、Rjは、イソシアネートを形成できる基であり、R1-aは、CH2又はC6H5CH2CHであり、R1-bは、ｎ-ブチル、イソブチル、tert-ブチル又はシクロヘキシルであり、R1-cは、ｎ-プロピル、イソプロピル又はシクロペンチルであり、Rkは、カルボン酸、アルデヒド、イソシアネートのいずれか１種とアミノとの反応により生成される基であり、
前記R1、R2は、それぞれ又は同時にイソシアネート、ベンジルアルコール又は安息香酸から選択され、
前記ステップeにおいて、前記骨格分子は、p-ヒドロキシフェニルプロピオン酸、p-アミノ安息香酸、p-ヒドロキシフェニルグリシン、N-フルオレニルメトキシカルボニル-グリシン、N-フルオレニルメトキシカルボニル-L-フェニルアラニン、tert-ブチルイソニトリル、シクロヘキシルイソニトリル、3-メチルブチルアルデヒド、シクロペンチルアルデヒド、
0006554180.tif 000086
のうちのいずれか1種又は２種以上から選択される、ことを特徴とするDNAコード化化合物ライブラリーの固相合成方法。
【請求項２】
前記ステップaにおいて、固相担体G-1とリンカー分子L-1との重量比が1：0.08〜0.2であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記ステップaにおいて、反応溶媒は、ハロゲン化炭化水素系溶媒であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップaにおいて、反応温度は、15〜25℃、反応時間は、12〜16時間であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記ステップaにおいて、分離、精製の方法は、溶媒を除去し、固体を得た後、DMF及びジクロロメタンで固体を洗浄することであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記ステップbにおいて、前記DNAは、一本鎖DNAであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記ステップbにおいて、反応は、縮合剤の条件下で進むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記ステップbにおいて、前記縮合剤は、2-クロロ-4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジンであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ステップbにおいて、DNAとリンカー分子L-0とのモル比は、1：50~300であり、リンカー分子L-0と縮合剤とのモル比は、1：1〜2であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップbにおいて、反応温度は、15〜25℃、反応時間は、12〜16時間であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステップbにおいて、分離、精製の方法は、pH=4〜5に調節し、その後、エタノールを加え、-20℃で沈殿した後、遠心して得られた固体を洗浄することであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
前記ステップcにおいて、反応は、有機溶媒の条件下で進むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
前記ステップcにおいて、L-G-1とL-2とのモル比は、2〜10：1であり、L-G-1とピリジンとの重量体積比は、1：0.8〜2.5 mg/μLであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
前記ステップcにおいて、反応温度は、20〜45℃、反応時間は、14〜30時間であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
前記ステップcにおいて、分離、精製の方法は、溶媒を除去し、固体を得、固体を水及びTEAA緩衝溶液で洗浄することであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
前記ステップdにおいて、前記保護基は、アミノ保護基であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
前記ステップdにおいて、L-G-2は、ピペリジン、窒素含有溶媒の条件下でその保護基を脱離し、前記L-G-2とピペリジンとのモル体積比は、1：100~10000mol/Lであり、前記ピペリジンと窒素含有溶媒との体積比は、1〜4：5〜20であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
前記ステップeにおいて、DNAコード化の方法は、タグ配列iをL-G-2-1-1、L-G-2-2-1、L-G-3-1-1又はL-G-2-2のDNA直列に接続させることにより、タグ配列iでRiにタグを特異的に付け（ここで、Riは、ビルディングブロックであり、i=1，2であり）、合成の過程において、新しいRiを導入するたびに、DNA又はタグ配列（i-1）にタグ配列iを直列に接続させ、合成が終了した後、タグ配列iに末端配列を接続させることであることを特徴とする請求項1〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ステップeの方法１において、反応は、有機アミン及び有機溶媒の条件下で進むことを特徴とする請求項1〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ステップeの方法１において、L-G-2-1と、R1と、有機アミンとのモル比は、1：50~500：50~500であり、L-G-2-1と有機溶媒とのモル体積比は、1：50~500 nmol/μLであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ステップeの方法１において、反応温度は、25℃〜30℃、反応時間は、12h〜16hであることを特徴とする請求項1〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ステップeの方法１において、分離、精製の方法は、溶媒を除去し、固体を得、固体を水及びTEAA緩衝溶液で洗浄することであることを特徴とする請求項1〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ステップeの方法2又は方法3において、ステップiの反応は、縮合剤、有機アミン及び有機溶媒の条件下で進み、ステップeの方法4において、ステップiの反応は、有機溶媒の条件下で進み、
前記L-G-2-1と、骨格分子と、縮合剤と、有機アミンとのモル比は、1：50~500：50~500：50~500であり、前記化合物L-G-2-1と窒素含有溶媒とのモル体積比は、50~500 nmol/μLであることを特徴とする請求項1〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ステップeの方法2、方法3又は方法4において、ステップiの反応温度は、25℃〜30℃、反応時間は、12h〜16hであることを特徴とする請求項1〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ステップeの方法2、方法3又は方法4において、ステップiの分離、精製の方法は、溶媒を除去し、固体を得、固体を水及びTEAA緩衝溶液で洗浄することであることを特徴とする請求項1〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ステップeの方法2、方法3又は方法4において、ステップiiの反応は、有機アミン又は有機ホスフィン及び有機溶媒の条件下で進み、前記有機アミンは、N,N-ジイソプロピルエチルアミン又はトリエチルアミンから選択され、前記有機ホスフィンは、トリフェニルホスフィンから選択され、前記有機溶媒は、ハロゲン化炭化水素系溶媒、エーテル系溶媒又は窒素含有溶媒から選択され、前記エーテル系溶媒は、テトラヒドロフランから選択され、前記窒素含有溶媒は、N,N-ジメチルホルムアミドから選択されることを特徴とする請求項1〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ステップeの方法2、方法3又は方法4において、ステップiiの反応温度は、25℃〜30℃、反応時間は、12h〜16hであることを特徴とする請求項1〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ステップeの方法2、方法3又は方法4において、ステップiiの分離、精製の方法は、溶媒を除去し、固体を得、固体を水及びTEAA緩衝溶液で洗浄することであることを特徴とする請求項1〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ステップeの方法2、方法3又は方法4において、L-G-2-2又はL-G-3-1の保護基を脱離させる方法は、L-G-2-2又はL-G-3-1にピペリジンを加え、25℃〜30℃で2h〜6h撹拌しながら反応させた後、溶媒を除去し、固体を得、固体を水及びTEAA緩衝溶液で洗浄することであることを特徴とする請求項1〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ステップeの方法3又は方法4において、R2との反応は、有機アミン及び有機溶媒の条件下で進み、前記有機アミンは、N,N-ジイソプロピルエチルアミン又はトリエチルアミンから選択され、有機溶媒は、ハロゲン化炭化水素系溶媒から選択されることを特徴とする請求項1〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ステップeの方法3又は方法4において、R2との反応の反応温度は、25℃〜30℃、反応時間は、12h〜16hであることを特徴とする請求項1〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ステップeの方法3又は方法4において、ステップiiiの分離、精製の方法は、溶媒を除去し、固体を得、固体を水及びTEAA緩衝溶液で洗浄することであることを特徴とする請求項1〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ステップfにおいて、固相担体を除去する方法は
(a)L-G-3-I、L-G-3-1及び/又はL-G-3-2に塩基を加え、反応させた後、分離、精製すること、又は
(b)L-G-3-I、L-G-3-1及び/又はL-G-3-2にPBS緩衝溶液を加え、光源下で分解反応させた後、分離、精製することであることを特徴とする請求項1〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記(a)において、前記塩基は、有機塩基又は無機塩基から選択され、反応温度は、30~60℃、反応時間は、1~10時間であることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記(b)において、前記光源の波長は、365nmであり、分解反応の反応温度は、25℃〜40℃、反応時間は、1h〜8hであることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記(a)及び/又は(b)において、分離、精製の方法は、水及びTEAA緩衝溶液で洗浄して得られた濾液を濃縮した後、エタノールを加え、-20℃で沈殿した後、遠心して固体を得、洗浄することであることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
0006554180.tif 000087
又は
0006554180.tif 000088
を含み、
Rjは、イソシアネートを形成できる基であり、R1-aは、CH2又はC6H5CH2CHであり、R1-bは、ｎ-ブチル、イソブチル、tert-ブチル又はシクロヘキシルであり、R1-cは、ｎ-プロピル、イソプロピル又はシクロペンチルであり、Rkは、任意のカルボン酸、アルデヒド、イソシアネートのいずれか１種とアミノとの反応により生成される基であることを特徴とするDNAコード化化合物ライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DNAコード化化合物ライブラリーの固相合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物研究開発、特に新薬研究開発において、生物学的標的に対するハイスループットスクリーニングは、リード化合物を迅速取得する主要な手段の一つである。しかし、単一の分子に対する従来のハイスループットスクリーニングでは、必要な時間が長く、設備コストが大きく、ライブラリーにおける化合物の数量に限界（数百万）があり、且つ、化合物ライブラリーの構築に数十年もかかることで、リード化合物の発見効率及び可能性が制限される。近年に提案されているDNAコード化化合物ライブラリーの合成技術は、コンビナトリアル化学及び分子生物学技術と組み合わせ、分子レベルで各化合物にDNAタグを付けることにより、極めて短い時間内に億レベルの化合物ライブラリーを合成することを可能とする。また、遺伝子シーケンシングの方法により化合物を識別できるため、化合物ライブラリーの広さ及び合成効率を大幅に向上させ、次世代の化合物ライブラリーのスクリーニング技術のトレンドとなるとともに、外国の製薬産業で広く使用され始め、多数の肯定的な効果をもたらした（Accounts of Chemical Research, 2014, 47, 1247-1255）。
【０００３】
DNAコード化した化合物ライブラリーにおける各化合物分子は、ユニークな所与のDNA配列を有する。化合物ライブラリーのスクリーニングは、数千万さらに数億のDNAコード化化合物ライブラリーを全体として数十マイクロリットルの体積に溶解させ、従来の実験室条件で生物学的標的にハイスループットスクリーニングを行うことである。従来の化合物ハイスループットスクリーニングに比べて、高価なスクリーニング設備及び複雑な化合物ライブラリーの管理システムを使用する必要がないため、設備コスト及びスクリーニングコストを大幅に節約した。
【０００４】
1993年、Brennerらは、遺伝子DNAタグ（genetic DNA tag）の示唆により、ビーズコーディング（encoding of beads）技術を採用し、各ビーズを１種類の化合物に粘着させ、合成においてその「過程」をビーズにコーディングし、ビーズのコードを読み出すことにより、ビーズに粘着された化合物を確定する。こういう固相条件での「DNAコード化コンビナトリアル化学合成方法」は、米国化学会誌（J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 9812-9813）に発表されている。しかし、Brennerの方法は、ポリペプチドライブラリーの合成に制限され、現代薬物に必要な多様化小分子化合物ライブラリーの合成を満たすことができない。
【０００５】
Pehr B. Harburyらは、その後、固相条件でのDNAコード化化合物ライブラリーの合成方法を開発し、ポリペプチドの合成に使用した（PloS Biology 2004, 2, 1031-1038）。しかし、その固相材料として、アニオン交換樹脂DEAEアガロースゲルが使用された。固相担体とDNAとの作用力は、イオン相互作用であった。高濃度の塩系又は他のイオン相互作用に影響を与える系において安定して存在することが困難であるため、小分子化合物ライブラリーの合成における応用が大きく制限された。
【０００６】
出願番号：201210555548.3（発明名称：「リード化合物の合成及びスクリーニング方法、並びにキット」）である特許出願は、DNAコード化化合物ライブラリーの合成及びコーディング技術を開示する。まず、DNA一本鎖の開始配列の一端をビルディングブロックに接続させ、他端をビルディングブロックの特異的なタグ配列に直列に接続させることにより、一端が遊離の一本鎖DNAが標識された初期ビルディングブロックが得られ、次いで、得られた初期ビルディングブロックをベースとして、線形結合反応の方式により化合物を合成した。合成過程において、新しいビルディングブロックを導入した度に、初期ビルディングブロックに接続された一本鎖DNAの遊離端に、導入されたビルディングブロックの特異的なタグ配列を直列に接続することにより、前記一本鎖DNAを徐々に延長させ、合成終了後、前記一本鎖DNAの遊離端に末端配列を直列に接続させることで、一本鎖DNAで標記された化合物ライブラリーが得られた。該発明は、迅速で効果的に合成することができるとともに、スクリーニング、シーケンシングにより目的リード化合物を得ることができる。
【０００７】
しかし、従来のDNAコード化化合物ライブラリーの合成及びコーディング技術は、リード薬物のスクリーニングに良好に応用できるが、いくつかの欠点と限界がある。1）コーディングに使用されるDNAは、水相（又は水に溶解できる有機溶媒を含む水相）反応に適用され、反応分子が純粋な機溶媒における溶解度が劣り、水に敏感な純粋な有機相化学反応に適用できず、DNAコード化化合物ライブラリーの合成に使用できる反応タイプが制限され、DNAコード化化合物ライブラリーの合成の化学反応の速度が低減される。2）合成反応の各ステップを完全に進めさせるために、DNAコード化化合物ライブラリーの合成において大幅に過剰な小分子反応試薬を使用する場合が多く、このような試薬を水相のDNAコード化化合物ライブラリーの合成系から完全に分離することが非常に困難である。3）液相反応による化合物DNAライブラリーのライブラリー合成過程において、DNA化合物ライブラリーに対する純度要求を満たすために、DNAライブラリーの合成反応後の分離・精製ステップが多く、周期が長い。
【０００８】
従来の固相条件での「DNAコード化コンビナトリアル化学合成方法」は、ポリペプチド合成に制限され、適用される化学反応タイプに限界がある。また、固相担体とDNAとの作用力は、イオン相互作用であり、高濃度の塩系又は他のイオン相互作用に影響を与える系において安定して存在することが困難であるため、小分子化合物ライブラリーの合成における応用が大きく制限された。
【０００９】
そのため、操作が簡単で、コストが低く、周期が短く、且つ有機溶媒体に適用されるDNAコード化化合物ライブラリーの固相合成方法が必要とされる。
【発明の概要】
【００１０】
上記問題を解決し、DNAコード化化合物ライブラリーの合成及び精製方法を最適化し、DNAコード化化合物ライブラリーの化学小分子構造の多様性を増加し、新薬スクリーニングにおける応用範囲を広げるために、本発明は、DNAコード化化合物ライブラリーの固相合成方法を提供する。
【００１１】
用語説明
ビルディングブロック（Synthetic Building Block）：シントンとも呼ばれ、物理的および化学的特性、及び生化学的性質を有する、新薬（西洋薬、農薬）の研究開発過程において必須な小分子化合物をいう。
固相担体：固相反応において担持するための固相物質をいう。
リンカー分子：結合分子とも呼ばれ、DNA、小分子化合物ライブラリー、及び固相担体を結合する、特定の官能基を有する化合物をいう。
CPG（Controlled Pore Glass）：微多孔質ガラスビーズであり、材質がシリカである。 CPG球体の内部に数多くの不規則な細孔があり、間隙ネットワークが大きく、細孔のサイズを孔径と呼ばれ、孔径が安定する。
【００１２】
本発明は、DNAコード化化合物ライブラリーの固相合成方法を提供する。該方法は、
固相担体G-1とリンカー分子L-1とを反応させた後、分離、精製し、L-G-1を得るステップaと、
0006554180.tif 000002
DNAとリンカー分子L-0とを反応させた後、分離、精製し、L-2を得るステップbと、
0006554180.tif 000003
L-G-1とL-2とを反応させた後、分離、精製し、L-G-2を得るステップcと、
0006554180.tif 000004
L-G-2の保護基を脱離させ、L-G-2-1を得るステップdと、
方法1、方法2、方法3若しくは方法4、又はそれらの任意の組合せを採用するステップeと、
L-G-3-I、L-G-3-1及び/又はL-G-3-2の固相担体を除去し、DNAコード化した化合物ライブラリーであるL-D-Tを得るステップfと、を含み、
前記方法1は、L-G-2-1とR1とを反応させ、分離、精製し、L-G-2-1-1を得た後、L-G-2-1-1をDNAコード化し、L-G-3-Iを得るステップを含み、
0006554180.tif 000005
前記方法2は、
L-G-2-1と骨格分子とを反応させ、分離、精製し、L-G-2-2を得るステップiと、
0006554180.tif 000006
L-G-2-2又はL-G-2-2の保護基を脱離させた後、R1と反応させ、分離、精製し、L-G-2-2-1を得、L-G-2-2-1をDNAコード化し、L-G-3-1を得るステップiiと、を含み、
0006554180.tif 000007
前記方法3は、
L-G-2-1と骨格分子とを反応させ、分離、精製し、L-G-2-2を得るステップとi、
L-G-2-2又はL-G-2-2の保護基を脱離させた後、R1と反応させ、分離、精製し、L-G-2-2-1を得、L-G-2-2-1をDNAコード化し、L-G-3-1を得るステップiiと、
L-G-3-1又はL-G-3-1の保護基を脱離させた後、R2と反応させ、分離、精製し、L-G-3-1-1を得、L-G-3-1-1をDNAコード化し、L-G-3-2を得るステップiiiと、を含み、
0006554180.tif 000008
前記方法4：
L-G-2-1と骨格分子とを反応させ、分離、精製し、L-G-2-2を得、L-G-2-2をDNAコード化し、L-G-3-1を得るステップiと、
L-G-3-1又はL-G-3-1の保護基を脱離させた後、R2と反応させ、分離、精製し、L-G-3-1-1を得、L-G-3-1-1をDNAコード化し、L-G-3-2を得るステップiiと、を含み、
ここで、R1、R2は、ビルディングブロックである。
【００１３】
さらに、ステップaにおいて、前記固相担体は、PEG樹脂、PEGA樹脂、無機物固相担体、PEシートのうちいずれか１種又は複数種からなる群から選択される。
さらに、ステップaにおいて、前記固相担体は、アミノ反応性官能基を有する固相担体から選択され、好ましくは、前記固相担体が
0006554180.tif 000009
である。
さらに、ステップaにおいて、前記リンカー分子L-1は、エステル基、脂質基、チオエステル基、O-ニトロベンジル基、クマリン基、芳香族ケトン基、アジド基、ヒドロキシル基、メルカプト基、チオエーテル基、カルボキシル基、アルデヒド基、アミノ基、アミン基、アミド基、アルケニル基、アルキニル基からなる群から選択されるいずれか１種又は複数種の官能基を有する化合物であり、好ましくは、前記リンカー分子L-1は、
0006554180.tif 000010
又は
0006554180.tif 000011
である。
さらに、ステップaにおいて、固相担体G-1とリンカー分子L-1との重量比が1：0.08〜0.2であり、好ましくは、固相担体G-1とリンカー分子L-1との重量比が1：0.138である。
さらに、ステップaにおいて、反応溶媒は、ハロゲン化炭化水素系溶媒であり、好ましくは、反応溶媒は、ジクロロメタンである。
さらに、ステップaにおいて、反応温度は、15〜25℃、反応時間は、12〜16時間である。
さらに、ステップaにおいて、分離、精製の方法は、溶媒を除去し、固体を得た後、DMF及びジクロロメタンで固体を洗浄することである。
さらに、ステップaにおいて、前記L-G-1は、
0006554180.tif 000012
である。
さらに、ステップbにおいて、前記DNAは、一本鎖DNAである。
さらに、ステップbにおいて、前記リンカー分子L-0は、エステル基、脂質基、チオエステル基、O-ニトロベンジル基、クマリン基、芳香族ケトン基、アジド基、ヒドロキシル基、メルカプト基、チオエーテル基、カルボキシル基、アルデヒド基、アミノ基、アミン基、アミド基、アルケニル基、アルキニル基からなる群から選択されるいずれか１種又は複数種を含む官能基を有する化合物であり、好ましくは、前記リンカー分子L-0は、
0006554180.tif 000013
又は
0006554180.tif 000014
である。
さらに、ステップbにおいて、反応は、縮合剤の条件下で進む。
さらに、ステップbにおいて、前記縮合剤は、2-クロロ-4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジンである。
さらに、ステップbにおいて、DNAとリンカー分子L-0とのモル比は、1：50~300であり、リンカー分子L-0と縮合剤とのモル比は、1：1〜2であり、好ましくは、DNAとリンカー分子L-0とのモル比は、1：100であり、リンカー分子L-0と縮合剤とのモル比は、1：1である。
さらに、ステップbにおいて、反応温度は、15〜25℃、反応時間は、12〜16時間である。
さらに、ステップbにおいて、分離、精製の方法は、pH=4〜5に調節し、その後、エタノールを加え、-20℃で沈殿した後、遠心して得られた固体を洗浄することである。
さらに、ステップbにおいて、前記L-2は、
0006554180.tif 000015
である。
さらに、ステップcにおいて、反応は、有機溶媒の条件下で進み、好ましくは、反応は、ピリジンの条件下で進む。
さらに、ステップcにおいて、L-G-1とL-2とのモル比は2〜10：1であり、L-G-1とピリジンとの重量体積比は、1：0.8〜2.5 mg/μLであり、好ましくは、L-G-1とL-2とのモル比は5：1であり、L-G-1とピリジンとの重量体積比は、1：1 mg/μLである。
さらに、ステップcにおいて、反応温度は、20〜45℃、反応時間は、14〜30 時間であり、好ましくは、反応温度は、40℃、反応時間は、21hである。
さらに、ステップcにおいて、分離、精製の方法は、溶媒を除去し、固体を得、固体を水及びTEAA緩衝溶液で洗浄することである。
さらに、ステップcにおいて、前記L-G-2は、
0006554180.tif 000016
である。
さらに、ステップdにおいて、前記保護基は、アミノ保護基であり、好ましくは、前記保護基は、フルオレニルメトキシカルボニルである。
さらに、ステップdにおいて、L-G-2は、ピペリジン、窒素含有溶媒の条件下でその保護基を脱離し、前記L-G-2とピペリジンとのモル体積比は、1：100~10000mol/Lであり、前記ピペリジンと窒素含有溶媒との体積比は、1〜4：5〜20である。
さらに、ステップdにおいて、前記L-G-2-1は、
0006554180.tif 000017
である。
さらに、ステップeにおいて、DNAコード化の方法は、タグ配列iをL-G-2-1-1、L-G-2-2-1、L-G-3-1-1又はL-G-2-2のDNA直列に接続させることにより、タグ配列iでRiにタグを特異的に付け（ここで、Riは、ビルディングブロックであり、i=1，2であり）、合成の過程において、新しいRiを導入するたびに、DNA又はタグ配列（i-1）にタグ配列iを直列に接続させ、合成が終了した後、タグ配列iに末端配列を接続させることである。
さらに、ステップeにおいて、前記R1、R2は、それぞれ又は同時に、多官能基化合物から選択され、前記多官能基は、互いに独立してアミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、アルケニル基、アルキニル基、ハロゲン、アジド基、ヒドロキシル基、メルカプト基、フェニル基のうちのいずれか２種又は2種以上から選択され、好ましくは、前記R1、R2は、それぞれ又は同時にアミノ酸、置換されているか又は置換されていないカルボン酸、置換されているか又は置換されていないアミン、置換されているか又は置換されていないオレフィン、置換されているか又は置換されていないアルキン、置換されているか又は置換されていないアルデヒド、イソシアネートから選択され、より好ましくは、前記R1、R2は、それぞれ又は同時にイソシアネート、ベンジルアルコール又は安息香酸から選択される。
さらに、ステップeにおいて、前記骨格分子は、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、シアノ、アルデヒド基のうちのいずれか1種又は２種以上を含む。
さらに、ステップeにおいて、前記骨格分子は、p-ヒドロキシフェニルプロピオン酸、p-アミノ安息香酸、p-ヒドロキシフェニルグリシン、N-フルオレニルメトキシカルボニル-グリシン、N-フルオレニルメトキシカルボニル-L-フェニルアラニン、tert-ブチルイソニトリル、シクロヘキシルイソニトリル、3-メチルブチルアルデヒド、シクロペンチルアルデヒド、
0006554180.tif 000018
のうちのいずれか1種又は２種以上から選択される。
さらに、ステップeの方法１において、反応は、有機アミン及び有機溶媒の条件下で進み、好ましくは、反応は、トリエチルアミン及びN,N-ジメチルホルムアミドの条件下で進む。
さらに、ステップeの方法１において、L-G-2-1と、R1と、有機アミンとのモル比は、1：50~500：50~500であり、L-G-2-1と有機溶媒とのモル体積比は、1：50~500 nmol/μLであり、好ましくは、L-G-2-1と、R1と、有機アミンとのモル比は、1:150:150であり、L-G-2-1と有機溶媒とのモル体積比は、1:240nmol/μLである。
さらに、ステップeの方法１において、反応温度は、25℃〜30℃、反応時間は、12h〜16hである。
さらに、ステップeの方法１において、分離、精製の方法は、溶媒を除去し、固体を得、固体を水及びTEAA緩衝溶液で洗浄することである。
さらに、ステップeの方法2又は方法3において、ステップiの反応は、縮合剤、有機アミン及び有機溶媒の条件下で進み、ステップeの方法4において、ステップiの反応は、有機溶媒の条件下で進み、好ましくは、反応は、2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチル尿素ヘキサフルオロホスフェート、N,N-ジイソプロピルエチルアミン及び窒素含有溶媒の条件下で進み、
前記L-G-2-1と、骨格分子と、縮合剤と、有機アミンとのモル比は、1：50~500：50~500：50~500であり、前記化合物L-G-2-1と窒素含有溶媒とのモル体積比は、50~500 nmol/μLである。
さらに、ステップeの方法2、方法3又は方法4において、ステップiの反応温度は、25℃〜30℃、反応時間は、12h〜16hである。
さらに、ステップeの方法2、方法3又は方法4において、ステップiの分離、精製の方法は、溶媒を除去し、固体を得、固体を水及びTEAA緩衝溶液で洗浄することである。
さらに、ステップeの方法2、方法3又は方法4において、ステップiiの反応は、有機アミン又は有機ホスフィン及び有機溶媒の条件下で進み、好ましくは、前記有機アミンは、N,N-ジイソプロピルエチルアミン又はトリエチルアミンから選択され、前記有機ホスフィンは、トリフェニルホスフィンから選択され、前記有機溶媒は、ハロゲン化炭化水素系溶媒、エーテル系溶媒又は窒素含有溶媒から選択され、好ましくは、前記エーテル系溶媒は、テトラヒドロフランから選択され、前記窒素含有溶媒は、N,N-ジメチルホルムアミドから選択される。
さらに、ステップeの方法2、方法3又は方法4において、ステップiiの反応温度は、25℃〜30℃、反応時間は、12h〜16hである。
さらに、ステップeの方法2、方法3又は方法4において、ステップiiの分離、精製の方法は、溶媒を除去し、固体を得、固体を水及びTEAA緩衝溶液で洗浄することである。
さらに、ステップeの方法2、方法3又は方法4において、L-G-2-2又はL-G-3-1の保護基を脱離させる方法は、L-G-2-2又はL-G-3-1にピペリジンを加え、25℃〜30℃で2h〜6h撹拌しながら反応させた後、溶媒を除去し、固体を得、固体を水及びTEAA緩衝溶液で洗浄することである。
さらに、ステップeの方法3又は方法4において、R2との反応は、有機アミン及び有機溶媒の条件下で進み、好ましくは、前記有機アミンは、N,N-ジイソプロピルエチルアミン又はトリエチルアミンから選択され、有機溶媒は、ハロゲン化炭化水素系溶媒から選択される。
さらに、ステップeの方法3又は方法4において、R2との反応の反応温度は、25℃〜30℃、反応時間は、12h〜16hである。
さらに、ステップeの方法3又は方法4において、ステップiiiの分離、精製の方法は、溶媒を除去し、固体を得、固体を水及びTEAA緩衝溶液で洗浄することである。
さらに、ステップeにおいて、
前記L-G-3-Iは、
0006554180.tif 000019
であり、
前記L-G-2-2は、
0006554180.tif 000020
又は
0006554180.tif 000021
であり、
前記L-G-3-1は、
0006554180.tif 000022
、
0006554180.tif 000023
又は
0006554180.tif 000024
であり、
其中，Rjは、イソシアネートを形成できる基である。
さらに、ステップfにおいて、固相担体を除去する方法は
(a)L-G-3-I、L-G-3-1及び/又はL-G-3-2に塩基を加え、反応させた後、分離、精製すること、又は
(b)L-G-3-I、L-G-3-1及び/又はL-G-3-2にPBS緩衝溶液を加え、光源下で分解反応させた後、分離、精製することである。
さらに、(a)において、前記塩基は、有機塩基又は無機塩基から選択され、反応温度は、30~60℃、反応時間は、1~10時間であり、好ましくは、前記無機塩基は、アンモニア水であり、反応温度は、55℃、反応時間は、1時間である。
さらに、(b)において、前記光源の波長は、365nmであり、分解反応の反応温度は、25℃〜40℃、反応時間は、1h〜8hである。
さらに、(a)及び/又は(b)において、分離、精製の方法は、水及びTEAA緩衝溶液で洗浄して得られた濾液を濃縮した後、エタノールを加え、-20℃で沈殿した後、遠心して固体を得、洗浄することである。
さらに、ステップfにおいて、前記L-D-Tは、
0006554180.tif 000025
、
0006554180.tif 000026
、
0006554180.tif 000027
、
0006554180.tif 000028
又は
0006554180.tif 000029
；
であり、Rjは、イソシアネートを形成できる基であり、R1-aは、CH2又はC6H5CH2CHであり、R1-bは、ｎ-ブチル、イソブチル、tert-ブチル又はシクロヘキシルであり、R1-cは、ｎ-プロピル、イソプロピル又はシクロペンチルであり、Rkは、カルボン酸、アルデヒド、イソシアネートのいずれか１種とアミノとの反応により生成される基である。
【００１４】
本発明は、式Iに表される一般式を有するDNAコード化化合物ライブラリーをさらに提供する。
0006554180.tif 000030
式I
（式Iにおいて、
0006554180.tif 000031
は、化合物ライブラリーの骨格分子であり、
Ri'は、水素又はビルディングブロックから選択され、
Eは、アミン基、アルケニル基、アルキニル基、アミド基、脂質基、チオエーテル基又はアジド基から選択され、
Aは、ヒドロキシル基、メルカプト基から選択され、
Bは、
0006554180.tif 000032
、
0006554180.tif 000033
、
0006554180.tif 000034
、
0006554180.tif 000035
又は
0006554180.tif 000036
から選択され、Rは、水素、C1〜C8アルキル基若しくはC1〜C8アルケニル基であり、又はB1における原子と環を形成し、B1は、置換されているか又は置換されていないアルキニル基、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、アジド基又はメルカプト基から選択され、
0006554180.tif 000037
は、DNAを示す。）
さらに、前記骨格分子は、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、シアノ基、アルデヒド基のうちのいずれか1種又は２種以上を含む。
さらに、前記骨格分子は、p-ヒドロキシフェニルプロピオン酸、p-アミノ安息香酸、p-ヒドロキシフェニルグリシン、N-フルオレニルメトキシカルボニル-グリシン、N-フルオレニルメトキシカルボニル-L-フェニルアラニン、tert-ブチルイソニトリル、シクロヘキシルイソニトリル、3-メチルブチルアルデヒド、シクロペンチルアルデヒド、
0006554180.tif 000038
のうちのいずれか1種又は２種以上からなる群から選択される。
さらに、前記Aの長さは、10〜50個の原子である。
さらに、以下のDNAコード化化合物ライブラリー、即ち、
0006554180.tif 000039
、
0006554180.tif 000040
、
0006554180.tif 000041
、
0006554180.tif 000042
又は
0006554180.tif 000043
を含み、
Rjは、イソシアネートを形成できる基であり、R1-aは、CH2又はC6H5CH2CHであり、R1-bは、ｎ-ブチル、イソブチル、tert-ブチル又はシクロヘキシルであり、R1-cは、ｎ-プロピル、イソプロピル又はシクロペンチルであり、Rkは、任意のカルボン酸、アルデヒド、イソシアネートのいずれか１種とアミノとの反応により生成される基である。
【００１５】
従来のDNAコード化化合物ライブラリーの液相合成の方法に比べて、本発明の方法は、ただ数回のろ過・洗浄操作だけにより、反応後の処理、精製を完成することができ、操作が簡単で、DNAコード化化合物ライブラリーの生産周期を50%以上短縮させ、DNAコード化化合物ライブラリーの生産効率、唯一性、及び最終産物の純度を顕著に向上させ、経済的価値が高く、産業上の応用に非常に適している。
【００１６】
例を挙げて、本発明の技術手段をさらに説明する。
（1）、G-1 (0.5 g, 負荷量:32 μmol/g)に3 mLの化合物L-1(69 mg, 0.1 mmol；製造者： Aldrich）を含有するジクロロメタン溶液を加え、室温で一晩反応させ、反応終了後、ろ過により溶媒を除去し、固体を得た。LC-MS検出により濾液に化合物L-1を含まないことを確認したまで、固体をそれぞれDMF(2 mL×3)及びジクロロメタン(2 mL×3)で洗浄し、L-G-1を得た。
L-G-1の一部を取り、ピペリジンでFmoc保護基を脱離させ、遊離アミノ基の紫外線吸収により定量した結果、CPGの負荷量は14.5 μmol/gであることを確認した。
（2）一本鎖DNAを30 μLのNaHCO3緩衝溶液に溶解させ、20 mlのL-0(1.0 mg, 3.0 μmol；製造者：Aldrich）のDMSO溶液、10 μLのDMT-MM (0.83 mg, 3.0 μmol)の水溶液を順次加え、室温で一晩反応させ、反応終了後、3MのHCl溶液を加えてpH=4〜5に調節し、240 μLのエタノールを加え、-20℃で2 時間沈殿した後、遠心し、固体を得えた。固体を85%のエタノールで１回洗浄し、L-2を得た。
（3）L-G-1 (10 mg, 140 nmol)に90 μLのL-2 (28 nmol)を含有する水溶液及び10 μLのピリジンを加え、40℃で21時間撹拌しながら反応させ、反応終了後、ろ過により溶媒を除去し、固体を得た。固体をそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で３回洗浄し、L-G-2を得た。
（4）L-G-2に窒素含有溶媒及びピペリジンを加え、25℃〜30℃で4h~ 6h撹拌しながら反応させ、反応終了後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で３回洗浄し，L-G-2-1を得た。
前記L-G-2とピペリジンとのモル体積比は、1：（1〜4）mol/mlであり、前記ピペリジンと窒素含有溶媒との体積比は、（1〜4）：（5〜20）である。
（5）L-G-2-1にカルボン酸官能基を有する骨格分子、2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチル尿素ヘキサフルオロホスフェート、N,N-ジイソプロピルエチルアミン、及びハロゲン化炭化水素系溶媒を加え、25℃〜30℃で撹拌しながら12h〜16h反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で３回洗浄し、L-G-2-2.aを得た。
前記L-G-2-1と、カルボン酸官能基を有する骨格分子と、2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチル尿素ヘキサフルオロホスフェートと、N,N-ジイソプロピルエチルアミンとのモル比は1：（1〜2）：（1〜2）：（2〜4）であり、前記化合物L-G-2-1とハロゲン化炭化水素系溶媒との質量体積比は、1：（9〜20）g/mlである。
（6）L-G-2-2.aにRi（Riは、ビルディングブロックであり、イソシアネート、ベンジルアルコール又は安息香酸から選択されることがき、i=1、2又は3である）、N,N-ジイソプロピルエチルアミン、及びハロゲン化炭化水素系溶媒を加え、25℃〜30℃で12h〜16h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で３回洗浄し、L-G-2-2-1.aを得た。
各ステップのビルディングブロック化学反応による精製が終了した度に、特許出願（出願番号：201210555548.3、発明名称：「リード化合物の合成及びスクリーニング方法、並びにキット」）に開示されたDNAコード技術により本発明の化合物ライブラリーのR1、R2、R3に対して生体触媒によるDNAコードを行い、L-G-3-1.aを得た。
（7）塩基除去又は光除去の方法により、L-G-3-1.aにおけるCPGを除去し、DNAコード化した化合物ライブラリーL-D-T-1を得た。
【００１７】
本発明の上記の教示に照らして、当技術分野における通常の技術的知識および従来の手段に照らして、本発明の基本的技術思想から逸脱することなく、様々な他の修正、置換又は変更を行うことができることは明らかであろう。
【００１８】
以下、実施例を参照しながら本発明の上記内容をさらに詳細に説明する。上記主題の範囲が以下の実施例に限定されることは理解されるべきではない。 上記に基づいて実施される技術は、本発明の範囲内にあるものとする。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の実施形態に使用される原料、設備は、いずれも既知製品であり、市販品を購入することにより得られる。
【００２０】
略称
Fmoc：フルオレニルメトキシカルボニル、DMF：N,N-ジメチルホルムアミド；DMSO：ジメチルスルホキシド；DMT-MM：2-クロロ-4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン；TEAA：酢酸トリエチルアミン；DIEA：N,N-ジイソプロピルエチルアミン。
【００２１】
実施例1  
【００２２】
（1）、L-G-1の調製
0006554180.tif 000044
G-1（0.5 g、CPG初期負荷量：32 μmol/g、上海凌江実業発展有限公司）に3 mLの化合物L-1（69 mg，0.1 mmol；製造者：Aldrich）を含有するジクロロメタン溶液を加え、室温で一晩反応させ、反応終了後、ろ過により溶媒を除去し、固体を得た。固体をそれぞれDMF（2 mL×3）及びジクロロメタン（2 mL×3）で洗浄し、L-G-1を得た。
L-G-1を取り、そこにピペリジンでFmoc保護基を脱離させ、Fmocの脱離生成物の紫外線吸収により定量した結果、L-G-1の負荷量が14.5 μmol/g、収量が91%であることを確認した。
【００２３】
（2）、L-2の調製
0006554180.tif 000045
一本鎖DNA（32.0 nmol，分子量7663.9）（一本鎖DNAの配列：GGAGCTTGTGAATTCTGGCACTCG）を30 μLのNaHCO3緩衝溶液に溶解させ、20 mlのL-0（1.0 mg，3.0 μmol；製造者：Aldrich）のDMSO溶液、10 μLのDMT-MM（0.83 mg，3.0 μmol）の水溶液を加え、室温で一晩反応させ、反応終了後、3MのHCl溶液を加えてpH=4〜5に調節し、240 μLのエタノールを加え、-20℃で2時間沈殿した後遠心し、固体を得た。固体を85%エタノールで１回洗浄し、L-2を得た。OD紫外線吸収により定量した結果、L-2の量が28.0 nmol、収量が80%であることを確認した。
MS (ESI) m/z 7979.6（M+1）+。
【００２４】
（3）、L-G-2の調製
0006554180.tif 000046
L-G-1 (10 mg, 140 nmol)に90 μLのL-2 (28 nmol)を含有する水溶液及び10 μLのピリジンを加え、40℃で21時間撹拌しながら反応させ、反応終了後、ろ過により溶媒を除去し、固体を得た。固体をそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で３回洗浄し、L-G-2を得た。
【００２５】
（4）、L-G-2-1の調製
0006554180.tif 000047
L-G-2（8.0 mg）にDMF（160 μL）及びピペリジン（40 μL）を加え、25℃〜30℃で6h撹拌しながら反応させ、反応終了後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で３回洗浄し、L-G-2-1を得た。
L-G-2-1の一部（3.0 mg）を取り、そこに150 μLの濃アンモニア水を加え、55℃に加熱し、1時間反応させ、固相担体を除去し、ろ過後減圧蒸留して溶媒を除去し、固体をそれぞれ0.1 MのTEAA緩衝液及び蒸留水３回洗浄した。250 μLエタノール及び100 μL酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液（pH=4.7，0.5 M）を加え、-20℃で沈殿し、DNA成分を得た。OD紫外線吸収により定量した結果、L-G-2-1におけるDNA物質量が6.0 nmol、収量が65%であることを確認した。
MS (ESI) m/z 8251.0（M+1）+。
【００２６】
（5）、L-G-2-2.aの調製
0006554180.tif 000048
L-G-2-1にカルボン酸官能基を有する骨格分子、2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチル尿素ヘキサフルオロホスフェート、DIEA、及びDMFを加え、25℃〜30℃で16h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で３回洗浄し、L-G-2-2.aを得た。
【００２７】
具体的には、L-G-2-1（20 mg）にp-アミノ安息香酸（製造者：Alfa，4.15 mg）、2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチル尿素ヘキサフルオロホスフェート（製造者：Alfa， 6.9 mg）、DIEA（20 μL）及びDMF（60 μL）を加え、25℃〜30℃で16 h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で３回洗浄し、L-G-2-2.aを得た。
【００２８】
L-G-2-2.aの一部（3.0 mg）を取り、そこに150 μLの濃アンモニア水を加え、55℃に加熱し、1時間反応させて固相担体を除去し、ろ過後減圧蒸留して溶媒を除去し、固体をそれぞれ0.1 MのTEAA緩衝液及び蒸留水で３回洗浄した。250 μLエタノール及び100 μL酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液（pH=4.7，0.5 M）を加え、-20℃で沈殿し、DNA成分を得た。OD紫外線吸収により定量した結果、L-G-2-2-2.aにおけるDNA物質量が4.5 nmol、収量が75%であることを確認した。
MS (ESI) m/z 8369.7（M+1）+。
【００２９】
（6）、L-G-3-1.aの調製
0006554180.tif 000049
L-G-2-2.aにRj'（Rj'は、ビルディングブロックであり、Rjで置換されたイソシアネートから選択される）、DIEA及びDMFを加え、25℃〜30℃で16h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で３回洗浄し、L-G-2-2-1.aを得た。
発明名称：「リード化合物の合成及びスクリーニング方法、並びにキット」（出願番号：201210555548.3）に記載のDNAコード化方法により、L-G-2-2-1.aに対して固相条件下でのDNAコード化（一本鎖DNAの配列：GGAGCTTGTGAAGGCTGGCACTCG）を行い、L-G-3-1.aを得た。
コード化終了後、固体をそれぞれ0.1 MのTEAA緩衝溶液（4×100μL）及び蒸留水（4×100 μL）で洗浄し、さらに、100 μL蒸留水で洗浄した後、固体の一部を取り、そこに50μLのアンモニア水を加え、55℃で1時間反応させ、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝溶液及び蒸留水で３回洗浄し、得られた濾液をエタノールで沈殿し、凍結乾燥した後、アガロース電気泳動検出に使用した。
【００３０】
（7）、L-D-T -1化合物ライブラリーの合成
0006554180.tif 000050
塩基除去又は光除去の方法によりL-G-3-1.aにおけるCPGを除去し、DNAコード化した化合物ライブラリーL-D-T-1を得た。
【００３１】
実施例2
（1）実施例1における L-G-1の調製方法に従って、L-G-1を得た。
（2）実施例1におけるL-2の調製方法に従って、L-2を得た。
（3）実施例1におけるL-G-2の調製方法に従って、L-G-2を得た。
（4）実施例1におけるL-G-2-1の調製方法に従って、L-G-2-1を得た。
（5）L-G-3-1.bの調製
0006554180.tif 000051
L-G-2-1（5.0 mg）に2-エチルフェニルイソシアネート（1.47 mg；製造者：Alfa）、トリエチルアミン（5 μL）及びDMF（15 μL）を加え、25℃〜30℃で16h反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で３回洗浄し、L-G-2-1-1.bを得た。
L-G-2-1-1.bの一部（2.0 mg）を取り、そこに150 μLの濃アンモニア水を加え、55℃に加熱し、1時間反応させて固相担体を除去し、ろ過後減圧蒸留して溶媒を除去し、固体をそれぞれ0.1 MのTEAA緩衝液及び蒸留水で３回洗浄した。250 μLエタノール及び100 μL酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液（pH=4.7，0.5 M）を加え、-20℃で沈殿し、DNA成分を得た。OD紫外線吸収により定量した結果、L-G-2-1-1.bにおけるDNA物質量が2.5 nmol、収量が63%であることを確認した。
MS (ESI) m/z 8395.4（M+1）+。
発明名称：「リード化合物の合成及びスクリーニング方法、並びにキット」（出願番号：201210555548.3）に記載のDNAコード化方法により、L-G-2-1-1.bに対して、固相条件下でのDNAコード化（一本鎖DNAの配列：GGAGCTTGTGAACCCTGGCACTCG）を行い、L-G-3-1.bを得た。
コード化終了後、固体をそれぞれ0.1 MのTEAA緩衝溶液（4×100μL）及び蒸留水（4×100 μL）で洗浄し、さらに、100 μL蒸留水で洗浄した後、固体の一部を取り、50 μLのアンモニア水を加え、55℃で1 時間反応させ、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝溶液及び蒸留水で３回洗浄し、得られた濾液をエタノールで沈殿し、凍結乾燥し、アガロース電気泳動検出に使用した。
（6）実施例1におけるL-D-T-1の調製方法に従って、L-D-T-2を得た。
0006554180.tif 000052
【００３２】
実施例3
（1）実施例1における L-G-1の調製方法に従って、L-G-1を得た。
（2）実施例1におけるL-2の調製方法に従って、L-2を得た。
（3）実施例1におけるL-G-2の調製方法に従って、L-G-2を得た。
（4）実施例1におけるL-G-2-1の調製方法に従って、L-G-2-1を得た。
（5）L-G-2-2.cの調製
0006554180.tif 000053
L-G-2-1（20 mg）にｐ-アミノ安息香酸（4.15 mg，製造者：Alfa）、2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチル尿素ヘキサフルオロホスフェート（6.9 mg，製造者：Alfa）、DIEA（20 μL）、及びDMF（60 μL）を加え、25℃〜30℃で16h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で３回洗浄し、L-G-2-2.cを得た。
L-G-2-2.cの一部（2.0 mg）を取り、150 μLの濃アンモニア水を加え、55℃に加熱し、1時間反応させて固相担体を除去し、ろ過後減圧蒸留して溶媒を除去し、固体をそれぞれ0.1 MのTEAA緩衝液及び蒸留水で３回洗浄した。250 μLエタノール及び100 μL酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液（pH=4.7，0.5 M）を加え、-20℃で沈殿し、DNA成分を得た。OD紫外線吸収により定量した結果、L-G-2-2.cにおけるDNA物質量が3.0 nmol、収量が75%であることを確認した。
MS (ESI) m/z 8369.7（M+1）+。
（6）L-G-3-1.cの調製
0006554180.tif 000054
L-G-2-2.c（10 mg）に安息香酸（2.0 mg）、2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチル尿素ヘキサフルオロホスフェート（6.9 mg，製造者： Alfa）、DIEA（20 μL）、及びDMF（60 μL）を加え、25℃〜30℃で16h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1Mの TEAA緩衝溶液で３回洗浄し、L-G-2-2-1.cを得た。
L-G-2-2-1.cの一部（2.0 mg）を取り、そこに150 μLの濃アンモニア水を加え、55℃に加熱し、1時間反応させて固相担体を除去し、ろ過後減圧蒸留して溶媒を除去し、固体をそれぞれ0.1 MのTEAA緩衝液及び蒸留水で３回洗浄した。250 μLエタノール及び100 μL酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液（pH=4.7，0.5 M）を加え、-20℃で沈殿し、DNA成分を得た。OD紫外線吸収により定量した結果、L-G-2-2-1.cにおけるDNA物質量が1.5 nmol、収量が38%であることを確認した。
MS (ESI) m/z 8473.1（M+1）+。
発明名称：「リード化合物の合成及びスクリーニング方法、並びにキット」（出願番号：201210555548.3）に記載のDNAコード化方法により、L-G-2-2-1.cに対して、固相条件下でのDNAコード化（一本鎖DNAの配列：GGAGCTTGTGAAATCTGGCACTCG）を行い、L-G-3-1.cを得た。
コード化した後、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝溶液（4×100μL）及び蒸留水（4×100 μL）で洗浄し、100 μL蒸留水で洗浄し、洗浄した後、固体の一部を取り、そこに50 μLのアンモニア水を加え、55℃で1 時間反応させ、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝溶液及び蒸留水で３回洗浄し、得られた濾液をエタノールで沈殿し、凍結乾燥し、アガロース電気泳動検出に使用した。
（7）実施例1におけるL-D-T-1の調製方法に従って、L-D-T-3を得た。
0006554180.tif 000055
【００３３】
実施例4
（1）実施例1における L-G-1の調製方法に従って、L-G-1を得た。
（2）実施例1におけるL-2の調製方法に従って、L-2を得た。
（3）実施例1におけるL-G-2の調製方法に従って、L-G-2を得た。
（4）実施例1におけるL-G-2-1の調製方法に従って、L-G-2-1を得た。
（5）L-G-2-2.dの調製
0006554180.tif 000056
L-G-2-1（20 mg）にS-2（17.4 mg，製造者：Alfa）、2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチル尿素ヘキサフルオロホスフェート（6.9 mg，製造者：Alfa）、DIEA（20 μL）及びDMF（60 μL）を加え、25℃〜30℃で16h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で３回洗浄し、L-G-2-2.dを得た。
L-G-2-2.dの一部（2.0 mg）を取り、そこに150 μLの濃アンモニア水を加え、55℃に加熱し、1時間反応させて固相担体を除去し、ろ過後減圧蒸留して溶媒を除去し、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝液及び蒸留水で３回洗浄した。250 μLエタノール及び100 μL酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液（pH=4.7，0.5 M）を加え、-20℃で沈殿し、DNA成分を得た。OD紫外線吸収により定量した結果、L-G-2-2.dにおけるDNA物質量が2.0 nmol、収量が50%であることを確認した。
MS (ESI) m/z 8698.0（M+1）+。
（6）、L-G-3-1.dの調製
0006554180.tif 000057
L-G-2-2.d（15 mg）にピペリジン（40 μL）を加え、25℃〜30℃で6h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で３回洗浄し、固体を得た。固体にRj'（Rj'は、Rjで置換されたイソシアネートであり、 1.5 mg）、トリエチルアミン（10 μL）、及びDMF（100 μL）を加え、25℃〜30℃で16h反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で３回洗浄し、L-G-2-2-1.dを得た。
発明名称：「リード化合物の合成及びスクリーニング方法、並びにキット」（出願番号：201210555548.3）に記載のDNAコード化方法により、L-G-2-2-1.dに対して固相条件下でのDNAコード化（一本鎖DNAの配列：GGAGCTTGTGAATACTGGCACTCG）を行い、L-G-3-1.dを得た。
コード化した後、固体をそれぞれ0.1Mの TEAA緩衝溶液（4×100 μL）及び蒸留水（4×100 μL）で洗浄し、さらに100 μL蒸留水で洗浄し、洗浄した後、固体の一部を取り、50 μLアンモニア水を加え、55℃下で1 時間反応させ、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝溶液及び蒸留水で３回洗浄し、得られた濾液をエタノールで沈殿し、凍結乾燥し、アガロース電気泳動検出に使用した。
（7）、L-D-T-4化合物ライブラリーの合成
0006554180.tif 000058
L-G-3-1.d（10 mg）を取り、そこに150 μLの濃アンモニア水を加え、55℃に加熱し、1時間反応させて固相担体を除去し、ろ過後減圧蒸留して溶媒を除去し、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝液及び蒸留水で３回洗浄した。250 μLエタノール及び100 μL酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液（pH=4.7，0.5 M）を加え、-20℃で沈殿し、L-D-T-4を得た。
【００３４】
実施例5
（1）実施例1における L-G-1の調製方法に従って、L-G-1を得た。
（2）実施例1におけるL-2の調製方法に従って、L-2を得た。
（3）実施例1におけるL-G-2の調製方法に従って、L-G-2を得た。
（4）実施例1におけるL-G-2-1の調製方法に従って、L-G-2-1を得た。
（5）L-G-2-2.eの調製
0006554180.tif 000059
L-G-2-1にS-1、S-2、S-3及びDMFを加え、25~30℃で16h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で３回洗浄し、L-G-2-2.eを得た。
具体的には、L-G-2-1（20 mg）にN-フルオレニルメトキシカルボニル-グリシン（S-1）（製造者：Alfa，14.8 mg）、tert-ブチルイソニトリル（S-2）（製造者：Alfa，4.2 mg）、3-メチルブチルアルデヒド（S-3）（製造者：Alfa，4.3 mg）、及びDMF（100 μL）を加え、25℃〜30℃で16 h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で３回洗浄し、L-G-2-2.eを得た。
L-G-2-2.eの一部（2 mg）を取り、150 μLの濃アンモニア水を加え、55℃に加熱し、1時間反応させて固相担体を除去し、ろ過後減圧蒸留して溶媒を除去し、固体をそれぞれ0.1 MのTEAA緩衝液及び蒸留水で３回洗浄した。250 μLエタノール及び100 μL酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液（pH=4.7，0.5 M）を加え、-20℃で沈殿し、DNA成分を得た。OD紫外線吸収により定量した結果、L-G-2-2.eにおけるDNA物質量が38 nmol、収量が76%であることを確認した。
MS (ESI) m/z 9111.4（M+1）+。
（6）、L-G-3-1.eの調製
0006554180.tif 000060
発明名称：「リード化合物の合成及びスクリーニング方法、並びにキット」（出願番号：201210555548.3）に記載のDNAコード化方法により、L-G-2-2.eに対して固相条件下でのDNAコード化（一本鎖DNAの配列：GGAGCTTGTGAACGCTGGCACTCG）を行い、L-G-2-2-1.eを得た。コード化した後、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝溶液（4×100μL）及び蒸留水（4×100 μL）で洗浄し、さらに100 μL蒸留水で洗浄した後、固体の一部を取り、50 μLのアンモニア水を加え、55℃で1 時間反応させ、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝溶液及び蒸留水で３回洗浄し、得られた濾液をエタノールで沈殿し、凍結乾燥し、アガロース電気泳動検出に使用した。
L-G-2-2-1.e（10 mg）にピペリジン（40 μL）を加え、25℃〜30℃で6h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で３回洗浄し、固体を得た。固体にRk'（官能基にカルボン酸、アルデヒド基又はイソシアネートを有するビルディングブロックから選択できる）、2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチル尿素ヘキサフルオロホスフェート（6.1 mg，製造者：Alfa）、DIEA（20 μL）、及びDMF （60 μL）を加え、25℃〜30℃で16h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し，濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で３回洗浄し、L-G-3-1-1.eを得た。
発明名称：「リード化合物の合成及びスクリーニング方法、並びにキット」（出願番号：201210555548.3）に記載のDNAコード化方法により、L-G-3-1-1.eに対して固相条件下でのDNAコード化（一本鎖DNAの配列：GGAGCTTGTGAAGCCTGGCACTCG）を行い、L-G-3-1.eを得た。コード化した後、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝溶液（4×100 μL）及び蒸留水（4×100 μL）で洗浄し、100 μL蒸留水で洗浄した後、固体の一部を取り、50 μLアンモニア水を加え、55℃で1 時間反応させ、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝溶液及び蒸留水で３回洗浄し、得られた濾液をエタノールで沈殿し、凍結乾燥し、アガロース電気泳動検出に使用した。
（7）、L-D-T-5化合物ライブラリーの合成
0006554180.tif 000061
L-G-3-1.e（2 mg）を取り、そこにアンモニア水（40μL）を加え、55℃で1 h反応させ、固体をそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で数回洗浄し、濾液を得た。濾液を濃縮し、適量のエタノールを加え、-20℃で沈殿し、2h後遠心し、固体を得た。固体を85%エタノールで１回洗浄し、DNAコード化した化合物ライブラリーL-D-T-5を得た。
【００３５】
実施例6
（1）実施例1におけるL-G-1の調製方法に従って、L-G-1を得た。
（2）実施例1におけるL-2の調製方法に従って、L-2を得た。
（3）実施例1におけるL-G-2の調製方法に従って、L-G-2を得た。
（4）実施例1におけるL-G-2-1の調製方法に従って、L-G-2-1を得た。
（5）L-G-2-2.fの調製
0006554180.tif 000062
L-G-2-1にS-1、S-2、S-3及びDMFを加え、25~30℃で16h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で３回洗浄し、L-G-2-2.fを得た。
具体的には、L-G-2-1（20 mg）にN-フルオレニルメトキシカルボニル-L-フェニルアラニン（S-1）（製造者：Alfa，15.1 mg）、シクロヘキシルイソニトリル（S-2）（製造者：Alfa，4.8 mg）、シクロペンチルアルデヒド（S-3）（製造者：Alfa，4.1 mg）、及びDMF（100 μL）を加え、25℃〜30℃で16 h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で３回洗浄し、L-G-2-2.fを得た。
上述L-G-2-2.fの一部（2 mg）を取り、150 μLの濃アンモニア水を加え、55℃に加熱し、1時間反応させて固相担体を除去し、ろ過後減圧蒸留して溶媒を除去し、固体をそれぞれ0.1 MのTEAA緩衝液及び蒸留水で３回洗浄した。250 μLエタノール及び100 μL酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液（pH=4.7，0.5 M）を加え、-20℃で沈殿し、DNA成分を得た。OD紫外線吸収により定量した結果、L-G-2-2.fにおけるDNA物質量が35 nmol、収量が70%であることを確認した。
MS (ESI) m/z 9241.9（M+1）+。
（6）、L-G-3-1.fの調製
0006554180.tif 000063
発明名称：「リード化合物の合成及びスクリーニング方法、並びにキット」（出願番号：201210555548.3）に記載のDNAコード化方法により、L-G-2-2.fに対して固相条件下でのDNAコード化（一本鎖DNAの配列：GGAGCTTGTGAACGATGGCACTCG）を行い、L-G-2-2-1.fを得た。コード化した後、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝溶液（4×100μL）及び蒸留水（4×100 μL）で洗浄し、さらに、100 μL蒸留水で洗浄した後、固体の一部を取り、そこに50 μLアンモニア水を加え、55℃で1時間反応させ、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝溶液及び蒸留水で３回洗浄し、得られた濾液をエタノールで沈殿し、凍結乾燥し、アガロース電気泳動検出に使用した。
L-G-2-2-1.f（10 mg）にピペリジン（40 μL）を加え、25℃〜30℃で6h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で３回洗浄し、固体を得た。固体にRk'（官能基にカルボン酸、アルデヒド基及イソシアネートを有するビルディングブロックから選択できる）、2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチル尿素ヘキサフルオロホスフェート（6.1 mg，製造者：Alfa）、DIEA（20 μL）、及びDMF（60 μL）を加え、25℃〜30℃で16h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で３回洗浄し、L-G-3-1-1.fを得た。
発明名称：「リード化合物の合成及びスクリーニング方法、並びにキット」（出願番号：201210555548.3）に記載のDNAコード化方法によりL-G-3-1-1.fに対して固相条件下でのDNAコード化（一本鎖DNAの配列：GGAGCTTGTGAAGCGTGGCACTCG）を行い、L-G-3-1.fを得た。コード化した後、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝溶液（4×100 μL）及び蒸留水（4×100 μL）で洗浄し、さらに100 μL蒸留水で洗浄した後、固体の一部を取り、50 μLアンモニア水を加え、55℃で1時間反応させ、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝溶液及び蒸留水で３回洗浄し、得られた濾液をエタノールで沈殿し、凍結乾燥し、アガロース電気泳動検出に使用した。
（7）、L-D-T-6化合物ライブラリーの合成
0006554180.tif 000064
L-G-3-1.f（2 mg）を取り、アンモニア水（40 μL）を加え、55℃で1 h反応させ、固体をそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で２回洗浄し、濾液を得た。濾液を濃縮し、適量のエタノールを加え、-20℃で沈殿し、2h後遠心し、固体を得た。固体を85%エタノールで１回洗浄し、DNAコード化した化合物ライブラリーであるL-D-T-6を得た。
【００３６】
本発明の方法により、有機溶媒体系でのDNAコード化化合物ライブラリーの合成を実現でき、従来の液相条件でのDNAコード化化合物ライブラリーの合成で実現できない、又は合成効率が低い化学反応を順調に進めさせることができ、コード化化合物ライブラリーの化学反応のタイプ及び化合物ライブラリーの多様性をさらに拡充することができる。拡充される反応タイプは、有機触媒によるアルドール縮合反応、オレフィンメタセシス反応等を含む。これらの反応は、従来の液相系でのDNAコード化化合物ライブラリー合成において効率が極めて低いが、本発明の方法によりその合成効率を顕著に向上させることができる。
【００３７】
従来のDNAコード化化合物ライブラリーの液相合成の方法に比べて、本発明のCPG負荷DNAコード化化合物の合成技術は、ただ数回のろ過・洗浄操作だけにより、反応後の処理、精製を完成することができ、化学合成反応及びDNAコード化反応の後処理を簡単化し、分離精製の過程を簡単化し、DNAコード化化合物ライブラリーの合成周期を50%以上短縮させ、コストを大幅に節約し、精製の品質を向上させ、DNAコード化の効率、唯一性、及び最終産物の純度を顕著に向上させる。
【００３８】
本発明のDNAコード化化合物ライブラリーの合成方法は、過剰なDNAの除去に有利であり、DNAコード化化合物ライブラリーの合成過程における過剰なDNAによる後ほどのスクリーニング等の作業に対する干渉を低減し、新薬スクリーニングの標的性及び正確性を大幅に向上させる。
【００３９】
本発明で用いられるリンカー分子は、CPG、DNAと小分子とを適切な距離で接続することで、各機能ブロックの間の分子結合が温和な条件で形成でき、また、温和な条件で断裂でき、複数種の化学反応がDNAとCPGの共存で順調に進むことができる。
【配列表】
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