(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属イオンの９０ａｔ％以上がＳｒイオンであり、
表面に複数の柱状構造体からなる凹凸形状を有し、
前記柱状構造体の平均直径が５０〜５００ｎｍである、
ことを特徴とするハイドロキシアパタイト薄膜。
【請求項２】
前記柱状構造体の平均表面密度が前記ハイドロキシアパタイト薄膜の表面１００μｍ２当たり８００〜５０００個であり、
前記柱状構造体の平均ピッチが７０〜４００ｎｍである、
ことを特徴とする請求項１に記載のハイドロキシアパタイト薄膜。
【請求項３】
前記凹凸形状の平均深さが前記柱状構造体の平均中心軸長さの５０〜１００％であることを特徴とする請求項１又は２に記載のハイドロキシアパタイト薄膜。
【請求項４】
前記柱状構造体の平均直径が５０〜２００ｎｍであることを特徴とする請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載のハイドロキシアパタイト薄膜。
【請求項５】
金属又はその酸化物からなる基板の表面に配置されていることを特徴とする請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載のハイドロキシアパタイト薄膜。
【請求項６】
前記柱状構造体の中心軸と前記基板との成す角度が３０°以上であることを特徴とする請求項５に記載のハイドロキシアパタイト薄膜。
【請求項７】
共役酸の酸解離定数ｐＫａが４．８以下の電解質を含有する電解液に過酸化水素を添加した後、前記電解液中に配置したカソードとアノードとの間に通電しながら、ストロンチウム塩とリン酸化合物とを添加して、前記カソードの表面に金属イオンの９０ａｔ％以上がＳｒイオンであるハイドロキシアパタイトを成長せしめることを特徴とするハイドロキシアパタイトの製造方法。
【請求項８】
前記過酸化水素を還元しながら、前記ストロンチウム塩と前記リン酸化合物とを添加することを特徴とする請求項７に記載のハイドロキシアパタイトの製造方法。
【請求項９】
基板と、該基板の表面に配置された、請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載のハイドロキシアパタイト薄膜とを備えていることを特徴とする細胞培養基材。
【請求項１０】
請求項７又は８に記載のハイドロキシアパタイトの製造方法によって、前記カソードからなる基板の表面に前記ハイドロキシアパタイトからなる薄膜を形成することを特徴とする、前記基板と前記ハイドロキシアパタイト薄膜とを備える細胞培養基材の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載のハイドロキシアパタイト薄膜の表面で細胞を増殖させることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項１２】
前記細胞が付着性の動物細胞であることを特徴とする請求項１１に記載の細胞培養方法。
【請求項１３】
前記細胞が正常気道上皮細胞であることを特徴とする請求項１１に記載の細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイドロキシアパタイト及びその製造方法、並びにハイドロキシアパタイトを用いた細胞培養基材及び細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハイドロキシアパタイト（ＨＡｐ）は生体親和性に優れた材料であり、インプラント等のバイオマテリアルとして実用化されているほか、細胞を特定の形状に誘導することが可能な細胞培養基材への応用も検討されている。例えば、特開２００５−２７８６０９号公報（特許文献１）には、ハイドロキシアパタイトを所定の形状に形成した生体親和部と、これに隣接する非生体親和性材料又は難生体親和性材料からなる非生体親和部とを備えている細胞培養足場が開示されている。また、特開２００６−２５６９００号公報（特許文献２）には、２０〜２００μｍ周期のハイドロキシアパタイトの縞状パターンをゲル中に形成し、このゲルを焼成することによって、２０〜２００μｍ周期の波状パターンを表面に形成した焼結体からなるハイドロキシアパタイトシートを用いた細胞培養基板が開示されている。
【０００３】
従来のＨＡｐ薄膜は、化学式Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２で表されるカルシウムハイドロキシアパタイト（ＣａＨＡｐ）からなるものであり、通常得られるＣａＨＡｐ薄膜は、表面が平坦且つ緻密な薄膜や長さが数μｍのファイバが不規則に配置した薄膜（特開２０１０−２９０６５号公報（特許文献３））や、面方向の直径が数μｍの板状粒子が不規則に配置した薄膜（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１３年、第２８２巻、第４５６〜４６２頁（非特許文献１））であるため、ＣａＨＡｐ薄膜表面への細胞の付着性は十分ではなかった。
【０００４】
Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ、２００６年、第４７巻、第５号、第１３９１〜１３９４頁（非特許文献２）には、ＣａＨＡｐ薄膜表面に針状構造体からなる凹凸形状を形成することによって、骨誘導性が高くなることが開示されている。しかしながら、非特許文献２に記載されたＣａＨＡｐ薄膜の形成方法は生産性に劣るという問題があった。また、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１１年、第２５７巻、第４８１１〜４８１６頁（非特許文献３）にも、表面に微細な針状構造体からなる凹凸形状を備えているＣａＨＡｐ薄膜の形成方法が開示されているが、この方法も生産性に劣るという問題があった。
【０００５】
また、国際公開第２０１４／０３８４４７号（特許文献４）には、水性媒体と、結晶性を有するハイドロキシアパタイト微粒子と、ポリリン酸（塩）とを含むハイドロキシアパタイト微粒子分散物が開示されており、前記結晶性を有するハイドロキシアパタイトとして、ＣａＨＡｐ、ＣａＨＡｐ中のカルシウムイオンの一部又は全部がストロンチウムイオンによって置換されているストロンチウムアパタイト等が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−２７８６０９号公報
【特許文献２】特開２００６−２５６９００号公報
【特許文献３】特開２０１０−２９０６５号公報
【特許文献４】国際公開第２０１４／０３８４４７号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｙ．Ｈｕａｎｇら、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１３年、第２８２巻、第４５６〜４６２頁
【非特許文献２】Ｋ．Ｋｕｒｏｄａら、Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ、２００６年、第４７巻、第５号、第１３９１〜１３９４頁
【非特許文献３】Ｅ．Ｃ．Ｍｅｎｇら、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１１年、第２５７巻、第４８１１〜４８１６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、表面に微細な柱状構造体からなる凹凸形状を有するハイドロキシアパタイト、並びに、このようなハイドロキシアパタイトを容易に得ることが可能なハイドロキシアパタイトの製造方法を提供することを目的とする。
【０００９】
また、本発明は、このようなハイドロキシアパタイトを備える細胞培養基材、並びに、前記ハイドロキシアパタイトを用いた細胞培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、特定の電解質を含有する電解液に過酸化水素を添加した後、ストロンチウム塩とリン酸化合物とを添加して電析処理を行うことによって、表面に微細な柱状構造体からなる凹凸形状を有するハイドロキシアパタイトが得られることを見出し、さらに、このハイドロキシアパタイト表面で細胞を培養することによって、細胞増殖が促進されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明のハイドロキシアパタイト薄膜は、金属イオンの９０ａｔ％以上がＳｒイオンであり、表面に複数の柱状構造体からなる凹凸形状を有し、前記柱状構造体の平均直径が５０〜５００ｎｍである、ことを特徴とするものである。
【００１２】
本発明のハイドロキシアパタイト薄膜において、前記柱状構造体の平均表面密度としては前記ハイドロキシアパタイト薄膜の表面１００μｍ２当たり８００〜５０００個が好ましく、また、前記柱状構造体の平均ピッチとしては７０〜４００ｎｍが好ましく、前記凹凸形状の平均深さとしては前記柱状構造体の平均中心軸長さの５０〜１００％が好ましく、前記柱状構造体の平均直径としては５０〜２００ｎｍが好ましい。また、本発明のハイドロキシアパタイト薄膜は、金属又はその酸化物からなる基板の表面に配置されていることが好ましく、前記柱状構造体の中心軸と前記基板との成す角度が３０°以上であることがより好ましい。
【００１３】
また、本発明のハイドロキシアパタイトの製造方法は、共役酸の酸解離定数ｐＫａが４．８以下の電解質を含有する電解液に過酸化水素を添加した後、前記電解液中に配置したカソードとアノードとの間に通電しながら、ストロンチウム塩とリン酸化合物とを添加して、前記カソードの表面に金属イオンの９０ａｔ％以上がＳｒイオンであるハイドロキシアパタイトを成長せしめることを特徴とする方法である。このような本発明のハイドロキシアパタイトの製造方法においては、前記過酸化水素を還元しながら、前記ストロンチウム塩と前記リン酸化合物とを添加することが好ましい。
【００１４】
さらに、本発明の細胞培養基材は、基板と、該基板の表面に配置された、前記本発明のハイドロキシアパタイト薄膜とを備えていることを特徴とするものである。また、本発明の細胞培養基材の製造方法は、前記本発明のハイドロキシアパタイトの製造方法によって、前記カソードからなる基板の表面に前記ハイドロキシアパタイトからなる薄膜を形成することを特徴とする、前記基板と前記ハイドロキシアパタイト薄膜とを備える細胞培養基材の製造方法である。さらに、本発明の細胞培養方法は、前記本発明のハイドロキシアパタイト薄膜の表面で細胞を増殖させることを特徴とする方法である。また、前記細胞としては付着性の動物細胞又は正常気道上皮細胞であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、表面に微細な柱状構造体からなる凹凸形状を有するハイドロキシアパタイトを得ることができ、細胞増殖を促進することが可能な細胞培養基材及び細胞培養方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】柱状構造体の平均ピッチの測定方法を示す模式図である。
【図１Ｂ】柱状構造体の平均ピッチの測定方法を示す模式図である。
【図２】実施例で実施した電析処理を示す工程図である。
【図３】実施例で得られた薄膜のＸ線回折パターンを示すグラフである。
【図４Ａ】実施例１で得られた薄膜の表面を示す走査型電子顕微鏡写真である。
【図４Ｂ】実施例１で得られた薄膜の表面を示す走査型電子顕微鏡写真である。
【図５Ａ】実施例２で得られた薄膜の表面を示す走査型電子顕微鏡写真である。
【図５Ｂ】実施例２で得られた薄膜の表面を示す走査型電子顕微鏡写真である。
【図６Ａ】実施例３で得られた薄膜の表面を示す走査型電子顕微鏡写真である。
【図６Ｂ】実施例３で得られた薄膜の表面を示す走査型電子顕微鏡写真である。
【図７Ａ】比較例２で得られた薄膜の表面を示す走査型電子顕微鏡写真である。
【図７Ｂ】比較例２で得られた薄膜の表面を示す走査型電子顕微鏡写真である。
【図８Ａ】比較例３で得られた薄膜の表面を示す走査型電子顕微鏡写真である。
【図８Ｂ】比較例３で得られた薄膜の表面を示す走査型電子顕微鏡写真である。
【図９Ａ】実施例１で得られたＳｒＨＡｐ薄膜上の生細胞を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図９Ｂ】実施例１で得られたＳｒＨＡｐ薄膜上の死細胞を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１０Ａ】実施例２で得られたＳｒＨＡｐ薄膜上の生細胞を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１０Ｂ】実施例２で得られたＳｒＨＡｐ薄膜上の死細胞を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１１Ａ】実施例３で得られたＳｒＨＡｐ薄膜上の生細胞を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１１Ｂ】実施例３で得られたＳｒＨＡｐ薄膜上の死細胞を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１２Ａ】比較例２で得られたＣａＨＡｐ薄膜上の生細胞を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１２Ｂ】比較例２で得られたＣａＨＡｐ薄膜上の死細胞を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１３Ａ】比較例４で得られたＡＣＰ薄膜上の生細胞を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１３Ｂ】比較例４で得られたＡＣＰ薄膜上の死細胞を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１４Ａ】Ｔｉ基板上の生細胞を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１４Ｂ】Ｔｉ基板上の死細胞を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１５】実施例１〜３及び比較例２、４で得られた薄膜並びにＴｉ基板における生細胞数及び細胞死亡率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。
【００１８】
先ず、本発明のハイドロキシアパタイト（ＳｒＨＡｐ）について説明する。本発明のＳｒＨＡｐは、表面に複数の柱状構造体からなる凹凸形状を有し、前記柱状構造体の平均直径が５０〜５００ｎｍである、ものである。このようなＳｒＨＡｐの表面で細胞（例えば、付着性の動物細胞、正常気道上皮細胞等）を培養することによって、微細な柱状構造体からなる前記凹凸形状が細胞の足場となり、細胞増殖が促進される。前記柱状構造体の平均直径が前記範囲から逸脱すると、細胞増殖の促進効果が低下する。また、細胞増殖の促進効果が向上するという観点から、前記柱状構造体の平均直径としては５０〜２００ｎｍが好ましい。
【００１９】
本発明のＳｒＨＡｐは、金属イオンの９０ａｔ％以上がＳｒイオンである。これにより、細胞培養時の細胞死が抑制される。この細胞死の抑制効果が向上するという観点から、金属イオンの９５ａｔ％以上がＳｒイオンであることが好ましい。
【００２０】
本発明のＳｒＨＡｐにおいて、前記柱状構造体の平均表面密度としては、ＳｒＨＡｐの表面１００μｍ２当たり８００〜５０００個が好ましく、１０００〜３０００個がより好ましい。柱状構造体の平均表面密度が前記範囲から逸脱すると、細胞増殖の促進効果が低下する傾向にある。
【００２１】
また、前記柱状構造体の平均ピッチ（隣接する柱状構造体の上面の中心間距離の平均値）としては、７０〜４００ｎｍが好ましく、１５０〜３００ｎｍがより好ましい。柱状構造体の平均ピッチが前記範囲から逸脱すると、細胞増殖の促進効果が低下する傾向にある。なお、柱状構造体の平均ピッチは、以下のようにして測定されるものである。
【００２２】
すなわち、ハイドロキシアパタイトの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真において、先ず、無作為に１個の柱状構造体を抽出する（図１Ａ及び図１Ｂ中の柱状構造体Ｏ。以下、この柱状構造体Ｏを「抽出柱状構造体」という。）。次に、この抽出柱状構造体に隣接する各柱状構造体（以下、これらの柱状構造体を「隣接柱状構造体」という）と前記抽出柱状構造体との上面の中心間距離を測定し（図１Ａ及び図１Ｂ中の円内の数値は柱状構造体の上面の中心間距離を表す。）、それらの中から、前記抽出柱状構造体との上面の中心間距離が最も近い隣接柱状構造体（図１Ａ及び図１Ｂ中の柱状構造体Ａ）を選択し、これを「第１近接柱状構造体」とする。
【００２３】
次に、残りの隣接柱状構造体の中から、前記抽出柱状構造体との上面の中心間距離がより近いものを選択し、下記条件（i）を満たすか否かを判定する。満たす場合には、選んだ柱状構造体（図１Ａ及び図１Ｂ中の柱状構造体Ｂ）を「第２近接柱状構造体」とする。満たさない場合には、前記抽出柱状構造体との上面の中心間距離が次に近いものを選択して上記の判定を行い、満たすものが見つかるまでこれを繰り返す。
（i）選んだ柱状構造体Ｂと前記抽出柱状構造体Ｏの上面の中心同士を結んだ線分ＢＯと前記第１近接柱状構造体Ａと前記抽出柱状構造体Ｏの上面の中心同士を結んだ線分ＡＯとの成す角度（∠ＡＯＢ）が６０°以上であること。なお、本発明において、線分ＡＯと線分ＢＯとが成す角度とは、線分ＡＯと線分ＢＯによって形成される共役角のうち、小さい方（劣角）の角度を意味する（他も同様）。
【００２４】
例えば、図１Ａにおいては、柱状構造体Ｂが前記抽出柱状構造体との上面の中心間距離がより近いものであり、この柱状構造体Ｂは前記条件（i）を満たしている（∠ＡＯＢ＝６４°）ことから、第２近接柱状構造体となる。また、図１Ｂにおいては、柱状構造体Ｂ及びＤが前記抽出柱状構造体との上面の中心間距離がより近いものである。これらのうち、柱状構造体Ｄは前記条件（i）を満たしていない（∠ＡＯＤ＝４０°）。一方、柱状構造体Ｂは、前記条件（i）を満たしている（∠ＡＯＣ＝１２９°）。従って、図１Ｂにおいては、柱状構造体Ｂが第２近接柱状構造体となる。
【００２５】
次に、残りの隣接柱状構造体の中から、前記抽出柱状構造体との上面の中心間距離がより近いものを選択し、下記条件（ii）〜（iv）を満たすか否かを、さらに前記∠ＡＯＢが１２０°未満の場合には下記条件（v）を満たすか否かを判定する。すべての条件を満たす場合には、選んだ柱状構造体（図１Ａ及び図１Ｂ中の柱状構造体Ｃ）を「第３近接柱状構造体」とする。いずれか１つでも満たさない場合には、前記抽出柱状構造体との上面の中心間距離が次に近いものを選択して上記の判定を行い、満たすものが見つかるまでこれを繰り返す。
（ii）選んだ柱状構造体Ｃと前記抽出柱状構造体Ｏの上面の中心同士を結んだ線分ＣＯと、前記第１近接柱状構造体Ａと前記抽出柱状構造体Ｏの上面の中心同士を結んだ線分ＡＯとの成す角度（∠ＡＯＣ）が６０°以上であること。
（iii）選んだ柱状構造体Ｃと前記抽出柱状構造体Ｏの上面の中心同士を結んだ線分ＣＯと、前記第２近接柱状構造体Ｂと前記抽出柱状構造体Ｏの上面の中心同士を結んだ線分ＢＯとの成す角度（∠ＢＯＣ）が６０°以上であること。
（iv）線分ＡＯと線分ＢＯに挟まれた領域ＡＯＢ、線分ＡＯと線分ＣＯに挟まれた領域ＡＯＣ、及び線分ＢＯと線分ＣＯに挟まれた領域ＢＯＣが互いに含まれていない（重なっていない）こと。なお、本発明において、線分ＡＯと線分ＢＯに挟まれた領域ＡＯＢとは、線分ＡＯ及び線分ＢＯを境界とす２つの領域のうち、劣角側の領域を意味する（他も同様）。
（v）前記∠ＡＯＣ及び前記∠ＢＯＣのうちの少なくとも一方が１２０°以上１８０°以下であること。
【００２６】
例えば、図１Ａにおいては、柱状構造体Ｄが前記抽出柱状構造体との上面の中心間距離がより近いものではあるが、前記条件（ii）を満たしていない（∠ＡＯＤ＝４８°）。このため、前記抽出柱状構造体との上面の中心間距離が次に近い柱状構造体として、柱状構造体Ｃ、Ｅ、Ｆを選択する。これらのうち、柱状構造体Ｅは、前記条件（ii）、（iii）及び（v）を満たしている（∠ＡＯＥ＝１５３°、∠ＢＯＥ＝８９°）が、前記条件（iv）を満たしていない（線分ＡＯと線分ＢＯに挟まれた領域ＡＯＢ及び線分ＢＯと線分ＥＯに挟まれた領域ＢＯＥが線分ＡＯと線分ＥＯに挟まれた領域ＡＯＥに含まれている。）。また、柱状構造体Ｆは、前記条件（ii）、（iii）及び（v）を満たしている（∠ＡＯＦ＝１０４°、∠ＢＯＦ＝１６８°）が、前記条件（iv）を満たしていない（線分ＡＯと線分ＢＯに挟まれた領域ＡＯＢ及び線分ＡＯと線分ＦＯに挟まれた領域ＡＯＦが線分ＢＯと線分ＦＯに挟まれた領域ＢＯＦに含まれている。）。一方、柱状構造体Ｃは、前記条件（ii）、（iii）及び（v）を満たしており（∠ＡＯＣ＝１７６°、∠ＢＯＣ＝１２０°）、前記条件（iv）も満たしている。従って、図１Ａにおいては、柱状構造体Ｃが第３近接柱状構造体となる。
【００２７】
また、図１Ｂにおいては、柱状構造体Ｅが前記抽出柱状構造体との上面の中心間距離がより近いものであり、前記条件（ii）も満たしている（∠ＡＯＥ＝８２°）が、前記条件（iii）を満たしていない（∠ＢＯＥ＝４７°）。このため、前記抽出柱状構造体との上面の中心間距離が次に近い柱状構造体として、柱状構造体Ｆが選択されるが、柱状構造体Ｆは前記条件（ii）を満たしていない（∠ＡＯＦ＝３１°）。このため、前記抽出柱状構造体との上面の中心間距離が次に近い柱状構造体として、柱状構造体Ｃを選択する。柱状構造体Ｃは、前記条件（ii）、（iii）及び（v）を満たしており（∠ＡＯＣ＝１４４°、∠ＢＯＣ＝８７°）、前記条件（iv）も満たしている。従って、図１Ｂにおいては、柱状構造体Ｃが第３近接柱状構造体となる。
【００２８】
なお、１個の抽出柱状構造体に対して前記条件を満たす近接柱状構造体の組み合わせが複数存在する場合には、柱状構造体の上面の中心間距離の合計（線分ＡＯ、ＢＯ及びＣＯの長さの合計）が最小となる組み合わせを、当該抽出柱状構造体における第１〜第３の近接柱状構造体の組み合わせとして選択する。また、柱状構造体の上面の中心間距離の合計が最小となる組み合わせが複数存在する場合には、いずれの組み合わせを第１〜第３の近接柱状構造体の組み合わせとして選択してもよい。
【００２９】
このような第１〜第３の近接柱状構造体の選択を、無作為に抽出した２０個の抽出柱状構造体について行い、近接柱状構造体と抽出柱状構造体との上面の中心間距離６０個（＝２０か所×３個）の平均値を求め、それを柱状構造体の平均ピッチとする。
【００３０】
さらに、前記柱状構造体により形成される凹凸形状の平均深さ（凹部の底面と凸部の上端面との距離の平均値）としては、前記柱状構造体の平均中心軸長さの５０〜１００％であることが好ましい。凹凸形状の平均深さが前記下限未満になると、細胞増殖の促進効果が低下する傾向にある。
【００３１】
次に、本発明のハイドロキシアパタイト（ＳｒＨＡｐ）の製造方法について説明する。本発明のＳｒＨＡｐの製造方法は、共役酸の酸解離定数ｐＫａが４．８以下の電解質を含有する電解液に過酸化水素を添加した後、前記電解液中に配置したカソードとアノードとの間に通電しながら、ストロンチウム塩とリン酸化合物とを添加して、前記カソードの表面に金属イオンの９０ａｔ％以上がＳｒイオンであるＳｒＨＡｐを成長せしめる方法である。
【００３２】
前記共役酸の酸解離定数ｐＫａが４．８以下の電解質としては、塩化カリウム（ｐＫａ＝−３．７）、テトラメチルアンモニウムクロライド（ｐＫａ＝−３．７）、酢酸カリウム（ｐＫａ＝４．８）、硝酸カリウム（ｐＫａ＝−１．８）、臭化カリウム（ｐＫａ＝−４．１）等が挙げられる。これらの電解質のうち、形成される柱状構造体の平均直径がより小さくなるという観点から、塩化カリウム及びテトラメチルアンモニウムクロライドが好ましい。また、電解液中の電解質の濃度としては、０．０５〜０．１ｍｏｌ／Ｌが好ましい。
【００３３】
前記ストロンチウム塩としては、塩化ストロンチウム、硝酸ストロンチウム、酢酸ストロンチウム等が挙げられる。これらのストロンチウム塩のうち、電解質のアニオンと同じアニオンを有するという観点から、塩化ストロンチウムが好ましい。これにより、電解液に含まれる元素の種類を制限することができる。
【００３４】
前記リン酸化合物としては、リン酸二水素アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、リン酸三カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム等が挙げられる。これらのリン酸化合物のうち、電解液中でのリン酸ストロンチウム化合物の析出を防ぐという観点から、リン酸二水素アンモニウム、リン酸二水素カリウム等のリン酸二水素化合物が好ましく、リン酸二水素アンモニウムがより好ましい。
【００３５】
前記カソードとしては、Ｔｉ基板、Ｍｇ基板、ステンレス基板といった金属基板、及びその酸化物基板等が挙げられる。これらのカソードのうち、耐食性及びカソードと柱状構造体との固着強度に優れているという観点から、Ｔｉ基板が好ましい。また、前記アノードとしては通常の電気分解に用いられるものであれば特に制限はなく、例えば、白金線が挙げられる。参照極としては通常の電気分解に用いられるものであれば特に制限はなく、例えば、ＫＣｌ飽和Ａｇ／ＡｇＣｌ電極が挙げられる。
【００３６】
本発明のＳｒＨＡｐの製造方法においては、先ず、前記電解質を含有する電解液に過酸化水素を添加する。前記ストロンチウム塩及び前記リン酸化合物を添加する前に過酸化水素を添加することによって、表面に微細な柱状構造体からなる凹凸形状を有するＳｒＨＡｐを得ることができる。また、過酸化水素は、電解液中の濃度が３〜１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加することが好ましい。
【００３７】
また、本発明のＳｒＨＡｐの製造方法においては、前記過酸化水素を添加する前に、予め、前記カソードと前記アノードとの間に通電して電解処理を行うことが好ましい。これにより、得られるＳｒＨＡｐの構造の電析処理毎のバラツキを低減することができる。この電解処理時の前記カソードへの印加電位としては−１．２〜−１．０Ｖが好ましい。また、電解処理時間としては３〜１０分間が好ましい。
【００３８】
次に、前記電解液中の配置した前記カソードと前記アノードとの間に通電しながら、前記ストロンチウム塩及び前記リン酸化合物を添加して電析処理を行い、前記カソードの表面に金属イオンの９０ａｔ％以上がＳｒイオンであるＳｒＨＡｐを成長させる。本発明のＳｒＨＡｐの製造方法においては、通電により過酸化水素を還元しながら前記ストロンチウム塩及び前記リン酸化合物を添加しているため、電析処理の初期段階において、ＳｒＨＡｐの核密度が増大する。核密度が増大すると、柱状構造体の表面密度が増大するだけでなく、各柱状構造体の成長速度が均一となるため、微細な柱状構造体が均一に形成される。前記電析処理時の前記カソードへの印加電位としては−０．９〜−０．７Ｖが好ましい。また、電析処理時間としては５〜３０分間が好ましい。また、前記ストロンチウム塩及び前記リン酸化合物は、電解液中の濃度がそれぞれ２〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ及び０．８〜４ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加することが好ましい。
【００３９】
また、本発明のＳｒＨＡｐの製造方法においては、前記ストロンチウム塩及び前記リン酸化合物を添加する前に、予め、前記カソードと前記アノードとの間に通電して過酸化水素の還元を行うことが好ましい。これにより、均一かつ微細な柱状構造体を確実に形成することができる。この還元処理時の前記カソードへの印加電位としては−１．２〜−０．８Ｖが好ましい。また、還元処理時間としては１〜５分間が好ましい。
【００４０】
次に、本発明の細胞培養基材及び細胞培養方法について説明する。本発明の細胞培養基材は、基板と、この基板の表面に配置されている前記本発明のハイドロキシアパタイトからなるものであり、例えば、インプラント等が挙げられる。前記基板としては、Ｔｉ基板、Ｍｇ基板、ステンレス基板といった金属基板、及びその酸化物基板等が挙げられる。また、本発明の細胞培養方法は、前記本発明のハイドロキシアパタイトの表面で細胞（例えば、付着性の動物細胞、正常気道上皮細胞等）を増殖させる方法であり、前記本発明の細胞培養基材を用いて行うことが好ましい。このような本発明の細胞培養基材を用いて細胞を培養することによって、細胞の定着及び速やかな伸展・増殖に加えて、定着後の細胞の細胞死が抑制される。その結果、インプラント等の人工基板のみの場合と比較して、人工基板と生体組織の細胞及び細胞分泌物（例えば、骨芽細胞による細胞外マトリックス及びヒドロキシアパタイト）による強固な結合を早期に実現することが可能となり、オッセオインテグレーション（骨結合）による機能的な治癒を促進することが可能となる。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４２】
（実施例１）
作用極（カソード）として研磨したＴｉ基板、対極（アノード）として白金線、参照極としてＫＣｌ飽和Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を使用し、電解液として０．１Ｍの塩化カリウム（ＫＣｌ、共役酸の酸解離定数ｐＫａ＝−３．７）水溶液（７０℃、ｐＨ５．６）を使用して、図２に示す工程図に従って電析処理を行なった。先ず、前記電解液２０ｍｌをマグネティックスターラーを用いて２００ｒｐｍの回転速度で撹拌しながら、Ｔｉ基板に−１．２Ｖの電位で５分間、電圧を印加して電解処理を行なった。このとき、印加開始から４分間経過した時点で、前記電解液に０．５Ｍの過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を０．２ｍｌ添加した（電解液中のＨ２Ｏ２濃度：５ｍＭ）。次に、Ｔｉ基板の印加電位を−０．８Ｖに変更してＨ２Ｏ２の還元を２分間行なった。その後、Ｔｉ基板への電圧の印加（電位：−０．８Ｖ）を継続した状態で、Ｈ２Ｏ２の還元を行いながら、前記電解液に０．２５Ｍの塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）と０．１Ｍのリン酸二水素アンモニウム（ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４）との混合水溶液０．４２ｍｌを添加して（電解液中のＳｒＣｌ２濃度：５ｍＭ、電解液中のＮＨ４Ｈ２ＰＯ４濃度：２ｍＭ）２０分間電析処理を行い、Ｔｉ基板表面に薄膜を形成した。
【００４３】
（実施例２）
電解液として０．１Ｍのテトラメチルアンモニウムクロライド（ＴＭＡＣｌ、共役酸の酸解離定数ｐＫａ＝−３．７）水溶液（７０℃、ｐＨ５．６）を使用した以外は実施例１と同様にしてＴｉ基板表面に薄膜を形成した。
【００４４】
（実施例３）
電解液として０．１Ｍの酢酸カリウム（ＫＯａｃ、共役酸の酸解離定数ｐＫａ＝４．８）水溶液（７０℃、ｐＨ５．６）を使用した以外は実施例１と同様にしてＴｉ基板表面に薄膜を形成した。
【００４５】
（比較例１）
電解液として０．１Ｍの塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ、共役酸の酸解離定数ｐＫａ＝９．２５）水溶液（７０℃、ｐＨ５．６）を使用した以外は実施例１と同様にして電析処理を行なったが、薄膜は形成されなかった。
【００４６】
（比較例２）
塩化ストロンチウムの代わりに塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を使用した以外は実施例１と同様にしてＴｉ基板表面にカルシウムハイドロキシアパタイト（ＣａＨＡｐ）薄膜を形成した。
【００４７】
（比較例３）
Ｈ２Ｏ２の還元を行う前に、ＳｒＣｌ２とＮＨ４Ｈ２ＰＯ４との混合水溶液を添加した以外は実施例１と同様にしてＴｉ基板表面に薄膜を形成した。すなわち、先ず、前記電解液２０ｍｌをマグネティックスターラーを用いて２００ｒｐｍの回転速度で撹拌しながら、Ｔｉ基板に−１．２Ｖの電位で５分間、電圧を印加して電解処理を行なった。次に、前記電解液に、０．２５Ｍの塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）と０．１Ｍのリン酸二水素アンモニウム（ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４）との混合水溶液０．４２ｍｌを添加し、さらに、０．５Ｍの過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を０．２ｍｌ添加した（電解液中の過酸化水素濃度：５ｍＭ）。その後、Ｔｉ基板に−０．８Ｖの電位で電圧を印加して、Ｈ２Ｏ２の還元を行いながら、２０分間電析処理を行い、Ｔｉ基板表面に薄膜を形成した。
【００４８】
（比較例４）
ＳｒＣｌ２とＮＨ４Ｈ２ＰＯ４との混合水溶液の代わりに、１６．７ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）と１０ｍＭのＮＨ４Ｈ２ＰＯ４との混合水溶液０．４２ｍｌを添加した（電解液中のＣａＣｌ２濃度：約０．３４ｍＭ、電解液中のＮＨ４Ｈ２ＰＯ４濃度：約０．２ｍＭ）以外は実施例１と同様にして、Ｔｉ基板表面にアモルファスリン酸カルシウム（ＡＣＰ）薄膜を形成した。
＜Ｘ線回折パターン＞
各実施例で得られた薄膜のＸ線回折パターンをＸ線回折装置（（株）リガク製「Ｕｌｔｉｍａ  ＩＶ」）を用いて測定した。その結果を図３に示す。この結果から明らかなように、実施例１〜３で得られた薄膜は金属イオンがＳｒイオンであるストロンチウムハイドロキシアパタイト（ＳｒＨＡｐ）薄膜であることが確認された。
【００４９】
＜走査型電子顕微鏡写真＞
実施例及び比較例で得られた薄膜の表面を走査型電子顕微鏡（（株）日立ハイテクノロジーズ製「ＳＵ−３５００」）を用いて観察した。実施例１〜３及び比較例２〜３で得られた薄膜のＳＥＭ写真を図４Ａ〜図８Ｂに示す。これらの結果から明らかなように、実施例１〜３で得られたＳｒＨＡｐ薄膜の表面には、微細な柱状構造体からなる凹凸形状が均一に形成されていることが確認された。一方、比較例２で得られた薄膜は、面方向の粒子径が数μｍの板状粒子が不規則に配置したものであることがわかった。また、比較例３で得られた薄膜は、数十μｍの大きさの塊状体が存在する不均一なものであることがわかった。
【００５０】
＜柱状構造体の平均直径＞
各実施例で得られた薄膜のＳＥＭ写真において、１００個の柱状構造体を無作為に抽出し、それらの直径を測定して、その平均値を求めた。その結果、柱状構造体の平均直径は、実施例１においては１０５ｎｍ、実施例２においては１３０ｎｍ、実施例３においては２２０ｎｍであった。
【００５１】
＜柱状構造体の平均ピッチ＞
各実施例で得られた薄膜のＳＥＭ写真において、先ず、無作為に１個の柱状構造体Ｏを抽出した。次に、この抽出柱状構造体Ｏに隣接する各柱状構造体と前記抽出柱状構造体Ｏとの上面の中心間距離を測定し、それらの中から、前記抽出柱状構造体Ｏとの上面の中心間距離が最も近い隣接柱状構造体Ａを選択し、これを「第１近接柱状構造体Ａ」とした。
【００５２】
次に、残りの隣接柱状構造体の中から、前記抽出柱状構造体Ｏとの上面の中心間距離がより近い柱状構造体Ｂを選択し、下記条件（i）を満たすか否かを判定した。満たさない場合には、前記抽出柱状構造体Ｏとの上面の中心間距離が次に近いものを選択して上記の判定を行なった。これを満たすものが見つかるまで繰り返し、満たしたものを「第２近接柱状構造体Ｂ」とした。
（i）選んだ柱状構造体Ｂと前記抽出柱状構造体Ｏの上面の中心同士を結んだ線分ＢＯと前記第１近接柱状構造体Ａと前記抽出柱状構造体Ｏの上面の中心同士を結んだ線分ＡＯとの成す角度（∠ＡＯＢ）が６０°以上であること。
【００５３】
次に、残りの隣接柱状構造体の中から、前記抽出柱状構造体Ｏとの上面の中心間距離がより近い柱状構造体Ｃを選択し、下記条件（ii）〜（iv）を満たすか否かを、さらに前記∠ＡＯＢが１２０°未満の場合には下記条件（v）を満たすか否かを判定した。いずれか１つでも満たさない場合には、前記抽出柱状構造体Ｏとの上面の中心間距離が次に近いものを選択して上記の判定を行なった。これを満たすものが見つかるまで繰り返し、すべての条件を満たしたものを「第３近接柱状構造体Ｃ」とした。
（ii）選んだ柱状構造体Ｃと前記抽出柱状構造体Ｏの上面の中心同士を結んだ線分ＣＯと、前記第１近接柱状構造体Ａと前記抽出柱状構造体Ｏの上面の中心同士を結んだ線分ＡＯとの成す角度（∠ＡＯＣ）が６０°以上であること。
（iii）選んだ柱状構造体Ｃと前記抽出柱状構造体Ｏの上面の中心同士を結んだ線分ＣＯと、前記第２近接柱状構造体Ｂと前記抽出柱状構造体Ｏの上面の中心同士を結んだ線分ＢＯとの成す角度（∠ＢＯＣ）が６０°以上であること。
（iv）線分ＡＯと線分ＢＯに挟まれた領域ＡＯＢ、線分ＡＯと線分ＣＯに挟まれた領域ＡＯＣ、及び線分ＢＯと線分ＣＯに挟まれた領域ＢＯＣが互いに含まれていない（重なっていない）こと。
（v）前記∠ＡＯＣ及び前記∠ＢＯＣのうちの少なくとも一方が１２０°以上１８０°以下であること。
【００５４】
なお、１個の抽出柱状構造体Ｏに対して前記条件を満たす近接柱状構造体の組み合わせが複数存在した場合には、柱状構造体の上面の中心間距離の合計（線分ＡＯ、ＢＯ及びＣＯの長さの合計）が最小となる組み合わせを、当該抽出柱状構造体Ｏにおける第１〜第３の近接柱状構造体の組み合わせとして選択した。また、柱状構造体の上面の中心間距離の合計が最小となる組み合わせが複数存在した場合には、それらの組み合わせの中から第１〜第３の近接柱状構造体の組み合わせを任意に選択した。
【００５５】
このような第１〜第３の近接柱状構造体の選択を、無作為に抽出した２０個の抽出柱状構造体について行い、近接柱状構造体と抽出柱状構造体との上面の中心間距離６０個（＝２０か所×３個）の平均値を求め、それを柱状構造体の平均ピッチとした。その結果、柱状構造体の平均ピッチは、実施例１においては１７０ｎｍ、実施例２においては２０５ｎｍ、実施例３においては２５５ｎｍであった。
【００５６】
＜柱状構造体の平均密度＞
画像解析ソフトウェア（アメリカ国立衛生研究所のＷａｙｎｅ  Ｒａｓｂａｎｄが開発した「Ｉｍａｇｅ  Ｊ」）を用いて各実施例で得られた薄膜のＳＥＭ写真を２値化処理して柱状構造体を抽出し、薄膜表面４５２μｍ２中に含まれる柱状構造体の個数を求めたところ、実施例１においては６６００個、実施例２においては６８００個、実施例３においては５３００個であった。
【００５７】
以上の結果から、実施例１〜３で得られた薄膜は、金属イオンがＳｒイオンであるハイドロキシアパタイト薄膜であり、その表面には、平均直径が５０〜５００ｎｍの柱状構造体からなる凹凸形状が形成されており、特に、電解質としてＫＣｌを用いた場合（実施例１）及びＴＭＡＣｌを用いた場合（実施例２）には、平均直径が５０〜２００ｎｍの柱状構造体からなる凹凸形状が形成されていることがわかった。また、柱状構造体の平均表面密度は薄膜表面１００μｍ２当たり８００〜５０００個であり、柱状構造体の平均ピッチは７０〜４００ｎｍであることがわかった。
【００５８】
＜柱状構造体の平均深さ＞
各実施例で得られた薄膜のＸ線回折パターンにおいて、（００２）面（２θ＝２４．４８°）、（１０２）面（２θ＝２６．６９°）、（ｈｋ０）面（２θ＝２１．０３°）及び（１１１）面（２θ＝２１．９４°）に起因するピーク強度を比較すると、（００２）面及び（１０２）面に起因するピーク強度が強く、（ｈｋ０）面及び（１１１）面に起因するピーク強度が弱いことがわかった。この結果は、柱状構造体の中心軸がｃ軸に一致し、大部分の柱状構造体の中心軸と基板との成す角度が３０°以上であることを示している。したがって、柱状構造体からなる凹凸形状の凹部の底面と凸部の上端面との距離の平均値（凹凸形状の平均深さ）は柱状構造体の平均中心軸長さの５０％以上であることがわかった。
【００５９】
＜細胞増殖・毒性試験＞
実施例１〜３で得られたＳｒＨＡｐ薄膜、比較例２で得られたＣａＨＡｐ薄膜、比較例４で得られたＡＣＰ薄膜、及びＴｉ基板の表面に、正常気道上皮細胞株（ＢＥＡＳ−２Ｂ）を播種し（培地：１０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ−１６４０）、翌日に培地を０．５％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ−１６４０に置換した。播種４日後の細胞に対して、生細胞・死細胞同時染色キット（ＰｒｏｍｏＫｉｎｅ社製「Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ＩＩ」）を用いて細胞を同時染色した後、蛍光顕微鏡観察を行なった。実施例１〜３及び比較例２、４で得られた薄膜並びにＴｉ基板における生細胞・死細胞の蛍光顕微鏡写真を図９Ａ〜図１４Ｂに示す。図９Ａ、図１０Ａ、図１１Ａに示した結果から明らかなように、実施例１〜３で得られたＳｒＨＡｐ薄膜上では、ＣａＨＡｐ薄膜上（図１２Ａ）、ＡＣＰ薄膜上（図１３Ａ）及びＴｉ基板上（図１４Ａ）に比べて明らかに細胞が増殖しており、ＳｒＨＡｐ薄膜表面全体を細胞が被覆していることが確認された。
【００６０】
画像解析ソフトウェア（（株）キーエンス製「ＢＺ−ＩＩ解析アプリケーション」）を用いて、実施例１〜３及び比較例２、４で得られた薄膜並びにＴｉ基板における生細胞・死細胞の蛍光顕微鏡写真について画像解析を行い、一視野（０．０９６ｍｍ２）当たりの生細胞数及び死細胞数を測定し、細胞死亡率を算出した。それらの結果を図１５に示す。図１５に示した結果から明らかなように、実施例１〜３で得られたＳｒＨＡｐ薄膜上の生細胞数はＴｉ基板上の生細胞数の約４倍以上であり、本発明のＳｒＨＡｐ薄膜上で細胞増殖が促進されることがわかった。特に、電解質としてＫＣｌ及びＴＭＡＣｌを用いた場合には、ＫＯａｃを用いた場合に比べて、生細胞数が２０％程度多くなり、細胞増殖には平均直径が５０〜２００ｎｍの柱状構造体が有効であることがわかった。また、実施例１〜３で得られたＳｒＨＡｐ薄膜上での細胞死亡率はＴｉ基板の場合の約３分の１（２％程度）であり、本発明のＳｒＨＡｐ薄膜は細胞死を抑制する効果を有することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
以上説明したように、本発明によれば、表面に微細な柱状構造体からなる凹凸形状を有するハイドロキシアパタイトを得ることが可能となる。
【００６２】
したがって、このようなハイドロキシアパタイトを表面に備えている本発明の細胞培養基材は、細胞の付着性が高く、細胞増殖を促進でき、また、細胞死を抑制できるため、インプラント等として有用である。
【符号の説明】
【００６３】
Ｏ：抽出柱状構造体
Ａ：最近接柱状構造体
Ｂ、Ｃ：平均ピッチ測定の対象となる隣接構造体
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
0006590199.tif 000008
【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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