(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）第１の融合タンパク質コーディングベクター、第２の融合タンパク質コーディングベクター、およびデスティネーションベクターを準備すること、ここで、
前記第１の融合タンパク質コーディングベクターは、
第１のａｔｔＬ組換え部位と、
ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸セグメントと、
前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質を形成するように位置する、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインをコードする遺伝子と、
第２のａｔｔＬ組換え部位と、
を含み、
前記第１の融合タンパク質コーディングベクターにおける前記第１のａｔｔＬ組換え部位、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸セグメント、前記ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインをコードする遺伝子、および前記第２のａｔｔＬ組換え部位は、前記ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインがコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されており、前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸セグメントとの間に、プロモーターは存在せず、
前記第２の融合タンパク質コーディングベクターは、
第３のａｔｔＬ組換え部位と、
ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸セグメントと、
前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質を形成するように位置する、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインをコードする遺伝子と、
第４のａｔｔＬ組換え部位と、
を含み、
前記第２の融合タンパク質コーディングベクターにおける前記第３のａｔｔＬ組換え部位、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸セグメント、前記ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインをコードする遺伝子、および前記第４のａｔｔＬ組換え部位は、前記ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインがコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されており、前記第３のａｔｔＬ組換え部位と前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸セグメントとの間に、プロモーターは存在せず、
前記デスティネーションベクターは、第１のＤＮＡブロックおよび第２のＤＮＡブロックを含み、
前記第１のＤＮＡブロックは、
植物細胞で作動可能な第１のプロモーターと、
第１のａｔｔＲ組換え部位と、
第２のａｔｔＲ組換え部位と、
を含み、
前記第２のＤＮＡブロックは、
植物細胞で作動可能な第２のプロモーターと、
第３のａｔｔＲ組換え部位と、
第４のａｔｔＲ組換え部位と、
を含み、
前記第２のＤＮＡブロックは前記第１のプロモーターの上流側に位置し、かつ前記第１のＤＮＡブロックとは逆向きに配置されており、前記第１のＤＮＡブロックにおいて、前記第１のプロモーター、前記第１のａｔｔＲ組換え部位および前記第２のａｔｔＲ組換え部位は、前記第１のプロモーターがコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されており、前記第２のＤＮＡブロックにおいて、前記第２のプロモーター、前記第３のａｔｔＲ組換え部位および前記第４のａｔｔＲ組換え部位は、前記第２のプロモーターがコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されており、
前記第１のａｔｔＬ組換え部位は、ａｔｔＬ１〜ａｔｔＬ４から選択される１種であり、前記第２のａｔｔＬ組換え部位は、ａｔｔＬ１〜ａｔｔＬ４から選択され、かつ前記第１のａｔｔＬ組換え部位とは異なる１種であり、前記第３のａｔｔＬ組換え部位は、ａｔｔＬ１〜ａｔｔＬ４から選択される１種であり、前記第４のａｔｔＬ組換え部位は、ａｔｔＬ１〜ａｔｔＬ４から選択され、かつ前記第３のａｔｔＬ組換え部位とは異なる１種であり、
前記第１のａｔｔＲ組換え部位は、ａｔｔＲ１〜ａｔｔＲ４から選択され、かつ前記第１のａｔｔＬ組換え部位と組換え可能な一種であり、前記第２のａｔｔＲ組換え部位は、ａｔｔＲ１〜ａｔｔＲ４から選択され、前記第１のａｔｔＲ組換え部位とは異なり、かつ前記第２のａｔｔＬ組換え部位と組換え可能な一種であり、前記第３のａｔｔＲ組換え部位は、ａｔｔＲ１〜ａｔｔＲ４から選択され、かつ前記第３のａｔｔＬ組換え部位と組換え可能な一種であり、前記第４のａｔｔＲ組換え部位は、ａｔｔＲ１〜ａｔｔＲ４から選択され、前記第３のａｔｔＲ組換え部位とは異なり、かつ前記第４のａｔｔＬ組換え部位と組換え可能な一種である、ならびに
（ｂ）第１の融合タンパク質コーディングベクターにおける前記第１のａｔｔＬ組換え部位を、前記デスティネーションベクターにおける前記第１のａｔｔＲ組換え部位と組換え、前記第１の融合タンパク質コーディングベクターにおける前記第２のａｔｔＬ組換え部位を、前記デスティネーションベクターにおける前記第２のａｔｔＲ組換え部位と組換え、前記第２の融合タンパク質コーディングベクターにおける前記第３のａｔｔＬ組換え部位を、前記デスティネーションベクターにおける前記第３のａｔｔＲ組換え部位と組換え、かつ、前記第２の融合タンパク質コーディングベクターにおける前記第４のａｔｔＬ組換え部位を、前記デスティネーションベクターにおける前記第４のａｔｔＲ組換え部位と組換えること、
を含む、植物細胞用ＴＡＬＥＮ発現ベクターの製造方法。
【請求項２】
前記ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインをコードする遺伝子がイントロンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の融合タンパク質コーディングベクターは、前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記第２のａｔｔＬ組換え部位との間にマーカー遺伝子をさらに含み、および／または前記第２の融合タンパク質コーディングベクターは、前記第３のａｔｔＬ組換え部位と前記第４のａｔｔＬ組換え部位との間にマーカー遺伝子をさらに含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の融合タンパク質コーディングベクターは、前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記第２のａｔｔＬ組換え部位との間に第１のマーカー遺伝子を含み、かつ
前記第２の融合タンパク質コーディングベクターは、前記第３のａｔｔＬ組換え部位と前記第４のａｔｔＬ組換え部位との間に、第１のマーカー遺伝子とは異なる第２のマーカー遺伝子を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（ｃ）  第１のａｔｔＬ組換え部位と、
可変領域を有するＴＡＬＥ（ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ）のＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントを挿入可能な、制限酵素による切断可能位置である挿入位置を有する挿入領域と、
前記挿入位置にＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントが挿入された場合にＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質をコードする核酸配列を形成可能となるように位置する、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインをコードする遺伝子と、
第２のａｔｔＬ組換え部位と、
を含み、
前記第１のａｔｔＬ組換え部位、前記挿入領域、前記ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインをコードする遺伝子、および前記第２のａｔｔＬ組換え部位は、前記ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインがコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されており、前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記挿入位置との間に、プロモーターを有しない、第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターを準備し、
前記第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターを前記制限酵素で切断して、前記挿入位置に、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントを挿入することで第１の融合タンパク質コーディングベクターを得ること、ならびに
（ｄ）  第３のａｔｔＬ組換え部位と、
可変領域を有するＴＡＬＥ（ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ）のＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントを挿入可能な、制限酵素による切断可能位置である挿入位置を有する挿入領域と、
前記挿入位置にＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントが挿入された場合にＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質をコードする核酸配列を形成可能となるように位置する、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインをコードする遺伝子と、
第４のａｔｔＬ組換え部位と、
を含み、
前記第３のａｔｔＬ組換え部位、前記挿入領域、前記ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインをコードする遺伝子、および前記第４のａｔｔＬ組換え部位は、前記ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインがコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されており、前記第３のａｔｔＬ組換え部位と前記挿入位置との間に、プロモーターを有しない、第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターを準備し、
前記第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターを前記制限酵素で切断して、前記挿入位置に、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントを挿入することで第２の融合タンパク質コーディングベクターを得ること、をさらに含む、
請求項１〜請求項４のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記制限酵素がＢｓａＩまたはＥｓｐ３Ｉである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記デスティネーションベクターが、前記第１のＤＮＡブロックにおける前記第１のプロモーターがコードされた方向を基準として前記第２のａｔｔＲ組換え部位よりも下流側の位置に配置された右境界配列ＲＢを有する核酸セグメントと、前記第２のＤＮＡブロックにおける前記第２のプロモーターがコードされた方向を基準として前記第４のａｔｔＲ組換え部位よりも下流側の位置に配置された左境界配列ＬＢを有する核酸セグメントと、をさらに含む、請求項１〜請求項６のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜請求項７のうちいずれか一項に記載の方法により植物細胞用ＴＡＬＥＮ発現ベクターを製造すること、および
前記植物細胞用ＴＡＬＥＮ発現ベクターを植物細胞に導入すること
を含む、前記植物細胞用ＴＡＬＥＮ発現ベクターを遺伝子導入した植物細胞を作製する方法。
【請求項９】
前記導入することが、前記植物細胞用ＴＡＬＥＮ発現ベクターをアグロバクテリウムに導入すること、および前記アグロバクテリウムを植物細胞に感染させることにより、前記植物細胞用ＴＡＬＥＮ発現ベクターを前記植物細胞内に導入すること、を含み、
前記デスティネーションベクターは、前記第１のＤＮＡブロックにおける前記ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインをコードする遺伝子がコードされた方向を基準として前記第２のａｔｔＲ組換え部位よりも下流側の位置に配置された右境界配列ＲＢをコードする核酸セグメントと、前記第２のＤＮＡブロックにおける前記ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインをコードする遺伝子がコードされた方向を基準として前記第４のａｔｔＲ組換え部位よりも下流側の位置に配置された左境界配列ＬＢをコードする核酸セグメントと、をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜請求項７のうちいずれか一項に記載の方法により植物細胞用ＴＡＬＥＮ発現ベクターを製造すること、
前記植物細胞用ＴＡＬＥＮ発現ベクターを植物細胞に導入すること、
前記導入された植物細胞用ＴＡＬＥＮ発現ベクターから前記ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインを発現させること、および
前記ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインを植物細胞のゲノムに作用させること、を含むゲノム編集方法であって、
前記ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインが、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインと共にＴＡＬＥＮ融合タンパク質を形成しており、
前記ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインが前記植物細胞のゲノムにおける、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインが結合可能な特定の配列の近傍を切断する、ゲノム編集方法。
【請求項１１】
第１のＤＮＡブロックおよび第２のＤＮＡブロックを含む植物細胞用ＴＡＬＥＮ発現ベクターであって、
前記第１のＤＮＡブロックは、
植物細胞で作動可能な第１のプロモーターと、
第１のａｔｔＢ組換え部位と、
特定の核酸配列に結合可能なＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをコードする第１の核酸セグメントと、
前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質を形成するように位置する、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインをコードする第１の遺伝子と、
第２のａｔｔＢ組換え部位と、
を含み、
前記第２のＤＮＡブロックは、
植物細胞で作動可能な第２のプロモーターと、
第３のａｔｔＢ組換え部位と、
特定の核酸配列に結合可能なＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをコードする第２の核酸セグメントと、
前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質を形成するように位置する、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインをコードする第２の遺伝子と、
第４のａｔｔＢ組換え部位と、
を含み、
前記第２のＤＮＡブロックは前記第１のプロモーターの上流側に位置し、かつ前記第１のＤＮＡブロックとは逆向きに配置されており、前記第１のＤＮＡブロックにおいて、前記第１のプロモーター、前記第１のａｔｔＢ組換え部位、前記第１の核酸セグメント、前記第１の遺伝子および前記第２のａｔｔＢ組換え部位は、前記第１の遺伝子がコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されており、前記第２のＤＮＡブロックにおいて、前記第２のプロモーター、前記第３のａｔｔＢ組換え部位、前記第２の核酸セグメント、前記第２の遺伝子および前記第４のａｔｔＢ組換え部位は、前記第２の遺伝子がコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されており、
前記第１のａｔｔＢ組換え部位は、ａｔｔＢ１〜ａｔｔＢ４から選択され、前記第２のａｔｔＢ組換え部位は、ａｔｔＢ１〜ａｔｔＢ４から選択され、かつ前記第１のａｔｔＢ組換え部位とは異なる１種であり、前記第３のａｔｔＢ組換え部位は、ａｔｔＢ１〜ａｔｔＢ４から選択され、前記第４のａｔｔＢ組換え部位は、ａｔｔＢ１〜ａｔｔＢ４から選択され、かつ前記第３のａｔｔＢ組換え部位とは異なる１種である、植物細胞用ＴＡＬＥＮ発現ベクター。
【請求項１２】
前記ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインをコードする遺伝子がイントロンを含む、請求項１１に記載の植物細胞用ＴＡＬＥＮ発現ベクター。
【請求項１３】
前記第１のＤＮＡブロックは、前記第１のａｔｔＢ組換え部位と前記第２のａｔｔＢ組換え部位との間にマーカー遺伝子をさらに含み、および／または前記第２のＤＮＡブロックは、前記第３のａｔｔＢ組換え部位と前記第４のａｔｔＢ組換え部位との間にマーカー遺伝子をさらに含む、請求項１１または請求項１２に記載の植物細胞用ＴＡＬＥＮ発現ベクター。
【請求項１４】
前記第１のＤＮＡブロックは、前記第１のａｔｔＢ組換え部位と前記第２のａｔｔＢ組換え部位との間に第１のマーカー遺伝子を含み、かつ
前記第２のＤＮＡブロックは、前記第３のａｔｔＢ組換え部位と前記第４のａｔｔＢ組換え部位との間に、第１のマーカー遺伝子とは異なる第２のマーカー遺伝子を含む、請求項１３に記載の植物細胞用ＴＡＬＥＮ発現ベクター。
【請求項１５】
前記第１のＤＮＡブロックにおける前記第１のプロモーターがコードされた方向を基準として前記第２のａｔｔＢ組換え部位よりも下流側の位置に配置された右境界配列ＲＢを有する核酸セグメントと、前記第２のＤＮＡブロックにおける前記第２のプロモーターがコードされた方向を基準として前記第４のａｔｔＢ組換え部位よりも下流側の位置に配置された左境界配列ＬＢを有する核酸セグメントと、をさらに含む、請求項１１〜請求項１４のうちいずれか一項に記載の植物細胞用ＴＡＬＥＮ発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１１〜請求項１５のうちいずれか一項に記載の植物細胞用ＴＡＬＥＮ発現ベクターを植物細胞に導入することを含む、前記植物細胞用ＴＡＬＥＮ発現ベクターを遺伝子導入した植物細胞を作製する方法。
【請求項１７】
前記導入することが、前記植物細胞用ＴＡＬＥＮ発現ベクターをアグロバクテリウムに導入すること、および前記アグロバクテリウムを植物細胞に感染させることにより、前記植物細胞用ＴＡＬＥＮ発現ベクターを前記植物細胞内に導入すること、を含み、
前記植物細胞用ＴＡＬＥＮ発現ベクターは、前記第１のＤＮＡブロックにおける前記ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインをコードする第１の遺伝子がコードされた方向を基準として前記第２のａｔｔＢ組換え部位よりも下流側の位置に配置された右境界配列ＲＢをコードする核酸セグメントと、前記第２のＤＮＡブロックにおける前記ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインをコードする遺伝子がコードされた方向を基準として前記第４のａｔｔＢ組換え部位よりも下流側の位置に配置された左境界配列ＬＢをコードする核酸セグメントと、をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１１〜請求項１５のうちいずれか一項に記載の植物細胞用ＴＡＬＥＮ発現ベクターを植物細胞に導入すること、
前記導入された植物細胞用ＴＡＬＥＮ発現ベクターから前記ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインを発現させること、および
前記ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインを植物細胞のゲノムに作用させること、を含むゲノム編集方法であって、
前記ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインが、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインと共にＴＡＬＥＮ融合タンパク質を形成しており、
前記ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインが前記植物細胞のゲノムにおける、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインが結合可能な特定の配列の近傍を切断する、ゲノム編集方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターおよびそのセット、融合タンパク質コーディングベクターおよびそのセットならびにその製造方法、デスティネーションベクター、植物細胞用発現ベクターおよびその製造方法、植物細胞用発現ベクター作製用キット、形質転換方法、ならびにゲノム編集方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ）は、植物に対する細菌病原体であるＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のタンパク質であるＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ（ＴＡＬＥ）と、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインとを連結した人工融合タンパク質である。ＴＡＬＥの中には、典型的にはLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHG（配列番号１）で表される通常３４アミノ酸長の配列が繰り返された中央繰り返しドメイン（ｃｅｎｔｒａｌ  ｒｅｐｅａｔ  ｄｏｍａｉｎ）が存在する。繰り返し数は概ね１．５〜３３．５であり、つまりＣ末端の最後の繰り返しは完全なものではなく、２アミノ酸残基のみとなっている（ｈａｌｆ  ｒｅｐｅａｔ）。上記の配列の１２番目および１３番目のアミノ酸残基は可変であり、ＴＡＬＥが結合するＤＮＡ配列に対する特異性を決めている。これら２つのアミノ酸残基はｒｅｐｅａｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ（ＲＶＤ）とも呼ばれ、この２アミノ酸残基の配列と、認識されるヌクレオチドとの間には固定した関係が存在する。
【０００３】
このため、各繰り返しにおけるＲＶＤの配列を改変することにより、ＴＡＬＥは一定の範囲内の長さを有する任意のＤＮＡ配列に結合可能となる。ＴＡＬＥがＤＮＡ配列に結合すると、ＴＡＬＥに連結したＦｏｋＩヌクレアーゼが作用して、その近傍でＤＮＡを切断する。この技術によれば、従来の制限酵素が有していた認識配列についての制約が大きく解消される。
【０００４】
今から始めるゲノム編集（羊土社２０１４、ｐ１９１）にはＴＡＬＥＮ構成用ベクターが開示されており、プロモーターの下流にＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインを導入している。このベクターは制限酵素を用いてさらなるクローニングを受ける。また、Zhang et al., PLOS ONE（November 2013 | Volume 8 Issue 11, e80281）には動物細胞でＴＡＬＥＮを発現するためのＴＡＬＥＮ構成用ベクターが記載されており、やはりプロモーターの下流にＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインを導入している。
【０００５】
また、核酸を細胞に導入することにより、当該核酸にコードされたタンパク質やＲＮＡを発現させることも行われている。細胞を核酸に導入する技術については、例えば細菌である大腸菌については広く研究されており、例えば、対数増殖期の細胞を塩化カルシウム溶液で処理することによって得られるコンピテントセルをＤＮＡ存在下で熱処理するなどの方法により、核酸を導入することが出来る。また、動物細胞の場合にはリポフェクション（核酸含有リポソームを動物細胞内に導入する方法）、エレクトロポレーション（電気パルスにより細胞膜に穴をあけ、核酸を動物細胞内に導入する方法）、マイクロインジェクション（ガラスのマイクロピペットを用いて、ＤＮＡを動物細胞内に注入する方法）、パーティクル・ガン法（金属の微粒子をＤＮＡでコーティングし、動物細胞内に打ち込む方法）、およびウイルスベクターを利用して遺伝子を動物細胞内に導入する方法などがある。特に、マイクロインジェクションなどの方法を用いれば、ＤＮＡを高い確実性で動物細胞内に導入することが可能である。
【０００６】
しかし、これらの方法の多くは、植物細胞には適用できない。植物細胞には細胞壁が存在し、このために、マイクロインジェクションなどの方法を採ることは出来ない。植物細胞の形質転換方法としては、アグロバクテリウムを用いる方法や、パーティクル・ガン法などがあるだけである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】今から始めるゲノム編集（羊土社２０１４、ｐ１９１）
【非特許文献２】Zhang et al., PLOS ONE（November 2013 | Volume 8 Issue 11, e80281）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
先に述べたＦｏｋＩヌクレアーゼは、二量体として機能するため、ＴＡＬＥＮを細胞内で機能させる場合、ＤＮＡ二重鎖の一方上の特定配列を認識するＤＮＡ結合ドメインを有するＴＡＬＥＮと、その相補鎖上の特定配列を認識するＤＮＡ結合ドメインを有するＴＡＬＥＮ、の２つのタンパク質を発現させる必要がある。これは一般に、動物細胞では比較的容易である。何故なら、動物細胞に対してはマイクロインジェクションなどの方法により高い確実性で、上記２つのタンパク質をコードする２種のプラスミドを導入することが可能であるためである。
【０００９】
しかし、植物細胞中でＴＡＬＥＮを発現させようとした場合、前記２つのタンパク質をコードする２種のプラスミドを導入するといった戦略は一般に効率が低い。何故なら、パーティクル・ガン法による遺伝子導入効率は必ずしも高いものではなく、２種のプラスミドが両方成功裏に導入される確率は低く、また、アグロバクテリウムを用いる方法は効率は高いものの導入できるプラスミドが一種に制限されるからである。二量体で機能する酵素はＴＡＬＥＮに限定されるものではなく、核酸に対して作用する酵素では他の酵素でも見られるものである。このような酵素にＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインを連結して融合タンパク質を作製した場合にも、細胞への導入に際して同様の問題が生じうる。
【００１０】
本願発明者らは、植物細胞中でＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインにＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインなどの生物学的活性を有するタンパク質を連結した融合タンパク質を２つ発現できるようにするよう植物細胞中に遺伝子導入を行うことは、従来の技術では困難であることを見いだした。このため、本発明の一実施形態は、前記融合タンパク質を複数、効率よく植物細胞に導入する方法、およびそのために使用可能なベクター群を提供すること、を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題に鑑みて、本発明は以下の態様を包含する。
本発明の第１の観点によれば、
第１のａｔｔＬ組換え部位と、
可変領域を有するＴＡＬＥ（ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ）のＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントを挿入可能な挿入位置を有する挿入領域と、
前記挿入位置にＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントが挿入された場合にＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質をコードする核酸配列を形成可能となるように位置する、生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、
第２のａｔｔＬ組換え部位と、
を含み、
前記第１のａｔｔＬ組換え部位、前記挿入領域、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、および前記第２のａｔｔＬ組換え部位は、前記生物学的活性を有するタンパク質がコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されており、前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記挿入位置との間に、プロモーターを有しない、ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター、が提供される。
【００１２】
本発明の第２の観点によれば、
各々が第１の観点に記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターである複数種類のベクターを含む、ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセットであって、
前記複数種類のベクターは、
前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記第２のａｔｔＬ組換え部位との間に第１のマーカー遺伝子を含む、第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター、および
前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記第２のａｔｔＬ組換え部位との間に、第１のマーカー遺伝子とは異なる第２のマーカー遺伝子を含む、第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター、
を含む、ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセット、が提供される。
【００１３】
本発明の第３の観点によれば、各々が第１の観点に記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターである複数種類のベクターを含む、ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセットであって、
前記複数種類のベクターは、前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記第２のａｔｔＬ組換え部位との間に第１のマーカー遺伝子を含む、第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群、および前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記第２のａｔｔＬ組換え部位との間に、第１のマーカー遺伝子とは異なる第２のマーカー遺伝子を含む、第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群、を含み、
前記第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群は、それぞれ、アデニン認識用ジペプチド、シトシン認識用ジペプチド、チミン認識用ジペプチド、およびグアニン認識用ジペプチド、をコードする核酸セグメントを前記挿入領域における前記挿入位置の下流側隣接位置に含む４種のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターを含み、
前記第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群は、それぞれ、アデニン認識用ジペプチド、シトシン認識用ジペプチド、チミン認識用ジペプチド、およびグアニン認識用ジペプチド、をコードする核酸セグメントを前記挿入領域における前記挿入位置の下流側隣接位置に含む４種のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターを含む、ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセット、が提供される。
【００１４】
本発明の第４の観点によれば、第１の観点に記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターを準備すること、および
前記ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターの前記挿入位置に、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントを挿入すること、
を含む、融合タンパク質をコードする核酸セグメントを含む融合タンパク質コーディングベクターの製造方法、が提供される。
【００１５】
本発明の第５の観点によれば、
第１のａｔｔＬ組換え部位と、
ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸セグメントと、
前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質を形成するように位置する、生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、
第２のａｔｔＬ組換え部位と、
を含み、
前記第１のａｔｔＬ組換え部位、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸セグメント、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、および前記第２のａｔｔＬ組換え部位は、前記生物学的活性を有するタンパク質がコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されており、前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸セグメントとの間に、プロモーターを有しない、融合タンパク質コーディングベクター、が提供される。
【００１６】
本発明の第６の観点によれば、
各々が第５の観点に記載の融合タンパク質コーディングベクターである複数種類のベクターを含む、融合タンパク質コーディングベクターセットであって、
前記複数種類のベクターは、前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記第２のａｔｔＬ組換え部位との間に第１のマーカー遺伝子を含む、第１の融合タンパク質コーディングベクター、および前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記第２のａｔｔＬ組換え部位との間に、第１のマーカー遺伝子とは異なる第２のマーカー遺伝子を含む、第２の融合タンパク質コーディングベクター、を含む、融合タンパク質コーディングベクターセット、が提供される。
【００１７】
本発明の第７の観点によれば、
第１のＤＮＡブロックおよび第２のＤＮＡブロックを含むデスティネーションベクターであって、
前記第１のＤＮＡブロックは、
植物細胞で作動可能な第１のプロモーターと、
第１のａｔｔＲ組換え部位と、
第２のａｔｔＲ組換え部位と、
を含み、
前記第２のＤＮＡブロックは、
植物細胞で作動可能な第２のプロモーターと、
第３のａｔｔＲ組換え部位と、
第４のａｔｔＲ組換え部位と、
を含み、
前記第２のＤＮＡブロックは前記第１のプロモーターの上流側に位置し、かつ前記第１のＤＮＡブロックとは逆向きに配置されており、前記第１のＤＮＡブロックにおいて、前記第１のプロモーター、前記第１のａｔｔＲ組換え部位および前記第２のａｔｔＲ組換え部位は、前記第１のプロモーターがコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されており、前記第２のＤＮＡブロックにおいて、前記第２のプロモーター、前記第３のａｔｔＲ組換え部位および前記第４のａｔｔＲ組換え部位は、前記第２のプロモーターがコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されている、デスティネーションベクター、が提供される。
【００１８】
本発明の第８の観点によれば、
第６の観点に記載のベクターセットにおける前記第１の融合タンパク質コーディングベクターにおける前記第１のａｔｔＬ組換え部位を、前記第７の観点に記載のデスティネーションベクターにおける前記第１のａｔｔＲ組換え部位と組み換えること、
前記第１の融合タンパク質コーディングベクターにおける前記第２のａｔｔＬ組換え部位を、前記デスティネーションベクターにおける前記第２のａｔｔＲ組換え部位と組み換えること、
前記ベクターセットにおける前記第２の融合タンパク質コーディングベクターの前記第１のａｔｔＬ組換え部位を、前記デスティネーションベクターにおける前記第３のａｔｔＲ組換え部位と組み換えること、および
前記第２の融合タンパク質コーディングベクターの前記第２のａｔｔＬ組換え部位を、前記デスティネーションベクターにおける前記第４のａｔｔＲ組換え部位と組み換えること、
を含む、植物細胞用発現ベクターの製造方法、が提供される。
【００１９】
本発明の第９の観点によれば、
第１のＤＮＡブロックおよび第２のＤＮＡブロックを含む植物細胞用発現ベクターであって、
前記第１のＤＮＡブロックは、
植物細胞で作動可能な第１のプロモーターと、
第１のａｔｔＢ組換え部位と、
特定の核酸配列に結合可能なＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをコードする第１の核酸セグメントと、
前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質を形成するように位置する、生物学的活性を有するタンパク質をコードする第１の遺伝子と、
第２のａｔｔＢ組換え部位と、
を含み、
前記第２のＤＮＡブロックは、
植物細胞で作動可能な第２のプロモーターと、
第３のａｔｔＢ組換え部位と、
特定の核酸配列に結合可能なＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをコードする第２の核酸セグメントと、
前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質を形成するように位置する、生物学的活性を有するタンパク質をコードする第２の遺伝子と、
第４のａｔｔＢ組換え部位と、
を含み、
前記第２のＤＮＡブロックは前記第１のプロモーターの上流側に位置し、かつ前記第１のＤＮＡブロックとは逆向きに配置されており、前記第１のＤＮＡブロックにおいて、前記第１のプロモーター、前記第１のａｔｔＢ組換え部位、前記第１の核酸セグメント、前記第１の遺伝子および前記第２のａｔｔＢ組換え部位は、前記第１の遺伝子がコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されており、前記第２のＤＮＡブロックにおいて、前記第２のプロモーター、前記第３のａｔｔＢ組換え部位、前記第２の核酸セグメント、前記第２の遺伝子および前記第４のａｔｔＢ組換え部位は、前記第２の遺伝子がコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されている、植物細胞用発現ベクター、が提供される。
【００２０】
本発明の第１０の観点によれば、
第２または第３の観点に記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセットおよび第７の観点に記載のデスティネーションベクターを含む、植物細胞用発現ベクター作製用キット、が提供される。
【００２１】
本発明の第１１の観点によれば、
第９の観点に記載の植物細胞用発現ベクターを植物細胞に導入することを含む、前記植物細胞用発現ベクターを遺伝子導入した植物細胞を作製する方法、が提供される。
【００２２】
本発明の第１２の観点によれば、
第９の観点に記載の植物細胞用発現ベクターを植物細胞に導入すること、前記導入された植物細胞用発現ベクターから前記生物学的活性を有するタンパク質を発現させること、および前記生物学的活性を有するタンパク質を植物細胞のゲノムに作用させること、を含むゲノム編集方法であって、前記生物学的活性を有するタンパク質が、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインであり、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインと共にＴＡＬＥＮ融合タンパク質を形成しており、前記ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインが前記植物細胞のゲノムにおける、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインが結合可能な特定の配列の近傍を切断する、ゲノム編集方法、が提供される。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の一実施形態によれば、前記融合タンパク質を複数、効率よく植物細胞に導入することが出来、また、そのために使用可能なベクター群が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に係る植物細胞用発現ベクターの作製の一例である。
【図２】図２は、本発明の一実施例に係るＳＳＡ  ａｓｓａｙによるＴＡＬＥＮ活性の確認用のプラスミド構造を模式的に示す図である。
【図３】図３は、本発明の一実施例に係るＳＳＡ  ａｓｓａｙによるＴＡＬＥＮ活性の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本開示においては、１つのベクター上に、マーカー遺伝子以外の複数遺伝子が発現可能に配置されているベクター（以下マルチ遺伝子ベクターとも称する）を植物細胞に導入する。これにより、１つのベクターの細胞内導入によって、所望の複数の遺伝子を植物細胞内に導入することが出来る。これにより、別々の遺伝子を有する複数のベクターを、例えばパーティクル・ガン法などの植物細胞形質転換方法により細胞内に導入する場合に比べて、高い遺伝子導入効率を達成することが可能となる。さらに、ベクターの数が１つで済むことから、アグロバクテリウムを遺伝子導入に用いることが可能になり、この方法によっても、前記複数のベクターを導入する方法よりも、高い遺伝子導入効率を達成することが可能になる。
【００２６】
なお、動物細胞に複数の遺伝子を導入する場合には、複数のベクターをマイクロインジェクションなどの方法により高効率で導入できるため、マルチ遺伝子ベクターを作製する必要も動機付けもそもそも存在しない。
【００２７】
（ＴＡＬＥの構造）
ＴＡＬＥは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓが植物細胞に感染した際に、植物細胞のプロモーター配列に結合して自己の感染を助ける植物遺伝子群の発現を活性化するタンパク質である。ＴＡＬＥはそのＣ末端側に核移行シグナルと転写活性化ドメイン、中央に繰り返し構造のＤＮＡ結合ドメインを有する。本開示においては、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインよりＮ末端側の領域をＴＡＬＥ−Ｎ領域、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインよりもＣ末端側の領域をＴＡＬＥ−Ｃ領域と称する場合がある。ＴＡＬＥの分子量は約１２０ｋＤａである。
【００２８】
（ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメイン）
ＴＡＬＥの中央部には繰り返し配列からなるＤＮＡ結合ドメインが存在する。繰り返し配列における繰り返し単位となる配列の長さはおよそ３４アミノ酸長であるが、一定はしていない。典型的な繰り返し単位は、配列番号１で表されるものであるが、配列番号１における１２番目と１３番目のアミノ酸残基は可変であり、この残基を変更することにより当該繰り返し単位が認識するヌクレオチドが変わる。具体的には、これらの２アミノ酸残基（ＲＶＤ）がアミノ酸一文字表記でＮＩの場合アデニン（Ａ）を認識し、ＨＤの場合シトシン（Ｃ）を認識し、ＮＨあるいはＮＫの場合グアニン（Ｇ）を認識し、ＮＧの場合チミン（Ｔ）を認識する。ＮＮは主にグアニン（Ｇ）を認識する。本開示中において、アデニン認識用ジペプチド、シトシン認識用ジペプチド、チミン認識用ジペプチド、グアニン認識用ジペプチド、とは、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの繰り返し配列の可変部位において指定されたヌクレオチドを特異的に認識可能な任意のジペプチドを指すが、その例としては、上記に記載したジペプチドが挙げられる。各繰り返し単位中におけるＲＶＤを適宜設計することによって、所望のヌクレオチド配列を有するＤＮＡにＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインが特異的に結合するようにすることが出来る。また、上記のＲＶＤ以外にも繰り返し単位には細かなバリエーションが存在し、いずれも本開示において用いることが出来る。本開示においては、例えばAddgeneから提供されるPlatinum Gate TALEN kitにより作製可能な繰り返し単位を用いることが出来る。この場合の繰り返し配列の一例は、GLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAH（配列番号５１、NNはRVDに相当）であり、ハーフリピートの一例は、GLTPEQVVAIASHDGG（配列番号５２、HDはRVDに相当）である。
【００２９】
本明細書においては、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインとは、上記のように各繰り返し単位におけるＲＶＤが設計された、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインのことを指す。つまり、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓが元々有しているＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインだけでなく、ＲＶＤ等の変更により得られた人工のＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをも包含する。また、上記のように繰り返し配列における繰り返し単位によってＲＶＤの配列は変わりうるため、本明細書においては、この繰り返し配列を可変繰り返し配列とも称する。
【００３０】
ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの繰り返し単位の繰り返し数によって、認識できるＤＮＡ配列の長さが変わる。認識配列の長さが長くなれば、植物細胞ゲノム全体の中における認識配列の数は減少するため、特異性が向上すると言える。言い換えれば、標的となる箇所以外の箇所にＤＮＡ結合ドメインが結合する確率が減少する。一方で、繰り返し単位をコードするＤＮＡの長さは約１００ｂｐ程度になるため、繰り返し単位の繰り返し数を増加させると、それをコードするＤＮＡの長さも長くなり、当該ＤＮＡの作製が複雑化する。また、繰り返し数を２５を超えて長くしても特異性の向上といった点での効果は限定的となるため、本発明においては繰り返し単位の数（Ｃ末端側のhalf repeatは含めない）は、例えば１０〜２５、好ましくは１４〜２０である。なお、Platinum Gate法を用いる場合には、前記繰り返し単位の数は、例えば１２〜２１、好ましくは１５〜１９としてもよい。
【００３１】
（ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの作製）
人工的に設計したＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインは、Platinum Gate法（Addgeneからキット入手可能、Tetsushi Sakuma et al., Scientific Reports 3, Article number 3379, 2013, doi: 10. 1038/srep03379）Golden Gate法（Addgeneからキット入手可能、Cermak et al., Nucleic Acids Res.2011）、FLASH assembly法（Addgeneからキット入手可能、Reyon D, et al., Nat Biotechnol. 2012 Apr 8. doi: 10.1038/nbt.2170）、Ligation independent cloning法（Addgeneからキット入手可能）などの方法を用いて、調製することが出来るが、Platinum Gate法を用いることが特に好ましい。Platinum Gate法においては、それぞれアデニン認識用ジペプチド、シトシン認識用ジペプチド、チミン認識用ジペプチド、およびグアニン認識用ジペプチド、を含むＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメイン繰り返し単位をコードするヌクレオチド配列を有する４種類のプラスミドからなるプラスミド群が使用される。
【００３２】
このプラスミド群は、さらに繰り返し単位両側の４ヌクレオチド配列が異なる、４組のプラスミド群を形成している（Addgeneから提供されるPlatinum Gate TALEN kit (Addgene, One Kendall Aq. B7102, Cambridge MA 02139）の場合、p1HD、p1NG、p1NI、p1NN、p2HD．．．p4NIおよびp4NN）。ステップＩでは、まず、上記４組のプラスミド群のそれぞれにおいて、所望のＲＶＤを有するものを選択し（Platinum Gate TALEN kitの場合、p1HD、p1NG、p1NIおよびp1NNのうちいずれか、p2HD、p2NG、p2NIおよびp2NNのうちいずれか、p3HD、p3NG、p3NIおよびp3NNのうちいずれか、ならびにp4HD, p4NG, p4NIおよびp4NNのうちいずれか）、これらに含まれる繰り返し単位（以下、モジュールとも称する）同士を連結しつつ、別のプラスミド（Platinum Gate TALEN kitの場合、pFUS2_a1a（モジュール数が６〜９個の場合）、pFUS2_a2aおよびpFUS2_a2b（モジュール数が１０〜１３個の場合）、pFUS2_a3a、pFUS2_a3bおよびpFUS_a2b（モジュール数が１４〜１７個の場合）、pFUS2_a4a、pFUS2_a4b、pFUS2_a3bおよびpFUS_a2b（モジュール数が１８〜２１個の場合））に挿入し、４つの繰り返しを有するプラスミド（Platinum Gate TALEN kitの場合、pFUS2_aXX_TALE）を作製する（ステップ１）。ステップ１においては、各プラスミドの切断には制限酵素を、切断された断片同士の連結にはリガーゼを用いればよい（Platinum Gate TALEN kitの場合は、各プラスミドの切断にはＢｓａＩ−ＨＦを用い、切断された断片同士の連結にはＱｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｓｅを用いる）。また、繰り返し数の端数については、別途用意した繰り返し単位の端数挿入用のベクター（Platinum Gate TALEN kitの場合、pFUS2_b(1-4)）に、所望のＲＶＤを有するものを１〜４から選択される所望の数挿入して、プラスミド（Platinum Gate TALEN kitの場合、pFUS2_b(1-4)_TALE）を作製する。ステップ２では、これらの中に含まれるモジュール連結体同士（Platinum Gate TALEN kitの場合、pFUS2_aXX_TALEおよびpFUS2_b(1-4)_TALE）をさらに連結しつつ、別途用意したベクターに挿入して、所望のＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメイン繰り返し配列を含むベクターを作製する。モジュール同士あるいはモジュール連結体同士の連結の際には、モジュールあるいはモジュール連結体の末端の配列が、特定のモジュールあるいはモジュール連結体の末端の配列あるいはプラスミドの配列に相補的になっているため、所定の順序で連結されることになる。ステップ２における各プラスミドの切断には制限酵素を用いればよい（Platinum Gate TALEN kitの場合は、各プラスミドの切断にはＥｓｐ３Ｉを用いる）。連結の際にはＴ４ＤＮＡリガーゼなどを用いればよい。Platinum Gate法の詳細については、Tetsushi Sakuma et al., Scientific Reports 3, Article number 3379, 2013, doi: 10. 1038/srep03379に記載されている。本開示においては、前記別途用意したベクターとして、後述する本開示に係るＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターを使用できる。
【００３３】
ＢｓａＩ（あるいはその高信頼性版であるＢｓａＩ−ＨＦ）は、ＧＧＴＣＴＣを認識して、この配列の外側の位置でＤＮＡを切断する酵素である。その認識配列は、以下のように表される。
５’．．．ＧＧＴＣＴＣ（Ｎ）１．．．３’
３’．．．ＣＣＡＧＡＧ（Ｎ）５．．．５’
つまり、一方鎖では、ＧＧＴＣＴＣの１ヌクレオチド分３’側のヌクレオチドと、２ヌクレオチド分３’側のヌクレオチドの間を切断し、また他方鎖では、ＣＣＡＧＡＧの５ヌクレオチド分５’側のヌクレオチドと、６ヌクレオチド分５’側のヌクレオチドの間を切断する。
【００３４】
Ｅｓｐ３Ｉは、ＣＧＴＣＴＣを認識して、この配列の外側の位置でＤＮＡを切断する酵素である。その認識配列は、以下のように表される。
５’．．．ＣＧＴＣＴＣ（Ｎ）１．．．３’
３’．．．ＧＣＡＧＡＧ（Ｎ）５．．．５’
つまり、一方鎖では、ＣＧＴＣＴＣの１ヌクレオチド分３’側のヌクレオチドと、２ヌクレオチド分３’側のヌクレオチドの間を切断し、また他方鎖では、ＧＣＡＧＡＧの５ヌクレオチド分５’側のヌクレオチドと、６ヌクレオチド分５’側のヌクレオチドの間を切断する。
Platinum Gate法においては、上記のようなＤＮＡ切断酵素を用いているために、その認識配列と、切断によって生じる突出末端の配列とを独立に設計できる。このため、複数のプラスミドを同一のＤＮＡ切断酵素で切断しながらも、一定の順序で断片同士を連結することが可能である。
【００３５】
このようなペプチドによるヌクレオチド配列認識の別の例としてはジンクフィンガー構造が挙げられる。ジンクフィンガー構造を利用して、３〜６個のジンクフィンガーを有するＤＮＡ結合ドメインと、ＤＮＡ切断ドメインとを連結したジンクフィンガーヌクレアーゼが考案されている。しかしながら、ジンクフィンガー構造によって４種のヌクレオチドの全てを明瞭に区別して認識することは困難であり、全ての配列を標的配列に出来る訳ではない。また、ジンクフィンガー構造によるヌクレオチド配列認識の特異性は、周囲の環境による影響を受けるため、得られたジンクフィンガーヌクレアーゼが期待した特異性を有しない場合もある。本開示においては、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの繰り返し配列を用いるため、各ヌクレオチドを明瞭に区別して認識でき、標的配列とする配列が制限される事態が避けられる。
【００３６】
（Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）法）
λファージは大腸菌染色体へ侵入するための、部位特異的組換えシステムを有している。Ｇａｔｅｗａｙ法は、このλファージの組換えシステムのコンポーネントを改変し、組み換え反応の特異性および効率を高めた方法である。具体的には、組換えには、ａｔｔ 配列と称される特定の配列と、組換え反応を仲介するクロナーゼ（登録商標）が関与する。ａｔｔ配列としては、ａｔｔＬ配列、ａｔｔＲ配列、ａｔｔＢ配列およびａｔｔＰ配列が存在する。なお、ａｔｔＢ配列とａｔｔＰ配列は、ＢＰクロナーゼ（登録商標）によって特異的に組換えを起こし、組換え後にはａｔｔＲ配列とａｔｔＰ配列とを生じる。一方、ａｔｔＬ配列とａｔｔＲ配列とは、ＬＲクロナーゼ（登録商標）によって特異的に組換えを起こし、組換え後にはａｔｔＢ配列とａｔｔＰ配列を生じる。なお、ａｔｔＬ配列、ａｔｔＲ配列、ａｔｔＢ配列およびａｔｔＰ配列には、ａｔｔＬ１配列（配列番号２）、ａｔｔＬ２配列（配列番号３）、ａｔｔＬ３配列、ａｔｔＬ４配列等の亜種が存在し、ａｔｔＲ配列にもａｔｔＲ１配列（配列番号４）、ａｔｔＲ２配列（配列番号５）、ａｔｔＲ３配列、ａｔｔＲ４配列等の亜種が存在し、ａｔｔＢ配列にもａｔｔＢ１配列（配列番号６）、ａｔｔＢ２配列（配列番号７）、ａｔｔＢ３配列、ａｔｔＢ４配列等の亜種が存在し、またａｔｔＰ配列にもａｔｔＰ１配列（配列番号８）、ａｔｔＰ２配列（配列番号９）、ａｔｔＰ３配列、ａｔｔＰ４配列などの亜種が存在する。これらの亜種については、例えばａｔｔＬ１配列とａｔｔＲ１配列のように、同じ番号のもの同士が特異的に組換えを起こす。本開示においては、これらの亜種を包含する概念として、ａｔｔＬ組換え部位、ａｔｔＲ組換え部位、ａｔｔＢ組換え部位、およびａｔｔＰ組換え部位の用語を用いる。つまり、例えば、ａｔｔＬ組換え部位は、ａｔｔＬ１配列、ａｔｔＬ２配列、ａｔｔＬ３配列、ａｔｔＬ４配列等の亜種のうち任意のものを指しうるが、その場合、組換えを生じるのに用いられるａｔｔＲ組換え部位も、対応する番号のものが用いられる。ａｔｔＰ組換え部位およびａｔｔＢ組換え部位についても同様のことが言える。詳細については、Gateway(登録商標) Technology  A universal technology to clone DNA sequences for functional analysis and expression in multiple systems, Catalog Numbers 12535-019 and 12535-027, Revision 1.0  Document Part Number 250522, Publication Number MAN0000282を参照することも出来る。なお、亜種（例えば、ａｔｔＬ１、ａｔｔＲ２、ａｔｔＰ１やａｔｔＰ２）といった亜種の中でも若干のバリエーションが存在し得るが、本開示においては、対応する亜種（例えば、ａｔｔＲ１、ａｔｔＬ２、ａｔｔＢ１やａｔｔＢ２）との間の特異的な組換えが可能な範囲において、こうしたバリエーションも各亜種の範囲に含まれる。なおこのようなバリエーションとしては、例えば配列番号５４〜５７で表されるものなどが挙げられる。
【００３７】
なお、ａｔｔＬ３〜ａｔｔＬ５などは、マルチサイトゲートウェイ法において使用可能であるが、これらの特異性、信頼性はａｔｔＬ１やａｔｔＬ２と比較すると低い。また、マルチサイトゲートウェイは、標準的なＬＲクロナーゼ以外の組換え酵素が必要になるなど、非常にコストが高い。Zhang et al., PLOS ONE（November 2013 | Volume 8 Issue 11, e80281）では、ａｔｔＬ５の使用など、マルチサイトゲートウェイ法が用いられており、コストが高くなる。本開示においては、ａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２、ａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２からなる群から選択される組換え部位を用いて、ＬＲクロナーゼによる組換えを行うことが、コスト面から好ましい。
【００３８】
（ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター）
本開示においては、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメイン繰り返し配列を挿入するベクターとして、
第１のａｔｔＬ組換え部位と、
可変領域を有するＴＡＬＥ（ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ）のＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントを挿入可能な挿入位置を有する挿入領域と、
前記挿入位置にＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントが挿入された場合にＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質をコードする核酸配列を形成可能となるように位置する、生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、
第２のａｔｔＬ組換え部位と、
を含み、
前記第１のａｔｔＬ組換え部位、前記挿入領域、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、および前記第２のａｔｔＬ組換え部位は、前記生物学的活性を有するタンパク質がコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されており、前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記挿入位置との間に、プロモーターを有しない、ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター（以下、本開示に係るＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターとも称する）、を用いることが出来る。
【００３９】
ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸配列を挿入可能な挿入位置の下流にＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインをコードする遺伝子を配置したベクターとしては、今から始めるゲノム編集（羊土社２０１４、ｐ１９１）に記載のベクターがある。ただし、このベクターはａｔｔ配列を有しておらず、その後の組換え操作は制限酵素により行っている。また、挿入位置の上流には３５Ｓプロモーターが配置されている。
また、Zhang et al., PLOS ONE（November 2013 | Volume 8 Issue 11, e80281）には、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸配列を挿入可能な挿入位置の上流にＣＡＧプロモーターあるいはＥＦ１プロモーターを有するベクターが記載されている。このベクターはａｔｔ配列を有している。
今から始めるゲノム編集（羊土社２０１４、ｐ１９１）に記載のベクターと比べると、本開示に係るＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターは、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商法）法による組換えが可能であるため、制限酵素法の場合に必要なフェノール−クロロホルム処理やエタノール沈殿等の処理が不要である。これにより、その後の組換え操作を簡便なものとすることが出来る。
【００４０】
また、上記のベクターを、例えば２−ｉｎ−１発現ベクター（マーカー遺伝子を除いて、２つの生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を同一のベクター上に有する発現ベクター）の作製に用いる場合、それぞれの生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子にＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの繰り返し配列をコードする核酸配列を融合させるために、少なくとも２種類のベクターが必要である。ベクターがＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの繰り返し配列の、末端ハーフリピートを有する場合には、４種類のＲＶＤを用意しなければならないため、少なくとも２×４＝８種類のベクターを用意しなければならない。目的とする実験に応じてプロモーターを所望の誘導プロモーターに変更したり、所望の発現レベルのプロモーターに変更したり、所望の種類の植物の細胞で発現するプロモーターに変更したりする場合、ベクター自体にプロモーター配列が含まれていると、上記少なくとも８種類のベクターの各々についてプロモーター交換のための操作が必要になる。しかし、本開示に係るＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおいては、前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記挿入位置との間に、プロモーターが存在しないため、プロモーターの交換は容易である。例えば２−ｉｎ−１発現ベクターを作製する場合などは、後述するデスティネーションベクター中のプロモーターを最終的な２−ｉｎ−１発現ベクターにおけるプロモーターとして用いることが可能である。前記「プロモーターが存在しない」とは、より具体的には、前記生物学的活性を有するタンパク質あるいは前記融合タンパク質をコードする遺伝子を、大腸菌などのクローニング用微生物、植物細胞、動物細胞などで発現させるためのプロモーターが存在しないことを指してもよい。
【００４１】
さらに、上記のZhang et al., PLOS ONE（November 2013 | Volume 8 Issue 11, e80281）に記載の方法においては、ＣＡＧやＥＦ１といった動物細胞用のプロモーターが用いられている。そもそも、動物細胞においてはマイクロインジェクションなどの方法により複数のベクターを効率よく同時導入することが出来る。このため、例えば、複数のＴＡＬＥＮを導入したい場合でも、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの繰り返し配列を挿入するベクターを複数種用意し、これら自身にプロモーターとＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインを設けておけば、前記ＤＮＡ結合ドメインの繰り返し配列を挿入するだけで動物細胞への導入用ベクターが完成する。このため、これ以上の組換え操作を行う必要は無く、これら動物細胞用のベクターは動物細胞用のプロモーターを保持している必要があり、プロモーターを除去する動機付けは何ら存在しない。
【００４２】
また、Zhang et al., PLOS ONE（November 2013 | Volume 8 Issue 11, e80281）に記載の方法においては、動物細胞用プロモーターの下流にＧＦＰもしくはｍＣｈと、ＴＡＬＥＮとが続けて配置されるため、これらの間に自己切断性ペプチドＴ２Ａを設けることで両者を別々のタンパク質として発現させている。しかし、このＴ２Ａペプチドは、最終的な動物細胞用発現ベクター中にも残存し、その結果、プロモーターとＴＡＬＥＮの間の距離は遠くなり、また、発現のメカニズムが複雑化してしまう。
【００４３】
本開示に係るＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントを挿入可能な挿入位置を有する挿入領域は、好ましくは、可変繰り返し配列のＣ末端側のハーフリピートをコードする核酸配列を挿入位置の下流側隣接位置に有する。つまり、前記挿入領域は、前記挿入位置の下流側隣接位置に、アデニン認識用ジペプチド、シトシン認識用ジペプチド、チミン認識用ジペプチド、またはグアニン認識用ジペプチド、をコードする核酸セグメントを含むことが好ましい。なお、下流側隣接位置とは、前記挿入位置に対し、前記生物学的活性を有するタンパク質がコードされている方向における下流側の位置であって、前記ジペプチドをコードする核酸セグメントが、挿入されるＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントと一体となってＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインを形成可能である位置を指す。前記ハーフリピートをコードする核酸配列は、通常は、前記挿入位置の下流側（３’末端側）直後に（つまり、前記挿入位置との間隔を置かずに）存在しており、挿入されるＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントと一体となってＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインを形成することができる。
【００４４】
前記挿入領域における挿入位置の両側の配列は、前記モジュール連結体同士をさらに連結したものの両末端の配列に対して相補的なものであってもよい。これにより、モジュール連結体を挿入位置に特異的に挿入することが出来る。挿入の際にはＴ４ＤＮＡライゲースなどを用いればよい。Platinum Gate TALEN kitの場合には、最終的なモジュール連結体の両端の配列が、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列のコード鎖について５’側末端がＴＣＡＡ（これがＥｓｐ３Ｉによる切断で突出末端となる）、３’側末端がＴＧＧＧ（実際にはこれがＥｓｐ３Ｉによる切断で非コード鎖の突出末端となる）に相補的な配列（つまりＡＣＣＣ）になっているため、挿入領域は前記生物学的活性を有するタンパク質のコード鎖について挿入位置の５’側にＡＧＴＴ（実際にはこれがＥｓｐ３Ｉによる切断で非コード鎖の突出末端となる）に相補的な配列（ＴＣＡＡ）、３’側にＡＣＣＣ（Ｅｓｐ３Ｉによる切断で突出末端となる）の配列を有していることが好ましい。ハーフリピートをコードする核酸配列がある場合には、前記ＡＣＣＣの配列も繰り返し配列をコードする核酸セグメントの一部を構成する。なお、上記説明では、便宜上、非コード鎖上の配列は３’→５’の向きで表記している。
【００４５】
前記挿入位置は、例えば制限酵素により切断可能な位置であってもよく、前記制限酵素としてはＢｓａＩまたはＥｓｐ３Ｉが好ましく、Ｅｓｐ３Ｉがさらに好ましい。Platinum Gate法を用いる場合などは、前記挿入位置は、Ｅｓｐ３Ｉの認識部位（ＣＧＴＣＴＣ）に隣接する位置となる（Ｅｓｐ３Ｉは前述のとおり認識部位の外側を切断する酵素であるため）。つまり、一つの実施形態では、前記挿入領域はＥｓｐ３Ｉの認識部位を有し、好ましくはＥｓｐ３Ｉの認識部位を２つ有する。前記挿入領域がＥｓｐ３Ｉの認識部位を２つ有する場合には、Ｅｓｐ３Ｉの認識部位は、ＤＮＡの二本鎖のそれぞれに一つづつ存在することが好ましい。両認識部位の間の領域は、Ｅｓｐ３Ｉによる切断によりベクターから失われ、その代わりに前記モジュール連結体が挿入可能となる。挿入領域中にＥｓｐ３Ｉの認識部位が１つしか存在しない場合には、切断によって生じた各鎖の突出末端が挿入位置を構成する。挿入領域中にＥｓｐＩの認識部位が２つ以上存在する場合にも、各鎖の突出末端が挿入位置を構成するが、この場合は、各鎖の突出末端の配列を異ならせることが出来るため、モジュール連結体を特定の方向で挿入する上で有利である。なお、挿入領域中にＥｓｐＩの認識部位は３つ以上存在してもよいが、その場合は、実際に挿入位置を構成する突出末端を生じるのは、前記生物学的活性を有するタンパク質がコードされている方向における最上流の認識部位と最下流の認識部位となる。
【００４６】
挿入のために用いる制限酵素がＥｓｐ３Ｉである場合、ベクター中の挿入領域以外の箇所が切断されないように、前記ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターは、前記挿入領域以外にはＥｓｐ３Ｉの認識部位を有しないことが好ましい。
上記のとおり、挿入領域が、前記生物学的活性を有するタンパク質のコード鎖について挿入位置の５’側にＴＣＡＡ、３’側にＡＣＣＣの配列を有している場合には、前記挿入領域は、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列のコード鎖上に、ＴＣＡＡＮＧＡＧＡＣＧ（配列番号５８）の配列およびＣＧＴＣＴＣＮＡＣＣＣ（配列番号５９）の配列を有することとなる（ＮはＡ、Ｇ、ＴおよびＣのうち任意のもの）。この２つの配列を有する結果、２つの配列のうち一方においてはコード鎖上にＥｓｐ３Ｉの認識配列ＣＧＴＣＴＣが存在し、他方においては非コード鎖上に該認識配列が存在する。この場合、ＴＣＡＡＮＧＡＧＡＣＧの配列はＥｓｐ３Ｉにより、
【００４７】
【化１】
0006590333.tif 000002
【００４８】
のように切断され、ＣＧＴＣＴＣＮＡＣＣＣの配列はＥｓｐ３Ｉにより
【００４９】
【化２】
0006590333.tif 000003
【００５０】
のように切断される。そして、ＴＣＡＡＮＧＡＧＡＣＧの下流側かつＣＧＴＣＴＣＮＡＣＣＣの上流側の部分が、ベクターから失われ、その代わりに前記モジュール連結体が挿入可能となることになる。このため、一つの実施形態では、前記挿入領域は、前記生物学的活性を有するタンパク質がコードされている方向における上流側の位置にＴＣＡＡＮＧＡＧＡＣＧの配列を、下流側の位置にＣＧＴＣＴＣＮＡＣＣＣを含む。
上記の説明では、Platinum Gate TALEN kit（Addgene）、Platinum Gate法およびＥｓｐＩを使用する場合を想定したが、ＢｓａＩなど、認識配列の外側で核酸を切断する制限酵素（例えばIIS型制限酵素）を使用する場合には、ＥｓｐＩを使用する場合について説明した事項が同様に当てはまる。また、上記の説明における挿入領域の切断によって生じる突出末端の配列はPlatinum Gate TALEN kit（Addgene）を使用する場合を想定した一例であり、挿入領域の切断によって生じる突出末端の配列はモジュール連結体側の突出末端の配列と連結可能な配列であれば上記の説明で言及された配列以外の配列であってもよい。つまり、モジュール連結体の形成に用いるプラスミドがPlatinum Gate TALEN kitに含まれるプラスミドとは異なるものであっても、形成されるモジュール連結体の両側の突出末端に相補的な突出末端を形成できるように挿入領域中の挿入位置近傍の配列を選択すれば、上記の説明と同様にしてモジュール連結体を挿入位置に挿入できる。認識配列の外側で核酸を切断する制限酵素を用いる場合には、切断によって生じる突出末端の配列を、制限酵素の認識配列とは独立して設計することが可能になるため、Platinum Gate法およびPlatinum Gate TALEN kitからの改変が可能であり、そのような場合にも本開示に係るＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターは使用可能である。
【００５１】
本開示に係るＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける、生物学的活性を有するタンパク質は、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質を形成した場合において、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインが標的核酸部位に結合した際に生物学的活性を発揮するタンパク質であれば、特に限定されない。その例としては、ヌクレアーゼ活性、ポリメラーゼ活性、核酸組換え活性、転写制御活性、および核酸修飾活性からなる群から選択される１つ以上を有するタンパク質である。なお、本発明において、「核酸」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸を包含する概念であり、核酸は修飾されたものであってもよい。つまり、「核酸」は、修飾または未修飾のＤＮＡまたはＲＮＡを指しうる。
【００５２】
特に、本開示に係るＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターを用いれば２−ｉｎ−１ベクターなどを容易に作製可能である点を考慮すれば、前記タンパク質は２量体として機能するタンパク質であることが好ましい。その例としては、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインが挙げられる。ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインは二量体として働き、各単量体がＤＮＡ二重鎖の各鎖上に位置し、配列非特異的にＤＮＡを切断する。このため、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質（Transcription activator-like effector nuclease(TALEN)）とすることで、ゲノム上の所望の位置でＤＮＡを切断することが可能である。その他、本開示において、生物学的活性を有するタンパク質の例としては、リプレッションドメイン（ＣＲＥＳ−Ｔ法で使用される）、グルココルチコイドレセプター、およびＶＰ１６転写制御ドメインが挙げられる。
【００５３】
前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、イントロンを含んでいてもよい。前記タンパク質は、クローニング用の微生物（例えば、大腸菌）内で発現してしまうと、タンパク質の種類によっては、該微生物の増殖を阻害する場合もある。しかし、前記タンパク質をコードする遺伝子がイントロンを含んでいる場合には、前記微生物はイントロンのスプライシングが出来ないため、前記微生物内では前記タンパク質は発現せず、前記微生物の増殖が妨げられることを防止できる。なお、後述するデスティネーションベクター中の植物細胞で作動可能な第１のプロモーターおよび第２のプロモーターが、前記微生物中で全く発現を生じないものであれば、前記タンパク質は前記微生物中で発現しないため、イントロンを含ませる必要は基本的に無い。つまり、イントロンを含ませるかどうかは、前記プロモーターがどの程度クローニング用微生物中で発現を誘導するかによって決めればよい。なお、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターは、大腸菌内においても弱く発現を誘導する。このため、イントロンを含ませると、含ませない場合よりも、大腸菌の増殖を早くすることが出来る。挿入するイントロン領域の数は１つでもよいが、２つ以上（例えば２つ）にすればより確実にクローニング用の微生物（例えば大腸菌）内における機能的なタンパク質の発現を防止できる。なお、融合タンパク質のＮ末端側に位置するＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインと、Ｃ末端側に位置する前記生物学的活性を有するタンパク質（例えばＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメイン）の各々に、１つ以上のイントロンを有することは、クローニング用の微生物（例えば大腸菌）内における機能的なタンパク質の発現を防止できる上でさらに有効である。
【００５４】
前記挿入位置から前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子までの核酸配列は、前記挿入位置にPlatinum Gate法などによってＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの繰り返し配列をコードする核酸セグメントが挿入された場合に、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインと前記生物学的活性を有するタンパク質が融合タンパク質を形成できるように、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸配列と前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子とが共通のオープンリーディングフレームを形成できるように設計されている。これは、両者の間のヌクレオチドの数を、コドンフレームが共通となるような数にし、また終始コドンを両者の間に含まないように設計することにより可能となる。
【００５５】
前記挿入領域および前記生物学的活性をタンパク質をコードする遺伝子を挟むように、その上流及び下流には第１のａｔｔＬ組換え部位と第２のａｔｔＬ組換え部位が位置する。これらの組換え部位をａｔｔＲ組換え部位と組換えさせることによって、前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記第２のａｔｔＬ組換え部位の間の領域を他のベクターに移すことが可能である。この操作は特異性が高く、また、制限酵素処理に伴うフェノールクロロホルム処理やエタノール沈殿の必要が無いため、これらの組換え部位の存在によって、デスティネーションベクターへの組換え処理が容易になっている。
【００５６】
前記第１のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列は、前記第２のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列とは異なることが好ましい。この配列が同じであると、後にａｔｔＲ配列と組換えを起こす場合に、どちらのａｔｔＬ組換え部位で組換えが生じるかを制御することが難しくなるためである。さらに、前記第１のａｔｔＬ組換え部位は、第１のａｔｔＲ組換え部位と組み換え可能であり、前記第２のａｔｔＬ組換え部位は、第１のａｔｔＲ組換え部位とは核酸配列が異なる第２のａｔｔＲ組換え部位と組み換え可能であることが好ましい。また、前記第１のａｔｔＬ組換え部位は前記第２のａｔｔＲ組換え部位と組み換え可能ではなく、前記第２のａｔｔＬ組換え部位は前記第１のａｔｔＲ組換え部位とは組み換え可能ではないことが好ましい。これらの構成によって、組換えにより挿入される領域の方向性を制御できる。
【００５７】
前記第１のａｔｔＬ組換え部位がａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２のうちの一方であり、前記第２のａｔｔＬ組換え部位がａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２のうちの他方である構成を採用してもよい。ａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２の組換えの特異性により、これら両者における組換えを独立に制御できる。なお、ａｔｔＬ配列としては、他にもａｔｔＬ３配列やａｔｔＬ４配列などがあるが、ａｔｔＬ３やａｔｔＬ４の組換えの特異性はａｔｔＬ１やａｔｔＬ２の組換えの特異性に比べると低いものと考えられる。
【００５８】
本開示に係るＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターは、前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記第２のａｔｔＬ組換え部位との間に、マーカー遺伝子をさらに含んでいてもよい。マーカー遺伝子が存在すれば、大腸菌を始めとするクローニング用の微生物にトランスフォームした際に、ベクターが導入された細胞を容易に検出し、選択することが出来る。
前記マーカー遺伝子は、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と前記第２のａｔｔＬ組換え部位との間に位置してもよい。このような位置にあれば、前記第１のａｔｔＬ組換え部位を用いて、別のベクターのプロモーター領域の下流に前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を配置するように組換えた場合でも、マーカー遺伝子がプロモーター領域と前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子との間に割り込むことがない。
前記マーカー遺伝子は、蛍光タンパク質をコードする遺伝子（例えばＧｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ））、呈色反応を触媒する酵素をコードする遺伝子、および薬剤（例えば抗生物質）耐性遺伝子からなる群から選択されてもよい。これらの遺伝子を有するクローンは、光学的観察あるいは薬剤（例えば抗生物質）含有培地を用いての培養によって容易に検出することが出来る。
【００５９】
前記マーカー遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子であってもよい。抗生物質耐性遺伝子の例としては、アンピシリン耐性遺伝子（amp）、クロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）、クラリスロマイシン耐性遺伝子（cam）、カナマイシン耐性遺伝子（kan)、ストレプトマイシン−スペクチノマイシン耐性遺伝子（spec)、およびテトラサイクリン耐性遺伝子（tet)が挙げられる。
【００６０】
前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の終始コドンと、前記マーカー遺伝子との間の距離は、例えば０．２ｋｂ〜１．０ｋｂ、好ましくは０．３ｋｂ〜０．６ｋｂであってもよい。この距離が長すぎると、プラスミド構築上の困難性が増す傾向がある。なお、前記マーカー遺伝子は、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と同じ向きであってもよく、逆向きであってもよい。前記マーカー遺伝子が、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と同じ向きであるとは、前記マーカー遺伝子と前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子とが、同じ鎖にコードされている（コード鎖が同じ）であることを意味し、前記マーカー遺伝子が、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と逆向きであるとは、前記マーカー遺伝子と前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子とが、別の鎖（相補鎖）にコードされている（前記マーカー遺伝子のコード鎖が、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の非コード鎖に相当する）ことを意味する。
【００６１】
前記マーカー遺伝子と前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子とが同じ向きである場合は、前記距離とは、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の終始コドンと、前記マーカー遺伝子の５’末端との距離を意味し、前記マーカー遺伝子と前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が逆向きである場合は、前記距離とは、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の終始コドンと、前記マーカー遺伝子の３’末端との距離を意味する。逆向きの場合、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、前記マーカー遺伝子とは、それぞれ別々の鎖にコードされているが、その場合前記距離とは、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のコード鎖上における、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の終始コドンと前記マーカー遺伝子の３’末端（これは相補鎖上に存在する）に対応する位置との距離を指す。本明細書中に記載された他の距離についても、同様に、遺伝子、核酸セグメント、特定配列、組換え部位、プロモーター等の、要素間の距離とは、各要素の間の最短距離を指し、各要素が別々の鎖にコードされている場合には、一方の要素がコードされている核酸鎖上の領域に対応する相補鎖上の領域と、他方の要素がコードされている領域との間の最短距離を指す。
【００６２】
前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と前記マーカー遺伝子との間にはターミネーターが存在してもよい。これにより、両遺伝子は別々のｍＲＮＡに転写されるようになる。このようなターミネーターの例としては、例えばＮＯＳターミネーターがある。
【００６３】
前記マーカー遺伝子発現用のプロモーターは、マーカー遺伝子自身が通常有しているプロモーターでよく、大腸菌内で発現可能なプロモーターであることが好ましい。
前記挿入位置と、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子との間の距離は、例えば０．１ｋｂ〜０．５ｋｂであってもよい。この領域には、後述のとおりＴＡＬＥ−Ｃ領域を配置できる。前記距離を適切に設定することで、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインが特定配列のＤＮＡに結合した際に、前記生物学的活性を有するタンパク質がより有効に機能できるようになる。
【００６４】
前記第１のａｔｔＬ組換え部位と、前記挿入位置との間の距離は、例えば０ｂｐ〜１．０ｋｂ、好ましくは６ｂｐ〜０．５ｋｂである。この距離が長すぎると、プラスミド構築上の困難性が増す傾向がある。この間には、ＴＡＬＥ−Ｎ領域を配置できる。前記挿入位置の上流（ＴＡＬＥ−Ｎ領域が配置されている場合には、ＴＡＬＥ−Ｎ領域の上流）には、制限酵素部位、Ω因子および翻訳促進効果のある５’ＵＴＲからなる群から選択される一つ以上を配置することも出来る。
【００６５】
本開示に係るＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターは、環状二本鎖プラスミドベクターであることが好ましい。また、前記ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターは、大腸菌内で機能可能な複製起点を有することが好ましい。この複製起点が存在する場合は、大腸菌を用いたクローニングが可能となる。前記複製起点は、ｐＵＣ起点であってもよいし、大腸菌で機能するその他の複製起点であってもよい。前記ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターは、さらに構成セグメントを含むことが好ましい。この構成セグメントは、ベクターの土台として働くものであり、一般的に使われている大腸菌用ベクターのセグメントを前記構成セグメントとして用いてもよい。前記構成セグメントは、プラスミドベクターの構成セグメントであることが好ましい。また、前記構成セグメントの長さは、例えば０．５ｋｂ〜５．０ｋｂの長さであってもよい。この距離が長すぎると、プラスミド構築上の困難性が増す傾向がある。前記構成セグメントは好ましくは大腸菌内で機能可能な複製起点を有する他、転写や複製の制御のための領域を含んでいてもよい。前記構成セグメントは、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＤＯＮＲ２０７等に由来する構成セグメントであってもよい。
【００６６】
本開示のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターは、前記挿入領域の上流側（前記機能性タンパク質をコードする遺伝子のコード鎖の５’側）に隣接してＴＡＬＥ−Ｎ領域の全長あるいは一部（例えば１４０〜１５３アミノ酸長程度）をコードする核酸セグメントをさらに含んでいてもよい。この場合は、前記挿入領域にＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントが挿入された場合に、前記ＴＡＬＥ−Ｎ領域の全長あるいは一部は、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメイン及び前記生物学的活性を有するタンパク質との融合タンパクを形成可能となるように、コドンのフレームが合っていることが好ましい。また、本開示のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターは、前記挿入領域の下流側（前記機能性タンパク質をコードする遺伝子のコード鎖の３’側）に隣接してＴＡＬＥ−Ｃ領域の全長あるいは一部（例えば４０〜４７アミノ酸長程度）をコードする核酸セグメントをさらに含んでいてもよい。この場合は、前記挿入領域にＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントが挿入された場合に、前記ＴＡＬＥ−Ｃ領域の全長あるいは一部は、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメイン及び前記生物学的活性を有するタンパク質との融合タンパクを形成可能となるように、コドンのフレームが合っていることが好ましい。ＴＡＬＥ−Ｎ領域およびＴＡＬＥ−Ｃ領域については、部分的に欠失させた方が融合タンパク質の活性が高くなるという報告があり、１３６／６３や１５３／４７（スラッシュの左側がＴＡＬＥ−Ｎ領域のアミノ酸残基数、右側がＴＡＬＥ−Ｃ領域のアミノ酸残基数）といった部分欠失型が知られている。また、上記のようなＴＡＬＥ−Ｎ領域の全長もしくは一部、またはＴＡＬＥ−Ｃ領域の全長あるいは一部、にイントロンを含ませてもよい。
【００６７】
（第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセット）
本開示に係るＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターを用いて、２−ｉｎ−１ベクターを作製する場合などは、各々の、生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む、２つ以上のベクターを準備してもよい。このため、本開示に係る第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセットは、
各々が本開示に係るＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターである複数種類のベクターを含む、ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセットであって、
前記複数種類のベクターは、
前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記第２のａｔｔＬ組換え部位との間に第１のマーカー遺伝子を含む、第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター、および
前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記第２のａｔｔＬ組換え部位との間に、第１のマーカー遺伝子とは異なる第２のマーカー遺伝子を含む、第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター、
を含む、ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセットである。
このように複数のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターを用いることによって、生物学的活性を有するタンパク質をコードする複数の核酸領域を、複数のベクターにそれぞれ含ませることが実現される。
【００６８】
一つの実施形態では、前記第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第１のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列と、前記第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第１のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列が同じものであり、前記第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第２のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列と、前記第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第２のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列が同じものである。これにより、ａｔｔＬ組換え部位の種類を少なくできるため、組換え操作をより簡略化することが可能になる。
一つの実施形態では、前記第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第１のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列と、前記第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第２のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列が同じものであり、前記第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第２のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列と、前記第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第１のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列が同じものである。これは、前記実施形態の変形例と考えることが出来る。
【００６９】
なお、前記第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、前記第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、同じものであるかまたはこれらがコードするタンパク質が協同して機能するものであることが好ましい。その例としては、前述のＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインが挙げられる。
前記第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターおよび前記第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターの詳細については、本開示に係るＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターの詳細と同じである。
【００７０】
（第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセット）
先に述べたとおり、本開示に係るＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターは、前記挿入位置の下流側（前記生物学的活性を有するタンパク質のコード鎖における３’側）隣接領域に、ＴＡＬＥの繰り返し配列のハーフリピートを有していてもよい。その場合、ハーフリピートの種類に対応して、多種類のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターを用意することが考えられる。具体的には、本開示に係る第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセットは、
各々が本開示に係るＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターである複数種類のベクターを含む、ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセットであって、
前記複数種類のベクターは、前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記第２のａｔｔＬ組換え部位との間に第１のマーカー遺伝子を含む、第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群、および前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記第２のａｔｔＬ組換え部位との間に、第１のマーカー遺伝子とは異なる第２のマーカー遺伝子を含む、第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群、を含み、
前記第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群は、それぞれ、アデニン認識用ジペプチド、シトシン認識用ジペプチド、チミン認識用ジペプチド、およびグアニン認識用ジペプチド、をコードする核酸セグメントを前記挿入領域における前記挿入位置の下流側隣接位置に含む４種のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターを含み、
前記第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群は、それぞれ、アデニン認識用ジペプチド、シトシン認識用ジペプチド、チミン認識用ジペプチド、およびグアニン認識用ジペプチド、をコードする核酸セグメントを前記挿入領域における前記挿入位置の下流側隣接位置に含む４種のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターを含む、ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセット、である。
【００７１】
一つの実施形態においては、前記第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群の前記４種のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第１のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列と、前記第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群の前記４種のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第１のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列が同じものであり、前記第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群の前記４種のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第２のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列と、前記第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群の前記４種のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第２のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列が同じものである。これにより、ａｔｔＬ組換え部位の種類を少なくできるため、組換え操作をより簡略化することが可能になる。
【００７２】
別の実施形態においては、前記第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群の前記４種のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第１のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列と、前記第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群の前記４種のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第２のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列が同じものであり、前記第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群の前記４種のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第２のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列と、前記第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群の前記４種のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第１のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列が同じものである。これは、前記実施形態の変形例と考えることが出来る。
【００７３】
なお、前記第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群の前記４種のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、前記第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群の前記４種のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、同じものであるかまたはこれらがコードするタンパク質が協同して機能するものであることが好ましい。その例としては、前記第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセットの説明において挙げた例と同様である。
前記第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群および前記第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群における各ベクターの詳細については、本開示に係るＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターの詳細と同じである。
【００７４】
（融合タンパク質コーディングベクターの製造方法）
本開示に係るＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターには、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントを挿入することが出来る。すなわち、本開示に係る融合タンパク質コーディングベクターの製造方法は、
本開示に係るＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターを準備すること、および
前記ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターの前記挿入位置に、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントを挿入すること、
を含む、融合タンパク質をコードする核酸セグメントを含む融合タンパク質コーディングベクターの製造方法である。ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントの挿入は、例えばＰｌａｔｉｎｕｍ Ｇａｔｅ法によって行うことが出来る。前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列の繰り返し数は、１３〜２５であってもよく、好ましくは１４〜２０である。なお、Platinum Gate法を用いる場合には、前記繰り返し単位の数は、例えば１２〜２１、好ましくは１５〜１９としてもよい。反応条件の詳細については、Tetsushi Sakuma et al., Scientific Reports 3, Article number 3379, 2013, doi: 10. 1038/srep03379を参照することが出来る。
得られた融合タンパク質は、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインと前記生物学的活性を有するタンパク質とが融合されたタンパク質である。これによって、前記生物学的活性を、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインが認識する特定の核酸配列の位置で発揮することが可能になる。このためには、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列は、前記生物学的活性を有するタンパク質の作用対象部位となる対象核酸領域の配列に基づいて、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列が前記対象核酸領域に結合可能となるように選択されることになる。
【００７５】
なお、このような融合タンパク質を発現するために、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインと、前記生物学的活性を有するタンパク質とは、コドンのフレームは合っていなければならない。
なお、本開示に係るＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターがＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの繰り返し配列の末端ハーフリピートを有している場合には、挿入される前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントは、標的配列を認識するためのＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインのモジュール繰り返しのうち、前記末端ハーフリピートを除いた部分となる。
【００７６】
（融合タンパク質コーディングベクター）
本開示に係るＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターに、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントを挿入することで、融合タンパク質コーディングベクターが得られる。つまり、本開示に係る融合タンパク質コーディングベクターは、
第１のａｔｔＬ組換え部位と、
ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸セグメントと、
前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質を形成するように位置する、生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、
第２のａｔｔＬ組換え部位と、
を含み、
前記第１のａｔｔＬ組換え部位、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸セグメント、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、および前記第２のａｔｔＬ組換え部位は、前記生物学的活性を有するタンパク質がコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されており、前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸セグメントとの間に、プロモーターを有しない、融合タンパク質コーディングベクターである。
【００７７】
前記融合タンパク質コーディングベクターは、本開示に係るＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターに、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントを挿入することで得ることができるものであるため、ベクターの構造についての詳細、ａｔｔＬおよびａｔｔＲ組換え部位についての詳細、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの繰り返し配列およびそれをコードする核酸セグメントについての詳細、前記生物学的活性を有するタンパク質およびそれをコードする遺伝子についての詳細、前記マーカー遺伝子についての詳細、前記イントロンについての詳細、前記核酸上の距離についての詳細については、本開示に係るＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターの説明におけるそれらの詳細と同様である。
【００７８】
前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列の繰り返し数は、１３〜２５であってもよく、好ましくは１４〜２０である。あるいは、別の実施形態では、前記繰り返し単位の数は、例えば１２〜２１、好ましくは１５〜１９としてもよい。
前記融合タンパク質コーディングベクター上にコードされた融合タンパク質は、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインと前記生物学的活性を有するタンパク質とが融合されたタンパク質である。これによって、前記生物学的活性を、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインが認識する特定の核酸配列の位置で発揮することが可能になる。このためには、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列は、前記生物学的活性を有するタンパク質の作用対象部位となる対象核酸領域の配列に基づいて、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列が前記対象核酸領域に結合可能となるように選択されることになる。
なお、このような融合タンパク質を発現するために、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインと、前記生物学的活性を有するタンパク質とは、コドンのフレームは合っている。また、前記ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターの場合と同様に、マーカー遺伝子が存在する場合は、該マーカー遺伝子は生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と同じ向きに配置されていても、逆向きに配置されていてもよい。
【００７９】
（融合タンパク質コーディングベクターセット）
本開示に係る融合タンパク質コーディングベクターを用いて、２−ｉｎ−１ベクターを作製する場合などは、各々融合タンパク質をコードする遺伝子を含む、２つ以上のベクターを準備してもよい。このため、本開示に係る融合タンパク質コーディングベクターセットは、
各々が本開示に係る融合タンパク質コーディングベクターである複数種類のベクターを含む、融合タンパク質コーディングベクターセットであって、
前記複数種類のベクターは、前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記第２のａｔｔＬ組換え部位との間に第１のマーカー遺伝子を含む、第１の融合タンパク質コーディングベクター、および前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記第２のａｔｔＬ組換え部位との間に、第１のマーカー遺伝子とは異なる第２のマーカー遺伝子を含む、第２の融合タンパク質コーディングベクター、を含む、融合タンパク質コーディングベクターセットである。
このように複数の融合タンパク質コーディングベクターを用いることによって、融合タンパク質をコードする複数の核酸領域を、複数のベクターにそれぞれ含ませることが実現される。
【００８０】
前記第１の融合タンパク質コーディングベクターにおける前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、前記第２の融合タンパク質コーディングベクターにおける前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、同じものであるかまたはこれらがコードするタンパク質が協同して機能するものであるものであってもよい。これらについての詳細は、本開示に係るＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセットの説明におけるそれらの詳細と同様である。
【００８１】
（デスティネーションベクター）
前記融合タンパク質コーディングベクター中の前記第１のａｔｔＬ組換え部位および前記第２のａｔｔＬ組換え部位の間の領域は、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）法によって、デスティネーションベクターに導入することが出来る。ａｔｔＬ組換え部位との組換えを可能とするために、デスティネーションベクターはａｔｔＲ組換え部位を有している。
具体的には、本開示に係るデスティネーションベクターは、
第１のＤＮＡブロックおよび第２のＤＮＡブロックを含むデスティネーションベクターであって、
前記第１のＤＮＡブロックは、
植物細胞で作動可能な第１のプロモーターと、
第１のａｔｔＲ組換え部位と、
第２のａｔｔＲ組換え部位と、
を含み、
前記第２のＤＮＡブロックは、
植物細胞で作動可能な第２のプロモーターと、
第３のａｔｔＲ組換え部位と、
第４のａｔｔＲ組換え部位と、
を含み、
前記第２のＤＮＡブロックは前記第１のプロモーターの上流側に位置し、かつ前記第１のＤＮＡブロックとは逆向きに配置されており、前記第１のＤＮＡブロックにおいて、前記第１のプロモーター、前記第１のａｔｔＲ組換え部位および前記第２のａｔｔＲ組換え部位は、前記第１のプロモーターがコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されており、前記第２のＤＮＡブロックにおいて、前記第２のプロモーター、前記第３のａｔｔＲ組換え部位および前記第４のａｔｔＲ組換え部位は、前記第２のプロモーターがコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されている、デスティネーションベクターである。
【００８２】
前記デスティネーションベクターにおいては、前記第１のＤＮＡブロックと、前記第２のＤＮＡブロックとは、互いに逆向きに配置されている。つまり、第１のＤＮＡブロックにおける第１のプロモーターのコード鎖と同じ鎖は、第２のＤＮＡブロックにおける第２のプロモーターの非コード鎖に相当する。この構成により、第１のプロモーターと第２のプロモーターとの間に遺伝子を配置する必要が無く、このため、第１のプロモーターと第２のプロモーターを含む領域を、別のＤＮＡフラグメントで置き換えることにより、第１のプロモーターと第２のプロモーターとを１回の操作でまとめて置換可能である。目的とする実験に応じてプロモーターを所望の誘導プロモーターに変更したり、所望の発現レベルのプロモーターに変更したり、所望の種類の植物の細胞で発現するプロモーターに変更したりする場合、１回の操作で複数のプロモーターを交換できることは作業効率を大きく向上させる。なお、本明細書中において、ＤＮＡブロックについて「逆向き」とは、上記と同様に、一方のＤＮＡブロックにおけるコード鎖（センス鎖）が、他方のＤＮＡブロックにおける非コード鎖（アンチセンス鎖）となっていることを指し、例えば、植物細胞用プロモーターの配列や、生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の配列がコードされている鎖が二重鎖のうちどちらであるかを判別することで判断することが出来る。
【００８３】
さらに、前記第１のＤＮＡブロックと、前記第２のＤＮＡブロックとが逆向きに配置されていることは、次のような利点も有する。前述の今から始めるゲノム編集（羊土社２０１４、ｐ１９１）やZhang et al., PLOS ONE（November 2013 | Volume 8 Issue 11, e80281）に記載のベクターでは、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸配列を含む２つの遺伝子発現単位が、同方向に配置されている。この場合、両遺伝子発現単位中のＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインにおいては数多くの重複する配列が存在することから、細胞中で、両発現単位は自然に相同組換えを起こし、その結果、組換えを起こした部位の間に存在した核酸セグメントは欠失することになり、機能するＴＡＬＥＮが得られなくなる場合がある。
一方、本開示におけるようにＤＮＡブロックが逆方向に配置されている場合には、たとえ両ＤＮＡブロックの配列が相同組換えを起こしたとしても、結果として起こることは、単に両ブロックの配列が入れ替わるだけであり、依然として機能的なＴＡＬＥＮが得られる。
【００８４】
前記第１のプロモーターおよび前記第２のプロモーターは、構成的プロモーター、誘導的プロモーター、組織特異的プロモーターおよび時期特異的プロモーターから選択されてもよい。このようなプロモーターの選択を行うことで、所望の植物種、時期、および発現レベルで、発現の制御を行うことが可能である。
前記構成的プロモーターは、強発現プロモーターであってもよい。また、前記第１のプロモーターおよび前記第２のプロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、イネユビキチンプロモーター、およびアグロバクテリウムＮＯＳプロモーターからなる群から選択されてもよい。
前記第１のプロモーターと前記第２のプロモーターは、互いに異なるプロモーターであってもよいが、通常は互いに同じプロモーターである。
【００８５】
また、前記デスティネーションベクターの各プロモーター領域の下流には、ａｔｔＲ組換え部位が配置されているため、ａｔｔＬ組換え部位との間で組換えを起こすことが出来る。これにより、各プロモーターの下流に、該プロモーターにより発現制御される核酸あるいはタンパク質をコードする遺伝子（例えば、前記融合タンパク質）を挿入することが可能であり、これによって、前記核酸あるいはタンパク質をコードする遺伝子発現ベクターを形成することが出来る。
【００８６】
前記第１〜第４のａｔｔＲ組換え部位は、各々ａｔｔＲ１またはａｔｔＲ２であってもよい。ａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２配列の組換え特異性は、ａｔｔＲ３やａｔｔＲ４の組換え特異性よりも高いため、ａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２の使用により所望の構築物をより高効率に得ることが出来る。
前記第１のａｔｔＲ組換え部位の核酸配列が前記第２のａｔｔＲ組換え部位の核酸配列とは異なり、前記第３のａｔｔＲ組換え部位の核酸配列が前記第４のａｔｔＲ組換え部位の核酸配列とは異なる構成を有していてもよい。これにより、第１のａｔｔＲ組換え部位と前記第２のａｔｔＲ組換え部位の間、あるいは前記第３のａｔｔＲ組換え部位と前記第４のａｔｔＲ組換え部位との間に、特定の方向性で核酸フラグメントを導入することがより容易になる。
また、前記第１のａｔｔＲ組換え部位の核酸配列と前記第３のａｔｔＲ組換え部位の核酸配列が同じであり、前記第２のａｔｔＲ組換え部位の核酸配列と前記第４のａｔｔＲ組換え部位の核酸配列とが同じである構成を採用してもよい。この場合、使用するａｔｔＲ配列の種類を少なくできるため、組換え操作を簡略化することができるようになる。
【００８７】
前記第１のａｔｔＬ組換え部位および前記第３のａｔｔＲ組換え部位は、第１のａｔｔＬ組換え部位と組み換え可能であり、前記第２のａｔｔＲ組換え部位および前記第４のａｔｔＲ組換え部位は、第１のａｔｔＬ組換え部位とは核酸配列が異なる第２のａｔｔＬ組換え部位と組み換え可能である構成を採用してもよい。これにより、第１のａｔｔＲ組換え部位と前記第２のａｔｔＲ組換え部位の間、あるいは前記第３のａｔｔＲ組換え部位と前記第４のａｔｔＲ組換え部位との間に、特定の方向性で核酸フラグメントを導入することがより容易になる。
前記第１のａｔｔＲ組換え部位および前記第３のａｔｔＲ組換え部位は前記第２のａｔｔＬ組換え部位と組み換え可能ではなく、前記第２のａｔｔＲ組換え部位および前記第４の組換え部位は前記第１のａｔｔＬ組換え部位とは組み換え可能ではない構成を採用してもよい。これにより、第１のａｔｔＲ組換え部位と前記第２のａｔｔＲ組換え部位の間、あるいは前記第３のａｔｔＲ組換え部位と前記第４のａｔｔＲ組換え部位との間に、特定の方向性で核酸フラグメントを導入することがより容易になる。
【００８８】
あるいは、前記第１のａｔｔＲ組換え部位の核酸配列と前記第４のａｔｔＲ組換え部位の核酸配列が同じであり、前記第２のａｔｔＲ組換え部位の核酸配列と前記第３のａｔｔＲ組換え部位の核酸配列とが同じである構成を採用してもよい。この場合、使用するａｔｔＲ配列の種類を少なくできるため、組換え操作を簡略化することができるようになる。どの構成を採用するかについては、例えば前記融合タンパク質コーディングベクターとの組換えを行う場合には、各融合タンパク質コーディングベクター中においてどのａｔｔＬ配列がどの配置で用いられているかを考慮して決定することが出来る。
また、前記第１のプロモーターと前記第１のａｔｔＲ組換え部位との間の距離および前記第２のプロモーターと前記第３のａｔｔＲ組換え部位との間の距離は、例えば０ｂｐ〜５００ｂｐであってもよく、あるいは６ｂｐ〜１００ｂｐとしてもよい。前記第１のプロモーターと前記第１のａｔｔＲ組換え部位との間の領域および前記第２のプロモーターと前記第３のａｔｔＲ組換え部位との間の領域には、ベクター開発のための制限酵素部位や、翻訳を制御する５’ＵＴＲ領域（Ω配列、OsMac1、OsMac3等）を配置することができる。この距離が大きすぎると、プロモーターと発現対象の核酸領域との距離が大きくなりすぎ、有効な発現制御が出来ない場合がある。
【００８９】
前記デスティネーションベクターは、前記第１のＤＮＡブロックにおける前記第２のａｔｔＲ組換え部位よりも下流側の位置に配置された右境界配列ＲＢを有する核酸セグメントと、前記第２のＤＮＡブロックにおける前記第４のａｔｔＲ組換え部位よりも下流側の位置に配置された左境界配列ＬＢを有する核酸セグメントと、をさらに含んでいてもよい。本開示において、ＲＢ（右境界配列）およびＬＢ（左境界配列）とは、アグロバクテリウム（A. tumefaciens）の有するＴｉプラスミドの一部であるＴ−ＤＮＡ（transfer DNA）の両端に存在する２５塩基対(コンセンサス配列: 5'-TGGCAGGATATATN(C/G)N(G/A)(T/G)TGTAA(A/T)(T/C)-3', NはACGTのうちの任意のもの)：配列番号５０)の境界配列である。この配列は、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞のゲノムに挿入するのに必要な配列であり、この配列を上記の位置に配置することにより、ＬＢとＲＢとの間の領域を植物ゲノムに導入することが可能となる。
【００９０】
本開示に係るデスティネーションベクターは、環状二本鎖プラスミドベクターであることが好ましい。また、前記ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターは、大腸菌内で機能可能な複製起点を有することが好ましい。この複製起点が存在する場合は、大腸菌を用いたクローニングが可能となる。前記複製起点は、ｐＵＣ起点であってもよいし、大腸菌で機能するその他の複製起点であってもよい。また、前記デスティネーションベクターは、アグロバクテリウム内でベクターの複製および維持を可能とする複製起点を有することも好ましい。このような複製起点の例としてはRiプラスミド由来の変異型複製起点（Ri-ori）がある。前記デスティネーションベクターは、さらに構成セグメントを含むことが好ましい。この構成セグメントは、ベクターの土台として働くものであり、一般的に使われている大腸菌用ベクターのセグメントやpCAMBIA1301のセグメントを前記構成セグメントとして用いてもよい。前記構成セグメントは、プラスミドベクターの構成セグメントであることが好ましい。また、前記構成セグメントの長さは、４．５ｋｂ〜１２ｋｂの長さであってもよい。この距離が長すぎると、プラスミド構築上の困難性が増す傾向がある。
【００９１】
（植物細胞用発現ベクターの製造方法）  
本開示の融合タンパク質コーディングベクターセットにおける各ベクター中の前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記第２のａｔｔＬ組換え部位の間の領域は、組み換えにより、前記デスティネーションベクターに導入することが出来る。この組み換えは、前記第１のａｔｔＬ組換え部位および前記第２のａｔｔＬ組換え部位と、前記デスティネーションベクター中の第１〜第４のａｔｔＲ組換え部位との間の特異的な組換えによって行われる。
このため、本開示に係る植物細胞用発現ベクターの製造方法は、
本開示に係る融合タンパク質コーディングベクターセットにおける前記第１の融合タンパク質コーディングベクターにおける前記第１のａｔｔＬ組換え部位を、本開示に係るデスティネーションベクターにおける前記第１のａｔｔＲ組換え部位と組み換えること、
前記第１の融合タンパク質コーディングベクターにおける前記第２のａｔｔＬ組換え部位を、前記デスティネーションベクターにおける前記第２のａｔｔＲ組換え部位と組み換えること、
前記ベクターセットにおける前記第２の融合タンパク質コーディングベクターの前記第１のａｔｔＬ組換え部位を、前記デスティネーションベクターにおける前記第３のａｔｔＲ組換え部位と組み換えること、および
前記第２の融合タンパク質コーディングベクターの前記第２のａｔｔＬ組換え部位を、前記デスティネーションベクターにおける前記第４のａｔｔＲ組換え部位と組み換えること、
を含む、植物細胞用発現ベクターの製造方法である。
【００９２】
前記組み換えは、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）法に従い、ＬＲクロナーゼを用いて行ってもよい。反応条件の詳細については、Gateway(登録商標) Technology, A universal technology to clone DNA sequences for functional analysis and expression in multiple systems, Catalog Numbers 12535-019 and 12535-027, Revision 1.0, Document Part Number 250522, Publication Number MAN0000282を参照することが出来る。
【００９３】
（植物細胞用発現ベクター）
例えば上記の反応により、植物細胞用発現用ベクターを得ることが出来る。本開示に係る植物細胞用発現ベクターは、
第１のＤＮＡブロックおよび第２のＤＮＡブロックを含む植物細胞用発現ベクターであって、
前記第１のＤＮＡブロックは、
植物細胞で作動可能な第１のプロモーターと、
第１のａｔｔＢ組換え部位と、
特定の核酸配列に結合可能なＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをコードする第１の核酸セグメントと、
前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質を形成するように位置する、生物学的活性を有するタンパク質をコードする第１の遺伝子と、
第２のａｔｔＢ組換え部位と、
を含み、
前記第２のＤＮＡブロックは、
植物細胞で作動可能な第２のプロモーターと、
第３のａｔｔＢ組換え部位と、
特定の核酸配列に結合可能なＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをコードする第２の核酸セグメントと、
前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質を形成するように位置する、生物学的活性を有するタンパク質をコードする第２の遺伝子と、
第４のａｔｔＢ組換え部位と、
を含み、
前記第２のＤＮＡブロックは前記第１のプロモーターの上流側に位置し、かつ前記第１のＤＮＡブロックとは逆向きに配置されており、前記第１のＤＮＡブロックにおいて、前記第１のプロモーター、前記第１のａｔｔＢ組換え部位、前記第１の核酸セグメント、前記第１の遺伝子および前記第２のａｔｔＢ組換え部位は、前記第１の遺伝子がコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されており、前記第２のＤＮＡブロックにおいて、前記第２のプロモーター、前記第３のａｔｔＢ組換え部位、前記第２の核酸セグメント、前記第２の遺伝子および前記第４のａｔｔＢ組換え部位は、前記第２の遺伝子がコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されている、植物細胞用発現ベクターである。
【００９４】
前記植物細胞用発現ベクターを、植物細胞に導入した場合、前記第１の遺伝子と、前記第２の遺伝子から、生物学的活性を有するタンパク質がそれぞれ発現する。これにより、一つのベクターの導入によって、第１の遺伝子および第２の遺伝子の両方の発現を達成することが出来る。このような利点は、例えば、ＴＡＬＥＮをアグロバクテリウムを用いて植物細胞に導入する場合などに顕著である。ＴＡＬＥＮは二量体で作用する人工ヌクレアーゼであり、ＴＡＬＥＮのＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインは、それぞれ相補鎖の特定領域を認識するように特定の配列を有していなければならない。このため、ＴＡＬＥＮを発現させるためには、例えば２つのＴＡＬＥＮ遺伝子の導入が必要となるが、アグロバクテリウムには１つのベクターしか導入できないため、前記２つのＴＡＬＥＮ遺伝子は１つのベクター上に配置する必要があるためである。
【００９５】
本開示に係る植物細胞用発現ベクターは、環状二本鎖プラスミドベクターであることが好ましい。また、前記植物細胞用発現ベクターは、大腸菌内で機能可能な複製起点を有することが好ましい。この複製起点が存在する場合は、大腸菌を用いたクローニングが可能となる。前記複製起点は、ｐＵＣ起点であってもよいし、大腸菌で機能するその他の複製起点であってもよい。また、前記植物細胞用発現ベクターは、アグロバクテリウム内でベクターの複製および維持を可能とする複製起点を有することも好ましい。前記ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターは、さらに構成セグメントを含むことが好ましい。この構成セグメントは、ベクターの土台として働くものであり、一般的に使われている大腸菌用ベクターのセグメントを前記構成セグメントとして用いてもよい。前記構成セグメントは、プラスミドベクターの構成セグメントであることが好ましい。また、前記構成セグメントの長さは、４．５ｋｂ〜１２ｋｂの長さであってもよい。
【００９６】
前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第１の遺伝子および前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第２の遺伝子の詳細は、本開示に係る第１の融合タンパク質コーディングベクターセットにおける前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第１の遺伝子および前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第２の遺伝子の詳細と同様である。
また、前記植物細胞用発現ベクターは、前記第１のａｔｔＢ組換え部位と前記第２のａｔｔＢ組換え部位との間に位置する第１のマーカー遺伝子、および前記第３のａｔｔＢ組換え部位と前記第４のａｔｔＢ組換え部位との間に位置する第２のマーカー遺伝子をさらに含んでいてもよい。前記第１のマーカー遺伝子および前記第２のマーカー遺伝子についての詳細は、本開示に係る第１の融合タンパク質コーディングベクターセットにおける前記第１のマーカー遺伝子および前記第２のマーカー遺伝子についての詳細と同様である。前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第１の遺伝子の終始コドンと前記第１のマーカー遺伝子との間の距離、および前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第２の遺伝子の終始コドンと前記第２のマーカー遺伝子との間の距離は、例えば０．２ｋｂ〜１．０ｋｂ、好ましくは０．３ｋｂ〜０．６ｋｂであってもよい。
また、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインおよびそれをコードする第１および第２の核酸セグメントについての詳細、および核酸上の距離についての詳細、ならびにイントロンについての詳細については、本開示に係る第１の融合タンパク質コーディングベクターセットにおけるそれらの詳細と同様である。また、前記第１および第２のプロモーターについての詳細、およびＲＢおよびＬＢについての詳細については、本開示に係るデスティネーションベクターにおけるそれらの詳細と同様である。また、前記ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターの場合と同様に、マーカー遺伝子は生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と同じ向きであっても、逆向きであってもよい。
【００９７】
ａｔｔＢ組換え配列（２５ヌクレオチド長程度）は、ａｔｔ配列の中では際だって短い。ａｔｔＰ組換え配列は２４０ヌクレオチド長程度であり、ａｔｔＲ配列は１２５ｂｐヌクレオチド長程度であり、ａｔｔＬ配列は１００ｂｐヌクレオチド長程度である。前記植物細胞用発現ベクターにおいては、ａｔｔＢ配列の長さが比較的短いために、プロモーターと融合タンパク質の間の距離が短く、プロモーターによる発現制御が有効に働くようにすることが出来る。
【００９８】
前記第１〜第４のａｔｔＢ組換え部位は、各々ａｔｔＢ１またはａｔｔＢ２であってもよい。
前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする第１の核酸セグメントと、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第１の遺伝子との間の距離、および前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする第２の核酸セグメントと、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第２の遺伝子との間の距離は、０．１ｋｂ〜０．５ｋｂであってもよい。この領域には、前述のとおりＴＡＬＥ−Ｃ領域を配置できる。前記距離を適切に設定することで、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインが特定配列のＤＮＡに結合した際に、前記生物学的活性を有するタンパク質がより有効に機能できるようになる。
【００９９】
前記第１のａｔｔＢ組換え部位と、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする第１の核酸セグメントとの間の距離、および前記第３のａｔｔＢ組換え部位と、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする第２の核酸セグメントとの間の距離は、０ｂｐ〜１．０ｋｂであってもよい。この領域には、ＴＡＬＥ−Ｎ領域、制限酵素部位、Ω因子および翻訳促進効果のある５’ＵＴＲからなる群から選択される一つ以上を配置することができる。
前記植物細胞用発現ベクターは、前記第１のＤＮＡブロックにおける前記第２のａｔｔＢ組換え部位よりも下流側の位置に配置された右境界配列ＲＢをコードする核酸セグメントと、前記第２のＤＮＡブロックにおける前記第４のａｔｔＢ組換え部位よりも下流側の位置に配置された左境界配列ＬＢをコードする核酸セグメントと、をさらに含んでいてもよい。このような境界配列が存在すれば、前記植物細胞用発現ベクター中の領域を、アグロバクテリウムを用いて植物細胞に高効率に導入することが出来る。
前記第１のプロモーターと前記第１のａｔｔＢ組換え部位との間の距離および前記第２のプロモーターと前記第３のａｔｔＢ組換え部位との間の距離は、０ｂｐ〜５００ｂｐであってもよい。この程度の距離であれば、プロモーターによる発現制御を有効に働かせることが出来る。
【０１００】
（方向性）
前記ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおいてマーカー遺伝子が存在する場合、前述のとおり、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子とマーカー遺伝子とは同じ向きに配置されていても、逆向きに配置されていてもよい。また、前記融合タンパク質コーディングベクターにおいて、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸セグメントおよび前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は同じ向きに配置されているが、マーカー遺伝子が存在する場合、マーカー遺伝子はこれらと同じ向きに配置されていても逆向きに配置されていてもよい。前記植物細胞用発現ベクターにおいて、前記第１のプロモーター、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをコードする第１の核酸セグメントおよび前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第１の遺伝子は同じ向きに配置されており、マーカー遺伝子が存在する場合はマーカー遺伝子はこれらと同じ向きに配置されていても逆向きに配置されていてもよい。前記植物細胞用発現ベクターにおいて、前記第２のプロモーター、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをコードする第２の核酸セグメントおよび前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第２の遺伝子は同じ向きに配置されているが、この向きは前記第１のプロモーター、前記第１の核酸セグメントおよび前記第１の遺伝子の向きとは逆向きである。前記第２のＤＮＡブロック内にマーカー遺伝子が存在する場合は、マーカー遺伝子は、前記第２のプロモーター、前記第２の核酸セグメントおよび前記第２の遺伝子の向きと同じ向きに配置されていても逆向きに配置されていてもよい。
前記ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターおよび前記融合タンパク質コーディングベクターにおいて、前記第１のａｔｔＬ組換え部位および前記第２のａｔｔＬ組換え部位は、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と同じ向きに配置されていても、逆向きに配置されていてもよい。前記植物細胞用発現ベクターにおいて、前記第１のａｔｔＢ組換え部位および前記第２のａｔｔＢ組換え部位は、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第１の遺伝子と同じ向きに配置されていてもよいし、逆向きに配置されていてもよい。同様に前記第３のａｔｔＢ組換え部位および前記第４のａｔｔＢ組換え部位は、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第２の遺伝子と同じ向きに配置されていてもよいし、逆向きに配置されていてもよい。
前記ａｔｔＬ、ａｔｔＲ、ａｔｔＢ組換え部位の向きは、前記植物細胞で作動可能なプロモーターの下流に該プロモーターとは同じ向きで前記融合タンパク質をコードする遺伝子を導入できるようであれば特に制限されない。例えば、前記融合タンパク質コーディングベクターにおいて、前記第１のａｔｔＬ組換え部位および前記第２のａｔｔＬ組換え部位が、前記融合タンパク質をコードする遺伝子と同じ向きの場合、前記デスティネーションベクターの各ＤＮＡブロックにおいて植物細胞で作動可能なプロモーターと各ａｔｔＲ組換え部位が同じ向きを向いていれば、これらのベクターの間の組換えによって、前記プロモーターの下流に該プロモーターと同じ向きで融合タンパク質をコードする遺伝子が配置される。一方、前記融合タンパク質コーディングベクターにおいて、前記第１のａｔｔＬ組換え部位および前記第２のａｔｔＬ組換え部位が、前記融合タンパク質をコードする遺伝子と逆向きの場合であっても、前記デスティネーションベクターの各ＤＮＡブロックにおいて植物細胞で作動可能なプロモーターと各ａｔｔＲ組換え部位が逆向きであれば、これらのベクターの間の組換えによって、前記プロモーターの下流にやはり該プロモーターと同じ向きで融合タンパク質をコードする遺伝子が配置される。
【０１０１】
なお、特に明示の無い限り、本開示において「上流」および「下流」の方向性については、以下の方向を基準としている。
ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターの説明における基準方向：前記生物学的活性を有するタンパク質がコードされている方向；
融合タンパク質コーディングベクターの説明における基準方向：前記生物学的活性を有するタンパク質がコードされている方向；
デスティネーションベクターの説明において：
第１のＤＮＡブロック内の要素の配置の説明における基準方向：前記第１のプロモーターがコードされている方向
第２のＤＮＡブロック内の要素の配置の説明における基準方向：前記第２のプロモーターがコードされている方向
第１のＤＮＡブロックと第２のＤＮＡブロックとの間の配置の関係の説明における基準方向：前記第１のプロモーターがコードされている方向
植物細胞用発現ベクターの説明において：
第１のＤＮＡブロック内の要素の配置の説明における基準方向：前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第１の遺伝子がコードされている方向；
第２のＤＮＡブロック内の要素の配置の説明おける基準方向：前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第２の遺伝子がコードされている方向
第１のＤＮＡブロックと第２のＤＮＡブロックとの間の配置の関係の説明における基準方向：前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第１の遺伝子がコードされている方向
また、本開示において、ベクターやＤＮＡブロックに存在する一つの要素（遺伝子、核酸セグメント、特定配列、組換え部位、プロモーター等）と別の要素とが逆向きに存在するときは、両要素は同一の核酸鎖にコードされているわけではないが、このような形態も本開示の範囲には包含される。つまり、当該別の要素は、明示が無い限り、あるいは前記一の要素との方向性が本開示中で定義されていない限りは、前記一の要素と同じ向きであっても逆向きであってもよい。
【０１０２】
（実施形態の例）
以上に説明した、植物細胞用発現ベクター作製の一例について、図１を用いて説明する。図１の上段には、pPlat_Aシリーズと命名された、本開示に係るＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターの構成を有するベクターが描かれている。このベクター中にはＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインをコードする遺伝子がコードされている方向における上流側から下流側に向かって、ａｔｔＬ１、前記第１のａｔｔＬ組換え部位の下流側に位置し、可変領域を有するＴＡＬＥ（ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ）のＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントを挿入可能な挿入位置を有する挿入領域、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインをコードする遺伝子、Ａｍｐ遺伝子、およびａｔｔＬ２がこの順で配置されている。なお、この例においては、以上の要素の中で、Ａｍｐ遺伝子だけは他の要素とは逆向きに配置されている。このようなプラスミドは、例えば、Addgeneから入手可能なPlatinum Gate TALEN Kitに含まれるベクター、例えばptCMV-136/63-VR-HD、などを標準的な組換え操作を用いて改変してａｔｔＬ１組換え部位やａｔｔＬ２組換え部位、Ａｍｐ遺伝子などを導入することで作製可能である。
【０１０３】
このpPlat_Aシリーズには、挿入位置の下流側に隣接してＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインのハーフリピートが含まれている。このため、pPlat_Aシリーズは実際にはＨＤ，ＮＧ、ＮＩ、ＮＮのハーフリピートに対応して４種類が用意されている。なお、pPlat_Aと同様の構造を有しながらもＡｍｐ遺伝子の代わりにＣＡＴ遺伝子を有する、pPlat_Cシリーズも同様に作製される（ハーフリピートの存在のため４種類）。
【０１０４】
ジャガイモＧＢＳＳ遺伝子中の特定の領域を標的として、当該領域のＤＮＡ二重鎖それぞれの配列（標的配列）をそれぞれ選択する。なお、各標的配列は、標的配列間の中央位置よりは５’側にずれるように、互いに１５ｂｐ程度の距離を置いて設計する。この標的配列を認識するＲＶＤの並びを設計し、当該設計に基づいてＴＡＬＥのモジュール同士を連結し、pPlat_AベクターおよびpPlat_Cベクターに、それぞれ導入する。ＴＡＬＥのモジュール同士の連結およびpPlat_AベクターおよびpPlat_Cベクターへの導入はＰｌａｔｉｎｕｍ Ｇａｔｅ法のプロトコールに準拠して行う。
【０１０５】
こうして得られる融合タンパク質コーディングベクターをそれぞれpPlat_C（標的認識部位入り）およびpPlat_A（標的配列認識部位入り）と命名する。
これと並行して、デスティネーションベクターである、pDual35SGwを用意する。このベクターは、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターがコードされている方向における上流側から下流側に向かって、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、ａｔｔＲ１、およびａｔｔＲ２がこの順で配置されたＤＮＡブロックが２つ、互いに逆向きに（互いに離れる方向で）配置された構造を有する。このＤＮＡブロックが２つ並んだ構造の両側には、それぞれＬＢおよびＲＢが配置されている。このベクターも、各構成要素を標準的な組換え手法を用いて基本となるベクターに導入することで作製することが出来る。
【０１０６】
Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）法のプロトコールに基づいて、ａｔｔＲ１とａｔｔＬ１との間、ａｔｔＲ２とａｔｔＬ２との間で組換えを起こすことで、pDual35SGwベクターの各ＤＮＡブロックのａｔｔＲ１とａｔｔＲ２の間に、融合タンパク質−Ａｍｐ／ＣＡＴのフラグメントを導入する。この結果、植物細胞用発現ベクターである、２−ｉｎ−１ベクターpDual35S-TALENが得られる。pDual35S-TALENを植物細胞内に導入すれば、標的配列への結合能を有する２つのＴＡＬＥＮが発現し、各々の標的配列が存在するＤＮＡ鎖に結合する。その結果、標的とする領域（ジャガイモＧＢＳＳ遺伝子）においてＴＡＬＥＮ二量体が形成され、当該領域で植物ゲノムが切断できる。これにより、前記遺伝子は破壊されるものと予想される。ＴＡＬＥＮによる切断を受けたＤＮＡの修復は完全には出来ないことが多く、その結果フレームシフトを起こすなどして機能的なタンパク質が発現しなくなるためである。
【０１０７】
（植物細胞用発現ベクター作製用キット）
なお、上記のような操作を簡便に行うことが出来るようにするために、本開示においてはキットも提供される。本開示に係るキットは、本開示に係る第１または第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセットおよび本開示に係るデスティネーションベクターを含む、植物細胞用発現ベクター作製用キットである。なお、このキットはさらにＬＲクロナーゼ（登録商標）を含んでいてもよい。
上記のようなキットを用いれば、標的配列に対応したＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメイン繰り返し配列を設計することにより、植物細胞用発現ベクターを容易に得ることが出来、この植物細胞用発現ベクターを植物細胞に導入することにより、標的配列を含む植物ゲノム領域において生物学的活性を有するタンパク質を作用させることが可能となる。
【０１０８】
（形質転換方法）
本開示に係る植物細胞用発現ベクターを用いれば、植物細胞を形質転換することが出来る。すなわち、本開示に係る植物細胞用発現ベクターを遺伝子導入した植物細胞を作製する方法は、本開示に係る植物細胞用発現ベクターを植物細胞に導入することを含む。一つの実施形態では、前記導入することは、前記植物細胞用発現ベクターをアグロバクテリウムに導入すること、および前記アグロバクテリウムを植物細胞に感染させることにより、前記植物細胞用発現ベクターを前記植物細胞内に導入すること、を含み、前記植物細胞用発現ベクターは、前記第１のＤＮＡブロックにおける前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第１の遺伝子がコードされた方向を基準として前記第２のａｔｔＢ組換え部位よりも下流側の位置に配置された右境界配列ＲＢをコードする核酸セグメントと、前記第２のＤＮＡブロックにおける前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第２の遺伝子がコードされた方向を基準として前記第４のａｔｔＢ組換え部位よりも下流側の位置に配置された左境界配列ＬＢをコードする核酸セグメントと、をさらに含む。
アグロバクテリウムを用いた遺伝子導入は、導入効率の高さ、操作に複雑な機器を必要としないこと、および遺伝子導入が可能な植物の種類の多さといった点から好ましい。
【０１０９】
前記植物細胞用発現ベクターを導入する植物細胞は、特に限定されない。本開示の方法は、原理的には任意の植物細胞に適用でき、デスティネーションベクターが有する植物細胞で作動可能な第１および第２のプロモーターとして、選択した植物細胞の種類に応じて適切なプロモーターを用いることで、任意の植物細胞において生物学的活性を有するタンパク質（例えばＦｏｋＩ）を発現できる。植物細胞の例としては、イネ、シロイヌナズナ、タバコ、およびジャガイモの細胞が挙げられる。
【０１１０】
（ゲノム編集方法）
前記植物細胞用発現ベクターを植物細胞に導入した場合の作用は、導入される融合タンパク質に含まれる前記生物学的活性を有するタンパク質の種類により異なる。例えば、前記タンパク質がＤＮＡ切断酵素である場合、遺伝子破壊を生じさせることが出来る。
本開示に係るゲノム編集方法は、
本開示に係る植物細胞用発現ベクターを植物細胞に導入すること、
前記導入された植物細胞用発現ベクターから前記生物学的活性を有するタンパク質を発現させること、および
前記生物学的活性を有するタンパク質を植物細胞のゲノムに作用させること、
を含むゲノム編集方法であって、前記生物学的活性を有するタンパク質が、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインであり、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインと共にＴＡＬＥＮ融合タンパク質を形成しており、前記ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインが前記植物細胞のゲノムにおける、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインが結合可能な特定の配列の近傍を切断する、ゲノム編集方法、である。
前記切断により、遺伝子破壊を生じさせてもよい。また、切断されたＤＮＡの修復の際に、切断端に相補的な配列を有する核酸フラグメントを修復鎖中に取り込んでしまう場合がある。このため、前記切断の生じる箇所の近傍のゲノム配列に相同的な人工設計核酸配列を存在させておくことにより、前記人工設計核酸配列をゲノム中に導入してもよい。
【実施例】
【０１１１】
0. 使用した材料
エントリーベクターpPlatシリーズの構築にはpDONR207（Invitrogen社）の複製起点とクロラムフェニコール耐性遺伝子、pCAMBIA1301（CAMBIA、オーストラリア）のNOSターミネーターとトウゴマ・カタラーゼ遺伝子のイントロン、pGEX3X（ゼネラルエレクトリック社）のアンピシリン耐性遺伝子、及びプラチナゲートTALENキット（Addgene、イギリス）に含まれるptCMV136/63VRシリーズ(HD型、NG型、NI型、NN型の４種)のTALENコード領域を用いた。
なお、pDONR207に含まれるattP1配列、attP2配列、ゲンタマイシン耐性遺伝子は以下に示す製作過程で除去されたためpPlatシリーズには残存しない。ccdB遺伝子はGatewayBP反応により除去され、ゲンタマイシン耐性遺伝子は製作過程(項1-1参照)で除去された。Gateway attP1配列とGateway attP2配列はGateway BP clonase 反応によりattL1、attL2配列に置換された。
【０１１２】
デスティネーションベクターpDual35sGwIII-1301の製作にはpCAMBIA1301、pGWB2のGateway クローニングユニット、pCAMBIA1301のカリフラワーモザイクウイルス35SプロモーターとLacZ αサブユニット遺伝子を用いた。
特に記載の無い場合、制限酵素はWakoニッポンジーン社の製品を、DNA ligase はToyobo社のLigation highを、PCR酵素はToyobo社のKOD plus neoを使用した。Gateway反応にはinvitrogen 社の LR clonaseII およびBP clonaseII を使用した。Platinum Gate TALEN kit のStep1およびStep2では制限酵素BsaI-HF (New England Biolab)、制限酵素Esp3I（Thermo Scientific）、Quick Ligation kit (New England Biolab)に含まれるQuick Ligase、10xT4 DNA ligase buffer (New England Biolab) を使用した。その他、DNA断片の精製、大腸菌を利用したプラスミドクローニング、プラスミドDNA溶液の調製は一般的な手法、器具、試薬で実施した。
【０１１３】
1. GatewayエントリーベクターpPlatシリーズの製作
1-1. pDONR-dGentの製作
pDONR207から制限酵素Esp3Iの認識部位を含む領域を除去するため、以下の方法でゲンタマイシン耐性遺伝子を除去した。pDONR207を鋳型とし、pDONRt-A_SpeI（表１、配列番号１５）とpDONRt-B_XbaI（表１、配列番号１６）をプライマーとするPCRによりpDONR207のゲンタマイシン耐性遺伝子を除く全領域を増幅した。得られたPCR産物を制限酵素SpeI(Wako)とXbaI(Wako)で消化し、DNA Ligase を用いて連結することで環状とし、大腸菌を利用してクローニングした。得られたプラスミドをpDONR-dGentと名付けた。
【０１１４】
1-2. pDONR-tAmpおよびpDONR-tCATシリーズの製作
以下の方法でpDONR-dGentにattL1配列、NOSターミネーター、アンピシリン耐性遺伝子、attL2配列、およびTALENコード領域を挿入するための制限酵素部位を導入した。NOSターミネーターを含むDNA断片はpCAMBIA1301を鋳型とし、Ter-F_attB1_SpeIXhoI（表１、配列番号１７）とTer-R_AdAmp（表１、配列番号１８）をプライマーとするPCRにより得た。アンピシリン耐性遺伝子はpGEX3Xを鋳型とし、Amp-F_attB2（表１、配列番号１９）とAmp-R_AdTer（表１、配列番号２０）をプライマーとするPCRにより増幅した。これらのPCR産物を混合したものを鋳型とし、Ter-F_attB1_SpeIXhoI（表１）とAmp-F_attB2（表１）をプライマーとするPCRにより、attB1配列、NOSターミネーター、アンピシリン耐性遺伝子、attB2配列をこの順で含むDNA断片を得た。pDONR-dGentとこのPCR断片の混合物をBP clonase IIにより消化した。これにより、DNA断片に含まれる配列をpDONR-dGentのattP1-attP2間に挿入するとともに両端の配列をそれぞれattL1、attL2配列に変換し、大腸菌を利用してクローニングした。得られたプラスミドをpDONR-tAmpと名付けた。
【０１１５】
以下の方法でpDONR-dGentにattL1配列、NOSターミネーター、クロラムフェニコール耐性遺伝子、attL2配列を導入した。NOSターミネーターを含むDNA断片はpCAMBIA1301を鋳型とし、Ter-F_attB1_SpeIXhoI（表１）とTer-R_AdCAT（表１、配列番号２１）をプライマーとするPCRにより得た。クロラムフェニコール耐性遺伝子はpDONR207を鋳型とし、CAT-F_attB2（表１、配列番号２３）とCAT-R_AdTer（表１、配列番号２２）をプライマーとするPCRにより増幅した。これらのPCR産物を混合したものを鋳型とし、Ter-F_attB1_SpeIXhoI（表１）とCAT-F_attB2（表１）をプライマーとするPCRにより、attB1配列、NOSターミネーター、クロラムフェニコール耐性遺伝子、attB2配列をこの順で含むDNA断片を得た。pDONR-dGentとこのPCR断片の混合物をBP clonase IIにより消化した。これにより、DNA断片に含まれる配列をpDONR-dGentのattP1-attP2間に挿入するとともに両端の配列をそれぞれattL1、attL2配列に変換し、大腸菌を利用してクローニングした。得られたプラスミドをpDONR-tCATと名付けた。
【０１１６】
pDONR-tAmpおよびpDONR-tCATのattL1配列とNOSターミネーターの間にTALENをコードする配列を挿入するための制限酵素部位は以下の方法で挿入した。pDONR-tAmpおよびpDONR-tCATを鋳型とし、pDONR-Cxba_HindIII（表１、配列番号２４）とpDONR-Dbgl_HindIII （表１、配列番号２５）をプライマーとするPCRによりプラスミドの全域を含むDNA断片を調製した。これらのDNA断片をそれぞれ制限酵素HindIIIで消化したのちDNA ligase を用いて分子内で連結することで環状DNAを得、大腸菌を利用してクローニングした。得られたプラスミドをそれぞれpDONR-tAmpIIおよびpDONR-tCATIIと名付けた。
クロラムフェニコール耐性遺伝子に含まれるEsp3I認識部位は以下の方法で除去した。pDONR-tCATIIを鋳型とし、CAT-A_BsaI（表１、配列番号３６）とCAT-T_MscI（表１、配列番号３７）をプライマーとするPCRによりクロラムフェニコール耐性遺伝子の一部を増幅し、制限酵素BsaIとMscIで消化した。この領域以外のプラスミド全領域を含むDNA断片は、pDONR-tCATIIを鋳型とし、CAT-S_MscI（表１、配列番号３８）とCAT-B_Esp3I（表１、配列番号３９）をプライマーとするPCRにより得た。このDNA断片を制限酵素Esp3IとMscIで消化した。これらのDNA断片をDNA ligase により連結し、大腸菌を用いてクローニングした。得られたプラスミドをpDONR-tCATIIIと名付けた。
【０１１７】
1-3. pPlatIシリーズの製作
TALENをコードする領域は以下の方法でpDONR-tAmpIIおよびpDONR-tCATIIに挿入した。ptCMV136/63VRシリーズを鋳型とし、TALEN63-F_BglII（表１、配列番号２６）とTALEN63-R_HindIII（表１、配列番号２７）をプライマーとするPCRによりTALENをコードする領域を含むDNA断片を増幅し、制限酵素HindIIIとBglIIで消化した。これをpDONR-tAmpIIおよびpDONR-tCATIIの HindIII部位とBglII部位の間に挿入した。得られたプラスミドをそれぞれpPlatIAシリーズ(pPlatIA-HD、pPlatIA-NG、pPlatIA-NI、pPlatIA-NNの４種)、pPlatICシリーズ（pPlatIC-HD、pPlatIC-NG、pPlatIC-NI、pPlatIC-NNの４種）と名付けた。
【０１１８】
1-4. pPlatIIAシリーズの製作
pPlatIAシリーズの複製起点を含む領域が逆位となったpPlatIIAシリーズは以下の方法で製作した。pPlatIAシリーズを鋳型とし、pPlatII-A_SpeI（表１、配列番号２８）とpPlatII-B_EcoRI（表１、配列番号２９）をプライマーとするPCRによりattL1配列からattL2配列までのTALENコード領域（HD型、NG型、NI型、NN型の４種類）を含む部位を増幅し、これらをそれぞれ制限酵素SpeIとEcoRIで消化した。pPlatIAシリーズを鋳型とし、pPlatII-D_XbaI（表１、配列番号３１）とpPlatII-C_EcoRI（表１、配列番号３０）をプライマーとするPCRにより複製起点を含むDNA断片を増幅し、制限酵素XbaIとEcoRIで消化した。このDNA断片とTALENコード領域を含むDNA断片（HD型、NG型、NI型、NN型の４種類）をDNA ligase により連結し、大腸菌を利用してクローニングした。得られたプラスミドをpPlatIIAシリーズ(pPlatIIA-HD、pPlatIIA-NG、pPlatIIA-NI、pPlatIIA-NNの４種)と名付けた。
【０１１９】
1-5. pPlat5Aシリーズの製作
TALENコード領域にイントロンを含むpPlat5Aシリーズは以下の方法で製作した。pCAMBIA1301を鋳型とし、Gint-F2_SpeI（表１、配列番号３２）とGint-TALn-R（表１、配列番号３３）をプライマーとするPCRによりトウゴマ・カタラーゼ遺伝子のイントロンを含むDNA断片を得た。このDNA断片を断片Aとする。pPlatIIAシリーズ(pPlatIIA-HD、pPlatIIA-NG、pPlatIIA-NI、pPlatIIA-NNの４種)を鋳型とし、Gint-TALn-F（表１、配列番号３５）と pPlatII-B_EcoRI（表１）をプライマーとするPCRにより４種類のDNA断片を得た。この４種類のDNA断片を断片Bシリーズ(pPlatIIA-HD、pPlatIIA-NG、pPlatIIA-NI、pPlatIIA-NNに由来する４種)とする。この断片Bシリーズを含むDNA溶液にそれぞれ断片Aを混合したものを鋳型とし、Gint-F2_SpeI（表１）とpPlatII-B_EcoRI（表１）をプライマーとするPCRで増幅することで、断片Bシリーズにトウゴマカタラーゼ遺伝子のイントロンを連結したDNA断片(pPlatIIA-HD、pPlatIIA-NG、pPlatIIA-NI、pPlatIIA-NNに由来する４種)を作成した。これらをそれぞれ制限酵素EcoRIとSpeIで消化したものを断片Cシリーズ(pPlatIIA-HD、pPlatIIA-NG、pPlatIIA-NI、pPlatIIA-NNに由来する４種)とする。一方、pPlatIIA-HDを鋳型とし、pPlat4-H_XbaI（表１、配列番号３４）とpPlatC-EcoRI（表１）をプライマーとするPCRにより、複製起点とattL1配列とTALENのN末端部分をコードする領域を含むDNA断片を調製した。これを制限酵素XbaIとEcoRIで消化したものを断片Dとする。断片Cシリーズと、この断片Dをそれぞれ混合し、DNA ligase により連結することでpPlatIIAのTALENコード領域にイントロンが挿入された環状DNAを得た。これを大腸菌を用いてクローニングし、得られたプラスミドをpPlat5Aシリーズ(pPlatI5A-HD、pPlat5A-NG、pPlat5A-NI、pPlat5A-NNの４種)と名付けた。
【０１２０】
1-6. pPlat5Cシリーズの製作
pPlat5Aシリーズに含まれるTALENコード領域を以下の方法でpDONR-tCATIIIに挿入した。pPlat5Aシリーズを鋳型とし、TALEN63-F_BglII（表１）とTALEN63-R_HindIII（表１）をプライマーとするPCRによりTALENをコードする領域を含むDNA断片を増幅し、制限酵素HindIIIとBglIIで消化した。これをpDONR-tCATIIIの HindIIIとBglIIの間に挿入し、大腸菌を利用してクローニングした。得られたプラスミドをそれぞれpPlat5Cシリーズ（pPlat5C-HD、pPlat5C-NG、pPlat5C-NI、pPlat5C-NNの４種）と名付けた。
【０１２１】
2. TALENをコードする遺伝子の製作
TALEN コード領域に標的認識部位を挿入する操作は以下のようにPlatinum Gate TALEN kit (Addgene, One Kendall Aq. B7102, Cambridge MA 02139) の方法 (Sakuma T. et al., 2013, Sci. Rep. 3: 3379; DOI: 10.1038/srep03379) にpPlat5シリーズとジャガイモGBSS遺伝子の配列を標的として適用することで実施した。今回はジャガイモGBSS遺伝子に含まれる配列tGGTTTAAGGGCTGTTaacaagcttgatgggCTCCAATCAAGAACTAa(配列番号１０)を標的としたため、5'-tGGTTTAAGGGCTGTt-3'（配列番号１１） 及び5'-tTAGTTCTTGATTGGAg-3'（配列番号１２） を認識するTALENを以下のように設計・構築した。両配列の5'末端のTは天然のTALEの機能で認識される塩基である。また、TALEN認識配列の3'末端のTおよびGを認識する部位はpPlat5A-NGとpPlat5C-NNにそれぞれ含まれている。このためpPlat5A-NGとpPlat5C-NNに挿入された標的認識部位はそれぞれGGTTTAAGGGCTGT（配列番号１３）を認識する部分とTAGTTCTTGATTGGA（配列番号１４）を認識する部分である。
pPlat5A-NGにGGTTTAAGGGCTGTを認識する部位を挿入するための４種のプラスミド群はPlatinum Gate TALEN kit のStep1 を表３に示す組み合わせで実施することで得た。同様に、pPlat5C-NNにTAGTTCTTGATTGGAを認識する部位を挿入するための４種のプラスミド群はPlatinum Gate TALEN kit のStep1 を表４に示す組み合わせで実施することで得た。
Platinum Gate TALEN kit のStep2は、Platinum Gate TALEN kit に含まれるptCMVシリーズプラスミドの代わりにpPlat5A-NGとpPlat5C-NNをそれぞれ使用して実施した。Step1で得られた各４種のプラスミドとpPlat5A-NGとpPlat5C-NNをそれぞれ混合し、Step2で用いる緩衝液と酵素類を加えStep2と同じ温度と時間で反応を実施した。大腸菌を利用してクローニングし、得られたプラスミドをそれぞれpPlat5A-GBSS1aおよびpPlat5C-GBSS1bと名付けた。
【０１２２】
3. GatewayデスティネーションベクターpDual35sGwIII-1301の製作
カリフラワーモザイクウイルス35SプロモーターとGateway attR配列をつないだ配列２種類は以下の方法でpCAMBIA1301に挿入した。
pGWB2 を鋳型とし、attR1-F_KpnI（表２、配列番号４０）とattR2-R_SacI （表２、配列番号４１）をプライマーとするPCRによりGateway クローニングユニットを増幅した。得られたDNA断片を制限酵素KpnIとSacIで消化し、pCAMBIA1301のKpnI部位とSacI部位の間にクローニングした。得られたプラスミドをpCAM-attRと名付けた。
同様にpGWB2を鋳型とし、35S-C _KpnI（表２、配列番号４２）とattR2-R_HindIII （表２、配列番号４３）をプライマーとするPCRによりGateway クローニングユニットをその5'上流配列を含めて増幅した。得られたDNA断片を制限酵素KpnIとHindIIIで消化し、pCAM-attRのKpnI部位とHindIII部位の間にクローニングした。得られたプラスミドをpCAM-attR-35SattRと名付けた。
pCAMBIA1301を鋳型とし、LacZ-S（表２、配列番号４４）と35S-Z_XbaI（表２、配列番号４５）をプライマーとするPCRによりカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターとその5'上流に位置するLacZαサブユニット遺伝子を含むDNA断片を得た。pCAMBIA1301を鋳型とし、LacZ-A_EcoRI（表２、配列番号４６）とLacZ-T（表２、配列番号４７）をプライマーとするPCRによりpCAMBIA1301に含まれるLacZ遺伝子のプロモーター部位と開始コドンを含む領域を増幅した。これらのPCR産物を混合したものを鋳型とし、LacZ-A_EcoRI（表２）と35S-Z_XbaI（表２）をプライマーとするPCRによりこれらを連結し、制限酵素EcoRIとXbaIで消化した。一方で、pCAMBIA1301を鋳型とし、35S-D_EcoRI（表２、配列番号４８）と35S-Z_KpnI（表２、配列番号４９）をプライマーとするPCRによりカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターを増幅し、制限酵素EcoRIとKpnIで消化した。この２種類のDNA断片と、pCAM-attR-35SattRをKpnIとXbaIで消化したものの３種類を混合し、DNA ligase により連結し、大腸菌を利用してクローニングした。得られたプラスミドをpDual35sGwIII-1301と名付けた。
【０１２３】
4. 植物で発現するTALEN遺伝子の製作
Gateway LR clonaseII を用いてpPlat5A-GBSS1aとpPlat5C-GBSS1bに含まれるTALENコード領域をpDual35sGw1301に含まれる２ヶ所のattR部位と置換した。得られた反応物から大腸菌を利用して２種のTALEN遺伝子を含むプラスミドをクローニングするため、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシンの３種類の抗生物質を含む培地を用いて、クローニングを実施した。得られたプラスミドをpTALEN-StGBSS1と名付けた。
【０１２４】
【表１】
0006590333.tif 000004
【０１２５】
【表２】
0006590333.tif 000005
【０１２６】
【表３】
0006590333.tif 000006
【０１２７】
【表４】
0006590333.tif 000007
【０１２８】
上記で得られた植物細胞用発現ベクターpTALEN-StGBSS1を植物細胞内に導入し、ＴＡＬＥＮの発現実験を行った。具体的には、pTALEN-StGBSS1と共に、ＴＡＬＥＮの活性をモニターするためのレポーターを有するプラスミドも植物細胞に導入した。このプラスミドは、以下のようにして作製された。pCAMBIA1301に含まれるＧＵＳ遺伝子の開始コドン〜開始コドンの下流１．４ｋｂまでの領域と、ＧＵＳ（β-グルクロニダーゼ）遺伝子の終始コドン〜終始コドンの上流１．４ｋｂまでの領域との間に、試験用の認識配列を導入した構造（図２）を有するプラスミドを、標準的なＰＣＲおよび組換え手法を用いて作製した。図２において、試験用の認識配列の導入部位は＊で表されている。ここで、本実験では、試験用の認識配列として、pTALEN-StGBSS1に含まれるＴＡＬＥＮをコードする遺伝子から発現するＴＡＬＥＮの認識配列である配列番号１０の配列（この配列が挿入されているプラスミドを、以下、ＴＡＬＥＮ＃１２とも称する）、および、前記ＴＡＬＥＮの認識配列ではない配列番号５３（この配列が挿入されているプラスミドを、以下、ｍｉｓｍａｔｃｈとも称する）の配列を用いた。また、上記のＧＵＳ遺伝子上流側領域と、ＧＵＳ遺伝子下流側領域とは、図２に示されるように一部が重複した構造となっている。認識配列が挿入されている結果、プラスミドが植物細胞に導入されても、ＧＵＳは有効に発現しないようになっている。
これらのプラスミドを導入する植物細胞としてはコメ（Ｒｉｃｅ）の培養細胞を用い、プロトプラスト−ＰＥＧ法によって、プラスミドの導入を行った。プロトプラスト−ＰＥＧ法の詳細は、Yoo SD, Cho YH, Sheen J (2007) Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis (Nat Protoc 2: 1565-1575)などを参照できる。その他、培養の手法などは、Aoki et al., Plant Biotechnol. 31:221-228(2014)に記載の方法に準拠して行った。
【０１２９】
プラスミドを導入したプロトプラストは、最初にＷＩバッファー中でインキュベートし、一旦、遠心により回収した。回収したプロトプラストをＧＵＳ抽出バッファー（50mM Tris-HCl (pH 7.0), 10mM EDTA, 0.1% TritonX-100および0.1%NoniDet P-40 (Sigma-Aldrich）)に懸濁した。懸濁液の一部（ａｌｉｑｕｏｔ）を分取し、ＧＵＳ活性の測定に用いた。ＧＵＳの活性は、１ｍＭの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドを含むバッファー溶液を用いて、ＧＵＳ活性により生じる生成物である４−メチルウンベリフェロンからの蛍光強度を蛍光光度系ＡＲＶＯ  Ｘ２（パーキンエルマー）を用いて測定することで行った。ここで、４−メチルウンベリフェロンの励起は３５５ｎｍ／４０ｎｍの光（３５５ｎｍを中心とする４０ｎｍの波長幅の光）で行い、蛍光の測定は４６０ｎｍ／２５ｎｍの光（４６０ｎｍを中心とする２５ｎｍの波長幅の光）を測定することにより行った。
ここで、ＴＡＬＥＮが有効に発現して機能した場合、ＴＡＬＥＮ＃１２中の配列番号１０の配列にＴＡＬＥＮが結合して、ＤＮＡ鎖の切断を行う結果、ＳＳＡ（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ａｎｎｅａｌｉｎｇ）が起こり、前記ＧＵＳ遺伝子上流側領域と前記ＧＵＳ遺伝子下流側領域がその重複部において適切に連結される結果、機能的なＧＵＳ遺伝子が形成され、ＧＵＳ活性が生じると考えられる。
【０１３０】
実験の結果を図３に示す。図３において、ｍｉｓｍａｔｃｈは上記の配列番号５３（ＴＡＬＥＮの認識配列ではない配列）が挿入されたプラスミドをpTALEN-StGBSS1と共に導入した場合の結果を、ＴＡＬＥＮ＃１２は上記の配列番号１０（ＴＡＬＥＮの認識配列）が挿入されたプラスミドをpTALEN-StGBSS1と共に導入した場合の結果を、そして、ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄは、遺伝子導入の際に、上記のプラスミドもpTALEN-StGBSS1も遺伝子導入用溶液に含ませなかった場合の結果を示す。
上記の図３から分かるように、ＴＡＬＥＮの認識配列を有するＴＡＬＥＮ＃１２は、認識配列を有しないｍｉｓｍａｔｃｈと比べて、より有効に切断およびＳＳＡが起こり、その結果、より高いＧＵＳ活性が観察された。
【０１３１】
以上で説明したとおり、本開示によって、例えば、新規な植物細胞用発現ベクターならびにその製造方法およびその製造に用いるベクターなどが提供され、これにより、例えば、ＤＮＡ結合ドメインを有し二量体として機能する所望のタンパク質を、所望の植物細胞において適切に発現することが可能となる。
【０１３２】
本開示における、例示的な実施形態は以下のものを含む。
＜１＞  第１のａｔｔＬ組換え部位と、
可変領域を有するＴＡＬＥ（ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ）のＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントを挿入可能な挿入位置を有する挿入領域と、
前記挿入位置にＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントが挿入された場合にＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質をコードする核酸配列を形成可能となるように位置する、生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、
第２のａｔｔＬ組換え部位と、
を含み、
前記第１のａｔｔＬ組換え部位、前記挿入領域、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、および前記第２のａｔｔＬ組換え部位は、前記生物学的活性を有するタンパク質がコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されており、前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記挿入位置との間に、プロモーターを有しない、ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター。
＜２＞  環状二本鎖プラスミドベクターである、＜１＞に記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター。
【０１３３】
＜３＞  さらに構成セグメントを含む、＜１＞または＜２＞に記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター。
＜４＞  前記第１のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列は、前記第２のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列とは異なる、＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター。
＜５＞  前記第１のａｔｔＬ組換え部位は、第１のａｔｔＲ組換え部位と組み換え可能であり、前記第２のａｔｔＬ組換え部位は、第１のａｔｔＲ組換え部位とは核酸配列が異なる第２のａｔｔＲ組換え部位と組み換え可能である、＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター。
＜６＞  前記第１のａｔｔＬ組換え部位は前記第２のａｔｔＲ組換え部位と組み換え可能ではなく、前記第２のａｔｔＬ組換え部位は前記第１のａｔｔＲ組換え部位とは組み換え可能ではない、＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター。
【０１３４】
＜７＞  前記第１のａｔｔＬ組換え部位がａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２のうちの一方であり、前記第２のａｔｔＬ組換え部位がａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２のうちの他方である、＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター。
＜８＞  前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、ヌクレアーゼ活性、ポリメラーゼ活性、核酸組換え活性、核酸修復活性、転写制御活性、および核酸修飾活性からなる群から選択される１つ以上を有するタンパク質をコードする遺伝子である、＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター。
＜９＞  前記生物学的活性を有するタンパク質が、２量体として機能するタンパク質である、＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター。
＜１０＞  前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインをコードする遺伝子である、＜１＞〜＜９＞のいずれかに記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター。
＜１１＞  前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がイントロンを含む、＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター。
＜１２＞  前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記第２のａｔｔＬ組換え部位との間に、マーカー遺伝子をさらに含む、＜１＞〜＜１１＞のいずれかに記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター。
【０１３５】
＜１３＞  前記マーカー遺伝子が、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と前記第２のａｔｔＬ組換え部位との間に位置する、＜１２＞に記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター。
＜１４＞  前記マーカー遺伝子が、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、呈色反応を触媒する酵素をコードする遺伝子および薬剤耐性遺伝子からなる群から選択される、＜１２＞または＜１３＞に記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター。
＜１５＞  前記マーカー遺伝子が、抗生物質耐性遺伝子である、＜１２＞〜＜１４＞のいずれかに記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター。
＜１６＞  前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の終始コドンと、前記マーカー遺伝子との間の距離が、０．２ｋｂ〜１．０ｋｂである、＜１２＞〜＜１５＞のいずれかに記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター。
＜１７＞  前記挿入領域が、前記挿入位置の下流側隣接位置に、アデニン認識用ジペプチド、シトシン認識用ジペプチド、チミン認識用ジペプチド、またはグアニン認識用ジペプチド、をコードする核酸セグメントを含む、＜１＞〜＜１６＞に記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター。
【０１３６】
＜１８＞  前記挿入位置と、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子との間の距離が、０．１ｋｂ〜０．５ｋｂである、＜１＞〜＜１７＞のいずれかに記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター。
＜１９＞  前記第１のａｔｔＬ組換え部位と、前記挿入位置との間の距離が、０ｂｐ〜１．０ｋｂである、＜１＞〜＜１８＞のいずれかに記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター。
＜２０＞  各々が＜１＞〜＜１９＞のいずれかに記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターである複数種類のベクターを含む、ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセットであって、
前記複数種類のベクターは、
前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記第２のａｔｔＬ組換え部位との間に第１のマーカー遺伝子を含む、第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター、および
前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記第２のａｔｔＬ組換え部位との間に、第１のマーカー遺伝子とは異なる第２のマーカー遺伝子を含む、第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター、
を含む、ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセット。
【０１３７】
＜２１＞  前記第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第１のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列と、前記第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第１のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列が同じものであり、前記第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第２のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列と、前記第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第２のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列が同じものである、＜２０＞に記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセット。
＜２２＞  前記第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第１のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列と、前記第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第２のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列が同じものであり、前記第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第２のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列と、前記第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第１のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列が同じものである、＜２０＞に記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセット。
＜２３＞  前記第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、前記第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、同じものであるかまたはこれらがコードするタンパク質が協同して機能するものである、＜２０＞〜＜２２＞のいずれかに記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセット。
【０１３８】
＜２４＞  各々が＜１＞〜＜１９＞のいずれかに記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターである複数種類のベクターを含む、ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセットであって、
前記複数種類のベクターは、前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記第２のａｔｔＬ組換え部位との間に第１のマーカー遺伝子を含む、第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群、および前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記第２のａｔｔＬ組換え部位との間に、第１のマーカー遺伝子とは異なる第２のマーカー遺伝子を含む、第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群、を含み、
前記第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群は、それぞれ、アデニン認識用ジペプチド、シトシン認識用ジペプチド、チミン認識用ジペプチド、およびグアニン認識用ジペプチド、をコードする核酸セグメントを前記挿入領域における前記挿入位置の下流側隣接位置に含む４種のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターを含み、
前記第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群は、それぞれ、アデニン認識用ジペプチド、シトシン認識用ジペプチド、チミン認識用ジペプチド、およびグアニン認識用ジペプチド、をコードする核酸セグメントを前記挿入領域における前記挿入位置の下流側隣接位置に含む４種のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターを含む、ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセット。
【０１３９】
＜２５＞  前記第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群の前記４種のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第１のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列と、前記第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群の前記４種のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第１のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列が同じものであり、前記第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群の前記４種のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第２のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列と、前記第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群の前記４種のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第２のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列が同じものである、＜２４＞に記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセット。
＜２６＞  前記第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群の前記４種のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第１のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列と、前記第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群の前記４種のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第２のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列が同じものであり、前記第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群の前記４種のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第２のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列と、前記第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群の前記４種のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記第１のａｔｔＬ組換え部位の核酸配列が同じものである、＜２４＞に記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセット。
＜２７＞  前記第１のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群の前記４種のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、前記第２のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター群の前記４種のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターにおける前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、同じものであるかまたはこれらがコードするタンパク質が協同して機能するものである、＜２４＞〜＜２６＞のいずれかに記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセット。
【０１４０】
＜２８＞  ＜１＞〜＜１９＞のいずれかに記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターを準備すること、および
前記ＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターの前記挿入位置に、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントを挿入すること、
を含む、融合タンパク質をコードする核酸セグメントを含む融合タンパク質コーディングベクターの製造方法。
＜２９＞  前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列の繰り返し数が、１３〜２５である、＜２８＞に記載の方法。
＜３０＞  前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列の繰り返し数が、１４〜２０である、＜２８＞または＜２９＞に記載の方法。
＜３１＞  前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列が、前記生物学的活性を有するタンパク質の作用対象部位となる対象核酸領域の配列に基づいて、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列が前記対象核酸領域に結合可能となるように選択されたものである、＜２８＞〜＜３０＞のいずれかに記載の製造方法。
＜３２＞  前記挿入が、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｇａｔｅ法によって行われる、＜２８＞〜＜３１＞に記載の製造方法。
【０１４１】
＜３３＞  第１のａｔｔＬ組換え部位と、
ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸セグメントと、
前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質を形成するように位置する、生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、
第２のａｔｔＬ組換え部位と、
を含み、
前記第１のａｔｔＬ組換え部位、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸セグメント、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、および前記第２のａｔｔＬ組換え部位は、前記生物学的活性を有するタンパク質がコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されており、前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸セグメントとの間に、プロモーターを有しない、融合タンパク質コーディングベクター。
＜３４＞  環状二本鎖プラスミドベクターである、＜３３＞に記載の融合タンパク質コーディングベクター。
＜３５＞  さらに構成セグメントを含む、＜３３＞または＜３４＞に記載の融合タンパク質コーディングベクター。
【０１４２】
＜３６＞  前記第１のａｔｔＬ組換え部位はａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２のうちの一方であり、前記第２のａｔｔＬ組換え部位はａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２のうちの他方である、＜３３＞〜＜３５＞のいずれかに記載の融合タンパク質コーディングベクター。
＜３７＞  前記第１のａｔｔＬ組換え部位は、第１のａｔｔＲ組換え部位と組み換え可能であり、前記第２のａｔｔＬ組換え部位は、第１のａｔｔＲ組換え部位とは核酸配列が異なる第２のａｔｔＲ組換え部位と組み換え可能である、＜３３＞〜＜３６＞のいずれかに記載の融合タンパク質コーディングベクター。
＜３８＞  前記第１のａｔｔＬ組換え部位は前記第２のａｔｔＲ組換え部位と組み換え可能ではなく、前記第２のａｔｔＬ組換え部位は前記第１のａｔｔＲ組換え部位とは組み換え可能ではない、＜３３＞〜＜３７＞のいずれかに記載の融合タンパク質コーディングベクター。
＜３９＞  前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、ヌクレアーゼ活性、ポリメラーゼ活性、核酸組換え活性、核酸修復活性、転写制御活性、および核酸修飾活性からなる群から選択される１つ以上を有するタンパク質をコードする遺伝子である、＜３３＞〜＜３８＞のいずれかに記載の融合タンパク質コーディングベクター。
＜４０＞  前記生物学的活性を有するタンパク質が、２量体として機能するタンパク質である、＜３３＞〜＜３９＞のいずれかに記載の融合タンパク質コーディングベクター。
＜４１＞  前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインをコードする遺伝子である、＜３３＞〜＜４０＞のいずれかに記載の融合タンパク質コーディングベクター。
【０１４３】
＜４２＞  前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がイントロンを含む、＜３３＞〜＜４１＞のいずれかに記載の融合タンパク質コーディングベクター。
＜４３＞  前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記第２のａｔｔＬ組換え部位との間に、マーカー遺伝子をさらに含む、＜３３＞〜＜４２＞のいずれかに記載の融合タンパク質コーディングベクター。
＜４４＞  前記マーカー遺伝子が、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と前記第２のａｔｔＬ組換え部位との間に位置する、＜４３＞に記載の融合タンパク質コーディングベクター。
＜４５＞  前記マーカー遺伝子が、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、呈色反応を触媒する酵素をコードする遺伝子および薬剤耐性遺伝子からなる群から選択される、＜４３＞または＜４４＞に記載の融合タンパク質コーディングベクター。
＜４６＞  前記マーカー遺伝子が、抗生物質耐性遺伝子である、＜４３＞〜＜４５＞のいずれかに記載の融合タンパク質コーディングベクター。
＜４７＞  前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の終始コドンと、前記マーカー遺伝子との間の距離が、０．２ｋｂ〜１．０ｋｂである、＜４３＞〜＜４６＞のいずれかに記載の融合タンパク質コーディングベクター。
【０１４４】
＜４８＞  前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントと、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子との間の距離が、０．１ｋｂ〜０．５ｋｂである、＜３３＞〜＜４７＞のいずれかに記載の融合タンパク質コーディングベクター。
＜４９＞  前記第１のａｔｔＬ組換え部位と、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントとの間の距離が、０ｂｐ〜１．０ｋｂである、＜３３＞〜＜４８＞のいずれかに記載の融合タンパク質コーディングベクター。
＜５０＞  各々が＜３３＞〜＜４９＞のいずれかに記載の融合タンパク質コーディングベクターである複数種類のベクターを含む、融合タンパク質コーディングベクターセットであって、
前記複数種類のベクターは、前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記第２のａｔｔＬ組換え部位との間に第１のマーカー遺伝子を含む、第１の融合タンパク質コーディングベクター、および前記第１のａｔｔＬ組換え部位と前記第２のａｔｔＬ組換え部位との間に、第１のマーカー遺伝子とは異なる第２のマーカー遺伝子を含む、第２の融合タンパク質コーディングベクター、を含む、融合タンパク質コーディングベクターセット。
＜５１＞  前記第１の融合タンパク質コーディングベクターにおける前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、前記第２の融合タンパク質コーディングベクターにおける前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、同じものであるかまたはこれらがコードするタンパク質が協同して機能するものである、＜５０＞に記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセット。
【０１４５】
＜５２＞  第１のＤＮＡブロックおよび第２のＤＮＡブロックを含むデスティネーションベクターであって、
前記第１のＤＮＡブロックは、
植物細胞で作動可能な第１のプロモーターと、
第１のａｔｔＲ組換え部位と、
第２のａｔｔＲ組換え部位と、
を含み、
前記第２のＤＮＡブロックは、
植物細胞で作動可能な第２のプロモーターと、
第３のａｔｔＲ組換え部位と、
第４のａｔｔＲ組換え部位と、
を含み、
前記第２のＤＮＡブロックは前記第１のプロモーターの上流側に位置し、かつ前記第１のＤＮＡブロックとは逆向きに配置されており、前記第１のＤＮＡブロックにおいて、前記第１のプロモーター、前記第１のａｔｔＲ組換え部位および前記第２のａｔｔＲ組換え部位は、前記第１のプロモーターがコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されており、前記第２のＤＮＡブロックにおいて、前記第２のプロモーター、前記第３のａｔｔＲ組換え部位および前記第４のａｔｔＲ組換え部位は、前記第２のプロモーターがコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されている、デスティネーションベクター。
＜５３＞  前記第１のＤＮＡブロックにおける前記第１のプロモーターがコードされた方向を基準として前記第２のａｔｔＲ組換え部位よりも下流側の位置に配置された右境界配列ＲＢを有する核酸セグメントと、前記第２のＤＮＡブロックにおける前記第２のプロモーターがコードされた方向を基準として前記第４のａｔｔＲ組換え部位よりも下流側の位置に配置された左境界配列ＬＢを有する核酸セグメントと、をさらに含む、＜５２＞に記載のデスティネーションベクター。
＜５４＞  前記第１のプロモーターおよび前記第２のプロモーターが、構成的プロモーター、誘導的プロモーター、組織特異的プロモーターおよび時期特異的プロモーターから選択される、＜５２＞または＜５３＞に記載のデスティネーションベクター。
＜５５＞  前記構成的プロモーターが、強発現プロモーターである、＜５４＞に記載のデスティネーションベクター。
【０１４６】
＜５６＞  前記第１のプロモーターおよび前記第２のプロモーターが、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターである、＜５２＞〜＜５５＞のいずれかに記載のデスティネーションベクター。
＜５７＞  環状二本鎖プラスミドベクターである、＜５２＞〜＜５６＞のいずれかに記載のデスティネーションベクター。
＜５８＞  アグロバクテリウム内でベクターの複製および維持を可能とする複製起点を有する、＜５２＞〜＜５７＞のいずれかに記載のデスティネーションベクター。
＜５９＞  さらに構成セグメントを含む、＜５２＞〜＜５８＞のいずれかに記載のデスティネーションベクター。
＜６０＞  前記第１〜第４のａｔｔＲ組換え部位は、各々ａｔｔＲ１またはａｔｔＲ２である、＜５２＞〜＜５９＞のいずれかに記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクター。
＜６１＞  前記第１のａｔｔＲ組換え部位の核酸配列が前記第２のａｔｔＲ組換え部位の核酸配列とは異なり、前記第３のａｔｔＲ組換え部位の核酸配列が前記第４のａｔｔＲ組換え部位の核酸配列とは異なる、＜５２＞〜＜６０＞のいずれかに記載のデスティネーションベクター。
【０１４７】
＜６２＞  前記第１のａｔｔＲ組換え部位の核酸配列と前記第３のａｔｔＲ組換え部位の核酸配列が同じであり、前記第２のａｔｔＲ組換え部位の核酸配列と前記第４のａｔｔＲ組換え部位の核酸配列とが同じである、＜５２＞〜＜６１＞のいずれかに記載のデスティネーションベクター。
＜６３＞  前記第１のａｔｔＬ組換え部位および前記第３のａｔｔＲ組換え部位は、第１のａｔｔＬ組換え部位と組み換え可能であり、前記第２のａｔｔＲ組換え部位および前記第４のａｔｔＲ組換え部位は、第１のａｔｔＬ組換え部位とは核酸配列が異なる第２のａｔｔＬ組換え部位と組み換え可能である、＜５２＞〜＜６２＞のいずれかに記載のデスティネーションベクター。
＜６４＞  前記第１のａｔｔＲ組換え部位および前記第３のａｔｔＲ組換え部位は前記第２のａｔｔＬ組換え部位と組み換え可能ではなく、前記第２のａｔｔＲ組換え部位および前記第４の組換え部位は前記第１のａｔｔＬ組換え部位とは組み換え可能ではない、＜５２＞〜＜６３＞のいずれかに記載のデスティネーションベクター。・  
＜６５＞  前記第１のａｔｔＲ組換え部位の核酸配列と前記第４のａｔｔＲ組換え部位の核酸配列が同じであり、前記第２のａｔｔＲ組換え部位の核酸配列と前記第３のａｔｔＲ組換え部位の核酸配列とが同じである、＜５２＞〜＜６１＞に記載のデスティネーションベクター。
＜６６＞  前記第１のプロモーターと前記第１のａｔｔＲ組換え部位との間の距離および前記第２のプロモーターと前記第３のａｔｔＲ組換え部位との間の距離が、０ｂｐ〜５００ｂｐである、＜５２＞〜＜６５＞に記載のデスティネーションベクター。
【０１４８】
＜６７＞  ＜５０＞または＜５１＞に記載のベクターセットにおける前記第１の融合タンパク質コーディングベクターにおける前記第１のａｔｔＬ組換え部位を、＜５２＞〜＜６５＞のいずれかに記載のデスティネーションベクターにおける前記第１のａｔｔＲ組換え部位と組み換えること、
前記第１の融合タンパク質コーディングベクターにおける前記第２のａｔｔＬ組換え部位を、前記デスティネーションベクターにおける前記第２のａｔｔＲ組換え部位と組み換えること、
前記ベクターセットにおける前記第２の融合タンパク質コーディングベクターの前記第１のａｔｔＬ組換え部位を、前記デスティネーションベクターにおける前記第３のａｔｔＲ組換え部位と組み換えること、および
前記第２の融合タンパク質コーディングベクターの前記第２のａｔｔＬ組換え部位を、前記デスティネーションベクターにおける前記第４のａｔｔＲ組換え部位と組み換えること、
を含む、植物細胞用発現ベクターの製造方法。
＜６８＞  前記組み換えが、いずれも、ＬＲクロナーゼ（登録商標）によって行われる、＜６７＞に記載の方法。
【０１４９】
＜６９＞  第１のＤＮＡブロックおよび第２のＤＮＡブロックを含む植物細胞用発現ベクターであって、
前記第１のＤＮＡブロックは、
植物細胞で作動可能な第１のプロモーターと、
第１のａｔｔＢ組換え部位と、
特定の核酸配列に結合可能なＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをコードする第１の核酸セグメントと、
前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質を形成するように位置する、生物学的活性を有するタンパク質をコードする第１の遺伝子と、
第２のａｔｔＢ組換え部位と、
を含み、
前記第２のＤＮＡブロックは、
植物細胞で作動可能な第２のプロモーターと、
第３のａｔｔＢ組換え部位と、
特定の核酸配列に結合可能なＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをコードする第２の核酸セグメントと、
前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質を形成するように位置する、生物学的活性を有するタンパク質をコードする第２の遺伝子と、
第４のａｔｔＢ組換え部位と、
を含み、
前記第２のＤＮＡブロックは前記第１のプロモーターの上流側に位置し、かつ前記第１のＤＮＡブロックとは逆向きに配置されており、前記第１のＤＮＡブロックにおいて、前記第１のプロモーター、前記第１のａｔｔＢ組換え部位、前記第１の核酸セグメント、前記第１の遺伝子および前記第２のａｔｔＢ組換え部位は、前記第１の遺伝子がコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されており、前記第２のＤＮＡブロックにおいて、前記第２のプロモーター、前記第３のａｔｔＢ組換え部位、前記第２の核酸セグメント、前記第２の遺伝子および前記第４のａｔｔＢ組換え部位は、前記第２の遺伝子がコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されている、植物細胞用発現ベクター。
＜７０＞  環状二本鎖プラスミドベクターである、＜６９＞に記載の植物細胞用発現ベクター。
＜７１＞  アグロバクテリウム内でベクターの複製および維持を可能とする複製起点を有する、＜６９＞または＜７０＞に記載の植物細胞用発現ベクター。
＜７２＞  さらに構成セグメントを含む、＜６９＞〜＜７１＞のいずれかに記載の植物細胞用発現ベクター。
＜７３＞  前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第１の遺伝子および前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第２の遺伝子が、それぞれ独立に、ヌクレアーゼ活性、ポリメラーゼ活性、核酸組換え活性、核酸修復活性、転写制御活性、および核酸修飾活性からなる群から選択される１つ以上を有するタンパク質をコードする遺伝子である、＜６９＞〜＜７２＞のいずれかに記載の植物細胞用発現ベクター。
【０１５０】
＜７４＞  前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第１の遺伝子および前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第２の遺伝子が、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインをコードする遺伝子である、＜６９＞〜＜７３＞のいずれかに記載の植物細胞用発現ベクター。
＜７５＞  前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第１の遺伝子および前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第２の遺伝子が、２量体として機能するタンパク質である、＜６９＞〜＜７４＞のいずれかに記載の植物細胞用発現ベクター。
＜７６＞  前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第１の遺伝子および前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第２の遺伝子が、同じものであるかまたはこれらがコードするタンパク質が協同して機能するものである、＜６９＞〜＜７５＞のいずれかに記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセット。
＜７７＞  前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第１の遺伝子および前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第２の遺伝子が、イントロンを含む、＜６９＞〜＜７６＞のいずれかに記載の植物細胞用発現ベクター。
＜７８＞  前記第１〜第４のａｔｔＢ組換え部位は、各々ａｔｔＢ１またはａｔｔＢ２である、＜６９＞〜＜７７＞のいずれかに記載の植物細胞用発現ベクター。
【０１５１】
＜７９＞  前記第１のａｔｔＢ組換え部位と前記第２のａｔｔＢ組換え部位との間に位置する第１のマーカー遺伝子、および前記第３のａｔｔＢ組換え部位と前記第４のａｔｔＢ組換え部位との間に位置する第２のマーカー遺伝子をさらに含む、＜６９＞〜＜７８＞のいずれかに記載の植物細胞用発現ベクター。
＜８０＞  前記第１のマーカー遺伝子と、前記第２のマーカー遺伝子が異なるものである、＜７９＞に記載の植物細胞用発現ベクター。
＜８１＞  前記第１のマーカー遺伝子が、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第１の遺伝子と前記第２のａｔｔＢ組換え部位との間に位置し、前記第２のマーカー遺伝子が、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第２の遺伝子と前記第４のａｔｔＢ組換え部位との間に位置する、＜７９＞または＜８０＞に記載の植物細胞用発現ベクター。
＜８２＞  前記第１のマーカー遺伝子が、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、呈色反応を触媒する酵素をコードする遺伝子および薬剤耐性遺伝子からなる群から選択される、＜７９＞〜＜８１＞のいずれかに記載の植物細胞用発現ベクター。
【０１５２】
＜８３＞  前記第２のマーカー遺伝子が、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、呈色反応を触媒する酵素をコードする遺伝子および薬剤耐性遺伝子からなる群から選択される、＜７９＞〜＜８２＞のいずれかに記載の植物細胞用発現ベクター。
＜８４＞  前記第１のマーカー遺伝子および前記第２のマーカー遺伝子が、抗生物質耐性遺伝子である、＜７９＞〜＜８３＞のいずれかに記載の植物細胞用発現ベクター。
＜８５＞  前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第１の遺伝子の終始コドンと前記第１のマーカー遺伝子との間の距離、および前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第２の遺伝子の終始コドンと前記第２のマーカー遺伝子との間の距離が、０．２ｋｂ〜１．０ｋｂである、＜７９＞〜＜８４＞のいずれかに記載の植物細胞用発現ベクター。
＜８６＞  前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする第１の核酸セグメントと、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第１の遺伝子との間の距離、および前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする第２の核酸セグメントと、前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第２の遺伝子との間の距離０．１ｋｂ〜０．５ｋｂである、＜６９＞〜＜８５＞のいずれかに記載の植物細胞用発現ベクター。
＜８７＞  前記第１のａｔｔＢ組換え部位と、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする第１の核酸セグメントとの間の距離、および前記第３のａｔｔＢ組換え部位と、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする第２の核酸セグメントとの間の距離が、０ｂｐ〜１．０ｋｂである、＜６９＞〜＜８６＞のいずれかに記載の植物細胞用発現ベクター。
【０１５３】
＜８８＞  前記第１のＤＮＡブロックにおける前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第１の遺伝子がコードされた方向を基準として前記第２のａｔｔＢ組換え部位よりも下流側の位置に配置された右境界配列ＲＢをコードする核酸セグメントと、前記第２のＤＮＡブロックにおける前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第２の遺伝子がコードされた方向を基準として前記第４のａｔｔＢ組換え部位よりも下流側の位置に配置された左境界配列ＬＢをコードする核酸セグメントと、をさらに含む、＜６９＞〜＜８７＞のいずれかに記載の植物細胞用発現ベクター。
＜８９＞  前記第１のプロモーターと前記第１のａｔｔＢ組換え部位との間の距離および前記第２のプロモーターと前記第３のａｔｔＢ組換え部位との間の距離が、０ｂｐ〜５００ｂｐである、＜６９＞〜＜８８＞のいずれかに記載の植物細胞用発現ベクター。
＜９０＞  ＜２０＞〜＜２７＞のいずれかに記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセットおよび＜５２＞〜＜６６＞のいずれかに記載のデスティネーションベクターを含む、植物細胞用発現ベクター作製用キット。
＜９１＞  さらにＬＲクロナーゼを含む、＜９０＞に記載のキット。
＜９２＞  ＜６９＞〜＜８９＞のいずれかに記載の植物細胞用発現ベクターを植物細胞に導入することを含む、前記植物細胞用発現ベクターを遺伝子導入した植物細胞を作製する方法。
【０１５４】
＜９３＞  前記導入することが、前記植物細胞用発現ベクターをアグロバクテリウムに導入すること、および前記アグロバクテリウムを植物細胞に感染させることにより、前記植物細胞用発現ベクターを前記植物細胞内に導入すること、を含み、
前記植物細胞用発現ベクターは、前記第１のＤＮＡブロックにおける前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第１の遺伝子がコードされた方向を基準として前記第２のａｔｔＢ組換え部位よりも下流側の位置に配置された右境界配列ＲＢをコードする核酸セグメントと、前記第２のＤＮＡブロックにおける前記生物学的活性を有するタンパク質をコードする第２の遺伝子がコードされた方向を基準として前記第４のａｔｔＢ組換え部位よりも下流側の位置に配置された左境界配列ＬＢをコードする核酸セグメントと、をさらに含む、＜９２＞に記載の方法。
＜９４＞  ＜６９＞〜＜８９＞のいずれかに記載の植物細胞用発現ベクターを植物細胞に導入すること、前記導入された植物細胞用発現ベクターから前記生物学的活性を有するタンパク質を発現させること、および前記生物学的活性を有するタンパク質を植物細胞のゲノムに作用させること、を含むゲノム編集方法であって、前記生物学的活性を有するタンパク質が、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインであり、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインと共にＴＡＬＥＮ融合タンパク質を形成しており、前記ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインが前記植物細胞のゲノムにおける、前記ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインが結合可能な特定の配列の近傍を切断する、ゲノム編集方法。
＜９５＞  前記切断により、遺伝子破壊が起こる、＜９４＞に記載のゲノム編集方法。
＜９６＞  前記切断の際に、前記切断の生じる箇所の近傍のゲノム配列に相同的な人工設計核酸配列を存在させておくことにより、前記人工設計核酸配列をゲノム中に導入する、＜９４＞に記載のゲノム編集方法。
＜９７＞  前記挿入領域が制限酵素認識部位を有する、＜１＞〜＜１９＞に記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターまたは＜２０＞〜＜２７＞に記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセット。
＜９８＞  前記挿入領域が認識配列の外側を切断する制限酵素の認識部位を１つ、２つ、または３つ以上有する、＜１＞〜＜１９＞に記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターまたは＜２０＞〜＜２７＞に記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセット。
＜９９＞  前記挿入領域がＢｓａＩまたはＥｓｐＩの認識部位を１つ、２つ、または３つ以上有する、＜１＞〜＜１９＞に記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターまたは＜２０＞〜＜２７＞に記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセット。
＜１００＞  前記挿入領域がＥｓｐＩの認識部位を２つ有する、＜１＞〜＜１９＞に記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターまたは＜２０＞〜＜２７＞に記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセット。
＜１０１＞  前記挿入領域の他にはＥｓｐＩの認識部位を有しない、＜１００＞に記載のＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターまたはＤＮＡ結合ドメイン組込み用ベクターセット。
【０１５５】
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【図１】
0006590333.tif 000008
【図２】
0006590333.tif 000009
【図３】
0006590333.tif 000010
【配列表】
0006590333000001.app