(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物細胞型の表現型の調節因子抗体を同定する方法であって、
（ａ）修飾された抗体発現細胞の異種性の集団を産生するため、真核生物細胞型の細胞集団において、分泌される、または膜に埋め込まれる候補抗体又はその抗原結合フラグメントのライブラリを発現すること、並びに
（ｂ）前記真核生物細胞型の修飾されていない対照細胞の表現型に対して変更された表現型を伴う特異的抗体発現細胞を選択し、それによって、前記真核生物細胞型の調節因子として前記特異的抗体発現細胞において発現される前記候補抗体又はその抗原結合フラグメントを同定することを含む方法であって、前記発現した候補抗体又はその抗原結合フラグメントによって該細胞に、細胞自身が発現、分泌等をしない外部からの物質の作用に依ることなく、細胞自身が発現した候補抗体又はその抗原結合フラグメントによって、外部からの物質による作用と同等の作用が起こるようになる、前記方法。
【請求項２】
前記候補抗体又はその抗原結合フラグメントのライブラリが、各細胞が３つ以下の異なる抗体種を発現する条件下で細胞内において発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記候補抗体又はその抗原結合フラグメントのライブラリが分泌抗体のコンビナトリアルライブラリである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記コンビナトリアルライブラリが、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターを介して前記細胞内において発現される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記真核生物細胞型が哺乳動物細胞型である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体発現細胞が、選択の間、拡散制限培地で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
同定された候補抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記表現型が細胞応答又は細胞のシグナル伝達活性である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞型が幹細胞型であり、前記表現型が細胞分化である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記表現型が、標的分子により媒介される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的分子が、腫瘍抑制遺伝子又はがん遺伝子によりコードされている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的分子が分泌ホルモン又はサイトカインである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記分泌ホルモン又はサイトカインがエリスロポエチン、トロンボポエチン又はＩＬ−１である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的分子が前記細胞型のシグナル伝達受容体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記受容体が、分泌ホルモン又はサイトカインに対する受容体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記同定された候補抗体がヘテロ二量体二重特異性抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記二重特異性抗体が、標的分子上の２つの異なるエピトープに結合する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記調節因子抗体が前記標的分子を刺激する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記調節因子抗体が前記標的分子を拮抗するか、又は前記標的分子の阻害剤を拮抗する、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
前記選択が、前記阻害剤の存在下で行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
表現型選択のため前記細胞集団において、標的分子に結合する抗体を発現する前に、前記標的分子に結合するものを同定するため、前記候補抗体のライブラリをスクリーニングすることをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２２】
前記標的分子に結合する抗体がファージディスプレイにより同定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記表現型が、前記真核生物細胞型における標的分子又はマーカー遺伝子の発現である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記標的分子が細胞表面受容体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
標的細胞をリプログラムするか又は分化転換することが可能なポリペプチド物質を同定する方法であって、
（１）修飾されたポリペプチド物質発現レポーター細胞の異種性集団を産生するため、前記標的細胞によって発現されるシグナル伝達受容体を有するレポーター細胞において、分泌される、または膜に埋め込まれる候補ポリペプチド物質のライブラリを発現すること、（２）前記受容体の活性化されたシグナル伝達により、ポリペプチド物質発現レポーター細胞の亜集団を同定すること、
（３）前記同定された細胞の亜集団からアゴニスト物質の群を単離すること、及び
（４）アゴニスト物質の群を前記標的細胞の集団と接触させ、分化転換の特異的表現型指標により細胞を選択し、それによって、前記標的細胞をリプログラム又は分化転換することが可能なポリペプチド物質を同定することを含む方法。
【請求項２６】
前記標的細胞が、体細胞又は系統制限幹細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記候補ポリペプチド物質が抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記候補ポリペプチド物質及び前記受容体が、前記レポーター細胞の原形質膜へと同時に組み込まれる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記標的細胞における前記受容体の活性化が前記特異的表現型を促進する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記受容体がＧ−ＣＳＦＲであり、前記特異的表現型が神経発生である、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、米国仮特許出願番号第６１／６９５，５２７号（２０１２年８月３１日付出願）及び第６１／８１４，６４６号（２０１３年４月２２日付出願）の優先権の利益を主張する。優先出願の全開示は、それらの全体において、また全ての目的のため参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
機能性抗体は、幅広い疾患の治療に対する重要な治療法の選択肢である。現在、免疫化学の分野は、有用な分子が非常に稀である幅広い中和抗ウイルス抗体の作製等のより挑戦的な目標に対してその注目を転換した。この頻度の問題は、今日、１０１１もの異なる多くのメンバーを含むレパートリーから選択することができるコンビナトリアル抗体ライブラリの出現により大部分は解決された。例えば、このアプローチの力は、インフルエンザウイルスの研究において、希少な抗体の選択が新たな様式のウイルス中和の発見へと導き、それによって以前には実現されていない治療法の可能性、さらには万能ワクチンの作製を提案した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、上記頻度の問題に対する解決策によっても、その機能が単純な結合を超える抗体の単離は、いまだに骨が折れるものである。当該技術分野では、候補分子のプールから機能性抗体を同定するより優れた手段が必要とされている。本発明は、この及び他の必要を対象とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ある１つの態様では、本発明は真核生物細胞の表現型を調整する調節性タンパク質物質（例えば、抗体又は他のポリペプチド）を同定する方法を提供する。上記方法は、最初に、真核生物細胞型の細胞集団において、候補物質（例えば、抗体又はその抗原結合フラグメント）のライブラリを発現することを必要とする。これにより、候補物質を発現する修飾された細胞の異種性集団を産生する。上記候補物質のライブラリは、各細胞が候補物質のライブラリの３つ以下の異なるメンバーを発現する条件下で、細胞の開始異種性集団に導入されて発現されることが好ましい。これらの好ましい実施形態の幾つかでは、各細胞は、導入された外因性物質の１つの種のみを発現する。この後、同じ真核生物細胞型の修飾されていない対照細胞に対して、少なくとも１つの変更された表現型を伴う特異的物質発現細胞を選択する。これにより、真核生物細胞型の調節因子として特異的物質発現細胞において発現された特異的な候補物質（例えば、アゴニスト抗体）の同定を可能とする。
【０００５】
典型的には、候補物質のライブラリは、分泌ポリペプチド又はタンパク質（例えば、分泌抗体又は細胞内抗体）のコンビナトリアルライブラリである。ある実施形態では、上記コンビナトリアル物質ライブラリは、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターを介して上記細胞において発現された抗体ライブラリである。ある好ましい実施形態では、上記方法に採用される細胞型は、哺乳動物細胞型である。本発明のある実施形態では、調節性抗体が同定される上記細胞は、選択の間拡散制限培地で培養される。本発明のある方法は、上記特異的候補抗体をコードするポリヌクレオチド配列を単離すること、及び上記同定された候補抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を決定することをさらに包含する。
【０００６】
ある実施形態では、調節される又は制御される上記表現型は、細胞応答又は細胞のシグナル伝達活性である。ある実施形態では、上記真核生物細胞型は幹細胞型であり、上記表現型は上記幹細胞の分化である。本発明のある実施形態では、調節される表現型は、標的分子により媒介される。ある実施形態では、標的分子は腫瘍抑制遺伝子又はがん遺伝子によってコードされる。他の実施形態では、上記標的分子は分泌されたホルモン又はサイトカイン、例えば、エリスロポエチン、トロンボポエチン又はＩＬ−１である。ある実施形態では、上記標的分子は、上記細胞のシグナル伝達受容体である。例えば、それは分泌されたホルモン又はサイトカインに対する受容体であってもよい。本発明のある実施形態は、ヘテロ二量体二重特異性抗体である表現型調節因子を同定することを対象とする。ある実施形態では、同定された二重特異性抗体は、ターゲット分子上の２つの異なるエピトープに結合する。
【０００７】
ある実施形態では、上記同定された調節因子抗体は、上記標的分子を刺激する。他の実施形態では、上記同定された調節因子抗体は、上記標的分子を拮抗するか、又は上記標的分子の阻害剤を拮抗する。後者の実施形態の幾つかでは、上記選択は、阻害剤の存在下で行われ得る。ある実施形態では、上記選択は、表現型選択のため、上記細胞においてバインダー抗体を発現する前に上記標的分子のバインダーを同定するため、候補抗体のライブラリをスクリーニングすることをさらに含んでもよい。例えば、上記標的分子のバインダー抗体は、ファージディスプレイを介して同定される。本発明の他の方法では、調節される上記表現型は、真核生物細胞型における標的分子又はマーカー遺伝子の発現である。例えば、上記同定された抗体調節因子は、細胞表面受容体の発現を制御する。
【０００８】
関連する態様では、本発明は、真核生物細胞の表現型を調節する抗体を同定する方法を提供する。これらの方法は、（ａ）抗体発現細胞の異種性集団を産生するため、各細胞が３つ以下の異なる抗体種を発現する条件下で、候補抗体又はその抗原結合フラグメントのライブラリを第２細胞型の同種性集団において発現すること、（ｂ）前記真核生物細胞型の細胞の集団及び抗体発現細胞の集団を共培養すること、並びに（ｃ）上記真核生物細胞型の表現型を変更する特異的抗体発現細胞を選択すること、を含む。これは、真核生物細胞型の調節因子として、特異的抗体発現細胞において発現される候補抗体の同定を導く。ある実施形態では、上記抗体ライブラリの１つの異なるメンバーのみが、抗体発現細胞集団の各細胞において発現される。
【０００９】
これらの方法の幾つかは、疾患哺乳動物細胞の抗体調節因子を同定することを対象とする。例えば、上記方法は、腫瘍細胞のある特定の表現型を調節する、例えば、腫瘍細胞の成長を停止又は遅延する抗体を選択するために使用され得る。ある実施形態では、上記表現型は、標的分子により媒介される。これらの実施形態の幾つかでは、上記同定された候補抗体は、標的分子のアンタゴニストである。
【００１０】
別の態様では、本発明は、所望の経路に沿って標的細胞をリプログラムするか、又は分化転換することが可能なタンパク質又はポリペプチド物質（抗体、ポリペプチド又はペプチド）を同定する方法を提供する。これらの方法は、（１）標的細胞により発現されるシグナル伝達受容体を有するレポーター細胞において候補ポリペプチド物質のライブラリを発現し、それにより修飾された物質発現レポーター細胞の異種性集団を産生すること、（２）細胞の異種性集団から上記受容体の活性化されたシグナル伝達を有する物質発現レポーター細胞の亜集団を同定すること、（３）同定された細胞の亜集団からアゴニスト物質の群を単離すること、並びに（４）アゴニスト物質の群と標的細胞の集団とを接触させ、分化転換の特異的表現型指標を伴う細胞を選択すること、を含む。
【００１１】
これらの方法の幾つかは、体細胞又は系統制限幹細胞である標的細胞のリプログラミングを対象とする。幾つかの方法は、具体的には、標的細胞のリプログラミングのための抗体又は抗原結合フラグメントに対するアゴニストを同定することを対象とする。ある方法では、上記候補物質及び上記受容体は、上記レポーター細胞の原形質膜へと同時に組み込まれる。様々な実施形態では、上記レポーター細胞において共発現される上記受容体は、上記標的細胞において通常は特異的な表現型を促進する。幾つかの方法では、アゴニスト物質を同定するのに使用される上記受容体は、Ｇ−ＣＳＦＲであり、上記標的細胞の分化転換を証明する特異的な表現型は、神経発生である。
【００１２】
別の態様では、本発明は、ヒトエリスロポエチン受容体に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。これらの抗体は、（１）配列番号１、配列番号２及び配列番号３にそれぞれ示される、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列；並びに配列番号４、配列番号５及び配列番号６にそれぞれ示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列、（２）配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１にそれぞれ示される、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列；並びに配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４にそれぞれ示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列、又は（３）配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７にそれぞれ示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列；並びに配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０にそれぞれ示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列、を含む抗体と同じ結合特異性を有する。ある実施形態では、上記抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１、配列番号２及び配列番号３とそれぞれ実質的に同一である重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を有し、且つ、配列番号４、配列番号５及び配列番号６とそれぞれ実質的に同一である軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を有する。本発明の抗体の幾つかは、配列番号１、配列番号２及び配列番号３とそれぞれ同一である、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を有し、且つ配列番号４、配列番号５及び配列番号６とそれぞれ同一である軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を有する。本発明の抗体の幾つかは、配列番号７及び配列番号８にそれぞれ示される重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列を有する。
【００１３】
本発明の幾つかの他の実施形態は、本明細書に記載される特異的抗ＴｐｏＲアゴニスト抗体、抗Ｇ−ＣＳＦＲアゴニスト抗体又は幹細胞分化誘導抗体を対象とする。これらの抗体の幾つかは、（１）配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７にそれぞれ示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列、並びに配列番号３８、配列番号１３及び配列番号３９にそれぞれ示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列、（２）配列番号４３、配列番号４４及び配列番号４５にそれぞれ示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列、並びに配列番号４６、配列番号１３及び配列番号４７にそれぞれ示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列、（３）配列番号５１、配列番号５２及び配列番号５３にそれぞれ示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列、並びに配列番号５４、配列番号５５及び配列番号５６にそれぞれ示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列、又は（４）配列番号６０、配列番号６１及び配列番号６２にそれぞれ示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列、並びに配列番号６３、配列番号６４及び配列番号６５にそれぞれ示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列、を含む抗体と同じ結合特性を有する。
【００１４】
本発明のこれらの抗体の幾つかは、（１）配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７とそれぞれ同一又は実質的に同一である重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列、並びに配列番号３８、配列番号１３及び配列番号３９それぞれ同一又は実質的に同一である軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列、（２）配列番号４３、配列番号４４及び配列番号４５とそれぞれ同一又は実質的に同一である重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列、並びに配列番号４６、配列番号１３及び配列番号４７それぞれ同一又は実質的に同一である軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列、（３）配列番号５１、配列番号５２及び配列番号５３とそれぞれ同一又は実質的に同一である重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列、並びに配列番号５４、配列番号５５及び配列番号５６とそれぞれ同一又は実質的に同一である軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列、又は（４）配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６３とそれぞれ同一又は実質的に同一である重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列、並びに配列番号６４、配列番号６５及び配列番号６６とそれぞれ同一又は実質的に同一である軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を有する。上記抗体の幾つかは、（１）それぞれ、配列番号３３及び配列番号３４、（２）それぞれ、配列番号４１及び配列番号４２、（３）それぞれ、配列番号４９及び配列番号５０、又は（４）それぞれ、配列番号５８及び配列番号５９に示される重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列を有する。
【００１５】
様々な実施形態では、本発明の受容体アゴニスト抗体は、ｓｃＦｖ抗体フラグメントである。これらの抗体の幾つかは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合されたｓｃＦｖ抗体フラグメントを含有する。幾つかの関連する実施形態では、本発明は、本明細書に開示される受容体アゴニスト抗体の重鎖又は軽鎖の可変領域をコードする単離された又は組換えのポリヌクレオチドを提供する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、ヒトエリスロポエチン受容体又はヒトインテグリンα３鎖に結合するヘテロ二量体二重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。これらの二重特異性抗体は、（１）配列番号９〜１４にそれぞれ実質的に同一であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の配列を含む第１単量体、及び配列番号１５〜２０にそれぞれ実質的に同一であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の配列を含む第２単量体、又は（２）配列番号６９〜７４にそれぞれ実質的に同一であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の配列を含む第１単量体、及び配列番号７８〜８３にそれぞれ実質的に同一であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の配列を含む第２単量体を有する。
【００１７】
これらの抗体の幾つかはヒトＥｐｏＲに結合し、配列番号９〜１４にそれぞれ同一又は実質的に同一であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の配列を含む第１単量体、及び配列番号１５〜２０にそれぞれ同一又は実質的に同一であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の配列を含む第２単量体を有する。これらの抗ＥｐｏＲ二重特異性抗体の幾つかは、配列番号２１及び配列番号２２にそれぞれ示される重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列を含む第１単量体、並びに（２）配列番号２３及び配列番号２４にそれぞれ示される重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列を含む第２単量体を有する。
【００１８】
本発明の幾つかの二重特異性抗体はヒトインテグリンα３鎖に結合し、配列番号６９〜７４にそれぞれ同一又は実質的に同一であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の配列を含む第１単量体、及び配列番号７８〜８３にそれぞれ同一又は実質的に同一であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の配列を含む第２単量体を有する。これらの抗インテグリンα３鎖二重特異性抗体の幾つかは、配列番号６７及び配列番号６８にそれぞれ示される重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列を含む第１単量体、並びに（２）配列番号７６及び配列番号７７にそれぞれ示される重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列を含む第２単量体を有する。
【００１９】
ある実施形態では、上記二重特異性抗体の各モノマーは、ｓｃＦｖ抗体フラグメントであり、上記単量体の各々の可変領域配列は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合される。ある関連する実施形態では、上記発明は、本明細書に開示される二重特異性抗体の第１単量体又は第２単量体の重鎖又は軽鎖の可変領域をコードする単離された又は組換えのポリヌクレオチド配列を提供する。
【００２０】
本発明の特徴及び利点のさらなる理解は、残りの本明細書及び特許請求の範囲の部分に対する参照により実現され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、コンビナトリアルライブラリに由来する抗体アゴニストの選択に関する概略図である。親和性ビーズ選択によりファージにおいてディスプレイされたコンビナトリアルライブラリからＥｐｏＲを結合した抗体を選択した。選択されたファージに由来する抗体遺伝子をレンチウイルスベクターにクローニングして、真核生物細胞の感染及び抗体遺伝子のゲノムへの組込み後の表現型の選択を可能とした。分泌された抗体がそれらを産生する細胞の周囲に捕捉されるように、形質導入された細胞をメチルセルロースアガーに播種した。マイクロマニピュレーターを使用して形成されたコロニーを採取し、抗体遺伝子をＰＣＲにより回収した。ＰＣＲ産物をクローニングして配列決定し、各抗体又は抗体の組合せをそれらの活性について試験した。活性な抗体を哺乳動物細胞において発現させ、さらなる特性評価のため精製した。
【図２】図２Ａ、２Ｂは、アゴニスト抗体の選択を示す。図２Ａは、ＥＦ１αがＵｂＣプロモーターよりも抗体合成に関してより強力なプロモーターであることを示すウェスタンブロット分析。したがって、ＥＦ１αプロモーターを有するレンチウイルスベクターを、全てのさらなる実験において使用した。ｈＥｐｏＲ−Ｔ２Ａ−ＧＦＰと抗体ライブラリとを同時に形質導入したＴＦ−１細胞を、２週間〜３週間に亘って、サイトカイン不含メチルセルロースアガー中で培養した。２Ｂは、形態学を研究するための明視野顕微鏡又はＥｐｏＲの発現をモニターするためのコロニーの色若しくは蛍光顕微鏡のいずれかを使用してコロニーを示す。ＥＰＯ遺伝子により形質導入したＴＦ−１細胞を陽性対照として使用した。その成長がＥＰＯから独立しているコロニーをマイクロマニピュレーターで採取した。抗体を産生するため、選択された細胞コロニーに由来する単一の抗体遺伝子をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入した。
【図３】図３Ａ、３Ｂは、形質移入による抗体の相乗作用を示す図である。図３Ａは、個々の抗体のＴＦ−１細胞増殖を誘導する能力を、形質移入の４８時間後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞による馴化培地を使用して試験した。ＴＦ−１細胞をマイクロタイターウェルにおいて等容量の馴化培地と混合して、ＥＰＯの不在下で７２時間に亘り培養した。生存可能な細胞の数をＭＴＳアッセイにより特定した。抗体Ｅ−１は真正ＥＰＯの約６０％の活性を有する最も強力なアゴニストであった。図３Ｂは、形質移入による抗体の相乗作用を示す図である。相乗作用を研究するため、同じコロニーから単離された２つの異なる抗体遺伝子の組合せをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入した。ＴＦ−１細胞増殖を、形質移入から４８時間後に得られた馴化培地を使用して試験した。ＴＦ−１細胞を等容量の馴化培地と混合して、ＥＰＯを伴わずに７２時間に亘り培養した。生存可能な細胞の数をＭＴＳアッセイにより特定した。Ｖ−１／Ｖ−３遺伝子による同時形質移入は、ＥＰＯと等しい最も強力な活性をもたらした。
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、抗体タンパク質コンストラクトにおける相乗作用を示す図である。単一の抗体Ｖ−１及びＶ−３、並びに「Ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅ」技術を使用して作製された二重特異性抗体Ｖ−１／Ｖ−３（ＢｓＡｂ）をＨＥＫ２９３Ｆ細胞から精製した。図４Ａは、精製したタンパク質を、ＴＡランニングバッファーを用いて７％Ｔｒｉｓ−アセテートゲルを使用して分析した。図４Ｂは、ＥｐｏＲに対する抗体結合を、「プルダウン」実験により試験した。種々の抗体をｈＥｐｏＲ−ｈｉｓタグの細胞外ドメインと混合した。上記複合体をＨｉｓタグＤｙｎａｂｅａｄｓにより捕捉し、結合した抗体を抗Ｆｃ：ＨＲＰ抗体により検出した。図４Ｃは、ヘテロ二量体ＢｓＡｂ及びホモ二量体抗体Ｅ−１の能力に関する用量反応曲線、ＥＰＯ依存性ＴＦ−１ヒトエリスロ白血病細胞の増殖を刺激する最も有力な単一の抗体（図３Ａ）。ＢｓＡｂの最大応答はＥＰＯに等しく、それが完全アゴニストであることを示しているのに対して、最も強力なホモ二量体抗体Ｅ−１は、真正のＥＰＯにより生み出される最大応答の６０％しか示さなかった。図４Ｄは、精製されたＥｐｏＲ外部ドメインＦｃキメラが抗体アゴニスト活性を阻害することを示すため、ＴＦ−１細胞を、増加した濃度のＥｐｏＲ外部ドメインＦｃ融合タンパク質の存在下で１０ｎＭの濃度の抗体で処理した。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、ＥｐｏＲシグナル伝達経路の活性化を示した。図５Ａは、１週間に亘り、ＴＦ−１細胞を最適以下の濃度のＧＭ−ＣＳＦ（０．１ｎｇ／ｍＬ）及び様々な濃度のＥＰＯ又はＢｓＡｂで維持した。細胞をペレット化して、ペレットの色の観察及び抗ヘモグロビン抗体でプローブされたウェスタンブロットによりヘモグロビンの産生について溶解物を分析した。図５Ｂは、誘導されたＪＡＫ２及びＳｔａｔ５のリン酸化を研究するため、サイトカインを枯渇させたＴＦ−１細胞を２ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ、４ＩＵ／ｍＬ  ＥＰＯ又はＢｓＡｂを用いて３７℃で３０分間処理した。刺激されていない細胞を対照として使用した。細胞溶解物の半分を抗ＪＡＫ２抗体による免疫沈降（ＩＰ）に供し、その後、抗ホスホチロシン抗体によるウェスタンブロット分析（ＷＢ）に供した。フィルムを剥がした後、ゲルバンド中のＪＡＫ２の総量を抗ＪＡＫ２抗体により検出した。細胞溶解もう半分のウェスタンブロット分析をホスホＳｔａｔ５（Ｔｙｒ６９４）に対する抗体及びＳｔａｔ抗体を使用して行った。ＴＦ−１細胞（左）又はｗｔ  ｈＥｐｏＲにより補完された操作したＴＦ−１細胞（右）の両方に対して実験を行った。図５Ｃは、ＢｓＡｂは、ヒト幹細胞の赤血球分化を誘導した。骨髄から新たに単離されたヒトＣＤ３４＋造血幹細胞を、軟寒天に組み込まれたＢｓＡｂ又はＥｐｏと共に１４日間インキュベートした。典型的な赤いＣＦＵ−Ｅコロニーが示される。
【図６】図６は、アゴニスト抗体によるＥｐｏＲの可能性のある活性化メカニズムを示す図である。有力なアゴニスト活性は、ＥＰＯに関して、おそらくはヘテロ二量体二重特異性抗体の非対称性の結合と関連する。非対称性の結合は、Ｄ１及びＤ２外部ドメインをＪＡＫ２／Ｓｔａｔ５経路を介する最適なシグナル伝達について再配向させる。ホモ二量体抗体（Ｅ−１）は部分アゴニストに過ぎず、ペプチドアゴニストに関して、より少ない活性化とのより対照的な相互作用を示唆する（Ｌｉｖｎａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：４６４，１９９６）。ＥｐｏＲを結合するが、活性化しない抗体は、おそらく抗体の二価対合を排除する配向でＥｐｏＲリガンド非結合二量体の片方のアームにのみ結合する。
【図７】図７Ａ〜７Ｄは、ｓｖＦｖ−Ｆｖ融合タンパク質を発現するために構築されたツールキットプラスミドの構造の略図を示す図である。図７Ａは、ファージミドベクター。図７Ｂは、任意のプロモーター及び分泌シグナル配列としてＩＬ２シグナルペプチドをコードする遺伝子を含むレンチウイルスプラスミド。ｓｃＦｖをコードする遺伝子は、ＩｇＧのＦｃタンパク質をコードする遺伝子に融合される。図７Ｃは、Ｆｃに融合されたｓｃＦｖを有する哺乳動物発現プラスミド。図７Ｄは、２Ａ媒介リボソームスキッピングによりｈＥｐｏＲ及びＧＦＰを同時翻訳するレンチウイルスベクター。
【図８】図８Ａ、８Ｂは、蛍光レポーターアッセイ及び細胞増殖アッセイの両方におけるＴｐｏアゴニスト抗体の用量応答を示す図である。ＴｐｏＲ−ＩＬ６ＳＴキメラ受容体を発現するレポーター細胞を、アゴニスト抗体又はＴｐｏにより５時間、指定の濃度範囲に亘って刺激し、その後、細胞をＬｉｖｅＢＬＡｚｅｒ−ＦＲＥＴ  Ｂ／Ｇ基質と共に２時間インキュベートした。蛍光発光比率（５３０ｎｍに対する４６０ｎｍ）を指定の濃度に対してプロットした。ＨＥＫ２９３Ｔ  ＳＩＥ−ＢＬＡ細胞を陰性対照として使用した。図８Ｂは、Ｔｐｏ依存性Ｂａ／Ｆ３−ｈＭｐＬ細胞を、アゴニスト抗体又はＴｐｏで７２時間、指定の濃度範囲に亘り刺激し、ＭＴＳアッセイを使用して細胞増殖を計測した。Ｂａ／Ｆ３細胞又はＥＰＯ依存性ＴＦ−１細胞を陰性対照として使用した。ＥＣ５０を算出するため、上記データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を用いて４パラメーターロジスティックモデルに整合させた。
【図９】図９は、Ｔｐｏアゴニスト抗体により媒介されるシグナル伝達を示す図である。抗ＪＡＫ２アガロースに対する親和性を使用して細胞溶解物からＪＡＫ２を精製し、抗ホスホチロシン抗体を使用するウェスタンブロットによりそのリン酸化を検出した。アゴニスト抗体又はｒｈＴｐｏ刺激により誘導されたＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、Ａｋｔ及びＭＡＰＫのリン酸化を、細胞溶解物のダイレクトウェスタンブロッティングにより検出した。
【図１０】図１０は、Ｂａｌｂ／ＣマウスにおけるＴｐｏアゴニスト抗体３Ｄ９のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を示す図である。１５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇの濃度の抗体又はＰＢＳビヒクルを０日目に１回皮下注射し、Ｕｎｏｐｅｔｔｅを使用して２週間に亘り２日おきに血液を採取した。Ｈｅｍａｃｙｔｏｍｅｔｅｒにより血小板を数えた。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｄは、Ｇ−ＣＳＦ受容体が選択された抗体３Ｂ３により認識され、活性化されることを示す図である。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｆは、神経発生の指標である選択されたＧ−ＣＳＦＲアゴニスト抗体で２週間処理した後の被覆されていないカバーガラスに付着したＣＤ３４＋細胞の視野を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
Ｉ．概要
本発明は、部分的には、それらの表現型を制御する目的で細胞に新たな結合エネルギー景観を与えるためのコンビナトリアル抗体ライブラリを使用する方法の本発明者らによる開発が前提となる。下記実施例に詳述されるように、上記方法は、有力なアゴニストのフェノコピーの直接的な選択を可能とする、細胞内で発現される大きなコンビナトリアル抗体ライブラリを採用する。具体的には、細胞で発現される抗体を、単純な結合よりもむしろ機能（すなわち、抗体発現細胞の表現型の変更）について直接的に選択した。特異的抗体種により調節された表現型の容易な関連付けを確実にするため、各細胞が約２又は３以下の異なる抗体種を発現することを可能とする条件下で細胞に抗体ライブラリを導入し、発現させる。これは、抗体ライブラリのメンバーを本明細書において例示されるレンチウイルス系ベクターシステムを介して細胞へと導入することにより成し遂げられる。ある実施形態では、上記細胞を、低い感染多重度（ＭＯＩ）、例えば１未満で抗体をコードするウイルスにより感染させる。かかる条件のもと、各個別の細胞は、おそらく抗体ライブラリの異なるメンバーの１つのみを発現する。これらの実施形態で選択される抗体は、典型的には、ホモ二量体分子である。他のある実施形態では、例えば、本明細で例示されるヘテロ二量体二重特異性抗体を作製するために、細胞に一度導入された最初のコンビナトリアル多様性を超えた抗体ライブラリのさらなる多様性が望まれる。これは、１より多いレンチウイルスが単一の細胞に感染し得ることから、わずかに高いＭＯＩ（例えば、２又は３程度）で抗体をコードするウイルスを感染することにより達成され得る。ｓｃＦｖ抗体ライブラリの場合、細胞内の抗体分子自体の異なるＦｖドメインの再集合は、さらなる多様性を導く。
【００２３】
本発明の方法の利点は、部分的には、スクリーニングよりもむしろ選択に由来する。本明細書に開示される選抜法は、特異的抗体調節因子又はリガンド（例えば、ＥｐｏＲ抗体又はＴｐｏＲ抗体）により変更された表現型の直接的な相関を可能とする。かかる効果を結合に関するスクリーニング又は設計により達成することは困難である。また、これは、種々のプールされた抗体コード配列が機能性分析のため同じ宿主細胞へと形質移入される一部の従来のハイスループットスクリーニング法（例えば、米国特許第７，８８４，０５４号を参照されたい）と異なる。かかるスクリーニング法において陽性クローンが同定されると、観察される表現型を担う具体的な分子を同定するため抗体配列の単離及び追加試験が必要とされる。
【００２４】
また、本発明の選択方法の利点は、非常に稀な抗体（例えば、二重特異性ＥｐｏＲ抗体又は分化転換Ｇ−ＣＳＦＲ抗体）を選択する能力によっても実証される。これらの希少な抗体の幾つかは、その個体発生が、同じ細胞で発現される１対の抗体のタンパク質レベルでの組換えに依存してヘテロ二量体二重特異性抗体を作製する、有力な完全エリスロポエチンアゴニストである。抗体の単量体サブユニットの異なる結合特異性の間の絶対的な相乗作用は、真正のエリスロポエチン（Ｅｐｏ）の非対称性の結合機構を再現すると考えられる。例示されるように、本明細書で選択される二重特異ＥｐｏＲ抗体は、完全アゴニスト活性を有し、そのアゴニスト機構がＥｐｏＲとのＥＰＯの非対称性相互作用に類似する２つの異なる結合特異性を協同的に必要とすると考えられる。そのため、両方の特異性を有する抗体がＥｐｏＲには結合できるが、同じ分子において組み合わされた場合にアゴニストに過ぎないという事実は、それらの機能が、ＥｐｏＲの単純な二量体化を超えるか、又は他の部分アゴニスト、アンタゴニスト、アンタゴニスト、又はリガンド非結合二量体によりもたらされる二量体配置とは異なることを示唆する（図６）。
【００２５】
本明細書に記載される選択系は、細胞内の新たなタンパク質結合エネルギーの発現により細胞表現型の混乱の結果として無数の効果を明らかにすることができる。下記実施例で実証されるように、本発明の方法は、細胞表現型のホモ二量体単一特異性抗体アゴニスト及びヘテロ二量体二重特異性抗体調節因子の両方、並びにシグナルカスケードの同定を可能とする。ある好ましい実施形態では、抗体ライブラリの構築に採用されるウイルスは、水疱性口内炎ウイルス／レンチウイルス偽型である。これらのウイルスは、広い宿主範囲を有し、そのため、多様な細胞で使用され得る。抗体により例示される一方、本出願は、細胞集団内での発現により各々異なる結合可能性を有する他のポリペプチド各々のライブラリの直接的な表現型選択も対象とする。
【００２６】
関連する実施形態では、本発明は、選抜法が分化した標的細胞又は系統制限幹細胞のリプログラムが可能なタンパク質アゴニストを同定することを可能とし得ることを実証した。本明細書で例示されるのは、ヒト骨髄系統ＣＤ３４＋幹細胞を神経前駆体細胞へと分化転換することができるＧ−ＣＳＦＲの抗体アゴニストの選択である。具体的には、顆粒球コロニー刺激因子受容体のアゴニストである抗体を、それらの受容体細胞においてシグナル伝達経路を活性化する能力に基づいて、細胞内ライブラリから選択した。特殊化された「最近傍」アプローチにより、全抗体ライブラリ及びその標的受容体を需要体細胞集団の原形質膜へと同時に組み込む。このフォーマットは、受容体とそれらのタンパク質リガンドとの異常な相互作用を援助し、抗体が自己分泌方式でそれを産生する細胞に対して作用することを確実にする。その結果、所定の経路に沿って細胞が分化するように活性化する天然の顆粒球コロニー刺激因子と異なり、一部の単離されたアゴニスト抗体は、ヒト骨髄系統ＣＤ−３４＋骨髄細胞を神経前駆体へと分化転換することが見出された。アゴニスト抗体によるこの分化転換は、開始が非遺伝子的であることから、より一般的に使用される方法とは異なる。原形質膜で作用する抗体は、自家細胞を分化転換する物質としての治療可能性を有する場合がある。
【００２７】
本明細書で例示されるように、機能性抗体の容易な回復に役立つことから、１つの強力なフォーマットは陽性選択を利用する。しかしながら、上記フォーマットにおけるわずかな変化は、がんの治療法についての新たなターゲットを見出すのに重要となり得る細胞死等の事象の陰性選択も可能とする。これらの実施形態の幾つかでは、抗体（「産生細胞」）及び標的細胞（「指標細胞」）を産生する差次的に標識化されたフィーダー細胞の共培養の後、標的細胞が殺傷されることからフィーダー細胞のみが存在するコロニー又はプラークを選択することができる。ある実施形態では、任意の標的について予め選択されていない抗体ライブラリを、制御分子の摂動により間接的に作用する抗体アゴニストを単離するために使用することができる。例えば、これは、幹細胞の分化を制御する抗体の選択、腫瘍抑制遺伝子産物の同定、又は別の方法では利用できない治療的アゴニスト（例えば、トロンボポエチンフェノコピー）の作製に有用となり得る。本明細書で例示されるように、トロンボポエチンに対するアゴニスト抗体アゴニストの選択、形態形成表現型に基づく幹細胞分化の抗体調節因子の選択、及び自己分泌シグナル伝達に基づく顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）アゴニスト抗体の選択が挙げられる。最後に、本発明の方法は、抗体によって対処することができない場合であっても、新たな治療標的の同定に有用である場合がある。そのため、細胞内に広範囲に存在する分子が同定された場合、小分子療法の新規な標的となり得る。これは、特定の種のがんに独占的であり得る標的、又は個別の患者から単離された腫瘍であっても、がんにおいて特に重要な場合がある。
【００２８】
本明細書で例示される一部の抗体は、新規な機能又は構造特性を有する有用な免疫化学試薬（例えば、ＥｐｏＲ二重特異性抗体又は分化転換Ｇ−ＣＳＦＲ抗体）である。例えば、本発明の選択方法は、天然のサイトカイン受容体シグナル伝達経路で使用される複雑な非対称性の結合機構を再現する、有力な二重特異性ヘテロ二量体Ｅｐｏアゴニスト抗体を同定するのに十分強力であった。
【００２９】
ＩＩ．定義
別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び学術用語は、本発明が属する技術の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。以下の参考文献：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｒｒｉｓ（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１ｓｔ  ｅｄ．，１９９２）；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（ｒｅｖｉｓｅｄ  ｅｄ．，２０００）；Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉｃ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋｕｍａｒ（Ｅｄ．），Ａｎｍｏｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（３ｒｄ  ｅｄ，２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｈｕｎｔ（Ｅｄ．），Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ（１ｓｔ  ｅｄ，１９９９）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｈｌｅｒ  （Ｅｄ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｔｅｌｏｓ（１９９４）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋｕｍａｒ  ａｎｄ  Ａｎａｎｄａｎｄ（Ｅｄｓ．），Ａｎｍｏｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）；ａｎｄ  Ａ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐａｐｅｒｂａｃｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ），Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｈｉｎｅ（Ｅｄｓ．），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（４ｔｈ  ｅｄ，２０００）が、本発明において使用される用語の多くの一般的な定義と共に当業者に提供される。さらに、本発明の実施において読者を補助するため以下の定義が提供される。
【００３０】
「抗体」、又は「抗原結合フラグメント」の用語は、所与の抗原、エピトープ又はエピトープ（複数）に対する強力な一価、二価又は多価の結合を呈するポリペプチド鎖（複数の場合がある）を指す。別段の注釈がない限り、本明細書で使用される抗体又は抗原結合フラグメントは、任意の脊椎動物、ラクダ科、鳥類又は魚類の種に由来する配列を有し得る。上記抗体又は抗原結合フラグメントは、任意の好適な技術、例えば、ハイブリドーマ技術、リボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、遺伝子シャフリングライブラリ、半合成又は全合成ライブラリ又はそれらの組合せを使用して作製され得る。別段の注釈がない限り、本発明で使用される「抗体」の用語は、インタクト抗体、抗原結合ポリペプチドフラグメント及び以下に記載され当該技術分野でよく知られている（例えば、Ｓｅｒａｆｉｎｉ，Ｊ  Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３４：５３３−６，１９９３を参照されたい）他のデザイナー抗体を包含する。
【００３１】
インタクト「抗体」は、典型的には、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重鎖（Ｈ）（約５０ｋＤ〜７０ｋＤ）及び２つの軽鎖（Ｌ）（約２５ｋＤ）を含む。認識された抗体鎖をコードする免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、及びミュー定常領域遺伝子、並びに、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を包含する。軽鎖は、カッパ又はラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロンに分類され、同様に、それぞれ免疫グロブリンのクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥと定義される。
【００３２】
抗体の各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞及び古典的な補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を包含する、免疫グロブリンの宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００３３】
抗体のＶＨ及びＶＬ領域は、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲｓ）と共に散在する、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）とも呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化され得る。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲｓ及び４つのＦＲｓで構成され、以下の順にアミノ末端からカルボキシル末端へと配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。ＣＤＲ領域及びＦＲ領域の位置、並びにナンバリングシステムは、例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ（１９８７及び１９９１）により規定されている。
【００３４】
また、本発明で使用される抗体は、抗体フラグメント、又は同種の抗原に結合する能力を保持するインタクト抗体の抗原結合部分含有する抗原結合フラグメントを包含する。かかる抗体フラグメントの例として、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨＩドメインからなる一価フラグメントであるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントである、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）インタクト抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）構造上保存されたフレームワーク領域の間に操作された鎖間ジスルフィド結合を有する、ジスルフィド安定化Ｆｖｓ（ｄｓＦｖｓ）、（ｖｉ）ＶＨドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）（例えば、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６，１９８９を参照されたい）、並びに（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。
【００３５】
また、本発明を実施するのに適した抗体は、単鎖抗体を包含する。「単鎖抗体」の用語は、一般的にスペーサーペプチドを介して連結され、アミノ及び／カルボキシル末端に追加のドメイン又はアミノ酸配列を含む場合があるポリペプチド結合においてＶＨドメイン及びＶＬドメインを含むポリペプチドを指す。例えば、単鎖抗体は、コードするポリヌクレオチドへの連結のためのテザーセグメントを含む場合がある。例として、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）は、単鎖抗体である。別々の遺伝子によりコードされるＦｖフラグメントのＶＬ及びＶＨドメインと比較して、ｓｃＦｖは、合成リンカーによって（例えば、組換え法により）結合された２つのドメインを有する。これにより、ＶＬ及びＶＨ領域が対になって一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖とすることができる。
【００３６】
本発明の実施に使用され得る抗体は、ラクダ科のスキャフォルドを有する単一ドメイン抗原結合単位も包含する。ラクダ科の動物として、ラクダ、ラマ及びアルパカが挙げられる。ラクダ科動物は、軽鎖を欠く機能性抗体を産生する。重鎖可変（ＶＨ）ドメインは、自律的に折りたたまれ、独立して抗原結合単位として機能する。その結合表面は、古典的な抗原結合分子（Ｆａｂｓ）又は単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の６つのＣＤＲｓと比べて、たった３つのＣＤＲｓを含む。ラクダ科の抗体は、従来の抗体の結合親和性に匹敵する結合親和性を獲得することができる。
【００３７】
本明細書に記載される様々な抗体又は抗原結合フラグメントは、インタクトな抗体の酵素的又は化学的な修飾により産生されるか、又は組換えＤＮＡ方法論を使用して新たに合成されるか、又はファージディスプレイライブラリを使用して同定され得る。これらの抗体又は抗原結合分子を作製する方法は、全て当該技術分野でよく知られている。例えば、単鎖抗体はファージディスプレイライブラリ又はリボソームディスプレイライブラリ、遺伝子シャフリングライブラリ（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４，１９９０；及び米国特許第４，９４６，７７８号を参照されたい）を使用して同定され得る。具体的には、ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，１９８８；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３，１９８８に記載される方法を使用して得られる。Ｆｖ抗体フラグメントは、Ｓｋｅｒｒａ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−４１，１９８８に記載され用に作製され得る。ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖｓ）は、例えば、Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６７：１１３−２３，１９９６に記載される方法を使用して得られる。同様に、単一ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）は、例えば、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６，１９８９；ａｎｄ  Ｃａｉ  ａｎｄ  Ｇａｒｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：６２８０−８５，１９９６に記載される様々な方法により産生され得る。ラクダ科の単一ドメイン抗体は、例えば、Ｄｕｍｏｕｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１１：５００−５１５，２００２；Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４１４：５２１−５２６，１９９７；及びＢｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３３２：６４３−５５，２００３の当該技術分野でよく知られている方法を使用して産生され得る。抗原結合フラグメントの他のタイプ（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｄフラグメント）もまた、通例実施される免疫学の方法により容易に産生され得る。例えば、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８を参照されたい。
【００３８】
細胞内抗体は、細胞内タンパク質に結合するため細胞内ではたらく抗体である。細胞外環境から細胞内へと抗体を運ぶための確実な機構がないことから、これは、典型的には、標的細胞内での抗体の発現を必要とする。通常、抗体は細胞から分泌されるように設計されることから、細胞内抗体は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）の使用、超安定性のための免疫グロブリンＶＬドメインの修飾、より還元された細胞内環境に対する抗体抵抗性の選択、又はマルトース結合タンパク質若しくは他の安定な細胞内タンパク質との融合タンパク質としての発現を包含する、特殊な変更を必要とする。
【００３９】
結合親和性は、一般的には、会合平衡又は解離定数（それぞれＫａ又はＫｄ）の用語で表され、同じく解離及び会合の速度定数（それぞれｋｄ及びｋａ）の逆比である。よって、同等の親和性は、速度定数の比が同じままである限り異なる速度定数に対応する場合がある。
【００４０】
「接触させる」の用語は、その通常の意味を有し、２以上の物質（例えば、ポリペプチド又はファージ）を複合すること、物質と細胞を複合すること、又は２つの異なる細胞の集団を複合することを指す。接触は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、例えば、２つのポリペプチドを混合すること、又は抗体集団と細胞集団を試験管若しくは培地中で混合することで生じ得る。また、接触は、細胞で、すなわちｉｎ  ｓｉｔｕで、例えば、２つのポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドの細胞における共発現により細胞内で２つのポリペプチドを接触すること、又は細胞溶解物中で生じ得る。
【００４１】
「融合」タンパク質又はポリペプチドは、少なくとも２つのポリペプチドで構成されるポリペプチド、及び連結配列又は２つのポリペプチドを１つの連続するポリペプチドに制御可能に連結するための連結を指す。融合ポリペプチドで連結された２つのポリペプチドは、典型的には、２つの独立した起源に由来し、そのため、融合ポリペプチドは、天然では通常連結して見出されない２つの連結されたポリペプチドを含む。
【００４２】
「異種性」は、２つのポリペプチドを参照して使用される場合、その２つが、天然に同じ細胞又は微生物において見出されないことを示す。対立遺伝子変異又は天然に生じる突然変異事象は、本明細書に定義される異種性の生体分子又は配列をもたらさない。ベクターコンストラクトの「異種性」領域は、天然でより大きな分子に関して見出されないより大きなポリヌクレオチド分子内の同定可能なポリヌクレオチドセグメントである。そのため、異種性領域が哺乳動物遺伝子をコードする場合、その遺伝子は、通常、起源生物のゲノム中の哺乳動物ゲノムポリヌクレオチドに隣接しないポリヌクレオチドと隣接する。
【００４３】
「リガンド」は、特定の抗原、受容体又は標的分子に認識される分子である。本発明の実施に採用され得るリガンドの例として、これらに限定されないが、細胞膜受容体のアゴニスト及びアンタゴニスト、毒物又は毒、ウイルスエピトープ、ホルモン、ホルモン受容体、ポリペプチド、ペプチド、酵素、酵素基質、コファクター、薬物（例えば、オピエート、ステロイド等）、レクチン、糖、ポリヌクレオチド、核酸、オリゴ糖、タンパク質、及びモノクローナル抗体が挙げられる。
【００４４】
「連結」は、組換え融合、共有結合、ジスルフィド結合、イオン結合、水素結合、及び静電結合を含むがこれらに限定されない、２つの生体分子（例えば、ポリペプチド又は２つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）の制御可能な又は機能的な接続の意味を指す。「融合」は、共有結合による連結を指す。「リンカー」又は「スペーサー」は、２つの生体分子を接続して、最小の立体障害で好ましい配置で２つの分子を配置するためにはたらく分子又は分子群を指す。
【００４５】
感染の多重度、すなわちＭＯＩは、感染標的（例えば、細胞）に対する感染性物質（例えば、ファージ又はウイルス）の比率を指す。例えば、感染性ウイルス粒子が接種された細胞群を指す場合、感染の多重度、すなわちＭＯＩは、規定の空間に存在する標的細胞の数に対する感染性ウイルス粒子の数の比率である。
【００４６】
核酸に対して参照する場合、「制御可能に連結された」の用語は、機能的な関係におけるポリヌクレオチド要素の連結を指す。別の核酸配列と共に機能的な関係へと置かれる場合、核酸は「制御可能に連結」される。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、コードする配列の転写に影響を与える場合、コーディング配列に制御可能に連結される。制御可能に連結されるとは、連結されるＤＮＡ配列が、典型的には隣接しており、必要に応じて、２つのタンパク質をコードする領域を結合するため、隣接し、且つリーディングフレーム中にあることを意味する。
【００４７】
本明細書で使用されるように、表現型選択又は変更された表現型の選択は、産生細胞（真各細胞型の細胞集団）内で発現された候補抗体のライブラリを、指標細胞において特異的な表現型における変化をもたらす能力について調査する工程を指す。指標細胞は、抗体を産生する同じ細胞（産生細胞）であってもよく、異なる細胞であってもよい。変更される指標細胞の特異的表現型は、抗体の標的分子への特異的結合以外の任意の活性又は細胞プロセスであってもよい。抗体ライブラリ（又は抗体を発現する産生細胞）と指標細胞の同種性集団との接触により、目的の表現型に変更をもたらすそれらの抗体を、その後、指標細胞の表現型調節因子として同定する。
【００４８】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」の用語は、プリン及びピリミジン塩基、又は他の天然の、化学的若しくは生化学的に修飾された、非天然の若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むリボヌクレオチド又はデオキシリボポリヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドの多量体型を指す。本発明の実施形態のポリヌクレオチドとして、デオキシリボポリヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボポリヌクレオチド（ＲＮＡ）、又は天然起源から単離されてもよく、組換え的に産生されてもよく、又は人工的に合成されてもよいリボポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）のＤＮＡコピーが挙げられる。本発明の実施形態のポリヌクレオチドのさらなる例は、ポリアミドポリヌクレオチド（ＰＮＡ）であってもよい。ポリヌクレオチド及び核酸は、１本鎖又は２本鎖として存在し得る。ポリヌクレオチドの骨格は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡに典型的に見出されることがある糖及びリン酸基、又は修飾若しくは置換された糖若しくはリン酸基を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログ等の修飾ヌクレオチドを含む場合がある。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断される場合がある。核酸、ポリヌクレオチド及びポリヌクレオチド等のヌクレオチドでできたポリマーもまた、本明細書では「ヌクレオチドポリマーと呼ばれる場合がある。
【００４９】
ポリペプチドは、アミノ結合（ペプチド結合）により共に結合されたアミノ酸残基モノマーで構成されるポリマー鎖である。アミノ酸は、Ｌ−光学異性体であってもよく、Ｄ−光学異性体であってもよい。一般に、ポリペプチドは、例えば、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、それ以上のアミノ酸残基モノマーからなるアミノ酸残基の長いポリマーを指す。しかしながら、別段の注釈がない限り、本明細書で使用されるポリペプチドの用語は、典型的には、２つ以上のアミノ酸モノマーを含有する短いペプチドを包含するが、通常は、１０、１５、２０以下のアミノ酸モノマーである。
【００５０】
タンパク質は、ペプチド結合を介して連結されたアミノ酸の長いポリマーであり、２以上のポリペプチド鎖により構成され得る。より具体的には、「タンパク質」の用語は、特異的な順序、例えば、そのタンパク質をコードする遺伝子におけるヌクレオチドの塩基配列により特定される順序のアミノ酸の１又は複数の鎖で構成される分子を指す。タンパク質は、身体の細胞、組織及び器官の構造、機能、及び制御に必須であり、各タンパク質は特有の機能を有する。例として、ホルモン、酵素、及び抗体が挙げられる。ある実施形態では、ポリペプチド及びタンパク質の用語は、同様の意味で使用され得る。
【００５１】
別段の注釈がない限り、「受容体」の用語は、所与のリガンドに対して親和性を有する分子を広く指す。受容体は、天然起源でもよく、人工的に作られた分子であってもよい。また、受容体は、それらの変更されていない状態又は他の種との凝集体として採用されてもよい。受容体は、直接的に又は特異的な結合物質を介して共有結合又は非共有結合により、結合メンバーに付着され得る。本発明の実施に使用され得る受容体の典型的な例は、細胞表面シグナル伝達受容体である。
【００５２】
「被験体」の用語は、ヒト及び非ヒト動物（特に、非ヒト哺乳動物）を指す。ヒトに加えて、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル等の他の非ヒト動物も包含する。
【００５３】
系統リプログラムとしても知られる分化転換は、１つの成熟体細胞又は系統制限幹細胞が、中間の多能性状態又は前駆体細胞型を経ずに別の成熟体細胞へと転換する過程である。これは化生の一種であり、幹細胞の相互変換を包含する全ての細胞運命の転換を包含する。分化転換の現在の用途として、疾患モデリング及び創薬が挙げられ、将来的には遺伝子治療及び再生医療を包含する可能性がある。「分化転換」の用語は、本来はＳｅｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｋａｆａｔｏｓ（Ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ３：８１−９４，１９７４）によって、変態を経るカイコガにおいて表皮産生細胞が塩分泌細胞になるという細胞特性における変化を説明するために作り出された。
【００５４】
「標的」、「標的分子」又は「標的細胞」の用語は、分析される又は検出される目的の分子又は生体細胞、例えば、サイトカイン若しくはホルモン等のリガンド、ポリペプチド、細胞受容体又は細胞を指す。
【００５５】
細胞は、外因性又は異種性のポリヌクレオチドが細胞内に導入された場合、かかるポリヌクレオチドにより「形質転換」される。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノム中に組み込まれてもよく（共有結合）、組み込まれなくてもよい。例えば、真核生物、酵母、及び哺乳動物細胞では、形質転換ポリヌクレオチドは、プラスミド等のエピソーム要素上に維持され得る。真核生物細胞に関して、安定に形質転換された細胞は、染色体の複製を通じて娘細胞により受け継がれるように、染色体へと形質転換ポリヌクレオチドが組み込まれた細胞である。この安定性は、真核生物細胞の細胞株、又は形質転換ポリヌクレオチドを含有する娘細胞集団で構成されるクローンを樹立する能力により実証される。「クローン」は、単一の細胞又は有糸分裂により共通する祖先に由来する細胞集団である。「細胞株」は、多くの世代に亘ってｉｎ  ｖｉｔｒｏで安定的に成長することが可能な初代細胞のクローンである。
【００５６】
腫瘍抑制遺伝子、すなわち抗がん遺伝子は、がんになる１つのステップから細胞を保護する遺伝子である。この遺伝子が突然変異されて、その機能を喪失又は低下すると、細胞は、通常他の遺伝的変化と組み合わされて、がんへと進行する。腫瘍抑制遺伝子の例として、ｐ５３遺伝子及びｐ２７Ｋｉｐｌ細胞周期阻害遺伝子が挙げられる。
【００５７】
「ベクター」は、付着したセグメントの複製を起こすように別のポリヌクレオチドセグメントが付着され得る、プラスミド、ファージ又はコスミド等のレプリコンである。１又は複数のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を制御することが可能なベクターは、「発現ベクター」と呼ばれる。
【００５８】
ＩＩＩ．真核生物細胞内でのコンビナトリアルライブラリの発現
本発明は、真核生物細胞において機能的抗体を直接に選択することを可能とする新規な方法を提供する。上記方法は、感染により、真核生物宿主細胞内で抗体の効率的な発現を導くコンビナトリアル抗体ライブラリ（例えば、レンチウイルスベクターを介する）の構築に依存する。上記細胞内で発現された抗体は、細胞から分泌されて細胞内に細胞内抗体として残留する。その結果、抗体による細胞内及び細胞外標的の両方の調節を利用できる。典型的には、観察される表現型の変更と特異的抗体分子又は抗体コード配列を直接的に相関させるため、抗体ライブラリを、各細胞が約２又は３以下の異なる抗体又は抗体コード配列（例えば、ｓｃＦｖ配列）を発現する条件下で細胞へと導入して発現させる。ある実施形態では、組換えにより産生された細胞の異種性集団の各個別の細胞は、抗体ライブラリの１つ以下の異なるメンバーを発現する。本明細書に例示されるレンチウイルス又はレトロウイルスのベクター系を用いて、産生細胞又は指標細胞に抗体発現ウイルスを比較的低い感染重合度（ＭＯＩ）、例えば、２又は３以下で感染させることによりこれが成し遂げられ得る。ホモ二量体抗体のみの選択のため、ウイルスによる細胞の感染は、より低いＭＯＩ、例えば、約１未満で行われてもよい。二重特異性ヘテロ二量体抗体調節因子の選択を可能とするため、抗体発現配列を、より高いＭＯＩ、例えば、約２又は３で細胞へと形質導入してもよい。これらの条件のもと、表現型アッセイにおける陽性クローンから単離された抗体をわずかに試験するだけ、又はさらなる試験をせずに、観察される表現型の変更から直接的に抗体調節因子を同定することができる。
【００５９】
本明細書に記載される方法は、真核生物細胞の様々な表現型を調節する抗体を選択するのに使用され得る。ある実施形態では、同定された抗体調節因子は、宿主真核生物細胞（例えば、エリスロポエチン）の表現型を調節するか、その細胞応答を実現する標的分子のフェノコピーである。典型的には、表現型は、それに対して抗体調節因子が本発明の方法において選択される標的分子（例えば、受容体又はシグナル伝達リガンド）により直接的又は間接的に媒介される。候補抗体は、標的分子（例えば、Ｅｐｏ又はＥｐｏＲ）を刺激する調節因子について選択され得る。また、候補抗体は、標的分子（例えば、ＴＮＦα又はがん遺伝子産物）を拮抗するか、又は標的分子（例えば、ＩＬ−１又はＩＬ−１β）の阻害剤（例えば、ＩＬ−１受容体アンタゴニストＩＬ−１Ｒα）を拮抗する調節因子について選択され得る。
【００６０】
ある実施形態では、コンビナトリアルライブラリは、同じ細胞型（「指標細胞」）のフェノタイプの抗体調節因子を選択するため、細胞集団内で発現される。これらの実施形態では、抗体は、細胞から分泌されるか、又は細胞内抗体として細胞内に留まるかのいずれでもよい。他のある実施形態では、抗体は、指標細胞の表現型の調節因子の選択のため、第２細胞型（「産生細胞」）の細胞集団において発現され、これから分泌される。これらの実施形態では、指標細胞は、典型的には、分泌された抗体と指標細胞との相互作用を可能とするため、好適な条件下で抗体発現産生細胞と共培養される。
【００６１】
抗体ライブラリは、インタクト完全長抗体又はインタクト抗体の抗原結合部分を含有する抗原結合フラグメント（すなわち、同種抗原に結合する能力を保持する抗体フラグメント）を発現することができる。抗体ライブラリによって産生された抗体は、単鎖であっても二重鎖であってもよい。ある実施形態では、単鎖抗体ライブラリは、真核生物細胞内で発現される。単鎖抗体ライブラリは、抗体の重鎖若しくは軽鎖を単独で含んでもよく、その可変ドメインを含んでもよい。より典型的には、単鎖抗体ライブラリのメンバーは、単一の連続したタンパク質内の好適なスペーサーによる重鎖と軽鎖の可変ドメインの融合によって作製される。例えば、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、国際特許公開第８８／０６６３０号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．、国際特許公開第９２／０１０４７号を参照されたい。他の実施形態では、二重鎖抗体は、別々に発現された重鎖及び軽鎖、又はそれらの結合フラグメントの非共有結合的な会合によって産生細胞内に形成され得る。抗体ライブラリの多様性は、免疫された又は免疫されていないＢ細胞の非クローン集団等の天然起源から抗体コード配列を得ることに起因する。代替的には、又は追加的には、標的分子に対する抗体の人工的な突然変異誘発により多様性を導入することができる。典型的には、本発明に採用された抗体ライブラリは、少なくとも１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０又はそれより多い異なるメンバー又は種を含有する。
【００６２】
本発明の選択方法の実施では、必要に応じて抗体の様々な既知のライブラリを利用し、修飾することができる。抗体ライブラリは、ナイーブ抗体ライブラリからの関連しない抗体を含むことができる。例えば、ナイーブ抗体のライブラリ（例えば、ヒト脾臓細胞に由来するｓｃＦｖライブラリ）は、Ｆｅｌｄｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：１６３−１７０，２００３；に記載されるように調製され、またＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３４６：８９６−９０３，２００６．Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．６８：１０９−１５，２００５）も単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）フォーマットの大きな免疫されていない人ファージ抗体ライブラリを記載する。具体的な疾患を伴う被験体に由来する抗体ライブラリは、Ｋａｕｓｍａｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８５：３４９３−５００，２００４）に記載される方法を使用し、被験体の末梢血リンパ球から抽出されたＲＮＡより調製され得る。代替的には、抗体ライブラリは、合成抗体又は例えば、ＤＮＡシャフリング又は突然変異誘発による、特異的抗体に由来する抗体を含んでもよい。例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（ＥＭＢＯ  Ｊ  １３：３２４５−３２６０，１９９４）は、大きな合成レパートリーから作製されたヒト抗体のライブラリ（ｌｏｘライブラリ）を記載する。本発明のある実施形態は、特異的なスキャフォルド抗体に由来する抗体のライブラリを採用することができる。かかる抗体ライブラリは、本明細書に記載される方法を使用するか、そうでなければ当該技術分野でよく知られている方法を使用して参照抗体の組換え操作により産生され得る。例えば、Ｐｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５７：６０７−２０，２００６）は、既知のハプテン特異的ｓｃＦｖに基づく改善されたハプテン認識に焦点を合わせた抗体ライブラリの構築を記載する。
【００６３】
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、抗体ライブラリは、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）等の単鎖抗体を発現する。本発明に適した具体的なｓｃＦｖライブラリは、下記実施例に記載され、また当該技術分野において、例えばＧａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：１２６１２−６，２００２に記載される。かかる抗体ライブラリは、当該技術分野でよく知られている様々なベクターにより作製されてもよく、それから発現されてもよい。本発明で使用される抗体ライブラリは、レンチウイルス系又はレトロウイルス系のベクターにより構築されることが好ましい。真核生物細胞内での発現のためのかかる抗体ライブラリの構築は、本明細書に例示される技術に従って行われてもよく、当該技術分野でよく知られている他の方法により行われてもよい。ある実施形態では、抗体ライブラリは、レンチウイルスベクターにより構築される。レンチウイルスベクターは、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に形質導入又は感染することができるレトロウイルスベクターであり、典型的には高いウイルス力価をもたらす。本発明に適したレンチウイルス系ベクターの例として、例えば、本明細書に例示されるレンチウイルスベクターｐＬＶ２が挙げられる。例えば、下記実施例に詳述されるように、レンチウイルス系コンビナトリアルｓｃＦｖ抗体ライブラリは、Ｓｆｉｌで消化されたｓｃＦｖをコードする遺伝子をＳｆｉｌで消化されたｐＬＶ２ベクターにクローニングすることにより作製されて、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（ヒンジからＣＨ３）として同じフレーム中でｓｃＦｖを発現することができる。本発明の実施に採用され、修飾され得る他のレンチウイルスベクターとして、例えば、ｐＬＶＸ−Ｐｕｒｏ、ｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−Ｎｅｏ、ｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−Ｈｙｇ、及びｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏが挙げられる。クローニングされた抗体配列を含む様々なレンチウイルスベクターを抗体ライブラリの発現のため、適切な宿主細胞へと導入することができる。例えば、本明細書に例示されるＴＦ−１細胞株及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞株、並びに当該技術分野でよく知られている他のパッケージング細胞株（例えば、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞株）を、本発明において抗体ライブラリの発現のため採用してもよい。レンチウイルス系ベクター及び宿主細胞に加えて、他のレトロウイルス系ベクター及び発現系もまた、本発明の方法の実施において採用され得る。これらは、ＭＭＬＶ系ベクターｐＱＣＸＩＮ、ｐＱＣＸＩＱ及びｐＱＣＸＩＨ、並びにＨＥＫ２９３系パッケージング細胞株ＧＰ２−２９３、ＥｃｏＰａｃｋ  ２−２９３及びＡｍｐｈｏＰａｃｋ  ２９３等の適合性の産生細胞株、並びにＮＩＨ／３Ｔ３系パッケージング細胞株ＲｅｔｒｏＰａｃｋ  ＰＴ６７を包含する。
【００６４】
上述の通り、宿主細胞又は産生細胞から産生された抗体は、細胞内に含有される（すなわち、細胞内抗体として）か、又は細胞から分泌されるかのいずれかである。ある実施形態では、抗体産生細胞は、その表現型の抗体調節因子を得るために研究されるのと同じ細胞である。これらの実施形態では、調節される特異的な表現型に依存して、抗体は、細胞から分泌されるか、又は細胞内に細胞内抗体として存在するかのいずれかである。通常、抗体は産生細胞から分泌されるように設計されることから、細胞内抗体は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）の使用、超安定性のための免疫グロブリンＶＬドメインの修飾、より還元性の細胞な環境に対する抗体耐性の選択、又はマルトース結合タンパク質若しくは他の安定な細胞内タンパク質との融合タンパク質としての発現を含む、特殊な変更を必要とする。かかる最適化は、細胞内抗体の安定性及び構造を改善し得る。細胞内抗体を発現するライブラリは、細胞内標的分子により細胞表現型の調節因子の選択に使用され得る。例えば、細胞内抗体のコンビナトリアルライブラリを使用して、健康細胞な又は疾患細胞における細胞内経路の調節因子を選択することができる。かかる抗体調節因子の同定は、同様に、それに対してより小さな、細胞に侵入可能な化合物（例えば、ｓｉＲＮＡ又は小さな有機物質）が設計又はスクリーニングされ得る、新規な薬物標的の発見を導く可能性がある。
【００６５】
ある実施形態では、細胞外又は細胞表面に存在する（例えば、細胞表面受容体又はインテグリン）標的分子の調節因子について抗体を選択できるように、発現された抗体をスクリーニングするために抗体ライブラリを構築する。これらの実施形態では、抗体を発現する指標細胞（又は、本明細書に記載される共培養選択フォーマットのため指標細胞と抗体発現細胞の両方）を、拡散制限マトリクス、例えば、メチルセルロース又はアガロースにおいて成長させ、維持することが好ましい。拡散制限培養培地は、細胞の周囲に分泌された抗体を捕捉して、選択工程の間、抗体と指標細胞との物理的な相互作用を確実にする。
【００６６】
ある実施形態では、抗体ライブラリは、第２細胞型（「産生細胞」）の細胞集団において発現される。上述の通り、観察される表現型と特異的抗体分子との直接的な相関を可能とするため、抗体ライブラリは、典型的には、各細胞が約２又は３以下の異なる抗体種を発現する条件下で産生細胞内へと導入される。ある実施形態では、各細胞は、抗体ライブラリの１つの異なるメンバーのみを発現する。第２細胞型は指標細胞の細胞型と同一又は異なってもよいが、産生細胞及び指標細胞は典型的には異なる細胞型又は系統である。これらの実施形態では、第２細胞（抗体産生細胞）は、典型的には、例えば、メチルセルロースアガー等の拡散制限培地中で２つの細胞型を共培養することにより、指標細胞の近辺に存在する。例えば、指標細胞は、それに対して成長阻害又はアポトーシス刺激抗体制御因子が選択される腫瘍細胞（又は他の疾患細胞）であってもよい。そのため、かかる共培養選択フォーマットの一部では、第２細胞において発現される抗体及びそれから分泌される抗体は、指標細胞を殺傷するか、その成長を阻害する（遅延又は停止する）調節因子について選択される。本発明のある実施形態は、様々な腫瘍における標的分子に対する機能的抗体を同定することを対象とする。例えば、候補抗体は、結腸がんにおけるＥＧＦ受容体を標的とするか、又は幾つかのタイプのがん（例えば、大腸がん、肺がん及び転移性乳がん）におけるＶＥＧＦを標的とする治療的抗体について選択され得る。ある実施形態では、候補抗体は、腫瘍細胞の運動性の阻害、接着及び転移可能性についてＨＥＲ１／ＥＧＦＲを標的とする治療的アンタゴニスト抗体について選択され得る。他の実施形態では、抗体は、乳がんに関係があるとされるＨＥＲ２及びＨＥＲ３を標的とする物質について選択され得る。さらに他の実施形態では、産生細胞内に発現された抗体ライブラリは、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２又は様々な腫瘍細胞における選択的アポトーシスを誘導する他の細胞死受容体を標的とするアゴニスト抗体を選択するために採用され得る。
【００６７】
本明細書に開示されるように、本発明の選択方法は、一般に、同定される抗体の標的分子が予め知られていることを必要としない。それにもかかわらず、本発明のある実施形態は、具体的な既知の標的分子により媒介される表現型の調節因子を同定することを対象とする。標的分子は、指標細胞の内因性又は異種性の分子であってもよい。例えば、表現型は、細胞内又は表面に位置する受容体（例えば、ＥｐｏＲ又はＩＬ−１Ｒ）により媒介されるシグナル伝達活性、又は対応する受容体のリガンドであってもよい。例えば、本発明の選択方法は、様々な分泌サイトカイン又はホルモンの抗体調節因子を同定するのに適している。例として、Ｅｐｏ、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、ＩＬ−１β、ＴＮＦα及びグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）が挙げられる。これらの分子により媒介される表現型の調節因子は、典型的には、標的分子のアゴニスト又はアンタゴニスト（例えば、受容体又はリガンド）、並びに標的分子の阻害剤の調節因子（例えば、中和抗体）を包含する。例えば、抗体ライブラリは、本明細書に例示されるように、ＥｐｏＲ又はＩＬ−１Ｒのアゴニストについて選択され得る。また、候補抗体は、標的分子（例えば、ＩＬ−１Ｒ）の阻害剤（例えば、ＩＬ−１Ｒα）のアンタゴニストについて選択され得る。他の実施形態では、候補抗体は、望ましくない細胞応答（例えば、望ましくない炎症反応又はアポトーシス）を媒介するシグナル伝達リガンド（例えば、ＴＮＦα）を中和するアンタゴニストについて選択され得る。他の実施形態では、候補抗体は、腫瘍抑制遺伝子産物（例えば、ｐ５３）に対するアゴニスト抗体、又はがん遺伝産物に対するアンタゴニスト抗体について選択され得る。例えば、ｅｒｂＢ２がん遺伝子は、成長因子受容体をコードする。これらの実施形態では、候補抗体は、受容体のアンタゴニストについて選択される。
【００６８】
調節される表現型が既知の標的分子によって媒介される場合、本発明の選択方法で使用されるコンビナトリアル抗体ライブラリは、具体的な標的分子に対して生じた抗体を含んでもよい。様々な標的分子が本発明の実施における使用に適している。それらは、タンパク質、炭水化物、脂質又は核酸等の任意の生体分子であってもよい。標的分子は、細胞（「非細胞表面に発現された」）又はウイルス等の他の粒子（「粒子表面に発現された」）と会合し得る。標的分子は細胞内であってもよく、細胞外であってもよい。好適な標的分子として、例えば、サイトカイン又は成長ホルモン及びそれらの細胞受容体、ウイルスタンパク質及び宿主受容体、ビタミン受容体、細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ４１）、並びに細胞酵素及びそれらの基質が挙げられる。ある実施形態では、選択方法は、サイトカイン及びケモカイン、例えば、インターロイキン（ＩＬ−１からＩＬ−１８）、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β及びγ、形質転換成長因子アルファ及びベータ（ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子及び顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）等の目的の分泌タンパク質の調節因子を同定することを対象とする。これらの既知の標的分子のいずれかに対する抗体ライブラリの調製及びその真核生物宿主細胞内での発現は、当該技術分野でよく知られているか、又は本明細書に具体的に例示される標準的な技術に従って実施され得る。
【００６９】
指標細胞の表現型の抗体調節因子が機能選択（表現型選択）により同定されるのに対し、候補抗体は、機能選択に先立って結合活性について最初にスクリーニングされてもよい。そのため、それに対して抗体調節因子が選択される標的分子が既知である場合、本発明の方法は、標的分子の認識のためのメンバー及びそれに対する所望の親和性を高めるため、コンビナトリアル抗体ライブラリをスクリーニングする追加工程を包含してもよい。標的分子に対するバインダーについて抗体をスクリーニングすることは、当該技術分野でよく知られている多くの方法により行われ得る。例えば、コンビナトリアル抗体ライブラリは、標的ポリペプチドに対する結合親和性に関して選択するため、ファージディスプレイにより発現され得る。ファージ系は、抗体フラグメント（ｓｃＦｖ又はＦａｂ’）、ホルモン、酵素、及び酵素阻害剤等の機能性タンパク質のディスプレイ、並びに機能的な相互作用に基づく特異的ファージの選択（抗体−抗原、ホルモン−ホルモン受容体、酵素−酵素阻害剤）に採用され、成功してきた。例えば、Ｐａｓｃｈｋｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７０：２−１１，２００６；ａｎｄ  Ｋｅｈｏｅ  ａｎｄ  Ｋａｙ，Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．１０５：４０５６−７２，２００５を参照されたい。ファージディスプレイにより標的分子（例えば、Ｅｐｏ）に対するバインダーについてコンビナトリアルｓｃＦｖ抗体ライブラリをスクリーニングする詳細な手順が本明細書に例示される。ファージディスプレイプラットフォームを使用するより一般的なガイダンスは、従来技術において提供される。例えば、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）を参照されたい。
【００７０】
ＩＶ．抗体調節因子の表現型選択
本発明は、真核生物細胞、特に哺乳動物細胞において目的の表現基の抗体調節因子（アゴニスト又はアンタゴニスト）を同定する方法を提供する。上記選択方法は、任意の細胞応答、細胞（指標細胞）の物理的活性又は生物学的特性を包含する、細胞における目的の様々な表現型の抗体調節因子を同定することに適用され得る。例えば、調節される表現型は、シグナル伝達カスケードに関連する過程又は活性の開始又は変更、特的遺伝子（例えば、後述される分化指標マーカー遺伝子）の発現の誘導又は減少、疾患状態又は病状の変化、形態学的変更又は細胞の他の物理的属性（例えば、馴化培地におけるコロニー形成）、及び細胞分化又は増殖に関連する活性の変更であってもよい。本明細書で例示されるように、候補抗体によって調節される指標細胞の表現型もまた、成長の変更（成長の停止又は遅延）、アポトーシス、又は特定の処理若しくは阻害の生存であってもよい。しかしながら、本発明の選択方法において候補抗体によって調節される表現型は、抗体と任意の標的分子若しくは抗原との特異的結合又は物理的相互作用を包含しないことに留意するのが重要である。
【００７１】
目的の細胞（「指標細胞」又は「標的細胞」）の抗体調節因子を選択するため、候補抗体のライブラリを、同じ指標細胞系統の細胞集団内で発現することができる。代替的には、上記抗体を、指標細胞と接触する前に第２細胞型（「産生細胞」）の細胞集団内で発現することができる。後者の場合、抗体発現産生細胞及びその表現型が調査される指標細胞は、典型的には、適切な条件下で共培養される。調査される細胞の表現型の調節は、典型的には、上記抗体との相互作用に供されない対照細胞の同じ表現型と比較することにより測定される。特異的抗体と接触した細胞における対照細胞と比較した表現型の著しい逸脱又は変化が、細胞の調節因子として特異的抗体を同定し得る。細胞内抗体を選択することを除き、抗体発現指標細胞（又は、共培養フォーマットにおける産生細胞及び指標細胞の両方）を、選択工程の間拡散制限マトリクスにおいて成長させ、維持できることが好ましい。これは、可能性のある抗体調節因子が細胞に対してそれらの効果を与えることができるように、分泌された抗体と指標細胞の間の十分な接触及び相互作用を確実にするためである。そのため、本発明のある実施形態は、メチルセルロース又はアガロース等の拡散制限成長培地を採用し得る。
【００７２】
様々な細胞型を、本発明の選択方法における指標細胞として採用することができる。これらは、樹立された細胞株、並びに真核生物（例えば、ヒト等の哺乳動物）から単離された初代細胞を包含する。本明細書に例示されるように、被験体の骨髄から単離された幹細胞等の初代細胞は、その表現型（例えば、分化）の抗体調節因子の選択のための指標細胞として容易に使用され得る。これらの実施形態の幾つかでは、指標細胞を、産生細胞で発現される候補抗体のライブラリと接触させることができる。同様に、ＴＦ−１及びＨＥＫ２９３Ｔ等の樹立された哺乳動物細胞株を、哺乳動物細胞の多くの表現型の抗体調節因子、例えば、シグナル伝達経路のアゴニスト又はアンタゴニストを選択するため使用することができる。本発明の方法の実施のため使用され、変更され得る他のよく知られている哺乳動物細胞株として、例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、Ｄ１０Ｓ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８及びＪｕｒｋａｔ  Ｅ６細胞が挙げられる。他の方法では、細胞の具体的な抗体調節因子を選択するために初代細胞を採用することができる。例えば、哺乳動物種（例えば、ヒト）から単離された幹細胞を、細胞の増殖又は分化を促進する抗体調節因子を選択するために使用することができる。これらの細胞は、様々な細胞応答及びシグナル伝達経路の抗体調節因子、例えば、造血幹細胞分化を促進するトロンボポエチンアゴニスト抗体を同定するのに適している。同様に、哺乳動物被験体から単離された腫瘍細胞を、細胞の成長又はアポトーシスを刺激する抗体調節因子を選択するため採用することができる。指標細胞のアポトーシス又は成長の変更は、当該技術分野でよく知られている様々な方法により容易に判断され得る。例えば、指標細胞のアポトーシスは、死細胞又は死んで行く細胞を検出するために日常的に実施されるエチジウムホモ二量体（ＥｔｈＤ−１）アッセイによりモニターされ得る。他の実施形態では、産生細胞において発現され、そこから分泌される抗体は、指標細胞の他の表現型の調節因子について選択される。下記に詳述されるように、指標細胞の様々な表現型及び／又は形態学の変更は、当該技術分野で容易に利用可能な標準的な技術によって調査され得る。これらは、容易に検出され得る（例えば、免疫蛍光発光により）レポーター遺伝子又は特異的バイオマーカーを指標細胞に導入することを包含する。
【００７３】
表現型選択は、陽性選択又は陰性選択のいずれかによって行われ得る。陽性表現型選択では、抗体調節因子は、抗体との相互作用に供されていない対照細胞に関して、細胞における陽性の応答又は活性により同定される。本明細書で例示されるように、Ｅｐｏアゴニスト抗体を選択するため、指標細胞を、関連のあるシグナル伝達経路のアゴニスト抗体による活性化に依存する陽性の細胞成長又は増殖について選択することができる。さらに、シグナル伝達経路を誘発するアゴニスト抗体を、シグナル伝達経路（例えば、ＩＬ−２媒介Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路）によって活性化される特異的プロモーター（例えば、ＴＮＦ−βプロモーター又はＧＬＰ−１応答性プロモーター）の制御下に配置されたレポーター遺伝子の発現について選択することができる。このタイプの選択に使用されるレポーター遺伝子は、例えば、検出可能な物理的属性（例えば、ＧＦＰ及びベータ−ラクタマーゼ）又は抗生物質耐性（例えば、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ）を細胞に与える遺伝子であってもよい。例えば、Ｔｐｏアゴニスト抗体は、蛍光マーカー遺伝子の発現がＴｐｏＲシグナル伝達経路によって制御される抗体発現レポーター細胞株において選択され得る。
【００７４】
陰性表現型選択では、抗体調節因子は、それらの表現型を阻害又は抑制する活性、そうでない場合は抗体に供されていない対照細胞において検出可能な活性又は応答について同定される。例えば、毒素をコードするレポーター遺伝子（例えば、ジフテリア毒素遺伝子）をシグナル伝達カスケード（例えば、ＩＬ−２媒介Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路）プロモーター（例えば、ＴＮＦ−βプロモーター）の制御下に置くことができる。シグナル伝達経路のアンタゴニスト抗体を、それらのシグナル伝達経路を阻害する能力について選択することができ、その結果、毒素の発現を抑制し細胞の成長を確実にする。よって、対照細胞（抗体と接触していない）の毒素発現による成長の抑制に対して、正常な又はあまり阻害されていない細胞成長は、細胞内の特異的シグナル伝達経路のアンタゴニスト抗体調節因子を同定し得る。
【００７５】
標的細胞の様々な表現型の抗体調節因子を同定するため、本発明の選択方法における使用のため修正し、適合することができる。細胞の表現型を評価する例示的方法として、顕微鏡法（例えば、光学、共焦点、蛍光、走査電子及び透過電子）、蛍光発光性に基づく細胞ソーティング、分画遠心法、示差結合、免疫アッセイ、酵素アッセイ、成長アッセイ、及びｉｎ  ｖｉｖｏアッセイが挙げられる。本明細書でＴｐｏアゴニスト抗体について例示されるように、蛍光発光に基づく細胞ソーティングを使用して、蛍光マーカー遺伝子の発現がシグナル伝達経路の活性化と関連する細胞におけるシグナル伝達カスケードの抗体調節因子を選択することができる。ある実施形態では、走化性、形態学的変化、又はアポトーシス等の細胞の表現型挙動を、目視検査により、又は顕微鏡検査によりモニターすることができる。表現型の変更を伴う細胞を自動的に検出するために、コンピュータソフトウェアを使用されていてもよい。この目的を達成するため、様々なハイコンテンツスクリーン（「ＨＣＳ」）が、細胞構成成分及び過程の時間−空間力学に関するより詳細な情報に対する必要性に対処するため開発された。ハイコンテンツスクリーンは、細胞内へと取り込まれた特異的な蛍光発光ビーズ試薬多色蛍光情報の抽出を自動化する（例えば、Ｇｉｕｌｉａｎｏ  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：４，１９９５を参照されたい）。システム空間的、また時間的な力学を計測することができる光学システム使用して細胞を分析する。さらに、多くの蛍光の生理学的指標及び「バイオセンサー」が、細胞内の生化学的活性及び分子活性における変化をモニターするために利用可能である（例えば、Ｇｉｕｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２４：４０５，１９９５を参照されたい）。
【００７６】
本発明の様々な実施形態では、生化学的アッセイ又は所望の表現型と関連する他の指標を使用して、標細胞の表現型を評価することができる。例示として、下記実施例は、特異的ＴＦ−１細胞増殖アッセイ、ヒト幹細胞の赤血球分化をモニタリングするためのコロニー形成アッセイ、ＴＦ−１細胞分化をモニタリングするためのヘモグロビン発現アッセイ、及びＥｐｏＲシグナル伝達経路をモニタリングするためのＳＴＡＴ５リン酸化アッセイを記載する。これらのアッセイは、全て、本発明の実施において必要に応じて採用され、修正され得る。よって、ある実施形態では、対照細胞と比べて変化した速度で細胞を分化させる抗体調節因子は、好適な増殖アッセイにより同定される。例えば、ＩＬ−ＩＲαに対するアンタゴニスト抗体は、ＩＬ−ＩＲαの阻害効果による適切な指標細胞（例えば、Ｄ１０Ｓ  ｃｅｌｌ；Ｏｒｅｎｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １：１４−２２，１９８９）のＩＬ−１βによって媒介される細胞増殖活性を回復することにより選択され得る。ある実施形態では、刺激性シグナル（例えば、成長因子又は他のマイトジェン）に対する応答の変更を有する細胞は、特異的なシグナル伝達経路に対応する生化学的アッセイ又は他のレポーターアッセイにより同定される。細胞表面レポーターを発現し、レポーター遺伝子コンストラクトを含有する組換え細胞を使用する細胞外シグナルの細胞内シグナル伝達を検出し、評価するアッセイが、当該技術分野でよく知られている（例えば、米国特許第５，４０１，６２９号及び米国特許第５，４３６，１２８号を参照されたい）。
【００７７】
他の実施形態では、細胞分化の抗体調節因子が選択される。好適なマーカータンパク質を使用して、ＥＳ細胞及び体性幹細胞等の幹細胞を包含する多様な細胞の分化能及び増殖能を調節することができる。細胞（例えば、幹細胞）の分化は、当該技術分野でよく知られている多くの技術により容易に試験され得る。例えば、マーカー遺伝子及びマーカータンパク質の発現を、細胞分化を評価するために利用することができる。かかるマーカーの例として、巨核球へと分化する造血幹細胞についてＣＤ４１、内皮細胞についてＦＬＫ１（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９８：３６３５−４２，２００１；Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２５：１７４７−１７５７，１９９８）、平滑筋について血管平滑筋細胞特異的ミオシン重鎖（Ｄｒａｂ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１１：９０５−１５，１９９７）、骨芽細胞について骨特異的アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）及びオステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉ）（Ｄｅｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ８８：２９１９−２６，２０００）、白血球細胞に対してＣＤ４、ＣＤ８及びＣＤ４５（Ｏｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９６：３９８８−９０，２０００；ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９６：２５１１−９，２０００）、造血幹細胞に対してＦｌｋ−２及びＣＤ３４（Ｊｕｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８：１４５４１−１４５４６，２００１；Ｗｏｏｄｗａｒｄ＆Ｊｅｎｋｉｎｓｏｎ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：３３２９−３８，２００１；及びＧｅｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９７：３９２５−３０，２００１）、造血幹細胞及びＭＳＣ前駆体に対してＣＦＵ（Ｆｒｉｍｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２９：６４３−５２，２００１）、骨髄線維芽細胞に対してＭｕｃ−１８（ＣＤ１４６）（Ｆｉｌｓｈｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １２：４１４−２１，１９９８）、軟骨細胞に対してＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン及び軟骨細胞発現タンパク質−６８（Ｃａｒｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ６７：１２８−３８，２００１，Ｓｔｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５３：１６９−７４，２００１）、脂肪細胞に対して脂肪細胞脂質結合タンパク質（ＡＬＢＰ）及び脂肪酸トランスポーター（Ａｍｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２３６７−２３７１，１９９５；Ｂａｓｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２１９２０−５，１９９９；Ｆｒｏｈｎｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３９７０−３９７７，１９９９；及びＴｅｂｏｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６０：３０５−３１２，２００１）、神経幹細胞に対してＣＤ１３３（Ｕｃｈｉｄａ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１４７２０−５，２０００）、星状細胞に対してＧＦＡＰ（Ｄａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：１９１３−２５，２００１）、並びにニューロンに対して微小管結合タンパク質−２（Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：２７１��７，２０００）が挙げられる。
【００７８】
また、本発明の方法は、抗腫瘍化、アポトーシスの変更、及び抗ウイルス性表現型等の哺乳動物細胞の他の特性の抗体調節因子を選択するために使用され得る。例えば、上記方法は、細胞にウイルス感染又はウイルス産生に対する耐性を与える抗体調節因子を選択するために適合され得る。同様に、細胞シグナル伝達経路における変化を導く調節因子は、上記経路の活性若しくは不活性と相関するプローブを使用して、又は上記経路の活性若しくは不活性と相関する観察可能な指標により検出され得る。ある実施形態では、上記選択は、指標細胞における目的の化合物、例えば、代謝産物、分泌タンパク質、及び翻訳後修飾タンパク質の発現又は合成における変更を生じる調節因子を同定することが意図される。かかる抗体調節因子は、応答細胞の使用、マイクロアレイ、化学的検出アッセイ、及び免疫アッセイを包含する多様な手段により同定され得る。ある実施形態では、抗体調節因子は、ウイルス又は指標細胞へのウイルスベクターによる形質移入効率の向上について選択される。かかる表現型調節因子の選択は、限界濃度のレポーター又はマーカーコンストラクトで細胞に形質移入し、細胞によるレポーターコンストラクトの取り込みを促進する抗体を選択することにより行われ得る。
【００７９】
ある実施形態では、上記選択方法は、幹細胞の増殖又は分化を調節する抗体調節因子を同定することを対象とする。抗体調節因子は、主要なサイトカイン及び成長因子に対して効果（阻害又は活性化）を及ぼすことにより幹細胞の増殖又は分化を調節し得る。幹細胞の分化及び増殖の可能性を制御する能力は、とりわけ、未分化細胞の十分な供給の提供、及び具体的な細胞型への分化制御の提供を可能とし得る。よって、本発明のある実施形態では、産生細胞内で発現された候補抗体のコンビナトリアルライブラリは、幹細胞の規定の有糸分裂後の細胞サブタイプ（例えば、ドーパミン性又はコリン性ニューロン）への分化を促進するか、又は胚性幹（ＥＳ）細胞の制限された系統（例えば、神経前駆体細胞又は造血幹細胞）への分化を制御する調節因子について選択され得る。ある実施形態では、候補抗体は、分化細胞を異なる分化状態へと適合させるか、又は分化細胞の未分化状態への適合を可能とする、例えば、それにより幹細胞又は多能性前駆体細胞を作製する、調節因子について選択される。ある実施形態では、候補抗体は、分化を妨げるか、又は分化の程度及び特徴を制御する、自己複製の可能性を高める調節因子について選択される。幹細胞の調節因子を選択するための様々な実施形態では、抗体を幹細胞内又は幹細胞前駆体細胞内で発現させ、その後、細胞の特異的表現型を評価する。
【００８０】
上述のように、指標細胞の多くの表現型の調節は、レポーターコンストラクトの使用により試験され得る。レポーターコンストラクトは、指標細胞に導入されて、対応する表現型細胞（例えば、細胞表面受容体におけるシグナル伝達活性）の調節に応答して、計測可能なシグナル（検出可能な標識）を提供する。レポーターコンストラクト中のレポーター遺伝子は、検出可能な酵素反応（例えば、検出可能な発色反応又は蛍光定量的反応に関連付けられたもの）を触媒し得る酵素（例えば、β−ラクタマーゼ又はβ−ガラクトシダーゼ）をコードし得る。また、レポーターコンストラクトは、検出可能な蛍光シグナル又は化学発光（例えば、緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ）を提供する分子を発現し得る。
【００８１】
様々なシグナル伝達カスケードの活性をモニタリングするためのレポーターコンストラクトは、当該技術分野でよく知られている方法に従って作製され、指標細胞へと導入され得る。例えば、レポーターコンストラクトを作製するのに適したベクターは、プラスミド（例えば、ｐＵＣ１８、ｐＹＥＳ２、ｐＣＤＭ８）又はアデノウイルス等のウイルスゲノム、ＡＡＶ、若しくはレトロウイルスベクター（モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）であってもよい。調節される表現型に依存して、レポーター遺伝子（例えば、規定可能な酵素、毒素又はＧＦＰ）を、表現型の調節に応答性のウイルスプロモーターの制御下に置くことができる。例として、ｂｃｌ−ｘプロモーター（エリスロポエチン経路に対して）、ＴＮＦ−βプロモーター（ＩＬ−２シグナル伝達に対して）、Ｕ６又はｔＲＮＡｍｅｔプロモーター、レトロウイルス長反復配列、及びＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが挙げられる。他の好適なベクター及びレポーターコンストラクトに適したプロモーター要素、並びにクローニング、形質移入、一過性遺伝子発現及び安定に形質移入された細胞の取得に関するプロトコルは、当該技術分野、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，（３ｒｄ  ｅｄ．，２０００）；及びＢｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（ｒｉｎｇｂｏｕ  ｅｄ．，２００３）に記載される。
【００８２】
Ｖ．タンパク質アゴニストによる標的細胞の分化転換
本発明は、標的細胞、例えば、分化した体細胞又は系統制限幹細胞をリプログラム又は分化転換することが可能なタンパク質物質を選択する方法を提供する。本発明の幾つかの関連する実施形態は、かかるタンパク質物質（例えば、受容体アゴニスト抗体）を、標的細胞をリプログラムするか、又は分化転換するために使用する方法を対象とする。例えば、タンパク質物質（例えば、ポリペプチド又は抗体アゴニスト）を、異なる経路（例えば、神経前駆細胞への分化転換のため）に沿って標的細胞（例えば、ミエロイド系統ＣＤ３４＋細胞）をリプログラムする活性について選択することができる。本明細書で実証されるように、本発明の選択フォーマットは、希少な特性、例えば、受容体の天然リガンドとは異なる方式で標的受容体を調節する能力を有する抗体アゴニスト等のタンパク質物質を同定することを可能とする。本発明者らによって選択されたＧ−ＣＳＦアゴニスト抗体により例示されるように、選択されたＧ−ＣＳＦアゴニスト抗体及びＧ−ＣＳＦの両方がＧ−ＣＳＦＲに結合して細胞分化を誘導するのに対し、選択されたＧ−ＣＳＦ抗体のみが神経発生を開始できる。
【００８３】
標的細胞をリプログラムして所望の経路に沿って分化転換するため、まず、例えばレポーター細胞において、シグナル伝達経路又は所望の分化経路の活動を活性化し得るタンパク質調節因子（例えば、アゴニスト抗体又はポリペプチド物質）を同定する必要がある。同定された物質を、その後、それらが実際に所望の様式で標的細胞をリプログラムし得ることを確認するため、さらに試験することができる。典型的には、候補ポリペプチド物質は、通常は標的細胞上に存在するシグナル伝達受容体を同時発現するレポーター細胞株において発現される。選択されたシグナル伝達受容体は、標的細胞において通常、所望の分化経路を反映するか、又はそれに対応する細胞事象若しくは特異的シグナル伝達経路を媒介するか若しくは活性化するものでなくてはならない。候補タンパク質物質は、例えば、特異的シグナル伝達経路を媒介又は活性化する受容体に対して起こされた抗体又はその抗原結合フラグメントのライブラリであってもよい。また、候補物質は、受容体を調節することが可能な他のポリペプチド又はペプチド、例えば、受容体の天然リガンドの変異体又は誘導体であってもよい。選択においてモニターされるシグナル伝達経路は、標的細胞の所望の分化経路を介する又は活性化する細胞事象、例えば、所望の分化経路の特異的分子マーカー指標の発現を反映するか、又はそれに対応するはずである。例えば、標的細胞をニューロン又は神経前駆細胞へと分化転換するため、レポーター細胞において共発現される受容体は、この受容体の活性化が中枢神経系において神経発生の誘導をもたらすことから、Ｇ−ＣＳＦＲであってもよい。抗体物質の細胞内で発現されたライブラリは、まず、受容体に対する１又は複数のアゴニスト物質を得るため受容体細胞を有するＧ−ＣＳＦＲにおいて選択される。その後、同定されたアゴニストを、神経系統、例えば、神経チューブリンの存在の証拠となる、表現型又はシグナル伝達活性を伴う細胞について選択するための適切な条件下で標的細胞（例えば、ミエロイドＣＤ３４＋細胞）に適用する。同定された物質を、それらが実際に標的細胞を所望の分化経路に沿って（ａｌｏｎｅ）分化転換することが可能であることを確認するため、他の試験にさらに供することができる。
【００８４】
ある実施形態では、候補ポリペプチド物質のライブラリは、選択された受容体と共にレポーター細胞集団の原形質膜へと同時に組み込まれる。かかる共局在フォーマットは、受容体とそれらのタンパク質リガンド間の通常の相互作用を援助し、タンパク質物質（例えば、抗体）が自己分泌方式でそれを産生する細胞に対して作用することを確実にする。本発明は、ＣＤ３４＋ミエロイド細胞のリプログラミングが、共局在するＧ−ＣＳＦＲを活性化するアゴニストを選択することにより、神経前駆細胞とすることを例証した。本明細書で記載される一般的な選択法は、他の細胞受容体を調節することにより標的細胞を分化転換することができる物質を同定するのに広く適用され得る。ＧＰＣＲｓ及びサイトカイン受容体の場合、シグナル伝達の多能性は、特定の下流の経路に対して受容体を介するシグナル伝達をバイアスするアゴニストを見出すことに焦点を絞る薬理学の成長分野である。これを達成するため、多数のアゴニストを試験する必要がある。これは小分子リガンドについては比較的容易であるが、大きく多様なタンパク質アゴニストのライブラリの作製及び研究はより問題がある。本発明の方法は、受容体の異なる領域に結合する多数の可能性のあるタンパク質アゴニストの研究を促進し、代替的な下流のシグナル伝達経路を援助する、この問題に対する解決策を提供する。本明細書で例示されるＦＡＣＳによる自己分泌系のスクリーニングは、希少な事象（例えば、分化転換）及びかかる希少な事象を媒介することが可能なタンパク質物質の表現型選択を大いに促進する。さらに、かかる相互作用は受容体の自然な環境で生じることから、それらは、生理学的関連性についてより高い可能性を有する。
【００８５】
本発明の方法及び抗体は、様々な治療適用、例えば、再生医学における適用を有し得る。治療薬として、抗体等のタンパク質物質は、長寿命で細胞へと進入して融合する必要がないという利点を有する。上記抗体薬剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで自家幹細胞の分化転換をして、自身の分化細胞を作製し得る。かかる細胞は、脳又は脊椎の損傷領域の修復を包含する、様々な用途で有用となり得る。
【００８６】
ＶＩ．二重特異性抗体
感染の多重度（ＭＯＩ）を制御することにより、１より多い抗体をコードするレンチウイルス又は他のレトロウイルスを単一の細胞に感染させることができる。本明細書で例示されるｓｃＦｖ−Ｆｃ融合抗体の場合、これは、細胞内の抗体Ｆｖドメインそれ自体の再会合を可能とし、ヘテロ二量体抗体を生じる。したがって、本発明のある実施形態は、２つの異なる抗原性エピトープを標的とするヘテロ二量体二重特異性抗体を同定することを対象とする。本発明の二重特異性抗体が２つの異なる分子上に存在する２つの抗原性エピトープを認識する（トランス反応性）を包含するのに対し、それらは、典型的には、同じ分子内の２つの異なる部位に結合するヘテロ二量体を指す（シス反応性）。かかる抗体の調節因子の機能（アゴニスト又はアンタゴニスト）は、同じ抗体分子内に含有されなければならない２つの異なる抗原結合特異性間の絶対的な相乗作用に依存する。本明細書で抗Ｅｐｏ二重特異性抗体アゴニスト抗体について例示されるように、このヘテロ二量体抗体の非対称性結合は、その完全アゴニスト活性がその受容体上の２つの結合部位への非対称性結合に依存する、真正な標的分子（例えば、Ｅｐｏ）の機構を再現する。
【００８７】
１より多い抗体を発現する細胞から直接に相乗的な抗体を選択する能力は、ｓｃＦｖ抗体全体のレベルで作動する第２のコンビナトリアルな自由度を提供し、非常に多数の抗体重鎖及び軽鎖の無作為の会合によって既に達成された多様性を増大することができる。そのため、第１のコンビナトリアルパラメータは、大多数の単一特異性フラグメントの変動を与える、抗体分子の重鎖及び軽鎖の無作為の会合である。ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合の会合が変性されるため、第２のコンビナトリアルパラメータは、抗体分子それら自体の複数の結合ドメイン（ｓｃＦｖ）の無作為の再会合に由来して二重特異性ヘテロ二量体を与える。本明細書で使用されるように、二重特異性の用語は、この用語が２つの異なる分子に結合する能力（トランス反応性）を指す通常免疫化学で使用される方法とは異なる、同じ分子内の２つの異なる部位に結合する（シス反応性）ヘテロ二量体の能力を指す。
【００８８】
本明細書に記載される抗体ライブラリ及び選抜法を、真核生物細胞の任意の表現型の二重特異性抗体調節因子を得るため、特に、それらの同種の細胞受容体への結合及び対応するシグナル伝達経路の活性化において絶対的な協同作用を必要とするリガンドの抗体調節因子（例えば、アゴニスト）を選択するため、容易に採用し、適合することができる。本明細書で例示される抗Ｅｐｏ二重特異性抗体に加えて、本発明の二重特異性アゴニスト抗体もまた、形態学的選択により同定され、幹細胞分化（例えば、１２−１／１２−２二重特異性抗体）を誘導することが可能な抗体を包含する。同じ細胞内の複数の抗体鎖（例えば、ｓｃＦｖ鎖）の再集合及び選択のための二重特異性抗体の産生を確実にするため、抗体をコードするウイルスベクターを、わずかに高いＭＯＩにより産生細胞内へと導入することができる。ＭＯＩは、形質導入される細胞１個当たりの形質導入ウイルス粒子の（例えば、レンチウイルス粒子）の数である。高いＭＯＩ形質導入により、ホモ二量体抗体及びヘテロ二量体抗体の両方が機能的選択に対して作製され得る。ある実施形態では、選出法は、最適な抗体産生及びホモ二量体／ヘテロ二量体抗体の所望の比率を得るためにＭＯＩの範囲の検査を実施してもよい。よって、主にヘテロ二量体抗体が所望される場合、ウイルス感染で使用されるＭＯＩは、例えば、２又は３程度であってもよい。抗体が産生細胞又は指標細胞へと導入され、その内部で発現されると、抗体調節因子が選択される表現型に対応する適切なアッセイを行うことができる。本明細書で例示されるヘテロ二量体ＥｐｏＲ抗体の選択と同様に、真核生物細胞の他の表現型に対する二重特異性抗体調節因子を選択するための指標細胞株及び表現型アッセイもまた、当該技術分野で通例実施される方法に従って得られる。
【００８９】
ＭＯＩを制御することに加えて、ある特定の修飾を抗体鎖に導入してヘテロ二量体形成を促進することができる。例えば、ヘテロ二量体の形成は、本明細書で例示されるＥｐｏＲに対するｓｃＦｖ−Ｆｃ融合抗体のＦｃ部分におけるＴ３６６Ｙ及びＹ４０７Ｔ等の単一の残基置換により促進される。Ｔ３６６Ｙ及びＹ４０７Ｔ  Ｆｃ変異体は、１つのＩｇＧ鎖（Ｋｎｏｂ）中のＴｙｒ３６６のより大きな側鎖が、他の抗体鎖のＴｈｒ４０７のより小さな側鎖と選択的に相互作用し得ることから、ヘテロ二量体を形成しやすい。採用される抗体ライブラリの特異的構造に依存して、ヘテロ二量体の形成を高める他の修飾もまた設計され得る。例えば、ｓｃＦｖのロイシンジッパーＦｏｓ／Ｊｕｎへの融合は、二重特異性抗体ヘテロ二量体の産生を促進し得る。
【００９０】
ＶＩＩ．表面マーカー又はシグナル伝達受容体のアゴニスト抗体
さらなる例示として、本発明は、エリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）、トロンボポエチン受容体（ＴｐｏＲ）及び顆粒細胞コロニー刺激因子受容体（Ｇ−ＣＳＦＲ）等の細胞シグナル伝達受容体に特異的に結合して調節する抗体又は抗原結合分子を提供する。これらのアゴニスト抗体は、下記実施例に記載されるようにＪａｋ２リン酸化及び活性化、幹細胞増殖又はヘモグロビン産生を調節するため例えばＥｐｏＲのような各受容体により媒介されるシグナル伝達活性を刺激することができる。モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の調製のための一般的な方法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８；Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７，１９７５；Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２，１９８３；ａｎｄ  Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｐｐ．７７−９６  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９８５を参照されたい。本明細書に開示される特異的アゴニスト抗体（例えば、抗ＥｐｏＲ抗体）は、各受容体（例えば、ＥｐｏＲ）によって媒介されるシグナル伝達経路の活性化における活性についてレンチウイルス系抗体ライブラリから抗体を選択することによって同定された。下記実施例に詳述されるように、同定された一部のＥｐｏＲアゴニスト抗体はホモ二量体抗体であるが、その他はヘテロ二量体二重特異性抗体である。抗ＥｐｏＲ機能性抗体に加えて、トロンボポエチン受容体（ＴｐｏＲ）又は顆粒細胞刺激因子受容体（Ｇ−ＣＳＦＲ）のアゴニストである機能性抗体もまた、本明細書において提供される。
【００９１】
本発明の抗体アゴニスト（例えば、抗ＥｐｏＲ機能性抗体）は、下記実施例に例示される抗体のようにモノクローナル抗体であることが好ましい。それらは、例示される機能性抗体（例えば、本明細書に例示されるＥ−１、Ｖ−１及びＶ−３抗ＥｐｏＲ抗体、３Ｄ９及び１４Ｆ１２抗ＴｐｏＲ抗体、３Ｂ３抗Ｇ−ＣＳＦＲ抗体、及び９−３、１１−３及び１２−１／１２−２抗体）と同じ結合特異性を有することが好ましい。これらの抗体は、典型的には、例示される抗体と同じか、実質的に同一の可変領域配列を持つ。例示される抗体に由来する可変領域配列を含有することに加えて、本発明の一部のアゴニスト抗体は、可変領域配列に融合された他の抗体配列も含有し得る。例えば、上記抗体は、本明細書の実施例に記載されるようにヒトＩｇＧ１配列（ヒンジからＣＨ３）のＦｃ部分を含有してもよい。さらに、所望の特性のため様々な修飾を抗体配列中に導入することができる。例えば、ヘテロ二量体抗体の形成を向上するため、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合は、「Ｋｎｏｂｓ−Ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅ」ＣＨ３突然変異（例えば、Ｔ３６６Ｙ及び／又はＹ４０７Ｔ突然変異）を持つことができる。
【００９２】
一部の抗ＥｐｏＲアゴニスト抗体は、配列番号７及び配列番号８にそれぞれ示される重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列を含む、特異的ホモ二量体ｓｃＦｖ抗体（Ｅ−１）に由来する。この抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ配列は、ＧＹＴＦＴＧＹＹ（ＣＤＲ１；配列番号１）、ＩＮＰＮＳＧＧＴ（ＣＤＲ２；配列番号２）、及びＣＡＲＬＳＳＧＷＴＦＤＹＷ（ＣＤＲ３；配列番号３）である。その軽鎖可変領域のＣＤＲ配列は、ＱＳＶＬＹＳＰＮＮＫＮＹ（ＣＤＲ１；配列番号４）、ＷＡＳ（ＣＤＲ２；配列番号５）、及びＣＱＱＳＹＳＬＰＦＴＦ（ＣＤＲ３；配列番号６）である。本発明の他の抗ＥｐｏＲアゴニスト抗体の幾つかは、配列番号２１及び配列番号２２にそれぞれ示される重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列を含有する第１単量体（Ｖ−１）、並びに配列番号２３及び配列番号２４にそれぞれ示される重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列を含有する第２単量体（Ｖ−３）を含む、特異的ヘテロ二量体ｓｃＦｖ抗体（Ｖ−１４／Ｖ−３）に由来する。第１単量体（Ｖ−１）の重鎖可変領域のＣＤＲ配列は、ＧＧＴＦＳＳＹＡ（ＣＤＲ１；配列番号９）、ＩＩＰＩＦＧＴＡ（ＣＤＲ２；配列番号１０）、及びＣＡＲＤＱＧＹＹＹＧＳＧＧＬＤＹＷ（ＣＤＲ３；配列番号１１）である。その軽鎖可変領域のＣＤＲ配列は、ＱＳＩＳＳＹ（ＣＤＲ１；配列番号１２）、ＡＡＳ（ＣＤＲ２；配列番号１３）、及びＣＬＱＤＹＮＹＰＬＴＦ（ＣＤＲ３；配列番号１４）である。第２単量体（Ｖ２単量体）の重鎖可変領域のＣＤＲ配列は、ＧＹＴＦＴＳＹＧ（ＣＤＲ１；配列番号１５）、ＩＳＡＹＮＧＮＴ（ＣＤＲ２；配列番号１６）、及びＣＡＲＧＶＡＡＡＬＳＹＷ（ＣＤＲ３；配列番号１７）である。その軽鎖可変領域のＣＤＲ配列は、ＳＳＤＶＧＡＹＮＹ（ＣＤＲ１；配列番号１８）、ＥＶＴ（ＣＤＲ２；配列番号１９）、及びＣＩＳＦＴＡＳＳＴＷＡＦ（ＣＤＲ３；配列番号２０）である。
【００９３】
本発明の一部の抗ＴｐｏＲアゴニスト抗体は、下記実施例に詳述される３Ｄ９  ｓｃＦｖ抗体に由来する。このｓｃＦｖ抗体は、配列番号３２に示されるアミノ酸配列を有する。ｓｃＦｖの重鎖部分及び軽鎖部分の配列は、配列番号３３及び配列番号３４にそれぞれ示される。この抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ配列は、ＲＤＴＦＮＴＹＧ（ＣＤＲ１；配列番号３５）、ＩＩＰＩＦＧＴＡ（ＣＤＲ２；配列番号３６）、及びＣＡＲＤＲＫＬＧＧＳＤＹＷ（ＣＤＲ３；配列番号３７）である。その軽鎖可変領域のＣＤＲ配列は、ＱＧＬＧＲＷ（ＣＤＲ１；配列番号３８）、ＡＡＳ（ＣＤＲ２；配列番号１３）、及びＱＱＳＮＳＦＰＷＴ（ＣＤＲ３；配列番号３９）である。
【００９４】
本発明の一部の抗Ｇ−ＣＳＦＲアゴニスト抗体は、本明細書の実施例に例示される３Ｂ３抗体に由来する。このｓｃＦｖ抗体は、配列番号４０に示されるアミノ酸配列を有する。ｓｃＦｖの重鎖部分及び軽鎖部分の配列は、配列番号４１及び４２にそれぞれ示される。この抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ配列は、ＧＧＳＩＳＳＧＧＹＹ（ＣＤＲ１；配列番号４３）、ＩＹＹＳＧＳＴ（ＣＤＲ２；配列番号４４）、及びＣＡＲＷＮＧＶＮＮＡＦＤＩ（ＣＤＲ３；配列番号４５）である。その軽鎖可変領域のＣＤＲ配列は、ＱＧＩＳＳＷ（ＣＤＲ１；配列番号４６）、ＡＡＳ（ＣＤＲ２；配列番号１３）、及びＬＱＨＮＴＹＰＦＴ（ＣＤＲ３；配列番号４７）である。
【００９５】
本発明の一部のアゴニスト抗体は、幹細胞の分化を誘導することが可能な特異的抗体である、抗体９−３、１１−３、１２−１及び１２−２に由来する。下記実施例に詳述されるように、これらの例示される抗体は、ナイーブ抗体ライブラリの直接的な形態学的選択により同定される。これら４つのｓｃＦｖ抗体のアミノ酸配列は、配列番号４８、５７、６６及び７５にそれぞれ示される。これらの抗体の重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列は、配列番号４９及び配列番号５０（抗体９−３）、配列番号５８及び配列番号５９（抗体１１−３）、配列番号６７及び配列番号６８（抗体１２−１）、並びに配列番号７６及び配列番号７７（抗体１２−２）にそれぞれ示される。抗体９−３の重鎖可変領域のＣＤＲ配列は、ＧＦＳＦＴＴＹＧ（ＣＤＲ１；配列番号５１）、ＩＳＳＳＳＳＴ（ＣＤＲ２；配列番号５２）、及びＡＲＧＧＤＮＳＲＧＹＹＹＩＡＧＧＤＹ（ＣＤＲ３；配列番号５３）である。抗体９−３の軽鎖可変領域のＣＤＲ配列は、ＳＳＩＲＹ（ＣＤＲ１；配列番号５４）、ＤＴＳ（ＣＤＲ２；配列番号５５）、及びＱＥＷＳＧＹＰＹＴ（ＣＤＲ３；配列番号５６）である。抗体１１−３の重鎖可変領域のＣＤＲ配列は、ＧＹＴＦＴＧＹＹ（ＣＤＲ１；配列番号６０）、ＩＮＰＮＳＧＧＴ（ＣＤＲ２；配列番号６１）、及びＡＲＧＧＰＳＹＧＤＹＦＲＷＦＤＰ（ＣＤＲ３；配列番号６２）である。抗体１１−３の軽鎖可変領域のＣＤＲ配列は、ＨＡＶＳＳＮＳ（ＣＤＲ１；配列番号６３）、ＧＡＳ（ＣＤＲ２；配列番号６４）、及びＱＱＹＧＳＳＰＰＩＴ（ＣＤＲ３；配列番号６５）である。抗体１２−１の重鎖可変領域のＣＤＲ配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＥ（ＣＤＲ１；配列番号６９）、ＩＳＳＳＧＳＴ（ＣＤＲ２；配列番号７０）、及びＡＲＥＶＡＡＡＧＩＮＤＡＦＤＩ（ＣＤＲ３；配列番号７１）である。抗体１２−１の軽鎖可変領域のＣＤＲ配列は、ＳＳＩＲＹ（ＣＤＲ１；配列番号７２）、ＤＴＳ（ＣＤＲ２；配列番号７３）、及びＱＥＷＳＧＹＰＹＴ（ＣＤＲ３；配列番号７４）である。抗体１２−２の重鎖可変領域のＣＤＲ配列は、ＧＹＩＦＴＳＹＤ（ＣＤＲ１；配列番号７８）、ＩＦＰＧＥＧＳＴ（ＣＤＲ２；配列番号７９）、及びＡＲＧＤＹＹＲＲＹＦＤＬ（ＣＤＲ３；配列番号８０）である。抗体１２−２の軽鎖可変領域のＣＤＲ配列は、ＱＤＩＤＤＤ（ＣＤＲ１；配列番号８１）、ＥＰＴ（ＣＤＲ２；配列番号８２）、及びＬＱＨＧＤＦＬＴＷＴ（ＣＤＲ３；配列番号８３）である。様々な実施形態において、９−３、１１−３、又は１２−１／１２−２の抗体に由来するこれらの抗体を、系統特異的な方法で、例えば、樹状細胞を形成するため、幹細胞（例えば、ヒトＣＤ３４＋細胞）の分化を誘導するために使用することができる。
【００９６】
典型的なインタクト抗体は、６つの重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ’ｓ）に位置するアミノ酸残基により優先的に標的抗原と相互作用する。本発明の機能性アゴニスト抗体（例えば、抗ＥｐｏＲ抗体）は、例示される抗ＥｐｏＲ、抗ＴｐｏＲ、抗Ｇ−ＣＳＦＲ又は幹細胞誘導抗体（例えば、抗体９−３）の対応するＣＤＲ配列と同じか実質的に同一のそれらの重鎖ＣＤＲ配列及び軽鎖ＣＤＲ配列の少なくとも１つを有する抗体又は抗原結合フラグメントを包含する。本発明の一部のアゴニスト抗体は、下記実施例に開示される例示される抗体と同じ結合特異性を有する。これらの抗体は、各受容体（例えば、ＥｐｏＲ）への結合について例示される抗体と競合することができる。上記抗体は、例示される抗体、例えば、ＥｐｏＲシグナル伝達経路を刺激する抗ＥｐｏＲ抗体と同じ又は同様の機能特性をさらに有する。本発明のアゴニスト抗体の一部は、例示される抗体（例えば、３Ｄ９抗ＴｐｏＲ抗体、３Ｂ３抗Ｇ−ＣＳＦＲ抗体、又は抗ＥｐｏＲ抗体Ｅ−１、Ｖ−１又はＶ−３）の対応するＣＤＲ配列にそれぞれ同一のそれらの重鎖及び軽鎖の可変領域中に全てのＣＤＲ配列を有するホモ二量体である。他の実施形態では、上記抗体は、Ｖ−１／Ｖ−３抗ＥｐｏＲヘテロ二量体抗体の第１単量体及び第２単量体のものとそれぞれ同一の３つの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を有するヘテロ二量体である。他の抗ＥｐｏＲは、例示されるＶ−１／Ｖ−３二重特異性抗体の２つの単量体のＣＤＲ配列にそれぞれ同一の重鎖及び軽鎖のＣＤＲを有する２つの二量体とのヘテロ二量体である。それらの結合特異性に加えて、本発明の一部のアゴニスト抗体（例えば、抗ＥｐｏＲ抗体）もまた、各受容体（例えば、ＥｐｏＲ）により媒介されるシグナル伝達活性の調節（例えば、刺激）において機能的に活性である。
【００９７】
例示される抗体（例えば、Ｅ−１、Ｖ−１、Ｖ−３又はＶ−１／Ｖ−３抗ＥｐｏＲ抗体、３Ｄ９抗ＴｐｏＲ抗体、３Ｂ３抗Ｇ−ＣＳＦＲ抗体、又は１２−１／１２−２抗インテグリンα３抗体）の対応するＣＤＲ配列にそれぞれ同一のＣＤＲ配列を有することに加え、本発明の一部のアゴニスト抗体は、例示される抗体の対応する可変領域配列とそれぞれ同一の重鎖及び軽鎖の可変領域配列全体を有する。他の実施形態では、同一のＣＤＲ配列の他に、上記抗体は、可変領域のフレームワーク部分に例示される抗体の対応するアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を含有する。例示される抗体に関連して、本発明のアゴニスト抗体は、結合特異性若しくはエフェクタ機能の喪失、又は結合親和性若しくは受容体刺激活性の容認し得ない低下を伴うことなく、可変領域における重大でないアミノ酸の置換、付加又は欠失を経てもよい。通常、かかる変更を組み込む抗体は、由来する参照抗体（例えば、３Ｂ３抗Ｇ−ＣＳＦＲ抗体、３Ｄ９抗ＴｐｏＲ抗体、抗ＥｐｏＲ抗体Ｅ−１、Ｖ−１、Ｖ−３若しくはＶ−１／Ｖ−３、又は抗インテグリンα３抗体１２−１及び１２−２）に対して実質的な配列同一性を呈する。例えば、本発明の一部のアゴニスト抗体の成熟した軽鎖可変領域は、例示される抗体の成熟した軽鎖可変領域に対して、少なくとも７５％又は少なくとも８５％の配列同一性を有する。同様に、上記抗体の成熟した重鎖可変領域は、例示されるアゴニスト抗体の成熟した重鎖可変領域に対して、少なくとも７５％又は少なくとも８５％の配列同一性を有する。様々な実施形態では、上記抗体は、典型的には、例示される抗体の対応する可変領域に対して実質的に同一（例えば、７５％、８５％、９０％、９５％、又は９９％）の全可変領域配列を有する。本発明の一部のアゴニスト抗体は同じ特異性を有するが、例示される抗体（例えば、３Ｂ３、３Ｄ９、Ｅ−１、Ｖ−１、Ｖ−３、１２−１及び１２−２）と比較した場合に、改善された親和性又は受容体認識活性を有する。
【００９８】
ＶＩＩＩ．抗ＥｐｏＲアゴニスト抗体を産生するためのポリヌクレオチド、ベクター及び宿主細胞
本発明は、本明細書に記載される受容体アゴニスト抗体鎖又は抗原結合分子のセグメント又はドメインを含むポリヌクレオチドをコードする、実質的に精製されたポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を提供する。本発明の一部のポリヌクレオチドは、配列番号２５、２７若しくは２９に示される重鎖可変領域及び／又は配列番号２６、２８若しくは３０に示される軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明の他のポリヌクレオチドは、配列番号２５〜３０に示されるヌクレオチド配列の１つに実質的に同一（例えば、少なくとも６５％、８０％、９５％又は９９％）であるヌクレオチド配列を含む。適切な発現ベクターから発現されると、これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、抗原結合能を呈することができる。
【００９９】
また、本発明では、少なくとも１つのＣＤＲ領域、及び通常は下記実施例に記載されるアゴニスト抗体の重鎖又は軽鎖に由来する３つ全てのＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドが提供される。他のポリヌクレオチドは、例示される抗体の全て又は実質的に全て重鎖及び／又は軽鎖の可変領域をコードする。例えば、これらの幾つかのポリヌクレオチドは、配列番号７、２１若しくは２３に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び／又は配列番号８、２２若しくは２４に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする。本発明の他のポリヌクレオチドは、配列番号３３、４１、４９、５８、６７若しくは７６に示される重鎖可変領域及び／又は配列番号３４、４２、５０、５９、６８若しくは７７に示される軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。上記コードの縮重のため、多様な核酸配列が各々の免疫グロブリンアミンの酸配列をコードする。
【０１００】
本発明のポリヌクレオチドはアゴニスト抗体の可変領域配列のみをコードしてもよい。また、それらは、抗体の可変領域及び定常領域の両方をコードしてもよい。本発明の核酸の一部のポリヌクレオチドでは、配列番号７、２１、２３、３３、４１、４９、５８、６７又は７６に示される成熟な重鎖可変領域配列に実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、９０％、又は９９％）の成熟な重鎖可変領域配列をコードする。他のポリヌクレオチド配列は、配列番号８、２２、２４、３４、４２、５０、５９、６８又は７７に示される成熟な軽鎖可変領域配列に実質的に同一の成熟な軽鎖可変領域配列をコードする。あるポリヌクレオチド配列は、例示される抗ＥｐｏＲ抗体の１つの重鎖及び軽鎖の両方の可変領域を含むポリペプチドをコードする。他のポリヌクレオチドは、例示される抗体（例えば、３Ｂ３、３Ｄ９、Ｅ−１、Ｖ−１、Ｖ−３又は９−３）の１つの重鎖及び軽鎖の可変領域に実質的にそれぞれ同一である２つのポリヌクレオチドセグメントをコードする。
【０１０１】
錠ポリヌクレオチド配列は、新たに固相ＤＮＡ合成により、又は抗ＥｐｏＲ抗体又は抗原結合フラグメントをコードする既存の配列（例えば、下記実施例に記載される配列）のＰＣＲ突然変異誘発により、産生され得る。核酸の直接的な化学合成は、当該技術分野で既知の方法、例えば、Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０，１９７９のリン酸トリエステル法；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９，１９７９のリン酸ジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９，１９８１のジエチルホスホラミダイト法；及び米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持法により成し遂げられ得る。ＰＣＲによりポリヌクレオチド配列に突然変異を導入することは、例えば、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ（Ｅｄ．），Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ，１９９２；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０；Ｍａｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：９６７，１９９１；ａｎｄ  Ｅｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １：１７，１９９１．に記載されるように行われ得る。
【０１０２】
また、本発明において、本明細書に記載される受容体アゴニスト抗体を産生するための発現ベクター及び宿主細胞が提供される。抗体を発現するためのレンチウイルス系ベクターの具体的な例は、下記実施例（図７を参照されたい）に記載される。また、様々な他の発現ベクターを採用して、アゴニスト抗体鎖又は結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを発現することができる。ウイルス系及び非ウイルスの発現ベクターのいずれも、哺乳動物宿主細胞において抗体を産生するために使用することができる。非ウイルスベクター及び非ウイルス系として、プラスミド、エピソーマルベクター、典型的には、タンパク質又はＲＮＡを発現する発現カセットにより、及びヒト人工染色体（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：３４５，１９９７を参照されたい）が挙げられる。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞において抗ＥｐｏＲポリヌクレオチド及びポリペプチドを発現するのに有用な非ウイルスベクターとして、ｐＴｈｉｏＨｉｓ  Ａ、Ｂ及びＣ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ  Ａ、Ｂ及びＣ（カリフォルニア州サンディエゴのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＭＰＳＶベクター、及び他のタンパク質発現用に当該技術分野で既知の多数の他のベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとして、レンチウイルス又は他のレトロウイルスに基づくベクター、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０に基づくベクター、パピローマウイルス、ＨＢＰ  エプスタインバールウイルス、ワクシニアウイルスベクター及びセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）が挙げられる。Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：８０７，１９９５及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６８：１４３，１９９２を参照されたい。
【０１０３】
発現ベクターの選択は、そこでベクターが発現されることが意図される宿主細胞に依存する。典型的には、発現ベクターは、プロモーター及びアゴニスト抗体鎖又はフラグメントをコードするポリヌクレオチドに制御可能に連結された他の調節配列（例えば、エンハンサー）を含有する。ある実施形態では、誘導性プロモーターは、導入条件下以外で挿入された配列の発現を防止するために採用される。誘導性プロモーターとして、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーター又はヒートショックプロモーターが挙げられる。形質転換された生物の培養物を、その発現産物が宿主細胞によってより良好に認容されるコーディング配列について集団をバイアスせずに、被誘導条件下で拡大することができる。プロモーターに加えて、他の調節要素もまた、アゴニスト抗体鎖又はフラグメントの効率的な発現に必要であるか、望まれる場合がある。これらの要素は、典型的には、ＡＴＧ開始コドン及び隣接するリボソーム結合部位又は他の配列を包含する。さらに、発現効率は、使用されている細胞系に適したエンハンサーを包含することにより増強され得る（例えば、Ｓｃｈａｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５，１９９４；及びＢｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：５１６，１９８７を参照されたい）。例えば、ＳＶ４０エンハンサー又はＣＭＶエンハンサーは、哺乳動物宿主細胞において発現を増加するために使用され得る。
【０１０４】
また、発現ベクターは、挿入されたアゴニスト抗体配列によりコードされるポリペプチドと融合タンパク質を形成する分泌シグナル配列位置も提供し得る。より頻繁に、挿入されたアゴニスト抗体配列は、ベクターに包含される前にシグナル配列に連結される。アゴニスト抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインをコードする配列を受け取るために使用されるベクターは、時には、それらの定常領域又は定常部分もコードする。かかるベクターは、定常領域との融合タンパク質としての可変領域の発現を可能とし、それにより、インタクト抗体又はそのフラグメントの産生を導く。典型的には、かかる定常領域はヒトである。
【０１０５】
アゴニスト抗体鎖を有し、発現するための宿主細胞は、原核生物又は真核生物のいずれであってもよい。ある好ましい実施形態では、本発明の抗体ポリペプチドを発現し、産生するため、哺乳動物宿主細胞が使用される。例えば、それらは、免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株、又は外因性発現ベクターを有する哺乳動物細胞株（例えば、下記に例示されるＴＦ−１細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞）のいずれであってもよい。これらは、任意の正常な死に至る、又は正常若しくは異常な不死の動物若しくはヒト細胞を包含する。本明細書に例示される細胞株に加えて、インタクト免疫グロブリンを分泌することが可能な多数の他の好適な宿主細胞株もまた当該技術分野で既知である。これらとして、例えば、ＣＨＯ細胞株、様々なＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、形質転換Ｂ細胞及びハイブリドーマが挙げられる。ポリペプチドを発現するための哺乳動物組織細胞培養の使用は、一般的には、例えば、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．，１９８７において考察される。哺乳動物宿主細胞に対する発現ベクターは、複製起点、プロモーター、及びエンハンサー等の発現制御配列、並びにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位等の必要なプロセッシング情報部位、及び転写終結配列を包含し得る。これらの発現ベクターは、通常、哺乳動物遺伝子又は哺乳動物ウイルスに由来する。好適なプロモーターは、構成型の細胞型特異的、ステージ特異的、及び／又は調節可能若しくは制御可能であってもよい。有用なプロモーターとして、これらに限定されないが、本明細書で例示されるＥＦ１及びヒトＵｂＣプロモーター、メタロチオネインプロモーター、構成型アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ  ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成型ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（ヒト前初期ＣＭＶプロモーター等）、構成型ＣＭＶプロモーター、及び当該技術分野で既知のプロモーター−エンハンサーの組合せが挙げられる。
【０１０６】
目的のポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入するする方法は、細胞宿主のタイプによって変化する。例えば、塩化カルシウム形質転換は原核細胞生物に対して一般的に利用されるが、他の細胞宿主に対しては、リン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションが使用され得る（一般的に、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，を参照されたい）。他の方法として、例えば、エレポトロポレーション、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介形質転換、注入及びマイクロインジェクション、ｂａｌｌｉｓｔｉｃ法、ビロソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン：核酸複合体、ネイキッドＤＮＡ、人工ウイルス粒子、ヘルペス構造タンパク質ＶＰ２２への融合（Ｅｌｌｉｏｔ  ａｎｄ  Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｃｅｌｌ  ８８：２２３，１９９７）、薬剤により増強されたＤＮＡの取り込み、並びにｅｘ  ｖｉｖｏ形質導入が挙げられる。長期に亘る高収率の組換えタンパク質の産生のため、安定な発現が望まれることが多い。例えば、安定に抗体鎖又は結合フラグメントを発現する細胞株を、複製のウイルス領域又は内因性の発現要素及び選択可能なマーカー遺伝子を含有する本発明の発現ベクターを使用して調整することができる。ベクターの導入に続き、選択培地に交換する前に、細胞を富化培地中で１日〜２日成長させてもよい。選択可能なマーカーの目的は、選択するための体制を与えることであり、その存在により、選択培地において導入された配列の発現に成功する細胞の成長を促す。耐性の安定に形質移入された細胞を、細胞型に適した組織培養技術を使用して増殖させることができる。
【０１０７】
［実施例］
以下の実施例は、本発明のさらに解説するために提供されるが、その範囲を限定するものではない。本発明の他の変化は、当業者に容易に明らかであり、添付の特許請求に包含される。
【０１０８】
［実施例１］
アゴニスト抗体の機能性選択のための材料及び方法
この実施例は、Ｅｐｏアゴニスト抗体の選択に採用される幾つかの材料及び方法を記載する。
【０１０９】
細胞株。ＴＦ−１細胞株を、１０％ウシ血清（ＦＣＳ）（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ペニシリン及びストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）並びに２ｎｇ／ｍＬ  ＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有するＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に維持した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を、１０％ＦＣＳ、ペニシリン及びストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＤＭＥＭ培地中に維持した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞株を、４ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘを含むＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に維持した。
【０１１０】
プラスミドの構築。レンチウイルスコンビナトリアルライブラリの作製及びｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質の発現のため、ツールキットプラスミドを構築した。プラスミドの各特性を、図７に示されるベクターマップに標識する。全てのベクターを、抗体遺伝子が単純なＳｆｉｌ消化及びライゲーションによりそれらの間で交換され得るように設計した。
【０１１１】
レンチウイルスコンビナトリアルライブラリの構築。ファージミドプラスミドと互換性の一対のＳｆｉｌ部位をレンチウイルスベクターに導入した。ファージで感染された微生物を３０℃で播種した。ファージミドを単離した微生物から直接に調製した。ファージミドをＳｆｉｌで消化し、約８００ｂｐのインサートをＳｆｉｌで消化したレンチウイルスベクターにライゲートした。
【０１１２】
ＳｃＦｖ−Ｆｃ融合発現ベクターの構築。ｓｃＦｖ及びヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（ヒンジからＣＨ３）をコードする遺伝子をオーバーラップＰＣＲにより融合し、ｐＦＵＳＥタンパク質発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。
【０１１３】
ｂｓＡｂ発現に対する「Ｋｎｏｂｓ−Ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅ」ＣＨ３突然変異体の操作。残基Ｔ３６６Ｙ及びＹ４０７Ｔを含有する免疫グロブリン分子のＣＨ３領域を、ＳｃＦｖ−Ｆｃ融合発現ベクター中に別々に構築した。突然変異は、アミノ酸残基及び番号の後に置換されたアミノ酸により表示される。
【０１１４】
ｓｃＦｖ−Ｆｌａｇ発現ベクターの構築。ｆｌａｇタグに対応するオリゴヌクレオチドを合成し、アニーリングして、ｓｃＦｖ−Ｆｃ発現ベクターにライゲートし、Ｆｃと置換した。ＥｐｏＲ及びＧＦＰが同時に翻訳されるようにＴｈｏｓｅａａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）を含有するコンストラクトを作製するため、ペプチドＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３１）及びＧＦＰをコードするＥｐｏＲ及びＴ２Ａオリゴヌクレオチドを、オーバーラップＰＣＲにより会合させて、ＵｂＣプロモーターを含有するレンチウイルスベクターにクローニングした。
【０１１５】
ファージ中のコンビナトリアル抗体ライブラリからのＥｐｏＲ結合抗体の選択。２つのパニングのプロトコルが使用された。最初に、ファージ中のコンビナトリアル抗体ｓｃＦｖライブリを、磁性プロテインＧビーズ（ＮＥＢ）を使用し、第１回においてＥｐｏＲ  ＥＣＤ  Ｆｃ融合タンパク質について選択した。第２及び第３回では、Ｎｉｃｋｅｌ被覆磁性ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してファージをＥｐｏＲ  ＥＣＤ−ｈｉｓタグ単量体タンパク質について選択し、グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）により溶出した。第２のプロトコルでは、ファージにおいてディスプレイされたコンビナトリアル抗体ｓｃＦｖライブラリを、ＥｐｏＲ外部ドメインＦｃ融合タンパク質と共にインキュベートした。ファージ抗体−ＥｐｏＲ複合体を磁性プロテインＧビーズにより捕捉し、結合していないファージを洗浄により除去した。結合したファージをＥＰＯ又はグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）のいずれかで溶出した。ＸＬ１−ブルー細胞を溶出したファージで感染し、３０℃にて終夜成長させた。プレートから微生物をかき取り、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３を添加して、次回のパニングのためファージを増幅した。第２回及び第３回のパニングに先立って、ファージを無関係なＩｇＧ１と予めインキュベートし、Ｆｃに結合したファージを除去した。ファージをＥｐｏＲ  ＥＣＤ  Ｆｃ融合タンパク質に対して選択し、結合したファージをＥｐｏのみで溶出した。各プロトコルからの４８のクローンを採取し、それらのＥｐｏＲへの結合能をファージＥＬＩＳＡにより分析した。選択したファージミドをＳａｎｇｅｒシーケンシングにより配列決定した。配列をＶｂａｓｅ２により分析した。重鎖ＣＤＲ３ｓをＣｌｕｓｔａｌ  Ｘとアラインし、Ｎｊｐｌｏｔを用いて系統樹を構築した。
【０１１６】
レンチウイルスの調製。１：１：１の比率でレンチウイルスベクターとｐＣＭＶＤ８．９及びｐＶＳＶｇウイルスパッケージングベクターとを同時に形質移入することにより、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてウイルスを産生した。ウイルスを含有する上清を形質移入の４８時間後に回収した。細胞残屑を遠心分離及び０．２２μｍのＰＥＳメンブレンＦｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通す濾過により除去した。レンチウイルスプレップの力価を、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ｐ２４  ＥＬＩＳＡｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して測定した。ウイルス調製物を分割して８０℃で凍結した。
【０１１７】
レンチウイルスによるＴＦ−１細胞の形質導入。レンチウイルスを、５μｇ／ｍＬのポリブレン及び２ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦを含有する１ｍＬの培地中のＴＦ−１細胞に添加した。レンチウイルス及び細胞の混合物を３０℃にて９０分間、１２００ｇで遠心分離して「ウイルス接種（Ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）」を行った。細胞をレンチウイルスと共に３７℃で終夜インキュベートした。過剰のウイルスを除去し、次の日ＧＭ−ＣＳＦ不含の新しい培地を添加した。
【０１１８】
免疫蛍光染色。細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）により室温で２０分間固定し、ブロックし、１ｎｇ／ｍＬの抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ：ＰＥ抗体で室温にて３０分間染色した。また、細胞をＰＢＳ中０．１％Ｔｒｉｔｏｎで室温にて２０分間透過処理し、抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ：ＰＥ抗体と共に室温にて３０分間インキュベートした。ブロッキング溶液中で１５分間に亘り３回洗浄した後、Ｚｅｉｓｓ倒立型蛍光顕微鏡を使用して画像を回収した。
【０１１９】
メチルセルロース系培地を使用するコロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイによるＥｐｏＲアゴニスト抗体の選択。野生型ｈＥｐｏＲ過剰発現ＴＦ−１細胞（ＴＦ−１／ｈＥｐｏＲ）を２の感染多重度（ＭＯＩ）でレンチウイルス抗体ライブラリにより形質導入した。このＭＯＩは、抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ：ＰＥ抗体による免疫蛍光分析によって測定される８０％形質導入効率をもたらした。抗体ライブラリを用いて導入されたＴＦ／ｈＥｐｏＲ細胞を、メチルセルロースの最終濃度が１．２７％であり、細胞濃度がおよそ３×１０４細胞／ｍＬになるように、メチルセルロース培地に添加した。１．５ｍＬの細胞懸濁物を３５ｍｍ径のディッシュに添加した。軟寒天中で細胞を２週間〜３週間培養した。マイクロマニピュレーター（モデルＭＭ３３Ａ／Ｌ  Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ）により補助してコロニーを採取し、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｋを含有する溶解バッファーにより５０℃で１時間溶解した。各コロニーに由来する抗体遺伝子を、本発明者らのレンチウイルスベクターのために別注したプライマー対を用いるＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲを、ＵＶ３  ＴＥＰＡ  ＰＣＲキャビネット（ＴＳＳ  ｉｎｃ．）で行った。増幅した抗体遺伝子を電気泳動により分析し、回復した。Ｓｆｉｌによる消化の後、遺伝子をレンチウイルスベクターにライゲートし、Ｘｌ−１ブルーバクテリアを形質転換した。各微生物の形質転換から選択した４つのコロニーをＳａｎｇｅｒシーケンシング（Ｅｔｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ又はＢＡＴＪ）により配列決定した。重鎖ＣＤＲ３配列をＶｂａｓｅ２により抽出した。
【０１２０】
ＴＦ−１増殖アッセイ。ＴＦ−１細胞をＲＰＭＩで洗浄して、全ての残留ＧＭ−ＣＳＦを除去し、１０％の熱不活性化ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中、１ウェル当たり２×１０４細胞で９６ウェルマイクロプレエートに播種した。形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの馴化培地、様々な濃度の精製した抗体又はＥｐｏを添加し、ウェルを１００μＬの容量にし、３７℃で７２時間インキュベートした。２０μＬのＭＴＳ溶液（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに添加した。２時間後、４９０ｎｍの吸光度を計測した。
【０１２１】
ＥｐｏＲ外部ドメインによる阻害。ＴＦ−１細胞を、１μｇ／ｍＬ  ＢｓＡｂ及び増加する濃度の切断された（Ｍｅｔ  １−Ｐｒｏ  ２５０）ＥｐｏＲ−Ｆｃ受容体の存在下でマイクロタイターウェルに１ウェル当たり２×１０４細胞で播種した。細胞を３７℃で７２時間インキュベートした。ＭＴＳ溶液を各ウェルに添加し、２時間後に４９０ｎｍでの吸光度を計測した。
【０１２２】
ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質及びｓｃＦｖ−ｆｌａｇタンパク質の発現及び精製。単一の抗体について、抗体発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｆ細胞に形質移入した。ＢｓＡｂについて、ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ抗体対プラスミドをＨＥＫ２９３Ｆ細胞に同時に形質移入した。プールした上清に由来する抗体を、ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓ精製装置によりＨｉＴｒａｐＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥ）を使用して精製した。ｓｃＦｖ−ｆｌａｇタグ融合タンパク質をコードするベクターを一時的な発現のためＨＥＫ２９３Ｆ細胞に形質移入した。ｓｃＦｖ−ｆｌａｇを、力流のもと抗Ｆｌａｇ  Ｍ２親和性ゲル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）パックカラムを用いて培養培地から重精製した。バッファーをＤＰＢＳ、ｐＨ７．４に交換し、４℃で保存した。
【０１２３】
リン酸化アッセイ。ＴＦ−１細胞を、５％ＦＢＳを含有し、ＧＭ−ＣＳＦを含まないＲＰＭＩ１６４０培地中で２４時間に亘り欠乏させた。５×１０６細胞を各アッセイに使用した。細胞を３７℃で３０分間、４単位／ｍｌのＥＰＯ、２ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ又は様々な濃度のＢｓＡｂを含有するＲＰＭＩ血清不含培地で処理した。細胞を１×Ｈａｌｔプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテルを含有する氷冷ＰＢＳで１回洗浄し、時折撹拌しながら５００μｌの２×Ｈａｌｔプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテルを含有するＰｉｅｒｃｅ  ＩＰ溶解バッファー中で３０分間氷上にて溶解した。細胞残屑を１３，０００ｇで１０分間遠心分離することにより除去した。抗ホスホＳＴＡＴ−５（Ｔｙｒ６９４）抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔ＃９３５６）を使用する細胞溶解物のウェスタンブロット分析により、ＳＴＡＴ−５のリン酸化状態を測定し、ゲルバンド中のタンパク質量を抗全ＳＴＡＴ−５抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔ＃９３６３）を使用して定量した。細胞溶解物の他の半分を、試料１つ当たり２μｇの抗ＪＡＫ２抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｃａｔ＃ＨＲ−７５８）と共に４℃で終夜インキュベートして免疫複合体を形成させた。室温にて１時間のインキュベーションの後、抗原抗体複合体をプロテインＡ／Ｇ磁性ビーズにより捕捉した。３回の洗浄の後、免疫複合体をＬｏｗ−ｐＨ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｃａｔ＃８８８０４）により溶出した。抗リン酸チロシン抗体（クローン４Ｇ１０  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃａｔ＃０５−３２１Ｘ）でプローブされた免疫沈降物をウェスタンブロットにより分析し、ゲルバンド中のタンパク質量を抗全ＪＡＫ２抗体により定量した。
【０１２４】
ＴＦ−１細胞分化アッセイ。ＴＦ−１細胞を、０．１ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ及びＥＰＯ（４ＩＵ／ｍＬ）又は様々な濃度のＢｓＡｂの存在下、３７℃で２週間培養した。ペレット化された細胞の色を観察した。細胞を、その後ＲＩＰＡ中で溶解し、抗ヘモグロビン抗体を使用するウェスタンブロッティングによりヘモグロビンの発現を分析した。
【０１２５】
ヒト造血幹細胞からの赤血球コロニー形成。直接的免疫磁性ＣＤ３４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｌｌ  ｃｅｌｌｓ，Ｃａｔ＃ＡＢＭ０１０）を使用してＣＤ３４＋幹細胞をヒト骨髄から単離した。ＥＰＯ（４ＩＵ／ｍＬ）又は種々の濃度のＢｓＡｂの存在下で、５０ｎｇ／ｍＬ  ｒｈ−ＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍＬ  ｒｈ−ＩＬ−３及び２０ｎｇ／ｍＬ  ｒｈ−ＩＬ−６で補充された３ｍＬのＭｅｔｈｏｃｕｌｔ  メチルセルロース培地（Ｃａｔ＃Ｈ４２３０、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に、２％ＦＢＳを含むＩｓｃｏｖｅ’ｓ  ＭＤＭ（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｃａｔ＃０７７００）中のＣＤ３４＋細胞を１：１０で希釈した。３０００〜４０００個の細胞を３５ｍｍディッシュに２連で播種し、１４日目にコロニー形成を採点した。
【０１２６】
生物層干渉（ＢＬＩ）を使用する動的特性評価。Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ  Ｉｎｃ．）を使用して実験を行った。ｓｃＦｖ  Ｆｃ融合タンパク質を抗ヒトＩｇＧ  Ｃａｐｔｕｒｅ（ＡＨＣ）Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（動的グレード  Ｃａｔ＃１８−５０６０）を用いて補足した。精製したＥｐｏＲ外部ドメイン単量体タンパク質の滴定シリーズを、会合／解離サイクルにおける固定化ｓｃＦｖ  Ｆｃに対して計測した。データセットを１：１結合モデルに適合させてｋａ、ｋｄ及びＫｄを決定した。
【０１２７】
［実施例２］
コンビナトリアルライブラリからのＥｐｏＲ結合抗体の単離
上記方法の初期の目的は、抗体が細胞質に含有されるか、分泌されるいずれかである真核生物細胞内で可能な限り大きな抗体ライブラリを発現することであった。より大きな自由度を与える方法でこれを成し遂げるため、本発明者らは、Ｍ−１３ファージ及び抗体遺伝子が容易に入れ替えられ得るように構築されたレンチウイルスベクターの両方を使用した（図７）。一般に、この問題に対しては、標的が既知であるかどうかによって２つのアプローチが存在する。標的タンパク質に対する抗体について富化し、その後、選択された遺伝子をレンチウイルスへと切り替えるためにファージ中のコンビナトリアル抗体ライブラリの従来のパニングを使用してもよいが、我々は、予備選択せずに直接的にレンチウイルスライブラリを使用することができた（図１）。ファージ系が、真核生物系において可能であるよりも大きな多様性空間（およそ１．０×１０１１）を調べることができるため、ファージ中の初期選択は、標的が既知である場合には最適である。しかしながら、経路の分子構成成分についてあまり知られていない場合、真核生物細胞における直接的な表現型の選択は好ましい選択肢である。ここに報告される実験では、エリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）がエリスロポエチン（ＥＰＯ）の標的であることは既に知られており、したがって、本発明者らは、最初に、ファージ中のコンビナトリアルライブラリからＥｐｏＲに結合した抗体を選択した。ＥｐｏＲの正しい配置に対して抗体を選択することは重大である可能性があることから、溶液中のパニングのみを試みた。標的タンパク質は、Ｆｃ融合又はＨｉｓタグ化単量体ＥｐｏＲとして構築されたＥｐｏＲ二量体であった。２つの異なるプロトコルを使用した。最初のプロトコル（Ｐ１）を、ＥＰＯ結合部位と直接的に競合的ではないエピトープに取り組むため設計したが、なおも二量体において利用可能であった。最初の２回のパニングは、ＥｐｏＲ二量体−Ｆｃ融合とＨｉｓタグ化単量体ＥｐｏＲの間で変更した。これらの回の後、コンストラクトのＦｃ領域を標的とする全ての残渣ファージを排除するため単量体ＥｐｏＲを使用する第３回が続いた。グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）を使用して結合したファージを溶出した。そのため、第１回において、ＥｐｏＲ二量体Ｆｃ融合タンパク質に結合した全ての抗体を選択し、第２回においては、その活性がＦｃ融合パートナーに依存する抗体を除外するため、プールを狭くした。ＥＰＯＲ二量体Ｆｃ融合に付着した第２プロトコル（Ｐ２）ファージをプロテインＧビーズ上に回収し、その後、ＥＰＯにより特異的溶出を行った。ＥｐｏＲのＥＰＯ結合部位を結合するかそれに近い抗体を富化するため、このプロトコルを使用した。パニング結果をサンプリングするため、吸着したＨｉｓタグ化単量体ＥｐｏＲを抗原として使用して、各プロトコルからの４８クローンをファージＥＬＩＳＡ用に無作為に選んだ。各手法によるクローンの約半分は、ＢＳＡに対する非特異的結合と比べて、ＥｐｏＲに特異的に結合した。ファージＥＬＩＳＡにより測定される範囲が存在する。反応性クローンの配列分析は、２１の異なるファミリーに配置され得ることを示した。あるケースでは、両方のプロトコルを使用して同じ抗���を選択したが、他方では選択された抗体は、１つのプロトコルのみに由来した（Ｐ１対Ｐ２）。
【０１２８】
［実施例３］
アゴニスト抗体の選択
各プロトコルによりファージにおいて選択されたＥｐｏＲに結合した抗体をコードする遺伝子を、本発明者らが野生型ＥｐｏＲを過剰発現するように操作したＴＦ−１細胞に感染させるために使用されるレンチウイルスに別々に移した。ＴＦ−１細胞における野生型ＥｐｏＲ（ｗｔ  ＥｐｏＲ）の発現は、持続的な細胞成長にそれらの内因性の切断されたＥｐｏＲに対して必要な補足物である。ＥｐｏＲの発現の研究を促進するため、ｗｔ  ＥｐｏＲ及びＧＦＰをＴ２Ａリンカーにより連結した（図７）。ＥＦ１α又はＵｂＣプロモーターのいずれかを使用してＥＦレンチウイルスにより感染された細胞における抗体の発現を、ウェスタンブロット分析により分析した（図２Ａ）。発現された抗体の量は、ＥＦ１αプロモーターの場合より高かった（図２Ａ）。
【０１２９】
成長にＥＰＯを必要とするｗｔ  ＥｐｏＲを発現するため操作されたヒトＴＦ−１細胞。あらゆる発現抗体がＥＰＯに代わることを決定するため、感染された、及び対照の細胞をＥＰＯ不含軟寒天に播種し、赤色コロニーの成長について１４日後に観察した（図２Ｂ）。抗体をコードするウイルスで感染された細胞のみが赤色コロニーを生じた（図２Ｂ）。ＧＦＰをコードするに過ぎない対照ベクターはいかなるコロニーの成長も誘導しなかったという事実により、観察されたコロニーの成長は、レンチウイルスゲノムの組込みにより誘導される挿入変異の結果ではないことが示された。真正のＥＰＯが播種された細胞のほとんどで成長を誘導したのに対し、８０％より多い細胞が感染されているにもかかわらず、抗体遺伝子のみを含有する細胞の成長は、ほとんど見られなかった。感染細胞に由来する３３のコロニーを選び、抗体遺伝子をＰＣＲにより回復し、レンチウイルスベクター中にクローニングした（図７）。抗体ＣＤＲ３領域をコードする遺伝子を分析して、所与のクローン中の異なる配列の数を決定した。この分析は、各コロニーから１つ及び４つの異なるレンチウイルスが取得されたことを示す。ＥｐｏＲに結合したファージから単離された抗体遺伝子の初期配列が利用可能な多様性のサンプリングのみであることから、幾つかの新たな配列は、レンチウイルス感染により選択されたクローンにおいて見出された。
【０１３０】
トロンボポエチン（Ｔｐｏ）のアゴニスト抗体を選択するため、同様の実験を行った。蛍光マーカーをコードするキメラ受容体により構築されたＴｐｏ受容体細胞株における抗体ライブラリの実験に続き、蛍光活性化細胞ソーティングによりＴｐｏ模倣抗体を選択した。詳細は以下を参照されたい。
【０１３１】
［実施例４］
選択された抗体のＥｐｏ刺激活性
レンチウイルスによりコードされる抗体を、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の一時的な形質移入により産生し、ＴＦ１細胞の増殖を誘導する能力について検査した。２つの抗体は、活性型ＥｐｏＲアゴニストであり、真正ＥＰＯのおよそ６０％の活性を有した。それら２つの抗体は異なる日に異なるコロニーから採取されたが、同じ配列を有する（図３Ａ）。
【０１３２】
［実施例５］
選択されたＥｐｏアゴニスト抗体の絶対的二重特異性
多くのコロニーが１より多い抗体を発現したため、観察されたアゴニスト活性が異なる抗体特異性間の相互作用に依存するという可能性があった。この考えを試験するため、同じコロニーに由来する２つの抗体で形質移入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の馴化培地を、ＭＴＳアッセイにより細胞増殖について観察した。例えば、抗体配列Ａ、Ｂ及びＣを有するコロニーに対して、同時形質移入ペアはＡＢ、ＡＣ及びＢＣを包含した。合計４９の組合せを試験した（図３Ｂ）。これらの組合せの幾つかは、著しく増強されたアゴニスト活性を与え、１つ（Ｖ−１／Ｖ−３）は真正ＥＰＯと同じくらい強力であった（図３Ｂ）。
【０１３３】
これらの相互作用効果に対して２つの可能性のあるルートが存在する。１つのシナリオでは、２つの異なるホモ二量体抗体分子が、単に効果において添加的である可能性がある。しかしながら、ここで使用されるｓｃＦｖが免疫グロブリン分子のＦｃフラグメントに融合されるフォーマットのため、１つより多い抗体を発現するヘテロ二量体が細胞内で形成されるという別の可能性が存在する。
【０１３４】
観察された相乗作用の分子性を決定するため、本発明者らは、２つの異なる結合特異性が同じ免疫グロブリン分子中に存在しなければならないのか否かを研究した。可能な抗体の組合せを精製するため、ホモ二量体抗体又はそのパートナーがＦｃフラグメントの「ｋｎｏｂ  ｉｎ  ｈｏｌｅ」工学により指示されるヘテロ二量体（Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９：６１７，１９９６）のいずれかをコードする発現ベクターで細胞を形質移入した。「ｋｎｏｂ  ｉｎ  ｈｏｌｅ」工学は、２つの異なる単量体のＦｃ部分のＣＨ３領域へＴ３６６Ｙ突然変異及びＹ４０７Ｔ突然変異をそれぞれ導入することによるヘテロ二量体形成を促進する。幸いにも、可能性のある抗体パートナーはわずかに異なる大きさであるため、プロテインＧクロマトグラフィーの後の「ｋｎｏｂｓ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅコンストラクト」の純度をアクリルアミドゲル分析により確認することができた（図４Ａ）。精製された抗体は全てＥｐｏＲに結合したが（図４Ｂ）、個別の抗体又は２つの異なる抗体の単純な混合物のいずれもが、いかなるアゴニスト効果も有しなかった（図４Ｃ）。しかしながら、２つの特異性が単一の抗体分子中で組み合わされた場合、上記タンパク質は、複数の抗体種が同時の形質移入により細胞内で作製された場合に見られるのと等しい強力なＥＰＯ様活性を有した（図４Ｃ）。二重特異性ヘテロ二量体抗体及びＥＰＯの最大応答は同様であった（図４Ｃ）。重要なことには、ホモ二量体抗体の１つ（抗体Ｅ−１）が約６０％の最大のアゴニスト効果を示したという事実にもかかわらず（図４Ｃ）、どのホモ二量体抗体とも異なり、ヘテロ二量体二重特異性抗体（Ｖ−１／Ｖ−３）は完全アゴニストであった。アゴニスト効果の特異性を、精製したＥｐｏＲ外部ドメインにより完全に阻害され得ることを示すことにより確認した（図４Ｄ）。さらに、抗ＥｐｏＲ抗体の結合特異性を、トロンボポエチン受容体を包含する他のタンパク質と反応しないことを示すことにより確認した。
【０１３５】
様々な抗体コンストラクトのアゴニスト活性を確認するため、ヘモグロビン合成及びタンパク質リン酸化を誘導する能力をＴＦ−１細胞及びＴＦ−１  ｗｔＥｐｏＲ細胞において研究した（図５Ａ〜図５Ｂ）。ヘテロ二量体二重特異性抗体はヘモグロビン合成を誘導し（図５Ａ）、ＥＰＯ又はＧＭ−ＣＳＦのいずれかのそれら自体よりも大きなＪＡＫ−２及びＳＴＡＴ−５のリン酸化を誘導した（図５Ｂ）。ＧＭ−ＣＳＦがＴＦ−１細胞の維持に必要とされることから、ＪＡＫ−２及びＳＴＡＴ−５のリン酸化に対するその効果も追加の陽性対照として研究した（図５Ｂ）。
【０１３６】
［実施例６］
選択されたＥｐｏアゴニスト抗体の非対称性の共同性
コンポーネント抗体の結合パラメーターの生物層干渉分析は、ＥｐｏＲに対して各々が結合したことを示し、Ｖ−３が４５ｎＭの親和性と比べてＶ−１が２６ｎＭの親和性を有した。ＥｐｏＲに対する結合について、真正ＥＰＯは抗体Ｖ−３とは競合するが、Ｖ−１とは競合せず、ＥＰＯ結合部位の付近で１つの抗体のみが結合し、他方は他の場所で結合したことを実証した。そのため、異なる方法ではあるが、ＥＰＯ及び二重特異性抗体の両方が、完全アゴニスト活性に必要なＥｐｏＲへの絶対的な非対称性結合を達成する。ＥＰＯの場合、非対称性は、ホモ二量体ＥｐｏＲの単一の部位に対する異なる親和性により結合する２つの異なる界面（部位１及び部位２）の使用により達成される（Ｗａｔｏｗｉｃｈ，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｍｅｄ．５９：１０６７，２０１１）。対照的に、ヘテロ二量体二重特異性抗体は、ＥｐｏＲ上の異なる部位と相互作用するためのその２つの結合特異性を使用して、非対称を達成する（図６）。
【０１３７】
２つの異なる特異性間の結合共同性の特徴を決定するため、各抗体が他方のＥｐｏＲ単量体に対する結合に対して有する効果の研究を可能とする競合実験を設計した。そのため、非標識化ｓｃＦｖ−ｆｌａｇ融合とビオチン化ｓｃＦｖ−ｆｌａｇ融合の間の競合をＨＲＰ標識化ストレプトアビジンによりモニターして、１つの抗体の他方のオフ率に対する結合効果を計測する。予想したように、二量体の各アームに同じ特異性を有するホモ二量体抗体対は互いに競合した。この知見は、互いに競合しない異なる特異性を有するホモ二量体対に関する結果と著しい対照をなし、ここでも、それらがＥｐｏＲの異なる領域に結合したことを確認した。また、この結果は、２つの異なる抗体がアロステリックパターンでないことを示す。
【０１３８】
［実施例７］
ヒト骨髄幹細胞の誘導
本発明者らが研究したＴＦ−１細胞は、様々なサイトカイン（３０）の活性をアッセイするため広く使用されている。しかしながら、骨髄における実際の赤血球前駆細胞を忠実に表していない可能性がある。そのため、本発明者らは、本発明者らのアゴニスト抗体がヒト骨髄造血幹細胞から赤血球形成を誘導したことを実証することを望んだ。二重特異性アゴニスト抗体を使用して、ヒト骨髄から新しく単離されたＣＤ３４＋幹細胞を刺激した。１週間後、細胞増殖及びヘモグロビン合成が既に明らかであった（図５Ｃ）。上記結果をより定量的な基準に置くため、誘導されたコロニー数を１４日後に数えた。真正のＥＰＯ及び二重特異性抗体は、およそ同じ数のコロニーを誘導したことが見出された。
【０１３９】
［実施例８］
トロンボポエチン（Ｔｐｏ）アゴニスト抗体の選択
本実施例は、完全なトロンボポエチンフェノコピーである抗体アゴニストの選択を記載する。上記抗体を、細胞複製よりも細胞経路の活性化について直接的に選択した。以下に詳述されるように、選別法は、単一細胞レベルではたらく蛍光レポーター系を利用した。上記レポーター系は、シグナル伝達経路の活性化に基づき、真正Ｔｐｏにより活性化される全ての下流経路に関与する抗体アゴニストを数週間のうちに直接的に選択することを可能とする。それらの標的と共に候補アゴニスト分子をコードする遺伝子の同時パッケージングが存在することから、各細胞はそれ自身に関する選択系である。
【０１４０】
キメラＴｐｏＲレポーター系の構築：ｗｔＴｐｏＲを選択可能なマーカーとして発現する細胞の成長を使用して、可能性のある抗体アゴニストを研究することができた。しかしながら、かかる系は、調べられ得る選択可能な事象の数が大多数のライブラリからの可能性のある入力事象と一致しないことから、それほどロバストではない。また、かかる選択は、アゴニストの不在下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで持続する細胞増殖を有する突然変異細胞の出現により引き起こされる高いバックグラウンドにより混同され得る。観察可能な事象の数を増加するため、本発明者らは、単一細胞レベルでスクリーニングを可能とする蛍光レポーター系を構築した。Ｓｉｓ誘導性要素（ＳＩＥ）プロモーター配列の制御下の組み込まれたベータ−ラクタマーゼ遺伝子を含有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞株により開始して、Ｔｐｏに反応性であった２つのレポーター細胞株を構築した。これらのＨＥＫ２９３Ｔ（Ｓｉｅ−ｂｌａ）細胞は、Ｊａｋ−Ｓｔａｔシグナル伝達経路を介してＩＬ６によって活性化され得る。残念ながら、Ｔｐｏは、これらの細胞において野生型Ｔｐｏ受容体（ＴｐｏＲ）がそれらに導入された場合であっても、発生期の蛍光レポーター系を活性化しない。この問題を克服するため、本発明者らは、２つの異なる交差点でＴｐｏＲ外部ドメインをＩＬ６ｓｔ（ｇｐｌ３０）シグナル伝達する細胞内ドメインまでスプライシングすることによりキメラ受容体を構築した。ある１つの場合には、Ｎ末端からｂｏｘＩ領域のＴｐｏＲの外部ドメイン（アミノ酸１〜５２７）は、ｂｏｘＩ領域の後からＣ末端のＩＬ６ｓｔシグナル伝達する細胞内ドメイン（アミノ酸６５１〜９１８）に連結された。代替的には、Ｎ末端から膜貫通へリックスの前のＴｐｏＲ外部ドメイン（アミノ酸１〜４９１）は、膜貫通へリックスからＣ末端までのＩＬ６ｓｔドメイン（アミノ酸６０５〜９１８）に連結される。Ｔｐｏがこれらのキメラ受容体のＴｐｏＲ外部ドメインに結合すると、それらの細胞内ＩＬ６シグナル伝達成分は結合されて、特有のＦＲＥＴに基づく蛍光シグナルの発生により検出され得る経路の活性化へと導く。実際、これらのキメラ受容体を含有する細胞は、そのときには、フローサイトメトリー、細胞内のＯＤ４６０ｎｍ〜ＯＤ５３０ｎｍの分析比、及び形質導入された細胞の蛍光顕微鏡法により測定されるＴｐｏに応答性であった。シグナルを発現する細胞を蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により容易に選択することができ、それにより活性化されたクローンの選択的な回復を可能とした。最初の構築は、最も強力な蛍光発光の増強を与え、ｂｏｘ１要素は効率的なシグナル伝達に重要であることを示し、さらなる実験に使用された。
【０１４１】
単一細胞フォーマットの検証：本発明者らが単一細胞選択フォーマットを使用することを望んだため、２つの戦略を使用して、抗体をそれを産生した細胞に制限した。１つでは、細胞を薄層のアガーで被覆して抗体が隣接する細胞へと拡散するのを制限した。他方では、Ｅ．Ｒ．内腔に保留されるように、小胞体（Ｅ．Ｒ．）保留シグナルペプチドであるリジン−グルタミン酸−アスパラギン酸−ロイシン（ＫＥＤＬ）を抗体分子のＣ末端に付け加えた。
【０１４２】
ファージ中の抗体候補を、２回のパニングにより精製されたＴｐｏＲに結合する能力について最初に選択した。選択された抗体を、ファージＥＬＩＳＡにより特性評価し、その後、陽性クローンのサンプリングの核酸配列決定を行った。２２の配列を回復した。これらの中から、２つの異なる配列がそれぞれ３回及び９回反復されていることを見出し、強力な富化パラメーターであることを示した。
【０１４３】
アゴニストであった抗体を選択するため、選択されたファージの富化集団全体からの抗体遺伝子をレポーター細胞の感染のためのレンチウイルスベクターへと移した。抗体遺伝子はゲノムへと組み込まれるため、各候補抗体は、単一のレポーター細胞へと連結されたまま残される。抗体ライブラリの分析に先立って、ＦＲＥＴ基質に暴露した後のシグナル誘導の観察のための最適な時間を、動的分析により決定した。具体的には、キメラ受容体を発現する細胞を、Ｔｐｏ又はＴｐｏＲからのグリシン溶出の後ファージから回復された遺伝子を含有するレンチウイルス抗体ライブラリを用いて形質導入した。形質導入の後異なる時間点で、細胞を回収し、ＦＲＥＴ基質をロードした。フローサイトメトリーにより細胞を分析した。非処理又はＴｐｏ処理を陰性対象として使用した。２０時間当たりで最大４６０ｎｍの発光を観察し、４８時間までに消失した。
【０１４４】
抗体ライブラリの分泌フォーマットでの感染から１６時間後、レポーター細胞をＦＲＥＴ基質と共にインキュベートし、フローサイトメトリーによりソートした。ＴｐｏＲに対して２回のパニングの後選択された抗体により感染された細胞の誘導頻度を、ナイーブの選択されていないライブラリで感染された細胞の誘導頻度と比較した。真正Ｔｐｏを陽性対照とした。予想されるように、ＴｐｏＲについて予め選択された抗体は、選択されていないライブラリに由来するものよりもはるかに多い細胞を誘導した。
【０１４５】
個々の蛍光発光細胞をマイクロタイターウェルに入れ、コンフルエントまで成長させた。どれがｗｔＴｐｏＲを含有する細胞の増殖及びキメラ受容体を含有するレポーター細胞における蛍光の発生の両方により測定される活性な抗体を産生したかを試験するため、これらのクローンから採取された成長培地を使用した。２つのアッセイに対して強い正の相関があった。細胞増殖アッセイは選択に関してロバストではないが、一旦候補アゴニストが得られれば有用なアッセイであることに留意されるべきである。活性な抗体を産生していた選択された細胞クローンからの抗体遺伝子をＰＣＲにより回復し、シーケンシングのためｐＦＵＳＥ哺乳動物発現ベクターへとクローニングした。大半のクローンは、多くの異なるクローンで非常に反復された単一の配列を保持した。本発明者らのＥＰＯ系の研究において先に見られたように、幾つかのクローンは１つより多い配列を有し、使用された感染多重度と一致した。
【０１４６】
上記系は、様々な細胞内コンパートメントに存在する活性な抗体が選択され得る場合に最も有用であろう。これを試験するため、１つのアゴニスト抗体（３Ｄ９）を分泌フォーマット及びＥ．Ｒ．保留フォーマットの両方で構築した。保留シグナルを保持する抗体の細胞内での束縛は、成長培地の分析及びそれを産生する細胞に由来する細胞溶解物の分析により確認された。Ｅ．Ｒ保留配列を有する抗体は、細胞溶解物中に高濃度で存在したが、成長培地中には検出されなかった。対照的には、分泌シグナルを有した大量の抗体が、成長培地中に存在した。細胞の誘導は、両方のフォーマットにより発現された抗体について観察された。これらの結果は、おそらく、Ｅ．Ｒ内腔に保持されるか、原形質膜中に埋め込まれるかに関わらず、受容体が同じ全体的なトポロジーを有することから、分泌が細胞内で発現された抗体による受容体の活性化に絶対的ではないことを示す。分泌経路では、受容体活性部位はＥ．Ｒ内腔に配置され、一方、原形質膜に埋め込まれた場合には細胞外環境に向くが、両方の場合でシグナル伝達ドメインは細胞質に向く。
【０１４７】
選択された抗体による血栓形成：最も活性な２つの抗体（３Ｄ９及び１４Ｆ１２）をＨＥＫ２９３Ｆ細胞で発現させ、プロテインＧ親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。上記抗体のＥＣ５０を、細胞増殖及び蛍光レポーターアッセイの両方を使用して決定した（図８Ａ及び図８Ｂ）。両抗体は完全アゴニストであった。短期間の蛍光発光アッセイでは、抗体３Ｄ９及び１４Ｆ１２のＥＣ５０は、内因性タンパク質アゴニストＴｐｏが約２０ｐＭであるのに比べて、それぞれ、およそ１０ｐＭ及び５００ｐＭであった。対照的に、長期の増殖アッセイでは、抗体３Ｄ９及び１４Ｆ１２のＥＣ５０は、このアッセイにおいてＴｐｏが７０ｐＭのＥｃ５０を有するのに比べて、それぞれ５ｐＭ及び５０ｐＭである。これらのアッセイにおける相違は、真正Ｔｐｏが約２０時間〜約４０時間の半減期であるのに比べて、血清中で数週間の半減期を有し得る抗体分子のより優れた安定性を反映する可能性がある。抗体及びＴｐｏが同時にＴｐｏＲにおいて作用したのかどうかを判定するため、本発明者らは、異なるアゴニスト抗体及び真正Ｔｐｏの間に相乗作用があったのかどうかを研究した。相乗作用は観察されず、内因性アゴニストＴｐｏ及びアゴニスト抗体の活性は、両者が準最大濃度で採用された場合に単に追加的であり、アゴニスト抗体及びＴｐｏが異なる相互に排他的な結合部位に結合するか、又はＴｐｏＲ中の同じ結合部位に結合することを示す。
【０１４８】
抗体がヒト骨髄幹細胞から巨核球形成を誘導し得るかどうかを特定するため、新しいＣＤ３４陽性細胞を抗体又はＴｐｏで処理し、白血球マーカーであるＣＤ４５  ＲＡと比較して巨核球マーカーであるＣＤ４１に対する抗体を使用するフローサイトメトリーにより分析した。３Ｄ９及びＴｐｏの両抗体は、ヒト幹細胞から巨核球を顕著に誘導した。これらの研究は、異なるチャネルを使用する共焦点顕微鏡画像法、並びに各染色及びフローサイトメトリーを使用する成熟な巨核球の特徴的な多核特性の計測により確認された。
【０１４９】
Ｔｐｏによる細胞の活性化は、Ｊａｋ２−Ｓｔａｔ３／Ｓｔａｔ５、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ、及びＭＡＰＫ経路が関与するタンパク質リン酸化の特徴的なパターンにより完遂される。本発明者らは、非修飾ＨＥＫ２９３Ｔ（Ｓｉｅ−ｂｌａ）細胞と異なり、Ｔｐｏに反応し得る野生型ヒトＴｐｏＲを発現したＢＡＦ−３細胞を使用するこれらの経路を活性化するＴｐｏ及びアゴニスト抗体の両方の能力を研究した。重要なことには、アゴニスト抗体は、真正Ｔｐｏのように、３つ全ての経路を活性化し、それらの作用機序が類似していることを示した（図９）。他の研究におけるように、抗体３Ｄ９は、抗体１４Ｆ１２よりも低いＥＣ５０を有した（ｗａｓ  ｈａｄ）。
【０１５０】
全体的な機構的な類似性の直交する基準として、細胞増殖アッセイを使用して高特異的キナーゼ阻害剤を研究した。アゴニスト抗体及び真正Ｔｐｏが同じ経路上で動作する場合、阻害のプロファイルも同じでなければならない。本発明者らは、ホスファチジルイノシトール３（ＰＩ３）、Ｊａｋ２、及びＭＥＫ−１媒介経路に特異的なキナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２、ＰＤ９８０５９及びＳＤ−１０２９を研究した。アゴニスト抗体及び真正Ｔｐｏの両方により誘導された細胞増殖は、ＰＩ３Ｋ及びＪＡＫ２により用量依存方式で阻害されたが、ＭＥＫ−１阻害剤によっては阻害されず、ここでもそれらが類似する経路を活性化することが示された。
【０１５１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの血小板形成の活性化：齧歯類とヒトのＴｐｏＲｓ間には高い配列類似性がある。この関連性は、マウスにおける本発明者らのアゴニスト抗体の活性の研究を実現可能なものとし、それによりそれらの推定上の治療的有用性の評価を大いに簡素化する。免疫化学研究は、抗体３Ｄ９がヒト及びマウスのＴｐｏＲｓの両方と反応することを示した。また、精製されたマウス及びヒトのＴｐｏＲ外部ドメインはいずれも、アゴニスト抗体により蛍光レポーター細胞の活性化を阻害することができる。この交差反応性の利点を利用して、マウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで血小板形成を誘導するアゴニスト抗体の能力を研究した。１キログラム当たり５４０マイクログラムの単回投与で、アゴニスト抗体３Ｄ９は、８日目までに血小板カウントを３倍に増加した（図１０）。この誘導の程度は、５日間連続で１日に２回投与されたにもかかわらず、マウスでのｒｈＴｐｏによる血栓形成よりも良好である。
【０１５２】
本実施例に採用された材料及び方法のより詳細な説明は、以下に提供される。
【０１５３】
細胞株：齧歯類インターロイキン３依存性細胞株Ｂａ／Ｆ３（Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．ＡＣＣ  ３００、ＤＳＭＺ）を、１０％（容量／容量）ＦＣＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン及びストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、並びに２ｎｇ／ｍＬのｒｍＩＬ３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．４０３−ＭＬ−０１０）を含有するＲＰＭＩ−１６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で維持した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞株を、４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＦｒｅｅ  Ｓｔｙｌｅ  Ｆ１７培地で維持した。ＳＩＥ−ＢＬＡ  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．Ｋ１６４９）を１０％（容量／容量）の透析されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン、及びストレプトマイシン、非必須アミノ酸、並びにＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するＤＭＥＭで維持した。
【０１５４】
ファージ中のコンビナトリアル抗体ライブラリからのＥＰＯＲ結合抗体の選択：組換え精製ヒトトロンボポエチン受容体（ＴｐｏＲ）細胞外ドメイン（Ｓｅｒ２５〜Ｔｒｐ４９１）（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．４４４４−ＴＲ−０５０）ＥＺ−Ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチン及びビオチン化キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．２１４５５）でビオチン化し、ビオチン化タンパク質を溶液中のパニングに使用した。ファージ中のコンビナトリアル抗体ｓｃＦｖライブラリをビオチン化ＴｐｏＲ細胞外ドメインと共にインキュベートし、その後、ストレプトアビジン被覆Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．１１２０５）を添加して、ＴｐｏＲ−ファージ複合体をプルダウンした。結合していないファージを洗浄により除去した。結合したファージをトロンボポエチン（Ｔｐｏ）（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．、Ｃａｔａｌｏｇ  ｎｏ．１０３８１−Ｈ０８Ｃ）又はグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）のいずれかで溶出した。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を溶出したファージで感染させ、３０℃で終夜成長させた。微生物をプレートからかき取り、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３を添加して、次回のパニングのためファージを増幅した。各プロトコルから２４個のクローンを採取し、それらのＴｐｏＲへの結合をファージＥＬＩＳＡにより分析した。選択されたファージミドをＳａｎｇｅｒシーケンシングにより配列決定した。配列をＶｂａｓｅ２により分析した。重鎖ＣＤＲ３ｓをＣｌｕｓｔａｌ  Ｗを使用してアラインした。
【０１５５】
Ｔｐｏ応答性レポーター細胞株の樹立及びＴｐｏＲ−ＩＬ６ｓｔキメラ受容体の構築：ヒトＴｐｏＲ及びヒトＩＬ６シグナル伝達物質（ＩＬ６ｓｔ、ＧＰ１３０）細胞内ドメインで構成される２つのキメラ受容体を構築した。ある１つの場合では、ＴｐｏＲの外部ドメイン［Ｎ末端からｂｏｘＩ領域まで（アミノ酸１〜５２７）］をＩＬ６シグナル伝達物質細胞内ドメイン［ｂｏｘＩ領域の後からＣ末端まで（アミノ酸６５１〜９１８）］に連結した。代替的には、ＴｐｏＲ外部ドメイン［Ｎ末端から膜貫通へリックスまで（アミノ酸１〜４９１）］をＩＬ６ＳＴドメイン［膜貫通へリックスからＣ末端まで（アミノ酸６０５〜９１８）］に連結した。キメラ受容体を、受容体発現を制御するのにユビキチンＣプロモーター（ＵｂＣ）を使用するレンチウイルスベクターへとクローニングした。
【０１５６】
ＳＩＥ応答要素の制御下のベータラクタマーゼレポーター遺伝子を含有するＣｅｌｌＳｅｎｓｏｒ  ＳＩＥ−ｂｌａ  ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞株を、ＴｐｏＲ−ＩＬ６ｓｔキメラ受容体遺伝子を保持するレンチウイルスで感染した。形質導入された細胞を組換えＴｐｏで刺激し、Ｔｐｏに対して最も大きな応答を示す細胞（最も高いＯＤ４６０ｎｍからＯＤ５３０ｎｍの比率を有する）を、ＭｏＦｌｏ  ＸＤＰ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｏｒｔｅｒを使用する９６ウェルマイクロタイタープレートにソートした。単一細胞クローンをコンフルエントとし、単一クローンのＴｐｏに対する応答を、励起フィルタ４０９ｎｍ、並びに発光フィルタ４６０ｎｍ及び５３０ｎｍを使用する蛍光プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００Ｐｒｏ）を使用して、黒壁透明底のアッセイプレート中で計測した。最も高いＴｐｏへの応答を有するクローンをＣＲ２−９とした。
【０１５７】
ＢａＦ３／ｈＭｐｌ細胞株の樹立：野生型ヒトＴｐｏＲ遺伝子をレンチウイルスベクターにクローニングし、ＵｂＣプロモーターの制御下で発現させた。齧歯類インターロイキン３依存性細胞Ｂａ／Ｆ３を、ＴｐｏＲ遺伝子を保持するレンチウイルスにより形質導入し、細胞を２０ｎｇ／ｍＬのｒｈＴｐｏ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．２８８−ＴＰ−００５）を含有するＲＰＭＩ１６４０中で選択した。
【０１５８】
レンチウイルスコンビナトリアル抗体ライブラリの構築：ｓｃＦｖ遺伝子をファージミドベクターから切り出し、上述の入れ替え可能な非対称性Ｓｆｉｌ部位においてレンチウイルスベクターにサブクローニングした。
【０１５９】
ＦＡＣＳを使用するＴｐｏＲ抗体の単一細胞選択スクリーニング：レンチウイルスの調製中に作製された分泌抗体を、プロテインＧ磁性ビーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．Ｓ１４３０Ｓ）を使用して除去した。抗体枯渇の完全性を、ＨＲＰ複合抗ヒトＦｃ抗体を用いるウェスタンブロッティングにより確認した。Ｔｐｏ応答性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞ＣＲ２−９を形質導入の１日前に低密度で播種した。細胞をレンチウイルスで形質導入した後、終夜培養の前にメチルセルロース系培地を細胞層の上に置き、分泌された細胞がそれらを産生した細胞に制限した。細胞を採取する前に、メチルセルロース系培地を過剰な培地を使用して溶解し、廃棄した。細胞を剥がし、ＬｉｖｅＢＬＡｚｅｒ  ＦＲＥＴ  Ｇ  Ｌｏａｄｉｎｇ基質（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．Ｋ１０９５）を添加した。最も高いＯＤ５３０ｎｍに対するＯＤ４６０ｎｍの比率を有する細胞を、ＭｏＦｌｏ  ＸＤＰ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｏｒｔｅｒを使用して９６ウェルタイタープレートへとソートした。単一細胞クローンをコンフルエントし、それらから採取した馴化培地を、二次スクリーニング用のＣＲ２−９細胞を含有する３８４ウェル黒壁透明底マイクロタイターアッセイプレートに添加した。また、馴化培地をＢａ／Ｆ３−ｈＭｐｌ細胞を含有する３８４ウェルマイクロタイタープレートにおいて試験した。細胞増殖に対する効果を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ非放射性細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．Ｇ３５８０）を使用して測定した。最も高いシグナルを与えるクローンからの抗体遺伝子をＰＣＲにより回復し、配列決定のためｐＦＵＳＥ哺乳動物発現ベクターへとクローニングし、特異な抗体配列をＨＥＫ２９３Ｆ細胞に形質移入して抗体を産生した。ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓ精製装置によりＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．１７−０４０５−０１）を使用して抗体を精製した。
【０１６０】
ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）の分化：アッセイを２つの異なるドナーに由来するＨＳＣ細胞を用いて２連で行った。直接免疫磁性ＣＤ３４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄラベリングシステム（Ａｌｌ  Ｃｅｌｌｓ、ｃａｔａｌｏｇ  ｎｏ．ＡＢＭ０１０）を使用してＣＤ３４＋幹細胞をヒト骨髄から単離した。約５０，０００のＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞を、５０ｎｇ／ｍ＋のヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）のみ、又はＳＣＦと種々の濃度のヒトＴｐｏアゴニスト抗体３Ｄ９又は１４Ｆ１２で補充されたＳｔｅｍＳｐａｎ血清不含培地（ＳＦＥＭ）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．０９６００）中で１４日間培養した。免疫蛍光アッセイのため、細胞をＰＢＳ中３％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中２％ＢＳＡにおいて３０分間ブロックした。ヒト血清から精製したＩｇＧを１００μｇ／ｍＬの濃度で使用して（Ｓｉｇｍａ  Ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．１４５０６）細胞上のＦｃ受容体を１０分間ブロックした。細胞をＰＥ複合抗ヒトＣＤ４１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．３０３７０５）及びＡＰＣ複合抗ヒトＣＤ４５ＲＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．１７−０４５８−４１）で染色した。
【０１６１】
細胞核をＨｏｅｃｈｓｔ  Ｄｙｅで染色し、ＰＢＳで洗浄してＬＳＲＩＩ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析した。共焦点顕微鏡による画像化のため、各染色に加えて、細胞表面をＷＧＡレクチンＦＩＴＣ（Ｇｅｎｅｔｅｘ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．ＧＴＸ  ０１５０２）により染色した。サイトスピン遠心分離機を使用してスライド上に置いた細胞に対して共焦点顕微鏡画像法を行った。
【０１６２】
リン酸化アッセイ：Ｂａ／Ｆ３−ｈＭｐｌ細胞を、５％ＦＢＳを含有し、Ｔｐｏを含まないＲＰＭＩ−１６４０培地で１８時間欠乏させた。各アッセイについて合計８×１０６細胞を使用した。細胞を、５０ｎｇ／ｍＬ  Ｔｐｏ、１００ｎｇ／ｍＬアゴニスト抗体３Ｄ９、又は２００ｎｇ／ｍＬアゴニスト抗体１４Ｆ１２を含有するＲＰＭＩ血清不含培地を用いて３７℃で２０分処理した。細胞を１×Ｈａｌｔプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤混合物（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．７８４２８）を含有する氷冷ＰＢＳで一度洗浄し、２×Ｈａｌｔプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤混合物を含有する５００μＬの免疫沈降溶解バッファー中で時折撹拌しながら３０分間溶解した。細胞残屑を１３，０００×ｇで１０分間遠心分離することにより除去した。Ｓｔａｔ３、Ｓｔａｔ５、Ａｋｔ及びｐ４４／４２  ＭＡＰＫのリン酸化状態を、抗ホスホ−ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）（Ｄ３Ａ７）ＸＰ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．９１４５Ｐ）、抗ホスホ−Ｓｔａｔ５（Ｔｙｒ６９４）（Ｄ４７Ｅ７）ＸＰ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．４３２２Ｐ）、抗ホスホｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（Ｅｒｋｌ／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（１９７Ｇ２）抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．４３７７Ｓ）及び抗ホスホＡｋｔ（Ｔｈｒ３０８）（２４４Ｆ９）抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．４０５６Ｓ）を使用する細胞溶解物のウェスタンブロット分析により測定した。ゲルバンド中のタンパク質量を、抗全Ｓｔａｔ３（Ｃ−２０）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ  Ｎｏ．ｓｃ−４８２）、抗全Ｓｔａｔ５（Ｃ−１７）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．ｓｃ−８３５）、抗Ａｋｔ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．９２７２Ｓ））及び抗ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．９１０２Ｓ）を使用して定量した。
【０１６３】
抗ＪＡＫ２アガロース（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．１６−１２１）を用いて４℃で３時間、免疫沈降により細胞溶解物からＪＡＫ２を精製した。ＪＡＫ２をＬｏｗ−ｐＨ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．８８８０４）で溶出し、２Ｍ  Ｔｒｉｅｓバッファーで中和した。免疫沈降物を、抗ホスホＪＡＫ２（Ｔｙｒｌ００７／１００８）（Ｃ８０Ｃ３）抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．３７７６）及び抗全ＪＡＫ２抗体（Ｃ−１４）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．ｓｃ−３４４７９）を使用するウェスタンブロットにより分析した。
【０１６４】
マウスにおける血栓形成：９週齢の正常Ｂａｌｂ／Ｃマウスを各群６匹の３群に分けた。マウスの群を１５０μｇ／ｋｇ又は５００μｇ／ｋｇの３Ｄ９アゴニスト抗体又は対照としてＰＢＳで０日目に皮下処理した。抗体調製物は、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ＬＡＬ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．Ｌ００３５０）により測定されるタンパク質１μｇ当たり０．００２５ＥＵ未満のエンドトキシンを含有した。各マウスを麻酔し、Ｕｎｏｐｅｔｔｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｍｅｄｉｘ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．ＢＴＰ−４０１５）を備えたキャピラリを使用して、１４日間に亘り１日おきに（注射前の０日目、処理後２日目、４日目、６日目、８日目、１０日目、１３日目）眼窩洞から１０μＬの血液を採取した。血液を予め１ｍＬの溶解バッファーで満たしたエッペンドルフチューブに移した。４０倍対物レンズ及び１０倍接眼Ｚｅｉｓｓレンズを使用するＣ−Ｃｈｉｐ  ＩＮＣＹＴＯディスポーザブル血球計（Ｓｋｃ  Ｉｎｃ．Ａｍｅｒｉｃａ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．ＤＨＣ−Ｎ０１）を使用して血小板を数えた。
【０１６５】
本実施例に記載される研究は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達を介して活性化されるサイトカイン経路がＦＡＣＳにより選択され、抗体遺伝子（複数の場合がある）が回復され得ることを実証した。また、上記系は、例えば、ここで使用されたのと同じＦＲＥＴ基質を採用することによりβ−アレスチンに基づく系を研究することができるＧＰＣＲ経路を調節するもののような他の重要な抗体の選択に適用可能である。
【０１６６】
経路の活性化に基づく発見系が小分子について使用されているのに対し、ここで報告される系は、ライブラリの大きさが非常に大きいことから、感染レンチウイルスにおける抗体のうちで同時により多くの可能性のあるアゴニストを調べることができる点、及び単一細胞フォーマットを使用して調べることができる点で異なる。別の重要な相違は、候補アゴニストが複製し、それにより、選択された分子が同定され、初期分解能（ａｄｄｒｅｓｓａｂｉｌｉｔｙ）を必要とせずに多量に産生されることである。
【０１６７】
本発明者らが遺伝学に基づく方法を採用したことから、多数の可能性のあるアゴニストは、同じ細胞によって発現される受容体においてそれらの分子濃度が非常に高くなるように、単一細胞又はそのコンパートメントの非常に少ない容量の要素で産生される。実際、本明細書に記載されるように、本発明者らは、この方法を使用して、他のサイトカイン受容体、インテグリン、及びイオンチャネル、並びに形態形成を調製するもの及びウイルス複製を阻害するものに対するアゴニスト抗体を迅速に作製した。これらの場合の幾つかでは、既知の標的に対する予備選択を使用するのに対して、他の選択では予備選択はされない。また、これらの研究は、原形質膜の外側面でのみ作用する分泌された抗体に制限されない方法を示し、それにより、様々な細胞内コンパートメントに抗体と共に存在する任意の分子に対して一般化する。
【０１６８】
［実施例９］
ヒト幹細胞を分化転換する抗体アゴニストの選択
この実施例は、ヒト幹細胞を分化転換する細胞内コンビナトリアルライブラリからの抗体アゴニストの作製及び選択を記載する。本発明者らは、抗体を共発現するため「最近傍」フォーマットでコンビナトリアル抗体ライブラリ及び顆粒球コロニー刺激因子受容体（Ｇ−ＣＳＦＲ）を使用した。意外なことに、この方法を使用することにより、本発明者らは、ヒトＣＤ３４＋幹細胞が神経前駆細胞を形成するのを誘導することができるＧ−ＣＳＦＲに対するアゴニスト抗体を単離した。ＣＤ３４＋幹細胞が骨髄細胞系統であることから、この抗体は、分化転換プロセスを誘導するようである。
【０１６９】
「最近傍」抗体ライブラリの構築：多様な細胞コンパートメントに取り組む多くの異なる抗体フォーマットを細胞内コンビナトリアルライブラリに使用することができる。単一細胞選択系に関連して細胞内ライブラリを使用する本発明者らの以前の研究において、本発明者らは、天然アゴニストのフェノコピーである多くの抗体を作製した。抗体アゴニストが、天然のアゴニストとは異なる方法で受容体に結合する可能性を有することから、抗体アゴニストは多面的な効果が可能であるかもしれない。通常の方法で受容体に結合する抗体の選択を補助するため、本発明者らは、コンビナトリアル抗体ライブラリのメンバーが標的細胞の原形質膜中に組み込まれる新たなフォーマットを作製した。固定された抗体を使用する選択は、抗体がそれを産生する細胞に対して作用することを確実にする自己分泌機構に基づく。
【０１７０】
付加されたＦｃドメインにより二量体化された単鎖ＳｃＦｖは、抗体分子がそれらの結合部位を溶媒に向けて二量体として原形質膜中に組み込まれるように、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）膜貫通ドメインに可動性リンカーを介して連結される。中心的な概念は、「最近傍」ライブラリを使用することにより、相互作用するペアに対する制約された反応ジオメトリーが非常に高い有効モル濃度に関連付けられるため、溶媒中で選択が行われる場合には頻繁には見られない異常な抗体が好まれる可能性がある。また、上記方法は、標的受容体がその天然の環境に存在するという重要な利点を有し、生理学的に関連する配置の存在を確実にする。
【０１７１】
その後、本発明者らは、既知のトロンボポエチン（Ｔｐｏ）フェノコピーである抗体がその可溶性形態で、トロンボポエチン受容体（ＴｐｏＲ）標的と共に共発現されて原形質膜中に固定される場合に機能する可能性を試験した。上記抗体は、原形質膜中に組み込まれた場合でもアゴニストとして機能し、近辺のＴｐｏＲを活性化し得ることを示唆した。２つの別々のアッセイを使用した。１つでは、シグナル伝達経路の活性化を計測するＦＲＥＴ蛍光レポーターアッセイを研究した。２つ目のアッセイは、細胞成長の刺激を計測した。抗体が、細胞−細胞相互作用によって隣接する細胞ではなく、それを発現する同じ細胞を活性化したことを確認するため、個別に研究できるように細胞を低密度で播種した。培養物をＦＲＥＴ基質に暴露した場合、分離された細胞が活性化されたことが見出され、膜に結合した抗体が隣接する受容体に結合することにより、それを発現する細胞を活性化したことを強く示唆した。赤色蛍光タンパク質を単独で発現するウイルスにより感染した細胞においては、何らの活性化も観察されなかった。
【０１７２】
Ｇ−ＣＳＦ抗体フェノコピーの単離；異常な抗体を単離する可能性を高めるため、二重選択戦略を使用した。第１工程では、溶液中でＧ−ＣＳＦＲ外部ドメインに結合した抗体を、約１．０×１０９メンバーを含有するファージ中に発現されたコンビナトリアルライブラリから選択した。この工程の目的は、最も多くの候補をより厳しい二次スクリーンへと進めるため、多様性の高い系から結合抗体を選択することであった。本発明者らは、この富化ライブラリが、容易に利用可能なエピトープに対する多数の抗体を有し、また他の領域に対してはより少ない抗体有すると予想した。単純な結合よりも機能に基づく二次「最近傍」スクリーンを、アゴニストである予備選択ライブラリのメンバーを直接単離するため、また異常な機能を有する、おそらくは希少な抗体を明らかにするため設計した。そのため、２回のパニングの後ファージにおいて予備選択された抗体を、原形質膜結合フォーマットに変換し、レポーター細胞の感染のためレンチウイルスに移した。約５．０×１０５メンバーを有するこれらの選択された抗体の全プールを使用して、固定されたＧ−ＣＳＦＲが原形質膜に共局在するレポーター細胞株を感染させた。これらのレポーター細胞株において、ＢａＦ３細胞の成長又はＳＩＥ／ＢＬＡ／ＳＩＧ細胞におけるＦＲＥＴシグナルの誘導のいずれかが、Ｇ−ＣＳＦＲアゴニストの存在に厳密に依存した。抗体ライブラリによる感染、又は真正Ｇ−ＣＳＦに対する暴露の両方がこれらの細胞におけるＧ−ＣＳＦＲを活性化した。ここでも、赤色蛍光タンパク質のみをコードするウイルスによる感染は、細胞を活性化しなかった。
【０１７３】
選択された抗体は原形質膜中に組み込まれた場合にアゴニストであったが、それらが、分泌成長因子である内因性ＧＣＳＦアゴニストと同様の様式の可溶性タンパク質としても機能することを実証することが重要であった。これを研究するため、選択された抗体遺伝子を、９６ウェルプレート中でＨＥＫ−２９３細胞を形質移入するために使用された発現ベクターにおいて分泌形態へと変換した。分泌抗体を採取し、Ｇ−ＣＳＦＲに結合し、レポーター細胞を活性化する能力について試験した。陽性クローンからの抗体遺伝子のシーケンシングにより、それらが単一のコロニーに由来することが明らかになり、これは、選択可能な事象が起こったことを強く示す。このクローンは、５０の無作為に選ばれた微生物コロニーからの抗体遺伝子の配列により特定されるように１０％未満の頻度でオリジナルのプールに存在し、ファージにおいてより多い回数のパニングに選択が限定された場合には容易に喪失され得る。ウェスタンブロット及びＦＡＣＳによる親和性精製された抗体の分析は、Ｇ−ＣＳＦＲに強く結合し（図１１Ａ）、アゴニストである（図１１Ｂ〜図１１Ｄ）ことを示した。追加の研究は、精製抗体が、Ｇ−ＣＳＦＲ下流シグナル伝達及びレポーター細胞株の成長の両方を誘導したことを示した。サイクルを完了するため、抗体をレンチウイルスにおいて膜繋留フォーマット（ＭＴＡ）に再変換し、感染後、再び選択的にレポーター細胞を活性化することができた。
【０１７４】
抗体及びその受容体標的が、実際に原形質膜中に共局在するかどうかを判定するため、Ｇ−ＣＳＦＲ及び選択された抗体クローン３Ｂ３の両方を発現する細胞の蛍光顕微鏡研究を行った。これらの研究は、抗体分子及びＧ−ＣＳＦＲの両方が原形質膜上に同時に強力に発現し、架橋により誘導される古典的なパッチにおいて共局在することを示した。Ｇ−ＣＳＦ又はアゴニスト抗体のいずれかにより活性化された受容体は、ここでも、Ｇ−ＣＳＦＲの存在に厳密に依存した。Ｇ−ＣＳＦＲ又はアゴニスト抗体のいずれかにより偽形質移入された細胞の活性化は見られなかった。
【０１７５】
ヒト幹細胞の分化転換：「最近傍」コンビナトリアル抗体ライブラリの開発の主な目的が通常ではない方法で作用し得るアゴニストを選択することであったため、本発明者らは、これらの可溶性フォーマットでのＧ−ＣＳＦＲ結合抗体のヒトＣＤ３４＋幹細胞を活性化する能力を試験した。本発明者らは、それらはより強力になる可能性があり、及び／又は骨髄系統の経路に沿ってさらに分化を制御する可能性があると考えた。しかしながら、実際に起こったのは、神経リガンドと異なり、抗体がこれらの幹細胞の神経発生を開始したということである。
【０１７６】
ＣＤ３４＋細胞を、５名の個体から細胞ソーティングにより別々の機会に単離した。ソートされた細胞は９６％〜９９％の純度であった。最初の実験では、半分の細胞をＧ−ＣＳＦで処理し、もう半分を選択された可溶性抗体３Ｂ３で処理した。予想したように、Ｇ−ＣＳＦは、ディッシュに付着していない細胞の増殖を引き起こし、骨髄系統の形態学的特性を有した。対照的に、上記抗体は、ディッシュに付着した細胞の広範囲に亘る形成を引き起こした。付着は８日目に開始し、１４日目までに細胞の約４０％が付着し、神経発生を経る細胞とほぼ一致する特性を有することが明らかとなった（図１２Ａ〜図１２Ｆ）。これらの細胞は可動性であり、長い神経突起を有し、二極性配置及びピラミッド型の成長円錐の広範囲な発生を包含する複数の形態学を呈した（図１２Ｅ〜図１２Ｆ）。走査型電子顕微鏡法をこれらの細胞について行い、さらなる形態学的な詳細を得た。これらの研究は、神経突起先端の成長円錐が、糸状仮足及び葉状仮足の広範囲な形成を伴う古典的な形態学を有することを示した。
【０１７７】
神経細胞の誘導が、異なるドナーのＣＤ３４＋細胞による反復実験において観察された。同様の形態学的特徴は、同じ細胞集団がＧ−ＣＳＦ、不適切な抗体、又はインテグリン等のＣＤ３４＋細胞上の他の受容体に対するアゴニスト抗体で処理された場合には観察されなかった。これらの細胞が神経系統のものであることを確認するため、高度に特異的な神経マーカーとして神経チューブリン（Ｔｕｊ１）、神経前駆細胞の一時的マーカーとしてのネスチン、成長円錐の西部としてのＦ−アクチン、及び神経芽細胞を包含する他の系統の細胞マーカーとしてのＣＤ−２９としての存在について蛍光顕微鏡法により研究した。Ｆ−アクチン、Ｔｕｊ１及びネスチンに対する抗体による細胞の強い染色が観察された。対照的に、上記細胞は線維芽細胞マーカーであるＣＤ−２９は発現しなかった。Ｆ−アクチン及び神経特異的Ｔｕｊ１タンパク質は、神経前駆細胞の成長で観察される標準的なパターンに体系づけられた。Ｔｕｊ１チューブリンは、成長円錐マージンへと伸長し、アクチン束で終結した。成長円錐先端でアクチンフィラメントは、スパイク様からより平滑末端化された配置の形態学の範囲をとった。
【０１７８】
チューブリン染色の強度は、神経系統の細胞の際立った特徴である神経突起の発生の著しい長さを明確に観察できるようにした。培養における神経芽細胞の別の特徴は、成長円錐の運動性である。この特徴を研究するため、１時間間隔で細胞を観察した。この短い時間間隔でも、神経突起の伸長に付随する成長円錐の広範囲な運動性を容易に観察することができた。
【０１７９】
シグナル伝達経路及び遺伝子発現の差次的活性化：
抗体が幹細胞を分化転換するであろうことから、シグナル伝達経路の活性化は、Ｇ−ＣＳＦ等のサイトカインにより一般的に使用されるものとは異なるであろうと予測し得た。これを試験するため、新しく単離したヒトＣＤ３４＋骨髄幹細胞をＧ−ＣＳＦ又はアゴニスト抗体のいずれかで処理し、ＳＴＡＴ５、ＡＫＴ及びＥＲＫ等の主要なＧ−ＣＳＦ受容体シグナル伝達経路の活性化を、選択的抗ホスホ抗体を使用して分析した。Ｇ−ＣＳＦは、ＳＴＡＴ５、ＡＫＴ及びＥＲＫのリン酸化を誘導したのに対し、抗体はＡＫＴのリン酸化をより強く誘導したが、ＳＴＡＴ５又はＥＲＫには影響を与えなかった。よって、本発明者らが観察する細胞運命は、他の喪失と関連する１つのシグナル伝達経路の協奏的な増強の結果であるかもしれない。興味深いことに、ＰＩ３キナーゼ／ＡＫＴ経路は、神経発生に重要であることが知られている。
【０１８０】
遺伝子発現の誘導のより包括的な分析を神経発生のＲＴ−ＰＣＲアレイに基づく分析を使用して行い、神経発生に重要であることが知られている８４の遺伝子を研究した。結果は、未処理細胞に対して、抗体又はＧ−ＣＳＦにより誘導された比率として表される。誘導されない細胞又はＧ−ＣＳＦにより誘導される細胞と比べて、神経発生に重要な多くの遺伝子の発現が、抗体により発現増加された。この発現増加は、とりわけ、神経突起の伸長及び接着（ＮＲＰ１、ＮＲＰ２及びＮＲＣＡＭ）及びノッチシグナル伝達（ＮＲＰ２、ＨＥＹ１、ＤＬＬ１及びＡＤＯＲＡ１）を促進するタンパク質をコードする遺伝子を包含した。一部の遺伝子発現の誘導はＧ−ＣＳＦと抗体に共通するが、多くは、抗体のみに特異であり高度に活性化された。その発現がＡＤＯＲＡ１以外のいずれよりも多く発現増加された（２２９倍）興味深い遺伝子は、ノリエ病（ＮＤＰ）に関与する遺伝子である。この遺伝子は、Ｗｎｔ／ベータカテニン経路におけるリガンドである分泌タンパク質をコードし、神経外胚葉の初期発生で役割を果たす可能性がある。
【０１８１】
本実施例は、ヒト幹細胞を分化転換する細胞内コンビナトリアルライブラリからの抗体アゴニストの作製を記載する。以下に詳述されるように、顆粒細胞コロニー刺激因子受容体に対するアゴニストである抗体を、レポーター細胞におけるシグナル伝達経路の活性化能に基づいて細胞内ライブラリから選択した。本発明者らは、全抗体ライブラリ及びその標的受容体をレポーター細胞集団の原形質膜中に組み込む、特殊化した「最近傍」アプローチを使用した。このフォーマットは、受容体とそれらのタンパク質リガンドの異常な相互作用を補助し、抗体がそれを産生する細胞に対して自己分泌方式で採用することを確実にする。細胞を所定の経路に沿って分化するよう活性化する天然の顆粒細胞コロニー刺激因子と異なり、単離されたアゴニスト抗体は、ヒト骨髄系統ＣＤ−３４＋骨髄細胞を神経前駆細胞へと分化転換する。このアゴニスト抗体による分化転換は、開始が遺伝子的でないため、より一般的に使用される方法とは異なる。原形質膜で作用する抗体は、自家細胞を分化転換する物質として治療的可能性を有し得る。
【０１８２】
これらの研究による結果は、同じ受容体に結合する抗体アゴニスト及び天然リガンドは、同一の開始細胞集団から異なる細胞運命を誘導し得ることを実証した。
【０１８３】
［実施例１０］
形態学の調節に基づく抗体剤の選択
本発明に記載される表現型スクリーニングは一般的な方法であり、選択系を利用できる任意の細胞経路に存在する既知又は未知のタンパク質に対するアゴニストを選択するために使用できた。本実施例は、軟寒天中で成長する幹細胞コロニーの形態学を変更する細胞内抗体の能力に基づく抗体アゴニストの選択を記載する。かかる抗体の抗原性標的及びアゴニスト特性は、幹細胞の運命に関与するタンパク質の同定を可能とする。特に、これは、抗体プローブそれ自体が治療剤となり得る重要な相違を伴う、タンパク質レベルで動作するフォワード遺伝学的アプローチである。
【０１８４】
生物学における一般的な観察の１つは、細胞が発生及び分化の間に形態を変化することである。細胞発生のこの一般的な特徴を生かす選択フォーマットを考案することができれば、それは、分化を誘導する抗体の選択のための新規なスクリーニングフォーマットとなり得る。これは、本発明者らの以前のサイトカインフェノコピーに対する抗体の選択と概念が似ているが、標的空間が大きい場合があり、ほとんど未知であることから、別のレベルの困難性がある。また、未知の標的の探索においては、既知のタンパク質の結合に関して予め選択されたライブラリにより見られるよりも回復されるアゴニストの頻度を低くする必要のある、不偏性ライブラリを使用しなければならない。一方、標的が未知であることから、新しい発見の可能性は高い。
【０１８５】
軟寒天中で成長する細胞のコロニーの成長及び形態は、足場依存性を喪失したがん細胞の悪性状態の計測として、又は細胞増殖に対する成長因子の効果に関するアッセイのため広く使用されてきた。本発明者らは、このアプローチは、幹細胞のコロニーの形態がそれらの分化した状態の機能として変化し得る幹細胞の研究まで拡大され得ると推論した。そのため、細胞コロニー中で形態学的変化を誘導するアゴニスト抗体は、抗体ライブラリで感染された幹細胞から選択され得る。このアプローチは、サイトカインフェノコピーの選択に既に採用されて成功している方法の範囲を、細胞表現型と相関する経路のタンパク質成分のより一般的な生物学的問題まで拡大できるかどうかについて情報を提供する。
【０１８６】
本発明者らは、不偏性コンビナトリアル抗体ライブラリによる幹細胞の感染が様々な形態学を呈する軟寒天中のコロニーの成長を引き起こすことを示す。新しい幹細胞をこれらのコロニーから回復した抗体で処理すると、軟寒天中のそれらの成長及び形態学的特性が再現された。質量分析を使用することにより、回復された抗体に対する標的はチャネル又はインテグリンとして示した。各場合に、顆粒経路の活性によりアゴニストとしての抗体機能が明らかにされた。インテグリンアゴニストである抗体は、樹状細胞及び泡沫細胞の表現型を有するものを包含するマクロファージ系統の細胞への細胞の分化を引き起こした。全体的な選択工程の力は、選択された抗体がそれらのＣＤＲ−Ｈ３にインテグリン結合配列であるＲＧＤを有する収束進化を伴うという事実により示された。ＲＧＤ配列がＲＧＥに突然変異したとき、全てのアゴニスト活性が失われた。
【０１８７】
不偏性コンビナトリアル抗体ライブラリによる抗体選択の戦略：
細胞の表現型に影響を及ぼす既知の標的に対する活性な抗体を選択するため、本発明者らは、従来の抗体パニングによらない感染コンビナトリアル抗体ライブラリ、コロニー形成アッセイ及び質量（ＭＳ）分析に基づく方法を考案した。最初に、レンチウイルス抗体ライブラリを構築するため、本発明者らは、ナイーブなヒトコンビナトリアル抗体ファージライブラリからのファージミドプールを採取した。その後、本発明者らはレンチウイルスベクター中にｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体遺伝子を構築した。ライブラリサイズは１０８であった。その後、レンチウイルスを産生するため、本発明者らは、レンチウイルス抗体ライブラリ及びウイルスパッケージングのプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一時的に形質移入した。ウイルス滴定の後、本発明者らは、レンチウイルスライブラリをＴＦ−１赤芽球細胞に感染させ、形態形成スクリーニングのためメチルセルロースアガーにロードした。対照と比較して、アモルファス、散在、線状又は円形の形状等の幾つかのタイプのコロニーがあった。
【０１８８】
形態形成表現型に基づく抗体の選択：形態学的基準に基づいて、本発明者らは、２週間後に特異的な形態学を示した３０のコロニーを選んだ。その後、各抗体遺伝子をＰＣＲにより増幅し、２０の抗体遺伝子を回復した。抗体重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ−Ｈ３）領域をコードする遺伝子を分析して、各クローンの異なる配列の数を計測した。各コロニーは、１〜４の異なる抗体を示した。レンチウイルスによりコードされる抗体を、単一の又は２つの遺伝子の組合せによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一時的な形質移入により作製し、５１の複合上清をＴＦ−１細胞の増殖に影響を及ぼす能力について試験した。８つの抗体がＧＭ−ＣＳＦの約５０％の活性を有した。興味深いことに、３つの活性な抗体は二重特異性であった。次の工程のため、本発明者らは、特異な形態を表す３つの抗体（９−３、１１−３及び１２−１／１２−２）を任意に選択した。
【０１８９】
標的タンパク質の同定：本発明者らは、９−３、１１−３及び１２−１／１２−２等の３つの活性な抗体をコードする抗体遺伝子を抗体産生のため２９３Ｆ細胞に形質移入し、それらを精製した。これらの抗体が細胞機能を活性化するかどうかを試験した。これらの抗体は、ＴＦ−１細胞の増殖、並びにＡＫＴ及びＥＲＫ等の主なシグナル伝達分子のリン酸化を増加した。特に、９−３は、さらに、ＳＴＡＴ５のリン酸化を活性化した。その後、本発明者らは、各抗体によりＴＦ−１細胞溶解物を免疫沈降した。免疫沈降されたタンパク質試料を、これらの抗体により免疫ブロットするか、又は銀染色を行った。免疫ブロットと一致された銀染色ゲルバンドをスライスし、ナノ−ＬＣ  ＭＳ／ＭＳ分析用にトリプシン処理した。本発明者らは、抗体を主要なタンパク質（データは示されていない）として同定し、また、上記バンドの分析において様々な非抗体タンパク質を得た。タンパク質リストの中で、本発明者らは、予想サイズ、細胞局在等の幾つかの基準により候補標的タンパク質を選んだ。インテグリンアルファ３、ＨＶＣＮ１及びＴＲＰＭ７を欠く抗体の候補標的タンパク質としてこれらの基準に整合させた。インテグリンは病態生理学においてそれらの重要性がよく知られていることから、本発明者らは、活性な抗体のさらなる特性評価のためこの抗体を選択し、我々の方法を改善した。ヒトインテグリンアルファ３を過剰発現した溶解物を使用して、本発明者らは、免疫ブロットにより１２−１／１２−２がヒトインテグリンアルファ３と相互作用することを確認した。次に、本発明者らは、１２−１／１２−２がインテグリンアルファＶ又はアルファ５等のインテグリンアルファの他の主要なタイプに結合するかどうかを試験した。１２−１／１２−２は、インテグリンアルファＶとも相互作用した。この観察は、１２−１／１２−２がインテグリンアルファ３の特異的バインダーではなく、他のインテグリンアルファと関連し得ることを暗示する。
【０１９０】
抗体はヒト骨髄ＣＤ３４＋細胞の遊走を増加した：ＴＦ−１細胞は、様々なサイトカインの機能に関連する研究に対して広く使用されている。しかしながら、ＴＦ−１細胞は、大半の細胞集団が赤血球へと分化するように運命づけられている赤芽球であり、したがって、幅広い細胞型及び表現型検査におけるアゴニストの可能性を調べるのに適していない。本発明者らは、ヒト骨髄ＣＤ３４＋細胞を１２−１／１２−２を含有するメチルセルロースアガーにロードした。１週間後、１２−１／１２−２は、対照と比較して細胞の散乱及び仮足形成を増強した。細胞を詳細に特性評価するため、本発明者らは、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により各単一の細胞を分析した。ＳＥＭのもと、１２−１／１２−２処理細胞は、仮足形成の増加を示した。次に、本発明者らは、これらの効果がインテグリンシグナルの主な細胞機能の１つとして知られる細胞運動に影響を及ぼすかどうかを試験した。１２−１／１２−２がヒト骨髄ＣＤ３４＋細胞に対して処理されると、上部チャンバから下部チャンバへの骨髄ＣＤ３４細胞の遊走が増加し、インテグリンシグナル伝達の主な下流分子として知られるＡＫＴ及びＥＲＫのリン酸化が強力に増加された。これらの観察は、インテグリンシグナル伝達による主な制御として知られている仮足形成を増強することにより、１２−１／１２−２がヒト骨髄ＣＤ３４＋細胞の運動性に影響を及ぼし得ることを暗示する。
【０１９１】
ヒト骨髄ＣＤ３４＋細胞の樹状細胞への抗体誘導性分化：骨髄ＣＤ３４＋細胞が血液中の全ての細胞型を生じさせる多能性幹細胞を含有することから、免疫サイトカイン等の細胞外刺激により様々な系統へと分化する可能性がある。したがって、本発明者らは、１２−１／１２−２が幹細胞の特異的系統を誘導する能力を有するかどうかを確認した。結果は、１２−１／１２−２が樹状細胞等の特異な形態学を示した細胞集団を増加したことを示す。本発明者らは、自免疫組織化学研究による樹状細胞の特異的マーカーであるＣＤ１１ｃを発現した細胞を観察した。これらの観察は、１２−１／１２−２が骨髄ＣＤ３４＋細胞から樹状細胞を特異的に誘導し得ることを示す。
【０１９２】
収束進化：興味深いことに１２−１／１２−２の１２−２は、ＣＤＲ−Ｈ３内に天然リガンドのＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）インテグリン認識モチーフを含有した。１２−１／１２−２の細胞機能におけるＣＤＲ−Ｈ３のＲＧＤモチーフの寄与を調査するため、この配列を部位特異的突然変異誘発法によりＲＧＥに突然変異した。ＲＧＤモチーフ内のＤ（Ａｓｐ）からＥ（Ｇｌｕ）への変更は、インテグリンアルファサブユニットによるリガンド認識を減少するか、又は消滅させることが知られている。１２−１／１２−２によるＡＫＴ及びＥＲＫ等の主要なインテグリンシグナル伝達分子のリン酸化は、ＲＧＥ突然変異により著しく阻害された。さらに、ＲＧＥ突然変異抗体は、フローサイトメトリー分析による樹状細胞分化の減少を示した。この知見は、１２−２のＲＧＤは抗体−インテグリン結合に重要であることを暗示する。
【０１９３】
上述の発明は、例示として、また理解の明確性の目的のための例示として詳細に記載されるが、添付の特許請求の範囲の趣旨又は範囲から逸脱することなく、特定の変更及び修飾がそれに対して行われてもよいことが、本発明の教示に照らして、当業者には容易に明白であろう。
【０１９４】
本明細書に引用される全ての刊行物、データベース、ＧｅｎＢａｎｋ配列、特許、及び特許出願は、各々が、具体的且つ個別に参照により援用されるように、参照により本明細書中に援用される。
【０１９５】
幾つかの例示されるアゴニスト抗体の配列
ＥｐｏＲ抗体Ｅ−１アミノ酸配列
重鎖（配列番号７）
0006590694.tif 000002
軽鎖（配列番号８）
0006590694.tif 000003
ＥｐｏＲ抗体Ｖ−１アミノ酸配列
重鎖（配列番号２１）
0006590694.tif 000004
軽鎖（配列番号２２）
0006590694.tif 000005
ＥｐｏＲ抗体Ｖ−３アミノ酸配列
重鎖（配列番号２３）
0006590694.tif 000006
軽鎖（配列番号２４）
0006590694.tif 000007
（配列番号２４）
ＥｐｏＲ抗体Ｅ−１ヌクレオチド配列
重鎖（配列番号２５）
0006590694.tif 000008
軽鎖（配列番号２６）
0006590694.tif 000009
0006590694.tif 000010
ＥｐｏＲ抗体Ｖ−１ヌクレオチド配列
重鎖（配列番号２７）
0006590694.tif 000011
軽鎖（配列番号２８）
0006590694.tif 000012
ＥｐｏＲ抗体Ｖ−３ヌクレオチド配列
重鎖（配列番号２９）
0006590694.tif 000013
軽鎖（配列番号３０）
0006590694.tif 000014
３Ｄ９  ＴｐｏＲアゴニスト抗体アミノ酸配列
ｓｃＦｖ配列（配列番号３２）
0006590694.tif 000015
重鎖可変領域配列（配列番号３３）
0006590694.tif 000016
軽鎖可変領域（配列番号３４）
0006590694.tif 000017
３Ｂ３抗Ｇ−ＣＳＦＲアゴニスト抗体アミノ酸配列
ｓｃＦｖ配列（配列番号４０）
0006590694.tif 000018
重鎖可変領域配列（配列番号４１）
0006590694.tif 000019
軽鎖可変領域配列（配列番号４２）
0006590694.tif 000020
９−３アゴニスト抗体アミノ酸配列
ｓｃＦｖ配列（配列番号４８）
0006590694.tif 000021
重鎖可変領域配列（配列番号４９）
0006590694.tif 000022
軽鎖可変領域配列（配列番号５０）
0006590694.tif 000023
１１−３アゴニスト抗体アミノ酸配列
ｓｃＦｖ配列（配列番号５７）
0006590694.tif 000024
重鎖可変領域配列（配列番号５８）
0006590694.tif 000025
軽鎖可変領域配列（配列番号５９）
0006590694.tif 000026
１２−１アゴニスト抗体アミノ酸配列
ｓｃＦｖ配列（配列番号６６）
0006590694.tif 000027
重鎖可変領域配列（配列番号６７）
0006590694.tif 000028
軽鎖可変領域配列（配列番号６８）
0006590694.tif 000029
１２−２アゴニスト抗体アミノ酸配列
ｓｃＦｖ配列（配列番号ＮＯ：７５）
0006590694.tif 000030
重鎖可変領域配列（配列番号７６）
0006590694.tif 000031
軽鎖可変領域配列（配列番号７７）
0006590694.tif 000032
【図１】
0006590694.tif 000033
【図２】
0006590694.tif 000034
【図３】
0006590694.tif 000035
【図４】
0006590694.tif 000036
【図５】
0006590694.tif 000037
【図６】
0006590694.tif 000038
【図７】
0006590694.tif 000039
【図８】
0006590694.tif 000040
【図９】
0006590694.tif 000041
【図１０】
0006590694.tif 000042
【図１１】
0006590694.tif 000043
【図１２】
0006590694.tif 000044
【配列表】
0006590694000001.app