(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式［１］：
【化１】
0006457841.tif 000012
で表される１，１−ジフルオロアセトンに、該アセトンを不斉還元する活性を有する微生物または該活性を有する酵素を作用させることを特徴とする、式［２］： 
【化２】
0006457841.tif 000013
［＊は不斉原子を表す。］
で表されるキラル−１，１−ジフルオロ−２−プロパノールの製造方法であって、
前記微生物が、下記表に示す受託番号の微生物からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、前記酵素が、オガタエア・ポリモルファ（Ogataea polymorpha）NBRC0799菌株由来の精製酵素である、
前記製造方法。
【表１】
0006457841.tif 000014
【請求項２】
前記微生物を、微生物の菌体またはその細胞抽出物として作用させることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記作用させる際の温度が、５℃〜６０℃であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記作用させる際のｐＨが、４．０〜８．０の範囲であることを特徴とする、請求項１乃至３の何れかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記作用させた後に得られる１，１−ジフルオロ−２−プロパノールおよび不純物を含む混合液を蒸留することにより、該混合液から不純物を分離し、１，１−ジフルオロ−２−プロパノールを精製する工程を含む、請求項１乃至４の何れかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医農薬中間体として重要なキラル−１，１−ジフルオロ−２−プロパノールの工業的な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キラル−１，１−ジフルオロ−２−プロパノールは、種々の医農薬中間体として重要な化合物である。これまでに、化学触媒Ｂ−クロロジイソピノカンフェイルボラン（商品名：ＤＩＰ−Ｃｈｌｏｒｉｄｅ）とＢ-イソピノカンフェイル−９−ボラビシクロ[３．３．１]ノナン（登録商標：Ｒ−Ａｌｐｉｎｅ−Ｂｏｒａｎｅ）とを１，１−ジフルオロアセトンに作用させて不斉還元し、キラル−１，１−ジフルオロ−２−プロパノールを得る方法が、非特許文献１で開示されている。しかし、得られた生成物の光学純度はそれぞれ５％ｅｅ（Ｒ）、１６％ｅｅ（Ｓ）と低く、医農薬中間体として求められる光学純度には到達していなかった。なお、本明細書において、「ｅｅ」とは鏡像体過剰率（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ  ｅｘｃｅｓｓ）を意味する。
【０００３】
他方、関連化合物のキラル−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールについては、１，１，１−トリフルオロアセトンを不斉還元して得る方法が知られている。当該方法のうち、生物学的な方法については、例えば、特許文献１では、９９％ｅｅ以上の光学純度を持つキラル−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを、アルコール脱水素酵素を用いた１，１，１−トリフルオロアセトンの不斉還元により製造する方法が、特許文献２では、市販の乾燥パン酵母により１，１，１−トリフルオロアセトンを不斉還元することで、９３〜９９％ｅｅの（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを製造する方法が、特許文献３では、アルコール脱水素酵素、カルボニル還元酵素等の酵素を機能的に発現する微生物、もしくは形質転換体、又はそれらの処理物を１，１，１−トリフルオロアセトンに作用させる工程を含む、キラル−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールの製造方法が、非特許文献２では、アルコール脱水素酵素を用いて１，１，１−トリフルオロアセトンを不斉還元することにより、キラル−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを得る方法が、非特許文献３では、乾燥パン酵母を用いて、１，１，１−トリフルオロアセトンを不斉還元することにより（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを約８０％ｅｅの光学純度で得る方法が、開示されている。また、化学的な方法については、例えば、非特許文献１では、化学触媒を用いて１，１，１−トリフルオロアセトンを不斉還元して９０％ｅｅの（Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールを得る方法が開示されている。本発明者らも野生株酵母を用いた方法を開示している（特許文献４、５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００７／０５４４１１号
【特許文献２】国際公開第２００７／００６６５０号
【特許文献３】国際公開第２００７／１４２２１０号
【特許文献４】特開２０１１−１８２７８７号公報
【特許文献５】特開２０１２−５３９６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｐ．Ｖｅｅｒａｒａｇｈａｖａｎ  Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１２８巻，８４４−８５０頁，２００７年
【非特許文献２】Ｔ．Ｃ．Ｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｍｉｃａ  Ｏｇｇｉ  Ｓｕｐｐｌ．，４３−４５頁，２００４年
【非特許文献３】Ｍ．Ｂｕｃｃｉｅｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１１巻，８９７−８９９頁，１９８３年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述のとおり、これまでに、化学触媒を用いて１，１−ジフルオロアセトンを不斉還元し、キラル−１，１−ジフルオロ−２−プロパノールを得る方法が非特許文献１で開示されているが、光学純度は１６％ｅｅと低かった。非特許文献１の方法では、１，１−ジフルオロ−２−プロパノール以外に、種々のフッ素を含む基質についても化学触媒を用いた不斉還元を検討しており、化合物によっては高い光学純度（＞９９％ｅｅ）で不斉還元反応が進む場合もあり、本発明で対象とする１，１−ジフルオロ−２−プロパノールの関連化合物である１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールについて高い光学純度（＞９０％ｅｅ）で得られることが確認されている。生物学的な方法についても、関連化合物であるキラル−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノールでは、生物の酵素を用いた方法で高い光学純度（９０％ｅｅ以上）が特許文献１、特許文献３、非特許文献２で確認されている。
【０００７】
前述の非特許文献１の方法では、１，１，１−トリフルオロアセトンでは化学触媒で高い光学純度が確認されたが、１，１，１−トリフルオロアセトンのＣＨ３基がＣＦ２Ｈ基に置き換わった化合物の１，１−ジフルオロアセトンに化学触媒を作用させた場合、置換基の電気陰性度や水素原子による立体障害のため触媒の立体選択性が低下し、光学純度が低下していた。このような現象は、１，１，１−トリフルオロアセトンと１，１、−ジフルオロアセトンの関係だけでなく、ＣＦ３ＣＯＲ（ＲはＰｈ−Ｃ、ｎ−Ｂｕ−Ｃまたはｎ−Ｈｅｘ）のＣＨ３基がＣＦ２Ｈ基に置き換わった場合でも同様の現象が確認されており（非特許文献１）、ＣＨ３基とＣＦ２Ｈ基はフッ素の数が一つ違うだけのフルオロメチル基であるものの、触媒の立体選択性に対して明確な違いが生じていた。ジフルオロメチル基に隣接するケトンの不斉還元の検討において、化学触媒の適用が上手く進まない中、生物学的方法についても検討が見送られ、キラル−１，１−ジフルオロ−２−プロパノールの合成法については近年進展がなかった。このような中、分子中のＣＦ２Ｈ基とＣＨ３基とがほぼ同じ大きさである擬似対象ケトンと言える１，１−ジフルオロアセトンの立体構造を厳密に判別する触媒等の開発が望まれていた。
【０００８】
そこで、本発明の課題は、キラル−１，１−ジフルオロ−２−プロパノールを高い立体選択性で製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、鋭意検討した結果、１，１−ジフルオロアセトンに特定の生体触媒を作用させることにより、高い立体選択性で不斉還元が生じ、両立体のキラル−１，１−ジフルオロ−２−プロパノールを得られる方法を見出し、本発明を完成した。
【００１０】
［発明１］
下記式［１］：
【化１】
0006457841.tif 000002
で表される１，１−ジフルオロアセトンに、該アセトンを不斉還元する活性を有する微生物または該活性を有する酵素を作用させることを特徴とする、下記式［２］： 
【化２】
0006457841.tif 000003
［式中、＊は不斉原子を表す。以下本明細書において同じ。］
で表されるキラル−１，１−ジフルオロ−２−プロパノールの製造方法。
【００１１】
［発明２］
前記微生物が、キャンディダ・グイリエルモンディ(Candida guilliermondii)、キャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis)、キャンディダ・ビニ(Candida vini)、キャンディダ・ビスワナシィ(Candida viswanathii)、クリプトコッカス・ラウレンティ(Cryptococcus laurentii)、クリプトコッカス・カルバタス(Cryptococcus curvatus)、デバリョマイセス・マラムス(Debaryomyces maramus)、クルイベロマイセス・マーキシアヌス(Kluyveromyces marxianus)、オガタエア・ポリモルファ(Ogataea polymorpha)、ピキア・アノマラ(Pichia anomala)、ピキア・ファリノーサ(Pichia farinosa)、ピキア・ハプロフィラ(Pichia haplophila)、ピキア・ミヌタ(Pichia minuta)、ロドトルラ・ムシラギノーサ(Rhodotorula mucilaginosa)、ジゴサッカロマイセス・バイリィ(Zygosaccharomyces bailii)、トルラスポーラ・デルブルエキィ(Torulaspora delbrueckii)、ウィッカーハモマイセス・サブペリクロサ(Wickerhamomyces subpelliculosa)、およびジゴサッカロマイセス・ロウキシィ(Zygosaccharomyces rouxii)からなる群より選ばれる少なくとも１種である、発明１に記載の製造方法。
【００１２】
［発明３］
前記微生物が、下記表に示す受託番号の微生物であることを特徴とする、発明２に記載の製造方法。
【００１３】
【表１】
0006457841.tif 000004
【００１４】
［発明４］
前記微生物を、微生物菌体またはその細胞抽出物として作用させることを特徴とする、発明１乃至３の何れかに記載の製造方法。
【００１５】
［発明５］
前記酵素が、オガタエア・ポリモルファ（Ogataea polymorpha）、オガタエア・パラポリモルファ（Ogataea parapolymorpha）、ピキア・アノマラ（Pichia anomala）、またはピキア・ミヌタ（Pichia minuta）由来の精製酵素であることを特徴とする、発明１に記載の製造方法。
【００１６】
［発明６］
前記オガタエア・ポリモルファ（Ogataea polymorpha）が、オガタエア・ポリモルファ（Ogataea polymorpha）NBRC0799菌株である、発明５に記載の製造方法。
【００１７】
［発明７］
前記作用させる際の温度（反応温度）が、５℃〜６０℃であることを特徴とする、発明１乃至６の何れかに記載の製造方法。
【００１８】
［発明８］
前記作用させる際のｐＨ（反応時におけるｐＨ）が、４．０〜８．０の範囲であることを特徴とする、発明１乃至７の何れかに記載の製造方法。
【００１９】
［発明９］
前記作用させた後（反応終了後）に得られる１，１−ジフルオロ−２−プロパノールおよび不純物を含む混合液（反応終了液）を蒸留することにより、該混合液から不純物を分離し、１，１−ジフルオロ−２−プロパノールを精製する工程を含む、発明１乃至８の何れかに記載の製造方法。
【００２０】
前述したように、１，１，１−トリフルオロアセトンに高い立体選択性を示した化学触媒を１，１−ジフルオロアセトンに作用させ立体選択的に不斉還元し、キラル−１，１−ジフルオロ−２−プロパノールを得ようとする方法が検討されたが、その光学純度は最大でも１６％ｅｅと低いものであった。一般に、フッ素原子のvan der Waals半径は1.47Åであり、水素原子1.20Åと近い大きさであることから、水素原子がフッ素原子に置き換わった化合物が元の化合物を認識する生体触媒や化学触媒の活性部位に同様に取り込まれる（ミミック効果と呼ばれる）ことが知られている。しかしながら、フッ素原子の持つ電気陰性度やＣ−Ｆ結合の強さなどにより、元の化合物と異なる性質を示す場合が多く（薬効の増大、毒性の増大・低減）、医農薬に頻繁に使用されている。同様に、トリフルオロメチル（ＣＦ３）基とジフルオロメチル（ＣＦ２Ｈ）基とはフッ素原子が一つしか違わない極めて類似した置換基であるが、生体触媒に及ぼす影響については未解明な部分が多く、それぞれの置換基を持つ化合物を実際に生体触媒に作用させて反応性を調査する必要があった。
【００２１】
そこで本発明者らは、微生物菌体や精製酵素といった生体触媒の中から本発明の目的を達成することができる生体触媒のスクリーニングを鋭意実施し、従来技術では成し得なかった高い光学純度のキラル−１，１−ジフルオロ−２−プロパノールを与える生体触媒を見出し、本発明を完成するに至った。
【００２２】
またその過程において、本発明者らは、用いる生体触媒を変えることで、キラル−１，１−ジフルオロ−２−プロパノールの両光学異性体を作り分けることができるという、大変有用な知見を得た。
【００２３】
また、詳細は後述するが、本発明者らは、有機溶媒を特定の濃度に設定して添加することで、反応が円滑に進行すると言う、好ましい知見も得た。
【００２４】
本発明においては、１，１−ジフルオロアセトンの濃度は、反応液中の該アセトンの濃度（ｗ／ｖ）のことを意味し（還元された生成物の濃度は考慮されない（除外される））、反応全体を通しての該アセトンの添加総量を規定するものではない。
【００２５】
本発明のように、高い光学純度で目的物を与える微生物または酵素を見出し、これを１，１−ジフルオロアセトンに作用させることにより、高い光学純度（８５％ｅｅ〜１００％ｅｅ）の両光学異性のキラル−１，１−ジフルオロ−２−プロパノールを効率よく製造できる知見は従来知られていなかった。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、医農薬中間体として重要なキラル−１，１−ジフルオロ−２−プロパノールを、高い光学純度で効率良く製造することができる。
【００２７】
本発明の製造方法において用いる微生物または酵素は、１，１−ジフルオロアセトンのカルボニル基を水酸基へと高い光学純度で還元し得るものであり、さらに不斉還元の反応方法（補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを外部から新たに加えることなく、脱水素酵素により再生させる方法など）を考案することにより、工業的に採用可能な生産性でキラル−１，１−ジフルオロ−２−プロパノールを提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下に、本発明について詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
【００２９】
本発明に係るキラル−１，１−ジフルオロ−２−プロパノール（下記式［２］）の製造方法（以下、本発明の方法）において用いる１，１−ジフルオロアセトン（下記式［１］）は、公知の化合物であり、従来技術を基に当業者が適宜調製してもよいし、市販されているものを用いてもよい。
【００３０】
【化３】
0006457841.tif 000005
【００３１】
【化４】
0006457841.tif 000006
【００３２】
本発明の方法において、１，１−ジフルオロアセトンは、化合物そのもの自体は当然、それ以外に水または炭素数１から４のアルコールとの混合物も同等に用いることができる。該アセトンを水を主成分とする反応液に直接投入することもできるが、該アセトンは水と水和する際、発熱を生じるため、事前に水和した後に投入するほうが好ましい。
【００３３】
本発明の方法に用い得る微生物、すなわち、１，１−ジフルオロアセトンをキラル−１，１−ジフルオロ−２−プロパノールへ還元する活性を有する微生物は、特に限定はされないが、例えば、キャンディダ・グイリエルモンディ (Candida guilliermondii) 、キャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）、キャンディダ・ビニ（Candida vini）、キャンディダ・ビスワナシィ（Candida viswanathii）、クリプトコッカス・ラウレンティ（Cryptococcus laurentii）、クリプトコッカス・カルバタス（Cryptococcus curvatus）、デバリョマイセス・マラムス (Debaryomyces maramus) 、クルイベロマイセス・マーキシアヌス (Kluyveromyces marxianus) 、オガタエア・ポリモルファ（Ogataea polymorpha）、ピキア・アノマラ（Pichia anomala）、ピキア・ファリノーサ（Pichia farinosa）、ピキア・ハプロフィラ（Pichia haplophila）、ピキア・ミヌタ（Pichia minuta）、ロドトルラ・ムシラギノーサ(Rhodotorula mucilaginosa) 、ジゴサッカロマイセス・バイリィ（Zygosaccharomyces bailii） 、トルラスポーラ・デルブルエキィ (Torulaspora delbrueckii)、ウィッカーハモマイセス・サブペリクロサ (Wickerhamomyces subpelliculosa) 、ジゴサッカロマイセス・ロウキシィ (Zygosaccharomyces rouxii) からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられ、好ましくは、キャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）、キャンディダ・ビニ（Candida vini）、クリプトコッカス・カルバタス（Cryptococcus curvatus）、デバリョマイセス・マラムス (Debaryomyces maramus) 、クルイベロマイセス・マーキシアヌス (Kluyveromyces marxianus) 、オガタエア・ポリモルファ（Ogataea polymorpha）、ピキア・アノマラ（Pichia anomala）、ピキア・ハプロフィラ（Pichia haplophila）、ピキア・ミヌタ（Pichia minuta）、ロドトルラ・ムシラギノーサ(Rhodotorula mucilaginosa) 、ジゴサッカロマイセス・バイリィ（Zygosaccharomyces bailii）、トルラスポーラ・デルブルエキィ(Torulaspora delbrueckii) からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられ、より好ましくは、クリプトコッカス・カルバタス（Cryptococcus curvatus）、クルイベロマイセス・マーキシアヌス (Kluyveromyces marxianus) 、オガタエア・ポリモルファ（Ogataea polymorpha）、ピキア・アノマラ（Pichia anomala）、ピキア・ハプロフィラ（Pichia haplophila）、ロドトルラ・ムシラギノーサ (Rhodotorula mucilaginosa) 、トルラスポーラ・デルブルエキィ (Torulaspora delbrueckii) からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
【００３４】
これらの微生物については、それぞれ下記表に示す受託番号を得て、独立行政法人製品評価技術基盤機構（〒151-0066  東京都渋谷区西原2-49-10）に寄託されている。これらの微生物は、他の微生物株保存機関にも相互に寄託されている場合があり、同様に利用することができる。なお、これらの微生物は一般に公開されているものであり、当業者が容易に入手できる。
【００３５】
【表２】
0006457841.tif 000007
【００３６】
本発明の方法に用いる微生物としては、培養した菌体をそのまま用いることができるのは勿論、超音波やガラスビーズで破砕した菌体、アクリルアミド等で固定化した菌体、アセトンやグルタルアルデヒドなどの有機化合物で処理した菌体、アルミナ、シリカ、ゼオライトおよび珪藻土等の無機担体に担持した菌体、該微生物より調製した無細胞抽出液や精製酵素、該微生物よりクローニングした酵素の遺伝子を導入した遺伝子組換え体も用いることができる。
【００３７】
本発明の方法に用い得る酵素、すなわち、１，１−ジフルオロアセトンをキラル−１，１−ジフルオロ−２−プロパノールへ還元する活性を有する酵素は、特に限定はされないが、例えば、アルコール脱水素酵素またはカルボニル還元酵素が挙げられる。上記活性を有する酵素は、１，１−ジフルオロアセトンを基質に用いたスクリーニングを行うことで選抜することができる。
【００３８】
アルコール脱水素酵素は、例えば、オリエンタル酵母工業株式会社の「アルコール脱水素酵素、酵母由来」、ユニチカ株式会社の「アルコール脱水素酵素（ＺＭ−ＡＤＨ）」、株式会社ダイセルのChiralscreen(登録商標) OH E001（以下同じ）、E007、E008、E031、E039、E072、E077、E082、E092から選ばれる少なくとも１種が挙げられ、好ましくはE001、E007、E008、E031、E039、E077、より好ましくはE001、E031、E039、E077である。また、当該酵素を発現する遺伝子組換え微生物も同様に用いることができる。
【００３９】
他方、カルボニル還元酵素は、例えば、オガタエア・ポリモルファ（Ogataea polymorpha）、オガタエア・パラポリモルファ（Ogataea parapolymorpha）、ピキア・アノマラ（Pichia anomala）、ピキア・ミヌタ（Pichia minuta）などのサッカロミケス目の酵母から産生される酵素が挙げられる。該酵素の精製には、硫安分画、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの一般的なタンパク質の精製方法が適用できる。
【００４０】
前記微生物の培養には、通常、微生物の培養に用いられる栄養成分を含む培地（固体培地または液体培地）が使用できるが、水溶性である１，１−ジフルオロアセトンの還元反応を行う場合には、液体培地が好ましい。培地は、炭素源としてグルコース、スクロース、マルトース、ラクトース、フルクトース、トレハロース、マンノース、マンニトール、デキストロース等の糖類、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、グリセロール等のアルコール類、クエン酸、グルタミン酸、リンゴ酸等の有機酸類が、そして窒素源としてアンモニウム塩、ペプトン、ポリペプトン、カザミノ酸、尿素、酵母エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。さらに、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム等の他の無機塩や、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類等の培地組成が適宜添加できる。
【００４１】
これらの炭素源、窒素源、無機塩のうち、炭素源については微生物が十分に増殖する量且つ増殖を阻害しない量を加えることが好ましく、通常、培地１Ｌに対して５〜８０ｇ、好ましくは１０〜４０ｇ加える。窒素源についても同様で、微生物が十分に増殖する量かつ増殖を阻害しない量を加えることが好ましく、通常、培地１Ｌに対して５〜６０ｇ、好ましくは１０〜５０ｇ、栄養源としての無機塩については微生物の増殖に必要な元素を加える必要があるが、高い濃度の場合には増殖が阻害されるため、通常、培地１Ｌに対して０．００１〜１０ｇ加える。なお、これらは微生物に応じて複数の種類を組み合わせて使用することができる。
【００４２】
培地におけるｐＨは微生物の増殖に好適な範囲で調整する必要があり、通常４．０〜１０．０、好ましくは６．０〜９．０で行う。培養における温度範囲は微生物の増殖に好適な範囲で調整する必要があり、通常１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で行う。培養中は培地に空気を通気する必要があり、好ましくは０．３〜４ｖｖｍ（「ｖｖｍ」は１分間当たりの培地体積に対する通気量を意味する。ｖｏｌｕｍｅ／ｖｏｌｕｍｅ／ｍｉｎｕｔｅ）、より好ましくは０．５〜２ｖｖｍで行う。酸素の要求量が多い微生物に対しては、酸素発生器等を用いて、酸素濃度を高めた空気を通気しても良い。また、試験管やフラスコ等の任意の通気量を設定し難い器具については、該器具の容積に対して培地量を２０％以下に設定し、綿栓やシリコン栓等の通気栓を取り付ければ良い。培養を円滑に進めるためには培地を攪拌することが好ましく、培養槽の場合には該装置の攪拌能力の好ましくは１０〜１００％、より好ましくは２０〜９０％で行う。一方、試験管やフラスコ等の小規模な器具の場合には振盪機を用いて行うのが良く、好ましくは５０〜３００ｒｐｍ、より好ましくは１００〜２５０ｒｐｍで行う。培養時間は微生物の増殖が収束する時間であれば良く、６〜７２時間、好ましくは１２〜４８時間で行う。
【００４３】
基質である１，１−ジフルオロアセトンに前記微生物を作用させるには、通常、微生物を培養した懸濁液をそのまま反応に使用することができる。培養中に生じる成分が還元反応に悪影響を与える場合には、遠心分離等の操作で培養液から菌体を１度回収して得られた菌体（静止菌体）を用いて再び懸濁液を調製して反応に使用しても良い。また、培養した微生物菌体の細胞を破砕等して得られたものや、培養した微生物菌体から調製した酵素などの、各種細胞抽出物も反応に使用することもできる。他方、基質である１，１−ジフルオロアセトンに前記酵素（精製酵素）を作用させる場合には、該酵素を溶解させた緩衝液中で行うことができる。本反応は還元反応であることから、弱酸性の緩衝液が好ましく、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、クエン酸カリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸カリウム緩衝液が挙げられる。
【００４４】
前記微生物を用いた反応を効率的に進めるには、これらの懸濁液中の菌体の密度を高める必要があるが、密度が高過ぎると自己溶解酵素の産生や終末代謝産物の蓄積等により反応が阻害される場合があるため、通常１０6〜１０12ｃｆｕ／ｍｌ（「ｃｆｕ」は寒天培地上に形成されるコロニーの数を意味する、ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ）、好ましくは１０7〜１０11ｃｆｕ／ｍｌ、より好ましくは１０8〜１０10ｃｆｕ／ｍｌで行う。他方、前記酵素を用いた反応を効率的に進めるためには、緩衝液中の酵素の濃度を高める必要があるが、酵素を使用しすぎると経済的ではないため、好ましくは０．０１ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１ｇ〜１０ｇの範囲で使用する。
【００４５】
これらの懸濁液または緩衝液への１，１−ジフルオロアセトンの添加において、該アセトンの濃度は、還元反応が円滑に進み且つ微生物または酵素の活性に悪影響を与えない濃度を維持することが好ましい。該アセトンの濃度は、５％（ｗ／ｖ）より高い場合、微生物が死滅したり、酵素が変性することがあるため、この数値以下の濃度、すなわち、通常０．０１〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０５〜６％（ｗ／ｖ）で行う。該アセトン濃度算出の容量の根拠は、例えば、後述する実施例１では蒸気滅菌前の試験管に分注した培養液量を、後述する実施例３では培養後の微生物の懸濁液総量を、目安として考えれば良い。
【００４６】
基質である１，１−ジフルオロアセトンに前記微生物または酵素を作用させる際の温度（すなわち反応温度）は、該微生物または酵素に好適な範囲を維持する必要があり、通常５〜６０℃、好ましくは１５〜５０℃、より好ましくは１５〜３８℃である。また、上記作用させる際のｐＨ（すなわち反応時のｐＨ）も、好適な範囲を維持する必要があり、通常４．０〜８．０、好ましくは５．５〜８．０、より好ましくは５．５〜７．０である。
【００４７】
微生物懸濁液または酵素緩衝液が静置状態にあると反応効率が低下するため、反応時は反応液を攪拌しながら行う。また、反応時は無通気で行うことができるが、必要に応じて通気を行ってもよい。その際、通気量が多過ぎる場合には１，１−ジフルオロアセトンおよびキラル−１，１−ジフルオロ−２−プロパノールが系外に気体として飛散するおそれがあるため、通気量は、０．３ｖｖｍ以下が好ましく、より好ましくは０．１ｖｖｍ以下である。反応時間は、目的物の生成具合によって決定すればよく、通常６〜３１２時間である。
【００４８】
本発明では、還元反応に利用される補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（水素供与体）は、微生物が本来持つ脱水素酵素、大腸菌に組み込まれた脱水素酵素を利用して補酵素ＮＡＤ（Ｐ）より再生されるため、懸濁液に水素源となる基質を別途存在させて還元反応を行うのが好ましく、ここでは糖類やアルコール類も使用可能である。補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは市販されているものを別途加えて還元反応を行うことも可能であるが、非常に高価なため経済的ではない。本発明のように補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを外部から新たに加えることなく、脱水素酵素により再生させることで、１菌体当たりの還元回数が増え、経済的に且つ高い生産性で目的物を製造することができる。
【００４９】
本発明の方法は、１，１−ジフルオロアセトンからキラル−１，１−ジフルオロ−２−プロパノールへ変換する際に、工業的な製造方法を目的とし、好適な反応条件を採用することで、キラル−１，１−ジフルオロ−２−プロパノールを大量に製造することが可能である。
【００５０】
なお、本発明の方法では、光学活性体のアルコール、すなわちキラル−１，１−ジフルオロ−２−プロパノールを、実用的にも採用できる光学純度として、８５％ｅｅ以上、特に好ましくは９８％ｅｅ以上で得ることができる。
【００５１】
微生物の菌体を用いた場合、菌体内には多数の酸化還元酵素が混在することから、全体として見た場合、光学純度が低下するが、目的の酵素を精製して用いることで光学純度を向上することができる。
【００５２】
生成したキラル−１，１−ジフルオロ−２−プロパノールを反応終了液（反応終了後の不純物などを含む混合液）から回収するには、有機合成における一般的な単離方法が採用できる。反応終了後、蒸留や有機溶媒による抽出等の通常の後処理操作を行うことにより、粗生成物を得ることができる。特に、反応終了液または必要に応じて菌体を取り除いた後の濾洗液を直接、蒸留に付すことで簡便に且つ収率良く回収することができる。得られた粗生成物は、必要に応じて、脱水、活性炭、分別蒸留、カラムクロマトグラフィー等の精製操作を行うことができる。
【００５３】
［実施例］
次に実施例を示すが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００５４】
［１，１−ジフルオロアセトンに対する微生物の反応性調査（スクリーニング）結果］
蒸留水１０００ｍｌ、ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇの組成からなる液体培地を調製し、試験管（φ１．８ｃｍ×１８ｃｍ）に５ｍｌずつ分注し、下記表Ａに示す各微生物を接種し、２８℃、１６０ｓｐｍで２４時間の培養を行った。培養終了後、１，１−ジフルオロアセトンを１％ｗｔ／ｖとなるように添加し、２８℃、１６０ｒｐｍで還元反応を２４時間行った。反応後の変換率の測定は、19Ｆ−ＮＭＲの内部標準法により行い、光学純度の測定は、反応液に酢酸エチルを加えて混合し、１，１−ジフルオロ−２−プロパノールを有機層に抽出し、後述するキラルカラムを用いたガスクロマトグラフィー法での分析により行った。用いた微生物ごとに、変換率及び光学純度の測定結果をそれぞれ下記表Ａに示した。（変換率及び光学純度の測定方法は以下同）
【００５５】
【表３】
0006457841.tif 000008
【００５６】
［キラルカラムを用いたガスクロマトグラフィー法の分析条件］
酢酸エチルに抽出された１，１−ジフルオロアセトンに対して、無水酢酸１．２当量、ピリジン１．２等量を反応させ、アセトキシ体に誘導し、分析試料とした。ガスクロマトグラフィーのカラムにはアジレント・テクノロジー社製のＣｙｃｌｏｓｉｌ−Ｂ（０．２５ｍｍ×３０ｍ×０．２５μｍ）を用い、キャリアガスは窒素、圧力は１００ｋＰａ、カラム温度は６０〜９０℃（１℃／ｍｉｎ）〜１５０℃（１０℃／ｍｉｎ）、気化室・検出器（ＦＩＤ）温度は２３０℃の分析条件で得られるピークの面積により光学純度を算出した。１，１−ジフルオロ−２−プロパノールのそれぞれのエナンチオマーの保持時間は、Ｓ体が４．６ｍｉｎ、Ｒ体が５．３ｍｉｎであった。立体配置の決定は(-)-モッシャー酸クロリドを用いた新モッシャー法により決定した（１Ｈ−ＮＭＲ化学シフト：［Ｓ−ＭＴＰＡエステル］ＣＦ２Ｈ  ６．０６、Ｈ  ５．４２、ＣＨ３  １．４４、［Ｒ−ＭＴＰＡエステル］ＣＦ２Ｈ  ６．１８、Ｈ  ５．４４、ＣＨ３  １．３６）。
【実施例２】
【００５７】
［微生物菌体による（Ｓ）−１，１−ジフルオロ−２−プロパノールの製造］
前培養の培地として、蒸留水１０００ｍｌ、ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇの組成からなる液体培地を調製し、試験管（φ１．８ｃｍ×１８ｃｍ）に５ｍｌずつ分注し、１２１℃で１５分間の蒸気滅菌を行った。この液体培地にOgataea polymorpha NBRC0799菌株を白金時で無菌的に接種し、２８℃、１６０ｓｐｍで１６時間の培養を行い、１．４×１０７ｃｆｕ／ｍｌの前培養液を得た。本培養の培地として、蒸留水５００ｍｌ、グルコース１６．２５ｇ、酵母エキス１２．５ｇ、ポリペプトン７．５ｇ、リン酸二水素カリウム１．２ｇ、リン酸水素二カリウム０．６２５ｇ、消泡剤（旭化成製、ＦＣ２９０１）０．２ｇの組成からなる液体培地を調製し、容量１Ｌの培養槽（（株）エイブル製、ＢＭＥ０１型）に張り込み、１２１℃で１５分間の蒸気滅菌を行った。この培養槽に前培養液を無菌的に５ｍｌ接種し、２８℃、通気１ｖｖｍ、攪拌７００ｒｐｍで１８時間培養し、１．７×１０9ｃｆｕ／ｍｌ（湿菌重として２８ｇ／Ｌ）の懸濁液を調製した。培養時のｐＨは２０％重炭酸ナトリウム水溶液、４２．５％リン酸水溶液を用いてｐＨ６．５に調整した。培養終了後、通気を０ｖｖｍに変更し、培養液に対して１，１−ジフルオロアセトン１％ｗｔ／ｖ、グルコースを６．２５ｇｗｔ／ｖとなるように添加し、２８℃で還元反応を４３時間行った。反応後の変換率は１００％、光学純度は９３．４％ｅｅ（Ｓ）であった。反応後の培養液から直接蒸留により（Ｓ）−１，１−ジフルオロ−２−プロパノールの水溶液を９．８ｇ回収した。この水溶液に水酸化カルシウム（無水）を加え脱水し、水分濃度２．１％の（Ｓ）−１，１−ジフルオロ−２−プロパノールを４．１ｇ得た。
【実施例３】
【００５８】
［無細胞抽出液による（Ｓ）−１，１−ジフルオロ−２−プロパノールの製造］
実施例２で培養したOgataea polymorpha NBRC0799菌株の菌体懸濁液を５００ｍｌ容の遠沈管に移液し、１８，０００×ｇ、３０分間の遠心分離を行い、菌体を回収した。回収した湿菌体に０．２ＭのｐＨ７．０のリン酸緩衝液を１５ｍｌ加え、懸濁液を調製した。ビーズ式細胞破砕装置（ＢｉｏＳｐｅｃ社製、ビードビーター）を用いて、懸濁液中の細胞を破砕し、ガラスビースを除去後、２０，０００×ｇ、３０分間の遠心分離を行い、無細胞抽出液を調製した。この無細胞抽出液１ｍｌに１，１−ジフルオロアセトンを１％ｗｔ／ｖ、２Ｍグルコースを２５０μＬ添加し、２８℃で還元反応を２４時間行った。反応後の変換率は１００％、光学純度は９５．６％ｅｅ（Ｓ）であった。
【実施例４】
【００５９】
[Ogataea polymorpha NBRC0799菌株からのカルボニル還元酵素の精製]
Ogataea polymorpha NBRC0799菌株を、グルコース１０ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム３ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム２．０ｇ／Ｌの組成からなるｐＨ６．５の液体培地を５ｍｌ分注した試験管（φ１．４ｃｍ×１８ｃｍ）を１２１℃で１５分間蒸気滅菌した後、白金時で無菌的に接種し、３０℃、３００ｒｐｍで２４時間の培養を行い、３．８４×１０１０ｃｆｕ／ｍｌの前々培養液を調製した。
【００６０】
２００ｍｌの上記液体培地を含む５００ｍｌ三角フラスコを、１２１℃で１５分間の蒸気滅菌を行い、前培養液を無菌的に２ｍｌ添加し、３０℃、攪拌１８０ｒｐｍで２４時間培養し、３．８×１０１０ｃｆｕ／ｍｌの前培養液を調製した。
【００６１】
上記と同一の培地を２Ｌ容の坂口フラスコに１０００ｍｌづつ分注し、１２１℃で１５分間の蒸気滅菌し、前培養液を無菌的に１０ｍｌ添加し、３０℃、９６ｒｐｍで２４時間培養した。培養液を５００ｍｌ容の遠沈管に移し、３０００×ｇ、８分間の遠心分離を行い、菌体として回収した。
【００６２】
［酵素活性測定方法］
酵素活性は、酵素または微生物を含む１６８ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にＮＡＤＨを終濃度０．１ｍＭとなるように添加し、この反応溶液に終濃度５０ｍＭとなるように１，１−ジフルオロアセトンを添加して反応を開始した（反応液１ｍＬ）。反応は３０℃で行い、分光光度計（日本分光株式会社、Ｖ−６３０ＢＩＯ）を用いてＮＡＤＨの減少を３４０ｎｍの吸光度でモニターした。なお、酵素活性は、１分当たり１μｍｏｌのＮＡＤＨの酸化を触媒する酵素量を１Ｕ（ユニット）として定義した。
【００６３】
［無細胞抽出液の調製］
回収した菌体に１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を菌体の５倍量加え、懸濁液を調製した。ビーズ式細胞破砕装置（安井器械株式会社、マルチビーズショッカー）を用いて、菌体を破砕し、２０，０００×ｇ、１０分間の遠心分離を行い、上清を無細胞抽出液として使用した。
【００６４】
［硫安分画］
３０％飽和硫安濃度になるように硫安を無細胞抽出液に添加し、氷上で３時間撹拌した。２０，０００×ｇ、３０分間の遠心分離を行い、上清を３０％飽和硫安画分として次の精製過程に使用した。
【００６５】
［疎水クロマトグラフィー−ＰｈｅｎｙｌＴｏｙｏｐｅａｒｌ］
３０％飽和硫安溶液で平衡化した６０ｍｌのＰｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（東ソー株式会社、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ(登録商標) Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍ）カラムに上記の３０％飽和硫安上清画分を供した。３００ｍＭの硫安を含む、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３００ｍｌで洗浄し１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で溶出した。得られた活性画分をプールしＰｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ活性画分として、次の精製ステップに使用した。
【００６６】
［イオン交換クロマトグラフィー−Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ］
上記、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ活性画分を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した３０ｍｌのＱ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ.、Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）カラムに供した。そして、カラムを１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１５０ｍｌで洗浄後、０〜１５０ｍＭの塩化ナトリウムのリニアグラジェントにより溶出した。得られた活性画分をＱ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ活性画分として次の精製ステップに用いた。
【００６７】
［ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー−Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ］
Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ活性画分を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した１０ｍＬのＨｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ（ナカライテスク株式会社、ヒドロキシアパタイト）カラムに供した。１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍｌで洗浄し、１０ｍＭと３００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）によるリニアグラジェントにより溶出した。活性を示した画分をプールし、遠心式フィルターユニット（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５、１０ｋＤａ）で濃縮し、酵素を単離した。
精製酵素は最終的に比活性２９．８Ｕ／ｍｇとなった。
【実施例５】
【００６８】
[Ogataea polymorpha NBRC0799菌株由来のカルボニル還元酵素の１，１−ジフルオロアセトンに対する反応性の確認]
Ogataea polymorpha NBRC0799菌株から精製した酵素を含む１６８ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にＮＡＤＨを終濃度０．１ｍＭとなるように添加し、この反応溶液に終濃度５０ｍＭとなるように、下記表Ｂに示す各基質を添加して反応を開始した（反応液１ｍＬ）。３０℃で反応を行い、分光光度計（日本分光株式会社、Ｖ−６３０ＢＩＯ）を用いてＮＡＤＨの減少を吸光度３４０ｎｍにより測定した。
【００６９】
Relative activity（相対活性）とは、アセトンを基質に用いた際の酵素の活性を100%として、それと比較した場合の各基質の酵素活性（変換速度）の割合を示し、１，１−ジフルオロアセトンや１，１，１−トリフルオロアセトンを基質として供した場合、酵素の変換速度自体は低下している（時間を掛ければ反応は完結する）。アセトンについてはどちらのメチル基も同一のため、酵素の認識部位に区別なく取り込まれるが、１，１−ジフルオロアセトンや１，１，１−トリフルオロアセトンでは、フルオロメチル基とメチル基を認識しながら酵素の活性部位に取り込まれるため速度が遅くなっていると考えられる。他方、１，３−ジフルオロアセトンについては、フッ素が導入されることで電気陰性度などがアセトンと比べて変化したと考えられる。
【００７０】
【表４】
0006457841.tif 000009
【実施例６】
【００７１】
［１，１−ジフルオロアセトンに対する市販のアルコール脱水素酵素の反応性の調査（スクリーニング）結果］
１ｍｌの２００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５、２０６ｍＭ  ギ酸ナトリウム、２２２ｍＭ  グルコース、５ｍＭ  ＮＡＤ＋、（ＮＡＤ＋:ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型、以下同じ）５ｍＭ  ＮＡＤＰ＋（ＮＡＤ＋:ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型、以下同じ）に１，１−ジフルオロアセトンを１重量％になるように添加し、下記表Ｃの「酵素名」に示す株式会社ダイセルのChiralscreen(登録商標) OH（アルコール脱水素酵素）を、それぞれ５ｍｇ加えてマグネチックスターラーで攪拌しながら２５℃で２日間反応させた。反応後の変換率と光学純度を測定し、下記表Ｃに示した。
【００７２】
【表５】
0006457841.tif 000010
【００７３】
［比較例１］
実施例５と同様の方法で、下記表Ｄの「酵素名」に示す株式会社ダイセルのChiralscreen(登録商標) OH（アルコール脱水素酵素）の、１，１−ジフルオロアセトンに対する反応性を評価し、下記表Ｄにその結果を示した。
【００７４】
【表６】
0006457841.tif 000011
【実施例７】
【００７５】
[アルコール脱水素酵素を発現する遺伝子組換え大腸菌による（Ｒ）−１，１−ジフルオロ−２−プロパノールの製造]
前培養の培地として、蒸留水１０００ｍｌ、ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇの組成からなる液体培地を調製し、試験管（φ１．６ｃｍ×１５ｃｍ）に５ｍｌずつ分注し、１２１℃で１５分間の蒸気滅菌を行った。この液体培地に、株式会社ダイセルのChiralscreen(登録商標) OH E031のアルコール脱水素酵素を大量発現する遺伝子組換え大腸菌を白金時で無菌的に接種し、３０℃、１６０ｓｐｍで一晩培養を行い、波長６００ｎｍでの光学濃度（ＯＤ６００）７．７の前培養液を得た。
【００７６】
本培養の培地として、蒸留水２０００ｍｌに酵母エキス、グルタミン酸ナトリウム、グルコース、ラクトース、無機塩類、消泡剤からなる液体培地を調製し、容量５Ｌの培養槽（（株）丸菱バイオエンジ製、ＭＤＮ型５Ｌ（Ｓ））に張り込み、１２１℃で３０分間の蒸気滅菌を行った。この培養槽に前培養液を無菌的に５ｍｌ接種し、３０℃、通気０．５ｖｖｍ、攪拌しながら４０時間培養し、光学濃度（ＯＤ６００）２４の懸濁液を調製した。培養時のｐＨは２８％アンモニア水溶液、５０％リン酸水溶液を用いてｐＨ７．０付近に調整した。培養終了後、通気を０ｖｖｍに変更し、培養液に対して１，１−ジフルオロアセトンを３．６％ｗｔ／ｖ（７２ｇ）となるように添加し、補酵素の再生を行いながら２０℃、ｐＨ６．５で還元反応を２４時間行った。反応後の変換率１００％光学純度は９６．９％ｅｅ（Ｒ）であった。
【００７７】
反応後の培養液から直接蒸留により（Ｒ）−１，１−ジフルオロ−２−プロパノールの水溶液を１０２ｇ回収した。この水溶液に水酸化カルシウム（無水）を加え脱水し、水分濃度１．２％の（Ｒ）−１，１−ジフルオロ−２−プロパノールを７０ｇ得た。この（Ｒ）−１，１−ジフルオロ−２−プロパノール７０ｇをヘリパックパッキンＮｏ．１（トウトクエンジ株式会社製）を充填したφ２ｃｍ×３０ｃｍの精留塔を用いて分別蒸留を実施し、蒸気温度８７〜８８℃で留分を回収した。回収した留分をアジレント・テクノロジー社製のＣｙｃｌｏｓｉｌ−Ｂ（０．２５ｍｍ×３０ｍ×０．２５μｍ）を用いたガスクロマトグラフィー［キャリアガスは窒素、圧力は１００ｋＰａ、カラム温度は６０〜９０℃（１℃／ｍｉｎ）〜１５０℃（１０℃／ｍｉｎ）、気化室・検出器（ＦＩＤ）温度は２３０℃］によりピークを取得し、全体の面積に占める１，１−ジフルオロ−２−プロパノールの面積を算出したところ９９．０％であった。