(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３又は配列番号４のデオキシリボヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号３である請求項１に記載のデオキシリボヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号４である請求項１に記載のデオキシリボヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１に記載のデオキシリボヌクレオチド及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項５】
請求項４に記載の医薬組成物を含む近視を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項６】
配列番号２１の、ロックド核酸修飾及びホスホロチオエート結合修飾オリゴヌクレオチドであって、配列番号２１の５’末端から３’末端まで１位、２位、３位、４位、１７位、１８位、１９位及び２０位はロックド核酸で修飾し、配列番号２１の全てのホスホジエステル結合はホスホロチオエート結合で修飾することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載のロックド核酸修飾及びホスホロチオエート結合修飾オリゴヌクレオチドならびに薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項８】
請求項６に記載の医薬組成物を含む近視を予防又は治療するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴデオキシリボヌクレオチド、又はロックド核酸（ＬＮＡ）修飾及びホスホロチオエート結合修飾オリゴヌクレオチドの形態のアンチセンスマイクロＲＮＡ‐３２８、ならびに近視などの眼疾患の治療におけるそれらの治療用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
近視は、眼球を伸長させ、次に、眼球の網膜及び強膜を引き伸ばして薄くする。それに伴い、近視眼の軸長は正常眼のものより長い。留意すべきこととしては、軸長には個体差がある。動物実験では、一方の眼を近視に誘発し、他方の眼を対照として用いる。誘発された近視眼と対照眼との間の軸長の差を利用して近視の重症度を示すことが可能である。また、軸長の差の変化は、抗近視治療の治療効果を評価するための読取り機構としても利用可能である。眼球の伸長は、網膜剥離、黄斑変性症など近視の合併症を引き起こす主な発症機序と考えられている。このことは、軸長の伸長を妨げずに屈折を修正すること（眼鏡など）では近視の合併症を防止できない理由も説明している。
【０００３】
ペアードボックス６（ＰＡＸ６）遺伝子は、ペアード及びホメオボックスＤＮＡ結合ドメインを含む転写因子の高度に保存されたファミリーに属する。ＰＡＸ６は中枢神経系及び眼の発生に関与している。ＰＡＸ６は水晶体及び網膜分化の誘導に重要な役割を担い、眼の発生におけるマスター遺伝子と考えられている。ヒトでは、ＰＡＸ６の突然変異は無虹彩、中心窩形成不全、早老白内障、及び無虹彩関連角膜症（Ｔｓｏｎｉｓ及びＦｕｅｎｔｅｓによる報告）などの様々なヒト眼疾患が伴う。生物学的根拠に加えて、全ゲノム連鎖研究により、屈折異常がＰＡＸ６遺伝子座に強く連鎖することが明らかになった。これに伴い、ＰＡＸ６が近視発症の候補遺伝子として提案されている。低レベルのＰＡＸ６は、近視の危険因子である可能性がある。
【０００４】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、約２１〜２３ヌクレオチドの長さの非コード一本鎖ＲＮＡ分子である。動物では、成熟ｍｉＲＮＡは、１つ以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に相補的である。ｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡへのアニーリングにより、タンパク質翻訳の阻害、及び／又はｍＲＮＡの切断が起こる。ｍｉＲＮＡは細胞増殖、分化及びアポトーシスを調節できる。
【０００５】
Ｃｈｅｎら（非特許文献１）はマイクロＲＮＡ‐３２８（ｍｉＲ‐３２８）がＰＡＸ６遺伝子の媒介により近視の発症に影響を及ぼす可能性があることを報告している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，５３：２７３２〜２７３９，２０１２年）
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ｍｉＲ‐３２８アンチセンスＤＮＡ（１５量体〜３０量体）及び対照によるトランスフェクション後のＲＰＥ細胞における相対的ｍｉＲ‐３２８発現レベルを示す。平均及び標準偏差を示す（ｎ＝３）。
【図２】ロックド核酸及びホスホロチオエート化結合で修飾したｍｉＲ‐３２８アンチセンスＤＮＡ（４０１〜４０６）ならびに対照によるトランスフェクション後のＲＰＥ細胞における相対的ｍｉＲ‐３２８発現レベルを示す。平均及び標準偏差を示す（ｎ＝３）。
【図３】生理食塩水の対照（ＮＳ）、ＤＮＡ１６量体、ＤＮＡ１７量体、ＬＮＡ４０３、ＬＮＡ４０４及びＬＮＡ４０５で処置したマウスにおける右眼（近視）と左眼とのマウスのΔ軸長を示す。
【図４】生理食塩水の対照（「生理食塩水」）、１％アトロピン（「アトロピン」）、ＤＮＡ１６量体及びＬＮＡ４０３で処置したマウスにおける右眼（近視）と左眼とのマウスのΔ軸長を示す。
【図５】生理食塩水の対照（「生理食塩水」）、１％アトロピン、１０ｎＭ、１００ｎＭ及び１μＭのＤＮＡ１６量体で処置したマウスにおける右眼（近視）と左眼とのマウスのΔ軸長を示す。
【図６】生理食塩水の対照（「生理食塩水」）、１０μＭ及び５０μＭのＤＮＡ１６量体で処置したウサギの右眼（近視）と左眼とのウサギのΔ軸長を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
定義
接触できないＲＮＡと呼ばれることもある「ロックド核酸」（ＬＮＡ）は修飾ＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は２’酸素と４’炭素とを結合する付加的な架橋で修飾される。架橋は、Ａ形態の二本鎖において見られることも多い３’‐エンド（ノース）構造のリボースを「ロック」する。ＬＮＡヌクレオチドは、必要に応じてオリゴヌクレオチド中のＤＮＡ又はＲＮＡ残基と混合することが可能である。
【０００９】
本明細書で使用する「オリゴデオキシリボヌクレオチド」は、５〜５０塩基、好ましくは１０〜３０塩基、又は１５〜３０塩基長のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を指す。ＤＮＡは場合により、塩基又はホスホジエステル結合上で修飾される。
【００１０】
本明細書で使用される「オリゴリボヌクレオチド」は、５〜５０塩基、好ましくは１０〜３０塩基、又は１５〜３０塩基長のリボ核酸（ＲＮＡ）を指す。ＲＮＡは任意に修飾する。
【００１１】
本明細書中で使用する「オリゴヌクレオチド」は、オリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、又はそのハイブリッドを指す。
【００１２】
「ホスホロチオエート」は、ホスホジエステル結合の非架橋酸素の少なくとも１つが硫黄で置換された正常ＤＮＡの変異体である。ヌクレオチド間結合の硫黄化は、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼの作用を劇的に減少させる。ホスホロチオエート（ＰＳ）結合の包含は、ヒト血清中のオリゴヌクレオチド半減期を増加させる；しかし、ＰＳ結合の導入はオリゴヌクレオチドの結合親和性を低下させ、細胞毒性を引き起こす可能性がある。
【００１３】
本発明は、ｍｉＲ‐３２８に対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチド配列を対象とする。１実施形態では、オリゴヌクレオチドは、特定の長さのオリゴデオキシリボヌクレオチドである。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドはＬＮＡ修飾及びホスホロチオエート修飾を有する。本発明のオリゴヌクレオチドは近視などの眼疾患の予防又は治療に有用である。
【００１４】
ヒト成熟ｍｉＲ‐３２８は、ＣＵＧＧＣＣＣＵＣＵＣＵＧＣＣＣＵＵＣＣＧＵ（配列番号１）の配列を有する。
【００１５】
本発明の第１の態様では、本発明者らは成熟ヒトｍｉＲ‐３２８に従ったアンチセンスｍｉＲ‐３２８オリゴデオキシリボヌクレオチド（長さ１５〜２２量体）を設計し、未成熟ヒトｍｉＲ‐３２８配列に従ったアンチセンスｍｉＲ‐３２８オリゴデオキシリボヌクレオチド（長さ２３〜３０量体）を設計した。次に、本発明者らは１５〜３０塩基を有する（１５〜３０量体）ｍｉＲＮＡ‐３２８アンチセンスＤＮＡを得て、それらの活性を試験した。ＤＮＡ１５量体〜３０量体の配列を表１に示す。
【００１６】
【表１】
0006516196.tif 000002
【００１７】
本発明者らは、試験した１６種のアンチセンスＤＮＡのうち１６量体及び１７量体のみがインビトロでｍｉＲ‐３２８発現を阻害することを発見した。驚くべきことに、アンチセンスＤＮＡ（１５量体及び１８〜３０量体）はインビトロでｍｉＲ‐３２８発現を阻害する活性を全く示さなかった。１６量体及び１７量体は動物試験において安全であり、処置したマウスの平均軸長を減少させることにより近視を治療するための活性を示した。
【００１８】
本発明はＤＮＡ１６量体、５’‐ＡＧＧＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＣＣＡ‐３’（配列番号３）及びＤＮＡ１７量体、５’‐ＡＡＧＧＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＣＣＡ‐３’（配列番号４）を対象とする。
【００１９】
本発明の第２の態様では、本発明者らは、成熟ヒトｍｉＲ‐３２８配列及びギャップマーの原理（Ｋｕｒｒｅｃｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０：１９１１〜１９１８，２００２年）に従って、ＬＮＡ修飾及びホスホロチオエート（ＰＳ）結合修飾した１７〜２２量体のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計した。１５及び１６量体の５’末端の末端配列は連続的な３Ｇの自己相補的パターンを示し、これによりオリゴヌクレオチドが二量体を形成する可能性があるため、１５及び１６量体のＬＮＡ修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは含まれない。その後、本発明者らは１７〜２２塩基のｍｉＲＮＡ‐３２８アンチセンスＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを得て、それらの活性を試験した。ＬＮＡ修飾及びＰＳ結合修飾したアンチセンスｍｉＲ‐３２８オリゴヌクレオチドの配列を表２に示す。それらのそれぞれの非修飾天然ＤＮＡ配列は配列番号１８〜２３として配列リストのコンピュータ可読フォーマットで示す。
【００２０】
【表２】
0006516196.tif 000003
＋：ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾を示す；
＊：ホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合で置換したことを示す。  
＾は、配列番号１８〜２３が、表中の「＋」や「＊」で示しているそれぞれのＬＮＡ修飾及びＰＳ修飾したそれらの対応物の天然（非修飾）オリゴヌクレオチドの配列であることを示す。
【００２１】
表２では、ＤＮＡ配列のホスホジエステル結合は全て、ホスホロチオエート結合（ＰＳ）で修飾されている。表２では、各ＤＮＡ配列の中芯には、５’及び３’末端の両方にある４つのＬＮＡ修飾ヌクレオチドが隣接している。
【００２２】
本発明者らは、試験した６種のアンチセンスＬＮＡ／ＰＳ結合修飾オリゴヌクレオチドのうち、４０３，４０４及び４０５のみがインビトロでｍｉＲ‐３２８発現を阻害することを発見した。他のアンチセンスＬＮＡ／ＰＳ結合修飾ＤＮＡは、インビトロでのｍｉＲ‐３２８発現を阻害する活性を全く示さなかった。インビトロ活性に加えて、４０３は、処置したマウスの平均軸長を減少させることにより近視を治療する活性を示した。
【００２３】
本発明はアンチセンスＬＮＡ／ＰＳ結合修飾オリゴヌクレオチド４０３、４０４、４０５を対象とし；４０３が好ましい。
【００２４】
本発明のｍｉＲＮＡ‐３２８アンチセンス組成物は、ｍｉＲＮＡ‐３２８に対して良好なハイブリダイゼーション活性を示し、水溶性は良好であり、安定している（エキソヌクレアーゼ耐性）。
【００２５】
ＰＡＸ６、ＦＭＯＤ及びＣＯＬ１Ａ１は近視病因において重要な遺伝子であり、ｍｉＲ‐３２８の直接標的遺伝子である。これらの遺伝子は近視発症に関与していることが分かっている。本発明のｍｉＲＮＡ‐３２８アンチセンス組成物は、インビトロでＰＡＸ６、ＦＭＯＤ及びＣＯＬ１Ａ１の発現レベルを増加させた。
【００２６】
本発明のｍｉＲＮＡ‐３２８アンチセンス組成物は眼疾患の予防又は治療に有用である。特に、本発明のｍｉＲＮＡ‐３２８アンチセンス組成物は近視の予防又は治療に有用である。
【００２７】
本発明は、本発明のｍｉＲＮＡ‐３２８アンチセンスオリゴヌクレオチド及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を対象とする。近視を治療するための好ましい形態は局所液剤又は局所軟膏である。
【００２８】
アンチセンスｍｉＲＮＡ‐３２８を含有する局所液剤は、眼科分野の当業者が従来の基準を使用して選択することができるように、生理学的に適合可能な賦形剤を含有することが可能である。眼科用賦形剤には、生理食塩水、ポリエチレングリコールなどの水ポリエーテル類、ポリビニルアルコール及びポビドンなどのポリビニル類、メチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体類、鉱物油及び白色ワセリンなどの石油誘導体類、ラノリンなどの動物性油脂類、カルボキシポリメチレンゲルなどのアクリル酸のポリマー類、落花生油などの植物性油脂類、デキストランなどの多糖類、ヒアルロン酸ナトリウムなどのグリコサミノグリカン類、ならびに塩化ナトリウム及び塩化カリウムなどの塩類が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００２９】
製剤は場合により、塩化ベンザルコニウムなどの防腐剤、及びＥＤＴＡなどの他の不活性成分を含む。しかし、慢性（２週間超）使用する場合、塩化ベンザルコニウムなどの防腐剤に長期間頻繁に曝露されることにより角膜上皮が損傷する可能性があるため、防腐剤を含まない製剤が好ましい製剤である。防腐剤を含まない製剤は、単位用量で調製し、一回分使用容器に保存する。
【００３０】
製剤のｐＨは、生理学的及び眼科学的に許容可能なｐＨを調整する酸、塩基又は緩衝液を添加することにより、約５〜７．５、好ましくは６〜７の範囲内に調整する。酸の例としては酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸、塩酸等が挙げられ、塩基の例としては水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、トロメタミン、ＴＨＡＭ（トリスヒドロキシメチルアミノ‐メタン）等が挙げられる。塩及び緩衝液には、クエン酸塩／デキストロース、重炭酸ナトリウム、塩化アンモニウム、ならびに上記の酸及び塩基の混合物が挙げられる。
【００３１】
水性眼科用組成物の浸透圧は一般的に、約２００〜約４００ミリオスモル（ｍＯｓＭ）、より好ましくは２６０〜３４０ｍＯｓＭである。浸透圧は、適量の生理学的及び眼科的に許容可能なイオン性又は非イオン性薬剤を使用することにより調整可能である。塩化ナトリウムは好ましくはイオン性薬剤であり、塩化ナトリウムの量は約０．０１％〜約１％（ｗ／ｖ）、好ましくは約０．０５％〜約０．４５％（ｗ／ｖ）の範囲である。カリウム及びアンモニウム等の陽イオン、ならびに塩化物、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩、重炭酸塩、硫酸塩、チオ硫酸塩、重硫酸塩、重硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等の陰イオンから成る１種以上の塩の等量は、塩化ナトリウムに加えて、又は塩化ナトリウムの代わりに使用して上述の範囲内の浸透圧を達成することが可能になる。更に、マンニトール、デキストロース、ソルビトール、グルコース等の非イオン性薬剤も浸透圧を調整するために使用可能である。
【００３２】
本発明のｍｉＲＮＡ‐３２８アンチセンスオリゴヌクレオチドは適切な手段であればどのような手段を利用しても患者の眼に投与可能であるが、点眼薬、噴霧剤、ゲル剤又は軟膏の形態で投与することが好ましい。１実施形態では、オリゴヌクレオチドは点眼薬の形態であり、眼球表面上に滴下する。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは眼球表面に使用可能なスワブ又はスポンジ内に含ませる。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは眼球表面に使用可能な液体噴霧剤又は軟膏内に含ませる。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは涙液組織内に、又は眼球表面上に直接注射する。あるいは、オリゴヌクレオチドはリポソームを介して眼に投与可能である。更に、オリゴヌクレオチドは、ポンプ‐カテーテルシステムを介して涙膜に注入可能である。更なる実施形態として、オリゴヌクレオチドは眼球上に設置されたコンタクトレンズ又は他の適合可能な放出制御材料内に含ませるか、それに担持させるか、又は付着させることが可能である。
【００３３】
局所液剤に含まれるオリゴヌクレオチドの濃度は近視を予防及び／又は治療するために十分な量である。オリゴヌクレオチド濃度は一般的に、約３０ｎＭ〜２．５ｍＭ、好ましくは約１００ｎＭ〜１０μＭ、約１μＭ〜１００μＭ、又は約１５μＭ〜１．５ｍＭの範囲である。本明細書で使用される「約」は、列挙した値の±１０％を意味する。
【００３４】
本発明は更に、被検体の近視を予防又は治療するための方法を対象とする。当該方法には、本発明の有効量のアンチセンスマイクロＲＮＡ‐３２８オリゴヌクレオチド組成物を、それを必要とする被検体に投与する工程が含まれる。局所投与経路が好ましい。「有効量」は、近視の予防又は治療、すなわち眼の軸長増大の予防、又は近視眼の軸長の減少に有効な量を指す。
【００３５】
近視を治療又は予防する１日用量は、１回又は数回の単位用量投与に分けることが可能である。１日用量は例えば、被検体の年齢及び状態に応じて１滴（約３０〜５０μｌ）を１日に１〜４回投与する範囲にすることが可能である。ｍｉＲ‐３２８アンチセンスＤＮＡ組成物の１つのレジメンとしては、１日に１〜２回、１滴の局所液剤を投与する。あるいは、局所液剤を１週間に１回投与することも可能である。
【００３６】
近視を治療又は予防する場合、本方法は当業者に公知の他の方法と組み合わせることが可能である。
【００３７】
本発明はまた、近視の予防又は治療用薬物又は医薬組成物を製造するための本発明のデオキシリボヌクレオチド配列の使用を提供する。好ましい実施形態では、薬物又は医薬組成物は局所液剤又は局所軟膏である。
【００３８】
本発明はまた、近視の予防又は治療用薬物又は医薬組成物を製造するための本発明のロックド核酸修飾及びホスホロチオエート結合修飾オリゴヌクレオチド配列の使用を提供する。好ましい実施形態では、薬物又は医薬組成物は局所液剤又は局所軟膏である。
【００３９】
以下の実施例は本発明を更に説明するものである。これらの実施例は単に本発明を説明することを意図しており、本発明を限定するものと解釈すべきではない。
【実施例】
【００４０】
実施例１．アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）合成及び精製
ＤＮＡヌクレオチドから成るアンチセンスｍｉＲ‐３２８オリゴヌクレオチドを成熟ヒトｍｉＲ‐３２８及びヒトｐｒｅ‐３２８配列に従って設計した。メーカー説明書に従って、Ｄｒ．Ｏｌｉｇｏ１９２と呼ばれるＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（Ｂｉｏｌｙｔｉｃ  Ｌａｂ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ社）を用いてＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成した。全てのデオキシリボヌクレオチドを含む１５〜３０量体のアンチセンスオリゴヌクレオチドを作成した。生成物をＨＰＬＣで精製した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成及び精製はＧｅｎｏｍｉｃｓ  ＢｉｏＳｃｉ＆Ｔｅｃｈ社（台湾）により行った。ＤＮＡ１５量体〜３０量体の配列を表１に示す。
【００４１】
実施例２．アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＬＮＡ）合成及び精製
１７〜２２量体の範囲のＬＮＡ修飾及びＰＳ結合修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを成熟ヒトｍｉＲ‐３２８配列及びギャップマーの原理に従って設計した；修飾配列及び非修飾形態を表２に示す。この設計に従って、１７〜２２量体のＬＮＡ修飾及びＰＳ結合修飾アンチセンス配列を合成し、Ｅｘｉｑｏｎ社（デンマーク）により精製した。
【００４２】
実施例３．アンチセンスオリゴヌクレオチドによるｍｉＲ‐３２８発現の阻害についてのインビトロ試験
細胞培養、処理及びトランスフェクション
「ＡＲＰＥ‐１９」と呼ばれるＲＰＥ細胞株をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２培地で培養した。細胞系は、９５％空気／５％二酸化炭素（ＣＯ２）の加湿雰囲気下、３７℃で１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と共に培養した。トランスフェクション実験を行うため、細胞を１×１０５個／ウェルの密度で１２ウェルプレートに播種した。ウェル中で７０％コンフルエントに達した後、メーカー説明書に従ってアンチセンスオリゴヌクレオチド（濃度３０、５０及び１００ｎＭ）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でトランスフェクトした。インキュベーションの２４時間後、細胞を次の試験のために溶解した。
【００４３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドによるｍｉＲ‐３２８発現の阻害の検出
メーカー説明書に従って、Ｔｒｉｚｏｌを用いて培養細胞から全ＲＮＡを抽出した。Ａ２６０／Ａ２８０の読み取りを利用してＲＮＡ純度を調べた。初めに、以下の手順によりｍｉＲ‐３２８をｍｉＲ‐３２８ｃＤＮＡに逆転写した：ｍｉＲ‐３２８特異的プライマー及びＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により５ｎｇのＲＮＡを逆転写した。ｍｉＲ‐３２８発現を測定するために、メーカー説明書（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に従って、ｍｉＲ‐３２８特異的プローブを備えたＡＢＩ７５００リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）において定量的リアルタイムＰＣＲを実施した。定量的リアルタイムＰＣＲによりｍｉＲ−３２８ｃＤＮＡレベルを測定することで、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる阻害効果を評価した。ｍｉＲ‐３２８の発現レベルを、内部標準として小さい非コード核ＲＮＡ  Ｕ６の発現レベルへと正規化した。
【００４４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドによるｍｉＲ‐３２８発現阻害についてのインビトロ試験の結果
ａ．ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド
ＲＰＥ細胞におけるｍｉＲ‐３２８の発現に対する阻害効果について、実施例１に従って調製した１６個の長さ１５〜３０量体のＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを調べた。相対的ｍｉＲ‐３２８発現レベルを図１に示す。ＤＮＡ１６量体及びＤＮＡ１７量体のみがｍｉＲ‐３２８発現を阻害した。ＤＮＡ１６量体の阻害効果は、３０、５０及び１００ｎＭの濃度で３９％、３５％及び４９％であった。ＤＮＡ１７量体では、その阻害効果は、３０、５０及び１００ｎＭの濃度で４３％、４１％及び４８％であった。残りのアンチセンスオリゴヌクレオチド（１５量体及び１８〜３０量体）はｍｉＲ‐３２８発現に対する阻害効果を示さなかった。
【００４５】
ｂ．ＬＮＡ修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド
ＲＰＥ細胞におけるｍｉＲ‐３２８発現に対する阻害効果について、名称がＬＮＡ４０１〜ＬＮＡ４０６である６つのＬＮＡ修飾アンチセンス配列を試験した。相対的なｍｉＲ‐３２８発現レベルを図２に示す。ＬＮＡ４０３、ＬＮＡ４０４及びＬＮＡ４０５のみがｍｉＲ‐３２８発現を阻害した。ＬＮＡ４０３の阻害効果は、３０、５０及び１００ｎＭの濃度でそれぞれ９７％、９７％及び９０％であった。ＬＮＡ４０４及びＬＮＡ４０５の阻害効果は、３０、５０及び１００ｎＭの濃度でそれぞれ９８％、９８％及び９９％と、同じであった。残りのＬＮＡオリゴヌクレオチドはｍｉＲ‐３２８発現に対して阻害効果を示さなかった。
【００４６】
実施例４．近眼治療におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を評価するインビボ試験
動物モデル
２１日齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを台湾のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒから購入した。動物実験は全て、ＡＲＶＯ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ａｎｄ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈに準拠した。近視誘発の手順を簡単に以下のように説明する：２３日齢のマウスの右眼を近視（すなわち近眼）を誘発するために覆い隠し、左眼は覆い隠すことはしなかった。その後、３０日目、３７日目及び４４日目に、近視誘発マウスの右眼を３０μＬの生理食塩水（すなわち対照群）、１μＭのＤＮＡ１６量体、ＤＮＡ１７量体、ＬＮＡ４０３、ＬＮＡ４０４又はＬＮＡ４０５で処置した。５１日目にマウスを屠殺し、眼を回収した。単離した眼を解剖顕微鏡下で撮影し、軸長を画像Ｊにより測定した。近視（近眼）は、近視の主要な病理学的変化である軸長の伸長を引き起こす。同じマウスの覆い隠した右眼と覆い隠していない左眼との軸長差（すなわちΔ軸長）は近視の重症度を示す。結果を表３及び図３に要約する。統計的評価はマンホイットニーＵ検定により行った。ｐ値＜０．０５である分析は有意であると考える。
【００４７】
【表３】
0006516196.tif 000004
＊は、生理食塩水群と比較したｐ値＜０．０５での有意差を示す。
【００４８】
ＤＮＡ１６量体及びＤＮＡ１７量体
ＤＮＡ１６量体及びＤＮＡ１７量体で処置したマウスの平均Δ軸長は、対照動物より統計的に有意に小さかった。ＤＮＡ１６量体及びＤＮＡ１７量体では、Δ軸長は対照群と比較して０．０７７ｍｍ及び０．０６５ｍｍ有意に減少した。結果から、ＤＮＡ１６量体及びＤＮＡ１７量体はマウス近視の治療に有効であることが分かった。
【００４９】
ＬＮＡ修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド
ＬＮＡ４０３〜４０５で処置したマウスの平均Δ軸長は、対照動物より小さかった。ＬＮＡ４０３ではΔ軸長は対照群と比較して０．０５４ｍｍ減少し、ＬＮＡ４０４でははΔ軸長は０．０２５ｍｍ減少し、ＬＮＡ４０５ではΔ軸長は０．０３５ｍｍ減少した。しかし、統計的有意性を示している（ｐ値＜０．０５）のはＬＮＡ４０３のみである。結果から、ＬＮＡ４０３はマウス近視の治療に有効であることが分かった。
【００５０】
実施例５．ＤＮＡ１６量体及びＬＮＡ４０３の検証
動物モデル
２１日齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを台湾のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒから購入した。動物実験は全て、ＡＲＶＯ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ａｎｄ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈに準拠した。近視誘発の手順を簡単に以下のように説明する：２３日齢のマウスの右眼を近視（すなわち近眼）を誘発するために４週間覆い隠し、左眼は覆い隠すことはしなかった。その後、３０日目、３７日目及び４４日目に、近視誘発マウスの右眼を３０μＬの生理食塩水（すなわち陰性対照群）、１％のアトロピン（すなわち陽性対照群）、１μＭのＤＮＡ１６量体又はＬＮＡ４０３で処置した。５１日目にマウスを屠殺し、眼を回収した。単離した眼を解剖顕微鏡下で撮影し、軸長を画像Ｊ及び自動測定のための専用ソフトウェアにより測定した。近視（近眼）は、近視の主要な病理学的変化である軸長の伸長を引き起こす。同じマウスの覆い隠した右眼と覆い隠していない左眼との軸長差（すなわちΔ軸長）は近視の重症度を示す。結果を表４及び図４に要約する。統計的評価は、マンホイットニーＵ検定により行った。ｐ値＜０．０５である分析は有意であると考える。
【００５１】
【表４】
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【００５２】
更に、ＤＮＡ１６量体及びＬＮＡ４０３の有効性と、明確に文書化されている抗近視薬（アトロピン）とを比較するために、これらの３種の点眼薬を試験した。本発明者らが使用しているのは臨床濃度より１０倍高い濃度の１％アトロピンであり、１％アトロピンは低濃度の場合より効果的であると分かっていることに留意されたい。ＤＮＡ１６量体及びＬＮＡ４０３は通常の生理食塩水に溶解したことから、陰性対照として通常の生理食塩水を用いた。上記のデータから、ＤＮＡ１６量体及びＬＮＡ４０３の両方は１％アトロピンより、眼球伸長の減少に有効であることが分かった。
【００５３】
実施例６．独立した第三者機関によるＤＮＡ１６量体の確認
本発明者らのＤＮＡ１６量体の結果を確認するためにＣＲＯを利用した。
【００５４】
動物モデル
近視誘発の手順は以下のとおりである：２１日齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを台湾のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒから購入した。動物実験は全て、ＡＲＶＯ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ａｎｄ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈに準拠した。近視誘発の手順を簡単に以下のように説明する：２３日齢のマウスの右眼を近視を誘発するために４週間覆い隠し、左眼は覆い隠すことはしなかった。その後、３０日目、３７日目及び４４日目に、近視誘発マウスの右眼を３０μＬの生理食塩水（すなわち陰性対照群）、１％のアトロピン（すなわち陽性対照群）、１０ｎＭ、１００ｎＭ及び１μＭのＤＮＡ１６量体で処置した。５１日目にマウスを屠殺し、眼を回収した。単離した眼を解剖顕微鏡下で撮影し、軸長を画像Ｊ及び自動測定のための専用ソフトウェアにより測定した。近視（近眼）は、近視の主要な病理学的変化である軸長の伸長を引き起こす。同じマウスの覆い隠した右眼と覆い隠していない左眼との軸長差（すなわちΔ軸長）は近視の重症度を示す。
【００５５】
ＣＲＯ実験の結果を表５及び図５に示す。第三者機関の結果は本発明者らのデータを完全に再現している。
【００５６】
【表５】
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【００５７】
実施例７．第２の動物に対するＤＮＡ１６量体効果の確認
動物モデル
近視誘発の手順：３日齢の着色ウサギを台湾のＤＡ‐ＺＯＮＧ畜産場から購入した。動物実験は全て、ＡＲＶＯ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ａｎｄ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈに準拠した。７日齢で、ウサギの右眼を８週間覆い隠して近視を誘発し、左眼は覆い隠さないままにした。２１日目から両眼の軸長（ＡＸＬ）を週に１回、Ａ‐ｓｃａｎ（Ｓｏｎｏｍｅｄ（登録商標）、ＰＡＣＳＣＡＮ  ３００Ａ、米国）により測定した。近視は、３５日目に右眼ＡＸＬが左眼ＡＸＬより０．２ｍｍ以上長い状態であると定義した。ウサギがこの定義した基準に達すると、このような近視のウサギの右眼を、２０μＬの生理食塩水（すなわち対照群）又は１０μＭもしくは５０μＭのＤＮＡ１６量体（２０μＬ）で３５日目から６３日目まで１日おきに処置した。６１日目に測定した最後のＡＸＬを用いて右ＡＸＬと左ＡＸＬとの差（すなわちΔＡＸＬ）を求め、計算した。治療効果がない場合、ΔＡＸＬは正の値となる。
【００５８】
結果は、近視眼におけるＡＸＬ減少に対する用量依存的応答を示している（表６及び図６参照）。
【００５９】
【表６】
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【００６０】
本発明ならびに本発明を製造及び使用する方法及びプロセスはここでは、当業者が本発明を製造及び使用することを可能にするように、このような完全で明解で簡潔かつ正確な用語で記載している。前述は本発明の好ましい実施形態を説明していること、また、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲から逸脱することなく実施形態において修正がなされ得ることを理解されたい。発明と見なされる対象を特別に指摘し、明確に請求するために、以下の特許請求の範囲が本明細書を完結させる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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