(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物を検出及び定量化する方法であって、
試料を得るステップであり、前記試料がＰＥＧ３３５０を含有する、ステップと；
前記試料、水性のヒドロキシド含有塩、及び有機溶媒に溶かしたペンタフルロベンゾイルクロリドを混合して、二相液体系を製造するステップであり、前記二相液体系がペンタフルオロベンゾエートエステル誘導体を含む、ステップと；
前記二相液体系から液体相上澄を分離するステップと；
液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）の使用で前記上澄を分析して、前記ペンタフルオロベンゾエートエステル誘導体の保持時間を検出するステップと
を含み、
前記ペンタフルオロベンゾエートエステル誘導体の前記保持時間に基づいて、前記試料中のエチレングリコールが、試料当たり１００ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌのエチレングリコールの濃度にて定量化され、
前記ペンタフルオロベンゾエートエステル誘導体の前記保持時間に基づいて、前記試料中のジエチレングリコールが、試料当たり２０ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌのジエチレングリコールの濃度にて定量化される、
方法。
【請求項２】
前記試料が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を摂取した個体から採取された検体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検体が血液検体を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記検体が尿検体を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記検体が胆汁検体を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記検体が器官検体を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記検体が脳脊髄液検体を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＥＧ３３５０が別の化合物と混合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ペンタフルロベンゾイルクロリドがヘキサンに溶解されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒドロキシド含有塩が水酸化ナトリウムを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記水酸化ナトリウムが５Ｍ水酸化ナトリウム溶液を構成する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒドロキシド含有塩が水酸化カリウムを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ペンタフルオロベンゾエートエステル誘導体を定量化するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記エチレングリコールが、前記ペンタフルオロベンゾエートエステル誘導体に基づいて、試料当たり約１００ｎｇ／ｍｌのエチレングリコールの濃度にて定量化される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ジエチレングリコールが、前記ペンタフルオロベンゾエートエステル誘導体に基づいて、試料当たり約２０ｎｇ／ｍｌのジエチレングリコールの濃度にて定量化される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記二相液体系が約２０〜２，０００ｎｇ／ｍｌのジエチレングリコールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
分離する前記ステップが、前記二相液体系を遠心分離するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記二相液体系を急速凍結させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＬＣ／ＭＳが負化学イオン化モードを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ペンタフルオロベンゾエートエステル誘導体がエタン−１，２−ジイルビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
エタン−１，２−ジイルビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）が、エチレングリコールの保持時間より大きい保持時間を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ペンタフルオロベンゾエートエステル誘導体が２，２’−オキシビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
２，２’−オキシビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）が、ジエチレングリコールの保持時間より大きい保持時間を有する、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
[0001]ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、下剤として通常に使用されているポリエーテルである。例えば、ＰＥＧは、医療処置又は外科的処置に備えて個体のＧＩ管をパージするために使用することができる。
【０００２】
[0002]ＰＥＧは、例えば、消化過程の結果として又はその他の理由で、その構成成分の要素に分解することができる。ＰＥＧの分解生成物としては、エチレングリコール及びジエチレングリコールが挙げられる。ＰＥＧ又はＰＥＧ含有物質を個体が摂取すると、エチレングリコール及びジエチレングリコールを含むある種のＰＥＧ代謝物の産生がもたらされ得る。ＰＥＧの摂取に続いて、ＰＥＧ代謝物は、例えば、ＰＥＧを摂取した個体の血液、尿、又は消化器系に存在することができる。
【０００３】
[0003]ＰＥＧ分解はまた、ＰＥＧ含有の製品又は溶液内でも起こり得る。例えば、ＰＥＧ含有の製品又は溶液が摂取される前であっても、ＰＥＧ含有腸管前処置剤にはある特定量のＰＥＧ分解生成物が含有されている場合もある。
【０００４】
[0004]一般には、摂取化合物の代謝物並びに化合物の分解生成物について、試料においてアッセイすることが可能である。代謝物について、上記化合物を摂取した対象から採取された試料においてアッセイすることが可能である。分解生成物について、上記分解生成物を含有する化合物又は溶液から採取された試料においてアッセイすることが可能である。このようなアッセイを使用して、例えば、試料の上記の代謝物又は分解生成物の存在及び量を決定することができる。
【発明の概要】
【０００５】
[0005]本発明では、高感度、高精度、及び高再現性でＰＥＧ代謝物及びＰＥＧ分解生成物を検出及び定量化する化合物及び方法が提供されている。ＰＥＧ代謝物を検出することは、ＰＥＧを摂取した個体の身体内におけるＰＥＧ代謝物の存在について評価するのに有用とすることができる。ＰＥＧ分解生成物を検出することは、ＰＥＧ含有の化合物又は混合物を摂取する前にＰＥＧ分解生成物の存在について評価するのに有用とすることができる。個体から採取された試料の代謝物を検出及び定量化することは、例えば、物質又は物質の代謝物のいずれかの毒性を判定するのに一般に有用とすることができる。同様に、例えば物質の、分解生成物を検出及び定量化することは、例えば、物質及び物質の分解生成物の毒性を判定するのに有用である。
【０００６】
[0006]本明細書では、化合物を検出及び定量化する方法が記載されている。上記方法は、試料を得るステップを含み、この場合、試料はエチレングリコール及びジエチレングリコールのうち１つ又は複数を含有している。試料を、水性のヒドロキシド含有塩の存在中で、水性のペンタフルロベンゾイルクロリド（ｐｅｎｔａｆｌｕｒｏｂｅｎｚｏｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）と一緒に混合して、水溶液を製造するが、この水溶液はペンタフルオロベンゾエートエステル誘導体を含む。液体相上澄を水溶液から分離し、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）の使用により上澄を分析して、製造されたペンタフルオロベンゾエートエステル誘導体を検出するとともに定量化もする。
【０００７】
[0007]個体から得られた試料には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を摂取した個体から採取した検体が含まれてもよい。ＰＥＧを摂取した個体から得た検体には、体液試料のうち組織試料が含まれてもよい。組織又は体液試料には、器官若しくはその一部、血液、血漿、尿、検便、脳脊髄液又はその他の組織若しくは体液が含まれてもよい。
【０００８】
[0008]記載の方法で使用するペンタフルロベンゾイルクロリドは、ヘキサンに溶解することができる。ヒドロキシド含有塩には、水酸化ナトリウムを含めることができる。使用するヒドロキシド塩が、水酸化ナトリウムである場合、５Ｍの濃度を構成することができる。或いは、ヒドロキシド含有塩には、水酸化カリウムを含めることができる。
【０００９】
[0009]ＰＥＧを摂取した個体から得た試料を含む、アッセイの水溶液は、約１００〜１０，０００ｎｇ／ｍｌのエチレングリコールを含み得る。エチレングリコールは、試料当たり約１００ｎｇ／ｍｌのエチレングリコールの濃度にて定量化され得る。
【００１０】
[0010]ＰＥＧを摂取した個体から得た試料を含む、アッセイの水溶液は、約２０〜２，０００ｎｇ／ｍｌのジエチレングリコールを含み得る。ジエチレングリコールは、試料当たり約２０ｎｇ／ｍｌのエチレングリコールの濃度にて定量化され得る。
【００１１】
[0011]アッセイのうち分離するステップは、水溶液を遠心分離するステップを含んでもよく、アッセイは上記水溶液を急速凍結させるステップをさらに含み得る。
【００１２】
[0012]使用するＬＣ／ＭＳモードは、負化学イオン化モード（negative chemical ionization mode）を含み得る。
【００１３】
[0013]ペンタフルオロベンゾエートエステル誘導体生成物は、エタン−１，２−ジイルビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）を含み得、エタン−１，２−ジイルビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）は、０．８と１．４分の間の保持時間を有し得る。より詳細には、エタン−１，２−ジイルビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）は、約１．０５分の保持時間を有し得る。
【００１４】
[0014]ペンタフルオロベンゾエートエステル誘導体生成物は、２，２’−オキシビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）を含み得、２，２’−オキシビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）は、０．８と１．４分の間の保持時間を有する。より詳細には、２，２’−オキシビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）は、約０．９６分の保持時間を有し得る。
【００１５】
[0015]本明細書ではまた、エタン−１，２−ジイルビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）を含む化合物も記載されている。エタン−１，２−ジイルビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）は、０．８と１．４分の間の液体クロマトグラフィー保持時間を有し得る。より詳細には、エタン−１，２−ジイルビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）は、約１．０５分の液体クロマトグラフィー保持時間を有し得る。
【００１６】
[0016]本明細書ではまた、エタン−１，２−ジイルビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）を含む化合物も記載されている。２，２’−オキシビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）は、０．８と１．４分の間の液体クロマトグラフィー保持時間を有し得る。より詳細には、２，２’−オキシビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）は、約０．９６分の液体クロマトグラフィー保持時間を有する。
［参照による組み込み］
【００１７】
[0017]本明細書に言及されている全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許、又は特許出願が、参照によって組み込まれるために具体的且つ個別に示されたかのように、同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【００１８】
[0018]個々の事項の新規な特徴は、添付の請求項に詳細に記載されている。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が活用されている例示的実施形態について記載している以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することによって得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】試料内のＰＥＧ代謝物又はＰＥＧ分解生成物を正確に検出及び定量化する例示的方法の模式的説明を示す図である。
【図２】誘導体化剤ペンタフルオロベンゾイルクロリドの化学構造を示す図である。
【図３】誘導生成物であるエタン−１，２−ジイルビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）を製造する化学プロセスの模式的説明を示す図である。
【図３Ａ】誘導生成物である２，２’−オキシビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）を製造する化学プロセスの模式的説明を示す図である。
【図４】誘導体化生成物であるエタン−１，２−ジイルビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）のクロマトグラムの例を示す図である。
【図５】誘導体化生成物である２，２’−オキシビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）のクロマトグラムの例を示す図である。
【図６】エチレングリコールの既知量に対する検量データの例示的表を示す図である。
【図７】ジエチレングリコールの既知量に対する検量データの例示的表を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
[0027]本明細書に開示されている個々の事項について詳細に説明する前に、個々の事項は、それらの適用において、以下の説明に記載されているか又は図面に示されている、構成、実験、例示的なデータ、及び／又は構成成分の配置に関する詳細には限定されないことを理解されたい。本明細書に記載の主題は、他の変形形態が可能であり、したがって本明細書に記載の変形形態は、明細書の個々の事項の範囲をいかようにも限定するものと捉えるべきではない。また、本明細書で利用される語法及び用語は説明のみを目的とするものであり、いかようにも限定的であると考えるべきではないことを、理解されたい。
【００２１】
[0028]記載されている主題に関する実施形態の以下の詳細な説明では、特定の多数の詳細が、本発明の概念のより徹底的な理解を提供するために記載されている。しかし、本開示内にある本発明の概念はこのような特定の詳細無しで実施され得ることが、当技術分野において通常の技能を有する者には明白である。他の事例では、良く知られた特徴については、本件の開示を不必要に複雑にすることを回避するために詳述されていない。
【００２２】
[0029]本明細書で使用する用語「対象」とは、ヒト又は任意の動物種を含み得る。
【００２３】
[0030]更に、反対の明示的な記載がある場合を除き、「又は」は、包含的な「又は」を指し、排他的な「又は」を指さない。例えば、条件Ａ又はＢとは、以下のいずれか１つにより満たされる：Ａは真であり（又は存在する）及びＢは偽である（又は存在しない）、Ａは偽であり（又は存在しない）及びＢは真である（又は存在する）、並びにＡとＢの両方は真である（又は存在する）。
【００２４】
[0031]加えて、「ａ」又は「ａｎ」の使用も、本明細書における実施形態の要素及び構成成分を説明するために利用されている。これは、単に便宜のためであって、及び本発明の概念の一般的な意味を与えるために行われる。このような記載は、１つ又は少なくとも１つを含むと読み取るべきであり、上記の単数形にはまた、別段に意味することが明らかでない限り、上記の複数形も含まれる。
【００２５】
[0032]最後に、本明細書で使用する場合、「１つの（ｏｎｅ）実施形態」又は「一（ａｎ）実施形態」に対する任意の言及は、上記の実施形態に関連して記載されている特定の要素、特徴、構造、又は特性が少なくとも１つの実施形態に含まれていること、を意味する。本明細書の様々な箇所において句「１つの実施形態において」が登場するが、必ずしも全てが同じ実施形態を指しているというわけではない。
【００２６】
[0033]本明細書では、個体の組織又は体液試料中のＰＥＧ代謝物並びにＰＥＧ含有の製品又は溶液が摂取される前に上記製品又は溶液に存在し得るＰＥＧ分解生成物を、検出、同定、及び定量化するためのアッセイ及び化合物が記載されている。
【００２７】
[0034]ＰＥＧ代謝物とは、ＰＥＧを摂取する個体の消化器系を通して吸収され得る、ＰＥＧの代謝生成物である。一般的に、代謝物が消化器系を通して吸収されると、代謝物は、例えば、体全体にわたって循環される又はある特定の器官に濃縮され得る。本明細書に記載のアッセイ及び化合物を使用して、例えば、ＰＥＧを摂取した個体において吸収されたＰＥＧ代謝物の分布を調べるために、ＰＥＧを摂取した個体の組織又は体液試料内のＰＥＧ代謝物を検出及び定量化することができる。
【００２８】
[0035]ＰＥＧ分解生成物は、ＰＥＧから生じる化学物質及び化合物である。このような分解生成物は、例えば、ＰＥＧの分解の結果として生じ得る。例えば、ＰＥＧ化合物を含む治療剤はＰＥＧの分解生成物を同様に含む場合もある。このような分解生成物は、例えば、ＰＥＧ含有治療剤が薬局の棚にある間も存在し得る。
【００２９】
[0036]ＰＥＧとは、一般構造Ｈ−（０−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−ＯＨを持つエチレンオキサイドのポリマーである。ＰＥＧ変異体は、そこに含有しているエチレンオキサイド分子の数「ｎ」によって、構造的に互いに異なっている。エチレンオキサイド単位の数「ｎ」が増えるにつれて、ＰＥＧ分子の分子量は増大する。
【００３０】
[0037]ＰＥＧ変異体は、それらの平均分子量を表す数とともに命名されることが多い。例えば、ＰＥＧ３３５０とは、平均分子量が３３５０ダルトンであるＰＥＧ化合物を云う。
【００３１】
[0038]様々な分子量を有する様々なＰＥＧ化合物が、医療用及び商業用用途を含めて、種々の用途において使用されている。ＰＥＧ３３５０は、例えば、いくつかの経口及び直腸投与下剤において活性医薬成分として使用されている。ＰＥＧ３３５０はまた、結腸内視鏡検査を含むいくつかの医療処置及び外科的処置に備えて腸を洗浄又は灌注するのに使用される腸管前処置剤の製剤における、活性医薬成分でもある。
【００３２】
[0039]ＰＥＧ３３５０の作用機構は、流体を個体のＧＩ管に浸透圧的に引き出すことである。ＰＥＧの作用によりＧＩ管に引き出された、ＧＩ管中の増大した流体は、個体の大便中に保持され、したがって個体の大便を軟化させる。上記個体のＧＩ管中で流体の量が増大することでも、ＧＩ管が効果的に洗浄される。
【００３３】
[0040]個体により経口的に摂取されたＰＥＧは、吸収が可能で、したがって個体の組織又は体液中に見いだされ得る代謝物に消化管で通常は分解される。個体の組織又は体液中に見いだされるＰＥＧ代謝物を検出及び定量化することによって、ＰＥＧにより標的とされた活性の部位（すなわちＧＩ管）を超えて、個体の身体全体にわたるＰＥＧの分布に関する情報が提供される。
【００３４】
[0041]同様に、ＰＥＧを含有する製品又は溶液のＰＥＧ分解生成物を検出及び定量化するアッセイによって、ＰＥＧ含有の製品又は溶液中の潜在的に毒性であるＰＥＧ分解生成物に関する情報が提供される。例えば、ＰＥＧ含有治療剤又はＰＥＧ含有食品が、アッセイを使用して検出及び定量化され得るＰＥＧ分解生成物の或る量を含有しているおそれもある。
【００３５】
[0042]ＰＥＧ代謝物の例の非限定的リストには、エチレングリコール、ジエチレングリコール、グリコール酸、及びジグリコール酸が含まれ得る。これらのＰＥＧ代謝物については、例えば、ＰＥＧを摂取した個体の血液又はＧＩ系に見いだし得るが、この場合、上記ＧＩ系には、ＧＩ系の全ての器官並びに、例えば、胆汁、消化酵素、及び大便などのＧＩ産物が含まれてもよい。ＰＥＧ代謝物については、例えば、全ての器官、血液、血漿、リンパ液、唾液、脳脊髄液、尿、及び汗を含む、例えば、個体のあらゆる組織又は体液にさらに見いだし得る。
【００３６】
[0043]ＰＥＧ分解生成物の例の非限定的リストには、エチレングリコール、ジエチレングリコール、グリコール酸、及びジグリコール酸が含まれ得る。これらの分解生成物については、ＰＥＧ含有化合物及び混合物に見いだし得る。例えば、ＰＥＧ分解生成物については、ＰＥＧが含まれる治療化合物を含む試料においてアッセイを行ってもよい。例えば、ＰＥＧ分解生成物については、ＰＥＧのみを実質的に含む試料においてアッセイを行ってもよい。例えば、ＰＥＧ分解生成物については、ＰＥＧと一緒に混合された食品又はＰＥＧと一緒の食品を含む複数の成分を互いに混合することにより調製された食品を含む試料においてアッセイを行ってもよい。
【００３７】
[0044]ＰＥＧを摂取した個体の組織又は体液については、例えば、上記対象から血液試料を得ることにより、サンプリングを行ってもよい。個体の組織については、例えば、上記対象から器官検体を得ることによりサンプリングを行ってもよいが、この器官検体には、例えば、器官全体又は生検材料が含まれ得る。ＰＥＧを摂取した個体の体液については、例えば、上記対象から胆汁試料、尿試料、又はその他の体液試料を得ることにより、サンプリングを行ってもよい。
【００３８】
[0045]試料が得られたら、組織又は体液試料は、本明細書に記載の分析方法及び化合物を使用して様々な方法で分析することができる。例えば、本明細書に記載の分析方法及び化合物を使用して高感度、高精度、及び高再現性で、ＰＥＧを摂取した個体の血液試料中で、ＰＥＧ代謝物であるエチレングリコールを検出するとともに定量化もすることができる。
【００３９】
[0046]ＰＥＧ含有製品の分解生成物向けにサンプリングする際、試料は、例えば、ＰＥＧ含有化合物を適切な溶媒に溶解させることにより得ることができる。ＰＥＧ含有化合物は、ＰＥＧ含有化合物を破砕及び粉砕を含むその他の手段によっても、最初に細かく砕くか又はサイズを縮小させてもよい。
【００４０】
[0047]一部の実施形態では、本明細書に記載の方法には、以下のステップが含まれる。組織及び流体の一試料（又は複数の組織及び体液試料）をＰＥＧを摂取した個体から採取する。ＰＥＧ代謝物を試料から抽出してもよい。次いで、試料又は抽出代謝物を、誘導体化剤と反応させて、ＰＥＧ代謝物と誘導体化剤との両方が含まれる生成物化合物を形成させる。次いで、生成物化合物を、例えば、試料を遠心分離することにより試料から分離させて、ＰＥＧ代謝物に結合した誘導体化剤を含む新たに形成された化合物を含む上澄層を作製する。上澄を分離し、トレイに置き、液体クロマトグラフィーカラム及び質量分析計（すなわちＬＣ／ＭＳ）を通過させて２Ｄクロマトグラムを作製する。２Ｄクロマトグラムにより、各ＰＥＧ代謝物のそれぞれについてまったく予測通りの保持時間で読出しが得られる。ＰＥＧ代謝物の既知量に対する読出しを含む検量データを作製する。検量試料の応答をＰＥＧ代謝物のそれぞれの濃度に対してプロットし、次いで、その応答が既知である場合に未知の試料濃度を決定するために使用可能な方程式に、各点を当てはめる。次いで、上記検量データを使用して、ＰＥＧを摂取した対象から得た種々の試料における未知の代謝物量を定量化する。
【００４１】
[0048]一部の実施形態では、本明細書に記載の方法には、以下のステップが含まれる。ＰＥＧ含有化合物（例えばＰＥＧ含有治療剤製品）の試料を得る。ＰＥＧ分解生成物を試料から抽出してもよい。次いで、試料又は抽出したＰＥＧ分解生成物を、誘導体化剤と反応させて、ＰＥＧ分解生成物と誘導体化剤との両方が含まれる生成物化合物を形成させてもよい。次いで、生成物化合物を、例えば、試料を遠心分離することにより試料から分離させて、ＰＥＧ代謝物に結合した誘導体化剤を含む新たに形成された化合物を含む上澄層を作製する。上澄を分離し、トレイに置き、液体クロマトグラフィーカラム及び質量分析計（すなわちＬＣ／ＭＳ）を通過させて２Ｄクロマトグラムを作製する。２Ｄクロマトグラムにより、各ＰＥＧ代謝物のそれぞれについてまったく予測通りの保持時間で読出しが得られる。ＰＥＧ代謝物の既知量に対する読出しを含む検量データを作製する。検量試料の応答をＰＥＧ代謝物のそれぞれの濃度に対してプロットし、次いで、その応答が既知である場合に未知の試料濃度を決定するために使用可能な方程式に、各点を当てはめる。次いで、上記検量データを使用して、ＰＥＧを摂取した対象から得た種々の試料における未知の代謝物量を定量化する。
【００４２】
[0049]述べてあるとおり、２Ｄ  ＬＣ／ＭＳクロマトグラムは、物質の保持時間（クロマトグラフィーを使用して）と強度（質量分析を使用して）とを含み得る。試料がクロマトグラフィーカラムを通過するのに要する時間は、その物質の保持時間として一般には知られている。
【００４３】
[0050]同じ物質の保持時間は、少なくとも部分的にはカラムの特性及びカラムをとおして物質を流すのに使用される条件に応じてカラムごとに著しく異なり得る。
【００４４】
[0051]保持時間は２Ｄ  ＬＣ／ＭＳクロマトグラムのｘ軸で通常には測定される。物質の保持時間は、少なくとも部分的には物質の極性によって決定され得る。ＬＣカラム上での物質の保持時間は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）などのその他の通常のクロマトグラフィー法により得られる保持時間よりも一般的には短い。
【００４５】
[0052]質量分析での物質の強度は、少なくとも部分的には物質のイオン化効率によって決定され得る。
【００４６】
[0053]強度は２Ｄ  ＬＣ／ＭＳクロマトグラムのｙ軸で通常には測定される。物質の広範囲の断片化がもたらされる、ＧＣで使用する高エネルギーイオン化法とは対照的に、エレクトロスプレイイオン化（ＥＳＩ）などの、ＬＣ／ＭＳ向けの通常のイオン化法によれば、物質のインタクトな分子がもたらされる。
【００４７】
[0054]概して、ＰＥＧ代謝物及びＰＥＧ分解生成物を含有する試料は、ＰＥＧ代謝物及びＰＥＧ分解生成物の質量電荷比と極性とに類似する質量電荷比と極性とを持つ、その他の複数の物質を含む可能性があり、したがってこのことが、作成されるクロマトグラム上で、組織試料に含有されているその他の物質から分析予定の物質を分離することを困難としている。すなわち、類似の極性と質量電荷比とを持つ物質は、２Ｄクロマトグラムの同一セクション周辺にクラスタを形成することになり、このことが、その他の物質により生み出されたバックグラウンドノイズから目的とする物質を同定することを困難とするおそれのある、バックグラウンドノイズを生み出す。ＬＣ／ＭＳでのバックグラウンドノイズは、組織又は体液試料のＰＥＧ代謝物を分析する際、問題である。
【００４８】
[0055]例えば、物質を誘導体化剤に結合させて、したがって物質だけで有するのとは異なる保持時間又は強度を有する新たな化合物（誘導体化剤に結合した物質からなる）を生み出すことによって、ＬＣ／ＭＳ上のバックグラウンドノイズから物質を分離することができる。例えば、分析予定の目的の物質を誘導体化剤と反応させることによって化学的に改変すると、化学的に改変された物質の極性に影響を与え、したがって物質の保持時間に影響を与えることが可能である。例えば、目的の物質を誘導体化剤と反応させることによってまた、化学的に改変された物質の質量に影響を与え、したがって質量分析で、物質の測定質量電荷比と強度とに影響を与えることも可能である。すなわち、誘導体化剤と目的とする物質との生成物が、試料内のその他の物質存在によって生み出されたバックグラウンドノイズから取り出される、２Ｄクロマトグラフィー上の外観を有し得るように、誘導体化剤と目的とする物質との生成物は、それ自体、目的とする物質とは異なる特性を有することが求められる。すなわち、誘導体化剤と目的とする物質との生成物は、ある特定の分析プラットフォーム上で、物質単独よりは高感度で検出可能であるとともに定量化可能であり得る。
【００４９】
[0056]エチレングリコール及びジエチレングリコールなどのＰＥＧ代謝物と誘導体化剤の化学的生成物によって、ＰＥＧ代謝物及びＰＥＧ分解生成物のＬＣ／ＭＳが高感度で高再現性となる。代謝物の化学的改変により、検体内のその他の物質によって生み出されたバックグラウンドノイズから代謝物が少なくとも分離されるので、代謝物又は分解生成物を誘導体化剤に結合させると、ＬＣ／ＭＳが高感度で高再現性となる。例えば、誘導体化剤とエチレングリコール又はジエチレングリコールのいずれかの間の反応によって、物質単独よりも保持時間の高い生成物が形成され、したがって、生成物は、ＰＥＧ代謝物単独で通常には出現するよりは、ｘ軸に沿ったさらに進行した位置でクロマトグラム上に出現し得る。同様に、誘導体化剤とエチレングリコール又はジエチレングリコールのいずれかの間の反応によって、質量分析で強度の高い生成物が形成され、したがって、生成物は、ＰＥＧ代謝物単独で通常には出現するよりは、ｙ軸に沿ってさらに進行して出現する。
【００５０】
[0057]ペンタフルロベンゾイルクロリドは、ＮａＯＨの存在中でＰＥＧ代謝物及びＰＥＧ分解生成物と反応して、ペンタフルオロベンゾエートエステル誘導体を作製する分子である。通常には、２個のペンタフルロベンゾイルクロリド分子が単一のエチレングリコール分子又は単一のジエチレングリコール分子のいずれかと反応する。ペンタフルオロベンゾイルクロリドは多数のフッ素原子を含有し、このことが、２個のペンタフルオロベンゾイルクロリド分子と単一のＰＥＧ代謝物又はＰＥＧ分解生成物からなるフッ素高含有生成物を負モード化学イオン化（ＮＣＩ）液体クロマトグラフィーで使用するのに最適としている。ＮＣＩは、電子捕獲効率の高い物質向けの効果的なイオン化法であり、ハロゲン原子は電気陰性度が高いので、ハロゲン原子を含有する化合物は、高い電子捕獲効率を持ち得る。したがって、ＰＥＧ代謝物又はＰＥＧ分解生成物とペンタフルオロベンゾイルクロリドとの反応生成物にはフッ素が存在することから、ＮＣＩは、ＰＥＧ代謝物及びＰＥＧ分解生成物のアッセイの感度を最適化する上で効果的である。
【００５１】
[0058]本明細書に記載のアッセイ方法にはまた、ＰＥＧ代謝物又はＰＥＧ分解生成物の既知量に対する検量データを作製するステップが含まれる。例えば、十分な検量データが集められるまで、１００ｎｇ／ｍｌエチレングリコール、２５０ｎｇ／ｍｌエチレングリコール、５００ｎｇ／ｍｌエチレングリコール等に対して、ＬＣ／ＭＳ検量データを収集することができる。ＰＥＧ代謝物又はＰＥＧ分解生成物であるエチレングリコールの未知量を含む検体をＬＣ／ＭＳをとおして流す場合、エチレングリコールの既知量の検量値と比較することで、試料に存在するエチレングリコールの量を推定することができることになる。
【００５２】
[0059]本明細書に記載の方法及び化合物によって、高感度、高精度、及び高再現性でＰＥＧ代謝物及びＰＥＧ分解生成物を検出及び定量化する手段が提供される。エチレングリコールについては、例えば、約１００ｎｇ／ｍｌ程度の低さの量で試料内で正確に検出し、定量化することができ、ジエチレングリコールについては、例えば、約２０ｎｇ／ｍｌ程度の低さの量で試料内で正確に検出し、定量化することができる。
【００５３】
[0060]図１には、試料内のＰＥＧ代謝物及びＰＥＧ分解生成物を正確に検出及び定量化する例示的方法１００の模式的説明が示されている。ステップ１０２では、個体から試料が得られる。或いは、ステップ１０２では、ＰＥＧ含有化合物から試料が得られてもよい。対象としては、ヒト及び動物対象の両方を含むことができる。記載されている方法で使用するのに適切な広範ないろいろの試料種としては、対象の組織及び体液検体が挙げられる。血中のＰＥＧ代謝物濃度によって、個体におけるＰＥＧ代謝物の全身分布の度合いを全体的に示すことができるので、血液検体が分析可能であることが好ましい。しかし、例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）などの他の試料種内のＰＥＧ代謝物に関するアッセイはＣＮＳ曝露を反映することができ、或いは胆汁はＰＥＧ代謝物の肝負荷を反映することができる。例えば、尿内のＰＥＧ代謝物に関するアッセイはまた、代謝されたＰＥＧの量を全体的に反映し得る。試料は個体から直接に得てもよいし、試料は前もって凍結されていてもよい。ＰＥＧ含有化合物の試料は、実質的にＰＥＧである化合物、ＰＥＧが別の化合物又は賦形剤に結合している化合物、又はＰＥＧが他の物質と一緒に混合されている化合物を含んでいてもよい。試料が前もって凍結されている場合、ステップ１０２にはまた、大気温度にて上記凍結試料を解凍するステップが含まれることになる。
【００５４】
[0061]ステップ１０４では、試料を、試料の構成成分が試料全体にわたり均等に分布するように例えば、ボルテックスによって混合する。
【００５５】
[0062]ステップ１０６では、試料を、バイアル、チューブ、又はその他の類似の容器に移すことができる。加えて、標準物質試料が、及びブランクもそれぞれのチューブに添加される。したがって、各アッセイには複数のバイアルを含めることができる。複数のバイアルは、様々な試料、標準物質試料、及びブランクをそれぞれ含有することができる。
【００５６】
[0063]ステップ１０８では、アッセイにおいて使用しているバイアル全てに基準内部標準物質を添加する。
【００５７】
[0064]ステップ１１０では、複数のバイアルのそれぞれに等しい分量で、水を任意選択で添加する。添加する水の量は、例えば、１５０μＬを構成することができる。
【００５８】
[0065]ステップ１１２では、ヒドロキシド含有塩を、アッセイにおいて使用している複数のバイアルのそれぞれに添加する。本明細書に記載のアッセイにおいて使用に適切なヒドロキシド含有塩の非制限的例としては、水酸化ナトリウム及び水酸化カリウムが挙げられる。塩であるヒドロキシド含有塩は、アッセイにおいて使用している複数のバイアルに添加される際、既に溶液であることが好ましい。水酸化ナトリウムを使用する場合、約５ＭのＮａＯＨ溶液が好ましいが、当技術分野における技能を有する者であれば理解されるようにその他のモル濃度も適切である。複数のバイアルのそれぞれに添加される５Ｍ  ＮａＯＨの量は、例えば、約２００μＬを構成することができる。
【００５９】
[0066]ステップ１１４では、複数のバイアルのそれぞれに等容量で、水を任意選択で添加する。添加する水の量は、例えば、複数のバイアルに添加されたヒドロキシド含有塩のモル濃度を低下させることになる、水の容量を構成することができる。
【００６０】
[0067]ステップ１１６では、誘導体化剤を複数のバイアルに添加する。誘導体化剤であるペンタフルオロベンゾイルクロリドを使用するのが好ましい。ペンタフルオロベンゾイルクロリドはヘキサンに溶解してもよいが、当技術分野における知識を有する者であれば理解されるようにその他の溶媒も適切である。ヘキサン中の４％ペンタフルオロベンゾイルクロリド１．００ｍｌを、アッセイにおいて使用する複数のバイアルのそれぞれに添加するのが好ましい。（ペンタフルオロベンゾイルクロリドを含有する）有機溶媒を水性溶媒と混合することによって、２つの混じり合わない液体相を含む二相液体系（biphasic liquid system）が生み出される。本明細書に記載のアッセイ及び方法は、二相液体系のみに限定される必要がないこと、及びその他の多相液体系も使用に適切であることが、当技術分野における知識を有する者であれば理解されよう。
【００６１】
[0068]ステップ１１８では、アッセイにおいて使用する複数のバイアルを振とうするが、水平振とう機を用いるのが好ましい。水平振とう器は最低設定に設定し、複数のバイアルの内容物を穏やかに振とうすることが好ましい。
【００６２】
[0069]ステップ１２０では、複数のバイアルを遠心分離する。好ましい設定は、摂氏１０度にて２０分間、４，５００ｒｐｍである。遠心分離によって、個々の又は複数の対象から得られた試料を含有するバイアルに上澄が製造される。形成された上澄には、誘導体化剤及びＰＥＧ代謝物又はＰＥＧ分解生成物を含む化合物が含まれ得る。例えば、誘導体化剤として、ペンタフルオロベンゾイルクロリドが使用される場合、上澄には、ペンタフルオロベンゾエートエステル誘導体が含まれる。
【００６３】
[0070]ステップ１２２では、複数のバイアルを、水性層を急速凍結させるために遠心分離に続いて即座に、ドライアイスバスなどの冷浴の中に置くことができる。
【００６４】
[0071]ステップ１２４では、各バイアルからの上澄をオートサンプラープレートに移す。適切なオートサンプラープレートは、例えば、９６ウエルの１ｍＬオートサンプラープレートを備えていてもよい。
【００６５】
[0072]ステップ１２６では、オートサンプラープレートの試料を、試料が乾燥するまで、オートサンプラープレートを、例えば、摂氏４５度及び６０Ｌ／分に設定した蒸発器に置くことによって乾燥することができる。
【００６６】
[0073]ステップ１２８では、各ウエルにＭｅＯＨを添加することができ、そしてオートサンプラープレートをプレートボルテクサーでボルテックスすることができる。
【００６７】
[0074]ステップ１３０では、試料、標準物質と一緒に、及びブランクをＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して分析する。
【００６８】
[0075]誘導体化剤ペンタフルオロベンゾイルクロリドの化学構造が図２に示されている。一般的に、誘導体化とは、化学化合物を誘導体と称される類似の化学構造の生成物（反応の派生物）に変換する、化学において使用されている技法である。誘導体は、誘導体化されていない化学化合物より様々な化学特性を有することができる。誘導体化は、例えば、化学化合物の融点又は沸点、溶解性又は反応性をもたらすことができる。
【００６９】
[0076]従来のＧＣ−ＭＳ／ＭＳアプローチを使用するエチレングリコール（ＥＧ）及びジエチレングリコール（ＤＥＧ）単独の生物的分析アッセイは、電子イオン化による必要とされる感度を備えていない。また、低分子量の観測される断片によって、マルチプルリアクションモニタリング（ＭＲＭ）による分析が難題なものとなってしまう可能性があるだろう。
【００７０】
[0077]負モード化学イオン化（ＮＣＩ）を使用するＬＣ／ＭＳによる分析を少なくとも部分的には容易にするために、ＰＥＧ代謝物又はＰＥＧ分解生成物をペンタフルオロベンゾイルクロリドで誘導体化した。ペンタフルオロベンゾイルクロリドは多くのフッ素原子を有し、フッ素はハロゲンである。ハロゲン原子は電気陰性度が高いので、ハロゲンを含有する化合物はＮＣＩによる分析に特に適切である。
【００７１】
[0078]図３及び図３Ａに、それぞれのＰＥＧ代謝物及び分解生成物の誘導体化生成物を作製する化学反応の説明が示されている。図３に示されているように、エチレングリコールをＮａＯＨの存在中でペンタフルオロベンゾイルクロリドと混合させると、反応によって、単一のエチレングリコール分子に結合した２つのペンタフルオロベンゾイルクロリド分子を含む、誘導生成物であるエタン−１，２−ジイルビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）が製造される。図３Ａに示されているように、ジエチレングリコールをＮａＯＨの存在中でペンタフルオロベンゾイルクロリドと混合させると、反応によって、単一のジエチレングリコール分子に結合した２つのペンタフルオロベンゾイルクロリド分子を含む、誘導生成物である２，２’−オキシビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）が製造される。
【００７２】
[0079]図４に、１００ｎｇ／ｍｌを構成する既知の出発濃度のエチレングリコールから作製された、誘導体化生成物エタン−１，２−ジイルビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）のクロマトグラムの例が示されている。クロマトグラム曲線の頂点に相当するｘ軸に沿った点はエタン−１，２−ジイルビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）４０２の保持時間である。図４の例では、エタン−１，２−ジイルビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）の保持時間はおよそ１．０５分である。クロマトグラム曲線の頂点に相当するｙ軸に沿った点はエタン−１，２−ジイルビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）４０２の強度である。図４の例では、エタン−１，２−ジイルビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）の強度は、およそ２４６００ＣＰＳである。
【００７３】
[0080]図５に、２０ｎｇ／ｍｌを構成する既知の出発濃度のジエチレングリコールから作製された、誘導体化生成物２，２’−オキシビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）のクロマトグラムの例が示されている。クロマトグラム曲線の頂点に相当するｘ軸に沿った点は２，２’−オキシビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）５０２の保持時間である。図４の例では、２，２’−オキシビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）の保持時間はおよそ０．９６分である。クロマトグラム曲線の頂点に相当するｙ軸に沿った点は２，２’−オキシビス（エタン−２，１−ジイル）ビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）５０４の強度である。図５の例では、エタン−１，２−ジイルビス（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンゾエート）の強度は、およそ８７９０ＣＰＳである。
【００７４】
[0081]図６に、エチレングリコールの既知量に対する検量データの例示的表が示されている。検量データを少なくとも部分的には使用して、ＰＥＧを摂取した個体から得た試料内のエチレングリコール量を定量化する。本明細書に記載のアッセイの感度は、エチレングリコール約１００〜１０，０００ｎｇ／ｍｌの範囲内のエチレングリコール量を定量化するのに通常には最も至適である。
【００７５】
[0082]図７に、ジエチレングリコールの既知量に対する検量データの例示的表が示されている。検量データを少なくとも部分的には使用して、ＰＥＧを摂取した個体から得た試料内のジエチレングリコール量を定量化する。本明細書に記載のアッセイの感度は、ジエチレングリコール約２０〜２，０００ｎｇ／ｍｌの範囲内のエチレングリコール量を定量化するのに通常には最も至適である。
【００７６】
[0083]さらなる詳細については、以下の非限定的実施例のセクションによってさらに説明する。
【実施例】
【００７７】
[0084]市販のレファレンス製品と比較して、試験製剤のＰＥＧ代謝物の定量化とともにＰＥＧ３３５０の吸収率及び経口生物学的利用率を比較することを課題とした、研究を完了した。本明細書に記載の組成物及び方法を使用して、研究においてＰＥＧ代謝物のジエチレングリコール及びエチレングリコールについてアッセイした。
【００７８】
[0085]計１４人の対象を本研究に参加させ、これら対象の内１２人（８５．７％）が研究を完了した。この研究は、１２人の健常成人対象がある期間中には試験製剤そして別の期間中には市販製品の別の用量を摂取することとした、非盲検、無作為化、連続化、２期間、２処置交差試験とした。
【００７９】
[0086]対象には、処置Ａ、試験製剤、の５回用量をある期間中１４時間にわたって投与し、及び処置Ｂ、市販製品、の単回用量をある期間中３時間にわたって投与した。両処置ともに、無作為化、連続化で投与した。
【００８０】
[0087]血液試料を試験対象から得て、アッセイして、ＰＥＧ３３５０の薬物動態プロファイル及び曝露並びに各処置後の以下のあり得るＰＥＧ３３５０代謝物：エチレングリコール（ＥＧ）及びジエチレングリコール（ＤＥＧ）、を決定した。
【００８１】
[0088]ジエチレングリコール（ＤＥＧ）
[0089]ほとんどの試料では、ＤＥＧ血漿濃度は定量限界未満（ＢＬＱ、＜４０．０ｎｇ／ｍＬ）であった。定量化可能な濃度のＤＥＧが、試験製剤の投与後、わずか３人の対象：対象１９０３（２試料）、対象１９０５（３試料）、及び対象１９１６（３試料）に対して観察され、これらの濃度は定量下限をわずか上回るものであり、４０．９から４７．５ｎｇ／ｍＬに範囲していた。ＥＣＰを投与されたその他の９人の対象及び市販製品を投与された１２人の対象についてＤＥＧに関して全ての他の血漿濃度はＢＬＱであった。定量可能なデータがこのように限られていたことから、ＤＥＧについては薬物動態解析に含めなかった。したがって、これらのデータによって、市販製品又はＥＣＰのいずれにおいてもＰＥＧ３３５０がＤＥＧに有意に代謝されているという、証拠は示されていない。
【００８２】
[0090]エチレングリコール（ＥＧ）
[0091]エチレングリコールの平均ベースライン濃度は、ＥＣＰ  Ｃｏｌｏｎ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ及び市販製品を受けて、それぞれ、６０２ｎｇ／ｍＬ及び６１５ｎｇ／ｍＬであった。定量可能なＥＧが、処置Ａ、試験製剤、及び処置Ｂ、市販製品の両方の投与前後、どの血漿試料においても見いだされた。研究対象において観測されたＥＧレベルは、全体のサンプリングスケジュールにわたってベースライン（０時間）値を超えて変化しなかった。
【００８３】
[0092]表１に本研究の１２人の対象において観測された平均ＥＧ濃度が示されている。
【表１】
0006516859.tif 000002
【００８４】
[0093]本発明の個々の事項の好ましい実施形態が、本明細書に示され、記載されているが、このような実施形態は、ほんの一例として提供されていることは当業者であれば明白であろう。多数の変形形態、変更、及び置換が、個々の事項から逸脱することなく、当業者であれば直ちに思いつくであろう。本明細書に記載の個々の事項の実施形態に対する様々な代替が、本明細書に記載の個々の事項の実施において利用し得ることを理解されたい。以下の請求項は本明細書に記載の個々の事項の範囲を規定するものであり、この請求項とその均等物の範囲内の方法及び構造体がそれによって包含されるものであるということが意図されている。
【図１】
0006516859.tif 000003
【図２】
0006516859.tif 000004
【図３】
0006516859.tif 000005
【図３Ａ】
0006516859.tif 000006
【図４】
0006516859.tif 000007
【図５】
0006516859.tif 000008
【図６】
0006516859.tif 000009
【図７】
0006516859.tif 000010