(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の磁性ナノ粒子を含む構造体であって、前記磁性ナノ粒子の表面がカテコールで官能化され、前記磁性ナノ粒子は、ナノメートルのマグネタイト粒子からなり、かつ官能化された前記複数の磁性ナノ粒子がクラスタを形成する、生体適合性のポリマーマトリックス中に封入されるものである、構造体。
【請求項２】
治療作用を有する分子が前記生体適合性のポリマーマトリックス中に分散される、請求項１に記載の構造体。
【請求項３】
複数の金ナノロッドをさらに含む、請求項１または２に記載の構造体。
【請求項４】
前記生体適合性のポリマーマトリックスが生分解性ポリマーおよびコポリマーからなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の構造体。
【請求項５】
前記生分解性ポリマーおよびコポリマーが、ポリエステル、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリグルタミン酸、ポリエーテルアミン、およびポリベンジルグルタメートから選択される、請求項４に記載の構造体。
【請求項６】
前記生分解性コポリマーが、乳酸−グリコール酸コポリマーおよびポリエチレングリコールカルボキシレート（ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）からなり、式（Ｉ）を有し、
【化１】
0006590809.tif 000035
式中、ｍ＝［１１７〜３３０］、ｎ＝［１１７〜３３０］、ｐ＝［６０〜１００］である、請求項５に記載の構造体。
【請求項７】
治療作用を有する前記分子が、抗癌剤、過酸化亜硝酸捕捉剤、スーパーオキシドジスムターゼ阻害剤、レチノイド、サイトカイン、アスピリンから選択される、請求項２に記載の構造体。
【請求項８】
前記コポリマーのフラグメントＰＥＧ−ＣＯＯＨの末端カルボキシ基が、モノクローナル抗体、タンパク質、ペプチド、または細胞過剰発現による特異的認識のために目的の活性分子でさらに官能化される、請求項６に記載の構造体。
【請求項９】
前記抗体が、ｈＥＧＲ、ｈＥＧＦＲ、ＩｇＧ、ｍｏＡｂから選択される、請求項８に記載の構造体。
【請求項１０】
有機バインダーでコーティングされたナノ粒子の懸濁液と混合され、溶媒に溶解したポリマーの有機溶液であって、両方が同一の溶媒である有機溶液、
および
Ｎａ２ＨＰＯ４水溶液１ｍＭ
が、バッチまたは連続合成の混合セルの中で、一定の流量で混合される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の構造体を調製するためのプロセス。
【請求項１１】
フラグメントＰＥＧ−ＣＯＯＨの末端カルボキシ基が、アミノ末端基のエステル化による後続の攻撃を促進するために活性化される、請求項８に記載の構造体を調製するためのプロセス。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の構造体を含有する、ヒト免疫系の細胞。
【請求項１３】
前記ヒト免疫系の細胞が、Ｔリンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂリンパ球、好中性顆粒球、好酸性顆粒球、好塩基性顆粒球、ガンマデルタ細胞から選択される、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
温熱療法のための前記構造体を付加したヒト免疫系の細胞の製造のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の構造体の使用。
【請求項１５】
癌、変性疾患、中枢神経系疾患、脳心血管疾患、感染症、移植関連疾患、自己免疫疾患の診断のための、ならびに、さらに腫瘍、脳心血管疾患、変性疾患（例えば、アルツハイマー病）、感染症、移植関連疾患、肝硬変、および線維形成を特徴とする他の疾患、習慣性流産、子宮内胎児死亡を特徴とする疾患、新生児疾患、先天性および後天性凝固障害、遺伝障害、自己免疫疾患の処置のための、ならびに、疼痛緩和に使用するための、請求項１２または１３に記載の細胞。
【請求項１６】
ＭＲＩ撮像手段として有用であるための前記構造体を付加したヒト免疫系の細胞の製造のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の構造体の使用。
【請求項１７】
腫瘍疾患の診断および処置のための前記構造体を付加したヒト免疫系の細胞の製造のための、請求項３に記載の構造体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、官能化ナノ粒子、その生成、およびその使用の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
知られているように、マグネタイトは、化学式がＦｅ３Ｏ４（時にはＦｅＯ・Ｆｅ２Ｏ３とも書かれる）である、強磁性特性を有する鉱物である。
【０００３】
ナノ粒子形態のマグネタイト、すなわち数ナノメートルから数十までの範囲の寸法を有するものは、電波の範囲の変動磁場に入れられると、電磁場と相互作用し、次に、その周囲にあるものに熱エネルギーを放出し、ひいては、いわゆる温熱効果または磁気温熱療法を引き起こすことがよく知られている。
【０００４】
腫瘍学では、温熱療法は、化学療法または放射線療法の有効性を向上させるために利用され、実際には、４１と４５℃との間に、固形腫瘍の温度を上げると、腫瘍細胞のアポトーシスを誘起する。一般に、これは、適切な温度にされて腫瘍塊の影響を受けている部位の近くに巡らされる液体で洗浄することにより適応される。
【０００５】
近年、腫瘍塊に直接挿入され、マイクロ波を発生し、ひいては水の双極子分子と相互作用させて、高熱を生じるアンテナが採用されている。
【０００６】
これらの処置は一般に、極めて侵襲的であり、有効性が低く（前者の場合）、後者の場合、起こりうる負の副作用、例えば転移のリスク、組織壊死などがないわけではない。
【０００７】
腫瘍組織のすぐ近くに届く、または好ましくは癌細胞に侵入する磁性ナノ粒子を用いて、上記の課題を克服し、高効率の温熱効果を達成して、細胞レベルでそれを局部集中させることが可能である。
【０００８】
特に、固形腫瘍の腫瘍細胞、またはアルツハイマー病アミロイド斑などの病理組織もしくは部位、または多発性硬化症の損傷組織に、ナノ構造体を送るようにすれば、その結果、効果的な仕方でかつ副作用のない、温熱処置および薬理学的処置などの多様な複合処置をもたらすことが、可能である。
【０００９】
文献では、ナノ粒子マグネタイトの生体適合性コアと、場合により薬物が付加されかつ好適な標的薬剤で表面が官能化されたポリマーまたはタンパク質のいずれかのコーティングとを含むハイブリッド無機ポリマーまたはタンパク質ナノ粒子の例が多くある。
【００１０】
これらのナノ粒子は、セラノスティックスが可能な薬剤であり、電磁ＥＭ場の影響下で熱を発生させることができること（温熱効果）、薬物送達（ＤＤ：ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）が起こりうること、および撮像手法（ＭＲＩ）によるその作用中に識別され得ることが、相乗的に組み合わされる。
【００１１】
特許文献１は、磁性ナノ粒子、および肝臓腫瘍に到達して処置することが主な目的である生物学的に活性な分子を含有する単層または二層状リポソーム型マイクロカプセルからなる化合物を記載する。
【００１２】
特許文献２では、出願人は、二官能性分子で官能化されたナノメートル磁性粒子からなる構造体について記載しており、前記分子の一端が、磁性粒子の表面に結合され、一方、他端が自由であり、それ故、バイオポリマー、シクロデキストリン、抗体、ならびに医薬品および診断分野で用いられる薬物などの複雑なユニットと反応することができ、ナノ粒子／バインダー複合体が得られることが可能になり、それに応じて特性（例えば、光学的または磁気的性質）が大きく変化することなく、ナノ粒子の全体的かつコンパクトなコーティングを生じる。
【００１３】
後続の特許文献３は、上記特許文献２に記載されるものと類似する官能化粒子が、薬理学的特性を有する分子が場合により分散されているポリマーでコーティングされる構造体について記載する。
【００１４】
さらに、特許文献４（同一出願人の名義）は、サイズが均一であり、かつ制御される（従って、高い温熱効率を有する）マグネタイトナノ粒子を容易に得ることが可能になるポリオール合成プロセスについて記載する。
【００１５】
従って、以上のように、温熱療法を単独でまたは従来の薬物と組み合わせて適用することの両方により、治療作用を果たすことのできる粒子を、身体内で選択的に移動させることについての課題の解決のために、多くの解決策が文献で提案されている。しかし、既知の製品は、いまだ克服されていない種々の課題に起因して、ナノ構造体での腫瘍および他の疾患の有効な処置を達成するために、多くの解決策が必要とされる適用性を完全に満たさない。
【００１６】
第１の課題は、ナノ構造体の特異性であり、実際に、ハイブリッド無機−ポリマー／タンパク質粒子が、全身的に（細網細胞、マクロファージ、クッパー細胞）投与されると、細網内皮系からすぐに排除されることが、文献から知られている。
【００１７】
従って、ナノ構造体のクリアランスは、全身レベルでのナノセラノスティックス処置（ｎａｎｏｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）の非効率の原因となり、多くの試みは、モノクローナル抗体、ペプチド、および活性分子（例えば糖類など）などの送達単位でのナノ粒子ポリマー／タンパク質表面の官能化を含むこの困難を克服するためになされているが、この場合でも、粒子のほとんどが、細網内皮系により排除され、少量しか、当該部位である腫瘍組織および癌性細胞に到達しない。
【００１８】
第１の課題の結果である第２の課題は、腫瘍または病理組織に到達する磁性粒子の量が、効率的な温熱効果を実現するには不十分であることが証明されそうなことである。
【００１９】
最後に、現在のナノセラノスティック系（ｎａｎｏｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ）は、生物学的流体における安定性が乏しく、ひいては腫瘍塊に侵入しそうにない、または正常な血液脳関門を越えていきそうにない大きなアグリゲート（５００〜１０００ｎｍ以上に至るまで）が形成されやすく、標的細胞における、これらの系の特定の標的指向化を悪化させ、処置の効率をさらに限定する。
【００２０】
文献から、免疫系内のＴリンパ球が、抗腫瘍応答の主役であることが知られている。
【００２１】
Ｔリンパ球は、それ自体の、ＴＣＲと呼ばれる特定のレセプターに起因して、腫瘍細胞を選択的に認識できる。それぞれの腫瘍抗原ペプチドによるＴリンパ球の活性化は、抗原が、単球、マクロファージに、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、ミクログリア、またはさらにＢリンパ球に代表される細胞により提示される場合に限り、生じ得る。
【００２２】
有効なＴリンパ球の活性化には、膜シグナルおよび可溶性シグナルが、抗原に加えて、さらに必要とされる。可溶性シグナルのうち、最も強力なのは、インターロイキン２（ＩＬ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）−２）である一方、膜シグナルのうち、最も強力なのはＢ７分子である。
【００２３】
腫瘍は識別されると、種々の機序を介してリンパ球により破壊され、その中で主なものは、パーフォリンに関連する細胞傷害機構およびＦａｓリガンドに関連する細胞障害機構である。
【００２４】
黒色腫は、Ｔリンパ球の介在する強力な局所的免疫応答と一番に関係がある腫瘍のうちの１つであり、長年にわたって、強力なＴリンパ球応答が良好な予後に関係することを証明することができている。
【００２５】
ナノ粒子を用いることにより、レーザ／電磁界による活性化後の、腫瘍を攻撃する準備ができたナノ粒子を武器に、腫瘍を死滅させることに特化されたＴリンパ球の使用に基づく新しいカスタムな抗癌戦略を発展させることが可能である。
【００２６】
さらに、文献は、多発性硬化症、アルツハイマー病などの神経系の疾患において、免疫系、特にリンパ球および炎症細胞が果たす役割について広範囲にわたって記載する。
【００２７】
多発性硬化症は実際、重要な役割をＴリンパ球が果たす病理発生における自己免疫疾患の原型である（非特許文献１）。特に、Ｔヘルパー細胞１（Ｔｈ１：Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌ  １）と呼ばれる、インターフェロンγおよびリンホトキシンなどの重要な炎症性サイトカインを産生できるＴヘルパー細胞、さらにはＴリンパ球ＣＤ８、Ｂリンパ球、および単球系統の免疫細胞も、非常に需要である。さらに、アルツハイマー病（非特許文献２）では、アミロイドタンパク質に起因する、重要な病原性役割は、ミクログリアおよびアストロサイトによる、インターロイキン１、インターロイキン６，腫瘍壊死因子αの産生に関する炎症性機序により行われ、従って、本発明によるナノ粒子は、これらの疾患の処置においても、重要な役割を果たすことができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２８】
【特許文献１】国際公開第２００４／０７１３８６号
【特許文献２】欧州特許第１９７９３６５号
【特許文献３】欧州特許第２１１７６００号
【特許文献４】欧州特許公開第２５１２９９２号
【非特許文献】
【００２９】
【非特許文献１】エリオット・Ｍ・フローマン医学博士（Ｅｌｌｉｏｔ  Ｍ．Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ｄ．）、マイケル・Ｋ・ラッケ医学博士（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｋ．Ｒａｃｋｅ，Ｍ．Ｄ．）、およびセドリック・Ｓ・レイン（Ｃｅｄｒｉｃ  Ｓ．Ｒａｉｎｅ）、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ）２００６年、３５４巻、９４２−９５５頁
【非特許文献２】ヘンリー・Ｗ・クァーファース（Ｈｅｎｒｙ  Ｗ．Ｑｕｅｒｆｕｒｔｈ）、およびフランク・Ｍ・ラフェルラ（Ｆｒａｎｋ  Ｍ．ＬａＦｅｒｌａ）、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン２０１０年、３６２巻、３２９−３４４頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００３０】
表面がカテコールで官能化された磁性ナノ粒子および生体適合性ポリマーマトリックス中に封入された複数の前記ナノ粒子を含む構造体について記載され、治療作用を有する分子は、任意に分散され、前記ポリマーマトリックスは任意に順次さらに官能化される。驚くべきことに、前記ポリマー構造体は、作り変え（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を生じながら免疫系細胞に組み込むことができることが見出された。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＳＴＥＭモードの電界放射型銃走査顕微鏡で撮影された、ポリマーマトリックス内の本発明によるナノ粒子がとる代表的なクラスタ形成を示す。
【図２】磁性粒子および金ナノロッドの混合構造体を示す。
【図３】マグネタイトまたはマグネタイトおよび金ナノロッドのナノ粒子からなり、ブロックポリマーＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨでコーティングされた構造体モデルを概略的に示す。
【図４】本発明によるナノ構造をした構造体の段階的な調製プロセスのレイアウトを示す。
【図５】リンパ球の精製および選択のためのプロセスのレイアウトを示す。
【図６】本発明によるナノ粒子が充填された単球／マクロファージの光学顕微鏡で撮影された写真を示す。
【図７】ＮＨ２−ＰＥＧ−ＣＯＯＨと共役されたポリマーＰＬＧＡ−ＮＨＳの１Ｈ−ＮＭＲを示す。
【図８】ＮＨ２−ＰＥＧ−ＣＯＯＨと共役されたポリマーＰＬＧＡ−ＮＨＳの１Ｈ−ＮＭＲを示す。
【図９】本発明による生成物のＵＶ−可視スペクトルを示す。
【図１０】本発明による生成物のＢＣＡ試験を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
ここで驚くべきことに、生体適合性ポリマーマトリックス中に封入され、カテコールで官能化された複数の磁性ナノ粒子を含む構造体が、前記課題を克服して、生理学的培地およびヒト血液中での必要な安定性を確保できることが見出されている。
【００３３】
さらに、これらの構造体の構造的特徴は、上記の諸特許で記載された単分散の無機コアにより示されるものと比較して、実現される温熱効果を確実にするのに役立つ。この利点は、温熱特性への相乗効果を実現するポリマーマトリックス内の複数の粒子の構造中心に結合する傾向がある磁性粒子のいわゆる「クラスタ構造」（図１参照）に起因する。
【００３４】
本発明による磁性粒子のカテコールでの官能化は、上記クラスタ構造が生じることが不可欠であり、従って、温熱特性および経時的な安定性に関して、先行技術で知られているものよりもはるかに優れた構造を得ることが可能になる。
【００３５】
磁性粒子のうち、マグネタイトは特に好ましい。好ましい場合、本発明による構造体は、上記のような磁性ナノ粒子に加えて、複数の金ナノロッドを有してもよい（図２参照）。
【００３６】
ナノロッドの存在は、赤外レーザ照射を適用することによりかなりの温熱効果、例えばＣＯ２レーザにより生じる温熱効果を可能にし、マグネタイトのクラスタ構造がもたらす温熱効果をさらに増大させることになる。
【００３７】
これにより、表面区域またはプローブで到達できる区域に対しレーザを、深部区域に対し電波を用いるレーザおよび電波が組み合わされたシステムが可能になる。
【００３８】
磁性ナノ粒子は、例えば、上記特許文献４の実施例に記載されるように、既知のポリオールプロセスで調製できる。特許文献４は、
ｉ）ＦｅＩＩＩのポリオール溶液が、Ｆｅ０から出発して調製され、
ｉｉ）マグネタイトナノ粒子が、ポリオール合成条件で調製される、
調製プロセスについて記載する。
【００３９】
上記工程（ｉ）は、よく知られ説明されている、下記式による鉄への酸攻撃反応（酢酸などの弱酸も）である。
Ｆｅ０＋２Ｈ＋→Ｆｅ２＋＋１／２Ｈ２↑
【００４０】
その後、１００℃未満の温度の反応環境で、エアーフラッシュおよびＨ２Ｏ２の添加を通して、ＦｅＩＩのポリオール溶液をＦｅＩＩＩ（例えば酢酸塩（ａｃｅｔａｔｅ））に完全に酸化することが可能である。
【００４１】
金ナノロッドは、種々の添加剤：アルキルトリメチルアンモニウムブロミド、ＣｎＴＡＢ  ｎ＝１０〜１６、塩化セチルピリジニウム、Ｃ１６ＰＣおよびＰＶＰ［この点に関しては、Ｍ・ツジ（Ｍ．Ｔｓｕｊｉ）、Ｋ・マツモト（Ｋ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ）、Ｔ・ツジ（Ｔ．Ｔｓｕｊｉ）、Ｈ・カワズミド（Ｈ．Ｋａｗａｚｕｍｉｄ）、マテリアル・レターズ（Ｍａｔｅｒ．Ｌｅｔｔ．）５９巻（２００５）３８５６頁参照］の存在下でのイオン型の金から出発するマイクロ波アシスト合成により、またはＣＴＡＢおよびＡｇＮＯ３の存在下でのアスコルビン酸によるＨＡｕＣｌ４の還元［この点に関しては、ラット・Ｆ（Ｒａｔｔｏ  Ｆ．）ら、ジャーナル・オブ・ナノパーティクル・リサーチ（Ｊ  ＮＡＮＯＰＡＲＴＩＣＬＥ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ）２０１０］および［ラット・Ｆ（Ｒａｔｔｏ  Ｆ．）ら、ジャーナル・オブ・ナノパーティクル・リサーチ（Ｊ  ＮＡＮＯＰＡＲＴＩＣＬＥ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ）２０１２］により、既知の仕方で調製される。
【００４２】
上記のように得られる磁性粒子および／または光磁性粒子の表面は、後続のポリマー／タンパク質マトリックスへの組み込みに好適な疎水的反応性を維持するために、粒子の表面への極性基ＯＨの親和性を利用し、端部を粒子表面に結合させないことにより、カテコール（二官能基）で官能化される。
【００４３】
本発明によるポリマーマトリックスは、生分解性コポリマーからなると理解され、ひいては薬物を放出させることができる。これは、マトリックスが生理学的環境で分解するにつれて徐々に進行しなければならない。
【００４４】
目的に適したコポリマーの例は、生分解性ナノミセル、ポリエステル、ポリエステル、ポリウレタン、ポリカーボネートおよびポリ（グルタミン）酸、ポリエーテルアミン、ならびにポリベンジルグルタメートである。
【００４５】
式（Ｉ）を有する乳酸−グリコール酸コポリマーおよびポリエチレングリコールカルボキシレートのブロックコポリマー（ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、ＭｎＰＬＧＡ範囲＝４４〜１０ｋＤａ、ＭｎＰＥＧ＝２〜３ｋＤａ）からなる生分解性ナノミセルは、特に好ましい。
【００４６】
【化１】
0006590809.tif 000002
【００４７】
式中、ｍ＝［１１７〜３３０］、ｎ＝［１１７〜３３０］、ｐ＝［６０〜１００］
【００４８】
本生成物は既知であり、抗癌剤の試験のための臨床の第Ｉ相のレベルでも、薬物送達の種々の他の研究にすでに用いられている（Ｘ．シュアイ（Ｘ．Ｓｈｕａｉ）ら、２００４年およびＸ．シュアイ（Ｘ．Ｓｈｕａｉ）、Ｈ．アイ（Ｈ．Ａｉ）、Ｎ．ナソンクラ（Ｎ．Ｎａｓｏｎｋｌａ）、Ｓ．キム（Ｓ．Ｋｉｍ）、Ｊ・ジェオ（Ｊ．Ｇｅｏ）、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ）、２００４年、９８巻、４１５頁参照）。
【００４９】
実際には、ポリマーは、ＰＬＧＡの残基により保証される疎水性の内側領域およびＰＥＧ−ＣＯＯＨの末端により付与される親水性の外側領域を有するナノ球状系（ｎａｎｏｓｐｈｅｒｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を組み立てることができる特徴を有する（図３を参照）。
【００５０】
この二面的な特徴により、ナノ球状体が、疎水性部分に有機活性成分をトラップし、親水性部分のおかげで水溶液に分散することが可能になる。
【００５１】
必要に応じて、ポリマーは、既知のプロセスに従って、下記の実施例に例示されるように、ポリマーマトリックス中に分散する治療作用を有する分子と混合できる。
【００５２】
本発明による治療作用を有する分子の例は、例えば抗癌剤（タキサン、ゲムシタビン、ビンクリスチンなど）、過酸化亜硝酸捕捉剤、スーパーオキシドジスムターゼ阻害剤、レチノイド（ベキサロテン）、インターロイキン１０などのサイトカイン、ＴＬＲ２を活性化できるＨＰ−ＮＡＰ分子などのＴＬＲリガンド、アスピリンである。
【００５３】
加えて、ミセルのＰＥＧ−ＣＯＯＨフラグメントのカルボン酸の官能性は、細胞の過剰発現による特異的認識のために、モノクローナル抗体、タンパク質、ペプチドまたは関心のある活性分子（例えば、および／または蛍光染料）との化学的に安定な結合を可能にする。
【００５４】
本発明による官能化にとって有用である抗体のうち、本発明者らは、ｈＥＲＧ、ｈＥＧＦＲ、ＩｇＧ、ｍｏＡｂなどに言及するであろう。
【００５５】
実施例（実施例１０参照）は、特に、伊国特許第１，３６７，８６１号で記載および特許請求される特定のモノクローナル抗体ｈＥＲＧ１を用いた上記官能化について記載する。
【００５６】
特に、それは、ネズミの腫瘍性細胞株ＮＳ０に属する不死化細胞と、配列ＥＱＰＨＭＤＳＲＩＧＷＬＨＮのペプチドを有するマウスの免疫化により得られるリンパ球との間の融合の生成物を含むハイブリドーマにより産生されるタンパク質ＨＥＲＧ１の細胞外部分Ｓ５ポアに対する特定のモノクローナル抗体である。
【００５７】
カテコールで官能化された磁性ナノ粒子を含有する、本発明による構造体（以下、「ナノバイオリアクタ」または「ＮＢＲ：ｎａｎｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ」とも呼ばれる）は、ナノ沈殿を行うことにより調製され、２つの流体：
−  有機バインダーでコーティングされたナノ粒子の懸濁液と混合され、溶媒に溶解したポリマーの有機溶液、ただし両方は同一の溶媒である
および
−  １ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４水溶液
が、バッチまたは連続合成の混合セルの中で、一定の流量で混合される。
【００５８】
バッチ合成の場合、ポリマーおよび粒子を含有する有機懸濁液は、単一の工程で磁気撹拌なしに水溶液にシリンジで注入される。
【００５９】
連続合成の場合、ダブル蠕動ポンプシステムは、水流に有機溶液の添加を行うために準備される（有機容積／水の比は１／１０）。それぞれのチューブは、（官能化された粒子およびポリマーを有する）有機懸濁液ならびに１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ３溶液（ｐＨ７．４）を含有する人工心肺装置（ｌｕｎｇｓ）から直接溶液を引き出す。
【００６０】
ハイブリッド粒子（ポリマーに含まれカテコールで官能化された磁性ナノ粒子からなる）の分散体が得られると、有機溶媒の部分は、後続の生成工程での有機相の量を最小限にするために、ロータリーエバポレータで除去される。
【００６１】
次に、懸濁液は、有機相を除去するためにＮａ２ＨＰＯ３水溶液に対して透析し、０．１〜１ｗ／ｗ％の濃度を得るために、できる限り最小容積まで濃縮する。
【００６２】
２回目の濃縮を通じ、用途に応じて、５×〜２０×の理論上の濃縮係数を有する膜透析によって、はるかに多くの濃縮生成物を得ることができる。次に、生成物は、細菌負荷を除去するために、０．２２μｍまでのフィルタで濾過される。生成物は、２１〜２４ｋＡ／ｍおよび１６０〜１９０ｋＨｚの周波数の交番磁界で３０分間照射される場合、優れた温熱効率を有し、その温度は少なくとも５℃上昇する。
【００６３】
本明細書で記載される方法により、３０から６０ｎｍの範囲に中心がある次元分布を有する構造体の調製が可能となる。
【００６４】
このように得られた生成物のξ電位（マルバーン（Ｍａｌｖｅｒｎ）のゼータサイザーナノＳ（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ｎａｎｏ−Ｓ））は、懸濁液の静電的安定性およびそのイオン強度についての情報を持つために測定され、−３０ｍＶ未満であり、これは、粒子が、（生理学的な）ｐＨ７．４で、部分的に脱プロトン化されるカルボキシ基（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ｇｒｏｕｐｓ）により生じる負の表面静電反発力により影響を受けることを意味する。
【００６５】
上記実験条件により、細胞培養に通常用いられる培地（ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ）中への希釈後の安定性が良好である懸濁液を作製することが可能になり、希釈のせいでイオン強度条件が明らかに変わった後でも、凝集および沈降する傾向をほとんど示さない。
【００６６】
モノクローナル抗体、ならびに／または標的送達、および撮像手法用のための蛍光染料（例えば、Ｃｙａｎｉｎｅ（登録商標）、Ｄｙｌｉｇｈｔ（登録商標）など）で表面が官能化された生成物を得る場合、２回目の濃縮プロセス（上記参照）にかけられる前に、前駆体としてのＮＢＲの使用を必要とする。
【００６７】
通常、このステージでは、生成物は、濃度が無機材料の約０．０５〜０．１ｗｔ％である。
【００６８】
準備プロセス工程は、モノクローナル抗体および／または蛍光染料の末端アミン基のエステル化による、後続の攻撃を促進するために、ＥＤＡＣ［１−エチル−３−（−３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩］（モル比ＥＤＡＣ／ＣＯＯＨ＝１０／１）およびスルホ−ＮＨＳ（ＮＨＳ／ＣＯＯＨ＝１／１）などの活性剤での、極性相と接触しナノ粒子の外側部分に向かって露出するポリマーの末端カルボキシ（ｃａｒｂｏｘｙｌ）基の活性化を提供する。
【００６９】
（インビボでのＮＩＲ撮像用途に適した）λ６００〜８００ｎｍで発光する蛍光染料の場合、ＮＨＳエステル末端分子のみが市販されているので、ジアミノ末端リンカーが、一方では蛍光染料との、他方では活性化されたポリマーのカルボキシ基（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ｇｒｏｕｐｓ）との架橋結合のために添加される中間工程を提供する必要がある。
【００７０】
ナノ粒子の表面が活性化されると、抗体および／またはアミノ末端染料溶液が添加され、放置される。
【００７１】
次に、懸濁液が濃縮され、水性Ｎａ２ＨＰＯ３に対して透析され、用途に応じて無機相の０．２〜１．０ｗｔ％まで濃縮される。
【００７２】
次に、生成物は、細菌負荷を除去するために、０．２２μｍまでのフィルタで濾過される。
【００７３】
本明細書で記載される方法により、４０から７０ｎｍの範囲に中心がある次元分布を有する構造体の調製が可能となる。
【００７４】
このように得られた生成物のξ電位（マルバーンのゼータサイザーナノＳ）は、懸濁液の静電的安定性およびそのイオン強度についての情報を持つために測定され、−３０ｍＶ未満であるが、ＮＢＲ生成物で測定されたものよりも大きく、このことは、粗生成物のカルボキシ基（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ｇｒｏｕｐｓ）によりもたらされる負電荷が、結合される抗体／染料により部分的に中和されることを意味する。
【００７５】
粒子に結合された抗体の含有量は、ＢＣＡ（登録商標）試験を用いて分析される。タンパク質検体を含有する溶液に好適な試薬を添加した後に、Ｃｕ２＋の錯体が生じ、この５６２ｎｍでの発色がスペクトル分析で観察され、そこから抗体の濃度が線形較正を用いて導き出される。
【００７６】
本明細書に記載された手順で、例えば、ｍｏＡｂで官能化されたナノ粒子を生成することが可能であり、無機相含有量と比較したｍｏＡｂ攻撃のパーセントが、５と３０ｗｔ％との間である。
【００７７】
ナノバイオリアクタ／親油性薬物（以後、ＮＢＲ＿ＰＴＸ）およびナノバイオリアクタ／抗体／親油性薬物（ＮＢＲ＿ｈＥＲＧ＿ＰＴＸ）系（親油性薬物は、例えばパクリタキセルである）の生成は、上記のようなナノバイオリアクタの合成プロセスと全く同じであり、従って、ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨをベースとするポリマーマトリックス内で、カテコールで予め官能化された無機ナノ粒子の封入を提供する。このプロセスを変更しさえすれば、ポリマーおよび官能化されたナノ粒子の懸濁液内で、特定量の薬物の溶解がもたらされる。
【００７８】
次に、パクリタキセルが付加されたナノバイオリアクタ（ＮＢＲ＿ＰＴＸ）は、ナノ沈殿法を用いて得られ、前述の有機溶液が、混合セルの内部で、１ｍｍのＮａ２ＨＰＯ４水溶液に勢いよく添加される。バッチ合成から連続合成までの懸濁液の形態的特性における変化はない。適用された精製、濾過、および濃縮プロセスは、上記と同じである。
【００７９】
生成物の特性評価では、平均粒径、そのξ電位、および無機相の濃度の測定に加えて、封入された活性成分の量が、高速液体クロマトグラフィーでさらに測定される。
【００８０】
このように得られ特性評価された生成物については、次に、（ｈＥＧＲ、ｈＥＧＦＲ、ＩｇＧ、．．．）などの標的化単位によって表面をさらに官能化できる。
【００８１】
この目的のために設定されたプロセスは、上記のようなナノバイオリアクタＮＢＲ＿ｍｏＡｂの標的化手順（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）に正確に従う。
【００８２】
実際には、それは、ＥＤＡＣおよびスルホ−ＮＨＳなどの活性剤によるポリマー上に存在するカルボキシ（ｃａｒｂｏｘｙｌ）基の活性化の準備工程、およびモノクローナル抗体との反応工程を提供し、全て、ＮＢＲ＿ｍｏＡｂに対する上記プロセスで説明したのと同じ比率による。
【００８３】
次に、通常の精製および特性評価プロセスを実施した。このように得られたナノ粒子懸濁液は、４５と５５ｎｍとの間の平均の流体力学的直径を特徴とするが、ξ電位は、−３０ｍＶをはるか下回る。
【００８４】
本発明のさらなる実施形態によれば、上で定義されたような構造体は、タンパク質または抗体での修飾に代えて、免疫系の細胞に組み込まれてもよい。
【００８５】
驚くべきことに、上記のように、カテコールで官能化され、乳酸−グリコール酸コポリマーおよびポリエチレングリコールカルボキシレートのブロックコポリマー（ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、ＭｎＰＬＧＡ範囲＝４４〜１０ｋＤａ、ＭｎＰＥＧ＝２〜３ｋＤａ）でコーティングされたマグネタイト粒子のクラスタを含む構造体は、その官能性および活力を損なうことなく免疫系の細胞によって容易に組み込まれる。
【００８６】
免疫系細胞が、本発明による構造体の導入によって作り変えられると、これらは、中枢神経系の腫瘍性疾患、変性疾患（例えば、アルツハイマー病）、脳心血管（ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ）症および感染症、移植、自己免疫疾患の診断のために、さらには腫瘍、脳心血管疾患（ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）、変性疾患（例えば、アルツハイマー病）、感染症、移植、肝硬変、ならびに線維形成、多発性流産（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｂｏｒｔｉｏｎｓ）を特徴とする疾患、子宮内胎児死亡、新生児疾患、先天性および後天性凝固障害、遺伝性疾患、自己免疫疾患を含む他の状態の治療のために、最後には疼痛軽減のために用いることができる。
【００８７】
放出の誘導は、特異的抗原（例えば、黒色腫の処置の場合にＭＡＧＥ−３、多発性硬化症の処置においてはＭＯＧもしくはミエリン抗原など）などの種々の方法で、または、ＩＬ−２、ＣＤ４０リガンド、ＴＬＲアゴニスト、リポソーム、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ：ｉｍｍｕｎｏ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）などの適切な免疫調節物質で行うことができる。
【００８８】
実際には、免疫系の細胞の重要な特性は、身体のほとんど全ての区域に到達できる能力によって表され、従って、目的地で必要とされる特定の生成物を本発明による構造体を介して運び特定の区域に到達する担体として、それを用いることにより、処置の特異性が低いことに代表されるナノセラノスティックスの重大な現在の限界を超えることに留意されるべきである。
【００８９】
上記目的に有用な免疫系の細胞は、例えば、
Ｔリンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂリンパ球、好中性顆粒球、好酸性顆粒球、好塩基性顆粒球、ガンマデルタ細胞
から選択される。
【００９０】
細胞は、一人の患者から採取され、所望のナノ粒子が付加され、次に局所的にまたは全身的に同一の患者に再導入される。
【００９１】
次に、免疫系の細胞は、下記のように精製されることになり、問題の疾患によって影響を受ける身体の区域の選択的な／優先的な標的化を容易にするために、細胞は、関連する抗原（またはアレルゲン）、免疫調節薬によりエクスビボで処置されるか、または免疫増強分子もしくは免疫抑制分子で作り変えることができる。
【００９２】
診断目的または治療目的のために、Ｔ細胞を選択する方法の１つは、上記のように、腫瘍抗原とすることができる特定の抗原に特異的なＴリンパ球の数を高めることである。
【００９３】
本発明の構造体によって適切に作り変えられたリンパ球は、適切な化学的刺激により、所定位置で一回、粒子を放出でき、次に、粒子は、電波の範囲の電磁場の照射下で、高熱を発するか、または活性成分、例えば、抗腫瘍薬、脳組織の酸化ストレスに活性がある分子の捕捉剤、抗炎症分子などを放出することができる。ナノ粒子は、たとえリンパ球自体の中に閉じ込められたままであっても、依然として自身の機能を実施できる。
【００９４】
磁性ナノ粒子は、ＭＲＩ撮像機能をさらに果たすことができ、良好なＴ２  Ｔ２＊の造影剤であり（上記特許を参照）、金ナノロッドを含有するナノ粒子は、レーザを介する抗腫瘍治療法に用いられ、光音響分光法型の方法により識別され得る。
【００９５】
リンパ球の精製および選択
腫瘍に対して用いられるＴリンパ球は、標準化された方法を用いて、および／または選択的ＭＡＣＳ（登録商標）法（カレント・プロトコル・イン・イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）２０１３年；デリオス（Ｄ’Ｅｌｉｏｓ）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）１９９７年；１５８巻、９６２−９６７頁）を採用して、末梢血から、または関連する腫瘍抗原の事前投与後の腫瘍部位からもしくは患者のリンパ節から、または関連するとみなされるような身体の他の区域から精製される。
【００９６】
腫瘍に特異的なＴリンパ球を選択するために、Ｔリンパ球は、５日間、完全ＲＰＭＩ培地において、関連する腫瘍抗原を有する培養物（例えば、黒色腫に対するＭＡＧＥ−３、１０μｇ／ｍｌの濃度で）に入れられる。次に、組換えヒトＩＬ−２が３日ごとに添加され、次に、細胞にナノ粒子が付加され、洗浄され、次に局所的におよび／または全身的に患者に投与されることになる。
【００９７】
磁気共鳴技術とともに、例えば多発性硬化症用の診断薬として用いられるＴ細胞は、ミエリン抗原もしくはＭＯＧ（１０μｇ／ｍｌ）、またはＣＮＳの構造体を優先的に獲得できるような他の抗原に対する特異性に関して選択される。
【００９８】
この目的のために、それらは、５日間１つ以上の抗原とともに培養され、次にＩＬ−２で増やされ、次にＮＰが付加される。
【００９９】
同一手順は、適切な関連する抗原を用いて、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、および他の脳心血管（ｃｅｒｅｂｒｏ−ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ）疾患などの他の神経疾患のために用いることができる。
【０１００】
樹状細胞（Ｔリンパ球に抗原を提示する能力について非常に効率的であり、ひいてはＴリンパ球を大いに活性化できる）は、従来の標準化された方法を用いて、および／または選択的ＭＡＣＳ（登録商標）方法（カレント・プロトコル・イン・イムノロジー２０１３；コドロ（Ｃｏｄｏｌｏ）らアースリティス・アンド・リューマトロジー（Ａｒｔｈｒ  Ｒｈｅｕｍ）２００８年；５８巻、３６０９−１７）を採用して得られる。それらは、所望の抗原とともに３６〜４４時間インキュベートされ、次にＮＰが付加され、洗浄され、治療目的または診断目的のために患者に再注入されることになる（図５のプロセスレイアウトを参照）。
【０１０１】
強い細胞障害活性を有する、ナチュラルキラー細胞および／またはガンマデルタリンパ球は、従来の標準化された方法を用いて、および／または選択的ＭＡＣＳ（登録商標）方法（カレント・プロトコル・イン・イムノロジー、２０１３年）を採用して得られ、次に、それらは所望のＮＰのほか、場合により他の免疫調節化合物が付加され、洗浄され、治療目的（例えば、抗腫瘍）またはさらに診断目的のために患者に再導入される。
【０１０２】
好中性顆粒球は、従来の標準化された方法を用いておよび／または選択的ＭＡＣＳ（登録商標）方法（カレント・プロトコル・イン・イムノロジー、２０１３）を採用して得られ、次に、それらは所望のＮＰのほか、場合により他の免疫調節化合物が付加され、洗浄され、診断目的（例えば、他の手法では識別できない、体内の何らかの感染の病巣の存在を識別する）または治療目的のためにも患者に再導入される。
【０１０３】
さらに、従来の標準化された方法を用いておよび／または選択的ＭＡＣＳ（登録商標）方法（カレント・プロトコル・イン・イムノロジー２０１３）を採用して得られる、Ｂリンパ球、好酸球、好塩基球などの他の細胞種が、診断用および／または治療用のために選択されてもよい（例えば、腫瘍、自己免疫疾患、感染症、変性疾患の治療のために用いられるエフェクター細胞）。
【０１０４】
次に、それらは、所望のＮＰまたは場合により他の免疫調節化合物が付加され、洗浄され、患者に再導入される。
【０１０５】
ナノ粒子が付加された免疫細胞は、疾患の位置となっている身体の区域を適切な撮像手法で表示するために用いることができる。
【０１０６】
Ｔ細胞およびジャーカット細胞は、最適には４時間後にＮＰが充填される。
【０１０７】
単球／マクロファージ、樹状細胞、Ｊ７７４Ａ．１細胞は、本発明による方法で、ナノ粒子を組み込むことができる。単球／マクロファージ、樹状細胞、Ｊ７７４Ａ．１細胞は、好適な特定の培地（ｍ培地（ｍｍｅｄｉｕｍ））で、０．０５％の濃度でナノ粒子（ＮＰ：ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）が付加される。ＮＰを含有するｍ培地（ｍｍｅｄｉｕｍ）を形成するために、ＮＰがまず調合され、次に特定の培地が調合される。
【０１０８】
ｍ培地（ｍｍｅｄｉｕｍ）は、
完全ＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ
完全ＤＭＥＭ：
・ＤＭＥＭ高グルコース（ＤＭＥ／高）、（ユーロクローン（ＥＵＲＯＣＬＯＮＥ））（コード：ＥＣＢ７５０１Ｌ）
・Ｌ−グルタミン、溶液２００ｍＭ（１００×）、（ユーロクローン）（コード：ＥＣＢ  ３０００Ｄ）
・ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（１００×）、（ＡＴＣＣ）（コード：３０−２３００）
・１０％ウシ胎児血清ＦＢＳ：ウシ胎児血清、クオリファイド（Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ）（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））（コード：Ｆ６１７８−１００ｍＬ）からなる。必要な場合には、患者の自己血清または無血清培地は、ウシ胎児血清の代わりに用いられることになる。
【０１０９】
単球／マクロファージ、樹状細胞、Ｊ７７４Ａ．１細胞は、最適には２時間後にＮＰが充填されるが、取り込み現象は、１５分後から２４時間まで活性がある。
【０１１０】
図６は、ナノ粒子を帯びた単球／マクロファージの光学顕微鏡で撮影された写真を示す。
【０１１１】
本発明は、下記の実施例に照らして、より多く、よりよく理解されるであろう。本発明は、構造体の調製および免疫系の細胞の作り変えのための種々の工程を概略的にまとめる図４および５についてさらに記載する。
【実施例】
【０１１２】
実施例１
ジエチレングリコールＤＥＧに含まれる酢酸鉄の調製
試薬
０．７１６ｍｏｌに等しい４０ｇのＦｅ（Ｆｅ＜９９％、＜２１２ｍｍ）、８００ｇの水、１０．６７ｍｏｌに等しい８００ｇのＣＨ３ＣＯＯＨ（８０％）、０．４１ｍｏｌに等しい４６．６４ｇの過酸化水素水（３０％）、０．１２ｇの濃ＨＣｌ、ＤＥＧ（ジエチレングリコール：ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）３８５０ｇ。
【０１１３】
合成
鉄、酢酸水溶液、および塩酸を、窒素気流下で５０００ｍＬの４つ口フラスコに入れ、温度を９０℃にし、６時間維持した。系を放置してＮ２下で冷却させ、溶液を濾過して未溶解Ｆｅを除去した。ドリッパを用いてフラスコに入れた透明な溶液に過酸化水素水を滴下し、１時間３５℃に温度を保ち、鉄の力価として２．４０ｗ／ｗ％を有する１６２８．３ｇに等しい透明溶液を得る。次に過剰な酸をストリッピングする。これは、４０℃の温度での第１の真空蒸留、水による乾燥部の再循環、および２回の蒸留（２回連続洗浄）による除去、ならびに約５０℃の温度での最後のストリッピングによって行う。理論上の鉄の力価を、１．０１ｗ／ｗ％Ｆｅの値にするために、乾燥させたものに、３８５０ｇのＤＥＧを添加する。
【０１１４】
実施例２
ジエチレングリコールに含まれるＦｅ３Ｏ４ナノ粒子の調製
試薬
１．５０ｇのＦｅ０（Ｆｅ０＜９９％、＜２１２ｍｍ）Ｆｅ０＝０．１７９ｍｏｌ、１５０ｇのＤＥＧ、ＤＥＧと３７％の濃ＨＣｌが１：１０の溶液１．２ｇ、ＤＥＧに含まれる３００．００ｇのＦｅＡｃ３（１．０１ｗ／ｗ％ＦｅＩＩＩ）。
【０１１５】
Ｎ２下で５００ｍＬの４つ口フラスコに金属鉄およびＤＥＧを入れ、温度を１５０℃にした。系に塩酸のＤＥＧ溶液を添加し、５分間撹拌しながら放置した。次に、粒子の適切な成長を確保するために、シリンジを用いて等しい１０のアリコートで、酢酸鉄を添加し、温度を１７０℃にし、反応を２４〜３６時間内に終わらせる。
【０１１６】
生成物を放置して６０℃まで冷却させ、ビーカーにデカントし、未反応の金属鉄を磁気的に保持し、次に０．４５μｍのガラス繊維で濾過した。
【０１１７】
ジエチレングリコールに含まれるマグネタイトのナノ懸濁液４５０ｇは、０．９１±０．０５に等しいイオン性Ｆｅでの力価を有し、Ｆｅ３Ｏ４で表現すると１．２５３％±０．０５に相当する。高熱についてこの試料で測定したところ、値は表に示されるようなものであった。
【０１１８】
【表１】
0006590809.tif 000003
【０１１９】
ＳＡＲＭ：金属（Ｆｅ）の質量で表現される比吸収率（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）
【０１２０】
実施例３
有機バインダーＮ−（３，４ジヒドロキシフェネチル）ドデカンアミド（ＤＤＡ）の調製
【０１２１】
【化２】
0006590809.tif 000004
【０１２２】
ＭＷ＝３３５．４８ｇ／ｍｏｌ
【０１２３】
試薬
０．１３１８ｍｏｌに等しい２５ｇの塩酸ドーパミン、１ＬのＴＨＦ、４５ｍＬのトリエチルアミン０．３２ｍｏｌ、３１．２０ｍＬの塩化ラウロイル０．１３５ｍｏｌ。
【０１２４】
精製および結晶化
４００ｍＬのＴＨＦ（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）４０１７５７−２Ｌ−Ｌｏｔ  ＳＴＢＣ４９２３Ｖ）
９３５ｍＬの酢酸エチル（アルドリッチ３４９７２−２，５Ｌ−Ｌｏｔ  ５７ＢＣ０１１ＡＶ）
３１５ｍＬの石油エーテル（アルドリッチ７７３７９−２，５Ｌ−Ｌｏｔ  ＢＣＢＧ７３６７Ｖ）。
【０１２５】
合成
５Ｌの４つ口フラスコに、窒素雰囲気下で塩酸ドーパミン次にＴＨＦ（１Ｌ）を入れ、次にトリエチルアミンを添加し、系を約２０分間撹拌下に保ち、白色懸濁液を得る。
【０１２６】
３Ｌの平底フラスコに、ＴＨＦ（１Ｌ）およびアシル化剤を添加する。溶液を撹拌し、９時間以上、約２ｍＬ／ｍｉｎの速度で、蠕動ポンプを用いて５Ｌのフラスコに含有される試薬に添加し、底にいくらかの白色固体がある状態の橙黄色の溶液を得る。
【０１２７】
精製
次に、合成生成物を含有する有機相を精製し、反応中に形成された副生成物から生成物を回収する。２回の再循環で（２×２００ｍＬ）ロータベーパでの溶媒の除去により精製を行う。他方では、合成フラスコ中の固形残留物および残留痕跡に、分離漏斗で、水性抽出および酢酸エチルでの処理を行う。有機相を全て混ぜ合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、最後にロータベーパで乾燥させる。５７ｇの橙色の油状生成物を得る。
【０１２８】
結晶化
生成物に、４５０ｍＬの、石油エーテル：酢酸エチル＝７：３の混合物を添加する。懸濁液を冷水下に置くと、白色固体が結晶化しはじめた。系を１日放置して、静置させた。
【０１２９】
ブフナー漏斗（Ｂｕｃｋｎｅｒ）で固体を濾過し、母液で洗浄し、オイルポンプを用いて乾燥させた。約３９ｇを得た（理論上は４４ｇ、収率８８．６％）。
【０１３０】
結晶化から生じた母液を乾燥させ（２．４５ｇ橙褐色固体）、洗浄から生じた母液を乾燥させた（主要な２７．１３ｇ、暗褐色固体）。
【０１３１】
実施例４
（ＴＨＦ中に含まれる）Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子の表面官能化
試薬
２．１６４×１０−３ｍｏｌと等しい４０．０ｇのＦｅ３Ｏ４分散体、３．２４７×１０−３ｍｏｌと等しい１０８９ｍｇのＤＡＡ、１２０ｍＬのＥｔＯＨ、８０．０ｇのＴＨＦ。
【０１３２】
２５０ｍＬのフラスコ内で、１２０ｍＬのＥｔＯＨ中に１０８９ｍｇのＤＤＡを可溶化させ、６０ｍｌシリンジでマグネタイトに、このように調製した溶液を添加する。次に、超音波浴中で１時間、それを超音波処理する。試料を放置して、数分間静置させ、次に６０ｍＬのＨ２Ｏを添加し、ＮＰをネオジム磁石上に沈殿させ、上澄みを分離させ、８０．０ｇのＴＨＦにナノ粒子を再度分散させる。分散液にトリエチルアミン４滴を添加する（粒子が、約１０分後に分散する）。
【０１３３】
特性評価
ＤＬＳ
【０１３４】
【表２】
0006590809.tif 000005
【０１３５】
実施例５
（アセトンに含まれる）Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子の表面官能化
試薬
０．２×１０−３ｍｏｌと等しい４．０ｇのＦｅ３Ｏ４分散体、０．３×１０−３ｍｏｌと等しい１０８．０ｍｇのＤＡＡ、１２．０ｍＬのＥｔＯＨ、１３．６ｍＬのアセトン。
【０１３６】
超音波浴中で、マグネタイトの懸濁液を１時間超音波処理し、次に、２５ｍＬのシリンジで、１０８ｍｇのＤＤＡの１２．０ｍＬのＥｔＯＨ溶液に、それを添加する。次に、それを配置させて３０分間超音波処理する。標本を放置して、数分間静置させる。６ｍＬのＨ２Ｏを添加し、ＮＰをネオジム磁石上に沈殿させ、次に、上澄みを分離させ、ＮＰは１３．６ｍＬのアセトンに再度分散する。分散体にトリエチルアミン２滴を添加する（粒子は直ちに分散する）。
【０１３７】
特性評価
ＤＬＳ
【０１３８】
【表３】
0006590809.tif 000006
【０１３９】
実施例６
ポリマーＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ  ４３−３ｋＤａの合成
ブロックコポリマーＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨの合成の場合、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ：ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）のカップリング化学を用いてＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ：Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）で前駆体ＰＬＧＡ−ＣＯＯＨ（ＭＷ４４−１０ｋＤａ）を活性化し、次に、以下に記載されるように、ジクロロメタン（ＤＣＭ：ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）のアミノ官能性部位のＰＥＧ−ＮＨ２（ＭＷ２−３ｋＤａ）と付加物を組み合わせた。
工程１：ＮＨＳでのカルボキシ基（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ）官能性の活性化
【０１４０】
【化３】
0006590809.tif 000007
【０１４１】
試薬
９８ｇ  ＰＬＧＡ−ＣＯＯＨ（５０：５０  ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド））、カルボキシレート末端基
１．０３７ｇ  ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド  ９８％）
７２０ｍＬ  ＤＣＭ（ジクロロメタン＞９９．９％）
１．９８ｇ  ＤＣＣ（Ｎ，Ｎジシクロヘキシルカルボジイミド  ９９％）
９９０ｍＬ  ＤＣＭ（ジクロロメタン＞９９．９％）
１６００ｍＬ  ジエチルエーテル（≧９９．８）。
【０１４２】
プロセス
窒素下の５Ｌの４つ口フラスコにＰＬＧＡ−ＣＯＯＨおよび６００ｍＬのジクロロメタンを添加した。ポリマーの可溶化後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、次に、Ｎ，Ｎジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、一度に約０．２５ｇ）を添加して、不活性雰囲気中で約４０時間、系を撹拌しながら放置した。原料を失わないために、１２０ｍＬのジクロロメタンを用いて、漏斗の固体を洗浄した。
【０１４３】
ジシクロヘキシル尿素を除去するために、黄色懸濁液を２Ｌのテールド（ｔａｉｌｅｄ）フラスコに濾過した。２５０ｍＬ（×３）および１９０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で、５Ｌのフラスコを洗浄した。
【０１４４】
１Ｌのフラスコ中、ロータベーパで約４００ｍＬの容積まで生成物を濃縮した（５０ｍｌの無水ＤＣＭで洗浄）。濃厚な黄色がかった懸濁液を得た。
【０１４５】
４００ｍＬ（×４）の冷ジエチルエーテルを用いて、ＰＬＧＡ−ＮＨＳを沈殿させた。各洗浄の場合、白色固体をデカントして、上澄みを除去した。続いて、オイルポンプを用いて約２時間３０分間固体を乾燥する。
【０１４６】
工程２：ＮＨ２−ＰＥＧ−ＣＯＯＨとのＰＬＧＡ−ＮＨＳの共役
【０１４７】
ＰＬＧＡ−ＮＨＳ
【０１４８】
【化４】
0006590809.tif 000008
【０１４９】
ＣＨＣｌ３
ＣＨ２Ｃｌ２−ＰＭ＝１１９．３８
ＤＩＰＥＡ  Ｎ−エチルジイソプロピルアミン  ［（ＣＨ３）２ＣＨ］２ＮＣ２Ｈ５−ＰＭ＝１２９．２４
ＣＯＯＨ−ＰＥＧ−ＮＨ２  ＨＣｌｘＮＨ２−ＰＥＧ−Ｏ−Ｃ３Ｈ６−ＣＯＯＨ−ＰＭ  ＰＥＧ＝３０００ｄａ
【０１５０】
試薬
ＰＬＧＡ−ＮＨＳ（反応中間体）
１Ｌ（合成）  ＣＨＣｌ３（クロロホルム≧９９．５）
１００ｍＬ＋２５０ｍＬ（洗浄）  ＣＨＣｌ３（クロロホルム≧９９％、０．７５％のエタノールで安定化）
１．２ｍＬ  ＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン  ９９．５％）
７ｇ  ＣＯＯＨ−ＰＥＧ−ＮＨ２（ポリマー−塩酸塩形態比）
１２５０ｍＬ  ジエチルエーテル（≧９９．８％）
１２５０ｍＬ  脱イオン水。
【０１５１】
プロセス
窒素気流下の機械的撹拌機が装着された２Ｌの３つ口フラスコにおいて、結果として生じた中間体を１Ｌのクロロホルムに溶解させた。シリンジを用いて系に１．２ｍＬのＤＩＰＥＡを添加し、続いて７ｇのＣＯＯＨ−ＰＥＧ−ＮＨ２を添加した（少量添加）。約９０時間不活性気流下で、系を撹拌しながら放置した。
【０１５２】
３つ口フラスコから、２Ｌの１つ口フラスコに黄色溶液を移し、１００ｍＬのクロロホルムで洗浄する。
【０１５３】
ロータベーパを用いて約５５０ｍｌ（ＣＨＣｌ３の留分容積＝６５０ｍｌ）に生成物を濃縮した。２Ｌのフラスコから１Ｌの１つ口フラスコに生成物を移す（２５０ｍＬのＣＨＣｌ３で洗浄する）。
【０１５４】
コポリマーを沈殿させ、２５０ｍＬ（×５）の冷ジエチルエーテルで洗浄した。最初に、過飽和を防ぐために、懸濁液をゆっくり添加し、ガラス棒で振盪しなければならない。各洗浄で、系を氷浴中に置き、次に上澄みを除去した（第４級塩および未反応の有機不純物を含有する乳白色懸濁液）。
【０１５５】
微量の未反応のＣＯＯＨ−ＰＥＧ−ＮＨ２を除去するために、２５０ｍＬ（×５）の脱イオン水で、ゴム状外観の白色固体を洗浄した。
【０１５６】
減圧下（はじめに液体リングポンプ、その後オイルポンプ）にシステムを置き、ポリマーの真空乾燥（オイルポンプトラップは−３０℃）、乾燥を容易にするための粉状化、一晩の冷凍庫での保存を交互に繰り返した。これ以上の重量の減少が観察されなくなるまで、手順を繰り返す。
【０１５７】
冷凍庫で生成物を保存する。
【０１５８】
８６．８０ｇのポリマーを回収した（約８３％の収率）。
【０１５９】
実施例７
合成（ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ  １２−３ｋＤａ）
工程１：ＮＨＳでのカルボキシ基（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ）官能性の活性化
【０１６０】
【化５】
0006590809.tif 000009
【０１６１】
試薬技術仕様
試薬
７ｇのＰＬＧＡ−ＣＯＯＨ  ７０００〜１７０００（５０：５０  ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）、カルボキシレート末端基）→０．５８２ｍｍｏｌ
ＰＬＧＡ−ＣＯＯＨの可溶化のための１５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２（ジクロロメタン−＞９９．９％）
３０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で洗浄された０．２７ｇのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−９８％）→２．３４ｍｍｏｌ
５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で洗浄された０．５１ｇのＤＣＣ（Ｎ，Ｎジシクロヘキシルカルボジイミド−９９％）→２．４９３ｍｍｏｌ
ブフナー漏斗（Ｂｕｃｋｎｅｒ）で濾過する前に５００ｍＬのフラスコを洗浄するための７０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２（ジクロロメタン＞９９．９％）
５５０ｍＬのジエチルエーテル（アルドリッチ≧９９．８％）。
【０１６２】
窒素下で５００ｍＬのフラスコにＰＬＧＡ−ＣＯＯＨおよび１５０ｍＬのジクロロメタンを添加した。ポリマーの可溶化後に、ＮＨＳを添加し（漏斗洗浄のための３０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２）、次にＤＣＣを添加−逐次的添加した（漏斗洗浄のための５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２）。
【０１６３】
不活性雰囲気中で約２４時間、系を撹拌しながら放置した。
【０１６４】
ジシクロヘキシル尿素を除去するために、１Ｌのテールド（ｔａｉｌｅｄ）フラスコに、ブフナー漏斗（Ｂｕｃｋｎｅｒ）で（懸濁液中の白色固体と共に）無色溶液を濾過した。７０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で５００ｍＬのフラスコを洗浄した。
【０１６５】
梨型１つ口フラスコに生成物を移し、ビュッヒ（Ｂｕｃｈｉ）製ロータベーパで濃縮し、約１時間後に、粘度の高い白色懸濁液を得た。
【０１６６】
工程２：ＮＨ２−ＰＥＧ−ＣＯＯＨとのＰＬＧＡ−ＮＨＳの共役
【０１６７】
【化６】
0006590809.tif 000010
【０１６８】
試薬
粘度の高い懸濁液に含まれるＰＬＧＡ−ＮＨＳ（反応中間体）
中間体のための２６０ｍＬのＣＨＣｌ３（クロロホルム−アルドリッチ≧９９．５％−触媒）
アミノＰＥＧ  ＣＯＯＨの洗浄のための２０ｍＬのＣＨＣｌ３
０．３５ｍＬのＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン  ９９．５％）
１．８２ｇのＣＯＯＨ−ＰＥＧ−ＮＨ２（ポリマー−塩酸塩形態比）→０．６０６６ｍｍｏｌ
５２０ｍＬのジエチルエーテル（≧９９．８％）
３００ｍＬの脱イオン水。
【０１６９】
プロセス
窒素下の５００ｍＬのフラスコに、中間体１００（×２）および６０ｍＬのＣＨＣｌ３を可溶化した。シリンジを用いて系に０．３５ｍＬのＤＩＰＥＡを添加し、続いて２０ｍＬの漏斗洗浄ＣＨＣｌ３と１．８２ｇのＣＯＯＨ−ＰＥＧ−ＮＨ２を添加した。９６時間不活性気流下で、系を撹拌しながら放置した。
【０１７０】
４つ口フラスコから、５００ｍＬの１つ口フラスコに、ブフナー漏斗（Ｂｕｃｋｎｅｒ）で褐色および白色残渣の存在を濾過した懸濁液を移し、数ｍＬのクロロホルムで洗浄した。
【０１７１】
ロータベーパを用いて生成物を濃縮する（ＣＨＣｌ３の留分容積＝１７０ｍＬ）。黄色溶液に、１２０ｍＬの冷ジエチルエーテル（白色懸濁液−ガラス棒のラビング−氷浴）、６０ｍＬ（白色懸濁液−氷浴）、８０ｍＬ（沈殿しはじめる−氷浴）、６０ｍＬ（約１時間冷凍庫）を添加する。１００ｍＬ（×２）の冷ジエチルエーテルで生成物を洗浄した。各洗浄で、系を冷凍庫の中に置き、次に上澄みを除去した（第４級塩および未反応の有機不純物を含有する乳白色懸濁液）。エーテル中の３つの画分を乾燥させた（１．２０ｇ）。
【０１７２】
微量の未反応のＣＯＯＨ−ＰＥＧ−ＮＨ２を除去するために、１００ｍＬ（×３）の脱イオン水（氷浴）で、ゴム状外観の白色固体を洗浄した。
【０１７３】
ビュッヒ製ロータベーパでの減圧下にコポリマー（１８．１０ｇ）を置き、次に約４時間オイルポンプ（エタノール−ドライアイストラップ）に接続した（７．７８ｇ−乾燥が粉状化と交互におこる）。生成物に粉状化を施し、次に減圧下に置き、乾燥、粉状化、および冷凍庫の段階を交互に繰り返した。これ以上の重量の減少が観察されなくなるまで、手順を繰り返す。
【０１７４】
冷凍庫で生成物を保存する。
【０１７５】
７．５２ｇのポリマーを回収した（８８％〜８６％の収率）
（２ｇ）  Ｐ．Ｍ．：１１３００ｇ／ｍｏｌ−０．１７６９ｍｍｏｌ
（５ｇ）  Ｐ．Ｍ．：１５４００ｇ／ｍｏｌ−０．３２４６ｍｍｏｌ
ｍｍｏｌ  ＰＬＧＡ  ＣＯＯＨ：
０．５０１５ｇのＰＬＧＡ  ＰＥＧ  ＣＯＯＨ（ｍｏｌ２ｇ＊Ｐ．Ｍ．２ｇ）＋（ｍｏｌ５ｇ＊Ｐ．Ｍ．５ｇ）＝２．５２９＋５．９７２＝８．５ｇ
ＰＭ＝１２０００で計算。８．７４ｇのＰＬＧＡ  ＰＥＧ  ＣＯＯＨが予想される。
【０１７６】
実施例８
ナノバイオリアクタ（ＮＢＲ）のセットアップ
試薬
９．５ｅ−０４ｍｏｌのＦｅ３Ｏ４に等しい４０．０ｇのＦｅ３Ｏ４−ＤＤＡ、５ｅ−０６ｍｏｌのポリマーに等しい２２０．０ｍｇのＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、４００ｍｌのリン酸緩衝液１ｍＭ。
【０１７７】
５ｍＬのＴＨＦに２２０．０ｍｇのポリマーを可溶化した後、有機溶液に４０．０ｇのＦｅ３Ｏ４−ＤＤＡを注入する。６０ｍＬのシリンジを用いて、存在するＴＨＦを除去するために、ロータベーパ内で生成物を濃縮する。もはや有機蒸気の形成および凝縮がない時に、プロセスを停止する。
【０１７８】
次に、生成物を濃縮し、次の手順に従って、ペリコン（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）２ｍｉｎｉ  １００ｋＤａの膜を備えるコジェント（Ｃｏｇｅｎｔ）Ｍシステムで透析する。
【０１７９】
システムが排液すると、理論係数１．５まで濃縮され、次に水でメスアップして１０−３Ｍに緩衝された２０００ｍＬにより透析されたＮＢＲの懸濁液を導入する。
【０１８０】
３０分間ＮａＯＣｌ  １：１０の系を保持した後、５００ｋＤａの膜を備えるペリコンＸＬシステムで１００ｍＬの容積まで、それをさらに濃縮する。
【０１８１】
２０×の理論上の濃縮係数が、（理論上の無機の濃度１．０％）に到達すると、プロセスを停止させる。
【０１８２】
次に、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）ステリベクス（Ｓｔｅｒｉｖｅｘ）０．２２μｍのＰＥＳフィルタでそれを濾過する。冷蔵庫でそれを保存する。
【０１８３】
特性評価
ＤＬＳ
【０１８４】
【表４】
0006590809.tif 000011
【０１８５】
Ｚ電位
【０１８６】
【表５】
0006590809.tif 000012
【０１８７】
ＩＣＰ
【０１８８】
【表６】
0006590809.tif 000013
【０１８９】
培地の安定性
ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋グルタミン＋抗生物質で、１：２０（０．０５ｗｔ％の無機相）まで試料を希釈する。それはアグリゲートのない透明である。
【０１９０】
ＤＬＳ
【０１９１】
【表７】
0006590809.tif 000014
【０１９２】
実施例９
連続ナノバイオリアクタ生成（ＮＢＲ）
試薬：
４．４ｅ−０６ｍｏｌのポリマーと等しい２００ｍｇのＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、５２．６ｇのＴＨＦ、８．６ｅ−０４ｍｏｌのＦｅ３Ｏ４と等しい３６．４ｇのＦｅ３Ｏ４−ＤＤＡ、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液を有するＨ２Ｏ  ＭｉｌｌｉＱ１０００ｍＬ＝１０−３Ｍ。
【０１９３】
１００ｍＬの三角フラスコに、０．２ｇのポリマーＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨおよび５２．６ｇのＴＨＦを添加し、完全に溶解するまで（数分間）撹拌する。最後に、３６．４ｇのＦｅ３Ｏ４−ＤＤＡを加える。
【０１９４】
合成
水流への有機溶液の添加を実施するために、較正後にダブル蠕動ポンプシステムをセットアップした（ＴＨＦ／水容積比＝１／１０）。それぞれのチューブは、（ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨおよび粒子を有する）ＴＨＦ溶液ならびに２．５Ｌのボトルで調製されたリン酸緩衝溶液を含有する人工心肺装置から直接溶液を引き出す。
【０１９５】
まず、ＴＨＦを除去するためにロータベーパで生成物をストリッピングし、次に乾燥させ、揮発成分が蒸発すると、生成物を回収する。
【０１９６】
次に、生成物を濃縮し、ペリコン２ｍｉｎｉ  １００ｋＤａの膜を備えるコジェントＭシステムで透析する。
【０１９７】
システムを空にし、２５４．５ｇの生成物を回収する。
理論上の濃縮係数：４．７×
理論上の濃度：０．０７８％
濃縮および透析に必要とされる時間：２０分。
【０１９８】
５００ｋＤａの膜を備えるペリコンＸＬで生成物をさらに濃縮する。最終濃度までに必要とされる時間：１時間
回収量：１１．５１ｇ膜内部の正味のデッドボリューム約１〜２ｍＬ。
（Ｖｄｅａｄ１．５ｍＬを考慮する）理論上の濃度：１４％。
【０１９９】
特性評価
ＤＬＳ
【０２００】
【表８】
0006590809.tif 000015
【０２０１】
ＩＣＰ
【０２０２】
【表９】
0006590809.tif 000016
【０２０３】
実施例１０
ｍｏＡｂで標的化されたナノバイオリアクタ（ＮＢＲ＿ｈＥＲＧ）のセットアップ
試薬
０．５３３μｍｏｌの−ＣＯＯＨと等しい４０．３８ｍＬのＮＢＲ、０．５３３μｍｏｌに等しい０．２３ｍＭのスルホ−ＮＨＳ溶液２．３２ｍＬ、０．０５３ｍｍｏｌに等しい２８ｍＭのＥＤＡＣ＊ＨＣｌ溶液１９０μＬ、４．０ｍｇのｈＥＲＧ（２．７ｅ−０８ｍｏｌ）と等しい１．５２ｍｇ／ｍＬのｈＥＲＧ溶液２．６４ｍＬ、１５００ｍＬのＮａ２ＨＰＯ３水溶液＝１０−３Ｍ。
【０２０４】
無菌の２５０ｍＬの容器に、４０．３８ｍＬのＮＢＲを添加し、次に０．１９ｍＬのＥＤＡＣ（０．０２８Ｍ）および２．３２ｍＬのスルホ−ＮＨＳを添加する。（静止して）４０分後、１ｍＭのリン酸緩衝液１５．５２ｍＬで、２．６４ｍＬのｈＥＲＧ１溶液（１．５２ｍｇ／ｍＬ＝４．０ｍｇ）を希釈し、４２．８９ｍＬの活性化されたＮＢＲにこれを添加する。（Ｖｆｉｎａｌ＝６１．０５ｍＬ、Ｆｅ３Ｏ４＝０．０５６％）。それを放置して、一晩静置させる。
【０２０５】
ペリコンＸＬの５００ｋＤａのＰＥＳ膜を用いて、生成物の透析のためにシステムをセットアップする。３００ｍＬのＨ２Ｏ  ＭｉｌｌｉＱでシステムを洗浄し、０．５％の次亜塩素酸ナトリウム４００ｍＬを流し、システムを放置して、約３０分間滅菌する。次に、１ｍＭの緩衝液４００ｍＬで、それを洗浄した。
【０２０６】
次に、生成物を２２ｍＬの容積まで濃縮し、約１５ｍＬ／ｍｉｎ（Ｐ＝０．２７ｂａｒ）にポンプ速度を設定した。さらに、ＢＣＡ（登録商標）試験で、最初の透析透過物を分析した。
【０２０７】
１５ｍＬ／ｍｉｎ（Ｐ＝０．２７ｂａｒ）の速度で、１ｍＭの緩衝液１００ｍＬ（４容積）でそれを透析し、４．７ｍＬの量に濃縮する。
【０２０８】
最後に、０．２２μＭのＰＥＳフィルタで、生成物を濾過する。冷蔵庫でそれを保存する。
【０２０９】
このように得られた生成物は、培地中で０．０５ｗｔ％に希釈後に、良好な安定性を示し、肉眼で確認できる凝集の中に、アグリゲートまたは固体形成はない。
【０２１０】
特性評価
ＤＬＳ
【表１０】
0006590809.tif 000017
【０２１１】
Ｚ電位
【０２１２】
【表１１】
0006590809.tif 000018
【０２１３】
ＩＣＰ
【０２１４】
【表１２】
0006590809.tif 000019
【０２１５】
安定性
【０２１６】
ＤＬＳ
【０２１７】
【表１３】
0006590809.tif 000020
【０２１８】
ＢＣＡ試験
ＢＣＡ試験の実行のために、対応する抗体不含（ＮＢＲ）の濃度に関して、ＮＢＲ＿ｈＥＲＧの濃度を正規化し、従って、ブランク（ｗｈｉｔｅ）として機能する。染色が関連する試薬の添加により進行すると、ＵＶ−可視分光光度計で試料を分析し、次に（ＢＳＡ標準を用いて）予め作製された較正曲線上で吸光度値を補間し、同等のｍｏＡｂ濃度を外挿する。ＮＢＲ＿ｈＥＲＧの試料に相当するものから、溶出液中およびブランク（ｗｈｉｔｅ）（ＮＢＲ）中に見つかったｍｏＡｂの値を差し引くことにより、ＮＢＲ＿ｈＥＲＧに存在する抗体の正味の量を計算する。以下の等式を参照のこと。
ＣｍｏＡｂ（ＮＢＲ＿ｍｏＡｂ）ｎｅｔ＝ＣｍｏＡｂ（ＮＢＲ＿ｍｏＡｂ）−ＣｍｏＡｂ（ＮＢＲ）−ＣｍｏＡｂ（ｅｌｕａｔｅ）
【０２１９】
次のものは、測定された実験値である。
ｍＡｂ溶出液＝４５μｇ／ｍＬ
ｍＡｂ  ＮＢＲ＝４３５μｇ／ｍＬ
ｍＡｂ  ＮＢＲ＿ｈＥＲＧ＝８６３μｇ／ｍＬ
実際のｍＡｂ（ｍＡｂ  ＮＢＲ＿ｈＥＲＧ−ｍＡｂ  ＮＢＲ）＝４２８μｇ／ｍＬ
比率ｍＡｂ／Ｆｅ３Ｏ４＝０．１４。
【０２２０】
実施例１１
フルオ染料で標的化されたナノバイオリアクタ（ＮＢＲ＿Ｆｌｕｏ）のセットアップ
試薬技術仕様
ＮＢＲ  ［Ｆｅ３Ｏ４］＝０．０８１％  ［ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ］＝０．０６１％＊
１，４−ジアミノブタン  ＭＷ＝８８．１５ｇ／ｍｏｌ  ｄ＝０．８７７ｇ／ｍＬ
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０（７５０ｎｍ）  ＭＷ＝１３００ｇ／ｍｏｌ
水でメスアップしたリン酸緩衝液  Ｃ＝１Ｍ、ｐＨ７．４。
【０２２１】
試薬：
３０．００ｍＬのＮＢＲ（０．４０μｍｏｌのＰＰＧＣ４３−３．１）
１ｍｇのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０（７７０μＬ中→［１ｍＭ］）
７．４のリン酸緩衝液を含むＨ２Ｏ  ＭｉｌｌｉＱ１５００ｍＬ＝１０−３Ｍ
スルホ−ＮＨＳ  ＭＷ＝２１７．１３ｇ／ｍｏｌ
ＥＤＡＣ・ＨＣｌ  ＭＷ＝１９１．７ｇ／ｍｏｌ。
【０２２２】
フルオＮＨ２溶液の調製
７７０μＬのＤＭＳＯでフルオロフォアを可溶化し、溶液１ｎｍｏｌ／μＬを得る。１２ｍＬのバイアル瓶に、１ｍＭのリン酸緩衝液４９５０μＬを添加し、５０μＬのフルオロフォアＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０溶液（５０ｎｍｏｌ）を加える。次に、それを磁気撹拌下に置き、次に１３２μｇ／ｍＬの１，４−ジアミノブタン溶液１００μＬ（１５０ｎｍｏｌに相当するもの＝１３．２ｇ）を添加する。溶液を放置して、暗闇中および窒素気流下で、２４時間反応させる。後続の精製なしの合成工程のために、このように得られたＮＨ２−末端フルオロフォアを用いることになる。
【０２２３】
スルホ−ＮＨＳ溶液（０．２３ｍＭ）の調製
５．０ｍｇのスルホ−ＮＨＳを、正確に計量し、１ｍＭのリン酸緩衝液を用いて１００ｍＬのフラスコ中で可溶化する。
【０２２４】
ＥＤＡＣ溶液（０．０２８ｍＭ）の調製
４ｍＬのバイアル瓶に、２．７ｍｇのＥＤＡＣおよび１ｍＭの緩衝液０．５ｍＬを添加する。混合を容易にするために、ふたをして振盪する。本溶液は、反応の直前に調製しなければならない。
【０２２５】
合成
１００ｍＬの容器に、３０．００ｍＬのＮＢＲ  ＤＦを添加し、０．１４ｍＬのＥＤＡＣ（０．０２８Ｍ）および１．７２ｍＬのスルホ−ＮＨＳ（０．２３ｍＭ）を添加する。
【０２２６】
全容積：３０．００ｍＬ＋０．１４ｍＬ＋１．７２ｍＬ＝３１．８６ｍＬ
【０２２７】
（静止して）４０分後、２．６４ｍＬのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０溶液（１０ｎｍｏｌ／ｍＬ）を添加する。
【０２２８】
それを放置して、４時間静置させる。
【０２２９】
対照ＤＬＳを実施する（ＮＢＲ＿Ｆｌｕｏ  ＴＱ）。
【０２３０】
精製
ペリコンＸＬの５００ｋＤａのＰＥＳ膜およびイージーロードＩＩヘッド（ｅａｓｙ−ｌｏａｄ  ＩＩ  ｈｅａｄ）を備えた蠕動ポンプマスターフレックス（Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ）Ｌ／Ｓを用いて、生成物を透析するためにシステムをセットアップする。次に、システムを滅菌して、０．５％の次亜塩素酸ナトリウムを溶かし放置して約３０分間反応させる。無菌ＭｉｌｌｉＱ水で洗浄し、１ｍＭのリン酸緩衝液（同じく無菌）でシステムをセットアップした後、生成物を１０ｍＬの容積まで濃縮して（２３ｍｌの透過物を収集）、ポンプ速度を約１２ｍＬ／ｍｉｎ（Ｐ＝０．２５ｍｂａｒ）に設定する。最初の透過物の速度は、ＵＶ−可視分析のために保持する。次に、１２ｍＬ／ｍｉｎ（Ｐ＝０．２５ｍｂａｒ）の速度で動作する、１ｍＭの緩衝液４０ｍＬ（４容積）でそれを透析する。この時点で、６ｍＬの容積までそれを濃縮する。
【０２３１】
回収量：５．００ｇ
理論上の合成濃縮係数：５．８×
ＮＢＲと比較した理論上の濃縮係数：５×
【０２３２】
濾過
０．２２μＭのマイレクス（Ｍｉｌｌｅｘ）のＰＥＳフィルタで、生成物を濾過する。全生成物を精製する場合、１つのフィルタが必要とされる。冷蔵庫でそれを保存する。
回収されたＮＢＲ＿２７＿Ｆｌｕｏ＿０１  ＤＦ＝４．４９ｇ。
【０２３３】
特性評価
ＤＬＳ
Ｒ０３６６／２０１３；Ｒ０３６８／２０１３
【０２３４】
【表１４】
0006590809.tif 000021
【０２３５】
Ｚ電位
Ｒ０３６８／２０１３
【０２３６】
【表１５】
0006590809.tif 000022
【０２３７】
ＩＣＰ
Ｒ０３６８／２０１３
【０２３８】
【表１６】
0006590809.tif 000023
【０２３９】
ＵＶ−可視
Ｒ０３６８／２０１３
【０２４０】
【表１７】
0006590809.tif 000024
【０２４１】
実施例１２
フルオ染料で標的化されたナノバイオリアクタ（ＮＢＲ＿Ｆｌｕｏ）のセットアップ
試薬技術仕様
ＮＢＲ  ［Ｆｅ３Ｏ４］＝０．０８１％  ［ＰＰＧＣ４３−３．１］＝０．０６１％＊
１，４−ジアミノブタン  ＭＷ＝８８．１５ｇ／ｍｏｌ  ｄ＝０．８７７ｇ／ｍＬ
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０（７５０ｎｍ）  ＭＷ＝１３００ｇ／ｍｏｌ
水でメスアップしたリン酸緩衝液  Ｃ＝１Ｍ、ｐＨ７．４。
【０２４２】
試薬：
３０．００ｍＬのＮＢＲ（０．４０μｍｏｌのＰＰＧＣ４３−３．１）
５０．００ｎｍｏｌのシアニン５−１，４−ジアミノブタン  （５．０ｍＬ中→［１０μＭ］）
７．４のリン酸緩衝液を含むＨ２Ｏ  ＭｉｌｌｉＱ１５００ｍＬ＝１０−３Ｍ
スルホ−ＮＨＳ  ＭＷ＝２１７．１３ｇ／ｍｏｌ
ＥＤＡＣ・ＨＣｌ  ＭＷ＝１９１．７ｇ／ｍｏｌ。
【０２４３】
フルオＮＨ２溶液の調製
１２ｍＬのバイアル瓶に、１ｍＭのリン酸緩衝液５ｍＬ、５０ｎｍｏｌ（１ボトル）のシアニン５、ＮＨＳ−エステル、および次に１５０ｎｍｏｌ（１３．２ｇ）の１，４−ジアミノブタンを添加する。溶液を放置して、暗闇中、磁気撹拌下、および窒素気流下で、２４時間反応させる。後続の精製なしの合成工程のために、このように得られたＮＨ２−末端フルオロフォアを用いることになる。
【０２４４】
窒素気流。後続の精製なしの合成工程のために、このように得られたＮＨ２−末端フルオロフォアを用いることになる。
【０２４５】
スルホ−ＮＨＳ溶液（０．２３ｍＭ）の調製
５．０ｍｇのスルホ−ＮＨＳを、正確に計量し、１ｍＭのリン酸緩衝液を用いて１００ｍＬのフラスコ中で可溶化する。
【０２４６】
ＥＤＡＣ溶液（０．０２８ｍＭ）の調製
４ｍＬのバイアル瓶に、２．７ｍｇのＥＤＡＣおよび１ｍＭの緩衝液０．５ｍＬを添加する。混合を容易にするために、ふたをして振盪する。本溶液は、反応の直前に調製しなければならない。
【０２４７】
合成
５０ｍＬの無菌容器に、３０．００ｍＬのＮＢＲを添加し、０．１４ｍＬのＥＤＡＣ（０．０２８Ｍ）および１．７２ｍＬのスルホ−ＮＨＳ（０．２３ｍＭ）を添加する。
【０２４８】
全容積：３０．００ｍＬ＋０．１４ｍＬ＋１．７２ｍＬ＝３１．８６ｍＬ
【０２４９】
（静止して）４０分後、２．６４ｍＬのシアニン−５−ＮＨ２溶液（１０ｎｍｏｌ／ｍＬ）を添加する。
【０２５０】
それを放置して、４時間静置させる。
【０２５１】
精製
ペリコンＸＬの５００ｋＤａのＰＥＳ膜を用いて、生成物の透析のためにシステムをセットアップする。
【０２５２】
この時点で、生成物を１０ｍＬの容積まで濃縮する（２３ｍＬの透過物を収集する）。ポンプ速度を約１２ｍＬ／ｍｉｎ（Ｐ＝０．２５ｍｂａｒ）に設定する。ｔ＝４分。
【０２５３】
ＵＶ−可視分析のために最初の透過物の速度を保持する。
【０２５４】
１２ｍＬ／ｍｉｎ（Ｐ＝０．２５ｍｂａｒ）の速度で、１ｍＭの緩衝液４０ｍＬ（４容積）で透析する。ｔ＝１１分。
【０２５５】
この時点で、６ｍＬの容積までそれを濃縮する。ｔ＝５分。
【０２５６】
回収量：４．２９ｇ
理論上の合成濃縮係数：５．５×
ＮＢＲと比較した理論上の濃縮係数：４．８×
【０２５７】
濾過
０．２２μＭのマイレクスのＰＥＳフィルタで、生成物を濾過する。全生成物を精製する場合、１つのフィルタが必要とされる。冷蔵庫でそれを保存する。
回収されたＮＢＲ＿Ｆｌｕｏ＝４．１１ｇ。
【０２５８】
実施例１３
ｍｏＡｂおよびフルオ染料で標的化されたナノバイオリアクタ（ＮＢＲ＿ｈＥＲＧ−Ｆｌｕｏ）の生成
試薬技術仕様
ＮＢＲ  ［Ｆｅ３Ｏ４］＝０．８２１％  ［ＰＰＧＣ４３−３．１］＝０．６１６％
１，４−ジアミノブタン  ＭＷ＝８８．１５ｇ／ｍｏｌ  ｄ＝０．８７７ｇ／ｍＬ
シアニン５−ＮＨＳエステル  （６５０ｎｍ）
水でメスアップしたリン酸緩衝液  Ｃ＝１Ｍ、ｐＨ７．４
スルホ−ＮＨＳ  ＭＷ＝２１７．１３ｇ／ｍｏｌ
ＥＤＡＣ・ＨＣｌ  ＭＷ＝１９１．７ｇ／ｍｏｌ
ｈＥＲＧ１  ＭＷ＝１５０００ｇ／ｍｏｌ。
【０２５９】
試薬
４．７９ｍＬのＮＢＲ  （０．６４μｍｏｌのＰＰＧＣ４３−３．１）
２５ｎｍｏｌのシアニン５−ＮＨＳエステル  （２．５ｍＬ中→［１０μＭ］）
２．７ｍｇのＥＤＡＣ
５．０ｍｇのスルホ−ＮＨＳ
４．８ｍｇのｈＥＲＧ  （３．２ｍＬ→１５００μｇ／ｍｌ）
ｐＨ７．４のリン酸緩衝液を有するＨ２Ｏ  ＭｉｌｌｉＱ１５００ｍＬ  ［］＝１０−３Ｍ。
【０２６０】
フルオＮＨ２溶液の調製
１２ｍＬのバイアル瓶に、１ｍＭのリン酸緩衝液５ｍＬ、５０ｎｍｏｌ（１ボトル）のシアニン５ＮＨＳ−エステルを添加し、磁気撹拌下に置き、次に１３．２ｍｇ／１００ｍＬの１，４−ジアミノブタン溶液１００μＬを添加する（１５０ｎｍｏｌに相当するもの＝１３．２μｇ）。溶液を放置して、暗闇中および窒素気流下で、２４時間反応させる。後続の精製なしの合成工程のために、このように得られたＮＨ２−末端フルオロフォアを用いることになる。
【０２６１】
スルホ−ＮＨＳ溶液（０．２３ｍＭ）の調製
５．０ｍｇのスルホ−ＮＨＳを、正確に計量し、１ｍＭのリン酸緩衝液を用いて１００ｍＬのフラスコ中で可溶化する。
【０２６２】
ＥＤＡＣ溶液（０．０２８ｍＭ）の調製
４ｍＬのバイアル瓶に、２．７ｍｇのＥＤＡＣおよび１ｍＭの緩衝液０．５ｍＬを添加する。混合を容易にするために、ふたをして振盪する。本溶液は、反応の直前に調製しなければならない。
【０２６３】
合成
無菌の１００ｍＬの容器に、１ｍＭの緩衝液７．９５ｍＬ、次に４．７９ｍＬのＮＢＲを添加する。混合物を穏やかに撹拌して混合し、次に２．２９ｍＬのＥＤＡＣ（０．０２８Ｍ）および２．７９ｍＬのスルホ−ＮＨＳ（０．２３ｍＭ）を添加する。
【０２６４】
全容積：７．９５ｍＬ＋４．７９ｍＬ＋２．２９ｍＬ＋２．７９ｍＬ＝１７．８３ｍＬ
【０２６５】
（静止して）４０分後、２．５ｍＬのシアニン５−ＮＨ５エステル溶液（１０ｎｍｏｌ／ｍＬ）を添加する。次に、３．２ｍＬのｈＥＲＧ１溶液（１．５ｍｇ／ｍＬ＝４．８ｍｇ）を、１ｍＭのリン酸緩衝液５２．３２ｍＬで希釈し、活性化されたＮＢＲおよびフルオロフォアを含有する懸濁液に添加する。それを放置して、一晩静置させる。
【０２６６】
精製
ＮＢＲ＿１９にすでに用いられているペリコンＸＬの５００ｋＤａのＰＥＳ膜を用いて、生成物を透析するためにシステムをセットアップする。３００ｍＬのＨ２Ｏ  ＭｉｌｌｉＱで洗浄し、次に０．５％の次亜塩素酸ナトリウム４００ｍＬで溶かし、約３０分間次亜塩素酸塩中に放置する。１ｍＭの緩衝液４００ｍＬでシステムを洗浄する。
【０２６７】
この時点で、生成物を２０ｍＬの容積まで濃縮する（５０ｍＬの透過物を収集する）。ポンプ速度を約１４ｍＬ／ｍｉｎ（Ｐ＝０．２ｍｂａｒ）に設定する。ｔ＝１５分。
【０２６８】
ＢＣＡ試験のために最初の透過物の速度を保持する。
【０２６９】
１４ｍＬ／ｍｉｎ（Ｐ＝０．２ｍｂａｒ）の速度で、１ｍＭの緩衝液８０ｍＬ（４容積）で透析する。ｔ＝１６分。
【０２７０】
この時点で、１０ｍＬの容積までそれを濃縮する。ｔ＝４分。
【０２７１】
回収量：６．４６ｇ
ＮＢＲと比較した理論上の希釈係数：１．３×
【０２７２】
濾過
０．２２μＭのマイレクスのＰＥＳフィルタで、生成物を濾過する。全生成物を精製する場合、１つのフィルタが必要とされる。冷蔵庫でそれを保存する。
回収されたＮＢＲ＿ｈＥＲＧ−Ｆｌｕｏ＝７．７９ｇ。
【０２７３】
特性評価
ＤＬＳ
【０２７４】
【表１８】
0006590809.tif 000025
【０２７５】
Ｚ電位
【表１９】
0006590809.tif 000026
【０２７６】
ＩＣＰ
【０２７７】
【表２０】
0006590809.tif 000027
【０２７８】
実施例１４
活性成分が付加されたナノバイオリアクタ（ＮＢＲ＿ＰＴＸおよびＮＢＲ＿ｈＥＲＧ＿ＰＴＸ）の生成
試薬技術仕様
ＰＰＧＣ４３−３．１（バッチ５−Ａ）  ５０：５０  Ｍｗ＝４３０００、ＰＥＧ  Ｍｗ３０００
Ｆｅ３Ｏ４−ＤＤＡ  ［Ｆｅ３Ｏ４］＝０．５５％
ＰＴＸ  ディスカバリー・ファイン・ケミカル（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）
１ｍＭのリン酸緩衝液  ｐＨ＝７．４
ＴＨＦ  ｄ＝０．８９。
【０２７９】
試薬
３５．６ｇのＦｅ３Ｏ４−ＤＤＡ（４０．０ｍＬ）（１９５．８ｍｇのＦｅ３Ｏ４）  ４９０ｍｇ／Ｌ（水中）
２１２．６ｍｇのＰＰＧＣ４３−３．１  ４９０ｍｇ／Ｌ（水中）
２１．２ｍｇのＰＴＸ
１ｍＭのリン酸緩衝液４００ｍｌ（実際：４４０ｍＬ）
２５Ｇの針の６０ｍＬのシリンジ。
【０２８０】
［ＰＬＧＡ−ＰＥＧ（５．５ｍｇ／ｇ）、ＰＴＸ（０．５５ｍｇ／ｇ）、およびＦｅ３Ｏ４（５．５ｍｇ／ｇ）での］ＴＨＦ溶液の調製
４ｍＬのＴＨＦ（４ｍＬのバイアル瓶）に２１２．６ｍｇのＰＰＧＣ４３−３．１を可溶化させ、２．１２ｍＬのＴＨＦ（４ｍＬのバイアル瓶）に２１．２ｍｇのＰＴＸを可溶化させ、１００ｍＬのフラスコ内の３５．６ｇのＦｅ３Ｏ４−ＤＤＡにこれを添加する。
【０２８１】
合成
２５Ｇの針を備えた６０ｍｌのシリンジを用いて、１ｍＭのリン酸緩衝液４００ｍｌに、ＴＨＦ溶液をスタックする。
得られたＮＢＲ＿ＰＴＸ：４５５．８ｇ。
【０２８２】
ストリッピング
存在するＴＨＦを除去するために、ロータベーパで生成物を処理する。この目的のために、１０００ｍＬのフラスコにそれを移し、次の条件に設定する。
恒温槽  温度４０℃
圧力：１５４ｍｂａｒ
回転：８０ｒｐｍ。
【０２８３】
１時間後、揮発性成分の蒸発が終わると、生成物を回収し、計量する。
ロータバップで回収されたＮＢＲ＿ＰＴＸ＝４１８．２２ｇ（３７．５８ｇのＴＨＦが除去された）。
【０２８４】
透析および濃縮
次の手順に従って、５０ｋＤａの膜を備えるＡＭＩＣＯＮシステムで、生成物を濃縮および透析する。
１）５０ｍＬの逆浸透水（ｏｓｍｏｔｉｚｅｄ  Ｈ２Ｏ）で洗浄して、膜中の不純物を除去する。
２）５０ｍＬの水で１０−３Ｍにメスアップしたリン酸緩衝水溶液を含む溶液でのシステムの洗浄。
【０２８５】
システムが排液すると、ＮＢＲ＿ＰＴＸを添加し、約１００ｍＬまで濃縮する。
【０２８６】
その後、１ｍＭの緩衝液１５０ｍＬで４回洗浄を行う。最後に、それを７５ｍＬまで濃縮して、４５ｍＬの排液を捨てる。
【０２８７】
システムを空にし、５９．４０ｇの生成物（ＮＢＲ＿ＰＴＸ）を回収する。
理論上の濃縮係数＝７．７×
【０２８８】
濾過
ミリポアステリベクス  ０．２２μＭのＰＥＳフィルタ（円筒形フィルタ）で生成物を濾過する。
【０２８９】
特性評価
ＤＬＳ
【０２９０】
【表２１】
0006590809.tif 000028
【０２９１】
ＩＣＰ
【０２９２】
【表２２】
0006590809.tif 000029
【０２９３】
安定性
ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ＋グルタミン＋抗生物質で１：８に希釈された濃縮試料は、アグリゲートがなく澄んでいる。
【０２９４】
ＤＬＳ
Ｒ０２１１／２０１３
【０２９５】
【表２３】
0006590809.tif 000030
【０２９６】
ＰＴＸ分析
【０２９７】
【表２４】
0006590809.tif 000031
【０２９８】
実施例１５
活性成分が付加されたナノバイオリアクタ（ＮＢＲ＿ＰＴＸおよびＮＢＲ＿ｈＥＲＧ＿ＰＴＸ）の生成
試薬技術仕様
ＮＢＲ＿ＰＴＸ  ［Ｆｅ３Ｏ４］＝０．４８％  ［ＰＰＧＣ４３−３．１］＝０．３６％＊
水でメスアップしたリン酸緩衝液  Ｃ＝１Ｍ、ｐＨ７．４
スルホ−ＮＨＳ  ＭＷ＝２１７．１３ｇ／ｍｏｌ
ＥＤＡＣ  ＭＷ＝１５５．２４ｇ／ｍｏｌ  ｄ＝０．８７７ｇ／ｍＬ
ｈＥＲＧ  ＭＷ＝１５００００ｇ／ｍｏｌ。
【０２９９】
試薬
４．２６ｍＬのＮＢＲ＿ＰＴＸ＿ｐ１０  ＤＦ  （３．３３＊１０−４μｍｏｌ  ＰＰＧＣ４３−３．１）
５．０ｍｇのスルホ−ＮＨＳ  （１００ｍＬ中→［０．２３ｍＭ］）
２０μＬのＥＤＡＣ  （４ｍＬ中→［２８ｍＭ］）
２．５ｍｇのｈＥＲＧ  （０．８３３ｍＬ＊３ｍｇ／ｍＬ）
ｐＨ７．４のリン酸緩衝液１５００ｍＬ  ［］＝１０−３Ｍ。
【０３００】
スルホ−ＮＨＳ溶液（０．２３ｍＭ）の調製
５．０ｍｇのスルホ−ＮＨＳを計量し、１ｍＭのリン酸緩衝液を用いて、１００ｍＬのフラスコ中で可溶化する。
【０３０１】
ＥＤＡＣ溶液（０．０２８ｍＭ）の調製
４ｍＬのバイアル瓶に、２．７ｍｇのＥＤＡＣおよび１ｍＭの緩衝液０．５ｍＬを添加する。混合を容易にするために、ふたをして振盪する。本溶液は、反応の直前に調製しなければならない。
【０３０２】
合成
無菌の４０ｍＬの容器に、１ｍＭの緩衝液２．３６ｍＬ、次に４．２６ｍＬのＮＢＲ＿ＰＴＸを添加する。混合物を穏やかに撹拌して混合し、次に１．１９ｍＬのＥＤＡＣ（０．０２８Ｍ）および１．４５ｍＬのスルホ−ＮＨＳを添加する。
全容積：２．３６ｍＬ＋４．２６ｍＬ＋１．１９ｍＬ＋１．４５ｍＬ＝９．２６ｍＬ
【０３０３】
（静止して）４０分後、１ｍＭの緩衝液２７．２５ｍＬで０．８３３ｍＬのｈＥＲＧ１溶液（３ｍｇ／ｍＬ）を希釈することにより得られたＨＥＲＧ１溶液を添加する。（Ｖｆｉｎａｌ＝３７．３４ｍＬ、Ｆｅ３Ｏ４＝０．０５６％）。
【０３０４】
それを放置して、一晩静置させる。
【０３０５】
精製
ペリコンＸＬの５００ｋＤａのＰＥＳ膜を用いて、生成物の透析のためにシステムをセットアップする。３００ｍＬのＨ２Ｏ  ＭｉｌｌｉＱで洗浄し、次に０．５％の次亜塩素酸ナトリウム４００ｍＬで溶かし、約３０分間次亜塩素酸塩中に放置する。１ｍＭの緩衝液４００ｍＬでシステムを洗浄する。
【０３０６】
この時点で、生成物を１３ｍＬの容積まで濃縮する（２５ｍＬの透過物を収集する）。ポンプ速度を約１３ｍＬ／ｍｉｎ（Ｐ＝０．２ｍｂａｒ）に設定する。ｔ＝５分。
【０３０７】
ＢＣＡ試験のために最初の透過物の速度を保持する。
【０３０８】
１３ｍＬ／ｍｉｎ（Ｐ＝０．２ｍｂａｒ）の速度で、１ｍＭの緩衝液６０ｍＬ（４容積）で透析する。ｔ＝１４分。
【０３０９】
この時点で、１０ｍＬの容積までそれを濃縮する。ｔ＝１０分。
【０３１０】
回収量：７．４０ｇ
理論上の合成濃縮係数：５．５×
ＮＢＲ＿ＰＴＸと比較した理論上の希釈係数：２．８×
【０３１１】
濾過
０．２２μｍのステリベクスのＰＥＳフィルタで生成物を濾過する。全生成物を精製する場合、１つのフィルタが必要とされる。冷蔵庫でそれを保存する。
回収されたＮＢＲ＿ＰＴＸ＝６．８８ｇ。
【０３１２】
特性評価
ＤＬＳ
【０３１３】
【表２５】
0006590809.tif 000032
【０３１４】
Ｚ電位
【０３１５】
【表２６】
0006590809.tif 000033
【０３１６】
ＩＣＰ
【０３１７】
【表２７】
0006590809.tif 000034
【０３１８】
プロセスの実際の収率＝９４．５％
【０３１９】
実施例１６
リンパ球へのＮＢＲの組み込み
Ｔ細胞およびジャーカット細胞は、本出願人らにより開発された方法でナノ粒子を組み込むことができる。適切な特定の培養培地（培地）中で０．０５％の濃度のＮＰを、Ｔ細胞／ジャーカット細胞に付加する。ＮＰを含有する培地を形成するために、はじめにＮＰを、次に特定の培地を分散する。次の通り、培地を作製する。
・ＲＰＭＩ  １６４０培地、ｗ２．０ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３−ｗ／ｏ  Ｌ−グルタミン、（バイオクロム（ＢＩＯＣＨＲＯＭ））（コード：Ｆ１２１５）−５００ｍＬ、以下のものを添加される
・Ｌ−グルタミン、溶液２００ｍＭ（１００×）、（ユーロクローン）（コード：ＥＣＢ  ３０００Ｄ）−希釈なしの５．５ｍＬ
・ピルビン酸ナトリウム、１００ｍＭ（１００×）、（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））（コード：１１３６０−０３９）−希釈なしの５．５ｍＬ
・ＭＥＭ  ＮＥＡＡ  最小必須培地  非必須アミノ酸（１００×）、（ギブコ）（コード：１１１４０−０３５）−希釈なしの５．５ｍＬ
・ＧＥＮＴＯＭＩＬ（ゲンタマイシン）８０ｍｇ／２ｍｌ（ＡＩＣ  Ｎ°０２９３１４０５９）−１２ｍＬのバイアル瓶
・２−メルカプトエタノール（メルク（Ｍｅｒｃｋ））（コード：４４４２０３）−次の通り、５．５ｍＬの２−メルカプトエタノールを用いる。９９．９６３ｍＬの無菌Ｈ２Ｏに溶かした３７μｌの２−メルカプトエタノール（最終容積１００ｍＬ）
・１０％のウシ胎児血清ＦＢＳ：ウシ胎児血清、クオリファイド（シグマ−アルドリッチ）（コード：Ｆ６１７８）。
【０３２０】
必要な場合には、患者の自己血清または血清不含培地は、ウシ胎児血清の代わりに用いられることになる。
【図１】
0006590809.tif 000036
【図２】
0006590809.tif 000037
【図３】
0006590809.tif 000038
【図４】
0006590809.tif 000039
【図５】
0006590809.tif 000040
【図６】
0006590809.tif 000041
【図７】
0006590809.tif 000042
【図８】
0006590809.tif 000043
【図９】
0006590809.tif 000044
【図１０】
0006590809.tif 000045