(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１〜３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号４〜６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体又は抗体フラグメント。
【請求項２】
配列番号７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、請求項１に記載の抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体又は抗体フラグメント。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸。
【請求項４】
ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１１〜１３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１４〜１６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体又は抗体フラグメント。
【請求項５】
配列番号１７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号１８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、請求項４に記載の抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体又は抗体フラグメント。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体又は抗体フラグメント、抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体又は抗体フラグメント及びそれらをコードする核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、実験動物としてマウスやラットが主に用いられてきた。しかし、これらの実験動物を大量に使うことは、コスト面や倫理上の問題等から今後ますます困難になっていくと思われる。
【０００３】
一方、ゼブラフィッシュ等の小型魚類は、飼育が容易であり、多産であり、世代サイクルが短く、体外発生を行うとともに、脊椎動物としての基本的な構造を有しており、哺乳類と同等の器官、組織を備えている。また、胚が透明で発生が早く進むため、例えば、受精後２４時間程度の胚を用いて、重大な遺伝子を欠損した場合の臓器異常等を外部から容易に観察することができる。
【０００４】
このような特徴から、最近ヒト疾患に対するモデルとしてゼブラフィッシュ等の小型魚類が注目されるようになりつつある。この背景にはゲノムがほぼ解読され、ヒトと魚類間の遺伝子の相同性が高いことが挙げられる。
【０００５】
ヒト疾患に対する魚類モデルとして、これまでに神経系、免疫系、泌尿器系、造血系、循環器系疾患に関連する多くの突然変異体が作製されている。また、急性Ｔ細胞白血病を起こすトランスジェニック魚や肥満モデルなど生活習慣病といわれる疾患モデルの変異体も作製されている（例えば非特許文献１を参照）。
【０００６】
また、近年、創薬のための大規模な新薬化合物のスクリーニングに際しても小型魚類が注目されている。ゼブラフィッシュ等は、成魚の体長が約３ｃｍであるため、飼育スペース、コストが抑えられ、卵の数が多いことから、例えば大量の卵や胚を９６穴のマイクロプレートを用いてスクリーニングすることができる。また、発生速度が速いことから結果を早く得ることができる（例えば非特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】中西照幸、ヒト疾患モデルとしての魚類および魚類を利用した創薬研究の展望、応用薬理、第８０巻、５／６号、第９９頁、２０１１年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように、近年、実験動物としてゼブラフィッシュが注目されている。しかしながら、ゼブラフィッシュの免疫系細胞表面に発現するＣＤ４及びＣＤ８αに対する抗体は知られていない。これらの抗体はゼブラフィッシュの免疫系を解析するうえで必須のものである。そこで、本発明は、ゼブラフィッシュのＣＤ４抗原に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメント、及び、ゼブラフィッシュのＣＤ８α抗原に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメントを提供することを目的とする。本発明はまた、これらの抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は以下の通りである。
（１）ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１〜３のアミノ酸配列又は配列番号１〜３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号４〜６のアミノ酸配列又は配列番号４〜６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体又は抗体フラグメント。
（２）ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１〜３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号４〜６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、（１）に記載の抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体又は抗体フラグメント。
（３）配列番号７のアミノ酸配列又は配列番号７のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号８のアミノ酸配列又は配列番号８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、（１）又は（２）に記載の抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体又は抗体フラグメント。
（４）配列番号７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、（３）に記載の抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体又は抗体フラグメント。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸。
（６）ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１１〜１３のアミノ酸配列又は配列番号１１〜１３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１４〜１６のアミノ酸配列又は配列番号１４〜１６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体又は抗体フラグメント。
（７）ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１１〜１３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１４〜１６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、（６）に記載の抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体又は抗体フラグメント。
（８）配列番号１７のアミノ酸配列又は配列番号１７のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号１８のアミノ酸配列又は配列番号１８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、（６）又は（７）に記載の抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体又は抗体フラグメント。
（９）配列番号１７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号１８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、（８）に記載の抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体又は抗体フラグメント。
（１０）（６）〜（９）のいずれかに記載の抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ゼブラフィッシュのＣＤ４抗原に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメント、及び、ゼブラフィッシュのＣＤ８α抗原に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメントを提供することができる。また、これらの抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】（ａ）及び（ｂ）は、実験例３の結果を示すグラフである。
【図２】（ａ）及び（ｂ）は、実験例４の結果を示すグラフである。
【図３】（ａ）及び（ｂ）は、実験例５の結果を示すグラフである。
【図４】（ａ）及び（ｂ）は、実験例６の結果を示すグラフである。
【図５】（ａ）及び（ｂ）は、実験例７の結果を示すグラフである。
【図６】実験例８の結果を示す写真である。
【図７】実験例９の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体又は抗体フラグメント］
１実施形態において、本発明は、相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３が、それぞれ配列番号１〜３のアミノ酸配列又は配列番号１〜３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号４〜６のアミノ酸配列又は配列番号４〜６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体又は抗体フラグメントを提供する。ここで、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３における数個とは、５個、４個、３個又は２個を意味する。
【００１３】
抗体フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを適切なリンカーで連結したｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ（ｓｃＦｖ）等が挙げられる。ｓｃＦｖのリンカーとしては、例えば、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号２１）等のペプチドが挙げられる。
【００１４】
本実施形態の抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、ゼブラフィッシュのリンパ球表面のＣＤ４抗原に良好に結合することができることから、ＦＡＣＳ解析、蛍光顕微鏡観察等によるゼブラフィッシュの免疫機構の解析に用いることができる。
【００１５】
抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１〜３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号４〜６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有するものであってもよい。
【００１６】
また、抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、配列番号７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有するものであってもよい。
【００１７】
また、抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、ゼブラフィッシュのＣＤ４抗原に対する反応性を有している限り、配列番号７のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有するものであってもよい。ここで、重鎖可変領域又は軽可変領域における数個とは、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個又は２個を意味する。
【００１８】
抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、標識物質で標識されていてもよい。標識物質としては、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アミラーゼ等の酵素；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｒ−フィコエリトリン、Ｂ−フィコエリトリン、アレクサフルオロ４８８、アレクサフルオロ６４７等の蛍光物質；トリチウム、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１等の放射性核種；ビオチン；ストレプトアビジン等が挙げられる。
【００１９】
［抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸］
１実施形態において、本発明は、上述した抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸を提供する。
【００２０】
このような核酸としては、例えば、上述した抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体の重鎖可変領域遺伝子、上述した抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体の軽鎖可変領域遺伝子、上述した抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体の重鎖可変領域及び定常領域の一部をコードする遺伝子、上述した抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体の軽鎖可変領域及び定常領域の一部をコードする遺伝子、上述した抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体の重鎖全長をコードする遺伝子、上述した抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体の軽鎖全長をコードする遺伝子、上述した抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを適切なリンカーで連結したｓｃＦｖをコードする遺伝子等が挙げられる。
【００２１】
上記の重鎖可変領域遺伝子は、配列番号９に記載の塩基配列の５８〜４１４番目の残基からなる重鎖可変領域遺伝子であってもよい。また、上記の軽鎖可変領域遺伝子は、配列番号１０に記載の塩基配列の５８〜３７８番目の残基からなる軽鎖可変領域遺伝子であってもよい。
【００２２】
また、上記の重鎖可変領域遺伝子は、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１〜３に記載のアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ以外のフレームワーク領域が非ラット抗体由来である重鎖可変領域をコードする遺伝子であってもよい。また、上記の軽鎖可変領域遺伝子は、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号４〜６に記載のアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ以外のフレームワーク領域が、非ラット抗体由来である軽鎖可変領域をコードする遺伝子であってもよい。ここで、非ラット抗体としては、マウス、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ロバ、ウシ、ウマ、ブタ、サル、ヒト等の抗体が挙げられる。
【００２３】
本実施形態の核酸は、上述した抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体の重鎖可変領域遺伝子又はこれに由来する遺伝子と、抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体の軽鎖可変領域遺伝子又はこれに由来する遺伝子との組み合わせであることが好ましい。ここで、重鎖可変領域遺伝子に由来する遺伝子としては、例えば、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１〜３に記載のアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ以外のフレームワーク領域が非ラット抗体由来である重鎖可変領域をコードする遺伝子が挙げられる。また、同様に、軽鎖可変領域遺伝子に由来する遺伝子としては、例えば、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号４〜６に記載のアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ以外のフレームワーク領域が非ラット抗体由来である軽鎖可変領域をコードする遺伝子が挙げられる。
【００２４】
本実施形態の核酸は、上述した抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸を発現可能に保持するベクターであってもよい。このようなベクターにより、本実施形態の核酸を発現させ、上述した抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体又は抗体断片を作製することができる。ベクターとしては、各発現系に応じたものを用いることができ、例えば、大腸菌発現用のｐＥＴ、酵母発現用のｐＡＵＲ、昆虫細胞発現用のｐＩＥｘ、動物細胞発現用のｐＣＭＶ、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられる。
【００２５】
［抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体又は抗体フラグメント］
１実施形態において、本発明は、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１１〜１３のアミノ酸配列又は配列番号１１〜１３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１４〜１６のアミノ酸配列又は配列番号１４〜１６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体又は抗体フラグメントを提供する。ここで、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３における数個とは、５個、４個、３個又は２個を意味する。
【００２６】
抗体フラグメントについては上述したものと同様である。本実施形態の抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、ゼブラフィッシュのリンパ球表面のＣＤ８α抗原に良好に結合することができることから、ＦＡＣＳ解析、蛍光顕微鏡観察等によるゼブラフィッシュの免疫機構の解析に用いることができる。
【００２７】
抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１１〜１３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１４〜１６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有するものであってもよい。
【００２８】
また、抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、配列番号１７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号１８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有するものであってもよい。
【００２９】
また、抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、ゼブラフィッシュのＣＤ８α抗原に対する反応性を有している限り、配列番号１７のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号１８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有するものであってもよい。ここで、重鎖可変領域又は軽可変領域における数個とは、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個又は２個を意味する。
【００３０】
抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、標識物質で標識されていてもよい。標識物質については、上述したものと同様である。
【００３１】
［抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸］
１実施形態において、本発明は、上述した抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸を提供する。
【００３２】
このような核酸としては、例えば、上述した抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体の重鎖可変領域遺伝子、上述した抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体の軽鎖可変領域遺伝子、上述した抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体の重鎖可変領域及び定常領域の一部をコードする遺伝子、上述した抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体の軽鎖可変領域及び定常領域の一部をコードする遺伝子、上述した抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体の重鎖全長をコードする遺伝子、上述した抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体の軽鎖全長をコードする遺伝子、上述した抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを適切なリンカーで連結したｓｃＦｖをコードする遺伝子等が挙げられる。
【００３３】
上記の重鎖可変領域遺伝子は、配列番号１９に記載の塩基配列の５８〜４０２番目の残基からなる重鎖可変領域遺伝子であってもよい。また、上記の軽鎖可変領域遺伝子は、配列番号２０に記載の塩基配列の６１〜３８１番目の残基からなる軽鎖可変領域遺伝子であってもよい。
【００３４】
また、上記の重鎖可変領域遺伝子は、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１１〜１３に記載のアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ以外のフレームワーク領域が非ラット抗体由来である重鎖可変領域をコードする遺伝子であってもよい。また、上記の軽鎖可変領域遺伝子は、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１４〜１６に記載のアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ以外のフレームワーク領域が、非ラット抗体由来である軽鎖可変領域をコードする遺伝子であってもよい。ここで、非ラット抗体としては、上述したものと同様のものが挙げられる。
【００３５】
本実施形態の核酸は、上述した抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体の重鎖可変領域遺伝子又はこれに由来する遺伝子と、抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体の軽鎖可変領域遺伝子又はこれに由来する遺伝子との組み合わせであることが好ましい。ここで、重鎖可変領域遺伝子に由来する遺伝子としては、例えば、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１１〜１３に記載のアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ以外のフレームワーク領域が非ラット抗体由来である重鎖可変領域をコードする遺伝子が挙げられる。また、同様に、軽鎖可変領域遺伝子に由来する遺伝子としては、例えば、ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１４〜１６に記載のアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ以外のフレームワーク領域が非ラット抗体由来である軽鎖可変領域をコードする遺伝子が挙げられる。
【００３６】
本実施形態の核酸は、上述した抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸を発現可能に保持するベクターであってもよい。このようなベクターにより、本実施形態の核酸を発現させ、上述した抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体又は抗体断片を作製することができる。ベクターとしては上述したものと同様のものが挙げられる。
【実施例】
【００３７】
次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【００３８】
〔実験例１〕
［抗ゼブラフィッシュＣＤ４モノクローナル抗体の作製］
（ギンブナＣＤ４安定発現ＮＲＫ細胞株の樹立）
発明者らは、過去にギンブナ（Ｃａｒａｓｓｉｕｓ  ａｕｒａｔｕｓ  ｌａｎｇｓｄｏｒｆｉｉ）のＣＤ４遺伝子のクローニングに成功した。ギンブナＣＤ４遺伝子の塩基配列を配列番号２２に示す。ギンブナＣＤ４遺伝子を発現ベクターに組み込み、ラット腎臓由来細胞株であるＮＲＫ細胞株に遺伝子導入後、ネオマイシン存在下で培養し、ギンブナＣＤ４安定発現ＮＲＫ細胞株を樹立した。
【００３９】
（ラットの免疫及びハイブリドーマの作製）
従来、遺伝子情報を基に作製した抗原については、大腸菌等を用いて作成した組み換えタンパク質を免疫抗原として主に用いられてきた。しかし、組み換えタンパク質を免疫して得られたほとんどの抗体は、目的の分子の１次構造を認識することができても、細胞表面に発現した場合の３次元構造を認識することができない。
【００４０】
そこで、本発明者らはラット腸骨リンパ節法によるラットの免疫を行った。より具体的には、上述したギンブナＣＤ４安定発現ＮＲＫ細胞株を、ＮＲＫ細胞株と同系のラットに免疫した。これにより、ＮＲＫ細胞株の細胞表面に発現した非自己のギンブナＣＤ４のみを認識する抗体が得られると考えられた。
【００４１】
ギンブナＣＤ４安定発現ＮＲＫ細胞株を、Ｗｉｓｔａｒラット（日本エスエルシー株式会社）の足蹠に投与し免疫した。続いて、鼡径リンパ節を採取し、リンパ球を回収した。続いて、回収したリンパ球及びマウスミエローマ細胞株であるＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞を細胞融合した。得られた細胞を、ＨＡＴ培養液で培養して、リンパ球とマウスミエローマ細胞とが融合したハイブリドーマを作製した。得られたハイブリドーマの中から、ギンブナＣＤ４に反応するモノクローナル抗体を産生するクローンを選択し、抗ギンブナＣＤ４モノクローナル抗体を樹立した。
【００４２】
続いて、樹立した抗ギンブナＣＤ４モノクローナル抗体の遺伝子を定法によりクローニングしてその塩基配列を決定した。抗ギンブナＣＤ４モノクローナル抗体の重鎖可変領域の塩基配列を配列番号９に示し、アミノ酸配列を配列番号７に示す。また、抗ギンブナＣＤ４モノクローナル抗体の軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号１０に示し、アミノ酸配列を配列番号８に示す。なお、後述するように、発明者らは、本抗体がゼブラフィッシュのＣＤ４抗原に反応することを明らかにした。
【００４３】
〔実験例２〕
［抗ゼブラフィッシュＣＤ８αモノクローナル抗体の作製］
（ギンブナＣＤ８α安定発現ＮＲＫ細胞株の樹立）
発明者らは、過去にギンブナ（Ｃａｒａｓｓｉｕｓ  ａｕｒａｔｕｓ  ｌａｎｇｓｄｏｒｆｉｉ）のＣＤ８α遺伝子のクローニングに成功した。ギンブナＣＤ８α遺伝子の塩基配列を配列番号２３に示す。ギンブナＣＤ８α遺伝子を発現ベクターに組み込み、ラット腎臓由来細胞株であるＮＲＫ細胞株に遺伝子導入後、ネオマイシン存在下で培養し、ギンブナＣＤ８α安定発現ＮＲＫ細胞株を樹立した。
【００４４】
続いて、実験例１と同様にして、上述したギンブナＣＤ８α安定発現ＮＲＫ細胞株を、ＮＲＫ細胞株と同系のラットに免疫してハイブリドーマを作製し、ギンブナＣＤ８αに反応するモノクローナル抗体を産生するクローンを選択し、抗ギンブナＣＤ８αモノクローナル抗体を樹立した。
【００４５】
続いて、樹立した抗ギンブナＣＤ８αモノクローナル抗体の遺伝子を定法によりクローニングしてその塩基配列を決定した。抗ギンブナＣＤ８αモノクローナル抗体の重鎖可変領域の塩基配列を配列番号１９に示し、アミノ酸配列を配列番号１７に示す。また、抗ギンブナＣＤ８αモノクローナル抗体の軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号２０に示し、アミノ酸配列を配列番号１８に示す。なお、後述するように、発明者らは、本抗体がゼブラフィッシュのＣＤ８α抗原に反応することを明らかにした。
【００４６】
〔実験例３〕
［ゼブラフィッシュのリンパ球集団に対する抗体の反応性の解析（１）］
ゼブラフィッシュのリンパ球集団を実験例１及び２で作製したモノクローナル抗体で染色してＦＡＣＳで解析した。魚類は腎臓で造血を行うことが知られている。そこで、まず、ゼブラフィッシュの腎臓からリンパ球を含む細胞集団を採取した。より具体的には、まず、ゼブラフィッシュの腎臓から白血球及び赤血球を分離して細胞浮遊液を作製した。得られた細胞浮遊液には赤血球が多く含まれるため、溶血処理により赤血球を取り除き、得られた全白血球集団を上述したモノクローナル抗体で染色してＦＡＣＳで解析した。
【００４７】
また、ＦＡＣＳ解析において、前方散乱（ＦＳＣ）及び側方散乱（ＳＳＣ）のパターンからリンパ球集団を同定してゲーティングを行い、リンパ球集団に対するモノクローナル抗体の反応性を解析した。
【００４８】
１次抗体として、実験例１で作製した抗ＣＤ４モノクローナル抗体又は実験例２で作製した抗ＣＤ８αモノクローナル抗体を用い、２次抗体としてＡｌｅｘａ  Ｆｒｕｏｒｏ４８８（ライフテクノロジーズ社）標識された抗ラットＩｇＧ抗体を使用した。
【００４９】
図１（ａ）は抗ＣＤ４モノクローナル抗体による染色結果を示すグラフである。その結果、ゼブラフィッシュのリンパ球集団のうち約９．２％が染色された。なお、図１（ａ）の破線はアイソタイプコントロール抗体で染色した陰性対照を示す。
【００５０】
図１（ｂ）は抗ＣＤ８αモノクローナル抗体による染色結果を示すグラフである。その結果、ゼブラフィッシュのリンパ球集団のうち約９．１％が染色された。なお、図１（ｂ）の破線はアイソタイプコントロール抗体で染色した陰性対照を示す。
【００５１】
〔実験例４〕
［ゼブラフィッシュのリンパ球集団に対する抗体の反応性の解析（２）］
実験例３と同様にしてゼブラフィッシュのリンパ球集団に対する抗体の反応性を解析した。具体的には、ゼブラフィッシュのリンパ球集団を、実験例１又は２で作製したモノクローナル抗体と、抗ＺＡＰ−７０抗体とを用いて二重染色した。
【００５２】
なお、ＺＡＰ−７０はＴ細胞特異的なマーカーである。また、抗ＺＡＰ−７０抗体としては、抗ヒトＺＡＰ−７０抗体を使用した。Ｔ細胞特異的転写因子であるＺＡＰ−７０は、脊椎動物において保存されており、ヒトＺＡＰ−７０に対する抗体が魚類においても交差反応することが報告されている。今回、発明者らは、抗ヒトＺＡＰ−７０抗体がゼブラフィッシュやギンブナのＴ細胞に反応することを確認した。
【００５３】
図２（ａ）は、ゼブラフィッシュのリンパ球集団を、実験例１で作製した抗ＣＤ４モノクローナル抗体及び抗ＺＡＰ−７０抗体で二重染色した結果を示すグラフである。その結果、抗ＣＤ４モノクローナル抗体が認識する細胞がＴ細胞であることが明らかとなった。
【００５４】
図２（ｂ）は、ゼブラフィッシュのリンパ球集団を、実験例２で作製した抗ＣＤ８αモノクローナル抗体及び抗ＺＡＰ−７０抗体で二重染色した結果を示すグラフである。その結果、抗ＣＤ８αモノクローナル抗体が認識する細胞がＴ細胞であることが明らかとなった。
【００５５】
〔実験例５〕
［ゼブラフィッシュＣＤ４を強制発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対する抗体の反応性の解析］
実験例１で作製した抗ＣＤ４モノクローナル抗体が、ゼブラフィッシュＣＤ４抗原を認識するか否かを検討した。具体的には、まず、ゼブラフィッシュＣＤ４遺伝子をヒト胚性腎細胞株であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞で強制発現させた。ゼブラフィッシュＣＤ４遺伝子の塩基配列を配列番号２４に示す。
【００５６】
ここで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させたゼブラフィッシュＣＤ４遺伝子には、ＨＡタグが連結されていた。したがって、導入したゼブラフィッシュＣＤ４遺伝子を発現したＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、抗ＨＡ抗体を用いて染色することができる。
【００５７】
続いて、上記のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、抗ＨＡ抗体又は実験例１で作製した抗ＣＤ４モノクローナル抗体で染色してＦＡＣＳで解析した。
【００５８】
図３（ａ）は、ゼブラフィッシュＣＤ４遺伝子を強制発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、抗ＨＡ抗体で染色した結果を示すグラフである。この結果は遺伝子導入効率を示しているといえる。その結果、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のうち約９４．８％が染色された。なお、図３（ａ）の破線はアイソタイプコントロール抗体で染色した陰性対照を示す。
【００５９】
図３（ｂ）は、ゼブラフィッシュＣＤ４遺伝子を強制発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、実験例１で作製した抗ＣＤ４モノクローナル抗体で染色した結果を示すグラフである。その結果、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のうち約８１．４％が染色された。なお、図３（ｂ）の破線はアイソタイプコントロール抗体で染色した陰性対照を示す。
【００６０】
〔実験例６〕
［ゼブラフィッシュＣＤ４Ｌ２を強制発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対する抗体の反応性の解析］
魚類には、哺乳類のＣＤ４抗原と相同なＣＤ４抗原に加えて、魚類特有のＣＤ４抗原（「ＣＤ４Ｌ２」又は「ＣＤ４ｒｅｌ」と呼ばれる）が存在する。本実験例では、実験例１で作製した抗ＣＤ４モノクローナル抗体が、ゼブラフィッシュＣＤ４Ｌ２抗原を認識するか否かを検討した。
【００６１】
具体的には、まず、ゼブラフィッシュＣＤ４Ｌ２遺伝子をＨＥＫ２９３Ｔ細胞で強制発現させた。ゼブラフィッシュＣＤ４Ｌ２遺伝子の塩基配列を配列番号２５に示す。
【００６２】
ここで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させたゼブラフィッシュＣＤ４Ｌ２遺伝子には、ＨＡタグが連結されていた。したがって、導入したゼブラフィッシュＣＤ４Ｌ２遺伝子を発現したＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、抗ＨＡ抗体を用いて染色することができる。
【００６３】
続いて、上記のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、抗ＨＡ抗体又は実験例１で作製した抗ＣＤ４モノクローナル抗体で染色してＦＡＣＳで解析した。
【００６４】
図４（ａ）は、ゼブラフィッシュＣＤ４Ｌ２遺伝子を強制発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、抗ＨＡ抗体で染色した結果を示すグラフである。この結果は遺伝子導入効率を示しているといえる。その結果、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のうち約９７．２％が染色された。なお、図４（ａ）の破線はアイソタイプコントロール抗体で染色した陰性対照を示す。
【００６５】
図４（ｂ）は、ゼブラフィッシュＣＤ４Ｌ２遺伝子を強制発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、実験例１で作製した抗ＣＤ４モノクローナル抗体で染色した結果を示すグラフである。その結果、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はほとんど染色されなかった。なお、図４（ｂ）の破線はアイソタイプコントロール抗体で染色した陰性対照を示す。
【００６６】
〔実験例７〕
［ゼブラフィッシュＣＤ８αを強制発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対する抗体の反応性の解析］
実験例２で作製した抗ＣＤ８αモノクローナル抗体が、ゼブラフィッシュＣＤ８α抗原を認識するか否かを検討した。
【００６７】
具体的には、まず、ゼブラフィッシュＣＤ８α遺伝子をＨＥＫ２９３Ｔ細胞で強制発現させた。ゼブラフィッシュＣＤ８α遺伝子の塩基配列を配列番号２６に示す。
【００６８】
ここで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させたゼブラフィッシュＣＤ８α遺伝子には、ＨＡタグが連結されていた。したがって、導入したゼブラフィッシュＣＤ８α遺伝子を発現したＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、抗ＨＡ抗体を用いて染色することができる。
【００６９】
続いて、上記のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、抗ＨＡ抗体又は実験例２で作製した抗ＣＤ８αモノクローナル抗体で染色してＦＡＣＳで解析した。
【００７０】
図５（ａ）は、ゼブラフィッシュＣＤ８α遺伝子を強制発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、抗ＨＡ抗体で染色した結果を示すグラフである。この結果は遺伝子導入効率を示しているといえる。その結果、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のうち約９７．２％が染色された。なお、図５（ａ）の破線はアイソタイプコントロール抗体で染色した陰性対照を示す。
【００７１】
図５（ｂ）は、ゼブラフィッシュＣＤ８α遺伝子を強制発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、実験例２で作製した抗ＣＤ８αモノクローナル抗体で染色した結果を示すグラフである。その結果、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のうち約６９．６％が染色された。なお、図５（ｂ）の破線はアイソタイプコントロール抗体で染色した陰性対照を示す。
【００７２】
〔実験例８〕
［分画細胞集団における遺伝子発現解析（１）］
実験例１で作製した抗ＣＤ４モノクローナル抗体で染色される細胞集団を分取し、遺伝子発現を検討した。
【００７３】
具体的には、まず、実験例３と同様にしてゼブラフィッシュの全白血球集団を採取し、実験例１で作製した抗ＣＤ４モノクローナル抗体で染色した。続いて、セルソーター（型式「ＦＡＣＳ  ＡｒｉａＩＩ」、ＢＤバイオサイエンス社）を用いて、全リンパ球集団、ＣＤ４陰性細胞集団、ＣＤ４陽性細胞集団を分取した。
【００７４】
続いて、分取した各細胞集団より全ＲＮＡを抽出して逆転写反応を行いｃＤＮＡを合成した。合成した各ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応を行い、ゼブラフィッシュＣＤ４遺伝子、ゼブラフィッシュＣＤ８α遺伝子、ゼブラフィッシュＴ細胞受容体定常部位（ＴＣＲＡＣ）遺伝子、ゼブラフィッシュ免疫グロブリン軽鎖定常部位（ＩｇＬＣ）遺伝子の発現を検討した。また、βアクチン遺伝子を内部標準遺伝子とし、各ｃＤＮＡの標準化を行った。表１に、各遺伝子増幅用プライマーのプライマー名及び塩基配列の配列番号を示す。
【００７５】
【表１】
0006614431.tif 000002
【００７６】
図６は、ＰＣＲ反応の結果を示すアガロースゲル電気泳動の写真である。図６中、「全白血球」は全白血球集団のｃＤＮＡを鋳型とした結果であり、「全リンパ球」は全リンパ球集団のｃＤＮＡを鋳型とした結果であり、「ＣＤ４−」はＣＤ４陰性細胞集団のｃＤＮＡを鋳型とした結果であり、「ＣＤ４＋」はＣＤ４陽性細胞集団のｃＤＮＡを鋳型とした結果であり、「陰性対照」は鋳型を入れていない対照の結果である。また、写真の右側の数字はＰＣＲ反応のサイクル数を示す。
【００７７】
その結果、ＣＤ４陽性細胞集団のみにおいてゼブラフィッシュＣＤ４遺伝子の発現が認められた。また、ＴＣＲＡＣ遺伝子の発現は全白血球集団以外の全ての分画において認められた。全白血球集団でＴＣＲＡＣ遺伝子の発現が認められなかったのは、全白血球集団におけるＴ細胞の割合が低かったためであると考えられた。また、ＩｇＬＣ遺伝子の発現は、全リンパ球集団及びＣＤ４陰性細胞集団においてのみ認められた。
【００７８】
〔実験例９〕
［分画細胞集団における遺伝子発現解析（２）］
実験例２で作製した抗ＣＤ８αモノクローナル抗体で染色される細胞集団を分取し、遺伝子発現を検討した。
【００７９】
具体的には、まず、実験例３と同様にしてゼブラフィッシュの全白血球集団を採取し、実験例２で作製した抗ＣＤ８αモノクローナル抗体で染色した。続いて、セルソーター（型式「ＦＡＣＳ  ＡｒｉａＩＩ」、ＢＤバイオサイエンス社）を用いて、全リンパ球集団、ＣＤ８α陰性細胞集団、ＣＤ８α陽性細胞集団を分取した。
【００８０】
続いて、分取した各細胞集団より全ＲＮＡを抽出して逆転写反応を行いｃＤＮＡを合成した。合成した各ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応を行い、ゼブラフィッシュＣＤ４遺伝子、ゼブラフィッシュＣＤ８α遺伝子、ゼブラフィッシュＴＣＲＡＣ遺伝子、ゼブラフィッシュＩｇＬＣ遺伝子の発現を検討した。また、βアクチン遺伝子を内部標準遺伝子とし、各ｃＤＮＡの標準化を行った。各遺伝子増幅用プライマーとしては、実験例８と同じものを用いた。
【００８１】
図７は、ＰＣＲ反応の結果を示すアガロースゲル電気泳動の写真である。図７中、「全白血球」、「全リンパ球」、「陰性対照」は実験例８と同様の意味を示す。また、「ＣＤ８α−」はＣＤ８α陰性細胞集団のｃＤＮＡを鋳型とした結果であり、「ＣＤ８α＋」はＣＤ８α陽性細胞集団のｃＤＮＡを鋳型とした結果である。また、写真の右側の数字はＰＣＲ反応のサイクル数を示す。
【００８２】
その結果、ＣＤ８α陽性細胞集団のみにおいてゼブラフィッシュＣＤ８α遺伝子の発現が認められた。また、ＴＣＲＡＣ遺伝子の発現は全白血球集団以外の全ての分画において認められた。全白血球集団でＴＣＲＡＣ遺伝子の発現が認められなかったのは、全白血球集団におけるＴ細胞の割合が低かったためであると考えられた。また、ＩｇＬＣ遺伝子の発現は、全リンパ球集団及びＣＤ８α陰性細胞集団においてのみ認められた。
【００８３】
以上の実験例３〜９の結果は、実験例１で作製した抗ＣＤ４モノクローナル抗体がゼブラフィッシュＣＤ４抗原に反応することを示し、実験例２で作製した抗ＣＤ８αモノクローナル抗体がゼブラフィッシュＣＤ８α抗原に反応することを示す。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明によれば、ゼブラフィッシュのＣＤ４抗原に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメント、及び、ゼブラフィッシュのＣＤ８α抗原に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメントを提供することができる。また、これらの抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸を提供することができる。
【図１】
0006614431.tif 000003
【図２】
0006614431.tif 000004
【図３】
0006614431.tif 000005
【図４】
0006614431.tif 000006
【図５】
0006614431.tif 000007
【図６】
0006614431.tif 000008
【図７】
0006614431.tif 000009
【配列表】
0006614431000001.app