(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質から過酸化物を発生させる工程と、
前記過酸化物に、重合物質生成用酸化還元酵素、および前記重合物質生成用酸化還元酵素の基質であるｏ−フェニレンジアミンを接触させて前記基質の重合物質であるジアミノフェナジンを得る工程と、
前記ジアミノフェナジンに光を照射して、前記ジアミノフェナジンが凝集して光を散乱する重合体であるポリマー凝集体を得る工程と、
前記ポリマー凝集体における、照射点からの散乱光の強度の時間的変化情報を記録する工程と、
を含む被験物質の濃度測定方法。
【請求項２】
前記被験物質は、酵素反応によって過酸化物を生成する物質である請求項１に記載の被験物質の濃度測定方法。
【請求項３】
被験物質に、前記被験物質に対して特異的な相互作用を有する物質に重合物質生成用酸化還元酵素が修飾された修飾物質を接触させた後、過酸化物、および前記重合物質生成用酸化還元酵素の基質であるｏ−フェニレンジアミンを接触させて前記基質の重合物質であるジアミノフェナジンを得る工程と、
前記ジアミノフェナジンに光を照射して、前記ジアミノフェナジンが凝集して光を散乱する重合体であるポリマー凝集体を得る工程と、
前記ポリマー凝集体における、照射点からの散乱光の強度の時間的変化情報を記録する工程と、
を含むことを特徴とする被験物質の濃度測定方法。
【請求項４】
被験物質に、前記被験物質に対して特異的な相互作用を有する物質に重合物質生成用酸化還元酵素が修飾された修飾物質を接触させた後、過酸化物、および前記重合物質生成用酸化還元酵素の基質であるｏ−フェニレンジアミンを接触させて重合物質であるジアミノフェナジンを得る工程と、
前記ジアミノフェナジンに光を照射して、前記ジアミノフェナジンが凝集して光を散乱する重合体であるポリマー凝集体を得る工程と、
前記ポリマー凝集体を起点とする２つの光の位相差に基づく、照射点からの散乱光の強度の時間的変化情報を記録する工程と、
を含むことを特徴とする被験物質の濃度測定方法。
【請求項５】
被験物質に、前記被験物質に対して特異的な相互作用を有する物質に重合物質生成用酸化還元酵素が修飾された修飾物質を接触させた後、過酸化物、および前記重合物質生成用酸化還元酵素の基質であるｏ−フェニレンジアミンを接触させて前記基質の重合物質であるジアミノフェナジンを得る工程と、
前記ジアミノフェナジンに光を照射して、前記ジアミノフェナジンが凝集して光を散乱する重合体であるポリマー凝集体を得る工程と、
前記ポリマー凝集体を起点とする２つの光の位相差に基づく、照射点からの散乱光の強度の時間的変化情報を記録する工程と、
を含むことを特徴とする被験物質の濃度測定方法。
【請求項６】
前記被験物質に対して特異的な相互作用が抗原抗体反応である請求項３〜５のいずれかに記載の被験物質の濃度測定方法。
【請求項７】
前記時間的変化情報が信号波形を構成しており、前記被験物質への前記光の照射開始時以降の所定の時から、前記信号波形が極値を示すまでにかかる時間を特定する工程をさらに含む請求項１〜６のいずれかに記載の被験物質の濃度測定方法。
【請求項８】
前記ジアミノフェナジンを得る工程は基体の上で行なうものである請求項１〜７のいずれかに記載の被験物質の濃度測定方法。
【請求項９】
前記被験物質、および前記被験物質に対して特異的な相互作用を有する物質よりなるＸ群物質の少なくとも一種が存在する第１の基体と、
前記被験物質、および前記被験物質に対して特異的な相互作用を有する物質よりなるＸ群物質の少なくとも一種が存在しない第２の基体と、
を重ね合わせ、前記第２の基体から光を照射するものである請求項８に記載の被験物質の濃度測定方法。
【請求項１０】
前記基体は、前記被験物質、および前記被験物質に対して特異的な相互作用を有する物質よりなるＸ群物質の少なくとも一種が存在するＸ群物質存在領域と、前記Ｘ群物質が存在しないＸ群物質非存在領域とを有しており、前記Ｘ群物質非存在領域に前記光を照射するものである請求項８に記載の被験物質の濃度測定方法。
【請求項１１】
前記基体の上に多孔質担体を設け、前記多孔質担体によって前記Ｘ群物質を固定している請求項９に記載の被験物質の濃度測定方法。
【請求項１２】
被験物質に光を入射できる光源と、
下記（１）または（２）の工程によって得られるポリマー凝集体からの散乱光を検知する光電変換素子と、
前記光電変換素子から出力される信号を所定時間のあいだ続けて記録する記録媒体と、を有することを特徴とする被験物質の検出装置。
（１）被験物質から過酸化物を発生させる工程と、
前記過酸化物に、重合物質生成用酸化還元酵素、および前記重合物質生成用酸化還元酵素の基質であるｏ−フェニレンジアミンを接触させて前記基質の重合物質であるジアミノフェナジンを得る工程と、
前記ジアミノフェナジンに光を照射して、前記ジアミノフェナジンが凝集して光を散乱する重合体であるポリマー凝集体を得る工程。
（２）被験物質に、前記被験物質に対して特異的な相互作用を有する物質に重合物質生成用酸化還元酵素が修飾された修飾物質を接触させた後、過酸化物、および前記重合物質生成用酸化還元酵素の基質であるｏ−フェニレンジアミンを接触させて前記基質の重合物質であるジアミノフェナジンを得る工程と、
前記ジアミノフェナジンに光を照射して、前記ジアミノフェナジンが凝集して光を散乱する重合体であるポリマー凝集体を得る工程。
【請求項１３】
前記ポリマー凝集体への前記光の照射開始時以降の所定の時から、前記記録媒体に記録されている信号波形が極値を示すまでにかかる時間を特定する計算手段をさらに有することを特徴とする請求項１２に記載の検出装置。
【請求項１４】
前記ポリマー凝集体が光透過基体の第１面側に存在しており、
前記光透過基体の第２面側に対向しているレンズを更に有する請求項１２または１３に記載の検出装置。
【請求項１５】
前記光透過基体の第１面側に、前記ポリマー凝集体、および前記ポリマー凝集体に対する特異的な相互作用を有する物質よりなるＸ群物質の少なくとも一種が存在するＸ群物質存在領域と、前記Ｘ群物質が存在しないＸ群物質非存在領域とを有する請求項１４に記載の検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペルオキシダーゼなどの重合物質生成用（酸化還元）酵素を用いて被験物質を検出する方法、および上記方法に用いられる検出装置に関する。以下では、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ；酵素結合免疫吸着法）を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定する趣旨ではない。
【背景技術】
【０００２】
ＥＬＩＳＡ法は、抗原の抗原決定基と抗体との特異的結合反応、および抗体または抗原に標識した酵素による呈色反応を組み合わせて用いる免疫学的測定法（イムノアッセイ）の一種である。ＥＬＩＳＡ法では、特異性の高い抗原抗体反応を利用し、酵素反応に基づく発色をシグナルに変換して測定するため、高感度で検出でき、定量性にも優れている。また、標識物質として放射性物質を用いる放射免疫測定（ラジオイムノアッセイ、ＲＩＡ）に比べて安全性が高く、安価で簡便である。そのため、ＥＬＩＳＡ法は、抗体、インフルエンザウイルス、血漿タンパク質、サイトカイン、ＤＮＡ、ペプチド、リガンドなどの生体関連物質；食品などに含まれる残留農薬や環境ホルモンなどの化学物質；糖尿病、癌などの診断に用いられる血糖、腫瘍マーカーなどの診断用物質など、様々な被験物質の検出や定量に汎用されている。【０００３】
ＥＬＩＳＡ法は、測定原理の違いにより、直接吸着法、競合法、サンドイッチ法に大別される。各測定方法の概要は以下のとおりである。【０００４】
直接吸着法では、まず、マイクロプレートなどに被験物質を固定化した後、酵素で標識した抗体（酵素標識抗体）を添加し、被験物質中の抗原と反応させる（抗原抗体反応）。次に、共雑物を洗浄により除去した後、標識した酵素に対する発色基質を添加して反応させ、発色した色素の吸光度を、比色計を用いて測定し、被験物質中の抗原量を測定する。直接吸着法は、微量タンパク質の定量性が低いなどの欠点を有する。【０００５】
競合法は、直接吸着法の上記欠点を改善するために開発されたものであり、抗原に対して一種類の抗体を用い、被験物質中の抗原を高感度に検出する方法である。競合法では、まず、抗体を固定化したマイクロプレートなどに、被験物質と酵素標識抗原を添加し、競合的に反応させる（抗原抗体反応）。次に、共雑物を洗浄により除去した後、酵素の発色基質を添加して反応させ、発色した色素の吸光度を、比色計を用いて測定し、被験物質中の抗原量を測定する。【０００６】
サンドイッチ法は、被験物質中の抗原を、二種類の抗体を用いて検出する方法であり、特異性が非常に高いという利点がある。詳細には、マイクロプレートなどに固定化した抗体（一次抗体、捕獲抗体）に被験物質を添加し、反応させる（抗原抗体反応）。次に、共雑物を洗浄により除去した後、更に酵素で標識した抗体（二次抗体）を添加し、上記抗原抗体反応と異なる部位で反応させる。これにより、一次抗体−抗原−二次抗体のサンドイッチ構造が形成される。共雑物を洗浄により除去した後、酵素の発色基質を添加して反応させ、発色した色素の吸光度を、比色計を用いて測定し、被験物質中の抗原量を測定する。【０００７】
例えばＥＬＩＳＡ法を用いて、ＩｇＧ抗体などの抗体を検出する場合、標識酵素として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰ）と、その基質である過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）を用いた呈色反応が汎用されている。ＨＲＰのほか、グルタチオンペルオキシダーゼやハロペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼは、抗体のほか、グルコースやコレステロールなどの生体成分の定量に広く用いられている。ペルオキシダーゼは酸化される物質に対して基質特異性が低く、種々の定量法を適用することができる。特に上記ＨＲＰは分子量が小さいため、ＥＬＩＳＡ法では抗体に結合させて標識酵素として用いられ、発色試薬（発色基質とも呼ばれる）と組み合わせることにより、医学、疫学、臨床検査などの分野で利用されている。ＨＲＰを用いた呈色反応には、発色基質として、アニリンの誘導体であるｏ−フェニレンジアミン（ｏ−ＰＤ）を用いることが多い。【０００８】
以下に、ｏ−ＰＤにＨＲＰと過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）を添加し、酸化重合反応によって２，３−ジアミノフェナジン（ＤＡＰ）の重合物質が生成する反応式を示す。【０００９】
【化１】
0006516679.tif 000002
【００１０】
上記反応式によって得られるＤＡＰは橙色や赤色の発色物質であり、波長４２０ｎｍ付近の吸収ピークが時間と共に増加する。この呈色反応に基づく吸光度を測定することにより、抗体のほか、グルコースやコレステロールなどの生体物質を検出することもできる。【００１１】
以下に、β−Ｄ−グルコースと、β−Ｄ−グルコースのみに特異的に作用する酵素グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）を用いた呈色反応を示す。ＧＯＤによってβ−Ｄ−グルコースが酸化されると、Ｄ−グルコノ−σ−ラクトン（グルコン酸）と過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）が生成する。生成した過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）は次の反応２に供給され、ＨＲＰにより、ｏ−ＰＤが酸化重合されて橙色のダイマー（重合物質）のＤＡＰが生成する。【００１２】
【化２】
0006516679.tif 000003
【００１３】
前述したようにＥＬＩＳＡ法には幾つかの方法が含まれるが、上記いずれの方法を用いる場合でも、酵素標識抗体などによって発色した色素を、比色計を用いて分光測定する。しかし、分光測定には回折格子、光学フィルター、高感度検出器など複数の装置が必要であり、装置が大型化し、高価であるという問題がある。【００１４】
そこで、ＥＬＩＳＡ法に適用可能であり、従来の分光測定法に代替し得る新規な検出技術として、例えば、走査光源による導波管に基づく光学的検出システム（特許文献１）、円盤型分析チップ（特許文献２）、光導波路型抗体チップ（特許文献３）などが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特表２０１２−５２５５９５号公報
【特許文献２】特開２０１２−２１５５１５号公報
【特許文献３】特開２００８−２２４５２４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
上述したようにＥＬＩＳＡ法は、抗原抗体反応と標識酵素を利用し、微量の被験物質を高感度且つ定量的に検出、分析可能な手段として極めて有用である。しかし、酵素反応に基づく発色物質の吸光度の測定に用いられる分光測定装置は大型であり、また測定時間が長いという問題を抱えている。【００１７】
上記の問題は、ＥＬＩＳＡ法などのイムノアッセイに限定されず、酵素反応によって生成する発色物質の吸光度を測定してグルコースなどの被験物質を検出する方法（酵素を用いるという意味で、広義の酵素アッセイに含まれる。）においても同様に見られる。【００１８】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、酵素反応による発色、または抗原抗体反応などのような特異的な相互反応と酵素反応による発色を利用して被験物質を検出する方法に当たり、分光測定装置を用いずに、被験物質を迅速且つ感度良く定量的に検出可能な方法を提供することにある。【００１９】
本発明の他の目的は、上記方法に好適に用いられる被験物質の検出装置であって、小型且つ計測時間の短い検出装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上記課題を解決し得た本発明に係る被験物質の濃度測定方法は、被験物質から過酸化物を発生させる工程と、前記過酸化物に、重合物質生成用酸化還元酵素、および前記重合物質生成用酸化還元酵素の基質を接触させて重合物質を得る工程と、前記重合物質に光を照射して、照射点からの散乱光の強度の時間的変化情報を記録する工程と、を含むところに要旨を有するものである。【００２１】
本発明の好ましい実施形態において、前記被験物質は、酵素反応によって過酸化物を生成する物質である。【００２２】
また、上記課題を解決し得た本発明に係る被験物質の他の濃度測定方法は、被験物質に、前記被験物質に対して特異的な相互作用を有する物質に重合物質生成用酸化還元酵素が修飾された修飾物質を接触させた後、過酸化物、および前記重合物質生成用酸化還元酵素の基質を接触させて重合物質を得る工程と、前記重合物質に光を照射して、照射点からの散乱光の強度の時間的変化情報を記録する工程と、を含むところに要旨を有するものである。【００２３】
本発明の好ましい実施形態において、前記被験物質に対して特異的な相互作用は抗原抗体反応である。【００２４】
本発明の好ましい実施形態において、前記時間的変化情報が信号波形を構成しており、前記被験物質への前記光の照射開始時以降の所定の時から、前記信号波形が極値を示すまでにかかる時間を特定する工程をさらに含む。【００２５】
本発明の好ましい実施形態において、前記重合物質を得る工程は基体の上で行なうものである。【００２６】
本発明の好ましい実施形態において、前記被験物質、および前記被験物質に対して特異的な相互作用を有する物質よりなるＸ群物質の少なくとも一種が存在する第１の基体と；前記被験物質、および前記被験物質に対して特異的な相互作用を有する物質よりなるＸ群物質の少なくとも一種が存在しない第２の基体と；を重ね合わせ、前記第２の基体から光を照射するものである。【００２７】
本発明の好ましい実施形態において、前記基体は、前記被験物質、および前記被験物質に対して特異的な相互作用を有する物質よりなるＸ群物質の少なくとも一種が存在するＸ群物質存在領域と、前記Ｘ群物質が存在しないＸ群物質非存在領域とを有しており、前記Ｘ群物質非存在領域に前記光を照射するものである。【００２８】
本発明の好ましい実施形態において、前記基体の上に多孔質担体を設け、前記多孔質担体によって前記Ｘ群物質を固定しているものである。【００２９】
また、上記課題を解決し得た本発明の検出装置は、被験物質に光を入射できる光源と、前記被験物質由来の重合物質からの散乱光を検知する光電変換素子と、前記光電変換素子から出力される信号を所定時間のあいだ続けて記録する記録媒体と、を有するところに要旨を有するものである。【００３０】
本発明の好ましい実施形態において、前記被験物質由来の重合物質は光透過基体の第１面側に存在しており、前記光透過基体の第２面側に対向しているレンズを更に有している。【００３１】
本発明の好ましい実施形態において、前記被験物質由来の重合物質への前記光の照射開始時以降の所定の時から、前記記録媒体に記録されている信号波形が極値を示すまでにかかる時間を特定する計算手段をさらに有する。【００３２】
本発明の好ましい実施形態において、前記光透過基体の第１面側に、前記被検物質由来の重合物質、および前記被験物質由来の重合物質に対する特異的な相互作用を有する物質よりなるＸ群物質の少なくとも一種が存在するＸ群物質存在領域と、前記Ｘ群物質が存在しないＸ群物質非存在領域とを有する。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によれば、分光装置を利用する従来法に比べ、迅速且つ感度良く定量的に被験物質の濃度を測定し、検出することができる。【００３４】
また、本発明によれば、分光装置を用いる従来の検出装置に比べ、小型化且つ安価で、計測時間の短い検出装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、β−Ｄ−グルコースを検出するための方法について、本発明法と従来法を対比した図である。
【図２】図２は、本発明において推察される反応メカニズムを示す図である。
【図３】図３は、本発明に用いられる検出装置の一実施形態を示す図である。
【図４】図４は、実験に用いた基板の説明図である。
【図５】図５（ａ）は、ｏ−ＰＤ溶液に緑色ＬＥＤを照射したとき、各照射時間におけるｏ−ＰＤ溶液の吸収スペクトルの結果を示す図である。図５（ｂ）は、照射時間の異なるｏ−ＰＤ溶液にレーザー光を集光して後方散乱光強度を測定したときの、後方散乱光強度の時間的変化を示す図である。
【図６】図６は、ｏ−ＰＤ溶液のピーク吸光度に対する後方散乱光強度のピーク時間をプロットした図である。
【図７】図７（ａ）は、種々の濃度のｏ−ＰＤ水溶液に緑色レーザー光を集光したとき、レーザー照射時間と後方散乱光強度との関係を示す図である。図７（ｂ）は、各濃度のｏ−ＰＤ水溶液について、緑色レーザーを８０秒間照射した後のＳＥＭ写真である。
【図８】図８（ａ）〜（ｆ）は、１ｍＭのｏ−ＰＤ水溶液に緑色レーザーを集光し、４秒ごとに反射光の画像を撮影した写真である。
【図９】図９（ａ）は、本実験の測定手順を示す図である。図９（ｂ）は、レーザーを４秒から１６秒間照射したときのＡＦＭ観察像である。図９（ｃ）は、レーザー照射時間と、後方散乱光強度および重合体の高さとの関係を示す図である。
【図１０】図１０は、本発明において検出している光を模式的に示す図である。
【図１１】図１１（ａ）は、実験に用いた、ガラス基板と水に挟まれたモデル試料の説明図である。図１１（ｂ）は、上記モデル試料における、ポリマー薄膜の厚さと反射率との関係を示す図である。
【図１２】図１２（ａ）は、本実験の測定手順を示す図である。図１２（ｂ）は、１ｍＭのｏ−ＰＤ溶液に種々の濃度のＤＡＰを混合した溶液にレーザー光を集光したときの、後方散乱光強度の時間的変化を示す図である。図１２（ｃ）は、ＤＡＰの濃度と、後方散乱光強度のピーク時間との関係を示す図である。
【図１３】図１３（ａ）は、ＨＲＰ溶液、種々の濃度の過酸化水素、及びｏ−ＰＤ溶液の混合液における、レーザー照射時間と後方散乱光強度との関係を示す図である。図１３（ｂ）は、過酸化水素濃度と後方散乱光強度のピーク時間との関係を示す図である。
【図１４】図１４（ａ）は、ｏ−ＰＤ溶液にレーザー光を集光したときのＳＥＭ観察像である。図１４（ｂ）はｏ−ＰＤ溶液、ＨＲＰ溶液、および過酸化水素の混合液にレーザー光を集光したとき、集光点に形成されたナノ構造体のＳＥＭ観察像である。
【図１５】図１５（ａ）は、本実験の測定手順を示す図である。図１５（ｂ）は、種々の濃度のグルコース水溶液、ＧＯＤ、およびＨＲＰの混合液にレーザーを照射したときの、レーザー照射時間と後方散乱光強度との関係を示す図である。図１５（ｃ）は、各グルコース濃度に対する後方散乱光強度の最初のピークが現れた時間をプロットした図である。
【図１６】図１６（ａ）は、本実験の測定手順を示す図である。図１６（ｂ）は、種々の濃度のグルコース水溶液、ＧＯＤ、ＨＲＰの混合液における吸収スペクトルの結果を示す図である。図１６（ｃ）は、各グルコース濃度に対するピーク吸光度をプロットした図である。
【図１７】図１７は、種々の濃度のグルコースに波長４７３ｎｍのレーザーを照射したときの、後方散乱光強度の時間的変化を示す図である。
【図１８】図１８は、種々の濃度のグルコースに波長５３２ｎｍのレーザーを照射したときの、後方散乱光強度の時間的変化を示す図である。
【図１９】図１９は、種々の濃度のグルコースに波長６３３ｎｍのレーザーを照射したときの、後方散乱光強度の時間的変化を示す図である。
【図２０】図２０は、各波長における、グルコース濃度に対する後方散乱光強度のピーク時間を示す図である。
【図２１】図２１は、実験に用いたｏ−ＰＤ溶液（３．８ｍＭ）の吸収スペクトルを示す図である。
【図２２】図２２は、各波長における、ｏ−ＰＤ水溶液の吸収スペクトル（左軸）と、ｏ−ＰＤ水溶液にレーザーを集光して形成されたナノ構造体の後方散乱光強度スペクトル（右軸）の関係を示す図である。
【図２３】図２３は、集光レーザー光によるｏ−ＰＤの酸化重合反応の進行状態を示す模式図である。
【図２４】図２４は、光増感反応のエネルギーダイヤグラムを説明する図である。
【図２５】図２５は、６３３ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザーを用い、メチレンブルーによる光増感効果を調べた図である。
【図２６】図２６は、種々の濃度のグルコース水溶液、ＧＯＤ、ＨＲＰ溶液にｏ−ＰＤ／ｂｌｕｅ溶液２０μＬを加えた混合溶液における。後方散乱光強度の時間的変化を示す図である。
【図２７】図２７は、各グルコース濃度に対する後方散乱光強度のピーク時間をプロットした図である。
【図２８】図２８は、種々の濃度のエタノール、ＨＲＰ溶液、およびＡＯＤ溶液にｏ−ＰＤ溶液を加えた混合溶液における、後方散乱光強度の時間的変化を示す図である。
【図２９】図２９は、各エタノール濃度に対する後方散乱光強度のピーク時間をプロットした図である。
【図３０】図３０（ａ）は、ＥＬＩＳＡ法（その１）における、測定法の概略図である。図３０（ｂ）は、レーザー照射時間と後方散乱光強度の関係を示す図である。図３０（ｃ）は、後方散乱光強度反射光強度が一度減少して、再び元の強度まで増加するまでの時間（所定時間）と、ＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体の濃度との関係を示す図である。
【図３１】図３１（ａ）は、ＥＬＩＳＡ法（その２）における、測定法の概略図である。図３１（ｂ）は、レーザー照射時間と後方散乱光強度の関係を示す図である。図３１（ｃ）は、後方散乱光強度反射光強度が一度減少して、再び元の強度まで増加するまでの時間（所定時間）と、ＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体の濃度との関係を示す図である。
【図３２】図３２は、抗体が存在する抗体存在領域Ａと、抗体が存在しない抗体非存在領域Ｂとを有する基板を示す図である。
【図３３】図３３は、基板の上に設けたドーナツ状の多孔質担体によって抗体を固定化した基板を示す図である。
【図３４】図３４は、多孔質担体と基板との間にスペーサーを介在させた基板を示す図である。
【図３５】図３５は、多孔質担体を凸状に変形させた基板を示す図である。
【図３６】図３６は、７−１に記載の実験において、従来の吸光度測定法による結果を示すグラフである。
【図３７】図３７は、７−１に記載の実験において、本発明法による結果を示す図である。図３７（ａ）は、レーザー照射時間と後方散乱光強度の関係を示す図である。図３７（ｂ）は、後方散乱光強度のピーク時間と、ＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体の濃度との関係を示す図である。
【図３８】図３８は、７−２に記載の実験において、従来の吸光度測定法による結果を示すグラフである。
【図３９】図３９は、７−２に記載の実験において、本発明法による結果を示す図である。図３９（ａ）は、レーザー照射時間と後方散乱光強度の関係を示す図である。図３９（ｂ）は、後方散乱光強度が一度減少して、再び元の強度まで増加するまでの時間（所定時間）と、ＣＲＰの濃度との関係を示す図である。
【図４０】図４０は、７−３に記載の実験手順を説明する図である。
【図４１】図４１は、７−３に記載の実験において、後方散乱光強度のピーク時間と、ＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体の濃度との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明者らは上記課題を解決するため、鋭意検討してきた。その結果、
（ｉ）被験物質から過酸化物を発生させ、当該過酸化物に、重合物質生成用酸化還元酵素、および前記重合物質生成用酸化還元酵素の基質を接触させて得られる重合物質、または（ｉｉ）被験物質に、当該被験物質に対して特異的な相互作用を有する物質に重合物質生成用酸化還元酵素が修飾された修飾物質を接触させた後、過酸化物、および重合物質生成用酸化還元酵素の基質を接触させて得られる重合物質に光を照射して、照射点からの散乱光の強度の時間的変化情報を記録することによって所期の目的が達成されることを見出し、本発明を完成した。
【００３７】
本明細書において「重合物質生成用酸化還元酵素」、「重合物質生成用酸化還元酵素の基質」、「重合物質」、および「重合体」を以下のように定義する。
【００３８】
まず、上記「重合物質生成用酸化還元酵素」は、重合反応によって重合物質を得るための酵素であり、例えば、前述した反応式に記載の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のほか、グルタチオンペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼが挙げられる。但し、本発明はこれに限定されず、当該酵素の重合基質を酸化的に重合する酵素であれば良い。以下では、単に酵素と呼ぶ場合がある。
【００３９】
上記「重合物質生成用酸化還元酵素の基質」は、前記重合反応により重合物質を得るためのものであり、例えば、アニリンおよびその誘導体であるｏ−フェニレンジアミン（ｏ−ＰＤ）、ｐ−フェニレンジアミン（ｐ−ＰＤ）などのフェニレンジアミン；フェノール系化合物などが挙げられる。以下では、上記基質を単に重合基質と呼ぶ場合がある。
【００４０】
上記「重合物質」は、前述した重合物質生成用酸化還元酵素と重合物質生成用酸化還元酵素の基質との反応によって得られるものであり、例えば、ジアミノフェナジン（ＤＡＰ）などのダイマー（二量体）が挙げられる。
【００４１】
上記「重合体」は、後記する図１および図２に示すように、上記重合物質がレーザー光などの光を吸収して形成されるものである。上記「重合体」の重合度が高まり、基体上の集光スポット内で凝集した重合体（光を散乱する重合体）を特に「ナノ構造体」と呼ぶ。
【００４２】
前述したとおり、本発明の測定方法は、下記第１の方法と第２の方法からなる。
（１）第１の方法：
被験物質から過酸化物を発生させる工程と、
前記過酸化物に、重合物質生成用酸化還元酵素、および前記重合物質生成用酸化還元酵素の基質を接触させて重合物質を得る工程と、
前記重合物質に光を照射して、照射点からの散乱光の強度の時間的変化情報を記録する工程と、
を含む被験物質の濃度測定方法。
【００４３】
（２）第２の方法：
被験物質に、前記被験物質に対して特異的な相互作用を有する物質に重合物質生成用酸化還元酵素が修飾された修飾物質を接触させた後、過酸化物、および前記重合物質生成用酸化還元酵素の基質を接触させて重合物質を得る工程と、
前記重合物質に光を照射して、照射点からの散乱光の強度の時間的変化情報を記録する工程と、
を含むことを特徴とする被験物質の濃度測定方法。
【００４４】
上記第１の方法と第２の方法は、重合物質を得る工程が相違している。すなわち、上記第１の方法は、酵素反応などの生化学反応によって過酸化物を生成する被験物質を用い、当該被験物質由来の過酸化物を利用して重合物質を得るものである。これに対し、上記第２の方法は、被験物質に対する特異的な相互作用（例えば抗原抗体反応など）を利用するものであり、上記第２の方法に用いられる被験物質は、上記第１の方法で用いられる過酸化物生成被験物質に限定されない。第２の方法は、従来のＥＬＩＳＡ法の代替技術として有用である。
【００４５】
本発明によれば、上記方法に適用可能な被験物質を感度良く検出、定量することができる。上記被験物質としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法により検出可能な被験物質（例えば、抗体、インフルエンザウイルス、Ｃ反応性タンパク質、血漿タンパク質、サイトカイン、ＤＮＡ、ペプチド、リガンドなどの生体関連物質；食品などに含まれる残留農薬や環境ホルモンなどの化学物質；糖尿病、癌などの診断に用いられる血糖、腫瘍マーカーなどの診断用物質など）のほか、グルコース、コレステロール、ヒスタミンなどの生体物質；エタノール、ギ酸など（上記グルコースも含む。）の酵素反応によって酸化する物質など、様々な被験物質を感度良く検出、定量することができる。
【００４６】
以下、各工程について説明する。
【００４７】
はじめに、上記第１および第２の各方法において、重合物質を得る工程を説明する。重合物質を得る工程は本発明を特徴付けるものではなく、下記要件を満足する限り、公知の方法を適用することができる。
【００４８】
（Ｉ）第１の方法において、被験物質から過酸化物を発生させる工程と、前記過酸化物に、重合物質生成用酸化還元酵素、および前記重合物質生成用酸化還元酵素の基質を接触させて重合物質を得る工程
この工程は、被験物質由来の過酸化物に酵素を反応させ、酵素の酸化還元反応に伴って重合基質を二量化するなどして重合物質を得るものである。
【００４９】
上記方法に用いられる被験物質は、過酸化物を発生させるものであれば特に限定されない。上記過酸化物として、例えば、過酸化水素、過酸化ナトリウムなどの無機過酸化物の他、過酸化ベンゾイル、クメンヒドロペルオキシドなどの有機過酸化物などが挙げられる。上記過酸化物は、例えば、被験物質に酵素を添加する酵素反応によって得ることができる。上記被験物質として、例えば、グルコース、エタノール、コレステロール、ギ酸などが挙げられる。例えば、被験物質としてグルコースなどのように酸化酵素（グルコースの場合、グルコースオキシダーゼ）によって酸化する過酸化物発生物質を用いる場合、前述した反応式に示すように、グルコースとグルコースオキシダーゼが反応し、生成した過酸化水素が、重合物質生成用酸化還元酵素と重合物質生成用酸化還元酵素の基質と反応する。勿論、本発明はこれに限定されない。
【００５０】
（ＩＩ）第２の方法において、被験物質に、前記被験物質に対して特異的な相互作用を有する物質に重合物質生成用酸化還元酵素が修飾された修飾物質を接触させた後、過酸化物、および前記重合物質生成用酸化還元酵素の基質を接触させて重合物質を得る工程
前述したように上記第２の方法は、酵素の酸化還元反応に伴う重合基質の重合物質化を行なう点では上記第１の方法と共通するが、その前提として、上記第１の方法のように、被験物質由来の過酸化物を用いるのではなく、被験物質と、被験物質に対して特異的な相互作用を有する物質に重合物質生成用酸化還元酵素が修飾された修飾物質を混合し、得られた物質に過酸化物および重合基質を混合したものを用いる点で、上記第１の方法と相違する。
【００５１】
ここで上記「被験物質に対して特異的な相互作用」とは、例えば、抗原抗体反応などが挙げられる。また、上記「被験物質に対して特異的な相互作用を有する物質」とは、例えば被顕物質に対する抗体または抗原が挙げられる。また、上記「被験物質に対して特異的な相互作用を有する物質に重合物質生成用酸化還元酵素が修飾された修飾物質」とは、酸化還元酵素などによって標識された、被験物質に対する抗体または抗原が挙げられる。
【００５２】
上記「被験物質に対して特異的な相互作用」が抗原抗体反応である場合、例えば、ＥＬＩＳＡ法に用いられる種々の方法（前述した直接吸収法、競合法、サンドイッチ法など）を全て適用することができる。ＥＬＩＳＡ法の詳細は、例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ＆Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，測定原理ＥＬＩＳＡ法（２０１１）などの文献を参照することができる。
【００５３】
具体的には、例えば、被験物質に対する抗体（一次抗体）に、重合物質生成用酸化還元酵素で標識された抗体および上記酵素の基質を順次反応させても良い。ここで、上記「重合物質生成用酸化還元酵素で標識された抗体」は、結果的に、上記酵素で標識された抗体となるものを意味する。従って、使用時には、抗体に直接、上記酵素が標識されていても良いし、標識されていなくても良い。前者の酸化還元酵素標識抗体は高価なため、後者のように、使用時に抗体と上記酸化還元酵素を反応させ、上記酸化還元酵素で標識された抗体を用いることもできる。また、上記酵素は、被験物質に対する抗体または抗原に共有結合していても良い。或いは、更に被験物質に対する抗体（一次抗体）を認識する抗体（二次抗体）または抗原が、上記酵素で標識されていても良い。
【００５４】
（ＩＩＩ）前記重合物質に光を照射して、照射点からの散乱光の強度の時間的変化情報を記録する工程（第１および第２の方法に共通する工程）
上記工程を詳しく述べると、まず、上記重合物質に光を照射する。光の照射により酸化重合が進み、上記重合物質が光を吸収して重合体が形成され、重合度が高められる。その重合体が、光透過基体上の集光スポット内で凝集してナノ構造体（光を散乱する重合体）が形成される。上記散乱光には、反射光、後方反射光、後方散乱光も含まれる。また、散乱光強度の変化を精度良く測定するには、上記光として、レーザー光が好ましく用いられる。また、光の照射に当たっては、ガラス基板などの基体と被験物質由来の重合物質を含む溶液との界面に集光させることが好ましい。
【００５５】
本発明では、上記時間的変化情報が信号波形を構成しており、前記被験物質への前記光の照射開始時以降の所定の時から、前記信号波形が極値を示すまでにかかる時間を特定する工程をさらに含むことが好ましい。
【００５６】
以下、本発明を特徴付ける上記工程について、図１および図２を用いて説明する。図１および図２では、重合物質生成用酸化還元酵素としてＨＲＰを、ＨＲＰの基質として過酸化水素を、上記酸化還元酵素の発色基質としてｏ−ＰＤを、光としてレーザー光を用いた例を示しているが、本発明はこれに限定する趣旨ではない。
【００５７】
図１に、前述したβ−Ｄ−グルコースの検出に用いられる一連の反応によって生成する重合物質（ＤＡＰ）にレーザー光を照射して、ｏ−ＰＤのポリマー凝集体が生成する様子を模式的に示す。図１に示すように、従来では、ｏ−ＰＤの酸化反応によって生成する重合物質のＤＡＰ（ダイマー）の吸光度を、分光装置を用いて測定し、被験物質の濃度を定量していた。これに対し、本発明では、上記ＤＡＰにレーザー光を照射して酸化重合反応を進行させ、生成したポリマー凝集体（ナノ構造体）の照射点からの散乱光の強度の時間的変化情報を記録する。上記時間的変化情報として、例えば、散乱光のピーク強度が得られるまでのピーク時間や、レーザー光の照射開始時以降の所定の時から信号波形が極値を示すまでにかかる時間などが挙げられる。本発明によれば、従来法に比べ、迅速且つ感度良く定量的に被験物質の濃度を測定することができる。
【００５８】
上記工程に用いられるレーザー光は、測定感度などの観点から、可視光域のレーザーが好ましく用いられる。例えば、波長５００〜５５０ｎｍの緑色レーザーが好ましく用いられる。但し、メチレンブルー、ポルフィリン系色素などの光増感剤を用いることにより、これにより、より長波長域のレーザー（例えば、波長６００〜７００ｎｍの赤色レーザーなど）を用いることもできる。その結果、使用可能な測定波長の幅が広がるなど、実用性が向上する。
【００５９】
本発明において推察される反応メカニズムを、図２を参照しながら、更に詳しく説明する。図２では、光透過基体に、被験物質を含む試料溶液（詳細には、ＨＲＰと、ＨＲＰの発色基質であるｏ−ＰＤと、過酸化水素を含む溶液）を用いた例を示している。
【００６０】
まず、上記基体に、上記の試料溶液を所定量滴下する（図２の（ｉ）を参照）。その結果、ＨＲＰの酸化重合反応により、ｏ−ＰＤは、光吸収性を有する、二量体の２，３−ジアミノフェナジン（ＤＡＰ）に変化する。次に、ＤＡＰにレーザー光を照射して基板上に集光すると、ＤＡＰの光吸収により、酸化力の高い活性酸素種が生成する（図２の（ｉｉ）を参照）。このようにして生成した活性酸素種の高い酸化力によって、ＨＲＰによる酸化重合反応は一層促進され、レーザー光の集光点に、ｏ−ＰＤのポリマー凝集体が形成される（図２の（ｉｉｉ）を参照）。なお、図２の（ｉｉｉ）には、ｏ−ＰＤのポリマー凝集体の構造を示しているが、これは予想される構造の一例を示したに過ぎず、これに限定する趣旨ではない。このようにして得られるｏ−ＰＤのポリマー凝集体は、レーザー反射光の照射点（集光点）からの散乱光の強度を変化させる。散乱光の強度を測定し、照射点からの散乱光の強度の時間的変化情報を記録する。上記散乱光の強度の時間的変化情報の一例として、例えば、ピーク強度が得られるまでのピーク時間が挙げられる。後記する実施例で実証したように、上記ピーク時間は、ｏ−ＰＤ溶液や過酸化水素などの濃度と良好な相関関係を有するため、上記ピーク時間の測定により、試料溶液中の被験物質を感度良く定量的に検出できると推察される。
【００６１】
ここで、「ピーク強度」とは、極大および極小の両方の極値を含む。後記する実験例に示すように被験物質を含む試料溶液の組成、被験物質の濃度などによっては、両方の極値をとり得るからである。ピーク強度は、最初のピーク強度であっても良いし、２回目、３回目など、いずれのピーク強度であっても良い。また、信号には常にノイズが含まれる関係上、レーザー光の照射開始時における散乱強度の例えば±１０％以内（より好ましくは±７％以内、さらに好ましくは±５％以内）の極値は、本発明における極値から除外してもよいものとする。また、極値の位置の判定方法としては、例えば、散乱光の強度の時間的変化情報であるグラフを微分したときに、その微分値が、所定区間（例えば５ビット）において負の値であったものが、所定区間（例えば５ビット）において正の値の転じた部分として特定することも可能である。
【００６２】
次に、本発明の検出装置について説明する。本発明の検出装置は、被験物質に光を入射できる光源と、前記被験物質由来の重合物質からの散乱光を検知する光電変換素子と、前記光電変換素子から出力される信号を所定時間のあいだ続けて記録する記録媒体とを有するところに特徴がある。本発明の検出装置は、好ましくは、光透過基体の第１面側に存在している被験物質を検出する装置であって、前記光透過基体の第２面側に対向しているレンズと、前記レンズを通して前記光透過基体に光を入射させることができるレーザー光源と、前記光透過基体の第１面側に存在している被験物質に由来する重合物質から散乱される光を、前記レンズを通して検知する光電変換素子と、光電変換素子から出力される信号を所定時間のあいだ続けて記録する媒体とを有しているものである。なお、本発明の検出装置における被験物質とは、上記第１および第２の方法で用いられる被験物質には限定されず、光を吸収することで被験物質に由来する重合物質が得られる物質を意味する。
【００６３】
光透過基体は、光を透過させることができる物体を指すものであるが、好ましくは、波長５３２ｎｍの光を８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上透過させるものである。具体的には、例えば、ガラス基板、プラスチックなどが挙げられる。光透過基体の形状としては、平板状であることが好ましい。本発明では、光透過基体の第１面側に存在している被験物質からの散乱光の強度に基づいて被験物質を検出するものであるため、光透過基体そのものによる散乱や屈折による検出光量の低下をできるだけ避けるためである。光透過基体の厚さは薄いことが好ましく、例えば、０．５ｍｍ以下、さらに好ましくは０．２ｍｍ以下である。光透過基体の厚さに特に好ましい下限値はないが、被験物質を保持する機能を果たすため、例えば、０．０５ｍｍ以上、好ましくは０．１ｍｍ以上とする。レーザー光の波長及び強度に特に制限はなく、重合物質のポリマー化を促進するものであればよい。光電変換素子としては、光電子増倍管、フォトダイオード、フォトトランジスタ、固体撮像素子等を用いることができる。光電変換素子から出力される信号を所定時間のあいだ続けて記録する媒体としては、各種フラッシュメモリー、パソコンに内蔵されるハードディスクやＤＲＡＭ、或いはＳＲＡＭ等、揮発性／不揮発性を問わずあらゆる記録媒体を用いることができる。
【００６４】
本発明の検出装置は、さらに、被験物質へのレーザー光の照射開始時以降の所定の時から、記録媒体に記録されている信号波形が極値を示すまでにかかる時間を特定する計算手段を備えていても良い。信号波形の極値を得るためには、例えば、画素ユニットが１つである光電変換素子を使用することにより単一の信号波形を得て、当該信号波形から極値を特定することもできるし、固体撮像素子など、複数の画素ユニットを備えたイメージセンサーである光電変換素子を使用することにより一旦画素毎に信号波形を得て、これらの信号波形の平均値を取るなどして単一の信号波形を得て、当該信号波形から極値を特定することもできる。
【００６５】
なお、照射開始時以降の所定の時からの時間を特定するのは、照射開始直後の不安定な時間のデータを一部捨てることも可能とするためである。もちろん「照射開始時以降」は、「照射開始時」を含むものである。光透過基体へのレーザー光の照射開始時から、光電変換素子の出力信号が極値を示すまでに要する時間を算出する時間算出手段は、ハードウエアにより実現してもよいが、ソフトウエア上の処理により実施することが好ましい。被験物質から散乱される光としては、後方散乱光を用いることが好ましい。レーザー光を被験物質に入射させるための光学系と被験物質から散乱される光を検出するための光学系を少なくとも一部共有でき、装置全体の小型化に有用だからである。
【００６６】
以下、本発明の一実施形態である図３の検出装置を用い、種々の基礎実験や実施形態を通じて、本発明の測定方法を更に詳細に説明する。
【００６７】
以下の説明では、下記の略称を用いる場合がある。
ｏ−フェニレンジアミン（酸化還元酵素の基質）：ｏ−ＰＤ
２，３−ジアミノフェナジン（重合物質）：ＤＡＰ
ポリフェニレンジアミン：重合体
グルコースオキシダーゼ：ＧＯＤ
西洋ワサビペルオキシダーゼ（酸化還元酵素）：ＨＲＰ
アルコールオキシダーゼ：ＡＯＤ
【００６８】
なお、ｏ−ＰＤは酸化力が非常に強く、自然に酸化され易いため、実験に用いたｏ−ＰＤ溶液には、自然酸化によるＤＡＰを少量含んでいる。
【００６９】
１．実験に用いた試薬および測定装置
１−１．試薬
ｏ−フェニレンジアミン（Ｗａｋｏ）
グルコースオキシダーゼ（１６２ｕｎｉｔ／ｍｇ、東洋紡績株式会社）
西洋ワサビペルオキシダーゼ（１００ｕｎｉｔ／ｍｇ、Ｗａｋｏ）
メチレンブルー（Ｗａｋｏ）
これらの溶媒にはクエン酸バッファー（ｐＨ４．６）を用い、所定濃度となるように溶解した。
アルコールオキシダーゼ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、３８ｕｎｉｔ／ｍＬ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）
エタノール（９９．５％、Ｗａｋｏ）
【００７０】
１−２．基板の作製
マイクロカバーガラス１７（サイズ２４ｍｍ×３６ｍｍ、厚さ０．１２〜０．１７ｍｍ、ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）を洗剤（ｄｅｃｏｎ９０、Ｄｅｃｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）で洗浄して乾燥し、その上にパンチで直径３．５ｍｍの穴を９〜１２個開けたシリコンシート１５（厚さ０．２ｍｍ、Ａｓｏｎｅ）を載せ、図４のマルチウェル基板（以下、基板と略記する場合がある。）を作製した。図中、１６は測定対象の溶液である。
【００７１】
１−３．レーザー集光装置を用いた後方散乱光強度の測定
１−３−１．測定装置
本実験に用いたレーザー集光装置の概略図を図３に示す。レーザー光源１には波長４７３ｎｍのＤＰＳＳレーザー（ＳＤＬ−４７３−０５０ＴＬ、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｄｒｅａｍ  Ｌａｓｅｒｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、波長５３２ｎｍのＹＡＧレーザー（ＳＤＬ−５３２−０２０ＴＬ、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｄｒｅａｍ  Ｌａｓｅｒｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、波長６３３ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザー（３１−２０６６−０００、ＣＯＨＥＲＥＮＴ）を用いた。レーザー光をビームエキスパンダー２で拡げた後、ＮＤフィルター３を通し、倒立型顕微鏡５（ＩＸ７０−Ｓ１Ｆ２、ＯＬＹＭＰＵＳ）へ導入した。レーザー光はハーフミラー６（７０％反射）で反射され、対物レンズ７（ＵＰｌａｎＦＬ  Ｎ、６０ｘ、ＯＬＹＭＰＵＳ）を用いて倒立型顕微鏡のステージ８上にセットした基板９の上面（基板−溶液の界面）へ集光させた。集光スポットには重合体のナノ構造体１０が形成される。表１に各レーザー光源の集光点でのレーザー強度を示す。後方散乱光は、カップラー１１により光ファイバー１２を通り、光電子増倍管（Ｈａｍａｍａｔｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ、Ｒ１１６６）１３で検出され、電気信号に変換された後、データ収録用拡張ボード１４を介してコンピュータ（ＰＣ）に出力される。レーザーの光路上には外部入力で開閉を制御できるメカニカルシャッター４を置き、コンピュータからプログラムで自動制御できるようにした。
【００７２】
【表１】
0006516679.tif 000004
【００７３】
光照射によるｏ−ＰＤの着色には緑色ＬＥＤ（Ｍ５３０Ｌ２、波長５３０ｎｍ、強度２２０ｍＷ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を用いた。
【００７４】
１−３−２．後方散乱光強度の測定手順
基板９を倒立型顕微鏡５のステージ上に固定し、レーザー光を基板上面に集光するため、基板上面で反射したレーザー集光スポット径が小さくなるように対物レンズ７の高さを調整した。シャッター４を閉じ、レーザー光を遮断してからｏ−ＰＤを含む試料溶液を基板９のウェルに１０〜２０μＬ滴下した。プログラムにより光電子増倍管１３からの電圧の測定レートを５０Ｈｚ、測定ポイント数を３０００〜１５０００に設定することで測定時間を１〜５分に調整した。コンピュータの操作によりシャッター４を開くと、レーザーが試料に集光され、ポリフェニレンジアミンナノ構造形成に伴う後方散乱光強度の測定を開始した。メカニカルシャッター４は設定した時間が経過すると自動的に閉じて測定を終了した。
【００７５】
１−４．吸収スペクトルの測定手順（比較用）
比較のため、ｏ−ＰＤの酸化によって生成したＤＡＰ（ダイマー）の吸収スペクトルを分光光度計で測定した。吸収スペクトルの測定には分光光度計（ＵＶ−２５５０、ＳＨＩＭＡＤＺＵ）を用いた。試料と対照用の純水をそれぞれ測定用セル（１０×１０×４５ｍｍ、ディスポセルＵＶ、ニッコー・ハンセン株式会社）に入れ、分光光度計にセットする。そして波長３００〜９００ｎｍの範囲でサンプリングピッチを０．５ｎｍ、スキャンスピードを高速に設定して試料の吸収スペクトルを測定した。
【００７６】
１−５．ＳＥＭによる重合体の観察
基板上に形成した重合体を、走査型電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、以下、ＳＥＭと略記する。）（ＦＥＩ、ＤＢ−２３５）を用いて観察した。ＳＥＭは、電子線を絞った電子ビームを測定する試料に照射させ、その試料から放出される２次電子を検出することで試料を観察することが出来る電子顕微鏡の一つである。ＳＥＭは電子ビームを試料に照射するため、試料表面に導電性が必要である。そのため、本実験ではネオオスミウムコーター（メイワフォーシス株式会社、ＮｅｏＣ−ＳＴ）を用い、基板表面にオスミウム金属導電被膜を約２．５ｎｍ堆積形成させて、表面に導電性を付与させてから、ＳＥＭによる測定を行った。
【００７７】
２．レーザー照射によるｏ−ＰＤの酸化重合反応
ここでは、ＨＲＰ酵素反応を用いる代わりに、ｏ−ＰＤに緑色ＬＥＤを照射してＤＡＰを形成させ、ｏ−ＰＤ溶液中に含まれるＤＡＰの光吸収によって、ポリマー凝集体であるナノ構造体が得られることを示す。
【００７８】
２−１．ｏ−ＰＤへの緑色ＬＥＤ照射による吸収スペクトルの変化と、後方散乱光強度の変化
ｏ−ＰＤ溶液（０．３３ｍＭ）を分光装置の測定用セルに入れ、２００ｍＷ／ｃｍ2の緑色ＬＥＤ（波長５３０ｎｍ）を一定時間照射した後、各照射時間におけるｏ−ＰＤ溶液の吸収スペクトルを分光光度計で測定した。得られた吸光スペクトルを図５（ａ）に示す。上記図より、緑色ＬＥＤの照射時間が長くなる程、波長４５０ｎｍ付近をピークとする光吸光度スペクトルの吸光度が増加した。この吸収スペクトルの形状は、ｏ−ＰＤのダイマーであるＤＡＰの吸収スペクトルの形状と一致する。すなわち、ｏ−ＰＤ溶液の酸化によりＤＡＰが生成し、橙色に呈色したことが分かった。
【００７９】
次いで、上記分光装置の測定用セルから、ＬＥＤ照射時間の異なるｏ−ＰＤ溶液を２０μＬずつ取り、レーザー集光装置の基板に滴下し、レーザー光を集光して後方散乱光強度を６０秒間測定した。得られた後方散乱光強度の時間的変化を図５（ｂ）に示す。上記図から、ＬＥＤ照射時間が長くなると、後方散乱光強度が極大になる時間（ピーク時間）が短くなることが分かった。これは、ｏ−ＰＤ溶液中のＤＡＰ濃度が増加すると、ナノ構造体がある高さまで成長する時間が早くなることを示している。ＬＥＤを照射していないｏ−ＰＤ溶液にレーザーを集光しても、後方散乱光強度は変化しなかった。このことから、ナノ構造体の形成には、ｏ−ＰＤ溶液中の重合物質が重要であると考えられる。
【００８０】
図６は、ピーク吸光度に対する後方散乱光強度のピーク時間をプロットしたグラフである。上記図より、ｏ−ＰＤ溶液が酸化されて吸光度が増加するのに伴い、後方散乱光強度のピーク時間が早くなることが分かる。
【００８１】
２−２．後方散乱光の時間的変化とＳＥＭ写真
０．２ｍＭ、１ｍＭ、４ｍＭの三種類のｏ−ＰＤ水溶液を上記基板上に滴下し、波長５３２ｎｍ、強度２ｍＷの緑色レーザー光を集光して８０秒間照射し、後方散乱光強度を測定して、その時間的変化を調べた。この結果を図７（ａ）に示す。図７（ａ）に示すように、ｏ−ＰＤ水溶液の濃度が高いほど、後方散乱光強度が最初に極大となる時間（最初のピーク強度が得られるまでのピーク時間）が早い。
【００８２】
更に、レーザー照射後、基板上の集光位置に形成された重合体のＳＥＭ像を測定した。図７（ｂ）は、各濃度のｏ−ＰＤ水溶液について、緑色レーザーを８０秒間照射した後におけるＳＥＭ写真である。図７（ｂ）より、集光スポット位置に重合体の構造物が形成されていることが分かる。重合体の大きさは、ｏ−ＰＤ水溶液の濃度が高いほど大きい。これは、ｏ−ＰＤ水溶液の濃度が高いほど、ナノ構造体の形成速度が速いためである。なお、ｏ−ＰＤ水溶液の濃度が４ｍＭのとき、いびつな形状の構造物が形成された。これは、前述した図７（ａ）に示すように、後方散乱光強度の時間的変化が５０秒付近で不連続になった原因であると考えられる。
【００８３】
２−３．後方散乱光強度変化の光学顕微鏡写真
図８（ａ）〜（ｆ）は、１ｍＭのｏ−ＰＤ水溶液に緑色レーザーを集光し、４秒ごとに反射光の画像を光学顕微鏡に取り付けたＣＣＤカメラで順次撮影したものである。中心部の緑色のスポットがレーザー集光点からの反射光である。後方散乱光強度は図８（ａ）〜（ｄ）にかけて増加し、その後、図８（ｄ）〜（ｆ）にかけて減少していることが分かる。
【００８４】
２−４．後方散乱光強度の時間的変化と重合体の高さとの関係
ここでは、後方散乱光強度の時間的変化と、形成されるナノ構造体の高さとの関係を調べた。図９（ａ）に本実験の測定手順を示す。
【００８５】
具体的には、１ｍＭのｏ−ＰＤ水溶液に２００ｍＷ／ｃｍ2の緑色レーザー（波長５３２ｎｍ)を１０分間程度照射し、ＤＡＰを含むｏ−ＰＤ溶液を作製した。このようにして得られたｏ−ＰＤ溶液を基板上に２０μＬ滴下し、レーザー光を集光して、反射光強度の時間的変化を２０秒間測定した。レーザー光の照射時間を変えて同様の実験を行い、各レーザー照射時間によってガラス基板上のレーザー集光位置に形成したナノ構造体の形状を、原子間力顕微鏡（Ａｔｏｍｉｃ  Ｆｏｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、以下、ＡＦＭと略記する場合がある。）（ＳＩＩ、ＳＰＩ−４０００）で観察した。ＡＦＭの測定はＳｉカンチレバーを用いてタッピングモードで行った。
【００８６】
図９（ｂ）は、レーザーを４秒から１６秒間照射したときのＡＦＭ観察像である。これらの図から、レーザー照射時間が増加すると、ナノ構造体のサイズが大きくなり、成長していることが分かる。
【００８７】
図９（ｃ）は、横軸にレーザー照射時間、左縦軸に後方散乱光強度、右縦軸にナノ構造体の高さをプロットしたグラフである。後方散乱光強度が最初に極大になる時間（最初のピーク時間）は、ある高さまで重合体が大きくなるまでの時間を表している。上記図より、後方散乱光強度が極大値をとるときにナノ構造体の高さは８０ｎｍになり、極小値をとるときにナノ構造体の高さは１８０ｎｍに成長していることが分かる。
【００８８】
本発明において検出している光は、図１０に示すように、集光レーザーの基板−ナノ構造体の界面での反射光と、構造体−溶液の界面での反射光の重ね合わせである。従って、ナノ構造体の成長と共に光の位相が変化し、２つの波の位相が一致した時に後方散乱光強度は極大値となり、位相が半波長ずれたときに極小となる。そして、更なる位相変化により再び増加に転じると考えられる。
【００８９】
２−５．反射率のシミュレーション
ここでは、後方散乱光強度の時間的変化のメカニズムを示すため、モデル系に対するフレネルの式を計算した。
【００９０】
図１１（ａ）に示すモデル試料（ガラス基板（屈折率１．５２）と水（屈折率１．３３）に挟まれたポリマー薄膜)を準備し、ポリマー薄膜の複素屈折率と膜厚をパラメーターとして、ガラス基板側から波長５３２ｎｍの光を入射させた時の反射率を計算した。ポリマー薄膜の複素屈折率を１．７−０．２ｉ、１．６−０．２ｉ、１．５−０．２ｉとしたときの、膜厚と反射率の関係を図１１（ｂ）に示す。
【００９１】
上記図より、ポリマー薄膜の膜厚の増加によって、反射率が増加と減少を繰り返すことが分かる。これは、ポリマー薄膜の２つの界面で反射した光の干渉に起因する。上記の計算条件では、膜厚が７０〜１００ｎｍ付近および２４０〜２９０ｎｍ付近で反射率が極大値をとり、１６０〜２００ｎｍ付近で極小となるが、これは重合体の高さとレーザー照射時間の関係を調べた実験結果と類似している。すなわち、本実験における後方散乱光強度の時間的変化は、集光レーザースポットに形成されたナノ構造体の成長に起因することが分かる。屈折率の実部が小さいほど、ポリマー薄膜の膜厚が０から増加するとき、反射率の大きな減少がみられる。
【００９２】
２−６．ＤＡＰ濃度と後方散乱光強度のピーク時間との関係
ここでは、ＤＡＰ濃度と後方散乱光強度のピーク時間の関係について調べた。図１２（ａ）に本実験の測定手順を示す。
【００９３】
具体的には、１ｍＭのｏ−ＰＤ溶液に０〜７５０μＭのＤＡＰ（詳細は０Ｍ、７５ｐＭ、７５０ｐＭ、７５ｎＭ、７．５ｍＭ、７５０ｍＭ）を混合し、合計６種類の溶液を作製した。それぞれ、２０ｍＬを基板上に滴下し、２ｍＷのレーザー光を対物レンズで集光し、後方散乱光強度の時間的変化を測定した。この結果を図１２（ｂ）に示す。上記図より、ＤＡＰの濃度が高いほど、後方散乱光強度が最初に極大となる時間（ピーク時間）が早く現れることが分かる。
【００９４】
図１２（ｃ）に、ＤＡＰの濃度と、後方散乱光強度のピーク時間との関係を示す。上記図より、両者は良好な相関関係を有しており、後方散乱光強度が最初に極大となるピーク時間を検出することによって、ＤＡＰ濃度を定量良く測定できることが分かった。
【００９５】
前述したように、ＨＲＰと過酸化水素を用いた酵素反応によってｏ−ＰＤが酸化されると重合物質のＤＡＰ（ダイマー）が生成する。ＨＲＰ濃度が異なる溶液中に過酸化水素とｏ−ＰＤを一定の濃度で混合すると、ＨＲＰ濃度に比例したＤＡＰが生成するため、同様にして、レーザー光を集光して後方散乱光強度の時間的変化を測定することにより、ＨＲＰ濃度を測定することができる。これは、本発明の方法がＥＬＩＳＡ法に適用可能であることを示している。
【００９６】
３．酵素反応によるｏ−ＰＤの酸化重合反応の促進
ここでは、酵素によってｏ−ＰＤの酸化重合反応が促進されることを説明する。レーザーを基板上に集光すると、酵素による酸化重合反応によって得られるＤＡＰの光吸収により活性酸素種が発生する。活性酸素の高い酸化力により酸化重合が進行し、集光点にポリマー凝集体であるナノ構造体が形成される。このナノ構造体がレーザー反射光強度を変化させる。
【００９７】
３−１．酵素反応による酸化重合反応の促進
ＨＲＰ溶液、過酸化水素（０〜２００μＭ）、及びｏ−ＰＤ溶液（１ｍＭ）をそれぞれ２０μＬ採取してマイクロチューブ内で混合し、その混合液を基板上に２０μＬ滴下して後方散乱光強度を測定した。以下に、ＨＲＰ酵素反応によるｏ−ＰＤの酸化重合反応［ｏ−ＰＤ→ＤＡＰ→Ｐｏｌｙ(ＯＰＤ)（＝重合体）］を示す。
【００９８】
【化３】
0006516679.tif 000005
【００９９】
図１３（ａ）に、このようにして得られた後方散乱光強度の時間的変化を示す。上記図より、過酸化水素の濃度が高くなるにつれて、後方散乱光強度のピーク(極大値)が増加し、ピーク時間が早くなることが分かる。
【０１００】
図１３（ｂ）に、過酸化水素濃度に対する後方散乱光強度のピーク時間をプロットしたグラフを示す。上記図より、上記方法によって過酸化水素を３．１〜２００μＭの濃度範囲で定量できていることが分かる。これは、ＨＲＰと過酸化水素によってｏ−ＰＤが酸化され、ＤＡＰを生成するためである。
【０１０１】
この結果は、上記のようにして得られたナノ構造体の形成速度が酵素による酸化反応によって促進され、ナノ構造体の形成速度を後方散乱光の時間的変化として検出できることを示している。
【０１０２】
３−２．酵素反応による重合体のＳＥＭ観察
ｏ−ＰＤ溶液（０．３３ｍＭ）２０μＬ、ｏ−ＰＤ溶液（１ｍＭ）、ＨＲＰ溶液、および過酸化水素（０．２ｍＭ）の各２０μＬを加えた混合液２０μＬを基板上に滴下し、２分間レーザー光を集光し、集光点に形成されたナノ構造体のＳＥＭ観察を行なった。比較のため、ｏ−ＰＤ溶液のみにレーザー光を集光し、同様にＳＥＭ観察を行なった。
【０１０３】
図１４（ａ）はｏ−ＰＤ溶液のみを用いたときのＳＥＭ観察像であり、図１４（ｂ）はｏ−ＰＤ溶液にＨＲＰ溶液と過酸化水素を加えたときのＳＥＭ観察像である。それぞれの図において、左側がナノ構造体を上から測定した図であり、右側が４５°傾けた図である。図１４（ｂ）のＳＥＭ観察像より、酵素反応によって重合体の形成速度が速くなり、サイズの大きい重合体が形成されていることが分かる。上記の結果より、酵素による酸化重合反応の促進は、直径方向よりも高さ方向に起こっていることが分かる。これは、上記の酸化重合反応がレーザー集光スポット内で進行するためであると推察される。
【０１０４】
本願は、２０１３年１０月２１日に出願された日本国特許出願第２０１３−２１８７５０号、および２０１３年１０月２２日に出願された日本国特許出願第２０１３−２１９６８８号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１３年１０月２１日に出願された日本国特許出願第２０１３−２１８７５０号、および２０１３年１０月２２日に出願された日本国特許出願第２０１３−２１９６８８号の各明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
【０１０５】
４．グルコースの検出
４−１．グルコース濃度の定量
図１５（ａ）に本実験の測定手順を示す。具体的には、グルコース水溶液（０〜１ｍＭ）２０μＬと、ＧＯＤとＨＲＰを１：１で混合した溶液（以下、ＧＯＤ／ＨＲＰと略記する。）２０μＬを混合し、１分間恒温放置した。ｏ−ＰＤ溶液（１ｍＭ）２０μＬを加えた混合溶液から２０μＬ採取し、基板に滴下し、後方散乱光強度を測定した。コントロールとしてＧＯＤに活性がないリボース、ラクトース水溶液（５ｍＭ）を用いて同様に後方散乱光強度の測定を行った。
【０１０６】
図１５（ｂ）に、得られた後方散乱光強度の時間的変化を示す。グルコース濃度が高いほど、後方散乱光強度の極大値（最初のピーク強度）が早い時間に現れた。
【０１０７】
図１５（ｃ）に、各グルコース濃度に対する後方散乱光強度の最初のピークが現れた時間をプロットしたグラフを示す。上記図より、両者には明瞭な相関関係が見られ、１００ｎＭ〜１ｍＭの濃度範囲でグルコースを定量できることが分かった。これは、ｏ−ＰＤの重合体への形成速度がグルコース濃度に依存するため、後方散乱光強度の時間的変化からグルコース濃度を定量できたと考えられる。一方、グルコースの代わりに、コントロールであるリボースとラクトース（５ｍＭ）を用いて同様の反射光強度を測定したところ、後方散乱光強度のピークはグルコース濃度１００ｎＭとほぼ同じ時間に現れた。これは、ＧＯＤがリボースとラクトースに対して僅かな活性を有するためと考えられる。
【０１０８】
上記結果より、本発明によれば、ＧＯＤの特異性を利用してグルコース濃度を高感度（検出感度１００ｎＭ〜１ｍＭ）、且つ特異的に測定できることが分かった。
【０１０９】
４−２．従来型グルコース検出法（分光光度法）との比較
図１６（ａ）に本実験の測定手順を示す。具体的には、分光光度計の測定用セルにグルコース水溶液（０〜１ｍＭ）３００μＬと、ＧＯＤ／ＨＲＰ溶液３００μＬを混合し、１分間恒温放置した。ここにｏ−ＰＤ溶液（１ｍＭ）３００μＬを加えて混合し、分光光度計で吸収スペクトルを測定した。図１６（ｂ）に得られた吸収スペクトルを示す。また、図１６（ｃ）に、各グルコース濃度に対するピーク吸光度をプロットしたグラフを示す。
【０１１０】
その結果、グルコース濃度が１ｍＭ、１００μＭ、および１０μＭの濃度の間で、吸光度の差が見られた。すなわち、従来型グルコース検出法である吸収スペクトル測定では、１００μＭ〜１ｍＭの濃度範囲でグルコースを検出することができた。グルコースの代わりに、リボースおよびラクトース（５ｍＭ）を用いて同様の反射光強度の測定を行なった結果、１０μＭ以下のグルコースと同様の結果が得られた。
【０１１１】
この結果より、本発明によれば、従来法に比べてグルコースを１０００倍高感度で検出できることが分かった。
【０１１２】
表２に本発明法と従来法の比較を示す。従来法に比べて、本発明によるグルコースの検出方法は、必要なサンプル量が少なく、検出感度が高い点で極めて優れている。
【０１１３】
【表２】
0006516679.tif 000006
【０１１４】
更に、比色法を用いる市販のグルコース検出キット（グルコースキット  グルコースＣＩＩ−テストワコー、和光純薬株式会社）によるグルコース検出法との比較を行った。表３に、温度、測定時間、必要な試料の量、グルコース検出感度について本発明法と比較した結果を示す。この表に示すように、市販のグルコース検出キットでは、３７℃に加温する必要があり、測定に５分以上要する。また、２００μＬの試料で２００μＭ〜３９ｍＭのグルコース濃度を検出することができる。これに対し、本発明法によれば、加温の必要はなく常温で測定可能であり、且つ、測定開始から１〜２分程度の時間しか要さない。更に本発明法によれば、２０μＬ以下の試料で１００ｎＭ〜１ｍＭのグルコース濃度を定量することができる。従って、本発明によれば、市販のキットを用いる場合に比べても、迅速かつ高感度にグルコースを定量できることが分かった。
【０１１５】
【表３】
0006516679.tif 000007
【０１１６】
４−３．グルコース検出感度のレーザー波長依存性
波長４７３ｎｍ、５３２ｎｍ、６３３ｎｍのレーザー光源を用いてグルコースの検出における後方散乱光強度を測定し、レーザー波長依存性を調べた。得られた後方散乱光強度の時間的変化を図１７（波長４７３ｎｍ）、図１８（波長５３２ｎｍ）、図１９（波長６３３ｎｍ）に示す。更に図２０に、上記の各波長における、グルコース濃度に対する後方散乱光強度のピーク時間を示す。これらの図より、波長４７３ｎｍではグルコースが１μＭ〜１ｍＭ、波長５３２ｎｍでは１００ｎＭ〜１ｍＭ、波長６３３ｎｍでは０．５〜２．５ｍＭの濃度範囲を定量できることが分かった。よって、本実験の条件下では、波長５３２ｎｍの緑色レーザー光がグルコースの検出に最も適していることが分かった。
【０１１７】
４−４．ｏ−ＰＤ溶液の吸収スペクトルと、重合体の後方散乱光強度スペクトルとの関係について
ここでは、ｏ−ＰＤ溶液の吸収スペクトルと重合体の後方散乱光強度スペクトルとの関係を調べた。
【０１１８】
図２１に、本実験に用いたｏ−ＰＤ溶液（３．８ｍＭ）の吸収スペクトルを示す。上記図に示すように、ｏ−ＰＤ溶液の吸収スペクトルは波長４５０ｎｍ付近にピークがあり、各レーザー波長における吸光度は０．０５６（波長４７３ｎｍ）、０．０１７（波長５３２ｎｍ）、０．００７（波長６３３ｎｍ）であった。ｏ−ＰＤ水溶液には、空気中の酸素による自然酸化によって形成されたＤＡＰが含まれるため、４５０ｎｍ付近にピークを有するＤＡＰの吸収スペクトルが得られたと考えられる。
【０１１９】
図２２に、上記ｏ−ＰＤ水溶液の吸収スペクトル（左軸）と、上記ｏ−ＰＤ水溶液を基板上に滴下し、波長５３２ｎｍのレーザーを集光することによって形成されたナノ構造体の後方散乱光強度スペクトル（右軸）を示す。上記方法によって形成されたナノ構造体は１μｍ以下のナノレベルの大きさであり、吸収スペクトルを測定できないため、ハロゲンランプを暗視野コンデンサーレンズで照射して、その散乱スペクトルを測定した。
【０１２０】
集光点に形成されるナノ構造体の散乱ピークは約６２０ｎｍであり、ｏ−ＰＤ溶液中のダイマー（ＤＡＰ）の吸収スペクトルのピークよりも長波長側にある。微小粒子の散乱スペクトルは、吸収スペクトルと同様の情報を与えるため、上記散乱スペクトルの結果から、形成されたナノ構造体は、ＤＡＰよりも長波長領域の光を強く吸収することが分かる。これは、ｏ−ＰＤが重合することでπ電子共役長が伸び、吸収ピークが長波長側にシフトためであると考えられる。波長４７３ｎｍ、５３２ｎｍ、６３３ｎｍの３種類の波長のレーザーでグルコース濃度測定を行った場合、波長５３２ｎｍのレーザーが最も感度よく測定できた。波長４７３ｎｍの場合、ＤＡＰは強い光吸収を示すが、π電子共役長の長い重合体はほとんど光吸収しない。波長６３３ｎｍの場合、ＤＡＰはほとんど光吸収しない。
【０１２１】
表４に各波長におけるｏ−ＰＤ溶液の吸光度とナノ構造体の散乱強度の結果をまとめて示す。
【０１２２】
【表４】
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【０１２３】
図２３は、集光レーザー光によるｏ−ＰＤの酸化重合反応の進行状態を示す模式図である。上記図に示すように、レーザー集光直後は、ダイマー（ＤＡＰ）の光吸収により酸化重合が進行し、更に酸化重合が進んでナノ構造体の成長が進むと、ナノ構造体による光吸収の割合が大きくなる。このため、ｏ−ＰＤ溶液中のダイマーとナノ構造体の両方による光吸収が本発明の方法に重要であると考えられる。よって、前述した表４に示したように、これらの両方に吸収のある波長５３２ｎｍの緑色レーザー光がグルコースの検出に最も適していると考えられる。
【０１２４】
４−５．光増感剤の添加効果
本実験では、光増感剤の一つであるメチレンブルーによる酸化重合反応促進効果を調べた。
【０１２５】
はじめに、図２４に示す、光増感反応のエネルギーダイヤグラムを参照しながら、集光レーザー光により酸化重合が進行し、ナノレベルの合体が形成されるメカニズムについて考察する。酸素分子は基底状態が三重項状態であり、励起状態にあたる一重項酸素は有用な酸化剤である。メチレンブルーなどの色素分子の三重項状態は、一重項酸素と三重項酸素とのエネルギー差とほぼ等しい励起エネルギーを有している。色素分子を光励起すると、項間交差により三重項状態に遷移する。この三重項状態の色素が三重項酸素と衝突すると、電子とエネルギーの交換が起こり、色素が基底状態に戻ると同時に、三重項酸素が一重項酸素に遷移する。このように光励起により生じた一重項酸素による酸化が、光酸化反応の典型的なメカニズムであり、一重項酸素発生のために用いられる色素は光増感剤と呼ばれている。
【０１２６】
本実験では、ｏ−ＰＤのダイマー（ＤＡＰ）の吸収が殆どない波長６３３ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザーを用い、メチレンブルーによる光増感効果について調べた。具体的には、メチレンブルーの濃度が２００μＭとなるようにクエン酸バッファーに溶解し、メチレンブルー溶液の濃度を０．２ｍＭに調整した。次に、ｏ−ＰＤ（４ｍＭ）と上記メチレンブルー溶液（０．２ｍＭ）を混合し、ｏ−ＰＤ（１ｍＭ）＋メチレンブルー（１８．７５μＭ）の混合溶液（以下、ｏ−ＰＤ／ｂｌｕｅ溶液と略記する。）を得た。
【０１２７】
図２５に、このようにして得られたｏ−ＰＤ／ｂｌｕｅ溶液の吸光スペクトルを示す。ｏ−ＰＤ溶液にメチレンブルーを加えることにより、ｏ−ＰＤ本来の吸収に加えて、長波長側に吸収ピークが現れた。
【０１２８】
次に、グルコース水溶液（０〜１ｍＭ）２０μＬとＧＯＤ／ＨＲＰ溶液２０μＬを混合し、１分間恒温放置した。ここに上記ｏ−ＰＤ／ｂｌｕｅ溶液２０μＬを加えた混合溶液２０μＬを基板上に滴下し、後方散乱光強度を測定した。図２６に、得られた後方散乱光強度の時間的変化を示す。また、図２７に各グルコース濃度に対する後方散乱光強度のピーク時間をプロットしたグラフを示す。
【０１２９】
上記図より、メチレンブルーの添加によってグルコースの検出感度が向上し、０．２５〜１ｍＭのグルコース濃度を定量することができた。これは、光吸収により発生した一重項酸素による酸化反応が集光レーザーによる重合体形成に関与していることを示している。また、上記の結果は、メチレンブルーのような光増感剤の使用により、波長６５０ｎｍの安価な半導体レーザー（ＬＤ）を用いた測定システムにも適用可能であることを示している。
【０１３０】
なお、上記実験では、光増感剤としてメチレンブルーを用いたが、そのほか、ｏ−ＰＤのダイマー（ＤＡＰ）や重合体も光増感剤として作用し、ｏ−ＰＤ自身の酸化重合を促進すると考えられる。
【０１３１】
５．エタノールの検出
ここでは、本発明法によりエタノールを検出した。以下に、エタノールとＡＯＤ、ｏ−ＰＤとＨＲＰの反応式を示す。
【０１３２】
【化４】
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【０１３３】
エタノールを純水で希釈し、濃度が０〜１００ｍＭの５種類のエタノールを調製した。また、ＡＯＤをクエン酸バッファーに溶かして濃度が１００ｕｎｉｔ／ｍＬとなるようにＡＯＤ溶液を調製した。
【０１３４】
次に、上記のようにして調製したエタノール（０〜１００ｍＭ）２０μＬ、ＨＲＰ溶液、ＡＯＤ溶液各１０μＬを混合し、１分間恒温放置した。ここにｏ−ＰＤ溶液（１ｍＭ）２０μＬを加えた混合溶液２０μＬを基板に滴下して、後方散乱光強度を測定した。図２８に、得られた後方散乱光強度の時間的変化を示す。図２９には、各エタノール濃度に対する後方散乱光強度のピーク時間をプロットしたグラフを示す。
【０１３５】
これらの図より、本発明によれば、１０〜１００ｍＭの濃度範囲でエタノールを検出できることが分かった。
【０１３６】
６．イムノセンシングへの応用
ここでは、ＩｇＧ抗体を固定化したＩｇＧ抗体固定化基板を用い、これにＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体を結合させ、集光レーザービームによるｏ−ＰＤの酸化重合反応を利用してＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体の検出を行った。
【０１３７】
６−１．試料溶液の調製
ＩｇＧ抗体固定化基板の作製に用いられる試料溶液を以下のようにして調製した。まず、レセプターとして用いるＩｇＧ抗体（ＣｈｒｏｍＰｕｒｅ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ，ｗｈｏｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅｒｃｈ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ．，１１．８ｍｇ／ｍＬ）の濃度が１００μｇ／ｍＬとなるようにＨＥＰＥＳバッファー（１０  ｍＭ、ｐＨ７．２５）に溶解した。検出用抗原としてＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ−Ｈ＆Ｌ（ＨＲＰ），ｐｒｅ−ａｄｓｏｒｂｅｄ、０．５ｍｇ／ｍＬ）を純水に溶解し、濃度１０ｎｇ／ｍＬの水溶液を作製した。その水溶液を純水で１０倍希釈を繰り返し、濃度１０ｆｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬの１１種のＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体水溶液を作製した。
【０１３８】
更に、ＩｇＧ抗体のカルボキシ基を活性化するため、Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（以下、ＮＨＳと呼ぶ。）と、１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）  ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｄｏｊｉｎｄｏ）（以下、ＷＳＣと呼ぶ。）の混合溶液を以下のようにして作製した。まず、ＮＨＳ（Ｗａｋｏ）の濃度が１１ｍｇ／ｍＬとなるようにＭＥＳバッファー（０．１Ｍ、ｐＨ５．０２）に溶解した。更に、ＷＳＣ（Ｄｏｊｉｎｄｏ）の濃度が４ｍｇ／ｍＬとなるように上記ＭＥＳバッファーに溶解し、ＮＨＳとＷＳＣの混合溶液（以下、ＮＨＳ／ＷＳＣ溶液と略記する。）を調製した。
【０１３９】
６−２．ＩｇＧ抗体固定化基板の作製
ここでは、基板として、一般的に用いられる市販のマイクロプレートよりもサイズの小さい顕微鏡用カバーガラスを用いた。マイクロプレートを用いたＥＬＩＳＡ法では、サンプル溶液や試薬などがそれぞれ、１ウェル当たり１００μＬ程度必要であるが、サイズの小さい上記カバーガラスを用いれば、サンプル溶液などの容量を減らすことができる。よって、微量の被験物質を簡便且つ感度良く検出することができる。
【０１４０】
まず、洗剤で洗浄した顕微鏡用カバーガラス（サイズ２４ｍｍ×３６ｍｍ、厚さ０．１２〜０．１７ｍｍ、ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）を、更にプラズマドライクリーナー（ＰＤＣ２１０２Ｚ、ヤマト科学株式会社）を用いて洗浄した。カバーガラスをエタノールで１００倍希釈した（３−Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（９８％以上、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）に３０分間浸した後、エタノールで洗浄し、乾燥させた。そして、ドライオーブン（ＤＸ３１、ｙａｍａｔｏ）にて１２０℃で２時間加熱することでカバーガラスをアミノシラン処理した。
【０１４１】
上記のカバーガラスにパンチで直径３．５ｍｍの穴を９〜１２個あけたシリコンシートを載せ、マルチウェル基板とした。そして、ＩｇＧ抗体のカルボキシ基を活性化するため、ＮＨＳ／ＷＳＣ溶液１０μＬとＩｇＧ抗体溶液９９０μＬを混合し、それをウェルに２０μＬずつ滴下し、３０分間恒温放置した。次いで基板を洗浄し、乾燥した後、ブロッキング試薬（ＥＬＩＳＡ  ＵＬＴＲＡＢＬＯＣＫ、ＡｂＤ  ｓｅｒｏｔｅｃ）２０μＬを滴下し、３０分間恒温放置することで未反応のアミノ基をブロックした。このようにして作製したＩｇＧ抗体固定化基板を、使用時まで冷暗所に保管した。
【０１４２】
６−３．ＥＬＩＳＡ法（その１）
図３０（ａ）に、本測定法による概略図を示す。
【０１４３】
ガラス基板にＩｇＧ抗体を固定し、ＩｇＧ抗体と特異的に結合するＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体の検出を行った。詳細には、上記のようにして作製したＩｇＧ抗体固定化基板に濃度の異なるＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体溶液（１０ｆｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ）をそれぞれ２０μＬ滴下し、３０分間恒温放置した後、リン酸バッファー溶液で洗浄し、乾燥した。
【０１４４】
次に、ｏ−ＰＤ（１ｍＭ）、過酸化水素（０．１ｍＭ）の混合溶液を反応溶液とし、反応溶液２０μＬをそれぞれの基板に滴下して、１分間恒温放置した後、２０ｍＷのレーザー光を集光して後方散乱光強度変化を測定した。その結果を図３０（ｂ）に示す。上記図に示すように、基板上に滴下したＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体溶液の濃度が高いほど、後方散乱光強度の変化が早い時間に現れた。
【０１４５】
図３０（ｃ）は、後方散乱光強度が一度減少して、再び元の強度まで増加する時間を計測したときの時間（図の縦軸では「所定時間」と記載）と、ＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体の濃度との関係を示すグラフである。この図より、上記時間は、ＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体の濃度が１０ｐｇ／ｍｌ（５０ｆＭ）〜１μｇ／ｍｌ（５ｎＭ）の範囲において良好な相関関係を有することが分かった。これは、本発明の方法により、基板上の被験物質と特異的に結合したＨＲＰ標識抗体の濃度を定量出来ることを示している。すなわち、本発明の方法は、直接吸着法、サンドイッチ法などのＥＬＩＳＡ測定に利用できることを示している。
【０１４６】
６−４．ＥＬＩＳＡ法（その２）
抗ＩｇＧ抗体の検出を、ＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体との競合法によって検出した。図３１（ａ）に、本測定法による概略図を示す。
【０１４７】
各濃度の抗ＩｇＧ抗体溶液（０ｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ）２０μＬを、上記のようにして作製したＩｇＧ抗体固定化基板上に滴下し、３０分間恒温放置した。基板を洗浄した後、乾燥し、ＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体溶液（１μｇ／ｍＬ）を２０μＬ、基板上に滴下し、３０分間恒温放置した。その後、基板を洗浄して乾燥し、レーザー光を集光して後方散乱光強度を測定した。その結果を図３１（ｂ）に示す。上記図より、抗ＩｇＧ抗体の濃度が低い程、後方散乱光強度の変化が早い時間に現れた。
【０１４８】
図３１（ｃ）は、後方散乱光強度が一度減少して、再び元の強度まで増加する時間を計測したときの時間（図の縦軸では「所定時間」と記載）と、ＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体の濃度との関係を示すグラフである。上記図より、１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲で、抗ＩｇＧ抗体を検出できることが分かる。これは、本発明の方法により、基板上の被験物質と特異的に結合した抗原の濃度を、ＨＲＰ標識抗体と競合させることにより定量出来ることを示している。すなわち、本発明の方法は、競合法によるＥＬＩＳＡの測定に利用できることを示している。
【０１４９】
６−５．ＥＬＩＳＡ法による検出感度の向上方法
上述したとおり、ＥＬＩＳＡ法では、被験物質に対する抗体、抗原のレセプターのほか、被験物質も固定化した基板を用いることができる。しかし、抗体などが固定化された基板表面は分子レベルでは平坦でないため、ナノ構造体が形成されにくい。
【０１５０】
そこで、基板上に固定化された抗体などの影響を排除し、本発明法による測定の検出感度を高めるため、例えば図３２に示すように、抗体２３が存在する抗体存在領域Ａと、抗体２３が存在しない抗体非存在領域Ｂとを有する基板２１を用い、抗体非存在領域Ｂにレーザー光を照射する方法が挙げられる。この方法によれば、抗体存在領域Ａに形成された重合体は、抗体非存在領域Ｂにも侵入するようになるため、抗体を介さずに重合体に直接、レーザー光を照射させることができる。なお、図３２には、抗体２３が基板２１の上に固定化された例を示したが、本発明はこれに限定されない。例えば、基板は、被験物質、および被験物質に対して特異的な相互作用を有する物質（例えば抗原、抗体）よりなるＸ群物質の少なくとも一種が存在するＸ群物質存在領域と、上記Ｘ群物質が存在しないＸ群物質非存在領域とを有していても良い。
【０１５１】
具体的には、例えば、図３３に示すように、基板２１の上にドーナツ状の多孔質担体２２を設け、多孔質担体２２によって抗体２３を固定化（吸着）しても良い。図３３には、多孔質担体２２に、抗体や抗原などのレセプターが吸着される様子を示している。多孔質担体２２が設けられている部分（外側）が抗体存在領域Ａであり、多孔質担体が設けられていない部分（中心部分）が抗体非存在領域Ｂである。多孔質担体２２の素材は、抗体２３が固定化しやすく、また、抗体存在領域に形成された重合体が抗体非存在領域に侵入し易いようなものであれば特に限定されず、例えば、ニトロセルロース、フッ化ポリビニリジンなどが挙げられる。
【０１５２】
また、集光スポット部分に多孔質担体２２が触れないようにしても良い。例えば、図３４に示すように、多孔質担体２２と基板２１との間にスペーサー２４を介在させることにより、集光点では抗体が存在しないようにしても良い。スペーサー２４としては、例えば、ポリマー微粒子などが挙げられる。或いは、多孔質担体２２の形状を、例えば図３５のように凸状に変形させることによって（集光スポット位置に空洞を設けることによって）集光点では抗体が存在しないようにしても良い。
【０１５３】
或は、後記する７−３に記載の実験に示すように、抗体が存在する基板と、抗体が存在しない基板とを、図４０に示すように重ね合わせ、抗体が存在しない基板から光を照射するようにしても良い。この方法によっても、集光点では抗体が存在しないため、高感度で被験物質を定量測定できることが実証された。実験方法および実験結果の詳細は、後記する７−３．の欄で説明する。なお、図４０には、基板として用いたカバーガラス１７の上に抗体２５が固定化された例を示したが、本発明はこれに限定されない。例えば抗体のほか、被験物質、および被験物質に対して特異的な相互作用を有する物質（例えば、抗原など）よりなるＸ群物質の少なくとも一種が存在する基板を用いても良い。
【０１５４】
７．イムノセンシングへの応用（その２）
一般的にＥＬＩＳＡ法では、検出対象物質の抗体が固相化されたマイクロプレート、酵素標識抗体（二次抗体）、希釈やブロッキングなどに必要な溶液、酵素と反応して発色や蛍光性物質を産生する発色基質などが含まれた試薬キットを用いることが多い。そこで、以下では、市販のＥＬＩＳＡキットを用いて、従来の吸光度測定法と本発明の後方散乱光強度測定法の比較実験を行った。
【０１５５】
７−１．ＩｇＧとＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体の特異結合のＥＬＩＳＡ法による測定
本実験では、被験物質としてＩｇＧ抗体を用いた。また、実験に使用するＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体（二次抗体）、ブロッキング溶液、洗浄液、および各工程のプロトコルは、ＫＰＬ社のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ，Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎを使用した。
【０１５６】
（１）実験方法
ＩｇＧ抗体（１４．７ｍｇ／Ｌ）をマイクロプレート（Ｎｕｎｃ、マキシプレート）の各ウェルに１００μＬ滴下し、室温で３時間静置した後、洗浄して固相化した。具体的には、各ウェルにブロッキング溶液を３００μＬ滴下し、室温で５分間静置した後、洗浄してブロッキングを行った。次いで、各濃度に希釈したＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体を各ウェルに１００μＬ滴下し、室温で１時間静置した後、洗浄してＩｇＧ抗体固相基板を作製した。
【０１５７】
次に、反応溶液として、２ｍＭのｏ−ＰＤと１０ｍＭの過酸化水素のクエン酸バッファー溶液との混合溶液１００μＬを各ウェルに滴下し、室温で１時間静置した。
【０１５８】
（２）本発明法による測定
上記のようにして得られた静置後の溶液を各ウェルから１０μＬ採取し、別に用意したガラス基板に滴下した後、レーザー（波長５３２ｎｍ、強度８ｍＷ）を、６０倍の対物レンズを用いて上記ガラス基板と上記溶液との固液界面に集光して後方散乱光強度変化を測定した。
【０１５９】
（３）従来の吸光度測定法による測定
各ウェルにおける波長４０５ｎｍの吸光度を、マイクロプレートリーダー（コロナ電気、ＳＨ−１０００）を用いて測定した。
【０１６０】
（４）測定結果と考察
これらの結果を図３６（従来法）および図３７（本発明法）に示す。詳細には図３６は、吸光度とＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体の濃度との関係を示すグラフである。図３７は、後方散乱光強度の最初のピークが現れた時間（図の縦軸では「ピーク時間」と記載）と、ＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体の濃度との関係を示すグラフである。これらの図を対比すると、両者は、ＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体濃度が１００ｐｇ／ｍＬ以下の極微量レベルで明瞭な差が見られた。よって、本発明の方法を用いれば、従来の吸光度法では困難であった、例えば１０ｐｇ／ｍＬ以上の極微量濃度における定量測定が可能であることが分かった。
【０１６１】
７−２．Ｃ反応性タンパクのサンドイッチＥＬＩＳＡ法による測定
本実験では、被験物質としてＣ反応性タンパク（Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＣＲＰ）を用いた。ＣＲＰは、体内で炎症反応や組織の破壊が起きているときに血中に現れるタンパク質であり、感染症、悪性腫瘍、心筋梗塞などの疾病の指標となる。本実験では、一般的なサンドイッチ法を利用してＣＲＰの測定を行った。具体的には、抗体固相化マイクロプレート、ＨＲＰ標識二次抗体、希釈溶液、および各工程のプロトコルは、Ｂｉｏｃｈｅｃｋ社のＨｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｔｅｓｔ  Ｋｉｔを用いて実施した。
【０１６２】
（１）実験方法
まず、抗ＣＲＰ抗体が固相化されたマイクロプレートの各ウェルに、濃度を調整したＣＲＰ溶液を１０μＬ滴下した。続いて、各ウェルにＨＲＰ標識二次抗体を１００μＬ滴下し、室温で４５分間静置した。
【０１６３】
（２）本発明法による測定
反応溶液として、２ｍＭのｏ−ＰＤと１０ｍＭの過酸化水素のクエン酸バッファー溶液との混合溶液１００μＬを各ウェルに滴下し、室温で１時間静置した。
【０１６４】
上記のようにして得られた静置後の溶液を各ウェルから１０μＬ採取し、別に用意したガラス基板に滴下した後、レーザー（波長５３２ｎｍ、強度９．７ｍＷ）を、６０倍の対物レンズを用いて上記ガラス基板と上記溶液との固液界面に集光して後方散乱光強度変化を測定した。
【０１６５】
（３）従来の吸光度測定法による測定
反応溶液として、本実験に用いた上記Ｋｉｔに付属の反応溶液［３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と過酸化水素の混合溶液］を各ウェルに１００μＬ滴下し、室温で１時間静置した後、上記Ｋｉｔに付属の反応停止液を各ウェルに１００μＬ滴下した。各ウェルにおける波長４０５ｎｍの吸光度を、マイクロプレートリーダー（コロナ電気、ＳＨ−１０００）を用いて測定した。
【０１６６】
（４）測定結果と考察
これらの結果を図３８（従来法）および図３９（本発明法）に示す。詳細には図３８は、吸光度とＣＲＰ濃度との関係を示すグラフである。図３９は、後方散乱光強度が一度減少して、再び元の強度まで増加する時間を計測したときの時間（図の縦軸では「所定時間」と記載）と、ＣＲＰ濃度との関係を示すグラフである。厳密な測定感度は使用するＥＬＩＳＡキットに依存するが、本発明の方法を用いれば、従来の吸光度法では困難であった、例えば５００ｐｇ／ｍＬ以上の極微量濃度におけるＣＲＰの定量測定が可能であることが分かった。
【０１６７】
７−３．ＩｇＧ抗体固相化カバーガラスを用いたＥＬＩＳＡ法による測定
本実験では、被験物質としてＩｇＧ抗体を用いると共に、微量測定のため、基板として、マイクロプレートよりサイズの小さいカバーガラスを用いた。本実験に用いたＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体（二次抗体）、ブロッキング溶液、洗浄液、および各工程のプロトコルは、ＫＰＬ社のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ，Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎを使用した。
【０１６８】
（１）実験方法
図４０を参照しながら、本実験の測定手順を説明する。まず、顕微鏡用カバーガラス１７（サイズ２４ｍｍ×３６ｍｍ、厚さ０．１２〜０．１７ｍｍ、ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）にポリスチレン溶液（溶媒キシレン、濃度１０ｗｔ％）を滴下し、スピンコート法によりポリスチレン薄膜を作製した。次に、直径３ｍｍの穴の開いたシリコンシート１５（厚さ０．２ｍｍ、Ａｓｏｎｅ）を密着させ、ウェルを作製した。次いで、ＩｇＧ抗体２５（１４．７ｍｇ／Ｌ）を各ウェルに１０μＬ滴下し、室温で３時間静置した後、洗浄した。次に、各ウェルにブロッキング溶液を１０μＬ滴下し、室温で５分間静置した後、洗浄してブロッキングを行ってＩｇＧ抗体固相化基板を得た（以上、図４０の（１）を参照）。
【０１６９】
このようにして得られたＩｇＧ抗体固相化基板のウェルに、各濃度に希釈したＨＲＰ標識二次抗体を１０μＬ滴下し、室温で１時間静置した後、洗浄した。次いで、反応溶液として、２ｍＭのｏ−ＰＤと１０ｍＭの過酸化水素のクエン酸バッファー溶液の混合溶液１０μＬを各ウェルに滴下し、室温で１時間静置した（図４０の（２）を参照）。このウェルには、重合物質含有溶液２６が含まれている。
【０１７０】
次いで、図４０の（３）に示すように静置後の基板２７を裏返して、その両端に、厚さ１ｍｍのシリコンゴムシートをスペーサー２４として密着させ（図４０の（５）を参照）、上記基板の作製に用いたのと同じカバーガラス２８（ポリスチレン薄膜のない清浄な基板）を重ねて置いた。次に、図４０の（４）に示すように、カバーガラス２８と重合物質含有溶液２６との固液界面にレーザー（波長５３２ｎｍ、強度２．６ｍＷ）を、６０倍の対物レンズを用いて集光して、後方散乱光強度変化を測定した。すなわち、本実験方法によれば、図４０の（５）に示すように、抗体が固相化されていない清浄なカバーガラス２８と重合物質含有溶液２６との固液界面にレーザーを集光し、ナノ構造体を形成させることが出来る。
【０１７１】
（２）測定結果と考察
得られた結果を図４１に示す。図４１は、後方散乱光強度の最初のピークが現れた時間（図の縦軸では「ピーク時間」と記載）と、ＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体（二次抗体）濃度との関係を示すグラフである。本実験のように抗体固相化基板と清浄な基板を重ねて、上記清浄な基板からレーザーを集光する方法を用いれば、１ｎｇ／ｍＬ以上の抗ＩｇＧ抗体を再現性良く測定できることが分かった。
【０１７２】
８．まとめ
上述したようにｏ−ＰＤ溶液に緑色レーザー光を集光すると、基板上の集光点で酸化重合反応が進行し、反応により形成されるナノサイズの重合体の成長に伴って後方散乱光強度が時間的に変化する。この酸化重合反応は、ＨＲＰなどのペルオキシダーゼ酵素反応によって促進され、重合体の形成速度が増加することがＳＥＭ観察像により確認された。本発明の方法は、これらの現象を利用したものであり、１００ｎＭ〜１ｍＭのグルコース濃度を感度良く定量することができた。また、グルコースの検出におけるレーザー波長依存性を調べたところ、グルコースの検出には、波長５３２ｎｍの緑色レーザー光が適していることが分かった。更に、レーザー光の波長依存性とｏ−ＰＤ溶液の吸収スペクトル、重合体の後方散乱光強度スペクトルの関係から、本発明の検出方法では、ｏ−ＰＤ溶液中のＤＡＰ（ダイマー）と、集光点に形成される重合体の両方による光吸収が重要であることが強く示唆された。更に本発明の方法により、エタノールを定量良く検出することができた。
【０１７３】
更に本発明の方法はイムノアッセイにも適用可能であり、ＩｇＧ抗体固定化基板を作製してＥＬＩＳＡ法を行った結果、１０ｐｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬのＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体を検出することが出来た。
【０１７４】
イムノアッセイの適用に当たっては、例えば、被験物質を含む試料溶液の濃度や、基板への抗体固定化方法などを適切に制御することにより、ＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体の検出感度を更に向上させることができる。また、測定装置の小型化により迅速、高感度、且つポータブルなＥＬＩＳＡ測定システムを実現できる。本発明の方法は、例えば一枚の基板上に複数の酵素を固定したマルチセンサーチップにも適用可能である。従って、本発明の技術は、極微量の被験物質を検出可能な小型、安価、且つ簡便なバイオセンシングシステムの開発に極めて有用である。
【符号の説明】
【０１７５】
１  レーザー光源
２  ビームエキスパンダー
３  ＮＤフィルター
４  メカニカルシャッター
５  倒立型顕微鏡
６  ハーフミラー
７  対物レンズ
８  ステージ
９  基板
１０  ナノ構造体
１１  カップラー
１２  光ファイバー
１３  光電子増倍管
１４  データ収録用拡張ボード
１５  シリコンシート
１６  溶液
１７  カバーガラス
２１  基板
２２  多孔質担体
２３  抗体
２４  スペーサー
２５  抗体（ＩｇＧ）
２６  重合物質含有溶液
２７  抗体固相基板
２８  清浄な基板
Ａ  抗体存在領域
Ｂ  抗体非存在領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0006516679.tif 000019
【図１１】
0006516679.tif 000020
【図１２】
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【図１３】
0006516679.tif 000022
【図１４】
0006516679.tif 000023
【図１５】
0006516679.tif 000024
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
0006516679.tif 000029
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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