(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドが、下表１〜３の以下の配列： 
【表１】
0006488237.tif 000013
【表２】
0006488237.tif 000014
【表３】
0006488237.tif 000015
のいずれかからなる、前記ペプチド。 
【請求項２】
Ｎｏｘ１活性および／または増大した活性酸素種（ＲＯＳ）産生のいずれかに関連する病理的状態または疾患を予防する、および／または、処置する方法における使用のための医薬組成物であって、前記組成物が、下表４〜６の以下の配列： 
【表４】
0006488237.tif 000016
【表５】
0006488237.tif 000017
【表６】
0006488237.tif 000018
のいずれかからなるペプチドを含む、前記組成物。 
【請求項３】
さらに、１種または２種以上の薬学的に許容し得る担体（単数または複数）を含む、請求項２に記載の使用のための組成物。 
【請求項４】
ペプチドが、細胞透過性ペプチドまたは細胞におけるその蓄積を増大させる剤と、共有結合または非共有結合を介して抱合されている、請求項２または３に記載の使用のための組成物。 
【請求項５】
細胞透過性ペプチドが、配列ＲＲＲＲＲＲＲＲＲを有するポリアルギニンタグ（配列番号４６）、アミノペプチダーゼ（ＣＤ１３）Ｎリガンドに由来するＮＧＲペプチド（ＣＮＧＲＣＧ：配列番号４７）、アンテナペディアリーダーペプチド（ＣＴ）（ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＶＫＶＱＲＧ：配列番号４８）、Ｂｃｌ−２結合ペプチド（デカノイル−ＫＮＬＷＡＡＱＲＹＧＲＥＬＲＲＭＳＤＥＦＥＧＳＦＫＧＬ：配列番号４９）、ｔａｔ配列（ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ：配列番号５０）、ブフォリン（ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ：配列番号５１）、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）−ＩＩ  Ｒｅｘのペプチド性フラグメント（ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ：配列番号５２）、脂質膜転位ペプチド（ＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ：配列番号５３）、ＮＲＰ−１標的ペプチド、Streptomyces hygroscopicus（ＲＰＡＲＰＡＲ：配列番号５４）、および、ペネトラチン（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＧＧ：配列番号５５）の中から選ばれる、請求項４に記載の使用のための組成物。 
【請求項６】
ペプチドが、配列ｔａｔ−ＰＰＴＶＰＴＲ（配列番号３９）または配列（Ｒ）９−ＰＰＴＶＰＴＲ（配列番号４０）を有する、請求項２〜５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。 
【請求項７】
ＮＡＤＰＨオキシダーゼ１（Ｎｏｘ１）活性を少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％または６０％低下させる、および／またはＮＡＤＰＨオキシダーゼ１（Ｎｏｘ１）活性を選択的に低減させるおよび／または阻害する、請求項２〜６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。 
【請求項８】
心血管疾患、呼吸器障害、糖尿病などの代謝障害に関する疾患、糖尿病、糖尿病性腎症、アテローム性動脈硬化、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺感染性疾患、肺線維症、がん、ＵＶ放射に関連した病気、神経変性障害、アルツハイマー病、眼および／または水晶体に影響を及ぼす疾患、色素性乾皮症、血管新生に依存的な障害、皮膚障害、アレルギー性および自己免疫障害、血液学的障害、筋障害、骨粗しょう症、骨関節の障害の処置および／または予防の方法における使用のための、請求項２〜７のいずれか一項に記載の組成物。 
【請求項９】
がんが、皮膚がん、前がん皮膚病変、扁平上皮癌、大腸がん、大腸腺癌、前立腺がん、白血病、神経芽細胞腫、神経節腫、良性のまたは悪性の乳頭腫である、請求項２〜７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。 
【請求項１０】
皮膚障害、ＵＶ曝露（ＵＶ  ＡまたはＵＶ  Ｂ）に続く皮膚の腫瘍発生、またはＲＯＳの増大を引き起こすかまたは炎症を引き起こす物品などのあらゆる物品による皮膚損傷を処置するおよび／または予防する方法における使用のための、請求項２〜７のいずれか一項に記載の組成物。 
【請求項１１】
対象が、ＵＶＡおよびＵＶＢの長期曝露により皮膚がんのリスクが高まっている、請求項９または１０に記載の組成物。 
【請求項１２】
早期老化による皮膚状態を予防する方法における使用のための組成物であって、前記方法が、前記組成物を皮膚へ投与することまたは適用することを含む、請求項１０に記載の組成物。 
【請求項１３】
組成物が、局所的、経口的または非経口的に、対象へ投与される、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の、使用のための組成物。 
【請求項１４】
（ｉ）ＵＶ放射、ＵＶ損傷、ＵＶ老化に対して、または、ＲＯＳの増加または炎症の増加等を通してストレス、炎症、皮膚損傷を誘導するあらゆる剤に対して、皮膚、粘膜、頭皮および／または毛髪を、ケアする、修復する、および防護するか、あるいは、ＵＶＡおよびＵＶＢの両放射線への光防護を強化するための、または、 
（ｉｉ）老化、光老化、早期老化、ＲＯＳに誘導される皮膚損傷、および、早期老化による皮膚状態の兆候を、低下する、延期する、および／または予防するための 
医薬の製造における、請求項１に記載のペプチド、または、請求項２〜７のいずれか一項に記載の組成物の使用。 
【請求項１５】
ペプチドまたは組成物が、局所的、経口的または非経口的に、対象へ投与される、請求項１４に記載のペプチドまたは組成物の使用。 
【請求項１６】
抗老化剤としての、または、光防護剤としての、請求項１４または１５に記載のペプチドまたは組成物の使用。 
【請求項１７】
必要とする対象において、活性酸素種（ＲＯＳ）のレベルを低減する、および／または活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を阻害する方法、および／またはＮＡＤＰＨオキシダーゼ１（Ｎｏｘ１）活性を選択的に低下する、および／または阻害する方法における使用のための医薬組成物であって、前記組成物が、請求項１に記載のペプチドを含み、前記方法が、前記組成物を投与することを含む、前記組成物。 
【請求項１８】
ＮＡＤＰＨオキシダーゼ１（Ｎｏｘ１）活性が、選択的に、少なくとも２０％または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％または６０％低下する、請求項１７に記載の組成物。 
【請求項１９】
ＵＶ放射に対する防護を提供するための、またはＵＶＡおよびＵＶＢの両放射線への光防護を強化するための方法における使用のための医薬組成物であって、前記組成物が、請求項１に記載のペプチドを含み、前記方法が、前記組成物の有効量を、対象の皮膚へ投与すること、または適用することを含む、前記組成物。 
【請求項２０】
対象の皮膚、粘膜、頭皮および／または毛髪を修復するおよび／またはケアする方法における使用のための医薬組成物であって、前記組成物が、請求項１に記載のペプチドを含み、前記方法が、前記組成物を、前記対象の皮膚、粘膜、頭皮および／または毛髪へ投与すること、または適用することを含む、前記組成物。 
【請求項２１】
老化、光老化の兆候を低下する、延期する、および／または予防する方法における使用のための医薬組成物であって、前記組成物が、請求項１に記載のペプチドを含み、前記方法が、前記組成物を皮膚へ投与すること、または適用することを含む、前記組成物。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ１（Ｎｏｘ１）活性および／または増大した活性酸素種（ＲＯＳ）の産生に関連する病理的状態および疾患の予防および／または処置のための、新規なペプチド、組成物および方法に関する。よって、新規ペプチドは、がん、アテローム性動脈硬化、血管新生および老化を処置するおよび／または予防するのに特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
Ｎｏｘ１は、生理的状態およびある病理的状態においてＲＯＳを発生させる。ＲＯＳは、生体内での損傷の一因となることが知られ、よって、多くの異なる病気に関連する。ＮＡＤＰＨオキシダーゼもまた、多くの病気の要因となる酸化ストレスの原因として知られている。Ｎｏｘ１の発現は、がんを含む多くの異なる病気に関連することが知られている。
【０００３】
毒性のない治療選択性は、治療剤において明らかに重要である。特に、正常細胞に毒性のない、がん細胞の優先的な死滅は、がん治療における最も重要な検討事項の１つである。
【０００４】
本発明に先立ち、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（Ｎｏｘ）のインヒビターがいくつか同定されたが、これまで、特異的Ｎｏｘインヒビターは開発されていない。
【０００５】
ｇｐ９１ｄｓ−ｔａｔペプチド、ＰＲ−３９等のいくつかの細胞浸透性ペプチドインヒビターならびにＲａｃペプチドインヒビターもまた試験されている。ｇｐ９１ｄｓ−ｔａｔペプチドは、ｐ４７ｐｈｏｘとの相互作用に重要であると考えられるＮｏｘ２の配列を模倣することによって、Ｎｏｘ２を特異的に阻害するよう設計された。しかしながら、該ペプチドに標的にされる領域が他のＮＯＸアイソフォームのものと相同であるため、該ペプチドには特異性がない。加えて、該ペプチドは、好中球ＲＯＳ発生を５０ｍＭで２５％阻害する、低有効性のインヒビターであった。
【０００６】
近年、GenKyoTexという企業が、ピラゾロ−ピリド−ジアゼピン、−ピラジンおよび−オキサジンジオン誘導体を使用して、特にＮｏｘ１およびＮｏｘ４酵素を標的にする、より特異的なＮｏｘインヒビターを開発した。GenKyoTexは現在、糖尿病性腎症の処置のための小分子GKT137831を用いて、第一相臨床を実施している。前臨床実験もまた、糖尿病性腎症、アテローム性動脈硬化、特発性肺線維症、肝線維症および血管新生のモデルの処置において、実施されている。しかしながら、Ｎｏｘ１／Ｎｏｘ４に特異的である一方、GKT137831はまた、Ｎｏｘ２、Ｎｏｘ３およびＮｏｘ５にも親和性を示すため、選択性が低い。
【０００７】
アポシニン、ジフェニレンヨードニウム（ＤＰＩ）およびフッ化４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニル塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）およびネオプテリンを含む他の化学化合物も、長年使用されている。
【０００８】
Picrorhiza kurroaから抽出されたアポシニンは、活性オキシダーゼ複合体の形成を予防し得る。しかしながら、アポシニンの阻害効果には議論の余地がある。実際アポシニンは、ＮＡＤＰＨオキシダーゼに特異的ではなくむしろトロンボキサンＡ２形成およびＡＰ−１転写因子の誘導等の他の事象に影響を及ぼすこと、およびＮｏｘ酵素インヒビターよりむしろ抗酸化剤であることが示された。
【０００９】
ジフェニレンヨードニウム（ＤＰＩ）は、全てのフラビン酵素の非特異的なインヒビターであるため、Ｎｏｘ酵素を阻害し得るが、キサンチンオキシダーゼおよびチトクロムＰ４５０酵素もまた阻害し得る。非選択的であることに加え、ＤＰＩは毒性があることが示された。それはまた、アセチルコリンエステラーゼおよびブチリルコリンエステラーゼの、ならびに、内部Ｃａ２＋ポンプのインヒビターでもあり、その固有の毒性と併せてその適用への大きな懸念をもたらす。
【００１０】
アミノエチル−ベンゼンスルホノ−フルオリド（ＡＥＢＳＦ）は、フラボチトクロムｂ５５８のｐ４７ｐｈｏｘへの結合、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性化およびマクロファージにおけるＯ・−２産生の誘発を予防することが示された。しかしながら、ＡＥＢＳＦは、本来セリンプロテアーゼインヒビターである；よって、キモトリプシン、カリクレイン、プラスミン、トロンビンおよびトリプシン等のプロテアーゼを、より高い効率で阻害することが可能であり、多くのさらなる効果を有する。
【００１１】
間接的Ｎｏｘインヒビターと紛らわしく名付けられたいくつかの他の非特異的分子は、Ｎｏｘ酵素に作用する上流のシグナル伝達経路を妨げることが示された。これらは、Ｎｏｘ酵素のＰＤＧＦ依存的Ｓｒｃ活性化を阻害するチオトリアゾロピリミジン化合物であるVAS2870、アンジオテンシン変換酵素インヒビター（ＡＣＥインヒビター）、ＡｎｇＩＩ受容体ブロッカー（ＡＲＢ）、ホスホジエステラーゼ、エイコサノイド、コルチコステロイド、ＭＡＰキナーゼ、プロテインキナーゼＣインヒビター（ベンゾ（ｂ）ピラン−４−オン誘導体であるShionogi PharmaのS17834等）を含む。
【００１２】
Ｎｏｘ酵素に対するｓｉＲＮＡアプローチを使用した報告もまた増えつつある。具体的には、いくつかのＲＮＡｉが、Ｎｏｘ１発現をノックダウンするように開発された。しかしながら、治療介入としてのＲＮＡｉのヒトへの使用は未だにその初期段階にあり、最適化に数年を要する可能性がある。残念なことに、ｓｉＲＮＡのうち数種しかＮｏｘアイソフォームの特異性について適切に試験されていない。Ｎｏｘ、特にＮｏｘ１の選択的阻害のための満足なｓｉＲＮＡアプローチは存在しない。
【００１３】
したがって、これまでに開発された化合物は、酵素を直接遮断するよう作用するものではないが、上流の伝達経路を妨げるか、または、抗酸化剤またはＲＯＳのスカベンジャーとして作用するかのいずれかである。酵素を直接遮断することが可能な唯一の化合物は、選択性がなく、他の酵素活性を阻害する。それらはまた、効能およびバイオアベイラビリティも低く、それゆえ、in vivoでの治療標的としてのＮｏｘの薬理的実証を不可能にする。いくつかの小分子およびペプチドのＮｏｘ酵素インヒビターは、実験研究においては有用であったが、特異性および毒性の問題は、創薬の候補としての既存の化合物のいずれにも不利な影響を及ぼす。
【００１４】
近年の仕事において記述された広範囲の疾患標的を考慮すると、Ｎｏｘ酵素の新規で臨床的に有用なインヒビターを見出すことは重要であった。しかしながら、最大の課題は、個々のＮｏｘアイソフォームに特異的に作用することが可能なペプチドインヒビターの発見であった。
【００１５】
本出願人は、この課題に着手し、成功裏に達成した。実際、本発明は、他のＮＡＤＰＨオキシダーゼ、特にＮｏｘ２、Ｎｏｘ４、Ｎｏｘ５、Ｄｕｏｘ１およびＤｕｏｘ２を阻害せずに、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ−１（Ｎｏｘ１）集合体を直接的および特異的に遮断する新規ペプチドインヒビターを提供する。Ｎｏｘ１は、がん、老化、神経変性の疾患および心血管疾患を含む広範囲の疾患の発症および進行に関与し、よって意味のある治療標的を表す。よって、本発明の新規ペプチドはまた、それらが、非特異的なＲＯＳの除去または抗酸化剤の活性を有さず、それらが、ＲＯＳの他の供給源を阻害しないことからも、特に有利である。ＲＮＡｉ技術と比較して、ペプチドインヒビターは、それらの標的タンパク質に対して極めて特異的であり、それゆえオフターゲット効果の可能性を低下させる。化学的インヒビターと比較したとき、本発明のペプチドは、in vivoで毒性効果を示さなかった。さらには、設計および産生が容易である。
【発明の概要】
【００１６】
本発明の概要
よって、本発明は、以下のアミノ酸一般配列Ｘ１−Ｐ−Ｘ２−Ｘ３−Ｐ−Ｘ４−Ｒ（配列番号１）、式中、Ｘ１は、Ａ、ＰまたはＱであり；Ｘ２は、Ｐ、Ｔ、Ｖ、Ａ、Ｓ、Ｃ、ＭまたはＫであり；Ｘ３は、Ｌ、Ｉ、ＶまたはＡであり；および、Ｘ４は、Ｔ、Ｖ、Ｓ、ＡまたはＭである、の一部分を含み、少なくとも７〜３５個の連続したアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むペプチド自体を提供する。かかるペプチドは、Ｎｏｘ１活性および／または増大した活性酸素種（ＲＯ4Ｓ）の産生のいずれかに関連する病理的状態または疾患を予防する、および／または処置する方法において特に有用である。
【００１７】
本発明は、Ｎｏｘ１の活性化を選択的に阻害することが可能であり、以下Ｎｏｘ１インヒビターペプチドと呼ばれる、新規な選択的ペプチドに向けられる。よって、これらの新規ペプチドは、医薬品として、光防護剤として、および／または、抗老化剤として、有用である。それらは、細胞透過性ペプチドまたは細胞における前記ペプチドの蓄積を増大させる剤（細胞担体）と、任意に抱合されてもよい。
【００１８】
第１の態様によれば、本発明は、本発明のＮｏｘ１インヒビターペプチドの有効量を含む組成物、ならびに、治療有効量のＮｏｘ１インヒビターペプチドと、薬学的に許容し得るビヒクルまたは賦形剤とを含む医薬組成物、および、化粧用組成物に関係する。
【００１９】
本発明の新規のＮｏｘ１インヒビターペプチドおよび組成物は、酸素ラジカルを媒介する疾患、より具体的には、心血管障害、血管新生に依存的な障害、呼吸器障害、皮膚障害、神経変性障害、アレルギー性および自己免疫障害、胃腸障害、がん、および、代謝障害に関する疾患を含むＮＡＤＰＨオキシダーゼ−１／Ｎｏｘ１が関する障害を処置する、および／または予防する方法において有利に使用されてもよい。最も特徴的には、それらは、血管および心血管疾患、大腸がんおよび皮膚がん等のがん疾患、ならびに、皮膚障害、ＵＶ皮膚損傷、老化による皮膚状態、ＲＯＳに誘導される皮膚損傷、早期老化、および／または、ＵＶ曝露（ＵＶ  ＡまたはＵＶ  Ｂ）に続く皮膚の腫瘍発生を処置する、および／または予防する方法において有用である。
【００２０】
第２の態様によれば、本発明は、新規のＮｏｘ１インヒビターペプチドまたは組成物の治療的有効量を投与することを含む、必要とする対象において活性酸素種（ＲＯＳ）のレベルを低減する、および／または活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を阻害する方法、ならびに特にＮＡＤＰＨオキシダーゼ１（Ｎｏｘ１）活性を選択的に低下するおよび／または阻害する方法に関する。
【００２１】
第３の態様によれば、本発明は、酸素ラジカルにより媒介される疾患、より具体的には、心血管障害、血管新生に依存的な障害、呼吸器障害、皮膚障害、神経変性障害、アレルギー性および自己免疫障害、胃腸障害、大腸がんおよび皮膚がん等のがんおよび代謝障害に関する疾患を含む、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ−１／Ｎｏｘ１が関連する障害を処置する、および／または予防する方法に関係する。本発明の方法はまた、皮膚障害、ＵＶ皮膚損傷、老化による皮膚状態、ＲＯＳに誘導される皮膚損傷、早期老化および／またはＵＶ曝露（ＵＶ  ＡまたはＵＶ  Ｂ）に続く皮膚の腫瘍発生を処置する、および／または予防するのにも有用である。
【００２２】
第４の態様によれば、本発明は、新規ペプチドならびに細胞透過性ペプチドまたは細胞担体に任意に抱合されるペプチドを調製するための方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
図面の簡単な説明
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、トリパンブルー排除アッセイおよびＭＴＴアッセイを使用して、正常な初代ヒトケラチノサイトに対し試験された各ペプチドの毒性効果を示す。図１Ａおよび１Ｂに示されるように、ヒトケラチノサイトは、ペプチドＡ（配列番号４１）、Ｂ（配列番号４２）およびＣ（配列番号４３）の異なる濃度で処理され、生存率は、トリパンブルー色素（Ａ）およびＭＴＴアッセイ（Ｂ）を使用して、処理から２４、４８および７２時間後に測定された。処理されたケラチノサイトにおける生存率のパーセンテージは、非処理の細胞（ＮＴＣ）に対して標準化された。
【００２４】
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦ−ＤＡプローブを使用して、１０または５０μＭのペプチドインヒビターにより２４時間処理された初代ヒトケラチノサイトおよびＨＴ２９（ヒト結腸腺癌細胞株）において測定されたＲＯＳの相対レベルを示す。細胞は、１０μＭのペプチドＡ（配列番号４１）、Ｂ（配列番号４２）およびＣ（配列番号４３）により処理され、ＲＯＳレベルは処理から２４時間後に測定された。ＲＯＳレベルは、非処理の細胞（ＮＴＣ）に対して標準化された（＊Ｐ＜０．０５）。図２Ａのとおり、ＲＯＳレベルの有意な低減が、ペプチドＡ（配列番号４１）およびペプチドＢ（配列番号４２）により処理されたケラチノサイトにおいて観察された。図２Ｂのとおり、ＨＴ２９細胞におけるＲＯＳレベルの測定は、ペプチドＡおよびＢによる処理が、ＲＯＳレベルの有意な低下をもたらしたことを示した。これは、Ｎｏｘ１活性に対するこれらのペプチドの特異的な阻害効果を示唆する。
【００２５】
【図３】図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃは、レンチウイルスに媒介されるＮｏｘ１およびＮｏｘ２に対するｓｈＲＮＡの発現を使用する、内在性Ｎｏｘ１およびＮｏｘ２タンパク質発現の阻害を示す。ケラチノサイトには、異なるｓｈＲＮＡ（ｓｈＮｏｘ１、ｓｈＮｏｘ２および対照のｓｈＣｔｒｌ）が形質導入された。形質導入の有効性は、ウェスタンブロッティング分析によりチェックされた。図３Ａは、ｓｈＮｏｘ１およびｓｈＮｏｘ２がともに、８０％を超えるＮｏｘ１およびＮｏｘ２の発現を夫々安定的に阻害したことを示す。形質導入の有効性は、ウェスタンブロッティング分析によりチェックされた。ＲＯＳの相対レベル（３Ｂ）およびＮｏｘ活性（３Ｃ）は、Ｎｏｘ１インヒビターペプチドＡによる処理と対照ペプチドＣによる処理との比較として、処理から２４時間後に測定された。ＲＯＳレベルは、対応するペプチドＣにより処理された細胞に対して標準化された。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性は、タンパク質のμｇあたりの相対発光単位(relative luminescence unit)（ＲＬＵ）により測定された。＊Ｐ＜０．０５。図３Ｂのとおり、ＲＯＳレベルの測定は、ペプチドインヒビターＡによる処理が、ｓｈＮｏｘ１により形質導入された細胞におけるＲＯＳの定常状態レベルに対して効果がなかったことを明らかにした。これは、ペプチドＡが、極めて高い（１００％に近い）効率および特異性で、Ｎｏｘ１依存的ＲＯＳ発生を遮断したことを示す。図３Ｃにおいて、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性は、Ｎｏｘ１インヒビターペプチドＡで処理したまたは処理しなかった、ｓｈＣｔｒｌおよびｓｈＮｏｘ１が形質導入された細胞において測定された。
【００２６】
【図４】図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、ＲＯＳ産生およびＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の阻害、したがってヒトおよびマウスのケラチノサイトに対するＮｏｘ１インヒビターペプチドＡの光防護効果を示す。ヒト生検およびマウス表皮から単離されたケラチノサイト（KerヒトおよびKerマウス）は、１０μＭのインヒビターペプチドＡまたは対照のスクランブルペプチドＣのいずれかにより処理された。ＲＯＳレベル（４Ａ）およびＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性（４Ｂ）は、処理から２４時間後に測定された。対照のスクランブルペプチド（Ｃ）により処理されたヒトおよびマウスのケラチノサイトの両者におけるＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性が、無作為に１００％に設定された。次に、Ｎｏｘ１インヒビターペプチドＡを用いた処理によるＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の阻害の％が査定された（４Ｃ）。
【００２７】
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、マウス皮膚におけるＮｏｘ１活性に対するペプチドＡの効果を示す。ＳＫＨ−１マウスは、異なる用量：０．４、３および１２ｍｇ／ｋｇ（用量あたりマウス３匹）のＮｏｘ１インヒビターペプチドＡにより局所的に処理された。皮膚生検は、処理後２時間、２４時間、４８時間および７２時間に採取され、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性が測定された（ＲＬＵ／タンパク質のμｇ）。結果は、非処理（ＮＴ）のマウスに対して標準化され、Ｎｏｘ活性の阻害の％として表わされた。（Ｂ）マウスは、３および１２ｍｇ／ｋｇのペプチドＡにより局所的に処理された（用量あたりマウス２匹）。処理後１０分で、マウスはＵＶＢに曝露された（１５０ｍＪ／ｃｍ２）。皮膚生検は、２時間、２４時間に採取された。最初の処理から４６時間後に、マウスを同じ濃度のペプチドＡにより再度処理し、１０分後にＵＶＢに曝露した。次いで、皮膚生検は、２時間、２４時間（すなわち、最初の処理から夫々４８および７２時間後）に採取された。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性が測定され（ＲＬＵ／タンパク質のμｇ）、非処理（ＮＴ）および非照射のマウスに対して標準化された。
【００２８】
【図６】図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、ＳＫＨ−１無毛マウスを用いた、ＵＶＢにより誘導される扁平上皮癌（ＳＣＣ）誘導に対するペプチドＡの光防護効果を示す。マウスは、１週間につき３回、３ｍｇ／ｋｇのペプチドＡまたは対照ペプチドで局所的に処理し、１０分後にＵＶＢを照射した。腫瘍の数（６Ａ）およびサイズ（６Ｂ）が、２９週の間、１週間に１回査定された（６Ｃ）。腫瘍容積分布が２９週に評価された。ペプチドＡが局所的に投与されたＳＫＨ−１マウスにおいて、ＵＶＢにより誘導された腫瘍の数およびサイズが、明らかに大きく低下する。
【００２９】
【図７】図７は、ペプチドＡまたは対照ペプチドにより処理されたＳＫＨ−１マウスにおける、非腫瘍担持皮膚とＵＶＢに誘導された腫瘍との両者において、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性が有意に低減したことを示す。マウスは、処理から２９週後に殺処理された。非腫瘍担持皮膚および腫瘍は、ペプチドＡまたはビヒクルにより処理された照射マウスから採取された。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性は、非腫瘍担持皮膚およびＵＶＢにより誘導された腫瘍においてＲＬＵ／タンパク質のμｇとして測定された。非腫瘍担持皮膚および腫瘍におけるＮｏｘ活性の相対的阻害は、ビヒクルにより処理されたマウスから採取された非腫瘍担持皮膚および腫瘍におけるＮｏｘ活性を無作為に１００％に設定した後に評価した。そして結果をビヒクルにより処理されたマウスの平均パーセンテージとして表した。
【００３０】
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、ｔａｔのないペプチドＡが、ペプチドＡと同程度に効率的にＮｏｘ活性を阻害し得ることを示す。さらに、ペプチドＡに由来するより小さなペプチドが、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を効率的に阻害する。ケラチノサイトは、１０μＭの示されたペプチド：スクランブル対照ペプチドＰ１（配列番号５７）、ｔａｔ配列のあるペプチドＡ（配列番号４１）またはｔａｔ配列のないペプチドＡ（配列番号２０）；より短いペプチドＰ７（配列番号２）およびＰ８（配列番号５６）により処理された（図８Ａ）。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性は、処理から２４時間後に測定され（ＲＬＵ／タンパク質のμｇ）、スクランブルにより処理された細胞に対して標準化された（図８Ｂ）。
【００３１】
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、若年および老年のＸＰＣ非欠損(proficient)（ＸＰＣ＋／＋）および欠損（ＸＰＣ−／−）マウスの皮膚生検におけるプロジェリン発現を示す。若年マウスは４月齢であり、老年マウスは１．５年齢であった。（Ａ）皮膚生検の総タンパク質抽出物は、ウェスタンブロット分析によりプロジェリン(progerin)について査定された。β−アクチンが、ローディングの対照として使用された。（Ｂ）プロジェリンに対応するタンパク質バンドが、β−アクチンにより定量化され、標準化された。各群における６匹のマウスからの平均の濃さ±ＳＤは、若年野生型マウスにおける濃さに対する相対値として提示される。
【００３２】
【図１０】図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃは、Ｎｏｘ活性およびＯＸＰＨＯＳ複合体発現に対するＸＰＣ欠損の効果を示す。（Ａ）ＮＯＸ活性は、若年および老年ＸＰＣ＋／＋およびＸＰＣ−／−マウスの皮膚生検において測定された（ＲＬＵ／μｇタンパク質）。結果は、若年野生型マウスに対して標準化された。（Ｂ）ＯＸＰＨＯＳ複合体の発現は、若年および老年の非欠損および欠損ＸＰＣマウスにおけるウェスタンブロット分析により査定された。（Ｃ）異なるＯＸＰＨＯＳ複合体に対応するバンドが、β−アクチンにより定量化され、標準化された。各群における６匹のマウスからの平均の濃さ±ＳＤは、若年野生型マウスにおける濃さに対する相対値として提示される。
【００３３】
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、若年ＸＰＣ＋／＋およびＸＰＣ−／−マウス皮膚生検におけるプロジェリン発現に対する、ＮＯＸ１インヒビターペプチドＡ（ＩｎｈＮＯＸ）の効果を示す。１月齢マウスが、３ヶ月間１週間あたり３回、３ｍｇ／ｋｇ（群あたりマウス６匹）のＮｏｘ１インヒビターペプチドＡ（ＩｎｈＮＯＸ）または対照ペプチド（ビヒクル）により局所的に処理された。（Ａ）皮膚生検の総タンパク質抽出物が、ウェスタンブロット分析によりプロジェリンについて査定された。β−アクチンがローディングの対照として使用された。（Ｂ）プロジェリンに対応するタンパク質バンドは、β−アクチンにより定量化され、標準化された。各群における６匹のマウスからの平均の濃さ±ＳＤは、若年野生型マウスにおける濃さに対する相対値として提示される。
【００３４】
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂは、若年ＸＰＣ＋／＋およびＸＰＣ−／−マウス皮膚生検におけるＯＸＰＨＯＳ複合体のタンパク質発現に対する、Ｎｏｘ１インヒビターペプチドＡ（ＩｎｈＮＯＸ）の効果を示す。１月齢マウスが、３ヶ月間１週間あたり３回、３ｍｇ／ｋｇ（群あたりマウス６匹）のＮｏｘ１インヒビターペプチドＡ（ＩｎｈＮＯＸ）または対照ペプチド（ビヒクル）により局所的に処理された。（Ａ）ＯＸＰＨＯＳ複合体の発現は、ウェスタンブロット分析により査定された。β−アクチンがローディングの対照として使用された。（Ｂ）異なるＯＸＰＨＯＳ複合体に対応するバンドは、β−アクチンにより定量化され、標準化された。各群における６匹のマウスからの平均の濃さ±ＳＤは、若年野生型マウスにおける濃さに対する相対値として提示される。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
詳細な説明
本発明は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ−１集合体を遮断し、その結果としてその活性を特異的に遮断することによって、Ｎｏｘ１活性を選択的に阻害することが可能な新規の選択的ペプチド、ならびに、医薬品および光防護剤としてのそれらの適用に向けられる。よって、本発明は、治療および化粧の方法の両者に関する。これらのペプチドは、以降、Ｎｏｘ１インヒビターペプチドと表されることがある。
【００３６】
細胞質中のタンパク質を標的にするために、追加の修飾が細胞内へのペプチド透過性を伴っていてもよい。成功した方法の例は、アルギニンリッチ配列またはｔａｔ配列を加えること等である。本発明のペプチドは、Ｎｏｘ１との相互作用を通じてＮｏｘ１集合体と競合するそれらの潜在能力に基づき、選択された。
【００３７】
処置されるであろう個体は、ヒトおよび動物、好ましくは齧歯類および霊長類等の哺乳動物を含む。個体は、非ヒト動物または非ヒト哺乳動物であってもよい。個体は、本明細書中に言及される病気のいくつかを有していてもよく、または、それらを発症するリスクがあってもよい。ヒト個体のケースにおいて、彼らは、少なくとも６０歳または７０歳等の、少なくとも５０歳であってもよい。
【００３８】
本発明のペプチドは、配列番号４４（ＮｏｘＯ１のＰＲＲ領域）または配列番号４５（ＮｏｘＡ１のＳＨ３領域）に由来する。それらは、通常、配列番号４４または配列番号４５からの、５〜３５アミノ酸または５〜２０アミノ酸または７〜２０の連続したアミノ酸を含むであろう。配列番号４４は、ＰＰＴＶＰＴＲＰＳＰＧＡＩＱＳＲＣＣＴＶＴＲＲＡＬであり、配列番号４５は、ＱＶＶＡＱＨＳＹＳＡＱＧＰＥＤＬＧＦＲＱＧＤＴＶＤＶＬＣＥＥＰＤＶＰＬＡＶＤＱＡＷＬＥＧＨＣＤＧＲＩＧＩＦＰＫＣＦＶＶＰＡＧＰＲＭである。
【００３９】
本発明のペプチドは、典型的には、２つの特徴的な配列を含む。これらのうち１つは、一般に、本明細書中「一部分」と称され、これは、本明細書において説明されるペプチドの治療活性に関与する。一部分は、一般に、７〜１９；７〜１８；７〜１７；７〜１６；７〜１５；７〜１４；７〜１３；７〜１２；７〜１１；７〜１０；好ましくは、７〜１８；７〜１５；７〜１０；おおよそ７アミノ酸；または８〜１８；８〜１５；８〜１０アミノ酸等の５〜２０アミノ酸または７〜２０アミノ酸の長さを有していてもよい。
【００４０】
２つ目の特徴的な配列、または、ペプチド内の配列の残りのいずれかは、ペプチドに対し、さらなる有利な特性を提供してもよい。ペプチドのこの第２部は、存在していなくてもよく、そのため一態様において、ペプチドは、治療特性を授ける上記「一部分」配列のみからなる。すなわち、一部分とペプチドとの長さは同じである。第２配列は、典型的には、５〜３０、７〜３０、１０〜２５または１５〜２０アミノ酸長等の０〜３１アミノ酸長である。第２配列は、本明細書中に言及される特異的な細胞透過性ペプチドのいずれかと同一であるかまたは相同である、細胞透過性ペプチドであってもよい。一部分のＮ末端およびＣ末端の両側に、さならる「第２」配列があってもよいことは、明らかである。
【００４１】
ペプチドは、典型的には、７〜３５アミノ酸の長さ、または７〜３０、または７〜２０、または７〜１５、または７〜１０、またはおおよそ〜７、８、９または１０アミノ酸長、または好ましくは７、８または９、および最も好ましくは７アミノ酸長を有する。
【００４２】
前記ペプチドまたは一部分は、一般の以下のアミノ酸一般式Ｘ１−Ｐ−Ｘ２−Ｘ３−Ｐ−Ｘ４−Ｒ（配列番号１）、
式中、Ｘ１は、Ａ、ＰまたはＱであり、
Ｘ２は、Ｐ、Ｔ、Ｖ、Ａ、Ｓ、Ｃ、ＭまたはＫであり、
Ｘ３は、Ｌ、Ｉ、ＶまたはＡであり、および、
Ｘ４は、Ｔ、Ｖ、Ｓ、ＡまたはＭである、
で表される配列であってもよく、または、該配列を含んでもよい。
【００４３】
前記ペプチドまたは一部分は、下表１に列記された配列のいずれかであってもよく、または、該配列のいずれかもまた含んでもよく、または、それらのホモログであってもよい：
【表１】
0006488237.tif 000002
【００４４】
他の態様によれば、前記ペプチドまたは一部分は、以下の表２および３に列記された配列のいずれかであってもよく、または、該配列のいずれかもまた含んでもよく、または、それらのホモログであってもよい：
【表２】
0006488237.tif 000003
【表３】
0006488237.tif 000004
【００４５】
他の態様によれば、本発明はまた、配列番号４４（ＮｏｘＯ１のＰＲＲ領域）または配列番号４５（ＮｏｘＡ１のＳＨ３領域）のフラグメントと同一であってもよいか、または相同性を有していてもよい、少なくとも７〜３５の連続したアミノ酸、７〜３０の連続したアミノ酸、または７〜２０の連続したアミノ酸のアミノ酸配列を含むペプチドまたは部分も提供する。相同性の好適なレベルは、相同性に関する以下のセクションにおいて説明され、例えばそれらの類縁体または保存的変異体を含む。好ましくは、治療的一部分またはペプチドの配列は、配列番号４４または配列番号４５と、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。任意に、前記ペプチドは、Ｎｏｘ１活性および／または増大した活性酸素種（ＲＯＳ）の産生のいずれかに関連する病理的状態または疾患を予防する、および／または、処置する方法における使用のためのものである。好ましくは、前記ペプチドは７〜１５アミノ酸長であり、および／または、前記一部分は、好ましくは７〜１０アミノ酸長、より好ましくはおおよそ７アミノ酸長である。最も好ましくは、前記ペプチドは、配列番号４４（ＮｏｘＯ１のＰＲＲ領域）または配列番号４５（ＮｏｘＡ１のＳＨ３領域）の少なくとも７個の連続的なアミノ酸と同一であり、または、配列番号４４または配列番号４５と少なくとも８０％または８５％または９０％または９５％の同一性を有する。
【００４６】
相同配列
【００４７】
相同配列が本明細書において言及される。相同配列は、ペプチド内の治療的「一部分」配列を表してもよく、または、本発明のペプチド中の第２（残りの）配列であってもよい。相同配列は、本明細書において言及される任意の具体的な配列と相同であってもよい。ホモログは、元の配列と比較して、１種または２種以上（少なくとも２種、３種、４種または５種等）の付加および／または欠失および／または置換を有する。相同配列は、元の配列の長さにわたり、または、元に配列の４、６、１０、１５または２０アミノ酸にわたり、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸同一性を含んでもよい。
【００４８】
用語「配列同一性」は、典型的には、以下のパラメーター：Pairwise alignment parameters−Method：accurate、Matrix：PAM、Gap open penalty：10.00、Gap extension penalty：0.10；Multiple alignment parameters−Matrix：PAM、Gap open penalty：10.00、% identity for delay：30、Penalize end gaps：on、Gap separation distance：0、Negative matrix：no、Gap extension penalty：0.20、Residue-specific gap penalties：on、Hydrophilic gap penalties：on、Hydrophilic residues：G、P、S、N、D、Q、E、KでClustalW（Thompson et al., 1994, supra）を使用して査定されたときに所定の値を有する配列を指す。特定の残基における配列同一性は、単純に誘導体化された同一の残基を含むことが意図される。
【００４９】
相同配列は、元の配列と比較して、１、２、３、４、５またはそれ以上、または１０アミノ酸の置換を有していてもよい。置換は、好ましくは保存的置換である。これらは、下表４に従ってなされてもよい。第２カラムにおける同じブロック、好ましくは第３カラムにおける同じ列におけるアミノ酸が、互いに置換されてもよい。
【表４】
0006488237.tif 000005
【００５０】
本発明のペプチドは、化学合成および／または組換えＤＮＡ技術等の、当該技術分野において知られているあらゆる好適な方法によって産生されてもよい。例えば、本発明のペプチドは、固相ペプチド合成技術（例えばＦｍｏｃ等）を使用して合成され得る。代替的に、ペプチドは、組換えＤＮＡ技術を使用して（例えば細菌または真核生物発現システム等を使用して）合成され得る。本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、関連のあるアミノ酸残基（単数または複数）の導入（すなわち挿入または置換）または除去（すなわち欠失または置換）をもたらすために、親ペプチドをコードするヌクレオチド配列を単離または合成し、次にヌクレオチド配列を変えることによって、構築されてもよい。固相タンパク質合成および組換えタンパク質合成のための方法は当該技術分野において周知である。例えば「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」（Sambrook et al., 3d Edition, Cold Spring Harmor Press）等は、ポリペプチドの組換え産生のための多くの好適な技術を詳述する周知の参考文献である。ペプチドの変異体は、天然に存在するものであってもよいし、天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。ペプチドの天然に存在しない変異体は、直接合成によって作製されてもよいし、または代替的に、突然変異が、従来の方法による飽和突然変異誘発または部位特異的変異誘発等によって、本発明のペプチドの全部または一部にランダムに導入され得る。産生の方法とは無関係に、得られた変異体は、本発明の変異体を同定するために、Ｎｏｘ１および／またはＲＯＳを阻害する能力についてスクリーニングされ得る。
【００５１】
新規ペプチドは、単離および／または精製され（または、実質的に単離および／または実質的に精製され）得る。したがって、本発明は、単離されたかまたは実質的に単離された形態の（例えば他のペプチドまたは不純物から実質的に単離された）本発明の第１の側面のペプチドを提供する。ペプチドは、例えば固相タンパク質合成等の結果として、他のペプチドから単離され得る。代替的に、ペプチドは、組換え産生からの細胞溶解後、他のタンパク質から実質的に単離され得る。タンパク質精製の標準的な方法（例えばＨＰＬＣ等）は、本発明のペプチドを実質的に精製するのに採用され得る。よって、本発明のペプチドの調製物は、好ましくは他のペプチドおよび／または夾雑物が少なくとも９０（重量）％フリーである、より好ましくは他のペプチドおよび／または夾雑物が少なくとも約９５（重量）％フリーである（他のペプチドおよび／または夾雑物が少なくとも約９７（重量）％または９８（重量）％フリーである等）。
【００５２】
用語「ペプチド」は、アミノ酸残基がペプチド（−ＣＯ−ＮＨ−）連結によって結び付けられる分子のみならず、ペプチド結合が逆転された分子もまた含む。かかるレトロ−インベルソ(retro-inverso)ペプチド模倣薬は、当該技術分野において知られている方法を使用して作製されてもよい。このアプローチは、側鎖の向きではなく主鎖に関する変化を含有する擬ペプチドを作製することを含む。ＣＯ−ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含有するレトロ−インベルソペプチドは、タンパク質分解に対してはるかに耐性を持つ。同様に、ペプチド結合は、アミノ酸残基の炭素原子間の間隔を保持する適切なリンカー部分が使用されるという条件で、完全にないものとしてもよい；これは、リンカー部分が、ペプチド結合と実質的に同じ電荷分布および実質的に同じ平面性を有する場合、特に好ましい。外部タンパク質分解性の(exoproteolytic)消化に対する感受性の低下を助長するために、ペプチドがそのＮまたはＣ末端を都合よく遮断されてもよいこともまた理解されるであろう。例えば、ペプチドのＮ末端のアミノ基は、カルボン酸と反応させることによって防護されてもよく、ペプチドのＣ末端のカルボキシル基は、アミンと反応させることによって防護されてもよい。修飾の他の例は、糖付加およびリン酸化等を含む。可能性のある他の修飾は、ＲまたはＫの側鎖アミン上の水素がメチレン基で置き換えられてもよい（−ＮＨ２−”−ＮＨ（Ｍｅ）または−Ｎ（Ｍｅ）２）ことである。
【００５３】
ペプチドは、例えばペプチドのin vivoでの半減期を増大または低減する等の他のやり方で修飾されてもよい。よって、ペプトイド類縁体、Ｄ−アミノ酸誘導体およびペプチド−ペプトイドハイブリッドが使用されてもよい。本発明によって使用される変異体ポリペプチドのさらなる態様は、ポリペプチドのＤ−アミノ酸形態を含む。Ｌ−アミノ酸よりむしろＤ−アミノ酸を使用するポリペプチドの調製物は、通常の代謝過程によるかかる剤のあらゆる意図しない分解を大いに低減させることで、剤の投与の頻度とともに投与に必要とされる剤の量も低減される。
【００５４】
本発明のペプチドは、Ｎｏｘ１活性を、例えば少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％または６０％等低下させることが可能である。好ましくは、ペプチドは、Ｎｏｘ１活性を選択的に低減および／または阻害するが、Ｎｏｘ２、Ｎｏｘ４、Ｎｏｘ５、Ｄｕｏｘ１およびＤｕｏｘ２から選択されるヒトＮＡＤＰＨオキシダーゼは阻害しない。より好ましくは、本発明のペプチドは、ｐ４７ｐｈｏｘとｐ６７ｐｈｏｘとの間ではなく、ＮｏｘＯ１とＮｏｘＡ１との間の相互作用を特異的に抑制することによって、Ｎｏｘ１活性を選択的に低減および／または阻害する。よって、本明細書中、上に記載の本発明のペプチドは、Ｎｏｘ１の特異的な阻害性ペプチドである。
【００５５】
本発明は、さらに、対象の皮膚または粘膜への、ＮＡＤＰＨオキシダーゼまたはＮＯＸにより誘導されるＲＯＳを媒介する損傷を低下するための方法および組成物に向けられる。本発明の一態様は、対象の皮膚または粘膜への、ＮＡＤＰＨオキシダーゼまたはＮＯＸにより誘導されるＲＯＳを媒介する損傷を阻害および低下するための方法であって、該方法は、薬学的に許容し得る担体中の本発明のペプチドの有効用量を、対象の皮膚または粘膜に対するＮＡＤＰＨオキシダーゼまたはＮＯＸにより誘導されるＲＯＳを媒介する損傷を患う対象へ送達するステップを含む。さらにまた、本発明は、早期老化に関連する酸化組織損傷の原因となる、ＮＡＤＰＨオキシダーゼまたはＮＯＸにより誘導されるＲＯＳを媒介するフリーラジカルを調整する方法を提供する。本発明は、さらに一般に、好適な組成物に、機能性食品および／または医薬製剤として本発明のペプチドを組み込むことを含む。用語「調整する(modulate)」、「調整(modulation)」または「調整すること(modulating)」は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼまたはＮＯＸシステムのいずれかの構成要素の、具体的にはＮｏｘ１の活性における増大または低減のいずれかを含む。ＲＯＳが、極めて反応性の高い分子であり、細胞において多様な損傷を発生させ得ることから、ＲＯＳの悪循環は、老化過程を特徴付ける漸進的な機能低下をもたらす老化における酸化的損傷の指数関数的な増加の理由であると考えられている。
【００５６】
好ましい態様において、ペプチドおよびそれらの組成物は、光防護剤として極めて効果的である。日光は、早期皮膚老化、皮膚がんおよび多数の皮膚変化の原因となる、皮膚に対する甚大な効果を有する。紫外光、特にＵＶＡまたはＵＶＢへの曝露は、早期皮膚老化の症状のうち９０％の割合を占める。皮膚がんは、慢性的ＵＶ曝露の深刻な結果である。太陽からの紫外（ＵＶ）放射は、皮膚がんの主な原因である。ＵＶの放射線は、ＤＮＡ、遺伝子を構成する遺伝物質に損傷を与える。遺伝子は、皮膚細胞の成長および健康全般を制御する。遺伝子の損傷が重度である場合、正常な皮膚細胞は、非制御の無秩序なやり方で成長し始め、がん化することがある。ＵＶはまた、日焼け、および、年不相応に老けてしわの目立つ皮膚にさせる他の損傷も引き起こし得る。皮膚がんは、それらが起因する皮膚細胞のタイプに依存して異なるタイプの皮膚がんがある。皮膚がんは、基底細胞癌、扁平上皮癌または悪性の黒色腫であり得る。
【００５７】
本発明によって、ＵＶＡおよびＵＶＢの両放射への光防護を強化する本発明のペプチドに基づく組成物が記載される。かかる組成物は、急性または慢性のＵＶ曝露に関連する皮膚損傷のリスクが高まっている対象を処置するために使用され得る。前記組成物は、局所的な、経口的な、または、皮内的な手段を通して投与され得る。該組成物は、皮膚の望ましい領域へ活性剤を直接投与する手段として、溶液、懸濁液、エマルション、油、クリーム、軟膏、粉末、リニメント、膏薬などの局所的に提供されるビヒクル中に容易に組み込まれ得る。さらに、前記組成物はまた、カプセル、錠剤、シロップ、タフィー、チョコレート、機能性飲料などのような経口投与形態へも組み込まれてもよい。
【００５８】
好ましい態様において、本発明は、慢性的ＵＶ曝露（ＵＶＡまたはＵＶＢ）に続く皮膚腫瘍発生を処置する、および／または、予防するように向けられた方法を提供する。さらなる態様において、本発明は、ＵＶ放射からの防護を提供するための皮膚を処置する方法に関し、該方法は、上に記載のＮｏｘ１インヒビターペプチドまたはその類縁体またはその保存的変異体の治療的有効量を含む組成物を皮膚へ適用することを含み、ここで、ペプチドは、任意に、細胞における該ペプチドの蓄積を増大させる剤に抱合されるか、または付着される。最も好ましくは、配列番号１のアミノ酸一般式による配列を有するペプチド、または、配列番号２〜４２、好ましくは２〜１９に記載のアミノ酸配列のいずれかのペプチドが使用されてもよい。
【００５９】
さらに他の態様において、本発明は、皮膚、粘膜、頭皮および／または毛髪の処置および／またはケアのための方法に向けられており、該方法は、上に記載のＮｏｘ１インヒビターペプチドまたはその類縁体または保存的変異体の化粧品的または医薬的有効量を含む組成物を適用することを含み、ここで、ペプチドは、任意に、細胞における該ペプチドの蓄積を増大させる剤に抱合されるか、または付着される。好ましくは、ペプチドは、配列番号１または４２を有する。好ましい態様において、本発明は、ＲＯＳ発生の結果である、皮膚、粘膜、頭皮および／または毛髪の病気、障害および／または病変のための処置および／またはケアのための方法に向けられる。本発明の方法および組成物によって提供されるより具体的な処置および／またはケアは、皮膚、粘膜、頭皮および／または毛髪の細胞ＤＮＡの光防護、防護および／または修復である。
【００６０】
代替的な態様によれば、本発明の組成物を用いる処置および／または皮膚ケアは、老化、光老化などの兆候を低下する、延期する、および／または予防するためになされる。具体的には、処置されてもよい疾患状態は、老化または早期老化による皮膚状態を含み得、ここで、本発明のペプチドが、抗老化剤または光防護剤として投与される。
【００６１】
本発明はまた、ＵＶＡおよびＵＶＢの両者によって誘導される皮膚損傷への光防護を強化する組成物も提供し、該組成物は、上に記載のとおりＮｏｘ１インヒビターペプチド、その類縁体またはその保存的変異体の治療的有効量を含む。前記ペプチドは、細胞において該ペプチドの蓄積を増大させる剤と、任意に抱合されていてもよいし、または付着していてもよい。好ましい態様において、前記組成物は、ＵＶＡおよびＵＶＢの両放射線への強化された光防護を必要とする対象のために、安全で長期にわたる治療的解決策を提示するものである。具体的には、かかる組成物は、長時間のＵＶＡおよびＵＶＢ曝露による皮膚がんのリスクが高まっている対象へ投与され得る。
【００６２】
本発明は、それを必要とする対象におけるＮＯＸ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼの、具体的にはＮｏｘ１の活性、機能またはレベルを選択的に低下させるか、または阻害するか、または調整する方法に関する。前記方法は、本明細書中に記載のＮｏｘ１インヒビターペプチドの有効量を対象へ投与することを含み、ここでペプチドは、細胞における該ペプチドの蓄積を増大させる剤と任意に抱合されていてもよいし、または付着していてもよい。
【００６３】
本発明は、さらに、それを必要とする対象において、活性酸素種（ＲＯＳ）のレベルを低減するか、または、増大した活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を阻害する方法を提供し、該方法は、本明細書中に記載のＮｏｘ１インヒビターペプチドの有効量を対象へ投与することを含み、ここでペプチドは、細胞における該ペプチドの蓄積を増大させる剤と任意に抱合されているか、または付着している。
【００６４】
ペプチドは、細胞における該ペプチドの蓄積を増大させる剤と任意に抱合されているか、または付着している。かかる好適な剤との抱合によって、前記ペプチドは、細胞膜浸透性担体として、膜へより浸透し易くなるであろう。かかる剤は、例えば正に荷電したアミノ酸がリッチなペプチド、例えばアルギニンリッチペプチド等の細胞膜浸透性担体であってもよい。例示の目的で、アルギニンリッチペプチドは、配列ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号４６）を有するポリアルギニンタグであってもよい。他の細胞透過性ペプチドは、アミノペプチダーゼ（ＣＤ１３）Ｎリガンドに由来するＮＧＲペプチド（ＣＮＧＲＣＧ：配列番号４７）、または、アンテナペディアリーダーペプチド（ＣＴ）（ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＶＫＶＱＲＧ：配列番号４８）、または、Ｂｃｌ−２結合ペプチド（デカノイル−ＫＮＬＷＡＡＱＲＹＧＲＥＬＲＲＭＳＤＥＦＥＧＳＦＫＧＬ：配列番号４９）、ｔａｔ配列（ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ：配列番号５０）、ブフォリン(buforin)（ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ：配列番号５１）、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）−ＩＩ  Ｒｅｘのペプチド性フラグメント（ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ：配列番号５２）、脂質膜転位(lipid membrane translocating)ペプチド（ＫＫＡＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ：配列番号５３）、ＮＲＰ−１標的ペプチド、Streptomyces hygroscopicus（ＲＰＡＲＰＡＲ：配列番号５４）、および、ペネトラチン（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＧＧ：配列番号５５）の中から選ばれてもよい。
【００６５】
本発明のペプチドは、これらに限定されないが、高血圧、アテローム性動脈硬化、心肥大、心不全、心筋梗塞、再狭窄、糖尿病、糖尿病性腎症、腸粘膜への（特に炎症性腸疾患の粘膜病変への）損傷、新生内膜過形成および狭心症を含む心血管疾患および障害、これらに限定されないが、関節炎、慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、敗血症および他の炎症性障害、気管支喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺感染性疾患、肺線維症、急性呼吸不全症候群（ＡＲＤＳ）、がん、自己免疫疾患、再灌流傷害、腎疾患、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病および他の神経変性の疾患、嚢胞性線維症、臓器拒絶反応ならびに肺高血圧を含む、ＮＡＤＰＨオキシダーゼを媒介する増大したスーパーオキシドの産生と同時に起こる他の疾患および障害を含んでもよい、ＮＡＤＰＨオキシダーゼに関するあらゆる障害の予防および／または処置のために使用され得る。本発明のペプチドは、これらに限定されないが、リン酸化を媒介する障害、多形核白血球を媒介する障害、マクロファージを媒介する障害、リポ多糖を媒介する障害、腫瘍壊死因子−αを媒介する障害、サイトカインＩＦＮ−γを媒介する障害、インターロイキン−２を媒介する障害、炎症性関節炎、ペルオキソクロム酸カリウム関節炎、リウマチ性関節炎、骨関節炎またはアルツハイマー病を含む、活性酸素種（ＲＯＳ）を媒介するあらゆる炎症性障害の予防または処置のために、幅広く使用され得る。好ましい態様において、本発明は処置または予防に関し、ここで、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ１（Ｎｏｘ１）活性またはＲＯＳ活性が、心血管障害、呼吸器障害、代謝障害、皮膚障害、骨障害、ＣＮＳ障害、神経炎症性および／または神経変性障害、腎疾患、睡眠障害、生殖障害、眼および／または水晶体に影響を及ぼす疾患、炎症性障害、肝疾患、疼痛、がん、腫瘍、急性腎不全（ＡＲＦ）、アレルギー性障害、皮膚障害、ＵＶ損傷、老化による皮膚状態、皮膚の光損傷、ＲＯＳに誘導される皮膚損傷、早期老化、加齢性の疾患または障害、胃腸系の障害、血管新生障害、アテローム性動脈硬化、ステント挿入後の再狭窄および／または高血圧などを含む群から選択される疾患状態をもたらす。
【００６６】
好ましい態様において、本発明は、それを必要とする対象における腫瘍細胞成長を阻害する方法を提供し、該方法は、本発明のＮｏｘ１インヒビターペプチド、その類縁体または保存的変異体の治療的有効量を投与することを含む。前記ペプチドは、細胞における該ペプチドの蓄積を増大させる剤と任意に抱合されていてもよいし、または付着していてもよい。最も好ましい態様において、腫瘍細胞成長の前記阻害は、腫瘍形成性ケラチノサイト成長の阻害である。さらなる他の好ましい態様において、それは、慢性ＵＶ曝露（ＵＶＡまたはＵＶＢ）に続く皮膚腫瘍発生を処置する、および／または、予防するための方法である。
【００６７】
好ましい側面において、本発明の方法は、がん、ＲＯＳに誘導される皮膚損傷、皮膚および他の加齢性の障害における老化の予防、アテローム性動脈硬化、ステント挿入後の再狭窄および／または高血圧などを含む群から選択される多数の病気に有用である。極めて好ましい態様において、本発明の方法による処置の影響を受けやすいがんは、皮膚がん、前がん皮膚病変、結腸、結腸腺癌、前立腺がん、良性のまたは悪性の乳頭腫などを含む群から選択される。がんは、黒色腫、または、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）等の造血器悪性腫瘍、または、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）または急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）等の骨髄性白血病であってもよい。膵がんであってもよい。
【００６８】
がんは、大腸がん等の、Ｒａｓにより誘導される発がん性の細胞形質転換により引き起こされるものであってもよい。がんは、腺癌またはHelicobacter pylori感染により誘導される胃腸新生物であってもよい。がんは、乳頭腫ウイルスによって引き起こされてもよい。がんは、色素性乾皮症タイプＣ（ＸＰＣ）遺伝子サイレンシングによって引き起こされてもよい。
【００６９】
本発明は、薬学的に許容し得る塩および典型的には少なくとも１種の化粧品的または薬学的に許容し得る賦形剤またはアジュバントとともに、少なくとも１種の本発明のペプチドまたは本発明のペプチドの混合物の化粧品的または薬学的または治療的有効量を含む化粧品または医薬組成物を幅広く包含する。
【００７０】
本発明はまた、本発明のペプチドを含む、対象におけるＮｏｘ１活性を阻害または調整するための医薬または機能性食品組成物も提供する。さらなる他の好ましい態様において、本発明は、それを必要とする対象におけるＮｏｘ１活性を選択的に低下および／または阻害するための組成物、または、それを必要とする対象において、活性酸素種（ＲＯＳ）のレベルを低減するか、または、活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を阻害するための組成物を提供し、ここで、該組成物は、本発明のＮｏｘ１インヒビターペプチドの効率的な量を含む。最も好ましい態様において、本発明は、それを必要とする対象において、Ｎｏｘ１活性を選択的に低下するか、および／または阻害するための、および／または、活性酸素種（ＲＯＳ）のレベルを低減するか、または、活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を阻害するための組成物を提供し、該組成物は、配列番号１〜４２および好ましくは１〜１９の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド、その類縁体または保存的変異体の有効量を含み、ここで、ペプチドは、細胞における該ペプチドの蓄積を増大させる剤と任意に抱合されているか、または付着している。
【００７１】
さらなる他の側面において、本発明は、本発明のペプチドを含む組成物に関し、該組成物は、薬学的に許容し得る賦形剤または担体をさらに含む。具体的に、本発明は、本明細書中に開示される疾患の処置および／または予防のための医薬組成物の製造のために、少なくとも１種の薬学的に許容し得る担体、賦形剤および／または希釈剤と一緒に、活性成分として本発明のＮｏｘ１インヒビターペプチドを使用することに関する。かかる医薬組成物は、少なくとも１種の薬学的に許容し得る担体、賦形剤、結合剤、崩壊剤、流動促進剤、希釈剤、潤滑剤、着色剤、甘味剤、香味剤、防腐剤などと一緒に、Ｎｏｘ１インヒビターペプチドを含む。本発明の医薬組成物は、従来の固体または液体の担体または希釈剤および従来の薬学的に作製されたアジュバント中で、好適な投薬レベルで、知られている方法で調製され得る。投与形態は、例えばピル、錠剤、フィルム錠、コート錠、カプセル、リポソーム製剤、マイクロおよびナノ製剤、粉末および沈着物(deposit)等を含む。さらに、本発明はまた、経皮(dermal)、皮内(intradermal)、胃内、皮内(intracutaneous)、血管内、静脈内、筋肉内、腹腔内、膣内、口内、経皮(percutaneous)、経直腸、皮下、舌下、局所を含む非経口適用または、経皮(transdermal)適用のための医薬調製物をも含み、ここで、典型的なビヒクルおよび／または希釈剤を加えた調製物は、本発明の新規ペプチドを含有する。本発明のペプチドの処方および投与のための技術は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」（Mack Publishing Co., Easton PA）において見出され得る。
【００７２】
本発明のペプチドはまた、その薬学的に活性な塩の形態でも投与され得る。好適な薬学的に活性な塩は、酸付加塩およびアルカリまたはアルカリ土類塩を含む。例えばナトリウム、カリウム、リチウム、マグネシウムまたはカルシウムの塩等が得られ得る。本発明のＮｏｘ１インヒビターペプチドまたはペプチドの組み合わせは、有機および無機酸と薬学的に許容し得る塩を形成する。かかる酸付加塩の形成に好適な酸の例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、マロン酸、サリチル酸、ｐ−アミノサリチル酸、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、アスコルビン酸、マレイン酸、スルホン酸、ホスホン酸、過塩素酸、硝酸、ギ酸、プロピオン酸、グルコン酸、乳酸、酒石酸、ヒドロキシマレイン酸、ピルビン酸、フェニル酢酸、安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、亜硝酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、エチレンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフチルスルホン酸、スルファニル酸、カンファースルホン酸、キナ酸、マンデル酸、ｏ−メチルマンデル酸、水素−ベンゼンスルホン酸、ピクリン酸、アジピン酸、Ｄ−ｏ−トリル酒石酸、タルトロン酸、α−トルイル酸、（ｏ、ｍ、ｐ）−トルイル酸、ナフチルアミンスルホン酸，および当業者に周知の他の鉱酸またはカルボン酸である。塩は、従来のやり方で塩を産生するための充分量の望ましい酸と、遊離塩基形態とを接触させることによって調製される。
【００７３】
本発明のこの側面の一態様において、本発明のＮｏｘ１インヒビターペプチドは、非ペプチド部分と抱合されてもよい。ペプチドとカップリングされるポリマー分子は、典型的には、約３００〜１００，０００Ｄａ（例えば約５００〜２０，０００Ｄａ等）の範囲の分子量を有する天然または合成のホモポリマーまたはヘテロポリマー等の、あらゆる好適なポリマー分子であってもよい。好適なポリマー分子の例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）等のポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）を含むポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、分枝状ＰＥＧ、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシラート、ポリ（ビニルピロリドン）、エチレン−無水マレイン酸共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体、カルボキシメチル−デキストランを含むデキストラン、または、免疫原性を低下するのに、および／または、機能的in vivo半減期および／または血清半減期を増大するのに好適なあらゆる他のバイオポリマーからなる群から選択されるポリマー分子を含む。ポリマー分子の他の例は、ヒトアルブミンまたは他の豊富な血漿タンパク質等である。一般に、ポリアルキレングリコールに由来するポリマーは、生体適合性、無毒性、非抗原性、非免疫原性であり、様々な水可溶性特性を有し、生体から容易に排出される。
【００７４】
本発明のＮｏｘ１インヒビターペプチドはまた、医薬送達システムおよび／または徐放システムにも組み込まれ得る。用語「送達システム」は、本発明のペプチドがともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤または担体に関する。これらの化粧品用または医薬用担体は、例えばこれらに制限されないが、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油、ひまし油、ポリソルベート、ソルビタンエステル、硫酸エーテル、スルファート、ベタイン、配糖体、マルトシド、脂肪アルコール、ノノキシノール、ポロキサマー、ポリオキシエチレン、ポリエチレングリコール、デキストロース、グリセロール、ジギトニンおよび類似物等の石油、動物、植物または合成物を起源とするものを含む、水、油または界面活性剤等の液体であり得る。E.W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」において、希釈剤、アジュバントまたは賦形剤は、適切な担体として記載されている。用語「徐放」は、化合物の送達システムに関する従来の意味で使用され、ある期間の間に化合物の漸次的放出を、必ずではないが好ましくは、ある期間にわたる相対的に一定の化合物放出レベルを提供する。送達または徐放システムの例は、Ｎｏｘ１インヒビターペプチドのより多くの透過を達成するために、および／またはその薬物動態学的および薬力学的特性を改善するために加えられ得る、リポソーム、混合リポソーム、オレオソーム、ニオソーム、エトソーム(ethosome)、ミリ粒子(milliparticle)、ミクロ粒子、ナノ粒子および固体脂質ナノ粒子、ナノ構造の脂質担体、スポンジ、シクロデキストリン、ベシクル、ミセル、界面活性剤の混合ミセル、界面活性剤−リン脂質混合ミセル、ミリスフェア(millisphere)、ミクロスフェアおよびナノスフェア、リポスフェア(liposphere)、ミリカプセル(millicapsule)、マイクロカプセルおよびナノカプセル、ならびに、マイクロ−エマルションおよびナノ−エマルション等である。好ましい送達または徐放システムは、リポソーム、界面活性剤−リン脂質混合ミセルおよびミクロ−エマルションであり、より好ましくは逆ミセルの内部構造を有する油中水ミクロ−エマルションである。
【００７５】
光防護または抗老化剤として使用される場合、本発明の組成物はまた、特に、脂肪性物質、有機溶媒、増粘剤、軟化剤、抗酸化剤、乳白剤、安定剤、皮膚軟化剤、ヒドロキシ酸、消泡剤、保湿剤、ビタミン、香料、防腐剤、界面活性剤、充填剤、金属イオン封鎖剤(sequestering agent)、ポリマー、噴射剤、塩基性化または酸性化剤、色素、着色剤、または、特にエマルション形態の日焼け止め／サンスクリーン組成物の製造のために化粧品中に通常処方されるあらゆる他の成分から選択される従来の化粧品用添加剤およびアジュバントを含んでもよい。
【００７６】
本発明の方法および組成物は、疾患の処置のための他の組成物および手順と組み合わせて使用され得る。例えば腫瘍は、本発明の方法および組成物と組み合わせた外科的処置、放射、化学治療または免疫治療により従来どおり処置され得る。次に、本発明の方法および組成物はまた、微小転位の休止状態を延ばすために、および、あらゆる残りの原発腫瘍を安定化および阻害するために、続けて患者へ投与もされ得る。本発明の組成物はまた、他の抗血管新生化合物またはタンパク質、フラグメント、抗血清、他の抗血管新生タンパク質の受容体アゴニスト、受容体アンタゴニストと組み合わせてもよい。加えて、本発明の新規Ｎｏｘ１インヒビターペプチドは、治療用組成物を形成するために、薬学的に許容し得る賦形剤、および任意に生分解性ポリマー等の徐放マトリックスと組み合わせられ得る。
【００７７】
加えて、本発明の組成物は、他の治療とともに、例えば化学治療または放射治療レジメン等と併せて投与されてもよい。本発明の新規Ｎｏｘ１インヒビターペプチドと組み合わせられ得る化学治療剤の例は、アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード、エチレンイミン化合物、スルホン酸アルキル、および、ニトロソウレア、シスプラチンおよびダカルバジン等のアルキル化作用を有する他の化合物等；代謝拮抗剤、例えば葉酸、プリンまたはピリミジンアンタゴニスト等；有糸分裂インヒビター、例えばビンカアルカロイドおよびポドフィロトキシンの誘導体等；細胞毒性抗生物質およびカンプトテシン誘導体を含む。好ましい化学治療剤または化学治療は、アミホスチン（エチヨル(ethyol)）、シスプラチンおよび／または他の白金化合物を含み、好ましくはカルボプラチンおよび／またはオキサリプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ドキソルビシンリポ（ドキシル）、ゲムシタビン（ジェムザール）、ダウノルビシン、ダウノルビシンリポ（daunoxome）、プロカルバジン、マイトマイシン，シタラビン、エトポシド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレノマイシン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテレ）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、ＣＰＴ−１  １、１０−ヒドロキシ−７−エチル−カンプトテシン（ＳＮ３８）、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、イリノテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペグアスパラガーゼ、ペントスタチン，ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、および、それらの組み合わせを含む。
【００７８】
アテローム性動脈硬化、ステント挿入後の再狭窄および／または高血圧の処置または管理のために使用される場合、本発明のＮｏｘ１インヒビターペプチドは、単独で使用されるか、または、アテローム性動脈硬化、ステント挿入後の再狭窄および／または高血圧の処置および／または管理のために使用される他の薬物と組み合わせて使用されるかのいずれかであってもよい。かかる他の薬物は、これらに制限されないが、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、プラスミンおよびウロキナーゼなどの血栓溶解剤、組織因子プロテアーゼインヒビター（ＴＦＰＩ）、線虫から抽出された抗凝固性タンパク質（ＮＡＰ）などの抗血栓剤、メタロプロテアーゼインヒビター、抗炎症剤、インスリン、インスリン分泌促進物質またはインスリン増感剤を含む抗糖尿病剤または抗高血糖剤、ＳＧＬＴ−２インヒビター、ＡＴ１−受容体アンタゴニスト、ＨＭＧ−Ｃｏ−Ａレダクターゼインヒビター、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビター、カルシウムチャネルブロッカー、アルドステロンシンターゼインヒビター、アルドステロンアンタゴニスト、アンジオテンシン変換酵素／中性エンドペプチダーゼ（ＡＣＥ／ＮＥＰ）二重インヒビター、エンドセリンアンタゴニスト、利尿剤などを含む。
【００７９】
抗老化剤または光防護剤として使用されるとき、本発明のＮｏｘ１インヒビターペプチドは、１種または２種以上の植物由来品(botanical)／植物抽出物(plant extract)；チオジプロピオン酸（ＴＤＰＡ）およびそのエステル；レチノイド（例えば全トランス型レチノイン酸、９−ｃｉｓレチノイン酸、フィタン酸など）；ヒドロキシ酸（アルファ−ヒドロキシ酸およびベータ−ヒドロキシ酸を含む）、サリチル酸およびサリチラート；剥離剤（例えばグリコール酸、３，６，９−トリオキサウンデカン二酸など）、エストロゲンシンセターゼを刺激する化合物（例えばカフェインおよび誘導体等）；５アルファ−レダクターゼ活性を阻害することが可能な化合物（例えばリノレイン酸、リノール酸、フィナステリドおよびそれらの混合物等）；バリア機能を強化する剤（例えばセラミド、グリセリド、コレステロールおよびそのエステル、アルファ−ヒドロキシおよびオメガ−ヒドロキシ脂肪酸およびそれらのエステルなど）；コラゲナーゼインヒビター；およびエラスターゼインヒビターなど、と組み合わせてもよい。
【００８０】
抗老化または光防護組成物はまた、以下：皮膚透過強化剤、皮膚軟化薬、皮膚プランパー(skin plumper)、光ディフューザー、サンスクリーン、剥離剤および抗酸化剤の１種または２種以上をも含んでもよい。皮膚軟化薬は、皮膚の滑らかさを強化し、細線および粗いしわの出現を低下させる機能的な利益を提供する。これらは、例として、ミリスチン酸イソプロピル、ワセリン、ラノリン酸イソプロピル、シリコーン（例えばメチコン、ジメチコン等）、油、鉱油、脂肪酸エステル等またはこれらのあらゆる混合物を含む。皮膚軟化薬は、好ましくは、組成物の総重量の約０．１ｗｔ％から約５０ｗｔ％まで存在してもよい。
【００８１】
皮膚プランパーは、皮膚に対してコラーゲン強化剤として働く。好適かつ好ましい皮膚プランパーの例は、パルミトイルオリゴペプチド等である。他の皮膚プランパーは、コラーゲンおよび／または他のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の強化剤である。存在する場合、皮膚プランパーは、組成物の総重量の約０．１ｗｔ％から約２０ｗｔ％まで含んでもよい。光ディフューザーは、皮膚の表面オプトメトリクス(optometrics)を変化させる粒子であり、例えば線およびしわ等を視覚的にぼやかせ、和らげる。本発明において使用され得る光ディフューザーの例は、これらに限定されないが、窒化ホウ素、マイカ、ナイロン、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリウレタン粉末、絹雲母、シリカ、シリコーン粉末、タルク、Teflon(登録商標)、二酸化チタン、酸化亜鉛等またはこれらのあらゆる組み合わせを含む。存在する場合、光ディフューザーは、組成物の総重量の約０．０１ｗｔ％から約２０ｗｔ％まで存在してもよい。
【００８２】
有害な紫外線から皮膚を防護するためのサンスクリーンもまた含まれてもよい。好ましいサンスクリーンは、オクトクリレン、アボベンゾン（Parsol 1789）、メトキシ桂皮酸オクチル、サリチル酸オクチル、オキシベンゾン、ホモシラート、ベンゾフェノン、カンファー誘導体、酸化亜鉛および二酸化チタン等の、幅広いＵＶＢおよびＵＶＡの防護を有するものである。存在する場合、サンスクリーンは、組成物の約０．０１ｗｔ％から約７０ｗｔ％まで含んでもよい。
【００８３】
好適な剥離剤は、例えばアルファ−ヒドロキシ酸、ベータ−ヒドロキシ酸、オキサ酸、オキサ二酸等、および、それらのエステル、無水物および塩等のそれらの誘導体である。好適なヒドロキシ酸は、とりわけ、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、２−ヒドロキシアルカン酸、マンデル酸、サリチル酸およびそれらの誘導体を含む。好ましい剥離剤は、グリコール酸である。存在する場合、剥離剤は、組成物の約０．１ｗｔ％から約８０ｗｔ％まで含んでもよい。
【００８４】
抗酸化剤は、数ある中でも、皮膚からフリーラジカルを除去し、環境アグレッサー(environmental aggressor)から皮膚を防護するように機能する。本組成物において使用されてもよい抗酸化剤の例は、アスコルビン酸およびその誘導体／エステル等の、フェノール性ヒドロキシ官能性を有する化合物；ベータ−カロテン；カテキン；クルクミン；フェルラ酸誘導体（例えばフェルラ酸エチル、フェルラ酸ナトリウム等）；没食子酸誘導体（例えば没食子酸プロピル等）；リコペン；還元酸；ロスマリン酸；タンニン酸；テトラヒドロクルクミン；トコフェロールおよびその誘導体；尿酸；またはそれらのあらゆる混合物を含む。他の好適な抗酸化剤は、グルタチオン、リポ酸、チオグリコール酸および他のスルフヒドリル化合物等の還元型または非還元型のいずれかで、１つまたは２つ以上のチオール官能性（−ＳＨ）を有するものである。抗酸化剤は、亜硫酸水素塩、メタ重亜硫酸塩、亜硫酸塩等の無機塩および酸、または、硫黄を含有する他の無機塩および酸であってもよい。
【００８５】
他の従来の添加剤は、トコフェロールおよびアスコルビン酸等のビタミン；モノパルミチン酸アスコルビル等のビタミン誘導体；ヒドロキシアルキルセルロース等の増粘剤；ゲル化剤；ベントナイト、スメクタイト、ケイ酸アルミニウムマグネシウムおよびケイ酸マグネシウムリチウム等の構造化剤；ＥＤＴＡ等の金属キレート剤；酸化亜鉛および二酸化チタン等の顔料；着色剤；皮膚軟化薬；湿潤剤を含む。
【００８６】
本発明はまた、Ｎｏｘ１遺伝子またはそのｍＲＮＡの一部分または一部またはフラグメント、具体的には、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ１アイソフォームの長い変異体、ＮＡＤＰＨオキシダーゼアクチベーター１アイソフォーム３、ＮＡＤＰＨオキシダーゼオーガナイザー１アイソフォームにまでも及ぶ。特に、本発明は、本発明のペプチドをコードする核酸配列に関する。「一部分または一部またはフラグメント」は、少なくとも約８ヌクレオチド、または好ましくは約１２〜１７ヌクレオチド、またはより好ましくは少なくとも約１８〜２５ヌクレオチドの最小サイズを有するものとして定義され、少なくとも約５０００ヌクレオチドの最大サイズを有してもよい。５０００ヌクレオチドより長い遺伝的均等物もまた採用されてもよい。この定義は、８〜５０００ヌクレオチドの範囲の全サイズを含む。よって、この定義は、少なくとも１２、１５、２０、２５、４０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００または１０００ヌクレオチドの核酸、または、これらの数値の間のヌクレオチド数（例えば１３、１６、２３、３０、２８、５０、７２、１２１ヌクレオチドなど）のいずれかを有する核酸または５００ヌクレオチドより多いか、または５００との間のヌクレオチド数のいずれかを有する核酸を含む。本発明は、本発明のＮｏｘ１インヒビターペプチドをコードする核酸、それらの相補体または機能的均等物に由来する少なくとも８ヌクレオチドを有する全ての新規核酸を含む。最も好ましい態様において、本発明は、配列番号２〜４２のペプチド、その類縁体または保存的変異体をコードする核酸を提供する。さらにまた、本発明は、本発明のＮｏｘ１インヒビターペプチドをコードする核酸を含むプラスミドまたはベクターに関連する。本発明の核酸、プラスミドおよびベクターは、本明細書中で言及された病気のいずれかを処置するために使用されてもよい。
【００８７】
本発明のペプチドは、１種または２種以上の検出可能な標識により標識されてもよい。標識は、直接的またはリンカーの使用によってのいずれかで、ペプチドへ抱合されてもよい。本発明のペプチドが直接標識へ抱合されるとき、直接標識は、好適には、自然な状態で検出可能である実体である。例えば、直接標識が、色素ゾル、金属ゾル（例えばコロイド金等）および着色されたラテックス粒子等の着色された粒子である場合、これは、肉眼で見えるものであっても、光学フィルターの助けにより見えるようになるものであってもよい。直接標識が蛍光標識である場合、これは、例えばＵＶ光等の、蛍光発光を促進するために適用される刺激に供されてもよい。好適な検出可能な物質は、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、ルミネセンス材料および放射性材料を含む。
【００８８】
本発明の一態様において、本発明のＮｏｘ１インヒビターペプチドは、がん等の、特にヒトにおけるがん等の疾患部位へ選択的に送達するための１種または２種以上の検出剤、診断剤または治療剤へ抱合されてもよい。抱合は、上に記載の抱合と類似して、直接的またはリンカーの使用のいずれかによるものであってもよい。疾患の検出、診断および治療の対応する方法は、ペプチドがかかる検出、診断および治療方法における使用のためのものであるから、本発明の対応する側面である。検出剤、診断剤および治療剤は、天然に存在するものであっても、修飾されたものであっても、合成されたものであってもよい。治療剤は、ヒト疾患の経路に関わるあらゆる生物学的過程を促進または阻害してもよい。疾患部位へ選択的に送達するための１種または２種以上の検出剤、診断剤または治療剤へ抱合される本発明のペプチドを使用する、検出、診断および治療の方法は、in vitroにて、特に対象から得られた試料に対して、または、in vivoにて、試験または処置される対象（患者）の体内で行われてもよい。例えば、添加剤は、がんを処置するのに有用であると当該技術分野において承認されている治療剤であり得る。ペプチドと細胞との間の特異的結合相互作用は、治療剤が、哺乳動物患者におけるがん性細胞を正確に標的にするのを可能にさせる。この使用に好適な治療剤は、アポトーシス、細胞死、細胞分化、細胞静止および／または抗血管新生を誘導するか、または他の方法で、がん細胞の生存率および／または成長率に影響を及ぼす、あらゆる化合物を含んでもよい。
【００８９】
本発明は、さらに、固相または液相合成により本発明のＮｏｘ１インヒビターペプチドを調製する方法を提供し、ここで該方法は、任意に、細胞における該ペプチドの蓄積を増大させる剤を抱合または付着するステップを含む。
送達方法
【００９０】
ひとたび処方されると、本発明の組成物（本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを含有する）は、様々な知られている経路および技術を使用してin vivoで対象へ送達され得る。例えば、組成物は、注射用の溶液、懸濁液またはエマルションとして提供され得、従来の針およびシリンジを使用するか、または液体ジェット注射システムを使用して、非経口、皮下、表皮、皮内、筋肉内、動脈内、腹腔内、静脈内の注射を介して投与され得る。組成物はまた、例えば経鼻的、気管内的、経腸的、経直腸的または経膣的に、皮膚または粘膜組織へ局所的にも投与され得るか、または、呼吸器または肺への投与に好適な超微粒子スプレーとしても提供され得る。投与の他のやり方は、経口投与、坐薬、舌下投与、および、能動的または受動的経皮送達技術を含む。
送達レジーム
【００９１】
ペプチド／ポリヌクレオチドの投与は、上に記載のあらゆる好適な方法によるものであってもよい。ペプチドの好適な量は、経験的に決定されてもよいが、典型的には以下に与えられる範囲である。各ペプチドの単回投与は、患者にとって有益な効果を有するのに充分なものであり得るが、ペプチドが１回より多く投与される場合に有益であり得、そのケースにおいて、典型的な投与レジームは、例えば６ヶ月間毎月２〜４週間週１回または２回、または、４〜６ヶ月間毎月１週間１日１回等であり得ることが理解されるであろう。理解されるように、各ペプチドまたはポリヌクレオチド、または、ペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの組み合わせは、単一で、または、組み合わせて、患者へ投与されてもよい。
【００９２】
投与のための投薬量は、組成物の性質、投与経路、および、投与レジームのスケジュールおよびタイミングを含む多くの因子に依存するであろう。本発明の分子または分子の組み合わせの好適な用量は、投与あたり１μｇ〜最大１０μｇ、〜最大１５μｇ、〜最大２０μｇ、〜最大２５μｇ、〜最大３０μｇ、〜最大３５μｇ、〜最大５０μｇ、〜最大１００μｇ、〜最大５００μｇまたはそれ以上である。好適な用量は、１５μｇ未満であってもよいが、少なくとも１ｎｇ、または少なくとも２ｎｇ、または少なくとも５ｎｇ、または少なくとも５０ｎｇ、または少なくとも１００ｎｇ、または少なくとも５００ｎｇ、または少なくとも１μｇ、または少なくとも１０μｇであってもよい。本発明のいくつかの分子では、使用される用量がより高い、例えば最大１ｍｇ、最大２ｍｇ、最大３ｍｇ、最大４ｍｇ、最大５ｍｇまたはそれ以上であってもよい。かかる用量は、選択された経路による投与にとって適切な容積を与えるのに好適な濃度での液体製剤として提供されてもよい。
【００９３】
例
下表５に列記されたように、ＡおよびＢと名付けられたさらなる２種の本発明のペプチドを試験し、対照ペプチドＣと比較した。
【００９４】
ペプチドＡ（配列番号４１）は、Ｎ末端であるｔａｔ配列〜配列番号２０の配列を含む。ペプチドＢ（配列番号４２）は、Ｎ末端であるｔａｔ配列〜配列番号２１の配列を含む。ペプチドＣ（配列番号４３）は、対照ペプチド（またはスクランブルペプチド）である。
【表５】
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【００９５】
各ペプチドの毒性効果を、トリパンブルー排除アッセイおよびＭＴＴアッセイを使用し、正常な初代ヒトケラチノサイトに対して、最初に試験した。図１Ａおよび１Ｂに図示されるとおり、５０μＭ未満のペプチドによる処理後、有意な毒性は観察されなかった。
Ｎｏｘ１インヒビターペプチドは、以下の結果から実証されるように、細胞内ＲＯＳレベルを効果的に減少させることが見出された。
【００９６】
１０または５０μＭのペプチドＡ、ＢおよびＣにより２４時間処理された初代ヒトケラチノサイトにおけるＲＯＳレベルを、ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦ−ＤＡプローブを使用してアッセイした（図２Ａ）。ＲＯＳレベルにおける有意な低減が、Ｎｏｘ１インヒビターペプチドＡおよびＢにより処理された細胞において観察された。これらのペプチドの特異性を検査するために、ＲＯＳレベルを、Ｎｏｘ１がＮｏｘファミリーの唯一の活性メンバーであるヒト結腸腺癌ＨＴ２９細胞株において査定した。ＨＴ２９細胞におけるＲＯＳレベルの測定によって、Ｎｏｘ１インヒビターペプチドＡおよびＢによる処理が、ＲＯＳレベルに有意な低下をもたらすことが示された。このことから、Ｎｏｘ１活性に対するこれらのペプチドの特異的な阻害効果が示唆される（図２Ｂ）。
【００９７】
これらのペプチドの特異性を検査するために、内在性Ｎｏｘ１およびＮｏｘ２タンパク質の発現を、Ｎｏｘ１およびＮｏｘ２に対するｓｈＲＮＡのレンチウイルスを媒介した発現を使用して阻害させた。ｓｈＮｏｘ１およびｓｈＮｏｘ２はともに、Ｎｏｘ１およびＮｏｘ２夫々の発現を、８０％を超えて安定的に阻害した（図３Ａ）。次に、ｓｈＣｔｒｌ、ｓｈＮｏｘ１またはｓｈＮｏｘ２が形質導入されたケラチノサイトをペプチドＡにより処理した。ＲＯＳレベルの測定によって、ペプチドＡによる処理が、ｓｈＮｏｘ１が形質導入された細胞におけるＲＯＳの定常状態レベルに対して効果がなかったことが明らかにされ、よって、ペプチドＡが、極めて高い（１００％近い）効率および特異性をもって、Ｎｏｘ１依存性ＲＯＳ発生を遮断することが示された（図３Ｂ）。さらに、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を、ペプチドＡでまたはペプチドＡ無しで処理された、ｓｈＣｔｒｌおよびｓｈＮｏｘ１が形質導入された細胞において測定した（図３Ｃ）。同じように、低減されたＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性は、ｓｈＮｏｘ１が形質導入された細胞、ペプチドＡにより処理された細胞、および、ｓｈＮｏｘ１が形質導入されペプチドＡにより処理された細胞においても見出され、それによって、Ｎｏｘ１活性を遮断するペプチドＡの効率および特異性が実証された。
【００９８】
例１−Ｎｏｘ１インヒビターペプチドのin vivoでの評価
Ｎｏｘ１インヒビターペプチドＡの光防護効果を評価するために、このペプチドが、マウスおよびヒトのケラチノサイトにおいてＮｏｘ１により誘導されるＲＯＳ発生に対する阻害効果を有するかを最初に検査した（図４）。結果は、マウスおよびヒトのケラチノサイトにおいて、Ｎｏｘ１により誘導されるＲＯＳ発生およびＮｏｘ活性に対するペプチドＡの同様の予防効果を示した。
【００９９】
マウス皮膚におけるＮｏｘ１活性に対するペプチドＡの効果を検査するために、ＳＫＨ−１マウスを、種々の用量のペプチドＡにより局所的に処理した（図５Ａ）。結果は、ペプチドＡが、３および１２ｍｇ／ｋｇで投与されたとき、最大３日間、効率的にＮｏｘ活性を阻害したことを示した。次に、ＵＶＢで照射されたマウスに対するペプチドＡの効果を試験した（図５Ｂ）。結果は、照射１０分前のペプチドＡによる局所的処理が、３および１２ｍｇ／ｋｇで処理されたマウスにおいて、ＵＶＢにより誘導されるＮｏｘ活性を効率的に遮断することを示した。
【０１００】
ペプチドＡの光防護効果を検査するために、良性の乳頭腫および悪性のＳＣＣを含む皮膚腫瘍を発症させる光発癌の研究において明確に定義されたマウスモデルであるＳＫＨ−１無毛マウスを使用する、ＵＶＢにより誘導される扁平上皮癌（ＳＣＣ）誘導に対するペプチドＡ投与の効果。このモデルの妥当性は、これらのマウスにおけるＵＶＢにより誘導される発癌と、ヒト皮膚におけるＵＶ発癌経路との間に驚くべき類似点により例証される。ＳＫＨ−１無毛マウスによって、慢性的なＵＶＢ照射に続く皮膚腫瘍発生についての、用量、経時変化および活性スペクトルの極めて貴重なデータが得られた。この研究において、ペプチドＡ（３ｍｇ／ｋｇ）を、週３回、各ＵＶＢ曝露１０分前に投与した。結果は、ペプチドＡによる処理が、腫瘍数および腫瘍サイズにおいて、夫々２．３および２．９倍の低減をもたらすことを示した（図６Ａおよび６Ｂ）。さらに、ペプチドＡにより処理されたマウスにおける腫瘍の５７％は５ｍｍ３未満の容積であったのに対して、対照ペプチドＣにより処理されたマウスにおいてはたったの８％であった（図６Ｃ）。
【０１０１】
マウス腫瘍におけるＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の測定は、Ｎｏｘ活性の予防におけるペプチドＡの有意な効率を示した（図７）。ＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性は、ビヒクル処理マウスと比較して、非腫瘍担持皮膚において７０％、およびペプチドＡにより処理されたマウスから単離された腫瘍において５４％低下した（図７）。
例２−がん治療におけるＮｏｘ１インヒビターペプチドの効果
【表６】
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【０１０２】
例２．１：がん細胞株に対するin vitroでの効果
Ｎｏｘ１阻害の効果を、表６に列記した種々の細胞株で査定する。細胞増殖、細胞周期進行およびアポトーシスを、非処理細胞と、Ｎｏｘ１インヒビターペプチドにより処理した細胞との間で比較し得る。
【０１０３】
例２．２：ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの細胞の異種移植
細胞をトリプシン処理し、ＤＰＢＳで洗浄し、２５％のMatrigel（BD Biosciences）を有するＤＰＢＳ中に再懸濁する。２×１０６個の細胞を、６〜８週齢(weeks old)のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（The Jackson Laboratory）へ皮下注射する。各細胞株につき、マウスを２群に分ける：１つは、ビヒクルにより処理し、他は、Ｎｏｘ１インヒビターペプチドにより処理する。腫瘍形成および腫瘍成長を、最大２ヶ月間監視する。各腫瘍を切除し、測定し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン中に包埋し、Ｈ＆Ｅ染色で処理する。増殖率およびアポトーシス率を評価する。
【０１０４】
例２．３：マウスモデル
皮膚腫瘍に対するＮｏｘ１インヒビターペプチドの効果を、以下のモデルを使用して試験する：Patch＋／−マウスにおいて、自然発生およびＵＶＢにより誘導されるＢＣＣ；ＳＫＨ−１において、ＵＶＢにより誘導されるＳＣＣ；および、ＢＲＡＦマウスにおいて、自然発生による黒色腫の形成。各モデルにつき、マウスを２群に分ける：１つは、ビヒクルにより処理し、他は、Ｎｏｘ１インヒビターペプチドにより処理する。
【０１０５】
例３−炎症性および自己免疫疾患に対するＮｏｘ１インヒビターペプチドの効果
【表７】
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【０１０６】
例３．１：in vitroでの効果
Ｎｏｘ１インヒビターペプチドを関節炎に対し試験し、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）に由来するマクロファージを、Ｎｏｘ１インヒビターペプチドの存在下および非存在下において活性化させる。種々の炎症性メディエーター（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＩＬ−１０）の分泌を検出する。
Ｎｏｘ１インヒビターペプチドの効果をまた、Ｎｏｘ１インヒビターペプチドの存在下および非存在下において試験するＩｇＥ−ＤＮＰにより誘導される炎症の査定により喘息についても試験する、。
【０１０７】
例３．２：in vivoでの効果
関節炎のラットモデルを、ペプチドによる臨床スコアの向上および骨破壊予防を評価するため、種々の用量のＮｏｘ１インヒビターペプチドにより処理する。
さらに、喘息、ラット耳過敏症におけるＮｏｘ１インヒビターペプチドの効率を、Ｎｏｘ１インヒビターペプチドの存在下および非存在下において試験する。
【０１０８】
例４−血管新生に対するＮｏｘ１インヒビターペプチドの効果
【表８】
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【０１０９】
In vitroでの正常な血管新生に対するＮｏｘ１インヒビターペプチドの効果を評価するために、ＨＵＶＥＣを使用した内皮細胞移動および管様構造形成を試験する。
In vivoでの正常な血管新生に対するＮｏｘ１インヒビターペプチドの効果を評価するために、ビヒクルまたはＮｏｘ１インヒビターペプチドにより処理されたＣ５７ＢＬ／６およびＳＫＨ−１マウスモデルにおける皮膚血管新生を検査する。
腫瘍の血管新生に対するＮｏｘ１インヒビターペプチドの効果を評価するために、異種移植モデルを使用し得る。表６に列記された様々な細胞株をマウスへ注射し得、次に、血管新生を、ビヒクルおよびＮｏｘ１インヒビターペプチドにより処理されたマウス間で比較し得る。
【０１１０】
例５−血管および心血管障害に対するＮｏｘ１インヒビターペプチドの効果
【表９】
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【０１１１】
血管腫に対するＮｏｘ１インヒビターペプチドの効果、マウスポリオーマウイルス（ＰｙｍＴ）のミドルＴ抗原による内皮細胞の形質転換を、Ｎｏｘ１インヒビターペプチドの存在下および非存在下において試験する。
また、Ｎｏｘ１インヒビターペプチドの効果も高血圧、Ｎｏｘ１インヒビターペプチドの存在下および非存在下におけるアンジオテンシンＩＩの注入後の高血圧誘導に対して査定する。。
【０１１２】
例６−神経変性障害に対するＮｏｘ１インヒビターペプチドの効果
【表１０】
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【０１１３】
パーキンソンおよびアルツハイマー病に対するＮｏｘ１インヒビターペプチドの効果を評価するために、ｉＰＳ技術によって皮膚細胞から派生させた神経細胞を使用する。患者および健常な皮膚に由来する神経細胞のＲＯＳレベルに対するＮｏｘ１インヒビターペプチドの効果もまた試験する。
Ｎｏｘ１インヒビターペプチドの効果を、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のマウスモデルに対し査定する。実際には、ＳＪＬマウスの、ＰＬＰ１３９−１５１ペプチドにより誘導されたＥＡＥモデルを使用する。
【０１１４】
例７−皮膚障害に対するＮＯＸ１インヒビターの効果
【表１１】
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Ｎｏｘ１インヒビターペプチドの効果を、アトピー性皮膚炎、Ｎｏｘ１インヒビターペプチドの存在下および非存在下でＩｇＥにより誘導され活性化されたケラチノサイトによる炎症性メディエーターの分泌に対し査定する。ＩｇＥにより誘導された耳過敏症もまた、Ｎｏｘ１インヒビターペプチドの存在下および非存在下で試験する。
【０１１５】
白斑に対するＮｏｘ１インヒビターペプチドの効果を評価するために、メラノサイトの脱離を、再構築された表皮および初代メラノサイトを使用して試験し得る。
最後に、Ｎｏｘ１インヒビターペプチドの抗老化効果を、初代ケラチノサイトおよび再構築された表皮において試験する。分化および老齢化マーカーを、ビヒクルまたはＮｏｘ１インヒビターペプチドにより処理された細胞間で比較する。
【０１１６】
例８−皮膚老化に対するＮＯＸ１インヒビターペプチドの効果
Ｎｏｘ１インヒビターペプチドＡ（配列番号４１）の抗老化効果を査定するために、ＸＰＣ欠損マウスにおける加速老化を最初に評価した。この目的のために、プロジェリン、早老症候群に関与するラミンＡタンパク質のトランケート型の発現を、４月齢（若年）および１．５年齢（老年）の非欠損および欠損ＸＰＣマウス（夫々ＸＰＣ＋／＋およびＸＰＣ−／−）において評価した（図９Ａおよび９Ｂ）。結果は、プロジェリンレベルが年齢(age)とともに増大したこと、および、その発現が野生型マウスよりＸＰＣ−／−マウスの方が高いことを示した。
【０１１７】
この表現型がＮＡＤＰＨオキシダーゼの過剰活性化に関係するか検査するため、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性を、マウス皮膚において最初に測定した（図１０Ａ）。結果は、ＮＯＸ活性が年齢とともに増大したこと、および、それもまた、ＸＰＣ−／−マウスの方が対応する野生型より高いことを明らかにした。いくつかの研究が、ミトコンドリア構造の増大した組織崩壊、ミトコンドリア酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）機能における減退および老化に伴うｍｔＤＮＡ突然変異の蓄積を含む、ミトコンドリアおよびミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の広範囲の変質を明らかにしていることから、次に、ＯＸＰＨＯＳタンパク質の発現レベルを、若年および老年のＸＰＣ−／−およびＸＰＣ＋／＋マウス間で比較した（図１０Ｂ）。結果は、対応する若年のものと比較して、老年の野生型マウスにおいて、複合体Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの発現の顕著な低減を示した。さらに、若年ＸＰＣ−／−におけるこれらの複合体の発現レベルは、老年野生型マウスと同程度に低かった。このことは、ＸＰＣ−／−マウスにおける早期老化と相関する。
【０１１８】
ＸＰＣ欠損マウスにおける早期老化に対するＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の役割を調査するため、１月齢のＸＰＣ＋／＋およびＸＰＣ−／−マウスを、３ヶ月間週３回、ＮＯＸ１インヒビターペプチドまたはビヒクルにより処理した。次に、マウス表皮細胞におけるプロジェリン発現（図１１）、ＯＸＰＨＯＳタンパク質発現（図１２）および代謝プロファイルを評価した。結果は、ＮＯＸ１活性の阻害が、ＸＰＣ欠損マウスにおいて加速老化を減少させることを示した。実際、ＮＯＸ１の阻害は、プロジェリンのタンパク質発現における増大を遮断し（図１１）、ＯＸＰＨＯＳ複合体Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの発現における低減を抑制した（図１２）。ＸＰＣノックダウンにより誘導された代謝変化に対するＮＯＸ１ペプチドインヒビターの効果についての概念をわかるようにするため、プロテオミクスアプローチを使用した。結果は、ペントースリン酸経路、ＴＣＡサイクル、ミトコンドリアＯＸＰＨＯＳおよび脂肪酸β酸化に関するいくつかのタンパク質の発現において有意に低下することを示した。ＮＯＸ１インヒビターペプチドによるマウスの処理によって、代謝変化におけるＸＰＣ欠損の効果が排除された。
【０１１９】
これらの実験の全ては、配列番号２で表されるＮｏｘ１インヒビターペプチドを用いても行われ、同じ結果が得られている。
要するに、これらの結果は、ＮＯＸ１インヒビターペプチドＡならびに配列番号２で表されるＮｏｘ１インヒビターペプチドが、ＸＰＣ欠損により誘導される早期老化を遮断することを示した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ−Ｂ】
0006488237.tif 000021
【図３Ａ】
0006488237.tif 000022
【図３Ｂ−Ｃ】
0006488237.tif 000023
【図４Ａ−Ｂ】
0006488237.tif 000024
【図４Ｃ】
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【図５Ａ−Ｂ】
0006488237.tif 000026
【図６Ａ−Ｂ】
0006488237.tif 000027
【図６Ｃ】
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【図７】
0006488237.tif 000029
【図８Ａ−Ｂ】
0006488237.tif 000030
【図９Ａ−Ｂ】
0006488237.tif 000031
【図１０Ａ−Ｃ】
0006488237.tif 000032
【図１１Ａ−Ｂ】
0006488237.tif 000033
【図１２Ａ−Ｂ】
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【配列表】
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