(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンジダ・インファンティコーラ（Candida infanticola）菌株を用いて炭化水素または脂肪酸を含む基質からジオイック酸類（dioic acids）を生産する方法であって、
前記カンジダ・インファンティコーラ菌株が、カンジダ・インファンティコーラ野生型菌株（Candida infanticola ＤＳ０２；ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）、カンジダ・インファンティコーラ突然変異菌株（Candida infanticola ＬＣ−ＤＡ０１；ＫＣＴＣ１３０９９ＢＰ）、カンジダ・インファンティコーラ形質転換菌株（Candida infanticola；ＫＣＴＣ１３１０３ＢＰ、ＫＣＴＣ１３１０４ＢＰ、ＫＣＴＣ１３１０５ＢＰ、ＫＣＴＣ１３１０６ＢＰ）またはこれらの組合わせである、前記方法。
【請求項２】
前記ジオイック酸類を生産する方法が、
（Ａ）初期細胞集団を確保するための炭化水素または脂肪酸を含む基質を添加した酵母エキスグルコース培地（yeast extract glucose medium;YG medium）でカンジダ・インファンティコーラ菌株を培養する段階と、
（Ｂ）前記段階（Ａ）の培養液に炭化水素、脂肪酸またはこれら誘導体を含む炭素源または基質を添加して、ω酸化（ω-oxidation）反応を誘導する段階と、
（Ｃ）前記段階（Ｂ）の反応液に炭化水素または脂肪酸を含む基質及びグルコースを添加しながら培養する段階と、
を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記段階（Ａ）の培養が、３０±５℃、溶存酸素量１０％以上の条件で２０〜５０時間進行する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記段階（Ｂ）の反応が、０．５〜５％の炭素源で１０〜３０時間進行する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記段階（Ｃ）の培養が、０．１〜１０ｍｌ／Ｌ／ｈの基質及び１〜３ｇ／Ｌ／ｈのグルコースで５０〜１００時間進行する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ジオイック酸類が、エタンジオイック酸（ethanedioic acid）、プロパンジオイック酸（propanedioic acid）、ブタンジオイック酸（butanedioic acid）、ペンタンジオイック酸（pentanedioic acid）、ヘキサンジオイック酸（hexanedioic acid）、オクタンジオイック酸（octanedioic acid）、ノナンジオイック酸（nonanedioic acid）、デカンジオイック酸（decanedioic acid）、ウンデカンジオイック酸（undecanedioic acid）、ドデカンジオイック酸（dodecanedioic acid）、及びヘキサデカンジオイック酸（hexadecanedioic acid）からなる群から選択されるか、これらの組合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
炭化水素または脂肪酸を含む基質からジオイック酸類（dioic acids）を生産する、カンジダ・インファンティコーラ野生型菌株（Candida infanticola ＤＳ０２；ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）、カンジダ・インファンティコーラ突然変異菌株（Candida infanticola ＬＣ−ＤＡ０１；ＫＣＴＣ１３０９９ＢＰ）、カンジダ・インファンティコーラ形質転換菌株（Candida infanticola；ＫＣＴＣ１３１０３ＢＰ、ＫＣＴＣ１３１０４ＢＰ、ＫＣＴＣ１３１０５ＢＰ、ＫＣＴＣ１３１０６ＢＰ）またはこれらの組合わせ。
【請求項８】
カンジダ・インファンティコーラ野生型菌株（Candida infanticola ＤＳ０２；ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）に水酸化尿素（hydroxyurea）処理及び熱処理（heatshock）する段階と、
ウラシルを含む培地を使用してウラシル栄養要求体菌株を製作し、選別する段階と、
β酸化（β-oxidation）遺伝子を欠損させる段階と、
を含むカンジダ・インファンティコーラ（candida infanticola）形質転換菌株（Candida infanticola；ＫＣＴＣ１３１０３ＢＰ、ＫＣＴＣ１３１０４ＢＰ、ＫＣＴＣ１３１０５ＢＰ、ＫＣＴＣ１３１０６ＢＰ）またはこれらの組合わせの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カンジダ・インファンティコーラ菌株を用いて炭化水素または脂肪酸のような基質からジオイック酸類（dioic acids）を生産する方法及びこれに用いられるカンジダ・インファンティコーラ微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジオイック酸（dioic acids）は、化学産業において非常に重要な化学物質であって、エンジニアリング樹脂、自動車部品、スポーツ用品、カーペット及び歯ブラシなどに用いられる石油由来のナイロンだけではなく、他の高分子可塑剤、接着剤、潤滑油、エポキシ樹脂、腐食防止剤、コーティング剤、加工プラスチック、香水及び薬製品など多様な産業的用途として使われる。これらジオイック酸（dioic acids）のうち、年間約１５，０００，０００，０００ポンドのドデカンジオイック酸が石油化学原料から合成されており、このような石油化学原料は、主に足りない天然原料であって、これら原料の使用は、全世界的に環境破壊・変化と密接な関連があり、このような石油化学原料は、価格変動に敏感であり、環境汚染に対する負担を加重させる。
【０００３】
したがって、再生と持続可能であり、環境に対する負担を減らしうるジオイック酸の代替的な生産方法が要求されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明では、前記のような従来技術の問題点を解決するために、ジオイック酸類を生産する方法及びカンジダ・インファンティコーラ菌株を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を果たすために、本発明は、カンジダ・インファンティコーラ菌株を用いて炭化水素または脂肪酸を含む基質からジオイック酸類を生産する方法を提供する。
【０００６】
前記ジオイック酸類を生産する方法は、（Ａ）初期細胞集団を確保するための炭化水素または脂肪酸を含む基質を添加した酵母エキスグルコース培地（yeast extract glucose medium;YG medium）でカンジダ・インファンティコーラ菌株を培養する段階と、（Ｂ）前記段階（Ａ）の培養液に炭化水素、脂肪酸またはこれら誘導体を含む炭素源または基質を添加して、ω酸化（ω−oxidation）反応を誘導する段階と、（Ｃ）前記段階（Ｂ）の反応液に炭化水素または脂肪酸を含む基質及びグルコースを添加しながら培養する段階と、を含むものであり得る。
【０００７】
前記段階（Ａ）の培養は、３０±５℃、溶存酸素量１０％以上の条件で２０〜５０時間進行するものであり得る。
また、前記段階（Ｂ）の反応は、０．５〜５％の炭素源で１０〜３０時間進行しうる。
また、前記段階（Ｃ）の培養は、０．１〜２ｍｌ／Ｌ／ｈの基質及び１〜３ｇ／Ｌ／ｈのグルコースで５０〜１００時間進行しうる。
【０００８】
ジオイック酸類を生産する方法において、前記ジオイック酸類は、エタンジオイック酸（ethanedioic acid）、プロパンジオイック酸（propanedioic acid）、ブタンジオイック酸（butanedioic acid）、ペンタンジオイック酸（pentanedioic acid）、ヘキサンジオイック酸（hexanedioic acid）、オクタンジオイック酸（octanedioic acid）、ノナンジオイック酸（nonanedioic acid）、デカンジオイック酸（decanedioic acid）、ウンデカンジオイック酸（undecanedioic acid）、ドデカンジオイック酸（dodecanedioic acid）、及びヘキサデカンジオイック酸（hexadecanedioic acid）からなる群から選択されるか、これらの組合わせであり得る。
【０００９】
ジオイック酸類を生産する方法において、前記カンジダ・インファンティコーラ菌株は、カンジダ・インファンティコーラ野生型菌株（Candida infanticola ＤＳ０２；ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）、カンジダ・インファンティコーラ突然変異菌株（Candida infanticola ＬＣ−ＤＡ０１；ＫＣＴＣ１３０９９ＢＰ）、カンジダ・インファンティコーラ形質転換菌株（Candida infanticola；ＫＣＴＣ１３１０３ＢＰ、ＫＣＴＣ１３１０４ＢＰ、ＫＣＴＣ１３１０５ＢＰ、ＫＣＴＣ１３１０６ＢＰ）またはこれらの組合わせであり得る。
【００１０】
本発明はまた、炭化水素または脂肪酸を含む基質からジオイック酸類（dioic acids）を生産するカンジダ・インファンティコーラ（Candida infanticola）菌株を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、カンジダ・インファンティコーラ菌株を用いて炭化水素または脂肪酸を含む基質からジオイック酸類（dioic acids）を生産する方法及びこれに使われるカンジダ・インファンティコーラ微生物に関するものであって、化石燃料の使用による国際原油価格変動によるコスト増加及び環境汚染の負担を減らして、ＤＤＤＡを原料とする多様な産業分野に活用されうる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、競争誘導連続式集積培養装置を簡略に示す図面である。
【図２】図２は、競争誘導連続式集積培養で微生物の経時的なＯＤ値の変化を示すグラフである。
【図３】図３は、競争誘導連続式集積培養で微生物の経時的な希釈率（dilution rate）の変化を示すグラフである。
【図４】図４は、分離菌株の１８ｓ  ｒＲＮＡ塩基配列を示す図面である。
【図５】図５は、分離菌株（カンジダ・インファンティコーラ野生型菌株（Candida infanticola ＤＳ０２；ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ））のｐＨによる成長率を示すグラフである。
【図６】図６は、カンジダ・インファンティコーラ野生型菌株（ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）及びカンジダ・トロピカリス（ＡＴＣＣ  ２０３３６）に対する経時的なドデカン消耗速度及び生産される菌体量を示すグラフである。
【図７】図７は、カンジダ・インファンティコーラ野生型菌株（Candida infanticola ＤＳ０２；ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）によるドデカンのＤＤＤＡ（dodecanedioic acid）転換を示すグラフである。
【図８】図８は、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis；ＡＴＣＣ  ２０３３６）によるドデカンのＤＤＤＡ（dodecanedioic acid）転換を示すグラフである。
【図９】図９は、蒸気を利用した固体培地の製作についての概略図である。
【図１０】図１０は、カンジダ・インファンティコーラ突然変異菌株（Candida infanticola ＬＣ−ＤＡ０１：ＫＣＴＣ１３０９９ＢＰ）に対する単一炭素源利用有無によるＯＤ値を示すグラフである。
【図１１】図１１は、脂肪酸を利用した突然変異菌株のジオイック酸類転換結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、ドデカンを利用した突然変異菌株のジオイック酸類転換結果を示すグラフである。
【図１３】図１３は、デカンを利用した突然変異菌株のジオイック酸類転換結果を示すグラフである。
【図１４】図１４は、熱処理による菌株の形質転換結果を示すグラフである。
【図１５】図１５は、水酸化尿素の濃度による細胞の状態を示す位相差顕微鏡写真である。
【図１６】図１６は、ウラシル栄養要求体菌株製作カセット模式図及びｇＤＮＡ  ＰＣＲ結果である。
【図１７】図１７は、ＣｉＰＯＸ１遺伝子欠損菌株製作カセット模式図及びｇＤＮＡ  ＰＣＲ結果である。
【図１８】図１８は、ＣｉＰＯＸ２遺伝子欠損菌株製作カセット模式図及びｇＤＮＡ  ＰＣＲ結果である。
【図１９】図１９は、ＣｉＰＯＸ１及びＣｉＰＯＸ２遺伝子欠損菌株製作カセット模式図及びｇＤＮＡ  ＰＣＲ結果である。
【図２０】図２０は、野生型菌株、ＣｉＰＯＸ１及びＣｉＰＯＸ１／ＣｉＰＯＸ２遺伝子欠損菌株に対するフラスコでのジカルボン酸生産能を示す結果である。
【図２１】図２１は、ＣｉＰＯＸ１／ＣｉＰＯＸ２遺伝子欠損菌株に対する５Ｌ発酵槽でジカルボン酸生産能を示す結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、多様な変換を加え、さまざまな実施例を有することができるので、特定実施例を図面に例示し、詳細な説明に詳細に説明する。しかし、これは、本発明を特定の実施形態に対して限定しようとするものではなく、本発明の思想及び技術範囲に含まれるあらゆる変換、均等物ないし代替物を含むものと理解しなければならない。本発明を説明するに当って、関連した公知技術についての具体的な説明が、本発明の要旨を不明にする恐れがあると判断される場合、その詳細な説明を省略する。
【００１４】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明に使われた用語「遮断」とは、「阻害」と混用され、ある経路または反応などを防ぐことを意味する。
また、「炭化水素」は、炭素と水素のみでなされている有機化合物を称する。
また、「脂肪酸」は、鎖状の飽和または不飽和モノカルボン酸を称する。
【００１５】
また、「ω酸化（ω-oxidation）」は、脂肪酸のメチル基末端が酸化されてジカルボン酸になる反応を意味し、「β酸化（β-oxidation）」は、カルボキシ基でβ位の炭素源子が酸化されてアセチルＣｏＡを放出しながら分解される反応を意味する。一般的に、脂肪酸の酸化は、カルボキシ基末端から炭素２個単位で切断されるβ酸化（ω-oxidation）が主要反応であり、ω酸化（ω-oxidation）は、炭素数１０〜１２の中鎖脂肪酸に対する補助経路として理解されている。
【００１６】
本発明のジオイック酸類を生産する方法によれば、カンジダ・インファンティコーラ菌株を用いて炭化水素または脂肪酸を含む基質を使用してジオイック酸類を生産することができる。
【００１７】
前記ジオイック酸類を生産する方法は、（Ａ）初期細胞集団を確保するための炭化水素または脂肪酸を含む基質を添加した酵母エキスグルコース培地（yeast extract glucose medium;YG medium）でカンジダ・インファンティコーラ菌株を培養する段階と、（Ｂ）前記段階（Ａ）の培養液に炭化水素、脂肪酸またはこれら誘導体を含む炭素源または基質を添加して、ω酸化反応を誘導する段階と、（Ｃ）前記段階（Ｂ）の反応液に炭化水素または脂肪酸を含む基質及びグルコースを添加しながら培養する段階と、を含むことを特徴とする。
【００１８】
前記段階（Ａ）の培養は、３０±５℃、溶存酸素量１０％以上の条件で２０〜５０時間進行し、望ましくは、３０±３℃、溶存酸素量３０±３％の条件で２４〜４８時間進行しうる。また、前記基質は、ラウリン酸メチル（methyl laurate）であり得るが、これに限定されるものではない。
【００１９】
前記段階（Ｂ）の反応は、０．５〜５％の炭素源または基質で１０〜３０時間進行し、望ましくは、０．５〜３％で１５〜２５時間進行し、さらに望ましくは、約１％のドデカンで１５〜２５時間進行しうる。
【００２０】
前記段階（Ｃ）の培養は、０．１〜２ｍｌ／Ｌ／ｈの基質及び１〜３ｇ／Ｌ／ｈのグルコースで５０〜１００時間進行し、望ましくは、０．５〜１ｍｌ／Ｌ／ｈの基質及び１．５〜２．５ｇ／Ｌ／ｈのグルコースで８０〜１００時間進行しうる。前記基質は、ラウリン酸メチル（methyl laurate）であり得るが、これに限定されるものではない。
【００２１】
前記ジオイック酸類は、エタンジオイック酸（ethanedioic acid）、プロパンジオイック酸（propanedioic acid）、ブタンジオイック酸（butanedioic acid）、ペンタンジオイック酸（pentanedioic acid）、ヘキサンジオイック酸（hexanedioic acid）、オクタンジオイック酸（octanedioic acid）、ノナンジオイック酸（nonanedioic acid）、デカンジオイック酸（decanedioic acid）、ウンデカンジオイック酸（undecanedioic acid）、ドデカンジオイック酸（dodecanedioic acid）、ヘキサデカンジオイック酸（hexadecanedioic acid）、及びこれらの組合わせからなる群から選択されたものを含み、望ましくは、ジオイック酸類がドデカンジオイック酸を含みうる。
前記カンジダ・インファンティコーラ菌株は、野生型菌株、突然変異菌株、形質転換菌株、及びこれらの組合わせから選択されたものを含みうる。
【００２２】
具体的に、前記野生型菌株は、遺伝子操作を行っていないカンジダ・インファンティコーラ野生型菌株（Candida infanticola ＤＳ０２；ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）であり、前記突然変異菌株は、カンジダ・インファンティコーラ突然変異菌株（Candida infanticola ＬＣ−ＤＡ０１；ＫＣＴＣ１３０９９ＢＰ）、前記形質転換菌株は、カンジダ・インファンティコーラ形質転換菌株（Candida infanticola；ＫＣＴＣ１３１０３ＢＰ、ＫＣＴＣ１３１０４ＢＰ、ＫＣＴＣ１３１０５ＢＰ、ＫＣＴＣ１３１０６ＢＰ）であり得る。
【００２３】
一具現例によれば、前記カンジダ・インファンティコーラ野生型菌株（Candida infanticola ＤＳ０２；ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）は、炭化水素及び脂肪酸からなる群から選択されるか、これらの組合わせを含むものを炭素源として用いる菌株であり得る。
【００２４】
前記炭素源は、炭素数６〜３０の炭化水素または脂肪酸、望ましくは、炭素数８〜２０のアルカンまたは脂肪酸から選択されうる。例えば、ドデカン（dodecane）、ラウリン酸メチル（Methyl laurate）、ラウリン酸（lauric acid）、これらの誘導体、またはこれらの組合わせであり、ラウリン酸の誘導体は、Ｃ１〜８ラウリン酸アルキルであり得る。望ましくは、ラウリン酸メチル（methyl laurate）、ラウリン酸エチル、ラウリン酸プロピルなどからなる群から選択されるか、これらの組合わせであり得る。
【００２５】
また、前記カンジダ・インファンティコーラ突然変異菌株（Candida infanticola ＬＣ−ＤＡ０１；ＫＣＴＣ１３０９９ＢＰ）は、炭化水素または脂肪酸からなる群から選択されるか、これらの組合わせを含むものを基質として用いる菌株であり得る。突然変異菌株は、例えば、野生型菌株にＥＭＳ（ethyl methanesulfonate）、ＵＶ（ultra violet）、及びこれらの組合わせから選択された方法を処理して製造可能であるが、前記方法に限定されるものではない。
【００２６】
また、前記カンジダ・インファンティコーラ形質転換菌株（Candida infanticola；ＫＣＴＣ１３１０３ＢＰ、ＫＣＴＣ１３１０４ＢＰ、ＫＣＴＣ１３１０５ＢＰ、ＫＣＴＣ１３１０６ＢＰ）は、炭化水素または脂肪酸からなる群から選択されるか、これらの組合わせを含むものを基質として用いられる。形質転換菌株は、熱処理、電気穿孔法などの物理的刺激、水酸化尿素処理などの化学的刺激などを加えて形質転換を誘導することで製造し、例えば、熱処理（heatshock）時に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、酢酸リチウム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などを用いて形質転換効率を向上させうる。一般的に、酵母のような真核生物は、細胞周期によって相同組替え、非相同組替えが調節されると知られている。相同組替えは、ＤＮＡ複製時に染色粉体を用いるＳ期、Ｇ２期で主に発生し、例えば、相同組替えの確率を増加させるために、水酸化尿素（hydroxyurea）を用いて細胞周期を調節することができる。具体的に、水酸化尿素（hydroxyurea）は、リボヌクレオチド還元酵素を抑制させてＤＮＡ合成に用いられるｄＮＴＰの量を下げて、Ｓ期で細胞周期を停滞させる役割ができて、形質転換時に相同性組合わせの確率を増加させることができる。
【００２７】
一具現例によれば、形質転換菌株は、ＵＲＡ３及びＰＯＸ遺伝子が欠損した菌株を含みうる。前記遺伝子欠損菌株は、例えば、野生型カンジダ・インファンティコーラ菌株に熱処理（heatshock）、水酸化尿素（hydroxyurea）処理またはこれらの組合わせを適用して形質転換を誘導し、その順序と回数は、当業者によって適切に選択されうる。また、一具現例によれば、前記形質転換菌株は、半数体であり得る。例えば、一般的に、産業上、ジカルボン酸の生産に主に使われる二倍体であるカンジダ・トロピカリス（Candida tropicallis）に比べて、倍数性が半数体であるカンジダ・インファンティコーラ菌株が遺伝子操作において有利である。
【００２８】
以下、本発明の理解を助けるために、実施例を提示するが、下記の実施例は、本発明を例示するものであり、本発明の範疇及び技術思想の範囲内で多様な変更及び修正が可能であることは当業者にとって明らかなものであり、このような変形及び修正が添付の特許請求の範囲に属すことも自明である。
【００２９】
実施例１：カンジダ・インファンティコーラ野生型菌株（Candida infanticola ＤＳ０２；ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）の分離
高濃度の多様な炭素源が含まれた石油化学工場の廃水を処理するために、オイルセパレータ（ＣＰＩ、Coagulated Plate Interceptor）で一次的に処理を進行した後、均等槽、曝気槽、沈殿槽などを経ながら廃水処理を進行する石油化学工程の廃水処理施設のオイルセパレータ（ＣＰＩ）、曝気槽、沈殿槽から試料を採取した。
【００３０】
前記試料は、オイルセパレータの流入水、オイルセパレータの放流水、均等槽放流水、曝気槽流入水、曝気槽放流水、沈殿槽流入水及び沈殿槽放流水から廃水サンプルを１Ｌ滅菌水質サンプルパックに採取して準備し、採取した試料は、アイスボックスに入れて実験室に移送した。前記採取したサンプルの一部を下記表１に示した１次培養培地の組成で作られた固体培地（agar plate）に１次平板塗抹（spreading）し、３０℃恒温培養器で１週間培養した。培養後、ドデカン（Dodecane；Ｃ１２アルカン）が含まれた培養液で生長性が早い菌株を選別するために、固体培地に生成された群落（colony）を採取して、下記表１に示した２次培養培地の組成で作られたドデカン（Dodecane；Ｃ１２アルカン）を唯一の炭素源として含む競争誘導連続式集積培養培地に接種して、３０℃、１ｖ／ｖ／ｍ通気量、４００ｒｐｍ撹拌速度及びｐＨ５．０（controlled by １０Ｎ  ＮａＯＨ）の条件の競争誘導連続式集積培養装置（図１）で培養した。前記競争誘導連続式集積培養時に、初期投入された２０ｇ／Ｌのドデカンを消尽した後、さらに４０ｇ／Ｌのドデカンが含まれた下記表２の追加培地を投入して、希釈率（dilution rate）を０から０．４まで上昇させて、最終的に生長性が最も優れた菌株カンジダ・インファンティコーラ野生型菌株（Candida infanticola ＤＳ０２；ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）を分離した。前記実験で一部微生物の成長を抑制するために、抗生剤カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを使用した。前記実験結果を図２及び図３に示した。
【００３１】
【表１】
0006577666.tif 000002
【００３２】
実験例１：分離菌株の１８ｓ  ｒＲＮＡ遺伝学的分析
前記実施例１から分離した分離菌株に対して１８ｓ  ｒＲＮＡ塩基配列分析法で分析した。Yeast gDNA prep kit（PureHelix ＴＭ、ＮＡＮＯＨＥＬＩＸ）を用いて、前記実施例１の分離菌株のゲノム（genomic）ＤＮＡを抽出し、前記抽出したgenomic ＤＮＡを鋳型として下記表２の１８ｓ  ＩＴＳ  １／４  primerを利用したＰＣＲ反応で増幅させた後、ＴＡベクタークローニングさせた後、ＤＮＡシーケンシング反応を通じて１８ｓ  ｒＲＮＡ塩基配列を得て、前記塩基配列は、配列番号１として図４に示した。
【００３３】
【表２】
0006577666.tif 000003
【００３４】
図４（配列番号１）に示した前記分離菌株の塩基配列をＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment search tool）を使用して菌株の相同性を調査した。前記調査結果は、下記表３に示した。
下記表３に示すように、前記分離菌株は、カンジダ・インファンティコーラＣＢＳ１１９４０と高い相同性を有する近縁種であることを確認することができる。
【００３５】
【表３】
0006577666.tif 000004
【００３６】
実験例２：カンジダ・インファンティコーラ野生型菌株（Candida infanticola ＤＳ０２；ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）の炭素源資化能の分析
前記菌株（カンジダ・インファンティコーラ野生型菌株（Candida infanticola ＤＳ０２；ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）の炭素源資化能を調べるために、ＡＰＩ  ２０ｃ  ＡＵＸ（Biomerieux社）を使用して分析した。ＡＰＩ  ２０ｃ  ＡＵＸ（Biomerieux社）を用いて分析した実験結果は、従来のカンジダ・インファンティコーラkurtzman及びカンジダ・インファンティコーラｓｐ．と比較分析し、その結果を下記表４に示した。
【００３７】
【表４】
0006577666.tif 000005
【００３８】
前記表４に示すように、比較例１（Candida infanticola kurtzman）及び比較例２（Candida infanticola ｓｐ．）とカンジダ・インファンティコーラ野生型菌株（ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）（実施例１）とを比べると、既存に知られたカンジダ・インファンティコーラ菌株である比較例１及び比較例２の場合、グルコース、グリセロール、Ｄ−ガラクトース及びＤ−ソルビトールの炭素源に対する資化能を有する一方、カンジダ・インファンティコーラ野生型菌株（ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）は、炭素源としてグルコースのみ利用できるということを確認することができる。前記実験結果のように、本発明の新規なカンジダ・インファンティコーラ野生型菌株（ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）は、既存の菌株と比較して炭素資化能で大きな差を示すことが分かる。
【００３９】
実験例３：カンジダ・インファンティコーラ野生型菌株（Candida infanticola ＤＳ０２；ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）の最適成長ｐＨ
カンジダ・インファンティコーラ野生型菌株（Candida infanticola ＤＳ０２；ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）の最適成長ｐＨを調べるために、前記菌株をアミノ酸が含まれていないＹＮＢ（yeast nitrogen base(without amino acid)）培地の初期ｐＨを４〜７に多様に設定して培養した。前記実験結果は、図５に示した。
図５に示すように、カンジダ・インファンティコーラ野生型菌株（ＫＣＴＫ  １２８２０ＢＰ）の最適生長ｐＨは、ｐＨ７であることを確認することができる。
【００４０】
実験例４：カンジダ・インファンティコーラ野生型菌株（Candida infanticola ＤＳ０２；ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）をアルカン（Ｃ１２）を唯一の炭素源として培養した時のアルカン（Ｃ１２）基質摂取速度の比較
カンジダ・インファンティコーラ野生型菌株（Candida infanticola ＤＳ０２；ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）のアルカン（Ｃ１２）基質培養でのアルカン（Ｃ１２）消耗速度及び生産される菌体量に対して調べるために、下記表５に示されたように、２０ｇ／Ｌのドデカンを唯一の炭素源として含む酵母エキス培地に実施例１のカンジダ・インファンティコーラ野生型菌株（Candida infanticola ＤＳ０２；ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）及び比較標準菌株カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis；ＡＴＣＣ  ２０３３６）を培養した。前記実験結果は、図６に示した。
【００４１】
【表５】
0006577666.tif 000006
【００４２】
図６に示すように、カンジダ・インファンティコーラＤＳ０２のドデカン消耗速度は、日当たり６．２ｇ／Ｌであって、比較菌株として使われたカンジダ・トロピカリスのドデカン消耗速度日当たり３．７ｇ／Ｌに比べて、１．６倍速いことを確認することができる。それだけではなく、生産された菌体量も、１７％高いことを確認することができる。
【００４３】
実施例２：カンジダ・インファンティコーラ野生型菌株（Candida infanticola ＤＳ０２；ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）によるドデカン（dodecane）のＤＤＤＡ（dodecanedioic acid）転換
カンジダ・インファンティコーラ野生型菌株（Candida infanticola ＤＳ０２；ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）及び前記菌株と同じ種に属し遺伝子操作されていない野生型菌株カンジダ・トロピカリス（Candida trpoicalis；ＡＴＣＣ  ２０３３６）、カンジダ・パラプシローシス（Candida parapsilosis）及びピチア・カリビカ（Pichia caribbica）によるドデカンのＤＤＤＡ（dodecanedioic acid）転換のための初期細胞集団（cell mass）を得るために、５０ｇ／Ｌのグルコースを含むラウリン酸メチル（methyl laurate）基質を使用した酵母エキス（yeast extract）培地に実施例１のカンジダ・インファンティコーラ野生型菌株（Candida infanticola ＤＳ０２；ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）を３０℃、１ｖ／ｖ／ｍ通気量、溶存酸素量（dissolved oxygen：ＤＯ）３０％の撹拌速度（ＤＯ値によって１００〜９００ｒｐｍ）及びｐＨ５に２４〜４８時間培養した後、１％ドデカンを用いてｐＨ７で１２〜２０時間ω酸化（ω-oxidation）誘導を進行した後、ラウリン酸メチル０．５〜１．０ｍｌ／Ｌ／ｈ及びグルコース２ｇ／Ｌ／ｈで入れ、９６時間培養して、ｐＨ７〜ｐＨ８でＤＤＤＡ転換を進行した。前記実験結果は、図７、図８及び下記表６に示した。
【００４４】
【表６】
0006577666.tif 000007
【００４５】
前記表６に示すように、実施例１（Candida infanticolaＤＳ０２；ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）の場合、１４４時間培養結果、Ｏ．Ｄ（optical density）値及びＤＤＤＡ濃度が１５７及び１４．０ｇ／Ｌであって、比較例３（Candida tropicalis；ＡＴＣＣ  ２０３３６）のＯ．Ｄ値１３３．１及びＤＤＤＡ濃度０．６２ｇ／Ｌよりも格段に高く表われ、比較例４及び比較例５では、ＤＤＤＡ転換がなされず、投入された炭素源は、細胞の成長のみに使われたことを確認することができる。
【００４６】
実施例３：野生型カンジダ・インファンティコーラ菌株に対する突然変異誘導及びスクリーニング
野生型カンジダ・インファンティコーラ（Candida infanticola ＤＳ０２；ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）菌株の場合、ドデカン（dodecane）を単一炭素源として用いて生長が可能であるが、β酸化（β-oxidation）経路が遮断された突然変異菌株の場合、ドデカンを単一炭素源として用いて実質的に生長することができない。前記実質的に生長することができないということは、成長しないか、微弱に成長することを意味する。したがって、グルコース（glucose）またはドデカン（dodecane）を単一炭素源として含む固体培地での菌株生長性を比較して突然変異菌株を選別した。
【００４７】
選別された突然変異菌株に突然変異を誘導するために、ＥＭＳ（ethyl methanesulfonate）とＵＶとを使用した。ＰＢＳバッファ（phosphate buffered saline）を用いてＯＤ（optical density ６００ｎｍ）０．０１〜０．１であるカンジダ・インファンティコーラ（Candida infanticola ＤＳ０２；ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）菌株混濁液を準備して、２％濃度の突然変異原（mutagen）ＥＭＳ（ethyl methanesulfonate）処理して１ｍｌを合わせた後、３０℃、１５０ｒｐｍで１２０分反応させ、遠心分離して上澄み液を除去した後、２０％チオ硫酸ナトリウム（sodium thiosulfate）で２回水洗してＥＭＳを除去する。そして、１ｍｌ  ＰＢＳバッファに菌株を混濁させた後、そのうち、１０ｕｌをＹＰＤ固体培地に塗布して、３０℃、３日培養して、１０％以内の生存された１次変異菌株を得た。
【００４８】
ＥＭＳ突然変異原を処理した菌株にＰＢＳバッファ（phosphate buffered saline）でＯＤ  ０．０１〜０．１である菌株混濁液を準備して、ＹＰＤ固体培地に１０ｕｌ塗布後、ＵＶ（ultraviolet ２５４ｎｍ）を１２０秒照射し、３０℃、３日培養して、約１０％以内の生存された２次変異菌株を得た。突然変異誘導過程は、ＥＭＳ処理後、ＵＶ照射、ＵＶ照射後、ＥＭＳ処理またはＥＭＳ、ＵＶ単独でも進行し、その順序及び回数は、当業者によって適切に選択されうる。
【００４９】
突然変異誘導によってβ酸化（β-oxidation）が遮断された突然変異菌株を選別するために、グルコース（glucose）またはドデカン（dodecane）を単一炭素源として含む固体培地での菌株生長性を比較した。使われた固体培地の組成は、グルコース（glucose）を単一炭素源として使用した固体培地（ＹＮＢ、yeast nitrogen base without amino acid）６．７ｇ／Ｌ、グルコース（glucose）１０ｇ／Ｌとドデカン（dodecane）を単一炭素源として使用した固体培地（ＹＮＢ、yeast nitrogen base without amino acid）６．７ｇ／Ｌ、ドデカン（Dodecane）１０ｇ／Ｌである。ドデカンを含んだ固体培地の場合、固体培地の色が不透明な白色で生長したコロニー確認が容易ではないために、ドデカン蒸気を利用した固体培地を製作して、菌株成長性を効率的に比較し、固体培地は、図９に図示した。
【００５０】
固体培地内に滅菌された紙材のフィルターを入れ、フィルターに定量のドデカンを塗布して、固体培養時に、ドデカンが蒸気で固体培地内に広がって菌株が用いる方法で進行した。候補突然変異菌株をＰＢＳバッファに混濁させて、ＯＤ  ０．０１〜０．１である菌株混濁液準備後、前述した２つの固体培地にマイクロピペットを用いて１０ｕｌ接種した後、３０℃、３日培養を進行して、グルコース固体培地ではよく育つが、β酸化（β-oxidation）が遮断されてドデカン固体培地では育つことができない菌株を選別する方法で１次選別を進行した。
【００５１】
１次選別された突然変異菌株をドデカンが単一炭素源として含まれた液体培地での菌株生長性を通じてβ酸化（β-oxidation）遺伝子遮断菌株を２次選別した。本実施では、総６個の選別された菌株の液体培養を行った。使われた液体培養は、２５０ｍｌの三角フラスコ（Erlenmeyer flask）に７０ｍｌのドデカンを単一炭素源とする培養液に、各選別された菌株を初期培養ＯＤ  １に合わせて接種して、３０℃、１５０ｒｐｍで６日間培養した。使われた液体培地の組成は、ドデカンを単一炭素源として使用した培地（ＹＮＢ、yeast nitrogen base without amino acid）２０ｇ／Ｌ、ドデカン（Dodecane）２０ｇ／Ｌである。培養結果は、ドデカンを炭素源として利用することができなかった突然変異菌株とデカンを利用した突然変異菌株とのＯＤ測定値をグラフでそれぞれ図１０に示した。ドデカンを利用することができなかった菌株は、β酸化（β-oxidation）が遮断された菌株と判断して、２次選別を完了して、β酸化（β-oxidation）が遮断された突然変異菌株をCandida infanticola ＬＣ−ＤＡ０１と名付け、韓国生命工学研究院生物資源センターに寄託した（寄託番号：ＫＣＴＣ１３０９９ＢＰ、２０１６年９月８日）。
【００５２】
図１０に示されたように、突然変異菌株（寄託番号：ＫＣＴＣ１３０９９ＢＰ）のβ酸化経路が遮断されたことを１次的に確認することができる。
【００５３】
実施例４：脂肪酸基質を利用したカンジダ・インファンティコーラ突然変異菌株のジオイック酸転換培養
カンジダ・インファンティコーラ突然変異菌株（受託番号：ＫＣＴＣ１３０９９ＢＰ）によるラウリン酸メチル（methyl laurate）のドデカンジオイック酸（ＤＤＤＡ、dodecanedioic acid）転換のための初期細胞集団（cell mass）を得るために、５０ｇ／Ｌのグルコース（glucose）を含むラウリン酸メチル（methyl laurate）基質を使用した酵母エキス（yeast extract）培地にカンジダ・インファンティコーラ突然変異菌株（Candida infanticola ＬＣ−ＤＡ０１；受託番号：ＫＣＴＣ１３０９９ＢＰ）を３０℃、１ｖ／ｖ／ｍ通気量、溶存酸素量（dissolved oxygen: ＤＯ）３０％の撹拌速度（ＤＯ値によって１００〜９００ｒｐｍ）及びｐＨ５で２４〜４８時間培養した。培養中、１２〜２４時間に５０ｇ／Ｌのグルコースをいずれも消耗した後、１〜４ｇ／Ｌ／ｈでグルコースを投入して培養終了まで進行した。
【００５４】
初期細胞集団を得た後、１％ドデカンを用いてｐＨ７で１２〜２０時間ω酸化誘導（ω-oxidation）を進行した後、ラウリン酸メチル０．５〜４．０ｍｌ／Ｌ／ｈ及びグルコース１〜４ｇ／Ｌ／ｈで入れ、９６〜１４４時間培養して、ｐＨ７〜ｐＨ８でＤＤＤＡ転換を進行し、結果は、図１１及び表７に示した。
【００５５】
【表７】
0006577666.tif 000008
【００５６】
β酸化（β-oxidation）が遮断されたカンジダ・インファンティコーラ突然変異菌株（Candida infanticola ＬＣ−ＤＡ０１；受託番号：ＫＣＴＣ１３０９９ＢＰ）の場合、１０８時間培養結果、Ｏ．Ｄ（optical dendity、最大／最終）値は、６２．１／３６．２、ＤＤＤＡ濃度は、１４０．９ｇ／Ｌ（転換収率９０％）、ＤＤＤＡ生産性は、１．６７ｇ／Ｌ／ｈであって、β酸化（β-oxidation）が遮断されていない野生型カンジダ・インファンティコーラ菌株（Candida infanticola ＤＳ０２；ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）のＤＤＤＡ濃度１０．６ｇ／Ｌに比べて、１３倍以上格段に高く得られるということを確認することができる。
【００５７】
実施例５：炭化水素基質を利用したカンジダ・インファンティコーラ突然変異菌株のジオイック酸転換培養
カンジダ・インファンティコーラ突然変異菌株（ＫＣＴＣ１３０９９ＢＰ）によるドデカン（dodecane）とデカン（decane）とのジオイック酸（dioic acid）転換のための初期細胞集団（cell mass）を得るために、５０ｇ／Ｌのグルコース（glucose）を含むラウリン酸メチル（methyl laurate）基質を使用した酵母エキス（yeast extract）培地にカンジダ・インファンティコーラ突然変異菌株（Candida infanticola ＬＣ−ＤＡ０１；受託番号：ＫＣＴＣ１３０９９ＢＰ）を３０℃、１ｖ／ｖ／ｍ通気量、溶存酸素量（dissolved oxygen: ＤＯ）３０％の撹拌速度（ＤＯ値によって１００〜９００ｒｐｍ）及びｐＨ５で２４〜４８時間培養する。培養中、１２〜２４時間に５０ｇ／Ｌのグルコースをいずれも消耗した後、１〜４ｇ／Ｌ／ｈでグルコースを投入して培養終了まで進行した。
【００５８】
初期細胞集団を得た後、１％ドデカンを用いてｐＨ７で１２〜２０時間ω酸化（ω-oxidation）誘導を進行した後、ドデカン（dodecane）及びデカン（decane）基質を０．５〜４．０ｍｌ／Ｌ／ｈ及びグルコース１〜４ｇ／Ｌ／ｈで入れ、９６〜１４４時間培養して、ｐＨ７〜ｐＨ８でＤＤＤＡ転換を進行し、ドデカン基質結果は、図１２、デカン基質結果は、図１３及び表８に示した。
【００５９】
【表８】
0006577666.tif 000009
【００６０】
β酸化（β-oxidation）が遮断されたカンジダ・インファンティコーラ突然変異菌株（Candida infanticola ＬＣ−ＤＡ０１；受託番号：ＫＣＴＣ１３０９９ＢＰ）のドデカン基質発酵結果の場合、９６時間培養結果、Ｏ．Ｄ（optical density、最大／最終）値は、６４．２／４２．６、ＤＤＤＡ濃度は、１２２．５ｇ／Ｌ（転換収率９９％）、ＤＤＤＡ生産性は、１．７０ｇ／Ｌ／ｈであって、β酸化（β-oxidation）が遮断されて炭化水素を基質としてジオイック酸の生産性を向上させるということを確認することができる。
【００６１】
また、β酸化（β-oxidation）が遮断されたカンジダ・インファンティコーラ突然変異菌株（Candida infanticola ＬＣ−ＤＡ０１；受託番号：ＫＣＴＣ１３０９９ＢＰ）のデカン基質発酵結果の場合、９６時間培養結果、Ｏ．Ｄ（optical dendity、最大／最終）値は、６６．９／４０．０、セバシン酸（sebacic acid）濃度は、７７．６ｇ／Ｌ（転換収率９９％）、セバシン酸（sebacic acid）生産性は、０．７５ｇ／Ｌ／ｈであって、β酸化（β-oxidation）が遮断されて炭化水素を基質としてジオイック酸の生産性を向上させるということを確認することができる。
【００６２】
実験例５：形質転換方法の最適化
形質転換菌株を獲得するために、外来遺伝子導入のための形質転換方法として酵母で主に使われるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び酢酸リチウムを利用した熱処理（heatshock）方法を利用した。ＹＰＥＤ固体培地で３０℃、２０〜２４時間培養した後、カンジダ・インファンティコーラ（Candida infanticola ＤＳ０２；ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）２ｘ１０６個の菌体を取って、５０％ポリエチレングリコールと酢酸リチウムとを混ぜたバッファに懸濁させた後、３０℃で４５分反応、４２℃で１５分反応させ、上澄み液を除去した後、ＹＰＥＤ培地に懸濁して３０℃で６時間振盪培養後、抗生剤が含まれたＹＥＰＤ培地に塗抹して、３０℃に３日間培養した。形質転換効率を高めるために、熱処理（heatshock）過程でジチオトレイトール（ＤＴＴ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような化学物質を添加して、効率が最も高い方法を比較した結果、ＤＭＳＯを処理した熱処理方法が最も効率が高いということを確認し、結果は、図１４に示した。
【００６３】
実験例６：水酸化尿素を利用した細胞周期調節
ＤＮＡ複製時に染色粉体を用いるＳ期、Ｇ２期で相同組替えが主に発生することができるので、相同組替えの確率を増加させるために、水酸化尿素（hydroxyurea）を用いて細胞周期を調節した。ＹＥＰＤ培地で生長中である１０７／２０ｍｌのカンジダ・インファンティコーラ（Candida infanticola ＤＳ０２；ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）菌体に０．２Ｍの水酸化尿素処理後、２時間反応時に、Ｓ期の細胞が最も多く観察されることを確認し、結果は、図１５に示した。
【００６４】
実施例６：ウラシル栄養要求体菌株の獲得
Ｓ期で細胞周期が停滞したカンジダ・インファンティコーラ（Candida infanticola ＤＳ０２；ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）菌体を用いて、前記熱処理及び水酸化尿素処理方法で形質転換をさせた結果、ＵＲＡ３ gene位置に外来遺伝子が置き換えられたウラシル栄養要求体菌株（受託番号：ＫＣＴＣ１３１０３ＢＰ）を獲得した。
【００６５】
選別培地は、ウラシル及び５−フルオロオロチン酸（５’−ＦＯＡ）を添加した最少培地を使用し、ウラシル栄養要求体菌株製作模式図及びｇＤＮＡ  ＰＣＲを利用した配列確認結果を図１６に示した。
【００６６】
５−フルオロオロチン酸（5-Fluoroorotic acid、５’−ＦＯＡ）は、ウラシル合成過程で有害な物質である５−フルオロウラシル（5-fluorouracil）に転換されて細胞死滅に至らせるので、ＵＲＡ３遺伝子欠損菌株は、ウラシル、５’−ＦＯＡが入った培地で生長し、ウラシルのない培地で生長することができない。
【００６７】
実施例７：β酸化遺伝子選別
β酸化の最初の段階である脂肪酸アシル−ＣｏＡ（fatty acyl-CoA）から２trans-enoyl-CoAに転換する酵素であるacyl-CoA oxidase（pox gene）を除去するために、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）２０３３６のＰＯＸ４、ＰＯＸ５、ＰＯＸ２遺伝子のアミノ酸配列を比較した結果、２つの遺伝子ＣＩＮＦ＿０４６７０、ＣＩＮＦ＿１３４５５の相同性が４０％以上と最も高く出て、この遺伝子をＣｉＰＯＸ１、ＣｉＰＯＸ２と名付け、下記表９にアミノ酸配列を比較して示した。また、ＣＩＮＦ＿０４６７０に対して核酸配列は、配列番号４に、アミノ酸配列は、配列番号５に示した。また、ＣＩＮＦ＿１３４５５に対して核酸配列は、配列番号６に、アミノ酸配列は、配列番号７に示した。
【００６８】
【表９】
0006577666.tif 000010
【００６９】
配列番号４（核酸）
ＴＡＧＴＧＴＣＡＴＧＡＡＧＣＣＴＴＴＣＴＴＣＡＣＣＣＧＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＧＡＣＧＡＣＣＣＴＧＡＴＣＴＣＡＧＴＧＣＴＣＴＴＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＧＡＡＣＧＡＧＴＡＡ
配列番号５（アミノ酸）
ＭＴＫＳＬＳＴＮＰＡＮＤＶＶＩＤＧＫＫＹＮＴＦＴＥＰＰＫＡＭＡＡＥＲＡＫＡＳＦＰＶＲＥＭＴＹＹＬＤＧＧＥＫＶＴＥＹＮＥＡＶＷＥＱＬＥＲＡＰＡＦＤＮＴＤＹＹＤＶＣＧＤＨＥＬＬＲＡＲＴＬＡＫＶＧＡＩＡＥＩＶＴＤＧＲＳＥＲＤＩＱＫＶＬＳＦＶＳＶＩＤＰＧＡＭＴＲＩＧＶＨＦＧＬＦＬＮＧＶＲＧＳＧＴＳＥＱＦＮＹＷＶＧＥＧＡＡＮＬＳＮＦＦＧＣＦＣＭＴＥＬＧＨＧＳＮＶＡＧＶＥＴＴＡＴＦＤＲＮＴＥＥＦＶＩＮＴＰＴＩＡＡＳＫＷＷＩＧＧＡＡＨＴＡＴＨＧＬＶＦＡＲＬＩＶＤＧＫＤＹＧＶＫＮＦＶＶＰＬＲＤＲＮＴＷＮＬＭＰＧＶＳＩＧＤＩＧＫＫＭＧＲＤＧＩＤＮＧＷＶＱＦＳＮＶＲＩＰＲＬＦＭＭＭＫＹＡＫＶＳＫＤＧＫＶＴＱＰＰＬＡＱＬＡＹＧＡＬＩＳＧＲＶＳＭＶＹＤＳＹＴＷＡＲＲＦＬＴＩＡＩＲＹＡＣＣＲＲＱＦＳＳＳＰＧＧＬＥＴＫＬＩＤＹＴＦＨＱＲＲＬＬＰＲＬＡＹＡＹＡＭＮＡＧＳＡＥＬＹＫＩＹＦＡＡＴＤＲＬＡＳＴＫＰＴＤＫＥＧＬＱＳＡＩＤＤＶＫＥＬＦＳＶＳＡＧＬＫＡＦＳＴＷＧＴＡＱＩＩＤＥＣＲＱＡＣＧＧＬＧＹＳＧＹＮＧＦＧＱＧＹＮＤＷＶＶＱＣＴＷＥＧＤＮＮＶＬＴＬＳＡＧＲＳＬＩＱＳＧＬＡＩＲＫＧＥＨＶＧＡＡＡＳＹＬＫＲＥＬＮＡＫＬＮＧＲＳＬＥＤＬＮＶＬＩＤＧＷＥＨＶＳＡＶＧＩＳＱＡＶＤＲＹＶＥＬＥＫＥＧＶＳＱＴＥＡＦＥＲＬＳＱＱＲＹＤＶＴＲＶＨＴＲＭＹＬＩＫＳＦＦＥＮＬＫＴＡＳＰＡＬＱＰＶＬＴＤＬＡＬＬＦＡＬＷＳＩＥＩＤＡＳＶＦＬＲＹＧＦＬＥＰＫＤＩＳＴＩＴＶＬＶＮＫＹＴＧＫＶＲＥＱＡＩＰＬＴＤＡＦＮＱＳＤＦＶＩＮＡＰＩＧＮＹＮＧＤＶＹＮＮＹＦＡＫＴＫＡＡＮＰＰＩＮＴＨＰＰＹＹＤＳＶＭＫＰＦＦＴＲＫＦＮＤＤＰＤＬＳＡＬＥＥＥＥＡＥＥＮＥ
【００７０】
配列番号６（核酸）
ＣＧＣＡＴＴＣＴＴＣＡＡＧＣＧＣＡＣＴＣＣＣＴＡＴＧＡＧＣＡＡＣＣＣＡＧＧＣＴＣＧＡＴＧＡＧＡＴＴＴＡＡ
配列番号７（アミノ酸）
ＭＫＡＮＮＴＡＳＬＬＫＤＧＫＥＬＮＴＦＴＲＰＡＳＤＭＱＡＥＲＤＲＴＳＦＰＶＲＥＭＴＨＦＦＮＮＧＫＥＮＴＥＦＬＥＫＬＦＥＲＩＱＲＤＰＡＦＮＮＫＤＦＹＤＬＤＹＫＰＬＲＱＲＴＦＥＱＩＧＲＭＷＳＹＬＤＥＬＧＡＤＳＰＬＡＲＲＦＬＳＰＦＧＭＩＮＰＳＡＱＴＲＶＳＶＨＹＧＬＦＶＳＡＬＲＧＱＧＴＤＫＱＹＥＦＷＫＳＱＧＣＬＳＬＮＲＦＹＧＣＦＧＭＴＥＬＧＨＧＳＮＶＡＥＬＥＴＴＡＴＦＤＲＡＴＤＥＦＩＩＨＴＰＮＴＡＡＴＫＷＷＩＧＧＡＡＨＳＳＮＨＴＶＣＦＡＲＬＩＶＤＧＫＤＹＧＶＲＮＦＶＶＰＬＲＤＰＥＳＨＮＬＬＰＧＩＡＶＧＤＩＧＫＫＭＧＲＤＧＩＤＮＧＷＩＱＦＳＮＶＲＩＰＲＴＹＭＬＭＲＹＳＱＶＴＰＥＧＫＶＩＥＰＰＬＡＱＬＴＹＧＡＬＩＮＧＲＶＡＭＡＹＤＳＷＶＷＡＲＲＦＬＴＩＡＬＲＹＡＡＶＲＲＱＦＳＳＴＥＧＲＥＥＳＫＬＬＤＹＶＬＨＱＲＲＬＩＰＬＬＡＱＡＩＧＩＥＡＡＡＴＥＬＹＲＬＦＤＥＶＴＨＨＱＡＳＬＤＴＳＤＲＫＡＶＳＤＭＶＤＫＴＫＥＬＦＳＬＳＡＧＬＫＡＦＳＴＷＡＴＶＤＴＩＤＥＣＲＱＡＣＧＧＬＧＹＬＳＡＴＧＦＧＱＧＦＤＤＷＶＶＮＣＴＷＥＧＤＮＮＶＬＣＬＳＡＧＲＳＬＩＱＳＧＣＫＶＬＤＧＫＨＶＴＧＡＡＤＹＬＧＲＩＫＴＬＲＧＫＳＬＡＳＧＤＬＲＤＰＫＶＬＶＧＡＷＥＳＶＡＡＱＡＶＭＤＡＡＥＡＹＫＫＬＲＡＲＧＶＳＤＫＡＡＦＥＥＬＳＩＤＲＦＮＩＡＲＬＨＴＲＣＦＱＩＫＡＬＦＲＫＩＡＮＡＮＰＳＩＱＫＶＬＴＮＶＧＬＬＦＡＬＷＳＩＥＫＮＧＳＰＦＬＱＹＧＦＬＴＳＤＤＭＮＫＶＩＤＬＶＴＦＹＣＧＥＶＲＤＱＶＩＧＩＴＤＳＦＮＩＳＤＦＦＬＮＳＰＩＧＮＹＤＧＮＡＹＥＮＬＭＤＳＶＴＥＲＮＶＰＧＴＰＣＰＹＱＤＡＭＮＡＦＦＫＲＴＰＹＥＱＰＲＬＤＥＩ
【００７１】
実施例８：ＣｉＰＯＸ１遺伝子欠損菌株選別
ＣｉＰＯＸ１遺伝子の両末端５００ｂｐの相同領域（homology region）を含んだＵＲＡ３  pop-outベクターを用いてＣｉＰＯＸ１遺伝子除去カセットを製作した後、Ｓ期で調節されたウラシル栄養要求体菌株（受託番号：ＫＣＴＣ１３１０３ＢＰ）に形質転換を通じてＣｉＰＯＸ１遺伝子除去カセットを導入した。ＵＲＡ３  pop-outベクターは、ウラシル除去培地で生存できるようにCandida tropicalisのＵＲＡ３（Ｃｔ．ＵＲＡ３）遺伝子と、Ｃｔ．ＵＲＡ３遺伝子の除去（pop-out）のためのＣｔ．ＵＲＡ３遺伝子の両末端のbacillus subtilis由来の反復配列（repeated sequence）が含まれており、形質転換された菌株は、Ｃｔ．ＵＲＡ３遺伝子によって表１０のウラシル除去培地で選別可能である。配列番号８は、Candida tropicalisのＵＲＡ３（Ｃｔ．ＵＲＡ３）配列、配列番号９は、bacillus subtilis由来の反復配列（repeated sequence）を示し、ベクターとカセット模式図及びｇＤＮＡ  ＰＣＲを利用した配列確認結果を図１７に示した（受託番号：ＫＣＴＣ１３１０４ＢＰ）。
【００７２】
【表１０】
0006577666.tif 000011
【００７３】
配列番号８
ｃｇｇｇａｃａｔｇｇｇｇｇｇｔａｇａｇａａｇａａｇｇｇｔｔｔｇａｔｔｇｇａｔｃａｔｃａｔｇａｃｇｃｃｔｇｇｔｇｔｇｇｇｇｔｔｇｇａｔｇａｔａａａｇｇｃｇａｔｇｃｇｔｔｇｇｇｃｃａｇｃａｇｔａｔａｇｇａｃｔｇｔｔｇａｔｇａｇｇｔｇｇｔｔｃｔｇａｃｔｇｇｔａｃｃｇａｔｇｔｇａｔｔａｔｔｇｔｃｇｇｇａｇａｇｇｇｔｔｇｔｔｔｇｇａａａａｇｇａａｇａｇａｃｃｃｔｇａｇｇｔｇｇａｇｇｇａａａｇａｇａｔａｃａｇｇｇａｔｇｃｔｇｇａｔｇｇａａｇｇｃａｔａｃｔｔｇａａｇａｇａａｃｔｇｇｔｃａｇｔｔａｇａａｔａａａｔａｔｔｇｔａａｔａａａｔａｇｇｔｃｔａｔａｔａｃａｔａｃａｃｔａａｇｃｔｔｃｔａｇｇａｃｇｔｃａｔｔｇｔａｇｔｃｔｔｃｇａａｇｔｔｇｔｃｔｇｃｔａｇｔｔｔａｇｔｔｃｔｃａｔｇａｔｔｔｃｇａａａａｃｃａａｔａａｃｇｃａａｔｇｇａｔｇｔａｇｃａｇｇｇａｔｇｇｔｇｇｔｔａｇｔｇｃｇｔｔｃｃｔｇａｃａａａｃｃｃａｇａｇｔａｃｇｃｃｇｃｃｔｃａａａｃｃａｃｇｔｃａｃａｔｔｃｇｃｃｃｔｔｔｇｃｔｔｃａｔｃｃｇｃａｔｃａｃｔｔｇｃｔｔｇａａｇｇｔａｔｃｃａｃｇｔａｃｇａｇｔｔｇｔａａｔａｃａｃｃｔｔｇａａｇａａｃｇｇｃｔｔｃｇｔｃｔｇａｃｃｃｔｔｇａｇｃｔｔｃｇｃｃｔｃｇｔｔｇｔａａｔｇａｔｔａｔａｃａｃａｔｃｃａａｃｇｃｔｔｃｃａａｃｃｔｃｇａｔａａａｔｇｇａｔｃｔｔｃｔｇｃａｃｔｔｔｔｇａａａｔｃｇｇｇｔａｃｔｇｇａｔｃｇｃａａｇｃａａｃｇａｇａａｃｇｃｃｇｃｃｇａｔｇｃｔｃｃｇｇｃａａｇｃａａｃａｃａａａｃｇａｇｇａｃｔｔｃａａｇａｔｃ
【００７４】
配列番号９
ｇｔｔｔａａｔａｃｔｇｇｔｔｔｔｃｇｇａｇａａｇｃｇｃｃｔｇｔａｃｃｔｃｃｇｔｃａｔａｇｃｃｇｃｔｇａｔｃａｃａａｔｇａｃａｔｃｔｇｃａｇｔｃｇｃｔｔｔｇｇｃａａｃａｃｃｔｇｃａｇｃｇａｔｔｇｔｔｃｃｔａｃａｃｃｔｇｃｔｔｔｔｇａｃａｃｃａｇｃｔｔｔａｃｇｃｔｇａｔｔｃｔｔｇｃｇｔｃａｃｇｇｔｔｇｇｃａｔｔｔｔｔｃａａａｔｃｇｔｇｇａｔｃａｇｃｔｇｇｇｃｔａａａｔｃｃｔｃａａｔｃｇａａｔａａａｔｇｔｃａｔｇｇｔｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔｇａｇａｔｔａａｔｃｃｇａｃａｃｃｔｇｇｃｇｔｔｇａｃｃｃａｃｇｇａｃａｔｃｇｇｃａａｃｃｃａｔｇｇａｔａｔａｃｃｔｔｇｔｔｇｃｃａｇｇａａｇｃｔｇｃｃｃｇｃｃｔｔｃａｃｃｃｇｇｃｔｔａｇｃａｃｃｔｔｇａｇｃｃａｔｔｔｔａａｔｃｔｇｃａｇｃｔｃａｔｃａｇｃａｔｔｇａｃｇａｇｇｔａａｔｇｇｃｔｔｔｔｇａｃａｃｃａａａｃｃｇｔｃｃｇｇａｔｇｃａａｔｔｔｇｔｔｔｇａｔｃｇｃａｃｔｔｃｔｔｃｔａｔｃａｔｃｇｃｃｇｔｔｃｔｃａｔｃｔｇｇａａｃａａａｇｃｇｔｔｔｇｇｇａｔｃｔｔｃｔｃｃｇｃｃｔｔｃａｃｃｇｃｔｇｔｔｇｃｔｔｔｔｔｃｃｔｃｃａａｇａｃｇｇｔｔｃａｔｔｇｃｇａｔｔｇｃｔａａａｇｃｔｔｃｇｔ
【００７５】
実施例９：ＣｉＰＯＸ２遺伝子欠損菌株選別
ＣｉＰＯＸ２遺伝子の両末端５００ｂｐの相同領域（homology region）を含んだＵＲＡ３  pop-outベクターを用いてＣｉＰＯＸ２遺伝子除去カセットを製作した後、Ｓ期で調節されたウラシル栄養要求体菌株（受託番号：ＫＣＴＣ１３１０３ＢＰ）に形質転換を通じてＣｉＰＯＸ２遺伝子除去カセットを導入した。ＵＲＡ３  pop-outベクターは、ウラシル欠損培地で生存できるようにCandida tropicalisのＵＲＡ３（Ｃｔ．ＵＲＡ３）遺伝子と、Ｃｔ．ＵＲＡ３遺伝子の除去（pop-out）のためのＣｔ．ＵＲＡ３遺伝子の両末端のbacillus subtilis由来の反復配列（repeated sequence）が含まれており、形質転換された菌株は、Ｃｔ．ＵＲＡ３遺伝子によってウラシル除去培地で選別可能である。ベクターとカセット模式図及びｇＤＮＡ  ＰＣＲを利用した配列確認結果を図１８に示した（受託番号：ＫＣＴＣ１３１０５ＢＰ）。
【００７６】
実施例１０：ＣｉＰＯＸ１及びＣｉＰＯＸ２遺伝子欠損菌株選別
ＣｉＰＯＸ２遺伝子の両末端５００ｂｐの相同領域（homology region）を含んだＵＲＡ３  pop-outベクターを用いてＣｉＰＯＸ２遺伝子除去カセットを製作した後、Ｓ期で調節されたＣｉＰＯＸ１及びＣｔＵＲＡ３除去菌株に形質転換を通じてＣｉＰＯＸ２遺伝子除去カセットを導入した。ＣｉＰＯＸ１及びＣｔＵＲＡ３除去菌株は、ＣｉＰＯＸ１除去菌株（受託番号：ＫＣＴＣ１３１０４ＢＰ）からＣｔ．ＵＲＡ３をpop-outしたものである。ＵＲＡ３  pop-outベクターは、ウラシル欠損培地で生存できるようにCandida tropicalisのＵＲＡ３（Ｃｔ．ＵＲＡ３）遺伝子と、Ｃｔ．ＵＲＡ３遺伝子の除去（pop-out）のためのＣｔ．ＵＲＡ３遺伝子の両末端のbacillus subtilis由来の反復配列（repeated sequence）が含まれている。形質転換された菌株は、Ｃｔ．ＵＲＡ３遺伝子によってウラシル除去培地で選別可能である。ベクターとカセット模式図及びｇＤＮＡ  ＰＣＲを利用した配列確認結果を図１９に示した（受託番号：ＫＣＴＣ１３１０６ＢＰ）。
【００７７】
実施例１１：カンジダ・インファンティコーラ形質転換菌株のジオイック酸転換フラスコ培養
本発明の形質転換菌株に対するジカルボン酸生産能を調べるために、それぞれの菌株を（野生型菌株（受託番号：ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）、ＰＯＸ１遺伝子除去菌株（受託番号：ＫＣＴＣ１３１０４ＢＰ）、ＣｉＰＯＸ２遺伝子除去菌株（受託番号：ＫＣＴＣ１３１０５ＢＰ）、ＣｉＰＯＸ１／ＣｉＰＯＸ２遺伝子除去菌株（受託番号：ＫＣＴＣ１３１０６ＢＰ））フラスコ培養施行した。５００ｍｌbaffledフラスコを用いて５０ｍｌ液体培養を実施した。培養条件は、ＹＰＥＤ培地利用、総培養時間７２時間、３０℃、２００ｒｐｍ、ｐＨは、６〜７．５である。十分な量の菌体増殖確保のために、グルコースを炭素源として用いて２４時間培養した後、ドデカン１％添加、ｐＨ７．５調節のために、リン酸カリウム（potassium phosphate）を添加した。ドデカンを添加した時点から６時間周期でグルコースを０．５％ずつ添加した。転換されたドデカンジオイック酸の濃度を確認した結果、７２時間基準野生型菌株（受託番号：ＫＣＴＣ１２８２０ＢＰ）０ｇ／Ｌ、ＰＯＸ１遺伝子除去菌株（受託番号：ＫＣＴＣ１３１０４ＢＰ）９．３９ｇ／Ｌ、ＰＯＸ１及びＰＯＸ２遺伝子除去菌株（受託番号：ＫＣＴＣ１３１０６ＢＰ）９．３２ｇ／Ｌであって、ＣｉＰＯＸ１が除去された菌株がドデカンを炭素源として使用せず、ドデカンジオイック酸に９２％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）以上転換されることを確認し、結果は、図２０に示した。
【００７８】
実施例１２：カンジダ・インファンティコーラ形質転換菌株のジオイック酸転換５Ｌ発酵器培養
本発明の形質転換菌株に対するジカルボン酸生産能を調べるために、ＣｉＰＯＸ１及びＣｉＰＯＸ２遺伝子欠損菌株（受託番号：ＫＣＴＣ１３１０６ＢＰ）を利用した５Ｌ規模の発酵器培養を実施した。１次培養条件は、培養体積２Ｌ、ｐＨ５〜ｐＨ６、温度３０℃、aeration １ｖｖｍ、agitation ２００ｒｐｍであり、ｐＨ調節のために、１０Ｎ  ＮａＯＨを使用し、培養液内の溶存酸素が減ることによって、ｒｐｍを調節して溶存酸素を３０％以上保持させた。初期培地内の細胞生長のためのグルコースが消耗する時点である１２時間以後にジオイック酸の転換のための２次培養のために、ω酸化誘導物質であるドデカン２０ｍｌ添加、還元力提供のために、グルコースを４ｇ／ｈｒの速度で添加し、培養条件は、ｐＨ７．５、aeration ０．５ｖｖｍに変更した。２次培養１２時間後に基質であるラウリン酸メチルを１．２〜１．５ｍｌ／ｈｒの速度で投入して、総４８時間培養した。転換されたドデカンジオイック酸は、４８時間基準１７．６４ｇ／Ｌ生産及び９０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）以上の転換収率を確認し、結果は、図２１に示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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