(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質担体に結合しているジェジュニ菌莢膜多糖および／またはシゲラ属種リポ多糖を含み、
前記タンパク質担体が大腸菌毒素原性組換えポリペプチドコンストラクトを含み、
前記大腸菌毒素原性組換えポリペプチドコンストラクトが、ポリペプチドリンカー経由で同じ線毛型の１つまたは複数の大腸菌線毛大サブユニットまたはその免疫原性断片に接続している大腸菌線毛小サブユニットを含み、
前記１つまたは複数の大腸菌線毛大サブユニットの各々が、ドナーβ鎖を含有し、ポリペプチドリンカー経由で互いにも接続し、
前記大腸菌毒素原性組換えポリペプチドコンストラクトが、そのＣ末端にＣ末端ヒスチジンタグを含有することができ、
前記大腸菌線毛小サブユニットがＣｆａＥを含み、前記ＣｆａＥが、そのＣ末端で、前記大腸菌線毛大サブユニットとしてのＣｆａＢのＮ末端に接続し、
前記大腸菌線毛大サブユニットとしてのＣｆａＢのＣ末端側が、ポリペプチドリンカー経由で、隣接するＮ末端側の別の大腸菌線毛大サブユニットと同種または異種の大腸菌線毛大サブユニットに由来するＣ末端ドナーβ鎖に接続しているか、または、前記大腸菌毒素原性組換えポリペプチドコンストラクトが、１つまたは複数の追加の大腸菌毒素原性組換えポリペプチドコンストラクトに接続し、
前記１つまたは複数の追加の大腸菌毒素原性組換えポリペプチドコンストラクトの各々が、ポリペプチドリンカー経由で、１つまたは複数の大腸菌線毛大サブユニットまたはその免疫原性断片に接続している大腸菌線毛小または大サブユニットを含み、
前記１つまたは複数の追加の大腸菌毒素原性組換えポリペプチドコンストラクトに接続される大腸菌線毛大サブユニットの各々が、ドナーβ鎖を含有し、ポリペプチドリンカー経由で互いにも接続し、
前記追加の大腸菌毒素原性組換えポリペプチドコンストラクトの各々が、他の大腸菌毒素原性組換えポリペプチドコンストラクトのいずれとも異なる線毛型に由来する大腸菌線毛小または大サブユニットを含有し、
前記追加の大腸菌毒素原性組換えポリペプチドコンストラクトが、そのＣ末端にＣ末端ヒスチジンタグを含有することができる、多病原体免疫原性コンストラクト。
【請求項２】
前記ジェジュニ菌莢膜多糖または前記シゲラ属種リポ多糖対大腸菌組換えタンパク質担体のモル比が１：１〜５：１である、請求項１に記載の多病原体免疫原性コンストラクト。
【請求項３】
前記ＣｆａＢ以外の大腸菌線毛大サブユニットが、クラス５、ＣＳ３およびＣＳ６からなる群から選択されるＥＴＥＣ株に由来する、請求項１に記載の多病原体免疫原性コンストラクト。
【請求項４】
前記大腸菌毒素原性組換えポリペプチドコンストラクトが、配列番号７、９、１７、１９、２１、２３、１０４、１１２および１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の多病原体免疫原性コンストラクト。
【請求項５】
前記大腸菌毒素原性組換えポリペプチドコンストラクトが、配列番号６、８、１６、１８、２０、２２、１０３、１１１および１１３からなる群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされる、請求項１に記載の多病原体免疫原性コンストラクト。
【請求項６】
前記ジェジュニ菌多糖が、以下からなる群から選択される式を有する三糖の繰り返し構造である、請求項１に記載の多病原体免疫原性コンストラクト：
【化１】
0006590916.tif 000012
Ｌ−ｇｌｙｃｅｒｏ−β−Ｄ−ｉｄｏ−ヘプトースの２位でＯ−メチルホスホロアミデートの不定比置換を伴う［→３）−Ｌ−β−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→］ｎ；
ＨＳ１３に由来し、６−デオキシ−β−Ｄ−ｉｄｏ−ヘプトースの２位または／および７位でＯ−メチルホスホロアミデートの非化学量論的置換を伴う［→３）−６ｄ−β−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→］ｎ；
［→３）−Ｌ−β−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→］ｎ；  ６−デオキシ−α−Ｄ−ｉｄｏ−ヘプトースの２位でＯ−メチルホスホロアミデートの不定比置換を伴う［→３）−Ｌ−α−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→４）−α−Ｇａｌ−（１→］ｎ；
【化２】
0006590916.tif 000013
ＨＳ３、ＨＳ１３およびＨＳ５０に由来し、Ｌ−ｇｌｙｃｅｒｏ−α−Ｄ−ｉｄｏ−ヘプトースの２位でＯ−メチルホスホロアミデートの不定比置換を伴う［→３）−６ｄ−α−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１−＞４）−α−Ｇａｌ−（１→］ｎ（式中、「ｎ」は１から１００である）。
【請求項７】
前記シゲラ属リポ多糖が構造：
【化３】
0006590916.tif 000014
を有する、請求項１に記載の多病原体免疫原性コンストラクト。
【請求項８】
前記ドナーβ鎖が１２〜１６アミノ酸を含有する、請求項１に記載の多病原体免疫原性コンストラクト。
【請求項９】
前記大腸菌線毛小または大サブユニットのＮ末端が、１８〜２２アミノ酸のシグナルペプチドを含有する、請求項１に記載の多病原体免疫原性コンストラクト。
【請求項１０】
前記ポリペプチドリンカーのアミノ酸配列が、配列番号５のアミノ酸配列またはトリグリシンである、請求項１に記載の多病原体免疫原性コンストラクト。
【請求項１１】
前記１つまたは複数の大腸菌線毛大サブユニットが、Ｎ末端の１４〜１８アミノ酸の欠失を含有する、請求項１に記載の多病原体免疫原性コンストラクト。
【請求項１２】
前記大腸菌毒素原性組換えポリペプチドコンストラクトが、ＣｓｆＤ、ＣｓｕＤ、ＣｏｏＤ、ＣｓｂＤ、ＣｏｓＤ、ＣｓｄＤ、ＣｏｔＤからなる群から選択される大腸菌線毛小サブユニットと、ＣｓｆＡ、ＣｓｕＡ２、ＣｏｏＡ、ＣｓｄＡ、ＣｏｓＡ、ＣｓｂＡ、ＣｏｔＡ、ＣｓｔＧ、ＣｓｔＨ、ＣｓｓＡ、およびＣｓｓＢまたはそれらの免疫原性断片からなる群から選択される大腸菌線毛大サブユニットとを含む、請求項１に記載の多病原体免疫原性コンストラクト。
【請求項１３】
前記ＣｆａＥ以外の大腸菌線毛小サブユニットのアミノ酸配列が、配列番号４５、４６、５１、５２、５７、５８、６５、７１、７５、７９、８３、８８、９０、９３、９５、および９７からなる群から選択され、前記ＣｆａＥ以外の大腸菌線毛大サブユニットのアミノ酸配列が、配列番号２、４、４８、４９、５４、５５、６０、６１、６３、６７、６９、７３、７７、８１、８５、８７、８９、９１、９２、９４、９６、９８、９９、１０１、１３５、および１３７からなる群から選択される、請求項１に記載の多病原体免疫原性コンストラクト。
【請求項１４】
非ヒト動物に対して免疫応答を誘導する方法であって、ジェジュニ菌株、大腸菌、およびシゲラ属からなる群から選択される１つまたは複数の腸内細菌に対する免疫応答を誘導し、
ａ．請求項１に記載の多病原体免疫原性コンストラクトから構成される多病原体免疫原性組成物を用量あたり０．１μｇ〜１０ｍｇの用量範囲で投与するステップと、
ｂ．追加刺激用量の前記多病原体免疫原性組成物を用量あたり０．１μｇ〜１０ｍｇの用量範囲で投与するステップとを含む、方法。
【請求項１５】
前記ジェジュニ菌莢膜多糖が請求項６に記載の多糖構造を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記多病原体免疫原性組成物がシゲラ属種リポ多糖を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記大腸菌毒素原性組換えコンストラクトの前記ＣｆａＥ以外の大腸菌線毛小サブユニットのアミノ酸配列が、配列番号４５、４６、５１、５２、５７、５８、６５、７１、７５、７９、８３、８８、９０、９３、９５、および９７からなる群から選択され、前記大腸菌毒素原性組換えポリペプチドコンストラクトの前記大腸菌線毛大サブユニットのアミノ酸配列が、配列番号２、４、４８、４９、５４、５５、６０、６１、６３、６７、６９、７３、７７、８１、８５、８７、８９、９１、９２、９４、９６、９８、９９、１０１、１３５、および１３７からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記大腸菌毒素原性組換えポリペプチドコンストラクトが、配列番号７、９、１７、１９、２１、２３、１０４、１１２および１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記大腸菌毒素原性組換えポリペプチドコンストラクトが、配列番号６、８、１６、１８、２０、２２、１０３、１１１および１１３からなる群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされている、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記ドナーβ鎖が１２〜１６アミノ酸を含有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記大腸菌線毛小または大サブユニットのＮ末端が、１８〜２２アミノ酸のシグナルペプチドを含有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリペプチドリンカーのアミノ酸配列が、配列番号５のアミノ酸配列またはトリグリシンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つまたは複数の大腸菌線毛大サブユニットが、Ｎ末端の１４〜１８アミノ酸の欠失を含有する、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００５年１月１１日に出願された米国仮出願６０／６４２，７７１号の優先権を主張する、２００６年１月１０日に出願された米国非仮出願１１／３４０，００３号の一部継続出願であり、かつ、２００５年９月２１日に出願された米国仮出願６０／７２２，０８６号の優先権を主張する、２００６年９月２０日に出願された米国非仮出願１１／５２４，０５７号の一部継続出願であり、かつ、２０１２年１１月１９日に出願された米国仮出願６１／７２７，９４３号の優先権を主張する、２０１３年１０月８日に出願された米国非仮出願１４／０４８，２６４号の一部継続出願であり、その内容が参照により本明細書に組み込まれている。また本出願は、２０１４年９月２４日に出願された米国仮出願６２／０５４，４５４号、２０１５年３月４日に出願された米国仮出願６２／１２７，９２７号、２０１５年５月２２日に出願された米国仮出願６２／１６５，３０１号、２０１５年３月４日に出願された米国仮出願６２／１２７，９３５号、および２０１４年１１月５日に出願された米国仮出願６２／０７５，３９９号の優先権を主張し、その内容が参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本発明の主題は、毒素原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）およびジェジュニ菌（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）に対する組換えコンストラクトであって、抗ＥＴＥＣ組換えポリペプチドコンストラクトおよびジェジュニ菌莢膜多糖の組合せを含む、組換えコンストラクトに関する。
【背景技術】
【０００３】
毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、シゲラ属種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．）およびジェジュニ菌（ＣＪ）は、世界的に見られる細菌性下痢症の主原因である。両方の病原体は、物資に制約のある国々においては西洋人の旅行者および幼児にとって深刻な脅威であり、そのため彼らは、ＥＴＥＣおよびＣＪに対する単一または二重の病原体ワクチンの適切な標的集団となる。いずれの病原体についても、利用可能なＦＤＡ認可ワクチンはない。
【０００４】
ＥＴＥＣは、乳幼児の間で年間推定２億１，０００万件の下痢症および３８万件の死亡を引き起こしている。その上、ＥＴＥＣは旅行者下痢症の最も一般的な原因である。ＥＴＥＣが引き起こす下痢症は、重症度が軽度の不調から重度のコレラ様利通に及ぶ。２つの主要な病原性因子、すなわち定着因子（ＣＦ）と呼ばれる粘着性の線毛およびエンテロトキシンが存在する。表面発現するＣＦは複雑なタンパク質ヘテロポリマーからなり、小腸上皮への粘着性を媒介してこの特権的宿主ニッチ内での定着を開始する。ＥＴＥＣは、熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）および熱安定性エンテロトキシン（ＳＴＩ）という、２種の異なるエンテロトキシンの一方または両方を産生する。ＬＴおよびＳＴＩは上皮細胞を中毒させ、体液および電解質の分泌ならびに臨床上の下痢症をもたらす。ＬＴは高度に免疫原性でありかつ強力なアジュバントであるが、ＳＴＩは小さく免疫原性の低いペプチドである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
優勢なＣＦおよびＬＴ（またはその同属コレラ毒素（ＣＴ））の無毒性形態は、ＥＴＥＣワクチンを開発するいくつかの戦略にとっての焦点であった。このような抗原は個々に用いるか、または全細胞死滅ワクチン、弱毒化したＥＴＥＣもしくは他の腸内細菌種（例えば、シゲラ属およびコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）０１）により誘導された生ワクチン、および精製タンパク質ワクチンの構成成分としてまとめられた。十分に高くかつ広範なレベルの防御の付与を示したワクチンはまだない。臨床試験からの多くのエビデンスにより、抗ＬＴ免疫がＬＴを産生するＥＴＥＣに対して短期の防御を付与することが示されている。ある特定のＣＦが防御抗原として機能することを示すエビデンスも存在する。しかし、ＥＴＥＣワクチン開発には大きな難題が存在する。１つには、すべてのＥＴＥＣのうちの約半分は抗ＬＴ免疫が有効でないと考えられるＳＴＩのみを発現することが挙げられ、したがって抗ＣＦまたは抗細菌の免疫が必要となる。また、ＥＴＥＣのＣＦの多様性は、現実的な数のＣＦを包含するのに十分に広範な適用範囲を達成する上での問題となる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ジェジュニ菌莢膜多糖またはシゲラ属種リポ多糖（ＬＰＳ）と組み合わせた毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）線毛サブユニットを発現するポリペプチドコンストラクトを含む免疫原性コンストラクトに関する。
【０００７】
好ましい実施形態では、１つまたは複数のジェジュニ菌莢膜多糖は、１つまたは複数の大腸菌毒素原性組換えポリペプチドコンストラクトに結合している。別の実施形態では、シゲラ属ＬＰＳがＥＴＥＣポリペプチドコンストラクトに結合している。
【０００８】
ジェジュニ菌は、麻痺をもたらし得る感染後多発神経障害であるギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）の誘導に関連している。その関連性は、リポオリゴ糖（ＬＯＳ）のシアル酸含有外部コアとヒトのガングリオシドとの間の分子擬態によるものである（５、６、８９、９１）。したがって、ＬＯＳコアに対して生成された抗体が、ヒトの神経組織に自己免疫応答をもたらす。ジェジュニ菌莢膜多糖を用いることで、ギラン・バレー症候群を誘導する可能性を伴わずに免疫応答を誘導することができる。
【０００９】
好ましい実施形態では、この組成物は、同じＥＴＥＣの線毛型に由来する大または小サブユニットがポリペプチドリンカー経由で接続し、ドナー鎖相補性によって安定化されるＥＴＥＣ組換えポリペプチドコンストラクト設計を含む。最もＣ末端側のＥＴＥＣ大サブユニットは、リンカー経由で、このＣ末端大サブユニットと同種でも異種でもあり得るＥＴＥＣ大サブユニットからのドナー鎖領域に接続している。免疫原性組成物は、ＥＴＥＣ線毛大または小サブユニットの全体、またはドナーβ鎖領域を含有する免疫原性断片を含むことができる。一部のコンストラクトの例では、サブユニット間の、特にＣＳ６の互いのサブユニットにおける偶発性会合を避けるために、ＥＴＥＣ線毛大サブユニットは１４〜１８アミノ酸のＮ末端欠失を含有することができる。
【００１０】
別の実施形態では、上記のコンストラクトのうちの１つまたは複数がポリペプチドリンカー経由で接続して多部分融合コンストラクトを形成し、複数の線毛型に由来するサブユニットが発現される。この実施形態では、線毛サブユニットは、限定するものではないが、クラス５ａ、５ｂまたは５ｃを含むＥＴＥＣクラス５線毛型およびＥＴＥＣ  ＣＳ６を含む任意のＥＴＥＣ線毛型に由来し得る。
【００１１】
この実施形態の多部分コンストラクトは、他の単量体または多量体との望ましくない会合を避けるために、かつポリペプチド間のアミノ酸配列長を除去、縮小してプロテアーゼ切断を減らすために、１つまたは複数の線毛サブユニットのＮ末端領域の欠失を含有することができる。
【００１２】
ＥＴＥＣ組換えポリペプチドコンストラクトをコードしているＤＮＡは、ジェジュニ菌またはシゲラ属ＬＰＳへの付着のためのポリペプチドを発現するために用いることができる。そのため、本発明の目的には、ＥＴＥＣ、ジェジュニ菌およびシゲラ属株を含めた複数の細菌の種からの抗原を含む組成物による、ヒトを含めた哺乳動物に免疫を与えるためのコンストラクトの使用も含まれる。この実施形態の使用は、組合せコンストラクトの１つまたは複数の初回刺激投与を含む。初回刺激用量の後に１用量または複数用量の追加刺激用量を実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】同じＥＴＥＣの線毛型に由来する大または小サブユニットが、ポリペプチドリンカー経由で接続しドナー鎖相補性により安定化される、本発明のコンストラクト設計を示す図である。このコンストラクトは、Ｎ末端サブユニットのＮ末端領域の欠失を含有することができる。この特徴は他の単量体または多量体との望ましくない会合を防ぐ。Ｃ末端サブユニットは、ポリペプチドリンカー経由でこのサブユニットに接続しているドナーβ鎖によって安定化され、このドナーβ鎖は、自らが安定化しているサブユニットと同じサブユニットとして定義される同種のサブユニットに由来するか、または、この同じ線毛型となお異なるサブユニットに由来すると定義される異種のサブユニットに由来する。
【図２】図１に示す複数の組成物がポリペプチドリンカー経由で接続している多部分コンストラクトを示す図である。第１のサブユニットは、ＥＴＥＣ線毛の大または小（例えばＥＴＥＣクラス５アドヘシン）サブユニットである。次に、１つまたは複数のＥＴＥＣ線毛大サブユニットは、リンカー経由で第１のサブユニットにかつ互いに接続し、これらのサブユニットはドナー鎖相補性により安定化されている。最もＣ末端側のＥＴＥＣ大サブユニットは、リンカー経由で、この末端大サブユニットと同種でも異種でもあり得るＥＴＥＣ大サブユニットからのドナー鎖領域に接続している。一部のコンストラクトの例では、サブユニット間の、特にＣＳ６サブユニット間相互の偶発性会合を避けるために、ＥＴＥＣ線毛大サブユニットは１４〜１８アミノ酸のＮ末端欠失を含有することができる。
【図３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび結合型ワクチンの免疫ブロットの図である。Ａ．ＣｆａＥ−ＨＳ３６結合体の分析。レーン１〜３は、Ｇｅｌ  Ｃｏｄｅ  Ｂｌｕｅで染色されている。レーン１、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｎｄａｒｄ（ＢｉｏＲａｄ）；レーン２、ＣｆａＥ；レーン３、ＣｆａＥ−ＨＳ３６結合体。レーン４〜５は、抗ＣｆａＥ抗体で免疫検出されている。レーン４、ＣｆａＥ；レーン５、ＣｆａＥ−ＨＳ３６結合体。レーン６〜７は、８１−１７６の全細胞に対して抗体で免疫検出されている（ＨＳ３６）。レーン６、ＣｆａＥ−ＨＳ３６結合体；レーン７、プロテイナーゼＫに消化された８１−１７６の全細胞。Ｂ．ＣｆａＥＢ−ＨＳ３６結合体の分析。レーン１〜３はＧｅｌ  Ｃｏｄｅ  Ｂｌｕｅで染色されている。レーン１、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｎｄａｒｄ（ＢｉｏＲａｄ）；レーン２、ＣｆａＥＢ；レーン３、ＣｆａＥＢ−ＨＳ３６結合体。レーン４〜５は抗ＣｆａＥ抗体で免疫検出されている。レーン４、ＣｆａＥＢ；レーン５、ＣｆａＥＢ−ＨＳ３６結合体。レーン６〜７は、８１−１７６の全細胞に対して抗体で免疫検出されている（ＨＳ３６）。レーン６、ＣｆａＥＢ−ＨＳ３６結合体；レーン７、プロテイナーゼＫに消化された８１−１７６の全細胞。プロテインマーカーの分子量を左に示す。
【図４】マウスにおけるＣｆａＥまたはＣｆａＥＢに結合されたＨＳ３６により誘導されたジェジュニ菌抗ＣＰＳ（Ａ）またはＥＴＥＣ抗ＣｆａＥ（Ｂ）の図である。
【図５】ＨＳ３６結合型ワクチンで免疫処理されたマウスにおいて誘導され、ＨＡＩ力価により証明された、機能的抗体の図である。
【図６】多糖コンストラクトの合成およびＣＲＭ１９７への結合の概要図である。
【図７】アミノペンタニルＯＭｅ−ホスホロアミデートガラクトシドの合成の図である。試薬および条件：（ａ）ＴｒＣｌ、ピリジン、９５％；（ｂ）ＡｌｌＢｒ、ＮａＨ、ＤＭＦ、０℃、８９％；（ｃ）ＣＡＮ、ＣＨ３ＣＮ、Ｈ２Ｏ、０℃；次にＣＣｌ３ＣＮ、Ｋ２ＣＯ３、ＣＨ２Ｃｌ２、２ステップにわたって５７％；（ｄ）ＨＯ（ＣＨ２）５ＮＰｈｔｈ、ＴＭＳＯＴｆ、ＣＨ２Ｃｌ２、６５％；（ｅ）８０％のＡｃＯＨ、８０℃、７８％；（ｆ）ＰＣｌ２Ｏ２Ｍｅ２、Ｅｔ３Ｎ、ＣＨ２Ｃｌ２、それからＮＨ３（ｇ）、２７％；（ｇ）ＰｄＣｌ２、ＭｅＯＨ、７５％、（ｈ）Ｈ２ＮＮＨ２、ＥｔＯＨ、８２％。
【図８】複数の結合免疫原性組成物に対する抗体による６−ＭｅＯＰＮ−Ｇａｌへの莢膜交差反応性の図である。
【図９】ＣｆａＥＢ−ＨＳ２３−３６コンストラクトで免疫処置したナンシーマーヨザル（Ａｏｔｕｓ  ｎａｎｃｙｍａａｅ）の血清学の図である。０日目対１４０日目。
【図１０】Ｃｆａ１を発現しているＥＴＥＣ株Ｈ１０４０７に対するナンシーマーヨザルのＨＡＩ力価の図である。
【図１１】ＣｓｓＢＡ−ＨＳ３結合型ワクチンで免疫処置を行った後の、ＨＳ３莢膜（上パネル）およびＣＳ６（下パネル）に対するマウスの免疫応答の図である。ワクチンは、体重によって５μｇまたは２５μｇの２用量のいずれかを投与した。
【図１２】ＬＴＢ−ＨＳ４結合型ワクチンで免疫処置を行った後の、ＨＳ４莢膜（上パネル）およびＬＴＢ（下パネル）へのマウスの免疫応答の図である。ワクチンは、体重によって５ｕｇまたは２５ｕｇの２用量を投与した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
腸内細菌という用語が本明細書で使用される場合、毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、ジェジュニ菌、または志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ボイド赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  Ｂｏｙｄｉｉ）もしくはソンネ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）を含むシゲラ属種を指す。本明細書で使用される場合、腸内細菌多糖ポリマーは腸内細菌に由来する多糖ポリマーである。本明細書で使用される場合、用語「多糖抗原」は、ジェジュニ菌（ジェジュニ菌莢膜）に由来する莢膜多糖またはシゲラ属種に由来するリポ多糖を指す。本明細書で使用される場合、「多糖」は炭水化物ポリマー分子を構成する２つ以上の単糖ユニットを指す。「多糖ポリマー」は、一緒に接続された２つ以上の多糖分子を指す。
【００１５】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書で使用される場合、互換的に使用可能であり、２つ以上のアミノ酸残基から形成されるポリマーを指し、１つまたは複数のアミノ酸残基は天然存在のアミノ酸である。用語「アミノ酸配列」は、ポリペプチド内のアミノ酸の順序を指す。本明細書で使用される場合、「オリゴマー」は比較的少数のアミノ酸を含むポリペプチド配列である。
【００１６】
用語「組換えポリペプチド」、「組換えポリペプチドコンストラクト」、または「組換えタンパク質」は、本明細書で使用される場合、組換えＤＮＡ手法により産生されたポリペプチドまたはタンパク質、すなわち、所望のポリペプチドまたは所望のタンパク質をコードしている外因性のＤＮＡコンストラクトによって形質転換された細胞から産生されたポリペプチドまたはタンパク質、を指す。用語「組換えコンストラクト」は、組換えポリペプチド、組換えポリペプチドコンストラクトまたは組換えタンパク質をコードしているＤＮＡを指す。
【００１７】
用語「ドナー鎖」または「ドナーβ鎖」は、ドナー鎖相補性においてもう１つのＥＴＥＣ線毛サブユニットと会合するＥＴＥＣ線毛サブユニットのＮ末端領域を示す。
【００１８】
用語「免疫原性組成物」は、液性および／または細胞性免疫応答を誘導するタンパク質もしくはポリペプチドまたは多糖もしくは多糖ポリマーを含有する製剤を指す。用語「免疫原性適用範囲」または「適用範囲のスペクトル」は、「適用範囲」下での細菌の特定株に対する液性および／または細胞性免疫応答の誘導を指す。用語「免疫原性断片」は、１つまたは複数のＢまたはＴ細胞エピトープを含有するポリペプチドを指し、免疫応答を誘導するのに、またはＴもしくはＢ細胞に認識されるのに十分な長さを有する。用語「誘導体」は、同定される遺伝子の配列との同一性が少なくとも８０％であるポリペプチドまたは核酸配列を示す。この文脈において、「同一性」は、最大限一致するように整列したときに、同じであるかまたは特定の百分率で同じアミノ酸残基を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。一部の配列が保存的置換、すなわち、同一の特性を有する残基の置換、において相違する場合、そのパーセント配列同一性は、置換の保存的性質について補正するように上方に調整してもよい。パーセント類似性は、同一および類似（保存された変化）の残基の割合を示す。
【００１９】
「線毛」は、ＥＴＥＣ細菌上の突起またはフィラメントとして定義され、ＣＳ３およびＣＳ６の線毛の場合のように大サブユニットで構成されているか、またはクラス５ａ、５ｂおよび５ｃのＥＴＥＣの場合のように大および小サブユニットで構成されている。「小線維」は細菌からの細い突起である。ＣＳ３およびＣＳ６の線毛は、その細い特徴から小線維とも呼ばれ得る。用語「線毛サブユニット」は、ＥＴＥＣ線毛を構成するタンパク質を指し、「ピリン」と互換的に用いられる。したがって、「ピリン」は、ＥＴＥＣ線毛を構成する「大」または「小」「線毛サブユニット」を指すことができる。「線毛小サブユニット」はクラス５のＥＴＥＣ線毛の先端におけるアドヘシンタンパク質を指し、「大」サブユニットと比較して化学量論的に低い量で発現される。「線毛小サブユニット」には、限定するものではないが、ＣｆａＥ、ＣｓｆＤ、ＣｓｕＤ、ＣｏｏＤ、ＣｏｓＤ、ＣｓｄＤ、ＣｓｂＤおよびＣｏｔＤが含まれる。「線毛大サブユニット」は、ＥＴＥＣ線毛において、「線毛小サブユニット」に比べて化学量論的により大きい量で表されるＥＴＣ線毛タンパク質を指す。「線毛大サブユニット」には、ＥＴＥＣクラス５タンパク質：ＣｆａＢ、ＣｓｆＡ、ＣｓｕＡ２、ＣｓｕＡ１、ＣｏｏＡ、ＣｏｓＡ、ＣｓｄＡ、ＣｓｂＡ、ＣｏｔＡ；ＥＴＥＣ  ＣＳ３タンパク質：ＣｓｔＨ、ＣｓｔＧ；ならびにＥＴＥＣ  ＣＳ６タンパク質：ＣｓｓＡおよびＣｓｓＢ、が含まれる。
【００２０】
ジェジュニ菌の病因はＥＴＥＣに比べると依然十分に理解されておらず、この生物がより良好に特徴づけられた病原体と共有する病原性因子はわずかである。ただし、ジェジュニ菌は、確認された数少ない病原性因子の１つである多糖莢膜（ＣＰＳ）を発現するという点で、腸内の病原体の中ではまれな存在である。
【００２１】
ＥＴＥＣおよびジェジュニ菌が病原体として重要であることから、両方の病原体に対する防御をもたらすためにＥＴＥＣ−ＣＪ組合せ組成物が構築された。一実施形態では、クラス５  ＥＴＥＣ株の線毛サブユニットを含む組換えポリペプチドコンストラクトを、ジェジュニ菌株１８−１７６の莢膜多糖と融合させる。
【００２２】
好ましい実施形態では、ＥＴＥＣ線毛接着を含む１つまたは複数の組換えポリペプチドＥＴＥＣコンストラクトを、単離されたジェジュニ菌莢膜多糖（ＣＰＳ）と結合させる。複数のＥＴＥＣ組換えコンストラクトのうちの１つまたは複数を、複数のジェジュニ菌莢膜多糖構造のうちの１つまたは複数に結合させることができる。本発明のコンストラクトにおいて、ＥＴＥＣ組換えコンストラクトは、ＥＴＥＣに対する免疫原としてもジェジュニ菌多糖を提示するタンパク質担体分子としても機能する。組合せの構造に組込むことができるＥＴＥＣ組換えポリペプチドおよびジェジュニ菌莢膜多糖の例を、次の実施例に示す。
【００２３】
好ましい実施形態では、ＥＴＥＣポリペプチドコンストラクトは、ＥＴＥＣに対する抗原として機能するだけではなく、ジェジュニ菌莢膜多糖などの多糖抗原のためのタンパク質担体としても機能する。
【実施例１】
【００２４】
ＥＴＥＣポリペプチドとジェジュニ菌莢膜多糖（ＣＰＳ）との結合
好ましい実施形態では、ＥＴＥＣ組換えポリペプチドまたはポリペプチドコンストラクトをジェジュニ菌ＣＰＳに結合させる。このＣＰＳは、複数のジェジュニ菌株に由来し得る。この実施形態では、任意のジェジュニ菌株の任意のＣＰＳをＥＴＥＣ組換えポリペプチドコンストラクトに結合させることが想定される。あるいは、シゲラ属ＬＳＰをＥＴＥＣ組換えポリペプチドコンストラクトに結合させることができる。
【００２５】
全体的な結合方法には、ジェジュニ菌ＣＰＳを、例えば酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）中のＮａＩＯ４で酸化させることが含まれる。酸化ＣＰＳを５ｋＤａカットオフ膜を用いて攪拌限外濾過により脱塩し、次に凍結乾燥した。次に、ＥＴＥＣタンパク質を添加する。化学量論的タンパク質対ＣＰＳは様々なものとなり得るが、典型的な質量比はタンパク質対ＣＰＳが１：２である。構成成分の濃度は任意の方法によりあり得る。しかし、例えば、多糖濃度がアントロンアッセイにより決定し、タンパク質濃度は決定した。次に、ＮａＣＮＢＨ３を添加する。次に結合体を限外濾過により脱塩し、凍結乾燥する。ＣＰＳ（またはシゲラ属ＬＰＳ）、ＥＴＥＣタンパク質および結合体を、例えばＳＥＣ−ＨＰＬＣにより分析した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびＧｅｌ  Ｃｏｄｅ（登録商標）Ｂｌｕｅ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ、Ｌｏｍｂａｒｄ、ＩＬ）の染色による分析も結合体に対して行なった。抗ＣＰＳおよび抗ＥＴＥＣタンパク質を用いた抗体ベースアッセイによって結合体を検出した。
【００２６】
ＥＴＥＣ組換えポリペプチドとジェジュニ菌との結合の例として挙げられるのは、ジェジュニ菌株８１−１７６のＣＰＳを、ＥＴＥＣ組換えポリペプチドコンストラクトＣｆａＥ（クラス５  ＥＴＥＣアドヘシン）、または、ポリペプチドリンカー経由で大サブユニットＣｆａＢに連結している組換えポリペプチドコンストラクトＣｆａＥに結合させた例である。
【００２７】
ジェジュニ菌株８１−１７６（ＰＧ３２０８）からＣＰＳジェジュニ菌莢膜を精製した。クロラムフェニコールカセットによりｇａｌＴ遺伝子が挿入不活性化されたこの変異体は、リポオリゴ糖（ＬＯＳ）コアにおけるすべてのガングリオシド模倣が欠如している。
【００２８】
細胞をブタのブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）ブロスで生育し、超音波処理して細胞を不活性化した。同じ生物に以前使用された熱水／フェノール法（Ｃｈｅｎ、他、Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．２４３：１０３４（２００８））によりＣＰＳを抽出した。細胞を水／フェノール混合物（３：２の容積比）中に浸漬し、６７℃に加熱し４時間攪拌した。懸濁液を冷却し、混合物を２つの別々の層（水層およびフェノール層）へ分離し水層を抽出した。水層を取り出し、残渣にフェノール／水抽出を繰り返して収率を最大化した。２回の抽出からの水層をプールし、酢酸を添加してｐＨ３．５にしたものを１．５時間煮沸した。水層を流水に対して２日間透析し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濃縮セルを用いて５ｋＤａカットオフ膜で濃縮した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＣＣｌ／１ｍＭ  ＭｇＣｌ２中９０ｕ／ｍｌのベンゾナーゼ酵素を用いて、ｐＨ８、３７℃で終夜消化させることにより残留ＲＮＡの痕跡量を除去した。ベンゾナーゼをＣＰＳから除去し、攪拌限外濾過を用いた脱塩および濃縮をそれぞれ３０ｋＤａ、５ｋＤａのディスク膜で行った。
【００２９】
ｐＨ４の酢酸ナトリウム中の４０ｍＭ  ＮａＩＯ４にＣＰＳ  ４０ｍｇを添加し、暗中４０℃にて２日間置き、単離したＣＰＳを酸化させた。酸化ＣＰＳを５ｋＤａカットオフ膜を用いた攪拌限外濾過により脱塩し、続いて凍結乾燥した。
【００３０】
結合の前に、ＥＴＥＣタンパク質、例えばｄｓｃＣｆａＥおよびｄｓｃＣｆａＥＢをｐＨ９．０の０．１Ｍホウ酸塩緩衝液に移した。各々のＥＴＥＣタンパク質に酸化ＣＰＳを、タンパク質対ＣＰＳの質量比１：２で添加し、次にＮａＣＮＢＨ３をＣＰＳの質量の２倍当量添加した。室温にて１日、暗中３７℃にて連続撹拌を伴い６日間、反応物をインキュベートした。３０ｋＤａ膜を用いた攪拌限外濾過により結合体を脱塩し、凍結乾燥した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）（１２．５％）の電気泳動法をｄｓｃＣｆａＥおよびｄｓｃＣｆａＥＢへのＣＰＳの結合体に対して行った。
【００３１】
ＰＡＧＥ分析では、ＣＰＳを検出するのにウサギポリクローナル抗体を用いた８１−１７６の全細胞に対する免疫検出を用い、ＣｆａＥについても同様に行った。この試験の結果を図３に示す。両方の結合体に対し抗ＣｆａＥ抗血清で免疫ブロットすることで、タンパク質が、各々に対応するタンパク質の質量より高い質量から２５０ｋＤａ超までの範囲の見かけ上の質量を有する高分子量の結合体として移動することが確認された。ホルマリン固定されたジェジュニ菌８１−１７６の全細胞に対し抗血清で免疫ブロットすることで、莢膜多糖体がタンパク質と結合したことが確認される。図３に示すように、いずれの結合においても非結合型のタンパク質は残っていなかった。
【００３２】
図３の結果はＳＥＣ−ＨＰＬＣで確認したものである。ＳＥＣ−ＨＰＬＣにおいては、ＩＣＳ−５０００  Ｄｉｏｎｅｘシステム上でｐＨ６．８の０．１Ｍリン酸塩、０．１Ｍ硫酸ナトリウムおよび５％アセトニトリルを用いて０．６ｍｌ／分の流速で動作するＴＳＫｇｅｌ−Ｇ２０００ＳＷｘｌカラム（３０ｃｍ×７．８ｍｍ  ＩＤ）およびＴＳＫｇｅｌ  ＳＷガードカラムによるＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて非酸化および酸化ＣＰＳ、ＥＴＥＣタンパク質および結合体を分析した。試料を２１４ｎｍにてＵｌｔｉｍａｔｅ３０００可変波長検出器およびＲＩ検出器（いずれもＤｉｏｎｅｘ製）を用いてモニターした。
【００３３】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣの結果を、ｄｓｃＣｆａＥＢについては図４に、ｄｓｃＣｆａＥについては図５に示す。マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）による分析を、ｄｓｃＣｆａＥＢについては図６に、ＣｆａＥについては図７に示す。
【００３４】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣにおける屈折率（ＲＩ）による結合体の検出から、多糖の４５％および５０％が、それぞれＣｆａＥおよびＣｆａＥＢ結合体と結合せずにとどまっていたことが明らかになった。表１にこのことを概括するが、表１はＣＰＳ対ＣｆａＥの結合モル比が４．８対１、ＣＰＳ対ＣｆａＥＢの結合モル比が４．４：１であったことも示している。
【００３５】
【表１】
0006590916.tif 000002
【実施例２】
【００３６】
抗クラス５  ＥＴＥＣ、ＣＳ３またはＣＳ６コンストラクト
ジェジュニ菌多糖体に結合させることが考慮されている抗ＥＴＥＣコンストラクトは、図１および図２に図示するような構造を含む。図１は、基本的な組換えコンストラクト設計を示している。図１に図示するように、このコンストラクト設計は、同じＥＴＥＣ線毛型に由来するドナー鎖を含有する１つまたは複数のＥＴＥＣ線毛大もしくは小サブユニットまたは線毛大サブユニットの断片を含み、これらはポリペプチドリンカー経由で接続し、ドナー鎖相補性により安定化されている。このコンストラクトは、Ｎ末端サブユニットのＮ末端領域の欠失を含有することができる。この特徴は、他の単量体または多量体との望ましくない会合を防ぐ。Ｃ末端サブユニットは、ポリペプチドリンカー経由で接続しているドナーβ鎖に接続しかつそれにより安定化され、このドナーβ鎖は、隣接するサブユニット（すなわち、同種の）または同じ線毛型の異なるサブユニット（すなわち、異種の）にいずれかに由来する。
【００３７】
図２は、図１のような複数のコンストラクトが接続し２つ以上の線毛型を含む組換えコンストラクトを形成する、基本的な多部分コンストラクトを図示している。図１に図示するように、同じ線毛型からの大または小サブユニットがポリペプチドリンカー配列経由で接続している。多部分コンストラクトでは、図１のような２つ以上のコンストラクトが、リンカーポリペプチド経由で接続している。
【００３８】
多部分コンストラクト設計では、基本的な設計のように（図１を図２と比較のこと）、第１のサブユニット（Ｎ末端側）はＥＴＥＣ線毛大または小サブユニットである。各々の追加サブユニットは、分子の構成要素の回転自由度を可能にするポリペプチドリンカーを経由して、隣接するサブユニットに接続している。これらのサブユニットは、ドナーβ鎖経由でＣ末端に隣接するサブユニットからのドナー鎖相補性で会合しかつそれを介して安定化されており、ドナーβ鎖はリンカーポリペプチド経由で接続しているこの安定化されたサブユニットのＣ末端に接続している。一部の実施形態では、サブユニットはそのＮ末端から１４〜１８アミノ酸の欠失を含有することができる。さらに、特定のコンストラクトは、１８〜２２アミノ酸のシグナルペプチド有りまたは無しで、かつＣ末端におけるヒスチジンタグ有りまたは無しで構築することができる。
【００３９】
多部分コンストラクトでは、同じ線毛型からのサブユニットが直接接続している。同じ線毛型からのサブユニットのグルーピングが、次に他の線毛型からのサブユニットの他のグルーピングに接続される。線毛型にはＥＴＥＣクラス５ａ、５ｂ、５ｃ、ＣＳ３およびＣＳ６が含まれるが、これらに制限されない。例えば、単一のコンストラクトは、クラス５ａ、５ｂ、５ｃ、ＣＳ３およびＣＳ６のうちの任意の２つ以上の線毛型に由来するサブユニットを含むことができる。
【００４０】
複数のリンカー配列が、個々のサブユニットの接続に利用され得る。特定のリンカーの例として、配列番号５のテトラペプチドが挙げられる。もう１つの例は、トリグリシンリンカー（すなわち、Ｇ−Ｇ−Ｇ）である。本発明のコンストラクトでは、ｃｉｓにおけるドナー鎖相補性は、アドヘシンおよび代表的なクラス５ａ、５ｂおよび５ｃアドヘシンにおけるアドヘシン−ピリン融合を安定化するために用いられる。
【００４１】
考慮されている組成物は、ＥＴＥＣ株の適用範囲を可能な限り広範にできるように設計されている。そのため、一実施形態では、考慮されている組成物および使用は、クラス５ａ、５ｂ、５ｃ  ＥＴＥＣに加えてＣＳ３またはＣＳ６線毛の構成成分を発現しているＥＴＥＣ株に対する免疫原性応答を誘導することを目指している。
【００４２】
好ましい実施形態では、組換えポリペプチドＥＴＥＣコンストラクトは、ジェジュニ菌莢膜多糖体（ＣＰＳ）に結合している。複数のＥＴＥＣ組換えコンストラクトのうちの１つまたは複数を、複数のジェジュニ菌莢膜多糖構造のうちの１つまたは複数に結合させることができる。クラス５  ＥＴＥＣ組換えポリペプチドの例を表２に記載する。表２において、小サブユニットは、関連大サブユニットとのポリペプチドリンカー経由での接続により安定化されている。あるいは、この関連大サブユニットに由来する１２〜１６アミノ酸ドナー鎖が、ポリペプチドリンカー経由でこの小サブユニットに接続している。これらのポリペプチドは、図１および図２にしたがって連結させて表３に記載のコンストラクト例に導かせることもできる。これらの例は次に、実施例１のように、単離したジェジュニ菌莢膜多糖体に結合させることができる。
【００４３】
【表２】
0006590916.tif 000003
【００４４】
【表３】
0006590916.tif 000004
【００４５】
抗ＥＴＥＣコンストラクトの重要な特徴は、線毛接着の免疫認識が強化されている点である。ＥＴＥＣクラス５線毛の小サブユニット（すなわち、ＥＴＥＣアドヘシン）は、大サブユニットに比べて化学量論的に非常に低い数字で表される。したがって、組換えコンストラクトの重要な特徴は、小サブユニットの免疫認識を強化するために小サブユニットの化学量論的提示を大きく改善している点である。加えて、ＣｆａＥなどの線毛サブユニットは、線毛構造外のタンパク分解に比較的影響されやすいため、アドヘシンの安定化も重要である。したがって、コンストラクトは、ドナー鎖相補性により、ミスフォールディングおよび分解に対し安定化されたＥＴＥＣサブユニットを発現するように設計されている。
【００４６】
ドナーβ鎖は、線毛大サブユニットによりもたらされる。例えば、ＣｆａＥの場合には、ＣｆａＢのＮ末端領域により安定化がもたらされる。ＣＦＡ／Ｉ大サブユニットＣｆａＢのＮ末端からのドナーペプチド鎖をＣ末端に組込むことによるｄｓｃＣｆａＥの操作により、不溶性の扱いにくい未変性の組換えタンパク質が安定な免疫原性組成物に形質転換された（Ｓａｖａｒｉｎｏ、米国特許出願公開第２００６０１５３８７８号（２００６年７月１３日））。この内容は参照により本明細書に組み込まれている。
【００４７】
その原子構造に基づき、ｄｓｃＣｆａＥは、Ｎ末端アドヘシンドメイン（ＣｆａＥａｄ）、短いαヘリックスコネクター、およびＣ末端ピリンドメイン（ＣｆａＥｐｄ）を含む２つの半バレルからなる未変性のβサンドイッチ立体構造に折り畳まれる。この分子は、ウシおよびヒトの赤血球のＭＲＨＡを直接媒介し、免疫電子顕微鏡法においてＭＲＨＡを阻害しＣＦＡ／Ｉ線毛の先端を装飾するように作用する中和抗体を生成するという点において、機能的である。
【００４８】
融合タンパク質は、ＣｆａＢなどのＥＴＥＣアドヘシンの成熟構造大サブユニットのコード配列をＣｆａＥなどの小サブユニットの３’末端に遺伝的に挿入することにより、操作された。この概念はＳａｖａｒｉｎｏ、米国特許出願（第１１／３４０，００３号、２００６年１月１０日出願）で明らかにされ、この内容は本明細書に組み込まれている。この分子は、ＣＦＡ／Ｉ線毛の３つのドメインすべて（すなわち、ａｄ、ｐｄ、および大サブユニット）を、天然の線毛で見いだされる比（およそ１：１：１０００）とは異なる１：１：１の比で含有する。
【００４９】
複数の観察から、（ＥＴＥＣ菌株Ｅ７４７３からクローニングされた）ｄｓｃＣｆａＥのワクチン抗原としての適合性が示されている。第１に、ｃｆａＥにおける様々な地理的起源および血清型のＥＴＥＣ分離株からの３１の異なる野生型対立遺伝子の配列決定は、遺伝子および予測されたポリペプチド配列がほとんど不変であることを示し、これら３１対立遺伝子のうちの５つのみが、１つの部位ごとに３つの異なる非同義置換のヌクレオチド変化を有する（Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ、他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８７巻（９号）：６１５０〜６１５８頁（２０１２年））。よって、標的タンパク質は天然ＥＴＥＣ細菌の個体群においては均等性を示す。
【００５０】
加えて、クラス５ａ線毛アドヘシンの１つであるＣｆａＥは、他のクラス５ａ小サブユニットタンパク質アドヘシンであるＣＳ１４線毛のＣｓｕＤおよびＣＳ４線毛のＣｓｆＤと８０〜８１％同一である。ＣｓｕＤおよびＣｓｆＤは、９４％の同一性を共有する。これは、他のクラス５ｂおよび５ｃの線毛アドヘシンの平均同一性（平均５０％同一性）よりもかなり高い。
【００５１】
さらに、ウサギ抗ｄｓｃＣｆａＥ血清は、血球凝集反応アッセイ（ＨＡＩ）においてＣＳ４およびＣＳ１４−ＥＴＥＣを交差中和する。小さい動物（ウサギおよびマウス）および大きい動物（サルおよびウシ）における複数のワクチン接種研究が様々な投与経路およびアジュバントの組合せで行われ、ｄｓｃＣｆａＥが、ｄｓｃＣｆａＥおよびＣＦＡ／Ｉを認識しかつ（ＨＡＩアッセイにより測定されるように）中和性である全身および粘膜の抗体を誘発し得る強力な免疫原であることが示された。
【００５２】
一実施形態には、図１に図示するコンストラクト設計に基づいた抗クラス５  ＥＴＥＣコンストラクトが含まれ、これにより、Ｎ末端サブユニットは、表２に記載の同じＥＴＥＣクラス５タイプからの１つまたは複数のＥＴＥＣ大サブユニットにポリペプチドリンカー経由で接続しているＣｆａＥ、ＣｓｆＤ、ＣｓｕＤ、ＣｏｏＤ、ＣｓｄＤ、ＣｏｓＤ、ＣｓｂＤおよびＣｏｔＤを含めた、表２に記載のＥＴＥＣクラス５小（すなわち、アドヘシン）サブユニットである。ポリペプチドリンカーは、複数あるポリペプチドのサイズのいずれでもあり得る。好ましい実施形態では、リンカーは配列番号５のポリペプチド配列を有するテトラペプチドである。Ｃ末端クラス５サブユニットは、同種のサブユニットに由来するドナーβ鎖に接続し、典型的には１２〜１９アミノ酸である。代替の実施形態では、１つまたは複数の大サブユニットがサブユニットのＮ末端領域からの１２〜１６アミノ酸の欠失を含むことができる。
【００５３】
図１における設計は、安定化されたクラス５  ＥＴＥＣアドヘシンを提供するドナー鎖相補性を含めて、Ｓａｖａｒｉｎｏ、米国特許出願（第１１／３４０，００３号、２００６年１月１０日出願））で開示されている概念を利用している。ＥＴＥＣクラス５小サブユニットと大サブユニットとの類似性のため、図１ではさらに、表２の線毛サブユニットまたはこれらのポリペプチドもしくはＤＮＡ配列の誘導体を組込む複数のコンストラクトが考慮されている。
【００５４】
図１に図示するコンストラクト設計は、Ｓａｖａｒｉｎｏ（米国特許出願（第１１／３４０，００３号、２００６年１月１０日出願））のドナー鎖相補性安定化の特徴を組み込み、そして特定のＥＴＥＣ型からの複数の大サブユニットを単一のアドヘシン−ピリンコンストラクトの中に組込むことにより、その特徴を促進する。例えば、複数のクラス５ｂ大サブユニットをクラス５ｂアドヘシン（すなわち、小サブユニット）に接続させることができる。実施形態には、ＣｓｂＤ（ＥＴＥＣクラス５ｂ線毛アドヘシン）およびＣｏｔＤ（ＥＴＥＣクラス５ｃ線毛アドヘシン）を含有するアドヘシン−ピリンコンストラクトが含まれる。例示のために、クラス５ａ、５ｂおよび５ｃを表すアドヘシン−ピリンＥＴＥＣクラス５アドヘシン−ピリンコンストラクトの実施形態の例を、表３に示す。
【００５５】
ＣＳ６およびＣＳ３
ウサギモデル（ＲＩＴＡＲＤ）の研究は、定着因子ＣＳ６およびＣＳ３が免疫防護的潜在能力を有することを示唆するものである（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ、他、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５６巻：５２３〜５２８頁（１９８８年）；Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ、他、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８巻：３４１〜３４６頁（１９９０年））。そのため、重要な技術上の目的は、ＣＳ６が指示する接着に対し抑制的な抗体応答を最大限に誘発するＣＳ６抗原を発現する、安定化されたＣＳ６発現組換え構造を再現することである。
【００５６】
クラス５  ＥＴＥＣ線毛と異なり、線毛構造はモノアドヘシンではなくポリアドヘシンとして機能することができる（Ｚａｖｉａｌｏｖ、他、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．３１巻：４７８−５１４頁（２００７年））。関連する線毛、ＥＴＥＣ  ＣＳ６およびＣＳ３の集合体からの外挿は、Ｃ６またはＣ３サブユニットと隣接サブユニットのＮ末端ドナー鎖領域との会合を通じたドナー鎖相補性媒介プロセスにより媒介することができる。加えて、ミスフォールディングおよびタンパク質分解に対しての防御もドナー鎖相補性を通じてもたらすことができる。
【００５７】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）で変性および非変性条件下でのサブユニットタンパク質を可視化することにより、ＣＳ３およびＣＳ６単量体の会合を評価した。ＣＳ３およびＣＳ６単量体の両方について、変性条件下ではタンパク質が予想されるサイズで移動し、非変性条件下では、サブユニットの多量体会合により複数のサイズ（すなわち、ラダー）が形成されているのが見られる。
【００５８】
ＣＳ６線毛
ＣＳ６線毛は、ＣｓｓＡおよびＣｓｓＢを含む。この２つのＣＳ３大サブユニットは、ポリペプチド配列では全くまたはわずかしか変異を示さないのに対し、ＣＳ６タンパク質では中程度の変異が観察される。例えば、９０％超の同一性がＣＳ６タンパク質ＣｓｓＡで見いだされ、９５％超の同一性がＣｓｓＢアロタイプに見いだされる。両方のＣＳ６構造タンパク質が、比較的低い変異レベル（すなわち、９０％超のアミノ酸保存）を示し、ＣｓｓＡにおけるより大きい変異および突然変異はＣｓｓＡポリペプチドに沿ってランダムに分布している。
【００５９】
ワクチン製剤における包含に好適であろう有効な免疫原性組成物を設計するために、多くの判断基準が好適なコンストラクトの決定について考案された。それらの判断基準には、望ましくない自己会合または集合体を伴わない構造を維持する能力、熱安定性、およびＣＳ６を用いた免疫処置により誘発されたものに類似の抗ＣＳ６ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体レベルを生み出す能力が含まれた。
【００６０】
単量体ＣＳ６サブユニット集合体は、上記で論じられているように、隣接するＣＳ６サブユニットからのドナー鎖により媒介されているように思われる。これらの安定な構造を形成する相互作用は、ドナー鎖相補性を通じたサブユニット間の相互作用により媒介されるものと仮定される。ドナー鎖相補性は、ミスフォールディングおよびタンパク質分解に対する防護ももたらす。したがって、好ましい実施形態では、ドナー鎖相補性のこれらの特質を活用するために多量体ＣＳ６コンストラクトを開発した。加えて、多量体の発現は単量体の産生よりも効率的な製造をもたらす。
【００６１】
一実施形態では、ジェジュニ菌に結合しているコンストラクトは、ＣＳ６サブユニットであるＣｓｓＡおよびＣｓｓＢのうちの１つもしくは複数、または対立遺伝子変異もしくは誘導体、を有する多量体ＣＳ６を、図１に図示するコンストラクト設計構成で含む。好ましい実施形態では、コンストラクトは、ＣｓｓＢがＣｓｓＡに対しＮ末端側にある（すなわち、ＣｓｓＢ−ＣｓｓＡ）ＣｓｓＢおよびＣｓｓＡの二量体を含む。
【００６２】
図１または図２に図示するように、ＣＳ６サブユニットの会合はｃｉｓにおけるドナーβ鎖相補性によって安定化されている。Ｃ末端のＣＳ６サブユニットをテトラペプチドリンカー経由で別のＣＳ６サブユニットのドナーβ鎖領域に連結させることにより、ドナー鎖相補性が与えられる。リンカーは多数あるポリペプチド領域のうちのいずれでもあり得る。ただし、好ましい実施形態では、リンカーは配列番号５のようなものかトリグリシンリンカーかのいずれかである。末端ＣＳ６サブユニットの場合、Ｃ末端に接続している同種または異種のＣＳ６サブユニットからのドナーβ鎖により安定化がもたらされる。同種のサブユニットは、同じ形態（例えば、ＣｓｓＡまたはＣｓｓＢ）の２つのサブユニットとして定義される。異種サブユニットは、異なる形態を有する（例えば、一方はＣｓｓＡに由来し、もう一方はＣｓｓＢに由来する。ＣＳ６ドナーβ鎖は典型的にはＣＳ６サブユニットのＮ末端１４〜１６アミノ酸領域である。組換えタンパク質は、通常Ｃ末端上にあるヘキサヒスチジンアフィニティタグ有りまたは無しで構築することができる。
【００６３】
加えて、望ましくない非共有結合のオリゴマー形成がもたらされる、組換えポリペプチドコンストラクトによる分子会合の形成を防ぐために、好ましい実施形態では、Ｎ末端ＣＳ６サブユニットのＮ末端側の１４〜１６アミノ酸を欠失させる。１つの例示として、「ｄｓｃＢ１４ＣｓｓＢＡ」であれば、コンストラクトのＣ末端で挿入されるＣＳ６  ＣｓｓＢからの異種ドナー鎖（すなわち、「ｄｓｃ」）を含有することになる。この場合、「１４」によって示されるように、このドナー鎖は長さが１４のアミノ酸である。同様に、「ｎｔｄ１５ｄｓｃＡＣｓｓＢＡ」と称されるものが構築される場合、コンストラクトのＣ末端で同種のドナー鎖を含有することになるし、Ｎ末端アミノ酸領域（「ｎｔｄ」と呼ばれる）の欠失も含む。
【００６４】
コンストラクトの例は、配列番号２（ＣｓｓＡ）または配列番号４（ＣｓｓＢ）、またはこれらのポリペプチドの誘導体からなる群から選択されるアミノ酸配列配列を有する１つまたは複数のＣＳ６サブユニットを含む。ＣｓｓＡについてのＤＮＡ配列は配列番号１であり、そしてＣｓｓＢについては配列番号３である。サブユニットは、ポリペプチドリンカー配列によって接続している。好ましい実施形態では、リンカーは配列番号５のアミノ酸配列を有するテトラペプチドである。
【００６５】
ＣＳ３線毛
Ｓａｖａｒｉｎｏ（米国特許出願第１１／３４０，００３号（２００６年））は、ドナー鎖相補性により安定化されるＥＴＥＣコンストラクトについて開示している。この出願の実施形態では、ＣｓｔＨのドナー鎖安定化が組み込まれ、第２のＣＳ３サブユニットであるＣｓｔＧが添加されている。本明細書の実施形態では、ＣＳ３サブユニットおよびＣＳ３に対する免疫原性の安定化のために重要であると見いだされるさらなる特徴が加えられる。ＣＳ３は、ＣｓｔＨおよびＣｓｔＧを含む。ＣＳ３構造タンパク質ＣｓｔＨは不変である。ＣｓｔＧも保存性が高く、配列決定された３９の野生型ＣＳ３遺伝子のポリペプチド配列において９９〜１００％の同一性を示している。同様に、一部の変異ＣｓｔＧが観察されるが、これも比較的不変であり、９９〜１００％のアミノ酸保存を有する。
【００６６】
ＣＳ３は、ＣｓｔＧおよびＣｓｔＨの両方をほとんど等しい量で含有する。このため、ＣｓｔＧおよびＣｓｔＨを組み込み、図１のそのテンプレートコンストラクト設計による二量体コンストラクトを考案した。
【００６７】
一実施形態では、ジェジュニ菌莢膜多糖体に結合しているポリペプチドコンストラクトは、図１にしたがって設計したＣＳ３  ｓコンストラクトを含む。図１において、ＣＳ３コンストラクトは、ポリペプチドリンカー経由で接続している１つまたは複数のＣＳ３線毛サブユニットを含む。Ｃ末端線毛サブユニットは、ＣＳ３線毛サブユニットのドナーβ鎖領域に、ポリペプチドリンカー経由で接続している。Ｃ末端ドナーβ鎖は、接続している同じＣＳ３サブユニット（すなわち、同種）に由来する可能性も、異なるサブユニット（すなわち、異種）に由来する可能性もある。ポリペプチドリンカーは任意の数のポリペプチド領域であり得るが、好ましい実施形態では、リンカーは配列番号５の配列のテトラペプチド、またはトリグリシン（すなわち、Ｇ−Ｇ−Ｇ）である。ドナーβ鎖領域は、ＣｓｔＨまたはＣｓｔＧの成熟タンパク質におけるＮ末端側の１４〜１６アミノ酸である。この実施形態の代替形態では、望ましくない会合を避けるために、最もＮ末端側のサブユニットのＮ末端領域における第１の１４〜１８アミノ酸を欠失させる。
【００６８】
好ましい実施形態では、ＣＳ３コンストラクトは二量体である。図１の設計を例示的な例として用いる他の例が考慮されているが、組換えポリペプチドコンストラクトは「ｄｓｃ１６ＣｓｔＨＣｓｔＧ−（リンカー）−ＣｓｔＨ」として設定することができる。この例では、ＣｓｔＧの成熟ポリペプチド（配列番号１０１）または全長ポリペプチド配列（配列番号８７）は、そのＣ末端においてＣｓｔＨポリペプチド（配列番号９９）にポリペプチドリンカー経由で接続している。この例では、ＣｓｔＨポリペプチドはＣ末端で、ＣｓｔＨに由来する１６アミノ酸のドナーβ鎖領域にポリペプチドリンカー経由で接続している。
【００６９】
他の例は、図１にしたがってコンストラクトを含むことができる。他の例では、Ｃ末端ドナーβ鎖は、最もＣ末端側のＣＳ３線毛サブユニットと同種（同じサブユニットに由来する）または異種（異なったサブユニットに由来する）のいずれでもあり得る。
【００７０】
多部分融合コンストラクトの構築
ＥＴＥＣの複数の株への免疫は、最も大きい程度の抗ＥＴＥＣ免疫を得るために重要である。この目標に向け、図２に図示する設計による、異なるＥＴＥＣ線毛型に由来する２つ以上のサブユニットを含む組換えポリペプチドコンストラクトを開発し、多部分融合コンストラクトを形成した。本明細書で用いられる多部分融合体または多部分融合コンストラクトは、図２による組換えポリペプチドコンストラクトである。この設計において、異なるＥＴＥＣ線毛型は、表４または５に記載されるような異なる株ＥＴＥＣ型の線毛に由来する線毛タンパク質として、またはこれらのポリペプチドもしくはＤＮＡ配列の誘導体として、定義される。例えば、線毛型「ＣＳ３」はＣｓｔＨおよびＣｓｔＧを含む。線毛型「ＣＳ６」は、ＣｓｓＡおよびＣｓｓＢを含む。クラス５  ＥＴＥＣの線毛タイプには、線毛型クラス５ａ、クラス５ｂおよびクラス５ｃが含まれる。
【００７１】
好ましい実施形態では、同じＥＴＥＣ線毛型に由来する大および／または小サブユニットは、ポリペプチドリンカー経由で接続し、図１に図示するようにドナーβ鎖相補性により安定化される。多部分融合体は、図１のように、同じ線毛タイプの１つまたは複数の線毛サブユニットを含み、図２に図示するように異なる線毛型に由来する１つまたは複数の線毛サブユニットに接続している。
【００７２】
一実施形態では、多部分融合コンストラクトは、１つまたは複数の線毛のサブユニットのＮ末端領域の欠失を含み得るが、図２に図示するように、所与のＥＴＥＣ線毛型について最もＮ末端側の線毛サブユニットで行われることが好ましい。この特徴は、他の単量体または多量体との望ましくない会合を防ぐ。Ｎ末端領域欠失のサイズは１４〜１８アミノ酸である。他の実施形態では、クラス５アドヘシンを含む多部分融合コンストラクトはＮ末端領域の欠失を含有しない。
【００７３】
図２に図示するように、あるＥＴＥＣ線毛型についてのＣ末端サブユニットは、このサブユニットにポリペプチドリンカー経由で接続しているドナーβ鎖に接続しかつ安定化されており、このドナーβ鎖は、隣接するサブユニット（すなわち、同種）または同じ線毛型の異なるサブユニット（すなわち、異種）に由来している。Ｎ末端ドナー鎖のサイズは、線毛型および安定化されたサブユニットに依存する。好ましい実施形態では、クラス５線毛サブユニットについては、安定化されたクラス５サブユニットのＮ末端領域に由来するドナーβ鎖は１２〜１６アミノ酸である。ＣＳ３およびＣＳ６サブユニットについては、ドナーβ鎖は１４〜１６アミノ酸である。上述されているように、コンストラクトはＮ末端サブユニットのＮ末端領域の欠失を含有することができる。この特徴は、他の単量体または多量体との望ましくない会合を防ぐ。Ｎ末端領域欠失のサイズは１４〜１８アミノ酸である。
【００７４】
図２に図示するように、図１のような複数のコンストラクトが２つ以上のＥＴＥＣ線毛タイプを含む組換えポリペプチドコンストラクトを形成して接続している。このようにして、同じＥＴＥＣ線毛型に由来する１つまたは複数の大または小サブユニットは、ポリペプチドリンカー経由で接続し、ドナー鎖相補性により安定化される。別の実施形態では、１つまたは複数のグリシン残基が異なるＥＴＥＣ型間の「スイベル」手段として機能し、異なるＥＴＥＣ線毛型を分離する。グリシン残基は、小さく枝分かれのない分子特性により、分子の構成要素の回転自由度を可能にする。（図１のような）同じ線毛型に由来するサブユニットは、ポリペプチドリンカーにより接続し、ドナー鎖相補性により安定化される。図２に示すように、各々のＥＴＥＣ線毛型のＣ末端サブユニットは、その線毛型のＣ末端サブユニットに同種または異種であるドナーβ鎖により安定化される。
【００７５】
他の実施形態では、コンストラクトは、コンストラクト全体のＮ末端におけるＮ末端欠失に加えて、異なる線毛型である第１の「内部」サブユニットのＮ末端において、さらなる１４〜１８アミノ酸の欠失を含有することができる。これは図２に図示されている。「内部」サブユニットのＮ末端での欠失の場合、この欠失はサブユニット間の長さを短くし、よってミスフォールディングおよびタンパク質分解の可能性を低減する働きをする。別の実施形態では、同種または異種サブユニットに由来するドナーβ鎖は、Ｃ末端ＣＳ６またはＣＳ３サブユニットのＣ末端に挿入される。クラス５線毛サブユニットについては、安定化されるクラス５サブユニットのＮ末端領域に由来するドナーβ鎖は１２〜１６アミノ酸である。例えば、好ましい実施形態では、ＣｆａＢは１４アミノ酸ドナーβ鎖により安定化され、ＣｓｆＡは１４アミノ酸ドナーβ鎖、ＣｓｂＡは１５アミノ酸ドナーβ鎖、ＣｏｏＡは１４アミノ酸ドナーβ鎖、そしてＣｏｔＡは１４アミノ酸ドナーβ鎖により安定化される。ＣＳ３およびＣＳ６サブユニットについては、ドナーβ鎖は１４〜１６アミノ酸であり、好ましい実施形態では、ＣＳ３線毛サブユニット（すなわち、ＣｓｔＨまたはＣｓｔＧ）はＣｓｔＨまたはＣｓｔＧに由来する１６アミノ酸ドナーβ鎖により安定化され、ＣＳ６線毛サブユニット（すなわち、ＣｓｓＡまたはＣｓｓＢ）はＣｓｓＡまたはＣｓｓＢに由来する１６アミノ酸ドナーβ鎖で安定化される。ただし、他のドナーβ鎖の長さも想定される。
【００７６】
本発明の組成物は異なるリンカー配列を利用することができる。好ましい実施形態では、リンカーは配列番号５のアミノ酸配列を含有する。別の実施形態では、リンカーはトリグリシンリンカーである。他の実施形態では、コンストラクトのＣ末端はコンストラクト精製のためのヒスチジンタグを含有する。
【００７７】
本発明のコンストラクトでは、ｃｉｓにおけるドナー鎖相補性は、代表的なクラス５ａ、５ｂおよび５ｃアドヘシンのためにアドヘシンおよびアドヘシン−ピリン融合を安定化するために用いられる。各々のアドヘシン標的集団のために、好ましい実施形態では、抗接着免疫応答を誘発する目的で組成物を構築する。さらにこの目標に向け、クラス５アドヘシン小サブユニットを含むクラス５多部分融合体は、典型的には、アドヘシン（すなわち、線毛小サブユニット）がコンストラクトのＮ末端に位置し、この線毛小サブユニットがＣ末端で１つまたは複数の大サブユニットと連結しており、コンストラクトの末端で最後の大サブユニットのドナーβ鎖が後続するようなコンストラクトである。
【００７８】
他の実施形態には、ＣｆａＢ（ＣＦＡ／Ｉ大サブユニット）、ＣｓｕＡ２（ＣＳ１４大サブユニット）およびＣｓｆＡ（ＣＳ４大サブユニット）のうちの１つまたは複数にＣ末端で直列に連結しているクラス５ａアドヘシンＣｆａＥ、ＣＳ１９ピリンサブユニットＣｓｄＡと高い同一性を共有するＣｓｂＡ（ＣＳ１７大サブユニット）およびＰＣＦＯ７１ピリンサブユニットＣｏｓＡと高い同一性を共有するＣｏｏＡ（ＣＳ１大サブユニット）のうちの１つまたは複数にＣ末端で直列に連結しているクラス５ｂアドヘシンＣｓｂＤ、ならびにＣｏｔＡ（ＣＳ２大サブユニット）にＣ末端で直列に連結しているクラス５ｃアドヘシンＣｏｔＤ、を含むコンストラクトが含まれる。
【００７９】
ＥＴＥＣ多部分融合コンストラクトの実施形態を表４および５に例示する。この実施形態では、コンストラクトは、リンカーポリペプチドによって接続し、図２に図示する設計を利用しているドナー鎖相補性によりタンパク質分解に対して安定化されている、表２の任意のＥＴＥＣ線毛大または小サブユニットを複数の組合せで含む。表２には、図２の多部分融合コンストラクトの設計に用いて組込むことができ、次にジェジュニ菌莢膜多糖またはシゲラ属ＬＰＳに結合させることができる、ＥＴＥＣ線毛サブユニット（大および小サブユニット）が記載されている。したがって、任意のサブユニットは、クラス５ａ、５ｂ、５ｃ、ＣＳ３およびＣＳ６を含めた任意のＥＴＥＣ線毛表現形タイプからの１つまたは複数の他のＥＴＥＣ大サブユニットと組み合わされている。
【００８０】
組換えポリペプチドコンストラクトのモチーフは、Ｃ末端でリンカーに接続しているＥＴＥＣ線毛小または大サブユニットの全体または免疫原性断片を含む。リンカーはそのＣ末端において、ＥＴＥＣ線毛大サブユニット全体または同じ線毛型に由来するＥＴＥＣ構造大サブユニットのポリペプチドドナー鎖と接続している。次に、このＥＴＥＣ大サブユニット全体またはドナー鎖ポリペプチドは、リンカー経由でそのＣ末端において、表２にある同じ線毛型に由来する１つまたは複数の追加の構造線毛大サブユニットに接続する。
【００８１】
特定の遺伝的融合コンストラクトを選択し開発するための戦略は、部分的には、サブユニットにおける系統発生および抗原の関連性により導かれる。例えば、クラス５ａ、５ｂおよび５ｃピリンサブユニットを含有するコンストラクトは、特定のＥＴＥＣ線毛クラス（すなわち、クラス５ａ、５ｂまたは５ｃ）内で小および大サブユニットの関連性に基づいて選択される。そのため、特定の線毛型（例えば、クラス５ａ）からのアドヘシン（すなわち、線毛小サブユニット）は、クラス５ａ大サブユニットに連結させる。ＥＴＥＣ株の最適な免疫原性適用範囲を達成するために、サブユニットのさらなる選択を疫学調査に基づいて導く。どのようなジェジュニ菌莢膜多糖を結合すべきかについては、主に、莢膜多糖をもたらす株の病原性を示唆する疫学データを根拠に置く。多くのジェジュニ菌株が存在するが、大部分は病原性ではない。
【００８２】
表４および５に記載する多部分コンストラクトにおいて、リンカーポリペプチドは、例にあるコンストラクトによって、４アミノ酸配列（テトラペプチド）またはトリグリシンを含むことができる。また、図２に図示するように、サブユニットは「ｄｓｃ」と記されているドナー鎖相補性によって相互接続し安定化される。この命名法では、線毛サブユニットの由来も示される。例えば、コンストラクト「ｄｓｃ１６ＣｓｔＨＣｓｔＧ−ＣｓｔＨ−（Ｇ）−ｎｔｄ１５ｄｓｃ１６ＣｓｓＡＣｓｓＡ−ＣｓｓＢ」では、Ｎ末端ＣＳ３サブユニットの「ＣｓｔＧ」は、リンカー経由でＣＳ３サブユニット「ＣｓｔＨ」に接続し、「ＣｓｔＨ」は、リンカー経由で「ＣｓｔＨ」に由来する１６アミノ酸ドナー鎖に接続している。同様に、Ｎ末端ＣＳ６サブユニット「ＣｓｓＢ」は、図２に図示するように、リンカー経由で「ＣｓｓＡ」に由来する１６アミノ酸ドナー鎖に接続している。この例では、「ＣｓｓＢ」サブユニットのドナー鎖相補性は、異種ドナー鎖（すなわち、「ＣｓｓＡ」に由来する）経由である。
【００８３】
表４および５にある例は、「スイベル」を提供する「Ｇ」（すなわち、グリシン）を含有する。また、一部の例では、上述のように、他のＣＳ６サブユニットとの望ましくない会合を避けるために、Ｎ末端ＣＳ６サブユニットのＮ末端領域が欠失している（「ｎｔｄ」で表される）。表４または５（または表３）に例示する例に加えて、図２に図示するコンストラクト設計および表２の線毛サブユニットを利用して大および小サブユニットの他の組合せも考慮されていることに注意されたい。記載している一部の配列で、６ヒスチジン（すなわち、Ｈｉｓ６）タグが挿入されている。コンストラクトは、ヒスチジン（すなわち、Ｈｉｓ６）タグを含むように設計することも、このタグ領域なしで設計することもできる。加えて、一部の配列は、シグナルペプチド（表２および３で「ｓｐｄ」と称されている）領域を含有する。コンストラクトは、この領域有りまたは無しで構築することができ、また、多部分融合コンストラクトの製造効率を改善するためにこの領域を追加してもよい。
【００８４】
【表４】
0006590916.tif 000005
【００８５】
【表５】
0006590916.tif 000006
【００８６】
別の実施形態では、組換えポリペプチドコンストラクトは、コレラ毒素Ａ２（ＣＴＡ）などのＣ末端毒素Ａサブユニットを含有してキメラ分子を形成し得る。この実施形態では、全長のまたは切断されたＣＴＡ２は、ＣＳ６またはＣＳ３二量体などの、ＣＳ６またはＣＳ３多量体組換えポリペプチドコンストラクトに接続している。
【００８７】
これらの毒素コンストラクトの例を表４および５に例示する。これらのコンストラクトでは、ＬＴＢ遺伝子およびＣＳ３またはＣＳ６（毒素キメラ）が別々に発現される。ＬＴＢは一旦発現されると、自己組織化して五量体構造を形成するであろう。結果として生じるＬＴＢ多量体組成物（すなわち、ＬＴＢ５）およびＣＳ３またはＣＳ６（毒素キメラ）は、次に非共有結合的に会合してホロ毒素様ヘテロ六量体を形成する。
【００８８】
他の例も考慮されるが、Ｃ末端の毒素構成成分を含有する、実例となるキメラコンストラクトの配列例を、（ＣＳ３について）表４および（ＣＳ６について）表５に示す。
【００８９】
ＣＳ３−キメラ分子については、１つまたは複数のＣＳ３線毛サブユニットが、ポリペプチドリンカー経由で、好ましくはテトラペプチドまたはトリグリシン経由で、図１のように接続している。そして、最もＣ末端側のＣＳ３線毛サブユニットは、ポリペプチドリンカー経由でドナーβ鎖に接続している。このドナー鎖は、Ｃ末端線毛サブユニットと同種でも異種でもあり得る。そして、このドナー鎖はＣＴＡ２などの毒素断片に接続している。表４に示すＣＳ３−キメラの例は、配列番号３６のＤＮＡ配列によってコード化されている配列番号３７のポリペプチド配列を構成するものである。この例では、Ｎ末端線毛サブユニットは、Ｎ末端で接続しているｐｅｌＢリーダー（２２アミノ酸）を有するＣｓｔＧである（図１３参照）。ただし、ＣＳ３線毛サブユニットユニットの異なる順序づけが考慮される。また、この例では、ＣｓｔＨは、ポリペプチドリンカー経由で、ＣｓｔＨのＮ末端１６アミノ酸に由来しＡ２毒素断片（すなわち、ＣＴＡ２）に接続している１６アミノ酸ドナー鎖に接続している。好ましい実施形態では、ＬＴＢも発現される。ＬＴＢは配列番号３９のアミノ酸配列を含み、配列番号３８のヌクレオチド配列によってコード化される。一旦発現されると、ＬＴＢ配列は自己組織化して五量体となり、非共有結合的にＣＳ３−キメラと会合してヘテロ六量体のホロ毒素様構造を形成することになる。
【００９０】
ＣＳ６毒素キメラの例も表５に例示する。ＣＳ６キメラについては、ＣＳ３のように、１つまたは複数のＣＳ６線毛サブユニットが、ポリペプチドリンカー経由で、好ましくはテトラペプチドまたはトリグリシン経由で接続している。そして、最もＣ末端側のＣＳ６線毛サブユニットは、ポリペプチドリンカー経由でドナーβ鎖に接続している。ドナー鎖は、Ｃ末端線毛サブユニットと同種でも異種でもあり得る。そして、ドナー鎖は毒素構成成分（例えば、ＣＴＡ２）に接続している。好ましい実施形態では、キメラは、ＣＳ３におけるように、自己組織化して五量体となり接着−類毒素キメラ融合分子と非共有結合的会合を形成するＬＴＢと同時発現される。
【００９１】
多くの追加的組合せが可能であるが、表５に示す例におけるコンストラクトは、テトラペプチドリンカー経由で接続しているＣＳ６サブユニットの二量体であり、そのＣ末端線毛サブユニットはテトラペプチドリンカー経由でドナーβ鎖に接続している。ドナーβ鎖は、最もＣ末端側の線毛サブユニットと同種でも異種でもあり得る。ただし、表５の例におけるドナー鎖は、Ｃ末端線毛サブユニットと異種である。そして、ドナー鎖はコレラ毒素Ａ２（ＣＴＡ２）サブユニットに接続している。例の１つであるポリペプチド配列は、配列番号４２のヌクレオチド配列によりコード化される配列番号４３のようなものである。この例では、Ｎ末端サブユニットはＣｓｓＡであり、成熟ＣｓｓＡ配列のＮ末端１５アミノ酸が欠失している。この例ではｐｅｌＢリーダー配列（２２アミノ酸）も追加され、これは図１４に図示する。
【実施例３】
【００９２】
ジェジュニ菌莢膜多糖類
近年の分子ＣＰＳタイピングシステム開発により、ＣＰＳとＰｅｎｎｅｒ型との間の強い相関が強化された（Ｐｏｌｙ、他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９巻：１７５０頁（２０１１年））。Ｐｅｎｎｅｒ血清型判定および分子ＣＰＳタイピングの両方が、ひと握りのＣＰＳタイプが世界的に優勢であることを明らかにした。また、６０超のＰｅｎｎｅｒ血清型が同定されたにもかかわらず、ほとんどのカンピロバクター下痢症が、限られた数の血清型のみを発現するジェジュニ菌によって引き起こされる。したがって、疫学調査に基づいて選択されたジェジュニ菌株のみが、ワクチン組成物開発に好適な候補株を提供する。しかし、この生物のヒト疾患に対する重要性にもかかわらず、ジェジュニ菌に対する認可ワクチンが存在しない。
【００９３】
下痢症との関連に基づいて選択されたジェジュニ菌株から、ジェジュニ菌莢膜多糖（ＣＰＳ）を抽出した。熱水−フェノール抽出を７０℃で２時間行うことにより、細菌からのＣＰＳを抽出した。水層を水に対して透析し（１０００Ｄａ）、その後に超遠心分離法を行いＬＯＳからＣＰＳを分離した。さらなる精製のために、ＣＰＳを含有する上清物質をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０）にかけて無傷のＣＰＳを得た。単糖組成物に対して、酢酸アルジトール法（Ｃｈｅｎ、他、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３４３巻：１０３４（２００８年））を受け入れられる手順を用いて実施し、酢酸アルジトールは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ  ＰＯＬＡＲＩＳ（商標）−Ｑ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）ガスクロマトグラフ／質量分光計（ＧＣ／ＭＳ）でＤＢ−１７キャピラリーカラムを用いて分析された。糖結合型は、先述したように、ＧＣ／ＭＳによる完全メチル化酢酸アルジトールの性質決定によって特性を明らかにした（Ｃｈｅｎ、他、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３４３巻：１０３４頁（２００８年））。外部標準として重水素化トリメチルシリルプロパン酸およびオルトリン酸を用いた、２９５ＫにおけるＢｒｕｋｅｒクライオプラットフォームが装備されたＢｒｕｋｅｒ４００ＭＨｚ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉａ、ＭＡ）上でＮＭＲ実験を実施した。重要な病原体であるジェジュニ菌莢膜多糖の構造を表６に示す。
【００９４】
【表６】
0006590916.tif 000007
【００９５】
加えて、ジェジュニ菌のＨＳ５株からの莢膜多糖が付着され得る。ＨＳ５は多糖の変異複合体を含有する。これらは以下の構造を含む：
【００９６】
【化１】
0006590916.tif 000008
【実施例４】
【００９７】
ＥＴＥＣ−カンピロバクター属莢膜結合体による免疫応答の誘導。
結合体による免疫応答の誘導を評価した。この試験では、ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）（Ｓｅｒｇｅｎｔ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ）ワクチンを漸増量投与することでＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫処置した。マウスは、４週間間隔で合計２回の免疫処置を受けた。
【００９８】
この試験の結果を図４に図示する。図４に示すように、第１の免疫処置の２週間後、ＨＳ３６−ＣｆａＥＢ（１０μｇ、６０μｇ）およびＨＳ３６−ＣｆａＥ（６０μｇ）で免疫処置したマウスは、免疫前血清に比べて有意なレベルのＨＳ３６ＣＰＳに対する特異的な血清ＩｇＧ抗体を示した（ｐ＜０．０５）（図４（Ａ）参照）。２回の免疫処置の後、免疫処置されたすべての動物群は、１回のみの免疫処置後に観察されたレベルに比べて抗体レベルが有意に上昇した（ｐ＜０．０５）。この効果は、試験されたワクチン用量に関して用量依存性はなかった。
【００９９】
さらに、図４（Ｂ）に図示するように、ＣｆａＥに対する抗体もＥＬＩＳＡにより決定した。図４（Ｂ）に示すように、結合型ワクチンで免疫処置したすべてのマウスが、ＣＰＳ−ＣｆａＥまたはＣＰＳ  ＣｆａＥＢに対する有意レベルの抗ＣｆａＥ  ＩｇＧを有した（ｐ＜０．０５）。用量依存性の効果は観察されず、すべての群が同様なレベルのＣｆａＥに特異的なＩｇＧを示した。
【０１００】
図４に示すデータは、ジェジュニ菌ＣＰＳに結合しているＥＴＥＣアドヘシンベースの担体タンパク質を含む結合型ワクチンが、両方の細菌構成成分、すなわち、ジェジュニ菌ＣＰＳおよびＥＴＥＣ  ＣｆａＥに対する免疫応答を誘導することができることを示すものである。
【０１０１】
ＨＳ３６結合型ワクチンによって生成される機能的抗接着抗体のレベルを決定するために、血球凝集抑制アッセイ（ＨＡＩ）アッセイにより血清試料を試験し、免疫マウス血清中に存在する機能的抗接着抗体を測定した。
【０１０２】
ＨＡＩアッセイは、各動物からの試料を評価することにより行った。試料をまず１：８に希釈し、次に広い範囲の希釈度について２倍希釈した。等量のＣＦＡ／Ｉ＋ＥＴＥＣ細菌（Ｈ１０４０７株）と共に各々の血清希釈液をインキュベートし、これにより血清はさらに１：２に希釈された。最終的な最小希釈度は１：１６であり、これが検出限界（ＬＯＤ）だった。次に、プレインキュベートした混合物をＵ底９６ウェルプレート中０．５％マンノースの存在下でウシの赤血球と混合した。抗接着抗体の非存在下では、赤血球は可視的な凝集した細胞の「ボタン」を形成した。抗接着抗体の存在下では、凝集が阻害された。ＨＡＩ力価は最も高い段階希釈でありかつ完全に凝着を阻害した。１：１６の最小血清希釈度で検出可能な阻害がなかった場合は、その試料には計算目的で検出限界の２分の１の値（すなわち、８）を割り当てた。
【０１０３】
ＨＡＩ分析の結果を図５に図示する。免疫処置前、プールした血清は、アッセイの検出レベルを下回るＨＡＩ力価を含有していた。免疫処置後は、すべてのマウス群の血清で免疫前の力価に比べて有意に（ｐ＜０．０５）高いレベルの抗接着抗体が示された。概して、ＨＳ３６−ＣｆａＥＢ結合型ワクチンで免疫処置したマウスは、より高いＨＡＩ力価を示した。ただし、有意差（Ｐ＜０．０５）が観察されたのは、ＨＳ３６−ＣｆａＥＢ（６０μｇ）およびＨＳ３６−ＣｆａＥ（１０μｇ）で免疫処置したマウス間のみである。
【実施例５】
【０１０４】
複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌに対する免疫応答
多糖コンストラクトの合成
図６に示すように、構築された多糖を合成した。過去に報告された化合物４−メトキシフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（図７、構造１も参照）（Ｃｏｍｆｏｒｔ、他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．４６巻：３３１９〜３３３０頁（２００７年））から、Ｃ−６にトリチル基を選択的に導入した。当初は化合物（図７、構造２）にベンゾイル化を実施したが、ＭｅＯＰＮの導入中に広範な転位が観察されたため、発明者らはより好適な保護基を探すことになった。したがって、転位に対し抵抗性のＣ−２、Ｃ−３およびＣ−４位を保護するためにアリル基を選択した。アリル基はのちに、ＭｅＯＰＮ修飾に適合性であることが判明した触媒的水素化分解で脱保護した。
【０１０５】
図６および図７に示すように、アリル基を組み込んだ後、アミノ−ペンタニルリンカーを結合部位としてアノマー位置に導入した。ガラクトシド（図７、構造３）から、まず４−メトキシフェニル基（ＯＭＰ）をセリウム硝酸アンモニウム（ＣＡＮ）で除去した。次に、対応するヘミアセタールをトリクロロアセトイミデートドナーに変換した。次に、５−アミノ−Ｎ−フタルイミド−ペンタニルリンカーを活性化剤としてのＴＭＳＯＴｆと共に０℃で導入した。化合物５（図７）をβアノマーとして６５％、αアノマーとして２９％収集した。トリチル基の除去により、修飾のための遊離した６−ヒドロキシル基がもたらされた。
【０１０６】
ＭｅＯＰＮ基導入のための戦略は、Ｃ．マーラ他、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．６１８０〜６１８３頁（２０１１年）によって最初に提案された同様の反応から直感を得た。化合物６（図６および図７）を、トリエチルアミンの存在下、商業的に入手可能なメチルジクロロホスフェートで処理し、次にアンモノリシスを行った。新たに導入したＭｅＯＰＮ（ＲおよびＳ）のキラリティー性質のため、２つのジアステレオ異性体の混合物としての生成物７（図７、構造７）を収集した。１Ｈ  ＮＭＲからは、スペクトル全体でアノマーおよびＯ−Ｍｅのシグナルと考えられる２組のシグナルが明らかになり、生成物７（図７）が実際に２つのジアステレオマーの１：１混合物であることが確認できた。反応により副産物の混合物がもたらされたが、最も豊富だったのは第２のＮＨ２で置き換えられたＯ−Ｍｅ基であり、この反応における低収率の説明となる。
【０１０７】
アリルおよびフタルイミド保護基をそれぞれ塩化パラジウム（ＩＩ）およびヒドラジンで除去し、生成物９（図７、構造９）を生成した。化合物７（図７）と同様、ジアステレオ異性体の混合物がＮＭＲにおいて明らかである。光学的に純粋ではないが、３１Ｐ  ＮＭＲの結果は、およそ１４ｐｐｍの亜リン酸シグナルを有する天然のＭｅＯＰＮ含有多糖に一致する。３  １Ｈ−３１Ｐ  ＨＭＢＣ  ＮＭＲ実験からは、ＭｅＯＰＮが、Ｏ−Ｍｅに加えてＨ−６シグナルとの相関シグナルを示しているＯ−６位に導入されたことが確認できた。
【０１０８】
ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌに対する免疫誘導
一実施形態では、６にある炭素をＯ−メチルホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ）で修飾したガラクトースは、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを発現しない複数のジェジュニ菌株に対しても免疫誘導するのに用いられる。図８に示すように、ＨＳ２３／３６から単離されＣＲＭ１９７に結合している莢膜多糖に対する抗体が単糖コンストラクトＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを認識した。予想外なことに、ＨＳ４からの、ＣＲＭ１９７に結合している多糖に対する抗体も、抗ＨＳ２３／３６  ＣＲＭ１９７結合体としてＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌに対する同等の応答を誘発した。また、抗ＨＳ１−ＣＲＭ１９７も、幾分低い程度ではあるがＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌに反応した。
【０１０９】
ＭｅＯＰＯＮ−６−ＧａｌとＨＳ２３／３６およびＨＳ４抗体との間で示された強い交差反応性は、ＭｅＯＰＮ−６−ＧａｌがＨＳ２３／３６およびＨＳ４莢膜多糖とエピトープ構造を共有するという事実によって説明することができる。１つには、ＨＳ２３／３６およびＨＳ４の両方におけるＭｅＯＰＮ基が一級ヒドロキシルに対するものであるという説明が考えられる。ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ（ＨＳ２３／３６）のＭｅＯＰＮ−７−６ｄ−β−Ｄ−ｉｄｏ−ヘプトースを含有するＨＳ４との交差反応は予想外であったが、両方の糖上の一級ヒドロキシル位置に対するＭｅＯＰＮの連結によるものである可能性がある。この特徴を図８に矢印で示す。
【実施例６】
【０１１０】
ジェジュニ菌莢膜／ＥＴＥＣの組合せコンストラクトを用いた、ジェジュニ菌および腸内毒素原性の大腸菌（ＥＴＥＣ）に対する免疫原性組成物
複数の腸内病原体から保護するために、合成の結合型ワクチン戦略を展開することができる。細菌腸内病原体のワクチン開発における大半の努力は特定の病原体に限定されている。複数の抗原的に可変な病原体に対する諸ワクチンを組み合わせて単一の多価性注射用ワクチンにすることができれば、これらの病原体の世界的な獲得および伝播を防ぐアプローチが大いに単純化されるであろう。世界的規模で、ＥＴＥＣおよびジェジュニ菌は細菌性下痢症の主因の１つである。加えて、ＣＪはギラン・バレー症候群、過敏性腸症候群および反応性関節炎を含めたいくつかの重度な続発症の原因として結びつけられてきた。その上、最近の研究からは、ＣＪ感染と、物資に制約のある環境における幼児の栄養障害および発達阻止との間の関連性が示されている。
【０１１１】
従来の方法を用いて、発明者らは、複数の動物種で免疫原性でありかつＮＨＰにおいてジェジュニ菌下痢症に対する防護を付与することが判明したＣＪ多糖莢膜を含有する結合型ワクチンを開発した。このより新しい合成のアプローチは、ＣＪ多糖莢膜結合型ワクチン上の免疫優性エピトープは、異なる莢膜タイプにおける異なる糖に見いだされるＭｅＯＰＮ修飾であるという最近のデータに基づいている。
【０１１２】
したがって、ジェジュニ菌およびＥＴＥＣの両方に対する免疫原性プラットフォームは、合成ＭｅＯＰＮ糖を異なるＥＴＥＣタンパク質抗原に連結させることによって作ることができる。このアプローチは、ＥＴＥＣタンパク質に結合している（合成または無毒化）シゲラ属リポ多糖を含めるように拡張することもできるであろう。よって、このプラットフォームは、３種の主要な細菌性下痢症病原体に対する多価性ワクチンの基盤を形成できる可能性がある。結合は、カンピロバクター属コンストラクトの免疫原性を強化するためにタンパク質担体としての役目も果たし得る。
【０１１３】
ＥＴＥＣコンストラクトに実施例３〜５のコンストラクトを結合することが想定されている。全体的な結合方法には、ジェジュニ菌ＣＰＳを、例えば酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）中のＮａＩＯ４で酸化させることが含まれる。酸化ＣＰＳを５ｋＤａカットオフ膜を用いて攪拌限外濾過により脱塩し、次に凍結乾燥した。次に、ＥＴＥＣタンパク質を添加する。化学量論的タンパク質対ＣＰＳは様々なものとなり得るが、典型的な質量比はタンパク質対ＣＰＳが１：２である。構成成分のその濃度は任意の方法によるものであり得る。しかしながら、例えば、多糖濃度はアントロンアッセイにより決定し、タンパク質濃度はＰｉｅｒｃｅ６６０タンパク質アッセイまたはＢＣＡアッセイにより決定した。次に、ＮａＣＮＢＨ３を添加する。次に結合体を限外濾過により脱塩し、凍結乾燥することができる。ＣＰＳ、ＥＴＥＣタンパク質および結合体を、例えば、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって、またはＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、または他の方法によって分析した。
【実施例７】
【０１１４】
非ヒト霊長類の応答
マウスにおけるＣｆａＥ−ＨＳ２３／３６およびＣｆａＥＢ−ＨＳ２３／３６の結合体の免疫原性、ならびにマウスにおけるＣｆａＩに対する血球凝集反応阻害（ＨＡＩ）力価の誘導を観察した。用いたｄｓｃＣｆａＥコンストラクトのアミノ酸配列は、配列番号１３８（ヌクレオチド配列は配列番号１３９）である。ｄｓｃ１９ＣｆａＥアミノ酸配列は、配列番号１４３（ヌクレオチド配列は配列番号１４２）である。ｄｓｃ１９ＣｆａＥＢのアミノ酸配列は、配列番号１４１（ヌクレオチド配列は配列番号１４０）である。
【０１１５】
ナンシーマーヨザルの試験に進むために、ＣｆａＥＢ−ＨＳ２３／３６結合体をダウン選択した。この非ヒト霊長類（ＮＨＰ）モデルは、ＥＴＥＣおよびジェジュニ菌の両方の下痢症モデルとして用いられてきたために選択された。発明者らは、３つのＮＨＰ試験に十分なサイズの多くのＣｆａＥＢ−ＨＳ２３／３６ワクチンを還元的アミノ化により合成した。最初のこのような試験で唯一完了したことは、ジェジュニ菌曝露前の用量設定試験であった。
【０１１６】
このＮＨＰ試験の設計を表７に示す。動物（群当たり６匹）に０日目、４２日目、および８４日目の３回免疫処置を行った。水酸化アルミニウムでアジュバント化した多糖（ＰＳ）０．５ｕｇまたは３．５ｕｇのいずれかでＣｆａＥＢ−ＨＳ２３／３６ワクチンを皮下に投与した。ワクチン中のＰＳ対タンパク質の比はおよそ１：１であり、これは用量当たりのＣｆａＥＢ０．５または３．５ｕｇに相当した。３．５ｕｇの用量は、アジュバントとしてのポリＩＣと共に皮内（ＩＤ）にも投与した。これは、ＣｆａＥＢのみでＩＤ免疫処置を用いて行った以前の研究とつなげるために行った。同様に、別のタンパク質に結合している同じ莢膜を用いた以前の研究とつなげるために、別の群にはＨＳ２３／３６−ＣＲＭ１９７を皮下に投与した。最終的に、対照群にはＰＢＳで免疫処置を行った。１４８日目に、動物をすべて４×１０１１ＣＦＵのＣＧ８４２１（ＨＳ２３／３６株の１つ）に曝露した。
【０１１７】
【表７】
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【０１１８】
曝露後１０日間、動物の下痢症について毎日観察した。下痢症を、グレード３以上の便が２日以上連続するものとして定義した。その結果を表８に概括する。ＰＢＳ群のわずか３／５匹の動物が６０％の罹患率で下痢症にかかった。曝露前に下痢症にかかったために動物１匹が除かれたことに注意されたい。この陰性対照群における疾患発症までの平均期間は２．３日であり、平均罹患期間は５．３日であった。ＨＳ２３／３６−ＣＲＭ１９７ワクチンを用いて免疫処理された動物における罹患率は３３％（２／６）であり、疾患発症までの平均が２日、平均罹患期間が４日であった（４５％の有効性）。ポリＩＣと共にＣｆａＥＢ−ＨＳ２３／３６を用いて皮内に免疫処置された動物も３３％の罹患率を示し、疾患発症までの平均が１．５日、期間が２日であった（４５％の有効性）。ＣｆａＥＢ−ＣＰＳで皮下に免疫処置された動物は、６７〜１００％の下痢症に対する有効性を示した。ワクチン０．５ｕｇで免疫処置された群における罹患率は０（０／５、ただし曝露後に嘔吐した動物１匹を除く）であり、ワクチン３．５ｕｇで免疫処置された群における罹患率は２０％（１／５、ただし曝露前の下痢症のために動物１匹を除く）であった。下痢を起こしたこの群の動物１匹は、疾患発症がより遅かった（９日目）。群当たりの動物数が少ないため、対照群と免疫処置されたいずれの動物との間にも有意差は存在しなかった。
【０１１９】
【表８】
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【０１２０】
血清学結果を図９に示す。ＣＰＳおよびＣｆａＥに対する免疫応答をＥＬＩＳＡにより測定した。群１、２および３の動物は両方の抗原に対するＩｇＧ応答およびＣｆａＥに対するＩｇＡ応答を示した。ＣｆａＩ線毛を発現しているＥＴＥＣ株Ｈ１０４０７に対する血球凝集反応阻害（ＨＡＩ）力価を測定した結果を図１０に示す。ＨＡＩ力価が群１、２および３の動物で検出され、群２が最も高い力価を示していることを結果は示している。
【実施例８】
【０１２１】
ＥＴＥＣ−カンピロバクター属莢膜結合体の追加の組合せの合成および免疫原性
ＣｓｓＢＡ−ＨＳ３ワクチン。ＣｓｓＢＡは、融合される２つのＣＳ６サブユニットの組換え形態である。このタンパク質をＴＥＭＰＯ酸化によりＨＳ３株からの莢膜に結合させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティングによりこの結合体を分析した。精製されたＣｓｓＢＡは、３１．８ｋＤａの推定Ｍｒを有する。ＣｓｓＢＡ−ＨＳ３  ＣＰＳの結合体は２本のバンドとして移動し、一方はＣｓｓＢＡよりわずかに小さく、一方は約６０ｋＤａで移動する。結合体のバンドは、抗ＣｓｓＢＡ抗血清およびＨＳ３の全細胞に対する抗体の両方に反応するが、このことは多糖がタンパク質に結合したことを示している。
【０１２２】
４週間の間隔で投与するワクチン３用量でマウスの皮下に免疫処置した。用量は、体重によって５ｕｇまたは体重によって２５ｕｇとした。０日目および各免疫処置の２週間後に動物を放血させ、ＣｓｓＢＡおよびＣＰＳに対する応答をＥＬＩＳＡによって測定した。図１１に示す結果からは、タンパク質および多糖両方の用量両方に対してロバストな応答が存在したことが示されている。
【０１２３】
ＬＴＢ−ＨＳ４ワクチン。ＬＴＢは、ＥＴＥＣの熱不安定性エンテロトキシンにおける結合性の構成成分である。還元的アミノ化により、毒性のない組換えＬＴＢをＨＳ４株の多糖莢膜に結合させた。図１２に示すように、免疫ブロッティングによりこの結合体を分析した。抗ＬＴＢ抗血清による免疫検出から、約１０ｋＤａのＬＴＢの単一バンドが明らかになった。この結合体は約２０ｋＤａ〜＞７５ｋＤａの範囲の主要バンドを４本含有し、抗ＬＴＢおよび抗ＨＳ４抗血清の両方に反応性があったことから結合の成功が示された。
【０１２４】
ＬＴＢ−ＨＳ４結合体（体重によって）５または２５ｕｇのいずれかを３用量、４週間の間隔でマウスの皮下に免疫処置し、血清免疫応答を測定した。図１２に示す結果からは、ＨＳ４莢膜およびＬＴＢ両方の用量両方に対してロバストな免疫応答が存在したことが示されている。
【実施例９】
【０１２５】
シゲラ属リポ多糖（ＬＰＳ）への結合
ヒト病原体であり下痢症および細菌性赤痢などの疾患を引き起こすシゲラ属には、志賀赤痢菌、フレクスナー赤痢菌、ボイド赤痢菌およびソンネ赤痢菌の４種が存在し、これらは重要な腸病原体であり、シゲラ属種株は長鎖のリポ多糖を発現する。多くの株について化学構造が決定された（Ｌｉｕ、他、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．３２巻：６２７〜６５３頁（２００８年）を参照）。
【０１２６】
本発明の対象の１つは、シゲラ属ＬＰＳ−ＥＴＥＣコンストラクトである。このコンストラクトは上記の諸例のようにＥＴＥＣコンストラクトを含み、このＥＴＥＣコンストラクトが、ジェジュニ菌莢膜多糖の代わりとしてまたはそれに加えてシゲラ属リポ多糖類に結合している。シゲラ属種のいずれかがこのＥＴＥＣコンストラクトに結合され得ることが想定されている。一例として、フレクスナー赤痢菌２ａリポ多糖を、ＥＴＥＣコンストラクトに結合され得る潜在的なポ多糖構造として以下のように例示する。
【０１２７】
【化２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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