(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
発作性障害に罹患している患者における前記障害の治療のための医薬組成物であって、
前記発作性障害が焦点性てんかんであり、
改変された受容体をコードするベクター、および前記受容体に対する外因性アゴニストを含み、
前記改変された受容体が、Ｇｉタンパク質を介してＧタンパク質共役型内向き整流性カリウムチャネル（GIRK）と共役するＧタンパク質共役型受容体（GPCR）であるヒトムスカリン性アセチルコリン受容体Ｍ４であり、前記受容体が（ｉ）その内在性活性化リガンドに対する応答性が低下していること、（ｉｉ）前記外因性アゴニストに対する応答性が保持または増強されていることを特徴とし、いずれの場合も前記改変された受容体が、神経細胞型に特異的なプロモーターに作動可能に連結した核酸によりコードされ、
治療が、
（ａ）前記患者に前記ベクターを投与する工程であって、
前記改変された受容体が、前記患者の脳内の発作病巣の興奮性ニューロンにおいて発現される、工程と、
（ｂ）前記患者に前記外因性アゴニストを投与する工程であって、
前記患者の脳内に前記アゴニストが存在することにより前記改変された受容体が活性化され、
前記改変された受容体が活性化されることにより前記発作病巣内の前記興奮性ニューロンの興奮性及び前記興奮性ニューロンによる神経伝達が可逆的に抑制される、工程と
を含む、医薬組成物。
【請求項２】
発作性障害に罹患している患者における前記障害の治療のための医薬組成物であって、
前記発作性障害が焦点性てんかんであり、
改変された受容体をコードするベクターを含み、
前記改変された受容体が、Ｇｉタンパク質を介してＧタンパク質共役型内向き整流性カリウムチャネル（GIRK）と共役するＧタンパク質共役型受容体（GPCR）であるヒトムスカリン性アセチルコリン受容体Ｍ４であり、前記受容体が（ｉ）その内在性活性化リガンドに対する応答性が低下していること、（ｉｉ）外因性アゴニストに対する応答性が保持または増強されていることを特徴とし、いずれの場合も前記改変された受容体が、神経細胞型に特異的なプロモーターに作動可能に連結した核酸によりコードされ、
治療が、
（ａ）前記患者に前記ベクターを投与する工程であって、
前記改変された受容体が、前記患者の脳内の発作病巣の興奮性ニューロンにおいて発現される、工程と、
（ｂ）前記患者に前記外因性アゴニストを投与する工程であって、
前記患者の脳内に前記アゴニストが存在することにより前記改変された受容体が活性化され、
前記改変された受容体が活性化されることにより前記発作病巣内の前記興奮性ニューロンの興奮性及び前記興奮性ニューロンによる神経伝達が可逆的に抑制される、工程と
を含む、医薬組成物。
【請求項３】
発作性障害に罹患している患者における前記障害の治療のための医薬組成物であって、
前記発作性障害が焦点性てんかんであり、
改変された受容体に対する外因性アゴニストを含み、
前記改変された受容体が、Ｇｉタンパク質を介してＧタンパク質共役型内向き整流性カリウムチャネル（GIRK）と共役するＧタンパク質共役型受容体（GPCR）であるヒトムスカリン性アセチルコリン受容体Ｍ４であり、前記受容体が（ｉ）その内在性活性化リガンドに対する応答性が低下していること、（ｉｉ）前記外因性アゴニストに対する応答性が保持または増強されていることを特徴とし、いずれの場合も前記改変された受容体が、神経細胞型に特異的なプロモーターに作動可能に連結した核酸によりコードされ、
治療が、
（ａ）前記患者に、前記改変された受容体をコードするベクターを投与する工程であって、
前記改変された受容体が、前記患者の脳内の発作病巣の興奮性ニューロンにおいて発現される、工程と、
（ｂ）前記患者に前記外因性アゴニストを投与する工程であって、
前記患者の脳内に前記アゴニストが存在することにより前記改変された受容体が活性化され、
前記改変された受容体が活性化されることにより前記発作病巣内の前記興奮性ニューロンの興奮性及び前記興奮性ニューロンによる神経伝達が可逆的に抑制される、工程と
を含む、医薬組成物。
【請求項４】
発作性障害に罹患している患者における前記障害の治療のための医薬組成物であって、
前記発作性障害が焦点性てんかんであり、
改変された受容体に対する外因性アゴニストを含み、
前記改変された受容体が、Ｇｉタンパク質を介してＧタンパク質共役型内向き整流性カリウムチャネル（GIRK）と共役するＧタンパク質共役型受容体（GPCR）であるヒトムスカリン性アセチルコリン受容体Ｍ４であり、前記受容体が（ｉ）その内在性活性化リガンドに対する応答性が低下していること、（ｉｉ）前記外因性アゴニストに対する応答性が保持または増強されていることを特徴とし、いずれの場合も前記改変された受容体が、神経細胞型に特異的なプロモーターに作動可能に連結した核酸によりコードされ、
前記患者が、前記改変された受容体をコードするベクターを予め投与されており、
前記改変された受容体が、前記患者の脳内の発作病巣の興奮性ニューロンにおいて発現され、
前記治療が、前記患者に前記外因性アゴニストを投与する工程であって、
前記患者の脳内に前記アゴニストが存在することにより前記改変された受容体が活性化され、
前記改変された受容体が活性化されることにより前記発作病巣内の前記興奮性ニューロンの興奮性及び前記興奮性ニューロンによる神経伝達が可逆的に抑制される工程を含む、医薬組成物。
【請求項５】
前記外因性アゴニストが、てんかん発作が前記患者に起きる前３０分以内またはてんかん発作が起きた後２４時間以内に投与される、請求項１から４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記外因性アゴニストが、（ｉ）自動発作検出機構と共役したデバイスによって、または（ｉｉ）ＥＥＧ分析によって予測される発作に応答して、自動的に投与される、請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
トランスジェニック哺乳動物の脳内のニューロンの興奮性を領域特異的かつ時間特異的に選択的に抑制するための方法であって、前記トランスジェニック哺乳動物が非ヒトの疾患モデルであり、
（ａ）前記哺乳動物に、改変された受容体をコードするベクターを投与する工程であって、改変された受容体が、Ｇｉタンパク質を介してＧタンパク質共役型内向き整流性カリウムチャネル（GIRK）と共役するＧタンパク質共役型受容体（GPCR）であるヒトムスカリン性アセチルコリン受容体Ｍ４であり、前記受容体が（ｉ）その内在性活性化リガンドに対する応答性が低下していること、（ｉｉ）外因性アゴニストに対する応答性が保持または増強されていることを特徴とし、前記改変された受容体が、前記哺乳動物の脳内の興奮性ニューロンにおいて発現されるように、いずれの場合も前記改変された受容体が、神経細胞型に特異的なプロモーターに作動可能に連結した核酸によりコードされる、工程と、
（ｂ）前記哺乳動物に前記外因性アゴニストを投与する工程であって、
前記患者の脳内に前記アゴニストが存在することにより前記改変された受容体が活性化され、
前記改変された受容体が活性化されることにより前記興奮性ニューロンの興奮性及び前記興奮性ニューロンによる神経伝達が抑制される、工程と
を含む方法。
【請求項８】
前記改変されたＧＰＣＲが、少なくとも１１３位および／または２０３位における改変を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記改変されたＧＰＣＲが、Ｙ１１３Ｃ／Ａ２０３Ｇ改変を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１から６及び８から９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターからなるリストから選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記神経細胞型に特異的なプロモーターがＣａＭｋ２Ａプロモーターである、請求項１から６及び８から１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記外因性アゴニストが、合成分子またはその代謝産物であり、１００〜１０００Ｄａの間の分子量を有する、請求項１から６及び８から１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記外因性アゴニストが、クロザピン−Ｎ−オキシドであり、または、
前記外因性アゴニストが、ペルラピンである、請求項１から６及び８から１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記クロザピン−Ｎ−オキシドが、クロザピンとして投与される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、てんかんおよび同様の神経性障害の治療において使用するための、遺伝子治療（genetic-therapy）に基づく方法および材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
てんかんは、脳における発作性の強力な放電によって引き起こされる短時間の不随意の行動変化である発作の再発性エピソードによって定義される。
【０００３】
てんかんは、全人口（５千万人超）の１％もの人々に影響を及ぼしており（１）、症例の少なくとも２０％で薬物療法に対して耐性である（２）。てんかんは社会および罹患している者にとって重大な負荷である。現行の最良の治療を用いてさえも、患者の２５％超で、その生存に対して極めて破壊的である発作が起こり続ける。
【０００４】
てんかんは、焦点性（特定の脳領域から生じる）または全般性（両方の半球から生じる）であり得る。焦点性に発症したてんかんを有する人は、特に、薬剤耐性（pharmacoresistance）を起こしやすい（３）。そのような場合では、てんかん原性域（epileptogenic zone）は多くの場合小さな領域に制限され、これは、多くの場合、イメージングおよび電気生理学的技法を用いてその場所を突き止めることができる（４）。しかし、発作病巣の外科的除去は、それにより首尾よく治療される薬剤耐性患者は約５％のみであり、また、多くの場合、焦点性新皮質てんかんでは脳機能上重要な皮質（eloquent cortex）に近いために不適切である（５、６）。
【０００５】
ＷＯ００／１８９０３には、てんかんおよび難治性の疼痛、ならびに心不整脈に対する療法のためのシステムが記載されており、そのシステムでは、いわゆる「電気的サイレンシング」遺伝子を、導入遺伝子の発現の感受性制御を伴って細胞に移入する。一例としては、ポリシストロニックなアデノウイルスベクターにおいて内向き整流性カリウムチャネルの発現を駆動するエクジソン誘導性プロモーターである。遺伝子発現の誘導後、正常な電気的活動は影響を受けないが興奮性は抑止されることが報告されている。
【０００６】
さらに、てんかん原性域を標的とする遺伝子療法が、焦点性新皮質てんかんを含めたてんかんのげっ歯類モデルにおいて有効であることが示されている（７）。
【０００７】
しかし、興奮性を恒久的に変更する導入遺伝子のウイルスによる送達では、発作病巣の近くの回路の必須機能が損なわれる恐れがある。魅力的な戦略は、発作が検出されたら「要望に応じて」回路の興奮性を抑止することである。げっ歯類における光遺伝学的発作抑止における最近の進歩により、これが原理上は実行可能であることが示された（７〜９）。臨床への移行するうえでの主な制約の１つは、適切な波長、強度および持続時間の光を形質導入されたニューロンの領域に送達する必要があることである。これには光学デバイスの埋め込みが必要であり、また、脳組織において光が大きく減衰してしまう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、焦点性てんかんなどのてんかんを治療する新規の方法が、当技術分野への貢献をもたらすはずであることが分かる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ベクターを使用して発作病巣内のニューロンの制限されたサブセットの興奮性を変更することができる改変された受容体を発現させる新規の処置システムを開発したのであるが、このシステムでは、特異的な外因性リガンドも投与した場合にのみ受容体が活性化される。
【００１０】
該受容体は、内在性神経伝達物質に対しては非感受性であるが、通常は脳機能に影響を及ぼさない物質に対しては感受性になるように、突然変異させた受容体である。
【００１１】
このように改変された受容体はそれ自体公知であり（例えば１０、１１、２４）、当該文献ではＤＲＥＡＤＤ（デザイナー薬物によって排他的に活性化されるデザイナー受容体（Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs））およびＲＡＳＳＬ（合成リガンドによってのみ活性化される受容体（Receptors Activated Solely by Synthetic Ligands））と称されている。しかし、そのような改変された受容体は、以前にてんかんの治療における使用については提案されたことはない。本明細書に記載の当該技術のいくつかは、現在特許請求されている優先日の後に公開されたものである（２６）。
【００１２】
例として、本発明者らは、ｈＭ４Ｄｉと称される抑制性ＤＲＥＡＤＤ  ＧＰＣＲを焦点性てんかんのｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて発現させることにより、特異的なリガンドＣＮＯ（クロザピン−Ｎ−オキシド）を全身投与すると発作を減少させることが可能になることを実証した。これを、急性発作の２つのモデルにおいて試験し、慢性薬剤耐性てんかんのモデルにおいても試験し、脳内の電気的活動（脳波−EEG）を分析するためにいくつかの補完的な方法を適用した。当該治療は耐容性がよく、ＣＮＯが脳内に存在する持続時間のみ、単回の腹腔内注射後およそ４５〜６０分にわたって発作が抑止された。
【００１３】
本発明の治療は、ウイルスベクターを注射する脳領域とその領域内の細胞型の両方を標的とすることができ、したがって、リガンドを送達した際の効果を有効に局在化させることができ、また、リガンドの非存在下では、脳機能に対するいかなる影響も予測されない。
【００１４】
したがって、当該療法は、標的化かつ時間的に限定されるものである。本発明の実施例において使用したてんかんの前臨床モデルは全身性薬物に応答しないものであり、これにより、本発明が現在有効に治療されていない患者において有用性を有することが示唆される。
【００１５】
したがって、本発明の一態様では、発作性障害に罹患している患者において前記障害を治療する方法であって、
（ａ）前記患者に、改変された受容体をコードするベクターを投与する工程であって、改変された受容体が、（ｉ）その内在性活性化リガンドに対する応答性が低下していること、（ｉｉ）外因性アゴニストに対する応答性が保持または増強されていることを特徴とし、
前記改変された受容体が、患者の脳内の発作病巣のニューロンにおいて発現される工程と、
（ｂ）前記患者に前記外因性アゴニストを投与する工程であって、
それによって、患者の脳内に前記アゴニストが存在することにより前記改変された受容体が活性化され、
それによって、前記改変された受容体が活性化することにより、発作病巣内のニューロンの興奮性が可逆的に変更、好ましくは抑制される工程と
を含む方法が提供される。
【００１６】
別の態様では、例えば哺乳動物の脳内の興奮性ニューロンの興奮性を領域特異的かつ時間特異的に、選択的に抑制するための方法であって、
（ａ）前記哺乳動物に、改変された受容体をコードするベクターを投与する工程であって、改変された受容体が、（ｉ）その内在性活性化リガンドに対する応答性が低下していること、（ｉｉ）外因性アゴニストに対する応答性が保持または増強されていることを特徴とし、
前記改変された受容体が、哺乳動物の脳内の前記ニューロンにおいて発現される工程と、
（ｂ）前記哺乳動物に前記外因性アゴニストを投与する工程であって、
それによって、患者の脳内に前記アゴニストが存在することにより前記改変された受容体が活性化され、
それによって、前記改変された受容体が活性化されることによりニューロンの興奮性が抑制される工程と
を含む方法が提供される。
【００１７】
他の実施形態では、興奮性受容体の活性化により抑制性ニューロンの活性化を導くことができ、それにより、シナプスのサイレンシングまたは抑制などの抑制性応答がさらに導かれる。
【００１８】
哺乳動物は、非ヒト哺乳動物、例えば、げっ歯類（例えばマウス、ラット）などの試験動物または霊長類であってよい。哺乳動物は、トランスジェニック哺乳動物であってよい。そのような試験動物により本発明の別の態様が形成される。
【００１９】
関連する態様では、患者または哺乳動物は、当該方法を実施する前に、ベクターを予め投与されていてよい。
【００２０】
本発明は、発作性障害に罹患している患者における前記障害の治療方法において使用するための、改変された受容体をコードするベクター、および前記受容体に対する外因性アゴニストであって、治療が、
（ａ）前記患者に前記ベクターを投与する工程であって、改変された受容体が、（ｉ）その内在性活性化リガンドに対する応答性が低下していること、（ｉｉ）外因性アゴニストに対する応答性が保持または増強されていることを特徴とし、
前記改変された受容体が、患者の脳内の発作病巣のニューロンにおいて発現される工程と、
（ｂ）前記患者に前記外因性アゴニストを投与する工程であって、
それによって、患者の脳内に前記アゴニストが存在することにより前記改変された受容体が活性化され、
それによって、前記改変された受容体が活性化されることにより発作病巣内のニューロンの興奮性が可逆的に変更される工程と
を含む、改変された受容体をコードするベクター、および前記受容体に対する外因性アゴニストも提供する。
【００２１】
本発明は、発作性障害に罹患している患者における前記障害の治療方法において使用するための、改変された受容体をコードするベクターであって、治療が、
（ａ）前記患者に前記ベクターを投与する工程であって、改変された受容体が、（ｉ）その内在性活性化リガンドに対する応答性が低下していること、（ｉｉ）外因性アゴニストに対する応答性が保持または増強されていることを特徴とし、
前記改変された受容体が、患者の脳内の発作病巣のニューロンにおいて発現される工程と、
（ｂ）前記患者に前記外因性アゴニストを投与する工程であって、
それによって、患者の脳内に前記アゴニストが存在することにより前記改変された受容体が活性化され、
それによって、前記改変された受容体が活性化されることにより発作病巣内のニューロンの興奮性が可逆的に変更される工程と
を含む、改変された受容体をコードするベクターも提供する。
【００２２】
本発明は、発作性障害に罹患している患者における前記障害の治療方法において使用するための、外因性アゴニストであって、治療が、
（ａ）前記患者に、改変された受容体をコードするベクターを投与する工程であって、改変された受容体が、（ｉ）その内在性活性化リガンドに対する応答性が低下していること、（ｉｉ）外因性アゴニストに対する応答性が保持または増強されていることを特徴とし、
前記改変された受容体が、患者の脳内の発作病巣のニューロンにおいて発現される工程と、
（ｂ）前記患者に前記外因性アゴニストを投与する工程であって、
それによって、患者の脳内に前記アゴニストが存在することにより前記改変された受容体が活性化され、
それによって、前記改変された受容体が活性化されることにより発作病巣内のニューロンの興奮性が可逆的に変更される工程と
を含む、外因性アゴニストも提供する。
【００２３】
本発明は、発作性障害に罹患している患者における前記障害の治療方法において使用するための、外因性アゴニストであって、前記患者が、改変された受容体をコードするベクターを予め投与されており、改変された受容体が、（ｉ）その内在性活性化リガンドに対する応答性が低下していること、（ｉｉ）外因性アゴニストに対する応答性が保持または増強されていることを特徴とし、
前記改変された受容体が、患者の脳内の発作病巣のニューロンにおいて発現され、
治療が、前記患者に前記外因性アゴニストを投与する工程であって、
それによって、患者の脳内に前記アゴニストが存在することにより前記改変された受容体が活性化され、
それによって、前記改変された受容体が活性化されることにより発作病巣内のニューロンの興奮性が可逆的に変更される工程
を含む、外因性アゴニストも提供する。
【００２４】
治療方法または療法を以下により詳細に記載する。
【００２５】
本発明は、本明細書に記載の治療方法または療法において使用するための医薬の調製における、本明細書で定義されているベクターおよび／またはアゴニストの使用も提供する。
【００２６】
ここで本発明のいくつかの特定の態様をより詳細に考察する。
【００２７】
受容体
上記の通り、人工的なアゴニストによってのみ活性化されるように改変された受容体は、何年にもわたって当技術分野で公知であり、時には、ＤＲＥＡＤＤまたはＲＡＳＳＬと称される。
【００２８】
当業者は、公知の方法を使用し、本開示を考慮し、次いで本発明において適用することによってそのような受容体をもたらすことができる。「改変された受容体」など、ＤＲＥＡＤＤおよびＲＡＳＳＬという用語は、文脈により別段の指定のない限り、本明細書では互換的に使用される。
【００２９】
例えば、ＷＯ９７／３５４７８には、ＲＡＳＳＬの調製が記載されている。ＲＡＳＳＬの調製および特性についてのその記載に関するその出願の内容は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。ＷＯ９７／３５４７８では、Ｇｉ共役型アセチルコリンムスカリン性受容体を含めたＧタンパク質共役型受容体からＲＡＳＳＬをどのように調製することができるかが教示されている。内容には、「ＲＡＳＳＬの構築」についての記載、ＷＯ９７／３５４７８の２０〜３０頁が含まれる。さらに、ＷＯ９７／３５４７８からのＲＡＳＳＬに関するある特定の定義をそれらの技術分野で理解されている意味と一貫させるために本明細書で使用する。そこで記載されているＲＡＳＳＬは、ＧＰＣＲの特定の天然の（すなわち内在性の）リガンドに対する結合親和性が低下しているが（野生型Gタンパク質共役型受容体による、特定のリガンドの結合と比較して）、外因性の、一般には、合成の、小分子に対する結合親和性は正常である、ほぼ正常である、または好ましくは増強された、改変されたＧタンパク質共役型受容体である。したがって、ＲＡＳＳＬ発現細胞のＲＡＳＳＬ媒介性活性化は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて天然のリガンドの存在下では有意な程度では起こらないが、外因的に導入された小分子に曝露すると有意に応答する。言い換えると、ＲＡＳＳＬは、天然のリガンドと比較して外因性リガンドによって優位に活性化される（すなわち、小分子リガンドの結合により、同様の濃度の特定の天然のリガンドとの結合によるよりも大きくまたはより有意な程度に活性化される）。
【００３０】
ＧＰＣＲ
本発明において使用するための好ましい受容体は、通常は脳に存在しない合成小分子に結合する改変されたＧタンパク質共役型受容体（GPCR）である。
【００３１】
本明細書に記載の方法には、真核細胞、特に哺乳動物の脳内のニューロンにおけるＧタンパク質媒介性細胞応答に影響を及ぼすまたはそれを誘導するという目的があり得る。ニューロンは、一般には、改変されたＧＰＣＲをコードするベクターで形質転換された、神経集団内の神経細胞である。
【００３２】
「Ｇタンパク質共役型受容体」とは、本明細書で使用される場合、その天然のリガンドに結合し、受容体が活性化されると、細胞応答をもたらすＧタンパク質媒介性シグナル（複数可）を伝達する受容体を意味する。Ｇタンパク質共役型受容体は、進化的に関連するタンパク質の大きなファミリーを形成する（ＷＯ９７／３５４７８参照）。Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーのメンバーであるタンパク質は、一般に、７つの推定膜貫通ドメインで構成される。Ｇタンパク質共役型受容体は、「７回膜貫通セグメント（７ＴＭ）受容体」として、および「ヘプタヘリカル受容体」としても当技術分野で公知であった（例えば、Schwartz、1994、Curr. Opin. Biotechnol. 5: 434-444を参照されたい）。
【００３３】
ＧＰＣＲは、ヘテロ三量体グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Gタンパク質）の複合体と相互作用し、したがって、イオンチャネルを含めた多種多様な細胞内シグナル伝達経路を調節する。したがって、本明細書では、「Ｇタンパク質共役細胞応答」とは、リガンドとＧタンパク質共役型受容体が結合すると起こる細胞応答またはシグナル伝達経路を意味する。本発明に関連するそのようなＧタンパク質共役細胞応答は、ニューロン興奮性を改変して、神経伝達を改変するものである。好ましい応答は抑制性応答であり、それによって、リガンドを用いた受容体の活性化によりシナプスのサイレンシングまたは抑制が引き起こされる。
【００３４】
ＧＰＣＲによりニューロン興奮性を改変して、神経伝達を改変することができる１つの機構は、例えば、シナプス前カルシウムチャネルに対する影響を介した神経伝達物質放出の抑制を通じたものである。
【００３５】
ＧＰＣＲによってニューロン興奮性を改変して、神経伝達を改変することができる別の機構は、Ｇタンパク質を介したＧタンパク質共役型内向き整流性カリウムチャネル（GIRK）との共役を通じたものである。したがって、本発明では、Ｇタンパク質共役細胞応答は、膜過分極およびニューロン抑制である（１１）。
【００３６】
本発明の好ましい改変された受容体は、これらの細胞応答または活性の一方または両方をもたらすＧＰＣＲである。
【００３７】
Ｍ２−ムスカリン性受容体、Ａ１−アデノシン受容体、α２−アドレナリン作動性受容体、Ｄ２−ドーパミン受容体、μ−オピオイド受容体、δ−オピオイド受容体、およびκ−オピオイド受容体、５−ＨＴ１Ａセロトニン受容体、ソマトスタチン受容体、ガラニン受容体、ｍ−Ｇｌｕ受容体、ＧＡＢＡＢ受容体、およびスフィンゴシン−１−リン酸受容体を含めた多種多様なＧタンパク質共役型受容体によりＧＩＲＫが活性化される（Yamada M、Inanobe A、Kurachi Y（1998年12月）. "G protein regulation of potassium ion channels". Pharmacological Reviews 50（4）: 723-60）。
【００３８】
ＧＩＲＫＳを活性化する好ましいＧＰＣＲは、コリン作動性受容体としても公知のムスカリン性アセチルコリン受容体Ｍ４である。この受容体は、ヒトでは、ＣＨＲＭ４遺伝子によりコードされるタンパク質であり、本明細書ではｈＭ４と称される。これは、Ｇｉアルファサブユニット（またはGi／GoまたはGiタンパク質）と共役している。ｈＭ４Ｄｉ活性化により、シナプス前カルシウムチャネルに対する影響によってほぼ確実に媒介される神経伝達物質放出も抑制されると考えられる。この活性は、Ｌｅｖｅｙら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １５：４０７７−４０９２、１９９５；およびＳｈｉｒｅｙ  ＪＫら、Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ４：４２−５０、２００８によって以前報告されたＭ４ムスカリン性受容体のシナプス前の分布および作用に関する証拠と一致する。）
【００３９】
別の適切なＧＰＣＲは、ｈＭ３Ｄｑ（ｈＭ３Ｄとしても公知−２７参照）であり得る。これは、興奮性受容体であるが、本発明の実施形態では、抗てんかん作用を実現するために抑制性ニューロンにおいて発現させることができる。
【００４０】
本明細書で使用される改変された受容体（RASSL）は、その対応するネイティブなＧタンパク質共役型受容体に対して、ＲＡＳＳＬが、特定の天然のリガンドに対して、リガンドとその対応するネイティブなＧタンパク質共役型受容体の結合と比較して低減している、好ましくは実質的に低減している、より好ましくは実質的に排除されている結合を示すという点で改変されている。
【００４１】
したがって、ＲＡＳＳＬ活性は、特定の天然のリガンド（例えば、アセチルコリン）の天然のゆらぎによっては比較的影響を受けない。特定の天然のリガンドのＲＡＳＳＬ結合は、ＲＡＳＳＬの対応するネイティブなＧタンパク質共役型受容体との結合と比較して少なくとも５分の１、好ましくは１０分の１、より好ましくは５０分の１、さらにより好ましくは７５分の１に低減していることが好ましく、１００分の１以下に低減していてよい。
【００４２】
ＲＡＳＳＬは、合成リガンド結合親和性と特定の天然のリガンドの結合親和性の比によっても特徴づけることができる。本発明のＲＡＳＳＬの示す小分子リガンド結合と特定の天然のリガンドの結合の比は高いことが好ましく、少なくとも０．８、好ましくは少なくとも１．０、より好ましくは少なくとも５、なおより好ましくは１０、さらにより好ましくは１００以上の小分子リガンド：特定の天然のリガンドの結合比を示す。
【００４３】
ＲＡＳＳＬは、ネイティブなＧタンパク質共役型受容体の小分子リガンド：特定の天然のリガンドの結合比の２倍超、好ましくは５倍超、より好ましくは１０倍超、なおより好ましくは５０〜１００倍超の結合比を示すことが好ましい。
【００４４】
ＲＡＳＳＬは、合成リガンドへの曝露による活性化のレベルと特定の天然のリガンドへの曝露による活性化のレベルの比（「活性化比」）によっても特徴づけることができる。活性化レベルは、下記の通り測定することができる。本発明のＲＡＳＳＬの示す小分子リガンド活性化と特定の天然のリガンドによる活性化の比は高いことが好ましく、少なくとも０．８、好ましくは少なくとも１．０、より好ましくは少なくとも５、なおより好ましくは１０、さらにより好ましくは１００以上の小分子リガンド：特定の天然のリガンドによる活性化比を示す。ＲＡＳＳＬは、ネイティブなＧタンパク質共役型受容体の小分子リガンド：特定の天然のリガンドによる活性化比の２倍超、好ましくは５倍超、より好ましくは１０倍超、なおより好ましくは５０〜１００倍超の活性化比を示すことが好ましい。
【００４５】
チャネル電気生理学的試験を（１１、補足の材料および方法）に記載の通り実施することができる。簡単に述べると、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｐｒｅｐ  Ｃｙｔｏｆｅｃｔｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Bio-Rad）を使用して受容体をＨＥＫ（ｔｓＡ２０１細胞）細胞に２：１：１（２  ＧＰＣＲ：１  ＧＩＲＫ１：１  ＧＩＲＫ２）のモル比で一過性にトランスフェクトする。ＧＩＲＫチャネル媒介性Ｋ＋電流のトランスフェクト後（１２〜２４時間）発現を、−１００から、それらの内向き整流特性による０ｍＶから＋５０ｍＶまでの５０−ｍｓ電圧勾配によって検証する。以下の細胞外記録溶液および細胞内記録溶液を使用する；細胞外（２０ｍＭのＮａＣｌ／１２０ｍＭのＫＣｌ／２ｍＭのＣａＣｌ２／１ｍＭのＭｇＣｌ２／１０ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＮａＯＨ、ＫＯＨを用いてｐＨ７．３）、細胞内（１００ｍＭのＫ−アスパラギン酸／４０ｍＭのＫＣｌ／５ｍＭのＭｇＡＴＰ／１０ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ／５ｍＭのＮａＣｌ／２ｍＭのＥＧＴＡ／２ｍＭのＭｇＣｌ２／１０ｍＭのＧＴＰ、ＫＯＨを用いてｐＨ７．３）。電流が同定されたら、ＨＥＫ細胞を−６０ｍＶで１５〜６０秒にわたって電圧固定し、急速灌流システム（ALA Scientific Instruments、Westbury、NY）を使用して１０ｍＭのＣＣｈまたはＣＮＯを直接細胞上に２秒にわたって適用する。
【００４６】
代替として、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ＳＥ、Ｒａｊａｋｕｌｅｎｄｒａｎ  Ｓ、Ｔａｎ  ＳＶら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ２０１３；８４：１１０７−１１１２に基づく方法を利用することができる。プラスミドｐＭＴ２ＬＦに含有される、ＧＰＣＲ、ＧＩＲＫサブユニットおよび緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードするｃＤＮＡをヒト胚腎臓（HEK）細胞にリポフェクタミン２０００（Invitrogen）を使用して２：１：１：１（２  ＧＰＣＲ：１  ＧＩＲＫ１：１  ＧＩＲＫ２：１  ＧＦＰ）のモル比で一過性にトランスフェクトする。トランスフェクトの３６〜７２時間後に記録を行う。細胞全体パッチクランプ記録を室温で実施する。外液は、ＮａＣｌ２  １３５；ＫＣｌ  ４；ＭｇＣｌ２  １；ＣａＣｌ２  ２；ＨＥＰＥＳ  １０（mM単位）を含有する。ピペット溶液は、ＮａＣｌ  １３５；ＫＣｌ  ２．５；ＥＧＴＡ  ２；ＨＥＰＥＳ  １０（mM単位）を含有する。ピペット抵抗は、細胞内溶液を満たした場合２〜４ＭΩである。ＧＦＰを発現する細胞は−８０ｍＶで保持され、直列抵抗は代償性ではない。直列抵抗が１０ＭΩを超える細胞は廃棄する。−Ｐ／４プロトコールを使用してリーク電流を引く。Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００ＢまたはＡｘｏｃｌａｍｐ  ７００Ｂ増幅器（Molecular Devices）を使用して電流を記録する。データを取得し、ＬａｂＶｉｅｗ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（National Instruments）を使用して解析する。
【００４７】
培養した海馬ニューロンの膜電位をモニタリングするために、スプラーグドーリーラットの仔（Zivic Miller Inc.、Pittsburgh、PA）を出生後１日目に屠殺し、海馬ニューロンを解離させ、カバーガラス上で培養する。ニューロン（１０〜１４日齢）にシンドビスウイルスを感染させ、感染後１２〜２４時間を記録のために使用した。その代わりに、好ましくは、レンチウイルスを使用することができる。簡単に述べると、ＧＰＣＲおよびＧＦＰを発現するレンチウイルスを、ニューロンをプレーティングした１日後に添加し、１４日後にｉｎ  ｖｉｔｒｏで記録を得る（Heeroma J H、Henneberger C、Rajakulendran S、Hanna MG、Schorge S、Kullmann DM、Disease Models & Mechanisms 2、612-619、2009）。海馬ニューロンを細胞外緩衝液（１７２ｍＭのＮａＣｌ／２．４ｍＭのＫＣｌ／１０ｍＭのＨｅｐｅｓ／１０ｍＭのグルコース／４ｍＭのＣａＣｌ２／４ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．３）および細胞内緩衝液（１４５ｍＭのＫ＋グルコン酸塩／１５ｍＭのＨｅｐｅｓ／１ｍＭのＫ＋−ＥＧＴＡ／４ｍＭのＮａ−ＡＴＰ／０．４ｍＭのＮａ−ＧＴＰ、ｐＨ７．３）において記録する。海馬ニューロンの膜電位の変化を電流固定モードで実施し、上記の通りＣＣｈまたはＣＮＯを細胞に直接適用する。活動電位発火を記録するために、１０μＭのビククリン（Sigma）を細胞外記録溶液に添加して海馬ニューロンへの抑制性インプットを遮断する。Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ  ７００Ｂ（Molecular Devices）増幅器を用いてパッチクランプ記録を実施する。電流を１０ｋＨｚでデジタル化し内蔵１０−ｋＨｚ３極ベッセルフィルタ（フィルタ１）、連続して２．９−ｋＨｚ４極ベッセルフィルタ（フィルタ２）を用いてフィルタにかける。
【００４８】
シナプス伝達に対するＧＰＣＲの影響を特徴づけるために、ＧＰＣＲおよび蛍光レポータータンパク質ｍＣｉｔｒｉｎｅを発現するアデノ随伴ウイルス血清型５（ＡＡＶ５）１μｌを雄スプラーグドーリーラット（生後４週間）の背側海馬ＣＡ３亜領域に、ブレグマから３．６ｍｍ側方（右側）、２．８ｍｍ後側および２．９ｍｍ腹側に毎分１００ｎｌで注射する（Akam T、Oren I、Mantoan L、Ferenczi E、Kullmann DM. Nat Neurosci 2012 May; 15（5）: 763-8）。４〜６週間後、動物を、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、９２；ＫＣｌ、２．５；ＮａＨ２ＰＯ４、１．２５；チオ尿素、２；アスコルビン酸、５；Ｎａ−ピルビン酸、３；ＭｇＣｌ２、１０；Ｄ−グルコース、２５；ＮａＨＣＯ３、３０；ＣａＣｌ２、０．５；スクロース、１（mM単位）を含有する室温の溶液を用いて経心的に灌流し、水平海馬切片を調製する。細胞外灌流溶液は、ＮａＣｌ、１１９；ＫＣｌ、２．５；ＣａＣｌ２、０．５；ＭｇＳＯ４、１．３；ＭｇＣｌ、２；ＮａＨ２ＰＯ４、１．２５；ＮａＨＣＯ３、２５；グルコース、１０を含有する（mM）。ＣＮＯ（１０μＭ）のバス灌流の前、その間およびその後に、ＣＡ１の放射状層において興奮性シナプス後場電位（fEPSP）を３０秒ごとに細胞外刺激（２０〜３２０μＡ  １００μｓ）によって誘発する。
【００４９】
好ましいＧｉ共役型ヒトムスカリン性受容体は、経口的に生物が利用可能であり、通常は不活性なクロザピン、クロザピン−Ｎ−オキシド（CNO）の代謝産物に対して感受性にさせた「ｈＭ４Ｄｉ」である（１１、１２）。この改変されたＧＰＣＲは、以下の突然変異：Ｙ１１３Ｃ／Ａ２０３Ｇを含む。改変された受容体は配列番号１によりコードされることが好ましい。
【００５０】
重要なことに、ｈＭ４Ｄｉは、親受容体の内在性アゴニストであるアセチルコリンに対しては比較的感受性が低い。
【００５１】
改変された受容体ｈＭ４Ｄｉは、参考文献１１（B. N. Armbruster、X. Li、M. H. Pausch、S. Herlitze、B. L. Roth、"Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand"、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104、5163-5168（2007））において最初に記載された。これらの著者らは、定義済みのリガンド特異性を有するＧＰＣＲを生成するための一般的で検証された、偏りのない手法を記載しており、それをムスカリン性ＡＣｈ受容体（mAChR）ＤＲＥＡＤＤのファミリーを創出するために利用した。これらのＤＲＥＡＤＤの調製および特性についてのその記載に関するその刊行物の内容は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
【００５２】
ヒトＭ４  ＤＲＥＡＤＤの調製は、Ｎａｗａｒａｔｎｅ，Ｖ．、Ｌｅａｃｈ，Ｋ．、Ｓｕｒａｔｍａｎ，Ｎ．、Ｌｏｉａｃｏｎｏ，Ｒ．Ｅ．、Ｆｅｌｄｅｒ，Ｃ．Ｃ、Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒ，Ｂ．Ｎ．、＆  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ａ．（２００８）．「Ｎｅｗ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍ４  ｍｕｓｃａｒｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｇａｉｎｅｄ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ  ａｎｄ  ａ  ＤＲＥＡＤＤ（designer receptor exclusively activated by a designer drug）」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、７４（４）、１１１９−１１３１にも記載されている。
【００５３】
ｈＭ４Ｄｉをコードするプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ  ０２１３９からプラスミド４５５４８：ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ−ＨＡ−ｈＭ４Ｄ（Ｇｉ）として市販されており（http://www.addgene.org/45548/）、また、添付の配列および下記の図面に記載されている。
【００５４】
ｈＭ３ＤｑをコードするプラスミドもＡｄｄｇｅｎｅ（https://www.addgene.org/44361/）から市販されており、同様に参考文献（１９）に記載されている。この受容体はペルラピンに対して感受性である（２７）。
【００５５】
ベクターおよびその投与
種々のベクターのいずれも、ＲＡＳＳＬ発現細胞を作製するために本発明に従って使用することができる。
【００５６】
本発明の療法において使用するためのベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子療法プロトコールに適する。ベクターは、安定な組込み型ベクターであっても安定な非組込み型ベクターであってもよい。好ましいベクターは、レンチウイルスベクターまたはＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）ベクターなどのウイルスベクターである。
【００５７】
これらの型のウイルスベクターのどちらの使用も、遺伝子療法に関して当技術分野において周知である。単に例として、ＷＯ２００８０１１３８１には、対象において受容体を発現させるための、これらおよび他のベクターの使用が記載されている。ＡＡＶベクターおよびレンチウイルスベクターの調製および特性についてのその記載に関するその出願の内容は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
【００５８】
簡単に述べると、ＷＯ２００８０１１３８１に記載の通り、ＡＡＶは、欠陥パルボウイルスであり、多くの細胞型に感染することができ、ヒトに対しては非病原性であるので、好ましいベクターである。ＡＡＶ型ベクターは、約４〜５ｋｂを運搬することができ、野生型ＡＡＶは第１９染色体に安定に挿入されることが公知である。この部位特異的組込み性を含有するベクターが好ましい。この型のベクターの特に好ましい実施形態は、Ａｖｉｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡによって製造されているＰ４．１  Ｃベクターである。別の型のＡＡＶベクターでは、ＡＡＶは、異種遺伝子（本発明ではRASSL）に作動可能に連結した、細胞特異的発現を導くプロモーターを含有する少なくとも１つのカセットを挟む末端逆位配列（ITR）の対を含有する。さらなる情報は、米国特許第６，２６１，８３４号に見いだすことができる。
【００５９】
レンチウイルスベクターは、一般には、感染のために長いインキュベーション期間を有することを特徴とする特別な型のレトロウイルスベクターである。さらに、レンチウイルスベクターは非分裂細胞に感染することが可能である。レンチウイルスベクターは、ウイルスのレンチウイルスファミリーに由来するウイルスの核酸骨格に基づく。一般には、レンチウイルスベクターは、ＳＩＶおよびＨＩＶなどのレンチウイルスの５’ＬＴＲ領域および３’ＬＴＲ領域を含有する。レンチウイルスベクターはまた、一般には、ＳＩＶおよびＨＩＶなどのレンチウイルスのＲｅｖ応答配列（RRE）も含有する。レンチウイルスベクターの例としては、Ｄｕｌｌ，Ｔ．ら、「Ａ  Ｔｈｉｒｄ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７２（１１）：８４６３−７１（１９９８）のものが挙げられる。
【００６０】
本明細書に記載のベクターは、当技術分野で公知の種々のアクセス方法で標的細胞に局所的に送達することができる。例えば、「Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ」Ｎｉｋｋｈａｈ＆Ｐｉｎｓｋｅｒ編；Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒｕｒｇｉｃａ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １１７巻、２０１３を参照されたい。特に、送達は、穿頭孔開頭術および定位注射などの公知の方法体系を使用した脳への直接注射によるものであってよい。注射は、定義された発作病巣を標的とする（例えば焦点性てんかんにおいて）またはより一般的には、他の発作疾患において活動過剰が疑われる脳の領域へのものである。
【００６１】
ベクターは、恒久的な形質転換を行うために使用することもでき、脳において単に一過性に発現させることもできる。
【００６２】
一般的に言うと、当業者は、組換え遺伝子発現のためのベクターを構築し、プロトコールを設計することが十分に可能である。上記の本発明のエレメントに加えて、プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、マーカー遺伝子および他の配列を含めた適切な調節配列を必要に応じて含有する適切なベクターを選択または構築することができる。さらなる詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＰｒｅｓｓまたはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、（１９９５、および定期的な補足）を参照されたい。
【００６３】
ＤＮＡ構築物は、標的細胞内でのＲＡＳＳＬをコードするＤＮＡの発現を容易にするためにプロモーターを含有することが好ましい。特異性は、例えば組織または領域に特異的なプロモーターを使用して受容体を排他的に、領域および細胞型特異的に発現させることによって実現することができる。
【００６４】
一例として、前脳において比較的特異的に発現を駆動するＣａｍｋ２ａ（アルファCaMキナーゼII遺伝子）プロモーターである。例えば、Ｓａｋｕｒａｄａら（２００５）「Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ  ＣａＭ  ｋｉｎａｓｅ  ＩＩ  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  Ｚｉｃ２、ａ  Ｚｉｃ  ｆａｍｉｌｙ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ」Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．２００５年１１月；５３（３）：３２３−３０．Ｅｐｕｂ  ２００５年９月１２日を参照されたい。
【００６５】
他の神経細胞型に特異的なプロモーターとしては、ＮＳＥプロモーター（Liu H.ら、Journal of Neuroscience. 23（18）: 7143-54、2003）；チロシンヒドロキシラーゼプロモーター（Kessler MA.ら、Brain Research. Molecular Brain Research. 112（1-2）: 8-23、2003）；ミエリン塩基性タンパク質プロモーター（Kessler MA.らB Biophysical Research Communications. 288（4）: 809-18、2001）；グリア線維酸性タンパク質プロモーター（Nolte C.ら、GLIA. 33（1）: 72-86、2001）；ニューロフィラメント遺伝子（重鎖、中鎖、軽鎖）プロモーター（Yaworsky PJら、Journal of Biological Chemistry. 272（40）: 25112-20、1997）が挙げられる（すべて、少なくともプロモーターの配列および関連する配列に関して参照により本明細書に組み込まれる）。ＮＳＥプロモーターは、Ｐｅｅｌ  ＡＬ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．４（１）：１６−２４、１９９７に開示されている（配列番号６９）（ｐＴＲ−ＮＴ３ｍｙｃ; Powell Gene Therapy Center、University of Florida、Gainesville FL）。別の適切なプロモーターは、シナプシン１プロモーターである（Kuglerら"Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area." Gene Ther. 2003年2月; 10（4）: 337-47を参照されたい）。
【００６６】
アゴニストおよびその投与
本発明では、改変された受容体は、外因性アゴニストが存在することによって活性化される。外因性アゴニスト（またはリガンド、または小分子、この用語は、本明細書では互換的に使用される）は、経口的にまたは非経口的に（例えば全身投与）送達することができ、血液脳関門を透過するものである。リガンドは、一般には脳に存在しない、または改変された受容体を活性化しない十分に低い基底濃度で存在するという点で外因性である。
【００６７】
リガンドの脳における半減期は１２０分未満、６０分未満、または３０分未満であることが好ましい。これには、リガンドと受容体の相互作用によって引き起こされる正常な脳機能に対するあらゆる副作用が最小限になるという利点がある。
【００６８】
リガンドは合成の、すなわち天然に存在しないものであることが好ましい。
【００６９】
好ましいリガンド（複数可）は、ＲＡＳＳＬ活性化以外の生物学的活性が最小であるものまたはＲＡＳＳＬ活性化以外の生物学的活性がないものである。
【００７０】
ＲＡＳＳＬの膜貫通ドメイン内に結合し、Ｇタンパク質の所望のファミリーのＲＡＳＳＬ媒介性活性化を容易にすることが可能な小分子、好ましくは合成小分子はいずれも、本発明の標的化活性化方法の方法において使用するために適している。一般には２０００〜６０００Ｄａの分子量を有するＧタンパク質共役型受容体の天然のペプチドリガンドとは対照的に、Ｇタンパク質共役型受容体の小分子リガンドは、一般に、１００〜１０００Ｄａの分子量を有する。
【００７１】
本発明において有用な合成小分子としては、天然手段（例えば、組換え細胞株から単離する）または化学的手段（例えば、有機または無機化学的プロセスを使用する）のいずれかによって生成される合成小分子が挙げられる。
【００７２】
リガンドは、一般に、経口投与または非経口（例えば、静脈内）投与後に血液脳関門を通過することが可能になる分子量および正味のイオン電荷を有する。
【００７３】
一般には、血液脳関門を通過する分子はペプチド分子よりも電荷が少ない。合成薬物は、分子上の荷電基の数に応じて血液脳関門を通過するようにも通過しないようにもすることができる（例えば、Freidinger、1993、Prog. Drug Res. 40: 33-98を参照されたい）。より小さな分子、例えば、４０００Ｄａ未満の分子も血液脳関門を通過する可能性がより高い。
【００７４】
ネイティブなＧタンパク質共役型受容体に結合し、それを活性化するいくつかの合成小分子が当技術分野で公知であり、本発明において有用である。本発明において使用するために適した追加的な合成小分子は、候補化合物をネイティブなＧタンパク質共役型受容体との結合またはＲＡＳＳＬとの結合についてスクリーニングすることによって同定することができる。例えば、上記の通り、培養したニューロンのチャネル電気生理学的性質を評価し、膜電位を測定することによる。特に、ＲＡＳＳＬおよび関連する目的のカリウムチャネルを発現する（またはそれをトランスフェクトした）細胞株を、様々な濃度の、ＲＡＳＳＬ結合について試験する化合物に曝露する。ＲＡＳＳＬ結合は、試験化合物に曝露したがＲＡＳＳＬに結合せず、かつ／または細胞活性化を誘導しない対照化合物の非存在下での膜過分極およびニューロン抑制の誘導によって検出する（１１）。
【００７５】
好ましい実施形態では、リガンドは、クロザピンの代謝産物であるクロザピン−Ｎ−オキシド（CNO）である。これは、頬側または鼻腔内を含めた、本明細書に記載の種々の経路によって送達することができる。
【００７６】
別の好ましいリガンドは、ｈＭ３Ｄｑに結合するペルラピンである（２７）。ｈＭ３ＤｑとｈＭ４Ｄｉの結合部位は高度に類似しているので、ペルラピンは同様にｈＭ４Ｄｉに結合することが予測される。
【００７７】
障害
好ましい実施形態では、発作性障害は、てんかん、例えば、特発性てんかん、症候性てんかんおよび原因不明性てんかんである。本明細書に記載の方法は、てんかん原性の活動をクエンチまたは遮断するために使用することができる。当該方法は、それを必要とする患者の脳または神経組織における発作閾値を上昇させるため、または患者の脳細胞におけるてんかんバーストを低減させるために使用することができる。
【００７８】
本発明の複合化学遺伝学的（combined chemical-genetic）（化学遺伝学的（chemogenetic）としても公知）方法は、ヒト焦点性てんかんを治療するため、領域および時間特異的に発作を抑止するために特に適している。
【００７９】
患者は、脳の新皮質の単一の領域に影響を及ぼす明確な焦点性てんかんを有すると診断された患者であってよい。焦点性てんかんは、例えば、発達異常から、または脳卒中、腫瘍、穿通性頭部外傷または感染の後に生じ得る。
【００８０】
しかし、本発明は、多数のてんかん病巣を多数の同定された遺伝子座に直接注射することによって同時に治療するためにも使用することができる。
【００８１】
患者は、抗てんかん薬の適切な投与にもかかわらずてんかん発作が継続することを意味する薬物耐性または医学的不応性（medically-refractory）てんかんを有すると診断された患者であってよい。
【００８２】
患者は、抗てんかん薬を用いた既存の治療を受けている患者であってよく、その場合、当該方法は、既存の治療の中止を可能にするまたは薬物レジメンを軽減するという目的を有する。
【００８３】
患者は、持続性部分てんかんを有すると診断されている患者であってよい。
【００８４】
ニューロン興奮性の恒久的な低下（例えばカリウムチャネル過剰発現を用いて実現することができる）が、例えば、それによる正常な脳機能に対するリスクが大きすぎることが理由で望ましくない場合に、本発明の治療に特定の有用性がある。てんかん原性域が言語または運動機能を担う皮質領域内にある場合であっても、リガンドを投与しなければ、これらの機能への影響はない。難治性焦点性てんかんを有する患者には、これは許容される副作用とみなされる可能性がある。
【００８５】
本発明には、側頭葉てんかんおよび焦点性新皮質てんかんなどの焦点性の発症を特徴とする発作性障害に対する特定の有用性があるが、本発明はまた、より全般性の形態のてんかんも、特に第二選択適応症として、それに適用することができる。これらの場合には、送達の標的は、状態に対して必要に応じて選択する、例えば、送達は視床に対して両側性であってよい。したがって、本発明を適用することができる他の障害として、点頭てんかん、ミオクローヌス発作および「小運動」発作、ならびに強直間代発作および複雑部分発作が挙げられる。
【００８６】
さらに、原理上は、本発明は、てんかん原性回路を「リセット」し、一部の場合ではリガンドの投与より長く続く発作の持続的低減をもたらす目的で、固定期間にわたるニューロン興奮性の継続的な変更を引き起こすことにより、予防的に使用することができる。
【００８７】
投与および投与量
大多数のてんかん患者は、てんかん原性病巣によって生じる活動拡散のステレオタイプのパターンを有する。したがって、本発明は、異常な活動が拡散する前にそれを抑止するため、またはその経過の初期に打ち切るために予防的に（例えば、３０分前まで）適用することができる。さらに、発作は、多くの場合、群発するので、患者は、所望であれば、群発が開始した時にリガンドを摂取することができる。
【００８８】
リガンドは、介護人が投与することができる。
【００８９】
リガンドは、自動発作検出機構と共役したデバイスによって自動的に送達することができる。例えば、皮下ポンプ（インスリンを送達するために使用するような（２３；２５））を用いて要望に応じた投与を使用することができる。自動ＥＥＧ分析によって発作を予測することができるという最近の証拠（２２）により、閉ループデバイスを使用してリガンドを投与するという選択肢がもたらされる。
【００９０】
「治療」という用語は、状態を治療することに関して本明細書で使用される場合、一般に、いくつかの所望の治療効果、例えば、状態の進行の抑制が実現されるヒトの治療および療法に関し、進行速度の低下、進行速度の停止、状態の退行、状態の好転、および状態の治癒を含む。予防的処置としての治療（すなわち、予防法、予防）も包含される。
【００９１】
リガンドは治療有効量で送達することができる。
【００９２】
「治療有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、所望の治療レジメンに従って投与した場合に妥当な損益比に見合ういくつかの所望の治療効果を生じさせるために有効である受容体またはリガンドの量に関する。
【００９３】
同様に、「予防有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、所望の治療レジメンに従って投与した場合に妥当な損益比に見合ういくつかの所望の予防効果を生じさせるために有効である受容体またはリガンドの量に関する。
【００９４】
「予防法」とは、本明細書に関しては、完全な成功、すなわち完全な保護または完全な予防を包含するものと理解されるべきではない。そうではなく、この状況における予防法とは、症候性の状態が検出される前に、その特定の状態を遅延し、弱めまたは回避するように補助することによって健康を維持することを目的として投与する処置を指す。
【００９５】
リガンドは単独で使用する（例えば、投与する）ことが可能であるが、多くの場合、例えば、薬学的に許容される担体または希釈剤と共に組成物または製剤としてもたらすことが好ましい。
【００９６】
「薬学的に許容される」という用語は、本明細書で使用される場合、良好な医学的判断の範囲内に入る、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題または合併症を伴わない問題の対象（例えば、ヒト）の組織と接触させて使用するのに適した、妥当な損益比に見合う化合物、成分、材料、組成物、剤形などに関する。各担体、希釈剤、賦形剤などはまた、製剤の他の成分と適合するという意味でも「許容される」ものでなければならない。
【００９７】
いくつかの実施形態では、組成物は、唯一の活性成分として本明細書に記載のリガンド、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなる医薬組成物（例えば、製剤、調製物、医薬）である。
【００９８】
ＷＯ２００８０９６２６８に記載の通り、改変された受容体のウイルスによる送達を利用する遺伝子療法実施形態では、単位用量は、投与されるウイルス粒子の用量を単位として算出することができる。ウイルス用量は特定の数のウイルス粒子またはプラーク形成単位（pfu）を含む。アデノウイルスを伴う実施形態については、特定の単位用量は、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３または１０１４ｐｆｕを含む。粒子用量は、感染欠陥粒子の存在に起因して、いくらか多くてよい（１０〜１００倍）。
【００９９】
いくつかの実施形態では、本発明の方法または治療は、症候性であるか疾患修飾性であるかにかかわらず、他の療法と組み合わせることができる。
【０１００】
「治療」という用語は、２つ以上の治療または療法を、例えば、逐次的にまたは同時に組み合わせる併用治療および療法を含む。
【０１０１】
例えば、本明細書に記載の化合物を用いた治療と１種または複数種の他の（例えば、１種、２種、３種、４種の）薬剤または療法を組み合わせることが有益であり得る。
【０１０２】
併用治療薬の適切な例は、本明細書における本開示に基づいて当業者には公知になろう。一般には、併用治療薬は、治療される個体の診断に供される本明細書に記載の疾患の治療において治療効果をもたらすことが可能であると考えられる当技術分野において公知の任意のものであってよい。例えば、てんかんは、時には、基礎をなす病因を直接治療することによって好転させることができるが、フェニトイン、ガバペンチン、ラモトリジン、レベチラセタム、カルバマゼピンおよびクロバザムなどの抗けいれん薬、ならびにトピラマート、ならびに異常な放電および発作を抑止するその他のものが、従来の治療の中核である（Rho & Sankar、1999、Epilepsia 40: 1471-1483）。
【０１０３】
特定の組合せは、医師の自由裁量であり、当該医師は、自身の一般的全般的知見および当業者に公知の投薬レジメンを使用して投与量の選択も行う。
【０１０４】
薬剤（すなわち、改変された受容体およびリガンドと、それに加えて１種または複数種の他の薬剤）は、同時に投与することも逐次的に投与することもでき、また、用量スケジュールを個別に変動させて、および異なる経路を介して投与することができる。例えば、逐次的に投与する場合、薬剤は、密接な間隔で（例えば、５〜１０分にわたって）またはより長い間隔で（例えば、１時間、２時間、３時間、４時間またはそれ超離して、または必要な場合にはさらに長い期間離して）投与することができ、正確な投薬レジメンは、治療剤（複数可）の性質に見合うものにする。
【０１０５】
選択された定義
「受容体−リガンド結合」、「リガンド結合」および「結合」とは、受容体（例えば、Gタンパク質共役型受容体）とリガンド（例えば、天然のリガンド、（例えば、ペプチドリガンド）または合成リガンド（例えば、合成小分子リガンド））との物理的な相互作用を意味するために本明細書では互換的に使用される。リガンド結合は、当技術分野で公知の種々の方法（例えば、放射標識したリガンドとの会合の検出）によって測定することができる。
【０１０６】
「シグナル伝達」とは、リガンド結合の結果として（例えば、Gタンパク質共役型受容体への合成リガンド結合の結果として）の生化学的または生理学的応答の生成を意味する。
【０１０７】
「受容体の活性化」、「ＲＡＳＳＬ活性化」および「Ｇタンパク質共役型受容体活性化」とは、リガンド（例えば、天然リガンドまたは合成リガンド）が、Ｇタンパク質媒介性シグナル伝達、およびＧタンパク質媒介性シグナル伝達に付随する生理的または生化学的応答が誘導される様式で受容体に結合することを意味するために本明細書では互換的に使用される。活性化は、Ｇタンパク質関連シグナルに付随する生物学的シグナルを測定すること（例えば、電気生理学を用いて）によって測定することができる。
【０１０８】
「標的化細胞活性化」および「標的細胞活性化」とは、合成小分子がＲＡＳＳＬに結合することによってＲＡＳＳＬ媒介性活性化が起こる、標的細胞における特定のＧタンパク質媒介性生理的応答のＲＡＳＳＬ媒介性活性化を意味するために本明細書では互換的に使用される。本明細書で使用される場合、細胞の活性化とは、シナプスサイレンシングまたは抑制などの抑制性応答を包含する。
【０１０９】
ネイティブなＧタンパク質共役型受容体の「天然のリガンド」および「天然に存在するリガンド」および「内在性リガンド」とは、哺乳動物宿主に内在する生体分子を意味するために本明細書では互換的に使用され、その生体分子は、ネイティブなＧタンパク質共役型受容体に結合してＧタンパク質共役細胞応答を誘導するものである。一例としてアセチルコリンである。
【０１１０】
「合成小分子」、「合成小分子リガンド」、「合成リガンド」、および「合成アゴニスト」などは、Ｇタンパク質共役型受容体または改変されたＧタンパク質共役型受容体（すなわち、RASSL）の膜貫通ドメイン内に結合し、その受容体の活性化およびＧタンパク質の所望のファミリーの同時活性化を容易にすることが可能な、天然または化学的手段によって外因的に作出される任意の化合物を意味するために本明細書では互換的に使用される。
【０１１１】
「形質転換」とは、新しいＤＮＡ（すなわち、細胞に対して外因性のDNA）の組み入れ後に細胞において誘導される一過性のまたは恒久的な遺伝子変化を意味する。細胞が哺乳動物細胞である場合、恒久的な遺伝子変化は、一般に、ＤＮＡを細胞のゲノム内に導入することによって実現される。
【０１１２】
「プロモーター」とは、それが作動可能に連結したＤＮＡ配列の直接転写を導くために十分な最小のＤＮＡ配列を意味する。「プロモーター」とは、外部のシグナルまたは薬剤に対し細胞型特異的、組織特異的に制御可能、または外部のシグナルまたは薬剤によって誘導可能なプロモーター依存性遺伝子発現のために十分なプロモーターエレメントも包含することを意味し、そのようなエレメントは、ネイティブな遺伝子の５’領域または３’領域に位置してよい。
【０１１３】
核酸のバリアント
本明細書において上記で考察した配列（添付の配列の配列番号１を参照されたい）に由来する機能的バリアントも同様に本発明において利用できることが当業者には理解されよう。
【０１１４】
薬剤の好ましい機能性誘導体としては、突然変異（野生型と比較して）を含み得るが、それにもかかわらず薬剤の活性は変更されないようなタンパク質が挙げられる。本発明によると、薬剤の好ましい別の変化は、一般に、「保存的」または「安全な」置換として公知である。保存的アミノ酸置換とは、薬剤の構造および生物学的機能を保存するために、十分に類似した化学的性質を有するアミノ酸を用いたものである。特に、挿入または欠失に数個のアミノ酸のみ、例えば、１０個未満および好ましくは５個未満が関与し、薬剤の機能的コンフォメーションに欠かせないアミノ酸の除去または入れ替えがなされなければ、上記の定義済みの配列に、それらの機能を変更させることなくアミノ酸の挿入および欠失も行うことができることが明らかである。文献から、配列および／または天然のタンパク質の構造に対する統計学的試験および物理化学的試験に基づいて保存的アミノ酸置換の選択を行うことができる多くのモデルが得られる。
【０１１５】
本明細書に開示されているアミノ酸の機能性誘導体、および核酸配列は、本明細書で参照される配列のいずれかのアミノ酸／ポリペプチド／核酸配列に対して少なくとも３０％、好ましくは４０％、より好ましくは５０％、およびなおより好ましくは、６０％の配列同一性を有する配列を有してよいことが当業者には理解されよう。参照される配列のいずれかに対して、好ましくは６５％超、より好ましくは７５％超、なおより好ましくは８５％超、およびなおより好ましくは９０％超の同一性を有するアミノ酸／ポリペプチド／核酸配列も想定される。好ましくは、アミノ酸／ポリペプチド／核酸配列は、参照される配列のいずれかに対して、９２％の同一性、なおより好ましくは９５％の同一性、なおより好ましくは９７％の同一性、なおより好ましくは９８％の同一性、最も好ましくは、９９％の同一性を有する。
【０１１６】
それぞれの場合において、改変された受容体は、上で定義した用語に含まれる性質を保持し、例えば、アゴニストの存在下では標的化細胞を活性化するが、天然のリガンドの存在下では標的化細胞を活性化しない。
【０１１７】
異なるアミノ酸／ポリペプチド／核酸配列間の百分率同一性の算出は、以下の通り行うことができる。まず、ＣｌｕｓｔａｌＸプログラム（ペアワイズパラメータ：gap opening  １０．０、gap extension  ０．１、protein matrix  Ｇｏｎｎｅｔ  ２５０、DNA MATRIX  IUB；多数のパラメータ：gap opening  １０．０、gap extension  ０．２、delay divergent sequences  ３０％、DNA transition weight  ０．５、negative matrix  ｏｆｆ、protein matrix  Ｇｏｎｎｅｔ  ｓｅｒｉｅｓ、DNA weight IUB；Protein gap parameters、residue-specific penalties  on、hydrophilic penalties  on、hydrophilic residues  GPSNDQERK、gap separation distance  ４、end gap separation  off）によって多数のアラインメントを生成する。次いで、多数のアラインメントから、百分率同一性を（Ｎ／Ｔ）＊１００として算出し、ここで、Ｎは２つの配列が同一の残基を共有する位置の数であり、Ｔは比較した位置の総数である。あるいは、百分率同一性は、（Ｎ／Ｓ）＊１００として算出することができ、ここで、Ｓは比較対象であるより短い配列の長さである。アミノ酸／ポリペプチド／核酸配列は、新規に合成することもでき、ネイティブなアミノ酸／ポリペプチド／核酸配列、またはそれらの誘導体であってもよい。
【０１１８】
遺伝暗号の縮重に起因して、任意の核酸配列を、コードされる薬剤タンパク質の配列に実質的に影響を及ぼすことなく変動または変化させ、それにより、その機能的バリアントをもたらすことができることが明らかである。適切なヌクレオチドバリアントは、配列内の同じアミノ酸をコードする異なるコドンの置換、したがって、サイレント変化を生じさせることによって変更された配列を有するものである。他の適切なバリアントは、相同なヌクレオチド配列を有するが、置換されるアミノ酸と同様の生物物理学的性質の側鎖を有するアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって変更されることで保存的変化が生じている配列の全体、または一部を含むバリアントである。例えば、小さな非極性、疎水性アミノ酸として、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、およびメチオニンが挙げられる。大きな非極性、疎水性アミノ酸として、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが挙げられる。極性中性アミノ酸として、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸として、リシン、アルギニンおよびヒスチジンが挙げられる。負に荷電した（酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。
【０１１９】
本明細書における副題はいずれも、単に便宜上含まれるものであり、いかなる形でも本開示を限定するものとは解釈されない。
【０１２０】
ここで、以下の非限定的な図面および実施例を参照して本発明をさらに説明する。これらを考慮すると他の本発明の実施形態が当業者には想起されよう。
【０１２１】
本明細書において引用されたすべての参考文献の本開示は、当業者が本発明を実施するために使用することができるである限りは、これにより相互参照により具体的に本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
（参考文献２６より）
【図１】ピロカルピン誘導性発作の化学遺伝学的サイレンシングを示す図である。（ａ）：腹腔内ビヒクル（上）またはＣＮＯ（下）と共に皮質内ピロカルピンを投与した（時間０）ラットからのＭｏｒｌｅｔ−ｗａｖｅｌｅｔ  ＥＥＧスペクトル。（ｂ）：単一棘波（SS）活動、複合棘波（CS）活動および一連の中間周波数（IF）活動（下に拡大）を示す（ａ、上）からのＥＥＧセグメントである。（ｃ）：ＥＥＧと相関する行動発作。ＳＳ活動は運動発作なし（重症度スコア０）または肢、頭部または身体の単収縮（スコア１）に関連し、ＩＦは、反復性の頭部または身体の揺れ（スコア２）または後肢での立ち上がり（rearing）、逆行移動（retrograde locomotion）および全身痙攣（３）に関連した。ラット３匹（１〜３の番号を付した）においてラット当たり６００の連続した４秒間隔を評価した。（ｄ）：フーリエ変換による中間周波数（IF）活動の検出：ピロカルピンによって誘導されるＳＳ活動（黒色）またはＩＦ活動（赤色）のいずれかを示すラット１匹におけるＥＥＧセグメントのフーリエ変換（右側）（２つの５秒周期が左側に示されている）。ＩＦフーリエ変換により、７Ｈｚ周辺のピーク（および１４Ｈｚにおける調和）が示される。（ｅ）：ビヒクル試験（赤色）およびＣＮＯ試験（青色）（ピロカルピンおよびビヒクル／CNO注射の前（−１０〜０分）および後の連続した１０分間隔）における棘波周波数の時間的進展（左側）、４〜１４Ｈｚパワー（中央）、およびＩＦの回数（右側）。Ｎ＝６ラット（１０対の試験、繰り返した場合ラット内の平均、データは、平均±ｅ．ｍ．として示されている）。（ｆ）：ｅと同じデータであるが、各動物についてビヒクルとＣＮＯを比較した（色によって示される）、累積的な電気記録による発作測定値（周波数、パワー、IF事象数）としてプロットしたものである。記号は、１０分間隔での連続した累積測定値を示す。４５度の線（灰色）はＣＮＯとビヒクルの同等性を示す。
【図２】ピクロトキシン誘導性発作の化学遺伝学的サイレンシングを示す図である。（ａ）：時間０においてピクロトキシンを注射し（軟膜の１ｍｍ下、１０ｍＭ、３００ｎｌ）、それと共に連続した日に腹腔内ビヒクル（上）またはビヒクル中１ｍｇ  ｍｌのＣＮＯ（下）を注射した動物における、ＥＥＧのＭｏｒｌｅｔ−ｗａｖｅｌｅｔパワースペクトル。（ｂ）：ＥＥＧ活動。下、ＳＳ活動、ＣＳ活動およびＩＦ活動を示す、示されている時間（２秒の持続時間）からの拡大部分。（ｃ）：運動発作は、ＩＦ活動に伴うものの方がＳＳ活動に伴うものよりも重症であり、ＣＳ活動に伴うものは中間である（図２ｃの重症度の尺度）。ラット３匹（１〜３の番号を付した）においてラット当たり６００の連続した４秒間隔を評価した。（ｄ）：ピクロトキシンによって誘導されるＳＳ活動（黒色）およびＩＦ活動（４〜１４Ｈｚ、１１．５Ｈｚ付近のピーク；赤色）を含有する、示された５秒のトレースのフーリエ変換（右側）（左側、中央）。（ｅ）：ビヒクル試験（赤色）およびＣＮＯ試験（青色）（ピクロトキシンおよびビヒクル／CNO注射の前（−１０〜０分）および後の連続した１０分間隔）における棘波周波数の時間的進展（左側）、４〜１４Ｈｚパワー（中央）、およびＩＦの回数（右側）。Ｎ＝ラット５匹（１２対の試験、繰り返した場合ラット内の平均、平均±ｓ．ｅ．ｍ．）。（ｆ）：ｅと同じデータであるが、図２ｅの各動物について累積的な電気記録による発作測定値をプロットしたものである。
【図３】破傷風毒素によって誘導される焦点性新皮質てんかんの化学遺伝学的サイレンシングを示す図である。（ａ）：バックグラウンド活性（１）およびてんかん様活動の４つの型：「低振幅の長い事象」（２）、「高振幅の短い事象」（３）、「高振幅の長い事象」（４）、および「高振幅に加えて断続的な棘波」（５）を示す、破傷風毒素を注射した動物からの試料ＥＥＧトレース。（ｂ）：てんかん様事象の周波数のビヒクル試験とＣＮＯ試験の間のペアワイズ比較。Ｎ＝６ラット；１５対の試験、繰り返した場合には動物内の平均。オレンジのバーは有意な場合の（ウィルコクソン検定；Ｐ＜０．０５）低下（％、右軸）を示す。（ｃ）：コーストラインのビヒクル試験とＣＮＯ試験の間のペアワイズ比較。Ｎ＝６ラット；１５対の試験、繰り返した場合には動物内の平均。オレンジのバーは有意な場合の（ウィルコクソン検定；Ｐ＜０．０５）低下（％、右軸）を示す。（ｄ）：高周波パワーのビヒクル試験とＣＮＯ試験の間のペアワイズ比較。Ｎ＝６ラット；１５対の試験、繰り返した場合には動物内の平均。オレンジのバーは有意な場合の（ウィルコクソン検定；Ｐ＜０．０５）低下（％、右軸）を示す。
【図４】ＨＡ−ｈＭ４Ｄｉ−ｍＣｉｔｒｉｎｅの発現および忍容性を示す図である。（ａ）：抗ＨＡ抗体を用いて可視化した、右側一次運動野のより深い層（Ｍ１）におけるＨＡ−ｈＭ４Ｄｉ−ｍＣｉｔｒｉｎｅの発現。目盛り、１００μｍ。（ｂ）：抗ＨＡ抗体（左側）および抗ＣａｍＫＩＩα抗体（中央）、および両抗体（右側）を用いて可視化した、ＣａｍＫＩＩα−ＨＡ−ｈＭ４Ｄｉ−ｍＣｉｔｒｉｎｅの共局在。目盛り、２０μｍ。（ｃ）：偽注射（左手のバー）または右側Ｍ１へのＨＡ−ｈＭ４Ｄｉ−ｍＣｉｔｒｉｎｅ（中央および右手のバー）を受けたラットにおける腹腔内ＣＮＯを伴う（右側）および伴わない（左側）運動協調性。左前肢についてのフットフォールト（ＨＡ−ｈＭ４Ｄｉ−ｍＣｉｔｒｉｎｅの反対側）を右（同側性）前肢（対応のあるt検定）と、および偽注射した動物の左前肢のフットフォールトと比較した（対応のないｔ検定；平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝５、偽手術および７ｈＭ  ４を注射したラット）。ＮＳ：Ｐ＞０．０５。
【図５】下記の実施例において説明する通り、ｈＭ４Ｄｉを送達するために使用する（プラスミド：５４２１〜８１５５ｂｐ）におけるウイルス（AAV）ベクターのマップである。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１２３】
実施例１−てんかんのモデルにおける化学遺伝学的療法の実証
緒言および概要
ＤＲＥＡＤＤ（デザイナー薬物によって排他的に活性化されるデザイナー受容体）のウイルスによる発現を使用して、発作病巣におけるニューロン興奮性の局在化された抑止を実現するための複合化学遺伝学的手法を実証した。ＤＲＥＡＤＤを用いて形質導入したニューロンは、原理上は選択的リガンドの非存在下では影響を受けず、形質導入されていないニューロンはリガンドが存在する場合にのみ影響を受け、それにより、それらの性質が恒久的に変更されることが回避される（１０）。
【０１２４】
経口的に生物が利用可能であり、通常は不活性なクロザピン、クロザピン−Ｎ−オキシド（CNO）の代謝産物に対して感受性にさせた（１１、１２）、工学的に操作したＧｉ共役型ヒトムスカリン性受容体ｈＭ４Ｄｉを選択した。重要なことに、ｈＭ４Ｄｉは、親受容体の内在性アゴニストであるアセチルコリンに対しては比較的感受性が低い。ｈＭ４Ｄｉ活性化により、Ｇタンパク質によりゲーティングされる内向き整流性カリウムチャネルが開放され、それにより、膜過分極およびニューロン抑制がもたらされる（１１）。
【０１２５】
ＣＮＯの全身投与により、２つの異なる化学的けいれん薬（chemoconvulsant）、ピロカルピンおよびピクロトキシンによって誘発された焦点発作が抑止された。ＣＮＯには、焦点性新皮質てんかんの慢性モデルにおけるロバストな抗けいれん効果もあった。化学遺伝学的発作の減弱により、形質導入されていない脳領域における、または特異的なリガンドの非存在下での正常な回路機能の破壊を最小限にしながら、難治性焦点性てんかんを治療するための新規の手法がもたらされる。
【０１２６】
材料および方法
Ｄｒ．Ｂｒｙａｎ  Ｒｏｔｈ（University of North Carolina）から提供されたＣａｍｋ２α−ＨＡ−ｈＭ４Ｄ（Ｇｉ）−ＩＲＥＳ−ｍＣｉｔｒｉｎｅカセットを含有するアデノ随伴ウイルス血清型５を、ＵＮＣ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅから、１ｍｌ当たり８×１０１２感染単位（IU）の濃度で得た。対照実験として、化学遺伝学的サイレンサーｈＭ４Ｄｉの代わりに光遺伝学的サイレンサーＡｒｃｈＴを発現する同様のウイルス（ＡＡＶ５−Ｃａｍｋ２α−ＡｒｃｈＴ−ＧＦＰ）を注射した。
【０１２７】
定位的外科手術。動物実験をＡｎｉｍａｌｓ（Scientific Procedures）Ａｃｔ  １９８６に従って行った。雄スプラーグドーリーラット（生後６〜１２週間、２６３〜３２５ｇ）にイソフルランを使用して麻酔をかけ、定位枠（Kopf、CA）に置いた。ＡＡＶ５ウイルスを発現するｈＭ４Ｄｉ１．５μｌを毎分１００ｎｌのスピードで右側一次運動野の前肢領域の層５に注射した（座標、軟膜から１．０ｍｍの深さでブレグマの２．２〜２．４ｍｍ側方および１．０ｍｍ前側；一部のラットでは、体積の半分をそれぞれ軟膜から１．１ｍｍおよび０．７ｍｍのところで沈着させた）。ＥＥＧトランスミッター（Ａ３０１９Ｄ、Open Source Instruments（１３））を皮下に埋め込み、硬膜下頭蓋内記録電極を注射部位の上に位置づけた。参照電極を対側頭蓋骨に埋め込んだ。化学的けいれん薬を逐次的に注射するために、テフロンカニューレガイド（Ｃ３１３ＧＴ／ＳＰ、PlasticsOne）を注射部位の上に埋め込んだ。慢性てんかん実験のために、破傷風毒素（Dr G. Schiavoからの寄贈品）１２〜１６ｎｇを、ｈＭ４Ｄｉを発現するＡＡＶ５ウイルスと共に最終的な体積１．６〜１．８μｌで注射した。動物を別々にファラデーケージに収容し、外科手術後８週間まで継続的にＥＥＧを記録した。
【０１２８】
発作モデル。ｈＭ４Ｄｉ  ＡＡＶ注射の１７〜５２日後に、ピロカルピン（滅菌生理食塩水中５Ｍ）またはピクロトキシン（１０％ＤＭＳＯ／滅菌生理食塩水中１０ｍＭ）を、予め埋め込んだテフロンカニューレガイドを通じて注射した。注射体積は、各動物において結果生じた発作の重症度を指針として、ピロカルピンについては２００〜９００ｎｌの間に調整し、ピクロトキシンについては１００〜６００ｎｌに調整し、対応するＣＮＯ試験とビヒクル試験の間で一定に保った。ＣＮＯ（１ｍｇ／ｋｇ、１％ＤＭＳＯ／生理食塩水ビヒクル中１ｍｇ／ｍｌに希釈）またはビヒクル単独を、けいれん薬注入のすぐ後に腹腔内に注射した。化学的けいれん薬を注射して５分以内に棘徐波（spike-wave）が発生した。
【０１２９】
てんかんモデル。ＴｅＴｘ（１２〜１６ｎｇ）を、ｈＭ４Ｄｉを発現するウイルスと共に懸濁液として注射することにより（上記を参照されたい）、４日以内に開始し、一般には１秒未満続く高周波数（７０〜１６０Ｈｚ）事象が誘発された。そのような事象は、注射後少なくとも８週間にわたって起こったが、それらの周波数は日によって変動し、また、１日のうちの時間に応じても変動した。したがって、データセットに含める試験について、ＣＮＯ試験／ビヒクル試験の対を１日のうちの時間に応じて対応させ、第１のＣＮＯまたはビヒクル注射の前４時間にわたって平均で１時間当たり少なくとも２事象が起こらなければならないという基準を設定した。ＣＮＯおよび対応するビヒクル試験の順序はランダム化した。ビヒクル（１％ＤＭＳＯ／生理食塩水）またはＣＮＯ（ＤＭＳＯ／生理食塩水中１ｍｇ／ｋｇ）を２時間の間隔で２回注射し、第１の注射後３．５時間続く期間を分析した。
【０１３０】
ＥＥＧ分析。ＥＥＧを記録し、Ｎｅｕｒｏａｒｃｈｉｖｅｒツール（Open Source Instruments）およびＩｇｏｒＰｒｏ（Wave metrics, Inc）を使用して処理した。トレースは、平均の引き算により０Ｖ付近に集中した。短い（＜１００ｍｓ）、高振幅のアーチファクト（「グリッチ」）が閾値および期間によって検出され、失敗した伝達を取り除いた。Ｉｇｏｒスクリプト「ＵｎｉｐｏｌａｒＰｅａｋＡｒｅａｓ．ｉｐｆ」を使用して、個々の負の振れ（棘徐波）を検出し、Ｉｇｏｒ内の特注のスクリプトによりそれらの周波数ならびにトレースのコーストラインおよびパワーを抽出した。コーストラインを連続的な点間の絶対的な差異の合計として決定した。ＥＥＧエポックもＬａｂｖｉｅｗ（National Instruments）にエクスポートしてＭｏｒｌｅｔ  ｗａｖｅｌｅｔパワースペクトルを計算した。
【０１３１】
異なる型のＥＥＧ−パターンおよび挙動間の相関を確立するために、ＥＥＧトレースを用いて継続的なビデオ記録を比較した。単一または複合の棘徐波を個別に計数したが（振れによって）、継続的かつ可干渉性の中間周波数活動のエピソードをエピソード当たりの１つの事象として計数した。運動発作を以下の重症度の尺度に対して類別した：０（明白な運動発作なし）、１（対側性前肢単収縮）、２（反復性の前肢、頭部または身体の揺れ）、３（全身の揺れ、弓状になることおよび後肢での立ち上がり、時には後ろ向きに歩くことを伴う）。
【０１３２】
自動てんかん様事象計数。破傷風毒素に誘導されるてんかん事象に関して、事象の選別は参考文献（７）において説明されている。ソースコードを伴う発作検出アルゴリズムについてのより完全な記載は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｐｅｎｓｏｕｒｃｅｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ．ｃｏｍ／Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ／Ａ３０１８／Ｓｅｉｚｕｒｅ＿Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ＃Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ％２０ｏｆ％２０Ｅｖｅｎｔｓ．において入手可能である。
ピクロトキシンまたはピロカルピンによって誘発された中間周波数（IF）振動を、５〜１４Ｈｚの範囲の３秒ＥＥＧセグメントの高速フーリエ変換を使用することによって検出した（図１ｄも参照されたい）。３秒ウインドウを１秒工程のトレースに沿って移動させた。ＩＦ事象を、５〜１４Ｈｚの間のピークの大きさが、活動の全体的な強度に応じて閾値２０〜４５ｍＶを超える期間と定義した。閾値をＣＮＯ／ビヒクル試験の各対応対内で一定に保った。
【０１３３】
統計解析。対応のあるｔ検定またはウィルコクソン検定を必要に応じてＳＰＳＳ  ２０（IBM）を使用して実施した。発作モデルに関して、実験時間を、注射前１０分ならびに注射後７つの連続した１０分の期間を含め、１０分の期間に分割した。
【０１３４】
蛍光および免疫組織化学的分析。脳を取り出し、４％ＰＦＡ／ＰＢＳ中、４℃で３〜７日間放置し、次いで、ＰＢＳ中で洗浄した。データセットに寄与する各ラットについて、対照切片（厚さ５０μｍおよび１００μｍ）を振動スライサーで切り取り、切片作製の直後にネイティブなｍＣｉｔｒｉｎｅ発現について調べた。５０μｍの切片の一部をさらに処理した： ＰＢＳ、０．１５％トリトンＸ−１００中で２０分間透過処理し、１０％ウマ血清（Vector Labs）を用いて振とう機で１時間ブロッキングし、ＣａＭＫＩＩαに対する一次抗体（ウサギ、１：５００、Epitomics/Abcam）および赤血球凝集素に対する一次抗体（HA；マウス、１：１０００、Covance）と２日間インキュベートした。ＰＢＳ中でさらに３回洗浄（１０分）した後、切片を二次抗体（１：５００、Invitrogen、Ａｌｅｘａ−４８８、およびＡｌｅｘａ−５４６で標識）と４℃で一晩インキュベートし、再度ＰＢＳ中で洗浄し（４回、１０分）、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Vector Labs）に封入した。共焦点顕微鏡を対物レンズ２５×拡大率および３×デジタル拡大率で使用して画像を得た。
【０１３５】
結果
ピロカルピンに誘導される急性発作の化学遺伝学的サイレンシング
発作活動を改変するＤＲＥＡＤＤの能力を試験するために、Ｃａｍｋ２ａプロモーターの下にあるｈＭ４Ｄｉをコードするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ５−ＣａＭＫＩＩａ−ＨＡ−ｈＭ４Ｄ（Ｇｉ）ＩＲＥＳ−ｍＣｉｔｒｉｎｅ）を、イソフルラン麻酔下にある２６３〜３２５ｇのラットの一次運動野（Ｍ１）の前肢領域に注射した。同時に、化学的けいれん薬の投与を可能にするためにテフロンカニューレガイド（Plastics l）を注射部位の上に埋め込み、無線ＥＥＧ記録のためにＭ１を覆う活性なリードを伴う皮下トランスミッター（Open Source Instruments, Inc.）を埋め込んだ。トランスミッターによりＥＥＧを５１２Ｈｚで数週間にわたって継続的にサンプリングした（１３）。ｈＭ４Ｄｉの発現（図４）には、挙動または肢の使用に対する注目すべき影響はなく、これを３〜２０週間後に屠殺したすべてのラットについて蛍光顕微鏡によって確認した。
【０１３６】
最初に、ｈＭ４Ｄｉ  ＡＡＶ注射の１７〜５２日後に運動野の層５に化学的けいれん薬を注射することによって急性に誘発された発作を調べた。埋め込んだカニューレガイド（軟膜から１．６〜２．０ｍｍ）を介して注射したピロカルピン（２００〜９００ｎｌ、５Ｍ）により、注射して５分で開始し、４５〜９０分の間続く０．５〜２Ｈｚの間の周波数の大振幅棘徐波の振れが誘導された（図１ａ、ｂ）。棘徐波複合は、単一の負のピーク（「単一の」棘波、SS）を有したまたは１つまたは複数の肩（多棘徐波または「複合」棘波、CS；図１ｂ）を特徴とした。これらの間には、一般にはより小さな振幅を有する一連の０．２〜１２秒続く中間周波数（IF）放電（５〜１２Ｈｚ）が散在していた（図１ｂ）。ＩＦ放電は、重症度の尺度の高次末端で運動発作と相関した。これは、短い運動痙攣（重症度スコア０）から、頭部または身体の単収縮（スコア１）、反復性の頭部または身体の揺れ（スコア２）を通って、後肢での立ち上がり、逆行移動および全身痙攣（スコア３）までにわたった（図１ｃ）。したがって、重複する周波数バンド（４〜１４Ｈｚ）におけるＥＥＧパワーを、ｈＭ４Ｄｉ活性化の抗けいれん効果を評価するための代用マーカーとして使用した。
【０１３７】
ＣＮＯ（ＤＭＳＯ／生理食塩水ビヒクル中１ｍｇ／ｋｇ）（１２）、またはビヒクル単独を焦点性新皮質ピロカルピン注入のすぐ後に腹腔内注射によって投与する実験を１日置きにランダムに設定した。ＣＮＯ試験では、電気記録と運動けいれんの両方が実質的に低減した（ラット６匹における１４対の試験）。ＥＥＧ、平均４〜１４Ｈｚパワーにおける負の振れの平均周波数、または重症運動発作と相関するＩＦの回数のいずれかを比較する対応のあるｔ検定（図１ｃ）により、データを解析するために使用した大多数の連続した１０分ビンについて有意な低減が明らかになった（図１ｅ、ｆ）。
【０１３８】
ピクロトキシンに誘導される急性発作の化学遺伝学的サイレンシング
したがって、ＣＮＯにより、ピロカルピン誘発性発作が極めて大きく抑止された。しかし、この抗けいれん効果の解釈は、ムスカリン性受容体に対するピロカルピン作用およびｈＭ４Ｄｉに対するＣＮＯ作用の下流のシグナル伝達カスケードの重複によって潜在的に交絡する（１４）。したがって、第２の化学的けいれん薬、ＧＡＢＡＡ受容体遮断薬ピクロトキシンを試験した。一次運動野へのピクロトキシン注射（１００〜６００ｎｌ、１０ｍＭ）によっても、電気記録および運動発作が誘導された。これらは、持続時間全体、棘徐波およびＩＦ複合の構成、ならびにピロカルピンによって引き起こされる発作と行動の相関（図２ａ〜ｃ）で同様であった。軽微な差異として、電気記録バーストは突然スイッチがオンおよびオフになり、「複合棘波」は高周波数で続く多数の（２〜６）棘波を特徴とすることもあった（図２ｂ）。ＣＮＯを焦点性ピクロトキシンすぐ後に腹腔内注射によって投与すると、電気記録放電は再度減弱された（図２ｅ、ｆ；ラット５匹における１２対の試験）。これは、より重症の運動発作と相関した（図２ｃ）ＩＦ活動について特に顕著であった（図２ｆ）。
【０１３９】
ｈＭ４Ｄｉとは無関係のＣＮＯのオフターゲットの効果によりその抗けいれん効果を説明できるかどうかを問うた。ｈＭ４Ｄｉの代わりに光遺伝学的アクチュエータＡｒｃｈＴを発現する類似のウイルスを注射したラットにピロカルピン（１２対の試験、ラット６匹）またはピクロトキシン（９対の試験、ラット５匹）のいずれかの局所的な皮質内注射を使用して、上記と同じ実験プロトコールを行った。発作重症度の３つの測定基準のいずれにおいてもビヒクル試験とＣＮＯ試験の間に有意差は観察されなかった。
【０１４０】
破傷風毒素によって誘導される焦点性新皮質てんかんの化学遺伝学的サイレンシング
したがって、ＣＮＯを用いたｈＭ４Ｄｉ活性化は２つの化学的けいれん薬モデルにおいて有効である。ＣＮＯを用いたｈＭ４Ｄｉ活性化により、確立されたてんかんにおける自発性発作も抑止されるであろうか。抗てんかん薬に対する応答が不十分であり、ヒト持続性部分てんかん（１７）と類似した慢性てんかんの破傷風毒素モデル（１５、１６）に目を向けた。このモデルは、高周波数（１２０〜１６０Ｈｚ）パワーの増加、コーストライン（EEGにおける連続的な点の間の累積的な差異）の増加、および自動事象分類器によって検出することができる（７）高周波数ＥＥＧ活動の短いバーストの出現を含めた、いくつかのＥＥＧ特徴を特徴とする（図３ａ）。（動物福祉を考慮して破傷風毒素の用量を制限したので、短期実験中に運動発作はめったに起こらなかった。）
【０１４１】
ラットにおけるＣＮＯの半減期は系統的に測定されていないが、ＣＮＯは、ｈＭ４Ｄｉを用いて形質導入したニューロンまたはその興奮性類似体ｈＭ４Ｄｑに少なくとも９０分にわたって影響を及ぼし（１２、１８、１９）、その前駆体クロザピンを投与してから１２時間以内に完全に消える（２０）。したがって、ＣＮＯまたはビヒクルのいずれかの２回の腹腔内注射の１回目から開始し、２回目の注射を２時間の時点で行う３．５時間ウインドウの間、てんかんの電気記録マーカーを評価した。次いで、アゴニストの休薬を可能にするため、および発作周波数の日周変動性を制御するために、２４時間後にビヒクルとＣＮＯを切り換えて評価を繰り返した（図３ｂ〜ｄ、ラット６匹における１５対の試験）。てんかん３つの測定基準（てんかん様バーストの周波数、コーストライン、および高周波パワー）はすべて、ＣＮＯによって、ビヒクルと比較して有意に減弱された（Ｐ＝０．０２８、ウィルコクソン検定；ｎ＝６）。
【０１４２】
考察
この試験では、化学遺伝学を使用して、要望に応じて発作を減弱させることができることが示される。ｈＭ４Ｄｉを用いた形質導入は、その特異的なリガンドＣＮＯの非存在下ではニューロン興奮性に対して影響を及ぼさず（１０〜１２）、したがって、この手法では、イオンチャネル、神経伝達物質受容体または神経ペプチドの恒久的な過剰発現を中心に設計された遺伝子療法の理論的なリスクが回避される。効果の持続時間は、ヒトでは７〜８時間であると推定されているＣＮＯの半減期（２１）によって規定されるので、その時間的な特異性は光遺伝学のものとは一致しない（参考文献（７〜９））。しかし、化学遺伝学では、発作病巣の近くの形質導入された脳領域に光を送達するための浸潤性の生体適合性デバイスの必要性が回避される。さらに、比較的大きな領域を標的とすることができ、これは光の吸収によって限定されない。代わりに、ＣＮＯは、全身投与することができる。
【０１４３】
ＣＮＯを投与して１０分以内に発作重症度有意な低減が観察され（図１ｅ、２ｅ）、これは、通常てんかん重積状態を規定する３０分の時点を十分に下回っていた。薬物耐性てんかんを有する多くの患者では、先に前駆前兆がある発作、群発する発作、または予測可能な時間に起こる発作（例えば、月経随伴性てんかん）を有し、したがって、このような化学遺伝学的サイレンシングが有効であり得る。
【０１４４】
化学遺伝学のてんかんへの別の潜在的な適用は、固定期間にわたるニューロン興奮性の継続的な変更により、てんかん原性回路を「リセット」し、一部の場合ではリガンドの投与より長く続く発作の持続的低減をもたらすことができるという仮説を検定することである。この手法は、化学遺伝学の領域および細胞型特異性と共に、可逆性によって、イオンチャネルまたは他のシグナル伝達分子の発現に基づく利用可能な小分子または遺伝子療法とは区別される。
【０１４５】
結論として、本発明者らは、化学遺伝学により、発作を抑止するためにニューロン興奮性の領域および細胞型特異的減弱を実現することができることを示した。
【０１４６】
【化１−１】
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【０１４７】
【化１−２】
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【０１４８】
【化１−３】
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【０１４９】
【化１−４】
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参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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