(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
巨核球（５）懸濁液から血小板を産生する流体装置（１）であって、
非多孔質壁で区切られた少なくとも１つのチャネル（８）と、一端に設けられ、巨核球または巨核球フラグメントを含む細胞懸濁液が導入される少なくとも１つの流入口開口（９）と、他端に設けられ、血小板が収集される少なくとも１つの流出口開口（１０）と、を有する産生チャンバー（３）を備え、
前記チャネル（８）の壁の内面の少なくとも一部分（１１）には、複数の障害物によりテクスチャ加工が施され、
血小板脱落に対して、前記チャネルの前記内面の前記テクスチャ加工が施された部分における巨核球の捕捉が可能となるように、前記障害物の密度、サイズおよび形状が決定される流体装置。
【請求項２】
前記チャネル（８）の内面の前記テクスチャ加工を施された部分（１１）は、さらに、巨核球に対する結合親和性を有するリガンドでコーティングされる、請求項１に記載の流体装置。
【請求項３】
前記巨核球に対する結合親和性を有するリガンドは、ヴォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、それの機能的変異体、ヴォン・ヴィレブランド因子のフラグメントを含む組み換えポリペプチド、またはフィブリノゲン若しくはフィブロネクチンから選択される請求項１または２に記載の流体装置。
【請求項４】
前記障害物は、ポスト（１２）またははり（１５）である請求項１乃至３のいずれか１項に記載の流体装置。
【請求項５】
前記チャネル（８）は、実質的に正方形断面または長方形断面を有する請求項１乃至４のいずれか１項に記載の流体装置。
【請求項６】
前記障害物は、半径ｒの実質的に円形断面を有するポスト（１２）であり、前記ポストは、前記チャネルの少なくとも一部の内面（１３）に配置され、六角形周期構造を有する規則的パターンを形成し、
（ｉ）前記ポストの前記半径ｒは、５０ｎｍから１５ｍｍの間であり、
（ｉｉ）２つのポスト中心間の最短距離ｐは、少なくとも１００ｎｍに等しく、
（ｉｉｉ）角度αは、チャネル（１４）の長手方向と、六角形ブラベー格子の格子ベクトルの一つと、により規定される最小角度であり、０から９０°の間、好ましくは、０から３０°の間である、
請求項１乃至５のいずれか１項に記載の流体装置。
【請求項７】
前記ポストの前記半径ｒは、５００ｎｍから１．５ｎｍの間である請求項６に記載の流体装置。
【請求項８】
前記２つのポスト中心間の最短距離ｐは、１００ｎｍから５０ｎｍの間である請求項６または７に記載の流体装置。
【請求項９】
前記２つのポスト中心間の最短距離ｐは、５μｍから１ｍｍの間である請求項６または７に記載の流体装置。
【請求項１０】
前記ポストは、０＜ｈ＜Ｈの高さｈを有し、Ｈは、前記チャネルの断面における２つの対向壁の間で測定される最小距離である請求項６乃至９のいずれか１項に記載の流体装置。
【請求項１１】
前記チャネルは、５μｍから１ｍｍの間のＨの高さを有する、請求項６乃至１０のいずれか１項に記載の流体装置。
【請求項１２】
前記産生チャンバー（３）は、少なくとも１つ、または複数の内面にテクスチャ加工が施された部分を有する平行チャネルを備える、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の流体装置。
【請求項１３】
前記産生チャンバー（３）は、２個のチャネルから１０６個のチャネルを備える請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の流体装置。
【請求項１４】
巨核球から血小板を産生する生体外方法であって、
巨核球またはそれらのフラグメントの懸濁液を請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の流体装置に導入する導入ステップと、
前記懸濁液を伸長に適したずり速度下でフローにさらすステップであって、前記産生チャンバーの前記チャネルにおいて、前記巨核球の断片化および血小板解放をするステップと、
前記チャネルの流出口で血小板を収集する収集ステップと、
を含む方法。
【請求項１５】
流量は、前記チャネルの前記テクスチャ加工が施された部分の前記巨核球を、最小値から最大壁ずり速度
0006554466.tif 000021
まで変化する壁ずり速度にさらすことができる範囲に固定され、前記最大壁ずり速度は、３０，０００ｓ-1を超えない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記最大壁ずり速度は、１０，０００ｓ−１を超えない請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記最大壁ずり速度は、８，０００ｓ−１を超えない請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記最大壁ずり速度は、５，０００ｓ−１を超えない請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記チャネルの前記流出口で収集された血小板は、さらに、裸の核および／または無傷巨核球を含み、
前記懸濁液から血小板を精製、濃縮または分離するステップをさらに含む、請求項１４乃至１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記懸濁液は、以下のステップにより得られた懸濁液であり、該ステップは、
（ｉ）巨核球前駆体および／または幹細胞を供給する供給ステップと、
（ｉｉ）前記巨核球前駆体および／または幹細胞を増殖させる増殖ステップと、
（ｉｉｉ）伸長した細胞を巨核球に分化させる分化ステップと、
を含む、請求項１４乃至１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記巨核球前駆体および／または幹細胞は、造血幹細胞、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞を含むグループから選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
巨核球の前記懸濁液は、前記産生チャンバーに導入される前に、均質化および／または生成される請求項１４乃至２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記血小板は、クロスフロー濾過、層流フロー、誘電泳動現象、光学力、磁力、音響力または慣性力を含むグループから選択された方法により前記チャネルの前記流出口で分類される請求項１４乃至２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記血小板は、機能性血小板であり、循環血液血小板のように活性化させることができる、請求項１４乃至２３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、巨核球またはそのフラグメントから血小板を産生する改良された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板は小さい無核細胞であり、止血にとって極めて重要な細胞である。血小板産生または血小板機能を損なう臨床疾患がたくさんあり、血小板輸血を必要とする患者の数は増加している。現在、その解決手段は、献血者から得られた血小板の輸血を行うことにあります。生体外における血小板産生の治療への応用は、魅力的な選択肢ではあるが、大きな技術的課題がある。
【０００３】
血小板は、巨核球に由来する。巨核球の分化は、連続工程で特徴付けられる継続的なプロセスである。巨核球の分化は、骨髄で生じるのに対して、血小板産生は、骨髄の血管への巨核球フラグメントの移動を必要とする。血小板産生に特化したバイオリアクターを設計する試みがなされてきた。
【０００４】
特許文献１には、ヴォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）でコートされた固相上において、少なくとも６００ｓ-1のずり速度（せん断速度）で成熟巨核球の懸濁液を流動させることにより、生体外で成熟巨核球から血小板を産生する方法が開示されている。ずり速度の影響については、非特許文献１においてさらに議論されている。しかしながら、産生収率は、潜在的な治療用途のために依然として改善する必要がある。
【０００５】
いくつかの文献においては、自然の骨髄環境を再現するように設計された３Ｄシステムを用いることを示唆している（非特許文献２および非特許文献３）。これらのシステムにおいて、細胞フラグメントは、細胞が多孔質または管を通じて流動チャネルに埋め込まれる足場から自由に移動する。さらに、最近、非特許文献４には、血小板産生のための毛細血管を再現する２つの新しいバイオリアクターが開示されている。これらのバイオリアクターは、巨核球を捕捉することができる多孔質構造またはスリットを備える。圧力流を利用することにより、巨核球の固定を確実なものとする。さらに、メインフロー（主流）は、圧力流に対して垂直に供給されるか、または圧力流とメインフローとの間の角度が６０°となるように供給される。メインフローにより捕捉された巨核球に対してずり応力（せん断応力）が与えられる。しかしながら、メインフローは巨核球がないまま残る。巨核球フラグメントは、メインフローにさらされ、解放された血小板は、メインフローの流出口で収集される。非特許文献５には供給チャネルおよび貫通壁によって区切られ、互いに平行なメインチャネルフローに基づいた他のバイオリアクターが開示されている。供給チャネルの終端が閉じている場合、巨核球はスリットから押し出される。巨核球は、メインフローと接触させられ、ずり応力にさらされる。このようなシステムにおいて、巨核球のために利用可能な場所の数は限られており、最初の細胞が血小板を引き伸ばし、解放するまでは、多くの細胞は容器（reservoir）に留まっている。これによって、血小板産生プロセスの速度が制限される。これらのシステムの形状は、高速で大規模な産生のためには効率的ではない。さらに、得られた産生収率は十分ではなく、血小板の機能評価を困難にする事実である。また、数時間または数日間かけて行われた実験では、ほとんど評価されない固有の血小板が脱落する。
【０００６】
特定構造のマイクロ流体装置が、異なる生物学的応用例に適用された例が開示されている。例えば、非特許文献６は、内面が循環腫瘍細胞を分離する抗体により被覆されたマイクロ流体装置の使用例が開示されている。チャネル内側の層流ストリームラインを破壊し、抗体被覆装置における細胞表面相互作用の数を増やすために、内面に溝が彫られている。非特許文献７には、細胞を分離し収集するマイクロピラーの配列を有するマイクロ流体チャネルの使用についての教示が開示されている。しかしながら、本発明に反して、当該マイクロ流体装置の目的は、巨核球から血小板脱落を誘発することではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０６３８２３１１号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Dunois-Larde et al., “Exposure of human megakaryocytes to high shear rates accelerates platelet production”, Blood, vol.114, n°9, p.1875-1883, 2009.
【非特許文献２】Pallotta et al, “Three-Dimensional System for the In Vitro Study of Megakaryocytes and Functional Platelet Production Using Silk-Based Vascular Tubes”, Tissue Engineering: Part C, vol.17, n°12, p.1223-1232, 2011.
【非特許文献３】Sullenbarger et al., “Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds”, Experimental Hematology, vol.37, n°1, p.101-110, 2009.
【非特許文献４】Nakagawa et al., “Two differential flows in a bioreactor promoted platelet generation from human pluripotent stem cell-derived megakaryocytes”, Experimental Hematology, 2013vol.41, n°8 p742-748, 2013.
【非特許文献５】Thon et al., “Platelet bioreactor-on-a-chip”, Blood, vol 124, n°12 p1857-1867, 2014.
【非特許文献６】Stott et al., “Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip”, PNAS, vol.107, n°43, p.18392-18397, 2010.
【非特許文献７】Chang et al., “Biomimetic technique for adhesion-based collection and separation of cells in a microfluidic channel”, Lab Chip, vol.5, p.64-73, 2005.
【非特許文献８】Balduini A, Pallotta I, Malara A, Lova P, Pecci A, Viarengo G, Balduini CL, Torti M. Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes. J Thromb Haemost. 2008; 6: 1900-7.
【非特許文献９】Takayama N, Nishimura S, Nakamura S, Shimizu T, Ohnishi R, Endo H, Yamaguchi T, Otsu M, Nishimura K, Nakanishi M, Sawaguchi A, Nagai R, Takahashi K, Yamanaka S, Nakauchi H, Eto K. Transient activation of c-MYC expression is critical for efficient platelet generation from human induced pluripotent stem cells. The Journal of Experimental Medicine. 2010; 207: 2817-30.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の１つの目的は、巨核球または巨核球フラグメントを含む細胞懸濁液から血小板を産生する流体装置を提供することであり、具体的には、高収率産生に適しており、新たに生成された血小板の機能性品質を維持した流体装置を提供することである。本発明の他の目的は、高品質かつ標準化された血小板の大量産生に適した血小板産生方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一態様において、本発明は、
巨核球または巨核球フラグメントを含む細胞懸濁液を導入して、流入口から流出口へ流す、少なくとも１つのチャネル（８）を有する産生チャンバー（３）と、
必要に応じて、チャネル（８）における前記懸濁液の流量（フロー速度）を制御する流量制御部（７）と、
必要に応じて、巨核球の懸濁液を濃縮し、巨核球の懸濁液の細胞濃度を均質化し、産生チャンバー（３）の上流に設けられた巨核球の分類器および／または混合器（２）と、
必要に応じて、巨核球または他の細胞残留物から血小板を分類することにより流出懸濁液（６）を精製する産生チャンバー（３）の下流に設けられた血小板分類器（４）と、
を備え、
チャネル（８）の壁の内面の少なくとも１つの部分（１１）には、複数の障害物によりテクスチャ加工が施されている、巨核球の懸濁液（５）から血小板を産生する流体装置（１）に関する。
【００１１】
関連する態様において、本発明は、
非多孔質壁で区切られた少なくとも１つのチャネル（８）と、チャネルの一端に設けられ、巨核球または巨核球フラグメントを含む細胞懸濁液が導入される少なくとも１つの流入口開口（９）と、チャネルの他端に設けられ、血小板が収集される少なくとも１つの流出口開口（１０）と、を有する産生チャンバー（３）と、
チャネル（８）における前記懸濁液の流量を制御する流量制御部（７）と、
巨核球の懸濁液を濃縮し、巨核球の懸濁液の細胞濃度を均質化し、産生チャンバー（３の上流に設けられた巨核球の分類器および／または混合器（２）と、
巨核球または他の細胞残留物から血小板を分類することにより流出懸濁液（６）を精製する産生チャンバー（３）の下流に設けられた血小板分類器（４）と、
を備え、
前記チャネル（８）の壁の内面の少なくとも一部分（１１）には、複数の障害物によりテクスチャ加工が施されている、巨核球または巨核球フラグメントを含む細胞懸濁液から血小板を産生する流体装置に関する。
【００１２】
特定の実施形態において、前記複数の障害物が２次元平面上に分配され、障害物の３次元配列が形成される。
【００１３】
他の特定の実施形態において、巨核球または巨核球フラグメントから血小板を産生する生体外方法を対象とし、その方法は、
巨核球または巨核球フラグメントを含む細胞懸濁液を上述の流体装置に導入し、
前記懸濁液を伸長に適したずり速度下でフローにさらして、巨核球フラグメントおよび血小板を産生チャンバーのチャネルに解放し、および、
チャネルの流出口で血小板を収集する、ことを含む。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、細胞懸濁液から血小板を産生することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の実施形態に係る血小板産生流体装置を示す図である。
【図２】図２は、本発明の実施形態に係る流体装置の産生チャンバーを示す図である。
【図３】図３は、ポスト形状の障害物によりテクスチャ加工が施された表面を示す図であり、図３ａは、透視図であり、図３ｂは、平面図であり、図３ｃは、断面図である。
【図４】図４は、はり形状の障害物によりテクスチャ加工が施された表面を示す図であり、図４ａは、透視図であり、図４ｂは、平面図であり、図４ｃは、断面図である。
【図５】図５は、実施形態において用いられた３つの異なるチャネル配置を示す図であり、図５ａは、“チャネル配置１”を示し、図５ｂは、“チャネル配置２”を示し、図５ｃは、“チャネル配置３”を示す。
【図６】図６は、本実施形態において用いられた並列化チャネルから上流の細胞分布を示す図であり、図６ａは、平面図であり、図６ｂは、断面図である。
【図７】図７は、巨核球捕捉に対するテクスチャ加工が施された表面の効果を表すグラフである。
【図８】図８は、細胞捕捉のＶＷＦの効果を示す図である。
【図９】図９は、ｒが１５μｍの場合の配置１における付着した巨核球の表面密度のプロット密度の効果を示す写真である。
【図１０】図１０は、ポスト配列に向かう巨核球の異なる挙動を示す写真である。
【図１１】図１１は、成熟巨核球の伸長および切断を示す写真である。
【図１２】図１２は、血小板解放の詳細を示す写真である。
【図１３】図１３ａおよびｂは、同時に多数のポストに捕捉された伸長巨核球からの大規模血小板産生の一例を示す写真である。図１３ｃおよびｄは、流体装置における血小板産生の定量的評価を表す図である。
【図１４】図１４は、上述の図１３ｃの凡例に詳細に記載されているように、マイクロ流体チップを欠く制御システムで得られた血小板と比較したマイクロ流体装置で産生された血小板のフローサイトメトリー分析（flow cytometry analysis）を示す図である。
【図１５】図１５は、上述の図１３ｃの凡例に詳細に記載されているように、マイクロ流体チップを欠く制御システムで得られた血小板と比較したマイクロ流体装置で産生された血小板の接着および凝集を示すマイクロ写真である。
【図１６】図１６は、微小流体混合器に導入された成熟巨核球懸濁液を示す写真である。
【図１７】図１７は、細胞分類器の２つの例を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下に、本発明のさらなる詳細が記載される。以下の説明においては、「間に含まれる」という表現は、下限および上限を含む、特定された値の範囲を指定する。
【００１７】
本発明は、巨核球または巨核球フラグメントの懸濁液から血小板を産出する流体装置を目的とする。
【００１８】
本明細書で用いられるように、「血小板」という用語は、血の塊を作る一次止血の細胞機構に含まれる無核細胞を意味する。
【００１９】
本明細書で用いられるように、「血小板前駆体」という用語は、巨核球または血小板を形成する、細胞質連結血小板状粒子などの巨核球フラグメントの任意の構造形態を意味する。その構造形態には、小結節および水疱など種々の形成ステージの血小板体を包含する膨張部を含む、長い細胞質の伸長、突起または仮足を有する細胞が含まれるが、これらには限定されない。
【００２０】
本明細書で用いられるように、「巨核球」という用語は、正常止血に必要な血液血小板の産生の原因である骨髄細胞を意味する。巨核球は、巨核球系統（lineage）に限定される造血系幹細胞に由来する。巨核球産出の一次シグナルは、トロンボポエチン（ＴＰＯ）である。ＴＰＯは、最終的な巨核球表現型に向けて、骨髄中の前駆細胞の分化を誘導するために必要である。巨核球分化の他の分子シグナルには、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、Ｆｌｔ−３リガンドおよびＳＣＦがある。巨核球前駆細胞は、体外培養により得られる。
【００２１】
典型的に、巨核球の懸濁液は、適切な細胞培養地で懸濁された巨核球の集団を含む。１つの実施形態では、細胞培養地は、ＩＭＤＭ（Iscove's Modified Dulbecco's Medium）であり、ＢＩＴ血清代替物、α―モノチオグリセロールおよびリポソームが追加されている。懸濁液は、さらに、巨核球または血小板前駆体のフラグメントを含む。
【００２２】
１つの特定の実施形態では、成熟巨核球の懸濁液は、好ましくは、次のステップにより得られる。
（ｉ）巨核球前駆細胞を供給するステップ
（ｉｉ）前記巨核球前駆細胞を培養増殖するステップ
（ｉｉｉ）増殖した細胞を巨核球に分化するステップ
巨核球前駆細胞は、例えば、造血幹細胞（例えば、臍帯、末梢血または骨髄）、または胚性幹細胞および多能性幹細胞で構成される群から選択される幹細胞から選択される。
【００２３】
いくつかの実施形態において、懸濁液の細胞の多数派は巨核球であるが、そのような懸濁液は制限なしに巨核球前駆細胞、細胞質フラグメントおよび血小板前駆体を含み、他の細胞または細胞残留物が少量見出される。１つの実施形態では、細胞懸濁液は、本発明に係る装置または方法で用いる巨核球を含み、したがって、さらに巨核球フラグメント、特に、血小板前駆体または血小板を含む。例えば、巨核球を含む細胞の多数派は、それらの膜上にＣＤ４１およびＣＤ４２ｂ抗原を発現する。前駆体または幹細胞からの巨核球産生の詳細については、例えば、非特許文献８および非特許文献９に記載されている。
【００２４】
１つの実施形態では、装置に流れるように導入された巨核球懸濁液は、１０3／ｍＬと１０8／ｍＬとの間、好ましくは、１０5／ｍＬと５．１０6／ｍＬとの間に含まれる細胞濃度を提示する。
【００２５】
本発明に係る流体装置は、少なくとも２つの開口を有する少なくとも１つのチャネルを有する産生チャンバーを備え、チャネルの流入口および流出口としてさらに説明される。チャネルでは、巨核球または巨核球フラグメントの懸濁液が、チャネルの流入口から流出口へ向けて流れる。好ましくは、チャネルは、流入口と流出口とを１つずつ有し、メインフローを巨核球の懸濁液に適用して、巨核球の懸濁液を流入口から流出口へ流すことができる。
【００２６】
特定の実施形態においては、産生チャンバーは、非多孔質壁で区切ることにより、いくつかの平行チャネルにさらに分割することができ、それらは、巨核球を含む細胞懸濁液を導入できる少なくとも１つの流入口（９）をチャンバーの一端に有し、さらに、巨核球を含む細胞懸濁液を収集できる少なくとも１つの流出口（１０）をチャンバーの他端に有し、チャネルでは、チャネルの流入口から流出口へ向けて１つのフローが形成される。
【００２７】
本明細書で用いられるように、「非多孔質」という用語は、（血小板または血小板前駆体を含む）巨核球または巨核球フラグメントが壁を横断することができず、それにより、チャネルの流入口から流出口へのメインフローに留まることを意味する。
【００２８】
発明者らは、高収率で血小板を産生するために、流体装置のチャネルは、内面の少なくとも一部、すなわち、巨核球の懸濁液と接触するチャネル壁表面の少なくとも一部にテクスチャ加工が施され（textured）なければならいことを発見した。テクスチャ（texture）は、複数の障害物により生成される。好ましくは、障害物は、少なくともチャネルの２次元表面上に分布し、これにより、障害物の３次元配列が形成される。障害物のために、チャネルの内面は、滑らかではない。発明者らは、テクスチャが施されたチャネルを流されれば、テクスチャが施された表面での巨核球の捕捉およびそれらの血小板への脱落が促進されることを発見した。典型的に、チャネルの内面の少なくとも一部は、チャネルの少なくとも１つの表面上に分布した少なくとも１つの障害物の３次元配列によりテクスチャ加工が施され、隣接ストリームラインとの距離を修正して、障害物の表面および／またはチャネルの内面を流れる巨核球の捕捉を可能にし、血小板脱落を誘導するためにずり応力にさらす。テクスチャが施されたチャネルを通じてフローにさらされた巨核球により生成された血小板は、循環血液血小板の機能的特徴と類似するいくつかの機能的特徴を示す。マイクロ流体装置で生成された血小板は、血小板状粒子とは異なってもよい。これらの血小板状粒子は、マイクロ流体チップを通過することなく形成することができ、完全に機能的であるわけではない。特に、特定の実施形態において、本発明に係る装置で産生した血小板は、天然の血小板または循環血液血小板のように活性化することができるのに対して、血小板状粒子は活性化することができない。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態によれば、チャネルの内面のテクスチャが施された部分は、巨核球、例えば、ヴォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）またはそれの変異体に対する結合親和性を有するリガンドでコートしてもよい。そのようなリガンドは、血小板および／または巨核球またはそれらの特異的受容体に対して特異的親和性を有し、または、血小板および／または巨核球に対して非特異的親和性を有する。このようなコーティングは、チャネルの内壁または障害物に対する細胞接着を増加させる。
【００３０】
本明細書において、用語「ヴォン・ヴィレブランド因子」または「ＶＷＦ」は、止血に関与する数個のモノマーを含む多量体タンパク質を意味する。ヒトのヴォン・ヴィレブランド因子の例示的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＰｅｐｔデータベースに受入番号ＡＡＢ５９４５８として登録されている。好ましくは、本発明に係るヴォン・ヴィレブランド因子は、哺乳類のヴォン・ヴィレブランド因子であり、より好ましくは、マウスの因子または霊長類の因子であり、より好ましくは、ヒトのヴォン・ヴィレブランド因子である。用語「ＶＷＦ」は、霊長類ＶＷＦなどの任意の哺乳類起源のＶＷＦ、好ましくは、ヒトＶＷＦを含む。本発明によれば、ＶＷＦ因子は、組み換えＶＷＦであっても、天然ＶＷＦであってもよい。ＶＷＦは、天然の形態では、精製されていても、他の成分を含む組成物中（細胞外マトリックス中）に含まれていてもよい。当業者は、本技術分野の標準的な手法、例えば、組み換えＶＷＦまたはそれの機能的変異体を生成できるトランスフェクト宿主細胞を用いた手法にしたがって容易に組み替えＶＷＦを製造することができる。
【００３１】
本明細書において、用語「ＶＷＦの『機能的変異体』」は、ＶＷＦ因子の天然若しくは組み換えフラグメント、または、ＧＰＩｂ、特にヒトＧＰＩｂに結合する能力を持っているＶＷＦの相同体（homologue）若しくは相似体（analogue）を意味する。
【００３２】
ＶＷＦの相同体は、ヒトＶＷＦアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％の同一性、好ましくは、少なくとも６０％，７０％，８０％，９０％および９５％の同一性を共有するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００３３】
本明細書において、２つの配列間の一致度（percent identity）は、配列によって共有される同一位置の数の関数であり（すなわち、一致度＝（同一位置の数／位置の総数）×１００）、２つのシーケンスの最適なアライメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さが考慮される。シーケンスの比較および２つの配列間の一致度の決定は、以下に説明するように、数学的アルゴリズムを用いて達成される。
【００３４】
２つのアミノ酸シーケンス間の一致度は、ＡＬＩＧＮプログラムに組み込まれているE.MyersおよびW.Miller（Comput. Appl. Biosci. 4: 1 1-17, 1998）のアルゴリズムを用いて決定される。さらに、２つのアミノ酸シーケンス間の一致度は、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedlemanおよびWunsch（J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970）のアルゴリズムを用いて決定される。また、一致度を決定する別のプログラムは、スタンドアロン型プログラムとして利用可能、またはウェブサーバ（http://www.clustal.org/参照）を介して利用可能なＣＬＵＳＴＡＬ（M. Larkin et al., Bioinformatics 23: 2947-2948, 2007; D. Higgins and P. Sharp, Gene 73: 237-244, 1988に最初に記述された）である。
【００３５】
変異体はさらに、ＶＷＦに自然に結合しない、異種ペプチドシーケンスと融合したＶＷＦ因子のフラグメントを有するポリペプチドまたは融合タンパク質を含む。別の変異体は、ＶＷＦドメインの多重体構造を含み、ＶＷＦドメインは、ＧＰＩｂに対する親和性を有するＶＷＦのフラグメントである。
【００３６】
本明細書において、用語「フラグメント」は、所定のポリペプチドの少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個または少なくとも２０個の連続したアミノ酸の天然または組み換え部分アミノ酸シーケンスを含む。
【００３７】
本発明に係る装置のコーティングに用いることのできるＶＷＦの変異体の例は、制限なしに、大腸菌中で発現させることができる組み換えＶＷＦ−Ａ１（アミノ酸Ｑ１２３８−Ｐ１４７１）ポリペプチド、または、Martin, C., Morales, L. D. and Cruz, M. A. (2007), Journal of Thrombosis and Haemostasis, 5: 1363-1370. doi: 10.1111/j.1538-7836.2007.02536.x.に記載されたとおり、哺乳類細胞で発現させ、精製することができる組み換えＶＷＦ−Ａ１Ａ２Ａ３（アミノ酸Ｄ１２６１−Ｇ１８７４）ポリペプチドを含む。
【００３８】
代替案として、当業者は、ＶＷＦの相似体、すなわち、ＶＷＦ一次アミノ酸配列と配列相同性を共有しないが、巨核球結合親和性および／または血小板結合親和性の類似した特性を示すタンパク質またはポリペプチドを選択する。そのような相似体は、制限なしに、フィブリノゲン、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンおよびテネイシンを含むグループから選択される。
【００３９】
本発明に係る流体装置のチャネルは、装置の流入口と流出口との間の長さＬによって規定される。チャネルの断面は、好ましくはチャネルの全長と同じであってもよく、円形、卵形、長方形または正方形であってもよい。本明細書において、用語「チャネルの高さＨ」は、チャネルの一部の２つの向かい合う壁の間の最短距離を意味する。例えば、円形部では、チャネルの高さＨは、チャネルの円形部の直径である。１つの好ましい実施形態によれば、チャネルは、チャネルの高さＨを決める底壁および上壁並びにチャネルの幅Ｗを決める側壁を有する実質的に正方形断面または長方形断面を有する。チャネルは、好ましくは、直線状であり、直線状チャネルの軸は、チャネルの縦方向を決定する。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態によれば、流体装置は、マイクロ流体装置である。すなわち、装置の断面の寸法の１つが１ミリメートルより小さい。チャネルは、マイクロチャネルと呼ばれる。
【００４１】
チャネルの寸法に関して、血小板産生に用いられる巨核球の平均サイズに応じて、これらは最適化される。Ｄcellと呼ばれるパラメータは、本明細書を通じて、本発明の方法で用いられる懸濁液中の平均巨核球直径として定義され、インピーダンス・セル・カウンター検出法（impedance cell counter detection）（例えば、ＵＳ特許２，６５６，５０８に記載されているCoulterカウンター）または光学顕微鏡による画像解析のような異なる手法で測定することができる。
【００４２】
前駆細胞の供給源および巨核球産生法に応じて、Ｄcellは、典型的には５μｍから１５０μｍの間、例えば、７μｍから１００μｍの間、また、例えば、１０μｍから５０μｍの間が用いられる。特定の実施形態において、本発明に係る装置の寸法は、以下のサイズから選択されるＤcellにあわせて最適化される。サイズは、１５μｍ，２０μｍ，２５μｍ，３０μｍ，３５μｍ，４０μｍおよび４５μｍである。
【００４３】
特定の実施形態において、チャネルの高さＨは、Ｄcellから１ｍｍの間であり、好ましくは、Ｄcellから１００μｍの間である。チャネルの幅Ｗは、Ｄcellから１ｍｍの間であり、好ましくは、１０×Ｄcellから１ｃｍの間である。チャネルの長さＬは、１ｍｍから１０ｍの間であり、好ましくは、１０ｍｍから１ｍの間であり、さらに好ましくは、１０ｃｍから１ｍの間である。
【００４４】
本発明の流体チャネルの産生チャンバーは、１つのチャネルまたは複数のチャネルを有し、それらは、異なっていても、同じであってもよい。複数のチャネルを用いる場合、平行に並べられたチャネルは、同じフロー流入口（１６）およびフロー流出口（１７）を共有する。本発明の好ましい実施形態によれば、産生チャンバーは、複数の平行に並べられたチャネルを有する。産生チャンバーのチャネルの数Ｎは、２個から１，０００，０００個の間であり、好ましくは、２個から１００，０００個の間である。
【００４５】
平行に並べられたチャネルを用いる場合、産生チャンバーは、好ましくは、さらに分配チャネルを有し、流入口懸濁液を全てのチャネルへ分配する。分配チャネルは、三角形である。有利なことに、分配チャネルの形は、例えば、平行に並べられたチャネルで用いられるものよりも高い高さを有することにより、非常に高いずり速度による細胞の損傷を回避するような形である。
【００４６】
チャネルの内面は、少なくとも一部にテクスチャ加工が施されている。チャネルのテクスチャ加工が施された部分は、チャネルの長さＬの１％からチャネルの長さＬの１００％の長さ、好ましくは、チャネルの長さＬの５０％からチャネルの長さＬの１００％の長さである。
【００４７】
テクスチャ加工は、複数の障害物によりなされる。障害物の密度、サイズおよび形は、障害物および／または内側チャネル壁の表面で血小板脱落のための巨核球を捕捉するように決定される。
【００４８】
本明細書において、用語「捕捉」は、巨核球が障害物および／または内側チャネルの表面に接触し、フローの平均速度と比較して強力に減速することを意味する。巨核球は、障害物の表面に接触した後、停止させられる。
【００４９】
障害物は、例えば、ポスト形状（posts）、支柱形状（pillars）、はり形状（beams）、三日月形状（crescent）、穴あき三日月形状（pierced-crescent）、星形状（stars）、空洞形状（cavities）またはピラミッド形状（pyramids）である。好ましくは、障害物は、ポスト形状またははり形状である。ポストは、好ましくは、断面が正方形、円形または三角形であり、その半径ｒと高さｈとによって定義できる。本明細書において、用語ポストの「半径」は、ポストの断面の最大寸法の半分として定義される。はり形状は、好ましくは、断面が長方形または正方形であり、その長さｌbeam＝Ｗ、その幅ｗbeam＝２ｒおよびその高さｈで定義される。
【００５０】
ポストの寸法に関して：ポストの高さｈは、好ましくは、０からＨの間であり、より好ましくは、Ｄcell／２から（Ｈ−Ｄcell／２）の間である。ポストの半径ｒは、好ましくは、Ｄcell／１００から１００×Ｄcellの間であり、より好ましくは、Ｄcell／１０から１０×Ｄcellである。Ｄcellは、５から１５０μｍの間であり、ポストの高さｈは、好ましくは、０から１ｍｍの間である。ポストの半径ｒは、好ましくは、５０ｎｍから１５ｍｍの間であり、より好ましくは、５００ｎｍから１．５ｍｍの間である。
【００５１】
はりの寸法に関して：はりの高さｈは、好ましくは、０からＨの間であり、より好ましくは、Ｄcell／２から（Ｈ−Ｄcell／２）の間である。はりの幅２ｒは、好ましくは、Ｄcell／１０から１００×Ｄcellであり、より好ましくは、Ｄcellから１０×Ｄcellの間である。Ｄcellは、５から１５０μｍの間であり、はりの高さｈは、好ましくは、０から１ｍｍの間である。はりの幅２ｒは、好ましくは、５００ｎｍから１５ｍｍの間であり、より好ましくは５μｍから１．５ｍｍの間である。
【００５２】
障害物は、チャネルの内面にランダムまたは特定のパターンに従って配置される。その結果、テクスチャは、不規則または規則的に配置される。規則パターンは、周期的な構造、格子ピッチ（lattice pitch）およびチャネルの長手方向に対する格子方向の傾きのようないくつかの特徴により特徴付けられる。不規則なパターンであれば、障害物の密度、または障害物間の平均距離により特徴付けられる。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態によれば、障害物は、チャネルの少なくとも一部の内面に配置され、規則パターンを形成する。
【００５４】
他の実施形態によれば、障害物密度は、チャネルに従って変化する。
【００５５】
特定の実施形態によれば、障害物は、半径ｒの略円形断面を有するポストであり、そのポストは、チャネルの少なくとも一部の内面に配置され、例えば、以下のような六角形の周期構造を持つ規則パターンを形成する。
【００５６】
（ｉ）２つのポストの中心間の最短距離ｐは、少なくとも２ｒに等しく、好ましくは、（２ｒ＋Ｄcell／１０）から（２ｒ＋１００×Ｄcell）の間であり、より好ましくは、（２ｒ＋Ｄcell）から（２ｒ＋１０×Ｄcell）の間である。
【００５７】
（ｉｉ）角度αは、チャネルの長手方向と、六角形周期構造の単純格子の格子ベクトルとによって規定される最小角であり、
ｒ≧Ｄcell／２の場合、αは、ａｒｃｓｉｎ（ｒ／１０ｐ）からａｒｃｓｉｎ（２ｒ／ｐ）の間であり、
ｒ＜Ｄcell／２の場合、αは、ａｒｃｓｉｎ（Ｄcell／２０ｐ）からａｒｃｓｉｎ（Ｄcell／ｐ）の間である。
【００５８】
（ｉｉｉ）必要に応じて、ポストの高さｈは、０＜ｈ＜Ｈを満たし、好ましくは、Ｄcell／２＜ｈ≦（Ｈ−Ｄcell／２）を満たし、ここで、Ｈはチャネルの高さである。
【００５９】
特定の実施形態において、障害物は、半径ｒの略円形断面を有するポスト（１２）であり、ポストは、チャネルの少なくとも一部の内面に配置され、以下のような六角形周期構造を有する規則パターンを形成する。
【００６０】
（ｉ）ポストの半径ｒは、好ましくは、５０ｎｍから１５ｍｍの間であり、より好ましくは、５００ｎｍから１．５ｍｍの間である。
【００６１】
（ｉｉ）２つのポストの中心間の最短距離ｐは、少なくとも１００ｎｍに等しく、好ましくは、１００ｎｍから５０ｍｍの間であり、好ましくは、５００ｎｍから１０ｍｍの間であり、さらに好ましくは５μｍから１ｍｍの間である。
【００６２】
（ｉｉｉ）角度αは、チャネル（１４）の長手方向と、六角形ブラベー格子（Bravais lattice）の格子ベクトルのうちの１つとによって規定される最小角度であり、αは、０から９０°の間、好ましくは、０から３０°の間である。
【００６３】
（ｉｖ）必要に応じて、ポストの高さｈは、０＜ｈ＜Ｈを満たし、ここで、Ｈは、チャネルの一部の２つの向かい合う壁の間で測定された最小距離である。
【００６４】
流体装置は、好ましくは、例えば、ソフトリソグラフィーにより、マイクロ流体システムの製造において一般的に知られている技術によって製造することができる（Xia et al. 1998. “Soft lithography”. Annual Review of Materials Science. vol.28, n°1, p.153-184）。
【００６５】
少なくとも部分的にテクスチャ加工が施されたチャネルの正のレリーフ（positive relief）を有する装置のマスター（master）は、従来方法により準備できる。１つの方法は、チャネルの設計図を含むＣＡＤ（computer assisted design）ファイルからトランスペアレンシー（transparencies）を製造することにある。その後、これらのトランスペアレンシーは、マスターを形成するためのネガティブ・フォトレジストにパターンを転写する際のマスクとして用いられる。
【００６６】
流体装置は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から作製され、ガラススライド上に密封できる。この材料は、装置を視覚的に制御するのに好都合である。しかしながら、シリコンやガラス、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニル、塩化物、環状オレフィン共重合体、ポリ（メチルメタクリル樹脂）、熱硬化性ポリエステル、ポリウレタンメタクリル樹脂、Norland光学接着剤、ヒドロゲル（例えば、アルギン酸塩、コラーゲン、アガロース、ポリアクリルアミド、多糖）のような他の材料を、流体装置の製造に用いることができる。
【００６７】
有利なことに、流体装置、より具体的には産生チャンバーは、無菌状態で動作可能である。好ましい実施形態において、流体装置は無菌である。本発明に係る流体装置の製造方法は、装置の滅菌工程を含んでもよい。この滅菌工程は、装置の密封の前後に行われる。
【００６８】
さらに、製造方法は、少なくとも、巨核球、例えば、ヴォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）またはそれの機能的変異体に対する結合親和性を有するリガンドを備えるチャネルの内面のテクスチャ加工部のコーティング工程を含んでもよい。特定の実施形態において、チャネルの内面は、ヴォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）またはそれの機能的変異体の溶液で培養することによりコーティングされる。一般的に、固相のコーティングに用いられるＶＷＦの濃度は、５から１００μｇ／ｍＬである。好ましい実施形態において、ＶＷＦの濃度は、２０から４０μｇ／ｍＬである。ある実施形態において、チャネルの内面は、単量体ポリペプチドまたは二量体ポリペプチドとして、大腸菌または哺乳類細胞で表現される組み換え野生型ＶＷＦまたは変異ＶＷＦを含むグループから選択されたＶＷＦの機能的変異体でコーティングされている。
【００６９】
産生チャンバーに加えて、本発明に係る流体装置は、以下のような任意の手段を備える。
【００７０】
―チャネル内の懸濁液の流量を制御する流量制御部
―巨核球の懸濁液を濃縮し、巨核球の懸濁液の細胞濃度を均質化する、産生チャンバーの上流に設けられた巨核球の分類器および／または混合器
―巨核球または他の細胞残留物から血小板を分類することにより流出懸濁液を精製する産生チャンバーの下流に設けられた血小板分類器
流量制御部は、流量を制御するためにチャネル上に配置され、好ましくは、チャネルの流入口またはチャネルの流出口に配置される。この流量制御部は、必要に応じて、流体装置への巨核球の懸濁液の流れを発生させるポンプと結合させてもよい。
【００７１】
産生チャンバー上流の巨核球分類器を用いると、細胞集団に関して均質な懸濁液を得ることができ、また、血小板の工業的生産のための一貫した収量と品質とを得ることができる。具体的には、巨核球分類器は、血小板および他の細胞残留物から巨核球を分離する手段を備える。血小板細胞分類器として下記のように従来の細胞分類器を用いてもよい。具体的には、巨核球分類器を用いると巨核球が濃縮された細胞懸濁液を得ることができる。すなわち、懸濁液中の細胞の少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも７０％、８０％、９５％または約１００％が巨核球である。
【００７２】
混合器を用いると、特に、産生チャンバーが複数のチャネルを備える場合、流体装置の産生チャンバーに流入する懸濁液の良好な均質性を確保するためにさらに有利になる。細胞混合器は、例えば、Ｓｔｒｏｏｃｋら（“Chaotic Mixer for Microchannels”, Science, vol.295, n°5555, p.647-651, 2002）によって開示されたタイプのものであってもよい。産生チャンバーの流出口において、アウトフロー（outflow）には産生された血小板が含まれるが、裸の核および／または無傷の巨核球をさらに含んでもよい。したがって、産生された血小板を分離する手段は、有利なことに産生チャンバーの下流に置かれる。従来の細胞分離装置は、マイクロ流体技術のため、またはアフェレーシス技術のような大きな容量のために取り付けられたものとして用いてもよい。血小板分類器は、クロスフロー濾過装置、層流に基づく細胞分類装置、誘電泳動現象活性化細胞部分類装置、光学力に基づく細胞分類装置、磁力に基づく細胞分類装置、音響力に基づく細胞分類装置および慣性力に基づく細胞分類装置を含むグループから選択される。層流に基づく細胞分離装置の中で、その装置は、例えば、Takagiら（“Continuous particle separation in a microchannel having asymmetrically arranged multiple branches”, Lab Chip, vol.5, n°7, p.778, 2005）により開示されたピンチド・フロー（pinched-flow）分別技術に基づく細胞分離装置、または、例えば、L. R. Huangら（“Continuous Particle Separation through Deterministic Lateral Displacement”, Science, 304, 987, 2004）により開示された決定論的側方変位（Deterministic Lateral Displacement）に基づく細胞分離装置であってもよい。
【００７３】
本発明は、さらに、巨核球またはそれらのフラグメントから血小板を産生する生体外方法を対象とする。この方法は、上述の本発明に係る流体装置を用いて実行される。上述した流体装置の全ての特定の特徴および実施形態は、従って、この方法の特徴および実施形態である。
【００７４】
まず初めに、この方法は、巨核球またはそれらのフラグメントの懸濁液を本発明に係る流体装置に導入するステップを含む。この懸濁液のフローは、必要に応じて流量制御部に接続されるポンプにより生成および制御される。一般的に、産生チャンバーの各チャネルは、単一のフローを規定し、巨核球またはそれらのフラグメントの懸濁液を産生チャンバーの流入口から、産生チャンバーを通って、産生チャンバーの流出口まで流れさせる。その結果、フローは、チャンネル流入口からチャンネル流出口へと導かれる。好ましい実施形態によれば、流体装置に導入されたフローは、連続的である。
【００７５】
上述したように、巨核球の懸濁液は、ドナーから分離された、または前駆細胞の分化により得られた懸濁液であり、例えば、前駆細胞は、造血幹細胞、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞を含むグループから選択される。
【００７６】
流体装置において、巨核球またはそれらのフラグメントの懸濁液は、産生チャンバーに運ばれる。好ましい実施形態によれば、産生チャンバーに導入される前に、懸濁液は、細胞分類器を用いて分類および／または均質化される。均質化は、産生チャンバーの上流の混合器で実行される。巨核球またはそれらのフラグメントの懸濁液は、産生チャンバーの１つ以上のチャネルの流入口に運ばれる。
【００７７】
導入の後、巨核球またはそれらのフラグメントの懸濁液は、産生チャンバーのチャネルにおける巨核球の伸長、断片化および血小板解放に適したずり速度のフローにさらされる。
【００７８】
本明細書において、用語「壁ずり速度（wall shear rate）」
0006554466.tif 000002
は、チャネル、障害物または巨核球の表面とフローとの相互作用を特徴付けるために用いられるパラメータを意味する。
【００７９】
壁ずり速度
0006554466.tif 000003
は、任意の局所表面要素（local surface element）において定義される。
特定の表面要素上では、法線ベクトル
0006554466.tif 000004
および表面に対して接線方向のベクトル
0006554466.tif 000005
が定義され、流体速度
0006554466.tif 000006
の局所方向において、
0006554466.tif 000007
は平面デカルト座標系である。壁ずり速度は、
0006554466.tif 000008
で定義される。ずり速度のＳＩ単位系はｓ-1である。
【００８０】
壁ずり速度の値は、障害物のサイズ、形状および位置により局所的に変化する。その結果、本発明に係る装置のチャネルのテクスチャ加工が施された部分において、巨核球またはそれらのフラグメントの懸濁液は、ずり速度
0006554466.tif 000009
でフローにさらされ、ずり速度は、最小値
0006554466.tif 000010
から最大値
0006554466.tif 000011
の間で変化する。
【００８１】
本発明の好ましい実施形態によれば、流量は、チャネルのテクスチャ加工が施された部分の巨核球を０から最大値
0006554466.tif 000012
、
好ましくは、３０，０００ｓ-1を超えない、好ましくは、１０，０００ｓ-1、より好ましくは、８，０００ｓ-1、さらに好ましくは、５，０００ｓ-1の間の壁ずり速度
0006554466.tif 000013
にさらすことのできる範囲値内に固定できる。
【００８２】
本発明に係る装置のチャネルのテクスチャ加工が施された部分におけるずり速度
0006554466.tif 000014
は、与えられたチャネル形状、懸濁液液相パラメータおよび流量に対して有限要素法を用いて数値計算することができる。
【００８３】
ヒトの循環において比較すると、壁ずり速度は、最大の静脈における３０−４０ｓ-1から微小循環における５０００ｓ-1まで変化する。
【００８４】
チャネルの流出口で、収集された懸濁液は、産生された血小板を含む。本発明の特徴によれば、チャネルの流出口で収集された懸濁液は、裸の核および／または無傷の巨核球をさらに含む。その結果として、この方法は、懸濁液から血小板を精製、濃縮または分離するステップをさらに含む。さらに、血小板は、チャネルの流出口で分類することができる。上述したように、分類は、産生チャンバーの下流の細胞分類装置で行われる。例えば、分類は、クロスフロー濾過方法、層流に基づく分類方法、誘電泳動現象に基づく分類方法、光学力に基づく分類方法、磁力に基づく分類方法、音響力に基づく分類方法または慣性力に基づく分類方法を含むグループから選択された方法により実行される。
【００８５】
有利なことに、本発明の流体装置は、新たに生成された血小板の機能的品質を維持しつつ巨核球の懸濁液から血小板を高収率産生で産生することができる。
【００８６】
上述した方法により得られた血小板は、医薬組成物の調製に用いることができ、例えば、血小板数減少疾患の治療、特に、血小板減少症および血小板病症の治療に用いることができる。例えば、本発明に係る方法により得られた血小板は、血小板産生疾患を患う対象者に効率的な量で輸血することができる。
【００８７】
さらに、本発明に係る血小板産生方法は、高品質および画一化された血小板の大規模産生に適している。その結果、産生された血小板は、診断目的に用いることができる。これらは、血小板機能の画一化の正常コントロール（normal control）として用いることができる。実際に、血小板機能検査は、正常個体および罹患者からネイティブ機能状態（native functional condition）の新鮮血液の血小板を必要とする。血小板機能の画一化検査は、検査所が、血小板機能検査が行われた全てのバッチに対して正常コントロールを実行すべきことを必要とする。しかしながら、静脈穿刺による連続定期的な血液採取は、いくつかの健康上の懸念および倫理的問題を提起する。有利なことに、本発明に係る方法により得られた血小板は、血小板機能を測定するための体外臨床検査（in vitro diagnostic test）におけるポジティブ・コントロール（positive control）として用いることができる。
【００８８】
本発明は、以下の非限定的な実施形態を参照してさらに理解され、これらの実施形態は、添付の図面に関連して、例示の目的のみで与えられる。
【００８９】
図１は、本発明の実施形態に係る血小板産生流体装置を示す図である。
【００９０】
図２は、本発明の実施形態に係る流体装置の産生チャンバーを示す図である。
【００９１】
図３は、ポスト形状の障害物によりテクスチャ加工が施された表面を示す図であり、図３ａは、透視図であり、図３ｂは、平面図であり、図３ｃは、断面図である。
【００９２】
図４は、はり形状の障害物によりテクスチャ加工が施された表面を示す図であり、図４ａは、透視図であり、図４ｂは、平面図であり、図４ｃは、断面図である。
【００９３】
図５は、実施形態において用いられた３つの異なるチャネル配置を示す図であり、図５ａは、“チャネル形状１”を示し、図５ｂは、“チャネル形状２”を示し、図５ｃは、“チャネル形状３”を示す。
【００９４】
図６は、本実施形態において用いられた並列化チャネルから上流の細胞分布を示す図であり、図６ａは、平面図であり、図６ｂは、断面図である。
【００９５】
図７は、巨核球捕捉に対するテクスチャ加工が施された表面の効果を表すグラフである。白丸（empty circle）は、テクスチャ加工が施されていないチャネルに付着した巨核球の密度σを表すのに対して、黒丸（plain circle）は、破線間のテクスチャ加工が施されたチャネルに付着した巨核球の密度σを表す。テクスチャは、ｒ＝１５μｍ、ｐ＝８５μｍ、＝３４μｍおよびｈ＝２０μｍにより定義された形状に相当する。ｘ軸は、チャネル流入口からの距離を表す。画像は、実験開始後５０分で記録された。
【００９６】
図８は、細胞捕捉のＶＷＦの効果を示す図である。（ａ）ＶＷＦ（白丸）およびＢＳＡ（黒丸）表面コーティングで代わりに作られた８つの異なる実験の付着した巨核球の表面密度σを示す。ｘ軸は、チャネル流入口からの距離を表す。計測は、かん流の５０分後に各実験に対してなされる。グレーゾーンは、マイクロチャネルのテクスチャ加工が施された部分を表す。（ｂ）ＶＷＦでコーティングされたマイクロチャネルを用いた場合のかん流の５０分後の表面の代表的な画像である。（ｃ）ＢＳＡでコーティングされたマイクロチャネルを用いた場合のかん流の５０分後の表面の代表的な画像である。スケール・バーは、８０μｍを表す。
【００９７】
図９は、ｒが１５μｍの場合の形状１における付着した巨核球の表面密度のプロット密度の効果を示す図である。異なるチャネルのそれぞれには、ｐが１２０μｍ、８５μｍおよび６０μｍに等しいパターンの模様が付けられている。最後のチャネルは、陰性試験である。画像は、試験開始５０分後に撮影された。特定の閾値以下にｐが減少した場合、巨核球の重要な凝集が観察され、本実施形態においてはｐ＝６０μｍの場合である。スケール・バーは、１００μｍを表す。
【００９８】
図１０は、ポスト配列に向かう巨核球の異なる挙動を示す図である。（ａ）巨核球は、ポストの平面上で移流から捕捉され、位置を変えることを示す。シーケンスは、２つの異なる時間スケールおよび輸送挙動を示す。０ｍｓから３ｍｓまでの間、巨核球は、数ｍｍ・ｓ-1のスピードを生み出すフローにより活性化される。１４ｍｓから１４３１ｍｓまでの間、巨核球は、ポストの平面上で位置を変え、数μｍ・ｓ-1の速度を生み出す。（ｂ）ポストの曲面上での巨核球の捕捉を示す。シーケンスは、２つの輸送挙動を示す。巨核球は、０ｍｓから３ｍｓまで、ポストに運ばれ、そして、７ｍｓから１８２３ｍｓまで、ポスト曲面上で位置を変え、２１１１ｍｓから、最終的に移流に放出される。（ｃ）巨核球は、ポストの平面で捕捉され、その右側にトラップされる。４ｓから９７８ｓまで、巨核球の伸長が観察され、糸に通されたビーズ様構造（beads-on-a-thread-like structure）を形成する。スケール・バーは、３０μｍを表す。
【００９９】
図１１は、成熟巨核球の伸長および切断を示す図である。時間モンタージュは、細長い構造の３つの断裂を受けている糸に通されたビーズ様構造を持つ捕捉された巨核球を示す。各白矢印は、移流に放出される伸長部分を示し、次の画像からは消えている。スケール・バーは、３０μｍを表す。
【０１００】
図１２は、血小板解放の詳細を示す図である。時間モンタージュは、伸長した糸に通されたビーズ様特徴を持つ捕捉された巨核球を示す。断裂は、８．５ｍｓと９ｍｓとの間で起こる。巨核球は、捕捉されたままであり（左側）、解放された血小板前駆体は、フローに引きずられる。スケール・バーは、２０μｍを表す。
【０１０１】
図１３ａおよび図１３ｂは、同時に多数のポストに捕捉された伸長巨核球からの大規模血小板産生の一例を示す写真である。写真は、（ａ）臍帯血造血幹細胞および（ｂ）末梢血造血幹細胞由来の成熟巨核球からの血小板脱落プロセスの２次元の並列化を可能とする単一チャネルの詳細を示す。後者の場合、長い伸長巨核球は観察の全領域をカバーする。スケール・バーは、１００μｍを表す。図１３ｃおよび図１３ｄは、流体装置における血小板産生の定量的評価を表す。（ｃ）臍帯血造血幹細胞および（ｄ）末梢血造血幹細胞由来の成熟巨核球からのマイクロ流体装置における２時間の血小板産生とコントロール（対照群）との比較。この実験において、巨核球懸濁液は、５つの平行マイクロ流体チップ（マイクロ流体装置）のチューブを介して閉ループ回路を循環する。コントロール巨核球懸濁液は、マイクロ流体チップ（コントロール）なしのチューブを介して閉ループ回路を循環する。血小板濃度は、血球計をカウントすることで得られる。（ｃ）マイクロ流体装置（黒棒）のコントロール（ライトグレーの棒）に対する平均（Means）±ＳＥＭ（ｎ＝５）が、実験の開始時（無地の棒、ｔ＝０ｍｉｎ）および実験の終了時（斜線の棒、ｔ＝１２０ｍｉｎ）において、提供される。統計分析は、コントロールに対するマイクロ流体装置における血小板濃度のペア・サンプル（paired samples）のスチューデントのｔ検定（Student t-test）を用いて実行され、また、ｔ＝１２０ｍｉｎで得られたｐ値は、有意差（＊＊＊ｐ＜０．００５）を表す。（ｄ）マイクロ流体装置（黒棒）のコントロール（ｎ＝１）（ライトグレーの棒）に対する平均（Means）±ＳＥＭ（ｎ＝３）が、実験の開始時（無地の棒、ｔ＝０ｍｉｎ）および実験の終了時（斜線の棒、ｔ＝１２０ｍｉｎ）において、提供される。
【０１０２】
図１４は、上述の図１３ｃの凡例に詳細に記載されているように、マイクロ流体チップを欠く制御システムで得られた血小板と比較したマイクロ流体装置で産生された血小板のフローサイトメトリー分析（flow cytometry analysis）を示す。
【０１０３】
（ａ）マイクロ流体装置（黒棒）とコントロール（ライトグレーの棒）とで産生された血小板の表面上のＣＤ６１，ＣＤ４２ｂおよびＣＤ４９ｂ受容体の数を示す、血小板受容体の単色フローサイトメトリー分析。平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）が提供され、統計分析は、コントロールに対するミクロ流体装置内の受容体の数を比較する非ペア・サンプルに対するスチューデントのｔ検定を用いて実行される。ＣＤ４２ｂヒストグラムのアスタリスクは有意差を示す（ｐ＜０．０５）。
【０１０４】
（ｂ）コントロールのバックグラウンド値に対するマイクロ流体装置で産生されたＣＤ４１+ＣＤ４２+血小板の個体群を示す、血小板受容体の２色フローサイトメトリー分析。
【０１０５】
（ｃおよびｄ）ヒトＰＡＲ−１トロンビン受容体（ＴＲＡＰ）を刺激するアゴニスト・ペプチドＳＦＬＬＲＮによるＣＤ４１／ＣＤ６１受容体の活性化を、有しないまたは有する血小板受容体の２色フローサイトメトリー分析。図１４ｃにおいて、ヒストグラムは、血小板およびＣＤ４２ｂ+ゲートの範囲内で、マイクロ流体装置（黒棒）とコントロール（ライトグレーの棒）とで産生された血小板のＴＲＡＰ活性化の前（無地の棒）または後（斜線の棒）のＰＡＣ−１ポジティブ・エレメント（positive element）のパーセンテージを示す。平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）が提供され、統計分析は、非刺激血小板とＴＲＡＰ刺激血小板とを比較する非ペア・サンプルに対するスチューデントのｔ検定を用いて実行される。ｐ値のアスタリスクは、コントロールではなく、マイクロ流体装置で産生された血小板のＴＲＡＰ活性化の前または後のＰＡＣ−１ポジティブ・エレメントのパーセンテージの間の有意差（ｐ＜０．０５）を示す。図１４ｄは、血小板ゲート内の対応するドット・プロットを示し、コントロール（右パネル）に対するマイクロ流体装置（左パネル）で産生された非刺激（上パネル）およびＴＲＡＰ刺激サンプル（下パネル）におけるＰＡＣ１+ＣＤ４２ｂ+血小板の個体群を示す。コントロールには存在しないマイクロ流体装置で産生したＴＲＡＰ刺激血小板のＰＡＣ１+ＣＤ４２ｂ+個体群のシフトに注意する。
【０１０６】
図１５は、上述の図１３ｃの凡例に詳細に記載されているように、マイクロ流体チップを欠く制御システムで得られた血小板と比較したマイクロ流体装置で産生された血小板の接着および凝集のマイクロ写真を示す。
【０１０７】
（ａ）Ｆ―アクチン染色の二次ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抗マウス抗体およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６ファロイジンにより明らかにされた、抗チューブリン抗体を用いた間接免疫蛍光ラベリングが、流体装置（左パネル）またはコントロール（右パネル）により産生されたサンプルにおけるトロンビン（下パネル）の不在（上パネル）または存在下で実行される。画像取得は、ＱＩＣｌｉｃｋ−Ｆ−ＣＬＲ−１２のデジタルＣＣＤカメラ（Ｑイメージング）で４０×１．６6倍の倍率でアクシオオブザーバー顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社）を用いて行った。円形チューブリン染色、活性化されていない血小板の特徴は、流体装置（左上）の出口で採取した試料に見られる一方、円形チューブリン染色なしのより大きなフラグメントは、コントロール（右上）から採取したサンプルに収集される。活性化血小板のアクチン・ストレス・ファイバー特性は、流体装置の出口で採取したサンプルに見られる（左下）、一方、組織化されたストレス・ファイバー染色を持たないより大きいエレメントがコントロールから採取されたサンプルにおいて収集される（右下）。スケール・バーは、５μｍを表す。
【０１０８】
（ｂ）流体装置の出口で収集された血小板またはエレメント（左上）およびヒトＰＡＲ−１トロンビン受容体（ＴＲＡＰ）を刺激するアゴニスト・ペプチドＳＦＬＬＲＮによる活性化の有無（上パネル）にかかわらず生じるコントロール（右）から収集されたサンプルの走査型電子顕微鏡画像である。各条件は、ウシ血清アルブミンまたはウシ血清フィブリノゲンへの接着のいずれかを含む。スケール・バーは、５μｍを表す。
【０１０９】
（ｃ）フィブリノゲンおよびＣａＣｌ２の存在下での凝集。血小板凝集体は、ヒトＰＡＲ−１トロンビン受容体（ＴＲＡＰ）を刺激するアゴニスト・ペプチドＳＦＬＬＲＮによる活性化の前（上パネル）または後（下パネル）に観察される。大きい凝集体は、流体装置の出口で採取されたサンプルで見られる（左下パネル）。コントロールサンプルで収集されたフラグメントは、アゴニスト・ペプチドの存在下では凝集しない（右下パネル）。スケール・バーは、１０μｍを表す。
【０１１０】
図１６は、微小流体混合器に導入された成熟巨核球懸濁液を示す写真を含む。（ａ）マイクロ混合器の流入口で撮影された懸濁液の４００枚の写真。細胞は、左から右へＸ方向の移流に流れ、ｙ軸に対して局在化している。（ｂ）マイクロ混合器の流出口で撮影された懸濁液の４００枚の写真。細胞フローは、ｙ方向に対して均一である。（ｃ）混合器内の成熟巨核球の軌道。１ｍｓで区切られた懸濁液の２００枚の連続写真。スケール・バーは、１００μｍを表す。
【０１１１】
図１７は、細胞分類器の２つの例を示している。図１７ａは、ピンチド・フロー・フラクショネーションによる血小板分類を示す写真である。流入口細胞懸濁液は、固定血小板およびＤＡＭＩ細胞の両方で構成される。混合物は、チャネル（１）に導入される。無細胞バッファは、チャネル（２）に導入される。ＤＡＭＩ細胞が、チャネル（４）の外側で取り戻され、血小板は、チャネル（３）の外側で取り戻される。写真は、異なる細胞軌道を表示するために、１ｍｓで区切られた３０枚の連続画像の重ね合わせです。スケール・バーは、２００μｍを表す。図１７ｂは、決定論的な側方変位による血小板の分類を示す写真である。流入口の細胞懸濁液は、固定血小板およびＤＡＭＩ細胞の両方で構成される。混合物は、入口で導入され、出口で分類される（写真で示した）。ＤＡＭＩ細胞は、中央流出口（５）で反射され、分類されるのに対して、血小板は、側部流出口（６）で反射され、分類される。写真は、異なる細胞軌道を表示するために、０．３ｍｓで区切られた懸濁液の４８５枚の連続写真です。スケール・バーは、１００μｍを表す。
【０１１２】
図１において、流体装置１が示されている。流体装置１は、側部細胞混合器２と、産生チャンバー３と、細胞分類器４とを順番に備える。巨核球懸濁液５は、流体装置１に導入される。流出（outflow）懸濁液６は、収集される。流量制御部７は、流入（inflow）懸濁液５と流出懸濁液６との間に組み込まれる。流量は、例えば、開放システムのシリンジポンプや、閉ループシステムの蠕動ポンプ（不図示）などの圧力差または流量源により与えられる。
【０１１３】
図２には、流体装置の産生チャンバー３の詳細が示されている。産生チャンバー３は、２つの開口９，１０を備えるチャネル８、巨核球５の懸濁液を導入するための流入口９および流出懸濁液６の収集のための流出口１０を有する。チャネルの長手方向は、矢印１４により示される。チャネル８は、長さＬ、幅Ｗおよび高さＨである。本発明によれば、チャネル８は内面の少なくとも一部１１にテクスチャ加工が施されている。
【０１１４】
表面のテクスチャ加工は、チャネルの少なくとも一部の内面に配置された複数の障害物によりなされる。
【０１１５】
好ましい実施形態によれば、障害物は、ポストであり、図３に示したように整列している。ポスト１２は、チャネル壁１３の内面に配置されている。各ポスト１２は、半径ｒの実質的に円形断面を有し、ポストは、六角形の周期構造を有する規則的なパターンを形成するように配置される。２つのポストの中心間の最短距離は、ｐで表される。角度αは、チャネルの長手方向、および六角形の周期構造の基本セルの格子ベクトルのうちの１つによって規定される最小角度である。ポストの高さはｈで表され、ｈは、０＜ｈ≦Ｈであり、Ｈは、チャネルの高さである
他の好ましい実施形態によれば、障害物は、はりであり、図４に示したように整列している。はり１５は、チャネル壁１３の内面に配置されている。各はり１５は、高さｈおよび幅２ｗの実質的に長方形断面を有する。はりの長さは、チャネルの幅Ｗの長さに等しい。はりは、チャネル１４の長手方向に対して垂直に配置されている。２つのはりの間の最短距離は、ｐで表される。はりの高さはｈで表され、０＜ｈ≦Ｈであり、Ｈは、チャネルの高さである。
【０１１６】
［実施例］
材料および方法
ＣＤ３４+細胞培養および分化
ＣＤ３４+細胞は、上述したように（Poirault-Chassac et al, “Notch/Delta4 signaling inhibits human megakaryocytic terminal differentiation”, Blood, vol.116, n°25, p.5670-5678, 2010参照）、免疫磁性技術（Miltenyi Biotec, Paris, France）によりヒト臍帯血（ＵＣＢ）または末梢血から分離される。これらの血液サンプルは、インフォームドコンセント並びに我々の研究所の倫理委員会の承認およびヘルシンキ宣言に従った承認の後に得られた。ＣＤ３４＋細胞は、１５％のＢＩＴ９５００血清代替物、α−モノチオグリセロール（Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France）およびリポソーム（ホスファチジル・コリン・コレステロールおよびオレイン酸；SigmaAldrich）が添加されたＩＭＤＭ（Iscove modified Dulbecco medium; GibcoInvitrogen, Saint-Aubin, France）を含んで構成される完全培地中、５％ＣＯ2、３７℃で培養した。ヒト組み換え幹細胞因子（ＳＣＦ，１０ｎｇ／ｍＬ；Miltenyi Biotec）およびトロンボポエチン・ペプチド・アゴニストＡＦ１３９４８（ＴＰＯ，５ｎＭ）（Dunois-Larde et al, “Exposure of human megakaryocytes to high shear rates accelerates platelet production”, Blood, vol.114, n°9, p.1875-1883, 2009参照）は、０日目に培地に添加され、その後、７日目にＳＣＦなしで２０ｎＭ  ＴＰＯを添加される。培地の１２日〜１４日後に得られる成熟ＵＣＢ巨核球は、０．７−１．２×１０6ｍＬの濃度になるように完全培地で希釈され、従って、以前に報告された実験よりも約１０倍希釈されている。測定された平均直径Ｄcellは、１２．５＋／−１．７μｍであった。培養中に形成され、せん断力への暴露の直前の血小板の除去は、（Robert A, Cortin V, Garnier A, Pineault N. Megakaryocyte and platelet production from human cord blood stem cells. Methods Mol Biol. 2012; 788: 219-47）で報告されたＢＳＡ  ｇｒａｄｉｅｎｔ法により行われる。そして、濃度は、２００，０００巨核球／ｍＬに調整された。結果は、特別の定めのない限り、ＵＣＢ  ＣＤ３４＋由来の巨核球である。
【０１１７】
システム構成
成熟巨核球の懸濁液は、少なくとも３００ｒｐｍで回転する、軌道混合器（IKA MS3 basic）、に固定された２５ｃｍ2フラスコに導入される。軌道混合器は、懸濁液中の細胞の均一性を維持するために用いられる。フラスコ中の巨核球の濃度範囲は、少なくとも１００ｍＬ-1であり、１０×１０6ｍＬ-1を超えない。
【０１１８】
例えば、差圧制御、シリンジポンプおよび蠕動ポンプなどの様々な方法により、異なるコンポーネントを通るフローをコントロールすることができる。差圧制御を用いる場合、空気圧流入口および懸濁液流出口は、フラスコのコルクに密閉して差し込まれる。空気圧は、圧力制御器（MFCS-4C, Fluigent S.A., France）により、フラスコに与えられる。フラスコは、ポリエーテル・エーテル・ケトン（ＰＥＥＫ）チューブを有するマイクロ流体チップの流入口に接続される（Upchurch Scientific, USA）。他のチューブを用いることができる（例えば、Tygon R-1000, Saint-Gobain, France, PTFE tubing, Saint Gobain, France）。懸濁液は、流出口で収集される。蠕動ポンプを用いる場合（(Reglo, Ismatec, Switzerland）、流入口チューブおよび流出口チューブの両方が、同じ回転フラスコに到達する。蠕動ポンプは、マイクロ流体コンポーネントから上流または下流に接続することができる。巨核球懸濁液フローは、シリンジポンプによって与えることもできる（PHD 2000, Harvard apparatus, US）。
【０１１９】
３つのマイクロ流体コンポーネントが、順番に実行される。つまり、図１に示したように、巨核球分類器および／または上流の側方細胞混合器、血小板産生チャネルおよび下流の細胞分類器が実行される。細胞混合器および細胞分類器は任意である。
【０１２０】
装置製造
マイクロ流体コンポーネントは、以下のソフト・リソグラフィー・ラピッド・プロトタイピングにより製造される（Xia et al. 1998. “Soft lithography”. Annual Review of Materials Science. vol.28, n°1, p.153-184）。初めに、マイクロチャネルのデザインを含むＣＡＤファイルからトランスペアレンシーを作成する。これらのトランスペアレンシーは、従来のフォトリソグラフィーにより、ネガティブ・フォトレジスト（(SU-8 2000 and 3000 series, Microchem, US）にパターンを転写する際にマスクとして用いられ、マイクロチャネルの正のレリーフを有するマスターを作り出す。両方のチャネルは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ，Sylgard, Dow Corning, USA）成形品から作られ、ガラススライド上に密封される。ＰＤＭＳプレポリマーと硬化剤とが混合され、脱気される。混合物をマスターの上に注ぎ、７０℃で２時間硬化させ、個々のチップに切断し、流入口および流出口の穴をあける。ガラススライドをイソプロパノールで洗浄し、乾燥させる。ＰＤＭＳの個々の構造とガラススライドとを、酸素プラズマ・オーブンに入れ、そして、封をする。
【０１２１】
血小板産生チャネル
テクスチャ加工が施された表面は、チャネル壁（ガラスまたはＰＤＭＳ）上の３次元パターンにより規定される。ここで、我々は、これらの可能なパターンの２つの例、つまり、（Оｘｙ）面におけるディスクの六角形配列および（Оｘ）方向におけるはりの１次元配列を提示する。これらのパターンの形状は、図３および図４に示されている。ポスト配列のデザインは、３つのパラメータ、つまり、ディスク半径ｒ、２つのディスク中心間の距離ｐおよび流入口におけるフローの方向と２つのピラー中心により規定される方向との間の角度αで規定される。ここに実験のために我々が用いた形状において、αは、次の基準、ｓｉｎα＝ｒ／ｐにより規定される。この基準は、幾何学的に、２つの隣接ディスク中心が、最初のフロー方向に垂直な軸に投影されると、１つの半径により分離されるという意味を含む。実験的に、ｒは、１５μｍから２０μｍまで変化し、ｐは、６０μｍから１２０μｍまで変化する。図３ｃおよび図４ｃは、（Оｘｚ）面における障害物（はりまたはポスト）のプロファイルを示す。チャネルの高さおよび障害物の高さはそれぞれ、Ｈおよびｈで定義される。パラメータｈ／Ｈは、実験的に、０．２２（小さいポスト）と１（全ピラー）との間で変化する。
【０１２２】
本実施形態で用いられる３つの異なるチャネル形状は、図５ａ、図５ｂおよび図５ｃに示されている。
【０１２３】
１番目、いわゆる「チャネル形状１」は、チャネル・テクスチャによる巨核球の捕捉の影響を評価するために用いる。これは、８個の平行チャネルで構成され、その内訳は、６個のテクスチャが施されたチャネルおよび２つのテクスチャが施されていないチャネルで構成される。ｘ＝０ｍｍからｘ＝２０ｍｍの間は、全てのチャネルにテクスチャが施されていない。パターンは、以下のパラメータ、ｒ＝１５μｍ，Ｈ＝３６μｍ，ｈ／Ｈ＝０．５５に従う。ｐは、異なるテクスチャを施されたチャネルごとに変わり、ｐ＝６０μｍ（２チャネル）、ｐ＝８５μｍ（２チャネル）およびｐ＝１２０μｍ（２チャネル）である。全ての水圧耐性は、異なるｐパラメータに対してテクスチャの長さを変えることで等しくなる。ｐ＝８５μｍに対しては、チャネルは、２０ｍｍと２２ｍｍとの間でテクスチャが施され、そして、２２ｍｍから４０ｍｍまではテクスチャが施されていない。
【０１２４】
２番目、いわゆる「チャネル形状２」は、タンパク質表面コーティング効果およびテクスチャ効果を評価するために用いる。これは、８個の平行チャネルで構成される。全てのチャネルは、４センチメートルの長さであり、全てのチャネルのうち第１センチメートルおよび第３センチメートルの間でテクスチャ加工が施される。チャネル形状２は、パラメータｒ＝１５μｍ、Ｈ＝３６μｍ、ｈ／Ｈ＝０．５５およびｐ＝８５μｍでパターン化される。
【０１２５】
３番目、いわゆる「チャネル形状３」は、障害物効果を用いて血小板産生プロセスを並列化するために用いる。これは、蛇行形状の８個の平行チャネルで構成される（図５ｃのブロックとして示される）。全てのチャネルは、長さが１７．３ｃｍで、全長の７７％に相当するチャネルの直線部分にテクスチャが施されている。チャネル形状３は、パラメータｒ＝１５μｍ、Ｈ＝５２μｍ、ｈ／Ｈ＝１およびｐ＝８５μｍでパターン化される。
【０１２６】
ずり速度
我々は、チャネル壁上、ガラス上またはＰＤＭＳ（ＰＤＭＳ障害物を含む）上の表面要素を定義する。この表面要素において、我々は、それに垂直なベクトル
0006554466.tif 000015
により平面の単位ベクトルを定義する。
0006554466.tif 000016
は、平面デカルト座標系であるので、表面に対して接線方向および流体速度
0006554466.tif 000017
の局所方向の単位ベクトル
0006554466.tif 000018
が決定される。よって、壁ずり速度
0006554466.tif 000019
（ｓ-1）は、
0006554466.tif 000020
で定義される。壁ずり速度は、装置内の流量と装置の形状との両方により制御される。流体システム全体の流体力学的抵抗は、圧力制御器を用いて流入口と流出口との間に圧力差を与えること、得られた流量を測定することにより特徴付けられる（Flowell, Fluigent, France）。
【０１２７】
ビデオ顕微鏡システム
マイクロ流体チップは、倒立顕微鏡のステージ上にセットされる（DMI6000 B, Leica Microsystems GmbH, Germany）。コンピュータ支援電動式ステージ制御は、チャネルの長さ方向に沿った位置を記録するために用いられる。我々は、観察フィールド位置を記録し、そして、実験時間中に画像の記録と位置の記録とを交互に行う。微分干渉コントラスト法は、１０倍と４０倍との間の動画および画像を記録するために用いられる。ＣＭＯＳハイスピード・カメラ（Fastcam SA3, Photron, USA）は、０．５から１５００Ｈｚの周波数の画像を記録するために用いられる。
表面接着細胞は、記録されたチャネル画像から手動で計数され、懸濁液中の細胞は、大量にサンプリングされた場合、血球計数器およびコールター・カウンター（Scepter II, Millipore, US）の両方で計数される。
【０１２８】
タンパク質表面処理
ヒト・ヴォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）は、Laboratoire Francais du fractionnement et des Biotechnologiesから提供された。それは、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのないリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で４０μｇ・ｍＬ-1に希釈され、密封マイクロチャネルでかん流される。我々は、血小板産生チャネルだけでこの表面コーティングを用いた。
【０１２９】
ウシ血清アルブミン（Sigma-Aldrich La Verpilleres, France）は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で４０μｇ・ｍＬ-1に希釈され、マイクロチャネルでかん流される。
【０１３０】
両方のタンパク質処理のために、チップの流入口と流出口とは、カバーガラスでカバーした。チップは、４℃で一晩培養され、実験前にＰＢＳで洗浄された。ガラスとＰＤＭＳにおけるＶＷＦ吸着は、一次多クローン性ウサギ抗ｖＷＦ抗体（Dako, 10 μg.mL-1）および二次Alexa fluor５４６多クローン性ヤギ抗ウサギ抗体による蛍光標識法により検証される。
【０１３１】
細胞混合器
混合器のデザインは、Stroockら（Chaotic Mixer for Microchannels”, Science, vol.295, n°5555, p.647-651, 2002）により開示されたマイクロチャネルのためのカオスの混合器のヘリングボーン状構造から直接着想を得ている。Stroockらのパラメータを考慮すると、細胞混合器は、ｈ＝５０μｍ，ｗ＝３００μｍ，α＝１，ｐ＝２／３または１／３およびｑ＝０．６３μｍで設計される。
【０１３２】
血小板産生チャネルの並列化
装置における高巨核球流量は、血小板産生数増大のために必要となる。所定の障害物のパターンおよびチャネル高さに対して、細胞流量は、チャネル幅を増加させることにより増やすことができる。ＰＤＭＳチャネルの機械的制約により、チャネル崩壊を回避する幅／高さの最大比が与えられるので、我々は、有効幅を増やすためにチャネルを並列化した。
【０１３３】
巨核球は、チューブによって、血小板産生チャネルに導入される。細胞は、細胞を全てのチャネル（図６）に運ぶ三角形状の入口を通って並列チャネルに分配される。所定のチャネル高さに対して、壁ずり速度は、チャネル幅に反比例する。これにより、壁ずり速度は、並列チャネルの入口の前よりも流入口壁に近い場所でより高くなる。細胞に損傷を与える壁ずり速度が与えられることを回避するために、分配チャネルは、並列せん断チャネルで使われるものよりも高さの高いものを用いて作られる。これら２つの高さの比は、典型的には２から２０までの間である。
【０１３４】
血小板分類
図１に示したように、裸の核および無傷巨核球は、血小板産生チャネルからの流出懸濁液を連続的に分類することにより血小板から除去することができる。これは、マイクロ流体技術で行われる。大量の場合、アフェレーシス技術を考慮することもできる。我々は、ピンチド・フロー分別技術（Takagi et al., “Continuous particle separation in a microchannel having asymmetrically arranged multiple branches”, Lab Chip, vol.5, n°7, p.778, 2005）および決定論的側方変位（L. R. Huang et al. “Continuous Particle Separation through Deterministic Lateral Displacement”, Science, 304, 987, 2004）を用いた血小板分類の２つの例を示す。ピンチド・フロー分別技術について、装置は、５０μｍのピンチ部分の幅を用いて作られる（図１７）。細胞懸濁液は、（全血からの）パラホルムアルデヒド固定血小板およびＤＡＭＩ細胞（megakaryotic cell line, Greenberg et al. 1988. “Characterization of a new megakaryocytic cell line: the Dami cell”. Blood. 72:1968-1977）を含んで構成される。図１７ａは、この技術を用いて、ＤＡＭＩ細胞および血小板は、異なる流出口枝に分画できることを示す。決定論的側方変位（ＤＬＤ）は、ミクロンスケールの障害物の周期的配列を通り抜ける層流に基づく、受動的な構造依存の粒子サイズ分離法である。ＤＡＭＩ細胞および固定血小板の混合物は、L. R. Huangら（Science, 304, 987 (2004)）によって最初に記載された装置およびK. Loutherbackら（AIP Advances 2, 042107 (2012)）によって発展させられた装置に基づいて、分類される。装置は、１つの流入口、球形状のポスト配列および２つの流出口（中央および側方）で構成される。図１７ｂにおいて、装置は、長さ５ｃｍ、幅３ｍｍおよび高さ４０μｍである。ポストの直径は８５μｍであり、ポスト間の空間は１５μｍである。ポスト列のシフトは、０．０５ラジアンの角度を形成する。表面はＢＳＡコーティングによって覆われる。ＤＡＭＩ細胞は、中央流出口（６）でそらされて分類される一方で、血小板は、側方流出口（５）でそらされずに分類される。装置は、血小板純度１００％および血小板収率回収８０％を提供する。画像は、異なる細胞軌道を示す０．３ｍｓで分離された４８５枚の連続的画像の重ね合わせである。スケール・バーは、１００μｍである。
【０１３５】
収集血小板評価
形状３のマイクロ流体装置における血小板生成は、マイクロ流体チップなしのチューブからなるコントロールサンプルと比較される。ＣＤ４１抗原およびＣＤ４２抗原の発現は、フロー血球計算機ＢＤ蛍光活性細胞分類器（ＦＡＣＳ：Fluorescence Activated Cell Sorter）Calibur（BD Biosciences, Le Pont de Claix, France）を用いて特徴付けられる。血小板は、２２℃で１５分間、フルオレセイン・イソチオシネアート（ＦＩＴＣ）接合抗ヒトＣＤ４１（αＩＩｂ）、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）接合抗ヒトＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）（両方とも、Beckman Coulter, Villepinte, Franceから）およびＦＩＴＣ接合抗ヒト活性αＩＩｂｂ３（BDBiosciences）によって培養された。コントロールは、ＦＩＴＣマウスＩｇＧ1（Beckman Coulter）、ＰＥマウスＩｇＧ1（Beckman Coulter）を用いて行われた。血小板受容体の単色フローサイトメトリー解析は、ＧＰスクリーン分析（Biocytex, Marseille, France）を用いて行われた。抗原部位の数は、較正ビーズ標準曲線に基づいて、蛍光強度を血小板あたりの結合されるモノクロナール抗体の対応する数に変換することにより決定される。活性化は、トロンビンの存在下またはＰＡＲ−１トロンビン受容体のアゴニスト・ペプチドの存在下で得られることを除き、上記非特許文献１において以前に報告されているように、フィブリノゲン接着分析および落射蛍光特性評価を実行した。落射蛍光は、高分解能の生体イメージング・プラットフォーム（EMCCD MGi Plus Qimaging Rolera camera, Roper Scientific, Evry, France）を用いて４９４ｎｍおよび５２２ｎｍで分析された（吸収および放射）。走査型電子顕微鏡による撮像は、３０分間、２％ＢＳＡまたはフィブリノゲン（０．２ｍｇ／ｍｌ）でコーティングされたガラススライド上に血小板を添加して行った。その後、ＨＥＰＥＳ５０ｍＭのＮａＣｌ、１３５ｍＭのＣａ2+、２ｍＭのＰＦＡ２％およびグルタルアルデヒド４％を含む溶液の液滴は、血小板固定のためにスライド上に添加され、スライドは、同じ溶液を含む溶液槽で一晩培養された。翌日、サンプルを、２５％、５０％、７５％、９５％エタノール、最終的には１００％エタノールで洗浄および脱水し、空気真空により乾燥させる。凝集は、デュアル・チャネル全血／光ルミ‐アグリゴメータ（Model 700 Chronolog Corporation）を用いて行われる。
【０１３６】
巨核球混合
へリングボーン溝は、細胞の側方変位を導くチャネルの（Ｏｙｚ）平面においてカオスのマイクロ渦を作り出す。それらは、経路から出て、メインチャネルにとどまる前に、フロー軌道に対して４５°回転した経路に入るために細胞が軌道を壊すことを可能にする。図１６ｂに記載されているように、これらのカオス的変位は、均質な側方細胞流量を引き起こす。
【０１３７】
巨核球捕捉
我々は、巨核球の移動速度（非移動細胞を含む）とは無関係に、表面付着性巨核球により捕捉巨核球を定義する。我々は、（図３および図４で定義された）はりまたはポストの異なる形状に従って巨核球捕捉を評価する。図７に結果を示す。テクスチャ加工が施されていないチャネルの最初の部分では、付着性巨核球の密度は非常に低い（σ＜１００ｍｍ-2）。これとは対照的に、チャネルのテクスチャが施された部分では、密度は、はるかに高かった（７５０ｍｍ-2）。コントロールとして、テクスチャの施されていないチャネルは、巨核球の検出不可能な表面密度を示した。捕捉増強は、インターポスト距離ｐ＝６０μｍ、ｐ＝８５μｍおよびｐ＝１２０μｍに対して検証された。
【０１３８】
テクスチャが施された部分に続く部分であり、障害物がないチャネルの最後の部分では、我々は、テクスチャが施されたチャネル（σ〜２５０ｍｍ-2）とテクスチャが施されていないチャネル（σ＜１０ｍｍ-2）との間のシャープな密度差を観察する。これは、巨核球の移動スピードと結び付けられた第２部分で生じる捕捉の直接の結果である（移動スピードの分布は、０μｍ・ｓ-1から２００μｍ・ｓ-1まで広がる）。
【０１３９】
タンパク質の表面コーティング効果
血管内皮細胞において、それらのＧＰＩｂ受容体（Huizinga et al, Structures of Glycoprotein Ibα and Its complex with von Willebrand Factor A1 Domain”, Science, vol.297, n°5584, p.1176-1179, 2002）の結合を介して、高ずり速度（＞１０００ｓ-1）を受けたときに、ＶＷＦは、循環血小板の移動を可能にする。インビトロにおいて、ＶＷＦの吸着により、巨核球、血小板および血小板前駆体はＰＤＭＳおよびガラス表面に移動できる（Dunois-Larde et al, “Exposure of human megakaryocytes to high shear rates accelerates platelet production”, Blood, vol.114, n°9, p.1875-1883, 2009）。我々は、ＶＷＦコーティングおよびＢＳＡコーティングのチャネル壁の巨核球の接着への効果を比較した。
【０１４０】
我々は、ＶＷＦでコーティングされたチャネル形状２について４つの実験を行い、ＢＳＡでコーティングされたチャネル形状２について４つの実験を行った。我々は、ｔ＝５０ｍｉｎで巨核球の表面密度を比較した。図８に結果を示す。ＶＷＦでコーティングした場合、平均巨核球密度は、チャネルのテクスチャ加工が施されていない部分で５４ｍｍ-2であり、チャネルのテクスチャ加工が施された部分で２７５ｍｍ-2である。ＢＳＡでコーティングした場合、平均巨核球密度は、チャネルのテクスチャ加工が施されていない部分で４ｍｍ-2であり、チャネルのテクスチャ加工が施された部分で３９ｍｍ-2である。これにより、先のパラグラフで説明した捕捉効果が両方のコーティングで発生していることが検証できる。さらに、チャネルにおいて、接着細胞の密度を急激に増加させる。
【０１４１】
実験の第３のセットは、フィブリノゲンコーティングで行われた。フィブリノゲンは、低ずり速度で巨核球に結合することが知られているが、巨核球伸長を促進するために用いられた高ずり速度での巨核球捕捉は観察できなかった。
【０１４２】
これらの結果は、表面上の細胞の挙動を詳細に記述していません。我々は、テクスチャ加工が施されていないチャネル内でのｘ軸に沿った距離についてのσの重要な減少を定性的に観察する。テクスチャ加工が施されたチャネルにおいて、我々は、ほんのわずかな増加の後にテクスチャ加工が施された長さに沿ったσの減少を観察する。これらの結果は、一時的なものであり、巨核球の異なる輸送機構から生じる。
【０１４３】
巨核球および血小板輸送
細胞は、２つの異なる輸送モードを持つ：数ｍｍ・ｓ-1のスピードを産出する移流、および数μｍ・ｓ-1のスピードを産出する移動を持つ。図１０は、細胞と壁との間の異なる可能な相互作用を示す。ポスト配列を用いると、非特許文献１（同）に記載されているように、細胞は、チャネル壁により捕捉されるだけでなく、ポストの上部またはポストの垂直側面上に移動することにより捕捉することができる。ポストに捕捉された場合、細胞は、チャネル壁上での移動に従うか、移流に放出されるか（図１０ｂ）、または、移動をストップするかして（図１０ｃ）、ポストの背後に閉じ込められたままとなる。これらの単一細胞のイベントは、２つ前の段落に記載されたより大きいスケールでの挙動を解明する。
【０１４４】
巨核球破裂および血小板放出
我々は、表面付着性巨核球からの血小板脱落を観察した。チャネル壁上で巨核球が移動する場合、それらは、壁表面上のＶＷＦとの一時的な相互作用を確立する。そして、それは、巨核球からの血小板脱落までの形態学的な変化を次第に引き起こす。伸長と細胞体が移動している場合に、脱落が生じる。このプロセスは、非特許文献１および国際特許出願ＷＯ２０１０／０６３８２３１１に記載されている。破裂後、両エンティティは、壁表面上の移動を継続する。細胞体が移動する場合は、ポストの周囲または背後に捕捉されるまで、脱落は発生する（図１０ｃ）。数分間の時間スケールで、以前非特許文献１で報告されたように、巨核球は、伸長の形成を引き起こす形態変化を起こし、それは糸に通されたビーズ構造を採用した。さらに、コーティングされた表面との全細胞接触の代わりに、細胞は、少なくとも１つの接点により同じ位置にとどまるけれども、いくつかの伸長は、フローとともに自由に動く（ぶら下がる（dangling））ように見える。糸に通されたビーズの伸びのサイズが大きくなるにつれて、破裂が起こり、血小板および／または血小板前駆体を解放する。図１１には、１０個のうち巨核球伸長の異なる３つの破裂が示されている（データは示されていない）。ぶら下がり解放は、図１２に短い時間スケールで詳述されている。破裂の後、解放された血小板前駆体のスピードは、秒速４ｃｍと測定され、これはフローの速度に対応する。我々は、解放された要素が破裂後に運ばれると仮定する。
【０１４５】
各巨核球により解放することができる血小板の量は、単一細胞の長時間撮影により見積もることができる。我々の観察は、ポストに捕捉され、せん断力にさらされた巨核球は、１時間あたり１１個のフラグメントを解放できることを示す。これらのフラグメントは、糸に通されたビーズの形状をしている。我々は、ビデオのフレーム上の楕円として解放されたビーズのそれぞれをフィッティングすることにより、解放されたビーズのサイズ分布を測定した。回転対称性を仮定すると、我々は、解放されたビーズの全体積を推定し、全体積を、我々が血小板であるとみなす観測されたビーズの最小体積で割る。この方法では、我々は、巨核球１個あたり最大３５０血小板の血小板産生量を見出す。比較として、ヒト巨核球は、生体内で１０２〜１０３血小板に変換される（Thon et al, “Cytoskeletal mechanics of proplatelet maturation and platelet release”, J Cell Biol, vol.191, n°4, p.961-874, 2010, and Thon et al., “Platelet Formation”, Seminars in Hematology, vol.47, n°3, p.220-226, 2010）。
【０１４６】
巨核球からの血小板産生の並列化
我々は、はりの配列パターンを有する並列化チャネルを製造して血小板産生のプロセスを増幅した。以下の全ての実験において、上述した形状３を用いた。形状３は、合計１６８７７０個のはりを有する。図１３ａおよび図１３ｂは、合計６６個のはりを示すはり配列の詳細であり、そのうち４８個のはりは、巨核球捕捉または伸長過程に関与している。我々は、単一のはりがいくつかの巨核球を捕捉できることを観察する。このプロセスは、一時的なプロセスであり、フローの方向に対して距離依存のプロセスである。図１３ａは、臍帯血巨核球の捕捉および伸長を示し、図１３ｂは、末梢血巨核球の捕捉および伸長を示している。
【０１４７】
「マイクロ流体装置」の構成において、２０ｍＬ撹拌巨核球懸濁液（２０００００巨核球／ｍＬ）は、形状３に従って作成された５つの並列装置を介して、２時間、閉ループ内を循環した。「コントロール」の構成において、２０ｍＬ撹拌巨核球懸濁液は、単一チューブのいかなるマイクロ流体装置なしで、閉ループ内を循環した（Tygon, 0.57 mm I.D., Saint-Gobain, France）。血小板産生量を計るため、マイクロ流体装置か、またはコントロールシステムを介して、開始時および１２０分かん流後に収集された細胞懸濁液を血球計で計数した。１μｍと４μｍとの間の直径を有する複屈折細胞は、血小板と考えられる。図１３ｃおよび図１３ｄはそれぞれ、臍帯血巨核球および末梢血巨核球からの血小板産生の血球計計数の結果を示す。図１３ｃは、ｔ＝０分で、マイクロ流体装置で収集された血小板濃度およびコントロールは、有意差を示さなかった（２７３，０００および３０１，０００血小板／ｍＬ）。ｔ＝１２０分で、濃度はそれぞれ、４８６，０００±６９，４００血小板／ｍＬおよび１，３６０，０００±１５９，０００血小板／ｍＬであり、有意差を示した（スチューデントのｔ検定、対のサンプル、ｐ＜０．００５）。この濃度の増加について、我々は、マイクロ流体装置を通過した結果であると仮定した。図１３ｄは、同様の傾向を示しているが、マイクロ流体装置で収集された血小板濃度とコントロールとの間における統計分析は行われなかった。
【０１４８】
マイクロ流体装置で産生された血小板の特徴付け
２時間のかん流後、装置で循環する細胞懸濁液は、コントロールシステムで循環する細胞懸濁液よりも多くの血小板を含む。これらの血小板は、上述した異なる手法により分類することができる。流体装置で産生された血小板は、天然の血小板、すなわち、血液から分離された血小板または循環血液血小板に相当するいくつかの特徴を示す。我々は、これらの特徴は、流体チャネルを除く全ての要素からなるコントロールシステムから得られたサンプルから失われていることを発見した。図１４ａに示したように、ＣＤ４２ｂ受容体の発現は、コントロールサンプルで収集された血小板状粒子よりも流体装置により生成された血小板において著しく高かった（ｐ＜０．０５）。ＣＤ４１＋ＣＤ４２ｂ＋要素の明らかな集団が、マイクロ流体装置により生成された血小板において識別され、コントロールサンプルで収集された血小板状粒子では見られなかった（図１４ｂ）。
【０１４９】
興味深いことに、ＴＲＡＰ刺激により、血小板は、αＩＩｂβ３受容体の活性化構造のＰＡＣ１モノクロナール抗体の結合のレベルを増大させるような、血液血小板を特徴づけるために知られているものと同じ活性化特性を受けることができ、コントロールサンプルで収集された血小板状粒子は存在しない（図１４ｃおよび図１４ｄ）。図１５ａは、血小板のチューブリン環特性が、コントロールサンプルから収集したサンプルではなく、流体装置から収集したサンプルに存在することを示す。トロンビンによるこれらの活性化の際、流体装置により生成された血小板は、糸状仮足、膜状仮足およびアクチン・ストレス・ファイバーを示し、アクチン・フィラメントは、血液から分離されたトロンビン活性化血小板のように再編成されることを示す。血小板機能の両方の特徴は、コントロールサンプルから欠落している。走査型電子顕微鏡（図１５ｂ）は、流体装置により生成されたＴＲＡＰ活性化血小板における糸状仮足および膜状仮足の存在を示している一方で、これらの構造は、コントロールサンプルでは検出されなかった。図１５ｃは、流体装置を通過して収集されたサンプルにおける血小板凝集を示している。再び、このような大規模な凝集は、コントロールで収集された血小板には見られない。したがって、本明細書は、血小板の目立った特徴が、並列化マイクロ流体装置を介して巨核球の暴露から収集されたサンプルで観察されることを最初に示し、それらは、マイクロ流体チップを欠いているコントロールにおいて収集された血小板状粒子からいなくなっている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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