(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（ＩＩＩ）〜（Ｖ）からなる群から選択されるいずれかのラブダン型ジテルペン化合物、またはそれらの医学的に許容可能な塩。
【化１】
0006590658.tif 000009
【請求項２】
下記式で示されるラブダン型ジテルペン化合物（ＩＩ）または（ＩＩＩ）、またはそれらの医学的に許容可能な塩を有効成分とする、脱顆粒抑制剤。
【化２】
0006590658.tif 000010
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ラブダン型ジテルペン化合物および脱顆粒抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物由来の抗ヒスタミン薬として、ステビオール配糖体を１種以上含有する抗アレルギー剤がある(特許文献１）。ステビアの葉から抽出精製されたステビオール配糖体は白色から淡黄色の粉末で、従来から甘味料の原料として使用されている。経口投与したところ、アラキドン酸の代謝活性抑制作用および接触皮膚炎抑制作用を有し、即時型から遅延型のアレルギーを抑制しうるという。当該特許公報に記載されたステビオール配糖体は、ステビオールの４位の−ＣＯＯＨに代えて−ＣＯＯ−ｇｌｃが結合し、１３位の−ＯＨに代えて−Ｏ−ｇｌｃ２−１ｇｌｃが結合した化合物である。
【０００３】
また、ステビア植物組織に酵母と水とを加えて直接発酵させ、得られた発酵ステビアをエタノール水溶液で抽出し、その抽出液の９０％エタノール可溶画分を凍結・乾燥してなる抗ヒスタミン物質もある（特許文献２）。乾燥ステビア粉末を直接発酵させることで抗ヒスタミン効果に優れる抽出物が得られるというもので、実施例では、得られた９０％エタノール可溶画分について、マグヌス法により抗ヒスタミン活性を評価している。
【０００４】
一方、ステビア植物の酵母発酵物から抽出された新規ジテルペン化合物が美白作用を有するとの報告もある（特許文献３）。ステビア植物組織に酵母と水とを加えて直接発酵させ、得られた発酵ステビアをエタノール水溶液で抽出し、その抽出液の８５．５％エタノール可溶画分に含まれるクロロホルム溶解物質に、新規ジテルペン化合物が含まれるという。当該新規ジテルペン化合物について、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞あたりのメラニン産生量を評価したところ、ポジティブコントロールとして使用したコウジ酸よりメラニン産生量が低くなったという。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３９３５９１７号公報
【特許文献２】特許第４３７５７５８号公報
【特許文献３】国際公開第２０１４／８０６６６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前記特許文献１は、ステビオール配糖体を抗アレルギー剤として使用するものであるが、配糖体は条件によって糖部分が離脱するなど取扱いが容易でない。よって、配糖体を有することなく抗ヒスタミン活性に優れる化合物の開発が望まれる。
【０００７】
また、特許文献２は、ステビア植物の酵母発酵物から得た粗抽出物を抗ヒスタミン物質として使用するものである。抗ヒスタミン作用を有する化合物は特定されていない。しかも、特許文献３に示すように、ステビア植物の酵母発酵物には美白成分も含まれている。よって、特定成分を分離できれば、純度が高い医薬品等として使用することができる。
【０００８】
一方、ステビア植物の酵母発酵物には種々の美白成分も含まれ、特定の効能を有する物質の分離や同定は容易でない。副作用が少なく、製品にした際に変質等が少ない、成分の特定、および抗アレルギー作用の特定が望まれる。
【０００９】
上記現状に鑑み、本発明は、ステビア植物の酵母発酵物由来の新規ラブダン型ジテルペン化合物、および当該化合物を主成分とする脱顆粒抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らはステビア植物について詳細に検討したところ、ステビア植物を酵母菌で発酵させた発酵物には原ステビア植物とは異なる新規化合物が含有されること、この新規化合物を分析したところ、脱顆粒抑制効果を有する化合物が含まれていること、当該化合物を使用すれば脱顆粒抑制剤や抗アレルギー剤として使用しうることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち本発明は、下記式（Ｉ）〜（Ｖ）からなる群から選択されるいずれかのラブダン型ジテルペン化合物の内、式（ＩＩＩ）〜（Ｖ）、またはそれらの医学的に許容可能な塩を提供するものである。
【００１２】
【化１】
0006590658.tif 000002
【００１３】
また本発明は、下記式で示されるラブダン型ジテルペン化合物（ＩＩ）または（ＩＩＩ）、またはそれらの医学的に許容可能な塩を有効成分とする、脱顆粒抑制剤を提供するものである。
【００１４】
【化２】
0006590658.tif 000003
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、上記式（ＩＩＩ）〜（Ｖ）で表される新規ラブダン型ジテルペン化合物が提供される。ラブダン型ジテルペン化合物（ＩＩ）やラブダン型ジテルペン化合物（ＩＩＩ）は脱顆粒作用に優れ、抗アレルギー剤として使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ラブダン型ジテルペン化合物（Ｉ）〜（Ｖ）の基本骨格と置換基とを説明する図である。
【図２】実施例１において、式（Ｉ）〜（ＩＶ）で示す化合物を製造する際の分離工程および収量を説明する図である。
【図３】実施例１において、化合物（Ｖ）で示す化合物を製造する際の分離工程および収量を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の第一は、上記式（Ｉ）〜（Ｖ）からなる群から選択されるいずれかのラブダン型ジテルペン化合物の内、式（ＩＩＩ）〜（Ｖ）、またはそれらの医学的に許容可能な塩である。「ラブダン」とは、トランス−デカリンの９位の炭素に炭素数６の側鎖を有するジテルペンである。本発明の化合物（Ｉ）〜（Ｖ）は、いずれもトランス−デカリンの９位の炭素に炭素数６の側鎖を有するジテルペンであるため、上記式（Ｉ）〜（Ｖ）に示す化合物をラブダン型ジテルペン化合物と称する。
【００１８】
本発明のラブダン型ジテルペン化合物（Ｉ）〜（Ｖ）は、トランス−デカリン構造の４位の炭素原子に２つのメチル基が導入され、８位および１０位の炭素原子にそれぞれ１つのメチル基が導入され、６位、７位、８位の炭素原子にそれぞれ１つの水酸基が導入され、および９位の炭素原子に側鎖を有する基本骨格を有する点で共通する。この基本骨格と、９位の炭素原子に導入される置換基Ｘの構造を図１に示す。
【００１９】
化合物（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および化合物（ＩＶ）は、いずれもＣ２０Ｈ３６Ｏ６の分子式を有する光学異性体であり、化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）とは１３位の不斉炭素がＲ配位（１３Ｒ）であり、化合物（ＩＩＩ）と化合物（ＩＶ）とは同１３Ｓである。更に、化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩＩ）とは１４位の不斉炭素がＲ配位であり、化合物（ＩＩ）と化合物（ＩＶ）とは同Ｓ配位である。その結果、化合物（Ｉ）は、１３Ｒ１４Ｒ、化合物（ＩＩ）は１３Ｒ１４Ｓとなる。同様に、化合物（ＩＩＩ）は１３Ｓ１４Ｒ、化合物（ＩＶ）は１３Ｓ１４Ｓである。
【００２０】
一方、化合物（Ｖ）の分子式はＣ２０Ｈ３６Ｏ５であり、炭素１２-１３間に二重結合を有するため１３位は不斉炭素でなく、水酸基を有しない。この点で化合物（Ｉ）等と相違する。なお、化合物（Ｖ）の炭素１４位はＲ配位である。
【００２１】
本発明のラブダン型ジテルペン化合物（Ｉ）〜（ＩＶ）は、９位の炭素原子に導入された側鎖に３個の水酸基を有する点に特徴がある。従来、ステビア植物に由来する化合物としてステレビンＡ、ステレビンＢなどが知られているが、９位の側鎖に３個の水酸基を有する化合物は知られていない。
【００２２】
また、本発明のラブダン型ジテルペン化合物（Ｖ）は、９位の炭素原子に導入された側鎖の１２位−１３位の炭素間に二重結合をする化合物である。従来、ステビア植物に由来する化合物としてステレビンＡ、ステレビンＢなどが知られているが、９位の炭素原子に導入される側鎖には、２以上の二重結合を有する場合が一般的であった。したがって、この側鎖に、１の二重結合と２個の水酸基を有する化合物は従来、存在しない。これらは、ステビア植物を酵母発酵することで生成した新規化合物である。生成経路は明確ではないが、たとえば、ステビア植物（学名：Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）の主成分であるアウストロイヌリンを出発化合物として生成された可能性がある。
【００２３】
本発明のラブダン型ジテルペン化合物（Ｉ）〜（ＩＶ）には、脱顆粒抑制効果に優れる化合物が含まれることが判明した。ラブダン型ジテルペン化合物（Ｉ）〜（ＩＶ）は、光学異性体であるが、脱顆粒抑制効果が相違し、従来の抗アレルギー薬と同等またはそれ以上の脱顆粒抑制効果を有する化合物が含まれる。
【００２４】
上記新規化合物は、ステビア植物の酵母発酵物から抽出し、または抽出物を修飾することで製造することができる。
【００２５】
酵母は、糖分からアルコールと炭酸ガスを排出する微生物であり、日本酒、ビール、ワインなどの酒類、醤油、チーズなどの発酵食品、パンなどの製造に利用されている。上記式（Ｉ）〜（Ｖ）で示されるラブダン型ジテルペン化合物を生成しうる酵母としては、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）類、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などがある。
【００２６】
本発明で使用するステビア植物（学名：Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）は、南アメリカを原産とするキク科ステビア属の多年草である。現在、日本、中国、韓国などのアジアでも栽培されている。本発明では、特に、ステビア・レバウディアナ・ベルトニー（Ｓｔｅｖｉａ Ｒｅｂａｕｄｉａｎａ Ｂｅｒｔｏｎｉ）及びその類縁植物を好適に使用することができる。ステビア植物として、ステビア植物の茎、葉、蕾を持つ前の全草、成熟した植物の根や花も使用することができる。
【００２７】
ステビア植物は、甘味料として使用しうるステビオール配糖体を含み、ステビア植物から水などでステビオール配糖体を高濃度で抽出した粗ステビオール配糖体などもある。本発明では、予め調製したこのような粗ステビオール配糖体を酵母で発酵してもよい。
【００２８】
上記ステビア植物は、適期に収穫したものを生のまま使用することができ、収穫後に乾燥したものを使用することもできる。ステビア植物を所定サイズに切断、粉砕、その他によって細切し、または粉砕したものに水や酵母菌を加えて撹拌すると発酵が開始される。ステビア植物は、葉部及び茎部を選別して使用することが好ましい。
【００２９】
加える水の量は、発酵に必要なだけの量があれば良く、全体が湿る程度の量で十分である。発酵前のステビア植物は、テルペノイド配糖体による甘味を有するが、発酵が進行すると甘味が消失する。本発明では、甘味の消失を発酵終期の目安とする。このような甘味の消失は、常温で２〜３週間である。反応終了後、ステビア酵母発酵物を乾燥し、酵母菌の活性を停止する。乾燥温度は５〜３５℃である。
【００３０】
たとえば、ステビア酵母発酵物に、２〜３０倍量、好ましくは５〜２０倍量の１０〜５０（ｖ／ｖ）％アルコール水溶液、好ましくは２０〜４０（ｖ／ｖ）％アルコール水溶液を加え、残渣をろ別する。アルコールとしては、炭素数１〜５の一価アルコールが好適であり、特に好ましくはエタノールである。次いで、ろ液を濃縮した後に合成吸着剤に吸着させた後に、含水アルコール液で溶出する。含水アルコールのアルコール濃度は、３０〜９９(ｖ／ｖ）％であることが好ましく、より好ましくは５０〜９９(ｖ／ｖ）％、特に好ましくは８０〜９５(ｖ／ｖ）％である。このようにして得られた含水溶媒抽出物を用いて、上記ラブダン型ジテルペン化合物を得ることができる。
【００３１】
ステビア酵母発酵物の含水溶媒抽出物からラブダン型ジテルペン化合物（Ｉ）〜（Ｖ）を単離する際には、水のほか、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどの炭素数１〜１２の分岐を有していてもよいアルコール類、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルなどのエーテル類、ポリエチレングリコールなどのポリエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素などのハロゲン化炭素類、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテルなどの炭化水素類、ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素類、ピリジン類、超臨界二酸化炭素、油脂、ワックスその他のオイル類などを抽出溶媒として使用することができる。
【００３２】
また、分離精製の際には、液液分配、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、ゲルろ過、活性炭素処理、精密蒸留その他を単独で、またはこれらを組み合わせて行うことができる。これらは、使用した抽出溶剤の種類その他に応じて適宜選択できる。
【００３３】
一方、本発明の化合物（Ｉ）〜（ＩＶ）は光学異性体を含むため、溶媒やカラムクロマトによる分離精製が容易でない場合がある。ラセミ体に置換基を導入して誘導体とし、この誘導体でカイラルセパレーションを行い、光学異性体を単離した後に加水分解して導入基を除去してもよい。このような誘導体としてベンゾイル化合物があるが、誘導体の調製は、光学異性体を分離できることを条件に、ベンゾイル化に限定されるものではない。
【００３４】
なお、光学異性体を分離精製する際に、置換基を導入して誘導体化を行い、単離後に加水分解工程を経るため、ステビア酵母発酵物に本来含有された際の化学構造を維持していない可能性があってもよい。いずれにしても、上記式（Ｉ）〜（Ｖ）で示す化合物を製造することができるからである。ステビア植物の酵母発酵物を原料とすることで、極めて高い脱顆粒抑制効果を有する化合物を製造することができる。
【００３５】
本発明では、上記ラブダン型ジテルペン化合物（Ｉ）〜（Ｖ）の他、これらの医学的に許容可能な塩であってもよい。「医学的に許容可能な塩」とは、薬理学的に許容可能であり、かつ投与された被験者に対して略無毒の本発明の化合物である塩形態をいう。上記ラブダン型ジテルペン化合物の医薬的に許容可能な塩には、適切な無毒の有機酸または無機酸あるいは無機塩基から形成された従来の化学量論的酸追加塩または塩基追加塩がある。適切な無機酸は、たとえば、塩化水素酸、硫酸、またはリン酸などのハロゲン酸である。適切な有機酸は、たとえば、カルボン酸、ホスホン酸、またはスルホン酸であり、たとえば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシブチル酸、リンゴ酸、マレイン酸、マロン酸、サリチル酸、フマル酸、琥珀酸、アジピン酸、酒石酸、クエン酸、グルタル酸、２−または３−グリセロリン酸、ならびに当業者には周知の他の鉱物の酸である。塩は、従来の方式で塩を生成するために、自由塩基の形態を十分な量の所望の酸と接触させることによって製造される。酸性置換基を含む化合物も、無機塩基または有機塩基で塩を形成することが可能である。塩を形成するのに適切な塩基の例には、非限定的に、アルカリまたはアルカリ土類金属（たとえば、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、またはマグネシウム）水酸化物などの無機塩基、およびアンモニウム水酸化物から導出されたもの（たとえば、テトラメチルアンモニウム水酸化物などの第４アンモニウム水酸化物）がある。また、アンモニア、アルキルアミン、ヒドロキシアルキルアミン、Ｎ−メチルグルカミン、ベンジルアミン、ピペリジン、およびピロリジンなど、医薬的に許容可能なアミンで形成された塩も考慮される。カルボキシル基またはフェノール性ヒドロキシル基を有する化合物など、ある化合物は酸性である。フェノールの塩は、当業者には周知の手続きにより、上述された塩基のいずれかと共に酸性化合物を加熱することによって作成することができる。
【００３６】
本発明の第二は、下記式で示されるラブダン型ジテルペン化合物（ＩＩ）または（ＩＩＩ）、またはそれらの医学的に許容可能な塩を有効成分とする、脱顆粒抑制剤である。
【００３７】
【化３】
0006590658.tif 000004
【００３８】
ラブダン型ジテルペン化合物（Ｉ）〜（ＩＶ）は、光学異性体であり、物理化学的特性はほとんど同じである。しかしながら、肥満細胞におけるβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制効果を評価したところ、１３Ｒ１４Ｓの化合物（ＩＩ）は、既存の抗アレルギー薬であるテルフェナジンよりもβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制効果に優れることが判明した。また、化合物（ＩＩＩ）は、テルフェナジンとほぼ同等の脱顆粒抑制効果を発揮した。
【００３９】
ラブダン型ジテルペン化合物（ＩＩ）は１３Ｒ１４Ｓであり、化合物（Ｉ）とは１４位の立体配置のみが異なる。しかしながら、化合物（Ｉ）は脱顆粒抑制効果がほとんど観察されない。また、化合物（ＩＩＩ）は１３Ｓ１４Ｒであり、化合物（ＩＶ）とは１４位の立体配置のみが異なるが、化合物（ＩＶ）は脱顆粒抑制効果がほとんど観察されない。従来から、光学異性体間で特定の効果に相違が生じることは知られているが、９位の炭素原子に炭素数６の側鎖が導入されたラブダン型ジテルペン化合物において、前記側鎖の立体構造が異なるだけで脱顆粒抑制効果が相違し、かつ従来の抗アレルギー薬と同等またはそれ以上の脱顆粒抑制効果を発揮する化合物が含まれることは、従来、全く知られていなかった。
【００４０】
なお、脱顆粒抑制剤としては、ステロイド系化合物などが知られているが、本発明のラブダン型ジテルペン化合物は、ステロイド骨格を有しておらず、ステロイドホルモンに類似する副作用と切り離して脱顆粒抑制効果を奏すると推定され、安全性に優れる。
【００４１】
本発明のラブダン型ジテルペン化合物（ＩＩ）やラブダン型ジテルペン化合物（ＩＩＩ）は、肥満細胞の脱顆粒抑制効果に優れるため、脱顆粒抑制剤や抗アレルギー剤として使用することができる。塗布などの経皮投与のほか、口腔内投与や舌下投与などを含む経口投与でもよい。
【００４２】
脱顆粒抑制剤や抗アレルギーの外用の剤型としては、散剤、細粒、顆粒、錠剤、カプセル剤、丸剤、液剤、エキス剤、座剤、軟膏剤、硬膏剤、エアゾール、パップ剤、注射剤、点眼剤などがある。これら脱顆粒抑制剤における上記化合物の配合量は、基材によって適宜選択しうるが、０．００００１％〜２０質量％、好ましくは０．０００１％〜５質量％、より好ましくは０．００１〜３質量％である。
【００４３】
本発明の脱顆粒抑制剤には、その効果を損なわない限り、通常の化粧品、医薬部外品、医薬品などに配合される成分を配合することができる。このような成分としては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル、フェノキシエタノール、チモールなどの保存料、亜硫酸水素ナトリウム、アスコルビン酸、トコフェロール、ジブチルヒドロキシトルエン、エデト酸ナトリウム水和物、ベンゾトリアゾールなどの抗酸化剤、モノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸ソルビタン、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、ポリソルベート６０などの界面活性剤、クエン酸水和物、クエン酸ナトリウム水和物、乳酸、ジイソプロパノールアミン、酢酸、酢酸ナトリウム水和物などのｐＨ調製剤、保湿剤、増粘剤、無機充填剤、着色料、香料、紫外線吸収剤、細胞賦活剤、各種皮膚栄養成分などがある。
【実施例】
【００４４】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。
【００４５】
（実施例１）
（１）ステビア酵母発酵物の調製
日本国北海道産のステビア植物（学名：Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）の茎と葉とを乾燥させた乾燥ステビア植物を約１ｃｍ以下に粉砕した。粉砕ステビア植物１．２ｋｇに酵母菌（サッカロマイセス・セレビシエ）２７ｇ、水２．３リットルを加えて温度２５〜３５℃の条件下に撹拌し発酵を開始させた。これを温度２５〜３５℃にて１４日間静置し、発酵物の甘味が消失したときを発酵終期とした。温度２５〜３５℃にて１０日間乾燥させ、酵母発酵を停止させ、ステビア発酵物を得た。
【００４６】
（２）含水溶媒抽出物の調製
前記ステビア発酵物の全量に、１０質量倍量の３０．０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液を加え、穏やかに攪拌しながら数日、常温にて浸潤させた。浸潤後、１４０メッシュ程度の大きさでろ過した。得られたろ液を６０℃で減圧濃縮（６０ｍｍＨｇ）し、ダイヤイオンＨＰ２０カラムに吸着させた後に９０％含水エタノール液で溶出し、これをステビア発酵物含水溶媒抽出物とした。
【００４７】
（３）化合物（Ｉ）〜（ＩＶ）の抽出
図２の分離工程図に従い、ステビア発酵物含水溶媒抽出物を１０００ｍＬのクロロホルムに溶解後、１０００ｍＬの水を添加し、クロロホルム層と水層とに分離した後、水層に１０００ｍＬの酢酸エチルを加え、酢酸エチル層と水層に分離した。さらに水層に１０００ｍＬのｎ−ブタノールを添加し、ブタノール層と水層とに分離し、ブタノール層（１９．２ g）を分取した。
【００４８】
次いで、ブタノール層（１９．２g）をクロロホルム：メタノール：水＝８０：４０：１→３０：１５：１→６：４：１→メタノールを溶出溶媒とし、シリカゲルカラムクロマトグラフィーより５つのフラクションに分離した。各フラクションの収量を図２に示す。
【００４９】
フラクション１(４．６１g)を、クロロホルム：メタノール＝１０：１→７：１→５：１→３：１→メタノールを溶出溶媒とし、シリカゲルカラムクロマトグラフィーより５つのフラクションに分離した。
【００５０】
フラクション１−４(１．３７g)を、メタノールを溶出溶媒とし、セファデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーより５つのフラクションに分離した。
【００５１】
フラクション１−４−２(１．０１g)を、クロロホルム：メタノール＝３０：１→１５：１→７：１→３：１→１：１→メタノールを溶出溶媒とし、シリカゲルカラムクロマトグラフィーより５つのフラクションに分離した。
【００５２】
フラクション１−４−２−３(５８．１ｍｇ)を、メタノール：水＝５０：５０→６０：４０を溶出溶媒とし、ＯＤＳカラムクロマトグラフィーより４つのフラクションに分離した。
【００５３】
得られた１−４−２−３−２フラクション（８．０ｍｇ）に、以下に示すベンゾイル化反応と反応生成物の精製方法に従いベンゾイル化を行い、含まれる２種のベンゾイル誘導体を単離し、単離後、各誘導体を水酸化ナトリウムで加水分解した。
【００５４】
ベンゾイル化反応と反応生成物の精製方法：
フラクション１−４−２−３−２の全量をピリジン２ｍＬに溶解し、ＤＭＡＰ６ｍｇとベンゾイルクロライド１００μｌを加えて室温で1時間反応させた。反応終了後、反応液にベンゼンと水を加えて分配抽出し、ベンゼン層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、およびエバポレーターで溶媒を留去した。これを、カラム内径１．５ｃｍ、カラム高さ１５．７ｃｍのＯＤＳカラムを使用し、ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝４：１を溶出溶媒とし、ベンゾイル誘導体を得た。ついで、ベンゾイル誘導体を、下記ＨＰＬＣ条件でカイラルセパレーションした。溶出時間２２分、および２５分にて、それぞれ誘導体を分取した。
【００５５】
（ＨＰＬＣ条件）
ポンプ：センシューＳＳＣ−３４６１
検出器：センシューＳＳＣ−５４１０
カラム：ダイセルＣＨＩＲＡＬＰＡＫＩＥ    １ｃｍ×２５ｃｍ
検出波長：２５４ｎｍ
溶出溶媒：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝５０：１
【００５６】
次いで、これらベンゾイル誘導体を、それぞれメタノール１ｍＬに溶かし、２００μｌの１Ｎ−ＮａＯＨを加えて室温で１時間反応させた。反応物はそのままエバポレーターにて溶媒を留去した。これを、カラム内径１．５ｃｍ、カラム高さ１２ｃｍのＯＤＳカラムを使用し、ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝７：３を溶出溶媒とし、１５ｍＬずつ分取し、２種の加水分解物を得た。これらは、いずれも無色オイル状物であった。
【００５７】
得られたフラクション１−４−２−３−３についても上記と同様にベンゾイル化反応と反応生成物の精製し、２種の加水分解物を得た。これらはいずれも無色オイル状物であった。
【００５８】
（４）化合物（Ｖ）の抽出
前記したステビア発酵物含水溶媒抽出物の溶媒を留去した抽出物（６０ｇ）にクロロホルム１０００ｍＬを加え、温度２３〜２８℃（室温）で抽出した。残渣をろ過により除き、クロロホルム層（２８．８４ｇ）と、残渣とに分け、この残渣に１０倍量のメタノールを添加し、２５．９８ｇのメタノール抽出物を得た。
【００５９】
メタノール抽出液（２５．９８g）を、クロロホルム：メタノール：水＝８０：４０：１→３０：１５：１→６：４：１→メタノールを溶出溶媒としたシリカゲルカラムクロマトグラフィーより３つのフラクションに分離した。各フラクションの収量を図３に示す。
【００６０】
フラクション１’(８．３８g)を、クロロホルム：メタノール＝１０：１→７：１→５：１→３：１→１：１→メタノールを溶出溶媒としたシリカゲルカラムクロマトグラフィーより６つのフラクションに分離した。
【００６１】
フラクション１’−３(１．３６ｇ)を、メタノール：水＝５０：５０→６０：４０を溶出溶媒とするＯＤＳカラムクロマトグラフィーより５つのフラクションに分離した。
【００６２】
１’−３−３フラクション(２３５．４ｍg)を、クロロホルム：メタノール＝１５：１→１０：１→メタノールを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーより７つのフラクションに分離した。
【００６３】
フラクション１’−３−３−５(１２．３ｍｇ)を、メタノール：水＝５０：５０→６０：４０を溶出溶媒とするＯＤＳカラムクロマトグラフィーより５つのフラクションに分離した。
１’−３−３−５−２フラクション（４．４ｍｇ）は無色オイル状物であった。
【００６４】
（５）構造決定
図２に示すフラクション１−４−２−３−２から単離した２種の無色オイル状物、およびフラクション１−４−２−３−３から単離した２種の無色オイル状物、並びに図３に示すフラクション１’−３−３−５−２から単離した無色オイル状物について、１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲを測定した。結果を表１および表２に示す。なお、表１の下部にラブダン型ジテルペン化合物の基本骨格と位置番号とを示す。１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲのシグナルパターンより、炭素数２０であり、すでにステビアより単離報告のあるステレビンＡとＡ環、Ｂ環は同じ構造を有し、９位の側鎖が異なる化合物と推定された。
【００６５】
Ｃ２０Ｈ３６Ｈ６の分子式を有する、フラクション１−４−２−３−２から単離した２種の無色オイル状物、フラクション１−４−２−３−３から単離した２種の無色オイル状物について、詳細な構造解析を行った。
まず、フラクション１−４−２−３−３の単離物の一方について、１Ｈ−１ＨＣＯＳＹ相関およびＨＭＰＣ相関を評価した。その結果、９位の水素原子と１１位の水素原子、および１１位の水素原子と１２位の水素原子、１４位の水素原子と１５位の水素原子の１Ｈ−１ＨＣＯＳＹ相関、および１６位の水素原子と１２位、１３位および１４位の炭素原子のＨＭＰＣ相関が観察され、前記式（Ｉ）に示すラブダン型ジテルペン化合物（Ｉ）と決定した。また、他方はＮＭＲの結果が化合物（Ｉ）と同じであること、およびＸ線解析によって、１４位の炭素原子のみが相違する化合物であると結論されたことから、化合物（Ｉ）の１４位の炭素原子の立体配置が異なる光学異性体と決定した。
同様に、フラクション１−４−２−３−２の単離物の一方について、上記と同様に解析して化合物（ＩＩＩ）と決定し、他方を１４位の炭素原子の立体配置が相違する化合物（ＩＶ）と決定した。それぞれの収量を図２に示す。
【００６６】
一方、フラクション１’−３−３−５−２の単離物は、分子式Ｃ２０Ｈ３６Ｈ５の分子式を有し、１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲがラブダン型ジテルペン化合物（Ｉ）と類似し、９位の側鎖が異なり、この側鎖はメチレン、オレフィン系炭素および水素、グリコールおよびメチル基からなると推定された。そこで、１Ｈ−１ＨＣＯＳＹ相関およびＨＭＰＣ相関を評価した。その結果、９位の水素原子と１１位の水素原子、および１１位の水素原子と１２位の水素原子、１４位の水素原子と１５位の水素原子の１Ｈ−１ＨＣＯＳＹ相関、および１６位の水素原子と１２位、１３位および１４位の炭素原子のＨＭＰＣ相関が観察され、化合物（Ｖ）と決定した。
【００６７】
【表１】
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【００６８】
【表２】
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【００６９】
【化４】
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【００７０】
（実施例２）
培養細胞を用いたβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制を脱顆粒反応の指標として、実施例１で得た化合物（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の、抗アレルギー作用を評価した。
（１）  肥満細胞のモデルとしてラット好塩基球白血病細胞ＲＢＬ−２Ｈ３（ＪＣＲＢ００２３）を使用した。培地は１０％ウシ胎児血清（バイオロジカルインダストリー製）、１００Ｕ／ｍＬペニリシン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ギブコ社製）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ギブコ社製）を用い、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養を行った。
（２）  実施例１で得た化合物（Ｉ）〜（ＩＶ）に、それぞれＤＭＳＯを加えて１０ｍｇ／ｍＬの試料溶液を調製した。各化合物の濃度は、終濃度５０μｇ／ｍＬであり、ＤＭＳＯ濃度は０．５％であった。
（３）ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を２４ウェルプレートに５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で４００μＬずつ播種した。マウスモノクローナル抗ＤＮＰ−ＩｇＥ抗体（ヤマサ株式会社製）を終濃度０．４５μｇ／ｍＬになるよう培養液に加え一晩３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。上澄を除去し、５００μＬのシラガニアン緩衝液（１１９ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、０．４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、４０ｍＭ  ＮａＯＨ）で２回洗浄し、１６０μＬのリリーシング緩衝液（Ｄ−グルコース５．６ｍＭ、ＣａＣｌ２  １．０ｍＭ、ＢＳＡ０．１％を含むシラガニアン緩衝液）を加え、３７℃で１０分間培養し、２０μＬの試料溶液（終濃度５０μｇ／ｍＬ）を加えさらに１０分間培養した。その後、抗原溶液として２０μＬの２，４−ジニトロフェニル化ウシ血清アルブミン（ＤＮＰ−ＢＳＡ）（ＬＳＬ社製）を終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように加えてさらに１０分間、３７℃で反応させ細胞の脱顆粒を惹起させた。氷上で冷却し反応を止め、反応上澄を回収し、基質溶液（１ｍＭ  ｐ−ニトロフェニル−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（ナカライ社製）、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ  ４．５））５０μＬに反応上澄５０μＬを加え、３７℃で６０分間反応させた。次いで、０．１ＭのＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３緩衝液（ｐＨ１０．０）を２００μＬ加え、反応生成物の４０５ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（東ソー社製）にて測定した。細胞に抗体処理をせずに抗原のみを加えた反応上澄をコントロールとし、化合物（Ｉ）に代えてテルフェナジンを同量加えたものをポジティブコントロールとした。各化合物およびポジティブコントロールのコントロール比（％）、およびβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制（％）をそれぞれの吸光度から以下の式により算出した。結果を表３に示す。
【００７１】
コントロール比（％）＝｛（Ｃ−Ｄ）／（Ａ−Ｂ）｝×１００
β−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制（％）＝｛１−（Ｃ−Ｄ）／（Ａ−Ｂ）｝×１００
Ａ：陽性対照の吸光度（試料の代わりにシラガニアン緩衝液を添加し、抗原刺激したもの）
Ｂ：陰性対照の吸光度（試料と抗原の代わりにシラガニアン緩衝液を添加したもの）
Ｃ：検体の吸光度（試料と抗原を添加したもの）
Ｄ：検体対照の吸光度（試料を添加し、抗原の代わりにシラガニアン緩衝液を添加したもの）
【００７２】
(結果）
ポジティブコントロールとして使用したテルフェナジンは、ヒスタミンＨ１受容体拮抗作用を有する第二世代抗ヒスタミン薬である。化合物（Ｉ）〜（ＩＶ）は、いずれもコントロールよりβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制を示した。特に、化合物（ＩＩ）は、コントロールと統計学的有意にβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制効果を示し、および化合物（ＩＩＩ）もテルフェナジンと同等のβ−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制効果を示した。
【００７３】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明の新規ラブダン型ジテルペン化合物（ＩＩ）および（ＩＩＩ）は、脱顆粒抑制効果に優れ、抗アレルギー剤等として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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