(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
青蒿とプロポリスとからなる原材料から作られる漢方薬抽出物であって、前記青蒿と前記プロポリスとの質量比は３：５〜５：３である漢方薬抽出物。
【請求項２】
請求項１に記載の漢方薬抽出物を製造する方法であって、青蒿とプロポリスとを抽出する工程を有する、製造方法。
【請求項３】
前記抽出する工程における抽出用溶媒は、アルコール類、アルカン、クロロフォルム、アセトン、水及び酢酸エチルからなる群から選択される一種又は複数種の混合物である、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記抽出の方法は、パーコレーション法、浸漬法、煎出法、還流抽出法、連続還流抽出法、超臨界流体抽出法又は超音波抽出法である、請求項２に記載の製造方法。
【請求項５】
ＣａＮ−ＮＦ−ＡＴ経路阻害剤の製造における、請求項１に記載の漢方薬抽出物、又は、請求項２から４のいずれか一項に記載の製造方法によって作られる漢方薬抽出物の使用方法。
【請求項６】
皮膚炎症又は自己免疫性疾患の治療用の薬剤の製造における、請求項１又は２に記載の漢方薬抽出物の使用方法、又は、請求項２から４のいずれか一項に記載の製造方法によって作られる漢方薬抽出物の使用方法。
【請求項７】
請求項１に記載の漢方薬抽出物、又は、請求項２から４のいずれか一項に記載の製造方法によって作られる漢方薬抽出物を含む、皮膚炎症又は自己免疫性疾患の治療用の薬剤。
【請求項８】
アレルギー緩和用又は抗アレルギー用化粧品の製造における、請求項１に記載の漢方薬抽出物、又は、請求項２から４のいずれか一項に記載の製造方法によって作られる漢方薬抽出物の使用方法。
【請求項９】
請求項１に記載の漢方薬抽出物、又は、請求項２から４のいずれか一項に記載の製造方法によって作られる漢方薬抽出物を含む、アレルギー緩和用又は抗アレルギー用の化粧品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、ここにその開示を参考文献として合体させる、２０１５年７月３０日出願の、「漢方薬抽出物、その製造方法及び使用方法」と題する中国特許出願第２０１５１０４６６５４４．１号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、漢方薬の分野に属し、特に、漢方薬抽出物、その製造方法及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
カルシニューリン（ｃａｌｅｉｎｅｕｒｉｎ，ＣａＮ）、別名：プロテインホスファターゼ２Ｂ（ＰＰ２Ｂ）は、セリン／トレオニンプロテインホスファターゼファミリに属する。今日まで、ＣａＮは、Ｃａ２＋カルモジュリン（ＣａＭ）によって調節される唯一のセリン／トレオニンプロテインホスファターゼである。ＣａＮは、その基質からリン酸を除去することによってその機能を果たす。Ｔ細胞においては、Ｃａ２＋の流入によって細胞内Ｃａ２＋濃度が増大し、Ｃａ２＋がＣａＭとＣａＮとに結合してＣａＮを活性化する。活性化したＣａＮがその基質ＮＦ−ＡＴからリン酸を除去した後、細胞核に入りＩＬ−２を含むいくつかのサイトカインの発現をトリガする。ＣａＮ−ＦＮ−ＡＴ経路は、Ｔ細胞活性化において重要な調節の役割を果たす。
【０００４】
現在、カルシニューリン阻害剤は、臨床において最も効果の高い免疫抑制物質であり、臓器移植、移植拒絶反応の制御、自己免疫性疾患（ＲＡ、ＣＤ、乾癬）の治療に使用される。とりわけ、カルシニューリン阻害剤は、近年、皮膚アレルギーと皮膚の炎症（湿疹等）の治療に十分な効果を示した。免疫抑制物質としては、カルシニューリン阻害剤（ＣＮＩｓ）は、外因性阻害剤と内因性たん白質阻害剤とに分類される。外因性阻害剤は、シクロスポリン、タクロリムス等を含む。内因性たん白質阻害剤は、カイン（Ｃａｉｎ）、ＦＫＢＰ３８等を含む。目下、臨床における最も一般的なＣＮＩｓは、シクロスポリンＡ、タクロリムス、ピメクロリムスといったアスコマイシン誘導体である。これらの阻害剤は、類似する物理化学的性質、作用機構及び効果を有するが、それらの毒性と副作用（腎毒性、高血糖等）が、それらの利用において大な障害となっている。従って、ＣａＮ−ＮＦ−ＡＴ経路を標的とするより効果的且つ安全なカルシニューリン阻害剤が、新しいタイプの皮膚炎症薬開発において重要となっている。
【０００５】
漢方薬は中国における伝統的な医薬であって、臨床上では、漢方薬は、皮膚の炎症（湿疹等）と自己免疫性疾患との治療において良好な作用効果を示している。最近の研究成果によって、漢方薬中のある種の活性成分（ケルセチン、ケンフェロール、フェノールゴシポール等）は、ＣａＮに直接結合してその活性を抑制することができることが判った。又、漢方薬中のある種の活性成分（コルジセピン、ファレロール、フィセチン等）は、細胞レベルにおいてＣａＮ−ＮＦ−ＡＴ経路の活性を抑制し、それによってＴｈ１及びＴｈ２サイトカインの発現と、更には、Ｔ細胞の活性、を抑制することができる。漢方薬は、幅広い原料、低コスト及び低毒性といった性質を有するので、それは広く用いられるべきである。合理的な漢方薬処方により、漢方薬は、皮膚炎症の治療において西洋医薬に遜色しない治療効果を示し、抗アレルギー用及びアレルギー緩和用化粧品に使用することが可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記に鑑みて、本発明の課題は、漢方薬抽出物、その製造方法及び使用方法を提供することにある。本発明において提供される漢方薬抽出物は、ＣａＮ−ＮＦ−ＡＴ経路を効果的に阻害することができ、皮膚の炎症又は自己免疫性疾患、例えば、湿疹の治療において効果を示すことができる。更に、本発明において提供される漢方薬組成物は、広範囲の原材料源を有し、その製造方法が簡易であり、大量生産に適している。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明において提供される漢方薬抽出物は、青蒿とプロポリスとから作られる。
【０００８】
本発明の一実施例において、青蒿とプロポリスとの質量比は３：５〜５：３である。
【０００９】
いくつかの実施例において、青蒿とプロポリスとの質量比は３：５である。
【００１０】
いくつかの実施例において、青蒿とプロポリスとの質量比は５：３である。
【００１１】
青蒿は、キク科に属するクソニンジン（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ  Ｌ）の乾燥した地上部分である。青蒿は、アルテミシン類化合物、フラボノイド類といった種々の活性物質を含み、清熱、暑気除去、除蒸、マラリア予防といった作用を有する。それは熱射病、陰虚潮熱、夜熱朝寒、骨蒸労熱、マラリア、湿熱、黄疸を治療するために使用される。
【００１２】
プロポリスは、ミツバチ科の動物がハチの巣を補強するときに分泌される黄褐色又は黒茶色のねばねばした物質である。それは漢方薬として使用可能である。プロポリスは、温和な性質を有し、苦味、辛味、及び薄い甘味を有する。最近の研究によって、プロポリスは豊富なフラボノイド類、アミノ酸、ビタミン及び有機酸を含有していることが示されている。プロポリスは、皮膚の湿潤を保ち、皮膚の成長を促進し、炎症を抑制し、痛みを無くす作用を有する。それは胃潰瘍、口腔潰瘍、熱傷、火傷、皮膚のひび割れの治療及び放射線保護に使用することができる。
【００１３】
本発明において、青蒿とプロポリスとの組み合わせから抽出することによって得られる前記抽出物は、ＣａＮ−ＮＦ−ＡＴ経路を効果的に抑制して、その効果が青蒿又はプロポリス単体の効果よりも遥かに優れている。又、実験によって、本発明によって提供される前記抽出物は比較的低い細胞毒性を有することが示されている。
【００１４】
本発明によって提供される漢方薬抽出物の製造方法は、青蒿とプロポリスとを抽出する工程を含む。
【００１５】
本発明の実施例において、抽出工程における抽出用溶媒は、アルコール類、アルカン、クロロフォルム、アセトン、水及び酢酸エチルからなる群から選択される一種又は二種以上の混合物である。
【００１６】
いくつかの実施例において、アルコール類は、エタノール、メタノール、グリセロール、ブタンジオール、グリコール、ペンチレングリコール及びヘキシレングリコールからなる群から選択される一種又は二種以上の混合物である。
【００１７】
いくつかの実施例において、アルカンは、メタン、エタン、又は石油エーテルである。
【００１８】
いくつかの実施例において、抽出用の溶媒は、エタノール−水溶液である。
【００１９】
いくつかの実施例において、前記抽出用の溶媒は、９５％（体積百分率）のエタノールを含むエタノール−水溶液である。
【００２０】
本発明の一実施例において、抽出方法は、パーコレーション法、浸漬法、煎出法、還流抽出法、連続抽出法、超臨界流体抽出法又は超音波抽出法である。
【００２１】
本発明の一実施例において、抽出温度は、室温、高温又はインテリジェント温度調節であり、抽出圧は真空、高圧又は常圧である。
【００２２】
本発明の一実施例において、本発明において提供される漢方薬抽出物の製造方法は、パーコレーション法によって抽出を行い、抽出溶媒としてエタノール−水溶液を使用して青蒿とプロポリスとを抽出する工程と、濾液を濃縮する工程とを有する。
【００２３】
いくつかの実施例において、パーコレーション法によって抽出を行い、抽出溶媒中のエタノールは、９５％（体積百分率）である。
【００２４】
いくつかの実施例において、パーコレーション法によって抽出を行い、使用されるエタノール−水溶液の質量は、青蒿とプロポリスとの質量の合計の２０〜３０倍である。
【００２５】
いくつかの実施例において、パーコレーション法によって抽出を行い、使用されるエタノール−水溶液の質量は、青蒿とプロポリスとの質量の合計の２０倍、２５倍又は３０倍である。
【００２６】
いくつかの実施例において、前記パーコレーション法による抽出の時間は４０時間〜６０時間である。
【００２７】
いくつかの実施例において、前記パーコレーション法による抽出の時間は４８時間である。
【００２８】
いくつかの実施例において、パーコレーション法によって抽出を行い、低温減圧下で濃縮を行う。
【００２９】
いくつかの実施例において、パーコレーション法によって抽出を行い、前記濾溶液は、青蒿とプロポリスとの質量の合計と同じ質量になるまで濾液を濃縮する。
【００３０】
本発明の一実施例において、本発明において提供される前記漢方薬抽出物の製造方法は、抽出溶媒としてメタノールを使用して、パーコレーション法によって青蒿とプロポリスとを抽出する工程と、濾過された抽出物溶液を濃縮する工程とを有する。
【００３１】
いくつかの実施例において、パーコレーション法によって抽出を行い、メタノールの量は、青蒿とプロポリスとの合計質量の３０倍である。
【００３２】
いくつかの実施例において、パーコレーションによる抽出の時間は４８時間である。
【００３３】
いくつかの実施例において、パーコレーションによって抽出を行い、濾液の質量が、青蒿とプロポリスとの合計質量と同じとなるように濾液を濃縮する。
【００３４】
本発明の一実施例において、本発明において提供される漢方薬抽出物の製造方法は、抽出溶媒としてクロロフォルムを使用し、連続還流法によって青蒿とプロポリスとを抽出する工程と、濾抽出物液を濃縮する工程とを有する。
【００３５】
いくつかの実施例において、連続還流法によって抽出を行い、クロロフォルムの質量は、青蒿とプロポリスとの合計質量の１０倍である。
【００３６】
いくつかの実施例において、連続還流法による抽出の時間は２４時間である。
【００３７】
いくつかの実施例において、連続還流法によって抽出を行い、濾液の質量が青蒿とプロポリスとの合計質量と同じになるまで濃縮される。
【００３８】
本発明の一実施例において、本発明において提供される前記漢方薬抽出物の製造方法は、抽出溶媒として酢酸エチルを使用して還流抽出法によって青蒿とプロポリスとを抽出する工程と、濾液を濃縮する工程とを有する。
【００３９】
いくつかの実施例において、還流法によって抽出を行い、酢酸エチルの質量が青蒿とプロポリスとの合計質量の１０倍である。
【００４０】
いくつかの実施例において、還流法による抽出の時間は３６時間である。
【００４１】
いくつかの実施例において、還流法によって抽出を行い、濾液の質量が青蒿とプロポリスとの合計質量と同じとなるように濾液を濃縮する。
【００４２】
本発明の一実施例において、本発明において提供される漢方薬抽出物の製造方法は、抽出溶媒としてブタンジオール又はアセトンを使用して超音波法によって青蒿とプロポリスとを抽出する工程と、濾抽出物液を濃縮する工程とを有する。
【００４３】
いくつかの実施例において、超音波法によって抽出を行い、前記溶媒の質量が青蒿とプロポリスとの合計質量と同じである。
【００４４】
いくつかの実施例において、超音波法によって抽出を行い、温度が１８℃〜５０℃で、時間が１時間〜３時間である。
【００４５】
いくつかの実施例において、超音波法によって抽出を行い、抽出液の質量が、青蒿とプロポリスとの合計質量と同じとなるように抽出液に対して定量を行う。
【００４６】
本発明の一実施例において、本発明において提供される漢方薬抽出物の製造方法は、抽出溶媒として石油エーテルを使用して浸漬法によって青蒿とプロポリスとを抽出する工程と、濾液を濃縮する工程とを有する。
【００４７】
いくつかの実施例において、浸漬法によって抽出を行い、石油エーテルの質量が、青蒿とプロポリスとの合計質量の３０倍である。
【００４８】
いくつかの実施例において、浸漬法による抽出の時間は４８時間である。
【００４９】
いくつかの実施例において、浸漬法によって抽出を行い、濾液の質量が、青蒿とプロポリスとの合計質量と同じとなるように濾液を濃縮する。
【００５０】
本発明の一実施例において、本発明において提供される漢方薬抽出物の製造方法は、水中での煎出法によって青蒿とプロポリスとを抽出する工程と、濾液を濃縮する工程とを有する。
【００５１】
いくつかの実施例において、煎出法によって抽出を行い、水の質量が、青蒿とプロポリスとの合計質量の３０倍である。
【００５２】
いくつかの実施例において、煎出法による抽出では、煎出時間が４８時間であり、煎出温度が９８℃〜１０５℃である。
【００５３】
いくつかの実施例において、濾液の質量が、青蒿とプロポリスとの合計質量のと同じとなるように濾液を濃縮する。
【００５４】
本発明の一実施例において、本発明において提供される漢方薬抽出物の製造方法は、共溶媒としてエタノールを使用して超臨界流体抽出によって青蒿とプロポリスとを抽出する工程と、濾液を濃縮する工程とを有する。
【００５５】
いくつかの実施例において、共溶媒の質量は、青蒿とプロポリスとの合計質量の３０倍である。
【００５６】
いくつかの実施例において、抽出圧は３３Ｍｐａ〜３５Ｍｐａ、抽出温度は５０℃、抽出時間は４８時間、ＣＯ２流速は１５Ｌ／ｈ〜２５Ｌ／ｈである。
【００５７】
いくつかの実施例において、濾液の質量が、青蒿とプロポリスとの合計質量と同じとなるように濾液を濃縮する。
【００５８】
本発明によって提供される漢方薬抽出物の製造方法は、簡易なものであり、容易に操作することができ、複雑な機器を必要とせず、大量生産に適している。
【００５９】
本発明は、ＣａＮ−ＮＦ−ＡＦ経路阻害剤の製造における漢方薬抽出物の使用方法を提供する。
【００６０】
本発明において、ＰＭＡとＡ２３１８７とによってＫ５６２細胞を誘導させ、そのＮＦ−ＡＴ遺伝子を活性化させて試験の対象とする。本発明によって提供される漢方薬抽出物をテストサンプルとして使用する。実験結果から、本発明によって提供される漢方薬抽出物が、ＣａＮ−ＮＦ−ＡＦ経路の活性化を効果的に抑制し、その抑制率は、青蒿又はプロポリスを単体として使用する場合と比べて遥かに良好で最高で６９．４３％に上ることを示している。本発明において提供される漢方薬抽出物はＣａＮ−ＮＦ−ＡＦ経路を劇的に抑制することができるので、当該漢方薬抽出物はＣａＮ−ＮＦ−ＡＦ経路を標的とする疾患を治療することができる。
【００６１】
本発明は、皮膚炎症又は自己免疫性疾患の治療薬の製造における漢方薬抽出物の使用方法を提供する。
【００６２】
好ましくは、皮膚炎症は湿疹である。
【００６３】
好ましくは、自己免疫性疾患は、ＲＡ、ＣＤ又は乾癬である。
【００６４】
本発明は、本発明にかかる漢方薬抽出物を含む、皮膚炎症又は自己免疫性疾患の治療薬を提供する。
【００６５】
本発明によって提供される膚炎症又は自己免疫性疾患の治療薬の剤型は、クリームである。
【００６６】
本発明は、アレルギー緩和用又は抗アレルギー用化粧品の製造における漢方薬抽出物の使用方法を提供する。
【００６７】
本発明は、本発明にかかる漢方薬抽出物を含む、アレルギー緩和用又は抗アレルギー用化粧品を提供する。
【００６８】
本発明は、青蒿とプロポリスとを原料として作られる抽出物を提供し、前記抽出物は、ＣａＮ−ＮＦ−ＡＦ経路を効果的に抑制することができ、その抑制効果が、青蒿又はプロポリスを単体として利用する場合と比べて遥かに優れた効果を有する。更に、本発明の実験結果から、本発明によって提供される前記抽出物は比較的低い細胞毒性を有するものであることが示されている。本発明にかかる漢方薬抽出物の製造方法は、簡易であり、容易に操作することができ、複雑な機器を必要とせず、大量生産に適している。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
本発明は、漢方薬抽出物、その製造方法及び使用方法を提供する。当業者は、本明細書を参照して工程上のパラメータを適宜に変更することで本発明を実現することができる。ここで、いかなる類似する置換や改変は当業者にとって自明的なものであれば、本発明の範囲内に包含されるものと見なされる。本発明にかかる方法、用途は、好適な実施例により説明されており、当業者であれば、本発明の内容を逸脱することなく本発明の精神及び範囲内において行われる適宜な変更又は組み合わせを行うことで、本発明の技術的手段を実現し、さらに応用することができる。
【００７０】
本発明において使用される機器及び試薬はいずれも市販品として入手可能なものである。
以下、本発明を実施例と結びつけてより詳細に説明する。
【００７１】
実施例１
３０ｇの青蒿と５０ｇのプロポリスとを２０倍質量の９５％エタノールに添加し、パーコレーション抽出を４８時間行った。濾液を収集し、低温減圧下で８０ｇまで濃縮することによって抽出物を得た。
【００７２】
実施例２
３０ｇの青蒿と５０ｇのプロポリスとを２５倍質量の９５％エタノールに添加し、パーコレーション抽出を４８時間行った。濾液を収集し低温減圧下で８０ｇまで濃縮することによって抽出物を得た。
【００７３】
実施例３
５０ｇの青蒿と３０ｇのプロポリスとを３０倍質量の９５％エタノールに添加し、パーコレーション抽出を４８時間行った。濾液を収集し低温減圧下で８０ｇまで濃縮することによって抽出物を得た。
【００７４】
実施例４
５０ｇの青蒿と３０ｇのプロポリスとを３０倍質量のメタノールに添加し、パーコレーション抽出を４８時間行った。濾液を収集し低温減圧下で８０ｇまで濃縮することによって抽出物を得た。
【００７５】
実施例５
４０ｇの青蒿と４０ｇのプロポリスとを１０倍質量のクロロフォルムに添加し、連続還流抽出（ソックスレー抽出）を室温で２４時間行った。濾液を収集し低温減圧下で８０ｇまで濃縮することによって抽出物を得た。
【００７６】
実施例６
３５ｇの青蒿と４５ｇのプロポリスとを１０倍質量の酢酸エチルに添加し、還流抽出を室温で３６時間行った。濾液を収集し低温減圧下で８０ｇまで濃縮することによって抽出物を得た。
【００７７】
実施例７
５０ｇの青蒿と３０ｇのプロポリスとを同質量のブタンジオールに添加し、超音波抽出を室温で２時間行った。濾液を収集し低温減圧下で８０ｇまで濃縮することによって抽出物を得た。
【００７８】
実施例８
５０ｇの青蒿と３０ｇのプロポリスとを同質量のプロパンジオールに添加し、超音波抽出を５０℃で２時間行った。濾液を収集し低温減圧下で８０ｇまで濃縮することによって抽出物を得た。
【００７９】
実施例９
５０ｇの青蒿と３０ｇのプロポリスとを３０倍質量の石油エーテルに添加し、浸漬抽出を室温で４８時間行った。濾液を収集し低温減圧下で８０ｇまで濃縮することによって抽出物を得た。
【００８０】
実施例１０
４５ｇの青蒿と３５ｇのプロポリスとを３０倍質量の水に添加し、煎じ出し抽出を４８時間行った。濾液を収集し低温減圧下で８０ｇまで濃縮することによって抽出物を得た。
【００８１】
実施例１１
３０ｇの青蒿と５０ｇのプロポリスとに対して下記条件下で超臨界流体抽出を行い、圧力が３３ＭＰａ〜３５ＭＰａ、温度が５０℃、時間が３．５時間、ＣＯ２が流速１５Ｌ／ｈ〜２５Ｌ／ｈ、エタノール共溶媒中のエタノール含有率が１５％（体積百分率）であった。濾液を収集し低温減圧下で８０ｇまで濃縮することによって抽出物を得た。
【００８２】
比較例１
８０ｇの青蒿を２５倍質量の９５％エタノールに添加し、パーコレーション抽出を４８時間行った。濾液を収集し低温減圧下で８０ｇまで濃縮することによって抽出物を得た。
【００８３】
比較例２
８０ｇのプロポリスを２５倍質量の９５％エタノールに添加し、パーコレーション抽出を４８時間行った。濾液を収集し低温減圧下で８０ｇまで濃縮することによって抽出物を得た。
【００８４】
比較例３
６０ｇの青蒿と２０ｇのプロポリスとを２５倍質量の９５％エタノールに添加し、パーコレーション抽出を４８時間行った。濾液を収集し低温減圧下で８０ｇまで濃縮することによって抽出物を得た。
【００８５】
比較例４
２０ｇの青蒿と６０ｇのプロポリスとを２５倍質量の９５％エタノールに添加し、パーコレーション抽出を４８時間行った。濾液を収集し低温減圧下で８０ｇまで濃縮することによって抽出物を得た。
【００８６】
実施例１２
テストサンプル：
すべての抽出物を７０％エタノール中に溶解し、脱イオン水中で０．２ｍｇ／ｍｌの使用液を調製した。測定時に、１０μｌのサンプルを試験管に添加し、測定される抽出物の最終濃度が０．２ｍｇ／ｍｌである。
【００８７】
ＣａＮ酵素活性テスト：
エンゾライフサイエンス社（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）のＣａＮ活性テストキット使用し、テストキットの説明書に従ってテストを行った。小径の遠心分離管に、２５μｌのＣａＭ使用液、５μｌのＣａＮ使用液、１０μｌの５０μＭのテストサンプル使用液とを添加すると共に、対照管において、１０μｌの０．５％ＤＭＳＯ水溶液を添加し、均一に混合させ、３０℃で１０分間インキュベートした。その後、１０μｌの基質希釈標準溶液を各管に添加し、よく混合した。３０℃で５０〜６０分間のインキュベーション後、１００μｌの顕色剤を添加しよく混合した。２０分間〜３０分間の放置後、各管から１３５μｌの溶液を９６ウェルプレートに移し、６２０ｎｍでの吸光度測定を行った。
【００８８】
活性化剤ＰＭＡ及びＡ２３１８７の最適濃度の決定：
ＣａＮ−ＮＦ−ＡＴ経路を活性化するＰＭＡとＡ２３１８７の最適濃度を決定するために、ＰＭＡを、２．５ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ及び４０ｎｇ／ｍｌの濃度で調製し、Ａ２３１８７を、０．１２５μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭ、１μＭ及び２μＭの濃度で調製した。各濃度は４つの反復ウェルを有するようにした。１８時間の活性化後、すべての実験グループの蛍光強度を１μｍで測定した。
【００８９】
測定方法
ＮＦＡＴレポータ遺伝子が常時発現されるＮＦＡＴ  Ｋ５６２レポータ安定細胞株をアフィメトリクス社（Ａｆｆｉｍａｔｒｉｘ）（米国）から購入した。Ｋ５６２細胞をＰＭＡ（プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤）及びＡ２３１８７（カルシウムチャンネル活性化剤）で処理した後、転写因子ＮＦＡＴによって調節されるルシフェラーゼ遺伝子の発現レベルを測定した。ルシフェラーゼレポータ遺伝子の発現レベルは、カルシニューリン（ＣａＮ）経路の活性レベルを反映する。結果を表１に示す。
【００９０】
表１は、ＰＭＡとＡ２３１８７の様々な濃度でのＫ５６２細胞ＮＦ−ＡＴレポータ遺伝子の発現に対する影響を示す。
【表１】
0006554181.tif 000002
【００９１】
表１に示されているように、ＰＭＡとＡ２３１８７は、投与量依存的にレポータ遺伝子の発現を活性化することができる。反復ウェル間の蛍光強度の読取値の差は、合理的な範囲に制御することが可能である。上記実験によって、カルシニューリン経路活性化剤の最適濃度が確定され、それぞれ、ＰＭＡの最適濃度が１０ｎｇ／ｍｌ、Ａ２３１８７の最適濃度が０．５μＭであった。
【００９２】
ＮＦＡＴレポータ遺伝子が常時発現されるＫ５６２細胞を、１０％胎児ウシ血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で従来式に二次培養した。健全な対数増殖期細胞を実験で使用した。細胞を、２ｘ１０５／ウェルの濃度で２４ウェルプレートで接種し、抽出物を含まないブランク対照グループと、ＰＭＡとＡ２３１８７を含まないブランク対照グループとを保留した。その他のウェルには、それぞれ、実施例１〜３及び比較例１〜５の抽出物を入れた。１時間のインキュベーション後、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）とＡ２３１８７（０．５μＭ）（チャンネル刺激剤）を添加して１８時間刺激し、その後、細胞を収集し、説明書の操作に従ってルシフェラーゼテストキットを使用することで蛍光強度（細胞中のＣａＮ経路の活性レベルを反映する）を１μｍで検出した。
【００９３】
抑制率の計算は以下の通りである。
抑制率（％）Ｗ＝［１−（Ｘ−Ａ）／（Ｂ−Ａ）］ｘ１００
ここで、Ａは１μｍのブランクの平均値、Ｂは１μｍの対照の平均値、Ｘは１μｍでの抽出物の平均値である。その結果を表２に示す。
【００９４】
表２はＫ５６２細胞中のＣａＮ−ＮＦ−ＡＴ経路に対する種々のサンプルの抑制率を示す。
【表２】
0006554181.tif 000003
【００９５】
表２に示されているように、青蒿とプロポリス中のフラボノイド類は、ＣａＮ−ＮＦ−ＡＴ経路を良好に抑制することができる。ＳＰＳＳ  １９．０版統計ソフトウェアを分析のために使用した。
【００９６】
実施例の平均値±標準偏差値：６８．３２％±１．５３％
【００９７】
比較例平均値±標準偏差値：４０．９３％±３．８１％
【００９８】
一元配置分散分析により、実施例と比較例との間に顕著な差があり、その差は統計学上に有意なものである（ｐ＜０．０１）。
【００９９】
統計分析の結果から、青蒿とプロポリスとの組み合わせは、青蒿又はプロポリスを単体として使用する場合よりも遥かに良好に作用効果を有することを示した。従って、本発明において提供される調合法（処方）は、ＣａＮ−ＮＦ−ＡＴ経路に対して良好な結果を有し、皮膚炎症（湿疹）及び自己免疫性疾患（ＲＡ、ＣＤ又は乾癬）等の、ＣａＮ−ＮＦ−ＡＴ経路を標的とする疾患の治療に使用可能である。
【０１００】
本発明の他の例からの抽出物によるＫ５６２細胞のＣａＮ−ＮＦ−ＡＴ経路に対する抑制率は、実施例１〜３の抽出物の抑制率と類似しており、いずれも、比較例１〜４の抽出物の抑制率に対して有意な差を有している。
【０１０１】
実施例１３
以下の工程を含む通常のＣＣＫ８アッセイによって、実施例１〜３と比較例１〜５との抽出物の細胞毒性を測定した
（１）１００μＬのＫ５６２細胞懸濁液（１ｘ１０５／ウェル）を９６ウェルプレートに入れ、インキュベータ内で２４時間（３７℃，５％ＣＯ２）インキュベートした。
（２）実施例１〜３及び比較例１〜５からの１０μＬの抽出物をウェルにそれぞれ添加し、そのほかに、６つのウェルを対照群とした。
（３）９６ウェルプレートをインキュベータ内で２４時間インキュベートした。
（４）１０μＬのＣＣＫ８溶液を各ウェルに添加した。
（５）９６ウェルプレートをインキュベータ内で４時間インキュベートした。
（６）ＥＬＩＳＡプレートリーダで吸光度（波長４５０ｎｍ）を測定した。
【０１０２】
細胞毒性の計算式：
相対毒性（％）  Ｗ＝［（Ａ−Ｘ）／Ａ］ｘ１００
ここで、ＡはブランクＯＤ４５０の平均値、Ｘは抽出物ＯＤ４５０の平均値である。
【０１０３】
表３は、本発明によって提供される抽出物の相対細胞毒性を示す。
【表３】
0006554181.tif 000004
【０１０４】
上記結果は、テストサンプルの細胞毒性間に統計学上に有意な差は存在しないことを示した。相対的細胞毒性はすべて極めて低かった。本発明において提供される抽出物は、天然の漢方薬から作られたので、非常に大きな副作用を有する西洋医薬又はホルモン剤の潜在的なリスクを回避するものであった。この抽出物は、抗湿疹用及び湿疹緩和用化粧品のための素材に供する。
【０１０５】
本発明の他の実施例で得られた抽出物は、実施例１〜３又は比較例１〜４で得られた抽出物と類似の相対細胞毒性を有する。
【０１０６】
以上の実施例は本発明の好適実施例に過ぎない。当業者は本発明の範囲内において適度な変更及び修飾を行うことができ、これらの適度な変更及び修飾は本発明の保護範囲内にあるものであることに留意すべきである。