(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識された抗体を製造する標識抗体の製造方法であって、
樹脂粒子に複数の金属粒子が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体を、ｐＨ２〜７の範囲内の条件で前記抗体と混合して標識抗体を得る工程を含むことを特徴とする標識抗体の製造方法。
【請求項２】
前記標識抗体をｐＨ２〜９の範囲内の条件で処理する工程、
をさらに含む請求項１に記載の標識抗体の製造方法。
【請求項３】
前記金属粒子が、金又は金合金の粒子である、請求項１又は２に記載の標識抗体の製造方法。
【請求項４】
前記樹脂−金属複合体における前記金属粒子は、
前記樹脂粒子外に露出した部位を有する第１の粒子と、
全体が前記樹脂粒子に内包されている第２の粒子と、
を含んでおり、
前記第１の粒子及び前記第２の粒子のうち、少なくとも一部の粒子が、前記樹脂粒子の表層部において三次元的に分布しているものである、請求項１から３のいずれか１項に記載の標識抗体の製造方法。
【請求項５】
前記樹脂粒子が、金属イオンを吸着することが可能な置換基を構造に有するポリマー粒子である、請求項１から４のいずれか１項に記載の標識抗体の製造方法。
【請求項６】
前記金属粒子の平均粒子径が１〜８０ｎｍの範囲内である、請求項１から５のいずれか１項に記載の標識抗体の製造方法。
【請求項７】
前記樹脂−金属複合体の平均粒子径が１００〜１０００ｎｍの範囲内である、請求項１から６のいずれか１項に記載の標識抗体の製造方法。
【請求項８】
前記抗体が、抗インフルエンザウィルス抗体である、請求項１から７のいずれか１項に記載の標識抗体の製造方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項に記載の標識抗体の製造方法によって製造された標識抗体。
【請求項１０】
請求項９に記載の標識抗体を用いることを特徴とする、免疫学的測定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば免疫学的測定に使用可能な標識抗体、その製造方法及び免疫学的測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内には、無数の化学物質が存在することから、生体内の特定の微量成分を定性的、定量的に分析することは、極めて重要である。医療、製薬、健康食品、バイオテクノロジー、環境等の分野において、生体内の特定の箇所（化学物質）にのみ作用する薬品及び食品、生体の僅かな変化を検出する分析装置及び診断薬等は、上記技術とともに発展してきた。
【０００３】
上記分析技術の一つに、イムノアッセイがある。これは、免疫学的測定法とも呼ばれ、免疫反応の一つである、抗原−抗体間における特異的な反応を利用し、微量成分を定性的、定量的に分析する方法である。抗原−抗体間反応は感度や反応の選択性が高いため、上記分野で広く用いられている。イムノアッセイは、その測定原理により、様々な測定法がある。例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ラテックス等の凝集法（ＬＩＡ、ＰＡ）、イムノクロマトグラフィー法（ＩＣＡ）、赤血球凝集法（ＨＡ）、赤血球凝集抑制法（ＨＩ）等が挙げられる。
【０００４】
イムノアッセイは、抗原及び抗体が反応し複合体を形成した際の変化（抗原、抗体または複合体の濃度変化）から、抗原または抗体を定性的または定量的に検出する。これらを検出する際に、抗体、抗原または複合体に標識物質を結合させることで、検出感度が増大する。そのため、標識物質の標識能力は、イムノアッセイにおける検出能力を左右する重要な要素であるといえる。上記に例示したイムノアッセイにおいても、標識物質として、赤血球（ＨＡの場合）、ラテックス粒子（ＬＩＡの場合）、蛍光色素（ＦＩＡの場合）、放射性元素（ＲＩＡの場合）、酵素（ＥＩＡの場合）、化学発光物質（ＣＬＩＡの場合）等が用いられている。
【０００５】
ところで、標識物質として着色した微粒子を用いた場合、特別な分析装置を用いることなく目視により検出を確認することができるため、より簡便な測定ができることが期待される。このような着色した微粒子として、例えば、特許文献１では、ポリマー系ラテックス粒子の表面に結合した金ナノ粒子からなる着色ラテックスが提案されている。ポリマー系ラテックス粒子の表面に金ナノ粒子を結合させることにより、該金ナノ粒子自身が着色剤として目視判定性や検出感度の向上に役立つ一方、金ナノ粒子自身が抗原又は抗体に対する結合性にも優れることから、充分な濃色となる程度にまで金ナノ粒子を結合させても充分な量の抗原又は抗体を結合させ得るとされている。
【０００６】
上記着色ラテックスは、スチレン−アクリル酸共重合体ラテックス及び金ナノ粒子の前駆体であるＨＡｕＣｌの分散液にガンマ線を照射することで、上記ラテックスの表面に金ナノ粒子を結合させたものである。しかし、上記着色ラテックスは、金ナノ粒子がラテックスの表面のみに結合されることから、表面プラズモン吸収が発現する金ナノ粒子の担持量に制限があるうえに、金ナノ粒子が脱離しやすい。その結果、免疫学的測定試薬としての視認性や感度が十分でない恐れがある。また、ガンマ線等の電磁放射線を照射するため、ラテックスにダメージを与える恐れがある。さらに、特許文献１の明細書中には、上記ラテックス径や金ナノ粒子径の好ましい範囲を開示しているが、実施例においてこれらの好ましい範囲で検証されているか明らかでなく、好ましい範囲の規定の根拠がない。
【０００７】
また、特許文献２では、金属金で被覆されたポリマーラテックス粒子が開示され、顕微鏡検査法及びイムノアッセイ法に利用可能な試薬への適用が示唆されている。しかし、上記金属金で被覆されたポリマーラテックス粒子は、ポリマーラテックス粒子の材質や粒径の開示がない。さらに、イムノアッセイ法に利用可能な試薬としての効果について検証がない。そのため、金属金及びポリマーラテックス粒子における試薬としての効果は不明である。
【０００８】
このような背景から、本発明者らは、先に、高感度な免疫学的測定を可能にする標識物質として、特定の構造の樹脂−金属複合体を提案した（特願２０１４−１３６３５５、特願２０１４−１３６３５６、特願２０１４−１３６３５７）。
【０００９】
ところで、ラテックス粒子と結合させた抗体には、凝集が生じやすいという欠点がある。そのため、例えば特許文献３では、標識としてラテックス粒子を用いる免疫測定用組成物において、抗体と結合したラテックス粒子の自然凝集を防止するため、ｐＨを９．０〜９．８に調整することが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００９−１６８４９５号公報
【特許文献２】特開平３−２０６９５９号公報
【特許文献３】特開２００７−３１５８８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
樹脂−金属複合体を免疫学的測定法における標識物質として使用するためには、抗体などのリガンドに安定的に結合させることが必要である。しかし、リガンドを樹脂−金属複合体によって標識する場合、安定的な結合状態を形成できたとしても、必ずしも優れた検出感度が得られるとは限らない。特に、樹脂−金属複合体の金属粒子を構成する金属種によって、検出感度が大きく低下する場合がある。
【００１２】
従って、本発明は、樹脂−金属複合体によって標識され、高感度な免疫学的測定が可能な標識抗体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、特定の構造を有する樹脂−金属複合体を特定の条件で抗体と結合させることによって、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は、標識された抗体を製造する標識抗体の製造方法であって、
樹脂粒子に複数の金属粒子が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体を、ｐＨ２〜７の範囲内の条件で前記抗体と混合して標識抗体を得る工程を含むことを特徴とする。
【００１５】
本発明の標識抗体の製造方法は、前記標識抗体をｐＨ２〜９の範囲内の条件で処理する工程、
をさらに含んでいてもよい。
【００１６】
本発明の標識抗体の製造方法は、前記金属粒子が、金又は金合金の粒子であってもよい。
【００１７】
本発明の標識抗体の製造方法は、前記樹脂−金属複合体における前記金属粒子が、
前記樹脂粒子外に露出した部位を有する第１の粒子と、
全体が前記樹脂粒子に内包されている第２の粒子と、
を含んでいてもよく、
前記第１の粒子及び前記第２の粒子のうち、少なくとも一部の粒子が、前記樹脂粒子の表層部において三次元的に分布しているものであってもよい。
【００１８】
本発明の標識抗体の製造方法は、前記樹脂粒子が、金属イオンを吸着することが可能な置換基を構造に有するポリマー粒子であってもよい。
【００１９】
本発明の標識抗体の製造方法は、前記金属粒子の平均粒子径が１〜８０ｎｍの範囲内であってもよい。
【００２０】
本発明の標識抗体の製造方法は、前記樹脂−金属複合体の平均粒子径が１００〜１０００ｎｍの範囲内であってもよい。
【００２１】
本発明の標識抗体の製造方法は、前記抗体が、抗インフルエンザウィルス抗体であってもよい。
【００２２】
本発明の標識抗体は、上記いずれかに記載の標識抗体の製造方法によって製造されたものである。
【００２３】
本発明の免疫学的測定法は、上記標識抗体を用いることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の標識抗体の製造方法によれば、樹脂−金属複合体をｐＨ２〜７の範囲内の条件で抗体と混合することによって、標識抗体の凝集が抑制されて、高感度な免疫学的測定が可能な標識抗体を製造できる。本発明により得られる標識抗体は、耐久性、視認性、目視判定性、検出感度に優れた材料として、例えば、ＥＩＡ、ＲＩＡ、ＣＬＩＡ、ＦＩＡ、ＬＩＡ、ＰＡ、ＩＣＡ、ＨＡ、ＨＩ等の免疫学的測定において有利に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の一実施の形態に係る樹脂−金属複合体の断面の構造を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、適宜図面を参照しながら、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
［標識抗体の製造］
本実施の形態の標識抗体の製造方法は、樹脂−金属複合体で標識された抗体を製造するものである。ここで、「抗体」としては、特に制限はなく、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、遺伝子組み換えにより得られた抗体のほか、抗原と結合能を有する抗体断片［例えば、Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等］などを用いることができる。また、免疫グロブリンとして、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれでもよい。抗体の産生動物種としては、ヒトをはじめ、ヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等）でもよい。抗体の具体例としては、抗ＰＳＡ抗体、抗ＡＦＰ抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗アデノウイルス抗体、抗インフルエンザウィルス抗体、抗ＨＣＶ抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＥ抗体等が挙げられる。
【００２７】
また、本実施の形態の標識抗体の製造方法において、標識として使用される樹脂−金属複合体は、樹脂粒子に複数の金属粒子が固定化された構造を有するものである。この樹脂−金属複合体の詳細については後述する。
【００２８】
本実施の形態の標識抗体の製造方法は、少なくとも、次の工程Ａ；
工程Ａ）樹脂−金属複合体をｐＨ２〜７の範囲内の条件で抗体と混合して結合させることによって、標識抗体を得る工程
を含み、好ましくは、さらに工程Ｂ； 
工程Ｂ）標識抗体をｐＨ２〜９の範囲内の条件で処理する工程
を含むことができる。
【００２９】
＜工程Ａ＞
工程Ａでは、樹脂−金属複合体をｐＨ２〜７の範囲内の条件で抗体と混合して標識抗体を得る。工程Ａは、固体状の樹脂−金属複合体を液相中に分散させた状態で抗体と接触させることが好ましい。この場合、樹脂−金属複合体と抗体との結合は、樹脂−金属複合体の分散と抗体の活性を維持したまま樹脂−金属複合体と抗体を均一に接触させる観点から、ｐＨ２〜７の範囲内の条件で行われ、さらに酸性条件、例えばｐＨ２．５〜５．５の範囲内が好ましい。樹脂−金属複合体と抗体とを結合させるときの条件が、ｐＨ２未満では強酸性により抗体が変質し失活する場合があり、ｐＨ７を超えると樹脂−金属複合体と抗体を混合した際に凝集し分散が困難となる。ただし、強酸性により抗体が失活しない場合はｐＨ２未満においても処理が可能である。
【００３０】
工程Ａは、ｐＨ２〜７の範囲内の条件に調整した結合用緩衝液（Binding  Buffer）中で行うことが好ましい。例えば、上記ｐＨに調整した結合用緩衝液に所定量の樹脂−金属複合体を混合し、十分に混和する。結合用緩衝液としては、例えば、所定濃度に調整したホウ酸溶液などを用いることができる。結合用緩衝液のｐＨの調整は、例えば塩酸、水酸化ナトリウムなどを用いて行うことができる。
【００３１】
次に、得られた混合液に、所定量の抗体を添加し、十分に撹拌、混合することによって、標識抗体含有液を得ることができる。このようにして得られた標識抗体含有液は、例えば遠心分離などの固液分離手段により、固形部分として標識抗体のみを分取できる。
【００３２】
＜工程Ｂ＞
工程Ｂでは、工程Ａで得られた標識抗体をｐＨ２〜９の範囲内の条件で処理することによって、標識抗体への非特異的な吸着を抑制するブロッキングを行う。この場合、固液分離手段によって分取しておいた標識抗体を、ｐＨ２〜９の範囲内の条件で液相中に分散させる。このブロッキングの条件は、抗体の活性を保ちかつ標識抗体の凝集を抑制する観点から、例えばｐＨ２〜９の範囲内であり、標識抗体の非特異的な吸着を抑制する観点から、さらに酸性条件、例えばｐＨ２〜６の範囲内が好ましい。ブロッキングの条件が、ｐＨ２未満では強酸性により抗体が変質し失活する場合があり、ｐＨ９を超えると標識抗体が凝集してしまい分散が困難となる。
【００３３】
工程Ｂは、ｐＨ２〜９の範囲内の条件に調整したブロック用緩衝液（Blocking  Buffer）を用いて行うことが好ましい。例えば、所定量の標識抗体に上記ｐＨに調整したブロック用緩衝液を添加し、ブロック用緩衝液中で標識抗体を均一に分散させる。ブロック用緩衝液としては、例えば、被検出物と結合しない蛋白質の溶液を用いることがこのましい。ブロック用緩衝液に使用可能な蛋白質としては、例えば牛血清アルブミン、卵白アルブミン、カゼイン、ゼラチンなどを挙げることができる。より具体的には、所定濃度に調整した牛血清アルブミン溶液などを用いることが好ましい。ブロック用緩衝液のｐＨの調整は、例えば塩酸、水酸化ナトリウムなどを用いて行うことができる。標識抗体の分散には、公知の方法が使用できるが、例えば超音波処理、ローテーターによる撹拌などの分散手段を用いることが好ましい。このようにして標識抗体が均一分散した分散液が得られる。
【００３４】
以上のようにして、標識抗体の分散液が得られる。この分散液から、例えば遠心分離などの固液分離手段により、固形部分として標識抗体のみを分取できる。また、必要に応じて、洗浄処理、保存処理など任意の工程を実施することができる。以下、洗浄処理、保存処理について説明する。
【００３５】
（洗浄処理）
洗浄処理は、固液分離手段によって分取した標識抗体に洗浄用緩衝液を添加し、洗浄用緩衝液中で標識抗体を均一に分散させる。分散には、例えば超音波処理などの分散手段を用いることが好ましい。洗浄用緩衝液としては、特に限定されるものではないが、例えばｐＨ８〜９の範囲内に調整した所定濃度の、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液、グリシンアミド緩衝液、アルギニン緩衝液などを用いることができる。洗浄用緩衝液のｐＨの調整は、例えば塩酸、水酸化ナトリウムなどを用いて行うことができる。標識抗体の洗浄処理は、必要に応じて複数回を繰り返し行うことができる。
【００３６】
（保存処理）
保存処理は、固液分離手段によって分取した標識抗体に保存用緩衝液を添加し、保存用緩衝液中で標識抗体を均一に分散させる。分散には、例えば超音波処理などの分散手段を用いることが好ましい。保存用緩衝液としては、例えば、上記洗浄用緩衝液に、所定濃度の凝集防止剤及び／又は安定剤を添加した溶液を用いることができる。凝集防止剤としては、例えば、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロースに代表される糖類や、グリセリン、ポリビニルアルコールに代表される多価アルコールなどを用いることができる。安定剤としては、特に限定されるものではないが、例えば牛血清アルブミン、卵白アルブミン、カゼイン、ゼラチンなどの蛋白質を用いることができる。このようにして標識抗体の保存処理を行うことができる。
【００３７】
以上の各工程では、さらに必要に応じて、界面活性剤や、アジ化ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステルなどの防腐剤を用いることができる。
【００３８】
＜標識抗体＞
以上のようにして標識抗体が製造することができる。本実施の形態の標識抗体は、従来の標識抗体と同様に、各種の免疫学的測定に利用できる。例えば、アナライトを含む試料と標識抗体とを混合し、反応させ、それによって生じる発色を、肉眼的に、あるいは分析機器を用いて測定することによって免疫学的測定が可能になる。従って、本実施の形態の標識抗体は、フロースルー式測定、ラレラルフロー式測定（イムノクロマトグラフィー）等の免疫学的測定において、標識抗体として好ましく使用することができる。
【００３９】
＜樹脂−金属複合体＞
次に、本実施の形態の標識抗体の製造方法において標識として使用される樹脂−金属複合体について詳細に説明する。図１は、本実施の形態で標識として使用する樹脂−金属複合体の断面模式図である。樹脂−金属複合体１００は、樹脂粒子１０と、金属粒子２０と、を備えている。
【００４０】
樹脂−金属複合体１００は、樹脂粒子１０に金属粒子２０が分散または固定化されている。また、樹脂−金属複合体１００は、金属粒子２０の一部が樹脂粒子１０の表層部６０において三次元的に分布し、かつ前記三次元的に分布した金属粒子２０の一部が部分的に樹脂粒子１０外に露出しており、残りの一部が樹脂粒子１０に内包されている。
【００４１】
ここで、金属粒子２０には、樹脂粒子１０に完全に内包された金属粒子（以下、「内包金属粒子３０」ともいう。）、樹脂粒子１０内に埋包された部位及び樹脂粒子１０外に露出した部位を有する金属粒子（以下、「一部露出金属粒子４０」ともいう。）及び樹脂粒子１０の表面に吸着している金属粒子（以下、「表面吸着金属粒子５０」ともいう。）が存在する。一部露出金属粒子４０及び表面吸着金属粒子５０は、本発明における「第１の粒子」に該当し、内包金属粒子３０は、本発明における「第２の粒子」に該当する。
【００４２】
例えば、樹脂−金属複合体１００を免疫学的測定に使用する場合、一部露出金属粒子４０または表面吸着金属粒子５０上に、抗体を固定化して使用する。その際、一部露出金属粒子４０及び表面吸着金属粒子５０には、前記抗体が固定化される一方で、内包金属粒子３０には、固定化されない。しかし、内包金属粒子３０を含む金属粒子２０の全てが局在型表面プラズモン吸収を発現することから、一部露出金属粒子４０及び表面吸着金属粒子５０のみならず、内包金属粒子３０も、免疫学的測定用標識としての視認性向上に寄与する。さらに、一部露出金属粒子４０及び内包金属粒子３０は、表面吸着金属粒子５０と比較して樹脂粒子１０との接触面積が大きいことに加え、埋包状態によるアンカー効果等の物理的吸着力が強く、樹脂粒子１０から脱離しにくい。そのため、樹脂−金属複合体１００を使用した免疫学的測定用標識としての耐久性、安定性を優れたものにすることができる。
【００４３】
内包金属粒子３０は、その表面の全てが、樹脂粒子１０を構成する樹脂に覆われているものである。また、一部露出金属粒子４０は、その表面積の５％以上１００％未満が、樹脂粒子１０を構成する樹脂に覆われているものである。上記各用途の耐久性の観点から、その下限は、表面積の２０％以上であることが好ましく、３０％以上であることがより好ましい。また、表面吸着金属粒子５０は、その表面積の０％を超えて５％未満が、樹脂粒子１０を構成する樹脂に覆われているものである。
【００４４】
また、樹脂−金属複合体１００への金属粒子２０（内包金属粒子３０、一部露出金属粒子４０及び表面吸着金属粒子５０の合計）の担持量は、樹脂−金属複合体１００の重量に対して、５ｗｔ％〜７０ｗｔ％であることが好ましい。この範囲であれば、樹脂−金属複合体１００は、標識物質としての視認性、目視判定性及び検出感度に優れる。金属粒子２０の担持量が５ｗｔ％未満では、抗体の固定化量が少なくなり、検出感度が低下する傾向がある。金属粒子２０の担持量は、より好ましくは、１５ｗｔ％〜７０ｗｔ％である。
【００４５】
また、金属粒子２０の１０ｗｔ％〜９０ｗｔ％が、一部露出金属粒子４０及び表面吸着金属粒子５０であることが好ましい。この範囲であれば、金属粒子２０上への抗体の固定化量が充分確保できるため、標識物質としての感度が高い。金属粒子２０の２０ｗｔ％〜８０ｗｔ％が一部露出金属粒子４０及び表面吸着金属粒子５０であることがより好ましく、耐久性の観点から、表面吸着金属粒子５０が２０ｗｔ％以下であることがさらに好ましい。
【００４６】
また、金属粒子２０の６０ｗｔ％〜１００ｗｔ％が、表層部６０に存在し、表層部６０に存在する金属粒子２０の５ｗｔ％〜９０ｗｔ％が、一部露出金属粒子４０または表面吸着金属粒子５０であることが、金属粒子２０上への抗体の固定化量が充分確保できるため、標識物質としての感度が高くなり好ましい。換言すれば、表層部６０に存在する金属粒子２０の１０ｗｔ％〜９５ｗｔ％が内包金属粒子３０であることがよい。
【００４７】
ここで、前記「表層部」とは、樹脂粒子１０の表面から、深さ方向に粒子半径の５０％の範囲を意味する。また、前記「三次元的に分布」とは、金属粒子２０が、樹脂粒子１０の面方向だけでなく、深さ方向にも分散されていることを意味する。
【００４８】
樹脂粒子１０は、金属イオンを吸着することが可能な置換基を構造に有するポリマー粒子であることが好ましい。特に、含窒素ポリマー粒子であることが好ましい。含窒素ポリマー中の窒素原子は、視認性に優れ、抗体の固定化が容易な金、パラジウムなどの金属粒子の前駆体であるアニオン性金属イオンを化学吸着しやすいため、好ましい。本実施の形態では、含窒素ポリマー中に吸着した金属イオンを還元し、金属ナノ粒子を形成する為、生成した金属粒子２０の一部は、内包金属粒子３０または一部露出金属粒子４０となる。また、アクリル酸重合体のように、カルボン酸等はカチオン性金属イオンを吸着することができるため、銀、ニッケル、銅などの金属粒子の前駆体であるカチオン性金属イオンを吸着しやすく、銀、ニッケル、銅などの金属粒子２０を形成することが可能であり、上記金、パラジウムなどの金属との合金を作ることも可能である。
一方、金属イオンを吸着することが可能な置換基を構造に有する含窒素ポリマー以外の樹脂粒子、例えばポリスチレン等の場合、前記金属イオンを樹脂内部に吸着しにくい。その結果、生成した金属粒子２０の大部分は、表面吸着金属粒子５０となる。上記のとおり、表面吸着金属粒子５０は、樹脂粒子１０との接触面積が小さいため、樹脂と金属の接着力が小さく、樹脂粒子１０から金属粒子２０が脱離する影響が大きい傾向にある。
上記含窒素ポリマーは、主鎖または側鎖に窒素原子を有する樹脂であり、例えば、ポリアミン、ポリアミド、ポリペプチド、ポリウレタン、ポリ尿素、ポリイミド、ポリイミダゾール、ポリオキサゾール、ポリピロール、ポリアニリン、等がある。好ましくは、ポリ−２−ビニルピリジン、ポリ−３−ビニルピリジン、ポリ−４−ビニルピリジン等のポリアミンである。また、側鎖に窒素原子を有する場合は、例えば、アクリル樹脂、フェノール樹脂、エポキシ樹脂等幅広く利用することが可能である。
【００４９】
金属粒子２０の材質としては、例えば、銀、ニッケル、銅、金、パラジウム等が適用できる。これらの金属は、単体もしくは合金等の複合体で使用することが可能である。好ましくは、視認性に優れ、抗体の固定化が容易な金及びパラジウムである。これらは、局在型表面プラズモン共鳴に由来する吸収を発現するため、好ましい。より好ましくは、保存安定性がよい金である。また、樹脂−金属複合体１００をｐＨ２〜７の範囲内の条件で抗体と結合させた場合に、優れた発色性が得られるという観点でも、金属粒子２０の材質として金または金合金が最も好ましい金属種である。ここで金合金とは、例えば金と金以外の金属種からなり、金を１０重量％以上含有する合金を意味する。
【００５０】
また、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察により測長される金属粒子２０の平均粒子径は、例えば１〜８０ｎｍであることが好ましい。金属粒子２０の平均粒子径が、１ｎｍ未満の場合や８０ｎｍを超える場合は、局在型表面プラズモンが発現しにくくなるため感度が低下する傾向がある。金属粒子２０の平均粒子径は、好ましくは、２０ｎｍ以上７０ｎｍ未満であり、より好ましくは、２２ｎｍ以上５０ｎｍ未満である。
【００５１】
また、樹脂−金属複合体１００の平均粒子径は、例えば１００〜１０００ｎｍである。平均粒子径が１００ｎｍ未満では、例えば、金属粒子２０として金粒子を使用する場合に、金粒子の担持量が少なくなる傾向がある為、同サイズの金粒子より着色が弱くなる傾向にあり、１０００ｎｍを超えると、標識物質又は試薬とした際に、メンブランフィルター等のクロマトグラフ媒体の細孔内に詰まりやすい傾向や、分散性が低下する傾向がある。樹脂−金属複合体１００の平均粒子径は、好ましくは、１００ｎｍ以上７００ｎｍ未満であり、より好ましくは、３４０ｎｍ以上６５０ｎｍ未満である。ここで、樹脂−金属複合体１００の粒子径は、樹脂粒子１０の粒子径に、一部露出金属粒子４０又は表面吸着金属粒子５０の突出部位の長さを加えた値を意味し、レーザー回折／散乱法、動的光散乱法、または遠心沈降法により測定することができる。
【００５２】
樹脂−金属複合体１００の製造方法は、特に限定されない。例えば、乳化重合法により製造した樹脂粒子１０の分散液に、金属イオンを含有する溶液を加えて、金属イオンを樹脂粒子１０に吸着させる（以下、「金属イオン吸着樹脂粒子」という。）。さらに、前記金属イオン吸着樹脂粒子を還元剤溶液中に加えることで、金属イオンを還元して金属粒子２０を生成させ、樹脂−金属複合体１００を得る。
【００５３】
また、例えば、金属粒子２０として、金粒子を使用する場合、金属イオンを含有する溶液としては、塩化金酸（ＨＡｕＣｌ４）水溶液等が挙げられる。また、金属イオンの代わりに金属錯体を用いても良い。
また、金属イオンを含有する溶液の溶媒として、水の代わりに、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔ−ブタノール等の含水アルコール又はアルコール、塩酸、硫酸、硝酸等の酸等を用いても良い。
また、前記溶液に、必要に応じて、例えば、ポリビニルアルコール等の水溶性高分子化合物、界面活性剤、アルコール類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類；アルキレングリコール、ポリアルキレングリコール、これらのモノアルキルエーテル又はジアルキルエーテル、グリセリン等のポリオール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類等の各種水混和性有機溶媒等の添加剤を添加してもよい。このような添加剤は、金属イオンの還元反応速度を促進し、また生成される金属粒子２０の大きさを制御するのに有効となる。
【００５４】
また、還元剤は、公知の物を用いることができる。例えば、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボラン、クエン酸、次亜リン酸ナトリウム、抱水ヒドラジン、塩酸ヒドラジン、硫酸ヒドラジン、ホルムアルデヒド、ショ糖、ブドウ糖、アスコルビン酸、ホスフィン酸ナトリウム、ハイドロキノン、硫酸ヒドラジン、ホルムアルデヒド、ロッシェル塩等が挙げられる。このうち、水素化ホウ素ナトリウム又は、ジメチルアミンボラン、クエン酸が好ましい。還元剤溶液には、必要に応じて界面活性剤を添加したり、溶液のｐＨを調整したりすることが出来る。ｐＨ調整にはホウ酸やリン酸等の緩衝剤、塩酸や硫酸などの酸、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどのアルカリにより調整することが出来る。
さらに還元剤溶液の温度により、金属イオンの還元速度を調整することで、形成する金属粒子の粒径をコントロールすることが出来る。
【００５５】
また、前記金属イオン吸着樹脂粒子中の金属イオンを還元して金属粒子２０を生成させる際、前記金属イオン吸着樹脂粒子を還元剤溶液に添加しても良いし、還元剤を前記金属イオン吸着樹脂粒子に添加しても良いが、内包金属粒子３０及び一部露出金属粒子４０の生成しやすさの観点から、前者が好ましい。
【００５６】
また、樹脂−金属複合体１００の、水への分散性を保持するために、例えば、クエン酸、ポリ−Ｌ−リシン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピリジン、ポリビニルアルコール、ＤＩＳＰＥＲＢＹＫ１９４、ＤＩＳＰＥＲＢＹＫ１８０、ＤＩＳＰＥＲＢＹＫ１８４（ビッグケミージャパン社製）等の分散剤を添加してもよい。さらにホウ酸やリン酸等の緩衝剤、塩酸や硫酸などの酸、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどのアルカリによりｐＨを調整し、分散性を保持することが出来る。
【００５７】
以上の構成を有する樹脂−金属複合体１００は、特に、金属粒子２０の表面に抗体を吸着させることにより、ＥＩＡ、ＲＩＡ、ＣＬＩＡ、ＦＩＡ、ＬＩＡ、ＰＡ、ＩＣＡ、ＨＡ、ＨＩ等の免疫学的測定法に好ましく適用できる。また、特に、低濃度域（高感度領域）での目視判定性に優れた免疫学的測定用標識物質又は免疫学的測定用試薬の材料として好ましく適用できる。また、免疫学的測定用標識物質又は免疫学的測定用試薬の形態に特に限定はないが、例えば、樹脂−金属複合体１００を水もしくは、ｐＨを調整した緩衝液中に分散させた分散液として使用できる。
【実施例】
【００５８】
次に、本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。以下の実施例、比較例において特にことわりのない限り、各種測定、評価は下記によるものである。
【００５９】
＜樹脂−金属複合体の吸光度測定＞
樹脂−金属複合体の吸光度は、光学用白板ガラス製セル（光路長１０ｍｍ）に０．０１ｗｔ％に調製した樹脂−金属複合体分散液（分散媒：水）を入れ、瞬間マルチ測光システム（大塚電子社製、ＭＣＰＤ−３７００）を用いて、５７０ｎｍの吸光度を測定した。
【００６０】
＜固形分濃度測定及び金属担持量の測定＞
磁製るつぼに濃度調整前の分散液１ｇを入れ、７０℃、３時間熱処理を行った。熱処理前後の重量を測定し、下記式により固形分濃度を算出した。
【００６１】
固形分濃度（ｗｔ％）＝［乾燥後の重量（ｇ）／  乾燥前の重量（ｇ）］×  １００
【００６２】
また、上記熱処理後のサンプルを、さらに５００℃、５時間加熱処理を行い、加熱処理前後の重量を測定し、下記式より金属担持量を算出した。
金属担持量（ｗｔ％）＝
［５００℃加熱処理後の重量（ｇ）／５００℃加熱処理前の重量（ｇ）］×１００
【００６３】
＜樹脂−金属複合体の平均粒子径の測定＞
ディスク遠心式粒度分布計（CPS  Instruments社製）を用いて測定した。測定は、樹脂−金属複合体を水に分散させた状態で行った。
【００６４】
＜金属粒子の平均粒子径の測定＞
金属粒子の平均粒子径の測定は、樹脂−金属複合体分散液をカーボン支持膜付き金属性メッシュへ滴下して作製した基板を、電界放出形走査電子顕微鏡（ＳＴＥＭ；日立ハイテクノロジーズ社製、ＳＵ−９０００）により観測した画像から、金属粒子の面積平均径を測定した。
【００６５】
［作製例１］
＜樹脂粒子の合成＞
Ａｌｉｑｕａｔ  ３３６［アルドリッチ社製］（１．００ｇ）及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（ＰＥＧＭＡ、２．００ｇ）を８０ｇの純水に溶解した後、２−ビニルピリジン（２−ＶＰ、９．９０ｇ）及びジビニルベンゼン（ＤＶＢ、０．１００ｇ）を加え、窒素気流下において２５０ｒｐｍ、６０℃で３０分間撹拌した。撹拌後、９．００ｇの純水に溶解した２，２−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（ＡＩＢＡ、０．１００ｇ）を５分かけて滴下し、２５０ｒｐｍ、６０℃で６時間撹拌することで、平均粒子径０．３６μｍの樹脂粒子Ａ−１を得た。前記Ａ−１を遠心分離（９０００ｒｐｍ、１０分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させ、２．１ｗｔ％の樹脂粒子分散液Ｂ−１を得た。
【００６６】
＜樹脂−金複合体の合成＞
前記Ｂ−１（１９．０９ｇ）に３０ｍＭ塩化金酸水溶液（１０６．６ｇ）を加え、室温で２４時間放置した。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去することで余分な塩化金酸を除去した後、４０ｇの純水に再度分散させ、金イオン吸着樹脂粒子分散液Ｃ−１を調製した。前記Ｃ−１（２０ｇ）を３．３ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液（６００ｍｌ）に４分かけて滴下した後、８℃で１時間撹拌し、さらに室温で５時間撹拌することで、平均粒子径０．３８μｍの樹脂−金複合体Ｄ−１を得た。前記Ｄ−１を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１２０分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、適量の純水を加えて再度分散させ、限外濾過膜により精製することで、１ｗｔ％の樹脂−金複合体分散液Ｅ−１を得た。Ｅ−１中の樹脂−金複合体Ｆ−１の吸光度は上記方法に従って測定した結果、１．０であった。また、Ｆ−１における金粒子の平均粒子径は２２．０ｎｍ、金の担持量は４９．１ｗｔ％であった。この樹脂−金複合体において、金粒子は、樹脂粒子に完全に内包された内包金粒子と、樹脂粒子内に埋包された部位及び樹脂粒子外に露出した部位を有する一部露出金粒子と、樹脂粒子の表面に吸着している表面吸着金粒子と、を含んでおり、少なくとも一部の金粒子が、樹脂粒子の表層部において三次元的に分布していた。
【００６７】
［作製例２］
＜樹脂粒子の合成＞
Ａｌｉｑｕａｔ  ３３６［アルドリッチ社製］（１．００ｇ）及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（ＰＥＧＭＡ、１０．００ｇ）を３００ｇの純水に溶解した後、４−ビニルピリジン（４−ＶＰ、４８．００ｇ）及びジビニルベンゼン（ＤＶＢ、２．００ｇ）を加え、窒素気流下において１５０ｒｐｍ、３０℃で５０分、次いで６０℃で３０分間撹拌した。撹拌後、１８．００ｇの純水に溶解した２，２−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（ＡＩＢＡ、０．５００ｇ）を２分かけて滴下し、１５０ｒｐｍ、６０℃で３．５時間撹拌することで、平均粒子径４３８ｎｍの樹脂粒子を得た。遠心分離（９０００ｒｐｍ、４５分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる操作を３回行った後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い１０ｗｔ％の樹脂粒子分散液を得た。
【００６８】
＜樹脂−金複合体の合成＞
上記樹脂ビーズ（５０ｍｌ）に純水１２３３ｍｌを加えた後、３０ｍＭ塩化金酸水溶液（１００ｍｌ）を加え、室温で２４時間放置した。その後、遠心分離（３１００ｒｐｍ、３０分）により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去する作業を３回繰り返すことで余分な塩化金酸を除去した。その後、濃度調整を行い、２．５ｗｔ％金イオン吸着樹脂粒子分散液を調製した。
【００６９】
次に、純水１５８０ｍｌに前記２．５ｗｔ％金イオン吸着樹脂粒子分散液（４２．４ｍｌ）を加え、１６０ｒｐｍ、３℃で撹拌しながら、５２８ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液（１０ｍｌ）を２分かけて滴下した後、室温で２時間撹拌することで、平均粒子径４４８ｎｍの樹脂−金複合体を得た。前記樹脂−金複合体を遠心分離（３１００ｒｐｍ、６０分）により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる作業を３回繰り返した後、透析処理により精製、濃度調整することで、１ｗｔ％の樹脂−金複合体分散液を得た。作製した樹脂−金複合体の吸光度は上記方法に従って測定した結果、０．９９であった。また、形成した金粒子の平均粒子径は２４．０ｎｍ、金の担持量は５５．７ｗｔ％であった。この樹脂−金複合体において、金粒子は、樹脂粒子に完全に内包された内包金粒子と、樹脂粒子内に埋包された部位及び樹脂粒子外に露出した部位を有する一部露出金粒子と、樹脂粒子の表面に吸着している表面吸着金粒子と、を含んでおり、少なくとも一部の金粒子が、樹脂粒子の表層部において三次元的に分布していた。
【００７０】
［試薬等］
実施例、比較例では以下の試薬等を使用した。
抗インフルエンザＡ型モノクローナル抗体（７．１５ｍｇ／ｍＬ／ＰＢＳ）：アドテック株式会社製
結合用緩衝液ａ：１００ｍＭ  ホウ酸溶液をＨＣｌでｐＨ≒３に調整した。
結合用緩衝液ｂ：１００ｍＭ  ホウ酸溶液をＨＣｌでｐＨ≒４に調整した。
結合用緩衝液ｃ：１００ｍＭ  ホウ酸溶液をＨＣｌでｐＨ≒５に調整した。
結合用緩衝液ｄ：１００ｍＭ  ホウ酸溶液  ｐＨ≒６．５
結合用緩衝液ｅ：１００ｍＭ  ホウ酸溶液をＮａＣｌでｐＨ≒７．５に調整した。
結合用緩衝液ｆ：１００ｍＭ  ホウ酸溶液をＮａＣｌでｐＨ≒８．５に調整した。
結合用緩衝液ｇ：５０ｍＭ  ２−モルフォリノエタンスルホン酸溶液  ｐＨ≒３．８
ブロック用緩衝液ａ：１重量％牛血清アルブミン溶液をＨＣｌでｐＨ≒５に調整した。
ブロック用緩衝液ｂ：１重量％牛血清アルブミン溶液をＨＣｌでｐＨ≒７に調整した。
ブロック用緩衝液ｃ：１重量％牛血清アルブミン溶液をＨＣｌでｐＨ≒８．５に調整した。  
ブロック用緩衝液ｄ：１重量％牛血清アルブミン溶液をＨＣｌでｐＨ≒９．５に調整した。
洗浄用緩衝液：５ｍＭトリス溶液をＨＣｌでｐＨ≒８．５に調整した。
保存用緩衝液：洗浄用緩衝液に、スクロースを１０重量％濃度になるように添加した。
インフルエンザＡ型陽性コントロール（ＡＰＣ）：インフルエンザＡ型ウィルス不活化抗原（アドテック株式会社製）を、検体処理液（アドテック株式会社製）を用いて１００倍希釈して調製した。ＡＰＣの抗原濃度は、５０００ＦＦＵ／ｍｌに相当する。
陰性コントロール：検体処理液（アドテック株式会社製）
ＡｕＮＣＰビーズ：作製例１で得た樹脂−金複合体（１重量％；平均粒子径３８０ｎｍ）
【００７１】
［実施例１］
（結合工程）
マイクロチューブ［アイビス（登録商標；アズワン社製）２ｍＬ］に、樹脂−金属複合体としてＡｕＮＣＰビーズ０．１ｍＬを投入し、結合用緩衝液ａ０．９ｍＬを添加した。転倒混和によって十分に混合した後、抗インフルエンザＡ型モノクローナル抗体１００μｇを添加し、室温で３時間かけて転倒撹拌を行い、樹脂−金属複合体で標識した抗インフルエンザＡ型モノクローナル抗体を含む標識抗体含有液Ａ−１を得た。
【００７２】
（ブロック工程）
次に、標識抗体含有液Ａ−１を氷冷後、１２０００ｒｐｍで５分間かけて遠心分離を行い、上澄みを除去した後、固形分残渣にブロック用緩衝液ａ１ｍＬを添加し、１０〜２０秒間かけて超音波分散処理を行い、さらに、室温で２時間かけて転倒撹拌を行い、標識抗体含有液Ｂ−１を得た。
【００７３】
（洗浄処理）
次に、標識抗体含有液Ｂ−１を氷冷後、１２０００ｒｐｍで５分間かけて遠心分離を行い、上澄みを除去した後、固形分残渣に洗浄用緩衝液１ｍＬを添加し、１０〜２０秒間かけて超音波分散処理を行った。この操作を３回繰り返し、洗浄処理とした。
【００７４】
（保存処理）
次に、氷冷後、１２０００ｒｐｍで５分間かけて遠心分離を行い、上澄みを除去した後、固形分残渣に保存用緩衝液１ｍＬを添加し、１０〜２０秒間かけて超音波分散処理を行うことによって、標識抗体含有液Ｃ−１を得た。
【００７５】
［実施例２］
実施例１の結合工程で結合用緩衝液ａの代わりに結合用緩衝液ｂを用いる以外は実施例１と同様にして、標識抗体含有液Ａ−２，Ｂ−２、Ｃ−２を得た。
【００７６】
［実施例３］
実施例１の結合工程で結合用緩衝液ａの代わりに結合用緩衝液ｃを用いる以外は実施例１と同様にして、標識抗体含有液Ａ−３，Ｂ−３，Ｃ−３を得た。
【００７７】
［実施例４］
実施例１の結合工程で結合用緩衝液ａの代わりに結合用緩衝液ｄを用いる以外は実施例１と同様にして、標識抗体含有液Ａ−４，Ｂ−４、Ｃ−４を得た。
【００７８】
［比較例１］
実施例１の結合工程で結合用緩衝液ａの代わりに結合用緩衝液ｅを用いた場合、樹脂−金属複合体が凝集してしまうため、標識抗体含有液を得ることが困難であった。
【００７９】
［比較例２］
実施例１の結合工程で結合用緩衝液ａの代わりに結合用緩衝液ｆを用いた場合、樹脂−金属複合体が凝集してしまうため、標識抗体含有液を得ることが困難であった。
【００８０】
［実施例５］
実施例１のブロック工程でブロック用緩衝液ａの代わりにブロック用緩衝液ｂを用いる以外は実施例１と同様にして、標識抗体含有液Ｂ−５、Ｃ−５を得た。
【００８１】
［実施例６］
実施例１のブロック工程でブロック用緩衝液ａの代わりにブロック用緩衝液ｃを用いる以外は実施例１と同様にして、標識抗体含有液Ｂ−６、Ｃ−６を得た。
【００８２】
［実施例７］
実施例１の結合工程で結合用緩衝液ａの代わりに結合用緩衝液ｇを用いる以外は実施例１と同様にして、標識抗体含有液Ａ−７，Ｂ−７、Ｃ−７を得た。
【００８３】
＜評価方法＞
評価は、インフルエンザＡ型評価用モノクロスクリーン（アドテック社製）を用い、５分後、１０分後、１５分後の発色レベルを比較した。発色レベルは金コロイド判定用色見本（アドテック社製）を用いて判定した。スクリーニング評価において、抗原はインフルエンザＡ型陽性コントロール（ＡＰＣ）を用いた。性能評価において、抗原はＡＰＣの２倍希釈列（１倍〜１０２４倍希釈）を用いた。
【００８４】
＜スクリーニング評価＞
９６ウェルプレートの７ウェルに、実施例１〜７で得られた標識抗体含有液Ｃ−１〜７を３μＬずつ入れ、それぞれにＡＰＣ１００μＬを混和した。次に、インフルエンザＡ型評価用モノクロスクリーンに５０μＬずつ添加し、５分後、１０分後、１５分後の発色レベルを評価した。その結果を表１に示した。なお、表１における数値が大きい程、発色レベルが高い（発色が強い）ことを意味する。
【００８５】
【表１】
0006614826.tif 000002
【００８６】
表１から、実施例１で得られた抗体標識含有液Ｃ−１は、最も強い発色を示し、優れた標識性能を有することが確認された。
【００８７】
＜性能評価＞
９６ウェルプレートの１２ウェルに、実施例１で得られた標識抗体含有液Ｃ−１を３μＬずつ入れ、ＡＰＣの２倍希釈列（１倍〜１０２４倍希釈、それぞれＡＰＣ×１〜ＡＰＣ×１０２４と表す）及び陰性コントロールを、それぞれ１００μＬを混和した。次に、インフルエンザＡ型評価用モノクロスクリーンに５０μＬ添加し、５分後、１０分後、１５分後の発色レベルを評価した。その結果を表２に示した。なお、表２における数値が大きい程、発色レベルが高い（発色が強い）ことを意味する。
【００８８】
【表２】
0006614826.tif 000003
【００８９】
表２から、実施例１で得られた標識抗体含有液Ｃ−１は、２５６倍希釈の抗原に対しても良好な発色を示し、優れた標識性能を有することが確認された。
【００９０】
［実施例８］
作製例２で得た樹脂−金複合体分散液を使用した以外は、実施例１と同様の操作を行い、標識抗体含有液Ａ−９、Ｂ−９、Ｃ−９を得た。
＜性能評価＞
９６ウェルプレートの１２ウェルに、実施例８で得られた標識抗体含有液Ｃ−９を３μＬずつ入れ、ＡＰＣの２倍希釈列（１倍〜１０２４倍希釈、それぞれＡＰＣ×１〜ＡＰＣ×１０２４と表す）及び陰性コントロールを、それぞれ１００μＬを混和した。次に、インフルエンザＡ型評価用モノクロスクリーンに５０μＬ添加し、５分後、１０分後、１５分後の発色レベルを評価した。その結果を表３に示した。なお、表３における数値が大きい程、発色レベルが高い（発色が強い）ことを意味する。
【００９１】
【表３】
0006614826.tif 000004
【００９２】
上記表３から、実施例８で得られた標識抗体含有液Ｃ−９は、２５６倍希釈の抗原に対して良好な発色を示すことが確認された。
【００９３】
以上、本発明の実施の形態を例示の目的で詳細に説明したが、本発明は上記実施の形態に制約されることはない。
【符号の説明】
【００９４】
１０…樹脂粒子、２０…金属粒子、３０…内包金属粒子、４０…一部露出金属粒子、５０…表面吸着金属粒子、６０…表層部、１００…樹脂−金属複合体
【図１】
0006614826.tif 000005