(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶの病態を示すマーカーとして、準完全長ＨＩＶプロウイルスを検出及び／又は定量する方法であって、準完全長ＨＩＶプロウイルスとは、完全長ＨＩＶプロウイルスの全長に点在する５箇所以上の領域が単一のゲノム内に同時に存在するＤＮＡである前記方法。
【請求項２】
ＨＩＶの病態を検査する方法であって、テンプレートとなるＨＩＶプロウイルスＤＮＡを１反応あたり平均１コピー以下とした上で、第１ラウンドと第２ラウンドの少なくとも２段階のＰＣＲ反応を行って、単離されたＨＩＶ感染細胞内の準完全長ＨＩＶプロウイルスの量を評価し、前記感染細胞内に準完全長ＨＩＶプロウイルスが検出されなかった場合には、ＨＩＶの機能的治癒が達成されたと判定し、前記感染細胞内に準完全長ＨＩＶプロウイルスが検出された場合には、ＨＩＶの機能的治癒が達成されていないと判定することを含み、準完全長ＨＩＶプロウイルスとは、完全長ＨＩＶプロウイルスの全長に点在する５箇所以上の領域が単一のゲノム内に同時に存在するＤＮＡである前記方法。
【請求項３】
ＨＩＶの病態を検査する方法であって、テンプレートとなるＨＩＶプロウイルスＤＮＡを１反応あたり平均１コピー以下とした上で、第１ラウンドと第２ラウンドの少なくとも２段階のＰＣＲ反応を行って、単離されたＨＩＶ感染細胞内の準完全長ＨＩＶプロウイルスの量を評価し、前記感染細胞内に準完全長ＨＩＶプロウイルスがある濃度以下であると評価された場合には、ＨＩＶの機能的治癒が達成されたと判定し、前記感染細胞内に準完全長ＨＩＶプロウイルスがある濃度以上であると評価された場合には、ＨＩＶの機能的治癒が達成されていないと判定することを含み、準完全長ＨＩＶプロウイルスとは、完全長ＨＩＶプロウイルスの全長に点在する５箇所以上の領域が単一のゲノム内に同時に存在するＤＮＡである前記方法。
【請求項４】
ＨＩＶプロウイルスの全長に点在する５〜７箇所の領域を検出することにより、ＨＩＶ感染細胞内の準完全長ＨＩＶプロウイルスの量を評価する請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
抗ＨＩＶ薬の薬効を検査する方法であって、抗ＨＩＶ薬投与の前後及び／又は抗ＨＩＶ薬投与継続中のある期間の前後で、テンプレートとなるＨＩＶプロウイルスＤＮＡを１反応あたり平均１コピー以下とした上で、第１ラウンドと第２ラウンドの少なくとも２段階のＰＣＲ反応を行って、単離されたＨＩＶ感染細胞内の準完全長ＨＩＶプロウイルスの量を評価し、準完全長ＨＩＶプロウイルスの数が減少した場合には、ＨＩＶの機能的治癒が達成された、あるいは達成しつつあると判定し、準完全長ＨＩＶプロウイルスの量が減少しなかった場合には、ＨＩＶの機能的治癒を可能としないと判定することを含み、準完全長ＨＩＶプロウイルスとは、完全長ＨＩＶプロウイルスの全長に点在する５箇所以上の領域が単一のゲノム内に同時に存在するＤＮＡである前記方法。
【請求項６】
ＨＩＶの機能的治癒を可能とする薬剤をスクリーニングする方法であって、薬剤投与の前後及び／又は薬剤投与継続中のある期間の前後で、テンプレートとなるＨＩＶプロウイルスＤＮＡを１反応あたり平均１コピー以下とした上で、第１ラウンドと第２ラウンドの少なくとも２段階のＰＣＲ反応を行って、単離されたＨＩＶ感染細胞内の準完全長ＨＩＶプロウイルスの量を評価し、準完全長ＨＩＶプロウイルスの数が減少した場合には、ＨＩＶの機能的治癒を可能としうると判定し、準完全長ＨＩＶプロウイルスの数が減少しなかった場合には、ＨＩＶの機能的治癒を可能としないと判定することを含み、準完全長ＨＩＶプロウイルスとは、完全長ＨＩＶプロウイルスの全長に点在する５箇所以上の領域が単一のゲノム内に同時に存在するＤＮＡである前記方法。
【請求項７】
テンプレートとなるＨＩＶプロウイルスＤＮＡを１反応あたり平均１コピー以下とした上で、第１ラウンドと第２ラウンドの少なくとも２段階のＰＣＲ反応を行って、ＨＩＶプロウイルスの全長に点在する５箇所以上の領域を検出することにより、単離されたＨＩＶ感染細胞内の準完全長ＨＩＶプロウイルスの量を評価する方法であって、準完全長ＨＩＶプロウイルスとは、完全長ＨＩＶプロウイルスの全長に点在する５箇所以上の領域が単一のゲノム内に同時に存在するＤＮＡである前記方法。
【請求項８】
配列番号１〜４０のいずれかのヌクレオチド配列の一部又は全部を含む20〜30塩基長のプライマーを用いて、ＨＩＶ感染細胞内の準完全長ＨＩＶプロウイルスの量を評価する請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
準完全長ＨＩＶプロウイルスの量を評価するためのキットであって、ＨＩＶプロウイルスの全長に点在する５箇所以上の領域を２段階のＰＣＲ反応で増幅できるプライマー及び前記プライマーにより増幅された核酸を検出できる試薬を含み、準完全長ＨＩＶプロウイルスとは、完全長ＨＩＶプロウイルスの全長に点在する５箇所以上の領域が単一のゲノム内に同時に存在するＤＮＡである前記キット。
【請求項１０】
ＨＩＶプロウイルスの全長に点在する５箇所以上の領域を増幅できるプライマーが、配列番号１〜４０のいずれかのヌクレオチド配列の一部又は全部を含む20〜30塩基長のプライマーである請求項９記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＶの病態マーカー及び検査法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＶ感染症の治療は近年著しく進歩し、ＨＩＶ感染者の有病率と死亡率は大幅に改善した。しかし、この治療は生涯継続する必要があり、薬剤耐性ウイルスの出現や副作用の問題もある。また、感染者の増大にともなう治療費の増加も大きな社会的問題となっている。このような背景のもと、抗ＨＩＶ治療を中断してもウイルスの増殖が抑えられたままで、病気が進行しない状態（機能的治癒）が注目され、それを実現するための治療法の研究に期待が集まっている。この研究を進展させるためには、抗ＨＩＶ治療によって縮小させることが困難なウイルス感染巣（リザーバー）の大きさを決定することが必要であるが、そのための適当な測定法はまだ確立されていない。【０００３】
ＨＩＶ感染症のリザーバーを定量する方法として次の二つの代表的な技術が報告されている。
Viral outgrowth assay:
Siliciano JD, Siliciano RF. (2005) Enhanced culture assay for detection and quantitation of latently infected, resting CD4+ T-cells carrying replication competent virus in HIV-1-infected individuals. Methods Mol Biol 304: 3-15.（非特許文献１）
Droplet digital PCR for HIV-1 DNA:
Strain MC, Lada SM, Luong T, Rought SE, Gianella S, et al. (2013) Highly accurate measurement of HIV DNA by droplet digital PCR. PLOS ONE 8: e55943.（非特許文献２）
上記のviral outgrowth assayは感染性ＨＩＶの培養操作を必要とするため、感染の危険があり、操作が複雑で、長時間を要し、さらに費用が高額である。Droplet digital PCR for ＨＩＶ−１ ＤＮＡは不完全なプロウイルスも含めて定量するため、リザーバーを正確に評価できない。【０００４】
【非特許文献１】Siliciano JD, Siliciano RF. (2005) Enhanced culture assay for detection and quantitation of latently infected, resting CD4+ T-cells carrying replication competent virus in HIV-1-infected individuals. Methods Mol Biol 304: 3-15.
【非特許文献２】Strain MC, Lada SM, Luong T, Rought SE, Gianella S, et al. (2013) Highly accurate measurement of HIV DNA by droplet digital PCR. PLOS ONE 8: e55943.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＨＩＶウイルス粒子中のＲＮＡはプラス一本鎖のＲＮＡであり、宿主内では、ｍＲＮＡの構造をとる。宿主内で、ウイルスＲＮＡは、逆転写酵素（ＲＴ）により二本鎖ＤＮＡに変換され、インテグラーゼにより宿主ＤＮＡに組み込まれてプロウイルスを形成する（図１９）。【０００６】
リザーバーは感染性のある感染細胞から構成されていると考えられている。感染細胞において、ＨＩＶプロウイルスは、完全長プロウイルスか欠損プロウイルス（なんらかの原因でプロウイルスに欠損が生じた状態）のいずれかの状態で存在する。感染性のある感染細胞には必ず完全長プロウイルスが存在するはずであり、すべてのプロウイルスが欠損型になった時、体内にウイルスが存在していても、増殖できず、それこそが“機能的治癒”という状況なのではないかと考えられる（図２０）。しかし、完全長プロウイルスは直接検出することが困難である。【０００７】
よって、本発明は、欠失のないプロウイルスをより簡単、かつ安価に検出する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、課題を解決すべく鋭意努力した結果、完全長プロウイルス量を推定するため、プロウイルスの全長に点在する数個の部位を同時に有するプロウイルス（準完全長プロウイルス）を定量する測定法を確立した。さらに、この方法を用いて抗ＨＩＶ治療開始前後の患者の末梢血単核球中に存在する準完全長プロウイルス量を測定し、その臨床学的意義を検討した。本発明は、これらの知見に基づき、完成されたものである。【０００９】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）準完全長ＨＩＶプロウイルスを含む、ＨＩＶの病態を示すマーカー。
（２）ＨＩＶの病態を検査する方法であって、ＨＩＶ感染細胞内の完全長ＨＩＶプロウイルスの量を評価することを含む、前記方法。
（３）感染細胞内に準完全長ＨＩＶプロウイルスがある検出限界以下であると評価された場合には、ＨＩＶの機能的治癒が達成されたと判定し、感染細胞内に準完全長ＨＩＶプロウイルスがある検出限界以上であると評価された場合には、ＨＩＶの機能的治癒が達成されていないと判定する（２）記載の方法。
（４）  ＨＩＶプロウイルスの全長に点在する３〜７箇所の領域を検出することにより、ＨＩＶ感染細胞内の準完全長ＨＩＶプロウイルスの量を評価する（２）又は（３）に記載の方法。
（５）抗ＨＩＶ薬の薬効を検査する方法であって、ＨＩＶ感染細胞内の準完全長ＨＩＶプロウイルスの量を評価することを含む、前記方法。
（６）抗ＨＩＶ薬投与の前後及び／又は抗ＨＩＶ薬投与継続中のある期間の前後で、ＨＩＶ感染細胞内の準完全長ＨＩＶプロウイルスの量を評価し、準完全長ＨＩＶプロウイルスの数が減少した場合には、ＨＩＶの機能的治癒が達成された、あるいは達成しつつあると判定し、準完全長ＨＩＶプロウイルスの量が減少しなかった場合には、ＨＩＶの機能的治癒を可能としないと判定する（５）記載の方法。
（７）ＨＩＶの機能的治癒を可能とする薬剤をスクリーニングする方法であって、ＨＩＶ感染細胞内の準完全長ＨＩＶプロウイルスの量を評価することを含む、前記方法。
（８）薬剤投与の前後及び／又は薬剤投与継続中のある期間の前後で、ＨＩＶ感染細胞内の準完全長ＨＩＶプロウイルスの量を評価し、準完全長ＨＩＶプロウイルスの量が減少した場合には、ＨＩＶの機能的治癒を可能としうると判定し、準完全長ＨＩＶプロウイルスの量が減少しなかった場合には、ＨＩＶの機能的治癒を可能としないと判定する（７）記載の方法。
（９）ＨＩＶプロウイルスの全長に点在する３〜７箇所の領域を検出することにより、ＨＩＶ感染細胞内の準完全長ＨＩＶプロウイルスの量を評価する方法。
（１０）配列番号１〜４０のいずれかのヌクレオチド配列の一部又は全部を含む20〜30塩基対のプライマーを用いて、ＨＩＶ感染細胞内の準完全長ＨＩＶプロウイルスの量を評価する（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）準完全長ＨＩＶプロウイルスの量を評価するためのキットであって、ＨＩＶプロウイルスの全長に点在する３〜７箇所の領域を増幅できるプライマー及び前記プライマーにより増幅された核酸を検出できる試薬を含む、前記キット。
（１２）ＨＩＶプロウイルスの全長に点在する３〜７箇所の領域を増幅できるプライマーが、配列番号１〜４０のいずれかのヌクレオチド配列の一部又は全部を含む20〜30塩基対のプライマーである（１１）記載のキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、ＨＩＶの完全長プロウイルス量を推定することが可能となった。この推定に基づき、ＨＩＶ感染症の機能的治癒の判定を行うことが可能となる。その結果、抗ＨＩＶ治療の簡素化を図ることができる。抗ＨＩＶ治療は近年著しい進歩を遂げたが、副作用や薬剤耐性の問題がまだ解決されておらず、またいったん開始すると終生継続する必要がある。本発明により、治療の簡素化、中断あるいは中止を判定することができれば、治療を受けている患者のQOLを格段に向上させるだけでなく、医療費の大幅な削減にもつながる。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2014‐222314の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】SYBR Greenを用いたリアルタイムＰＣＲにおける陽性反応の判定法を示す。
【図２】ある患者の抗ＨＩＶ治療後9年間にわたる7血液検体のCD4とウイルス量の推移を示す。
【図３】ＨＩＶ−１プラスミドの構造（検体：pREjo.c）を示す。
【図４】ＨＩＶ−１プラスミドの構造（検体：pCH077.t）を示す。
【図５】ＨＩＶ−１プラスミドの構造（検体：pNL43）を示す。
【図６】調製操作後のＨＩＶ−１プラスミドpNL43の構造（１回目の実験）を示す。
【図７】調製操作後のＨＩＶ−１プラスミドpNL43の構造（２回目の実験）を示す。
【図８】調製操作後のＨＩＶ−１プラスミドpNL43の構造（３回目の実験）を示す。
【図９】ＨＩＶ−１感染者PBMC中プロウイルスの構造（検体：C97SP369）を示す。
【図１０】ＨＩＶ−１感染者PBMC中プロウイルスの構造（検体：C119SP429）を示す。
【図１１】ＨＩＶ−１感染者PBMC中プロウイルスの構造（検体：C125SP447）を示す。
【図１２】ＨＩＶ−１感染者PBMC中プロウイルスの構造（検体：C369SP1131）を示す。
【図１３】ＨＩＶ−１感染者PBMC中プロウイルスの構造（検体：C370SP1138）を示す。
【図１４】ＨＩＶ−１感染者PBMC中プロウイルスの構造（検体：C272SP1117）を示す。
【図１５】ＨＩＶ−１感染者PBMC中プロウイルスの構造（検体：C95SP1162）を示す。
【図１６】ＨＩＶ−１感染者PBMC中プロウイルスの構造（検体：C232SP1163）を示す。
【図１７】ＨＩＶ−１感染者PBMC中プロウイルスの構造（検体：C252SP1164）を示す。
【図１８】ＨＩＶ−１感染者PBMC中プロウイルスの構造（検体：C193SP1174）を示す。
【図１９】ＨＩＶウイルスが宿主に感染し、増幅する様子を示す模式図である。
【図２０】ＨＩＶプロウイルスの2つの可能な状態を示す。
【図２１】ＨＩＶゲノム中の保存された領域における、設計した5か所のプライマーの位置を示す。
【図２２】ＨＩＶ−１感染者PBMC中プロウイルスの構造（抗ＨＩＶ治療開始後9年間の追跡調査）（検体：C53SP271）を示す。
【図２３】ＨＩＶ−１感染者PBMC中プロウイルスの構造（抗ＨＩＶ治療開始後9年間の追跡調査）（検体：C53SP278）を示す。
【図２４】ＨＩＶ−１感染者PBMC中プロウイルスの構造（抗ＨＩＶ治療開始後9年間の追跡調査）（検体：C53SP281）を示す。
【図２５】ＨＩＶ−１感染者PBMC中プロウイルスの構造（抗ＨＩＶ治療開始後9年間の追跡調査）（検体：C53SP294）を示す。
【図２６】ＨＩＶ−１感染者PBMC中プロウイルスの構造（抗ＨＩＶ治療開始後9年間の追跡調査）（検体：C53SP313）を示す。
【図２７】ＨＩＶ−１感染者PBMC中プロウイルスの構造（抗ＨＩＶ治療開始後9年間の追跡調査）（検体：C53SP679）を示す。
【図２８】ＨＩＶ−１感染者PBMC中プロウイルスの構造（抗ＨＩＶ治療開始後9年間の追跡調査）（検体：C53SP1028）を示す。
【図２９】ＨＩＶ−１感染者(C53)における、抗ＨＩＶ治療開始後9年間にわたるPBMC中の全プロウイルス量と準完全長プロウイルス量の結果を示す。
【図３０】マルチプレックス・ネステッドPCR産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【図３１】個別2回目PCR産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
【００１３】
本発明は、ＨＩＶの病態を検査する方法であって、ＨＩＶ感染細胞内の準完全長ＨＩＶプロウイルスの量を評価することを含む、前記方法を提供する。
【００１４】
「ＨＩＶ」とは、ヒトの免疫細胞に感染して、これを破壊し、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を発症させるウイルスであり、ウイルスの分類上は、エンベロープを持つプラス鎖の一本鎖ＲＮＡウイルスであるレトロウイルス科レンチウイウルス属に属し、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２の２種類が存在する。本発明において、ＨＩＶは、ＨＩＶ−１又は２のいずれであってもよい。
【００１５】
ＨＩＶ感染細胞としては、ＨＩＶ感染が確認されている感染者もしくは患者、または抗HIV治療を受けている患者などの被験者からの血液、リンパ液、髄液、精液、リンパ節、直腸、母乳などに含まれる感染細胞を挙げることができ、具体的には、末梢血単核球、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、細胞障害性Ｔ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、グリア細胞などを挙げることができる。
【００１６】
「準完全長ＨＩＶプロウイルス」とは、ＨＩＶプロウイルスの全長に点在する数個の部位を同時に有するプロウイルスをいう。準完全長ＨＩＶプロウイルスは、ＨＩＶプロウイルスの全長に点在する３〜７個の部位を同時に有するプロウイルスであればよく、好ましくは、５〜７個の部位を同時に有するプロウイルスである。ＨＩＶは、ＲＮＡ全長がおよそ9000塩基対であり、10個の遺伝子（gag, pro,pol, vif, vpr, vpu, tat, rev, env, nef）と、両端にLTR（Long Terminal Repeat）を持つ（図２１）。点在する３〜７個の部位は、上記の10個の遺伝子、5’LTR及び3’LTRのいずれかの領域にあればよく、変異が起こりにくい部位であることが好ましい。
【００１７】
ＨＩＶ感染細胞内の準完全長ＨＩＶプロウイルスの量の評価は、以下のようにして行うことができる。
１．ＨＩＶプロウイルスの全長に点在する数個の部位を同時に増幅する。
【００１８】
増幅する部位及び数は、感染細胞における欠失のないプロウイルスの有無を推定できる数及び部位であればよい。
【００１９】
増幅する部位は、変異が起こりにくい部位であるとよく、ＨＩＶ−１プロウイルスの場合、例えば、5’LTRの475〜813の部位、gagの1814〜2189の部位、vifの5047〜5313の部位、envの7647〜7821の部位、3’LTRの8685〜9196の部位、gagの1231〜1423、polの2598〜2774、polの4026〜4223、envの6413〜6609などの遺伝子の部位を挙げることができる。
【００２０】
なお、ＨＩＶ−１プロウイルスの遺伝子配列情報は、ＨＩＶ Datebases (http://www.hiv.lanl.gov/content/index)から入手することができる。
【００２１】
増幅する部位の数は、３〜７個が適当であり、好ましくは、５〜７個、より好ましくは５個である。増幅する部位の長さは、100〜2000塩基対が適当であり、好ましくは、160〜550塩基対である。
【００２２】
増幅は、Multiplex ＰＣＲで行うことができるが、これに限定されるわけではなく、他の増幅法、例えば、long ＰＣＲ、recombinant ＰＣＲを用いてもよい。
【００２３】
ＰＣＲプライマーとしては、配列番号１〜１０、２１〜３０のいずれかのヌクレオチド配列の一部又は全部を含む20〜30塩基長のプライマーを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。プライマーの長さは、20〜30塩基長であるとよく、好ましくは20〜25塩基長である。プライマーを構成するヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのキメラ分子、それらの誘導体、修飾体などのいずれであってもよい。
【００２４】
増幅にあたっては、陽性対照及び／又は陰性対照も用意するとよく、陽性対照としては、pREJO.c、pCH077.t、pNL43などを、陰性対照としては、TE、dH2O、PolyA、非感染者ＤＮＡなどを用いることができる。
【００２５】
測定対象とする感染細胞を含むサンプルは、ＰＣＲ反応の約20〜40％が陽性となるように１反応あたり約0.2〜0.5コピーのＨＩＶプロウイルスＤＮＡを含む溶液となるように、限界希釈をしておくことが好ましい。
【００２６】
マルチプレックスＰＣＲ装置として、GeneAmp PCR system 9700（Applied Biosystems）を使用し、温度条件は、94℃ 2分の反応後、94℃ 5秒、60℃ 10秒、72℃ 30秒の3ステップ反応を30サイクルで行うとよい。但し、これらの条件は、実験が再現できる限り、適宜変更できる。その変更した条件で発明が実施される場合も、本発明の範囲に含まれるものとする。
【００２７】
ＰＣＲの反応終了後、EDTAを添加して、反応を停止させるとよい。長期保存をする場合は冷凍庫(-20℃以下)に保存する。
２．１の増幅物をそれぞれの部位につき別個に増幅する。
【００２８】
１の増幅産物を適当な倍率に希釈した後、それぞれの部位につき、同時あるいは別個に増幅する。
【００２９】
増幅は、リアルタイムＰＣＲで行うことができるが、これに限定されるわけではなく、他の増幅法、例えば、通常のＰＣＲを実施後にゲル電気泳動を行ってもよい。
【００３０】
ＰＣＲプライマーとしては、配列番号１１〜２０、３１〜４０のいずれかのヌクレオチド配列の一部又は全部を含む20〜30塩基長のプライマーを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。プライマーの長さは、20〜30塩基長であるとよく、好ましくは20〜25塩基長である。プライマーを構成するヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのキメラ分子、それらの誘導体、修飾体などのいずれであってもよい。
【００３１】
１の増幅反応と２の増幅反応は、nested ＰＣＲであるとよく、２の増幅反応に用いるＰＣＲプライマーは、１の増幅反応で用いたＰＣＲプライマーの目的とする領域の位置より、両側とも内側にプライマー位置を設定するとよい。後述の実施例で用いた第１ラウンドのＰＣＲに用いたプライマーと第２ラウンドのＰＣＲに用いたプライマーの設計の概念を図２１に示す。
【００３２】
１の増幅において、増幅する部位の長さは、60〜1800塩基対が適当であり、好ましくは、150〜500塩基対である。
【００３３】
２の増幅において、増幅する部位の長さは、60〜1800塩基対が適当であり、好ましくは、60〜250塩基対である。
【００３４】
リアルタイムＰＣＲ装置として、ABI Step One plus（Applied Biosystems）を使用し、温度条件は、95℃ 20秒の反応後、95℃ 1秒、60℃ 10秒、72℃ 20秒の3ステップ反応を50サイクル行い、融解曲線ステージを95℃ 15秒、60℃ 1分、95℃、15秒で行うとよい。但し、これらの条件は、実験が再現できる限り、適宜変更できる。その変更した条件で発明が実施される場合も、本発明の範囲に含まれるものとする。
【００３５】
ＰＣＲ増幅産物の検出には、ＤＮＡに結合するインターカレーター（例えば、SYBR Greenなど）などの試薬を用いるとよい。検出試薬としては、蛍光標識プローブを用いてもよいが、蛍光標識プローブを用いた場合、ＰＣＲ増幅産物に変異が１個でも入ると光らなくなるのに対して、SYBR GreenのようなＤＮＡに結合するインターカレーターは変異があっても蛍光を発するので、有利である。SYBR Greenは、ＤＮＡに結合するインターカレーターで、ＰＣＲによって合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発する。ＰＣＲ反応中の蛍光強度の測定により、ＰＣＲ増幅産物の生成をモニターすることができ、さらに、ＰＣＲ反応後に融解曲線分析を行うことにより、Ｔｍ値（融解温度）を算出でき、この値から、目的とするＰＣＲ増幅産物が得られたかどうかを確認できる。
【００３６】
蛍光標識プローブとしては、プローブの５’末端に蛍光物質FAMを、３’末端にNFQ(Non Fluorescent Quencher)とＴｍエンハンサーであるMGB（Minor Groove Binder）を修飾した、TaqMan MGBプローブなどを用いることができる。プローブの長さは、１０〜４０塩基長であるとよく、好ましくは２０〜３０塩基長である。プローブを構成するヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのキメラ分子、それらの誘導体、修飾体などのいずれであってもよい。
３．２の結果をCt値と融解曲線を基に陽性・陰性を判定する。
【００３７】
陽性反応の判定は、(i) ２の増幅反応（例えば、リアルタイムＰＣＲ）で得られたCT値が陰性対照反応よりも陽性対照反応に近いこと、(ii) ２の増幅反応の融解曲線から得られる融解温度が陽性対照のそれの0.5℃以内であること、(iii) 融解曲線の半値幅が陽性対照のそれとほぼ同じであることの3つを同時に満たすことを条件として、行うことができる（例、図１）。準完全長プロウイルスの定量は次のようにして行う。終点希釈において5か所すべてでＰＣＲが陽性ではなかった反応の頻度をＰ(0)とする。これをポアソン分布式、ｍ=-ln(Ｐ(0))に代入し、1反応に含まれる準完全長プロウイルスのコピー数ｍを求める。これにプロウイルスＤＮＡ溶液の希釈比を乗ずれば、元の準完全長プロウイルスＤＮＡ濃度を求めることができる。欠損型プロウイルスの定量は、終点希釈において5か所のうちの1か所でもＰＣＲが陰性とならなかった反応の頻度を用いて、上と同じ方法で求める。
【００３８】
上記の評価により、感染細胞内に準完全長ＨＩＶプロウイルスがある検出限界以下であると評価された場合には、ＨＩＶの機能的治癒が達成されたと判定し、感染細胞内に準完全長ＨＩＶプロウイルスがある検出限界以上であると評価された場合には、ＨＩＶの機能的治癒が達成されていないと判定することができる。例えば、後述の実施例記載の方法において、準完全長プロウイルスの検出限界は1μgの細胞ＤＮＡあたり1コピーである。1μgの細胞ＤＮＡは14万個のリンパ球に含まれる量である。すなわち14万個のリンパ球の中に準完全長ＨＩＶプロウイルスをもつ感染細胞1個以上存在する場合、その準完全長プロウイルスを検出することができる。機能的治癒を判定するための検出限界は、本発明の測定法を用いた機能的治癒の臨床研究により、将来決定されるものである。
【００３９】
感染細胞内における準完全長ＨＩＶプロウイルスの量を評価することにより、ＨＩＶ感染症の機能的治癒が達成されたか否かを判定することができる。よって、本発明は、準完全長ＨＩＶプロウイルスが、ＨＩＶの病態を示すマーカーとなりうることを証明するものである。
【００４０】
ＨＩＶ感染細胞内の準完全長ＨＩＶプロウイルスの量を評価することにより、抗ＨＩＶ薬の薬効を検査することができる。よって、本発明は、抗ＨＩＶ薬の薬効を検査する方法であって、ＨＩＶ感染細胞内の準完全長ＨＩＶプロウイルスの量を評価することを含む、前記方法を提供する。
【００４１】
例えば、抗ＨＩＶ薬投与の前後及び／又は抗ＨＩＶ薬投与継続中のある期間の前後で、ＨＩＶ感染細胞内の準完全長ＨＩＶプロウイルスの量を評価し、準完全長ＨＩＶプロウイルスの数が減少した場合には、ＨＩＶの機能的治癒が達成された、あるいは達成しつつあると判定し、準完全長ＨＩＶプロウイルスの量が減少しなかった場合には、ＨＩＶの機能的治癒を可能としないと判定することができる。
【００４２】
また、ＨＩＶ感染細胞内の準完全長ＨＩＶプロウイルスの量を評価することにより、ＨＩＶの機能的治癒を可能とする薬剤をスクリーニングすることができる。よって、本発明は、ＨＩＶの機能的治癒を可能とする薬剤をスクリーニングする方法であって、ＨＩＶ感染細胞内の準完全長ＨＩＶプロウイルスの量を評価することを含む、前記方法を提供する。
【００４３】
例えば、薬剤投与の前後及び／又は薬剤投与継続中のある期間の前後で、ＨＩＶ感染細胞内の準完全長ＨＩＶプロウイルスの量を評価し、準完全長ＨＩＶプロウイルスの量が減少した場合には、ＨＩＶの機能的治癒を可能としうると判定し、準完全長ＨＩＶプロウイルスの量が減少しなかった場合には、ＨＩＶの機能的治癒を可能としないと判定することができる。
【００４４】
また、本発明は、ＨＩＶプロウイルスの全長に点在する３〜７箇所の領域を検出することにより、ＨＩＶ感染細胞内の準完全長ＨＩＶプロウイルスの量を評価する方法も提供する。この評価方法については、上述した。
【００４５】
さらに、本発明は、準完全長ＨＩＶプロウイルスの量を評価するためのキットであって、ＨＩＶプロウイルスの全長に点在する３〜７箇所の領域を増幅できるプライマー及び前記プライマーにより増幅された核酸を検出できる試薬（例えば、蛍光標識プローブ、インターカレーターなど）を含む、前記キットを提供する。準完全長ＨＩＶプロウイルス、準完全長ＨＩＶプロウイルスの量、準完全長ＨＩＶプロウイルスの量の評価、ＨＩＶプロウイルスの全長に点在する３〜７箇所の領域を増幅できるプライマー、前記プライマーにより増幅された核酸を検出できる試薬などについては、上述した。キットには、さらに、準完全長ＨＩＶプロウイルスの量の評価に必要なその他の試薬一式、緩衝液、取扱説明書、評価のためのソフトウェアなどが含まれてもよい。取扱説明書には、キットの使用方法の説明の他、検量線、準完全長ＨＩＶプロウイルスの量の評価結果からＨＩＶ感染者に対する治療効果、病態進行度、治療中断時期などを予測するための判定基準、注意書きなども記載しておくとよい。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例1〕
実験方法
(1) 準完全長プロウイルス定量法（表1、表2、図1）
血液からFicoll-Paque（GE Health care）を用いて末梢血単核球を調製し、そこからDNA Blood Kit（QIAGEN）を用いてＤＮＡを抽出した。【００４７】
第1ラウンドのマルチプレックスＰＣＲは、ポアソン分布の確率分布を参考に、ＰＣＲ反応の約30%が陽性となるように1反応あたり約0.4コピーのＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡを含む20μlのTEを調製し、プロウイルスの全長に点在する5か所のＰＣＲプライマー（塩基配列を表1に示す）を含む30μlのプレミックス液（組成を表2に示す）に加えた。陽性対照にはpNL43、陰性対照にはTEを用いた。ＰＣＲ装置は、GeneAmp PCR system 9700を使用した。ＰＣＲの温度条件は、94℃ 2分の反応後、94℃ 5秒、60℃ 10秒、72℃ 30秒の3ステップ反応を30サイクルとした。反応終了後、250 mM EDTAを1反応あたり1μl加え、反応を停止した。第2ラウンドのリアルタイムＰＣＲは、第1ラウンド マルチプレックスＰＣＲ産物を100倍に希釈した溶液5μlに、表1に塩基配列を示すプライマーを含む15μlのプレミックス液（組成を表2に示す）に加えた。リアルタイムＰＣＲ装置は、ABI Step One plusを使用した。リアルタイムＰＣＲの温度条件は、95℃ 20秒の反応後、95℃ 1秒、60℃ 10秒、72℃ 20秒の3ステップ反応を50サイクル行い、 融解曲線ステージを95℃ 15秒、60℃ 1分、95℃、15秒で行った。【００４８】
陽性反応の判定は、(i) 第2ラウンド リアルタイムＰＣＲで得られたCT値が陰性対照反応よりも陽性対照反応に近いこと、(ii) 融解曲線から得られる融解温度が陽性対照のそれの0.5℃以内であること、(iii) 融解曲線の半値幅が陽性対照のそれとほぼ同じであることの3つを同時に満たすことを条件とした（図1）。【００４９】
準完全長プロウイルスの定量は、終点希釈において5か所すべてでＰＣＲが陽性になった反応の頻度をポアソン分布の確率密度式に代入して求めた。
(2) 定量値の正確さ
制限酵素を用いて直鎖状にしたHIV-1サブタイプBのプラスミド（pREJO.c、pCH077.t、pNL43、すべてNIHから入手）各々について定量値の正確さを検討した。制限酵素は、pREJO.cに対してはSal I、pCH077.tに対してはNot I、pNL43に対してはNco I（すべてNew England BioLabs）を用いた。プラスミドの濃度は260 nmの吸光度から、1 OD = 50 mg/mlを用いて求めた。
(3) ＤＮＡ抽出段階におけるＤＮＡ損傷
HIV-1非感染者の血液から調製した末梢血単核球に、制限酵素Nco Iを用いて直鎖状にしたＨＩＶ−１サブタイプBプラスミド（pNL43）を混和し、DNA Blood Kitを用いてＤＮＡ抽出を行った後、本検査を行った。
(4) 抗ＨＩＶ治療開始前後の準完全長プロウイルス量
未治療患者5例と抗ＨＩＶ治療開始後3年以上ウイルス未検出の患者5例の血液検体を用いて本検査を行った。
(5) 抗ＨＩＶ治療開始後9年間の追跡調査
ある患者の抗ＨＩＶ治療後9年間にわたる7血液検体（図2）を用いて本検査を行った。血漿中ＨＩＶ ＲＮＡ量の測定は、コバスタックマンＨＩＶ−１「オート」を用いて行った（BML（本社  〒151-0051  渋谷区千駄ヶ谷5-21-3、総合研究所  〒350-1101  埼玉県川越市的場1361-1）に依頼）。ＣＤ４陽性リンパ球は、フローサイトメーター用いて測定を行った（慶応義塾大学病院中央検査部へ依頼）。【００５０】
結果
(1) 定量値の正確さ（図3、図4、図5）
全プロウイルスに対する準完全長プロウイルスの割合は、pREJO.cは16/16、pCH077.tは14/15、pNL43は18/18であり、平均98％であった。本検査法を用いて準完全長プロウイルスの定量が可能であることが示された。（表3）
(2) ＤＮＡ抽出段階におけるＤＮＡ損傷（図6、図7、図8）
全プロウイルスに対する準完全長プロウルスの割合は、1回目は17/20、2回目は18/20、3回目は14/18であり、平均88％であった。ＤＮＡ抽出の操作によるＤＮＡへの大きな損傷は見受けられなかった。（表4）
(3) 抗ＨＩＶ治療開始前後の準完全長プロウイルス量（図9〜図18）
全プロウイルスに対する準完全長プロウイルスの割合は、治療前は平均26％、治療後は平均2％（ウェルチのt検定、P＝0.003）であり、統計学的に極めて有意であった。（表5）
(4) 抗ＨＩＶ治療開始後9年間の追跡調査（図22-29）
抗ＨＩＶ治療を始めて年数が経つにつれて、欠損プロウイルスを含めた全プロウイルス量も準完全長プロウイルス量も減少したが、抗ＨＩＶ治療を始めて約5年以上が経過した検体では、全プロウイルスが80〜150copies/μg DNAが存在するにも関わらず、準完全長プロウイルスが検出されなかった。この結果は準完全長プロウイルス量の方が全プロウイルス量よりも抗ＨＩＶ療法の効果をより精確に反映していることを示している。【００５１】
考察
本発明を用いて、ＨＩＶ−１プロウイルス1コピーを5か所（U5、gag、vif、env、U3）の部位で定量することが可能であることが確認された。また、増幅可能感染個体内のプロウイルスは、抗ＨＩＶ治療によりウイルス複製が長期にわたり抑制される間に断片化されていくことが示唆された。準完全長プロウイルス定量は、培養操作を必要とせず、ＰＣＲだけで実行可能であるため、多数の抗ＨＩＶ治療患者のリザーバーサイズのモニタリングとして有望な方法と考えられる。【００５２】
【表１】
0006614455.tif 000002
【００５３】
【表２】
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【００５４】
【表３】
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【００５５】
【表４】
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【００５６】
【表５】
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【００５７】
【表６】
0006614455.tif 000007
【００５８】
〔実施例2〕
実験方法
(1) マルチプレックス・ネステッドPCR（図30）
マルチプレックス・ネステッドPCR産物のアガロースゲル電気泳動を行った。具体的には、1 × TAE緩衝液を用い、2.0%アガロースゲルで、8 V/cmの電圧をかけて15分間電気泳動を行った。1回目のPCRは、1 × PCR緩衝液（インビトロジェン）、4 mMのMgCl2、0.2 mMの各dNTP、0.12 μMの各プライマー（U5-1FG、U5-1RG、gag-1FG、gag-1RG、vif-1FG、vif-1RG、env-1FG、env-1RG、U3-1FG、U3-1RG）、0.1 μlのPlatinum Taq DNAポリメラーゼ（インビトロジェン）、および50 ngのヒト細胞DNAを含む25 μl溶液中で行った。2回目のPCRは、1 × PCR緩衝液、4 mMのMgCl2、0.2 mMの各dNTP、0.12 μMの各プライマー（U5-2FG、U5-2RG、gag-2FG、gag-2RG、vif-2FG、vif-2RG、env-2FG、env-2RG、U3-2FG、U3-2RG）、0.1 μlのPlatinum Taq DNAポリメラーゼ（インビトロジェン）、および1回目のPCR産物のうちの1 μlを含む25 μlの溶液中で行った。1回目のPCRの温度設定は、97°Cで2分間の後、97°Cで5秒間、58°Cで10秒間、72°Cで15秒間からなるサイクルを5回行った後、94°Cで5秒間、58°Cで10秒間、72°Cで15秒間からなるサイクルを35回行い、最後は4°Cで冷却した。2回目のPCRの温度設定は、94°Cで2分間の後、94°Cで5秒間、58°Cで10秒間、72°Cで15秒間からなるサイクルを30回行い、最後は4°Cで冷却した。レーン1は陰性対照としてTEをPCRに加えた。レーン2-15は1反応あたり平均して1コピーのNotI切断HIV-1 DNAプラスミドpTRJO.cを加えた。レーン16は陽性対照として10コピーのNotI切断HIV-1 DNAプラスミドpRHPA.cを加えた。レーン17は100 bp DNAラダー（タカラバイオ）である。
PCR用プライマー
・1回目のPCRにおいてU5領域を増幅するための上流側プライマーU5-1FGの塩基配列：
5'-GGCTAACTAGGGAACCCACTGC-3'（配列番号２１）
(塩基数、22；標準株HXB2における塩基番号、496-517）
・1回目のPCRにおいてU5領域を増幅するための下流側プライマーU5-1RGの塩基配列：
5'-AGCAAGCCGAGTCCTGCG-3'（配列番号２２）
(塩基数、18；標準株HXB2における塩基番号、707-690）
・1回目のPCRにおいてgag領域を増幅するための上流側プライマーgag-1FGの塩基配列：
5'-GGGACATCAAGCAGCYATGC-3'（配列番号２３）
(塩基数、20；標準株HXB2における塩基番号、1365-1384）
・1回目のPCRにおいてgag領域を増幅するための下流側プライマーgag-1RGの塩基配列：
5'-ATCCATCCTATTTGTTCCTGAAGGKTACT-3'（配列番号２４）
(塩基数、29；標準株HXB2における塩基番号、1538-1510）
・1回目のPCRにおいてvif領域を増幅するための上流側プライマーvif-1FGの塩基配列：
5'-CCTAGGTGTGAHTATCMAGCAGGACA-3'（配列番号２５）
(塩基数、26；標準株HXB2における塩基番号、5431-5456）
・1回目のPCRにおいてvif領域を増幅するための下流側プライマーvif-1RGの塩基配列：
5'-GTCTTCKGGGGCTTGTTCCATCT-3'（配列番号２６）
(塩基数、23；標準株HXB2における塩基番号、5579-5557）
・1回目のPCRにおいてenv領域を増幅するための上流側プライマーenv-1FGの塩基配列：
5'-GAGATATGAGGGAYAATTGGAGAAGTGA-3'（配列番号２７）
(塩基数、28；標準株HXB2における塩基番号、7642-7669）
・1回目のPCRにおいてenv領域を増幅するための下流側プライマーenv-1RGの塩基配列：
5'-GCGCCCATAGTGCTTCCTGC-3'（配列番号２８）
(塩基数、20；標準株HXB2における塩基番号、7819-7800）
・1回目のPCRにおいてU3領域を増幅するための上流側プライマーU3-1FGの塩基配列：
5'-GTGGGTTTTCCAGTCARRCCTCA-3'（配列番号２９）
(塩基数、23；標準株HXB2における塩基番号、8992-9014）
・1回目のPCRにおいてU3領域を増幅するための下流側プライマーU3-1RGの塩基配列：
5'-RYCCCTGGCCCTGGTGTGTA-3'（配列番号３０）
(塩基数、20；標準株HXB2における塩基番号、9194-9175）
・2回目のPCRにおいてU5領域を増幅するための上流側プライマーU5-2FGの塩基配列
5'-GCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGT-3'（配列番号３１）
(塩基数、22；標準株HXB2における塩基番号、546-567）
・2回目のPCRにおいてU5領域を増幅するための下流側プライマーU5-2RGの塩基配列
5'-GGGCGCCACTGCTAGAGATTTT-3'（配列番号３２）
(塩基数、22；標準株HXB2における塩基番号、643-622）
・2回目のPCRにおいてgag領域を増幅するための上流側プライマーgag-2FGの塩基配列
5'-CAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATA-3'（配列番号３３）
(塩基数、26；標準株HXB2における塩基番号、1404-1429）
・2回目のPCRにおいてgag領域を増幅するための下流側プライマーgag-2RGの塩基配列
5'-TAGTTCCTGCTATGTCACTTCCCCT-3'（配列番号３４）
(塩基数、25；標準株HXB2における塩基番号、1507-1483）
・2回目のPCRにおいてvif領域を増幅するための上流側プライマーvif-2FGの塩基配列
5'-CAAGGTAGGATCYCTACARTACTTGGC-3'（配列番号３５）
(塩基数、27；標準株HXB2における塩基番号、5460-5486）
・2回目のPCRにおいてvif領域を増幅するための下流側プライマーvif-2RGの塩基配列
5'-AGTTTCBYAACACTAGGYAAAGGTGG-3'（配列番号３６）
(塩基数、26；標準株HXB2における塩基番号、5546-5521）
・2回目のPCRにおいてenv領域を増幅するための上流側プライマーenv-2FGの塩基配列
5'-GTAAAAATTGAACCATTAGGRRTAGCACC-3'（配列番号３７）
(塩基数、29；標準株HXB2における塩基番号、7689-7717）
・2回目のPCRにおいてenv領域を増幅するための下流側プライマーenv-2RGの塩基配列
5'-GCTTCCTGCTGCTCCCAARAA-3'（配列番号３８）
(塩基数、21；標準株HXB2における塩基番号、7808-7788）
・2回目のPCRにおいてU3領域を増幅するための上流側プライマーU3-2FGの塩基配列
5'-GACAAGATATCCTTGAYCTGTGGRT-3'（配列番号３９）
(塩基数、25；標準株HXB2における塩基番号、9113?9137）
・2回目のPCRにおいてU3領域を増幅するための下流側プライマーU3-2RGの塩基配列
5'-GTGTGTAGTTMTGCCARTCAGGGAA-3'（配列番号４０）
(塩基数、25；標準株HXB2における塩基番号、9181?9157）
・塩基配列に示した「5'-」と「-3'」はそれぞれ5'端と3'端であることを表す。
また、塩基配列にしめした「A」、「G」、「C」、「T」以外の記号は、
R：AとGの縮重、
M：AとCの縮重、
K：TとGの縮重、
Y：TとCの縮重、
H：AとCとTの縮重、
B：GとCとTの縮重
を表す。
（２）個別2回目PCR（図31）
個別2回目PCR産物のアガロースゲル電気泳動を行った。具体的には、1 × TAE緩衝液を用い、2.0%アガロースゲルで、8 V/cmの電圧をかけて15分間電気泳動を行った 個別2回目PCRは、1 × PCR緩衝液、4 mMのMgCl2、0.2 mMの各dNTP、0.12 μMの次のプライマー対のいずれか（U5-2FG/U5-2RG、gag-2FG/gag-2RG、vif-2FG/vif-2RG、env-2FG/env-2RG、U3-2FG/U3-2RG）、0.1 μlのPlatinum Taq DNAポリメラーゼ（インビトロジェン）、および1回目のPCR産物のうちの1 μlを含む25 μl溶液中で行った。PCRの温度設定は、94°Cで2分間の後、94°Cで5秒間、58°Cで10秒間、72°Cで15秒間からなるサイクルを30回行い、最後は4°Cで冷却した。レーン1-5は陰性対照として1 回目のPCR産物(1)（図1のレーン1）をPCRに加えた。レーン6-10は1 回目のPCR産物(8)（図1のレーン8）を加えた。レーン11-15は1 回目のPCR産物(10)（図1のレーン10）を加えた。レーン16-20は1 回目のPCR産物(12)（図1のレーン12）を加えた。レーン21-25は1 回目のPCR産物(15)（図1のレーン15）を加えた。レーン26-30は陽性対照として1 回目のPCR産物(16)（図1のレーン16）を加えた。レーン31は100 bp DNAラダー（タカラバイオ）である。レーン1、6、11、16、21、26にはU5-2FG/U5-2RGのプライマー対を使用した。レーン2、7、12、17、22、27にはgag-2FG/gag-2RGのプライマー対を使用した。レーン3、8、13、18、23、28にはvif-2FG/vif-2RGのプライマー対を使用した。レーン4、9、14、19、24、29にはenv-2FG/env-2RGのプライマー対を使用した。レーン5、10、15、20、25、30にはU3-2FG/U3-2RGのプライマー対を使用した。レーン31は100 bp DNAラダー（タカラバイオ）である。
結果
マルチプレックス・ネステッドPCR産物のアガロースゲル電気泳動を図30に示す。また、個別2回目PCR産物のアガロースゲル電気泳動を図31に示す。
図30において、陰性対照のレーン1には予想通りバンドがなかった。陽性対照のレーン16には予想通り、レーン17の分量マーカーと比較して、約100塩基対付近にバンドが認められた。レーン2から15の14個のPCR反応のうち10個で、陽性対照と同様なバンドが0.71の割合で検出された。ポアソン分布式によると、1反応あたり平均1個の対象DNAが存在する場合、陽性反応が検出される割合は0.63と計算され、両者はよく一致している。したがって、本実験の結果は、1分子のHIV-1 DNAが本法によりほぼ必ず検出されることを示している。
図31において、陰性対照のレーン1-5には予想通りバンドがなかった。陽性対照のレーン26-30には、レーン17の分量マーカーと比較して、それぞれのプライマー対から予想される通りの塩基対をもったバンドが認められた。図30で陽性が確かめられた4個の1回目のPCR産物を用いた場合の結果である、レーン6-10、レーン11-15、レーン16-20、レーン21-25には、陽性対照と同様に、それぞれのプライマー対から予想される通りの塩基対をもったバンドが検出された。この結果は、本法により1分子の全長のHIV-1 DNAをU5、gag、vif、env、U3の5カ所の部位で同時に検出することを示している。すなわち、この結果は、完全長のHIV-1 DNAとを断片化したHIV-1 DNAを区別して定量できることを意味している。
考察
これらの結果は、我々の開発したマルチプレックス・ネステッドPCRと個別2回目PCRを用いることにより、単一コピーのHIV-1 DNA分子を5カ所の部位（U5、gag、vif、env、U3）で同時に検出できることを示している。このことは、本技術により準完全長HIV-1プロウイルスDNAを、部分的なプロウイルスDNAと区別して定量できることを意味している。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明は、HIV感染者に対する治療効果や病態の進行度の予測に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００６０】
＜配列番号１＞
配列番号１は、フォワードプライマーU5-1Fの塩基配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、リバースプライマーU5-1Rの塩基配列を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、フォワードプライマーgag-1Fの塩基配列を示す。
＜配列番号４＞
配列番号４は、リバースプライマーgag-1Rの塩基配列を示す。
＜配列番号５＞
配列番号５は、フォワードプライマーvif-1Fの塩基配列を示す。
＜配列番号６＞
配列番号６は、リバースプライマーvif-1Rの塩基配列を示す。
＜配列番号７＞
配列番号７は、フォワードプライマーenv-1Fの塩基配列を示す。
＜配列番号８＞
配列番号８は、リバースプライマーenv-1Rの塩基配列を示す。
＜配列番号９＞
配列番号９は、フォワードプライマーU3-1Fの塩基配列を示す。
＜配列番号１０＞
配列番号１０は、リバースプライマーU3-1Rの塩基配列を示す。
＜配列番号１１＞
配列番号１１は、フォワードプライマーU5-2Fの塩基配列を示す。
＜配列番号１２＞
配列番号１２は、リバースプライマーU5-2Rの塩基配列を示す。
＜配列番号１３＞
配列番号１３は、フォワードプライマーgag-2Fの塩基配列を示す。
＜配列番号１４＞
配列番号１４は、リバースプライマーgag-2Rの塩基配列を示す。
＜配列番号１５＞
配列番号１５は、フォワードプライマーvif-2Fの塩基配列を示す。
＜配列番号１６＞
配列番号１６は、リバースプライマーvif-2Rの塩基配列を示す。
＜配列番号１７＞
配列番号１７は、フォワードプライマーenv-2Fの塩基配列を示す。
＜配列番号１８＞
配列番号１８は、リバースプライマーenv-2Rの塩基配列を示す。
＜配列番号１９＞
配列番号１９は、フォワードプライマーU3-2Fの塩基配列を示す。
＜配列番号２０＞
配列番号２０は、リバースプライマーU3-2Rの塩基配列を示す。
＜配列番号２１＞
配列番号２１は、フォワードプライマーU5-1FGの塩基配列を示す。
＜配列番号２２＞
配列番号２２は、リバースプライマーU5-1RGの塩基配列を示す。
＜配列番号２３＞
配列番号２３は、フォワードプライマーgag-1FGの塩基配列を示す。
＜配列番号２４＞
配列番号２４は、リバースプライマーgag-1RGの塩基配列を示す。
＜配列番号２５＞
配列番号２５は、フォワードプライマーvif-1FGの塩基配列を示す。
＜配列番号２６＞
配列番号２６は、リバースプライマーvif-1RGの塩基配列を示す。
＜配列番号２７＞
配列番号２７は、フォワードプライマーenv-1FGの塩基配列を示す。
＜配列番号２８＞
配列番号２８は、リバースプライマーenv-1RGの塩基配列を示す。
＜配列番号２９＞
配列番号２９は、フォワードプライマーU3-1FGの塩基配列を示す。
＜配列番号３０＞
配列番号３０は、リバースプライマーU3-1RGの塩基配列を示す。
＜配列番号３１＞
配列番号３１は、フォワードプライマーU5-2FGの塩基配列を示す。
＜配列番号３２＞
配列番号３２は、リバースプライマーU5-2RGの塩基配列を示す。
＜配列番号３３＞
配列番号３３は、フォワードプライマーgag-2FGの塩基配列を示す。
＜配列番号３４＞
配列番号３４は、リバースプライマーgag-2RGの塩基配列を示す。
＜配列番号３５＞
配列番号３５は、フォワードプライマーvif-2FGの塩基配列を示す。
＜配列番号３６＞
配列番号３６は、リバースプライマーvif-2RGの塩基配列を示す。
＜配列番号３７＞
配列番号３７は、フォワードプライマーenv-2FGの塩基配列を示す。
＜配列番号３８＞
配列番号３８は、リバースプライマーenv-2RGの塩基配列を示す。
＜配列番号３９＞
配列番号３９は、フォワードプライマーU3-2FGの塩基配列を示す。
＜配列番号４０＞
配列番号４０は、リバースプライマーU3-2RGの塩基配列を示す。
【図１】
0006614455.tif 000008
【図２】
0006614455.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
0006614455.tif 000020
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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