(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成による配列決定によりポリヌクレオチド鎖を配列決定する方法であって、
前記方法は、
ａ）配列決定されるポリヌクレオチド鎖、プライマー、およびポリメラーゼ酵素を反応中で提供する工程；
ｂ）あらかじめ定められた順序でヌクレオチドを反応に提供する工程であって、あらかじめ定められた順序がポリヌクレオチド鎖について予測される配列と相関するように選択される、工程；
ｃ）合成されたポリヌクレオチド鎖へのヌクレオチドのとり込みを検知するために反応をモニタリングする工程を含み、
ヌクレオチドのとり込みが検知される場合、あらかじめ定められた順序で次のヌクレオチドを提供するように進められる、方法。
【請求項２】
ヌクレオチドのとり込みが検知されない場合、ポリヌクレオチド鎖について予測される配列は修正されて、ヌクレオチドの新しいあらかじめ定められた順序が選択され、
新しいあらかじめ定められた順序は修正された予測された配列と相関するように選択される、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヌクレオチドのとり込みが検知されない場合、４つのすべてのヌクレオチドの複数のサイクルを表すヌクレオチドの新しいあらかじめ定められた順序が選択される、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ヌクレオチドのとり込みが検知されない場合、反応は停止する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ヌクレオチドの順序は、予測されたポリヌクレオチド配列の順序に相補的な配列の順序に一致する、ことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
予測されたポリヌクレオチド配列は経験的な情報に基づいて予測される、ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
複数の予測される配列の最初の相対的な可能性を決定する工程と、複数の予測される配列の最も可能性がある配列となるように最初の予測される配列を選択する工程を含む、ことを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
予測された配列を修正する際に、複数の予測される配列の次の最も可能性のある配列を、修正された予測された配列として選択する工程をさらに含む、ことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
予測される配列は、既知の対象の配列に基づく、ことを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ヌクレオチドのとり込みを検知するために反応をモニタリングする工程は、とり込みが検知される場合に、そのヌクレオチドを表すデータを、配列決定されるポリヌクレオチドを表す記録された配列データに加えることをさらに含む、ことを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ヌクレオチドのとり込みを検知するために反応をモニタリングする工程は、ヌクレオチドのとり込みが検知されない場合、そのヌクレオチドの不在を表すデータを、配列決定されるポリヌクレオチドを表す記録された配列データに加えることをさらに含む、ことを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
予測された配列データを修正する工程は、記録された配列データを、データベースに保存されたポリヌクレオチド配列データと比較することと、記録された配列データと一致するデータベースから最も可能性の高い候補配列を、修正された予測された配列として選択することを含む、ことを特徴とする請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）の前に、反応に複数の異なるヌクレオチドを同時に提供する工程をさらに含む、ことを特徴とする請求項１乃至１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
複数の異なるヌクレオチドは４つのヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔの１つまたは２つが欠けている、ことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
複数の異なるヌクレオチドを提供する工程が複数回使用される、ことを特徴とする請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
ヌクレオチドのあらかじめ定められた順序は、配列決定される２以上の異なるポリヌクレオチドについて予測される配列と相関するように選択される、ことを特徴とする請求項１乃至１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ヌクレオチドの順序は、２以上の異なるポリヌクレオチド配列の各々の効率的な配列決定を可能にするように選択される、ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
合成による配列決定によりポリヌクレオチド鎖を配列決定する方法であって、
前記方法は、
ａ）配列決定されるポリヌクレオチド鎖、プライマー、およびポリメラーゼ酵素を反応中で提供する工程；
ｂ）複数の異なるヌクレオチドを反応に同時に提供する工程であって、複数の異なるヌクレオチドが４つのヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ  Ｔの少なくとも１つを欠いている、工程；
ｃ）その後、あらかじめ定められた順序で反応にヌクレオチドを提供する工程であって、あらかじめ定められた順序がポリヌクレオチド鎖の予測される配列と相関するように選択される、工程；
ｄ）合成されたポリヌクレオチド鎖へのあらかじめ定められた順序のヌクレオチドのとり込みを検知するために、反応をモニタリングする工程、および、
ｅ）ヌクレオチドのとり込みが検知される場合、あらかじめ定められた順序で次のヌクレオチドを提供するように進める工程、を含む、方法。
【請求項１９】
ｆ）ヌクレオチドのとり込みが検知されない場合に、ポリヌクレオチド鎖の予測された配列を修正し、ヌクレオチドの新しいあらかじめ定められた順序を選択する工程であって、新しいあらかじめ定められた順序が修正された予測された配列と相関するように選択される、工程、をさらに含む、ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ｆ）ヌクレオチドのとり込みが検知されない場合に、ポリヌクレオチド鎖の予測された配列を修正し、４つのすべてのヌクレオチドの複数のサイクルを表すヌクレオチドの新しいあらかじめ定められた順序を選択する工程、をさらに含む、ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ｆ）ヌクレオチドのとり込みが検知されない場合に、反応を停止させる工程、をさらに含む、ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、合成方法による配列決定を使用して、ポリヌクレオチド鎖を配列決定する方法に関し、とりわけ、改善されたまたは最適化されたヌクレオチドフローの順序を有する方法に関する。本発明の態様は、合成方法による配列決定の際にヌクレオチドフローの順序を改善または最適化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
合成方法による配列決定は、次世代の配列決定（ＮＧＳ）技術で一般に使用される。標的ポリヌクレオチドフラグメントに相補的なヌクレオチド鎖は、ポリメラーゼ酵素によるヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰｓ）のとり込みによって拡張され、とり込みは、例えば、螢光、または重合中に放出された水素イオンの検出によって検知される。後者の技術はイオン半導体配列決定方法で使用される。所定のｄＮＴＰの鎖へのとり込みは、相補的なヌクレオチドが鋳型鎖中のその位置に存在することを意味する。
【０００３】
いくつかの技術では、取り込まれた特異的なヌクレオチドを決定することができるように、様々なヌクレオチドには様々な検知可能な標識が与えられる。しかしながら、ある代替的な手法は、単純に、ポリメラーゼ反応に対して一度に単一のタイプのヌクレオチドを加えることであり、ヌクレオチドのとり込みが検知されると、鋳型鎖中の相補的なヌクレオチドに知らされる。典型的に、配列決定反応は、４つのヌクレオチドすべてを順番に循環し、配列決定の間これを繰り返す。しかしながら、これはプロセスに時間制限を課すものである。なぜなら、配列を得るためにサイクルを複数回繰り返すことが必要だからであり、鋳型鎖中のヌクレオチドの順序に依存して、一塩基の情報を得るために最大で４つのヌクレオチドフローが必要になることもあるからである。
【０００４】
しかしながら、合成技術による配列決定の多くの適用について、鋳型の予想される配列は知られているか、または少なくとも部分的には知られている。例えば、患者のサンプルは疑わしい病原体の存在について分析されることもあり、それによって所定の病原体について特徴的な配列が検知される。この例において、検知される配列は既に知られている。代替的に、例えば、ある遺伝子配列での変異体は、所定の多型性または突然変異の存在または不在を決定するために検知されることもある。ここで再度、配列の少なくとも一部は知られている。合成による配列決定の特定の適用では、ポリヌクレオチドフラグメントは、配列決定プライマーが結合することができる既知の配列のアダプターに連結またはさもなければ該アダプターを取り込むことにより配列決定のために作成される。配列決定反応の少なくともこの部分は、配列決定される領域についての知識から利益を得ることもある。
【０００５】
ＵＳ２０１４／００３１２３８は、単なる４つのヌクレオチドすべての連続的な繰り返しではない、代替的なヌクレオチドフローの順序付けの使用について記載している。この代替的な順序付けは、不完全な拡張に起因する相の同調性の喪失を伴う潜在的な問題に対処するためといわれている。ヌクレオチドフローの順序は既知の配列の存在を利用して修正されてもよいという提案はない。
【０００６】
合成方法による配列決定を提供することは有利であり、それによってヌクレオチドフローの順序が改善または最適化されることもある。特定の実施形態では、検知されるために配列についての経験的知識を使用して達成される。他の実施形態では、有望と思われる候補配列が選択されることもあり、ヌクレオチドフローは存在する特定の配列の可能性に基づいて決定されることもある。またさらなる実施形態では、フィードバック機構は合成による配列決定の間にヌクレオチドフローを修正するために使用されることもある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の態様によれば、合成による配列決定によりポリヌクレオチド鎖を配列決定する方法が提供され、該方法は、
ａ）配列決定されるポリヌクレオチド鎖、プライマー、およびポリメラーゼ酵素を反応中で提供する工程；
ｂ）あらかじめ定められた順序でヌクレオチドを反応に提供する工程であって、あらかじめ定められた順序がポリヌクレオチド鎖について予測される配列と相関するように選択される、工程；
ｃ）合成されたポリヌクレオチド鎖へのヌクレオチドのとり込みを検知するために反応をモニタリングする工程を含み、
ヌクレオチドのとり込みが検知される場合、あらかじめ定められた順序で次のヌクレオチドを提供するように進められる。
【０００８】
該方法はさらに、ヌクレオチドのとり込みが検知されない場合、ポリヌクレオチド鎖について予測された配列を修正する工程と、ヌクレオチドの新しいあらかじめ定められた順序を選択する工程であって、新しいあらかじめ定められた順序は修正された予測された配列と相関するように選択される、工程をさらに含む。
【０００９】
予測された配列を修正して合成を継続する代わりに、反応が単純に停止させられることもある。これは、配列決定が特異的な予測される配列の存在異を判定するために使用される場合（従って、存在しない場合には反応は停止させられることもある）、または複数の候補となりそうな予測される配列が試験された場合に、望ましいこともある。反応の停止に取って代わるまたさらなる代替策は、すべての４つのヌクレオチドの複数のサイクル（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、繰り返し）を表すヌクレオチドの新しいあらかじめ定められた順序を選択することである。これは、複数の候補となりそうな予測される配列が試験され、かつ実際の配列が依然として未知である場合に有利なこともあり、従って、配列決定は４つのヌクレオチドの単純な繰り返しサイクルに戻ることができる。
【００１０】
したがって、本方法では、ヌクレオチドが反応に提供される順序は、配列決定されるポリヌクレオチドについての知識に基づいて選択される。予測される配列が正しい場合、ヌクレオチドが提供されるたびにヌクレオチド合成が生じる（合成誤差を考慮するとともに、あらかじめ定められた順序が予測される配列に完全に相補的であると仮定する）。ヌクレオチドのとり込みの検出は、予測される配列が正しく、次のヌクレオチドが提供されることを確認する。ヌクレオチドのとり込みが検知されない場合、（再度、合成誤差を考慮して）予測されたヌクレオチド配列は正しくない。その後、予測される配列は誤差を考慮に入れるために修正されることもあり、ヌクレオチドの順序はそれに応じて修正される。
【００１１】
したがって、本方法は、ヌクレオチドが提供される順序を知らせて修正するために合成反応からのフィードバックを利用するという点で適応性がある。これにより、ヌクレオチドのとり込みの予想速度を、４つに１つ（４つのヌクレオチドフローごとに１つのフローだけが正しい）から、より高く、すなわち、１つに１つ（配列が完全に予測されている−実際にはもっと低い）まで上昇させることが可能である。これは配列決定操作を行うために必要な時間を減らすことができるだけでなく、必要な試薬の量も減らすことができる。
【００１２】
ヌクレオチドは好ましくはｄＮＴＰｓであり、より好ましくは、４つの異なるｄＮＴＰｓが提供される（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）。
【００１３】
「相関するように選択される」との用語は好ましくは、ヌクレオチドの順序が、予測されたポリヌクレオチド配列の順序に相補的な配列の順序に一致することを意味する。「相補的な」は好ましくは「完全に相補的である」ことを意味するが、多少なりとも１００％未満の相補性が使用される状況もある。
【００１４】
予測されるポリヌクレオチド配列は経験的な情報に基づいて予測されることもある。例えば、配列は検知される可能性のある配列についての知識に基づいて予測されることもある。一例として、患者が細菌または他の感染症に罹っている疑いのある臨床設定において、臨床的状況−症状、最近の病歴、または他の患者の詳細など−についての知識は、他の感染よりも特定の感染をよく確認することもある。予測される配列はこの情報に基づいて決定されることもある。例えば、ある患者がＭＲＳＡ感染症に罹っている疑いがある場合、予測される配列はＭＲＳＡ感染症の症状を示すように選択されることもある。複数の異なる感染が可能性があると考えられることもあれば、異なる可能性の場合もある。したがって、該方法は、複数の予測される配列の最初の相対的な可能性を決定する工程と、複数の予測される配列の最も可能性がある配列となるように最初の予測される配列を選択する工程を含むこともある。該方法は、予測された配列を修正する際に、複数の予測される配列の最も可能性のあるものを修正された予測された配列として選択する工程をさらに含むこともある。このように、いくつかの可能性が考慮されて、確認されるか、または却下されてもよい。
【００１５】
代替的に、または、加えて、予測される配列は、既知の対象の配列に基づくこともある。例えば、分析が特定の生命体の存在または不在を検知するために実行されている場合、その生命体の特徴的なポリヌクレオチド配列が予測される配列として使用されてもよい。これも一連の様々な生命体を包含するために拡張されてもよい−例えば、１６Ｓと２３Ｓのリボソーム遺伝子は複数の異なる生命体の診断に役立つこともあり、１つまたは他方、または両方が最初の予測される配列として使用されてもよい。これは、もっとも可能性の高い配列が当初選択される事前の実施形態と組み合わせ可能であり、これはヌクレオチドのとり込みが非検出されない場合に、次にもっとも可能性の高い予測される配列に修正される。他の多くの診断用配列が使用されてもよい；例えば、腫瘍遺伝子、細菌毒素。
【００１６】
特定の実施形態において、ヌクレオチドのとり込みを検知するために反応をモニタリングする工程は、とり込みが検知される場合に、そのヌクレオチドを表すデータを、配列決定されるポリヌクレオチドを表す記録された配列データに加えることをさらに含む。ヌクレオチドを表すデータは、そのヌクレオチドの相補体を表すこともある。これにより、配列決定が進むにつれ、配列情報を記録することが可能になる。ヌクレオチドのとり込みが検知されない場合、配列からそのヌクレオチド（またはその相補体）の不在を表すデータも、記録された配列データに加えられることもある。
【００１７】
予測される配列データを修正する工程は、記録された配列データ（関連する場合、所定のヌクレオチドの不在の情報を含む）を、データベースに保存されたポリヌクレオチド配列データと比較することと、記録された配列データと一致するデータベースから最も可能性の高い候補配列を、修正された予測された配列として選択することを含んでもよい。データベースは、例えば、インターネットのようなコンピュータネットワークによってアクセス可能な遠隔のデータベースであってもよく、それは、公的に利用可能であってもよい（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ配列データベース）。代替的に、データベースは、例えば、ローカルのコンピュータメモリまたはローカルデータ記憶装置内に保存されるローカルデータベースであってもよい。データベースは、対象である可能性が最も高いとみなされる配列のみなどの配列情報の制限された部分集合を表すこともある。例えば、データベースは、一般的な病原体からの１６Ｓと２３Ｓの配列データのみを含むこともある。制限されたデータベースの使用は、記録された配列データをデータベース中の配列データと比較するのにかかる時間を減らすことができる。
【００１８】
該方法は、工程（ｂ）の前に、反応に複数の異なるヌクレオチドを同時に提供する工程をさらに含むかこともある。複数の異なるヌクレオチドは４つのヌクレオチドの１つまたは２が欠けていることがある。これは、欠けているヌクレオチドに遭遇するまで、ポリヌクレオチド配列の領域の迅速な拡張を可能にする。方法のこの態様は、配列の領域が既知のものであるか、または、配列決定の目的に有益であるか、対象であるとみなされない場合に、役に立つこともある；欠けているヌクレオチドは、対象領域までの、または対象領域に近くまでの配列拡張を可能にするように選択されてもよい。このように、対象ではない領域は迅速に回避されることもある。対象ではない既知の配列の領域は、例えば、アダプター配列、または高度に保存された遺伝子領域を含むことがある。提供される複数の異なるヌクレオチドは、対象領域に到達する前に迅速な合成が確実に終了するように、対象ではない既知の領域に基づいて選択されてもよい。複数の異なるヌクレオチドを提供する工程が複数回使用されてもよい。
【００１９】
該方法は、単一のポリヌクレオチド配列が配列決定されることになっている、または、複数の異なるポリヌクレオチド配列が配列決定されることになっている状況で、使用されてもよい。後者の状況では、ヌクレオチドのあらかじめ定められた順序は、２以上の、好ましくは、複数の異なるポリヌクレオチド配列のすべてについて予測される配列と相関するように選択されてもよい。好ましくは、ヌクレオチドの順序は、２つ以上の様々なポリヌクレオチド配列の各々の効率的な配列決定を可能にするように選択される。「効率的な」とは、４つの塩基がすべて反復して循環している順序と比較して（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの繰り返し）、検討中の配列すべてにわたって与えられるヌクレオチドに対する取り込まれた塩基の改善された比率を提供するヌクレオチドの順序として定められることもある。例えば、様々な配列は比較され、共通配列が決定されてもよく、ヌクレオチドの順序は共通配列（またはその相補体）に一致することもある。ヌクレオチドの順序を決定する他の方法が使用されてもよい。最も効率的な順序が他の実際的な理由によって可能ではないこともあるため、その順序は最も効率的な配列決定を提供する必要はない。「最適化した」との用語も、効率的な配列決定を提供する配列を参照するために本明細書で使用され、再度、「最適化した」とは、配列が最も効率的な配列決定を提供することを単に示唆しない。したがって、いくつかの配列は、他の配列よりももっと最適化されることもある。
【００２０】
本発明のさらなる態様は、合成反応による配列決定で提供されるヌクレオチドの順序を最適化する方法を提供し、該方法は、
ａ）配列決定されるポリヌクレオチドの予測される配列を決定する工程と、
ｂ）配列決定反応に提供されるヌクレオチドのあらかじめ定められた順序を決定する工程であって、あらかじめ定められた順序はポリヌクレオチド鎖の予測される配列と相関するように選択される、工程を含む。
【００２１】
該方法はさらに：
ｃ）配列決定されるポリヌクレオチドを含む配列決定反応にヌクレオチドを提供することにより、ポリヌクレオチド鎖の実際の配列を決定する工程と、
ｄ）予測される配列を実際の配列と比較する工程と、
ｅ）予測される配列が実際の配列と異なる場合に、実際の配列に基づいてポリヌクレオチド鎖の予測された配列を修正して、ヌクレオチドの新しいあらかじめ定められた順序を選択する工程であって、新しいあらかじめ定められた順序が修正された予測された配列と相関するように選択される、工程、を含む。
【００２２】
本発明のこの態様の他の特徴は上に記載された第１の態様に関するものである。
【００２３】
本発明のまたさらなる態様は、合成による配列決定により、ポリヌクレオチド鎖を配列決定する方法を提供し、該方法は、
ａ）配列決定されるポリヌクレオチド鎖、プライマー、およびポリメラーゼ酵素を反応で提供する工程；
ｂ）複数の異なるヌクレオチドを反応に同時に提供する工程であって、複数の異なるヌクレオチドが４つのヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ  Ｔの少なくとも１つを欠いている、工程、
ｃ）その後、あらかじめ定められた順序で反応にヌクレオチドを提供する工程であって、あらかじめ定められた順序がポリヌクレオチド鎖の予測される配列と相関するように選択される、工程、および、
ｄ）合成されたポリヌクレオチド鎖へのあらかじめ定められた順序のヌクレオチドのとり込みを検知するために、反応をモニタリングする工程、を含む。
【００２４】
該方法はさらに：
ｅ）ヌクレオチドのとり込みが検知される場合、あらかじめ定められた順序で次のヌクレオチドを提供するように進める工程、または、
ｆ）ヌクレオチドのとり込みが検知されない場合に、ポリヌクレオチド鎖の予測された配列を修正し、ヌクレオチドの新しいあらかじめ定められた順序を選択する工程であって、新しいあらかじめ定められた順序が修正された予測された配列と相関するように選択される、工程、をさらに含むこともある。
【００２５】
特定の実施形態では、ヌクレオチドのとり込みを検知するために反応をモニタリングする工程は、とり込みが検知される場合に、そのヌクレオチドを表すデータを、配列決定されるポリヌクレオチドを表す記録された配列データに加えることをさらに含む。ヌクレオチドを表すデータは、そのヌクレオチドの相補体を表すこともある。これにより、配列決定が進むにつれ、配列情報を記録することが可能になる。ヌクレオチドのとり込みが検知されない場合、配列からそのヌクレオチド（またはその相補体）の不在を表すデータも、記録された配列データに加えられることもある。
【００２６】
予測される配列データを修正する工程は、記録された配列データ（関連する場合、所定のヌクレオチドの不在の情報を含む）を、データベースに保存されたポリヌクレオチド配列データと比較することと、記録された配列データと一致するデータベースから最も可能性の高い候補配列を、修正された予測された配列として選択することを含んでもよい。データベースは、例えば、インターネットのようなコンピュータネットワークによってアクセス可能な遠隔のデータベースであってもよく、それは、公的に利用可能であってもよい（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ配列データベース）。代替的に、データベースは、例えば、ローカルのコンピュータメモリまたはローカルデータ記憶装置内に保存されるローカルデータベースであってもよい。データベースは、対象である可能性が最も高いとみなされる配列のみなどの配列情報の制限された部分集合を表すこともある。例えば、データベースは、一般的な病原体からの１６Ｓと２３Ｓの配列データのみを含むこともある。制限されたデータベースの使用は、記録された配列データをデータベース中の配列データと比較するのにかかる時間を減らすことができる。
【００２７】
本発明のまたさらなる態様は、合成による配列決定によりポリヌクレオチド鎖を配列決定する方法を提供し、該方法は、
ａ）配列決定される複数の異なるポリヌクレオチド鎖、１つ以上のプライマー、および１つのポリメラーゼ酵素を反応中に提供する工程、
ｂ）あらかじめ定められた順序で反応にヌクレオチドを提供する工程であって、あらかじめ定められた順序は複数の異なるポリヌクレオチド鎖の予測される配列と相関するように選択される、工程、および、
ｃ）合成されたポリヌクレオチド鎖へのあらかじめ定められた順序のヌクレオチドのとり込みを検知するために反応をモニタリングする工程を含み、ヌクレオチドのあらかじめ定められた順序が複数の異なるポリヌクレオチド配列の各々の効率的な配列決定を可能にするために選択される。
【００２８】
「効率的な」とは、すべての４つの塩基が単純に循環している（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの繰り返し）順序と比較して、検討中の配列すべてにわたって与えられるヌクレオチドに対する取り込まれた塩基の改善された比率を提供するヌクレオチドの順序として定められることもある。例えば、様々な配列は比較され、共通配列が決定されてもよく、ヌクレオチドの順序は共通配列（またはその相補体）に一致することもある。ヌクレオチドの順序を決定する他の方法が使用されてもよい。最も効率的な順序が他の実際的な理由によって可能ではないこともあるため、その順序は最も効率的な配列決定を提供する必要はない。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、ヌクレオチド送達の配列の変化を介して特定のポリヌクレオチドサンプルのヌクレオチド配列を決定するのにかかる時間を減らすことに関する。典型的には、合成方法による配列決定の際に、ヌクレオチドは、固定された順序（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）で配列決定反応に個々に提供され、合成されている鎖に加えられる次のヌクレオチドが存在する場合、鎖は拡張され、拡張は検知される。未使用のヌクレオチドは反応から洗い落とされ、配列の次のヌクレオチドが加えられる。ＩＳＦＥＴセンサーを使用するＤＮＡの配列決定は、一般にチップ上でのヌクレオチド（Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ａ）の連続するフローを含む。チップ全体に流された特定のヌクレオチドが鋳型鎖上でその相補体ヌクレオチドを見つけると、水素イオンは遊離され、ｍＶの変化としてＩＳＦＥＴセンサーによって検知される。一般に、それぞれの個々のセンサーは、ＤＮＡ鋳型のクローン母集団から放出された水素イオンを検知する。それはｅｍＰＣＲなどのクローン増幅技術によって生成されることがあり、ウェル内のビーズ上で固定化されてもよい。それぞれのクローン母集団は何百万もの同一のＤＮＡコピーを含むこともある。
【００３０】
文献では、標準的な４つのヌクレオチドサイクルを使用する際、ランダムなＤＮＡ配列は１サイクル当たり約２．４の塩基によって伸びることが報告されている。これは、すべてのヌクレオチドフローが鋳型鎖上に対応する相補的な塩基を持っているわけではないからであり、これにより約４０％のフローがヌルに（または０量体）に戻る結果になるからである。
【００３１】
発明者らは、成長している鎖に送達されるヌクレオチドの順序を最適化し、かつ従ってサンプルを配列決定するのににかかる時間を減らすために使用され得る多くの手法を本明細書において記載している。こうした手法は本明細書に個々に記載されているが、１つ以上の手法が組み合わせて使用されてもよいことが分かるだろう。本発明は、特定の標識とされたサンプルを配列決定するのにかかる時間を減らすことを目的としている。配列は、特定の長さの配列が短時間で読み取られることを可能にするか、または同じ時間でより長い読み取り長さを可能にすることもある。すべての手法は、反応に提供されるヌクレオチドの順序が、配列決定されるサンプルについての知識に基づいて事前に決定されるという共通した特徴を共有する。こうした手法の特定の手法において、ヌクレオチドの順序はそれまでの配列決定の結果に基づいて配列決定中に修正されてもよい。ヌクレオチドの順序は、様々な臨床学的因子を考慮して、確率的なアルゴリズムに経験的に基づいて選択されてもよい。
【００３２】
予測される配列と一致するようにヌクレオチドフローを調整することによって、それぞれのフローの事象の効率は、適切な配列が予測される場合に、１００％まで増加する。
【００３３】
本発明の１つの例では、特定の配列に一致するサンプルの可能性に関する仮定を作ることができる場合、対象のサンプルは標的配列であってもよい。例えば、臨床設定において、特定の感染病原体の存在の可能性を判定するために、他の患者のデータがシステムへ供給され得る。別の例において、チップへのヌクレオチド送達の配列は、既に確立されたＤＮＡ配列に関するフィードバックに依存して、知的に決定されることもあれば、試験の期間中にずっと更新されることもある。
【００３４】
サンプルがデノボまたは非常に高スループットなＤＮＡ塩基配列決定とは対照的に特定の遺伝子領域を標的とするとき、本発明は特に関連性があるとみなされる。既知の参照配列と一致するサンプル配列の可能性について仮説を立てることができる。
【００３５】
標識とされる配列決定の適用については、試験を行うのにかかる時間を減らすことによりパフォーマンスを改善する余地がある。標識とされた配列が知られているか、またはある程度予測可能であるという事実により、ヌクレオチドフローパターンは試験のスループットと効率を増加させるために調整されることもある。本文書で議論されるように、この概念が適用され得る主な４つの方法が特定されている：
１．予測的なヌクレオチドフロー
２．適応性のあるヌクレオチドフロー
３．多重ヌクレオチドフロー
４．多くの鋳型について最適化されたフロー
【００３６】
以下に提示されるように、本発明はいくつかの方法で実行することが可能である。
【００３７】
１）予測的な配列フロー
調査中の特定のサンプルに関する試験を実行する前に、可能性評価を行うことが可能である場合。これは、サンプルの「未知の」領域と、事前増幅またはライブラリの調製に用いられるプライマー配列のような「基地の」領域の両方を含むこともある。可能性評価は、様々な他のソースから得られた臨床学的な患者のデータをさらに含むこともあり、このデータはその後配列決定機器に入力される。可能性評価は単純に医師によって行れることもある（例えば、患者の歴史と症状を検討する際、医師は、感染が細菌＃１である可能性が最も高いが、感染が細菌＃２または細菌＃３がある可能性は低いと結論を下す）。代替的に、可能性評価は、様々な感染の相対的な可能性を決定するための専門家システムまたは同様の自動的な手段を利用することもある。
【００３８】
専門家システムは、所定の患者について最も可能性の高い感染病原体を同定するために、配列決定機器（または、別のシステムとして、例えば、適切なコンピュータプログラムを実行するコンピュータシステム）上で行れる可能性評価として実行されてもよい。
−例えば、関連する患者の病歴（最近の手術または外傷、最近の感染、薬物療法など）および局地的な院内データ（感染症プロフィル、最近の抗生物質耐性の発生など）を含む臨床医をによる機器へのデータ入力
−アルゴリズムは以下の表のように入力データ（単なる単に実例となる例に過ぎない）に基づいて最も可能性の高い感染病原体を予測する。
−最初のヌクレオチドフローは予測された感染病原体のそれと正確に一致するように調整される。
【００３９】
【表１】
0006590831.tif 000002
【００４０】
代替物において、医師は患者を診察し、感染が最初の感染病原体によって引き起こされる可能性が最も高く、感染が第２または第３の感染病原体によると可能性が低い（すなわち、専門家システムを使用することなく、または、定量的な可能性を直接割り当てることなく）と結論を下すこともある。この場合、医師（または専門家）は、配列決定機器に３つの潜在的な感染病原体のリストを直接入力してもよい；その後、機器は、予測された感染病原体として３つの潜在的な病原体の各々を順番に取り入れ、従って、最初のヌクレオチドフローを最初の予測された病原体に合わせる。
【００４１】
ほとんどの場合、有益な遺伝子は、配列決定（例えば、細菌からのリボソーム遺伝子）について、および最初のヌクレオチドフローの配列を決定するために用いられる最も可能性の高い予測された感染病原体におけるこの遺伝子の配列について選択されてもよい。
【００４２】
２）適応性のある配列フロー
配列決定機器からのリアルタイムフィードバックに依存し、これに応じてヌクレオチドのパターンを適応させる。これは、データベースに対して出力データに参照することと（継続的に、または特定の時点で）、既に生成されたデータに基づいて将来のヌクレオチドフローパターンを適応させることを含むことになる。この手法は、調査中の配列についてあまり知られていない場合、または最初に予測される配列が正しくないと分かる場合に役立つ。
【００４３】
適応性のある配列フローは、機器からのリアルタイムフィードバックに基づいてフローパターンを変更する。
【実施例】
【００４４】
最初の可能性評価は上記のように行われ、配列決定機器は、ヌクレオチドフローの最初の順序を決定し、その順序は「最も可能性の高い」感染病原体に合わされる。予測される配列が正しくない場合、鋳型の拡張の失敗は機器によって検知され、修正された予測された配列はヌクレオチドフローの新しい順序を決定するために識別され、使用される。
【００４５】
例えば、最初の評価は以下の可能性を与える：
【００４６】
【表２】
0006590831.tif 000003
【００４７】
感染は実際には細菌＃３である。アルゴリズムは、可能性評価に基づいて細菌＃１を不正確に予測し、機器は、細菌＃１配列に適合したヌクレオチドフローを開始する。
【００４８】
【化１】
0006590831.tif 000004
【００４９】
それぞれのヌクレオチドが標的鎖上の鋳型を拡張すると、機器は各ヌクレオチドと、標的および／または合成された鎖の配列を表すデータを記録する。
【００５０】
最初のミスマッチした塩基に遭遇すると、機器は適切な塩基を見つけるためにヌクレオチドを循環する：
【００５１】
【化２】
0006590831.tif 000005
【００５２】
この場合、ヌクレオチドの順序は、Ｃが細菌＃１配列と一致するために配列の次の塩基になると予測した。しかしながら、Ｃは鋳型配列を拡張しなかった；したがって、機器は拡張の事象を検知せず、どれが鋳型を拡張しないかを決定するために残りのヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｔ）を提供する。この場合、Ｔは鋳型を拡張する。この情報は合成された配列の記録に加えられる。得られた配列に基づいて、機器は、今までに得られた配列を次の最も可能性の高い配列−この場合、細菌＃２−と比較し、この場合のように、次の最も可能性の高い配列がそれまでに合成された鎖と一致する場合、次の最も可能性の高い配列は新しい予測される配列となり、ヌクレオチドフローの順序は新しい予測される配列に対応するように修正される。その後、機器は、細菌＃２に適合させたヌクレオチドフローを再開する：
【００５３】
【化３】
0006590831.tif 000006
【００５４】
さらなるミスマッチ（予測される配列がＡのフロー順序をもたらすときのＧ）に遭遇すると、機器は再び拡張の事象を検知することができず、もう一度残りのヌクレオチドを循環して適切な塩基挿入を見つける：
【００５５】
【化４】
0006590831.tif 000007
【００５６】
得られた配列と様々な感染病原体の相対的な可能性に基づいて、アルゴリズムは予測される配列を細菌＃３のそれに修正し、細菌＃３に合わせたヌクレオチドフローを再開する。
【００５７】
【化５】
0006590831.tif 000008
【００５８】
合成された配列の末端にそれ以上のミスマッチなく到達すると、感染が細菌＃３であるという結論が導き出される。機器は動作を止めて、検知された感染を指示する出力を表示する。
【００５９】
３）多重ヌクレオチドフロー
上に記載された手法は、各フローの事象のあるときに単一のヌクレオチドを提供する方法を利用する。これは、それが配列決定されている関心領域であるときに好ましい。なぜなら、検知された配列を予測される配列と、必要に応じて修正された予測された配列と比較することが可能となるからである。しかしながら、多くの場合、関心領域を配列決定することができる前に配列決定される必要のあるすくなくともいくつかの非関心領域がある。例えば、配列決定のためにサンプルを調製するために使用されるプライマーまたはアダプターは、分析されるサンプルに含まれることもあり、こうした領域は関心領域の同一性に関して有益ではない。代替的に、遺伝子中の高度に保存された領域により、ユーザーは代替的な配列を識別することができないため、こうした領域は対象として考慮されないこともある。特定のフロー事象において２つまたは３つのヌクレオチドを組み合わせることによって、既知の配列の領域を「ファーストトラックする（ｆａｓｔ−ｔｒａｃｋ）」ことができる。例えば、「未知の」対象配列を拡張することなく、非常に少数のフロー中の既知のプライマー配列を拡張することが可能なこともある。これは、例えば、細菌の１６Ｓと２３ＳのｒＲＮＡ遺伝子で、またはヒト腫瘍遺伝子のめったに変異しない領域で高度に保存される領域を拡張する際に役立つこともある。
−上記のように、「可能性評価」は可能性の順序で感染病原体をランク付けするために行われてもよく、ヌクレオチドの順序は、「最も可能性の高い」感染病原体の配列と一致するように決定される。ヌクレオチドフローはこの配列に基づいて開始される。
−配列の最初の部分は細菌中に保存されることもある。例えば、
【００６０】
【化６】
0006590831.tif 000009
−この場合、最初の有益でないＣＡＣＣＴＧＴＣ部分を配列決定するために個々のヌクレオチドを流す代わりに、２つ以上のヌクレオチドを混合することにより保存された領域を「ファーストトラックする」ことが可能である。これは、混合したヌクレオチドの専用試薬容器を使用して、または「オンザフライ」でヌクレオチドを混合することによりなされてもよい。
−標準的なヌクレオチド命名法において：
・「Ｃ」と「Ａ」は「Ｍ」によって表示可能である（ａＭｉｎｏを含むヌクレオチドについて）。
・「Ｔ」と「Ｇ」は「Ｋ」によって表示可能である（Ｋｅｔｏを含むヌクレオチドについて）。
−この例において、Ｍとその後のＫの最初のフローは、保存された領域で７つの塩基を拡張する：
【００６１】
【化７】
0006590831.tif 000010
−
−機器は拡張の事象が生じたことを機器は検知するが、どのヌクレオチドが配列を拡張したかは明白ではない。しかしながら、この保存された領域については、それは懸念事項ではない。いくつかの実施形態では、３つのヌクレオチドが一緒に提供されることもある；例えば、Ａ、Ｃ、およびＴの混合物を提供することは、ＣＡＣＣＴの最初の配列を拡張し、その後、Ｇで停止する。既知の保存された領域を通るこの最初の「ファーストトラック」の後に、ヌクレオチドの順序は、配列決定テストを継続するために、上で議論されるように、予測性または適合性の配列に戻ることができる。
【００６２】
４）多くの配列のための最適化されたフロー
多くの適用において、配列決定を必要とする＞１の配列がある。この場合、すべての鋳型を配列決定するために最も効率的なヌクレオチドフローパターンを決定するアルゴリズムを作成することが可能である。確かに、シミュレーションは、フローパターンが以下に記載される基本的なアルゴリズムに従って最適化される場合、３つの５０ｂｐの標的鋳型を配列決定するのに必要とされるヌクレオチドフローの数を２８％も減らすことができることを示す。
−上記のように、「可能性評価」は可能性の順序で感染病原体をランク付けするために行われることもあり、ヌクレオチドの順序は「最も可能性の高い」感染病原体の配列と一致するように決定される。ヌクレオチドフローはこの配列に基づいて開始される。
−調査中で＞１の配列があるときのシナリオがある。例えば、腫瘍学用途では、配列決定される多くの腫瘍遺伝子がある可能性がある。
−血流感染については、検査が詳細な同定をもたらすことが必要とされる場合、単一の生命体内にさえ、調査中で＞１のゲノムの領域があることもある。
−以下の配列は同時の配列決定を必要とする多くの配列を代表するものである。
【００６３】
【化８】
0006590831.tif 000011
・Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ａの循環的なフローパターンを用いることで、３つの標的すべてを配列決定するために１００のフロー事象を必要とする。
・最適なフローパターンは７２のフロー事象ですべての鋳型を配列決定する：
【００６４】
【化９】
0006590831.tif 000012
−フロー継続時間の２８％の減少
−最適なパターンは、対象の鋳型をすべて配列決定するためにフロー事象の数を
最小限にするそのパターンとして決定されることもある。代替的な定義が使
用されてもよい。
−このシナリオでは、配列は互いに似ておらず、または、重要な相同領域を共有しない。しかしながら、できるだけ短い時間ですべての配列の拡張を完了する非循環ヌクレオチドフローパターンを決定することは可能である。
−この態様と連動して使用される予測および適合アルゴリズムはさらに試験を最適化し、継続時間を減らすことになる。
【００６５】
多くの標的領域の別の例と、すべての標的を配列決定するために必要とされるサイクルの減少は、以下によって与えられる：
【００６６】
代表的な標的配列：
【００６７】
【化１０】
0006590831.tif 000013
【００６８】
４つのヌクレオチドすべての単純なサイクルを使用して、これらの各々はそれぞれ、配列決定を完了させるために８４、７２、および１００のヌクレオチドを取り込む。以下の最適化された配列を用いて、
【００６９】
【化１１】
0006590831.tif 000014
すべての標的配列の配列決定は７２のヌクレオチドで完了可能である。
【００７０】
最適化のプロセスの一例が以下のように挙げられる。これが単なる一例に過ぎないことに留意されたい；他のアルゴリズムを使用することができ、他のこうしたアルゴリズムはかなりの程度の最適化をもたらすことにあることがあり得る。
【００７１】
概略では、アルゴリズムは、ＤＮＡ鎖の各々において配列決定される次の塩基を見て、もっとも生じる可能性の高いものを選択する。等しく出現する可能性がある２つ以上の塩基が存在する場合、アルゴリズムは、流されるために最も長く待機している塩基を選択する。アルゴリズムを記載するための出発点として、我々は、以下のＤＮＡ配列の１つを含むと我々が信じているサンプルを配列決定したいと仮定する：
【００７２】
【化１２】
0006590831.tif 000015
【００７３】
各配列について、アルゴリズムは、配列決定される次の塩基へのポインターを維持する。以下の詳細では、こうしたポインターは各配列の真下の矢印として表される。以下の部分はアルゴリズムの最初の１０の工程を示しており、それがどのように作動するかを例証している。
【００７４】
フロー工程１
最初のヌクレオチドフローの前に、各配列における現在位置は以下に示される通りである：
【００７５】
【化１３】
0006590831.tif 000016
【００７６】
この場合、配列の２つはＡであり、１つはＣである。したがって、流れる最初のヌクレオチドは、拡張を与える可能性が最も高いＡである。
【００７７】
フロー工程２
このヌクレオチドが流れる前に、各配列における現在位置は以下に示される通りである：
【００７８】
【化１４】
0006590831.tif 000017
【００７９】
この場合、ヌクレオチドの２つはＣであり、１つはＴである。アルゴリズムは、拡張を与える可能性の最も高いＣを選択した。
【００８０】
フロー工程３
このヌクレオチドが流れる前に、各配列における現在位置は以下に示される通りである：
【００８１】
【化１５】
0006590831.tif 000018
【００８２】
この場合、ヌクレオチドの２つはＴであり、１つはＧである。アルゴリズムは、拡張を与える可能性の最も高いＴを選択した。
【００８３】
フロー工程４
このヌクレオチドが流れる前に、各配列における現在位置は以下に示される通りである：
【００８４】
【化１６】
0006590831.tif 000019
【００８５】
この場合、３つのヌクレオチドＣ、Ｇ、およびＡはすべて等しく可能性がある。最も長く待っているヌクレオチドはＧであり、したがって、これが配列の入れ子ヌクレオチド（ｎｅｓｔ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）に選ばれる。
【００８６】
フロー工程５
このヌクレオチドが流れる前に、各配列における現在位置は以下に示される通りである：
【００８７】
【化１７】
0006590831.tif 000020
【００８８】
この場合、ヌクレオチドＡが最も可能性が高いため、これが選ばれる。
【００８９】
フロー工程６
このヌクレオチドが流れる前に、各配列における現在位置は以下に示される通りである：
【００９０】
【化１８】
0006590831.tif 000021
【００９１】
この場合、ヌクレオチドＣが最も可能性が高いため、我々はこれを選ぶ。
【００９２】
フロー工程７
このヌクレオチドが流れる前に、各配列における現在位置は以下に示される通りである：
【００９３】
【化１９】
0006590831.tif 000022
【００９４】
この場合、ヌクレオチドＴが最も可能性が高いため、我々はこれを選ぶ。
【００９５】
フロー工程８
このヌクレオチドが流れる前に、各配列における現在位置は以下に示される通りである：
【００９６】
【化２０】
0006590831.tif 000023
【００９７】
この場合、ヌクレオチドＧが最も可能性が高いため、我々はこれを選ぶ。
【００９８】
フロー工程９
このヌクレオチドが流れる前に、各配列における現在位置は以下に示される通りである：
【００９９】
【化２１】
0006590831.tif 000024
【０１００】
この場合、すべての配列はヌクレオチドＡを要求するため、我々はこれを選ぶ。
【０１０１】
フロー工程１０
このヌクレオチドが流れる前に、各配列における現在位置は以下に示される通りである：
【０１０２】
【化２２】
0006590831.tif 000025
【０１０３】
この場合、ヌクレオチドＣが最も可能性が高いため、これが選ばれる。
【０１０４】
多くの適用では、上記の実施方法のいくつかを組み合わせることは有益である。例えば、血流感染ツールでは、確率的なアルゴリズムは最も可能性の高い感染病原体を予測することができる。複数の１６Ｓの増幅産物の配列を予測することによって、最適化されたフローパターンを決定することができる。検査中に、予測された感染病原体が正しくないことが判明した場合、知的な適応性のあるフローは、修正された確率的なアルゴリズムに基づいて最適なヌクレオチドフローパターンを調節することができる。
【０１０５】
多くの標的配列について最適なフロー配列を決定する際の制約を考慮すると、本発明の様々な態様は、１つだけのまたは少数の配列が存在する状況に主として適する可能性が高い。
【配列表】
0006590831000001.app