(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＢＨ抗原の発現を増加させる物質を有効成分として含む組成物であって、
前記ＡＢＨ抗原の発現を増加させる物質が、１，３‐ジカフェオイルキナ酸、１，５‐ジカフェオイルキナ酸、及びアメントフラボンからなる群から選択された１種以上の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩であり、かつ、
前記組成物が肌細胞の皮脂生成抑制用であることを特徴とする肌外用剤組成物。
【請求項２】
ＡＢＨ抗原の発現を増加させる物質を有効成分として含む組成物であって、
前記ＡＢＨ抗原の発現を増加させる物質が、１，３‐ジカフェオイルキナ酸、１，５‐ジカフェオイルキナ酸、及びアメントフラボンからなる群から選択された１種以上の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩であり、かつ、
前記組成物が毛穴縮小用であることを特徴とする肌外用剤組成物。
【請求項３】
ＡＢＨ抗原の発現を増加させる物質を有効成分として含む組成物であって、
前記ＡＢＨ抗原の発現を増加させる物質が、１，３‐ジカフェオイルキナ酸、１，５‐ジカフェオイルキナ酸、及びアメントフラボンからなる群から選択された１種以上の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩であり、かつ、
前記組成物が毛穴拡大予防用であることを特徴とする肌外用剤組成物。
【請求項４】
前記組成物がＡＢＨ抗原の発現を増加させる物質を組成物総重量に対して０．００１重量％〜２０重量％の量で含むことを特徴とする請求項１〜３の中の何れか一項に記載の肌外用剤組成物。
【請求項５】
前記組成物が化粧料組成物または薬学組成物であることを特徴とする請求項１〜４の中の何れか一項に記載の肌外用剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＡＢＨ抗原の発現を調節する物質を含む組成物に関し、より具体的には、ＡＢＨ抗原の発現を調節することにより皮脂の生成を調節するとともに、肌のトラブルを改善することができ、抗酸化効果を提供して毛穴が広くなることを予防し、また肌刺激の生成を防御することができる組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液型抗原は血液の赤血球表面の糖蛋白質或いは糖脂質で発現された特定の抗原性を現わす構造を言う。代表的にＡＢＯ式血液型抗原（ＡＢＨ抗原）、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）式血液型抗原などがあり、特定構造の糖質化末端基の構造によって血液型が決まる。ＡＢＯ式血液型抗原及びルイス式血液型抗原は赤血球のみで発現されるのではなく、人体の多様な部位で発現され、特にＡＢＯ式血液型抗原は個人の血液型によって体の中の食道、胃膓、小腸などの上皮でも発現されることと知られており、肌では表皮の顆粒層で発現される。
【０００３】
このようなＡＢＯ式血液型抗原の表皮の顆粒層での発現は、解剖学的な位置において皮膚の一番外層で現われるので、皮膚関連疾患、特に炎症疾患と密接な関係がある。
【０００４】
このように、ＡＢＯ式血液型抗原は輸血と臓器移植の拒絶反応の主原因となる非常に重要な抗原であるが、１９００年に発見されて以来未だに拒絶反応以外の生理的機能に対しては研究されたことがほとんどない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明者はＡＢＨ抗原発現の調節が皮脂の調節、肌トラブルの改善、毛穴拡大予防などと関連があることを確認して本発明の完成に至った。
【０００６】
従って、本発明の目的は、ＡＢＨ抗原の発現を調節することにより、皮脂の調節または肌トラブルの改善に効果的な組成物を提供することにある。
【０００７】
また、本発明の他の目的は、ＡＢＨ抗原の発現を調節することにより、毛穴の縮小または拡大の予防、肌老化予防に効果的な物質を含む組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述した目的を達するために、本発明はＡＢＨ抗原の発現を調節する物質を有効成分として含む皮脂調節用組成物を提供する。
【０００９】
また、本発明はＡＢＨ抗原の発現を調節する物質を有効成分として含む肌トラブル改善用組成物を提供する。
【００１０】
また、本発明はＡＢＨ抗原の発現を調節する物質を有効成分として含む毛穴縮小用組成物を提供する。
【００１１】
また、本発明はＡＢＨ抗原の発現を調節する物質を有効成分として含む毛穴拡大予防用組成物を提供する。
【００１２】
また、本発明はＡＢＨ抗原の発現を調節する物質を有効成分として含む肌老化予防用組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の組成物はＡＢＨ抗原の発現を調節することにより、優れた皮脂調節または肌トラブル改善効果を提供し、また、活性酸素の除去とコラーゲン合成の促進を通じて毛穴を縮小し、優れた抗酸化力によって肌刺激の生成を防御する効果が卓越である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＡＢＨ抗原及びルイス式血液型抗原の構造を示す。
【図２】図２は、ＡＢＨ抗原の発現を調節する物質によってＨａＣａＴ細胞株でＢ抗原の発現が増加されることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明はＡＢＨ抗原の発現を調節する物質を有効成分として含む組成物に関する。
【００１６】
特に、本発明の組成物はＡＢＨ抗原の発現を調節することにより皮脂調節または肌トラブル改善効果を現わす。
【００１７】
また、本発明の組成物はＡＢＨ抗原の発現を調節することにより毛穴の縮小、毛穴の拡大予防または肌老化予防効果を現わす。
【００１８】
本明細書において、「ＡＢＨ抗原」は血液の赤血球表面の糖蛋白質或いは糖脂質で発現された特定の抗原性を有する構造をいい、代表的にＡＢＨ抗原は図１に示したＡＢＨ抗原、ルイス式血液型抗原などのＡＢＨ抗原類似体の集合体を全部含む意味で用いる。ＡＢＨ抗原類似体は、単糖類、アミノ酸などがさらに結合されている物質で、ＡＢＨ抗原本来の機能と同じ機能をする物質を意味する。図１にＡＢＨ抗原及びルイス式血液型抗原の構造を示した。
【００１９】
本明細書において、「有効成分」は単独で目的とする活性を現すかまたはその自己活性のない担体とともに活性を現すことができる成分を意味する。
【００２０】
本発明の組成物において、上記ＡＢＨ抗原の発現を調節する物質はＡＢＨ抗原の発現を増加させる物質を含む。このようなＡＢＨ抗原の発現増加は、具体的にＨａＣａＴ細胞株でのＢ抗原の発現増加を通じて現われることができる。
【００２１】
本発明の組成物において、上記ＡＢＨ抗原の発現を調節する物質は１，３‐ジカフェオイルキナ酸（１，３‐ｄｉｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）（化学式１）、１，５‐ジカフェオイルキナ酸（１，５‐ｄｉｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ）（化学式２）及びアメントフラボン（ａｍｅｎｔｏｆｌａｖｏｎ）（化学式３）からなる群から選択される１種以上の化合物、その誘導体または薬学的に許容可能なその塩を含む。
【００２２】
【化１】
0006577581.tif 000002
【００２３】
【化２】
0006577581.tif 000003
【００２４】
【化３】
0006577581.tif 000004
【００２５】
本明細書において、「誘導体」は上記化合物の置換可能な位置で他の置換基に変更される全ての化合物を意味し、このような置換基の種類には制限がない。
【００２６】
本明細書において、「薬学的に許容可能」と言うのは、通常の医薬的服用量（ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｄｏｓａｇｅ）で利用する際に相当な毒性効果を避けることにより、動物、より具体的には人に利用することができるという政府またはそれに準ずる国際機構の承認を受けることができたり承認されたり、または薬局方に列挙されたり、その他一般的な薬局方に認知されることを意味する。
【００２７】
本明細書において、「薬学的に許容可能な塩」は薬学的に許容可能で、ある化合物（ｐａｒｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の好ましい薬理活性を有する本発明の一観点による塩を意味する。上記塩は（１）塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などのような無機酸で形成されたり；または酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクルロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３‐(４‐ヒドロキシベンゾイル)安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２‐エタンジスルホン酸、２‐ヒドロキシエタンジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４‐クロロベンゼンスルホン酸、２‐ナフタレンスルホン酸、４‐トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、４‐メチルビシクロ[２，２，２、]オクト‐２‐エン‐１‐カルボン酸、グルコヘプトン酸、３‐フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、酢酸tert-ブチル、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸のような有機酸で形成される酸付加塩（ａｃｉｄ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｓａｌｔ）；または（２）ある化合物に存在する酸性プロトンが置換される時に形成される塩を含むことができる。
【００２８】
本発明の組成物は、ＡＢＨ抗原の発現を調節する物質を組成物総重量に対して０．００１重量％〜２０重量％の量で含むことができる。
【００２９】
上記ＡＢＨ抗原の発現を調節する物質を上記範囲で用いる場合、本発明が意図する効果を現わすのに適切であるだけでなく、組成物の安定性及び安全性を全部満足することができ、費用に比べて効果の側面で有用である。上記のような観点から、本発明の組成物はＡＢＨ抗原の発現を調節する物質を組成物総重量に対して０．００５重量％〜１９．５重量％、０．０１重量％〜１９重量％、０．０１５重量％〜１８．５重量％、０．０２重量％〜１８重量％、０．０２５重量％〜１７．５重量％、０．０３重量％〜１７重量％、０．０３５重量％〜１６．５重量％、０．０４重量％〜１６重量％または０．０４５重量％〜１５．５重量％の量で含むことができる。
【００３０】
本発明の一観点である皮脂調節用組成物において、上記組成物は５α‐レダクターゼの発現を抑制することができる。具体的に、本発明の組成物は５α‐レダクターゼ遺伝子の発現を妨害して抑制または阻害させたり、５α‐レダクターゼタンパク質の活性を阻害してその作用を妨害することができる。
【００３１】
また、本発明の他の観点である毛穴縮小または拡大予防用組成物において、上記組成物は活性酸素の除去とコラーゲン合成を促進して毛穴を縮小させ、毛穴の拡大または肌老化を予防することができ、また、優れた抗酸化力によって活性酸素種の生成を抑制して肌の炎症を抑制することにより、肌刺激の生成を防御することができる。
【００３２】
本発明の一観点である組成物において、上記組成物は化粧料組成物であることができる。
【００３３】
上記化粧料組成物は剤形が特に限定されなく、目的によって適切に選択することができる。例えば、柔軟化粧水（スキンローション及びミルクローション）、栄養化粧水、エッセンス、栄養クリーム、マッサージクリーム、パック、ゲル、アイクリーム、アイエッセンス、クレンジングクリーム、クルレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パウダー、ボディーローション、ボディークリーム、ボディーオイル及びボディーエッセンスからなる群から選択された何れか一つ以上の剤形に製造されることができるが、これに制限されるのではない。また、上記化粧料組成物は、軟膏、パッチなどの形態で肌外用剤の剤形として用いることを含むことができる。
【００３４】
本発明による化粧料組成物は、局所適用に適合する全ての剤形で提供されることができる。例えば、溶液、水相に油相を分散させて得たエマルジョン、油相に水相を分散させて得たエマルジョン、懸濁液、固体、ゲル、粉末、ペースト、泡沫（ｆｏａｍ）またはエアロゾル組成物の剤形で提供されることができる。このような剤形の組成物は当該分野における通常の方法によって製造されることができる。
【００３５】
本発明による化粧料組成物は、上記した物質以外に主な効果を損なわない範囲内で、好ましくは、主な効果に相乗効果を与えることができる他の成分を含むことができる。また、本発明による化粧料組成物は、補湿剤、エモリエント剤、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、有機及び無機顔料、香料、冷感剤または制汗剤をさらに含むことができる。上記成分の配合量は本発明の目的及び効果を損なわない範囲内で当業者が容易に選定可能であり、その配合量は組成物全体重量を基準として０．０１重量％〜５重量％、具体的に０．０１重量％〜３重量％であってもよい。
【００３６】
本発明の一観点である組成物において、上記組成物は薬学組成物であることができる。
【００３７】
本発明による薬学組成物の剤形は溶液剤、懸濁液剤、乳液剤、ゲル、点滴剤、坐剤、パッチまたは噴霧剤であってもよいが、これに制限されるのではない。上記剤形は当該分野における通常の方法によって容易に製造されることができ、賦形剤、水和剤、乳化促進剤、懸濁液剤、浸透圧調節のための塩または緩衝剤、着色剤、香辛料、安定化剤、防腐剤、保存剤またはその他常用する補助剤を適当に用いることができる。
【００３８】
本発明の薬学組成物の有効成分は投与する対象の年齢、性別、体重、病理状態及びその深刻度、投与経路または処方者の判断によって異なることができる。このような因子に基づいた適用量の決定は当業者の水準内にあり、その１日投与量は例えば０．００００２５ｍｇ／ｇ／日〜０．０２５ｍｇ／ｇ／日、より具体的には、０．０００２５ｍｇ／ｇ／日〜０．０１ｍｇ／ｇ／日になることができるが、これに制限されるのではない。
【００３９】
本発明の薬学組成物は経口または経皮で投与されることができるが、これに制限されるのではない。
【００４０】
また、本発明はＡＢＨ抗原の発現を調節する物質をスクリーニングする方法を提供し、上記方法は
１）試験肌細胞で発現するＡＢＨ抗原の発現水準を確認する段階；
２）上記試験肌細胞に候補物質を処理する段階；
３）上記２）段階の細胞でＡＢＨ抗原の発現水準を確認する段階；及び
４）上記１）段階と３）段階の結果を比較してＡＢＨ抗原の発現を増加させる物質であるか否かを決める段階；
を含む。
【００４１】
本発明の一観点であるスクリーニング方法において、上記ＡＢＨ抗原の発現を調節する物質は皮脂生成の抑制または肌トラブルの緩和活性を有する物質である。
【００４２】
また、本発明の他の観点であるスクリーニング方法において、上記ＡＢＨ抗原の発現を調節する物質は毛穴の縮小または毛穴の拡大抑制活性を有するか、肌老化抑制活性を有する物質である。
【００４３】
本発明の方法において、上記ＡＢＨ抗原の発現を調節する物質は１，３‐ジカフェオイルキナ酸（１，３‐ｄｉｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、１，５‐ジカフェオイルキナ酸（１，５‐ｄｉｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ）及びアメントフラボン（ａｍｅｎｔｏｆｌａｖｏｎ）からなる群から選択される１種以上の化合物、その誘導体または薬学的に許容可能なその塩を含む。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例を通じて本発明をより詳しく説明する。これら実施例は本発明を例示的に示すものであって、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないように解釈することは本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００４５】
［試験例１］ＨａＣａＴ細胞株でのＢ抗原の発現増加効果
多様な種類の化合物がＡＢＨ抗原の発現に及ぶす影響を実験した。このために、ＨａＣａＴ細胞（ｐｒｏｖｉｄｅｄ  ｂｙ  Ｐｒｏｆ．Ｄｒ．Ｎ．Ｅ．Ｆｕｓｅｎｉｇ、ＤＫＦＺ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を３５ｍｍディッシュで１０％ＦＢＳ‐ＤＭＥＭで２４時間培養した後、２４時間０％ＦＢＳ‐ＤＭＥＭで培養して飢餓状態にした。再び０％ＦＢＳ‐ＤＭＥＭに培地を取り替えながら試験物質として多様な種類の化合物をそれぞれ２μｇ／ｍｌの濃度でＨａＣａＴ細胞に処理した後、４８時間培養した。この時、比較のために対照群はＤＭＳＯを試料と同じ濃度で処理した。試験物質の中でＡＢＨ抗原の発現を有意的に増加させる３つの物質、即ち１，３‐ジカフェオイルキナ酸（１，３‐ｄｉｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、１，５‐ジカフェオイルキナ酸（１，５‐ｄｉｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）及びアメントフラボン（ａｍｅｎｔｏｆｌａｖｏｎ）を確認した（データは提示しない）。これら３つの化合物を処理した場合において、細胞でタンパク質を抽出して細胞溶解物を等量にローディングしてウェスタンブロットでＢ型抗原の発現を調査した。対照群としてはα‐チューブリンタンパク質を用いた。測定結果は図２に示した。
【００４６】
図２を見れば、１，３‐ジカフェオイルキナ酸、１，５‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンは何れもＨａＣａＴ細胞でＢ型抗原の発現を増加させる効果があることを確認することができる。
【００４７】
［試験例２］５α‐レダクターゼ活性抑制効果
５α‐レダクターゼ活性抑制効果を確認するために、ＨＥＫ２９３‐５αＲ２細胞で［１４Ｃ］テストステロンが［１４Ｃ］ジヒドロテストステロンに変換される割合を測定した。ＨＥＫ２９３細胞はｐ３ｘＦＬＡＧ‐ＣＭＶ‐５αＲ２を形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させて、２４ウェルプレートにウェル当たりに形質感染させた ２．５×１０５ ＨＥＫ２９３細胞で入れて培養した（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、ＪＤＳ．Ｖｏｌ．３１、ｐｐ１９１‐９８）。翌日、酵素基質及び阻害剤が添加された新しい培地に交換した。培地の基質としては、０．０５μＣｉ［１４Ｃ］テストステロン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ、ＵＫ）を用いた。阻害程度を確認するために、試験物質として１，３‐ジカフェオイルキナ酸、１，５‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンをそれぞれ２μｇ／ｍｌ入れて３７℃で、５％ＣＯ２培養器で２時間培養した。この時、比較のために、陰性対照群としては上記試験物質の中で何も含有しないものを用い、陽性対照群としてはフィナステリド（Ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄｅ）を培地に２μｇ／ｍｌ入れて同一条件で培養したものを用いた。培養培地を回収してテストステロンを８００μl酢酸エチルで抽出した。上部の有機溶媒層を分離して乾かした後、残った残渣を再び５０μl酢酸エチルで溶かしてシリカプラスチックシートカイゼルゲル６０Ｆ  ２５４（Ｓｉｌｉｃａ  ｐｌａｓｔｉｃ  ｓｈｅｅｔ  ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  Ｆ２５４）上において酢酸エチルヘキサン（１：１）を展開溶媒として展開した。  
【００４８】
プラスチック試料を空気中において乾燥させた後、同位元素の量を測定するためにバスシステム(BAS system)を用いたが、乾燥されたプラスチックシートおよびＸ線フィルムを一緒にバスカセットに入れて１週間後にフィルムに残留されているテストステロン及びジヒドロテストステロンの同位元素の量を測定した。その結果を下記表１に示す。
【００４９】
【表１】
0006577581.tif 000005
【００５０】
上記表１の結果から、本発明の１，３‐ジカフェオイルキナ酸、１，５‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンはテストステロンをジヒドロテストステロンに転換させて細胞質内にある受容体タンパク質と結合して核内に入り込んで皮脂腺細胞を活性化させ、且つ、分化を促して皮脂腺内の皮脂を過分泌させる５α‐リダクターゼの活性を効果的に抑制することにより、テストステロンのジヒドロテストステロンへの転換を遮断することを確認することができる。
【００５１】
従って、本発明の１，３‐ジカフェオイルキナ酸、１，５‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンは優れた５α‐リダクターゼの活性抑制効果があって、皮脂の過分泌を抑制するのに効果的である。
【００５２】
［参考例１］実施例１〜３及び比較例１の製造
下記の表２に記載した組成によってローション剤形の実施例１〜３及び比較例１を通常の製造方法で製造した（単位：重量％）。
【００５３】
【表２】
0006577581.tif 000006
【００５４】
＜実施例及び比較例の製造方法＞
１）上記１１〜１４成分を７０℃まで加熱しながら均一に混合して水相パートを製造した。
２）上記１〜１０成分を７０℃まで加熱しながら均一に混合して油相パートを製造した。
３）上記１）の水相パートに上記２）の油相パートを投入し、７，２００ｒｐｍで６分間ホモミキシングした。
４）上記３）の混合物を室温まで冷却した。
【００５５】
［試験例３］皮脂分泌抑制効果
上記実施例１〜３及び比較例１の皮脂分泌抑制効果を調べるために次のように評価した。皮脂の分泌が多いと感じる被験者男女４０名を選定して１０名ずつ４つの群に分け、各群に対して実施例１〜３及び比較例１のローションをそれぞれ指定された部位に４週間毎日塗るようにした。皮脂減少の効果に対する判定は皮脂量測定器（Ｓｅｂｕｍｅｔｅｒ８１５、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定し、その結果は下記の表３に示した。
【００５６】
【表３】
0006577581.tif 000007
【００５７】
上記表３の結果から、本発明による１，３‐ジカフェオイルキナ酸、１，５‐ジカフェオイルキナ酸またはアメントフラボンを含む実施例１〜３はこれら物質を含まない比較例１より過剰に分泌される皮脂を効果的に抑制することができることを確認することができた。
【００５８】
従って、本発明による肌外用剤組成物は優れた皮脂分泌抑制効果がある。
【００５９】
［試験例４］皮膚炎症因子の発現減少効果
本発明の１，３‐ジカフェオイルキナ酸、１，５‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンの皮膚炎症因子であるＰＧＥ‐２の発現を抑制する効果を測定するために、ＥＬＩＳＡ（ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）を実施した（ＳＥ  Ｄｕｎｓｍｏｒｅ、ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７１：２４５７６‐２４５８２、１９９６）。
【００６０】
人の表皮組織で分離した角質形成細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）を２４‐ウェル試験プレートに５×１０４個ずつ入れて２４時間付着させた。ＦＢＳが含まれない培地に取り替え、アスピリン処理をしてプロスタグランジン生合成酵素（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｈ２  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、またはｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）の活性を除去した。アスピリン処理２時間後に角質形成細胞が入っている各ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、各ウェルに１００μｌのＰＢＳを入れた。この角質形成細胞に紫外線Ｂ（ＵＶ  Ｂ）ランプ（Ｍｏｄｅｌ：Ｆ１５Ｔ８、ＵＶ  Ｂ１５Ｗ、Ｓａｎｋｙｏ  Ｄｅｎｎｋｉ社、Ｊａｐａｎ）を利用して紫外線３０ｍＪ／ｃｍ２を照射した後、ＰＢＳを取り出して各ウェルに角質形成細胞培養液（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｄｉａ、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  ＢｉｏＷｈｉｔｔａｃｋｅｒ社，ＭＤ，ＵＳＡ）２５０μｌを添加した。ここに上記物質１，３‐ジカフェオイルキナ酸、１，５‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンを約２μｇ／ｍｌずつ処理した後、１６時間培養した。培養上層液を適量に取って１６時間生合成されたＰＧＥ‐２を定量することにより、１，３‐ジカフェオイルキナ酸、１，５‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンのプロスタグランジン抑制効果を判断した。ＰＧＥ‐２の発現抑制効果は下記の数学式１によって算出し、その結果は下記の表４に示した。
【００６１】
【数１】
0006577581.tif 000008
【００６２】
【表４】
0006577581.tif 000009
【００６３】
上記表４の結果から、本発明の組成物に含有される１，３‐ジカフェオイルキナ酸、１，５‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンは肌の炎症因子であるＰＧＥ‐２の発現を効果的に抑制することを確認することができる。従って、本発明の組成物に含有される１，３‐ジカフェオイルキナ酸、１，５‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンは皮膚炎症因子の発現を抑制して肌トラブルを防止する効果が優れることを確認することができる。
【００６４】
［試験例５］活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）生成抑制効果
人の表皮組職で分離した角質形成細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）を２４ウェル（ｗｅｌｌ）細胞培養プレートの各ウェルに５×１０４個を入れて２４時間付着させた。培養液を除去した後、各ウェルに１００μｌのリン酸緩衝塩液（ＰＢＳ）を入れた。この角質形成細胞に紫外線Ｂ（ＵＶ  Ｂ）ランプ（Ｍｏｄｅｌ：Ｆ１５Ｔ８，ＵＶ  Ｂ１５Ｗ、Ｓａｎｋｙｏ  Ｄｅｎｎｋｉ社、Ｊａｐａｎ）を利用して紫外線３０ｍＪ／ｃｍ２を照射した後、ＰＢＳを取り出して各ウェルに角質形成細胞培養液２００μｌを添加した。ここに試験物質として１，３‐ジカフェオイルキナ酸、１，５‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンをそれぞれ２μｇ／ｍｌ処理し、所定時間帯別に紫外線刺激によって増加した活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）の量を定量した。この時、比較のために試験物質を処理しないで（無処理）紫外線刺激もしないもの及び試験物質を処理しないで紫外線刺激をしたものに対する活性酸素種の量も測定した。ＲＯＳの量はＲＯＳによって酸化されるＤＣＦ‐ＤＡ（ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ）の蛍光を測定するＴａｎの方法を参考して定量し（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  Ｖｏｌ．１４１、ｐｐ１４２３‐１４３２）、対照群のＲＯＳに対する割合を下記の表５に示した。
【００６５】
【表５】
0006577581.tif 000010
【００６６】
上記表５に示した結果から、本発明の１，３‐ジカフェオイルキナ酸、１，５‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンは紫外線によって肌細胞損傷を引き起こすと知られたＲＯＳの生成を効果的に抑制することを確認することができた。従って、これらの物質は抗酸化効能が優れていることを確認することができた。
【００６７】
従って、本発明の組成物に含有される１，３‐ジカフェオイルキナ酸、１，５‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンは活性酸素種の生成を抑制して皮膚炎症を抑制することにより肌刺激の生成を防御することができ、また肌細胞損傷を防止して肌老化を防ぐことによって、毛穴が広くなることを予防することができる。
【００６８】
［試験例６］コラーゲン生合成促進
本発明で用いられる１，３‐ジカフェオイルキナ酸、１，５‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンのコラーゲン生合成促進効果をＴＧＦ‐βと比較して測定した。
【００６９】
まず、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）を２４ウェルプレートの各ウェルに１×１０５個ずつ播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）して約９０％育つまで培養した。これを２４時間無血清ＤＭＥＭ培地で培養した後、これに１，３‐ジカフェオイルキナ酸、１，５‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンとＴＧＦ‐βをそれぞれ２μｇ／ｍｌ処理し、ＣＯ２培養器で２４時間培養した。これらの上層液を取ってプロコラーゲン型（Ｉ）ＥＬＩＳＡキット（ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ（Ｉ））を利用してプロコラーゲン（ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ）の増減有無を見た。その結果を表６に示し、コラーゲンの合成能は非処理群を１００にして比較した。
【００７０】
【表６】
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【００７１】
上記表６に示した結果から、本発明の１，３‐ジカフェオイルキナ酸、１，５‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンは陽性対照群であるＴＧＦ‐βのように高いコラーゲン合成能を現わすことを確認することができた。
【００７２】
従って、本発明の１，３‐ジカフェオイルキナ酸、１，５‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンは毛穴周辺のコラーゲン生成量を増加させて広くなった毛穴を縮めることができるということを確認することができた。
【００７３】
［試験例７］肌毛穴収縮効果評価
１，３‐ジカフェオイルキナ酸、１，５‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンの毛穴縮小効果をトコフェロール及びＥＧＣＧと比較して測定した。ライノマウス６０匹を１０匹ずつ６つの群に分け、各群のライノマウスに１，３‐ジカフェオイルキナ酸、１，５‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボン、トコフェロールまたはＥＧＣＧの１％溶液（溶媒として１，３‐ブチレングリコール：エタノール＝７：３使用）を０．５ｍｌずつ塗布した。この時、比較のために一つの群には溶媒のみ０．５ｍｌ塗布した。物質を１週間処理し、最後の処理２４時間後に背中の部分を生検した。表皮を分離して０．５％の酢酸に浸した後、１０％ホルマリンに固定して６ｍｍで垂直に切った。ヘマトキシリンとエオシンで染色した後、機械接眼マイクロメーター（Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｅｙｅｐｉｅｃｅ  ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ）を利用して毛穴の大きさを測定した。その結果を下記の表７に示した。
【００７４】
【表７】
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【００７５】
上記表７に示すように、本発明の１，３‐ジカフェオイルキナ酸、１，５‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンはトコフェロール及びＥＧＣＧに比べて毛穴の大きさを減少させる効果が優れていることを確認することができた。
【００７６】
［参考例２］実施例４〜６及び比較例２の製造
下記の表８に記載した組成によって柔軟化粧水（スキンローション）剤形の実施例４〜６及び比較例２を通常の製造方法で製造した（単位：重量％）。
【００７７】
【表８】
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【００７８】
［試験例８］毛穴収縮に対する官能評価
試験対象としては２０〜５０歳女性層で脂性肌の人６０名を無作為に１５名ずつ４つの群に分けた。各群に対して洗顔後所定時間が経った後上記実施例４〜６または比較例２の製品をそれぞれ塗布するようにし、これを朝、夜１日２回実施するようにした後、４週後に毛穴の大きさを肉眼で測定した。その結果は下記の表９に示した（評価等級：０．全く縮小されない；５．非常に縮小した）。
【００７９】
【表９】
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【００８０】
上記表９の結果から分かるように、本発明の１，３‐ジカフェオイルキナ酸、１，５‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンを含む組成物は毛穴収縮効果が何も含まない比較例の組成物より優れていると回答した使用者が有意的に多かった。
【００８１】
従って、本発明の１，３‐ジカフェオイルキナ酸、１，５‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンを含む肌外用剤組成物の毛穴収縮効果が優れていることが分かった。
【００８２】
以下、本発明による組成物の剤形例を説明するが、薬学組成物及び化粧料組成物は様々な剤形で応用可能であり、これは本発明を限定するのではなく、ただ具体的に説明するためのものである。
【００８３】
［剤形例１］化粧水
以下の表１０に記載した組成で通常の方法によって化粧水を製造する。
【００８４】
【表１０】
0006577581.tif 000015
【００８５】
［剤形例２］栄養クリーム
以下の表１１に記載した組成で通常の方法によって栄養クリームを製造する。
【００８６】
【表１１】
0006577581.tif 000016
【００８７】
［剤形例３］マッサージクリーム
以下の表１２に記載した組成で通常の方法によってマッサージクリームを製造する。
【００８８】
【表１２】
0006577581.tif 000017
【００８９】
［剤形例４］パック
以下の表１３に記載した組成で通常の方法によってパックを製造する。
【００９０】
【表１３】
0006577581.tif 000018
【００９１】
［剤形例５］ゲル
以下の表１４に記載した組成で通常の方法によってゲルを製造する。
【００９２】
【表１４】
0006577581.tif 000019
【００９３】
［剤形例６］軟膏
以下の表１５に記載した組成で通常的な方法で軟膏を製造する。
【００９４】
【表１５】
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【００９５】
［剤形例７］軟質カプセル剤
１，３‐ジカフェオイルキナ酸、１，５‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンからなる群から選択された１種以上の化合物０．００２５ｇ、ビタミンＣ０．００２５ｇ、パーム油２ｍｇ、パーム硬化油８ｍｇ、黄蝋４ｍｇ及びレシチン６ｍｇを混合して、通常の方法によって１カプセル当たり４００ｍｇずつ充填して軟質カプセルを製造した。
【００９６】
［剤形例８］精製
１，３‐ジカフェオイルキナ酸、１，５‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンからなる群から選択された１種以上の化合物０．００２５ｇ、ビタミンＣ０．００２５ｇ、葡萄糖１００ｍｇ、澱粉９６ｍｇ及びマグネシウムステアレート４ｍｇを混合して、３０％エタノールを４０ｍｇ添加して顆粒を形成した後、６０℃で乾燥して打錠機を利用して錠剤に打錠した。
【００９７】
［剤形例９］顆粒剤
１，３‐ジカフェオイルキナ酸、１，５‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンからなる群から選択された１種以上の化合物１５０ｍｇ、ビタミンＣ１５０ｍｇ、葡萄糖１００ｍｇ、及び澱粉６００ｍｇを混合して、３０％エタノールを１００ｍｇ添加して顆粒を形成し、６０℃で乾燥して顆粒を形成した後包に充填した。内容物の最終重量は１ｇにした。
【００９８】
［剤形例１０］ドリンク剤
１，３‐ジカフェオイルキナ酸、１，５‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンからなる群から選択された１種以上の化合物０．００２５ｇ、ビタミンＣ０．００２５ｇ、葡萄糖１０ｇ、クエン酸２ｇ及び精製水１８７．８ｇを混合して瓶に充填した。内容物の最終用量は２００ｍｌにした。
【００９９】
以上、本発明の内容の特定部分について詳しく説明したが、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者にとってこのような具体的な技術は好ましい実施態様に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるのではないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は請求項及びそれらの等価物によって定義されると理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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