(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中の可溶型線維芽細胞増殖因子受容体（ｓＦＧＦＲ）を検出するためのキットであって、
マイクロスフェアにコンジュゲートされたｓＦＧＦＲと特異的に結合する捕捉抗体組成物（ここで、該捕捉抗体組成物は、ＦＧＦＲ２と特異的に結合する捕捉抗体、ＦＧＦＲ３と特異的に結合する捕捉抗体、及びＦＧＦＲ４と特異的に結合する捕捉抗体を含む。）と、
検出標識にコンジュゲートされたｓＦＧＦＲと特異的に結合する検出抗体組成物（ここで、該検出抗体組成物は、ＦＧＦＲ２と特異的に結合する検出抗体、ＦＧＦＲ３と特異的に結合する検出抗体、及びＦＧＦＲ４と特異的に結合する検出抗体を含む。）とを含み、
前記生体試料中で０．１４〜４９４ｎｇ／ｍＬのｓＦＧＦＲ２、０．０２３〜７４ｎｇ／ｍＬのＦＧＦＲ３、及び０．０３３〜１２３ｎｇ／ｍＬのＦＧＦＲ４が検出される、
前記キット。
【請求項２】
前記生体試料が、血液、血清、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血漿、リンパ液、唾液、汗、胸液、滑液、涙液、胆汁、膵臓分泌からなる群から選択される、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記捕捉抗体が、
マウス抗ヒトＦＧＦＲ２モノクローナル抗体、
マウス抗ヒトＦＧＦＲ３モノクローナル抗体、及び
マウス抗ヒトリン酸化ＦＧＦＲ４ポリクローナル抗体からなる群から選択される、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
前記検出抗体が、
マウス抗ヒトＦＧＦＲ２モノクローナル抗体、
マウス抗ヒトＦＧＦＲ３モノクローナル抗体、及び
マウス抗ヒトＦＧＦＲ４ポリクローナル抗体からなる群から選択される、請求項１に記載のキット。
【請求項５】
前記マイクロスフェアが、２種類のフルオロフォアにコンジュゲートされる、請求項１に記載のキット。
【請求項６】
前記マイクロスフェアにコンジュゲートされた２種類のフルオロフォアが赤色と赤外領域とのフルオロフォアである、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
前記マイクロスフェアが約５μｍの直径を有する、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
ブロッキングバッファー及びインキュベーションバッファーを更に含む、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
生体試料中のｓＦＧＦＲ２、ｓＦＧＦＲ３、及びｓＦＧＦＲ４を検出するためのキットであって、
マイクロスフェア上にコンジュゲートされたマウス抗ヒトＦＧＦＲ２モノクローナル抗体と、
マイクロスフェア上にコンジュゲートされたマウス抗ヒトＦＧＦＲ３モノクローナル抗体と、
マイクロスフェア上にコンジュゲートされたマウス抗ヒトリン酸化ＦＧＦＲ４ポリクローナル抗体と、
検出標識にコンジュゲートされたマウス抗ヒトＦＧＦＲ２モノクローナル抗体と、
検出標識にコンジュゲートされたマウス抗ヒトＦＧＦＲ３モノクローナル抗体と、
検出標識にコンジュゲートされたマウス抗ヒトＦＧＦＲ４ポリクローナル抗体とを含み、
前記生体試料中で０．１４〜４９４ｎｇ／ｍＬのｓＦＧＦＲ２、０．０２３〜７４ｎｇ／ｍＬのＦＧＦＲ３、及び０．０３３〜１２３ｎｇ／ｍＬのＦＧＦＲ４が検出される、
請求項１に記載のキット。
【請求項１０】
ブロッキングバッファー及びインキュベーションバッファーを更に含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
試料中のｓＦＧＦＲを測定する方法であって、
ａ．前記試料を提供することと、
ｂ．請求項１０のキットを使用して前記試料中のｓＦＧＦＲを測定することとを含む、
前記方法。
【請求項１２】
前記試料が生きた対象から得られる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
生体試料中のｓＦＧＦＲ２、ｓＦＧＦＲ３、及びｓＦＧＦＲ４の量を測定するための方法であって、
ａ．前記生体試料を、マイクロスフェア上にコンジュゲートされたｓＦＧＦＲ２、ｓＦＧＦＲ３、及びｓＦＧＦＲ４と特異的に結合する捕捉抗体組成物と接触させることと、
ｂ．前記生体試料を、検出標識に連結されたｓＦＧＦＲ２、ｓＦＧＦＲ３、及びｓＦＧＦＲ４と特異的に結合する検出抗体組成物と接触させることと、
ｃ．前記検出抗体によって発生されるシグナルを測定することと、
ｄ．前記ｃで発生されたシグナルの量を、前記生体試料中のｓＦＧＦＲ２、ｓＦＧＦＲ３、又はｓＦＧＦＲ４の量と関連付けることとを含む、
前記方法。
【請求項１４】
最小検出感度が、
ｓＦＧＦＲ２について０．１４ｎｇ／ｍＬであり、
ｓＦＧＦＲについて０．０２３ｎｇ／ｍＬであり、
ｓＦＧＦＲについて０．０３３ｎｇ／ｍＬである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記生体試料が、血液、血清、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血漿、リンパ液、唾液、汗、胸液、滑液、涙液、胆汁、膵臓分泌からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
各マイクロスフェアが約５μｍの直径を有する、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（先行出願）
本願は、２０１２年１２月２１日出願の米国特許出願第６１／７４０，４６６号に基づく優先権を主張するものであり、当該出願の全容を参照によって本明細書に援用するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本明細書に述べられ、特許請求される主題は、被測定物質検出の分野のものであり、詳細には、生体試料中の、２型、３型、及び４型受容体（ｓＦＧＦＲ２、ｓＦＧＦＲ３及びｓＦＧＦＲ４）をはじめとする線維芽細胞増殖因子受容体の可溶性又は細胞外ドメインを測定及び同定するためのキット並びに方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発がんとは、正常細胞が幾つかの遺伝子突然変異を蓄積し、しばしば「がんの特徴的性質（hallmarks of cancer）」と呼ばれる悪性形質を促進する幾つかの共通の特徴を獲得することによってがん細胞に転換する多段階の過程である。６つの古典的ながんの特徴的性質として、増殖シグナルの自己充足、増殖抑制シグナルへの感受性の欠如、無制限な複製能力、アポトーシスの回避、持続的な血管新生、及び組織浸潤能と転移形成能が挙げられる（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｗｅｉｎｂｅｒ，Ｒ．Ａ．Ｃｅｌｌ  ２０００，１００：５７〜７０）。これらの特徴の多くは、主要がん遺伝子の機能獲得、増幅、及び／又は過剰発現と同時に、腫瘍抑制因子の機能喪失、欠失、及び／又は後成的サイレンシングをともなう遺伝子変化によって生じるものである（Ｌｕｏ，Ｊ．，Ｓｏｌｉｍｉｎｉ，Ｎ．Ｌ．，Ｅｌｌｅｄｇｅ，Ｓ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  ２００９，１３６：８２３〜８３７）。例えば、各種のヒトのがんにおいて、幾つかの変化及び突然変異が線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦＲ）のファミリー内で同定されている。これらの突然変異は、乳がん、膀胱がん、胃がん、前立腺がん、結腸がん、多発性骨髄腫、及び特に肺がんを含むがんにおいて、ＦＧＦＲシグナル伝達の脱調節又は受容体の過剰発現を引き起こす（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｎ．，Ｇｒｏｓｅ，Ｒ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１０，１０：１１６〜１２９；Ｖｏｌｍ，Ｍ．，Ｋｏｏｍａｇｉ，Ｒ．，Ｍａｔｔｅｒｎ，Ｊ．，Ｓｔａｍｍｌｅｒ，Ｇ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９７，３３：６９１〜６９３；Ｂｅｒｇｓａｇｅｌ，Ｐ．Ｌ．，Ｋｕｅｈｌ，Ｗ．Ｍ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００５，２３：６３３３〜６３３８．Ｔｒｕｄｅｌ，Ｓ．，Ｓｔｅｗａｒｔ，Ａ．Ｋ．，Ｒｏｍ，Ｅ．，Ｗｅｉ，Ｅ．，Ｌｉ，Ｚ．Ｈ．，Ｋｏｔｚｅｒ，Ｓ．，Ｃｈｕｍａｋｏｖ，Ｉ．，Ｓｉｎｇｅｒ，Ｙ．，Ｃｈａｎｇ，Ｈ．，Ｌｉａｎｇ，Ｓ．Ｂ．，Ｙａｙｏｎ，Ａ．，Ｂｌｏｏｄ．２００６，１０７：４０３９〜４０４６）。
【０００４】
肺がんは、男性及び女性の両方においてがん関連死の主因であり、米国内では２０１０年において１５７，３００人の死亡例を占めている（Ｊｅｍａｌ，Ａ．，Ｓｉｅｇｅｌ，Ｊ．Ｘｕ，Ｊ．，Ｗａｒｄ，Ｅ．ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ．２０１０，６０：２７７〜３００）。肺がん症例の大半（約８５％）は、過去数十年間において生存率の向上がほとんどみられない非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）として分類される（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ＆  Ｆｉｇｕｒｅｓ，２０１０，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）。近年、ＮＳＣＬＣにおける増殖因子信号伝達の理解が深まったことで、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を標的とした新規な治療法が開発されている。ＥＧＦＲ阻害剤は任意抽出の患者において一定の効果を示すものの、ＥＧＦＲの活性化突然変異によってＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に極めて応答性の高い一群の腫瘍が同定されている（Ｌｙｎｃｈ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．，Ｓｏｒｄｅｌｌａ，Ｒ．，Ｇｕｒｕｂｈａｇａｖａｔｕｌａ，Ｓ．，Ｏｋｉｍｏｔｏ，Ｒ．Ａ．，Ｂｒａｎｎｉｇａｎ，Ｂ．Ｗ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ｐ．Ｌ．，Ｈａｓｅｒｌａｔ，Ｓ．Ｍ．，Ｓｕｐｋｏ，Ｊ．Ｇ．，Ｈａｌｕｓｋａ，Ｆ．Ｇ．，Ｌｏｕｉｓ，Ｄ．Ｎ．，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｉ，Ｄ．Ｃ．，Ｓｅｔｔｌｅｍａｎ，Ｊ．，Ｈａｂｅｒ，Ｄ．Ａ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００４，３５０：２１２９〜２１３９；Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｆ．Ａ．，Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｊ．Ｒ．，Ｃｉｕｌｅａｎｕ，Ｔ．，Ｅｎｇ，Ｈ．Ｔ．，Ｈｉｒｓｈ，Ｖ．，Ｔｈｏｎｇｐｒａｓｅｒｔ，Ｓ．，Ｃａｍｐｏｓ，Ｄ．，Ｍａｏｌｅｅｋｏｏｎｐｉｒｏｊ，Ｓ．，Ｓｍｙｌｉｅ，Ｍ．，Ｍａｒｔｉｎｓ，Ｒ．，Ｖａｎ  Ｋｏｏｔｅｎ，Ｍ．，Ｄｅｄｉｕ，Ｍ．，Ｆｉｎｄｌａｙ，Ｂ．，Ｔｕ，Ｄ．，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｄ．，Ｂｅｚｊａｋ，Ａ．，Ｃｌａｒｋ，Ｇ．，Ｓａｎｔａｂａｒｂａｒａ，Ｐ．，Ｓｅｙｍｏｕｒ，Ｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００５，３５３：１２３〜１３２．）。同様に、抗ＶＥＧＦ治療は、ＮＳＣＬＣを有する特定の患者において優れた成績を収めている（Ｓａｎｄｌｅｒ，Ａ．，Ｇｒａｙ，Ｒ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｍ．Ｃ．，Ｂｒａｈｍｅｒ，Ｊ．，Ｓｃｈｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．，Ｄｏｗｌａｔｉ，Ａ．，Ｌｉｌｅｎｂａｕｍ，Ｒ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｈ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００６，３５５：２５４２〜２５５０．）ものの、抗ＶＥＧＦの治療効果を特徴付ける予測バイオマーカーはそれほどの効果を示していない（Ｒａｍａｌｉｎｇａｍ，Ｓ．Ｓ．，Ｂｅｌａｎｉ，Ｃ．Ｐ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０１０，２２：７９〜８５）。ＮＳＣＬＣにおけるＥＧＦＲ及びＶＥＧＦ阻害剤でのこうした経験は、腫瘍の進行、血管新生、及び現在利用可能な治療に対する抵抗性に関与する他のシグナル伝達経路を規定する必要性を強調するものである（Ｓｉｅｇｅｌ，Ｒ．，Ｎａｉｓｈａｄｈａｍ，Ｄ．，Ｊｅｍａｌ，Ａ．ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ．２０１２，６２：１０〜２９）。
【０００５】
線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）は、血管新生、器官形成、組織の発生、及び内分泌系のシグナル伝達を含む複数の生理学的プロセスに関与している膜貫通チロシンキナーゼ受容体である。構造的には、ＦＧＦＲは、切断されるシグナルペプチド、３つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、酸性箱構造、膜貫通ドメイン、及び分割されたチロシンキナーゼドメインで構成される（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｎ．，Ｇｒｏｓｅ，Ｒ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１０，１０：１１６〜２９；Ｂｅｅｎｋｅｎ，Ａ．，Ｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｍ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２００９，８：２３５〜２５３）。これまでのところ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ４と称されるＦＧＦＲをコードした４つの遺伝子が同定されている。ＦＧＦＲのそれぞれのタイプは感受性及び特異性において異なっている。この系は、ＦＧＦＲ１〜３のｍＲＮＡにおいて生じうる、リガンド結合活性及びシグナル伝達活性の異なる多様な変異体を生成する広範囲のスプライシングによってより複雑なものとなっている（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｎ．，Ｇｒｏｓｅ，Ｒ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１０，１０：１１６〜２９；Ｂｅｅｎｋｅｎ，Ａ．，Ｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｍ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２００９，８：２３５〜２５３）。線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）はＦＧＦＲのリガンドであり、細胞の必要性に応じて放出される２２種類の可溶性の排泄ペプチドからなる。ＦＧＦとＦＧＦＲはともに、増殖シグナルの正確な微調整を可能とする極めて多くのリガンド／受容体の組合わせを生じる。ＦＧＦのシグナル伝達の調節には、メタロプロテアーゼによる細胞表面におけるタンパク質分解的切断によって生成されるＦＧＦＲの可溶型（ｓＦＧＦＲ）の放出を含むいくつかの機序が含まれる（Ｍｕｌｌｂｅｒｇ  Ｊ，Ａｌｔｈｏｆｆ  Ｋ，Ｊｏｓｔｏｃｋ  Ｔ，Ｒｏｓｅ−Ｊｏｈｎ  Ｓ．Ｅｕｒ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．２０００，１１：２７〜３８）。これらの受容体の脱落（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）は、ＦＧＦシグナル伝達のダウンレギュレーション及び循環中への生物学的活性タンパク質の放出の主要な機序をもたらすものである（Ｐｅｓｃｈｏｎ  Ｊ．Ｊ．，Ｓｌａｃｋ  Ｊ．Ｌ．，Ｒｅｄｄｙ  Ｐ．，Ｓｔｏｃｋｉｎｇ  Ｋ．Ｌ．，Ｓｕｎｎａｒｂｏｒｇ，Ｓ．Ｗ．，Ｌｅｅ，Ｄ．Ｃ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｃａｓｔｎｅｒ，Ｂ．Ｊ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ｓ．，Ｆｉｔｚｎｅｒ，Ｊ．Ｎ．，Ｂｏｙｃｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｎ．，Ｋｏｚｌｏｓｋｙ，Ｃ．Ｊ．，Ｗｏｌｆｓｏｎ，Ｍ．Ｆ．，Ｒａｕｃｈ，Ｃ．Ｔ．，Ｃｅｒｒｅｔｔｉ，Ｄ．Ｐ．，Ｐａｘｔｏｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｍａｒｃｈ，Ｃ．Ｊ．，Ｂｌａｃｋ，Ｒ．Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９８，２８２：１２８１〜２１８４）。
【０００６】
過去２０年間において、がん患者の血中に可溶型ＦＧＦＲ受容体が特に高濃度で存在することを示す証拠が積み重ねられており（Ｈａｎｎｅｋｅｎ，Ａ．，Ｙｉｎｇ，Ｗ．，Ｌｉｎｇ，Ｎ．，Ｂａｉｒｄ，Ａ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１９９４，９１：９１７０〜９１７４；Ｈａｎｎｅｋｅｎ  Ａ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２００１，４８９：１７６〜１８１）、循環中のこれらの受容体の存在を監視することががんの進行及び／又は治療を理解するうえで重要となる可能性を示唆するものである。例えば、ＦＧＦＲ４のＣ末端が切断された可溶型は、ＦＧＦの作用を機能的に調節することができるヒトの上皮乳がん細胞系によって発現される（Ｅｚｚａｔ，Ｓ，，Ｚｈｅｎｇ，Ｌ．，Ｙｕ，Ｓ．，Ａｓａ，Ｓ．Ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００１，２８７：６０〜６５）。更に、ＦＧＦＲ３の別のスプライスされた形態がヒト扁平上皮がん細胞系において同定されており、架橋実験によって示されるようにＦＧＦ１及びＦＧＦ２と結合する能力を有するものである（Ｔｅｒａｄａ，Ｍ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ａ．，Ｓａｔｏ．Ｎ．，Ｍｉｙａｋａｚｅ，Ｓ．Ｉ．，Ｋａｔａｙａｍａ，Ｈ．，Ｋｕｒｏｋａｗａ−Ｓｅｏ．Ｍ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００１，４：３６５〜３７３）。これらの分泌されるｓＦＧＦＲのリガンド結合親和性はこれらの受容体の膜結合型としばしば同様であり、それらの生物学的な役割が、細胞表面の受容体と競合することによりリガンドの作用を調節することであることを示唆するものである。
【０００７】
これらの研究の一部では、ＦＧＦＲは血中又は細胞培地内で同定されているが、従来技術において用いられている唯一の方法は、高感度でもなければ、線形でも診断的でもない技法である免疫ブロット法である（Ｈａｎｎｅｋｅｎ，Ａ．，Ｙｉｎｇ，Ｗ．，Ｌｉｎｇ，Ｎ．，Ｂａｉｒｄ，Ａ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１９９４，９１：９１７０〜９１７４；Ｈａｎｎｅｋｅｎ  Ａ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２００１，４８９：１７６〜１８１）。したがって、自動化しやすい、ｓＦＧＦＲの標準化された高速かつ正確で経済的なスクリーニング法の開発が依然、求められている。全ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、及びＦＧＦＲ４の可溶型を検出するための市販のＤｕｏＳｅｔ（登録商標）抗体が入手可能であることから、出願人らは、このＥＬＩＳＡ法を利用して可溶型上皮増殖因子受容体の検出に使用されるものと似たｓＦＧＦＲの検出アッセイを開発した（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｖ．，Ｗｉｔｚｅｌ，Ｉ．，Ｐａｎｔｅｌ，Ｋ．，Ｋｒｅｎｋｅｌ，Ｓ．，Ｌｕｃｋ，Ｈ．Ｊ．，Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｒ．，Ｋｅｌｌｅｒ，Ｔ．，Ｄｉｔｔｍｅｒ，Ｊ．，Ｊａｎｉｃｋｅ，Ｆ．，Ｔｈｏｍｓｓｅｎ，Ｃ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６，２６：１４７９〜１４８７）。しかしながら、ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡシステムでは、アッセイした生体試料中の可溶型ＦＧＦＲ３（ｓＦＧＦＲ３）のみしか検出されないので、充分とはいえなかった。そこで、出願人らは、可溶型のＦＧＦＲ２（ｓＦＧＦＲ２）及びＦＧＦＲ４（ｓＦＧＦＲ４）に対する検出感度を向上させるためにＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙフォーマットにアッセイを移行した。しかしながらｓＦＧＦＲ２及びｓＦＧＦＲ４は依然検出されなかった。そこで、多重のマイクロスフェアに基づいたプラットフォームを利用した、生体試料中のｓＦＧＦＲ２、ｓＦＧＦＲ３、及びｓＦＧＦＲ４を検出するためのまったく異なるアッセイシステムの開発に成功したものである。本明細書に開示される主題は、生体試料中のｓＦＧＦＲ２、ｓＦＧＦＲ３、及びｓＦＧＦＲ４を検出するためのキット及び方法を提供するものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
がん患者は、疾患を有さない患者と比較して一般的に生体液及び組織中の可溶型ＦＧＦ受容体の含量が高くなっている。本明細書に述べられるキット及び方法は、当業者がこうした患者における可溶型ＦＧＦ受容体の複数のアイソフォームを同定及び定量化することを可能にするものであり、がん患者におけるＦＧＦ含量を同定及び定量化するための基礎を与えるものである。本発明の別の実施形態は、複数ｓＦＧＦＲを同時にスクリーニングするための多重化されたマイクロスフェア技術にも関するものである。
【０００９】
記載される一実施形態の第１の態様は、ｓＦＧＦＲの検出に用いられるキットである。キットは、マイクロスフェアにコンジュゲートされたｓＦＧＦＲと特異的に結合する捕捉抗体組成物を含む。コンジュゲートされた捕捉抗体を有するマイクロスフェアは、約５μｍの直径を有し、２種類のフルオロフォアを有する。各フルオロフォアは、他方のフルオロフォアとスペクトル的に異なっている。キットは、ｓＦＧＦＲと特異的に結合するが捕捉抗体とは異なる検出抗体組成物を更に含み、検出抗体は、説明される意図的目的に好適な当該技術分野では周知の任意の検出可能な標識とコンジュゲートされる。更にキットはブロッキングバッファー及びインキュベーションバッファーを備えてもよい。
【００１０】
第２の実施形態は、ｓＦＧＦＲ２、ｓＦＧＦＲ３及び／又はｓＦＧＦＲ４の特定の予め定義された閾値濃度を検出するためのキットを含む。好ましくは、そのような濃度は、以下のような値を有する濃度で検出される。すなわち、生体試料中、少なくとも０．１４〜４９４ｎｇ／ｍＬのｓＦＧＦＲ２、０．２３〜７４ｎｇ／ｍＬのｓＦＧＦＲ３、及び０．３３〜１２３ｎｇ／ｍＬのｓＦＧＦＲ４である。キットは、マイクロスフェアにコンジュゲートされたｓＦＧＦＲ２、ｓＦＧＦＲ３、及びｓＦＧＦＲ４に対する捕捉抗体と、当該技術分野では周知の検出標識とコンジュゲートされたｓＦＧＦＲ２、ｓＦＧＦＲ３、及びｓＦＧＦＲ４に対する検出抗体とを含む。キットは更にブロッキングバッファー及びインキュベーションバッファーを含んでもよい。
【００１１】
本明細書に述べられ、特許請求される主題の第３の実施形態は、生体試料中のｓＦＧＦＲ２、ｓＦＧＦＲ３、及びｓＦＧＦＲ４の量を測定するための方法を含む。この方法は、前記生体試料を、マイクロスフェア上にコンジュゲートされた、ｓＦＧＦＲと特異的に結合する捕捉抗体組成物と接触させることと、前記生体試料を、当該技術分野では周知の検出標識と連結された、ｓＦＧＦＲと特異的に結合する検出抗体組成物と接触させることと、前記検出標識により生成されるシグナルを測定することと、生成された前記シグナルの量を前記生体試料中のｓＦＧＦＲ２、ｓＦＧＦＲ３、及び／又はｓＦＧＦＲ４の量と関連付けることと、を含む。
【００１２】
【表１】
0006488236.tif 000002
【００１３】
用語の定義
本明細書で使用される用語「キット」は、試薬及び他の材料の組合わせのことを指す。キットは、緩衝剤、タンパク質安定化試薬、シグナル生成システム（例えば蛍光シグナル生成システム）、抗体、コントロールタンパク質、及び試験容器（例えばマイクロタイタープレートなど）を含むことが考えられる。「キット」なる用語は、試薬及び／又は他の材料の特定の組合わせに限定されるものではない。一実施形態では、キットは、試薬を使用するための使用説明書を更に含む。試験キットは、任意の適当な態様で、通常は、必要に応じて１個の容器又は異なる容器に入れられた各要素が、試験を実施するための１枚の使用説明書とともにパッケージングされていてよい。幾つかの実施形態では、キットは、ポジティブコントロール試料も含んでいることが好ましい。キットは、当該技術分野で周知の様々な方法で製造することができる。
【００１４】
「生体試料」なる用語は、生物から得られる様々な種類の試料を含むものであり、診断的又はモニタリングアッセイにおいて使用することができる。この用語には、生物由来の血液及び他の液体試料、生検検体若しくは組織培養物などの固体組織試料、又はこれらに由来する細胞及びその子孫細胞が含まれる。この用語には、試料を調達後に、試薬による処理、可溶化、又は特定の成分の濃縮など、任意の方法で操作された試料が含まれる。この用語には臨床試料が含まれ、また、細胞培養物、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生体液、及び組織試料における細胞も含まれる。「生体試料」なる用語は、臨床現場における試料と、組換え試料でありうる、又は組換え試料に由来しうる試料とを識別するためのものである。
【００１５】
本出願の意味における「捕捉抗体」及び「検出抗体」なる用語は、高い親和性で特定のｓＦＧＦＲと結合するこれら抗体を含むものとする。
【００１６】
「抗体」なる用語は広義で用いられ、詳細には、無損傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２種類の無損傷の抗体から形成される多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び所望の生物学的性質を示すものである抗体フラグメントを含む。抗体は任意の種に由来するものでよく、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）、ＩｇＤ、ＩｇＡ、又はＩｇＥであってよい。所望の生物活性はｓＦＧＦＲに対する結合性である。
【００１７】
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」なる用語は、単一の分子組成の抗体の調製物のことを指す。モノクローナル抗体組成物は、ｓＦＧＦＲの特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す。
【００１８】
本明細書で使用する「ポリクローナル抗体」なる用語は、同じ又は異なる抗原上の複数の異なる特異的抗原決定基と結合又はこれと反応することが可能な異なる抗体分子の組成物を指す。ポリクローナル抗体の抗原特異性の変動性は、ポリクローナル抗体を構成する個々の抗体の可変領域、特に相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域内に存在する。好ましくは、ポリクローナル抗体は、標的ｓＦＧＦＲ又はその部分によって動物を免疫化することによって調製される。あるいは、ポリクローナル抗体は、標的ｓＦＧＦＲに対する所望の特異性を有する複数のモノクローナル抗体を混合することによって調製することもできる。
【００１９】
「特異的に結合する」なる用語は、ある分子（抗原）が、他の多くの多様な分子の存在下であっても別の特定の分子（抗体）と結合する能力、すなわち、１つの分子が、分子の異種混合物中で別の分子に対して優先的な結合性を示す能力によって特徴づけられる、２つの分子（例えば抗原と抗体）の間の結合性を指す。
【００２０】
「マイクロスフェア」なる用語は、微小な別個の固体支持体のことを指す。これらの別個の固体支持体は、プローブの集団内のそれぞれ個々のプローブが互いから異なるようにプローブの集団を付着させるために使用することができる。マイクロスフェアの組成は、例えばフォーマット、化学的性質、及び／又は付着の方法、及び／又は、核酸合成の方法に応じて異なりうる。代表的なマイクロスフェア組成物は、固体支持体、並びに固体支持体に付与されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び／又は有機部分の合成に用いられる化学的官能性を含む。このような組成物には、例えば、プラスチック、セラミックス、ガラス、ポリスチレン、メチルスチレン、アクリルポリマー、常磁性材料、トリアゾル（thoria sol）、カーボングラファイト、二酸化チタン、ラテックス、又はセファロースなどの架橋デキストラン、セルロース、ナイロン、架橋ミセル及びテフロン（商標）、並びに他の任意の材料が含まれる。
【００２１】
本明細書で使用するところの「フルオロフォア」なる用語は、ｓＦＧＦＲ抗原の定量及び検出に使用することが可能な任意の蛍光化合物又はタンパク質のことを指す。
【００２２】
「感度」なる用語は、本発明に述べられる多重アッセイが、特定のｓＦＧＦＲをその最小濃度においてどの程度正しく特定するかの物差しである。本明細書に述べられるように、感度は、８０〜１２０％で正確に回収することが可能な特定のｓＦＧＦＲの最小検出可能用量（ｎｇ／ｍＬ）として定義される。
【００２３】
「バッファー」なる用語は、緩衝溶液又は水のことを指す。バッファーは、対象とする被測定物質（例えばｓＦＧＦＲ）と被測定物質結合物質（例えばｓＦＧＦＲ抗体）との間の反応を支持し、抗体／抗原反応を阻害しない。
【００２４】
本明細書で使用する「生きた対象」とは、ヒトを含むあらゆる生物を指す。
【００２５】
本明細書で使用する「ａ」、又は「ａｎ」なる語は、１又はそれ以上を意味する場合がある。特許請求の範囲で使用する「ａ」、又は「ａｎ」なる語は、「含む（comprising）」と組み合わせて使用される場合、１又は１よりも多くを意味しうる。本明細書で使用する「別の」とは、少なくとも２番目、又はそれ以降のものを意味しうる。
【００２６】
本明細書で使用する「含む（comprise）」、又は「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」若しくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などのその変化形は、記載された要素若しくは整数、又は要素若しくは整数の群が含まれることを示唆するものであるが、他の任意の要素若しくは整数、又は要素若しくは整数の群を除外することを示唆するものではない。
【００２７】
特に断らないかぎり、本明細書で使用される技術的及び科学的用語はすべて、本発明が関連する技術分野の当業者によって一般的に解釈されるものと同じ意味を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】可溶型ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、及びＦＧＦＲ４について開発されたアッセイを使用して血清及び血漿について確立された検証パラメータを示す。
【図２】血清及び血漿（Ｎ＝３）中、７．８、２．９、１．７、及び０．８２ｎｇ／ｍＬの濃度におけるＦＧＦＲ２のスパイク回収率を示す。
【図３】血清及び血漿（Ｎ＝３）中、１．４、０．５７、０．３０、及び０．１５ｎｇ／ｍＬの濃度におけるＦＧＦＲ３のスパイク回収率を示す。
【図４】血清及び血漿（Ｎ＝３）中、２．２、０．９４、０．５４、及び０．２９ｎｇ／ｍＬの濃度におけるＦＧＦＲ４のスパイク回収率を示す。
【図５】ＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ４と捕捉抗体としての抗ＦＧＦＲ２との、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ４と捕捉抗体としての抗ＦＧＦＲ３との、及びＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３と捕捉抗体としての抗ＦＧＦＲ４との交差反応性を示す。
【図６】ｎｇ／ｍＬで表した公称濃度に対するｎｇ／ｍＬで表した逆算濃度を示したＦＧＦＲ２の標準曲線（Ｎ＝５）を示す。
【図７】ｎｇ／ｍＬで表した公称濃度に対するｎｇ／ｍＬで表した逆算濃度を示したＦＧＦＲ３の標準曲線（Ｎ＝５）を示す。
【図８】ｎｇ／ｍＬで表した公称濃度に対するｎｇ／ｍＬで表した逆算濃度を示したＦＧＦＲ４の標準曲線（Ｎ＝５）を示す。
【図９】低濃度、中濃度、及び高濃度の被測定物質（Ｎ＝５）でスパイクした複数回のランにわたったコントロール試料におけるＦＧＦＲ２の血清濃度の実験による評価を示す。
【図１０】低濃度、中濃度、及び高濃度の被測定物質（Ｎ＝５）でスパイクした複数回のランにわたったコントロール試料におけるＦＧＦＲ３の血清濃度の実験による評価を示す。
【図１１】低濃度、中濃度、及び高濃度の被測定物質（Ｎ＝５）でスパイクした複数回のランにわたったコントロール試料におけるＦＧＦＲ４の血清濃度の実験による評価を示す。
【図１２】ＦＧＦＲ２については濃度７．８、２．９、１．７、及び０．８２ｎｇ／ｍＬにおける、ＦＧＦＲ３については濃度１．４、０．５７、０．３０、及び０．１５ｎｇ／ｍＬにおける、ＦＧＦＲ４については濃度２．２、０．９４、０．５４、及び０．２９ｎｇ／ｍＬにおける血清（Ｎ＝３）及び血漿（Ｎ＝３）中でのスパイク回収率データを示す。
【図１３】血漿、血清、及び高スパイクコントロールにおけるＦＧＦＲ２の希釈直線性のデータを示す。
【図１４】血漿、血清、及び高スパイクコントロールにおけるＦＧＦＲ３の希釈直線性のデータを示す。
【図１５】血漿、血清、及び高スパイクコントロールにおけるＦＧＦＲ４の希釈直線性のデータを示す。
【図１６】図の上部区画は、前立腺がん血清及び肺がん血清においてより良好な範囲を確立するために使用した試料バッファーを示す。下部区画は、転移性がん血清でより高いシグナルを得るために試した異なるブロッキングバッファーを示す。
【図１７】前立腺がん（Ｎ＝５）及び肺がん（Ｎ＝１０）におけるＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、及びＦＧＦＲ４の基準範囲を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
可溶型ＦＧＦＲ濃度の早期の分析はがんの状態（治療の前後の）を理解するうえで有益であり、ＦＧＦＲを標的とする特異的な候補薬剤の選定を助けるものである。このような分析は、ＦＧＦＲ薬剤の作用機序についての手がかりを与えるものである。したがって、ＦＧＦＲに対して感度が高く、特異的である好適な診断アッセイを得ることが必須である。
【００３０】
ｓＦＧＦＲの複数のアイソフォームを正確に検出する好適なアッセイを得るためのこれまでの試みは、他の可溶型増殖因子受容体の検出においては効果的であることが示されたものの失敗に終わっている。意外にも、マイクロスフェアに基づいた多重免疫測定技術（詳細には本明細書並びに米国特許第６，５９９，３３１号、同第６，５９２，８２２号、及び同第６，２６８，２２２号に述べられる「Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００／２００（商標）」プラットフォーム）の使用により、生体試料中のｓＦＧＦＲ２、ｓＦＧＦＲ３、及びｓＦＧＦＲ４を正確に測定するためのアッセイの開発が可能となった。このマイクロスフェアに基づく多重免疫測定技術は、サンドイッチ測定法である。「サンドイッチ測定法」なる用語は、抗原が、通常は抗体である２種類の結合試薬の間に挟み込まれる免疫測定のことを指す。第１の結合試薬（捕捉抗体）はマイクロスフェアに付着され、第２の結合試薬（検出抗体）は検出可能な基を有している。検出可能な基の例としては、例えば、これらに限定されるものではないが、蛍光色素、酵素、例えば抗原又はビオチンなどの結合ペアのメンバーなどの第２の結合試薬が結合するためのエピトープ（例えば、第２の結合試薬／抗体が、蛍光標識された抗マウス抗体により検出されるマウス抗体である場合）が挙げられる。
【００３１】
ポリスチレンマイクロスフェアは、このアッセイの重要な構成要素である。これらのマイクロスフェアビーズは、２種類のスペクトル的に異なるフルオロフォアによって内部染色されている。これらのフルオロフォアを正確な比で使用することで、特定のスペクトルアドレスを有する１００個の異なるマイクロスフェアのセットからなるアレイが生成される。それぞれのマイクロスフェアのセットは、その表面に異なる反応物質を有することができる。本出願では、この反応物質を「捕捉抗体」と呼ぶ。マイクロスフェアの各セットは、それらのスペクトルアドレスによって識別することが可能であるため、これらを組み合わせることで、１個の反応容器内で最大で１００種類の異なる被測定物質を同時に測定することが可能である。本出願では検出抗体と呼ばれる、リポーター分子と連結された第３のフルオロフォアによって、マイクロスフェア表面で生じた生体分子反応が定量される。マイクロスフェアがＬｕｍｉｎｅｘ分析装置内で２本の別々のレーザーを通過する際に、高速で流れる液流中で個々に問い合わせが行われる。高速デジタル信号処理によって、マイクロスフェアはそのスペクトルアドレスに基づいて分類され、１つの試料反応につき数秒間で表面上での反応が定量される。
【００３２】
本明細書に述べられるアッセイでは、マイクロスフェアに基づく多重免疫測定は幾つかの利点を提供する。
・それぞれ個々のｓＦＧＦＲについて別のキットが必要とされないため、アッセイのコストが安価である。
・１つのキットで複数のｓＦＧＦＲを試験できることから、アッセイを行うのに必要な生体試料の量が大幅に低減される。
・生体試料の前処理又は力価測定が必要とされないため、アッセイの定量測定の再現性が高い。
【００３３】
これらの理由から、本発明との関連ではラジオ免疫測定のような他の免疫測定の使用も可能ではあるが、マイクロスフェアに基づく多重免疫測定が好ましい。
【実施例】
【００３４】
以下の非限定的な実施例は、本発明を更に説明するために示すものである。当業者であれば、以下の実施例に開示される技術は、特許請求される発明の実施にあたって効果的に機能することが本発明者らによって見出された手法を代表するものであり、したがって、その実施の態様の実例をなすものとみなすべきである点は認識されるであろう。しかしながら、当業者であれば、本開示を考慮することで、開示される特定の実施形態に、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく多くの変更を行いうるものであり、なお同様又は類似の結果を得ることが可能である点も認識されるであろう。
【００３５】
実施例１：生体試料の採取及び保存
ｓＦＧＦＲは大部分がタンパク質分解的切断後に循環中に放出されることから、血液、血清、及び血漿試料（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ社（ニューヨーク州ウェストベリー））を用いて多重免疫測定の開発及び検証を行った。同意を得た健常者の前腕前部の場所から、州の資格免許を有する瀉血技術者によって血液試料を採取し、４５０〜５００ｍＬの乾燥採血バッグに入れ、冷蔵庫内で一晩凝固させた。２７Ｎ（２８００×Ｇ）、５℃で２０分間遠心して血清を分離した。分離した血清を、赤血球が混入しないように血漿抽出装置を使用してトランスファーバッグに移した。ヒト血漿を、カリウムーＥＤＴＡが入ったコレクションバッグ中に回収し、５分間穏やかに混合し、３０分間室温で静置した。各バッグを２７Ｎ（２８００×ｇ）、５℃で２０分間遠心した。分離した血漿を、赤血球が混入しないように血漿抽出装置を使用してトランスファーバッグに移した。これらのヒト血清及びヒト血漿を両方とも、４℃で最大１週間保存した後、分取物アリコートに分けてクライオチューブに入れ、使用時まで−８０℃で保存した。
【００３６】
実施例２：多重免疫測定の開発
生体試料中のｓＦＧＦＲを検出するためのマイクロスフェアに基づく多重免疫測定の効果的な実施には、プロトコールの開発及び最適化が必要である。最初に、最も感度の高いアッセイが得られる試薬を特定する必要がある。評価を行った第１の試薬のセットは、ｓＦＧＦＲ２、ｓＦＧＦＲ３、及びｓＦＧＦＲ４に対する捕捉及び検出抗体のペアである。いくつかの異なる抗体のソースについて調べたが、表１に示される抗体のペアが、ｓＦＧＦＲ２、ｓＦＧＦＲ３、及びｓＦＧＦＲ４の最良の検出範囲を与えたことから、多重システムにおいて使用した。
【００３７】
【表２】
0006488236.tif 000003
【００３８】
次に調製したアッセイの構成要素は、捕捉抗体を連結させたマイクロスフェアである。捕捉抗体は、以下のように、ポリスチレン製の５．６ミクロンのマイクロスフェアに対して特異的にカルボキシル化（−ＣＯＯＨ）された。すなわち、ビーズＮｏ（８８）に対して抗ＦＧＦＲ２、ビーズＮｏ（１６）に対して抗ＦＧＦＲ３、及びビーズＮｏ（７９）に対して抗ＦＧＦＲ４。これらの領域は、Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００／２００（商標）システムによって使用される１００個の固有に染色された可能な領域のうちの３個に対応している。ポリスチレンマイクロスフェアへの標的捕捉抗体の連結は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社より販売されるＢｉｏ−Ｐｌｅｘ（登録商標）Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇキット（カタログ番号：１７１−４０６００１）と同様の方法を用いた独自技術のコンジュゲートシステムを用いて行った。簡単に述べると、カルボキシル化されたポリスチレンマイクロスフェアに対する標的捕捉抗体の共有結合は、タンパク質の第一級アミノ基とポリスチレンマイクロスフェアの表面に結合したカルボキシル官能基が関与するカルボジイミド反応によって実現される。このような共有結合による付着は、洗浄後には未結合のタンパク質は残らず、長期間の保存後も永久的なものである。ｓＦＧＦＲ２及びｓＦＧＦＲ３に対する検出抗体は、製造者のプロトコールにしたがってスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ社，カタログ番号２１３２７）を用いてビオチン標識し、ｓＦＧＦＲ４に対する検出抗体は、予めビオチン標識がコンジュゲートされたものを購入した。
【００３９】
評価した別の試薬のセットは、試料の希釈、ブロッキング工程、及びインキュベーションに使用されるバッファーである。多重アッセイで用いられる一般的なバッファーは、ＰＢＳを主成分、又はＴｒｉｓを主成分とするものである。インキュベーション及び希釈において最も効果的に機能したバッファーは、１％  ＢＳＡを含むＰＢＳであり、非特異的なタンパク質ブロッキングにおいて最も効果的に機能したバッファーは、１％ウシγグロブリン及び免疫グロブリンＧを含むＰＢＳであった。
【００４０】
免疫測定の各試薬を調製した後、以下のプロトコールを用いて生体試料中のｓＦＧＦＲ２、ｓＦＧＦＲ３、及びｓＦＧＦＲ４を定量した。
・３種類のｓＦＧＦＲのすべてについて、希釈した捕捉抗体標識されたマイクロスフェア５μＬ（各被測定物質当たり各ウェル当たり１８００個のビーズ）を、免疫グロブリンＧを加えたＰＢＳに１％ウシγグロブリン（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社、カリフォルニア州サンタアナ、カタログ番号：８２０４１）を含むものからなるブロッカー５μＬと混合した。
・この混合物を９６ウェル平底マイクロタイタープレートに加えた。
・使用する試料を試験の直前に室温で解凍した。
・１０μＬのスタンダード、クオリティーコントロール、又は、保存剤（アジ化ナトリウム）を含む４％  ＢＳＡバッファーに１：５で希釈した血清をプレートに加え、各試料をピペットで混合し、プレートを室温で１時間、振盪せずにインキュベートした。
・１０μＬのビオチン標識検出抗体（３種類の被測定物質のすべてについて、保存剤を含む１％  ＢＳＡバッファーに、３μｇ／ｍＬの最終濃度にまで希釈したもの）を各ウェルに加え、よく混合し、室温で１時間インキュベートした。
・１００μｇ／ｍＬに希釈したストレプトアビジン−フィコエリトリン１０μＬを各ウェルに加え、よく混合し、室温で３０分間インキュベートした。
・フィルターメンブレンマイクロタイタープレートを、アジ化ナトリウムを含むＢＳＡ系洗浄バッファー１００μＬで予め濡らした後、真空マニホールド装置で吸引した。
・平底マイクロタイタープレート中の反応内容物をフィルタープレートのそれぞれのウェルに移した。すべてのウェルを真空吸引し、内容物を１００μＬの洗浄バッファーで２回洗った。
・最後の洗浄後、１００μＬの洗浄バッファーを各ウェルに加え、よく混合することによってマイクロスフェアを再懸濁した。
・次いで、独自技術の分析ソフトウェアを用いたＬｕｍｉｎｅｘ  １００／２００（商標）リーダーでプレートを分析した。各プレートについて、独自技術のソフトウェアを用いて各ｓＦＧＦＲの標準曲線を作成する。ｓＦＧＦＲ２及びｓＦＧＦＲ３の標準曲線では５変量ロジスティック回帰を用い、ｓＦＧＦＲ４の標準曲線では４変量ロジスティック回帰を用いる。
【００４１】
実施例３：多重免疫測定の統計的検証
アメリカ食品医薬品局の指針（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＤＥＲ），ａｎｄ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＣＶＭ）．Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ．Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ．Ｍａｙ  ２００１．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／Ｄｒｕｇｓ／ＧｕｉｄａｎｃｅＣｏｍｐｌｉａｎｃｅＲｅｇｕｌａｔｏｒｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／Ｇｕｉｄａｎｃｅｓ／ＵＣＭ０７０１０７．ｐｄｆ）に基づき、ｓＦＧＦＲ２、ｓＦＧＦＲ３、及びｓＦＧＦＲ４多重免疫測定の完全な検証を行う検証プログラムを開発した。このプログラムは、最良の試料マトリックス、アッセイ選択性、標準曲線により決定される直線性範囲、最小検出可能用量（ＬＤＤ）、定量下限（ＬＬＯＱ）、精度、絶対回収率、希釈直線性、マトリックス干渉、凍結／解凍安定性、室温安定性、及び基準範囲の評価を含むものである（図１）。
【００４２】
血漿及び血清試料の比較：アッセイにおけるｓＦＧＦＲ２、ｓＦＧＦＲ３、及びｓＦＧＦＲ４の含量を測定するために血液が用いられていることから、血漿又は血清間で比較を行って最良の生体マトリックスを同定した。図２、図３及び図４に示されるように、ｓＦＧＦＲ回収率は、血清をアッセイした場合に一貫してより高かった。したがって、更なる検証分析用の最終的なマトリックスとして血清を選択した。本発明に述べられる多重免疫測定法は他の生体試料（脳脊髄液、尿、リンパ液、唾液、汗、胸液、滑液、水性液、涙液、胆汁、膵臓分泌）にも適用できるが、最良のマトリックスの選択を同定するためには目的にかなった検証法も確立される必要がある。
【００４３】
アッセイ選択性：ｓＦＧＦＲ２、ｓＦＧＦＲ３、及びｓＦＧＦＲ４を同じ試料ウェル中で試験したことから、３種類の被測定物質間で顕著な交差反応性がないようにすることが重要であった。交差反応性を調べるため、ＦＧＦＲ２捕捉抗体を、シグナルについて最も高い濃度のｓＦＧＦＲ３及びｓＦＧＦＲ４に対して試験した。同様に他のすべての組合わせを評価したところ、ＦＧＦＲ４捕捉抗体と最も高い濃度のｓＦＧＦＲ２との間ではわずか１．６％の交差反応性が認められたのみであった（図５）。
【００４４】
標準曲線：Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社Ｄｕｏｓｅｔｓより販売される全ＦＧＦＲ２αスタンダード（部品番号：８４１６５０）、全ＦＧＦＲ３スタンダード（部品番号：８４１８７９）、及び全ＦＧＦＲ４スタンダード（部品番号：８４２７４２）（それぞれカタログ番号：ＤＹＣ６６５、ＤＹＣ７６６及びＤＹＣ６８５）を用いて標準曲線を作成した。各ｓＦＧＦＲの標準曲線を、魚血清／ＢＳＡバッファー中、最初に３種類のスタンダードの高スタンダードミックス（ＦＧＦＲ２で１００ｎｇ／ｍＬ、ＦＧＦＲ３で１５ｎｇ／ｍＬ、ＦＧＦＲ４で２５ｎｇ／ｍＬ）を生成することによって作成した。この高スタンダードを、８８μＬの標準希釈液とともに３７μＬの各スタンダードを加えることによって７回連続希釈した。ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、及びＦＧＦＲ４の標準曲線範囲は、それぞれ１００ｎｇ／ｍＬ〜０．０２０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ〜０．００３ｎｇ／ｍＬ、及び２５ｎｇ／ｍＬ〜０．００５ｎｇ／ｍＬであった。各被測定物質の標準曲線をすべてのプレートでランし、値の平均を求め、ＣＶ（％）を各ランにわたって計算した（図６、図７及び図８）。ｓＦＧＦＲ２、ｓＦＧＦＲ３、及びｓＦＧＦＲ４の平均ＣＶはそれぞれ８．３８％、６．３８％、５．１３％であり、曲線の変動が各プレート間で極めて僅かであることを示している。
【００４５】
最小検出可能用量：９９％の信頼度でブランクから区別することができる被測定物質の最低濃度は、最小検出可能用量（ＬＤＤ）として知られる。ＬＤＤは、標準曲線ブランクの２０個の反復測定からのシグナルを平均し、３つの標準偏差を平均のブランクシグナルに加えることによって計算した。
【００４６】
定量下限（ＬＬＯＱ）：定量下限（ＬＬＯＱ）は、正確に検出することができるスタンダードの最低濃度である。ＬＬＯＱの定義に当てはまるためには、スタンダードは直線性でかつ３０％のＣＶ内のアッセイの範囲内に収まり、マトリックス中でスパイクされる際に７５〜１２５％回収しなければならない。ＬＬＯＱは、低スタンダードの２倍希釈を３重で３回ランすることによって求めた。スタンダード５〜８は、２倍に希釈し、３回のランにわたって３重でアッセイした。ＣＶを計算し、濃度に対してプロットした。このプロットから内挿し、希釈係数をかけたＬＬＯＱを計算したところ、ｓＦＧＦＲ２、ｓＦＧＦＲ３、及びｓＦＧＦＲ４についてそれぞれ、０．５３ｎｇ／ｍＬ、０．０８４ｎｇ／ｍＬ、及び０．１５ｎｇ／ｍＬであった。上記に述べたように、被測定物質はＬＬＯＱの濃度において７５〜１２５％の範囲内で回収することが重要である。しかしながら、各試料は、０．８２ｎｇ／ｍＬ以下の濃度ではｓＦＧＦＲ２についてうまく回収されなかった。血清における０．８２ｎｇ／ｍＬでの平均回収率（Ｎ＝３）を求めたところ、８５．６７％であった。ＦＧＦＲ３試料は、０．８２ｎｇ／ｍＬ以下の濃度ではうまく回収されず、ｓＦＧＦＲ３でスパイクした血清試料の平均回収率（Ｎ＝３）は１０３．３％であった。ＦＧＦＲ４試料は、０．１７ｎｇ／ｍＬ以下の濃度ではうまく回収されず、ｓＦＧＦＲ３でスパイクした血清試料の平均回収率（Ｎ＝３）は１０１．３％であった。最後に、ｓＦＧＦＲ２、ｓＦＧＦＲ３、及びｓＦＧＦＲ４について求めたＬＬＯＱは、それぞれ、０．８２ｎｇ／ｍＬ、０．１５ｎｇ／ｍＬ、０．１７ｎｇ／ｍＬであった（表２）。
【００４７】
【表３】
0006488236.tif 000004
【００４８】
精度：１回のラン内（アッセイ内ＣＶ）で、また、最低でも５回のランにわたって３つのコントロールの濃度を２重で測定することによって一連のランにわたった（アッセイ間ＣＶ）アッセイの精度を求めた。ｓＦＧＦＲ２の各コントロールの平均値は、１．３、９．３、及び３５ｎｇ／ｍＬであり、アッセイ間ＣＶは８〜１３％の範囲であり、アッセイ内ＣＶは１〜１１％の範囲であった（図９）。ｓＦＧＦＲ３の各コントロールの平均値は、０．１１７、２．８、及び１４ｎｇ／ｍＬであり、アッセイ間ＣＶは８〜１３％の範囲であり、アッセイ内ＣＶは０〜１６％の範囲であった（図１０）。ｓＦＧＦＲ４の各コントロールの平均値は、０．０９５、４．１、及び２３ｎｇ／ｍＬであり、アッセイ間ＣＶは３〜３３％の範囲であり、アッセイ内ＣＶは１〜２１％の範囲であった（図１１）。ｓＦＧＦＲ４の上側範囲は３０％よりもわずかに高いが、これは２１％の高いＣＶを有する１回の不良ランの結果である。高いＣＶの理由は、その試料の平均濃度が０．０９５ｎｇ／ｍＬであり、これはｓＦＧＦＲ４のＬＬＯＱよりも大幅に低いためである。
【００４９】
絶対回収率：各ｓＦＧＦＲの回収率（％）を求めるため、血清をスタンダードの４つの濃度でｓＦＧＦＲ２、ｓＦＧＦＲ３、及びｓＦＧＦＲ４によりスパイクし、３重で分析した。スパイクした濃度からベースライン値を引き、その結果をスパイク濃度で割り、１００を掛けることによって回収率（％）を計算した。ｓＦＧＦＲ２の平均回収率は７６〜１２６％の範囲であり（Ｎ＝３）、ｓＦＧＦＲ３では８９〜１４３％の範囲であり（Ｎ＝３）、ｓＦＧＦＲ４では８１〜１４５％の範囲である（Ｎ＝３）ことが観察された（図２、図３、図４及び図１２）。
【００５０】
希釈直線性：被測定物質のそれぞれで、アッセイの上側範囲よりも高く読み取られる試料が存在する場合がある。正確な値を得るためには、試料がアッセイバッファー中に直線的に希釈され、７０〜１３０％の範囲内の回収率を有することが重要である。試料を、アッセイバッファー中に最初の試料の１：５から開始して、１：１０、１：２０、及び１：４０の最終濃度にまで２倍に希釈した。希釈直線性試験は未希釈の正常血清及び血漿試料で行ったが、これらの試料について計算されたｓＦＧＦＲ濃度は、アッセイのＬＬＯＱを下回っていた。プールした正常ヒト血清を組換えｓＦＧＦＲで最初にスパイクしてから、１：１０、１：２０、及び１：４０の最終濃度に希釈した。スパイクした血漿試料は１：４０にまで支障なく希釈することができ、平均回収率（％）はｓＦＧＦＲ２で１０９％、ｓＦＧＦＲ３で１０９％、及びｓＦＧＦＲ４で９６％であった（図１３、図１４、及び図１５）。
【００５１】
マトリックス干渉：マトリックス干渉は、ヘモグロビン、ビリルビン、又はトリグリセリドなどの試料中にみられる共通成分が多重アッセイに誤差を導入するか否かを測定するものである。マトリックス干渉は、コントロール試料に、ヘモグロビン（５００ｍｇ／ｄＬ以下）、ビリルビン（２０ｍｇ／ｄＬ以下）、及びトリグリセリド（５００ｍｇ／ｄＬ以下）をスパイクし、スパイクしていない試料に対してスパイクした試料で観察される回収率（％）を求めることによって評価した。ヘモグロビン（５００ｍｇ／ｄＬ以下）、ビリルビン（２０ｍｇ／ｄＬ以下）、及びトリグリセリド（５００ｍｇ／ｄＬ以下）をスパイクした後の回収率（％）は、ｓＦＧＦＲ２でそれぞれ、８９％、９１％、及び１１７％、ｓＦＧＦＲ３で８８％、９０％、及び１０７％、ｓＦＧＦＲ４で８５％、８９％、及び１１７％であった。
【００５２】
安定性：分析の間、試料には数回の凍結解凍サイクルが行われる場合があるため、数ラウンドの凍結解凍を行った後の被測定物質の安定性を評価すること、また、４℃での安定性を決定することが重要である。血清試料を最大で３サイクルの凍結解凍サイクルにわたってアッセイすることによって凍結解凍安定性を判定し、各試料の回収率（％）を求めた。更に、血清試料の安定性をそれぞれ室温及び４℃で２４時間インキュベートすることによっても試験した。インキュベートした試料をインキュベートしない試料とともに試験して回収率（％）を求めた。
【００５３】
簡単に述べると、血清（Ｎ＝３）を組換えスタンダードでスパイクし、それぞれについてベースライン濃度を測定した。試料に３サイクルの凍結解凍サイクルを行ってベースライン試料と比較することによって回収率（％）を計算した。３サイクルの凍結乾燥サイクルにわたった血清（Ｎ＝３）における平均回収率は、ｓＦＧＦＲ２で９０．１１％、ＦＧＦＲ３で８４．１１％、ＦＧＦＲ４では８９．００％であった。試料（Ｎ＝３）は、４℃では２、４、及び２４時間の時点において、室温では４及び２４時間の時点において、抗原安定性についても評価を行った。室温及び４℃における２４時間以内の血清（Ｎ＝３）での平均回収率（％）は、ｓＦＧＦＲ２、ｓＦＧＦＲ３、及びｓＦＧＦＲ４について８３．９３％、８３．３３％、及び８９．８７％であった。
【００５４】
実施例４：アッセイの応用
がん試料中のｓＦＧＦＲを検出するアッセイの能力を評価した。図１６は、アッセイにおける最良のｓＦＧＦＲシグナルは、がん血清の分析用の試料バッファーが４％  ＢＳＡを含み、ブロッキングバッファーが洗剤であるＮＰ−４０を含んでいる場合に得られた。最良のバッファーの選択後、５個の前立腺がん試料、及び１０個の肺がん試料からなる１５個の異なるがん試料を調べた（図１７）。これら１５個の試料のうち、ｓＦＧＦＲ２が、４個の試料においてのみ、０．００７〜０．４１ｎｇ／ｍＬの範囲の測定可能な量で検出することができた。興味深い点として、ｓＦＧＦＲ３が、０．０１５〜１．２ｎｇ／ｍＬの範囲の測定値で１５検体の試料すべてで測定することができた。更に、ｓＦＧＦＲ４はすべての試料中に存在し、０．０７〜４．４ｎｇ／ｍＬの範囲の最も高い濃度であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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