(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を増幅して増幅が起こるにつれてアンプリコン合成を監視するローカル機器を使用して行われる、定量分析のための調整された較正曲線を確立する方法であって、
（ａ）前記定量分析に特有の較正曲線上の固定点の一対の座標を取得するステップであって、
前記一対の座標は、被分析ポリヌクレオチドの量、および正規化増幅兆候値を特定する、ステップと、
（ｂ）固定量の内部較正物質と、既知量の前記被分析ポリヌクレオチドとを備える、調整較正物質を取得するステップと、
（ｃ）前記ローカル機器を使用して、前記調整較正物質の前記被分析ポリヌクレオチドおよび前記内部較正物質を同時増幅するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で同時増幅した前記被分析ポリヌクレオチドおよび前記内部較正物質のそれぞれの増幅兆候値を判定するステップと、
（ｅ）前記被分析ポリヌクレオチドについて判定された前記増幅兆候値を、前記内部較正物質について判定された前記増幅兆候値に正規化するステップと、
（ｆ）第１の点および第２の点を備える、較正プロットを作成することによって、前記調整された較正曲線を確立するステップであって、
前記第１の点は、前記調整較正物質の前記被分析ポリヌクレオチドの前記既知量と、ステップ（ｄ）で判定された前記被分析ポリヌクレオチドの前記正規化増幅兆候値とを特定する一対の座標を備え、
前記第２の点は、前記固定点についてステップ（ａ）で取得された前記一対の座標を備える、ステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）で取得された前記一対の座標によって特定される、前記被分析ポリヌクレオチドの量は、前記ローカル機器以外の第１のリアルタイム増幅および監視機器を使用して判定され、前記ローカル機器を用いて行われる任意の増幅反応からの結果を使用して判定されない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のリアルタイム機器を用いて、複数の較正標準のそれぞれに含有される前記被分析ポリヌクレオチドおよび前記内部較正物質を同時増幅するステップをさらに含み、
前記複数の較正標準のそれぞれは、前記調整較正物質の前記被分析ポリヌクレオチドの異なる開始濃度を備え、
前記複数の較正標準のそれぞれの中および前記調整較正物質の中の前記内部較正物質の濃度は、実質的に同一である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ａ）の前記較正曲線、およびステップ（ｆ）で確立された前記調整された較正曲線は、両方とも一次方程式によって表される線形較正曲線である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）は、集合的に、前記調整較正物質と、前記固定点の前記一対の座標の有形実施形態とを備える、キットを取得するステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記有形実施形態は、機械可読バーコードを備える、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）の前に、核酸を増幅して増幅が起こるにつれてアンプリコン合成を監視する、前記ローカル機器以外の複数の機器を使用して取得される、結果の集合に方程式を適合することによって、前記定量分析に特有の前記較正曲線を作成するステップがあり、
前記結果の集合は、前記ローカル機器を使用して取得される結果を備えない、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｆ）は、前記ローカル機器と通信しているプロセッサを用いて、前記第１の点および前記第２の点を備える前記較正プロットを作成することによって、前記調整された較正曲線を確立するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ローカル機器と通信している前記プロセッサは、前記ローカル機器の一体構成要素である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ａ）で取得された前記一対の座標は、前記較正曲線の前記正規化増幅兆候値が０であるときに、前記被分析ポリヌクレオチドの量を特定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ａ）で取得された前記一対の座標は、前記較正曲線の前記正規化増幅兆候値が０であるときに、前記被分析ポリヌクレオチドの量を特定する、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ａ）で取得された前記一対の座標は、前記較正曲線の前記正規化増幅兆候値が０であるときに、前記被分析ポリヌクレオチドの量を特定する、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
取得するステップ（ｂ）は、前記固定量の前記内部較正物質および前記既知量の前記被分析ポリヌクレオチドを組み合わせるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
試験サンプル中に存在し得る被分析ポリヌクレオチドおよび固定量の内部較正物質の同時増幅を含む核酸増幅分析を使用して、前記被分析ポリヌクレオチドを定量化するためのコンピュータプログラムが記憶されたコンピュータ読み取り可能な記憶媒体であって、前記コンピュータプログラムは、ソフトウェア命令の有形実施形態を備え、前記コンピュータプログラムは、メモリおよびローカル機器と通信するプロセッサ上で実行されるように構成され、前記ローカル機器は、核酸を増幅して時間の関数としてアンプリコン合成を監視し、前記コンピュータプログラムが前記プロセッサ上で実行されると、前記コンピュータプログラムは、
（ａ）前記被分析ポリヌクレオチドを定量化するために使用される前記核酸増幅分析に特有の較正曲線上の固定点の一対の座標を受信するステップであって、
前記一対の座標は、前記被分析ポリヌクレオチドの量、および正規化増幅兆候値を特定する、ステップと、
（ｂ）前記ローカル機器を用いて行われる第１の増幅反応で同時増幅した、調整較正物質に含有される前記固定量の前記内部較正物質の増幅兆候値に正規化される、既知量の前記被分析ポリヌクレオチドの増幅兆候の値を取得するステップと、
（ｃ）第１の点および第２の点を備える、調整された較正曲線を作成するステップであって、
前記第１の点は、前記調整較正物質の前記被分析ポリヌクレオチドの前記既知量と、ステップ（ｂ）で取得された前記値とを特定する一対の座標を備え、
前記第２の点は、前記固定点についてステップ（ａ）で受信された前記一対の座標を備える、ステップと、
（ｄ）前記ローカル機器を用いて行われる第２の増幅反応でそれと同時増幅した、前記固定量の前記内部較正物質の増幅兆候値に正規化される、前記試験サンプル中の未知量の前記被分析ポリヌクレオチドの増幅兆候の値を取得するステップと、
（ｅ）前記試験サンプル中に存在する前記未知量の前記被分析ポリヌクレオチドの定量的結果を生じるように、ステップ（ｄ）で取得された前記値を、前記調整された較正曲線と比較するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）からの前記定量的結果の有形記録を出力するステップと、
を前記プロセッサに行わせる、コンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
【請求項１５】
ステップ（ａ）で受信された前記一対の座標は、前記較正曲線が０の正規化増幅兆候値に投影されるときに、前記被分析ポリヌクレオチドの前記量を特定する、請求項１４に記載のコンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
【請求項１６】
前記ソフトウェア命令の有形実施形態は、光学ディスク、磁気記憶媒体、フラッシュドライブ、コンピュータハードドライブ、および少なくとも１つのコンピュータによってアクセス可能なネットワークドライブから成る群から選択される媒体上に記憶されるソフトウェア命令を備える、請求項１４に記載のコンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
【請求項１７】
ステップ（ｂ）およびステップ（ｄ）はそれぞれ、数学的に計算することによって取得するステップを含む、請求項１４に記載のコンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
【請求項１８】
ステップ（ｂ）および（ｄ）は、それぞれの値の数値入力を受信することによって取得するステップを含む、請求項１４に記載のコンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
【請求項１９】
ステップ（ｃ）で作成された、前記調整された較正曲線は、一次方程式によって定義される、請求項１４に記載のコンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
【請求項２０】
ステップ（ｅ）の前記有形記録は、紙に印刷される、請求項１４に記載のコンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
【請求項２１】
前記核酸増幅分析は、等温核酸増幅分析である、請求項１４に記載のコンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
【請求項２２】
試験サンプル中の標的核酸配列の開始量を判定するための装置であって、
（ａ）少なくとも１つの検出機構であって、
（ｉ）前記標的核酸配列および第１の核酸増幅反応で増幅されている第１の内部較正物質のそれぞれの数量を示す信号であって、
前記第１の内部較正物質は、前記標的核酸配列とは異なる第２の核酸配列を備える、信号と、
（ｉｉ）既知量の被分析ポリヌクレオチドおよび第２の核酸増幅反応で増幅されている第２の内部較正物質のそれぞれの数量を示す信号であって、
前記被分析ポリヌクレオチドおよび前記第２の内部較正物質は、両方とも調整較正物質の構成要素であり、
前記第２の内部較正物質は、前記第２の核酸配列を備え、
前記第２の核酸配列の開始量は、前記第１および第２の核酸増幅反応において実質的に等しい、信号と、
を測定する、検出機構と、
（ｂ）前記検出機構と通信している、少なくとも１つのプロセッサであって、
前記プロセッサは、被分析ポリヌクレオチドの量および正規化増幅兆候値を特定する、固定点の一対の座標でプログラムされ、
前記プロセッサはさらに、
（ｉ）前記測定された信号から、前記既知量の前記被分析ポリヌクレオチド、前記第１および第２の内部較正物質のそれぞれ、および前記標的核酸配列の増幅兆候値のそれぞれの値を判定するステップと、
（ｉｉ）前記標的核酸配列について判定された前記増幅兆候値を、前記第１の内部較正物質について判定された前記増幅兆候値に正規化するステップと、
（ｉｉｉ）前記既知量の前記被分析ポリヌクレオチドについて判定された前記増幅兆候値を、前記第２の内部較正物質について判定された前記増幅兆候値に正規化するステップと、
（ｉｖ）前記固定点、前記既知量の前記被分析ポリヌクレオチド、および前記既知量の前記被分析ポリヌクレオチドの前記正規化増幅兆候値から、較正曲線を確立するステップと、
（ｖ）前記較正曲線および前記標的核酸配列の前記正規化増幅兆候値を使用して、前記試験サンプル中の前記標的核酸配列の開始量を判定するステップと、
を行うようにプログラムされる、プロセッサと、
を備える、装置。
【請求項２３】
前記固定点の前記一対の座標は、前記第１および第２の核酸増幅反応を行った前記装置以外の装置のみを使用して行われる、複数の核酸増幅反応からの結果を使用して判定される、請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
前記一対の座標のうちの１つの要素は、０の正規化増幅兆候値を特定する、請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
前記第１および第２の核酸増幅反応が行われる、温度制御されたインキュベータをさらに備える、請求項２３に記載の装置。
【請求項２６】
前記温度制御されたインキュベータは、実質的に一定の温度を維持し、前記第１および第２の核酸増幅反応は、等温核酸増幅反応である、請求項２５に記載の装置。
【請求項２７】
ステップ（ｉｖ）での前記較正曲線は、一次方程式によって定義される、請求項２３に記載の装置。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの検出機構は、蛍光信号を測定する蛍光光度計を備える、請求項２３に記載の装置。
【請求項２９】
核酸を増幅して増幅が起こるにつれてアンプリコン合成を監視するローカル機器を使用して行われる、定量分析のための調整された較正曲線を確立する方法であって、
（ａ）前記定量分析に特有の較正曲線上の固定点の一対の座標を取得するステップであって、
前記一対の座標は、被分析ポリヌクレオチドの量、および増幅兆候値を特定する、ステップと、
（ｂ）既知量の前記被分析ポリヌクレオチドを備える、被分析ポリヌクレオチド標準を取得するステップと、
（ｃ）前記ローカル機器を使用して、核酸増幅反応で前記被分析ポリヌクレオチド標準の前記被分析ポリヌクレオチドを増幅するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で増幅した前記被分析ポリヌクレオチドの増幅兆候値を判定するステップと、
（ｅ）第１の点および第２の点を備える、較正プロットを作成することによって、前記調整された較正曲線を確立するステップであって、
前記第１の点は、前記被分析ポリヌクレオチド標準の前記被分析ポリヌクレオチドの前記既知量と、ステップ（ｄ）で判定された増幅兆候値とを特定する一対の座標を備え、
前記第２の点は、前記固定点についてステップ（ａ）で取得された前記一対の座標を備える、ステップと、
を含む、方法。
【請求項３０】
ステップ（ａ）の前に、核酸を増幅して増幅が起こるにつれてアンプリコン合成を監視する、前記ローカル機器以外の複数の機器を使用して取得される、結果の集合に方程式を適合することによって、前記定量分析に特有の前記較正曲線を作成するステップがあり、
前記結果の集合は、前記ローカル機器を使用して取得される結果を備えない、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（ｅ）は、前記較正プロットを作成するために、前記ローカル機器と通信しているプロセッサを使用するステップを含む、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、２０１３年３月１５日に出願された、米国仮出願第６１／７９２，４０９号の利益を主張するものであり、該仮出願の全体の内容は、参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
本開示は、バイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本開示は、リアルタイム増幅手順からの結果を使用して、ポリヌクレオチドを定量化するための較正方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
生体外核酸増幅の動態分析を伴う方法は、現在、被分析核酸を定量化するために日常的に使用されている。「リアルタイム」増幅手順と称されることもある、これらの手順では、核酸増幅反応混合物中に存在するアンプリコンの量は、増幅手順の経過にわたる時間の関数として監視される。完全自動リアルタイム核酸分析は、反応中に収集される時間依存性データを分析することが可能な機械実行可能アルゴリズムを必要とする。この点に関して、観察された増幅結果を生じるであろう、核酸の量または濃度を正確に出力するデータ処理アルゴリズムの要求がある。
【０００４】
絶対量の特定の核酸標的を定量化することと関連付けられる困難点が、特許文献で理解されている。これらの困難は、増幅プロセスの指数関数性質、ならびにプライマー対の長さおよびヌクレオチド配列を含む、反応速度を制御する変数のうちのいずれかのわずかな差が、アンプリコン収率の劇的な差につながり得るという事実に起因している。Ｗａｎｇらは、米国特許第５，２１９，７２７号で、被分析ポリヌクレオチドを増幅した同一のプライマーを使用して増幅した、内部標準の使用を説明し、標準としての無関係のｃＤＮＡの使用が、定量化されている特定の標的核酸とは無関係のオリゴヌクレオチドプライマーの第２のセットを必要としたという事実に対処した。Ｗａｎｇらによると、無関係のプライマーの２つのセットを使用する分析は、標的核酸濃度の絶対尺度よりむしろ、２つの独立増幅反応の相対比較を提供することしかできない。他の者は、この教示に従い、類似配列を有することによって、および一般的な一対のプライマーを用いて増幅することによって、目的とする標的に類似する内部標準を採用している（例えば、公開された米国特許出願第１０／２３０，４８９号を参照）。さらに他の者は、増幅の効率を判定することに依拠する定量的方法を説明している（例えば、公開された欧州特許出願第ＥＰ１１３８７８４号を参照）。対照および標的配列の増幅比の判定を伴う方法も説明されている（米国特許第６，０６６，４５８号参照）。
【０００５】
リアルタイム核酸増幅結果の内部較正調整を行うための最も一般的な方法は、「同時」較正調整、および「記憶された」較正曲線の調整を含む。米国特許第６，７１３，２９７号でＭｃＭｉｌｌａｎらによって例証される、これらのうちの第１の方法では、較正プロットが作成される度に、複製において被分析核酸と並行して従来的に増幅される、２つ以上の較正標準を必要とする。残念ながら、この要求は、機器が再較正される度に、概してキット形態で購入され、高価であり得る、限定された試薬を消費する。米国特許第７，９３０，１０６号でＣａｒｒｉｃｋによって例証される、第２の方法は、機器が再較正される度に複数の較正物質を実行する必要性を有利に回避するが、（例えば、キット製造業者またはエンドユーザのいずれかによって）ある時点で完全較正プロットの作成を依然として必要とする。この技法の体験は、定量化されている標的が、高いまたは非常に高いレベルで存在するときに、単一の較正標準を使用して、定量的結果を再現する良好な能力を示している。例えば、過去のデータによる検証試験は、１０７個の標的コピーを有する単一の調整較正物質を使用する、記憶された曲線の調整が、１０４〜１０８個の標的コピーの範囲内でほぼ同一に、完全ローカル曲線を有利に再現したことを確認した。この場合、調整された曲線は、１０２個の標的コピーの入力量で、わずか０．６のログコピーだけローカル曲線から逸脱した。対照的に、１０２個の標的コピーを有する単一の調整較正物質を使用することにより、１０３個の標的コピーの入力標的レベルで０．４のログコピーだけ逸脱し、かつ１０６個の標的コピーの入力標的レベルで１．６のログコピーだけ逸脱する、調整された曲線をもたらした。したがって、高い標的量を有する較正標準を使用して、記憶された曲線を調整することに、明確な利益があった。
【０００６】
これらの有用なアプローチを考慮しても、内部較正調整を簡略化された様式で実行することができる、生体外増幅技法を使用して核酸の高度に正確な定量化を可能にする、自動化解決策の必要性が残っている。また、測定される標的量または濃度の全動的範囲にわたって正確な定量化を達成するために、低濃度の被分析ポリヌクレオチド標準を備える、単一の較正標準を使用できることが望ましいであろう。本開示は、これらの問題に対処する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，２１９，７２７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，０６６，４５８号明細書
【特許文献３】米国特許第６，７１３，２９７号明細書
【特許文献４】米国特許第７，９３０，１０６号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示の第１の側面は、増幅が起こるにつれて、核酸を増幅してアンプリコン合成を監視する、ローカル機器を使用して行われる、定量分析のための調整された較正曲線を確立する方法を考慮する。本方法は、（ａ）定量分析に特有の較正曲線上の固定点の一対の座標を取得するステップを含み、一対の座標は、被分析ポリヌクレオチドの量、および正規化増幅兆候値を特定する。また、固定量の内部較正物質と、既知量の被分析ポリヌクレオチドとを備える、調整較正物質を取得するステップ（ｂ）もある。また、ローカル機器を使用して、調整較正物質の被分析ポリヌクレオチドおよび内部較正物質を同時増幅するステップ（ｃ）もある。また、ステップ（ｃ）で同時増幅した被分析ポリヌクレオチドおよび内部較正物質のそれぞれの増幅兆候を判定するステップ（ｄ）もある。また、被分析ポリヌクレオチドについて判定された増幅兆候を、内部較正物質について判定された増幅兆候に正規化するステップ（ｅ）もある。また、第１の点および第２の点を含む、較正プロットを作成することによって、調整された較正曲線を確立するステップ（ｆ）もあり、第１の点は、調整較正物質の既知量の被分析ポリヌクレオチドの座標と、ステップ（ｄ）で判定された被分析ポリヌクレオチドの正規化増幅兆候とを含み、第２の点は、固定点についてステップ（ａ）で取得された一対の座標を含む。好ましい実施形態では、ステップ（ａ）で取得された一対の座標によって特定される、被分析ポリヌクレオチドの量は、ローカル機器以外の第１のリアルタイム増幅および監視機器を使用して判定され、ローカル機器を用いて行われる任意の増幅反応からの結果を使用して判定されない。より好ましくは、本方法はさらに、第１のリアルタイム機器を用いて、複数の較正標準のそれぞれに含有される被分析ポリヌクレオチドおよび内部較正物質を同時増幅するステップを含み、複数の較正標準のそれぞれは、調整較正物質の被分析ポリヌクレオチドの異なる開始濃度を含み、複数の較正標準のそれぞれの中および調整較正物質の中の内部較正物質の濃度は、実質的に同一である。代替として、ステップ（ａ）の較正曲線、およびステップ（ｆ）で確立された調整された較正曲線は、両方とも一次方程式によって表される線形較正曲線であってもよい。異なる好ましい実施形態によると、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）は、集合的に、調整較正物質と、固定点の一対の座標の有形実施形態とを含む、キットを取得する（例えば、購入する）ステップを伴う。この場合、有形実施形態は、機械可読バーコードを含んでもよい。さらに別の好ましい実施形態によると、ステップ（ａ）の前に、増幅が起こるにつれて、核酸を増幅してアンプリコン合成を監視する、ローカル機器以外の複数の機器を使用して取得される、結果の集合に方程式を適合することによって、定量分析に特有の較正曲線を作成するステップがあり、結果の集合は、ローカル機器を使用して取得される結果を含まない。さらに別の好ましい実施形態によると、ステップ（ｆ）は、ローカル機器と通信しているプロセッサを用いて、第１の点および第２の点を備える較正プロットを作成することによって、調整された較正曲線を確立するステップを伴う。例えば、ローカル機器と通信しているプロセッサは、ローカル機器の一体構成要素であってもよい。さらに別の好ましい実施形態によると、ステップ（ａ）で取得された一対の座標は、較正曲線の正規化増幅兆候値が０であるときに、被分析ポリヌクレオチドの量を特定する。ステップ（ａ）で取得された一対の座標によって特定される、被分析ポリヌクレオチドの量が、ローカル機器以外の第１のリアルタイム増幅および監視機器を使用して判定され、ローカル機器を用いて行われる任意の増幅反応からの結果を使用して判定されない、ある実施形態によると、ステップ（ａ）で取得された一対の座標は、較正曲線の正規化増幅兆候値が０であるときに、被分析ポリヌクレオチドの量を特定する。ステップ（ａ）の前に、増幅が起こるにつれて、核酸を増幅してアンプリコン合成を監視する、ローカル機器以外の複数の機器を使用して取得される、結果の集合に方程式を適合することによって、定量分析に特有の較正曲線を作成するステップがあり、結果の集合が、ローカル機器を使用して取得される結果を含まない、異なる好ましい実施形態によると、ステップ（ａ）で取得された一対の座標は、較正曲線の正規化増幅兆候値が０であるときに、被分析ポリヌクレオチドの量を特定する。
【０００９】
本開示の別の側面は、時間の関数として核酸を増幅してアンプリコン合成を監視する、ローカル機器を用いた、試験サンプル中に存在し得る被分析ポリヌクレオチドおよび固定量の内部較正物質の同時増幅を含む、核酸増幅分析を使用して、被分析ポリヌクレオチドを定量化するためのコンピュータプログラム製品を考慮する。コンピュータプログラム製品は、一連のステップを行うためのソフトウェア命令の有形実施形態を含む。これらのステップは、被分析ポリヌクレオチドを定量化するために使用される核酸増幅分析に特有の較正曲線上の固定点の対の座標を受信するステップ（ａ）を含み、一対の座標は、被分析ポリヌクレオチドの量、および正規化増幅兆候値を特定する。また、ローカル機器を用いて行われる第１の増幅反応で同時増幅した、調整較正物質に含有される固定量の内部較正物質の増幅兆候に正規化される、既知量の被分析ポリヌクレオチドの増幅兆候の値を取得するステップ（ｂ）もある。また、第１の点および第２の点を含む、調整された較正曲線を作成するステップ（ｃ）もあり、第１の点は、調整較正物質の既知量の被分析ポリヌクレオチドの座標と、ステップ（ｂ）で取得された値とを含み、第２の点は、固定点についてステップ（ａ）で受信された一対の座標を含む。また、ローカル機器を用いて行われる第２の増幅反応でそれと同時増幅した、固定量の内部較正物質の増幅兆候に正規化される、試験サンプル中の未知量の被分析ポリヌクレオチドの増幅兆候の値を取得するステップ（ｄ）もある。また、試験サンプル中に存在する未知量の被分析ポリヌクレオチドの定量的結果を生じるように、ステップ（ｄ）で取得された値を、調整された較正曲線と比較するステップ（ｅ）もある。また、ステップ（ｅ）からの定量的結果の有形記録を出力するステップ（ｆ）もある。好ましい実施形態では、ステップ（ａ）で受信された一対の座標は、較正曲線が０の正規化増幅兆候値に投影されるときに、被分析ポリヌクレオチドの量を特定する。異なる実施形態では、ソフトウェア命令の有形実施形態は、光学ディスク、磁気記憶媒体、フラッシュドライブ、コンピュータハードドライブ、および少なくとも１つのコンピュータによってアクセス可能なネットワークドライブから成る群から選択される、媒体上に記憶されるソフトウェア命令を含む。異なる実施形態では、ステップ（ｂ）およびステップ（ｄ）はそれぞれ、数学的に計算することによって取得するステップを伴う。異なる実施形態では、ステップ（ｂ）および（ｄ）は、それぞれの値の数値入力を受信することによって取得するステップを伴う。異なる実施形態では、ステップ（ｃ）で作成された、調整された較正曲線は、一次方程式によって定義される。異なる実施形態では、ステップ（ｅ）の有形記録は、紙に印刷される。異なる実施形態では、核酸増幅分析は、等温核酸増幅分析である。
【００１０】
本開示の別の側面は、試験サンプル中の標的核酸配列の開始量を判定するための装置に関する。本装置は、（ｉ）標的核酸配列および第１の核酸増幅反応で増幅されている第１の内部較正物質のそれぞれの数量を示す、信号であって、第１の内部較正物質は、標的核酸配列とは異なる第２の核酸配列を含む、信号と、（ｉｉ）既知量の被分析ポリヌクレオチドおよび第２の核酸増幅反応で増幅されている第２の内部較正物質のそれぞれの数量を示す、信号であって、被分析ポリヌクレオチドおよび第２の内部較正物質は、両方とも調整較正物質の構成要素であり、第２の内部較正物質は、第２の核酸配列を含み、第２の核酸配列の開始量は、第１および第２の核酸増幅反応において実質的に等しい、信号とを測定する、（ａ）少なくとも１つの検出機構を含む。発明された装置はさらに、（ｂ）検出機構と通信している、少なくとも１つのプロセッサを含み、プロセッサは、被分析ポリヌクレオチドの量および正規化増幅兆候値を特定する、固定点の一対の座標でプログラムされ、プロセッサはさらに、（ｉ）測定された信号から、それぞれ第１および第２の内部較正物質の既知量の被分析ポリヌクレオチド、および標的核酸配列の増幅兆候のそれぞれの値を判定するステップと、（ｉｉ）標的核酸配列について判定された増幅兆候値を、第１の内部較正物質について判定された増幅兆候値に正規化するステップと、（ｉｉｉ）既知量の被分析ポリヌクレオチドについて判定された増幅兆候値を、第２の内部較正物質について判定された増幅兆候値に正規化するステップと、（ｉｖ）固定点、既知量の被分析ポリヌクレオチド、および既知量の被分析ポリヌクレオチドの正規化増幅兆候から、較正曲線を確立するステップと、（ｖ）較正曲線および標的核酸配列の正規化増幅兆候を使用して、試験サンプル中の標的核酸配列の開始量を判定するステップとを行うようにプログラムされる。好ましい実施形態では、固定点の一対の座標は、第１および第２の核酸増幅反応を行った装置以外の装置のみを使用して行われる、複数の核酸増幅反応からの結果を使用して判定される。より好ましくは、一対の座標のうちの１つの要素は、０の正規化増幅兆候値を特定する。代替として、本装置はさらに、第１および第２の核酸増幅反応が行われる、温度制御されたインキュベータを含んでもよい。特定の場合において、温度制御されたインキュベータは、実質的に一定の温度を維持し、第１および第２の核酸増幅反応は、等温核酸増幅反応である。異なる好ましい実施形態によると、ステップ（ｉｖ）での較正曲線は、一次方程式によって定義される。さらに異なる好ましい実施形態によると、少なくとも１つの検出機構は、蛍光信号を測定する蛍光光度計を含む。
【００１１】
本開示の別の側面は、増幅が起こるにつれて、核酸を増幅してアンプリコン合成を監視する、ローカル機器を使用して行われる、定量分析のための調整された較正曲線を確立する方法に関する。発明された方法は、定量分析に特有の較正曲線上の固定点の一対の座標を取得するステップ（ａ）を含み、一対の座標は、被分析ポリヌクレオチドの量、および増幅兆候値を特定する。また、既知量の被分析ポリヌクレオチドを含む、被分析ポリヌクレオチド標準を取得するステップ（ｂ）もある。また、ローカル機器を使用して、核酸増幅反応で被分析ポリヌクレオチド標準の被分析ポリヌクレオチドを増幅するステップ（ｃ）もある。また、ステップ（ｃ）で増幅した被分析ポリヌクレオチドの増幅兆候を判定するステップ（ｄ）もある。また、第１の点および第２の点を含み、較正プロットを作成することによって、調整された較正曲線を確立するステップ（ｅ）もあり、第１の点は、被分析ポリヌクレオチド標準の既知量の被分析ポリヌクレオチドの座標と、ステップ（ｄ）で判定された増幅兆候とを含み、第２の点は、固定点についてステップ（ａ）で取得された一対の座標を含む。好ましい実施形態では、ステップ（ａ）の前に、増幅が起こるにつれて、核酸を増幅してアンプリコン合成を監視する、ローカル機器以外の複数の機器を使用して取得される、結果の集合に方程式を適合することによって、定量分析に特有の較正曲線を作成するステップがあり、結果の集合は、ローカル機器を使用して取得される結果を含まない。異なる好ましい実施形態によると、ステップ（ｅ）は、較正プロットを作成するために、ローカル機器と通信しているプロセッサを使用するステップを含む。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
増幅が起こるにつれて、核酸を増幅してアンプリコン合成を監視する、ローカル機器を使用して行われる、定量分析のための調整された較正曲線を確立する方法であって、
（ａ）前記定量分析に特有の較正曲線上の固定点の一対の座標を取得するステップであって、
前記一対の座標は、被分析ポリヌクレオチドの量、および正規化増幅兆候値を特定する、ステップと、
（ｂ）固定量の内部較正物質と、既知量の前記被分析ポリヌクレオチドとを備える、調整較正物質を取得するステップと、
（ｃ）前記ローカル機器を使用して、前記調整較正物質の前記被分析ポリヌクレオチドおよび前記内部較正物質を同時増幅するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で同時増幅した前記被分析ポリヌクレオチドおよび前記内部較正物質のそれぞれの増幅兆候を判定するステップと、
（ｅ）前記被分析ポリヌクレオチドについて判定された前記増幅兆候を、前記内部較正物質について判定された前記増幅兆候に正規化するステップと、
（ｆ）第１の点および第２の点を備える、較正プロットを作成することによって、前記調整された較正曲線を確立するステップであって、
前記第１の点は、前記調整較正物質の前記既知量の前記被分析ポリヌクレオチドの座標と、ステップ（ｄ）で判定された前記被分析ポリヌクレオチドの正規化増幅兆候とを備え、
前記第２の点は、前記固定点についてステップ（ａ）で取得された前記一対の座標を備える、ステップと、
を含む、方法。
（項目２）
ステップ（ａ）で取得された前記一対の座標によって特定される、前記被分析ポリヌクレオチドの量は、前記ローカル機器以外の第１のリアルタイム増幅および監視機器を使用して判定され、前記ローカル機器を用いて行われる任意の増幅反応からの結果を使用して判定されない、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記第１のリアルタイム機器を用いて、複数の較正標準のそれぞれに含有される前記被分析ポリヌクレオチドおよび前記内部較正物質を同時増幅するステップをさらに含み、
前記複数の較正標準のそれぞれは、前記調整較正物質の前記被分析ポリヌクレオチドの異なる開始濃度を備え、
前記複数の較正標準のそれぞれの中および前記調整較正物質の中の前記内部較正物質の濃度は、実質的に同一である、項目２に記載の方法。
（項目４）
ステップ（ａ）の前記較正曲線、およびステップ（ｆ）で確立された前記調整された較正曲線は、両方とも一次方程式によって表される線形較正曲線である、項目２に記載の方法。
（項目５）
ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）は、集合的に、前記調整較正物質と、前記固定点の前記一対の座標の有形実施形態とを備える、キットを取得するステップを含む、項目２に記載の方法。
（項目６）
前記有形実施形態は、機械可読バーコードを備える、項目５に記載の方法。
（項目７）
ステップ（ａ）の前に、増幅が起こるにつれて、核酸を増幅してアンプリコン合成を監視する、前記ローカル機器以外の複数の機器を使用して取得される、結果の集合に方程式を適合することによって、前記定量分析に特有の前記較正曲線を作成するステップがあり、
前記結果の集合は、前記ローカル機器を使用して取得される結果を備えない、項目１に記載の方法。
（項目８）
ステップ（ｆ）は、前記ローカル機器と通信しているプロセッサを用いて、前記第１の点および前記第２の点を備える前記較正プロットを作成することによって、前記調整された較正曲線を確立するステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記ローカル機器と通信している前記プロセッサは、前記ローカル機器の一体構成要素である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
ステップ（ａ）で取得された前記一対の座標は、前記較正曲線の前記正規化増幅兆候値が０であるときに、前記被分析ポリヌクレオチドの量を特定する、項目１に記載の方法。
（項目１１）
ステップ（ａ）で取得された前記一対の座標は、前記較正曲線の前記正規化増幅兆候値が０であるときに、前記被分析ポリヌクレオチドの量を特定する、項目２に記載の方法。
（項目１２）
ステップ（ａ）で取得された前記一対の座標は、前記較正曲線の前記正規化増幅兆候値が０であるときに、前記被分析ポリヌクレオチドの量を特定する、項目７に記載の方法。
（項目１３）
取得するステップ（ｂ）は、前記固定量の前記内部較正物質および前記既知量の前記被分析ポリヌクレオチドを組み合わせるステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
時間の関数として核酸を増幅してアンプリコン合成を監視する、ローカル機器を用いた、試験サンプル中に存在し得る被分析ポリヌクレオチドおよび固定量の内部較正物質の同時増幅を含む、核酸増幅分析を使用して、前記被分析ポリヌクレオチドを定量化するためのコンピュータプログラム製品であって、
（ａ）前記被分析ポリヌクレオチドを定量化するために使用される前記核酸増幅分析に特有の較正曲線上の固定点の対の座標を受信するステップであって、
前記一対の座標は、前記被分析ポリヌクレオチドの量、および正規化増幅兆候値を特定する、ステップと、
（ｂ）前記ローカル機器を用いて行われる第１の増幅反応で同時増幅した、調整較正物質に含有される前記固定量の前記内部較正物質の増幅兆候に正規化される、既知量の前記被分析ポリヌクレオチドの増幅兆候の値を取得するステップと、
（ｃ）第１の点および第２の点を備える、調整された較正曲線を作成するステップであって、
前記第１の点は、前記調整較正物質の前記既知量の前記被分析ポリヌクレオチドの座標と、ステップ（ｂ）で取得された前記値とを備え、
前記第２の点は、前記固定点についてステップ（ａ）で受信された前記一対の座標を備える、ステップと、
（ｄ）前記ローカル機器を用いて行われる第２の増幅反応でそれと同時増幅した、前記固定量の前記内部較正物質の増幅兆候に正規化される、前記試験サンプル中の未知量の前記被分析ポリヌクレオチドの増幅兆候の値を取得するステップと、
（ｅ）前記試験サンプル中に存在する前記未知量の前記被分析ポリヌクレオチドの定量的結果を生じるように、ステップ（ｄ）で取得された前記値を、前記調整された較正曲線と比較するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）からの前記定量的結果の有形記録を出力するステップと、
を行うためのソフトウェア命令の有形実施形態を備える、コンピュータプログラム製品。
（項目１５）
ステップ（ａ）で受信された前記一対の座標は、前記較正曲線が０の正規化増幅兆候値に投影されるときに、前記被分析ポリヌクレオチドの前記量を特定する、項目１４に記載のコンピュータプログラム製品。
（項目１６）
前記ソフトウェア命令の有形実施形態は、光学ディスク、磁気記憶媒体、フラッシュドライブ、コンピュータハードドライブ、および少なくとも１つのコンピュータによってアクセス可能なネットワークドライブから成る群から選択される、媒体上に記憶されるソフトウェア命令を備える、項目１４に記載のコンピュータプログラム製品。
（項目１７）
ステップ（ｂ）およびステップ（ｄ）はそれぞれ、数学的に計算することによって取得するステップを含む、項目１４に記載のコンピュータプログラム製品。
（項目１８）
ステップ（ｂ）および（ｄ）は、それぞれの値の数値入力を受信することによって取得するステップを含む、項目１４に記載のコンピュータプログラム製品。
（項目１９）
ステップ（ｃ）で作成された、前記調整された較正曲線は、一次方程式によって定義される、項目１４に記載のコンピュータプログラム製品。
（項目２０）
ステップ（ｅ）の前記有形記録は、紙に印刷される、項目１４に記載のコンピュータプログラム製品。
（項目２１）
前記核酸増幅分析は、等温核酸増幅分析である、項目１４に記載のコンピュータプログラム製品。
（項目２２）
試験サンプル中の標的核酸配列の開始量を判定するための装置であって、
（ａ）少なくとも１つの検出機構であって、
（ｉ）前記標的核酸配列および第１の核酸増幅反応で増幅されている第１の内部較正物質のそれぞれの数量を示す、信号であって、
前記第１の内部較正物質は、前記標的核酸配列とは異なる第２の核酸配列を備える、信号と、
（ｉｉ）既知量の被分析ポリヌクレオチドおよび第２の核酸増幅反応で増幅されている第２の内部較正物質のそれぞれの数量を示す、信号であって、
前記被分析ポリヌクレオチドおよび前記第２の内部較正物質は、両方とも調整較正物質の構成要素であり、
前記第２の内部較正物質は、前記第２の核酸配列を備え、
前記第２の核酸配列の開始量は、前記第１および第２の核酸増幅反応において実質的に等しい、信号と、
を測定する、検出機構と、
（ｂ）前記検出機構と通信している、少なくとも１つのプロセッサであって、
前記プロセッサは、被分析ポリヌクレオチドの量および正規化増幅兆候値を特定する、固定点の一対の座標でプログラムされ、
前記プロセッサはさらに、
（ｉ）前記測定された信号から、それぞれ前記第１および第２の内部較正物質の前記既知量の前記被分析ポリヌクレオチド、および前記標的核酸配列の増幅兆候のそれぞれの値を判定するステップと、
（ｉｉ）前記標的核酸配列について判定された前記増幅兆候値を、前記第１の内部較正物質について判定された前記増幅兆候値に正規化するステップと、
（ｉｉｉ）前記既知量の前記被分析ポリヌクレオチドについて判定された前記増幅兆候値を、前記第２の内部較正物質について判定された前記増幅兆候値に正規化するステップと、
（ｉｖ）前記固定点、前記既知量の前記被分析ポリヌクレオチド、および前記既知量の前記被分析ポリヌクレオチドの前記正規化増幅兆候から、較正曲線を確立するステップと、
（ｖ）前記較正曲線および前記標的核酸配列の前記正規化増幅兆候を使用して、前記試験サンプル中の前記標的核酸配列の開始量を判定するステップと、
を行うようにプログラムされる、プロセッサと、
を備える、装置。
（項目２３）
前記固定点の前記一対の座標は、前記第１および第２の核酸増幅反応を行った前記装置以外の装置のみを使用して行われる、複数の核酸増幅反応からの結果を使用して判定される、項目２２に記載の装置。
（項目２４）
前記一対の座標のうちの１つの要素は、０の正規化増幅兆候値を特定する、項目２３に記載の装置。
（項目２５）
前記第１および第２の核酸増幅反応が行われる、温度制御されたインキュベータをさらに備える、項目２３に記載の装置。
（項目２６）
前記温度制御されたインキュベータは、実質的に一定の温度を維持し、前記第１および第２の核酸増幅反応は、等温核酸増幅反応である、項目２５に記載の装置。
（項目２７）
ステップ（ｉｖ）での前記較正曲線は、一次方程式によって定義される、項目２３に記載の装置。
（項目２８）
前記少なくとも１つの検出機構は、蛍光信号を測定する蛍光光度計を備える、項目２３に記載の装置。
（項目２９）
増幅が起こるにつれて、核酸を増幅してアンプリコン合成を監視する、ローカル機器を使用して行われる、定量分析のための調整された較正曲線を確立する方法であって、
（ａ）前記定量分析に特有の較正曲線上の固定点の一対の座標を取得するステップであって、
前記一対の座標は、被分析ポリヌクレオチドの量、および増幅兆候値を特定する、ステップと、
（ｂ）既知量の前記被分析ポリヌクレオチドを備える、被分析ポリヌクレオチド標準を取得するステップと、
（ｃ）前記ローカル機器を使用して、核酸増幅反応で前記被分析ポリヌクレオチド標準の前記被分析ポリヌクレオチドを増幅するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で増幅した前記被分析ポリヌクレオチドの増幅兆候を判定するステップと、
（ｅ）第１の点および第２の点を備える、較正プロットを作成することによって、前記調整された較正曲線を確立するステップであって、
前記第１の点は、前記被分析ポリヌクレオチド標準の前記既知量の前記被分析ポリヌクレオチドの座標と、ステップ（ｄ）で判定された増幅兆候とを備え、
前記第２の点は、前記固定点についてステップ（ａ）で取得された前記一対の座標を備える、ステップと、
を含む、方法。
（項目３０）
ステップ（ａ）の前に、増幅が起こるにつれて、核酸を増幅してアンプリコン合成を監視する、前記ローカル機器以外の複数の機器を使用して取得される、結果の集合に方程式を適合することによって、前記定量分析に特有の前記較正曲線を作成するステップがあり、
前記結果の集合は、前記ローカル機器を使用して取得される結果を備えない、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
ステップ（ｅ）は、前記較正プロットを作成するために、前記ローカル機器と通信しているプロセッサを使用するステップを含む、項目２９に記載の方法。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（緒言）
本明細書では、較正プロット上の記憶された点（例えば、「固定点」）と組み合わせて、エンドユーザの機器上で判定される結果を採用する、内部較正アプローチが開示される。随意に、固定点は、エンドユーザの機器上で判定し、次いで、その同一の機器上で後に使用するために記憶することができる。代替として、固定点は、（例えば、キット製造業者の場所で）１つ以上の機器を使用して判定し、次いで、エンドユーザの機器上で使用するために提供することができる。開示されたアプローチは、有利なことには、わずか単一の核酸較正標準を使用して、核酸定量化のための完全較正曲線の生成を促進する。また、本アプローチは、ワークフローを単純化し、再較正手順が必要とされる度に較正物質の全セットを使用する完全較正曲線の生成より費用効果的である。なおもさらに、本アプローチは、拡張動的範囲にわたって卓越した定量化を提供し、経年劣化した、または部分的に分解された試薬の使用に適応する。
【００１３】
特に有用なシステムおよび方法は、較正されるエンドユーザの機器上で増幅される最小数の較正標準を使用して、完全較正曲線を生成することが可能であろう。実際、本明細書で詳述されるアプローチによって、完全較正曲線を再作成するために単一の較正標準のみを使用して、卓越した結果が達成されている。これは、最初に、異なる量の被分析ポリヌクレオチド標準および同一の一定量の内部較正物質（すなわち、「ＩＣ」）をそれぞれ有する、複数の較正標準を使用して、較正基準曲線を確立するステップを伴うことができる。次に、基準曲線上の外挿点を、固定点として使用するために識別することができる。次いで、標的／ＩＣ比率値（すなわち、それぞれの増幅兆候の比）を判定し、それによって、（例えば、エンドユーザによって生成される）「ローカル」データ点を確立するために、エンドユーザの機器上で較正標準（例えば、単一の較正標準）を使用して行われる増幅反応からの結果を使用することができる。ローカルデータ点および固定点は、線形較正曲線等の「調整された較正曲線」を生成するために、組み合わせて使用することができる。最終的に、調整された較正曲線を使用して、エンドユーザの機器上の試験サンプル中に存在する標的量を定量化するためのステップがある。好ましくは、これは、試験サンプルの増幅によって取得される標的およびＩＣの測定された増幅兆候を使用して計算される比率値を、調整された較正曲線と比較するステップを伴う。
【００１４】
第１の実施形態によると、時間またはサイクル数の関数として核酸を増幅してアンプリコン合成を監視する、第１の機器上の異なる較正標準を使用して行われる、２つ以上の増幅反応からの結果（例えば、増幅された標的およびＩＣの正規化閾値または他の増幅兆候値）を使用して、マスタ較正曲線が作成される。閾値ＣＴの値、または較正標準の中の標的核酸の増幅のための特定のレベルの反応進行を示す、他の増幅兆候は、比率をもたらすように、例えば、除算によって、同一の反応について判定されるＩＣの対応する値に正規化される。次いで、２つ以上の較正反応のそれぞれについて計算される比率値が、反応に入力される開始量の標的の関数として（例えば、電子表計算を使用して）描画される。いくつかの好ましい場合において、線形較正プロットが確立される。
【００１５】
既知の開始コピーレベルの標的核酸を有する、わずか１つの較正標準、および固定点を確立するために使用することができる、較正曲線を確立するために使用される反応で採用されるものと同一の一定量のＩＣを使用して、較正または再較正手順を行うことができる。リアルタイム増幅反応における標的およびＩＣの閾値を判定し、正規化することにより、完全較正プロットを生成するために固定点と組み合わせて使用することができる、１つの点を生じる。
【００１６】
上記で示されるように、較正プロットを生成するために第２の点と組み合わせて固定点を使用することができる、異なる方法がある。第１の場合において、較正標準について判定される固定点および比率値は、両方とも同一の機器（例えば、「第１の」機器）上で生成される。第２の場合において、較正標準について判定される固定点および比率値は、異なる機器（例えば、第１および第２の機器）上で生成される。両方の場合において、本技法は、有利なことには、特定の機器の電源を数回オンおよびオフにした試薬を含む、経年劣化した試薬に対処するように、較正プロットを補正する。同様に、本技法は、増幅効率の判定に依存しない。なおもさらに、各反応に含まれるＩＣのコピーレベルまたは量が把握されることが要求されない。しかしながら、各反応におけるＩＣのコピーレベルまたは量は、同一となるはずである。
【００１７】
（定義）
以下の用語は、本明細書で明示的に反対に記述されない限り、本開示の目的で以下の意味を有する。
【００１８】
本明細書で使用されるように、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含有するキメラ分子のいずれかを意味する。本用語はまた、ＲＮＡまたはＤＮＡのヌクレオチド類似体を含有する分子も包含する。
【００１９】
「被分析ポリヌクレオチド」または「被分析核酸」により、定量化される、目的とするポリヌクレオチドを意味する。一般的に言えば、被分析核酸は、試験サンプル中で見出されるであろう。特定のウイルスのゲノムが、被分析ポリヌクレオチドを例示するであろう。
【００２０】
本明細書で使用されるように、「試験サンプル」は、特定のポリヌクレオチド配列の存在について調査される任意のサンプルである。試験サンプルは、ヒト、動物、環境、または研究室由来あるいは合成サンプルから取得される、任意の組織またはポリヌクレオチド含有物質を含む。血液および尿が、試験サンプルの好ましい実施例である。
【００２１】
「被分析ポリヌクレオチド標準」により、既知の数量の被分析ポリヌクレオチドまたはその断片を備える、組成物を意味する。例えば、ＨＩＶ−１被分析ポリヌクレオチド標準は、ＨＩＶ−１ゲノム、ＨＩＶ−１転写産物、またはウイルスゲノムの一部分を表す生体外合成転写産物の既知数のコピーを含有してもよい。
【００２２】
「較正標準」により、既知の一定量の内部較正物質ポリヌクレオチドと組み合わせて、既知または所定量の被分析ポリヌクレオチド標準を含む、組成物を意味する。２つの異なる較正標準は、異なる量の被分析ポリヌクレオチドまたはその断片を含有することができるが、同一量の内部較正物質核酸を含有するであろう。被分析ポリヌクレオチド標準の被分析ポリヌクレオチド、および内部較正物質核酸は、例えば、異なるヌクレオチド塩基配列を有することによって、相互から区別可能であろう。
【００２３】
「調整較正物質」は、ローカル機器上で増幅反応を行うために使用される較正標準であり、これらの増幅反応から取得される結果は、較正プロットを作成するためのデータを提供する。例えば、調整較正物質の増幅は、完全較正プロットを作成するために固定点と組み合わせて使用され得る、データ点を提供してもよい。
【００２４】
「アンプリコン」は、標的核酸配列が、ポリヌクレオチドコピーまたは増幅産物の合成のためのテンプレートとしての機能を果たした、増幅反応のポリヌクレオチド産物である。
【００２５】
「増幅」または「核酸増幅」あるいは「生体外核酸増幅」および同等物により、ＲＮＡおよびＤＮＡ均等物を可能にする、標的核酸配列またはその相補体あるいはその断片の複数のコピーを取得するための任意の既知の手順を意味する。「その断片」の増幅とは、完全に満たない標的領域核酸配列またはその相補体を含有する、増幅核酸の産生を指す。そのような断片は、例えば、標的核酸の内部位置に交雑し、そこから重合を開始する、増幅オリゴヌクレオチドを使用することにより、標的核酸の一部分を増幅することによって産生されてもよい。
【００２６】
本明細書で使用されるように、「同時増幅する」および「同時増幅」という用語、ならびにその変化形は、異なる標的核酸配列が単一の（すなわち、同一の）増幅反応において増幅されるプロセスを指す。例えば、被分析ポリヌクレオチドおよび無関係の内部較正物質核酸は、両方の核酸が単一の管の中で行われる反応において増幅されるとき、および両方の増幅反応が共通する少なくとも１つの試薬（例えば、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、酵素、プライマー等）を共有するときに、「同時増幅される」。
【００２７】
本明細書で使用されるように、「熱循環」とは、反応混合物の温度の反復変化（すなわち、温度の上昇または低下）を指す。熱循環を受けるサンプルは、ある温度から別の温度へ偏移し、その温度で安定化し、第２の温度に遷移するか、または開始温度に戻る。温度サイクルは、目的とする特定の化学反応を研究するか、または完成させるために必要に応じて何度も繰り返されてもよい。
【００２８】
「標的」または「標的核酸」により、増幅、検出、および定量化される配列を含有する、核酸を意味する。増幅される標的核酸配列は、好ましくは、２つの反対に配置されたオリゴヌクレオチドの間に位置付けられ、オリゴヌクレオチドのそれぞれに相補的である標的核酸の一部分を含むであろう。
【００２９】
「標的核酸配列」または「標的配列」あるいは「標的領域」により、一本鎖核酸分子のヌクレオチド配列の全体または一部を備える、特定のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列、およびそれに相補的なデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を意味する。
【００３０】
「転写関連増幅」により、核酸テンプレートから複数のＲＮＡ転写産物を産生するためにＲＮＡポリメラーゼを使用する、任意の種類の核酸増幅を意味する。従来、これらの増幅反応は、ＤＮＡポリメラーゼの活性によって拡張することができる３′末端を有する、少なくとも１つのプライマーを採用する。「転写介在増幅」（ＴＭＡ）と呼ばれる、転写関連増幅方法の一実施例は、概して、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、および標的核酸に相補的なプロモータ含有オリゴヌクレオチドを採用する。ＴＭＡの変形例は、Ｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，４３７，９９０号、Ｋａｃｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号、Ｋａｃｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ第ＷＯ９３／２２４６１号、Ｇｉｎｇｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＣＴ第ＷＯ８８／０１３０２号、Ｇｉｎｇｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＣＴ第ＷＯ８８／１０３１５号、Ｍａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，１３０，２３８号、Ｕｒｄｅａ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８６８，１０５号および第５，１２４，２４６号、ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ第ＷＯ９４／０３４７２号、およびＲｙｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ第ＷＯ９５／０３４３０号で詳細に開示されるように、当技術分野で周知である。シリアル番号１１／２１３，５１９を有する米国特許出願で開示されるように、ＤＮＡポリメラーゼによって拡張することができる、単一のプライマーのみを採用する他の転写関連増幅方法が、特に定義によって包含され、本明細書で開示される方法と関連して使用するために極めて好ましい。
【００３１】
本明細書で使用されるように、「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、少なくとも２つ、概して、約５〜約１００個の化学サブユニットのポリマー鎖であり、各サブユニットは、ヌクレオチド塩基部分と、糖部分と、線形空間較正でサブユニットを接合する結合部分とを備える。一般的なヌクレオチド塩基部分は、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）であるが、水素結合が可能な他の希少または修飾ヌクレオチド塩基が、当業者に周知である。オリゴヌクレオチドは、随意に、糖部分、塩基部分、および骨格構成物質のうちのいずれかの類似体を含んでもよい。本開示の好ましいオリゴヌクレオチドは、約１０〜約１００個の残基のサイズ範囲に入る。オリゴヌクレオチドは、自然発生源から精製されてもよいが、好ましくは、種々の周知の酵素または化学方法のうちのいずれかを使用して合成される。
【００３２】
「増幅オリゴヌクレオチド」または「増幅オリゴマー」により、標的核酸またはその相補体に交雑し、核酸増幅反応に関与するオリゴマーを意味する。増幅オリゴマーの実施例は、増幅プロセスの一部として拡張される３′末端を含有する、プライマーを含むが、また、ポリメラーゼによって拡張させられない（例えば、３′ブロック化オリゴマー）が、プライマーからの効率的な増幅に関与するか、またはそれを促進し得る、オリゴマーも含む。増幅オリゴマーの好ましい範囲は、長さが約１０〜約８０個のヌクレオチド、または長さが１０〜約６０個のヌクレオチドであり、標的核酸配列（またはその相補鎖）の領域に相補的である、少なくとも約１０個の隣接塩基、より好ましくは、少なくとも１２個の隣接塩基を含有するものを含む。隣接塩基は、増幅オリゴマーが結合する標的配列に対して、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは約１００％相補的である。増幅オリゴマーは、随意に、修飾ヌクレオチドまたは類似体、あるいは増幅反応に関与するが、標的核酸に相補的ではないか、またはそれに含有されない、付加的なヌクレオチドを含んでもよい。３′ブロック化されるが、標的核酸に交雑し、転写を開始する働きをする上流プロモータ配列を提供することが可能である、増幅オリゴマーは、「プロモータプロバイダ」オリゴマーと称される。
【００３３】
「プライマー」は、テンプレート核酸に交雑し、ＤＮＡポリメラーゼによって拡張することができる３′ＯＨ末端を有する、増幅オリゴマーである。プライマーの５′領域は、標的核酸に非相補的であり（例えば、プロモータ配列）、「プロモータプライマー」と称されるオリゴマーをもたらし得る。当業者であれば、プライマーとして機能することができる任意のオリゴマーは、５′プロモータ配列を含むように修飾することができ、したがって、プロモータプライマーとして機能し得ることが理解するであろう。同様に、任意のプロモータプライマーは、プロモータ配列の除去、またはプロモータ配列を伴わない合成によって修飾することができ、依然としてプライマーとして機能することができる。
【００３４】
本明細書で使用されるように、増幅オリゴヌクレオチドの「セット」とは、アンプリコンを合成するように生体外核酸増幅反応に協調的に関与する、２つ以上の増幅オリゴヌクレオチドの集合を指す。
【００３５】
本明細書で使用されるように、「プローブ」は、検出可能なハイブリッドを形成するように、ハイブリダイゼーションを助長する条件下で、核酸中、好ましくは、増幅核酸中の標的配列に特異的に交雑する、オリゴヌクレオチドである。
【００３６】
本明細書で使用されるように、核酸増幅の「時間依存性」監視、または「リアルタイム」での核酸増幅の監視は、核酸増幅反応において存在するアンプリコンの量が、反応時間またはサイクル数の関数として測定され、次いで、増幅反応が開始された時間に反応混合物中に存在したテンプレートの開始量を判定するために使用される、プロセスを指す。例えば、ＰＣＲ等の熱循環を含む増幅反応の各完全サイクルを開始する前に、アンプリコンの量を測定することができる。代替として、時間の関数として存在するアンプリコンの量に関する情報を取得するように、増幅サイクル間の遷移を開始するために医師の介入を必要としない、等温増幅反応を連続的に、または規則的な時間間隔で監視することができる。
【００３７】
本明細書で使用されるように、「成長曲線」とは、時間またはサイクル数の関数として、反応におけるアンプリコン等の合成産物の出現の特徴的なパターンを指す。成長曲線は、蛍光測定（ｙ軸）等の産物量のあるインジケータに対する時間（ｘ軸）の２次元プロットとして、利便的に表される。全てではないが、いくつかの成長曲線は、Ｓ字形状を有する。
【００３８】
本明細書で使用されるように、成長曲線の「基準段階」とは、産物（アンプリコン等）の量が実質的に一定の速度で増加し、この速度は、成長曲線の（対数線形プロファイルを有し得る）成長段階の特性を示す増加の速度より小さい、曲線の初期段階を指す。成長曲線の基準段階は、典型的には、頻繁に０に近似する、非常に浅い傾斜を有する。
【００３９】
本明細書で使用されるように、成長曲線の「成長段階」とは、測定可能な産物が時間とともに実質的に増加する、曲線の一部分を指す。典型的な核酸増幅反応における基準段階から成長段階への遷移は、時間とともに増加する速度でのアンプリコンの出現によって特徴付けられる。成長曲線の成長段階から停滞段階への遷移は、アンプリコン出現の速度が減少し始める、変曲点で始まる。
【００４０】
本明細書で使用されるように、三相成長曲線の「停滞段階」とは、曲線の最終段階を指す。停滞段階では、測定可能な産物の形成の速度は、概して、対数線形段階でのアンプリコン産生の速度より実質的に低く、０に接近さえし得る。
【００４１】
本明細書で使用されるように、「増幅兆候」という語句は、核酸増幅反応の所定のレベルの進行を示す、リアルタイム実行曲線の特徴を指す。そのような兆候は、強度が、時間、サイクル数等の関数として、反応混合物中に存在するアンプリコンの数量に関係付けられる、測定可能な信号（蛍光示度値等）を表示する、「成長曲線」と称されることもある実行曲線の数学的分析によって、一般的に判定される。
【００４２】
本明細書で使用されるように、「閾値ベースの増幅兆候」という語句は、成長曲線信号が恣意的な値または閾値を横断するときに時間またはサイクル数を測定する、増幅兆候を指す。ＴＴｉｍｅ判定が、閾値ベースの増幅兆候の実施例である一方で、ＴＡｒｃおよびＯＴＡｒｃ判定は、非閾値ベースの増幅兆候の実施例である。
【００４３】
本明細書で使用されるように、「時間依存性」増幅兆候という語句は、概して、時間単位（例えば、分）で測定される増幅兆候（例えば、反応進行パラメータ）を指す。時間依存性増幅兆候は、一般的に、明確に異なる「サイクル」によって特徴付けられない、等温核酸増幅反応の進行を監視するために使用される。ＴＴｉｍｅ、ＴＡｒｃ、およびＯＴＡｒｃの全てが、時間依存性増幅兆候の実施例である。
【００４４】
本明細書で使用されるように、「内部較正物質」（本明細書では時として「ＩＣ」）は、生体外核酸増幅反応において増幅することができ、同一の反応において同時増幅した被分析ポリヌクレオチドから区別可能である、ポリヌクレオチドである。「内部」は、較正物質ポリヌクレオチドが、被分析ポリヌクレオチドまたはその断片と同一の反応混合物内で増幅、検出、および定量化されることを意味する。一般的に言えば、内部較正物質の量または濃度は、較正曲線を作成するため、および分析ポリヌクレオチドを定量化するために使用される異なる反応において一定であろう。好ましくは、内部較正物質の一定の量または濃度は、内部較正物質の既知の量、または内部較正物質の既知の濃度であろう。ある好ましい実施形態では、内部較正物質および被分析ポリヌクレオチドは、１つ以上の異なる増幅オリゴマーまたはプライマーを使用して、生体外核酸増幅反応において同時増幅される。例えば、以下で詳述される実施例で採用される被分析および内部較正物質ポリヌクレオチドは、共有されなかった増幅オリゴヌクレオチドを使用して増幅された。他の好ましい実施形態では、内部較正物質および被分析ポリヌクレオチドは、１つ以上の同一の増幅オリゴマーまたはプライマーを使用して、生体外核酸増幅反応において同時増幅される。
【００４５】
本明細書で使用されるように、「の関数として」という語句は、従属変数（すなわち、１つ以上の他の変数に依存する変数）と独立変数（すなわち、任意の他の変数の値を考慮することなく自由に選択される、その値を有し得る変数）との間の関係を表し、独立変数の各入力値は、従属変数の正確に１つの出力値に関する。ｘ値（すなわち、独立変数）「の関数として」ｙ値（すなわち、従属変数）を関係付ける方程式の従来の表記は、ｙ＝ｆ（ｘ）である。
【００４６】
本明細書で使用されるように、方程式を「最適化すること」または「適合すること」とは、一般的に数学的モデリングまたは曲線適合手順として実践されるように、実験的測定に「適合」または「近似」する式を生じるように、方程式の中の係数の数値を取得するためのプロセスを指す。典型的には、最適化された方程式が、最良適合曲線を定義するであろう。
【００４７】
本明細書で使用されるように、「最適化された方程式」および「適合された方程式」という用語は、最適化手順の結果として係数の固定数値を含有する方程式の代替的言及である。「適合された」曲線は、方程式を最適化することに起因する。
【００４８】
「ローカル」により、エンドユーザに関することを意味する。例えば、ローカル機器とは、エンドユーザの機器を指す。ローカル較正プロットとは、例えば、ローカル機器上で増幅反応を行うことによって、エンドユーザによって取得される結果を使用する較正プロットを指す。
【００４９】
「再構成する」または「再較正」により、同一の機器を使用して行われるか、または取得される、先の較正手順または結果に続く、較正手順または結果を意味する。例えば、サイクル数または時間の関数として核酸を増幅してアンプリコン合成を監視する、機器（例えば、リアルタイムＰＣＲ機器）を使用して、較正手順が最初に行われると、２つの異なる較正標準が増幅されてもよく、較正プロットが結果として生じてもよい。較正プロットは、増幅反応に入力される開始標的量の関数として、比率値を数学的に関係付けてもよい。再較正手順は、後続の、または更新された較正プロットを生成するために、同一の機器を採用するであろう。
【００５０】
「較正プロット」により、増幅反応について測定することができる数量（例えば、増幅標的および内部較正物質の測定された閾値の比）を、増幅反応に入力される基質の既知量（例えば、標的核酸の開始量）を関係付ける、図式的または数学的表現を意味する。較正プロットは、好ましくは、コンピュータ表計算ソフトウェアを使用して確立され、較正結果または情報の電子表現を含む。「較正プロット」および「較正曲線」は、同義的に使用される。較正プロットまたは曲線は、線形および非線形較正曲線を指すことができると理解されたい。
【００５１】
本明細書で使用されるように、「固定点」は、較正または再較正手順で較正プロットを確立するために使用することができる、データ点（例えば、ｘおよびｙ座標を有する）であり、そのデータ点は、時間とともに変化しない。固定点は、単一の装置（例えば、ローカル機器）上で判定および使用されてもよい。代替として、固定点は、分析キット製造業者の現場での装置を使用して判定され、次いで、異なる装置上で顧客またはエンドユーザによって使用されてもよい。
【００５２】
「キット」により、典型的には、相互と併せた使用のために意図される、材料の包装された組み合わせを意味する。本開示によるキットは、「有形」形態で使用説明書または他の情報を含んでもよい（例えば、印刷された情報、コンピュータ可読媒体上に電子的に記録される、または数値を記憶するためのバーコード等の機械可読媒体上に別様に記録される）。
【００５３】
「本質的に〜から成る」により、本開示の基本的および新規特性を物質的に変化させない、付加的な構成要素、組成物、または方法ステップが、本開示に含まれ得ることを意味する。本開示の基本的および新規特性に重大な影響を及ぼす、任意の構成要素、組成物、または方法ステップは、この用語の範囲外になるであろう。
【００５４】
（好ましい核酸増幅方法）
本開示と関連して有用な増幅方法の実施例は、転写介在増幅（ＴＭＡ）、単一プライマー核酸増幅、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、自律的配列複製（３ＳＲ）、ＤＮＡリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、および自己複製ポリヌクレオチド分子ならびにＭＤＶ−１ＲＮＡおよびＱ−ベータ酵素等の複製酵素を使用する増幅方法を含むが、それらに限定されない。これらの種々の増幅技法をそれぞれ実行するための方法は、米国特許第５，３９９，４９１号、米国特許出願第１１／２１３，５１９号、公開された欧州特許出願第ＥＰ０５２５８８２号、米国特許第４，９６５，１８８号、米国特許第５，４５５，１６６号、Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８  （１９９０）、国際公開第ＷＯ８９／０９８３５号、米国特許第５，４７２，８４０号、およびＬｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ９：５３−５８  （１９９１）で見出すことができる。核酸増幅反応を行う方法を説明する、これらの文書の開示は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００５５】
開示されたアルゴリズムおよび方法はまた、単一の拡張可能なプライマーのみを必要とする増幅反応を使用して取得される、結果を処理するために使用することもできる。これらの反応は、核酸ポリメラーゼによって拡張することができない３′ブロック化オリゴヌクレオチドと組み合わせて、単一の拡張可能なプライマーを採用する、転写関連増幅システムを含む。そのような増幅反応を実行するための方法は、例えば、米国特許出願第１１／２１３，５１９号で詳述されている。
【００５６】
（有用な増幅兆候の実施例）
種々の増幅兆候を開示された方法と関連して使用することができる。例えば、一次導関数の最大値の発生の時間、またはリアルタイム実行曲線の二次導関数の最大値の発生の時間を識別するために、通常レベルの技能を有する当業者に周知となるであろう、数学および計算技法を使用することができる。成長曲線のこれらの特徴を判定するためのアプローチは、その開示が参照することにより本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５０３，７２０号でＷｉｔｔｗｅｒらによって詳述されている。他の有用なアプローチは、成長曲線の導関数を計算し、成長曲線の特性を識別し、次いで、導関数の特性に対応する閾値時間またはサイクル数を判定することを伴う。そのような技法は、その開示が参照することにより本明細書に組み込まれる、米国特許第６，７８３，９３４号で開示されている。なおも他の有用な増幅兆候は、「ＴＴｉｍｅ」および「ＴＡｒｃ」を含む。注目すべきは、ＴＡｒｃ値を判定するための異なるアプローチは、指向的に類似するベクトル（すなわち、単純に「ＴＡｒｃ」によって識別される値をもたらす）、および指向的に反対のベクトル（すなわち、「ＯＴＡｒｃ」として識別される値をもたらす）を採用する。なおも他の技法は、信号、好ましくは、蛍光信号が、統計閾値（例えば、所定の統計閾値）に等しい、反応中の時間またはサイクル数としてサイクル閾値（例えば、「Ｃｔ」）の値を識別することを伴う。後者のこれらの方法の一般的説明が、以下で挙げられる。
【００５７】
（ＴＴｉｍｅ値を判定する方法）
簡単に言うと、ＴＴｉｍｅ値は、アンプリコン産生を示す特定の閾値がリアルタイム増幅反応において渡される、時間を推定する。ＴＴｉｍｅ値を計算して使用するためのアルゴリズムは、その開示が参照することにより組み込まれる、第６０／６５９，８７４号によって識別される米国特許出願で説明されている。このアルゴリズムによると、曲線適合手順が、正規化および背景調整されたデータに適用される。周知の曲線適合方法のうちのいずれかが採用されてもよいが、好ましい実施形態では、線形最小二乗（「ＬＬＳ」）曲線適合が採用される。曲線適合は、所定の下限と上限との間のデータの一部分のみについて行われる。データに適合する曲線を見出した後の最終的な目標は、曲線またはその投影が所定の統計閾値に交差する点に対応する、時間を推定することである。一実施形態では、正規化データの閾値は、０．１１である。曲線が種々の対照データセットに適合する、その範囲が、所与の閾値と関連付けられる時間の最小変動性を示すため、上限および下限は、経験的に判定される。一実施形態では、下限は、０．０４であり、上限は、０．３６である。曲線は、下限を下回る第１のデータ点から、上限を過ぎる第１のデータ点を通って延在するデータについて適合される。次に、適合の傾斜が統計的に有意であるかどうかという判定が行われる。例えば、一次係数のｐ値が０．０５未満である場合、適合は有意と見なされ、処理が継続する。もしそうでなければ、処理が停止する。代替として、Ｒ２値によって、データの妥当性を判定することができる。線形曲線ｙ＝ｍｘ＋ｂの傾斜ｍおよび切片ｂは、適合された曲線について判定される。その情報を用いて、ＴＴｉｍｅを判定することができる。
【００５８】
（ＴＡｒｃ値を判定する方法）
「ＴＡｒｃ」および「ＯＴＡｒｃ」と称される時間依存性増幅兆候は、リアルタイム実行曲線のベクトルベースの分析を使用して判定される。ＴＡｒｃ値は、成長曲線が上向きに曲線を描き、または「湾曲」し始める時点を識別する。この判定された点は、標準曲線を作成するため、または試験サンプル中の被分析ポリヌクレオチドの量または濃度に関する増幅反応のパラメータを確立するために使用することができる。ベクトル分析は、実質的に一様な時間間隔にわたって分布したデータ点を有する成長曲線を使用して、最も利便的に実行される。ＴＡｒｃおよびＯＴＡｒｃ値の判定および使用に関する詳細な表現は、参照することにより本明細書に組み込まれる、米国特許第７，７３９，０５４号で見られる。
【００５９】
（好ましいシステムおよび装置）
本明細書で開示される方法は、コンピュータまたは類似処理デバイス（以降では「コンピュータ」）を使用して利便的に実装される。異なる好ましい実施形態では、アルゴリズムを実施するためのソフトウェアまたは機械実行可能命令は、独立コンピュータのメモリ構成要素の中で、または好ましくは時間の関数として、分析を受ける産物の量を監視するために使用されるデバイスに連結されたコンピュータのメモリ構成要素の中で、ロードするか、または別様に保持することができる。極めて好ましい実施形態では、較正アルゴリズムを実行するためのソフトウェアは、時間の関数として反応混合物中に存在するアンプリコンの量を監視することが可能なデバイスに連結されるか、またはその一体部品である、コンピュータのメモリ構成要素の中で保持される。
【００６０】
実際、リアルタイム増幅デバイスを制御するためのコントローラシステムおよび／またはリアルタイム増幅デバイスの検出システムのいずれか一方または両方は、事前プログラムまたはユーザ入力された命令に従って、これらの機器の動作を指示するように機能する、適切にプログラムされたコンピュータに連結することができる。コンピュータはまた、好ましくは、これらの機器からデータおよび情報を受信し、この情報を解釈して操作し、ユーザに報告することもできる。
【００６１】
一般に、コンピュータは、典型的には、パラメータフィールドのセットへのユーザ入力の形態で、または事前プログラムされた命令（例えば、種々の異なる特定の動作のために事前にプログラムされる）の形態でのいずれかで、ユーザ命令を受信するための適切なソフトウェアを含む。次いで、ソフトウェアは、これらの命令を、所望の動作を実行するようにリアルタイム増幅コントローラの動作を指示するための適切な言語に変換する。コンピュータはまた、システム内に含まれる１つ以上のセンサ／検出器からデータを受信することも可能であり、プログラミングに従ってデータを解釈する。本システムは、好ましくは、検出器によって検出されるような、時間の関数としての目的とする核酸の増幅コピーの数量を表す成長曲線の特徴を、試験サンプル中に存在する目的とする核酸のコピーの数に相関する、ソフトウェアを含む。
【００６２】
好ましくは、開示された較正アルゴリズムを実行するために使用されるコンピュータが、リアルタイム核酸増幅反応を行って分析するための装置の一体構成要素であるとき、本装置は、好ましくは、温度制御されたインキュベータと、信号を収集するための検出デバイスと、信号を分析するための分析デバイス（例えば、コンピュータまたはプロセッサ）と、分析デバイスによって取得または生成されるデータを表示するための出力デバイスとを備える。分析デバイスは、当技術分野で公知の入力デバイスを通して、温度制御されたインキュベータに、および／またはデータ表示のための当技術分野で公知の出力デバイスに接続されてもよい。一実施形態では、温度制御されたインキュベータは、温度循環が可能である。
【００６３】
一般的に言えば、開示された方法と関連して有用なリアルタイム核酸増幅を行うための装置の種々の構成要素は、通常レベルの技能を有する当業者に周知となるであろう、従来の構成要素であろう。リアルタイム核酸増幅を行って分析するために使用される、温度制御されたインキュベータは、複数の反応管、または標準増幅反応管の中またはマルチウェルプレートのウェルの中の温度制御されたブロック内の反応サンプルを保持することができる、従来の設計であってもよい。一側面では、検出システムは、１つ以上の蛍光指標から光学信号を検出するために好適である。検出システムの出力（例えば、増幅反応中に生成されるものに対応する信号）は、データ記憶および操作のためのコンピュータに供給することができる。一実施形態では、本システムは、複数の異なる種類の蛍光標識等の複数の異なる種類の光学信号を検出し、マイクロプレート蛍光読取機の能力を有する。検出システムは、好ましくは、可視光レーザまたは紫外線ランプあるいはハロゲンランプであり得る、励起光源と、励起光を個々の反応管に分配するため、および反応管から蛍光を受容するためのマルチプレクサデバイスと、それらの波長によって励起光から蛍光を分離するためのフィルタリング手段と、蛍光強度を測定するための検出手段とを含有する、多重化蛍光光度計である。好ましくは、温度制御されたインキュベータの検出システムは、フルオロフォア選択の融通性、高い感度、および優れた信号対雑音比を可能にする、広い検出範囲を提供する。検出システムによって受信される光学信号は、概して、プロセッサと通信しているユーザデバイスのディスプレイ上でユーザによって視認することができるデータを提供するようにプロセッサによる影響を受けることができる、信号に変換される。ユーザデバイスは、ユーザインターフェースを備えてもよく、またはキーボードおよびビデオモニタを伴う従来の市販コンピュータシステムであってもよい。ユーザデバイスによって表示することができるデータの実施例は、増幅プロット、散布図、アセンブリ内の全ての管または反応容器のため、および使用される全ての指標のためのサンプル値画面、光学信号強度画面（例えば、蛍光信号強度画面）、最終呼び出し結果、テキストレポート、および同等物を含む。
【００６４】
（コンピュータプログラム製品）
本開示の範囲内には、データ処理方法を行うために使用することができる、ソフトウェアベースの製品（例えば、種々の手順ステップを実行するようにコンピュータに指示するためのソフトウェアの有形実施形態）が含まれる。これらは、磁気媒体、光学媒体、「フラッシュ」メモリデバイス、およびコンピュータネットワーク等のコンピュータ可読媒体上に記憶されたソフトウェア命令を含む。同様に、本開示は、核酸を増幅し、核酸増幅産物を検出し、試験サンプル中の標的の定量的結果を示すように結果を処理する、システムまたは装置を包含する。本装置の種々の構成要素は、好ましくは、協調的に機能するが、構成要素が（例えば、単一のシャーシ上の）統合アセンブリの一部であるための要件はない。しかしながら、好ましい実施形態では、本装置の構成要素は、ともに接続される。「接続される」の意味には、有線および無線接続を介した接続が含まれる。
【００６５】
特に、本開示の範囲内に、サイクル数または時間の関数として、核酸を増幅してアンプリコン合成を監視するデバイスに連結されたコンピュータを含む、装置またはシステムが入り、コンピュータは、本明細書で開示される定量的アルゴリズムを実行するようにプログラムされる。本開示による例示的なシステムは、温度制御されたインキュベータと、蛍光発光の少なくとも２つの波長を監視して区別することが可能な蛍光光度計とを含むであろう。これらの発光は、標的アンプリコン合成およびＩＣアンプリコン合成を示すために使用されてもよい。
【００６６】
（単一点較正および再較正手順がランダムアクセス形式を促進する）
リアルタイム増幅を有利に使用して、試験サンプル中の標的核酸を定量化する、現代の「ランダムアクセス」デバイスは、エンドユーザが機器の電源を複数回オンおよびオフにすることを可能にするであろう。したがって、単一のキット用の試薬は、キットが完全に使用される前に数回、装填／装填解除されてもよい。結果として、（例えば、キットが機器上に装填される度に）較正プロットを再実行することが必要であり得る。２つ以上の較正物質が各較正または再較正手順に採用された場合、ランダムアクセス特徴に適応するように、有意なキットリソースが消費され得る。しかしながら、このプロセスは、本明細書で開示されるように、固定点アプローチを使用して単純化することができる。
【００６７】
１つの好ましい実施形態では、固定点は、分析製造業者によって確立され、次いで、キットの購入に関連する顧客またはエンドユーザに提供される。例えば、較正標準の集合を、分析製造業者の場所での機器上で増幅することができ、それによって、被分析ポリヌクレオチド標準およびＩＣのそれぞれについて増幅兆候が判定される。一方の値を他方の値で、これらの値を除算することにより（例えば、ＣＴＴａｒｇｅｔ／ＣＴＩＣ）、電子表計算ソフトウェアを使用して描画され得る、比率値を確立する。曲線または線を収集された点に適合することにより、第１の較正プロットをもたらす。較正プロットを比率値が０に等しい点まで拡張することにより、固定点として使用することができる点を識別する。より具体的には、入力標的量または濃度が０の比率値に対応するであろう、外挿点は、同一の機器、または異なる機器上でさえも較正プロットを作成するための固定点として使用することができる。異なる言い方をすると、単一の調整較正物質を使用して作成される全ての較正プロットは、その同一の固定点を共有するであろう。
【００６８】
異なる好ましい実施形態では、内部較正調整に使用される固定点は、ローカル機器のみを使用して、エンドユーザによって作成されてもよい。例えば、これは、０の比率値を生じることが期待される被分析ポリヌクレオチド標準の入力量または濃度を判定することを伴うことができる。当然ながら、これは、少なくとも最初に、エンドユーザ側で付加的な努力を必要とするであろう。おそらく、これの平衡を保つことが、特定の機器に特有の基準曲線を作成するという起こり得る利益である。
【００６９】
ある実施形態では、最初にキットが使用されるときに、ローカル機器上でエンドユーザによって従来の較正プロットを確立することができる。これは、２つの較正反応の実施を伴い得る。両方の較正物質中の標的およびＩＣの増幅の時間依存性またはサイクル数依存性を判定し、例えば、同一の反応で増幅したＩＣの兆候で標的の兆候を除算することによって正規化することができる。試験サンプル中の標的核酸を定量化するために即時に使用することができる、較正プロットを確立するために、２つの点を使用することができる。別個に、０の比率値と関連付けられる入力標的数量または濃度に対応する点を識別するように、結果として生じる較正プロットを投影することができる。この投影された点は、再較正プロットを作成するための固定点として使用することができる。初期較正プロットを作成するために使用されないが、識別された固定点を再較正手順と併せて使用するために記憶することができる。
【００７０】
システム再較正は、わずか１つの調整較正物質を使用して実行することができる。固定点の可用性を考慮すると、比率値を生じるように標的および同時増幅ＩＣの増幅兆候を正規化することができ、正規化された結果は、完全較正曲線をもたらすように固定点と組み合わせて使用することができる。
【００７１】
一般的に言えば、周期的機器較正を促進するように、最小限のリソースを使用して較正および再較正手順を行うことに明確な利点がある。実際、研究室リソースを節約することは、単一点システム較正または再較正手順を採用するための理由である。
【００７２】
（基準較正曲線および固定点を選択する好ましい方法）
開示された較正アプローチで採用されるような、入力標的量または濃度の関数としての標的およびＩＣの増幅兆候の比の較正プロット上の固定点は、種々の方法で判定することができる。ある好ましいアプローチでは、異なるリアルタイム増幅および検出機器を使用する複数の較正標準の増幅および検出からの集合結果が組み合わせられ、単一の最良適合較正曲線が集合結果（すなわち、異なる較正標準のそれぞれからの集合増幅兆候データ点）に適合される。これは、（例えば、分析製造業者およびエンドユーザに属する）異なる機器上で分析を行うことに起因する、較正プロットの変動を効果的に平均する。（本明細書の実施例で明示される）代替的なアプローチでは、単一のリアルタイム機器のみからの結果を使用して、単一の較正曲線が確立された。一般的に言えば、いったん較正曲線がある手段によって確立されると、同一または異なる機器上で実行される単一の調整較正物質からの結果と組み合わせて使用される、固定点を選択するプロセスが続く。これは、種々の条件下で被分析ポリヌクレオチドを定量化するために有用な「調整された」較正曲線を生じるように、調整較正物質からの結果と組み合わせて（例えば、異なる較正標準、補間データ点、または外挿データ点に対応する）較正曲線からの候補点を試験することを伴い得る。これらの異なる条件は、異なる機器上で分析を実行すること、または経年劣化した、あるいは「応力を受けた」試薬条件を使用すること等を含み得る。
【００７３】
他の好ましいアプローチでは、固定点は、較正プロットの外挿によって０の比率値（例えば、ＣＴＴａｒｇｅｔ／ＣＴＩＣまたはＴＴｉｍｅＴａｒｇｅｔ／ＴＴｉｍｅＩＣ等）を生じるであろう、入力標的量または濃度として識別される。１つの好ましい方法では、１つ以上の異なる機器上で生成される較正データを使用して、プロットが生成される。例えば、次いで、エンドユーザの機器（すなわち、判定を行うために使用されるものとは異なる機器）上で使用するためにキットのエンドユーザに提供される、固定点を判定するために、分析製造業者の現場での１つ以上の機器が使用されてもよい。代替として、固定点は、試験を受けるサンプル中の標的核酸を定量化するために使用される同一の機器（例えば、ローカル機器）上で判定することができる。この場合、エンドユーザは、単一の機器上で増幅反応を実行し、複数の較正プロットを生成するために結果として生じるデータを使用し、次いで、固定点を判定するために較正プロットを使用してもよい。２つより多くの較正プロットが利用可能である場合、０の比率値と関連付けられる入力標的値を平均することによって、固定点を判定することが望ましくあり得る。ある好ましい実施形態では、固定点を確立するために使用される較正プロット自体が、複数の異なる較正標準を使用して作成される。ある極めて好ましい実施形態では、固定点を確立するために使用される較正プロットは、２つの異なる較正標準を使用して作成される。
【００７４】
（実施例）
以下の実施例の全てにおける核酸標的捕捉および増幅手順は、サイクル数または時間の関数として、温度制御された条件下で核酸を増幅し、（例えば、蛍光の光学監視によって）アンプリコン産生を監視することが可能な自動機器を使用して、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）で行われた。その開示全体が参照することにより本明細書に組み込まれる、公開された米国特許出願第２０１１／０１４７６１０号は、リアルタイム増幅手順を行うための好ましい機器の特徴を詳述する。別の好ましい機器が、その開示が参照することにより本明細書に組み込まれる、米国特許第６，７１３，２９７号で説明されている。被分析標的およびＩＣの合成転写産物は、反応でテンプレートとしての機能を果たした。合成ＩＣ転写産物の一定の１５０，０００個のコピー、および増幅のためのテンプレートとしての機能を果たした被分析標的転写産物の量を含有する０．５ｍｌアリコートを組み合わせることによって、処理および増幅されるサンプルが調製された。本手順で使用された標的核酸の濃度は、６回の反応のセットにわたって１０２〜１０７個のコピー／ｍｌに及んだ。サンプル中の不純物を除去または削減するように、標的捕捉および洗浄ステップに続いて、テンプレート核酸を使用して、増幅反応が実行された。標的およびＩＣテンプレートは、独立プライマーセット（すなわち、共有プライマーがない）を使用して、同一の反応で同時増幅された。それぞれ異なる蛍光レポータを抱える、区別可能に標識されたアンプリコン特有の分子トーチハイブリダイゼーションプローブを使用して、増幅産物が検出および監視された。全ての増幅反応が、反復して行われた。その開示が参照することにより本明細書に組み込まれる、公開された特許出願第２００６／０２７６９７２号で本質的に説明されるように、ＴＴｉｍｅアルゴリズムを使用して、同時増幅標的およびＩＣのそれぞれの増幅兆候を表す閾値時間値が判定された。同一の反応で増幅したＩＣについて判定されたＴＴｉｍｅ値（すなわち、ＴＴｉｍｅＩＣ）で、標的について判定されたＴＴｉｍｅ値（すなわち、ＴＴｉｍｅＴａｒｇｅｔ）を除算することによって、比率値が計算された。
【００７５】
明確にすると、内部較正物質ポリヌクレオチドは、較正標準で、調整較正物質で、および試験サンプル増幅反応で同一であった。同様に、内部較正物質ポリヌクレオチドの量（例えば、開始濃度）は、全ての反応で同一であった。
【００７６】
実施例１は、核酸を増幅し、リアルタイム形式でアンプリコン産生を監視する、第１の機器を使用して生成された、線形基準較正プロットが、単一点較正手順で後に使用するための固定点を確立するためにどのようにして使用されたかを示す。第１の機器は、以下では機器「Ｖ３５」と称される。
【００７７】
（実施例１）
（内部較正調整のための固定点を確立する）
Ｖ３５として識別された第１のリアルタイム機器を使用して、６つの核酸較正標準が５回の反復で増幅された。機器Ｖ３５上の全ての反応は、増幅に先立って標的核酸を濃縮するための標準標的捕捉試薬（「ＴＣＲ」）を使用して実行された。較正反応に使用されたサンプルは、それぞれ０．５ｍｌの体積、および１０２〜１０７個のコピー／ｍｌに及んだ核酸標的濃度を有した。異なるサンプルから捕捉された核酸は、ＩＣの固定された１５０，０００個のコピーで反復して同時増幅された。標的およびＩＣの測定されたＴＴｉｍｅ増幅兆候は、閾値比率値を生じるように正規化された（すなわち、ＴＴｉｍｅＴａｒｇｅｔ／ＴＴｉｍｅＩＣ）。入力標的数量（例えば、濃度）の関数としての比率値の線形較正プロットが確立され、本明細書では「値が割り当てられた」数量と称される、実際の標的開始数量を、各異なる較正標準に割り当てるために使用された。表１は、較正標準の要約された結果および値が割り当てられた濃度を表し、値の割当は、６つ全ての較正物質を使用して確立された。表１の中の数値結果は、適切な小数第２位以上を使用して提示される。
【表１】
0006463332.tif 000002
【００７８】
実施例２は、第２のリアルタイム機器（すなわち、以下では「Ｖ５３」と称される）上で取得された結果を処理するために、第１のリアルタイム機器（すなわち、Ｖ３５）上で確立された固定点をどのようにして使用することができたかを例証する。異なる較正標準を増幅するために機器Ｖ５３を使用して取得された結果は、線形較正プロットを作成するように機器Ｖ３５を使用して確立された固定点と個別に対合された。これらの較正プロットは、後に、機器Ｖ５３上で実行された残りの反応からの試験を過去のデータによって検証するために使用された。異なる言い方をすると、一方の較正標準が調整較正物質として扱われた一方で、他方の較正標準が模擬試験サンプルとして扱われ、調整較正物質および固定点からの結果を使用して判定された、調整された較正曲線を使用して、模擬試験サンプル中に存在する標的核酸の数量が判定された。
【００７９】
（実施例２）
（固定点を組み込む、調整された較正曲線の作成）
実施例１で説明されるものに類似する核酸増幅反応が、リアルタイム機器Ｖ５３を使用して行われ、監視された。表２は、較正標準の要約された結果および値が割り当てられた濃度を提示し、値の割当は、６つ全ての較正物質を使用して行われた。値が割り当てられた数量は、概して、真の定量値と見なされる。表２の中の数値結果は、適切な小数第２位以上を使用して提示される。
【表２】
0006463332.tif 000003
【００８０】
表３は、調整された較正曲線を生成するために、第２の機器（Ｖ５３）上で生成された単一の結果と組み合わせて、第１の機器（Ｖ３５）を用いて確立された固定点をどのようにして使用することができたかを例証する。表２の中の個々の較正標準１−６からの比および値の割当の結果は、６つの異なる調整された線形較正曲線を生成するように、固定点（１０．３９８９，０）と対合された。例えば、第１の線形較正プロットは、２つの点（２．０２５２，１．０４２４）および（１０．３９８９，０）に基づいた。このようにして、各較正標準は、模擬調整較正標準として独立して扱われた。次いで、調整された線形較正曲線を確立するために使用されなかった表２の中の残りの入力は、模擬試験サンプルとしての機能を果たし、標的量が計算された。値が割り当てられた標的数量と、調整された較正曲線を使用して計算された値との間の差もまた、表３で提示される。全ての表集計値は、ログコピー／ｍｌ単位である。
【表３】
0006463332.tif 000004
【００８１】
実施例３は、加速した分解によって損なわれた試薬を使用して核酸標的を定量化するための手順で、上記で説明される方法によって確立された固定点もまた、どのようにして使用することができたかを例証する。
【００８２】
（実施例３）
（加速した分解条件を受けた試薬を使用して標的核酸を定量化する）
Ｖ４７として識別された第３のリアルタイム機器を使用して、６つの核酸較正標準が増幅された。加速した分解を助長するように、５５℃で加熱を２８日間受けたＴＣＲを使用して、全ての反応が実行された。全ての他の増幅反応および監視条件は、上記で説明されるものと類似した。
【００８３】
表４は、較正標準の要約された結果および値が割り当てられた濃度を提示し、値の割当は、６つ全ての較正物質を使用して行われた。表４の中の数値結果は、適切な小数第２位以上を使用して提示される。
【表４】
0006463332.tif 000005
【００８４】
上記のように、表４の中の個々の較正標準１−６からの結果は、６つの異なる調整された線形較正曲線を生成するように、機器Ｖ３５を使用して確立された固定点（１０．３９８９，０）と対合された。このようにして、各較正標準は、模擬調整較正標準として独立して扱われた。次いで、調整された線形較正曲線を確立するために使用されなかった表４の中の残りの入力は、模擬試験サンプルとしての機能を果たし、標的量が計算された。値が割り当てられた標的数量と、調整された較正曲線を使用して計算された値との間の差もまた、表５で提示される。全ての表集計値は、ログコピー／ｍｌ単位である。
【表５】
0006463332.tif 000006
【００８５】
実施例４は、異なる固定点を使用して表２および４からのデータを処理することによる、開示された単一点較正アプローチの利点を例証する。より具体的には、実施例１で確立された固定点を使用するもむしろ、機器Ｖ３５を使用して生成された較正曲線上の異なる点が確立された。以下で示されるように、この異なる固定点は、標準試薬を使用して取得されたデータを処理するときに非常に良好な結果を生じたが、加速した分解条件にさらされた試薬を使用して取得されたデータを処理するときには成績が良くなかった。
【００８６】
（実施例４）
（異なる固定点の使用が差分定量的能力につながる）
方程式１は、機器Ｖ３５を使用して生成された線形較正曲線上の点の座標を判定するために解法され、その点は、７ログコピー／ｍｌの被分析ポリヌクレオチド標準の入力標的レベルに対応した。この点は、座標（７，０．４３１）を有した。
【００８７】
表２の中の個々の較正標準１−６からの結果は、６つの異なる調整された線形較正曲線を生成するように、固定点（７，０．４３１）と対合された。このようにして、各較正標準は、模擬調整較正標準として独立して扱われた。次いで、調整された線形較正曲線を確立するために使用されなかった表２の中の残りの入力は、模擬試験サンプルとしての機能を果たし、標的量が計算された。値が割り当てられた標的数量（すなわち、至適標準値を表す）と、調整された較正曲線を使用して判定された値との間の差もまた、表６で提示される。全ての表集計値は、ログコピー／ｍｌ単位である。
【表６】
0006463332.tif 000007
【００８８】
表４の中の個々の較正標準１−６からの結果は、６つの異なる調整された線形較正曲線を生成するように、固定点（７，０．４３１）と対合された。このようにして、各較正標準は、模擬調整較正標準として独立して扱われた。次いで、調整された線形較正曲線を確立するために使用されなかった表４の中の残りの入力は、模擬試験サンプルとしての機能を果たし、標的量が計算された。値が割り当てられた標的数量と、調整された較正曲線を使用して計算された値との間の差もまた、表７で提示される。全ての表集計値は、ログコピー／ｍｌ単位である。
【表７】
0006463332.tif 000008
【００８９】
前述の内容は、完全較正曲線（すなわち、調整された較正曲線）を再現するように、単一の調整較正物質からの結果と組み合わせて使用するための候補固定点として、単一の較正曲線（例えば、「第１の」較正曲線）からの異なる点をどのようにして評価することができるかを図示する。明確に、試験サンプル中の被分析ポリヌクレオチドを定量化することに関して、結果として生じる調整された較正曲線の値の間に差がある。ｘ切片および第１の較正曲線からの１つの点が、本技法を例証するために使用されたが、第１の較正曲線に沿った任意の数の点を分析のために選択できることを理解されたい。例えば、試験することができる第１の較正曲線からの付加的な点は、限定ではないが、ｙ切片、ｘ切片、種々の較正標準で使用される被分析ポリヌクレオチドの入力量に対応する値、またはさらに較正標準データ点の間に補間される点、あるいは分析の動的範囲を越える外挿を含んだ。
【００９０】
成長曲線を生成するローカル機器を使用して取得される定量的結果を処理するために、どの点が固定点として使用されるべきかを選択するためのプロセスは、異なる検討事項を考慮する。これらの検討事項は、再度、限定ではないが、試薬安定性、異なる温度間の試薬の循環、核酸増幅を行うための異なる温度条件の使用等を含む。較正標準の回復された濃度の精度を査定すること、およびそれによって実現される最高精度に基づいて固定点を選択することが望ましくあり得る。
【００９１】
本開示は、そのいくつかの具体的実施例および実施形態を参照して説明されている。当然ながら、本開示のいくつかの異なる実施形態自体が、前述の詳細な説明を再検討することにより、当業者に示唆されるであろう。したがって、本開示の真の範囲は、添付の請求項を参照して判定されるものである。