(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
増殖性疾患の治療剤の製造における組成物の使用であって、前記組成物は、
（１）エピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣＧ）と、
（２）クルクミンと、
（３）スルフォラファン（ＳＦＮ）、ブロッコリースプラウト（ＢＳＰ）、またはブロッコリースプラウト（ＢＳＰ）の粉末と、および
（４）カイワレ大根、カイワレ大根抽出物、またはカイワレ大根抽出物もしくはカイワレ大根の粉末とを、
含有し、かつ
任意選択的に、修正ケトン生成食又はケトン生成食が対象に提供されることを特徴とする、
治療剤の製造における組成物の使用。
【請求項２】
前記増殖性疾患が、癌である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記増殖性疾患が、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、エイズ関連癌、エイズ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、小脳星状細胞腫、基底細胞癌、胆管癌、肝臓外膀胱癌、膀胱癌、骨癌、骨肉腫及び悪性繊維性組織球腫、胎児性腫瘍、大脳星状細胞腫、上衣芽細胞腫、神経髄芽細胞腫、上衣細胞腫、中分化型松果体実質部腫瘍、テント上未分化神経外胚葉性腫瘍及び松果体芽細胞腫、視経路及び視床下部癌、脳脊髄腫瘍、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、胃腸癌、頭頚部癌、中枢神経系リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮体癌、上衣芽細胞腫、上皮細胞腫、食道癌、ユーイングファミリー腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、肝臓外胆管癌、眼の癌、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃（Ｓｔｏｍａｃｈ）癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）、頭蓋外胚細胞腫瘍、胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣癌、妊娠性絨毛腫瘍、有毛状細胞性白血病、頭頚部癌、肝細胞（肝臓）癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、膵島細胞腫瘍（膵臓内分泌腺）、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）癌、腎臓癌、喉頭癌、慢性リンパ性白血病、慢性白血病、骨髄性白血病、口唇及び口腔癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞型リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、マクログロブリン血症、ヴァルデンストレム、骨の悪性繊維性組織球腫及び骨肉腫、神経髄芽細胞腫、上衣細胞腫、黒色腫、眼内メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明の転移性頚部扁平上皮癌、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、脊髄形成異常／骨髄増殖疾患、骨髄性白血病、多発性骨髄増殖障害、鼻腔及び副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽腫、非小細胞肺癌、口腔癌、口腔内癌、口唇及び口腔咽頭癌、骨肉腫及び骨の悪性繊維性組織症、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、低悪性度卵巣腫瘍、膵臓癌、膵臓癌、膵島細胞腫瘍、乳頭腫、副鼻腔及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、クロム親和性細胞腫、中間型松果体実質腫瘍、松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞新生物／多発性骨髄腫、胸膜配芽球腫、原発性中枢神経リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）癌、腎盂尿管癌、移行上皮細胞癌、染色体１５上のＮＵＴ遺伝子が関与する呼吸器管の癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、カポジ肉腫、軟組織肉腫、子宮セザリー症候群、皮膚癌（非黒色腫）、皮膚上皮癌、メルケル細胞、小細胞肺癌、腸癌、扁平細胞癌、原発不明の頚部扁平上皮癌、テント上原始神経外胚葉腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫及びセザリー症候群、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫瘍及び胸腺、甲状腺癌、腎盂尿管の移行上皮細胞癌、妊娠性絨毛腫瘍、原発部位が不明の上皮癌、尿道癌、子宮内膜肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレーム型マイクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍からなる群から選択される、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記癌が、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、及び肺癌からなる群から選択される、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
前記使用が、前記増殖性疾患を治療するための追加の療法又は療法（複数）をさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記増殖性疾患を治療するための前記追加の療法又は療法（複数）が、放射線療法、化学療法、手術、小型分子、キナーゼ阻害、免疫療法、及び／又はモノクローナル抗体療法から選択される、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記追加の療法又は療法（複数）が、酢酸アビラテロン、アビトレキサート（メトトレキサート）、アブラキサン（パクリタキセルアルブミン懸濁型ナノ粒子化製剤）ＡＢＶＤ、ＡＢＶＥ、ＡＢＶＥ−ＰＣ、ＡＣ、ＡＣ−Ｔ、アドセトリス（ブレンツキシマブ  べドチン）ＡＤＥ、アドリアマイシン（ドキソルビシン塩酸塩）、アドルシル（フルオロウラシル）、アフィニトール（エベロリムス）、アルダラ（イミキモド）、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリムタ（ペメトレキセド二ナトリウム）、アロキシ（パロノステロン塩酸塩）、アムボクロリン（クロラムブシル）、アミノレブリン酸、アナストロゾール、アプレピタントアリミデックス（アナストロゾール）、アロマシン（エキセメスタン）、アルラノン（ネララビン）、三酸化アルセニン、アルゼラ（オファツムマブ）、アスパラギナーゼ  エルウィニア・クリサンセミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）、アバスチン（ｂｅｂａｓｈｉｚｕｍａｂｕ）アキシチニブ、アザシチジン、ＢＥＡＣＯＰＰ、ベンダムスチン塩酸塩、ＢＥＰ、ベバシズマブ、ベキサロテン、ベキサー（トシツモマブ及びＩ  １３１  ヨウ素  トシツモマブ）、ブレオマイシン、ボルテゾマブ、ボスリフ（ボスチニブ）ボスチニブ、ブレンツキシマブ  ベドチン、カバジタキセル、カボザンチニブ−Ｓ−マレート、ＣＡＦ、カンパス（アレムツズマブ）、カンプトサール（イリノテカン塩酸塩）、カペシタビン、ＣＡＰＯＸ、カルボプラチン、カルボプラチン−タキソール、カルフィルゾマブ、ＣｅｅＮＵ（ロムスチン）、セルビジン（ダウノルビシン塩酸塩）、セルバリックス（組換えＨＰＶ二価ワクチン）、セツキシマブ、クロラムブシル、クロラムブシル−プレドニゾン、ＣＨＯＰ、シスプラチン、クラフェン（シクロホスファミド）、クロファラビン、クロファレックス（クロファラビン）、クロラール（クロファラビン）、ＣＭＦ、コメトリク（カボザンチニブ−Ｓ−マレート）、ＣＯＰＰ、コスメゲン（アクチノマイシンＤ）、クリゾチニブ、ＣＶＰ（ＣＯＰ）、シクロホスファミド、Ｃｙｆｏｓ（イホスファミド）シタラビン、シタラビン、リポソーム化シトサール−Ｕ（シタラビン）、シトキサン（シクロホスファミド）、ダカルバジン、ダコゲン（デシタビン）、アクチノマイシンＤ、ダサチニブ、ダウノルビシン塩酸塩、デシタビン、デガレリクス、デニロイキン、ジフィチトクス、デノスマブ、ＤｅｐｏＣｙｔ（リポソーム化シタラビン）、ＤｅｐｏＦｏａｍ（リポソーム化シタラビン）、デキストラゾキサン塩酸塩、ドセタキセル、ドキシル（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム型）、ドキソルビシン塩酸塩、ドキソルビシン塩酸塩リポソーム、Ｄｏｘ−ＳＬ（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム型）、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍe（ダカルバジン）、エフデックス（フルオロウラシル）、エリテック（ラスブリカーゼ）、エレンス（エピルビシン塩酸塩）、エロキサチン（オキサリプラチン）、エルトロムボパグ  オラミン、イメンド（アプレピタント）、エンザルタミド、エピルビシン塩酸塩、ＥＰＯＣＨ、アービタックス（セツキシマブ）、メシル酸エリブリン、エリベッジ（ビスモデギブ）、アルロチニブ塩酸塩、エルウィナーゼ（アスパラギナーゼ  エルウィ��ア・クリサンセミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ））、エトポフォス（リン酸エトポシド）、エトポシド、リン酸エトポシド、エバセット（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム型）、エベロリムス、エビスタ（ラロキシフェン塩酸塩）、エキセメスタン、ファレストン（トレミフェン）、ファスロデックス（フルベストラント）、ＦＥＣ、フェマーラ（レトロゾール）、フィルグラスチン、フルダラ（リン酸フルダラビン）、リン酸フルダラビン、フルオロプレックス（フルオロウラシル）、フルオロウラシル、フォレックス（メトトレキサート）、フォレックスＰＦＳ（メトトレキサート）、フォルフィル、フォルフィリ−ベバシズマブ、フォルフィルノクス、フォルフォックス、フォロチン（プララトレキサート）、ＦＵ−ＬＶ、フルベストラント、ガルダシル（組換えＨＰＶ四価ワクチン）、ゲフィチニブ、ゲムシタビン塩酸塩、ゲムシタビン−シスプラチン、ゲムツズマブ  オゾガマイシン、ジェムザール（ゲムシタビン塩酸塩）、グリベック（メシル酸イアマチニブ）、グルカルピダーゼ、ハラベン（メシル酸エリブリン）、ヘルセピン（トラスツズマブ）、ＨＰＶ二価ワクチン（組換え体）、ＨＰＶ四価ワクチン（組換え体）、ハイカムチン（トポテカン塩酸塩）、イブリツモマブ  チウキセタン、ＩＣＥ、イクルシグ（ポナチニブ塩酸塩）、アイフェックス（イホスファミド）、イホスファミド、イホスファミダム（イホスファミド）、メシル酸イマチニブ、イミキモド、インライタ（アキシチニブ）、イピリムマブ、イレッサ（ゲフィチニブ）、イリノテカン塩酸塩、イストダックス（ロミデプシン）、イキサベピロン、イクゼンプラ（イキサベピロン）、ジャカフィ（リン酸ルキソリチニブ）、ジェブタナ（カバジタキセル）、ケオキシフェン（ラロキシフェン塩酸塩）、ケピバンス（パリフェルミン）、キプロリス（カルフィルゾミブ）、トシル酸ラパチニブ、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリンカルシウム、ロイケラン、（クロラムブシル）、酢酸ロイプロリド、レブラン（アミノレブリン（酸））、リンフォリジン（クロラムブシル）、リポドックス（ドキソルビシン塩酸塩、リポソーム型）、リポソーム化シタラビン、ロムスチン、ルプロン（酢酸ルプロリド）、ルプロンデポット（酢酸ルプロリド）、ルプロンデポット−Ｐｅｄ（酢酸ルプロリド）、ルプロンデポット３ヶ月（酢酸ルプロリド）、ルプロンデポット４ヶ月（酢酸ルプロリド）、マルキボ（硫酸ビンクリスチン、リポソーム型）、マチュイレーン（プロカルバジン塩酸塩）、メクロレタミン塩酸塩、メスナ、メスネックス（メスナ）、メタゾラストン（テモゾロミド）、メトトレキサート、メトトレキサートＬＰＦ（メトトレキサート）、メキセート（メトトレキサート）、メキセート−ＡＱ（メトトレキサート）、ミトマイシンＣ、ミトジトレックス（ミトマイシンＣ）、ＭＯＰＰ、モゾビル（プレリキサフォル)、ムスタルゲン（メクロレタミン塩酸塩）、ムタマイシン（ミトマイシンＣ）、ミロサール（アザシチジン）、ミロタルグ（ゲムツズマブ  オゾマイシン）、ナノ粒子パクリカキセル（パクリタキセルアルブミン懸濁型ナノ粒子化製剤）、ナベルビン（酒石酸ビノレルビン）、ネララビン、ネオサール（��クロホスファミド）、ニューポジェン（フィルグラスチン）、ネキサバール（トシル酸サロフェニブ）、ニロチニブ、ノルバデックス（クエン酸トモキシフェン）、Ｎｐｌａｔｅ（ロモプロスチン）、オファツムマブ、オマセタキシン、メペスクシネート、オンキャスパー（ペグアスパラガーゼ）、オンタック（デニロイキン  ジフチトクス）、オキサリプラスチン、パクリタキセル、パクリタキセルアルブミン懸濁型ナノ粒子化製剤、パリフェルミン、パロノセトロン塩酸塩、パニツムマブ、パラプラット（カルボプラチン）、パラプラチン（カルボプラチン）、パゾパニブ塩酸塩、ペグアスパラガーゼ、ペメトレキセド二ナトリウム、パージェタ（ペルツズマブ）、ペルツムマブ、プラチノール（シスプラスチン）、プラチノール−ＡＱ（シスプラスチン）、プレリキサフォル、ポナチニブ塩酸塩、プララトレキサート、プレドニゾン、プロカルバジン塩酸塩、プロロイキン（アルデスロウキン）、プラリア（デノスマブ）、プロマクタ（エルトロンボパグ  オラミン）、プロベンジ（シプロイセル−Ｔ）、ラロキシフェン塩酸塩、ラスブリカーゼ、Ｒ−ＣＨＯＰ、Ｒ−ＣＶＰ、組み換えＨＰＶ二価ワクチン、組み換えＨＰＶ、四価ワクチン、レゴラフェニブ、レブリミド（レナリドミド）、リウマトレックス（メトトレキサート）、リツキサン（リツキシマブ）、リツキシマブ、ロミデスピン、ロミプロスチム、ルビドマイシン（ダウノルビシン塩酸塩）、リン酸ルキソリチニブ、スクレロソール・イントラプルーラル、アエロゾル（タルク）、シプロイセル−Ｔ、トシル酸ソラフェニブ、スプリシル（ダサチニブ）、スタンフォードＶ、滅菌タルク粉末（タルク）、ステリタルク（タルク）、スチバーガ（レゴラフェニブ）、リンゴ酸スニチニブ、ステント（リンゴ酸スニチニブ）、サイノビル（サリドマイド）、シンリボ（オマセタキシン  メピスクシネート）、タルク、クエン酸タモキシフェン、タラビンＰＦＳ（シタラビン）、タルセバ（エルロチニブ塩酸塩）、タルグレチン（ベキサロテン）、タシグナ（ニロチニブ）、タキソール（パクリタキセル）、タキソテール（ドセタキセル）、テモダール（テモゾロミド）、テモゾロミド、テムシロリムス、サリドマイド、サロミド（サリドマイド）、トポサール（エトポシド）、トポテカン塩酸塩、トレミフェン、トリセル（テミロリムス）、トシツモマブ及びＩ  １３１ヨウ素トシツモマブ、トテクト（デクスラゾキサン塩酸塩）、トラスツズマブ、トレアンダ（ベンダムスチン塩酸塩）、トリセノックス（三酸化ヒ素）、タイケルブ（二トシル酸ラパチニブ）、バンデタニブ、ＶＡＭＰ、ベクティビックス（パニツムマブ）、ＶｅＩＰ、ベルバン（硫酸ビンブラスチン）、ベルケイド（ボルテゾミブ）、ベルサール（硫酸ビンブラスチン）、ベムラフェニブ、ベプシド（エトポシド）、ビアジュール（酢酸ロイプロリド）、ビダーザ（アザシチジン）、硫酸ビンブラスチン、ビンカサーＰＦＳ（硫酸ビンクリスチン）、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンクリスチンリポソーム型、酒石酸ビノレルビン、ビスモデジブ、ボラキサーゼ（グルカルピダーゼ）、ボリノスタット、ボトリエント（パゾパニブ塩酸塩）、ウェルコボリン（ロイコボリンカルシウム）、ザーコリ（クロゾチニブ）、ゼローダ（カペシタビン）、ＸＥＬＯＸ、イクスゲバ（デノスマブ）、イクスタンジ（エンザルタミド）、ヤーボイ（イピリムマブ）、ザルトラップ(Ｚｉｖ−アフリベルセプト)、セルボラフ（ベムラフェニブ）、ゼバリン（イブリツモマブ  チウキセタン）、ザインカード（デクスラゾキサン塩酸塩）、Ｚｉｖ−アフリベルセプト、ゾレドロン酸、ゾリンザ（ボリノスタット）、ゾメタ（ゾレドロン酸）、又はザイティガ（酢酸アビラテロン）から選択される化合物の１つ以上を投与することを含む、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記癌が膠芽細胞腫である、請求項２に記載の使用。
【請求項９】
前記組成物がブロッコリースプラウト（ＢＳＰ）を含有する、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
前記組成物がブロッコリースプラウト（ＢＳＰ）の粉末を含有する、請求項１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１４日に出願された、米国特許仮出願第６１／７８４，３８６号の利益を主張するものであり、この開示は、全ての図面、表並びにアミノ酸又は核酸配列を含めるその全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
大部分の癌細胞における酸化的リン酸化から好気的解糖（ワールブルク効果として知られる）へのシフトのために、癌は、エネルギー束がエネルギーを発生する高効率的な方法（グルコースの１分子からＡＴＰの３６分子）から非効率的な方法（グルコースの１分子からＡＴＰの４分子）までシフトされる代謝疾患とみなされ得る。その結果、癌細胞は、生存しかつ増殖するために、莫大な量のグルコースを消費する。ワールブルグ効果とシグナル伝達経路の変化との間の関係については色々な意見があるが、過剰量のグルコース及びシグナル伝達経路の変化のための腫瘍細胞の組み合わされた確実性は、これら２つの関連する現象を標的化することが、癌治療におけるより良い転帰を提供し得ることを示唆している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
大部分の癌治療は、癌性細胞を殺傷することを目指した毒性化学物質の使用を用いる。これらの治療は高度に有効であるが、残念ながら、これらは正常な非癌性細胞に及ぼす同様な効果を更に有する。有効かつ忍容性に優れる化学療法計画を開発するために重要なポイントは、化合物のポジティブな腫瘍殺傷効果と毒性副作用とを釣り合わせることである。シグナル伝達経路の変化を標的化し、エネルギー束に影響を及ぼすことができる非毒性化合物の使用は、有効かつ忍容性がある治療を提供することができる。非毒性アプローチを用いることの追加の利点は、毒性が蓄積する機会を減らしながら、複数の薬剤を同時に適用するための能力である。本発明は、癌性細胞中のシグナル伝達経路の変化及びエネルギー束を標的とする増殖性障害の治療を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、増殖性疾患に対する治療を必要とする対象に、１つ以上の天然生成物（化合物）を含む組成物を投与することと、必要に応じて、対象に低炭水化物食を対象に同時に提供することと、を含む増殖疾患の治療を提供する。本発明の特定の実施形態では、対象は修正ケトン生成食（ｍＫＤ）又はケトン生成食（ＫＤ）を摂取する（又は提供される）。したがって、本発明は、増殖性疾患に対する治療の必要がある対象のための療法も提供し、この療法は、ｍＫＤ又はＫＤ食を摂取する対象に、エピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣＧ）、クルクミンから選択される１つ以上の天然化合物（成分（複数可））、グルコシノレート及び／又はこれらの誘導体（グルコラファニン及び／又はスルフォラファン（ＳＦＮ）など）（ブロッコリースプラウト又は他のアブラナ科野菜のスプラウトで見出される）を含む組成物、必要に応じて、カイワレダイコン、カイワレ大根抽出物若しくは該抽出物又はカイワレ大根の粉末を投与することを含む。本発明の別の態様では、増殖性障害を治療する方法は、エピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣＧ）、クルクミンから選択される１つ以上の天然成分（複数可）、グルコシノレート及び／又はこれらの誘導体（グルコラファニン及び／又はスルフォラファン（ＳＦＮ）など）（ブロッコリースプラウト、他のアブラナ科野菜のスプラウト又はアブラナ科野菜それ自体に由来）を含む組成物、必要に応じてカイワレ大根、カイワレ大根抽出物若しくは該抽出物又はカイワレ大根の粉末を投与することと、任意選択的に、低炭水化物、ｍＫＤ又はＫＤ食を同時に提供することと、を含む。
【０００５】
本発明の別の態様は、腫瘍を発症している若しくは腫瘍を有する対象において、又はパーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳卒中、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）及び視神経脊髄炎（ＮＭＯ）などの神経変性疾患若しくは老化又は老人性認知障害に関連する疾患又は障害を有する対象において、神経幹細胞（ＮＳＣ）又はＣＮＳのそれらの後代［総じて前駆体細胞と呼ばれる］の損失又は増殖能力を減弱する／低減する方法を提供する。したがって、本発明のこの態様の様々な実施形態は、腫瘍を発症している若しくは腫瘍を有する対象において、若しくは神経変性疾患又は障害若しくはＣＮＳ機能における老化関連低下を有する対象において、ＣＮＳ中の前駆体細胞の活性における損失又は前記体細胞の数における損失を減弱し／低減する方法を提供し、方法は、エピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣＧ）、クルクミンから選択される１つ以上の天然化合物（成分（複数可））を含む組成物、グルコシノレート及び／又はそれらの誘導体（例えば、グルコラファニン及び／又はスルフォラファン（ＳＦＮ）（ブロッコリースプラウト、他のアブラナ科野菜のスプラウト又はアブラナ科野菜それ自体など）を含む組成物、必要に応じて、カイワレ大根、カイワレ大根抽出物又は該抽出物若しくはカイワレ大根の粉末を対象に投与することと、任意選択的に、これと同時に低炭水化物食、ｍＫＤ又はＫＤ食を提供することと、を含む。
【０００６】
本発明は、以下の天然化合物（成分）のうちの１つ以上を含む組成物も提供する：ＥＧＣＧ、クルクミン、グルコシノレート及び／又はそれらの誘導体（ＳＦＮ及び／又はグルコラファニン（必要に応じて、ブロッコリースプラウト、他のアブラナ科野菜のスプラウト又はアブラナ科野菜それ自体の形態で）など）を含む組成物、並びにカイワレ大根、カイワレ大根抽出物若しくは該抽出物又はカイワレ大根の粉末、任意選択的に、中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ｍＫＤの血糖値レベルに及ぼす効果である。血糖値レベルを、それぞれ異なる食餌［対照、ケトン生成食（ＫＤ）、修正ケトン生成食（ｍＫＤ）又はｍＫＤ／ＮＰ］で２週間にわたって飼育した動物間で比較した。血糖レベルは、ＫＤ、ｍＫＤ、天然生成物（ＮＰ）及びｍＫＤ／ＮＰ群の間で同様であって、対照と比較して有意に減少した（対照と比較して＊、＊＊＊は、ｐ＜０．０１、０．００１、一元配置分散分析法（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ））。処置組成は次の通りである：対照（５５％の炭水化物、３０％のタンパク質、１５％の脂肪）、ＫＤ（９２％の脂肪、３％の炭水化物、５％のタンパク質）、ｍＫＤ＝１０％の炭水化物、６０％の脂肪（半分はＭＣＴ、Ｎｅｏｂｅｅ  ５９８に由来）、３０％のタンパク質、天然生成物（ＮＰ）［５５％の炭水化物、３０％のタンパク質、１５％の脂肪＋ＳＦＮ（２５ｍｇ／ｋｇ；ＢＳＰ  ９５％／ＤＲＳＰ  ５％）、クルクミン（１２００ｍｇ／ｋｇ）、ＥＧＣＧ（１２００ｍｇ／ｋｇ）］、ｍＫＤ／ＮＰ＝ｍｋＤ＋天然生成物（ＮＰ）。
【図２】ｍＫＤの血中ケトンレベルに及ぼす効果である。血中ケトンレベルを、それぞれ異なる食餌［対照、ケトン生成食（ＫＤ）、修正ケトン生成食（ｍＫＤ）又はｍＫＤ／ＮＰ］で２週間にわたって飼育した動物間で比較した。ケトンレベルは、ＫＤ、ｍＫＤ、天然生成物（ＮＰ）及びｍＫＤ／ＮＰ群の間で同様であって、対照と比較して有意に減少した（対照と比較して＊＊＊は、ｐ＜０．００１、一元配置分散分析法（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ））。処置組成は次の通りである：対照（５５％の炭水化物、３０％のタンパク質、１５％の脂肪）、ＫＤ（９２％の脂肪、３％の炭水化物、５％のタンパク質）、ｍＫＤ＝１０％の炭水化物、６０％の脂肪（半分はＭＣＴ、Ｎｅｏｂｅｅ  ５９８に由来）、３０％のタンパク質、天然生成物（ＮＰ）［５５％の炭水化物、３０％のタンパク質、１５％の脂肪＋ＳＦＮ（２５ｍｇ／ｋｇ；ＢＳＰ  ９５％／ＤＲＳＰ  ５％）、クルクミン（１２００ｍｇ／ｋｇ）、ＥＧＣＧ（１２００ｍｇ／ｋｇ）］、ｍＫＤ／ＮＰ＝ｍｋＤ＋天然生成物（ＮＰ）。
【図３】ｍＫＤ／ＮＰの体重に及ぼす効果である。ｍＫＤ／ＮＰの毒性を、体重を１６日間にわたって監視することによって評価した。試験の過程にわたって、ｍＫＤ／ＮＰ処置動物は、体重を減少せず、対照動物と比べて体重増加も示した（ｐ＜０．００５、線形回帰分析）。
【図４】毒性−血液検査である。毒性を、次の被験物質の血漿測定値を介して、処置（ｍＫＤ／ＮＰ）の４週間後に評価した（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ）：クレアチニン（腎臓）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ、肝臓）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ、肝臓）、及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ、膵臓）。対照と比べてｍＫＤ／ＮＰ処置動物の間で差は観察されなかった（ｐ＞０．１、１標本ｔ検定）。
【図５】非腫瘍死−ＴＭＺ対ｍＫＤ／ＮＰである。腫瘍とは無関係の死亡率を、治療の過程中に監視した。通常の療法（テモゾロミド［ＴＭＺ］、２０ｍｇ／ｋｇ）と比べて、ｍＫＤ／ＮＰ処置は、１０倍まで死亡率を低下させた（＊＊、ｐ＜０．０１、ｔ検定）。
【図６】体重−ＴＭＺ対ｍＫＤ／ＮＰである。ｍＫＤ／ＮＰの毒性／安全性を、処置の４日後に体重を監視することによって、標準的ケア（ＴＭＺ、２０ｍｇ／ｋｇ）と比較した。対照とｍＫＤ／ＮＰ処置動物との間で差は観察されなかったが（ｐ＞０．０５、一元配置分散分析法（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ））、一方従来の治療で処置された動物は、対照及びｍＫＤ／ＮＰと比べて体重の有意な減少を示した（ＴＭＺと比較した＃＃、＃＃＃は、ｐ＜０．００１、ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析法（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ））。
【図７】ＮＰのインビトロの増殖倍率である。初代ヒトＧＢＭ幹細胞株を、ＥＧＣＧ（８μＭ）、クルクミン（０．５μＭ）及びスルフォラファン（２．５μＭ）又は３つ（Ｅ＋Ｃ＋Ｓ）全ての組み合わせを含む培養液で５日間のうち４日間毎日処置した。５〜７日後に細胞を継代させ、細胞計数を行った。個々の化合物の全てが、ＧＢ細胞の平均日増殖倍率において有意な減少を示した。３つの天然生成物（ＮＰ）の組み合わせは、全体として最強の効果を示した。この組み合わせの相乗効果は、ＮＰの各成分が、重複しないメカニズムを及ぼしていることを示唆している（対照と比べて、＊、＊＊、＊＊＊は、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析法（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）であり、ＮＰと比べて＃＃＃はｐ＜０．００１、一元配置分散分析法（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）であった）。顕微鏡写真は、異なる処置に曝露後４日目の培養物を示す。
【図８】個々のＮＰ対組み合わせのカプラン−マイヤー（ＫＭ）生存曲線である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、１ＭのｈＧＢ細胞を右側腹部内に接種した。ノギスを使用して、腫瘍直径の２つの測定値を記録し、これを次の式：（４／３）πＲ３を用いて変換することによって、腫瘍進行を追跡した。スフェロイド腫瘍については、２つの実測値を平均化し、スフェアの直径を決定した。楕円体腫瘍（すなわち、偏長スフェロイド又は扁平スフェロイド塊）の場合には、使用された式は、（４／３）π＊（ｄ／２）＊（ｄ／２）２であった。この場合、２番目の測定値「ｄ２」は２回計数され、「ｄ」は１回だけ計数された。偏長スフェロイドについては、長い実測値が１回存在するが、短い実測値が２回存在する。逆に、扁平スフェロイド腫瘍については、長軸測定を２回行うが、短軸測定は１回だけ行う。この基準に従って、腫瘍体積を経時的に追跡した。治療は、触診可能な塊が特定された際［約６５ｍｍ３］に開始した。動物が終点（１７００ｍｍ３の腫瘍体積）に到達したときに、動物を殺処分した。時間の関数としての生存する動物の割合をカプラン−マイヤー生存曲線を用いて表わした。ＮＰで処置した動物は、対照又は個々の成分で処置された動物を超える有意な改善を示した（＊、＊＊は、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．００５、ログランク検定）。
【図９Ａ】ＮＰ−癌幹細胞（ＣＳＣ）に及ぼす効果である。規定培地中で培養された患者由来のＧＢ細胞株を、ＮＰで処置した。培養の５〜７日後に、スフェアを採取し、単一細胞の懸濁液に解離させ、対照条件において９６ウェルプレート中、低密度で平板培養した。７日から１０日後に、スフェアの数を計数し（Ａ：クローン形成発生頻度）、サイズ分類した（Ｂ）。このアッセイは、スフェア形成細胞（すなわち、Ａのクローン形成発生頻度）に及ぼす、及びクローン（Ｂ）のそれぞれの増殖能力に及ぼす処置の効果を評価することができる。ヒトＧＳ細胞のインビトロでのＮＰへの７日間の曝露は、クローン形成発生頻度及びクローンの増殖能力において有意な減少をもたらす（＊＊、ｐ＜０．０１、ｔ検定）。
【図９Ｂ】ＮＰ−癌幹細胞（ＣＳＣ）に及ぼす効果である。規定培地中で培養された患者由来のＧＢ細胞株を、ＮＰで処置した。培養の５〜７日後に、スフェアを採取し、単一細胞の懸濁液に解離させ、対照条件において９６ウェルプレート中、低密度で平板培養した。７日から１０日後に、スフェアの数を計数し（Ａ：クローン形成発生頻度）、サイズ分類した（Ｂ）。このアッセイは、スフェア形成細胞（すなわち、Ａのクローン形成発生頻度）に及ぼす、及びクローン（Ｂ）のそれぞれの増殖能力に及ぼす処置の効果を評価することができる。ヒトＧＳ細胞のインビトロでのＮＰへの７日間の曝露は、クローン形成発生頻度及びクローンの増殖能力において有意な減少をもたらす（＊＊、ｐ＜０．０１、ｔ検定）。
【図１０Ａ】ＮＰ−ＣＳＣに及ぼす効果である。ＮＰはインビトロで腫瘍増殖細胞を標的化する。Ａ）患者由来のｈＧＢ細胞を、種々の処置条件下で、培養中で５継代にわたって連続継代させた。細胞は、ＥＧＣＧ（８μＭ）、クルクミン（０．５μＭ）、ＳＦＮ（２．５μＭ）、又はこれらの組み合わせ（ＮＰ）で処置した。ＮＰは、最大の増殖阻害効果を有した（＊、＊＊＊は、対照と比べてｐ＜０．０５、ｐ＜０．００１であり、＃＃＃は対照と比べてｐ＜０．００１であった。線形回帰分析）。Ｂ）腫瘍増殖細胞（別名癌幹細胞（ＣＳＣ））増殖の比（Ｋｌｌ）は、ＣＳＣが自己複製対称的分裂増殖を行う確率に直接的に相関し、増殖倍率の自然対数を取り、継代時間で除算することによって計算することができる（Ｄｅｌｅｙｒｏｌｌｅら、２０１１）。ヒトＧＢ細胞を、ニューロスフェアアッセイにおいて５継代にわたって培養し、その間、ＣＳＣの増殖を評価した。ＳＦＮ又はＮＰ処置群のみが、対照と比べてＣＳＣ自己複製対称的分裂増殖比の有意な減少を立証した。更にＮＰは、最大の効果を示し、このことは、特徴的な相乗効果を示唆している（対照と比べて＊＊＊はｐ＜０．００１であり、＃＃＃は、ＮＰと比べてｐ＜０．００１であった。一元配置分散分析法（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ））。
【図１０Ｂ】ＮＰ−ＣＳＣに及ぼす効果である。ＮＰはインビトロで腫瘍増殖細胞を標的化する。Ａ）患者由来のｈＧＢ細胞を、種々の処置条件下で、培養中で５継代にわたって連続継代させた。細胞は、ＥＧＣＧ（８μＭ）、クルクミン（０．５μＭ）、ＳＦＮ（２．５μＭ）、又はこれらの組み合わせ（ＮＰ）で処置した。ＮＰは、最大の増殖阻害効果を有した（＊、＊＊＊は、対照と比べてｐ＜０．０５、ｐ＜０．００１であり、＃＃＃は対照と比べてｐ＜０．００１であった。線形回帰分析）。Ｂ）腫瘍増殖細胞（別名癌幹細胞（ＣＳＣ））増殖の比（Ｋｌｌ）は、ＣＳＣが自己複製対称的分裂増殖を行う確率に直接的に相関し、増殖倍率の自然対数を取り、継代時間で除算することによって計算することができる（Ｄｅｌｅｙｒｏｌｌｅら、２０１１）。ヒトＧＢ細胞を、ニューロスフェアアッセイにおいて５継代にわたって培養し、その間、ＣＳＣの増殖を評価した。ＳＦＮ又はＮＰ処置群のみが、対照と比べてＣＳＣ自己複製対称的分裂増殖比の有意な減少を立証した。更にＮＰは、最大の効果を示し、このことは、特徴的な相乗効果を示唆している（対照と比べて＊＊＊はｐ＜０．００１であり、＃＃＃は、ＮＰと比べてｐ＜０．００１であった。一元配置分散分析法（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ））。
【図１１】日増殖倍率−インビトロでのＮＰ及びＴＭＺの効果である。初代ヒトＧＢ幹細胞株を、ＴＭＺ単独又はＥＧＣＧ（８μＭ）、クルクミン（０．５μＭ）、スルフォラファン（２．５μＭ）と組み合わせて、若しくは全ての３つの混合（ＮＰ）と組み合わせて、培養の５日間のうちの４日間にわたって毎日処置した。５〜７日後に、細胞を継代させて、細胞計数を行った。ＴＭＺ処置へのＥＧＣＧ、クルクミン又はＳＦＮの添加は、対照と比べて、ｈＧＢ細胞の平均日増殖倍率において有意な減少をもたらした。しかしながら、ＮＰは、相乗効果を示して最大の効果を有した。星印（＊）を対照と比較し、＃をＴＭＺ単独と比較し、＄を個々の天然生成物のそれぞれとのＴＭＺの異なる組み合わせと比較する。（１つ記号ではｐ＜０．０５であり、３つ記号ではｐ＜０．００１であった。一元配置分散分析法（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ））。
【図１２】ｍＫＤの体重に及ぼす効果（２４日の処置）である。ｍＫＤの毒性及び栄養十分性を、体重を監視することによって、評価した。ＫＤで飼育した動物は、対照と比べて有意な体重損失を示したが、一方ｍＫＤ処置群は、２４日間の処置の過程にわたって体重損失を示さず、対照と同様な体重を呈した（＊、＊＊、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．００５、一元配置分散分析法（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ））。
【図１３】腫瘍体積進行に及ぼすｍＫＤの効果である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。腫瘍寸法を、ノギスを用いて１週間に３回監視し、体積を計算した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定された際に開始した。動物が、終点［１７００ｍｍ３］に到達したときに、動物を殺処分した。ＫＤ又はｍＫＤで処置された動物は同様な腫瘍進行を示し、対照と比べて緩慢な有意な進行を示した（＊＊、ｐ＜０．００５、一元配置分散分析法（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ））。
【図１４】ｍＫＤのＫＭ曲線に及ぼす効果である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。腫瘍寸法を、ノギスを用いて１週間に３回監視し、体積を計算した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定された際に開始した。動物が、ノギスを用いて行われた測定から計算された１７００ｍｍ３の腫瘍体積に基づく終点に到達した際に、動物を殺処分した。時間の関数としての生存している動物の割合を、カプラン−マイヤー生存率曲線を用いて表わした。ＫＤ又はｍＫＤで処置された動物は、同様な生存率を示し、対照を超える有意な改善を裏付けた（＊＊、ｐ＜０．００５、ログランク検定）
【図１５】ｍＫＤの無進行性生存期間に及ぼす効果である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。腫瘍体積を１週間に３回計算し、僅かに触診可能な腫瘍［約６５ｍｍ３］から相当なサイズ［３００ｍｍ３］の腫瘍までの時間を計算した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。ＫＤ又はｍＫＤで処置された動物は、同様な無進行性生存期間（腫瘍体積が３００ｍｍ３より低く維持されている間の時間）を示し、対照を超える有意な改善を立証した（＊、＊＊は、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．００５、ｔ検定）。
【図１６】ｍＫＤの全生存率に及ぼす効果である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。腫瘍寸法を、ノギスを用いて１週間に３回監視し、体積を計算した。処置は、触診可能な塊が特定された際［約６５ｍｍ３］に開始した。動物が終点（１７００ｍｍ３）に到達したときに、動物を殺処分した。ＫＤ又はｍＫＤで処置された動物は同様な全生存率を示し、対照を超える有意な改善を立証した（＊＊はｐ＜０．００５、ログランク検定）。
【図１７】ｍＫＤ／ＮＰの増殖（インビトロ）に及ぼす効果である。ニューロスフェアアッセイにおいて、ヒトＧＢ細胞を、５０，０００細胞毎ｍｌで平板培養した。細胞を指示された処置法で処置し、培養の７日後に細胞数の定量化のために採集した。３つの処置群は、ｍＫＤ／ＮＰ処置動物がｍＫＤ及びｎＰ群と比べて有意な差を示しながら、対照と比べて増殖の有意な減少を立証した（対照と比べて、＊＊が、ｍＫＤ／ＮＰと比べて＃＃が、ｐ＜０．００１であった。ｔ検定）。処置の詳細は、［１］ｍＫＤ＝４ｍＭのケトン［βヒドロキシブチレート］（平板培養後２日目に施された単一の処置）、［２］ＮＰ＝ＥＧＣＧ［８μＭ］＋ＳＦＮ［２．５μＭ］＋クルクミン［０．５μＭ］：３日目から６日目まで毎日処置、［３］ｍＫＤ／ＮＰ＝４ｍＭのケトン＋ＥＧＣＧ［８μＭ］＋ＳＦＮ［５μＭ］＋クルクミン［０．５μＭ］。血糖値レベルがｍＫＤ及びｍＫＤ／ＮＰ群において６５ｍｇ／ｄＬであって、対照及びＮＰ群において１３０ｍｇ／ｄＬであったことも注目に値する。
【図１８】ｍＫＤ／ＮＰのＣＳＣに及ぼす効果である。スフェア形成頻度を、異なる処置のＣＳＣの増殖に及ぼす効果を評価するために測定した。ニューロスフェアアッセイにおいて、ヒトＧＢ細胞を、５０，０００細胞毎ｍｌで平板培養した。細胞を指示された処置法で処置し、採集して、それらの対応のスフェア形成能力の比較のために、クローン密度で規定培地（処置無し）中に平板培養した。ｍＫＤ／ＮＰ処置細胞は、対照群と比べてスフェア形成能力の有意な減少を示した（＊＊がｐ＜０．００５、ｔ検定）。
【図１９】ｍＫＤ／ＮＰのＣＳＣ増殖に及ぼす効果である。癌幹細胞（ＣＳＣ）増殖比（Ｋｌｌ）は、ＣＳＣが自己複製対称的分裂増殖を行う確率に直接的に相関し、増殖倍率の自然対数を取り、継代時間で除算することによって計算することができる（Ｄｅｌｅｙｒｏｌｌｅら、２０１１）。ヒトＧＢ細胞を、ニューロスフェアアッセイにおいて４継代にわたって培養し、その間、ＣＳＣの増殖を評価した。３つの処置群は、対照と比べてＣＳＣの自己複製対称的分裂増殖比の有意な減少を立証した。ｍＫＤ／ＮＰ群もまた、ｍＫＤ及びＮＰ群と比べて有意な減少を示した（ｍＫＤ／ＮＰと比較して＊、＊＊、＊＊＊はｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１であった。ｔ検定）。
【図２０】ｍＫＤ／ＮＰの腫瘍進行に及ぼす効果である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。腫瘍寸法を、ノギスを用いて１週間に３回監視し、体積を計算した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定された際に開始した。動物が終点（１５００ｍｍ３）に到達したときに、それらを殺処分した。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、対照若しくはｍＫＤ又はＮＰで処置された動物と比べて、有意により緩慢な腫瘍進行を示した（＊＊、＊＊＊がｐ＜０．０１、ｐ＜０．００２であった。一元配置分散分析法（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ））。
【図２１】ｍＫＤ／ＮＰのＫＭ曲線に及ぼす効果である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。腫瘍体積を、１週間に３回監視した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定された際に開始した。動物が終点（１５００ｍｍ３）に到達したときに、それらを殺処分した。時間の関数としての生存する動物の割合をカプラン−マイヤー生存曲線を用いて表わした。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、対照若しくはｍＫＤ又はＮＰで処置された動物を超える有意な改善を立証した（＊＊、＊＊＊がｐ＜０．０１、ｐ＜０．００２であった。ログランク検定）。
【図２２】ｍＫＤ／ＮＰの全生存期間に及ぼす効果である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。腫瘍体積を、１週間に３回監視した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定された際に開始した。動物が終点（１５００ｍｍ３）に到達したときに、それらを殺処分した。次いで終点体積に到達するまでの平均時間を比較した。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、対照若しくはｍＫＤ又はＮＰで処置された動物と比べて、全生存期間の有意な増加を立証した（ｍＫＤ／ＮＰと比べて、＊、＊＊、＊＊＊がｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００２であった。ｔ検定）。
【図２３】ｍＫＤ／ＮＰの無進行性生存期間に及ぼす効果である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。腫瘍体積を１週間に３回計算し、僅かに触診可能な腫瘍［約６５ｍｍ３］から相当なサイズ［３００ｍｍ３］の腫瘍までの時間を計算した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、対照若しくはｍＫＤ又はＮＰで処置された動物と比べて、無進行性生存期間（腫瘍体積が３００ｍｍ３より低く維持されている間の時間）を示した（ｍＫＤ／ＮＰと比べて、＊＊＊がｐ＜０．００００１であった。一元配置分散分析法（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ））。これらの結果は、ｍＫＤ処置とＮＰ処置との間の相乗効果を示唆している。
【図２４】ｈＧＢ細胞の頭蓋内接種後のｍＫＤ／ＮＰのＫＭに及ぼす効果である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、線条体において２００Ｋ  ｈＧＢ細胞を接種した。処置は、移植後３日目に開始した。動物が神経学的徴候の発症（嗜眠、麻痺、又は発作を含むがこれらに限定されない）によって特徴付けられる終点に到達したときに、動物を殺処分した。時間の関数としての生存する動物の割合をカプラン−マイヤー生存曲線を用いて表わした。ｍＫＤ／ＮＰ処置動物は、対照動物と比べて有意に増加した生存率を立証した（＊はｐ＝０．０１４であった。ログランク検定）。
【図２５】ｈＧＢ細胞の頭蓋内接種後のｍＫＤ／ＮＰの全生存期間及ぼす効果である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、線条体において２００Ｋ  ｈＧＢ細胞を接種した。処置は、移植後３日目に開始した。動物が神経学的徴候の発症（嗜眠、麻痺、又は発作を含むがこれらに限定されない）によって特徴付けられる終点に到達したときに、動物を殺処分した。次いで、終点体積に到達するまでの平均時間（すなわち、全生存時間）を比較した。ｍＫＤ／ＮＰ処置動物は、対照と比べて有意に増加した全生存期間を立証した（＊はｐ＜０．０５であった。ｔ検定）。
【図２６】腫瘍進行−ＴＭＺ対ｍＫＤ／ＮＰである。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。腫瘍体積を、ノギスを用いて１週間に３回監視し、腫瘍体積を計算した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定された際に開始した。動物が終点（１５００ｍｍ３）に到達したときに、それらを殺処分した。標準的ケア（テモゾロミド、ＴＭＺ、５ｍｇ／ｋｇ）又はｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、対照と比べて、同様かつ有意な緩慢な腫瘍進行を示した（＊＊＊がｐ＜０．０００１であった。一元配置分散分析法（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ））。
【図２７】無進行性生存期間−ＴＭＺ対ｍＫＤ／ＮＰである。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。腫瘍体積を１週間に３回計算し、僅かに触診可能な腫瘍［約６５ｍｍ３］から相当なサイズ［３００ｍｍ３］の腫瘍までの時間を計算した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。標準的ケア（テモゾロミド、ＴＭＺ、５ｍｇ／ｋｇ）又はｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、対照と比べて、無進行性生存期間（腫瘍体積が３００ｍｍ３より低く維持されている間の時間）の同様かつ有意な増加を立証した（＊は、ｐ＜０．０５であった。ｔ検定）。
【図２８】ｍＫＤ／ＮＰ−アジュバント腫瘍進行である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。腫瘍体積を、ノギスを用いて１週間に３回監視し、腫瘍体積を計算した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定された際に開始した。標準的ケア（テモゾロミド、ＴＭＺ、５ｍｇ／ｋｇ）又はｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、対照と比べて、同様かつ有意な緩慢な腫瘍進行を示した。標準的ケアとｍＫＤ／ＮＰとの組み合わせは、対照及びｍＫＤ／ＮＰ処置群と比べて腫瘍進行の有意な減少を示した（＊＊、＊＊＊がｐ＜０．００５、ｐ＜０．０００１であった。一元配置分散分析法（２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ））。
【図２９】ＴＭＺ抵抗性細胞の腫瘍進行に及ぼすｍＫＤ／ＮＰの効果である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１ＭのＴＭＺ不応答性ｈＧＢ細胞を接種した。腫瘍体積を、ノギスを用いて１週間に３回監視し、腫瘍体積を計算した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定された際に開始した。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、対照と比較して有意に遅い腫瘍進行を示し、この治療の、従来の治療に対する耐性が発現された後の第二選択療法としての有効性を立証している。標準的ケア（ＴＭＺ、５ｍｇ／ｋｇ）のｍＫＤ／ＮＰとの組み合わせは、対照、ＴＭＺ及びｍＫＤ／ＮＰ処置群と比べて、腫瘍進行の有意な減少を示した。この結果は、ｍＫＤ／ＮＰの、抵抗性獲得後の従来の治療に対して細胞を再増感させるための能力を立証している（＊＊＊はｐ＜０．０００１であった。一元配置分散分析法（２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ））。
【図３０】ｍＫＤ／ＮＰの腫瘍形成開始までの時間―ＧＢに及ぼす効果である。動物をｓｕｂ−Ｑ腫瘍移植の前にｍＫＤ／ＮＰ処置に２ヶ月間配置した。処置の２ヶ月後に、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。次いで、腫瘍増殖を、１週間に３回監視し、腫瘍細胞移植と腫瘍が触診可能な（すなわち、約６５ｍｍ３の体積に到達する）時間との間の時間を決定した。グラフは、移植と溶性触診との間の平均時間を示す。ｍＫＤ／ＮＰ処置群は、対照におけるものよりも約３倍長い腫瘍形成開始までの時間を示した（＊＊＊はｐ＜０．００１であった。ｔ検定）。
【図３１】ｍＫＤ／ＮＰの腫瘍形成頻度−ＧＢに及ぼす効果である。動物をｓｕｂ−Ｑ腫瘍移植の前にｍＫＤ／ＮＰ処置に２ヶ月間配置した。処置の２ヶ月後に、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。次いで、腫瘍増殖を、１週間に３回監視し、腫瘍細胞移植と腫瘍が触診可能な（すなわち、約６５ｍｍ３の体積に到達する）時間との間の時間を決定した。腫瘍を発現した動物のパーセンテージを記録した。ｍＫＤ／ＮＰ前処置群は、対照と比較して腫瘍形成開始において６０％の減少を示した。
【図３２】ｍＫＤ／ＮＰの腫瘍形成頻度−肺癌に及ぼす効果である。ＮＯＤ／ＤＣＩＤ動物を、右側腹部において２Ｍの肺癌細胞（Ａ５４９）で接種する前に、対照食餌又はｍＫＤ／ＮＰで２週間処置した。腫瘍増殖を１週間に３回監視した。移植後２１日目に、対照動物のほぼ９０％が、腫瘍を発現したが、一方ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、腫瘍の形成を示さなかった。
【図３３Ａ】ｍＫＤ／ＮＰが神経幹細胞（ＮＳＣ）活性に及ぼす効果である。Ａ）ｍＫＤ／ＮＰは、神経幹細胞を腫瘍発現に関連する調節異常から保護する。腫瘍の存在は、腫瘍部位から遠隔にある組織において損傷及び細胞調節異常を誘発するのに十分な慢性炎症性応答を生じさせ得ることが立証されている（Ｒｅｄｏｎら、２０１０）。我々は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物の右側腹部におけるｈＧＢ細胞の皮下移植後の腫瘍塊の発現が、認知に関連する領域（例えば、海馬）における神経幹細胞活性をダウンレギュレートする（ＢｒｄＵの組み込みに基づく）ことを立証した。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、腫瘍を担持しない群と比べて、ＮＳＣ活性におけるいかなる減少も示さなかった。これらの結果は、ｍＫＤ／ＮＰのＮＳＣ活性に及ぼす保護効果を裏付けている。Ｂ）ｎＨＳＣを、１００ｕｌの培地当たり２０Ｋ細胞でプレートし、神経スフェアアッセイにおいて１４日間培養した。プレーティング後最初の２日間に、細胞をＥＧＣＧ（８μＭ）、クルクミン（０．５μＭ）、スルフォラファン（ＳＦＮ、２．５μＭ）又は３つの全ての組み合わせで毎日処置した。培養１４日後に、ＭＴＴアッセイを行い、細胞生存率を測定した。３つの天然生成物（ＮＰ）の組み合わせだけが、対照と比べて有意な効果を示した。ＮＰで処置された細胞は、対照又はそれぞれ個々の成分と比べて細胞生存率において７０％の増加を示した（ＮＰと比較して、＊＊＊は、ｐ＜０．０００１であった。一元配置分散分析法（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ））。これらのデータは、ｍＫＤ／ＮＰ処置がＮＳＣの生存率を増加させることを裏付けている。
【図３３Ｂ】ｍＫＤ／ＮＰが神経幹細胞（ＮＳＣ）活性に及ぼす効果である。Ａ）ｍＫＤ／ＮＰは、神経幹細胞を腫瘍発現に関連する調節異常から保護する。腫瘍の存在は、腫瘍部位から遠隔にある組織において損傷及び細胞調節異常を誘発するのに十分な慢性炎症性応答を生じさせ得ることが立証されている（Ｒｅｄｏｎら、２０１０）。我々は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物の右側腹部におけるｈＧＢ細胞の皮下移植後の腫瘍塊の発現が、認知に関連する領域（例えば、海馬）における神経幹細胞活性をダウンレギュレートする（ＢｒｄＵの組み込みに基づく）ことを立証した。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、腫瘍を担持しない群と比べて、ＮＳＣ活性におけるいかなる減少も示さなかった。これらの結果は、ｍＫＤ／ＮＰのＮＳＣ活性に及ぼす保護効果を裏付けている。Ｂ）ｎＨＳＣを、１００ｕｌの培地当たり２０Ｋ細胞でプレートし、神経スフェアアッセイにおいて１４日間培養した。プレーティング後最初の２日間に、細胞をＥＧＣＧ（８μＭ）、クルクミン（０．５μＭ）、スルフォラファン（ＳＦＮ、２．５μＭ）又は３つの全ての組み合わせで毎日処置した。培養１４日後に、ＭＴＴアッセイを行い、細胞生存率を測定した。３つの天然生成物（ＮＰ）の組み合わせだけが、対照と比べて有意な効果を示した。ＮＰで処置された細胞は、対照又はそれぞれ個々の成分と比べて細胞生存率において７０％の増加を示した（ＮＰと比較して、＊＊＊は、ｐ＜０．０００１であった。一元配置分散分析法（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ））。これらのデータは、ｍＫＤ／ＮＰ処置がＮＳＣの生存率を増加させることを裏付けている。
【図３４】ｍＫＤ／ＮＰの最適化−腫瘍進行である。カイワレ大根粉末（ＤＲＳＰ）は、ｍＫＤ／ＮＰの効果を増強する。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。腫瘍進行を、ノギスを用いて１週間に３回腫瘍体積を測定することによって監視した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定された際に開始した。ＤＲＳＰを含有するｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、対照又はＤＲＳＰを含まないｍＫＤ／ＮＰで処置された動物と比べて、有意に遅い腫瘍進行を示した（＊、＊＊＊は、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．００１であった。一元配置分散分析法（２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ））。処置：対照：５５％の炭水化物、３０％のタンパク質、１５％の脂肪。ｍＫＤ／ＮＰ．００１＝１０％の炭水化物、６０％の脂肪（半分はＭＣＴ、Ｎｅｉｂｅｅ  ６９８に由来）、３０％のタンパク質＋ＳＦＮ（２５ｍｇ／ｋｇ；ＢＳＰ  １００％）を含油する天然生成物（ＮＰ）、クルクミン（１２００ｍｇ／ｋｇ）、ＥＧＣＧ（１２００ｍｇ／ｋｇ）。ｍＫＤ／ＮＰ．００２＝１０％の炭水化物、６０％の脂肪（半分はＭＣＴ、Ｎｅｉｂｅｅ  ６９８に由来）、３０％のタンパク質＋ＳＦＮ（２５ｍｇ／ｋｇ；ＢＳＰ  ９５％／ＤＲＳＰ  ５％）を含油する天然生成物（ＮＰ）、クルクミン（１２００ｍｇ／ｋｇ）、ＥＧＣＧ（１２００ｍｇ／ｋｇ）。
【図３５】ｍＫＤ／ＮＰの最適化−無進行性生存期間である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。腫瘍体積を１週間に３回計算し、僅かに触診可能な腫瘍［約６５ｍｍ３］から相当なサイズ［３００ｍｍ３］の腫瘍までの時間を計算した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。ｍＫＤ／ＮＰ．００２（ＤＲＳＰを含有する）で処置された動物は、対照又はｍＫＤ／ＮＰ．００１（ＤＲＳＰを含有しない）で処置された動物と比べて、無進行性生存期間（腫瘍体積が３００ｍｍ３よりも低く維持されている期間）の有意な増加を示した（ｍＫＤ／ＮＰ．００２と比べて、＊はｐ＜０．０５であった。Ｆ検定）。
【図３６】ｍＫＤ／ＮＰの最適化‐全生存期間である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。腫瘍体積を１週間に３回監視した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。動物が終点（１５００ｍｍ３）に到達したときに、それらを殺処分した。終点の体積（すなわち全生存期間）を比較した。ｍＫＤ/ＮＰ．００２（ＤＲＳＰを含有）で処置した動物は、対照またはｍＫＤ／ＮＰ．００１（ＤＲＳＰを含有しない）で処置した動物に比べて、平均生存に有意な増加がみられた（ｍＫＤ/ＮＰ．００２に比べて＊はｐ＜０．０５であった。Ｆ検定）。
【図３７Ａ】ｍＫＤ／ＮＰの最適化−Ｋｉ６７及びｐＳｔａｔ３である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。腫瘍体積を１週間に３回監視した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。動物が終点（１５００ｍｍ３）に到達したときに、それらを殺処分し、腫瘍を採集し、Ｋｉ６７及びｐＳｔａｔ３標識を用いて腫瘍細胞増殖を定量化するために調製した。（Ａ）免疫反応性細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーを用いて定量化した。ｍＫＤ／ＮＰ．００２（ＤＲＳＰを含有する）で処置された動物は、対照又はｍＫＤ／ＮＰ．００１（ＤＲＳＰを含有しない）で処置された動物と比べて、増殖の有意な減少を示した（ｍＫＤ／ＮＰ．００２と比べて、＊、＊＊はｐ＜０．０５、ｐ＜０．００１であった。ｔ検定）。
【図３７Ｂ】ｍＫＤ／ＮＰの最適化−Ｋｉ６７及びｐＳｔａｔ３である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。腫瘍体積を１週間に３回監視した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。動物が終点（１５００ｍｍ３）に到達したときに、それらを殺処分し、腫瘍を採集し、Ｋｉ６７及びｐＳｔａｔ３標識を用いて腫瘍細胞増殖を定量化するために調製した。（Ｂ）Ｓｔａｔ３の活性化（リン酸化を介する）は、一般に、及び神経膠芽腫において、癌細胞の増殖に必要とされる（Ｓｈｅｒｒｙら、２００９）。したがって、Ｓｔａｔ３の標的化は、癌療法にとって有望な標的である。ｍＫＤ／ＮＰは、対照と比べて、Ｓｔａｔ３のリン酸化を阻害することができる。この効果は、上述のように、ＤＲＳＰが治療に含まれるときにｍＫＤ／ＮＰ．００２で可能とされる。
【図３８】結腸癌−腫瘍進行に及ぼすｍＫＤ／ＮＰの効果である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において２Ｍの結腸直腸腺癌細胞（ＨＴ−２９）を接種した。腫瘍進行を、ノギスを用いて１週間に３回、腫瘍体積を測定することによって監視した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。動物が終点（１０００ｍｍ３）に到達したときに、それらを殺処分した。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、対照と比べて、有意に遅い腫瘍進行を示した（＊＊＊はｐ＜０．０００１であった。一元配置分散分析法（２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ））。
【図３９】結腸癌−腫瘍体積に及ぼすｍＫＤ／ＮＰの効果である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において２Ｍの結腸直腸腺癌細胞（ＨＴ−２９）を接種した。腫瘍進行を、ノギスを用いて１週間に３回、腫瘍体積を測定することによって監視した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。腫瘍体積を、処置開始後３０日目で比較した。平均して、ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、対照と比べて、有意に低い腫瘍体積を示した（＊＊は、ｐ＜０．０１であった。ｔ検定）。
【図４０】結腸癌−ＫＭ曲線に及ぼすｍＫＤ／ＮＰの効果である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において２Ｍの結腸直腸腺癌細胞（ＨＴ−２９）を接種した。腫瘍進行を、ノギスを用いて１週間に３回、腫瘍体積を測定することによって監視した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。動物が終点（１０００ｍｍ３）に到達したときに、それらを殺処分した。時間の関数としての生存する動物の割合をカプラン−マイヤー生存曲線を用いて表わした。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、対照を超える有意な改善を示した（＊＊、ｐ＜０．０１、ログランク検定）。
【図４１】結腸癌−全生存期間に及ぼすｍＫＤ／ＮＰの効果である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において２Ｍの結腸直腸腺癌細胞（ＨＴ−２９）を接種した。腫瘍進行を、ノギスを用いて１週間に３回、腫瘍体積を測定することによって監視した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。動物が終点（１０００ｍｍ３）に到達したときに、それらを殺処分した。次いで、終点体積に到達するまでの平均期間（すなわち、全生存期間）を比較した。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、対照と比べて、全生存期間の有意な増加を示した（＊＊はｐ＜０．０１、ｔ検定）。これらのデータは、ｍＫＤ／ＮＰが結腸癌のための有効な治療であることを裏付けている。
【図４２】結腸癌細胞に及ぼすＮＰの効果（インビトロ）である。結腸腺癌細胞（ＨＴ−２９）を、ＥＧＣＧ（８μＭ）、クルクミン（０．５μＭ）及びスルフォラファン（２．５μＭ）で毎日処置した。対照培養物が集密状態になったら、細胞計数を行った。個々の成分の全てが、細胞数において有意な減少を示した。３つの天然生成物を一緒にした組み合わせ（ＮＰ）は、最強の効果を示した（対照と比較して、＊、＊＊はｐ＜０．０５、ｐ＜０．００１であって、ＮＰと比較して＃＃、＃＃＃はｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１であった。一元配置分散分析法（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ））。
【図４３】肺癌−腫瘍進行に及ぼすｍＫＤ／ＮＰの効果である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において２Ｍの肺癌細胞（Ａ５４９）を接種した。腫瘍進行を、ノギスを用いて１週間に３回、腫瘍体積を測定することによって監視した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。動物が終点（１０００ｍｍ３）に到達したときに、それらを殺処分した。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、対照と比べて、有意に遅い腫瘍進行を示した（＊＊＊はｐ＜０．０００１であった。一元配置分散分析法（２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ））。
【図４４】肺癌−腫瘍体積に及ぼすｍＫＤ／ＮＰの効果である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において２Ｍの肺細胞（Ａ５４９）を接種した。腫瘍体積を、１週間に３回測定し、処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。腫瘍体積を、処置開始後３１日目で比較した。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、対照と比べて、有意に低い腫瘍体積を示した（＊は、ｐ＜０．０５であった。ｔ検定）。
【図４５】肺癌−無腫瘍進行性生存に及ぼすｍＫＤ／ＮＰの効果である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において２Ｍの肺細胞（Ａ５４９）を接種した。腫瘍体積を、１週間に３回計算し、僅かに触診可能な腫瘍［約６５ｍｍ３］から相当なサイズ［３００ｍｍ３］の腫瘍までの時間を計算した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、対照と比べて、無進行性生存期間（腫瘍体積が３００ｍｍ３よりも低く維持されている期間）の有意な増加を示した（＊＊はｐ＜０．０１であった。ｔ検定）。
【図４６】肺癌−ＫＭ曲線に及ぼすｍＫＤ／ＮＰの効果である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において２Ｍの肺癌細胞（Ａ５４９）を接種した。腫瘍進行を、ノギスを用いて１週間に３回、腫瘍体積を測定することによって監視した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。動物が終点（１０００ｍｍ３）に到達したときに、それらを殺処分した。時間の関数としての生存する動物の割合をカプラン−マイヤー生存率曲線を用いて表わした。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、対照を超える有意な改善を示した（＊、ｐ＜０．０５、ログランク検定）。
【図４７】肺癌−全生存期間に及ぼすｍＫＤ／ＮＰの効果である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において２Ｍの肺癌細胞（Ａ５４９）を接種した。腫瘍体積を、ノギスを用いて１週間に３回、監視した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。動物が終点（１０００ｍｍ３）に到達したときに、それらを殺処分した。次いで、終点体積に到達するまでの平均期間（すなわち、全生存期間）を比較した。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、対照と比べて、全生存期間の有意な増加を示した（＊はｐ＜０．０５、ｔ検定）。これらのデータは、ｍＫＤ／ＮＰが肺癌のための有効な治療であることを裏付けている。
【図４８】肺癌細胞に及ぼすＮＰの効果（インビトロ）である。肺癌細胞（Ａ５４９）を、ＥＧＣＧ（８μＭ）、クルクミン（０．５μＭ）及びスルフォラファン（２．５μＭ）で毎日処置した。対照培養物が集密状態になったら、細胞計数を行った。個々のＥＧＣＧ及びクルクミンは、細胞数を減少する上で統計的に有意な効果を示さないが、一方ＳＦＮは示した。この効果は、３つの成分の全て（ＮＰ）が一緒に使用されるときに可能とされる（対照と比較して、＊、＊＊＊はｐ＜０．０５、ｐ＜０．００１であって、ＮＰと比較して＃、＃＃、＃＃＃はｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１であった。一元配置分散分析法（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ））。
【図４９】ＮＰの乳癌細胞生存率に及ぼす効果である。ヒト乳癌細胞（ＺＲ７５１）をＥＧＣＧ（８μＭ）、クルクミン（０．５μＭ）又はＳＦＮ（２．５μＭ）で個々に若しくは組み合わせて（ＮＰ）毎日処置した。対照培養物が集密状態になったら、細胞生存率を、ＭＴＴアッセイを用いて測定した。天然生成物は個々では、対照と比べて統計的に有意な効果を示さなかったが、それらの組み合わせ（ＮＰ）は統計的に有意な効果を示した（対照と比べて、＊＊＊はｐ＜０．００１であった。一元配置分散分析法（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ））。
【図５０】乳癌−腫瘍進行に及ぼすｍＫＤ／ＮＰの効果である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において２Ｍの乳癌細胞（ＺＲ７５１）を接種した。腫瘍進行を、ノギスを用いて１週間に３回、腫瘍体積を測定することによって監視した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。動物が終点（１０００ｍｍ３）に到達したときに、それらを殺処分した。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、対照と比べて、有意に遅い腫瘍進行を示した（＊＊＊はｐ＜０．０００１であった。一元配置分散分析法（２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ））。
【図５１】乳癌−腫瘍体積（７０日目）に及ぼすｍＫＤ／ＮＰの効果である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において２Ｍの乳癌細胞（ＺＲ７５１）を接種した。腫瘍体積を、ノギスを用いて１週間に３回監視した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。腫瘍体積を、処置開始後７０日目で比較した。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、対照と比べて、有意に低い腫瘍体積を示した（＊＊はｐ＜０．０１であった。ｔ検定）。
【図５２】乳癌−腫瘍体積（１４５日目）に及ぼすｍＫＤ／ＮＰの効果である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において２Ｍの乳癌細胞（ＺＲ７５１）を接種した。腫瘍体積を、ノギスを用いて１週間に３回監視した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。腫瘍体積を、処置開始後１４５日目で比較した。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、対照と比べて、有意に低い腫瘍体積を示した（＊＊はｐ＜０．０１であった。ｔ検定）。
【図５３】乳癌−無進行性生存に及ぼすｍＫＤ／ＮＰの効果である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において２Ｍの乳細胞（ＺＲ７５１）を接種した。腫瘍体積を、１週間に３回計算し、僅かに触診可能な腫瘍［約６５ｍｍ３］から相当なサイズ［３００ｍｍ３］の腫瘍までの時間を計算した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、対照と比べて、無進行性生存期間（腫瘍体積が３００ｍｍ３よりも低く維持されている期間）の有意な増加を示した（＊＊はｐ＜０．０１であった。ｔ検定）。
【図５４】乳癌−ＫＭ曲線に及ぼすｍＫＤ／ＮＰの効果である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において２Ｍの乳癌細胞（ＺＲ７５１）を接種した。腫瘍体積を、ノギスを用いて１週間に３回、監視した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。動物が終点（１０００ｍｍ３）に到達したときに、それらを殺処分した。時間の関数としての生存する動物の割合をカプラン−マイヤー生存曲線を用いて表わした。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、対照を超える有意な改善を示した（＊＊、ｐ＜０．０５、ログランク検定）。これらのデータは、ｍＫＤ／ＮＰが乳癌のための有効な治療であることを裏付けている。
【図５５】ｍＫＤ／ＮＰのｈＧＢ細胞のアポトーシスに及ぼす効果（インビボ）である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。腫瘍体積を、ノギスを用いて１週間に３回監視した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。動物が終点（１５００ｍｍ３）に到達したときに、それらを殺処分し、腫瘍を採集し、ＤＡＰＩ標識を用いて腫瘍細胞死を定量化するよう調製し、アポトーシス部分を示すＳｕｂＧ１領域を特定した。アポトーシス細胞を、フローサイトメトリーを用いて定量化した。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、対照と比べて、細胞死における有意な増加を示した（＊＊、ｐ＜０．０１、ｔ検定）。これらのデータは、インビボにおいて、ｍＫＤ／ＮＰがｈＧＢ細胞死を増加させることを示している。
【図５６】ｍＫＤ／ＮＰの腫瘍形成開始細胞に及ぼす効果（インビボ）である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。腫瘍体積を、ノギスを用いて１週間に３回監視した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。動物が終点（１５００ｍｍ３）に到達したときに、それらを殺処分し、腫瘍を採集し、ＣＤ１３３を発現する腫瘍細胞を定量化するよう調製した。ＣＤ１３３は、腫瘍形成開始細胞のマーカーである。ＣＤ１３３免疫反応性細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーを用いて定量化した。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物に由来するＳｕｂ−Ｑ腫瘍は、対照とくらべて、低い量のＣＤ１３３＋ｖｅ細胞を示した。これらのデータは、ｍＫＤ／ＮＰがインビボで癌幹細胞（すなわち、腫瘍形成開始細胞）を標的とすることができることを示している。
【図５７】ｍＫＤ／ＮＰのＣＤＣ中のＤＮＡ損傷に及ぼす効果（インビボ）である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。腫瘍体積を、ノギスを用いて１週間に３回監視した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。動物が終点（１５００ｍｍ３）に到達したときに、それらを殺処分し、腫瘍を採集し、ＣＤ１３３及びＨ２ＡＸのリン酸化型（ｐＨ２ＡＸ）で同時標識された腫瘍細胞を定量化するよう調製した。ｐＨ２ＡＸは、ＤＮＡ二重鎖破壊のマーカーである。ＣＤ１３３／ｐＨ２ＡＸ二重免疫反応性細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーを用いて定量化した。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物に由来するＳｕｂ−Ｑ腫瘍は、対照と比べて、ＤＮＡ損傷（ｐＨ２ＡＸ）を呈する癌幹細胞（ＣＤ１３３＋）の数における増加を示した。これらの結果は、ｍＫＤ／ＮＰがインビボで特異的に標的化し、癌幹細胞中のＤＮＡ損傷を誘発し得ることを示している。
【図５８Ａ】ＹＢ１増殖−ＴＭＺ抵抗性のＭＧＭＴ非依存的増感（インビボ）に及ぼすｍＫＤ／ＮＰの効果である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。腫瘍体積を、ノギスを用いて１週間に３回監視した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。動物が終点（１５００ｍｍ３）に到達したときに、それらを殺処分し、腫瘍を採取し、Ｙ−ｂｏｘ結合タンパク質１（ＹＢ１）の発現及びリン酸化のレベルをフローサイトメトリーによって定量するよう調製した。ＹＢ−１は、ｈＧＢを含む多くのヒト悪性腫瘍においてアップレギュレートされ、ＣＳＣの維持に関与する（Ｆｏｔｏｖａｔｉら、２０１１）。ＹＢ−１がｈＧＢ管理及び増殖に重要であるばかりでなく、これは化学療法薬によって引き起こされたＤＮＡ損傷を修復することによって、ＴＭＺに対する抵抗性のメカニズム（ＭＧＭＴ非依存的）においても役割を果たす（Ｇａｏら、２００９）。したがって、ＹＢ−１を標的化することは、ｈＧＢ増殖を阻害するための及びｈＧＢをＴＭＺに対して増感させるための魅力的なアプローチを示す。対照と比べて、ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物に由来する腫瘍は、ＹＢ１発現のレベル（Ａ）並びにリン酸化のレベル（Ｂ）の有意な減少を示した（＊、ｐ＜０．０５、Ｆ検定）。これらの結果は、ＭＧＭＴに非依存的なメカニズムを介して処置が腫瘍細胞増殖を阻害している及び細胞をＴＭＺに対して増感させているメカニズムを提唱しながら、ｍＫＤ／ＮＰが、ＹＢ−１経路を標的化し得ることを立証している。
【図５８Ｂ】ＹＢ１増殖−ＴＭＺ抵抗性のＭＧＭＴ非依存的増感（インビボ）に及ぼすｍＫＤ／ＮＰの効果である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。腫瘍体積を、ノギスを用いて１週間に３回監視した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。動物が終点（１５００ｍｍ３）に到達したときに、それらを殺処分し、腫瘍を採取し、Ｙ−ｂｏｘ結合タンパク質１（ＹＢ１）の発現及びリン酸化のレベルをフローサイトメトリーによって定量するよう調製した。ＹＢ−１は、ｈＧＢを含む多くのヒト悪性腫瘍においてアップレギュレートされ、ＣＳＣの維持に関与する（Ｆｏｔｏｖａｔｉら、２０１１）。ＹＢ−１がｈＧＢ管理及び増殖に重要であるばかりでなく、これは化学療法薬によって引き起こされたＤＮＡ損傷を修復することによって、ＴＭＺに対する抵抗性のメカニズム（ＭＧＭＴ非依存的）においても役割を果たす（Ｇａｏら、２００９）。したがって、ＹＢ−１を標的化することは、ｈＧＢ増殖を阻害するための及びｈＧＢをＴＭＺに対して増感させるための魅力的なアプローチを示す。対照と比べて、ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物に由来する腫瘍は、ＹＢ１発現のレベル（Ａ）並びにリン酸化のレベル（Ｂ）の有意な減少を示した（＊、ｐ＜０．０５、Ｆ検定）。これらの結果は、ＭＧＭＴに非依存的なメカニズムを介して処置が腫瘍細胞増殖を阻害している及び細胞をＴＭＺに対して増感させているメカニズムを提唱しながら、ｍＫＤ／ＮＰが、ＹＢ−１経路を標的化し得ることを立証している。
【図５９】ＣＳＣにおける化学療法抵抗性を阻害することに及ぼすｍＫＤ／ＮＰの効果（インビボ）である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。腫瘍体積を、ノギスを用いて１週間に３回監視した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。動物が終点（１５００ｍｍ３）に到達したときに、それらを殺処分し、腫瘍を採取し、ＣＤ１３３及びＮＦｋＢで同時標識された腫瘍細胞を定量化するよう調製した。ＮＦｋＢは、ｈＧＢにおける化学療法抵抗性にも寄与する抗アポトーシスエフェクターである（Ｈａｎら、２００４）。Ａ）ＣＤ１３３／ＮＦｋＢ二重免疫反応性細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーを用いて定量化した。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物に由来する腫瘍は、対照と比べて、ＮＦｋＢに対して陽性な癌幹細胞（ＣＤ１３３＋）の数における減少を示した。これらの結果は、ｍＫＤ／ＮＰが、抗アポトーシスエフェクターＮＦｋＢを阻害することによってＣＳＣを標的化し得ることを示唆している。
【図６０】ｍＫＤ／ＮＰのＭＧＭＴ増殖に及ぼす効果（インビトロ）である。患者由来のＧＢ細胞を、インビトロで、ＴＭＺ［１０μＭ］又はＴＭＺ［１０μＭ］＆ＮＰ（ＥＧＣＧ（８μＭ）、クルクミン（０．５μＭ）及びスルフォラファン（２．５μＭ））で処置した。処置の７日後に、細胞を採集し、フローサイトメトリーを用いてＭＧＭＴの発現レベルについて分析した。２つの処置群における蛍光中央値を未処置動物に対して比較した。このデータは、ＴＭＺが、ＭＧＭＴ発現におけるほぼ３０％の増加を誘起することと、ＮＰがこの増加を対照のレベル近辺まで低減させることができることを示している。
【図６１Ａ】サバイビン発現に及ぼすｍＫＤ／ＮＰの効果（インビトロ）である。Ａ）ｈＧＢ細胞を神経スフェアアッセイにおいて培養した。インビトロで７日後に、サバイビン（その過発現が化学療法抵抗性に関連するアポトーシスの阻害物質のメンバー）のレベルを評価するために、細胞を免疫標識法及びフローサイトメトリー分析用に処理した。サバイビンの発現レベルは、ＴＭＺ処置（１０μＭ、７日間毎日処置）で増加される。この効果は、ＴＭＺ処置細胞がさらにＮＰ［ＥＧＣＧ（８μＭ）、クルクミン（０．５μＭ）及びスルフォラファン（２．５μＭ）、４〜７日間の毎日処置］に曝露されるときに、対照のレベルまで低減される、Ｂ）同様に、ＮＰは、サバイビンを発現する細胞のフラクションを低減し、この細胞のフラクションは、細胞がＴＭＺで処置される時に増加する（対照と比較して＊＊、＊＊＊；ＴＭＺと比較して＃＃＃は、２つ記号ではｐ＜０．０１、３つ記号ではｐ＜０．０００１であった。一元配置分散分析法（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ））。
【図６１Ｂ】サバイビン発現に及ぼすｍＫＤ／ＮＰの効果（インビトロ）である。Ａ）ｈＧＢ細胞を神経スフェアアッセイにおいて培養した。インビトロで７日後に、サバイビン（その過発現が化学療法抵抗性に関連するアポトーシスの阻害物質のメンバー）のレベルを評価するために、細胞を免疫標識法及びフローサイトメトリー分析用に処理した。サバイビンの発現レベルは、ＴＭＺ処置（１０μＭ、７日間毎日処置）で増加される。この効果は、ＴＭＺ処置細胞がさらにＮＰ［ＥＧＣＧ（８μＭ）、クルクミン（０．５μＭ）及びスルフォラファン（２．５μＭ）、４〜７日間の毎日処置］に曝露されるときに、対照のレベルまで低減される、Ｂ）同様に、ＮＰは、サバイビンを発現する細胞のフラクションを低減し、この細胞のフラクションは、細胞がＴＭＺで処置される時に増加する（対照と比較して＊＊、＊＊＊；ＴＭＺと比較して＃＃＃は、２つ記号ではｐ＜０．０１、３つ記号ではｐ＜０．０００１であった。一元配置分散分析法（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ））。
【図６２Ａ】ＭＧＭＴ依存的メカニズムを介しての腫瘍細胞のＴＭＺに対するｍＫＤ／ＮＰによる増感（インビボ）である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。腫瘍体積を、ノギスを用いて１週間に３回監視した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。動物が終点（１５００ｍｍ３）に到達したときに、それらを殺処分し、腫瘍を採取し、ＭＧＭＴ及びｐＳＴＡＴ３を発現する腫瘍細胞を定量化するよう調製した。Ａ）ＭＧＭＴはＴＭＺに対する抵抗性を供与する。ＭＧＭＴ免疫反応性細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーを用いて定量化した。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、対照と比べてＭＧＭＴ＋ｖｅ細胞の減少を示した（ｐ＜０．０５、ｔ検定）。Ｂ）Ｓｔａｔ３のリン酸化は、ＭＧＭＴに依存するメカニズムを通してＴＭＺ抵抗性との相関性が示されている（Ｋｏｈｓａｋａら、２０１２）。ｍＫＤ／ＮＰのＳｔａｔ３活性化及びＭＧＭＴ発現を減少させるための能力は、ｍＫＤ／ＮＰが、ＭＧＭＴ依存的メカニズムを介して腫瘍細胞をＴＭＺに対して増感させる（図２９に記載）潜在的なメカニズムを提供している。
【図６２Ｂ】ＭＧＭＴ依存的メカニズムを介しての腫瘍細胞のＴＭＺに対するｍＫＤ／ＮＰによる増感（インビボ）である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。腫瘍体積を、ノギスを用いて１週間に３回監視した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。動物が終点（１５００ｍｍ３）に到達したときに、それらを殺処分し、腫瘍を採取し、ＭＧＭＴ及びｐＳＴＡＴ３を発現する腫瘍細胞を定量化するよう調製した。Ａ）ＭＧＭＴはＴＭＺに対する抵抗性を供与する。ＭＧＭＴ免疫反応性細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーを用いて定量化した。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、対照と比べてＭＧＭＴ＋ｖｅ細胞の減少を示した（ｐ＜０．０５、ｔ検定）。Ｂ）Ｓｔａｔ３のリン酸化は、ＭＧＭＴに依存するメカニズムを通してＴＭＺ抵抗性との相関性が示されている（Ｋｏｈｓａｋａら、２０１２）。ｍＫＤ／ＮＰのＳｔａｔ３活性化及びＭＧＭＴ発現を減少させるための能力は、ｍＫＤ／ＮＰが、ＭＧＭＴ依存的メカニズムを介して腫瘍細胞をＴＭＺに対して増感させる（図２９に記載）潜在的なメカニズムを提供している。
【図６３】Ｚｅｂ１発現に及ぼすｍＫＤ／ＮＰの効果（インビボ）である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。腫瘍体積を、ノギスを用いて１週間に３回監視した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。動物が終点（１５００ｍｍ３）に到達したときに、それらを殺処分し、腫瘍を採取し、ＺＥＢ１を発現する腫瘍細胞を定量化するよう調製した。ＺＥＢ１は、腫瘍形成開始細胞のマーカーであり、ｈＧＢ再発についての重要な候補分子であり、侵襲性腫瘍細胞のマーカーであり、有望な治療標的である（Ｓｉｅｂｚｅｈｎｒｕｂｌら、検討中）。ＺＥＢ１免疫反応性細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーを用いて定量化した。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物に由来する腫瘍は、対照と比べてＺＥＢ１＋ｖｅ細胞の有意な減少を示した（＊、ｐ＜０．０５、ｔ検定）。
【図６４】ＮＦｋＢ発現に及ぼすｍＫＤ／ＮＰの効果（インビボ）である。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。腫瘍体積を、ノギスを用いて１週間に３回監視した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。動物が終点（１５００ｍｍ３）に到達したときに、それらを殺処分し、腫瘍を採取し、ＮＦｋＢを発現する腫瘍細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって定量化するよう調製した。ＮＦｋＢは、ｈＧＢにおける化学療法抵抗性にも寄与する抗アポトーシスエフェクターである（Ｈａｎら、２００４）。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物に由来する腫瘍は、対照と比べて、ＮＦｋＢ＋ｖｅ細胞の有意な減少を示した（＊、ｐ＜０．０５、ｔ検定）。
【図６５】Ｇｌｕｔ３発現に及ぼすｍＫＤ／ＮＰの効果（インビボ）である。多くの腫瘍細胞は、正常な細胞と比べて増加したレベルのグルコース代謝を示す。グルコース取り込みは、Ｇｌｕｔ３を含むグルコース輸送体（ＧＬＵＴ）ファミリーによって媒介され、Ｇｌｕｔ３は、神経膠芽腫中でアップレギュレートされ（Ｂｏａｄｏら、１９９４）、腫瘍細胞の増殖並びにＴＭＺに対する獲得された抵抗性に関与する（Ｌｅ  Ｃａｌｖｅら、２０１０）ことが報告されている。これらの研究所見は、Ｇｌｕｔ３の選択的な標的化が腫瘍細胞の増殖及びＴＭＺ抵抗性の発現を遅延させることになることを示唆している。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。腫瘍体積を、ノギスを用いて１週間に３回監視した。処置は、触診可能な塊［約６５ｍｍ３］が特定されたときに開始した。動物が終点（１５００ｍｍ３）に到達したときに、それらを殺処分し、腫瘍を採取し、Ｇｌｕｔ３を発現する腫瘍細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーによって定量化するように調製した。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物に由来する腫瘍は、対照と比べて、Ｇｌｕｔ３＋ｖｅ細胞の有意な減少を示した（＊＊、ｐ＜０．００５、ｔ検定）。
【図６６Ａ】ｍＴｏｒ経路−インビボである。ｍＴｏｒ経路は、増殖因子、栄養素、エネルギー及びストレス信号によって活性化され、細胞の成長、増殖及び生存に関与する。ｍＴｏｒ経路の調節解除（例えば、ＡＫＴなどの上流活性化因子若しくはＳ６及び４ＥＢＰなどの下流エフェクターのアップレギュレーション）が、多くの癌において報告されている。ｍＴｏｒ経路は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路によって活性化される。ｍＴｏｒの活性化は、Ｓ６のリン酸化／活性化及び４ＥＢＰのリン酸化／不活性化（Ｓ６、４ＥＢＰは、それぞれｍＴｏｒが調節するリボソーム生合成及びタンパク質合成の２つの最も良く特性評価された下流エフェクターである）をもたらす。したがって、ｍＴｏｒは、魅力的な治療標的であり、ｍＴｏｒ経路阻害物質は、実行可能な治療戦略のための可能な候補であることを示している。Ａ）ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。動物が終点（１５００ｍｍ３）に到達したときに、それらを殺処分し、腫瘍を採取し、ｐ−Ｓ６を発現する腫瘍細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって定量化するように調製した。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、対照と比べて、ｐＳ６＋ｖｅ細胞の有意な減少を示した（＊＊、ｐ＜０．００５、ｔ検定）。
【図６６Ｂ】ｍＴｏｒ経路−インビボである。ｍＴｏｒ経路は、増殖因子、栄養素、エネルギー及びストレス信号によって活性化され、細胞の成長、増殖及び生存に関与する。ｍＴｏｒ経路の調節解除（例えば、ＡＫＴなどの上流活性化因子若しくはＳ６及び４ＥＢＰなどの下流エフェクターのアップレギュレーション）が、多くの癌において報告されている。ｍＴｏｒ経路は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路によって活性化される。ｍＴｏｒの活性化は、Ｓ６のリン酸化／活性化及び４ＥＢＰのリン酸化／不活性化（Ｓ６、４ＥＢＰは、それぞれｍＴｏｒが調節するリボソーム生合成及びタンパク質合成の２つの最も良く特性評価された下流エフェクターである）をもたらす。したがって、ｍＴｏｒは、魅力的な治療標的であり、ｍＴｏｒ経路阻害物質は、実行可能な治療戦略のための可能な候補であることを示している。Ｂ）組織標本を終点で採取し、ｐＳ６免疫標識を、対照とｍＫＤ／ＮＰ処置動物との間で比較した。顕微鏡写真は、ｍＫＤ／ＮＰで処置された腫瘍中のｐＳ６染色の減少を示した。
【図６６Ｃ】ｍＴｏｒ経路−インビボである。ｍＴｏｒ経路は、増殖因子、栄養素、エネルギー及びストレス信号によって活性化され、細胞の成長、増殖及び生存に関与する。ｍＴｏｒ経路の調節解除（例えば、ＡＫＴなどの上流活性化因子若しくはＳ６及び４ＥＢＰなどの下流エフェクターのアップレギュレーション）が、多くの癌において報告されている。ｍＴｏｒ経路は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路によって活性化される。ｍＴｏｒの活性化は、Ｓ６のリン酸化／活性化及び４ＥＢＰのリン酸化／不活性化（Ｓ６、４ＥＢＰは、それぞれｍＴｏｒが調節するリボソーム生合成及びタンパク質合成の２つの最も良く特性評価された下流エフェクターである）をもたらす。したがって、ｍＴｏｒは、魅力的な治療標的であり、ｍＴｏｒ経路阻害物質は、実行可能な治療戦略のための可能な候補であることを示している。Ｃ）ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物に、右側腹部において１Ｍ  ｈＧＢ細胞を接種した。動物が終点（１５００ｍｍ３）に到達したときに、それらを殺処分し、腫瘍を採取し、ｐ４ＡＢＰ１を発現する腫瘍細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって定量化するように調製した。ｍＫＤ／ＮＰで処置された動物は、対照と比べて、ｐ４ＡＢＰ１＋ｖｅ細胞の有意な減少を示した（＊＊、ｐ＜０．００５、ｔ検定）。
【図６６Ｄ】ｍＴｏｒ経路−インビボである。ｍＴｏｒ経路は、増殖因子、栄養素、エネルギー及びストレス信号によって活性化され、細胞の成長、増殖及び生存に関与する。ｍＴｏｒ経路の調節解除（例えば、ＡＫＴなどの上流活性化因子若しくはＳ６及び４ＥＢＰなどの下流エフェクターのアップレギュレーション）が、多くの癌において報告されている。ｍＴｏｒ経路は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路によって活性化される。ｍＴｏｒの活性化は、Ｓ６のリン酸化／活性化及び４ＥＢＰのリン酸化／不活性化（Ｓ６、４ＥＢＰは、それぞれｍＴｏｒが調節するリボソーム生合成及びタンパク質合成の２つの最も良く特性評価された下流エフェクターである）をもたらす。したがって、ｍＴｏｒは、魅力的な治療標的であり、ｍＴｏｒ経路阻害物質は、実行可能な治療戦略のための可能な候補であることを示している。Ｄ）ＷＢ：ｐＳ６＆ｐ４ＥＢＰ１。ｍＫＤ／ＮＰ処置腫瘍中のｐＳ６及びｐ４ＡＢＰ１の発現の減少は、ウェスタンブロットによっても裏付けられた。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
典型的な北米人の食事は、そのカロリー摂取量の約５０〜６０％が炭水化物からのものである。炭水化物は、グルコースの主な供給源及びグルコースを貯蔵した腫瘍細胞のためのエネルギーの主要な供給源であり、食事制限を通して炭水化物を低減することは、グルコースレベルの低下において補助し、したがって、この燃料源への腫瘍細胞のアクセスを制限する。したがって、開示された発明の一態様は、対象において増殖性疾患を治療するための方法に関し、方法は、エピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣＧ）、クルクミン、グルコシノレート及び／又はこれらの誘導体（グルコラファニン及び／又はスルフォラファン（ＳＦＮ）（必要に応じて、ブロッコリースプラウト、他のアブラナ科野菜のスプラウト、又はアブラナ科植物それ自体の形態で）など）、任意選択的に、カイワレダイコン（成熟大根、大根のスプラウト又は粉末、そのスプラウト又はその抽出物の形態で）から選択される１つ以上成分（複数可）を含む組成物を、単独で又は低炭水化物食と組み合わせて投与することを含む。これらの成分は、別個の組成物として個々に、又は種々の組み合わせで（例えば、対で、３成分組成物若しくは４つ又は５つの成分全てを含有する単一の組成物で）投与され得る。
【０００９】
ＭＣＴは、ココナッツ又はパームナッツ油から分留され、吸収不良症状を有する患者に臨床的に使用される。これらの小さい分子サイズのために、ＭＣＴは、迅速に消化され、肝臓に直接進み、肝臓でこれらは迅速に代謝され、血中ケトンレベルの上昇をもたらす。ケトン濃度の増加及びグルコース濃度の減少は、ケトン生成食の主要な生理学的作用である（例えば、食事は９０％の脂肪及び１０％のタンパク質／炭水化物から構成される）。
【００１０】
ＥＧＣＧは、緑茶で最も豊富に見出されるカテキンである。クルクミンは、ウコン根に由来する。
【００１１】
アブラナ科野菜は、イオウ含有化学物質であるグルコシノレートとして知られる一群の物質を含有する。消化、食物調理又は咀嚼の際に、グルコシノレートは多くの生理活性化合物に分解され、これらは、インドール、ニトリル、チオシアネート、イソチオシアネート、インドール−３−カルビノール及びスルフォラファン［ＳＦＮ］が含まれるが、これらに限定されない。
【００１２】
ＳＦＮは、アブラナ科野菜（例えば、芽キャベツ、キャベツ、カリフラワー、チンゲンサイ、ケール、コラード、カイラン菜、ブロッコリー・ラーブ、コールラビ、カラシ、カブ、大根、キバナスズシロ、及びクレソン）で見出される、グルコシノレート前駆体であるグルコラファニンの転化から誘導された生物活性分子である。これは、ブロッコリースプラウトで最も高い濃度で見出される。グルコラファニン及びＳＦＮを含むその生理活性分解生成物などのグルコシノレートの有効用量は、前述のアブラナ科野菜又はアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属からの植物に由来のスプラウト又はスプラウト粉末の摂取によって供給され得る。フレーズ「グルコシノレート及び／又はその誘導体（グルコラファニン及び／又はスルフォラファン（ＳＦＮ）など）を含む組成物（複数可）」又はグルコシノレートを含む組成物（複数可）」又は「グルコラファニンを含む組成物（複数可）」又は「ＳＦＮを含む組成物（複数可）」は、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属の成熟植物又は成熟アブラナ科野菜の１つ以上の粉末、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属の成熟植物又は成熟アブラナ科野菜の摂取可能な野菜物質、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属の植物又はアブラナ科野菜の乾燥又は非乾燥スプラウト、若しくはアブラナ科野菜から又はアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属の植物から得た粉末状スプラウトを含んでもよい。
【００１３】
いくつかの実施形態では、グルコシノレート及び／又はその誘導体（グルコラファニン及び／又はスルフォラファン（ＳＦＮ）など）を含む組成物（複数可）は、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属の成熟植物又は成熟アブラナ科野菜の粉末、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属の成熟植物又は成熟アブラナ科野菜の摂取可能な野菜物質、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属の植物又はアブラナ科野菜の乾燥又は非乾燥スプラウトから形成された粉末、若しくはアブラナ科野菜から又はアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属の植物から得た粉末状スプラウトを含む。上述のように、１つ以上のアブラナ科野菜又はアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属からの植物から得た粉末は、グルコシノレート及び／又はその誘導体（グルコラファニン及び／又はスルフォラファン（ＳＦＮ）など）を含む組成物に組み合わせることができる。上述の粉末は、凍結乾燥粉末の形態で提供されてもよい。こうした粉末の投与は、グルコラファニン、すなわち、ミロシナーゼによってその後ＳＦＮに代謝される化合物を含むグルコシノレートを、治療される対象に供給する。カイワレ大根は、上述の成分と共に組成物中に組み合わせることができる。カイワレ大根が、本明細書に記載される種々の成分を含む組成物中に配合される場合、カイワレ大根は、粉末（任意選択的に、凍結乾燥されて）、スプラウト、成熟野菜又はスプラウト粉末（乾燥した及び／又は凍結乾燥スプラウト粉末を含む）の形態で提供され得る。
【００１４】
本発明は、増殖性障害、例えば癌の治療を目的とする。したがって、本発明の一態様は、増殖性障害の治療を提供し、治療は、増殖性疾患に対する治療を必要とする対象に、化合物の組み合わせを投与することと、必要に応じて、対象に低炭水化物食若しくは修正ケトン生成食又はケトン生成食を同時に提供することとを含む。対象に投与される化合物の組み合わせは、ＥＧＣＧ、クルクミン、グルコラファニンなどのグルコシノレート及びＳＦＮなどの分解生成物（これらは、ブロッコリースプラウト若しくは他のアブラナ科野菜又はアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属の植物のスプラウトに由来し得る）を含む組成物、並びに、任意選択的に、カイワレ大根、カイワレ大根抽出物又は該抽出物の粉末、大根又はカイワレ大根を含む。これらの化合物（成分）は、単一の組成物として又は個別に（別個の組成物／成分として）、逐次的に又は同時に投与され得る。本発明のこの態様はまた、治療される増殖性障害に対して正常な細胞増殖の回復を提供し得る。したがって、本発明のこの態様において治療される様々な形態の癌については、増殖性障害に関連付けられる過剰な細胞増殖が、増殖性障害を引き起こす特定の細胞（例えば、Ｂ細胞リンパ腫が治療される場合、Ｂ細胞）についての正常な増殖レベルにおける、若しくは正常な増殖レベルに近いレベルまで低減又は減弱される。細胞の正常な又は正常に近い増殖レベルは、一般的には、当該技術分野で既知であるか、又は当業者によって決定され得る。したがって、本発明の特定の実施形態は、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９５％又はそれ以上まで増殖性障害に関連付けられる増殖細胞を低減する／減弱することを提供する。
【００１５】
本発明の種々の他の態様は、増殖性障害を治療するために、対象において増殖性疾患の発生を減少させるために、対象において増殖性疾患の進行を遅らせるために、増殖性疾患を有する対象において生存率を増加させるために、増殖性疾患を有する患者に対する従来の療法の効果を増強させるために、増殖性疾患を有する患者について抵抗性細胞を従来の療法に対して増感させるために、化学療法で治療された対象において化学療法の神経作用を低減するために、若しくは腫瘍を発現している又は腫瘍を有する対象において、あるいは神経変性疾患又は障害を有する対象においてＣＮＳの神経幹細胞（ＮＳＣ）のダウンレギュレーションを低減するために、対象におけるエピガロカテキン−３−ガレートを含む組成物、クルクミンを含む組成物、並びにグルコラファニンなどのグルコシノレート及びＳＦＮなどの分解生成物を含む組成物、必要に応じて、修正ケトン生成食又はケトン生成食の使用を提供する。上述の組成物は、別個に、２、３又は４成分の組成物で別個に、若しくは組成物の全ての成分の組み合わされた組成物（任意選択的に、上述のように、カイワレ大根、それらの抽出物及び／又はそれらの粉末を含む）として、投与され得る。対象において増殖性疾患の進行を遅らせることは、増殖性疾患が経時的に進行する速度を低減することに関連し、例えば、腫瘍の増加した体積の低減として測定され得る。増殖性疾患を有する対象において生存率を増加させることは、対象において増殖性疾患の進行を遅延させることに関連し、増殖性疾患を有する対象の生存期間の増加につながる。増殖性疾患を有する患者について従来の療法の効果を増強させることは、開示された方法を、増殖性疾患を有する対象を治療するために使用される従来の療法と組み合わせることに関連する。この療法の組み合わせは、従来の治療法と開示された方法の個々の効果に等しい（加算効果）又はこれよりも大きい（相乗効果）肯定的な結果につながる。増殖性疾患を有する患者について抵抗性細胞を従来の療法に対して増感させることは、開示された方法の、増殖性疾患を有する患者を治療するために使用された従来の治療法に非感受性であった増殖性疾患を、疾患が以前には無反応性／不応性であった従来の治療法に応答する増殖性疾患に変換するための能力に関連する。化学量の神経作用を低減することは、対象が化学療法を受ける際に、神経幹細胞及び前駆体細胞の活性の低下を低減又は予防することに関連する。
【００１６】
修正ケトン生成食は、少なくとも５％かつ２０％以下の炭水化物（一日の対象による摂取によっての総カロリー摂取量の関数として）を含有する食事であり、対象のための食事の残部は、脂肪及びタンパク質を含む。したがって、この食事は、毎日の総カロリー摂取量の関数として、約５％〜約２０％の炭水化物、約３０％〜約７５％の脂肪及び約５％〜約６５％のタンパク質を含有する。特定の実施形態では、この食事は、約８％〜約１５％の炭水化物、約５０％〜約７０％の脂肪、及び約１８％〜約４２％のタンパク質を提供し得る。いくつかの実施形態では、対象の食事の脂肪含有量の約３０％〜約７０％（例えば、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、又は約７０％）は、中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）からなり得る。他の実施形態は、ＭＣＴが対象の食事の脂肪含有量の約５０％を構成する食事を提供する。
【００１７】
２０００キロカロリーの一日摂取量に基づく（並びに炭水化物１ｇが４キロカロリーを提供し、脂肪１ｇが９キロカロリーを提供し、タンパク質１ｇが４キロカロリーを提供し、およびＭＣＴ１ｇが６．８キロカロリーを提供するという事実に基づく）食物の総量（グラム）の関数として、修正ケトン生成食は、少なくとも２５ｇかつ１００ｇ以下の炭水化物を含有し、対象のための食事の残部が、脂肪及びタンパク質を含む。したがって、この食事は、毎日の総グラム摂取量の関数として、約２５ｇ〜１００ｇの炭水化物、約６７ｇ〜約１６７ｇの脂肪及び約２５ｇ〜約３２５ｇのタンパク質を含有する。特定の実施形態では、この食事は、約４０ｇ〜約７５ｇの炭水化物、約１１１ｇ〜約１５５ｇの脂肪及び約９０ｇ〜約２１０ｇのタンパク質を提供し得る。いくつかの実施形態では、対象の食事の脂肪含有量のうちの約３０％〜約７０％（例えば、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、又は約７０％）は、中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）からなり得る。これは、約４０ｇ〜約１６５ｇのＭＣＴを表す。
【００１８】
ケトン生成食（ＫＤ）は、炭水化物含有量が、対象の毎日のカロリー摂取量の５％未満、又は約５％に等しく、食事の残部が脂肪又はタンパク質からなる食事である。したがって、この食事は、毎日の総摂取量の関数として、約５％以下の炭水化物、約３０％〜約９０％の脂肪、及び約５％〜約７０％のタンパク質を提供する。特定の実施形態では、この食事は、約３％（又はそれ以下）の炭水化物、約５７％〜約９５％の脂肪、及び約５％〜約４０％のタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、対象の食事の脂肪含有量のうちの約３０％〜約７０％（例えば、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、又は約７０％）は、中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）からなり得る。他の実施形態は、ＭＣＴが対象の食事の脂肪含有量の約５０％を構成する食事を提供する。
【００１９】
本発明の別の実施形態では、治療は、増殖性障害のための治療を必要とする対象に、ｍＫＤ又はＫＤ食を提供することと、必要に応じて、ＥＧＣＧ、クルクミン、グルコシノレート、任意選択的にカイワレ大根のうちの１つ以上を含む組成物を投与することを含む。種々の実施形態は、ＥＧＣＧ、クルクミン、及びグルコシノレートを含む組成物又はＥＧＣＧ、クルクミン、グルコシノレート及びカイワレ大根を含む組成物を対象に投与することを含む。本発明の任意の態様では、ＥＧＣＧ、クルクミン、グルコラファニン及びその分解生成物のＳＦＮなどのグルコシノレート（これは、ブロッコリースプラウト若しくは他のアブラナ科野菜又はアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属の植物のスプラウトにおいて高濃度で見出される）を含む組成物、並びにカイワレ大根又はそれらの抽出物を含む組成物は、食品から生成される粉末又は抽出物の形態で提供されてもよく、これらの化合物の少なくとも１つは天然に存在する。さらに、対象に投与される組成物は、組み合わせとして（例えば、ＥＧＣＧ、クルクミン、グルコラファニンなどのグルコシノレート及びその分解生成物のＳＦＮ、及び／又はカイワレ大根のそれぞれが単一組成物で）対象に投与され得るか、又は成分（ＥＧＣＧ、クルクミン、グルコラファニン及びその分解生成物のＳＦＮなどのグルコシノレート、並びにカイワレ大根）のそれぞれが、同時又は逐次摂取用に対象に個々に提供され得る（例えば、カプセル剤、カプレット剤、錠剤、粉剤、ゲル剤又は他の単位投与剤形の形態）。
【００２０】
増殖性障害又は癌の治療のための本発明の前述の態様のいずれかは、１つ以上の追加の抗癌療法又は療法（複数）の実行をさらに含んでもよい。こうした療法としては、放射線療法、化学療法、手術、免疫療法、小型分子、キナーゼ阻害及び／又はモノクローナル抗体療法（例えば、Ｂ細胞リンパ腫の治療のためのリツキシマブ）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のある実施形態では、追加の療法は、テモゾロミド（ＴＭＺ）の投与を含む。
【００２１】
本発明の種々の他の態様では、抗癌療法又は療法（複数）は、本発明によって提供される治療に加えて（組み合わせて）実行される。こうした抗癌療法は、限定されないが、以下の１つ以上を投与することを含む。酢酸アビラテロン、アビトレキサート（メトトレキサート）、アブラキサン（パクリタキセルアルブミン懸濁型ナノ粒子化製剤）ＡＢＶＤ、ＡＢＶＥ、ＡＢＶＥ−ＰＣ、ＡＣ、ＡＣ−Ｔ、アドセトリス（ブレンツキシマブ  べドチン）ＡＤＥ、アドリアマイシン（ドキソルビシン塩酸塩）、アドルシル（フルオロウラシル）、アフィニトール（エベロリムス）、アルダラ（イミキモド）、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリムタ（ペメトレキセド二ナトリウム）、アロキシ（パロノステロン塩酸塩）、アムボクロリン（クロラムブシル）、アミノレブリン酸、アナストロゾール、アプレピタント、アリミデックス（アナストロゾール）、アロマシン（エキセメスタン）、アルラノン（ネララビン）、三酸化アルセニン、アルゼラ（オファツムマブ）、アスパラギナーゼ  エルウィニア・クリサンセミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）、アバスチン（ｂｅｂａｓｈｉｚｕｍａｂｕ）アキシチニブ、アザシチジン、ＢＥＡＣＯＰＰ、ベンダムスチン塩酸塩、ＢＥＰ、ベバシズマブ、ベキサロテン、ベキサー（トシツモマブ及びＩ  １３１  ヨウ素  トシツモマブ）、ブレオマイシン、ボルテゾマブ、ボスリフ（ボスチニブ）ボスチニブ、ブレンツキシマブ  ベドチン、カバジタキセル、カボザンチニブ−Ｓ−マレート、ＣＡＦ、カンパス（アレムツズマブ）、カンプトサール（イリノテカン塩酸塩）、カペシタビン、ＣＡＰＯＸ、カルボプラチン、カルボプラチン−タキソール、カルフィルゾマブ、ＣｅｅＮＵ（ロムスチン）、セルビジン（ダウノルビシン塩酸塩）、セルバリックス（組換えＨＰＶ二価ワクチン）、セツキシマブ、クロラムブシル、クロラムブシル−プレドニゾン、ＣＨＯＰ、シスプラチン、クラフェン（シクロホスファミド）、クロファラビン、クロファレックス（クロファラビン）、クロラール（クロファラビン）、ＣＭＦ、コメトリク（カボザンチニブ−Ｓ−マレート）、ＣＯＰＰ、コスメゲン（アクチノマイシンＤ）、クリゾチニブ、ＣＶＰ（ＣＯＰ）、シクロホスファミド、Ｃｙｆｏｓ（イホスファミド）シタラビン、シタラビン、リポソーム化シトサール−Ｕ（シタラビン）、シトキサン（シクロホスファミド）、ダカルバジン、ダコゲン（デシタビン）、アクチノマイシンＤ、ダサチニブ、ダウノルビシン塩酸塩、デシタビン、デガレリクス、デニロイキン、ジフィチトクス、デノスマブ、ＤｅｐｏＣｙｔ（リポソーム化シタラビン）、ＤｅｐｏＦｏａｍ（リポソーム化シタラビン）、デキストラゾキサン塩酸塩、ドセタキセル、ドキシル（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム型）、ドキソルビシン塩酸塩、ドキソルビシン塩酸塩リポソーム、Ｄｏｘ−ＳＬ（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム型）、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍe（ダカルバジン）、エフデックス（フルオロウラシル）、エリテック（ラスブリカーゼ）、エレンス（エピルビシン塩酸塩）、エロキサチン（オキサリプラチン）、エルトロムボパグ  オラミン、イメンド（アプレピタント）、エンザルタミド、エピルビシン塩���塩、ＥＰＯＣＨ、アービタックス（セツキシマブ）、メシル酸エリブリン、エリベッジ（ビスモデギブ）、エルロチニブ塩酸塩、エルウィナーゼ（アスパラギナーゼ  エルウィニア・クリサンセミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ））、エトポフォス（リン酸エトポシド）、エトポシド、リン酸エトポシド、エバセット（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム型）、エベロリムス、エビスタ（ラロキシフェン塩酸塩）、エキセメスタン、ファレストン（トレミフェン）、ファスロデックス（フルベストラント）、ＦＥＣ、フェマーラ（レトロゾール）、フィルグラスチン、フルダラ（リン酸フルダラビン）、リン酸フルダラビン、フルオロプレックス（フルオロウラシル）、フルオロウラシル、フォレックス（メトトレキサート）、フォレックスＰＦＳ（メトトレキサート）、フォルフィル、フォルフィリ−ベバシズマブ、フォルフィルノクス、フォルフォックス、フォロチン（プララトレキサート）、ＦＵ−ＬＶ、フルベストラント、ガルダシル（組換えＨＰＶ四価ワクチン）、ゲフィチニブ、ゲムシタビン塩酸塩、ゲムシタビン−シスプラチン、ゲムツズマブ  オゾガマイシン、ジェムザール（ゲムシタビン塩酸塩）、グリベック（メシル酸イアマチニブ）、グルカルピダーゼ、ハラベン（メシル酸エリブリン）、ヘルセピン（トラスツズマブ）、ＨＰＶ二価ワクチン（組換え体）、ＨＰＶ四価ワクチン（組換え体）、ハイカムチン（トポテカン塩酸塩）、イブリツモマブ  チウキセタン、ＩＣＥ、イクルシグ（ポナチニブ塩酸塩）、アイフェックス（イホスファミド）、イホスファミド、イホスファミダム（イホスファミド）、メシル酸イマチニブ、イミキモド、インライタ（アキシチニブ）、イピリムマブ、イレッサ（ゲフィチニブ）、イリノテカン塩酸塩、イストダックス（ロミデプシン）、イキサベピロン、イクゼンプラ（イキサベピロン）、ジャカフィ（リン酸ルキソリチニブ）、ジェブタナ（カバジタキセル）、ケオキシフェン（ラロキシフェン塩酸塩）、ケピバンス（パリフェルミン）、キプロリス（カルフィルゾミブ）、トシル酸ラパチニブ、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリンカルシウム、ロイケラン、（クロラムブシル）、酢酸ロイプロリド、レブラン（アミノレブリン（酸））、リンフォリジン（クロラムブシル）、リポドックス（ドキソルビシン塩酸塩、リポソーム型）、リポソーム化シタラビン、ロムスチン、ルプロン（酢酸ルプロリド）、ルプロンデポット（酢酸ルプロリド）、ルプロンデポット−Ｐｅｄ（酢酸ルプロリド）、ルプロンデポット３ヶ月（酢酸ルプロリド）、ルプロンデポット４ヶ月（酢酸ルプロリド）、マルキボ（硫酸ビンクリスチン、リポソーム型）、マチュイレーン（プロカルバジン塩酸塩）、メクロレタミン塩酸塩、メスナ、メスネックス（メスナ）、メタゾラストン（テモゾロミド）、メトトレキサート、メトトレキサートＬＰＦ（メトトレキサート）、メキセート（メトトレキサート）、メキセート−ＡＱ（メトトレキサート）、ミトマイシンＣ、ミトジトレックス（ミトマイシンＣ）、ＭＯＰＰ、モゾビル（プレリキサフォル)、ムスタルゲン（メクロレタミン塩酸塩）、ムタマイシン（ミトマイシンＣ）、ミロサール（アザシチジン）、ミロタルグ（���ムツズマブ  オゾマイシン）、ナノ粒子パクリカキセル（パクリタキセルアルブミン懸濁型ナノ粒子化製剤）、ナベルビン（酒石酸ビノレルビン）、ネララビン、ネオサール（シクロホスファミド）、ニューポジェン（フィルグラスチン）、ネキサバール（トシル酸サロフェニブ）、ニロチニブ、ノルバデックス（クエン酸トモキシフェン）、Ｎｐｌａｔｅ（ロモプロスチン）、オファツムマブ、オマセタキシン、メペスクシネート、オンキャスパー（ペグアスパラガーゼ）、オンタック（デニロイキン  ジフチトクス）、オキサリプラスチン、パクリタキセル、パクリタキセルアルブミン懸濁型ナノ粒子化製剤、パリフェルミン、パロノセトロン塩酸塩、パニツムマブ、パラプラット（カルボプラチン）、パラプラチン（カルボプラチン）、パゾパニブ塩酸塩、ペグアスパラガーゼ、ペメトレキセド二ナトリウム、パージェタ（ペルツズマブ）、ペルツムマブ、プラチノール（シスプラスチン）、プラチノール−ＡＱ（シスプラスチン）、プレリキサフォル、ポナチニブ塩酸塩、プララトレキサート、プレドニゾン、プロカルバジン塩酸塩、プロロイキン（アルデスロウキン）、プラリア（デノスマブ）、プロマクタ（エルトロンボパグ  オラミン）、プロベンジ（シプロイセル−Ｔ）、ラロキシフェン塩酸塩、ラスブリカーゼ、Ｒ−ＣＨＯＰ、Ｒ−ＣＶＰ、組み換えＨＰＶ二価ワクチン、組み換えＨＰＶ、四価ワクチン、レゴラフェニブ、レブリミド（レナリドミド）、リウマトレックス（メトトレキサート）、リツキサン（リツキシマブ）、リツキシマブ、ロミデスピン、ロミプロスチム、ルビドマイシン（ダウノルビシン塩酸塩）、リン酸ルキソリチニブ、スクレロソール・イントラプルーラル、アエロゾル（タルク）、シプロイセル−Ｔ、トシル酸ソラフェニブ、スプリシル（ダサチニブ）、スタンフォードＶ、滅菌タルク粉末（タルク）、ステリタルク（タルク）、スチバーガ（レゴラフェニブ）、リンゴ酸スニチニブ、ステント（リンゴ酸スニチニブ）、サイノビル（サリドマイド）、シンリボ（オマセタキシン  メピスクシネート）、タルク、クエン酸タモキシフェン、タラビンＰＦＳ（シタラビン）、タルセバ（エルロチニブ塩酸塩）、タルグレチン（ベキサロテン）、タシグナ（ニロチニブ）、タキソール（パクリタキセル）、タキソテール（ドセタキセル）、テモダール（テモゾロミド）、テモゾロミド、テムシロリムス、サリドマイド、サロミド（サリドマイド）、トポサール（エトポシド）、トポテカン塩酸塩、トレミフェン、トリセル（テミロリムス）、トシツモマブ及びＩ  １３１ヨウ素トシツモマブ、トテクト（デクスラゾキサン塩酸塩）、トラスツズマブ、トレアンダ（ベンダムスチン塩酸塩）、トリセノックス（三酸化ヒ素）、タイケルブ（二トシル酸ラパチニブ）、バンデタニブ、ＶＡＭＰ、ベクティビックス（パニツムマブ）、ＶｅＩＰ、ベルバン（硫酸ビンブラスチン）、ベルケイド（ボルテゾミブ）、ベルサール（硫酸ビンブラスチン）、ベムラフェニブ、ベプシド（エトポシド）、ビアジュール（酢酸ロイプロリド）、ビダーザ（アザシチジン）、硫酸ビンブラスチン、ビンカサーＰＦＳ（硫酸ビンクリスチン）、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンクリスチンリポソーム型、酒石酸ビノレルビン、ビスモデジブ、ボラキサーゼ（グルカルピダーゼ）、ボリノスタット、ボトリエント（パゾパニブ塩酸塩）、ウェルコボリン（ロイコボリンカルシウム）、ザーコリ（クロゾチニブ）、ゼローダ（カペシタビン）、ＸＥＬＯＸ、イクスゲバ（デノスマブ）、イクスタンジ（エンザルタミド）、ヤーボイ（イピリムマブ）、ザルトラップ(Ｚｉｖ−アフリベルセプト)、セルボラフ（ベムラフェニブ）、ゼバリン（イブリツモマブ  チウキセタン）、ザインカード（デクスラゾキサン塩酸塩）、Ｚｉｖ−アフリベルセプト、ゾレドロン酸、ゾリンザ（ボリノスタット）、ゾメタ（ゾレドロン酸）、及びザイティガ（酢酸アビラテロン）。
【００２２】
本発明の特定の態様では、本発明によって治療される増殖性疾患は、神経膠芽細胞腫ではない。しかしながら、本発明の治療は、広範囲にわたる他の増殖性障害のための有意義な治療を提供する。例えば、本発明によって提供される治療は、脳、乳房、結腸、及び肺癌を含む、前臨床モデルにおいて有効かつ非毒性であると考えられる。したがって、本発明の治療で処置され得る増殖性障害としては、限定されないが、以下のものが挙げられる。急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、エイズ関連癌、エイズ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、小脳星状細胞腫、基底細胞癌、胆管癌、肝臓外膀胱癌、膀胱癌、骨癌、骨肉腫及び悪性繊維性組織球腫、胎児性腫瘍、大脳星状細胞腫、上衣芽細胞腫、神経髄芽細胞腫、上衣細胞腫、中分化型松果体実質部腫瘍、テント上未分化神経外胚葉性腫瘍及び松果体芽細胞腫、視経路及び視床下部癌、脳脊髄腫瘍、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、胃腸癌、頭頚部癌、中枢神経系リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮体癌、上衣芽細胞腫、上皮細胞腫、食道癌、ユーイングファミリー腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、肝臓外胆管癌、眼の癌、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃（Ｓｔｏｍａｃｈ）癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）、頭蓋外胚細胞腫瘍、胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣癌、妊娠性絨毛腫瘍、有毛状細胞性白血病、頭頚部癌、肝細胞（肝臓）癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、膵島細胞腫瘍（膵臓内分泌腺）、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）癌、腎臓癌、喉頭癌、慢性リンパ性白血病、慢性白血病、骨髄性白血病、口唇及び口腔癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞型リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、マクログロブリン血症、ヴァルデンストレム、骨の悪性繊維性組織球腫及び骨肉腫、神経髄芽細胞腫、上衣細胞腫、黒色腫、眼内メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明の転移性頚部扁平上皮癌、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、脊髄形成異常／骨髄増殖疾患、骨髄性白血病、多発性骨髄増殖障害、鼻腔及び副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽腫、非小細胞肺癌、口腔癌、口腔内癌、口唇及び口腔咽頭癌、骨肉腫及び骨の悪性繊維性組織症、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、低悪性度卵巣腫瘍、膵臓癌、膵臓癌、膵島細胞腫瘍、乳頭腫、副鼻腔及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、クロム親和性細胞腫、中間型松果体実質腫瘍、松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞新生物／多発性骨髄腫、胸膜配芽球腫、原発性中枢神経リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）癌、腎盂尿管癌、移行上皮細胞癌、染色体１５上のＮＵＴ遺伝子が関与する呼吸器管の癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、カポジ肉腫、軟組織肉腫、子宮セザリー症候群、皮膚癌（非黒色腫）、皮膚上皮癌、メルケル細胞、小細胞肺癌、腸癌、扁平細胞癌、原発不明の頚部扁平上皮癌、テント上原始神経外胚葉腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫及びセザリー症候群、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫瘍及び胸腺、甲状腺癌、腎盂尿管の移行上皮細胞癌、妊娠性絨毛腫瘍、原発部位が不明の上皮癌、尿道癌、子宮内膜肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレーム型マイクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、粉末、飲料、乳剤、ゲル、又はこれらの混合物の形態で、ＭＣＴ、ＥＣＧＣ、クルクミンを含む組成物、並びにグルコシノレート及び／又はそれらの誘導体（グルコラファニン及び／又はスルフォラファン（ＳＦＮ）など）を含む組成物を提供する。本発明のさらに他の態様は、カプセル、錠剤、粉剤、飲料、乳剤ゲル剤、又はこれらの混合物の形態で、ＭＣＴ、ＥＣＧＣ、クルクミン、及び／又はグルコシノレート及び／又はそれらの誘導体（グルコラファニン及び／又はスルフォラファン（ＳＦＮ）など）含む組成物、そのカイワレ大根を含む組成物を提供する。増殖性疾患に対する治療又はＮＳＣダウンレギュレーションのスペア処理を必要としている対象は、本発明によって提供される組成物を、直接的に又は他の食物又は飲料、例えば、水、果実ジュース、ヨーグルト、スープ、シチュー、ペーストなどとこれを混合することによってのいずれかで摂取することができる。さらに、本組成物（又は個々の成分）はまた、他の食品、例えば、ケーキ、クッキー、シリアルバーなどに組み込まれ得る。
【００２４】
本明細書で言及され又は引用される全ての特許、特許出願、仮出願、及び刊行物は、これらが本明細書の明示的な教示と矛盾しない限りにおいて、図面及び表を含むそれらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２５】
以下は、本発明を実施するために手順を例示する実施例である。これらの実施例は、限定的なものとして解釈されるべきではない。特に明記されない限り、全てのパーセンテージは重量基準又はカロリー基準であり、全ての溶媒混合物の比率は、体積基準である。
実施例１：修正ケトン生成食［ｍＫＤ］は、グルコース及びケトンレベルをケトン生成食［ＫＤ］と同様な範囲まで変更する
【００２６】
ＮＯＤ−ＳＣＩＤ動物を、ＫＤ又はｍＫＤ又はｍＫＤ＋ＥＤＰに２週間にわたって配置した。食餌の組成は以下の通りである（カロリーのパーセンテージとして表される）。
対照の食餌：標準的マウス用の試料であり、５５％の炭水化物、３０％のタンパク質、１５％の脂肪から構成される。
ＫＤ：９２％の脂肪、３％の炭水化物、５％のタンパク質。
ｍＫＤ：１０％の炭水化物、６０％の脂肪（半分は中鎖トリグリセリド［ＭＣＴ、Ｎｅｏｂｅｅ  ５９８］に由来）、３０％のタンパク質。
ＮＰ食餌：５５％の炭水化物、３０％のタンパク質、１５％の脂肪＋スルフォラファン（ＳＦＮ；２５ｍｇ／ｋｇ；ＢＳＰ９５％／ＤＲＳＰ５％）、クルクミン（１２００ｍｇ／ｋｇ）、ＥＧＣＧ（１２００ｍｇ／ｋｇ）。
ｍＫＤ／ＮＰ：１０％の炭水化物、６０％の脂肪（半分は中鎖トリグリセリド［ＭＣＴ、Ｎｅｏｂｅｅ  ５９８］に由来）、３０％のタンパク質＋ＳＦＮ（２５ｍｇ／ｋｇ；ＢＳＰ９５％／ＤＲＳＰ５％）、クルクミン（１２００ｍｇ／ｋｇ）、ＥＧＣＧ（１２００ｍｇ／ｋｇ）。
【００２７】
各食餌群中、１０匹の動物を、修正食に２週間配置し、この時点で尾端部法を用いて、以下のプロトコルに従って血液を採集した。すなわち、「５０ｍＬのコニカル（又はマウス固定具）を用いて、麻酔処理していないマウスを、マウスの尾部をつかみながらコニカルの内部に優しく配置する。マウスの尾部を硬質表面上に配置する。解剖用メスを用いて、尾端部の１ｍｍ未満を切断する。実施者の指を尾部の根元に置き、実施者の指を尾端部から上方に走らせながら、優しく絞り出す。１滴から２滴の血液（５〜１０μＬ）が尾端部で現れる。乾燥ガーゼを用いて血液の最初の数滴を拭き取り、所望の量の血液が採集されるまでこのステップを繰り返す（暗色の全血であるべきで、透明な［血漿様］血液は、血液読取りの非一貫性をもたらすであろう）。マウスをケージに戻して配置し、過剰の出血を監視する」。
【００２８】
血液サンプルを、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ血中グルコース／ケトンモニターで分析し、グルコースについてはｍｇ／ｄｌで、ケトンについてはミリモルでそれぞれ表した。グルコースレベルに関しては、全ての４つの実験の食餌は、グルコースにおける有意な減少をもたらした［図１、ｐ＜０．００１］。同様に、ケトンレベルを、ＮＰ食餌を除く全ての食餌群で評価した［図２、ｐ＜０．００１］。これらのデータは、ｍＫＤ及びｍＫＤ／ＮＰ食餌が、ＫＤの２つの重要な生理学的特徴、すなわち、グルコースにおける有意な減少及びケトンにおける有意な増加を模倣することができることを立証している。
実施例２：ｎＫＤ／ＮＰ食餌は、安全であり、毒性の徴候を有さない
【００２９】
癌治療薬の大半は、患者の健康状態に影響を与えるばかりでなく、治療の中止及び治療の有効性に影響を及ぼし得る投与量の低減ももたらす、用量限定的な毒性副作用を有する。齧歯類の全般的な健康状態の最適な指標の１つは、その体重である［これは、ヒトの患者においても同様な事実である］。ＮＯＤ−ＳＣＩＤ動物に、１ＭのＧＢ細胞［患者由来の株］をその右側腹部に接種した。動物を、腫瘍形成の徴候について、１週間に３回開始した。一旦腫瘍が特定されたら［触診によって、及び約６５ｍｍ３］、動物を無作為に１又は２群：［１］対照の食餌又は［２］ｍＫＤ／ＮＰ食餌に割り付けた。体重を週３回監視した。図３は、初めの対照群が終点［１６日目］に到達するまでの体重における変化率を示している。ｍＫＤ／ＮＰ群は、最初の数日間にわたって、初めは体重が減少したが［新しい食事に対する適合することに起因する］、これらの群は体重減少を急激に回復し、対照群よりも有意な速度で体重を増加し続けた［ｐ＜０．００５、線形回帰、ＧｒａｐｈＰａｄ］。
【００３０】
動物が終点に到達したときに、心臓内穿刺又は後眼窩穿刺を介して血液を採集し、血液サンプルを、以下の分析用に、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＬＬＣに送った。
［１］ アルカリホスファターゼ［ＡＬＰ］−肝臓、骨及び膵臓機能検査
［２］ アラニントランスアミナーゼ［ＡＬＴ］−肝機能検査
［３］ アスパルテートアミノトランスフェラーゼ［ＡＳＴ］−肝機能検査
［４］クレアチニン−腎臓機能検査
図４は、対照とｍＫＤ／ＮＰ給餌動物との間で、肝臓、腎臓、骨及び膵臓機能において統計的有意差がないことを示している。これと共に、図３及び４は、ｍＫＤ／ＮＰ食餌が安全であり、注目される毒性副作用を有さないという結論を支持している。
実施例３：標準的なケア［ＳＯＣ］対ｍＫＤ／ＮＰの間の安全性の比較
【００３１】
高グレード神経膠腫のための第１選択化学療法は、テモゾロミド［ＴＭＺ］であり、ＴＭＺは、ＤＮＡを損傷し、細胞死を標的とする経口アルキル化剤である。ＴＭＺは、有効な化学療法剤ではあるが、これはまた重度の毒性を有する。実施例２に記載されたものと同様な皮下モデルを用いて、腫瘍提示の時点で、動物を、３つの群：［１］対照の食餌、処置なし、［２］対照の食餌、ＳＯＣ［ＴＭＺ、２０ｍｇ／ｋｇ、週３回］、［３］ｍＫＤ／ＮＰの食餌のうちの１つに無作為に割り付けした。我々は腫瘍に無関係の原因の結果として死亡した動物の数を分析し、ＳＯＣ処置が、未処置の対照と比べて死亡率の増加をもたらしたことを注目した［図５］。死亡率における同様な増加は、ｍＫＤ／ＮＰ群では見られず、ここでは死亡率は、対照と統計的な差はなかったが、ＳＯＣ群よりも有意に低かった。
【００３２】
ＳＯＣ処置を受けている間に、体重が測定されたが、驚くべきことに、対照及びｍＫＤ／ＮＰ処置動物と比べて、ＳＯＣ群では有意に減少しなかった［図６］。ｍＫＤ／ＮＰ処置がＳＯＣと同じほど有効であったことに留意することが重要である。したがって、これらのデータは、ｍＫＤ／ＮＰが、全般的な健康状態に及ぼす有害な作用［体重によって明らかにされるような］を有さず、全般的な健康状態に影響を及ぼし、死亡率を増加させるＳＯＣとは異なり、死亡率に直接的に影響しないことを教示している。
実施例４：天然生成物［ＮＰ］は有効な癌治療を提供する
【００３３】
患者由来のｈＧＢ細胞を、腫瘍細胞にそれらの表現型及び遺伝子型特性の両方を保持させる確立されたプロトコルを用いて、インビトロにおいて規定条件下で培養した。ｈＧＢ細胞株を、以下ＮＰで処置した。
［１］ ＥＧＣＧ−８μＭ
［２］ クルクミン−０．５Ｍ
［３］ ＳＦＮ−２．５μＭ
［４］３つのＮＰ全ての組み合わせ
ＮＰのそれぞれは、対照培養と比べて、産生された細胞の全体数において有意な減少をもたらした［図７］。しかしながら、３つのＮＰの全ての同時適用は、新しい細胞の産生を減少させることに関して相乗効果をもたらした。これらのデータは、ＮＰのそれぞれが異なるメカニズムによってそれらの作用を及ぼすという仮説を支持するものである。
【００３４】
１００万個のｈＧＢ細胞を、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの右側腹部に移植し、触診可能な腫瘍が特定された時点で、動物をランダムに５つの群のうちの１つに割り付けた。
［１］ 対照の食餌
［２］ 対照の食餌＋ＥＧＣＧ［１２００ｍｇ／ｋｇ］
［３］ 対照の食餌＋クルクミン［１２００ｍｇ／ｋｇ］
［４］ 対照の食餌＋ＳＦＮ［２５ｍｇ／ｋｇ；ＢＳＰ９５％／ＤＲＳＰ５％］
［５］対照の食餌＋ＥＧＣＧ／クルクミン／ＳＦＮ［群］２〜４と同一の濃度］
【００３５】
動物は、腫瘍が終点［１５００ｍｍ３］に到達するまでそれらの対応の食餌で維持され、殺処分された。カプランマイヤー生存曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄを用いて作成した。群２〜４は、対照動物よりも長く生存しなかったが、３つの天然生成物の全てで処置されたもの［群５］は、有意に長く生存した［図８］。これらのデータは、３つのＮＰを組み合わせる相乗作用並びにそれらの腫瘍の進行の低減及び寿命の向上に及ぼす効果を証拠立てるものである。
【００３６】
全体として、これらのデータは、我々のＮＰの特徴的な組み合わせが、インビトロで相乗効果を有することを教示しているが、インビボの相乗作用は、この特定の組み合わせが、予期せぬ抗癌作用を生み出し、それ自体が特徴的な多分子の植物性薬剤として定義されることを示している。
実施例５：天然生成物［ＮＰ］は、増殖する腫瘍細胞及び癌幹細胞を標的とする
【００３７】
患者由来のｈＧＢ細胞を、以下のＮＰの存在下で５〜７日間にわたって培養した。
［１］ＥＧＣＧ−８μＭ、［２］クルクミン−０．５μＭ、［３］スルフォラファン−２．５μＭ。次いで細胞を単一細胞懸濁液に分離し、対照栄養成長培地［ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ＋ＥＧＦ］と共に、９６ウェルプレート中、低密度でプレートした。この段階では、細胞はもはやＮＰに曝露させなかった。９６ウェルプレート中で７〜１０日間培養された後に、スフェアの数を計数し［クローン形成頻度を決定するため］、スフェアを大きさに従って分けた［各クローン形成細胞の増殖能力を決定するため］。９６ウェルプレート中の細胞を、まず初めに０．２％のトリトン−Ｘ及びＤＡＰＩの１：１０００希釈物を含有する４％のパラホルムアルデヒド溶液で固定した。蛍光画像を撮影し、スフェアの数及びそれらのサイズを、顕微鏡倍率を用いて定量化した。データをエクセルにエクスポートし、ＧｒａｐｈＰａｄで統計的分析を行った。図９は、この実験の結果を詳説し、我々のNPの組み合わせの増殖するクローン形成前駆体細胞のプールを低減するための能力及びクローンの増殖能力を低減するための能力を裏付けている。癌は、クローン形成性癌細胞の無秩序な増殖によって定義される疾患であるために、我々のＮＰのクローンを低減するための能力及び既存のクローンの増殖能力を低減するための能力は、我々の研究所見の新規性及び有用性を指し示している。
【００３８】
第２の実験［図１０］において、患者由来のｈＧＢ細胞を、以下のＮＰで処置しながら、連続継代させた。
［１］ ＥＧＣＧ−８μＭ、
［２］ クルクミン−０．５μＭ、
［３］ ＳＦＮ−２．５μＭ
［４］３つのＮＰＳの全ての組み合わせ
図１０Ａは、対照培養と比較しての各ＮＰそれ自体の増殖曲線の傾きを減らすための能力を示している。３つのＮＰの全ての組み合わせは、予期せぬ相乗効果を生み出した。我々が細菌開発し刊行したアルゴリズムを適用して、この連続継代実験から誘導されたデータは、処置の癌幹細胞集団に及ぼす効果を我々が調査しかつ測定することを可能にする。ＫＩＩ値［癌幹細胞が、所定の時間期間にわたって対称的細胞分裂を行う確率］として表されるとき、我々は、我々のＮＰのそれぞれが癌幹細胞の増殖を標的とすることができることを見ることができる。驚くべきことに、我々の３つのＮＰの組み合わせは、対照又はＮＰそれ自体の使用のいずれかと比べて、対称的癌幹細胞分裂を低減する上で統計的に有意な効果を有する［図１０Ｂ］
【００３９】
全体として、これらのデータは、我々のＮＰの組み合わせの、相当に攻撃的な固形組織腫瘍中のクローン形成性集団を標的化しこれらを低減する能力及びクローンの増殖能力を低減することができる能力を裏付けている。増殖の低減は、細胞がもはやＮＰに曝されない場合に観察された［図９］。このことは、我々のＮＰへの簡単な曝露が、腫瘍細胞増殖に及ぼす持続する効果を有し得ることを示唆している。加えて、治療に対する抵抗性及び再発の原因となるものが癌幹細胞集団であるために、我々のＮＰの組み合わせの癌幹細胞集団を標的化するための能力は、非常に重要かつ適切である。
実施例６：天然生成物［ＮＰ］は従来の化学療法と相乗的に作用する
【００４０】
多くの固形組織癌に対する標準的なケア［ＳＯＣ］は、進行性腫瘍又は高グレード腫瘍に対しては、限界的な恩恵をもたらす化学療法を伴う。患者由来のｈＧＢ細胞を培養によって増殖させ、従来薬のテモゾロミド［ＴＭＺ、２０μＭ］単独で、又はいかのＮＰと組み合わせて毎日処置した。
［１］ ＥＧＣＧ−８μＭ、
［２］ クルクミン−０．５μＭ、
［３］ ＳＦＮ−２．５μＭ
［４］３つのＮＰＳの全ての組み合わせ
培養の５〜７日後に、細胞を計数し、平均日増殖倍数を計算した。ＳＯＣ薬のＴＭＺは、腫瘍細胞の増殖を低減することに及ぼす統計学的に有意な効果を有すると同時に、ＳＦＮが最大の効果を示しながら、ＥＧＣＧ又はＳＦＮの添加はこの効果を増強させた。しかしながら、ＴＭＺと併せての３つのＮＰの全ての組み合わせは、全ての群と比べて、統計学的に有意な低減が存在して、最大の効果を有した。これらの結果は、我々の特徴的なＮＰの組み合わせが、ＳＯＣ  ＴＭＺの治療有効性を８倍まで増強させることができることを裏付けている。
実施例７：修正ケトン生成食［ｍＫＤ］は、癌治療として、安全で、栄養学的に十分であり、かつケトン生成食［ＫＤ］と同程度に有効である
【００４１】
ＮＯＤ−ＳＣＩＤ動物を以下の食餌のうちの１つに配置した。
［１］ 対照の食餌：標準的マウス用試料であり、５５％の炭水化物、３０％のタンパク質、１５％の脂肪から構成される。
［２］ ＫＤ：９２％の脂肪、３％の炭水化物、５％のタンパク質。
［３］ｍＫＤ：１０％の炭水化物、６０％の脂肪（半分は中鎖トリグリセリド［ＭＣＴ、Ｎｅｏｂｅｅ  ５９８］に由来）、３０％のタンパク質。
体重を処置開始後２４日目に測定し、ＫＤ群は体重で有意な減少を示したが、ｍＫＤ処置動物は、対照の食餌動物に比べて、これらの体重を維持した［図１２］。このことは、ｍＫＤが正常な健康状態を支援するのに栄養学的に十分であるという考えを支持する。
【００４２】
１Ｍ  ＧＢ腫瘍細胞をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの右側腹部に接種後に、動物を、３つの食餌のうちの１つに無作為に割り付けた。腫瘍の直径の２つの測定値を記録し、これを次の式：（４／３）πＲ３を用いて体積に変換することによって、腫瘍進行を追跡した。スフェロイド腫瘍については、２つの測定値を平均化し、スフェアの直径を決定した。楕円体腫瘍の場合（偏長又は偏平スフェロイド塊）には、使用された式は、（４／３）π＊（ｄ／２）＊（ｄ／２）２であった。この場合、２番目の測定値「ｄ２」は２回計数し、「ｄ」は１回だけ計数する。偏長スフェロイドについては、長軸測定を１回行い、短軸測定は２回行う。逆に、偏平スフェロイド腫瘍については、長軸測定は２回行い、一方短軸測定は１回だけ行う。この基準に従って、腫瘍体積を経時的に追跡した。図１３は、ＫＤ及びｍＫＤが、対照群と比べて腫瘍進行における有意な遅延をもたらすことを示している。ＫＤ及びｍＫＤ飼料動物間で差は認められなかった。全体的な生存率を、カプラン−マイヤー生存率曲線［ＧｒａｐｈＰａｄ］を用いて分析し、両ｍＫＤ及びＫＤ飼料動物は、対照よりも有意に長く生存した［図１４］。腫瘍進行と同様に、ｍＫＤとＫＤ群との間で有意差はなかった。最後に、我々は、腫瘍進行までの時間［触診可能な腫瘍が見ることができるサイズ−３００ｍｍ３に到達するのに要する時間として定義］を比較し、この場合、両ＫＤ及びｍＫＤ群における腫瘍進行までの時間で統計的有意差はなかった［図１５］。ＫＤ及びｍＫＤ飼料動物の間で差は認められなかった。図１６は、我々の３つの処置群の平均生存率を示している。平均生存率は、ＫＤ及びｍＫＤ飼育動物の両方で、これらの２つの群間で差が認められずに、有意に上昇された。
【００４３】
全体として、これらのデータは、我々のｍＫＤは、全体的な健康状態に及ぼす有害な作用がなく、栄養学的に十分であり、同様にＫＤも、腫瘍の進行を遅延させ、全体的な生存率を上昇させる有効な癌治療であるとの我々の結論を支持している。
実施例８：ｍＫＤ及びＮＰの併用は、ＧＢ細胞増殖に及ぼす治療効果及びインビトロでの癌幹細胞集団の標的化を強化する
【００４４】
患者由来のｈＧＢ細胞株を、ｍＫＤ、ＮＰ又はこれらの両方に培養中で５〜７日間にわたって曝露させ、その後総細胞数を決定し、対照と比較した。グルコースレベルをＫＤ下に置かれている患者で見られるもの［６５〜８０ｍｇ／ｄｌ］まで低下させて、ケトンを４ｍＭ［ヒドロキシブチレート、Ｓｉｇｍａ］まで上昇させることによって、ｍＫＤをインビトロで模倣した。添加された３つの天然生成物は、以下の通りである。
［１］ ＥＧＣＧ−８μＭ、
［２］ クルクミン−０．５μＭ、
［３］ＳＦＮ−２．５μＭ
これらの条件下では、ｍＫＤ及びＮＰ処置培養の両方で５〜７日間にわたって生成された細胞の数において有意な減少が見られた。しかしながら、ｍＫＤをＮＰと一緒に使用したときに、最も有意な減少が認められた［図１７］。別の実験において、我々は、各処置［ｍＫＤ、ＮＰ、及びこれらの組み合わせ］の増殖している細胞又はクローン化可能細胞の数に及ぼす効果を検討した。培養されたｈＧＢを、インビトロで我々の３つの処置条件のうちの１つで７日間にわたって処置し、その後培養物を洗浄し、単一細胞懸濁液に分離して、対照培地中でプレートし、スフェア形成細胞に及ぼす［又はクローン形成頻度に及ぼす］処置の効果を評価した。スフェアの数を、７〜１０日後に数えた。図１８は、ｍＫＤ及びＮＰ処置が、スフェア形成細胞の数における約５０％の減少をもたらしたが［これは、大きな変動のために有意ではなかった］、ｍＫＤ／ＮＰ処置培養においては統計的に有意な減少はなかった［９０％］。
【００４５】
癌幹細胞は、治療抵抗性に寄与し、長期の腫瘍増殖に駆り立てる原因であると考えられ、この集団を標的化することは、有効な癌治療薬の開発のために必須であると広く考信じられている。対照的癌幹細胞分裂を数えることができる以前に公開されたアルゴリズムを用いて、患者由来のｈＧＢ細胞を我々の４つの処置条件［対照、ｍＫＤ、ＮＰ又はｍＫＤ／ＮＰ］のうちの１つの中で連続継代させることによって、データを収集した。我々のデータは、処置条件のそれぞれが、対照と比べて対称的癌幹細胞分裂の頻度における有意な減少をもたらした。最大の効果は、ｍＫＤ／ＮＰの併用処置においてみられた［図１９］
【００４６】
全体として、この実施例における実験は、ｍＫＤ及び我々のＮＰの併用が、ＧＢ腫瘍細胞のこの重要なサブ集団内の対象的幹細胞分裂の数を減少させることによって、全体的な増殖を減少させることで、増殖するクローン形成細胞の数を減少させることで、並びに癌幹細胞集団を標的化することで最大の効果を示すことを裏付けている。
実施例９：ｍＫＤ及びＮＰの併用は、ｍＫＤ又はＮＰ単独と比べて、腫瘍進行を低下させ、全体の生存率を増加させる
【００４７】
ＮＯＤ−ＳＣＩＤ動物に、１Ｍの患者由来のｈＧＢ細胞を接種した。触診可能な腫瘍が一旦特定されたら［２〜４週間後］、動物を４つの群のうちの１つに無作為割り付けした。
［１］ 対照の食餌：標準的マウス試料であり、５５％の炭水化物、３０％のタンパク質、１５％の脂肪から構成される。
［２］ ｍＫＤ：１０％の炭水化物、６０％の脂肪（半分は中鎖トリグリセリド［ＭＣＴ、Ｎｅｏｂｅｅ  ５９８］に由来）、３０％のタンパク質。
［３］ ＮＰ食餌：５５％の炭水化物、３０％のタンパク質、１５％の脂肪＋ＳＦＮ（２５ｍｇ／ｋｇ；ＢＳＰ９５％／ＤＲＳＰ５％）、クルクミン（１２００ｍｇ／ｋｇ）、ＥＧＣＧ（１２００ｍｇ／ｋｇ）。
［４］ ｍＫＤ／ＮＰ：１０％の炭水化物、６０％の脂肪（半分は中鎖トリグリセリド［ＭＣＴ、Ｎｅｏｂｅｅ  ５９８］に由来）、３０％のタンパク質＋ＳＦＮ（２５ｍｇ／ｋｇ；ＢＳＰ９５％／ＤＲＳＰ５％）、クルクミン（１２００ｍｇ／ｋｇ）、ＥＧＣＧ（１２００ｍｇ／ｋｇ）。
【００４８】
腫瘍を１週間に３回測定し、体積を計算し、進行を追跡して、提示し、ＧｒａｐｈＰａｄにおいて統計的な比較を行った［非線形回帰、一元配置分散分析法（２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を使用］。図２０は、これらの４つの処置群についての腫瘍進行を示し、対照と比べて、全ての処置群に関して腫瘍進行における有意な減少を示した。ｍＫＤ／ＮＰの組み合わせは、処置群のいずれかに比べて最も有意な減少を示した。動物が終点［１５００ｍｍ３を超える腫瘍］に達した際に、これらを殺処分し、カプラン−マイヤープロットを用いて、生存率を分析した［ＧｒａｐｈＰａｄ］。図２１は、ｍＫＤ／ＮＰ処置動物がｍＫＤ及びＮＰ処置動物と比べて生存率において統計的に有意な増加を示して、全ての処置群が対照よりも有意に長く生存したことを明らかにしている。平均生存率を図２２に示し、生存率の増加におけるｍＫＤ／ＮＰの優位性を裏付けている。２つの処置の組み合わせもまた、触診可能な腫瘍が３００ｍｍ３に到達するのに要する時間によって決定されるように［図２３］、無進行生存率における統計的な有意な増加をもたらした。
【００４９】
全体として、これらのデータは、腫瘍進行を遅延させ、予期せぬ相乗効果を生み出し、平均及び最大寿命を増加させるための２つの新規かつ有効な治療プロトコル［ｍＫＤ及びＮＰ］を組み合わせることの利点を裏付けている。
実施例１０：ｍＫＤ／ＮＰ食は、ＧＢの同所生異種移植モデルにおいて寿命を増加させる
【００５０】
ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに、２００Ｋ  ｈＧＢ細胞を、右線条体に頭蓋内投与した。最初の手術の３日後に、動物を２つの群のうちの１つに無作為割り付けした。
［１］ 対照の食餌：標準的マウス試料であり、５５％の炭水化物、３０％のタンパク質、１５％の脂肪から構成される。
［２］ ｍＫＤ／ＮＰ：１０％の炭水化物、６０％の脂肪（半分は中鎖トリグリセリド［ＭＣＴ、Ｎｅｏｂｅｅ  ５９８］に由来）、３０％のタンパク質＋ＳＦＮ（２５ｍｇ／ｋｇ；ＢＳＰ９５％／ＤＲＳＰ５％）、クルクミン（１２００ｍｇ／ｋｇ）、ＥＧＣＧ（１２００ｍｇ／ｋｇ）。
【００５１】
疾患又は苦痛のいずれかの徴候について厳密に監視し、これらが異常な神経学的徴候［嗜眠、麻痺、発作又は異常な運動挙動］を呈し始めた際に、動物を殺処分した。カプラン−マイヤープロットは、ｍＫＤ／ＮＰ群が、対照飼育動物よりも有意に長く生存したことを示した［図２４］。平均生存率を両方の群について計算し、図２５は、ｍＫＤ／ＮＰ飼育動物についての平均生存率における有意な増加を明らかにしている。
【００５２】
これらのデータは、同所性異種移植モデルにおいて我々の組み合わせｍＫＤ／ＮＰ処置を使用することの有効性を強く支持している。
実施例１１：ｍＫＤ／ＮＰ処置は、ＧＢに対する標準的なケアの化学療法と同様なほど機能する
【００５３】
ＧＢなどの高グレードの神経膠腫を有する患者のための標準的ケア［ＳＯＣ］は、化学療法剤のテモゾロミド［ＴＭＺ］の使用を伴う。ＴＭＺは、ＧＢ患者に対してある程度の有効性を示すが、生存率における増加は限界があり［約２〜３ヶ月］、ネガティブな副作用は深刻である［悪心、嘔吐及び血液学的毒性］。したがって、毒性が低いが有効な治療に対する要求が存在する。ＮＯＤ−ＳＣＩＤ動物に１Ｍの患者由来のｈＧＢ細胞を接種した。触診可能な腫瘍が一旦特定されたら［移植後約２〜３週間］、動物を３つの群のうちの１つに無作為割り付けした。  
［１］ 対照の食餌：標準的マウス試料であり、５５％の炭水化物、３０％のタンパク質、１５％の脂肪から構成される。
［２］ 標準的ケア：毎日のＴＭＺ注射［５ｍｇ／ｋｇ］と共に対照の食餌
［３］ ｍＫＤ／ＮＰ：１０％の炭水化物、６０％の脂肪（半分は中鎖トリグリセリド［ＭＣＴ、Ｎｅｏｂｅｅ  ５９８］に由来）、３０％のタンパク質＋ＳＦＮ（２５ｍｇ／ｋｇ；ＢＳＰ９５％／ＤＲＳＰ５％）、クルクミン（１２００ｍｇ／ｋｇ）、ＥＧＣＧ（１２００ｍｇ／ｋｇ）。
【００５４】
腫瘍を１週間に３回測定し、体積を計算し、進行を追跡して、提示し、ＧｒａｐｈＰａｄにおいて統計的な比較を行った［非線形回帰、一元配置分散分析法（２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を使用］。図２６は、ｍＫＤ／ＮＰ食餌が、ＳＯＣと同様な程度まで腫瘍の進行を低減することができることを示している。対照動物と比較して、ＳＯＣ及びｍＫＤ／ＮＰの両方は、触診可能な腫瘍が３００ｍｍ３に到達するのに要する時間によって測定されるように、無進行生存率における有意な増加をもたらした［図２７］。
【００５５】
全体として、これらのデータは、ｍＫＤ／ＮＰ治療薬が、腫瘍の進行を遅延させ、無進行生存率を増強させることでＳＯＣ化学療法ほどに有効であることを示している。
実施例１２：ｍＫＤ／ＮＰは、ＧＢのための標準的ケアと共に使用されるとき、有効な補助療法である
【００５６】
ＮＯＤ−ＳＣＩＤ動物に、１Ｍの患者由来のｈＧＢを右側腹部に投与した。触診可能な腫瘍が一旦特定されたら、動物を４つの処置群のうちの１つに無作為割り付けした
［１］ 対照の食餌：標準的マウス試料であり、５５％の炭水化物、３０％のタンパク質、１５％の脂肪から構成される。
［２］ 標準的ケア：毎日のＴＭＺ注射［５ｍｇ／ｋｇ］と共に対照の食餌
［３］ ｍＫＤ／ＮＰ：１０％の炭水化物、６０％の脂肪（半分は中鎖トリグリセリド［ＭＣＴ、Ｎｅｏｂｅｅ  ５９８］に由来）、３０％のタンパク質＋ＳＦＮ（２５ｍｇ／ｋｇ；ＢＳＰ９５％／ＤＲＳＰ５％）、クルクミン（１２００ｍｇ／ｋｇ）、ＥＧＣＧ（１２００ｍｇ／ｋｇ）。
［４］ ＳＯＣ＋ｍＫＤ／ＮＰ：毎日のＴＭＺ注射［５ｍｇ／ｋｇ］と共に、１０％の炭水化物、６０％の脂肪（半分は中鎖トリグリセリド［ＭＣＴ、Ｎｅｏｂｅｅ  ５９８］に由来）、３０％のタンパク質＋ＳＦＮ（２５ｍｇ／ｋｇ；ＢＳＰ９５％／ＤＲＳＰ５％）、クルクミン（１２００ｍｇ／ｋｇ）、ＥＧＣＧ（１２００ｍｇ／ｋｇ）
【００５７】
腫瘍体積を１週間に３回測定し、記録し、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いて分析した。図２８は、経時的な腫瘍属色を示し、ｍＫＤ／ＮＰがＳＯＣ程に良好に機能することを示唆しているが、ｍＫＤ／ＮＰのＳＯＣと一緒の組み合わせは、腫瘍の進行においてさらなる減少を示した。ＴＭＺ抵抗性ｈＧＢ細胞をドナー細胞として用いて、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに移植したとき、ＳＯＣは腫瘍の進行に及ぼす効果がなかった。しかしながら、ｍＫＤ／ＮＰは、ｍＫＤ／ＮＰ及びＳＯＣを組み合わせることによって増強された有効な治療であった［図２９］。
【００５８】
要約すると、この実施形態における実験は、ｍＫＤ／ＮＰ処置の有効性及びこの有効性がＳＯＣと組み合わせることによって増強され得ることを裏付けている。予想外に、ＳＯＣ抵抗性腫瘍は、ｍＫＤ／ＮＰに対して応答性であるばかりでなく、ｍＫＤ／ＮＰにＴＭＺを添加することが腫瘍細胞を以前無効であった療法に増感させる。実際に、ステージＩＶ癌を有する全ての患者が、彼らのＳＯＣ化学療法に対して抵抗性を発現するために、安全で低毒性の補助治療を備えるＳＯＣ療法に腫瘍を増感させるための能力は、癌治療コミュニティーにとって大きな価値のあるものである。
実施例１３：予防的治療としてのｍＫＤ／ＮＰ
【００５９】
現在、アメリカ合衆国だけでほぼ１，４００万人の人々が癌をかかえながら生きていて、この数は、１０年後には１，８００万人にまで上昇すると予想されている。癌の初期発生又は再発を予防又は遅延させる治療の開発は、癌の個別的な影響のみならず、同様に非常に重大な経済的影響に及ぼす多大な効果を有するであろう。このために、我々は、ｍＫＤ／ＮＰ治療の予防的治療としての能力、及び腫瘍発症を遅延するための能力をテストした。
【００６０】
ＮＯＤ−ＤＣＩＤ動物を２つの食餌のうちの１つに配置した。
［１］ 対照の食餌：標準的マウス試料であり、５５％の炭水化物、３０％のタンパク質、１５％の脂肪から構成される。
［２］ ｍＫＤ／ＮＰ：１０％の炭水化物、６０％の脂肪（半分は中鎖トリグリセリド［ＭＣＴ、Ｎｅｏｂｅｅ  ５９８］に由来）、３０％のタンパク質＋ＳＦＮ（２５ｍｇ／ｋｇ；ＢＳＰ９５％／ＤＲＳＰ５％）、クルクミン（１２００ｍｇ／ｋｇ）、ＥＧＣＧ（１２００ｍｇ／ｋｇ）
【００６１】
この食餌下に２ヶ月間置かれた後に、動物に、１Ｍの患者由来のｈＧＢ細胞の皮下注射を右側腹部に投与した。動物を、触診可能な腫瘍［約６５ｍｍ３］の初期発現について毎日監視した。図３０は、ｍＫＤ／ＮＰ食餌に置かれた動物は、腫瘍の初めの発現までの時間において有意な遅延を有した［約３００％］ことを示している。より興味深いことは、腫瘍を発現した動物の数における６０％の減少であった［図３１］。
【００６２】
同様なパラダイムを用いて、２Ｍの肺腺癌細胞［Ａ５２９］をＮＯＤ−ＳＣＩＤ動物の右側腹部に接種する前に、動物を対照又はｍＫＤ／ＮＰ食餌に２週間置いた。腫瘍移植後２１日目に、対照動物の約９０％が触診可能な腫瘍を発現し、これとは対照的に、ｍＫＤ／ＮＰ食餌かに置かれた動物の僅か５０％が、触診可能な腫瘍を有した［図３２］。
【００６３】
全体として、これらのデータは、ｍＫＤ／ＮＰの食餌の識別可能な腫瘍の発症を遅延における有効性のみならず、腫瘍の発生を低減するその能力、したがって、予防的効果を有することを裏付けている。
実施例１４：ｍＫＤ／ＮＰは、表在性腫瘍の中枢神経系幹細胞増殖に及ぼす効果を減弱させ、ＮＰはインビトロで神経幹細胞のプールを増長させることができる
【００６４】
ＮＯＤ−ＳＣＩＤ動物に、１Ｍの細胞を右腹部において接種した。識別可能な腫瘍が触診されたら、動物を２つの群の１つに無作為割り付けした。
［１］ 対照の食餌：標準的マウス試料であり、５５％の炭水化物、３０％のタンパク質、１５％の脂肪から構成される。
［２］ ｍＫＤ／ＮＰ：１０％の炭水化物、６０％の脂肪（半分は中鎖トリグリセリド［ＭＣＴ、Ｎｅｏｂｅｅ  ５９８］に由来）、３０％のタンパク質＋ＳＦＮ（２５ｍｇ／ｋｇ；ＢＳＰ９５％／ＤＲＳＰ５％）、クルクミン（１２００ｍｇ／ｋｇ）、ＥＧＣＧ（１２００ｍｇ／ｋｇ）
【００６５】
腫瘍が終点に到達したときに、動物に、ＢｒｄＵ［５０ｍｇ／ｋｇ］の３回の注射を７２時間にわたって実施した。動物を殺処分し、脳を取り出し、固定し、切片化して、ＢｒｄＵ抗体を用いて７２時間の注入時間中にＳ−相に合った細胞を特定した。ＢｒｄＵ免疫反応性細胞の数を、海馬の歯状回において計数した。図３３Ａは、正常群［腫瘍を宿さない動物］に比べて、表在性腫瘍は、増殖する細胞の数において劇的かつ有意な減少を引き起こしたことを明らかにしている。しかしながら、ｍＫＤ／ＮＰ食餌で処置された動物では、増殖する歯状回幹細胞の数の著しい増加があった。これらのデータは、ｍＫＤ／ＮＰ処置が内因性神経幹細胞をＣＮＳの外側に位置する腫瘍のネガティブな効果から保護することができることを示している。癌患者の認知障害を裏付ける文献が増えている状況で、このデータは、ｍＫＤ／ＮＰ食の正常な脳機能及び記憶を維持するための使用を裏付けている。
【００６６】
体性ヒト神経幹細胞（ｈＮＳＣ）を、神経スフェアアッセイを用いてインビトロで培養し、個々の天然生成物（［１］ＥＧＣＧ−８μＭ、［２］クルクミン−０．５μＭ又は［３］ＳＦＮ−２．５μＭ）若しくは全ての３つの組み合わせで処置し、それぞれの天然生成物それ自体は、ｈＮＳＣの生存能力にいかなる効果も示さなかった（標準ＭＴＴアッセイを用いて分析）。しかしながら、３つの天然生成物の全ての組み合わせは、生存能の有意な増加を示した［図３３Ｂ］。
【００６７】
全体として、これらのデータは、ｍＫＤ／ＮＰ及びＮＰは、インビトロ及びインビボの両方で、体性神経幹細胞のプールを効率的に増強しかつ維持することができる特徴的な組み合わせを表すという概念を支持している。
実施例１５：ｍＫＤ／ＮＰ食の最適化
【００６８】
ｍＫＤ／ＮＰ食の有効性を改善するために、我々は、カイワレ大根粉末［ＤＲＳＰ］の添加を検討した。ＮＯＤ−ＳＣＩＤ動物に、１Ｍの患者由来のＧＢ細胞を接種し、触診可能な腫瘍が一旦特定されたら、動物を３つの群の１つに無作為割り付けした。
［１］ 対照の食餌：標準的マウス試料であり、５５％の炭水化物、３０％のタンパク質、１５％の脂肪から構成される。
［２］ ｍＫＤ／ＮＰ．００１：１０％の炭水化物、６０％の脂肪（半分は中鎖トリグリセリド［ＭＣＴ、Ｎｅｏｂｅｅ  ５９８］に由来）、３０％のタンパク質＋ＳＦＮ（２５ｍｇ／ｋｇ；ＢＳＰ９５％）、クルクミン（１２００ｍｇ／ｋｇ）、ＥＧＣＧ（１２００ｍｇ／ｋｇ）
［３］ ｍＫＤ／ＮＰ．００２：１０％の炭水化物、６０％の脂肪（半分は中鎖トリグリセリド［ＭＣＴ、Ｎｅｏｂｅｅ  ５９８］に由来）、３０％のタンパク質＋ＳＦＮ（２５ｍｇ／ｋｇ；ＢＳＰ９５％／ＤＲＳＰ５％）、クルクミン（１２００ｍｇ／ｋｇ）、ＥＧＣＧ（１２００ｍｇ／ｋｇ）
【００６９】
腫瘍体積を、ノギスを用いて１週間に３回測定した。図３４は、ｍＫＤ／ＮＰ．００２が、対照と比べて腫瘍進行を低減することで有意な効果を有し［ｐ＜０．００１］、ｍＫＤ／ＮＰ．００１よりも統計的に有意に良好であったこと［ｐ＜０．０５］を示している。同様に、触診可能な腫瘍が３００ｍｍ３の体積まで到達するための時間は、ｍＫＤ／ＮＰ．００１群と比べてｍＫＤ／ＮＰ．００２飼育動物において有意に遅延した［図３５］。重要なことに、平均生存率は、ｍＫＤ／ＮＰ．００１群と比べて、ｍＫＤ／ＮＰ．００２処置動物において増強された［図３６、ｐ＜０．０５］。
【００７０】
動物が一旦終点まで到達したら、腫瘍を外科的に切除し、これらがフローサイトメトリーを用いて分析され得るように、単一細胞懸濁液中に解離させた。細胞を固定し［４％のＰＦＡ］、細胞増殖抗原Ｋｉ６７及びｐＳＡＴＡ３（制御不能な増殖の第１のドライバーである、ＧＢ中で経路活性化される）を特定する抗体を用いる免疫組織化学法用に処理した。図３７Ａは、ｍＫＤ／ＮＰ．００１［ｐ＜０．０５］及び対照［ｐ＜０．０１］と比べて、ｍＫＤ／ＮＰ．００２群中での能動的に分裂している細胞のパーセンテージにおける有意な減少を示している。同様に、ｐＳＴＡＴ３免疫反応性細胞の数における減少によって明らかであるように、活性化ＳＴＡＴ３シグナル伝達を有するＧＢ細胞のパーセンテージにおける著しい減少があった［図３７Ｂ］。
実施例１６：ｍＫＤ／ＮＰ処置は、結腸癌のための有効な療法である。
【００７１】
結腸直腸腺癌細胞株［ＨＴ−２９］を用いて、２Ｍの細胞を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物の右腹部に移植した。一旦触診可能な腫瘍が観察されたら、動物を２つの群のうちの１つに無作為に割り付けた。
［１］ 対照の食餌：標準的マウス試料であり、５５％の炭水化物、３０％のタンパク質、１５％の脂肪から構成される。
［２］ ｍＫＤ／ＮＰ：１０％の炭水化物、６０％の脂肪（半分は中鎖トリグリセリド［ＭＣＴ、Ｎｅｏｂｅｅ  ５９８］に由来）、３０％のタンパク質＋ＳＦＮ（２５ｍｇ／ｋｇ；ＢＳＰ９５％／ＤＲＳＰ５％）、クルクミン（１２００ｍｇ／ｋｇ）、ＥＧＣＧ（１２００ｍｇ／ｋｇ）
【００７２】
腫瘍を３回／週で測定し、一旦腫瘍が終点［１０００ｍｍ３］に達したら、動物を殺処分した。腫瘍体積を経時的に測定し、図３８は、ｍＫＤ／ＮＰ処置動物について腫瘍進行における有意な減少を示している。ｍＫＤ／ＮＰの腫瘍進行の遅延に及ぼす効果は、腫瘍体積が、腫瘍接種後３０日目で対照群と処置群との間で比較された図３９中でさらに反映されている。この場合、平均腫瘍体積における有意な減少があった［スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０１］。
【００７３】
重要なことは、カプラン−マイヤー生存率曲線が、ｍＫＤ／ＮＰ処置動物が対照よりも有意に長く生存することを立証し［図４０、ｐ＜０．０１、ログランク検定］、このことは、終点に達するまでの平均時間においても反映されている［図４１］。
【００７４】
結腸癌細胞がインビトロで、個々の天然生成物、又は３つの全ての組み合わせで処置されるとき、それぞれの天然生成物それ自体は、生成された細胞の数における有意な減少を示した。しかしながら、３つの天然生成物の全ての組み合わせは、細胞数において最大の減少を示した。
【００７５】
全体として、これらのデータは、ｍＫＤ／ＮＰ及びＮＰが、結腸癌の増殖をインビトロ及びインビボで減少させることができるという概念を支持している。
実施例１７：ｍＫＤ／ＮＰ処置は、肺癌のための有効な治療である。
【００７６】
肺腺癌細胞（Ａ５４９）を用いて、２Ｍの細胞を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物の右腹部に移植した。一旦触診可能な腫瘍が観察されたら、動物を２つの群のうちの１つに無作為に割り付けた。
［１］ 対照の食餌：標準的マウス試料であり、５５％の炭水化物、３０％のタンパク質、１５％の脂肪から構成される。
［２］ ｍＫＤ／ＮＰ：１０％の炭水化物、６０％の脂肪（半分は中鎖トリグリセリド［ＭＣＴ、Ｎｅｏｂｅｅ  ５９８］に由来）、３０％のタンパク質＋ＳＦＮ（２５ｍｇ／ｋｇ；ＢＳＰ９５％／ＤＲＳＰ５％）、クルクミン（１２００ｍｇ／ｋｇ）、ＥＧＣＧ（１２００ｍｇ／ｋｇ）
【００７７】
腫瘍を３回／週で測定し、一旦腫瘍が終点［１０００ｍｍ３］に達したら、動物を殺処分した。腫瘍体積を経時的に測定し、図４３は、ｍＫＤ／ＮＰ処置動物について腫瘍進行における有意な減少を示している［ｐ＜０．００１］。ｍＫＤ／ＮＰの腫瘍進行の遅延に及ぼす効果は、腫瘍体積が、腫瘍接種後３１日目で対照群と処置群との間で比較された図４４中でさらに反映されている。この場合、平均腫瘍体積における有意な減少があった［スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０５］。腫瘍の無進行生存期間を、触診可能な段階から３００ｍｍ３のサイズまで腫瘍が進むのに要する時間を測定することによって決定した。この場合、無進行生存期間は、ｍＫＤ／ＮＰ群において有意に遅延化された［図４５］。重要なことは、カプラン−マイヤー生存率曲線が、ｍＫＤ／ＮＰ処置動物が対照よりも有意に長く生存することを立証し［図４６、ｐ＜０．０５、ログランク検定］、このことは、終点に達するまでの平均時間においても反映されている［図４７］。
【００７８】
結腸癌細胞がインビトロで、個々の天然生成物、又は３つの全ての組み合わせで処置されるとき、それぞれの天然生成物それ自体は、生成された細胞の数における有意な減少を示した。しかしながら、３つの天然生成物の全ての組み合わせは、細胞数において最大の減少を示した［図４８］。
【００７９】
全体として、これらのデータは、ｍＫＤ／ＮＰ及びＮＰが、結腸癌の増殖をインビトロ及びインビボで減少させることができること、及びこの特徴的な組み合わせが癌治療に有効であるという概念を支持している。
実施例１８：ｍＫＤ／ＮＰ処置は、乳癌のための有効な療法である
【００８０】
ヒト乳癌細胞［ＺＲ７５１］を培養中で増殖させ、ＥＧＣＧ（８μＭ）、クルクミン（０．５μＭ）又はＳＦＮ（２．５μＭ）の生理学的濃度で、若しくは組み合わせ（ＮＰ）を使用して、毎日処置した。対照培養物が集密状態になったら、細胞数を、標準ＭＴＴアッセイを用いて決定した。図４９は、ＮＰのそれぞれは個々では、乳癌細胞の数の減少に及ぼす統計的に有意な効果を有さなかったが、３つＮＰの全ての組み合わせは、細胞の数をほぼ４０％まで減少させた。
【００８１】
次に、２ＭのＺＲ７５１乳癌細胞を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの腹部に移植し、一旦、検出可能な腫瘍が触診され得たら、宿主動物を２つの群のうちの１つに無作為割り付けした。
［１］ 対照の食餌：標準的マウス試料であり、５５％の炭水化物、３０％のタンパク質、１５％の脂肪から構成される。
［２］ ｍＫＤ／ＮＰ：１０％の炭水化物、６０％の脂肪（半分は中鎖トリグリセリド［ＭＣＴ、Ｎｅｏｂｅｅ  ５９８］に由来）、３０％のタンパク質＋ＳＦＮ（２５ｍｇ／ｋｇ；ＢＳＰ９５％／ＤＲＳＰ５％）、クルクミン（１２００ｍｇ／ｋｇ）、ＥＧＣＧ（１２００ｍｇ／ｋｇ）
【００８２】
腫瘍を、ノギスを用いて１週間に３回測定し、腫瘍体積を以下の手順に従って計算する。腫瘍の直径の２つの測定値を記録し、これを次の式：（４／３）πＲ３を用いて体積に変換することによって、腫瘍進行を追跡した。スフェロイド腫瘍については、２つの測定値を平均化し、スフェアの直径を決定した。楕円体腫瘍の場合（すなわち、偏長又は偏平スフェロイド塊）には、使用された式は、（４／３）π＊（ｄ／２）＊（ｄ／２）２であった。この場合、２番目の測定値「ｄ２」は２回計数し、「ｄ」は１回だけ計数する。偏長スフェロイドについては、長軸測定を１回行い、一方短軸測定は２回行う。逆に、偏平スフェロイド腫瘍については、長軸測定は２回行い、一方短軸測定は１回だけ行う。この基準に従って、腫瘍体積を経時的に追跡した。図５０は、動物が終点［１０００ｍｍ３］に到達するまでの経時的な腫瘍の進行を示し、ｍＫＤ／ＮＰ食が全体的な腫瘍進行における有意な減少をもたらすことを明らかにしている［ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析法（２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ））］。腫瘍の進行を効果的に減少させるためのｍＫＤ／ＮＰの能力は、処置開始後７０日目及び１４５日目における乳房腫瘍の平均サイズの比較においても反映されている。この場合、図５１及び５２に示すように、それぞれ、７０日目に腫瘍サイズにおける約５０％の減少があり［ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定］、１４５日目に同様な減少がある。
【００８３】
腫瘍の無進行生存期間を、わずかに触診可能な段階［約６５ｍｍ３］から相当なサイズの腫瘍［視覚的に特定可能、３００ｍｍ３］まで腫瘍が増殖するのに要する時間を測定することによって決定した。この場合、ｍＫＤ／ＮＰ食は、無進行生存期間において約２０％の増加を生じた［図５３、ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定］。重要なことは、２つの群の間の生存率曲線（カプラン−マイヤー）の比較は、ｍＫＤ／ＮＰ食が生存率において統計的な有意な増加をもたらしたことを示している［図５３、ｐ＜０．０１、ログランク検定］。
【００８４】
全体として、これらのデータは、乳癌の攻撃的及び致死的な型の治療することでのｍＫＤ／ＮＰの有効性を裏付けている。
実施例１９：ｍＫＤ／ＮＰのメカニズム：細胞死、癌幹細胞及びＤＮＡ損傷
【００８５】
培養で増殖させた患者由来のＧＢを用いて、１ＭをＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物の右側腹部に移植した。一旦、触診可能な腫瘍が特定されたら、動物を、２つの処置群のうちの１つに無作為割り付けした。
［１］ 対照の食餌：標準的マウス試料であり、５５％の炭水化物、３０％のタンパク質、１５％の脂肪から構成される。
［２］ ｍＫＤ／ＮＰ：１０％の炭水化物、６０％の脂肪（半分は中鎖トリグリセリド［ＭＣＴ、Ｎｅｏｂｅｅ  ５９８］に由来）、３０％のタンパク質＋ＳＦＮ（２５ｍｇ／ｋｇ；ＢＳＰ９５％／ＤＲＳＰ５％）、クルクミン（１２００ｍｇ／ｋｇ）、ＥＧＣＧ（１２００ｍｇ／ｋｇ）
【００８６】
腫瘍を１週間に３回監視し、動物が終点［１５００ｍｍ３］に到達したときに、動物を殺処分した。腫瘍を採取し、代表的なアポトーシスサブ集団である、ＳｕｂＧ１集団の同定用に調製した［固定し、ＤＡＰＩで標識した］。細胞が細胞死を起こすパーセンテージは、ｍＫＤ／ＮＰ処置動物において有意に増加する［図５５、ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定］。
【００８７】
ＣＤ１３３は、ＧＢ癌幹細胞についての候補マーカーであり、これらの発生頻度における増加は、より攻撃的かつ治療がより困難な腫瘍の指標である。この集団を標的化し、ＣＤ１３３陽性細胞または癌幹細胞の発生頻度を減少させることができる療法の開発は、より有効な治療薬の開発における重要な構成要素であると考えられている。この実施例におけるパラダイムの詳細を用いて、我々は、ＣＤ１３３陽性癌幹細胞の全体的なパーセンテージを計算するために、ＣＤ１３３に特異的な抗体で、対照及びｍＫＤ／ＮＰ処置腫瘍を探索した。図５６は、１つの特定の実験からの結果を示し、ここで、我々はＣＤ１３３陽性癌幹細胞集団のサイズにおいて６０％の減少を観察した。図５７のｍＫＤ／ＮＰ処置動物において、ＣＤ１３３陽性癌幹細胞に、対照処置動物の約３倍の注目すべき二重鎖ＤＮＡ破壊が存在したことも認められた［これは、ＤＮＡ二重鎖破壊の量に正相関するＨ２ＡＸのリン酸化型をマークする抗体を用いて決定された］。
【００８８】
全体として、これらのデータは、ｍＫＤ／ＮＰの、アポトーシス細胞死の発生を増加させる能力のみならず、重要なことには、この特定な臨床的に関連するサブ集団においてＤＮＡ損傷の量を増加させることよりＧＢ癌幹細胞を標的とする能力を裏付けている。
実施例２０：ｍＫＤ／ＮＰは、腫瘍増殖の既知のドライバー及び従来の治療に対する抵抗性をもたらすメカニズムを標的とする
【００８９】
患者の腫瘍に由来し、無血清培地で培養された細胞株を用いて、１ＭのＧＢ細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物の右側腹部に移植した。触診可能な腫瘍が一旦特定されたら、動物を２つの処置群のうちの１つに無作為割り付けした。
［１］ 対照の食餌：標準的マウス試料であり、５５％の炭水化物、３０％のタンパク質、１５％の脂肪から構成される。
［２］ ｍＫＤ／ＮＰ：１０％の炭水化物、６０％の脂肪（半分は中鎖トリグリセリド［ＭＣＴ、Ｎｅｏｂｅｅ  ５９８］に由来）、３０％のタンパク質＋ＳＦＮ（２５ｍｇ／ｋｇ；ＢＳＰ９５％／ＤＲＳＰ５％）、クルクミン（１２００ｍｇ／ｋｇ）、ＥＧＣＧ（１２００ｍｇ／ｋｇ）
【００９０】
腫瘍体積を、ノギスを用いて１週間に３回監視し、動物が終点［１５００ｍｍ３］に到達したときに、動物を殺処分し、腫瘍を切除し、免疫組織化学法及び細胞内経路活性化の同定用に細胞を処理した。フローサイトメトリーを用いて分析を行った。図５８は、ｍＫＤ／ＮＰの、腫瘍細胞［脳及び乳房腫瘍を含む］の維持及び増殖に関係するタンパク質であるＹ−ｂｏｘ結合タンパク質１［ＹＢ１］の発現［図５８Ａ］及び活性化［図５８Ｂ］に及ぼす効果をまとめている。図５８のデータは、全体的なＹＢ１の発現における及びリン酸化、すなわち、ＹＢ１の活性化を示す細胞の数における有意な減少を示している［それぞれ図５８Ａ及びＢ］。
【００９１】
この同様な実験のシリーズ内で、我々は、ＣＤ１３３＋癌幹細胞集団及び抗アポトーシスエフェクターＮＦｋＢのレベルを評価し［図５９］、ＮＦｋＢを発現している癌幹細胞のパーセンテージにおける８０％を超える顕著な減少を観察した。これは、ｍＫＤ／ＮＰの、癌幹細胞が従来の治療に耐えるために使用する抗アポトーシスのメカニズムを標的とするための能力を裏付けている。
【００９２】
まとめると、これらの実験からのデータは、ｍＫＤ／ＮＰが、腫瘍増殖の既知のドライバー及び抗アポトーシスメカニズムを標的とし、全体として、ｍＫＤ／ＮＰの標的（複数可）のより良好なメカニズムの理解を提供する。
実施例２１：ｍＫＤ／ＮＰは、治療抵抗性に寄与するタンパク質の化学療法誘発性アップレギュレーションを減弱させる
【００９３】
患者由来のＧＢ細胞を、神経スフェアアッセイにおいて培養した［既定の培養条件を用いて］。この細胞を、以下のうちの１つで、それらの７日間の培養のうちの４日間にわたって毎日処置した。
［１］ 対照
［２］ ＴＭＺ［１０μＭ］
［３］ ＮＰの組み合わせ［ＥＧＣＧ（８μＭ）、クルクミン（０．５μＭ）及びスルフォラファン（２．５μＭ）］
［４］ ＴＭＺ［１０μＭ］＆ＮＰの組み合わせ［ＥＧＣＧ（８μＭ）、クルクミン（０．５μＭ）及びスルフォラファン（２．５μＭ）］
【００９４】
培養の７日後に、細胞を採取し、４％のＰＦＡで固定し、免疫細胞化学法用に処理し、フローサイトメトリーで分析した。図６０は、ＴＭＺで処置された細胞中のＭＧＭＴレベルにおける増加を示し［約３０％］、ＴＭＺ処置培養がＮＰの組み合わせでさら処置された際に、この増加の減弱を示した［対照のレベルに対して１０％未満］。図６１は、集団内のサバイビン［過発現が化学療法抵抗性に関連するアポトーシスの阻害物質のメンバー］の全体的な発現及びサバイビン発現細胞の数の変化を示している。ＴＭＺはサバイビンの全体的な発現において及びサバイビンを発現する細胞の数において統計的に有意な増加をもたらしたが、一方、ＮＰの添加は、このレベルを対照に匹敵するレベルまで戻した。興味深いことに、ＮＰそれ自体は、対照と比べてサバイビンの発現に影響を及ぼさなかった。
【００９５】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物の右側腹部への１ＭのＧＢ細胞を接種し、２つの処置群のうちの１つへのそれらの無作為割付の後に、動物を２つの食餌のうちの１つで処置した。
［１］ 対照の食餌：標準的マウス試料であり、５５％の炭水化物、３０％のタンパク質、１５％の脂肪から構成される。
［２］ ｍＫＤ／ＮＰ：１０％の炭水化物、６０％の脂肪（半分は中鎖トリグリセリド［ＭＣＴ、Ｎｅｏｂｅｅ  ５９８］に由来）、３０％のタンパク質＋ＳＦＮ（２５ｍｇ／ｋｇ；ＢＳＰ９５％／ＤＲＳＰ５％）、クルクミン（１２００ｍｇ／ｋｇ）、ＥＧＣＧ（１２００ｍｇ／ｋｇ）
【００９６】
動物が終点に到達した際に、動物を殺処分し、腫瘍を取り出し、単一細胞懸濁液に解離させ、４％のＰＦＡで固定し、ＭＧＭＴまたはｐＳＴＡＴ３発現についてフローサイトメトリーにより分析した。図６２は、この実験の結果をまとめていて、ｍＫＤ／ＮＰで処置されたときに、対照と比べて、ＭＧＭＴ［図６１Ａ］及びｐＳＴＡＴ３［図６１Ｂ］レベルが著しく減少したことを教示している。ＭＧＭＴ及びｐＳＴＡＴの両方の上昇が、化学療法に対する抵抗性に相関し、この抵抗性を増大させることが既知であるために、ｍＫＤ／ＮＰは、これらのタンパク質の発現レベルを低下させ、細胞を化学療法に増感させるための有望なアプローチを示している。
【００９７】
まとめると、この実施例の実験は、我々の腫瘍進行における観察された減少、生存率の増加及び化学療法に対する応答の増強についてのメカニズムを提供している。
実施例２２：腫瘍進行の低減及び生存率の増強に及ぼすｍＫＤ／ＮＰの治療的効果についてのメカニズム
【００９８】
図６３〜６６は、ｍＫＤ／ＮＰ食が腫瘍進行を低減し、寿命を延ばすよう影響を及ぼす多くのメカニズムを図示している。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物の右側腹部への１ＭのＧＢ細胞を接種し、２つの処置群のうちの１つへのそれらの無作為割付の後に、動物を２つの食餌のうちの１つで処置した。
［１］ 対照の食餌：標準的マウス試料であり、５５％の炭水化物、３０％のタンパク質、１５％の脂肪から構成される。
［２］ ｍＫＤ／ＮＰ：１０％の炭水化物、６０％の脂肪（半分は中鎖トリグリセリド［ＭＣＴ、Ｎｅｏｂｅｅ  ５９８］に由来）、３０％のタンパク質＋ＳＦＮ（２５ｍｇ／ｋｇ；ＢＳＰ９５％／ＤＲＳＰ５％）、クルクミン（１２００ｍｇ／ｋｇ）、ＥＧＣＧ（１２００ｍｇ／ｋｇ）
【００９９】
動物が終点に到達した際に、動物を殺処分し、腫瘍を取り出し、単一細胞懸濁液に解離させ、４％のＰＦＡで固定し、フローサイトメトリー［図６３、６４、６５＆６６］、免疫組織化学法［図６６Ｂ］及びウェスタンブロット法［図６６Ｄ］により分析した。全体として、これらのデータは、ｍＫＤ／ＮＰ食が、ＺＥＢ１［図６３］、ｍＴＯＲ［図６６］、ＮＦｋＢ［図６４］などの生存率を増強するものを含む多くのドライバーの発現を低減させることができることを示している。ｍＫＤ／ＮＰ食はまた、ＧＢ中でアップレギュレートされ、グルコースを提供する上で重要な役割を果たす、したがってＧＢ細胞を能動的に増殖させることをあおる、グルコース代謝に関与する重要なタンパク質を標的とすることもできる［図６５］。
【０１００】
これらのデータは、ｎＫＤ／ＮＰが腫瘍細胞に対して有する広範な効果及び腫瘍進行の一次ドライバーを変更することで役割を果たす複数のメカニズムを同時に標的化するが、固有の腫瘍抵抗性並びに獲得された腫瘍抵抗性の原因であるメカニズムをさらに回避するその能力を裏付けている。
【０１０１】
本明細書に記載される実施例及び実施形態は、単に例示を目的とするものであること、これらを考慮しての種々の修正または変更が当業者に認識され、これらは本出願の精神及び範囲内に含まれることを理解するべきである。加えて、本明細書に開示される任意の発明又はその実施形態の任意の要素若しくは制限事項は、本明細書に開示される任意の他の発明又はその実施形態の任意の及び／又は全ての他の要素若しくは制限事項と組み合わせることができ（個々に、または任意の組み合わせで）、こうした組み合わせの全ては、限定されることなく本発明の範囲内で企図される。
参考文献
Ｄｅｌｅｙｒｏｌｌｅ，Ｌ．Ｐ．，Ｈａｒｄｉｎｇ，Ａ．，Ｃａｔｏ，Ｋ．，Ｓｉｅｂｚｅｈｎｒｕｂｌ，Ｆ．Ａ．，Ｒａｈｍａｎ，Ｍ．，Ａｚａｒｉ，Ｈ．ら著（２０１１）．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｌａｂｅｌ−ｒｅｔａｉｎｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ−ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｂｒａｉｎ．，ｐｐ．１−１３．
Ｒｅｄｏｎ，Ｃ．Ｅ．，Ｄｉｃｋｅｙ，Ｊ．Ｓ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ａ．Ｊ．，Ｋａｒｅｖａ，Ｉ．Ｇ．，Ｎａｆ，Ｄ．，Ｎｏｗｓｈｅｅｎ，Ｓ．，ら著（２０１０）．Ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎｄｕｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，１０７（４２），１７９９２‐１７９９７．
Ｓｈｅｒｒｙ，Ｍ．Ｍ．，Ｒｅｅｖｅｓ，Ａ．，Ｗｕ，Ｊ．Ｋ．，＆  Ｃｏｃｈｒａｎ，Ｂ．Ｈ．著（２００９）．ＳＴＡＴ３  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａnｄ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ  ｉｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（Ｄａｙｔｏｎ，Ｏｈｉｏ），２７（１０），２３８３−２３９２．
Ｆｏｔｏｖａｔｉ，Ａ．，Ａｂｕ−Ａｌｉ，Ｓ．，Ｗａｎｇ，Ｐ．−Ｓ．，Ｄｅｌｅｙｒｏｌｌｅ，Ｌ．Ｐ．，Ｌｅｅ，Ｃ．，Ｔｒｉｓｃｏｔｔ，Ｊ．，ら著（２０１１）．ＹＢ−１  Ｂｒｉｄｇｅｓ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｒ−Ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  Ｉｔｓ  Ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７１（１６），５５６９−５５７８．
Ｇａｏ，Ｙ．，Ｆｏｔｏｖａｔｉ，Ａ．，Ｌｅｅ，Ｃ．，Ｗａｎｇ，Ｍ．，Ｃｏｔｅ，Ｇ．，Ｇｕｎｓ，Ｅ．，ら著（２００９）．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｙ−ｂｏｘ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  ｓｌｏｗｓ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ  ｔｏ  ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｏ６−ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ−ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８（１２），３２７６−３２８４．
Ｋｏｈｓａｋａ，Ｓ．，Ｗａｎｇ，  Ｌ．，Ｙａｃｈｉ，Ｋ．，Ｍａｈａｂｉｒ，Ｒ．，Ｎａｒｉｔａ，Ｔ．，  Ｉｔｏｈ，Ｔ．，ら著（２０１２）．ＳＴＡＴ３  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ  ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｓｅ  ｉｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｂｙ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ＭＧＭＴ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１１（６），１２８９−１２９９．
Ｂｏａｄｏ，ＲＪ．，Ｂｌａｃｋ，Ｋｌ．，Ｐａｒｄｒｉｇｅ，ＷＭ．著，Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＧＬＵＴ３  ａｎｄ  ＧＬＵＴ１  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ．（１９９４）．Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＧＬＵＴ３  ａｎｄ  ＧＬＵＴ１  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ，２７（１），５１−５７．
Ｌｅ  Ｃａｌｖｅ，Ｂ．，Ｒｙｎｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｌｅ  Ｍｅｒｃｉｅｒ，Ｍ．，Ｂｒｕｙｅｒｅ，Ｃ．，Ｌｏｎｅｚ，Ｃ．，Ｇｒａｓ，Ｔ．，ら著（２０１０）．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｓｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＬＵＴ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ａｎｄ  ａｌｄｏ−ｋｅｔｏ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ＡＫＲ１Ｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ），１２（９），７２７−７３９．
Ｆ．Ａ．Ｓｉｅｂｚｅｈｎｒｕｂｌ，Ｄ．Ｊ．Ｓｉｌｖｅｒ，Ｂ．Ｔｕｇｅｒｔｉｍｕｒ，Ｌ．Ｐ．Ｄｅｌｅｙｒｏｌｌｅ，Ｄ．  Ｓｉｅｂｚｅｈｎｒｕｂｌ，Ｍ．Ｒ．Ｓａｒｋｉｓｉａｎ，Ｋ．Ｇ．Ｄｅｖｅｒｓ，Ａ．Ｔ．Ｙａｃｈｎｉｓ，Ｍ．Ｄ．Ｋｕｐｐｅｒ，Ｄ．Ｎｅａｌ，Ｎ．Ｈ．Ｎａｂｉｌｓｉ，Ｍ．Ｐ．Ｋｌａｄｄｅ，Ｏ．Ｓｕｓｌｏｖ，Ｓ．Ｂｒａｂｌｅｔｚ，Ｔ．Ｂｒａｂｌｅｔｚ，Ｂ．Ａ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｄ．Ａ．Ｓｔｅｉｎｄｌｅｒ著、Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｌｉｎｋｉｎｇ  ｉｎｖａｓｉｏｎ，ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｕｎｄｅｒ  ｒｅｖｉｅｗ．
【図１】
0006488276.tif 000002
【図２】
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【図３】
0006488276.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８Ａ】
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【図５８Ｂ】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１Ａ】
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【図６１Ｂ】
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【図６２Ａ】
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【図６２Ｂ】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６Ａ】
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【図６６Ｂ】
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【図６６Ｃ】
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【図６６Ｄ】
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