(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの発酵生成物の生成を増加させる方法であって、
ａ．液体栄養培地中の少なくとも１つの酢酸生成カルボキシド栄養性クロストリジウム属微生物の培養物を含むバイオリアクタにガス状基質を提供することと、
ｂ．少なくとも１つの酢酸生成カルボキシド栄養性クロストリジウム属微生物の培養物を発酵させ、少なくとも１つの発酵生成物を生成することと、
ｃ．２−ヒドロキシイソ酪酸（２−ＨＩＢＡ）、２−ヒドロキシル−２−メチル酪酸、２−ヒドロキシブチレート、２−ヒドロキシ−３−メチル酪酸、２−ケト−３−ヒドロキシイソバレレート、及び２−ケトイソバレレートからなる群から選択される、少なくとも１つの化合物を前記液体栄養培地に添加することにより、炭素の分岐鎖アミノ酸へのフラックスを阻害することと、
を含み、
それにより、少なくとも１つの発酵生成物の生成を増加させる、方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの発酵生成物が、酢酸、エタノール、２，３−ブタンジオール、２−ブタノン、２−ブタノール、アセトイン、イソプロパノール、乳酸塩、コハク酸塩、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、プロパンジオール、２−プロパノール、イソブタノール、シトラマル酸塩、ブタジエン、ポリ乳酸、３−ヒドロキシブチレート、イソブチレン、３−ヒドロキシプロピオネート（３ＨＰ）、アセトン、及び脂肪酸からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの発酵生成物が、２，３−ブタンジオールである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ガス状基質が、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＨ４、Ｈ２、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記酢酸生成カルボキシド栄養性微生物が、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイ、クロストリジウム・カルボキシジボランス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・スカトロゲネス、クロストリジウム・アセチカム、クロストリジウム・フォルミコアセチカム、及びクロストリジウム・マグナムからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
２，３−ブタンジオールの生成を増加させる方法であって、
ａ．液体栄養培地中の少なくとも１つの酢酸生成カルボキシド栄養性クロストリジウム属微生物の培養物を含むバイオリアクタに、ＣＯを含むガス状基質を提供すること、
ｂ．少なくとも１つの酢酸生成カルボキシド栄養性クロストリジウム属微生物の培養物を発酵させ、ガス状基質から少なくとも２，３−ブタンジオールを生成することと、
ｃ．２−ヒドロキシイソ酪酸（２−ＨＩＢＡ）、２−ヒドロキシル−２−メチル酪酸、２−ヒドロキシブチレート、２−ヒドロキシ−３−メチル酪酸、２−ケト−３−ヒドロキシイソバレレート、及び２−ケトイソバレレートからなる群から選択される、少なくとも１つの化合物を前記液体栄養培地に添加することにより、炭素の分岐鎖アミノ酸へのフラックスを阻害することと、
を含み、
それにより、２，３−ブタンジオールの生成を増加させる、方法。
【請求項７】
前記培養物が、酢酸、エタノール、２−ブタノン、２−ブタノール、アセトイン、イソプロパノール、乳酸塩、コハク酸塩、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、プロパンジオール、２−プロパノール、イソブタノール、シトラマル酸塩、ブタジエン、ポリ乳酸、３−ヒドロキシブチレート、イソブチレン、３−ヒドロキシプロピオネート（３ＨＰ）、アセトン、及び脂肪酸からなる群から選択される少なくとも１つの生成物をさらに生成する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの化合物が２−ＨＩＢＡである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
２，３−ブタンジオールが、１日当たり少なくとも１０ｇ／Ｌの速度で生成される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記培養物が、エタノール対２，３−ブタンジオールの比率が、４：１〜１：２で、エタノールをさらに生成する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
液体栄養培地中の少なくとも１つの組換え酢酸生成カルボキシド栄養性クロストリジウム属微生物の培養物を含むバイオリアクタにガス状基質を提供し、少なくとも１つの発酵生成物を生成することを含む、発酵方法であって、
前記少なくとも１つの組換え酢酸生成カルボキシド栄養性クロストリジウム属微生物が、少なくとも１つの遺伝的修飾を有し、
前記少なくとも１つの遺伝的修飾が、ケトール酸レダクトイソメラーゼ遺伝子における不活性化、及び／又はアセト乳酸シンターゼ遺伝子の過剰発現である、方法。
【請求項１２】
ケトール酸レダクトイソメラーゼ遺伝子における不活性化突然変異を含み、親微生物と比較して、より多量の２，３−ブタンジオールを生成することができる、酢酸生成カルボキシド栄養性クロストリジウム属微生物。
【請求項１３】
ＣＯを含む基質の増殖及び／または発酵時、前記微生物が、親微生物と比較して、分岐鎖アミノ酸を生成する低減された能力を有する、請求項１２に記載の酢酸生成カルボキシド栄養性クロストリジウム属微生物。
【請求項１４】
前記微生物が、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイからなる群から選択される、請求項１２に記載の酢酸生成カルボキシド栄養性クロストリジウム属微生物。
【請求項１５】
過剰発現されたアセト乳酸シンターゼ遺伝子をさらに含む、請求項１２に記載の酢酸生成カルボキシド栄養性クロストリジウム属微生物。
【請求項１６】
アセト乳酸シンターゼの活性レベルを増加させるように適合される１つ以上の遺伝的修飾を含む、酢酸生成カルボキシド栄養性酢酸生成クロストリジウム属微生物。
【請求項１７】
ＣＯを含む基質の増殖及び／または発酵時、前記微生物が、親微生物と比較して、より多量の２，３−ブタンジオールを生成する、請求項１６に記載の酢酸生成カルボキシド栄養性酢酸生成クロストリジウム属微生物。
【請求項１８】
アセト乳酸シンターゼのレベルを増加させるように適合される前記１つ以上の遺伝的修飾が、内因性異化アセト乳酸シンターゼの過剰発現、内因性同化アセト乳酸シンターゼの過剰発現、外因性異化アセト乳酸シンターゼの発現、外因性同化アセト乳酸シンターゼの発現、内因性アセト乳酸シンターゼの外因性異化アセト乳酸シンターゼとの置換、内因性同化シンターゼのサブユニットの過剰発現からなる群から選択され、前記サブユニットが分岐鎖アミノ酸によるフィードバック阻害に非感受性である、請求項１６に記載の酢酸生成カルボキシド栄養性酢酸生成微生物クロストリジウム属。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年９月２２日に出願された米国仮出願第６１／８８０，９７０号からの優先権を主張するものであり、この内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、化合物を用いた発酵システムの代謝産物プロファイルを変化させるための方法に関する。特に、本発明は、アセト乳酸塩由来の生成物の生成を増加させるための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
輸送用バイオ燃料は、ガソリンの魅力的な代替品であり、低濃度混合物として燃料市場に急速に浸透してきている。天然植物源由来のバイオ燃料は、化石資源（ガソリン等）由来のものよりも環境的に持続可能で、それらの使用は、燃料燃焼の結果として、大気中に放出されるいわゆる化石二酸化炭素（ＣＯ２）ガスのレベルの低減を可能にする。さらに、バイオ燃料は、多くの地域で地元生産することができ、輸入化石エネルギー資源への依存を削減するために役立てることができる。バイオ燃料として使用するのに適しているアルコールとしては、エタノール、ブタノール、及び２，３−ブタンジオールが挙げられる。
【０００４】
エタノールは、世界中において、急速に主要な水素に富む液体輸送用燃料となっている。２００２年のエタノールの世界消費量は、１０８億ガロンと推定された。燃料エタノール産業の世界市場はまた、欧州、日本、米国、及びいくつかの発展途上国におけるエタノールへの関心の増加により、将来急成長すると予測されている。
【０００５】
１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、及び２，３−ブタンジオールを含むブタンジオールは、エタノールに優る様々な利点を有すると見なされ得る。エタノールと同様、ブタンジオールは、自動車燃料の添加剤として直接使用することができる。それらはまた、いくつかの潜在的に高い価値及び／または高エネルギー製品に比較的容易に変換することもできる。例えば、２，３−ブタンジオールは、二段階プロセスで、航空燃料として使用することができる８炭素ダイマーに容易に変換することができる。
【０００６】
２，３−ブタンジオールの多用途性は、その二官能性骨格から誘導され、すなわち、２個のヒドロキシル基が隣接Ｃ原子上に位置しているので、該分子は、ブタジエン、ブタジオン、アセトイン、メチルエチルケトン等の物質に極めて容易に変換させることが可能となる。これらの化学的化合物は、広範囲の化学工業製品を製造するためのベース分子として使用される。
【０００７】
さらに、２，３−ブタンジオールは、内燃機関の燃料として使用することもできる。それは、いくつかの点でエタノールよりもガソリンに類似している。環境的に持続可能な燃料の製造及び応用への関心が高まるにつれ、２，３−ブタンジオール（しばしばバイオブタノールと称される）を製造するための生物学的プロセスへの関心も高まっている。
【０００８】
一酸化炭素（ＣＯ）は、石炭または石油及び石油由来の製品等の有機材料の不完全燃焼の主要副産物である。炭素含有前駆物質を完全燃焼すれば、最終生成物としてＣＯ２と水だけが得られるが、一部の産業プロセスはＣＯ２よりも一酸化炭素の蓄積を促しやすい高温を必要とする。１つの例が製鋼業で、所望のスチール品質を得るのに高温を必要とする。例えば、豪州の鉄鋼産業は、年間５００，０００トンを超えるＣＯを生成し、大気中に放出していると報告されている。
【０００９】
さらに、ＣＯは合成ガスの主成分でもあり、様々な量のＣＯ及びＨ２が炭素含有燃料のガス化によって生成されている。例えば、合成ガスは、廃木及び廃木材の有機バイオマスを分解することによって製造され得、燃料及びより複雑な化学製品の製造のために前駆物質を生成する。
【００１０】
大気中へのＣＯ放出は、重大な環境影響をもたらし得る。さらに、排出税の支払いも求められ、工業プラントにかかるコストを増加させる。ＣＯは反応エネルギー豊富な分子なので、様々な化学製品の製造のための前駆化合物として使用することができる。しかしながら、この価値ある原料は、２，３−ブタンジオールの製造には利用されてこなかった。
【００１１】
２，３−ブタンジオールが原料を含有する炭水化物の微生物発酵によって生成され得ることが実証されている（Ｓｙｕ  ＭＪ，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５５：１０−１８（２００１），Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｅｎｇ  １４（１）：１３２−１３６（２００６））。２，３−ブタンジオールはまた、砂糖大根、トウモロコシ、小麦、及びサトウキビ等の作物由来のバイオマスの微生物発酵によって製造することもできる。しかしながら、これらの炭水化物原料のコストは、人間の食料または動物の飼料としてのそれらの価値によって影響を受け、また、２，３−ブタンジオール製造用のデンプンまたは蔗糖を生産する作物の耕作は、すべての地域で経済的に持続可能ではない。したがって、より少ないコストかつ／またはより豊富な炭素資源を２，３−ブタンジオールに変換するための技術を開発することに関心が寄せられている。
【００１２】
ＣＯを含むガス状基質の微生物発酵による２，３−ブタンジオールの生成が実証されている。しかしながら、これらのプロセスによる２，３−ブタンジオールの生成は、副生成物である。エタノールを含む他の生成物の生成は、発酵において好まれる。ブタンジオールは、そのような発酵において生成される他の生成物よりも大きな価値を有する。２，３−ブタンジオールの生成が増加するような方法で発酵に影響を及ぼすことができることが望ましい。増加した２，３−ブタンジオールの生産性が、微生物培養による水素消費の速度に影響されることがこれまでに示されている（国際公開第ＷＯ２０１２１３１６２７号）。
【００１３】
経済的に有益な方法で産業用ガス状基質から有益な生成物を生成する能力を増加させることが、当該技術分野において依然として必要とされる。カルボキシド栄養性細菌によるガス状基質の発酵において通常生成される他の生成物の生成と比較して、２，３−ブタンジオールの生成を増強させる必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、当該技術分野での必要性への応答を提供する。本発明は、発酵の代謝プロファイルを変化させるための方法を提供する。特に、本発明は、アセト乳酸塩を通してフラックスを増加させるための方法を提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、アセト乳酸塩由来の１つ以上の生成物の生成を増加させるための方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、ガス状基質の微生物発酵によって２，３−ブタンジオールの生成を増加させるための方法を提供する。本発明は、エタノール及び酢酸等の他の発酵生成物と比較して、２，３−ブタンジオールの生成を増加させるための方法をさらに提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
第１の態様において、本発明は、アセト乳酸塩由来の少なくとも１つの生成物の生成を増加させる方法を提供する。本方法は、液体栄養培地中の１つ以上のカルボキシド栄養性酢酸微生物の培養物を含むバイオリアクタにガス状基質を提供し、少なくとも１つの発酵生成物を生成することを含む。
【００１６】
一実施形態において、本方法は、少なくとも１つの化合物を液体栄養培地に添加することを含む。一実施形態において、少なくとも１つの化合物は、発酵の代謝プロファイルに影響を及ぼす。一実施形態において、液体栄養培地への少なくとも１つの化合物の添加は、炭素の分岐鎖アミノ酸へのフラックスを阻害する。
【００１７】
一実施形態において、本化合物は、アセト乳酸塩を分岐鎖アミノ酸に変換する１つ以上の酵素を阻害する化合物である。一実施形態において、本化合物は、カルボン酸部分を含む。
【００１８】
一実施形態において、本化合物は、２−ヒドロキシイソ酪酸（２−ＨＩＢＡ）、アセト乳酸塩、２−オキソ−３−ヒドロキシイソバレレート、及び２，３−ヒドロキシ−３−メチルブタノエートと構造的に関連する化合物からなる群から選択される。一実施形態において、少なくとも１つの化合物は、２−ヒドロキシイソ酪酸（２−ＨＩＢＡ）、２−ヒドロキシル−２−メチル酪酸、２−ヒドロキシブチレート、２−ヒドロキシ−３−メチル酪酸、２−ケト−３−ヒドロキシイソバレレート、及び２−ケトイソバレレートからなる群から選択される。
【００１９】
一実施形態において、少なくとも１つの発酵生成物は、酢酸、エタノール、２，３−ブタンジオール、２−ブタノン、２−ブタノール、アセトイン、イソプロパノール、乳酸塩、コハク酸塩、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、プロパンジオール、２−プロパノール、アセトイン、イソブタノール、シトラマル酸塩、ブタジエン、ポリ乳酸、イソブチレン、３−ヒドロキシプロピオネート（３ＨＰ）、アセトン、及び脂肪酸からなる群から選択される。
【００２０】
一実施形態において、アセト乳酸塩由来の少なくとも１つの生成物は、２，３−ブタンジオール、２−ブタノン、２−ブタノール、及びアセトインからなる群から選択される。
【００２１】
一実施形態において、アセト乳酸塩由来の少なくとも１つの生成物の生成速度は、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％、または少なくとも１１０％、または少なくとも１２０％、または少なくとも１３０％、または少なくとも１４０％、または少なくとも１５０％増加する。
【００２２】
第２の態様において、本発明は、２，３−ブタンジオールの生成を増加させる方法を提供する。一実施形態において、本方法は、液体栄養培地中の１つ以上のカルボキシド栄養性酢酸微生物の培養物を含むバイオリアクタにガス状基質を提供し、２，３−ブタンジオールを生成することを含む。一実施形態において、発酵は、少なくとも１つの他の発酵生成物を生成する。
【００２３】
一実施形態において、本方法は、液体栄養培地に少なくとも１つの化合物を提供することをさらに含む。一実施形態において、少なくとも１つの化合物は、炭素の分岐鎖アミノ酸へのフラックスを阻害する。
【００２４】
一実施形態において、本化合物は、アセト乳酸塩を分岐鎖アミノ酸に変換する１つ以上の酵素を阻害する化合物である。一実施形態において、本化合物は、カルボン酸部分を含む。
【００２５】
一実施形態において、本化合物は、２−ヒドロキシイソ酪酸（２−ＨＩＢＡ）、アセト乳酸塩、２−オキソ−３−ヒドロキシイソバレレート、及び２，３−ヒドロキシ−３−メチルブタノエートと構造的に関連する化合物からなる群から選択される。一実施形態において、少なくとも１つの化合物は、２−ヒドロキシイソ酪酸（２−ＨＩＢＡ）、２−ヒドロキシル−２−メチル酪酸、２−ヒドロキシブチレート、２−ヒドロキシ−３−メチル酪酸、２−ケト−３−ヒドロキシイソバレレート、及び２−ケトイソバレレートからなる群から選択される。
【００２６】
一実施形態において、少なくとも１つの他の発酵生成物は、酢酸、エタノール、２−ブタノン、２−ブタノール、アセトイン、イソプロパノール、乳酸塩、コハク酸塩、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、プロパンジオール、２−プロパノール、アセトイン、イソブタノール、シトラマル酸塩、ブタジエン、ポリ乳酸、イソブチレン、３−ヒドロキシプロピオネート（３ＨＰ）、アセトン、及び脂肪酸からなる群から選択される。
【００２７】
一実施形態において、少なくとも１つの他の発酵生成物は、少なくともエタノールである。一実施形態において、化合物の添加は、発酵の代謝プロファイルの変化をもたらす。一実施形態において、発酵への化合物の添加は、２，３−ブタンジオールの生成を増加させる。
【００２８】
一実施形態において、２，３−ブタエンジオール（ｂｕｔａｅｎｅｄｉｏｌ）の生成速度は、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％、または少なくとも１１０％、または少なくとも１２０％、または少なくとも１３０％、または少なくとも１４０％、または少なくとも１５０％増加する。
【００２９】
第１及び第２の態様の実施形態において、ガス状基質は、ＣＯ、ＣＯ２、Ｈ２、Ｎ２、ＣＨ４、及びこれらの混合物からなる群から選択される。特定の実施形態において、ガス状基質は、少なくともＣＯを含む。
【００３０】
第３の態様において、本発明は、２，３−ブタンジオールの生成を増加させる方法を提供する。一実施形態において、本方法は、液体栄養培地中の１つ以上のカルボキシド栄養性酢酸微生物の培養物を含むバイオリアクタにガス状基質を提供し、少なくとも２，３−ブタンジオール及びエタノールを生成することと、１つ以上の手段を用いて培養物を操作して、２，３−ブタンジオールの生成速度を増加させることと、を含む。
【００３１】
一実施形態において、培養物を操作するステップは、発酵への１つ以上の化合物の添加を含む。一実施形態において、本化合物は、アセト乳酸塩を分岐鎖アミノ酸に変換する１つ以上の酵素を阻害する化合物である。一実施形態において、本化合物は、カルボン酸部分を含む。一実施形態において、１つ以上の化合物は、２−ＨＩＢＡ、アセト乳酸塩、２−オキソ−３−ヒドロキシイソバレレート、及び２，３−ジヒドロキシ−３−メチルブタノエートと構造的に関連する化合物からなる群から選択される。一実施形態において、１つ以上の化学的化合物は、２−ＨＩＢＡ、２−ヒドロキシル−２−メチル酪酸、２−ヒドロキシブチレート、２−ヒドロキシ−３−メチル酪酸、２−ケト−３−ヒドロキシイソバレレート、及び２−ケトイソバレレートからなる群から選択される。
【００３２】
一実施形態において、ガス状基質は、ＣＯ２、Ｈ２、Ｎ２、ＣＨ４、及びこれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの基質をさらに含む。
【００３３】
一実施形態において、培養物を操作する方法は、２−ＨＩＢＡを培養物に添加することを含む。一実施形態において、１つ以上のさらなる操作ステップは、２−ＨＩＢＡを微生物培養物に添加することとともに実行される。一実施形態において、発酵への２−ＨＩＢＡの添加は、発酵ブロス中の２＿ＨＩＢＡの濃度が所定レベルで維持されるように制御される。ある特定の実施形態において、２−ＨＩＢＡの濃度は、０．０１〜２．０ｇ／Ｌ（０．０９６ｍＭ〜１９．２ｍＭ）で維持される。一実施形態において、２−ＨＩＢＡの濃度は、０．０５ｍＭ〜５０ｍＭで維持される。
【００３４】
一実施形態において、発酵への２−ＨＩＢＡの添加は、２，３−ブタンジオールの生成を増加させる。一実施形態において、２−ＨＩＢＡの添加は、２，３−ブタンジオールを支持してエタノール対２，３−ブタンジオールの比率を改善する。特定の実施形態において、エタノール対２，３−ＢＤＯの比率は、４：１、３：１の、または２：１、または１：１、または１：２である。
【００３５】
一実施形態において、２，３−ブタエンジオール（ｂｕｔａｅｎｅｄｉｏｌ）の生成速度は、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％、または少なくとも１１０％、または少なくとも１２０％、または少なくとも１３０％、または少なくとも１４０％、または少なくとも１５０％増加する。
【００３６】
特定の実施形態において、微生物は、ＣＯを使用して、１０ｇ／Ｌ以上の濃度で２，３−ＢＤＯを生成することができる。特定の実施形態において、微生物は、ＣＯを使用して、１２ｇ／Ｌを超える、または１６ｇ／Ｌを超える、または２０ｇ／Ｌを超える濃度で２，３−ＢＤＯを生成することができる。一実施形態において、微生物は、少なくとも１０ｇ／Ｌ／日、または少なくとも１５ｇ／Ｌ／日、または少なくとも２０ｇ／Ｌ／日、または少なくとも２５ｇ／Ｌ／日の割合で２，３−ブタンジオールを生成することができる。
【００３７】
特定の実施形態において、微生物は、ＣＯを使用して、１０ｇ／Ｌ以上の濃度でエタノールを生成することができる。特定の実施形態において、微生物は、ＣＯを使用して、１５ｇ／Ｌを超える、または２０ｇ／Ｌを超える、または３０ｇ／Ｌを超える、または４０ｇ／Ｌを超える濃度でエタノールを生成することができる。
【００３８】
一実施形態において、発酵は、酢酸をさらに生成する。特定の実施形態において、微生物は、ＣＯを使用して、１０ｇ／Ｌ以下の濃度で酢酸を生成することができる。
【００３９】
第１〜第３の態様の実施形態において、１つ以上のカルボキシド栄養性酢酸生成微生物は、クロストリジウム属、ムーレラ属、オキソバクター属、ペプトストレプトコッカス属、アセトバクテリウム属、ユーバクテリウム属、またはブチリバクテリウム属からなる群から選択される。様々な実施形態において、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・カルボキシジボランス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・スカトロゲネス、クロストリジウム・アセチカム、クロストリジウム・フォルミコアセチカム、クロストリジウム・マグナム、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム、アセトバクテリウム・ウッディ、アルカリバクルム・バッキ、ブラウティア・プロダクタ、ユーバクテリウム・リモサム、ムーレラ・サーモアセチカ、スポロムサ・オヴァタ、スポロムサ・シルバセチカ、スポロムサ・スファエロイデス、オキソバクター・フェニジイ、及びサーモアナエロバクター・キウヴィを含む群から選択される。
【００４０】
特定の実施形態において、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナムまたはクロストリジウム・リュングダリイである。１つの特定の実施形態において、微生物はクロストリジウム・オートエタノゲナムである。特定の実施形態において、微生物は、寄託番号ＤＳＭＺ１００６１またはＤＳＭＺ２３６９３の識別特徴を有する。
【００４１】
第４の態様において、本発明は、アセト乳酸塩由来の少なくとも１つの生成物の生成を増加させるための方法を提供し、本方法は、液体栄養培地中の少なくとも１つの組換え酢酸生成カルボキシド栄養性微生物の培養物を含むバイオリアクタにガス状基質を提供し、少なくとも１つの発酵生成物を生成することを含み、少なくとも１つの組換え微生物は、ピルビン酸塩からアセト乳酸塩への変換を増加させる少なくとも１つの遺伝的修飾を有する。
【００４２】
一実施形態において、少なくとも１つの遺伝的修飾は、ケトール酸レダクトイソメラーゼ遺伝子における不活性化突然変異、及びアセト乳酸シンターゼ遺伝子の過剰発現を提供するように適合される修飾からなる群から選択される。
【００４３】
一実施形態において、組換え微生物は親微生物と比較してアセト乳酸シンターゼの過剰発現を提供するための修飾及びケトール酸レダクトイソメラーゼ遺伝子における不活性化突然変異の両方を有し、親微生物と比較してケトール酸レダクトイソメラーゼの活性を減少する。
【００４４】
一実施形態において、少なくとも１つの遺伝的修飾は、アセト乳酸塩の生成の増加をもたらす。一実施形態において、ケトール酸レダクトイソメラーゼの活性の減少は、分岐鎖アミノ酸の生成を阻害する。一実施形態において、アセト乳酸シンターゼ遺伝子の増加した活性は、ピルビン酸塩からアセト乳酸塩への変換の速度を増加させる。
【００４５】
第５の態様において、本発明は、ケトール酸レダクトイソメラーゼ遺伝子における不活性化突然変異を含むカルボキシド栄養性酢酸生成微生物を提供する。
【００４６】
一実施形態において、カルボキシド栄養性酢酸生成微生物は、ガス状基質の増殖及び／または発酵時、親微生物と比較して、アセト乳酸塩を分岐鎖アミノ酸に変換する能力の低下を有する。
【００４７】
一実施形態において、カルボキシド栄養性微生物は、アセト乳酸シンターゼ遺伝子の過剰発現を提供するように適合される１つ以上の遺伝的修飾をさらに含む。
【００４８】
第６の態様において、本発明は、アセト乳酸シンターゼの活性レベルを増加させるように適合される１つ以上の遺伝的修飾を含む、カルボキシド栄養性酢酸生成微生物を提供する。
【００４９】
一実施形態において、アセト乳酸シンターゼのレベルを増加させるように適合される１つ以上の遺伝的修飾は、内因性異化アセト乳酸シンターゼの過剰発現、内因性同化アセト乳酸シンターゼの過剰発現、内因性アセト乳酸シンターゼの外因性異化アセト乳酸シンターゼとの置換、内因性アセト乳酸シンターゼの外因性同化アセト乳酸シンターゼとの置換、及び内因性同化シンターゼのサブユニットの過剰発現からなる群から選択され、当該サブユニットが分岐鎖アミノ酸によるフィードバック阻害に非感受性である。
【００５０】
一実施形態において、微生物は、ガス状基質の増殖及び／または発酵時、親微生物と比較して、より高い生成速度のアセト乳酸塩を有し、及び／または親微生物と比較して、より多量のアセト乳酸塩由来の生成物を生成する。
【００５１】
第４〜第６の態様の特定の実施形態において、親微生物は、カルボキシド栄養性微生物である。様々な実施形態において、カルボキシド栄養性微生物は、クロストリジウム属、ムーレラ属、オキソバクター属、ペプトストレプトコッカス属、アセトバクテリウム属、ユーバクテリウム属、またはブチリバクテリウム属から選択される。様々な実施形態において、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・カルボキシジボランス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・スカトロゲネス、クロストリジウム・アセチカム、クロストリジウム・フォルミコアセチカム、クロストリジウム・マグナム、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム、アセトバクテリウム・ウッディ、アルカリバクルム・バッキ、ブラウティア・プロダクタ、ユーバクテリウム・リモサム、ムーレラ・サーモアセチカ、スポロムサ・オヴァタ、スポロムサ・シルバセチカ、スポロムサ・スファエロイデス、オキソバクター・フェニジイ、及びサーモアナエロバクター・キウヴィを含む群から選択される。
【００５２】
特定の実施形態において、親微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナムまたはクロストリジウム・リュングダリイである。１つの特定の実施形態において、親微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナムである。特定の実施形態において、親微生物は、寄託番号ＤＳＭＺ１００６１またはＤＳＭＺ２３６９３の識別特徴を有する。
【００５３】
一実施形態において、ガス基質は、ＣＯ、ＣＯ２、Ｈ２、Ｎ２、ＣＨ４、及びこれらの混合物からなる群から選択される。
【００５４】
一実施形態において、親微生物を用いて行われた方法と比較して、本発明のこの態様の方法によって生成されたアセト乳酸塩由来の生成物の量は、少なくとも１０％多い、少なくとも２０％多い、少なくとも３０％多い、少なくとも４０％多い、少なくとも５０％多い、少なくとも６０％多い、少なくとも７０％多い、少なくとも８０％多い、少なくとも９０％多い、少なくとも１００％多い、少なくとも１１０％多い、少なくとも１２０％多い、少なくとも１３０％多い、少なくとも１４０％多い、少なくとも１５０％多い。一実施形態において、本発明のこの態様の方法によって生成されたアセト乳酸塩由来の生成物の量は、９８％多い。
【００５５】
特定の実施形態において、組換えカルボキシド栄養性酢酸生成微生物は、ＣＯを使用して、１０ｇ／Ｌ以上の濃度で２，３−ＢＤＯを生成することができる。特定の実施形態において、微生物は、ＣＯを使用して、１２ｇ／Ｌを超える、または１６ｇ／Ｌを超える、または２０ｇ／Ｌを超える濃度で２，３−ＢＤＯを生成することができる。一実施形態において、微生物は、少なくとも１０ｇ／Ｌ／日、または少なくとも１５ｇ／Ｌ／日、または少なくとも２０ｇ／Ｌ／日、または少なくとも２５ｇ／Ｌ／日の割合で２，３−ブタンジオールを生成することができる。
【００５６】
特定の実施形態において、組換えカルボキシド栄養性酢酸生成微生物は、ＣＯを使用して、１０ｇ／Ｌ以上の濃度でエタノールを生成することができる。特定の実施形態において、微生物は、ＣＯを使用して、１５ｇ／Ｌを超える、または２０ｇ／Ｌを超える、または３０ｇ／Ｌを超える、または４０ｇ／Ｌを超える濃度でエタノールを生成することができる。特定の実施形態において、微生物は、ＣＯ２及びＨ２を使用して、１０ｇ／Ｌ以下の濃度で酢酸を生成することができる。
【００５７】
特定の実施形態において、組換えカルボキシド栄養性酢酸生成微生物は、エタノール対２，３−ＢＤＯの比率が４：１の、３：１の、または２：１、または１：１、または１：２の、エタノール及び２，３−ブタンジオールを生成する。
【００５８】
本発明はまた、用途の仕様において言及またはそれに指示された部分、要素、及び特性を、個別にまたは集合的に、該部分、要素、または特性のうちの２つ以上の任意またはすべての組み合わせで含み、特定の整数が本明細書に記載され、それが本発明の関連する当該技術分野において既知の等価物を有する場合、このような既知の等価物は、個別に記載されるかのように本明細書に組み込まれると見なされる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】発酵の代謝産物のプロファイルにおける２−ＨＩＢＡ添加の影響を示す。
【図２】液体希釈率及び細菌希釈率に基づいた２−ＨＩＢＡの指数関数的洗い流し曲線を示す。
【図３】２−ＨＩＢＡの濃度が０．５ｇ／Ｌ（４．８ｍＭ）で維持されるように、２−ＨＩＢＡを発酵に連続的に添加した場合のバイオリアクタの代謝産物プロファイルを示す。
【図４】発酵に連続的に添加した２−ＨＩＢＡの量が１．０ｇ／Ｌ（９．６ｍＭ）まで増加した場合のバイオリアクタの代謝産物プロファイルを示す。
【図５】２−ＨＩＢＡの濃度が０．５ｇ／Ｌ（４．８ｍＭ）で維持されるように、２−ＨＩＢＡを発酵に連続的に添加した場合のバイオリアクタのガスプロファイルを示す。
【図６】発酵に連続的に添加した２−ＨＩＢＡの量が１．０ｇ／Ｌ（９．６ｍＭ）まで増加した場合のバイオリアクタのガスプロファイルを示す。
【図７】２−ＨＩＢＡの濃度が、０．５ｇ／Ｌ（４．８ｍＭ）から１．０ｇ／Ｌ（９．６ｍＭ）に増加する場合の２リアクタシステムからの代謝産物プロファイルを示す。
【図８】エタノール：２，３−ＢＤＯの比率において異なる２−ＨｉＢＡ濃度の影響を示す。
【図９】培地中の０．０５ｇ／Ｌ（０．４８ｍＭ）の２−ＨＩＢＡを用いた発酵の代謝産物プロファイルを示す。
【図１０】培地中の０．０５ｇ／Ｌ（０．４８ｍＭ）の２−ＨｉＢＡを用いた発酵のガスプロファイルを示す。
【図１１】１００ｍｇ（０．９６ｍＭ）のＨｉＢＡの添加後の分岐鎖アミノ酸及びバイオマスの濃度を示す。
【図１２】ＬＺ１５６１の代謝における２−ＨＩＢＡの影響の概略図。
【図１３】１５ｍＭの２−ヒドロキシ−２メチル酪酸の添加の影響を示す発酵の代謝産物プロファイルを示す。
【図１４】２−ＨＩＢＡの添加前及び後のバイオリアクタにおける炭素の相対的なバランスを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
本発明は、ガス状基質の微生物発酵による１つ以上の生成物の生成のための方法を提供する。
【００６１】
ガス状基質は、ＣＯ、ＣＯ２、Ｈ２、Ｎ２、ＣＨ４、及びこれらの混合物からなる群から選択される。本発明は、アセト乳酸塩由来の１つ以上の生成物の生成を増加させるための方法を提供する。
定義
【００６２】
「アセト乳酸塩由来の生成物」または「アセト乳酸塩由来生成物」という用語または同様の用語は、本明細書において使用される場合、アセト乳酸塩前駆体を有する発酵生成物を包含することを意図する。これらの生成物としては、２，３−ブタンジオール、２−ブタノン、２−ブタノール、及びアセトインが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
「分岐鎖アミノ酸」という用語または同様の用語は、ロイシン、イソロイシン、及びバリンを包含することを意図する。
【００６４】
「２，３−ブタンジオール」という用語は、化合物のすべてのエナンチオ及びジアステレオ形、例えば、（Ｒ，Ｒ）、（Ｓ，Ｓ）、及びメソ形、ラセミ形、部分的に立体異性体的に純粋な形及び／または実質的に立体異性体的に純粋な形で含むと解釈されるべきである。
【００６５】
「バイオリアクタ」という用語は、１つ以上の容器及び／または塔もしくは配管からなる発酵装置を含み、連続撹拌槽型反応器（ＣＳＴＲ）、固定化細胞反応器（ＩＣＲ）、細流床反応器（ＴＢＲ）、バブルカラム（Ｂｕｂｂｌｅ  Ｃｏｌｕｍｎ）、ガスリフト発酵槽（Ｇａｓ  Ｌｉｆｔ  Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）、静的ミキサ（Ｓｔａｔｉｃ  Ｍｉｘｅｒ）、循環式ループリアクタ、膜反応器、例えば中空繊維膜バイオリアクタ（ＨＦＭＢＲ）、または気液接触に適切なその他の容器もしくはその他の装置を含む。本明細書において後で記載されるように、いくつかの実施形態において、バイオリアクタは、第１の増殖リアクタ及び第２の発酵リアクタを含み得る。したがって、バイオリアクタまたは発酵反応への、基質、例えば一酸化炭素を含む基質の添加を参照する場合、必要に応じて、これらのリアクタのいずれかまたは両方への添加を含むことが理解されるべきである。
【００６６】
「ガス状基質」及び／または「基質」という用語は、発酵において炭素源及び任意にエネルギー源として微生物によって使用される化合物または成分を含有する任意のガスを含む。ガス状基質は典型的に、相当割合のＣＯ、ＣＯ２、ＣＨ４、Ｈ２、またはこれらの混合物のいずれかを含有する。
【００６７】
「一酸化炭素を含む基質」という用語及び同様の用語は、一酸化炭素が、例えば増殖及び／または発酵のために細菌の１つ以上の株に利用可能である、任意の基質を含むように理解されるべきである。
【００６８】
「一酸化炭素を含むガス状基質」は、あるレベルの一酸化炭素を含有する任意のガスを含む。ガス状基質は典型的に、主要な割合のＣＯ、好ましくは少なくとも１５体積％〜９５体積％のＣＯを含有するであろう。
【００６９】
「ＣＯ２を含む基質」は、あるレベルの二酸化炭素を含有する任意の基質流を含む。しかしながら、ガス状基質は、代替形態で提供され得る。例えば、ＣＯ２を含有するガス状基質は、液体中に溶解されて提供され得る。本質的には、液体を二酸化炭素含有ガスで飽和し、次いで、その液体をバイオリアクタに添加する。これは、標準的な方法を用いて達成され得る。例として、微生物分散物生成器（Ｈｅｎｓｉｒｉｓａｋ  ｅｔ．ａｌ．Ｓｃａｌｅ−ｕｐ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  ｆｏｒ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  １０１，Ｎｕｍｂｅｒ  ３／Ｏｃｔｏｂｅｒ，２００２）が、使用され得る。さらなる例として、ＣＯ２及びＨ２を含有するガス状基質は、固体支持体上に吸収され得る。
【００７０】
「生成物」という用語は、本明細書において使用される場合、微生物発酵によって生成される物質を包含することが意図される。生成物は、アルコール、酸、または他の化学物質を含むことができる。生成物はまた、微生物発酵プロセスによって生成されるガスも含むことができる。
【００７１】
「効率の増加」、「増加した効率」等のような用語は、発酵プロセスに関して使用される場合、発酵を触媒する微生物の増殖速度、高濃度のブタンジオールでの増殖及び／または生成物生成速度、消費された基質の容量当たり生成される所望の生成物の容量、所望の生成物の生成速度または生成レベル、ならびに発酵の他の副生成物と比較した生成された所望の生成物の相対的比率のうちの１つ以上を増加することを含むが、これらに限定されない。
【００７２】
「生産性」または「生産率」という用語は、生成物の容量生産性である。連続システムでは、容積測定生産性は、生成物の定常状態の濃度と液体保持時間の比率として算出される。バッチシステムでは、容積測定生産性は、バッチシステムでの当該濃度を生成するのに必要とされる濃度及び時間として算出される。容積測定生産性は、ｇ／Ｌ／日として報告されている。
【００７３】
文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「発酵」、「発酵プロセス」、または「発酵反応」等のような語句は、本明細書において使用される場合、プロセスの増殖期及び生成物生合成期の両方を包含することが意図される。
【００７４】
「親微生物」は、本発明の組換え微生物を発生させるために使用される微生物である。親微生物は、天然に存在するもの（すなわち、野生型微生物）、または事前に改変されるが、本発明の対象の酵素のうちの１つ以上を発現もしくは過剰発現しないものであり得る。したがって、本発明の組換え微生物は、親微生物で発現または過剰発現しない１つ以上の酵素を発現または過剰発現するように改変された。
【００７５】
「外因性」という用語は、それらが導入される微生物の外部に由来する核酸を指す。外因性核酸は、それらが（例えば、組換え微生物が由来する親微生物に）導入される微生物、それらが導入される生物とは異なる微生物の株もしくは種を含むが、これらに限定されない任意の適切な源に由来し得るか、または人工的もしくは組換えによって作製され得る。「外因性」は、タンパク質を指すために使用することもできる。これは、組換え微生物が由来する親微生物に存在しないタンパク質を指す。
【００７６】
「内因性」という用語は、組換え微生物及び核酸またはタンパク質に関連して使用される場合、組換え微生物が由来する親微生物に存在する任意の核酸またはタンパク質を指す。
【００７７】
「過剰発現する」、「過剰発現」、ならびに同様の用語及び語句は、本発明に関して使用される場合、同じ条件下で、親微生物のタンパク質の発現レベルと比較して、１つ以上のタンパク質の発現における任意の増加を含むように広く解釈されるべきである。それは、タンパク質が任意の特定のレベルで発現されることを意味するように解釈されるべきではない。
【００７８】
以下の説明は、本発明の特定の実施形態、すなわち、一次基質としてＣＯを用いた２，３−ＢＤＯの生成に注目するが、本発明は、本発明が関連する当業者に既知である、代替的アルコールの生成及び／または酸、ならびに代替的基質の使用に適用可能であり得ることを理解されるべきである。より具体的には、本発明は、ＣＯ、ＣＯ２、Ｈ２、ＣＨ４、及びこれらの混合物からなる群から選択されるガス状基質を用いたアセト乳酸塩由来の生成物の生成に適用可能であり得る。
【００７９】
エタノール及び酢酸塩等の生成物を生成するために、一酸化炭素を含むガス状基質の微生物発酵プロセスは、当該技術分野において周知である。そのようなプロセスは、ＣＯを含む産業廃ガスから商業的に有用な燃料を生成する手段を提供する。
【００８０】
したがって、本発明者らは、まず、ＣＯを含むガス状基質の微生物発酵を通して、高濃度の２，３−ブタンジオールを生成するためのプロセスを考案する。第一段階では、ＣＯを含むガス状基質を、液体栄養培地中に懸濁する１つ以上の微生物の培養物を含むバイオリアクタに供給する。ガス状基質を嫌気的に発酵させて、１つ以上のアルコール及び／または１つ以上の酸またはこれらの混合物を生成する。化合物を発酵に提供して、発酵の代謝産物プロファイルを変更する。
【００８１】
本発明者らは、バイオリアクタへの２−ヒドロキシイソ酪酸（２−ＨＩＢＡ）の添加が増加した２，３−ＢＤＯの生成を誘発することを実証した。特定の実施形態において、このプロセスは、２，３−ＢＤＯ及びエタノールを生成する。本発明の方法によって生成された２，３−ブタンジオール対エタノールの比率は、１：１０〜１０：１である。特定の実施形態において、このプロセスは、１：４、または１：３、または１：２、または１：１、または１：２の比率で、２，３ブタンジオール及びエタノールを生成する。
【００８２】
本発明者らは、発酵への０．０１ｇ／Ｌ〜２．０ｇ／Ｌ（０．０９６〜１９．２ｍＭ）の濃度の２−ＨＩＢＡの添加が２，３−ＢＤＯの濃度を著しく増加させることを見出した。２−ＨＩＢＡの添加はまた、エタノール：２，３−ＢＤＯの比率を大幅に改善することも示されている。
【００８３】
本発明者らは、０．０１ｇ／Ｌ／日〜２．０ｇ／Ｌ／日（０．０９６〜１９．２ｍＭ／日）の濃度の２−ＨＩＢＡを、連続様式で発酵システムに添加して、全体的な発酵安定性に影響を及ぼすことなく、エタノール：２，３−ＢＤＯの比率を改善することができることを実証している。
【００８４】
２−ＨＩＢＡの添加後に増加した２，３−ブタンジオールの生成への変化を確認するために、炭素バランス測定を行った。炭素バランスは、エタノール、酢酸塩、及びバイオマスの生成の減少を伴う２，３−ブタンジオールの生成の明らかな増加を示した。図１４は、２−ＨＩＢＡの添加前及び後のバイオリアクタにおける炭素の相対的なバランスを示す。
【００８５】
本発明者らは、２−ＨＩＢＡが細菌に取り込まれない、または生成物に変換されないことをさらに見出した。２−ＨＩＢＡは、２，３−ＢＤＯの生成を増加させ、発酵によって消費されることなく、エタノール：２，３−ＢＤＯの比率を改善することを、本発明者らによって実証された。２−ＨＩＢＡが発酵によって消費されないため、バイオリアクタを出る２−ＨＩＢＡを回収し、それをバイオリアクタに戻して、発酵の効率を改善することが可能である。
【００８６】
２−ＨＩＢＡの添加は、クロストリジウム・オートエタノゲナムの代謝に影響を及ぼす。図１２は、クロストリジウム・オートエタノゲナムの代謝における２−ＨＩＢＡの影響を示す概略図である。天然システムでは、アセトルカテート（Ａｃｅｔｏｌｃａｔａｔｅ）シンターゼＩｌｖＢＮの発現及び活性は、分岐鎖アミノ酸合成によって下方制御される。発酵への２−ＨＩＢＡの添加は、ケトール酸レククトイソメラーゼ（ｒｅｃｕｃｔｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ）ＩｌｖＣ、分岐鎖アミノ酸生合成を阻害し、これにより、バリン、イソロイシン、及びロイシンの濃度の減少をもたらす。結果として、バリン、イソロイシン、及びロイシンによるＩｌｖＢＮ酵素のフィードバック阻害が解除される。これは、アセト乳酸塩の生成の増加をもたらす。アセト乳酸塩プールの増加は、炭素の２，３−ブタンジオールへの氾濫を引き起こす。アセト乳酸塩及びアセトインの２，３−ＢＤＯへの変換は、レート制限されず、２，３−ＢＤＯへの変換は、アセト乳酸塩のアセトインへの変換及び／またはアセトインの２，３−ＢＤＯへの変換に関与する酵素をさらに上方制御する必要なく、自由に生じる。
【００８７】
２−ＨＩＢＡは、Ｃ４カルボン酸及びアルファヒドロキシ酸である。２−ＨＩＢＡは、クロストリジウム・オートエタノゲナムによって合成されず、自然界ではめったに見られない、化学的化合物である。
【００８８】
ケトール酸レダクトイソメラーゼは、２−ＨＩＢＡの存在によって阻害される。２−ＨＩＢＡと同様の構造的特徴、及びその酵素が作用する基質を有する他の化合物（アセト乳酸塩。２−オキソ−３−ヒドロキシイソバレレート及び２，３−ジヒドロキシ−３−メチルブタノエート）が、ケトール酸レダクトイソメラーゼへの同様の効果を有するであろうと見られる。ケトール酸レダクトイソメラーゼの阻害剤は、アセト乳酸塩を分岐鎖アミノ酸に変換する１つ以上の酵素を阻害する化合物を含む。典型的には、本化合物は、ケトール酸レダクトイソメラーゼを阻害する。
【００８９】
典型的には、本化合物は、カルボン酸部分を含み、本化合物が、カルボン酸部分からアルファ位置の炭素原子で、ヒドロキシル基またはカルボニル基に置換される。好ましくは、本化合物は、カルボン酸部分を含み、本化合物が、カルボン酸部分からアルファ位置の炭素原子で、ヒドロキシル基に置換される。より好ましくは、本化合物は、カルボン酸部分を含み、本化合物が、カルボン酸部分からアルファ位置の炭素原子で、ヒドロキシル基に置換され、本化合物は、カルボン酸部分からアルファ位置の炭素原子で分岐される。カルボン酸部分からアルファ位置の炭素原子と結合するヒドロキシル基に加えて、カルボン酸部分からアルファ位置の炭素原子と結合する１つまたは２つの非水素置換基があることを意味する。
【００９０】
１つ以上のキラル中心を含む式Ｉの化合物は、鏡像異性的に純粋な形、または異性体の混合物の形で使用され得る。誤解を避けるために、式Ｉの化合物は、必要に応じて、その塩及び／または溶媒和物の形で使用することができる。さらに、誤解を避けるために、本発明の化合物は、任意の互変異性形で使用され得る。
【００９１】
典型的な塩形は、金属及びアミン化合物を有する塩を含む。金属を有する塩は、アルカリ金属（例えば、ナトリウムまたはカリウム）及びアルカリ土類金属（例えば、カルシウムまたはマグネシウム）を有する塩を含み得る。アミンを有する塩は、アルキルアミン、アラルキルアミン、及び複素環式アミンを有する塩を含み得る。
【００９２】
典型的には、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基、好ましくはＣ１〜Ｃ３アルキル基、ある状況においては、Ｃ１〜Ｃ２アルキル基である。Ｃ１〜Ｃ６アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、及びヘキシルが挙げられる。メチル、エチル、及びｉ−プロピル基が好ましい。誤解を避けるために、２つのアルキル部分が式（Ｉ）の化合物中に存在する場合、アルキル部分は、同じであっても、異なっていてもよい。典型的には、アルキル部分は、非置換である。
【００９３】
Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル基は、典型的には、１つ以上のヒドロキシル（−ＯＨ）基によって置換される当該Ｃ１〜Ｃ６アルキル基である。典型的には、それは、１つ、２つ、または３つのヒドロキシル基、好ましくは、１つまたは２つ、より好ましくは、１つのヒドロキシル基によって置換される。典型的には、Ｃ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル基は、Ｃ１〜Ｃ４ヒドロキシアルキル基、好ましくは、Ｃ１〜Ｃ３ヒドロキシアルキル基である。好ましいヒドロキシアルキル基は、−Ｃ（ＯＨ）（ＣＨ３）２基である。典型的には、ヒドロキシアルキル基は、前述のヒドロキシル基以外の基で置換されない。
【００９４】
典型的には、Ｒ１は、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ４アルキル基、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ４ヒドロキシアルキル基、または基−（Ｃ＝Ｏ）Ｒであり、式中、Ｒは直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ４アルキル基である。好ましくは、Ｒ１は、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１−Ｃ３アルキル基、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３ヒドロキシアルキル基、または基−（Ｃ＝Ｏ）Ｒであり、式中、Ｒは直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３アルキル基である。より好ましくは、Ｒ１は、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３アルキル基、分岐鎖Ｃ３ヒドロキシアルキル基、または基−（Ｃ＝Ｏ）Ｒであり、式中、Ｒはメチル基である。最も好ましくは、Ｒ１は、メチル、エチル、ｉ−プロピル、−Ｃ（ＯＨ）（ＣＨ３）２基、または基−（Ｃ＝Ｏ）Ｒであり、式中、Ｒはメチル基である。
【００９５】
典型的には、Ｒ２は、水素原子または直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ４アルキル基、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ４ヒドロキシアルキル基、または基−（Ｃ＝Ｏ）Ｒであり、式中、Ｒは直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ４アルキル基である。好ましくは、Ｒ２は、水素原子または直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３アルキル基、または直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３ヒドロキシアルキル基である。より好ましくは、Ｒ２は、水素原子またはメチルもしくはエチル基である。最も好ましくは、Ｒ２は、水素原子またはメチル基である。
【００９６】
典型的には、Ｒ１は、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ４アルキル基、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ４ヒドロキシアルキル基、または基−（Ｃ＝Ｏ）Ｒであり、式中、Ｒは直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ４アルキル基であり、Ｒ２は、水素原子または直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１−Ｃ４アルキル基、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ４ヒドロキシアルキル基、または基−（Ｃ＝Ｏ）Ｒであり、式中、Ｒは直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ４アルキル基である。好ましくは、Ｒ１は、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３アルキル基、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３ヒドロキシアルキル基、または基−（Ｃ＝Ｏ）Ｒであり、式中、Ｒは直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３アルキル基であり、Ｒ２は、水素原子または直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３アルキル基または直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３ヒドロキシアルキル基である。より好ましくは、Ｒ１は、直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３アルキル基、分岐鎖Ｃ３ヒドロキシアルキル基、または基−（Ｃ＝Ｏ）Ｒであり、式中、Ｒはメチル基であり、Ｒ２は、水素原子またはメチルもしくはエチル基である。最も好ましくは、Ｒ１は、メチル、エチル、ｉ−プロピル、−Ｃ（ＯＨ）（ＣＨ３）２基、または基−（Ｃ＝Ｏ）Ｒであり、式中、Ｒはメチル基であり、Ｒ２は、水素原子またはメチル基である。
【００９７】
典型的には、Ｒ１及びＲ２は両方とも、上で定義される基−（Ｃ＝Ｏ）Ｒではない。典型的には、Ｒ１及びＲ２は両方とも、上で定義されるＣ１〜Ｃ６ヒドロキシアルキル基ではない。したがって、典型的には、Ｒ１は、上で定義される通りであり、Ｒ２は、水素原子または直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、好ましくは、水素原子または直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ４アルキル基、より好ましくは、水素原子またはメチルもしくはエチル基、最も好ましくは、水素原子またはエチル基である。
【００９８】
ある特定の状況では、Ｒ１及びＲ２の両方が、アルキル基であることが好ましい場合がある。この場合には、Ｒ１は、直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキル基であり、Ｒ２は、直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキル基である。好ましくは、Ｒ１は、直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ４アルキル基であり、Ｒ２は、直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ４アルキル基である。より好ましくは、Ｒ１は、直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３アルキル基であり、Ｒ２は、直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３アルキル基である。さらにより好ましくは、Ｒ１は、メチルまたはエチル基であり、Ｒ２は、メチルまたはエチル基である。最も好ましくは、Ｒ１及びＲ２は、メチル基である。
【００９９】
式Ｉの特に好ましい化合物は、２−ヒドロキシイソ酪酸、２−ヒドロキシル−２−メチル酪酸、２−ヒドロキシブチレート、及び２−ヒドロキシ−３−メチル酪酸である。２−ヒドロキシイソ酪酸は、特に好ましい。したがって、式Ｉの特に好ましい化合物は、典型的には、以下の化合物から選択される。
【化１】
0006554102.tif 000002
【０１００】
典型的には、Ｒ３は、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ４アルキル基または直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ４ヒドロキシアルキル基である。好ましくは、Ｒ３は、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３アルキル基または直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３ヒドロキシアルキル基である。最も好ましくは、Ｒ３は、ｉ−プロピルまたは−Ｃ（ＯＨ）（ＣＨ３）２である。式ＩＩの特に好ましい化合物は、２−ケト−３−ヒドロキシイソバレレート及び２−ケトイソバレレートである。したがって、式ＩＩの特に好ましい化合物は、典型的には、以下の化合物から選択される。
【化２】
0006554102.tif 000003
【０１０１】
ケトール酸レダクトイソメラーゼ阻害剤の例としては、ケトβヒドロキシイソバレレート、ヒドロキシブチレート、ヒドロキシルαメチルブチレート、ヒドロキシイソバレレート、ケトイソバレレート（Ａｒｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｍｅｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｏｆ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９６９，Ｖｏｌ．２４４，Ｎｏ．５，ｐｐ１１１８−１１２７．）、及びオキサリルヒドロキサメート（Ａｕｌａｂａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｘａｌｙｌ  Ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅｓ  ａｓ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ−Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｋｅｔｏｌ−Ａｃｉｄ  Ｒｅｄｕｃｔｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９０，２９，ｐｐ  ２８２４−２８３０．）が挙げられるが、これらに限定されない。ＩｌｖＣ経路をもたらす化合物のさらなる例としては、２−ヒドロキシル−２−メチル酪酸、２−ヒドロキシブチレート、２−ヒドロキシ−３−メチル酪酸、２−ケト−３−ヒドロキシイソバレレート、及び２−ケトイソバレレートが挙げられる。
【０１０２】
発酵について論じられた阻害化合物のうちの１つ以上の添加は、分岐鎖アミノ酸の生成阻害の上記の機序によって、アセト乳酸塩の生成を増加させる。アセト乳酸塩プールの増加は、２，３−ブタンジオールを含む、他のアセト乳酸塩由来の生成物への炭素の増加する流れを引き起こす。
【０１０３】
阻害化合物は、分岐鎖アミノ酸の生成における阻害反応を引き起こすのに十分な濃度で液体栄養培地に添加され、アセト乳酸塩由来の他の生成物の生成を増加させる。本化合物は、０．０５ｍＭ〜５０ｍＭの濃度で、連続様式で液体栄養培地に添加され得る。発酵への化合物の添加によって生成されるアセト乳酸塩由来の生成物の量は、化合物を添加しない発酵と比較して、少なくとも１０％多い、少なくとも２０％多い、少なくとも３０％多い、少なくとも４０％多い、少なくとも５０％多い、少なくとも６０％多い、少なくとも７０％多い、少なくとも８０％多い、少なくとも９０％多い、少なくとも１００％多い、少なくとも１１０％多い、少なくとも１２０％多い、少なくとも１３０％多い、少なくとも１４０％多い、少なくとも１５０％多い。
【０１０４】
発酵は、例えば、固定化細胞反応器、ガスリフト反応器、バブルカラム反応器（ＢＣＲ）、膜反応器、例えば、中空繊維膜バイオリアクタ（ＨＦＭ  ＢＲ）、またはトリクルベッド反応器（ＴＢＲ）等の、任意の好適なバイオリアクタ内で行うことができる。また、本発明のいくつかの実施形態において、バイオリアクタは、微生物が培養される第１の増殖リアクタと、増殖リアクタからの発酵ブロスが供給され、かつ発酵生成物（例えば、エタノール及び酢酸塩）の大部分が生成され得る第２の発酵リアクタとを備え得る。本発明のバイオリアクタは、ＣＯ、ＣＯ２、Ｈ２、及びこれらの混合物からなる群から選択されるガス状基質を受容するように適合される。
【０１０５】
特定の実施形態において、微生物は、カルボキシド栄養性細菌である。様々な実施形態において、カルボキシド栄養性微生物は、クロストリジウム属、ムーレラ属、オキソバクター属、ペプトストレプトコッカス属、アセトバクテリウム属、ユーバクテリウム属、またはブチリバクテリウム属から選択される。様々な実施形態において、該微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・カルボキシジボランス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・スカトロゲネス、クロストリジウム・アセチカム、クロストリジウム・フォルミコアセチカム、クロストリジウム・マグナム、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム、アセトバクテリウム・ウッディ、アルカリバクルム・バッキ、ブラウティア・プロダクタ、ユーバクテリウム・リモサム、ムーレラ・サーモアセチカ、スポロムサ・オヴァタ、スポロムサ・シルバセチカ、スポロムサ・スファエロイデス、オキソバクター・フェニジイ、及びサーモアナエロバクター・キウヴィを含む群から選択される。
【０１０６】
特定の実施形態において、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナムまたはクロストリジウム・リュングダリイである。１つの特定の実施形態において、微生物はクロストリジウム・オートエタノゲナムである。特定の実施形態において、微生物は、寄託番号ＤＳＭＺ１００６１またはＤＳＭＺ２３６９３の識別特徴を有する。
【０１０７】
ＢＣＡＡ合成を阻害するための組換え微生物
本発明の１つの態様は、炭素質のガス状基質を分岐鎖アミノ酸に変換する能力の低下を有するカルボキシド栄養性酢酸生成微生物の提供である。ケトール酸レダクトイソメラーゼである酵素は、部分的または全体的にその活性を減少させる突然変異によって不活性化され得る。微生物が天然にまたは修飾によって、アセト乳酸塩由来の有用な炭素含有化合物を生成する能力を有する場合、ケトール酸レダクトイソメラーゼの能力を減少させることは、有用な化合物の蓄積をもたらすであろう。
【０１０８】
図１２を参照すると、アセトルカテート（Ａｃｅｔｏｌｃａｔａｔｅ）シンターゼＩｌｖＢＮの発現及び活性は、分岐鎖アミノ酸によって下方制御される。分岐鎖アミノ酸生合成におけるステップを触媒する酵素、ケトール酸レククトイソメラーゼ（ｒｅｃｕｃｔｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ）ＩｌｖＣの阻害は、バリン、イソロイシン、及びロイシンの生成の減少をもたらす。結果として、ＩｌｖＢＮをコードする遺伝子の発現が活性化され、分岐鎖アミノ酸によるＩｌｖＢＮ酵素のフィードバック阻害が解除される。これは、アセト乳酸塩の生成の増加をもたらす。アセト乳酸塩プールの増加は、炭素のアセト乳酸塩由来の生成物（２，３−ブタンジオール、アセトイン、２−ブタノール、及び２−ブタノンを含む）への増加したフラックスを引き起こす。
【０１０９】
本発明に従って改変され得る微生物には、アセト乳酸塩由来の生成物、例えば、アセトイン、ブタンジオール、ブタノン、及び２−ブタノールを作製し得る任意のものが含まれる。微生物はまた、ケトール酸レダクトイソメラーゼ遺伝子を有しなければならない。ケトール酸レダクトイソメラーゼは、配列番号１に従うアミノ酸配列を有し得る。
【０１１０】
不活性化突然変異は、その特定の微生物に対して当該技術分野で既知の任意の手段によって行われ得る。化学変異誘発、トランスポゾン変異誘発、ウイルス変異誘発、インビトロ変異誘発が、例示的な手段である。不活性化突然変異は、ケトール酸レダクトイソメラーゼの活性を部分的に軽減させても、全体的に排除してもよい。これらは、例えば、挿入、欠失、置換、またはナンセンス突然変異であり得る。突然変異は、微生物の酵素活性を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％低下し得る。これは、本質的に酵素活性を減少させる、または酵素の量を減少させることによって行われ得る。
【０１１１】
ある特定の実施形態において、ケトール酸レダクトイソメラーゼの活性は、例えば、遺伝子ノックアウト等の場合、全体的に不活性化され得る。ケトール酸レダクトイソメラーゼの活性が全体的に不活性化される場合、分岐鎖アミノ酸またはそれらの即時型生物学的前駆体で発酵を補助することが必要である。
【０１１２】
アセト乳酸塩合成を増加させるための組換え微生物
本発明の１つの態様は、アセト乳酸シンターゼ活性のレベルを増加させるように適合される１つ以上の遺伝的修飾を含むカルボキシド栄養性酢酸生成微生物の提供である。ガス状の炭素質基質の増殖及び／または発酵時、微生物は、親微生物と比較して、増加した量のアセト乳酸塩を生成する。アセト乳酸シンターゼは、配列番号２に従うアミノ酸配列を有し得る。
【０１１３】
「アセト乳酸シンターゼ」は、異化アセト乳酸シンターゼ酵素及び同化アセト乳酸塩（またはアセトヒドロキシ酸）シンターゼ酵素の両方を含むことが意図される。
【０１１４】
アセト乳酸シンターゼのレベルを増加させるように適合される１つ以上の遺伝子修飾は、内因性異化アセト乳酸シンターゼの過剰発現、外因性異化アセト乳酸シンターゼの発現、外因性同化アセト乳酸シンターゼの発現、内因性同化アセト乳酸シンターゼの過剰発現、内因性アセト乳酸シンターゼの外因性異化アセト乳酸シンターゼとの置換、内因性アセト乳酸シンターゼの外因性同化アセト乳酸シンターゼとの置換、または内因性同化シンターゼのサブユニットの過剰発現を含み得、当該サブユニットが分岐鎖アミノ酸によるフィードバック阻害に非感受性である。
【０１１５】
上記で既に述べた「アセト乳酸シンターゼ活性を増加させるように適合される遺伝的修飾」は、少なくとも、アセト乳酸シンターゼ発現、アセト乳酸塩生合成、アセト乳酸シンターゼ機能、及び／またはアセト乳酸シンターゼ活性のレベルを増加させるあらゆる遺伝的修飾を含むように広く解釈されるべきである。この語句は、例えば、１つ以上のアセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子の修飾、アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子の発現に関与する遺伝的調節要素への修飾、アセト乳酸シンターゼをコードする核酸の導入、アセト乳酸シンターゼ発現、アセト乳酸塩生合成、アセト乳酸シンターゼ機能、及び／またはアセト乳酸シンターゼ活性のレベルを増加させるタンパク質を生成する（またはその発現、活性のレベル、もしくは機能を増加させる）核酸の導入を含むように解釈されるべきである。当業者であれば、アセト乳酸シンターゼ活性の増加を達成させ得る他の遺伝的修飾を容易に理解するであろう。
【０１１６】
本明細書と同時に提出され、２０１４年９月１８日に作成されたＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル名「ＬＴ９７＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」のように同定される、コンピュータ可読ヌクレオチド／アミノ酸配列の一覧は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１７】
修飾され得る微生物としては、クロストリジウム種、Ｃ．オートエタノゲナム、Ｃ．リュングダリイ、及びＣ．ラグスダレイ等の酢酸生成カルボキシド栄養性細菌が挙げられるが、これらに限定されない。使用され得る他のカルボキシド栄養性微生物としては、クロストリジウム・カルボキシドビランス（ｃａｒｂｏｘｉｄｏｖｉｒａｎｓ）、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・スカトロゲネス、クロストリジウム・アセチカム、クロストリジウム・フォルミコアセチカム、クロストリジウム・マグナム、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム、アセトバクテリウム・ウッディ、アルカリバクルム・バッキ、ブラウティア・プロダクタ、ユーバクテリウム・リモサム、ムーレラ・サーモアセチカ、ムーレラ・サーマウトトロフィカ（ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、スポロムサ・オヴァタ、スポロムサ・シルバセチカ、スポロムサ・スファエロイデス、オキソバクター・フェニジイ、及びサーモアナエロバクター・キウヴィが挙げられる。１つの特定の実施形態において、微生物は、大腸菌、サッカロマイセス・セレビシエ、クロストリジウム・アセトブチリカム、Ｃ．ベイジェリンキ、Ｃ．サッカロブチリカム（ｓａｃｃｈａｒｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、Ｃ．サッカロペルブチルアセトニカム、Ｃ．ブチリカム、Ｃ．ジオリス、Ｃ．クルイベリ、Ｃ．パステリアニウム、Ｃ．ノビ、Ｃ．ディフィシル、Ｃ．サーモセラム、Ｃ．セルロリチカム、Ｃ．セルロボランス、Ｃ．フィトフェルメンタンス、ラクトコッカス・ラクティス、枯草菌、バチルス・リケニフォルミス、ザイモモナス・モビリス、クレブシエラ・オキシトカ、肺炎桿菌、コリネバクテリウム・グルタミカム、トリコデルマ・リーゼイ、ラルストニア・ユートロファ、シュードモナス・プチダ、ラクトバチルス・プランタルムからなる群から選択される。本発明に従い修飾され得る他の細菌としては、エシェリヒア属、サッカロマイセス属、クロストリジウム属、バチルス属、ラクトコッカス属、ザイモモナス属、コリネバクテリウム属、ピチア属、カンジダ属、ハンゼヌラ属、トリコデルマ属、アセトバクテリウム属、ラルストニア属、サルモネラ属、クレブシエラ属、パエニバチルス、シュードモナス属、ラクトバチルス属、ロドコッカス属、エンテロコッカス属、アルカリゲネス属、及びブレビバクテリウム属からのものが挙げられる。
【０１１８】
本明細書に記載される現時点で好ましい実施形態に対する様々な変更及び修正は、当業者にとっては明らかであることに留意すべきである。そのような変更及び修正は、本発明の趣旨及び範囲を逸脱せず、またそれに伴う利点を減少させることなく行われ得る。したがって、そのような変更及び修正は、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【０１１９】
発酵
ガス状基質（上記の背景技術の項で記載されたもの等）からエタノール及び他のアルコールの生成のためのプロセスは既知である。例示的プロセスとしては、例えば、国際公開第ＷＯ２００７／１１７１５７号及び同第ＷＯ２００８／１１５０８０号、ならびに米国特許第６，３４０，５８１号、同第６，１３６，５７７号、同第５，５９３，８８６号、同第５，８０７，７２２号、及び同第５，８２１，１１１号に記載されるものが挙げられ、これらの各々が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２０】
いくつかの嫌気性細菌は、ｎ−ブタノール及びエタノールを含むアルコール、及び酢酸へのガス状基質の発酵を実施することができることが既知であり、本発明のプロセスでの使用に好適である。本発明での使用に好適なこのような細菌の例としては、国際公開第００／６８４０７号、欧州特許第１１７３０９号、米国特許第５，１７３，４２９号、同第５，５９３，８８６号、及び同第６，３６８，８１９号、国際公開第９８／００５５８号及び同第０２／０８４３８号に記載されるものを含むクロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・カルボキシジボランス（Ｌｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３３：ｐｐ２０８５−２０９１）、ならびにクロストリジウム・オートエタノゲナム（Ａｂｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １６１：ｐｐ３４５−３５１）の株等のクロストリジウム属のものが挙げられる。他の好適な細菌としては、ムーレラ種ＨＵＣ２２−１（Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２９：ｐｐ１６０７−１６１２）を含むムーレラ属の細菌、及びカルボキシドサーマス（Ｓｖｅｔｌｉｃｈｎｙ，Ｖ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１），Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４：２５４−２６０）属の細菌が挙げられる。これらの公表文献の各々の開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。加えて、他のカルボキシド栄養性嫌気性細菌は、当業者によって本発明のプロセスで使用され得る。また、本開示を考慮すると、２つ以上の細菌の混合培養物が本発明のプロセスで使用され得ることも理解されるであろう。
【０１２１】
本発明の方法で使用される細菌の培養は、嫌気性細菌を用いて基質を培養及び発酵するために当該技術分野において既知であるあらゆるプロセスを用いて行われ得る。例示的な技術は、以下の「実施例」の項で提供される。さらなる例として、発酵のためのガス状基質を用いて以下の物品に一般に記載されるこれらのプロセスには、下記の文献が利用され得る。（ｉ）Ｋ．Ｔ．Ｋｌａｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）．Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇａｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ．Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ，５；１４５−１６５；（ｉｉ）Ｋ．Ｔ．Ｋｌａｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）．Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇａｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ．Ｆｕｅｌ．７０．６０５−６１４；（ｉｉｉ）Ｋ．Ｔ．Ｋｌａｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇａｓ  ｉｎｔｏ  ｌｉｑｕｉｄ  ｏｒ  ｇａｓｅｏｕｓ  ｆｕｅｌｓ．Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１４；６０２−６０８；（ｉｖ）Ｊ．Ｌ．Ｖｅｇａ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｇａｓｅｏｕｓ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ：Ｃａｒｂｏｎ  Ｍｏｎｏｘｉｄｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｔｏ  Ａｃｅｔａｔｅ．２．Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．３４．６．７８５−７９３；（ｖｉ）Ｊ．Ｌ．Ｖｅｇａ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｇａｓｅｏｕｓ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ：Ｃａｒｂｏｎ  ｍｏｎｏｘｉｄｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｔｏ  ａｃｅｔａｔｅ．１．Ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．３４．６．７７４−７８４；（ｖｉｉ）Ｊ．Ｌ．Ｖｅｇａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）．Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｃｏａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｇａｓ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ．Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ．３．１４９−１６０、これらのすべては、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２２】
一実施形態において、微生物または親微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイ、クロストリジウム・カルボキシジボランス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・スカトロゲネス、クロストリジウム・アセチカム、クロストリジウム・フォルミコアセチカム、クロストリジウム・マグナムを含むカルボキシド栄養性クロストリジウムの群から選択される。さらなる実施形態において、微生物は、Ｃ．オートエタノゲナム種、Ｃ．リュングダリイ種、及びＣ．ラグスダレイ種、ならびに関連の分離株を含むカルボキシド栄養性クロストリジウムのクラスタからのものである。これらとしては、Ｃ．オートエタノゲナムＪＡＩ‐１Ｔ（ＤＳＭ１００６１）（Ａｂｒｉｎｉ，Ｎａｖｅａｕ，＆  Ｎｙｎｓ，１９９４）の株、Ｃ．オートエタノゲナムＬＢＳ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）（国際公開第／２００９／０６４２００号）の株、Ｃ．オートエタノゲナムＬＢＳ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）の株、Ｃ．リュングダリイＰＥＴＣＴ（ＤＳＭ１３５２８＝ＡＴＣＣ  ５５３８３）（Ｔａｎｎｅｒ，Ｍｉｌｌｅｒ，＆  Ｙａｎｇ，１９９３）の株、Ｃ．リュングダリイＥＲＩ‐２（ＡＴＣＣ  ５５３８０）（米国特許第５，５９３，８８６号）の株、Ｃ．リュングダリイＣ‐０１（ＡＴＣＣ  ５５９８８）（米国特許第６，３６８，８１９号）の株、Ｃ．リュングダリイＯ‐５２（ＡＴＣＣ  ５５９８９）（米国特許第６，３６８，８１９号）の株、Ｃ．ラグスダレイＰ１１Ｔ（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ‐６２２）（国際公開第２００８／０２８０５５号）の株、「Ｃ．コスカチイ（ｃｏｓｋａｔｉｉ）」（米国第２０１１０２２９９４７号）及び「クロストリジウム種」（Ｔｙｕｒｉｎ  ＆  Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ，２０１２）等の関連の分離株、またはＣ．リュングダリイＯＴＡ‐１（Ｔｉｒａｄｏ‐Ａｃｅｖｅｄｏ  Ｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ  ｆｒｏｍ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｇａｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ．ＰｈＤ  ｔｈｅｓｉｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１０）等の変異株が挙げられるが、これらに限定されない。これらの株は、クロストリジウムｒＲＮＡクラスタＩ内にサブクラスタを形成し、それらの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、約３０％の同様の低いＧＣ含有量と９９％超同一である。しかしながら、ＤＮＡ‐ＤＮＡ再結合及びＤＮＡ指紋法の実験は、これらの株が別種に属することを示した（国際公開第２００８／０２８０５５号）。
【０１２３】
上記のクラスタのすべての種は、類似の形態及び大きさを有し（対数増殖細胞が０．５〜０．７×３〜５μｍであり）、中温性であり（３０〜３７℃の最適増殖温度）、厳格な嫌気性生物である（Ａｂｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４、Ｔａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）（国際公開第２００８／０２８０５５号）。さらに、それらはすべて、同じｐＨ範囲（５．５〜６の最適な初期ｐＨを有するｐＨ４〜７．５）、類似の増殖率を有するガスを含有するＣＯによる力強い独立栄養増殖、ならびに主発酵の最終生成物としてエタノール及び酢酸、及びある特定の条件下で形成された少量の２，３−ブタンジオール及び乳酸を有する類似の代謝プロファイル等の同じ主要な系統発生特性を共有する（Ａｂｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４、Ｋoｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｔａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）（国際公開第２００８／０２８０５５号）。インドール生成は、すべて３つの種を同様に用いて観察された。しかしながら、これらの種は、様々な糖類（例えば、ラムノース、アラビノース）、酸（例えば、グルコン酸、クエン酸）、アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン）、または他の基質（例えば、ベタイン、ブタノール）の基質利用において区別している。さらに、これらの種のうちのいくつかは、ある特定のビタミン（例えば、チアミン、ビオチン）への栄養要求性株であることを見出したが、他の種を見出さなかった。ガス摂取に関与するウッド−リュングダール経路遺伝子の組織及び数は、核配列及びアミノ酸配列の違いにかかわらず、すべての種で同じであると見出した（Ｋoｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。カルボン酸を対応するアルコールに還元することも、これらの微生物の範囲に示された（Ｐｅｒｅｚ，Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｌｏｆｔｕｓ，＆  Ａｎｇｅｎｅｎｔ，２０１２）。したがって、これらの特性は、Ｃ．オートエタノゲナムまたはＣ．リュングダリイのような１つの微生物に特異ではなく、むしろカルボキシド栄養性エタノール合成クロストリジウムの一般的な特性であり、機序がこれらの株にわたって同様に作用することが予期され得るが、能力の差があり得る（Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０１２４】
本発明での使用に好適なある例示的な微生物が、クロストリジウム・オートエタノゲナムである。一実施形態において、クロストリジウム・オートエタノゲナムは、Ｇｅｒｍａｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌ（ＤＳＭＺ）に識別寄託番号１９６３０で寄託された株の識別特徴を有するクロストリジウム・オートエタノゲナムである。別の実施形態において、クロストリジウム・オートエタノゲナムは、ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ１００６１の識別特徴を有するクロストリジウム・オートエタノゲナムである。
【０１２５】
発酵は、任意の好適なバイオリアクタで実施され得る。本発明のいくつかの実施形態において、バイオリアクタは、微生物が培養される第１の増殖リアクタと、増殖リアクタからの発酵ブロスが提供され、かつ発酵生成物（例えば、エタノール及び酢酸塩）の大部分が生成される第２の発酵リアクタとを備える。
【０１２６】
ガス状基質
ＣＯを含有する基質
【０１２７】
一酸化炭素を含む基質、好ましくは、一酸化炭素を含むガス状基質は、本発明の方法において、発酵反応に使用されて、エタノールを生成する。ガス状基質は、産業プロセスの副生成物として得られる廃ガスでも、燃焼機関（例えば自動車）の排ガスのような他の何らかの提供源から得られる廃ガスでもよい。ある特定の実施形態において、産業プロセスは、製鋼所等の鉄金属製品製造、非鉄製品製造、石油精製プロセス、石炭のガス化、発電、カーボンブラック製造、アンモニア製造、メタノール製造及びコークス製造からなる群から選択される。これらの実施形態において、ＣＯ含有ガスは、それが大気中に放出される前に任意の好都合な方法を用いて産業プロセスから捕捉され得る。
【０１２８】
一酸化炭素を含むガス状基質の組成に依存して、それを発酵に導入する前に処理して任意の望ましくない不純物、例えばダスト粒子を除去することも望ましくなり得る。例えば、ガス状基質は、既知の方法を使用して濾過または洗浄され得る。
【０１２９】
本発明の他の実施形態において、一酸化炭素を含むガス状基質は、バイオマスのガス化から提供され得る。ガス化のプロセスは、限られた空気または酸素の提供下でバイオマスを部分燃焼することを含む。得られるガスは典型的には、主にＣＯ及びＨ２と、少量のＣＯ２、メタン、エチレン及びエタンを含む。例えば、サトウキビから砂糖、またはトウモロコシや穀物からデンプンといった食料の抽出及び加工中に得られるバイオマス副生成物、または林業によって生じる非食料バイオマス廃棄物をガス化して、本発明で使用するのに好適なＣＯ含有ガスを生成することができる。
【０１３０】
ＣＯ含有基質は典型的には、主要割合のＣＯ、例えば、少なくとも１５体積％〜１００体積％のＣＯ、４０体積％〜９５体積％のＣＯ、４０体積％〜６０体積％のＣＯ、及び４５体積％〜５５体積％のＣＯを含有する。特定の実施形態において、基質は、２５体積％、または３０体積％、または３５体積％、または４０体積％、または４５体積％、または５０体積％のＣＯ、または５５体積％のＣＯ、または６０体積％のＣＯを含む。特に、Ｈ２及びＣＯ２もまた存在する場合、６％等の低濃度のＣＯを有する基質もまた、適切となり得る。
【０１３１】
ガス状基質はまた、例えば、１体積％〜８０体積％、または１体積％〜３０体積％のいくらかのＣＯ２も含有し得る。一実施形態において、それは、５体積％〜１０体積％を含有する。別の実施形態において、ガス状基質は、約２０体積％のＣＯ２を含有する。
【０１３２】
典型的には、一酸化炭素は、発酵反応にガス状態で添加される。しかしながら、本発明は、この状態での基質の添加に限定されると見なされるべきではない。例えば、一酸化炭素は、液体で提供され得る。例えば、液体を一酸化炭素含有ガスで飽和し、次いで、その液体をバイオリアクタに添加してもよい。これは、標準的な方法を用いて達成され得る。例として、微生物分散物生成器（Ｈｅｎｓｉｒｉｓａｋ  ｅｔ．ａｌ．Ｓｃａｌｅ−ｕｐ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  ｆｏｒ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  １０１，Ｎｕｍｂｅｒ  ３／Ｏｃｔｏｂｅｒ，２００２）が、使用され得る。
【０１３３】
本発明の一実施形態において、２つ以上の異なる基質の組み合わせが、発酵反応において使用され得る。
【０１３４】
加えて、多くの場合、基質流のＣＯ濃度（またはガス状基質におけるＣＯの分圧）を増加させ、ひいては、ＣＯが基質である発酵反応の効率を増加させることが望ましい。ガス状基質におけるＣＯの分圧を増加させることは、発酵培地へのＣＯの質量移動を増加させる。発酵反応を与えるために使用されるガス流の組成は、その反応の効率及び／または費用に対する大きな影響を有し得る。例えば、Ｏ２は、嫌気性発酵プロセスの効率を低減し得る。発酵前または後の発酵プロセスの段階における望ましくないまたは不必要なガスの処理は、そのような段階における負担を増加させ得る（例えば、ガス流がバイオリアクタに入る前にガス流を圧縮させる場合、不必要なエネルギーを使用して、発酵において必要とされないガスを圧縮させてもよい）。したがって、基質流、特に、産業源に由来する基質流を処理し、望ましくない成分を除去し、望ましい成分の濃度を増加することが望ましい場合がある。
【０１３５】
Ｈ２及びＣＯ２を含有する基質
二酸化炭素及び水素を含む基質は、発酵反応において使用し、本発明のある特定の実施形態に従って、酢酸塩を生成する。ガス状基質は、ＣＯを含有する基質に関して、上記に論じられるように、産業プロセスの副生成物として得られる廃ガスでもよい。当業者であれば、ＣＯ２を生成するプロセスが論じられたものに限定されないことが理解されよう。ＣＯ２及びＨ２は、任意の好適な源に由来され得る。ＣＯ２及びＨ２は、同じ源に由来され得るか、またはあるいは、ＣＯ２及びＨ２は、異なる源に由来され、次いで、混ぜ合わせて、ＣＯ２及びＨ２を含む基質を生成し得る。
【０１３６】
ＣＯ２及びＨ２を含む基質は、少なくとも５体積％のＣＯ２、少なくとも１０体積％のＣＯ２、少なくとも１５体積％のＣＯ２、少なくとも２０体積％のＣＯ２、少なくとも３０体積％のＣＯ２、または少なくとも４０体積％のＣＯ２を含み得る。少なくとも７０体積％等のより高い濃度のＣＯ２を有する基質もまた、適切であり得る。
【０１３７】
ＣＯ２及びＨ２を含む基質は、少なくとも３０体積％のＨ２、少なくとも４０体積％のＨ２、少なくとも５０体積％のＨ２、少なくとも６０体積％のＨ２、少なくとも７０体積％のＨ２、または少なくとも８０体積％のＨ２を含み得る。約５体積％のＨ２、または約１０体積％のＨ２、または約１５体積％のＨ２、または約２０体積％のＨ２のようなより低い濃度のＨ２を有する基質もまた、適切であり得る。
【０１３８】
発酵のための源としての産業廃ガス
本発明の他の態様によれば、産業廃ガスが発酵反応に使用され、その際、それに好適なガスを作製するために使用される追加のスクラビングまたは前処理ステップがないかまたはごく最小限である。
【０１３９】
廃ガスは、多数の産業プロセスによって生じ得る。本発明は、高容量のＣＯ２／Ｈ２を含有する産業煙道ガス等のガス状基質からのエタノール生成を支持することに特に適用可能性を有する。例としては、鉄金属製品製造、非鉄製品製造、精製プロセス、石油精製プロセス、石炭のガス化、バイオマスのガス化、発電、カーボンブラック生成、アンモニア生成、メタノール生成、及びコークス製造中に生成されるガスが挙げられる。ある特定の実施形態において、ＣＯ２／Ｈ２を含有する基質は、バイオマスまたは都市固形廃棄物のガス化に由来する。本発明の特定の実施形態において、廃ガスは、製鋼プロセス中に発生する。例えば、当業者であれば、製鋼プロセスの様々な段階で生成される廃ガスは、高いＣＯ２及びＨ２濃度を有することを理解するであろう。
【０１４０】
鋼の炭化中に生成される廃ガスは、任意に、水に通して粒状物質を除去した後、廃棄物集積所または廃ガスを大気中に排出するための煙道に送られる。典型的に、このガスは、１つ以上のファンを用いて廃棄物集積所に送り込まれる。
【０１４１】
本発明の特定の実施形態において、鋼の脱炭中に生成される廃ガスの少なくとも一部は、好適な導管手段によって発酵システムに転用される。例として、パイプまたは他の移送手段を製鋼所の廃ガス集積所に接続して、廃ガスの少なくとも一部を発酵システムに振り向けることができる。さらに、廃ガスの少なくとも一部を発酵システムに転用するために１つ以上のファンを使用することができる。本発明の特定の実施形態において、導管手段は、鋼の脱炭中に生成される廃ガスの少なくとも一部を発酵システムに提供するように適合される。バイオリアクタにガスを供給するための制御及び手段は、本発明に関連する分野の当業者に容易に明らかであろう。
【０１４２】
製鋼所は、鋼及びその後の廃ガスを実質的に連続的に生成するように適合させることができるが、このプロセスの特定の態様は間欠的な場合がある。典型的には、鋼の脱炭は、数分から数時間続くバッチプロセスである。したがって、導管手段は、鋼の脱炭中に生成されるガス等の廃ガスの少なくとも一部を、その廃ガスが所望の組成を有していると判定される場合に発酵システムに振り向けるように適合させることができる。
【０１４３】
発酵プロセスに使用されるバイオリアクタの内容物のｐＨは、必要に応じて調整され得る。適切なｐＨは、本発明に関連する技術分野の当業者に理解されるように、使用される栄養培地及び微生物を考慮して、特定の発酵反応に必要とされる条件に応じて異なるであろう。１つの好ましい実施形態において、クロストリジウム・オートエタノゲナムを利用するＣＯ２を含有するガス状基質の発酵では、ｐＨは、約４．５〜６．５に調整され得る。さらなる例としては、ムーレラ・サーモアセチカを用いる酢酸生成の場合のｐＨ５．５〜６．５、クロストリジウム・アセトブチリカムを用いるブタノール生成の場合のｐＨ４．５〜６．５、及びカルボキシドサーマス・ハイグロゲナフォルマンスを用いる水素生成の場合のｐＨ７が挙げられる。当業者であれば、バイオリアクタを所要ｐＨに維持するための好適な手段は周知であろう。しかしながら、例として、ＮａＯＨ等の塩基水溶液及びＨ２ＳＯ４等の酸水溶液が発酵培地のｐＨの上げ下げ及び所望ｐＨの維持に使用することができる。
【０１４４】
本発明のさらなる利点は、廃ガスを発酵反応に利用する前にそのガスに対して実施されるスクラビング及び／または他の処理プロセスがないかまたはごく最小限であるため、そのガスが産業プロセスに由来する追加の材料を含有し、その追加の材料が少なくとも一部、発酵反応のための供給原料として使用され得るという点である。
【０１４５】
天然ガス由来の合成ガスもまた、発酵プロセスに使用してもよい。天然ガス流を改質して、合成ガスを生成するための多くの既知の方法がある。合成ガスの最終用途は、最適な合成ガス特性を決定することができる。改質方法の種類、及び使用された動作条件は、合成ガスの濃度を決定する。したがって、合成ガスの組成は、触媒の選択、改質装置を動作させる温度及び圧力、ならびに天然ガス対ＣＯ２、Ｈ２Ｏ、及び／もしくはＯ２、またはＣＯ２、Ｈ２Ｏ、及びＯ２の任意の組み合わせに応じて異なる。当業者であれば、多くの改質技術を用いて、所望の組成物を用いて合成ガスを得ることができることを理解されよう。
【０１４６】
流のブレンド
発酵反応．発酵反応の効率、アルコール生成、及び／または全体的な炭素捕捉を改善するために、ＣＯ及びＨ２を含む改質された基質流を１つ以上のさらなる流とブレンドすることが望ましい場合がある。理論に拘束されることを望むものではないが、本発明のいくつかの実施形態において、カルボキシド栄養性細菌は、下記に従ってＣＯをエタノールに変換する。
６ＣＯ＋３Ｈ２Ｏ→Ｃ２Ｈ５ＯＨ＋４ＣＯ２
しかしながら、Ｈ２の存在下では、全体的な変換は次の通りであり得る。
６ＣＯ＋１２Ｈ２→３Ｃ２Ｈ５ＯＨ＋３Ｈ２Ｏ
【０１４７】
したがって、高いＣＯ含有量を有する流を、ＣＯ及びＨ２を含む改質された基質流とブレンドして、ＣＯ：Ｈ２の比率を増加させ、発酵効率を最適化することができる。例として、製鋼所からの排ガス等の産業廃棄流は、高いＣＯ含有量を有するが、最小量のＨ２を含むか、またはＨ２を含まない。したがって、ＣＯ及びＨ２を含む１つ以上の流を、ＣＯを含む廃水流とブレンドした後、ブレンドされた基質流を発酵槽に提供することが望ましい場合がある。発酵の全体的な効率、アルコール生産性、及び／または全体的な炭素捕捉は、ブレンドされた流中のＣＯ及びＨ２の化学量論に依存する。しかしながら、特定の実施形態において、ブレンドされた流は、実質的に２０：１、１０：１、５：１、３：１、２：１、１：１、または１：２のモル比でＣＯ及びＨ２を含み得る。
【０１４８】
加えて、発酵の異なる段階で特定の比率のＣＯ及びＨ２を提供することが望ましい場合がある。例えば、比較的高いＨ２含有量（例えば、１：２のＣＯ：Ｈ２）を有する基質流は、開始時の発酵段階及び／または急速微生物増殖期に提供されてもよい。しかしながら、増殖期が緩徐化し、それにより培養物が実質的に安定した微生物密度で維持されるようになると、ＣＯ含有量は増加し得る（少なくとも１：１または２：１以上等、その場合Ｈ２濃度は０以上であり得る）。
【０１４９】
流のブレンドはまた、特にＣＯを含む廃水流が間欠的な性質である場合、さらなる利点を有し得る。例えば、ＣＯを含む間欠廃水流は、ＣＯ及び任意にＨ２を含む実質的に連続した改質された基質流とブレンドされ、発酵槽に提供され得る。本発明の特定の実施形態において、実質的に連続した改質された基質流の組成及び流速は、実質的に連続した組成及び流速の基質流を発酵槽に提供することを維持するために、間欠流に従って変えることができる。
【０１５０】
培地
１つ以上の微生物及び基質の増殖からエタノール及び／または酢酸塩への発酵を生じさせるために、基質に加えて、好適な栄養培地は、バイオリアクタに供給される必要があることが理解されるであろう。栄養培地は、使用される微生物を増殖させるのに十分なビタミン及びミネラル等の成分を含有する。ほんの一例として、クロストリジウム・オートエタノゲナムの増殖に適している嫌気性培地は、例えば、Ａｂｒｉｎｉら（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ，ｓｐ．Ｎｏｖ．，Ａｎ  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｔｈａｔ  Ｐｒｏｄｕｃｅｓ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｆｒｏｍ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｍｏｎｏｘｉｄｅ；Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６１：３４５−３５１（１９９４））によって記載されるように、当該技術分野で既知である。以下の本明細書の「実施例」の項は、好適な培地のさらなる例を提供する。
【０１５１】
バイオリアクタ
発酵は、例えば、固定化細胞反応器、ガスリフト反応器、バブルカラム反応器（ＢＣＲ）、膜反応器、例えば、中空繊維膜バイオリアクタ（ＨＦＭ  ＢＲ）、またはトリクルベッド反応器（ＴＢＲ）等の、任意の好適なバイオリアクタ内で行うことができる。また、本発明のいくつかの実施形態において、バイオリアクタは、微生物が培養される第１の増殖リアクタと、増殖リアクタからの発酵ブロスが供給され、かつ発酵生成物（例えば、エタノール及び酢酸塩）の大部分が生成され得る第２の発酵リアクタとを備え得る。本発明のバイオリアクタは、ＣＯ２、Ｈ２、及び任意に、ＣＯを含有する基質を受容するように適合される。
【０１５２】
発酵
ガス状基質からエタノール及び他のアルコールの生成のためのプロセスは既知である。例示的なプロセスとしては、例えば、国際公開第２００７／１１７１５７号、同第２００８／１１５０８０号、同第２００９／０２２９２５号、同第２００９／０６４２００号、米国第６，３４０，５８１号、同第６，１３６，５７７号、同第５，５９３，８８６号、同第５，８０７，７２２号、及び同第５，８２１，１１１号に記載されるものが挙げられ、これらの各々が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５３】
発酵条件
発酵は、望ましくは、基質からエタノール及び／または酢酸塩への発酵を生じさせるために、適切な条件下で行われるべきである。考慮されるべき反応条件としては、温度、培地流量、ｐＨ、培地の酸化還元電位、撹拌速度（連続撹拌槽リアクタを使用する場合）、植菌レベル、基質レベルが制限的にならないことを確保するバイオリアクタへの基質の導入の最大基質濃度及び速度、ならびに生成物抑制を回避するための最大生成物濃度が挙げられる。
【０１５４】
最適な反応条件は部分的に、使用される特定の微生物によって異なる。しかしながら、一般に、発酵は、周囲圧力より高い圧力で行われることが好ましい。高められた圧力での操作により、気相から液相へのＣＯ移動速度の著しい増加が可能になり、その液相でＣＯは、微生物によってエタノール生成のための炭素源として取り込まれる。これは、ひいては、バイオリアクタが大気圧より高い圧力で維持される場合、滞留時間（バイオリアクタ中の液体体積÷流入ガス流量として定義される）を削減することができることを意味する。
【０１５５】
また、所定のＣＯから生成物への変換速度は一部、基質の滞留時間の関数であり、所望の滞留時間を達成することは、ひいては、バイオリアクタの必要容量を決定し、加圧システムの使用は、必要なバイオリアクタの容量、その結果として、発酵装置の資本コストを大きく削減することができる。米国特許第５，５９３，８８６号に付与された実施例によれば、リアクタの容量は、リアクタの動作圧力の増加に線形比例して減少され得、すなわち、１０気圧の圧力で操作されるバイオリアクタには、１気圧の圧力で操作されるリアクタの容量の１０分の１のみが必要である。
【０１５６】
ガスから生成物への発酵を高圧で行うことの利点はまた、他の箇所でも記載されている。例えば、国際公開第０２／０８４３８号は、３０ｐｓｉｇ及び７５ｐｓｉｇの圧力下で行われたガスからエタノールへの発酵で、それぞれ１５０ｇ／ｌ／日及び３６９ｇ／ｌ／日のエタノール生産性が得られたことが記載されている。しかしながら、類似の培地及び流入ガス組成を用いて大気圧で行われた例となる発酵では、１日あたり１リットルにつき１０〜２０分の１のエタノールを生成することが見出された。
【０１５７】
ＣＯを含む基質の嫌気性発酵に適している発酵条件の例は、国際公開第２００７／１１７１５７号、同第２００８／１１５０８０号、同第ＷＯ２００９／０２２９２５号、及び同第ＷＯ２００９／０６４２００号に詳細されている。それらの中に報告されている発酵条件は、本発明の方法に従って容易に修飾され得ることが理解される。
【０１５８】
発酵生成物
本発明の方法は、様々な炭化水素生成物のうちのいずれかを生成するために使用することができる。これは、アルコール、酸、及び／またはジオールを含む。より具体的には、本発明は、ブチレート、プロピオネート、カプロン酸塩、エタノール、プロパノール、ブタノール、２，３−ブタンジオール、プロピレン、ブタジエン、イソブチレン、及びエチレンを生成するための発酵に適用可能であり得る。一実施形態において、本発明は、プロパノール及びブタノールが挙げられるが、これらに限定されない、アルコールを生成するために使用することができる。次いで、アルコール（複数可）を酢酸塩と反応させて、酢酸プロピルまたは酢酸ブチルを含む生成物（複数可）を生成することができる。当業者であれば、本発明が言及されるアルコール及び生成物に限定されず、任意の適切なアルコール及びまたは酸が生成物を生成するために使用することができることを理解されよう。
【０１５９】
これらの及び他の生成物は、プラスチック、製剤、及び農薬等の他のプロセスの宿主に対して価値があり得る。一実施形態において、発酵生成物は、ガソリンの範囲の炭化水素（８炭素）、ディーゼルの炭化水素（１２炭素）、またはジェット燃料の炭化水素（１２炭素）を生成するために使用される。
【０１６０】
本発明の方法はまた、イソプロパノールを含むが、これに限定されない、他の生成物の、好気性発酵、嫌気性または好気性発酵に適用することもできる。本発明の方法はまた、イソプロパノールを含むが、これに限定されない、他の生成物の、好気性発酵、及び嫌気性または好気性発酵に適用することもできる。
【０１６１】
本発明はまた、発酵によって生成された炭化水素生成物の少なくとも一部が、流を改質するプロセスに再使用されることも提供する。ＣＨ４以外の炭化水素が触媒を越える流と反応させて、Ｈ２及びＣＯを生成することができるため、これを行われ得る。特定の実施形態において、エタノールは、流改質プロセスのための原材料として使用するために再利用される。さらなる実施形態において、炭化水素原材料及び／または生成物は、プレ改質装置を通過させた後に、流改質プロセスに使用される。プレ改質装置の通過は、水素生成の効率を増加させ、流改質炉の必要とされる容量を削減することができる流改質プロセスの流改質ステップを部分的に完了する。
【０１６２】
本発明の方法はまた、イソプロパノールを含むが、これに限定されない、他の生成物の、好気性発酵、及び嫌気性または好気性発酵に適用することもできる。
【０１６３】
より具体的には、本発明は、エタノール及び／または酢酸塩への発酵に適用可能であり得る。次いで、これらの生成物は、一緒に反応させて、エステルを含む化学的生成物を生成することができる。本発明の一実施形態において、発酵により生成されたエタノール及び酢酸塩は、一緒に反応させて、酢酸エチルを生成する。酢酸エチルは、表面コーティング及びシンナーを含む溶媒の生成等の他のプロセスの宿主に対して、ならびに製剤、香味剤、及び香料の製造において価値があり得る。
【０１６４】
生成物回収
発酵反応の生成物は、既知の方法を用いて回収され得る。例示的な方法としては、国際公開第０７／１１７１５７号、国際公開第０８／１１５０８０号、米国第６，３４０，５８１号、米国第６，１３６，５７７号、米国第５，５９３，８８６号、米国第５，８０７，７２２号、及び米国第５，８２１，１１１号に記載のものが挙げられる。しかしながら、簡潔に、単なる例として、エタノールは、分別蒸留または蒸発、及び抽出発酵等の方法によって、発酵ブロスから回収され得る。
【０１６５】
発酵ブロスからのエタノール蒸留により、エタノールと水の共沸混合物（すなわち、エタノール９５％及び水５％）が得られる。無水エタノールは、その後、同じく当該技術分野において周知である分子篩エタノール脱水技術を用いて得られ得る。
【０１６６】
抽出発酵手順は、エタノールを希釈発酵ブロスから回収するための、発酵生物に対する低い毒性リスクを示す水混和性溶媒の使用を含む。例えば、オレイルアルコールは、このタイプの抽出プロセスにおいて使用され得る溶媒である。オレイルアルコールは、発酵槽内に連続的に導入され、その後、この溶媒は、発酵槽の上部での層の形成を増大させ、これは、連続的に抽出され、遠心分離を通して提供される。次いで、水及び細胞は、容易にオレイルアルコールから分離され、発酵槽に戻されるが、エタノールが投入された溶媒は、フラッシュ蒸発ユニット内に提供される。エタノールのほとんどは蒸発及び濃縮されるが、オレイルアルコールは不揮発性であり、発酵において再利用するために回収される。
【０１６７】
発酵反応において副生成物として生成され得る酢酸塩もまた、当該技術分野において既知の方法を使用して、発酵ブロスから回収され得る。
【０１６８】
例えば、活性炭フィルタを含む吸着システムが使用され得る。この場合、まず、好適な分離ユニットを使用して、微生物細胞が発酵ブロスから除去されることが好ましい。生成物回収のための細胞不含発酵ブロスを生成する多くの濾過ベースの方法が、当該技術分野において既知である。次いで、透過物を含有する細胞不含エタノール及び酢酸塩を、活性炭を含有するカラムに通して酢酸塩を吸着させる。塩（酢酸塩）形態よりも酸形態（酢酸）の酢酸塩は、活性炭によってより容易に吸着される。したがって、発酵ブロスを活性炭カラムに通す前に、発酵ブロスのｐＨを３未満に下げて、酢酸塩の大部分を酢酸形態に変換するのが好ましい。
【０１６９】
活性炭に吸着された酢酸は、当該技術分野において既知の方法を使用した溶出により回収され得る。例えば、エタノールを使用して、結合した酢酸塩を溶出してもよい。ある特定の実施形態において、発酵プロセスにより生成されたエタノール自体を使用して、酢酸塩を溶出してもよい。エタノールの沸点は７８．８℃であり、酢酸の沸点は１０７℃であるため、エタノール及び酢酸塩は、蒸留等の揮発性に基づく方法を使用して互いから容易に分離され得る。
【０１７０】
発酵ブロスから酢酸塩を回収するための他の方法もまた、当該技術分野において既知であり、使用され得る。例えば、米国特許第６，３６８，８１９号及び同第６，７５３，１７０号は、発酵ブロスから酢酸の抽出に使用され得る溶媒及び共溶媒システムを説明している。エタノールの抽出発酵に関して説明されたオレイルアルコールベースのシステムと同様に、米国特許第６，３６８，８１９号及び同第６，７５３，１７０号に記載されるシステムは、酢酸生成物を抽出するために、発酵された微生物の存在下または非存在下のいずれかで発酵ブロスと混合され得る水非混和性溶媒／共溶媒を説明している。次いで、酢酸生成物を含有する溶媒／共溶媒は、蒸留によりブロスから分離される。次いで、第２の蒸留ステップを使用して、溶媒／共溶媒系から酢酸を精製することができる。
【０１７１】
発酵反応の生成物（例えばエタノール及び酢酸塩）は、発酵バイオリアクタからブロスの一部を連続的に除去し、ブロスから（好都合には濾過により）微生物細胞を分離し、同時または逐次的にブロスから１つ以上の生成物を回収することにより、発酵ブロスから回収され得る。上述の方法を使用して、エタノールの場合、蒸留により好都合に回収され得、酢酸塩は、活性炭上への吸着により回収され得る。分離された微生物細胞は、好ましくは、発酵バイオリアクタに戻される。エタノール及び酢酸塩が除去された後に残る細胞不含透過物もまた、好ましくは、発酵バイオリアクタに戻される。細胞不含透過物がバイオリアクタに戻される前に、栄養培地を補充するために追加の栄養物（ビタミンＢ等）が細胞不含透過物に添加されてもよい。また、活性炭への酢酸の吸着を高めるためにブロスのｐＨが上述のように調整された場合、ｐＨは、バイオリアクタに戻される前に、発酵バイオリアクタ内のブロスのｐＨと同様のｐＨに再調整されるべきである。
【０１７２】
バイオリアクタから回収されたバイオマスは、バイオマス生成物、好ましくはメタンを生成するために、消化物において嫌気性消化を行い得る。このバイオマス生成物は、流改質プロセスのための原材料として使用されても、補助的加熱を生成して、本明細書に定義される反応のうちの１つ以上に送り込むために使用されてもよい。
【０１７３】
概要
本発明の実施形態は、例として記載されている。しかしながら、一実施形態で必要な特定のステップまたは段階が、別の実施形態において必要でない場合があることが理解されるべきである。反対に、特定の実施形態の説明に含まれるステップまたは段階は、具体的に記載されない実施形態において任意に有利に利用されてもよい。
【０１７４】
本発明は、任意の既知の移行手段によってシステム（複数可）を通ってまたはその周囲を移動し得るあらゆる種類の流を参照して広範に記載されるが、ある特定の実施形態において、基質及び／または排気流は、ガス状である。当業者であれば、特定の段階が好適な導管手段等によって連結されるか、または流をシステム全体にわたって受容するか、もしくは流すように構成可能であり得ることを理解するであろう。ポンプまたは圧縮装置は、特定の段階への流の送達を促進するために提供されてもよい。さらに、圧縮装置は、１つ以上の段階、例えばバイオリアクタに提供されるガスの圧力を上昇させるために使用され得る。上記に論じられるように、バイオリアクタ内のガスの圧力は、その中で行われる発酵反応の効率に影響を与え得る。したがって、圧力は、発酵の効率を改善するように調整され得る。一般的な反応に対する好適な圧力は、当該技術分野において既知である。
【０１７５】
加えて、本発明のシステムまたはプロセスは任意に、プロセスの全体効率を改善するために他のパラメータを調節及び／または制御するための手段を含み得る。１つ以上のプロセッサは、プロセスの特定のパラメータを調節及び／または制御するためにシステムに組み込まれ得る。例えば、特定の実施形態は、基質及び／または排気流（複数可）の組成を監視するための判定手段を含んでもよい。加えて、特定の実施形態は、基質流（複数可）が特定の段階に好適な組成を有すると判定手段が判定する場合、特定のシステム内の特定の段階または要素へのその流の送達を制御するための手段を含み得る。例えば、ガス状基質流が発酵反応に有害であり得る低レベルのＣＯ２もしくはＨ２または高レベルのＯ２を含む場合、基質流は、バイオリアクタから離れて迂回されてもよい。本発明の特定の実施形態において、システムは、基質流の行き先及び／または流量を監視及び制御するための手段を含み、それにより所望または好適な組成を有する流が特定の段階に送達され得るようにする。
【０１７６】
加えて、プロセスにおける１つ以上の段階の前またはその間に特定のシステム構成要素または基質流（複数可）を加熱または冷却することが必要であり得る。このような例では、既知の加熱または冷却手段が使用され得る。例えば、熱交換器は、基質流を加熱または冷却するために用いられてもよい。
【０１７７】
さらに、システムは、特定の段階の操作または効率を改善するために１つ以上の前／後処理ステップを含み得る。例えば、前処理ステップは、粒状物質及び／または長鎖炭化水素もしくはタールをガス状基質流から除去するための手段を含み得る。行われ得る他の前または後操作は、例えば、バイオリアクタ生産段階等の特定の段階からの所望の生成物（複数可）の分離（例えば、蒸留によるエタノールの除去）を含む。
【０１７８】
ここで、本発明を以下の実施例を参照して、単なる例として説明する。
実施例
材料及び方法
【表１】
0006554102.tif 000004
0006554102.tif 000005
【０１７９】
バイオリアクタ培地調製：
Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３を用いた発酵を１．５Ｌのバイオリアクタ中で、３７℃で行った。表１に従って、培地を調製した。嫌気性を得るために、反応容器に窒素を散布した。植菌前に、ガスを、Ｈ２（３％）、Ｎ２（３０％）、ＣＯ（４７％）、及びＣＯ２（２０％）を含有する製鋼所ガスまたは純ガス（５０％のＣＯ、１８〜４０％のＣＯ２、バランスＮ２を含む）のいずれかに交換した。ガス流を、初めに、６７ｍｌ／分／Ｌに設定し、中間対数期間中、２００ｍｌ／分まで増加させるが、撹拌は、２００ｒｐｍから８００に増加させた。Ｎａ２Ｓを、バイオリアクタ内に、０．２５ｍｌ／時で投与した。ＯＤ６００が１．５に達した時点で、バイオリアクタは、希釈率２．０〜１．６ｄ−１及び細菌の希釈率０．９〜０．６ｄ−１で、連続モードに切り替えられた。連続モード時、ガス及び撹拌は、９００〜９５０ｒｐｍ及び８００〜９００ｍｌ／分に調節された。Ｎａ２Ｓを、１．０ｍｌ／時に増加した。
【０１８０】
サンプリング及び分析手順：
液体培養サンプルを、発酵の持続時間を通して異なる間隔で採取した。これらのサンプルを使用して、６００ｎｍでの光学密度（分光光度計）、ならびに基質及び生成物のレベル（高性能液体クロマトグラフィー−ＨＰＬＣ）を構築した。ＨＰＬＣを、通常、使用して、酢酸塩、エタノール、及び２，３−ブタンジオールのレベルを定量化した。入力及び出力ガス組成を、ガスクロマトグラファー（ＧＣ）を用いて分析し、培養によるＣＯ及びＨ２の消費量及びＣＯ２生成量の測定を可能にした。
【０１８１】
実施例１：
２−ＨＩＢＡの影響は、２，３−ＢＤＯの生成において最適化された単一のリアクタシステム上で調査された。これは、この化学物質が高性能システム上に有するであろう影響を究明し、全体的な発酵の安定性を妨げないであろう好適な濃度に関する情報を得るために行われた。０．５ｇ／Ｌ（４．８ｍＭ）の２−ＨＩＢＡを、７．９５日目に発酵槽に添加し、この添加からの結果を図１に示す。２−ＨＩＢＡの添加により、発酵の代謝産物プロファイルが変化し、２，３−ブタンジオールの生成を増加させる一方、エタノール、酢酸塩、及びバイオマスの生成を減少させた。
【０１８２】
２，３−ＢＤＯの濃度は、６ｇ／Ｌから１２ｇ／Ｌに増加し、比率は４：１から１．４：１の低比率に下がった。エタノール及びバイオマスの濃度が添加の結果として減少したが、この添加により、ガス取り込みに対して有害な影響を及ぼさないことを示した。リアクタの液体流出について、２−ＨＩＢＡの濃度を監視した。この結果を図２に示す。曲線は、この初期流出が希釈率１．８日−１と同様の倍率で生じる一方、２−ＨＩＢＡの全体的な流出が細菌希釈率０．７日−１と一致したことを示す。これらの結果は、２−ＨＩＢＡがリアクタ内で変換されないことを示す。２−ＨＩＢＡは、細菌希釈率に従って、発酵槽から洗い出す。２−ＨＩＢＡが細菌によって消費されないことを示すため、このことは、重要である。
【０１８３】
実施例２：
２つのリアクタシステムを使用して、代謝産物プロファイルにおける連続的な２−ＨＩＢＡ添加の影響を試験した。初めに、０．５ｇ／Ｌ／日（４．８ｍＭ／日）の２−ＨＩＢＡをＲ２のみに添加し、これにより、２，３−ＢＤＯの生成は増加したが、比率のみが１．９：１の低比率に下がった。次いで、２−ＨＩＢＡの連続添加を、０．５ｇ／Ｌ／日（４．８ｍＭ／日）でＲ１に行った。２−ＨＩＢＡが細菌によって変換されないため、Ｒ１への添加は２，３−ＢＤＯの全体的な生成を著しく増加し得ると仮定した。これは、改善された２，３−ＢＤＯ濃度に伴って、２−ＨＩＢＡがＲ１からＲ２（液体の流れを通して）に移動されるため、Ｒ１及びＲ２の両方の濃度を改善させることによって達成され得る。この連続添加からの結果を図３〜６に示す。２，３−ＢＤＯ濃度は、Ｒ１では５．７ｇ／Ｌから１４ｇ／Ｌ、Ｒ２では１６ｇ／Ｌから２１ｇ／Ｌに増加した（図３及び４を参照のこと）。エタノール：２，３−ＢＤＯの比率は、Ｒ１では１：１、Ｒ２では１．３：１まで下がり、８日間安定した状態を保った。比率の改善は、２，３−ＢＤＯ濃度の増加及びエタノール生成の減少の結果として達成された。
【０１８４】
経時的に、２−ＨＩＢＡ添加後のエタノール濃度は改善されたが、一方、２，３−ＢＤＯの濃度は安定した状態を保ち、これにより、システムの全アルコール生産性を改善させる効果があった。ガスデータ（図５及び６）に示されるように、２−ＨＩＢＡの添加は、ＣＯ及び水素の取り込みに悪影響を受けなかった。すべてのパラメータを表１及び２に要約する。表２は、８日間の安定した操作にわたる連結した２つの発酵槽システムにおけるＲ１及びＲ２の代謝産物の平均を示す。表３は、８日間の安定した操作にわたる連結した２つの発酵槽システムにおけるＲ１及びＲ２のガスデータの平均を示す。発酵システムは、撹拌をもたらしたＲ１制御ユニットにおける機械の故障、温度及びｐＨ制御システムの故障、ならびに発酵の失敗により安定性を失った。
【表２】
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【表３】
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【０１８５】
実施例３：
実施例２において得られた結果は、２，３−ＢＤＯの全体的な力価を改善することを目的として繰り返された。この実験において、２−ＨＩＢＡの濃度を１ｇ／Ｌ／日（９．６ｍＭ／日）まで増加した。上記の実験において得られた結果と同様に、ガスの取り込みは、悪影響を受けず、Ｒ２におけるエタノール：２，３−ＢＤＯ比は、１．３：１で７日間安定した状態を保った。１ｇ／Ｌ／日（９．６ｍＭ／日）の添加は、全体的な２，３−ＢＤＯ濃度の改善をもたらし、これは、２３．９ｇ／Ｌまで達した（図７を参照のこと）。
【０１８６】
実施例４：
最低濃度の決定は、２，３−ブタンジオの生成に対する影響を認めないために必要であった。
【０１８７】
実施例１〜３において、０．５ｇ／Ｌ〜１ｇ／Ｌ（４．８〜９．６ｍＭ）の濃度を試験し、これにより、２，３−ブタンジオール及びエタノールの生成に対する著しい影響を受けることを示した。同じ効果を得るのに必要とされる最低濃度を理解するために、使用された濃度を、一例では、０．１ｇ／Ｌ（０．９６ｍＭ）まで、別例では、０．０５ｇ／Ｌ（０．４８ｍＭ）まで引き下げた。両方の発酵は、酢酸塩を最小限に抑え、エタノールの生成を最大限にするようにガスを増加させた。さらなるＣＯ２を、ガス流にブレンドさせ、２，３−ＢＤＯの生成を最大限にし、使用されたガスブレンドは、Ｎ２バランスを含む５０％のＣＯ、３５％のＣＯ２、１．５％のＨ２であった。希釈率及び細菌希釈率は、それぞれ、１．８日−１及び０．８日−１に調整した。安定したデータが回収された時点で、培地を通して連続的な２−ＨＩＢＡの添加を開始し、代謝産物濃度に対して得られた影響を観察した。各例における添加前及び後のデータの要約を表４に示す。両方の例では、２−ＨＩＢＡの添加前の比率は、２：１であり、エタノール：２，３−ＢＤＯ比に対して得られた影響は、使用された２−ＨＩＢＡの濃度に比例した。０．１ｇ／Ｌ（０．９６ｍＭ）が使用された第１の例では、比率が１：１まで改善し、濃度が半分になった場合には（第２の例では）、この反応は、わずか１．５：１の比率の改善であった。
【表４】
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【０１８８】
２つのさらなる実験において、０．０１ｇ／Ｌ〜０．１ｇ／Ｌ（０．０９６、０．２４、０．４８、０．７２、０．９６ｍＭ）の濃度を添加し、代謝産物に対する影響を観察した。さらに、発酵は、ガス流にブレンドされたＣＯ２を用いて酢酸塩を最小限に抑え、エタノールの生成を最大限にするようにガスを増加させ、２，３−ＢＤＯの生成を最大限にした。希釈率及び細菌希釈率は、それぞれ、１．８日−１及び０．９日−１に調整した。使用されたガスブレンドは、Ｎ２バランスを含む４２％のＣＯ、３５％のＣＯ２、１．５％のＨ２であった。４つの例すべてからのデータの照合は、安定した発酵に添加した０．０５ｇ／Ｌ（０．４８ｍＭ）ごとに、エタノール：２，３−ＢＤＯ比が０．５単位減少することを示す。これらの結果を図８に示す。これらの結果は、２−ＨｉＢＡの影響が出発エタノール：２，３−ブタンジオール比と無関係であることを示し、０．０１ｇ／Ｌ（０．０９６ｍＭ）ほど低い濃度が、２，３−ブタンジオールの生成に影響を与えることも示す。
【０１８９】
実施例５：
２−ＨＩＢＡが増殖に悪影響を与えるかどうかを確認するために、０．０５ｇ／Ｌ（０．４８ｍＭ）の２−ＨＩＢＡの存在下で、発酵を開始した。増殖時、５．０日目までに、撹拌が最大９５０ｒｐｍ及びガス流れ８００ｍｌ／分に達するように、ガス及び撹拌を増加した。この時点で、希釈率は、１．８日−１であり、細菌希釈率は、０．８５日−１であった。２−ＨＩＢＡの存在は、発酵の増殖に対しては影響がなかったが、どれだけ素早く低いエタノール：２，３−ブタンジオール比を達し得るかにおいて大きく影響を及ぼした。２．０日までに、エタノール：２，３−ＢＤＯ比が２：１に達し、次いで、継続して、ゆっくりと減少し、最終的には、１７ｇ／Ｌの平均エタノール濃度及び１５．５ｇ／Ｌの２，３−ブタンジオール濃度で、比率は、１．１：１に達した。この発酵に対する結果を図９及び図１０に示す。これらの結果は、増殖に悪影響を与えずに、発酵培地中の２−ＨＩＢＡを、１：１の範囲内でエタノール：２，３−ＢＤＯ比を得るのに十分な０．０５ｇ／Ｌ（０．４８ｍＭ）で添加することが可能であることを示す。
【０１９０】
実施例６：
２−ＨＩＢＡ遺伝子発現
ＬＺ１５６１の代謝における２−ＨＩＢＡの影響を理解するために、サンプルを遺伝子発現分析のために採取した。リアクタをバッチとして開始し、１日後、Ｄ＝１．４日−１で連続的にした。酢酸塩を最小限に抑え、エタノール及び２，３−ＢＤＯの生成を最大限にするために、ガス流れ及び撹拌を調整した。７日目までに、エタノール：２，３−ＢＤＯ比は、５：１未満であり、ガスは、５〜６ｍｏｌ／Ｌ／日の標的ＣＯの取り込みに達した。９．６日目に、２−ＨＩＢＡを含まない安定したデータを示す、サンプルを遺伝子発現分析のために採取した。１０．７８日目に、０．５ｇ／Ｌ（４．８ｍＭ＿の２−ＨＩＢＡを注入物として、培地瓶に添加を通して、発酵に添加した。２−ＨＩＢＡの添加後、代謝産物において特徴的な反応が見られ、これには、２，３−ＢＤＯの増加に伴って、酢酸塩、エタノール、及びバイオマスの減少が含まれた。１３．８日目に、安定した２−ＨＩＢＡの添加を示す、別の遺伝子発現サンプルを採取した。表５は、データが遺伝子発現分析のために回収された２つの時点を示す。２−ＨＩＢＡの添加前、エタノール：２，３−ＢＤＯ比は４：１であり、添加後、この比率は、１．５：１に達した。小サブセットの遺伝子は、著しく上方制御または下方制御されることが見出され、これらの遺伝子を表６及び表７に示す。この分析における結果は、２−ＨＩＢＡが分岐鎖アミノ酸生合成経路（ＢＣＡＡ）と相互作用することを非常に明らかに示した。これらの結果から、２−ＨＩＢＡの作用モードを提案し、これを、図１１に例示し、説明する。
【表５】
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【表６】
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実施例７：
【表７】
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【０１９１】
２−ＨＩＢＡ添加時のＢＣＡＡ生成の監視
２−ＨｉＢＡが分岐鎖アミノ酸生成を妨げるさらなる証拠を導き出すために、これらのアミノ酸の濃度を２−ＨＩＢＡの添加前及び後に直接監視した。図１１は、２−ＨＩＢＡの添加直後の、バリン、ロイシン、及びイソロイシンの濃度がバイオマスと同様に減少する、結果を例証する。経時的に、バイオマス濃度は、横ばいの状態であり、イソロイシンの濃度は、２−ＨＩＢＡ添加前の値よりも依然として低いままであるロイシン及びバリンの濃度によって回復すると思われる。このデータは、２，３−ＢＤＯの生成が分岐鎖アミノ酸経路の妨害により増加することを示す遺伝子発現データを協調すると思われる。
【０１９２】
他の既知の阻害剤の添加
２−ヒドロキシ−２−メチルブチレートを、２，３−ブタンジオールの生成に最適化された発酵に添加した。この化学物質は、２−ＨｉＢＡに対するその構造相関性及びｉｌｖＣの既知の阻害剤として参考文献中のその参照に基づいて選択された。２−ヒドロキシ−２−メチル酪酸（１５ｍＭ）の単一添加を１３．２日目に安定したリアクタに行い、代謝産物プロファイルにおける結果を観察した。結果を図１３に示す。添加は、２，３−ブタンジオールの生成を増加させ、エタノール：２，３−ＢＤＯ比を減少させると思われる。
【０１９３】
実施例８：
アセト乳酸塩から２，３−ジヒドロキシ−３−メチルブチレートへの減少したフラックス
アセト乳酸塩から２，３−ジヒドロキシ−３−メチルブチレートへのフラックスを阻害するために、ケトール酸レダクトイソメラーゼ遺伝子を除去する。これは、ＣｌｏｓＴｒｏｎシステムを用いて遺伝子破壊によって達成され得る（Ｈｅａｐ  ｅｔ  ａｌ  ２００７）。
【０１９４】
ケトール酸レダクトイソメラーゼ遺伝子が微生物増殖にとって不可欠である分岐鎖アミノ酸の生合成のために必要とされる遺伝子であるため、ケトール酸レダクトイソメラーゼ遺伝子のノックアウトは、補足の分岐鎖アミノ酸の存在下で、発酵を操作することを必要とする。分岐鎖アミノ酸の生合成のための経路が上方制御され、活性になるように、分岐鎖アミノ酸を制限するレベルで添加する。
【０１９５】
あるいは、天然ケトール酸レダクトイソメラーゼ遺伝子（配列番号１）を、上述の機序によって除去し、天然遺伝子よりも低い活性を有する外因性ケトール酸レダクトイソメラーゼを、微生物に挿入する。外因性ケトール酸レダクトイソメラーゼ遺伝子は、宿主においてより低い活性を有する別の生物からの相同酵素または活性の低下を有する天然酵素の突然変異体のいずれかであり得る。活性を低下させる活性部位への突然変異は、大腸菌において特定され（Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ  ２００５）、主要な残基は、Ｃ．オートエタノゲナムにおいて観察され、これらの突然変異は、活性低下を伴って天然酵素の突然変異体を発生させるように複製させることが可能である。天然遺伝子の除去及び活性が低い遺伝子との置換は、分岐鎖アミノ酸に関してアセト乳酸塩からのフラックスを低下させる株をもたらす。利用可能なアセト乳酸塩のプールは、結果として増加する。
【０１９６】
実施例９
ピルビン酸塩から２−ヒドロキシ−２−メチル−３−ケトブチレート（アセト乳酸塩）へのフラックスの増加
ピルビン酸塩から２−ヒドロキシ−２−メチル−３−ケトブチレート（アセト乳酸塩）へのフラックスを増加させるために、天然異化アセト乳酸シンターゼを過剰発現する。
【０１９７】
天然異化アセト乳酸シンターゼ遺伝子（ａｌｓＳ）（配列番号２）を、ｐＭＴＬ８３１５５のＮｄｅＩ及びＮｈｅＩ部位にクローン化し（国際公開第２０１３１８５１２３Ａ１号）、過剰発現プラスミドを発生させ、これは、ホスホトランスアセチラーゼ−酢酸塩キナーゼオペロンのプロモーター領域の制御下でａｌｓＳを発現する。
【０１９８】
過剰発現プラスミドは、別の微生物からの異化アセト乳酸シンターゼ、天然同化アセト乳酸シンターゼ、または別の微生物からの同化アセト乳酸シンターゼを用いて同様に生成され得る。
【０１９９】
別の微生物からの異化アセト乳酸シンターゼまたは別の微生物からの同化アセト乳酸シンターゼのいずれかの使用が、ピルビン酸塩に関してより高い親和性及びより高速な反応速度論を有し得ると見なされる。別の微生物からの同化アセト乳酸シンターゼは、フィードバック阻害に対して非感受性であると特定される酵素であり得る。また、フィードバック阻害に対して非感受性である小サブユニットの同化アセト乳酸シンターゼ突然変異が過剰発現されると見なされる。
【０２００】
過剰発現プラスミドは、クロストリジウム・オートエタノゲナムに導入される。これにより、ピルビン酸塩からアセト乳酸塩のフラックスを増加させるように適合されるＣ．オートエタノゲナム株をもたらす。
【０２０１】
本発明は、不要な実験をすることなく読者が本発明を実践することを可能にするために、ある特定の好ましい実施形態を参照して本明細書に記載された。当業者であれば、本発明が具体的に記載されたもの以外の多くの変形及び修正に実践され得ることを理解するであろう。本発明は、そのようなすべての変形及び修正を含むことが理解されるべきである。さらに、表題、見出し等が本文献の読者の理解に役立つために提供されるものであり、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。本明細書に引用されるすべての出願、特許、及び公表文献の開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０２】
より具体的には、当業者には理解されるように、本発明の実施形態の実装は、１つ以上のさらなる要素を含み得る。その様々な態様において本発明を理解するのに必要なそのような要素のみが特定の実施例または説明に示され得る。しかしながら、本発明の範囲は、記載された実施形態に限定されず、１つ以上の追加のステップ及び／もしくは１つ以上の代わりのステップを含むシステム及び／もしくは方法、ならびに／または１つ以上のステップを省略するシステム及び／もしくは方法を含む。
【０２０３】
本明細書においていずれかの先行技術への言及は、先行技術があらゆる国において努力傾注分野の共通の一般的知識の一部を形成していることの承認、またはいかなる形態の示唆でもなく、またそのようなものとして解釈されるべきではない。
【０２０４】
本明細書及び以下のあらゆる請求項を通じて、特に文脈上必要としない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の用語は、排他的意味とは反対に包括的意味、すなわち、「〜を含むが、これらに限定されない」という意味で解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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