(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
厨房廃棄物の分解利用に有用な遺伝子組換えサッカロミセス・セレビシエであって、
直列接続された発現カセットａｍｙ−ｇａ−ａｐが導入されたサッカロミセス・セレビシエ発現ベクターにより、α−アミラーゼ（ＡＭＹ）遺伝子と、グルコアミラーゼ（ＧＡ）遺伝子と、酸性プロテアーゼ（ＡＰ）遺伝子とを、サッカロミセス・セレビシエに同時に導入し、正確な発現及び分泌を達成することによって構築され、
α−アミラーゼ遺伝子、グルコアミラーゼ遺伝子および酸性プロテアーゼ遺伝子は、イソカウダーナー（isocaudarner）Ｎｈｅ  Ｉ及びＸｂａ  Ｉの制限酵素認識部位が存在していないことを特徴とする遺伝子組換えサッカロミセス・セレビシエ。
【請求項２】
前記サッカロミセス・セレビシエ発現ベクターは、サッカロミセス・セレビシエ多重遺伝子同時発現ベクターであることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子組換えサッカロミセス・セレビシエ。
【請求項３】
前記サッカロミセス・セレビシエ多重遺伝子同時発現ベクターは、ベクターｐＳｃＩＫＰであることを特徴とする請求項２に記載の遺伝子組換えサッカロミセス・セレビシエ。
【請求項４】
厨房廃棄物の分解利用に有用な遺伝子組換えサッカロミセス・セレビシエの構築方法であって、
直列接続された発現カセットａｍｙ−ｇａ−ａｐが導入されたサッカロミセス・セレビシエ発現ベクターにより、α−アミラーゼ（ＡＭＹ）遺伝子と、グルコアミラーゼ（ＧＡ）遺伝子と、酸性プロテアーゼ（ＡＰ）遺伝子とを、サッカロミセス・セレビシエに同時に導入し、正確な発現及び分泌を達成するための方法であって、α−アミラーゼ遺伝子、グルコアミラーゼ遺伝子および酸性プロテアーゼ遺伝子は、イソカウダーナー（isocaudarner）Ｎｈｅ  Ｉ及びＸｂａ  Ｉの制限酵素認識部位が存在しておらず、
ＰＣＲ増幅により、α−アミラーゼ遺伝子、グルコアミラーゼ遺伝子、及び酸性プロテアーゼ遺伝子の配列をそれぞれ得て、グルコアミラーゼ遺伝子の１５６６位のヌクレオチド残基ＣがＴに置換される人工変異を導入し、酸性プロテアーゼ遺伝子の１１５５位のヌクレオチド残基ＣがＴに置換される人工変異を導入するステップＳ１と、
α−アミラーゼ遺伝子と、グルコアミラーゼ遺伝子と、酸性プロテアーゼ遺伝子とを、直列接続された発現カセットａｍｙ−ｇａ−ａｐの形で同一のサッカロミセス・セレビシエ発現ベクターに導入し、組換え多重遺伝子同時発現ベクターを構築するステップＳ２と、
構築した組換え多重遺伝子同時発現ベクターを制限エンドヌクレアーゼで消化して線状化した後、サッカロミセス・セレビシエに形質転換し、遺伝子組換えサッカロミセス・セレビシエを構築するステップＳ３と、
を含み、
前記ステップＳ２は、
サッカロミセス・セレビシエ発現ベクター、α−アミラーゼ遺伝子、グルコアミラーゼ遺伝子、酸性プロテアーゼ遺伝子を、制限エンドヌクレアーゼでそれぞれ消化するステップＳ１１と、
α−アミラーゼ遺伝子と、グルコアミラーゼ遺伝子と、酸性プロテアーゼ遺伝子とを、それぞれサッカロミセス・セレビシエ発現ベクターに導入し、３つの組換え単一遺伝子ベクターを形成するステップＳ１２と、
３つの組換え単一遺伝子ベクターから、ベクタープロモーター及びターミネーター断片を含有する完全なα−アミラーゼ遺伝子発現カセット、グルコアミラーゼ遺伝子発現カセット、及び酸性プロテアーゼ遺伝子発現カセットを、制限エンドヌクレアーゼでそれぞれ切断した後、直列接続された発現カセットａｍｙ−ｇａ−ａｐの形で同一のサッカロミセス・セレビシエ発現ベクターに導入するステップＳ１３と、
を含むことを特徴とする遺伝子組換えサッカロミセス・セレビシエの構築方法。
【請求項５】
前記ステップＳ３において、前記制限エンドヌクレアーゼはＡｐａ Ｉであることを特徴とする請求項４に記載の遺伝子組換えサッカロミセス・セレビシエの構築方法。
【請求項６】
前記ステップＳ３において、前記形質転換は、電気的形質転換法、冷凍法、又は化学試薬法で行う形質転換であることを特徴とする請求項４に記載の遺伝子組換えサッカロミセス・セレビシエの構築方法。
【請求項７】
前記ステップＳ１１において、サッカロミセス・セレビシエ発現ベクター、α−アミラーゼ遺伝子、グルコアミラーゼ遺伝子、酸性プロテアーゼ遺伝子を消化するための制限エンドヌクレアーゼは、ＢａｍＨ  Ｉ及びＳｐｅ  Ｉであり、
前記ステップＳ１３に使用される制限エンドヌクレアーゼは、イソカウダーナーＮｈｅ Ｉ及びＸｂａ  Ｉであることを特徴とする請求項４に記載の遺伝子組換えサッカロミセス・セレビシエの構築方法。
【請求項８】
前記α−アミラーゼ遺伝子は、麹菌由来のα−アミラーゼ遺伝子であり、
前記グルコアミラーゼ遺伝子は、アスペルギルス・ニガー由来のグルコアミラーゼ遺伝子であり、
前記酸性プロテアーゼ遺伝子は、アスペルギルス・ニガー由来の酸性プロテアーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項４又は７に記載の遺伝子組換えサッカロミセス・セレビシエの構築方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学及び発酵工学の分野に関し、より具体的に、厨房廃棄物の分解利用に有用な遺伝子組換えサッカロミセス・セレビシエ、および、サッカロミセス・セレビシエの構築方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、中国では自動車用燃料エタノールはほとんど穀物などを原料として製造されるので、量産化の燃料エタノールは、必然的に、穀物原料で食料との競合を引き起こし、ひいては穀物価格の高騰及び食糧不足の可能性をもたらす。そのため、非食料である再生可能バイオマスを原料としてエタノールを製造する解決法が提案された。中国で毎年６０００万トン以上発生する厨房廃棄物は、大量の再生可能バイオマスを含有するが、そのうち大部分が家畜の飼料に用いられ、又は埋め立てや焼却で処理され、深刻な環境汚染をもたらす一方、ごく小さな部分だけが堆肥やバイオガスなどの製造に利用されるが、経済的利益が低い。そのため、これらの厨房廃棄物を原料として燃料エタノールを製造することは、廃棄物を宝に変えるとともに、食糧及びエネルギー危機を緩和できるので、見込みのある研究方向になっている。
【０００３】
また、厨房廃棄物は、栄養豊富な再生可能バイオマスであり、デンプン、糖質、タンパク質、脂肪などの有機物を乾燥物質の９５％以上含み、さらにビタミン、窒素、リン、硫黄、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどの微量元素を含むので、生物学的に再利用できる。しかしながら、厨房廃棄物は含水量が高く、栄養物質に富むので、微生物が様々な有機物及び無機塩を利用して常温で繁殖及び代謝を速やかに行うことにより、厨房廃棄物を腐敗させ悪臭を放つとともに、環境汚染や厨房廃棄物の処理にトラブルを引き起こす。
【０００４】
サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)は、工業上のエタノール発酵のための最適な菌株であり、グルコースをエタノールに効率よく変換する能力を持つが、デンプンを分解してグルコースを効果的に生成するための酵素と、タンパク質を分解してポリペプチド及びアミノ酸を効果的に生成するための酵素とが足りず、自然条件下で厨房廃棄物におけるデンプン及びタンパク質を炭素源及び窒素源としてエタノールの発酵に直接利用することができない。したがって、厨房廃棄物を原料としてエタノールの発酵に使用する場合、デンプン及びタンパク質を分解可能な酵素の遺伝子を、サッカロミセス・セレビシエに導入して分泌、発現させる必要がある。このようにして、遺伝子組換えサッカロミセス・セレビシエは、遺伝子工学の手段で厨房廃棄物に対する分解能力の不足を補い、自己分泌のアミラーゼ及びプロテアーゼにより、厨房廃棄物におけるデンプン及びタンパク質を、利用可能な炭素源（すなわち、グルコース）と窒素源（すなわち、ポリペプチド及びアミノ酸）とに分解することで、産業上で厨房廃棄物を利用して燃料エタノールを製造するという目的を達成できる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、従来技術の上記した問題点を解決するために、厨房廃棄物の分解利用に有用な遺伝子組換えサッカロミセス・セレビシエを提供することにある。
本発明の別の課題は、厨房廃棄物の分解利用に有用な遺伝子組換えサッカロミセス・セレビシエの構築方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明における厨房廃棄物の分解利用に有用な遺伝子組換えサッカロミセス・セレビシエは、直列接続された発現カセットａｍｙ−ｇａ−ａｐが導入されたサッカロミセス・セレビシエ発現ベクターにより、α−アミラーゼ（α-amylase、ＡＭＹ）遺伝子と、グルコアミラーゼ（glucoamylase、ＧＡ）遺伝子と、酸性プロテアーゼ（acid protease、ＡＰ）遺伝子とを、サッカロミセス・セレビシエに同時に導入し、正確な発現及び分泌を達成することによって構築される。α−アミラーゼ遺伝子、グルコアミラーゼ遺伝子および酸性プロテアーゼ遺伝子は、イソカウダーナー（isocaudarner）Ｎｈｅ  Ｉ及びＸｂａ  Ｉの制限酵素認識部位が存在していない。
【０００７】
本発明は、サッカロミセス・セレビシエ発現ベクターをツールとして、α−アミラーゼ遺伝子と、グルコアミラーゼ遺伝子と、酸性プロテアーゼ遺伝子とを、サッカロミセス・セレビシエに同時に導入して発現及び分泌させることに着目する。好ましい実施形態において、上記サッカロミセス・セレビシエ発現ベクターは、α−アミラーゼ遺伝子と、グルコアミラーゼ遺伝子と、酸性プロテアーゼ遺伝子とをサッカロミセス・セレビシエに同時に導入可能なサッカロミセス・セレビシエ多重遺伝子同時発現ベクター（multi-gene co-expression vector）である。好ましい実施形態において、上記サッカロミセス・セレビシエ多重遺伝子同時発現ベクターは、ベクターｐＳｃＩＫＰ（作製方法は中国特許第２００８１００２９６３０．６号を参照）であるが、他の種類のサッカロミセス・セレビシエ多重遺伝子同時発現ベクターを使用してもよい。
【０００８】
本発明における厨房廃棄物の分解利用に有用な遺伝子組換えサッカロミセス・セレビシエの構築方法は、
ＰＣＲ増幅により、α−アミラーゼ遺伝子、グルコアミラーゼ遺伝子、及び酸性プロテアーゼ遺伝子の配列をそれぞれ得て、グルコアミラーゼ遺伝子の１５６６位のヌクレオチド残基ＣがＴに置換される人工変異（artificial mutation）を導入し、酸性プロテアーゼ遺伝子の１１５５位のヌクレオチド残基ＣがＴに置換される人工変異を導入するステップＳ１と、
α−アミラーゼ遺伝子と、グルコアミラーゼ遺伝子と、酸性プロテアーゼ遺伝子とを、サッカロミセス・セレビシエ発現ベクターに導入し、組換え多重遺伝子同時発現ベクターを構築するステップＳ２と、
上記構築した組換え多重遺伝子同時発現ベクターを制限エンドヌクレアーゼで消化して線状化した後、サッカロミセス・セレビシエに形質転換し、遺伝子組換えサッカロミセス・セレビシエを構築するステップＳ３と、
を含む。
【０００９】
好ましくは、上記ステップＳ２は、
サッカロミセス・セレビシエ発現ベクター、α−アミラーゼ遺伝子、グルコアミラーゼ遺伝子、酸性プロテアーゼ遺伝子を、制限エンドヌクレアーゼでそれぞれ消化するステップＳ１１と、
α−アミラーゼ遺伝子と、グルコアミラーゼ遺伝子と、酸性プロテアーゼ遺伝子とを、それぞれサッカロミセス・セレビシエ発現ベクターに導入し、３つの組換え単一遺伝子ベクター（single-gene vector）を形成するステップＳ１２と、
３つの組換え単一遺伝子ベクターから、ベクタープロモーター及びターミネーター断片を含有する完全なα−アミラーゼ遺伝子発現カセット、グルコアミラーゼ遺伝子発現カセット、及び酸性プロテアーゼ遺伝子発現カセットを、制限エンドヌクレアーゼでそれぞれ切断した後、直列接続された発現カセットａｍｙ−ｇａ−ａｐの形で同一のサッカロミセス・セレビシエ発現ベクターに導入するステップＳ１３と、
を含む。
【００１０】
好ましくは、上記ステップＳ３において、上記制限エンドヌクレアーゼはＡｐａ Ｉである。
好ましくは、上記ステップＳ３において、上記形質転換は、電気的形質転換（electrotransformation）法、冷凍法、又は化学試薬法で行う形質転換である。
好ましくは、上記ステップＳ１１において、α−アミラーゼ遺伝子、グルコアミラーゼ遺伝子、酸性プロテアーゼ遺伝子を消化するための制限エンドヌクレアーゼは、ＢａｍＨ Ｉ及びＳｐｅ Ｉであり、上記ステップＳ１３に使用される制限エンドヌクレアーゼは、イソカウダーナー（isocaudarner）Ｎｈｅ Ｉ及びＸｂａ Ｉである。
【００１１】
好ましくは、上記α−アミラーゼ遺伝子は麹菌（Aspergillus oryzae）由来のα−アミラーゼ遺伝子であり、上記グルコアミラーゼ遺伝子はアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来のグルコアミラーゼ遺伝子であり、上記酸性プロテアーゼ遺伝子はアスペルギルス・ニガー由来の酸性プロテアーゼ遺伝子である。
【００１２】
最も好ましくは、上記α−アミラーゼ遺伝子は、麹菌（Aspergillus oryzae）ＣＩＣＣ ４０３４４（China Center of Industrial Culture Collectionから購入される）由来のα−アミラーゼ遺伝子であり、上記グルコアミラーゼ遺伝子は、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）ＣＩＣＣ ４０１７９（China Center of Industrial Culture Collectionから購入される）由来のグルコアミラーゼ遺伝子であり、上記酸性プロテアーゼ遺伝子は、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）ＣＩＣＣ ４０１７９由来の酸性プロテアーゼ遺伝子である。
【００１３】
麹菌ＣＩＣＣ ４０３４４由来のα−アミラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示され、アスペルギルス・ニガーＣＩＣＣ ４０１７９由来のグルコアミラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（１５６６位のヌクレオチド残基Ｃ（シトシン）がＴ（チミン）に置換される人工変異を導入した）に示され、アスペルギルス・ニガーＣＩＣＣ ４０１７９由来の酸性プロテアーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（１１５５位のヌクレオチド残基Ｃ（シトシン）がＴ（チミン）に置換される人工変異を導入した）に示される。
【発明の効果】
【００１４】
従来技術と比較して、本発明は下記の有益な効果を有する。
通常のサッカロミセス・セレビシエは、厨房廃棄物に多く含まれる未分解のデンプン及びタンパク質などの栄養物質を炭素源及び窒素源としてエタノールの発酵に直接利用できない。このような事情に鑑み、サッカロミセス・セレビシエが厨房廃棄物を原料としてエタノールの発酵に利用することを可能にするために、本発明は、デンプン及びタンパク質を分解可能な酵素の遺伝子をサッカロミセス・セレビシエに導入して発現及び分泌を達成することで、アミラーゼ及びプロテアーゼを分泌する能力を本発明に係る組換えサッカロミセス・セレビシエに与える。このようにして、厨房廃棄物におけるデンプン及びタンパク質は、利用可能なグルコース、ポリペプチド及びアミノ酸などの炭素源物質と窒素源物質とに効果的に分解され、さらに組換えサッカロミセス・セレビシエによって発酵させてエタノールを製造することができる。
【００１５】
本発明の要点は、サッカロミセス・セレビシエ同時発現ベクターにより、α−アミラーゼ遺伝子と、グルコアミラーゼ遺伝子と、酸性プロテアーゼ遺伝子とを、サッカロミセス・セレビシエに同時に導入して発現及び分泌を達成することである。そのため、まず、ａｍｙ、ｇａ、ａｐの遺伝子発現カセットを同時に含有する組換えベクターを構築する必要がある。一方、組換え３遺伝子同時発現ベクターを構築する過程において、各遺伝子配列にイソカウダーナーＮｈｅ Ｉ及びＸｂａ Ｉの制限酵素認識部位（restriction site）が存在しないことが求められる。これは、Ｎｈｅ Ｉ及びＸｂａ Ｉの制限酵素認識部位が存在する場合、各遺伝子配列は直列接続して発現カセットになる過程において、Ｎｈｅ Ｉ及びＸｂａ Ｉによって切断され、完全な遺伝子配列として同時発現ベクターに導入できないためである。そのため、アミノ酸配列を変更しない前提で、グルコアミラーゼ遺伝子の１５６６位のヌクレオチド残基Ｃ（シトシン）がＴ（チミン）に置換される変異を導入することにより、グルコアミラーゼ遺伝子配列におけるＮｈｅ Ｉ制限酵素認識部位が破壊されるとともに、酸性プロテアーゼ遺伝子の１１５５位のヌクレオチド残基Ｃ（シトシン）がＴ（チミン）に置換される変異を導入することにより、酸性プロテアーゼ遺伝子配列におけるＸｂａ Ｉ制限酵素認識部位が破壊されることになる。このようにして、最終的に、３つの完全な遺伝子配列発現カセットを含有する組換え同時発現ベクターｐＳｃＩＫＰ−ａｍｙ−ｇａ−ａｐが得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、組換えサッカロミセス・セレビシエ多重遺伝子発現ベクターｐＳｃＩＫＰ−ａｍｙ−ｇａ−ａｐの構築流れ図である。
【図２】図２は、陽性形質転換体（positive transformant）のＰＣＲ結果であり、ここで、ａがα−アミラーゼ遺伝子の増幅断片を示し、ｂがグルコアミラーゼ遺伝子の増幅断片を示し、ｃが酸性プロテアーゼ遺伝子の増幅断片を示す。
【図３】図３は、組換え酵母α−アミラーゼ及びグルコアミラーゼの酵素活性アッセイ（ヨウ素染色法）を示す。
【図４】図４は、組換え酵母酸性プロテアーゼの酵素活性アッセイ（カゼイン染色法）を示す。
【図５】図５は、組換え酵母が厨房廃棄物を利用してエタノール発酵を行って得られた発酵液の液体クロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、図面及び具体的な実施例を参照しながら、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
サッカロミセス・セレビシエＡＳ２．４８９は、Microbiological Culture Collection Center, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciencesから購入される。ベクターｐＳｃＩＫＰは、Molecular Biology Center of Jinan Universityにより構築して保存され、その構築方法は中国特許第２００８１００２９６３０．６号に記載される。
【実施例】
【００１８】
実施例１：α−アミラーゼ遺伝子ａｍｙ、グルコアミラーゼ遺伝子ｇａ、及び酸性プロテアーゼ遺伝子ａｐのクローニング
ＧｅｎＢａｎｋに登録されている麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）α−アミラーゼ遺伝子ａｍｙ（受託番号ＸＭ＿００１８２１３８４）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ遺伝子ｇａ（受託番号ＸＭ＿００１３９０４９３．１）、及び酸性プロテアーゼ遺伝子ａｐ（受託番号ＸＭ＿００１４０１０５６．２）の配列に応じて、Ｏｌｉｇｏ ６プライマー設計ソフトウェアによりプライマーを設計するとともに、適切な制限酵素認識部位を導入する。
【００１９】
【表１】
0006532139.tif 000002
【００２０】
麹菌ＣＩＣＣ ４０３４４の全ＲＮＡを抽出してＲＴ−ＰＣＲ増幅反応を行った。ａｍｙ遺伝子のＰＣＲ増幅産物をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社から購入される）に連結し、シークエンシングにより検証を行った。
ここで、ａｍｙ遺伝子のＰＣＲ反応条件は、表２に示す通りである。
【００２１】
【表２】
0006532139.tif 000003
【００２２】
アスペルギルス・ニガーＣＩＣＣ ４０１７９の全ＲＮＡを抽出してＲＴ−ＰＣＲ増幅反応を行った。ｇａ遺伝子及びａｐ遺伝子のＰＣＲ増幅産物をそれぞれ、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社から購入される）に連結し、シークエンシングにより検証を行った。
ここで、ｇａ遺伝子のＰＣＲ反応条件は、表３に示す通りである。また、ａｐ遺伝子のＰＣＲ反応条件は、表４に示す通りである。
【００２３】
【表３】
0006532139.tif 000004
【００２４】
【表４】
0006532139.tif 000005
【００２５】
麹菌ＣＩＣＣ ４０３４４由来のα−アミラーゼ遺伝子ａｍｙのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される。アスペルギルス・ニガーＣＩＣＣ ４０１７９由来のグルコアミラーゼ遺伝子ｇａのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（１５６６位のヌクレオチド残基Ｃ（シトシン）がＴ（チミン）に置換される人工変異を導入した）に示される。アスペルギルス・ニガーＣＩＣＣ ４０１７９由来の酸性プロテアーゼ遺伝子ａｐのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（１１５５位のヌクレオチド残基Ｃ（シトシン）がＴ（チミン）に置換される人工変異を導入した）に示される。
【００２６】
実施例２：３つの酵素の遺伝子を含有する組換え同時発現プラスミドの構築
３つの酵素の遺伝子を含有する組換え同時発現ベクターの構築流れは図１に示される。
ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターから制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ Ｉ及びＳｐｅ Ｉでそれぞれ二重消化した（double digested）実施例１で得られたａｍｙ、ｇａ及びａｐコード配列を、同様の制限エンドヌクレアーゼで二重消化したベクターｐＳｃＩＫＰにそれぞれ連結し、組換えプラスミドｐＳｃＩＫＰ−ａｍｙ、ｐＳｃＩＫＰ−ｇａ、及びｐＳｃＩＫＰ−ａｐを得た。
【００２７】
ｐＳｃＩＫＰ−ｇａをＮｈｅ Ｉ及びＸｂａ Ｉで二重消化し、ＰＧＫプロモーター及びターミネーターを含有するｇａ遺伝子発現カセット断片を得た。ｐＳｃＩＫＰ−ａｍｙをＮｈｅ Ｉで単一消化して線状化した。得られたｇａ遺伝子発現カセット断片と線状化したｐＳｃＩＫＰ−ａｍｙとを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによって連結し（Ｎｈｅ Ｉ及びＸｂａ Ｉがイソカウダーナーであることを利用する）、組換えプラスミドｐＳｃＩＫＰ−ａｍｙ−ｇａを得た。同様に、ｐＳｃＩＫＰ−ａｐをＮｈｅ Ｉ及びＸｂａ Ｉで二重消化して得られたＰＧＫプロモーター及びターミネーターを含有するａｐ遺伝子発現カセット断片と、Ｎｈｅ Ｉで単一消化して線状化したｐＳｃＩＫＰ−ａｍｙ−ｇａとを連結し、最終的に組換えプラスミドｐＳｃＩＫＰ−ａｍｙ−ｇａ−ａｐを得た。
【００２８】
実施例３：組換え酵母形質転換体のスクリーニング及び検証
サッカロミセス・セレビシエに電気的形質転換を行う前に、サッカロミセス・セレビシエＡＳ２．４８９に対して、抵抗性選択マーカー（resistance selection marker）Ｇ４１８の感度検出を行った。その結果、Ｇ４１８濃度が１５０μｇ／ｍｌのＹＰＤプレートにおいて酵母の増殖が抑制されるので、形質転換体をスクリーニングするときに、濃度１５０μｇ／ｍｌ以上のＧ４１８によりスクリーニングを行うことができることが見出された。
【００２９】
実施例２で得られた３遺伝子同時発現組換えプラスミドｐＳｃＩＫＰ−ａｍｙ−ｇａ−ａｐを、制限エンドヌクレアーゼＡｐａ Ｉで消化して線状化した後、電気的形質転換法でサッカロミセス・セレビシエＡＳ２．４８９に導入し、Ｇ４１８濃度が２００μｇ／ｍｌのＹＰＤ寒天プレートで３日〜４日培養した。その後、正常に増殖したコロニーを選択して、上記組換えプラスミドを含有する形質転換体とした。各酵素の遺伝子の特異的プライマーでコロニーＰＣＲを行うことにより、それぞれの遺伝子断片を増幅することができ（図２を参照）、３つの酵素の遺伝子がサッカロミセス・セレビシエゲノムに確実に導入されることが検証された。
【００３０】
実施例４：組換えサッカロミセス・セレビシエによって分泌したアミラーゼ及びプロテアーゼの酵素活性アッセイ
実施例３で得られたＧ４１８抵抗性を有する形質転換体コロニーを、１％可溶性デンプンを含有するＹＮＢＳプレート（ＹＮＢ６．７ｇ／ｌ、可溶性デンプン１０ｇ／ｌ、寒天粉１５ｇ／ｌ）に接種し、培養器において３０℃で７２時間培養した。その後、プレートをヨウ素蒸気で燻蒸し、加水分解による透明区域の有無を観察した。その結果を図３に示すように、コロニーの周辺に明らかなデンプン加水分解による透明区域が観察されるから、形質転換体が培地におけるデンプンを炭素源として分解、利用することにより増殖できることが示される。
【００３１】
実施例３で得られたＧ４１８抵抗性を有する形質転換体コロニーを、１％カゼインを含有するＹＰＤ固体培地（０．５ｇ酵母抽出物、２ｇペプトン、１．５ｇ寒天に１％カゼイン溶液を１００ｍｌまで添加する）に接種し、３日〜４日培養した。その結果を図４に示すように、カゼインがプロテアーゼによって分解されるので、プロテアーゼを分泌可能な形質転換体コロニーの周辺で透明なカゼイン加水分解区域が観察された。
【００３２】
実施例５：組換え酵母により厨房廃棄物を発酵させて製造するエタノール
（１）培地の組成
＜シーディング酵母（seeding yeast）培地＞
ＹＰＤ培地（酵母抽出物１０ｇ／ｌ、トリプトン２０ｇ／ｌ、グルコース２０ｇ／ｌ）を用意して加圧滅菌を行った。得られた培地は、組換え酵母のシーディング酵母の培養に用いられる。
【００３３】
＜発酵培地＞
広州のある大学食堂の食物残渣から厨房廃棄物収集した。非食料品を取り除いた後、ゴミ処理用粉砕処理装置で厨房廃棄物を粉碎し、均一に撹拌した後、１Ｌの三角フラスコに投入し、１２１℃で滅菌処理を２０分間行った。得られた厨房廃棄物の混合物は、組換え酵母の発酵に用いられる。その混合物を測定し結果、水分含有量が７３．８％、乾燥物質含有量が２６．２％、デンプン含有量が９．７％、タンパク質含有量が１．０％、可溶性糖質含有量が４．４％、他の成分含有量が１１．１％であり、ｐＨ６．１である。
【００３４】
（２）発酵プロセス
組換えサッカロミセス・セレビシエの菌株を活性化した後、２％の接種量で２５ｍｌのＹＰＤシーディング酵母培地に接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間培養した。その後、培養液を１０％の接種量で２００ｍｌのＹＰＤ培地に接種して拡大培養を行い、３０℃、２００ｒｐｍで対数増殖期まで培養した。細胞数が約０．８〜ｌ．２ラ１０８／ｍＬ、出芽率が約２０％、死亡率が１％以下に達するとき、シーディング酵母が成熟とした。
【００３５】
発酵培地の体積の１０％の量で培養液を上記滅菌した厨房廃棄物に入れ、３０℃、２５０ｒｐｍ、自然ｐＨ、４時間通気発酵の発酵条件で、発酵を開始した。その後、発酵条件を３０℃、１５０ｒｐｍ、自然ｐＨ、６０時間嫌気発酵に変更した。発酵期間において、１２時間ごとにサンプリングし、ＨＰＬＣでエタノールの産量を測定した（結果を図５に示す）。その結果、組換え酵母によるエタノールの産量が５２時間前後で最高ピークになり、最高エタノール濃度が６６ｇ／Ｌに達することが見出された。厨房廃棄物からエタノールへの転換率は、４ｇの厨房廃棄物（乾燥重量）あたり１ｇのエタノールに達する。以上の結果から、本発明で構築された組換えサッカロミセス・セレビシエは、厨房廃棄物の分解利用に有用であり、廃棄物をエタノールに転換できることが分かる。そのため、本発明者は、その組換えサッカロミセス・セレビシエを「食汚酵母１号」と命名した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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