(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取した生体試料からDNA試料を調製する工程と、
前記DNA試料に含まれるAVPR1B遺伝子およびLRRC41遺伝子の少なくとも１つのプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の有無を判定する工程と、
前記判定工程において、メチル化が存在すると判定された場合は、前記生体試料が卵巣癌細胞を含むとの情報を取得する工程と
を含む、卵巣癌に関する情報の取得方法。
【請求項２】
前記プロモータ領域が、配列番号３または４の塩基配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記メチル化の有無の判定が、質量分析法およびメチル化特異的PCR法から選択される少なくとも１つの方法で得られた結果に基づいて行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記生体試料が、組織、血液または血清である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
配列番号７〜１０のいずれか１つの塩基配列からなるプライマーを含む卵巣癌検出用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者の卵巣癌に関する情報の取得方法に関する。また、本発明は、卵巣癌に関する情報を取得するためのマーカーおよび卵巣癌検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
卵巣は表層上皮、胚細胞、性ホルモン分泌細胞および間質細胞からなる組織であるため、卵巣癌は、非常に多くの種類の腫瘍を伴う疾患である。表層上皮性の卵巣癌としては、漿液性腺癌、粘液性腺癌、類内膜腺癌、明細胞腺癌等が代表的である。粘液性腺癌は、若年女性でも発症することがある。胚細胞性の卵巣癌としては、未分化胚細胞腫、卵黄嚢腫瘍、胎児性癌等が代表的であり、殆どが35歳までの若年女性においてみられる。性ホルモン分泌細胞性の卵巣癌では顆粒膜細胞腫等が代表的である。
【０００３】
卵巣癌は、早期診断が難しい癌として知られている。これは、卵巣が腹腔内に存在し、子宮等のように細胞を採取して検診することができないこと等が一因として挙げられる。また、初期の卵巣癌においてみられる症状としては、腹部膨満、腹痛、胃腸障害、頻尿、体重減少等が挙げられるが、これらは卵巣癌に特異的な症状ではなく、他の疾患においてもみられる症状である。よって、このことも、卵巣癌の早期診断が難しい理由の一つであると考えられる。
【０００４】
近年、新たな癌の診断方法として、遺伝子情報に基づく方法が研究されている。そのような方法としては、例えば、DNAのメチル化に関する情報に基づく方法が挙げられる。この方法では、所定の遺伝子の塩基配列中のCpG部位(5'-(CG)-3')をマーカーとして用いる。そして、該マーカーのメチル化状態の解析結果に基づいて癌細胞の存否などの情報を取得し、これを指標にして癌の診断が行われる。
【０００５】
例えば、特許文献１には、LRRC41遺伝子群のメチル化レベルを測定して、大腸癌の予後予測を行う方法が記載されている。また、特許文献２には、AVPR1Bを含む遺伝子群のメチル化レベルを測定して、メラノーマの予後予測や治療効果のモニタリングを行う方法が記載されている。さらに、特許文献３および４には、AVPR1Bを含む遺伝子群の発現量の変化を測定することによって、卵巣癌に対する抗癌剤の効果を評価する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１１−０２５７０３４号
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１３−０３１６９３１号
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１０−０３０５０５８号
【特許文献４】米国特許出願公開第２００７−０１７２８４４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のように、AVPR1B遺伝子またはLRRC41遺伝子のメチル化レベルを測定して大腸癌やメラノーマの予後を予測し得ること等が報告されているが、これらの文献のいずれにも、AVPR1B遺伝子またはLRRC41遺伝子のメチル化レベルを測定することによって、被検者が卵巣癌に罹患しているか否かを予測し得ることについて何ら記載も示唆もしていない。他方、卵巣癌を検出するためのマーカーとして用い得る遺伝子は少数である。それゆえ、遺伝子のメチル化解析を利用した卵巣癌の検出のための新規マーカーのさらなる開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、卵巣癌の癌部組織から得たDNAに特異的にメチル化が認められる遺伝子領域を、新規マーカーとして同定した。そして、本発明者らは、これらのマーカーについてメチル化状態を解析して得られた結果に基づいて、卵巣癌に由来する癌細胞と、その他の細胞(正常組織の細胞、非癌部組織の細胞、および、腎癌および子宮体癌以外の卵巣癌とは異なる種類の癌に由来する癌細胞)とを明確に区別できることを見出して、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明によれば、被験者から採取した生体試料からDNA試料を調製する工程と、DNA試料に含まれるAVPR1B遺伝子およびLRRC41遺伝子の少なくとも１つのプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の有無を判定する工程と、判定工程において、メチル化が存在すると判定された場合は、生体試料が卵巣癌細胞を含むとの情報を取得する工程とを含む、卵巣癌に関する情報の取得方法が提供される。
【００１０】
また、本発明によれば、被検者から単離した核酸に由来する核酸であって、由来する核酸は、AVPR1B遺伝子またはLRRC41遺伝子のプロモータ領域の全部またはその一部の連続する塩基配列をバイサルファイト処理して得られる配列を有し、プロモータ領域は、CpG部位と、CpG部位を構成しないシトシン塩基とを含み、卵巣癌に関する情報を取得するためのマーカーとして用いられる、核酸が提供される。
【００１１】
さらに、本発明によれば、プライマーを含む卵巣癌検出用試薬キットであって、プライマーは、AVPR1B遺伝子またはLRRC41遺伝子のプロモータ領域中のCpG部位を有する塩基配列における、CpG部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズし、且つメチル化CpG部位を含む領域にハイブリダイズするプライマーである、キットが提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、卵巣癌に関する情報の取得を可能にする方法を提供することができる。また、本発明は、卵巣癌に関する情報を取得するためのマーカーとして用いられる核酸および卵巣癌検出用試薬キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】卵巣癌の癌部組織および非癌部組織、ならびに正常組織のメチル化データから算出した、AVPR1B遺伝子のプロモータ領域のメチル化陽性率を示すグラフである。
【図１Ｂ】卵巣癌の癌部組織および非癌部組織、ならびに正常組織のメチル化データから算出した、LRRC41遺伝子のプロモータ領域のメチル化陽性率を示すグラフである。
【図２Ａ】種々の臨床検体のメチル化データから算出した、AVPR1B遺伝子のプロモータ領域のメチル化陽性率を示すグラフである。
【図２Ｂ】種々の臨床検体のメチル化データから算出した、LRRC41遺伝子のプロモータ領域のメチル化陽性率を示すグラフである。
【図３】卵巣癌および正常卵巣組織から抽出したDNA試料を、メチル化特異的PCR (MSP法)により増幅した結果を示す写真である。
【図４】種々の癌組織および各種臓器の正常組織から抽出したDNAをMSP法により増幅した結果を示す写真である。
【図５】被験者の卵巣癌に関する情報を提供するための判定装置の一例を示した概略図である。
【図６】図５の判定装置の機能構成を示すブロック図である。
【図７】図５に示された判定装置のハードウェア構成を示すブロック図である。
【図８】図５に示された判定装置を用いた、被験者の卵巣癌に関する情報を提供するための判定のフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本実施形態の卵巣癌に関する情報の取得方法(以下、単に「方法」ともいう)では、まず、被験者から採取した生体試料からDNA試料を調製する。
【００１５】
本実施形態において、生体試料は、被験者のDNAを含む生体由来の試料であれば特に制限されない。好ましくはゲノムDNAを含む試料、例えば臨床検体である。臨床検体としては、例えば、体液、尿、手術または生検により採取した組織などが挙げられる。体液としては、血液、血清、血漿、リンパ液、腹水、骨髄液、乳頭分泌液などが挙げられる。また、被検者から採取した細胞または組織を培養して得られた培養物を生体試料として用いることもできる。さらに、被験者から採取した組織のホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料を生体試料として用いてもよい。
【００１６】
DNA試料の調製は、生体試料からDNAを抽出することにより行うことができる。生体試料からのDNAの抽出方法は当該技術において公知である。例えば、生体試料と、細胞または組織を可溶化する界面活性剤(例えばコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウムなど)を含む処理液とを混合し、得られた混合液に物理的処理(撹拌、ホモジナイズ、超音波破砕など)を施して、生体試料に含まれるDNAを該混合液中に遊離させることによって、DNAを抽出することができる。この場合、混合液を遠心分離して細胞破片を沈殿させ、遊離したDNAを含む上清を後述の解析工程に用いることが好ましい。また、得られた上清を当該技術において公知の方法により精製してもよい。なお、生体試料からのDNAの抽出および精製は、市販のキットを用いて行うこともできる。
【００１７】
上記の調製工程は、抽出したDNAを断片化する工程をさらに含むことが好ましい。DNAを適当な長さに断片化することにより、後述するメチル化DNA免疫沈降(MeDIP)法および非メチル化シトシン変換処理を効率よく行うことができる。
DNAの断片化は、超音波処理、アルカリ処理、制限酵素処理などにより行うことができる。例えば、アルカリ処理によりDNAの断片化を行なう場合は、DNA溶液に水酸化ナトリウム溶液を終濃度0.1〜1.0 Ｎとなるよう添加し、10〜40℃で５〜15分間インキュベーションすることによりDNAが断片化される。また、制限酵素処理によりDNAの断片化を行なう場合、用いる制限酵素はDNAの塩基配列に基づいて適宜選択され、例えばMseIやBamHIなどが用いられる。
【００１８】
本実施形態の方法では、上記の調製工程で得られたDNAに含まれるAVPR1B (arginine vasopressin receptor 1B)遺伝子またはLRRC41(Leucine Rich Repeat Containing 41)遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の有無を判定する。なお、本明細書において、「CpG部位」とは、塩基配列中のシトシン(C)とグアニン(G)とが5'から3'への方向にこの順序で隣り合った配列の部位を意味する。なお、CpGの「p」の文字は、シトシンとグアニンとの間のホスホジエステル結合を表わす。
【００１９】
当該技術において、AVPR1BおよびLRRC41遺伝子のプロモータ領域の塩基配列自体は公知であり、例えば米国国立医学図書館の国立生物情報センター(National Center for Biotechnology Information：NCBI)により提供されるデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)などの公知のデータベースから知ることができる。AVPR1B遺伝子およびLRRC41遺伝子の各種ID番号を、表１に示す。また、AVPR1B遺伝子およびLRRC41遺伝子のプロモータ領域の塩基配列をそれぞれ配列番号１および２として示す。
【００２０】
【表１】
0006551656.tif 000002
【００２１】
本実施形態では、CpG部位のメチル化の有無の判定は、上記のプロモータ領域をメチル化解析した結果に基づいて行うことができる。メチル化解析は、例えば、AVPR1B遺伝子またはLRRC41遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のうち、少なくとも１つのCpG部位のシトシンがメチル化されているか否かを調べることにより行うことができる。この場合、解析するCpG部位は１つであってもよいが、複数のCpG部位のメチル化の有無を解析することが好ましい。なお、複数のCpG部位は、１つの遺伝子のプロモータ領域から選択してもよいし、複数の遺伝子のプロモータ領域のそれぞれの中から選択してもよい。
【００２２】
別の実施形態において、メチル化解析は、AVPR1B遺伝子またはLRRC41遺伝子のプロモータ領域におけるメチル化の頻度を調べることにより行ってもよい。ここで、「メチル化の頻度」とは、たとえば、上記のプロモータ領域に存在するCpG部位の数に対する、メチル化されたCpG部位の数の割合であり得る。この実施形態では、解析対象は、上記のプロモータ領域の全部であってもよいし、少なくとも１つのCpG部位を含む一部分であってもよい。なお、解析対象は、CpG部位を１つしか含んでいなくてもよいが、複数のCpG部位を含んでいることが好ましい。また、解析対象は、上記の遺伝子のうちのいずれか１つのプロモータ領域から決定してもよいし、複数の遺伝子のプロモータ領域から決定してもよい。なお、AVPR1B遺伝子およびLRRC41遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位の位置および数は既知であるので、本実施形態においては、該プロモータ領域におけるメチル化されたCpG部位の数自体をメチル化の頻度として利用できる。
【００２３】
上記のメチル化の頻度は、DNA中のCpG部位のメチル化状態を、後述するMassARRAY(登録商標)などの質量分析法で解析することにより得られる「メチル化スコア」であってもよい。MassARRAY(登録商標)では、DNA断片を測定して、メチル化DNA断片に由来するピークと非メチル化DNA断片に由来するピークとの面積比からメチル化スコアを算出できる。
【００２４】
本実施形態では、AVPR1B遺伝子およびLRRC41遺伝子のプロモータ領域におけるメチル化の頻度は、用手法によって算出してもよいし、コンピュータなどの機械によって算出してもよい。
【００２５】
本実施形態では、AVPR1B遺伝子および/またはLRRC41遺伝子のプロモータ領域中のいずれのCpG部位(あるいは該CpG部位を含む所定の範囲)を解析対象とするかについては特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。なお、これらの遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位の位置および数は既知である。よって、解析対象とするCpG部位または範囲は、後述の公知の解析方法を用いたルーチンの実験により決定することができる。
【００２６】
メチル化解析の手段としては、当該技術において種々の解析方法が公知である。本実施形態の方法では、いずれの解析方法を用いるかは特に限定されない。好ましくは、メチル化DNAと非メチル化DNAとを区別する工程と、DNAを増幅する工程と、メチル化DNAおよび／または非メチル化DNAを検出する工程とを含む方法である。
【００２７】
メチル化DNAと非メチル化DNAとを区別する工程としては、メチル化感受性制限酵素処理、MeDIP法、非メチル化シトシン変換処理などを行う工程が挙げられる。
DNAを増幅する工程としては、PCR法、定量的PCR法、IVT(in vitro transcription)増幅法、SPIA(商標)増幅法などを行う工程が挙げられる。
メチル化DNAおよび／または非メチル化DNAを検出する工程としては、電気泳動法、シークエンス解析法、マイクロアレイ解析法、質量分析法、サザンハイブリダイゼーションなどを行う工程が挙げられる。
【００２８】
MeDIP法とは、抗メチル化シトシン抗体もしくは抗メチル化シチジン抗体、またはメチル化DNA結合タンパク質を特異的に認識する抗体を用いる免疫沈降により、生体試料に含まれるメチル化DNAを濃縮する方法である。本実施形態では、抽出工程で得られたDNAに含まれるメチル化DNAをMeDIP法により濃縮し、得られたメチル化DNAについてメチル化解析を行ってもよい。また、MeDIP法により濃縮したメチル化DNAを、IVT増幅法などにより増幅し、得られた増幅産物について、マイクロアレイを用いてメチル化解析することもできる。このような解析方法は、MeDIP on chip法と呼ばれる。
【００２９】
非メチル化シトシン変換処理とは、生体試料から抽出したDNAと非メチル化シトシン変換剤とを反応させることにより、該DNA中の非メチル化シトシンを他の塩基(ウラシル、チミン、アデニンまたはグアニン)に変換する処理である。ここで、非メチル化シトシン変換剤とは、DNAと反応して該DNA中の非メチル化シトシンを他の塩基(ウラシル、チミン、アデニンまたはグアニン)に変換できる物質である。このような非メチル化シトシン変換剤としては、例えば亜硫酸水素のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの亜硫酸水素塩(バイサルファイト)が好適に用いられる。
【００３０】
バイサルファイトを用いるDNAの処理では、該DNA中の非メチル化シトシンは、脱アミノ化反応によりウラシルに変換されるが、メチル化シトシンには、このような塩基の変換が起こらない。したがって、DNA中のCpG部位のメチル化状態の違いは、バイサルファイトを用いる非メチル化シトシン変換処理によって、塩基配列の違い(CおよびUの違い)に変換される。なお、このようなバイサルファイトによる非メチル化シトシン変換処理は、バイサルファイト処理と呼ばれる。
【００３１】
バイサルファイト処理を行なう場合、バイサルファイトの添加量(濃度)は、DNA中の非メチル化シトシンを十分に変換できる程度であれば特に限定されない。例えば、DNAを含む溶液中の終濃度として１M以上、好ましくは１〜15 M、より好ましくは３〜10 Mである。また、バイサルファイトを添加した後のインキュベーションの条件(温度および時間)は、バイサルファイトの添加量に応じて適宜設定できる。例えば、バイサルファイトを終濃度６Mで添加した場合、50〜80℃で10〜90分間インキュベーションする。
【００３２】
DNAに含まれるCpG部位のメチル化は、バイサルファイト処理したDNAをシークエンス解析して、本来の塩基配列との違いを検出することにより解析できる。この方法は、バイサルファイトシークエンス法と呼ばれている。
【００３３】
また、CpG部位のメチル化は、質量分析法によって解析することができる。具体的には、バイサルファイト処理したDNAを鋳型として、解析対象とする塩基配列に特異的なプライマーセットを用いてPCR増幅した後、得られたPCR産物をさらにIVT増幅することにより、メチル化シトシンおよびウラシルはそれぞれグアニン(G)およびアデニン(A)となる。得られたIVT増幅産物をRNase Aで切断し、得られた核酸断片間におけるGとAとの質量差(16 Da)をMALDI-TOF(マトリックス支援レーザ脱離イオン化−飛行時間)型質量分析装置を用いて検出することにより、DNAのメチル化を解析できる。この方法はMassARRAY(登録商標)解析と呼ばれる。
【００３４】
IVT産物においてRNase Aによって切断される部位は、任意の塩基と該塩基に隣接するウラシル(U)またはチミン(T)との間であることが知られている。したがって、RNase Aによって切断されたIVT産物の塩基配列および質量は、鋳型として用いたDNAの塩基配列から予測することが可能である。したがって、MassARRAY(登録商標)で得られた各ピークについて、鋳型としたDNAの塩基配列のどの部分に由来するかを同定できる。例えば、DNA断片中の１か所のCpG部位がメチル化していた場合、MassARRAY(登録商標)で得られるピークは、高質量側へ16 Daシフトする。複数のCpG部位を有するDNA断片の解析では、例えば、該DNA断片中のCpG部位が２か所メチル化していた場合は32 Daシフトし、３か所メチル化していた場合は48 Daシフトする。
【００３５】
MassARRAY(登録商標)などの質量分析法では、測定したDNA断片のメチル化スコアを算出することができる。例えば、所定の配列のDNA断片について、分析で得られたチャートにおける非メチル化DNA断片のピークとメチル化DNA断片のピークとの面積比が１：３であった場合、このDNA断片のメチル化スコアは、３／(１+３)＝0.75より、0.75となる。なお、メチル化スコアは、理論上、DNA断片が有する全てのCpG部位がメチル化している場合は１であり、全てのCpG部位がメチル化していない場合は０である。
【００３６】
CpG部位のメチル化は、メチル化特異的PCR(MSP)法によって解析することができる。MSP法とは、バイサルファイト処理したDNAを、後述するプライマーセットを用いてPCR増幅を行い、PCR産物の有無を確認することによって、CpG部位のメチル化の有無を解析する方法である。MSP法では、解析対象のCpG部位がメチル化されている(すなわち、シトシンがウラシルに変換されていない)塩基配列は増幅できるが、CpG部位がメチル化されていない(すなわち、該シトシンがウラシルに変換されている)塩基配列は増幅できないプライマーセットを用いる。このようなプライマーセットを用いるMSP法では、PCR産物が得られた場合に、解析対象のCpG部位がメチル化されていることがわかる。また、MSP法は、解析対象のCpG部位のシトシンがウラシルに変換されていない塩基配列は増幅できないが、CpG部位のシトシンがウラシルに変換されている塩基配列は増幅できるプライマーセットを用いて行なうこともできる。この場合、PCR産物が得られなかった場合に、解析対象のCpG部位がメチル化されていることがわかる。
【００３７】
本実施形態では、PCR産物の有無は、例えば、ゲル電気泳動法により確認できる。増幅後の反応液をゲルに電気泳動して、PCR産物に由来するバンドがゲルに存在するか否かを目視で確認してもよい。あるいは、泳動後のゲルの画像を取得して、画像解析により確認してもよい。画像解析は、例えば、ゲルの画像中、PCR産物が存在すると予想される領域の画素の濃淡を示す値(例えば、バンド強度)を取得し、この値と所定の閾値を比較して行うことができる。具体的には、画素の濃淡を示す値が所定の閾値以上である場合、PCR産物が得られたと判定でき、画素の濃淡を示す値が所定の閾値より小さい場合、PCR産物が得られなかったと判定できる。なお、画素の濃淡に関する所定の閾値は特に限定されず、例えば、バックグラウンドの画素の濃淡を示す値であってもよいし、その値の２倍又は３倍の値であってもよい。
【００３８】
MSP法で用いられるプライマーセットに含まれる各プライマーは、解析対象のCpG部位を含む塩基配列に応じて当業者が適宜設計できるが、プライマーの3'末端またはその付近に、解析対象のCpG部位のシトシンを含むように設計することが好ましい。
【００３９】
CpG部位のメチル化は、マイクロアレイを用いて解析することもできる。この場合、解析用マイクロアレイは、AVPR1B遺伝子またはLRRC41遺伝子のプロモータ領域の塩基配列に相補的な核酸プローブを、基板上に固定して作製できる。なお、このようなマイクロアレイは、当該技術において公知の方法により作製できる。
【００４０】
マイクロアレイによる解析では、生体試料から抽出したDNAは、当該技術において公知の標識物質により標識されていることが好ましい。よって、本実施形態の判定方法は、抽出したDNAを標識する工程をさらに含むことが好ましい。この標識工程は、生体試料中の全てのDNAを標識できるので、上記のDNA増幅工程の後に行われるのが有利である。なお、標識物質としては、蛍光物質、ビオチンなどのハプテン、放射性物質などが挙げられる。また、蛍光物質としては、Cy3、Cy5、FITC、Alexa Fluor(商標)などが挙げられる。このようにDNAを標識することにより、マイクロアレイ上のプローブからのシグナルの測定が容易になる。なお、DNAをこれらの標識物質で標識する方法は、当該技術において公知である。
【００４１】
上記のシグナルは、マイクロアレイの種類に応じて適切なシグナルであり得る。例えば、シグナルは、マイクロアレイの各プローブとハイブリダイズしたDNA断片が存在する場合に発生する電気的シグナルであってもよいし、上記のように解析対象のDNAが標識されている場合は、標識物質から生じる蛍光、発光などのシグナルであってもよい。シグナルの検出は、通常のマイクロアレイ測定装置に備えられたスキャナーにより行うことができる。スキャナーとしては、例えば、GeneChip(登録商標) Scanner3000 7G(Affymetrix社)、Illumina(登録商標) BeadArray Reader(Illumina社)などが挙げられる。
【００４２】
本実施形態では、上記のメチル化解析により、メチル化されたCpG部位が有るという解析結果が得られた場合、上記遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位にメチル化が有ると判定できる。別の実施形態では、メチル化解析で得られたメチル化の頻度が所定の閾値より高いか、または閾値と同じという結果が得られた場合、上記遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位にメチル化が有ると判定できる。なお、所定の閾値は特に限定されず、種々の生体試料についてのデータの蓄積により経験的に設定することができる。あるいは、次のようにして所定の閾値を設定してもよい。まず、卵巣癌に由来する癌細胞を含まないことが予め確認されている生体試料(正常卵巣組織または細胞)、および、卵巣癌に由来する癌細胞を含む生体試料のそれぞれから抽出したDNAについて、メチル化の頻度を解析する。次いで、得られた解析結果に基づいて、癌細胞を含まない生体試料のメチル化の頻度よりも高く且つ癌細胞を含む生体試料のメチル化の頻度よりも低い範囲から閾値を設定する。好ましくは、癌細胞を含まない生体試料と癌細胞を含む生体試料とを高精度に区別し得る値を、閾値として設定する。
【００４３】
本実施形態の方法では、上記の判定工程で得られた判定結果に基づいて、被験者の卵巣癌に関する情報を取得する。ここで、卵巣癌に関する情報とは、被験者から採取した生体試料が卵巣癌由来の癌細胞を含むか否かに関する情報である。あるいは、卵巣癌の診断の指標となり得る情報または卵巣癌の診断を補助する情報であってもよく、好ましくは、被験者における卵巣癌の発生もしくは状態またはその両方を示す情報である。そのような情報としては、例えば、卵巣癌が被験者に発生している可能性、卵巣癌がこれから被験者に発生する危険性などが挙げられる。また、被験者に卵巣癌が発生している場合は、卵巣癌に関する情報として、被験者の予後、癌の進行度(ステージ)などが挙げられる。
【００４４】
本実施形態では、判定工程において、メチル化されたCpG部位が有ると判定された場合、生体試料が卵巣癌由来の癌細胞を含むとの情報を取得する。あるいは、卵巣癌が発生していることを示唆する情報、または卵巣癌の状態が不良である(もしくは、悪い)という情報を取得することもできる。また、被験者が卵巣癌になる危険性が高いという情報、または卵巣癌がすでに発生しているという情報を取得することができる。さらに、被験者に卵巣癌が発生しているならば、被験者の予後が不良である(もしくは、悪い)という情報、または癌の状態がより進行したステージであるという情報を取得することができる。
【００４５】
反対に、判定工程において、メチル化されたCpG部位が無いと判定された場合、生体試料が卵巣癌に由来する癌細胞を含まないとの情報を取得する。あるいは、卵巣癌が発生していないことを示唆する情報または卵巣癌の状態が良好であるという情報を取得することもできる。また、被験者が卵巣癌になる危険性が低いという情報、または卵巣癌はまだ発生していないという情報を取得することができる。さらに、被験者に卵巣癌が発生しているならば、被験者の予後が良好であるという情報、または癌の状態がそれほど進行したステージではないという情報を取得することができる。
【００４６】
本発明の範囲には、メチル化解析により卵巣癌に関する情報を取得するためのマーカーとして用いられる核酸も含まれる(以下、単に「マーカー」ともいう)。そのような核酸は、AVPR1B遺伝子またはLRRC41遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位から選択される少なくとも１つを含む単離核酸であり得る。本実施形態では、被験者から採取した生体試料から調製したDNA試料中の上記のマーカーについてメチル化解析を行い、得られた解析結果に基づいて該被験者の卵巣癌に関する情報を取得することができる。なお、メチル化解析および卵巣癌の情報の取得については、これまでに述べたことと同様である。
【００４７】
また、本発明の範囲には、上記のマーカーとして用いられる核酸として、AVPR1B遺伝子またはLRRC41遺伝子のプロモータ領域の全部またはその一部の連続する塩基配列をバイサルファイト処理して得られる配列を有する核酸も包含され得る。このような核酸において、プロモータ領域は、CpG部位と、CpG部位を構成しないシトシン塩基とを含み得る。ここで、CpG部位を構成しないシトシンとは、CpG部位に含まれるシトシン以外であればよく、例えば、シトシン(C)と、アデニン(A)、チミン(T)またはシトシン(C)とが5'から3'への方向にこの順序で隣り合った塩基配列(すなわち、CA、CTまたはCC)中のシトシンが挙げられる。また、そのような核酸は、被検者から単離した核酸に由来する核酸に由来し得る。
本実施形態では、被験者から採取した生体試料から調製したDNA試料中の上記のマーカーについてメチル化解析を行い、得られた解析結果に基づいて該被験者の卵巣癌に関する情報を取得することができる。なお、メチル化解析および卵巣癌の情報の取得については、これまでに述べたことと同様である。
【００４８】
本実施形態のマーカーとして用いられる核酸においては、上記の単離DNAのバイサルファイト処理により、該単離DNA中の非メチル化シトシンはウラシルに変換され得るが、メチル化シトシンはそのままであり得る。本実施形態では、このようなマーカーとして用いられる核酸中のCpG部位のメチル化解析を行うことによって、卵巣癌に関する情報を取得することができる。なお、上記の単離DNAは、これまでに述べたDNA試料の調製と同様にして得ることができる。また、バイサルファイト処理、メチル化解析および卵巣癌の情報の取得についても、これまでに述べたことと同様である。
【００４９】
本実施形態において、マーカーとして用いられる核酸のサイズは、MSP法、シーケンス法または質量分析法によるメチル化解析が可能なサイズであれば特に限定されないが、好ましくは50〜200塩基、より好ましくは80〜130塩基であり得る。
本実施形態において、マーカーとして用いられる核酸としては、例えば、配列番号３〜６のいずれか１つの塩基配列からなるマーカーとして用いられる核酸が挙げられる。この配列番号３〜６のいずれか１つの塩基配列からなるマーカーとして用いられる核酸は、MSP法によるメチル化解析に適している。
【００５０】
本発明の範囲には、卵巣癌検出用試薬キット(以下、単に「キット」ともいう)も含まれる。本実施形態のキットは、バイサルファイト処理された核酸を増幅するためのプライマーを含み得る。このようなプライマーは、AVPR1B遺伝子またはLRRC41遺伝子のプロモータ領域中のCpG部位を有する塩基配列における、CpG部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズし、且つメチル化CpG部位を含む領域にハイブリダイズし得る。
【００５１】
本実施形態において、キットに含まれるプライマーは、MSP法、バイサルファイトシーケンス法などのPCR増幅を伴う解析方法、MassARRAY (登録商標)などの質量分析法によりCpG部位のメチル化解析を行うためのプライマーであり得る。好ましくは、MSP法またはMassARRAY (登録商標)などの質量分析法で用いられるプライマーであり得る。なお、プライマーの塩基配列は、上記のプロモータ領域の塩基配列に応じて当業者が適宜設定できる。このようなプライマーとしては、例えば、配列番号７〜１０のいずれか１つで表される塩基配列のプライマーが挙げられる。
【００５２】
別の実施形態では、上記のキットは、第２のプライマーを含んでいてもよい。このような第２のプライマーは、AVPR1B遺伝子またはLRRC41遺伝子のプロモータ領域中のCpG部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズし得る。また、第２のプライマーは、非メチル化CpG部位のシトシンが変換処理によって他の塩基に変換された配列を含む領域にハイブリダイズし得る。
【００５３】
本発明には、患者の卵巣癌に関する情報の取得をコンピュータに実行させるためのプログラム製品も含まれる。このようなプログラム製品としては、インターネット等を介してダウンロード可能なプログラムや、当該プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体などが例示される。
【００５４】
たとえば、以下のような工程をコンピュータに実行させるためのプログラムが例示される。
被検者由来のDNA試料に含まれるAVPR1B遺伝子およびLRRC41遺伝子の少なくとも１つのプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の解析結果を測定装置から取得するステップ；
取得した解析結果に基づいて、前記生体試料における卵巣癌細胞の有無を判定するステップ。
【００５５】
以下に、本実施形態の方法を実施するのに好適な装置の一形態を、図面を参照して説明する。しかし、本発明はこの実施形態のみに限定されるものではない。図５は、被検者の卵巣癌に関する情報の取得に用いる診断補助装置の一例を示した概略図である。図５に示された診断補助装置１０は、測定装置２０と、前記測定装置２０と接続された判定装置３０とを含んでいる。
【００５６】
本実施形態において、MSP法によりメチル化解析を行う場合、測定装置２０は、蛍光イメージスキャナなどのゲルイメージング装置であり得る。この場合、MSP法による核酸増幅を行った反応液をゲル電気泳動し、泳動後のゲルを測定装置２０にセットすると、測定装置２０は増幅産物を検出する。そして、測定装置２０は、増幅産物のゲル画像情報を取得し、得られた情報を判定装置３０に提供する。
【００５７】
なお、測定装置２０は、MALDI-TOF型質量分析装置であってもよい。この場合、測定装置２０は、被験物質の飛行時間や質量電荷比(m/z値)などの質量分析情報を取得する。被験者由来のDNA試料から調製した測定用試料を測定装置２０にセットすると、測定装置２０は、該測定用試料に含まれる核酸の質量分析情報を取得し、得られた質量分析情報を判定装置３０に提供する。
【００５８】
判定装置３０は、コンピュータ本体３００と、キーボードやマウスからなる入力部３０１と、ＬＣＤやＣＲＴからなり検体情報や判定結果などを表示する表示部３０２とを含む。判定装置３０は、測定装置２０から、増幅産物のゲル画像情報を取得する。そして、判定装置３０は、これらの情報に基づいて、被検者における卵巣癌に関する情報を提供するプログラムを実行する。
なお、判定装置３０は、図５に示されるように測定装置２０とは別個の機器であってもよいし、測定装置２０を内包する機器であってもよい。後者の場合、判定装置３０は、それ自体で診断補助装置１０であり得る。
【００５９】
図６は、判定装置３０のコンピュータ本体３００のソフトウェアを機能ブロックで示すブロック図である。図６に示されるように、コンピュータは、取得部３２１と、記憶部３２２と、算出部３２３と、判定部３２４と、出力部３２５とを備える。取得部３２１は、測定装置２０と、ネットワークを介して通信可能に接続されている。
【００６０】
取得部３２１は、測定装置２０から提供された情報を取得する。記憶部３２２は、判定に必要な閾値およびバンド強度を取得するための式や処理プログラムなどを記憶する。算出部３２３は、取得部３２１で取得された情報を用い、記憶された処理プログラムにしたがって、バンド強度を算出する。判定部３２４は、取得部３２１によって取得されたか、または算出部３２３によって算出されたバンド強度が、記憶部３２２に記憶された閾値以上であるか否かを判定する。出力部３２５は、判定部３２４による判定結果を、被検者の卵巣癌に関する情報(例えば、被検者から採取した生体試料中の卵巣癌細胞の有無)として表示部３０２へ出力する。
【００６１】
図７は、図６に示すコンピュータ本体３００のハードウェア構成を示すブロック図である。図７に示されるように、コンピュータ本体３００は、ＣＰＵ(Central Processing Unit)３１０と、ＲＯＭ(Read Only Memory)３１１と、ＲＡＭ(Random Access Memory)３１２と、ハードディスク３１３と、入出力インターフェイス３１４と、読出装置３１５と、通信インターフェイス３１６と、画像出力インターフェイス３１７とを備えている。ＣＰＵ３１０、ＲＯＭ３１１、ＲＡＭ３１２、ハードディスク３１３、入出力インターフェイス３１４、読出装置３１５、通信インターフェイス３１６および画像出力インターフェイス３１７は、バス３１８によってデータ通信可能に接続されている。
【００６２】
ＣＰＵ３１０は、ＲＯＭ３１１に記憶されているプログラムおよびＲＡＭ３１２にロードされたプログラムを実行することが可能である。ＣＰＵ３１０がプログラムを実行することにより、図６に示す各機能が実行される。これにより、判定装置３０が、被検者の卵巣癌に関する情報を提供するための判定装置として機能する。
【００６３】
ＲＯＭ３１１は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成されている。ＲＯＭ３１１には、前述のようにＣＰＵ３１０によって実行されるプログラムおよびこれに用いるデータが記録されている。
【００６４】
ＲＡＭ３１２は、ＳＲＡＭ、ＤＲＡＭなどによって構成されている。ＲＡＭ３１２は、ＲＯＭ３１１およびハードディスク３１３に記録されているプログラムの読み出しに用いられる。ＲＡＭ３１２はまた、これらのプログラムを実行するときに、ＣＰＵ３１０の作業領域として利用される。
【００６５】
ハードディスク３１３は、ＣＰＵ３１０に実行させるためのオペレーティングシステム、アプリケーションプログラム(被検者の卵巣癌に関する情報を提供するためのコンピュータプログラム)などのプログラムおよび当該プログラムの実行に用いるデータがインストールされている。
【００６６】
読出装置３１５は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、ＤＶＤ−ＲＯＭドライブなどによって構成されている。読出装置３１５は、可搬型記録媒体４０に記録されたプログラムまたはデータを読み出すことができる。
【００６７】
入出力インターフェイス３１４は、例えば、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインターフェイスと、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインターフェイスと、Ｄ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインターフェイスとから構成されている。入出力インターフェイス３１４には、キーボード、マウスなどの入力部３０１が接続されている。操作者は、当該入力部３０１により、コンピュータ本体３００に各種の指令を入力することが可能である。
【００６８】
通信インターフェイス３１６は、例えば、Ethernet(登録商標)インターフェイスなどである。コンピュータ本体３００は、通信インターフェイス３１６により、プリンタなどへの印刷データの送信も可能である。
【００６９】
画像出力インターフェイス３１７は、ＬＣＤ、ＣＲＴなどで構成される表示部３０２に接続されている。これにより、表示部３０２は、ＣＰＵ３１０から与えられた画像データに応じた映像信号を出力することができる。表示部３０２は、入力された映像信号にしたがって画像(画面)を表示する。
【００７０】
次に、診断補助装置１０による、被検者の卵巣癌に関する情報の取得の処理手順を説明する。
図８は、卵巣癌に関する情報の取得のフローチャートの一例である。ここでは、被検者由来の生体試料を用いて得られたゲル画像情報からバンド強度を取得し、得られたバンド強度が閾値以上であるか否かの判定を行う場合を例として挙げて説明する。しかし、本発明は、この実施形態のみに限定されるものではない。
【００７１】
まず、ステップＳ１−１において、診断補助装置１０の取得部３２１は、測定装置２０からAVPR1B遺伝子およびLRRC41遺伝子の少なくとも１つについてのゲル画像情報を取得する。次に、ステップＳ１−２において、算出部３２３は、得られたゲル画像情報からバンド強度を取得し、記憶部３２２に送信する。
【００７２】
その後、ステップＳ１−３において、判定部３２４は、ステップＳ１−２で取得したバンド強度が、記憶部３２２に記憶された閾値以上であるか否かの判定を行う。ここで、バンド強度が閾値以上であるとき、ルーチンはステップＳ１−４に進行する。そして、判定部３２４は被検者由来の生体試料に卵巣癌細胞があることを示す判定結果を出力部３２５に送信する。一方、バンド強度が閾値より小さいとき、ルーチンはステップＳ１−５に進行する。そして、判定部３２４は被検者由来の生体試料に卵巣癌細胞がないことを示す判定結果を出力部３２５に送信する。
【００７３】
最後に、ステップＳ１−６において、出力部３２５は、判定結果を、被検者の卵巣癌に関する情報として出力し、表示部３０２に表示させる。これにより、診断補助装置１０は、被検者が卵巣癌を患っているか否かについて診断することを補助する情報を医師などに提供することができる。
【００７４】
以下に、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【００７５】
実施例１：  卵巣癌の癌部組織および非癌部組織、ならびに正常組織のメチル化データを利用した新規マーカーの同定
(1)メチル化データの取得
実施例１では、卵巣癌の癌部組織(49検体)および卵巣癌の非癌部組織(1検体)について、TCGA(The Cancer Genome Atlas：http://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaHome2.jsp)において公開されているInfinium HumanMethylation450 BeadChip(Illumina社)のメチル化データを取得した。また、正常組織(23検体)について、Nazor KL.らの文献(Recurrent variations in DNA methylation in human pluripotent stem cells and their differentiated derivatives. Cell Stem Cell 2012;10(5):620-634)に公開されているInfinium HumanMethylation450 BeadChipのメチル化データを取得した。
【００７６】
(2)新規マーカーの同定
Infinium HumanMethylation450 BeadChip(Illumina社)を用いたデータマイニングの結果、AVPR1B遺伝子またはLRRC41遺伝子のプロモータ領域が、卵巣癌の癌部組織に特異的にメチル化が認められるマーカーとして同定された(図１参照)。以降、これらのマーカーを本実施例のマーカーとも呼ぶ。
【００７７】
実施例２：  複数種類の癌／腫瘍由来の癌／腫瘍組織検体、非癌部組織検体および正常組織検体におけるメチル化データの比較
(1)メチル化データの取得
実施例２では、13種類の癌／腫瘍組織検体、10種類の非癌部組織検体および19種類の正常組織検体のメチル化データを比較した。なお、各組織の検体数を以下の表に示す。
【００７８】
【表２】
0006551656.tif 000003
【００７９】
【表３】
0006551656.tif 000004
【００８０】
【表４】
0006551656.tif 000005
【００８１】
表４において、「RCAST」の欄の検体については、Infinium HumanMethylation450 Bead Chip（Illumina社）を用いたInfinium Methylation Assayにより本発明者らがメチル化データを取得した。「論文１」および「論文２」の欄の検体については、下記の文献に公開されているInfinium HumanMethylation450 BeadChip（Illumina社）のメチル化データを取得した。
・論文１：Nazor KLら、Recurrent variations in DNA methylation in human pluripotent stem cells and their differentiated derivatives. Cell Stem Cell 2012;10(5):620-634
・論文２：Reinius LEら、Differential DNA Methylation in Purified Human Blood Cells: Implications for Cell Lineage and Studies on Disease Susceptibility, PLoS One, 7(7) e41361
【００８２】
なお、ここでいうメチル化データとは、次のようにして得られたAVPR1BおよびLRRC41のそれぞれのCpG領域のメチル化率(mCpG)である。Infinium HumanMethylation450 BeadChipには、ヒトのゲノム上にあるCpGサイトのうち、482,421ヶ所のCpGサイトごとにメチル化用プローブと非メチル化用プローブを設けている。対象となる遺伝子のCpGサイトのメチル化用プローブのシグナル強度(シグナルM)と非メチル化用プローブのシグナル強度(シグナルU)をBeadArray Readerで検出し、以下の計算式により対象となる遺伝子のCpG領域のメチル化率(mCpG)を算出した。
（mCpG）＝（シグナルM）／{（シグナルM）＋（シグナルU）}
【００８３】
(2)癌／腫瘍組織検体、非癌部組織検体および正常組織検体におけるメチル化陽性率の比較
得られたメチル化率(mCpG)の値について、腫瘍組織検体と正常組織検体との間で統計学的に有意な差を認められる場合にメチル化陽性とした。そして、各癌種のメチル化陽性率(％)を算出した。
メチル化陽性率（％）＝（メチル化陽性検体数／総検体数）×100
(例えば、脳腫瘍の場合、メチル化陽性率は「脳腫瘍検体のうちメチル化陽性検体数／脳腫瘍総検体数(＝114）×100」によって算出する。)
【００８４】
結果を図２に示す。なお、図２において、「正常組織」とは、表４に示される組織のうち、各種の正常血球成分60検体を除く正常組織を表し、「正常血球」とは各種の正常血球成分60検体を表す。図２より、本実施例のマーカーはいずれも、非癌部組織、ならびにヒト正常組織およびヒト正常血球ではメチル化はほとんど認められない。また、本実施例のマーカーはいずれも、他の癌に比べて、卵巣癌において特に高度にメチル化していることがわかった。よって、本実施例のマーカーは、卵巣癌の検出に好適であることが示された。
【００８５】
実施例３：  健常人および卵巣癌患者の組織におけるメチル化データ(MSP)の比較
(1)生体試料
実施例３では、卵巣癌患者由来の生体試料として、卵巣明細胞腺癌患者から採取した癌部組織のFFPEサンプル(３検体)、卵巣類内膜腺癌患者から採取した癌部組織のFFPEサンプル(３検体)および卵巣漿液性腺癌患者から採取した癌部組織のFFPEサンプル(３検体)を用いた。また、対照試料として、正常卵巣組織(１検体)を用いた。
【００８６】
(2)測定用試料の作製
(i)ゲノムDNAの抽出
上記の各卵巣癌組織のFFPEサンプルからゲノムDNAを、QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(QIAGEN社)を用いて抽出した。正常組織からゲノムDNAを、QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN社)を用いて抽出した。また、対照用ゲノムDNAとして、ヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAを用いた。このヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAを、GenomiPhi v2DNA amplificationキット(GEヘルスケアライフサイエンス社)を用いて増幅した。得られた増幅産物は非メチル化DNAからなる。次いで、該増幅産物をBioruptor(COSMO BIO社製)により断片化して、非メチル化DNA断片(０％メチル化DNA)の溶液を得た。この非メチル化DNA断片の溶液の一部を取り、これにSssIメチラーゼ(New England Biolab社)を反応させることによりＣＧ配列にある全てのシトシンをメチル化させて、メチル化DNA断片(100％メチル化DNA)の溶液を得た。
【００８７】
(ii)バイサルファイト処理
上記で得られた各DNA断片(500 ng)を、EZ DNA Methylation Kit(Zymo Research社)を用いてバイサルファイト処理を行い、処理後のゲノムDNAを滅菌蒸留水(80μl)に溶出した。
【００８８】
(3)MSP
上記(2)で得られた測定用試料および対照試料を用いて、MSPを行った。用いたPCR試薬の組成、プライマーセットおよびPCR条件を以下に示す。
＜PCR試薬＞
DW(滅菌水)                                       18.8μL
10×PCR buffer with MgCl2(Roche社)                2.5μL
10 mM dNTP mix                                    0.5μL
10μMセンスプライマー                             1.0μL
10μMアンチセンスプライマー                       1.0μL
Faststart Taq polymerase(Roche社)                 0.2μL
測定用試料                                        1.0μL 
トータル                                         25.0μL
【００８９】
＜プライマーセット＞
上記のMSPで用いたプライマーセットを表５に示す。これらのプライマーセットは、増幅対象の領域のDNAがメチル化している場合に増幅産物を得ることができるプライマーセット(以下、「メチル化検出用プライマーセット」とも呼ぶ)である。また、精度管理用プライマーセットとして、バイサルファイト処理が適切に行なわれたか否かを判定するためのプライマーセットも用いた(表６参照)。AVPR1B遺伝子およびLRRC41遺伝子のプロモータ領域において、メチル化検出用プライマーセットで解析される領域の塩基配列を、それぞれ配列番号３および４で示した。
【００９０】
【表５】
0006551656.tif 000006
【００９１】
【表６】
0006551656.tif 000007
【００９２】
＜PCR反応条件＞
95℃で6分、
95℃で30秒、Ｘ℃で30秒、72℃で30秒をＹサイクル、
72℃で7分、
16℃で放置。
なお、上記の反応条件において「Ｘ」および「Ｙ」はそれぞれ、表５および６に示されるアニーリング温度およびサイクル数を表す。
【００９３】
（4）メチル化特異的PCR（MSP）の結果解析
上述のMSPで得られた増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動で確認した。結果を図３に示す。なお、図中で「control」として示されている「０」および「100」はそれぞれ０％メチル化対照試料および１００％メチル化対照試料を表す。
【００９４】
図３より、精度管理用プライマーセットを用いたPCRでは、全ての試料についてバンドを検出した。このことから、試料のバイサルファイト処理が適切に行なわれたことがわかる。メチル化検出用プライマーセットを用いたPCRでは、正常卵巣組織の試料についてメチル化CpGに由来するバンドを検出しなかった。これに対して、卵巣癌組織の試料についてのPCRでは、AVPR1Bについては９症例中５症例でバンドを検出した。また、LRRC41については９症例中３症例でバンドを検出した。このように、MSP法による本実施例のマーカーのメチル化解析では、実施例１のInfinium法の結果と同様に、本実施例のマーカーのメチル化と卵巣癌とが相関することが示された。すなわち、AVPR1BおよびLRRC41は高率に卵巣癌でメチル化傾向を示すが、正常卵巣組織では検出されない特異性の高いマーカーであることが示された。
【００９５】
実施例４：  種々の癌組織及び正常組織におけるメチル化データの比較
(1)生体試料
本実施例では、生体試料として、種々の癌の患者から採取した組織試料と、種々の臓器の正常組織とを用いた。各試料の詳細については、表７に示す。なお、表７中、「Ｔ」は腫瘍組織、「Ｎ」は正常組織、「PBL」は末梢血白血球(peripheral blood leukocyte)を表す。
【００９６】
【表７】
0006551656.tif 000008
【００９７】
(2)測定用試料及び対照試料の作製
(i)ゲノムDNAの抽出
実施例３と同様にして、各組織試料からゲノムDNAを抽出した。また、対照用ゲノムDNAとして、ヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAを用いた。実施例３と同様にして、このヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAから、非メチル化DNA断片(０％メチル化DNA)の溶液及びメチル化DNA断片(100％メチル化DNA)の溶液を得た。
【００９８】
(ii)バイサルファイト処理
上記で得られた各DNA断片(500 ng)を、EZ DNA Methylation Kit(Zymo Research社)を用いてバイサルファイト処理を行い、処理後のゲノムDNAを滅菌蒸留水(80μl)に溶出した。
【００９９】
(3)MSP
上記(2)で得られた測定用試料及び対照試料(バイサルファイト処理後のDNA)を用いて、MSPを行った。なお、実施例４のMSPで用いたプライマーセット、PCR試薬の組成及びPCRの反応条件は実施例３と同じである。
【０１００】
(4)結果解析
上述のMSPで得られた増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動で確認した。結果を図４に示す。なお、図中の「NC」及び「PC」は、それぞれ０％メチル化対照試料及び100％メチル化対照試料を表す。また、「精度管理」は精度管理用プライマーの増幅産物を示す。
【０１０１】
図４より、精度管理用プライマーセットを用いたPCRでは、全ての試料についてバンドを検出したので、試料のバイサルファイト処理が適切に行なわれたことがわかる。メチル化検出用プライマーセットを用いたPCRでは、いずれの癌組織及び正常組織の試料においてもメチル化CpGに由来するバンドを検出しなかった。この結果より、本実施例のマーカーは、卵巣癌に特異的なマーカーであることが示唆された。
【符号の説明】
【０１０２】
１０      診断補助装置
２０      測定装置
３０      判定装置
４０      記録媒体
３００    コンピュータ本体
３０１    入力部
３０２    表示部
３１０    ＣＰＵ
３１１    ＲＯＭ
３１２    ＲＡＭ
３１３    ハードディスク
３１４    入出力インターフェイス
３１５    読出装置
３１６    通信インターフェイス
３１７    画像出力インターフェイス
３１８    バス
３２１    取得部
３２２    記憶部
３２３    算出部
３２４    判定部
３２５    出力部
【図１Ａ】
0006551656.tif 000009
【図１Ｂ】
0006551656.tif 000010
【図２Ａ】
0006551656.tif 000011
【図２Ｂ】
0006551656.tif 000012
【図３】
0006551656.tif 000013
【図４】
0006551656.tif 000014
【図５】
0006551656.tif 000015
【図６】
0006551656.tif 000016
【図７】
0006551656.tif 000017
【図８】
0006551656.tif 000018
【配列表】
0006551656000001.app