(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
i）SEQ ID NO:02およびSEQ ID NO:03を含む群から選択されるヘリカーモチーフアミノ酸配列を含む化合物と、
ii）kabatに従って決定される軽鎖CDR2中のシステイン残基を有し、該軽鎖CDR2中の該システイン残基が、kabatの軽鎖可変ドメインナンバリングに従う位置55にあることを特徴とする、該ヘリカーモチーフアミノ酸配列に特異的に結合する抗体と
を含むコンジュゲートであって、
該ヘリカーモチーフアミノ酸配列を含む該化合物と、該抗ヘリカー抗体の該軽鎖CDR2中の該システイン残基との間にジスルフィド結合を含む、コンジュゲート。
【請求項２】
ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物が、ポリペプチド配列の一方の末端またはポリペプチド配列内のいずれかに融合されたヘリカーモチーフアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする、請求項1記載のコンジュゲート。
【請求項３】
前記抗体が、重鎖についてはSEQ ID NO:04の可変ドメインと同様の超可変ループを、軽鎖についてはSEQ ID NO:06の可変ドメインと同様の超可変ループを含むことを特徴とする、請求項1〜2のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項４】
前記抗体が、アクセプターヒトフレームワークをさらに含む、請求項3記載のコンジュゲート。
【請求項５】
前記抗体が、非ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗原に対する第1結合特異性とヘリカーモチーフアミノ酸配列に対する第2結合特異性とを含む二重特異性抗体であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項６】
酸化還元活性作用物質を添加することなくジスルフィド結合がシステイン残基間に形成されることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項７】
SEQ ID NO:04のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、SEQ ID NO:06のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインとを含む、抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体。
【請求項８】
ヘリカーモチーフアミノ酸配列に特異的に結合する抗体として、請求項7記載の抗体を含むことを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項９】
請求項1〜6および8のいずれか一項記載のコンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む薬学的製剤。
【請求項１０】
請求項1〜6および8のいずれか一項記載のコンジュゲートを含む、医薬。
【請求項１１】
がんを処置するためのものである、請求項10記載の医薬。
【請求項１２】
治療用ポリペプチドを含む請求項1〜6および8のいずれか一項記載のコンジュゲートの、該治療用ポリペプチドの安定性を増加させるための使用。
【請求項１３】
治療用ポリペプチドを含む請求項1〜6および8のいずれか一項記載のコンジュゲートの、該治療用ポリペプチドのインビボ半減期を増加させるための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ヘリカー（helicar）モチーフアミノ酸配列と抗ヘリカー抗体とを含む（共有結合）複合体であって、ヘリカーモチーフアミノ酸配列がペイロード中に存在するかまたはペイロードにコンジュゲートされており、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有要素と抗ヘリカー抗体とが単結合によって互いに共有結合で連結されている複合体を、本明細書では報告する。共有結合的複合体の生産方法およびその用途も報告する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ポリペプチドの治療的応用にとって大きな障害は、ポリペプチドの限られた溶解度、インビボ安定性、短い血清中半減期、および血流からの迅速なクリアランスである。
【０００３】
これらの短所に対処するためにさまざまなアプローチが報告されている。しかしそれらの技術はいずれも、免疫原性のリスクや生物学的活性を喪失する可能性に直面することなく薬物動態（PK）の調整を可能にするロバストで汎用性のあるプラットフォームにはならない。
【０００４】
治療用ポリペプチドのPK/安定性および生物物理学的挙動を改良するためのアプローチの1つは、当該ポリペプチドを安定化し、それを溶解した状態に保ち、その半減期を延長する実体に、それらを融合することである。そのような実体の例は、ヒト血清アルブミンまたはヒト免疫グロブリンFc領域である。このアプローチは、天然のアミノ酸残基で構成されていて、C末端またはN末端のいずれかにおける修飾を、その生物学的活性を喪失することなく許容する多くの線状ポリペプチドに、応用することができる。環状ポリペプチド、ステープルド（stapled）ポリペプチド、非天然アミノ酸残基または追加の修飾を含有するポリペプチドは、融合ポリペプチドとして組換え生産することができない。しかし、治療的応用にはそのようなポリペプチドが望ましい選択肢になる場合もある。なぜなら、それらはプロテアーゼ安定性、活性および特異性の点で、「通常の」線状ポリペプチドより優れていることが多いからである。
【０００５】
治療用ポリペプチドのPK/安定性および生物物理学的挙動を改良するためのアプローチの1つであって、環状ポリペプチド、ステープルドポリペプチド、非天然構造を含有するポリペプチドにも応用することができるものに、ポリマーへの化学的または酵素的コンジュゲーション、例えばPEG化またはHES化がある。しかしそのような修飾は、ポリペプチドの生物学的活性の著しい低減につながることが多く、また一定の状況では安全性または毒性の問題の原因にもなりうる。
【０００６】
治療用ポリペプチドの安定化またはPK調整のための既存の化学カップリング技術の大半が持つ大きな欠点は、その複雑さである。化学カップリング工程に加えて、これらの方法は、多くの場合、あいまいな化学量論および/または不明確な位置でPK調整実体につながった、ポリペプチド誘導体の混合物をもたらす。加えて、現在使用されているポリペプチド修飾技術は、治療用ポリペプチドの生物学的活性を強く低減するか、さらには完全に喪失させる結果に終わることが多い。さらにまた、化学コンジュゲートの薬理学的特性および/または考えうる分解経路を予測することは困難である。
【０００７】
ヘリカー要素は、α-ヘリックスを形成する12merのアミノ酸ペプチドで構成されている。このペプチドの構造要素はNygaardらの文献に記載されており、この文献には、抗ヘリカー抗体や、GCN4と呼ばれる酵母ロイシンジッパータンパク質の一部である12merペプチドとの複合体構造も報告されている。抗体部分Fvは、ファージディスプレイ技法を使って、25pMのアフィニティーまで、親和性成熟が行われている（Zahnd, C., et al., J. Biol. Chem. 279（2004）18870-18877）（非特許文献１）。
【０００８】
Metz, S., et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108（2011）8194-8424）（非特許文献２）は、標的ペイロード送達のための二重特異性ジゴキシゲニン結合抗体を報告している。非共有結合的な抗体複合体形成によるハプテン化ペプチドのPK調整が、Hoffmann, E., et al.によって報告されている（J. Contr. Rel. 171（2013）48-56）（非特許文献３）。WO2012/093068（特許文献１）では、抗dig抗体とペプチドにコンジュゲートされたジゴキシゲニンとの複合体の薬学的組成物が報告されている。低ピコモル濃度域のアフィニティーを持つペプチド結合性一本鎖抗体複合体（scFv）のインビトロ指向性進化（directed in vitro evolution）および結晶解析が、Zahnd, C., et al.によって報告されている（J. Biol. Chem. 279（2004）18870-18877）（非特許文献１）。Hanes, J., et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95（1998）14130-14135）（非特許文献４）は、リボソームディスプレイが、免疫ライブラリーから高アフィニティー抗体をインビトロで効率よく選択し、進化させることを報告している。
【０００９】
US5,804,371は、ハプテン標識ペプチドと、免疫学的検出方法におけるそれらの用途とを報告している。ジゴキシゲニン標識ペプチド（ブラジキニン）と、炎症組織におけるブラジキニンの化学発光酵素イムノアッセイへのその応用とが、Decarie, A., et al.によって報告されている（Peptides 15（1994）511-518）（非特許文献５）。
【００１０】
WO2004/065569（特許文献2）には、多機能抗体が報告されている。
【００１１】
WO2014/006124（特許文献3）には、共有結合的ハプテン-抗ハプテン抗体複合体が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】WO2012/093068
【特許文献２】WO2004/065569
【特許文献３】WO2014/006124
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Zahnd, C., et al,, J. Biol. Chem. 279（2004）18870-18877
【非特許文献２】Metz, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108（2011）8194-8424
【非特許文献３】Hoffmann, E., et al., J. Contr. Rel. 171（2013）48-56
【非特許文献４】Hanes, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95（1998）14130-14135
【非特許文献５】Decarie, A., et al., Peptides 15（1994）511-518
【発明の概要】
【００１４】
ヘリカーが媒介する複合体形成を使って、ヘリカーモチーフアミノ酸配列を含むポリペプチドを、そのポリペプチド配列の一方の末端またはそのポリペプチド配列内のいずれかにおいて、共有結合でコンジュゲートできることを見いだした。挿入の場合は、12merヘリカーモチーフアミノ酸配列をポリペプチドの配列内に挿入するか、または既存のヘリカル（helical）モチーフを改変することで、抗ヘリカー抗体認識に関与する必須のアミノ酸を組み入れる。
【００１５】
ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物を抗ヘリカー抗体に共有結合でコンジュゲートすることにより、当該化合物の安定性、PK特性の改良、また二重特異性抗体の場合には、付加的なターゲティングを達成できることがわかった。
【００１６】
本明細書に報告する一局面は、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物とヘリカーモチーフアミノ酸配列に特異的に結合する抗体とを含むコンジュゲートであって、該ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物と、抗ヘリカー抗体のKabatに従って決定されるCDR2中のアミノ酸残基との間の共有結合を特徴とする、コンジュゲートである。
【００１７】
本明細書に報告するコンジュゲートおよび方法では、ヘリカーモチーフアミノ酸配列で誘導体化した時に、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物と抗体のCDR2中のアミノ酸残基との間に共有結合を形成させるための官能性残基を含む化合物は、どれでも使用できることがわかった。官能基の場所がヘリカーモチーフアミノ酸配列内にあれば、ヘリカーモチーフ誘導体化化合物を変更した時に、抗体のCDR2中の官能基の合成および位置を再設計する必要がない点で、有利である。
【００１８】
本明細書に報告する一局面は、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物と、該ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物のヘリカーモチーフアミノ酸配列に特異的に結合する抗体（抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体）とを含むコンジュゲートであって、該ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物と、抗体のKabatに従って決定されるCDR2中のアミノ酸残基との間の共有結合を特徴とする、コンジュゲートである。
【００１９】
一態様では、CDR2は軽鎖CDR2である。
【００２０】
一態様では、ヘリカーモチーフアミノ酸配列は、アミノ酸配列：
0006602304.tif 000002
、または1つのアミノ酸残基がシステインに変化しているその変異体である。一態様では、ヘリカーモチーフアミノ酸配列は、アミノ酸配列：
0006602304.tif 000003
を有し、その3つのC末端アミノ酸残基のうちの1アミノ酸残基がシステインに変化しているものである。一態様では、ヘリカーモチーフアミノ酸配列は、以下：
0006602304.tif 000004
のアミノ酸配列を有する。
【００２１】
一態様では、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物は、ヘリカーモチーフアミノ酸配列、任意でリンカー、およびペイロードを含む。
【００２２】
一態様では、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物は、ポリペプチド配列の一方の末端またはポリペプチド配列内のいずれかに融合されたヘリカーモチーフアミノ酸配列を含むポリペプチドである。この態様では、ペイロードはポリペプチドである。
【００２３】
本明細書に報告する一局面は、i）SEQ ID NO:01、1つのアミノ酸残基がシステインに変更されているSEQ ID NO:01の変異体、SEQ ID NO:02、およびSEQ ID NO:03を含む群から選択されるヘリカーモチーフアミノ酸配列を含む化合物と、ii）該ヘリカーモチーフアミノ酸配列に特異的に結合する抗体と、を含むコンジュゲートであって、該ヘリカーモチーフアミノ酸配列と、抗ヘリカー抗体のKabatに従って決定されるCDR2中のアミノ酸残基との間に共有結合を含む、コンジュゲートである。
【００２４】
一態様では、CDR2は軽鎖CDR2である。
【００２５】
一態様では、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物は、ヘリカーモチーフアミノ酸配列、任意でリンカー、およびペイロードを含む。
【００２６】
すべての局面の一態様において、共有結合は、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物と抗体のCDR2中のアミノ酸残基との間にある。
【００２７】
一態様では、共有結合は、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物中の官能基と抗体のCDR2中のアミノ酸残基との間にある。
【００２８】
一態様では、官能基は、ヘリカーモチーフアミノ酸配列中にある。
【００２９】
一態様では、共有結合は、抗体の軽鎖CDR2中のシステイン残基とヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物中の官能基との間にある。
【００３０】
一態様では、抗体の軽鎖CDR2中のシステイン残基は、Kabatの軽鎖可変ドメインナンバリングに従う位置55または位置51にある。
【００３１】
一態様では、抗体の軽鎖CDR2中のシステイン残基は、Kabatの軽鎖可変ドメインナンバリングに従う位置55にある。
【００３２】
すべての局面の一態様において、共有結合は、ジスルフィド結合である。
【００３３】
すべての局面の一態様において、共有結合は、ヘリカーモチーフアミノ酸配列中のシステイン残基と抗ヘリカー抗体の軽鎖のCDR2中のシステイン残基との間のジスルフィド結合である。一態様では、ヘリカーモチーフアミノ酸配列は、SEQ ID NO:02のアミノ酸配列を有する。
【００３４】
すべての局面の一態様において、抗体は、非ヘリカー抗原に対する第1結合特異性とヘリカーモチーフアミノ酸配列に対する第2結合特異性とを含む二重特異性抗体である。一態様では、（非ヘリカー）抗原は、細胞表面抗原である。一態様では、細胞表面抗原は、腫瘍関連抗原である。一態様では、二重特異性抗体の一方の重鎖がホール（hole）突然変異を含み、それぞれの他方の鎖がノブ（knob）突然変異を含む。一態様では、二重特異性抗体の一方の重鎖が突然変異T366S、L368A、およびY407Vを含み、それぞれの他方の鎖が突然変異T366Wを含む。一態様では、二重特異性抗体の一方の重鎖が突然変異S354Cをさらに含み、それぞれの他方の鎖が突然変異Y349Cを含む。
【００３５】
一態様では、二重特異性抗体は、一方または両方の重鎖C末端にscFvもしくはdsscFvもしくはscFabもしくはdsscFabまたはそれらの組み合わせが直接またはペプチドリンカーを介して融合されている完全長抗体である。
【００３６】
一態様では、二重特異性抗体は、完全長抗体である。一態様では、二重特異性抗体の一方の重鎖がホール突然変異を含み、それぞれの他方の鎖がノブ突然変異を含む。
【００３７】
一態様では、ペイロードは、結合部分、標識部分、および生物活性部分から選択される。
【００３８】
一態様では、抗体は、完全長抗体である。
【００３９】
一態様では、抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体である。
【００４０】
一態様では、抗体の定常領域は、IgG1サブクラスまたはIgG4サブクラスの定常領域である。
【００４１】
一態様では、抗体は、KabatのEUインデックスによるナンバリングに従う位置234および位置235にアラニンを持ち、かつ位置329にグリシンを持つ、IgG1サブクラスの定常領域を有する。
【００４２】
一態様では、抗体は、KabatのEUインデックスによるナンバリングに従う位置228にプロリンを持ち、位置235にグルタミン酸を持ち、かつ位置329にグリシンを持つ、IgG4クラスの定常領域を有する。
【００４３】
一態様では、抗体は、抗体フラグメントである。一態様では、フラグメントは、Fabまたは（Fab）2である。
【００４４】
すべての局面の一態様において、コンジュゲートは、1つの軽鎖CDR2につき厳密に1つの共有結合を含む。
【００４５】
一態様では、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物は、抗体のCDR2中のシステイン残基のチオール基と共有結合を形成することができる反応性基を含む。一態様では、反応性基は、チオール、またはマレイミド、またはハロアセチルである。
【００４６】
すべての局面の一態様において、共有結合は、ジスルフィド結合である。一態様では、ジスルフィド結合は、酸化還元活性作用物質を添加することなく形成される。
【００４７】
一態様では、コンジュゲートは、治療部分または検出可能部分を含む。一態様では、治療部分または検出可能部分は、ヘリカーモチーフアミノ酸配列に共有結合でコンジュゲートされるか、またはヘリカーモチーフアミノ酸配列が治療部分または検出可能部分に組み入れられる。
【００４８】
一態様では、ヘリカーモチーフアミノ酸配列は、5〜500個のアミノ酸からなるポリペプチドにコンジュゲートされる。一態様では、ポリペプチドは、10〜450個のアミノ酸残基を含む。一態様では、ポリペプチドは、12〜450個のアミノ酸残基を含む。一態様では、ポリペプチドは、15〜400個のアミノ酸残基を含む。
【００４９】
一態様では、ヘリカーモチーフアミノ酸配列は、検出可能なラベルにコンジュゲートされる。
【００５０】
一態様では、ヘリカーモチーフアミノ酸配列は、ポリペプチドまたは検出可能ラベルまたはペイロードに、リンカーを介してコンジュゲートされる。一態様では、リンカーは、非ペプチドリンカーである。一態様では、リンカーは、ペプチドリンカーである。
【００５１】
本明細書に報告する一局面は、軽鎖において、Kabatに従って決定されるCDR2中にシステイン残基を有する抗ヘリカー抗体である。
【００５２】
一態様では、抗体の軽鎖CDR2中のシステイン残基は、Kabatの軽鎖可変ドメインナンバリングに従う位置55または位置51にある。
【００５３】
一態様では、抗体の軽鎖CDR2中のシステイン残基は、Kabatの軽鎖可変ドメインナンバリングに従う位置55にある。
【００５４】
一態様では、抗体は、Kabatの軽鎖可変ドメインナンバリングに従う位置55または位置51にあるシステイン残基を、厳密に1つの軽鎖可変ドメインに有する。
【００５５】
すべての局面の一態様において、抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体である。
【００５６】
一態様では、抗体は、完全長抗体であるか、Fabであるか、scFvであるか、またはFc領域にコンジュゲートされたscFvである。
【００５７】
一態様では、システインは、孤立した（isolated）システイン残基または孤立したホモシステイン残基と、ジスルフィド結合を形成する。
【００５８】
本明細書に報告する一局面は、本明細書に報告するコンジュゲートと細胞傷害性作用物質とを含むイムノコンジュゲートである。
【００５９】
本明細書に報告する一局面は、本明細書に報告するコンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む薬学的製剤である。
【００６０】
医薬として使用するための本明細書に報告するコンジュゲート。
【００６１】
がんを処置するための本明細書に報告するコンジュゲート。
【００６２】
糖尿病を処置するための本明細書に報告するコンジュゲート。
【００６３】
脂肪症を処置するための本明細書に報告するコンジュゲート。
【００６４】
炎症性疾患を処置するための本明細書に報告するコンジュゲート。
【００６５】
代謝性疾患を処置するための本明細書に報告するコンジュゲート。
【００６６】
ウイルス性疾患を処置するための本明細書に報告するコンジュゲート。
【００６７】
本明細書に報告する一局面は、医薬の製造における、本明細書に報告するコンジュゲートの使用である。
【００６８】
本明細書に報告する一局面は、診断剤としての、本明細書に報告するコンジュゲートの使用である。
【００６９】
本明細書に報告する一局面は、治療用ポリペプチドを含む本明細書に報告するコンジュゲートの、該治療用ポリペプチドの安定性を増加させるための使用である。
【００７０】
本明細書に報告する一局面は、治療用ポリペプチドを含む本明細書に報告するコンジュゲートの、該治療用ポリペプチドの活性を増加させるための使用である。
【００７１】
本明細書に報告する一局面は、治療用ポリペプチドを含む本明細書に報告するコンジュゲートの、該治療用ポリペプチドのインビボ半減期を増加させるための使用である。
【００７２】
本明細書に報告する一局面は、疾患の処置における、本明細書に報告するコンジュゲートの使用である。
【００７３】
本明細書に報告する一局面は、疾患を有する個体を処置する方法であって、有効量の本明細書に報告するコンジュゲートを該個体に投与する工程を含む方法である。
【００７４】
本明細書に報告する一局面は、個体の疾患を処置する方法であって、有効量の本明細書に報告するコンジュゲートを該個体に投与する工程を含む方法である。
【００７５】
一態様では、疾患は、がんである。
【００７６】
一態様では、疾患は、糖尿病である。
【００７７】
一態様では、疾患は、脂肪過多症である。
【００７８】
本明細書に報告する一局面は、第1反応性基を含む抗ヘリカー抗体と第2反応性基を含むヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物との組み合わせを含む本明細書に報告するコンジュゲートを生産する方法であって、第1反応性基を保持するアミノ酸残基のアルファ炭素原子がヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物の原子から約10〜11オングストローム離れている、方法である。
【００７９】
本明細書に報告する一局面は、本明細書に報告するコンジュゲートを生産する方法であって、以下の工程を含む方法である:
・ヘリカーモチーフアミノ酸配列に特異的に結合し、かつCDR2中の1つのアミノ酸残基に第1反応性基を含む抗ヘリカー抗体を、第2反応性基を含みかつペイロード、例えば5〜500個のアミノ酸からなるペプチドまたは検出可能ラベルを含むヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物と、溶液中で混和する工程、および
・該溶液からコンジュゲートを回収する工程。
【００８０】
本明細書に報告する一局面は、本明細書に報告するコンジュゲートを形成させるための抗ヘリカー抗体を生産する方法であって、
・抗ヘリカー抗体をコードする核酸を含む細胞を培養する工程、および
・細胞または培養培地から抗ヘリカー抗体を回収する工程
を含み、該抗ヘリカー抗体では、抗ヘリカー抗体とヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物の非共有結合的複合体のX線構造において、共有結合を形成させようとする抗体CDR2中のアミノ酸残基のアルファ炭素原子とヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物の原子との間に10〜11オングストロームの距離を有する軽鎖CDR2中の残基が、システインに突然変異している、方法である。
【００８１】
本明細書に報告する一局面は、抗体CDR2中の残基と、結合したヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物との間に共有結合を形成させるために、システインに突然変異させることができる抗ヘリカー抗体CDR2中の位置を同定するための方法であって、
・抗ヘリカー抗体とヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物との非共有結合的複合体の結晶構造を提供する工程、および
・抗体CDR2中のアミノ酸残基のアルファ炭素原子とヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物中の原子との間に10〜11オングストロームの距離がある、抗ヘリカー抗体のCDR2中のアミノ酸残基、およびヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物中の原子を同定する工程
を含み、同定された位置が、抗体CDR2中の残基と、結合したヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物との間に共有結合を形成させるために、システインに突然変異させることができる抗体CDR2中の位置である、方法である。
【００８２】
本明細書に報告する一局面は、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物をターゲット細胞に標的送達するための二重特異性抗ヘリカー抗体であって、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物に特異的に結合する第1結合特異性（部位）と、ターゲット細胞の細胞表面マーカーに特異的に結合する第2結合特異性とを含む、二重特異性抗体である。
【００８３】
本明細書に報告する一局面は、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物を脳に送達するための、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物と、ヘリカーモチーフアミノ酸配列に特異的に結合する第1結合特異性および血液脳関門受容体に特異的に結合する第2結合特異性を有する抗体とからなる複合体の使用である。
【００８４】
一態様では、血液脳関門受容体は、トランスフェリン受容体（TfR）、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体（IGF受容体）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質8（LRP8）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質1（LRP1）、およびヘパリン結合性上皮成長因子様成長因子（HB-EGF）からなる群より選択される。
【００８５】
一態様では、二重特異性抗体は、2つの結合部位を含む完全長抗体である。
【００８６】
一態様において、二重特異性抗体は、1つまたは2つのscFvまたはscFabが融合されていて、3つまたは4つの結合部位を含む、完全長抗体である。
【００８７】
一態様では、二重特異性抗体は、抗体フラグメントである。一態様では、抗体フラグメントは、F（ab'）2およびダイアボディから選択される。
【００８８】
一態様では、二重特異性抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体である。
【００８９】
一態様では、二重特異性抗体は、エフェクター機能を持たない。一態様では、二重特異性抗体は、機能的Fc領域を持たない。一態様では、二重特異性抗体は、Fc領域を持たない。一態様では、二重特異性抗体は、突然変異L234A、L235A、およびP329G（これらの位置はKabat（Kabat EUインデックス）のFc領域ナンバリングに従って決められる）を持つヒトIgG1サブクラスのFc領域を有する。一態様では、二重特異性抗体は、突然変異S228P、L235E、およびP329G（これらの位置はKabat（Kabat EUインデックス）のFc領域ナンバリングに従って決められる）を持つヒトIgG4サブクラスのFc領域を有する。
【００９０】
一態様では、二重特異性抗体は、
a）ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物に対して1つの結合部位および血液脳関門受容体に対して1つの結合部位、または
b）ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物に対して2つの結合部位および血液脳関門受容体に対して1つの結合部位、または
c）ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物に対して1つの結合部位および血液脳関門受容体に対して2つの結合部位、または
d）ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物に対して2つの結合部位および血液脳関門受容体に対して2つの結合部位
を含む。
【００９１】
上記態様のb）およびc）の場合、二重特異性抗体の一方の重鎖はホール突然変異を含み、それぞれの他方の鎖はノブ突然変異を含む。
【００９２】
好ましい一態様では、二重特異性抗体は、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物に対して2つの結合部位および血液脳関門受容体に対して1つまたは2つの結合部位を含む。
【００９３】
一態様では、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物は、ハプテンとペイロードの間に、リンカーを含む。一態様では、リンカーは、ペプチドリンカーである。一態様では、リンカーは、化学的リンカー（非ペプチドリンカー）である。
【００９４】
ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物を抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物抗体に共有結合でカップリングすることにより、当該化合物の安定化とPK特性の改良とを達成することができることがわかった。
【００９５】
一態様では、二重特異性抗体とヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物とがそれぞれに官能基を含み、二重特異性抗体がヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物に結合した時に、該ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物と該二重特異性抗体との間に共有結合が形成される。
【００９６】
一態様では、二重特異性抗体は、抗体のKabatに従って決定されるCDR2中にあるアミノ酸残基に、官能基を含む。一態様では、抗体のCDR2中にあるアミノ酸残基の官能基は、チオール基である。一態様では、二重特異性抗体は、抗体のCDR2中にシステインアミノ酸残基を含む。
【００９７】
すべての局面の一態様において、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物は、そのヘリカーモチーフアミノ酸配列中に、またはヘリカーモチーフアミノ酸配列と化合物との間にリンカーが存在するなら、そのリンカー中に、官能基を含む。一態様では、官能基は、チオール、またはマレイミド、またはハロアセチルである。一態様では、ヘリカーモチーフアミノ酸配列中の官能基、またはリンカーが存在するならそのリンカー中の官能基が、チオール基である。
【００９８】
すべての局面の一態様において、共有結合は、抗体のCDR2中のシステイン残基と、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物中のチオール基との間にある。一態様では、共有結合は、ジスルフィド結合である。一態様では、共有結合は、ジスルフィド結合であり、酸化還元活性作用物質を添加することなく形成される。
【００９９】
すべての局面の一態様において、CDR2は、軽鎖CDR2である。一態様では、抗体の軽鎖CDR2中のシステイン残基は、Kabatの軽鎖可変ドメインナンバリングに従う位置51または位置55にある。好ましい一態様では、抗体の軽鎖CDR2中のシステイン残基は、Kabatの軽鎖可変ドメインナンバリングに従う位置55にある。
【０１００】
ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物と抗体の軽鎖CDR2中のシステイン残基との間にジスルフィド共有結合を形成させるための官能基を含むシステインでヘリカーアミノ酸配列を誘導体化すれば、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物には、任意の化合物を使用できることがわかった。ヘリカーモチーフアミノ酸配列中にシステイン残基（チオール官能基）を置くことには、ペイロードを変更しても、抗体の軽鎖CDR2中のシステイン残基の合成および位置を再設計する必要がないという利点がある。
【０１０１】
すべての局面の一態様では、1つの軽鎖CDR2につき厳密に1つの共有結合を形成させる。
【０１０２】
すべての局面の一態様では、化合物は、結合部分、標識部分、および生物活性部分から選択される。
【０１０３】
すべての局面の一態様では、生物活性部分は、抗体、ポリペプチド、1種または複数種のCNSターゲットの天然リガンド、1種または複数種のCNSターゲットの天然リガンドの修飾型、アプタマー、阻害性核酸（すなわち小分子阻害性RNA（siRNA）および低分子ヘアピンRNA（shRNA））、ロックト核酸（LNA）、リボザイム、および小分子、または前述のいずれかの活性フラグメントを含む群から選択される。
【０１０４】
すべての局面の一態様では、化合物は、核酸または核酸誘導体である。一態様では、核酸は、iRNAまたはLNAである。
【０１０５】
すべての局面の一態様では、化合物は、ポリペプチドである。
【０１０６】
一態様では、化合物は、小分子（非ポリペプチド生物活性部分）である。
【０１０７】
一態様では、生物活性部分は、ポリペプチドである。一態様では、ポリペプチドは、5〜500個のアミノ酸残基からなる。一態様では、ポリペプチドは、10〜450個のアミノ酸残基を含む。一態様では、ポリペプチドは、15〜400個のアミノ酸残基を含む。一態様では、ポリペプチドは、18〜350個のアミノ酸残基を含む。
【０１０８】
一態様では、二重特異性抗体は、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物に特異的に結合する第1結合特異性（抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列結合特異性）と、（ヒト）トランスフェリン受容体に特異的に結合する第2結合特異性（抗（ヒト）トランスフェリン受容体結合特異性;抗（h）TfR結合特異性）または低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質8に特異的に結合する第2結合特異性（抗低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質8結合特異性;抗LRP8結合特異性）とを含む。
【０１０９】
一態様では、二重特異性抗体は、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物に特異的に結合する2つの結合特異性（2つの抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列結合特異性）と、（ヒト）トランスフェリン受容体に特異的に結合する2つの結合特異性（2つの抗（ヒト）トランスフェリン受容体結合特異性）または低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質8に特異的に結合する2つの結合特異性（抗低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質8結合特異性）とを有する。
[本発明1001]
i）SEQ ID NO:01、1つのアミノ酸残基がシステインに変更されているSEQ ID NO:01の変異体、SEQ ID NO:02、およびSEQ ID NO:03を含む群から選択されるヘリカーモチーフアミノ酸配列を含む化合物と、
ii）該ヘリカーモチーフアミノ酸配列に特異的に結合する抗体と
を含むコンジュゲートであって、該ヘリカーモチーフアミノ酸配列を含む該化合物と、該抗ヘリカー抗体のKabatに従って決定されるCDR2中のアミノ酸残基との間に共有結合を含む、コンジュゲート。
[本発明1002]
前記CDR2が軽鎖CDR2であることを特徴とする、本発明1001のコンジュゲート。
[本発明1003]
共有結合がジスルフィド結合であり、CDR2中のアミノ酸残基がシステイン残基である、本発明1001〜1002のいずれかのコンジュゲート。
[本発明1004]
ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物が、ポリペプチド配列の一方の末端またはポリペプチド配列内のいずれかに融合されたヘリカーモチーフアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする、本発明1001〜1003のいずれかのコンジュゲート。
[本発明1005]
前記抗体の軽鎖CDR2中のシステイン残基が、Kabatの軽鎖可変ドメインナンバリングに従う位置55または位置51にあることを特徴とする、本発明1002〜1004のいずれかのコンジュゲート。
[本発明1006]
前記抗体が、非ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗原に対する第1結合特異性とヘリカーモチーフアミノ酸配列に対する第2結合特異性とを含む二重特異性抗体であることを特徴とする、本発明1001〜1005のいずれかのコンジュゲート。
[本発明1007]
酸化還元活性作用物質を添加することなくジスルフィド結合がシステイン残基間に形成されることを特徴とする、本発明1003〜1006のいずれかのコンジュゲート。
[本発明1008]
軽鎖において、Kabatに従って決定されるCDR2中にシステイン残基を有する、抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体。
[本発明1009]
前記抗体の軽鎖CDR2中のシステイン残基がKabatの軽鎖可変ドメインナンバリングに従う位置55または位置51にある、本発明1008の抗体。
[本発明1010]
重鎖についてはSEQ ID NO:04の可変ドメインと同様の超可変ループを、軽鎖可変ドメインについてはSEQ ID NO:05、またはSEQ ID NO:06、またはSEQ ID NO:07の可変ドメインのいずれかと同様の超可変ループを含み、アクセプターヒトフレームワークをさらに含むことを特徴とする、本発明1008〜1009のいずれかの抗体。
[本発明1011]
ヘリカーモチーフアミノ酸配列に特異的に結合する抗体として、本発明1008〜1010のいずれかの抗体を含むことを特徴とする、本発明1001〜1007のいずれかのコンジュゲート。
[本発明1012]
本発明1001〜1007および1011のいずれかのコンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む薬学的製剤。
[本発明1013]
医薬として使用するための本発明1001〜1007および1011のいずれかのコンジュゲート。
[本発明1014]
医薬が、がんを処置するためのものである、本発明1013の使用。
[本発明1015]
治療用ポリペプチドを含む本発明1001〜1007および1011のいずれかのコンジュゲートの、該治療用ポリペプチドの安定性を増加させるための使用。
[本発明1016]
治療用ポリペプチドを含む本発明1001〜1007および1011のいずれかのコンジュゲートの、該治療用ポリペプチドのインビボ半減期を増加させるための使用。
[本発明1017]
ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物に特異的に結合する第1結合部位と、ターゲット細胞の細胞表面マーカーに特異的に結合する第2結合特異性とを含む、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物をターゲット細胞に標的送達するための二重特異性抗ヘリカー抗体。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】ハプテンと抗体の適当な位置にSH官能性を導入すると、抗体とハプテンは両者の間に共有結合を形成してコンジュゲートを生じることが可能になる。
【図２】SDS-PAGE自己蛍光バンドパターンの概略図（他にSDS-PAGEゲルの染色はない）:  A:抗体とハプテン-発蛍光団コンジュゲートとの間に共有結合が形成されていない場合は、還元条件下でも非還元条件下でも、遊離ハプテン-発蛍光団コンジュゲートの分子量に、1本の自己蛍光バンドを検出することができる。  B:抗体とハプテン-発蛍光団コンジュゲートとの間に共有結合が形成されている場合、非還元条件下では、抗体とハプテン-発蛍光団コンジュゲートとを合わせた分子量に、1本の自己蛍光バンドを検出することができる。還元条件下では、抗体とハプテン-発蛍光団コンジュゲート（ハプテン化化合物）とのコンジュゲート中のジスルフィド架橋が切断され、遊離ハプテン-発蛍光団コンジュゲートの分子量に、1本の自己蛍光バンドを検出することができる。
【図３】酸化還元活性作用物質、すなわち酸化作用物質（グルタチオンジスルフィド、GSSG）および還元作用物質（ジチオエリスリトール、DTE）の存在下での、ハプテン結合性Cys突然変異型抗体とハプテン-Cys-蛍光ラベルコンジュゲート（ハプテン化化合物）とのコンジュゲート形成:抗体の複合体形成と、それに続く所定の位置における共有結合による連結を、SDS PAGE分析における蛍光シグナルで検出する。非還元SDS-PAGE分析（上側の像）および還元SDS-PAGE分析（下側の像）を実施例3で述べるように行った。共有結合で抗体に連結されたハプテンは、非還元条件下で適当な位置に、サイズが大きいタンパク質結合型シグナルとして検出することができる。これらのシグナルは還元するとタンパク質を離れ、還元条件下では小さな実体として見える。左:蛍光像右:クーマシーブルー染色シリーズ1: 52bC突然変異を持つ抗ジゴキシゲニン抗体シリーズ2:位置52bに野生型残基を持つ抗ジゴキシゲニン抗体（A）3mM DTEおよび10mM GSSGによる共有結合的カップリング;（B）0.3mM DTEおよび1mM GSSGによる共有結合的カップリング;（C）0.03mM DTEおよび0.1mM GSSGによる共有結合的カップリング。
【図４】酸化作用物質（グルタチオンジスルフィド、GSSG）だけが存在し、還元作用物質が存在しないか、またはどちらも存在しない場合の、ハプテン結合性Cys突然変異型抗体とハプテン-Cys-蛍光ラベルコンジュゲートとの複合体形成:抗体の複合体形成と、それに続く所定の位置における共有結合による連結を、SDS PAGE分析における蛍光シグナルによって検出する。非還元SDS-PAGE分析（上側の像）および還元SDS-PAGE分析（下側の像）を実施例4で述べるように行った。共有結合で抗体に連結されたハプテンは、非還元条件下では適当な位置に大きなサイズのタンパク質に結合したシグナルとして検出することができる。これらのシグナルは還元するとタンパク質を離れ、還元条件下では小さな実体として見える。左:蛍光像。右:クーマシーブルー染色。シリーズ1: 52bC突然変異を持つ抗ジゴキシゲニン抗体。シリーズ2:位置52bに野生型残基を持つ抗ジゴキシゲニン抗体。（A）添加物なし;（B）1mM GSSGによる共有結合的カップリング;（C）0.1mM GSSGによる共有結合的カップリング。
【図５Ａ】共有結合的コンジュゲートおよび非共有結合的複合体を、非複合体化抗原/ハプテンと比較した、インビボ血中PK試験の結果;ビオチン-Cy5非共有結合的複合体、および非複合体化ビオチン-Ser-Cy5（アスタリスク）の、Cy5媒介蛍光の相対的残存蛍光強度（％、黒い記号）;t＝0.08時間の時点における蛍光シグナルを100％に設定した;加えて、マウス血清試料中のヒトIgGの相対的残存濃度を示す（白抜きの記号）;t＝0.08時間におけるIgG血清中濃度（mg/ml）を100％に設定した。
【図５Ｂ】共有結合的コンジュゲートおよび非共有結合的複合体を、非複合体化抗原/ハプテンと比較した、インビボ血中PK試験の結果;共有結合（SS架橋）コンジュゲート、および非複合体化ビオチン-Ser-Cy5（アスタリスク）の、Cy5媒介蛍光の相対的残存蛍光強度（％、黒い記号）;t＝0.08時間の時点における蛍光シグナルを100％に設定した;加えて、マウス血清試料中のヒトIgGの相対的残存濃度を示す（白抜きの記号）;t＝0.08時間におけるIgG血清中濃度（mg/ml）を100％に設定した。
【図６】マウスの血清におけるジゴキシゲニン化PYYポリペプチドの量を決定するウェスタンブロット。
【図７】ハプテン化化合物と抗ハプテン抗体との、アフィニティーによって推進される複合体形成の分析。抗体の複合体形成と、それに続く所定の位置における共有結合による連結を、SDS PAGE分析における蛍光シグナルによって検出する。これは、実施例11で述べるように行った。左:非還元試料（ゲルの左側）および還元試料（ゲルの右側）による蛍光像。右:クーマシーブルー染色。1:ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体＋ビオチン-Cys-Cy5；2:ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体VH52bC＋ビオチン-Cys-Cy5；3:ヒト化抗ビオチン抗体＋ビオチン-Cys-Cy5；4:ヒト化抗ビオチン抗体VH53C＋ビオチン-Cys-Cy5。白い矢印は、過剰の（カップリングしていない）ビオチン-Cys-Cy5を示しており、抗ジゴキシゲニン抗体VH52bCを使用した場合には、それがかなり高い。これは、この場合のコンジュゲーション反応がアフィニティーによって推進されるものではないからである。
【図８】Dig-Cy5非共有結合的複合体および共有結合的（ジスルフィド架橋）コンジュゲート、ならびに非複合体化Dig-Cy5のCy5媒介蛍光の相対的残存蛍光強度（％）;t＝0.08時間の時点における蛍光シグナルを100％に設定した;加えて、マウス血清試料中のヒトIgGの相対的残存量も示す;t＝0.08時間におけるIgG血清中濃度（mg/ml）を100％に設定した。
【図９】非侵襲的眼イメージングによって決定した、非共有結合的複合体および共有結合的（ジスルフィド架橋）コンジュゲートのビオチン-Cy5ならびに非複合体化ビオチン-Cy5のCy5媒介蛍光のインビボ様条件下での薬物動態;黒い菱形:ビオチン-Cy5;黒い正方形:ビオチン-Cy5＋抗ビオチン抗体（複合体）;三角形: Cy5-ビオチン-抗ビオチン抗体コンジュゲート。
【図１０】ビオチン結合性抗体とビオチン-Cys-Cy5との共有結合的複合体の形成を、非還元SDS PAGEおよび還元SDS PAGEによって実証する;カップリング反応はマウス血清中、37℃で1時間行った。Cy5は、ビオチン-Cys-Cy5とCys突然変異型抗体とを含む試料において、非還元条件下でのみ、H鎖にカップリングしているようである。これらの共有結合的コンジュゲートは還元すると崩壊する（右側のレーン）;レーン1:分子量マーカー; 2〜3 非還元-2:抗ビオチン抗体（Cys突然変異なし）＋ビオチン-Cys-Cy5（複合体）; 3:抗ビオチン抗体-Cys＋ビオチン-Cys-Cy5（コンジュゲート）; 4〜5 還元-5:抗ビオチン抗体（Cys突然変異なし）＋ビオチン-Cys-Cy5（複合体）; 6:抗ビオチン抗体-Cys＋ビオチン-Cys-Cy5（コンジュゲート）。
【図１１】非侵襲的眼イメージングによって決定した、非共有結合的複合体および共有結合的（ジスルフィド架橋）コンジュゲートのビオチン-Cy5ならびに非複合体化ビオチン-Cy5のCy5媒介蛍光のインビボ薬物動態;黒い菱形:ビオチン-Cy5;黒い丸: 抗ビオチン抗体投与の24時間後に投与したビオチン-Cy5（インビボ複合体形成）;黒い正方形:抗ビオチン抗体-Cys投与の24時間後に投与したビオチン-Cys-Cy5（インビボコンジュゲート形成）。
【図１２】抗体0155とヘリカーモチーフアミノ酸配列システイン変異体2とのカップリングのSDS PAGEゲル。2.5モル過剰のヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物を用いると共有結合的複合体0156が形成される;1＝ヘリカーモチーフアミノ酸配列システイン変異体2; 2＝抗体0019; 3＝抗体0155。
【図１３】抗体0157とヘリカーモチーフアミノ酸配列システイン変異体1とのカップリングのSDS-PAGEゲル; 1＝ヘリカーモチーフアミノ酸配列システイン変異体1（酸化型）; 2＝対照カップリング（酸化型）; 3＝共有結合的コンジュゲート（酸化型）; 4＝分子量マーカー; 5＝共有結合的コンジュゲート（還元型）; 6＝対照カップリング（還元型）; 7＝ヘリカーモチーフアミノ酸配列システイン変異体1（還元型）。
【図１４】抗体0155、C末端リジン残基が欠失しているSEQ ID NO:28のシュードモナス（Pseudomonas）外毒素分子LR8Mを含有しヘリカーモチーフアミノ酸配列システイン変異体1、およびそれらの共有結合的コンジュゲートのSECクロマトグラム。
【図１５】非還元試料について、SDS-CE（Caliper）による、コンジュゲーション効率の分析。
【発明を実施するための形態】
【０１１１】
発明の詳細な説明
I.定義
本明細書に関して「アクセプターヒトフレームワーク」とは、以下に定義するヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（VL）フレームワークまたは重鎖可変ドメイン（VH）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、それと同じアミノ酸配列を含んでもよいし、アミノ酸配列変化を含んでいてもよい。いくつかの態様では、アミノ酸変化の数は、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、または2以下である。いくつかの態様では、VLアクセプターヒトフレームワークの配列は、VLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはVLヒトコンセンサスフレームワーク配列と同一である。
【０１１２】
「アミノ酸」という用語は、天然の、すなわち核酸によって直接的にまたは前駆体の形でコードされうる、カルボキシα-アミノ酸、または非天然のカルボキシα-アミノ酸の群を表す。個々の天然アミノ酸は、3つのヌクレオチドからなる核酸、いわゆるコドンまたは塩基トリプレットによってコードされる。各アミノ酸は少なくとも1つのコドンによってコードされる。このことは「遺伝暗号の縮重」として公知である。本願内で使用する用語「アミノ酸」は、アラニン（三文字記号:ala、一文字記号:A）、アルギニン（Arg、R）、アスパラギン（Asn、N）、アスパラギン酸（Asp、D）、システイン（Cys、C）、グルタミン（Gln、Q）、グルタミン酸（Glu、E）、グリシン（Gly、G）、ヒスチジン（His、H）、イソロイシン（Ile、I）、ロイシン（Leu、L）、リジン（Lys、K）、メチオニン（Met、M）、フェニルアラニン（Phe、F）、プロリン（Pro、P）、セリン（Ser、S）、スレオニン（Thr、T）、トリプトファン（Trp、W）、チロシン（Tyr、Y）、およびバリン（Val、V）を含む、天然のカルボキシα-アミノ酸を表す。非天然アミノ酸の例には、Aad（アルファ-アミノアジピン酸）、Abu（アミノ酪酸）、Ach（アルファ-アミノシクロヘキサン-カルボン酸）、Acp（アルファ-アミノシクロペンタン-カルボン酸）、Acpc（1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸）、Aib（アルファ-アミノイソ酪酸）、Aic（2-アミノインダン-2-カルボン酸; 2-2-Aicともいう）、1-1-Aic（1-アミノインダン-1-カルボン酸）,（2-アミノインダン-2-カルボン酸）、アリルグリシン（allylGly）、アロイソロイシン（allo-Ile）、Asu（アルファ-アミノスベリン酸、2-アミノオクタン二酸）、Bip（4-フェニル-フェニルアラニン-カルボン酸）、BnHP（（2S,4R）-4-ヒドロキシプロリン）、Cha（ベータ-シクロヘキシルアラニン）、Cit（シトルリン）、シクロヘキシルグリシン（Chg）、シクロペンチルアラニン、ベータ-シクロプロピルアラニン、Dab（1,4-ジアミノ酪酸）、Dap（1,3-ジアミノプロピオン酸）、p（3,3-ジフェニルアラニン-カルボン酸）、3,3-ジフェニルアラニン、ジ-n-プロピルグリシン（Dpg）、2-フリルアラニン、ホモシクロヘキシルアラニン（HoCha）、ホモシトルリン（HoCit）、ホモシクロロイシン、ホモロイシン（HoLeu）、ホモアルギニン（HoArg）、ホモセリン（HoSer）、ヒドロキシプロリン、Lys（Ac）、（1）Nal（1-ナフチルアラニン）、（2）Nal（2-ナフチルアラニン）、4-MeO-Apc（1-アミノ-4-（4-メトキシフェニル）-シクロヘキサン-1-カルボン酸）、ノル-ロイシン（Nle）、Nva（ノルバリン）、オマチン（Omathine）、3-Pal（アルファ-アミノ-3-ピリジルアラニン-カルボン酸）、4-Pal（アルファ-アミノ-4-ピリジルアラニン-カルボン酸）、3,4,5,F3-Phe（3,4,5-トリフルオロ-フェニルアラニン）、2,3,4,5,6,F5-Phe（2,3,4,5,6-ペンタフルオロ-フェニルアラニン）、Pqa（4-オキソ-6-（1-ピペラジニル）-3（4H）-キナゾリン-酢酸（CAS 889958-08-1））、ピリジルアラニン、キノリルアラニン、サルコシン（Sar）、チアゾリルアラニン、チエニルアラニン、Tic（アルファ-アミノ-1,2,3,4,テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸）、Tic（OH）、Tle（tertブチルグリシン）、およびTyr（Me）があるが、それらに限定されるわけではない。
【０１１３】
「アミノ酸配列変異体」という用語は、ネイティブ配列ポリペプチドとある程度異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。通常、アミノ酸配列変異体は、ネイティブ配列ポリペプチドと少なくとも約70％の配列同一性を有するであろう。一態様において、変異体は、ネイティブ配列ポリペプチドと約80％以上の配列同一性を有する。一態様において、変異体は、ネイティブ配列ポリペプチドと約90％以上の配列同一性を有する。一態様において、変異体は、ネイティブ配列ポリペプチドと約95％以上の配列同一性を有する。一態様において、変異体は、ネイティブ配列ポリペプチドと約98％以上の配列同一性を有する。アミノ酸配列変異体は、ネイティブアミノ酸配列内の一定の位置に置換、欠失、および/または挿入を持つ。アミノ酸は慣用名、一文字記号および三文字記号で指定される。
【０１１４】
本明細書において「抗体」という用語は、最も広義に使用され、例えば限定するわけではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および抗体フラグメントなどといったさまざまな抗体構造を、それらが望ましい抗原結合活性を呈する限り、包含する。
【０１１５】
「抗体フラグメント」という用語は、インタクト抗体以外の分子であって、インタクト抗体のうち、インタクト抗体が結合する抗原に結合する部分を含む分子を表す。抗原フラグメントの例には、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F（ab'）2;ダイアボディ;線状抗体;一本鎖抗体分子（例えばscFv）;および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体があるが、それらに限定されるわけではない。
【０１１６】
「ビオチン」、略して「BI」という用語は、5-［（3aS,4S,6aR）-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ［3,4-d］イミダゾール-4-イル］ペンタン酸を表す。ビオチンはビタミンHまたは補酵素Rとしても公知である。
【０１１７】
「二重特異性抗体」という用語は、2つの異なる（抗原/ヘリカー）結合特異性を有する抗体を表す。一態様では、本明細書において報告する二重特異性抗体は、2つの異なる抗原、すなわちヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物および非ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有抗原に特異的である。
【０１１８】
「キメラ」抗体という用語は、重鎖および/または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来すると共に、重鎖および/または軽鎖の残りの部分が異なる供給源または種に由来する抗体を指す。
【０１１９】
抗体の「クラス」とは、その重鎖が持っている定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体には5つの主要クラス、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、これらのうちのいくつかはさらに、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2などのサブクラス（アイソタイプ）に分割することができる。異なる免疫グロブリンクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれている。
【０１２０】
本明細書において使用する「細胞傷害性作用物質」という用語は、細胞機能を阻害または防止し、かつ/または細胞死もしくは細胞破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害性作用物質として、放射性同位体（例えばAt211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212、およびLuの放射性同位体）;化学療法剤または化学療法薬（例えばメトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他のインターカレーター剤）;増殖阻害性作用物質;酵素およびそのフラグメント、例えば核酸分解酵素;抗生物質;毒素、例えば細菌、真菌、植物、または動物由来の、小分子毒素または酵素活性毒素、ならびにそれらのフラグメントおよび/または変異体;および以下に開示するさまざまな抗腫瘍性作用物質または抗がん性作用物質が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０１２１】
「ジゴキシゲニン」、略して「DIG」という用語は、3-［（3S,5R,8R,9S,10S,12R,13S,14S,17R）-3,12,14-トリヒドロキシ-10,13-ジメチル-1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,15,16,17-テトラデカヒドロ-シクロペンタ［a］-フェナンスレン-17-イル］-2H-フラン-5-オン（CAS番号1672-46-4）を表す。ジゴキシゲニン（DIG）は、もっぱら植物ジギタリス・プルプレア（Digitalis purpurea）、ジギタリス・オリエンタリス（Digitalis orientalis）およびジギタリス・ラナタ（Digitalis lanata）（キツネノテブクロ）の花および葉に見いだされるステロイドである（Polya, G., Biochemical targets of plant bioactive compounds, CRC Press,ニューヨーク（2003）p.847）。
【０１２２】
「エフェクター機能」という用語は、抗体のFc領域に起因しうる生物学的活性を表し、抗体クラスによってさまざまである。抗体エフェクター機能の例として、C1q結合および補体依存性細胞傷害（CDC）; Fc受容体結合;抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）;貪食;細胞表面受容体（例えばB細胞受容体）のダウンレギュレーション;およびB細胞活性化が挙げられる。
【０１２３】
ある薬剤、例えば薬学的製剤の「有効量」という用語は、所望の治療結果または予防結果を達成するのに有効な量、投薬量、および必要な期間を表す。
【０１２４】
抗体をパパイン消化すると、「Fab」フラグメントと呼ばれる2つの同一抗原結合性フラグメント（それぞれが単一の抗原結合部位を持つ）と、残りの「Fc」フラグメント（この名称はそれが容易に結晶化しうることを反映している）とが生成する。ペプシン処理では、2つの抗原結合性部位を有し、抗原を架橋する能力が残っている、F（ab'）2フラグメントが得られる。
【０１２５】
Fabフラグメントは軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第1定常ドメイン（CH1）も含有する。Fab'フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の1つまたは複数のシステインを含む数残基が重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端に付加されている点でFabフラグメントとは異なる。Fab'-SHは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも1つの遊離チオール基を保持しているFab'の本明細書における名称である。F（ab'）2抗体フラグメントは、元々は、Fab'フラグメント間にヒンジシステインを有するFab'フラグメントの対として生産されたものである。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも公知である。
【０１２６】
「Fv」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含有する最小抗体フラグメントである。この領域は、非共有結合で堅く会合した1つの重鎖可変ドメインと1つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。各可変ドメインの3つの超可変領域が相互作用して、VH-VL二量体の表面に抗原結合部位を画定するのは、この構成でのことである。全体として、6つの超可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与している。しかし、単一の可変ドメイン（すなわち、抗原に特異的な3つの超可変領域しか含まないFvの半分）でも、アフィニティーは結合部位全体より低いものの、抗原を認識し抗原に結合する能力は有している。
【０１２７】
本明細書において「Fc領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のC末端領域を画定するために使用される。この用語は、ネイティブ配列Fc領域および変異体Fc領域を包含する。一態様では、ヒトIgG重鎖Fc領域が、Cys226またはPro230から、重鎖のカルボキシル末端まで伸びている。ただし、Fc領域のC末端リジン（Lys447）は、存在しても存在しなくてもよい。本明細書において別段の指定がある場合を除き、Fc領域または定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat, E.A. et al「Sequences of Proteins of Immunological Interest」第5版、Public Health Service, National Institutes of Health,メリーランド州ベセスダ（1991）, NIH Publication 91-3242に記載のEUナンバリグシステム（EUインデックスともいう）に従う。
【０１２８】
「フルオレセイン」、略して「FLUO」という用語は、6-ヒドロキシ-9-（2-カルボキシフェニル）-（3H）-キサンテン-3-オン、あるいは2-（6-ヒドロキシ-3-オキソ-（3H）-キサンテン-9-イル）安息香酸を表す。フルオレセインは、別名をレゾルシノールフタレイン、C.I.45350、ソルベントイエロー（solvent yellow）94、D&Cイエローno.7、アンギオフルオル（angiofluor）、ジャパンイエロー（Japan yellow）201、またはソープイエロー（soap yellow）ともいう。
【０１２９】
「フレームワーク」、略して「FR」という用語は、超可変領域（HVR）残基以外の重鎖および軽鎖可変ドメインアミノ酸残基を表す。可変ドメインのFRは一般に、FR1、FR2、FR3、およびFR4という、4つのFRドメインからなる。したがって、VH（またはVL）にはHVR配列とFR配列が一般に以下の配列で現れる: FR1-H1（L1）-FR2-H2（L2）-FR3-H3（L3）-FR4。
【０１３０】
「遊離システインアミノ酸」という用語は、親抗体に工学的に導入されたシステインアミノ酸残基であって、チオール官能基（SH）を有し、分子内ジスルフィド架橋として対を形成していないものを表す。しかしそれにもかかわらず、遊離システインアミノ酸は、例えばグルタチオンなどと、分子内ジスルフィド架橋として対を形成することができる。
【０１３１】
「完全長抗体」という用語は、ネイティブ抗体と実質的に類似する構造を有する抗体、または本明細書において定義するFc領域を含有する重鎖を有する抗体を表す。ネイティブIgG抗体は、ジスルフィド結合した2本の同一軽鎖と2本の同一重鎖とで構成される、約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、N末端からC末端に向かって、可変領域（VH）（可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインともいう）と、それに続く3つの定常ドメイン（CH1、CH2、およびCH3）とを有する。同様に、各軽鎖は、N末端からC末端に向かって、可変領域（VL）（可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインともいう）と、それに続く軽鎖定常（CL）ドメインとを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる2タイプのうちの一方に割り当てることができる。
【０１３２】
「完全長抗体」は、VLドメインとVHドメインならびに軽鎖定常（CL）ドメインおよび重鎖定常ドメインCH1、CH2およびCH3を含む抗体である。定常ドメインは、ネイティブ配列定常ドメイン（例えばヒトネイティブ配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体であることができる。完全長抗体は、1種または複数種の「エフェクター機能」（この用語は、抗体のFc定常領域（ネイティブ配列Fc領域またはアミノ酸配列変異体Fc領域）に起因しうる生物学的活性を指す）を有しうる。抗体エフェクター機能の例としては、C1q結合;補体依存性細胞傷害;Fc受容体結合;抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）;貪食;およびB細胞受容体やBCRなどの細胞表面受容体のダウンレギュレーションが挙げられる。
【０１３３】
「ハプテン」という用語は、タンパク質などの大きな担体に取り付けられた場合にのみ免疫応答を引き出すことができる小分子を表す。例示的なハプテンは、アニリン、o-、m-、およびp-アミノ安息香酸、キノン、ヒスタミン-スクシニル-グリシン（HSG）、ヒドララジン、ハロタン、インジウム-DTPA、フルオレセイン、ビオチン、ジゴキシゲニン、テオフィリンおよびジニトロフェノールである。一態様では、ハプテンがビオチンまたはジゴキシゲニンまたはテオフィリンまたはカルボランまたはブロモデオキシウリジンである。
【０１３４】
「ヘリカーモチーフアミノ酸配列」という用語は、SEQ ID NO:01のアミノ酸配列またはその変異体を有するアミノ酸配列を表すか、あるいはSEQ ID NO:04の可変重鎖ドメインおよびSEQ ID NO:05の軽鎖可変ドメインを有する抗ヘリカー抗体が特異的に結合するアミノ酸配列を表す。
【０１３５】
「〜にコンジュゲートされたヘリカーモチーフアミノ酸配列」または「ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物」という用語は、ポリペプチドまたはラベルなどといったさらなる部分に共有結合で連結されたヘリカーモチーフアミノ酸配列を表す。活性化ヘリカーモチーフアミノ酸配列誘導体は、そのようなコンジュゲートを形成させるための出発材料として使用することができる。一態様では、リンカーが、a）1つまたは複数（一態様では3〜6個）のメチレン-カルボキシ-メチル基（-CH2-C（O）-）、および/またはb）1〜10個（一態様では1〜5個）のアミノ酸残基（一態様では、グリシン、セリン、グルタミン酸、β-アラニン、γ-アミノ酪酸、ε-アミノカプロン酸またはリジンから選択される）、および/またはc）構造式NH2-［（CH2）nO］xCH2-CH2-COOH［式中、nは2または3であり、xは1〜10であり、一態様では1〜7である］を有する1つまたは複数（一態様では1つまたは2つ）の化合物を含む。最後に挙げた要素は、（少なくとも部分的には）式-NH-［（CH2）nO］xCH2-CH2-C（O）-のリンカー（部分）をもたらす。そのような化合物の一例が、例えば12-アミノ-4,7,10-トリオキサドデカン酸（TEG（トリエチレングリコール）リンカーをもたらす）である。一態様では、リンカーがさらにマレイミド基を含む。このリンカーは、電荷を含有し、かつ/または水素橋を形成することができるので、安定化効果および可溶化効果を有する。加えて、これは、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物への抗ヘリカー抗体の結合を立体的に容易にすることができる。一態様では、リンカーがヘリカーモチーフアミノ酸配列のアミノ酸の側鎖に配置される（例えばリジン側鎖またはシステイン側鎖にアミノ基またはチオール基を介してコンジュゲートされる）。一態様では、リンカーがヘリカーアミノ酸配列のアミノ末端またはカルボキシ末端に配置される。コンジュゲートされる化合物（＝ペイロード）上のリンカーの位置は、典型的には、ペイロードの生物学的活性に影響を及ぼさない領域に選ばれる。したがって、リンカーの取り付け位置は、ペイロードおよび生物学的活性を担う関連構造要素の性質に依存する。ヘリカーモチーフアミノ酸配列を取り付けるペイロードの生物学的活性は、インビトロアッセイで試験することができる。
【０１３６】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養」という用語は可換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞（そのような細胞の子孫を含む）を指す。宿主細胞には、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、これらは初代形質転換細胞およびそこから派生した子孫を含み、継代数は考慮しない。子孫は核酸含有物について親細胞と完全には同一でなくてもよく、突然変異を含みうる。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択の目的にしたものと同じ機能または同じ生物学的活性を有する突然変異型子孫は、ここに包含される。
【０１３７】
「ヒト抗体」とは、ヒトまたはヒト細胞が生産する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト供給源に由来するアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を持つものである。ヒト抗体のこの定義では、非ヒト抗原結合性残基を含むヒト化抗体は特に除外される。
【０１３８】
「ヒト化」抗体とは、非ヒトHVR由来のアミノ酸残基とヒトFR由来のアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。一定の態様において、ヒト化抗体は、少なくとも1つの可変ドメイン、典型的には2つの可変ドメインの実質上すべてを含み、その可変ドメインでは、HVR（例えばCDR）のすべてまたは実質上すべてが非ヒト抗体のものに対応し、FRのすべてまたは実質上すべてがヒト抗体のモノに対応するであろう。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。抗体（例えば非ヒト抗体）の「ヒト化型」とは、ヒト化を受けた抗体を指す。
【０１３９】
本明細書において使用する「超可変領域」または「HVR」という用語は、抗体可変ドメインのうち、配列が超可変であり（「相補性決定領域」または「CDR」）、かつ/または構造上明確なループ（「超可変ループ）を形成し、かつ/または抗原接触残基（「抗原接触部（antigen contact）」を含有する領域のそれぞれを指す。一般に抗体は、6つのHVRを含み、そのうちの3つはVH中にあり（H1、H2、H3）、3つはVL中にある（L1、L2、L3）。
【０１４０】
本明細書においてHVRは、
（a）アミノ酸残基26〜32（L1）、50〜52（L2）、91〜96（L3）、26〜32（H1）、53〜55（H2）、および96〜101（H3）に存在する超可変ループ（Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196（1987）901-917）;
（b）アミノ酸残基24〜34（L1）、50〜56（L2）、89〜97（L3）、31〜35b（H1）、50〜65（H2）、および95〜102（H3）に存在するCDR（Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health,メリーランド州ベセスダ（1991）, NIH Publication 91-3242）;
（c）アミノ酸残基27c〜36（L1）、46〜55（L2）、89〜96（L3）、30〜35b（H1）、47〜58（H2）、および93〜101（H3）に存在する抗原接触部（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262:732-745（1996））;および
（d）HVRアミノ酸残基46〜56（L2）、47〜56（L2）、48〜56（L2）、49〜56（L2）、26〜35（H1）、26〜35b（H1）、49〜65（H2）、93〜102（H3）、および94〜102（H3）を含む（a）、（b）、および/または（c）の組み合わせ
を包含する。
【０１４１】
「個体」または「対象」は哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜（例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えばヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、および齧歯類（例えばマウスおよびラット）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。一定の態様では、個体または対象がヒトである。
【０１４２】
「単離された」抗体とは、その自然環境の一構成要素から分離された抗体である。いくつかの態様では、抗体が、例えば電気泳動法（例:SDS-PAGE、等電点電気泳動（IEF）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー法（例:イオン交換または逆相HPLC）による決定で、純度95％超または99％超まで精製される。抗体の純度を評価するための方法を概観するには、例えばFlatman, S. et al, J. Chrom. B 848（2007）79-87を参照されたい。
【０１４３】
「単離された」核酸とは、その自然環境の一構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、当該核酸分子を通常含有する細胞に含まれている核酸分子であるが、当該核酸分子が染色体外に存在するか、またはその自然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子が含まれる。
【０１４４】
本明細書において使用する「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、例えば天然の突然変異を含有する変異型抗体、またはモノクローナル抗体の生産時に生じる変異型抗体（そのような変異体の存在量は一般に少量である）などといった考えうる変異体抗体を除けば、前記集団を構成する個々の抗体は同一であり、かつ/または同じエピトープに結合する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、1つの抗原上の単一の決定基を指向する。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示しており、何か特定の方法による抗体の生産を必要とするとみなしてはならない。例えば本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定するわけではないがハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法などといったさまざまな技法によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的方法を、本明細書において説明する。
【０１４５】
「単一特異性抗体」という用語は、1つ以上の結合部位を有し、そのそれぞれが同じ結合特異性を有する、すなわち同じ抗原または同じヘリカーモチーフアミノ酸配列に結合する、抗体を表す。
【０１４６】
「裸の抗体」とは、異種部分（例えば細胞傷害性部分）または放射性ラベルにコンジュゲートされていない抗体を指す。裸の抗体は薬学的製剤中に存在しうる。
【０１４７】
「添付文書」という用語は、治療製品の市販パッケージに通例含まれていて、適応症、用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌および/または当該治療製品の使用上の注意に関する情報が記載されている説明書を指すために使用される。
【０１４８】
「親抗体」とは、1つまたは複数のアミノ酸残基を1つまたは複数のシステイン残基で置き換える際の元となるアミノ酸配列を含む抗体である。親抗体はネイティブ配列または野生型配列を含みうる。親抗体は、他のネイティブ型、野生型、または修飾型の抗体との比較で、既存のアミノ酸配列修飾（付加、欠失および/または置換など）を有しうる。親抗体はヘリカーモチーフアミノ酸配列に特異的に結合する。親抗体は、加えて、関心対象のターゲット抗原、例えば生物学的に重要なポリペプチドを指向してもよい。非ポリペプチド抗原を指向する抗体も考えられる。
【０１４９】
「ペイロード」という用語は、細胞（内）に送達し、かつ/または細胞に局在化することが望まれる活性を有する任意の分子または分子の組み合わせを表す。ペイロードとしては、ラベル、細胞毒（例えばシュードモナス外毒素、リシン、アブリン、ジフテリア（Diphtheria）毒素など）、酵素、成長因子、転写因子、薬物、放射性核種、リガンド、抗体、リポソーム、ナノ粒子、ウイルス粒子、サイトカインなどが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０１５０】
「化学療法剤」は、がんの処置に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド（CYTOXAN（商標））;アルキルスルホネート、例えばブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン;アジリジン類、例えばベンゾドパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドパ（meturedopa）、およびウレドパ（uredopa）;エチレンイミン類およびメチルアミルアミン類、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド（trietylenephosphoramide）、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロメラミン;ナイトロジェンマスタード類、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド（chlorophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビチン（novembichin）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード;ニトロ尿素（nitrourea）類、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン;抗生物質、例えばアクラシノマイシン（aclacinomysin）類、アクチノマイシン、アウトラマイシン（authramycin）, アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン（carabicin）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン;代謝拮抗物質、例えばメトトレキサートおよび5-フルオロウラシル（5-FU）;葉酸アナログ、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート;プリン類似体、例えばフルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン;ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、5-FU;アンドロゲン、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン;抗副腎薬（anti-adrenal）、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン;葉酸補充薬、例えばフロリン酸（frolinic acid）;アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトラキサート（edatraxate）;デフォファミン（defofamine）;デメコルチン;ジアジコン;エルフォルニチン（elfornithine）;酢酸エリプチニウム;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシ尿素;レンチナン;ロニダミン;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダモール;ニトラクリン;ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ポドフィリン酸;2-エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK（登録商標）;ラゾキサン;シゾフィラン;スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジコン;2,2',2''-トリ��ロロトリエチルアミン;ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン（gacytosine）;アラビノシド（「Ara-C」）;シクロホスファミド;チオテパ;タキサン類、例えばパクリタキセル（TAXOL（登録商標）、Bristol-Myers Squibb Oncology、ニュージャージー州プリンストン）およびドセタキセル（TAXOTERE（登録商標）、Rh6ne-Poulenc.Rorer、フランス国アントニー）;クロラムブシル;ゲムシタビン;6-チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキサート;白金アナログ、例えばシスプラチンおよびカルボプラチン;ビンブラスチン;白金;エトポシド（VP-16）;イホスファミド;マイトマイシンC;ミトキサントロン;ビンクリスチン;ビノレルビン;ナベルビン;ノバントロン;テニポシド;ダウノマイシン;アミノプテリン;ゼローダ;イバンドロネート;CPT-11;35トポイソメラーゼインヒビターRFS2000;ジフルオロメチルオルニチン（DMFO）;レチノイン酸;エスペラミシン類;カペシタビン;および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。この定義には、腫瘍に対するホルモンの作用を調節または阻害するように作用する抗エストロゲンなどの抗ホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性4（5）-イミダゾール類、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン、およびトレミフェン（Fareston）;ならびに抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン;ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体も含まれる。
【０１５１】
「抗血管新生剤」とは、血管の発達をある程度、遮断しまたは妨害する化合物を指す。抗血管新生剤は、例えば、血管新生の促進に関与する成長因子または成長因子受容体に結合する小分子または抗体でありうる。抗血管新生因子は、一態様では、血管内皮成長因子（VEGF）に結合する抗体である。
【０１５２】
「サイトカイン」という用語は、ある細胞集団によって放出されて別の細胞に細胞間媒介物質として作用するタンパク質の総称である。そのようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、N-メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン;副甲状腺ホルモン;チロキシン;インスリン;プロインスリン;リラキシン;プロリラキシン;糖タンパク質ホルモン、例えば卵胞刺激ホルモン（FSH）、甲状腺刺激ホルモン（TSH）、および黄体形成ホルモン（LH）;肝成長因子（hepatic growth factor）;線維芽細胞成長因子;プロラクチン;胎盤性ラクトーゲン;腫瘍壊死因子-aおよび-P;ミュラー管抑制物質;マウスゴナドトロピン関連ペプチド;インヒビン;アクチビン;血管内皮成長因子;インテグリン;トロンボポエチン（TPO）;神経成長因子、例えばNGF-p;血小板成長因子（platelet growth factor）;トランスフォーミング成長因子（TGF）類、例えばTGF-aおよびTGF-p;インスリン様成長因子-Iおよび-II;エリスロポエチン（EPO）;骨誘導因子;インターフェロン類、例えばインターフェロン-a、-P、および-y;コロニー刺激因子（CSF）類、例えばマクロファージ-CSF（M-CSF）;顆粒球-マクロファージ-CSF（GM-CSF）;および顆粒球-CSF（GCSF）;インターロイキン（IL）類、例えばIL-I、IL-1a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12;腫瘍壊死因子、例えばTNF-αまたはTNF-P;および他のポリペプチド因子、例えばLIFおよびkitリガンド（KL）も含まれる。本明細書において使用する用語サイトカインは、天然供給源からのタンパク質または組換え細胞培養からのタンパク質、ならびにネイティブ配列サイトカインの生物活性等価物を包含する。
【０１５３】
「fMLP」という用語は、N-ホルミルメチオニン、ロイシンおよびフェニルアラニンからなるトリペプチドを表す。一態様では、エフェクター部分がfMLPまたはその誘導体である。
【０１５４】
「プロドラッグ」という用語は、腫瘍細胞に対する細胞傷害性が親薬物と比較して低く、しかも、より活性な親型へと酵素的に活性化されまたは転化されうる、医薬活性物質の前駆体型または誘導体型を指す。例えばWilman「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」Biochemical Society Transactions, Vol. 14, 615th Meeting Belfast（1986）pp.375-382およびStella, et al「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」Directed Drug Delivery, Borchardtら編, pp.247-267, Humana Press（1985）を参照されたい。エフェクター部分として使用することができるプロドラッグとしては、より活性な細胞傷害性遊離薬物に転化することができるホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、サルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、D-アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β-ラクタム含有プロドラッグ、置換されていてもよいフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは置換されていてもよいフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、5-フルオロシトシンおよび他の5-フルオロウリジンプロドラッグが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。本発明において使用するためにプロドラッグ型に誘導体化することができる細胞傷害性薬の例としては、本明細書に記載する化学療法剤が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０１５５】
「細胞傷害性部分」という用語は、細胞の機能を阻害しもしくは防止し、かつ/または細胞死または細胞破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害性作用物質としては、放射性同位体（例えばAt211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212、およびLuの放射性同位体）;化学療法剤または化学療法薬（例えばメトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他のインターカレーター剤）;増殖阻害性作用物質;酵素およびそのフラグメント、例えば核酸分解酵素;抗生物質;毒素、例えば細菌、真菌、植物、または動物由来の、小分子毒素または酵素活性毒素、ならびにそれらのフラグメントおよび/または変異体;および本明細書に開示するさまざまな抗腫瘍性作用物質または抗がん性作用物質が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０１５６】
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列同一性パーセントが最大になるように配列をアラインメントし、必要であればギャップを導入した後に、保存的置換を配列同一性の一部とみなさずに、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当技術分野における技能の範囲に含まれるさまざまな方法で、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGNまたはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使って、達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを得るために必要になるあらゆるアルゴリズムを含めて、配列をアラインメントするための適当なパラメータを決定することができる。ただし、本明細書における目的には、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を使って、アミノ酸配列同一性パーセント（％）値を生成させる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはGenentech, Inc.によって作成されたものであり、米国著作権局（ワシントンD.C., 20559）に利用者向け文書と共に登録申請され、米国著作権登録番号TXU510087として登録されている。ALIGN-2プログラムは、Genentech, Inc.（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）から公的に入手するか、またはソースコードからコンパイルすることができる。ALIGN-2プログラムは、digital UNIX V4.0DなどのUNIXオペレーティングシステム上で使用するためにコンパイルすべきである。配列比較パラメータはいずれもALIGN-2プログラムによって設定され、変動することはない。
【０１５７】
アミノ酸配列比較にALIGN-2を使用する場合、所与のアミノ酸配列Bに対する、または所与のアミノ酸配列Bとの、または所与のアミノ酸配列Bと対比した、所与のアミノ酸配列Aのアミノ酸配列同一性％（これは、所与のアミノ酸配列Bに対して、または所与のアミノ酸配列Bと、または所与のアミノ酸配列Bと対比して、一定のパーセントアミノ酸配列同一性を有する、または含む、所与のアミノ酸配列Aと、言い換えることもできる）は、次のように計算される。
分率X/Y×100
ここで、Xは、配列アラインメントプログラムALIGN-2が、そのプログラムによるAとBとのアラインメントにおいて、完全一致（identical match）と記録したアミノ酸残基の数であり、YはB中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合に、Bに対するAのアミノ酸配列同一性パーセント（％）が、Aに対するBのアミノ酸配列同一性パーセント（％）と一致しないことは、理解されるであろう。別段の具体的言明がある場合を除き、本明細書において使用するアミノ酸配列同一性パーセント（％）値はすべて、すぐ上の段落で説明したように、ALIGN-2コンピュータプログラムを使って得られる。
【０１５８】
「薬学的製剤」という用語は、そこに含まれる活性成分の生物学的活性が有効でありうるような形態にあり、かつその製剤の投与を受ける対象にとって許容できないほど毒性である追加構成要素を含有しない調製物を指す。
【０１５９】
「薬学的に許容される担体」とは、活性成分以外の薬学的製剤の成分を指し、これは対照にとって無毒性である。薬学的に許容される担体として、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または保存剤が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０１６０】
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合で接続されたアミノ酸からなるポリマーであり、天然に生産されたか、合成的に生産されたかを問わない。約20アミノ酸残基未満のポリペプチドは「ペプチド」ということができ、一方、2つ以上のポリペプチドからなる分子または100アミノ酸残基超の1つのポリペプチドを含む分子は「タンパク質」ということができる。ポリペプチドは、糖質基、金属イオン、またはカルボン酸エステルなどの非アミノ酸構成要素も含みうる。非アミノ酸構成要素は、当該ポリペプチドを発現する細胞によって付加される場合があり、細胞のタイプによって異なりうる。本明細書では、ポリペプチドを、そのアミノ酸主鎖構造またはそれをコードする核酸によって定義する。糖質基などの付加物は一般的には明示しないが、それでも存在しうる。
【０１６１】
ポリペプチド配列はすべて、一般に許容されている慣例に従い、アルファ-N末端アミノ酸残基を左側に置き、かつアルファ-C末端アミノ酸残基を右側に置いて記述される。本明細書において使用する用語「N末端」とは、ポリペプチド中のアミノ酸の遊離のアルファ-アミノ基を指し、用語「C末端」はポリペプチド中のアミノ酸の遊離のa-カルボン酸末端を指す。ある基をN末端に持つポリペプチドとは、ある基をN末端アミノ酸残基のアルファ-アミノ窒素上に保持するポリペプチドを指す。ある基をN末端に持つアミノ酸とは、ある基をアルファ-アミノ窒素上に保持するアミノ酸を指す。
【０１６２】
別途、接頭語「D」によって（例えばD-AlaまたはN-Me-D-Ile）または小文字で記載することによって（例えばa、i、l（D型のAla、Ile、Leu））表示を行う場合を除き、本明細書および本願特許請求の範囲に記載するポリペプチド中のアミノ酸およびアミノアシル残基のアルファ炭素の立体化学は、天然の立体配置、すなわち「L」立体配置である。ポリペプチドのN末端にある一定のアシル置換基中のキラル中心の立体化学を指定するには、カーン-インゴールド-プレローグの「R」および「S」表記を使用する。「R,S」という表記は、2つのエナンチオマー型のラセミ混合物を示すものとする。この命名法は、Cahn, R.S., et al, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 5（1966）385-415に記載の命名法に従う。
【０１６３】
「一本鎖Fv」、略して「scFv」という用語は、抗体のVHドメインとVLドメインとを含み、これらのドメインが単一のポリペプチド鎖中に存在する抗体フラグメントを表す。一態様において、このFvポリペプチドは、さらに、VHドメインとVLドメインとの間に、そのscFvが抗原結合のために望ましい構造を形成することができるようにするポリペプチドリンカーを含む。scFvを概観するには、Plueckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, RosenburおよびMoore編, Springer-Verlag,ニューヨーク, pp. 269-315（1994）を参照されたい。
【０１６４】
「テオフィリン」、略して「THEO」という用語は、1,3-ジメチル-7H-プリン-2,6-ジオンを表す。テオフィリンは別名ジメチルキサンチンという。
【０１６５】
「処置」という用語（およびその文法上の変形、例えば「処置する」または「処置すること」）は、処置される個体の自然経過を変化させようとする臨床的介入を表し、予防のために行うか、または臨床病理の過程において行うことができる。処置の望ましい効果としては、疾患の発生または再発を防止すること、症状の軽減、疾患の直接的または間接的な何らかの病理学的帰結の減縮、転移を防止すること、疾患の進行速度を減少させること、疾患状態の改善または一時的緩和、および寛解または予後の改善が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様では、疾患の発達を遅延させるか、疾患の進行を遅らせるために、本発明の抗体を使用する。
【０１６６】
「x価」、例えば「一価」または「二価」または「三価」または「四価」という用語は、1抗体分子中に指定した数（すなわち「x」個）の結合部位が存在することを表す。したがって「二価」、「四価」および「六価」という用語は、1抗体分子中に、それぞれ2つの結合部位、4つの結合部位、および6つの結合部位が存在することを表す。本明細書において報告する二重特異性抗体は少なくとも「二価」であり、「三価」または「多価」（例えば「四価」または「六価」）であってもよい。一態様では、本明細書において報告する二重特異性抗体は、二価、三価、または四価である。一態様では、二重特異性抗体は、二価である。一態様では、二重特異性抗体は、三価である。一態様では、二重特異性抗体は、四価である。
【０１６７】
一定の局面および態様では、本明細書において報告する抗体は、2つ以上の結合部位を有し、かつ二重特異性である。すなわち、結合部位が2つより多い場合（すなわち抗体が三価または多価である場合）でも、抗体は二重特異性でありうる。二重特異性抗体という用語には、例えば、多価一本鎖抗体、ダイアボディ、およびトリアボディ、ならびに完全長抗体の定常ドメイン構造を有し、そこにさらなる抗原結合部位（例えば一本鎖Fv、VHドメインおよび/またはVLドメイン、Fab、または（Fab）2）が1つまたは複数のペプチドリンカーを介して連結されている抗体が包含される。抗体は単一の種に由来する完全長であってもよいし、キメラ化またはヒト化されていてもよい。抗原結合部位が2つより多い抗体の場合、そのタンパク質が2つの異なる抗原に対する結合部位を有する限り、一部の結合部位は同一であってもよい。すなわち、第1結合部位はヘリカーモチーフアミノ酸配列に対して特異的であり、かつ第2結合部位は非ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗原に特異的であるか、またはその逆である。
【０１６８】
「可変領域」という用語は、抗体重鎖または抗体軽鎖のドメインであって、当該抗体のその抗原への結合に関与するドメインを表す。ネイティブ抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は一般に類似する構造を有し、各ドメインは4つの保存されたフレームワーク領域（FR）と3つの超可変領域（HVR）とを含んでいる（例えばKindt, T.J. et al. Kuby Immunology,第6版, W.H. Freeman and Co.,ニューヨーク（2007）の91頁を参照されたい）。抗原結合特異性を付与するにはVHドメインかVLドメインが1つあれば十分である。さらにまた、特定の抗原に結合する抗体を、その抗原に結合する抗体のVHドメインまたはVLドメインを使って、それぞれ相補的なVLドメインまたはVHドメインのライブラリーをスクリーニングすることによって単離することもできる。例えばPortolano, S. et al, J. Immunol. 150（1993）880-887; Clackson, T. et al, Nature 352（1991）624-628）を参照されたい。
【０１６９】
「ベクター」という用語は、そこに連結された別の核酸を伝播させる能力を有する核酸分子を表す。この用語には、自己複製核酸構造としてのベクターと、それが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターとが包含される。一定のベクターは、それが機能的に連結された核酸の発現を指示する能力を有する。そのようなベクターを本明細書では「発現ベクター」という。
【０１７０】
II.本明細書に報告するコンジュゲート
一局面において、本発明は、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物とヘリカーモチーフアミノ酸配列に特異的に結合する抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体とを含む共有結合的コンジュゲートを、ヘリカーモチーフアミノ酸配列中に適正に置かれた官能基と、抗体の可変ドメイン中、特に抗体のKabatによる可変ドメインナンバリングに従って決定されるCDR2中の官能基との間での共有結合の形成によって得ることができるという発見に基づいている。
【０１７１】
一態様では、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物は、ヘリカーモチーフアミノ酸配列、リンカー、およびペイロードを含むコンジュゲートである。
【０１７２】
一定の態様では、官能基は、電子欠損二重結合またはチオールを含有しうる。一態様では、官能基は、マレイミドまたはシステインである。
【０１７３】
本明細書に報告するコンジュゲートは治療用作用物質としてヒトに使用することができるので、ヘリカーモチーフアミノ酸配列に特異的に結合する上記抗体のヒト化変異体も、本明細書に規定する。
【０１７４】
ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物と抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体との共有結合的コンジュゲートは、該ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物に、良好な生物物理学的挙動と改良されたPK特性とを付与しうる。さらにまた、二重特異性抗体を使用すれば、その二重特異性抗体の第2結合特異性によって認識される抗原を提示する細胞にヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物をターゲティングするために、本コンジュゲートを使用することができる。そのようなコンジュゲートは、1つの抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列結合特異性と、1つのさらなる（非ヘリカーモチーフアミノ酸配列）抗原結合特異性とで構成される。抗体対ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有ポリペプチドとの化学量論比は、二重特異性抗体のフォーマットに依存し、1:1、1:2、2:1、2:2、2:4および4:2（抗体:ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有ポリペプチド）であることができる。
【０１７５】
ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物中の生物活性化合物は、ヘリカーモチーフアミノ酸配列にコンジュゲートされていても、また抗体にコンジュゲートされていても、なお、良好な生物学的活性を保っていることが望ましい。また、二重特異性抗体の細胞表面ターゲット結合部位が、共有結合でコンジュゲートされたヘリカーモチーフ含有化合物の存在下で、その結合特異性およびアフィニティーを保っていることも望ましい（二重特異性ターゲティングモジュールの場合）。
【０１７６】
ヘリカーモチーフアミノ酸配列中の反応性基は、例えばマレイミド、例えばN-エチルマレイミド（NEM）、ヨードアセトアミド、ピリジルジスルフィド、または他の反応性コンジュゲーションパートナーなど、任意の反応性基であることができる（例えばHaugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labeling: A Practical Approach, Academic Press,ロンドン; Means（1990）Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. Bioconjugate Techniques（1996）（Academic Press,サンディエゴ）のp.40〜55およびp.643〜671を参照されたい）。
【０１７７】
抗体の反応性基は、選択的に（すなわち位置特異的に）生成させることができるものに限られる。したがってこれは、アミノ酸残基であるシステイン、セリン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸の側鎖基に限られる。
【０１７８】
抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体とヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物との間で共有結合的コンジュゲートを形成させるには、反応性基の導入によって両者を修飾する必要がある。抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体がヘリカーモチーフアミノ酸配列に結合すると、それら2つの反応性基は近接して、共有結合の形成が可能になる。一態様では、修飾は、各化合物へのチオール官能性の導入である。一態様では、チオール化合物は、システイン残基である。
【０１７９】
突然変異させるべき位置は、以下の2つの要件を同時に満たさなければならない:（i）ヘリカーモチーフアミノ酸配列位置決め効果を指向的カップリングに利用するために、カップリング位置は結合領域の近傍に存在すべきであり、かつ、（ii）突然変異およびカップリングの位置は、ヘリカーモチーフアミノ酸配列結合そのものには影響を及ぼさないような位置になければならない。適切な位置を見つけるためのこれらの要件は、事実上、互いに「矛盾」している。なぜなら、要件（i）は、結合部位に近い位置によって満たされ、一方、（ii）は結合部位から離れた位置によって最も安全に達成されるからである。
【０１８０】
これらの事実上排他的な要件にもかかわらず、ヘリカーモチーフアミノ酸配列の位置決めに影響を及ぼさずに突然変異させることができ、それでもなお同時に指向的共有結合的カップリングを可能にする位置が同定された。
【０１８１】
位置の1つは、軽鎖可変ドメインのKabatナンバリングに従う位置VL55にある。
【０１８２】
位置の1つは、軽鎖可変ドメインのKabatナンバリングに従う位置VL51にある。
【０１８３】
これらの位置は、ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体に適用できるので、新しい共有結合的コンジュゲートを作製する必要が生じるたびに一から始める必要はなく、ヘリカーモチーフアミノ酸配列をペイロードに導入するか、コンジュゲートするだけでよい。
【０１８４】
本明細書において報告するように修飾された抗体は、その親（すなわち野生型）抗体対応物のヘリカーモチーフアミノ酸配列結合能を保っている。したがって、改変抗体は、ヘリカーモチーフアミノ酸配列に結合する能力（一態様では特異的に結合する能力）を有する。
【０１８５】
「結合特異性」または「〜に結合する抗体」という用語は、結合特異性を含む分子または抗体が、さらに別の分子と特異的に複合体を形成できることを表す。結合は、プラズモン共鳴アッセイ（BIAcore, GE-Healthcare,スウェーデン国ウプサラ）などのインビトロアッセイで検出することができる。複合体形成のアフィニティーは、ka（化合物の会合による複合体形成の速度定数）、kD（解離定数、複合体の解離）、およびKD（kD/ka）を使って定義される。結合または特異的結合とは、約10-7M以下、一態様では約10-8M〜約10-13M、一態様では約10-9M〜約10-13Mの結合アフィニティー（KD）を意味する。したがって、ヘリカーモチーフアミノ酸配列に結合して本明細書において報告する複合体を形成する抗体は、ヘリカーモチーフアミノ酸配列に、約10-8mol/l以下の結合アフィニティー（KD）で、一態様では約10-8mol/l〜約10-13mol/lの結合アフィニティー（KD）で、特異的に結合する。
【０１８６】
抗体がヘリカーモチーフアミノ酸配列に結合すると、形成される結合がジスルフィド結合である場合には、還元作用物質および/または酸化作用物質を添加しなくても、システイン修飾抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体と、ヘリカーモチーフアミノ酸配列中にシステイン残基を保持するシステイン修飾ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物との間で、共有結合の形成が起こることがわかった。したがって、これら2つの化合物の間のジスルフィド架橋は、非共有結合的複合体が形成されると自発的に形成される。それゆえに、本明細書において報告する共有結合的複合体を形成させるための方法は、単に2つの化合物を混合するだけでよい。ジスルフィド結合を形成させるための唯一の前提条件は、2つの化合物が互いに適切に配向することである。
【０１８７】
本明細書において報告する改変抗体は、反応性基を含むヘリカーモチーフアミノ酸配列と、部位特異的に、かつ効率よく、共有結合でコンジュゲート（カップリング）することができる。
【０１８８】
それぞれ位置VL55またはVL51（Kabatナンバリング方式に従う）のアミノ酸残基をシステイン残基で置き換えると、SEQ ID NO:06およびSEQ ID NO:07に示す重鎖可変領域配列を持つ抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体誘導体が得られた。
【０１８９】
本明細書に報告する一局面は、ヒト化抗体である抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体である。一態様では、抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体は、SEQ ID NO:04のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインに由来するヒト化重鎖可変ドメインと、SEQ ID NO:05のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインに由来するヒト化軽鎖可変ドメインとを含む。
【０１９０】
本明細書に報告する一局面は、ヒト化抗体である抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体である。一態様では、抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体は、SEQ ID NO:04のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインに由来するヒト化重鎖可変ドメインと、SEQ ID NO:06のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインに由来するヒト化軽鎖可変ドメインとを含む。
【０１９１】
本明細書に報告する一局面は、ヒト化抗体である抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体である。一態様では、抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体は、SEQ ID NO:04のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインに由来するヒト化重鎖可変ドメインと、SEQ ID NO:07のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインに由来するヒト化軽鎖可変ドメインとを含む。
【０１９２】
本明細書に報告する一局面は、重鎖についてはSEQ ID NO:04の可変ドメインと同様のCDRを含み、また軽鎖可変ドメインについてはSEQ ID NO:05、またはSEQ ID NO:06、またはSEQ ID NO:07の可変ドメインのいずれかと同様のCDRを含み、そしてさらにアクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む、抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体である。
【０１９３】
本明細書に報告する一局面は、重鎖についてはSEQ ID NO:04の可変ドメインと同様の超可変ループを含み、また軽鎖可変ドメインについてはSEQ ID NO:05、またはSEQ ID NO:06、またはSEQ ID NO:07の可変ドメインのいずれかと同様の超可変ループを含み、そしてさらにアクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む、抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体である。
【０１９４】
例えば、抗体が持つ薬物動態特性の利点を獲得すると共に、PYYに固有の不安定性を回避するために、ヘリカーモチーフアミノ酸配列を含むようにPYYを修飾し、抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体との複合体を形成させた。
【０１９５】
PYY3-36ペプチドの構造を調べると（Nygaard, R., et al, Biochem. 45（2006）8350-8357; SEQ ID NO:26）、中央アミノ酸にヘリカルモチーフ（ヘリカー様モチーフアミノ酸配列）が明らかになる。N末端イソロイシンと修飾されたC末端はこのペプチドの機能的活性にとって必須であると記述されているので、ヘリカーモチーフアミノ酸配列中のアミノ酸を反映するように、中央のヘリックスを修飾した。
0006602304.tif 000005
【０１９６】
完全IgG1抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体0019および修飾PYYペプチドPYY_ヘリカーを、抗体溶液にわずかに過剰のペプチドを適用することによって、インビトロで得た。複合体0052が形成された。複合体の化学量論は、SEC-Malls分析実験によって、1つの二価抗体に1.6個のペプチドが複合体化されていると決定された。
【０１９７】
抗体0019、PYY（3-36）野生型、PYY_ヘリカーおよび複合体0052を、Y2受容体ファミリーに対するそれらの効果について試験した。
0006602304.tif 000006
【０１９８】
実証されているとおり（Hoffmann, E., et al, J. Cont. Rel. 171（2013）48-56）、抗体との複合体を形成したペプチドは、インビボでの半減期が長くなる。そのうえ、驚いたことに、本複合体は、NPY2R受容体に対するアフィニティーが非複合体化ペプチドと比較して、わずかに向上していることがわかる。抗体は、ポリペプチドを安定化すると共に、ペプチドをその生物活性コンフォメーションに固定して提示しているのである。
【０１９９】
抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体とヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物との複合体のインビトロおよびインビボ安定性を増加させるために、結合後のジスルフィド架橋の形成を使用した。
【０２００】
第1段階は、特異的認識段階（高アフィニティー相互作用）、すなわちヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物-抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体複合体の形成である。これに続いて、第2段階では、ジスルフィド架橋の自発的シャフリングが起こって、安定性の改良された共有結合的複合体が形成される。
【０２０１】
12merペプチド（ヘリカーモチーフアミノ酸配列）は（少なくとも特異的抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体との複合体を形成した場合には）比較的剛性が高い実体であるから、ジスルフィド架橋のために構造特異的な設計を使用する必要があることがわかった。複合体形成と、その後に達成される共有結合的カップリングは、組換え生産された2つの実体間で起こるので、ジスルフィド共有結合を形成させるために導入される人工的ステイン残基は、必ずしも遊離システイン残基として生産されるわけではなく、還元型で、すなわち遊離システインまたはホモシステインアミノ酸にコンジュゲートされた形態で発現する。
【０２０２】
抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体可変ドメインのアミノ酸配列において、人工的遊離システイン残基を導入する位置は、極めて重要である。抗体可変ドメインアミノ酸配列中の非露出システインは、遊離システイン（非コンジュゲート型）として発現する可能性が高く、一方、結合ポケットに近い露出システイン残基は、遊離システインのような追加部分へのシステインコンジュゲーションが誘発する立体障害ゆえに、12merペプチド（ヘリカーモチーフアミノ酸配列）の結合を消滅させる可能性がある。
【０２０３】
立体障害と強いアフィニティー低減のリスクが最小限に抑えられる適切な位置を同定するために、ヘリカーモチーフアミノ酸配列への人工的システイン残基の導入に関して、さまざまな位置を試験した。パラトープの大部分が変化せずに残るように、12mer（ヘリカーモチーフアミノ酸配列）のC末端にシステイン残基を導入した。それらのペプチドを合成し、蛍光モチーフに融合した。
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【０２０４】
抗体には、それぞれが異なる3D環境にあるシステインを含む両設計ペプチドについて、ジスルフィド架橋の形成を可能にする構造設計を施した。
【０２０５】
12merヘリカルペプチド：
0006602304.tif 000008
（ヘリカーモチーフアミノ酸配列）を、VHドメインおよびVHドメイン中にモデリングする。ペプチドのC末端では、残基L10およびK11が考えうる位置として同定され、軽鎖可変ドメインでは、Kabatの軽鎖ナンバリングに従う位置N55およびG51が同定される。
【０２０６】
二価抗体0155（N55C）をヘリカーモチーフアミノ酸配列システイン変異体2にカップリングした。SDS page（変性条件、図12参照）では、抗体0155上だけに蛍光が見られ、還元条件下では小さなペプチドだけが見える。
【０２０７】
抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体へのヘリカーモチーフアミノ酸配列含有蛍光化合物の共有結合的コンジュゲーションは成功した。
【０２０８】
抗体0157（G51C）とヘリカーモチーフアミノ酸配列システイン変異体1とのカップリングは、予想される共有結合的複合体をもたらしていなかった。蛍光は予想されるレーンには見られず、この実験では陰性であるべき対照に見られる（図13参照）。
【０２０９】
抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体0157へのヘリカーモチーフアミノ酸配列含有蛍光化合物の共有結合的コンジュゲーションは成功しなかった。この理論に束縛されることは望まないが、この場合、抗体のシステイニル化は結合ポケットにおける位置が深すぎて、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有蛍光化合物が効率よく結合して、C51を攻撃するのに適当な位置に求核性チオール基を送達することができないと考えられる。
【０２１０】
ヘリカーに基づく方法論は、組換え生産されたヘリカーモチーフアミノ酸配列含有ポリペプチドとの共有結合的複合体の形成を考慮すると、とりわけ魅力的になる。
【０２１１】
VL-N55C突然変異を含有する抗体0155とヘリカーモチーフアミノ酸配列システイン変異体1：
0006602304.tif 000009
とのコンジュゲーションは、別の選択肢（VL上のG51Cとヘリカーモチーフアミノ酸配列システイン変異体2：
0006602304.tif 000010
と比較してはるかにうまくいったので、0155とヘリカーモチーフアミノ酸配列システイン変異体1含有ポリペプチドとのコンジュゲーションを、さらに調べることにした。このポリペプチドは、N末端に融合されたヘリカーモチーフアミノ酸配列システイン変異体1：
0006602304.tif 000011
を含有した。
【０２１２】
抗体0155を、SEQ ID NO:28の、C末端リジン残基を欠失させたシュードモナス外毒素分子LR8Mを含有するヘリカーモチーフアミノ酸配列システイン変異体1と、共有結合でコンジュゲートする。SECクロマトグラムを図14に示す。コンジュゲーション効率は、非還元試料について、SDS-CE（Caliper）で分析する（図15参照）。
【０２１３】
結論として、抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列モノクローナル抗体は、ペプチド、ペプチドリンカーを持つ小分子、および組換えタンパク質を、12merヘリカーモチーフアミノ酸配列の高いアフィニティー認識によって複合体化するために使用することができる。ヘリックスとして折りたたまれる傾向を持つペプチドは、元の12merヘリカーモチーフアミノ酸：
0006602304.tif 000012
を模倣するように修飾することができ、その後は、抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列モノクローナル抗体と複合体を形成することが可能になる。システインを含有するSEQ ID NO:01のシステイン変異体と、CDR中にシステインを含有する修飾抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体では、高いアフィニティーでの複合体化に加えて、安定なジスルフィド結合の形成による共有結合的コンジュゲーションが可能になる。その後は、異なる系で発現した組換えタンパク質を、特別な反応条件がなくても、自発的ジスルフィド架橋シャフリングによって、インビトロでコンジュゲートすることができる。
【０２１４】
抗体アフィニティー
一定の態様では、本明細書において報告する抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体そのもの、または本明細書において報告する複合体中の抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体が、≦1μM、≦100nM、≦約10nM（例えば約10-6M以下、例えば約10-6M〜約10-13M、例えば約10-8M〜約10-10M）の解離定数（Kd）を有する。
【０２１５】
一態様では、関心対象の抗体のFab型とその抗原とを使って、以下のアッセイで述べるように行われる放射性標識抗原結合アッセイ（RIA）によって、Kdが測定される。抗原に対するFabの溶液結合アフィニティーは、タイトレーションのための一連の濃度（a titration series）の非標識抗原の存在下で、Fabを最小濃度の（125I）-標識抗原と平衡化し、次に結合した抗原を抗Fab抗体被覆プレートで捕捉することによって測定される（例えばChen, Y. et al, J. Mol. Biol. 293（1999）865-881を参照されたい）。アッセイ条件を確立するために、MICROTITER（登録商標）マルチウェルプレート（Thermo Scientific）を50mM炭酸ナトリウム（pH9.6）中の5μg/mlの捕捉用抗Fab抗体（Cappel Labs）で一晩コーティングし、次に、PBS中の2％（w/v）ウシ血清アルブミンで、室温（およそ23℃）において2〜5時間ブロッキングする。非吸着性プレート（Nunc #269620）において（例えばPresta, L.G. et al, Cancer Res. 57（1997）4593-4599における抗VEGF抗体Fab-12の評価と同じように）100pMまたは26pM［125I］-抗原を関心対象のFabの段階希釈液と混合する。次に関心対象のFabを一晩インキュベートする。ただし、確実に平衡に到達させるために、インキュベーションをさらに長時間（例えば約65時間）続けてもよい。その後、混合物を捕捉プレートに移して、室温で（例えば1時間）インキュベートする。次に溶液を除去し、プレートをPBS中の0.1％ポリソルベート20（TWEEN-20（登録商標））で8回洗浄する。プレートが乾燥したら、150μl/ウェルのシンチラント（MICROSCINT-20（商標）; Packard）を加え、プレートをTOPCOUNT（商標）ガンマカウンター（Packard）で10分カウントする。最大結合量の20％以下を与える各Fabの濃度を競合結合アッセイにおいて試用するために選択する。
【０２１６】
別の態様では、BIACORE（登録商標）-2000またはBIACORE（登録商標）-3000（BIAcore, Inc.,ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用し、25℃において、約10レスポンスユニット（RU）の固定化抗原CM5チップを使って、表面プラズモン共鳴アッセイでKdを測定する。簡単に述べると、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（CM5, BIACORE, Inc.）を、N-エチル-N'-（3-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド塩酸塩（EDC）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）で、供給者の説明書に従って活性化する。抗原を、10mM酢酸ナトリウム、pH4.8で、5μg/ml（約0.2μM）に希釈してから、カップリングされたタンパク質がおよそ10レスポンスユニット（RU）になるように、5μl/分の流量で注入する。抗原の注入に続いて、反応していない基をブロッキングするために、1Mエタノールアミンを注入する。速度論的測定の場合は、Fabの二倍段階希釈液（0.78nM〜500nM）を、0.05％ポリソルベート20（TWEEN-20（商標））界面活性剤を含むPBS（PBST）に入れ、25℃において、およそ25μl/分の流量で注入する。会合センサーグラムと解離センサーグラムを同時にフィッティングすることにより、単純1対1ラングミュア結合モデル（BIACORE（登録商標）Evaluation Softwareバージョン3.2）を使って、会合速度（kon）と解離速度（koff）を算出する。平衡解離定数（Kd）は、比koff/konとして算出される。例えばChen, Y. et al, J. Mol. Biol. 293（1999）865-881を参照されたい。上記の表面プラズモン共鳴でオン速度が106M-1s-1を越える場合は、増加する一連の濃度の抗原の存在下で、PBS、pH7.2中の20nM抗抗原抗体（Fab型）の、25℃における蛍光放出強度（励起＝295nm;蛍光＝340nm、バンドパス16nm）の増加または減少を、ストップフローを装備した分光測光器（Aviv Instruments）や撹拌キュベット付きの8000シリーズSLM-AMINCO（商標）分光測光器（ThermoSpectronic）などといった分光光度計で測定される蛍光消光技法を使って、会合速度を決定することができる。
【０２１７】
抗体フラグメント
一定の態様では、本明細書に規定する抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体、または本明細書に報告するコンジュゲート中の抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体は、抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体フラグメントである。抗体フラグメントとしては、Fab、Fab'、Fab'-SH、F（ab'）2、Fv、およびscFvフラグメント、ならびに後述する他のフラグメントが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。一定の抗体フラグメントを概観するには、Hudson, P.J. et al, Nat. Med. 9（2003）129-134を参照されたい。scFvフラグメントを概観するには、例えばPlueckthun, A.「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies」Vol. 113, RosenburgおよびMoore編, Springer-Verlag,ニューヨーク（1994）のp.269-315を参照されたい。また、WO93/16185および米国特許第5,571,894号および同第5,587,458号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が増加しているFabフラグメントおよびF（ab'）2フラグメントについての議論は、US5,869,046を参照されたい。
【０２１８】
ダイアボディは2つの抗原結合部位を持つ抗体フラグメントであり、これは二価であっても、二重特異性であってもよい。例えばEP0404097; WO93/01161; Hudson, P.J. et al, Nat. Med. 9（2003）129-134;およびHolliger, P. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90（1993）6444-6448を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディもHudson, P.J. et al, Nat. Med. 9（20039 129-134）に記載されている。
【０２１９】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体フラグメントである。一定の態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA;例えばUS6,248,516を参照されたい）。
【０２２０】
抗体フラグメントは、本明細書において述べるように、例えば限定するわけではないが、インタクト抗体のタンパク質分解的消化、ならびに組換え宿主細胞（例えば大腸菌（E. coli）またはファージ）による生産など、さまざまな技法によって作製することができる。
【０２２１】
キメラ抗体およびヒト化抗体
一定の態様では、本明細書に規定する抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体、または本明細書に報告するコンジュゲート中の抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体は、キメラ抗体である。一定のキメラ抗体が、例えばUS4,816,567およびMorrison, S.L. et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81（1984）6851-6855に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類）由来の可変領域）とヒト定常領域とを含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスを親抗体から変化させた「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合性フラグメントが包含される。
【０２２２】
一定の態様では、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性およびアフィニティーを保ったまま、ヒトに対する免疫原性を低減するためにヒト化される。一般にヒト化抗体は、HVR、例えばCDR（またはその部分）が非ヒト抗体に由来し、FR（またはその部分）がヒト抗体配列に由来する1つまたは複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部分も含むであろう。いくつかの態様では、例えば抗体の特異性またはアフィニティーを回復しまたは改良するために、ヒト化抗体中のいくつかのFR残基が、非ヒト抗体（例えばHVR残基の由来源となった抗体）由来の対応する残基で置換される。
【０２２３】
ヒト化抗体と、それらを作製する方法は、例えばAlmagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13（2008）1619-1633に概説されており、また例えばRiechmann, I. et al., Nature 332（1988）323-329; Queen, C. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86（1989）10029-10033;米国特許第5,821,337号、同第7,527,791号、同第6,982,321号、および同第7,087,409号; Kashmiri, S.V. et al, Methods 36（2005）25-34（SDR（a-CDR）移植が記載されている）; Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28（1991）489-498（「リサーフェイシング（resurfacing）が記載されている）; Dall'Acqua, W.F. et al, Methods 36（2005）43-60（「FRシャフリング」が記載されている）;およびOsbourn, J. et al, Methods 36（2005）61-68およびKlimka, A. et al, Br. J. Cancer 83（2000）252-260（FRシャフリングのための「誘導選択（guided selection）」アプローチが記載されている）にも、さらに記載されている。
【０２２４】
ヒト化に使用することができるヒトフレームワーク領域としては、「ベストフィット」法を使って選択されるフレームワーク領域（例えばSims, M.J. et al., J. Immunol. 151（1993）2296-2308を参照されたい）;特定サブグループの軽鎖または重鎖可変領域のヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えばCarter, P. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89（1992）4285-4289およびPresta, L.G. et al, J. Immunol. 151（1993）2623-2632を参照されたい）;ヒト成熟（体細胞突然変異した）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えばAlmagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13（2008）1619-1633を参照されたい）;およびFRライブラリーのスクリーニングによって得られるフレームワーク領域（例えばBaca, M. et al, J. Biol. Chem. 272（1997）10678-10684およびRosok, M.J. et al, J. Biol. Chem. 271（19969 22611-22618を参照されたい）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０２２５】
ライブラリー由来の抗体
本発明の抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体、または本明細書に報告するコンジュゲート中の抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体は、1つまたは複数の所望の活性を持つ抗体に関してコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することもできる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作成し、所望の結合特徴を有する抗体に関してそのようなライブラリーをスクリーニングするためのさまざまな方法が、当技術分野において公知である。そのような方法は、例えばHoogenboom, H.R. et al, Methods in Molecular Biology 178（2001）1-37に概説されており、また例えばMcCafferty, J. et al, Nature 348（1990）552-554; Clackson, T. et al, Nature 352（1991）624-628; Marks, J.D. et al, J. Mol. Biol. 222（1992）581-597; Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248（2003）161-175; Sidhu, S.S. et al, J. Mol. Biol. 338（2004）299-310; Lee, C.V. et al, J. Mol. Biol. 340（2004）1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101（2004）12467-12472;およびLee, C.V. et al, J. Immunol. Methods 284（2004）119-132に、さらに記載されている。
【０２２６】
一定のファージディスプレイ法では、Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12（1994）433-455に記載されているように、VH遺伝子とVL遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって個別にクローニングし、それらをファージライブラリーでランダムに組み換えた後、そのライブラリーを抗原結合性ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは典型的には抗体フラグメントを、一本鎖Fv（scFv）フラグメントとして、またはFabフラグメントとして、ディスプレイする。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築しなくても、免疫原に対する高アフィニティー抗体を与える。あるいは、Griffiths, A.D. et al, EMBO J. 12（1993）725-734に記載されているように、免疫化を一切行わずに、ナイーブレパートリーを（例えばヒトから）クローニングすることで、広範囲にわたる非自己抗原に対する抗体、そしてまた自己抗原に対する抗体の単一の供給源とすることもできる。最後に、Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227（1992）381-388に記載されているように、幹細胞から非再編成V遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含有するPCRプライマーを使用することで可変性の高いCDR3領域をコードすると共に、インビトロで再編成を行うことにより、ナイーブライブラリーを合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載している特許公報には、例えば次に挙げるものがある: US5,750,373、US2005/0079574、US2005/0119455、US2005/0266000、US2007/0117126、US2007/0160598、US2007/0237764、US2007/0292936、およびUS2009/0002360。
【０２２７】
本明細書では、ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体フラグメントを、ヒト抗体またはヒト抗体フラグメントとみなす。
【０２２８】
抗体フォーマット
上に概略を記した抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体および抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体フラグメントを、さまざまな方法で組み合わせることで、異なる抗体フォーマットを生成させることができる。
【０２２９】
例えば、1つまたは複数のscFv抗体フラグメントを、完全抗体の1つまたは複数のポリペプチド鎖のC末端に融合することができる。とりわけ、各重鎖C末端または各軽鎖C末端に、scFv抗体フラグメントを融合することができる。
【０２３０】
例えば、1つまたは複数の抗体Fabフラグメントを、完全抗体の1つまたは複数のポリペプチド鎖のC末端に融合することができる。とりわけ、各重鎖C末端または各軽鎖C末端に、抗体Fabフラグメントを融合することができる。
【０２３１】
例えば、1つのscFvフラグメントと1つの抗体Fabフラグメントを抗体Fc-領域のN末端に融合することができる。
【０２３２】
例えば、1つのscFvフラグメントまたは抗体Fabフラグメントを、抗体Fc領域のN末端に融合し、1つのscFvまたは抗体Fabフラグメントを抗体Fc領域のそれぞれの他方の鎖のC末端に融合することができる。
【０２３３】
多重特異性抗体
例えばIgG抗体フォーマットと一本鎖ドメインの融合による四価二重特異性抗体など、多種多様な組換え抗体フォーマットが開発されている（例えばColoma, M.J., et al, Nature Biotech 15（1997）159-163; WO01/077342およびMorrison, S.L., Nature Biotech 25（2007）1233-1234を参照されたい）。
【０２３４】
例えばダイアボディ、トリアボディ、またはテトラボディ、ミニボディ、いくつかの一本鎖フォーマット（scFv、ビス-scFv）など、抗体のコア構造（IgA、IgD、IgE、IgGまたはIgM）がもはや保たれておらず、2つ以上の抗原を結合する能力を有するフォーマットが、他にもいくつか開発されている（Holliger, P., et al, Nature Biotech 23（2005）1126-1136; Fischer, N., Leger, O., Pathobiology 74（2007）3-14; Shen, J., et al, Journal of Immunological Methods 318（2007）65-74; Wu, C, et al, Nature Biotech. 25（2007）1290-1297）。
【０２３５】
そのようなフォーマットはいずれも、抗体コア（IgA、IgD、IgE、IgGまたはIgM）を、さらなる結合タンパク質（例えばscFv）に融合するか、例えば2つのFabフラグメントまたはscFvを融合するために、リンカーを使用する（Fischer, N. and Leger, O., Pathobiology 74（2007）3-14）。天然の抗体に対して高い類似度を維持することによって、例えば補体依存性細胞傷害（CDC）や抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）などといった、Fc受容体結合を介して媒介されるエフェクター機能を保っておきたい場合がありうることは、留意しておく必要がある。
【０２３６】
WO2007/024715には、改変多価および多重特異性結合タンパク質として、二重可変ドメイン免疫グロブリンが報告されている。生物活性抗体二量体を調製するためのプロセスが、US6,897,044に報告されている。互いにペプチドリンカーを介して連結された少なくとも4つの可変ドメインを有する多価FV抗体コンストラクトがUS7,129,330に報告されている。二量体型および多量体型抗原結合構造が、US2005/0079170に報告されている。接続構造によって互いに共有結合された3つまたは4つのFabフラグメントを含む三価または四価の単一特異性抗原結合タンパク質であって、天然免疫グロブリンでないものが、US6,511,663に報告されている。WO2006/020258には、原核細胞および真核細胞において効率よく発現させることができ、治療方法および診断方法に有用である、四価二重特異性抗体が報告されている。2タイプのポリペプチド二量体を含む混合物から、少なくとも1つの鎖間ジスルフィド連結によって連結された二量体を、少なくとも1つの鎖間ジスルフィド連結によって連結されていない二量体から分離し、または優先的に合成する方法が、US2005/0163782に報告されている。二重特異性四価受容体はUS5,959,083に報告されている。3つ以上の機能的抗原結合部位を持つ改変抗体はWO2001/077342に報告されている。
【０２３７】
多重特異性および多価抗原結合性ポリペプチドはWO97/001580に報告されている。WO92/004053には、典型的には同じ抗原決定基に結合するIgGクラスのモノクローナル抗体から調製されるホモコンジュゲートを、合成的架橋によって共有結合で連結することが報告されている。
【０２３８】
WO91/06305では、2つ以上の免疫グロブリン単量体が1つに会合されて四価また六価IgG分子を形成している典型的にはIgGクラスのオリゴマーが分泌される。インターフェロンガンマ活性が病因となる疾患を処置するために使用することができるヒツジ由来の抗体および改変抗体コンストラクトが、US6,350,860に報告されている。US2005/0100543では、二重特異性抗体の多価担体であるターゲティング可能なコンストラクトが報告されている。すなわち、ターゲティング可能なコンストラクトの各分子は、2つ以上の二重特異性抗体の担体として役立ちうる。遺伝子改変二重特異性四価抗体がWO95/009917に報告されている。WO2007/109254には、安定化scFvからなるまたは安定化scFvを含む安定化結合分子が報告されている。
【０２３９】
一定の態様では、本明細書において規定する抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体、または本明細書に報告するコンジュゲート中の抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。一定の態様では、結合特異性の一方はヘリカーモチーフアミノ酸配列に対する特異性であり、他方は他の任意の（非ヘリカーモチーフアミノ酸配列）抗原に対する特異性である。二重特異性抗体は細胞傷害性作用物質を細胞に局在化させるために使用することができる。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体フラグメントとして調製することができる。
【０２４０】
多重特異性抗体を作製するための技法には、異なる特異性を有する2対の免疫グロブリン重鎖-軽鎖ペアの組換え同時発現（Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305（1983）537-540、WO93/08829、およびTraunecker, A. et al, EMBO J. 10（1991）3655-3659参照）、および「ノブ・イン・ホール（knob-in-hole）」工学（例えば米国特許第5,731,168号を参照されたい）などがあるが、それらに限定されるわけではない。多重特異性抗体は、抗体Fcヘテロ二量体分子を作製するために静電的ステアリング効果（electrostatic steering effect）を工学的に作製すること（WO2009/089004）;2つ以上の抗体またはフラグメントを架橋すること（例えば米国特許第4,676,980号、およびBrennan, M. et al., Science 229（1985）81-83を参照されたい）;ロイシンジッパーを使って二重特異性抗体を生産すること（例えばKostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148（1992）1547-1553を参照されたい）;二重特異性抗体フラグメントを作製するために「ダイアボディ」技術を使用すること（例えばHolliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90（1993）6444-6448を参照されたい）;および単鎖Fv（scFv）二量体を使用すること（例えばGruber, M et al., J. Immunol. 152（1994）5368-5374を参照されたい）;および例えばTutt, A. et al., J. Immunol. 147（1991）60-69に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作製することもできる。
【０２４１】
一態様では、例えばWO96/027011、WO98/050431、Ridgway J.B., et al, Protein Eng. 9（1996）617-621、Merchant, A.M., et al, Nat Biotechnol 16（1998）677-681にいくつかの例と共に詳細に説明されている「ノブ・イントゥ・ホール（knob-into-holes）」技術によって、二重特異性抗体の重鎖のCH3ドメインを改変する。この方法では、2つのCH3ドメインの相互作用表面を改変することで、それら2つのCH3ドメインを含有する両重鎖のヘテロ二量体化を増加させる。（2つの重鎖の）2つのCH3ドメインのそれぞれを「ノブ」とすることができ、その場合は他方が「ホール」になる。ジスルフィド架橋を導入するとヘテロ二量体が安定化し（Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16（1998）677-681、Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270（1997）26-35）、収量が増加する。
【０２４２】
すべての局面の一態様では、二重特異性抗体は、以下の特徴を有する:
・一方の重鎖のCH3ドメインと他方の重鎖のCH3ドメインは、それぞれ、抗体CH3ドメイン間の元の界面を含む界面で接触し、
ここで、該界面は、二重特異性抗体の形成が促進されるように改変されており、その改変は、以下の特徴を有する:
a）一方の重鎖のCH3ドメインは、
二重特異性抗体内の他方の重鎖のCH3ドメインの元の界面と接触する一方の重鎖のCH3ドメインの元の界面内において、
あるアミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、一方の重鎖のCH3ドメインの界面内で、他方の重鎖のCH3ドメインの界面内の空洞に収まりうる突起が生成する
ように、改変され、
かつ
b）他方の重鎖のCH3ドメインは、
二重特異性抗体内の第1のCH3ドメインの元の界面と接触する第2のCH3ドメインの元の界面内において、
あるアミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第2のCH3ドメインの界面内に、第1のCH3ドメインの界面内の突起が収まりうる空洞が生成する。
【０２４３】
したがって、本明細書において報告する二重特異性抗体は、一態様では、以下の特徴を有する:
・完全長抗体の第1重鎖のCH3ドメインと完全長抗体の第2重鎖のCH3ドメインは、それぞれ、抗体CH3ドメインの元の界面中に改変を含む界面で接触し、
ここで、i）第1重鎖のCH3ドメインでは、
あるアミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、一方の重鎖のCH3ドメインの界面内で、他方の重鎖のCH3ドメインの界面内の空洞に収まりうる突起が生成しており、
かつ、ii）第2重鎖のCH3ドメインでは、
あるアミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第2のCH3ドメインの界面内に、第1のCH3ドメインの界面内の突起が収まりうる空洞が生成している。
【０２４４】
一態様では、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基が、アルギニン（R）、フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）からなる群より選択される。
【０２４５】
一態様では、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基が、アラニン（A）、セリン（S）、スレオニン（T）、バリン（V）からなる群より選択される。
【０２４６】
一態様では、両CH3ドメイン間にジスルフィド架橋を形成させることができるように、各CH3ドメインの対応する位置にアミノ酸としてシステイン（C）を導入することによって、両CH3ドメインがさらに改変される。
【０２４７】
一態様では、二重特異性抗体は、「ノブ鎖」のCH3ドメイン中にT366W突然変異を含み、かつ「ホール鎖」のCH3ドメイン中にT366S、L368A、Y407V突然変異を含む。また、例えば「ノブ鎖」のCH3ドメインにY349C突然変異を導入し、かつ「ホール鎖」のCH3ドメインにE356C突然変異またはS354C突然変異を導入することなどによって、CH3ドメイン間に追加の鎖間ジスルフィド架橋を使用することもできる（Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16（1998）677-681）（ナンバリングはKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版, Public Health Service, National Institutes of Health,メリーランド州ベセスダ（1991）のEUインデックスに従う）。
【０２４８】
一態様では、二重特異性抗体は、2つのCH3ドメインの一方にY349C、T366W突然変異を含み、かつ2つのCH3ドメインの他方にE356C、T366S、L368A、Y407V突然変異を含む。一態様では、二重特異性抗体は、2つのCH3ドメインの一方にY349C、T366W突然変異を含み、かつ2つのCH3ドメインの他方にS354C、T366S、L368A、Y407V突然変異を含む（一方のCH3ドメイン中の追加Y349C突然変異と、他方のCH3ドメイン中の追加E356CまたはS354C突然変異とは、鎖間ジスルフィド結合を形成する）（KabatのEUインデックスによるナンバリング;（Kabat, E.A., et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版, Public Health Service, National Institutes of Health,メリーランド州ベセスダ（1991）））。EP1870459A1に記載されているさらなるノブ・イントゥ-ホール技術を、上記に代えて、または上記に加えて使用することもできる。したがって、二重特異性抗体の別の例は、「ノブ鎖」のCH3ドメイン中のR409D、K370E突然変異および「ホール鎖」のCH3ドメイン中のD399K、E357K突然変異である（KabatのEUインデックスによるナンバリング;（Kabat, E.A., et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版, Public Health Service, National Institutes of Health,メリーランド州ベセスダ（1991））。
【０２４９】
一態様では、二重特異性抗体は、「ノブ鎖」のCH3ドメイン中にT366W突然変異を含み、かつ「ホール鎖」のCH3ドメイン中にT366S、L368A、Y407V突然変異を含み、さらに「ノブ鎖」のCH3ドメイン中にR409D、K370E突然変異を含み、かつ「ホール鎖」のCH3ドメイン中にD399K、E357K突然変異を含む。
【０２５０】
一態様では、二重特異性抗体は、2つのCH3ドメインの一方にY349C、T366W突然変異を含み、かつ2つのCH3ドメインの他方にS354C、T366S、L368A、Y407V突然変異を含むか、または二重特異性抗体は、2つのCH3ドメインの一方にY349C、T366W突然変異を含み、かつ2つのCH3ドメインの他方にS354C、T366S、L368A、Y407V突然変異を含み、さらに「ノブ鎖」のCH3ドメイン中にR409D、K370E突然変異を含み、かつ「ホール鎖」のCH3ドメイン中にD399K、E357K突然変異を含む。CH3ドメイン中のこのようなノブ突然変異およびホール突然変異は、典型的には、SEQ ID NO:08、SEQ ID NO:09、SEQ ID NO:10、またはSEQ ID NO:11（ヒトIgG1サブクラスアロタイプ（コーカサス人およびアフリカ系アメリカ黒人または突然変異体L234A/L235AおよびL234A/L235A/P329G））、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、またはSEQ ID NO:14（ヒトIgG4サブクラスまたは突然変異体S228P、L235E、およびS228P/L235E/P329G）のヒト重鎖定常領域において使用される（ナンバリングはKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版, Public Health Service, National Institutes of Health,メリーランド州ベセスダ（1991）のEUインデックスに従う）。
【０２５１】
一態様では、二重特異性抗体は、CH3ドメイン中に上述の「ノブ」および「ホール」突然変異（例えば2つのCH3ドメインの一方にY349C、T366W突然変異および2つのCH3ドメインの他方にS354C、T366S、L368A、Y407V突然変異）をさらに含むSEQ ID NO:08、SEQ ID NO:09、SEQ ID NO:10、またはSEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、またはSEQ ID NO:14のヒト重鎖定常領域を含む（ナンバリングはKabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版, Public Health Service, National Institutes of Health,メリーランド州ベセスダ（1991）のEUインデックスに従う）。
【０２５２】
一態様では、二重特異性抗体は、SEQ ID NO:15またはSEQ ID NO:16のヒト軽鎖定常領域を含む。
【０２５３】
「オクトパス（Octopus）抗体」などといった3つ以上の機能的抗原結合部位を持つ改変抗体も、本明細書に含まれる（例えばUS2006/0025576を参照されたい）。
【０２５４】
本明細書における抗体またはフラグメントには、ヘリカーモチーフアミノ酸配列に結合する抗原結合部位と、別の異なる抗原に結合する抗原結合部位とを含む、「二重作用性（Dual Acting）Fab」、すなわち「DAF」も含まれる（例えばUS2008/0069820を参照されたい）。
【０２５５】
本明細書における抗体またはフラグメントには、WO2009/080251、WO2009/080252、WO2009/080253、WO2009/080254、WO2010/112193、WO2010/115589、WO2010/136172、WO2010/145792、およびWO2010/145793に記載の多重特異性抗体も含まれる。
【０２５６】
一態様では、二重特異性抗体の第1結合特異性がヘリカーモチーフアミノ酸配列に対する結合特異性であり、かつ第2結合特異性が非ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗原に対する結合特異性である。一態様において、非ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗原は、白血球マーカーCD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD11a、b、c、CD13、CD14、CD18、CD19、CD22、CD23、CD27およびそのリガンド、CD28およびそのリガンドB7.1、B7.2、B7.3、CD29およびそのリガンド、CD30およびそのリガンド、CD40およびそのリガンドgp39、CD44、CD45およびアイソフォーム、CD56、CD58、CD69、CD72、CTLA-4、LFA-1およびTCR;組織適合性抗原MHCクラスIまたはII、ルイスY抗原、SLex、SLey、SLea、およびSLeb;インテグリンVLA-1、VLA-2、VLA-3、VLA-4、VLA-5、VLA-6、αVβ3、およびLFA-1、Mac-1、およびpl50,95、αVβ1、gpIIbIIIa、αRβ3、α6β4、αVβ5、αVβ6、およびαV 62 7;セレクチン類L-セレクチン、P-セレクチン、およびE-セレクチン、ならびにそれらの対抗受容体VCAM-1、ICAM-1、ICAM-2、およびLFA-3;インターロイキンIL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、およびIL-15から選択され;インターロイキン受容体は、IL-1R、IL-2R、IL-3R、IL-4R、IL-5R、IL-6R、IL-7R、IL-8R、IL-9R、IL-10R、IL-11R、IL-12R、IL-13R、IL-14R、およびIL-15Rからなる群より選択され;ケモカインは、PF4、RANTES、MIP1α、MCP1、NAP-2、Groα、Groβ、およびIL-8からなる群より選択され;成長因子は、TNFアルファ、TGFベータ、TSH、VEGF/VPF、VEGFA、VEGFB、VEGF111、VEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF206、PTHrP、EGFファミリー、PDGFファミリー、エンドセリン、フィブロシン（Fibrosin）（FSF-1）、ヒトラミニン、およびガストリン放出ペプチド（GRP）、PLGF、HGH、HGHRからなる群より選択され;成長因子受容体は、TNFアルファR、RGFベータR、TSHR、VEGFR/VPFR、EGFR、PTHrPR、PDGFRファミリー、EPO-R、GCSF-Rおよび他の造血受容体からなる群より選択され;インターフェロン受容体は、IFNCαR、IFNβR、およびIFNλRからなる群より選択され; Igおよびその受容体は、IgE、FcγRI、およびFcγRIIからなる群より選択され;腫瘍抗原は、her2-neu、ムチン、CEAおよびエンドシアリンからなる群より選択され;アレルゲンは、チリダニ類抗原、lol pl（イネ科植物）抗原、およびウルシオールからなる群より選択され;ウイルスポリペプチドは、CMV糖タンパク質B、H、およびgCIII、HIV-1エンベロープ糖タンパク質、RSVエンベロープ糖タンパク質、HSVエンベロープ糖タンパク質、HPVエンベロープ糖タンパク質、肝炎ファミリー表面抗原からなる群より選択され;毒素は、シュードモナスエンドトキシンおよびオステオポンチン/ウロポンチン、ヘビ毒、クモ毒、およびハチ毒コノトキシンからなる群より選択され;血液因子は、補体C3b、補体C4a、補体C4b〜9、Rh因子、フィブリノゲン、フィブリン、およびミエリン関連成長阻害因子からなる群より選択され;酵素は、コレステロールエステル転移ポリペプチド、膜結合型マトリックスメタロプロテアーゼ、およびグルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD）からなる群より選択される。
【０２５７】
抗体変異体
一定の態様では、本明細書に規定する抗体のアミノ酸配列変異体が考えられる。例えば、抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体の結合アフィニティーおよび/または他の生物学的性質を改良することが望ましいことがあるだろう。抗体のアミノ酸配列変異体は、その抗体をコードするヌクレオチド配列に適当な修飾を導入することによって調製するか、またはペプチド合成によって調製することができる。そのような修飾としては、例えば抗体のアミノ酸配列からの欠失、および/または抗体のアミノ酸配列への挿入、および/または抗体のアミノ酸配列内での残基の置換が挙げられる。最終コンストラクトが所望の特徴、例えば抗原結合性を有する限り、最終コンストラクトに到達するために、欠失、挿入、および置換をどのように組み合わせてもよい。
【０２５８】
a）置換、挿入、および欠失変異体
一定の態様では、1つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異導入の関心対象となる部位として、HVRおよびFRが挙げられる。アミノ酸置換を関心対象の抗体に導入し、生成物を所望の活性について、例えば保持された/改良された抗原結合性、減少した免疫原性、または改良されたADCCもしくはCDCについて、スクリーニングすることができる。
【０２５９】
（表１）
0006602304.tif 000013
【０２６０】
アミノ酸は、共通する側鎖の性質に従って、以下のようにグループ分けすることができる:
（1）疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
（2）中性親水性: Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
（3）酸性: Asp、Glu;
（4）塩基性: His、Lys、Arg;
（5）鎖の配向に影響を及ぼす残基: Gly、Pro;
（6）芳香族: Trp、Tyr、Phe。
【０２６１】
非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを別のクラスのものと交換することを伴うであろう。
【０２６２】
置換変異体の一タイプでは、親抗体（例えばヒト化抗体またはヒト抗体）の1つまたは複数の超可変領域残基が置換される。一般に、結果として生じる変異体のうち、以降の研究のために選ばれるものは、親抗体と比較して一定の生物学的性質に修飾（例えば改良）（例えば増加したアフィニティー、低減した免疫原性）を有し、かつ/または親抗体の一定の生物学的性質を実質上保っているであろう。例示的置換変異体は、例えばファージディスプレイに基づく親和性成熟技法（本明細書に記載するものなど）を使って好都合に生成させることができる親和性成熟抗体である。簡単に述べると、1つまたは複数のHVR残基を突然変異させ、変異抗体をファージ上にディスプレイし、特定の生物学的活性（例えば結合アフィニティー）についてスクリーニングする。
【０２６３】
例えば抗体アフィニティーを改良するために、HVRに改変（例えば置換）を加えることができる。そのような改変は、HVR「ホットスポット」、すなわち体細胞成熟プロセス中に高頻度に突然変異を起こすコドンによってコードされている残基（例えばChowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207（2008）179-196を参照されたい）、および/またはSDR（a-CDR）に加えることができ、結果として生じた変異体VHまたはVLを結合アフィニティーについて試験する。二次ライブラリーを構築し、そこから再び選択することによる親和性成熟は、例えばHoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178（2002）1-37に記載されている。親和性成熟のいくつかの態様では、さまざまな方法のいずれか（例えばエラープローンPCR、鎖シャフリング、またはオリゴヌクレオチド指定突然変異導入）によって、成熟用に選択された可変遺伝子に、多様性が導入される。次に、二次ライブラリーを作成する。次に、所望の親和性を持つ任意の抗体変異体を同定するために、ライブラリーをスクリーニングする。多様性を導入するための別の方法では、数個のHVR残基（例えば一度に4〜6残基）をランダム化するHVR指向的アプローチがとられる。抗原結合に関与するHVR残基は、例えばアラニンスキャニング変異導入法やモデリングなどを使って、特異的に同定することができる。特に重鎖CDR3および軽鎖CDR3を標的とすることが多い。
【０２６４】
一定の態様では、その改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減しない限り、置換、挿入、または欠失が、1つまたは複数のHVR内に存在してもよい。例えば、結合アフィニティーを実質的に低減しない保存的改変（例えば本明細書に規定する保存的置換）をHVRに加えることができる。そのような改変はHVR「ホットスポット」外またはSDR外にあるだろう。上に提示した変異体VHおよびVL配列の一定の態様では、各HVRが無改変であるか、または1つ、2つもしくは3つ以下のアミノ酸置換を含有する。
【０２６５】
突然変異導入の標的とすることができる抗体の残基または領域を同定するための有用な一方法は、Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244（1989）1081-1085に記載されているように、「アラニンスキャニング突然変異導入法」と呼ばれる。この方法では、残基または標的残基の群（例えばArg、Asp、His、Lys、およびGluなどの荷電残基）を同定し、それを中性アミノ酸または負荷電アミノ酸（例えばアラニンまたはポリアラニン）で置き換えることで、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定する。初回の置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸の場所に、さらなる置換を導入してもよい。上記に代えて、または上記に加えて、抗体と抗原の間の接触点を同定するための抗原-抗体複合体の結晶構造。そのような接触残基および近隣残基は、置換の候補として標的にするか、または排除することができる。変異体をスクリーニングして、それらが所望の性質を持っているかどうかを決定することができる。
【０２６６】
アミノ酸配列挿入には、単一アミノ酸残基または複数アミノ酸残基の配列内挿入だけでなく、長さが1残基から、100残基以上を含有するポリペプチドに及ぶ、アミノ末端および/またはカルボキシル末端融合も含まれる。末端挿入の例には、N末端メチオニル残基を持つ抗体も含まれる。抗体分子の他の挿入変異体としては、抗体のN末端またはC末端への（例えばADEPT用）の酵素または抗体の血清中半減期を増加させるポリペプチドの融合が挙げられる。
【０２６７】
b）グリコシル化変異体
一定の態様では、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるために、本明細書に規定する抗体または本明細書に報告するコンジュゲートに含まれる抗体が改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、1つまたは複数のグリコシル化部位が作製または除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって、都合よく達成することができる。
【０２６８】
抗体がFc領域を含む場合は、そこに取り付けられる糖質を改変することができる。哺乳動物細胞によって生産されるネイティブ抗体は、典型的には、分岐したバイアンテナ型オリゴ糖を含み、それは一般的には、Fc領域のCH2ドメインのAsn297にN結合によって取り付けられる。例えばWright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15（1997）26-32を参照されたい。オリゴ糖は、さまざまな糖質、例えばマンノース、N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）、ガラクトース、およびシアル酸、ならびにバイアンテナ型オリゴ糖構造の「ステム」中のGlcNAcに取り付けられたフコースを含みうる。いくつかの態様では、一定の改良された性質を持つ抗体変異体を作製するために、本発明の抗体中のオリゴ糖に修飾を加えることができる。
【０２６９】
一態様では、Fc領域に（直接的または間接的に）取り付けられた、フコースを欠く糖質構造を有する抗体変異体が提供される。例えばそのような抗体におけるフコースの量は、1％〜80％、1％〜65％、5％〜65％または20％〜40％でありうる。フコースの量は、例えばWO2008/077546に記載されているようにMALDI-TOF質量分析によって測定される、Asn297における糖鎖内のフコースの平均量を、Asn297に取り付けられたすべての糖構造（例えば複合型、混成型および高マンノース型構造）の和と比較して算出することによって決定される。Asn297とは、Fc領域の位置297（Fc領域残基のEUナンバリング）付近に位置するアスパラギン酸残基を指すが、抗体における軽微な配列変動ゆえに、Asn297は、位置297の上流側または下流側±3アミノ酸付近、すなわち位置294と位置300の間に位置する場合もありうる。そのようなフコシル化変異体は改良されたADCC機能を有しうる。例えばUS2003/0157108、US2004/0093621を参照されたい。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異体に関する刊行物の例には、US2003/0157108、WO2000/61739、WO2001/29246、US2003/0115614、US2002/0164328、US2004/0093621、US2004/0132140、US2004/0110704、US2004/0110282、US2004/0109865、WO2003/085119、WO2003/084570、WO2005/035586、WO2005/035778、WO2005/053742、WO2002/031140、Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336（2004）1239-1249、Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87（2004）614-622などがある。脱フコシル化抗体を生産する能力を有する細胞株の例には、タンパク質フコシル化が欠損しているLec13 CHO細胞（Ripka, J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 249（1986）533-545;US2003/0157108;およびWO2004/056312、特に実施例3）、およびアルファ-1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子FUT8ノックアウトCHO細胞などのノックアウト細胞株（例えばYamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87（2004）614-622、Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94（2006）680-688、およびWO2003/085107を参照されたい）などがある。
【０２７０】
例えば抗体のFc領域に取り付けられたバイアンテナ型オリゴ糖がGlcNAcによってバイセクト化（bisect）されているバイセクト化（bisected）オリゴ糖を持つ抗体変異体が、さらに提供される。そのような抗体変異体は、低減したフコシル化および/または改良されたADCC機能を有しうる。そのような抗体変異体の例は、例えばWO2003/011878、米国特許第6,602,684号、およびUS2005/0123546に記載されている。Fc領域に取り付けられたオリゴ糖中に少なくとも1つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。そのような抗体変異体は改良されたCDC機能を有しうる。そのような抗体変異体は、例えばWO1997/30087、WO1998/58964、およびWO1999/22764に記載されている。
【０２７１】
c）Fc領域変異体
一定の態様では、本明細書に規定する抗体のFc領域に1つまたは複数のアミノ酸修飾を導入することにより、Fc領域変異体を生成させることができる。Fc領域変異体は、1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトFc領域配列（例えばヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4 Fc領域）を含みうる。
【０２７２】
一定の態様において、本発明では、全部ではなく一部のエフェクター機能を持つ抗体変異体が考えられ、その抗体変異体は、これにより、インビボでの抗体の半減期は重要であるものの、一定のエフェクター機能（例えば補体およびADCC）は不必要または有害であるような応用にとって望ましい候補になる。CDCおよび/またはADCC活性の低減/消耗を確認するために、インビトロおよび/またはインビボ細胞傷害性アッセイを行うことができる。例えば、抗体がFcγR結合を欠く（それゆえにおそらくADCC活性を欠く）が、FcRn結合能は保持していることを保証するために、Fc受容体（FcR）結合アッセイを行うことができる。ADCCを媒介するための主要細胞であるNK細胞がFcγRIIIだけを発現するのに対し、単球はFcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現する。造血細胞におけるFcR発現は、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9（1991）457-492の464頁の表3に要約されている。関心対象の分子のADCC活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第5,500,362号（例えばHellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83（1986）7059-7063、およびHellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82（1985）1499-1502を参照されたい）、米国特許第5,821,337号（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166（1987）1351-1361参照）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を使用してもよい（例えばフローサイトメトリー用のACTI（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（CellTechnology, Inc.、カリフォルニア州マウンテンビュー）、およびCytoTox 96（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Promega、ウィスコンシン州マディソン）を参照されたい）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（PBMC）およびナチュラルキラー（NK）細胞がある。これに代えて、またはこれに加えて、関心対象の分子のADCC活性は、インビボで、例えばClynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95（1998）652-656に開示されているような動物モデルで、評価することもできる。抗体がC1qに結合することができず、したがってCDC活性を欠くことを確認するために、C1q結合アッセイを行うこともできる。例えばWO2006/029879およびWO2005/100402のC1qおよびC3c結合ELISAを参照されたい。補体活性化を評価するために、CDCアッセイを行うことができる（例えばGazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202（1996）163-171、Cragg, M.S. et al., Blood 101（2003）1045-1052、およびCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103（2004）2738-2743を参照されたい）。FcRn結合およびインビボクリアランス/半減期決定も、当技術分野において公知の方法を使って行うことができる（例えばPetkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18（2006: 1759-1769を参照されたい）。
【０２７３】
エフェクター機能が低減している抗体には、Fc領域残基238、265、269、270、297、327、および329の1つまたは複数の置換を持つものが含まれる（米国特許第6,737,056号）。そのようなFc突然変異体には、アミノ酸位置265、269、270、297、および327のうちの2つ以上に置換を持つFc突然変異体（残基265および297がアラニンに置換されているいわゆる「DANA」Fc突然変異体（米国特許第7,332,581号を含む）が含まれる。
【０２７４】
FcRへの結合が改良または減縮されている一定の抗体変異体が記載されている（例えば米国特許第6,737,056号、WO2004/056312、およびShields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276（2001）6591-6604を参照されたい）。
【０２７５】
一定の態様では、抗体変異体が、ADCCを改良する1つまたは複数のアミノ酸置換、例えばFc領域の位置298、333、および/または334（残基のEUナンバリング）に置換を持つFc領域を含む。
【０２７６】
いくつかの態様では、例えば米国特許第6,194,551号、WO99/51642、およびIdusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164（2000）4178-4184に記載されているように、C1q結合および/または補体依存性細胞傷害（CDC）の改変（すなわち改良または減縮）をもたらす改変が、Fc領域に加えられる。
【０２７７】
半減期が増加しており、かつ胎児への母体IgGの移行の原因となる新生児型Fc受容体（FcRn）（Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117（1976）587-593、およびKim, J.K. et al., J. Immunol. 24（1994）2429-2434）への結合が改良されている抗体が、US2005/0014934に記載されている。これらの抗体は、FcRnへのFc領域の結合を改良する1つまたは複数の置換をFc領域中に持つFc領域を含む。そのようなFc変異体として、Fc領域残基:238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、または434のうちの1つまたは複数に置換を持つもの、例えばFc領域残基434の置換を持つものが挙げられる（米国特許第7,371,826号）。
【０２７８】
Fc領域変異体の他の例については、Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322（1988）738-740、US5,648,260、US5,624,821、およびWO94/29351も参照されたい。
【０２７９】
d）システイン改変抗体変異体
一定の態様では、システイン改変抗体（cysteine engineered antibody）、例えば抗体の1つまたは複数の残基がシステイン残基で置換されている「チオMAb（thioMAb）」を作製することが望ましいであろう。特定の態様では、置換残基が抗体の接近可能部位に存在する。それらの残基をシステインで置換すると、それによって抗体の接近可能部位に活性チオール基が置かれることになり、本明細書においてさらに説明するように、それを使って、抗体を他の部分、例えば薬物部分またはリンカー-薬物部分にコンジュゲートすることで、イムノコンジュゲートを作製することができる。一定の態様では、次に挙げる残基のうちの任意の1つまたは複数をシステインで置換することができる:軽鎖のV205（Kabatナンバリング）、重鎖のA118（EUナンバリング）、および重鎖Fc領域のS400（EUナンバリング）。システイン改変抗体は、例えば米国特許第7,521,541号に記載されているように生成させることができる。
【０２８０】
e）抗体誘導体
一定の態様では、当技術分野において公知であり容易に入手することができる追加の非タンパク質部分を含有するように、本明細書に規定する抗体をさらに修飾することができる。抗体の誘導体化に適した部分として水溶性ポリマーが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（PEG）、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマー）、およびデキストランまたはポリ（n-ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、およびそれらの混合物が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性ゆえに、製造上の利点を有しうる。ポリマーは任意の分子量であってよく、分岐型であっても非分岐型であってもよい。抗体に取り付けられるポリマーの数はさまざまであってよく、2つ以上のポリマーが取り付けられる場合、それらは同じ分子または異なる分子であることができる。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および/またはタイプは、例えば限定するわけではないが、改良しようとする抗体の特定の特性または機能、その抗体誘導体が所定の条件下で治療に使用されるかどうかなどといった、考慮事項に基づいて決定することができる。
【０２８１】
別の態様では、抗体と、放射線への曝露によって選択的に加熱することができる非タンパク質部分とのコンジュゲートが提供される。一態様では、非タンパク質部分がカーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102（2005）11600-11605）。放射線は任意の波長であってよく、例えば限定するわけではないが、通常の細胞を傷つけないが、非タンパク質部分を、抗体-非タンパク質部分に近接する細胞が死滅する温度まで加熱する波長が挙げられる。
【０２８２】
ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物
本明細書に報告するコンジュゲート中のヘリカーモチーフアミノ酸配列は、治療用作用物質（薬物）、細胞傷害性作用物質（例えばドキソルビシンまたは百日咳毒素などの毒素）、発蛍光団、例えばフルオレセインやローダミンのような蛍光色素、イメージング用または放射線治療用の金属のためのキレート剤、ペプチジルまたは非ペプチジルラベルまたは検出タグ、あるいはクリアランス調整作用物質、例えばポリエチレングリコールのさまざまな異性体、第3の構成要素に結合するペプチド、または他の糖質もしくは親油性作用物質にコンジュゲートすることができる。そのようなコンジュゲートをヘリカーモチーフ含有化合物という。コンジュゲーションは直接的であっても介在リンカーによるものであってもよい。
【０２８３】
a）治療用作用物質
コンジュゲートの治療用作用物質（薬物）は、細胞傷害効果または細胞増殖抑制効果を有する任意の化合物、部分、または基であることができる。薬物部分としては、（i）微小管阻害剤、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、またはDNAインターカレーターとして機能しうる化学療法剤;（ii）酵素的に機能しうるタンパク質毒素、および（iii）放射性同位体が挙げられる。
【０２８４】
例示的な治療用作用物質としては、メイタンシノイド、アウリスタチン、ドラスタチン、トリコテシン、CC1065、カリケアマイシンおよび他のエンジイン抗生物質、タキサン、アントラサイクリン、およびそれらの立体異性体、等配電子体、類似体または誘導体が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０２８５】
タンパク質毒素には、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素A鎖（緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来）、リシンA鎖（Vitetta et al（1987）Science, 238:1098）、アブリンA鎖、モデシンA鎖、アルファ-サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（PAPI、PAPII、およびPAP-5）、ツルレイシ（momordica charantia）阻害因子、クルシン、クロチン、シャボンソウ（sapaonaria officinalis）阻害因子、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセン類（tricothecenes）（WO93/21232）などがある。
【０２８６】
治療用放射性同位体としては、32P、33P、90Y、125I、131I、131In、153Sm、186Re、188Re、211At、212B、212Pb、およびLuの放射性同位体が挙げられる。
【０２８７】
放射性同位体または他のラベルは、公知の方法で組み込むことができる（Fraker et al（1978）Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57;「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」Chatal, CRC Press 1989）。炭素-14標識1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸（MX-DTPA）は、複合体に放射性核種をコンジュゲートするための例示的キレート剤である（WO94/11026）。
【０２８８】
b）ラベル
ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物は、追加のラベル部分を含有するヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物であることができる。ヘリカーモチーフアミノ酸配列に共有結合で取り付けることができるラベル部分はどれでも使用することができる（例えばSingh et al（2002）Anal. Biochem. 304: 147-15; Harlow E. and Lane, D.（1999）Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press,ニューヨーク州コールドスプリングハーバー; Lundblad R. L.（1991）Chemical Reagents for Protein Modification,第2版, CRC Press,フロリダ州ボカラトンを参照されたい）。ラベルは、以下のように機能しうる:（i）検出可能なシグナルを提供する;（ii）第2ラベルと相互作用することで、第1ラベルまたは第2ラベルがもたらす検出可能なシグナルを調整する、例えばFRET（蛍光共鳴エネルギー移動）を与える;（iii）電荷、疎水性、形状、または他の物理パラメータにより、移動度、例えば電気泳動移動度、または細胞透過性に影響を与える、または（iv）例えばイオン的複合体化を調整するために、捕捉部分を与える。
【０２８９】
ヘリカーモチーフアミノ酸配列を含み、本明細書において報告するラベルを含有するコンジュゲートは、例えば特別な細胞、組織または血清における関心対象の抗原の発現を検出するためなどといった、診断アッセイに役立ちうる。診断的応用には、第1結合特異性がターゲットに結合し、かつ第2結合特異性がヘリカーモチーフアミノ酸配列含有ラベルに結合する二重特異性抗体が使用されるであろう。ヘリカーモチーフアミノ酸配列は、典型的には、検出可能部分で標識されるであろう。数多くのラベルを利用することができ、それらは一般に以下のカテゴリーに分類することができる。
【０２９０】
（a）放射性同位体（放射性核種）、例えば3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Gn、86Y、89Zr、99TC、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At、または131Bi。放射性同位体標識コンジュゲートは、受容体を標的とするイメージング実験に有用である。ヘリカーモチーフアミノ酸配列は、Current Protocols in Immunology（1991）Volumes 1 and 2, Coligenら編, Wiley-Interscience（ニューヨーク州ニューヨーク）刊に記載の技法を使って、放射性同位体金属を結合し、キレートし、または他の形で錯化するリガンド試薬で、標識することができる。金属イオンを錯化しうるキレート配位子として、DOTA、DOTP、DOTMA、DTPAおよびTETA（Macrocyclics,テキサス州ダラス）が挙げられる。放射性核種は、本明細書において報告する複合体との錯化によってターゲティングすることができる（Wu et al, Nature Biotechnology 23（9）（2005）1137-1146）。放射性核種標識複合体による受容体ターゲットイメージングは、腫瘍組織における複合体または対応する治療用抗体の漸進的蓄積の検出および定量によって、経路活性化のマーカーになりうる（Albert et al（1998）Bioorg. Med. Chem. Lett. 8: 1207-1210）。
【０２９１】
イメージング実験用のラベルとして好適な金属キレート錯体（US2010/0111856; US5,342,606; US5,428,155; US5,316,757; US5,480,990; US5,462,725; US5,428,139; US5,385,893; US5,739,294; US5,750,660; US5,834,456; Hnatowich et al, J. Immunol. Methods 65（1983）147-157; Meares et al, Anal. Biochem. 142（1984）68-78; Mirzadeh et al, Bioconjugate Chem. 1（1990）59-65; Meares et al, J. Cancer（1990）, Suppl. 10:21-26; Izard et al, Bioconjugate Chem. 3（1992）346-350; Nikula et al, Nucl. Med. Biol. 22（1995）387-90; Camera et al, Nucl. Med. Biol. 20（1993）955-62; Kukis et al, J. Nucl. Med. 39（1998）2105-2110; Verel et al, J. Nucl. Med. 44（2003）1663-1670; Camera et al, J. Nucl. Med. 21（1994）640-646; Ruegg et al, Cancer Res. 50（1990）4221-4226; Verel et al, J. Nucl. Med. 44（2003）1663-1670; Lee et al, Cancer Res. 61（2001）4474-4482; Mitchell, et al, J. Nucl. Med. 44（2003）1105-1112; Kobayashi et al Bioconjugate Chem. 10（1999）103-111; Miederer et al, J. Nucl. Med. 45（2004）129-137; DeNardo et al, Clinical Cancer Research 4（1998）2483-90; Blend et al, Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18（2003）355-363; Nikula et al J. Nucl. Med. 40（1999）166-76; Kobayashi et al, J. Nucl. Med. 39（1998）829-36; Mardirossian et al, Nucl. Med. Biol. 20（1993）65-74; Roselli et al, Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14（1999）209-20）。
【０２９２】
（b）蛍光ラベル、例えば希土類キレート（ユーロピウムキレート）、フルオレセインタイプ、例えばFITC、5-カルボキシフルオレセイン、6-カルボキシフルオレセイン;ローダミンタイプ、例えばTAMRA;ダンシル;リサミン;シアニン類;フィコエリトリン類;テキサスレッド;およびそれらの類似体。蛍光ラベルは、例えばCurrent Protocols in Immunology（前掲）に開示されている技法を使ってヘリカーモチーフアミノ酸配列にコンジュゲートすることができる。蛍光色素および蛍光ラベル試薬としては、Invitrogen/Molecular Probes（米国オレゴン州ユージーン）およびPierce Biotechnology, Inc.（イリノイ州ロックフォード）から市販されているものが挙げられる。
【０２９３】
蛍光色素や化学発光色素などの検出ラベル（Briggs et al「Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids」J. Chem. Soc, Perkin-Trans. 1（1997）1051-1058）は検出可能なシグナルを与え、一般に、とりわけ以下に挙げる性質を持つ標識化に応用することができる:（i）無細胞アッセイでも細胞ベースのアッセイでも、少量のコンジュゲートを高感度に検出することができるように、標識コンジュゲートは非常に高いシグナルを与えると共に、低いバックグラウンドを持つべきであり、また（ii）著しい光退色を起こすことなく、蛍光シグナルを観察し、監視し、かつ記録することができるように、標識コンジュゲートは光安定性を示すべきである。膜または細胞表面、とりわけ生細胞への、標識コンジュゲートの細胞表面結合が関わる応用の場合は、ラベルは（iii）有効なコンジュゲート濃度および検出感度を得るために良好な水溶性を持つべきであり、かつ（iv）細胞の正常な代謝プロセスを乱さず、時期尚早な細胞死も引き起こさないように、生細胞に対して非毒性である。
【０２９４】
（c）さまざまな酵素基質ラベルが入手可能であるか、または開示されている（例えばUS4,275,149を参照されたい）。酵素は一般に、さまざまな技法を使って測定することができる発色性基質の化学的変化を触媒する。例えば酵素は、基質の変色を触媒することができ、それは分光光度法で測定することができる。あるいは、酵素は、基質の蛍光または化学発光を変化させうる。化学発光基質は化学反応によって電子的励起状態になり、次いで光を放出しうるので、その光を（例えばケミルミノメーターを使って）測定することができるか、またはその光が蛍光アクセプターにエネルギーを供与する。酵素ラベルの例には、ルシフェラーゼ（例えばホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ; US4,737,456）、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ（AP）、（3-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環式オキシダーゼ（例えばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼなどがある。酵素をポリペプチドにコンジュゲートするための技法は、O'Sullivan et al.「Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay」Methods in Enzym.（J. Langone & IT Van Vunakis編）Academic Press,ニューヨーク, 73（1981）147-166に記載されている。
【０２９５】
酵素と基質の組み合わせの例（US4,275,149; US4,318,980）には、例えば以下に挙げるものがある:
（i）セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）と、基質としてのハイドロゲンペルオキシダーゼ（hydrogen peroxidase）。ここでは、ハイドロゲンペルオキシダーゼが色素前駆体（例えばオルト-フェニレンジアミン（OPD）または3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン塩酸塩（TMB））を酸化する;
（ii）アルカリホスファターゼ（AP）と、発色性基質としてのパラ-ニトロフェニルリン酸;および
（iii）（3-D-ガラクトシダーゼ（（3-D-Gal）と、発色性基質（例えばp-ニトロフェニル-（3-D-ガラクトシダーゼ）または蛍光原基質4-メチルウンベリフェリル-（3-D-ガラクトシダーゼ。
【０２９６】
本明細書に報告する標識コンジュゲートは、任意の公知アッセイ法、例えばELISA、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイに使用することができる（Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques（1987）pp. 147-158, CRC Press, Inc.）。
【０２９７】
本明細書に報告する標識コンジュゲートは、生物医学的分子イメージングのさまざまな方法および技法、例えば（i）MRI（磁気共鳴イメージング）;（ii）MicroCT（コンピュータ断層撮影）;（iii）SPECT（単光子放射型コンピュータ断層撮影）;（iv）PET（陽電子放射断層撮影法）Tinianow, J. et al Nuclear Medicine and Biology, 37（3）（2010）289-297; Chen et al, Bioconjugate Chem. 15（2004）41-49; US2010/0111856;（v）生物発光;（vi）蛍光;および（vii）超音波によるイメージングバイオマーカーおよびプローブとして有用である。イムノシンチグラフィは、放射性物質で標識されたコンジュゲートを動物またはヒト患者に投与し、そのコンジュゲートが局在する身体部位の写真を撮影するイメージング手法である（US6,528,624）。イメージングバイオマーカーは、客観的に測定され、正常な生物学的プロセス、病理学的プロセス、または治療的介入に対する薬理学的応答の指標として評価することができる。バイオマーカーにはいくつかのタイプがあると考えることができる:タイプ0マーカーは、疾患の天然の履歴マーカーであり、公知の臨床的指標、例えば関節リウマチにおける滑膜炎のMRI評価と、長期的に相関する;タイプIマーカーは、作用機序は臨床転帰とは関連しないかもしれないが、作用機序に従って介入の効果を捕捉する;タイプIIマーカーは、代替エンドポイントとして機能し、ここでは、バイオマーカーの変化またはバイオマーカーからのシグナルが臨床上の利益を予測することで、目標とした応答、例えばCTで測定される関節リウマチにおける骨びらんを「検証」する。このようにイメージングバイオマーカーからは、（i）ターゲットタンパク質の発現、（ii）ターゲットタンパク質に対する治療薬の結合、すなわち選択性、ならびに（iii）クリアランスおよび半減期薬物動態データに関する薬力学的（PD）治療情報を得ることができる。検査室ベースのバイオマーカーと比較したインビボイメージングバイオマーカーの利点としては、非侵襲的処置、定量化が可能、全身評価、反復的投薬と評価、すなわち複数時点、および前臨床（小動物）結果から臨床（ヒト）結果へと効果を移行できる可能性が挙げられる。いくつかの応用については、生体イメージングが前臨床試験における動物実験の代わりになり、そのような動物実験の数を最小限に抑える。
【０２９８】
ペプチド標識法が周知である。Haugland（2003）Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley（1992）Bioconjugate Chem. 3:2; Garman,（1997）Non-Radioactive Labeling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means（1990）Bioconjugate Chem. 1 :2; Glazer et al Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology（T. S. Work and E. Work, Eds.）American Elsevier Publishing Co.,ニューヨーク; Lundblad, R. L. and Noyes, C. M.（1984）Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I and II, CRC Press,ニューヨーク; Pfieiderer, G.（1985）"Chemical Modification of Proteins", Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGruyter,ベルリンおよびニューヨーク;ならびにWong（1991）Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, フロリダ州ボカラトン）; DeLeon-Rodriguez et al, Chem. Eur. J. 10（2004）1149-1155; Lewis et al, Bioconjugate Chem. 12（2001）320-324; Li et al, Bioconjugate Chem. 13（2002）110-115; Mier et al Bioconjugate Chem. 16（2005）240-237を参照されたい。
【０２９９】
抗体コンジュゲート
本明細書に報告するコンジュゲート中の抗体は、それ単独で分子の1つでない場合には、治療用作用物質（薬物）、細胞傷害性作用物質（例えばドキソルビシンや百日咳毒素などの毒素）、発蛍光団、例えばフルオレセインやローダミンのような蛍光色素、イメージング用または放射線治療用の金属のためのキレート剤、ペプチジルまたは非ペプチジルラベルまたは検出タグ、あるいはクリアランス調整作用物質、例えばポリエチレングリコールのさまざまな異性体、第3の構成要素に結合するペプチド、または他の糖質もしくは親油性作用物質に、さらにコンジュゲートすることができる。
【０３００】
イムノコンジュゲート
本発明は、本明細書において報告する抗体を含有するイムノコンジュゲート、または1つもしくは複数の細胞傷害性作用物質、例えば化学療法剤または化学療法薬、増殖阻害性作用物質、毒素（例えばタンパク質毒素、細菌、真菌、植物、または動物由来の、酵素活性毒素、またはそれらのフラグメント）、または放射性同位体にコンジュゲートされた本明細書に報告するコンジュゲートも提供する。
【０３０１】
一態様では、イムノコンジュゲートが、抗体が1つまたは複数の薬物、例えば限定するわけではないが、メイタンシノイド（US5,208,020、US5,416,064およびEP0 425 235 B1参照）;アウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチン薬物部分DEおよびDF（MMAEおよびMMAF）（US5,635,483、US5,780,588、およびUS7,498,298参照）;ドラスタチン;カリケアマイシンまたはその誘導体（US5,712,374、US5,714,586、US5,739,116、US5,767,285、US5,770,701、US5,770,710、US5,773,001、およびUS5,877,296; Hinman, L.M. et al, Cancer Res. 53（1993）3336-3342;およびLode, H.N. et al, Cancer Res. 58（1998）2925-2928参照）;アントラサイクリン、例えばダウノマイシンまたはドキソルビシン（Kratz, F. et al, Curr. Med. Chem. 13（2006）477- 523; Jeffrey, S.C. et al, Bioorg. Med. Chem. Lett. 16（2006）358-362; Torgov, M.Y. et al, Bioconjug. Chem. 16（2005）717-721; Nagy, A. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97（2000）829-834; Dubowchik, G.M. et al, Bioorg. & Med. Chem. Letters 12（2002）1529-1532; King, H.D. et al, J. Med. Chem. 45（2002）4336-4343;および米国特許第6,630,579号参照）;メトトレキサート;ビンデシン;タキサン類、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、およびオルタタキセル;トリコテセン;およびCC1065などにコンジュゲートされている、抗体-薬物コンジュゲート（ADC）である。
【０３０２】
別の態様において、イムノコンジュゲートは、酵素活性毒素またはそのフラグメント、例えば限定するわけではないが、次に挙げるものにコンジュゲートされた、本明細書に記載の抗体または本明細書に記載の複合体を含む:ジフテリア毒素A鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素A鎖（緑膿菌由来）、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、アルファ-サルシン、シナアブラギタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（PAPI、PAPII、およびPAP-S）、ニガウリ阻害因子、クルシン、クロチン、サボウソウ阻害因子、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセン類。
【０３０３】
別の態様において、イムノコンジュゲートは、放射性コンジュゲートが形成されるように放射性原子にコンジュゲートされた、本明細書に記載の抗体、または本明細書において報告する複合体を含む。放射性コンジュゲートの生産にはさまざまな放射性同位体を利用することができる。その例として、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212、およびLuの放射性同位体が挙げられる。放射性コンジュゲートを検出に使用する場合、それは、シンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばTC99mまたはI123を含むか、核磁気共鳴（NMR）イメージング（磁気共鳴イメージング、MRIとも呼ばれている）用のスピンラベル、例えば、ここでもヨウ素-123、ヨウ素-131、インジウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、ガドリニウム、マンガン、または鉄を含みうる。
【０３０４】
抗体と細胞傷害性作用物質のコンジュゲートは、N-スクシンイミジル-3-（2-ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）、スクシンイミジル-4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）、イミノチオラン（IT）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジプイミデートHCl）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス-アジド化合物（例えばビス（p-アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス-ジアゾニウム誘導体（例えばビス-（p-ジアゾニウムベンゾイル）-エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン2,6-ジイソシアネート）、およびビス活性フッ素化合物（例えば1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン）などといった、さまざまな二官能性タンパク質カップリング剤を使って作製することができる。例えばリシン免疫毒素は、Vitetta, E.S. et al., Science 238（1987）1098-1104に記載されているように調製することができる。炭素-14標識1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸（MX-DTPA）は、抗体に放射性核種をコンジュゲートするための例示的キレート剤である。WO94/11026参照。リンカーは、細胞における細胞傷害性薬の放出を容易にする「切断可能リンカー」であることができる。例えば酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52（1992）127-131;米国特許第5,208,020号）を使用することができる。
【０３０５】
本明細書におけるイムノコンジュゲートまたはADCでは、例えば限定するわけではないが（Pierce Biotechnology, Inc.（米国イリノイ州ロックフォード）などから）市販されているBMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、およびスルホ-SMPB、およびSVSB（スクシンイミジル-（4-ビニルスルホン）ベンゾエート）などといった架橋試薬を使って調製された上述のコンジュゲートが明示的に考えられるが、それらに限定されるわけではない。
【０３０６】
リンカー
「リンカー」という用語は、抗体またはヘリカーモチーフアミノ酸配列を他の化合物、例えば検出可能なラベルまたは薬物にコンジュゲート（連結）するために使用することができる二官能性部分または多官能性部分を表す。ヘリカーモチーフアミノ酸配列コンジュゲートは、さらなる化合物に結合すると共にヘリカーモチーフアミノ酸配列にも結合するための反応性官能基を有するリンカーを使って、好都合に調製することができる。
【０３０７】
一態様では、リンカーが、ヘリカーモチーフアミノ酸配列または抗体またはさらなる化合物上に存在する求核性基に対して反応性である求電子基を有する反応性部位を有する。例えばシステインチオール基はリンカー上の求電子基と反応性であり、リンカーへの共有結合を形成する。有用な求電子基として、別のチオール、マレイミド基およびハロアセトアミド（例えばKlussman et al, Bioconjugate Chemistry 15（4）（2004）765-773の766頁のコンジュゲーション法を参照されたい）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０３０８】
チオール反応官能基の例としては、チオール、マレイミド、アルファ-ハロアセチル、活性化エステル、例えばスクシンイミドエステル、4-ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、無水物、酸塩化物、塩化スルホニル、イソシアネート、およびイソチオシアネートが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０３０９】
リンカーは、抗原（ヘリカーモチーフアミノ酸配列）をペイロードに連結するアミノ酸残基を含みうる。これらのアミノ酸残基は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチド、またはドデカペプチド単位を形成しうる。アミノ酸残基としては、天然のアミノ酸残基、ならびに非天然のアミノ酸類似体、例えばシトルリン、またはβ-アミノ酸、例えばβ-アラニン、またはω-アミノ酸、例えば4-アミノ-酪酸が挙げられる。
【０３１０】
別の態様では、リンカーが、ヘリカーモチーフアミノ酸配列または抗体（抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体）上に存在する求電子基との反応性に富む求核基を有する反応性官能基を有する。有用な求電子基として、アルデヒド基およびケトンカルボニル基が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。リンカーの求核基のヘテロ原子は、ヘリカーモチーフアミノ酸配列または抗体上の求電子基と反応して、抗原（ヘリカーモチーフアミノ酸配列）または抗体への共有結合を形成することができる。リンカー上の有用な求核基としては、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジドが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。抗原（ヘリカーモチーフアミノ酸配列）上の求電子基は、リンカーを取り付けるための便利な部位になる。
【０３１１】
ペプチドタイプのリンカーは、典型的には、2つ以上のアミノ酸および/またはペプチドフラグメントの間にペプチド結合を形成させることによって調製することができる。そのようなペプチド結合は、例えばペプチド化学の分野において周知の液相合成法（E. Schroder and K. Lubke「The Peptide」volume 1（1965）76-136, Academic Press）に従って調製することができる。
【０３１２】
別の態様では、可溶性または反応性を調整する基で、リンカーを置換することができる。例えば、スルホネート（SO3-）またはアンモニウムなどの荷電置換基、またはPEGなどのポリマーは、試薬の水溶性を増加させ、リンカー試薬と抗原（ヘリカーモチーフアミノ酸配列）または薬物部分とのカップリング反応を容易にするか、または使用する合成経路に応じたカップリング反応を容易にする。
【０３１３】
本明細書において報告する薬物またはラベルを含むコンジュゲートでは、以下のリンカー試薬を使って調製される複合体が明示的に考えられるが、それらに限定されるわけではない: BMPEO、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、およびスルホ-SMPB、およびSVSB（スクシンイミジル-（4-ビニルスルホン）ベンゾエート）、ならびにビス-マレイミド試薬: DTME、BMB、BMDB、BMH、BMOE、BM（PEO）3、およびBM（PEO）4（これらはPierce Biotechnology, Inc.から市販されている）。ビス-マレイミド試薬は、例えばチオール基を、チオール含有薬物部分、ラベル、またはリンカー中間体に、逐次的にまたは同時進行的に取り付けることを可能にする。例えばチオール基との反応性に富むマレイミド以外の他の官能基としては、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアネート、およびイソチオシアネートが挙げられる。
【０３１４】
例示的なリンカーとして、マレイミドストレッチャー（stretcher）およびパラ-アミノベンジルカルバモイル（PAB）自壊性（self-immolative）スペーサーを有するバリン-シトルリン（val-citまたはvc）ジペプチドリンカー試薬、ならびにマレイミドストレッチャーユニットおよびp-アミノベンジル自壊性スペーサーを有するphe-lys（Mtr）ジペプチドリンカー試薬が挙げられる。
【０３１５】
システインチオール基は、求核性であり、リンカー試薬およびヘリカーモチーフ含有化合物上の求電子基、例えば（i）活性エステル、例えばNHSエステル、HOBtエステル、ハロホルメート、および酸ハライド;（ii）アルキルハライドおよびベンジルハライド、例えばハロアセトアミド;（iii）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、およびマレイミド基;ならびに（iv）スルフィド交換によるジスルフィド、例えばピリジルジスルフィドなどと反応して共有結合を形成する能力を有する。ヘリカーモチーフ含有化合物上の求核基としては、リンカー部分およびリンカー試薬上の求電子基と反応して共有結合を形成する能力を有するアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジド基が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０３１６】
III.核酸
本明細書において報告する抗体のアミノ酸配列、または本明細書に報告するコンジュゲートに含まれる化合物のアミノ酸配列、またはそのような化合物の一部分のアミノ酸配列をコードするDNAは、当技術分野において公知のさまざまな方法によって調製することができる。これらの方法としては、部位指定（またはオリゴヌクレオチド媒介）突然変異導入法、PCR突然変異導入法、および以前に調製されたポリペプチドをコードするDNAのカセット突然変異導入法が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０３１７】
組換え抗体の変異体は、制限フラグメント操作によって、または合成オリゴヌクレオチドを使ったオーバーラップ伸長PCRによって、構築することもできる。突然変異原プライマーはシステインコドン置換をコードする。標準的な突然変異導入技法を使用して、そのような修飾改変抗体をコードするDNAを生成させることができる。一般的指針は、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,ニューヨーク州コールドスプリングハーバー, 1989;およびAusubel et al Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience,ニューヨーク州ニューヨーク, 1993に見いだすことができる。
【０３１８】
IV.発現および精製
抗体は、例えばUS4,816,567に記載されている組換え法および組成物を使って生産することができる。一態様では、本明細書に記載する抗体をコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および/またはVHを含むアミノ酸配列（例えば抗体の軽鎖および/または重鎖）をコードしうる。さらなる態様では、そのような核酸を含む1つまたは複数のベクター（例えば発現ベクター）が提供される。さらなる態様では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような態様の1つでは、宿主細胞が（1）抗体のVLを含むアミノ酸配列と抗体のVHを含むアミノ酸配列とをコードする核酸を含むベクター、または（2）抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1ベクターと、抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2ベクターとを含む（例えばそれらのベクターで形質転換されている）。一態様では、宿主細胞が真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞またはリンパ球系細胞（例えばY0、NS0、Sp20細胞）である。一態様では、抗体を作製する方法であって、上に規定した抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で培養すること、および任意で、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む方法が提供される。
【０３１９】
本明細書において報告する抗体の組換え生産のために、抗体をコードする核酸、例えば上述のものを単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび/または発現のために1つまたは複数のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手法を使って（例えば抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力を有するオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離し、配列決定することができる。
【０３２０】
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に適した宿主細胞には、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば抗体は、グリコシル化とFcエフェクター機能とが必要ない場合は特に、細菌中で生産することができる。細菌における抗体フラグメントおよびポリペプチドの発現については、例えばUS5,648,237、US5,789,199、およびUS5,840,523を参照されたい（大腸菌における抗体フラグメントの発現を記載しているCharlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology、Vol. 248, Lo, B.K.C.編, Humana Press,ニュージャージー州トトワ（2003）, pp.245-254も参照されたい）。発現後に、抗体を細菌細胞ペーストから可溶性画分に単離して、さらに精製することができる。
【０３２１】
原核生物だけでなく、糸状菌や酵母などの真核微生物も、グリコシル化経路が「ヒト化」されていて部分的または完全にヒトのグリコシル化パターンを持つ抗体の生産をもたらす真菌株および酵母株を含めて、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング宿主または発現宿主である。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22（2004）1409-1414、およびLi, H. et al., Nat. Biotech. 24（2006）210-215を参照されたい。
【０３２２】
グリコシル化された抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎生物および脊椎動物）にも由来する。無脊椎生物細胞の例として、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞と一緒に使用することができる（特にスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションに使用することができる）バキュロウイルス株は、数多く同定されている。
【０３２３】
植物細胞培養を宿主として利用することもできる。例えば米国特許第5,959,177号、同第6,040,498号、同第6,420,548号、同第7,125,978号、および同第6,417,429号（トランスジェニック植物中で抗体を生産するためのPLANTIBODIES（商標）技術が記載されている）を参照されたい。
【０３２４】
脊椎動物細胞も宿主として使用することができる。例えば、懸濁培養に適応した哺乳動物細胞株は役立ちうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株（COS-7）、ヒト胎児腎臓株（Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36（1977）59-74に記載の293または293細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（BHK）、マウスセルトリ細胞（Mather, J.P., Biol. Reprod. 23（1980）243-252に記載のTM4細胞）、サル腎臓細胞（CV1）、アフリカミドリザル腎臓細胞（VERO-76）、ヒト子宮頸癌細胞（HELA）、イヌ腎臓細胞（MDCK、バッファローラット肝臓細胞（BRL3A）、ヒト肺細胞（W138）、ヒト肝臓細胞（Hep G2）、マウス乳房腫瘍（MMT060562）、例えばMather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383（1982）44-68に記載のTRI細胞、MRC5細胞、およびFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、DHFR- CHO細胞（Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77（1980）4216-4220）を含むチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、ならびにY0、NS0、およびSp2/0などの骨髄腫細胞株などがある。抗体生産に適した一定の哺乳動物宿主細胞株を概観するには、例えばYazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C.編, Humana Press,ニュージャージー州トトワ（2004）pp.255-268を参照されたい。
【０３２５】
V.診断および検出のための方法および組成物
一定の態様において、本明細書に報告する抗体、とりわけ二重特異性抗体、およびコンジュゲートはいずれも、生物学的試料中の1つまたは複数のターゲット分子の存在を検出するのに役立つ。本明細書において使用する「検出すること」という用語は、定量的検出または定性的検出を包含する。一態様では、生物学的試料は、細胞または組織を含む。
【０３２６】
一態様では、診断方法または検出方法に使用するための、本明細書に報告する抗体またはコンジュゲートが提供される。一定の態様において、本方法は、生物学的試料を、本明細書に報告する抗体またはコンジュゲートと、ターゲットへの抗体またはコンジュゲートの結合を許容する条件下で接触させる工程、および抗体またはコンジュゲートとターゲットとの間に複合体が形成されるかどうかを検出する工程を含む。そのような方法はインビトロ法またはインビボ法であることができる。
【０３２７】
一定の態様では、標識抗体または標識コンジュゲートが提供される。ラベルとしては、直接検出されるラベルまたは部分（例えば蛍光ラベル、発色団ラベル、高電子密度ラベル、化学発光ラベル、および放射性ラベル）、ならびに例えば酵素反応または分子相互作用などによって間接的に検出される部分、例えば酵素またはリガンドが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。例示的ラベルとして、放射性同位体32P、14C、125I、3H、および131I、発蛍光団、例えば希土類キレートまたはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（US4,737,456）、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、過酸化水素を使って色素前駆体を酸化する酵素（例えばHRP、ラクトペルオキシダーゼ、またはマイクロペルオキシダーゼ）と共役させた複素環オキシダーゼ（例えばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ビオチン/アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定フリーラジカルなどが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０３２８】
VI.薬学的製剤
本明細書において報告する抗体またはコンジュゲートの薬学的製剤は、望ましい純度を有するそのような抗体またはコンジュゲートを1つまたは複数の随意の薬学的に許容される担体（Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版, Osol, A.編（1980））と混合することにより、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製される。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量および濃度において受容者にとって一般に無毒性であり、これには、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤;酸化防止剤、例えばアスコルビン酸およびメチオニン;保存剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えばメチルパラベンまたはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾール）;低分子量（約10残基未満）のポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリ（ビニルピロリドン）;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン;単糖、二糖、および他の糖質、例えばグルコース、マンノース、またはデキストリン;キレート剤、例えばEDTA;糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール;塩形成対イオン、例えばナトリウム;金属錯体（例えばZn-タンパク質錯体）;および/または非イオン界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（PEG）などがあるが、それらに限定されるわけではない。本明細書における、例示的な薬学的に許容される担体には、さらに、間質薬物分散剤、例えば可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（sHASEGP）、例えばヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばrhuPH20（HYLENEX（登録商標）、Baxter International, Inc.）が含まれる。rhuPH20を含む一定の例示的sHASEGPおよびその使用方法は、米国特許公報第2005/0260186号ならびに同第2006/0104968号に記載されている。一局面では、sHASEGPが、1つまたは複数の追加グリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと併用される。
【０３２９】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、US6,267,958に記載されている。水性抗体製剤としては、US6,171,586およびWO2006/044908に記載されているものが挙げられ、後者の製剤はヒスチジン-酢酸緩衝液を含む。
【０３３０】
本明細書における製剤は、処置される特定適応症の必要に応じて、2つ以上の活性成分、好ましくは互いに有害な影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含有しうる。そのような活性成分は、適宜、意図した目的に有効な量で組み合わせされて存在する。
【０３３１】
活性成分は、例えばコアセルベーション技法または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ-（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに封入するか、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）に封入するか、またはマクロエマルションに封入することができる。そのような技法は、Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版, Osol, A.編（1980）に開示されている。
【０３３２】
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例としては、抗体またはコンジュゲートを含有する固形疎水性ポリマーの半透過性マトリックスであって、マトリックスがフィルムまたはマイクロカプセルなどの造形品の形態にあるものが挙げられる。
【０３３３】
インビボ投与に使用される製剤は一般に滅菌状態にある。滅菌性は例えば滅菌濾過膜による濾過などによって容易に達成することができる。
【０３３４】
VII.治療方法および治療組成物
本明細書に報告する抗体またはコンジュゲートはいずれも治療方法に使用することができる。
【０３３５】
一局面では、医薬として使用するための、本明細書に報告する抗体またはコンジュゲートが提供される。さらなる局面では、疾患の処置において使用するための本明細書に報告する抗体またはコンジュゲートが提供される。一定の態様では、処置方法において使用するための本明細書に報告する抗体またはコンジュゲートが提供される。一定の態様において、本発明は、個体に有効量の本明細書に報告する抗体またはコンジュゲートを投与する工程を含む、個体を処置する方法において使用するための、本明細書に報告する抗体またはコンジュゲートを提供する。そのような態様の1つにおいて、本方法はさらに、個体に有効量の少なくとも1つの追加治療剤、例えば後述するものを投与することを含む。上記の態様のいずれにおいても「個体」はヒトでありうる。
【０３３６】
さらなる局面において、本発明は、医薬の製造または調製における本明細書に報告する抗体またはコンジュゲートの使用を提供する。一態様では、医薬は、疾患を処置するための医薬である。さらなる一態様では、医薬は、疾患を有する個体に有効量の該医薬を投与する工程を含む疾患の処置方法において使用するための医薬である。そのような態様の1つにおいて、本方法はさらに、個体に、有効量の少なくとも1つの追加治療剤、例えば後述するものを投与する工程を含む。上記の態様のいずれにおいても「個体」はヒトでありうる。
【０３３７】
さらなる一局面において、本発明は、疾患を処置するための方法を提供する。一態様では、本方法は、そのような疾患を有する個体に有効量の本明細書に報告する抗体またはコンジュゲートを投与する工程を含む。そのような態様の1つでは、本方法はさらに、有効量の少なくとも1つの追加治療剤、例えば後述するものを、個体に投与する工程を含む。上記の態様のいずれにおいても「個体」はヒトでありうる。
【０３３８】
さらなる局面において、本発明は、例えば上記の治療方法のいずれかにおいて使用するための、本明細書に報告する抗体またはコンジュゲートのいずれかを含む薬学的製剤を提供する。一態様では、薬学的製剤は、本明細書に報告する抗体またはコンジュゲートのいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の態様では、薬学的組成物は、本明細書に報告する抗体またはコンジュゲートのいずれかと、少なくとも1つの追加治療剤、例えば後述するものとを含む。
【０３３９】
本明細書に報告する抗体およびコンジュゲートは、単独で、または他の作用物質と組み合わせて、治療に使用することができる。例えば本明細書に報告する抗体またはコンジュゲートは、少なくとも1つの追加治療剤と同時投与することができる。
【０３４０】
上記の併用治療には、併用投与（この場合は2つ以上の治療剤が同じ製剤または別個の製剤に含まれている）、および個別投与（この場合は、本発明の抗体の投与を、追加治療剤および/またはアジュバントの投与の前に、同時に、および/または後に、行うことができる）が包含される。本明細書に報告する抗体およびコンジュゲートは放射線療法と併用することもできる。
【０３４１】
本明細書に報告する抗体またはコンジュゲート（および任意の追加治療剤）は、非経口投与、肺内投与、および鼻腔内投与、そして局所処置にとって望ましい場合は、病巣内投与を含む、任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が含まれる。投薬は、投与が短期間であるか慢性的であるかにも一部依存して、任意の適切な経路で、例えば静脈内注射または皮下注射などの注射によって、行うことができる。限定するわけではないが、単回投与、またはさまざまな時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含む、さまざまな投薬スケジュールが、本明細書では考えられる。
【０３４２】
本明細書に報告する抗体またはコンジュゲートは、優良医療規範（good medical practice）に合致する方法で、製剤化され、調合され、投与されるであろう。この文脈において考慮すべき因子には、処置される特定障害、処置される特定哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与の方法、投与のスケジューリング、および医療従事者に公知の他の因子が含まれる。抗体またはコンジュゲートは、問題の障害を防止または処置するために現在使用されている1つまたは複数の作用物質と共に製剤化する必要はないが、任意でそのようにしてもよい。そのような他の作用物質の有効量は、製剤中に存在する抗体またはコンジュゲートの量、障害または処置のタイプ、および上で述べた他の因子に依存する。これらは、一般に、上述したものと同じ投薬量および投与経路で使用されるか、本明細書に記載する投薬量の約1〜99％で、または実験的/臨床的に適当であると決定された任意の投薬量および任意の経路で使用される。
【０３４３】
疾患の防止または処置に関して、本明細書に報告する抗体またはコンジュゲートの適当な投薬量（単独で使用する場合、または1つもしくは複数の他の追加治療剤と併用する場合）は、処置すべき疾患のタイプ、抗体またはコンジュゲートのタイプ、疾患の重症度および経過、抗体またはコンジュゲートを防止のために投与するか治療のために投与するか、治療歴、患者の病歴および抗体またはコンジュゲートに対する応答、ならびに担当医の裁量に依存するであろう。抗体またはコンジュゲートは、患者に1回で、または一連の処置で、適切に投与される。疾患のタイプおよび重症度に依存して、例えば1回または複数回の独立した投与によるか、または持続注入によるかを問わず、約1μg/kg〜15mg/kg（例えば0.5mg/kg〜10mg/kg）の抗体またはコンジュゲートを、患者に投与するための初回候補投薬量とすることができる。典型的な1日量は、上述の因子に依存して約1μg/kgから100mg/kgまで、またはそれ以上に及ぶかもしれない。数日またはそれ以上にわたる反復投与の場合、状態に依存して、処置は一般に、疾患症状の所望の抑制が起こるまで、維持されるであろう。抗体またはコンジュゲートの例示的投薬量の1つは約0.05mg/kg〜約10mg/kgの範囲にあるだろう。したがって約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kgまたは10mg/kg（またはそれらの任意の組み合わせ）の1つまたは複数の用量を患者に投与することができる。そのような用量は（例えば患者が抗体の投与を約2回〜約20回、例えば約6回受けることになるように）間欠的に、例えば毎週または3週ごとに投与することができる。高用量の初回負荷量を投与した後、それより低い用量を1回または複数回投与することができる。ただし他の投薬レジメンも役立ちうる。この治療の進行は、従来の技法およびアッセイによって容易に監視される。
【０３４４】
上記の製剤または治療方法はいずれも、本明細書に報告する抗体またはコンジュゲートの代わりに、または本明細書に報告する抗体またはコンジュゲートに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを使って行うこともできると理解される。
【０３４５】
VIII.製造品
本発明の別の局面では、上述の障害の処置、防止および/または診断に有用な材料が入っている製造品が提供される。製造品は、容器、および容器上のまたは容器に付随するラベルまたは添付文書を含む。適切な容器として、例えば瓶、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなど、さまざまな素材で形成されうる。容器は、組成物を単独で、または当該状態を処置、防止および/または診断するのに有効な別の組成物と組み合わせて保持し、滅菌アクセスポートを有しうる（例えば容器は静脈内溶液バッグであるか、皮下注射針で突き刺すことができる栓を有するバイアルであることができる）。組成物中の少なくとも1つの活性作用物質は本明細書に報告する抗体または複合体である。ラベルまたは添付文書は、当該組成物が、選択された状態を処置するために使用されることを示す。さらにまた、本製造品は、（a）本明細書に報告する抗体または複合体を含む組成物が入っている第1容器と、（b）さらなる細胞傷害性作用物質または他の治療剤を含む組成物が入っている第2容器とを含みうる。本発明のこの態様の製造品は、さらに、特定の状態を処置するために当該組成物を使用できることを示す添付文書を含みうる。これに代えて、またはこれに加えて、本製造品はさらに、薬学的に許容される緩衝液、例えば静菌性注射用水（BWFI）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液などを含む第2（または第3）の容器を含みうる。これは、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料、例えば他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、およびシリンジなどを、さらに含みうる。
【０３４６】
上記の製造品はいずれも、本明細書に報告する抗体またはコンジュゲートの代わりに、または本明細書に報告する抗体またはコンジュゲートに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含みうると理解される。
【０３４７】
IX.具体的態様
1.ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物とヘリカーモチーフアミノ酸配列に特異的に結合する抗体とを含むコンジュゲートであって、該ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物と、抗ヘリカー抗体のKabatに従って決定されるCDR2中のアミノ酸残基との間の共有結合を特徴とする、コンジュゲート。
2.ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物と、該ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物のヘリカーモチーフアミノ酸配列に特異的に結合する抗体（抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体）とを含むコンジュゲートであって、該ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物と、抗体のKabatに従って決定されるCDR2中のアミノ酸残基との間の共有結合を特徴とする、コンジュゲート。
3.CDR2が軽鎖CDR2であることを特徴とする、項目1〜2のいずれか一項記載のコンジュゲート。
4.ヘリカーモチーフアミノ酸配列がアミノ酸配列：
0006602304.tif 000014
を有するか、またはアミノ酸残基の1つがシステインに変化したその変異体であることを特徴とする、項目1〜3のいずれか一項記載のコンジュゲート。
5.ヘリカーモチーフアミノ酸配列が、アミノ酸配列：
0006602304.tif 000015
を有し、ここで3つのC末端アミノ酸残基のうちの1アミノ酸残基がシステインに変化していることを特徴とする、項目1〜4のいずれか一項記載のコンジュゲート。
6.ヘリカーモチーフアミノ酸配列が、以下：
0006602304.tif 000016
のアミノ酸配列を有することを特徴とする、項目1〜5のいずれか一項記載のコンジュゲート。
7.ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物が、ヘリカーモチーフアミノ酸配列、任意でリンカー、およびペイロードを含むことを特徴とする、項目1〜6のいずれか一項記載のコンジュゲート。
8.ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物が、ポリペプチド配列の一方の末端またはポリペプチド配列内のどちらかに融合されたヘリカーモチーフアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする、項目1〜7のいずれか一項記載のコンジュゲート。
9.共有結合が、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物と、抗体のCDR2中のアミノ酸残基との間にあることを特徴とする、項目1〜8のいずれか一項記載のコンジュゲート。
10.共有結合が、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物中の官能基と、抗体のCDR2中のアミノ酸残基との間にあることを特徴とする、項目1〜9のいずれか一項記載のコンジュゲート。
11.官能基が、ヘリカーモチーフアミノ酸配列中にあることを特徴とする、項目1〜10のいずれか一項記載のコンジュゲート。
12.共有結合が、抗体の軽鎖CDR2中のシステイン残基と、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物中の官能基との間にあることを特徴とする、項目1〜11のいずれか一項記載のコンジュゲート。
13.抗体の軽鎖CDR2中のシステイン残基が、Kabatの軽鎖可変ドメインナンバリングに従う位置55または位置51にあることを特徴とする、項目12記載のコンジュゲート。
14.抗体の軽鎖CDR2中のシステイン残基がKabatの軽鎖可変ドメインナンバリングに従う位置55にあることを特徴とする、項目12〜13のいずれか一項記載のコンジュゲート。
15.共有結合がジスルフィド結合であることを特徴とする、項目1〜14のいずれか一項記載のコンジュゲート。
16.ジスルフィド結合が、ヘリカーモチーフアミノ酸配列中のシステイン残基と、抗ヘリカー抗体の軽鎖のCDR2中のシステイン残基との間にあることを特徴とする、項目15記載のコンジュゲート。
17.ヘリカーモチーフアミノ酸配列がSEQ ID NO:02のアミノ酸配列を有することを特徴とする、項目1〜16のいずれか一項記載のコンジュゲート。
18.抗体が、非ヘリカー抗原に対する第1結合特異性とヘリカーモチーフアミノ酸配列に対する第2結合特異性とを含む二重特異性抗体であることを特徴とする、項目1〜17のいずれか一項記載のコンジュゲート。
19.（非ヘリカー）抗原が細胞表面抗原であることを特徴とする、項目18記載のコンジュゲート。
20.細胞表面抗原が腫瘍関連抗原であることを特徴とする、項目19記載のコンジュゲート。
21.二重特異性抗体が、重鎖C末端の一方または両方において、scFvもしくはdsscFvもしくはscFabもしくはdsscFabまたはそれらの組み合わせが、直接的に、またはペプチドリンカーを介して融合されている完全長抗体であることを特徴とする、項目18〜20のいずれか一項記載のコンジュゲート。
22.二重特異性抗体が完全長抗体であることを特徴とする、項目18〜21のいずれか一項記載のコンジュゲート。
23.二重特異性抗体の一方の重鎖がホール突然変異を含み、それぞれの他方の鎖がノブ突然変異を含むことを特徴とする、項目18〜22のいずれか一項記載のコンジュゲート。
24.ペイロードが、結合部分、標識部分、および生物活性部分から選択されることを特徴とする、項目7〜23のいずれか一項記載のコンジュゲート。
25.抗体が完全長抗体であることを特徴とする、項目1〜24のいずれか一項記載のコンジュゲート。
26.抗体がヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする、項目1〜25のいずれか一項記載のコンジュゲート。
27.抗体の定常領域がIgG1サブクラスまたはIgG4サブクラスであることを特徴とする、項目1〜26のいずれか一項記載のコンジュゲート。
28.抗体が、KabatのEUインデックスによるナンバリングに従う位置234および位置235にアラニンおよび位置329にグリシンを持つIgG1サブクラスの定常領域を有することを特徴とする、項目1〜27のいずれか一項記載のコンジュゲート。
29.抗体が、KabatのEUインデックスによるナンバリングに従う位置228にプロリン、位置235にグルタミン酸、および位置329にグリシンを持つIgG4クラスの定常領域を有する
ことを特徴とする、項目1〜27のいずれか一項記載のコンジュゲート。
30.抗体が抗体フラグメントであることを特徴とする、項目1〜24のいずれか一項記載のコンジュゲート。
31.フラグメントがFabまたは（Fab）2であることを特徴とする、項目30記載のコンジュゲート。
32.1つの軽鎖CDR2につき厳密に1つの共有結合を含むことを特徴とする、項目1〜31のいずれか一項記載のコンジュゲート。
33.ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物が、抗体のCDR2中のシステイン残基のチオール基との共有結合を形成することができる反応性基を含むことを特徴とする、項目1〜32のいずれか一項記載のコンジュゲート。
34.反応性基がチオール、マレイミド、またはハロアセチルであることを特徴とする、項目1〜33のいずれか一項記載のコンジュゲート。
35.共有結合がジスルフィド結合であることを特徴とする、項目1〜34のいずれか一項記載のコンジュゲート。
36.ジスルフィド結合が酸化還元活性作用物質を添加することなく形成されることを特徴とする、項目35記載のコンジュゲート。
37.治療部分または検出可能部分を含むことを特徴とする、項目1〜36のいずれか一項記載のコンジュゲート。
38.治療部分または検出可能部分が、ヘリカーモチーフアミノ酸配列に共有結合でコンジュゲートされているか、またはヘリカーモチーフアミノ酸配列が治療部分または検出可能部分に組み込まれていることを特徴とする、項目37記載のコンジュゲート。
39.ヘリカーモチーフアミノ酸配列が、5〜500個のアミノ酸残基からなるポリペプチドにコンジュゲートされていることを特徴とする、項目1〜38のいずれか一項記載のコンジュゲート。
40.ポリペプチドが10〜450個のアミノ酸残基を含むことを特徴とする、項目39記載のコンジュゲート。
41.ポリペプチドが12〜450個のアミノ酸残基を含むことを特徴とする、項目39〜40のいずれか一項記載のコンジュゲート。
42.ポリペプチドが15〜400個のアミノ酸残基を含むことを特徴とする、項目39〜41のいずれか一項記載のコンジュゲート。
43.ヘリカーモチーフアミノ酸配列が検出可能ラベルにコンジュゲートされていることを特徴とする、項目1〜42のいずれか一項記載のコンジュゲート。
44.ヘリカーモチーフアミノ酸配列が、ポリペプチドまたは検出可能ラベルまたはペイロードに、リンカーを介してコンジュゲートされていることを特徴とする、項目1〜43のいずれか一項記載のコンジュゲート。
45.リンカーが非ペプチドリンカーであることを特徴とする、項目44記載のコンジュゲート。
46.リンカーがペプチドリンカーであることを特徴とする、項目44記載のコンジュゲート。
47.軽鎖において、Kabatに従って決定されるCDR2中にシステイン残基を有する抗ヘリカー抗体。
48.抗体の軽鎖CDR2中のシステイン残基がKabatの軽鎖可変ドメインナンバリングに従う位置55または位置51にあることを特徴とする、項目47記載の抗ヘリカー抗体。
49.抗体の軽鎖CDR2中のシステイン残基がKabatの軽鎖可変ドメインナンバリングに従う位置55にあることを特徴とする、項目47〜48のいずれか一項記載の抗ヘリカー抗体。
50.厳密に1つの重鎖可変ドメインにおいて位置55または位置51にシステイン残基を有することを特徴とする、項目47〜49のいずれか一項記載の抗ヘリカー抗体。
51.ヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする、項目47〜50のいずれか一項記載の抗ヘリカー抗体。
52.完全長抗体、またはFab、またはscFv、またはFc領域にコンジュゲートされたscFvであることを特徴とする、項目47〜51のいずれか一項記載の抗ヘリカー抗体。
53.システインが孤立したシステイン残基または孤立したホモシステイン残基とジスルフィド結合を形成することを特徴とする、項目47〜52のいずれか一項記載の抗ヘリカー抗体。
54.項目1〜46のいずれか一項記載のコンジュゲートと細胞傷害性作用物質とを含むイムノコンジュゲート。
55.項目1〜46のいずれか一項記載のコンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む薬学的製剤。
56.医薬として使用するための項目1〜46のいずれか一項記載のコンジュゲート。
57.がんを処置するための項目1〜46のいずれか一項記載のコンジュゲート。
58.糖尿病を処置するための、項目1〜46のいずれか一項記載のコンジュゲート。
59.脂肪症を処置するための、項目1〜46のいずれか一項記載のコンジュゲート。
60.炎症性疾患を処置するための項目1〜46のいずれか一項記載のコンジュゲート。
61.代謝性疾患を処置するための項目1〜46のいずれか一項記載のコンジュゲート。
62.ウイルス性疾患を処置するための項目1〜46のいずれか一項記載のコンジュゲート。
63.医薬の製造における項目1〜46のいずれか一項記載のコンジュゲートの使用。
64.診断剤としての項目1〜46のいずれか一項記載のコンジュゲートの使用。
65.治療用ポリペプチドを含む項目1〜46のいずれか一項記載のコンジュゲートの、該治療用ポリペプチドの安定性を増加させるための使用。
66.治療用ポリペプチドを含む項目1〜46のいずれか一項記載のコンジュゲートの、該治療用ポリペプチドの活性を増加させるための使用。
67.治療用ポリペプチドを含む項目1〜46のいずれか一項記載のコンジュゲートの、該治療用ポリペプチドのインビボ半減期を増加させるための使用。
68.疾患の処置における項目1〜46のいずれか一項記載のコンジュゲートの使用。
69.疾患を有する個体を処置する方法であって、有効量の項目1〜46のいずれか一項記載のコンジュゲートを該個体に投与する工程を含む方法。
70.個体における疾患を処置する方法であって、有効量の項目1〜46のいずれか一項記載のコンジュゲートを該個体に投与する工程を含む方法。
71.疾患ががんであることを特徴とする、項目68〜70のいずれか一項記載の方法。
72.疾患が糖尿病であることを特徴とする、項目68〜70のいずれか一項記載の方法。
73.疾患が脂肪過多症であることを特徴とする、項目68〜70のいずれか一項記載の方法。
74.第1反応性基を含む抗ヘリカー抗体と、第2反応性基を有するヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物との組み合わせを含み、第1反応性基を保持するアミノ酸残基のアルファ炭素原子が、リンカーが融合されるヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物の原子から、約10〜11オングストローム離れている、項目1〜46のいずれか一項記載のコンジュゲートを生産する方法。
75.項目1〜46のいずれか一項記載のコンジュゲートを生産する方法であって、以下の工程を含む方法:
・ヘリカーモチーフアミノ酸配列に特異的に結合しかつCDR2中の1つのアミノ酸残基に反応性基を含む抗ヘリカー抗体を、反応性基を含みかつペイロード、例えば5〜500個のアミノ酸からなるペプチドまたは検出可能ラベルを含むヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物と、溶液中で混和する工程、および
・該溶液からコンジュゲートを回収する工程。
76.項目1〜46のいずれか一項記載のコンジュゲートを形成させるための抗ヘリカー抗体を生産するための方法であって、
・抗ヘリカー抗体をコードする核酸を含む細胞を培養する工程、および
・細胞または培養培地から抗ヘリカー抗体を回収する工程
を含み、該抗ヘリカー抗体では、抗ヘリカー抗体とヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物との非共有結合的複合体のX線構造において、共有結合を形成させようとする抗体CDR2中のアミノ酸残基のアルファ炭素原子とヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物の原子との間に10〜11オングストロームの距離を有する軽鎖CDR2中の残基が、システインに突然変異している、方法。
77.抗体CDR2中の残基と、結合したヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物との間に共有結合を形成させるためにシステインに突然変異させることができる抗ヘリカー抗体CDR2中の位置を同定するための方法であって、
・抗ヘリカー抗体とヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物の非共有結合的複合体の結晶構造を提供する工程、および
・抗体CDR2中のアミノ酸残基のアルファ炭素原子とヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物中の原子との間に10〜11オングストロームの距離がある、抗ヘリカー抗体のCDR2中のアミノ酸残基、およびヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物中の原子を同定する工程
を含み、同定された位置が、抗体CDR2中の残基と、結合したヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物との間に共有結合を形成させるためにシステインに突然変異させることができる抗体CDR2中の位置である、方法。
78.ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物をターゲット細胞に標的送達するための二重特異性抗ヘリカー抗体であって、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物に特異的に結合する第1結合部位と、ターゲット細胞の細胞表面マーカーに特異的に結合する第2結合特異性とを含む、二重特異性抗体。
【０３４８】
本明細書において言及するあらゆる文献の開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０３４９】
本発明の理解を助けるために、以下に実施例、図および配列を提供するが、本発明の真の範囲は、本願特許請求の範囲に記載するとおりである。記載する手法に、本発明の要旨から逸脱することなく、変更を加えうることはいうまでもない。
【実施例】
【０３５０】
以下の実施例において使用する抗ハプテン抗体およびハプテン化化合物のアミノ酸配列、合成および精製については、WO2014/006124を参照されたい。
【０３５１】
実施例1
ビオチン標識化合物（ハプテン化化合物）への組換えヒト化抗ビオチン抗体の結合
ヒト化手法およびその後のシステイン突然変異の導入によって完全な結合活性を保っている誘導体が得られたかどうかを決定するために、以下の実験を行った。
【０３５２】
組換え抗ビオチン抗体誘導体の結合特性を、バイオレイヤー干渉法（BLI）技術により、 Octet QK計器（Fortebio Inc.）を使って、分析した。これは、分子相互作用を研究するための確立されたシステムである。BLi技術は、バイオセンサーチップの表面と内部対照とから反射される白色光の干渉パターンの測定に基づいている。バイオセンサーチップへの分子の結合は、測定することができる干渉パターンのシフトをもたらす。上述のヒト化手法が抗ビオチン抗体のビオチンへの結合能を減少させたかどうかを解析するために、キメラ型およびヒト化型の抗体がビオチン化タンパク質に結合する能力について、それらの特性を直接比較した。結合研究は、抗huIgG Fc抗体捕捉（anti-huIgG Fc antibody Capture）（AHC）バイオセンサー（Fortebio Inc.）上で抗ビオチン抗体を捕捉することによって行った。まず、20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0中、濃度が0.5mg/mlの抗体溶液において、バイオセンサーを1分間インキュベートした。その後、安定なベースラインに到達するように、バイオセンサーを1×PBS（pH7.4）中で1分間インキュベートした。20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0中にビオチン化タンパク質を0.06mg/mlの濃度で含有する溶液において、抗体被覆バイオセンサーを5分間インキュベートすることによって、結合を測定した。解離は1×PBS（pH7.4）中で5分間モニターした。その結果得られたキメラ抗ビオチン化抗体とヒト化抗ビオチン抗体に関する結合曲線を直接比較した。
【０３５３】
ヒト化型の抗体は、キメラ抗体に等しいか、またはキメラ抗体より良好な、ビオチン化抗原の結合を示した。Kabat位置VH53にCys突然変異を持つヒト化抗体にも同じことがいえる。ビオチン化タンパク質はバイオセンサーへの残存非特異的結合を示し、それは、ビオチンを結合しないハーセプチンでバイオセンサーを被覆すると低減した。したがって、抗ビオチン抗体の機能性は、そのヒト化変異体（SEQ ID NO:19および20、SEQ ID NO:21および22に示す配列によって定義されるもの）でも保たれていた。
【０３５４】
表面プラズモン共鳴
表面プラズモン共鳴測定は、BIAcore（登録商標）T200計器（GE Healthcare Biosciences AB、スウェーデン）で、25℃において行った。およそ4300レゾナンスユニット（RU）の捕捉系（ヒト抗体捕捉キット（Human Antibody Capture Kit）BR-1008-39（GE Healthcare Biosciences AB、スウェーデン）の10μg/ml抗ヒト捕捉（Anti-human Capture）（IgG Fc））を、GE Healthcareが供給している標準的なアミンカップリングキット（BR-1000-50）を使って、CM3チップ（GE Healthcare、BR-1005-36）にpH5.0でカップリングした。アミンカップリングのためのランニング緩衝液はHBS-N（10mM HEPES、pH7.4、150mM NaCl、GE Healthcare、BR-1006-70）とした。続く結合研究用のランニングおよび希釈緩衝液は、PBS-T（0.05％Tween 20を含む10mMリン酸緩衝食塩水）pH7.4とした。ヒト化抗ビオチン抗体の捕捉は、2nM溶液を5μl/分の流量で60秒間注入することによって行った。ビオチン化siRNAをPBS-Tで0.14〜100nM（1:3希釈系列）の濃度に希釈した。各濃度を30μ1/分の流量で180秒間注入することによって結合を測定した（解離時間600秒）。流量5μl/分の3M MgCl2溶液による30秒間の洗浄で、表面を再生した。BIAevaluationソフトウェア（GE Healthcare Biosciences AB、スウェーデン）を使ってデータを評価した。抗ヒトIgG Fc表面から得られた応答を差し引くことによってバルク屈折率の差を補正した。ブランク注入も差し引いた（＝二重参照）。KDおよび速度論的パラメータの計算にはラングミュア1:1モデルを使用した。
【０３５５】
ヒト化抗ビオチン抗体SEQ ID NO:19および20ならびにヒト化抗ビオチン抗体VH53C SEQ ID NO:21および22について、表面プラズモン共鳴（SPR）による速度論的結合解析を行った。濃度が2nMの抗ビオチン抗体を、CM3センサーチップに結合している抗ヒトIgG Fc抗体によって捕捉した。ビオチン化siRNA（Mw:13868Da）の結合を、0.41、1.23、3.7、11.1、33.3、100および300nMの濃度で記録した。測定は二重に行った。計算されたKDは、ヒト化抗ビオチン抗体およびヒト化抗ビオチン抗体VH53Cについて、それぞれ0.633nMおよび0.654nMであった。
【０３５６】
実施例2
ハプテン化化合物と抗ハプテン抗体との非共有結合的複合体の生成
一般的方法:
抗ハプテン抗体とハプテン化化合物（＝ペイロードにコンジュゲートされたハプテン）との複合体の生成は、所定の複合体をもたらすべきであり、これらの複合体中の化合物（＝ペイロード）はその活性を保っていることが保証されるべきである。ハプテン化化合物とそれぞれの抗ハプテン抗体との複合体を生成させるために、ハプテン化化合物を最終濃度が1mg/mlになるようにH2Oに溶解した。抗体は、20mMヒスチジン緩衝液、140mM NaCl、pH＝6.0中で、1mg/ml（4.85μM）の最終濃度まで濃縮した。ハプテン化ペイロードと抗体とを、モル比が2:1（化合物対抗体）になるように、上下にピペッティングすることによって混合し、室温で15分間インキュベートした。
【０３５７】
あるいは、ハプテン化化合物を最終濃度が10mg/mlになるように100％DMFに溶解した。抗体は、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH=8.2中で、10mg/mlの最終濃度まで濃縮した。ハプテン化化合物と抗体とを、モル比が2.5:1（化合物対抗体）になるように、上下にピペッティングすることによって混合し、室温および350rpmで、60分間インキュベートした。
【０３５８】
ハプテン化蛍光色素と抗ハプテン抗体との複合体-非共有結合的ジゴキシゲニン-Cy5複合体-を形成させるための例示的方法
ヒト化およびマウス抗ジゴキシゲニン抗体または二重特異性抗ジゴキシゲニン抗体誘導体を抗体構成要素として使用した。ジゴキシゲニン化Cy5と抗ジゴキシゲニン抗体の複合体を生成させるために、Cy5-ジゴキシゲニンコンジュゲートをPBSに溶解して、最終濃度を0.5mg/mlにした。抗体は、20mMヒスチジンおよび140mM NaCl、pH6で構成される緩衝液中、1mg/ml（約5μM）の濃度で使用した。ジゴキシゲニン化Cy5と抗体とを2:1のモル比（ジゴキシゲニン化Cy5対抗体）で混合した。この手法により、所定の組成を持つ複合体の均一な調製物が得られた。
【０３５９】
複合体化反応は、サイズ排除カラムで、抗体会合発蛍光団の蛍光（650/667nm）を決定することによって監視することができる。これらの実験の結果は、抗体がジゴキシゲニンに対する結合特異性を持っている場合にのみ複合体化が起こることを実証している。ジゴキシゲニンに対する結合特異性を持たない抗体はジゴキシゲニン-Cy5コンジュゲートに結合しない。二価抗ジゴキシゲニン抗体では、ジゴキシゲニン-Cy5コンジュゲート対抗体の比が2:1になるまで、シグナルの増加を観察することができる。その後、組成依存的蛍光シグナルはプラトーに到達する。
【０３６０】
ハプテン化蛍光色素と抗ハプテン抗体の複合体-ビオチン-Cy5/キメラ抗ビオチン抗体（ヒトIgGサブクラス）複合体-を形成させるための例示的方法
システイニル化リンカーを含有するビオチン誘導体化Cy5（ビオチン-Cys-Cy5）の複合体を生成させるために、0.16mgのビオチン-Cys-Cy5を、濃度が10mg/mlになるように100％DMFに溶解した。1mgの抗体を、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、10.1mg/ml（約69μM）の濃度で使用した。ビオチン-Cys-Cy5と抗体とを2.5:1のモル比（ビオチン-Cys-Cy5対抗体）で混合し、350rpmで振とうしながら室温で60分間インキュベートした。その結果得られたコンジュゲートを、実施例3aで述べるようにSDS-PAGEで分析した。蛍光の検出は実施例3aで述べるように行った。
【０３６１】
ビオチン化蛍光色素と抗ビオチン抗体との複合体-ビオチン-Ser-Cy5/ヒト化抗ビオチン抗体-を形成させるための例示的方法
リンカー内にセリン残基を含有するビオチン誘導体化Cy5（ビオチン-Ser-Cy5）の複合体を生成させるために、0.61mgのビオチン-Ser-Cy5を、10mg/mlの濃度になるように、20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0に溶解した。18.5mgのヒト化抗ビオチン抗体を、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、10mg/ml（約69μM）の濃度で使用した。ビオチン-Ser-Cy5と抗体とを2.5:1のモル比（ビオチン-Ser-Cy5対抗体）で混合し、350rpmで振とうしながら室温で60分間インキュベートした。次に、20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0を移動相とし、1.5ml/分の流量で、Superdex 200 16/60高負荷分取用（high load prep）カラム（GE Healthcare）を用いるサイズ排除クロマトグラフィーに、試料を付した。ピーク画分を収集し、SDS-PAGEで純度を分析した。色素対抗体比は、（1）280nm（タンパク質）および650nm（Cy5）で試料の吸光度を測定し、（2）式:標識されたタンパク質のA650/ε（Cy5）×タンパク質濃度（M）＝タンパク質1モルあたりの色素のモル数（ここで、ε（Cy5）＝250000M-1cm-1、複合体のA650＝47.0、およびタンパク質濃度は86.67μMである）を使用することによって計算した。その結果得られた色素対抗体分子の比は2.17であった。これは、すべての抗体パラトープがビオチン-Cy5分子で飽和していることを示している。
【０３６２】
ハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体の複合体-ジゴキシゲニン-PYY（3-36）/抗ジゴキシゲニン抗体複合体-を形成させるための例示的方法
ジゴキシゲニン化ポリペプチドと抗ジゴキシゲニン抗体との非共有結合的複合体を生成させるために、マウスハイブリドーマ由来の抗体（10mM KP04、70mM NaCl; pH7.5からの凍結乾燥物）を12mlの水に溶解し、20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0を含む溶液に対して透析することにより、11mlの緩衝液中に300mg（2×10-6mol）を得た（c＝27.3mg/ml）。ジゴキシゲニン-PYY（3-36）コンジュゲート（11.57mg、4×10-6mol、2等量）を2.85mgずつ4回に分けて1時間以内に加え、室温でさらに1時間インキュベートした。複合体化反応の完了後に、複合体を、流量2.5ml/分の20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0におけるSuperdex 200 26/60 GLカラム（320ml）でのサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。溶出した複合体を各4mlの画分に収集し、プールし、0.2μmフィルタで滅菌することにより、234mgの複合体を14.3mg/mlの濃度で得た。同様にして、ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体の複合体を生成させるために、抗体を、20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0中、10.6mg/ml（0.93ml中に9.81mg、6.5×10-8mol）の濃度に調節した。0.57mg＝1.97×10-7mol＝3.03等量のジゴキシゲニン化ポリペプチド（DIG-PYY）を、凍結乾燥物として、抗体溶液に加えた。ポリペプチドと抗体とを室温で1.5時間インキュベートした。過剰のポリペプチドを、流量0.5ml/分の20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0におけるSuperose 6 10/300 GLカラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによって除去した。溶出した複合体を各0.5mlの画分に収集し、プールし、0.2μmフィルタで滅菌することにより、4.7mgの複合体を1.86mg/mlの濃度で得た。
【０３６３】
結果として得られたハプテン化ポリペプチド-抗ハプテン抗体複合体は、サイズ排除クロマトグラフィーに単一ピークが現れることから、単量体型のIgG様分子であることが明らかになった。結果として得られた複合体は、1抗体分子あたり2つのジゴキシゲニン-PYY誘導体を保有する単量体型IgG様分子であることが明らかになった。サイズ排除クロマトグラフィーは、これらのペプチド複合体の所定の組成を裏付けると共に、タンパク質凝集体が存在しないことも示した。これらの二重特異性ペプチド複合体の所定の組成（および2:1というポリペプチド対タンパク質比）は、SEC-MALS（サイズ排除クロマトグラフィー-多角度レーザー光散乱法）によって、さらに裏付けられた。SEC-MALS分析のために、100〜500μgの各試料を、1×PBS pH7.4を移動相として、0.25〜0.5ml/分の流量で、Superdex 200 10/300 GLサイズ排除カラムに適用した。光散乱はWyatt MiniDawn TREOS/QELS検出器で検出した、屈折率はWyatt Optilab rEX検出器で測定した。その結果得られたデータを、ソフトウェアASTRA（バージョン5.3.4.14）を使って解析した。SEC MALLS分析の結果は、複合体の質量、半径およびサイズに関する情報を与える。次に、これらのデータを対応する非複合体化抗体のデータと比較した。これらの実験の結果は、ジゴキシゲニン化PYYを抗ジゴキシゲニン抗体に曝露すると、1抗体分子につき2つのジゴキシゲニン-PYY誘導体を含有する複合体がもたらされることを実証している。このように、ジゴキシゲニン化PYYは、抗ジゴキシゲニン抗体と、所定の部位（結合領域）かつ所定の化学量論で、複合体を形成することができる。
【０３６４】
表面プラズモン共鳴研究による複合体の特徴付けにより、複合体化反応が所定の完全に複合体化した分子を生成させるという追加の証拠が得られた。抗ジゴキシゲニン抗体をSPRチップに結合させることができ、それがシグナルの増加をもたらす。次に、ジゴキシゲニン-PYYコンジュゲートを添加すると、すべての結合部位が完全に占有されるまで、さらなるシグナルの増加が起こる。すべての結合部位が完全に占有された状態になると、ジゴキシゲニン-PYYをさらに添加しても、シグナルはそれ以上増加しない。これは、複合体化反応が特異的であること、そしてシグナルがジゴキシゲニン化ポリペプチドの非特異的不着によって引き起こされるのではないことを示している。
【０３６５】
ハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体との複合体-Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Biot/キメラ抗ビオチン抗体複合体-を形成させるための例示的方法
システイニル化リンカーを含有するビオチン化PYYポリペプチドの非共有結合的複合体を生成させるために、0.19mgのAc-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Biotを、濃度が10mg/mlになるように100％DMFに溶解した。抗体は、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、10.7mg/ml（約73μM）の濃度で使用した。Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Biotと抗体とを2.5:1のモル比（Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Biot対抗体）で混合し、室温、350rpmで、60分間インキュベートした。その結果得られた複合体は、サイズ排除クロマトグラフィーにおいて単一ピークが存在することから、単量体型のIgG様分子（95％モノマー）であることが明らかになった。得られた複合体を、SDS-PAGEとそれに続くウェスタンブロット解析によって、さらに分析した。10μgの複合体を4×LDS試料緩衝液（Invitrogen）と混合し、95℃で5分間インキュベートした。試料を4-12％Bis-Trisポリアクリルアミドゲル（NuPAGE、Invitrogen）にのせ、それを200Vおよび120mAで35分間泳動した。ポリアクリルアミドゲル中で分離した分子をPVDFメンブレン（孔径0.2μm、Invitrogen）に25Vおよび160mAで40分間転写した。メンブレンを、1×PBST（1×PBS＋0.1％Tween20）中、1％（w/v）脱脂乳により、室温で1時間ブロッキングした。メンブレンを1×PBST中で5分間ずつ3回洗浄した後、ストレプトアビジン-PODコンジュゲート（2900U/ml、Roche）（1:2000希釈で使用）と共にインキュベートした。メンブレン上のビオチンに結合したストレプトアビジン-PODの検出は、Lumi-Lightウェスタンブロッティング基質（Roche）を使って行った。
【０３６６】
ハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体との複合体-Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biot/キメラ抗ビオチン抗体複合体-を形成させるための例示的方法
システイニル化リンカーを含有するビオチン化PYYポリペプチドの非共有結合的複合体を生成させるために、0.16mgのAc-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biotを、濃度が10mg/mlになるように100％DMFに溶解した。抗体は、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、10.7mg/ml（約73μM）の濃度で使用した。Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biotと抗体とを2.5:1のモル比（Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biot対抗体）で混合し、室温、350rpmで、60分間インキュベートした。その結果得られた複合体は、サイズ排除クロマトグラフィーにより、63％が単量体型IgG様分子であり、37％が二量体型可溶性凝集体であることが明らかになった。得られた複合体を、SDS-PAGEとそれに続くウェスタンブロット解析によって、さらに分析した。10μgの複合体を4×LDS試料緩衝液（Invitrogen）と混合し、95℃で5分間インキュベートした。試料を4-12％Bis-Trisポリアクリルアミドゲル（NuPAGE、Invitrogen）にのせ、それを200Vおよび120mAで35分間泳動した。ポリアクリルアミドゲル中で分離した分子をPVDFメンブレン（孔径0.2μm、Invitrogen）に25Vおよび160mAで40分間転写した。メンブレンを、1×PBST（1×PBS＋0.1％Tween20）中、1％（w/v）脱脂乳により、室温で1時間ブロッキングした。メンブレンを1×PBST中で5分間ずつ3回洗浄した後、ストレプトアビジン-PODコンジュゲート（2900U/ml、Roche）（1:2000希釈で使用）と共にインキュベートした。メンブレン上のビオチンに結合したストレプトアビジン-PODの検出は、Lumi-Lightウェスタンブロッティング基質（Roche）を使って行った。
【０３６７】
ハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体との複合体-Ac-PYY（PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo）/キメラ抗フルオレセイン抗体複合体-を形成させるための例示的方法
システイニル化リンカーを含有するフルオレセインコンジュゲートPYYポリペプチドの非共有結合的複合体を生成させるために、0.33mgのAc-PYY（PEG3-Cys-PEG2-5-Fluoを、濃度が10mg/mlになるように100％DMFに溶解した。抗体は、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、9.99mg/ml（約68μM）の濃度で使用した。Ac-PYY（PEG3-Cys-PEG2-5-Fluoと抗体とを2.5:1のモル比（Ac-PYY（PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo）対抗体）で混合し、室温、350rpmで、60分間インキュベートした。その結果得られた複合体は、サイズ排除クロマトグラフィーにより、76％単量体型IgG様分子および24％二量体型可溶性凝集体であることが明らかになった。得られた複合体を、SDS-PAGEと、それに続くポリアクリルアミドゲル内でのフルオレセイン関連蛍光の検出とによって、さらに分析した。8μgの複合体を4×LDS試料緩衝液（Invitrogen）と混合し、95℃で5分間インキュベートした。フルオレセイン関連蛍光はLumiImager F1デバイス（Roche）を使用して645nmの励起波長で記録した。
【０３６８】
実施例3
酸化還元作用物質の存在下でのハプテン化色素またはハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体VH52bC/VH53Cとの所定の共有結合的コンジュゲートの生成
ハプテン化蛍光色素と抗ハプテン抗体とのコンジュゲート-Dig-Cys-Ahx-Cy5/抗ジゴキシゲニン抗体VH52bC-を形成させるための例示的方法
抗ハプテン抗体とシステイン-リンカーを含有するハプテン化蛍光色素との共有結合的コンジュゲートの生成は、抗ハプテン抗体のCDR2中のVH52bCと、ハプテンと蛍光色素の間にあるリンカー中のシステインとの間の特異的位置でジスルフィド架橋が形成されている所定のコンジュゲートをもたらす。コンジュゲーション反応を酸化還元試薬の存在下で行った。Dig-Cys-Ahx-Cy5を20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0に溶解した。10％（v/v）酢酸を滴下することによって可溶化を容易にした。最終濃度を0.4mg/mlに調節した。20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0中の抗ジゴキシゲニン抗体VH52bCを10mg/mlの濃度にした。抗ジゴキシゲニン抗体を対照として使用し、抗ジゴキシゲニン抗体VH52bCと同じ方法で処理した。4.7nmolの各抗体を2.5モル等量のDig-Cys-Ahx-Cy5と混合した。これは、11.7nmolのこの物質を4回（各2.9nmol）に分けて15分ごとに加えることによって行った。これらの添加の間は、穏やかに振とうしながら、試料を25℃でインキュベートした。最終回分の添加後に、0.64nmolの各抗体-Dig-Cys-Ahx-Cy5複合体を、以下の酸化還元試薬が入っている緩衝液に移した:3mM DTE（ジチオエリスリトール）＋10mM GSSG（酸化型グルタチオン）、0.3mM DTE＋1mM GSSG、および0.03mM DTE＋0.1mM GSSG。すべての試料をこれらの条件下で15分間インキュベートした。インキュベーション後に試料を半分（各0.34nmol）に分割し、SDSゲル電気泳動用に調製した。そのために、4×LDS試料緩衝液（Invitrogen）を加えた。各試料につき、10×NuPAGE試料還元剤（Invitrogen）を加えることによって、還元タイプも調製した。すべての試料を、70℃で5分間インキュベートしてから、1×MOPS緩衝液（Invitrogen）による4-12％Bis-Trisポリアクリルアミドゲル（NuPAGE, Invitrogen）での電気泳動に付した。ゲル内のCy5関連蛍光をLumiImager F1デバイス（Roche）により、645nmの励起波長で検出した。蛍光の検出後にゲルをSimplyBlue SafeStain（Invitrogen）で染色した。ゲルを図3に示す。
【０３６９】
抗ジゴキシゲニン抗体VH52bC（図8、上側のゲル、レーン1A〜C）では部位特異的ジスルフィド結合形成が示され、 CDR2中にシステインを持たない抗ジゴキシゲニン抗体を使用した場合（レーン2A〜C）は、低いバックグラウンド蛍光シグナルであった。対照反応におけるバックグラウンドシグナルは、抗体鎖間ジスルフィド結合の形成に通常関与するシステインへのDig-Cys-Ahx-Cy5のカップリングによって説明することができる。酸化還元試薬の量を増加させると、抗体重鎖と抗体軽鎖をつなぐジスルフィド架橋が著しく低減し、主として3/4抗体（-1×LC）、HC二量体（-2×LC）および1/2抗体（1×HC＋1×LC）が生産される。抗体に共有結合で連結されていないDig-Cys-Ahx-Cy5の蛍光は、ゲルの最下部に検出することができる。図8の下側のゲルは、試料を還元した場合は、抗体重鎖および抗体軽鎖付近にCy5関連蛍光を検出することができないことを示しており、このことから、共有結合による連結は、実際に、ジスルフィド架橋によって形成されていたことがわかる。各ゲルのクーマシー染色は、各レーン中のタンパク質の総量が等しかったことを示している。
【０３７０】
ハプテン化蛍光色素と抗ハプテン抗体とのコンジュゲート-Dig-Cys-Cy5/抗ジゴキシゲニン抗体VH52bC-を形成させるための例示的方法
Dig-Cys-Cy5を、3.25mg/mlの最終濃度になるように、8.3mM HCl、10％（v/v）DMFに溶解した。20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0中の抗ジゴキシゲニン抗体VH52bC抗体を15mg/mlの濃度にした。抗ジゴキシゲニン抗体を対照として使用し、抗ジゴキシゲニン抗体VH52bCと同じ方法で処理した。13.3nmolの各抗体を、1mM GSH（還元型グルタチオン）および5mM GSSG（還元型グルタチオン）の存在下、10mg/mlの最終抗体濃度で、2モル等量のDig-Cys-Cy5と混合した。これは、26.6nmolのこの物質を、5分ごとに2回に分けて加えることによって行った。これらの添加の間は、穏やかに撹拌しながら室温で試料をインキュベートした。最終回分の添加後に、試料を室温で1時間インキュベートした。SDS-PAGEと、それに続くCy5関連蛍光シグナルの記録によって、カップリング反応の効率を評価した。SDS-PAGE用に5、10および20μgの各試料を調製した。そのために、4×LDS試料緩衝液（Invitrogen）を加えた。すべての試料を70℃で5分間インキュベートしてから、1×MOPS緩衝液（Invitrogen）による4-12％Bis-Trisポリアクリルアミドゲル（NuPAGE, Invitrogen）での電気泳動に付した。LumiImager Flデバイス（Roche）を使用し、645nmの励起波長で、ゲル内のCy5関連蛍光を検出した。蛍光の検出後に、ゲルをSimplyBlue SafeStain（Invitrogen）で染色した。
【０３７１】
ハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体とのコンジュゲート-PEG3-PYY（PEG3-Cys-4Abu-Dig）/ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体VH52bC-を形成させるための例示的方法
システイニル化リンカーを含有するジゴキシゲニン誘導体化PYYポリペプチドのコンジュゲートを生成させるために、1.4mgのPEG3-PYY（PEG3-Cys-4Abu-Dig）を10mg/mlの濃度になるように100％DMFに溶解した。1mgの抗体を、5mM Tris-HCl、1mM EDTA、1mM GSH、5mM GSSG、pH8.2で構成される緩衝液中、10mg/ml（約68μM）の濃度で使用した。PEG3-PYY（PEG3-Cys-4Abu-Dig）と抗体とを2:1のモル比（PEG3-PYY（PEG3-Cys-4Abu-Dig）対抗体）で混合し、100rpmで撹拌しながら室温で60分間インキュベートした。その結果得られたコンジュゲートを質量分析によって分析した。検出された分子種のうちの43％が2つのポリペプチド分子にカップリングされた抗体と同定され、46％が1つのポリペプチド分子にカップリングされた抗体であり、11％がカップリンしていない抗体と同定された。
【０３７２】
実施例4
酸化還元作用物質の非存在下でのハプテン化色素およびハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体VH52bC/VH53Cとの所定の共有結合的コンジュゲートの生成
共有結合的抗ハプテン抗体/ハプテン化ポリペプチドまたはハプテン化色素ジスルフィド連結コンジュゲートを生成させるには、（i）ポリペプチドを抗体表面の上に露出させることでその活性を保つことを可能にする適切な反応性基（例えばシステイン、マレイミドなど）含有リンカーを介して、ハプテン（例えばジゴキシゲニン、フルオレセイン、ビオチンまたはテオフィリン）をポリペプチドまたは色素にカップリングすること、および（ii）ポリペプチドの生物学的活性が保たれている、ハプテン化ポリペプチドとシステイン突然変異を持つ抗ハプテン抗体（＝抗体VH52bC/VH53C）との部位特異的共有結合的コンジュゲートを生成させること、および（iii）抗体鎖間ジスルフィド架橋の還元を避けるために、還元剤の非存在下で反応を行うことが必要である。
【０３７３】
一般的方法:
抗ハプテン抗体とハプテン化化合物とのコンジュゲートの生成は、所定の化学量論でコンジュゲートをもたらすべきであり、これらのコンジュゲート中の化合物はその活性を保っていることが保証されるべきである。ハプテン化化合物とそれぞれの抗ハプテン抗体とのコンジュゲートを生成させるために、ハプテン化化合物を最終濃度が10mg/mlになるように100％DMFに溶解した。抗ハプテン抗体VH52bC/VH53Cを、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH=8.2中、10mg/mlの濃度にした。ハプテン化化合物と抗ハプテン抗体VH52bC/VH53Cとを、モル比が2.5:1（化合物対抗体）になるように、上下にピペッティングすることによって混合し、室温および350rpmで、60分間インキュベートした。
【０３７４】
システイン含有リンカーを介してハプテンにコンジュゲートされたポリペプチドを、以下、ハプテン-Cys-ポリペプチドまたはポリペプチド-Cys-ハプテンと呼ぶ。ポリペプチドは遊離のN末端を有してもよいし、例えばアセチル基（Ac-ポリペプチド-Cys-ハプテン）またはPEG残基（PEG-ポリペプチド-Cys-ハプテン）でキャッピングされたN末端を有してもよい。
【０３７５】
以下、システイン含有リンカーを介してハプテンにコンジュゲートされた蛍光色素を色素-Cys-ハプテンまたはハプテン-Cys-色素と呼ぶ。
【０３７６】
ハプテン化蛍光色素と抗ハプテン抗体とのコンジュゲート-Dig-Cys-Ahx-Cy5/抗ジゴキシゲニン抗体VH52bC-を形成させるための例示的方法
抗体-Dig-Cys-Ahx-Cy5複合体を酸化還元化合物不含、0.1mM GSSG（酸化型グルタチオン）含有または1mM GSSG含有の緩衝液に移した点以外は、試料をまさに実施例3aで述べたとおりに調製した。その結果得られた蛍光スキャンおよびクーマシー染色したポリアクリルアミドゲルを図4に示す。3つの条件のいずれもが、部位特異的ジスルフィド結合形成に関して同様の特異性を示し（図4、上側のゲル、レーン1A〜C）、バックグラウンド反応のレベルは低かった（図4、レーン2A〜C）。これは、還元作用物質が存在しなくてもジスルフィド結合の形成は達成できることを裏付けている。3/4抗体（-1×LC）、HC二量体（-2×LC）および1/2抗体（1×HC＋1×LC）は、実施例3と比較して、残存量しか検出されないので、これは、抗体を著しく安定化し/抗体の崩壊を低減する。
【０３７７】
ハプテン化蛍光色素と抗ハプテン抗体とのコンジュゲート-Dig-Cys-Cy5/抗ジゴキシゲニン抗体VH52bC-を形成させるための例示的方法
13.3nmolの抗体を、酸化還元試薬の非存在下、10mg/mlの最終抗体濃度で2モル等量のDig-Cys-Cy5と混合した点以外は、試料をまさに実施例3bで述べたとおりに調製した。
【０３７８】
ハプテン化蛍光色素と抗ハプテン抗体とのコンジュゲート-ビオチン-Cys-Cy5/キメラ抗ビオチン抗体VH53C-を形成させるための例示的方法
システイニル化リンカーを含有するビオチン誘導体化Cy5のコンジュゲートを生成させるために、0.16mgのビオチン-Cys-Cy5を、濃度が10mg/mlになるように100％DMFに溶解した。1mgの抗ビオチン抗体VH53Cを、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、9.7mg/ml（約68μM）の濃度で使用した。ビオチン-Cys-Cy5と抗体とを2.5:1のモル比（Ac-ビオチン-Cys-Cy5対抗体）で混合し、350rpmで振とうしながら室温で60分間インキュベートした。その結果得られたコンジュゲートを、実施例3aで述べるようにSDS-PAGEで分析した。蛍光の検出は実施例3aで述べるように行った。
【０３７９】
ハプテン化蛍光色素と抗ハプテン抗体とのコンジュゲート-ビオチン-Cys-Cy5/ヒト化抗ビオチン抗体VH53C-を形成させるための例示的方法
システイニル化リンカーを含有するビオチン誘導体化Cy5のコンジュゲートを生成させるために、0.16mgのビオチン-Cys-Cy5を、濃度が10mg/mlになるように100％DMFに溶解した。1mgのヒト化抗ビオチン抗体VH53Cを、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、7.4mg/ml（約51μM）の濃度で使用した。ビオチン-Cys-Cy5と抗体とを2.5:1のモル比（Ac-ビオチン-Cys-Cy5対抗体）で混合し、350rpmで振とうしながら室温で60分間インキュベートした。その結果得られたコンジュゲートを、実施例3aで述べるようにSDS-PAGEで分析した。蛍光の検出は実施例3aで述べるように行った。
【０３８０】
ハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体とのコンジュゲート-Ac-PYY（PEG3-Cys-4Abu-Dig）/ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体VH52bC-を形成させるための例示的方法
システイニル化リンカーを含有するジゴキシゲニン誘導体化PYYポリペプチドのコンジュゲートを生成させるために、2.4mgのAc-PYY（PEG3-Cys-4Abu-Dig）を、5mg/mlの濃度になるように、20％アセテートに溶解した。10mgのヒト化抗ジゴキシゲニン抗体VH52bC（68.4nmol）を、20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0で構成される緩衝液中、19.5mg/ml（約133μM）の濃度で使用した。Ac-PYY（PEG3-Cys-4Abu-Dig）と抗体とを2:1のモル比（Ac-PYY（PEG3-Cys-4Abu-Dig）対抗体）で混合し、100rpmで撹拌しながら室温で60分間インキュベートした。その結果得られたコンジュゲートを質量分析で分析した。検出された分子種のうちの7.4％が2つのペプチド分子にカップリングされた抗体と同定され、40％は1つのペプチド分子にカップリングされた抗体であり、52％はカップリングしていない抗体と同定された。
【０３８１】
ハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体とのコンジュゲート-Ac-PYY（PEG3-Cys-βAla-Biot）/キメラ抗ビオチン抗体VH53C-を形成させるための例示的方法
システイニル化リンカーを含有するビオチン誘導体化PYYポリペプチドのコンジュゲートを生成させるために、0.19mgのAc-PYY（PEG3-Cys-βAla-Biot）を10mg/mlの濃度になるように100％DMFに溶解した。1mgのキメラ抗ビオチン抗体VH53Cを、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、9.7mg/ml（約67μM）の濃度で使用した。Ac-PYY［PEG3-Cys-βAla-Biotと抗体とを2.5:1のモル比（Ac-PYY［PEG3-Cys-βAla-Biot］対抗体）で混合し、350rpmで振とうしながら、室温で60分間インキュベートした。その結果得られたコンジュゲートを質量分析によって分析した。検出された分子種のうちの87.7％は、2つのペプチド分子にカップリングされた抗体と同定され、12.3％は、1つのペプチド分子にカップリングされた抗体と同定された。
【０３８２】
ハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体とのコンジュゲート-Ac-PYY（PEG3-Cys-PEG2-Biot）/キメラ抗ビオチン抗体VH53C-を形成させるための例示的方法
システイニル化リンカーを含有するビオチン誘導体化PYYポリペプチドのコンジュゲートを生成させるために、0.16mgのAc-PYY（PEG3-Cys-PEG2-Biot）を、濃度が10mg/mlになるように100％DMFに溶解した。1mgのキメラ抗ビオチン抗体VH53Cを、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、9.9mg/ml（約68μM）の濃度で使用した。Ac-PYY［PEG3-Cys-PEG2-Biotと抗体とを2.5:1のモル比（Ac-PYY［PEG3-Cys-PEG2-Biot］対抗体）で混合し、350rpmで振とうしながら、室温で60分間インキュベートした。その結果得られたコンジュゲートを質量分析によって分析した。検出された分子種の100％が2つのペプチド分子にカップリングされた抗体と同定された。
【０３８３】
ハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体とのコンジュゲート-Ac-PYY（PEG3-Cys-βAla-Biot）/ヒト化抗ビオチン抗体VH53C-を形成させるための例示的方法
システイニル化リンカーを含有するビオチン誘導体化PYYポリペプチドのコンジュゲートを生成させるために、0.06mgのAc-PYY（PEG3-Cys-βAla-Biot）を、濃度が10mg/mlになるように100％DMFに溶解した。0.8mgのヒト化抗ビオチン抗体VH53Cを、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、9mg/ml（約62μM）の濃度で使用した。Ac-PYY［PEG3-Cys-βAla-Biotと抗体とを2.5:1のモル比（Ac-PYY［PEG3-Cys-βAla-Biot］対抗体）で混合し、350rpmで振とうしながら、室温で60分間インキュベートした。その結果得られたコンジュゲートを質量分析によって分析した。検出された分子種のうちの62.2％が2つのペプチド分子にカップリングされた抗体と同定され、33.9％は1つのペプチド分子にカップリングされた抗体と同定され、3.9％はカップリングしていない抗体と同定された。
【０３８４】
ハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体とのコンジュゲート-Ac-PYY（PEG3-Cys-PEG2-Biot）/ヒト化抗ビオチン抗体VH53C-を形成させるための例示的方法
システイニル化リンカーを含有するビオチン誘導体化PYYポリペプチドのコンジュゲートを生成させるために、0.08mgのAc-PYY（PEG3-Cys-PEG2-Biot）を濃度が10mg/mlになるように100％DMFに溶解した。0.8mgのヒト化抗ビオチン抗体VH53Cを、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、9mg/ml（約62μM）の濃度で使用した。Ac-PYY［PEG3-Cys-PEG2-Biotと抗体とを2.5:1のモル比（Ac-PYY［PEG3-Cys-PEG2-Biot］対抗体）で混合し、350rpmで振とうしながら、室温で60分間インキュベートした。その結果得られたコンジュゲートを質量分析によって分析した。検出された分子種のうちの71.4％は2つのペプチド分子にカップリングされた抗体と同定され、26％は1つのペプチド分子にカップリングされた抗体と同定され、2.5％はカップリングしていない抗体と同定された。
【０３８５】
ハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体とのコンジュゲート-Ac-PYY（PEG3-Cys-PEG2-Fluo）/抗フルオレセイン抗体VH52bC-を形成させるための例示的方法
システイニル化リンカーを含有するビオチン誘導体化PYYポリペプチドのコンジュゲートを生成させるために、0.33mgのAc-PYY［PEG3-Cys-PEG2-Fluoを、濃度が10mg/mlになるように、100％DMFに溶解した。1mgの抗フルオレセイン抗体VH52bCを、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、9.3mg/ml（約63μM）の濃度で使用した。Ac-PYY［PEG3-Cys-PEG2-Fluoと抗体とを2.5:1のモル比（Ac-PYY［PEG3-Cys-PEG2-Fluo］対抗体）で混合し、350rpmで振とうしながら、室温で60分間インキュベートした。その結果得られたコンジュゲートを質量分析によって分析した。検出された分子種のうちの95％は2つのペプチド分子にカップリングされた抗体と同定され、5％は1つのペプチド分子にカップリングされた抗体と同定された。
【０３８６】
ハプテン化ポリペプチドと抗ハプテン抗体とのコンジュゲート-Ac-PYY（PEG3-Cys-PEG2-Fluo）/抗フルオレセイン抗体VH28C-を形成させるための例示的方法
システイニル化リンカーを含有するビオチン誘導体化PYYポリペプチドのコンジュゲートを生成させるために、0.33mgのAc-PYY［PEG3-Cys-PEG2-Fluoを、濃度が10mg/mlになるように、100％DMFに溶解した。1mgの抗フルオレセイン抗体VH28Cを、50mM Tris-HCl, 1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、9.5mg/ml（約63μM）の濃度で使用した。Ac-PYY［PEG3-Cys-PEG2-Fluoと抗体とを2.5:1のモル比（Ac-PYY［PEG3-Cys-PEG2-Fluo］対抗体）で混合し、350rpmで振とうしながら、室温で60分間インキュベートした。その結果得られたコンジュゲートを質量分析によって分析した。検出された分子種の100％が、2つのペプチド分子にカップリングされた抗体と同定された。
【０３８７】
実施例5
共有結合テオフィリン-抗テオフィリン抗体複合体の生成
ハプテン認識系としてテオフィリンとテオフィリン結合抗体とを利用する共有結合的抗体複合体の形成を評価するために、ハプテンをテオフィリンと交換した点以外は、一般にジゴキシゲニン-Cys-Cy5またはビオチン-Cys-Cy5について説明した合成技術および精製技術を応用することにより、テオフィリン-Cys-Cy5を、蛍光ペイロードとして生成させた。共有結合ジスルフィドの形成を実証するために、重鎖可変領域の位置54または位置55に計画的Cysを含有するテオフィリン結合抗体を生成させた（抗テオフィリン抗体-Cys）。これらの抗体誘導体をテオフィリン-Cys-Cy5と複合体化し、次に、実施例4で述べたように非還元条件下および還元条件下でのSDS-PAGEに付した。非還元条件下では、ジスルフィドで連結された抗テオフィリン抗体複合体化Cy5が、実施例4での記載と同様にゲル内に、そのH鎖関連蛍光によって検出された。ジゴキシゲニン、フルオレセインまたはビオチンをハプテンとして使用した場合に観察されたジスルフィドと同じように、簡単な添加反応の結果として、共有結合的複合体が形成されていた。これらの複合体は、還元すると、予想どおり解離した。すなわちジスルフィドが還元された状態になった場合にのみ、ペイロードをH鎖から放出した。
【０３８８】
実施例6
インビボ様条件下での共有結合的ハプテン-抗体複合体の生成と、インビボでの直接的ジスルフィド形成の証拠
インビボ様条件下での共有結合的ハプテン-抗体複合体の形成を評価するために、抗ビオチン抗体-Cysを、ビオチン-Cys-Cy5と共に、マウス血清中、37℃で60分、インキュベートした。次にプロテインAによって抗体をマウス血清から捕捉した。その後、捕捉された抗体を実施例4で述べたように非還元条件下および還元条件下でSDS-PAGEに付した。ジスルフィド連結抗体複合体化Cy5は、実施例4での記載と同様に、ゲル内でのそのH鎖関連蛍光によって検出された。図10は、抗体との共有結合的複合体が、37℃の血清中で、すなわちインビボ条件に似た条件下で形成することを実証している。これらの複合体は、還元すると、予想どおり解離する。すなわちペイロードは、ジスルフィドが還元された場合にのみ、H鎖から放出される（図10）。血清は多量のタンパク質、ペプチドおよび他の化合物（ジスルフィド形成反応を妨害しうるもの）を含有するので、ハプテンの位置決め後に、抗体とペイロードとの間に、血清の存在下でさえ、指向的なジスルフィド結合が形成されうるという知見は予想外である。ハプテンの位置決め後に、37℃の血清中で抗体とペイロードの間に指向的なジスルフィド結合が形成されうるという知見は、事前ターゲティング（pre-targeting）状況、すなわち抗体とハプテン-ペイロードとの個別適用と、それに続く抗体複合体のインビボアセンブリおよびそれに続くジスルフィド形成において、このPK調整系を応用することができるという可能性を切り開くものでもある。
【０３８９】
潜在的なインビボ「事前ターゲティング」応用をさらに評価するために、実施例10で述べる動物の眼の非侵襲的光学イメージング技術により、ビオチン-Cy5の薬物動態を事前ターゲティング条件下で決定した。これらの実験では、毛細管中のCy5の蛍光を明らかにする動物の眼の光学的イメージングにより、Cy5の存在を非侵襲的に決定した。ビオチン-Cy5の注射の10分後に本発明者らがマウスの眼に検出したCy5媒介蛍光値を100％値と設定し、その後の時点で測定される蛍光値を、それとの比較で表現した。この実験では、1mgの抗体（抗ビオチン抗体または抗ビオチン抗体-Cys（＝抗ビオチン抗体のCys突然変異体）のいずれか）を、ビオチン-Cy5の注射および眼イメージングの開始の24時間前に適用した。対照群には、抗ビオチン抗体を事前注射（pre-inject）しなかった。
【０３９０】
これらの実験の結果を図11に示す。抗体が事前に注射されていない動物にビオチン-Cy5を注射したところ、低い血清中半減期および低い曝露レベルで排除された（◆）。抗ビオチン抗体（Cys突然変異なし）を24時間前に注射した動物に注射されたビオチン-Cy5の血清中レベルおよび半減期は、著しく増加した。これは、抗体が、循環中のその抗原を（ペイロードと共に）捕捉し、抗原の（そしてまた、コンジュゲートされたペイロードの）血清中半減期を延長することを示している。抗ビオチン抗体-Cys（すなわち共有結合的ペイロードカップリングのために本明細書において報告するCys突然変異を含有する抗体）を24時間前に注射した動物に注射されたビオチン-Cys-Cy5の相対的血清中レベルおよび半減期は、さらに一層増加した。これらの試料では、相対的Cy5レベルが、非複合体化化合物より高いだけでなく、複合体化した（ただしジスルフィド結合していない）Cy5のレベルよりも高かった。このように、ハプテン複合体化ジスルフィド連結ペイロード（インビボで事前ターゲティング条件下で形成されるもの）は、非共有結合的複合体化ペイロードよりも、循環中で安定であり、より高い曝露レベルに到達することができる。
【０３９１】
実施例7
抗ハプテン抗体とのコンジュゲート中および複合体中のポリペプチドは機能性を保っている
本発明者らは、非共有結合的ハプテン-ポリペプチドコンジュゲートの一部であるポリペプチドおよび抗ハプテン抗体との複合体中のポリペプチドが、機能性を保っていることを、以前に示した（WO2011/003557、WO2011/003780およびPCT/EP2011/074273）。カップリングされたペプチドが、共有結合的ジスルフィドカップリング後も機能性を保っていることを実証するために、抗ジゴキシゲニン抗体と複合体化したポリペプチドの生物学的活性と、抗ジゴキシゲニン抗体VH52bCを使ったそれらのジスルフィドコンジュゲートの生物学的活性とを比較した。
【０３９２】
治療上望まれるPYY由来ペプチドの機能性は、そのコグネイト受容体NPY2に結合して、そのシグナリングを妨害することである。NPY2受容体を介したシグナリングは、代謝プロセスに関与し、かつ/または代謝プロセスを調節している。
【０３９３】
ポリペプチドDig-PYYと抗ジゴキシゲニン抗体の複合体化もしくはSSコンジュゲーションまたはポリペプチドDig-Cys-PYYと抗ジゴキシゲニン抗体VH52bCとのコンジュゲーションが、それぞれ、その活性に影響を及ぼすかどうかを評価するために、本発明者らは、NPY2受容体を発現するHEK293細胞において、フォルスコリン刺激によるcAMP蓄積を阻害するその能力を評価した（cAMPアッセイ）。
【０３９４】
PYY（3-36）、そのY2受容体特異的修飾類似体moPYY、その抗体複合体化Dig変異体、およびそのジスルフィドコンジュゲートDig-Cys誘導体の生物学的活性を評価するために行ったcAMPアッセイの結果を、以下の表2に示す。
【０３９５】
（表２）
0006602304.tif 000017
【０３９６】
cAMPアゴニストアッセイには、以下の材料を使用した: 384ウェルプレート; Tropix cAMPスクリーンキット; cAMP ELISAシステム（Applied Biosystems、カタログ番号T1505; CS 20000）;フォルスコリン（Calbiochemカタログ番号344270）;細胞: HEK293/hNPY2R;増殖用培地:ダルベッコ変法イーグル培地（D-MEM, Gibco）; 10％ウシ胎児血清（FBS, Gibco）,熱非働化; 1％ペニシリン/ストレプトマイシン（Pen 10000単位/mL: Strep 10000mg/mL, Gibco）; 500μg/mL G418（ジェネティシン、Gibcoカタログ番号11811-031）;およびプレーティング培地: DMEM/F12（フェノールレッド不含）（Gibco）; 10％FBS（Gibco、カタログ番号10082-147）,熱非働化; 1％ペニシリン/ストレプトマイシン（Gibco、カタログ番号15140-122）; 500μg/mL G418（ジェネティシン、Gibco、カタログ番号11811-031）。
【０３９７】
アッセイを行うために、1日目に、培地を捨て、フラスコ（T225）1本につき10mLのPBSで単層細胞を洗浄した。PBSをデカントした後、5mL VERSENE（Gibco、カタログ番号1504006）を使って細胞を剥離した（37℃で5分）。フラスコを軽くタッピングし、細胞懸濁液をプールした。各フラスコを10mLのプレーティング培地ですすぎ、1000rpmで5分間遠心分離した。懸濁液をプールし、カウントした。HEK293/hNPY2Rの場合、懸濁液をプレーティング培地に2.0×105細胞/mLの密度で再懸濁した。Multi-dropディスペンサを使って50μlの細胞（HEK293/hNPY2R-10,000細胞/ウェル）を384ウェルプレートに移した。プレートを37℃で終夜インキュベートした。2日目に、細胞が75〜85％コンフルエントであることを確認した。培地および試薬を室温にした。希釈液を調製する前に、ジメチルスルホキシド（DMSO、Sigma、カタログ番号D2650）中の刺激化合物の原液を、5〜10分間、32℃まで温めた。0.5mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX、Calbiochem、カタログ番号410957）および0.5mg/mL BSAを含むDMEM/F12中に、希釈液を調製した。刺激培地中の最終DMSO濃度は1.1％であり、フォルスコリン濃度は5μMであった。ペーパータオル上で細胞プレートをしずかに反転し、タッピングして細胞培地を除去した。50μLの刺激培地を各ウェルに入れた（各濃度を4つ一組にして行った）。プレートを室温で30分間インキュベートし、細胞を顕微鏡下で毒性について調べた。処理の30分後に、刺激培地を捨て、50μL/ウェルのアッセイ溶解緩衝液（Tropixキットの一部として提供されるもの）を加えた。プレートを37℃で45分間インキュベートした。20μLの溶解物をTropixキットの刺激プレートからプレコート抗体プレート（384ウェル）に移した。10μLのAPコンジュゲートと20μLの抗cAMP抗体とを加えた。プレートを室温で1時間、振とうしながらインキュベートした。次に、洗浄緩衝液（各洗浄につき1ウェルあたり70μL）でプレートを5回洗浄した。プレートをタッピングして乾燥させた。30μL/ウェルのCSPD/Sapphire-II RTU基質/エンハンサー溶液を加え、室温で45分インキュベートした（振とう）。ルミノメータ（VICTOR-V）でシグナルを1秒間/ウェル測定した。
【０３９８】
これらのアッセイの結果（表2）は、野生型PYYと比べて修飾ペプチド誘導体moPYYの活性の低下はごくわずかでしかないことを示している。cAMPアッセイのIC50値は野生型PYYでは0.09nM、修飾類似体では0.14nMであった。共有結合的ジスルフィドコンジュゲーションは、生物学的活性のわずかな低減をもたらした。IC50値は、コンジュゲートでは5-36nMであった。驚いたことに、共有結合的ジスルフィドコンジュゲートは、IC50値が10.91nMである非共有結合的複合体より、活性が2倍高い。
【０３９９】
実施例8
ビオチン化Cy5とヒト化抗ビオチン抗体VH53Cとの共有結合的コンジュゲートと比較した、ビオチン化Cy5とヒト化抗ビオチン抗体との複合体の血清中安定性
ここに記載するペプチド修飾技術の目的は、ペプチドの治療応用可能性を改良することである。ペプチドの治療的応用にとって大きな障害は、現在は限られているインビボでの安定性および/または短い血清中半減期ならびに迅速なクリアランスである。発蛍光団の抗体コンジュゲートのPKパラメータをインビボで決定し、非共有結合的抗体-発蛍光団複合体のPKと比較した。そこで、（i）抗ビオチン抗体VH53Cをビオチン化発蛍光団 Biot-Cys-Cy5に共有結合でコンジュゲートし、（ii）抗ビオチン抗体とビオチン化発蛍光団Biot-Cy5との非共有結合的複合体を生成させ、（iii）共有結合でコンジュゲートした化合物と、非共有結合的に複合体化した化合物とを、動物に適用し、（iv）Cy5の蛍光（A650）の決定と、ヒト化抗体を特異的に検出するELISA法による対応する抗体の決定とにより、これらの動物における化合物の血清中濃度を経時的に測定した。
【０４００】
実験手法
小さな蛍光基質の抗体複合体化がPKパラメータに及ぼす影響を分析するために、20mMヒスチジン/140mM NaCl、pH6.0中の、13nmolのCy5-ビオチン/ヒト化抗ビオチン抗体VH53C-コンジュゲート、または対応する抗体と非共有結合的に複合体化した化合物、または蛍光化合物のみを、各物質につき6匹の雌マウス（NRMI系統）に適用した。約0.1mlの血液試料を以下の時点後に収集した:第1群のマウス1、2、および3については0.08時間、4時間および48時間、第2群のマウス1、2、および3については0.08時間、24時間および72時間。室温で1時間後に、遠心分離（9300×g、3分、4℃）によって、少なくとも50μlの血清試料を得た。血清試料を-80℃で保存した。
【０４０１】
所与の時点における血清中の化合物の量を決定するために、Cy5の蛍光特性を使用する。すなわち、血清試料中のCy5関連蛍光を120μl石英キュベット中、室温で、Cary Eclipse蛍光分光測光器（Varian）を使って測定した。励起波長を640nmとし、発光を667nmで測定した。発光強度が適当な範囲に入るように、血清試料を1×PBSで希釈した。それぞれの試料と同じ希釈度で1×PBSに希釈した無処置マウスの血清をブランクプローブとして使用したが、それらは蛍光シグナルを何も示さなかった。
【０４０２】
共有結合的コンジュゲート、非共有結合的複合体および非複合体化ハプテン-Cy5を使用した分析の結果を図5に示す。データは、注射の5分後の（ピーク）血清中レベルに対して正規化したCy5媒介蛍光の相対的（％）レベルとして示されている。非複合体化ビオチン-Ser-Cy5は、かなり分子量の小さい化合物なので、血清から迅速に消失する。適用して5分後に検出可能であった蛍光のうち、注射の1時間後に依然として検出可能であったのは、6％に過ぎなかった。それより後の時点である、注射の2時間後、4時間後、および24時間後には、Cy5媒介シグナルを検出することはできなかった。
【０４０３】
抗体複合体化化合物は、注射の4時間後に、適用された蛍光（5分レベルを100％と設定）のうちの約50％を、依然として血清中に検出することができた。その後の時点でもCy5媒介蛍光レベルを検出することができ、2時間時点では5分値の約22％が検出可能であり、注射の48時間後には約12％が検出可能であり、72時間後は8％が依然として検出可能であった。抗体コンジュゲート化合物は、抗体複合体化化合物より著しく長いインビボ半減期を示す。注射の4時間後では、適用した蛍光（5分レベルを100％と設定）のうちの58％を、依然として血清中に検出することができた（抗体複合体化化合物より1.16倍高い）。24時間後に35％（1.6倍）、48時間後に31％（2.6倍）、そして72時間後に26％（3.3倍）のCy5媒介蛍光が、血清中に検出された。実験の最初の24時間において複合体化化合物とコンジュゲート化合物の蛍光の減少が同じぐらいであるのは、複合体とコンジュゲートの初期分布が似ていることで説明することができる。24時間後は、抗体コンジュゲート化合物のインビボ安定性が、相違の原因である。
【０４０４】
所与の時点における血清中のヒトIgG抗体の量を決定するために、以下のアッセイ原理を使用した:抗ヒトカッパ鎖モノクローナルIgG抗体でコーティングした固相（Maxisorb（登録商標）マイクロタイタープレート、NUNC-Immuno（商標））上に、血清試料中のヒトIgG1抗体を捕捉した。血清試料を1:105および1:106に希釈し、100μlのこれらの希釈液をウェルに加えた。インキュベーション後にウェルを各300μlのPBS/0.05％Tween 20で3回洗浄した。ヒトIgG抗体の検出は、まず、C末端でジゴキシゲニン化された抗ヒトCH1ドメインIgG（濃度0.25μg/ml）を100μl加えることによって行った。各300μlの1×PBS/0.05％Tween 20で3回洗浄した後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）にコンジュゲートされた抗ジゴキシゲニン抗体Fabフラグメント（濃度25mU/mL）を100μl加えた。最後に、各ウェルに100μlのABTS（登録商標）を加えた。周囲温度で30分間のインキュベーション後に、市販のマイクロタイタープレートELISAリーダー（例えばTecan Sunrise）において、吸光度（OD）を405nmおよび492nm［405/492］で測定した。
【０４０５】
抗体-ビオチン-Cy5複合体および抗体-ビオチン-Cy5コンジュゲートで処置したマウスにおけるBio-Cy5血清中レベルおよびヒトIgGの血清中レベルを図5に示す。データは、注射の5分後の（ピーク）血清中レベルに対して正規化した相対的（％）ヒトIgGレベルとして示されている。抗体-ハプテン複合体と抗体-ハプテンコンジュゲートの相対的ヒトIgG血清中レベルはどちらも、抗体-ハプテンコンジュゲートについて測定された相対的蛍光と一致している。このように、ビオチン-Cys-Cy5化合物は、それをコンジュゲートした抗体と類似するインビボ安定性を示し、それは、抗体-ハプテンコンジュゲートがインビボで無傷のままであることを意味している。抗体-ハプテン複合体の場合は、明らかにこれが当てはまらず、相対的Cy5媒介蛍光は、相対的ヒトIgG血清中レベルより早く減少する。これは、複合体がインビボで時間の経過と共にペイロードを放出することを意味している。
【０４０６】
要約すると、ハプテン化化合物のインビボ安定性は、抗ハプテン抗体に結合されると、著しく増加する。しかし、ハプテンCy5血清中レベルは抗体血清中レベルの減少よりも早いので、抗体-ハプテン複合体はインビボでは完全には安定でない。抗体-ハプテン-Cy5コンジュゲートの場合はこれが当てはまらず、正常IgG抗体と類似するインビボ挙動を示す。
【０４０７】
Dig-ペプチド血清中動態（非共有結合的複合体と共有結合的コンジュゲートの比較）
ジゴキシゲニン化ポリペプチドの抗体複合体化および抗体コンジュゲーションがPKパラメータに及ぼす影響を分析するために、20mMヒスチジン/140mM NaCl pH6.0中、32.1nmolのポリペプチド、または対応する抗体と非共有結合的に複合体化したポリペプチドを、各物質につき2匹の雌マウス（NRMI系統）に適用した。マウスの体重はMAK-DIG-PYYについては23gおよび25g、DIG-PYYについては28gおよび26gであった。約0.1mlの血液試料を以下の時点後に収集した:マウス1については0.08時間、2時間および24時間、マウス2については0.08時間、4時間、24時間。室温で1時間後に、遠心分離（9300×g、3分、4℃）によって、少なくとも40μlの血清試料を得た。血清試料を-80℃で保存した。
【０４０８】
所与の時点における血清中のジゴキシゲニン化ペプチドの量を決定することは、血清試料中のポリペプチドを検出するためにとりうる直接的手段がないので、Dig-Cy5の決定と比較して困難であった。そこで、血清中のジゴキシゲニン化ペプチドを検出するためのウェスタンブロット関連アッセイを確立した。第1段階では、血清試料を還元SDS-PAGEで分離した。高濃度のSDSおよび還元作用物質への血清の曝露を試料調製に含めたので、複合体化されたDig-ポリペプチドコンジュゲートは（完全に変性/折りたたまれていない）抗ジゴキシゲニン抗体から放出された状態になりうるが、共有結合的コンジュゲートの方は、結合したままであった。非共有結合的抗体複合体からのポリペプチドの放出を媒介し、個々の構成要素をSDS-PAGEで分離するために、2μlの各血清試料を18μlの20mMヒスチジン/140mM NaCl pH6.0に希釈し、6.7μlの4×LDS試料緩衝液および3μlの10×試料還元剤（NuPAGE, Invitrogen）と95℃で5分間混合した。同じ系統の無処置マウスの血清2μlを対照として使用した。試料を4-12％Bis-Trisゲル（NuPAGE, Invitrogen）に適用し、ランニング緩衝液として1×MES（Invitrogen）を使用して、200V/120mAで20分泳動した。次に、分離したポリペプチドをPVDFメンブレン（孔径0.22μm, Invitrogen）にXCell Sure Lock（登録商標）Mini-Cellシステム（Invitrogen）を使って25V/130mAで40分ブロッティングした。メンブレンを、1×PBS＋1％Tween20（PBST）中の1％脱脂乳により、室温で1時間ブロッキングした。次に、抗ジゴキシゲニン抗体を使って、メンブレン上のジゴキシゲニン化ポリペプチドを検出した。そのために、濃度13μg/mlの抗ジゴキシゲニン抗体を、10mlの1％脱脂乳/PBST中、室温で2時間、メンブレンに適用した。メンブレンを1×PBST中で5分×3回洗浄した。LumiLightPLUSウェスタンブロッティングキット（Roche）のPODにカップリングされた抗マウスIgG Fabフラグメントを、10mlの1％脱脂乳PBST中、1:25希釈液として室温で1時間適用した。メンブレンを1×PBSTで5分×3回洗浄した。検出は、メンブレンを4mlのLumiLightウェスタンブロッティング基質中、室温で5分インキュベートすることによって行った。化学発光を20分間の曝露時間でLumiImager Fl（Roche）を使って検出した。
【０４０９】
これらの分析の結果を図6Aおよび図6Bに示す。さまざまな時点におけるマウス血清中のジゴキシゲニンポリペプチドの存在/量を決定した。抗体複合体化ペプチドを与えたマウス（図6左）は、最も早い時点（投与の5分後）で強いシグナルを示した。これらのシグナルは、対照のブロット上でのサイズおよび場所によって示されるとおり、明確に割り当てることができた。抗体複合体化ポリペプチドで処置したマウスの血清では、ポリペプチド関連シグナルが、初期の時点で最も強く、時間の経過と共に減少した。それでもなお、ポリペプチドはすべての時点において、投与の24時間後でさえ、依然として良好なシグナルで検出可能であった。
【０４１０】
非複合体化ポリペプチドを与えたマウスでは、この小さなポリペプチドに関係づけうるシグナルは、最も早い時点でさえ、ほとんど検出することができなかった。図6の右側は、通常の曝露条件下では、遊離のポリペプチドはブロット上には見られないことを示している。ブロットのコントラスト強化により、投与の5分後に、何らかのポリペプチドが明らかになったが、それは痕跡量でしかなかった。その後の時点では、明確なポリペプチドバンドを検出することはできなかった。
【０４１１】
非複合体化ポリペプチドがマウスの血清中では非常に短い半減期を有することがわかる。同じポリペプチドであるが抗体複合体化した形態で与えたマウスは、長期間にわたって血清中にこれらのポリペプチドの存在を示す。注射の24時間後に、これらのマウスの血清中で、ポリペプチドを決定することができる。
【０４１２】
実施例9
共有結合で連結されたジゴキシゲニン-抗体複合体およびジゴキシゲニン結合性IgGの血清中半減期
共有結合的複合体化が、非共有結合で連結されたハプテン複合体に照らして、PK特性をさらに改良するかどうかを分析するために、抗ジゴキシゲニン抗体-ジゴキシゲニン-Cy5複合体および共有結合で連結された［抗ジゴキシゲニン抗体-Cys］-［ジゴキシゲニン-Cys-Cy5］コンジュゲートのPKパラメータをインビボで決定した。そこで、ジゴキシゲニン-Cy5をその蛍光（A650）を使って決定し、対応する抗体を、ヒト化抗体を特異的に検出するELISA法によって決定した。ハプテンとカップリングしたペプチドの低分子量「代用物」としてジゴキシゲニン-Cy5を適用した。なぜなら、その蛍光特性により、血清における容易かつ正確な検出が可能になるからである。
【０４１３】
ビオチン-Cy5またはビオチン-Cys-Cy5について説明したものと同じ方法で（実施例8参照）、ジゴキシゲニン-Cy5、または抗体複合体化ジゴキシゲニン-Cy5、もしくはさらに抗体-Cys連結ジゴキシゲニン-Cy5を雌NRMIマウスに静脈内注射した後、0.08時間、2時間、4時間および24時間の時点で血液を収集した。注射の5分後（t＝0.08時間）に両マウスに検出されたCy5媒介蛍光値を100％値に設定し、その後の時点で測定される蛍光値をそれとの比較で表した。
【０４１４】
これらの実験の結果は、ジゴキシゲニン-Cy5の場合、注射の2時間後に検出できたのは、適用した蛍光（5分値）の10％未満であったことを実証している。それより後の時点、それぞれ注射の4時間後および24時間後では、Cy5媒介シグナルは検出できなかった（図8参照）。非複合体化化合物とは対照的に、抗体複合体化化合物は、はるかに高いレベルで検出することができ、遅い時点でも検出することができた（図8）。これは、抗体複合体化が小さな化合物ジゴキシゲニン-Cy5の血清中半減期を著しく増加させることを示している。さらにまた、共有結合で連結されたペイロードは、非共有結合で連結された複合体と比較して、より大きなPK延長を示す。ジゴキシゲニン-Cy5レベルと抗体レベルとを直接比較することによって、時間の経過に伴う抗体からのペイロードの喪失が示され、Cy5レベルは抗体レベルより速く減少していた。対照的に、共有結合で連結されたジゴキシゲニンコンジュゲートは、ほとんど同一なCy5血清中半減期とIgG血清中半減期とを示した（図8）。これは、ジスルフィド連結ペイロードが抗体に安定につながれたままであり、一方、非共有結合的複合体は時間の経過と共に解離することを示している。
【０４１５】
実施例10
共有結合で連結されたハプテン-抗体複合体と、ハプテン結合部位を介して付着しているだけの複合体との、血清中半減期および曝露レベル
共有結合的複合体化が非共有結合で連結されたハプテン複合体のPK特性を改良するかどうかを分析するために、インビボでの抗ビオチン抗体とビオチン-Cy5との複合体のPK、および共有結合で連結されたコンジュゲート［抗ビオチン-抗体-Cys］-［ビオチン-Cys-Cy5］のPKを決定した。Cy5の存在は、毛細管中のCy5の蛍光を明らかにする動物の眼の光学的イメージングによって非侵襲的に決定した。注射の10分後に本発明者らがマウスの眼に検出したCy5媒介蛍光値を100％値と設定し、その後の時点で測定される蛍光値を、それとの比較で表した。これらの実験の結果を図9に示す。非複合体化ビオチン-Cy5は単独では低い血清中半減期および低い曝露レベルを有する。共有結合で連結されていない抗体複合体化化合物は、はるかに高いレベルで検出することができ、半減期も延長されていた。さらにまた、共有結合で連結されたペイロードは、非共有結合で連結された複合体と比較して、より大きなPK延長と、より高い血清中レベルとを示した。これは、ハプテン複合体化ジスルフィド連結ペイロードが非共有結合的複合体化ペイロードよりも循環中で安定であり、より高い曝露レベルに達しうることを示している。
【０４１６】
実施例11
異なるハプテンに結合する抗体とのペプチドの複合体化および共有結合的コンジュゲーション
ハプテン結合性モジュールを応用してハプテン化化合物（＝ペイロード）をターゲティング媒体にカップリングすることは、ハプテン媒介送達の実現を可能にする技術的可能性の1つである。この概念は、化合物を捕捉しそれらをターゲティングモジュールにつなぐさらなるハプテンまたは他の物体に拡張することができる。例えばポリペプチドの送達または安定化のために、ジゴキシゲニンまたは他のハプテンに結合する単一または二重特異性抗体を応用して、治療用ポリペプチドを安定化し、PK最適化することができる。
【０４１７】
ポリペプチド捕捉モジュールとして応用するための前提条件は、（i）ハプテンへの化合物のカップリングがポリペプチドの活性に深刻な妨害を加えないこと、および（ii）ハプテン化化合物への抗体の効果的結合/複合体化が可能であることである。
【０４１８】
ハプテン指向的結合は、ハプテン化色素またはハプテン化ポリペプチドと抗ハプテンシステイニル化抗体との効率のよい共有結合的カップリングの前提条件である。
【０４１９】
ハプテン化化合物と抗ハプテン抗体との、アフィニティーによって推進される複合体化が、効率のよいジスルフィド結合形成の前提条件であることを示すために、ビオチン-Cys-Cy5をヒト化抗ジゴキシゲニン抗体およびヒト化抗ジゴキシゲニン抗体VH53Cと共にインキュベートした。ビオチン-Cys-Cy5とヒト化抗ビオチン抗体およびヒト化抗ビオチン抗体VH53Cとのインキュベーションを対照反応として行った。
【０４２０】
0.13mgのビオチン-Cys-Cy5を濃度が10mg/mlになるように100％DMFに溶解した。0.7mgの各抗体を、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、6.7mg/ml（約46μM）の濃度で使用した。ビオチン-Cys-Cy5と抗体とを2.5:1のモル比（Ac-ビオチン-Cys-Cy5対抗体）で混合し、350rpmで振とうしながら、室温で60分間インキュベートした。その結果得られた複合体/コンジュゲートを、SDS-PAGEとそれに続くポリアクリルアミドゲル内でのCy5関連蛍光の検出とによって、さらに分析した。15μgの複合体/コンジュゲートを4×LDS試料緩衝液（Invitrogen）と混合し、95℃で5分インキュベートした。Cy5関連蛍光は、LumiImager Flデバイス（Roche）を使って645nmの励起波長で記録した。
【０４２１】
非還元試料は、ヒト化抗ビオチン抗体VH53Cについて、共有結合部位特異的ジスルフィド結合形成を示し（図36、レーン4）、CDR2中にシステインを持たないヒト化抗ビオチン抗体を使用した場合は、極めて低いバックグラウンド蛍光シグナルであった（図36、レーン3）。ビオチン-Cys-Cy5は、ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体VH52bCにも共有結合的にカップリングしたが（図36、レーン2）、その効率は著しく低く、ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体を使用した場合は低いバックグラウンドシグナルであった（図36、レーン1）。これは、ゲルの底部に検出される過剰なビオチンCys-Cy5（矢印）から推論することができる。ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体VH52bCの場合は、ヒト化抗ビオチン抗体VH53C（レーン4）の場合よりも著しく多い、カップリングしていないビオチン-Cys-Cy5を検出することができる（レーン2）。試料を還元すると、Cy5関連蛍光は抗体重鎖および抗体軽鎖付近に検出できなくなることから、共有結合による連結が実際にはジスルフィド架橋によって形成されていることが示される。各ゲルのクーマシー染色は、各レーン中のタンパク質の総量が等しかったことを示している。
【０４２２】
実施例12
ハプテン指向的結合は、ハプテン化色素またはハプテン化ポリペプチドと抗ハプテンシステイニル化抗体との効率のよい共有結合的カップリングの前提条件である
ハプテン化化合物と抗ハプテン抗体との、アフィニティーによって推進される複合体化が、効率のよいジスルフィド結合形成の前提条件であることを示すために、非ハプテン化ペプチドAc-PYY（PEG3-Cys-4Abu-NH2）（Biosynthan 1763.1、SEQ ID NO:23）をヒト化抗ジゴキシゲニン抗体VH52bCおよびヒト化抗ジゴキシゲニン抗体と共にインキュベートした。1.4mgのAc-PYY（PEG3-Cys-4Abu-NH2）を濃度が10mg/mlになるように100％DMFに溶解した。2mgの各抗体を、50mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成される緩衝液中、11〜13mg/ml（約75〜89μM）の濃度で使用した。Ac-PYY（PEG3-Cys-4Abu-NH2）と抗体とを2.1:1のモル比（Ac-PYY（PEG3-Cys-4Abu-NH2対抗体））で混合した。ペプチドは、撹拌子を使って溶液を500rpmで撹拌しながら、3回に分けて加えた。各添加の間に、試料を200rpmで5分インキュベートした。最終回分の添加後に、試料を室温および200rpmで1時間インキュベートした。
【０４２３】
その結果得られた複合体/コンジュゲートは、Ac-PYY（PEG3-Cys-4Abu-NH2）:ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体VH52bCコンジュゲートの場合は97％が単量体型IgG様分子、3％が二量体型可溶性凝集体であり、Ac-PYY（PEG3-Cys-4Abu-NH2）:ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体複合体の場合は100％が単量体型であると、サイズ排除クロマトグラフィーによって判明した。さらにまた、結果として得られた複合体/コンジュゲートを質量分析によって分析した。Ac-PYY（PEG3-Cys-4Abu-NH2）:ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体VH52bCコンジュゲートの場合、検出された分子種のうちの17％は2つのペプチド分子にカップリングされた抗体と同定され、51％は1つのペプチド分子にカップリングされた抗体と同定され、そして32％はペプチドがカップリングしていない抗体と同定された。Ac-PYY（PEG3-Cys-4Abu-NH2）:ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体複合体の場合、抗体の100％がカップリングしていなかった。
【０４２４】
実施例13
共有結合的ペイロードカップリングのためのシステイン突然変異を持つ適正にフォールディングされた機能的ハプテン結合抗体の形成に要求されるジスルフィドパターン
共有結合的化合物/ペイロードカップリング用のハプテン結合性モジュールは、ハプテン化化合物/ペイロードの共有結合による取り付けを可能にする余分なシステインを含有するIgGなどの「標準的」抗体で構成されうる。本明細書において報告する方法では、抗体機能性の基礎になる構造と配列を持つ折りたたまれたドメイン内に、必要な官能性（システイン）を導入する。抗体のドメイン内およびドメイン間に所定のジスルフィド結合が正しく形成されることは、正しい構造と機能性の形成および維持にとって不可欠である。適正なジスルフィドパターンを維持するには、VHドメインに導入された追加のシステインが占有されていない状態でなければならず、隣接するシステインと干渉したり、反応したりしてはならない。VH52bC/VH53Cという位置がVHドメイン内にある（そして他のシステインに非常に近接している）という事実は、不正なジスルフィドが重鎖の生合成中に形成されてしまうリスクを増大させる。別の潜在的問題は、VHドメインとVLドメインが分泌経路内で1つのFvフラグメントにアセンブルされてしまうことである。分泌経路は、酸化還元シャフリング条件と、ジスルフィド形成酵素およびジスルフィドシャフリング酵素とを伴う。したがって、VH52bC/VH53C突然変異を加えることによって不正なジスルフィドが導入される潜在的可能性は、軽鎖のジスルフィドにも「拡がり」うる。これは、不適正にフォールディングされた非機能的分子の取得/生成リスクを、さらに高めることになる。したがって、これらのリスクにもかかわらず、ハプテン化化合物/ペイロードに共有結合的につながる能力を有するVH52bC/VH53C突然変異を含有する均一な機能的抗体誘導体が良好な量で発現し、得られたことは、極めて驚くべきことである。
【０４２５】
実施例14
共有結合的カップリング用のシステイン突然変異を持つ抗ハプテンジスルフィド安定化一本鎖Fvフラグメントの組成および生成
共有結合的化合物/ペイロードカップリングのためのハプテン結合性モジュールは、「IgGなどの「標準的」抗体からなりうる。あるいは、それらは組換えFvもしくはFabフラグメント、またはそれらの誘導体などの修飾された実体であってもよい。一本鎖Fvフラグメントは、完全長抗体に代わる代替物として、小さなモジュールサイズが必要とされる応用例や、二重特異性または多重特異性抗体誘導体を生成させるために追加の結合モジュールが望まれる応用例ではとりわけ、よく応用されている。生成させた抗ハプテンFv誘導実体の一例は、ジゴキシゲニン化化合物/ペイロードに結合しそれを共有結合でつなぐジスルフィド安定化一本鎖Fvである。抗ジゴキシゲニン抗体のVHドメインとVLドメインをフレキシブルなGlyおよびSerリッチリンカーで互いにつなぐことによって、Dig結合特異性を持つジスルフィド安定化一本鎖Fvを生成させた。これらのVHドメインおよびVLドメインは、VHの位置44およびVLの位置100（Kabatらに従う位置）にさらにシステイン突然変異を内包していた。これらの追加システインはVHとVLの間に安定な分子間ジスルフィド結合を形成する。これは、以前に述べられているように（例えばReiter, Y., et al, Nature Biotechnology 14（1996）1239-1245）、scFvを安定化する。
【０４２６】
これに加えて、別のシステインを、Kabatナンバリングに従うVHの位置52bまたは位置53にそれぞれ導入することで、Fvフラグメントに共有結合的連結機能を付加した。
【０４２７】
しかし、そのような突然変異をジスルフィド安定化Fvに導入することは、完全長抗体にそれらを入れることより、はるかに難易度が高い。一本鎖Fvフラグメントは、安定化実体およびヘテロ二量体化促進実体としての定常ドメインを欠いているので、本質的に、完全長IgGまたはFabフラグメントより不安定である。安定性は、VH44-VL100ジスルフィドなどの追加のシステイン突然変異をFvに入れることによって付与することができる。しかしこの安定化原理は、ジスルフィドが正しいシステイン間に正しい位置で形成された場合にのみ機能する。したがって、所定のドメイン内ジスルフィド（VH中に1つとVL中に1つ）に加えて、単一の所定の正しいドメイン間ジスルフィドを形成させる必要がある。非適合システイン間のジスルフィド接続は、ミスフォールディングされた不安定で非機能的な実体を生成させることになる。ジスルフィド安定化Fvフラグメントが6つのシステインを含有することを考慮すると、理論的には21の異なるジスルフィド接続が形成されうるが、3つの所定のジスルフィドの正しい組み合わせだけが、機能的な安定化dsscFvを形成することになる。この問題は、別の遊離システインをVHドメインに付加すれば、さらに困難になる。望ましい安定化dsscFvは2つの所定のドメイン内ジスルフィド（VH中とVL中に1つずつ）と1つの所定のドメイン間ジスルフィド（VHとVLの間）を含有し、そのうえ、ハプテン化化合物/ペイロードカップリング用に1つの遊離システインを（VHの位置52b/53に）含有する。共有結合的カップリング用に余分なシステイン突然変異を持つジスルフィド安定化Fvフラグメントが7つのシステインを含有することを考慮すると、理論的には数多くの異なるジスルフィド接続が形成しうるが、3つの所定のジスルフィドの正しい組み合わせと、VH52b/VH53の厳密な遊離システイン位置だけが、機能的で安定化された共有結合的カップリング能を有するdsscFvをもたらすことになる。さらに別の難問は、追加の遊離システイン（VH52b/VH53）が天然のシステインではなくジスルフィド安定化のために導入された突然変異であるVH44システインに近接しているという事実にある。VH44Cは、正しいドメイン間ジスルフィドを形成させるために必要であり、理論に拘泥するわけではないが、このジスルフィドはおそらくVHとVLの独立したフォールディングとアセンブリ後に形成されるのであろう。VH44CとVH52bC/VH53Cとが近接していることは、ドメイン内ジスルフィドが正しく形成されないリスクを悪化させる。しかし、ジゴキシゲニンに結合し、同時にジゴキシゲニン化ペイロードに共有結合でつながる能力を有する機能的ジスルフィド安定化一本鎖Fvモジュールを生産できることがわかった。VH52bC突然変異Fv抗体誘導体を持つこのDig結合性dsscFvの軽鎖可変領域および修飾重鎖可変領域を、SEQ ID NO:25（VH）に示し、対応するVLをSEQ ID NO:24に示す。二重特異性抗体誘導体を生成させるためのモジュールとしてのそのようなdsscFvの生成の成功については、実施例15（以下）で述べる。
【０４２８】
実施例15
共有結合でカップリングされた化合物/ペイロードの標的送達のための二重特異性抗ハプテン抗体誘導体の組成、発現および精製
共有結合的化合物/ペイロードカップリングのためのハプテン結合性抗体モジュールを含有する二重特異性抗体を生成させた。これらの抗体は、他の抗原へのターゲティングを可能にする結合モジュールをさらに含有している。そのような二重特異性抗体の応用例としては、ターゲティング抗原を保持する細胞または組織へのハプテン化化合物/ペイロードの特異的ターゲティングが挙げられる。生成させたそのような分子の一例は、腫瘍関連糖質抗原LeYを認識する結合領域を持つと同時に、ジゴキシゲニン化化合物/ペイロードに結合し、それらを共有結合でつなぐジスルフィド安定化Fvも持つ、二重特異性抗体である。そこで、ジスルフィド安定化一本鎖Fvを、フレキシブルなGlyおよびSerリッチコネクターペプチドで、LeY抗体のCH3ドメインのC末端につなぐことで、2つのLeY結合アームとさらに2つのジゴキシゲニン結合実体を持つ四価分子を得た。このジゴキシゲニン結合性実体は、以前に述べられたVH44-VL100ジスルフィド結合を内包していた（Reiter, Y., et al, Nature Biotechnology 14（1996）1239-1245）。ジゴキシゲニン結合性実体は、さらに、共有結合的カップリング用のVH52bC突然変異を含んでいた。このLeY-Dig抗体誘導体の軽鎖および修飾重鎖をコードする配列を、SEQ ID NO:17およびSEQ ID NO:18に示す。
【０４２９】
これらの二重特異性分子は、上記と同様にして、分子生物学的技法で生成させ、培養細胞からの分泌によって発現させ、次に培養上清から精製した。こうして、ターゲティングモジュールとハプテン化化合物/ペイロードの共有結合的カップリングのためのモジュールとを含有する二重特異性抗体を生成し、均一に精製することができる。
【０４３０】
実施例16
ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有ペプチドYY
ペプチドYYは、回腸および結腸の細胞が摂食に応答して放出する短い（36アミノ酸）ペプチドである。ヒトでは、これは食欲を低減するようである。循環PYYの最も一般的な形態は、Y受容体ファミリーのY2受容体（Y2R）に結合するPYY3-36である。PYYは、消化管、特に回腸および結腸の粘膜中のL細胞に見いだされる。食道、胃、十二指腸および空腸にも少量のPYY（約1〜10％）が見いだされる。循環では、PYY濃度は食品摂取後に増加し、絶食中は減食する。PYYはNPY受容体を介してその作用を発揮し、胃運動を阻害し、結腸における水分および電解質吸収を増加させる。PYYとPYYミメティックは、肥満に対処するために使用されている。
【０４３１】
抗体の薬物動態特性の利点を取り入れ、PYY固有の不安定性を回避するために、ヘリカーモチーフアミノ酸配列を含むようにPYYを修飾し、抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体との複合体を形成させた。
【０４３２】
非共有結合的複合体形成
PYY3-36ペプチドの構造（Nygaard, R., et al, Biochem. 45（2006）8350-8357; SEQ ID NO:26）を調べると、中央のアミノ酸にヘリカルモチーフ（ヘリカー様モチーフアミノ酸配列）が明らかになる。N末端イソロイシンと修飾されたC末端は、このペプチドの機能的活性にとって必須であると記載されているので、ヘリカーモチーフアミノ酸配列中のアミノ酸を反映するように、中央のヘリックスを改変した。
0006602304.tif 000018
【０４３３】
それぞれ定常ヒトIgG1ドメインおよび定常ヒトラムダドメインを含有するベクターに挿入された重鎖および軽鎖の可変領域を含有する2つのプラスミドをトランスフェクトすることにより、完全IgG1抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体を、HEK293細胞において生産した。プロテインAクロマトグラフィーを用いる標準的手法で抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体（0019）を精製した。質量分析実験により、抗体0019の素性が確認された。
【０４３４】
抗体溶液に小過剰量のペプチドを適用することにより、抗体0019と修飾PYYペプチドPYY_ヘリカーとの複合体をインビトロで得た。複合体0052が形成された。この複合体の化学量論は、SEC-MALLS分析実験により、1つの二価抗体に1.6個のペプチドが複合体化していると決定された。
【０４３５】
抗体0019、PYY（3-36）野生型、PYY_ヘリカーおよび複合体0052を、Y2受容体ファミリーに対するそれらの効果について試験した。
0006602304.tif 000019
【０４３６】
実証されているとおり（Hoffmann, E., et al, J. Cont. Rel. 171（2013）48-56）、抗体と複合体化したペプチドは、インビボで延長された半減期を有する。そのうえ、驚いたことに、本複合体は、非複合体化ペプチドと比較して、NPY2R受容体に対して、わずかに向上したアフィニティーを示した。この抗体は、本ポリペプチドを安定化し、本ペプチドを、その固定された生物活性コンフォメーションで提示する。
【０４３７】
共有結合的複合体形成（ジスルフィド共有結合）
抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体とヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物との複合体のインビトロおよびインビボ安定性を増大させるために、結合後のジスルフィド架橋の形成を使用した。
【０４３８】
第1段階は、特異的認識段階（高アフィニティー相互作用）、すなわちヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物-抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体複合体の形成である。次に、第2段階では、ジスルフィド架橋の自発的シャフリングによる、安定性が改良された共有結合的複合体の形成が起こる。
【０４３９】
前記12merペプチド（ヘリカーモチーフアミノ酸配列）は（少なくとも特異的抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体と複合体化した場合には）比較的剛性の高い実体であるため、構造上特異的なジスルフィド架橋の設計を使用する必要があることがわかった。複合体形成と、その後に達成される共有結合的カップリングは、2つの組換え生産された実体間で起こるので、ジスルフィド共有結合を形成させるために導入された人工的システイン残基は、必ずしも遊離のシステイン残基として生産されるのではなく、還元型で、すなわち遊離システインまたはホモシステインアミノ酸にコンジュゲートされた形態で、発現する。
【０４４０】
人工的遊離システイン残基が導入される抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体可変ドメインのアミノ酸配列中の位置は、決定的に重要である。抗体可変ドメインアミノ酸配列中の非露出システインは、遊離システイン（非コンジュゲート型）として発現する可能性が高く、一方、結合ポケットに近い露出システイン残基は、遊離システインのようなさらなる部分へのシステインコンジュゲーションによって誘発される立体障害ゆえに、12merペプチド（ヘリカーモチーフアミノ酸配列）の結合を不可能にしうる。
【０４４１】
a）ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有蛍光化合物との複合体
立体障害と、強いアフィニティー低減のリスクとが最小限である適切な位置を同定するために、ヘリカーモチーフアミノ酸配列に人工的システイン残基を導入するための位置を、種々試験した。パラトープの主要部を変化させないために、当該12mer（ヘリカーモチーフアミノ酸配列）のC末端部にシステイン残基を導入した。これらのペプチドを合成し、蛍光モチーフに融合した。
0006602304.tif 000020
【０４４２】
抗体には、異なる3D環境にあるシステインをそれぞれ含む両方の設計ペプチドについて、ジスルフィド架橋の形成が可能になるように、構造設計を行った。
【０４４３】
12merヘリカルペプチドAHLENEVARLKK（ヘリカーモチーフアミノ酸配列）をVHドメインおよびVHドメイン中にモデリングする。ペプチドのC末端では、残基L10およびK11が、考えうる位置として同定され、軽鎖可変ドメインでは、Kabatの軽鎖ナンバリングに従うN55およびG51が同定される。
【０４４４】
抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体（0019）の重鎖可変ドメインは、アミノ酸配列:
0006602304.tif 000021
を有する。
【０４４５】
抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体（0019）の軽鎖可変ドメインはアミノ酸配列:
0006602304.tif 000022
を有する。
【０４４６】
抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体（0155）の軽鎖可変ドメインN55C変異体はアミノ酸配列:
0006602304.tif 000023
を有する。
【０４４７】
抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体（0157）の軽鎖可変ドメインN51C変異体はアミノ酸配列:
0006602304.tif 000024
を有する。
【０４４８】
i）ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物と抗体0155との共有結合的コンジュゲート
二価抗体0155は、遊離システインを持たないその親分子Y2R（bck）-0019と同様に、HEK293細胞で発現させる。修飾抗体は、抗体0019に使用したものと同じプロトコールを使って精製する。質量分析により、実験的に決定された脱グリコシル化抗体の質量は142,001Daであることが示される。これは質量計算値を259Da越えている。還元された鎖は、48,167Da（完全な重鎖、計算値48,168Da、Cys＝SH、C-末端＝-K）および22,720Da（完全な軽鎖、N55C、計算値22,720Da、Cys＝SH）の実験的に決定された質量を有する。鎖の配列は還元後に確認した。
【０４４９】
抗体0155を、ヘリカーモチーフアミノ酸配列システイン変異体2に、100％DMF中の2.5モル過剰のヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物を使ってカップリングすることで、共有結合的複合体0156を形成させた。
【０４５０】
SDS page（変性条件、図12参照）では、蛍光が抗体0155だけに見られ、還元条件下では、小さなペプチドだけが見える。
【０４５１】
結果:
抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体へのヘリカーモチーフアミノ酸配列含有蛍光化合物の共有結合的コンジュゲーションは成功した。全部で約43％の抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体が2つのヘリカーモチーフアミノ酸配列に共有結合でコンジュゲートされ、約40％の抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体が1つのヘリカーモチーフアミノ酸配列に共有結合でコンジュゲートされ、約17％の抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列はコンジュゲートされなかった。
【０４５２】
2つのヘリカーモチーフアミノ酸配列を含むコンジュゲートは、約50％まで修飾されている。定量にはこの分子種を考慮しなかった。出発物質に関して既に決定したように、ヘリカーモチーフアミノ酸配列を持たない抗体は、約128Daの修飾を2つ含有している。1つのヘリカーモチーフアミノ酸配列にコンジュゲートされた抗体は、約128Daの修飾を1つだけ有する。
【０４５３】
ii）ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有化合物と抗体0157との共有結合的コンジュゲート
抗体0155と同様に、抗体0157も、大半はシステイニル化型として発現する。質量分析により、実験的に決定された脱グリコシル化抗体の質量は141,863Daである。これは質量計算値を3Da超えている。抗体は主に単一または二重ホモシステイニル化型として存在する。還元された鎖は、実験的に決定される質量が48,168Da（完全な重鎖、計算値48,168Da, Cys＝SH, C-末端＝-K）および22,777Da（完全な軽鎖、N51C, 計算値22,777Da, Cys＝SH）である。鎖の配列は還元後に確認した。
【０４５４】
抗体0157とヘリカーモチーフアミノ酸配列システイン変異体1とのカップリングは予想される共有結合的複合体をもたらしていなかった。蛍光は予想されるレーンには見られず、この実験では陰性であるべき参照上に見られた（図13）。
【０４５５】
抗体0157をヘリカーモチーフアミノ酸配列システイン変異体1と共にインキュベートした。対照抗体として、0019を同じヘリカーモチーフアミノ酸配列システイン変異体1と共にインキュベートした。
【０４５６】
結果:
抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体へのヘリカーモチーフアミノ酸配列含有蛍光化合物の共有結合的コンジュゲーションは成功しなかった。この理論に拘泥するものではないが、この場合は、抗体システイニル化が結合ポケット内で深すぎて、ヘリカーモチーフアミノ酸配列含有蛍光化合物は、効率よく結合してC51を攻撃するのに適した位置に求核チオール基を送達することができないと考えられる。
【０４５７】
b）組換えポリペプチドを含有するヘリカーモチーフアミノ酸配列との複合体
ヘリカーに基づく方法論は、組換え生産されたヘリカーモチーフアミノ酸配列含有ポリペプチドとの共有結合的複合体の形成を考慮すると、とりわけ魅力的になる。
【０４５８】
VL-N55C突然変異を含有する抗体0155とヘリカーモチーフアミノ酸配列システイン変異体1：
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とのコンジュゲーションは、代替物（VL上のG51Cとヘリカーモチーフアミノ酸配列システイン変異体2）：
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と比較してはるかにうまくいったので、0155とヘリカーモチーフアミノ酸配列システイン変異体1含有ポリペプチドとのコンジュゲーションをさらに調べた。ポリペプチドはN末端に融合されたヘリカーモチーフアミノ酸配列システイン変異体1：
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を含有していた。
【０４５９】
C末端リジン残基が欠失したシュードモナス外毒素分子LR8Mを含有するヘリカーモチーフアミノ酸配列システイン変異体1（0236; SEQ ID NO:28）を大腸菌において生産し、アニオン交換クロマトグラフィーとSECとの組み合わせを使って精製した（例えばWO2011/032022を参照されたい）。
【０４６０】
抗体0155は、SEQ ID NO:28のC末端リジン残基が欠失しているシュードモナス外毒素分子LR8Mを含有するヘリカーモチーフアミノ酸配列システイン変異体1と共有結合でコンジュゲートされる。SECクロマトグラムを図14に示す。コンジュゲーション効率を非還元試料についてSDS-CE（Caliper）で分析する（図15参照）。
【０４６１】
合計約4％の抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体が、2つのSEQ ID NO:28のポリペプチドに共有結合でコンジュゲートされ、約41％の抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体が1つのSEQ ID NO:28のポリペプチドに共有結合でコンジュゲートされ、約55％の抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列がコンジュゲートされなかった。
【０４６２】
結論として、抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列モノクローナル抗体は、ペプチド、ペプチドリンカーを持つ小分子、および組換えタンパク質を、12merヘリカーモチーフアミノ酸配列の高いアフィニティー認識によって、複合体化するために使用することができる。
ヘリックスとして折りたたまれる傾向を持つペプチドは、元の12merヘリカーモチーフアミノ酸配列：
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を模倣するように修飾することができ、その後は、抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列モノクローナル抗体と複合体を形成することが可能になる。システインを含有するSEQ ID NO:01のシステイン変異体と、CDR中にシステインを含有する修飾抗ヘリカーモチーフアミノ酸配列抗体では、高いアフィニティーでの複合体化に加えて、安定なジスルフィド結合の形成による共有結合的コンジュゲーションが可能になる。その後は、さまざまな系で発現させた組換えタンパク質を、特別な反応条件がなくても、自発的ジスルフィド架橋シャフリングによって、インビトロでコンジュゲートすることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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