(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）もしくは配列番号２に少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体の、同等の未改変または未処置の野生型細胞と比較して低下した発現および／または活性を有するトリ細胞であって、前記変異体が、ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）と等価な機能を有する、トリ細胞。
【請求項２】
トリ胚内にあるか、トリ胚由来であるか、またはトリ細胞株である、請求項１に記載のトリ細胞。
【請求項３】
ニワトリ胚性線維芽細胞（ＣＥＦ）である、請求項２に記載のトリ細胞。
【請求項４】
前記トリ細胞において、前記ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）もしくは配列番号２に少なくとも９０％の配列同一性を有する前記変異体をコードするヌクレオチド配列がそのゲノム中に存在しない、請求項１から３のいずれかに記載のトリ細胞。
【請求項５】
前記ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）もしくは配列番号２に少なくとも９０％の配列同一性を有する前記変異体の発現がＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって低下されている、請求項１から３のいずれかに記載のトリ細胞。
【請求項６】
次のステップ：
（ｉ）請求項１から５のいずれかに記載のトリ細胞をウイルスで形質導入するステップ、および、
（ｉｉ）前記ウイルスを増殖させるために前記細胞を継代するステップ
を含むウイルスを増殖させるための方法。
【請求項７】
次のステップ：
（ｉ）請求項６にしたがってウイルスを増殖させるステップ、および、
（ｉｉ）増殖させた前記ウイルスをワクチンに組み込むステップ
を含むワクチンを産生するための方法。
【請求項８】
次のステップ：
（ｉ）請求項１から５のいずれかに記載のトリ細胞をウイルスで形質導入するステップ、および、
（ｉｉ）前記ウイルスが複数回の感染を完了し、弱毒化するように前記トリ細胞を継代するステップ
を含む弱毒化ウイルスを生成するための方法。
【請求項９】
次のステップ：
（ｉ）請求項８にしたがってウイルスを弱毒化するステップ、
（ｉｉ）弱毒化した前記ウイルスを増殖させるステップ、および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）において生成された前記ウイルスをワクチンに組み込むステップ
を含むワクチンを産生するための方法。
【請求項１０】
前記ウイルスが酸性エンドソームを通って前記トリ細胞に入る、請求項６から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）もしくは配列番号２に少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体の発現および／または活性が同等の未改変または未処置の野生型動物と比較して低下、ノックダウンまたはノックアウトされているトランスジェニックトリ動物であって、前記変異体が、ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）と等価な機能を有する、トランスジェニックトリ動物。
【請求項１２】
ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）もしくは配列番号２に少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体をコードする遺伝子のコピー数が増加しているトランスジェニックトリ動物であって、前記変異体が、ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）と等価な機能を有する、トランスジェニックトリ動物。
【請求項１３】
前記トリ動物が、家禽動物である、請求項１１または１２のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
【請求項１４】
前記トリ動物が、ニワトリである、請求項１３に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１５】
請求項１１から１４のいずれかに記載のトランスジェニックトリ動物に由来する、請求項１に記載のトリ細胞。
【請求項１６】
トリ動物においてウイルス感染を予防または処置するための方法であって、前記動物において、ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）もしくは配列番号２に少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体の発現を増加させるステップを含み、前記変異体が、ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）と等価な機能を有する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、少なくとも１種のインターフェロン誘導性膜貫通タンパク質（ＩＦＩＴＭ）の発現および／または活性が低下しているトリ細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ウイルス感染およびウイルス性疾患の予防および管理は、医学および獣医学の両方についての継続的課題である。このようにウイルス性疾患の発生率および重症度を低下させるための方法は、医学および生物工学的研究の最前線のままである。
【０００３】
ウイルス感染およびウイルス性疾患の管理のために現在利用されている最も一般的な戦略は、ワクチン接種アプローチである。ワクチンは、アジリジン、例えばバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）などの化学物質で処置された不活化ウイルスまたはその精製産物を含む場合がある。代替的にワクチンは、免疫原性を保持する一方でビルレンスの消失を導く条件下で培養された生の弱毒化ウイルスを含む場合がある。例えば疾患を引き起こすウイルスは、ワクチンとして使用され得る、その標的細胞での複製が十分に乏しい時点まで一連の細胞培養または動物胚を通じて継代され得る。この時点でウイルスは、ビルレンスを消失しているが、免疫原性のままであり、免疫応答を刺激できる。
【０００４】
胚形成ニワトリ卵および初代ニワトリ胚性線維芽細胞（ＣＥＦ）は、インフルエンザまたはニューカッスル病ワクチンなどの伝統的な大容量のワクチンおよびワクチン用のさらに最近の組換えウイルスベクター（例えばポックスウイルス）を含め、ヒト用および獣医学用のウイルスワクチンの製造のために一般に使用される。胚形成ニワトリ卵およびＣＥＦは、非ビルレントな弱毒化ウイルスを生成するためにウイルスを継代するために使用される。弱毒化ウイルスを利用するワクチンの例は、麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、経口ポリオワクチン（セービン）および黄熱ワクチンを含む。
【０００５】
動物およびヒトの両方の健康でのウイルス性疾患の世界的負担は、ワクチンにおける使用のための不活化および弱毒化ウイルスの大規模産生に対する必要を生じている。加えて（例えばインフルエンザの）季節性パンデミックの大流行は、短期間で大量のウイルスの産生を必要とする。実際に、パンデミックの際の治療に有効なインフルエンザウイルスワクチンの地球規模での入手可能性は、生物医薬品業界に関する主な課題のままである。
【０００６】
ワクチンのためのウイルスの産生における胚形成ニワトリ卵およびＣＥＦの使用に影響を与える現在の問題は、必要とされる多量のウイルスを生成するために要する時間である。さらに、ワクチンでの生の弱毒化ウイルスの使用の欠点は、弱毒化ウイルスを生成するために宿主細胞において十分な数の継代を達成するために要する時間の長さである。例えば感染性疾患およびがんに対して免疫するための候補ワクチンとして役立つ高度に弱毒化された改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）は、コードゲノム配列の本質的な部分を失っていて哺乳動物細胞での複製の厳しい制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）が実証された弱毒化ＭＶＡを生成するためにＣＥＦにおける５００回を超える継代を必要とした。加えて宿主細胞中でのウイルスの継代速度における制限は、ウイルスの産生および収量に影響を与える制限ステップとなり得る。
【０００７】
したがって、ワクチン産生のための胚形成ニワトリ卵およびＣＥＦなどの系において不活化および弱毒化ウイルスの両方の産生の収量および効率を増加させる方法に対する必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の局面の概要
インターフェロン誘導性膜貫通（ＩＦＩＴＭ）タンパク質ファミリーは、ＳＡＲＳコロナウイルス、フィロウイルス（マールブルグウイルスおよびエボラウイルス）、インフルエンザＡウイルスならびにフラビウイルス（デングウイルス）を含め、いくつかの非常に病原性のヒトウイルスの複製を制限するインターフェロン刺激性遺伝子ファミリーである。ＩＦＩＴＭ１、２、３および５を含むＩＦＩＴＭ遺伝子座は哺乳動物種に存在するが、この遺伝子座はトリ種では同定および特徴付けされていない。本発明者らは、ＩＦＩＴＭ遺伝子座がニワトリにおいて存在し、細胞で発現された場合にその細胞のウイルス感染を抑制する能力に関連する新規トリＩＦＩＴＭ配列を同定することを示した。
【０００９】
これらの同定されたＩＦＩＴＭ配列は、トリ宿主細胞においてウイルスを継代するおよび増殖させる、改善された方法を促進し得る。それらは、トリ動物（ａｖｉａｎ  ａｎｉｍａｌ）をウイルス感染への耐性についてスクリーニングする方法およびウイルス感染への増加した耐性を有する集団内で動物を選択するための方法においても使用され得る。
【００１０】
それゆえ、第１の態様では、本発明は、次のポリペプチド：ニワトリＩＦＩＴＭ１（配列番号１）、ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）およびニワトリＩＦＩＴＭ３（配列番号３）またはそのホモログのうちの１個または複数の低下した発現および／または活性を有するトリ細胞を提供する。
【００１１】
細胞は、ニワトリＩＦＩＴＭ３（配列番号３）またはそのホモログの低下した発現を有し得る。
【００１２】
トリ細胞は、トリ胚内にあってもよい。トリ細胞は、トリ胚由来であってもよい。例えば、トリ細胞は、ニワトリ胚性線維芽細胞（ＣＥＦ）であってもよい。
【００１３】
細胞は、器官、卵、鳥または任意の他の動物の一部であってよい。
【００１４】
トリ細胞は、次のポリペプチド：ニワトリＩＦＩＴＭ１（配列番号１）、ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）およびニワトリＩＦＩＴＭ３（配列番号３）またはそのホモログのうちの１個または複数の突然変異バージョンを含んでもよく、ここで前記突然変異バージョンは、ウイルス感染への耐性の減少に関連する。
【００１５】
トリ細胞のゲノムは、次のポリペプチド：ニワトリＩＦＩＴＭ１（配列番号１）、ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）およびニワトリＩＦＩＴＭ３（配列番号３）またはそのホモログのうちの１個をコードするヌクレオチド配列のうちの１個または複数を欠いていてもよい。
【００１６】
あるいは、次のポリペプチド：ニワトリＩＦＩＴＭ１（配列番号１）、ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）およびニワトリＩＦＩＴＭ３（配列番号３）またはそのホモログのうちの１個または複数の発現が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によってトリ細胞において低下されていてもよい。
【００１７】
第二の態様では、本発明は、次のステップ：
（ｉ）本発明の第一の態様に記載のトリ細胞をウイルスで形質導入するステップ、および、
（ｉｉ）前記ウイルスを増殖させるために前記細胞を継代するステップ
を含むウイルスを増殖させるための方法に関する。
【００１８】
第三の態様では、本発明は、次のステップ：
（ｉ）本発明の第二の態様の方法に従ってウイルスを増殖させるステップ、および、
（ｉｉ）増殖させた前記ウイルスをワクチンに組み込むステップ
を含むワクチンを産生するための方法を提供する。
【００１９】
第四の態様では、本発明は、次のステップ：
（ｉ）本発明の第一の態様に従ってトリ細胞をウイルスで形質導入するステップ、および、
（ｉｉ）前記ウイルスが複数回の感染を完了し、弱毒化するように前記トリ細胞を継代するステップ
を含む弱毒化ウイルスを生成するための方法を提供する。
【００２０】
第五の態様では、本発明は、次のステップ：
（ｉ）本発明の第四の態様に従ってウイルスを弱毒化するステップ、
（ｉｉ）弱毒化した前記ウイルスを増殖させるステップ、および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）において生成された前記ウイルスをワクチンに組み込むステップ
を含むワクチンを産生するための方法を提供する。
【００２１】
本発明の第五の態様の方法では、ステップ（ｉｉ）は、本発明の第２の態様の方法にしたがって実施され得る。
【００２２】
第二から第四の態様のいずれかに従う方法では、前記ウイルスは、酸性エンドソームを通って入ってもよい。
【００２３】
第六の態様では、本発明は、次のポリペプチド：ニワトリＩＦＩＴＭ１（配列番号１）、ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）およびニワトリＩＦＩＴＭ３（配列番号３）またはそのホモログのうちの１個または複数の発現または活性が低下、ノックダウンまたはノックアウトされているトランスジェニックトリ動物を提供する。
【００２４】
第七の態様では、本発明は、トランスジェニック動物であって、その生殖細胞および体細胞が次のポリペプチド：ニワトリＩＦＩＴＭ１（配列番号１）、ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）およびニワトリＩＦＩＴＭ３（配列番号３）またはそのホモログのうちの１個または複数をコードする１個または複数のヌクレオチド配列の異型遺伝子性バージョンを含み、その遺伝子が前記動物に、または前記動物の先祖に、胚期に導入された、トランスジェニックトリ動物を提供する。
【００２５】
第八の態様では、本発明は、次のポリペプチド：ニワトリＩＦＩＴＭ１（配列番号１）、ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）およびニワトリＩＦＩＴＭ３（配列番号３）またはそのホモログをコードする１個または複数の遺伝子のコピー数が増加しているトランスジェニックトリ動物を提供する。
【００２６】
本発明の第六、第七または第八の態様に従うトランスジェニック動物は、家禽動物であってもよい。例えば、トランスジェニック動物はニワトリであってもよい。
【００２７】
第九の態様では、本発明は、本発明の第六、第七または第八の態様に従うトランスジェニックトリ動物に由来する、本発明の第一の態様に従うトリ細胞を提供する。
【００２８】
第十の態様では、本発明は、次のポリペプチド：ニワトリＩＦＩＴＭ１（配列番号１）、ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）およびニワトリＩＦＩＴＭ３（配列番号３）またはそのホモログの１個または複数をコードするヌクレオチド配列を調査するステップおよび／またはゲノム上での前記ヌクレオチド配列のコピー数を調査するステップを含む、ウイルス感染へのトリ動物の生得的な耐性を調査するための方法に関する。
【００２９】
第十一の態様では、本発明は、同じ種の複数のトリ動物からウイルス感染への耐性を有するトリ動物を選択するための方法であって、次のステップ：
（ｉ）前記複数のトリ動物において次のポリペプチド：ニワトリＩＦＩＴＭ１（配列番号１）、ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）およびニワトリＩＦＩＴＭ３（配列番号３）もしくはそのホモログの１個もしくは複数をコードするヌクレオチド配列および／またはゲノム上の前記ヌクレオチド配列のコピー数を調査するステップ、
（ｉｉ）ウイルス感染への耐性に関連する、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２および／もしくはＩＦＩＴＭ３のヌクレオチド配列ならびに／またはコピー数を有するトリ動物を選択するステップ
を含む、方法を提供する。
【００３０】
前記複数のトリ動物は、ＩＦＩＴＭ遺伝子座で遺伝的変動および／またはコピー数多型（genetic  and/or  copy-number  variation）を表してもよい。
【００３１】
前記ウイルス感染は、酸性エンドソームを通って入ったウイルスによって媒介されてもよい。例えば、前記ウイルス感染は、トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）またはニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）によって媒介されてもよい。
【００３２】
第十二の態様では、本発明は、トリ動物においてウイルス感染を予防または処置するための方法であって、前記動物において次のポリペプチド：ニワトリＩＦＩＴＭ１（配列番号１）、ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）およびニワトリＩＦＩＴＭ３（配列番号３）またはそのホモログのうちの１個または複数の発現を増加させるステップを含む、方法を提供する。
【００３３】
第十三の態様では、本発明は、アミノ酸配列の配列番号２（ニワトリＩＦＩＴＭ２）またはその変異体もしくはホモログを含むトリＩＦＩＴＭポリペプチドを提供する。
【００３４】
トリＩＦＩＴＭポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸位置番号付けを参照して、次のアミノ酸残基、Ｔｒｐ３５、Ｓｅｒ３６、Ｌｅｕ３７、Ａｒｇ６４、Ａｓｐ６５、Ａｓｐ７１、Ｇｌｙ７４、Ａｌａ７５、Ｔｙｒ７８、Ａｌａ８２、Ｌｙｓ８３、Ａｓｎ８６およびＩｌｅ８７のうちの１個もしくは複数、またはすべてを含んでもよい。
【００３５】
変異体または相同なトリＩＦＩＴＭポリペプチドは、配列番号２に少なくとも８０％相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【００３６】
トリＩＦＩＴＭポリペプチドは、細胞において発現された場合に前記細胞のウイルス感染を抑制し得る。
【００３７】
第十四の態様では、本発明は、本発明の第十二の態様に従うポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。
【００３８】
トリＩＦＩＴＭ遺伝子座の同定は、ウイルスを継代するために使用されるトリ細胞のウイルス感染への耐性を減少させる能力を促進する。トリ宿主細胞のウイルス感染へのこの減少した耐性は、ウイルスの感染率を増加させ、それによりトリ宿主細胞におけるウイルス継代の効率を改善する。したがって本発明は、（例えばワクチンにおける使用のためのウイルスを産生するため、および弱毒化ウイルスを生成するために）トリ細胞においてウイルスを継代するための方法を提供する。
【００３９】
加えて、風土性および外来性の両方のウイルスが特に家禽産業および小規模家禽農場経営者への深刻な脅威となっており、病原体の管理は食品の安全性を確実にする鍵となる要素である。本発明者らによって実施されたトリＩＦＩＴＭ遺伝子座の同定および特徴付けは、家禽の重要なウイルス性疾患と闘うための改善された方法を提供し、それにより食品の安全性を改善する。
【００４０】
トリＩＦＩＴＭ遺伝子座の同定は、ウイルス感染への増加した耐性を有する鳥の選択および育種を促進し、ウイルス感染への耐性の増加と関連する外来性ＩＦＩＴＭ配列を発現しているトランスジェニック動物の生成を可能にする。このように本発明は、家禽の群れの生得的なウイルス耐性を増加させ、それにより家禽集団内のウイルスの導入および拡散を管理し、ワクチン接種プログラムに現在頼っている状態を減らすための戦略および技法を提供する。
本願の特定の態様において、例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
次のポリペプチド：ニワトリＩＦＩＴＭ１（配列番号１）、ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）およびニワトリＩＦＩＴＭ３（配列番号３）またはそのホモログのうちの１個または複数の低下した発現および／または活性を有するトリ細胞。
（項目２）
トリ胚内にあるか、トリ胚由来であるか、またはトリ細胞株である、項目１に記載のトリ細胞。
（項目３）
ニワトリ胚性線維芽細胞（ＣＥＦ）である、項目２に記載のトリ細胞。
（項目４）
次のポリペプチド：ニワトリＩＦＩＴＭ１（配列番号１）、ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）およびニワトリＩＦＩＴＭ３（配列番号３）またはそのホモログのうちの１個または複数の突然変異バージョンを含み、前記突然変異バージョンがウイルス感染への耐性の減少に関連する、項目１から３のいずれかに記載のトリ細胞。
（項目５）
前記トリ細胞において、次のポリペプチド：ニワトリＩＦＩＴＭ１（配列番号１）、ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）およびニワトリＩＦＩＴＭ３（配列番号３）またはそのホモログのうちの１個をコードするヌクレオチド配列のうちの１個または複数がそのゲノム中に存在しない、項目１から３のいずれかに記載のトリ細胞。
（項目６）
次のポリペプチド：ニワトリＩＦＩＴＭ１（配列番号１）、ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）およびニワトリＩＦＩＴＭ３（配列番号３）またはそのホモログのうちの１個または複数の発現がＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって低下されている、項目１から３のいずれかに記載のトリ細胞。
（項目７）
次のステップ：
（ｉ）項目１から６のいずれかに記載のトリ細胞をウイルスで形質導入するステップ、および、
（ｉｉ）前記ウイルスを増殖させるために前記細胞を継代するステップ
を含むウイルスを増殖させるための方法。
（項目８）
次のステップ：
（ｉ）項目７にしたがってウイルスを増殖させるステップ、および、
（ｉｉ）増殖させた前記ウイルスをワクチンに組み込むステップ
を含むワクチンを産生するための方法。
（項目９）
次のステップ：
（ｉ）項目１から６のいずれかに記載のトリ細胞をウイルスで形質導入するステップ、および、
（ｉｉ）前記ウイルスが複数回の感染を完了し、弱毒化するように前記トリ細胞を継代するステップ
を含む弱毒化ウイルスを生成するための方法。
（項目１０）
次のステップ：
（ｉ）項目９にしたがってウイルスを弱毒化するステップ、
（ｉｉ）弱毒化した前記ウイルスを増殖させるステップ、および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）において生成された前記ウイルスをワクチンに組み込むステップ
を含むワクチンを産生するための方法。
（項目１１）
前記ウイルスが酸性エンドソームを通って入る、項目７から１０のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
次のポリペプチド：ニワトリＩＦＩＴＭ１（配列番号１）、ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）およびニワトリＩＦＩＴＭ３（配列番号３）またはそのホモログのうちの１個または複数の発現および／または活性が低下、ノックダウンまたはノックアウトされているトランスジェニックトリ動物。
（項目１３）
トランスジェニック動物であって、その生殖細胞および体細胞が次のポリペプチド：ニワトリＩＦＩＴＭ１（配列番号１）、ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）およびニワトリＩＦＩＴＭ３（配列番号３）またはそのホモログのうちの１個をコードする１個または複数のヌクレオチド配列の異型遺伝子性バージョンを含み、そのヌクレオチド配列が前記動物に、または前記動物の先祖に、胚期に導入された、トランスジェニックトリ動物。
（項目１４）
次のポリペプチド：ニワトリＩＦＩＴＭ１（配列番号１）、ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）およびニワトリＩＦＩＴＭ３（配列番号３）またはそのホモログをコードする１個または複数の遺伝子のコピー数が増加しているトランスジェニックトリ動物。
（項目１５）
前記トリ動物が、家禽動物である、項目１２から１４のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
（項目１６）
前記トリ動物が、ニワトリである、項目１５に記載のトランスジェニック動物。
（項目１７）
項目１２から１６のいずれかに記載のトランスジェニックトリ動物に由来する、項目１に記載のトリ細胞。
（項目１８）
次のポリペプチド：ニワトリＩＦＩＴＭ１（配列番号１）、ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）およびニワトリＩＦＩＴＭ３（配列番号３）またはそのホモログの１個または複数をコードするヌクレオチド配列を調査するステップおよび／またはゲノム上での前記ヌクレオチド配列のコピー数を調査するステップを含む、ウイルス感染へのトリ動物の生得的な耐性を調査するための方法。
（項目１９）
同じ種の複数のトリ動物からウイルス感染への耐性を有するトリ動物を選択するための方法であって、次のステップ：
（ｉ）前記複数のトリ動物において次のポリペプチド：ニワトリＩＦＩＴＭ１（配列番号１）、ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）およびニワトリＩＦＩＴＭ３（配列番号３）もしくはそのホモログの１個もしくは複数をコードするヌクレオチド配列および／またはゲノム上の前記ヌクレオチド配列のコピー数を調査するステップ、
（ｉｉ）ウイルス感染への耐性に関連する、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２および／もしくはＩＦＩＴＭ３のヌクレオチド配列ならびに／またはコピー数を有するトリ動物を選択するステップ
を含む、方法。
（項目２０）
前記複数のトリ動物がＩＦＩＴＭ遺伝子座で遺伝的変動および／またはコピー数多型を表す、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記ウイルス感染が酸性エンドソームを通って入ったウイルスによって媒介される、項目１９または２０に記載の方法。
（項目２２）
前記ウイルス感染がトリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）またはニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）によって媒介される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
トリ動物においてウイルス感染を予防または処置するための方法であって、前記動物において次のポリペプチド：ニワトリＩＦＩＴＭ１（配列番号１）、ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）およびニワトリＩＦＩＴＭ３（配列番号３）またはそのホモログのうちの１個または複数の発現を増加させるステップを含む、方法。
（項目２４）
アミノ酸配列の配列番号２（ニワトリＩＦＩＴＭ２）またはその変異体もしくはホモログを含むトリＩＦＩＴＭポリペプチド。
（項目２５）
配列番号２に示すアミノ酸位置番号付けに従って、次のアミノ酸残基、Ｔｒｐ３５、Ｓｅｒ３６、Ｌｅｕ３７、Ａｒｇ６４、Ａｓｐ６５、Ａｓｐ７１、Ｇｌｙ７４、Ａｌａ７５、Ｔｙｒ７８、Ａｌａ８２、Ｌｙｓ８３、Ａｓｎ８６およびＩｌｅ８７を含む、項目２４に記載のトリＩＦＩＴＭポリペプチド。
（項目２６）
前記アミノ酸配列が配列番号２に少なくとも８０％相同性を有する、項目２４に記載のトリＩＦＩＴＭポリペプチド。
（項目２７）
細胞において発現された場合に前記細胞のウイルス感染を抑制する、項目２４または２５に記載のトリＩＦＩＴＭポリペプチド。
（項目２８）
項目２４から２７のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ｃｈＩＦＩＴＭ遺伝子座アーキテクチャおよび複数の配列アラインメント。Ｇｇａ５のＩＦＩＴＭ遺伝子クラスターには、ＡＴＨＬ１およびＢ４ＧＡＬＮＴ４が隣接している。この領域は、Ｈｓ１１のＩＦＩＴＭ遺伝子クラスターとシンテニーである（Ａ）。ヒト、チンパンジーおよびニワトリオルソログのアラインメントはＣｌｕｓｔａｌＷおよび手作業のアラインメント精密化（alignment  refinement）を使用して実行され、ＢｉｏＥｄｉｔを使用してアノテートされた。色つきカラムは、９個すべてのＩＦＩＴＭ配列で共有されている残基を示す。重要な残基は、配列の下の記号で強調されている：Δ−チロシン、Ｏ−二重システイン、＊−多量体化のために重要なフェニルアラニン、↑−保存されたユビキチン化リジン。ＩＭ１（膜内１）、ＣＩＬ（保存された細胞内ループ）、ＩＭ２（膜内２）。
【００４２】
【図２】リッサウイルス糖タンパク質エンベロープ（ＣＶＳ：攻撃ウイルス標準（狂犬病ウイルス）、ＭＨＫ：モコラウイルスおよびＲＶ１：ラゴスコウモリウイルス）またはインフルエンザヘマグルチニンエンベロープ（Ｈ１（ヒト）、Ｈ４（鳥（bird））およびＨ５（ヒト）、Ｈ７（鳥）、Ｈ１０（鳥）のいずれかを含むさまざまな偽型ウイルスでのＡ５４９細胞の感染。
【００４３】
【図３】Ａ５４９細胞における過剰発現ＩＦＩＴＭタンパク質の細胞内局在。
【００４４】
【図４】（Ａ）ＩＦＮ−γ刺激後のＤＦ−１ニワトリ細胞でのｃｈＩＦＩＴＭ３発現における対数倍数変化、（Ｂ）ｃｈＩＦＩＴＭ３に特異的なｓｉＲＮＡ（ＣＨ）またはスクランブルｓｉＲＮＡ（ＮＳ）でのｃｈＩＦＩＴＭ３ノックダウンの百分率、（Ｃ）核タンパク質（ＮＰ）に対する抗体を使用するフローサイトメトリーによって測定したインフルエンザＡウイルス（Ａ／ＷＳＮ／１９３３（ＷＳＮ／３３））でのＤＦ−１細胞の感染。ｃｈＩＦＩＴＭ３に特異的なｓｉＲＮＡ（ＣＨ）またはスクランブルｓｉＲＮＡ（ＮＳ）との予備インキュベーションはすべての場合に使用された。エラーバーは、３連で実行した各条件にわたる標準偏差を表す。
【００４５】
【図５】組織パネルにおけるニワトリＩＦＩＴＭ転写物の差次的発現。
【００４６】
【図６】ＨＡタグのウエスタンブロット（Ｂ）により異なるレベルのｃｈＩＦＴＩＭ３タンパク質を発現しているＡ５４９細胞は、発現されたタンパク質のレベル（Ａ）に応じて、ラゴスコウモリウイルス（ＬＢＶ）糖タンパク質エンベロープで偽型分類された（pseudotyped）レンチウイルスの複製を制限した。
【００４７】
【図７】ニワトリＩＦＩＴＭ３は、ＤＦ−１ニワトリ細胞において抗ウイルス活性を有する。ｃｈＩＦＩＴＭ３の発現レベルおよび対数倍数変化は、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γでの刺激後または非標的化ｓｉＲＮＡもしくはｃｈＩＦＩＴＭ３に特異的なものとの予備インキュベーション後に定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して測定された（Ａ）。インフルエンザＡウイルス（Ａ／ＷＳＮ／１９３３［ＷＳＮ／３３］）に感染したＤＦ−１細胞における内在性ｃｈＩＦＩＴＭ３発現のノックダウンの効果を核タンパク質（ＮＰ）に対する抗体を使用するフローサイトメトリーによって測定した（Ｂ）。Ｐ＝０．０１、スチューデントのｔ検定。ｃｈＩＦＩＴＭ３−ＨＡでトランスフェクトしたＤＦ−１細胞をＷＳＮに感染させた。ＨＡおよびＮＰの発現をフローサイトメトリーによって検出し（ＣおよびＤ）、ウイルス力価をＰＦＵによって測定した（Ｅ）。エラーバーは、３連で実行した各条件にわたる標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
詳細な説明
ＩＦＩＴＭ
本発明は、トリＩＦＩＴＭポリペプチドに関する。
【００４９】
インターフェロン誘導性膜貫通（ＩＦＩＴＭ）タンパク質は、ＳＡＲＳコロナウイルス、フィロウイルス（マールブルグウイルスおよびエボラウイルス）、インフルエンザＡ（ＩＡＶ）、フラビウイルス（デングウイルス）ならびにＨＩＶ−１を含むいくつかの高度に病原性のヒトウイルスの侵入工程および複製を制限する。それらの発現は、Ｉ型およびＩＩ型インターフェロンによって誘導され、そのためそれらはインターフェロン刺激性遺伝子（ＩＳＧ）の分類に入る。
【００５０】
ＩＦＩＴＭタンパク質は、小さく（約１３０ａａ）、保存されたＣＤ２２５ドメインによって定義される共通のトポロジーを共有している。ＣＤ２２５ドメインは、２個の膜内（ＩＭ）領域（ＩＭ１およびＩＭ２）ならびに保存された細胞内ループ（ＣＩＬ）を含み、Ｎ末端およびＣ末端ドメインが隣接している。
【００５１】
ヒトでは、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２およびＩＦＩＴＭ３は、広範な組織において発現されている一方でＩＦＩＴＭ５発現は、骨芽細胞に限定されている。マウスは、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３およびＩＦＩＴＭ５に対するオルソログならびに追加の遺伝子Ｉｆｉｔｍ６およびＩｆｉｔｍ７を有する。
【００５２】
ＩＦＩＴＭタンパク質は、多様なエンベロープウイルスの細胞質性侵入および複製をブロックすることによってウイルス感染を抑制する。ＩＦＩＴＭタンパク質媒介性制限は、タンパク質が膜内構造に取り込まれると予測される後期エンドソームおよびライソソーム構成成分中の、ＩＦＩＴＭ制限ウイルス侵入部位で生じる。したがって、ＩＦＩＴＭ媒介性制限は、ウイルスにコードされた対抗手段の合成のための機会が明白にないようにウイルス複製に先行する。
【００５３】
ＩＦＩＴＭタンパク質は、ウイルスエンベロープ融合タンパク質の酸性活性化の後のウイルスとエンドソーム膜との間の融合ポアの形成を妨害する。ヘミ膜融合の段階での融合ポア形成の停止を導く、ＩＦＩＴＭタンパク質の細胞膜特性変更能力が実証されている。マウス細胞におけるＩｆｉｔｍ３の欠乏は、エンドソーム侵入ウイルスに対するＩＦＮ媒介性防御効果の４０％〜７０％の消失を生じ、同様の減弱がＩｆｉｔｍ１、Ｉｆｉｔｍ２、Ｉｆｉｔｍ３、Ｉｆｉｔｍ５およびＩｆｉｔｍ６を欠いているＩｆｉｔｍＤｅｌマウスにおいても検出される。ウイルス制限へのＩＦＩＴＭ３の関与についての直接的臨床的証拠は、ＩＦＩＴＭ３変異体（variant）と、季節性またはパンデミックなインフルエンザＨ１Ｎ１／０９ウイルスで入院した個人の数との間の関連によって最近示された。
【００５４】
ニワトリゲノムは、第５染色体に２個の推定ＩＦＩＴＭ遺伝子、いわゆるＩＦＩＴＭ５（ＥＮＳＧＡＬＧ０００００００４２３９、第５染色体：１６２０３０４−１６２１８０５：１）およびＩＦＩＴＭ１０（ＥＮＳＧＡＬＧ００００００２０４９７、第５染色体：１５２４４０６１−１５２４９３５１：１）を含有する。ヌクレオチド配列相同性に基づくニワトリの以前のゲノム解析は、ヒトＩＦＩＴＭ１（変異体１：ＸＭ＿００１２３３９４９．２、変異体２：ＸＭ＿００３６４１２８１．１）およびＩＦＩＴＭ３（ＸＭ＿４２０９２５．３）にオルソロガスな２個の追加的ＩＦＩＴＭの存在を予測していた。そのようなゲノム解析は、種分化の際の遺伝子重複および進化的分岐事象の不完全な知識による偽遺伝子の不適切な同定およびオルソログの誤指定によってしばしば惑わされる。これは、予測されたトリＩＦＩＴＭ配列のヌクレオチド配列がヒトおよびチンパンジーのオルソログと顕著に異なっていることから、予測されたトリＩＦＩＴＭ配列には特に関連している。ＩＦＩＴＭ様機能を提供するトリポリペプチドの以前の報告は無い。
【００５５】
本発明者らは、機能性トリＩＦＩＴＭのヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を定義するためにシンテニー領域の注意深いゲノム解析および遺伝子産物の機能的特徴付けを実施した。
【００５６】
本発明は、配列番号１（ニワトリＩＦＩＴＭ１）、配列番号２（ニワトリＩＦＩＴＭ２）、配列番号３（ニワトリＩＦＩＴＭ３）ならびにそのホモログおよび変異体を含む群から選択されるアミノ酸配列を含むトリＩＦＩＴＭポリペプチドに関する。
【００５７】
配列番号1:
MQSYPQHTSINMPSYGQDVTTTIPISPQPPPKDFVLWSLFNFVLCNAFCLGLCALSYSIKSRDRIIAKDFVGASSYGRTAKIFNIFAFCVGLLVTILSIVLVFLYLPLYTVRP
配列番号2:
MKPQQAEVSIPLHPPGRGPPLASLPDEQPRDFILWSLFNVLAGFALAYLGCFCFPSLIFS
IKARDCKVLGDLEGARRYGSRAKVLNIIFSVLIAVGVLSTITIAIMFITAISR
配列番号3:
MERVRASGPGVPPYEPLMDGMDMEGKTRSTVVTVETPLVPPPRDHLAWSLCTTLYANVCCLGFLALVFSVKSRDRKVLGDYSGALSYGSTAKYLNITAHLINVFLIILIIALVASGTIMVANIFNHQQQHPEFIGPT
【００５８】
用語「ポリペプチド」とは、典型的には隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合によって相互に連結されている一連の残基（典型的にはＬ−アミノ酸）を従来の意味において意味して使用される。
【００５９】
これらのｃｈＩＦＩＴＭポリペプチドは、次の配列：ｃｈＩＦＩＴＭ１（配列番号４）、ｃｈＩＦＩＴＭ２（配列番号５）、ｃｈＩＦＩＴＭ３（配列番号６および配列番号７）によるｃＤＮＡ配列によってコードされ得る。
【００６０】
配列番号4:
acagctgccctccagcaccatgcagagctaccctcagcacaccagcatcaacatgccttc
ctacgggcaggatgtgaccaccactattcccatctctccgcagccgccccccaaggattt
tgtactctggtccctcttcaactttgtgctgtgcaacgccttctgcctgggcttatgtgc
tctctcatactccatcaagtccagggataggatcatcgccaaggacttcgtaggcgccag
cagctatgggaggacagcgaagatctttaacatctttgcattctgtgtgggacttcttgt
gaccatcctctccatcgtcctggtgtttctctacctcccgttgtacactgtgcggccctg
atctggcctgatcaagaggagcagcactgcggtcccactcctccttccctctacctctgg
tatcacccccaccgaggtgactcagttcgggatgagcccttggggtgagctgaaggcaaa
taaagcttcttccccattcta
配列番号5:
ATGAAGCCGCAACAGGCGGAGGTGAGCATCCCGCTGCACCCACCCGGGCGGGGGCCGCCCCTCGCCAGCCTCCCCGACGAGCAGCCCCGCGACTTCATCCTCTGGTCCCTCTTCAACGTCCTGGCGGGCTTCGCTCTCGCCTACCTCGGCTGCTTCTGCTTCCCCTCGCTCATCTTCTCCATCAAGGCCCGCGACTGCAAAGTGCTGGGCGACCTGGAAGGTGCTCGGCGGTATGGAAGCCGGGCCAAGGTGCTGAACATCATCTTCTCTGTGCTGATAGCCGTCGGTGTGTTGTCCACCATCACCATTGCCATCATGTTCATCACCGCGATCAGCAGATAG
配列番号6:
caccgggctgcggggaaacgaaaccagttccctccgtcctcccgtcccggcgccgccccc
aagcctcatagcccccgagccccgggatggagcgggtacgcgcttcgggtccgggagtcc
caccgtatgaacccctgatggacgggatggacatggaggggaagacccgcagcacggtgg
tgacggtggagacgcccctggtgcctcctccccgcgaccacctggcctggtcgctgtgca
ccacgctgtacgccaacgtctgctgcctcggcttcctggcgctcgtcttctccgtgaagt
ccagggatcgcaaagtcctgggtgactacagcggggcgctcagctatggctccactgcga
agtacctgaacatcacggcccatctgatcaacgtcttcctcatcatcctcatcatcgccc
tggttgccagtggcaccatcatggtggccaacatcttcaaccaccagcagcaacaccccg
aattcattggacccacttagctccattccatgggcagagcttcgcttggggccatgcttt
ccttgcttcttccaatcccctctccggtcagcatatggaaaagcacctcaagacacccct
tgctctggcaggaacccgaaaaactggctgtagtgcagactttgctgcttgccacctcac
tctgcctttctgctattgctccaagtgccctgagggcagcacctcattggtaaaaaacac
aataaaggtatctttcacttttgtcccac
配列番号7:
ggaccccccgagccccgggatggagcgggtacgcgcttcgggtccgggagtcccaccgta
tgaacccctgatggacgggatggacatggaggggaagacccgcagcacggtggtgacggt
ggagacgcccctggtgcctcctccccgcgaccacctggcctggtcgctgtgcaccacgct
gtacgccaacgtctgctgcctcggcttcctggcgctcgtcttctccgtgaagtccaggga
tcgcaaagtcctgggtgactacagcggggcgctcagctatggctccactgcgaagtacct
gaacatcacggcccatctgatcaacgtcttcctcatcatcctcatcatcgccctggttgc
cagtggcaccatcatggtggccaacatcttcaaccaccagcagcaacaccccgaattcat
tggacccacttagctccattccatgggcagagcttcgcttggggccatgctttccttgct
tcttccaatcccctctccggtcagcatatggaaaagcacctcaagacaccccttgctctg
gcaggaacccgaaaaactggctgtagtgcagactttgctgcttgccacctcactctgcct
ttctgctattgctccaagtgccctgagggcagcacctcattggtaaaaaacacaataaag
gtatctttcacttttgtcccac
【００６１】
本発明者らは、トリＩＦＩＴＭポリペプチドがさまざまなウイルスによる感染を制限できることを決定した。
【００６２】
ｃｈＩＦＩＴＭポリペプチドは一般にはトリ細胞を標的化しないヒトウイルスによる宿主細胞の感染を制限できる。したがってｃｈＩＦＩＴＭ配列は、その種の細胞型を一般的には標的化しないウイルスを含む広範なウイルスへの宿主細胞の易罹患性を操作することにおいて有用であり得る。
【００６３】
用語「トリ」（avian）は、鳥綱という系統発生的分類内の動物を指すために従来の意味において使用される。
【００６４】
具体的には用語トリは、ニワトリ、シチメンチョウ、ライチョウ、ウズラ、ヤマウズラおよびキジを含むがこれらに限定されない、キジ目の科内の動物に関連し得る。
【００６５】
トリ動物は家禽動物、例えばニワトリまたはシチメンチョウであってよい。
【００６６】
ホモログおよび変異体
用語「ホモログ」とは、配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列と等価な機能を有する別のトリ動物由来のポリペプチドをいう。トリＩＦＩＴＭホモログは、関連種（すなわちキジ目の科由来の別のトリ動物）由来または同種の異なる系統（例えばニワトリの別の系統）由来であり得る。
【００６７】
用語「変異体」とは、配列番号１、配列番号２および配列番号３の群から選択されるアミノ酸配列と等価な機能を有するが、１個または複数個のアミノ酸の置換、挿入または欠失を含むポリペプチドをいう。変異ＩＦＩＴＭポリペプチドは、部位特異的変異誘発またはエラープローンＰＣＲなどの当該技術分野において公知の方法によって作られ得る。
【００６８】
機能的等価性は、細胞において発現された場合にＩＦＩＴＭポリペプチドがその細胞のウイルス感染を抑制する能力に関する。
【００６９】
トリＩＦＩＴＭホモログは、ＣＤ２２５ドメインを含む構造を形成するように独立にフォールドし得る。
【００７０】
トリＩＦＩＴＭポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸位置番号付けを参照して次のアミノ酸残基、Ｔｒｐ３５、Ｓｅｒ３６、Ｌｅｕ３７、Ａｒｇ６４、Ａｓｐ６５、Ａｓｐ７１、Ｇｌｙうちの１個もしくは複数個またはすべてを含み得る。
【００７１】
変異または相同なトリＩＦＩＴＭポリペプチドは、配列番号１、配列番号２または配列番号３に、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の相同性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【００７２】
同一性比較は、目視、またさらに通常、容易に利用可能な配列比較プログラムの助けをかりて実行され得る。これらの商業的に利用できるコンピュータープログラムは、２個またはそれより多い配列間の同一性％を算出できる。そのようなアラインメントを実行するために好適なコンピュータープログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（University  of  Wisconsin,  U.S.A.;  Devereuxら、１９８４年,  Nucleotide  sequences  Research  １２巻：３８７頁）である。配列比較を実施できる他のソフトウェアの例としては、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ausubelら、１９９９年  同書-  １８章を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Atschulら、１９９０年,  J.  Mol.  Biol.,  ４０３〜４１０頁）および比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳ一式が挙げられるがこれらに限定されない。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡの両方は、オフラインおよびオンラインの検索で利用可能である。
【００７３】
いったんソフトウェアが最適なアラインメントをもたらせば、同一性％を算出できる。ソフトウェアは典型的にはこれを配列比較の一部として行い、数値的な結果を作成する。
【００７４】
遺伝暗号の冗長性により、同じポリペプチドをコードする配列番号４〜７の配列中のバリエーションが可能である。これらの配列は本発明により包含される。
【００７５】
コードヌクレオチド配列中の一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入および欠失、ならびにトリＩＦＩＴＭポリペプチド内の他のバリエーションは、このポリペプチドの抗ウイルス機能に影響を与え得る。ＩＦＩＴＭ変異体は、したがって活性または不活性な変異体である場合があり、ここで活性変異体は野生型配列と等しいかまたはより大きな抗ウイルス活性を有するＩＦＩＴＭポリペプチドであり、不活性変異体は、野生型配列より低い抗ウイルス活性を有するＩＦＩＴＭポリペプチドである。変異ＩＦＩＴＭ配列は、突然変異配列と称されてよい。
【００７６】
野生型タンパク質は、一般的集団において共通であるアミノ酸配列の非変異バージョンであるアミノ酸の配列を含むタンパク質をいう。
【００７７】
ＩＦＩＴＭ配列変異体は、トリ動物の群れ、品種および／または種内に存在し得る。これらのＩＦＩＴＭ配列変異体は、ウイルス感染へのさまざまなレベルの耐性と関連して活性または不活性な変異体である場合があり、それゆえ、群れ、品種および／または種内のそのような個々の動物は、ウイルス感染へのさまざまなレベルの耐性と関連している可能性がある。
【００７８】
ウイルスを増殖および弱毒化させること
本発明は、トリ細胞をウイルスで形質導入し、そのウイルスを増殖させるためにその細胞を継代することによりウイルスを増殖させるための方法を提供する。
【００７９】
トリ細胞は、トリ胚の一部を形成でき、トリ胚由来であってよく、またはトリ細胞株であってもよい。
【００８０】
細胞は、任意のトリ細胞またはトリ細胞株であってよい。
【００８１】
ワクチンにおける使用のためのウイルスは、胚形成ニワトリ卵および／または胚形成ニワトリ卵由来の細胞、例えばニワトリ胚性線維芽細胞（ＣＥＦ）における増殖を介して一般に産生される。
【００８２】
トリ細胞におけるウイルスの増殖のための一般的技術は、当該技術分野において周知である。
【００８３】
用語「形質導入する」とは、ウイルスベクターを介する宿主細胞への遺伝材料の形質導入をいためにその従来の意味において使用される。上述の場合、これは、生成されるウイルス後代が他の細胞に感染するために宿主細胞から放出されるようにウイルスが複製できるような宿主細胞へのウイルス遺伝材料の形質導入をいう。
【００８４】
用語「増殖」とは、ウイルス粒子の数または量を増加させることをいう。
【００８５】
句「細胞を継代する」とは、ウイルスが集団内の複数の細胞に感染し、ウイルス複製および増殖が生じるのを可能にするように、トリ宿主細胞の分裂および／または維持を促進または可能にすることをいう。
【００８６】
トリ細胞がトリ胚の一部を形成する場合、例えばそれが胚形成ニワトリ卵である場合、細胞を継代することは、最初の形質導入事象の後にウイルスが胚内の複数の細胞に感染できる、適した環境を提供することをいう場合がある。トリ細胞が胚形成ニワトリ卵由来である場合、例えば細胞がＣＥＦである場合、細胞を継代することは、要求される培養密度を維持するために新たな組織培養容器へ細胞を定期的に分割することなどの標準的細胞培養技術を使用して細胞を維持することおよび細胞の分裂を促進することを含む場合がある。
【００８７】
ワクチンは、死／不活化ウイルスまたはその精製された産物を含み得る。代替的にワクチンは、免疫原性を保持する一方でビルレンスの消失を導く条件下で培養された生の弱毒化ウイルスを含み得る。例えば疾患を引き起こすウイルスは、ワクチンとして使用され得る、その標的細胞における複製が十分に乏しい時点まで一連の細胞培養または動物胚を通じて継代されてよい。この時点でウイルスは、ビルレンスを消失しているが、まだ免疫原性であり、免疫応答を刺激できる。ワクチンにおける使用のための弱毒化ウイルスは、そのウイルスがその元の宿主細胞にもはやビルレントではなく、したがってその元の宿主種に対してもはやビルレントではないようなポイントまで、胚形成ニワトリ卵および／またはＣＥＦなどの胚形成ニワトリ卵由来の細胞においてウイルスを継代することによって一般に産生される。
【００８８】
ＩＦＩＴＭポリペプチドが発現される宿主細胞を一般的には標的としないウイルスによる感染を制限するＩＦＩＴＭポリペプチドの能力は、ワクチンにおける使用のための弱毒化ウイルスの生成の内容では重要である。トリ宿主細胞におけるＩＦＩＴＭ発現および／または活性の低下は、非トリウイルス、例えばヒトウイルスなどの哺乳動物ウイルスによる感染に対する宿主細胞の易罹患性を増加させ得る。
【００８９】
したがって本発明は、次のステップ：
（ｉ）第１の態様によるトリ細胞をウイルスで形質導入するステップ、および、
（ｉｉ）ウイルスが複数回の感染を完了し、弱毒化されるようにトリ細胞を継代するステップ
を含む弱毒化ウイルスを生成するための方法を提供する。
【００９０】
本発明によって提供されるウイルスを増殖させるおよび／または弱毒化する方法は、ウイルスを継代するために使用されるトリ胚またはトリ細胞においてＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２および／もしくはＩＦＩＴＭ３、またはそのホモログのタンパク質レベルを低下させることを含む。ＩＦＩＴＭタンパク質は、ウイルス感染を抑制するために機能し、したがってＩＦＩＴＭ発現または活性のレベルが減少した細胞は、ウイルス感染をさらに受けやすくなる。ウイルス感染への細胞の易罹患性の増加は、ＩＦＩＴＭ発現のレベルが操作されていない細胞と比較してさらに多い細胞が感染し、さらに多いウイルスが産生されて、ウイルス感染のさらに高い効率を生じる。そのような特徴は、宿主細胞においてウイルスを継代することを含む適用においてウイルス産生の収量を改善するために有益である。
【００９１】
本発明の第１の態様は、ニワトリＩＦＩＴＭ１（配列番号１）、ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）および／もしくはニワトリＩＦＩＴＭ３（配列番号３）またはそれらの相同配列の低下した発現および／または活性を有するトリ細胞に関する。
【００９２】
用語「低下した」とは、ＩＦＩＴＭの発現または活性が、同等の未改変または未処置の野生型細胞でのＩＦＩＴＭの発現または活性より少ないことを示した。
【００９３】
ＩＦＩＴＭの発現または活性は、例えば最大２５、５０または７５％低下する場合がある。
【００９４】
ＩＦＩＴＭの発現または活性が低下したトリ胚またはトリ細胞株は、当業者に公知の多くの技術によって生成され得る。
【００９５】
ＩＦＩＴＭ遺伝子発現は、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡまたは低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）などのＲＮＡｉメディエーターを使用するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を介して低下され得る。ＲＮＡｉメディエーター分子は、エレクトロポレーション、リポフェクションまたはナノ粒子送達などの技術を介して、裸のＲＮＡとして、プラスミドベクターにおいて、または脂質および／もしくはタンパク質カプセルにおいて、一過性に送達され得る。代替的にＲＮＡｉメディエーター分子は、レトロウイルスベクター（例えばレンチウイルス）の使用を通じて、標的細胞のゲノムに安定的に導入される場合があり、ここでは、標的細胞はレンチウイルスゲノムが標的細胞のゲノムに組み込まれるようにレンチウイルスで形質導入される。ＧＦＰなどの扱いやすいマーカーを含むレンチウイルスベクターが使用される場合、ＲＮＡｉメディエーター分子が発現されている細胞が選択され得る。レンチウイルスゲノムが宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれることから、ＲＮＡｉメディエーター分子の遺伝性の発現が可能になり、それによりＩＦＩＴＭの発現レベルが低下している安定な後代が生じる。
【００９６】
低下したＩＦＩＴＭ発現の確認は、当該技術分野において周知であるいくつかの技術を使用して評価され得る。例えばＩＦＩＴＭ  ｍＲＮＡのレベルは、従来のまたはリアルタイムのＰＣＲ技術を使用して評価でき、ＩＦＩＴＭタンパク質レベルはウエスタンブロット技術を使用して評価され得る。
【００９７】
次のポリペプチド：ニワトリＩＦＩＴＭ１（配列番号１）、ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）およびニワトリＩＦＩＴＭ３（配列番号３）またはそのホモログのうちの１個または複数の発現がその動物の生殖細胞および体細胞において低下されているまたはノックアウトされているトランスジェニック動物は、前記ポリペプチドをコードしている１個または複数のヌクレオチド配列に対して標的化されたＲＮＡｉメディエーター分子の、前記動物の適切な発生段階の成熟卵母細胞、精子、新たに受精した接合子、初期胚または始原生殖細胞（ＰＧＣ）へのレンチウイルス送達によって産生され得る。これは、細胞の後代におけるＲＮＡｉメディエーター分子の発現および標的化遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現の減少を生じる。
【００９８】
上のポリペプチドのうちの１個の活性は、前記動物の適切な発生段階の成熟卵母細胞、精子、新たに受精した接合子、初期胚または始原生殖細胞（ＰＧＣ）への、ポリペプチドのドミナントネガティブ突然変異バージョンをコードするトランスジェニック配列の送達によって低下され得る。
【００９９】
代替的に標的遺伝子のノックアウトは、相同組換え事象または標的化組換え事象によって生成され得る。
【０１００】
ＩＦＩＴＭコード遺伝子は、上に記載の技術を使用して機能性ＩＦＩＴＭタンパク質をコードしていないヌクレオチド配列でも置き換えられ得る。本発明の内容では、用語「機能的」とは、宿主細胞で発現された場合にＩＦＩＴＭポリペプチドがその宿主細胞のウイルス感染を抑制する能力をいう。
【０１０１】
ワクチン
本発明の方法によって増殖および／または弱毒化されたウイルスは、ワクチンに組み込まれ得る。
【０１０２】
用語「ワクチン」とは、本明細書で使用される場合、被験体に投与される場合に、防御免疫応答を誘導もしくは刺激する調製物をいう。ワクチンは、生物に特定の疾患に対する免疫をつけ得る。
【０１０３】
ワクチンは、治療的に使用されて、現存の感染を処置し得る；もしくは予防的に使用されて、感染の可能性をブロックもしくは低下させ得るか、そして／または疾患にかかる可能性を予防もしくは低下させ得る。
【０１０４】
ワクチンは、１種もしくはそれより多くのワクチン接種する実体、ならびに必要に応じて、１種もしくはそれより多くのアジュバント、賦形剤、キャリアおよび希釈剤を含む。
【０１０５】
ワクチン接種する実体は、本発明の方法によって増殖および／または弱毒化されたウイルスであってよい。
【０１０６】
ワクチン接種する実体は、本発明の方法によって増殖および／または弱毒化されたウイルスの精製された産物であってもよい。
【０１０７】
ワクチンはまた、別の活性因子（例えば、ワクチン接種する実体が誘導した適応免疫応答の前に初期の防御を刺激し得るもの）を含んでいてもよいし、別の活性因子を発現してもよい。この因子は、抗ウイルス剤（例えば、タイプＩインターフェロン）であり得る。代わりに、もしくは加えて、この因子は、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）であり得る。
【０１０８】
ウイルス感染へのトリ動物の生得的な耐性の調査
本発明は、次のポリペプチド：ニワトリＩＦＩＴＭ１（配列番号１）、ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）およびニワトリＩＦＩＴＭ３（配列番号３）またはそのホモログのうちの１個または複数をコードするヌクレオチド配列ならびに／またはそのコピー数を調査するステップを含む、ウイルス感染へのトリ動物の生得的な耐性を調査するための方法を提供する。
【０１０９】
ＩＦＩＴＭポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、例えばＩＦＩＴＭ遺伝子の配列を調査することは、配列バリエーションについてＩＦＩＴＭ遺伝子をスクリーニングすることによって実施され得る。ＩＦＩＴＭ変異体のスクリーニングは、当該技術分野において周知であってＰＣＲ、従来のＤＮＡ配列決定および第２世代ＤＮＡ配列決定を含むがこれらに限定されない多くの従来の技術を使用して実施され得る。
【０１１０】
遺伝子のコピー数は、ゲノムにある遺伝子のコピーの数である。コピー数多型（ＣＮＶ）は、１個または複数の遺伝子の異常な数のコピーを有する細胞を生じるゲノムのＤＮＡの変更である。ＣＮＶは、特定の染色体においてゲノムの比較的大きな領域が欠失された（通常の数より少ない遺伝子のコピーをもたらす）または重複した（通常の数より多い遺伝子のコピーをもたらす）場合に通常生じる。
【０１１１】
コピー数多型は、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、比較ゲノムハイブリダイゼーション、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション、ＳＮＰアレイを伴う仮想核型分析および次世代配列決定などの細胞遺伝学的技術によって調査され得る。
【０１１２】
上に記載のＩＦＩＴＭ遺伝子をスクリーニングする方法に加えて、本発明は、同じ種の複数のトリ動物からのウイルス感染に対する耐性を有するトリ動物を選択するための方法も提供する。そのような方法は、上に記載の１個または複数のトリＩＦＩＴＭ遺伝子の配列および／またはコピー数を調査するステップ、ウイルス感染への耐性に関連する、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２および／もしくはＩＦＩＴＭ３配列またはコピー数を有するトリ動物を選択するステップを含む。
【０１１３】
上記の方法においてスクリーニングされ、潜在的に選択される複数の動物は、群れ、品種または種を含み得る。ＩＦＩＴＭ遺伝子の遺伝的配列における起こりうるバリエーションのために、集団内の異なる動物は、異なるＩＦＩＴＭ配列に関連する場合がある。集団の個々のメンバー間でのＩＦＩＴＭ遺伝子の遺伝的配列におけるそのような差異は、多数の中での遺伝的変動と称される場合がある。
【０１１４】
ウイルス感染抑制
用語「ウイルス感染を抑制する」とは、ポリペプチドが、細胞へのウイルスの侵入、細胞内での複製または細胞からの放出のレベルを減少させる、抑制するまたは低下させる能力をいう。ウイルス感染を抑制できるポリペプチドを発現しているトリ動物は、したがってウイルス感染への耐性に関連する。
【０１１５】
ウイルス感染力のレベルを評価するための多くの技術は、当該技術分野において公知である。これらの技術は、典型的にはウイルス複製マーカーの存在を決定すること、例えばウイルスＲＮＡ、ウイルスペプチドおよび／もしくはウイルス粒子のレベルをアッセイすることまたはウイルスが感染した集団における死亡率のレベルをアッセイすることを含む。そのような技術は、試料中の候補抗ウイルス実体のレベルを増加または減少させ、ウイルス感染力のレベルを、抗ウイルス実体のレベルが調節されていない同等の試料と比較することによって、ポリペプチド、またはヌクレオチド配列などの実体の潜在的抗ウイルス機能を決定するために一般に使用される。ウイルス感染力のレベルを評価するための技術としては、プラークアッセイ、フローサイトメトリー、ｑＰＣＲ、ＥＬＩＳＡおよび死亡率が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１６】
ウイルス感染
本発明のポリペプチドは、ウイルス感染を抑制できる。
【０１１７】
ウイルス感染は、酸性エンドソームを通じて標的細胞に侵入する任意のウイルスによって引き起こされ得る。そのような侵入は、エンドソーム経路を通じた処理の前にエンドサイトーシスを介する標的細胞へのウイルスの取り込みを含む。エンドソームが、細胞においてプロセスされて成熟するにつれ、そのｐＨはさらに酸性になり、酸性度の増加は、エンドソームのコンホメーションの変化を生じ、このことは、ウイルスを細胞内に遊離させる。
【０１１８】
ウイルス感染は、トリおよび／または哺乳動物のウイルスによって引き起こされ得る。ウイルスは、エンベロープウイルスであってよい。ＩＦＩＴＭは、細胞エンドソーム膜とのウイルスエンベロープ融合をブロックすることによって、エンベロープウイルスのサイトゾル侵入をブロックする。
【０１１９】
トリウイルス感染は、トリインフルエンザ、トリ感染性気管支炎、伝染性ファブリキウス嚢病、マレック病またはニューカッスル病である場合がある。
【０１２０】
トリインフルエンザは、オルトミクソウイルスファミリーのインフルエンザＡウイルスであるトリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）によって引き起こされる。インフルエンザＡウイルスのすべてのサブタイプ（しかし、すべてのサブタイプのすべての系統ではない）は鳥に適応しており、インフルエンザＡウイルスのすべてのサブタイプの系統は、野鳥から単離されており、疾患症状の出現を伴わずにしばしば保有される。インフルエンザＡウイルスのいくつかの単離物は、しかし、家禽および、時にはヒトの両方において重度の疾患を引き起こす場合がある。インフルエンザＡウイルスは、マイナスセンスで１本鎖のセグメント化ＲＮＡウイルスである。それらは、ウイルスカプシド上に存在するヘマグルチニンの種類についてのＨ数、およびノイラミニダーゼの種類についてのＮ数によって定義される。１７種の異なるＨ抗原（Ｈ１からＨ１７）および９種の異なるＮ抗原（Ｎ１からＮ９）がある。ＡＩＶのサブタイプは、これだけに限らないがＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ８、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ３およびＨ７Ｎ７を含む。
【０１２１】
ＡＩＶ細胞侵入および複製は、ウイルスヘマグルチニンと宿主シアル酸との間の相互作用を介した宿主細胞へのウイルス侵入、酸性エンドソームのコンパートメントの状況でのウイルスＲＮＡゲノム（ｖＲＮＡ）およびウイルスコアタンパク質の放出、ウイルスタンパク質の発現を促進するｖＲＮＡからｍＲＮＡへの転換、ｖＲＮＡの複製、ならびに小胞形成による、感染した細胞からのウイルス粒子の放出を含む複数ステップ工程である。
【０１２２】
鳥における症状は、不定であり、非特異的である場合があるが、逆立った羽、産卵の低下および呼吸器疾患を伴う体重減少を含む場合がある。その最も高度に病原性の形態では、ニワトリおよびシチメンチョウにおけるＡＩＶは、重度の症状の突然の出現および２日以内にほとんど１００％の死亡率をもたらす。これらの大流行は、家禽農場経営者に大きな経済的損失をもたらし得る。
【０１２３】
トリ感染性気管支炎は、トリ感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）によって引き起こされる。ＩＢＶは、ニワトリを含むトリ種に感染し、気道、腸、腎臓および生殖器系を冒す、高度に感染性のコロナウイルスである。
【０１２４】
ＩＢＶは、セグメント化されていない、プラスセンス１本鎖ＲＮＡゲノムを有し、酸性エンドソーム中での宿主細胞へ侵入とその後のウイルスゲノムＲＮＡの細胞質への放出を介して複製する。コロナウイルスゲノムは、５’メチル化キャップおよび、直接翻訳のためにＲＮＡをリボソームに付着させる３’ポリアデニル化尾部を有する。コロナウイルスは、宿主細胞機構を使用してＲＮＡウイルスゲノムが新たなＲＮＡコピーに転写されるようにするレプリカーゼもコードしている。
【０１２５】
伝染性ファブリキウス嚢病（ＩＢＤ、ガンボロ病、感染性滑液包炎または感染性トリネフローゼとしても公知）は、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）によって引き起こされる若いニワトリの高度に伝染性の疾患である。ＩＢＤＶは、２セグメント化ゲノムを有し、Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科のＡｖｉｂｉｒｎａｖｉｒｕｓ属に属する２本鎖ＲＮＡウイルスである。ＩＢＤＶは、酸性エンドソームを介して宿主標的細胞に侵入する。このウイルスには２種の別々の血清型があるが、血清型１ウイルスだけが家禽において疾患を引き起こす。ＩＢＤＶ血清型１の少なくとも６種の抗原サブタイプが同定されており、このサブタイプ内の変異体は、商用の群れにおいて高レベルの移行抗体を突破でき、最大６０から１００パーセントの死亡率をニワトリにおいて生じる。
【０１２６】
ＩＢＤは、一般に３から６週齢での免疫抑制および死亡率によって特徴付けられる。疾患症状は、突然出現する場合があり、罹患率は典型的には１００％に達する。感染した鳥は、水様性下痢を生じる場合があり、糞便で汚れた腫脹した肛門（swallen  feces-stained  vent）を有する場合がある。感染した群れの大部分は、横臥し、羽を逆立てる場合がある。感染は、最初にファブリキュウス嚢を冒し、感染した鳥を免疫無防備状態にする。
【０１２７】
マレック病は、ニワトリの高度に伝染性のウイルス性腫瘍性疾患であり、マレック病ウイルス血清型１（ＭＤＶ−１）またはトリヘルペスウイルス２（Gallid  herpesvirus  2；ＧａＨＶ−２）として公知のアルファヘルペスウイルスによって引き起こされる。この疾患は、Ｔ細胞リンパ腫の存在、ならびにリンパ球による神経および器官の浸潤によって特徴付けられる。ＭＤＶ−１感染後に生じることが公知の６つの症候群は、神経リンパ腫症、急性マレック病、眼球リンパ腫症（ｏｃｕｌａｒ  ｌｙｍｐｈｏｍａｔｏｓｉｓ）、皮膚マレック病、粥状動脈硬化および免疫抑制である。
【０１２８】
ＭＤＶ−１は、ＤＮＡゲノムを含み、核複製性であり、ウイルスＤＮＡは感染細胞の核内でｍＲＮＡに転写される。感染は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質が標的細胞膜受容体と相互作用したときに開始し、ビリオンの酸性エンドソーム内への内部移行および解体を引き起こし、ウイルスＤＮＡを細胞核に移動させる。いったん核内に入ると、ウイルスＤＮＡの複製およびウイルス遺伝子の転写が生じる。
【０１２９】
症候性感染の際に、感染細胞は、感染宿主細胞の死をもたらす溶解性ウイルス遺伝子を転写する。溶解性ウイルス遺伝子に加えて、宿主細胞は、代わりに潜伏期関連転写物（ＬＡＴ）も発現する場合がある。この様式ではウイルスは無期限に細胞（したがって宿主）中に存続できる。
【０１３０】
ニューカッスル病は、トリパラミクソウイルスであるニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）によって引き起こされる。パラミクソウイルスのゲノムは、長さ１５〜１９キロ塩基の、セグメント化されてないマイナスセンスＲＮＡである。ＮＤＶでの感染の徴候は、ウイルスの系統ならびに宿主の健康、年齢および種などの要因に依存して大きく変化するが、しかし：呼吸徴候（あえぎ、咳嗽）、神経徴候（抑うつ、食欲不振、筋振戦、羽の下垂（ｄｒｏｏｐｉｎｇ  ｗｉｎｇ）、頭および首の湾曲、旋回、完全な麻痺）、眼および首の周辺組織の腫脹、緑色の水様性下痢、奇形、粗いまたは薄い殻の卵および産卵の低下を含む。急性の場合、死は突然である場合があり、大流行の初めでは、残っている鳥は症候性でない場合がある。しかし、良好な免疫を有する群れでは、徴候（呼吸器および消化器）は軽度で進行性であり、７日後に神経症状、特に頭部捻転（ｔｗｉｓｔｅｄ  ｈｅａｄ）が続く。ＮＤＶ系統は、短潜伏期性（強ビルレント）、亜病原性（中間ビルレンス）または長潜伏期性（非ビルレント）として分類され得る。短潜伏期性系統は、重度の神経および呼吸徴候を生じ、急速に広がり、最大９０％の死亡率をもたらす。亜病原性系統は、咳嗽を生じ、卵の品質および産卵に影響を与え、最大１０％の死亡率をもたらす。長潜伏期性系統は、無視できる死亡率で軽度の徴候を生じる。
【０１３１】
本発明のポリペプチドは、ウイルス性疾患の予防または処置において使用され得る。
【０１３２】
ウイルス性疾患の予防のためのポリペプチドの使用は、予防実体としてのその使用に関する。本明細書においてそのポリペプチドまたはそのポリペプチドをコードする核酸は、その疾患をまだ罹患していないおよび／またはその疾患のいかなる症状も示していないトリ動物に、その疾患を予防するかもしくはその疾患の原因を損なうために、またはその疾患に関連する少なくとも１つの症状の発症を低下させるもしくは予防するために投与され得る。
【０１３３】
ウイルス性疾患の処置のためのポリペプチドの使用は、治療実体としてのその使用に関する。本明細書においてそのポリペプチドまたはそのポリペプチドをコードする核酸は、現存の疾患または状態を有するトリ動物に、その疾患に関連する少なくとも１つの症状を少なくする、低下させるもしくは改善するためおよび／またはその疾患の進行を遅くする、低下させるもしくはブロックするために投与され得る。
【０１３４】
発現の増加
本発明は、次のポリペプチド：ニワトリＩＦＩＴＭ１（配列番号１）、ニワトリＩＦＩＴＭ２（配列番号２）およびニワトリＩＦＩＴＭ３（配列番号３）またはそのホモログのうちの１つまたは複数の発現をトリ動物において増加させるステップを含む、トリ動物においてウイルス感染を予防するまたは処置するための方法を提供する。
【０１３５】
発現は、例えばトリ動物を関連遺伝子でトランスフェクトするまたは形質導入することによって増加され得る。遺伝子は、ベクターに基づく方法によって導入され得る。ベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターであってよい。
【０１３６】
ベクターは、トリ動物のゲノムでの遺伝子のコピー数の永続的な増加を生じるように「遺伝子治療」型アプローチにおいて使用され得る。
【０１３７】
発現は、遺伝子の発現を制御するプロモーターおよび／またはエンハンサーを調節することによっても増加され得る。
【０１３８】
トランスジェニックトリ動物
上述のとおりＩＦＩＴＭポリペプチドの配列変異体は、ウイルス感染を抑制するそれらの能力が変化する場合がある。加えてＩＦＩＴＭの増大した発現レベルは、ウイルス感染に対する増大した防御と関連する場合がある。そのように本発明は、ウイルス感染への増大した耐性を有するトリ動物を産生するための方法にも関し、前記方法はトリＩＦＩＴＭ１、トリＩＦＩＴＭ２およびトリＩＦＩＴＭ３のうちの１個、２個もしくは３個の発現をトリ動物において増加させること、またはその活性変異体の発現もしくは過剰発現を誘導すること、またはゲノム上のそのコピー数を増加させることを含む。
【０１３９】
トランスジェニックトリ動物は、トランスジェニックニワトリであってよい。
【０１４０】
用語、外来性、トランスジェニックおよび異型遺伝子性とは本明細書において使用される場合、自発的変異ではなくヒトの介入によって被験体のゲノムに意図的に導入された核酸配列についてすべて同義である。トランスジェニックニワトリを含むトランスジェニック動物を産生するすべての方法は、生殖細胞を生じる細胞に新規遺伝材料を嵌め込むために設計された技術に依存している。それゆえ、成熟卵母細胞、精子、新たに受精した接合子、初期胚または始原生殖細胞（ＰＧＣ）は、導入遺伝子を導入するための標的として使用され得る。
【０１４１】
トランスジェニック動物を生成するために使用され得る方法は、当該技術分野において周知であり、これだけに限らないが、ウイルス媒介性遺伝子転移、ＤＮＡ微量注入、胚性幹細胞／始原細胞媒介性遺伝子転移、核転移、人工染色体転移、精巣媒介性遺伝子転移および精子媒介性遺伝子転移を含む。
【０１４２】
本発明は、その生殖細胞および体細胞が、トランスジェニックトリ動物または前記動物の先祖に胚期で導入された本発明のポリペプチドをコードする異型遺伝子ヌクレオチド配列を含む、トランスジェニックトリ動物も提供する。
【０１４３】
本発明は、ここで実施例によってさらに記載される。実施例は、本発明を実施するにあたって当業者を助けるのに役立つことが意図され、本発明の範囲を限定するとは如何様にも意図されない。
【実施例】
【０１４４】
（実施例１）
ニワトリＩＦＩＴＭ配列マイニング（Ｍｉｎｉｎｇ）
【０１４５】
ニワトリゲノムの最新バージョンのＴＢＬＡＳＴＮ分析（ｖ４．０、ＮＣＢＩ  ｂｒｏｗｓｅｒ）は、３個のニワトリＩＦＩＴＭを明らかにした。これらの内２個は、既に同定されており、ＩＦＩＴＭ３様（ＮＣＢＩ  Ｉ．Ｄ．ＸＭ＿４２０９２５．３）およびＩＦＩＴＭ１様（変異体１：ＸＭ＿００１２３３９４９．２、変異体２：ＸＭ＿００３６４１２８１．１）と命名されている。すべてのｃｈＩＦＩＴＭパラログは、哺乳動物ＩＦＩＴＭと同様に２個のエクソンから構成され、イントロンエクソン境界の位置はこれらの種のすべてにわたって保存されている。
【０１４６】
（実施例２）
ニワトリＩＦＩＴＭ遺伝子のアノテート
【０１４７】
３個のｃｈＩＦＩＴＭ遺伝子と霊長類種の直接オルソログとの間のアミノ酸アラインメントは、いくつかの保存されたＩＦＩＴＭ−ファミリーモチーフがニワトリ配列のいくつかに存在することを示している（図１Ｂ）。ニワトリ配列は、ヒトおよびチンパンジーのオルソログとは顕著に異なるが、保存された細胞内ループ（ＣＩＬ）ドメイン内に大部分があるいくつかの残基は保存されている。複数の配列のアラインメントも各配列をＩＦＩＴＭ１またはＩＦＩＴＭ２／３のいずれかに分類する助けとなるニワトリＩＦＩＴＭ遺伝子中のいくつかの重要な残基を明らかにしている。Ｔｙｒ２０は、すべての霊長類ＩＦＩＴＭ２配列または霊長類ＩＦＩＴＭ２３配列において保存されており、ニワトリＩＦＩＴＭ３にも存在するがいかなる他のＩＦＩＴＭ１オルソログにも存在しない。アラインメントは、他の種ではパルミトイル化されていることが示されていて膜の位置決めのために重要である膜内１（ＩＭ１）中の２個のシステイン（Ｃｙｓ７５−７６）を含め、他の機能的に重要な残基がニワトリＩＦＩＴＭ配列のいくつかにおいて保存されていることも明らかにしている。これまたＩＭ１内の、Ｐｈｅ７９は、ニワトリＩＦＩＴＭ３において保存されている。鍵となる残基の包括的な分析と並行しての、ヒトＩＦＩＴＭ遺伝子座とニワトリゲノム（ｖ４．０、ＮＣＢＩ）のこの領域との間での保存されたシンテニーの分析は、ニワトリＩＦＩＴＭ３（ｃｈＩＦＩＴＭ３）（以前は「ＮＣＢＩニワトリＩＦＩＴＭ１様」）およびニワトリＩＦＩＴＭ１（ｃｈＩＦＩＴＭ１）（以前は「ＮＣＢＩニワトリＩＦＩＴＭ３様」）としてのｃｈＩＦＩＴＭ遺伝子の決定をもたらした。新規ｃｈＩＦＩＴＭであるｃｈＩＦＩＴＭ２も同定した（図１）。
【０１４８】
（実施例３）
偽型ウイルスでのＩＦＩＴＭ発現細胞株の感染
【０１４９】
過剰発現されたｃｈＩＦＩＴＭ３のレベルとリッサウイルスエンベロープＬＢＶで偽型分類されたレンチウイルスベクターに感染した細胞の百分率との間に負の相関があった（図６）。
【０１５０】
ニワトリＩＦＩＴＭの抗ウイルス制限レベルをＡ５４９細胞においてそれらのオルソロガスヒトタンパク質と比較した。ｃｈＩＦＩＴＭ３の過剰発現は、リッサウイルスエンベロープ、ＲＡＢＶ、ＬＢＶおよびＭＯＫＶで偽型分類されたさまざまなレンチウイルスベクターへのＡ５４９細胞の感染において９４〜９８．５％低下を生じた。ニワトリはリッサウイルスにめったに感染しないにもかかわらず、これは、同じウイルスへのｈｕＩＦＩＴＭ３による制限レベルと非常に類似していた（図２）。ＣｈＩＦＩＴＭ２もリッサウイルスＬＢＶおよびＲＡＢＶ感染を７０％制限するが、しかしそれはＭＯＫＶリッサウイルスを最小限だけ制限する（２０％）。制限の同様のパターンがＩＡＶ  Ｈ１、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ７およびＨ１０で偽型分類されたレンチウイルスについて見られる。ＨｕＩＦＩＴＭ３およびｃｈＩＦＩＴＭ３は、すべてのインフルエンザヘマグルチニンのウイルス感染を非常に効果的に制限、感染を９０％超低下させる。ＣｈＩＦＩＴＭ２およびｈｕＩＦＩＴＭ２は、さらにおだやかに制限するが、ＭＯＫＶリッサウイルスエンベロープに対して限定された活性を有するｃｈＩＦＩＴＭ２は、インフルエンザＨ４をｃｈＩＦＩＴＭ３と同様のレベルまで制限した。同様にｈｕＩＦＩＴＭ２は、インフルエンザＨ５に対するよりもＨ１およびＨ４のより大きな制限を示した。全体として、ｃｈＩＦＩＴＭ３およびｈｕＩＦＩＴＭ３は４２％アミノ酸同一性を共有するだけだが、ｃｈＩＦＩＴＭ３のウイルス制限レベルは、９０％配列同一性を共有するがウイルス制限の異なるパターンを示すｈｕＩＦＩＴＭ３およびｈｕＩＦＩＴＭ２とは対照的に、ｈｕＩＦＩＴＭ３に相当する。
【０１５１】
（実施例４）
ＩＦＩＴＭタンパク質の細胞内局在
【０１５２】
形質導入されたＡ５４９におけるＩＦＩＴＭタンパク質の細胞内局在をＦＩＴＣに直接コンジュゲートした抗ＨＡ抗体を使用して蛍光顕微鏡法によって確立した。ニワトリＩＦＩＴＭ３およびｈｕＩＦＩＴＭ３は核周囲に局在している一方でｃｈＩＦＩＴＭ１およびｈｕＩＦＩＴＭ１は細胞質全体に局在している（図３）。
【０１５３】
（実施例５）
ＤＦ−１ニワトリ細胞における構成的ＩＦＩＴＭ発現ノックダウン
【０１５４】
定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定したＤＦ−１細胞におけるｃｈＩＦＩＴＭ３の基礎レベルは、比較的高いが、ＩＦＮ−γの添加は中程度の誘導を生じた（図４Ａ）。ＩＦＮ−γ処理細胞中のｃｈＩＦＩＴＭ３を標的化するｓｉＲＮＡでの前処理は、発現における１．４７ｌｏｇ倍の降下を生じた。このｌｏｇ倍の低下は、相対発現での６２．９％ノックダウンと等価である（図４Ｂ）。
【０１５５】
天然ニワトリ細胞でのｃｈＩＦＩＴＭ３の機能をさらに調査するために、インフルエンザ感染の際のその発現を調査した。インフルエンザ（Ａ／ＷＳＮ／１９３３）に感染したＤＦ−１細胞の百分率は、ｓｉＲＮＡ処置を行わないときの１４．０％からｃｈＩＦＩＴＭ３を標的化するｓｉＲＮＡで予備処理したときの３１．５％感染へと増加した（図４Ｃ）。
【０１５６】
本発明者らは、ＤＦ−１細胞におけるｃｈＩＦＩＴＭ３の発現の構成的レベルを、ｃｈＩＦＩＴＭ３についてのプライマーで定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価した。ＤＦ−１細胞は、ｃｈＩＦＩＴＭ３を大量に発現する（ＩＦＩＴＭ３について２０およびＧＡＰＤＨについて２２のサイクル閾値［ＣＴ］）。ＩＦＮ誘導性であるにもかかわらず、ＩＦＮ−γの添加は中程度の誘導しか生じず、一方ＩＦＮ−αの添加はｃｈＩＦＩＴＭ３発現において２．６７−ｌｏｇ２（６．４倍）の増加をもたらした（図７Ａ）。
【０１５７】
ＤＦ−１細胞におけるｃｈＩＦＩＴＭ３発現を、ｃｈＩＦＩＴＭ３転写物に対して設計されたｓｉＲＮＡを使用してノックダウンした。このｓｉＲＮＡでの未刺激ＤＦ−１細胞への処理は、転写物レベルでの１．２３−ｌｏｇ２（２．４倍）低下を生じ、非特異的ｓｉＲＮＡではｃｈＩＦＩＴＭ３転写物の存在量は変化しなかった。内在性ｃｈＩＦＩＴＭ３のノックダウンは、ＮＰ発現のフローサイトメトリー分析によってアッセイしたところ、複製能力のあるインフルエンザＡウイルス（Ａ／ＷＳＮ／１９３３）によるＤＦ−１細胞の感染において２倍を超える増加を生じた（図５Ｂ）。さらにＤＦ−１細胞におけるｃｈＩＦＩＴＭ３の過剰発現は、ウイルス複製を平均５５％低下させ（図７Ｄ）、プラークアッセイは、ｃｈＩＦＩＴＭ３過剰発現後にウイルス量が１．３×１０６ＰＦＵ  ｍｌ−１から３．１×１０５ＰＦＵ  ｍｌ−１へと低下したことを示している（図７Ｅ）。まとめると、これらの結果は、ｃｈＩＦＩＴＭ３がＤＦ−１細胞へのＩＡＶ侵入を制限できることを示している。
【０１５８】
（実施例６）
ＲＮＡ組織パネルにおけるｃｈＩＦＩＴＭ発現
【０１５９】
ｃｈＩＦＩＴＭ１、ｃｈＩＦＩＴＭ２またはｃｈＩＦＩＴＭ３に特異的なプライマーを使用し、さまざまな組織型においてＲＴ−ＰＣＲを使用してｍＲＮＡ転写物を増幅した。ＩＦＩＴＭ２およびＩＦＩＴＭ３の発現は、検査したすべての細胞株において構成的に発現されていた（図５）が、しかしＩＦＩＴＭ１の発現は、嚢（Ｂ細胞発達のために必要な器官）、胃腸管、盲腸扁桃および気管に限定されていた。
【０１６０】
材料および方法
【０１６１】
プラスミド。すべてのＩＦＩＴＭ遺伝子をｐＳＩＮ−ＢＮＨＡのＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ部位にクローン化し、配列をキャピラリー配列決定（ＧＡＴＣ  ｂｉｏｔｅｃｈ）によって確認した。
【０１６２】
細胞培養条件。Ａ５４９細胞はＦ−１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増殖させ、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＤＦ−１細胞はＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増殖させた。すべての培地には１０％ｖ／ｖ  ＦＢＳ（Ｂｉｏｓｅｒａ）を補充した。
【０１６３】
ＩＦＩＴＭ発現細胞株の生成。ニワトリおよびヒトのＩＦＩＴＭ遺伝子配列をＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から注文し、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化した。遺伝子カセットをレンチウイルスプラスミドであるｐＳＩＮ−ＢＮＨＡに挿入し、これにより、ＩＦＩＴＭタンパク質の後にＣ末端ＨＡタグがあることを確実にした。レンチウイルスは、ＨＥＫ２９３−Ｔ細胞の３個のプラスミドのトランスフェクションによって作り、コンフルエンスまで１０ｃｍディッシュで増殖させた。ＯｐｔｉＭＥＭ（２００μｌ、Ｇｉｂｃｏ）をＦｕｇｅｎｅ−６（Ｒｏｃｈｅ）１０μｌと混合した。トランスフェクション用のＤＮＡを、ｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクター（ｐ８．９１）１μｇ、ＶＳＶ−Ｇ発現ベクター（ｐＭＤＧ）１μｇおよび導入遺伝子発現ベクター（ｐＳＩＮ−ＢＮＨＡ）１．５μｇを含有するＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）最終容量１５μｌ中に作った。ＤＮＡをＯｐｔｉＭＥＭ溶液に加え、１５分間（分）インキュベートした。細胞から一度培地を除去し、１０％  ＦＢＳのＤＭＥＭ  ８ｍｌに置き換え、ＤＮＡ混合物を細胞に滴下した。３７℃、５％  ＣＯ２での２４時間（ｈ）後、培地を除去し、１０％  ＦＢＳのＤＭＥＭ  ８ｍｌで置き換え、さらに２４時間インキュベートした。上清を回収し、０．４５μＭフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ）を使用してろ過することによって、トランスフェクションの４８時間後および７２時間後にパッケージングされたウイルスを収集した。アリコート（１ｍｌ）を−８０℃で凍結した。レンチウイルスを使用してヒトＡ５４９肺上皮細胞に形質導入し、混合集団を産生した。
【０１６４】
共焦点顕微鏡法。細胞をＩＦＩＴＭコードプラスミド（Ｆｕｇｅｎｅ［Ｐｒｏｍｅｇａ］  ３μｌを含む１μｇＤＮＡ）でのトランスフェクションの１日前に１２ウェルプレート中のカバースリップに１＿１０５個／ウェルで播種した。細胞を１００％メタノールで１０分間固定し、その後、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中で３０分間ブロックした。ＨＡエピトープをＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５０（ａｂ１１７５１３）にコンジュゲートした抗ＨＡ抗体によって標的化し、エンドソームを、ヒト特異性を有するＬａｍｐ１抗体（ａｂ２５６３０、Ａｂｃａｍ）またはニワトリ特異性を有するＬａｍｐ１抗体（ＬＥＰ１００  ＩｇＧ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ）によって可視化し、その後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８にコンジュゲートした二次抗体（ａｂ９６８７１、Ａｂｃａｍ）とのインキュベーションを行った。
【０１６５】
単一細胞クローニング。透明平底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルＡ１以外のすべてのウェルを培養培地１００μｌで満たした。細胞懸濁物（２×１０４細胞／ｍｌ）２００μｌをウェルＡ１に加え、その後、ウェルＨ１まで１：２系列希釈を行った。追加の１００μｌの培養培地をカラム１のすべてのウェルに加え、別の系列希釈をプレートの各列に沿ってカラム１２まで実行した。さらに１００μｌの培地を９６ウェルプレートのすべてのウェルに加えて各ウェルの最終容量を２００μｌにし、その後、プレートを３７℃で４〜５日間インキュベートした。ウェルの中に１クローンだけを含むウェルに印を付け、２４ウェルプレートに収集する前に増幅（expand）させ、コンフルエンスに達させた。細胞をフローサイトメトリー分析のために調製し、高レベルのＨＡ発現を有するクローンをＴ２５フラスコに移した。
【０１６６】
フローサイトメトリー分析。各ウェルからの培地を２ｍｌエッペンドルフチューブに回収した。０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）３００μｌを使用して細胞をプラスチックから外し、１０％  ＦＢＳの細胞培養培地３００μｌで中和し、上清と共にプールした。細胞を２０００ｇで５分間回転させ、ペレットを１００μｌ  ＰＢＳに再懸濁し、９６ウェルｖ底プレート（Ｎｕｎｃ）に移した。プレートを再び遠心分離し、細胞を、製造者の指針に従っＣｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏｐｅｒｍＴＭ緩衝液（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）１００μｌで固定および透過処理し、そして洗浄した。細胞を一次抗体（表Ｓ４）に再懸濁し、４℃で１時間インキュベートし、その後、２回洗浄した。続いて、一次抗体がコンジュゲートされた蛍光マーカーを有する場合を除き、細胞を、蛍光タンパク質にコンジュゲートした二次抗体に再懸濁し、暗所にて１時間インキュベートした。細胞を再度洗浄し、ＰＢＳ  ３００μｌに再懸濁し、その後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  ＩＩ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析した。ＧＦＰを発現している細胞を４％  ｖ／ｖパラホルムアルデヒド（ＵＳＢ）で２０分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、フローサイトメトリーによる分析の前にＰＢＳ  ３００μｌに再懸濁した。
【０１６７】
ＩＦＩＴＭ発現細胞株を偽型ウイルスで感染させる。ニワトリまたはヒトＩＦＩＴＭ発現Ａ５４９細胞株を、ＧＦＰ発現偽型リッサウイルス（ＲＡＢＶ攻撃ウイルス標準１１（ＣＶＳ−１１、ＥＵ３５２７６７）、ラゴスコウモリウイルス（ＬＢＶ．ＮＩＧ５６−ＲＶ１、ＨＭ６２３７７９）およびモコラウイルス（ＭＯＫＶ．９８／０７１  ＲＡ３６１、ＧＱ５００１０８）のいずれかまたはルシフェラーゼ発現偽型インフルエンザウイルス（ＨＡ１（ＡＦ１１７２４１）、ＨＡ４（Ｄ９０３０２）、ＨＡ５（ＥＦ５４１３９４）、Ｈ７（ＡＪ４９１７２０）およびＨ１０（ＣＹ０１４６７１））での感染の１日前に、９６ウェルプレートに３×１０３細胞／ウェルで播種した。レンチウイルス感染の尺度としてのＧＦＰ発現を、感染４８時間後に、４％  ｖ／ｖパラホルムアルデヒド（ＵＳＢ）で２０分間の固定の後に、蛍光顕微鏡法によって測定した。細胞をＰＢＳ／Ｈｏｅｃｈｓｔ溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２００ｎｇ／μｌ）１００μｌで洗浄し、プレートシールを付着させた。ＧＦＰを発現している細胞の割合を決定するために、細胞を製造者の説明書に従って分析した（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＶＴＩ，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）。レンチウイルス感染の尺度としてのルシフェラーゼ活性を、曝露４８時間後にＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）５０μｌを使用して決定した。細胞を２分間溶解させた後、ＦＬＵＯｓｔａｒ  ｏｍｅｇａ（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用してルシフェラーゼ活性のレベルを測定した。ＧＦＰおよびルシフェラーゼレベルをＩＦＩＴＭタンパク質過剰発現の不在下でのＡ５４９細胞の感染と比較して報告する。ＩＦＩＴＭタンパク質を発現している感染細胞の百分率を未形質導入Ａ５４９細胞での感染の割合として記録する（１００％に正規化）。
【０１６８】
セロミクス蛍光細胞分析。細胞を低密度（透明平底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の１ウェルあたり３×１０３）で播種し、ＧＦＰ発現ウイルスで感染させた。４８時間後、細胞をＰＢＳ  １００μｌで洗浄し、４％  ｖ／ｖパラホルムアルデヒド（ＵＳＢ）で２０分間固定した。細胞をＰＢＳ／Ｈｏｅｃｈｓｔ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２００ｎｇ／μｌ）１００μｌで洗浄し、プレートシールを付着させた。ＧＦＰを発現している細胞の割合を決定するために、製造者の説明書に従って細胞を分析した（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＶＴＩ，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）。
【０１６９】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ。細胞を白色平底９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ）に３×１０３／ウェルで播種し、３７℃で２４時間置いた。インフルエンザウイルスのタンパク質コートおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現している偽型ウイルスの適切な容量を細胞に加え、３７℃で４８時間インキュベートした。細胞をインキュベーターから取り出し、室温に達してからＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）５０μｌを各ウェルに加えた。細胞を２分間溶解させた後、ルシフェラーゼ活性のレベルをＦＬＵＯｓｔａｒ  ｏｍｅｇａ（ＢＭＧ  ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して測定した。
【０１７０】
ｓｉＲＮＡノックダウン研究。ＤＦ−１細胞を２４ウェルプレートに５×１０４／ウェルで播種した。細胞をリポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に希釈したｃｈＩＦＩＴＭ３に対するｓｉＲＮＡ（ｇｃｇａａｇｔａｃｃｔｇａａｃａｔｃａｃｇ）または非特異的ｓｉＲＮＡ（ｕｕｃｕｃｃｇａａｃｇｕｇｕｃａｃｇｕｇｕ）に４８時間曝露した。細胞を、さらに２４時間にわたって２００ｎｇ／ｍｌのニワトリＩＦＮ−γ（Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ  ｂｉｏｔｅｃｈ  ＃ＲＰ０１１５ｃ）、または１時間にわたってＭＯＩ  ０．１のインフルエンザＡウイルス（Ａ／ＷＳＮ／１９３３（ＷＳＮ／３３））のいずれかの添加によって刺激した。ＲＮＡを製造者の説明書に従って抽出した（ＲＮＡｅａｓｙミニキット、Ｑｉａｇｅｎ）。ＲＴ−ＰＣＲ（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＲＴ−ＰＣＲキット、Ｑｉａｇｅｎ）を、ＡＢＩからのプローブおよびプライマー（ニワトリＧＡＤＰＨ、４４４８４８９およびニワトリ＿ＩＦＩＴＭ３３、カスタムアッセイ）を使用して実行した（表Ｓ１を参照されたい）。インフルエンザ感染を抗ＮＰ抗体（ａｂ２０９２１、ＡｂＣａｍ）を使用してフローサイトメトリー分析（上記を参照されたい）によって測定した。
【０１７１】
プラークアッセイ。アッセイする材料を血清不含有ＤＭＥＭに系列希釈し、１２ウェルプレートでＭＤＣＫ細胞を感染させるために使用した。１時間のインキュベーション後、接種材料を取り、細胞を０．２％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１．２５％  Ａｖｉｃｅｌ（ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ）および１μｇトリプシンｍｌ−１を含有するＤＭＥＭで覆った。２日後、覆いを除去し、細胞を４％ホルムアルデヒド食塩水ＰＢＳ溶液（formal  saline-PBS  solution）で２０分間固定した後、ＰＦＵの数を算出できるようにするために０．１％トルイジンブルー溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。
【０１７２】
さまざまなニワトリ組織におけるＩＦＩＴＭタンパク質の発現。組織を６から９週齢の特定病原体不在（ＳＰＦ）Ｒｈｏｄｅ  Ｉｓｌａｎｄ  ｒｅｄ（ＲＩＲ）ニワトリから採取した：具体的には胸腺、脾臓、ファブリキュウス嚢、ハーダー腺、盲腸扁桃、メッケル憩室、骨髄、脳、筋肉、心臓、肝臓、腎臓、肺および皮膚。ＲＮＡをＤＮａｓｅ処置し、逆転写を実行した（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。各組織からのｃＤＮＡを次のプライマーセット：ｃｈＩＦＩＴＭ１（Ｆ’−ＡＧＣＡＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＡＡＣＡＴＧＣ、Ｒ’−ＣＴＡＣＧＡＡＧＴＣＣＴＴＧＧＣＧＡＴＧＡ）、ｃｈＩＦＩＴＭ２（Ｆ’−ＡＧＧＴＧＡＧＣＡＴＣＣＣＧＣＴＧＣＡＣ、Ｒ’−ＡＣＣＧＣＣＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧＧ）およびｃｈＩＦＩＴＭ３（Ｆ’−ＧＧＡＧＴＣＣＣＡＣＣＧＴＡＴＧＡＡＣ、Ｒ’−ＧＧＣＧＴＣＴＣＣＡＣＣＧＴＣＡＣＣＡ）を使用するＰＣＲによって増幅した。ＧＡＰＤＨ（Ｆ’−ＡＣＴＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣＧＧ、Ｒ’−ＧＣＴＧＡＧＧＧＡＧＣＴＧＡＧＡＴＧＡ）を増幅するプライマーを、イントロンエクソン境界にまたがるように設計し（このことは、ｃＤＮＡおよびｇＤＮＡの増幅の検出、ならびにｃＤＮＡ増幅とｇＤＮＡ増幅との間の識別を可能にした）、ローディング対照として使用した。
【０１７３】
本明細書上記で言及されたすべての刊行物は、本明細書に参考として援用される。本発明の記載される方法およびシステムの種々の改変およびバリエーションは、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明は、具体的な好ましい実施形態に関連して記載されてきたが、本願発明がこのような具体的な実施形態に過度に限定されるべきでないことは、理解されるべきである。実際に、ウイルス学、分子生物学もしくは関連分野の当業者に明らかである本発明を実施するための記載される態様の種々の改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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