(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性ＥＣＭを作製する方法であって、
ａ）細胞が磁性ナノ粒子を摂取するように、前記細胞を前記磁性ナノ粒子を含む組成物と結合させることと、
ｂ）前記細胞が磁化されるのを可能にする期間、前記磁性ナノ粒子を有する前記細胞を磁場において培養することと、
ｃ）前記細胞を、ＥＣＭを有する３次元細胞培養に成長させることであり、前記磁性ナノ粒子が前記細胞から失われ、さらに、前記ＥＣＭによって保持されるまで成長させることと、
ｄ）細胞片を洗い流しながら前記ＥＣＭを保つ磁石を使用して、前記３次元細胞培養を脱細胞化して磁性ＥＣＭを作製することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記組成物が、
ｉ）負電荷を持つナノ粒子と、
ｉｉ）正電荷を持つナノ粒子と、
ｉｉｉ）支持分子と、
を含み、
前記負電荷を持つナノ粒子または前記正電荷を持つナノ粒子のうちのどちらかが磁性反応元素を包含し、さらに前記支持分子が前記負電荷を持つナノ粒子および前記正電荷を持つナノ粒子を密接な混合物内で保持する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ）前記支持分子がペプチド、多糖、核酸、ポリマー、ポリリジン、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ＢＳＡ、ヒアルロナン、グリコサミノグリカン、アニオン性非硫酸化グリコサミノグリカン、ゼラチン、核酸、細胞外マトリックスタンパク質混合物、抗体、またはこれらの混合体または派生物を含み、ｂ）前記負電荷を持つナノ粒子が金ナノ粒子であり、さらに、ｃ）前記正電荷を持つナノ粒子が酸化鉄ナノ粒子である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞によって前記磁性ＥＣＭを播種することと、前記播種されたＥＣＭを磁場で成長させることと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
線維芽細胞および／または上皮細胞および／または骨芽細胞、さらに幹細胞および／または前駆細胞によって前記磁性ＥＣＭを播種することと、前記播種されたＥＣＭを磁場でさらに成長させることと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が組織片の形である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が患者から摘出された組織片の形である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
患者から採取された幹細胞または前駆細胞によって前記ＥＣＭを播種することと、前記播種されたＥＣＭを磁場でさらに成長させることと、をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
患者に移植するための組織を作製する方法であって、
ａ）細胞と、前記細胞によって摂取される磁性ナノ粒子とを結合させることと、
ｂ）前記細胞が融合し浮上するように、前記細胞が磁化されるのを可能にする期間、前記細胞を磁場に曝露することと、
ｃ）前記細胞を、ＥＣＭを有する３次元細胞培養を形成するために成長させることであり、前記磁性ナノ粒子が前記細胞から失われ、さらに、前記ＥＣＭによって保持されるまで成長させることと、
ｄ）細胞片を洗い流しながら前記ＥＣＭを保つ磁石を使用して、前記３次元細胞培養を脱細胞化して磁性ＥＣＭを作製することと、
ｅ）前記磁性ＥＣＭを患者から採取された同種幹細胞または前駆細胞によって播種することと、
ｆ）前記播種されたＥＣＭを磁場で成長させることと、
を含む、方法。
【請求項１０】
前記磁性ナノ粒子が、
ｉ）負電荷を持つナノ粒子と、
ｉｉ）正電荷を持つナノ粒子と、
ｉｉｉ）支持分子と、
をさらに含み、
前記負電荷を持つナノ粒子または前記正電荷を持つナノ粒子のうちのどちらかが磁性反応元素を包含し、さらに前記支持分子が前記負電荷を持つナノ粒子および前記正電荷を持つナノ粒子を密接な混合物内で保持する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記磁性ナノ粒子が、吹き付け、注入、エレクトロポレーション、磁気圧力、ヒドロゲル、またはカチオン性リポソームによって提供される、請求項１又は請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
磁性ＥＣＭの作製方法であって、
ａ）磁性ナノ粒子を細胞内に設置することと、
ｂ）前記細胞が磁化されるのを可能にする期間、前記磁性ナノ粒子を有する前記細胞を磁場において培養し、さらに、前記磁場で前記細胞を、ＥＣＭを有する３次元細胞培養に成長させることであり、前記磁性ナノ粒子が前記細胞から失われ、さらに、前記ＥＣＭによって保持されるまで成長させることと、
ｃ）細胞片を洗い流しながら前記ＥＣＭを保つ磁石を使用して、前記３次元細胞培養を脱細胞化して磁性ＥＣＭを作製することと、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁性細胞外マトリックスの材料、作製方法、および使用方法に関する。
【０００２】
先行関連出願
本出願は、２０１２年６月１４日出願の米国特許第６１／６５９，９７０号に対する優先権を主張し、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
なし
【背景技術】
【０００４】
細胞外マトリックス、または「ＥＣＭ」は、動物組織の細胞外部分である。その多様な特質および組成物から、ＥＣＭは多くの機能を果たしうる。機能は、支持の提供、組織の相互分離、細胞間通信および細胞の動的挙動の制御を含む。さらに複雑なことに、ＥＣＭの構造および組成物は、常在細胞集団の進行中の代謝活動、細胞の機械的要求、現在の微小環境の生態的地位状況に対応して常に変化している。ＥＣＭと常在細胞集団との間の「動的相互依存」は、合成物質よりもＥＣＭ骨格物質を利用することの主要な利点であり、３次元骨格の作製時に、天然組成物およびその超微細構造の両方を可能な限り維持することの重要性を強調する。
【０００５】
ＥＣＭの成分は常在細胞によって細胞内に形成され、エクソサイトーシスまたは細胞死を通してＥＣＭ内に分泌（および／または蓄積）される。一旦分泌されると、それらはその後既存のマトリックスと統合する。ＥＣＭは、後述するグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）および線維性タンパク質の連結メッシュのから構成される。
【０００６】
ＧＡＧは炭水化物ポリマーであり、通常細胞外マトリックスタンパク質に連結してプロテオグリカンを形成する（ヒアルロン酸は明らかな例外、下記参照）。プロテオグリカンは、浸透作用によって水分子を引き付ける正電気を帯びたナトリウムイオン（Ｎａ＋）を引き付ける正味の負電荷を有し、ＥＣＭおよび常在細胞の水和を維持する。プロテオグリカンもまた、ＥＣＭ内部に成長因子を捕捉し格納するのに役立つことがある。
【０００７】
細胞外マトリックス内部に異なる種類のプロテオグリカンが発見されている。ヘパラン硫酸（ＨＳ）はあらゆる動物組織に見られる線状多糖類である。これは、２つまたは３つのＨＳチェーンが細胞表面または細胞外マトリックスタンパク質にごく接近して付着したプロテオグリカン（ＰＧ）として発生する。この構造によって、ＨＳは様々なタンパク質リガンドに結合し、育成過程、血管形成、血液凝固、腫瘍転移を含む幅広い生物活動を制御するのである。
【０００８】
細胞外マトリックス、特に基底膜において、多ドメイン・タンパク質パールカン、つまりアグリンおよびＸＶＩＩＩ型コラーゲンは、ヘパラン硫酸が付着する主要なタンパク質である。
【０００９】
コンドロイチン硫酸は、軟骨、腱、靭帯および大動脈壁の抗張力に貢献する。それらは、神経可塑性に影響を与えることでも知られている。
【００１０】
ケラタン硫酸は、様々な硫酸含有量を有し、他の多くのＧＡＧとは異なり、ウロン酸を包まない。これらは、角膜、軟骨、骨および動物の角に存在する。
【００１１】
ヒアルロン酸（または「ヒアルロナン」）は、Ｄ‐グルクロン酸およびＮ‐アセチルグルコサミンの代替残基で構成される多糖であり、他のＧＡＧとは異なり、それはプロテオグリカンとして見られることはない。細胞外空間内のヒアルロン酸は、大量の水を吸収することで反膨圧（膨張）力を提供することによって、組織に、圧縮に抵抗する能力を付与する。したがって、ヒアルロン酸は耐荷重性性関節のＥＣＭ内に豊富に見られる  。それは、間隙ゲルの最重要成分でもある。ヒアルロン酸は、細胞膜の内表面に見られ、生合成中に細胞外に移行される。それは、胚発生、治癒過程、炎症および腫瘍成長中の細胞行動を制御する環境信号として機能し、特定の膜貫通受容体、ＣＤ４４と相互に作用する。
【００１２】
コラーゲンは、ほぼ全ての動物のＥＣＭにもっとも豊富に含まれているタンパク質である。実際、コラーゲンは、人体中に最も豊富に含まれるタンパク質であり、骨マトリックスタンパク質含有量の９０％を占める。コラーゲンは、ＥＣＭ内に繊維性タンパク質として存在し、常在細胞に構造的支持を与える。コラーゲンは、前駆体の形（プロコラーゲン）でエクソサイトーシス化され、これがその後、細胞外集合を許すように、プロコラーゲンプロテアーゼによって開裂される。
【００１３】
コラーゲンは、形成される構造の型に応じていくつかの族に分けることができる。
・  繊維性（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＸＩ型）
・  断続性三重らせんを有する線維付随性（ＩＸ、ＸＩＩ、ＸＩＶ型）
・  短鎖（ＶＩＩＩ、Ｘ型）
・  基底膜（ＩＶ型）
・  他（ＶＩ、ＶＩＩ、ＸＩＩＩ型）
【００１４】
エラスチンは、コラーゲンとは対照的に、組織に弾性を与え、それが必要時に伸縮することおよび元の状態に戻ることを許す。これは血管、肺、皮膚、および項靭帯において有益であり、これらの組織は大量のエラスチンを包む。エラスチンは、線維芽細胞および平滑筋細胞によって合成される。これらは極めて不溶性で、トロポエラスチンはシャペロン分子内で分泌されており、これが成熟エラスチン繊維と接触することで、前駆体分子を放出する。その後、トロポエラスチンはアミノ基を取り去り、エラスチンの鎖に組み込む。
【００１５】
フィブロネクチンは、細胞をＥＣＭ内のコラーゲン繊維と結合する糖タンパク質であり、これは、細胞がＥＣＭ内を移動することを許す。フィブロネクチンは、コラーゲンと細胞表面のインテグリンを結合させ、これが細胞の細胞骨格の再構成を引き起こし、細胞運動を促進する。フィブロネクチンは、開いた、非活性型の細胞によって分泌される。インテグリンとの結合は、フィブロネクチン分子を開き、それらが適切に機能するために、それらが二量体を形成することを許す。フィブロネクチンは、血液凝固中に血小板と結合し、創傷治癒中に患部への細胞運動を促進することによって、組織損傷の部位でも役立つ。
【００１６】
ラミニンは、実質的に全ての動物の基底層に見られるタンパク質である。コラーゲンのような繊維を形成よりもむしろ、ラミニンは、基底膜内の張力に抵抗するクモの巣のような構造の網状組織を形成する。それらは、細胞接着においても役立つ。ラミニンは、他のコラーゲン、ナイドジェン、およびエンタクシンなどのＥＣＭ成分を結合する。
【００１７】
多くの細胞が細胞外マトリックスの成分に結合する。細胞接着は、２つの方法で発生しうる；ＥＣＭを細胞のアクチン・フィラメントに結合する接着斑、およびＥＣＭをケラチンのような中間径フィラメントに結合するヘミデスモソーム、によってである。この細胞とＥＣＭの粘着は、インテグリンとして知られる特異的細胞表面細胞接着分子（ＣＡＭ）によって制御される。インテグリンは、フィブロネクチンおよびラミニンのようなＥＣＭ構造、および他細胞の表面上のインテグリンタンパク質に、細胞を結合する細胞表面タンパク質である。
【００１８】
フィブロネクチンは、ＥＣＭ高分子と結合し、それらの膜貫通インテグリンとの結合を促進する。フィブロネクチンの細胞外領域との連結は、アクチンのような一連のアダプター分子による細胞骨格とのつながりはもちろん、細胞内シグナル伝達経路も引き起こす。
【００１９】
多量の組織型に見られる、多様な型の細胞外マトリックスの育成に貢献する多くの細胞型が存在する。しかしながら、線維芽細胞が結合組織ＥＣＭの中で最も一般的な細胞型であり、ＥＣＭの中でそれらは、構造的枠組みを合成、維持、および提供する。線維芽細胞は、基質を含むＥＣＭの前駆体成分もまた分泌する。他の細胞型は、特に軟骨細胞および骨芽細胞はもちろん、幹細胞も含む。軟骨細胞は軟骨に見られ、軟骨性マトリックスを生成する。骨芽細胞は、骨の形成に関与する。
【００２０】
ＥＣＭは、組織成長および再生を提供するための骨格として使用が可能なため、非常に強い医学的および科学的関心を集めている。天然ＥＣＭは臓器発生、修復および生理的再生を誘導するため、合成骨格および再生医療への取り組みの基盤に対して有望な代替手段を提供する。
【００２１】
この数年間、研究は成熟組織内の幹細胞の分化制御におけるＥＣＭの重要性を裏付けてきた。幹細胞に対するＥＣＭの影響に関与する多くの要因が、マトリックス構造、組成物、弾性、および統合性を含むその特性に関連する。これらのＥＣＭの特性はしばしば組織型に特有であるため、治療への応用のため幹細胞から分化した細胞を育成させる目的で、特定のＥＣＭ型を発生させる能力は、幹細胞環境の制御にとって非常に有益であるかもしれない（Ｒｅｉｌｌｙ，  ２０１０）。
【００２２】
幹細胞生物学における近年のパラダイム変化の１つは、マトリックス構造、弾性、および組成物などの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の固有特性に露出された時に、幹細胞は成熟組織細胞に分化を開始することができる、という発見であった。これらのパラメターは、細胞がそのマトリックスに及ぼすことのできる力を調節することで知られている。機械感受性の経路はその後、これらの生物物理学キューを、細胞を特定の系統に委ねる生化学信号に変換する。よく研究された成長因子と同様に、ＥＣＭパラメターは非常に動的で、育成中に空間的、時間的に制御され、これはそれらが細胞の分化および配列の誘導において形態形成の役割を果たすということを示す。体内で自然に発生するような方法で幹細胞の生態的地位を動的に制御する我々の能力は、治療への応用のために肝細胞から分化細胞を育成させることに対する重大な必須要件となり得る。
【００２３】
ＥＣＭは、適切な組織を採取し、それを化学的および／または酵素的細胞溶解手段、および／または組織上または組織中への強制流動などの、細胞を剥ぎ取る物理的手段で脱細胞化することによって、作製されてきた。しかしながら、これらの方法は非常に多くの時間を必要とするが、産出量が少なく、通常患者はそのような細胞を提供することができず、死体または動物組織に供給源を求めることとなる。そのため、既存の方法論は理想的ではない。
【００２４】
ＥＣＭを作製するもう１つの方法は、それを培養で形成された細胞から作製することである。単分子層で形成された細胞は、ＥＣＭを作製するのに用いられてきたが、その技術は困難で非常に生産量が少ない。さらに、２Ｄ培養は天然ＥＣＭの組織および構造を完全および正確には反映しないため、先と同様にこれらの方法も決して理想的なものとはならない。
【００２５】
これらの取り組みのいくつかは有望ではあるものの、従来技術の不都合な点のいくつかを回避し、天然ＥＣＭに可能な限り近い高生産量を提供するＥＣＭの作製および使用の方法の改善への余地は依然として存在する。
【発明の概要】
【００２６】
本明細書において、我々は疾病治療に治療的に使用することが可能な新しい生体模倣の３次元骨格を提示する。本発明は、Ｎａｎｏ３Ｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（商標）  Ｉｎｃによって開発された３次元培養法を活用し、磁性ＥＣＭの作製が可能な３次元培養を育成させるためにそれらの方法を用いる。
【００２７】
Ｎａｎｏ３Ｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）による特許出願国際公開第２０１００３６９５７号において、磁場に反応する磁性反応ナノ粒子を有するバクテリオファージを含む「ヒドロゲル」に細胞を接触させることによって、細胞は磁場に浮上する。特に、ｆｄ、ｆｌまたはＭ１３バクテリオファージのような線状ファージが用いられる。この方法がどのように機能するかは完全には明らかではないが、細胞を被膜し、何らかの方法で磁性反応ナノ粒子の細胞への摂取または吸収の助けとなるゲルのような構造または配列を、ファージが提供すると理論化されている。したがって、ヒドロゲルが洗い流された場合でも、細胞は磁場に反応する状態のままとなり、適切な磁場において浮上することができる。
【００２８】
ヒドロゲルはほぼ洗い流されるものの、ファージの感染性または遺伝物質の移動の可能性は残るため、ファージを使用せずに細胞摂取または吸着を許す物質を提供することが求められた。したがって、同じくＮａｎｏ３Ｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）による国際公開第２０１１０３８３７０号は、細胞の磁化を可能にするバクテリオファージの一切の使用を回避する第２世代ナノ粒子集合を記述する。さらに、前述のナノ粒子集合の多様性が、ＮＡＮＯＳＨＵＴＴＬＥ（商標）という商標でＮａｎｏ３Ｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）（ヒューストン、テキサス）から現在市販されている。この新しい磁性物質は、有害なまたは感染性の化学物質を使用せずに細胞を磁化する優れた方法を提供し、この物質が洗い流された際も細胞は磁性を保つ。
【００２９】
ＮＡＮＯＳＨＵＴＴＬＥ（商標）技術が磁性ＥＣＭの作製に使用可能であり、磁性浮上がＥＣＭの脱細胞化および処理に役立つ手段として使用可能である、ということが発見された。この新規発見は、本明細書に記載された様々な発明の基礎である。
【００３０】
一般的に言えば、この方法は磁性ナノ粒子を用いた３次元培養において細胞を成長させることを含む。磁性ナノ粒子は、細胞によって摂取されるが、ＥＣＭが磁性浮上する、および／または多細胞構造から分離されるように、最終的にはＥＣＭ内に行き着く。したがって、ＥＣＭは既知の方法論のいずれかを用いることで、ＥＣＭを用い得るあらゆる用途に使用可能な、細胞のない磁性ＥＣＭを形成するために、磁気によって適所に保たれ、３次元培養が脱細胞化されることができる。
【００３１】
一般的な工程は、以下を含む。
【００３２】
１．      
細胞が磁性ナノ粒子を摂取するような、細胞、細胞の混合物、または組織片のＮＡＮＯＳＨＵＴＴＬＥ（商標）、またはその他の磁性ナノ粒子溶液による処理。
【００３３】
２．      
細胞が３次元多細胞構造形成から生じるＥＣＭを発生させるのを可能にするため、３次元細胞培養が行われる。好ましくは、細胞または細胞の混合物の磁性浮上は、３次元多細胞構造を急速に発生させるその能力、および望ましい大きさに達するまで成長させられるそのような３次元培養によって、行われる。細胞が磁性ナノ粒子を摂取する限り、回転反応器、骨格、懸滴、非粘着性表面、丸底フラスコ、または３次元細胞培養生物反応器などの他の３次元培養方法が、この工程で使用されてもよい。
【００３４】
３．      
３次元培養の科学的、酵素的、および／または物理的方法を用いた脱細胞化。
【００３５】
４．      
磁性ＥＣＭの破片からの磁性分離による、新規脱細胞化された磁性ＥＣＭの回復、またはその他の回復方法。
【００３６】
５．      
磁性によって保持されるＥＣＭの洗浄、またはその他の洗浄方法による、界面活性剤または他の化学物質の除去。
【００３７】
６．      
工程１−５は、磁性ナノ粒子ＥＣＭ上のＥＣＭ量の強化または増加が望ましいまたは必要な場合には、必要な限り何度繰り返されてもよい。これは、工程５から生じる磁性ＥＣＭ生産物による工程１の新鮮細胞または組織の再処理によって達成される。
【００３８】
７．      
ＥＣＭの再播種、および必要に応じたさらなる使用。
【００３９】
本発明は、全ての可能な組み合わせにおける、以下の実施形態のうちの１つ以上を含む。
【００４０】
―本明細書に記載されたいずれかの方法によって作られた、磁性ＥＣＭまたは播種磁性ＣＭ。
【００４１】
―磁性ＥＣＭの作成方法であって、前述の方法は、磁性ナノ粒子を細胞内に設置することと、前述の細胞を磁場に浮上させ、前述の磁場に浮上した前述の細胞を３次元細胞培養へと成長させることと、磁性ＥＣＭを生産するように、前述の３次元細胞培養を脱細胞化することと、を含む、磁性ＥＣＭの作製方法。
【００４２】
―磁性ＥＣＭの作製方法であって、前述の方法は、磁性反応ナノ粒子を含む組成物と、細胞が前述の磁性反応ナノ粒子を摂取するように、細胞を混合することと、前述の磁性細胞を磁場に浮上させることと、前述の磁場に浮上した前述の細胞を３次元細胞培養へと成長させることと、磁性ＥＣＭを生産するように、前述の３次元細胞培養を脱細胞化することと、を含む、磁性ＥＣＭの作製方法。
【００４３】
―磁性ＥＣＭの作製方法であって、前述の方法は、負電荷を持つナノ粒子、正電荷を持つナノ粒子、および支持分子を含む組成物と細胞を混合することであって、前述の負電荷を持つナノ粒子のうちの１つまたは正電荷を持つナノ粒子が磁性反要素を含有し、前述の支持分子が前述の負電荷を持つナノ粒子および前述の正電荷を持つナノ粒子を密接な混合物内で保持することと、磁場において前述の細胞を浮上させること、および前述の磁場に浮上した前述の細胞を３次元細胞培養へと成長させることと、磁性ＥＣＭを生産するように、前述の３次元細胞培養を脱細胞化することと、を含む、磁性ＥＣＭの作製方法。
【００４４】
―患者に移植するための組織の作製方法であって、前述の方法は、細胞を、前述の細胞によって摂取された磁性ナノ粒子と結合させることと、前述の細胞が融合および浮上するように前述の細胞を磁場に露出することと、前述の細胞を３次元細胞培養へと成長させることと、磁性ＥＣＭを生産するように、前述の３次元細胞培養を脱細胞化することと、前述の磁性ＥＣＭを前述の患者から採取された同種幹細胞または前駆細胞と共に播種することと、前述の播種されたＥＣＭを磁場で成長させることと、播種されたＥＣＭを前述の患者に移植することと、を含む、患者に移植するための組織の作製方法。好みによって、元の細胞は患者からものであってもよいが、ＥＣＭがほぼ完全に脱細胞化されたため、これは必須ではない。
【００４５】
他の実施形態は、前述の磁性ＥＣＭを播種し、前述の播種されたＥＣＭを磁場で成長させること、前述の磁性ＥＣＭを線維芽細胞、および幹細胞または前駆細胞によって播種し、前述の播種されたＥＣＭを磁場でさらに成長させること、前述の磁性ＥＣＭを上皮細胞、および幹細胞または前駆細胞によって播種し、前述の播種されたＥＣＭを磁場でさらに成長させること、前述の磁性ＥＣＭを骨芽細胞、および幹細胞または前駆細胞によって播種し、前述の播種されたＥＣＭを磁場でさらに成長させること、前述の磁性ＥＣＭを患者から採取された自己線維芽細胞、上皮細胞、および幹細胞または前駆細胞によって播種し前述の播種されたＥＣＭを磁場でさらに成長させること、または前述の磁性ＥＣＭを前述の患者から採取された幹細胞または前駆細胞によって播種し、前述の播種されたＥＣＭを磁場でさらに成長させること、およびこれらの変動および組み合わせを含む。
【００４６】
好適な実施形態においては、起源細胞および／または再播種細胞は適切な供給源のどこから採取されてもよく、例えば細胞株または同種異系細胞、またはそれらの組み合わせから採取される。幹細胞は、若い動物から作製されたＥＣＭを用いた方がより簡単に増幅されることが知らているるため、なるべくなら若い患者から採取された同種異系細胞が好ましい。細胞は、組織片の形、または患者から摘出された組織片の形で生じてもよい。
【００４７】
再細胞化に必要な細胞の型および数は、臓器およびＥＣＭの大きさおよび複雑さによって大きく異なり、組織片はオーグラン全体よりも簡素である。好ましくは、選択される細胞型は、例えば骨組織のためのオストブラストなどのように、対象の細胞において必要となるものである。臓器に特有な機能に関与する細胞型である実質細胞は、例えば肝臓における幹細胞、心臓における心筋細胞、肺における上皮組織などのように、明白な必要性がある。さらに、線維芽細胞および内皮細胞などの非実質細胞は、実質細胞の機能的表現型を強化し、組織の細胞構築の組織化に貢献する。内皮細胞は、脱細胞化された臓器マトリックスのための非血栓障壁を提供し、その場の血流が脈管性間隙に限定され、実質細胞がこの血流によって引き起こされるせん断応力から保護されることを確実にするために重要である。ＥＣＭを分泌し再構築する線維芽細胞は明らかに重要であり、それらは共培養において実質細胞の機能を向上させる。近年、線維芽細胞が、心筋細胞と結合し、長距離の電気刺激の伝搬に役立つことよって、心筋の電気特性にも関わっているということが示された。
【００４８】
臓器によっては、必須ではないにせよ、他の細胞型もまた、機能的な再細胞化のために重要である。今日まで、多数の細胞型を扱うことの複雑性の増大は、主に内皮細胞および線維芽細胞の使用に共培養研究を限定してきた。細胞の混合物の扱いは組み合わせの問題であり、組織工学膀胱の場合のように、最適な播種および培養プロトコルの発見のために偶然の発見または広範な試験が必要かもしれない。
【００４９】
細胞は、例えば発破、注射、エレクトロポレーション、形質導入、カチオン性リポソーム、ヒドロゲル、磁気圧力、および同類の方法によって細胞によって導入される、または別の方法で細胞内に導入されるどのような磁性ナノ粒子によって浮上させられてもよい。以下に記載されたような能動的摂取は最も細胞に動揺を与えない方法である可能性があるゆえに推奨されるものの、どのような導入方法も十分であることが予期される。
【００５０】
好適な実施形態においては、ａ）負電荷を持つナノ粒子、ｂ）正電荷を持つナノ粒子、そしてｃ）支持分子を含む組成物であって、前述の負電荷を持つナノ粒子のうち１つまたは、前述の正電荷を持つナノ粒子のうち１つが鉄または酸化鉄などの磁性反応物質を含み、さらに前述の支持分子が前述の負電荷を持つナノ粒子および前述の正電荷を持つナノ粒子を密接な混合物内で保持する、組成物、によって浮上させられる。
【００５１】
最も好ましくは、組成物は、機能することが知られ、Ｎａｎｏ３Ｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（ヒューストン、テキサス）から市販されている、ＮＡＮＯＳＨＵＴＴＬＥ（商標）である。
【００５２】
さらに、先行特許に記載されたように、様々な形状をした３次元培養が、磁場の形状を変更することによって作製されてもよい。例えば、環状またはドーナツ型の３次元培養を作製するために環状磁石が使用されてもよい。脱細胞化および再細胞化過程においてそのような形状を維持または変更するために、磁場が用いられてもよい。
【００５３】
ＥＣＭは、界面活性剤、非イオン洗剤、イオン洗剤、両性イオン洗剤による処理、アルカリ処理、酸処理、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼ、浸透圧、高張液、低張液、凍結融解、かん流、超音波処理、攪拌、および上記の組み合わせを含む従来技術、しかしこれに限らない技術のどれによって３次元培養から作製されてもよい。３次元培養は処理前に、分割もしくは薄く切断、さいの目状に切断、または粉砕されてもよく、または３次元培養は損傷なく脱細胞化されてもよい。
【００５４】
磁性ＥＣＭは、ＥＣＭが用いられるどの方法に使用されてもよいが、磁性浮上する３次元培養内で再播種および成長させられる際には特別の有用性を有する。例えば、ＥＣＭは患者から採取された幹細胞、およびこの有用性に適切な他の細胞型によって播種されてもよく、結果として生じる３次元培養は様々な細胞または組織治療に用いられてもよい。
【００５５】
さらに、磁性ＥＣＭは、ＥＣＭ成分および／または細胞型の分化の研究に使用されてもよく、そのためにＥＣＭ（または細胞）のどの成分も、例えば、抗体、ＧＦＰ、蛍光標識、および同類のものによって標識化されてもよい。
【００５６】
本明細書には以下の略語が使用されることがある。
【表１】
0006466323.tif 000002
【００５７】
本明細書の「培養」によって、我々は単一細胞型の培養または２つ以上の細胞型の共培養を含む。
【００５８】
本明細書で使用されたように、「磁性ＥＣＭ」は、前述の磁性ＥＣＭが磁場に浮上するように、脱細胞化され、それと共に密接に混合された十分な磁性ナノ粒子を含む、細胞外マトリックスである。
【００５９】
本明細書で使用されたように、「ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ（脱細胞化された）」は、細胞の少なくとも９５％、好ましくは９８％、９９％またはそれ以上が除去されることを意味する。
【００６０】
本明細書で使用されたように、「ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（正電荷を持つナノ粒子）」または「ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（正のナノ粒子）」は、２００ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍかそれ以下で、全体として正電荷を有するあらゆる粒子と定義される。好ましくは、この粒子は非毒性だが、粒子は細胞内には残らないため、これは必須ではない。
【００６１】
本明細書で使用されたように、「ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（負電荷を持つナノ粒子）」または「ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（負のナノ粒子）」は、２００ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍ、最も好ましくは約２−２５ｎｍで、全体として負電荷を有するあらゆる粒子と定義される。好ましくは、この粒子は非毒性だが、粒子は細胞内には残らないため、これは必須ではない。
【００６２】
本明細書で使用されたように、「ｍａｇｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ（磁性反応元素）」は、磁場に反応するどのような元素および分子であってもよい。以下に記載されたように、ナノ粒子の１つは磁性反応元素であるか、それを含まなくてはならない。
【００６３】
本明細書で使用されたように、「ｓｕｐｐｏｒｔ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ（支持分子）」は、敷物のような線維構造またはゲルを形成するために、ナノ粒子と相互作用し、したがって摂取のために磁性ナノ粒子を細胞にごく接近して保持する、あらゆる長分子に言及する。
【００６４】
本明細書の「ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ（幹細胞）」によって、明確な別段の指示がない限り、我々は全能細胞および多能性細胞を含む。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】単一細胞型を用いた脱細胞化過程の概略図である。
【図２】細胞型Ａが３次元培養を作製するために使用され、したがってＥＣＭ  Ａを発生し、これがその後細胞型Ｂを処理するのに使用される順序過程において、２つの異なる細胞型を用いた脱細胞化過程の概略図である。最終生産物は、さらにＥＣＭ  Ｂによって改変された磁性ＥＣＭ  Ａである。もちろん、初期３次元培養において細胞型Ａを共培養することによって、ＥＣＭ  ＡおよびＢ混合物が作製されてもよく、そのような方法が推奨されてもよい。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
一般的に言えば、本発明は磁性ＥＣＭ、およびその作製および使用方法である。細胞が磁性反応元素を摂取または吸収すること、したがって磁場が適用される際に細胞培養内で浮上させられること、を許す磁性物質が用いられる。
【００６７】
好適な実施形態においては、磁性物質は正電荷および負電荷を持つナノ粒子を含み、それらのうちの１つがナノサイズの酸化鉄などの磁性反応元素を１つ以上包含する。これらのナノ粒子は、ポリマー、好ましくは細胞ポリマー、または電荷を持つナノ粒子および細胞の支持（本明細書では「支持分子」と呼ばれる）として機能する他の長分子とさらに結合し、これによりナノ粒子が細胞による摂取または吸着のために適所に保持される。正電荷および負電荷を持つナノ粒子の両方の包含は、ナノ粒子が密接に混合されることを許し、さらに３つの成分の集合を推進し、したがって均等な分布および良好な摂取を確保する。支持分子は、３つの成分と、細胞が磁性反応元素を摂取することを許す敷物のような線維構造中の細胞と、を密接に結合させる。
【００６８】
培養期間の後、磁性物質は洗浄されてもよく、これは細胞が磁場で操作されることを許す。磁性ナノ粒子は、最終的に８日以内に細胞から消失するが、それらがＥＣＭによって保持されると我々は理解しており、これが磁性ＥＣＭの作製および使用を許す。損傷のない３次元細胞培養は、既知のどの方法によって脱細胞化されてもよく、またはＥＣＭの最終用途によっては分割された３次元培養片は脱細胞化されてもよい。磁性ＥＣＭはその後、自己幹細胞などの望ましい細胞によって播種、および非常に天然な３次元環境において培養されてもよい。
【００６９】
磁性反応元素は、磁場に反応するどのような元素または分子、例えば希土類磁石（例えばサマリウムコバルト（ＳｍＣｏ）およびネオジウム鉄ボロン（ＮｄＦｅＢ））、セラミック磁石物質（例えばストロンチウムフェライト）、磁性要素（例えば鉄、コバルト、およびニッケルおよびその合金および酸化物）でもよい。最も推奨されるのは、磁場には反応するが自身は磁石ではないパラ磁性物質であるが、これはそれらが物質のより容易な集合を許すためである。
【００７０】
好ましくは、そのような細胞または磁性ＥＣＭを浮上させるのに使用される磁場は、約３００Ｇ−１０００Ｇである。しかしながら、場の強度は、培養からの距離、およびＥＣＭによって摂取または吸収される磁性反応元素の量および型の両方によって異なる。したがって、最適な場の強度は変化するが、経験から容易に決定される。
【００７１】
負電荷を持つナノ粒子は、電荷を持つ安定化金属（例えば銀、銅、プラチナ、パラジウム）を含むが、好ましくは金ナノ粒子である。
【００７２】
正電荷を持つナノ粒子は、界面活性剤または安定化ポリマーまたは被覆合金および／または酸化物（例えば鉄元素、鉄−コバルト、酸化ニッケル）を含み、好ましくは酸化鉄ナノ粒子である。
【００７３】
２つのナノ粒子のうち１つは磁性反応を持たなくてはならないが、明らかにどちらか１つ（または両方）はこの特徴を有し得る。
【００７４】
ナノ粒子は、ナノスケールの大きさを有するべきであり、したがってそれらは約１００ｎｍである。しかしながら、大きさは約５〜２５０ｎｍ、５０〜２００ｎｍ、７５〜１５０ｎｍの間で変動してもよいが、大きさが使用する細胞型への進入または吸着を許すのに適当であるという唯一の条件の下、それらは小さくても大きくてもよい。我々は他の研究において、磁性ナノ粒子の効率的な大きさの上限があり、マイクロメーターサイズではいくつかの機能性は依然として観察されるものの、効率性の点では大きすぎるということを示した。
【００７５】
「支持分子」は、一般的には、ナノ粒子と細胞を共に密接な混合物内で保持する役割を果たす、ポリマーまたは他の長分子である。支持分子は、正電荷を持っても、負電荷を持っても、混合電荷を持っても、中性でもよく、さらに１つ以上の支持分子の組み合わせでもよい。
【００７６】
そのような支持分子の例は、ペプチド、多糖、核酸、およびその類似物などの中性ポリマーを含むが、合成ポリマーが使用されてもよい。特に推奨される支持分子は、ポリリジン、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ＢＳＡ、ヒアルロナン、グリコサミノグリカン、アニオン性非硫酸化グリコサミノグリカン、ゼラチン、核酸、細胞外マトリックスタンパク質混合物、マトリゲル、抗体、およびこれらの混合体または派生物を含む。
【００７７】
一般的に言うと、支持分子の濃度は負電荷および正電荷を持つナノ粒子の濃度よりも大幅に大きく、１０〜１０００倍、２０〜５００、または５０〜２００倍となる。しかしながら、使用される細胞型および使用される支持分子およびナノ粒子によっては、より大きいまたはより小さい量も可能である。ポリマーが長ければ長いほど、摂取のためにナノ粒子を適所に保持するための十分な構造を形成する必要性が減少する。
【００７８】
一般的に、ナノ粒子は非常に低濃度で使用される。濃度は１０−１２〜１０−６モルの間であってよいが、好ましくはナノモルの範囲であり、さらに支持分子（複数可）は１０−９〜１０−３モルで、好ましくはミクロモルの範囲である。
【００７９】
３つの成分は静電相互作用によって集合するため、ポリリジンのような、電荷を持つまたは混合電荷支持分子が望ましい。しかしながら、成分および／または細胞のさらなる相互作用を促進するために、３つの成分のどれが官能化、誘導体化または被覆化されてもよい。したがって、１つ以上の要素が、例えば細胞表面抗原に結合するような抗体によって官能化、誘導体化または被覆化されてもよい。このようにして、成分および／または細胞間の相互作用がさらに促進される。他の結合ペアは、受容体−リガンド、ビオチン−ストレプトアビジン、相補的核酸、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、分子を包含するシアル酸、およびこれらの類似物を含んだ。
【００８０】
被覆は、特にナノ粒子については、ＰＶＰ、デキストラン、ＢＳＡ、ＰＥＧ、およびその類似物などの保護被膜または保護膜をまた含んでもよい。ナノ粒子、特に磁性反応元素を含むナノ粒子は、特に磁化された細胞および組織の育成および生体外試験中に、例えば蛍光色素分子、放射性標識およびその類似物によって、可視化のために標識化されてもよい。しかしながら、治療上の使用には、そのような標識は削除することが望ましいだろう。
【００８１】
他の実施形態においては、組成物は磁性ＥＣＭを単独で、またはそれと共に共培養される他の細胞を含み、この細胞は幹細胞または前駆細胞、がん細胞、初代細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞（特に自己細胞）、新鮮組織、バクテリア、酵母、植物細胞から直接摘出された細胞、またはそれらの混合物を含むが、これに限らない。
【００８２】
ポリリジンのような支持分子は合成的に容易に作製され得るため、必要に応じて、磁性ナノ粒子集合はファージや細胞生産物などの生体分子から解放されてもよい。それにも関わらず、全ての成分は一般的に非毒性で、安価で、作製が容易である。さらに、敷物のような線維構造は、追加の細胞支持分子（細胞外マトリックス成分など）の合体がナノ粒子磁性集合に含まれることを許す。
【００８３】
磁性ナノ粒子集合による細胞の磁化は、集合を均一細胞培養培地内の細胞に追加することのみから成る。細胞は磁性ナノ粒子処理から数分（５分）以内に磁化され、さらに連結または浮遊細胞の一方が磁性ナノ粒子集合によって処理され得る。細胞は望ましい大きさに達するまで培養されてもよく、その後に３次元培養が磁性ＥＣＭを作製するために脱細胞化されてもよい。
【００８４】
３次元培養は、どのような細胞、細胞混合体または組織片によって開始されてもよい。細胞株、異種細胞または好ましくは自己細胞が用いられてもよい。結果として得られる３次元培養から作製される磁性ＥＣＭは、その後に望ましい細胞型、特に患者から採取された自己細胞によって、患者から得られた少数の細胞が増幅し、既存のＥＣＭマトリックス上で非常に天然な３次元細胞培養に成長するように、播種されてもよい。最終３次元培養は、その後に細胞および組織治療、およびおそらく将来的には臓器移植に用いられてもよい。
【００８５】
例えばＥＣＭは、心臓組織および／または様々な同種異系心臓細胞型、および本発明の方法で作製されたＥＣＭに由来する、様々な細胞株の３次元培養から作製されてもよい。ＥＣＭはその後、患者自らの線維芽細胞、内皮細胞、幹細胞、前駆細胞、成人由来の誘導多能性幹細胞およびその類似物によって播種され、心筋細胞、血管平滑筋、内皮細胞などへの分化を促進させるために適切な成長因子によって処理されてもよい。結果として得られる組織は損傷した心筋を修復するために移植および使用されてもよい。脱細胞化され様々な自己細胞によって播種されているにも関わらず、ＥＣＭはいくつかの幹細胞および前駆細胞を含むより容易に利用可能な細胞型から成長されるため、この方法は、容易に利用可能で天然なＥＣＭを提供できるという利点を有し、このＥＣＭがその後貴重な、しかし安全な、患者由来の細胞を成長させる骨格となるため、移植用途のための成長可能で安全な組織を再生することができる。
【００８６】
我々のテスト実験においては、０．５ｍｌのＮＡＮＯＳＨＵＴＴＬＥ（商標）が５ｍｌのヒト初代線維芽細胞および平滑筋細胞と結合した。この混合物はピペットによってゆっくりと混合され、５分間培養および沈殿させられた。その後細胞が３．５ｃｍのペトリ皿に移され、環状ネオジム磁石（２０×（８．５×４．５）×７ｍｍ、引っ張り強度１３ｌｂｓ）によって浮上させられた。磁場の適用から数分以内に全ての細胞が浮上させられ、３次元培養に合体した。
【００８７】
細胞はその後４日間、１０％のＦＢＳによってＤＭＥＭ培地内で４日間培養された。培養後、細胞は従来技術（下記星印付きの方法参照）によって脱細胞化されたが、デブリを洗い流す間、ＥＣＭを浮上および保持するのには磁石が用いられた。最終ＥＣＭはＤＡＰＩによって染色され、これがＥＣＭ欠乏ＤＮＡ（図示なし）を示し、コラーゲンおよびラミニン（図示なし）を陽染した。
【００８８】
本発明と共に使用が可能な、幅広い種類のＥＣＭ作製技術が以下に記載される。
【表２】
0006466323.tif 000003
【００８９】
ＥＣＭの再細胞化で現在使用されている播種技術は、ＥＣＭへの細胞の注射、かん流による低用量播種、およびかん流による多重ボーラス投与播種を含む。これは、細胞を単純に磁化されたＥＣＭと混合することによって達成されてもよい。従来技術によって脱細胞化され得る磁性ＥＣＭを最終的に作製する、細胞の磁化および３次元培養の成長、を示す図１を参照されたい。図１は３次元培養に使用される単一細胞型を示すが、ここにおいて混合細胞型が使用されてもよい。
【００９０】
図２に示されるように、この工程は、同型または異型の細胞をそれぞれ有する磁化された精製ＥＣＭを強化または改変するのに使用されてもよい。これは、図１のようにして作製された磁性ＥＣＭを細胞型Ｂによって再細胞化し、その後２つの細胞型から作製された混合ＥＣＭを発生させるためにこの工程を繰り返すことによって達成されるであろう。
【００９１】
細胞がより堅固で自然な方法で成長するのに役立つ点における、磁性ＥＣＭの有用性およびその価値を示すために、数多くの実験が行われた。１つは創傷治癒分析で、もう１つは骨育成が骨アルカリホスファターゼレベルによって示される、骨分化分析であった。
【００９２】
創傷治癒分析用の脱細胞化マトリックスを作製するため、ＨＰＦのＴ７５フラスコがＮａｎｏＳｈｕｔｔｌｅ（商標）（８μＬ／ｃｍ２表面積）によって培養のため一晩処理された。翌日、ＨＰＦはその基質から分離され、２ｍＬの培地（１０％のウシ胎児血清、ＦＢＳ、および１％のペニシリン／ストレプトマイシン、つまりＰ／Ｓ、を有するＤＭＥＭ）中２８０万ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で、６枚のウェルプレートに浮上させられ、さらに３次元において２日間培養された。
【００９３】
その後、培養はＰＢＳ中濃度が増加する（１％、２％、３％）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００によって徐々に脱細胞化され、さらに３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で一晩培養された。次に、ピペット動作によって機械的に分解され、９０Ｕ／ｍＬを有するベンゾナーゼによって３７℃で一晩培養される前に、培養は０．１％ＳＤＳおよび１％Ｐ／Ｓを有するＰＢＳによって洗浄され、その後単独のＰＢＳによって洗浄された。翌日、脱細胞化された培養はＰＢＳで２回洗浄され、全ＮａｎｏＳｈｕｔｔｌｅ量がフラスコに追加されるにつれて、同量のＰＢＳに再懸濁された。これが以下の分析に使用するためのＨＰＦ細胞由来磁性ＥＣＭ（ｍＥＣＭ−ＨＰＦ）を提供する。
【００９４】
次に、我々はＮＮＤＦの創傷治癒能力に対するｍＥＣＭ−ＨＰＦの効果を検討した。ＮＮＤＦのＴ７５フラスコが、ＮａｎｏＳｈｕｔｔｌｅ（商標）（８μＬ／ｃｍ２表面積）によって培養された。翌日、細胞は基質から分離され、計測された。９６個の環状磁石の配列が上部に置かれた単独の９６ウェルプレートにおいて、我々は２００，０００個の細胞中のＮａｎｏＳｈｕｔｔｌｅ（商標）量に応じて、０〜２：１の間の比率で多量のｍＥＣＭ−  ＨＰＦを追加した。ｍＥＣＭ−ＨＰＦは、ウェル底部で１５分間パターニングすることが許された。次に、２００，０００個の細胞が各ウェルに追加され、さらに１５分間パターニングされた。その後、磁場が除去され、環の面積が１４００分にわたって測定されてから、時間と濃度に対する表に表された。我々は、ｍＥＣＭ−ＨＰＦの濃度を増加に伴って、細胞の環はより速い速度で縫合が可能であるということを発見した（表１）。このようにして、ＨＰＦ細胞由来磁性ＥＣＭはＮＮＤＦの創傷治癒を改善した。
【表３】
0006466323.tif 000004
【００９５】
次に、我々は、ＨＰＦ細胞由来磁性ＥＣＭが、ＮＮＤＦを骨表現型に分化に役立つかどうかを検討した。ＮＮＤＦのＴ７５フラスコが、単独のＮａｎｏＳｈｕｔｔｌｅ（商標）、単独のｍＥＣＭ−ＨＰＦ、または１：１で混合されたＮａｎｏＳｈｕｔｔｌｅ（商標）：ｍＥＣＭ−ＨＰＦ（８μＬ／ｃｍ２表面積）によって一晩培養のために処理された。翌日、ＮＮＤＦはその基質から分離され、４００μＬの培地中２００，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で、２４ウェルプレートに浮上させられた。ＮＮＤＦは、ＤＭＥＭ培地による培養と、骨形成培地（１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、１０ｍＭ  β−グリセロールフォプシェイト、１００ｎＭ  デキサメタゾン、５０μｇ／ｍＬ  アスコルビン酸を有するＤＭＥＭ）による培養とにさらに分割された。
【００９６】
付随して、ＮａｎｏＳｈｕｔｔｌｅ（商標）処理されたＮＮＤＦ、および未処理のＮＮＤＦが、いずれかの培地型によって２次元で固定された。培養は、培地を２日おきに交換して、６日間培養された。６日後、３次元培養は、２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳ中で均質化され、その後４℃にて１０，０００ｇで１５分間遠心分離された。２次元培養は、同様に２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳ中で洗浄され、その後４℃にて２，５００ｇで１０分間遠心分離された。上清が収集され、骨アルカリホスファターゼ分析キット（ＳｅｎｓｏＬｙｔｅ（登録商標））を用いて分析された。
【００９７】
骨アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）は、アルカリホスファターゼの骨特異的イソ型であり、アルカリホスファターゼ活性の変化は、骨育成、骨関連疾患、妊娠関連疾患、および炎症性腸疾患などの様々な生理的および病理的事象に関与している。アルカリホスファターゼはまた、ＥＬＩＳＡ用の二次抗体と接合された代表的な酵素である。ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）は、アルカリホスファターゼのための効果的な発色基質であることが証明されている。
【００９８】
上清のサンプルは等分され、アルカリホスファターゼ基質、ｐＮＰＰが１：１の濃度で加えられた。溶液は混合され、その後吸光度４０５ｎｍにおけるサンプルの吸光度が、分光光度計上で読み取られた。
【００９９】
結果が表２に示され、脱細胞化マトリックスを用いない、または１：１比率のＮａｎｏＳｈｕｔｔｌｅ：ｍＥＣＭ−ＨＰＦおよび骨形成培地による、ｍＥＣＭ−ＨＰＦの３次元培養への追加が、それらの３次元培養に対するＢＡＰ活性を増加させるということをさらに確認する。したがって、ｍＥＣＭ−ＨＰＦの追加は、骨育成を増加させ、３Ｄ培養におけるＮＮＤＦｓの骨表現型への分化を改善した。
【表４】
0006466323.tif 000005
【０１００】
将来のテスト実験においては、我々はＮａｎｏＳｈｕｔｔｌｅ単独で培養された細胞に対する、磁性ＥＣＭの能力を特性化し、評価するであろう。我々はＮａｎｏＳｈｕｔｔｌｅで処理された細胞に対する、我々の磁性ＥＣＭ中で成長させた細胞の有効性を評価するであろう。この実験は、磁性ＥＣＭに対してＮａｎｏＳｈｕｔｔｌｅで処理された際の、浮上する細胞に対して浮上しない細胞の産出量を決定することを含むであろう。次に、我々は、処理され浮上させられた培養の上清に対して、単層培養およびＮａｎｏＳｈｕｔｔｌｅ単独で処理され浮上させられた細胞から構成される制御システムの、インフラマトリーサイトカインのレベル、ＩＬ−６およびＩＬ−８を評価するであろう。
【０１０１】
我々はまた、免疫組織ケミスティーおよび／またはウェスタンブロット法を用いてＥＣＭタンパク質を証明することによって、磁性ＥＣＭの組成物に対する浮上時間の影響を調査するであろう。我々は、単一細胞型、浮上と共培養が同時になされる１つ以上の細胞型、および１つの細胞型が磁性ＥＣＭ（磁性ＥＣＭ  Ａ）の最初の集団を発生させ、その後それが第２の細胞型（磁性ＥＣＭ  Ｂ）を処理するのに使用され、それがさらに最初の磁性ＥＣＭを改変するために浮上させられる、２つの細胞型、から発生した磁性ＥＣＭも特性化するであろう（図２）。
【０１０２】
最後に、我々は、ｎａｎｏｓｈｕｔｔｌｅ単独で２次元において処理／浮上させられた細胞に対して、磁性ＥＣＭが、前脂肪幹細胞（３Ｔ３線維芽細胞）の脂肪細胞への分化制御に対して何らかの効果を有するかどうかを評価するであろう。これは、浮上させられた細胞（磁性ＥＣＭおよびＮＡＮＯＳＨＵＴＴＬＥ（商標）により処理）と単分子層（磁性ＥＣＭおよびＮＡＮＯＳＨＵＴＴＬＥ（商標）により処置および非処理）の脂肪細胞への分化を誘導することによって達成されるであろう。我々は、我々の磁性ＥＣＭが、様々な組織型の作製のための幹細胞の成長および正確な分化ために、容易に入手可能で適した環境を提供することを期待する。
【０１０３】
以下の参照は、その内容全体をあらゆる目的のために参照によって本願明細書に引用される。
【０１０４】
Ｌｕ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ，  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．００Ａ：０００−０００  （２０１２）（論文プレビューがオンラインで入手可能）。
【０１０５】
Ｒｅｉｌｌｙ，Ｇ．Ｃ．  ＆  Ｅｎｇｌｅｒ，Ａ．Ｊ．，  Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，  Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ．  ４３（１）：５５−６２（２０１０）．
【０１０６】
ＷＯ２０１００３６９５７  ＆  ＷＯ２０１１０３８３７０
【０１０７】
ＷＯ２００６０６０１７１
【図１】
0006466323.tif 000006
【図２】
0006466323.tif 000007