(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）明視野光源と；
（ｉｉ）撮像システムと；
（ｉｉｉ）計数のための細胞懸濁液を直接的に受け取るように構成される、上側及び下側の試料面を有する試料載置システムと、を備える細胞カウンタであって、
前記試料載置システムは、
（Ａ）ベース上面、ベース底面、及び対物レンズ空洞部を有するベースであって、前記対物レンズ空洞部が、前記撮像システムの対物レンズと一列に並ぶように前記ベースに配置されて前記対物レンズを受け取るように設けられる、ベース；
（Ｂ）前記ベースに固定されるヒンジ；
（Ｃ）移動可能なアーム上面、移動可能なアーム底面、及び明視野光源空洞部を有し、前記ヒンジに固定される移動可能なアームであって、前記明視野光源空洞部が、前記移動可能なアームにおいて前記ヒンジから離れた部分に設けられ、前記明視野光源を受け取るように構成される、移動可能なアーム；
（Ｄ）前記移動可能なアームが閉位置にあるとき、前記明視野光源からの明視野光を受け取るように構成される位置において、前記ベース上面に設けられる前記下側の試料面；及び
（Ｅ）前記明視野光源からの明視野光を受け取るように構成される位置において、前記移動可能なアームの前記移動可能なアーム底面に設けられる前記上側の試料面、を有し、
前記移動可能なアームが閉位置にあるとき、前記下側の試料面と前記上側の試料面との間の距離は、前記上側及び下側の試料面の間に載置される可変の量の細胞懸濁液の試料を収容するように、調節可能であって、
前記システムは、前記移動可能なアームを開位置に移動させて前記試料面を清掃することによって再使用可能である、細胞カウンタ。
【請求項２】
蛍光励起源をさらに備え、
前記下側の試料面は、前記蛍光励起源からの蛍光を受け取るように構成され、及び／又は、前記上側の試料面は、前記移動可能なアームが閉位置にあるとき、前記蛍光励起源からの蛍光を受け取るように構成される、請求項１に記載の細胞カウンタ。
【請求項３】
前記試料載置システムは、前記下側の試料面と前記上側の試料面との間の距離の検出、及び／又は較正のためのキャリブレータを備える、請求項１又は２に記載の細胞カウンタ。
【請求項４】
前記キャリブレータは、前記ベース及び前記移動可能なアームのいずれか一方又は両方に配置される距離センサを備える、請求項３に記載の細胞カウンタ。
【請求項５】
前記試料載置システムは、前記ベース又は前記移動可能なアームの一方における高さ調節ピンと、前記ベース又は前記移動可能なアームの他方における高さ調節ピン受け部と、を備え、前記下側の試料面と前記上側の試料面との間の距離は、前記高さ調節ピンにより調節可能である、請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞カウンタ。
【請求項６】
前記高さ調節ピンは、アクチュエータに接続される、請求項５に記載の細胞カウンタ。
【請求項７】
前記高さ調節ピンは精密ねじであって、前記アクチュエータはモータである、請求項６に記載の細胞カウンタ。
【請求項８】
前記高さ調節ピンと前記高さ調節ピン受け部との間の接触を検出するための検出器を備える、請求項５から７のいずれか一項に記載の細胞カウンタ。
【請求項９】
前記検出器は、前記高さ調節ピンと前記高さ調節ピン受け部との間の接触によって形成される電気回路の完成を検出する、請求項８に記載の細胞カウンタ。
【請求項１０】
試料がない状態で、前記上側の試料面が前記下側の試料面と直接的に接触するとき、前記高さ調節ピン及び前記高さ調節ピン受け部との間の接触が行われる、請求項９に記載の細胞カウンタ。
【請求項１１】
（ａ）細胞カウンタを用意すること、
前記細胞カウンタは、
（ｉ）明視野光源と；
（ｉｉ）任意の蛍光励起源と；
（ｉｉｉ）撮像システムと；
（ｉｖ）試料載置システムと、を備え、
前記試料載置システムは、
（Ａ）ベース上面、ベース底面、及び対物レンズ空洞部を有するベースであって、前記対物レンズ空洞部が、前記撮像システムの対物レンズと一列に並ぶように前記ベースに配置されて前記対物レンズを受け取るように設けられる、ベース；
（Ｂ）前記ベースに固定されるヒンジ；
（Ｃ）移動可能なアーム上面、移動可能なアーム底面、及び明視野光源空洞部を有し、前記ヒンジに固定される移動可能なアームであって、前記明視野光源空洞部が、前記移動可能なアームにおいて前記ヒンジから離れた部分に設けられ、前記明視野光源を受け取るように構成される、移動可能なアーム；
（Ｄ）前記移動可能なアームが閉位置にあるとき、前記明視野光源からの明視野光を受け取るように構成される位置において、前記ベース上面に設けられる下側の試料面；及び
（Ｅ）前記明視野光源からの明視野光を受け取るように構成される位置において、前記移動可能なアームの前記移動可能なアーム底面に設けられる上側の試料面であって、前記移動可能なアームが閉位置にあるとき、前記下側の試料面と前記上側の試料面との間の距離は、前記上側及び下側の試料面の間に載置される可変の量の液体の試料を収容するように、調節可能である、上側の試料面、を有し；
（ｂ）前記下側の試料面上に既知量の細胞懸濁液の試料を載置すること；
（ｃ）ステップ（ｂ）の前、後、又は同時に、前記ベースに対する閉位置に前記移動可能なアームを移動させること；
（ｄ）前記明視野光源、存在するときは前記蛍光励起源、又はその組み合わせにより試料を照らすこと；及び
（ｅ）細胞計数データを作成するために前記撮像システムにより細胞を検出してカウントすること；
（ｆ）ステップ（ｂ），ステップ（ｃ），ステップ（ｄ），又はステップ（ｅ）の前、後、又は同時に、前記下側の試料面上に載置された試料の量を収容するように、前記下側の試料面と前記上側の試料面との間の距離を調節すること；及び
（ｇ）前記移動可能なアームを前記ベースに対する開位置に移動させて、前記上側及び下側の試料面から細胞懸濁液の試料を取り除くことによって、ステップ（ｂ）からステップ（ｆ）までを繰り返すために、前記細胞カウンタを用意すること、を含む、細胞をカウントする方法。
【請求項１２】
前記移動のステップは、自動化される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料載置システムは、前記ベース又は前記移動可能なアームの一方における高さ調節ピンと、前記ベース又は前記移動可能なアームの他方における高さ調節ピン受け部と、を備え、前記下側の試料面と前記上側の試料面との間の距離は、前記高さ調節ピンにより調節される、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記高さ調節ピンは、アクチュエータに接続される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記高さ調節ピンは精密ねじであって、前記アクチュエータはモータである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記調節のステップは、自動化される、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
（ｈ）前記細胞計数データに基づいて、前記下側の試料面の試料の量を調節するステップ；及び
（ｉ）ステップ（ｂ）からステップ（ｇ）までを繰り返すステップ、をさらに含む、請求項１１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
試料がない状態で、前記上側の試料面と前記下側の試料面とが直接的に接触するとき、前記移動可能なアーム上の点と前記ベース上の点との間の距離を測定することによってゼロギャップ測定を行うことを含む、請求項１１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞カウンタは、前記ベース又は前記移動可能なアームの一方における高さ調節ピンと、前記ベース又は前記移動可能なアームの他方における高さ調節ピン受け部と、を備え、前記方法は、（１）試料がない状態で、前記下側の試料面と直接的に接触して前記上側の試料面を配置すること、（２）前記高さ調節ピン受け部と接触して前記高さ調節ピンを移動させること、及び（３）試料がない状態で、前記上側の試料面が前記下側の試料面と直接的に接触するとき、前記高さ調節ピンと前記高さ調節ピン受け部との間の接触を検出すること、によってゼロギャップ測定を行うことを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記高さ調節ピンと前記高さ調節ピン受け部との間の接触は回路を完成させ、検出することは前記回路の完成の検出を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記高さ調節ピンと前記高さ調節ピン受け部との間の接触は、距離センサによって検出される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、明視野および蛍光画像のモードを含む細胞カウンタに関し、細胞カウンタは、使い捨てカートリッジに依存しない試料載置システムを利用する。
【背景技術】
【０００２】
多くの医学および生物の分野において、細胞計数は、実験室分析の重要な側面である。細胞は、例えば、スライド上若しくは計数チャンバー内において単純に数えることによって手動でカウントすることができ、または、例えば、フローサイトメトリー若しくは画像解析を用いて自動的にカウントすることができる。画像解析システムの柔軟性と典型的なフローサイトメーターと比較した相対的な低コストを考慮すると、この最新の領域である画像解析が近年使用されている。
【０００３】
画像解析システムは、試料中の生細胞及び／又は死細胞の静止画像を作成するために、透過光及び蛍光の両方を利用する。光学は、典型的には、ＣＣＤ（ｃｈａｒｇｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ）カメラ又はＣＭＯＳ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｒｙ  ｍｅｔａｌ−ｏｘｉｄｅ−ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）カメラである検出システムと光通信を行う対物レンズを大抵備える。そして、カメラによって作成された画像は、明視野画像又は蛍光画像を単独又は組み合わせて細胞をカウントするように設計されたソフトウェアによる分析のために、コンピュータに送信される。
【０００４】
米国特許第８，８８３，４９１号明細書及び第９，０４６，４８９号明細書は、細胞をカウントするために明視野光及び蛍光を組み合わせて利用する細胞カウンタを開示する。米国特許第８，８８３，４９１号明細書では、細胞計数システムは、一定の高さを有するチャンバー内に載置された試料中の細胞の集まりの画像を撮る。当該システムは、一定の高さを有する、カバーされたチャンバーを利用するため、細胞濃度は細胞計数で決定され得る。米国特許第９，０４６，４８９号明細書は、蛍光光源と、白色光又は単色光を発するように構成された光源と、励起フィルタと、励起フィルタを透過する励起光を透過させ、蛍光発光を反射するように構成されるダイクロイックミラーと、対物レンズと、所定の波長の蛍光発光を透過するように構成されたエミッションフィルタと、検出器と、を備える蛍光撮像デバイスを開示する。
【０００５】
上述の自動化された画像解析システムの大きな欠点は、試料分析のためにカートリッジを使用することである。所謂「かみそりの刃のモデル」（基本アイテムを最初に低コストで購入する場合）と同様に、当該カートリッジは、使用者にとってコストを高くする結果につながる単回使用の使い捨ての製品である。さらに、当該カートリッジは、個別のデバイスのために設計される傾向にあって、他の製造業者からの細胞カウンタ又は同じ製造業者からの他のデバイスでさえ使用することができない。
【０００６】
定められた面領域における一定の経路長は、分析のための一定の試料の量を定める。正確な細胞計数を行うための試料の細胞濃度は低すぎるか高すぎるかもしれず、それによって、装置の効果的な検出範囲を制限する。さらに、細胞は、カウントされる焦点の領域外の細胞を除き、一定の経路長のチャンバー内で互いに重なり合って凝集し得る。
【０００７】
経路長を細胞の直径の２倍未満に小さくすると、試料中の全ての細胞は、同じ焦平面内へと強いられる。
【０００８】
このため、コストを低減し、より優れた分析の柔軟性を提供し、データの品質を向上させる、細胞カウンタ及びその使用方法の必要性は依然として存在する。
【発明の概要】
【０００９】
本開示の一態様は、
（ｉ）明視野光源と；
（ｉｉ）任意の蛍光励起源と；
（ｉｉｉ）撮像システムと；
（ｉｖ）試料載置システムと、を備える細胞カウンタであって、
試料載置システムは、
（Ａ）ベース上面、ベース底面、ベース上面を通りベース底面に通じ、高さ調節ピンを受け入れるように構成される調節ピンホール、及び撮像システムの対物レンズと一列に並ぶように構成され、ベース底面の基端部の近くに配置される対物レンズ空洞部、を有するベース；
（Ｂ）対物レンズ空洞部に対して先端の位置のベースに固定されるヒンジ；
（Ｃ）ヒンジに固定される移動可能なアームであって、移動可能なアーム上面、移動可能なアーム底面、移動可能なアームが閉位置にあるとき、調節ピンホールと一列に並ぶ位置において、移動可能なアーム底面に固定される高さ調節ピン受け部、及び明視野光源を受け取るように構成される移動可能なアームの基端部の近くにおける明視野光源空洞部、を有する前記移動可能なアーム；
（Ｄ）移動可能なアームが閉位置にあるとき、明視野光源からの明視野光を受け取り、蛍光励起源（存在するとき）からの蛍光を受け取るように構成される位置においてベース上面に設けられる下側の試料面；
（Ｅ）移動可能なアームが閉位置にあるとき、蛍光励起源（存在するとき）からの蛍光を受け取り、明視野光源からの明視野光を受け取るように構成される位置において、移動可能なアームの移動可能なアーム底面に設けられる上側の試料面；及び
（Ｆ）調節ピンホールを通じてベースに設けられる高さ調節ピン、を有する細胞カウンタに特徴がある。
【００１０】
ある実施形態では、上述の細胞カウンタは、蛍光励起源を備え、下側の試料面は、蛍光励起源からの蛍光を受け取るように構成され、及び／又は、上側の試料面は、移動可能なアームが閉位置にあるとき、蛍光励起源からの蛍光を受け取るように構成される。特に、対物レンズ、ダイクロイックミラー、及びエミッションフィルタ、を含む撮像システムを備えるより特定の実施形態において、対物レンズ空洞部は、蛍光励起源と一列に並ぶようにさらに構成される。当該実施形態では、ダイクロイックミラーは、蛍光励起光を反射し蛍光発光を透過するように構成されてもよく、又は、蛍光励起光を透過し蛍光発光を反射するように構成されてもよい。
【００１１】
上述の細胞カウンタの様々な実施形態では、高さ調節ピンは、アクチュエータに接続される。ある実施形態では、高さ調節ピンは精密ねじであって、アクチュエータはモータである。
【００１２】
様々な実施形態では、移動可能なアームは、例えば、所定の位置でのベースと移動可能なアームとの間の距離の測定により、直接的に又は間接的に、下側の試料面と上側の試料面との間の距離を検出、及び／又は較正するための、（ここで「キャリブレーション手段」とも呼ばれる）キャリブレータをさらに備える。例えば、キャリブレータは、ベース及び移動可能なアームのいずれか一方又は両方に配置される距離センサを備えてもよい。
【００１３】
ある実施形態では、試料載置システムは、高さ調節ピンと高さ調節ピン受け部との間の接触を検出するための検出器を備える。特定の実施形態では、検出器は、高さ調節ピンと高さ調節ピン受け部との間の接触によって形成される電気回路の完成を検出することで実現される。ある実施形態では、試料がない状態で、上側の試料面が下側の試料面と直接的に接触するとき、高さ調節ピンと高さ調節ピン受け部との間で接触が行われる。
【００１４】
本開示の第２態様は、
（ａ）上述の種類の細胞カウンタを用意すること、
（ｂ）細胞カウンタの下側の試料面に試料を載置すること、
（ｃ）ステップ（ｂ）の前、後、又は同時に、移動可能なアームをベースに対する閉位置に移動させること、
（ｄ）明視野光源、蛍光励起源（存在するとき）、又はその組み合わせ（蛍光励起源が存在するとき）により試料を照らすこと、
（ｅ）細胞計数データを作成するために撮像システムにより検出してカウントすること、を含む、細胞をカウントする方法に特徴がある。当該方法は、ステップ（ｃ）の後、高さ調節ピンにより、ベースと移動可能なアームとの間の距離を調節するステップをさらに含んでもよい。
【００１５】
様々な実施形態では、移動可能なアームの移動のステップ、及び／又は、ベースと移動可能なアームとの間の距離の調節のステップは、自動化される。
【００１６】
また、当該方法は、
（ｆ）細胞計数データに基づいて下側の試料面の試料の総量を調節するステップ、及び
（ｇ）ステップ（ｄ）及びステップ（ｅ）を繰り返すステップ、をさらに含んでもよい。
【００１７】
ある実施形態では、上述の方法は、試料がない状態で、下側の試料面及び上側の試料面が直接的に接触するときに行われる測定である、ゼロギャップ測定を行うことを含む。一実施形態では、これは、（１）試料がない状態で、下側の試料面と直接的に接触して上側の試料面を配置すること、（２）高さ調節ピンを高さ調節ピン受け部に接触して移動させること、（３）試料がない状態で、上側の試料面が下側の試料面と直接的に接触するとき、高さ調節ピンと高さ調節ピン受け部との間の接触を検出することによって行われる。ある実施形態では、高さ調節ピンと高さ調節ピン受け部との接触は回路を完成させ、検出することは回路の完成の検出を含む。別の方法として、高さ調節ピンと高さ調節ピン受け部との間の接触は、距離センサによって検出されてもよい。
【００１８】
第３態様は、
（ｉ）試料載置システムと、
前記試料載置システムは、
（Ａ）固定された下側の試料面を有するベース；及び
（Ｂ）固定された上側の試料面を有するカバー、を備え；
（ｉｉ）カバー内に組み込まれる明視野光源と；
（ｉｉｉ）試料載置システムの下方に設けられる対物レンズと；
（ｉｖ）明視野光源及び対物レンズと光通信を行うダイクロイックミラーと；
（ｖ）ダイクロイックミラーと光通信を行う蛍光励起源と；
（ｖｉ）明視野光源、対物レンズ、及びダイクロイックミラー、と光通信を行う撮像システムと、を備える細胞カウンタに特徴がある。
【００１９】
ある実施形態では、試料載置システムは、例えば所定の位置におけるベースと移動可能なアームとの間の距離の測定によって、直接的に又は間接的に、下側の試料面と上側の試料面との間の距離の検出、及び／又は較正のためのキャリブレータを備える。例えば、キャリブレータは、ベース及びカバーのいずれか一方又は両方に配置される距離センサを備えてもよい。
【００２０】
本細胞カウンタのある実施形態では、試料載置システムは、ベース又はカバーのいずれか一方に高さ調節ピンを備える。また、本実施形態の試料載置システムは、ベース又はカバーの他方に高さ調節ピン受け部を含んでもよい。高さ調節ピンは、アクチュエータに接続されてもよい。一実施形態では、高さ調節ピンは精密ねじであって、アクチュエータはモータである。
【００２１】
様々な実施形態では、細胞カウンタのベースは、ヒンジによりカバーに接続される。
【００２２】
また、高さ調節ピン及び高さ調節ピン受け部を備える、上述の細胞カウンタのある実施形態では、細胞カウンタは、高さ調節ピンと高さ調節ピン受け部との間の接触を検出するための検出器を備えてもよい。ある実施形態では、検出器は、高さ調節ピンと高さ調節ピン受け部との間の接触によって形成される電気回路の完成を検出することで実現される。ある実施形態では、試料がない状態で、上側の試料面が下側の試料面と直接的に接触するとき、高さ調節ピンと高さ調節ピン受け部との間で接触が行われる。
【００２３】
第４態様は、
（ａ）上記第３態様で説明したような細胞カウンタを用意すること；
（ｂ）細胞カウンタの固定された下側の試料面上に試料を載置すること；
（ｃ）ステップ（ｂ）の前、後、又は同時に、ベースに対する閉位置にカバーを移動させること；
（ｄ）明視野光源、蛍光励起源、又はその組み合わせにより試料を照らすこと；及び
（ｅ）細胞計数データを作成するために撮像システムにより細胞を検出してカウントすること、を含む、細胞をカウントする方法に特徴がある。当該方法は、ステップ（ｃ）の後、高さ調節ピンにより、ベースと移動可能なアームとの間の距離を調節するステップをさらに含んでもよい。
【００２４】
様々な実施形態では、移動可能なアームの移動のステップ、及び／又はベースと移動可能なアームとの間の距離の調節のステップは、自動化される。
【００２５】
また、当該方法は、
（ｆ）細胞計数データに基づいて下側の試料面の試料の総量を調節するステップ；及び
（ｇ）ステップ（ｄ）及びステップ（ｅ）を繰り返すステップ、をさらに含む。
【００２６】
ある実施形態では、当該方法は、上側の試料面と下側の試料面とが直接的に接触するとき、カバー上の点とベース上の点との間の距離を測定することによって、ゼロギャップ測定を行うことを含む。細胞カウンタが高さ調節ピン及び高さ調節ピン受け部を含むある実施形態では、これは、（１）試料がない状態で、下側の試料面に直接的に接触させて上側の試料面を配置すること、（２）高さ調節ピンを高さ調節ピン受け部に接触させて移動させること、（３）試料がない状態で、上側の試料面が下側の試料面と直接的に接触するとき、高さ調節ピンと高さ調節ピン受け部との間の接触を検出することによって、実現されてもよい。ある実施形態では、高さ調節ピンと高さ調節ピン受け部との間の接触は回路を完成させ、検出することは回路の完成の検出を含む。別の方法として、高さ調節ピンと高さ調節ピン受け部との間の接触は、距離センサによって検出されてもよい。
【００２７】
本開示の第５態様は、
（ｉ）試料載置システムと、
前記試料載置システムは、
（Ａ）固定された下側の試料面を有するベース；及び
（Ｂ）固定された上側の試料面を有するカバー、を備え、；
（ｉｉ）カバー内に取り込まれる明視野光源と；
（ｉｉｉ）試料載置システムの下方に設けられる対物レンズと；
（ｉｖ）任意の蛍光励起源と；
（ｖ）明視野光源及び対物レンズと光通信を行う撮像システムと、を備える細胞カウンタに特徴がある。
【００２８】
ある実施形態では、試料載置システムは、例えば所定の位置におけるベースとカバーとの間の距離を測定することによって、直接的に又は間接的に、下側の試料面と上側の試料面との間の距離を検出、及び／又は較正するためのキャリブレータを備える。例えば、キャリブレータは、ベース及びカバーのいずれか一方又は両方に配置される距離センサを備えてもよい。本細胞カウンタのある実施形態では、試料載置システムは、ベースかカバーのいずれか一方に高さ調節ピンを備える。また、本実施形態では、試料載置システムは、ベース又はカバーの他方に高さ調節ピン受け部を備えてもよい。高さ調節ピンは、アクチュエータに接続されてもよい。一実施形態では、高さ調節ピンは精密ねじであって、アクチュエータはモータである。
【００２９】
様々な実施形態では、細胞カウンタのベースはヒンジによりカバーに接続される。
【００３０】
また、高さ調節ピン及び高さ調節ピン受け部を備える、上述の細胞カウンタの実施形態では、細胞カウンタは、高さ調節ピンと高さ調節ピン受け部との間の接触を検出するための検出器を備える。ある実施形態では、検出器は、高さ調節ピンと高さ調節ピン受け部との間の接触によって形成される電気回路の完成を検出することで実現される。ある実施形態では、試料がない状態で上側の試料面が下側の試料面と直接的に接触するとき、高さ調節ピンと高さ調節ピン受け部との間で接触が行われる。
【００３１】
第６態様は、
（ａ）上記第５態様で説明したような細胞カウンタを用意すること；
（ｂ）細胞カウンタの固定された下側の試料面に試料を載置すること；
（ｃ）ステップ（ｂ）の前、後、又は同時に、ベースに対する閉位置にカバーを移動させること；
（ｄ）明視野光源、蛍光励起源（存在するとき）、又はその組み合わせ（蛍光励起源が存在するとき）によって試料を照らすこと；及び
（ｅ）撮像システムにより細胞を検出してカウントすること、を含む細胞をカウントする方法に特徴がある。当該方法は、ステップ（ｃ）の後、高さ調節ピンにより、ベースと移動可能なアームとの間の距離を調節するステップをさらに含んでもよい。
【００３２】
様々な実施形態では、移動可能なアームを移動させるステップ、及び／又はベースと移動可能なアームとの間の距離を調節するステップは、自動化される。
【００３３】
また、当該方法は、
（ｆ）細胞計数データに基づいて下側の試料面の試料の総量を調節するステップ；及び
（ｇ）ステップ（ｄ）及びステップ（ｅ）を繰り返すステップ、を含んでもよい。
【００３４】
ある実施形態では、当該方法は、上側の試料面と下側の試料面とが直接的に接触するとき、カバー上の点とベース上の点との間の距離を測定することによって、ゼロギャップ測定を行うことを含む。細胞カウンタが高さ調節ピン及び高さ調節ピン受け部を含む特定の実施形態では、これは、（１）試料がない状態で、下側の試料面と直接的に接触して上側の試料面を配置すること、（２）高さ調節ピン受け部と接触して高さ調節ピンを移動させること、及び（３）試料がない状態で、上側の試料面が下側の試料面と直接的に接触するとき、高さ調節ピンと高さ調節ピン受け部との間の接触を検出することによって、実現される。特定の実施形態では、高さ調節ピンと高さ調節ピン受け部との間の接触は回路を完成させ、検出することは回路の完成の検出を含む。別の方法として、高さ調節ピンと高さ調節ピン受け部との接触は、距離センサによって検出されてもよい。
【００３５】
本開示の第７態様は、
（ｉ）明視野光源と；
（ｉｉ）撮像システムと；
（ｉｉｉ）任意の蛍光励起源と；
（ｉｖ）試料載置システムと、を備える細胞カウンタであって、
試料載置システムは、
（Ａ）ベース上面、ベース底面、及び撮像システムの対物レンズと一列に並ぶように構成される対物レンズ空洞部、を有するベース；
（Ｂ）ベースに固定されるヒンジ；
（Ｃ）ヒンジに固定される移動可能なアームであって、移動可能なアーム上面、移動可能なアーム底面、及び明視野光源を受け取るように構成される、移動可能なアームの基端部の近くの明視野光源空洞部、を有する前記移動可能なアーム；
（Ｄ）移動可能なアームが閉位置にあるとき、明視野光源からの明視野光を受け取り、蛍光励起源（存在するとき）からの蛍光を受け取るように構成される位置において、ベース上面に設けられる下側の試料面；及び
（Ｅ）移動可能なアームが閉位置にあるとき、蛍光励起源（存在するとき）からの蛍光を受け取り、明視野光源からの明視野光を受け取るように構成される位置において、移動可能なアームの移動可能なアーム底面に設けられる上側の試料面、を有する細胞カウンタに特徴がある。
【００３６】
上述の細胞カウンタは、下側の試料面が蛍光励起源からの蛍光を受け取り、及び／又は、移動可能なアームが閉位置にあるとき、上側の試料面が蛍光励起源源からの蛍光を受け取るように構成される蛍光励起源を備えてもよい。ある実施形態では、対物レンズ空洞部は、蛍光励起源を受け入れるように構成される。
【００３７】
ある実施形態では、撮像システムは、
対物レンズ；
ダイクロイックミラー；及び
エミッションフィルタ、を備える。ダイクロイックミラーは、蛍光励起光を反射し蛍光発光を透過するように構成されてもよく、又は蛍光励起光を透過し蛍光発光を反射するように構成されてもよい。
【００３８】
ある実施形態では、試料載置システムは、例えば所定の位置におけるベースと移動可能なアームとの間の距離を測定することによって、直接的に又は間接的に、下側の試料面と上側の試料面との間の距離を検出、及び／又は較正するためのキャリブレータを備える。例えば、キャリブレータは、ベース及び移動可能なアームのいずれか一方又は両方に配置される距離センサを備えてもよい。
【００３９】
本態様の細胞カウンタは、ベース又は移動可能なアームのいずれか一方において高さ調節ピンを備える試料載置システムを含んでもよい。また、試料載置システムは、ベース又は移動可能なアームの他方において高さ調節ピン受け部を含んでもよい。高さ調節ピンは、アクチュエータに接続されてもよい。一実施形態では、高さ調節ピンは精密ねじであって、アクチュエータはモータである。
【００４０】
また、上述の細胞カウンタが高さ調節ピン及び高さ調節ピン受け部を備えるある実施形態では、細胞カウンタは、高さ調節ピンと高さ調節ピン受け部との間の接触を検出するための検出器を備えてもよい。特定の実施形態では、検出器は、高さ調節ピンと高さ調節ピン受け部との間の接触によって形成される電気回路の完成を検出することによって実現される。ある実施形態では、試料がない状態で、上側の試料面が下側の試料面と直接的に接触するとき、高さ調節ピンと高さ調節ピン受け部との間で接触が行われる。
【００４１】
第８態様は、
（ａ）上記第７態様で説明したような細胞カウンタを用意すること；
（ｂ）細胞カウンタの下側の試料面に試料を載置すること；
（ｃ）ステップ（ｂ）の前、後、又は同時にベースに対する閉位置に移動可能なアームを移動させること；
（ｄ）明視野光源、蛍光励起源（存在するとき）、又はその組み合わせ（励起光源が存在するとき）によって試料を照らすこと；及び
（ｅ）細胞計数データを作成するために、撮像システムにより細胞を検出してカウントすること、を含む、細胞をカウントする方法に特徴がある。当該方法は、ステップ（ｃ）の後、高さ調節ピンによりベースと移動可能なアームとの間の距離を調節するステップをさらに含んでもよい。
【００４２】
様々な実施形態では、移動可能なアームを移動させるステップ、及び／又はベースと移動可能なアームとの間の距離を調節するステップは、自動化される。
【００４３】
また、当該方法は、
（ｆ）細胞計数データに基づいて下側の試料面の試料の総量を調節するステップ；及び
（ｇ）ステップ（ｄ）及びステップ（ｅ）を繰り返すステップ、をさらに含んでもよい。
【００４４】
いくつかの実施形態では、当該方法は、ベース又は移動可能なアームの一方において高さ調節ピンを備える細胞カウンタを用いて行われ、当該細胞カウンタは、ベース又は移動可能なアームの他方に高さ調節ピン受け部も含んでもよい。
【００４５】
ある実施形態では、当該方法は、上側の試料面と下側の試料面とが直接的に接触するとき、カバー上の点とベース上の点との間の距離を測定することによって、ゼロギャップ測定を行うことを含む。細胞カウンタが高さ調節ピン及び高さ調節ピン受け部を含む特定の実施形態では、これは、（１）試料がない状態で、下側の試料面に直接的に接触して上側の試料面を配置すること、（２）高さ調節ピン受け部と接触して高さ調節ピンを移動させること、及び（３）試料がない状態で、上側の試料面が下側の試料面に直接的に接触するとき、高さ調節ピンと高さ調節ピン受け部との間の接触を検出すること、によって実現されてもよい。特定の実施形態では、高さ調節ピンと高さ調節ピン受け部との間の接触は回路を完成させ、検出することは回路の完了の検出を含む。別の方法として、高さ調節ピンと高さ調節ピン受け部との間の接触は、距離センサによって検出されてもよい。
【００４６】
本発明の他の特徴及び利点は、図面及び以下の詳細な説明を参照して当業者に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１（ａ）】一実施形態の試料載置システムをクローズアップした図
【図１（ｂ）】図１（ａ）に示す、代替の実施形態の試料載置システムをクローズアップした図
【図１（ｃ）】図１（ａ）に示す、別の代替の実施形態の試料載置システムをクローズアップした図
【図２】例示の細胞カウンタを部分的に分解した側面図
【図３】本開示の細胞カウンタの例示的な向き
【図４】本開示の細胞カウンタの例示的な向き
【図５】本開示の細胞カウンタからの例示の明視野画像
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本開示は、全てではないがいくつかの考えられる実施形態が示される添付の図面を参照して、以下でより十分に説明される。実際には、開示は、多くの異なる形式で具体化されてもよく、ここの４つの実施形態に限定して構成されるのではなく、むしろ、これらの実施形態は、本開示が適用される法律上の要件を満たすように提供される。
【００４９】
前記説明及び関連図面で示される内容の利点を有する、開示のデバイス、システム、及び方法が付随する多くの変更及び本開示の他の実施形態は、当業者に想定される。それゆえ、当該開示は開示される特定の実施形態に限定されず、変更及び他の実施形態は添付の特許請求の範囲内に含まれると意図されることが理解されるべきである。特定の用語がここで用いられるが、これらは一般的及び記述的な意味だけであって、限定する目的で用いられない。
【００５０】
出願人は、本開示の全ての引用文献の全内容を明確に包含する。さらに、総量、濃度、又は他の値若しくはパラメータが、範囲、好ましい範囲、又は大きい方の好ましい値及び小さい方の好ましい値のリストとして与えられるとき、このことは、範囲が別に開示されているかどうかに関わらず、大きい方の範囲の限度又は好ましい値と、小さい方の範囲の限度又は好ましい値の対から形成される全範囲を明確に開示していると理解されるべきである。数値範囲を列挙しているこの中の場所で、記載が無い限り、当該範囲は、範囲内の端点と全整数及び分数を含むことを意図する。本開示の範囲が範囲の定義をするときに列挙した特定の値に限定されることを意図しない。
【００５１】
また、ここで用いられる専門用語は、特定の態様を説明するためだけであって、制限されることを意図しない。明細書及び特許請求の範囲内で用いられるような「備える」という用語は、言及されるような、記載された特徴、整数、ステップ、又は構成要素の存在を明確にするように解釈され、１以上の特徴、整数、ステップ、又は構成要素、又はその集合の存在若しくは追加を除外しない。さらに、「備える」という用語は、「基本的に成り立つ」及び「成り立つ」という用語によって包含される実施形態を含むと意図される。同様に、「基本的に成り立つ」という用語は、「成り立つ」という用語によって包含される実施形態を含むと意図される。
【００５２】
定義しない限り、ここで用いられる全ての技術的及び科学的用語は、開示の構成及び方法に属する当業者の一人によって通常理解されるような意味と同じ意味を有する。ここで定義される多くの用語が、本明細書及び以下の特許請求の範囲で参照される。
【００５３】
前述の問題は、使い捨てカートリッジの代わりに、効率的で費用対効果の高い試料分析のために再利用可能な試料面を用いる本開示の細胞カウンタによって解決される。このため、当該デバイスは、交換カートリッジを買う必要性をなくすことによって、使用者における所有による全体のコストを減らす。
【００５４】
本細胞カウンタは、明視野光源、蛍光励起源、撮像システム、及び試料載置システム、を備える。図１（ａ），１（ｂ），及び／又は１（ｃ）を参照して、本開示の細胞カウンタは、明視野顕微鏡法で見られるような任意の種類の明視野光源であってもよい明視野光源１０３を備える。例えば、明視野光源１０３は、任意の種類の発光ダイオード（ＬＥＤ）であってもよい。他の実施形態では、明視野光源１０３は例えば白熱灯、ハロゲンランプ、又はキセノンランプのような任意の光源であってもよい。
【００５５】
明視野光の強度は、例えばコンピュータによってアナログ制御又はデジタル制御された強度で、使用者の必要に応じて変化してもよい。
【００５６】
また、細胞カウンタのいくつかの実施形態では、明視野光源１０３と目標の試料との間において、拡散スクリーン及び／又は集光レンズを利用してもよい。
【００５７】
典型的に、明視野光源１０３は、試料載置システムのカバー内に組み込まれる。一方、移動可能なアーム１０５がベース１０６に対して閉位置にあるとき、明視野光源１０３からの光が、下側の試料面１０２に配置された試料を透過するような任意の方法で、明視野光源１０３が取り付けられ得る。例えば、カバー、又は特定の実施形態では、移動可能なアーム１０５は、それ自身は明視野光源１０３を含まないが、代わりに、例えば空の空洞部として又は光ファイバを通じて、明視野光源１０３から試料に発せられる光の光路として機能する明視野光の空洞部１１６を含んでもよい。
【００５８】
いくつかの実施形態では、明視野光源１０３は、移動可能なアーム上面１１４に配置され、移動可能なアーム１０５がベース１０６に対して閉位置にあるとき、下側の試料面１０２上に発光するように構成される。
【００５９】
本開示の細胞カウンタは、試料載置システムと光通信を行う蛍光励起源を任意にさらに備える。図２を参照して、いくつかの実施形態では、蛍光励起源２１７は、蛍光励起源から下側の試料面上の試料へ発せられる蛍光励起光をダイクロイックミラー２２０が反射するように構成されるダイクロイックミラー２２０と光通信を行う位置で、細胞カウンタに配置される。次に、当該ダイクロイックミラーは、試料から撮像システム２２２に生じるいかなる蛍光発光をも透過する。
【００６０】
また、ダイクロイックミラーが上述と逆に機能するような方法で、蛍光励起源及びダイクロイックミラーを配置することができる。すなわち、当該実施形態では、ダイクロイックミラーは、蛍光励起源から下側の試料面上の試料に蛍光励起光を透過させ、試料から撮像システムへ生じる蛍光発光を反射する。
【００６１】
細胞カウンタのいくつかの実施形態は、下側の試料面の試料と直接的に光通信を行うような方法で蛍光励起源を配置することによって、ダイクロイックミラーの必要性をなくす。例えば、図１（ａ），１（ｂ），及び／又は１（ｃ）を参照して、蛍光励起源は、蛍光励起源からの励起光が対物レンズ空洞部１１３内のギャップを利用するように構成されてもよく、それによりダイクロイックミラーの必要性が回避される。また、蛍光励起源は、試料が蛍光励起源から励起光を受け取るように下側の試料面１０２の上又は側面に配置されてもよい。
【００６２】
本細胞カウンタにおいて用いられる、好ましい蛍光励起源は、レーザダイオード及びＬＥＤを含む。
【００６３】
図２を参照して、対物レンズ２０４は、ベース２０６の下方に設けられる。典型的には、明視野光源からの光が下側の試料面の試料を透過した後、次に、光は対物レンズ２０４を透過する。対物レンズ２０４は、主要な画像形成の要因であって、撮像システム２２２が作成することができる画像の質の決定に関与する。また、対物レンズ２０４は、特定の試料の倍率、及び微細な試料の詳細が撮像システム２２２で観察できる分解能の決定に関与する。
【００６４】
対物レンズ２０４は、典型的に、明視野又は蛍光顕微鏡法で用いられるような任意の対物レンズであってもよい。
【００６５】
対物レンズ２０４は、典型的に、ベース２０６の対物レンズ空洞部と一列に並ぶ位置で、ベース２０６の下方に配置される。さらに、移動可能なアーム２０５が閉位置にあるとき、明視野光源も、対物レンズ空洞部と一列に並んでいてもよいため、対物レンズは、明視野光源から上側の試料面、試料、下側の試料面、対物レンズ空洞部、そして対物レンズを通じて撮像システムへ進む光路を形成する。
【００６６】
また、好ましい光源が存在するとき、対物レンズ２０４は、蛍光励起した試料からの蛍光発光と光通信を行う。また、図２に配置されるように、蛍光励起源２１７からの蛍光励起光がダイクロイックミラー２２０によって反射した後、対物レンズ２０４は、当該光と光通信を行う。しかしながら、前述のように、いくつかの実施形態では、蛍光励起源はダイクロイックミラーの使用を必要とせず、このため、いくつかの場合において、対物レンズは、蛍光発光と光通信を行わない。
【００６７】
対物レンズ２０４と試料との間の距離は、限定されないが、典型的には、１０ｍｍ〜２０ｍｍ、例えば１０ｍｍ、１１ｍｍ、１２ｍｍ、１３ｍｍ、１４ｍｍ、１５ｍｍ、１６ｍｍ、１７ｍｍ、１８ｍｍ、１９ｍｍ、又は２０ｍｍである。しかしながら、より小さい距離またはより大きい距離が用いられてもよく、対物レンズ２０４と試料との間は、例えば、１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍ、６ｍｍ、７ｍｍ、８ｍｍ、又は９ｍｍであるか、対物レンズ２０４と試料との間は、例えば、２１ｍｍ、２２ｍｍ、２３ｍｍ、２４ｍｍ、２５ｍｍ、２６ｍｍ、２７ｍｍ、２８ｍｍ、２９ｍｍ、３０ｍｍ、３１ｍｍ、３２ｍｍ、３３ｍｍ、３４ｍｍ、３５ｍｍ、３６ｍｍ、３７ｍｍ、３８ｍｍ、３９ｍｍ、４０ｍｍ、４５ｍｍ、５０ｍｍ、５５ｍｍ、又は６０ｍｍ以上である。
【００６８】
エミッションフィルタ２１９は、少なくとも１つの他のエミッションフィルタを含むフィルタホイール上に設けられてもよい。いくつかの実施形態では、フィルタホイールは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ以上のエミッションフィルタを含んでもよい。好ましいフィルタは、望ましい蛍光波長によって選択されてもよい。例えば、エミッションフィルタは、発せられた蛍光のいかなる範囲、例えば、４６０ｎｍ（青色蛍光蛋白質）、４７９ｎｍ（シアン蛍光蛋白質）、５１０ｎｍ（野生型緑色蛋白質）、５２５ｎｍ（緑色蛋白質）、５３０ｎｍ（フルオレセインイソチオシアネート）、５３５ｎｍ（黄色蛍光蛋白質）、６２０ｎｍ（テトラメチルローダミンイソチオシアネート／シアニン）、又は６３０ｎｍ（テキサスレッド）であってもよい。エミッションフィルタ２１９があるとき、励起源（蛍光励起源２１７）が、目標の蛍光体励起波長を励起し、いくつかの実施形態ではすべての考えられる蛍光体を同時に励起し、さらに、選択されたエミッションフィルタ２１９が、興味のある蛍光体のみから撮像システム２２２へ信号を送信する。
【００６９】
いくつかの態様では、撮像システム２２２は、検出デバイス２２１を備える。検出デバイス２２１はカメラ、例えばＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳカメラ、ビデオカメラ、又は既知の光検出器、又は同様の物であってもよく、いかなるものも熱電冷却の能力を含んでもよい。
【００７０】
撮像システムは、細胞を識別してカウントするために画像をスキャンすることができるソフトウェアを利用する。また、大きさの区別を考慮するために、個々の細胞の直径及び／又は面積を測定してもよい。一般的に、使用者は、細胞の総数、死細胞に対する生細胞の比率、有核細胞の数、ある大きさの範囲に含まれる細胞数、及び上記の様々な並び方に関心がある。
【００７１】
撮像システムは、各々の試料の画像又は複数画像を撮る。
【００７２】
画像は、使用者によって必要とされるように、異なる蛍光波長で撮られてもよい。
【００７３】
また、細胞カウンタは、明視野において、非染色性の細胞の画像（例えば、明視野画像）を撮るためのモードのみで動作してもよい。
【００７４】
撮像システムと共に用いられ得る機械可読記憶媒体は、電子、磁気、及び／又は光記憶媒体を含む。電子、磁気、及び／又は光記憶媒体は、例えば、
磁気フロッピーディスク及びハードディスク；
いくつかの実施形態ではＤＶＤディスクを使用することができる、ＤＶＤドライブ、ＣＤドライブ；
ＣＤ−ＲＯＭディスク（すなわち読取専用光記憶ディスク）、ＣＤ−Ｒディスク（すなわち、一度書き込んで多くを読み込む光記憶ディスク）、及びＣＤ−ＲＷディスク（すなわち書き換え可能な光記憶ディスク）；
任意のフォーマットに沿ってブルーレイディスクを利用することができるブルーレイドライブ；
例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、コンパクトフラッシュカード、ＰＣＭＣＩＡカード、又は別のものとしてＳＤ若しくはＳＤＩＯメモリのような電子記憶媒体；及び
記憶媒体を収容し、記憶媒体から読み取り、及び／又は記憶媒体に書き込む電子部品（例えば、フロッピーディスク、ＤＶＤドライブ、ＣＤ／ＣＤ−Ｒ／ＣＤ−ＲＷドライブ、ブルーレイドライブ、又はコンパクトフラッシュ（登録商標）／ＰＣＭＣＩＡ／ＳＤアダプタ）、である。機械可読記憶媒体の分野の当業者にとって既知のように、データ記憶のための新しいメディア及びフォーマットは継続して考案されており、特に、より優れた記憶能力、より速いアクセス速度、より小さいサイズ、及び記憶された情報の１ビットあたりのより低いコスト、を提供する場合、将来利用可能になるかもしれない、任意の便利な商業的に利用可能な記憶媒体及び対応する読み取り／書き込み装置が、使用に適し得る。よく知られた古い機械可読メディアも、例えば、穴を開けた紙テープ若しくはカード、テープ若しくはワイヤ上の磁気記録、表示された文字（例えばＯＣＲ及び磁気的にコード化されるシンボル）の光若しくは磁気的な読み取り、及び一次元若しくは二次元バーコードのような機械可読シンボル、のようなある条件下で利用可能である。後の使用のための画像データの記録（例えば、メモリに画像又はデジタルメモリの書き込み）は、出力、使用者に表示するためのデータ、又は後の使用のために利用可能にされるデータのような、記録された情報の使用を可能にするために行われてもよい。当該デジタルメモリ素子又はチップは、独立型のメモリデバイスであってもよく、関心のあるデバイス内に組み込んでもよい。
【００７５】
図１（ａ），１（ｂ）及び／又は１（ｃ）を参照して、いくつかの実施形態では、試料載置システム１００は、
ベース上面１１１、ベース底面１１２、及び撮像システム１２２の対物レンズ１０４と一列に並ぶように構成される対物レンズ空洞部１１３、を有するベース１０６；
ベース１０６に固定されるヒンジ１１０；
ヒンジ１１０に固定される移動可能なアーム１０５であって、移動可能なアーム上面１１４、移動可能なアーム底面１１５、及び明視野光源１０３を受け取るように構成される移動可能なアームの基端部の近くの明視野光源空洞部１１６、を有する前記移動可能なアーム１０５；
移動可能なアーム１０５が閉位置にあるとき、明視野光源１０２から（下向き矢印破線で示される）明視野光を受け取り、蛍光励起源が存在するとき（いくつかの実施形態では、ダイクロイックミラー１２０によって反射される蛍光と共に）蛍光励起源１１７からの蛍光励起光を受け取るように構成される位置において、ベース上面１１１に設けられる下側の試料面１０２；及び
移動可能なアーム１０５が閉位置にあり、蛍光励起源が存在するとき、蛍光励起源からの蛍光（上向き矢印実線で示される蛍光励起光；及び下向き矢印点線で示される蛍光発光）を受け取り、明視野光源１０３からの明視野光を受け取るように構成される位置において、移動可能なアーム１０５の移動可能なアーム底面１１５に設けられる上側の試料面１０１を備える。
【００７６】
いくつかの態様では、ベース１０６は、高さ調節ピン１０８を受け入れるように構成される、ベース上面１１１を通ってベース底面１１２に通じる調節ピンホール１１８をさらに備える。当該態様では、移動可能なアーム１０５は、ベース底面１０６が高さ調節ピン１０８を受け入れるように構成される場合、移動可能なアーム１０５が閉位置にあるとき調節ピンホール１１８と一列に並ぶ位置において、移動可能なアーム底面１１５に固定される高さ調節ピン受け部１０９をさらに備えてもよい。
【００７７】
ベース１０６が調節ピンホール１１８を備える実施形態では、細胞カウンタは、調節ピンホール１１８を通じてベース１０６に設けられる高さ調節ピン１０８をさらに備える。高さ調節ピン１０８があるときは、高さ調節ピン１０８は、高さ調節ピン１０７の高さを手動又は自動で調節するように構成されるアクチュエータ１０７に接続される。いくつかの実施形態では、高さ調節ピン１０８は精密ねじであって、アクチュエータ１０７はモータである。当該実施形態では、モータは、調節ピンホール１１８内で精密ねじを上下に移動させる。特定の実施形態では、モータは、移動可能なアーム１０５から調節ピンホール１１８へ延びる高さ調節ピン受け部１０９に対して当たる精密ねじの回転移動を生み出すように設計される。モータによって駆動されて、高さ調節ピン受け部１０９に対する精密ねじの回転は、移動可能なアーム１０５、結果的にそこに含まれる上側の試料面１０１の制御された移動をもたらす。
【００７８】
一実施形態では、モータは、所定の位置に精密ねじを自動的に上下に移動させるエンコーダを有する。しかしながら、モータは任意のモータ、リニアアクチュエータ、又はリニアトランスレータモータであってもよい。
【００７９】
移動可能なアーム１０５を測定位置に配置するために、アクチュエータ１０７は調節ピン１０８を移動させ、次に調節ピン受け部１０９を移動させ、次に移動可能なアーム１０５を移動させ、それによって上側の試料面１０１と下側の試料面１０２との間の距離を制御する。一実施形態では、アクチュエータ１０７は、調節ピン１０８を下方に移動させ、移動可能なアーム１０５をベース１０６の近くに移動させ、上側の試料面１０１と下側の試料面１０２との間の距離を小さくする。測定された光学的特性に関するデータは、測定された光学的特性に基づいて様々な計算を行うことができる撮像システム１２２に送信される。
【００８０】
ヒンジ１１０は、移動可能なアーム１０５がベース１０６に対する開位置から閉位置に移動できるようにベース１０６に配置されてもよい。いくつかの態様では、ヒンジ１１０の位置は、対物レンズ空洞部１１３に対してベース１０６上の先端にある。
【００８１】
移動可能なアームは、（ここで「キャリブレータ」とも称される）キャリブレーション手段をさらに備えてもよい。移動可能なアームは、移動経路に沿った既知の位置を定めることによって較正されてもよい。このことは、限定されない以下のことを含む数多くの方法で実現されてもよい。
Ａ）較正された機械的なスペーサ又はギャップ器具の使用により既知のギャップを定める。
Ｂ）図１（ｃ）を参照して、カメラ１２５又は他の撮像装置は、上側の試料面１０１と下側の試料面１０２の端部を見るために用いられてもよい。そして、ギャップは、間隔が正しいと撮像システム１２２が確認するまで調節されてもよい。
Ｃ）磁石又は電磁石は、一番下の位置においてモータに対する抵抗を提供する。モータがこの休止位置からアームをうまく上げるとき、最も短い経路での正確なモータの位置が定められる。
Ｄ）光学面上に描かれ、撮像システムによって視覚化されるマーカーを用いて光学的な較正を行う。
Ｅ）モータは、機械的な停止を行うことによって、定められた参照位置に配置された、固定の又は「ホームの」位置を定めてもよい。
【００８２】
ある実施形態では、ギャップは、試料がない状態で、上側の試料面１０１が下側の試料面１０２と接触するときの「ゼロギャップ」又は「Ｐ−ゼロ」すなわち、ゼロの測定を参照することによって、設定され又は較正されてもよい。これを実現するために、調節ピン１０８は、調節ピン受け部１０９と接触しないように下げられ、そして、移動可能なアーム１０５は、上側の試料面１０１が下側の試料面１０２に直接置かれるように配置される。調節ピン１０８が調節ピン受け部１０９と接触するまで上げられ、接触が検出され、「ゼロギャップ」測定は行われる。
【００８３】
調節ピン１０８と調節ピン受け部１０９との間の接触の開始は、様々な種類の近接センサ又は圧力パッドの使用を含む様々な方法で検出されてもよい。好ましい実施形態では、接触の開始は、回路の完成により電気的に検出される。本実施形態では、調節ピン１０８及び調節ピン受け部１０９は、電圧源に直接的に又は間接的に接続される。調節ピン１０８と調節ピン受け部１０９とが互いに接触し、当該分野で既知の任意の一般的な手段によって検出して、回路が完成する。この方法は、条件を変更して自動修正する利点を有する。すなわち、機器を移動させることによって、又はこれらの要素の通常の摩耗によって生じる可能性があるように、調節ピン１０８と調節ピン受け部１０９との間の関係が時間とともに変化したとしても、「ゼロギャップ」測定は、機器が用いられる度に確実に行われ得る。
【００８４】
一実施形態では、上側の試料面１０１と下側の試料面１０２との間のギャップ又は隙間は、容量性の変位センサシステムを用いて較正されてもよい。当該システムは、当該分野においてよく知られている。（例えば、容量性のセンサの操作及び最適化（Ｃａｐａｃｉｔｉｖｅ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）；容量性センサ技術ノート（Ｃａｐａｃｉｔｉｖｅ  Ｓｅｎｓｏｒ  ＴｅｃｈＮｏｔｅ）ＬＴ０３−００２０、ミネソタ州（ＭＮ）、オークデール（Ｏａｋｄａｌｅ）、ライオンプレシジョン（Ｌｉｏｎ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）；ＵＲＬ  ｌｉｏｎｐｒｅｃｉｓｉｏｎ．ｃｏｍ参照。）当該装置は、センサ及びターゲットと典型的に呼ばれる、２つの導電性部材で構成される。本機器の適用において、一方の構成要素は移動可能なアームに配置され、他方の構成要素は、移動可能なアームが下げられた位置にあるとき２つの構成要素が互いに一列に並ぶように、ベース上の位置に配置される。容量性の変位センサは、調節ピン及び調節ピン受け部に対して移動可能なアーム／ベース上の任意の場所に配置されてもよい。図１（ｂ）に示す実施形態では、容量性の変位センサ１２３／１２４は、調節ピン／調節ピン受け部１０８／１０９と上側／下側の試料面１０１／１０２との間に配置される。図１（ｂ）では、センサのプローブコンポーネント１２３はベース１０６に収められ、ターゲットコンポーネント１２４は移動可能なアーム１０５に配置される。
【００８５】
また、当業者が理解するように、容量性の変位センサシステムは、上述したような「ゼロギャップ」測定を行うために用いられてもよい。これは、試料が無い状態で、上側及び下側の試料面１０１／１０２が接触するときに、移動可能なアーム１０５とベース１０６との間の測定をするだけで行われてもよい。別の方法として、センサは、上側及び下側の試料面１０１／１０２の間の移動、すなわち、互いに離れて移動するときを検出し記録してもよい。これらの技術は、高さ調節ピン又は高さ調節ピン受け部を備えない細胞カウンタの実施形態で利用されてもよい。
【００８６】
当業者は、ゼロギャップ測定の較正及び／又は設定のための容量性の変位センサの代わりに、他の距離センサが用いられてもよいと理解できる。例えば、光又は超音波に基づくＴＯＦセンサが用いられてもよい。
【００８７】
上側の試料面１０１及び下側の試料面１０２は使い捨てのカートリッジではないが、このことは、これらの試料面が、例えば、清掃、修理、交換などのために試料載置システムから取り外すことができないことを意味しない。しかしながら、必要であれば、個々のベース又はカバーに対して試料面のいずれか一方又は両方に永久に固定することができる。
【００８８】
上側及び下側の試料面は、限定されないが、ガラス、溶融シリカ、サファイア、石英、又は光学グレードのプラスチック（ｏｐｔｉｃａｌ  ｇｒａｄｅ  ｐｌａｓｔｉｃｓ）を含む、透明又は半透明材料を備えてもよい。上側の試料面及び下側の試料面は、同じ材料を備えてもよく、又は互いに異なる材料を備えてもよい。
【００８９】
図３は本細胞カウンタの考えられる１つの配置を示す。本設計は、蛍光励起源を、ダイクロイックミラーを通じて撮像経路につなげる。本ダイクロイックミラーは、励起光を反射して、発せられた蛍光を透過する。明視野画像モードでは、明視野光源からの光（下向きの薄い灰色の矢印）は試料、対物レンズ、及びダイクロイックミラーを通じて撮像システムへ透過する。
【００９０】
蛍光撮像モードでは、蛍光励起光（上向き矢印）は、ダイクロイックミラーによって、対物レンズを通じて試料へと反射される。試料が発する蛍光（下向きの濃い灰色の矢印）は、対物レンズ、ダイクロイックミラー、及びエミッションフィルタを透過する。
【００９１】
図４は、蛍光励起源が撮像経路から切り離された細胞カウンタの設計を示す。当該設計の利点は、照射と撮像経路が分離し、独立して調節できることである。また、ダイクロイックミラーがなく、撮像経路を単純化して短くする。
【００９２】
本開示の細胞カウンタの操作は、様々な方法によって行われてもよい。例えば、細胞計数は、
細胞カウンタの下側の試料面上に試料を載置すること；
ベースに対する閉位置に移動可能なアームを移動させること；
明視野光源、蛍光励起源（存在するとき）、又はその組み合わせ（蛍光励起源が存在するとき）により試料を照らすこと；及び
撮像システムにより細胞を検出してカウントすること、によって実現される。必要であれば、これらのいかなる操作のステップも繰り返されてもよい。
【００９３】
本開示の装置を利用してカウントするための試料を準備するとき、付着性細胞の培養又は懸濁液からの細胞は、バッファ内で再懸濁されてもよく、蛍光性及び／又は非蛍光性の染料を既知の濃度で混合してもよい。一度ラベルされると、試料はピペットで吸引されて下側の試料面上に載置されてもよい。
【００９４】
試料の載置及びカバー／アームの移動のステップは、互いに関連していかなる順序で行ってもよいことに注意する。このため、アームを閉位置に移動させる前、後、又は同時に下側の試料面上に試料を載置することができる。ステップ間のいかなるタイミングであっても、最後は、試料分析の前に上側の試料面と下側の試料面との間に液体の試料が挟まれる結果になる。
【００９５】
開位置と閉位置との間のカバー（又はいくつかの実施形態ではアーム）の移動は、手動又は自動で行われる。図１（ａ），１（ｂ），及び／又は１（ｃ）を参照して、ヒンジ１１０は、上側の試料面１０１と下側の試料面１０２とが接触しているか、又は互いに対して最も近い位置にある完全な閉位置から移動可能なアーム１０５の移動を可能にする。完全な閉位置に対して１８０度以上である完全な開位置に移動するとき、移動可能なアーム１０５は、必要であれば、機械的な又は電子的な機構を用いて完全な閉位置と完全な開位置との間で固定される位置に配置されてもよい。また、移動可能なアーム１０５が、完全な開位置と完全な閉位置との間において、任意の固定可能な位置を有しないことも可能である。
【００９６】
本開示の細胞カウンタを使用するとき、液体試料からの小滴は、下側の試料面に配置される。上述したように、当該試料を載置する前に、手動又は自動で、移動可能なアームをまず移動させてもよく、又は、試料を下側の試料面に載置するとき、移動可能なアームがすでに閉位置にあるか閉位置への途中にあってもよい。下側の試料面に配置される量は変わってもよく、典型的な試料の量は、１μｌ未満、１μｌ、２μｌ、３μｌ、４μｌ、５μｌ、６μｌ、７μｌ、８μｌ、９μｌ、１０μｌ、１１μｌ、１２μｌ、１３μｌ、１４μｌ、１５μｌ、１６μｌ、１７μｌ、１８μｌ、１９μｌ、２０μｌ、２１μｌ、２２μｌ、２３μｌ、２４μｌ、２５μｌ、２６μｌ、２７μｌ、２８μｌ、２９μｌ、３０μｌ、３１μｌ、３２μｌ、３３μｌ、３４μｌ、３５μｌ、３６μｌ、３７μｌ、３８μｌ、３９μｌ、４０μｌ、４１μｌ、４２μｌ、４３μｌ、４４μｌ、４５μｌ、４６μｌ、４７μｌ、４８μｌ、４９μｌ、５０μｌ、５１μｌ、５２μｌ、５３μｌ、５４μｌ、５５μｌ、５６μｌ、５７μｌ、５８μｌ、５９μｌ、６０μｌ、６１μｌ、６２μｌ、６３μｌ、６４μｌ、６５μｌ、６６μｌ、６７μｌ、６８μｌ、６９μｌ、７０μｌ、７１μｌ、７２μｌ、７３μｌ、７４μｌ、７５μｌ、７６μｌ、７７μｌ、７８μｌ、７９μｌ、８０μｌ、８１μｌ、８２μｌ、８３μｌ、８４μｌ、８５μｌ、８６μｌ、８７μｌ、８８μｌ、８９μｌ、９１μｌ、９１μｌ、９２μｌ、９３μｌ、９４μｌ、９５μｌ、９６μｌ、９７μｌ、９８μｌ、９９μｌ、１００μｌ以上、又は任意の間の値である。
【００９７】
そして、移動可能なアームは、試料の上方に移動して戻される。細胞カウンタが調節ピンを利用するとき、アクチュエータは、上側の試料面を下側の試料面から正確な距離上方に配置して、２つの間の液体の量を閉じ込める。２つの面の間の距離又はギャップは、使用者によって加えられる量によって予め決められ、典型的なギャップは、例えば、２５μｍ未満、２５μｍ、３０μｍ、４５μｍ、５０μｍ、５５μｍ、６０μｍ、６５μｍ、７０μｍ、７５μｍ、８０μｍ、８５μｍ、９０μｍ、９５μｍ、１００μｍ、１０５μｍ、１１０μｍ、１１５μｍ、１２０μｍ、１２５μｍ、１３０μｍ、１３５μｍ、１４０μｍ、１４５μｍ、１５０μｍ、１５５μｍ、１６０μｍ、１６５μｍ、１７０μｍ、１７５μｍ、１８０μｍ、１８５μｍ、１９０μｍ、１９５μｍ、２００μｍ、２０５μｍ、２１０μｍ、２１５μｍ、２２０μｍ、２２５μｍ、２３０μｍ、２３５μｍ、２４０μｍ、２４５μｍ、２５０μｍ、２５５μｍ、２６０μｍ、２６５μｍ、２７０μｍ、２７５μｍ、２８０μｍ、２８５μｍ、２９０μｍ、２９５μｍ、３００μｍ、３０５μｍ、３１０μｍ、３１５μｍ、３２０μｍ、３２５μｍ、３３０μｍ、３３５μｍ、３４０μｍ、３４５μｍ、３５０μｍ、３５５μｍ、３６０μｍ、３６５μｍ、３７０μｍ、３７５μｍ、３８０μｍ、３８５μｍ、３９０μｍ、３９５μｍ、４００μｍ、４０５μｍ、４１０μｍ、４１５μｍ、４２０μｍ、４２５μｍ、４３０μｍ、４３５μｍ、４４０μｍ、４４５μｍ、４５０μｍ、４５５μｍ、４６０μｍ、４６５μｍ、４７０μｍ、４７５μｍ、４８０μｍ、４８５μｍ、４９０μｍ、４９５μｍ、５００μｍ、５０５μｍ、５１０μｍ、５１５μｍ、５２０μｍ、５２５μｍ、５３０μｍ、５３５μｍ、５４０μｍ、５４５μｍ、５５０μｍ、５５５μｍ、５６０μｍ、５６５μｍ、５７０μｍ、５７５μｍ、５８０μｍ、５８５μｍ、５９０μｍ、５９５μｍ、６００μｍ、６０５μｍ、６１０μｍ、６１５μｍ、６２０μｍ、６２５μｍ、６３０μｍ、６３５μｍ、６４０μｍ、６４５μｍ、６５０μｍ、６５５μｍ、６６０μｍ、６６５μｍ、６７０μｍ、６７５μｍ、６８０μｍ、６８５μｍ、６９０μｍ、６９５μｍ、７００μｍ、７０５μｍ、７１０μｍ、７１５μｍ、７２０μｍ、７２５μｍ、７３０μｍ、７３５μｍ、７４０μｍ、７４５μｍ、７５０μｍ、７５５μｍ、７６０μｍ、７６５μｍ、７７０μｍ、７７５μｍ、７８０μｍ、７８５μｍ、７９０μｍ、７９５μｍ、８００μｍ、８０５μｍ、８１０μｍ、８１５μｍ、８２０μｍ、８２５μｍ、８３０μｍ、８３５μｍ、８４０μｍ、８４５μｍ、８５０μｍ、８５５μｍ、８６０μｍ、８６５μｍ、８７０μｍ、８７５μｍ、８８０μｍ、８８５μｍ、８９０μｍ、８９５μｍ、９００μｍ、９０５μｍ、９１０μｍ、９１５μｍ、９２０μｍ、９２５μｍ、９３０μｍ、９３５μｍ、９４０μｍ、９４５μｍ、９５０μｍ、９５５μｍ、９６０μｍ、９６５μｍ、９７０μｍ、９７５μｍ、９８０μｍ、９８５μｍ、９９０μｍ、９９５μｍ、１０００μｍ以上、又は任意の間の値である。
【００９８】
より多くの又はより少ない試料の量を使用して、面上の試料を等分するように経路の高さを調節することによって、カウントされる細胞濃度のダイナミックレンジを増加させる。試料が非常に高い細胞濃度を有するとき、使用者は、例えば２μｌの少なめの量の試料の液体を下側の試料面に加え、移動可能なアームが可能な限り低い位置に移動して、少なめの試料の量を均一に広げる。逆の場合で、少ない細胞密度のとき、使用者は例えば１００μｌ以下の多めの量を、下側の試料面に加え、より正確な結果が出る細胞の総数を増加させる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、染料が試料に加えられてもよい。本細胞カウンタで用いられる例示的な蛍光染料は、限定されないが、アクリジンオレンジ（ＡＯ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）を含む。他の考えられる染料は、臭化エチジウム、赤色蛍光蛋白質、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ヘキスト（３３３４２，３３２５８，３４５８０）、カルセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセインジアセテート（ＦＤＡ）、アロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｌｃｏｃｙａｎｉｎ）を含むが、細胞検出のために用いられるいかなる蛍光染料も本細胞カウンタと相性がよい。
【０１００】
ＡＯは、生細胞の核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）と選択的に結合する蛍光染料又は染料である。ＰＩは、生細胞を積極的に除く蛍光性核酸結合性バイタル染料（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｖｉｔａｌ  ｄｙｅ）である一方、死細胞は染料を吸収する。ＡＯ及びＰＩは、総数内の生存有核細胞計数を得るために共に用いられてもよい。この分析を行うとき、ＡＯに関するエミッションフィルタを用いたもの及びＰＩに関するエミッションフィルタを用いたものの２つの蛍光性顕微鏡画像が撮られてもよい。そして、これらは、生細胞及び死細胞の最終的な計数のために重ね合わされてもよい。
【０１０１】
ＧＦＰは、細胞ゲノムに人為的に取り込まれ、興味のある遺伝子が細胞内で活性化するとき蛍光する蛍光性マーカー蛋白質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｍａｒｋｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）である。この分析では、ある条件下の蛍光性の細胞計数は、異なる条件下の制御又は細胞と比較されてもよい。
【０１０２】
限定されないが、トリパンブルー、又はエリスロシンＢを含む非蛍光性染料は、細胞カウンタによって作成される明視野画像のために用いられてもよい。トリパンブルーは、生細胞を積極的に除外するバイタル染料であり、死細胞は染料を吸収する。この染料は、集合内の生細胞と死細胞とを識別して、死（染色）細胞に対する生（非染色）細胞の数の計数を得るために、明視野顕微鏡法で用いられる。（エリスロシン又は赤色３号（Ｒｅｄ  Ｎｏ．３）でも知られている）エリスロシンＢは、生細胞を積極的に除外するバイタル染料であり、死細胞は染料を吸収する。
【０１０３】
本発明は、ここで説明し実例で示した実施形態に限定されない。添付の特許請求の範囲内で変形及び改良が可能である。
【図１（ａ）】
0006579475.tif 000002
【図１（ｂ）】
0006579475.tif 000003
【図１（ｃ）】
0006579475.tif 000004
【図２】
0006579475.tif 000005
【図３】
0006579475.tif 000006
【図４】
0006579475.tif 000007
【図５】
0006579475.tif 000008