(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から得られたサンプルにおいて腫瘍抗原セットの発現パターンを決定し、腫瘍抗原セットが発現しているとき、該患者を処置すべき患者として決定することを含む、トリプルネガティブ乳癌に対して処置すべき患者を決定する方法であって、該サンプルが癌細胞を含み、該腫瘍抗原セットがＰＲＡＭＥ、ＣＸｏｒｆ６１およびＣＡＧＥ１を含む、方法。
【請求項２】
発現パターンの決定が、腫瘍抗原の発現の定性的および／または定量的な測定を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
発現パターンの決定が、腫瘍抗原のＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現を測定することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
トリプルネガティブ乳癌において腫瘍抗原セットの発現パターンを決定するためのキットであって、該腫瘍抗原セットがＰＲＡＭＥ、ＣＸｏｒｆ６１およびＣＡＧＥ１を含み、該キットが、該腫瘍抗原セットの各腫瘍抗原またはそれをコード化する核酸に特異的に結合する反応材を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、癌、特に乳癌、とりわけトリプルネガティブ乳癌の処置に関する。より具体的には、本発明は、特定の腫瘍抗原セットを含む癌処置のための方法および手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
乳癌は、胸部組織由来の癌の一種、最も一般的には、乳管の内層由来または乳管に乳汁を供給する小葉由来の癌の一種である。時には、乳癌は転移性疾患として現れる。転移の一般的な部位には、骨、肝臓、肺および脳が含まれる。乳癌の処置は、手術、薬物療法（ホルモン療法および化学療法）、放射線治療および／または免疫療法を含み得る。
【０００３】
乳癌細胞は、３つの重要な受容体：エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、およびＨＥＲ２を有するか、または有しない。ＥＲ陽性およびＰＲ陽性の乳癌は、例えばタモキシフェン（Nolvadex）を用いて受容体を遮断するか、あるいはアロマターゼ阻害剤、例えばアナストロゾール（Arimidex）もしくはレトロゾール（フェマーラ）を用いてエストロゲンの産生を遮断する薬剤を用いて処置することができる。しかしながら、アロマターゼ阻害剤は、閉経後の患者にのみ適している。このことは、閉経後の女性で活性なアロマターゼが、閉経前の女性に多い形態とは異なっており、それ故に、これらの薬剤は、閉経前の女性で優勢なアロマターゼを阻害するのに有効ではないためである。
【０００４】
化学療法は、ステージ２−４の疾患に主に使用され、ＥＲ陰性の疾患において特に有益である。それらは、通常３−６ヶ月の間、組み合わせて使用される。最も一般的な処置剤の１つは、シクロホスファミド＋ドキソルビシン（アドリアマイシン）（ＡＣとして公知）である。ほとんどの化学療法剤は、複製または他の機序によりＤＮＡ損傷を引き起こすことによって、急速に増殖し、および／または急速に複製している癌細胞を破壊することにより作用する。これらの薬剤はまた、急速に増殖している正常細胞にも損傷を与え、深刻な副作用を引き起こす。心筋の損傷は、ドキソルビシンの最も危険な合併症である。時には、ドセタキセルのようなタキサン薬剤が追加され、該処置レジメンはＣＡＴとして知られている。タキサンは、癌細胞内で微小官を攻撃する。同等の結果をもたらす別の一般的な療法剤は、シクロホスファミド、メトトレキサート、およびフルオロウラシル（ＣＭＦ）である。
【０００５】
ＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体であるトラスツマブ（ハーセプチン）は、ＨＥＲ２遺伝子増幅／過剰発現の患者でのみ有効である。しかしながら、トラスツマブは高価であり、患者の約２％は重大な心臓損傷を被る。他のモノクローナル抗体も臨床試験の段階である。乳癌の２５から３０％は、ＨＥＲ２遺伝子の増幅またはその過剰なタンパク質産生を有している。乳癌におけるこの受容体の過剰発現は、疾患再発の増加および予後不良と関係している。
【０００６】
抗原特異的免疫療法は、患者における特異的免疫応答を増強または誘発することを目的とし、癌疾患を制御するために成功裏に用いられている。特に、Ｔ細胞は、ヒトおよび動物における細胞性免疫において中心的な役割を果たしている。特定の抗原の認識および結合は、Ｔ細胞の表面に発現したＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって仲介される。Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合して、標的細胞の表面上に提示される免疫原性ペプチド（エピトープ）と相互作用することができる。ＴＣＲの特異的結合は、増殖および成熟したエフェクターＴ細胞への分化をもたらすＴ細胞内のシグナルカスケードを誘発する。
【０００７】
本出願は、癌患者、特に乳癌患者、とりわけトリプルネガティブ乳癌患者の大部分に有用な腫瘍抗原セット（腫瘍抗原標的ポートフォリオ）の同定に関する。該腫瘍抗原標的ポートフォリオの腫瘍抗原は、癌患者の大部分において発現される腫瘍抗原を共有している。本発明により同定される腫瘍抗原標的ポートフォリオは、“既製(off the shelf)”の予め製造されたワクチンのリポジトリ（ウェアハウス）のデザインに用いられ得る。これらのワクチンは、癌患者の大部分を処置するのに有用である。
【０００８】
具体的には、本発明は、本発明により同定された腫瘍抗原標的ポートフォリオの患者特異的発現パターンの同定および該個々の発現パターンに基づく癌治療レジメンの選択、好ましくは、腫瘍抗原標的ポートフォリオの発現された腫瘍抗原を標的とする予め製造されたワクチンからの好適なワクチンの選択による癌治療レジメンの選択を含み得る。あるいは、本発明は、本発明により同定された腫瘍抗原標的ポートフォリオを標的とする予め製造されたワクチンを、好ましくは、この腫瘍抗原標的ポートフォリオの患者に特異的な発現パターンを事前に同定することなく、投与することを含み得る。
【０００９】
ワクチン接種のために、好ましくは、本発明により同定される腫瘍抗原標的ポートフォリオの腫瘍抗原由来のエピトープは、ＭＨＣ分子により提示され、そして適当なＴ細胞の刺激のために患者に提供される。一態様において、該エピトープは、全腫瘍抗原もしくはその一部の形態または該エピトープを含むポリペプチドの形態のようなより大きな単位の一部として提供され、その後、適当にプロセシングされ、ＭＨＣ分子により提示されて、該エピトープは、適当なＴ細胞の刺激のために患者の免疫系に提示される。腫瘍抗原もしくはその一部または免疫応答が誘導される腫瘍抗原標的ポートフォリオの１つもしくはそれ以上の腫瘍抗原由来の１つもしくは複数の免疫原性エピトープを含むポリペプチドのような免疫原性産物は、好ましくは、免疫原性産物をコード化するＲＮＡとして患者に投与される。特に、インビトロで転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ−ＲＮＡ）は、異なる免疫化経路によって患者に直接注入され得て、その後、トランスフェクトされた細胞中でＲＮＡが翻訳され、プロセシング後の発現産物が細胞の表面上のＭＨＣ分子上に提示されて、免疫応答を誘発し得る。可逆的な遺伝子治療の一種としてＲＮＡを用いる利点には、一過性発現および非形質転換特性が含まれる。ＲＮＡは、発現されるために核に入ることを必要とせず、さらに宿主ゲノム中に組み込まれず、それ故に、腫瘍形成の危険性が除外される。ＲＮＡを用いて達成可能なトランスフェクション効率は、比較的高い。さらに、達成されるタンパク質の量は、生理的発現のものに相当する。
【発明の概要】
【００１０】
発明の説明
発明の概要
本発明は、患者の大部分に発現されている腫瘍抗原の特定のセット（腫瘍抗原標的ポートフォリオ）を含む、癌、特に乳癌、とりわけトリプルネガティブ乳癌の処置のための方法に関する。特に、本発明は、腫瘍抗原標的ポートフォリオを標的とする癌ワクチンまたは腫瘍抗原標的ポートフォリオから選択される腫瘍抗原を投与することにより、癌患者に免疫応答を誘導するための方法に関する。好ましくは、本発明により患者に投与される癌ワクチンは、ＭＨＣが提示するエピトープが由来する該腫瘍抗原標的ポートフォリオの抗原を発現する細胞に対してＴ細胞を刺激し、プライミングし、および／または増殖させるのに適当なＭＨＣが提示するエピトープを提供する。従って、本明細書に記載のワクチンは、該抗原の１つまたはそれ以上のクラスＩ ＭＨＣの提示により特徴付けられる癌疾患に対して、好ましくは、細胞応答、好ましくは細胞傷害性Ｔ細胞活性を誘導または促進できる。
【００１１】
本発明により、免疫応答を誘導するワクチンは、好ましくは予め提供されたＲＮＡワクチンウェアハウスのような予め提供されたワクチンウェアハウスから選択される。この方法はまた、本明細書中、“既製”とも言われる。かかる予め提供されたワクチンウェアハウスは、それぞれの予め製造されたワクチン製品がＣＸｏｒｆ６１、ＣＡＧＥ１またはＰＲＡＭＥのような本明細書に記載の腫瘍抗原に対して免疫応答を誘導する、予め製造されたワクチン製品を含むセットに関する。本発明により、かかるウェアハウスは、癌患者の大部分に適用可能なように設計されている。かかるワクチンウェアハウスは、患者の大部分に適用するように選択されているため、該予め提供されたワクチンウェアハウスから、処置すべき特定の患者の癌細胞で発現される１つまたはそれ以上の腫瘍抗原に対する免疫応答を誘導し得る１つまたはそれ以上のワクチン製品を選択して、処置すべき患者のために特別に設計されたワクチン製品をさらに提供する必要性なしに、それぞれの患者の腫瘍抗原プロファイルを標的とすることが可能であり得る。かかる選択は、腫瘍抗原発現について患者を試験した後、予め提供されたワクチンウェアハウスから適当なワクチン製品を選択し、患者の癌細胞で発現される該腫瘍抗原を標的とすることによって可能となり得る。かかる選択は、患者の腫瘍のトランスクリプトーム解析（transcriptomics）／ペプチド分析に基づいて行うことができる。例えば、望ましい患者由来の腫瘍サンプルは、それらの腫瘍抗原発現パターンを分析することができる。腫瘍抗原発現パターンは、定量的、マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲおよびＩＨＣにより決定され得て、それぞれのワクチン製品は、ウェアハウスから選択され得る。処置すべき特定の患者の癌細胞で発現される１つまたは複数の腫瘍抗原に対する免疫応答を誘導し、そうして、それぞれの患者の腫瘍抗原プロファイルを標的とし得る１つまたはそれ以上のワクチン製品の予め提供されたワクチンウェアハウスからの選択は、患者の癌細胞で発現される１つまたは複数の腫瘍抗原を標的とする可能性が高い経験的データに基づいて予め提供されたワクチンウェアハウスからワクチン製品を無作為に選択することによっても達成され得る。本明細書で用いる用語“腫瘍抗原プロファイル”は、患者の癌細胞で発現される腫瘍抗原の集合を意味する。
【００１２】
患者に投与されたとき、免疫応答を誘導するためのワクチンは、好ましくは、本明細書に記載の腫瘍抗原の１つまたは複数に由来するＭＨＣにより提示されるエピトープを提供する。これらのエピトープの患者の細胞、特に抗原提示細胞による提示は、好ましくは、ＭＨＣに結合したとき、該エピトープを標的とするＴ細胞を生じ、それ故に、患者の腫瘍、好ましくは原発腫瘍ならびに腫瘍転移は、ＭＨＣにより提示されるエピトープが由来する抗原を発現し、腫瘍細胞の表面上に同じエピトープを提示する。
【００１３】
本発明のワクチンの投与は、ＭＨＣにより提示されるエピトープが由来する抗原を発現する細胞に対するＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞応答を誘発し得るＭＨＣクラスＩＩにより提示されるエピトープを提供し得る。あるいは、または加えて、本発明のワクチンの投与は、ＭＨＣにより提示されるエピトープが由来する抗原を発現する細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発し得るＭＨＣクラスＩにより提示されるエピトープを提供し得る。さらに、本発明のワクチンの投与は、１つまたはそれ以上のネオエピトープ、ならびに癌特異的な体細胞変異を含まない１つまたはそれ以上のエピトープを提供し得る。一態様において、本発明のワクチンの投与は、ＭＨＣクラスＩＩにより提示されるエピトープであり、そして／またはＭＨＣにより提示されるエピトープが由来する抗原を発現する細胞に対するＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞応答を誘発し得るネオエピトープ、ならびにＭＨＣクラスＩにより提示されるエピトープであり、そして／またはＭＨＣにより提示されるエピトープが由来する抗原を発現する細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発し得る、癌特異的な体細胞変異を含まないエピトープを提供する。
【００１４】
本発明により、本発明で同定された腫瘍抗原セットの腫瘍抗原のエピトープは、ポリエピトープポリペプチドまたはかかるポリエピトープポリペプチドをコード化するＲＮＡのような核酸としてワクチン中に存在し得る。免疫応答を誘導するための予め製造されたポリエピトープポリペプチドを使用することが意図されるとき、ポリエピトープポリペプチドは、好ましくは、患者の個々の腫瘍抗原発現パターンを決定することなく投与される。ポリエピトープポリペプチドは、実験データに基づいて、患者の癌細胞により発現される１つまたはそれ以上の腫瘍抗原を標的とする免疫応答を誘導する可能性が高い複数のエピトープを含む。この目的のために、３つのみの異なる腫瘍抗原の特定のセットが、分析されたトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）患者サンプルの９５％に当てはめるのに十分であることが実施例において実証されている。言い換えると、ＴＮＢＣ患者の９５％は、３つのみの異なる腫瘍抗原の特定のセットのうち少なくとも１つの抗原を発現する。従って、ポリエピトープポリペプチドに含まれる、該３つの異なる腫瘍抗原のそれぞれ由来の少なくとも１つのエピトープは、ＴＮＢＣ患者の９５％で免疫応答を誘発することが期待され得る。
【００１５】
本発明の一面は、腫瘍抗原セットの発現パターンを決定し、決定された発現パターンに基づいて癌治療レジメンを選択する（ここで、腫瘍抗原セットは、ＣＸｏｒｆ６１およびＣＡＧＥ１を含む）ことを含む、患者において癌を処置する方法に関する。一態様において、腫瘍抗原セットは、ＰＲＡＭＥをさらに含む。別の態様において、腫瘍抗原セットは、ＣＢＸ２、ＰＬＡＣ１、ＣＬＤＮ６、ＳＰＡＮＸ、ＭＡＧＥＡ３、ＴＰＴＥ、ＡＣＴＬ８、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ５、ＳＵＮＣ１、ＭＡＧＥＡ１０、ＬＲＲＮ１およびＭＡＧＥＡ９からなる群より選択される１つまたはそれ以上の抗原をさらに含む。
【００１６】
一態様において、発現パターンは、癌患者から得られたサンプルにおいて決定される。一態様において、サンプルは癌細胞を含む。一態様において、サンプルは、癌患者の腫瘍試料である。
【００１７】
一態様において、発現パターンの決定は、腫瘍抗原の発現の定性的および／または定量的な測定を含む。一態様において、発現パターンの決定は、腫瘍抗原のＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現の決定を含む。
【００１８】
一態様において、決定された発現パターンに基づく癌治療レジメンは、患者の癌細胞で発現される腫瘍抗原セットの腫瘍抗原を免疫療法の標的とすることを含む。一態様において、決定された発現パターンに基づく癌治療レジメンは、患者の癌細胞で発現される腫瘍抗原セットの腫瘍抗原に対して、患者において免疫応答を誘導することを含む。一態様において、免疫応答は、患者の癌細胞で発現される腫瘍抗原セットの腫瘍抗原のそれぞれの１つまたはそれ以上の免疫原性エピトープを患者に提供することにより誘導される。
【００１９】
一態様において、免疫応答は細胞応答を含む。一態様において、免疫応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞応答を含む。一態様において、細胞応答は、患者の癌細胞で発現される腫瘍抗原セットの腫瘍抗原のそれぞれの１つまたは複数のＴ細胞エピトープを提供するワクチンを患者に投与することにより誘導される。一態様において、１つまたは複数のＴ細胞エピトープは、１つまたはそれ以上のペプチドまたはポリペプチド中のワクチンに含まれ、ここで、該１つまたはそれ以上のペプチドまたはポリペプチドは、投与後に、１つまたは複数のＴ細胞エピトープを産生するために処理される。一態様において、ワクチンはＲＮＡワクチンである。一態様において、適当なプロセシングおよびＭＨＣ分子による提示後、Ｔ細胞エピトープは、適当なＴ細胞の刺激のために患者の免疫系に提示される。
【００２０】
本発明のさらなる面は、腫瘍抗原セット（ここで、腫瘍抗原セットは、ＣＸｏｒｆ６１およびＣＡＧＥ１を含む）の各腫瘍抗原を免疫療法の標的とすることを含む、患者の癌の予防または処置方法に関する。一態様において、腫瘍抗原セットはＰＲＡＭＥをさらに含む。別の態様において、腫瘍抗原セットは、ＣＢＸ２、ＰＬＡＣ１、ＣＬＤＮ６、ＳＰＡＮＸ、ＭＡＧＥＡ３、ＴＰＴＥ、ＡＣＴＬ８、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ５、ＳＵＮＣ１、ＭＡＧＥＡ１０、ＬＲＲＮ１およびＭＡＧＥＡ９からなる群より選択される１つまたはそれ以上の抗原をさらに含む。
【００２１】
一態様において、本発明の方法は、腫瘍抗原セットの各腫瘍抗原に対して患者に免疫応答を誘導することを含む。一態様において、免疫応答は、腫瘍抗原セットの各腫瘍抗原の１つまたはそれ以上の免疫原性エピトープを患者に提供することにより誘導される。
【００２２】
一態様において、免疫応答は細胞応答を含む。一態様において、免疫応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞応答を含む。一態様において、細胞応答は、患者に腫瘍抗原セットの各腫瘍抗原の１つまたは複数のＴ細胞エピトープを提供するワクチンを投与することにより誘導される。一態様において、１つまたは複数のＴ細胞エピトープは、１つまたはそれ以上のペプチドまたはポリペプチド中のワクチンに含まれ、ここで、該１つまたはそれ以上のペプチドまたはポリペプチドは、投与後に、１つまたは複数のＴ細胞エピトープを産生するために処理される。一態様において、ワクチンはＲＮＡワクチンである。一態様において、適当なプロセシングおよびＭＨＣ分子による提示後、Ｔ細胞エピトープは、適当なＴ細胞の刺激のために患者の免疫系に提示される。
【００２３】
本発明のすべての面の一態様において、癌は乳癌である。本発明の全ての面の一態様において、癌はトリプルネガティブ乳癌である。
【００２４】
本発明のさらなる面は、患者において腫瘍抗原セット（ここで、腫瘍抗原セットは、ＣＸｏｒｆ６１およびＣＡＧＥ１を含む）の各腫瘍抗原に対する免疫応答を誘導するためのワクチン製品を含むワクチン製品セットに関する。一態様において、腫瘍抗原セットはＰＲＡＭＥをさらに含む。別の態様において、腫瘍抗原セットは、ＣＢＸ２、ＰＬＡＣ１、ＣＬＤＮ６、ＳＰＡＮＸ、ＭＡＧＥＡ３、ＴＰＴＥ、ＡＣＴＬ８、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ５、ＳＵＮＣ１、ＭＡＧＥＡ１０、ＬＲＲＮ１およびＭＡＧＥＡ９からなる群より選択される１つまたはそれ以上の抗原をさらに含む。
【００２５】
一態様において、ワクチン製品は、患者に投与されたとき、腫瘍抗原セットの各腫瘍抗原の１つまたはそれ以上の免疫原性エピトープを提供する。
【００２６】
一態様において、免疫応答は細胞応答を含む。一態様において、免疫応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞応答を含む。一態様において、ワクチン製品は、患者に投与されたとき、腫瘍抗原セットの各腫瘍抗原の１つまたは複数のＴ細胞エピトープを提供する。一態様において、本発明のワクチン製品のセットは、１つまたは複数のＴ細胞エピトープを含む１つまたはそれ以上のペプチドまたはポリペプチドを含む。一態様において、適当なプロセシングおよびＭＨＣ分子による提示後、Ｔ細胞エピトープは、適当なＴ細胞の刺激のために患者の免疫系に提示される。一態様において、ワクチン製品はＲＮＡワクチンである。
【００２７】
本発明のさらなる面は、腫瘍抗原セットの発現パターンを決定するためのキットであって、該腫瘍抗原セットがＣＸｏｒｆ６１およびＣＡＧＥ１を含み、該キットが腫瘍抗原セットの各腫瘍抗原またはそれをコード化する核酸に特異的に結合する反応材を含む、キットに関する。一態様において、腫瘍抗原セットはＰＲＡＭＥをさらに含み、反応材セットはＰＲＡＭＥまたはそれをコード化する核酸に特異的に結合する反応材をさらに含む。別の態様において、腫瘍抗原セットは、ＣＢＸ２、ＰＬＡＣ１、ＣＬＤＮ６、ＳＰＡＮＸ、ＭＡＧＥＡ３、ＴＰＴＥ、ＡＣＴＬ８、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ５、ＳＵＮＣ１、ＭＡＧＥＡ１０、ＬＲＲＮ１およびＭＡＧＥＡ９からなる群より選択される１つまたはそれ以上の抗原をさらに含み、反応材セットは、該腫瘍抗原またはそれをコード化する核酸に特異的に結合する反応材をさらに含む。
【００２８】
一態様において、本発明で用いる免疫原性エピトープは、患者の癌細胞中に存在する癌特異的な体細胞変異に基づき得る患者に特異的なアミノ酸配列修飾を有し得る。従って、本発明は、（ａ）癌患者の腫瘍試料における癌特異的な体細胞変異を同定し、そして（ｂ）工程（ａ）で決定された癌特異的な体細胞変異によってもたらされる配列の改変を挿入されている免疫原性エピトープまたは該エピトープをコード化する核酸を免疫処置のために使用することを含み得る。
【００２９】
従って、患者に投与されたとき免疫応答を誘導するためのワクチンは、同定された変異または配列の相違に基づく配列変化を挿入されているエピトープを提供し得る。かかる同定された変異または配列の相違に基づく配列変化を挿入されているＭＨＣにより提示されるエピトープは、本明細書中で“ネオエピトープ”と記載されることもある。
【００３０】
本明細書に記載のワクチンは、薬学的に許容される担体を含んでいてよく、所望により安定化剤などの１つまたはそれ以上のアジュバントを含んでいてよい。ワクチンは、治療的または予防的ワクチンの形態でもよい。
【００３１】
さらなる面において、本発明は、本明細書に記載の治療法における使用のための、特に癌の治療または予防に使用するための、本明細書に記載のワクチンを提供する。
【００３２】
本明細書に記載の癌の処置は、外科的切除および／または放射線療法および／または従来の化学療法と組み合わせることができる。
【００３３】
本発明のさらなる面は、配列番号２９の核酸配列または該核酸配列の変異体を含む核酸の発現に関してサンプルをアッセイする工程を含む、腫瘍抗原ＣＸｏｒｆ６１の発現を決定するための方法に関する。従って、本発明によって、ＣＸｏｒｆ６１またはＣＸｏｒｆ６１を含む腫瘍抗原セットの発現（パターン）が決定されるとき、該決定は、配列番号２９の核酸配列または該核酸配列の変異体を含む核酸の発現に関してサンプルをアッセイする工程を含み得る。
【００３４】
本発明のさらなる面は、配列番号２９の核酸配列または該核酸配列の変異体を含む核酸の発現に関してサンプルをアッセイする工程を含む、癌の退縮、進行、経過および／または発症を診断、検出またはモニタリングすること、すなわちそれらを判定する方法に関する。
【００３５】
上記の面において、核酸の発現に関してサンプルをアッセイすることは、該核酸の発現の定性的および／または定量的な測定を含み得る。
【００３６】
従って、本発明は、患者、好ましくは、癌を有するか、癌に罹患している疑いがあるか、または癌の可能性を有する患者から単離されたサンプルにおける、配列番号２９の核酸配列または該核酸配列の変異体を含む核酸の量の検出および／または測定を含む、癌の診断、検出またはモニタリングのための方法に関する。
【００３７】
好ましくは、上記の方法は、検出されるか、またはその量が決定される核酸に特異的に結合する核酸プローブのようなリガンドの使用を含む。上記方法は、対象が癌の（増加した）発症リスクを有するかどうか、例えば処置レジメンが効果的であるかどうかを検出するために用いることができる。
【００３８】
好ましくは、本発明の方法を用いて診断、検出またはモニタリングされる癌は、卵巣癌、肺癌、胃癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、食道癌および前立腺癌からなる群より選択される。特に好ましい態様において、癌は、乳癌、とりわけトリプルネガティブ乳癌である。
【００３９】
好ましくは、本発明の方法を用いて診断、検出またはモニタリングされる癌は、癌細胞が腫瘍抗原ＣＸｏｒｆ６１を発現する癌疾患、より好ましくは癌細胞が腫瘍抗原ＣＸｏｒｆ６１を発現するか、または異常に発現するが、一方で、非癌性組織の細胞が、好ましくは、腫瘍抗原ＣＸｏｒｆ６１を発現しないか、または腫瘍抗原ＣＸｏｒｆ６１をより低レベルで発現する癌疾患である。
【００４０】
典型的には、サンプル中の標的核酸のレベル（すなわち、本発明の方法でアッセイまたは検出されるべき核酸あるいは決定されるべきその量）を、対照レベルと比較する。好ましくは、該対照レベルからのずれの度合いは、対象における癌の存在および／またはステージの指標である。対照レベルは、１つまたはそれ以上の対照サンプル（例えば、健康な組織または対象からのサンプル）において決定されるレベルであるか、または健康な組織または対象からの平均レベルであってよい。好ましくは、試験サンプルおよび（ａ）対照サンプル（複数可）は、同じ組織タイプに由来し、そして／または対照レベルは、試験されるのと同じ組織タイプの組織（試験サンプルが由来する）で決定されるレベルである。好ましくは、試験サンプルは、癌に関して診断、検出またはモニタリングされる組織に由来する。例えば、診断、検出またはモニタリングされるべき癌は乳癌であり、サンプルおよび所望により、対照サンプル（複数可）は、乳房組織に由来する。好ましくは、対照レベルと比較して、例えば癌のない患者と比べて増加した、サンプル中の標的核酸の存在または該標的核酸の量は、癌の存在またはその危険性（すなわち、癌の発症の可能性）を示す。
【００４１】
一態様において、上記の方法におけるサンプルは癌細胞を含む。一態様において、サンプルは、癌患者の腫瘍試料である。
【００４２】
本発明の方法の一態様において、サンプルは、組織または臓器が癌を有さないとき、細胞が実質的にＣＸｏｒｆ６１を発現しない組織または臓器に由来する。
【００４３】
一態様において、サンプルは、組織または臓器が癌を有さないとき、細胞が実質的にＣＸｏｒｆ６１を発現しない組織または臓器に由来し、該組織または臓器は、要すれば、癌、例えば、該組織または臓器の細胞の目視検査または培養試験により、癌に罹患していると既に診断されている。この態様において、対照レベルと比較して、例えば癌のない患者と比較して増加した、標的核酸の存在および／または標的核酸の量は、該癌が、例えば、本明細書に記載の方法および手段を用いて、ＣＸｏｒｆ６１を免疫療法の標的とすることにより処置され得ることを示唆し得る。
【００４４】
上記の方法は、好ましくは、例えば、標的核酸の絶対的および／または相対的な測定値を定量的および／または定性的に評価するのを可能にする。
【００４５】
本明細書中、核酸の検出またはその量の決定のために参照が行われるとき、実際に検出されるべき核酸または実際に決定されるべきその量は、好ましくはｍＲＮＡである。しかしながら、これは、ｍＲＮＡが検出されるか、またはｍＲＮＡの量が間接的に測定される態様も含み得ることが理解されるべきである。例えば、ｍＲＮＡは、ｃＤＮＡに変換されてもよく、ｃＤＮＡを検出するか、またはその量を決定する。ｍＲＮＡは、本明細書中、ｃＤＮＡと均等物として記載される。当業者は、ｃＤＮＡ配列がｍＲＮＡ配列と等価であり、本明細書中、同じ目的のために使用することができること、例えば、検出すべき核酸にハイブリダイズするプローブの作製に使用し得ることを理解し得る。従って、本明細書中、配列表に示す配列に対して参照が行われるとき、これは、該配列のＲＮＡ等価物を含むこともある。
【００４６】
標的核酸の検出および／またはその量の決定のための手段は、本明細書中に記載され、当業者には明らかである。
【００４７】
好ましくは、標的核酸の検出および／またはその量の決定は、（ｉ）サンプルを標的核酸に特異的に結合する物質と接触させ、そして（ｉｉ）該物質と標的核酸の複合体の形成および／またはその量の決定を検出することを含む。
【００４８】
典型的には、標的核酸の検出および／またはその量の決定は、標的核酸に特異的に結合する標識されたリガンドの使用、例えば標的核酸にハイブリダイズする標識した核酸の使用を含む。
【００４９】
本発明によって、核酸の検出またはその量の決定は、ハイブリダイゼーションまたは核酸増幅技術を含む方法のような公知の核酸検出方法を用いて行うことができる。一態様において、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロット分析を用いて、ｍＲＮＡ転写物が検出されるか、またはその量が決定される。
【００５０】
かかる核酸検出方法は、標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの使用を含み得る。好適なオリゴヌクレオチドは、典型的には、５〜数百ヌクレオチド長、より典型的には、約２０−７０ヌクレオチド長またはそれより短い長さ、さらにより典型的には、約１０−３０ヌクレオチド長で変化する。
【００５１】
本発明のモニタリング方法は、好ましくは、第一の時点における第一のサンプル中の標的核酸の検出および／またはその量の決定ならびに第二の時点でのさらなるサンプル中の標的核酸の検出および／またはその量の決定を含み、ここで、癌の退縮、進行、経過および／または発症は、２つのサンプルを比較することにより決定することができる。
【００５２】
患者から以前に採取したサンプルと比較してサンプル中の減少した標的核酸の量は、該患者における癌の退縮、良好な経過、例えば処置の成功、または発症リスクの低下を示し得る。
【００５３】
患者から以前に採取したサンプルと比較してサンプル中の増加した標的核酸の量は、該患者における癌の進行、負の経過、例えば処置の失敗、再発または転移、発症または発症リスクを示唆し得る。
【００５４】
本発明のさらなる面は、上記の方法に有用なキットに関する。これらのキットは、一態様において、標的核酸に特異的に結合するリガンド、すなわち、配列番号２９の核酸配列または該核酸配列の変異体を含む核酸を含む。特定の態様において、リガンドは、上記の標的核酸に特異的な核酸プライマーまたはプローブを含む。キットは、有益なパンフレット、例えば、本明細書に記載の方法を実施するための反応材を使用する方法を示すパンフレットを含み得る。
【００５５】
さらなる面において、本発明は、組み換え核酸分子のような核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子に関し、それらは、配列番号２９の核酸配列または該核酸配列の変異体を含む。
【００５６】
本発明はまた、本発明の核酸分子を含む宿主細胞に関する。好ましくは、そのような宿主細胞は、該核酸分子によりコード化されたタンパク質を発現する。一態様において、該宿主細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球またはマクロファージである。
【００５７】
ＣＸｏｒｆ６１および配列番号２９の核酸配列に関する上記の面および開示は、同様に、配列番号４１もしくは４２の核酸配列または該核酸配列の変異体が関係しているＣＡＧＥ１にも適用される。例えば、本発明のさらなる面は、配列番号４１もしくは４２の核酸配列または該核酸配列の変異体を含む核酸の発現に関してサンプルをアッセイする工程を含む、腫瘍抗原ＣＡＧＥ１の発現を決定するための方法に関する。
【００５８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１：乳癌における腫瘍抗原発現の分析。
【図２】図２：トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）における腫瘍抗原発現の分析。３つの腫瘍抗原ＣＸｏｒｆ６１、ＣＡＧＥ１およびＰＲＡＭＥのみの組み合わせは、分析したサンプルの９５％を示すのに十分である。
【図３】図３：乳癌サンプルにおける転写産物の分布を示すボックス・ウィスカープロット。ＣＸＯＲＦ６１の転写産物の分布（図３Ａ）、ＰＲＡＭＥの転写産物の分布（図３Ｂ）、およびＣＡＧＥ１の転写産物の分布（図３Ｃ）は、サブタイプ（全ての乳癌：腫瘍）、ＴＮＢＣサブタイプなし（乳癌：腫瘍）およびＴＮＢＣサブタイプの乳癌サンプルに区別なく示される。
【図４】図４：タンパク質レベルでのＣＸＯＲＦ６１の発現。
【図５】図５：ＣＸＯＲＦ６１、ＣＡＧＥ１およびＰＲＡＭＥの腫瘍特異性。
【図６】図６：ＣＸＯＲＦ６１についてのＴ細胞エピトープの同定。
【図７】図７：ＣＸＯＲＦ６１についてのＴ細胞エピトープとの特異性についてのＴ細胞受容体の試験。
【図８】図８：ＮＧＳ分析から予測されるＣＸｏｒｆ６１転写産物配列。公知のＣＸｏｒｆ６１配列（ＮＭ＿００１０１７９７８．３）が示される。新しく予測された配列は太字で示す。
【図９】図９：ＣＸｏｒｆ６１−ｉｓｏ１転写産物の存在は、ＰＣＲによって確認できる。ＲＴ−ＰＣＲ分析を、以下のｃＤＮＡ：１  正常精巣、２  ＭＤＡ−ＭＢ４６８、３  ＭＤＡ−ＭＢ２３１を使用して、示したプライマー（プライマー配列については、表１を参照のこと）を用いて行った。
【図１０】図１０：ＣＸｏｒｆ６１−ｉｓｏ１は、正常組織で発現されない。示された正常組織（ｎ＝６５）を、ＣＸｏｒｆ６１またはＣＸｏｒｆ６１−ｉｓｏ１に特異的なプライマーを用いてｑＲＴ−ＰＣＲにより分析した。相対的発現を、ハウスキーピング遺伝子としてＨＰＲＴを用いてΔΔＣｔ法を用いて計算した。
【図１１】図１１：ＣＸｏｒｆ６１−ｉｓｏ１は、トリプルネガティブ乳癌組織で発現される。２９個のトリプルネガティブ乳癌組織を、ＣＸｏｒｆ６１−ｉｓｏ１に特異的なプライマーを用いてｑＲＴ−ＰＣＲにより分析した。相対的発現を、ハウスキーピング遺伝子としてＨＰＲＴを用いてΔΔＣｔ法を用いて計算した。
【図１２】図１２：新たに同定されたＣＡＧＥ１エキソンの位置。対照として、ＵＣＳＣに記載されるＣＡＧＥ１構造を用いた。発現分析に用いたプライマーの位置が示されている。配列番号４５［新規エキソン１］：ライトグレー、配列番号４６［新規エキソン２］、ダークグレー。
【図１３】図１３：正常組織における新規ＣＡＧＥ１イソ型の発現。ＣＡＧＥ１−Ｔｒｏｎ１の発現（黒カラム）およびＣＡＧＥ１−Ｔｒｏｎ２の発現（灰色カラム）を、示した正常組織において、それぞれプライマー５５２７＋４７８３およびプライマー４７８２＋５５４０を用いてｑＲＴ−ＰＣＲにより分析した。陽性腫瘍組織を対照として用いた。相対的発現を、ハウスキーピング遺伝子としてＨＰＲＴを用いてΔΔＣｔ法を用いて計算した。
【図１４】図１４：癌組織における新規ＣＡＧＥ１イソ型の発現。トリプルネガティブ乳癌患者からの３４個の組織を、それぞれＣＡＧＥ１−Ｔｒｏｎ１（プライマー５５２７＋４７８３、黒カラム）およびＣＡＧＥ１−Ｔｒｏｎ２（プライマー４７８２＋５５４０、灰色カラム）に特異的なプライマーを用いてｑＲＴ−ＰＣＲにより分析した。相対的発現を、ハウスキーピング遺伝子としてＨＰＲＴを用いてΔΔＣｔ法を用いて計算した。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
発明の詳細な説明
本発明は以下に詳細に記載されるが、本発明は、本明細書に記載の特定の方法、プロトコールおよび反応材に限定されることなく、これらは変更可能であることが理解されるべきである。また、本明細書で用いられる用語は、特定の態様を説明するためのものに過ぎず、後に続く特許請求の範囲によってのみ限定され得る本発明の範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。別段の定義がされない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。
【００６１】
以下に本発明の構成要素を説明する。これらの要素は特定の態様で記載されているが、それらを任意の方法かつ任意の数で組み合わせて、さらなる態様を作成してよいことが理解されるべきである。種々の記載される実施例および好ましい態様は、本発明を明示的に記載された態様にのみ限定するものと解釈されるべきではない。本明細書は、明示的に記載する態様を任意の数の開示された要素および／または好ましい要素と組み合わせた態様を裏付け、包含するものであると理解されるべきである。さらに、本出願に記載される要素のあらゆる順序および組み合わせは、文脈中にこれと異なる記載がない限り、本出願の記載により開示されているとみなされるべきである。
【００６２】
好ましくは、本明細書で用いる用語は、“A multilingual glossary of biotechnological terms：（IUPAC Recommendations)”, H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Koelbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH−4010 Basel, Switzerlandに記載の通りに定義される。
【００６３】
本発明の実施は、特に断らない限り、当技術分野の文献に説明されている生化学、細胞生物学、免疫学、および組み換えＤＮＡ技術の常套方法を用い得る（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989を参照のこと）。
【００６４】
本明細書および添付の特許請求の範囲の全体を通して、文脈上特に断る必要がある場合を除き、用語“含む”、ならびに“含んでいる”および“包含する”などの変形は、記載された単数の材料、整数もしくは工程または複数の材料、整数もしくは工程の群を包含することを意味するが、他の単数の材料、整数もしくは工程または複数の材料、整数もしくは工程の群を除くことを意味しないことが理解され得るが、ある態様において、かかる他の単数の材料、整数もしくは工程または複数の材料、整数もしくは工程の群は除外される場合もあり、すなわち、その主旨が、記載された材料、整数もしくは工程または複数の材料、整数もしくは工程の群の包含にあると理解され得る。本発明を記載する文脈において（とりわけ、添付の特許請求の範囲と関連して）使用される用語“ａ”および“ａｎ”および“ｔｈｅ”ならびに同様の言及は、本明細書に特に断るか、または文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、単数と複数の両方を包含するように解釈されるべきである。本明細書中、値の範囲の列挙は、その範囲内に含まれる個々の値について個別に言及する簡略化された方法であることを意図しているに過ぎない。本明細書中に特に断らない限り、それぞれの個々の値は、本明細書に個別に記載されているかのように本明細書中に組み込まれる。
【００６５】
本明細書に記載の全ての方法は、本明細書に特に断るか、または文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書に記載の任意および全ての実施例、または例示的表現（例えば、“のような（などの）”）の使用は、本発明をよりよく説明することを意図しているに過ぎず、特に断らない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中の用語は、本発明の実施に不可欠な特許請求の範囲に記載されていない要素を示していると解釈されるべきものはない。
【００６６】
いくつかの文献が本明細書全体を通して引用されている。本明細書に引用される各文献（全ての特許、特許出願、科学文献、業者の仕様書、説明書などを含む）は、上記または下記にかかわらず、その内容全体を引用により本明細書中に包含させる。本発明が先行発明を理由としてそれらの開示に先行する権利がないと認めるものとして解釈すべき文言は、本明細書中にはない。
【００６７】
本発明により、用語“ペプチド”は、２以上、好ましくは３以上、好ましくは４以上、好ましくは６以上、好ましくは８以上、好ましくは１０以上、好ましくは１３以上、好ましくは１６以上、好ましくは２１以上のアミノ酸を含む物質を意味し、好ましくは、ペプチド結合により共有結合した、８、１０、２０、３０、４０もしくは５０までの、特に１００アミノ酸を含む物質を意味する。用語“ポリペプチド”または“タンパク質”は、大きなペプチド、好ましくは１００アミノ酸残基以上のペプチドを意味するが、一般的に、用語“ペプチド”、”ポリペプチド”および“タンパク質”は同義語であり、本明細書において互換的に用いられる。
【００６８】
本発明によれば、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に関して、用語“修飾”は、野生型ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列のような親配列と比較して、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質における配列の変化に関する。該用語は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸富化変異体、アミノ酸欠失変異体およびアミノ酸置換変異体、好ましくはアミノ酸置換変異体を含む。これらの全ての配列の変化は、新しいエピトープを創造する可能性がある。
【００６９】
アミノ酸挿入変異体は、特定のアミノ酸配列内の単一または複数のアミノ酸の挿入を含みむ。
【００７０】
アミノ酸付加改変体は、１、２、３、４もしくは５、またはそれ以上のアミノ酸のような１つまたはそれ以上のアミノ酸のアミノ末端および／またはカルボキシ末端融合体を含む。
【００７１】
アミノ酸欠失変異体は、１、２、３、４もしくは５、またはそれ以上のアミノ酸の除去によるような、配列からの１つまたはそれ以上のアミノ酸の除去により特徴付けられる。
【００７２】
アミノ酸置換変異体は、除去される配列中の少なくとも１つの残基およびその位置に挿入される別の残基により特徴付けられる。
【００７３】
用語“由来する”は、本発明によれば、特定の要素、特に特定のペプチド配列が、それが由来する対象中に存在することを意味する。アミノ酸配列、とりわけ特定の配列領域の場合には、“由来する”は、特に関連するアミノ酸配列が、それが存在するアミノ酸配列から誘導される誘導されることを意味する。
【００７４】
用語“免疫応答”は、抗原または抗原を発現する細胞のような標的に対する統合された身体反応を意味し、好ましくは、細胞性免疫応答または細胞性ならびに体液性免疫応答を意味する。免疫応答は、保護的／防御的／予防的および／または治療的応答であり得る。
【００７５】
“免疫応答を誘導すること”は、誘導前には免疫応答がなかったことを意味するが、誘導前にある程度のレベルの免疫応答があり、誘導後に該免疫応答が増強されることもまた意味する。従って、“免疫応答を誘導すること”は、“免疫応答を増強すること”も含む。好ましくは、対象において免疫応答を誘導した後に、該対象が癌疾患のような疾患の発症から保護されるか、または疾患状態が免疫応答を誘導することにより改善される。例えば、腫瘍抗原に対する免疫応答は、癌疾患を有する患者または癌疾患を発症する危険がある対象において誘導され得る。この場合、免疫応答を誘導することは、対象の疾患状態が改善されること、対象が転移を発症しないこと、または癌疾患を発症する危険がある対象が癌疾患を発症しないことを意味し得る。
【００７６】
本発明により、ＣＸｏｒｆ６１、ＣＡＧＥ１および／またはＰＲＡＭＥのような特定の腫瘍抗原に関連して“〜に対する免疫応答を誘導すること”は、好ましくは、患者に、免疫応答、好ましくは該腫瘍抗原または該腫瘍抗原を発現および／または提示する癌細胞のような細胞に対するＴ細胞応答を誘導する能力に関する。従って、腫瘍抗原に対する免疫応答を誘導するためのワクチンは、腫瘍抗原またはその一部、特に腫瘍抗原の免疫原性エピトープを含む部分を含むポリペプチドのような、腫瘍抗原の１つまたはそれ以上の免疫原性エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドを含んでいてよい。特に好ましい一態様において、本発明のかかるペプチドまたはポリペプチドは、核酸、好ましくはインビトロで転写または合成されたＲＮＡのようなＲＮＡの形態で患者に投与され、それは、抗原提示細胞のような患者の細胞において発現されて、ペプチドまたはポリペプチドを産生し得る。
【００７７】
用語“細胞性免疫応答”および“細胞応答”または類似の用語は、“ヘルパー”または“キラー”のいずれかとして作用するＴ細胞またはＴ−リンパ球を含む、抗原をクラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣと共に提示することを特徴とする細胞による免疫応答を意味する。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞とも言う）は、免疫応答を調節することにより中心的な役割を果たし、キラー細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＴＬとも言う）は、多くの疾患細胞の産生を阻止しながら、癌細胞のような疾患細胞を殺す。好ましい態様において、本発明は、１つまたはそれ以上の腫瘍抗原を発現する、好ましくはかかる腫瘍抗原をクラスＩ ＭＨＣと共に提示する腫瘍細胞に対する抗腫瘍ＣＴＬ応答の刺激を伴う。
【００７８】
本発明の“抗原”は、抗体またはＴ−リンパ球（Ｔ細胞）との特異的な反応のような免疫応答の標的であり、および／または該応答を誘導する任意の物質、好ましくはペプチドまたはタンパク質を含む。好ましくは、抗原は、Ｔ細胞エピトープのような少なくとも１つのエピトープを含む。好ましくは、本発明の文脈における抗原は、要すればプロセシング後に、好ましくは抗原（抗原を発現する細胞を含む）に特異的な免疫応答を誘導する分子である。抗原またはそのＴ細胞エピトープは、ＭＨＣ分子に関連して、好ましくは細胞により、好ましくは疾患細胞、特に癌細胞を含む抗原提示細胞により提示され、その結果、抗原（抗原を発現する細胞を含む）に対する免疫応答がもたらされる。
【００７９】
一態様において、抗原は、腫瘍抗原（本明細書中、腫瘍により発現される抗原とも言う）、すなわち、細胞質、細胞表面または細胞核から誘導され得る腫瘍細胞において発現されるタンパク質またはペプチドのような腫瘍細胞の一部、特に主に腫瘍細胞の細胞内に生じるか、または表面抗原として生じるものである。例えば、腫瘍抗原には、ＣＸｏｒｆ６１、ＣＡＧＥ１およびＰＲＡＭＥが含まれる。本発明によれば、腫瘍抗原には、好ましくは腫瘍または癌ならびに腫瘍細胞または癌細胞で発現され、要すればそれらのタイプおよび／または発現レベルに関して特徴的な任意の抗原、すなわち、腫瘍関連抗原が含まれる。一態様において、用語“腫瘍関連抗原”は、通常の状態では、限られた数の組織および／または臓器で、または特定の発達段階で特異的に発現するタンパク質に関し、例えば、腫瘍関連抗原は、通常の状態では、胃組織、好ましくは胃粘膜、生殖器官、例えば精巣、絨毛組織、例えば胎盤、または生殖系列細胞で特異的に発現される場合があり、１つ以上の腫瘍または癌組織で発現されるか、または異常に発現する。本明細書中、“限られた数”とは、好ましくは、３以下、より好ましくは２以下を意味する。本発明の文脈において、腫瘍抗原には、例えば、分化抗原、好ましくは細胞タイプ特異的な分化抗原、すなわち、通常の状態では、特定の細胞タイプの特定の分化段階で特異的に発現されるタンパク質、癌／精巣抗原、すなわち、通常の状態では、精巣および時には胎盤で特異的に発現するタンパク質、ならびに生殖系列特異的な抗原が含まれる。好ましくは、腫瘍抗原または腫瘍抗原の異常な発現によって癌細胞が同定される。本発明の文脈において、対象、例えば、癌疾患に罹患している患者において癌細胞が発現する腫瘍抗原は、好ましくは、該対象の自己タンパク質である。好ましい態様において、本発明の文脈における腫瘍抗原は、通常の状態では、必須でない組織または臓器、すなわち、免疫系により損傷を受けたとき、対象の死をもたらさない組織または臓器、あるいは免疫系が到達できないか、またはほとんど到達できない臓器または身体構造において特異的に発現する。
【００８０】
本発明により、用語“腫瘍抗原”、“腫瘍により発現される抗原”、“癌抗原”および“癌により発現される抗原”は均等であり、本明細書において互換的に用いられる。
【００８１】
用語“ＣＸｏｒｆ６１”は、配列表の配列番号３のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の変異体を含む、好ましくはそれからなるタンパク質、ならびに該タンパク質をコード化する遺伝子に関する。本発明によれば、配列表の配列番号１０または１１のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の変異体を含む、好ましくはそれからなるペプチドは、ＣＸｏｒｆ６１を発現する細胞に対する免疫応答を誘発するためのＴ細胞エピトープとして有用である。
【００８２】
用語“ＣＡＧＥ１”は、配列表の配列番号４、５、６、７、８、４３もしくは４４、好ましくは、配列番号４、５、６、７もしくは８のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の変異体を含む、好ましくはそれからなるタンパク質、ならびに該タンパク質をコード化する遺伝子に関する。
【００８３】
用語“ＰＲＡＭＥ”は、配列表の配列番号９のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の変異体を含む、好ましくはそれからなるタンパク質、ならびに該タンパク質をコード化する遺伝子に関する。本発明によれば、配列表の配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３もしくは２４のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の変異体を含む、好ましくは、それからなるペプチドは、ＰＲＡＭＥを発現する細胞に対する免疫応答を誘発するためのＴ細胞エピトープとして有用である。
【００８４】
本発明によれば、用語“新生抗原”とは、親抗原と比較して１つまたはそれ以上のアミノ酸修飾を含む抗原に関する。例えば、新生抗原は、腫瘍関連新生抗原であってもよく、ここで、用語“腫瘍関連新生抗原”は、腫瘍特異的変異によるアミノ酸修飾を含むペプチドまたはタンパク質を含む。
【００８５】
本発明によれば、用語“腫瘍特異的変異”または“癌特異的変異”は、腫瘍または癌細胞の核酸に存在するが、対応する正常細胞、すなわち、非腫瘍性細胞または非悪性細胞の核酸には存在しない、体細胞変異に関する。用語“腫瘍特異的変異”および“腫瘍変異(tumor mutation)”ならびに用語“癌特異的変異”および“癌変異(cancer mutation)”は、本明細書において互換的に用いられる。
【００８６】
本発明によれば、用語“腫瘍抗原陽性癌”または“腫瘍抗原陽性腫瘍”または類似の用語は、腫瘍抗原を発現する癌細胞または腫瘍細胞を含む癌または腫瘍を意味する。
【００８７】
用語“免疫原性”は、好ましくは、癌に対する処置のような治療的処置に関連する免疫応答を誘導するために相対的有効性に関する。本明細書で用いる用語“免疫原性”は、免疫原性を有する特性に関する。例えば、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の文脈で使用されるとき、用語“免疫原性”は、該ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質によって引き起こされる、および／またはそれらに対して向けられる免疫応答を誘導するために、該ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の有効性に関する。
【００８８】
本発明により、腫瘍抗原のような抗原の標的化免疫療法は、該抗原を発現する細胞および要すれば、ＭＨＣ分子に関連して該抗原を提示する細胞を含む、該抗原を標的とする免疫応答または免疫反応を生じさせる任意の手段によって行われ得る。かかる標的化免疫療法は、抗原を発現する細胞および要すれば該抗原を提示する細胞の選択的死滅のために提供され、それ故に、該抗原を発現していない正常細胞および要すれば該抗原を提示していない細胞に対する悪影響を最小にする。
【００８９】
本発明により、用語“標的化免疫療法”は、特に、腫瘍抗原（複数可）を発現する細胞および要すれば癌細胞のような腫瘍抗原（複数可）を提示する細胞のような疾患細胞を優先的に標的化するが、腫瘍抗原（複数可）を発現していない非疾患細胞は標的としないか、またはより低い程度で標的化するために使用され得る、免疫系、その構成要素または免疫機構を伴う任意の治療法に関する。疾患細胞の標的化は、好ましくは、該細胞の死および／または疾患細胞の増殖または生存性の抑制をもたらす。
【００９０】
本発明により、能動および／または受動免疫療法の戦略が、標的化免疫療法のために想定される。能動免疫療法の戦略は、患者において抗原に特異的なＴ細胞であって、疾患細胞を特異的に認識して死滅させることができるＴ細胞を誘導すること、すなわち活性化または感作すること、および増殖させることを目的とし得る。タンパク質、ペプチドまたはＲＮＡのような核酸を含む種々の抗原形態を腫瘍ワクチン接種に使用することができ、それらは、直接インビボで適用可能であるか、または患者への移入後にＤＣのパルス処理によりインビトロで適用することができる。能動免疫療法の戦略は、例えば、リンパ系細胞、特にＴ細胞のような、免疫反応性細胞の養子免疫伝達に依存する。Ｔ細胞は、腫瘍抗原（ＭＨＣ分子に関連して提示される）を特異的に標的化する所定の抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するようにインビトロで操作されていてもよい。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖をコード化するＲＮＡのような核酸を、Ｔ細胞に導入することができる。好適な態様において、ＴＣＲαおよびβ鎖は、抗原特異的Ｔ細胞株からクローニングされ、養子Ｔ細胞療法に使用される。Ｔ細胞受容体は、好ましくは、抗原に由来し、かつＭＨＣ分子に関連して提示されるペプチドフラグメントに対する特異性を含む、抗原に対する特異性を有する。一般的に、Ｔ細胞受容体は、ＭＨＣに関連して提示される抗原ペプチドを認識するか、それに結合する。Ｔ細胞受容体のα鎖およびβ鎖をコード化する核酸は、発現ベクターなどの別個の核酸分子上に含まれていてもよいし、あるいは単一の核酸分子であってもよい。従って、用語“Ｔ細胞受容体をコード化する核酸”は、同じ核酸分子上の、または好ましくは異なる核酸分子上の、Ｔ細胞受容体鎖をコード化する核酸分子に関する。本発明によれば、Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボで刺激され、増幅され、および／または増殖し得る。本発明の処置に用いられるＴ細胞は、処置される対象にとって自己、同種異系、または同系であり得る。
【００９１】
養子細胞移入（ＡＣＴ）に基づく免疫療法は、レシピエントに移入されるか、または低い前駆体頻度から臨床的に妥当な細胞数までエクスビボで拡大した後に自己宿主に移入される、予め感作された細胞、特にＴ細胞による受動免疫の一形態であると、広く定義することができる。Ｔ細胞の抗原特異性は専らＴＣＲα鎖およびβ鎖のヘテロ二量体複合体に基づいているので、Ｔ細胞へのクローン化ＴＣＲ遺伝子の移入は、それらを任意の目的抗原にリダイレクトすることを潜在的に可能にする。それ故に、ＴＣＲ遺伝子治療は、治療の選択肢として自己リンパ球を用いる抗原特異的免疫療法を開発するための魅力的な戦略を提供する。
【００９２】
免疫療法戦略の他の形態は、そのままの、または細胞毒素もしくは放射性核種のような治療部分（therapeutic moiety）に連結されている抗体、抗体フラグメント、または抗体誘導体による、疾患細胞上の細胞表面抗原（複数可）のような疾患関連抗原（複数可）の標的化を含み得る。治療部分に連結されていない抗体、抗体フラグメント、または抗体誘導体は、例えば補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することにより、腫瘍細胞を破壊するために患者の免疫系を動員して作用し得る。
【００９３】
抗体を含む戦略は、能動および／または受動免疫療法戦略として適用され得る。
【００９４】
用語“主要組織適合遺伝子複合体”およびその略語“ＭＨＣ”には、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子が含まれ、これは、全ての脊椎動物に見出される遺伝子の複合体に関する。ＭＨＣタンパク質またはＭＨＣ分子は、免疫反応におけるリンパ球と抗原提示細胞または疾患細胞との間のシグナリングにとって重要であり、ここで、ＭＨＣタンパク質またはＭＨＣ分子がペプチドに結合し、Ｔ細胞受容体による認識のために、それらを提示する。ＭＨＣによってコード化されているタンパク質は、細胞の表面に発現され、自己抗原（細胞自身に由来するペプチドフラグメント）と非自己抗原（例えば、侵入した微生物のフラグメント）を両方ともＴ細胞に提示する。
【００９５】
ＭＨＣ領域は、３つのサブクラス、クラスＩ、クラスＩＩ、およびクラスＩＩＩに分類される。ＭＨＣクラスＩタンパク質は、α鎖とβ２−ミクログロブリン（ＭＨＣの一部ではなく１５番染色体によってコードされている）を含んでいる。これらは抗原フラグメントを細胞傷害性Ｔ細胞に提示する。大半の免疫系細胞において、特に抗原提示細胞において、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質はα鎖およびβ鎖を含んでおり、これらは、抗原フラグメントをヘルパーＴ細胞に提示する。ＭＨＣクラスＩＩＩ領域は、補体成分およびサイトカインをコードするものなどの他の免疫構成要素をコード化している。
【００９６】
ＭＨＣは、多遺伝子型（数種のＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ遺伝子がある）および多型（各遺伝子の複数のアレルが存在する）の両方である。
【００９７】
本明細書で用いる用語“ハプロタイプ”は、１つの染色体上に見出されるＨＬＡアレルおよびそれによりコード化されるタンパク質を意味する。ハプロタイプはまた、ＭＨＣ内の任意の１つの遺伝子座に存在するアレルを意味する。ＭＨＣの各クラスは、いくつかの遺伝子座で示され、例えば、クラスＩに関して、ＨＬＡ−Ａ（ヒト白血球抗原−Ａ）、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−Ｈ、ＨＬＡ−Ｊ、ＨＬＡ−Ｋ、ＨＬＡ−Ｌ、ＨＬＡ−ＰおよびＨＬＡ−Ｖ、ならびにクラスＩＩに関して、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１−９、ＨＬＡ−、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−ＤＭＢ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、およびＨＬＡ−ＤＯＢである。用語“ＨＬＡアレル”および“ＭＨＣアレル”は、本明細書中、互換的に用いられる。
【００９８】
ＭＨＣは、高度な多型を示す。ヒト集団内では、各遺伝子座に、異なるアレルを含む多数のハプロタイプが存在する。クラスＩおよびクラスＩＩの両方の異なる多型ＭＨＣアレルは、異なるペプチド特異性を有する。各アレルは、特定の配列パターンを示すペプチドに結合するタンパク質をコード化している。
【００９９】
本発明の全ての面の１つの好ましい態様において、ＭＨＣ分子はＨＬＡ分子である。
【０１００】
本発明により、用語“ＭＨＣ結合ペプチド”は、ＭＨＣクラスＩおよび／もしくはクラスＩＩに結合するペプチドまたはＭＨＣクラスＩおよび／もしくはクラスＩＩに結合するペプチドを生成するためにプロセシングされ得るペプチドを含む。クラスＩＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には、８−１２、好ましくは８−１０アミノ酸長であるが、これより長いまたは短いペプチドも有効であり得る。クラスＩＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には、９−３０、好ましくは１０−２５アミノ酸長であり、特に１３−１８アミノ酸長であるが、これより長いペプチドおよび短いペプチドも有効であり得る。
【０１０１】
ペプチドを直接提示させる場合、すなわち、プロセシングされることなく、特に切断されることなく提示させる場合、それは、ＭＨＣ分子、特にクラスＩ ＭＨＣ分子に結合するのに適する長さを有し、好ましくは７−３０アミノ酸長、例えば７−２０アミノ酸長、より好ましくは、７−１２アミノ酸長、より好ましくは、８−１１アミノ酸長、特に９または１０アミノ酸長である。
【０１０２】
ペプチドが、さらなる配列を含むより大きな要素の一部であって、例えばワクチン配列またはポリペプチドであり、プロセシング後、特に切断後に提示される場合、プロセシングによって生成されたペプチドは、ＭＨＣ分子、特にクラスＩ ＭＨＣ分子に結合するのに適する長さを有し、好ましくは７−３０アミノ酸長、例えば７−２０アミノ酸長、より好ましくは、７−１２アミノ酸長、より好ましくは、８−１１アミノ酸長、特に９または１０アミノ酸長である。好ましくは、プロセシング後に提示されるペプチドは、ワクチン接種に用いる抗原またはポリペプチドのアミノ酸配列に由来し、すなわち、その配列は抗原またはポリペプチドのフラグメントに実質的に対応し、好ましくは、抗原またはポリペプチドのフラグメントと完全に同一である。
【０１０３】
従って、一態様におけるＭＨＣ結合ペプチドは、抗原のフラグメントに実質的に対応し、好ましくは抗原のフラグメントと完全に同一の配列を含む。
【０１０４】
用語“エピトープ”は、抗原などの分子中の抗原性決定基、すなわち、特にＭＨＣ分子との関連において提示されたときに、免疫系、例えばＴ細胞によって認識される分子の一部またはフラグメントを意味する。腫瘍抗原などのタンパク質のエピトープは、好ましくは、該タンパク質の連続部分または不連続部分を含み、好ましくは５から１００、好ましくは５から５０、より好ましくは８から３０、最も好ましくは１０から２５アミノ酸長であって、例えば、エピトープは、好ましくは、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長であり得る。本発明との関連において、エピトープはＴ細胞エピトープであることが、特に好ましい。
【０１０５】
本発明によれば、エピトープは、細胞表面上のＭＨＣ分子などのＭＨＣ分子に結合し得るため、“ＭＨＣ結合ペプチド”であり得る。
【０１０６】
本明細書で用いる用語“ネオエピトープ”は、正常な非癌性細胞または生殖系列細胞のような対照には存在しないが、癌細胞に見出されるエピトープを意味する。これには、特に、正常な非癌性細胞または生殖系列細胞において、対応するエピトープが見出されが、癌細胞における１つまたは複数の変異によって、エピトープの配列がネオエピトープとなるように変化している状況が含まれる。
【０１０７】
本明細書で用いる用語“Ｔ細胞エピトープ”は、Ｔ細胞受容体によって認識される立体構造でＭＨＣ分子に結合するペプチドを意味する。典型的には、Ｔ細胞エピトープは、抗原提示細胞の表面上に提示される。
【０１０８】
本発明によれば、Ｔ細胞エピトープは、２以上のＴ細胞エピトープを含むワクチン配列および／またはポリペプチドのようなより大きな要素の一部として該ワクチン中に存在し得る。提示されたペプチドまたはＴ細胞エピトープは、適当なプロセシング後に生成される。
【０１０９】
Ｔ細胞エピトープは、ＴＣＲ認識またはＭＨＣとの結合のために必ずしも必要ではない１つまたはそれ以上の残基で修飾されていてよい。かかる修飾されたＴ細胞エピトープは、免疫学的に等価であるとみなされ得る。
【０１１０】
好ましくは、ＭＨＣによって提示され、Ｔ細胞受容体によって認識されるとき、Ｔ細胞エピトープは、適当な共刺激シグナルの存在下で、ペプチド／ＭＨＣ−複合体を特異的に認識するＴ細胞受容体を保有するＴ細胞のクローン増殖を誘導することができる。
【０１１１】
好ましくは、Ｔ細胞エピトープは、抗原フラグメントのアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含む。好ましくは、抗原の該フラグメントは、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ提示ペプチドである。
【０１１２】
本発明のＴ細胞エピトープは、好ましくは、抗原、または抗原を発現することにより、好ましくは疾患細胞、特に癌細胞などの抗原提示により特徴付けられる細胞に対する免疫応答、好ましくは細胞応答を刺激し得る抗原の一部またはフラグメントに関する。好ましくは、Ｔ細胞エピトープは、クラスＩ ＭＨＣによる抗原の提示により特徴付けられる細胞に対する細胞応答を刺激することができ、好ましくは抗原応答性細胞傷害性Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ）を刺激することができる。
【０１１３】
“抗原プロセシング”または“プロセシング”は、細胞、好ましくは抗原提示細胞によって特定のＴ細胞に提示するための、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のフラグメントであるプロセシング産物への該ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の分解（例えば、ポリペプチドのペプチドへの分解）、およびこれらのフラグメントの１つまたはそれ以上の結合（例えば、結合による）ＭＨＣ分子との会合を意味する。
【０１１４】
“抗原提示細胞”（ＡＰＣ）は、タンパク質抗原のペプチドフラグメントをＭＨＣ分子との関連においてその細胞表面上に提示する細胞である。いくつかのＡＰＣは、抗原特異的Ｔ細胞を活性化し得る。
【０１１５】
プロフェッショナル抗原提示細胞は、極めて効率よく、貪食によってまたは受容体媒介性エンドサイトーシスによって抗原を内部に取り込み、次に、クラスＩＩ ＭＨＣ分子に結合した抗原のフラグメントを、その膜上に提示する。Ｔ細胞は、抗原提示細胞の膜上の抗原−クラスＩＩ ＭＨＣ分子複合体を認識し、それと相互作用する。次いで、さらなる共刺激シグナルが抗原提示細胞によって生産され、それがＴ細胞の活性化をもたらす。共刺激分子の発現は、プロフェッショナル抗原提示細胞の決定的特徴である。
【０１１６】
プロフェッショナル抗原提示細胞の主なタイプは、抗原提示の範囲が最も広くおそらく最も重要な抗原提示細胞である樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および任意の活性化上皮性細胞である。樹状細胞（ＤＣ）は、末梢組織において補足された抗原をＭＨＣクラスＩＩおよびＩ抗原提示経路の両方によってＴ細胞に提示する白血球集団である。樹状細胞が免疫応答の強力な誘導因子であり、これらの細胞の活性化が、抗腫瘍免疫の誘導にとって決定的に重要なステップであることは、よく知られている。樹状細胞は、便宜上、“未成熟”細胞と“成熟”細胞とに分類され、これを、２つの詳しく特徴づけられた表現型を見分ける簡単な方法として使用することができる。しかしながら、この命名法を、分化の考えられる全ての中間段階を排除するものであると解釈してはならない。未成熟樹状細胞は、高い抗原取り込みおよびプロセシング能（これはＦｃγ受容体およびマンノース受容体の高発現と相関する）を有する抗原提示細胞として特徴づけられる。成熟表現型は、典型的には、これらのマーカーの低発現と、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ、接着分子（例えば、ＣＤ５４およびＣＤ１１）および共刺激分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６および４−１ ＢＢ）などといったＴ細胞活性化を担う細胞表面分子の高発現とを特徴とする。樹状細胞成熟は、その抗原提示樹状細胞がＴ細胞プライミングにつながるような樹状細胞活性化の状態とみなされ、一方、未熟樹状細胞による提示は寛容をもたらす。樹状細胞成熟は、主として、先天性受容体によって検出される微生物特性を有する生体分子（細菌ＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、エンドトキシンなど）、炎症促進性サイトカイン（ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＦＮ）、ＣＤ４０Ｌによる樹状細胞表面のＣＤ４０のライゲーション、およびストレス性細胞死を起こしている細胞が放出する物質によって引き起こされる。樹状細胞は、骨髄細胞をインビトロで顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および腫瘍壊死因子アルファなどのサイトカインと共に培養することによって派生させることができる。
【０１１７】
非プロフェッショナル抗原提示細胞は、ナイーブＴ細胞との相互作用に必要なＭＨＣクラスＩＩタンパク質を構成的には発現せず、これらは、ＩＦＮγなどの任意のサイトカインによって非プロフェッショナル抗原提示細胞が刺激されたときにのみ発現する。
【０１１８】
抗原提示細胞は、提示されるべきペプチドまたは該ペプチドを含むポリペプチドをコードする核酸、好ましくはＲＮＡ、例えばワクチン接種に使用する抗原またはポリペプチドをコードする核酸を、細胞に導入することにより、ＭＨＣクラスＩ提示ペプチドを負荷することができる。
【０１１９】
いくつかの態様において、樹状細胞または他の抗原提示細胞を標的とする核酸送達ビークルを含む医薬組成物またはワクチンを患者に投与して、インビボでトランスフェクションを起こさせてもよい。樹状細胞のインビボでのトランスフェクションは、例えば、一般に、当技術分野において知られている任意の方法、例えばＷＯ９７／２４４４７に記載の方法、またはMahvi et al., Immunology and cell Biology 75: 456−460, 1997に記載の遺伝子銃アプローチを用いて実施可能である。
【０１２０】
本発明により、用語“抗原提示細胞”は標的細胞も含む。
【０１２１】
“標的細胞”は、細胞免疫応答のような免疫応答の標的である細胞を意味し得る。標的細胞は、抗原、すなわち、抗原に由来するペプチドフラグメントを提示する細胞を含み、癌細胞のような望ましくない細胞を含む。好ましい態様において、標的細胞は、本明細書に記載の抗原を提示する細胞、好ましくはクラスＩ ＭＨＣにより該抗原を提示する細胞である。
【０１２２】
用語“一部(部分)”は、断片（fraction）を意味する。アミノ酸配列またはタンパク質などの特定の構造に関して、用語“その一部(部分)”は、該構造の連続的または不連続的断片を示し得る。好ましくは、アミノ酸配列の一部は、該アミノ酸配列のアミノ酸の少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を含む。好ましくは、部分が不連続断片である場合、前記不連続断片は、ある構造の２、３、４、５、６、７、８個またはそれ以上のパーツから構成され、各パーツはその構造の連続的要素である。例えば、アミノ酸配列の不連続断片は、該アミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８個またはそれ以上の、好ましくは４個以下のパーツから構成され得て、ここで、各パーツは、好ましくは、該アミノ酸配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸、少なくとも１０個の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも２０個の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも３０個の連続するアミノ酸を含む。
【０１２３】
用語“パーツ（ｐａｒｔ）”および“フラグメント”は、本明細書におて互換的に用いられ、連続的要素を意味する。例えば、アミノ酸配列またはタンパク質などの構造のパーツとは、該構造の連続的要素を指す。ある構造の部分、パーツまたはフラグメントは、好ましくは、該構造の１つまたはそれ以上の機能的特性を含む。例えば、エピトープ、ペプチドまたはタンパク質の部分、パーツまたはフラグメントは、好ましくは、それが由来するエピトープ、ペプチドまたはタンパク質と免疫学的に等価である。本発明との関連において、アミノ酸配列などの構造の“パーツ”は、好ましくは、その構造またはアミノ酸配列全体の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％を含み、好ましくはそれらからなる。
【０１２４】
本発明の文脈中、用語“免疫反応性細胞”は、免疫反応中にエフェクター機能を発揮する細胞に関する。“免疫反応性細胞”は、好ましくは、抗原または抗原もしくはそのペプチドフラグメント（例えば、Ｔ細胞エピトープ）の提示を特徴とする細胞に結合することができ、免疫応答を媒介することができる。例えば、そのような細胞は、サイトカインおよび／またはケモカインを分泌し、抗体を分泌し、癌性細胞を認識し、場合によってはそのような細胞を排除する。例えば、免疫反応性細胞には、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージ、および樹状細胞が含まれる。好ましくは、本発明との関連において、“免疫反応性細胞”は、Ｔ細胞、好ましくはＣＤ４＋および/またはＣＤ８＋ Ｔ細胞である。
【０１２５】
好ましくは、“免疫反応性細胞”は、抗原またはそのペプチドフラグメントを、特にそれが抗原提示細胞または癌細胞などの疾患細胞の表面上などにＭＨＣ分子との関連において提示されている場合には、ある程度の特異性を持って認識する。好ましくは、該認識は、抗原またはそのペプチドフラグメントを認識する細胞が、応答性または反応性であることを可能にする。細胞が、ＭＨＣクラスＩＩ分子との関連において抗原またはそのペプチドフラグメントを認識する受容体を保持するヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）である場合、かかる応答性または反応性は、サイトカインの放出および／またはＣＤ８＋ リンパ球（ＣＴＬ）および／またはＢ細胞の活性化を伴い得る。細胞がＣＴＬである場合、かかる応答性または反応性は、ＭＨＣクラスＩ分子との関連において提示された細胞、すなわちクラスＩ ＭＨＣによる抗原の提示を特徴とする細胞の、例えばアポトーシスまたはパーフォリン媒介性細胞溶解などによる排除を伴い得る。本発明によれば、ＣＴＬ応答性には、持続的カルシウム流束、細胞分裂、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αなどのサイトカインの生産、ＣＤ４４およびＣＤ６９などの活性化マーカーの上方制御、ならびに抗原発現標的細胞の特異的な細胞溶解性死滅が含まれ得る。ＣＴＬ応答性は、ＣＴＬ応答性を正確に示す人工的レポーターを使って決定することもできる。抗原または抗原フラグメントを認識し、応答性または反応性であるそのようなＣＴＬを、本明細書中、“抗原応答性ＣＴＬ”とも言う。細胞がＢ細胞である場合、かかる応答性は、免疫グロブリンの放出を伴い得る。
【０１２６】
用語“Ｔ細胞”および“Ｔリンパ球”は、本明細書では互換的に用いられ、これには、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）、および細胞溶解性Ｔ細胞を含む細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）が含まれる。
【０１２７】
Ｔ細胞は、リンパ球として公知の白血球のグループに属し、細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たしている。これらは、その細胞表面上にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれる特別な受容体が存在することで、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞のような他のリンパ球タイプとは識別することができる。胸腺はＴ細胞のＴ細胞成熟を担う主要臓器である。Ｔ細胞にはいくつかの異なるサブセットが発見されており、それぞれが独特な機能を有している。
【０１２８】
ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞の形質細胞への成熟や細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化をはじめとする免疫学的過程において、他の白血球を支援する。これらの細胞は、その表面にＣＤ４タンパク質を発現するので、ＣＤ４＋Ｔ細胞としても公知である。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現したＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原を提示されると、活性型になる。一旦活性化されると、それらは迅速に分裂し、能動免疫応答を調節または支援するサイトカインと呼ばれる小さなタンパク質を分泌する。
【０１２９】
細胞傷害性Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶とも関連付けられている。これらの細胞は、その表面にＣＤ８糖タンパク質を発現するので、ＣＤ８＋ Ｔ細胞としても公知である。これらの細胞は、身体のほぼ全ての細胞の表面に存在するＭＨＣクラスＩと会合した抗原に結合することによって、その標的を認識する。
【０１３０】
大半のＴ細胞は、数個のタンパク質の複合体として存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する。実際のＴ細胞受容体は、２つの別々のペプチド鎖から構成され、これらのペプチド鎖は、独立したＴ細胞受容体アルファおよびベータ（ＴＣＲαおよびＴＣＲβ）遺伝子から生産され、α−ＴＣＲ鎖およびβ−ＴＣＲ鎖と呼ばれる。γδＴ細胞（ガンマデルタＴ細胞）は、独特なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をその表面に保有するＴ細胞の小さなサブセットを表す。しかしながら、γδＴ細胞では、ＴＣＲが１つのγ鎖と１つのδ鎖で構成されている。このグループのＴ細胞は、αβＴ細胞よりも、はるかに少ない（全Ｔ細胞の２％）。
【０１３１】
Ｔ細胞の活性化における最初のシグナルは、別の細胞上のＭＨＣによって提示された短いペプチドへのＴ細胞受容体の結合によって与えられる。これが、そのペプチドに特異的なＴＣＲを有するＴ細胞だけが活性化されることを、保証する。パートナー細胞は、通常はプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、ナイーブ(naive)応答の場合は、通常は樹状細胞であるが、Ｂ細胞およびマクロファージも重要なＡＰＣである。
【０１３２】
本明細書に記載のＴ細胞は、例えばＴ細胞自身のＴ細胞受容体の代わりに、またはそれに加えて、人工Ｔ細胞受容体を含んでいてよい。かかるＴ細胞は、標的細胞の認識ための抗原のプロセシングおよび提示を必ずしも必要としないが、むしろ、好ましくは、標的細胞上に存在する抗原を特異的に認識することが要される。好ましくは、該人工Ｔ細胞受容体は、細胞の表面上に発現される。本発明の目的に関して、人工Ｔ細胞受容体を含むＴ細胞は、本明細書で用いる用語“Ｔ細胞”に包含される。
【０１３３】
本発明により、用語“人工Ｔ細胞受容体”は、用語“キメラＴ細胞受容体”および“キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）”と同義である。これらの用語は、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞に対するモノクローナル抗体の特異性のような任意の特異性を付与する遺伝子操作された受容体に関する。この方法では、癌特異的Ｔ細胞の大多数は、養子細胞移入のために生産され得る。
【０１３４】
一態様において、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、ＣＤ３−ζ膜貫通ドメインおよびエンドドメインに連結される。かかる分子は、標的細胞上のその抗原標的のｓｃＦｖによる認識に応答してζシグナルの伝達をもたらし、標的抗原を発現する標的細胞の死滅をもたらす。用いられ得る抗原認識ドメインには、他のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のうち、αおよびβ一本鎖が含まれる。実際には、高親和性で所定の抗原に結合するもののほとんど全てを、抗原認識ドメインとして用い得る。
【０１３５】
抗原認識後、受容体が集まり、シグナルが細胞に伝達される。最も一般的に使用されるエンドドメイン成分は、ＣＤ３−ζである。抗原が結合した後、T細胞に活性化シグナルが伝達される。
【０１３６】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＣＡＲ操作されたＴ細胞を用いる養子細胞移入療法は、ＣＡＲ修飾されたＴ細胞が実質的に腫瘍抗原を標的とするように操作され得るため、有望な抗原治療である。例えば、患者のＴ細胞は、患者の腫瘍細胞上の抗原に対して特異的なＣＡＲを発現するように遺伝子操作され、その後、該患者に移入して戻され得る。
【０１３７】
本発明により、ある分子、それが予め定められた標的に対して有意な親和性を有し、標準的アッセイにおいて該予め定められた標的に結合するのであれば、該標的に結合する能力を有する。“親和性”または“結合親和性”は、多くの場合、平衡解離定数（ＫＤ）によって測定される。ある分子は、標的に対して有意な親和性を有さず、標準的アッセイにおいて該標的に有意に結合しないのであれば、該標的に結合する能力を（実質的に）有さない。
【０１３８】
細胞傷害性Ｔリンパ球は、抗原、その免疫原性ペプチドフラグメントまたはかかる免疫原性ペプチドフラグメントを含むポリペプチドをインビボにて抗原提示細胞に導入することにより、インビボで生成させることもできる。抗原、ペプチドフラグメントまたはポリペプチドは、タンパク質、ＤＮＡ（例えば、ベクター内にあるもの）、またはＲＮＡとして表すことができる。抗原またはポリペプチドはプロセシングされてＭＨＣ分子のペプチドパートナーを生産し得るが、そのフラグメントは、さらなるプロセシングを受ける必要なく、提示され得る。後者は、これらがＭＨＣ分子に結合することができる場合には、特にそうである。一般的には、皮内注射によって患者に投与することが可能である。しかしながら、注射をリンパ節に節内的に行うこともできる（Maloy et al. (2001), Proc Natl Acad Sci USA 98:3299−303）。得られた細胞は目的の複合体を提示し、増殖した自己の細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識される。
【０１３９】
ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の特異的活性化は、さまざまな方法で検出することができる。特異的Ｔ細胞活性化を検出するための方法には、Ｔ細胞の増殖、サイトカイン（例えば、リンホカイン）の生産、または細胞溶解活性の生成を検出することが含まれる。ＣＤ４＋Ｔ細胞の場合、特異的Ｔ細胞活性化を検出するための好ましい方法は、Ｔ細胞の増殖の検出である。ＣＤ８＋Ｔ細胞の場合、特異的Ｔ細胞活性化を検出するための好ましい方法は、細胞溶解活性の生成の検出である。
【０１４０】
“抗原の提示により特徴付けられる細胞”または“抗原提示細胞”または類似の表現は、それが発現する抗原または該抗原に由来するフラグメントを、例えば、ＭＨＣ分子、特にＭＨＣクラスＩ分子と関連して、抗原のプロセシングによって提示する、疾患細胞、例えば癌細胞、または抗原提示細胞などの細胞を意味する。同様に、用語“抗原の提示を特徴とする疾患”は、特にクラスＩ  ＭＨＣによる抗原の提示を特徴とする細胞が関与する疾患を表す。細胞による抗原の提示は、抗原をコード化するＲＮＡなどの核酸を該細胞にトランスフェクトすることによって達成され得る。
【０１４１】
“提示される抗原のフラグメント”または類似の表現は、そのフラグメントが、例えば抗原提示細胞に直接添加されたとき、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ、好ましくはＭＨＣクラスＩによって提示され得ることを意味する。一態様において、フラグメントは、抗原を発現する細胞によって天然に提示されるフラグメントである。
【０１４２】
用語“免疫学的に等価”は、免疫学的に等価な分子、例えば免疫学的に等価なアミノ酸配列が、例えば体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答の誘導、誘導される免疫反応の強さおよび／または持続時間、あるいは誘導される免疫反応の特異性などといった免疫学的効果のタイプに関して、同じまたは本質的に同じ免疫学的性質を示し、かつ／または同じもしくは本質的に同じ免疫学的効果を発揮することを意味する。本発明との関連において、用語“免疫学に等価な”は、好ましくは、免疫処置に使用されるペプチドの免疫学的効果または性質に関して使用される。例えばアミノ酸配列は、対象の免疫系に曝露された時に、該アミノ酸配列が、対照アミノ酸配列と反応する特異性を有する免疫反応を誘導するのであれば、対照アミノ酸配列と免疫学的に等価である。
【０１４３】
本発明との関連において、用語“免疫エフェクター機能”には、免疫系の構成成分によって媒介される任意の機能であって、例えば腫瘍細胞の死滅をもたらすもの、または腫瘍の播種および転移の阻害を含む腫瘍成長の阻害およ／または腫瘍発生の阻害をもたらすものが含まれる。好ましくは、本発明との関連において、免疫エフェクター機能は、Ｔ細胞が媒介するエフェクター機能である。そのような機能は、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋ Ｔ細胞）の場合であれば、ＭＨＣクラスＩＩ分子との関連における抗原または抗原フラグメントによる認識、サイトカインの放出および／またはＣＤ８＋リンパ球（ＣＴＬ）および／またはＢ細胞の活性化を含み、ＣＴＬの場合であれば、ＭＨＣクラスＩ分子との関連におけるＴ細胞受容体により抗原または抗原フラグメントによる認識、ＭＨＣクラスＩ分子との関連において提示された細胞の、すなわちクラスＩ ＭＨＣによる抗原の提示を特徴とする細胞の、例えばアポトーシスもしくはパーフォリン媒介性細胞溶解による排除、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αのようなサイトカインの生産、および抗原を発現する標的細胞の特異的な細胞溶解的死滅を含む。
【０１４４】
本発明により、エピトープは、細胞の核酸中の変異から生じ得るアミノ酸修飾を有し得る。かかる変異は、公知の配列決定技術により同定され得る。
【０１４５】
一態様において、変異は、腫瘍サンプルのゲノム、エキソームおよび／またはトランスクリプトームと、非腫瘍原性サンプルのゲノム、エキソームおよび／またはトランスクリプトームとの配列相違を同定することにより決定され得る、癌患者の腫瘍サンプルにおける癌特異的な体細胞変異である。
【０１４６】
本発明により、腫瘍サンプルは、腫瘍または癌細胞を含むまたは含むと予期される患者由来の生体サンプルなどのサンプルに関する。生体サンプルは、血液のような組織サンプル、原発腫瘍もしくは腫瘍転移から得られる組織サンプル、または腫瘍もしくは癌細胞を含む他のサンプルであり得る。好ましくは、生体サンプルは、血液であり、癌特異的な体細胞変異または配列の相違が、血液中に含まれる１つまたはそれ以上の循環系腫瘍細胞（ＣＴＣ）において決定される。別の態様において、腫瘍サンプルは、１つまたはそれ以上の単離された、循環系腫瘍細胞（ＣＴＣ）のような腫瘍細胞または癌細胞、または１つまたはそれ以上の単離された、循環系腫瘍細胞（ＣＴＣ）のような腫瘍細胞または癌細胞を含むサンプルに関する。
【０１４７】
非腫瘍性サンプルは、患者由来、または好ましくは患者と同種の別の個体、好ましくは腫瘍または癌細胞を含まないか、またはそれらを含むと予期されない健康な個体由来の生体サンプルのようなサンプルに関する。生体サンプルは、血液または非腫瘍性組織由来のサンプルのような任意の組織サンプルであり得る。
【０１４８】
本発明は、患者の癌の変異指標（mutation signature）の決定を含み得る。用語“癌の変異指標”は、患者の１つまたはそれ以上の癌細胞に存在する全ての癌変異を意味し得るか、または患者の１つまたはそれ以上の癌細胞に存在する癌変異の一部のみを意味し得る。従って、本発明は、患者の１つまたはそれ以上の癌細胞に存在する全ての癌特異的変異の同定を含み得るか、または患者の１つまたはそれ以上の癌細胞に存在する癌特異的変異の一部のみの同定を含み得る。
【０１４９】
好ましくは、本発明により同定される変異は、非同義変異体、好ましくは、腫瘍または癌細胞で発現されたタンパク質の非同義変異体である。
【０１５０】
一態様において、癌特異的な体細胞変異または配列相違は、ゲノム、好ましくは腫瘍サンプルの全ゲノムにおいて決定される。従って、本発明は、ゲノム、好ましくは１つまたはそれ以上の癌細胞の全ゲノムの癌の変異指標を同定することを含み得る。一態様において、癌患者の腫瘍サンプルにおける癌特異的な体細胞変異の同定工程は、ゲノム−野生型の癌変異プロファイルを同定することを含む。
【０１５１】
一態様において、癌特異的な体細胞変異または配列相違は、エキソーム、好ましくは腫瘍サンプルの全エキソームにおいて決定される。従って、本発明は、エキソーム、好ましくは１つまたはそれ以上の癌細胞の全エキソームの癌の変異指標を同定することを含み得る。一態様において、癌患者の腫瘍サンプルにおける癌特異的な体細胞変異の同定工程は、エキソーム−野生型の癌変異プロファイルを同定することを含む。
【０１５２】
一態様において、癌特異的な体細胞変異または配列相違は、トランスクリプトーム、好ましくは腫瘍サンプルの全トランスクリプトームにおいて決定される。従って、本発明は、トランスクリプトーム、好ましくは１つまたはそれ以上の癌細胞の全トランスクリプトームの癌の変異指標を同定することを含み得る。一態様において、癌患者の腫瘍サンプルにおける癌特異的な体細胞変異の同定工程は、トランスクリプトーム−野生型癌変異プロファイルを同定することを含む。
【０１５３】
一態様において、癌特異的な体細胞変異の同定工程または配列相違の同定工程は、１以上、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の癌細胞の単細胞シークエンシングを含む。従って、本発明は、該１つまたはそれ以上の癌細胞の癌の変異指標を同定することを含み得る。一態様において、癌細胞は、循環系腫瘍細胞である。循環系腫瘍細胞のような癌細胞は、単細胞シーケンシングの前に単離され得る。
【０１５４】
一態様において、癌特異的な体細胞変異の同定工程または配列相違の同定工程は、次世代シーケンサー（ＮＧＳ）を用いて行う。
【０１５５】
一態様において、癌特異的な体細胞変異の同定工程または配列相違の同定工程は、腫瘍サンプルのゲノムＤＮＡおよび／またはＲＮＡのシーケンシングを含む。
【０１５６】
癌特異的な体細胞変異または配列相違を明らかにするために、腫瘍サンプルから得られた配列情報を、好ましくは、患者または異なる個体から得られ得る生殖系細胞のような正常な非癌細胞のＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸の配列決定から得られた配列情報のような対照配列と比較する。一態様において、正常なゲノム生殖細胞系列ＤＮＡは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得られる。
【０１５７】
用語“ゲノム”は、生物または細胞の染色体中の全ての遺伝子情報に関する。
【０１５８】
用語“エキソーム”は、発現された遺伝子のコーディング部分であるエキソンにより形成される生物のゲノムの一部を意味する。エキソームは、タンパク質および他の機能的遺伝子産物の合成に使用される遺伝的ブループリント(genetic blueprint)を提供する。それは、ゲノムの最も機能的に関連する部分であり、それ故に、生物の表現型に貢献する可能性が最も高い。ヒトゲノムのエキソームは、全ゲノムの１．５％を含むと概算される（Ng, PC et al.,  PLoS Gen., 4(8): 1−15, 2008）。
【０１５９】
用語“トランスクリプトーム”は、１つの細胞または細胞集団で産生された、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、および他の非コーディングＲＮＡを含む全てのＲＮＡ分子のセットに関する。本発明の文脈中、トランスクリプトームは、１つの細胞、細胞集団、好ましくは癌細胞集団、または任意の時点での所定の個々の全ての細胞において産生された、全てのＲＮＡ分子のセットを意味する。
【０１６０】
本発明によれば、“核酸”は、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、より好ましくはＲＮＡ、最も好ましくはインビトロで転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ  ＲＮＡ）または合成ＲＮＡである。本発明によれば、核酸には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組み換え的に調製された分子および化学合成された分子が含まれる。本発明によれば、核酸は、一本鎖または二本鎖で存在し得て、直線状の、または共有結合的に閉じて環を形成している分子の形態をとり得る。本発明によれば、核酸は単離され得る。用語“単離された核酸”は、本発明によれば、その核酸が、（ｉ）インビトロで、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅されたこと、（ｉｉ）クローニングによって組み換え生産されたこと、（ｉｉｉ）例えば切断およびゲル電気泳動による分画によって精製されたこと、または（ｉｖ）例えば化学合成によって合成されたことを意味する。核酸は、細胞中に導入するために、すなわち細胞のトランスフェクションのために、特に、ＤＮＡテンプレートからのインビトロ転写によって産生され得るＲＮＡの形態で用いられ得る。ＲＮＡはさらに、適用前に、安定化配列、キャッピング、およびポリアデニル化によって修飾することもできる。
【０１６１】
用語“遺伝物質”には、単離された核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか、二重らせんの一部、染色体の一部、または生物もしくは細胞の全ゲノムの一部、特にそのエキソームもしくはトランスクリプトームが含まれる。
【０１６２】
用語“変異”は、対照と比較して、核酸配列中の変化またはその相違（ヌクレオチド置換、付加または欠失）を意味する。“体細胞変異”は、生殖細胞（精子および卵子）を除く全ての体細胞に生じ得て、子供には受け継がれない。これらの変化は、癌または他の疾患の原因であり得る(常にではない)。好ましくは、変異は、アミノ酸が変わる(non−synonymous)変異である。用語“アミノ酸が変わる(non−synonymous)変異”は、翻訳産物におけるアミノ酸置換などのアミノ酸変化を生じない変異、好ましくはヌクレオチド置換を意味する。
【０１６３】
本発明によれば、用語“変異”には、点突然変異、挿入欠失（Indel）、融合（fusion）、クロモスリプシス（chromothripsis）およびＲＮＡ編集を含む。
【０１６４】
本発明によれば、用語“挿入欠失（Indel）”は、共局在する挿入および欠失ならびにヌクレオチドの付加または削除をもたらす変異として定義される、特別な変異クラスを記載する。ゲノムのコーディング領域において、ｉｎｄｅｌの長さが３の倍数でない限り、それらはフレームシフト変異を生じる。Ｉｎｄｅｌは、点変異と対比することができる。配列からのヌクレオチドのＩｎｄｅｌ挿入および欠失が起こるとき、点変異は、ヌクレオチドの１つが置換される置換形態である。
【０１６５】
融合（fusion）は、２つの別個であった遺伝子から形成されたハイブリッド遺伝子を生じ得る。それは、転座、間質性欠失、または染色体逆位の結果として生じ得る。融合遺伝子は癌遺伝子であることが多い。発癌性融合遺伝子は、２つの融合パートナーから、新規または異なる機能を有する遺伝子産物をもたらし得る。あるいは、癌原遺伝子（プロト癌遺伝子）は、強力なプロモーターに融合されて、発癌機能が、上流の融合パートナーの該強力なプロモーターによって引き起こされた上方制御によって機能するように設定される。発癌性融合転写産物は、トランススプライシングまたはリードスルー事象によって引き起こされ得る。
【０１６６】
本発明によれば、用語“クロモスリプシス（chromothripsis）”は、ゲノムの特定の領域が崩壊し、その後の、単一の崩壊的な事象によるつなぎ合わせ(異常な再編成)による、遺伝的現象を意味する。
【０１６７】
本発明によれば、用語“ＲＮＡ編集”は、ＲＮＡ分子中の情報が塩基メーキャップ(makeup)における化学変化を介して改変される分子過程を意味する。ＲＮＡ編集には、シチジン（Ｃ）からウリジン（Ｕ）、およびアデノシン（Ａ）からイノシン（Ｉ）への脱アミノ化のようなヌクレオシド修飾、ならびに非テンプレート化ヌクレオチド付加および挿入が含まれる。ｍＲＮＡにおけるＲＮＡ編集は、ゲノムＤＮＡ配列により予測されるものとは異なるように、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を効率的に変化させる。
【０１６８】
用語“癌の変異指標”は、非癌性の対照細胞と比較したとき、癌細胞に存在する変異のセットを意味する。
【０１６９】
本発明により、“対照”は、腫瘍サンプルから得られた結果を関連付けて比較するために使用することができる。典型的に、“対照”は、１つまたはそれ以上の正常サンプル、特に癌疾患に影響を受けないサンプル、患者または１人もしくは複数の異なる個人、好ましくは健常な個人、特に同種の個人のいずれかから得られたサンプルに基づいて得られ得る。
【０１７０】
本明細書において、用語“ＲＮＡ”は、リボヌクレオチド残基を含む分子、好ましくは全体的または実質的にリボヌクレオチド残基からなる分子に関する。“リボヌクレオチド”は、β−Ｄ−リボフラノース部分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関する。用語“ＲＮＡ”は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ、例えば部分的または完全に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、および組換え生産されたＲＮＡ、例えば天然のＲＮＡとは、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの付加、削除、置換および／または改変によって異なる改変ＲＮＡを包含する。そのような改変には、例えばＲＮＡの末端への、または内部への、例えばＲＮＡの１つまたはそれ以上のヌクレオチドにおける、非ヌクレオチド物質の付加が含まれ得る。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドには、非標準的ヌクレオチド、例えば天然に存在しないヌクレオチドもしくは化学合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドが含まれ得る。これらの改変ＲＮＡは、類似体または天然に存在するＲＮＡの類似体と称され得る。
【０１７１】
本発明により、用語“ＲＮＡ”は、“ｍＲＮＡ”を包含し、好ましくは“ｍＲＮＡ”に関する。用語“ｍＲＮＡ”は、“メッセンジャーＲＮＡ”を意味し、ＤＮＡテンプレートを用いて生産され、ペプチドまたはポリペプチドをコードする“転写産物”に関する。ｍＲＮＡは典型的には、５’−ＵＴＲ、タンパク質コーディング領域および３’−ＵＴＲを含む。ｍＲＮＡは、細胞内およびインビトロで限られた半減期を有する。本明細書において、ｍＲＮＡは、ＤＮＡテンプレートからインビトロ転写によって生産され得る。インビトロ転写方法は、当業者に公知である。例えば、種々のインビトロ転写キットが市販されている。
【０１７２】
本発明によれば、ＲＮＡの安定性および翻訳効率は、必要に応じて修飾することができる。例えば、安定化効果を有しかつ／またはＲＮＡの翻訳効率を増加させる１つまたはそれ以上の修飾によって、ＲＮＡを安定化し、その翻訳を増加させることができる。そのような修飾は、例えば引用により本明細書に包含されるＰＣＴ／ＥＰ２００６／００９４４８に記載されている。本発明で用いるＲＮＡの発現を増加させるために、コーディング領域内、すなわち発現させるペプチドまたはタンパク質をコードする配列内を、好ましくは発現させるペプチドまたはタンパク質の配列を変化させることなく、ＧＣ含量を増加させ、ｍＲＮＡ安定性を増加させ、コドン最適化が行われ、よって細胞における翻訳が強化されるように、修飾することができる。
【０１７３】
本発明で用いるＲＮＡの文脈中、用語“修飾”は、ＲＮＡに天然には存在しない、該ＲＮＡの修飾を含む。
【０１７４】
本発明の一態様において、本発明で用いるＲＮＡは、キャップされていない５’−三リン酸を有しない。かかるキャップされていない５’−三リン酸の除去は、ホスファターゼでＲＮＡを処理することによって達成することができる。
【０１７５】
本発明のＲＮＡは、その安定性を増加させ、かつ／または細胞毒性を減少させるためにリボヌクレオチドを修飾されてもよい。例えば、一態様において、本発明で用いるＲＮＡにおいて、５−メチルシチジンは、部分的に、または完全に、好ましくは完全に、シチジンに置換されている。あるいは、またはそれに加えて、一態様において、本発明で用いるＲＮＡにおいて、シュードウリジンは、部分的に、または完全に、好ましくは完全に、ウリジンに置換されている。
【０１７６】
一態様において、用語“修飾”は、５’−キャップまたは５’−キャップ類似体を有するＲＮＡを提供することに関する。用語“５’−キャップ”は、ｍＲＮＡ分子の５’末端に見られるキャップ構造を意味し、一般的に、通常、５’から５’三リン酸結合を介してｍＲＮＡに結合したグアノシンヌクレオチドからなる。一態様において、このグアノシンは７位でメチル化されている。用語“従来の５’−キャップ”は、天然に存在するＲＮＡ  ５’−キャップ、好ましくは７−メチルグアノシンキャップ（ｍ７Ｇ）を意味する。本発明の文脈中、用語“５’−キャップ”は、ＲＮＡキャップ構造に類似し、それに結合したとき、好ましくはインビボおよび／または細胞内で、ＲＮＡを安定化し、かつ／またはＲＮＡの翻訳を増強する能力を有するように改変される、５’−キャップ類似体を含む。
【０１７７】
５’−キャップまたは５’−キャップ類似体を有するＲＮＡの提供は、該５’−キャップまたは５’−キャップ類似体の存在下で、ＤＮＡテンプレートのインビトロ転写により達成され得るか（ここで、該５’−キャップは、共転写されて生成されたＲＮＡ鎖に挿入される）、または該ＲＮＡは、例えば、インビトロ転写により生成され得て、５’−キャップは、キャッピング酵素、例えば、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素を用いて転写後にＲＮＡに付加され得る。
【０１７８】
ＲＮＡは、さらなる修飾を含んでいてよい。例えば、本発明で用いるＲＮＡのさらなる修飾は、天然に存在するポリ（Ａ）テールの伸長もしくは切断または５’−もしくは３’−非翻訳領域（ＵＴＲ）の改変、例えば、該ＲＮＡのコーディング領域に関連しないＵＴＲの導入、例えば、既存の３’−ＵＴＲの交換、またはアルファ２−グロビン、アルファ１−グロビン、、ベータ−グロビン、好ましくはベータ−グロビン、より好ましくはヒトベータ−グロビンなどのグロビン遺伝子由来の３’−ＵＴＲの、１つ以上、好ましくは２つのコピーの挿入であり得る。
【０１７９】
マスキングされていないポリＡ配列を有するＲＮＡは、マスキングされたポリＡ配列を有するＲＮＡよりも効率よく翻訳される。用語“ポリ（Ａ）テール”または“ポリ−Ａ配列”は、典型的にはＲＮＡ分子の３’末端に位置するアデニル（Ａ）残基の配列に関し、“マスキングされていないポリＡ配列”とは、ＲＮＡ分子の３’末端にあるポリＡ配列が、ポリＡ配列のＡで終わっていて、ポリＡ配列の３’末端、すなわち下流に位置するＡ以外のヌクレオチドが後続していないことを意味する。さらに、約１２０塩基対の長いポリＡ配列は、最適な転写産物安定性とＲＮＡの翻訳効率をもたらす。
【０１８０】
それゆえに、本発明において使用されるＲＮＡの安定性および／または発現を増加させるために、ポリＡ配列、好ましくは１０〜５００、より好ましくは３０〜３００、さらにより好ましくは６５〜２００、とりわけ１００〜１５０個のアデノシン残基を有するものと一緒に存在するように、ＲＮＡを修飾することができる。とりわけ好ましい態様では、ポリＡ配列は約１２０個のアデノシン残基の長さを有する。本発明で用いるＲＮＡの安定性および／または発現をさらに増加させるために、ポリＡ配列を脱マスキングすることができる。
【０１８１】
加えて、ＲＮＡ分子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）への３’非翻訳領域の組み込みも、翻訳効率の強化をもたらし得る。そのような３’非翻訳領域を２つまたはそれ以上組み込むことによって相乗効果を得ることができる。３’非翻訳領域は、それらが導入されるＲＮＡに対して自己であっても異種であってもよい。特定の一態様において、３’非翻訳領域はヒトβ−グロビン遺伝子に由来する。
【０１８２】
上記の修飾、すなわちポリＡ配列の組み込み、ポリＡ配列の脱マスキングおよび１つまたはそれ以上の３’非翻訳領域の組み込みの組合せは、ＲＮＡの安定性に対して相乗的な影響を有し、翻訳効率を増加させる。
【０１８３】
用語ＲＮＡの“安定性”は、ＲＮＡの“半減期”に関する。“半減期”は、分子の活性、量または数の半分を除去するのに必要とされる時間に関する。本発明の文脈において、ＲＮＡの半減期は、該ＲＮＡの安定性の指標である。ＲＮＡの半減期は、ＲＮＡの“発現の持続時間”に影響し得る。長い半減期を有するＲＮＡは、延長された時間の間、発現され得ると予期され得る。
【０１８４】
本発明によれば、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を低下させることが望まれる場合は、もちろん、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を増加させる上記のような要素の機能を妨害するように、ＲＮＡを改変することが可能である。
【０１８５】
用語“発現”は、本明細書では、その最も広い意味で使用され、ＲＮＡおよび／またはペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の、例えば転写および／または翻訳による生産を含む。ＲＮＡに関して、用語“発現”または“翻訳”は、特に、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の生産に関する。それは、核酸の部分的な発現も含む。さらに、発現は一過性の発現であっても、安定的発現であってもよい。本発明によれば、腫瘍抗原は、該腫瘍抗原が、該腫瘍抗原に特異的に結合する抗体を用いる技術などのタンパク質検出のための常套技術により、細胞またはその溶解物中に検出され得るとき、該細胞中で発現される。好ましくは、腫瘍抗原は、Ｔ細胞が、ＭＨＣ分子に関連して細胞上の提示される腫瘍抗原に由来するペプチドフラグメントに結合し得て、好ましくは該細胞上で免疫エフェクター機能を発揮することができるとき、該細胞中で発現される。
【０１８６】
本発明によれば、発現という用語には“異状（aberrant）発現”または“異常（abnormal）発現”も含まれる。“異状発現”または“異常発現”とは、本発明によれば、対照と比較して、例えばあるタンパク質、例えば腫瘍抗原の異状または異常発現に関連する疾患を有さない対象における状態と比較して、発現が改変されていること、好ましくは増加していることを意味する。発現の増加とは、少なくとも１０％、特に少なくとも２０％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％、あるいはそれ以上の増加を意味する。一態様において、発現が、疾患組織にのみ見いだされ、健常組織における発現は抑止されている。
【０１８７】
用語“特異的に発現する”は、あるタンパク質が、本質的に、ある特異的組織または臓器でのみ発現することを意味する。例えば、胃粘膜において特異的に発現する腫瘍抗原とは、該タンパク質が主として胃粘膜において発現され、他の組織では発現しないこと、または他の組織もしくは臓器タイプでは有意な程度には発現しないことを意味する。従って、もっぱら胃粘膜の細胞において発現され、精巣などの他のどの組織においても、それより有意に少ない程度に発現されるタンパク質は、胃粘膜の細胞において特異的に発現している。いくつかの態様において、腫瘍抗原は、通常条件下で、２以上の組織または臓器において、例えば２つまたは３つの組織タイプまたは臓器において特異的に発現していてもよいが、好ましくは３つを超えない異なる組織または臓器タイプにおいて発現されない。この場合は、腫瘍抗原がこれら臓器において特異的に発現される。例えば、腫瘍抗原が、通常条件下で、肺および胃において、好ましくはほぼ同程度に発現している場合、該腫瘍抗原は肺および胃において特異的に発現されている。
【０１８８】
本発明の文脈において、用語“転写”は、ＤＮＡ配列中の遺伝コードがＲＮＡに転写される過程に関する。その後、そのＲＮＡはタンパク質に翻訳され得る。本発明によれば、用語“転写”は“インビトロ転写”を含み、この場合、用語“インビトロ転写”は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡが、無細胞系において、好ましくは適当な細胞抽出物を用いて、インビトロで合成される過程に関する。好ましくは、転写産物の生成には、クローニングベクターが適用される。これらのクローニングベクターは、一般に、転写ベクターとして設計され、本発明によれば、用語“ベクター”に包含される。本発明により、本発明で用いるＲＮＡは、好ましくはインビトロで転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ−ＲＮＡ）であり、適当なＤＮＡテンプレートのインビトロ転写によって得ることができる。転写を制御するためのプロモーターは、任意のＲＮＡポリメラーゼのための任意のプロモーターであり得る。ＲＮＡポリメラーゼの具体例は、Ｔ７、Ｔ３、およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼである。好ましくは、本発明のインビトロ転写は、Ｔ７またはＳＰ６プロモーターにより制御される。インビトロ転写用のＤＮＡテンプレートは、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、それを、インビトロ転写用の適当なベクター中に導入することによって得ることができる。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写によって得ることができる。
【０１８９】
本発明によれば、用語“翻訳”は、メッセンジャーＲＮＡの鎖がアミノ酸の配列のアセンブリを指示してペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を生成する、細胞のリボソームにおける過程に関する。
【０１９０】
本発明によれば、核酸と機能的に連結され得る発現制御配列または調節配列は、該核酸に関して相同であっても非相同であってもよい。コーティング配列および調節配列は、該コーティング配列の転写または翻訳が該調節配列の制御下または影響下にあるような形で互いに共有結合によって連結されているならば、それらは互いに“機能的に”連結している。コーティング配列が機能的タンパク質に翻訳されるものである場合は、調節配列がコーディング配列に機能的に連結されていることにより、該調節配列の誘導が、コーディング配列のフレームシフトを引き起こすことなく、または該コーディング配列が所望のタンパク質もしくはペプチドに翻訳されなくなることもなく、該コーディング配列の転写をもたらす。
【０１９１】
用語“発現制御配列”または“調節配列”は、本発明によれば、プロモーター、リボソーム結合配列、および核酸の転写またはそれに由来するＲＮＡの翻訳を調節する他の制御要素を含む。本発明の特定の態様において、調節配列は制御することができる。調節配列の正確な構造は種または細胞タイプに応じて異なり得るが、一般的には、例えばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などのような、転写または翻訳の開始に関与する５’非転写配列ならびに５’および３’非翻訳配列を含む。より具体的には、５’非転写調節配列は、機能的に連結された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。調節配列は、エンハンサー配列または上流のアクティベーター配列も含み得る。
【０１９２】
好ましくは、本発明によれば、細胞で発現されるべきＲＮＡは、該細胞に導入される。本発明の方法の一態様において、細胞に導入されるべきＲＮＡは、適当なＤＮＡテンプレートのインビトロ転写によって得られる。
【０１９３】
本発明により、“発現可能なＲＮＡ”および“をコード化するＲＮＡ”などの用語は、本明細書中、互換的に用いられ、特定のペプチドまたはポリペプチドに関して、適当な環境下、好ましくは細胞内に存在するならば、ＲＮＡが発現されて、該またはペプチドまたはポリペプチドを生産できることを意味する。好ましくは、本発明のＲＮＡは、それが発現することのできペプチドまたはポリペプチドを提供するために、細胞の翻訳機構と相互作用することができる。
【０１９４】
“移入”、“導入”または“トランスフェクト”等の用語は、本明細書において互換的に用いられ、細胞への、核酸、特に外来の、または異種の核酸、特にＲＮＡの導入に関連する。本発明により、細胞は、臓器、組織および／または生物の一部を形成することができる。本発明により、核酸の投与は、そのままの核酸としてか、または投与用反応材と組み合わせて達成される。好ましくは、核酸の投与は、そのままの核酸の形態である。好ましくは、ＲＮＡは、ＲＮａｓｅ阻害剤のような安定化物質と組み合わせて投与される。本発明はまた、長期間の持続的な発現を可能にするための、細胞への核酸の繰り返し導入を想定している。
【０１９５】
細胞は、例えば、該ＲＮＡと複合体を形成するか、または該ＲＮＡが封入されるか、もしくはカプセル化されるビークルを形成することにより連結され得て、そのままのＲＮＡと比較してＲＮＡの安定性の増加がもたらされる、任意の担体を用いてトランスフェクトされ得る。本発明により有用な担体には、例えば、カチオン性脂質ような脂質含有担体、リポソーム、特にカチオン性リポソーム、およびミセル、およびナノ粒子が含まれる。カチオン性脂質は、負に荷電した核酸と複合体を形成し得る。任意のカチオン性脂質は、本発明に従って用いられ得る。
【０１９６】
好ましくは、細胞への、特に生体内の細胞へのペプチドまたはポリペプチドをコード化するＲＮＡの導入は、細胞における該ペプチドまたはポリペプチドの発現をもたらす。特定の態様において、特定の細胞への核酸の標的化が好ましい。かかる態様において、細胞への核酸の投与に適用される担体（例えば、レトロウイルスまたはリポソーム）は、標的分子を示す。例えば、標的細胞上の細胞表面膜タンパク質または標的細胞上の受容体に対するリガンドに特異的な抗体などの分子は、核酸担体に組み込まれ得るか、またはそれに結合され得る。核酸がリポソームにより投与される場合、エンドサイトーシスに関係する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質を、標的化および／または取り込みを可能にするために、リポソーム製剤に組み込むことができる。かかるタンパク質は、特定の細胞タイプに対して特異的である、そのフラグメントのキャプシドタンパク質、内在化されるタンパク質に対する抗体細胞内局在を標的とするタンパク質などを包含する。
【０１９７】
用語“細胞”または“宿主細胞”は、好ましくは、無傷の細胞、すなわち、酵素、細胞小器官、または遺伝物質などのようなその正常な細胞内構成要素を放出していない、無傷の膜を有する細胞である。無傷の細胞は、好ましくは、生細胞、すなわちその正常な代謝機能を果たす能力を有する、生きている細胞である。好ましくは、該用語は、本発明によれば、外来の核酸により形質転換またはトランスフェクションされ得る任意の細胞に関する。用語“細胞”は、本発明によれば、原核細胞（例えば、大腸菌）または真核細胞（例えば、樹状細胞、Ｂ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｋ５６２細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＬＡ細胞、酵母細胞、および昆虫細胞）を包含する。外来の核酸は、細胞内に、（ｉ）そのまま自由に分散しているか、（ｉｉ）組み換えベクターに組み込まれているか、または（ｉｉｉ）宿主細胞のゲノムＤＮＡもしくはミトコンドリアＤＮＡ中に組み込まれた状態で、見いだすことができる。ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、および哺乳動物由来の細胞のような哺乳動物細胞は、特に好ましい。細胞は、数多くの組織タイプに由来することができ、これには、初代(培養)細胞および細胞株が含まれる。具体的な例には、ケラチノサイト、末梢血白血球、骨髄幹細胞、および胚性幹細胞が含まれる。さらなる態様において、細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球、またはマクロファージである。
【０１９８】
核酸分子を含む細胞は、好ましくは、該核酸によりコードされるペプチドまたはポリペプチドを発現する。
【０１９９】
用語“クローン拡大（clonal expansion）”は、特異的な実体が増倍される過程を意味する。本発明の文脈中、該用語は、好ましくは、リンパ球が抗原によって刺激され、増殖し、そして該抗原を認識する特異的リンパ球が増幅される、免疫学的応答との関連において用いられる。好ましくは、クローン拡大は、リンパ球の分化につながる。
【０２００】
“低減する”または“阻害する”などの用語は、レベルの全体的な低下、好ましくは５％以上、１０％以上、２０％以上、より好ましくは、５０％以上、最も好ましくは７５％以上の低下を引き起こす能力に関する。用語“阻害”または類似の語句には、完全な阻害または本質的に完全な阻害、すなわち、ゼロへの低減または本質的にゼロへの低減が含まれる。
【０２０１】
“増加する”、”増大する”、”促進する”または“延長する”のような用語は、好ましくは、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも１００％、好ましくは少なくとも２００％、および特に少なくとも３００％の、増加、増大、促進または延長に関する。これらの用語は、ゼロまたは測定不能もしくは検出不可能なレベルから、ゼロ以上または測定可能もしくは検出可能なレベルへの増加、増大、促進または延長にも関する。
【０２０２】
本発明によれば、用語“ワクチン”は、投与されることにより、病原体または癌細胞のような疾患細胞を認識し、攻撃する免疫応答、特に細胞性免疫応答を誘導する、医薬製剤（医薬組成物）または製品に関する。ワクチンは、疾患の予防または処置のために使用することができる。用語“個別化(personalizedまたはindividualized)癌ワクチン”は、特定の癌患者に関し、癌ワクチンが、個々の癌患者のニーズや特別な状況に適合していることを意味する。
【０２０３】
一態様において、本発明により提供されるワクチンは、Ｔ細胞エピトープまたは核酸、好ましくはペプチドもしくはポリペプチドをコード化するＲＮＡのような免疫原性エピトープを含む、１つまたはそれ以上のペプチドまたはポリペプチドを含み得る。
【０２０４】
本発明により提供される癌ワクチンは、本特許出願に従って投与されるとき、好ましくは、患者の腫瘍に特異的なＴ細胞を刺激し、増殖させ、および／または増大させるのに適する１つまたは複数のＴ細胞エピトープを提供する。Ｔ細胞は、好ましくはＴ細胞エピトープが由来する、抗原を発現する細胞に対して向けられている。従って、本明細書に記載のワクチンは、クラスＩ ＭＨＣを有する１つまたはそれ以上の腫瘍抗原の提示によって特徴付けられる癌疾患に対する細胞応答、好ましくは細胞傷害性Ｔ細胞活性化を誘導または促進することができる。
【０２０５】
一態様において、本発明により提供されるワクチンは、本特許出願に従って投与されるとき、好ましくは、１つまたは複数のＴ細胞エピトープ、例えば２以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、好ましくは６０まで、５５まで、５０まで、４５まで、４０まで、３５まで、または３０までのＴ細胞エピトープを提供するワクチンに関する。患者の細胞、特に抗原提示細胞によるこれらのエピトープの提示は、好ましくは、ＭＨＣに結合したとき、該エピトープを標的とするＴ細胞をもたらし、それ故に、患者の腫瘍、好ましくは原発腫瘍ならびに腫瘍転移は、Ｔ細胞エピトープが由来する抗原を発現し、腫瘍細胞の表面上の同じエピトープを提示する。
【０２０６】
本発明のワクチンにより提供されるエピトープは、好ましくはポリエピトープポリペプチドのような複数のエピトープを含むポリペプチドまたは核酸、特に該ポリペプチドをコード化するＲＮＡの形態で存在する。さらに、エピトープは、すなわち、例えば、天然に存在するタンパク質において該エピトープにも隣接するアミノ酸配列が隣接される、それらの天然配列コンテキスト中に存在するワクチン配列の形態で該ポリペプチド中に存在してよい。かかる隣接する配列はそれぞれ、５以上、１０以上、１５以上、２０以上、好ましくは５０まで、４５まで、４０まで、３５まで、または３０までのアミノ酸を含んでいてよく、エピトープ配列にそのＮ末端および／またはＣ末端に隣接し得る。従って、ワクチン配列は、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、好ましくは５０まで、４５まで、４０まで、３５まで、または３０までのアミノ酸を含んでいてよい。一態様において、エピトープおよび／またはワクチン配列は、ポリペプチド中、ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ型で並んでいる。
【０２０７】
一態様において、エピトープおよび／またはワクチン配列は、リンカー、特に天然のリンカーによって間隔が空いている。本発明の用語“リンカー”は、２つのペプチドドメイン、例えばエピトープまたはワクチン配列間に付加されて該ペプチドドメインを連結するペプチドである。リンカー配列は特に限定されない。しかしながら、リンカー配列は、２つのペプチドドメイン間の立体障害を低減させ、効率よく翻訳されるようにして、エピトープのプロセシングを補助するかまたは可能にすることが好ましい。さらに、リンカーは、免疫原性配列要素を有しないか、またはほんの少しだけ有するべきである。リンカーは、好ましくは、望ましくない免疫反応を生ずる可能性のある、隣接するエピトープ間の接合部から生成されたもののような非内因性のエピトープを作製すべきではない。従って、ポリエピトープワクチンは、好ましくは、望ましくないＭＨＣ結合接合エピトープの数を低減することが可能なリンカー配列を含むべきである。Hoyt et al. (EMBO J. 25(8), 1720−9, 2006)および Zhang et al. (J. Biol. Chem., 279(10), 8635−41, 2004）は、グリシンに富む配列は、プロテアソーム処理を損なうため、グリシンに富むリンカー配列の使用は、プロテアソームによって処理され得るリンカー含有ペプチドの数を最小限にするように作用することを示している。さらに、グリシンは、ＭＨＣ結合溝の位置の強い結合を阻害することが見出された（Abastado et al., J. Immunol. 151(7), 3569−75, 1993)。Schlessingerら (Proteins, 61(1), 115−26, 2005）は、アミノ酸配列に含まれるアミノ酸グリシンおよびセリンが、エンコードされたエピトープにより良好にアクセスを可能にして、プロテアソームによってより効率的に翻訳され、プロセシングされる、よりフレキシブルなタンパク質をもたらすことを見出した。リンカーはそれぞれ、３以上、６以上、９以上、１０以上、１５以上、２０以上、好ましくは５０まで、４５まで、４０まで、３５まで、または３０までのアミノ酸を含み得る。好ましくは、リンカーは、グリシンおよび／またはセリンのアミノ酸に富む。好ましくは、リンカーのアミノ酸の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が、グリシンおよび／またはセリンである。好ましい一態様において、リンカーは、実質的にアミノ酸グリシンおよびセリンからなる。一態様において、リンカーは、アミノ酸配列（ＧＧＳ）ａ（ＧＳＳ）ｂ（ＧＧＧ）ｃ（ＳＳＧ）ｄ（ＧＳＧ）ｅ｛式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０から独立して選択される数であり、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅは０ではなく、好ましくは２以上、３以上、４以上、または５以上である。｝を含む。一態様において、リンカーは、配列ＧＧＳＧＧＧＧＳＧを含む。
【０２０８】
特に好ましい一態様において、本発明のポリエピトープポリペプチドなどの１つまたはそれ以上のエピトープが挿入されているポリペプチドは、抗原提示細胞のような患者の細胞で発現されてポリペプチドを生じ得る核酸の形態、好ましくはインビトロで転写されたようなＲＮＡまたは合成ＲＮＡの形態で該患者に投与される。本発明はまた、本発明の目的のために、用語“ポリエピトープポリペプチド”に包含される、１つまたはそれ以上のマルチエピトープポリペプチドの投与を想定し、好ましくは抗原提示細胞のような患者の細胞で発現されて１つまたはそれ以上のポリペプチドを生じ得る核酸の形態、好ましくはインビトロで転写されたかまたは合成されたＲＮＡなどの形態での投与を想定する。２以上のマルチエピトープポリペプチドの投与の場合、異なるマルチエピトープポリペプチドにより提供されるエピトープは、異なるか、または部分的に重複していてよい。抗原提示細胞のような患者の細胞に存在する場合、本発明のポリペプチドは、エピトープを生成するために処理される。本発明により提供されるワクチンの投与は、ＭＨＣにより提示されるエピトープが由来する抗原を発現する細胞に対するＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞応答を誘発し得る、ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを提供し得る。あるいは、または加えて、本発明により提供されるワクチンの投与は、ＭＨＣにより提示されるエピトープが由来する抗原を発現する細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発し得る、ＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープを提供し得る。さらに、本発明により提供されるワクチンの投与は、１つまたはそれ以上のネオエピトープ（既知のネオエピトープおよび本発明により同定されたネオエピトープを含む）、ならびに１つまたはそれ以上の癌特異的な体細胞変異を含まないエピトープを提供し得る。一態様において、本発明により提供されるワクチンの投与は、ＭＨＣクラスＩＩにより提示されるエピトープであり、および／またはＭＨＣにより提示されるエピトープが由来する抗原を発現する細胞に対するＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞応答を誘発し得るネオエピトープ、ならびにＭＨＣクラスＩにより提示されるエピトープであり、および／またはＭＨＣにより提示されるエピトープが由来する抗原を発現する細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発し得る、癌特異的な体細胞変異を含まないエピトープを提供する。一態様において、特異的体細胞変異を含まないネオエピトープおよびエピトープは、癌の治療において相乗効果を有する。好ましくは、本発明により提供されるワクチンは、細胞傷害性および／またはヘルパーＴ細胞応答のポリエピトープ刺激のために有用である。
【０２０９】
本発明により提供されるワクチンは、組み換えワクチンであり得る。
【０２１０】
本発明の文脈中、用語“組み換え”は、遺伝子工学的に行われることを意味する。好ましくは、本発明の文脈において、組み換えポリペプチドのような“組み換え要素”は、天然に存在せず、好ましくは、天然に組み合わされていない、アミノ酸または核酸配列のような要素の組み合わせの結果である。例えば、本発明の文脈中、組み換えポリペプチドは、異なるタンパク質に由来するエピトープまたはワクチン配列のようないくつかのアミノ酸配列、例えばＣＸｏｒｆ６１、ＣＡＧＥ１および／またはＰＲＡＭＥまたは例えば、ペプチド結合または適当なリンカーにより互いに融合した同じタンパク質の異なる部分を含んでいてよい。
【０２１１】
本明細書で用いる用語“天然に存在する”は、目的物が天然に見出され得るという事実を意味する。例えば、生物（ウイルスを含む）中に存在し、天然中の供給源から単離され得て、実験室でヒトにより意図的に改変されていないペプチドまたは核酸は、天然に存在している。
【０２１２】
本明細書に記載の薬物、組成物および方法は、疾患、例えば、１つまたはそれ以上の抗原を発現し、そのフラグメントを提示する疾患細胞の存在により特徴付けられる疾患。特に好ましい疾患は、癌疾患を有する対象を治療するために用いることができる。本明細書に記載の薬物、組成物および方法はまた、本明細書に記載の疾患を予防するために免疫処置またはワクチン接種のために使用することができる。
【０２１３】
本発明により、用語“疾患”は、癌疾患を含む病的状態、特に本明細書に記載の癌疾患の形態を意味する。
【０２１４】
用語“正常”は、健常対象または健常組織における健康状態または状態、すなわち非病理学的状態を意味し、ここで“健常”とは、好ましくは、非がん性を意味する。
【０２１５】
“抗原を発現する細胞が関与する疾患”とは、本発明によれば、疾患組織または疾患臓器の細胞における抗原の発現が検出されることを意味する。疾患組織または疾患臓器の細胞における発現は、健常組織または健常臓器における状態と比較して増加している。増加とは、少なくとも１０％、特に少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、少なくとも１００００％またはそれ以上の増加を意味する。一態様において、発現が疾患組織にしか見いだされず、健常組織における発現は抑制されている。本発明によれば、抗原を発現する細胞が関与または関係する疾患には、癌疾患が含まれる。
【０２１６】
本発明により、用語“腫瘍”または“腫瘍疾患”は、細胞（新生物細胞、腫瘍形成細胞または腫瘍細胞と呼ばれる）の異常な増殖によって形成される腫脹または病変を意味する。“腫瘍細胞”とは、迅速で無制御な細胞増殖によって増殖し、新しい増殖を開始させた刺激が途絶えた後も増殖し続ける、異常な細胞を意味する。腫瘍は、構造的組織化および正常組織との機能的協調の部分的または完全な欠如を示し、通常は、良性、前悪性または悪性のいずれかでありうる異質な組織塊を形成する。
【０２１７】
癌（医学用語：悪性新生物）は、一群の細胞が制御されない増殖（正常限度を超えての分裂）、侵襲（隣接組織への貫入とその破壊）、および時には転移（リンパまたは血液を介した身体の他の場所への伝播）を示す疾患の一種である。これら３つのがんの悪性的性質により、癌は、自己限定性(self−limited)であって、侵入も転移もしない良性腫瘍と識別される。大半の癌は腫瘍を形成するが、白血病のように腫瘍を形成しないものもある。悪性病変、悪性新生物、および悪性腫瘍は、本質的に、癌と同義である。
【０２１８】
新生物は、新形成の結果としての異常な組織塊である。新形成（neoplasia：ギリシャ語で新しい成長の意）は、細胞の異常な増殖である。細胞の増殖は、それを取り囲む正常組織の増殖を上回り、それら正常組織の増殖とは協調しない。刺激が途絶えた後でさえ、同じく過剰な増殖が持続する。これは通常、しこりまたは腫瘍を引き起こす。新生物は良性、前悪性または悪性であり得る。
【０２１９】
“腫瘍の増殖”または“腫瘍増殖”は、本発明によれば、そのサイズを増加使用とする腫瘍の傾向、および／または増殖しようとする腫瘍細胞の傾向に関する。
【０２２０】
本発明の目的に関して、用語“癌”および“癌疾患”は、用語“腫瘍”および“腫瘍疾患”と互換的に用いられる。
【０２２１】
癌は、腫瘍に似ている細胞タイプ、すなわち、その腫瘍の起源であると想定される組織に分類される。これらは、それぞれ組織学的および位置(局在)である。
【０２２２】
本発明の用語“癌”は、癌腫、腺癌、芽腫、白血病、精上皮腫、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神経芽腫、神経膠腫、直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、副腎癌、甲状腺癌、血液の癌、皮膚癌、脳の癌、頚部癌、腸の癌、肝臓癌、結腸癌、胃癌、腸癌、頭頸部癌、胃腸癌、リンパ節癌、食道癌、結腸直腸癌、膵臓癌、耳鼻咽喉（ＥＮＴ）の癌、乳癌、前立腺癌、子宮の癌、卵巣癌および肺癌ならびにそれらの転移を包含する。それらの例は、肺癌腫、乳癌、前立腺癌、結腸癌、腎臓細胞癌腫、頚部癌腫、または上記の癌タイプもしくは腫瘍の転移である。本発明の用語癌はまた、癌転移および癌の再発も包含する。
【０２２３】
特に好ましい一態様において、本発明の用語“癌”は、“乳癌”に関する。
【０２２４】
用語“乳癌”は、乳房組織、最も一般的には乳管の内層由来または乳管に乳汁を供給する小葉由来の癌の一種に関する。乳管に由来する癌は乳管癌として知られ、一方、小葉に由来する癌は小葉癌として知られる。時には、乳癌は転移性疾患として出現する。転移の一般的な部位には、骨、肝臓、肺および脳が含まれる。乳癌は、ヒトおよび他の哺乳動物で発生する。ヒトの症例の圧倒的多数が女性で発生するが、男性の乳癌も発生し得る。
【０２２５】
乳癌の処置は、手術、薬物療法（ホルモン療法および化学療法）、放射線療法および／または免疫療法を含み得る。
【０２２６】
乳癌細胞は、３つの重要な受容体を有していても、有していなくてもよい。エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、およびＨｅｒ２／ｎｅｕ（ＨＥＲ２）。本発明の乳癌の特に好ましい形態は、トリプルネガティブ乳癌である。用語“トリプルネガティブ乳癌”は、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）およびＨＥＲ２の遺伝子を発現していないか、または過剰発現していない任意の乳癌を意味する。
【０２２７】
アジュバント乳癌治療に使用される薬剤の３つの主なグループは、ホルモン遮断療法、化学療法、およびモノクローナル抗体である。
【０２２８】
ホルモン遮断療法
ＥＲ陽性／ＰＲ陽性乳癌は、受容体を遮断する薬剤を用いて治療され得て、例えば受容体をタモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ）で遮断するか、あるいは、エストロゲンの産生をアロマターゼ阻害剤、例えばアナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ）もしくはレトロゾール（フェマーラ）で阻害する。しかしながら、アロマターゼ阻害剤は、閉経後の患者にのみ適している。このことは、閉経後の女性における活性なアロマターゼが、閉経前の女性における一般的な形態とは異なっており、そのため、これらの薬剤が、閉経前の女性の優勢なアロマターゼを阻害するのに有効ではないためである。
【０２２９】
化学療法
化学療法は、主に病期（ステージ）２−４の疾患に用いられ、特に、ＥＲ陰性乳癌において有益である。それらは、通常３−６ヶ月間組み合わせて用いられる。最も一般的な治療法の１つは、ＡＣとして公知の、シクロホスファミド＋ドキソルビシン（アドリアマイシン）である。ほとんどの化学療法薬は、急速に増殖している、および／または急速に複製している癌細胞を、複製もしくは他の機序の際にＤＮＡ損傷を引き起こすことにより破壊することによって作用する。これらの薬剤はまた、それらが重大な副作用を引き起こす、急速に増殖している正常な細胞も傷つける。心筋への損傷は、ドキソルビシンの最も危険な合併症である。ドセタキセルのようなタキサン薬剤が追加されることが多く、このレジメンはＣＡＴとして公知である。タキサンは、癌細胞内で微小管を攻撃する。同等の結果をもたらす別の一般的な治療は、シクロホスファミド、メトトレキサート、およびフルオロウラシル（ＣＭＦ）である。
【０２３０】
モノクローナル抗体
トラスツマブ（ハーセプチン）、ＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体は、ＨＥＲ２増幅／過剰発現を有する患者でのみ有効である。しかしながら、トラスツマブは高価であり、患者の約２％は、重大な心臓損傷を受ける。他のモノクローナル抗体も臨床試験の段階にある。乳癌患者の２５から３０％は、ＨＥＲ２遺伝子の増幅を有するか、またはそのタンパク質産物を過剰発現している。乳癌におけるこの受容体の過剰発現は、増加した疾患の再発および予後不良と関連している。
【０２３１】
本発明により、“癌腫”は、上皮性細胞由来の悪性腫瘍である。この群は、乳癌、前立腺癌、肺癌および結腸癌の一般的な形態を含む、最も一般的な癌を示す。
【０２３２】
“腺癌”は、腺組織に由来する癌である。この組織は、上皮性組織として公知のより大きな組織カテゴリーの一部でもある。上皮性組織には、皮膚、腺ならびに身体の腔組織および臓器を繋ぐ他の多様な組織が含まれる。上皮は、外胚葉、内胚葉および中胚葉から発生学的に由来する。腺癌として分類されるために、細胞は、それらが分泌特性を有する限り、必ずしも腺の一部である必要はない。癌腫のこの形態は、ヒトを含む、数種の高等哺乳動物で発生する可能性がある。高分化腺癌は、それらが由来する腺組織に似ている傾向があるが、低分化腺癌はそうではない。生検からの細胞を染色することにより、病理学者は、腫瘍が腺癌腫であるか、または癌の他のタイプであるかどうかを決定する。腺癌は、体内の腺のユビキタス特性のために、身体の多くの組織で発生し得る。各腺は、同じ物質を分泌するとは限らないが、該細胞に外分泌機能がある限り、それは腺と見なされるため、その悪性形態は、腺癌と称される。悪性腺癌は他の組織に浸潤し、多くの場合、十分な時間を与えられて転移する。卵巣腺癌は、卵巣癌腫の最も一般的なタイプである。それは、漿液性腺癌および粘液性腺癌、明細胞腺癌ならびに子宮内膜腺癌を含む。
【０２３３】
“転移”とは、身体の別の部分へのその元の部位からの癌細胞の拡散を意味する。転移の形成は、とても複雑な過程であり、原発腫瘍からの悪性細胞の剥離、細胞外マトリックスの侵襲、体腔および血管に入るための内皮基底膜の貫入、その後、血液によって輸送された後の標的臓器の浸潤に依存する。最後に、新たな腫瘍、すなわち、続発性腫瘍または転移性腫瘍の標的部位での増殖は、血管形成に依存する。腫瘍転移は、腫瘍細胞または成分が残存し、転移の可能性を生じ得るため、原発腫瘍の除去後でも起こることが多い。一態様において、本発明により、用語“転移”は、原発腫瘍および所属リンパ節系から離れた転移に関する“遠隔転移”に関する。
【０２３４】
続発性または転移性腫瘍の細胞は、元の腫瘍の細胞に似ている。これは、例えば、乳癌が肝臓に転移したとき、続発性腫瘍が異常な乳房細胞から構成され、異常な肝臓細胞から構成されるのではないことを意味する。そのため、肝臓における腫瘍は、転移性乳癌と呼ばれ、肝臓癌ではない。
【０２３５】
用語“循環腫瘍細胞”または“ＣＴＣ”は、原発腫瘍または腫瘍転移から離脱し、血流中を循環している細胞に関する。ＣＴＣは、異なる組織におけるさらなる腫瘍（転移）のその後の増殖のためのシードを構成し得る。循環腫瘍細胞は、転移性疾患を有する患者において、全血１ｍＬあたり１〜１０個程度のＣＴＣの頻度で見出される。研究方法は、ＣＴＣを単離するために開発されてきた。いくつかの研究方法、上皮性細胞が、通常、正常な血液細胞には存在しない、細胞接着タンパク質であるＥｐＣＡＭを発現するという事実を利用する技術が、ＣＴＣを単離するための当該技術分野で記載されている。免疫磁気ビーズ−ベースの捕捉は、磁性粒子とコンジュゲートされたＥｐＣＡＭに対する抗体を用いて血液サンプルを処理し、続いて磁場中でタグ付けされた細胞を分離することを含む。その後、単離された細胞を、白血球細胞で汚染されているＣＴＣから汚染されていないＣＴＣを区別するために、別の上皮マーカーであるサイトケラチン、ならびに一般的な白血球マーカーであるＣＤ４５に対する抗体で染色した。このロバスト法および半自動化方法は、およそ１ ＣＴＣ／ｍＬの平均収量および０．１％純度でＣＴＣを識別する（Allard et al., 2004: Clin 癌 Res 10, 6897−6904）。ＣＴＣを単離するための第二の方法は、ＥｐＣＡＭに対する抗体でコーティングすることにより機能的にされた８０，０００マイクロポストが埋め込まれたチャンバーを仲介して全血を流すことを含む、マイクロ流体ベースのＣＴＣキャプチャ装置を用いる。その後、ＣＴＣを、サイトケラチンまたは前立腺癌におけるＰＳＡもしくは乳癌におけるＨＥＲ２のような組織特異的マーカーに対する二次抗体で染色し、三次元座標に沿って複数の平面におけるマイクロポストの自動スキャンによって視覚化する。ＣＴＣ−チップは、５０細胞／ｍｌの平均収率および１−８０％の範囲の純度で、患者のサイトケラチン陽性循環腫瘍細胞を同定することができる（Nagrath et al., 2007: Nature 450, 1235−1239）。ＣＴＣを単離するための別の可能性のある方法は、捕捉、同定、および血液チューブ中のＣＴＣの計数を行う、Ｖｅｒｉｄｅｘ、ＬＬＣ（Ｒａｒｉｔａｎ、ＮＪ）からのセルサーチ（商標）循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）テストを用いる方法である。セルサーチ（商標）システムは、免疫磁気標識および自動化されたデジタル顕微鏡の組み合わせに基づいて、全血中のＣＴＣの列挙のための米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認された方法である。本発明と組み合わせて用いられ得る全ての文献に記載されるＣＴＣを単離するための他の方法がある。
【０２３６】
ヒトが、過去に影響を受けた状態に再び曝されるとき、再発（relapseまたはrecurrence）が起こる。例えば、患者が腫瘍疾患に罹患し、該疾患の治療が成功したことがあり、再び該疾患を発症したとき、該新たに発症した疾患は、再発と見なされ得る。しかしながら、本発明により、腫瘍疾患の再発は、必ずしも元の腫瘍疾患の部位で起こるとは限らない。従って、例えば、患者が胸部腫瘍を患っており、治療が成功したとき、再発は、胸部腫瘍の再発であり得るか、または胸部とは別の部位での腫瘍の再発であり得る。腫瘍の再発には、腫瘍が元の腫瘍の部位に発生する状況だけでなく、元の腫瘍の部位とは異なる部位に発生する状況も含まれる。好ましくは、患者が治療を受けた元の腫瘍は原発腫瘍であり、元の腫瘍の部位と異なる部位の腫瘍は、続発性腫瘍または転移性腫瘍である。
【０２３７】
“処置する”とは、疾患を防止または排除すること（対象における腫瘍のサイズまたは腫瘍の数を低減することを含む）、対象における疾患を停止または遅延させること、対象における新しい疾患の発生を阻害するかまたは遅延させること、現在疾患を有しているか、過去に疾患を有していた対象における、症状および／または再発の頻度もしくは重症度を減少させること、および／または対象の寿命を延長、すなわち増加させることを目的として、本明細書に記載する化合物または組成物を対象に投与することを意味する。特に、用語“疾患の処置”には、疾患またはその症状を治療すること、その持続時間を短縮すること、改善させること、防止すること、その進行または悪化を減速させるかまたは阻害すること、あるいはその発症を防止するかまたは遅延させることが含まれる。
【０２３８】
“危険性がある”とは、母集団と比較して、疾患、特に癌を発生させる可能性が通常より高いと同定された対象、すなわち患者を意味する。加えて、疾患、特に癌を有していた対象または現在有している対象は、疾患を発生させる危険性が増加している対象であり、すなわち、対象は疾患を発生させ続ける可能性がある。癌を現在有している対象または癌を有していた対象は、癌転移の危険性も増加している。
【０２３９】
用語“免疫療法”は、特異的免疫反応が関わる処置に関する。
【０２４０】
本発明において、“防御する”、“防止する”、“予防的”、“防止的”または“防御的”などの用語は、対象における疾患の発生および／または増殖の予防もしくは処置またはその両方、特に対象が疾患を発生する可能性を最小限に抑えること、または疾患の発生を遅延させることに関する。例えば、上記の通り、腫瘍の危険性があるヒトは、腫瘍を防止するための治療の候補であるだろう。
【０２４１】
免疫療法の予防的施行、例えば本発明のワクチンの予防的投与は、好ましくは、疾患の発生からレシピエントを防御する。免疫療法の治療的施行、例えば本発明のワクチンの治療的投与は、疾患の進行／増殖の阻害につながり得る。これは、疾患の進行／増殖の減速、特に、好ましくは疾患の排除につながる、疾患の進行の分断を含む。
【０２４２】
免疫療法は、本発明で提供される薬物が疾患細胞を患者から除去するように機能する種々の技術を、どれでも使っても行うことができる。そのような除去は、抗原または抗原を発現する細胞に特異的な患者の免疫応答を強化または誘導した結果として起こり得る。
【０２４３】
ある態様において、免疫療法は能動免疫療法であり得て、この場合、処置は、免疫応答修飾薬物（本発明で提供されるポリペプチドおよび核酸など）を投与して、疾患細胞に対して反応するように内在性宿主免疫系をインビボで刺激することによる。
【０２４４】
本発明で提供される薬物および組成物は、単独で使用するか、外科手術、放射線照射、化学療法および／または骨髄移植（自己、同系、同種異系または無関係）などといった従来の治療レジメンと組み合わせて使用することができる。
【０２４５】
用語“免疫処置（immunization）”または“ワクチン接種（vaccination）”は、治療的または予防的理由で免疫応答を誘導するという目的をもって、対象を処置するプロセスをいう。
【０２４６】
用語“インビボ”は、対象の状況に関する。
【０２４７】
用語“対象”、“個体”、“生物”または“患者”は互換的に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳動物に関する。例えば、本発明の文脈中、哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長動物、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマなどの家畜、マウス、ラット、ウサギ、モルモットなどの実験動物、ならびに動物園の動物などといった飼育下の動物である。本明細書で用いる用語“動物”にはヒトも含まれる。用語“対象”には、患者、すなわち疾患、好ましくは本明細書に記載するような疾患を有する動物、好ましくはヒトも含めることができる。
【０２４８】
一態様において、本発明の方法は、癌を有すると既に診断されている患者に行われる。
【０２４９】
用語“自己由来”は、同じ対象に由来するものを説明するために使用される。例えば、“自家移植”は、同じ対象由来の組織または臓器の移植を意味する。かかる方法は、それらが、さもなければ拒絶もたらす免疫学的バリアを克服するために有用である。
【０２５０】
用語“異種”は、複数の異なる要素からなるものを説明するために使用される。例としては、ある個体の骨髄の異なる個体への移植は、異種移植片を構成する。異種遺伝子は、対象以外の供給源に由来する遺伝子である。
【０２５１】
免疫処置またはワクチン接種のための組成物の一部として、好ましくは本明細書に記載の１つまたはそれ以上の薬物は、免疫応答を誘導するため、または免疫応答を増大させるために、１つまたはそれ以上のアジュバントと共に投与される。用語“アジュバント”は、免疫応答を延長または増強または促進する化合物に関する。本発明の組成物は、好ましくは、アジュバントを添加することなくその効果を発揮する。また、本発明の組成物は、公知のアジュバントを含んでもよい。アジュバントには、油性エマルジョン（例えば、フロイントのアジュバント）、鉱物性化合物（例えば、ミョウバン）、細菌生成物（例えば、百日咳毒素）、リポソーム、および免疫刺激複合体などの化合物の異種の群が含まれる。アジュバントの例は、モノホスホリル脂質Ａ（MPL SmithKline Beecham）、ＱＳ２１（SmithKline Beecham）、ＤＱＳ２１（SmithKline Beecham；ＷＯ９６／３３７３９）、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、およびＱＳ−Ｌ１（So et al., 1997, Mol. Cells 7: 178−186）のようなサポニン類、不完全フロイントのアジュバント、完全フロイントアジュバント、ビタミンＥ、モンタナイド、ミョウバン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（Krieg et al., 1995, Nature 374: 546−549）、ならびにスクアレンおよび／またはトコフェロールのような生分解性油状物から調製される種々の油中水型エマルジョンである。
【０２５２】
患者の免疫応答を刺激する他の物質も投与することができる。例えばワクチン接種では、サイトカイン類を、リンパ球に対するその調節特性ゆえに使用することができる。かかるサイトカイン類には、例えば、ワクチンの防御作用を増加させることが示されているインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）（Science 268:1432−1434, 1995参照）、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１８が含まれる。
【０２５３】
免疫応答を増強し、それ故に、ワクチン接種に使用され得る多数の化合物が存在する。該化合物には、Ｂ７−１およびＢ７−２（それぞれ、ＣＤ８０およびＣＤ８６）などのタンパク質または核酸の形態で提供される共刺激分子が含まれる。
【０２５４】
本発明により、サンプルは、好ましくは身体サンプルである。身体サンプルは、体液を含む組織サンプル、および／または細胞サンプルであり得る。かかる身体サンプルは、常套の方法により、例えばパンチ生検を含む組織生検により、および採血、気管支吸引、痰、尿、糞便または他の体液の採取により得られ得る。本発明により、用語“サンプル”には、生物学的サンプルの分画または単離物、例えば核酸または細胞分離物のような処理されたサンプルが含まれる。
【０２５５】
本明細書に記載のワクチン組成物のような薬物は、注射または注入を含む何れかの常套経路により投与され得る。投与は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下または経皮的に行われてよい。一態様において、投与は、例えばリンパ節への注射によって鼻腔内に行われる。投与の他の形態は、樹状細胞などの抗原提示細胞を、本明細書に記載の核酸を用いてインビトロでトランスフェクトし、その後、該抗原提示細胞を投与することを意図する。
【０２５６】
本明細書に記載の薬物は、有効量で投与される。“有効量”は、単独で、またはさらなる用量と共に、所望の反応または所望の効果を達成する量を意味する。特定の疾患または特定の病状を処置する場合、所望の反応とは、好ましくはその疾患の経過の阻害に関する。これは、疾患の進行を遅くすること、特に疾患の進行を中断することまたは反転させることを含む。疾患または病状の処置における所望の反応は、該疾患または該病状の発症の遅延または発症の予防でもあり得る。
【０２５７】
本明細書に記載する薬物の有効量は、処置すべき病状、疾患の重篤度、年齢、生理学的状態、サイズおよび体重を含む患者の個体パラメータ、処置の継続期間、併用療法のタイプ（存在する場合）、具体的投与経路および同様の因子によって変わる。従って、本明細書に記載する薬物の投与量は、種々の上記パラメータによって変わり得る。患者における反応が初回用量では不十分な場合は、より高い用量（または、より局所的な異なる投与経路によって達成される、事実上、より高い用量）を使用することができる。
【０２５８】
本明細書に記載の医薬組成物は、好ましくは滅菌されており、所望の反応または所望の効果が生じるように、有効量の治療的活性物質を含有している。
【０２５９】
本明細書に記載の医薬組成物は、一般に、医薬適合量で、かつ医薬適合調製物に入れて、投与される。用語“医薬適合（性）”は、医薬組成物の活性構成要素の作用と相互作用しない無毒性材料を意味する。この種の調製物には、通常、塩類、緩衝物質、防腐剤、担体、補助免疫強化物質、例えばＣｐＧオリゴヌクレオチドなどのアジュバント、サイトカイン、ケモカイン、サポニン、ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＲＮＡなど、そして適宜、他の治療活性化合物が含まれ得る。医薬品に使用する場合、塩類は医薬適合性であるべきである。しかしながら、医薬適合性でない塩類も、医薬適合性塩を調製するために使用することができ、医薬適合性でない塩類も、本発明に含まれる。薬理学的および医薬的に適合するこの種の塩類には、限定するわけではないが、以下の酸から調製されたものが含まれる：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸など。医薬適合性塩は、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩などのアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩として調製することもできる。
【０２６０】
本明細書に記載の医薬組成物は、医薬適合性担体を含み得る。用語“担体”は、適用を容易にするために活性構成要素がそこに混合される、天然のまたは合成の有機または無機構成要素を意味する。本発明によれば、、用語“医薬適合性担体”には、患者への投与に適する１つまたはそれ以上の適合性の固体または液体の充填剤、希釈剤または封入物質が含まれる。本発明の医薬組成物の構成要素は、通常は、所望の医薬効力を実質的に損なう相互作用が起こらないようなものである。
【０２６１】
本明細書に記載の医薬組成物は、塩中の酢酸、塩中のクエン酸、塩中のホウ酸、および塩中のリン酸のような、適当な緩衝物質を含有し得る。
【０２６２】
医薬組成物は、適宜、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールなどの適当な防腐剤も含み得る。
【０２６３】
医薬組成物は通常、均一な投与形態で提供され、それ自体公知の方法で調製することができる。本発明の医薬組成物は、例えばカプセル剤、錠剤、ロゼンジ、溶液、懸濁液、シロップ剤、エリキシル剤の形態、またはエマルジョンの形態を取り得る。
【０２６４】
非経腸投与に適する組成物には、通常、好ましくはレシピエントの血液と等張な、活性化合物の滅菌水性または非水性調製物が含まれる。適合性担体および適合性溶媒の例は、リンゲル液および等張塩化ナトリウム溶液である。加えて、通常は滅菌された不揮発性油が、溶液または懸濁液の媒質として使用される。
【０２６５】
本発明により、発現、例えば腫瘍抗原または腫瘍抗原セットの発現は、ｍＲＮＡレベル（転写レベル）またはタンパク質レベル（翻訳レベル）で、例えば、転写されたｍＲＮＡを測定することにより（例えば、ノーザンブロットにより）、生産されたタンパク質を測定することにより（例えば、ウェスタンブロットにより）、タンパク質を直接または間接的に染色することにより（例えば、免疫組織化学により）、またはｍＲＮＡを直接染色することにより（例えば、インサイチュウハイブリダイゼーションにより）、決定することができる。
【０２６６】
例えば、本発明により、ｍＲＮＡレベル（転写レベル）での腫瘍抗原の発現の決定は、それぞれの腫瘍抗原について本明細書に記載の核酸配列のいずれかの量を検出および／または決定することによって行うことができる。例えば、ＣＡＧＥ１の発現の決定は、配列番号４１もしくは４２の核酸配列またはその変異体の量を検出および／または決定することによって行うことができる。
【０２６７】
例えば、本発明により、タンパク質レベル（翻訳レベル）での腫瘍抗原の発現の決定は、それぞれの腫瘍抗原について本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれかの量を検出および／または決定することによって行うことができる。例えば、ＣＡＧＥ１の発現の決定は、配列番号４３もしくは４４のアミノ酸配列またはその変異体の量を検出および／または決定することによって行うことができる。
【０２６８】
好ましい一態様において、発現レベルは、免疫アッセイ、ゲル電気泳動、分光分析、クロマトグラフィー、インサイチュウハイブリダイゼーションを用いて、またはそれらの組み合わせにより決定される。
【０２６９】
本発明により、免疫アッセイは、ウェスタンブロット、免疫組織化学、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）、“サンドイッチ”免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、析出反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集反応アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、免疫蛍光、タンパク質Ａ免疫アッセイ、フローサイトメトリおよびＦＡＣＳ分析からなる群より選択され得る。
【０２７０】
本発明はさらに、好ましくは癌患者から単離されたサンプルにおける、腫瘍抗原セットの発現パターンを決定するための反応材のような手段を含むキットに関する。該キットは、本発明の方法を実施するのに有用である。
【０２７１】
本発明の文脈中、用語“複数部分のキット（単に、キット）”は、本明細書で同定された構成成分の少なくともいくつかが、機能的単位で、空間的に共存して組み合わされ、さらなる成分を含み得る、任意の組み合わせであると理解される。
【０２７２】
一態様において、キットは、腫瘍抗原セットの腫瘍抗原に特異的に結合する１つまたはそれ以上の手段を含む。
【０２７３】
腫瘍抗原に特異的に結合する該手段は、抗体またはそのフラグメントであってよく、それは、検出すべき抗原のエピトープまたは適当な構造的要素に特異的に結合することができる。
【０２７４】
他の態様において、該手段は核酸であり得る。核酸の検出のために、キットは、一般的に、腫瘍抗原をコード化するｍＲＮＡに特異的なプローブを含む（ただしこれらに限定されない）。定量的ＰＣＲのために、キットは、一般的に、腫瘍抗原をコード化する核酸配列に特異的な予め選択されたプライマーを含む。定量的ＰＣＲキットは、増幅のための反応混合物に必要な、核酸の増幅に適する酵素（例えば、Ｔａｑのようなポリメラーゼ）、およびデオキシヌクレオチドおよび緩衝液も含み得る。定量的ＰＣＲキットは、腫瘍抗原をコード化する核酸配列に特異的なプローブも含み得る。いくつかの態様において、定量的ＰＣＲキットはまた、逆転写反応に必要なデオキシヌクレオチドおよび緩衝液と共に、酵素（例えば、逆転写酵素）および逆転写のためのプライマーを含む逆転写ＲＮＡに適する構成成分を含む。
【０２７５】
特定の態様において、該手段は検出可能に標識されている。
【０２７６】
抗体または抗体フラグメントは固体支持体、例えばプラスチック表面に結合されて、タンパク質の結合および検出を可能にし得る。例えば、マイクロタイタープレートは、プラスチック表面として使用することができる。結合の検出は、検出可能な基で標識された二次抗体を用いて行うことができる。検出可能な基は、色素または蛍光シグナルを生成するために好適な基質を添加することにより検出される、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼのような酵素であり得る。
【０２７７】
該キットはさらに、（ｉ）容器、および／または（ｉｉ）データ担体を含んでいてよい。該容器は、上記の手段または反応材の１つまたはそれ以上を充填し得る。該データ担体は、非電子的データ担体、例えば、情報リーフレット、情報リーフレット、バーコードもしくはアクセスコードのようなグラフィックデータ担体、または電子的データ担体、例えばフロッピーディスク、コンパクトディスク（ＣＤ）、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、マイクロチップもしくは別の半導体ベースの電子化データ担体であり得る。アクセスコードは、データベース、例えばインターネットデータベース、集中型データベース、または分散型データベースへのアクセスを可能にする。該データ担体は、本発明の方法におけるキットの使用説明書を含み得る。
【０２７８】
加えて、または別個に、該キットは、タンパク質またはｍＲＮＡの発現を決定するために、緩衝剤（複数可）、反応材（複数可）および／または希釈剤（複数可）を含む商業的見地および使用者の見地から望ましい材料を含んでいてよい。
【０２７９】
上記のデータ担体は、タンパク質またはｍＲＮＡの閾値または基準レベルを含み得る。データ担体がデータベースへのアクセスを許可するアクセスコードを含む場合には、該閾値または基準レベルは、このデータベースに寄託される。
【０２８０】
加えて、データ担体は、本発明の方法を実施する方法に関する情報または指示を含んでもよい。
【０２８１】
具体的アミノ酸配列、例えば配列表に示すものに関して、本明細書に記載する内容は、該具体的配列と機能的に等価な配列、例えば具体的アミノ酸配列の性質と同一のまたは類似する性質を示すアミノ酸配列をもたらす、該具体的配列の変異体にも関するように解釈すべきである。
【０２８２】
本発明の用語“変異体”は、特に、変異体、スプライス変異体、コンホメーション変異体、イソ型、アレル変異体、種変異体および種ホモログを意味し、特に天然に存在するものを意味する。アレル変異体は、遺伝子の正常配列の変化に関係し、その重要性は多くの場合不明である。完全な遺伝子配列決定は、多くの場合、所定の遺伝子の多数のアレル変異体を同定する。種ホモログは、所定の核酸またはアミノ酸配列の種とは起源の異なる種を有する核酸またはアミノ酸配列である。用語“変異体”は、任意の翻訳後修飾された変異体およびコンホメーション変異体を包含し得る。
【０２８３】
本発明の目的に関して、アミノ酸配列の“変異体”は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸付加変異体、アミノ酸欠失変異体および／またはアミノ酸置換変異体を含む。
【０２８４】
好ましくは、所定のアミノ酸配列と該所定のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列との間の類似性の程度、好ましくは同一性の程度は、少なくとも約６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であり得る。類似性または同一性の程度は、好ましくは、対照アミノ酸配列の全長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％であるアミノ酸領域について与えられる。例えば、対照アミノ酸配列が２００アミノ酸からなる場合、類似性または同一性の程度は、好ましくは、少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０、または約２００アミノ酸、好ましくは連続アミノ酸配列について与えられる。好ましい態様では、類似性または同一性の程度は、対照アミノ酸配列の全長について与えられる。配列類似性、好ましくは配列同一性を決定するためのアラインメントは、当技術分野において公知のツールで、好ましくは最適配列アラインメントを用いて、例えばＡｌｉｇｎを用いて、標準的設定で、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、マトリックス：Ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップ開始（Gap Open）１０．０、ギャップ伸長（Gap Extend）０．５を用いて行うことができる。
【０２８５】
“配列類似性”は、同一であるかまたは保存的アミノ酸置換に相当するアミノ酸の割合を示す。２つのアミノ酸配列の間の“配列同一性”は、それらの配列の間で同一であるアミノ酸の割合を示す。
【０２８６】
用語“同一性パーセント”は、最適アラインメント後に得られる、比較すべき２つの配列間で同一であるアミノ酸残基の割合を表するものであり、この割合は純粋に統計的であって、２つの配列間の相違はそれらの全長にわたってランダムに分布する。２つのアミノ酸配列の間の配列比較は、従来どおり、それらを最適にアラインメントした後にこれらの配列を比較することによって行われ、該比較は、配列類似性を有する局所領域を同定し、比較するために、セグメントごとに、または“比較ウインドウ”ごとに実施される。比較のための配列の最適アラインメントは、手作業で行われる他、Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482の局所相同性アルゴリズムによって、Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443の局所相同性アルゴリズムによって、Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444の類似性検索法によって、またはこれらのアルゴリズムを用いるコンピュータプログラム（GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N and TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis．）によって作成することもできる。
【０２８７】
同一性パーセントは、比較される２つの配列間で同一な位置の数を決定し、その数を比較した位置の数で割り、これら２つの配列間の同一性パーセントが得られるように、得られた結果に１００を掛けることによって算出される。
【０２８８】
核酸分子に関して、用語“変異体”には、縮重核酸配列が含まれ、ここで、本発明の縮重核酸は、遺伝子コードの縮重により、コドン配列が対照核酸とは異なる核酸である。
【０２８９】
さらに、本発明の所定の核酸配列の“変異体”には、少なくとも２個、少なくとも４個、または少なくとも６個の、好ましくは３個まで、４個まで、５個まで、６個まで、１０個まで、１５個まで、または２０個までのヌクレオチド置換、欠失および／または付加などの、単一または複数のヌクレオチド置換、欠失および／または付加を含む核酸配列が含まれる。
【０２９０】
好ましくは、所定の核酸配列と該所定の核酸配列の変異体である核酸配列との同一性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％または最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であり得る。同一性の程度は、好ましくは、少なくとも約３０、少なくとも約５０、少なくとも約７０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、または少なくとも約４００ヌクレオチドの領域について与えられる。好ましい態様において、同一性の程度は、対照核酸配列の全長にわたって与えられる。
【０２９１】
２つの核酸配列間の“配列同一性”は、配列間で同一であるヌクレオチドの割合を示す。
【０２９２】
用語“同一性パーセント”は、最適アラインメント後に得られる、比較すべき２つの配列間で同一であるヌクレオチドの割合を表するものであり、この割合は純粋に統計的であって、２つの配列間の相違はそれらの全長にわたってランダムに分布する。２つのヌクレオチド配列の間の配列比較は、従来どおり、それらを最適にアラインメントした後にこれらの配列を比較することによって行われ、該比較は、配列類似性を有する局所領域を同定し、比較するために、セグメントごとに、または“比較ウインドウ”ごとに実施される。比較のための配列の最適アラインメントは、手作業で行われる他、Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482の局所相同性アルゴリズムによって、Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443の局所相同性アルゴリズムによって、Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444の類似性検索法によって、またはこれらのアルゴリズムを用いるコンピュータプログラム（GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N and TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis．）によって作成することもできる。
【０２９３】
同一性パーセントは、比較される２つの配列間で同一な位置の数を決定し、その数を比較した位置の数で割り、これら２つの配列間の同一性パーセントが得られるように、得られた結果に１００を掛けることによって算出される。
【０２９４】
本発明は図面および以下の実施例によって詳しく説明されるが、これらは例示を目的として使用されているに過ぎず、限定を意図していない。これらの説明と実施例とにより、当業者は、本発明に同様に包含されるさらなる態様に到達することができる。
【０２９５】
図面
図１：乳癌における腫瘍抗原発現の分析。
図２：トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）における腫瘍抗原発現の分析。３つの腫瘍抗原ＣＸｏｒｆ６１、ＣＡＧＥ１およびＰＲＡＭＥのみの組み合わせは、分析したサンプルの９５％を示すのに十分である。
図３：乳癌サンプルにおける転写産物の分布を示すボックス・ウィスカープロット。ＣＸＯＲＦ６１の転写産物の分布（図３Ａ）、ＰＲＡＭＥの転写産物の分布（図３Ｂ）、およびＣＡＧＥ１の転写産物の分布（図３Ｃ）は、サブタイプ（全ての乳癌：腫瘍）、ＴＮＢＣサブタイプなし（乳癌：腫瘍）およびＴＮＢＣサブタイプの乳癌サンプルに区別なく示される。
図４：タンパク質レベルでのＣＸＯＲＦ６１の発現。
図５：ＣＸＯＲＦ６１、ＣＡＧＥ１およびＰＲＡＭＥの腫瘍特異性。
図６：ＣＸＯＲＦ６１についてのＴ細胞エピトープの同定。
図７：ＣＸＯＲＦ６１についてのＴ細胞エピトープとの特異性についてのＴ細胞受容体の試験。
図８：ＮＧＳ分析から予測されるＣＸｏｒｆ６１転写産物配列。公知のＣＸｏｒｆ６１配列（ＮＭ＿００１０１７９７８．３）が示される。新しく予測された配列は太字で示す。
図９：ＣＸｏｒｆ６１−ｉｓｏ１転写産物の存在は、ＰＣＲによって確認できる。ＲＴ−ＰＣＲ分析を、以下のｃＤＮＡ：１  正常精巣、２  ＭＤＡ−ＭＢ４６８、３  ＭＤＡ−ＭＢ２３１を使用して、示したプライマー（プライマー配列については、表１を参照のこと）を用いて行った。
図１０：ＣＸｏｒｆ６１−ｉｓｏ１は、正常組織で発現されない。示された正常組織（ｎ＝６５）を、ＣＸｏｒｆ６１またはＣＸｏｒｆ６１−ｉｓｏ１に特異的なプライマーを用いてｑＲＴ−ＰＣＲにより分析した。相対的発現を、ハウスキーピング遺伝子としてＨＰＲＴを用いてΔΔＣｔ法を用いて計算した。
図１１：ＣＸｏｒｆ６１−ｉｓｏ１は、トリプルネガティブ乳癌組織で発現される。２９個のトリプルネガティブ乳癌組織を、ＣＸｏｒｆ６１−ｉｓｏ１に特異的なプライマーを用いてｑＲＴ−ＰＣＲにより分析した。相対的発現を、ハウスキーピング遺伝子としてＨＰＲＴを用いてΔΔＣｔ法を用いて計算した。
図１２：新たに同定されたＣＡＧＥ１エキソンの位置。対照として、ＵＣＳＣに記載されるＣＡＧＥ１構造を用いた。発現分析に用いたプライマーの位置が示されている。配列番号４５［新規エキソン１］：ライトグレー、配列番号４６［新規エキソン２］、ダークグレー。
図１３：正常組織における新規ＣＡＧＥ１イソ型の発現。ＣＡＧＥ１−Ｔｒｏｎ１の発現（黒カラム）およびＣＡＧＥ１−Ｔｒｏｎ２の発現（灰色カラム）を、示した正常組織において、それぞれプライマー５５２７＋４７８３およびプライマー４７８２＋５５４０を用いてｑＲＴ−ＰＣＲにより分析した。陽性腫瘍組織を対照として用いた。相対的発現を、ハウスキーピング遺伝子としてＨＰＲＴを用いてΔΔＣｔ法を用いて計算した。
図１４：癌組織における新規ＣＡＧＥ１イソ型の発現。トリプルネガティブ乳癌患者からの３４個の組織を、それぞれＣＡＧＥ１−Ｔｒｏｎ１（プライマー５５２７＋４７８３、黒カラム）およびＣＡＧＥ１−Ｔｒｏｎ２（プライマー４７８２＋５５４０、灰色カラム）に特異的なプライマーを用いてｑＲＴ−ＰＣＲにより分析した。相対的発現を、ハウスキーピング遺伝子としてＨＰＲＴを用いてΔΔＣｔ法を用いて計算した。
【実施例】
【０２９６】
実施例
ここで使用する技術および方法は、本明細書に記載されるか、またはそれ自体公知の方法で、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Yに記載されているように実施される。キットおよび反応材の使用を含む全ての方法は、他に特記する場合を除き、製造者の情報に従って行われる。
【０２９７】
実施例１：癌患者の大部分において有用な腫瘍抗原セットの確立
腫瘍を有する患者の大部分によって少なくとも一部共有される腫瘍抗原セットを確立することが可能であるかどうかを、癌患者の広いスペクトルに適用可能なワクチン製剤のセットが提供され得ることに基づいて、評価した。
【０２９８】
この目的のために、ＲＮＡを正常組織および乳癌サンプルからＲＮｅａｓｙ 脂質組織ミニキット（Qiagen）を用いて抽出した。ｃＤＮＡ合成を、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素キット（Invitrogen）およびオリゴ−ｄＴを用いて行った。発現をＢｉｏＭａｒｋ(商標)ＨＤシステム（Fluidigm）を用いて分析し、相対的発現量を、ＨＰＲＴをハウスキーピング遺伝子として用いて算出した。
【０２９９】
このように、いくつかの遺伝子の相対的発現量を検出することができた。３００００の相対的発現の閾値を用いて、陽性サンプルの割合は、サブタイプに関わらず全ての乳癌サンプル（ｎ＝３５）が分析された（図１）か、またはＴＮＢＣサブタイプ（ｎ＝６１）のみが分析された（図２）かどうかによって変わった。特に、３つの転写産物ＰＲＡＭＥ、ＣＸＯＲＦ６１およびＣＡＧＥ１は、ＴＮＢＣ群で分析された患者サンプルの約９５％を示すのに十分であり、すべての乳癌群では３５％を示した。乳癌サンプルにおける該３つの転写産物の分布は、ＴＮＢＣサブタイプを含まない乳癌サンプル（乳癌：腫瘍）およびＴＮＢＣサブタイプにおいて、サブタイプに関わらず（全ての乳癌：腫瘍）、図３Ａ（ＣＸＯＲＦ６１）、図３Ｂ（ＰＲＡＭＥ）、図３Ｃ（ＣＡＧＥ１）にボックス＆ウィスカー・プロットで示されている。
【０３００】
図４は、タンパク質レベルでもＣＸＯＲＦ６１の発現を示すものである。分析のために、全タンパク質抽出物を８つのヒトＴＮＢＣサンプルから作製し、β−アクチン（図４、下パネル）に対して正規化した。ＣＸＯＲＦ６１発現を特異的抗体を用いるイムノブロッティングにより分析した（図４、上パネル）。陰性細胞株（Ｈｅｋ−ｍｏｃｋ）および陽性細胞株、ＣＸＯＲＦ６１をコードするプラスミドでトランスフェクトされたＨｅｋ（Ｈｅｋ−ＣＸＯＲｆ６１）を、対照として用いた。ＣＸＯＲＦ６は、８つの試験したトリプルネガティブ乳癌サンプルのうち５つで検出可能であった（図４、レーン３−５、７−８）。
【０３０１】
実施例２：ＣＸＯＲＦ６１、ＣＡＧＥ１およびＰＲＡＭＥの腫瘍特異性の分析
上記３つの転写産物の腫瘍特異性を、正常組織の大規模セット（ｎ＝６５）におけるｑＲＴ−ＰＣＲにより分析した。図５に示すとおり、ＣＸＯＲＦ６１の高発現（＞３０．０００）が精巣でのみ検出され、ＰＲＡＭＥの高発現が精巣、子宮内膜および精巣上体で検出された。ＣＡＧＥ１は精巣でのみ弱い発現を示す。対照的に、ワクチン療法および他の免疫療法アプローチの一般的に認められた標的であるＥｒｂｂ２は、いくつかの正常組織において高い発現を示す。
【０３０２】
実施例３：ＣＸＯＲＦ６１、ＣＡＧＥ１およびＰＲＡＭＥのＴ細胞エピトープ
ＣＸＯＲＦ６１について、ＣＸＯＲＦ６１に由来するペプチドに対してＣＸＯＲＦ６で免疫化したＨＬＡ−Ａ＊０２−トランスジェニックマウス由来の脾臓細胞の、エキソビボ反応性によりＴＣＲエピトープが同定され、ＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより分析された。この目的のために、ＣＸＯＲＦ６１由来のＨＬＡ−Ａ＊０２結合ペプチドは、ＳＹＦＰＥＩＴＨＹアルゴリズムを適用して予測された（図６Ａ）。脾臓細胞を、ＣＸＯＲＦ６１ペプチドプールまたは予測されたＨＬＡ−Ａ＊０２結合ＣＸＯＲＦ６１に由来するペプチドＡ２−１−６に対する反応性について分析した（図６Ｂ）。陽性対照：ＰＭＡ処理した脾臓細胞；陰性対照：無関係のペプチドプール（ＨＩＶ−ｇａｇ）、無関係の九量体ペプチド（ＰＬＡＣ１−３１−３９）。２つのＡ２拘束性エピトープが同定された（ペプチドＡ２−２およびＡ２−４）。
【０３０３】
ＣＸＯＲＦ６１免疫化マウスのＣＤ８＋Ｔ細胞からのＴＣＲの単離後、ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性健常ドナーのＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＴＣＲ−α／β鎖ＲＮＡでトランスフェクトし、ＣＸＯＲＦ６１  ＲＮＡでトランスフェクトするか、またはＣＸＯＲＦ６１重複１５ｍｅｒ ペプチド（＝ＣＸＯＲＦ６１プール）またはＨＬＡ−Ａ＊０２結合ペプチド  ＣＸＯＲＦ６１−Ａ２−２／４でパルスした、Ｋ５６２−Ａ２細胞の認識についてＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより試験した（図７）。陰性対照：無関係のペプチドプール（ＨＩＶ−ｇａｇ）、無関係の９ｍｅｒ ペプチド（Ｐｌａｃ１−３１−３９）；陽性対照：ＳＥＢ。３つのＴＣＲが、ペプチドＡ−２に特異的であり、１つのＴＣＲがペプチドＡ２−４に特異的であった。
【０３０４】
ＰＲＡＭＥについて、Ｔ細胞エピトープの大多数が、抗腫瘍細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発することが報告されている。Kesslerらによる文献(2001, J. Exp. Med. 193(1):73−88)では、４つのＨＬＡ−Ａ＊０２０１提示細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）ＰＲＡＭＥエピトープ（ＶＬＤＧＬＤＶＬＬ、ＳＬＹＳＦＰＥＰＥＡ、ＡＬＹＶＤＳＬＦＦＬ、およびＳＬＬＱＨＬＩＧＬ）が報告されている。該文献は、これらのエピトープについて乳癌細胞株の溶解を実証した。細胞傷害性Ｔリンパ球による免疫応答を誘発するさらなるＰＲＡＭＥエピトープが、Kessler et al. (2003, Hum Immunol. 64(2):245−55)（ＬＰＲＥＬＦＰＰＬ、ＬＰＲＲＬＦＰＰＬＦ、ＦＰＰＬＦＭＡＡＦ、ＩＰＶＥＶＬＶＤＬＦ、ＬＰＴＬＡＫＦＳＰＹ、ＣＰＨＣＧＤＲＴＦＹ、ＥＰＩＬＣＰＣＦＭ、ＨＬＡ−Ｂ３５）、Kawahara et al. (2006, Exp Hematol. 34(11):1496−504)（ＧＱＨＬＨＬＥＴＦ、ＨＬＡ−Ｂ＊６２）、およびQuintarelli et al. (2011, Blood 117(12):3353−62)（ＮＬＴＨＶＬＹＰＶ、ＨＬＡ−Ａ＊０２）により同定されている。
【０３０５】
ＣＡＧＥ１について、ｃＤＮＡ発現ライブラリーの血清学的分析に関する文献（ＳＥＲＥＸ）は、癌患者が、この標的に対する自己抗体を特異的に産生したことを示した（Park et al., 2003, Biochim Biophys Acta. 1625(2):173−82）。細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の誘導は、いくつかの癌／精巣抗原について報告されている。
【０３０６】
実施例４：腫瘍組織において強力に発現されるＣＸｏｒｆ６１イソ型の同定
腫瘍細胞株で発現されるが、正常精巣では発現されない、新規のＣＸｏｒｆ６１転写産物が、次世代シーケンサーにより同定された。この配列は、より長い３’ＵＴＲを有し、ＣＸｏｒｆ６１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を変更しない（図８）。
【０３０７】
より長いＣＸｏｒｆ６１転写産物の存在を確認するために、予測された配列を、公知の配列の５’および新たに予測された配列の３’に結合するプライマー（プライマー３８７３＋３８７５）を用いて増幅させた（図９）。対照として、ＮＭ＿００１０１７９７８．３に結合するプライマー（プライマー３８７３＋３８７４）を用いた。ＮＭ＿００１０１７９７８．３配列は正常精巣ならびに乳房腫瘍細胞株ＭＤＡ−ＭＢ４６８およびＭＤＡ−ＭＢ２３１で検出されるが、新たな配列は、乳房腫瘍細胞株でのみ検出され得る。ＰＣＲ産物を、配列決定し、予測された配列の存在を確認するために送付した。
【０３０８】
ＣＸｏｒｆ６１−ｉｓｏ１の相対的発現を、Ｆｌｕｉｄｉｇｍのシステムを用いてｑＲＴ−ＰＣＲにより（プライマー２８９８＋３８７６）分析した。ＣＸｏｒｆ６１（プライマー２８９８＋２８９９）の発現は正常精巣で顕著に強く検出され、精巣上体および胎盤で弱く検出されたが、正常精巣でのみの無関係な発現がＣＸｏｒｆ６１−ｉｓｏ１について見出された（図１０）。
【０３０９】
ＣＸｏｒｆ６１−ｉｓｏ１の相対的発現を、Ｆｌｕｉｄｉｇｍのシステムを用いてトリプルネガティブ乳癌患者サンプルにおいてプライマー２８９８＋３８７６を用いるｑＲＴ−ＰＣＲにより分析した（図１１）。１００００の閾値を用いて、サンプルの５９％がＣＸｏｒｆ６１−ｉｓｏ１に陽性であった。
【０３１０】
【表１】
0006513086.tif 000002
【０３１１】
実施例５：腫瘍組織において強力に発現されるＣＡＧＥ１イソ型の同定
次世代シーケンサーを用いて、ＣＡＧＥ１配列における代替開始コドンを同定した。新たなエキソンの存在をＲＴ−ＰＣＲおよび配列決定により確認した。ＲＴ−ＰＣＲ分析を、トリプルネガティブ乳癌患者のｃＤＮＡを用いて、プライマー５２７４および５５２７（プライマー配列について、表２参照のこと。プライマー位置について、図１２参照のこと）を用いて行った。増副産物をゲルから抽出し、配列決定した。
【０３１２】
【表２】
0006513086.tif 000003
【０３１３】
発現分析に用いたプライマーの位置を図１２に示す。同図の灰色バーは、５’でのエキソンを示し、黒色バーは、３’でのエキソンを示す。新規のイソ型は、公知のＡＧＥ１イソ型より短い。新たに同定されたＣＡＧＥ１イソ型は、それぞれ配列番号４３［ＣＡＧＥ１−ＴＲＯＮ１−ＯＲＦ］および４４［ＣＡＧＥ１−ＴＲＯＮ２−ＯＲＦの予測されたＯＲＦをコード化する、配列番号４１［ＣＡＧＥ１−ＴＲＯＮ１］および４２［ＣＡＧＥ１−ＴＲＯＮ２］である。ＣＡＧＥ１−ＴＲＯＮ１は、配列番号４５の新規エキソンを含み、ＣＡＧＥ１−ＴＲＯＮ２は、配列番号４５および４６の新規エキソンを含む。対照として、ＵＣＳＣに記載のＣＡＧＥ１構造を用いた。
【０３１４】
【表３】
0006513086.tif 000004
【０３１５】
ＣＡＧＥ１−Ｔｒｏｎ１およびＣＡＧＥ１−Ｔｒｏｎ２は、正常組織において発現が制限されている。ＣＡＧＥ１−Ｔｒｏｎ１およびＣＡＧＥ１−Ｔｒｏｎ２の相対的発現を、いくつかの脳領域を含む６０の正常組織において、Ｆｌｕｉｄｉｇｍの技術を用いるｑＲＴ−ＰＣＲにより分析した。ＣＡＧＥ１−Ｔｒｏｎ１の発現は胎盤で検出されたが、精巣ではほどんと検出されなかった。ＣＡＧＥ１−Ｔｒｏｎ２は正常組織では検出されなかった（図１３）。
【０３１６】
ＣＡＧＥ１−Ｔｒｏｎ１およびＣＡＧＥ１−Ｔｒｏｎ２は、トリプルネガティブ乳癌組織で発現されている。ＣＡＧＥ１−Ｔｒｏｎ１およびＣＡＧＥ１−Ｔｒｏｎ２の相対的発現を、３４個のトリプルネガティブ乳癌患者サンプルにおいてｑＲＴ−ＰＣＲにより分析した。１００のカットオフを用いて、腫瘍の７３％がＣＡＧＥ１−Ｔｒｏｎ１陽性であり、３２％がＣＡＧＥ１−Ｔｒｏｎ２陽性である（図１４）。
【図１】
0006513086.tif 000005
【図２】
0006513086.tif 000006
【図３Ａ】
0006513086.tif 000007
【図３Ｂ】
0006513086.tif 000008
【図３Ｃ】
0006513086.tif 000009
【図４】
0006513086.tif 000010
【図５】
0006513086.tif 000011
【図６Ａ】
0006513086.tif 000012
【図６Ｂ】
0006513086.tif 000013
【図７】
0006513086.tif 000014
【図８】
0006513086.tif 000015
【図９】
0006513086.tif 000016
【図１０】
0006513086.tif 000017
【図１１】
0006513086.tif 000018
【図１２】
0006513086.tif 000019
【図１３】
0006513086.tif 000020
【図１４】
0006513086.tif 000021
【配列表】
0006513086000001.app