(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（４）で示されるプテロスピンを有効成分とすることを特徴とする歯周病改善剤。
【化１】
0006551924.tif 000014
【請求項２】
インドキノキ（Ｐｔｅｒｏｃａｒｐｕｓ  ｍａｒｓｕｐｉｕｍ）から含水系極性溶媒による溶媒抽出を行い、抽出エキスを得る工程を含む、以下の式（４）で示されるプテロスピンを有効成分とすることを特徴とする歯周病改善剤の製造方法。
【化２】
0006551924.tif 000015
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯周病改善剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年口臭に悩みを抱える人々が増加している。その多くは歯科・口臭外来を受診し治療を受けるが、口臭の発症には様々な要因があるため、改善しないケースも多いと言われている。
【０００３】
口臭には糖尿病や肝疾患などの全身病変由来のものと、歯周病や虫歯などの口腔病変由来のものがあるとされ、全身と口腔局所の病変に分けた治療が行われている。
【０００４】
口腔病変に起因する口臭の最大の原因は歯周病であることが明らかにされている。歯周病は歯周病菌感染に伴う歯周組織の破壊を特徴とする病態である。歯周病が進行すると、歯周組織が細菌の温床になって、さらに細菌感染が進行し、口臭の原因物質が産生されるという悪循環に陥る。従って、歯周病菌の増殖を抑制するとともに歯周病の発症及び進行を抑制することは口臭の抑制につながると考えられる。
【０００５】
歯周病における歯周組織の破壊は、歯肉の構造維持に重要な役割を担う結合組織の主成分であるコラーゲンの分解に起因する場合が多いとされている。細胞由来のコラゲナーゼについて、コラーゲンの分解は細菌の侵入が引き金となり、歯肉線維芽細胞より産生・放出されるマトリックスメタロプロテアーゼ‐１（ＭＭＰ−１）によって促進される。
従って、コラゲナーゼ阻害作用や線維芽細胞からのＭＭＰ−１放出抑制作用を有する素材は歯周病の進行を抑制することにより口臭を軽減できると考えられる。
【０００６】
このような観点から、口臭の予防あるいは治療を目的とした安全な、つまり天然由来の活性成分を含む口腔ケア化粧品の開発が望まれている。
【０００７】
これまで、歯周病菌に有効な天然資源が報告されている（例えば非特許文献１及び２）。
しかし、これらの発明は歯周病菌に対する抗菌作用を有するものであり、歯周組織におけるコラーゲンの破壊を抑制する成分は含まれていないという問題点を有する。
【０００８】
一方、アーユルヴェーダ医学はインドにおける伝統医学であり、近年その治療法や経験値が応用されている。
アーユルヴェーダ医学では、歯磨きに“歯木”と称される天然物素材が使われている。歯木による歯磨きは、磨くことによって物理的に口に生じた汚れを除くことができるが、それだけではなく、歯木は甘味、苦味、渋味及び辛味のいずれかを持つものだけが用いられていたことから化学的にも口臭の原因を除去していた可能性が考えられる。
【０００９】
「歯木」の口腔製品への応用例として下記特許文献１乃至３が挙げられる。
特許文献１には、歯木として使用されるヤナギ科のポプルス属及びサリクス属植物から選ばれる植物又は該植物の溶媒抽出物を有効成分として配合すること、あるいはポプリン、サリシン及びサリゲニンから選ばれる成分を有効成分として配合することにより、上記有効成分由来の収斂作用により優れた口腔内の引き締まり感を付与し得、かつ口内炎、う蝕等の口腔内の痛みの軽減作用を有し、しかも有効成分の安全性の高い口腔用組成物が記載されている。
しかし、特許文献１記載の発明は口内炎や口腔内の痛みを軽減することができるものの、口臭や歯周病を予防することができないという問題点を有する。
【００１０】
特許文献２には、ニーム（センダン科、アザディラクタ・インディカ）抽出物を含むう蝕予防剤が記載されているものの、口臭や歯周病を予防することはできないという問題点を有する。
【００１１】
特許文献３には、歯周病予防剤としてクロモジ（クスノキ科）抽出物が記載されている。特許文献３記載の発明は歯周病を予防することができるものの、歯垢の形成を抑制するものであるため、上記のような歯周組織におけるコラーゲンの破壊を抑制する成分は含まれていないという問題点を有する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｅｉｃｋ  Ｓ．、Ｓｃｈａｆｅｒ  Ｇ．、Ｋｗｉｅｃｉｎｓｋｉ  Ｊ．、Ａｔｒｏｔｔ  Ｊ．、Ｈｅｎｌｅ  Ｔ．、Ｐｆｉｓｔｅｒ  Ｗ．、ＢＭＣ  Ｏｒａｌ  Ｈｅａｌｔｈ、１４：２４（２０１４）
【非特許文献２】Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  Ｈ．、Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｋ．、Ｔｏｙａｍａ  Ｔ．、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｓ．Ｓ．、Ｓｕｇｉｙａｍａ  Ｓ．、Ｌｅｅ  ＭＣ．、Ｈａｍａｄａ  Ｎ．、Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ  Ｒｅｓ．（２０１４）
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開平９−２６８１１７号公報
【特許文献２】特開昭６０−５４３１２号公報
【特許文献３】特開昭５７−５８６１０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
そこで、Ｐｔｅｒｏｃａｒｐｕｓ  ｍａｒｓｕｐｉｕｍ（英名；Ｉｎｄｉａｎ  Ｋｉｎｏ  Ｔｒｅｅ、和名；インドキノキ）が歯木として歯磨きに利用されていたことから、インドキノキの歯周病に起因する口臭の予防・治療効果を検討した。
【００１５】
本発明は、インドキノキ（Ｐｔｅｒｏｃａｒｐｕｓ  ｍａｒｓｕｐｉｕｍ）の乾燥心材を粉末化し、この粉末からアルコール溶液による還流抽出を行い、この抽出液から減圧下でアルコール分を除去した後凍結乾燥させることによって得られた抽出成分を用いることで、口臭予防に使用できる歯周病改善剤とその製造方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
請求項１に係る発明は、インドキノキ（Ｐｔｅｒｏｃａｒｐｕｓ  ｍａｒｓｕｐｉｕｍ）から含水系極性溶媒による溶媒抽出を行い、得られた抽出エキスを含む歯周病改善剤に関する。
【００１７】
請求項２に係る発明は、以下の式（１）で示されるプテロスチルベン、式（２）で示されるリクイリチゲニン、式（３）で示されるイソリクイリチゲニン、及び式（４）で示されるプテロスピンの少なくとも１つを有効成分とすることを特徴とする歯周病改善剤に関する。
【００１８】
【化１】
0006551924.tif 000002
【００１９】
【化２】
0006551924.tif 000003
【００２０】
【化３】
0006551924.tif 000004
【００２１】
【化４】
0006551924.tif 000005
【００２２】
請求項３に係る発明は、インドキノキ（Ｐｔｅｒｏｃａｒｐｕｓ  ｍａｒｓｕｐｉｕｍ）から含水系極性溶媒による溶媒抽出を行い、抽出エキスを得る工程を含む歯周病改善剤の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００２３】
請求項１及び３に係る発明によれば、インドキノキから含水系極性溶媒による溶媒抽出を行い、抽出エキスを得る工程を経てインドキノキから歯周病改善剤として有効な抽出エキスを選択的に得ることができる。更にこの抽出エキスは、歯周病の進行を抑制することができることから、口臭予防に有効な歯周病改善剤を提供することができる。さらに、抽出エキスの主成分がプテロスチルベン、リクイリチゲニン、イソリクイリチゲニン、プテロスピンの少なくとも１つを含むことから、歯肉線維芽細胞からのＭＭＰ−１放出抑制作用を有するため、歯周病の進行が抑制され、口臭予防に有効な歯周病改善剤を提供することができる。
【００２４】
請求項２に係る発明によれば、プテロスチルベン、リクイリチゲニン、イソリクイリチゲニン、プテロスピンの少なくとも１つを有効成分とすることで、歯肉線維芽細胞からのＭＭＰ−１放出抑制作用を有するため、歯周病の進行が抑制され、口臭予防に有効な歯周病改善剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】インドキノキの乾燥心材から抽出エキスを得て、その後さらに酢酸エチル／水及びブタノール／水を用いて抽出操作を行った工程を示す図である。
【図２】図１で示す工程中で得られた酢酸エチル可溶画分をさらにシリカゲルクロマトグラフィに付し、プテロスチルベン、リクイリチゲニン及びイソリクイリチゲニンを抽出する工程を示す図である。
【図３】図１で示す工程中で得られたブタノール可溶画分をさらにシリカゲルクロマトグラフィに付し、プテロスピンを抽出する工程を示す図である。
【図４】インドキノキの心材から抽出した抽出エキスが、ＩＬ−１βによって刺激されたＨＧＦからのＭＭＰ−１放出に与える影響を示す図である。
【図５】インドキノキの心材から抽出した抽出エキスの酢酸エチル可溶画分、ブタノール可溶画分及び水可溶画分が、ＩＬ−１βによって刺激されたＨＧＦからのＭＭＰ−１放出に与える影響を示す図である。
【図６】プテロスチルベン（化合物１）がＩＬ−１βによって刺激されたＨＧＦからのＭＭＰ−１放出に与える影響を示す図である。
【図７】リクイリチゲニン（化合物２）がＩＬ−１βによって刺激されたＨＧＦからのＭＭＰ−１放出に与える影響を示す図である。
【図８】イソリクイリチゲニン（化合物３）がＩＬ−１βによって刺激されたＨＧＦからのＭＭＰ−１放出に与える影響を示す図である。
【図９】プテロスピン（化合物１）がＩＬ−１βによって刺激されたＨＧＦからのＭＭＰ−１放出に与える影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
＜抽出エキスの製造方法＞
図１は、インドキノキから抽出エキスを得る方法の一例として、インドキノキの乾燥心材から抽出エキスを得て、その後さらに酢酸エチル／水及びブタノール／水を用いて抽出操作を行った工程を示す図である。
本発明に係る歯周病改善剤に含まれる抽出エキスは以下の工程を経て得ることができる。
（１）インドキノキ（Ｐｔｅｒｏｃａｒｐｕｓ  ｍａｒｓｕｐｉｕｍ）の乾燥心材を粉末化する工程、
（２）（１）の粉末からアルコール溶液による還流抽出を行う工程、
（３）（２）で得られた抽出液から減圧下でアルコール分を除去した後凍結乾燥させる工程。
【００２７】
本発明に係る歯周病改善剤に含まれる抽出エキスの製造方法の一例について詳細に説明する。
先ず、工程（１）について説明する。
インドキノキを破砕機等により粉末化する。
粉末化はインドキノキ中に含まれる成分を抽出しやすくするために行うものであって、粉末化せずに抽出しても良い。
インドキノキは、マメ科シタン属に属するＰｔｅｒｏｃａｒｐｕｓ  ｍａｒｓｕｐｉｕｍであり、インド南部からスリランカに生息する常緑樹である。本例において、粉末化するにあたって、インドキノキの乾燥させた心材を使用しているが、インドキノキは乾燥したものでなくてもよく、心材以外にもインドキノキの葉、枝、地下部等他の部分であっても良い。また、粉末化により得られる粉末の粒径については特に限定されない。
【００２８】
工程（２）について説明する。
粉末化したインドキノキの粉末を含水系極性溶媒で溶媒抽出する。
溶媒抽出の方法としては、本例では還流抽出を使用しているが、還流抽出、浸漬抽出及び振とう抽出等いずれの抽出方法を使用しても良い。
還流抽出に用いる装置としてソックスレー抽出器等が挙げられるが、固体試料から溶媒抽出できる装置であれば特に限定されない。
含水系極性溶媒を用いて、含水系極性溶媒に可溶する成分を得る。このとき使用される含水系極性溶媒として、メタノール、エタノール、プロパノール等を含むアルコール溶液が好適に利用される。更にアルコール溶液に含まれるアルコールの含有量は３０〜８０％であることが好ましい。アルコール含有量が３０％より少ないと有効成分であるプテロスチルベン、リクイリチゲニン、イソリクイリチゲニン、プテロスピン等が抽出され難くいため好ましくない。
この操作に含水系極性溶媒を用いることで、インドキノキに含まれる歯周病の改善に有効な成分を抽出することができる。更に、この抽出操作に使用するインドキノキ及びアルコール溶液の質量比は、１：５〜１：２０であることが好ましい。１：３未満だとインドキノキに含まれる歯周病の改善に有効な成分を十分に抽出できないため好ましくなく、１：２０を超えると工程（３）においてアルコール分を手早く除去することができないため好ましくない。
還流抽出を行う時間や回数は、使用するインドキノキの量や状態によって適宜変更し得る。
【００２９】
工程（３）について説明する。
本例においては、工程（２）により得られた抽出液から減圧乾燥器等によってアルコール分を除去するが、この工程はなくても良い。このとき、減圧乾燥に使用される装置については特に限定されない。
その後抽出エキスを凍結乾燥させて使用しても良い。凍結乾燥は−４０℃で２４時間行うことが好ましい。
【００３０】
得られた抽出エキスは、以下の式（１）で示されるプテロスチルベン、式（２）で示されるリクイリチゲニン、式（３）で示されるイソリクイリチゲニン、及び式（４）で示されるプテロスピンを含んでいる。（図１−３参照）。
【００３１】
【化５】
0006551924.tif 000006
【００３２】
【化６】
0006551924.tif 000007
【００３３】
【化７】
0006551924.tif 000008
【００３４】
【化８】
0006551924.tif 000009
【００３５】
上記した方法により得られた抽出エキスは、歯周組織を形成するコラーゲン分解を促進するＭＭＰ−１の放出を抑制することができることから、口臭予防に有効な歯周病改善剤とすることができる（抽出エキスのＭＭＰ−１放出抑制作用については下記明細書段落［００６２］及び図４で説明する）。
【００３６】
また、上記抽出エキスに含まれるプテロスチルベン、リクイリチゲニン、イソリクイリチゲニン、及びプテロスピンはそれぞれ単体でもＭＭＰ−１の放出を抑制する効果を奏する（下記実施例２参照）。
本発明に係る歯周病改善剤に含まれるプテロスチルベン、リクイリチゲニン、イソリクイリチゲニン、及びプテロスピンは、それぞれ以下の工程を経て得られる。
【００３７】
＜プテロスチルベンの抽出方法＞
本発明に係る歯周病改善剤に含まれるプテロスチルベンは以下の工程を経て得られる。
（Ａ）前記抽出エキスを水に懸濁する工程。
（Ｂ）（Ａ）に酢酸エチルを加えて有機層を分離し、溶媒を除去して酢酸エチル可溶画分を得る工程。
（Ｃ）（Ｂ）をシリカゲルクロマトグラフィに付し、ヘキサン／酢酸エチル混液で溶出し、５つの画分を得る工程。
（Ｄ）（Ｃ）で得られた５つの画分の内２番目の画分から、逆相ＨＰＬＣにてプテロスチルベンを溶出する工程。
なお、本実施形態においては出発材料である抽出エキスの量が４０．０ｇである場合について記載する。当然ながら、出発材料の量や状態によって抽出条件は適宜変更し得る。
【００３８】
工程（Ａ）について説明する。
図１に示すように、抽出エキス（４０．０ｇ）を水（２５０ｍｌ）に懸濁する。懸濁する方法や装置は特に限定されない。
【００３９】
工程（Ｂ）について説明する。
工程（Ａ）で得られた懸濁液に酢酸エチルを加える。この際、酢酸エチルは懸濁液のおおよそ３倍量（本実施形態の場合７５０ｍｌ）であることが好ましい。酢酸エチルは一度に懸濁液に加えても、複数回に分けて加えても良い。
その後有機層を分離し、溶媒を減圧下で除去し、酢酸エチル可溶画分を得る。
【００４０】
工程（Ｃ）について説明する。
図２は、図１で示す工程中で得られた酢酸エチル可溶画分をさらにシリカゲルクロマトグラフィに付し、プテロスチルベン、リクイリチゲニン及びイソリクイリチゲニンを抽出する工程を示す図である。
図２に示すように、工程（Ｂ）で得られた酢酸エチル可溶画分をシリカゲルクロマトグラフィ（ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０、２８０ｇ  ２．２５×４０ｃｍ）に付し、ヘキサンと酢酸エチルが５：１であるヘキサン／酢酸エチル混液で溶出し、３００ｍｌずつ分取して３０の画分を得る。得た画分の薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）における検出スポットが同じＲｆ値を示す分画同士を合わせ５つの分画（Ｆ−Ｊ）とした。
【００４１】
工程（Ｄ）について説明する。
得られた５つの画分の内、画分Ｇから逆相ＨＰＬＣ（ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｃ１８カラム、１９×２５０ｍｍ、日本ウォーターズ）にて、移動相を７５％メタノール（０．１％ギ酸）、流速１０．０ｍｌ／分、検出２８０ｎｍの条件でプテロスチルベンを溶出する。溶出した物質がプテロスチルベンであることは、１Ｈ−及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル及びＤＥＰＴ、ＨＳＱＣ、ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＨＭＢＣ−ＮＭＲスペクトルの解析と文献（Ｊｏ  Ｇ．、Ｈｙｕｎ  Ｊ．、Ｈｗａｎｇ  Ｄ．、Ｌｅｅ  Ｙ．Ｈ．、Ｋｏｈ  Ｄ．、Ｌｉｍ  Ｙ．、Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｃｈｅｍ．、４９、３７４−３７７（２０１１））で示されている値との比較によって確認する。
【００４２】
＜リクイリチゲニン及びイソリクイリチゲニンの抽出方法＞
本発明に係る歯周病改善剤に含まれるリクイリチゲニン及びイソリクイリチゲニンは以下の工程を経て得られる。
（Ａ）前記抽出エキスを水に懸濁する工程。
（Ｂ）（Ａ）に酢酸エチルを加えて有機層を分離し、溶媒を除去して酢酸エチル可溶画分を得る工程。
（Ｃ）（Ｂ）をシリカゲルクロマトグラフィに付し、ヘキサン／酢酸エチル混液で溶出し、５つの画分を得る工程。
（Ｄ）（Ｃ）で得られた５つの画分の内３番目の画分をさらにシリカクロマトグラフィに付し、６つの画分を得る工程。
（Ｅ）（Ｄ）で得られた６つの画分の内３番目の画分から逆相ＨＰＬＣにて、リクイリチゲニン及びイソリクイリチゲニンを溶出する工程。
（Ｆ）（Ｅ）で得られた溶出液から分取用ＨＰＬＣにて、リクイリチゲニン及びイソリクイリチゲニンを分ける工程。
なお、本実施形態においては出発材料である抽出エキスの量が４０．０ｇである場合について記載する。当然ながら、出発材料の量や状態によって抽出条件は適宜変更し得る。
【００４３】
工程（Ａ）乃至（Ｃ）は、プテロスチルベンを抽出する方法における工程（Ａ）乃至（Ｃ）と同様の条件で行う。
工程（Ｄ）について説明する。
得られた５つの画分の内、画分Ｈをシリカゲルカラムクロマト（ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０、５０ｇ、１．２５×２５ｃｍ）に付し、５０ｍｌずつ分取して５０の画分を得る。得られた画分のＴＬＣにおける検出スポットが同じＲｆ値を示す分画同士を合わせ６つの分画（Ｈ−１〜Ｈ−６）とした。
【００４４】
工程（Ｅ）について説明する。
得られた６つの画分の内、画分Ｈ−３から逆相ＨＰＬＣ（ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｃ１８カラム、１９×２５０ｍｍ、日本ウオーターズ）にて、移動相を３５％アセトニトリル（０．１％ギ酸）、流速１０．０ｍｌ／分、検出２５４ｎｍの条件で、リクイリチゲニン及びイソリクイリチゲニンを溶出した。
【００４５】
工程（Ｆ）について説明する。
工程（Ｅ）で得られた溶出液を分取用ＨＰＬＣ（日本ウオーターズ製）にて、移動相を３５％アセトニトリル（０．１％ギ酸）、流速１０．０ｍｌ／分、検出２５４ｎｍの条件で、リクイリチゲニンとイソリクイリチゲニンを分けた。
溶出した物質がリクイリチゲニン及びイソリクイリチゲニンであることは、１Ｈ−及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル及びＤＥＰＴ、ＨＳＱＣ、ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＨＭＢＣ−ＮＭＲスペクトルの解析と文献（リクイリチゲニンはＣｈａｗｌａ  Ａ．、Ｋａｕｒ  Ｊ．、Ｓｈａｒｍａ  Ａ．Ｋ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈｙｔｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．、２、３１９−３２７（２０１３）、イソリクイリチゲニンはＳａｔｏ  Ｙ．、Ｈｅ  Ｊ．Ｘ．、Ｎａｇａｉ  Ｈ．、Ｔａｎｉ  Ｔ．、Ａｋａｏ  Ｔ．、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、３０、１４５−１４９（２００７））に示された値との比較から同定した。
【００４６】
＜プテロスピンの抽出方法＞
本発明に係る歯周病改善剤に含まれるプテロスピンは以下の工程を経て得られる。
（Ａ）前記抽出エキスを水に懸濁する工程。
（Ｂ）（Ａ）に酢酸エチルを加えて水層を分離する工程。
（Ｃ）（Ｂ）で分離した水層にブタノールを加えて有機層を分離し、溶媒を除去してブタノール可溶画分を得る工程。
（Ｄ）（Ｃ）をシリカゲルクロマトグラフィに付し、クロロホルム／メタノール／水の混液で溶出し、５つの画分を得る工程。
（Ｅ）（Ｄ）で得られた５つの画分の内４番目の画分から逆相ＨＰＬＣにてプテロスピンを溶出する工程。
なお、本実施形態においては出発材料である抽出エキスの量が４０．０ｇである場合について記載する。当然ながら、出発材料の量や状態によって抽出条件は適宜変更し得る。
【００４７】
工程（Ａ）及び（Ｂ）は上記プテロスチルベン、リクイリチゲニン及びイソリクイリチゲニンの抽出方法における工程（Ａ）及び（Ｂ）とほぼ同様に行うが、工程（Ｂ）において有機層ではなく水層を分離する点で相違する。
【００４８】
工程（Ｃ）について説明する。
工程（Ｂ）で分離した水層にブタノールを加える。この際、ブタノールは分離した水層のおおよそ等量（本実施形態の場合２５０ｍｌ）であることが好ましい。ブタノールは一度に懸濁液に加えても、複数回に分けて加えても良い。
その後有機層を分離し、溶媒を減圧下で除去し、ブタノール可溶画分を得る。
【００４９】
図３は、図１で示す工程中で得られたブタノール可溶画分をさらにシリカゲルクロマトグラフィに付し、プテロスピンを抽出する工程を示す図である。
工程（Ｄ）について説明する。
図３に示すように、工程（Ｃ）で得られたブタノール可溶画分をシリカゲルクロマトグラフィ（ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０、２５０ｇ  ２．２５×３５ｃｍ）に付し、クロロホルム／メタノール／水（３０：１０：１）混液で溶出し、３００ｍｌずつ分取して３５の画分を得る。得た画分の薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）の検出スポットが同じＲｆ値を示す分画同士を合わせ５つの分画（Ａ−Ｅ）とした。
【００５０】
工程（Ｅ）について説明する。
得られた５つの画分の内、画分Ｄから逆相ＨＰＬＣ（ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｃ１８カラム、１９×２５０  ｍｍ、日本ウオーターズ）にて、移動相を３０％メタノール（０．１％ギ酸）、流速１０．０ｍｌ／分、検出２８０ｎｍの条件で、プテロスピンを溶出した。溶出した物質がプテロスピンであることは、１Ｈ−及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル及びＤＥＰＴ、ＨＳＱＣ、ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＨＭＢＣ−ＮＭＲスペクトルの解析と文献（Ａｄｉｎａｒａｙａｎａ  Ｄ．、Ｓｙａｍａｓｕｎｄａｒ  Ｋ．Ｖ．、Ｓｅｌｉｇｍａｎｎ  Ｏ．、Ｗａｇｎｅｒ  Ｈ．、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．、３７ｃ、１４５−１４７（１９８２））に示された値との比較から同定した。
【００５１】
＜歯周病改善剤の剤形＞
本発明の歯周病改善剤の剤形は、飲食品、医薬品及び医薬部外品のいずれとするかによって適宜決定することができ、特に限定されない。経口投与される際の剤形の例としては、洗口剤等の液状のもの（液剤）、シロップ状（シロップ剤）、錠（錠剤、タブレット）、カプセル状（カプセル剤）、粉末状（顆粒、細粒）、ソフトカプセル状（ソフトカプセル剤）、シロップ状（シロップ剤）、固形状、半液体状、口腔塗布剤等のクリーム状のもの、歯磨き粉等のペースト状のものが挙げられる。
【実施例】
【００５２】
本発明に係る歯周病改善剤及びその製造方法に関する実施例を示すことにより、本発明の効果をより明確なものとする。但し、本発明はこの実施例に何ら限定されるものでない。
【００５３】
＜実施例１：インドキノキからの抽出エキスを含む歯周病改善剤のＭＭＰ−１放出抑制作用＞
（１−１．歯周病改善剤の作製）
インドキノキの乾燥心材を粉砕し、５倍量の５０％エタノールで２時間２回還流抽出した。還流抽出にはマントルヒ−タ−（大科電器（株）社製）を使用した。得られた５０％エタノール抽出液を合わせ、減圧下でエタノールを留去した後に凍結乾燥させ、５０％エタノール抽出エキス（収率：１１．６％）を得た。
【００５４】
（１−２．歯肉線維芽細胞からのＭＭＰ‐１放出抑制作用）
（Ａ．細胞）
本実施例では、Ｓｃｉｅｎ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより購入した歯肉線維芽細胞（Ｈｕｍａｎ  ｇｉｎｇｉｖａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＨＧＦ）を用いた。ＨＧＦは１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを加えたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２下にて７日間培養した。これを１回の継代培養として、継代回数３から８回のＨＧＦを使用した。
【００５５】
（Ｂ．ＩＬ−１β刺激）
ＨＧＦからのＭＭＰ−１の放出を促進するため、ＨＧＦをＩＬ−１βで刺激した。刺激した方法について以下に具体的に説明する。
上記Ａ．のように培養したＨＧＦ（１×１０５細胞／２ｍｌ）を６−ｗｅｌｌマイクロプレートに播種し、３７℃、５％  ＣＯ２下にてコンフルエントになるまで培養した。ＨＧＦをｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）１ｍｌで２回洗浄した後、抽出エキス及びＩＬ−１βを添加した無血清培地２ｍｌにて、３７℃、５％  ＣＯ２下で４８時間培養した。抽出エキスをＤＭＳＯあるいはＤＭＳＯ含有ＤＭＥＭに溶解し、ＤＭＥＭで所定の濃度に希釈した（ＤＭＳＯ最終濃度：０．２％）。陰性対照群及び溶媒対照群には２％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ／ＤＭＥＭを用いた。溶媒対照群及び抽出エキス群にＩＬ−１βを添加した．ＩＬ−１βは０．１％ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）で溶解して０．１ｍｇ／ｍｌの濃度に調整し、−８０℃で凍結保存させたものを用時溶解して用いた。
【００５６】
（Ｃ．培地中に放出されたＭＭＰ−１のウエスタンブロット分析）
ＨＧＦを６−ｗｅｌｌマイクロプレートで無血清培地にて３７℃、５％  ＣＯ２下で４８時間培養した。培地１ｍｌを採取し、１２、０００×ｇ、４℃、１５分間遠心分離し上清を得た。β−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを最終濃度が５％（ｖ／ｖ）になるように添加したｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ）含有サンプルバッファーと、得られた上清を等量混合し、１００℃、４分間インキュベートした後、氷上で冷却したものをウエスタンブロット用試料とした。ウエスタンブロット用試料１０μｌを１０％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、分離したタンパクをＰＶＤＦ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）メンブレンに転写した。これを５％（ｗ／ｖ）ｓｋｉｍｍｅｄ  ｍｉｌｋと０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ）で一晩ブロッキングした後、１％ｓｋｉｍｍｅｄ  ｍｉｌｋと０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで４００倍希釈した抗−ＭＭＰ−１抗体を室温、１時間反応させた。続いて、メンブレンに４、０００倍希釈したｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識二次抗体を室温、１時間反応させた。タンパクの検出にはＥＣＬ  Ｐｌｕｓを用い、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ  Ｐｌｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で化学発光を検出した。バンドの強度はＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ  １−Ｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｖｅｒｓｉｏｎ．４．６．７、２００８、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にて評価した。
【００５７】
（Ｄ．統計処理）
実験結果は平均値±標準誤差で表し、統計学的な有意差検定には一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びＤｕｎｎｅｔの多重比較検定を用いた。
【００５８】
（Ｅ．結果）
図４は、インドキノキの心材から抽出した抽出エキスが、ＩＬ−１βによって刺激されたＨＧＦからのＭＭＰ−１放出に与える影響を示す図である。
図４に示すように、抽出エキスは１０、２５及び５０μｇ／ｍｌの濃度で強いＭＭＰ−１放出抑制作用を示した。つまり、インドキノキの心材から得られた抽出エキスは、歯周組織の分解に関わる酵素ＭＭＰ−１の歯肉線維芽細胞からの放出に対する抑制作用を示すことが、本実施例からも明らかである。このことから、インドキノキから得られた抽出エキスは歯周組織を構成するコラーゲンの分解を抑制することで、歯周病の進行を抑制し、その結果として、口臭の予防・治療に寄与できる可能性が考えられる。
【００５９】
＜実施例２：インドキノキから得られた抽出エキスから分画したプテロスチルベン、リクイリチゲニン、イソリクイリチゲニン及びプテロスピンのいずれかを含む歯周病改善剤のＭＭＰ−１放出抑制作用＞
（２−１．抽出エキスの分画）
図１に示すように、実施例１記載の方法と同様の方法で得られた抽出エキス（４０．０ｇ）を水（２５０ｍｌ）で懸濁し、これを酢酸エチル（２５０ｍｌ）で３回抽出し、続いてブタノール（２５０ｍｌ）で抽出した。酢酸エチル及びブタノール抽出液をそれぞれ合わせ、減圧下で溶媒を留去し、酢酸エチル可溶画分（６．０ｇ、抽出エキスからの収率：１５．０％）とブタノール可溶画分（８．８ｇ、２２．０％）を得た。水層を減圧濃縮した後に凍結乾燥し、水可溶画分（２１．０ｇ、５２．５％）を得た。これらの画分についてＭＭＰ−１放出抑制作用を検討した。
【００６０】
図２に示すように、酢酸エチル可溶画分（５．６ｇ）をシリカゲルカラムクロマト（ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０、２８０ｇ、２．２５×４０ｃｍ）に付し、ＴＬＣでモニターしながらヘキサン／酢酸エチル（５：１）混液で溶出し、各画分を３００ｍｌずつ分取して３０の画分を得た。得られた画分のＴＬＣで検出したスポットでＲｆ値の同じ物を合わせ１つの分画部とし、Ｆ〜Ｊの５つの分画にした。
【００６１】
画分Ｇから逆相ＨＰＬＣ（ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｃ１８  Ｃｏｌｕｍｎ、１９×２５０ｍｍ、日本ウォーターズ）にて、移動相を７５％メタノール（０．１％ギ酸）、流速１０．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出２８０ｎｍの条件で溶出し、化合物１を得た。下記表１及び２に示す化合物１の１Ｈ−及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル及びＤＥＰＴ、ＨＳＱＣ、ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＨＭＢＣ−ＮＭＲスペクトルの解析と文献値（Ｊｏ  Ｇ．、Ｈｙｕｎ  Ｊ．、Ｈｗａｎｇ  Ｄ．、Ｌｅｅ  Ｙ．Ｈ．、Ｋｏｈ  Ｄ．、Ｌｉｍ  Ｙ．、Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｃｈｅｍ．、４９、３７４−３７７（２０１１））との比較から、化合物１をプテロスチルベンと同定した。
【００６２】
画分Ｈ（９７０ｍｇ）をシリカゲルカラムクロマト（ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０、５０ｇ、１．２５×２５ｃｍ）に付し、各画分を５０ｍｌずつ分取して５０の画分を得た。得られた画分のＴＬＣのデータに基づき、画分Ｈ−１〜Ｈ−６に分画した。得られた画分Ｈ−３から逆相ＨＰＬＣ（ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｃ１８  Ｃｏｌｕｍｎ、１９×２５０ｍｍ、日本ウオーターズ）にて、移動相を３５％アセトニトリル（０．１％ギ酸）、流速１０．０ｍｌ／分、検出２５４ｎｍの条件で溶出し、化合物２及び３を得た。さらに化合物２及び３を分けるために、分取用ＨＰＬＣ（日本ウオーターズ製）にて、移動相を３５％アセトニトリル（０．１％ギ酸）、流速１０．０ｍｌ／分、検出２５４ｎｍの条件で溶出し、化合物２及び３を分けた。表１及び２に示す化合物２及び３の１Ｈ−及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル及びＤＥＰＴ、ＨＳＱＣ、ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＨＭＢＣ−ＮＭＲスペクトルの解析と文献値（Ｃｈａｗｌａ  Ａ．、Ｋａｕｒ  Ｊ．、Ｓｈａｒｍａ  Ａ．Ｋ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈｙｔｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．、２、３１９−３２７（２０１３）及びＳａｔｏ  Ｙ．、Ｈｅ  Ｊ．Ｘ．、Ｎａｇａｉ  Ｈ．、Ｔａｎｉ  Ｔ．、Ａｋａｏ  Ｔ．、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、３０、１４５−１４９（２００７））との比較から、化合物２をリクイリチゲニン、化合物３をイソリクイリチゲニンと同定した。
【００６３】
図３に示すように、ブタノール可溶画分（５．４ｇ）をシリカゲルカラムクロマト（ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０、２５０ｇ、２．２５×３５ｃｍ）に付し、ＴＬＣでモニターしながらクロロホルム／メタノール／水（３０：１０：１）混液で溶出し、各画分を３００ｍｌずつ分取して３５の画分を得た。得られた画分のＴＬＣのデータに基づき、画分Ａ〜Ｅ（２．３０ｇ、４２．６％）に分画した。画分Ｄから逆相ＨＰＬＣ（ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｃ１８  Ｃｏｌｕｍｎ、１９×２５０ｍｍ、日本ウォーターズ）にて、移動相を３０％メタノール（０．１％ギ酸）、流速１０．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出２８０ｎｍの条件で溶出し、化合物４を得た。表３及び４に示す化合物４の１Ｈ−、及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル及びＤＥＰＴ、ＨＳＱＣ、ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＨＭＢＣ−ＮＭＲスペクトルの解析と文献値（Ａｄｉｎａｒａｙａｎａ  Ｄ．、Ｓｙａｍａｓｕｎｄａｒ  Ｋ．Ｖ．、Ｓｅｌｉｇｍａｎｎ  Ｏ．、Ｗａｇｎｅｒ  Ｈ．、Ｚ．  Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．、３７ｃ、１４５−１４７（１９８２））との比較から、化合物４をプテロスピンと同定した。
【００６４】
【表１】
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【００６５】
【表２】
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【００６６】
【表３】
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【００６７】
【表４】
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【００６８】
（２−２．歯肉線維芽細胞からのＭＭＰ−１放出抑制作用）
（Ａ．細胞）
実施例１と同様に行った。
（Ｂ．ＩＬ−１β刺激）
実施例１と同様に行った。
（Ｃ．培地中に放出されたＭＭＰ−１のウエスタンブロット分析）
実施例１と同様に行った。
（Ｄ．統計処理）
実施例１と同様に行った。
【００６９】
（Ｅ．結果）
（Ｅ−１．抽出エキスから得られた酢酸エチル可溶画分、ブタノール可溶画分及び水可溶画分のＭＭＰ−１放出抑制作用）
図５は、インドキノキの心材から抽出した抽出エキスの酢酸エチル可溶画分、ブタノール可溶画分及び水可溶画分が、ＩＬ−１βによって刺激されたＨＧＦからのＭＭＰ−１放出に与える影響を示す図である。
図５に示すように、いずれの画分も１０μｇｍｌの濃度でＭＭＰ−１放出抑制作用を示した。
【００７０】
（Ｅ−２．酢酸エチル可溶画分含有成分のＭＭＰ−１放出抑制作用）
図６は、プテロスチルベン（化合物１）がＩＬ−１βによって刺激されたＨＧＦからのＭＭＰ−１放出に与える影響を示す図である。
図７は、リクイリチゲニン（化合物２）がＩＬ−１βによって刺激されたＨＧＦからのＭＭＰ−１放出に与える影響を示す図である。
図８は、イソリクイリチゲニン（化合物３）がＩＬ−１βによって刺激されたＨＧＦからのＭＭＰ−１放出に与える影響を示す図である。
図６が示すように、プテロスチルベンは１．０μＭの濃度で溶媒対照群に対してＭＭＰ−１の放出を抑制する作用を示した。これ以上の濃度では細胞毒性を示したため検討できなかった。
図７及び８に示すように、リクイリチゲニン及びイソリクイリチゲニンは細胞毒性を示すことなく、それぞれ１０−４０μＭ、２０−４０μＭの濃度でＭＭＰ−１放出抑制作用を示した。
【００７１】
（Ｅ−３．ブタノール可溶画分含有成分のＭＭＰ−１放出抑制作用）
図９は、プテロスピン（化合物４）がＩＬ−１βによって刺激されたＨＧＦからのＭＭＰ−１放出に与える影響を示す図である。
図９に示すように、プテロスピンは４０μｍの濃度でＭＭＰ−１放出抑制作用を示した。
【００７２】
（Ｅ−４．考察）
インドキノキの抽出エキスを分画し、得られた酢酸エチル可溶画分、ブタノール可溶画分及び水可溶画分の作用を検討した。その結果、いずれの画分にもその作用が認められ、特に、酢酸エチル可溶画分及びブタノール可溶画分が強い作用を示した。
そこで酢酸エチル可溶画分より、活性を指標に有効成分の探索を進め、プテロスチルベン（化合物１）、リクイリチゲニン（化合物２）及びイソリクイリチゲニン（化合物３）を単離した。これらのＭＭＰ−１放出抑制作用について検討したところ、いずれの化合物もＭＭＰ−１放出抑制作用を示した。
具体的には、化合物１は弱いながらも１．０μＭという低濃度で活性を示した。また、化合物２は１０、２０及び４０μＭの濃度で、化合物３は２０及び４０μＭの濃度で活性を示した。これらの化合物にＨＧＦからのＭＭＰ−１放出抑制作用を見出したのは初めてである。
さらにブタノール可溶画分から有効成分の探索を進め、プテロスピン（化合物４）を単離した。これらのＭＭＰ−１放出抑制作用について検討したところ、化合物４にＭＭＰ−１放出抑制作用が４０μＭの濃度で認められた。これらの化合物にＨＧＦからのＭＭＰ−１放出抑制作用を見出したのは初めてである。
以上の結果から、インドキノキはＩＬ−１β刺激ＨＧＦからのＭＭＰ−１の放出を抑制する作用を有することが明らかとなり、さらに、その有効成分を明らかにすることに成功した。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明に係る歯周病改善剤及びその製造方法により、インドキノキから抽出することにより得られる抽出エキス及び該抽出エキスに含まれているプテロスチルベン、リクイリチゲニン、イソリクイリチゲニン及びプテロスピンは、口臭を予防／治療できる歯周病改善剤として好適に利用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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