(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコールセグメントと、疎水性官能基及びカチオン性官能基を側鎖カルボキシ基に直接または結合基を介して具備するポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントが連結したブロック型コポリマーであって、前記疎水性官能基が、（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の基であり、前記カチオン性官能基が、アルギニン誘導体結合基及び／またはリジン誘導体結合基である前記ブロック型コポリマー（Ａ）、並びに
側鎖カルボキシ基に疎水性官能基及びカチオン性官能基を直接または結合基を介して有するポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体である二官能性ポリマーであって、前記疎水性官能基が、（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の基であり、前記カチオン性官能基が、アルギニン誘導体結合基及び／またはリジン誘導体結合基である前記二官能性ポリマー（Ｂ）
を含有する核酸送達用組成物。
【請求項２】
前記ブロック型コポリマー（Ａ）において、前記疎水性官能基が、側鎖カルボキシ基に結合基を介して結合した（Ｃ６〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基及び／または（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基であり、前記カチオン性官能基が、アルギニル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルエステル基、アルギニル（Ｃ７〜Ｃ１０）アラルキルエステル基、アルギニル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミド基及びアルギニル（Ｃ７〜Ｃ１０）アラルキルアミド基からなる群から選択される１種以上の基であり、前記疎水性官能基と前記カチオン性官能基のそれぞれの含有モル当量の含有比率が、疎水性官能基：カチオン性官能基＝１：１〜１０である、請求項１に記載の核酸送達用組成物。
【請求項３】
前記二官能性ポリマー（Ｂ）において、前記疎水性官能基が、側鎖カルボキシ基に結合基を介して結合した（Ｃ６〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基及び／または（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基であり、前記カチオン性官能基が、アルギニル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルエステル基、アルギニル（Ｃ７〜Ｃ１０）アラルキルエステル基、アルギニル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミド基及びアルギニル（Ｃ７〜Ｃ１０）アラルキルアミド基からなる群から選択される１種以上の基であり、前記疎水性官能基と前記カチオン性官能基のそれぞれの含有モル当量の含有比率が、疎水性官能基：カチオン性官能基＝１：１〜２０である、請求項１に記載の核酸送達用組成物。
【請求項４】
前記ブロック型コポリマー（Ａ）が、一般式（１）
【化１】
0006513635.tif 000024
［式中、Ｒ１は水素原子または（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基を示し、Ｒ２は（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキレン結合基を示し、Ｒ３ａはメチレン基またはエチレン基を示し、Ｒ４ａは水素原子、（Ｃ１〜Ｃ６）のアシル基及び（Ｃ１〜Ｃ６）のアルコキシカルボニル基からなる群から選択される１種を示し、Ｒ５ａは（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の基を示し、Ｒ６ａはアルギニン誘導体結合基またはリジン誘導体結合基を示し、Ｒ７ａは水酸基及び／または−Ｎ（Ｒ８ａ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ａ）であり、ここで、Ｒ８ａ及びＲ９ａは同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３〜Ｃ８）の分岐鎖状または環状のアルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖状のアルキル基を示し、Ｘ１ａ及びＸ２ａは結合または結合基を示し、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ及びｇは、それぞれ独立して０〜２００の整数を示し、（ａ＋ｂ）及び（ｃ＋ｄ）は１〜２００の整数を示し、（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ）は１０〜２００の整数を示し、Ｒ５ａ、Ｒ６ａ及びＲ７ａが結合している各構成ユニット並びに側鎖カルボニル基の分子内環化型構成ユニットは、それぞれ独立してランダムに配列した構造であり、ｔは５〜１１，５００の整数である。］で示される請求項１に記載の核酸送達用組成物。
【請求項５】
前記二官能性ポリマー（Ｂ）が、一般式（２）
【化２】
0006513635.tif 000025
［式中、Ｒ３ｂはメチレン基またはエチレン基を示し、Ｒ４ｂは水素原子、（Ｃ１〜Ｃ６）のアシル基及び（Ｃ１〜Ｃ６）のアルコキシカルボニル基からなる群から選択される１種を示し、Ｒ５ｂは、（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の基を示し、Ｒ６ｂはアルギニン誘導体結合基またはリジン誘導体結合基を示し、Ｒ７ｂは水酸基及び／または−Ｎ（Ｒ８ｂ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ｂ）であり、ここで、Ｒ８ｂ及びＲ９ｂは同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３〜Ｃ８）の分岐鎖状または環状のアルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖状のアルキル基を示し、Ｒ１０は水素原子または（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基を示し、Ｘ１ｂ及びＸ２ｂは結合または結合基を示し、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは、それぞれ独立に０〜２００の整数を示し、（ｍ＋ｎ）及び（ｏ＋ｐ）は１〜２００の整数を示し、（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は１０〜２００の整数を示し、Ｒ５ｂ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ｂが結合している各構造ユニット並びに側鎖カルボニル基の分子内環化型構成ユニットは、それぞれ独立してランダムに配列した構造である。］で示される請求項１に記載の核酸送達用組成物。
【請求項６】
前記一般式（１）で表されるブロック型コポリマー（Ａ）において、Ｒ６aはアルギニン誘導体結合基であり、前記Ｒ６a基を有する構造ユニット数である（ｃ＋ｄ）が、前記ブロック型コポリマー（Ａ）の全体構造ユニット数である（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ）に対し、５０〜９０％である請求項４に記載の核酸送達用組成物。
【請求項７】
前記一般式（１）で表されるブロック型コポリマー（Ａ）において、Ｒ５aが（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基からなる群から選択される１種の基であり、前記Ｒ５a基を有する構造ユニット数である（ａ＋ｂ）が、前記ブロック型ポリマー（Ａ）における側鎖カルボキシ基修飾構造体の全体ユニット数である（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ）に対し、２〜５０％である請求項４に記載の核酸送達用組成物。
【請求項８】
前記一般式（１）で表されるブロック型コポリマー（Ａ）において、Ｘ１ａがヒスチジニルオキシ基及び／またはヒスチジニルアミド基である請求項４に記載の核酸送達用組成物。
【請求項９】
前記一般式（２）で表される二官能性ポリマー（Ｂ）において、Ｒ６ｂはアルギニン誘導体結合基であり、前記Ｒ６ｂ基を有する構造ユニット数である（ｏ＋ｐ）が、前記二官能性ポリマー（Ｂ）の全体ユニット数である（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）に対し、５０〜９０％である請求項５に記載の核酸送達用組成物。
【請求項１０】
前記一般式（２）で表される二官能性ポリマー（Ｂ）において、Ｒ５ｂが（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基からなる群から選択される１種の基であり、前記Ｒ５ｂ基を有する構造ユニット数である（ｍ＋ｎ）が、前記二官能性ポリマー（Ｂ）の全体ユニット数である（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）に対し、５〜４０％を占める請求項５に記載の核酸送達用組成物。
【請求項１１】
前記一般式（２）で表される二官能性ポリマー（Ｂ）において、Ｘ１ｂがヒスチジニルオキシ基及び／またはヒスチジニルアミド基である請求項５に記載の核酸送達用組成物。
【請求項１２】
前記ブロック型コポリマー（Ａ）のカチオン性官能基の含有モル当量（ＡＮ）と、前記二官能性ポリマー（Ｂ）のカチオン性官能基の含有モル当量（ＢＮ）において、前記二官能性ポリマー（Ｂ）のカチオン性官能基の含有モル当量（ＢＮ）が、前記核酸送達用組成物におけるカチオン性官能基総量（ＡＮ＋ＢＮ）に対する百分率（Ｂ％）として、３０〜８０％である請求項１に記載の核酸送達用組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１２の核酸送達用組成物に、核酸（Ｃ）を含有させた核酸含有組成物。
【請求項１４】
前記核酸（Ｃ）が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有するＲＮＡである請求項１３に記載の核酸含有組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸送達用組成物を含む核酸送達用キット。
【請求項１６】
請求項１３に記載の核酸含有組成物を有効成分として含む遺伝子治療剤。
【請求項１７】
一般式（１）
【化３】
0006513635.tif 000026
［式中、Ｒ１は水素原子または置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基を示し、Ｒ２は（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキレン結合基を示し、Ｒ３ａはメチレン基またはエチレン基を示し、Ｒ４ａは水素原子、（Ｃ１〜Ｃ６）のアシル基及び（Ｃ１〜Ｃ６）のアルコキシカルボニル基からなる群から選択される１種を示し、Ｒ５ａは（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の基を示し、Ｒ６ａはアルギニン誘導体結合基またはリジン誘導体結合基を示し、Ｒ７ａは水酸基及び／または−Ｎ（Ｒ８ａ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ａ）であり、ここで、Ｒ８ａ及びＲ９ａは同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３〜Ｃ８）の分岐鎖状または環状のアルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖状のアルキル基を示し、Ｘ１ａ及びＸ２ａは結合または結合基を示し、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ及びｇは、それぞれ独立して０〜２００の整数を示し、（ａ＋ｂ）及び（ｃ＋ｄ）は１〜２００の整数を示し、（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ）は１０〜２００の整数を示し、Ｒ５ａ、Ｒ６ａ及びＲ７ａが結合している各構成ユニット並びに側鎖カルボニル基の分子内環化型構成ユニットは、それぞれ独立してランダムに配列した構造であり、ｔは５〜１１，５００の整数である。］で示されるブロック型コポリマー。
【請求項１８】
ブロック型コポリマーと組み合わせて用いられる、核酸送達用組成物のための二官能性ポリマーであって、
前記ブロック型コポリマーは、ポリエチレングリコールセグメントと、ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントとが連結したブロック型コポリマーであり、
前記ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントの側鎖カルボキシ基に、疎水性官能基及びカチオン性官能基が直接または結合基を介して具備しており、
前記疎水性官能基は、（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の基であり、
前記カチオン性官能基は、アルギニン誘導体結合基及び／またはリジン誘導体結合基であり；及び
前記二官能性ポリマーが、一般式（２）
【化４】
0006513635.tif 000027
［式中、
Ｒ３ｂは、メチレン基またはエチレン基を示し、
Ｒ４ｂは、水素原子、（Ｃ１〜Ｃ６）のアシル基及び（Ｃ１〜Ｃ６）のアルコキシカルボニル基からなる群から選択される１種を示し、
Ｒ５ｂは、（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の基を示し、
Ｒ６ｂは、アルギニン誘導体結合基またはリジン誘導体結合基を示し、
Ｒ７ｂは、水酸基及び／または−Ｎ（Ｒ８ｂ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ｂ）であり、ここで、Ｒ８ｂ及びＲ９ｂは同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３〜Ｃ８）の分岐鎖状または環状のアルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖状のアルキル基を示し、
Ｒ１０は、水素原子または（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基を示し、
Ｘ１ｂは、一般式（１８’）
【化５】
0006513635.tif 000028
（式中、Ｘ３ｂは、酸素原子、−ＮＨ−基及び硫黄原子から選択される１種以上の基である。）
の結合基を示し、Ｒ５ｂはＸ３ｂと直接結合しており、
Ｘ２ｂは、結合または結合基を示し、
ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは、それぞれ独立に０〜２００の整数を示し、（ｍ＋ｎ）及び（ｏ＋ｐ）は１〜２００の整数を示し、（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は１０〜２００の整数を示し、
Ｒ５ｂ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ｂが結合している各構造ユニット並びに側鎖カルボニル基の分子内環化型構成ユニットは、それぞれ独立してランダムに配列した構造である。］
で示される、前記二官能性ポリマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸、特にｓｉＲＮＡを標的患部の細胞内に送達するための担体組成物、及びそれを用いた核酸医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸医薬品は、疾病の原因分子に対して直接作用することにより治療する技術である。このため、酵素阻害剤などの従来の低分子医薬品では効果が期待できない疾病に対しても、有効な治療方法として期待されている。近年、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、以下ＲＮＡｉと略す）が発見され、２００１年に、哺乳類細胞におけるＲＮＡｉが報告されている（非特許文献１）。この報告を契機に、あらゆる疾患治療への適用を目指した、ＲＮＡｉの研究開発が活発に行われてきている。
ＲＮＡｉはＲＮＡを機能発現分子として用いる。その発現に関わる主要分子の一つとして、３０塩基以下の短鎖ＲＮＡが機能する。この短鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）と名付けられている（特許文献１）。
ｓｉＲＮＡを核酸医薬として治療に用いる場合、その化学的安定性が課題となる。すなわち、短鎖ＲＮＡ分子であるｓｉＲＮＡは、血中で容易に分解される不安定な物性である。したがって、現在検討されているｓｉＲＮＡを治療剤として用いる治療方法の開発は、目や呼吸器など、ｓｉＲＮＡを局所投与にて用いることで、治療効果が得られる疾患に限定されている。ｓｉＲＮＡを、核酸医薬として幅広い疾患に適用するために、血中投与が可能であり、全身投与によって標的組織に効率よく送達する方法の開発が求められている。
核酸医薬を血中投与して、体内の疾病患部にて治療効果を発揮させるためには、（１）血中における該核酸医薬の安定性の確保、（２）核酸医薬の標的組織への効率的な送達、（３）核酸医薬の標的組織の細胞内への導入、の３つの課題を克服する必要がある。このため、核酸医薬を安定に保持し、標的細胞へ送達できる核酸送達システムが必要である。該核酸送達システムは、核酸医薬を保持して血中安定性を確保し、血中投与後は、血流を利用して標的患部組織へ到達するように血中滞留性を有するとともに、標的患部以外の組織細胞への非選択的な取り込みを抑制する機能が要求される。一方で、標的患部組織へ到達した際には、該核酸医薬を標的細胞内に導入させて、更に該核酸医薬を細胞質内にて放出して、核酸医薬を作用させて疾病原因遺伝子の機能抑制をすることにより治療効果をもたらす能力が要求される。加えて、該核酸送達システムは、生体親和性を有し、投与において生体防御反応や細胞死を誘導しないことも必要である。
以上のように、全身投与型核酸送達システムを完成させるには、（ａ）投与から標的患部到達までの間、核酸を安定に保持して血中分解酵素との接触を回避して安定性を確保すると共に、他部位において細胞への核酸導入を抑制して、該核酸を安定に保持すること、（ｂ）患部到達後は、核酸を保持したまま標的細胞内に侵入すること、（ｃ）細胞質内に到達後は、核酸（例えばｓｉＲＮＡ）を細胞質内に放出すること、（ｄ）生体親和的であること、の４つの性能を具備することが求められる。【０００３】
核酸医薬の送達システムとして、高分子キャリアを利用する方法が報告されている。特許文献２では、ポリエチレングリコールセグメントとカチオン性ポリマーセグメントからなるブロック型コポリマーと、カチオン性ポリマーの２種類のポリマーを用いてプラスミドＤＮＡの送達システムを作成している。該核酸送達システムは、核酸の血中安定性と細胞内取り込み能が両立できることが記載されている。また非特許文献２では、ポリエチレングリコールセグメントと疎水性ポリマーセグメントからなるブロック型コポリマーと、疎水性ポリマーセグメントとカチオン性ポリマーセグメントからなるブロック型コポリマーの２種類のポリマーを用いたｓｉＲＮＡ送達システムを報告している。
しかしながら、これまで知られている核酸送達システムは、上記（ａ）〜（ｄ）の４つの必要性能を充足するものではない。例えば、特許文献２の核酸送達システムは、カチオン性を具える２種類のポリマーの混合によって粒子表面のＰＥＧ密度を調節し、ＰＥＧ鎖の有する生体親和性を維持しつつ細胞内導入抑制能を低減させ、細胞毒性を抑制したプラスミドＤＮＡの細胞内導入を指向したシステムである。しかしながら、核酸−ポリマー複合体形成の駆動力が、プラスミドＤＮＡとポリマーのカチオン性との間の静電相互作用のみであるため、プラスミドＤＮＡのような巨大核酸分子はともかく、ｓｉＲＮＡのような短鎖核酸に当該システムを適用することは困難である。また、非特許文献２の核酸送達システムにおいては、システム間において疎水性相互作用を駆動力とした微小粒子状の安定な会合体が形成される。しかしながら、該システムは、ｓｉＲＮＡを微小粒子状会合体の表面に担持させることから、ｓｉＲＮＡが血中の分解酵素に曝される懸念があり、安定性に課題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開ＷＯ０１／７５１６４号
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１２／００５３７６号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４１１，ｐ．４９４−４９８，２００１
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ｖｏｌ１６６，ｐ．１０６〜１１４，２０１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
血中投与により機能発現させる核酸医薬において、該核酸医薬の安定性を確保すると共に、細胞内導入率が高く、効率的に該核酸医薬の機能発現をさせることができる核酸輸送用組成物が求められている。特に、ｓｉＲＮＡのような短鎖核酸医薬にも適用できる核酸輸送用組成物が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、前記課題を解決すべく鋭意努力した結果、ポリエチレングリコールセグメントと、疎水性官能基及びカチオン性官能基を有するポリマーセグメントからなるブロック型コポリマー（Ａ）と、疎水性官能基及びカチオン性官能基を有する二官能性ポリマー（Ｂ）をｓｉＲＮＡ等の核酸分子と混合した核酸−ポリマー複合体が、核酸分子の血中安定性を確保し、良好な核酸分子の細胞内導入効果が発揮できることを見出し、本発明を完成した。【０００８】
即ち、本発明は以下の（１）〜（１８）に関する。
［１］  ポリエチレングリコールセグメントと、疎水性官能基及びカチオン性官能基を側鎖カルボキシ基に直接または結合基を介して具備するポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントが連結したブロック型コポリマーであって、前記疎水性官能基が、（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の基であり、前記カチオン性官能基が、アルギニン誘導体結合基及び／またはリジン誘導体結合基である前記ブロック型コポリマー（Ａ）、並びに
側鎖カルボキシ基に疎水性官能基及びカチオン性官能基を直接または結合基を介して有するポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体である二官能性ポリマーであって、前記疎水性官能基が、（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の基であり、前記カチオン性官能基が、アルギニン誘導体結合基及び／またはリジン誘導体結合基である前記二官能性ポリマー（Ｂ）
を含有する核酸送達用組成物。
［２］  前記ブロック型コポリマー（Ａ）において、前記疎水性官能基が、側鎖カルボキシ基に結合基を介して結合した（Ｃ６〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基及び／または（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基であり、前記カチオン性官能基が、アルギニル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルエステル基、アルギニル（Ｃ７〜Ｃ１０）アラルキルエステル基、アルギニル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミド基及びアルギニル（Ｃ７〜Ｃ１０）アラルキルアミド基からなる群から選択される１種以上の基であり、前記疎水性官能基と前記カチオン性官能基のそれぞれの含有モル当量の含有比率が、疎水性官能基：カチオン性官能基＝１：１〜１０である、前記［１］に記載の核酸送達用組成物。
［３］  前記二官能性ポリマー（Ｂ）において、前記疎水性官能基が、側鎖カルボキシ基に結合基を介して結合した（Ｃ６〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基及び／または（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基であり、前記カチオン性官能基が、アルギニル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルエステル基、アルギニル（Ｃ７〜Ｃ１０）アラルキルエステル基、アルギニル（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミド基及びアルギニル（Ｃ７〜Ｃ１０）アラルキルアミド基からなる群から選択される１種以上の基であり、前記疎水性官能基と前記カチオン性官能基のそれぞれの含有モル当量の含有比率が、疎水性官能基：カチオン性官能基＝１：１〜２０である、前記［１］に記載の核酸送達用組成物。【０００９】
［４］  前記ブロック型コポリマー（Ａ）が、一般式（１）
【化１】
0006513635.tif 000002
［式中、Ｒ１は水素原子または炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基を示し、Ｒ２は（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキレン結合基を示し、Ｒ３ａはメチレン基またはエチレン基を示し、Ｒ４ａは水素原子、（Ｃ１〜Ｃ６）のアシル基及び（Ｃ１〜Ｃ６）のアルコキシカルボニル基からなる群から選択される１種を示し、Ｒ５ａは（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の基を示し、Ｒ６ａはアルギニン誘導体結合基またはリジン誘導体結合基を示し、Ｒ７ａは水酸基及び／または−Ｎ（Ｒ８ａ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ａ）であり、ここで、Ｒ８ａ及びＲ９ａは同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３〜Ｃ８）の分岐鎖状または環状のアルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖状のアルキル基を示し、Ｘ１ａ及びＸ２ａは結合基を示し、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ及びｇは、それぞれ独立して０〜２００の整数を示し、（ａ＋ｂ）及び（ｃ＋ｄ）は１〜２００の整数を示し、（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ）は１０〜２００の整数を示し、Ｒ５ａ、Ｒ６ａ及びＲ７ａが結合している各構成ユニット並びに側鎖カルボニル基の分子内環化型構成ユニットは、それぞれ独立してランダムに配列した構造であり、ｔは５〜１１，５００の整数である。］で示される前記［１］に記載の核酸送達用組成物。
［５］  前記二官能性ポリマー（Ｂ）が、一般式（２）
【化２】
0006513635.tif 000003
［式中、Ｒ３ｂはメチレン基またはエチレン基を示し、Ｒ４ｂは水素原子、（Ｃ１〜Ｃ６）のアシル基及び（Ｃ１〜Ｃ６）のアルコキシカルボニル基からなる群から選択される１種を示し、Ｒ５ｂは（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の基を示し、Ｒ６ｂはアルギニン誘導体結合基またはリジン誘導体結合基を示し、Ｒ７ｂは水酸基及び／または−Ｎ（Ｒ８ｂ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ｂ）であり、ここで、Ｒ８ｂ及びＲ９ｂは同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３〜Ｃ８）の分岐鎖状または環状のアルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖状のアルキル基を示し、Ｒ１０は水素原子または（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基を示し、Ｘ１ｂ及びＸ２ｂは結合基を示し、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは、それぞれ独立に０〜２００の整数を示し、（ｍ＋ｎ）及び（ｏ＋ｐ）は１〜２００の整数を示し、（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は１０〜２００の整数を示し、Ｒ５ｂ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ｂが結合している各構造ユニット並びに側鎖カルボニル基の分子内環化型構成ユニットは、それぞれ独立してランダムに配列した構造である。］で示される前記［１］に記載の核酸送達用組成物。【００１０】
［６］  前記一般式（１）で表されるブロック型コポリマー（Ａ）において、Ｒ６aはアルギニン誘導体結合基であり、前記Ｒ６a基を有する構造ユニット数である（ｃ＋ｄ）が、前記ブロック型コポリマー（Ａ）における側鎖カルボキシ基修飾構造体の全体ユニット数である（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ）に対し、５０〜９０％である前記［４］に記載の核酸送達用組成物。
［７］  前記一般式（１）で表されるブロック型コポリマー（Ａ）において、Ｒ５aが（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基からなる群から選択される１種の基であり、前記Ｒ５a基を有する構造ユニット数である（ａ＋ｂ）が、前記ブロック型ポリマー（Ａ）における側鎖カルボキシ基修飾構造体の全体ユニット数である（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ）に対し、２〜５０％である前記［４］に記載の核酸送達用組成物。
［８］  前記一般式（１）で表されるブロック型コポリマー（Ａ）において、Ｘ１ａがヒスチジニルオキシ基及び／またはヒスチジニルアミド基である前記［４］に記載の核酸送達用組成物。【００１１】
［９］  前記一般式（２）で表される二官能性ポリマー（Ｂ）において、Ｒ６ｂはアルギニン誘導体結合基であり、前記Ｒ６ｂ基を有する構造ユニット数である（ｏ＋ｐ）が、前記二官能性ポリマー（Ｂ）の全体ユニット数である（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）に対し、５０〜９０％である前記［５］に記載の核酸送達用組成物。
［１０］  前記一般式（２）で表される二官能性ポリマー（Ｂ）において、Ｒ５ｂが（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基からなる群から選択される１種の基であり、前記Ｒ５ｂ基を有する構造ユニット数である（ｍ＋ｎ）が、前記二官能性ポリマー（Ｂ）の全体ユニット数である（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）に対し、５〜４０％を占める前記［５］に記載の核酸送達用組成物。
［１１］  前記一般式（２）で表される二官能性ポリマー（Ｂ）において、Ｘ１ｂがヒスチジニルオキシ基及び／またはヒスチジニルアミド基である前記［５］に記載の核酸送達用組成物。【００１２】
［１２］  前記ブロック型コポリマー（Ａ）のカチオン性官能基の含有モル当量（ＡＮ）と、前記二官能性ポリマー（Ｂ）のカチオン性官能基の含有モル当量（ＢＮ）において、前記二官能性ポリマー（Ｂ）のカチオン性官能基の含有モル当量（ＢＮ）が、前記核酸送達用組成物におけるカチオン性官能基総量（ＡＮ＋ＢＮ）に対する百分率（Ｂ％）として、３０〜８０％である前記［１］に記載の核酸送達用組成物。【００１３】
［１３］  前記［１］〜［１２］の核酸送達用組成物に、核酸（Ｃ）を含有させた核酸含有組成物。
［１４］  前記核酸（Ｃ）が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有するＲＮＡである前記［１３］に記載の核酸含有組成物。【００１４】
［１５］  前記［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の核酸送達用組成物を含む核酸送達用キット。
［１６］  前記［１３］に記載の核酸含有組成物を有効成分として含む遺伝子治療剤。【００１５】
［１７］一般式（１）
【化３】
0006513635.tif 000004
［式中、Ｒ１は水素原子または（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基を示し、Ｒ２は（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキレン結合基を示し、Ｒ３ａはメチレン基またはエチレン基を示し、Ｒ４ａは水素原子、（Ｃ１〜Ｃ６）のアシル基及び（Ｃ１〜Ｃ６）のアルコキシカルボニル基からなる群から選択される１種を示し、Ｒ５ａは（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の基を示し、Ｒ６ａはアルギニン誘導体結合基またはリジン誘導体結合基を示し、Ｒ７ａは水酸基及び／または−Ｎ（Ｒ８ａ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ａ）であり、ここで、Ｒ８ａ及びＲ９ａは同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３〜Ｃ８）の分岐鎖状または環状のアルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖状のアルキル基を示し、Ｘ１ａ及びＸ２ａは結合または結合基を示し、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ及びｇは、それぞれ独立して０〜２００の整数を示し、（ａ＋ｂ）及び（ｃ＋ｄ）は１〜２００の整数を示し、（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ）は１０〜２００の整数を示し、Ｒ５ａ、Ｒ６ａ及びＲ７ａが結合している各構成ユニット並びに側鎖カルボニル基の分子内環化型構成ユニットは、それぞれ独立してランダムに配列した構造であり、ｔは５〜１１，５００の整数である。］で示されるブロック型コポリマー。【００１６】
［１８］  ポリエチレングリコールセグメントと、疎水性官能基及びカチオン性官能基を側鎖カルボキシ基に直接または結合基を介して具備するポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントが連結したブロック型コポリマーであって、前記疎水性官能基が、（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の基であり、前記カチオン性官能基が、アルギニン誘導体結合基及び／またはリジン誘導体結合基である前記ブロック型コポリマーと組み合わせて核酸送達用組成物として用いられる二官能性ポリマーであって、一般式（２）
【化４】
0006513635.tif 000005
［式中、Ｒ３ｂはメチレン基またはエチレン基を示し、Ｒ４ｂは水素原子、（Ｃ１〜Ｃ６）のアシル基及び（Ｃ１〜Ｃ６）のアルコキシカルボニル基からなる群から選択される１種を示し、Ｒ５ｂは（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の基を示し、Ｒ６ｂはアルギニン誘導体結合基またはリジン誘導体結合基を示し、Ｒ７ｂは水酸基及び／または−Ｎ（Ｒ８ｂ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ｂ）であり、ここで、Ｒ８ｂ及びＲ９ｂは同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３〜Ｃ８）の分岐鎖状または環状のアルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖状のアルキル基を示し、Ｒ１０は水素原子または（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基を示し、Ｘ１ｂ及びＸ２ｂは結合または結合基を示し、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは、それぞれ独立に０〜２００の整数を示し、ここで（ｍ＋ｎ）及び（ｏ＋ｐ）は１〜２００の整数を示し、（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は１０〜２００の整数を示し、Ｒ５ｂ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ｂが結合している各構造ユニット並びに側鎖カルボニル基の分子内環化型構成ユニットは、それぞれ独立してランダムに配列した構造である。］で示される二官能性ポリマー。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の核酸送達用組成物によれば、ポリエチレングリコールセグメントと、疎水性官能基及びカチオン性官能基を有するポリマーセグメントからなるブロック型コポリマー（Ａ）と、疎水性官能基及びカチオン性官能基を有する二官能性ポリマー（Ｂ）を核酸と混合することで、核酸分解酵素存在下でも安定的に核酸を保持しつつ、核酸を細胞内へ効率的に導入しうる組成物を提供することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の核酸含有組成物の、ウシ胎児血清に対する核酸分解抵抗性を示す電気泳動の結果である。
【図２】比較例の核酸含有組成物の、ウシ胎児血清に対する核酸分解抵抗性を示す電気泳動の結果である。
【図３】比較例の核酸含有組成物の、ウシ胎児血清に対する核酸分解抵抗性を示す電気泳動の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、標的組織及び標的細胞へ核酸分子を送達するための核酸送達用組成物であって、ポリエチレングリコールセグメントと、疎水性官能基及びカチオン性官能基を側鎖カルボキシ基に直接または結合基を介して具備するポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントが連結したブロック型コポリマー（Ａ）、並びにポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸であって側鎖カルボキシ基に疎水性官能基及びカチオン性官能基を直接または結合基を介して有する二官能性ポリマー（Ｂ）を含む組成物に関する。更に、核酸（Ｃ）を含む核酸含有組成物に関する。以下に、本発明の詳細について説明する。
【００２０】
［ブロック型コポリマー（Ａ）について］
本発明は、ポリエチレングリコールセグメントと、疎水性官能基及びカチオン性官能基を側鎖カルボキシ基に直接または結合基を介して具備するポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントが連結したブロック型コポリマー（Ａ）を用いる。
該ブロック型コポリマーは、ポリエチレングリコールセグメントとポリアスパラギン酸セグメントが適当な結合基により連結したブロック型コポリマーを主鎖とする。または、ポリエチレングリコールセグメントとポリグルタミン酸セグメントが適当な結合基により連結したブロック型コポリマーを主鎖とする。この主鎖において、ポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸の側鎖カルボニル基に、疎水性官能基及びカチオン性官能基を直接または結合基を介して結合させたブロック型コポリマーである。
【００２１】
ブロック型コポリマー（Ａ）における、該ポリエチレングリコールセグメントは、ポリエチレンオキシ基；（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）単位の繰り返し構造体セグメントであり、好ましくは重合度が５〜１２，０００、より好ましくは重合度が２０〜６，０００のポリエチレングリコール鎖を含むセグメント構造である。ポリエチレングリコール相当の平均分子量として２００〜５００，０００、好ましくは５００〜１００，０００の構造部分であり、特に好ましくは平均分子量として１，０００〜５０,０００である。なお、本発明で用いる分子量とは、ポリエチレングリコール標準品を基準としたＧＰＣ法（Ｇｅｌ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）により測定されるピークトップ分子量である。
該ポリエチレングリコールセグメントの末端基は、後述するポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントと結合するための連結基である。もう一方の末端基は、特に限定されるものではなく、水素原子、水酸基、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）のアルコキシ基、置換基を有していてもよい（Ｃ２〜Ｃ１２）のアルキニルオキシ基、置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）アラルキルオキシ基等を挙げることができる。該アルコキシ基、アルキニルオキシ基、アラルキルオキシ基における置換基としては、水酸基、アミノ基、ホルミル基、カルボキシル基等が挙げられる。また、前記置換基を介して、標的指向性分子を具備することもできる。標的指向性分子としては、タンパク質やペプチドまたは葉酸等が挙げられる。
【００２２】
ブロック型コポリマー（Ａ）における、ポリエチレングリコールセグメントと、ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントを連結する結合基としては、２つのポリマーセグメントを化学結合により連結する基であれば、特に限定されるものではなく、ポリエチレングリコール末端基とポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸の末端基と結合できる官能基を具備した結合基であれば良い。好ましくは、（Ｃ１〜６）アルキレン基である。ポリエチレングリコールセグメントとの結合様式は、ポリオキシエチレン基；（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）の末端酸素原子によるエーテル結合が好ましく、ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントとの結合様式はアミド結合またはエステル結合であることが好ましい。
【００２３】
ブロック型コポリマー（Ａ）における、ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントとは、アスパラギン酸またはグルタミン酸の重合体構造セグメントである。ポリアスパラギン酸の重合様式はペプチド結合であり、α結合体であってもβ結合体であっても良く、その混合物であってもよい。また、ポリグルタミン酸の重合様式もペプチド結合であり、α結合体であってもγ結合体であっても良く、その混合物であってもよい。
該ポリアスパラギン酸または該ポリグルタミン酸は、重合度が１０〜２００の重合体であることが好ましい。
【００２４】
ブロック型コポリマー（Ａ）における、ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントは、側鎖カルボキシ基に直接または結合基を介して疎水性官能基及びカチオン性官能基を具備する。
前記疎水性官能基は、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の基である。
ブロック型コポリマー（Ａ）の疎水性官能基としての、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基としては、例えば、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、シクロペンチル基、ｎ−へキシル基、シクロへキシル基、シクロへキシルメチル基、シクロへキシルエチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ヘキサデシル基、ｎ−オクタデシル基、イソオクチル基、イソデシル基、イソドデシル基、イソテトラデシル基、イソヘキサデシル基、イソオクタデシル基、ｔ−オクチル基、ｔ−デシル基、ｔ−ドデシル基、ｔ−テトラデシル基、ｔ−ヘキサデシル基、ｔ−オクタデシル基等が挙げられる。
前記疎水性官能基における前記アルキル基としては、（Ｃ８〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基がより好ましい。
【００２５】
前記疎水性官能基における、前記置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基とは、いずれか１カ所に炭素―炭素二重結合を有する、直鎖状、分岐鎖状または環状の炭素数（Ｃ４〜Ｃ２０）アルケニル基である。例えば、１−ブテニル基、２−メチル−２−ブテニル基、２−メチル−１，３−ブタジエニル基、１―オクテニル基、１−デセニル基、１−ドデセニル基、１−テトラデセニル基、１−ヘキサデセニル基、１−オクタデセニル基、ｃｉｓ−９−オクタデセニル基、９−ヘキサデセニル基等が挙げられる。
前記疎水性官能基における前記アルケニル基としては、（Ｃ８〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基がより好ましい。
【００２６】
前記疎水性官能基における、前記置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基とは、いずれか１カ所の水素原子がアリール基で置換されている直鎖または分岐鎖アルキル基である。例えば、ベンジル基、２−フェニルエチル基、４−フェニルブチル基、３−フェニルブチル基、５−フェニルペンチル基、６−フェニルへキシル基、８−フェニルオクチル基等が挙げられる。好ましくは４−フェニルブチル基、５−フェニルペンチル基、６−フェニルへキシル基、８−フェニルオクチル基等が挙げられる。
【００２７】
前記疎水性官能基における（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基は、それぞれ適当な置換基を有していてもよい。
置換基としては、メルカプト基、水酸基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、炭素環アリール基、複素環アリール基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、スルファモイル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、カルバモイルオキシ基、置換または無置換アミノ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基、ウレイド基、スルホニルアミノ基、スルファモイルアミノ基、ホルミル基、アシル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基またはシリル基等を挙げることができる。芳香環上の置換位置は、オルト位でも、メタ位でも、パラ位でもよい。
【００２８】
前記炭素環アリール基としては、例えば、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。
前記複素環アリール基としては、例えば、ピリジル基、ピリミジニル基、キノリル基、キナゾリニル基、ナフチリジニル基、フリル基、ピロリル基、インドリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、オキサゾリル基、イソキサゾリル基、トリアゾリル基等が挙げられる。
前記アルキルチオ基としては（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキルチオ基を示し、例えば、メチルチオ基、イソプロピルチオ基、ｎ−ヘキシルチオ基、ベンジルチオ基等が挙げられる。
前記アリールチオ基としては、例えば、フェニルチオ基、ナフチルチオ基、ピリジルチオ基等が挙げられる。
前記アルキルスルフィニル基としては、（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキルスルフィニル基を示し、例えば、メチルスルフィニル基、イソプロピルスルフィニル基、シクロヘキシルスルフィニル基、ベンジルスルフィニル基等が挙げられる。
前記アリールスルフィニル基としては、例えば、フェニルスルフィニル基、ナフチルスルフィニル基、ピリジルスルフィニル基等が挙げられる。
前記アルキルスルホニル基としては、（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキルスルホニル基を示し、例えば、メチルスルホニル基、イソプロピルスルホニル基、ベンジルスルホニル基等が挙げられる。
前記アリールスルホニル基としては、例えば、フェニルスルホニル基、ナフチルスルホニル基、ピリジルスルホニル基等が挙げられる。
前記スルファモイル基としては、例えば、ジメチルスルファモイル基、フェニルスルファモイル基等が挙げられる。
【００２９】
前記アルコキシ基としては、（Ｃ１〜Ｃ８）のアルコキシ基を示し、例えばメトキシ基、ｎ−プロピルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、ｎ−オクチルオキシ基、ベンジルオキシ基等の１級アルコキシ基、イソプロポキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基等の２級アルコキシ基、若しくはｔ−ブトキシ基等の３級アルコキシ基を挙げることができる。
前記アリールオキシ基としては、例えば、フェノキシ基、ナフチルオキシ基、ピリジルオキシ基等が挙げられる。
前記アシルオキシ基としては、（Ｃ１〜Ｃ８）のアシルオキシ基を示し、例えば、アセトキシ基、ベンゾイルオキシ基等が挙げられる。
前記アルコキシカルボニルオキシ基としては（Ｃ１〜Ｃ８）のアルコキシカルボニルオキシ基を示し、例えば、メトキシカルボニルオキシ基、トリフルオロメトキシカルボニルオキシ基等が挙げられる。
前記カルバモイルオキシ基としては、例えば、ジメチルカルバモイルオキシ基、フェニルカルバモイルオキシ基等が挙げられる。
【００３０】
前記置換または無置換アミノ基としては、例えば、無置換アミノ基、非環状の脂肪族１級アミノ基または非環状の脂肪族２級アミノ基、若しくは環状の脂肪族２級アミノ基を示す。
前記非環状の脂肪族１級アミノ基としては、（Ｃ１〜Ｃ１０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基が、Ｎ−モノ置換したアミノ基である。例えば、メチルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ネオペンチルアミノ基、ｎ−ヘキシルアミノ基、シクロヘキシルアミノ基、ｎ−オクチルアミノ基等が挙げられる。
前記非環状の脂肪族２級アミノ基としては、同一であっても異なっていても良く、（Ｃ１〜Ｃ１０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基が、Ｎ，Ｎ−ジ置換したアミノ基である。例えばジメチルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、Ｎ−メチル−Ｎ−シクロヘキシルアミノ基等が挙げられる。
前記環状の脂肪族２級アミノ基としては、モルホリノ基、ピペラジン−１−イル基、４−メチルピペラジン−１−イル基、ピペリジン−１−イル基、ピロリジン−１−イル基等が挙げられる。
前記アシルアミノ基としては、例えば、アセチルアミノ基、ベンゾイルアミノ基等が挙げられる。
前記アルコキシカルボニルアミノ基としては、例えば、メトキシカルボニルアミノ基、エトキシカルボニルアミノ基、ベンジルオキシカルボニルアミノ基等が挙げられる。
前記ウレイド基としては、例えば、トリメチルウレイド基、１−メチル−３−フェニル−ウレイド基等が挙げられる。
前記スルホニルアミノ基としては、例えば、メタンスルホニルアミノ基、ベンゼンスルホニルアミノ基等が挙げられる。
前記スルファモイルアミノ基としては、例えば、ジメチルスルファモイルアミノ基等が挙げられる。
【００３１】
前記アシル基としては、例えば、アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、ピリジンカルボニル基等が挙げられる。
前記アルコキシカルボニル基としては、例えば、メトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基等が挙げられる。
前記カルバモイル基としては、例えば、ジメチルカルバモイル基、フェニルカルバモイル基等が挙げられる。
前記シリル基としては、トリメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基等が挙げられる。
【００３２】
ブロック型コポリマー（Ａ）における前記疎水性官能基は、ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントの側鎖カルボキシ基に、直接または結合基を介して結合させる。該疎水性官能基を側鎖カルボキシ基に直接結合させる場合は、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルケニル基または置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキル基が、側鎖カルボキシ基にケトン型構造で結合することになる。しかしながら、側鎖カルボキシ基に対して、適当な結合基を介して該疎水性官能基を結合させる態様が、前記ブロック型コポリマーの調製し易い点で好ましい態様である。
適当な結合基としては、酸素原子、−ＮＨ−基、硫黄原子及びアミノ酸誘導体からなる群から選択される１種以上の結合基を用いることが好ましい。
前記結合基として酸素原子を用いる場合、前記疎水性官能基である置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルケニル基または置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキル基は、エステル結合の様式にて前記ブロック型ポリマー（Ａ）に官能基化される。また、前記結合基として−ＮＨ−基を用いる場合、前記疎水性官能基は、アミド結合の様式にて官能基化される。一方、前記結合基として硫黄原子を用いる場合、前記疎水性官能基は、チオエステル結合の様式にて官能基化される。
【００３３】
前記結合基としてアミノ酸誘導体を用いる場合、用いられるアミノ酸は、天然アミノ酸または非天然アミノ酸であってよく、Ｌ体、Ｄ体のいずれでも特に限定されずに用いることができる。例えば、グリシン、β−アラニン、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン等の炭化水素系アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸等を用いることができる。炭化水素系アミノ酸は、炭化水素基側鎖が疎水性官能基として機能する点で好ましい。また、酸性アミノ酸は、カルボン酸官能基を増やすことができ、多官能基化する場合に好適である。一方、塩基性アミノ酸を用いる場合、核酸保持に有利なカチオン性官能基を付与できる点で好ましく、また、酸性環境下において塩形成することによるｐＨ応答性を付与できる点で好ましい。疎水性官能基を具備させるための結合基としてアミノ酸を用いる場合は、目的とする機能に応じて適宜設定されるべきである。
なお、結合基としてアミノ酸を用いる場合は、該アミノ酸のＮ末アミノ基と前記側鎖カルボキシ基がアミド結合し、該アミノ酸のＣ末のカルボキシ基と、前記疎水性官能基である置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルケニル基または置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキル基が、酸素原子を介してエステル結合様式、−ＮＨ−基を介してアミド結合様式、若しくは硫黄原子を介してチオエステル結合様式にて官能基化がなされることが好ましい。
【００３４】
前記ブロック型ポリマー（Ａ）は、前記疎水性官能基として、疎水性官能基を結合させているアミノ酸誘導体を用いることが好ましく、特に疎水性官能基を結合させたヒスチジン誘導体を用いることが好ましい。ヒスチジンは、その側鎖イミダソール環が酸性環境下において塩形成することによるｐＨ応答性を付与でき、細胞質への核酸の導入の向上に有利な効果を奏する事から好ましい。
前記疎水性官能基を結合させたヒスチジン誘導体の好ましい結合様式としては、ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントの側鎖カルボキシ基と、ヒスチジンのＮ末アミノ基がアミド結合し、該ヒスチジンのＣ末カルボキシ基に、前記疎水性官能基をエステル結合またはアミド結合により結合させることが好ましい。
ヒスチジンを結合基として疎水性官能基を導入する態様としては一般式（３）で示される。
【化５】
0006513635.tif 000006
ここで、一般式（３）におけるＲ１２は、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアラルキル基からなる群から選択される１種であり、Ｘ３ａは酸素原子、−ＮＨ−基及び硫黄原子から選択される１種である。前記Ｒ１２の該アルキル基、該アルケニル基及び該アラルキル基は、前述の疎水性官能基と同義である。
【００３５】
前記ブロック型ポリマー（Ａ）は、前記疎水性官能基が複数当量で結合していることが好ましい。結合基当量数は、該疎水性官能基の疎水性により適宜設定してよいが、該ブロック型ポリマー１分子当り２当量以上で１００当量以下である。２当量以上で５０当量以下の結合当量であることが好ましい。
前記疎水性官能基が複数当量で結合している場合、該疎水性官能基は同一種類であっても、複数種類が混在していてもよい。
【００３６】
ブロック型コポリマー（Ａ）は、ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントの側鎖カルボキシ基に、直接または結合基を介してアルギニン誘導体結合基及び／またはリジン誘導体結合基を具備する。
該アルギニン誘導体結合基及び該リジン誘導体結合基としては、側鎖のグアニジル基またはアミノ基がカチオン性を示すものであれば良く、アルギニン構造単位またはリジン構造単位が含まれていれば良い。前記ブロック型コポリマー（Ａ）におけるカチオン性官能基は、該アルギニン誘導体結合基または該リジン誘導体結合基のいずれか一方を用いても良く、これらの混合物であってもよい。好ましくは、その何れか一方の単一分子構造で用いられる態様であって、より好ましくはアルギニン誘導体結合基を用いることが特に好ましい。
該アルギニン誘導体または該リジン誘導体の好ましい結合様式としては、ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントの側鎖カルボキシ基に、アルギニン誘導体またはリジン誘導体を、直接または結合基を介して結合させる態様を挙げることができる。
【００３７】
前記アルギニン誘導体結合基としては、一般式（４）または（５）で表される結合基であることが好ましい。
【化６】
0006513635.tif 000007
一般式（４）において、Ｒ１３は水酸基、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシ基、置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシ基、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルアミノ基、置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルアミノ基を示し、Ｌ１は任意の結合基を示す。
また、一般式（５）において、Ｒ１４は、水素原子、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアシル基、若しくは置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基を示し、Ｌ２は任意の結合基を示す。
【００３８】
一般式（４）におけるＲ１３の置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシ基とは、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｉ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−へキシルオキシ基、シクロへキシルオキシ基、ｎ−オクチルオキシ基、ｎ−ドデシルオキシ基、オクタデシルオキシ基等が挙げられる。
Ｒ１３の置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシ基としては、ベンジルオキシ基、２−フェニルエチルオキシ基、８−フェニルオクチルオキシ基等が挙げられる。
Ｒ１３の置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルアミノ基、としては、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、ｎ−プロピルアミノ基、ｉ−プロピルアミノ基、ｎ−ブチルアミノ基、ｉ−ブチルアミノ基、ｔ−ブチルアミノ基、ｎ−へキシルアミノ基、シクロへキシルアミノ基、ｎ−オクチルアミノ基、ｎ−ドデシルアミノ基、オクタデシルアミノ基等が挙げられる。
Ｒ１３の置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルアミノ基としては、ベンジルアミノ基、２−フェニルエチルアミノ基、８−フェニルオクチルアミノ基等が挙げられる。
【００３９】
一般式（５）におけるＲ１４の置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアシル基とは、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルカルボニル基、若しくは置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルカルボニル基を挙げることができる。一方、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基とは、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基、若しくは置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシカルボニル基等を挙げることができる。また、アミノ基のアシル保護基を用いることができ、例えば、Ｂｏｃ基、Ｆｍｏｃ基、Ｃｂｚ基等を挙げることができる。
Ｒ１４の（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルカルボニル基とは、例えば、アセチル基、エチルカルボニル基、ｎ−プロピルカルボニル基、ｉ−プロピルカルボニル基、ｎ−ブチルカルボニル基、ｉ−ブチルカルボニル基、ｔ−ブチルカルボニル基、ｎ−へキシルカルボニル基、シクロへキシルカルボニル基、ｎ−オクチルカルボニル基、ｎ−ドデシルカルボニル基、オクタデシルカルボニル基等が挙げられる。
Ｒ１４の（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基とは、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−プロピルオキシカルボニル基、ｉ−プロピルオキシカルボニル基、ｎ−ブトキシカルボニル基、ｉ−ブトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ｎ−へキシルオキシカルボニル基、シクロへキシルオキシカルボニル基、ｎ−オクチルオキシカルボニル基、ｎ−ドデシルオキシカルボニル基、オクタデシルオキシカルボニル基等が挙げられる。
Ｒ１４の（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルカルボニル基としては、例えば、ベンジルカルボニル基、２−フェニルエチルカルボニル基等が挙げられる。
Ｒ１４の（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシカルボニル基としては、例えば、ベンジルオキシカルボニル基、２−フェニルエチルオキシカルボニル基等が挙げられる。
【００４０】
一般式（４）及び（５）におけるＬ１及びＬ２は、前記ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントの側鎖カルボキシ基と、前記アルギニン誘導体結合基を連結する結合基である。Ｌ１及びＬ２の結合基としては、その両末端が、カルボキシ基及びアミノ基と結合する官能基を有する結合基であれば特に限定されるものではない。
該Ｌ１としては、例えば、―ＮＨ―(ＣＨ２)α―ＣＯ−、―ＮＨ―(ＣＨ２)α―ＮＨＣＯ−、―ＮＨ―(ＣＨ２)α―ＯＣＯ−、―Ｏ―(ＣＨ２)α―ＣＯ−、―Ｏ―(ＣＨ２)α―ＮＨＣＯ−、―Ｏ―(ＣＨ２)α―ＯＣＯ−または―ＮＨ―(ＣＨ２)２―ＳＳ−(ＣＨ２)２―ＮＨＣＯ−等が挙げられる。ここで、αは１〜１２の整数であり、好ましくは４〜１２の整数であり、特に好ましくは６〜１２の整数である。なお、Ｌ１は「結合」であってよい。該「結合」とは、特にリンカー相当基を介せず、ブロック型ポリマーの側鎖カルボキシ基と、アルギニン誘導体のＮ末アミノ基が直接結合していることを意味する。
また、該Ｌ２としては、例えば、―ＮＨ―(ＣＨ２)α―ＮＨ−、―ＮＨ―(ＣＨ２)α―Ｏ−、―Ｏ―(ＣＨ２)α―ＮＨ−、―Ｏ―(ＣＨ２)α―Ｏ−または―ＮＨ―(ＣＨ２)２―ＳＳ−(ＣＨ２)２―ＮＨ−等が挙げられる。ここで、αは１〜１２の整数であり、好ましくは４〜１２の整数であり、特に好ましくは６〜１２の整数である。
【００４１】
前記カチオン性官能基がアルギニン誘導体結合基の場合、好ましくは、アルギニン（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルエステル基、アルギニン（Ｃ７〜Ｃ１０）アラルキルエステル基、アルギニン（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミド基及びアルギニン（Ｃ７〜Ｃ１０）アラルキルアミド基からなる群から選択される１種以上の基であることが好ましい。
【００４２】
前記カチオン性官能基がリジン誘導体結合基である場合、一般式（６）または（７）で表される結合残基であることが好ましい。
【化７】
0006513635.tif 000008
一般式（６）において、Ｒ１５は水酸基、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシ基、置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシ基、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルアミド基、置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルアミド基を示し、Ｌ３は任意の結合基を示す。
また、一般式（７）において、Ｒ１６は、水素原子、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアシル基、若しくは置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基を示し、Ｌ４は任意の結合基を示す。
【００４３】
一般式（６）におけるＲ１５の置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシ基とは、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｉ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−へキシルオキシ基、シクロへキシルオキシ基、ｎ−オクチルオキシ基、ｎ−ドデシルオキシ基、オクタデシルオキシ基等が挙げられる。
Ｒ１５の置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシ基としては、ベンジルオキシ基、２−フェニルエチルオキシ基、８−フェニルオクチルオキシ基等が挙げられる。
Ｒ１５の置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルアミノ基、としては、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、ｎ−プロピルアミノ基、ｉ−プロピルアミノ基、ｎ−ブチルアミノ基、ｉ−ブチルアミノ基、ｔ−ブチルアミノ基、ｎ−へキシルアミノ基、シクロへキシルアミノ基、ｎ−オクチルアミノ基、ｎ−ドデシルアミノ基、オクタデシルアミノ基等が挙げられる。
Ｒ１５の置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルアミノ基としては、ベンジルアミノ基、２−フェニルエチルアミノ基、８−フェニルオクチルアミノ基等が挙げられる。
【００４４】
一般式（７）におけるＲ１６の置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアシル基とは、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルカルボニル基、若しくは置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルカルボニル基を挙げることができる。一方、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基とは、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基、若しくは置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシカルボニル基等を挙げることができる。また、アミノ基のアシル保護基を用いることができ、例えば、Ｂｏｃ基、Ｆｍｏｃ基、Ｃｂｚ基等を挙げることができる。
Ｒ１６の（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルカルボニル基とは、例えば、アセチル基、エチルカルボニル基、ｎ−プロピルカルボニル基、ｉ−プロピルカルボニル基、ｎ−ブチルカルボニル基、ｉ−ブチルカルボニル基、ｔ−ブチルカルボニル基、ｎ−へキシルカルボニル基、シクロへキシルカルボニル基、ｎ−オクチルカルボニル基、ｎ−ドデシルカルボニル基、オクタデシルカルボニル基等が挙げられる。
Ｒ１６の（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基とは、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−プロピルオキシカルボニル基、ｉ−プロピルオキシカルボニル基、ｎ−ブトキシカルボニル基、ｉ−ブトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ｎ−へキシルオキシカルボニル基、シクロへキシルオキシカルボニル基、ｎ−オクチルオキシカルボニル基、ｎ−ドデシルオキシカルボニル基、オクタデシルオキシカルボニル基等が挙げられる。
Ｒ１６の（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルカルボニル基としては、例えば、ベンジルカルボニル基、２−フェニルエチルカルボニル基等が挙げられる。
Ｒ１６の（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシカルボニル基としては、例えば、ベンジルオキシカルボニル基、２−フェニルエチルオキシカルボニル基等が挙げられる。
【００４５】
一般式（６）及び（７）におけるＬ３及びＬ４は、前記ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントの側鎖カルボキシ基と、前記アルギニン誘導体結合基を連結する結合基である。Ｌ３及びＬ４の結合基としては、その両末端が、カルボキシ基及びアミノ基と結合する官能基を有する結合基であれば特に限定されるものではない。
該Ｌ３としては、例えば、―ＮＨ―(ＣＨ２)α―ＣＯ−、―ＮＨ―(ＣＨ２)α―ＮＨＣＯ−、―ＮＨ―(ＣＨ２)α―ＯＣＯ−、―Ｏ―(ＣＨ２)α―ＣＯ−、―Ｏ―(ＣＨ２)α―ＮＨＣＯ−、―Ｏ―(ＣＨ２)α―ＯＣＯ−または―ＮＨ―(ＣＨ２)２―ＳＳ−(ＣＨ２)２―ＮＨＣＯ−等が挙げられる。ここで、αは１〜１２の整数であり、好ましくは４〜１２の整数であり、特に好ましくは６〜１２の整数である。なお、Ｌ３は「結合」であってよい。該「結合」とは、特にリンカー相当基を介せず、ブロック型ポリマーの側鎖カルボキシ基と、アルギニン誘導体のＮ末アミノ基が直接結合していることを意味する。
また、該Ｌ４としては、例えば、―ＮＨ―(ＣＨ２)α―ＮＨ−、―ＮＨ―(ＣＨ２)α―Ｏ−、―Ｏ―(ＣＨ２)α―ＮＨ−、―Ｏ―(ＣＨ２)α―Ｏ−または―ＮＨ―(ＣＨ２)２―ＳＳ−(ＣＨ２)２―ＮＨ−等が挙げられる。ここで、αは１〜１２の整数であり、好ましくは４〜１２の整数であり、特に好ましくは６〜１２の整数である。
【００４６】
前記カチオン性官能基がリジン誘導体結合基の場合、好ましくは、リジン（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルエステル基、リジン（Ｃ７〜Ｃ１０）アラルキルエステル基、リジン（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミド基及びリジン（Ｃ７〜Ｃ１０）アラルキルアミド基からなる群から選択される１種以上の基であることが好ましい。
【００４７】
前記ブロック型ポリマー（Ａ）は、前記カチオン性官能基が複数当量で結合していることが好ましい。結合基当量数は、該疎水性官能基の疎水性により適宜設定してよいが、該ブロック型ポリマー１分子当り２当量以上で１５０当量以下である。５当量以上で１００当量以下の結合当量であることが好ましい。
【００４８】
本発明のブロック型コポリマー（Ａ）において、前記疎水性官能基は核酸送達用キャリアとして、そのキャリア構造の安定化に寄与する。また、前記カチオン性官能基は、核酸分子との静電的相互作用による核酸保持のための機能性官能基である。本発明は、核酸分子の安定的な保持と送達を目的とするものであり、該ブロック型コポリマー（Ａ）は、疎水性官能基とカチオン性官能基の２つの機能性官能基を具備することを特徴とする。
該ブロック型コポリマー（Ａ）における、疎水性官能基とカチオン性官能基のそれぞれの結合量は、特に限定されるものではなく、キャリア構造の安定性と核酸分子の保持力を考慮して、適宜、設定することができる。すなわち、核酸送達キャリア構造の安定化を向上させるためには、ブロック型コポリマー（Ａ）の該疎水性官能基の結合量を増やすことが好ましい。また、核酸分子の保持力を向上させるためには、カチオン性官能基の結合量を増やすことが好ましい。
核酸分子の安定的な保持と送達を達成するためには、該疎水性官能基とカチオン性官能基の結合量のバランスを考慮することが重要である。ブロック型コポリマー（Ａ）において、疎水性官能基よりも、カチオン性官能基の方を多く付与することが好ましい。該ブロック型コポリマー（Ａ）における疎水性官能基とカチオン性官能基の含有モル当量比率は、疎水性官能基：カチオン性官能基＝１：１〜２０であることが好ましく、疎水性官能基：カチオン性官能基＝１：１〜１０であることがより好ましい。
【００４９】
本発明において、前記ブロック型コポリマー（Ａ）は、一般式（１）
【化８】
0006513635.tif 000009
［式中、Ｒ１は水素原子または置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基を示し、Ｒ２は置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキレン結合基を示し、Ｒ３ａはメチレン基またはエチレン基を示し、Ｒ４ａは水素原子、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）のアシル基及び置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）のアルコキシカルボニル基からなる群から選択される１種を示し、Ｒ５ａは置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の基を示し、Ｒ６ａはアルギニン誘導体結合基またはリジン誘導体結合基を示し、Ｒ７ａは水酸基及び／または−Ｎ（Ｒ８ａ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ａ）であり、ここで、Ｒ８ａ及びＲ９ａは同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３〜Ｃ８）の分岐鎖状または環状のアルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖状のアルキル基を示し、Ｘ１ａ及びＸ２ａは結合または結合基を示し、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ及びｇは、それぞれ独立して０〜２００の整数を示し、（ａ＋ｂ）及び（ｃ＋ｄ）は１〜２００の整数を示し、（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ）は１０〜２００の整数を示し、Ｒ５ａ、Ｒ６ａ及びＲ７ａが結合している各構成ユニット並びに側鎖カルボニル基の分子内環化型構成ユニットは、それぞれ独立してランダムに配列した構造であり、ｔは５〜１１，５００の整数である。］で示されるブロック型コポリマーであることが好ましい。
【００５０】
一般式（１）のＲ１における（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基としては、特に限定されるものではないが、置換基を有していてもよい直鎖状、分岐鎖状または環状の（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基が挙げられる。好ましくは直鎖または分岐鎖の（Ｃ１〜Ｃ４）のアルキル基である。
直鎖状、分岐鎖状または環状の（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−へキシル基、シクロへキシル基等が挙げられ、好ましくはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基が挙げられる。
該（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基において有していてもよい置換基とは、特に限定されるものではないが、例えば、メルカプト基、水酸基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、炭素環アリール基、複素環アリール基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、スルファモイル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、カルバモイルオキシ基、置換または無置換アミノ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基、ウレイド基、スルホニルアミノ基、スルファモイルアミノ基、ホルミル基、アシル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基またはシリル基等を挙げることができる。芳香環上の置換位置は、オルト位でも、メタ位でも、パラ位でもよい。なお、各置換基についての詳細な説明は、前述のブロック型ポリマー（Ａ）における置換基と同義である。
【００５１】
一般式（１）のＲ２における置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキレン結合基としては、特に限定されるものではなく、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキレン結合基であり、例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基等が挙げられ、好ましくはプロピレン基である。有していてもよい置換基とは、前記Ｒ１と同義である。
【００５２】
一般式（１）のＲ４ａにおける置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）のアシル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、ホルミル基、アセチル基、プロピオ二ル基、ピバロイル基等が挙げられ、好ましくはアセチル基である。
Ｒ４ａにおける置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）のアルコキシカルボニル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−プロポキシカルボニル基、ｉ−プロポキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、シクロへキシルオキシカルボニル基等が挙げられる。好ましくは、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基である。
なお、該Ｒ４ａにおける有していてもよい置換基とは、前記Ｒ１と同義である。
【００５３】
一般式（１）のＲ５ａは疎水性官能基である。該疎水性官能基は、本発明に係るブロック型コポリマー（Ａ）及び後述する二官能性ポリマー（Ｂ）において疎水性相互作用を惹起し、会合体を形成するための機能性官能基である。
該Ｒ５ａとしては、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルケニル基及び置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の基である。
該Ｒ５ａとしての疎水性官能基は、一般式（１）に係るポリマー分子中で単一種類であっても良く、また２種類以上の疎水性官能基の混合物であってもよい。
Ｒ５ａにおける（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルキル基としては、特に限定されるものではないが、置換基を有していてもよい直鎖状、分岐鎖状または環状の（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルキル基が挙げられる。例えば、ｎ−ブチル基、ネオペンチル基、ｎ−へキシル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ヘキサデシル基、ｎ−オクタデシル基、イソオクチル基、イソデシル基、イソドデシル基、イソテトラデシル基、イソヘキサデシル基、イソオクタデシル基、t−オクチル基、ｔ−デシル基、ｔ−ドデシル基、ｔ−テトラデシル基、ｔ−ヘキサデシル基、ｔ−オクタデシル基等が挙げられる
Ｒ５ａにおける（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルケニル基としては、特に限定されるものではないが、置換基を有していてもよい直鎖状、分岐鎖状または環状の（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルケニル基が挙げられる。例えば、１−ブテニル基、シクロヘキセニル基、１―オクテニル基、１−デセニル基、１−ドデセニル基、１−テトラデセニル基、１−ヘキサデセニル基、１−オクタデセニル基、ｃｉｓ−９−オクタデセ二ル基、９−ヘキサデセ二ル基等が挙げられる。
Ｒ５ａにおける（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキル基としては、特に限定されるものではないが、置換基を有していてもよい直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキル基が挙げられる。例えば、ベンジル基、２−フェニルエチル基、４−フェニルブチル基、３−フェニルブチル基、５−フェニルペンチル基、６−フェニルへキシル基、８−フェニルオクチル基等が挙げられる。
なお、該Ｒ５における有していてもよい置換基とは、前記Ｒ１と同義である。
【００５４】
一般式（１）におけるＸ１ａは結合基である。すなわち、ポリマー主鎖の側鎖カルボキシ基と、前記Ｒ５ａで示される疎水性官能基を結合するための連結基である。Ｘ１ａは、結合、酸素原子、−ＮＨ−基、硫黄原子及びアミノ酸誘導体からなる群から選択される１種以上の結合基である。ここで結合とは、結合基を介さないで直接、側鎖カルボキシ基に結合した結合様式を示す。該Ｘ１ａとしては、酸素原子、−ＮＨ−基及びアミノ酸誘導体からなる群から選択される１種以上の結合基であることが好ましい。
前記結合基として酸素原子を用いる場合、前記疎水性官能基である置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルケニル基または置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキル基は、エステル結合の様式にて当該ブロック型コポリマー（Ａ）に官能基化される。前記結合基として−ＮＨ−基を用いる場合、前記疎水性官能基はアミド結合の様式にて官能基化される。
前記Ｘ１ａに係る結合基としてアミノ酸誘導体を用いる場合、用いられるアミノ酸は、天然アミノ酸または非天然アミノ酸であってよく、Ｌ体、Ｄ体のいずれでも特に限定されずに用いることができる。例えば、グリシン、β−アラニン、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン等の炭化水素系アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸等を用いることができる。炭化水素系アミノ酸は、炭化水素基側鎖が疎水性官能基として機能する点で好ましい。また、酸性アミノ酸は、カルボン酸官能基を増やすことができ、多官能基化する場合に好適である。一方、塩基性アミノ酸を用いる場合、核酸保持に有利なカチオン性官能基を付与できる点で好ましく、また、酸性環境下において塩形成することによるｐＨ応答性を付与できる点で好ましい。前記Ｘ１ａに係る結合基としてアミノ酸を用いる場合は、目的とする機能に応じて適宜設定されるべきである。
なお、結合基としてアミノ酸を用いる場合は、該アミノ酸のＮ末アミノ基と前記側鎖カルボキシ基とがアミド結合し、該Ｃ末のカルボキシ基と、前記疎水性官能基である置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルケニル基または置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキル基が、酸素原子を介してエステル結合様式、−ＮＨ−基を介してアミド結合様式または硫黄原子を介してチオエステル結合様式にて官能基化がなされる。
【００５５】
一般式（１）のＸ１ａにおける疎水性官能基の結合基としては、アミノ酸誘導体を用いることが特に好ましく、ヒスチジンを用いることが、殊更好ましい。ヒスチジンは、側鎖イミダゾール環が酸性環境下において塩形成することによるｐＨ応答性を付与することができ、細胞質への核酸の導入の向上に有利な効果を奏する事から好ましい。
好ましい結合様式としては、ポリマー主鎖の側鎖カルボキシ基に、ヒスチジンのＮ末アミノ基をアミド結合させ、該ヒスチジンのＣ末カルボキシ基に、前記Ｒ５ａに係る疎水性官能基をエステル結合またはアミド結合により結合させることが好ましい。すなわち前記Ｘ１ａとして、ヒスチジニルオキシ基及び／またはヒスチジニルアミド基であることが好ましい。
前記Ｘ１ａとしてヒスチジンを結合基に用い、疎水性官能基であるＲ５ａを導入する態様としては、一般式（８）で示される置換基が好ましい。
【化９】
0006513635.tif 000010
ここで、一般式（８）におけるＲ５ａは、前記置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、前記置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び前記置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の基である。Ｘ３ａは酸素原子、−ＮＨ−基及び硫黄原子から選択される１種以上の基である。
【００５６】
一般式（１）において、疎水性官能基及び結合基であるＲ５ａ及びＸ１ａは、ヒスチジン誘導体を介して置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基を結合させる態様が好ましい。以下に、Ｘ１ａとしてヒスチジン誘導体を介した好ましい疎水性官能基；Ｒ５ａの置換基の態様を説明する。
Ｘ１ａとしてヒスチジン誘導体を介し、Ｒ５ａとして置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基である態様としては、エステル結合型、アミド結合型またはチオエステル結合型を挙げることができる。エステル結合型またはアミド結合型が好ましい。
該エステル結合型としては、例えば、ヒスチジニル−ｎ−オクチルエステル基、ヒスチジニルイソクチルエステル基、ヒスチジニルイソデシルエステル基、ヒスチヒスチジニル−ｎ−デシルエステル基、ヒスチジニル−ｎ−ドデシルエステル基、ヒスチジニル−ｎ−テトラデシルエステル基、ヒスチジニル−ｎ−ヘキサデシルエステル基、ヒスチジニル−ｎ−オクタデシルエステル基、ヒスチジニルイソドデシルエステル基、ヒスチジニルイソテトラデシルエステル基、ヒスチジニルイソヘキサデシルエステル基、ヒスチジニルイソオクタデシルエステル基、ヒスチジニル−ｔ−オクチルエステル基、ヒスチジニル−ｔ−デシルエステル基、ヒスチジニル−ｔ−ドデシルエステル基、ヒスチジニル−ｔ−テトラデシルエステル基、ヒスチジニル−ｔ−ヘキサデシルエステル基、ヒスチジニル−ｔ−オクタデシルエステル基等が挙げられる。
また、該アミド結合型としては、例えば、ヒスチジニル−ｎ−オクチルアミド基、ヒスチジニル−ｎ−デシルアミド基、ヒスチジニル−ｎ−ドデシルアミド基、ヒスチジニル−ｎ−テトラデシルアミド基、ヒスチジニル−ｎ−ヘキサデシルアミド基、ヒスチジニル−ｎ−オクタデシルアミド基、ヒスチジニルイソオクチルアミド基、ヒスチジニルイソデシルアミド基、ヒスチジニルイソドデシルアミド基、ヒスチジニルイソテトラデシルアミド基、ヒスチジニルイソヘキサデシルアミド基、ヒスチジニルイソオクタデシルアミド基、ヒスチジニル−ｔ−オクチルアミド基、ヒスチジニル−t−デシルアミド基、ヒスチジニル−t−ドデシルアミド基、ヒスチジニル−t−テトラデシルアミド基、ヒスチジニル−t−ヘキサデシルアミド基、ヒスチジニル−t−オクタデシルアミド基等が挙げられる。
【００５７】
Ｘ１ａとしてヒスチジン誘導体を介し、Ｒ５ａとして置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基である態様としては、エステル結合型、アミド結合型またはチオエステル結合型を挙げることができる。エステル結合型またはアミド結合型が好ましい。
該エステル結合型としては、例えば、ヒスチジニル−１−オクテニルエステル基、ヒスチジニル−１−デセニルエステル基、ヒスチジニル−１−ドデセニルエステル基、ヒスチジニル−１−テトラデセニルエステル基、ヒスチジニル−１−ヘキサデセニルエステル基、ヒスチジニル−１−オクタデセニルエステル基、ヒスチジニル−ｃｉｓ−９−オクタデセニルエステル基、ヒスチジニル−９−ヘキサデセニルエステル基等が挙げられる。
また、該アミド結合型としては、例えば、ヒスチジニル−１−オクテニルアミド基、ヒスチジニル−１−デセニルアミド基、ヒスチジニル−１−ドデセニルアミド基、ヒスチジニル−１−テトラデセニルアミド基、ヒスチジニル−１−ヘキサデセニルアミド基、ヒスチジニル−１−オクタデセニルアミド基、ヒスチジニル−ｃｉｓ−９−オクタデセニルアミド基、ヒスチジニル−９−ヘキサデセニルアミド基等が挙げられる。
【００５８】
Ｘ１ａとしてヒスチジン誘導体を介し、Ｒ５ａとして置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基である態様としては、エステル結合型、アミド結合型またはチオエステル結合型を挙げることができる。エステル結合型またはアミド結合型が好ましい。
該エステル結合型としては、例えば、ヒスチジニル−４−フェニルブチルエステル基、ヒスチジニル−３−フェニルブチルエステル基、ヒスチジニル−５−フェニルペンチルエステル基、ヒスチジニル−６−フェニルへキシルエステル基、ヒスチジニル−８−フェニルオクチルエステル基等が挙げられる。
該アミド結合型としては、例えば、ヒスチジニル−４−フェニルブチルアミド基、ヒスチジニル−３−フェニルブチルアミド基、ヒスチジニル−５−フェニルペンチルアミド基、ヒスチジニル−６−フェニルへキシルアミド基、ヒスチジニル−８−フェニルオクチルアミド基等が挙げられる。
【００５９】
一般式（１）におけるＲ６ａはカチオン性官能基であり、アニオン性に荷電する核酸分子と静電的相互作用により複合体を形成するための機能性官能基である。一般式（１）において、Ｒ６ａはアルギニン誘導体結合基及び／またはリジン誘導体結合基である。Ｒ６ａにおけるカチオン性官能基は、一般式（１）に係るポリマー分子中で単一種類であっても、アルギニン誘導体結合基及びリジン誘導体結合基の混合物であってもよい。
【００６０】
一般式（１）のＲ６ａがアルギニン誘導体結合基である場合、一般式（９）または（１０）で表されるアルギニン誘導体結合基であることが好ましい。
【化１０】
0006513635.tif 000011
一般式（９）において、Ｒ１３は水酸基、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシ基、置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシ基、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルアミド基、置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルアミド基を示す。
また、一般式（１０）において、Ｒ１４は、水素原子、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアシル基、若しくは置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基を示す。
【００６１】
一般式（９）におけるＲ１３の置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシ基とは、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｉ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−へキシルオキシ基、シクロへキシルオキシ基、ｎ−オクチルオキシ基、ｎ−ドデシルオキシ基、オクタデシルオキシ基等が挙げられる。
Ｒ１３の置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシ基としては、ベンジルオキシ基、２−フェニルエチルオキシ基、８−フェニルオクチルオキシ基等が挙げられる。
Ｒ１３の置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルアミノ基、としては、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、ｎ−プロピルアミノ基、ｉ−プロピルアミノ基、ｎ−ブチルアミノ基、ｉ−ブチルアミノ基、ｔ−ブチルアミノ基、ｎ−へキシルアミノ基、シクロへキシルアミノ基、ｎ−オクチルアミノ基、ｎ−ドデシルアミノ基、オクタデシルアミノ基等が挙げられる。
Ｒ１３の置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルアミノ基としては、ベンジルアミノ基、２−フェニルエチルアミノ基、８−フェニルオクチルアミノ基等が挙げられる。
なお、該Ｒ１３における有していてもよい置換基とは、前記Ｒ１と同義である。
【００６２】
一般式（１０）におけるＲ１４の置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアシル基とは、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルカルボニル基、若しくは置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルカルボニル基を挙げることができる。一方、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基とは、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基、若しくは置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシカルボニル基等を挙げることができる。また、アミノ基のアシル保護基を用いることができ、例えば、Ｂｏｃ基、Ｆｍｏｃ基、Ｃｂｚ基等を挙げることができる。
Ｒ１４の（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルカルボニル基とは、例えば、アセチル基、エチルカルボニル基、ｎ−プロピルカルボニル基、ｉ−プロピルカルボニル基、ｎ−ブチルカルボニル基、ｉ−ブチルカルボニル基、ｔ−ブチルカルボニル基、ｎ−へキシルカルボニル基、シクロへキシルカルボニル基、ｎ−オクチルカルボニル基、ｎ−ドデシルカルボニル基、オクタデシルカルボニル基等が挙げられる。
Ｒ１４の（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基とは、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−プロピルオキシカルボニル基、ｉ−プロピルオキシカルボニル基、ｎ−ブトキシカルボニル基、ｉ−ブトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ｎ−へキシルオキシカルボニル基、シクロへキシルオキシカルボニル基、ｎ−オクチルオキシカルボニル基、ｎ−ドデシルオキシカルボニル基、オクタデシルオキシカルボニル基等が挙げられる。
Ｒ１４の（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルカルボニル基としては、例えば、ベンジルカルボニル基、２−フェニルエチルカルボニル基等が挙げられる。
Ｒ１４の（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシカルボニル基としては、例えば、ベンジルオキシカルボニル基、２−フェニルエチルオキシカルボニル基等が挙げられる。
なお、該Ｒ１４における有していてもよい置換基とは、前記Ｒ１と同義である。
【００６３】
前記カチオン性官能基がアルギニン誘導体結合基の場合、好ましくは、一般式（９）で示されるアルギニン誘導体結合基であって、アルギニン（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルエステル基、アルギニン（Ｃ７〜Ｃ１０）アラルキルエステル基、アルギニン（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミド基及びアルギニン（Ｃ７〜Ｃ１０）アラルキルアミド基からなる群から選択される１種以上の基であることが好ましい。
【００６４】
一般式（１）におけるＲ６ａがリジン誘導体結合基である場合、一般式（１１）または（１２）で表されるリジン誘導体結合基であることが好ましい。
【化１１】
0006513635.tif 000012
一般式（１１）において、Ｒ１５は水酸基、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシ基、置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシ基、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルアミド基、置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルアミノ基を示す。
また、一般式（１２）において、Ｒ１６は、水素原子、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアシル基、若しくは置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基を示す。
【００６５】
一般式（１１）におけるＲ１５の（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシ基とは、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｉ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−へキシルオキシ基、シクロへキシルオキシ基、ｎ−オクチルオキシ基、ｎ−ドデシルオキシ基、オクタデシルオキシ基等が挙げられる。
Ｒ１５の（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシ基としては、ベンジルオキシ基、２−フェニルエチルオキシ基、８−フェニルオクチルオキシ基等が挙げられる。
Ｒ１５の（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルアミノ基、としては、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、ｎ−プロピルアミノ基、ｉ−プロピルアミノ基、ｎ−ブチルアミノ基、ｉ−ブチルアミノ基、ｔ−ブチルアミノ基、ｎ−へキシルアミノ基、シクロへキシルアミノ基、ｎ−オクチルアミノ基、ｎ−ドデシルアミノ基、オクタデシルアミノ基等が挙げられる。
Ｒ１５の（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルアミノ基としては、ベンジルアミノ基、２−フェニルエチルアミノ基、８−フェニルオクチルアミノ基等が挙げられる。
なお、該Ｒ１５における有していてもよい置換基とは、前記Ｒ１と同義である。
【００６６】
一般式（１２）におけるＲ１６の置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアシル基とは、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルカルボニル基、若しくは置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルカルボニル基を挙げることができる。一方、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基とは、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基、若しくは置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシカルボニル基等を挙げることができる。また、アミノ基のアシル保護基を用いることができ、例えば、Ｂｏｃ基、Ｆｍｏｃ基、Ｃｂｚ基等を挙げることができる。
Ｒ１６の（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルカルボニル基とは、例えば、アセチル基、エチルカルボニル基、ｎ−プロピルカルボニル基、ｉ−プロピルカルボニル基、ｎ−ブチルカルボニル基、ｉ−ブチルカルボニル基、ｔ−ブチルカルボニル基、ｎ−へキシルカルボニル基、シクロへキシルカルボニル基、ｎ−オクチルカルボニル基、ｎ−ドデシルカルボニル基、オクタデシルカルボニル基等が挙げられる。
Ｒ１６の（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基とは、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−プロピルオキシカルボニル基、ｉ−プロピルオキシカルボニル基、ｎ−ブトキシカルボニル基、ｉ−ブトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ｎ−へキシルオキシカルボニル基、シクロへキシルオキシカルボニル基、ｎ−オクチルオキシカルボニル基、ｎ−ドデシルオキシカルボニル基、オクタデシルオキシカルボニル基等が挙げられる。
Ｒ１６の（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルカルボニル基としては、例えば、ベンジルカルボニル基、２−フェニルエチルカルボニル基等が挙げられる。
Ｒ１６の（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシカルボニル基としては、例えば、ベンジルオキシカルボニル基、２−フェニルエチルオキシカルボニル基等が挙げられる。
なお、該Ｒ１６における有していてもよい置換基とは、前記Ｒ１と同義である。
【００６７】
前記カチオン性官能基がリジン誘導体結合基の場合、好ましくは、一般式（１１）で示されるリジン誘導体結合基であって、リジン（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルエステル基、リジン（Ｃ７〜Ｃ１０）アラルキルエステル基、リジン（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミド基及びリジン（Ｃ７〜Ｃ１０）アラルキルアミド基からなる群から選択される１種以上の基であることが好ましい。
【００６８】
一般式（１）におけるＸ２ａは、前記ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントの側鎖カルボキシ基と、前記Ｒ６ａに係る前記アルギニン誘導体結合基または前記リジン誘導体結合基を連結する結合基である。
該Ｘ２ａに係る結合基としては、両末端がカルボキシ基及びアミノ基と結合する官能基を有する結合基であれば特に限定されるものではないが、例えば、―ＮＨ―(ＣＨ２)α’’―ＣＯ−、―ＮＨ―(ＣＨ２)α’’―ＮＨＣＯ−、―ＮＨ―(ＣＨ２)α’’―ＯＣＯ−、―Ｏ―(ＣＨ２)α’’―ＣＯ−、―Ｏ―(ＣＨ２)α’’―ＮＨＣＯ−、―Ｏ―(ＣＨ２)α’’―ＯＣＯ−、―Ｏ―(ＣＨ２)α’’―ＮＨ−、―ＮＨ―(ＣＨ２)２―ＳＳ−(ＣＨ２)２―ＮＨＣＯ−、―ＮＨ―(ＣＨ２)α’’―ＮＨ−、―ＮＨ―(ＣＨ２)α’’―Ｏ―、―Ｏ―(ＣＨ２)α’’―Ｏ−または―ＮＨ―(ＣＨ２)２―ＳＳ−(ＣＨ２)２―ＮＨ−等が挙げられる。ここで、α’’は１〜１２の整数であり、好ましくは４〜１２の整数であり、特に好ましくは６〜１２の整数である。なお、該Ｘ２ａは「結合」であってよい。「結合」とは、特にリンカー相当基を介せず、ブロック型ポリマーの側鎖カルボキシ基とアルギニン誘導体結合基またはリジン誘導体結合基が直接結合していることを意味する。
【００６９】
一般式（１）におけるＲ６ａは、アルギニン誘導体結合基であることが好ましい。すなわち、一般式（１）におけるカチオン性官能基であるＲ６ａは、好ましくは、前記一般式（９）で示されるアルギニン誘導体結合基であって、アルギニン（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルエステル基、アルギニン（Ｃ７〜Ｃ１０）アラルキルエステル基、アルギニン（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミド基及びアルギニン（Ｃ７〜Ｃ１０）アラルキルアミド基からなる群から選択される１種以上の基であることが好ましい。その際、一般式（１）におけるＸ２ａは、結合であることが好ましい。
【００７０】
一般式（１）において、Ｒ７ａは水酸基及び／または−Ｎ（Ｒ８ａ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ａ）である。
該−Ｎ（Ｒ８ａ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ａ）において、Ｒ８ａ及びＲ９ａは同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３〜Ｃ８）の分岐鎖状または環状のアルキル基、若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖状のアルキル基である。
該（Ｃ３〜Ｃ８）の分岐鎖状または環状のアルキル基としては、例えば、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、ネオペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられ、好ましくはイソプロピル基、シクロへキシル基が挙げられる。
該三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖状のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、２−ジメチルアミノエチル基、３−ジメチルアミノプロピル基、６−ジメチルアミノヘキシル基等が挙げられ、好ましくは、エチル基、３−ジメチルアミノプロピル基が挙げられる。
【００７１】
前記Ｒ７ａは水酸基及び／または−Ｎ（Ｒ８ａ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ａ）であるが、水酸基のみである場合、水酸基及び−Ｎ（Ｒ８ａ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ａ）が共存する場合、若しくは−Ｎ（Ｒ８ａ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ａ）のみである場合の態様を取り得る。水酸基と−Ｎ（Ｒ８ａ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ａ）の存在比率は任意に設定されてよい。
【００７２】
一般式（１）のＲ７ａは、水酸基であってよい。すなわち、一般式（１）の側鎖カルボキシ基に、前記Ｒ５ａ、前記Ｒ６ａ及び−Ｎ（Ｒ８ａ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ａ）の何れもが結合していないカルボキシ基が存在して良い。一般式（１）において、Ｒ７ａが水酸基である場合、側鎖カルボン酸の遊離酸型で示されている。しかしながら、側鎖カルボン酸のアルカリ金属塩型、アルカリ土類金属塩型、アンモニウム塩型の形態も取り得て、これらの塩態様も含まれるものである。アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩の塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩が挙げられる。
また、本核酸送達用組成物が非経口投与にて供せられる場合、医薬品として許容される溶解液にて溶液調製されるが、Ｒ７ａが水酸基である場合の側鎖カルボン酸は、その溶液のｐＨ及び緩衝溶液の塩の有無に依存した側鎖カルボン酸塩の態様を取り得てよい。
【００７３】
一般式（１）は、ポリエチレングリコールセグメントとポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントが連結したブロック型コポリマー構造体である。そのポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントとしては、側鎖カルボキシ基にＲ５ａ、Ｒ６ａ及びＲ７ａが結合したユニット及び側鎖カルボン酸が分子内環化構造をとるユニットが存在する。これらの各アスパラギン酸ユニットまたはグルタミン酸ユニットは、それぞれ独立して、ランダムな配列にて存在したセグメント構造である。すなわち、該カルボキシ基にＲ５ａ、Ｒ６ａ及びＲ７ａが結合したユニット並びに側鎖カルボン酸が分子内環化構造をとるユニットが、それぞれ任意の順番で配列した態様であってもよい。例えば、それぞれの構成単位が、局在化して偏局した配列の態様であっても良く、それぞれの構成単位に規則性がないランダム配列で構成されたポリマー構造であってもよく、つまり、その側鎖修飾体の配列順序において、特に規則性のない配列である。
【００７４】
一般式（１）において、各アスパラギン酸ユニットまたはグルタミン酸ユニットの含量を示すａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ及びｇは、それぞれ独立して０〜２００の整数である。該ブロック型コポリマー（Ａ）の、ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントの総重合数である（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ）は、１０〜２００の整数である。好ましくは、重合数が１５〜１００である。
【００７５】
疎水性官能基であるＲ５ａが結合したユニットは必須の構成ユニットであり、総ユニット数である（ａ＋ｂ）は、１〜２００の整数である。好ましくは（ａ＋ｂ）が３〜１００の整数である。より好ましくは、（ａ＋ｂ）は３〜６０の整数である。
ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントの総重合数である（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ）に対する、疎水性官能基であるＲ５ａの含有総ユニット数である（ａ＋ｂ）の存在比率は、２〜５０％であることが好ましい。より好ましくは、（ａ＋ｂ）の全体ユニットに対する存在比率が５〜４５％である。
【００７６】
また、カチオン性官能基であるＲ６ａが結合したユニットは必須の構成ユニットであり、総ユニット数である（ｃ＋ｄ）は１〜２００の整数である。好ましくは（ｃ＋ｄ）が１０〜１５０の整数である。より好ましくは、（ｃ＋ｄ）は２０〜１００の整数である。
ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントの総重合数である（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ）に対する、カチオン性官能基であるＲ６ａの含有総ユニット数である（ｃ＋ｄ）の存在比率は、５０〜９０％であることが好ましい。より好ましくは、（ｃ＋ｄ）の全体ユニットに対する存在比率は５０〜８０％である。
Ｒ７ａが結合したユニット及び側鎖カルボキシ基が分子内環化構造をとるユニットは、任意に存在して良く、その存在含量数を示すｅ、ｆ及びｇは、０〜２００の整数である。
側鎖カルボキシ基に、疎水性官能基であるＲ５ａ及びカチオン性官能基であるＲ６ａが結合していないユニット総数である（ｅ＋ｆ＋ｇ）は、ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントの総重合数である（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ）に対して、０〜４０％である。好ましくは、（ｅ＋ｆ＋ｇ）の存在比率は２〜３０％である。
【００７７】
一般式（１）において、ポリエチレングリコールセグメントの重合数であるｔは５〜１１，５００の整数である。すなわちポリエチレングリコールセグメントの分子量としては、２００〜５００，０００である。好ましくは、ｔは１２〜２，５００の整数であり、分子量としては５００〜１００，０００である。より好ましくは、ｔは３０〜１２００の整数であり、分子量としては１３００〜５０，０００である。
【００７８】
次に、本発明のブロック型コポリマー（Ａ）の製造方法について説明する。
本発明のブロック型コポリマー（Ａ）の製造方法は特に限定されるものではなく、公知の方法により製造することができる。
例えば、ポリエチレングリコールセグメントと、側鎖カルボキシ基に疎水性官能基及びカチオン性官能基を導入したポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントを、適当な結合様式により結合させる方法で製造することができる。また、ポリエチレングリコールセグメントに対し、ポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体を構築できる重合性モノマー体を、逐次重合反応させてブロック型コポリマーを調製する方法であってもよい。若しくは、ポリエチレングリコールとポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸が結合したＡＢブロック型コポリマーをあらかじめ調製し、これに適当な疎水性官能基及びカチオン性官能基を導入して調製する方法であってもよい。
【００７９】
ブロック型コポリマー（Ａ）の製造方法として、好ましくは、ポリエチレングリコールとポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸が結合したＡＢブロック型コポリマーをあらかじめ調製し、これに適当な疎水性官能基及びカチオン性官能基をアミド結合様式及び／またはエステル結合様式により、適当な縮合条件で反応させることで、製造することができる。縮合条件は、通常の有機合成反応で用いることができる方法を、適宜使用することができる。
【００８０】
ポリエチレングリコールセグメントとポリアスパラギン酸セグメントが連結したＡＢブロック型コポリマーを用い、これに、疎水性官能基及びカチオン性官能基を導入して該ブロック型コポリマー（Ａ）を得る製造方法の一態様を説明する。
始めに、一方の末端がアミノ基であるポリエチレングリコール誘導体（例えば、メトキシポリエチレングリコール−１−プロピルアミン）に、β−ベンジルエステル等の適当な側鎖カルボキシ基保護したＮ−カルボニルアスパラギン酸無水物を順次反応させて、逐次重合によりポリエチレングリコールセグメントとポリアスパラギン酸セグメントが連結したＡＢブロック型コポリマー骨格を構築する。
その後、適当な脱保護反応を施し、複数のカルボン酸側鎖を備えるポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸共重合体を合成する。脱保護反応としては、ポリアスパラギン酸側鎖がβ−ベンジルエステルである場合、アルカリ条件下での加水分解や、加水素分解反応により脱保護基反応をすることができる。
このポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸共重合体に対し、アミノ基及び／または水酸基を有する疎水性官能基含有化合物を、カルボジイミド脱水縮合剤等の縮合反応条件にて反応させればよい。また、同様にアミノ基及び／または水酸基を有するカチオン性官能基含有化合物を、カルボジイミド脱水縮合剤等の縮合反応条件にて反応させればよい。該疎水性官能基含有化合物と、該カチオン性官能基含有化合物の反応順は、任意の順序であって良く、同時に反応させてもよい。なお、上述したカルボジイミド脱水縮合剤を用いる製造方法は、ブロック型コポリマー（Ａ）において、一般式（１）のＲ７ａに係る−Ｎ（Ｒ８ａ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ａ）基を同時に導入することができることから、有利な製造方法である。
該カルボジイミド脱水縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）等を用いることができる。該脱水縮合反応の際に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）や、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）等の反応補助剤を用いてもよい。
【００８１】
前記ブロック型コポリマー（Ａ）の、疎水性官能基及びカチオン性官能基のそれぞれの導入量は、脱水縮合反応において、疎水性基含有化合物及びカチオン性官能基含有化合物の仕込み量を、適宜増減させることで調整することができる。
なお、カルボジイミド縮合剤としてジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いた場合、前記−Ｎ（Ｒ８ａ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ａ）の、Ｒ８ａ及びＲ９ａはシクロへキシル基となる。また、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）を用いて縮合反応を行った場合、Ｒ８ａ及びＲ９ａはイソプロピル基となる。一方、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）を用いた場合、−Ｎ（Ｒ８ａ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ａ）のＲ８ａ及びＲ９ａは、エチル基と３−ジメチルアミノプロピル基の混合置換体となる。
前記反応終了後に、任意の精製工程を経由して本発明のブロック型コポリマー（Ａ）を製造することができる。
前記ブロック型コポリマー（Ａ）として、ポリグルタミン酸セグメントである場合の合成方法は、前述の合成例におけるＮ−カルボニルアスパラギン酸無水物に代えて、Ｎ−カルボニルグルタミン酸無水物を用いることで、ポリグルタミン酸を含む該共重合体が得られる。これに対し、上述と同様の操作により該疎水性官能基含有化合物及び該カチオン性官能基含有化合物を導入させれば、ポリグルタミン酸を備えるブロック型コポリマー（Ａ）を合成することができる。
【００８２】
［二官能性ポリマー（Ｂ）について］
本発明は、ポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸であって、側鎖カルボキシ基に疎水性官能基及びカチオン性官能基を直接または結合基を介して有する二官能性ポリマー（Ｂ）を用いる。
該二官能性ポリマー（Ｂ）における、ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントとは、アスパラギン酸またはグルタミン酸の重合体構造セグメントである。ポリアスパラギン酸の重合様式はペプチド結合であり、α結合体であってもβ結合体であっても良く、その混合物であってもよい。また、ポリグルタミン酸の重合様式もペプチド結合であり、α結合体であってもγ結合体であっても良く、その混合物であってもよい。
ポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸は、重合度が１０〜２００の重合体であることが好ましい。
【００８３】
二官能性ポリマー（Ｂ）におけるポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントは、側鎖カルボキシ基に直接または結合基を介して疎水性官能基を具備する。
前記疎水性官能基は、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の基である。
二官能性ポリマー（Ｂ）の疎水性官能基としての、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基としては、例えば、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、シクロペンチル基、ｎ−へキシル基、シクロへキシル基、シクロへキシルメチル基、シクロへキシルエチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ヘキサデシル基、ｎ−オクタデシル基、イソオクチル基、イソデシル基、イソドデシル基、イソテトラデシル基、イソヘキサデシル基、イソオクタデシル基、ｔ−オクチル基、ｔ−デシル基、ｔ−ドデシル基、ｔ−テトラデシル基、ｔ−ヘキサデシル基、ｔ−オクタデシル基等が挙げられる。
前記疎水性官能基における前記アルキル基としては、（Ｃ６〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基が、より好ましい。
【００８４】
前記疎水性官能基における、前記置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基とは、いずれか１カ所に炭素―炭素二重結合を有する、直鎖状、分岐鎖状または環状の（Ｃ４〜Ｃ２０）アルケニル基である。例えば、１−ブテニル基、２−メチル−２−ブテニル基、２−メチル−１，３−ブタジエニル基、１―オクテニル基、１−デセニル基、１−ドデセニル基、１−テトラデセニル基、１−ヘキサデセニル基、１−オクタデセニル基、ｃｉｓ−９−オクタデセニル基、９−ヘキサデセニル基等が挙げられる。
前記疎水性官能基における前記アルケニル基としては、（Ｃ８〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基が、より好ましい。
【００８５】
前記疎水性官能基における、前記置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基とは、いずれか１カ所の水素原子がアリール基で置換されている直鎖または分岐鎖アルキル基である。例えば、ベンジル基、２−フェニルエチル基、４−フェニルブチル基、３−フェニルブチル基、５−フェニルペンチル基、６−フェニルへキシル基、８−フェニルオクチル基等が挙げられる。好ましくは４−フェニルブチル基、５−フェニルペンチル基、６−フェニルへキシル基、８−フェニルオクチル基等が挙げられる。
【００８６】
前記疎水性官能基における（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基は、それぞれ適当な置換基を有していてもよい。
置換基としては、メルカプト基、水酸基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、炭素環アリール基、複素環アリール基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、スルファモイル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、カルバモイルオキシ基、置換または無置換アミノ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基、ウレイド基、スルホニルアミノ基、スルファモイルアミノ基、ホルミル基、アシル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基またはシリル基等を挙げることができる。芳香環上の置換位置は、オルト位でも、メタ位でも、パラ位でもよい。
置換基についての詳細な説明は、前述のブロック型ポリマー（Ａ）における有していてもよい置換基と同義である。
【００８７】
二官能性ポリマー（Ｂ）における前記疎水性官能基は、ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントの側鎖カルボキシ基に、直接または結合基を介して結合させる。該疎水性官能基を側鎖カルボキシ基に直接結合させる場合は、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルケニル基または置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキル基が側鎖カルボキシ基にケトン型構造で結合することになる。しかしながら、側鎖カルボキシ基に対し、適当な結合基を介して、該疎水性官能基を結合させる態様が、前記二官能性ポリマーの調製し易さから好ましい。
適当な結合基としては、酸素原子、−ＮＨ−基、硫黄原子及びアミノ酸誘導体からなる群から選択される１種以上の結合基を用いることが好ましい。
前記結合基として酸素原子を用いる場合、前記疎水性官能基である置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルケニル基または置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキル基は、エステル結合の様式にて前記二官能性ポリマー（Ｂ）に官能基化される。また、前記結合基として−ＮＨ−基を用いる場合、前記疎水性官能基は、アミド結合の様式にて官能基化される。一方、前記結合基として硫黄原子を用いる場合、前記疎水性官能基は、チオエステル結合の様式にて官能基化される。
【００８８】
前記結合基としてアミノ酸誘導体を用いる場合、用いられるアミノ酸は、天然アミノ酸または非天然アミノ酸であってよく、Ｌ体、Ｄ体のいずれでも特に限定されずに用いることができる。例えば、グリシン、β−アラニン、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン等の炭化水素系アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸等を用いることができる。炭化水素系アミノ酸は、炭化水素基側鎖が疎水性官能基として機能する点で好ましい。また、酸性アミノ酸は、カルボン酸官能基を増やすことができ、多官能基化する場合に好適である。一方、塩基性アミノ酸を用いる場合、核酸保持に有利なカチオン性官能基を付与できる点で好ましく、また、酸性環境下において塩形成することによるｐＨ応答性を付与できる点で好ましい。疎水性官能基を具備させるための結合基としてアミノ酸を用いる場合は、目的とする機能に応じて適宜設定されるべきである。
なお、結合基としてアミノ酸を用いる場合は、該アミノ酸のＮ末アミノ基と前記側鎖カルボキシ基がアミド結合し、該Ｃ末カルボキシ基と、前記疎水性官能基である（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルキル基、（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルケニル基または（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキル基が、酸素原子を介してエステル結合様式、−ＮＨ−基を介してアミド結合様式または硫黄原子を介してチオエステル結合様式にて官能基化がなされることが好ましい。
【００８９】
前記二官能性ポリマー（Ｂ）は、疎水性官能基を結合させるために、アミノ酸誘導体を結合基として用いることが好ましい。特に、結合基としてヒスチジン誘導体を用いることが好ましい。ヒスチジン誘導体は、側鎖イミダソール環が酸性環境下において塩形成することによるｐＨ応答性を付与することができ、細胞質への核酸の導入の向上に有利な効果を奏する事から好ましい。
好ましい結合様式としては、ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントの側鎖カルボキシ基に、ヒスチジン誘導体のＮ末アミノ基をアミド結合させ、該ヒスチジン誘導体のＣ末カルボキシ基に、前記疎水性官能基をエステル結合またはアミド結合により結合させることが好ましい。
ヒスチジン誘導体を結合基として疎水性官能基を導入する態様としては一般式（１３）で示される。
【化１２】
0006513635.tif 000013
ここで、一般式（１３）におけるＲ１７は、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の基であり、Ｘ３ｂは酸素原子、−ＮＨ−基及び硫黄原子から選択される１種以上の基である。前記Ｒ１７の該アルキル基、該アルケニル基及び該アラルキル基は、前述の疎水性官能基と同義である。
なお、前記有していてもよい置換基とは、前述の二官能性ポリマー（Ｂ）における置換基と同義である。
【００９０】
前記二官能性ポリマー（Ｂ）は、前記疎水性官能基が複数当量で結合していることが好ましい。結合基当量数は、該疎水性官能基の疎水性により適宜設定してよいが、該ブロック型ポリマー１分子当り２当量以上で１００当量以下である。２当量以上で５０当量以下の結合当量であることが好ましい。
前記疎水性官能基が複数当量で結合している場合、該疎水性官能基は同一種類であっても、複数種類が混在していてもよい。
【００９１】
二官能性ポリマー（Ｂ）は、ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントの側鎖カルボキシ基に、直接または結合基を介してアルギニン誘導体結合基及び／またはリジン誘導体結合基を具備する。該アルギニン誘導体結合基及び該リジン誘導体結合基としては、側鎖グアニジル基またはアミノ基がカチオン性を示すものであれば良く、アルギニン構造単位またはリジン構造単位が含まれていれば良い。
前記二官能性ポリマー（Ｂ）におけるカチオン性官能基は、該アルギニン誘導体結合基または該リジン誘導体結合基のいずれか一方を用いても良く、これらの混合物であってもよい。好ましくは、その何れか一方の単一分子構造で用いられる態様であり、特にアルギニン誘導体結合基を用いることが好ましい。
該アルギニン誘導体または該リジン誘導体の好ましい結合様式としては、ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントの側鎖カルボキシ基に、アルギニン誘導体またはリジン誘導体を、直接または結合基を介して結合させる態様を挙げることができる。
【００９２】
前記アルギニン誘導体結合基としては、一般式（１４）または（１５）で表される結合残基であることが好ましい。
【化１３】
0006513635.tif 000014
一般式（１４）において、Ｒ１８は水酸基、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシ基、置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシ基、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルアミド基、置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルアミノ基を示し、Ｌ５は任意の結合基を示す。
また、一般式（１５）において、Ｒ１９は、水素原子、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアシル基、若しくは置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基を示し、Ｌ６は任意の結合基を示す。
【００９３】
一般式（１４）におけるＲ１８の置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシ基とは、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｉ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−へキシルオキシ基、シクロへキシルオキシ基、ｎ−オクチルオキシ基、ｎ−ドデシルオキシ基、オクタデシルオキシ基等が挙げられる。
Ｒ１８の置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシ基としては、ベンジルオキシ基、２−フェニルエチルオキシ基、８−フェニルオクチルオキシ基等が挙げられる。
Ｒ１８の置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルアミノ基、としては、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、ｎ−プロピルアミノ基、ｉ−プロピルアミノ基、ｎ−ブチルアミノ基、ｉ−ブチルアミノ基、ｔ−ブチルアミノ基、ｎ−へキシルアミノ基、シクロへキシルアミノ基、ｎ−オクチルアミノ基、ｎ−ドデシルアミノ基、オクタデシルアミノ基等が挙げられる。
Ｒ１８の置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルアミノ基としては、ベンジルアミノ基、２−フェニルエチルアミノ基、８−フェニルオクチルアミノ基等が挙げられる。
【００９４】
一般式（１５）におけるＲ１９の置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアシル基とは、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルカルボニル基、若しくは置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルカルボニル基を挙げることができる。
一方、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基とは、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基、若しくは置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシカルボニル基等を挙げることができる。
また、アミノ基のアシル保護基を用いることができ、例えば、Ｂｏｃ基、Ｆｍｏｃ基、Ｃｂｚ基等を挙げることができる。
【００９５】
Ｒ１９の置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルカルボニル基とは、例えば、アセチル基、エチルカルボニル基、ｎ−プロピルカルボニル基、ｉ−プロピルカルボニル基、ｎ−ブチルカルボニル基、ｉ−ブチルカルボニル基、ｔ−ブチルカルボニル基、ｎ−へキシルカルボニル基、シクロへキシルカルボニル基、ｎ−オクチルカルボニル基、ｎ−ドデシルカルボニル基、オクタデシルカルボニル基等が挙げられる。
Ｒ１９の置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基とは、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−プロピルオキシカルボニル基、ｉ−プロピルオキシカルボニル基、ｎ−ブトキシカルボニル基、ｉ−ブトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ｎ−へキシルオキシカルボニル基、シクロへキシルオキシカルボニル基、ｎ−オクチルオキシカルボニル基、ｎ−ドデシルオキシカルボニル基、オクタデシルオキシカルボニル基等が挙げられる。
Ｒ１９の置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルカルボニル基としては、例えば、ベンジルカルボニル基、２−フェニルエチルカルボニル基等が挙げられる。
Ｒ１９の置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシカルボニル基としては、例えば、ベンジルオキシカルボニル基、２−フェニルエチルオキシカルボニル基等が挙げられる。
【００９６】
一般式（１４）及び（１５）におけるＬ５及びＬ６は、前記ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントの側鎖カルボキシ基と、前記アルギニン誘導体結合基を連結する結合基である。Ｌ５及びＬ６の結合基としては、その両末端が、カルボキシ基及びアミノ基と結合する官能基を有する結合基であれば特に限定されるものではない。
該Ｌ５としては、例えば、―ＮＨ―(ＣＨ２)β―ＣＯ−、―ＮＨ―(ＣＨ２)β―ＮＨＣＯ−、―ＮＨ―(ＣＨ２)β―ＯＣＯ−、―Ｏ―(ＣＨ２)β―ＣＯ−、―Ｏ―(ＣＨ２)β―ＮＨＣＯ−、―Ｏ―(ＣＨ２)β―ＯＣＯ−または―ＮＨ―(ＣＨ２)２―ＳＳ−(ＣＨ２)２―ＮＨＣＯ−等が挙げられる。ここで、βは１〜１２の整数であり、好ましくは４〜１２の整数であり、特に好ましくは６〜１２の整数である。なお、Ｌ５は「結合」であってよい。該「結合」とは、特にリンカー相当基を介せず、ブロック型ポリマーの側鎖カルボキシ基と、アルギニン誘導体のＮ末アミノ基が直接結合していることを意味する。
また、該Ｌ６としては、例えば、―ＮＨ―(ＣＨ２)β―ＮＨ−、―ＮＨ―(ＣＨ２)β―Ｏ−、―Ｏ―(ＣＨ２)β―ＮＨ−、―Ｏ―(ＣＨ２)β―Ｏ−または―ＮＨ―(ＣＨ２)２―ＳＳ−(ＣＨ２)２―ＮＨ−等が挙げられる。ここで、βは１〜１２の整数であり、好ましくは４〜１２の整数であり、特に好ましくは６〜１２の整数である。
【００９７】
前記カチオン性官能基がアルギニン誘導体結合基である場合、好ましくは、アルギニン（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルエステル基、アルギニン（Ｃ７〜Ｃ１０）アラルキルエステル基、アルギニン（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミド基及びアルギニン（Ｃ７〜Ｃ１０）アラルキルアミド基からなる群から選択される１種以上の基であることが好ましい。
【００９８】
前記カチオン性官能基がリジン誘導体結合基である場合、一般式（１６）または（１７）で表される結合残基であることが好ましい。
【化１４】
0006513635.tif 000015
一般式（１６）において、Ｒ２０は水酸基、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシ基、置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシ基、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルアミド基、置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルアミノ基を示し、Ｌ７は任意の結合基を示す。
また、一般式（１７）において、Ｒ２１は、水素原子、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアシル基、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基を示し、Ｌ８は任意の結合基を示す。
【００９９】
一般式（１６）におけるＲ２０の置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシ基とは、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｉ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−へキシルオキシ基、シクロへキシルオキシ基、ｎ−オクチルオキシ基、ｎ−ドデシルオキシ基、オクタデシルオキシ基等が挙げられる。
Ｒ２０の置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシ基としては、ベンジルオキシ基、２−フェニルエチルオキシ基、８−フェニルオクチルオキシ基等が挙げられる。
Ｒ２０の置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルアミノ基、としては、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、ｎ−プロピルアミノ基、ｉ−プロピルアミノ基、ｎ−ブチルアミノ基、ｉ−ブチルアミノ基、ｔ−ブチルアミノ基、ｎ−へキシルアミノ基、シクロへキシルアミノ基、ｎ−オクチルアミノ基、ｎ−ドデシルアミノ基、オクタデシルアミノ基等が挙げられる。
Ｒ２０の置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルアミノ基としては、ベンジルアミノ基、２−フェニルエチルアミノ基、８−フェニルオクチルアミノ基等が挙げられる。
【０１００】
一般式（１７）におけるＲ２１の置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアシル基とは、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルカルボニル基、若しくは置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルカルボニル基を挙げることができる。
一方、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基とは、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基、若しくは置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシカルボニル基等を挙げることができる。
また、アミノ基のアシル保護基を用いることができ、例えば、Ｂｏｃ基、Ｆｍｏｃ基、Ｃｂｚ基等を挙げることができる。
【０１０１】
Ｒ２０の置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルカルボニル基とは、例えば、アセチル基、エチルカルボニル基、ｎ−プロピルカルボニル基、ｉ−プロピルカルボニル基、ｎ−ブチルカルボニル基、ｉ−ブチルカルボニル基、ｔ−ブチルカルボニル基、ｎ−へキシルカルボニル基、シクロへキシルカルボニル基、ｎ−オクチルカルボニル基、ｎ−ドデシルカルボニル基、オクタデシルカルボニル基等が挙げられる。
Ｒ２０の置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基とは、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−プロピルオキシカルボニル基、ｉ−プロピルオキシカルボニル基、ｎ−ブトキシカルボニル基、ｉ−ブトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ｎ−へキシルオキシカルボニル基、シクロへキシルオキシカルボニル基、ｎ−オクチルオキシカルボニル基、ｎ−ドデシルオキシカルボニル基、オクタデシルオキシカルボニル基等が挙げられる。
Ｒ２０の置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルカルボニル基としては、例えば、ベンジルカルボニル基、２−フェニルエチルカルボニル基等が挙げられる。
Ｒ２０の置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシカルボニル基としては、例えば、ベンジルオキシカルボニル基、２−フェニルエチルオキシカルボニル基等が挙げられる。
【０１０２】
一般式（１６）及び（１７）におけるＬ７及びＬ８は、前記ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントの側鎖カルボキシ基と、前記リジン誘導体結合基を連結する結合基である。Ｌ７及びＬ８の結合基としては、その両末端が、カルボキシ基及びアミノ基と結合する官能基を有する結合基であれば特に限定されるものではない。
該Ｌ７としては、例えば、―ＮＨ―(ＣＨ２)β―ＣＯ−、―ＮＨ―(ＣＨ２)β―ＮＨＣＯ−、―ＮＨ―(ＣＨ２)β―ＯＣＯ−、―Ｏ―(ＣＨ２)β―ＣＯ−、―Ｏ―(ＣＨ２)β―ＮＨＣＯ−、―Ｏ―(ＣＨ２)β―ＯＣＯ−または―ＮＨ―(ＣＨ２)２―ＳＳ−(ＣＨ２)２―ＮＨＣＯ−等が挙げられる。ここで、βは１〜１２の整数であり、好ましくは４〜１２の整数であり、特に好ましくは６〜１２の整数である。なお、Ｌ７は「結合」であってよい。該「結合」とは、特にリンカー相当基を介せず、ブロック型ポリマーの側鎖カルボキシ基と、アルギニン誘導体のＮ末アミノ基が直接結合していることを意味する。
また、該Ｌ８としては、例えば、―ＮＨ―(ＣＨ２)β―ＮＨ−、―ＮＨ―(ＣＨ２)β―Ｏ−、―Ｏ―(ＣＨ２)β―ＮＨ−、―Ｏ―(ＣＨ２)β―Ｏ−または―ＮＨ―(ＣＨ２)２―ＳＳ−(ＣＨ２)２―ＮＨ−等が挙げられる。ここで、βは１〜１２の整数であり、好ましくは４〜１２の整数であり、特に好ましくは６〜１２の整数である。
【０１０３】
前記カチオン性官能基がリジン誘導体結合基の場合、好ましくは、リジン（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルエステル基、リジン（Ｃ７〜Ｃ１０）アラルキルエステル基、リジン（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミド基及びリジン（Ｃ７〜Ｃ１０）アラルキルアミド基からなる群から選択される１種以上の基であることが好ましい。
【０１０４】
前記二官能性ポリマー（Ｂ）は、前記カチオン性官能基が複数当量で結合していることが好ましい。結合基当量数は、該疎水性官能基の疎水性により適宜設定してよいが、該ブロック型ポリマー１分子当り２当量以上で１５０当量以下である。５当量以上で１００当量以下の結合当量であることが好ましい。
【０１０５】
本発明の二官能性ポリマー（Ｂ）において、前記疎水性官能基は核酸送達用キャリアとして、そのキャリア構造の安定化に寄与する。また、前記カチオン性官能基は、核酸分子との静電的相互作用による核酸保持のための機能性官能基である。本発明は、核酸分子の安定的な保持と送達を目的とするものであり、該二官能性ポリマー（Ｂ）は、疎水性官能基とカチオン性官能基の２つの機能性官能基を具備することを特徴とする。
該二官能性ポリマー（Ｂ）における、疎水性官能基とカチオン性官能基の、それぞれの結合量は、特に限定されるものではなく、キャリア構造の安定性と核酸分子の保持力を考慮して、適宜、設定することができる。すなわち、核酸送達キャリア構造の安定化を向上させるためには、二官能性ポリマー（Ｂ）の該疎水性官能基の結合量を増やすことが好ましい。また、核酸分子の保持力を向上させるためには、カチオン性官能基の結合量を増やすことが好ましい。
核酸分子の安定的な保持と送達を達成するためには、該疎水性官能基とカチオン性官能基の結合量のバランスを考慮することが重要である。二官能性ポリマー（Ｂ）において、疎水性官能基よりも、カチオン性官能基の方を多く付与することが好ましい。該二官能性ポリマー（Ｂ）における疎水性官能基とカチオン性官能基の含有モル当量比率は、疎水性官能基：カチオン性官能基＝１：１〜２５であることが好ましく、疎水性官能基：カチオン性官能基＝１：１〜２０であることがより好ましい。
【０１０６】
本発明において、前記二官能性ポリマー（Ｂ）は、一般式（２）
【化１５】
0006513635.tif 000016
［式中、Ｒ３ｂはメチレン基またはエチレン基を示し、Ｒ４ｂは水素原子、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアシル基及び置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）のアルコキシカルボニル基からなる群から選択される１種を示し、Ｒ５ｂは置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の基を示し、Ｒ６ｂはアルギニン誘導体結合基またはリジン誘導体結合基を示し、Ｒ７ｂは水酸基及び／または−Ｎ（Ｒ８ｂ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ｂ）であり、ここで、Ｒ８ｂ及びＲ９ｂは同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３〜Ｃ８）の分岐鎖状または環状のアルキル基若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖状のアルキル基を示し、Ｒ１０は水素原子または置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基を示し、Ｘ１ｂ及びＸ２ｂは結合または結合基を示し、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは、それぞれ独立に０〜２００の整数を示し、（ｍ＋ｎ）及び（ｏ＋ｐ）は１〜２００の整数を示し、（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は１０〜２００の整数を示し、Ｒ５ｂ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ｂが結合している各構造ユニット並びに側鎖カルボニル基の分子内環化型構成ユニットは、それぞれ独立してランダムに配列した構造である。］である事が好ましい。
【０１０７】
一般式（２）のＲ４ｂにおける（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、ホルミル基、アセチル基、プロピオ二ル基、ピバロイル基等が挙げられ、好ましくはアセチル基である。
Ｒ４ｂにおける置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）のアルコキシカルボニル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−プロポキシカルボニル基、ｉ−プロポキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、シクロへキシルオキシカルボニル基等が挙げられる。好ましくは、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基である。
なお、該Ｒ４ｂにおける有していてもよい置換基とは、後述するＲ１０と同義である。
【０１０８】
一般式（２）のＲ５ｂは疎水性官能基である。該疎水性官能基は、本発明に係る前記ブロック型コポリマー（Ａ）及び当該二官能性ポリマー（Ｂ）において、疎水性相互作用を惹起し、会合体を形成するための機能性官能基である。
該Ｒ５ｂとしては置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルケニル基及び置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の基である。該Ｒ５ｂとしての疎水性官能基は、一般式（２）に係るポリマー分子中で単一種類であっても良く、また２種類以上の疎水性官能基の混合物であってもよい。
【０１０９】
Ｒ５ｂにおける置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルキル基としては、特に限定されるものではないが、置換基を有していてもよい直鎖状、分岐鎖状または環状の（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルキル基が挙げられる。例えば、ｎ−ブチル基、ネオペンチル基、ｎ−へキシル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ヘキサデシル基、ｎ−オクタデシル基、イソオクチル基、イソデシル基、イソドデシル基、イソテトラデシル基、イソヘキサデシル基、イソオクタデシル基、t−オクチル基、ｔ−デシル基、ｔ−ドデシル基、ｔ−テトラデシル基、ｔ−ヘキサデシル基、ｔ−オクタデシル基等が挙げられる。
Ｒ５ｂにおける置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルケニル基としては、特に限定されるものではないが、置換基を有していてもよい直鎖状、分岐鎖状または環状の（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルケニル基が挙げられる。例えば、１−ブテニル基、シクロヘキセニル基、１―オクテニル基、１−デセニル基、１−ドデセニル基、１−テトラデセニル基、１−ヘキサデセニル基、１−オクタデセニル基、ｃｉｓ−９−オクタデセニル基、９−ヘキサデセニル基等が挙げられる。
Ｒ５ｂにおける置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキル基としては、特に限定されるものではないが、置換基を有していてもよい直鎖状または分岐鎖状の（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキル基が挙げられる。例えば、ベンジル基、２−フェニルエチル基、４−フェニルブチル基、３−フェニルブチル基、５−フェニルペンチル基、６−フェニルへキシル基、８−フェニルオクチル基等が挙げられる。
【０１１０】
一般式（２）におけるＸ１ｂは結合基である。すなわち、ポリマー主鎖の側鎖カルボキシ基と前記Ｒ５ｂで示される疎水性官能基を結合するための連結基である。Ｘ１ｂは、結合、酸素原子、−ＮＨ−基、硫黄原子及びアミノ酸誘導体からなる群から選択される１種以上の結合基である。ここで結合とは、結合基を介さないで直接、側鎖カルボキシ基に結合した結合様式を示す。該Ｘ１ｂとしては、酸素原子、−ＮＨ−基及びアミノ酸誘導体からなる群から選択される１種以上の結合基であることが好ましい。
前記Ｘ１ｂに係る結合基として酸素原子を用いる場合、前記疎水性官能基である置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルケニル基または置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキル基は、エステル結合の様式にて当該二官能性ポリマー（Ｂ）に官能基化される。一方、前記結合基として−ＮＨ−基を用いる場合、前記疎水性官能基はアミド結合の様式にて官能基化される。
【０１１１】
前記Ｘ１ｂに係る結合基としてアミノ酸誘導体を用いる場合、用いられるアミノ酸は、天然アミノ酸または非天然アミノ酸であってよく、Ｌ体、Ｄ体のいずれでも特に限定されずに用いることができる。例えば、グリシン、β−アラニン、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン等の炭化水素系アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸等を用いることができる。炭化水素系アミノ酸は、炭化水素基側鎖が疎水性官能基として機能する点で好ましい。また、酸性アミノ酸は、カルボン酸官能基を増やすことができ、多官能基化する場合に好適である。一方、塩基性アミノ酸を用いる場合、核酸保持に有利なカチオン性官能基を付与できる点で好ましく、また、酸性環境下において塩形成することによるｐＨ応答性を付与できる点で好ましい。前記Ｘ１ｂとしてアミノ酸を用いる場合は、目的とする機能に応じて適宜設定されるべきである。
なお、結合基としてアミノ酸を用いる場合は、該アミノ酸のＮ末アミノ基が、前記側鎖カルボキシ基とアミド結合し、該アミノ酸のＣ末カルボキシ基と前記疎水性官能基である置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）のアルケニル基または置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキル基が、酸素原子を介してエステル結合様式、−ＮＨ−基を介してアミド結合様式または硫黄原子を介してチオエステル結合様式にて官能基化がなされることが好ましい。
【０１１２】
一般式（２）におけるＸ１ｂとしては、アミノ酸誘導体を用いることが特に好ましく、ヒスチジン誘導体を用いることが殊更好ましい。該ヒスチジン誘導体は、側鎖イミダゾール環が酸性環境下において塩形成することによるｐＨ応答性を付与することができ、細胞質への核酸の導入の向上に有利な効果を奏する事から好ましい。
好ましい結合様式としては、ポリマー主鎖の側鎖カルボキシ基に、該ヒスチジン誘導体のＮ末アミノ基がアミド結合して、該ヒスチジン誘導体のＣ末カルボキシ基に、前記Ｒ５ｂに係る疎水性官能基を、エステル結合またはアミド結合により結合させることが好ましい。すなわち、該Ｘ１ｂとしては、ヒスチジニルオキシ基及び／またはヒスチジニルアミド基が好ましい。
該Ｘ１ｂとしてヒスチジン誘導体を用い、Ｒ５ｂに係る疎水性官能基を導入する態様としては一般式（１８）で示される置換基が好ましい。
【化１６】
0006513635.tif 000017
ここで、一般式（１８）におけるＲ５ｂは、前記置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、前記置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び前記置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基からなる群から選択される１種以上の基である。Ｘ３ｂは、酸素原子、−ＮＨ−基及び硫黄原子から選択される１種以上の基である。
【０１１３】
一般式（２）において、疎水性官能基及び結合基であるＲ５ｂ及びＸ１ｂは、ヒスチジン誘導体を介して置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基及び置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基を結合させる態様が好ましい。以下に、疎水性官能基であるＲ５ｂ結合基；Ｘ１ｂとしてヒスチジン誘導体を介した好ましい置換基の態様を説明する。
Ｘ１ｂとしてヒスチジン誘導体を介し、Ｒ５ｂとして置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基である態様としては、エステル結合型、アミド結合型またはチオエステル結合型を挙げることができる。エステル結合型またはアミド結合型が好ましい。
該エステル結合型としては、例えば、ヒスチジニル−ｎ−オクチルエステル基、ヒスチジニルイソオクチルエステル基、ヒスチジニルイソデシルエステル基、ヒスチヒスチジニル−ｎ−デシルエステル基、ヒスチジニル−ｎ−ドデシルエステル基、ヒスチジニル−ｎ−テトラデシルエステル基、ヒスチジニル−ｎ−ヘキサデシルエステル基、ヒスチジニル−ｎ−オクタデシルエステル基、ヒスチジニルイソドデシルエステル基、ヒスチジニルイソテトラデシルエステル基、ヒスチジニルイソヘキサデシルエステル基、ヒスチジニルイソオクタデシルエステル基、ヒスチジニル−ｔ−オクチルエステル基、ヒスチジニル−ｔ−デシルエステル基、ヒスチジニル−ｔ−ドデシルエステル基、ヒスチジニル−ｔ−テトラデシルエステル基、ヒスチジニル−ｔ−ヘキサデシルエステル基、ヒスチジニル−ｔ−オクタデシルエステル基等が挙げられる。
また、該アミド結合型としては、例えば、ヒスチジニル−ｎ−オクチルアミド基、ヒスチジニル−ｎ−デシルアミド基、ヒスチジニル−ｎ−ドデシルアミド基、ヒスチジニル−ｎ−テトラデシルアミド基、ヒスチジニル−ｎ−ヘキサデシルアミド基、ヒスチジニル−ｎ−オクタデシルアミド基、ヒスチジニルイソオクチルアミド基、ヒスチジニルイソデシルアミド基、ヒスチジニルイソドデシルアミド基、ヒスチジニルイソテトラデシルアミド基、ヒスチジニルイソヘキサデシルアミド基、ヒスチジニルイソオクタデシルアミド基、ヒスチジニル−ｔ−オクチルアミド基、ヒスチジニル−t−デシルアミド基、ヒスチジニル−t−ドデシルアミド基、ヒスチジニル−t−テトラデシルアミド基、ヒスチジニル−t−ヘキサデシルアミド基、ヒスチジニル−t−オクタデシルアミド基等が挙げられる。
【０１１４】
Ｘ１ｂとしてヒスチジン誘導体を介し、Ｒ５ｂとして置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基である態様としては、エステル結合型、アミド結合型またはチオエステル結合型を挙げることができる。エステル結合型またはアミド結合型が好ましい。
該エステル結合型としては、例えば、ヒスチジニル−１−オクテニルエステル基、ヒスチジニル−１−デセニルエステル基、ヒスチジニル−１−ドデセニルエステル基、ヒスチジニル−１−テトラデセニルエステル基、ヒスチジニル−１−ヘキサデセニルエステル基、ヒスチジニル−１−オクタデセニルエステル基、ヒスチジニル−ｃｉｓ−９−オクタデセニルエステル基、ヒスチジニル−９−ヘキサデセニルエステル基等が挙げられる。
また、該アミド結合型としては、例えば、ヒスチジニル−１−オクテニルアミド基、ヒスチジニル−１−デセニルアミド基、ヒスチジニル−１−ドデセニルアミド基、ヒスチジニル−１−テトラデセニルアミド基、ヒスチジニル−１−ヘキサデセニルアミド基、ヒスチジニル−１−オクタデセニルアミド基、ヒスチジニル−ｃｉｓ−９−オクタデセニルアミド基、ヒスチジニル−９−ヘキサデセニルアミド基等が挙げられる。
【０１１５】
Ｘ１ｂとしてヒスチジン誘導体を介し、Ｒ５ｂとして置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキル基である態様としては、エステル結合型、アミド結合型またはチオエステル結合型を挙げることができる。エステル結合型またはアミド結合型が好ましい。
該エステル結合型としては、例えば、ヒスチジニル−４−フェニルブチルエステル基、ヒスチジニル−３−フェニルブチルエステル基、ヒスチジニル−５−フェニルペンチルエステル基、ヒスチジニル−６−フェニルへキシルエステル基、ヒスチジニル−８−フェニルオクチルエステル基等が挙げられる。
該アミド結合型としては、例えば、ヒスチジニル−４−フェニルブチルアミド基、ヒスチジニル−３−フェニルブチルアミド基、ヒスチジニル−５−フェニルペンチルアミド基、ヒスチジニル−６−フェニルへキシルアミド基、ヒスチジニル−８−フェニルオクチルアミド基等が挙げられる。
【０１１６】
一般式（２）におけるＲ６ｂはカチオン性官能基であり、アニオン性に荷電する核酸分子と静電的相互作用により複合体を形成するための機能性官能基である。一般式（２）において、Ｒ６ｂはアルギニン誘導体結合基及び／またはリジン誘導体結合基である。Ｒ６ｂにおけるカチオン性官能基は、一般式（２）に係るポリマー分子中で単一種類であってもよく、該アルギニン誘導体結合基及び該リジン誘導体結合基の混合物であってもよい。
【０１１７】
一般式（２）のＲ６ｂがアルギニン誘導体結合基である場合、一般式（１９）または（２０）で表されるアルギニン誘導体結合基であることが好ましい。
【化１７】
0006513635.tif 000018
一般式（１９）において、Ｒ１８は水酸基、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシ基、置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシ基、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルアミノ基、置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルアミノ基を示す。
また、一般式（２０）において、Ｒ１９は、水素原子、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアシル基、若しくは置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基を示す。
【０１１８】
一般式（１９）におけるＲ１８の置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシ基とは、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｉ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−へキシルオキシ基、シクロへキシルオキシ基、ｎ−オクチルオキシ基、ｎ−ドデシルオキシ基、オクタデシルオキシ基等が挙げられる。
Ｒ１８の置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシ基としては、ベンジルオキシ基、２−フェニルエチルオキシ基、８−フェニルオクチルオキシ基等が挙げられる。
Ｒ１８の置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルアミノ基、としては、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、ｎ−プロピルアミノ基、ｉ−プロピルアミノ基、ｎ−ブチルアミノ基、ｉ−ブチルアミノ基、ｔ−ブチルアミノ基、ｎ−へキシルアミノ基、シクロへキシルアミノ基、ｎ−オクチルアミノ基、ｎ−ドデシルアミノ基、オクタデシルアミノ基等が挙げられる。
Ｒ１８の置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルアミノ基としては、ベンジルアミノ基、２−フェニルエチルアミノ基、８−フェニルオクチルアミノ基等が挙げられる。
【０１１９】
一般式（２０）におけるＲ１９の置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアシル基とは、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルカルボニル基、若しくは置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルカルボニル基を挙げることができる。
一方、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基とは、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基、若しくは置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシカルボニル基等を挙げることができる。
また、アミノ基のアシル保護基を用いることができ、例えば、Ｂｏｃ基、Ｆｍｏｃ基、Ｃｂｚ基等を挙げることができる。
【０１２０】
Ｒ１９の置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルカルボニル基とは、例えば、アセチル基、エチルカルボニル基、ｎ−プロピルカルボニル基、ｉ−プロピルカルボニル基、ｎ−ブチルカルボニル基、ｉ−ブチルカルボニル基、ｔ−ブチルカルボニル基、ｎ−へキシルカルボニル基、シクロへキシルカルボニル基、ｎ−オクチルカルボニル基、ｎ−ドデシルカルボニル基、オクタデシルカルボニル基等が挙げられる。
Ｒ１９の（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基とは、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−プロピルオキシカルボニル基、ｉ−プロピルオキシカルボニル基、ｎ−ブトキシカルボニル基、ｉ−ブトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ｎ−へキシルオキシカルボニル基、シクロへキシルオキシカルボニル基、ｎ−オクチルオキシカルボニル基、ｎ−ドデシルオキシカルボニル基、オクタデシルオキシカルボニル基等が挙げられる。
Ｒ１９の置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルカルボニル基としては、例えば、ベンジルカルボニル基、２−フェニルエチルカルボニル基等が挙げられる。
Ｒ１９の置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシカルボニル基としては、例えば、ベンジルオキシカルボニル基、２−フェニルエチルオキシカルボニル基等が挙げられる。
【０１２１】
前記カチオン性官能基がアルギニン誘導体結合基の場合、好ましくは、一般式（１９）で示されるアルギニン誘導体結合基であって、アルギニン（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルエステル基、アルギニン（Ｃ７〜Ｃ１０）アラルキルエステル基、アルギニン（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミド基及びアルギニン（Ｃ７〜Ｃ１０）アラルキルアミド基からなる群から選択される１種以上の基であることが好ましい。
【０１２２】
一般式（２）におけるＲ６ｂがリジン誘導体結合基である場合、一般式（２１）または（２２）で表されるリジン誘導体結合基であることが好ましい。
【化１８】
0006513635.tif 000019
一般式（２１）において、Ｒ２０は水酸基、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシ基、置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシ基、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルアミノ基、置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルアミノ基を示す。
また、一般式（２２）において、Ｒ２１は、水素原子、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアシル基、若しくは置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基を示す。
【０１２３】
一般式（２１）におけるＲ２０の置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシ基とは、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｉ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−へキシルオキシ基、シクロへキシルオキシ基、ｎ−オクチルオキシ基、ｎ−ドデシルオキシ基、オクタデシルオキシ基等が挙げられる。
Ｒ２０の置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシ基としては、ベンジルオキシ基、２−フェニルエチルオキシ基、８−フェニルオクチルオキシ基等が挙げられる。
Ｒ２０の置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルアミノ基としては、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、ｎ−プロピルアミノ基、ｉ−プロピルアミノ基、ｎ−ブチルアミノ基、ｉ−ブチルアミノ基、ｔ−ブチルアミノ基、ｎ−へキシルアミノ基、シクロへキシルアミノ基、ｎ−オクチルアミノ基、ｎ−ドデシルアミノ基、オクタデシルアミノ基等が挙げられる。
Ｒ２０の置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルアミノ基としては、ベンジルアミノ基、２−フェニルエチルアミノ基、８−フェニルオクチルアミノ基等が挙げられる。
【０１２４】
一般式（２２）におけるＲ２１の置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアシル基とは、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルカルボニル基、若しくは置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルカルボニル基を挙げることができる。
一方、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基とは、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基、若しくは置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシカルボニル基等を挙げることができる。
また、アミノ基のアシル保護基を用いることができ、例えば、Ｂｏｃ基、Ｆｍｏｃ基、Ｃｂｚ基等を挙げることができる。
【０１２５】
Ｒ２１の置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルカルボニル基とは、例えば、アセチル基、エチルカルボニル基、ｎ−プロピルカルボニル基、ｉ−プロピルカルボニル基、ｎ−ブチルカルボニル基、ｉ−ブチルカルボニル基、ｔ−ブチルカルボニル基、ｎ−へキシルカルボニル基、シクロへキシルカルボニル基、ｎ−オクチルカルボニル基、ｎ−ドデシルカルボニル基、オクタデシルカルボニル基等が挙げられる。
Ｒ２１の置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキルオキシカルボニル基とは、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−プロピルオキシカルボニル基、ｉ−プロピルオキシカルボニル基、ｎ−ブトキシカルボニル基、ｉ−ブトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ｎ−へキシルオキシカルボニル基、シクロへキシルオキシカルボニル基、ｎ−オクチルオキシカルボニル基、ｎ−ドデシルオキシカルボニル基、オクタデシルオキシカルボニル基等が挙げられる。
Ｒ２１の置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルカルボニル基としては、例えば、ベンジルカルボニル基、２−フェニルエチルカルボニル基等が挙げられる。
Ｒ２１の置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状または分岐鎖状のアラルキルオキシカルボニル基としては、例えば、ベンジルオキシカルボニル基、２−フェニルエチルオキシカルボニル基等が挙げられる。
【０１２６】
前記カチオン性官能基がリジン誘導体結合基の場合、好ましくは、一般式（２１）で示されるリジン誘導体結合基であって、リジン（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルエステル基、リジン（Ｃ７〜Ｃ１０）アラルキルエステル基、リジン（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミド基及びリジン（Ｃ７〜Ｃ１０）アラルキルアミド基からなる群から選択される１種以上の基であることが好ましい。
【０１２７】
一般式（２）におけるＸ２ｂは、前記ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントの側鎖カルボキシ基と、前記アルギニン誘導体結合基及び／または前記リジン誘導体結合基を連結する結合基である。
該Ｘ２ｂで示される結合基としては、その両末端が、カルボキシ基及びアミノ基と結合する官能基を有する結合基であれば特に限定されるものではないが、例えば、―ＮＨ―(ＣＨ２)β’’―ＣＯ−、―ＮＨ―(ＣＨ２)β’’―ＮＨＣＯ−、―ＮＨ―(ＣＨ２)β’’―ＯＣＯ−、―Ｏ―(ＣＨ２)β’’―ＣＯ−、―Ｏ―(ＣＨ２)β’’―ＮＨＣＯ−、―Ｏ―(ＣＨ２)β’’―ＯＣＯ−、―Ｏ―(ＣＨ２)β’’―ＮＨ−、―ＮＨ―(ＣＨ２)２―ＳＳ−(ＣＨ２)２―ＮＨＣＯ−、―ＮＨ―(ＣＨ２)β’’―ＮＨ−、―ＮＨ―(ＣＨ２)β’’―Ｏ―、―Ｏ―(ＣＨ２)β’’―Ｏ−または―ＮＨ―(ＣＨ２)２―ＳＳ−(ＣＨ２)２―ＮＨ−等が挙げられる。ここで、β’’は１〜１２の整数であり、好ましくは４〜１２の整数であり、特に好ましくは６〜１２の整数である。なお、該Ｘ２ｂ「結合」であってよい。該「結合」とは、特にリンカー相当基を介せず、ブロック型ポリマーの側鎖カルボキシ基と、該アルギニン誘導体結合基及び／またはリジン誘導体結合基がアミド結合により直接結合していることを意味する。
【０１２８】
一般式（２）におけるＲ６ｂは、アルギニン誘導体結合基であることが好ましい。すなわち、一般式（２）におけるカチオン性官能基であるＲ６ｂは、好ましくは、前記一般式（１９）で示されるアルギニン誘導体結合基であって、アルギニン（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルエステル基、アルギニン（Ｃ７〜Ｃ１０）アラルキルエステル基、アルギニン（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルアミド基及びアルギニン（Ｃ７〜Ｃ１０）アラルキルアミド基からなる群から選択される１種以上の基であることが好ましい。その際、一般式（２）におけるＸ２ｂは、結合であることが好ましい。
【０１２９】
一般式（２）において、Ｒ７ｂは水酸基及び／または−Ｎ（Ｒ８ｂ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ｂ）である。該−Ｎ（Ｒ８ｂ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ｂ）において、Ｒ８ｂ及びＲ９ｂは同一でも異なっていてもよく、（Ｃ３〜Ｃ８）の分岐鎖状または環状のアルキル基、若しくは三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖状のアルキル基である。
該（Ｃ３〜Ｃ８）の分岐鎖状または環状のアルキル基としては、例えば、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、ネオペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられ、好ましくはイソプロピル基、シクロへキシル基が挙げられる。
該三級アミノ基で置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖状のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、２−ジメチルアミノエチル基、３−ジメチルアミノプロピル基、６−ジメチルアミノヘキシル基等が挙げられ、好ましくは、エチル基、３−ジメチルアミノプロピル基が挙げられる。
【０１３０】
前記Ｒ７ｂは水酸基及び／または−Ｎ（Ｒ８ｂ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ｂ）であるが、水酸基のみである場合、水酸基及び−Ｎ（Ｒ８ｂ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ｂ）が共存する場合、若しくは−Ｎ（Ｒ８ｂ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ｂ）のみである場合の態様を取り得る。水酸基と−Ｎ（Ｒ８ｂ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ｂ）の存在比率は任意に設定されてよい。
【０１３１】
一般式（２）のＲ７ｂは、水酸基であってよい。すなわち、一般式（２）の側鎖カルボキシ基に、前記Ｒ５ｂ、前記Ｒ６ｂ及び−Ｎ（Ｒ８ｂ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ｂ）の何れもが結合していないカルボキシ基が存在して良い。一般式（２）において、Ｒ７ｂが水酸基である場合、側鎖カルボン酸の遊離酸型で示されている。しかしながら、側鎖カルボン酸のアルカリ金属塩型、アルカリ土類金属塩型、アンモニウム塩型の形態も取り得て良く、これらの塩態様も含まれるものである。アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩の塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩が挙げられる。
また、本核酸送達用組成物が非経口投与にて供せられる場合、医薬品として許容される溶解液にて溶液調製されるが、Ｒ７ｂが水酸基である場合の側鎖カルボン酸は、その溶液のｐＨ及び緩衝溶液の塩の有無に依存した側鎖カルボン酸塩の態様を取り得てよい。
【０１３２】
一般式（２）のＲ１０は、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基とは、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ネオペンチル基、ｎ−へキシル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ヘキサデシル基、ｎ−オクタデシル基、イソオクチル基、イソデシル基、イソドデシル基、イソテトラデシル基、イソヘキサデシル基、イソオクタデシル基、t−オクチル基、ｔ−デシル基、ｔ−ドデシル基、ｔ−テトラデシル基、ｔ−ヘキサデシル基、ｔ−オクタデシル基等が挙げられる。
【０１３３】
一般式（２）は、ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントの側鎖カルボキシ基修飾体である。そのポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントとしては、側鎖カルボキシ基にＲ５ｂ、Ｒ６ｂ及びＲ７ｂが結合したユニット及び側鎖カルボン酸が分子内環化構造をとるユニットが存在する。これらの各ユニットは、それぞれ独立して、ランダムな配列にて存在したセグメント構造である。すなわち、該カルボキシ基にＲ５ｂ、Ｒ６ｂ及びＲ７ｂが結合したユニット並びに側鎖カルボン酸が分子内環化構造をとるユニットが、それぞれ任意の順番で配列した態様であってもよい。例えば、それぞれの構成単位が、局在化して偏局した配列の態様であっても良く、また、それぞれの構成単位に規則性がないランダム配列で構成されたポリマー構造であってもよく、つまり、その側鎖修飾体の配列順序において、特に規則性のない配列である。
【０１３４】
一般式（２）において、各アスパラギン酸ユニットまたはグルタミン酸ユニットの含量を示すｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓはそれぞれ独立して０〜２００の整数である。該二官能性ポリマー（Ｂ）のポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントの総重合数である（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、１０〜２００の整数である。好ましくは、重合数が１５〜１００である。
【０１３５】
疎水性官能基であるＲ５ｂが結合した総ユニット数である（ｍ＋ｎ）は必須の構成ユニットであり、該（ｍ＋ｎ）は１〜２００の整数である。好ましくは（ｍ＋ｎ）が３〜１００の整数である。より好ましくは、（ｍ＋ｎ）は３〜６０の整数である。
ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントの総重合数である（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）に対する、疎水性官能基であるＲ５ｂの含有総ユニット数である（ｍ＋ｎ）の存在比率は、５〜４５％であることが好ましい。より好ましくは、（ｍ＋ｎ）の全体ユニットに対する存在比率は、５〜４０％である。
【０１３６】
また、カチオン性官能基であるＲ６ｂが結合した総ユニット数である（ｏ＋ｐ）は、必須のユニットであり、（ｏ＋ｐ）は１〜２００の整数である。好ましくは（ｏ＋ｐ）が１０〜１５０の整数である。より好ましくは、（ｏ＋ｐ）は２０〜１００の整数である。
ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントの総重合数である（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）に対する、カチオン性官能基であるＲ６ｂの含有総ユニット数である（ｏ＋ｐ）の存在比率は、５０〜９０％であることが好ましい。より好ましくは、（ｏ＋ｐ）の全体ユニットに対する存在比率は５０〜８０％である。
Ｒ７ｂが結合したユニット及び側鎖カルボキシ基が分子内環化構造をとるユニットは、任意に存在して良く、その存在含量数を示すｑ、ｒ及びｓは、０〜２００の整数である。
側鎖カルボキシ基に、疎水性官能基であるＲ５ｂ及びカチオン性官能基であるＲ６ｂが結合していないユニット総数である（ｑ＋ｒ＋ｓ）は、ポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントの総重合数である（ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）に対して、０〜４０％である。好ましくは（ｑ＋ｒ＋ｓ）の存在比率は、２〜３０％である。
【０１３７】
次に本発明の二官能性ポリマー（Ｂ）の製造方法を開示する。
二官能性ポリマー（Ｂ）は、側鎖カルボキシ基に疎水性官能基及びカチオン性官能基を有するポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸であり、その製造方法は特に限定されるものではなく、公知の方法により製造することができる。例えば、側鎖カルボキシ基に前記官能基が導入された重合性アスパラギン酸モノマーまたは重合性グルタミン酸モノマーを、重合反応させることにより製造することができる。また、重合性アスパラギン酸モノマーまたは重合性グルタミン酸モノマーを、重合反応させて、ポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸を構築し、その後、側鎖カルボキシ基に、疎水性官能基及びカチオン性官能基を導入することで製造してもよい。
好ましくは、あらかじめポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸を構築し、その後、側鎖カルボキシ基に、適当な縮合反応条件により疎水性官能基及びカチオン性官能基をアミド結合様式及び／またはエステル結合様式にて反応させて、該二官能性ポリマー（Ｂ）を製造する方法を挙げることができる。縮合条件は、通常の有機合成反応で用いることができる方法を適宜使用することができる。
【０１３８】
ポリマー主鎖がポリアスパラギン酸である二官能性ポリマー（Ｂ）の合成方法の一態様を開示する。
適当な１級アミン化合物または１級アルコール化合物に、Ｎ−カルボニルアスパラギン酸無水物を順次反応させ、片末端に１級アミン結合残基または１級アルコール結合残基を有するポリアスパラギン酸誘導体を合成する。この場合、Ｎ−カルボニルアスパラギン酸無水物において、アスパラギン酸の側鎖カルボキシ基は、ベンジルエステル等の適当なカルボン酸保護基修飾体を用いることが好ましい。得られたポリアスパラギン酸誘導体は、更に任意に、もう一方の末端基（Ｎ末端）をアシル化してもよい。このポリアスパラギン酸誘導体の側鎖カルボキシ基の保護基を、適当な条件により脱保護基反応を行うことにより、二官能性ポリマー（Ｂ）の主鎖ポリマーとなるポリアスパラギン酸を得ることができる。脱保護反応としては、ポリアスパラギン酸側鎖がβ−ベンジルエステルの場合、アルカリ条件下での加水分解や、加水素分解反応により脱保護基反応をすることができる。
次に、このポリアスパラギン酸に対し、アミノ基及び／または水酸基を有する該カチオン性官能基含有化合物並びに該疎水性官能基含有化合物を、カルボジイミド脱水縮合剤等の縮合反応条件にて反応させればよい。この製造方法によれば、ポリアスパラギン酸に、一般式（２）のＲ７ｂに係る−Ｎ（Ｒ８ｂ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ｂ）基を同時に導入することができることから、有利な製造方法である。
該カルボジイミド脱水縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）等を用いることができる。該脱水縮合反応の際に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）等の反応補助剤を用いてもよい。
【０１３９】
本発明において、カチオン性官能基と疎水性官能基の導入量は、脱水縮合反応において、各官能基含有化合物の仕込み量を適宜増減させることで調整することができる。
なお、カルボジイミド縮合剤としてジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いた場合、前記−Ｎ（Ｒ８ｂ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ｂ）の、Ｒ８ｂ及びＲ９ｂはシクロへキシル基となる。ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）を用いて縮合反応を行った場合、Ｒ８ｂ及びＲ９ｂはイソプロピル基となる。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）を用いた場合、該−Ｎ（Ｒ８ｂ）ＣＯＮＨ（Ｒ９ｂ）のＲ８ｂ及びＲ９ｂは、エチル基と３−ジメチルアミノプロピル基の混合置換体となる。
前記反応終了後に任意の精製工程を経由して、本発明の二官能性ポリマー（Ｂ）を製造することができる。
主鎖ポリマーがポリグルタミン酸である二感応性ポリマー（Ｂ）の合成方法は、前述の合成例におけるＮ−カルボニルアスパラギン酸無水物に代えて、Ｎ−カルボニルグルタミン酸無水物を用いてポリグルタミン酸を含む該共重合体を得て、その後、該カチオン性官能基含有化合物並びに該疎水性官能基含有化合物を導入させれば、主鎖ポリマーがポリグルタミン酸の二官能性ポリマー（Ｂ）を合成することができる。
【０１４０】
［核酸送達用組成物について］
本発明は、ブロック型コポリマー（Ａ）と、二官能性ポリマー（Ｂ）を混合して用いることを特徴とする核酸輸送用組成物に関する。
前記（Ａ）及び（Ｂ）の両者の混合比率は特に限定されず、任意に設定され得るものである。両者の混合比率を規定するに当たり、前記ブロック型コポリマー（Ａ）のカチオン性官能基の含有モル当量（ＡＮ）と、前記二官能性ポリマー（Ｂ）のカチオン性官能基の含有モル当量（ＢＮ）の比率を指標とすることが好ましい。
【０１４１】
本発明に当たり、前記ブロック型コポリマー（Ａ）と前記二官能性ポリマー（Ｂ）は、前記二官能性ポリマー（Ｂ）のカチオン性官能基の含有モル当量（ＢＮ）が、カチオン性官能基総量（ＡＮ＋ＢＮ）に対する百分率（Ｂ％）として、３０〜８０％であることが好ましい。より好ましくは、４０〜８０％である。Ｂ（％）を前記範囲内に設定することで、核酸分解酵素に対する安定性と細胞内導入効果が両立される優れた核酸送達用組成物を得ることが可能となる。
本発明において、Ｂ（％）を前記範囲内に収めることでこのような効果が得られる理由は明らかではないが、Ｂ（％）を前記範囲内に収めることで、調製される粒子が十分な量のポリエチレングリコールにより被覆され、核酸分解酵素に対する核酸安定性を高める。一方で、形成された粒子表面に、カチオン性官能基や疎水性官能基が配向して、該粒子表面電荷（ゼータ電位により示される）がプラスに荷電し、細胞に認識されやすくなることで細胞内導入効果が高められるものと推測される。このような理由から、本発明の核酸送達用組成物は核酸分解酵素に対する核酸安定性と、核酸の細胞内導入効果を両立できたものと予測される。
【０１４２】
なお、本発明において、前記ブロック型コポリマー（Ａ）及び前記二官能性ポリマー（Ｂ）の各ポリマー構造の組み合せは、特に限定されることなく用いて良い。しかしながら、該（Ａ）のポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントと、該（Ｂ）のポリアスパラギン酸構造またはポリグルタミン酸構造が、類似の化学構造である該（Ａ）及び該（Ｂ）の組み合わせて用いることが好ましい。すなわち、該（Ａ）がポリアスパラギン酸セグメントを含有するブロック型コポリマー（Ａ）を用いた場合、該（Ｂ）としてポリアスパラギン酸誘導体である二官能性ポリマー（Ｂ）であることが好ましい。逆に該（Ａ）がポリグルタミン酸セグメントを含有するブロック型コポリマー（Ａ）を用いた場合、該（Ｂ）はポリグルタミン酸誘導体である二官能性ポリマー（Ｂ）であることが好ましい。
【０１４３】
また、該（Ａ）の疎水性官能基及びカチオン性官能基と、該（Ｂ）の疎水性官能基及びカチオン性官能基も類似構造の官能基を、用いることが好ましい。すなわち、該（Ａ）が疎水性官能基として、炭素数（Ｃ４〜２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基を用い、カチオン性官能基として、アルギニン誘導体結合基を用いた場合、該（Ｂ）も炭素数（Ｃ４〜２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基及びアルギニン誘導体を具備する二官能性ポリマー（Ｂ）とすることが好ましい。すなわち、該（Ａ）及び該（Ｂ）における疎水性官能基及びカチオン性官能基は、各官能基の同じ群同士の組み合せで用いることが好ましい。
【０１４４】
該（Ａ）のポリアスパラギン酸セグメントまたはポリグルタミン酸セグメントと、該（Ｂ）のポリアスパラギン酸構造またはポリグルタミン酸構造が、類似の化学構造が類似である組み合わせとすることで、該（Ａ）と該（Ｂ）の相同性が高くなるため、核酸輸送用組成物として複合体形成が有利となるため好ましい。
【０１４５】
本発明の核酸送達用組成物は、ブロック型コポリマー（Ａ）及び二官能性ポリマー（Ｂ）の他、薬学的に許容される添加剤を加えてもよい。例えば、医薬製剤の様々な製剤型に調製するため、通常使用されている薬学的に許容される担体を添加して用いてもよい。担体としては、例えば、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、溶剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、保存剤、無痛化剤、色素、香料等を使用することができる。
【０１４６】
使用する製剤型としては、注射剤、点滴剤としての使用が望まれ、塩化ナトリウムや緩衝用塩、ブドウ糖、乳糖、マンニトール等の糖類。水溶性セルロース類、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等の水溶性高分子、水、グリセロール、エタノール、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン、ポリエチレングリコール、クレモフォア等の水溶性有機溶媒等を添加することができる。
【０１４７】
本発明は、前記ブロック型コポリマー（Ａ）及び前記二官能性ポリマー（Ｂ）を含む核酸送達用組成物として使用するものである。すなわち、該核酸送達用組成物を含み、任意の添付文書を一体に包装したキットとして用いてもよい。
該核酸送達用組成物を含むキットは、該ブロック型コポリマー（Ａ）及び該二官能性ポリマー（Ｂ）を任意の混合比率で併せて一体に充填した態様であって良く、若しくはそれぞれを別に充填しており、使用時に混合して用いる態様であって良い。その際、該ブロック型コポリマー（Ａ）及び該二官能性ポリマー（Ｂ）は、任意の添加剤や溶剤と共に充填されていて良い。
【０１４８】
［核酸（Ｃ）を含有させた核酸含有組成物について］
本発明は、前記ブロック型コポリマー（Ａ）と前記二官能性ポリマー（Ｂ）を混合し、核酸（Ｃ）を含有させた核酸含有組成物として用いることができる。該核酸含有組成物は、核酸分子を標的組織に送達し、細胞内に導入することができる。すなわち本発明は、生理活性機能性を有する核酸を、生体内の様々な核酸分解因子を回避して標的組織まで送達し、該核酸を標的細胞に導入し、細胞質へ放出させることにより、該核酸分子を機能発揮させるための核酸送達キャリアを包含するとともに、該核酸分子を含有する核酸医薬組成物を含む。
【０１４９】
本発明において、用いられる核酸（Ｃ）は特に制限されず、ＤＮＡ、ＲＮＡ、天然または非天然の核酸誘導体（例えばペプチド核酸等）、改変核酸、修飾核酸等が挙げられるが、何れであってもよい。また、該核酸（Ｃ）としては、一本鎖状態の核酸であっても、二本鎖形成状態の核酸であってもよい。但し、該核酸（Ｃ）としては、生体内に送達され、生体、組織、細胞等に対して何らかの生理活性作用を及ぼし得る機能性核酸であることが好ましい。
機能性核酸としては、プラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、デコイ核酸、リボザイム、ＤＮＡ酵素、各種抑制遺伝子（癌抑制遺伝子等）、機能性の改変核酸、修飾核酸等が挙げられる。
該修飾核酸としては、例えば、核酸のリン酸部分がホスホロチオエート、メチルホスホナート、ホスフェートトリエステル、ホスホロアミデート等に改変された核酸や、高分子ミセル安定化等の用途に向けて、コレステロールやビタミンＥ等の疎水性官能基が結合された核酸等を挙げることができる。
【０１５０】
用いる核酸（Ｃ）の種類は、その核酸の薬理活性を発揮させて、薬効を得るための目的や用途に応じて、適宜選択することができる。
例えば、プラスミドＤＮＡとしては、標的組織の細胞において所望の機能を発揮し得るものであれば良い。斯かるプラスミドＤＮＡは種々のものが知られており、核酸送達用組成物の用途に応じて所望のプラスミドＤＮＡを選択することが可能である。
また、ＲＮＡとしては、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用して目的の遺伝子発現を抑制し得るものであれば良い。ＲＮＡ干渉の目的遺伝子としては、癌（腫瘍）遺伝子、抗アポトーシス遺伝子、細胞周期関連遺伝子、増殖シグナル遺伝子等が好ましく挙げられる。またＲＮＡの塩基長については限定されないが、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡを用いることが好ましい。
本発明において、該核酸（Ｃ）は、特にＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有するＲＮＡを用いることが好ましく、特に好ましくは、塩基長が１０〜３０塩基の短鎖ＲＮＡであるｓｉＲＮＡを用いることを挙げることができる。
【０１５１】
本発明において、ブロック型コポリマー（Ａ）と二官能性ポリマー（Ｂ）を含有する核酸送達用組成物に、核酸（Ｃ）を添加して核酸含有組成物を調製する場合、これらの構成成分の相互作用による複合体を形成させて用いることが好ましい。すなわち、アニオン性荷電体である核酸（Ｃ）と、カチオン性荷電体であるブロック型コポリマー（Ａ）及び二官能性ポリマー（Ｂ）が、静電相互作用により会合し、更に疎水性官能基を共に有するブロック型コポリマー（Ａ）と二官能性ポリマー（Ｂ）が疎水性相互作用により会合することにより、これらの構成成分が相互作用による複合体を形成することを指向する。
該核酸含有組成物としては、前記複合体が形成される条件であれば特に制限なく使用できるが、該核酸送達用組成物と核酸（Ｃ）は適当な混合比率で用いることが好ましい。前記混合比率としては、ブロック型コポリマー（Ａ）と二官能性ポリマー（Ｂ）を含有する核酸送達用組成物の総カチオン数（Ｎ値）と、核酸（Ｃ）の総アニオン数（Ｐ値）の比で規定されるＮ／Ｐ比にて表すことが好ましい。
【０１５２】
本発明の核酸含有組成物において、このＮ／Ｐ比は特に限定されるものではないが、Ｎ／Ｐ比が１〜１００の範囲で用いることが好ましい。より好ましくはＮ／Ｐ比は１〜５０、特に好ましくは１〜３０の範囲である。Ｎ／Ｐ比を前記範囲内に収めることで、核酸分解酵素に対する安定性と、細胞内導入率の向上効果の両立が達成され、優れた核酸送達用組成物を得ることが可能となる。
本発明において、Ｎ／Ｐ比を前記範囲内に収めることでこのような効果が得られる理由は明らかではないが、Ｎ／Ｐ比を前記範囲内に収めることで、調製される複合体を十分な量のポリエチレングリコールセグメントが被覆し、核酸分解酵素に対する核酸安定性を高める。一方で、形成された複合体表面にカチオン性官能基や疎水性官能基が配向して、該粒子表面電荷（ゼータ電位で計測される）がプラスに荷電し、細胞に認識されやすくなることで細胞内導入効果が高められるものと推測される。このような理由から、本発明の核酸送達用組成物は核酸分解酵素に対する核酸安定性と、核酸の細胞内導入効果を両立できたものと予測される。
【０１５３】
前記核酸含有組成物の調製方法としては、特に限定されるものではなく、ブロック型コポリマー（Ａ）、二官能性ポリマー（Ｂ）及び核酸（Ｃ）を、適当な溶剤を用いて混合することで調製することができる。この際、更に、任意の添加剤を添加してもよい。例えば、ブロック型コポリマー（Ａ）の溶液と二官能性ポリマー（Ｂ）の溶液を混合して得られた組成物溶液に、更に核酸（Ｃ）を加えて混合すればよい。調製された核酸含有組成物溶液は、更に希釈、撹拌、超音波照射、透析、濃縮等の操作を適宜付加してもよい。
前記調製方法において、用いる溶媒は特に限定されるものではなく、水、エタノールやＤＭＳＯを含む有機溶媒、更には有機溶媒と水の含水溶媒であってもよい。水としては、通常、水や生理食塩水、グルコース水溶液、ＰＢＳやＨＥＰＥＳ等の緩衝液等を用いることができる。
【０１５４】
また、各成分の溶液及びそれら混合液のｐＨは、粒子形成能を阻害しない範囲で適宜調整することが可能である。好ましくはｐＨ５〜９、より好ましくはｐＨ６．５〜８．０である。ｐＨの調整は、溶媒として緩衝液を使用することで、容易に行うことができる。各成分の溶液及びそれら混合液の緩衝液の塩濃度は、粒子形成能を阻害しない範囲で適宜調整することが可能であるが、好ましくは１ｍＭ〜３００ｍＭ、より好ましくは５ｍＭ〜１５０ｍＭである。
【０１５５】
前記調製方法において、各成分の溶液調製時及びそれら混合時における温度は、ポリマーの溶解度を勘案して設定することが好ましい。具体的には、通常、０℃以上であり、好ましくは６０℃以下である。
前記調製方法において、混合液を静置して平衡化する時間を設けてもよい。平衡化の具体的な条件としては、０℃〜６０℃で、５０時間以内の静置が好ましい。Ｂ％が高い場合には、静置時間に伴い粒子径が増大する傾向にあるので、平衡化しない場合があってもよい。
【０１５６】
本発明の核酸含有組成物は、各種疾患の原因となる細胞または組織を標的として、所望の核酸を送達し、細胞内へ導入する治療（遺伝子治療）に用いることができる。すなわち、当該核酸含有組成物は、核酸医薬として用いることができる。
本核酸含有組成物による治療対象となる疾患としては特に限定されるものではないが、癌（例えば肺癌、腎臓癌、脳腫瘍、肝癌、乳癌、大腸癌、神経芽細胞腫及び膀胱癌等）、循環器疾患、運動器疾患及び中枢系疾患等が挙げられる。
本発明の核酸含有組成物には、薬剤製造において一般に使用されるその他の成分を含んでもよい。その他の例としては、賦形剤、増量剤、充填剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤及び等張化剤などが挙げられる。斯かるその他の成分は１成分を単独で使用しても、２種以上を任意の組み合わせ及び比率で混合してもよい。これらその他の成分の種類や使用量等の詳細は、医薬組成物の目的、用途、使用方法等に応じて、当業者であれば適宜決定することが可能である。
本発明において、核酸含有組成物の形態も任意であるが、通常は静脈内注射剤（点滴を含む）が採用され、例えば単位投与量アンプルまたは多投与量容器の状態等で提供される。
【０１５７】
本発明において、核酸含有組成物の使用方法としては、インビトロまたはインビボにおいて標的細胞または組織と接触させることにより、標的細胞または組織に核酸を送達する。インビトロにおいて好ましい接触方法としては、培養前の培地に予め添加するリバーストランスフェクション法、培養中の培地に後から添加するフォワードトランスフェクション法が挙げられる。またインビボにおいて好ましい接触方法としては、局所投与や血中投与等が挙げられる。これらの使用方法により、標的細胞へ、核酸分子を導入することができ、該核酸分子の生理活性機能を効率的に発揮させることができる。
【実施例】
【０１５８】
以下、本発明を実施例により更に説明する。ただし、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
核酸分子として、ｓｉＣＯＮ（ランダム配列（分子量約１３Ｋ）、ｓｉＲＮＡ濃度１００μＭのＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７）；北海道システムサイエンス社製）、ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ（ルシフェラーゼコードの蛍光標識体（分子量約１３Ｋ）、ｓｉＲＮＡ濃度１００μＭのＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７）；北海道システムサイエンス社製）を用いた。
また本発明品及び比較例において、水溶液中で構成する会合体の平均粒子径及びゼータ電位の測定は、動的光散乱法（ゼータサイザーナノ−ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ社製）にて測定した。
実施化合物中の、特にポリマー組成は以下のアミノ酸分析法より定量した。
方法：ＮｅｘｅｒａオートサンプラＳＩＬ―３０ＡＣによる自動プレカラム誘導体化アミノ酸分析（島津製作所）
機種：島津ＨＰＬＣ（Ｎｅｘｅｒａ）システム
オートサンプラ：ＳＩＬ―３０ＡＣ
検出条件：分光蛍光検出器ＲＦ−２０ＡＸＳ
Ｅｘ．：３５０  ｎｍ、Ｅｍ．：４５０  ｎｍ
カラム：ＹＭＣ  Ｔｒｉａｒｔ  Ｃ１８  １．９ｍｍ
（３．０ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×７５ｍｍ  Ｌ．）
移動相Ａ：２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．９）
移動相Ｂ：アセトニトリル／メタノール／水＝４５／４０／１５（vol/vol/vol）
グラディエント：移動相Ｂ濃度（時間）１１％（０分）  １３％（３．０分）  ３１％（５．０分）  ３７％（７．５分）  ７０％（１０．０分）  １００％（１０．０１分）  １００％（１３．０分）  １１％（１３．０１分）  ｓｔｏｐ（１５．０分）
流量：０．８  ｍＬ／ｍｉｎ【０１５９】
［合成例１］  ｔ−ブトキシカルボニルヒスチジン  ｎ−オクチルアミド（Ｂｏｃ−Ｈｉｓ−Ｏｃｔｙ）の合成
ｔ−ブトキシカルボニルヒスチジン（Ｂｏｃ−Ｈｉｓ−ＯＨ）  ９８３ｍｇをＤＭＳＯ  ３４ｍＬに溶解し、室温にてｎ−オクチルアミン  ４５０ｍｇ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）  ５３９ｍｇ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）  ９０５ｍｇを加え、室温にて一夜撹拌した。反応終了後、氷浴中で反応物にクロロホルム  １００ｍＬを加えて、重曹水  １００ｍＬで洗浄し、次いで蒸留水  １００ｍＬで洗浄し、抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウムを濾去後、減圧下にて溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９：１）で精製し、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ−Ｏｃｔｙｌを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ、ＴＭＳ）ｐｐｍ：０．９２（３Ｈ、ｔ）、１．３０〜１．５０（２１Ｈ、ｍ）、２．８０（１Ｈ、ｄｄ）、３．００（１Ｈ、ｄｄ）、３．１５（２Ｈ、ｍ）、４．２０（１Ｈ、ｔ）、６．８６（１Ｈ、ｓ）、７．６０（１Ｈ、ｓ）【０１６０】
［合成例２］  ヒスチジン  ｎ−オクチルアミド・２塩酸塩（Ｈ−Ｈｉｓ−Ｏｃｔｙｌ・２ＨＣｌ）の合成
氷浴中、合成例１で得たＢｏｃ−Ｈｉｓ−Ｏｃｔｙｌ  ０．８０ｇを、４Ｎ−ＨＣｌ／ジオキサン  ２０ｍＬに加え、室温で１時間撹拌した。反応終了後、減圧下にてＨＣｌ／ジオキサンを留去し、減圧乾燥を行うことでＨ−Ｈｉｓ−Ｏｃｔｙｌ・２ＨＣｌを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ、ＴＭＳ）ｐｐｍ：０．７５（３Ｈ、ｔ）、０．９９〜１．３０（１２Ｈ、ｍ）、２．９５〜３．２７（４Ｈ、ｍ）、４．０８（１Ｈ、ｔ）、７．３１（１Ｈ、ｓ）、８．５８（１Ｈ、ｓ）【０１６１】
［合成例３］  ｔ−ブトキシカルボニルヒスチジン  ｎ−オクタデシルアミド（Ｂｏｃ−Ｈｉｓ−Ｓｔｅａｒｙｌ）の合成
Ｂｏｃ−Ｈｉｓ−ＯＨ  １．５７ｇをＤＭＦ  ６０ｍＬに溶解し、室温にてステアリルアミン  １．３５ｇ、ＨＯＢｔ  ９３５ｍｇ、ＷＳＣ  １．３７ｇを加え、室温にて一夜撹拌した。反応終了後、氷浴中で反応物にクロロホルム  １８０ｍＬを加えて、重曹水  ２４０ｍＬで洗浄し、次いで蒸留水  ２４０ｍＬで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウムを濾去後、減圧下にて溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９：１）で精製し、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ−Ｓｔｅａｒｙｌを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、ＴＭＳ）ｐｐｍ：０．８８（３Ｈ、ｔ）、１．２３〜１．４５（４１Ｈ、ｍ）、２．９５（１Ｈ、ｄｄ）、３．１７（３Ｈ、ｍ）、４．３７（１Ｈ、ｓ）、６．８４（１Ｈ、ｓ）、７．５５（１Ｈ、ｓ）【０１６２】
［合成例４］  ヒスチジン  ｎ−オクタデシルアミド・２塩酸塩（Ｈ−Ｈｉｓ−Ｓｔｅａｒｙｌ・２ＨＣｌ）の合成
氷浴中、合成例３で得たＢｏｃ−Ｈｉｓ−Ｓｔｅａｒｙｌ  １．９３ｇを４Ｎ−ＨＣｌ／ジオキサン  ４０ｍＬに加え、室温で１時間撹拌した。反応終了後、減圧下にてＨＣｌ／ジオキサンを留去し、減圧乾燥を行うことでＨ−Ｈｉｓ−Ｓｔｅａｒｙｌ・２ＨＣｌを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ、ＴＭＳ）ｐｐｍ：０．８９（３Ｈ、ｔ）、１．２３〜１．５０（３１Ｈ、ｍ）、３．１７〜３．３０（４Ｈ、ｍ）、４．２３（１Ｈ、ｔ）、７．５０（１Ｈ、ｓ）、８．９３（１Ｈ、ｓ）【０１６３】
［合成例５］  分子量１２，０００のメトキシポリエチレングリコールセグメントと重合数が４３のポリアスパラギン酸セグメントが連結したブロック共重合体；ＰＥＧ１２Ｋ−Ａｓｐ４３−Ａｃ（ブロック型コポリマー（Ａ）の前駆体）の合成
特開平６−２０６８１５号公報に記載の方法に準じて、ブロック型コポリマー（Ａ）の前駆体であるＰＥＧ１２Ｋ−Ａｓｐ４３−Ａｃの合成を行った。
分子量１２，０００の片末端がメトキシ基でもう片末端がアミノ基であるメトキシペグアミン（ＭＥＰＡ、（株）日油製）にβ−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸−Ｎ−カルボキシ無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ、（株）日油製）を４５当量反応させた後、無水酢酸を反応させ、分子量１２，０００のメトキシポリエチレングリコールセグメントと、重合数が４３のポリアスパラギン酸ベンジルエステルセグメントが連結したブロック型共重合体を得た。これを、アルカリ加水分解することで、ブロック型コポリマー（Ａ）の前駆体であるＰＥＧ１２Ｋ−Ａｓｐ４３−Ａｃ（分子量１２，０００のメトキシポリエチレングリコールセグメントと、重合数が４３のポリアスパラギン酸セグメントが連結したブロック共重合体）を合成した。【０１６４】
［合成例６］  ブロック型コポリマー（Ａ−１）（一般式（１）において、Ｒ１＝メチル基、Ｒ２＝トリメチレン基、Ｒ３ａ＝メチレン基、Ｒ４ａ＝アセチル基、Ｒ５ａ＝ｎ−オクチル基、Ｒ６ａ＝アルギニルメチルエステル基、Ｘ１ａ＝ヒスチジニル基、Ｘ２ａ＝結合、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＝４３、ｔ＝２７３）の合成
合成例５で得たＰＥＧ１２Ｋ−Ａｓｐ４３−Ａｃ  １９６ｍｇをＤＭＦ  ５ｍＬに溶解し、３５℃にて１５分撹拌した。その後、２５℃にて、アルギニンメチルエステル（Ｈ−Ａｒｇ−ＯＭｅ、国産化学製）  ７９ｍｇ、及び合成例２で得たＨ−Ｈｉｓ−Ｏｃｔｙｌ・２ＨＣｌ  ６９ｍｇを加え、これにジイソプロピルエチルアミン  ３４０μＬを加えた。その後、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム  塩化物（ＤＭＴ−ＭＭ）  ３０４ｍｇを加え、２５℃にて一夜撹拌した。
反応終了後、反応液をジイソプロピルエーテル/エタノール（８０/２０（ｖ/ｖ）、５０ｍＬ）の混合溶媒に滴下析出後、沈析物を濾取し、ジイソプロピルエーテル／エタノール（８０／２０（ｖ／ｖ）、１００ｍＬ）で洗浄した。得られた沈析物をアセトニトリル／水（１／１（ｖ／ｖ）、６ｍＬ）に溶解後、アセトニトリル／水（１／１（ｖ／ｖ）、１Ｌ）を外液とし、分子量カット１４，０００の透析膜を使用して透析を行った。透析終了後、アセトニトリルを減圧留去し、凍結乾燥して目的化合物であるブロック型コポリマー（Ａ−１）を得た。
アミノ酸分析法により該ブロック型コポリマー（Ａ−１）中に含まれる各官能基導入量を定量したところ、Ａｒｇ−ＯＭｅ官能基が２５．８個（５９．６％）、Ｈｉｓ−Ｏｃｔｙｌ官能基９．９個（２２．９％）であった。【０１６５】
［合成例７］  ブロック型コポリマー（Ａ−２）（一般式（１）において、Ｒ１＝メチル基、Ｒ２＝トリメチレン基、Ｒ３ａ＝メチレン基、Ｒ４ａ＝アセチル基、Ｒ５ａ＝オクタデシル基、Ｒ６ａ＝アルギニルメチルエステル基、Ｘ１ａ＝ヒスチジニル基、Ｘ２ａ＝結合、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＝４３、ｔ＝２７３）の合成
合成例５で得たＰＥＧ１２Ｋ−Ａｓｐ４３−Ａｃ  １９６ｍｇをＤＭＦ  ５ｍＬに溶解し、３５℃にて１５分撹拌した。その後、２５℃にてＨ−Ａｒｇ−ＯＭｅ（国産化学製）  １０５ｍｇ及び合成例４で得たＨ−Ｈｉｓ−Ｓｔｅａｒｙｌ・２ＨＣｌ  ５０ｍｇを加え、これにジイソプロピルエチルアミン  ３４０μＬを加えた。その後、ＤＭＴ−ＭＭ  ３０４ｍｇを加え、２５℃にて一夜撹拌した。
反応終了後、反応液をジイソプロピルエーテル/エタノール（８０/２０（ｖ/ｖ）、５０ｍＬ）の混合溶媒に滴下析出後、沈析物を濾取し、ジイソプロピルエーテル／エタノール（８０／２０（ｖ／ｖ）、１００ｍＬ）で洗浄した。得られた沈析物をアセトニトリル／水（１／１（ｖ／ｖ）、６ｍＬ）に溶解後、アセトニトリル／水（１／１（ｖ／ｖ）、１Ｌ）を外液とし、分子量カット１４，０００の透析膜を使用して透析を行った。透析終了後、アセトニトリルを減圧留去し、凍結乾燥してブロック型コポリマー（Ａ−２）を得た。
アミノ酸分析法により該ブロック型コポリマー（Ａ−１）中に含まれる各官能基導入量を定量したところ、Ａｒｇ−ＯＭｅ官能基が３２．１個（７４．４％）、Ｈｉｓ−Ｓｔｅａｒｙｌ官能基が３．５個（８．１％）であった。【０１６６】
［合成例８］  ブロック型コポリマー（Ａ−３）（一般式（１）において、Ｒ１＝メチル基、Ｒ２＝トリメチレン基、Ｒ３ａ＝メチレン基、Ｒ４ａ＝アセチル基、Ｒ５ａ＝オクタデシル基、Ｒ６ａ＝アルギニルメチルエステル基、Ｘ１ａ＝ヒスチジニル基、Ｘ２ａ＝結合、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＝４３、ｔ＝２７３）の合成
合成例５で得たＰＥＧ１２Ｋ−Ａｓｐ４３−Ａｃ  １９６ｍｇをＤＭＦ５ｍＬに溶解し、３５℃にて１５分撹拌した。その後、２５℃にてＨ−Ａｒｇ−ＯＭｅ（国産化学製）  ８０ｍｇ及び合成例４で得たＨ−Ｈｉｓ−Ｓｔｅａｒｙｌ・２ＨＣｌ  ９８ｍｇを加え、更にジイソプロピルエチルアミン  ３４０μＬを加えった。その後、ＤＭＴ−ＭＭ  ３０４ｍｇを加え、２５℃にて一夜撹拌した。
反応終了後、反応液をジイソプロピルエーテル/エタノール（８０/２０（ｖ/ｖ）、５０ｍＬ）の混合溶媒に滴下析出後、沈析物を濾取し、ジイソプロピルエーテル／エタノール（８０／２０（ｖ／ｖ）、１００ｍＬ）で洗浄した。得られた沈析物をアセトニトリル／水（１／１（ｖ／ｖ）、６ｍＬ）に溶解後、アセトニトリル／水（１／１（ｖ／ｖ）、１Ｌ）を外液とし、分子量カット１４，０００の透析膜を使用して透析を行った。透析終了後、アセトニトリルを減圧留去し、凍結乾燥してブロック型コポリマー（Ａ−３）を得た。
アミノ酸分析法により該ブロック型コポリマー（Ａ−３）中に含まれる各官能基導入量を定量したところ、Ａｒｇ−ＯＭｅ官能基が２８．０個（６４．９％）、Ｈｉｓ−Ｓｔｅａｒｙｌ官能基が５．５個（１２．８％）であった。【０１６７】
合成例６〜８で合成したブロック型コポリマー（Ａ）の導入官能基の組成を表１にまとめた。【０１６８】
【表１】
0006513635.tif 000020
【０１６９】
［合成例９］  ｎ−ブチルアミン−ポリアスパラギン酸−アセチル（ポリアスパラギン酸の重合数３３）の合成
ｎ−ブチルアミン  ５０．３ｍｇのＤＭＳＯ３６ｍＬ溶液に、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ、（株）日油製）６．０ｇ（ｎ−ブチルアミンに対して３５当量）を添加し、３０℃で一晩反応させた。
反応終了後、反応液をジイソプロピルエーテル/エタノール（８０/２０（ｖ/ｖ）、７５０ｍＬ）の混合溶媒に滴下析出後、上澄みを除去した。ジイソプロピルエーテル/エタノール（８０/２０（ｖ/ｖ）、７５０ｍＬ）で希釈し、沈析物を濾取し、ジイソプロピルエーテル/エタノール（８０/２０（ｖ/ｖ）、２００ｍＬ）で洗浄して減圧乾燥することでｎ−ブチルアミン−ポリアスパラギン酸ベンジルエステルを得た。
得られたｎ−ブチルアミン−ポリアスパラギン酸ベンジルエステル  ４．３ｇを１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＩ）５０ｍＬに溶解し、無水酢酸  ２．１５ｍＬを添加し、５０℃で４．５時間反応させた。
反応終了後、反応液を室温冷却してジイソプロピルエーテル/エタノール（８０/２０（ｖ/ｖ）、１２５０ｍＬ）の混合溶媒に滴下析出後、上澄みを除去した。ジイソプロピルエーテル/エタノール（９０/１０（ｖ/ｖ）、１１２５ｍＬ）で希釈して沈析物を濾取し、ジイソプロピルエーテル/エタノール（８０/１０（ｖ/ｖ）、１２５ｍＬ）で洗浄して減圧乾燥することでｎ−ブチルアミン−ポリアスパラギン酸ベンジルエステル−アセチルを得た。
得られたｎ−ブチルアミン−ポリアスパラギン酸ベンジルエステル−アセチル  ４．０ｇをアセトニトリル４０ｍＬに溶解し、０．２Ｎ−ＮａＯＨ水溶液  １００ｍＬ加えて撹拌した。２４時間後、０．２Ｎ−ＮａＯＨを２５ｍＬ加え、３時間撹拌し、濃縮した。濃縮液をカチオン交換樹脂（ムロマック（Ｈ＋））カラムに通して、その溶出液を凍結乾燥してｎ−ブチルアミン−ポリアスパラギン酸−アセチル（ポリアスパラギン酸の重合数３３）を得た。【０１７０】
［合成例１０］  二官能性ポリマー（Ｂ−１）（一般式（２）において、Ｒ１０＝ｎ−ブチル基、Ｒ３ｂ＝メチレン基、Ｒ４ｂ＝アセチル基、Ｒ５ｂ＝ｎ−オクチル基、Ｒ６ｂ＝アルギニルメチルエステル基、Ｘ１ｂ＝ヒスチジニル基、Ｘ２ｂ＝結合、ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ＝３３）の合成
合成例９で得たｎ−ブチルアミン−ポリアスパラギン酸（アスパラギン酸の重合数３３）  １１９ｍｇをＤＭＦ１０ｍＬに溶解し、３５℃にて１５分撹拌した。２５℃にてＨ−Ａｒｇ−ＯＭｅ（国産化学製）  １５７ｍｇ及び合成例２で得たＨ−Ｈｉｓ−Ｏｃｔｙｌ・ＨＣｌ  １３５ｍｇを加え、これにジイソプロピルエチルアミン  ６４０μＬを加えた。その後、ＤＭＴ−ＭＭ  ５８８ｍｇを加え、２５℃にて一夜撹拌した。
反応終了後、反応液をジイソプロピルエーテル/エタノール（８０/２０（ｖ/ｖ）、１００ｍＬ）の混合溶媒に滴下析出後、沈析物を濾取し、ジイソプロピルエーテル／エタノール（８０／２０（ｖ／ｖ）、１００ｍＬ）で洗浄した。得られた沈析物をアセトニトリル／水（１／１（ｖ／ｖ）、６ｍＬ）に溶解後、アセトニトリル／水（１／１（ｖ／ｖ）、２Ｌ）を外液とし、分子量カット３，５００の透析膜を使用して透析を行った。透析終了後、アセトニトリルを減圧留去し、凍結乾燥して二官能性ポリマー（Ｂ−１）を得た。
アミノ酸分析法により該二官能性ポリマー（Ｂ−１）中に含まれる各官能基導入量を定量したところ、Ａｒｇ−ＯＭｅ官能基が１８．９個（５８．２％）、Ｈｉｓ−Ｏｃｔｙｌ官能基が６．３個（１９．２％）であった。【０１７１】
［合成例１１］  二官能性ポリマー（Ｂ−２）（一般式（２）において、Ｒ１０＝ｎ−ブチル基、Ｒ３ｂ＝メチレン基、Ｒ４ｂ＝アセチル基、Ｒ５ｂ＝オクタデシル基、Ｒ６ｂ＝アルギニルメチルエステル基、Ｘ１ｂ＝ヒスチジニル基、Ｘ２ｂ＝結合、ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ＝３３）の合成
合成例９で得たｎ−ブチルアミン−ポリアスパラギン酸（アスパラギン酸の重合数３３）  １１９ｍｇをＤＭＦ１０ｍＬに溶解し、３５℃にて１５分撹拌した。２５℃にてＨ−Ａｒｇ−ＯＭｅ（国産化学製）  ２０９ｍｇ及び合成例４で得たＨ−Ｈｉｓ−Ｓｔｅａｒｙｌ・ＨＣｌ  ９９ｍｇを加え、これにジイソプロピルエチルアミン  ６４０μＬを加えた。その後、ＤＭＴ−ＭＭ  ５８８ｍｇを加え、２５℃にて一夜撹拌した。
反応終了後、反応液をジイソプロピルエーテル/エタノール（８０/２０（ｖ/ｖ）、１００ｍＬ）の混合溶媒に滴下析出後、沈析物を濾取し、ジイソプロピルエーテル／エタノール（８０／２０（ｖ／ｖ）、１００ｍＬ）で洗浄した。得られた沈析物をアセトニトリル／水（１／１（ｖ／ｖ）、６ｍＬ）に溶解後、アセトニトリル／水（１／１（ｖ／ｖ）、２Ｌ）を外液とし、分子量カット３，５００の透析膜を使用して透析を行った。透析終了後、アセトニトリルを減圧留去し、凍結乾燥して二官能性ポリマー（Ｂ−２）を得た。
アミノ酸分析法により該二官能性ポリマー（Ｂ−２）中に含まれる各官能基導入量を定量したところ、Ａｒｇ−ＯＭｅ官能基が２５．２個（７７．５％）、Ｈｉｓ−Ｓｔｅａｒｙｌ官能基が１．８個（５．５％）であった。【０１７２】
［合成例１２］  二官能性ポリマー（Ｂ−３）（一般式（２）において、Ｒ１０＝ｎ−ブチル基、Ｒ３ｂ＝メチレン基、Ｒ４ｂ＝アセチル基、Ｒ５ｂ＝オクタデシル基、Ｒ６ｂ＝アルギニルメチルエステル基、Ｘ１ｂ＝ヒスチジニル基、Ｘ２ｂ＝結合、ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ＝３３）の合成
合成例９で得たｎ−ブチルアミン−ポリアスパラギン酸（アスパラギン酸の重合数３３）  １１９ｍｇをＤＭＦ１０ｍＬに溶解し、３５℃にて１５分撹拌した。２５℃にてＨ−Ａｒｇ−ＯＭｅ（国産化学製）  １５２ｍｇ及び合成例４で得たＨ−Ｈｉｓ−Ｓｔｅａｒｙｌ・ＨＣｌ  １９１ｍｇを加え、これにジイソプロピルエチルアミン  ６４０μＬを加えた。その後、ＤＭＴ−ＭＭ  ５８８ｍｇを加え、２５℃にて一夜撹拌した。
反応終了後、反応液をジイソプロピルエーテル/エタノール（８０/２０（ｖ/ｖ）、１００ｍＬ）の混合溶媒に滴下析出後、沈析物を濾取し、ジイソプロピルエーテル／エタノール（８０／２０（ｖ／ｖ）、１００ｍＬ）で洗浄した。得られた沈析物をアセトニトリル／水（１／１（ｖ／ｖ）、６ｍＬ）に溶解後、アセトニトリル／水（１／１（ｖ／ｖ）、２Ｌ）を外液とし、分子量カット３，５００の透析膜を使用して透析を行った。透析終了後、アセトニトリルを減圧留去し、凍結乾燥して二官能性ポリマー（Ｂ−３）を得た。
アミノ酸分析法により該二官能性ポリマー（Ｂ−３）中に含まれる各官能基導入量を定量したところ、Ａｒｇ−ＯＭｅ官能基が２０．５個（６３．０％）、Ｈｉｓ−Ｓｔｅａｒｙｌ官能基が３．８個（１１．８％）であった。【０１７３】
合成例１０〜１２で合成した二官能性ポリマー（Ｂ）の導入官能基の組成を表２にまとめた。【０１７４】
【表２】
0006513635.tif 000021
【０１７５】
［合成例１３］  Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ’−ビス（ｔ−ブトキシカルボニル）エチレンジアミンの合成
文献Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １０４  （２０１０）  ８１５−８１９．に記載の方法に準じて１Ｎ，３Ｎ−（Ｂｏｃ）２−ＤＥＴを合成した。
すなわち、ジエチレントリアミンに対して１当量のトリフルオロ酢酸エチルを反応させ、続いて２当量のＢｏｃ無水物（Ｂｏｃ２Ｏ）と反応させ、最後に炭酸カリウムで処理することで脱トリフルオロアセチル化を行い、  Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ’−ビス（ｔ−ブトキシカルボニル）エチレンジアミンを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ、ＴＭＳ）ｐｐｍ：１．４５（１８Ｈ、ｍ）、２．８０（２Ｈ、ｍ）、３．３０（６Ｈ、ｍ）【０１７６】
［合成例１４］  比較ブロック型コポリマー（ａ−１）（分子量１２，０００のメトキシポリエチレングリコールセグメントと重合数が４３のポリアスパラギン酸セグメントからなるブロック共重合体であって、側鎖カルボキシ基にジエチレントリアミノ基を導入した化合物）の合成
合成例５で得たメトキシポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体（アスパラギン酸の重合数４３）  ３９４ｍｇをＤＭＦ１４ｍＬに溶解し、３５℃にて１５分撹拌した。合成例１３で得た  Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ’−ビス（ｔ−ブトキシカルボニル）エチレンジアミン  ４５３ｍｇ、ＨＯＢｔ  １３７ｍｇ及びジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）  １５５μＬを加え、２５℃にて一夜撹拌した。
反応終了後、反応液をヘプタン/酢酸エチル（８０/２０（ｖ/ｖ）、１４０ｍＬ）の混合溶媒に滴下析出後、沈析物を濾取し、ヘプタン/酢酸エチル（８０/２０（ｖ/ｖ）、１４０ｍＬ）で洗浄し、固形物を得た。
得られた固形物  ２２０ｍｇをトリフルオロ酢酸  ８ｍＬに溶解し、室温で１時間撹拌した。
反応終了後、反応溶液を濃縮し、濃縮液を外液を蒸留水を用いて透析を行い、凍結乾燥することで比較ブロック型コポリマー（ａ−１）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ分析により、ポリアスパラギン酸側鎖へのジエチレントリアミノ基（ＤＥＴ）導入率は約１００％であった。【０１７７】
［合成例１５］  比較ブロック型コポリマー（ａ−２）（分子量１２，０００のメトキシポリエチレングリコールセグメントと重合数が１０４のポリアスパラギン酸セグメントからなるブロック共重合体であって、側鎖カルボキシ基にジエチレントリアミノ基を導入した化合物）の合成
前記合成例５において、β−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸−Ｎ−カルボキシ無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ、（株）日油製）を１４０当量で反応させる以外は、同様の操作を行うことにより、ＰＥＧ１２Ｋ−Ａｓｐ１０４−Ａｃ（分子量１２，０００のメトキシポリエチレングリコールセグメントと重合数が１０４のポリアスパラギン酸セグメントが連結したブロック共重合体）を合成した。
得られたＰＥＧ１２Ｋ−Ａｓｐ１０４−Ａｃ  ３５１ｍｇをＤＭＦ２０ｍＬに溶解し、３５℃にて１５分撹拌した。これに合成例１３で得た  Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ’−ビス（ｔ−ブトキシカルボニル）エチレンジアミン  ６７４ｍｇ、ＨＯＢｔ  ２０５ｍｇ及びＤＩＰＣＩ  ２３３μＬを加え、さらに２５℃にて一夜撹拌した。
反応終了後、反応液をヘプタン/酢酸エチル/ジイソプロピルエーテル（２４/７/６９（ｖ/ｖ/ｖ）、３００ｍＬ）の混合溶媒に滴下析出後、沈析物を濾取し、ヘプタン/酢酸エチル/ジイソプロピルエーテル（２４/７/６９（ｖ/ｖ/ｖ）、３００ｍＬ）で洗浄し、固形物を得た。
得られた固形物  ３６２ｍｇをトリフルオロ酢酸  １４ｍＬに溶解し、室温で１時間撹拌した。
反応終了後、反応溶液を濃縮し、濃縮液を外液を蒸留水を用いて透析を行い、凍結乾燥することで比較ブロック型コポリマー（ａ−２）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ分析により、ポリアスパラギン酸側鎖へのジエチレントリアミノ基（ＤＥＴ）導入率は約１００％であった。【０１７８】
［合成例１６］  比較二官能性ポリマー（ｂ−１）（重合数が４５のポリアスパラギン酸であって、側鎖カルボキシ基にジエチレントリアミノ基を導入した化合物）の合成
前記合成例９に記載の、ｎ−ブチルアミン−ポリアスパラギン酸ベンジルエステル−アセチルを得るまでの操作において、β−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸−Ｎ−カルボキシ無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ、（株）日油製）を４５当量で反応させる以外は、同様の操作を行うことにより、ｎ−ブチルアミン−ポリアスパラギン酸ベンジルエステル−アセチル（重合数が４５のポリアスパラギン酸誘導体）を得た。
得られたｎ−ブチルアミン−ポリアスパラギン酸ベンジルエステル−アセチル  ８００ｍｇをＤＭＦ４０ｍＬに溶解し、ジエチレントリアミン  １２．５ｇを加えて４０℃で１時間半撹拌した。
反応終了後、１０％酢酸水溶液に滴下して中和し、外液を０．０１Ｍ−ＨＣｌ水溶液で透析した。さらに外液を蒸留水として透析を行い、反応溶液を凍結乾燥することで比較二官能性ポリマー（ｂ−１）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲより構造を決定したところ、ポリアスパラギン酸のアスパラギン酸重合数は４５．５であった。また、ポリアスパラギン酸側鎖へのジエチレントリアミノ基（ＤＥＴ）導入率は１００％であった。【０１７９】
［実施例１］  ブロック型コポリマー（Ａ−１）と二官能性ポリマー（Ｂ−１）及びｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）からなる組成物（Ｂ（％）＝５０、Ｎ／Ｐ＝５）の調製
ブロック型コポリマー（Ａ−１）  ７．４１ｍｇ、二官能性ポリマー（Ｂ−１）  ４．０３ｍｇを、それぞれ別々に１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  ４ｍＬに溶解し、各溶液を１００μＬずつ混合して、超音波を約１０秒照射した。この混合溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ｓｉＣＯＮ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、実施例１の組成物溶液を調製した。
得られた実施例１の組成物の平均粒子径を、動的光散乱法で測定したところ３０ｎｍであった。【０１８０】
［実施例２］  ブロック型コポリマー（Ａ−１）と二官能性ポリマー（Ｂ−１）及びｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）からなる組成物（Ｂ（％）＝５０、Ｎ／Ｐ＝１０）の調製
ブロック型コポリマー（Ａ−１）  ７．４１ｍｇ、二官能性ポリマー（Ｂ−１）  ４．０３ｍｇを、それぞれ別々に１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  ２ｍＬに溶解し、各溶液を１００μＬずつ混合して超音波を約１０秒照射した。この混合溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ｓｉＣＯＮ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、実施例２の組成物溶液を調製した。
得られた実施例２の組成物の平均粒子径を、動的光散乱法で測定したところ３１ｎｍであった。【０１８１】
［実施例３］  ブロック型コポリマー（Ａ−１）と二官能性ポリマー（Ｂ−１）及びｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）からなる組成物（Ｂ（％）＝５０、Ｎ／Ｐ＝２０）の調製
ブロック型コポリマー（Ａ−１）  ７．４１ｍｇ、二官能性ポリマー（Ｂ−１）  ４．０３ｍｇを、それぞれ別々に１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  １ｍＬに溶解し、各溶液を１００μＬずつ混合して超音波を約１０秒照射した。この混合溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ｓｉＣＯＮ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、実施例３の組成物溶液を調製した。
得られた実施例３の組成物の平均粒子径を、動的光散乱法で測定したところ６５ｎｍであった。【０１８２】
［実施例４］  ブロック型ポリマー（Ａ−２）と二官能性ポリマー（Ｂ−２）及びｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）からなる組成物（Ｂ（％）＝５０、Ｎ／Ｐ＝５）の調製
ブロック型コポリマー（Ａ−２）  ５．８３ｍｇ、二官能性ポリマー（Ｂ−２）  ３．１１ｍｇを、それぞれ別々に１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  ４ｍＬに溶解し、各溶液を１００μＬずつ混合して超音波を約１０秒照射した。この混合溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ｓｉＣＯＮ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、実施例４の組成物溶液を調製した。
得られた実施例４の組成物の平均粒子径を、動的光散乱法で測定したところ９２ｎｍであった。【０１８３】
［実施例５］  ブロック型コポリマー（Ａ−２）と二官能性ポリマー（Ｂ−２）及びｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）からなる組成物（Ｂ（％）＝５０、Ｎ／Ｐ＝１０）の調製
ブロック型コポリマー（Ａ−２）  ５．８３ｍｇ、二官能性ポリマー（Ｂ−２）  ３．１１ｍｇを、それぞれ別々に１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  ２ｍＬに溶解し、各溶液を１００μＬずつ混合して超音波を約１０秒照射した。この混合溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ｓｉＣＯＮ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、実施例５の組成物溶液を調製した。
得られた実施例５の組成物の平均粒子径を、動的光散乱法で測定したところ４６ｎｍであった。【０１８４】
［実施例６］  ブロック型コポリマー（Ａ−２）と二官能性ポリマー（Ｂ−２）及びｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）からなる組成物（Ｂ（％）＝５０、Ｎ／Ｐ＝２０）の調製
ブロック型コポリマー（Ａ−２）  ５．８３ｍｇ、二官能性ポリマー（Ｂ−２）  ３．１１ｍｇを、それぞれ別々に１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  １ｍＬに溶解し、各溶液を１００μＬずつ混合して超音波を約１０秒照射した。この混合溶液  １５０μＬを１０μＭ−ｓｉＣＯＮ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、実施例６の組成物溶液を調製した。
得られた実施例６の組成物の平均粒子径を、動的光散乱法で測定したところ５６ｎｍであった。【０１８５】
［実施例７］  ブロック型コポリマー（Ａ−３）と二官能性ポリマー（Ｂ−３）及びｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）からなる組成物（Ｂ（％）＝５０、Ｎ／Ｐ＝５）の調製
ブロック型コポリマー（Ａ−３）  ６．８３ｍｇ、二官能性ポリマー（Ｂ−３）  ３．７９ｍｇを、それぞれ別々に１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  ４ｍＬに溶解し、各溶液を１００μＬずつ混合して超音波を約１０秒照射した。この混合溶液  １５０μＬを１０μＭ−ｓｉＣＯＮ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、実施例７の組成物溶液を調製した。
得られた実施例７の組成物の平均粒子径を、動的光散乱法で測定したところ２５ｎｍであった。【０１８６】
［実施例８］  ブロック型コポリマー（Ａ−３）と二官能性ポリマー（Ｂ−３）及びｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）からなる組成物（Ｂ（％）＝５０、Ｎ／Ｐ＝１０）の調製
ブロック型コポリマー（Ａ−３）  ６．８３ｍｇ、二官能性ポリマー（Ｂ−３）  ３．７９ｍｇを、それぞれ別々に１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  ２ｍＬに溶解し、各溶液を１００μＬずつ混合して超音波を約１０秒照射した。この混合溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ｓｉＣＯＮ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、実施例８の組成物溶液を調製した。
得られた実施例８の組成物の平均粒子径を、動的光散乱法で測定したところ２８ｎｍであった。【０１８７】
［実施例９］  ブロック型コポリマー（Ａ−３）と二官能性ポリマー（Ｂ−３）及びｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）からなる組成物（Ｂ（％）＝５０、Ｎ／Ｐ＝２０）の調製
ブロック型コポリマー（Ａ−３）  ６．８３ｍｇ、グラフト型コポリマー（Ｂ−３）  ３．７９ｍｇを、それぞれ別々に１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  １ｍＬに溶解し、各溶液を１００μＬずつ混合して超音波を約１０秒照射した。この混合溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ｓｉＣＯＮ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、実施例９の組成物溶液を調製した。
得られた実施例９の組成物の平均粒子径を、動的光散乱法で測定したところ２５ｎｍであった。【０１８８】
［比較例１］  二官能性ポリマー（Ｂ−１）とｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）からなる組成物（Ｂ（％）＝１００、Ｎ／Ｐ＝５）の調製
二官能性ポリマー（Ｂ−１）  ４．０３ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  ４ｍＬに溶解し、超音波を約１０秒照射した。この溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ｓｉＣＯＮ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、比較例１の組成物溶液を調製した。
得られた比較例１の組成物の平均粒子径を、動的光散乱法で測定したところ１１７ｎｍであった。【０１８９】
［比較例２］  二官能性ポリマー（Ｂ−１）とｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）からなる組成物（Ｂ（％）＝１００、Ｎ／Ｐ＝１０）の調製
二官能性ポリマー（Ｂ−１）  ４．０３ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  ２ｍＬに溶解し、超音波を約１０秒照射した。この溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ｓｉＣＯＮ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、比較例２の組成物溶液を調製した。
得られた比較例２の組成物の平均粒子径を、動的光散乱法で測定したところ５５ｎｍであった。【０１９０】
［比較例３］  二官能性ポリマー（Ｂ−１）とｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）からなる組成物（Ｂ（％）＝１００、Ｎ／Ｐ＝２０）の調製
二官能性ポリマー（Ｂ−１）  ４．０３ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  １ｍＬに溶解し、超音波を約１０秒照射した。この溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ｓｉＣＯＮ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、比較例３の組成物溶液を調製した。
得られた比較例３の組成物の平均粒子径を、動的光散乱法で測定したところ５６ｎｍであった。【０１９１】
［比較例４］  二官能性ポリマー（Ｂ−２）とｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）からなる組成物（Ｂ（％）＝１００、Ｎ／Ｐ＝５）の調製
二官能性ポリマー（Ｂ−２）  ３．１１ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  ４ｍＬに溶解し、超音波を約１０秒照射した。この溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ｓｉＣＯＮ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、比較例４の組成物溶液を調製した。
得られた比較例４の組成物の平均粒子径を、動的光散乱法で測定したところ１１６ｎｍであった。【０１９２】
［比較例５］  二官能性ポリマー（Ｂ−２）とｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）からなる組成物（Ｂ（％）＝１００、Ｎ／Ｐ＝１０）の調製
二官能性ポリマー（Ｂ−２）  ３．１１ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  ２ｍＬに溶解し、超音波を約１０秒照射した。この溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ｓｉＣＯＮ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、比較例５の組成物溶液を調製した。
得られた比較例５の組成物の平均粒子径を、動的光散乱法で測定したところ４４ｎｍであった。【０１９３】
［比較例６］  二官能性ポリマー（Ｂ−２）とｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）からなる組成物（Ｂ（％）＝１００、Ｎ／Ｐ＝２０）の調製
二官能性ポリマー（Ｂ−２）  ３．１１ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  １ｍＬに溶解し、超音波を約１０秒照射した。この溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ｓｉＣＯＮ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、比較例６の組成物溶液を調製した。
得られた比較例６の組成物の平均粒子径を、動的光散乱法で測定したところ１３ｎｍであった。【０１９４】
［比較例７］  二官能性ポリマー（Ｂ−３）とｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）からなる組成物（Ｂ（％）＝１００、Ｎ／Ｐ＝５）の調製
二官能性ポリマー（Ｂ−３）  ３．７９ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  ４ｍＬに溶解し、超音波を約１０秒照射した。この溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ｓｉＣＯＮ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、比較例７の組成物溶液を調製した。
得られた比較例７の組成物の平均粒子径を、動的光散乱法で測定したところ５８ｎｍであった。【０１９５】
［比較例８］  二官能性ポリマー（Ｂ−３）とｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）からなる組成物（Ｂ（％）＝１００、Ｎ／Ｐ＝１０）の調製
二官能性ポリマー（Ｂ−３）  ３．７９ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  ２ｍＬに溶解し、超音波を約１０秒照射した。この溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ｓｉＣＯＮ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、比較例８の組成物溶液を調製した。
得られた比較例８の組成物の平均粒子径を、動的光散乱法で測定したところ７５ｎｍであった。【０１９６】
［比較例９］  二官能性ポリマー（Ｂ−３）とｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）からなる組成物（Ｂ（％）＝１００、Ｎ／Ｐ＝２０）の調製
二官能性ポリマー（Ｂ−３）  ３．７９ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  １ｍＬに溶解し、超音波を約１０秒照射した。この溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ｓｉＣＯＮ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、比較例９の組成物溶液を調製した。
得られた比較例９の組成物の平均粒子径を、動的光散乱法で測定したところ１８６ｎｍであった。【０１９７】
［比較例１０］比較ブロック型コポリマー（ａ−１）とｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）からなる組成物（Ｂ（％）＝０、Ｎ／Ｐ＝１）の調製
比較ブロック型コポリマー（ａ−１）  ４．７６ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  ２０ｍＬに溶解し、超音波を約１０秒照射した。この溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ｓｉＣＯＮ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、比較例１０の組成物とした。【０１９８】
［比較例１１］比較ブロック型コポリマー（ａ−１）とｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）からなる組成物（Ｂ（％）＝０、Ｎ／Ｐ＝２）の調製
比較ブロック型コポリマー（ａ−１）  ４．７６ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  １０ｍＬに溶解し、超音波を約１０秒照射した。この溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ｓｉＣＯＮ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、比較例１１の組成物とした。【０１９９】
［比較例１２］比較ブロック型コポリマー（ａ−１）とｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）からなる組成物（Ｂ（％）＝０、Ｎ／Ｐ＝５）の調製
比較ブロック型コポリマー（ａ−１）  ４．７６ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  ４ｍＬに溶解し、超音波を約１０秒照射した。この溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ｓｉＣＯＮ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、比較例１２の組成物とした。【０２００】
［比較例１３］比較ブロック型コポリマー（ａ−１）とｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）からなる組成物（Ｂ（％）＝０、Ｎ／Ｐ＝１０）の調製
比較ブロック型コポリマー（ａ−１）  ４．７６ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  ２ｍＬに溶解し、超音波を約１０秒照射した。この溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ｓｉＣＯＮ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、比較例１３の組成物とした。【０２０１】
［比較例１４］比較ブロック型コポリマー（ａ−１）とｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）からなる組成物（Ｂ（％）＝０、Ｎ／Ｐ＝２０）の調製
比較ブロック型コポリマー（ａ−１）  ４．７６ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  １ｍＬに溶解し、超音波を約１０秒照射した。この溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ｓｉＣＯＮ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、比較例１４の組成物とした。【０２０２】
［比較例１５］比較ブロック型コポリマー（ａ−２）とｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）からなる組成物（Ｂ（％）＝０、Ｎ／Ｐ＝１）の調製
比較ブロック型コポリマー（ａ−１）  ４．７６ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  ２０ｍＬに溶解し、超音波を約１０秒照射した。この溶液  １５０μＬを１０μＭ−ｓｉＣＯＮ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、比較例１５の組成物とした。【０２０３】
［比較例１６］比較ブロック型コポリマー（ａ−２）とｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）からなる組成物（Ｂ（％）＝０、Ｎ／Ｐ＝２）の調製
比較ブロック型コポリマー（ａ−２）  ４．７６ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  １０ｍＬに溶解し、超音波を約１０秒照射した。この溶液  １５０μＬを１０μＭ−ｓｉＣＯＮ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、比較例１６の組成物とした。【０２０４】
［比較例１７］比較ブロック型コポリマー（ａ−２）とｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）からなる組成物（Ｂ（％）＝０、Ｎ／Ｐ＝５）の調製
比較ブロック型コポリマー（ａ−２）  ４．７６ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  ４ｍＬに溶解し、超音波を約１０秒照射した。この溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ｓｉＣＯＮ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、比較例１７の組成物とした。【０２０５】
［比較例１８］比較ブロック型コポリマー（ａ−２）とｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）からなる組成物（Ｂ（％）＝０、Ｎ／Ｐ＝１０）の調製
比較ブロック型コポリマー（ａ−２）  ４．７６ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  ２ｍＬに溶解し、超音波を約１０秒照射した。この溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ｓｉＣＯＮ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、比較例１８の組成物とした。【０２０６】
［比較例１９］比較ブロック型コポリマー（ａ−２）とｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）からなる組成物（Ｂ（％）＝０、Ｎ／Ｐ＝２０）の調製
比較ブロック型コポリマー（ａ−２）  ４．７６ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  １ｍＬに溶解し、超音波を約１０秒照射した。この溶液  １５０μＬを１０μＭ−ｓｉＣＯＮ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、比較例１９の組成物とした。【０２０７】
［試験例１］２０％ＦＢＳ中におけるｓｉＲＮＡの安定性評価
本発明の核酸送達用組成物を用いた核酸含有組成物が、生体内に存在する核酸分解酵素による核酸分解に対する耐性を有することを検証するため、ｓｉＲＮＡ含有組成物のウシ胎児血清（ＦＢＳ）に対する安定性を調べた。
実施例１〜９及び比較例１〜１９に係るｓｉＲＮＡ含有組成物に、ウシ胎児血清（終濃度２０％ＦＢＳ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）を、ｓｉＲＮＡの最終濃度が１μＭとなるように添加して、これを、３７℃で３時間インキュベートした。
その後、試料溶液に、終濃度０．０４％になるようにラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、ナカライテスク）を加え、ｓｉＲＮＡ分解反応を停止させると共に、各試料組成物から、ｓｉＲＮＡを解離させた。得られた試験試料を、１５％ポリアクリルアミドゲル（Ｔｒｉｓ-ホウ酸-ＥＤＴＡ（ＴＢＥ））を用いて、１００ボルト、６０分の条件で電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  ２(ライフテクノロジーズジャパン社)で染色することで、供試試料中に含まれるｓｉＲＮＡを検出した。ゲル中のｓｉＲＮＡのバンドを、モレキュラー・イメージャーＦＸ（ＢｉｏＲａｄ社）で解析した。なお、ｓｉＲＮＡのコントロール試料として、ｓｉＣＯＮ（北海道システムサイエンス社製）を用いた。得られた結果を、図１〜図３及び表３に示した。【０２０８】
【表３】
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【０２０９】
試験例１の結果から、本発明に係る実施例１〜９のｓｉＲＮＡ含有組成物は、Ｎ／Ｐが５である実施例１及び４において、若干のｓｉＲＮＡの分解が認められるものの、いずれのＮ／Ｐ比でも、ｓｉＲＮＡの安定性が確認された。これに対し、比較例１〜９のブロック型コポリマー（Ａ）を含まず、二官能性ポリマー（Ｂ）成分のみで調製されたＢ（％）＝１００なるｓｉＲＮＡ含有組成物は、ポリマー成分含量が少ないＮ／Ｐ＝５においてｓｉＲＮＡが分解する傾向が示された。これらの結果から、本発明の組成物は、核酸分解酵素に対して、核酸分解に対する耐性が付与され、含有する核酸を安定化できることが示された。一方、比較ブロック型コポリマーを使用した比較例１０〜１９は、核酸分解酵素に対する核酸分解耐性は有することが示された。【０２１０】
［実施例１０］ブロック型コポリマー（Ａ−１）と二官能性ポリマー（Ｂ−１）及びｓｉＲＮＡ（ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ）からなる組成物（Ｂ（％）＝７５、Ｎ／Ｐ＝２０）の調製
ブロック型コポリマー（Ａ−１）を７．４１ｍｇ、二官能性ポリマー（Ｂ−１）  ４．０３ｍｇを、それぞれ別々に１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  １ｍＬに溶解し、（Ａ−１）溶液  １００μＬと、（Ｂ−１）溶液  ３００μＬを混合し、超音波を約１０秒照射した。この混合溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、実施例１０の組成物とした。
実施例１０の組成物の、ゼータ電位を測定したところ、６ｍＶであった。【０２１１】
［実施例１１］ブロック型コポリマー（Ａ−１）と二官能性ポリマー（Ｂ−１）及びｓｉＲＮＡ（ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ）からなる組成物（Ｂ（％）＝５０、Ｎ／Ｐ＝２０）の調製
ブロック型コポリマー（Ａ−１）を７．４１ｍｇ、二官能性ポリマー（Ｂ−１）  ４．０３ｍｇを、それぞれ別々に１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ１ｍＬに溶解し、それぞれ１００μＬずつ混合して、超音波を約１０秒照射した。この混合溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、実施例１１の組成物とした。
実施例１１の組成物の、ゼータ電位を測定したところ１０ｍＶであった。【０２１２】
［実施例１２］ブロック型コポリマー（Ａ−２）と二官能性ポリマー（Ｂ−２）及びｓｉＲＮＡ（ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ）からなる組成物（Ｂ（％）＝７５、Ｎ／Ｐ＝２０）の調製
ブロック型コポリマー（Ａ−２）を５．８３ｍｇ、二官能性ポリマー（Ｂ−２）  ３．１１ｍｇを、それぞれ別々に１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  １ｍＬに溶解し、（Ａ−２）溶液  １００μＬと（Ｂ−２）溶液  ３００μＬを混合して、超音波を約１０秒照射した。この混合溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、実施例１２の組成物とした。
実施例１２の組成物の、ゼータ電位を測定したところ８ｍＶであった。【０２１３】
［実施例１３］ブロック型コポリマー（Ａ−２）と二官能性ポリマー（Ｂ−２）及びｓｉＲＮＡ（ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ）からなる組成物（Ｂ（％）＝５０、Ｎ／Ｐ＝２０）の調製
ブロック型コポリマー（Ａ−２）を５．８３ｍｇ、二官能性ポリマー（Ｂ−２）  ３．１１ｍｇを、それぞれ別々に１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  １ｍＬに溶解し、それぞれ１００μＬずつ混合して、超音波を約１０秒照射した。この混合溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、実施例１３の組成物とした。
実施例１３の組成物の、ゼータ電位を測定したところ１３ｍＶであった。【０２１４】
［実施例１４］ブロック型コポリマー（Ａ−３）と二官能性ポリマー（Ｂ−３）及びｓｉＲＮＡ（ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ）からなる組成物（Ｂ（％）＝７５、Ｎ／Ｐ＝２０）の調製
ブロック型コポリマー（Ａ−３）を６．８３ｍｇ、二官能性ポリマー（Ｂ−３）  ３．７９ｍｇを、それぞれ別々に１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  １ｍＬに溶解し、（Ａ−３）溶液  １００μＬと、（Ｂ−３）溶液  ３００μＬを混合して、超音波を約１０秒照射した。この混合溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、実施例１４の組成物とした。
実施例１４の組成物の、ゼータ電位を測定したところ７ｍＶであった。【０２１５】
［実施例１５］ブロック型コポリマー（Ａ−３）と二官能性ポリマー（Ｂ−３）及びｓｉＲＮＡ（ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ）からなる組成物（Ｂ（％）＝５０、Ｎ／Ｐ＝２０）の調製
ブロック型コポリマー（Ａ−３）を６．８３ｍｇ、二官能性ポリマー（Ｂ−３）  ３．７９ｍｇを、それぞれ別々に１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  １ｍＬに溶解し、それぞれ１００μＬずつ混合して、超音波を約１０秒照射した。この混合溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、実施例１５の組成物とした。
実施例１５の組成物の、ゼータ電位を測定したところ９ｍＶであった。【０２１６】
［比較例２０］ブロック型コポリマー（Ａ−１）とｓｉＲＮＡ（ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ）からなる組成物（Ｂ（％）＝０、Ｎ／Ｐ＝２０）の調製
ブロック型コポリマー（Ａ−１）  ７．４１ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ１ｍＬに溶解し、超音波を約１０秒照射した。この溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ＦＡＭ−ｓｉ−Ｌｕｃ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、比較例２０の組成物とした。
比較例２０の組成物の、ゼータ電位を測定したところ４ｍＶであった。【０２１７】
［比較例２１］ブロック型コポリマー（Ａ−２）とｓｉＲＮＡ（ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ）からなる組成物（Ｂ（％）＝０、Ｎ／Ｐ＝２０）の調製
ブロック型コポリマー（Ａ−２）  ５．８３ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ１ｍＬに溶解し、超音波を約１０秒照射した。この溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、比較例２１の組成物とした。
比較例２１の組成物の、ゼータ電位を測定したところ５ｍＶであった。【０２１８】
［比較例２２］ブロック型コポリマー（Ａ−３）とｓｉＲＮＡ（ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ）からなる組成物（Ｂ（％）＝０、Ｎ／Ｐ＝２０）の調製
ブロック型コポリマー（Ａ−３）  ６．８３ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  １ｍＬに溶解し、超音波を約１０秒照射した。この溶液  １５０μＬを、１０μＭ−ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  １５０μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、比較例２２の組成物とした。
比較例２２の組成物の、ゼータ電位を測定したところ４ｍＶであった。【０２１９】
［比較例２３］比較二官能性ポリマー（ｂ−１）とｓｉＲＮＡ（ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ）からなる組成物（Ｂ（％）＝１００、Ｎ／Ｐ＝４）の調製
比較二官能性ポリマー（ｂ−１）  ５．５２ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ１ｍＬに溶解し、超音波を約１０秒照射した。この溶液  ５８．７μＬを、１０μＭ−ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  ２１．３μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、比較例２３の組成物とした。【０２２０】
［比較例２４］比較ブロック型コポリマー（ａ−２）と比較二官能性ポリマー（ｂ−１）とｓｉＲＮＡ（ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ）からなる組成物（Ｂ（％）＝７５、Ｎ／Ｐ＝４）の調製
比較ブロック型コポリマー（ａ−２）  ４．６９ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  ２．５ｍＬに、比較二官能性ポリマー（ｂ−１）  ５．５２ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  ５ｍＬに、それぞれ別々に溶解し、超音波を約１０秒照射した。（ａ−２）溶液と（ｂ−１）溶液を体積比１：３で混合し、混合溶液  ５８．７μＬを、１０μＭ−ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  ２１．３μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、比較例２４の組成物とした。【０２２１】
［比較例２５］比較ブロック型コポリマー（ａ−２）と比較二官能性ポリマー（ｂ−１）とｓｉＲＮＡ（ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ）からなる組成物（Ｂ（％）＝５０、Ｎ／Ｐ＝４）の調製
比較ブロック型コポリマー（ａ−２）  ４．６９ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  ２．５ｍＬに、比較二官能性ポリマー（ｂ−１）  ５．５２ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  ５ｍＬに、それぞれ別々に溶解し、超音波を約１０秒照射した。（ａ−２）溶液と（ｂ−１）溶液を体積比１：１で混合し、混合溶液  ５８．７μＬを、１０μＭ−ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  ２１．３μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、比較例２５の組成物とした。【０２２２】
［比較例２６］比較ブロック型コポリマー（ａ−２）と比較二官能性ポリマー（ｂ−１）とｓｉＲＮＡ（ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ）からなる組成物（Ｂ（％）＝２５、Ｎ／Ｐ＝４）の調製
比較ブロック型コポリマー（ａ−２）  ４．６９ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  ２．５ｍＬに、比較二官能性ポリマー（ｂ−１）  ５．５２ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  ５ｍＬにそれぞれ別々に溶解し、超音波を約１０秒照射した。（ａ−２）溶液と（ｂ−１）溶液を体積比３：１で混合し、混合溶液  ５８．７μＬを、１０μＭ−ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  ２１．３μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、比較例２６の組成物とした。【０２２３】
［比較例２７］比較ブロック型コポリマー（ａ−２）とｓｉＲＮＡ（ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ）からなる組成物（Ｂ（％）＝０、Ｎ／Ｐ＝４）の調製
比較ブロック型コポリマー（ａ−２）  ４．６９ｍｇを、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ  ２．５ｍＬに溶解し、超音波を約１０秒照射した。この溶液  ５８．７μＬを、１０μＭ−ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ／１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ溶液  ２１．３μＬに加え、超音波を約１０秒照射した。その後、０．２μｍのフィルターを通すことで、比較例２７の組成物とした。【０２２４】
［試験例２］ヒト膠芽種細胞Ｕ８７ＭＧにおける細胞取り込みの評価
本発明の核酸送達用組成物を用いた核酸含有組成物が、核酸分子を細胞内に取り込まれることができることを検証するため、蛍光標識ｓｉＲＮＡ（ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ）を含む核酸含有組成物を用いて、細胞内取り込み試験を行った。
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＥａｇｌｅ‘ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を用いて、ヒト膠芽種細胞Ｕ８７ＭＧ（ＡＴＣＣ）を、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター下で継代培養維持した。
ヒト膠芽種細胞Ｕ８７ＭＧを、１００，０００細胞／ガラスボトムディッシュ（１ｍＬ）になるように播種して、３７℃のＣＯ２インキュベーターで４日間培養を行った。
これに、実施例１０〜１５及び比較例２０〜２７の蛍光標識ｓｉＲＮＡ（ＦＡＭ−ｓｉＬｕｃ）を含む核酸含有組成物を、ｓｉＲＮＡ濃度１００ｎＭで培地に添加し、Ｕ８７ＭＧ細胞に接触させた。各組成物添加後、３．５時間後及び１９時間後に、共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社）を用いて試験細胞の画像を採取した。
試験細胞の画像は、市販の画像処理ソフト（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ）を用いて、１細胞当たりのＦＡＭ蛍光量をｐｉｘｃｅｌ数としてカウントし、各供試試料における画像から１０細胞の平均ｐｉｘｃｅｌ数を求め表４に示した。【０２２５】
【表４】
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【０２２６】
試験例２の結果から、ブロック型コポリマー（Ａ）と二官能性ポリマー（Ｂ）を用いる本発明の核酸含有組成物は、Ｕ８７ＭＧ細胞において蛍光標識物であるＦＡＭ由来の蛍光が観察され、ｓｉＲＮＡを細胞内に取り込ませることができた。一方、二官能性ポリマー（Ｂ）を含まず、ブロック型コポリマー（Ａ）のみを用いた比較例２０〜２２は、実施例に比較して細胞内取り込み量が少ない結果であった。したがって、ブロック型コポリマー（Ａ）と二官能性ポリマー（Ｂ）の２種類のポリマーを用いる本発明の核酸送達用組成物は、細胞取り込みを優位に向上させることが示された。
また、引用文献２記載の化合物を使用している比較例２３〜比較例２７は、核酸分解酵素に対する分解耐性を有するものであるが、細胞内取り込み性能は全く確認することができなかった。【０２２７】
試験例１及び２の結果から、本発明によれば、核酸分解酵素への安定性を示すと同時に、細胞への効率的な取り込みを達成する組成物が提供される。かかる組成物は、例えば、治療用の医薬組成物として使用でき、その産業上の価値は極めて大きく、疾病の原因分子を直接的に抑制して、治療効果を得るための核酸医薬治療剤を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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