(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩であって、前記マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩は下記式（I）の構造を有しており、
0006460498.tif 000012
０≦ｘ≦４であることを特徴とするマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩。
【請求項２】
前記ｘはｘ＝２であることを特徴とする請求項１に記載のマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩。
【請求項３】
請求項１または２に記載のマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩の製造方法であって、この方法は、
1)アルカリ性ナトリウム塩またはアルカリ性カリウム塩を水に加えることにより、アルカリ性ナトリウム塩溶液またはアルカリ性カリウム塩溶液を製造するステップであって、前記溶液の濃度は０．１％〜２％（ｗ／ｖ）であるステップと、
2)マンギフェリンをジメチルスルホキシドに溶解させることによりマンギフェリン溶液を製造するステップと、
3)マンギフェリン溶液をアルカリ性ナトリウム塩溶液またはアルカリ性カリウム塩溶液にゆっくり入れ、充分撹拌し、５０℃〜１００℃の温度で反応を完了させることにより、マンギフェリン−６−Ｏ−ナトリウム塩溶液またはマンギフェリン−６−Ｏ−カリウム塩溶液を得るステップと、
4)塩酸ベルベリンを５０℃〜１００℃の水に溶解させることにより、塩酸ベルベリン溶液を製造するステップと、
5)塩酸ベルベリン溶液とマンギフェリン−６−Ｏ−ナトリウム塩溶液またはマンギフェリン−６−Ｏ−カリウム塩溶液を充分混合し、反応を完了させることにより沈殿物を析出させ、これを濾過することにより固形物を得るステップと、
6)固形物を乾燥させることによりマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩を得るステップを含むことを特徴とするマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩の製造方法。
【請求項４】
前記マンギフェリンとジメチルスルホキシドの比率は１：０．２〜５（ｗ／ｖ）であることを特徴とする請求項３に記載のマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩の製造方法。
【請求項５】
前記マンギフェリンとアルカリ性ナトリウム塩またはアルカリ性カリウム塩のモル比は１：０．５〜１であることを特徴とする請求項３に記載のマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩の製造方法。
【請求項６】
前記マンギフェリン−６−Ｏ−ナトリウム塩またはマンギフェリン−６−Ｏ−カリウム塩と塩酸ベルベリンのモル比は１：１であることを特徴とする請求項３に記載のマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩の製造方法。
【請求項７】
前記アルカリ性ナトリウム塩またはアルカリ性カリウム塩として、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウムのうち一種または二種以上の混合物を使用し、前記塩酸ベルベリンとして硫酸ベルベリンを使用するか或いは医学的に許容される他のベルベリンを使用することを特徴とする請求項３に記載のマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩の製造方法。
【請求項８】
請求項１または２に記載のマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩と薬学的補助材料で構成されることを特徴とする薬物。
【請求項９】
前記薬物は、臨床に適用可能な錠剤、カプセル、顆粒、経口液剤、経口懸濁剤、シロップ、丸薬、外用剤、注射剤にされることを特徴とする請求項８に記載の薬物。
【請求項１０】
ＡＭＰＫ活性剤の製造に用いられることを特徴とする請求項１または２に記載のマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩。
【請求項１１】
前記ＡＭＰＫ活性剤は、下記疾患のうちいずれか一種または複数種の疾患：糖尿病、糖尿病の各慢性合併症、肥満、高脂質血症、インスリン抵抗性、高インスリン血症、メタボリックシンドローム、高血圧、アテローム性動脈硬化、虚血性心疾患、心筋肥大症、不整脈、心不全、上気道感染症、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、喘息、肺線維症、肝炎、単純性脂肪肝、非アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、アルコール性肝臓疾患、アルコール性肝炎、肝線維症、肝硬変、前立腺炎、膵炎、腎炎、ネフローゼ症候群、高血圧性腎症、慢性腎不全、前立腺炎、リューマチ性関節炎、慢性関節リウマチ、骨関節炎、炎症性腸疾患、脳梗塞、記憶障害、アルツハイマー病、梗塞性認知症、パーキンソン病、腫瘍、筋萎縮、筋無力症を予防または治療することを特徴とする請求項１０に記載のマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩。
【請求項１２】
前記糖尿病の様々な慢性合併症は具体的に、動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、脳血管疾患、糖尿病性腎障害、糖尿病性網膜症、神経障害、糖尿病足病変、黄斑症、白内障、緑内障、屈折変化、虹彩毛様体病変のうち一種または複数種類を指すことを特徴とする請求項１１に記載のマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩。
【請求項１３】
請求項１または２に記載のマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩で、乳腺過形成、子宮ポリープ、前立腺肥大、性機能不全、不妊症、疲労、湿疹を治療する薬物を製造する応用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩およびその製造方法と、これをＡＭＰＫ活性剤などとして使う用途とに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マンギフェリン（mangiferin）は天然のポリフェノール系化合物であり、その分子式はＣ１９Ｈ１８Ｏ１１であり、その分子量は４２２であり、その化学構造は次のとおりである。
0006460498.tif 000002
【０００３】
ベルベリン（berberine）はイソキノリン類アルカロイドであり、その分子式は［Ｃ２０Ｈ１８ＮＯ４］＋であり、その分子量は３３６．３７であり、その化学構造は次のとおりである。
0006460498.tif 000003
【０００４】
本出願人は「マンギフェリンとベルベリンがイオン結合によって結合したマンギフェリンベルベリン塩」という発明を出願したことがあり、その出願の国際公開番号はＷＯ２０１０／１４５１９２Ａ１であり、発明の名称は「マンギフェリンベルベリン塩、その製造方法および用途」である。
【０００５】
前記出願の明細書の５〜７ページの第２段落において、前記マンギフェリンベルベリン塩のＣ−ＮＭＲデータ、Ｈ−ＮＭＲデータと、マンギフェリン、ベルベリン原型化合物の対応するデータとを比較することにより、マンギフェリン基とベルベリン基の各原子の化学環境が変化するという結論を得た。これはマンギフェリン基とベルベリン基の結合によりマンギフェリンベルベリン塩が形成されたことを意味する。
【０００６】
マンギフェリンの構造を分析すると、マンギフェリンの分子構造は４つのフェノール性水酸基を含み、前記マンギフェリンの塩形成位置には複数の可能性が存在するので、１つの塩形成位置を含むマンギフェリン塩を製造する困難性が大幅に増加する。
【０００７】
ＷＯ２０１０／１４５１９２Ａ１に記載されたマンギフェリンベルベリン塩のＮＭＲデータを分析すると、前記マンギフェリンベルベリン塩はマンギフェリン−３−Ｏ−ベルベリン塩とマンギフェリン−７−Ｏ−ベルベリン塩の組成物である。しかしながら、前記ＷＯ２０１０／１４５１９２Ａ１にはマンギフェリン−３−Ｏ−ベルベリン塩とマンギフェリン−７−Ｏ−ベルベリン塩の具体的な事項、例えば両者の比率などが記載されていない。
【０００８】
アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）で活性化されたＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰ−activated  protein  kinase、ＡＭＰＫ）は細胞内で新陳代謝を調節するプロテインキナーゼである。ＡＭＰＫの研究の発展に伴い、ＡＭＰＫは、代謝系疾患、血管心臓障害系疾患、神経系疾患、炎症系疾患、腫瘍、筋系疾患の分野において重要な役割を果たし、ＡＭＰＫは疾患治療の新規ターゲットとなっているが、現在、販売されているＡＭＰＫ活性剤はないので、ＡＭＰＫ活性剤の研究は臨床医学の重要な課題になりうる『李忌、ＡＭＰＫ：糖尿病と血管心臓障害を治療する新規ターゲット、中国医学論壇報、２００９（１１４９）。任俊芳、ＡＭＰＫと血管心臓障害を再構築、国際病理科学と臨床雑誌、２００８，２８（１）：３３−３６。Ricardo  Lage,  Carlos  Dieguez,  Antonio  Vidal-Puig.  Et  al.  AMPK：a  metabolic  gauge  regulating  whole-body  energy  homeostasis.  Trends  Mol  Med,  2008,  14(12):539-49。符慶瑛、高ユイチ、プロテインキナーゼＡＭＰＫの研究と進展、生命科学、１７（２）：１４７−１５２。陳奇、梁後杰、鄒嵐など、アデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼのシクロオキシゲナーゼ−２に対する発見と結腸癌治療における５−フルオロウラシル感受性との関係、実用医院臨床雑誌、２００８，５（３）：５６−５８など』。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ２０１０／１４５１９２Ａ１公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
医薬品登録の要件により、販売される薬物の原薬を明確に説明しなければならない。例えば、原料が組成物であることと、その比率を明確に説明することにより、薬物の品質の要件を満たすことができる。したがって、１つの塩形成位置を含むマンギフェリンベルベリン塩の製造は、該化合物を原料とする薬物に対して、解決しなければならない技術的課題になっている。
【００１１】
ＷＯ２０１０／１４５１９２Ａ１の出願の明細書の４ページの第３段落〜後ろから第３段落および実施例１〜６には、前記マンギフェリンベルベリン塩の製造方法が詳細に記載されている。その方法は次のとおりである。
1)反応容器に溶媒とマンギフェリンを加えて懸濁液を得て、アルカリ性ナトリウム（カリウム）塩溶液を懸濁液に加えて溶液が澄むまで反応させた後、それらを濾過することにより溶液Ａを得る。
2)ベルベリンを水に溶解させた後、それらを濾過することにより溶液Ｂを得る。
3)溶液Ａを撹拌下にある溶液Ｂに滴加し、滴加が終わっても撹拌を続けることにより、反応の充分性と沈殿物の大量の形成を確保し、その後濾過によって取り出された固形物を乾燥させることにより、マンギフェリンベルベリン塩を得る。
前記反応溶媒は、水と、エタノール、メタノール、アセトンなどの水混和性の有機溶剤の一種または二種以上との混合物であり、水の体積比は１０〜９０％（ｖ／ｖ）である。
上記ＷＯ２０１０／１４５１９２Ａ１に開示された製造方法から、マンギフェリンベルベリン塩を製造するとき、エタノール、メタノール、アセトンなどの有機溶剤を大量に使用しなければならないことが分かる。これらの有機溶剤は、コストが多くかかり、かつ工業的生産により環境に大きな影響を与えるおそれがある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明はマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩を提供し、前記マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩は下記式（I）の構造を有していることを特徴とし、
0006460498.tif 000004
前記構造において、０≦ｘ≦４である。
【００１３】
本発明の前記マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩において、前記ｘはｘ＝２であることを特徴とする。
【００１４】
本発明はマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩の製造方法を提供し、該方法は、
1)アルカリ性ナトリウム塩またはアルカリ性カリウム塩を水に加えることにより、アルカリ性ナトリウム塩溶液またはアルカリ性カリウム塩溶液を製造するステップであって、前記溶液の濃度が０．１％〜２％（ｗ／ｖ）であるステップと、
2)マンギフェリンをジメチルスルホキシドに溶解させることによりマンギフェリン溶液を製造するステップと、
3)マンギフェリン溶液をアルカリ性ナトリウム塩溶液またはアルカリ性カリウム塩溶液にゆっくり入れ、充分撹拌し、５０℃〜１００℃の温度で反応を完了させることにより、マンギフェリン−６−Ｏ−ナトリウム塩溶液またはマンギフェリン−６−Ｏ−カリウム塩溶液を得るステップと、
4)塩酸ベルベリンを５０℃〜１００℃の水に溶解させることにより、塩酸ベルベリン溶液を製造するステップと、
5)塩酸ベルベリン溶液とマンギフェリン−６−Ｏ−ナトリウム塩溶液またはマンギフェリン−６−Ｏ−カリウム塩溶液を充分混合し、反応を完了させることにより沈殿物を析出させ、これを濾過することにより固形物を得るステップと、
6)固形物を乾燥させることによりマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩を得るステップを含むことを特徴とする。
【００１５】
本発明の前記マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩の製造方法において、前記マンギフェリンとジメチルスルホキシドの比率は１：０．２〜５（ｗ／ｖ）であることを特徴とする。
【００１６】
本発明の前記マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩の製造方法において、前記マンギフェリンとアルカリ性ナトリウム塩またはアルカリ性カリウム塩のモル比は１：０．５〜１であることを特徴とする。
【００１７】
本発明の前記マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩の製造方法において、前記マンギフェリン−６−Ｏ−ナトリウム塩またはマンギフェリン−６−Ｏ−カリウム塩と塩酸ベルベリンのモル比は１：１であることを特徴とする。
【００１８】
本発明の前記マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩の製造方法において、前記アルカリ性ナトリウム塩またはアルカリ性カリウム塩として、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウムのうち一種または二種以上の混合物を使用し、前記塩酸ベルベリンとして硫酸ベルベリンを使用するか或いは医学的に許容される他のベルベリンを使用することを特徴とする。
【００１９】
本発明は薬物を提供し、前記薬物は前記マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩と薬学的補助原料で構成され、対応する製造方法により前記薬物を臨床に適用可能なトローチ、カプセル、顆粒、経口液剤、経口懸濁剤、シロップ、丸薬などのいずれか一種の経口薬剤にするか、或いはゲル化剤、軟膏、クリームなどの外用剤にするか、或いは凍結乾燥注射剤などの注射剤にすることを特徴とする。
【００２０】
本発明の前記マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩のＡＭＰＫ活性剤製造時の用途。
【００２１】
本発明の前記マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩を活性成分として製造した薬物のＡＭＰＫ活性剤製造時の用途。
【００２２】
現在の医学文献には疾患におけるＡＭＰＫの作用が記載されている。本発明のマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩のＡＭＰＫ活性剤製造時の用途であって、前記ＡＭＰＫ活性剤は、下記疾患のうちいずれか一種または複数種の疾患、例えば、糖尿病、糖尿病の様々な慢性合併症（動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、脳血管疾患、糖尿病性腎障害、糖尿病性網膜症、神経障害、糖尿病足病変、黄斑症、白内障、緑内障、屈折変化、虹彩毛様体病変などを含む）、肥満、高脂質血症、インスリン抵抗性、高インスリン血症、メタボリックシンドローム、高血圧、アテローム性動脈硬化、虚血性心疾患、心筋肥大症、不整脈、心不全、上気道感染症、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、喘息、肺線維症、肝炎、単純性脂肪肝、非アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、アルコール性肝臓疾患、アルコール性肝炎、肝線維症、肝硬変、前立腺炎、膵炎、腎炎、ネフローゼ症候群、高血圧性腎硬化、慢性腎不全、前立腺炎、リューマチ性関節炎、慢性関節リウマチ、骨関節炎、炎症性腸疾患、脳梗塞、記憶障害、アルツハイマー病、梗塞性認知症、パーキンソン病、腫瘍、筋萎縮、筋無力症を予防または治療することができる。
【００２３】
本発明はさらに、マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩の、乳腺過形成、子宮ポリープ、前立腺肥大、性機能不全、不妊症、湿疹、疲労を治療する薬物の製造における応用を提供する。
【００２４】
本発明の提供するマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩で前記疾患を治療する有効な用量は３７．５〜６００ｍｇ／日／人であり、好ましい用量は７５〜３００ｍｇ／日／人であり、毎日の使用回数は１〜３回であり、好ましい使用回数は２回である。具体的な疾患により適切用量を選択することができ、服用を選択することが好ましい。
【００２５】
マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩の理化学的性質は次のとおりである。
マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩において、その分子式はC20H18NO4・C19H17O11・xH2Oであり、その状態はオレンジ色の粉末であり、その融点は１７７〜１７９℃であり、それは水に殆ど溶解せず、メタノールに若干溶解し、希塩酸に多少溶解する。その化学構造式は次のとおりである。
0006460498.tif 000005
【００２６】
マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩のスペクトルデータ：ESI-MS(-) m/z 756(M-)，421；ESI-MS(+) m/z 336，423；マンギフェリン基の1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：4.56（H-1’），6.01（H-5),6.15（H-4),6.88（H-8)。13CNMR（400MHz，DMSO-d6)δ：161.51（C-1），106.58（C-2），163.06（C-3），92.77（C-4），155.55（C-4a），103.74（C-4b），98.64（C-5），166.93（C-6），147.03（C-7），100.47（C-8），100.53（C-8a），154.37（C-8b），176.73（C-9），73.51（C-1’），70.34（C-2’），79.14（C-3’），70.34（C-4’），81.37（C-5’），61.27（C-6’）；ベルベリン基の1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：3.2（H-5)，4.03（-OCH3)，4.07（-OCH3)，4.89（H-6)，6.13（-O-CH2-O-)，7.01（H-4)，7.69（H-1)，7.86（H-12)，8.07（H-11)，8.78（H-13)，9.78（H-8)。13CNMR（400MHz，DMSO-d6)δ：105.33（C-1），120.29（C-1a），147.56（C-2），149.71（C-3），108.22（C-4），130.45（C-4a），26.28（C-5），55.07（C-6），145.06（C-8），121.24（C-8a），143.51（C-9），150.15（C-10），126.55（C-11），123.33（C-12），132.87（C-12a），120.08（C-13），137.3（C-13a），56.93（C10(-OCH3)），61.74（C9(-OCH3)），101.96（-O-CH2-O-）。
【００２７】
付記：マンギフェリンのスペクトルデータESI-MS m/z 421(M-)；1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：4.60（H-1’），6.37（H-5),6.86（H-4),7.39（H-8)。3CNMR（400MHz，DMSO-d6)δ：161.68（C-1），107.54（C-2），163.73（C-3），93.27（C-4），156.15（C-4a），101.25（C-4b），102.54（C-5），153.91（C-6），143.63（C-7），108.05（C-8），111.68（C-8a），150.7（C-8b），179.02（C-9），73.04（C-1’），70.24（C-2’），78.9（C-3’），70.56（C-4’），81.44（C-5’），61.41（C-6’）。
【００２８】
ベルベリンのスペクトルデータESI-MS m/z 336(M)；1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：3.26（H-5)，4.11（-OCH3)，4.21（-OCH3)，4.92（H-6)，6.11（-O-CH2-O-)，6.96（H-4)，7.66（H-1)，8.0（H-12)，8.11（H-11)，8.7（H-13)，9.76（H-8)。13CNMR（400MHz，DMSO-d6)δ：106.54（C-1），121.49（C-1a），149.92（C-2），152.17（C-3），109.40（C-4），131.90（C-4a），28.24（C-5），57.20（C-6），145.73（C-8），123.33（C-8a），146.42（C-9），152.02（C-10），128.04（C-11），124.55（C-12），135.13（C-12a），121.86（C-13），139.65（C-13a），57.61（C10(-OCH3)），62.56（C9(-OCH3)）,103.68（-O-CH2-O-）である。
【００２９】
構造の分析の結果は次のとおりである。
ベルベリン原型化合物と比較すると、マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩のベルベリン基のカーボンスペクトルデータの各炭素元素の化学シフトは、遮蔽効果によって著しく変化している。
【００３０】
マンギフェリン原型化合物と比較すると、マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩のマンギフェリン基のカーボンスペクトルデータの炭素元素Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８ｂの化学シフトは遮蔽効果によって著しく変化している。ここで、炭素元素Ｃ６の化学シフトの変化が一番大きく、炭素元素Ｃ５、Ｃ８、Ｃ８ａの化学シフトは遮蔽効果によって異なって変化しており、Ｃ６のメタ位のＣ８とパラ位のＣ８ａの化学シフトはかなり変化している。
【００３１】
前記スペクトルデータを分析すると、マンギフェリン−６−Ｏ−とベルベリン−Ｎ＋の結合により、マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩が形成される。
【００３２】
マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩とその水和物の元素分析データは次のとおりである。
マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩とその水和物の元素分析データ
0006460498.tif 000006
【発明の効果】
【００３３】
発明者は長年研究をしてきた結果、新たな１つの塩形成位置を含むマンギフェリンベルベリン塩、すなわちマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩を獲得した。前記マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩は、原薬とするマンギフェリンベルベリン塩の構造が明確でなければならないという問題を解決することができる。ＷＯ２０１０／１４５１９２Ａ１に記載されたマンギフェリンベルベリン塩と比較すると、本発明のマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩は次のような予想外の技術的効果を得ることができる。
１、ＷＯ２０１０／１４５１９２Ａ１に記載されたマンギフェリンベルベリン塩と比較すると、本発明のマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩の塩酸溶液に溶解する溶解度が著しく向上しているので、胃内の溶解を向上させ、吸収を増加させることができる。ｐＨ値が１の塩酸溶液において、マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩の最大の溶解度は１２ｍｇ/ｍｌであり、ＷＯ２０１０／１４５１９２Ａ１に記載されたマンギフェリンベルベリン塩の溶解度は４ｍｇ/ｍｌである。すなわち、ｐＨ値が１の塩酸溶液において、マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩の溶解度は、ＷＯ２０１０／１４５１９２Ａ１に記載されたマンギフェリンベルベリン塩の溶解度の３倍であり、かつマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩の溶液の安定性は、ＷＯ２０１０／１４５１９２Ａ１に記載されたマンギフェリンベルベリン塩の溶液の安定性をかなり上回っている。
２、高湿度の環境において、本発明のマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩の吸湿重量増加比率はＷＯ２０１０／１４５１９２Ａ１に記載されたマンギフェリンベルベリン塩の吸湿重量増加比率をかなり下回っている。高湿度の環境下の安定性が良好なことにより、薬物の貯蔵を容易にし、製剤時の水分の吸収を抑制し、薬物の品質を向上させることができる。
３、本発明のマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩により、乳腺過形成、子宮ポリープ、性機能不全、前立腺肥大、不妊症、疲労、湿疹を治療できることを予期せずに発見した。ＷＯ２０１０／１４５１９２Ａ１に記載されたマンギフェリンベルベリン塩の活性によってはこれらの治療の効果を予測したり得ることができない。
出願人はマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩の製造方法も発明した。ＷＯ２０１０／１４５１９２Ａ１に記載されたマンギフェリンベルベリン塩の製造方法と比較すると、本発明の製造方法は大量の有機溶剤を使用することにより環境に影響を与える問題とコストの問題を解決することができるので、その方法を工業的生産に応用することができる。また、本発明の製造方法により、１つの塩形成位置を含むマンギフェリンベルベリン塩、すなわちマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩を得るという予想外の技術的効果を得る。
【００３４】
実験例１：ｐＨ値が１の溶液において、２種のマンギフェリンベルベリン塩の溶解状況を比較する。
１、供試サンプル：
サンプルＡ：マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩２水和物。
サンプルＢ：ＷＯ２０１０／１４５１９２Ａ１に記載されたマンギフェリンベルベリン塩の製造方法によって製造されたマンギフェリンベルベリン塩。
２、計器：ＰＨＳ−３Ｃマイコン型ｐＨ値測定装置（上海康儀社）
３、実験方法およびその結果
純水に塩酸を注入することにより、ｐＨ値が１の溶液（２５℃±２℃）を調整する。前記溶液を５０ｍｌずつ取り出して三角フラスコに入れた後、２００ｍｇの粉末状のマンギフェリンベルベリン塩のサンプルＡとサンプルＢを精度良く量り取ってそれぞれ三角フラスコにそれぞれ入れて振盪する。溶解状況を観察する。
サンプルＡは数秒似内に溶解し、溶液は透明状態になる。
サンプルＢは１分以内に溶解できるが、溶液は迅速に混濁状態になる。これは沈殿物が形成されたことを意味する。
また、溶液を５０ｍｌずつ取り出して三角フラスコに入れた後、４００ｍｇと６００ｍｇの粉末状のマンギフェリンベルベリン塩のサンプルＡを精度良く量り取ってそれぞれ三角フラスコに入れて振盪する。溶解状況を観察する。
４００ｍｇのサンプルＡは５０ｍｌの酸溶液に迅速に溶解し、溶液は透明状態になる。これらを２４時間置いても沈殿物が形成されない。
６００ｍｇのサンプルＡは５０ｍｌの酸溶液に完全に溶解し、溶液は透明状態になる。これらを３０分間置くと、少量の沈殿物が形成され、溶液は微濁状態になる。
前記実験の結果によると、ｐＨ値が１の塩酸溶液において、サンプルＡの最大の溶解度は１２ｍｇ/ｍｌであり、サンプルＢの最大の溶解度は４ｍｇ/ｍｌである。マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩の溶液の安定性は、ＷＯ２０１０／１４５１９２Ａ１に記載されたマンギフェリンベルベリン塩の溶液の安定性をかなり上回っている。
４、結論
ｐＨ値が１の塩酸溶液において、マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩の溶解度は、ＷＯ２０１０／１４５１９２Ａ１に記載されたマンギフェリンベルベリン塩の溶解度の３倍である。
【００３５】
実験例２：高湿度の環境において、２種のマンギフェリンベルベリン塩の安定性を比較する。
１、供試サンプル：
サンプルＡ：マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩２水和物
サンプルＢ：ＷＯ２０１０／１４５１９２Ａ１に記載されたマンギフェリンベルベリン塩の製造方法によって製造されたマンギフェリンベルベリン塩。
２、計器：感度が一万分の一である電子天びん（Sartorius、ドイツ）
３、観察方法
サンプルＡとサンプルＢを３部ずつ取り出してシャーレに入れた後、これらの重量を精度良く測定する。次に、サンプルを湿度が変化しない密閉容器内に入れて、２５℃、ＲＨ９０％±５％である環境に１０日置く。５日目と１０日目に、これらの重量を精度良く測定し、その結果を記録する。吸湿重量増加比率を測定する。
４、結果、次の表のとおりである。
0006460498.tif 000007
５、結論
高湿度の環境において、マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩２水和物の吸湿重量増加比率はＷＯ２０１０／１４５１９２Ａ１に記載されたマンギフェリンベルベリン塩の吸湿増加重量をかなり下回っている。
【００３６】
実験例３：マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩のＡＭＰＫに対する活性化作用
１、材料
前記実施例において製造したマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩２水和物をＤＭＳＯに溶解する。これを使用する前、培地またはＨＢＳ緩衝液により溶液を希釈する。ＤＭＳＯの最終濃度は≦０．２％である。
ＡＴＣＣからＬ６細胞を購入し、ＧＩＢＣＯ会社から高糖ＤＭＥＭ培地を購入し、Hyclone会社からウシ胎児血清を購入する。Cell  Signal  Technology会社から抗ＡＭＰＫウサギポリクローナル抗体、抗ＡＣＣウサギポリクローナル抗体、抗ＡＭＰＫトレオニン１７２部位リン酸化ウサギポリクローナル抗体、抗ＡＣＣセリン７９部位リン酸化ウサギポリクローナル抗体を購入する。
２、実験方法
２．１  細胞の培養と分化
分化前のＬ６細胞は、１０％のウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１０Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンを含む高糖ＤＭＥＭ培地を用い、５％のＣＯ２を含むインキュベーターに入れて３７℃の温度で培養する。Ｌ６細胞の分化は、細胞が６０％程度に成長するとき、２％のウシ胎児血清を含む高糖ＤＭＥＭ培地を取り替え、Ｌ６細胞の分化が約９０％になるまで、培地を２日に一回ずつ取り替える。
２．２  化合物の処理とサンプルの収集
６ウェルプレート中に細胞を血清が含まれない高糖ＤＭＥＭ培地に加えて飢餓させる。実験物を異なる濃度勾配で、血清が含まれない高糖ＤＭＥＭ培地に入れて実験を行い、ＤＭＳＯの含有量は０．２％である。実験物と細胞を３時間培養した後、冷たい１×ＰＢＳで２回洗浄し、２００μｌ  １×ＳＤＳ電気泳動用緩衝液（５０ｍＭのTris・HCL、１００ｍＭのＤＴＴ、２％の電気泳動級ＳＤＳ、０．１％のブロモフェノールブルー、１０％のグリセリン）を注入して細胞の溶解を１０min行う。溶解液を収集し、１５秒超音波にかけ、サンプルを１００℃で１０min煮沸する。
２．３  免疫ブロットの測定
溶解液に対して１０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析をした後、これを転写装置に加えて、１００Ｖで１〜２ｈの転写をすることにより、溶解液をＰＶＤＦ膜上に転写する。ゲル中のたんぱく質を硝酸繊維薄膜上にセミドライ転写し、ポンソーＳ（Ponceau  S）で帯状体を形成する。ブロッキング溶液（３％の脱脂粉乳、０．１％のTween、ＴＢＳ溶解）中に加えて１時間のブロッキングをし、１：１０００の希釈した一次抗体を加えた後4℃で一晩置き、ＴＢＳで３×１５min洗浄し、１：１０００の希釈した二次抗体を加えた後、室温で１時間培養し、ＴＢＳで３×１５min洗浄し、ＥＣＬに入れて５〜１０min洗浄した後、Ｘ線フィルム現像をする。
３、結果
その結果、１．２５〜５μｍｏｌ/Ｌのマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩２水和物は用量の増加によりＡＭＰＫリン酸化の程度が増加し、かつＡＣＣＫリン酸化の程度も増加することが判明した。
【００３７】
実験例４：マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩の代謝異常症の様々な指標に対する改善作用
２型糖尿病と非アルコール性脂肪肝疾患を患っている患者に対して、７５ｍｇのマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩錠剤（その製造方法は実施例６を参照）を毎日２回ずつ服用させる。６カ月後、患者の肝臓酵素（ＡＬＴ、ＡＳＴ）、カラードプラで診断可能な肝脂肪変性、ＡＰＲＩ指標（肝繊維症を反映）、ヘモグロビンA1c（HbA1c）、血清インスリン（ＩＮＳ）、インスリン感受性指数（ＩＳＩ）、血液脂質（ＴＧ）、血圧（収縮期血圧、拡張期血圧）、尿中微量アルブミン、体重などを著しく改善することが判明した。
その結果、マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩は、肝臓酵素を低減し、肝脂肪変性、肝繊維症を改善し、血糖、インスリンを低減し、インスリン感受性を増加させ、脂肪、血圧、尿蛋白、体重を低減することが判明した。
具体的な改善は次のとおりである。
0006460498.tif 000008
【００３８】
実験例５：人体に対するマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩の治療効果
患者にマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩（以下Ａと略称、その製造方法は実施例６を参照）を服用させる。マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩は、患者の慢性関節リウマチ、乳腺過形成、子宮ポリープ、前立腺肥大、認知症、性機能不全、不妊症、不整脈、心不全、疲労を改善することができる。マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩のゲル（以下Ｂと略称、その製造方法は実施例１０を参照）に塗布することにより、湿疹を治療することができる。具体的な効果は次のとおりである。
0006460498.tif 000009
【００３９】
実験例６：マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩とマンギフェリンベルベリン塩の薬物動態の比較
１、実験方法
サンプルＡ：マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩
サンプルＢ：ＷＯ２０１０／１４５１９２Ａ１に記載されたマンギフェリンベルベリン塩の製造方法によって製造されたマンギフェリンベルベリン塩
ＳＤラットに１００ｍｇ／ｋｇのサンプルＡまたはサンプルＢを一回経口投与した後、０、０．０８３、０．２５、０．５、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、１２および２４ｈ経過ごとに、頸静脈から血液を採集する。
マンギフェリンの対照溶液を製造。マンギフェリンの比較品を精密に量り取って２５ｍｌの容量フラスコに入れた後、メタノールを注入して溶解するとともに標線まで希釈することにより比較品の母液を形成する。比較品の母液を精密に量り取って希釈することにより、マンギフェリンが２、５、１０、５０、１００、２００ｎｇ／ｍｌ含まれる対照溶液を製造する。
塩酸ベルベリンの対照溶液を製造。塩酸ベルベリンの比較品を精密に量り取って２５ｍｌの容量フラスコに入れた後、メタノールを注入して溶解するとともに標線まで希釈することにより比較品の母液を形成する。比較品の母液を精密に量り取って希釈することにより、ベルベリンが０．２、０．５、２、１０、２０、５０ｎｇ／ｍｌ含まれる対照溶液を製造する。
内部標準溶液の製造。グリベンクラミドを精密に量り取って２５ｍｌの容量フラスコに入れた後、アセトニトリルを注入して溶解するとともに標線まで希釈することにより、５０ｎｇ／ｍｌのグリベンクラミドの内部標準溶液を製造する。
血液サンプルの処理方法：ラットの血液を採ってヘパリンの抗凝固遠心分離管に入れ、６０００ｒｐｍの遠心分離を１０ｍｉｎすることにより血漿を採集し、これを−２０℃で冷凍する。
ブランク血漿の処理：１００ｕｌの血漿に５００ｕｌのアセトニトリル＋酢酸（９：１）溶液を加えて５minボルテックスし、６０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離することにより、上清を取り出し、この後これを５０℃で真空乾燥する。残留物に流動相溶液を１００ｕｌ入れ、３minボルテックスし、６０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離することにより、ブランク血漿サンプルを得るとともに上清を取り出して１０ｕｌ試料注入する。
血漿サンプルに対する予備処理：各採血部位の血漿１００ｕｌにアセトニトリル＋酢酸（９：１）溶液を加えて５minボルテックスし、６０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離することにより、上清を取り出し、この後５０℃で真空乾燥する。残留物に流動相溶液を１００ｕｌ入れ、３minボルテックスし、６０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離することにより、ブランク血漿サンプルを得るとともに上清を取り出して１０ｕｌ試料注入する。
クロマトグラムの条件：Ａ相：０．１％のギ酸溶液、Ｂ相：メタノール、クロマトグラフカラム：Waters  Xbridge  Ｃ１８  (５０×２．１  ｍｍ、５  μｍ)、流速：０．４０ｍＬ・ｍｉｎ−１。
勾配溶出手順：
0006460498.tif 000010
マススペクトルの条件：イオン測定方法：多重イオン測定（ＭＲＭ）、イオン極性：正イオン、マンギフェリン：ｍ／ｚ  ４２２．９／３２７．１、ベルベリン：ｍ／ｚ  ３３７．３／３２１．３、内部標準：ｍ／ｚ  ４９４．２／３６９．１。
２、実験の結果
Pharsight  Phoenix  6.3中のノンコンパートメントモデルで薬物動態パラメータを計算する。
マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩とマンギフェリンベルベリン塩のＡＵＣの比較
（平均値±標準偏差）
0006460498.tif 000011
前記結果によると、マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩のＡＵＣはマンギフェリンベルベリン塩の２倍である。これは、マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩の吸収がマンギフェリンベルベリン塩より高いことを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明の好適な実施例
マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩２水和物の製造
反応容器に６７０ｍｌの水を加え、０．１molの炭酸水素カリウムをこの水に加えることにより、濃度が１．５％（ｗ／ｖ）である炭酸水素カリウム溶液を形成する。０．１molのマンギフェリン（４２．２ｇ）を２１ｍｌのＤＭＳＯ（マンギフェリンとＤＭＳＯの比率は１：０．５（ｗ／ｖ））に加えて加熱溶解することにより、マンギフェリン溶液を形成する。マンギフェリン溶液を炭酸水素カリウム溶液にゆっくり注入し、充分撹拌し、７０℃を維持することにより反応を完了させた後、濾過することによりマンギフェリン−６−Ｏ−カリウム塩溶液を形成し、これを６０℃の温度で保存する。０．１molの塩酸ベルベリンに７０℃の水を３７００ｍｌ注入して溶解させることにより、塩酸ベルベリン溶液を得て、これを８０℃の温度で保存する。マンギフェリン−６−Ｏ−カリウム塩溶液を塩酸ベルベリン溶液にゆっくり注入し、充分撹拌し、反応を完了させ、静置させて、沈殿を析出させる。その後、濾過によって得た固形物を４５℃真空乾燥することにより、橙黄色のマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩２水和物６５．７ｇを得る。その収率は８２．８％であり、ＨＰＬＣ測定方法によるサンプルの純度は９７．６％である。
【００４１】
本発明のマンギフェリンとして市販品（西安楊凌東科薬業有限公司、製造設備を有している会社であればだれでも生産することができ、その含有量は９８％である）を用いることができる。塩酸ベルベリン、硫酸ベルベリンなどはいずれも、市販品（西安小草植物科技有限公司）を用いることができる。炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸カリウム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などはいずれも、市販品を用いることができる。
【００４２】
製造例１：マンギフェリン−６−Ｏ−ナトリウム塩の製造
反応容器に１７００ｍｌの水を加え、０．１molの炭酸水素ナトリウムをこの水に加えることにより、濃度が０．５％（ｗ／ｖ）である炭酸水素ナトリウム溶液を形成する。０．１molのマンギフェリン（４２．２ｇ）を８５ｍｌのＤＭＳＯ（マンギフェリンとＤＭＳＯの比率は１：２（ｗ／ｖ））に加えて加熱溶解することにより、マンギフェリン溶液を形成する。マンギフェリン溶液を炭酸水素ナトリウム溶液にゆっくり注入し、充分撹拌し、８５℃を維持することにより反応を完了させた後、濾過し、反応液の温度を室温まで冷却する。その後、反応液体積の２倍のアセトンを入れ、充分撹拌することにより大量の沈殿物を析出させ、濾過により得た沈殿物を無水アルコールで充分洗浄する。その後、沈殿物を４０℃で真空乾燥し、粉砕することにより、淡黄色のマンギフェリン−６−Ｏ−ナトリウム塩２１．３ｇを得る。その収率は５０．５％であり、ＨＰＬＣ測定方法によるサンプルの純度は９８．６％である。
【００４３】
マンギフェリン−６−Ｏ−ナトリウム塩：1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：4.60（H-1’），6.01（H-5),6.10（H-4),6.96（H-8)。13CNMR(400MHz，DMSO-d6)（δppm）：162.43(C-1)，106.82(C-2)，161.56(C-3)，93.50(C-4)，157.12（C-4a)，101.06(C-4b)，99.53C-5)，161.56(C-6)，147.08(C-7)，103.75(C-8)，106.83（C-8a），154.28（C-8b），176.63(C-9) ，73.67(C-1’) ，70.24(C-2’) ，79.19(C-3’) ，70.24(C-4’) ，81.05(C-5’) ，60.97(C-6’)。
【００４４】
製造例２：マンギフェリン−６−Ｏ−カリウム塩の製造
反応容器に１７００ｍｌの水を加え、０．０５molの炭酸カリウムをこの水に加えることにより、濃度が０．８％（ｗ／ｖ）である炭酸カリウム溶液を形成する。０．１molのマンギフェリン（４２．２ｇ）を４２ｍｌのＤＭＳＯ（マンギフェリンとＤＭＳＯの比率は１：１（ｗ／ｖ））に加えて加熱溶解することにより、マンギフェリン溶液を形成する。マンギフェリン溶液を炭酸カリウム溶液にゆっくり注入し、充分撹拌し、６０℃を維持することにより反応を完了させた後、濾過し、反応液の温度を４０℃まで冷却する。その後、反応液体積の２倍のアセトンを入れ、充分撹拌することにより大量の沈殿物を析出させ、濾過により得た沈殿物を無水アルコールで充分洗浄する。その後、沈殿物を５０℃で真空乾燥し、粉砕することにより、淡黄色のマンギフェリン−６−Ｏ−カリウム塩２５．３ｇを得る。その収率は６０．２％であり、ＨＰＬＣ測定方法によるサンプルの純度は９８．３％である。
【００４５】
実施例１：マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩の製造
反応容器に２０００ｍｌの水を加え、０．１molの炭酸水素ナトリウムをこの水に加えることにより、濃度が０．４％（ｗ／ｖ）である炭酸水素ナトリウム溶液を形成する。０．１molのマンギフェリン（４２．２ｇ）を１２７ｍｌのＤＭＳＯ（マンギフェリンとＤＭＳＯの比率は１：３（ｗ／ｖ））に加えて加熱溶解することにより、マンギフェリン溶液を形成する。マンギフェリン溶液を炭酸水素ナトリウム溶液にゆっくり注入し、充分撹拌し、８０℃を維持することにより反応を完了させた後、濾過することによりマンギフェリン−６−Ｏ−ナトリウム塩溶液を形成し、これを６０℃の温度で保存する。０．１molの塩酸ベルベリンに６０℃の水を２０００ｍｌ注入して溶解させることにより、塩酸ベルベリン溶液を得て、これを６０℃の温度で保存する。マンギフェリン−６−Ｏ−ナトリウム塩溶液を塩酸ベルベリン溶液にゆっくり注入し、充分撹拌し、反応を完了させ、静置させて、沈殿を析出させる。その後、濾過によって得た固形物を６０℃で真空乾燥し、乾燥によって得た乾燥物をＤＭＳＯに溶解させる。その後、ＤＭＳＯ溶液を適量のアセトンにゆっくり注入し、充分撹拌した後、静置して、沈殿物を析出させる。濾過により得た沈殿物を適量の無水アルコールで洗浄し、５５℃で真空乾燥することにより、橙黄色のマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩５２．０ｇを得る。その収率は６５．６％であり、ＨＰＬＣ測定方法によるサンプルの純度は９５．６％である。
【００４６】
実施例２：マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩２水和物の製造
反応容器に３５００ｍｌの水を加え、０．０５molの炭酸ナトリウムをこの水に加えることにより、濃度が０．３％（ｗ／ｖ）である炭酸ナトリウム溶液を形成する。０．１molのマンギフェリン（４２．２ｇ）を１６９ｍｌのＤＭＳＯ（マンギフェリンとＤＭＳＯの比率は１：４（ｗ／ｖ））に加えて溶解させることにより、マンギフェリン溶液を形成する。マンギフェリン溶液を炭酸ナトリウム溶液にゆっくり注入し、充分撹拌し、１００℃を維持することにより反応を完了させ、マンギフェリン−６−Ｏ−ナトリウム塩溶液を形成し、これを８０℃の温度で保存する。０．１molの塩酸ベルベリンに９０℃の水を３７００ｍｌ注入して溶解させることにより、塩酸ベルベリン溶液を得て、これを８０℃の温度で保存する。塩酸ベルベリン溶液をマンギフェリン−６−Ｏ−ナトリウム塩溶液にゆっくり注入し、充分撹拌し、反応を完了させ、静置させて、沈殿を析出させる。その後、濾過によって得た固形物を乾燥させることにより、橙黄色のマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩２水和物５０．７ｇを得る。その収率は７１．８％であり、ＨＰＬＣ測定方法によるサンプルの純度は９４．５％である。
【００４７】
実施例３：マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩２水和物の製造
反応容器に１３８００ｍｌの水を加え、０．０６molの炭酸カリウムをこの水に加えることにより、濃度が０．１％（ｗ／ｖ）である炭酸カリウム溶液を形成する。０．１molのマンギフェリン（４２．２ｇ）を２１０ｍｌのＤＭＳＯ（マンギフェリンとＤＭＳＯの比率は１：５（ｗ／ｖ））に加えて溶解させることにより、マンギフェリン溶液を形成する。マンギフェリン溶液を炭酸カリウム溶液にゆっくり注入し、充分撹拌し、５０℃を維持することにより反応を完了させ、マンギフェリン−６−Ｏ−カリウム塩溶液を形成し、これを４０℃の温度で保存する。０．１molの硫酸ベルベリンに５０℃の水を８７０ｍｌ注入して溶解させ、濾過することにより、硫酸ベルベリン溶液を得て、これを４０℃の温度で保存する。硫酸ベルベリン溶液をマンギフェリン−６−Ｏ−カリウム塩溶液にゆっくり注入し、充分撹拌し、反応を完了させ、静置させて、沈殿を析出させる。その後、濾過によって得た固形物を５０℃で真空乾燥することにより、橙黄色のマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩２水和物４８．２ｇを得る。その収率は５７．６％であり、ＨＰＬＣ測定方法によるサンプルの純度は９５．５％である。
【００４８】
実施例４：マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩４水和物の製造
反応容器に８００ｍｌの水を加え、０．１molの炭酸水素ナトリウムをこの水に加えることにより、濃度が１％（ｗ／ｖ）である炭酸水素ナトリウム溶液を形成する。０．１molのマンギフェリン（４２．２ｇ）を８．５ｍｌのＤＭＳＯ（マンギフェリンとＤＭＳＯの比率は１：０．２（ｗ／ｖ））に加えて加熱溶解することにより、マンギフェリン溶液を形成する。マンギフェリン溶液を炭酸水素ナトリウム溶液にゆっくり注入し、充分撹拌し、９０℃を維持することにより反応を完了させ、濾過することにより、マンギフェリン−６−Ｏ−ナトリウム塩溶液を形成し、これを８０℃の温度で保存する。０．１molの塩酸ベルベリンに８０℃の水を３７０００ｍｌ注入して溶解させることにより、塩酸ベルベリン溶液を得て、これを７０℃の温度で保存する。マンギフェリン−６−Ｏ−ナトリウム塩溶液を塩酸ベルベリン溶液に注入し、充分撹拌し、反応を完了させ、沈殿物を析出させる。その後、濾過によって得た沈殿物を純水で充分洗浄し、固形物を乾燥させることにより、沈殿物５６．２ｇを得る。その収率は７０．８％である。得た乾燥物をメタノールに加えて再結晶することにより、橙黄色のマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩４水和物３５．９ｇを得る。その収率は４４．３％であり、ＨＰＬＣ測定方法によるサンプルの純度は９７．５％である。
【００４９】
実施例５：マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩２水和物の製造
反応容器に３８０ｍｌの水を加え、０．０４molの炭酸ナトリウムと０．０４molの炭酸水素ナトリウムをこの水に加えることにより、濃度が２％（ｗ／ｖ）であるアルカリ性ナトリウム塩溶液を形成する。０．１molのマンギフェリン（４２．２ｇ）を５０ｍｌのＤＭＳＯ（マンギフェリンとＤＭＳＯの比率は１：１．２（ｗ／ｖ））に加えて加熱溶解することにより、マンギフェリン溶液を形成する。マンギフェリン溶液をアルカリ性ナトリウム塩溶液にゆっくり注入し、充分撹拌し、９５℃を維持することにより反応を完了させ、濾過することにより、マンギフェリン−６−Ｏ−ナトリウム塩溶液を形成し、これを９０℃の温度で保存する。０．１molの塩酸ベルベリンに１００℃の水を３７０００ｍｌ注入して溶解させ、濾過することにより、塩酸ベルベリン溶液を得て、これを９０℃の温度で保存する。塩酸ベルベリン溶液をマンギフェリン−６−Ｏ−ナトリウム塩溶液にゆっくり注入し、充分撹拌し、反応を完了させ、冷却し、静置させて、沈殿を析出させる。その後、濾過によって得た沈殿物を純水で洗浄し、固形物を５５℃で真空乾燥することにより、橙黄色のマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩２水和物を６４．９ｇを得る。その収率は８１．８％であり、ＨＰＬＣ測定方法によるサンプルの純度は９６．５％である。
【００５０】
実施例６：マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩錠剤の製造
前記実施例の製造方法で製造したマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩２水和物を粉砕して１６０メッシュの篩にかける。取り出した３７．５ｇの粉末に、５０ｇの微結晶セルロース、４５ｇのアルファ澱粉を希釈剤として加えて製剤を調製し均一混合し、１０％のポリビドンＫ３０アルコール溶液を接着剤として軟質材料を製造した後、２４メッシュの篩により造粒を行い、これを乾燥させて整粒を行う。その後、０．５％のステアリン酸と２％のコロイド状二酸化ケイ素を潤滑剤として加え均一混合し、成型することにより、錠剤母体を１０００個形成する。その後、その上に薄膜を形成することにより錠剤を形成する。薬の含有量は３７．５ｍｇ／錠である。
【００５１】
実施例７：マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩顆粒の製造
前記実施例の製造方法で製造したマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩を粉砕した後１６０メッシュの篩にかける。取り出した１０３ｇの粉末に、希釈剤として１５０ｇのアルファ澱粉と矯味剤として１００ｇのキシロースを加えて製剤を製造し均一混合する。１％のカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を接着剤として軟質材料を製造し、２４メッシュの篩により造粒を行い、それを乾燥させて整粒を行い、分包により顆粒を得る。薬の含有量は４２ｍｇ／ｇである。
【００５２】
実施例８：マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩カプセルの製造
前記実施例の製造方法で製造したマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩２の化合物を粉砕した後１６０メッシュの篩にかける。取り出した７５ｇの粉末に、希釈剤として２０ｇの微結晶セルロースと、２５ｇの薬用澱粉を加えて製剤を調製し均一混合する。１０％のポリビドンＫ３０アルコール溶液を接着剤として軟質材料を製造し、２４メッシュの篩により造粒を行い、これを乾燥させて整粒を行う。粒子をカプセルに加えることにより、１０００個のカプセルを形成する。薬の含有量は７５ｍｇ／ｇである。
【００５３】
実施例９：マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩ゲルの製造
１５ｇのヒドロキシプロピルメチルセルロースと１０ｇのアルギン酸ナトリウムに適量の水を加えて撹拌して溶解させることにより、基剤を形成する。５ｇのマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩４水和物に１００ｍｌのジメチルスルホキシドを加えて溶解させた後、これらを基剤に加えて均一混合することにより１０００ｍｌの均一な液体、すなわちマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩ゲルを形成する。
【００５４】
実施例１０：マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩凍結乾燥粉末注射剤の製造
４０ｇのマンニトールが入っている適切な容器に２００ｍｌの注射用水を加えた後、０．２ｇ（０．１％ｗ／ｖ）の注射用炭素を入れ、８０℃まで加熱して３０ｍｉｎ撹拌し、０．２２μmのミリポアフィルターで濾過して濾過液を使用に備える。１０ｇのマンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩２水和物に１００ｍｌのtert−ブチルアルコールを加えて撹拌することにより、マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩を完全に溶解させる。マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩溶液とマンニトール溶液を混合し、注射用水を１０００ｍｌまで注入し、０．２２μmのミリポアフィルターで濾過する。マンギフェリン−６−Ｏ−ベルベリン塩を１０ｍｇずつ包装して冷凍して乾燥させる。その後、真空で蓋を提供し、蓋を押し、ラベルを貼ることにより粉末注射剤を得る。
【００５５】
以上、本発明の好適な実施例を詳述してきたが、本発明の構成は上記の実施例に限定されるものではない。
＜工業上の実用性＞
【００５６】
本発明の製造方法は大量の有機溶剤を使用することにより環境に影響を与える問題とコストの問題を解決することができるので、その方法を工業的生産に応用することができる。