(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
珪藻を改変する方法であって、
(a)細胞を毒性基質に対して感受性にするタンパク質をコードする選択可能マーカー遺伝子を、珪藻のゲノム内で選択する工程、
(b)前記選択可能マーカー遺伝子内の標的配列を特異的に認識し切断するヌクレアーゼを用意する工程、
(c)前記ヌクレアーゼによる切断が前記選択可能マーカー遺伝子を不活性化するように、前記ヌクレアーゼを珪藻に導入する工程、
(d)前記珪藻を前記毒性基質と共に培養する工程、及び
(e)毒性基質に対して耐性である珪藻を選択する工程
を含み、
前記選択可能マーカー遺伝子と、前記毒性基質が
−  前記選択可能マーカー遺伝子が、ウリジン-5'-一リン酸シンターゼ(UMPS)遺伝子であり、前記毒性基質が、5-フルオロオロチン酸(5-FOA)である；
−  前記選択可能マーカー遺伝子が、硝酸レダクターゼ遺伝子であり、前記毒性基質が、塩素酸塩である；及び
−  前記選択可能マーカー遺伝子が、トリプトファンシンターゼ遺伝子であり、前記毒性基質が、5-フルオロインドールである
から選択され、
前記選択可能マーカー遺伝子の一部に相同な少なくとも1つの領域を含むポリヌクレオチドを、前記ポリヌクレオチドが前記選択可能マーカー遺伝子と組み換わるように珪藻に導入する工程をさらに含む、方法。
【請求項２】
工程c)において、前記珪藻を、前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドで形質転換し、細胞中に前記ヌクレアーゼを発現させることを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記珪藻が、タラシオシラ・シュードナナ又はフェオダクチラム・トリコルヌタムからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記選択可能マーカー遺伝子が、ウリジン-5'-一リン酸シンターゼ(UMPS)遺伝子であり、前記毒性基質が、5-フルオロオロチン酸(5-FOA)である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記選択可能マーカー遺伝子が、硝酸レダクターゼ遺伝子であり、前記毒性基質が、塩素酸塩である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記選択可能マーカー遺伝子が、トリプトファンシンターゼ遺伝子であり、前記毒性基質が、5-フルオロインドールである、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ヌクレアーゼが、TALEヌクレアーゼ、MBBBDヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、Cas9ヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
目的とする別のタンパク質を珪藻に導入する工程をさらに含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記目的とする別のタンパク質が、目的とする標的配列を認識し切断することが可能なヌクレアーゼである、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
形質転換された珪藻の選択が、ゲノム内に統合されたいずれの抗生物質選択可能マーカー遺伝子も有さずになされる、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
UMPS遺伝子（配列番号1）及び硝酸レダクターゼ遺伝子（配列番号2）からなる群から選択される遺伝子内の標的配列を認識するヌクレアーゼを含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法によって得られる珪藻。
【請求項１２】
前記ヌクレアーゼがTALEヌクレアーゼである、請求項11に記載の珪藻。
【請求項１３】
前記TALEヌクレアーゼが、配列番号5〜配列番号8のアミノ酸配列と、少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項12に記載の珪藻。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換細胞を選択する方法に関する。特に、本発明は、毒性化合物に対する細胞の耐性又は感受性を付与する内因性選択可能マーカーを不活性化するように操作されたヌクレアーゼの使用に関する。本発明は、本選択工程を含む、細胞、好ましくは藻類細胞のゲノムを改変する方法に関する。また本発明は、特異的な操作されたヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド、それらをコードするベクター、前記ヌクレアーゼを含むキット及び単離された細胞にも関する。
【背景技術】
【０００２】
藻類の生成物の用途は、食物、飼料及び燃料のための簡単なバイオマス生産から、化粧品、医薬品、顔料、糖高分子及び栄養補助食品などの有益な製品までに及ぶ。
【０００３】
微小藻類の特定の群として、珪藻は、地球上で最も生態学的に成功した単細胞の植物プランクトンの1つであり、地球規模の炭素固定のおよそ20%を占め、海洋食物網における主要な参加者の一つである。珪藻の主要な可能性のある商業的又は技術的な用途の1つは、液体燃料への変換に好適な豊富な量の脂質を蓄積する能力である。珪藻の大量の脂質を生産する高い可能性及び優れた成長効率のために、珪藻は、再生可能な生物燃料生産にとって藻類の最良のクラスの1つとみなされている。微小藻類の特定の群として、珪藻は、二倍体の生活環(life history)を有する真核性植物プランクトンの唯一の主要な群であり、すなわち全ての栄養細胞が二倍体であり、減数分裂により寿命の短い一倍体の配偶子が生産されるが、これは、複製された(二倍体)ゲノムが大部分を占める生活環が始祖的に選択されていることを示唆している。
【０００４】
数種の藻類種のゲノムが現在配列決定されているが、現段階で利用可能な微小藻類の遺伝学を調査するための遺伝学的ツールはほとんどないことから、これらの生物の様々なバイオテクノロジー用途での使用が著しく制限される。これらのモデル種における二倍体ゲノム構成及び未知の有性生殖特性が、ランダム変異誘発及び表現型選択に基づく古典的なアプローチの妨げとなっている。遺伝子発現がモジュレートされた株の生成は、主として、ランダムな遺伝子の過剰発現及びRNA干渉(RNAi)を使用した標的化遺伝子サイレンシング系を使用する(Siaut、Heijdeら2007; De Riso、Ranielloら2009)。近年、藻類のゲノム内で標的化ゲノム操作を行う能力は、ホーミングエンドヌクレアーゼの使用によって高められた(WO2012/017329)。
【０００５】
それにもかかわらず、低い形質転換率及び導入遺伝子の弱い発現のために、形質転換方法は、成功した形質転換細胞を識別するのに有効な選択マーカーを必要とする。しかしながら、珪藻での使用に適した選択マーカーに言及した公報はほとんどない。3種の抗生物質が細胞の成長を抑制することが示されており、珪藻の形質転換細胞を選択するのに使用されている。Dunahay、Jarvisら1995; Zaslavskaia、Lippmeierら2001は、シクロテラ・クリプティカ(Cyclotella cryptica)、ナビクラ・サプロフィラ(Navicula saprophila)及びフェオダクチラム・トリコルヌタム(Phaeodactylum tricornutum)種においてリン酸化によりG418を不活性化するネオマイシンホスホトランスフェラーゼII(nptII)の使用を報告している。Falciatore、Casottiら1999; Zaslavskaia、Lippmeierら2001は、フェオダクチラム・トリコルヌタム及びシリンドロテカ・フシフォルミス(Cylindrotheca fusiformis)種において化学量論的な結合によって作用するゼオシン又はフレオマイシン耐性遺伝子(Sh ble)の使用を報告している。Zaslavskaia、Lippmeierら2001では、フェオダクチラム・トリコルヌタム及びタラシオシラ・シュードナナ(Thalassiosira pseudonana)において酵素的アセチル化によってノウルセオトリシン(Nourseothricin)に対する耐性を付与するN-アセチルトランスフェラーゼ1遺伝子(Nat1)の使用が報告されている。
【０００６】
さらに、抗生物質耐性マーカーの広範な使用についての社会的関心が、不活性化されると形質転換細胞の選択が可能になる遺伝子を標的化するヌクレアーゼを使用するように構成される代替マーカー系を開発することに本発明者を駆り立ててきた。この方法は、2つの利点、すなわち、第1に利用可能な抗生物質及び除草剤マーカーがほとんどない珪藻のための新しい選択可能マーカーの同定、第2にゲノムに抗生物質遺伝子がまったく統合されないことから、遺伝子改変生物が生じ得ない形質転換細胞の選択をもたらす。この選択は、二倍体株の場合は両方の、一倍体株の場合は一方のみの対立遺伝子の不活性化を必要とし、高頻度の標的化変異誘発を誘導するヌクレアーゼの能力によって検討することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO2012/017329
【特許文献２】米国特許第4,683,195号
【特許文献３】WO2006/097854
【特許文献４】PCT/US2013/051783
【特許文献５】WO2012/058458
【特許文献６】米国特許第6,706,394号
【特許文献７】米国特許第5,516,670号
【特許文献８】US2013/0065314
【特許文献９】WO9011354
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL、2000、Wiley and son Inc、Library of Congress、USA)
【非特許文献２】Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版(Sambrookら、2001、Cold Spring Harbor、New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press)
【非特許文献３】Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編、1984)
【非特許文献４】Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries及びS. J. Higgins編 1984)
【非特許文献５】Transcription And Translation (B. D. Hames及びS. J. Higgins編 1984)
【非特許文献６】Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney、Alan R. Lis, Inc.、1987)
【非特許文献７】Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press、1986)
【非特許文献８】B. Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)
【非特許文献９】Methods In ENZYMOLOGYのシリーズ(J. Abelson及びM. Simon編集長、Academic Press, Inc.、New York)、第154巻及び第155巻(Wuら編)並びに第185巻、「Gene Expression Technology」(D. Goeddel編)
【非特許文献１０】Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller及びM. P. Calos編、1987、Cold Spring Harbor Laboratory)
【非特許文献１１】Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker編、Academic Press、London、1987)
【非特許文献１２】Handbook Of Experimental Immunology、第I巻〜第IV巻(D. M. Weir及びC. C. Blackwell編、1986)
【非特許文献１３】Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1986)
【非特許文献１４】Donnellyら、J. of General Virology 82: 1013〜1025 (2001)
【非特許文献１５】Donnellyら、J. of Gen. Virology 78: 13〜21 (1997)
【非特許文献１６】Doroninaら、Mol. And. Cell. Biology 28(13): 4227〜4239 (2008)
【非特許文献１７】Atkinsら、RNA 13: 803〜810 (2007)
【非特許文献１８】Champagneら、Magnetophoresis for pathway engineering in green cells. Metabolic engineering V: Genome to Product、Engineering Conferences International Lake Tahoe CA、要旨76頁; 2004
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、毒性基質に対する耐性を付与する遺伝子の不活性化に基づく選択方法を開発する。具体的には、本発明者は、ウリジン-5'-一リン酸シンターゼ(UMPS)、硝酸レダクターゼ遺伝子又はトリプトファンシンセターゼのようなピリミジンの合成における主要な酵素を不活性化することによってこの原理の証明を開始することを提唱する。これらの遺伝子の不活性化は、それぞれ5-フルオロオロチン酸(FOA)(Sakaguchi、Nakajimaら2011)、塩素酸塩(Daboussi、Djeballiら1989)及び5-フルオロインドール(Rohr、Sarkarら2004; Falciatore、Merendinoら2005)に対する耐性を付与することが示されている。
【００１０】
この方法は、選択可能マーカー遺伝子の1つを標的化するヌクレアーゼを、目的とする別のタンパク質と共に共形質転換することによって不活性化された遺伝子形質転換細胞を選択するのに特に好適である。目的とするタンパク質は、目的とする遺伝子を標的化して不活性化させるヌクレアーゼ、又はバイオテクノロジー用途における藻類の有用性値を増加させるタンパク質であり得る。この共形質転換は、複数のプラスミドを使用して、又は1つのみのプラスミドを使用して行うことができる。したがって、本発明者らは、目的とする遺伝子を標的化するヌクレアーゼを含有する陽性選択マーカー(5-FOA又は塩素酸塩)に対して耐性な形質転換細胞の比率を増加させる。送達は、遺伝子銃による形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションによって行うことができるが、さらに細胞透過性ペプチドを使用するタンパク質送達によっても行うことができ、したがってゲノム内に導入遺伝子が統合されていない遺伝的に未改変の生物の生成が可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
使用される全ての専門用語や科学用語は、本明細書で具体的に定義されない限り、遺伝子治療、生化学、遺伝学、及び分子生物学分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００１２】
本明細書で説明したものに類似した、又は同等な全ての方法及び材料は、本明細書で説明される好適な方法及び材料を用いた本発明の実施又は試験において使用することができる。本明細書で述べられた全ての公報、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりそれら全体が組み入れられる。矛盾がある場合、本明細書が定義も含めて優先される。さらに、材料、方法、及び実施例は単なる例示にすぎず、特に他の規定がない限り限定することを意図しない。
【００１３】
本発明の実施は、特に他の指定がない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、及び免疫学の従来の技術を採用し、これらは当業界の技術範囲内である。このような技術は、文献で詳細に説明されている。例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL、2000、Wiley and son Inc、Library of Congress、USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版(Sambrookら、2001、Cold Spring Harbor、New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編、1984); Mullisら米国特許第4,683,195号; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries及びS. J. Higgins編1984); Transcription And Translation (B. D. Hames及びS. J. Higgins編.1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney、Alan R. Liss, Inc.、1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press、1986); B. Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); Methods In ENZYMOLOGYのシリーズ(J. Abelson及びM. Simon編集長、Academic Press, Inc.、New York)、具体的には第154巻及び第155巻(Wuら編)並びに第185巻、「Gene Expression Technology」(D. Goeddel編); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller及びM. P. Calos編、1987、Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker編、Academic Press、London、1987); Handbook Of Experimental Immunology、第I巻〜第IV巻(D. M. Weir及びC. C. Blackwell編、1986);及びManipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1986)を参照されたい。
【００１４】
本発明は、毒性基質に対する耐性を付与する選択可能マーカー遺伝子の不活性化に基づく選択方法に関する。この方法は、前記選択可能マーカー遺伝子を切断することが可能なヌクレアーゼを細胞に導入する工程、及び前記毒性化合物に対して耐性な細胞を選択する工程を含む。特に、本発明は、形質転換細胞を選択する方法であって、
(a)細胞を毒性基質に対して感受性にするタンパク質をコードする細胞のゲノム内で、選択可能マーカー遺伝子を選択する工程、
(b)前記選択可能マーカー遺伝子を特異的に認識し切断するヌクレアーゼを用意する工程、
(c)前記ヌクレアーゼによる切断が前記選択可能な遺伝子を不活性化するように、前記ヌクレアーゼを細胞に導入する工程、
(d)前記細胞を前記毒性基質と共に培養する工程、及び
(e)毒性基質に対して耐性である細胞を選択する工程
を含む、方法に関する。
【００１５】
本発明に係る選択可能マーカーは、不要なエレメントを排除するのに役立つ。特に、選択可能マーカー遺伝子は、毒性基質を含む培地に対する感受性を付与する内因性遺伝子である。したがって、選択可能マーカー遺伝子の不活性化は、毒性基質を含む培地に対する耐性を付与する。これらのマーカーはしばしば、特定の条件下で毒性であるか、又は別の方法で複製に対して阻害性である。その結果として、不活性化された選択可能マーカー遺伝子を含む細胞を選択することが可能である。また細胞の選択は、特定の代謝産物に対して栄養要求性株の使用を介して達成することもできる。非限定的な例として、アミノ酸合成又は炭素源代謝に必要な遺伝子における点変異又は欠失を使用して、必要な栄養素を含まない培地で成長させたときに株を選択することができる。ほとんどの場合、選択には既定「最小」培地が必要である。富栄養培地で使用することができる、大腸菌(E. coli)由来のthyA及びdapA〜Eなどの選択的な栄養要求性マーカーが多数ある。
【００１６】
非限定的な例として、前記選択可能マーカーは、テトラサイクリンに対する耐性を付与するが親油性成分、例えばフザリン酸及びキナルジン酸(quinalic acid)に対する感受性は付与しないtetAR遺伝子(Bochner、Huangら1980; Maloy及びNunn 1981)、スクロースを細菌にとって有害なレバンに変換するレバンスクラーゼをコードするsacB枯草菌(b. subtilis)遺伝子(Steinmetz、Le Coqら1983; Gay、Le Coqら1985)、ストレプトマイシンのリボソームサブユニットタンパク質(S12)標的をコードするrpsL遺伝子(Dean 1981)、細菌ジャイレースの強力な毒物である細胞傷害性タンパク質(cell-killing protein)をコードするccdB(Bernard、Gabantら1994)、細菌をフェニルアラニン類似体のp-クロロフェニルアラニンに対して感受性にするPhe-tRNAシンセターゼのアルファサブユニットをコードするPheS(Kast 1994)、トリメトプリム及び関連化合物に対する感受性を付与するチミジンシンセターゼをコードするthya遺伝子(Stacey及びSimson 1965)、細菌をt-o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシドに対して感受性にするラクトースパーミアーゼをコードするlacY(Murphy、Stewartら1995)、フルオロアセタミドを毒性化合物のフルオロアセテートに変換するタンパク質をコードするamiE遺伝子(Collier、Spenceら2001)、mazF遺伝子、チミジンキナーゼ、ピリミジンヌクレオチドのデノボ合成及び細胞死をもたらす毒性化合物の5-フルオロウラシルへの5-フルオロオロチン酸(5-FOA)の変換に関与するタンパク質をコードするウリジン5'-一リン酸シンターゼ遺伝子(UMPS)(Sakaguchi、Nakajimaら2011)、塩素酸塩に対する感受性を付与するタンパク質をコードする硝酸レダクターゼ遺伝子(Daboussi、Djeballiら1989)、インドール類似体の5-フルオロインドール(5-FI)を毒性のトリプトファン類似体である5-フルオロトリプトファンに変換するトリプトファンシンターゼ遺伝子(Rohr、Sarkarら2004; Falciatore、Merendinoら2005)であり得る。本発明によれば、前記選択可能マーカーは、上述した様々な遺伝子の相同配列であってもよい。ここでタンパク質間又はDNA配列間の相同性は、共通の祖先の観点から規定される。2つのDNAセグメントが、分種化事象(オーソログ)又は重複事象(パラログ)のどちらかの理由で共通の祖先を有する可能性がある。好ましい実施形態において、前記細胞は、藻類細胞、より好ましくは珪藻であり、前記選択可能マーカー遺伝子は、UMPS又は硝酸レダクターゼ遺伝子である。
【００１７】
これらの選択可能マーカー遺伝子の不活性化は、毒性基質に対する感受性を付与する。遺伝子を不活性化することは、その目的とする遺伝子が機能性タンパク質の形態で発現されないことを意図している。特定の実施形態において、本方法の遺伝学的改変は、あるヌクレアーゼがある標的化された遺伝子の切断を特異的に触媒することによって前記標的化された遺伝子が不活性化されるように、操作するために用意された細胞で前記ヌクレアーゼを発現させることに頼っている。ヌクレアーゼによって引き起こされる核酸鎖の破断は、一般的に相同組換え又は非相同末端結合(NHEJ)の別個のメカニズムを介して修復される。しかしながら、NHEJは、しばしば切断部位でDNA配列の変化を引き起こす不完全な修復プロセスである。メカニズムは、2つのDNA末端の残りの部分を、直接の再ライゲーションを介して(Critchlow及びJackson 1998)又はいわゆるマイクロホモロジー介在末端結合によって(Ma、Kimら2003)再結合させることを含む。非相同末端結合(NHEJ)を介した修復はしばしば小挿入又は欠失を引き起こし、特異的な遺伝子ノックアウトを作り出すのに使用することができる。前記改変は、少なくとも1つのヌクレオチドの置換、欠失、又は付加であり得る。
【００１８】
前記ヌクレアーゼは、DNA又はRNA分子、好ましくはDNA分子内の核酸間の結合の加水分解(切断)を触媒することが可能な野生型又はバリアント酵素であり得る。特に、前記ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼであってもよく、より好ましくは、長さが10から45塩基対(bp)の範囲、通常長さが10から35塩基対の範囲の核酸の標的部位を認識する高度に特異的な低頻度切断型エンドヌクレアーゼ(rare-cutting endonuclease)であってもよい。本発明に係るエンドヌクレアーゼは、以降「標的配列」と称される特異的なポリヌクレオチド配列で核酸を認識し切断する。低頻度切断型エンドヌクレアーゼは、特異的なポリヌクレオチド配列で認識して一本鎖又は二本鎖の破断を生成することができる。
【００１９】
特定の実施形態において、本発明に係る前記低頻度切断型エンドヌクレアーゼは、Cas9エンドヌクレアーゼであり得る。実際に、近年、新しいゲノム操作ツールが、II型原核性CRISPR[クラスター化された等間隔にスペーサーが入った短鎖反復回文配列(Clustered Regularly Interspaced Short palindromic Repeats)]適応免疫系由来のRNAガイドCas9ヌクレアーゼ(Gasiunas、Barrangouら2012; Jinek、Chylinskiら2012; Cong、Ranら2013; Mali、Yangら2013)に基づき開発されてきた(総論については、Sorek、Lawrenceら2013を参照)。CRISPR関連(Cas)系は最初に細菌で発見されたものであり、ウイルス又はプラスミドのいずれかである外来DNAに対する防御として機能する。まずCRISPR介在ゲノム操作は、しばしばプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)と称される短い配列モチーフを両端に有する標的配列の選択によって進行する。標的配列の選択後、この標的配列に相補的な特異的なcrRNAが操作される。II型CRISPR系に必要なトランス活性化crRNA(tracrRNA)がcrRNAと対を形成し、提供されたCas9タンパク質に結合した。Cas9は、tracRNAとcRNAとの塩基対形成を容易にする分子アンカーとして作用する(Deltcheva、Chylinskiら2011)。この三元複合体において、tracrRNA:crRNAの二元構造は、エンドヌクレアーゼCas9を同系の標的配列に方向付けるガイドRNAとして作用する。Cas9-tracrRNA:crRNA複合体による標的認識は、標的配列とcrRNAとの間の相同性に関して標的配列をスキャンすることによって開始される。標的配列-crRNAの相補性に加えて、DNAの標的化は、プロトスペーサーに隣接する短いモチーフ(プロトスペーサー隣接モチーフ-PAM)の存在を必要とする。二元RNAと標的配列との間で対が形成されたら、Cas9はその後、PAMモチーフの3塩基上流に平滑二本鎖の破断を導入する(Garneau、Dupuisら 2010)。本発明において、ガイドRNAは、前記選択可能マーカーを特異的に標的とするように設計することができる。ガイドRNAと標的配列との間で対が形成された後、Cas9は、選択可能マーカー遺伝子内に切断(二本鎖の破断又は一本鎖の破断)を誘導する。またCas9は、標的核酸配列をプロセシングすることが可能な、操作されたエンドヌクレアーゼ又はCas9の相同体又はスプリットCas9も意味する。ここで「スプリットCas9」は、RuvC又はHNHドメインのいずれかを含むがこれらのドメインの両方は含まない、Cas9タンパク質又はCas9バリアントの切り詰められた又はトランケートされた形態を意味する。このような「スプリットCas9」は、ガイドRNAとは独立して使用することもできるし、又は例えばRuvCドメインを提供する1つのスプリットCas9とHNHドメインを提供する別のスプリットのように相補的な様式で使用することもできる。RuvC及び/又はNHNドメインのいずれかを有する異なるスプリットCas9を一緒に使用することもできる。
【００２０】
また低頻度切断型エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼの名称でも公知のホーミングエンドヌクレアーゼであってもよい。このようなホーミングエンドヌクレアーゼは、当分野において周知である(Stoddard 2005)。ホーミングエンドヌクレアーゼは高度に特異的であり、長さが12から45塩基対(bp)の範囲、通常は長さが14から40bpの範囲のDNA標的部位を認識する。本発明に係るホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、LAGLIDADGエンドヌクレアーゼ、HNHエンドヌクレアーゼ、又はGIY-YIGエンドヌクレアーゼに相当し得る。本発明に係る好ましいホーミングエンドヌクレアーゼは、I-CreIバリアントであり得る。「バリアント」エンドヌクレアーゼ、すなわち、自然界には通常存在せず、遺伝子工学又はランダム変異誘発により得られるエンドヌクレアーゼは、野生型エンドヌクレアーゼによって認識されるDNA配列とは異なるDNA配列と結合することができる(国際出願WO2006/097854を参照)。
【００２１】
前記低頻度切断型エンドヌクレアーゼは、モジュール式のDNA結合ヌクレアーゼであり得る。モジュール式のDNA結合ヌクレアーゼは、少なくとも1つのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインと、少なくとも1つのDNA結合ドメイン又は核酸標的配列を特定するタンパク質とを含むあらゆる融合タンパク質を意味する。DNA結合ドメインは、一般的に、二本鎖又は一本鎖ポリヌクレオチドを認識する少なくとも1つのモチーフを含有する独立してフォールディングしたポリペプチドタンパク質ドメインによって形成されたRNA又はDNA結合ドメインである。多くのこのようなポリペプチドは、特異的な核酸配列に結合する能力を有することが当業界において説明されている。このような結合ドメインはしばしば、非限定的な例として、へリックス-ターンへリックスドメイン、ロイシンジッパードメイン、ウィングドヘリックスドメイン、へリックス-ループ-へリックスドメイン、HMG-ボックスドメイン、イムノグロブリンドメイン、B3ドメイン又は操作されたジンクフィンガードメインを含む。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態によれば、DNA結合ドメインは、キサントモナス属(Xanthomonas)又はラルストニア属(Ralstonia)の細菌タンパク質に由来する一連の33〜35アミノ酸の反復によって配列特異性が引き起こされる転写活性化因子様エフェクター(TALE)から誘導される。これらの反復は、塩基対との相互作用を特定する2つのアミノ酸位置で本質的に異なっている(Boch、Scholzeら2009; Moscou及びBogdanove 2009)。DNA標的中の各塩基対が単一の反復と接触すると、反復の2つのバリアントアミノ酸(いわゆる反復可変ジペプチド、RVD)によって特異性がもたらされる。TALE結合ドメインは、標的化された配列の第1のチミン塩基(T0)の必要条件に関与するN末端転移ドメイン及び核局在化シグナル(NLS)を含有するC末端ドメインをさらに含んでいてもよい。TALE核酸結合ドメインは、一般的に、複数のTALE反復配列を含む操作されたコアTALE足場に相当し、各反復は、TALE認識部位の各ヌクレオチド塩基に特異的なRVDを含む。本発明において、前記コア足場の各TALE反復配列は、30から42アミノ酸、より好ましくは33又は34アミノ酸で構成されており、ここで12位及び13位に位置する2つの重要なアミノ酸(いわゆる反復可変ジペプチド、RVD)が、前記TALE結合部位配列の1つのヌクレオチドの認識を媒介し、等価な2つの重要なアミノ酸は、特に長さが33又は34アミノ酸より長いTALE反復配列中において12位及び13位以外の位置に配置されていてもよい。好ましくは、異なるヌクレオチドの認識に関連するRVDは、Cを認識する場合はHD、Tを認識する場合はNG、Aを認識する場合はNI、G又はAを認識する場合はNNである。別の実施形態において、重要なアミノ酸12及び13は、それらのヌクレオチドA、T、C及びGに対する特異性をモジュレートするため、特にこの特異性を強化するために他のアミノ酸残基に変異していてもよい。TALE核酸結合ドメインは通常、8から30個の間のTALE反復配列を含む。より好ましくは、本発明の前記コア足場は、8から20個の間のTALE反復配列を含み、ここでもより好ましくは15個のTALE反復配列を含む。またTALE核酸結合ドメインは、一連の前記TALE反復配列のC末端に配置される、20アミノ酸で構成された追加の単一のトランケートされたTALE反復配列、すなわち追加のC末端側半分のTALE反復配列を含んでいてもよい。
【００２３】
他の操作されたDNA結合ドメインは、モジュラー塩基対塩基特異的核酸結合ドメイン(MBBBD、modular base-per-base specific nucleic acid binding domain)(PCT/US2013/051783)である。前記MBBBDは、例えば、新たに同定されたタンパク質、すなわち近年配列決定された内部共生菌類であるバークホルデリア・リゾキシニカ(Burkholderia Rhizoxinica)のゲノムからのEAV36_BURRH、E5AW43_BURRH、E5AW45_BURRH及びE5AW46_BURRHタンパク質(Lackner、Moebiusら2011)から操作されてもよい。MBBBDタンパク質は、塩基特異的な約31から33アミノ酸のモジュールを含む。これらのモジュールは、キサントモナス属TALEの共通の反復と40%未満の配列同一性を表示し、それに対してこれらはより高いポリペプチド配列の変異性を示す。それにもかかわらず、これらが一緒に組み立てられると、これらのモジュール式のポリペプチドは、キサントモナス属TALEヌクレアーゼと極めて類似した様式で標的特異的な核酸配列であり得る。本発明の好ましい実施形態によれば、前記DNA結合ドメインは、10から30個の間のモジュール、好ましくは16から20個の間のモジュールを含む操作されたMBBBD結合ドメインである。上記のバークホルデリア属及びキサントモナス属由来のタンパク質からの異なるドメイン(モジュール、N及びC末端)が、特異的な核酸配列への結合特性を有する新しいタンパク質又は足場を操作するのに有用である。特に、操作されたMBBBDの追加のN末端及びC末端ドメインは、非限定的な例として、AvrBs3、PthXo1、AvrHah1、PthA、Tal1cのような天然TALEから誘導されてもよい。
【００２４】
「TALEヌクレアーゼ」又は「MBBBDヌクレアーゼ」は、典型的には転写活性化因子様エフェクタータンパク質(TALE)から誘導されたDNA結合ドメイン又はMBBBD結合ドメインと、エンドヌクレアーゼ触媒ドメインとの融合の結果生じる操作されたタンパク質を指す。このような触媒ドメインは、好ましくはヌクレアーゼドメインであり、より好ましくは例えばI-TevI、ColE7、NucA及びFok-Iのようなエンドヌクレアーゼ活性を有するドメインである。特定の実施形態において、前記ヌクレアーゼは、単量体TALEヌクレアーゼ又はMBBBDヌクレアーゼである。単量体ヌクレアーゼは、WO2012138927で説明されている操作されたDNA結合ドメインとI-TevIの触媒ドメインとの融合などの特異的な認識及び切断のための二量体化を必要としないヌクレアーゼである。他の特定の実施形態において、前記低頻度切断型エンドヌクレアーゼは、好ましくはFokIに融合したDNA結合ドメインを含む、二量体TALEヌクレアーゼ又はMBBBDヌクレアーゼである。前記二量体ヌクレアーゼは、反復配列の一部及びそれに隣接する配列を含む標的配列と結合することが可能な第1のDNA結合ヌクレアーゼと、二量体ヌクレアーゼが反復配列内の切断事象を誘導するように反復配列内の標的配列と結合することが可能な第2のDNA結合ヌクレアーゼとを含む(図1を参照)。TALEヌクレアーゼはすでに説明されており、遺伝子の標的化及び遺伝子改変を刺激するのに使用されている(Boch、Scholzeら2009; Moscou及びBogdanove 2009; Cermak、Doyleら2010; Christian、Cermakら2010)。このような操作されたTALEヌクレアーゼは、TALEN(商標)(Cellectis、8 rue de la Croix Jarry、75013 Paris、France)という商標名で市販されている。
【００２５】
別の実施形態において、前記ヌクレアーゼを有する細胞に追加の触媒ドメインをさらに導入して、標的化された遺伝子を不活性化するそれらの能力を強化するために変異誘発を増加させることができる。特に、前記追加の触媒ドメインは、DNA末端プロセシング酵素である。DNA末端プロセシング酵素の非限定的な例としては、5-3'エキソヌクレアーゼ、3-5'エキソヌクレアーゼ、5-3'アルカリ性エキソヌクレアーゼ、5'フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ホスファターゼ(hosphatase)、ヒドロラーゼ及び鋳型非依存性DNAポリメラーゼが挙げられる。このような触媒ドメインの非限定的な例は、hExoI(EXO1_HUMAN)、酵母ExoI(EXO1_YEAST)、大腸菌ExoI、ヒトTREX2、マウスTREX1、ヒトTREX1、ウシTREX1、sae2ヌクレアーゼ(CtBP相互作用タンパク質(CtIP)相同体)、ラットTREX1、TdT(末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ)ヒトDNA2、酵母DNA2(DNA2_YEAST)からなる群から選択されるタンパク質ドメイン又はタンパク質ドメインの触媒活性誘導体で構成される。好ましい実施形態において、前記追加の触媒ドメインは、3'-5'-エキソヌクレアーゼ活性を有し、より好ましい実施形態において、前記追加の触媒ドメインは、TREX、より好ましくはTREX2触媒ドメイン(WO2012/058458)である。別の好ましい実施形態において、前記触媒ドメインは、単鎖TREX2ポリペプチドによってコードされている。前記追加の触媒ドメインは、任意選択でペプチドリンカーにより本発明に係るヌクレアーゼ融合タンパク質又はキメラタンパク質に融合されていてもよい。
【００２６】
エンドヌクレアーゼによる破断は、相同組換えの速度を刺激することが知られている。したがって、別の実施形態において、本方法の遺伝学的改変工程は、選択可能マーカー遺伝子などの標的核酸配列の一部に相同な少なくとも1つの配列を含むドナーマトリックスを、標的核酸配列とドナーマトリックスとの間で相同組換えが起こるように細胞に導入する工程をさらに含む。特定の実施形態において、前記ドナーマトリックスは、それぞれ標的核酸配列の5'及び3'領域に相同な第1及び第2の部分を含む。好ましくは少なくとも50bpの、好ましくは100bpより大きい、より好ましくは200bpより大きい相同配列が、前記ドナーマトリックス内に使用される。それゆえに、相同配列は、好ましくは200bpから6000bpであり、より好ましくは1000bpから2000bpである。実際に、共通の核酸相同性は、破断部位の上流及び下流の両側にある領域に配置され、導入しようとする核酸配列は、2つのアームの間に配置されると予想される。
【００２７】
特に、前記ドナーマトリックスは、前記切断の上流の配列に相同性を有する第1の領域、1つの選択可能マーカー遺伝子を不活性化するための配列、及び切断の下流の配列に相同性を有する第2の領域を連続して含む。前記ポリヌクレオチドの導入工程は、前記ヌクレアーゼの導入又は発現と同時、その前又はその後であってもよい。このようなドナーマトリックスは、破断事象が発生した標的核酸配列の配置に応じて、例えば外因性核酸が前記遺伝子のオープンリーディングフレーム内に配置される場合、遺伝子をノックアウトする、又は新しい配列又は目的とする遺伝子を導入するのに使用することができる。新しい配列又は目的とする遺伝子は、様々なバイオテクノロジー用途のための商業的に望ましい特色をそれらに付与することによって目的とするタンパク質、好ましくは可能性のある藻類の活用を増すタンパク質、又は細胞ゲノム内の不活性化しようとする遺伝子を特異的に標的とするヌクレアーゼをコードすることができる。このようなドナーマトリックスを使用することによる配列の挿入を使用して、標的化された既存の遺伝子の修正又は置き換えによって、前記標的化された既存の遺伝子を改変することができ(非限定的な例として、対立遺伝子交換)、又は標的化された遺伝子の修正又は置き換えによって、前記標的化された遺伝子の発現をアップ又はダウンレギュレートすることができる(非限定的な例として、プロモーター交換)。
【００２８】
本発明の方法は、目的とする別のタンパク質を細胞に導入する工程をさらに含んでいてもよい。好ましくは、目的とするタンパク質は、様々なバイオテクノロジー用途に関する藻類の有用性及び商業的な価値を高めるのに有用である。より好ましい実施形態において、前記タンパク質は、脂質代謝に関与する。また目的とするタンパク質は、目的とする標的配列を認識し切断することができるヌクレアーゼであってもよい。結果得られた遺伝子の不活性化は、様々なバイオテクノロジー用途、例えば生物燃料生産のための商業的に望ましい特色をそれらに付与することによって藻類の可能性のある活用を高めることができる。
【００２９】
より好ましい実施形態において、目的とする前記タンパク質は、導入遺伝子として細胞に導入することができる。目的とする前記タンパク質及び本発明に係る選択可能マーカー遺伝子を切断するヌクレアーゼをコードする前記導入遺伝子は、1つの核酸によってコードされていてもよいし、又は異なる核酸、好ましくは異なるベクターとしてコードされていてもよい。異なる導入遺伝子は、リボソームスキップ配列、例えば2Aペプチドをコードする配列をコードする核酸配列を含む1つのベクターに包含されていてもよい。2Aペプチドは、ピコルナウイルスのアフタウイルス亜群で同定されたものであり、コドンによってコードされた2つのアミノ酸間にペプチド結合を形成することなく1つのコドンから次へのリボソームの「スキップ」を引き起こす(Donnellyら、J. of General Virology 82: 1013〜1025 (2001); Donnellyら、J. of Gen. Virology 78: 13〜21 (1997); Doroninaら、Mol. And. Cell. Biology 28(13): 4227〜4239 (2008); Atkinsら、RNA 13: 803〜810 (2007)を参照)。「コドン」は、リボソームによって1つのアミノ酸残基に翻訳されるmRNA(又はDNA分子のセンス鎖)における3つのヌクレオチドを意味する。したがって、フレーム内にある2Aオリゴペプチド配列でポリペプチドが隔てられている場合、mRNA内の単一の連続したオープンリーディングフレームから2つのポリペプチドを合成することができる。このようなリボソームスキップメカニズムは当業界において周知であり、単一のメッセンジャーRNAによってコードされた数種のタンパク質の発現のために数種のベクターによって使用されることが公知である。非限定的な例として、本発明において、2Aペプチドは、選択可能マーカー遺伝子を切断するヌクレアーゼ、及び目的とする遺伝子を切断して不活性化するヌクレアーゼ、DNA末端プロセシング酵素、目的とするタンパク質をコードするドナーマトリックス又は別の導入遺伝子を細胞に発現するのに使用されている。
【００３０】
送達方法
目的とするタンパク質を細胞に導入するための多種多様の方法が公知である。様々な実施形態において、選択可能マーカー遺伝子又は目的とする他のタンパク質を切断する前記ヌクレアーゼは、好ましくはベクター内に含まれる導入遺伝子によってコードされていてもよい。別の実施形態において、目的とする前記タンパク質は、RNA配列によってコードされている。前記ベクター又はRNA配列は、例えば、これらに限定されないが、エレクトロポレーション、磁気泳動によって細胞に導入することができる。後者は、磁気泳動プロセスとミクロサイズの直線状の磁石のナノテクノロジーによる製作とを使用する核酸導入技術であり(Kuehnleら、米国特許第6,706,394号; 2004; Kuehnleら、米国特許第5,516,670号; 1996)、これは、淡水性のクラミドモナス属(Chlamydomonas)における有効な葉緑体工学に適していることを証明しており、プラスチドの形質転換効率を、現況技術の遺伝子銃と比べて2桁改善した(Champagneら、Magnetophoresis for pathway engineering in green cells. Metabolic engineering V: Genome to Product、Engineering Conferences International Lake Tahoe CA、要旨76頁; 2004)。細胞を形質転換させるのに使用できる別の技術は、プロトプラストのポリエチレングリコール処理である(Maliga 2004)。様々な実施形態において、形質転換方法は、細胞への核酸の導入を可視化又は定量化するための1つ又は複数の方法と組み合わせることができる。またタンパク質トランスフェクションのための市販の適切な混合物も、藻類にタンパク質を導入するのに使用することができる。より広範には、細胞又は細胞内区画の内部への薬剤/化学物質及び分子(タンパク質)の送達を可能にするための当業界において公知のあらゆる手段、非限定的な例として、リポソーム送達手段、高分子担体、化学的な担体、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、ナノ粒子、エマルジョン、天然エンドサイトーシス又は食作用経路などを使用することができる。直接の導入、例えば目的とするタンパク質又はDNAの細胞中のマイクロインジェクションを検討することができる。より好ましい実施形態において、前記形質転換コンストラクトは、パーティクルインフローガン照射法(particle inflow gun bombardment)又はエレクトロポレーションによって宿主細胞に導入される。
【００３１】
別の特定の実施形態において、前記導入遺伝子又は目的とするタンパク質は、細胞透過性ペプチド(CPP)を使用することによって細胞に導入することができる。前記CPPは、導入遺伝子又は目的とするタンパク質(カーゴ分子と名付けられる)に会合していてもよい。この会合は、共有結合でもよいし、又は非共有結合でもよい。CPPは、2つの主要なクラス、すなわちカーゴとの化学結合を必要とする第1のクラスと、安定な非共有結合による複合体の形成を含む第2のクラスとにさらに分割することができる。前記カーゴ分子は、非限定的な例として、DNA又はRNAタイプのいずれかのポリヌクレオチド、好ましくは、目的とするタンパク質、例えばヌクレアーゼ、マーカー分子、藻類の遺伝学的性質を操作するのに有用な目的とするタンパク質、特に、脂肪酸代謝、炭水化物代謝、成長条件におけるストレス耐性に関連する遺伝子に関与するタンパク質、及び同種のものをコードするポリヌクレオチドであり得る。また前記カーゴ分子は、遺伝子、発現カセット、プラスミド、sRNA、siRNA、miRNA、shRNA、CRISPR系のガイドRNA、及び目的とするタンパク質、ヌクレアーゼ、マーカー分子などのポリペプチドであってもよい。
【００３２】
CPPの定義は絶えず進化しているが、CPPは、一般的に、受容体とは無関係の方式で細胞膜を通過して極性親水性生体分子を輸送することが可能な、タンパク質又はキメラ配列のいずれかから誘導された35アミノ酸未満の短いペプチドと説明されている。CPPは、カチオン性ペプチド、疎水性配列を有するペプチド、両親媒性ペプチド、プロリンリッチで抗微生物性の配列を有するペプチド、及びキメラ又は2部構成のペプチド(Pooga及びLangel 2005)であり得る。特定の実施形態において、カチオン性CPPは、複数の塩基性基を有するカチオン性CPP(例えば、アルギニン及び/又はリシン)を含み得る。好ましくは、CCPは両親媒性であり、正味の正電荷を有する。CPPは、生体膜を通過して、細胞膜を通過して細胞質に入る様々な生体分子の運動を開始させ、それらの細胞内の経路決定を改善することができ、それによって標的との相互作用が促進される。CPPの例としては、非限定的な例として、1型ヒト免疫不全ウイルス(HIV-1)によるウイルス複製に必要な101アミノ酸のタンパク質である核内転写活性化因子タンパク質であるTat、ショウジョウバエ属(Drosophilia)におけるホメオタンパク質のアンテナペディアの第3へリックスに相当するペネトラチン、カポジ線維芽細胞増殖因子(FGF)シグナルペプチド配列、インテグリンβ3シグナルペプチド配列、MPG、pep-1、スイートアローペプチド(sweet arrow peptide)、デルマセプチン、トランスポータン、pVEC、ヒトカルシトニン、マウスプリオンタンパク質(mPrPr)(US2013/0065314を参照)を挙げることができる。
【００３３】
TALEヌクレアーゼ
別の態様において、本発明はまた、本明細書で開示されたヌクレアーゼにも関する。特定の実施形態において、本発明は、UMPS遺伝子又は硝酸レダクターゼ遺伝子内、好ましくは、P.トリコルヌタムのUMPS遺伝子(配列番号1、GenBank: AB512669.1)又はP.トリコルヌタムの硝酸レダクターゼ遺伝子(配列番号2、GenBank: AY579336.1)内の標的配列を認識することが可能なヌクレアーゼに関し、好ましい実施形態において、UMPS又は硝酸レダクターゼ遺伝子内の標的配列は、配列番号1又は2の核酸配列と、少なくとも70%、好ましくは80%、85%、90%、95%の同一性を有する。特定の実施形態において、前記標的配列は、配列番号3及び配列番号4からなる群から選択され、好ましい実施形態において、前記標的配列は、配列番号3及び配列番号4からなる群から選択される核酸配列と、少なくとも70%、好ましくは80%、85%、90%、95%の同一性を有する。
【００３４】
特定の実施形態において、前記ヌクレアーゼは、TALEヌクレアーゼである。さらに特定の実施形態において、本発明は、配列番号5〜配列番号8からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するTALEヌクレアーゼに関する。好ましい実施形態において、前記TALEヌクレアーゼは、配列番号5〜配列番号8からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも70%、好ましくは80%、85%、90%、95%の同一性を有する。
【００３５】
ポリヌクレオチド、ベクター
また本発明は、これまでに述べられたヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、特にDNA又はRNAにも関する。これらのポリヌクレオチドは、原核又は真核細胞で発現されることを考慮して、ベクター、より具体的にはプラスミド又はウイルスに包含されていてもよい。ポリヌクレオチドは、発現カセット又は発現ベクター(例えば細菌の宿主細胞に導入するためのプラスミド、又はウイルスベクター、例えば昆虫宿主細胞のトランスフェクションのためのバキュロウイルスベクター、又はプラスミド若しくはウイルスベクター、例えば哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションのためのレンチウイルス)中に存在していてもよい。特定の実施形態において、本発明は、配列番号9〜配列番号12の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。当業者は、遺伝子コードの縮重を考慮すれば、これらのポリヌクレオチド分子のなかでも相当な配列バリエーションが考えられることを認識していると予想される。好ましくは、本発明の核酸配列は、藻類細胞で発現させるために、好ましくは珪藻細胞で発現させるためにコドン最適化される。コドン最適化は、目的とする配列において、所与の種の高度に発現される遺伝子において一般的に低頻度のコドンを、このような種の高度に発現される遺伝子において一般的に高頻度のコドンで交換することを指し、このようなコドンは、交換を受けるコドンと同様のアミノ酸をコードする。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号9〜配列番号12からなる群から選択される核酸配列と、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、95%、97%又は99%の配列同一性を有する。
【００３６】
単離された細胞
別の態様において、本発明は、上述した方法により入手可能な又は入手された単離された細胞に関する。特に、本発明は、選択可能マーカー遺伝子、好ましくはUMPS又は硝酸レダクターゼ遺伝子を認識し切断することが可能なヌクレアーゼを含む、細胞、好ましくは藻類細胞に関する。本発明の構成において、「藻類」又は「藻類細胞」は、本発明のヌクレアーゼを使用する選択方法のための宿主として使用することができる藻類の様々な種を指す。藻類の大部分は、主として根、葉及び高等植物に特徴的な他の器官の欠如によって一体化される光独立栄養生物である。用語「藻類」は、これらに限定されないが、数種の真核生物門、例えば、紅藻植物門(Rhodophyta)(紅藻類)、緑藻植物門(Chlorophyta)(緑藻類)、褐藻植物門(Phaeophyta)(褐藻類)、珪藻植物門(Bacillariophyta)(珪藻類)、ユースティグマトフィタ門(Eustigmatophyta)及び渦鞭毛藻類など、加えて原核生物門である青緑色細菌門(Cyanobacteria)(青緑藻)で構成される。用語「藻類」は、例えば、アンフォラ属(Amphora)、アナベナ属(Anabaena)、アンキストロデスムス属(Anikstrodesmus)、ボツリオコッカス属(Botryococcus)、キートケロス属(Chaetoceros)、クラミドモナス属(Chlamydomonas)、クロレラ属(Chlorella)、クロロコックム属(Chlorococcum)、キクロテラ属(Cyclotella)、シリンドロテカ属(Cylindrotheca)、ドナリエラ属(Dunaliella)、エミリアナ属(Emiliana)、ユーグレナ属(Euglena)、ヘマトコッカス属(Hematococcus)、イソクリシス属(Isochrysis)、モノクリシス属(Monochrysis)、モノラフィディウム属(Monoraphidium)、ナノクロリス属(Nannochloris)、ナノクロロプシス属(Nannnochloropsis)、ナビクラ属(Navicula)、ネフロクロリス属(Nephrochloris)、ネフロセルミス属(Nephroselmis)、ニッチア属(Nitzschia)、ノデュラリア属(Nodularia)、ネンジュモ属(Nostoc)、オクロモナス属(Oochromonas)、オーシスティス属(Oocystis)、オシラトリア属(Oscillatoria)、パブロバ属(Pavlova)、フェオダクチラム属(Phaeodactylum)、プラチモナス(Playtmonas)、プレウロクリシス属(Pleurochrysis)、アマノリ属(Porhyra)、シュードアナベナ属(Pseudoanabaena)、ピラミモナス属(Pyramimonas)、スティココッカス属(Stichococcus)、シネココッカス属(Synechococcus)、シネコシスティス属(Synechocystis)、テトラセルミス属(Tetraselmis)、タラシオシラ属(Thalassiosira)、及びトリコデスミウム属(Trichodesmium)から選択される藻類を包含する。
【００３７】
より好ましい実施形態において、藻類は、珪藻である。珪藻は、それらのナノメートル規模で互いに変化する非晶質シリカの細胞壁の種特異的な形態学によって識別される単細胞の光合成生物である。珪藻としては、非限定的な例として、フェオダクチラム属、フラジラリオプシス属(Fragilariopsis)、タラシオシラ属(Thalassiosira)、コシノディスカス属(Coscinodiscus)、アラキノイジスクスム属(Arachnoidiscusm)、アスター・オムファルス(Aster omphalus)、ナビクラ属、キートケロス属、コレトロン属(Chorethron)、シリンドロテカ・フシフォルミス、キクロテラ属、ラムプリスカス属(Lampriscus)、ギロシグマ属(Gyrosigma)、アクナンテス属(Achnanthes)、コッコネイス属(Cocconeis)、ニッチア属、アンフォラ属、シゾチトリウム属(Schizochytrium)及びオドンテラ属(Odontella)が挙げられる。より好ましい実施形態において、本発明に係る珪藻は、タラシオシラ・シュードナナ種又はフェオダクチラム・トリコルヌタム種由来である。
【００３８】
キット
本発明の別の態様は、これまでに述べられたような選択可能マーカーを認識し切断するヌクレアーゼを含む、藻類細胞選択のためのキットである。より具体的には、このキットは、任意選択で細胞選択のための十分な毒性基質、例えば塩素酸塩又は5'FOAと共に、UMPS又は硝酸レダクターゼ遺伝子を認識し切断することが可能なヌクレアーゼを含む。特に、本キットは、配列番号5〜配列番号8からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、95%、97%又は99%の配列同一性を有するTALEヌクレアーゼを含んでいてもよい。本キットは、上述したような選択方法を実現するのに必要な1つ又は数種の成分をさらに含んでいてもよい。
【００３９】
定義
上記の記載において、広範囲にわたり多数の用語が使用されている。以下の定義は、本発明の実施形態の理解を容易にするために提供される。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「1つの(a)」又は「1つの(an)」は、1つ又は1つより多くを意味する場合がある。
【００４１】
-  ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、本明細書では1文字コードに従って指定され、例えば、Qは、Gln又はグルタミン残基を意味し、Rは、Arg又はアルギニン残基を意味し、Dは、Asp又はアスパラギン酸残基を意味する。
【００４２】
-  アミノ酸置換は、1つのアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置き換えることを意味し、例えば、ペプチド配列中でアルギニン残基をグルタミン残基で置き換えることは、アミノ酸置換である。
【００４３】
-  ヌクレオチドは、以下のように指定される。1文字コードは、ヌクレオシドの塩基を指定するために使用され、aは、アデニンであり、tは、チミンであり、cは、シトシンであり、gは、グアニンである。変性ヌクレオチドの場合、rは、g又はa(プリンヌクレオチド)を表し、kは、g又はtを表し、sは、g又はcを表し、wは、a又はtを表し、mは、a又はcを表し、yは、t又はc(ピリミジンヌクレオチド)を表し、dは、g、a又はtを表し、vは、g、a又はcを表し、bは、g、t又はcを表し、hは、a、t又はcを表し、nは、g、a、t又はcを表す。
【００４４】
-  本明細書で使用される場合、「核酸」又は「核酸分子」は、ヌクレオチド及び/又はポリヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸(DNA)又はリボ核酸(RNA)、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって生成したフラグメント、並びにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、及びエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成したフラグメントを指す。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド(例えばDNA及びRNA)、若しくは天然に存在するヌクレオチドの類似体(例えば、天然に存在するヌクレオチドのエナンチオマーの形態)である単量体、又は両方の組合せで構成されていてもよい。核酸は、一本鎖又は二本鎖のどちらであってもよい。
【００４５】
-  「遺伝子」は、染色体に沿って直線状に並べられた、特異的なタンパク質又はタンパク質のセグメントをコードするDNAのセグメントからなる遺伝の基本単位を意味する。遺伝子は、典型的には、プロモーター、5'非翻訳領域、1つ又は複数のコード配列(エクソン)、任意選択でイントロン、3'非翻訳領域を包含する。遺伝子は、ターミネーター、エンハンサー及び/又はサイレンサーをさらに含んでいてもよい。
【００４６】
「ゲノム」は、核のゲノム、葉緑体のゲノム、ミトコンドリアのゲノムなどの細胞中に含有される全遺伝物質を意味する。
【００４７】
-  「標的配列」は、本発明に係る低頻度切断型エンドヌクレアーゼによってプロセシングすることができるポリヌクレオチド配列であることを意図している。これらの用語は、特異的なDNAの配置、好ましくは細胞中のゲノムの配置に加えて、プラスミド、エピソーム、ウイルス、トランスポゾンなどの遺伝物質の本体に、又は非限定的な例としてミトコンドリア若しくは葉緑体などの細胞器官中に独立して存在することができる遺伝物質の一部も指す。核酸標的配列は、前記標的の1本の鎖の5'から3'への配列によって定義される。
【００４８】
-  導入遺伝子という用語は、本明細書で使用される場合、核酸配列(例えば、1つ又は複数のポリペプチドをコードする)であって、それが導入される宿主細胞に対して部分的又は全体的に異種、すなわち外来である、核酸配列、又はそれが導入される宿主細胞の内因性遺伝子に相同であるが、それが挿入される細胞のゲノムが変更される(例えば、それが天然遺伝子の配置とは異なる配置に挿入されるか、又はその挿入がノックアウトを引き起こす)ような方式で細胞ゲノムに挿入されるように設計することができるか又は、挿入され得る、核酸配列を意味する。導入遺伝子は、1つ又は複数の転写調節配列、及びポリペプチドをコードする選択された核酸の最適な発現に必要な可能性がある他のあらゆる核酸、例えばイントロンを包含することができる。導入遺伝子によってコードされたポリペプチドは、発現されなくてもよいし、又は発現されてもよいが、導入遺伝子が挿入される藻類又は藻類細胞中で生物学的に非活性である。また導入遺伝子は、干渉RNAを産生するためにゲノム中に挿入される配列であってもよい。最も好ましくは、導入遺伝子は、珪藻中の脂質の量及び/又は品質を増加させるのに有用なポリペプチドをコードする。
【００４９】
-  「相同な」は、配列間で相同組換えが起こるのに十分な程度の別の配列との同一性を有する配列であって、より具体的には少なくとも95%の同一性、好ましくは97%の同一性、より好ましくは99%を有する配列を意味する。
【００５０】
-  「同一性」は、2つの核酸分子又はポリペプチド間の配列同一性を指す。同一性は、比較目的で並べることができる各配列中の位置を比較することによって決定することができる。比較された配列中の位置が同じ塩基で占められている場合、その分子は、その位置において同一である。核酸又はアミノ酸配列間の類似性又は同一性の程度は、核酸配列に共通する位置における同一な又はマッチしたヌクレオチドの数と相関関係にある。2つの配列間の同一性を計算するのに、様々なアライメントアルゴリズム及び/又はプログラムを使用することができ、そのようなものとして、GCG配列分析パッケージ(University of Wisconsin、Madison、Wis.)の一部として利用可能なFASTA、又はBLASTなどがあり、これらは例えばデフォルト設定で使用することができる。
【００５１】
-  「ベクター」は、連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を意味することを意図している。本発明で使用することができるベクターとしては、これらに限定されないが、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、又は染色体、非染色体、半合成若しくは合成核酸からなっていてもよい直鎖状若しくは環状DNA若しくはRNA分子が挙げられる。好ましいベクターは、それらに連結されている核酸の自律複製が可能なもの(エピソームベクター)及び/又は発現が可能なもの(発現ベクター)である。膨大な数の好適なベクターが当業者公知であり、市販されている。いくつかの有用なベクターとしては、これらに限定されないが、例えば、pGEM13z、pGEMT及びpGEMTEasy(Promega社、Madison、WI);pSTBluel(EMD Chemicals Inc.社、San Diego、CA);並びにpcDNA3.1、pCR4-TOPO、pCR-TOPO-II、pCRBlunt-II-TOPO(Invitrogen社、Carlsbad、CA)が挙げられる。好ましくは、前記ベクターは発現ベクターであり、ここで本発明の低頻度切断型エンドヌクレアーゼをコードする配列は、前記低頻度切断型エンドヌクレアーゼの産生又は合成を許容する適切な転写及び翻訳制御エレメントの制御下に置かれる。それゆえに、前記ポリヌクレオチドは、発現カセット中に含まれる。より具体的には、ベクターは、複製起点、前記ポリヌクレオチドに機能するように連結されたプロモーター、リボソーム結合部位、RNAスプライシング部位(ゲノムDNAが使用される場合)、ポリアデニル化部位及び転写終結部位を含む。ベクターは、エンハンサーを含んでいてもよい。プロモーターの選択は、ポリペプチドが発現される細胞に依存すると予想される。好ましくは、前記低頻度切断型エンドヌクレアーゼがヘテロ二量体である場合、単量体のそれぞれをコードする2つのポリヌクレオチドは、プラスミド内の組換え事象を回避するために2つのベクターに包含される。別の実施形態において、単量体のそれぞれをコードする2つのポリヌクレオチドは、両方のポリヌクレオチドの発現を同時に駆動させることができる1つのベクターに包含される。いくつかの実施形態において、本発明に係る低頻度切断型エンドヌクレアーゼの発現のためのベクターは、藻類特異的なプロモーターに機能するように連結されていてもよい。いくつかの実施形態において、藻類特異的なプロモーターは、誘導性プロモーターである。いくつかの実施形態において、藻類特異的なプロモーターは、構成的プロモーターである。使用することができるプロモーターとしては、これらに限定されないが、例えば、Pptca1プロモーター(葉緑体の炭酸脱水酵素遺伝子のCO2応答性プロモーター、ptca1、P.トリコルヌタム由来)、NITlプロモーター、AMTlプロモーター、AMT2プロモーター、AMT4プロモーター、RHlプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、タバコモザイクウイルスプロモーター、シミアンウイルス40プロモーター、ユビキチンプロモーター、PBCV-IVP54プロモーター、若しくはそれらの機能的なフラグメント、又は当業者公知の他のあらゆる好適なプロモーター配列が挙げられる。本発明に係る別のより好ましい実施形態において、ベクターはシャトルベクターであり、これは、大腸菌で増殖することができ(適切な選択可能マーカー及び複製起点を含有するコンストラクト)、選択された藻類のゲノムでも増殖又は��合に対応することができる。
【００５２】
-  用語「プロモーター」は、本明細書で使用される場合、それに機能するように連結されている核酸配列の転写を指示するのに十分な最小の核酸配列を指す。用語「プロモーター」はまた、細胞型特異的な発現、組織特異的な発現に関して制御可能な、又は外来のシグナル又は薬剤によって誘導可能なプロモーター依存性遺伝子発現にとって十分なプロモーターエレメントを包含することも意図している。このようなエレメントは、天然に存在する遺伝子の5'又は3'領域に配置されている場合がある。
【００５３】
「誘導性プロモーター」は、転写活性を有するプロモーターであって、転写活性化因子に結合した場合、それに続いて、特異的な条件下で、例えば、転写活性化因子、例えばCO2又はNO2の誘導性プロモーターへの結合に影響を与える、及び/又は転写活性化因子それ自体の機能に影響を与える特定の化学的シグナル又は化学的シグナルの組合せの存在下で活性化される、プロモーターを意味する。
【００５４】
用語「宿主細胞」は、本発明の方法を使用して形質転換されている細胞を指す。一般的に、本明細書で使用されるような宿主細胞は、核酸標的配列が改変されている藻類細胞を意味する。
【００５５】
「変異誘発」は、低頻度切断型エンドヌクレアーゼの認識部位を境界に有する少なくとも1つの所与のDNAフラグメント(少なくとも1つのヌクレオチド)又は配列の排除又は付加と理解される。
【００５６】
「NHEJ」(非相同末端結合)は、相同なテンプレートを必要とせずに破断の末端が直接ライゲートされるDNA中の二本鎖の破断を修理する経路を意図している。NHEJは、少なくとも2種の異なるプロセスを含む。メカニズムは、2つのDNA末端の残りの部分を、直接の再ライゲーションを介して(Critchlow、1998 #17)、又は小挿入若しくは欠失を引き起こすいわゆるマイクロホモロジー介在末端結合によって(Akopian、Heら 2003)再結合させることを含み、特異的な遺伝子ノックアウトを作り出すのに使用することができる。
【００５７】
用語「相同組換え」は、DSB及び他のDNA損傷の修復に関与する、保存されたDNAの維持経路を指す。遺伝子標的化実験において、遺伝情報の交換は、内因性の染色体配列と外因性のDNAコンストラクトとの間で促進される。標的化されたコンストラクトの設計に応じて、遺伝子を、合理的で、正確で、効率的な方式でノックアウト、ノックイン、置き換え、修正又は変異することができる。このプロセスは、標的化コンストラクトと標的化された遺伝子座との間の相同性を必要とする。WO9011354で説明されているようなより正確な統合をもたらすために、相同組換えは、好ましくは、内因性配列との同一性を有する2つのフランキング配列を使用して行われる。
【００５８】
上記された本発明の説明は、あらゆる当業者が本発明を作製及び使用することができるように、本発明を作製及び使用する方式及びプロセスを提供するものであり、この実施可能性は、特に元の記載の一部を構成する添付の特許請求の範囲の主題に提供される。
【００５９】
上記で使用されているように、成句「〜からなる群から選択される」、「〜から選ばれる」及び同種のものは、特定の材料の混合物を包含する。
【００６０】
本明細書において数値の限定又は範囲が述べられている場合、端点も包含される。また数値の限定又は範囲内の全ての値及び部分範囲も、明示的に記述されているかのように具体的に包含される。
【００６１】
上記の説明は、当業者が本発明を作製及び使用することを可能にするために提示され、特定の適用及びその必要条件の状況下で提供される。好ましい実施形態への様々な改変は、当業者には容易に明らかになると予想され、本明細書において定義された全体的な原理は、本発明の本質及び範囲から逸脱することなく他の実施形態及び適用に適用され得る。したがって本発明は、示された実施形態に限定されることは意図されないが、本明細書で開示された原理及び特徴と一致する最も広い範囲を許容するものとする。
【００６２】
本発明を一般的に説明したが、ある種の具体的な実施例を参照することによりさらなる理解を達成することができるが、このような実施例は、単に例示のために本明細書で示され、特に他の規定がない限り限定することを意図しない。
【実施例】
【００６３】
(実施例1)
UMPS遺伝子を標的化して5-FOAに対する耐性を付与するTALENを使用して珪藻形質転換細胞を選択するための新しい方法
海洋性珪藻のフェオダクチラム・トリコルヌタムにおけるタンパク質をコードするプラスミドの送達は、10-8もの極めて低い形質転換効能のために、抗生物質で選択可能なマーカーとの共形質転換によって媒介される。
【００６４】
ここで本発明者らは、目的とするタンパク質をコードするプラスミドと、ピリミジン:ウリジン-5'-一リン酸シンターゼの合成において主要な酵素をコードする遺伝子UMPSを標的化するTALENをコードするプラスミドとの共形質転換からなる新しい選択可能な方法の使用を提唱する。このTALENにより誘導された変異誘発事象は、これまでに報告されているように(Sakaguchi、Nakajimaら 2011)、5-フルオロオロチン酸(5-FOA)に対する耐性を付与することがこれまでに報告されている遺伝子の不活性化をもたらすことができた。そのため、DNA配列5'-TTTAGTCTGTCTCTAGGTGTTCTCAAATTCGGCTCTTTTGTGCTGAAAA-3'(配列番号3)を切断するように設計されたpCLS20603(配列番号13)及びpCLS20604(配列番号14)プラスミドによってコードされたUMPS_TALEN(配列番号5及び配列番号6)が使用された。このTALENによって形質転換された珪藻は、Sakaguchi、Nakajimaら 2011で説明された条件に従って5-FOA培地で選択されると予想される。
【００６５】
材料及び方法
培養条件
フェオダクチラム・トリコルヌタムのBohlinクローンCCMP2561を、三洋のインキュベーター(モデルMLR-351)中、一定温度(20+/-0.5℃)で、ろ過済みのシリカ非含有ギラードf/2培地(1×ギラードf/2海水栄養液(Sigma社のG0154)が補充された40パーミルw/vのSigma社の海塩S9883)中で成長させた。インキュベーターは、フォトン約120μmol・m-2s-1の照度と12時間の明期:12時間の暗期の光周期(照明期間は9AMから9PM)をもたらす白色の冷たいネオン光チューブを備えている。
【００６６】
遺伝子形質転換
5.107個の細胞を、指数関数的に成長する液体培養物(細胞約106個/mlの濃度)から遠心分離によって収集した(3000rpm、10分、20℃)。上清を捨て、細胞ペレットを500μlの新しいf/2培地に再懸濁した。次いで細胞懸濁液を、シリカ非含有f/2溶液が補充された20パーミルの海塩を含有する10cmの1%寒天プレートの中心の3分の1に塗り広げた。2時間後、微粒子照射法[バイオリスティックPDS-1000/He粒子送達システム(BioRad社)]を使用して形質転換を実行した。このプロトコールは、Falciatore、Casottiら 1999及びApt、Kroth-Pancicら 1996からわずかな改変を加えて適合させたものである。簡単に言えば、M17タングステン粒子(直径1.1μm、BioRad社)を、製造元の説明書に従って1.25MのCaCl2及び20mMのスペルミジンを使用して、3μgのTALENの各単量体(pCLS20603及びpCLS20604)を含有する総量6μgのDNAでコーティングした。陰性対照として、ビーズを、6μgの空のベクター(pCLS0003)(配列番号17)を含有するDNA混合物でコーティングした。形質転換しようとする珪藻を含む寒天プレートを、照射チャンバー内のストッピングスクリーン(ポジション2上のターゲットシェルフ)から7.5cmに置いた。1550psiのバースト圧力及び25Hg/インチの真空を使用した。照射の後、プレートを、12時間の明期:12時間の暗期の光周期を用いて48時間インキュベートした。
【００６７】
選択
形質転換の2日後、照射した細胞を700μlのシリカ非含有f/2培地を用いて穏やかにかき取り、2つの10cmの5-FOAを含有する1%寒天プレート(シリカ非含有f/2培地が補充された20パーミルの海塩)上に塗り広げた。次いでプレートを、少なくとも3週間にわたり12時間の明期:12時間の暗期サイクル下でインキュベーター中に置いた。
【００６８】
特徴付け
耐性コロニーを選び、エッペンドルフチューブ中で20μlの溶解緩衝液(1%のTritonX-100、20mMのトリス-HCl pH8、2mMのEDTA)に解離させた。チューブを少なくとも30秒ボルテックスで混合し、次いで氷上で15分維持した。85℃で10分加熱した後、チューブを室温で冷却し、短時間で遠心分離して、細胞破片をペレット化した。上清を即座に使用するか又は4℃でストックした。上清とmilliQ H2Oとの1:5希釈液5μlを各PCR反応に使用した。UMPS標的を溶解コロニーの1:5希釈液を使用して特異的なプライマーにより増幅させ、配列決定して、変異誘発事象の性質を同定する。
【００６９】
結果
TALENをコードするプラスミドを用いた珪藻の形質転換は、5-FOAが補充された培地で成長する能力を付与するUMPS遺伝子の不活性化をもたらす。
【００７０】
(実施例2)
硝酸レダクターゼ遺伝子を標的化して塩素酸塩に対する耐性を付与するTALENを使用して珪藻形質転換細胞を選択するための新しい方法
海洋性珪藻のフェオダクチラム・トリコルヌタムにおけるタンパク質をコードするプラスミドの送達は、10-8もの極めて低い形質転換効能のために、抗生物質で選択可能なマーカーとの共形質転換によって媒介される。
【００７１】
ここで本発明者らは、目的とするタンパク質をコードするプラスミドと、硝酸塩代謝における1つの主要な酵素である硝酸レダクターゼをコードする遺伝子NRを標的化するTALENをコードするプラスミドとの共形質転換からなる新しい選択可能な方法の使用を提唱する。このTALENにより誘導された変異誘発事象は、これまでに報告されているように(Daboussi、Djeballiら1989)、塩素酸塩に対する耐性を付与することがこれまでに報告されている遺伝子の不活性化をもたらすことができた。そのため、DNA配列5'-TGAAGCAGCATCGATTTATTACGCCGTCCTCGTTGCATTACGTACGCAA-3'(配列番号2)を切断するように設計されたpCLS16353(配列番号15)及びpCLS16354(配列番号16)プラスミドによってコードされたNR_TALEN(配列番号7及び配列番号8)が使用された。このTALENによって形質転換された珪藻は、Daboussi、Djeballiら1989で説明された条件に従って塩素酸塩培地で選択されると予想される。
【００７２】
材料及び方法
培養条件
フェオダクチラム・トリコルヌタムのBohlinクローンCCMP2561を、三洋のインキュベーター(モデルMLR-351)中、一定温度(20+/-0.5℃)で、ろ過済みのシリカ非含有ギラードf/2培地(1×ギラードf/2海水栄養液(Sigma社のG0154)が補充された40パーミルw/vのSigma社の海塩S9883)中で成長させた。インキュベーターは、フォトン約120μmol・m-2s-1の照度と12時間の明期:12時間の暗期の光周期(照明期間は9AMから9PM)をもたらす白色の冷たいネオン光チューブを備えている。
【００７３】
遺伝子形質転換
5.107個の細胞を、指数関数的に成長する液体培養物(細胞約106個/mlの濃度)から遠心分離によって収集した(3000rpm、10分、20℃)。上清を捨て、細胞ペレットを500μlの新しいf/2培地に再懸濁した。次いで細胞懸濁液を、シリカ非含有f/2溶液が補充された20パーミルの海塩を含有する10cmの1%寒天プレートの中心の3分の1に塗り広げた。2時間後、微粒子照射法[バイオリスティックPDS-1000/He粒子送達システム(BioRad社)]を使用して形質転換を実行した。このプロトコールは、Falciatore、Casottiら 1999及びApt、Kroth-Pancicら 1996からわずかな改変を加えて適合させたものである。簡単に言えば、M17タングステン粒子(直径1.1μm、BioRad社)を、製造元の説明書に従って1.25MのCaCl2及び20mMのスペルミジンを使用して、3μgのTALENの各単量体(pCLS16353及びpCLS16354)を含有する総量6μgのDNAでコーティングした。陰性対照として、ビーズを、6μgの空のベクター(pCLS0003)(配列番号17)を含有するDNA混合物でコーティングした。形質転換しようとする珪藻を含む寒天プレートを、照射チャンバー内のストッピングスクリーン(ポジション2上のターゲットシェルフ)から7.5cmに置いた。1550psiのバースト圧力及び25Hg/インチの真空を使用した。照射の後、プレートを、12時間の明期:12時間の暗期の光周期を用いて48時間インキュベートした。
【００７４】
選択
形質転換の2日後、照射した細胞を700μlのシリカ非含有f/2培地を用いて穏やかにかき取り、2つの10cmの塩素酸塩を含有する1%寒天プレート(シリカ非含有f/2培地が補充された20パーミルの海塩)上に塗り広げた。次いでプレートを、少なくとも3週間にわたり12時間の明期:12時間の暗期サイクル下でインキュベーター中に置いた。
【００７５】
特徴付け
耐性コロニーを選び、エッペンドルフチューブ中で20μlの溶解緩衝液(1%のTritonX-100、20mMのトリス-HCl pH8、2mMのEDTA)に解離させた。チューブを少なくとも30秒ボルテックスで混合し、次いで氷上で15分維持した。85℃で10分加熱した後、チューブを室温で冷却し、短時間で遠心分離して、細胞破片をペレット化した。上清を即座に使用するか又は4℃でストックした。上清とmilliQ H2Oとの1:5希釈液5μlを各PCR反応に使用した。UMPS標的を溶解コロニーの1:5希釈液を使用して特異的なプライマーにより増幅させ、配列決定して、変異誘発事象の性質を同定する。
【００７６】
結果
TALENをコードするプラスミドを用いた珪藻の形質転換は、塩素酸塩が補充された培地で成長する能力を付与するNR遺伝子の不活性化をもたらす。
【００７７】
(参考文献)
0006542226.tif 000002
0006542226.tif 000003
【配列表】
0006542226000001.app