(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
臓器、組織又は細胞の移植における使用のための組成物であって、
（１）配列番号１のアミノ酸配列から成るペプチド、又は
（２）前記（１）のペプチドと９０％以上の配列相同性を有し、かつ、前記（１）のペプチドと同等の活性を有するペプチド
を含む、臓器、組織又は細胞の移植における使用のための組成物。
【請求項２】
前記組成物は、虚血再灌流損傷の治療又は予防のために使用される、請求項１に記載の臓器、組織又は細胞の移植における使用のための組成物。
【請求項３】
前記組成物は、供与者及び／又は受容者に投与されるものである、請求項１に記載の臓器、組織又は細胞の移植における使用のための組成物。
【請求項４】
前記組成物は、移植前、移植中及び移植後のうちいずれか一つ以上の段階で投与されるものである、請求項３に記載の臓器、組織又は細胞の移植における使用のための組成物。
【請求項５】
前記組成物は、供与者から分離した臓器、組織又は細胞を保存するために使用される、請求項１に記載の臓器、組織又は細胞の移植における使用のための組成物。
【請求項６】
前記組成物は、受容者に移植した後の臓器、組織又は細胞の生存力又は機能を強化するために使用される、請求項１に記載の臓器、組織又は細胞の移植における使用のための組成物。
【請求項７】
投与されるペプチドの一日投与用量は、１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｇ／ｋｇ／日である、請求項３に記載の臓器、組織又は細胞の移植における使用のための組成物。
【請求項８】
リン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、セルシオ（Celsior）（商標）溶液、パーファデックス（Perfadex）（商標）、コリンズ（Collins）溶液、クエン酸塩溶液、及びユニバーシティ・オブ・ウィスコンシン（ＵＷ）溶液から成る群から選択される、臓器、組織又は細胞を保持するのに適合した液体をさらに含む、請求項１に記載の臓器、組織又は細胞の移植における使用のための組成物。
【請求項９】
請求項１〜請求項８のうちいずれか１項に記載の臓器、組織又は細胞の移植における使用のための組成物、及び
前記組成物の使用方法を含む説明書を含む、臓器、組織又は細胞の移植における使用のためのキット。
【請求項１０】
前記組成物は、
移植前に供与者に投与される組成物、
移植前に受容者に投与される組成物、
移植中に供与者に投与される組成物、
移植中に受容者に投与される組成物、
供与者から分離した臓器、組織又は細胞を保存するための組成物、
移植後に供与者に投与される組成物、及び
移植後に受容者に投与される組成物のうちいずれか一つ以上である、請求項９に記載の臓器、組織又は細胞の移植における使用のためのキット。
【請求項１１】
前記説明書は、前記各組成物の投与量、投与方法及び投与間隔を含む、請求項１０に記載の臓器、組織又は細胞の移植における使用のためのキット。
【請求項１２】
前記説明書は、前記組成物を、臓器、組織又は細胞が供与者又は受容者の体内に存在する状態で、体内で臓器、組織又は細胞を灌流させる方式で投与する内容を含む、請求項１１に記載の臓器、組織又は細胞の移植における使用のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臓器、組織又は細胞移植に用いられる組成物、臓器、組織又は細胞移植に用いられるキット、又は臓器、組織又は細胞移植方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臓器移植とは、ある組織又は臓器の破損された機能を代替する目的として、存在する元の場所から他の場所に、組織又は臓器を移し植えることを言う。臓器移植の過程においては、様々な問題が生じ得るが、そのうちの一つは、虚血再灌流（ＩＲ：ischemia-reperfusion）による虚血性組織損傷である。臓器移植の過程で起こる虚血再灌流（ＩＲ：ischemia-reperfusion）による虚血性組織損傷は、臓器移植後に臓器機能の回復を遅延させる結果を生み出し、それは、炎症性組織反応により、移植された臓器機能の長期維持に好ましくない予後因子として作用する場合が多い。臓器移植の過程において付随的に発生する初期虚血再灌流損傷は、後続的な臓器機能の悪化及び移植の失敗につながることもある。
【０００３】
特に、肺移植は、末期の肺疾患において、唯一の治療の代案として知られており、将来、肺移植への患者の要求は、増え続けると予想される。しかし、医学の発展にも関わらず、肺移植の生存率は、いまだに他の臓器に比べて、高くない。最も頻繁に起こる、肺移植後の初期の問題は、移植機能障害（graft dysfunction）であって、この原因のうちの一つが、虚血再灌流損傷（ischemia-reperfusion injury）である。
【０００４】
一方、皮弁（flap）とは、移動される組織が生存可能な血管茎、及びこれに準する組織を付着させ、身体の一部分から他の部分に移される皮膚や組織を意味する。皮弁術は、皮膚移植術などでは解決できない軟部組織の欠損や慢性創傷などに利用され、成形外科の領域で最も広く行われる手術方法であり、外見上だけではなく、失った機能の復元に有用な方法であり、特に、骨、腱、筋肉、神経などの様々な組織の複合的な移植によって一次的な再建が可能で、迅速な回復の可能であるという長所がある。このような皮弁術において、皮弁生存率は、虚血再灌流損傷の治療と密接な関係がある。そのために、虚血再灌流損傷の治療方法を介して、皮弁生存率を安定して向上できる方法があれば、非常に有用であると予想される。
【０００５】
また、細胞移植は、臓器又は組織移植と同様に、疾病を治療するための手段として行われるものであって、代表的な例としては、１型糖尿病の改善のための膵島（ランゲルハンス島）移植を挙げられる。膵島（ランゲルハンス島）移植後、第１週内に、移植片の殆どが喪失されるが、その原因は、移植後、２次血管の形成の前に、低酸素症のような多様なストレス因子に暴露されることと、前駆炎症性サイトカイン及びフリーラジカルに暴露されることから見付けることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
非特許文献１： Ｇｒａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，５７、３１１−３３２（１９９５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、臓器、組織及び個々の細胞移植片の生存力及び／又は機能を促進することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、臓器、組織又は細胞の移植後の生存力及び／又は機能を強化することである。
【０００９】
本発明のまた他の目的は、臓器、組織又は細胞を損傷することなく、一時的に保存できる方法及び／又は組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一側面において、本発明は、臓器、組織又は細胞移植用組成物であって、前記組成物は、有効成分として、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、該アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、又はそのフラグメントであるペプチドを含む、臓器、組織又は細胞移植用組成物を提供する。前記組成物において、前記フラグメントは、３個以上のアミノ酸から構成されたフラグメントであってもよい。
【００１１】
一側面において、前記組成物は、供与者及び／又は受容者に投与されるものであってもよい。
【００１２】
一側面において、前記組成物は、移植前、移植中、及び移植後のうちいずれか一つ以上の段階で投与されるものであってもよい。
【００１３】
別の側面において、前記組成物は、供与者から分離した臓器、組織又は細胞を保存するためのものであってもよい。
【００１４】
一側面において、前記組成物は、前記有効成分であるペプチドを、受容者に移植した後の臓器、組織又は細胞の生存力又は機能を強化するのに十分な量で含むものであってもよい。
【００１５】
一側面において、前記組成物は、前記有効成分であるペプチドを、組成物全体の容積に対して、１０ｍｇ／Ｌ〜１００００ｍｇ／Ｌの濃度で含むものであってもよい。
【００１６】
一側面において、前記組成物は、前記有効成分であるペプチドを、組成物全体の容積に対して、５０ｍｇ／Ｌ〜６０００ｍｇ／Ｌの濃度で含むものであってもよい。
【００１７】
一側面において、本発明は、臓器、組織又は細胞移植用組成物、及び該組成物の使用方法を含む説明書を含む、臓器、組織又は細胞移植用キットを提供する。
【００１８】
一側面において、前記キットにおける前記組成物は、移植前に供与者に投与される組成物、移植前に受容者に投与される組成物、移植中に供与者に投与される組成物、移植中に受容者に投与される組成物、供与者から分離した臓器、組織又は細胞を保存するための組成物、移植後に供与者に投与される組成物、及び移植後に受容者に投与される組成物のうちいずれか一つ以上であってもよい。
【００１９】
別の側面において、前記キットにおける前記説明書は、前記各組成物の投与量、投与方法及び投与間隔を含んでもよい。
【００２０】
別の側面によるキットにおいて、前記説明書は、前記組成物を、臓器、組織又は細胞が供与者又は受容者の体内に存在する状態で、体内で臓器、組織又は細胞を灌流させる方式で投与する内容を含んでもよい。
【００２１】
別の側面において、本発明は、臓器、組織又は細胞移植方法であって、前記方法は、前述の臓器、組織又は細胞移植用組成物のうちいずれか一つ以上を、分離した臓器、組織又は細胞に処理するか、又は臓器、組織又は細胞移植の供与者及び／又は受容者に投与することを含む、臓器、組織又は細胞移植方法を提供する。
【００２２】
別の側面において、前記方法は、前記組成物を、移植前に供与者に投与すること、前記組成物を、移植前に受容者に投与すること、前記組成物を、移植中に供与者に投与すること、前記組成物を、移植中に受容者に投与すること、供与者から分離した臓器、組織又は細胞を、前記組成物に保存すること、前記組成物を、移植後に受容者に投与すること、及び、前記組成物を、移植後に供与者に投与することのうちいずれか一つ以上を含んでもよい。
【００２３】
一側面において、前記方法は、前記組成物を、臓器、組織又は細胞が供与者又は受容者の体内に存在する状態で、体内で臓器、組織又は細胞を灌流させる方式で投与することを含んでもよい。
【００２４】
一側面において、本発明は、前述の組成物のうちいずれか一つ以上の組成物の使用であって、分離した臓器、組織又は細胞に処理するか、又は臓器、組織又は細胞移植の供与者及び／又は受容者に投与するための使用を提供する。
【発明の効果】
【００２５】
一側面において、本発明は、臓器、組織又は個々の細胞移植片の生存力及び／又は機能を促進することができる。
【００２６】
別の側面において、本発明は、臓器、組織又は細胞の移植後、生存力及び／又は機能を強化することができる。
【００２７】
別の側面において、本発明は、臓器、組織又は細胞を損傷することなく、一時的に保存することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】虚血再灌流の２４時間後に採取した血液内尿素窒素（ＢＵＮ）及びクレアチンの数値を測定したグラフである。
【図２】虚血再灌流の２４時間後、腎臓組織をＰＡＳ（periodic acid stain）染色した結果を示した写真である。
【図３】虚血再灌流の２４時間後、腎臓組織に対して腎臓組織損傷スコアリング（renal tissue injury scoring）を実施した結果を示したグラフである。
【図４】虚血再灌流の２４時間後、腎臓組織をＴＵＮＥＬ染色で評価した結果の写真である。
【図５】虚血再灌流の２４時間後、腎臓組織をＴＵＮＥＬ染色で評価したＴＵＮＥＬ陽性細胞の測定の結果である。
【図６】虚血再灌流の２４時間後、腎臓組織において、Ｆ４／８０（macrophage marker）及びＧｒ−１（neutrophil marker）の免疫組織染色で先天性免疫細胞の浸潤を評価した結果である。
【図７】虚血再灌流の２４時間後、腎臓組織において、Ｆ４／８０（macrophage marker）及びＧｒ−１（neutrophil marker）の陽性細胞の測定の結果を示したグラフである。
【図８】虚血再灌流の２４時間後、腎臓組織で炎症性サイトカインの分泌抑制効果を示したグラフである。
【図９】虚血再灌流の２４時間後、腎臓組織で炎症性サイトカインの分泌抑制効果を示したグラフである。
【図１０】虚血再灌流の２４時間後、腎臓組織で炎症性サイトカインの分泌抑制効果を示したグラフである。
【図１１】皮弁生存率を評価するための虚血再灌流損傷の誘導過程を示す図面である。
【図１２】虚血再灌流の誘導後、７日後のＰＥＰ１処理群と食塩水（saline）処理群との皮弁生存率の測定の結果を示したグラフである。
【図１３】ＩｍａｇｅＪプログラムを介したデジタル写真である。
【図１４】ラットの肺移植術の途中に用いる肺保存液として、ｉ）生理食塩水、ｉｉ）ＰｅｒｆａｄｅｘTM、ｉｉｉ）ＰｅｒｆａｄｅｘTMとＰＥＰ１  ５ｍｇ、及び、ｉｖ）ＰｅｒｆａｄｅｘTMとＰＥＰ１  ５０ｍｇをそれぞれ用いた場合、移植した肺の中間部位をホルマリンで固定し、ヘマトキシリン＆エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色の後、光学顕微鏡で肺胞組織を互いに比較した結果を示した写真である。
【図１５】ラットの肺移植術の後、実験後に移植した肺の下葉を切除し、直ちに重さを量った後、２４時間６０℃の乾燥機で乾燥した後に、さらに重さを量った結果を示したグラフである。
【図１６】ラットの肺移植術の後、５ｍＬの生理食塩水を気管内に点滴注入（instillation）してから取り出して、好中性白血球内容（neutrophil content）を分析した結果を示した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、実施例に基づいて、本発明をより詳細に説明するが、本発明は、多様な変換を加えてもよく、様々な実施例を有してもよい。しかし、これは、本発明を特定の実施形態に限定することではなく、本発明は、特許請求の範囲に記載されたことに基づいて、多様な実施例及び応用が可能であり、本発明の思想及び技術範囲に含まれる全ての変換、均等物ないし代替物を含むことを理解すべきである。本発明を説明するにあたって、関連の公知技術に関する具体的な説明が、本発明の要旨を曖昧にする恐れがあると判断する場合、その詳細な説明を省略する。
【００３０】
テロメア（telomere）は、染色体の末端に繰り返して存在する遺伝物質であって、当該染色体の損傷や他の染色体との結合を防止すると知られている。テロメアの長さは、細胞が分裂する度に、少しずつ短くなり、一定の回数以上の細胞分裂があれば、テロメアは非常に短くなり、その細胞は、分裂を止めて死になる。その反面、テロメアを長くすると、細胞の寿命が延長されると知られており、その例として、癌細胞では、テロメラーゼ（telomerase）という酵素が分泌され、テロメアが短くなることを防ぐため、癌細胞が死ぬことなく、増殖し続けることができると知られている。
【００３１】
一側面において、本発明は、臓器、組織又は細胞の摘出、保存及び移植の過程における任意の段階で、供与者、受容者、臓器、組織、細胞塊、及び／又は個々の細胞の処理に用いる組成物又はキットに関する。臓器、組織、細胞塊、又は個々の細胞は、供与者から摘出して、本明細書に開示された組成物で処理した後、受容者に移植することができる。別の側面において、前記方法に加えて、臓器、組織、細胞塊、又は個々の細胞を、供与者の体内に存在する状態で、体内で処理することができる。代案として、本明細書に開示された組成物を、手術前、手術中及び／又は手術後に、例えば、受容者の血液に臓器を再灌流させる。また、本明細書に記載された組成物は、臓器、組織、細胞塊、又は個々の細胞を摘出する過程の前又は途中に、供与者に投与してもよい。
【００３２】
一側面において、配列番号１のペプチド、配列番号１のフラグメントであるペプチド、又は前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドは、テロメラーゼ、具体的には、ヒト（Homo sapiens）テロメラーゼ由来のペプチドを含む。
【００３３】
配列番号１に記載されたペプチドは、以下の表１の通りである。以下の表２における「名称」は、ペプチドを区別するために命名したものである。本発明の一側面において、配列番号１に記載されたペプチドは、ヒトテロメラーゼの全ペプチドを示す。本発明の別の側面において、配列番号１の配列を有するペプチド、配列番号１の配列のフラグメントであるペプチド、又は前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドは、テロメラーゼに含まれたペプチドのうち、当該位置のペプチドを選別して合成した「合成ペプチド」を含む。配列番号２は、全テロメラーゼのアミノ酸配列を示したものである。
【表１】
0006466971.tif 000002
【００３４】
本明細書に開示されたペプチドは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の配列相同性を有するペプチドを含んでもよい。また、本明細書に開示されたペプチドは、配列番号１を含むペプチド又はそのフラグメントと、１個以上のアミノ酸、２個以上のアミノ酸、３個以上のアミノ酸、４個以上のアミノ酸、５個以上のアミノ酸、６個以上のアミノ酸又は７個以上のアミノ酸が変化されたペプチドとを含んでもよい。
【００３５】
本発明の一側面において、アミノ酸の変化は、ペプチドの物理化学的特性を変更させる性質に属する。例えば、ペプチドの熱安定性を向上し、気質特異性を変更させ、最適のｐＨを変化させるなどのアミノ酸の変化が行われてもよい。
【００３６】
本明細書において、「アミノ酸」というのは、自然にペプチドに統合される２２個の標準アミノ酸のみならず、Ｄ−異性体及び変形されたアミノ酸を含む。これにより、本発明の一側面において、ペプチドは、Ｄ−アミノ酸を含むペプチドであってもよい。一方、本発明の別の側面において、ペプチドは、翻訳後修飾（post-translational modification）の非標準アミノ酸などを含んでもよい。翻訳後修飾の例には、リン酸化（phosphorylation）、グリコシル化（glycosylation）、アシル化（acylation）（例えば、アセチル化（acetylation）、ミリストイル化（myristoylation）及びパルミトイル化（palmitoylation）を含む）、アルキル化（alkylation）、カルボキシル化（carboxylation）、ヒドロキシル化（hydroxylation）、糖化反応（glycation）、ビオチニル化（biotinylation）、ユビキチニル化（ubiquitinylation）、化学的性質の変化（例えば、ベータ除去脱アミド化、脱アミド化）、及び構造的変化（例えば、二黄化物ブリッジの形成）が含まれる。また、ペプチドコンジュゲートを形成するための架橋剤（crosslinker）との結合過程で起こる化学反応により生じるアミノ酸の変化、例えば、アミノ基、カルボキシ基、又は側鎖における変化のようなアミノ酸の変化が含まれる。
【００３７】
本明細書に開示されたペプチドは、自然そのままの供給源から、同定及び分離された野生型ペプチドであってもよい。一方、本明細書に開示されたペプチドは、配列番号１のフラグメントであるペプチドと比較して、一つ以上のアミノ酸が、置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む、人工変異体であってもよい。人工変異体のみならず、野生型ポリペプチドにおけるアミノ酸の変化は、タンパク質のフォールディング（folding）及び／又は活性に有意義な影響を及ばさないアミノ酸の保存性置換を含む。保存性置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリン及びメチオニン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン及びトレオニン）の群の範囲内にある。一般に、特異的活性を変更させないアミノ酸の置換が、本分野に公知されている。最も頻繁に生じる交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、及びＡｓｐ／Ｇｌｙ、そしてこれらと逆のものである。保存的置換の他の例は、次の表の通りである。
【表２】
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【００３８】
ペプチドの生物学的特性における実在的な変形は、（ａ）置換領域内のポリペプチド骨格の構造、例えば、シート又は螺旋立体構造の保持におけるこれらの効果、（ｂ）標的部位での前記分子の電荷又は疎水性の保持におけるこれらの効果、又は（ｃ）側鎖のバルクの保持におけるこれらの効果が、相当に異なる置換部を選択することにより行われる。天然の残基は、通常の側鎖の特性に基づいて、次のグループに分けられる：
（１）  疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、 ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、
（２）  中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、
（３）  酸性： ａｓｐ、ｇｌｕ、
（４）  塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ、
（５）  鎖の配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、 ｐｒｏ、及び
（６）  芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【００３９】
非保存的置換は、これらの類型のうちの一つの構成員を、また他の類型に交換することにより行われる。ペプチドの適当な立体構造の保持と関連のないいかなるシステイン残基も、一般にセリンに置換されて、前記分子の酸化的安定性を向上し、異常な架橋結合を防ぐことができる。逆に言えば、システイン結合（複数の結合）を前記ペプチドに加え、その安定性を向上することができる。
【００４０】
ペプチドの他の類型のアミノ酸変異体は、抗体のグリコシル化パターンが変化されたものである。変化とは、ペプチドで見付けられた一つ以上の炭水化物残基の欠失及び／又はペプチド内に存在しない一つ以上のグリコシル化部位の付加を意味する。
【００４１】
ペプチドのグリコシル化は、典型的に、Ｎ−結合されるか、Ｏ−結合されるものである。Ｎ−結合されるとは、炭水化物残基が、アスパラギン残基の側鎖に付着したものを言う。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘは、プロリンを除いた任意のアミノ酸である）は、炭水化物残基を、アスパラギン側鎖に酵素的に付着するための認識配列である。従って、これらのトリペプチド配列のうちの一つが、ポリペプチドに存在することにより、潜在的なグリコシル化部位が生成される。Ｏ−結合されたグリコシル化は、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース及びキシロースのうちの一つを、ヒドロキシアミノ酸、最も通常的には、セリン又はトレオニンに付着することを意味するが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンを用いてもよい。
【００４２】
ペプチドへのグリコシル化部位の付加は、前に挙げられたトリペプチド配列の一つ以上を含有するようにアミノ酸配列を変化することで、便宜に行われる（Ｎ−結合されたグリコシル化部位の場合）。このような変化は、一つ以上のセリン又はトレオニン残基を、最初の抗体の配列に付加するか、これらの残基で置換することにより行われてもよい（Ｏ−結合されたグリコシル化部位の場合）。
【００４３】
本明細書において、「細胞」とは、移植に適合した動物細胞をはじめ、任意の類型の動物細胞を言う。細胞は、一般に動物供与体から得た一次細胞であるものの、確立された細胞株の２次細胞又は対等な細胞であってもよい。これらは、選択的にいずれの方式で、その機能を変化させる発現ベクタで体外から形質感染する。細胞には、例えば、ランゲルハンス島細胞、例えば、膵臓ランゲルハンス島の一部である細胞、肝細胞、線維芽細胞、骨髄細胞、筋細胞及び幹細胞、及び脊髄を含んだ中枢神経系細胞（例えば、神経細胞）を含むが、これらに制限されない。本明細書の全般に渡って、「ランゲルハンス島細胞」は、島、例えば、ランゲルハンス島と知られた膵臓内に存在する細胞塊を称する一般名として使用した。ランゲルハンス島には、例えば、β−細胞（インシュリン産生）、α−細胞（グルカゴン産生）、γ―細胞（ソマトスタチン産生）、Ｆ細胞（膵臓ポリペプチド産生）、エンテロクロマフィン細胞（セロトニン産生）、ＰＰ細胞及びＤ１細胞を始めた幾つかの類型の細胞が含まれる。「幹細胞」と言う用語は、培養液から無期限的に分裂して分化した細胞となり得る能力を有する細胞を称する当分野に公知された用語である。この用語には、例えば、全能（totipotent）、万能（pluripotent）、多能（multipotent）及び単一分化性（unipotent）幹細胞、例えば、神経細胞、肝細胞、筋細胞、及び造血母幹細胞が含まれる。
【００４４】
本明細書において、「臓器」とは、本明細書の全般に渡って、動物で特殊の機能を有するいずれの解部学的部分又は構成員を称する一般的な意味として使われる。また、この用語の意味には、例えば、臓器から得られる凝集性組織のような臓器の相当部分が含まれる。このような臓器には、腎臓、肝、心臓、胃、腸、例えば、大腸又は小腸、膵臓、皮膚、及び肺が含まれるが、これらに制限されない。この定義には、骨、骨格筋、腹筋、四肢、腸間膜、及び血管、例えば、大動脈移植片も含まれる。
【００４５】
本明細書において、「移植」とは、臓器、組織、細胞塊又は個別細胞を、患者に移植する過程を説明する一般的な意味として使われる。「移植」という用語は、受容者に移植した組織又は細胞の機能的完全性を保持するための目的として、供与者から受容者に生存組織又は細胞を伝達する過程として定義される。
【００４６】
本明細書において、「移植中の投与」とは、移植手術の全過程中に投与されることを意味する。即ち、供与者から臓器、組織又は細胞の摘出後、直ちに摘出した臓器、組織又は細胞を、受容者に移植する手術過程中、及び移植を完了した直後までも含む。
【００４７】
本明細書において、「移植前の投与」とは、移植手術に先立った用意段階であって、手術前に予め数分、数時間、数日又は数十日の前に、供与者及び／又は受容者に本明細書に開示された組成物を投与することを含む。
【００４８】
本明細書において、「移植後の投与」とは、移植手術の管理段階であって、手術後に数分、数時間、数日、数十日、数百日の後の時点で、受容者に本明細書に開示された組成物を投与することを含む。
【００４９】
本発明において、「虚血性損傷」というのは、心臓、脳、腎臓、肺など、血流の供給を必要とする臓器において、血液循環が遮断されながら酸素の伝達が減少して発生する損傷を意味し、組織の機能損傷及び細胞死をもたらす致命的損傷を含む。虚血性損傷を起こす原因としては、血管疾病、冠状動脈血栓症、脳血管血栓症、動脈瘤破裂、全身出血、圧潰損傷、敗血症、深刻な皮膚火傷、血管閉塞性手術方法（例：胸腹動脈瘤手術の過程における脊髄虚血）、心肺迂路方法、臓器移植、心肺虚脱（急性心臓死）及び窒息などがあるが、これらに限定されない。
【００５０】
また、本発明による「虚血性損傷」は、一般的に生じうる虚血性損傷の他に、臓器移植などによって生じうる虚血再灌流損傷を含む。前記虚血再灌流損傷には、脳血管虚血再灌流損傷、腎臓虚血再灌流損傷、肝臓虚血再灌流損傷、虚血再灌流心筋病症、皮膚虚血再灌流損傷、腸管虚血再灌流損傷、腸虚血再灌流損傷、胃虚血再灌流損傷、肺虚血再灌流損傷、膵臓虚血再灌流損傷、骨格筋虚血再灌流損傷、腹筋虚血再灌流損傷、四肢虚血再灌流損傷、虚血再灌流結腸炎、腸間膜虚血再灌流損傷及び無症侯性虚血再灌流損傷などがあるが、これらに限定されない。
【００５１】
虚血再灌流損傷は、臓器移植手術の過程でしばしば発生し、いわば、腎臓移植を行う場合、移植腎臓の漸進的機能喪失及び機能不全に、虚血再灌流損傷が関連しており、これは、虚血再灌流組織損傷による先天性免疫系の活性化が重要な発病メカニズムのうち一つであると知られている。
【００５２】
一側面において、本発明は、前記ペプチドを含有する組成物を、移植片供与者に投与するステップと、前記供与者から臓器、組織又は細胞を得るステップと、前記得られた臓器、組織又は細胞を、受容者に移植するステップとを含む方法を提供する。前記方法において、供与者に投与されるペプチドの量は、受容者に移植した後の臓器、組織又は細胞の生存力又は機能を強化するのに十分な量である。ここで、供与者への投与は、手術と同時に、又は直前だけではなく、手術前の用意段階及び／又は手術後の管理段階においても持続的に行われてもよい。供与者は、生存供与者、脳死供与者、又は脳死前又は脳死後の供与者であってもよい。
【００５３】
別の側面において、本発明は、供与者から臓器、組織又は細胞を得るステップと、前記得られた臓器、組織又は細胞を、前記ペプチドを含有する組成物に保存するステップと、前記保存した臓器、組織又は細胞を、受容者に移植するステップとを含む方法を提供する。前記方法において、臓器、組織又は細胞保存用組成物内のペプチドの量は、受容者に移植した後の臓器、組織又は細胞の生存力又は機能を強化するのに十分な量である。
【００５４】
別の側面において、本発明は、供与者から臓器、組織又は細胞を得るステップと、前記得られた臓器、組織又は細胞を、受容者に移植するステップと、前記受容者に前記ペプチドを含む組成物を投与するステップとを含む方法を提供する。前記方法において、受容者に投与されるペプチドの量は、受容者に移植した後の臓器、組織又は細胞の生存力又は機能を強化するのに十分な量である。ここで、受容者への投与は、手術と同時に、又は手術の直後だけではなく、手術後の管理段階においても持続的に行われてもよい。
【００５５】
一具体例において、本明細書に開示された組成物は、臓器、組織又は細胞を、受容者に移植してから０〜２０日内に、例えば、１日、２日、４日、６日、８日、１０日、１２日、１４日、１８日、又は２０日内に、受容者に投与できる。また、別の具体例において、本明細書に開示された組成物は、移植片の生存を保証するのに必要である限り、長期間受容者に臓器、組織又は細胞を移植する段階の後、２１日目から開始して、１回以上、例えば、数回又は継続的に受容者に投与できる。本明細書に開示された組成物は、移植した臓器、組織又は細胞が、拒絶反応、例えば、慢性拒絶反応又は急性拒絶反応を示すか否かの判断に従って、これに適切な形態で受容者に投与できる。
【００５６】
一側面において、前記ペプチドを含む組成物は、供与者及び受容者の両方に投与してもよい。他の側面において、前記ペプチドを含む組成物は、供与者及び／又は受容者に投与されると同時に、移植の途中に、臓器、組織又は細胞を、一時的に保存する前記ペプチドを含む組成物に保存してもよい。
【００５７】
一具体例において、本明細書に開示された組成物は、臓器、組織又は細胞が、供与者又は受容者の体内に存在する状態で、体内で臓器、組織又は細胞を灌流させる方式で投与できる。
【００５８】
本明細書に記述された方法において、臓器、組織又は細胞は、移植できるいずれの臓器、組織又は細胞であってもよい。例えば、臓器は、肝、腎臓、心臓、膵臓、肺、小腸、及び／又は皮膚であってもよく、これらの組織又は細胞であってもよい。
【００５９】
供与者は、受容者と異種であってもよく、同種であってもよい。供与者と受容者は、両方ともヒトでない動物であってもよく、ヒトであってもよい。又は、供与者は、ヒトでない動物、例えば、ブタであってもよく、受容者は、ヒトであってもよい。一具体例において、組織又は細胞は、受容者自身の組織又は細胞であってもよい。即ち、供与者と受容者とが、同一個体であってもよい。
【００６０】
本明細書に開示された組成物は、有効成分として、前記ペプチドのみならず、他の有効成分と組み合わせて含まれてもよい。例えば、肺保存液として、商業的に購入可能なＰｅｒｆａｄｅｘTMに、本明細書に開示されたペプチドを加えて使用してもよい。
【００６１】
本明細書に開示された組成物において、ペプチドの濃度は、当業界に公知されているように、通常決定することができる。例えば、本発明の一側面による組成物は、配列番号１のアミノ酸配列を含む（comprising）ペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、又はそのフラグメントであるペプチドを、１０ｍｇ／Ｌ〜１０００ｍｇ／Ｌ、具体的には、５０ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌ、より具体的には、３０ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌの含量で含むが、容量による効果の差を示す場合、これを適切に調整できる。他の具体例において、組成物は、ペプチドを、１ｍｇ／Ｌ以上、５ｍｇ／Ｌ以上、１０ｍｇ／Ｌ以上、２０ｍｇ／Ｌ以上、３０ｍｇ／Ｌ以上、４０ｍｇ／Ｌ以上、５０ｍｇ／Ｌ以上、６０ｍｇ／Ｌ以上、７０ｍｇ／Ｌ以上、８０ｍｇ／Ｌ以上、又は９０ｍｇ／Ｌ以上含んでもよい。また、組成物は、ペプチドを、５００００ｍｇ／Ｌ以下、４００００ｍｇ／Ｌ以下、３００００ｍｇ／Ｌ以下、２００００ｍｇ／Ｌ以下、１００００ｍｇ／Ｌ以下、８０００ｍｇ／Ｌ以下、６０００ｍｇ／Ｌ以下、４０００ｍｇ／Ｌ以下、２０００ｍｇ／Ｌ以下、１０００ｍｇ／Ｌ以下、 、９００ｍｇ／Ｌ以下、８００ｍｇ／Ｌ以下、７００ｍｇ／Ｌ以下、６００ｍｇ／Ｌ以下、５００ｍｇ／Ｌ以下で含んでもよい。前記範囲内又はその以下の範囲で含む場合、本発明の意図した効果を奏するのに適切であるだけでなく、組成物の安定性及び安全性を全て満たすことができ、費用対比効果の観点からも、前記範囲で含むことが適切である。
【００６２】
本明細書において、ペプチドの投与量、投与方法、投与周期などは、既に当業界で広く知られているので、各患者の状態によって当業界に知られている基準により投与できる。具体的な投与量の決定は、当業者のレベル内にあり、この一日投与用量は、例えば、具体的には、１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｇ／ｋｇ／日、より具体的には、１０μｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、さらにより具体的には、５０μｇ／ｋｇ／日〜５０ ｍｇ／ｋｇ／日となってもよいが、これに制限されず、投与しようとする対象の年齢、健康状態、合併症など、様々な要因によって異なる。例えば、ペプチドは、該当部位に局所投与又は皮内投与を通じて投与しても良い。移植の直前、移植時、移植の直後に投与される量は、６０ｋｇ体重の成人を基準に１回投与時、１ｍｇ〜１００００ｍｇであってもよい。他の側面において、投与量は、１ｍｇ以上、５ｍｇ以上、１０ｍｇ以上、５０ｍｇ以上、１００ｍｇ以上、２００ｍｇ以上、３００ｍｇ以上、４００ｍｇ以上、５００ｍｇ以上、６００ｍｇ以上、７００ｍｇ以上、８００ｍｇ以上、９００ｍｇ以上、又は９５０ｍｇ以上であってもよい。他の側面において、投与量は、１００００ｍｇ以下、９０００ｍｇ以下、８０００ｍｇ以下、７０００ｍｇ以下、６０００ｍｇ以下、５０００ｍｇ以下、４０００ｍｇ以下、３０００ｍｇ以下、２０００ｍｇ以下、１５００ｍｇ以下であってもよい。移植後の管理段階における投与は、数日間隔で１日１回以上行ってもよく、時間が経ってからさらに投与間隔をあけてもよい。例えば、１、２、３、４週目に各々投与した後には、６週目、１０週目で間隔をあけてもよい。
【００６３】
臓器、組織、細胞塊及び／又は分離した細胞は、供与者から摘出して、当業者に公知された任意の方法により移植することができる（Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds., Oxford University Press,1994を参照）。当業者らは、摘出及び移植方法が、多数の環境、例えば、臓器、組織又は細胞の類型及び供与者の類型によって異なることが分かる。
【００６４】
本明細書に開示された組成物は、ペプチドを溶媒に溶解した溶液の形態であってもよい。溶媒は、食塩水、水溶液、緩衝液など、生体に使用できる溶媒であれば、制限なく使用可能である。一側面において、組成物は、患者に投与するのに適合した、当業者に公知された任意の液体（参考文献の例：Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds., Oxford University Press,1994）又は臓器、組織又は細胞を、体外で保持するのに適合した任意の液体に、本明細書に開示されたペプチドを加えて製造した溶液であってもよい。一般に、液体は、水溶液である。溶液の例には、リン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、セルシオ（Celsior）ＴＭ溶液、パーファデックス（Perfadex）ＴＭ、コリンズ（Collins）溶液、クエン酸塩溶液、及びユニバーシティ・オブ・ウィスコンシン（University of Wisconsin、ＵＷ）溶液（Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds., Oxford University Press,1994）を挙げられる。
【００６５】
一つの公知された移植溶液は、例えば、ＫＨ2ＰＯ5（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＭｇＳＯ4（５ｍｍｏｌ／Ｌ）、ラフィノース（３０ｍｍｏｌ／Ｌ）、ヒドロキシエチルペンタフラクション澱粉（５０ｇ／Ｌ）、ペニシリン（２００，０００Ｕ／Ｌ）、インシュリン（４０Ｕ／Ｌ）、デキサメタゾン（１６ｍｇ／ｄＬ）、Ｋラクトビオネート（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）、グルタチオン刺激ホルモン（３ｍｍｏｌ／Ｌ）、アデノシン（５ｍｍｏｌ／Ｌ）、アロプリノール（１ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｎａ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）、及びＫ（１２５ｍｍｏｌ／Ｌ）を含有できるＵＷ（ウィスコンシン大学）溶液である。
【００６６】
また他の公知された移植溶液は、例えば、ナトリウム（１０ｍＭ）、塩化物（１５ｍＭ）、カリウム（１１５ｍＭ）、中炭酸塩（１０ｍＭ）、リン酸塩（５０ｍＭ）及びグルコース（１９５ｍＭ）を含有できるユーロコリンズ溶液である。
【００６７】
本発明の一側面においては、配列番号１のアミノ酸配列を含む（comprising）ペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、又はそのフラグメントであるペプチドを、有効成分として含む虚血性損傷の治療及び予防用組成物が提供される。
【００６８】
本発明の一側面による組成物は、一側面では、移植前の用意段階において、供与者及び／又は受容者に投与される組成物、又は移植後の管理段階において、供与者及び／又は受容者に投与される組成物であって、配列番号１のアミノ酸配列を含む（comprising）ペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、又はそのフラグメントであるペプチドを、０．１μｇ／ｍｇ〜１ｍｇ／ｍｇ、具体的には、１μｇ／ｍｇ〜０．５ｍｇ／ｍｇ、より具体的には、１０μｇ／ｍｇ〜０．１ｍｇ／ｍｇ の含量で含んでもよい。前記範囲で含む場合、本発明の意図した効果を奏するのに適切であるだけではなく、組成物の安定性及び安全性の両方を満たすことができ、費用対比効果の観点からも、前記範囲で含むことが適切である。
【００６９】
本発明の一側面による組成物は、ヒト、イヌ、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ギニアピッグ又はサルを含む全ての動物に適用できる。
【００７０】
本発明の一側面においては、配列番号１のアミノ酸配列を含む（comprising）ペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、又はそのフラグメントであるペプチドを、有効成分として含む虚血再灌流損傷の治療及び予防用薬学組成物が提供される。本発明の一側面による薬学組成物は、経口、直腸、経皮、静脈内、筋肉内、腹腔内、骨髄内、硬膜内又は皮下などに投与できる。
【００７１】
経口投与のための剤形は、錠剤、丸剤、軟質又は硬質のカプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、又は乳濁剤であってもよいが、これに限定されない。非経口投与のための剤形は、注射剤、点滴剤、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、懸濁剤、乳剤、坐剤、パッチ、又は噴霧剤であってもよいが、これに限定されない。
【００７２】
本発明の一側面による薬学組成物は、必要に応じて、希釈剤、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩解剤、緩衝剤、分散剤、界面活性剤、着色剤、香料、又は甘味剤などの添加剤を含んでもよい。本発明の一側面による薬学組成物は、当業界の通常的な方法により製造できる。
【００７３】
本発明の一側面による薬学組成物の有効成分は、投与される対象の年齢、性別、体重、病理状態及びその重症度、投与経路又は処方者の判断によって異なる。このような因子に基づいた適用量の決定は、当業者のレベル内にあり、この一日投与用量は、移植前の用意段階において、供与者及び／又は受容者に投与される組成物、又は移植後の管理段階において、供与者及び／又は受容者に投与される組成物の、例えば、０．１μｇ／ｋｇ／日〜１ｇ／ｋｇ／日、具体的には、１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、より具体的には、１０μｇ／ｋｇ／日〜１ｍｇ／ｋｇ／日、さらにより具体的には、５０μｇ／ｋｇ／日〜１００μｇ／ｋｇ／日となってもよいが、これに制限されない。本発明の一側面による薬学組成物は、１日１回〜３回投与してもよいが、これに限定されない。
【００７４】
本発明の一側面においては、配列番号１のアミノ酸配列を含む（comprising） ペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、又はそのフラグメントであるペプチドを、有効成分として含む虚血再灌流損傷の治療及び予防の食品組成物が提供される。
【００７５】
本発明の一側面による食品組成物の剤形は、特に限定されないが、例えば、錠剤、顆粒剤、粉末剤、液剤、固形製剤などに剤形化することができる。各剤形は、有効成分の他に、当該分野において通常用いられる成分を、剤形又は使用目的に応じて、当業者が容易に適宜選択して配合でき、他の原料と同時に適用する場合、上昇効果を奏することができる。
【００７６】
本明細書において用いられた用語は、特定の具体例を説明するための目的のみで意図されたものであり、本発明を限定しようとする意図ではない。名詞の前に個数が省略された用語は、数量を制限するものではなく、言及された名詞の物品が、一つ以上存在することを示すものである。用語「含む」、「有する」、及び「含有する」とは、包括的意味と解釈される（即ち、「含むが、これに限定されない」という意味）。
【００７７】
数値の範囲を言及することは、単にその範囲内に属するそれぞれの別個の数値を、個別的に言及することに代わることであり、それではないと明示されていない限り、各数値は、個別的に明細書に言及されているように本明細書に適用される。全ての範囲の限界値は、その範囲内に含まれ、独立して組み合わせ可能である。
【００７８】
本明細書に述べられる全ての方法は、特に明示されているか、文脈により明白に矛盾しない限り、適切な順序で行われ得る。いずれか一つの実施例及び全ての実施例又は例示的言語（例えば、「〜のような」）を使用するのは、特許請求の範囲に含まれていない限り、単に本発明の記載を容易にするためのものであり、本発明の範囲を制限するものではない。本明細書のいかなる言語も、請求されていない構成要素を、本発明の実施に必須的なものであると解釈してはいけない。特に定めのない限り、本明細書に用いられる技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者により通常理解されるような意味を有する。
【００７９】
本発明の好適な具体例は、本発明を実行するために、発明者に知られた最適のモードを含む。好適な具体例の変形は、先行する記載に触れれば、当業者に明白になるであろう。本発明者らは、当業者がそのような変形を適切に利用することを期待し、発明者らは、本明細書の記載とは異なる方式で、本発明が実施されることを期待する。従って、本発明は、特許法により許容されているように、添付の特許請求の範囲に述べられた発明の要旨の均等物及び全ての変形を含む。さらに、全ての可能な変形内で、前述の構成要素のいかなる組み合わせも、ここで異なって明示するか、文脈上、明白に矛盾しない限り、本発明に含まれる。本発明は、例示的な具体例を参照して、具体的に開示し、記述されたが、当業者は、添付の特許請求の範囲により定められる発明の思想及び範囲を逸脱することなく、形態及びディテールにおいて多様な変化が可能であることがよく分かる。
【００８０】
下記の実施例では、腎臓と肺、腹直筋皮膚弁の虚血再灌流損傷において、配列番号１に記載された配列を有するペプチド（ＰＥＰ１）を投与することにより、腎臓損傷の抑制及び皮弁生存率の向上の効果を確認し、虚血性損傷の予防及び治療の効果を確認するものである。
【００８１】
以下、実施例及び実験例をもって、本発明の構成及び効果をより詳細に説明する。しかし、以下の実施例及び実験例は、本発明の理解を助けるために例示の目的にのみ提供されたものに過ぎず、本発明の範疇及び範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００８２】
実施例１：ペプチドの合成
配列番号１のペプチド（以下、「ＰＥＰ１」という）を、従来知られている固相ペプチド合成法（solid phase peptide synthesis, ＳＰＰＳ）に従って製造した。具体的に、ペプチドは、ＡＳＰ４８Ｓ（Peptron, Inc., 大韓民国・大田）を用いて、Ｆｍｏｃ固相合成法でＣ−末端からアミノ酸を一つずつカップリングすることにより合成した。以下のように、ペプチドのＣ−末端の一番目のアミノ酸が、レジンに付着されたものを用いた。例えば、次の通りである。
【００８３】
ＮＨ2−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−２−クロロ−トリチルレジン
ＮＨ2−Ａｌａ−２−クロロ−トリチルレジン
ＮＨ2−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−２−クロロ−トリチルレジン
【００８４】
ペプチドの合成に用いた全てのアミノ酸原料は、Ｎ−末端がＦｍｏｃで保護され、残基は全て酸で除去される、Ｔｒｔ、Ｂｏｃ、ｔ−Ｂｕ（t-ブチルエステル）、Ｐｂｆ（２、２、４、６、７−ペンタメチルジヒドロ−ベンゾフラン−５−スルフォニル）などで保護されたものを用いた。例えば、次の通りである。
【００８５】
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｈｘ−ＯＨ、Ｔｒｔ−メルカプト酢酸。
【００８６】
カップリング試薬（Coupling reagent）としては、ＨＢＴＵ[２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル）−１、１、３、３−テトラメチルアンモニウムヘキサフルオロホスファート]／ＨＯＢｔ[Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾル]／ＮＭＭ［４−メチルモルホリン]を用いた。Ｆｍｏｃの除去は、２０％のＤＭＦ中のピペリジン （piperidine in DMF）を用いた。合成されたペプチドを、レジンから分離及び残基の保護基の除去には、切断カクテル（Cleavage Cocktail）［ＴＦＡ (トリフルオロ酢酸)／ＴＩＳ（トリイソプロピルシラン）／ＥＤＴ（エタンジチオール）／Ｈ2Ｏ＝９２．５／２．５／２．５／２．５］を用いた。
【００８７】
アミノ酸の保護基が結合された出発アミノ酸が、固相支持体に結合されている状態を利用して、ここに当該アミノ酸を各々反応させ、溶媒で洗浄した後、脱保護の過程を繰り返すことにより、各ペプチドを合成した。合成されたペプチドを、レジンから切り取った後、ＨＰＬＣで精製し、ＭＳで合成の可否を確認した後、凍結乾燥した。
【００８８】
本実施例に用いられたペプチドへの高速液体クロマトグラフィーの結果、全てのペプチドの純度は、９５％以上であった。
【００８９】
本発明によるペプチドＰＥＰ１の製造についての具体的な過程は、以下の通りである。
１）カップリング
ＮＨ2−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−２−クロロ−トリチルレジンに、保護されたアミノ酸（８当量）と、カップリング試薬ＨＢＴＵ（８当量）／ＨＯＢｔ（８当量）／ＮＭＭ（１６当量）とをＤＭＦに溶解して加えた後、常温で２時間反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ 、ＤＭＦの順に洗浄した。
２）Ｆｍｏｃ脱保護
２０％のＤＭＦ中のピペリジン（piperidine in DMF）を加えて、常温で５分間２回反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ 、ＤＭＦの順に洗浄した。
３）前記１）と２）の反応を繰り返して行い、ペプチドの基本骨格ＮＨ2−Ｅ（ＯｔＢｕ）−Ａ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｐ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｔ（ｔＢｕ）−Ｓ（ｔＢｕ）−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｌ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｆ−Ｉ−Ｐ−Ｋ（Ｂｏｃ）−２−クロロ−トリチルレジンを作製した。
４）切断（Cleavage）：合成が完了されたペプチドレジンに、切断カクテル（Cleavage Cocktail）を加えて、レジンからペプチドを分離した。
５）得られた混合物に、冷却ジエチルエーテルを加えた後、遠心分離して得られたペプチドを沈殿した。
６）Ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣで精製した後、ＬＣ／ＭＳで分子量を確認し、凍結してパウダーとして製造した。
【００９０】
実施例２：腎臓移植
腎臓移植で起こりうる腎臓虚血再灌流の誘導を、以下のように進行した後、ＰＥＰ１の効果を観察した。
【００９１】
腎臓虚血再灌流損傷のあるマウスモデルは、腎臓肉茎に３０分間、両側クランプ（bilateral clamping）を行い、３０分後にクランプを除去して血流を復元する方法で虚血再灌流を誘導して得た。実験群は、投与群（ＰＥＰ１）、対照群（ＰＢＳ：ＰＥＰ１を投与せず）、及びＳｈａｍ群（no bilateral clamping）の３グループに分類した。ＰＥＰ１は、１，０００ｎｍｏｌ／ｋｇの濃度で、虚血再灌流誘導の３０分前及び１２時間後に皮下注射した。
【００９２】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８週齢、チャールスリバー研究所（ウィルミントン、ＭＡ））を使用し、虚血再灌流腎臓損傷を誘導して実験を進めた。虚血再灌流腎臓損傷モデルは、腎臓の頚部（pedicle）を血管鉗子（forceps）で掴んで血流を阻み、２８分間虚血を誘導した後で再灌流した。
【００９３】
ペプチドＰＥＰ１は、ＰＢＳで１，０００ｎｍｏｌ／ｋｇの濃度に希釈し、虚血再灌流の３０分前及び１２時間後に２回腹腔内投与（i.ｐ injection）を行った。実験群は、それぞれ投与群（ＰＥＰ１）、対照群（ＰＢＳ）、Ｓｈａｍ群（虚血再灌流損傷を起こしていない群であって、腎臓損傷のない群）に分けて実験を進めた。
【００９４】
試験例１：虚血再灌流損傷誘導の腎臓機能損傷の保護効果
虚血再灌流の２４時間後に、血液を採取し、腎臓毒性指標である血中尿素窒素（ＢＵＮ：blood urea nitrogen）、クレアチン（creatine）を測定し、腎臓組織は、摘出し、パラフィンブロック（paraffin block）を作製し、免疫組織化学検査及び組織学的検査（immunohistochemical  and  histological  study）を進め、タンパク質を抽出してサイトカイン（cytokine）レベルを測定した。クレアチン濃度とＢＵＮは、自動分析機（Technicon ＲＡ−１０００；Bayer，Tarrytown，ＮＹ）を用いて測定した。
【００９５】
測定の結果、ＰＥＰ１投与群は、ＰＢＳ対照群に比べ、ＢＵＮ、クレアチンの値が有意的に減少した（図１を参照）。
【００９６】
試験例２：腎臓組織損傷の保護効果
虚血再灌流の２４時間後、腎臓組織をＰＡＳ（peridodic  acid-Schiff）染色（製造社：Polysciences株式会社（ウォリントン、ＰＡ、米国）のプロトコルに従って、ＰＡＳキットでＰＡＳ染色）を行った。染色を行った後、腎臓組織損傷スコアリング（renal  tissue  injury  scoring）で腎蔵組織の損傷を評価した。ＰＥＰ１の投与群は、ＰＢＳ対照群に比べ、腎臓組織の損傷が著しく緩和された様相を示した（図２及び図３を参照）。
【００９７】
試験例４：腎臓細胞死滅（renal apoptosis）抑制効果
虚血再灌流の２４時間後、腎臓組織に対して、ＴＵＮＥＬ染色で腎臓組織細胞の死滅（apoptosis）を評価した。ロシュ応用科学（インディアナポリス、ＩＮ、米国）で作ったＴＵＮＥＬ染色キットを介して、パラフィン腎臓セクションにＴＵＮＥＬ染色を行った。
【００９８】
確認の結果、ＰＥＰ１の投与群は、ＰＢＳ対照群に比べ、ＴＵＮＥＬ陽性細胞（positive cells）が著しく減少するので、腎蔵組織細胞の死滅を抑制することが確認できた（図４及び図５を参照）。
【００９９】
試験例５：腎臓組織における先天性免疫細胞浸潤の抑制効果
虚血再灌流の２４時間後、腎臓組織に対して、Ｆ４／８０（macrophage marker）、Ｇｒ−１（neutrophil marker）の免疫組織染色で、先天性免疫細胞の浸潤を評価した。具体的には、大食細胞に特異的な抗体（Ｆ４／８０、abcam.、Cambridge、ＭＡ）を用いて、パラフィン含有セクション上の免疫化学的な方法で、大食細胞及び好中球細胞の浸透染色を行った。
【０１００】
ＰＥＰ１投与群は、ＰＢＳ対照群に比べ、腎臓組織において、大食細胞（macrophage）と好中球（neutrophil）との腎臓組織への浸透が著しく低減したことを確認することができた（図６及び図７を参照）。
【０１０１】
試験例６：炎症性サイトカイン分泌抑制効果
虚血再灌流の２４時間後、腎臓組織からタンパク質を抽出し、サイトメトリックビードアレイ（cytometric bead array）方法で、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＴＮＦ−αのレベルを測定した。マウスＩＬ６、ＭＣＰ−１、ＴＮＦ−αＥＬＩＳＡキットは、Ｒ＆Ｄ Systemsから購入し、製造社のプロトコルに従って実験を行った。
測定の結果、ＰＥＰ１投与群は、ＰＢＳ対照群に比べ、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１レベルを有意的に低下したが、ＴＮＦ−αでは、有意な変化が観察されなかった（図８〜図１０を参照）。
【０１０２】
以上のように、ＰＥＰ１の虚血再灌流腎臓損傷に対する保護効果は、腎臓機能（ＢＵＮ、creatine）、腎臓組織損傷（tubular injury）、腎臓細胞死滅（renal apoptosis）、腎臓組織炎症細胞浸潤（immune cell infiltration）及び腎臓組織サイトカイン（cytokine）分泌抑制で評価した。
【０１０３】
虚血再灌流ＰＢＳ対照群では、Ｓｈａｍ群に比べ、血清ＢＵＮとクレアチンとの値が増加し、腎臓組織損傷も増大した。しかし、ＰＥＰ１投与群では、対照群に比べ、ＢＵＮとクレアチンとの値が有意的に低下し、腎臓組織損傷（renal tubular injury）だけではなく、腎臓細胞死滅も減少した。また、ＰＥＰ１投与群は、ＰＢＳ対照群に比べ、腎臓において、虚血再灌流による炎症細胞（neutrophils and macrophages）の浸潤を抑制し、炎症性サイトカイン（interleukin−６、monocyte chemotactic protein−１）分泌も有意的に抑制した。
【０１０４】
実施例３：皮弁移植
腹直筋皮膚弁の移植を、以下のように行った。
白ラット（Sprague-Dawley Rat、１８０ｇから２３０ｇ）の腹の皮膚から、５ｃｍｘ５ｃｍサイズで皮弁を採取した後、ＰＥＰ１又は食塩水（saline）を投与し、クランプ（clamping）を行い、局所貧血（ischemia）を起こさせ、７時間後にクランプを除去し、血流を復元する方法で虚血再灌流損傷を誘導して得た（図１１を参照）。
【０１０５】
実験群は、投与群（ＰＥＰ１処理群）、対照群（食塩水処理群：ＰＥＰ１を投与せず）、及びＳｈａｍ群（虚血再灌流損傷を起こしていない群）の３グループに分類した。ＰＥＰ１は、１０ｍｇ／５００μｌの濃度で、食塩水は、５００μｌを、虚血再灌流誘導の３０分前及びそれぞれ１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、７日後に、筋肉内（intramuscular）に注射した。
【０１０６】
虚血再灌流を誘導してから７日後に、皮弁生存率（flap survivability）を測定した。皮弁生存率の測定は、ＩｍａｇｅＪプログラムを介したデジタル写真の分析により行った。
【０１０７】
７日後の皮弁生存率の測定結果、食塩水処理群の場合、３４．６９％±１６．４４％と評価され、相対的にＰＥＰ１を処理した群の皮弁生存率は、５８．８８％±１１．４４％と、食塩水処理群に比べて向上していることを確認することができた（図１２を参照）。各グループ間には、統計的有意性（ｐ＜０．０５）が示された。
【０１０８】
実施例４：肺移植
ＰＥＰ１の虚血再灌流損傷の予防効果を測定するための肺移植モデルは、以下のようにセットした。
【０１０９】
実験は、同じ遺伝子を有する２匹のラット（rat）を対象にして行い、一方のラットから左側肺を摘出し、他方のラットにおいて、元の左側肺を摘出し、左側の胸腔に肺移植を行った。拒絶（rejection）反応を根本的に遮断するために、同じ遺伝子を有するラットを用いた。ラットは、供与体（Donor）と受容体（recipient）の両方とも３００ｇ〜３５０ｇの重さを有し、Sprague-Dawley種を対象にした。その後、供与体ラットから肺を摘出し、受容体ラットに移植する手術を行った。
【０１１０】
供与体ラットの肺摘出術は、以下のように行った。
（１）供与体である白いラットに、Rompun：Zoletil（１：２、１ｍｌ／ｋｇ）を腹腔内に注入（i. p injection）して麻酔する。
（２）器官切開術の後に、１６ゲージ静脈内カテーテル（16-gauge intravenous catheter）を用いたチューブを挿管し、人工呼吸器（Harvard Rodent Ventilator Model; Harvard Apparatus CO, Holliston, MA）に連結する（Ｖｔ＝１０ｍｌ／ｋｇ、ＰＥＥＰ＝２ｃｍＨ２Ｏ、respiratory rate＝８０／ｍｉｎ）。１００％酸素で機械換気を行う。
（３）開腹及び正中胸骨切開を施行し、下大静脈を通してへパリン（Heparin）３００ＩＵを注入する。
右心室の流出路を通して、主肺動脈に１８ゲージ血管カテーテル（1８-gauge angio-catheter）を挿入した後、腹腔内で下大静脈を切断し、左心房を切断しながら、主肺動脈カテーテルを通して２０ｃｍＨ２Ｏ圧力で、１０℃の５０ｍＬの生理食塩水を注入する。灌流中、機械呼吸を持続して、肺灌流が均一に行われるようにする。
（４）灌流が終わると、器官挿管下部で、肺が膨張した状態で器官を結紮し、心肺ブロックを摘出した後、冷ペトリディッシュ（petri-dish）で食道などの周辺構造物を除去する。心肺ブロックの重さを量った後、肺灌流液と同一の灌流液中に心肺ブロックを浸して、冷蔵保存する。虚血時間（ischemic time）は、３時間と決めた。
【０１１１】
移植肺の用意過程は、次の通りである。
（１）摘出した肺を、冷フラッシュ（cold flush）溶液が入っているペトリディッシュに置いた後、ウェットスポンジ（wet sponge）で覆い、カフス（cuff）を設ける間は、低体温（hypothermia）を保持する。
（２）カフスを連結するほど十分な距離を確保し、肺動脈は１８Ｇ、肺静脈は１６Ｇ、気管支は１６Ｇのカテーテルでカフスを入れ、４−０絹糸（silk）を用いて固定する。
【０１１２】
移植手術の過程は、次の通りである。
（１）受容体ラットを、腹腔注射で落ち着かせた後、器官切開術の後に１６ゲージ静脈内カテーテル（16-gauge intravenous catheter）を用いたチューブを挿管し、４−０絹糸で固定する。供与体と同様に機械換気を行う。
（２）右側の側臥位の姿勢を取り、大胸筋と広背筋とを切開し、４番目の肋間に左後側方開胸術を実施する。
（３）左肺靭帯を切断し、左側肺を胸郭の外に取り出して固定し、肺門部を剥離して肺動脈、肺静脈、左主気管支を露出する。
（４）上記の３つの構造物を全て微細血管クリップ（microvascular clips）（Micro-Serrefine, Fine Science Tools, Foster city, CA）を用いて鉗子する。
（５）左側肺を摘出し、移植肺の肺動脈、肺静脈、気管支をカフス技法（cuff technique）を利用して連結する。
【０１１３】
肺移植のラットを、次のように、４グループに分けて実験を進めた。ＰＥＰ１の適切な投与濃度を決めるために、ＰＥＰ１を低濃度（５ｍｇ）と高濃度（５０ｍｇ）とに分けて、移植前の供与体ラットの肺に、供与体から摘出した肺に、そして移植後の受容体にそれぞれ加えた。
（１）生理食塩水（Normal Saline）５０ｍＬ投与群
（２）ＰｅｒｆａｄｅｘTM５０ｍＬ投与群
（３）ＰｅｒｆａｄｅｘTM５０ｍＬ＋ＰＥＰ１  ５ｍｇ投与群
（４）ＰｅｒｆａｄｅｘTM５０ｍＬ＋ＰＥＰ１  ５０ｍｇ投与群
【０１１４】
肺移植後、移植した肺の機能を評価するために、以下の実験を行った。
【０１１５】
試験例１：ヘマトキシリン＆エオジン染色（Ｈ＆Ｅ  ｓｔａｉｎ）
虚血再灌流損傷による肺損傷が起こると、出血（hemorrhage）が発生し、肺胞壁が厚くなるが、上記の四つの溶液を、肺保存溶液として用いた時に発生する虚血再灌流損傷の程度を、出血の発生と肺胞壁の厚さとを介して測定するために、以下のように、ヘマトキシリン＆エオジン染色を行った。
【０１１６】
移植した肺の中間部位を、ホルマリンで固定し、ヘマトキシリン＆エオジン染色の後、光学顕微鏡を介した肺胞組織の所見を互いに比較した。
【０１１７】
分析の結果、生理食塩水（（１）群）、ＰｅｒｆａｄｅｘTM（（２）群）、ＰｅｒｆａｄｅｘTM とＰＥＰ１  ５０ｍｇ（（４）群）、ＰｅｒｆａｄｅｘTMとＰＥＰ１  ５ｍｇ（（３）群）の順に出血が多く見られ、肺胞壁も厚くなる様相を示した。特に、ＰｅｒｆａｄｅｘTMとＰＥＰ１  ５ｍｇ（（３）群）を肺保存液として用いた場合、出血が殆ど起こらず、肺胞壁も厚くならなかったことが観察できた。これは、ＰｅｒｆａｄｅｘTMに含まれるＰＥＰ１が、５０ｍｇの場合より５ｍｇであるとき、より高い出血防止及び肺胞壁の保持効果、即ち、虚血再灌流損傷の抑制効果があることを意味する（図１４を参照）。
【０１１８】
試験例２：湿乾重量比（wet/dry weight ratio）測定
移植した肺の下葉を切除し、直ちに重さを量った後、２４時間６０℃の乾燥機で乾燥した後に、さらに重さを量った。
【０１１９】
分析の結果、生理食塩水投与群（（１）群）、ＰｅｒｆａｄｅｘTMとＰＥＰ１  ５０ｍｇを投与した群（（４）群）、ＰｅｒｆａｄｅｘTM投与群（（２）群）、ＰｅｒｆａｄｅｘTMとＰＥＰ１  ５ｍｇを投与した群（（３）群）の順に再灌流浮腫（reperfusion edema）が多く示された。
【０１２０】
ＰｅｒｆａｄｅｘTM投与群（（２）群）、ＰｅｒｆａｄｅｘTMとＰＥＰ１  ５ｍｇを投与した群（（３）群）では、 生理食塩水投与群（（１）群）と比較したとき、再灌流浮腫が有意性（ｐ＜０．０５）で減少し、ＰｅｒｆａｄｅｘTMとＰＥＰ１  ５ｍｇを投与した群（（３）群）の場合、その数値が最低であった（図１５を参照）。
【０１２１】
試験例３：気管支肺砲洗浄液（ＢＡＬ、Bronchoalveolar lavage fluid）分析
５ｍＬの生理食塩水（normal saline）を、気管内に点滴注入（instillation）し、それを取り出し、好中性白血球内容（neutrophil content）を分析した。
【０１２２】
分析の結果、生理食塩水投与群（（１）群）、ＰｅｒｆａｄｅｘTM投与群（（２）群）、ＰｅｒｆａｄｅｘTMとＰＥＰ１  ５０ｍｇを投与した群（（４）群）、ＰｅｒｆａｄｅｘTMとＰＥＰ１  ５ｍｇを投与した群（（３）群）の順に、気管支肺砲洗浄液の炎症細胞（inflammatory cell）の比率が高くなっている。矢印部分が炎症細胞を示す。ＰｅｒｆａｄｅｘTMとＰＥＰ１  ５ｍｇを投与した群（（３）群）において、炎症細胞が最も少なく発現されたことが確認できた（図１６を参照）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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