(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含む、VDJ組み換え産物を特定する方法:
(a)VDJ組み換え産物を含むDNAサンプルを得ること;
(b)超音波処理、又は剪断、又はそれぞれのJ遺伝子の下流又は定常領域の下流の第1の部位と、V遺伝子の内部又はすぐ上流の第2の部位での制限エンドヌクレアーゼ反応を実施することによって、該VDJ組み換え産物を断片化して、消化されたVDJ組み換え断片及び非組み換えJ断片を産生すること;
(c)前記消化された断片にビオチン標識されたプライマーを、それぞれのJ遺伝子の内部又はすぐ下流のユニーク領域でアニーリングさせ、プライマー伸長を行い、続いて、ストレプトアビジン含有部分を用いて、J含有配列の濃縮を行うこと;
(d)該非組み換えJ断片及び残りのゲノムから、該消化されたVDJ組み換え断片を分離すること;
(e)該VDJ組み換え断片又は産物を配列決定すること;及び
(f)該配列決定データのデータ処理を行って、各VDJ組み換え産物を特定する及びVDJ組み換え頻度を定量化すること。
【請求項２】
VDJ組み換え産物を含む前記DNAサンプルが、細胞集団を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記細胞集団が、ヒト又はマウスから得られる、請求項2記載の方法。
【請求項４】
前記細胞集団が、免疫グロブリン含有細胞、又はT細胞受容体（TCR）含有細胞を含む、請求項2又は3記載の方法。
【請求項５】
VDJ組み換え産物を含む前記DNAサンプルが、インビトロ抗体産生システムから得られるVDJ組み換えDNAサンプルのライブラリを含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
前記VDJ組み換え産物が、重鎖免疫グロブリンから得られる、請求項1から5のいずれか1項記載の方法。
【請求項７】
前記VDJ組み換え産物が、軽鎖免疫グロブリンから得られる、請求項1から5のいずれか1項記載の方法。
【請求項８】
前記VDJ組み換え産物が、T細胞受容体から得られる、請求項1から5のいずれか1項記載の方法。
【請求項９】
VDJ組み換え産物を含む前記DNAサンプルが細胞集団を含み、該細胞集団が、マウス細胞を含み、かつ前記プライマーが、配列番号:1〜4又は47〜50に記載されたプライマーのいずれかから選択される、請求項2から8のいずれか1項記載の方法。
【請求項１０】
VDJ組み換え産物を含む前記DNAサンプルが細胞集団を含み、該細胞集団が、ヒト細胞を含み、かつ前記プライマーが、配列番号:51〜56に記載されたプライマーのいずれかから選択される、請求項2から8のいずれか1項記載の方法。
【請求項１１】
前記DNAサンプルが、超音波処理によって断片化される、請求項1から10のいずれか1項記載の方法。
【請求項１２】
前記DNAサンプルが、制限エンドヌクレアーゼ反応を実施することによって断片化される、請求項1から10のいずれか1項記載の方法。
【請求項１３】
ステップ(b)で使用される制限エンドヌクレアーゼ酵素が、DpnII及び/又はNlaIIIである、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
ステップ(b)が、第3の制限エンドヌクレアーゼ酵素の使用を含む、請求項12又は請求項13記載の方法。
【請求項１５】
ステップ(c)の後の、前記VDJ組み換え産物の一方の末端への第1のアダプター分子の付加をさらに含む、請求項1から14のいずれか1項記載の方法。
【請求項１６】
ステップ(b)で使用される前記制限エンドヌクレアーゼ酵素が、NlaIIIであり、かつ、前記アダプター分子が、配列番号:5である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
ステップ(b)で使用される前記制限エンドヌクレアーゼ酵素が、DpnIIであり、かつ、前記アダプター分子が、配列番号:6である、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
前記VDJ組み換え産物の第2の末端への第2のアダプター分子の付加をさらに含む、請求項15から17のいずれか1項記載の方法。
【請求項１９】
VDJ組み換え産物を含む前記DNAサンプルが細胞集団を含み、該細胞集団が、マウス細胞を含み、かつ、前記第2のアダプターの付加のために使用されるプライマーが、配列番号:7〜11又は57〜65から選択される、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
VDJ組み換え産物を含む前記DNAサンプルが細胞集団を含み、該細胞集団が、ヒト細胞を含み、かつ、前記第2のアダプターの付加のために使用されるプライマーが、配列番号:66〜72から選択される、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
ステップ(d)が、両方の鎖上のそれぞれのJ遺伝子の上流領域に対して特異的なオリゴヌクレオチドの使用を含む、請求項1から20のいずれか1項記載の方法。
【請求項２２】
VDJ組み換え産物を含む前記DNAサンプルが細胞集団を含み、該細胞集団が、マウス細胞を含み、かつ、ステップ(d)で使用される前記オリゴヌクレオチドが、配列番号:12〜19又は24〜34から選択される、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
VDJ組み換え産物を含む前記DNAサンプルが細胞集団を含み、該細胞集団が、ヒト細胞を含み、かつ、ステップ(d)で使用される前記オリゴヌクレオチドが、配列番号:39〜46から選択される、請求項21記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(発明の分野)
本発明は、配列特異的な濃縮と、特異的な制限エンドヌクレアーゼ酵素、又は抗原受容体レパートリーの高精度かつ高スループットな応答を提供するための他のDNA剪断手法との使用を含む、VDJ組み換え産物を特定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
(発明の背景)
VDJ組み換えは、体細胞組み換えとしても知られ、免疫系の免疫グロブリン(Ig)及びT細胞受容体(TCR)産生の初期段階における遺伝子組み換えの機構である。VDJ組み換えは、ほぼランダムに脊椎動物の可変(Variable)(V)、多様(Diverse)(D)、及び連結(Joining)(J)遺伝子セグメントが組み合わされ、異なる遺伝子を選択する際のそのランダム性のおかげで、細菌、ウイルス、寄生生物、腫瘍細胞などの機能異常細胞、及び花粉由来の抗原に適合するようにタンパク質を多様にコードすることを可能にする。
【０００３】
マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座のVDJ組み換えを、図1に図示する。これは、約195個の可変(V)遺伝子、10個の多様性(diversity)(D)遺伝子、及び4個の連結(J)遺伝子からなる、大きな3Mbの遺伝子座である。これらは、VDJ組み換えに関与するセグメントである。8個の定常遺伝子も存在し、これは、名前によって示唆される通り、VDJ組み換えを受けない。この遺伝子座のVDJ組み換えにおける第1の事象は、D遺伝子の1つが、J遺伝子の1つに再編成されることである。この後、V遺伝子の1つが、このDJ再編成に追加されて、その後、重鎖タンパク質の可変セグメントをコードする機能性のVDJ再編成遺伝子を形成する。これらのステップはどちらも、介在DNAを欠失させるRagと呼ばれるリコンビナーゼ酵素によって触媒される。類似の仕組みは、95個の可変(V)遺伝子、20個の多様性(D)遺伝子、及び6個の連結(J)遺伝子を代わりに含むヒトゲノムにも存在する。
【０００４】
この組み換えプロセスは、前駆B細胞において段階的様式で起こり、抗体レパートリーにとって必要とされる多様性を生じるが、別の必要性が存在する-すなわち、各B細胞が1つの抗体のみを生じるような、特異性である。この特異性は、免疫系の機能の基本であり、ある対立遺伝子の機能性の再編成が、現在明らかでない機構を介して伝達されて、第2の対立遺伝子のさらなる組み換えを防止するような、対立遺伝子排除と呼ばれるプロセスによって実現する。
【０００５】
VDJ組み換え産物を特定するために、既存の方法論は、PCRに基づく手法を使用する。これは、プライマーのペアを含む。ここでは、VDJ組み換え産物のV遺伝子成分に特異的な1つ又は複数のプライマーと組み合わせて、一方のプライマーが、すべてのVDJ組み換え産物に共通な、4つのJ遺伝子、又はJ遺伝子のすぐ下流の配列のうちの1つに結合する。
【０００６】
既存の方法論には、多くの弱点が存在する。例えば、多数のV遺伝子ファミリー(マウスIghでは16)が存在し、検出の特異性を確かなものにするために、各ファミリーに対して異なるV遺伝子プライマーを設計しなければならない。これによって、定量的比較分析に偏りがもたらされる。個々のV遺伝子ファミリーの増幅が、異なるV遺伝子ファミリーのために設計されたV遺伝子プライマーの相対的効率に依存することとなり、効率の違いによって、比較分析の不正確さがもたらされるからである。
【０００７】
V遺伝子ファミリー内であっても、V遺伝子メンバーは、わずかに異なる配列を有するので、これにより、各V遺伝子メンバーの配列と100%適合するプライマーを設計することが可能でない限り、あるファミリー内のV遺伝子の相対的増幅に偏りがもたらされることとなる。より大きなV遺伝子ファミリー、したがってV遺伝子の大部分については、すべてのVファミリーメンバーを検出することが可能なV遺伝子プライマーを設計することは事実上不可能である。これを回避する唯一の方法は、ファミリー内のV遺伝子のサブセットに対するプライマーを設計することであるが、これによって、異なるPCRプライマーに伴う増幅の効率が異なることによる、さらなる偏りがもたらされる。これらの2つの問題点の組み合わせは、現在の方法が、あるサンプルにおけるVDJ組み換え産物の偏りのない完璧な分析を提供できないことを意味する。
【０００８】
PCRに基づく現在の方法は、規模に関する問題も有する。PCR増幅後の通常のステップは、PCR産物をクローニング及び配列決定することである。一例を挙げると、マウスIghには、ほぼ200個のV遺伝子が存在する。最も頻度の高い目的は、これらが、免疫グロブリンレパートリーにおける他のそれぞれの遺伝子と比較して、どのくらいの頻度で使用されるかを決定することである。それぞれの別のV遺伝子を1回で検出するためには、これらが等しい効率で組み換えられかつPCRによって等しい効率で検出されると仮定した場合(これらはどちらも当てはまらないが)、200個のクローンが配列決定されなければならないであろう。桁数が異なり得る頻度で使用される、ある集団におけるV遺伝子の相対的使用頻度を実際に決定するためには、何万個ものクローンを産生及び配列決定しなければならないであろう。これは、現在、費用と労力の両面で高すぎる。
【０００９】
この方法論に、次世代の配列決定手法を取り入れることによる、規模の問題を克服するためのいくつかの試みがなされている。これらのいくつかは、最近記載されているが、これらはすべて、VDJ組み換え産物の検出の出発点としてV遺伝子ファミリーのためのPCRプライマーを引き続き使用し、続いて、多数のPCR産物の「クローニング及び配列決定」の方法として次世代の配列決定を取り入れている。したがって、PCRプライマー効率が原因である本来の偏りは残存している。
【００１０】
したがって、1以上の前述の問題を克服する、VDJ組み換え産物を特定する改良された方法を提供する大きな必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１１】
(発明の概要)
本発明の第1の態様によれば、以下のステップを含む、VDJ組み換え産物を特定する方法が提供される:
(a)VDJ組み換え産物を含む核酸サンプルを得ること;
(b)前記核酸サンプルが、DNAを含む場合、超音波処理、又は剪断、又はそれぞれのJ遺伝子の下流又は定常領域の下流の第1の部位と、V遺伝子の内部又はすぐ上流の第2の部位での制限エンドヌクレアーゼ反応を実施することによって、VDJ組み換え産物を断片化して、消化されたVDJ組み換え断片及び非組み換えJ断片を産生すること;
(c)前記核酸サンプルが、DNAを含む場合、前記消化された断片とオリゴヌクレオチドとを、それぞれのJ遺伝子の内部又はすぐ下流のユニーク領域でアニーリングさせること、また、前記核酸サンプルが、cDNA又はRNAである場合、前記VDJ組み換え産物とオリゴヌクレオチドとを、定常領域又はJ遺伝子に対して特異的な位置でアニーリングさせること;
(d)前記核酸サンプルが、DNAを含む場合、非組み換えJ断片及び残りのゲノムから、消化されたVDJ組み換え断片を分離すること;
(e)VDJ組み換え断片又は産物を配列決定すること;及び
(f)配列決定データのデータ処理を行って、各VDJ組み換え産物を特定する及びVDJ組み換え頻度を定量化すること。
【００１２】
本発明のさらなる態様によれば、VDJ組み換え産物を特定するためのキットであって、本明細書に記載する方法に従って前記キットを使用するための説明書を含む前記キットが提供される。
【００１３】
本発明のさらなる態様によれば、本明細書に記載する方法によって得ることが可能なVDJ組み換え産物が提供される。
【００１４】
本発明のさらなる態様によれば、免疫不全障害をモニタリングする際に使用するための、本明細書に記載する通りのVDJ組み換え産物、又はVDJ組み換え産物を特定する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１−２】図1及び2は、抗体多様性の産生のためのVDJ組み換えの概念の概要を提供する。
【図３−５】図3〜5は、本発明の方法の代替実施態様の模式的概要を提供する。
【図６】図6は、マウスIgh V領域全体を通したV遺伝子の組み換えの高精度の相対的頻度の模式的表示を提供する。
【図７】図7は、実施例1に記載する方法論に従って本発明の方法によって分析された195個の個々のV遺伝子の1つ1つの使用頻度の詳細画像を提供する。
【図８】図8は、マウスプロB細胞及びIghにおける超音波処理を用いる、実施例2についての組み換え頻度の詳細画像を提供する;B1、B2、B3は、重複サンプルであり;J4は、J4を含むVDJ組み換え配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
(発明の詳細な説明)
本発明の第1の態様によれば、以下のステップを含む、VDJ組み換え産物を特定する方法が提供される:
(a)VDJ組み換え産物を含む核酸サンプルを得ること;
(b)前記核酸サンプルが、DNAを含む場合、超音波処理、又は剪断、又はそれぞれのJ遺伝子の下流又は定常領域の下流の第1の部位と、V遺伝子の内部又はすぐ上流の第2の部位での制限エンドヌクレアーゼ反応を実施することによって、VDJ組み換え産物を断片化して、消化されたVDJ組み換え断片及び非組み換えJ断片を産生すること;
(c)前記核酸サンプルが、DNAを含む場合、前記消化された断片とオリゴヌクレオチドとを、それぞれのJ遺伝子の内部又はすぐ下流のユニーク領域でアニーリングさせること、また、前記核酸サンプルが、cDNA又はRNAである場合、前記VDJ組み換え産物とオリゴヌクレオチドとを、定常領域又はJ遺伝子に対して特異的な位置でアニーリングさせること;
(d)前記核酸サンプルが、DNAを含む場合、非組み換えJ断片及び残りのゲノムから、消化されたVDJ組み換え断片を分離すること;
(e)VDJ組み換え断片又は産物を配列決定すること;及び
(f)配列決定データのデータ処理を行って、各VDJ組み換え産物を特定する及びVDJ組み換え頻度を定量化すること。
【００１７】
本発明の第2の態様によれば、以下のステップを含む、VDJ組み換え産物を特定する方法が提供される:
(a)VDJ組み換え産物を含む核酸サンプルを得ること;
(b)核酸がDNAサンプルである場合には、それぞれのJ遺伝子の内部又はすぐ下流のユニーク領域に対して特異的なプライマーを、又は核酸がcDNAサンプルである場合には、定常領域に対して特異的なプライマーをアニーリングさせること;
(c)ステップ(b)でアニーリングさせたプライマーに対してプライマー伸長反応を実施すること;
(d)超音波処理、又は剪断、又はそれぞれのJ遺伝子の下流又は定常領域プライマーの下流の第1の部位と、V遺伝子の内部又はすぐ上流の第2の部位での制限エンドヌクレアーゼ反応を実施することによって、該DNAを断片化して、再結合したVDJ消化断片及び非組み換えJ断片を産生すること;
(e)非組み換えJ断片及び残りのゲノムから、再結合したVDJ消化断片を分離すること;
(f)再結合したVDJ消化断片を配列決定すること;
(g)配列決定データのデータ処理を行って、各VDJ組み換え産物を特定する及びVDJ組み換え頻度を定量化すること。
【００１８】
本発明の特定方法は、レパートリーの性質を決定するために用いられる従来の技術に対する、いくつかの意義深い利点を提供する。例えば、本発明の方法は、抗原受容体レパートリーの高精度の高スループット応答を提供する。
【００１９】
本発明は、本明細書に示した実験手順及びデータにおいて記載した通り、マウス免疫グロブリン重鎖IgH及びIgK並びにヒト重鎖IgHにおける抗原受容体レパートリーの疑問応答に有用性を見いだしているということが理解されよう。しかし、本方法は、他のレパートリーに対する適用可能性を有し、また、他の抗原受容体レパートリー及び他の種、例えばヒト、ウサギ、ラットなどにも適応性がある。本発明は、組み換え配列の偏りのない大きなライブラリの産生に加えて、VDJ及びDJ組み換え配列の濃縮も提供する。本発明の方法は、個々の組み換え事象の明確な特定、及びV、D、J遺伝子使用頻度、Nヌクレオチド付加などの完全な詳細を可能にする。本発明はまた、驚くべき高精度を有し、具体的には、以前は知られていなかった組み換え機構及び染色体転座の特定を可能にしている。より具体的には、本発明の方法は、規模拡大性に関する利点を提供する。本方法は、高スループット方式で実施することができ、本明細書に記載する実施例に示す通り、約100,000個のユニークVDJ組み換えが捕捉及び特定され、これは、既存の方法に対する1000倍の増大に相当する。
【００２０】
一実施態様では、VDJ組み換え産物を含む核酸サンプルは、細胞集団を含む。該細胞集団は、トランスジェニックな抗原受容体遺伝子座を含有する任意の種又は生物から得ることができることが理解されよう。一実施態様では、細胞集団は、トランスジェニックマウスなどのマウスから得られる。代替実施態様では、細胞集団は、ヒトから得られる。
【００２１】
細胞集団は、VDJ組み換え産物を含有するであろう細胞の任意の適切な集団を含むこととなることが理解されよう。一実施態様では、細胞集団は、免疫グロブリン含有細胞を含む。さらなる実施態様では、免疫グロブリン含有細胞は、白血球を含む。いっそうさらなる実施態様では、白血球は、リンパ球、例えば小リンパ球を含む。いっそうさらなる実施態様では、小リンパ球は、T細胞又はB細胞、例えばB細胞を含む。
【００２２】
一実施態様では、VDJ組み換え産物は、重鎖免疫グロブリンから得られる。発達しているB細胞においては、第1の組み換え事象は、重鎖遺伝子座のあるDとあるJ遺伝子セグメントの間に生じる。これらの2つの遺伝子の間のいかなるDNAも欠失される。このD-J組み換えに、新しく形成されるDJ複合体の上流の領域からのあるV遺伝子の連結が続き、再編成されたVDJ遺伝子が形成される。新しいVDJ遺伝子のVセグメントとDセグメントとの間のすべての他の遺伝子は、細胞のゲノムから直ちに欠失される。重鎖のVDJ領域、及び定常μ鎖とδ鎖(Cμ及びCδ)との両方を含有する一次転写産物(スプライシングされていないRNA)が産生される(すなわち、一次転写産物は、セグメント:V-D-J-Cμ-Cδを含有する)。一次RNAはプロセシングされて、Cμ鎖の後にポリアデニル化(ポリ-A)末端が付加される、また、VDJセグメントとこの定常遺伝子セグメントとの間の配列が除去される。このmRNAの翻訳によって、Ig μ重鎖タンパク質の産生がもたらされる。
【００２３】
代替実施態様では、VDJ組み換え産物は、軽鎖免疫グロブリンから得られる。免疫グロブリン軽鎖遺伝子座のカッパ(κ)及びラムダ(λ)鎖は、軽鎖がDセグメントを欠いていること以外は重鎖遺伝子座と非常に類似した方式で再編成される。例えば、軽鎖のための組み換えの第1ステップは、V鎖とJ鎖とが連結して、VJ複合体が与えられ、その後、一次転写中に定常鎖遺伝子の付加が行われることを含む。κ又はλ鎖に対するスプライシングされたmRNAの翻訳によって、Ig κ又はIg λ軽鎖タンパク質が形成される。Ig μ重鎖と、軽鎖のうちの1つとの集合体によって、未成熟B細胞の表面上に発現する膜結合型の免疫グロブリンIgMが形成される。
【００２４】
代替実施態様では、細胞集団は、T細胞を含む。一実施態様では、VDJ組み換え産物は、T細胞受容体から得られる。胸腺細胞の発達中、T細胞受容体(TCR)鎖は、免疫グロブリンについて記載したのと本質的に同じ順序の順序付けられた組み換え事象を受ける。D-対-J組み換えは、TCRのβ鎖において、最初に起こる。このプロセスは、Dβ1遺伝子セグメントと、6個のJβ1セグメントのうちの1つとの連結、又はDβ2遺伝子セグメントと、7個のJβ2セグメントのうちの1つとの連結を含み得る。DJ組み換えの後に、Vβ-対-DβJβ再編成が続く(先述の通り)。新たに形成された複合体におけるVβ-Dβ-Jβ遺伝子の間のすべての遺伝子は欠失され、定常ドメイン遺伝子(Vβ-Dβ-Jβ-Cβ)を組み込んだ一次転写産物が合成される。mRNA転写によって、いかなる介在配列もスプライシングされ、TCR Cβ鎖のための完全長タンパク質の翻訳が可能になる。
【００２５】
TCRのアルファ(α)鎖の再編成に、β鎖再編成が続き、これは、Ig軽鎖について記載したV-対-J再編成(先述の通り)と類似している。β-鎖とα-鎖との集合体によって、大半のT細胞上に発現するαβ-TCRが形成される。
【００２６】
T細胞受容体(TCR)鎖は、ガンマ(γ)及びデルタ(δ)鎖(これらは集合してγδ-TCRを形成する)も含むことができる。
【００２７】
代替実施態様では、VDJ組み換え産物を含む核酸サンプルは、リボソームディスプレイなどのインビトロ抗体産生システムから得られたVDJ組み換え核酸のライブラリを含む。
【００２８】
本明細書では、用語「特定すること」への言及は、抗原のレパートリーのあるメンバーを、抗原のレパートリーの別のメンバーから差別的に特定するのを可能にする任意のステップを指す。
【００２９】
本明細書では、用語「VDJ組み換え産物」への言及は、可変(V)、多様性(D)、及び連結(J)遺伝子の間の組み換え事象の産物を指す。
【００３０】
一実施態様では、核酸は、サンプルから得られるDNA又はRNAを含む。さらなる実施態様では、核酸は、cDNA又はmRNAを含む。いっそうさらなる実施態様では、核酸は、cDNAを含む。サンプルが、細胞集団を含む場合、細胞集団から核酸を得るプロセスは、標準の分子生物学技術に従って、当業者には容易に明らかであることが理解されよう。
【００３１】
一実施態様では、核酸サンプルは、DNAである。したがって、本発明のさらなる態様によれば、以下のステップを含む、VDJ組み換え産物を特定する方法が提供される:
(a)VDJ組み換え産物を含むDNAサンプルを得ること;
(b)超音波処理、又は剪断、又はそれぞれのJ遺伝子の下流又は定常領域の下流の第1の部位と、V遺伝子の内部又はすぐ上流の第2の部位での制限エンドヌクレアーゼ反応を実施することによって、VDJ組み換え産物を断片化して、消化されたVDJ組み換え断片及び非組み換えJ断片を産生すること;
(c)前記消化された断片とオリゴヌクレオチドとを、それぞれのJ遺伝子の内部又はすぐ下流のユニーク領域でアニーリングさせること;
(d)非組み換えJ断片及び残りのゲノムから、消化されたVDJ組み換え断片を分離すること;
(e)VDJ組み換え断片を配列決定すること;及び
(f)配列決定データのデータ処理を行って、各VDJ組み換え産物を特定する及びVDJ組み換え頻度を定量化すること。
【００３２】
核酸サンプルが、cDNA又はRNA(すなわちmRNA)を含む場合、本発明の第1の態様のステップ(b)及び(d)は省略可能であることが理解されよう。したがって、本発明のさらなる態様によれば、以下のステップを含む、VDJ組み換え産物を特定する方法が提供される:
(a)VDJ組み換え産物を含むcDNA又はRNAサンプルを得ること;
(c)前記VDJ組み換え産物とオリゴヌクレオチドとを、定常領域又はJ遺伝子に対して特異的な位置でアニーリングさせること;
(e)VDJ組み換え産物を配列決定すること;及び
(f)配列決定データのデータ処理を行って、各VDJ組み換え産物を特定する及びVDJ組み換え頻度を定量化すること。
【００３３】
本発明の第1の態様の一実施態様では、ステップ(c)で使用されるオリゴヌクレオチド(例えば、プライマー、又はインビトロ転写RNA)は、それぞれのJ遺伝子内のユニーク領域に対して特異的である。代替実施態様では、ステップ(c)で使用されるオリゴヌクレオチドは、それぞれのJ遺伝子のすぐ下流の領域に対して特異的である。最終産物が配列決定される時に、過剰量の塩基が存在しないようにするために、オリゴヌクレオチドが、Jセグメント内である又はJセグメントと非常に近いことは有益である。
【００３４】
本発明の第2の態様の一実施態様では、ステップ(b)で使用されるプライマーは、それぞれのJ遺伝子内のユニーク領域に対して特異的である。代替実施態様では、ステップ(b)で使用されるプライマーは、それぞれのJ遺伝子のすぐ下流の領域に対して特異的である。最終産物が配列決定される時に、過剰量の塩基が存在しないようにするために、プライマーが、Jセグメント内である又はJセグメントと非常に近いことは有益である。
【００３５】
本明細書では、用語「ユニーク」への言及は、残りのゲノム内には存在しない配列を指すことが理解されよう。この仕組みは、本発明の方法によって他の配列が誤って特定されるのを防止する。
【００３６】
細胞集団が、ヒト細胞を含む場合、6つの異なるヒトJ遺伝子のそれぞれに対して、6種の異なるプライマーが必要となることが理解されよう。細胞集団がヒト細胞を含む実施態様では、プライマーは、配列番号:51から56に記載されているプライマーのいずれかから選択される。細胞集団がヒト細胞を含む代替実施態様では、6種のプライマーは、6つのヒトJ遺伝子内の他の配列から選択することができる。
【００３７】
細胞集団が、マウス細胞を含む場合、4つの異なるマウスJ遺伝子のそれぞれに対して、4種の異なるプライマーが必要となることが理解されよう。細胞集団がマウス細胞を含む実施態様では、4種のプライマーは、配列番号:1から4に記載されているプライマーのいずれかから選択され得る。細胞集団がマウス細胞を含むさらなる実施態様では、4種のプライマーは、配列番号:47から50に記載されているプライマーのいずれかから選択することができる。細胞集団がマウス細胞を含むさらなる実施態様では、4種のプライマーは、配列番号:1から4に記載されているプライマーのいずれかから選択することができる。細胞集団がマウス細胞を含む代替実施態様では、4種のプライマーは、4つのマウスJ遺伝子内の他の配列から選択することができる。
【００３８】
代替実施態様では、サンプル核酸材料としてcDNAが使用される場合、定常領域のエキソン(すなわち任意の特定のエキソン)内の領域に対して特異的な単一のプライマーが、(例えば、本発明の第1の態様のステップ(c)において、又は第2の態様のステップ(b)において)使用され、したがって、成功裏にVDJ再結合された(かつ転写された)すべての産物は、J遺伝子使用頻度とは無関係に捕捉される。
【００３９】
さらなる代替実施態様では、サンプル核酸材料としてcDNAが使用される場合、定常領域の第1のエキソン内の領域に対して特異的である単一のプライマーが、(例えば、本発明の第1の態様のステップ(c)において、又は第2の態様のステップ(b)において)使用され、したがって、成功裏にVDJ再結合された(かつ転写された)すべての産物は、J遺伝子使用頻度とは無関係に捕捉される。
【００４０】
一実施態様では、本発明の第1の態様のステップ(c)は、消化された断片を、結合対の一方のメンバーでタグ付けすることを含む。特定の実施態様では、プライマーが使用される場合、プライマーは、結合対の一方のメンバーをさらに含む。この実施態様は、他の配列に対する標的J配列の濃縮を可能にするという利点を提供する。適切な結合対の例としては、ビオチンとストレプトアビジン又は抗原と抗体が挙げられる。一実施態様では、タグ又はプライマーは、ビオチン又はストレプトアビジン、例えばビオチンをさらに含む。ビオチン標識された断片の濃縮は、ストレプトアビジン含有部分、例えばストレプトアビジンを含有する磁気ビーズ、例えばkilobaseBINDERキット(Invitrogen社)のDynabeadsを必要とすることとなることが理解されよう。
【００４１】
一実施態様では、本発明の第1の態様のステップ(c)は、プライマー伸長、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、及び/又は逆転写を実施するステップをさらに含む。
【００４２】
本発明の第1の態様のステップ(c)において必要とされるプライマー伸長、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、及び逆転写技術は、標準の分子生物学技術に従って、当業者には容易に明らかであることが理解されよう。
【００４３】
一実施態様では、核酸サンプルは、超音波処理によって断片化される。
【００４４】
代替実施態様では、核酸サンプルは、制限エンドヌクレアーゼ反応を実施することによって断片化される。
【００４５】
一実施態様では、制限エンドヌクレアーゼ酵素は、DpnII及び/又はNlaIIIから選択される。
【００４６】
細胞集団がマウス細胞を含み、かつIgH遺伝子座が標的とされる、特定の実施態様では、使用される制限エンドヌクレアーゼ酵素は、DpnII及び/又はNlaIIIから選択される。
【００４７】
制限エンドヌクレアーゼは、以下の基準に基づいて選択される:磁気ビーズによる濃縮に適した断片サイズを産生するために、4bpカッターが好ましい。制限エンドヌクレアーゼは、J遺伝子、又は定常領域、又は本発明の第2の態様のステップ(b)で使用されるプライマーの5’の内部のどの場所も切断してはならない。突出末端を産生する制限エンドヌクレアーゼが好ましい。何故なら、粘着末端連結は、平滑末端連結よりも効率が良いからである。ヒト細胞においては、DpnII及び/又はNlaIIIはまた、Igh遺伝子座を標的にするのに適している。しかし、プライマーが位置する場所からほんの16bpしか離れていないJ2内に、DpnII切断部位が存在する。
【００４８】
一実施態様では、該方法は、第3の制限エンドヌクレアーゼ酵素の使用を含む。第3の制限エンドヌクレアーゼ酵素は、存在する場合、V遺伝子の上流の領域に対して特異的であることとなる。
【００４９】
本明細書に記載する配列決定方法は、Illumina社から入手可能である合成(SBS)技術によるIlluminaシークエンシングなどの、Illuminaシークエンシング法を含むことが理解されよう。Illuminaシークエンシング技術が使用される場合、その手順は通常、例えば本発明の第2の態様のステップ(d)における制限エンドヌクレアーゼ処理の後の、VDJ組み換え産物の各末端へのアダプター分子の付加を含むこととなる。したがって、一実施態様では、該方法は、VDJ組み換え産物の一方の末端への第1のアダプター分子の付加をさらに含む。特定の実施態様では、該方法は、制限エンドヌクレアーゼ処理の後の、VDJ組み換え産物の一方の末端への第1のアダプター分子の付加をさらに含む。さらなる実施態様では、第1のアダプターが、連結によってVDJ組み換え産物に付加される。アダプター分子は、使用される制限エンドヌクレアーゼに応じて選択されることとなることが理解されよう。例えば、使用される制限エンドヌクレアーゼが、NlaIIIである場合、アダプター分子は、NlaIIIと相補的なペアエンドを含むこととなる。一実施態様では、使用される制限エンドヌクレアーゼが、NlaIIIである場合、アダプター分子は、配列番号:5から選択することができる。代替実施態様では、使用される制限エンドヌクレアーゼが、DpnIIである場合、アダプター分子は、配列番号:6から選択することができる。
【００５０】
一実施態様では、DNAを断片化するために超音波処理が使用される場合、末端修復及びA-テーリングの後に、超音波処理したDNAに、T-突出末端アダプターが連結される。さらなる実施態様では、DNAを断片化するために超音波処理が使用される場合、アダプター分子は、配列番号:22及び23から選択することができる。
【００５１】
さらなる実施態様では、該方法は、VDJ組み換え産物の第2の末端への第2のアダプター分子の付加をさらに含む。さらなる実施態様では、第2のアダプターは、PCRによってVDJ組み換え産物に組み込まれる。細胞集団が、マウス細胞を含む場合、第2のアダプターの付加のためのプライマーは、配列番号:7〜11又は57〜65から選択することができる。さらなる実施態様では、細胞集団が、マウス細胞を含む場合、第2のアダプターの付加のためのプライマーは、配列番号:7〜11から選択することができる。
【００５２】
代替実施態様では、細胞集団が、ヒト細胞を含む場合、第2のアダプターの付加のためのプライマーは、配列番号:66〜72から選択される。
【００５３】
PCRによって第2のアダプターを組み込むことの利点は、組み換えVDJ産物の濃縮のために使用される場合、生じた増幅産物が、結合対複合体を含まないであろうことである。
【００５４】
本発明の第1の態様のステップ(d)(又は本発明の第2の態様のステップ(e))は通常、適切な分子生物学的除去手段による、非組み換えJ断片からの組み換えVDJ消化断片の分離又は除去を含む。例えば、本明細書に記載する方法論は、非組み換えJ断片上に存在するが組み換えVDJ断片上には存在しない部分に対して設計されたオリゴヌクレオチドの、(本発明の第2の態様のステップ(c)について記載された方式と類似の方式で実施される)プライマー伸長に関する。例えば、一実施態様では、本発明の第1の態様のステップ(d)(又は本発明の第2の態様のステップ(e))は、両方の鎖上の4又は6個のJ遺伝子のそれぞれの上流領域に対して特異的なオリゴヌクレオチドの使用を含む。さらなる実施態様では、細胞集団が、マウス細胞を含む場合、本発明の第1の態様のステップ(d)(又は本発明の第2の態様のステップ(e))で使用されるオリゴヌクレオチドは、配列番号:12〜19又は24〜34から選択することができる。いっそうさらなる実施態様では、細胞集団が、マウス細胞を含む場合、本発明の第1の態様のステップ(d)(又は本発明の第2の態様のステップ(e))で使用されるオリゴヌクレオチドは、配列番号:12〜19から選択することができる。
【００５５】
代替実施態様では、細胞集団が、ヒト細胞を含む場合、本発明の第1の態様のステップ(d)(又は本発明の第2の態様のステップ(e))で使用されるオリゴヌクレオチドは、配列番号:35〜46から選択される。
【００５６】
本明細書で先に記載した通り、一実施態様では、プライマーは、結合対の一方のメンバーをさらに含む。この実施態様は、組み換えVDJ配列に対する非組み換えJ断片の除去を可能にするという利点を提供する。適切な結合対の例としては、ビオチンとストレプトアビジン又は抗原と抗体が挙げられる。一実施態様では、プライマーは、ビオチン又はストレプトアビジン、例えばビオチンをさらに含む。ビオチン標識された断片の除去は、ストレプトアビジン含有部分、例えばストレプトアビジンを含有する磁気ビーズ、例えばストレプトアビジン結合Dynabeadsを必要とすることとなることが理解されよう。
【００５７】
除去ステップが完了したら、次いで、生じたVDJ組み換え産物を配列決定することができる。通常、任意の配列決定分析手順を使用することができることが理解されよう。一実施態様では、配列決定ステップは、標準のIllumina 36bpペアエンドシークエンシングを含む。代替実施態様では、配列決定ステップは、Illumina MiSeq 250bpシングルエンドシークエンシングを含む。
【００５８】
Illuminaシークエンシング技術が使用される場合、フローセルへの十分な結合を確実にするために、該手順は通常、配列分析の前に、粘着末端PCR反応を必要とすることとなる。こうした粘着末端PCR反応は、製品プロトコルに従って行うことができる。本発明の方法が、粘着末端PCRを含む場合、プライマーは、配列番号:20及び21から選択することができる。
【００５９】
或いは、配列決定は、例えばペアエンド配列決定については、ペアエンドアダプターの付加を必要とする可能性がある。これらのアダプターを使用して、Illuminaフローセルと付着させることができる。本発明の方法が、ペアエンド配列決定の使用を含む場合、プライマーは、配列番号:73〜85又は98〜106から選択することができる。
【００６０】
データは、4つの主要ステップに従って処理することができる。第1に、ペアエンドリード(read)を、Jセグメント同一性及び(DNA断片化のために使用される場合)制限エンドヌクレアーゼに従って分類する。第2に、分類されたリードを選別して、ユニーク組み換え事象を特定する、また、非組み換えリード及びPCR重複物を排除する。第3に、リードを、公知のV、D、及びJセグメント配列のゲノム又は仮想配列にマッピングして、各リードにおける組み換えV又はDセグメントを特定する。第4に、それぞれのV又はDセグメントに帰属するリードの数を定量化し、図7又は図8と同様の棒グラフとして示す。
【００６１】
本発明のさらなる態様によれば、VDJ組み換え産物を特定するためのキットであって、本明細書に記載する方法に従って前記キットを使用するための説明書を含む前記キットが提供される。
【００６２】
一実施態様では、該キットは、本発明の方法のステップ(a)に必要とされる核酸サンプルを得るために構成された核酸抽出試薬をさらに含む。
【００６３】
一実施態様では、該キットは、本明細書で定義される通りの、それぞれのJ遺伝子の内部又はすぐ下流の、又は定常領域の内部のユニーク領域に対して特異的なオリゴヌクレオチド又はプライマーをさらに含む。さらなる実施態様では、該キットは、本明細書で定義される通りの、それぞれのJ遺伝子の内部又はすぐ下流のユニーク領域に対して特異的なオリゴヌクレオチド又はプライマーをさらに含む。
【００６４】
一実施態様では、該キットは、本発明の第2の態様のステップ(c)のプライマー伸長プロセスを実施するために構成されたプライマー伸長試薬をさらに含む。
【００６５】
一実施態様では、該キットは、本明細書に定義する通りの1以上の制限エンドヌクレアーゼ酵素をさらに含む。
【００６６】
一実施態様では、該キットは、得られた配列決定データを処理し、かつサンプルにおけるVDJ組み換え頻度の視覚的表示を作成するために構成されたコンピュータ可読の記憶媒体をさらに含む。
【００６７】
この分析の偏りのない性質のおかげで、Jセグメントと組み換えしている、あらゆるDNA配列を特定することができる。いくつかのV遺伝子は、通常の欠失ではなく、介在DNA配列の逆位によって組み換えられることが判明している。逆位によるVDJ組み換えは、機能しないVD組み換え産物を産生するが、これらのIgh特異的な産物は、以前の文献には記載されていない。同様に、この分析は、転座(ここでは、J遺伝子とゲノムの別の領域との間に、異常な組み換えが起こっている)を検出することも可能である。したがって、この分析は、共通のIgh転座パートナーを特定する潜在的可能性を有する。したがって、本発明のさらなる態様によれば、本明細書に記載する通りの方法によって得ることが可能なVDJ組み換え産物が提供される。
【００６８】
本明細書に記載する通りの、個人のVDJレパートリーの分析を使用して、免疫不全障害をモニタリングすることができることが理解されよう。本発明のさらなる態様によれば、免疫不全障害をモニタリングする際に使用するための、本明細書に記載する通りのVDJ組み換え産物、又はVDJ組み換え産物を特定する方法が提供される。一実施態様では、免疫不全障害は、リンパ腫又は白血病から選択される。さらなる実施態様では、免疫不全障害は、臨床的に定義される免疫不全障害から選択される。いっそうさらなる実施態様では、免疫不全障害は、加齢に伴う免疫機能の障害から選択される。
【００６９】
本発明の方法に従ってVDJ組み換え産物をモニタリングすることによって、患者のケアを、患者の障害及び薬理ゲノム学的プロファイルによって決定される必要性に適合するように、厳密に調整することができる。
【００７０】
本発明を、これから、以下の非限定的な実施例に依拠して、より詳細に記載する。
【実施例】
【００７１】
(実施例1:制限エンドヌクレアーゼを使用するマウスB細胞におけるVDJ組み換え産物特定方法)
((A)方法)
((i)ビオチン標識されたJセグメント特異的オリゴヌクレオチドを使用するプライマー伸長)
~2×106個のFACSソートされた分画B/CのB細胞から、~7.5μgのDNAを単離し、8つの一定分量に分けて、1反応あたり~1μgを与えた。2UのVent(エキソ-)DNAポリメラーゼ(NEB社)(供給される1×反応バッファー中)と、200μmのdNTPを使用して、50μl体積のプライマー伸長反応物を構築した。この反応では、4つのビオチン標識されたオリゴヌクレオチドのカクテルを使用し、また、これらのビオチン標識されたオリゴヌクレオチドは、Igh遺伝子座における4つのJセグメントのそれぞれにアニーリングするように設計した:
Jセグメントビオチン標識オリゴヌクレオチド
【化１】
0006513949.tif 000002
ここでは、*は、ビオチン部分を指す。
【００７２】
プライマー伸長反応物を、94℃で4分間変性させ、60℃で2分間アニーリングさせ、72℃で10分間伸長させ、次いで氷上で冷却した。プライマー伸長反応物を合わせ、製品プロトコルに従って720μlのAgencourt AMPure XP SPRIビーズ(Beckman Coulter社)を使用して磁気的に精製し、208μlの水に溶出した。
【００７３】
((ii)制限エンドヌクレアーゼ消化)
サンプルを十分に混合し、2本のチューブに分け、各チューブに、1.2μlのBSA、12μlの適切なNEB消化バッファー、及び20単位のDpnII又はNlaIII(NEB)制限エンドヌクレアーゼを添加した。サンプルを、1200rpmのThermomixer(Eppendorf社)で、37℃で3時間インキュベートした。消化後、反応物を、216μlのSPRIビーズを使用して精製し、50μlの水に溶出した。
【００７４】
((iii)VDJ組み換えDNAの濃縮)
kilobaseBINDERキット(Invitrogen社)のストレプトアビジン結合Dynabeadsを使用して、ビオチン標識されたVDJ組み換えDNA断片を濃縮した。製品プロトコルに従って、Dynabeadsの10μl分量を調製し、これに、50μl DNAサンプルを添加し、1200rpmのThermomixerで、20℃で一晩インキュベートした。
【００７５】
サンプルを磁石上に5分間置き、上清を除去して捨てた。ペレットを、100μlのkilobaseBINDERキット洗浄バッファー中で2回洗浄し、DpnII又はNlaIIIのいずれかに適した100μlの1×NEB消化バッファー中で1回洗浄した。ペレットを1×NEB消化バッファーに再懸濁し、0.5μlのDpnII又はNlaIIIを添加し、37℃で1時間インキュベートして、完全な消化を確実にした。
【００７６】
((iv)連結による第1のIlluminaアダプターの組み込み)
磁石上での上清の除去、それに続く100μlのkilobaseBINDERキット洗浄バッファーの2回洗浄、及び100μlの10mM Tris-Cl(pH 8.5)中での1回洗浄によって、消化反応物を精製した。ビーズを50μlの1×NEBリガーゼバッファーに再懸濁し、55℃で5分間インキュベートし、次いで、氷上で急冷した。
【００７７】
さらに、NlaIII-Illuminaアダプター及びDpnII-Illuminaアダプターストックも、55℃で5分間インキュベートし、氷上で急冷した。ビーズを磁石上に置き、上清を除去した。各チューブに、サンプルに適した2μl(200pmol)のNlaIII-又はDpnII-Illuminaアダプターと共に、33μlの水、4μlの10×NEBリガーゼバッファー、及び1μl(2000U)のT4 DNAリガーゼ(NEB)を添加した:
ペアエンドアダプター1
PEアダプター1-NlaIII
【化２】
0006513949.tif 000003
PEアダプター1-DpnII
【化３】
0006513949.tif 000004
【００７８】
連結反応物を、回転ホイール上で室温で2時間インキュベートした。磁石上での上清の除去、それに続く100μlのkilobaseBINDERキット洗浄バッファーの2回洗浄、及び100μlの10mM Tris-Cl(pH 8.5)中での1回洗浄によって、連結反応物を精製した。
【００７９】
((v)PCRによる第2のIlluminaアダプターの組み込み)
サンプルを磁石上に置き、先程のTris-Cl洗浄液を除去した。
【００８０】
ビーズを、50μlの1×PCRミックス(1×バッファー及び200μMの各dNTP)で1回洗浄した。各サンプルは、8つのPCR反応に分ける予定であったので、十分なPCRマスターミックスを調製した。マスターミックス1は、反応あたり、以下を含有していた:21μlの水、1μlの10mM dNTPミックス、1.5μlの10μM Illuminaペアエンドアダプター1フォワードプライマー、及び、5'末端にIlluminaペアエンドアダプター2配列を組み込んだ4つのJセグメント特異的リバースプライマーの1.5μlの10μMミックス。
ペアエンドアダプター2の組み込みのためのPCRプライマー
PEアダプター1(フォワード)
【化４】
0006513949.tif 000005
J1 PE PCRアダプター2(リバース)
【化５】
0006513949.tif 000006
J2 PE PCRアダプター2(リバース)
【化６】
0006513949.tif 000007
J3 PE PCRアダプター2(リバース)
【化７】
0006513949.tif 000008
J4 PE PCRアダプター2(リバース)
【化８】
0006513949.tif 000009
【００８１】
マスターミックス2は、反応あたり、以下を含有していた:19.25μlの水、5μlの10×Expandハイフィデリティバッファー(Roche社)、及び0.75μlのExpandハイフィデリティTaq(Roche社、2.6U)。
【００８２】
サンプルを磁石上に置き、上清を除去した。ビーズを200μlのマスターミックス1に再懸濁し、25μlを8本のPCRチューブに分注した。各チューブに25μlのマスターミックス2を添加し、混合した。PCR反応物を、最初に94℃で2分間変性させたが、PCRサイクリング中は、15秒間変性させた。プライマーを、60℃で30秒間アニーリングさせ、72℃で1分間伸長させた。PCRサイクルを15回行い、続いて、72℃での5分の最終伸長ステップを行った。8つのPCR反応物を、単一のエッペンドルフにプールし、磁石上に置いた。400μlの上清を除去し、新しいチューブに入れ、ビーズを捨てた。製品プロトコルに従って720μlのSPRIビーズを使用して、プールされたPCR反応物を精製し、200μlの水に溶出した。
【００８３】
((vi)非組み換えJセグメントの除去)
各200μlサンプルを8つの25μl分量に分け、PCRチューブに入れた。
【００８４】
各一定分量に対して、5μlの供給されたNEBバッファー、1μlの10mM dNTPミックス、1μl(2U)のVent(エキソ-)DNAポリメラーゼ(NEB)、17μlの水、及び両方の鎖上の4つのJセグメントのそれぞれの上流領域に特異的な8種のビオチン標識されたオリゴの1μlの10μMカクテルを使用して、プライマー伸長反応物を構築した:
除去・ビオチン標識オリゴヌクレオチド
【化９】
0006513949.tif 000010
ここでは、*は、ビオチン部分を指す。
【００８５】
プライマー伸長反応物を、94℃で4分間変性させ、55℃で2分間アニーリングさせ、72℃で10分間伸長させ、次いで氷上で冷却した。8種のプライマー伸長反応物をプールし、製品プロトコルに従って720μlのSPRIビーズを使用して磁気的に精製し、50μlの水に溶出した。
【００８６】
kilobaseBINDERキット(Invitrogen社)からのストレプトアビジン結合Dynabeadsを使用して、ビオチン標識された非組み換えDNA断片を除去した。製品プロトコルに従ってDynabeadsの10μl分量を調製し、これに50μl DNAサンプルを添加して、1200rpmのThermomixerで20℃で一晩インキュベートした。サンプルを磁石上に5分間置き、上清を除去し、新しいチューブに入れ、非組み換え断片を含有しているビーズを捨てた。製品プロトコルに従って108μlのSPRIビーズを使用して、この除去済みサンプルを磁気的に精製し、50μlの水に溶出した。
【００８７】
((vii)Illuminaサイズ選択)
DpnII及びNlaIIIサンプルを、単一のチューブに合わせ、ゲル-ローディングバッファーを添加し、合わせたサンプルを、1.5%アガロースTAEゲル上に流した。サンプルを、ゲル切片の切り出しによって、100から1000bpに渡ってサイズ選択した。
【００８８】
製品プロトコルに従ってQIAGENゲル抽出キットを使用して、サンプルをゲル切片から単離し、50μlの溶出バッファーに溶出させた。
【００８９】
((viii)Illuminaフローセル結合のための粘着末端PCR)
5反応のために、十分なPCRマスターミックスを調製した。マスターミックス1は、反応あたり、以下を含有していた:11μlの水、1μlの10mM dNTPミックス、1.5μlの10 μM IlluminaペアエンドPCRフォワードプライマー、及び1.5μlの10μM IlluminaペアエンドPCRリバースプライマー。
粘着末端PCRプライマー
Illumina PE PCR(フォワード)
【化１０】
0006513949.tif 000011
Illumina PE PCR(リバース)
【化１１】
0006513949.tif 000012
【００９０】
マスターミックス2は、反応あたり、以下を含有していた:19.25μlの水、5μlの10×Expandハイフィデリティバッファー(Roche社)、及び0.75μlのExpandハイフィデリティTaq(Roche社、2.6U)。
【００９１】
75μlのマスターミックス1を、50μlサンプルと合わせ、混合し、5本のPCRチューブに分注した。各チューブに25μlのマスターミックス2を添加し、混合した。PCR反応物を、最初に94℃で2分間変性させたが、PCRサイクリング中は、15秒間変性させた。プライマーを、アニーリングさせ、72℃で1分間伸長させた。PCRサイクルを10回行い、続いて、72℃での5分の最終伸長ステップを行った。PCR反応物をプールし、製品プロトコルに従って450μlのSPRIビーズを使用して磁気的に精製し、60μlの10mM Tris-Cl(pH 8.5)に溶出した。
【００９２】
((ix)Illuminaシークエンシング)
サンプルを、標準のIllumina 36bpペアエンドシークエンシングに提供した。
【００９３】
((B)結果)
分析の結果を、図7に示す。図7は、マウスIgh遺伝子座におけるV遺伝子の組み換え頻度データを表す。すべての検出可能なV遺伝子を、x軸上に、遺伝子座順に示す。これは、広さの制約により、2つに分けてある。DpnII及びNlaIIIデータセットは、データセットあたりの読み取りの総数を、その制限酵素を用いて検出可能なVセグメントの数で割る(読み取りが均等分布している場合に期待される、セグメントあたりの読み取り数をもたらす)ことによって、正規化されている。最後に、各Vセグメントについて観察された読み取り数を、その期待数で割り、期待される読み取り数に対する観察された読み取り数の差(倍)をもたらした。1という値は、読み取りが均等分布している場合に期待される読み取り数に相当する。
【００９４】
(実施例2:超音波処理を使用するマウスB細胞におけるVDJ組み換え産物特定方法)
((A)方法)
((i)サンプル材料)
15匹のマウスから採取される骨髄は一般に、MACS除去及びFACSソーティングの後、約5×106個の分画B/CのVDJ組み換えB細胞をもたらす。Qiagen DNeasyキットを使用して、この数の細胞から約16μgのDNAが一般的に単離される。脾臓のB細胞については、CD43ビオチン(1:1000)及びTer119(1:400)を使用して、脾臓のT細胞、活性化B細胞、及び赤血球を除去する。1つの脾臓は一般的に、1〜1.5×108個の開始細胞から、90%を超える純度で6〜8×107個の細胞を与える。Qiagen DNeasyキットを使用して、107個の細胞から、20μg超のDNAを作製する。したがって、10μgを取り出すことは、4〜5×106個の細胞と同等である。このキットからのDNAをバッファーAE中で溶出した後、EtOH/NaOAcを用いて沈殿させ、70% EtOH洗浄液に、次いで新しいチューブにスプールアウトする。同体積の水に直ちに再懸濁する-この結果として、DNAはほとんど失われない(5%未満)。Nanodropを使用して、DNAの濃度及び収率を決定する。
【００９５】
((ii)断片化及び修復)
製品プロトコルを使用してCovaris E220システムを使用してDNAを断片化して、500bpピークの断片を産生する。この機械は、少なくとも1時間の予備冷却と、使用前の脱気を必要とする。
【００９６】
1. 最大10μgのDNAを130μlの水に再懸濁し、Covarisクリンプキャップマイクロチューブ(カタログ番号520052)に移す。このDNAについては、Nanodropは比較的に正確であるはずだが、picogreen分析を使用してDNAを定量化してもよい。
【００９７】
2. チューブをCovaris E220に入れ、500bpについて、以下のプログラムを実行する:
ピーク放射電力(Peak Incident Power)(W) 105
衝撃係数(Duty Factor) 5%
バーストあたりの周期(Cycles per Burst) 200
処理時間(秒) 80
温度(℃) 7
水位(Water Level) 6
【００９８】
3. サンプルを、マイクロチューブから1.5mlエッペンドルフに移す。不揃いの末端が原因で、この段階では、DNAの移動速度が段階的に異なる可能性があるが、少量を実行してサイズを確認する。
【００９９】
4. 以下のミックスを使用して、DNAを末端修復する:
130μl DNA
16μl 10×T4 DNAリガーゼバッファー(新しい一定分量を使用する)
4μl 10mM dNTPミックス
5μl T4 DNAポリメラーゼ(NEB)
1μl クレノウ(NEB)
5μl T4 PNK(NEB)
合計:体積161μl
20℃で30分間インキュベートする。
【０１００】
5. PCR精製プロトコルを使用してQiagen QIAquickカラムを使用して反応物を精製し、50μlバッファーEB中で溶出する。
【０１０１】
((iv)PE1アダプター連結)
6. 以下のミックスを使用して、修復されたDNAの末端にA-テールを作製する:
50μlの末端修復されたDNA
6μl 10×NEBバッファー2
1μl 10mM dATP
3μl クレノウ(エキソ-)(NEB)
合計:体積60μl
37℃で30分間インキュベートする。
【０１０２】
7. PCR精製プロトコルを使用してQiagen QIAquickカラムを使用して反応物を精製し、30μlの水中で2回溶出する。
【０１０３】
8. 以下のミックスを使用して、アダプターオリゴミックスを連結する:
30μlのA-テール付加DNA
5μl 10×T4 DNAリガーゼバッファー(NEB-新しい一定分量を使用する)
4/8μl アダプターオリゴミックス(50pmol)
5μl T4 DNAリガーゼ2000U(NEB)
合計:体積50μl
16℃で一晩インキュベートする。
【０１０４】
アダプターミックスは、2種のオリゴ:「DpnIIアダプターF」及び「Rev PE両アダプター」(共にアニーリングして非対称PE1アダプターが作製される)を使用する:
【表１】
0006513949.tif 000013
【０１０５】
各オリゴについての100μMの作業用ストックを混合して、50μMのアダプターを与える。これらを加熱及び冷却する必要はなく、単に等モル量を混合し、使用するだけである。反応に使用される4μlのアダプター=200pmol(5μgの500bp断片=15pmol×2=30pmol)。これは、アダプター末端(1×)とDNA末端(2×)との比が約6.67:1比である。10μg DNAに対して、8μlアダプターを使用する。
【０１０６】
9. PCR精製プロトコルを使用してQiagen QIAquickカラムを使用して反応物を精製し、50μlの水中で溶出する。ゲル上にこれが1μl存在していた場合、約40〜50bpのすべての断片のシフトは、非常に効率のよいアダプター連結を示す。
【０１０７】
((v)非組み換えJセグメントの除去)
10. 各Jセグメントの上流領域にアニーリングするビオチン標識されたオリゴを使用するプライマー伸長。サンプルを、反応あたり1μg DNAを超えないようにして、別々のプライマー伸長反応に分ける。例えば、8×反応は、精製中のDNAの喪失を考慮して、反応あたり1μg未満を使用する。
5μl 10×ThermoPol反応バッファー
1μl dNTP(各10mM)
1μl ビオチン標識されたプライマー(10mMミックス)
1μl Ventエキソ-(NEB)
~25μl DNA(反応あたり最大2.5μg DNA)
~17μl水(50μlまで)
合計:体積50μl
サーマルサイクラー条件:95℃4分間、55℃5分間、72℃15分間、4℃の休止。
【０１０８】
57.4℃から59.4℃のTmを有する8種のビオチン標識されたプライマーの混合物を使用する:
【表２】
0006513949.tif 000014
【０１０９】
11. 複数回反応物をプールし、PCR精製プロトコルを使用してQiagen QIAquickカラムを使用して精製する。バッファーPBに入れたpH指示薬(すなわちPBI)を使用する。10μl 3M NaOAcを添加し、40μlの水に溶出する。
【０１１０】
12. Dynabeads MyOne Streptavidin C1ビーズ(Invitrogen社)を調製する。Dynabeadストックをボルテックス処理し、20μlをエッペンドルフに移し、1ml 1×B&Wバッファー(結合及び洗浄用)を添加し、混合し、チューブを磁石上に2分間置き、上清を捨てる。ビーズを20μlの1×B&Wバッファーに再懸濁し、磁石上に置き、上清を捨てる。20μlの洗浄を、計3回繰り返す。ビーズを40μlの2×B&Wバッファーに再懸濁する。
【表３】
0006513949.tif 000015
【０１１１】
13. ステップ11の40μlのDNAサンプルをビーズに添加し、混合し、回転装置(rotator)上で室温で60分間又は一晩インキュベートする。
【０１１２】
14. サンプルを磁石上に5分間置き、上清を清潔なエッペンドルフにピペットで移す。80μl EBバッファーに再懸濁させることによってビーズを洗浄し、磁石上に5分間置き、上清を先述のと同じチューブに移す。
【０１１３】
15. PCR精製プロトコルを使用してQiagen QIAquickカラムを使用して反応物を精製し、50μlの水に溶出する。
【０１１４】
((vi)VDJ組み換え断片の濃縮)
16. 各Jセグメント内(5’末端からの約8bpインサート)にアニーリングするビオチン標識されたオリゴを使用するプライマー伸長。サンプルを、反応あたり1μg DNAを超えないようにして、別々のプライマー伸長反応に分ける。
5μl 10×ThermoPol反応バッファー
1μl dNTP(各10mM)
1μl ビオチン標識されたプライマー(10mMミックス)
1μl Ventエキソ-(NEB)
~25μl DNA(反応あたり最大2.5μg DNA)
~17μl水(50μlまで)
合計:体積50μl
サーマルサイクラー条件:95℃4分間、59℃5分間、72℃15分間、4℃の休止。
【０１１５】
ビオチン標識されたプライマーの混合物を、細胞集団に応じて使用する。Tmは、62.7℃から63.7℃である。
【表４】
0006513949.tif 000016
【０１１６】
17. 複数回反応物をプールし、PCR精製プロトコルを使用してQiagen QIAquickカラムを使用して精製する。バッファーPBに入れたpH指示薬(すなわちPBI)を使用し、40μlの水に溶出する。
【０１１７】
18. 先述の通りにDynabeads MyOne Streptavidin C1ビーズ(Invitrogen社)を調製する(ステップ12参照)。
【０１１８】
19. 調製したDynabeadsとDNAサンプルとを組み合わせ、混合し、回転装置上で室温で一晩インキュベートする。
【０１１９】
20. サンプルを磁石上に5分間置き、保持し、Qiagenキットを用いて除去分画としての上清を精製する。ビーズを100μl 1×B&Wバッファー中で2回洗浄し、100μl EB(Qiagen社)中で1回洗浄する。ビーズを46μlバッファーEBに再懸濁する。
【０１２０】
((vii)PCRによるPE2アダプターの組み込み)
21. 5'末端にPE2配列を有する不変の組み換えジャンクションの10bp下流の4種のJリバースプライマーと、連結されたアダプター中のPE1配列とアニーリングする単一のフォワードプライマーとの混合物と共に、Pwoマスター(Roche社)を使用するPCR。ライブラリの多様性を増大させるために、各サンプルを、4つの別々の25μl PCR反応物に分けた。PCRコンタミネーションについての対照として使用するために、DNAの代わりに水を使用する陰性対照を含めた。
【表５】
0006513949.tif 000017
【０１２１】
以下の条件を使用するPTC100上に乗せる:
94℃2分間; 94℃15秒間、61℃30秒間、72℃45秒間を15サイクル;続いて72℃5分間、及び4℃の休止。必要とされるPCRサイクルの最終数は、最適な増幅を実現するために数決定、例えば10、12、又は15サイクルを必要とすることとなる。第1過程において、第2過程よりも多いサイクルを実施することが最良であると考えられている(例えば、15×第1過程、7×第2過程)。これらのプライマーは、少なくともHPLC、理想的にはPAGE精製を確実に行う。短鎖PE1プライマーTm:68.5℃;JプライマーTm範囲:68.7〜69.8℃。
【表６】
0006513949.tif 000018
0006513949.tif 000019
【０１２２】
22. 4つの別々のPCR反応物を、単一の1.5mlチューブにプールする。5分間、磁石上に置き、対象のPE1-VDJ-PE2産物を含有する上清を新しいチューブにピペットで移す。
【０１２３】
23. ビーズを30μlバッファーEB中で1回洗浄し、上清を先程の上清に添加する。このビーズは、PCRをその上で再び試みることが可能なように保存するが、最初に水での2×1ml洗浄を行って、あらゆる残留PCR産物を除去し、46μl EBに再懸濁し、凍結させておく。
【０１２４】
24. 1×体積のSPRI/Seramagビーズ(約120μlとなる)を使用して、PCR反応物を精製及びサイズ選択する。これによって、200bp未満のプライマー/プライマーダイマー及び断片が除去される。SPRIビーズの結合能力は、3μg/μlであり、これを、20% PEG-8000、2.5M NaClに懸濁する(http://core-genomics.blogspot.co.uk/2012/04/how-do-spri-beads-work.htmlを参照のこと)。このビーズは、結合能力が非常に大きいので、このバッファーで希釈して、捕捉効率に影響を与えずにさらに薄めることも可能である。ビーズを添加し、ピペッティングによって十分に混合し、室温で10分間以上インキュベートし、磁石上に5分間置き、上清を捨てる。サンプルを磁石上に置いたまま、500μlの新しい70% EtOHで2回洗浄する。ビーズを再懸濁してはならない。最終EtOH洗浄液を除去し、ビーズペレットを、ある程度空気乾燥させる。チューブを磁石から外し、ビーズを46μlバッファーEBに十分に再懸濁する。チューブを磁石上に2分間戻し、精製かつサイズ選択されたPCRを含有する上清を新しいチューブに移す。
【０１２５】
((viii)PCRによるフローセル結合及びバーコーディング配列の組み込み)
25. サンプルごとに8種のインデックスプライマーのうちの1つ+PE2と組み合わせたユニバーサルフローセルPE1プライマーと共に、Pwoマスター(Roche社)を使用するPCR。ライブラリの多様性を増大させるために、各サンプルを、4つの別々の25μl PCR反応物に分ける。DNAの代わりに11.5μlの水を使用する陰性対照を含める。
【表７】
0006513949.tif 000020
【０１２６】
以下の条件を使用するPTC100上に乗せる:
94℃2分間; 94℃15秒間、55℃30秒間、72℃45秒間を7サイクル;続いて72℃5分間、及び4℃の休止。PCRサイクルの最終数は、最適な増幅を実現するために、数決定を必要とすることとなるが、第2過程PCRのサイクル数を低く(例えば5又は7に)保つのが良い可能性がある。標的とアニーリングする領域のTmは、PE1については58.2℃、PE2については61.9℃である。
【０１２７】
プライマーは、少なくともHPLC、好ましくはPAGE精製されるべきである。
【表８】
0006513949.tif 000021
【０１２８】
26. 24と同様に、1×体積のAmpure XP(SPRI)ビーズを使用して、PCR反応物を精製及びサイズ選択する。40μl EB中で溶出する。理想的には、最終のライブラリは約40〜50ngであるべきである。
【０１２９】
27. picogreenによって濃度を決定する。2μlをゲル上に流し、QC PCRを実施して、VDJ組み換え産物(例えばVJ558.FからJR)の存在及び非Igh遺伝子(例えばB2M)の非存在について確認する。J558FR3.F QPCR-J4.R QPCR分析及びDSP/DFL.F-J4.R QPCR(SYBRリアルタイム)を使用してV-DJ及びD-J産物の濃縮を分析し、ライブラリと、超音波処理したインプットDNAとを(例えば、超音波処理した脾臓DNAを対照として使用して)比較する。SYBRリアルタイムPCRを使用して、非組み換えJ領域及び非Igh配列の除去を分析する。IgH J領域については、J3〜J4新規int.F-mu0r2=141bp(IgH J)を使用する-この領域は、除去が成功裏に行われた場合に失われることとなる。非Ighについては、B2M又はアクチンを使用することができる。
【０１３０】
28. 結果を生物分析し、QPCRを実施して、データを作成する。
【０１３１】
((B)結果)
分析の結果を、図8に示す。図8は、マウスIgh遺伝子座におけるV遺伝子の組み換え頻度データを表す。すべてのV遺伝子を、x軸上に、遺伝子座順に示す。これは、広さの制約により、4つに分けてある。x軸上の各V遺伝子は、マウスプロB細胞の3つの生物学的重複実験の結果に相当する3本のバーによって表される。異なるシークエンシングライブラリが異なる数の配列を生じることを考慮して、生物学的重複実験間の変動が、読み取りの絶対数ではなく、組み換え頻度の割合的差異を反映するように、読み取り数を重複実験の中央値に正規化する。実施例1に対するこの方法の改善点は、超音波処理が使用されるので、すべてのV遺伝子が検出可能であることである。実施例1では、制限酵素がV遺伝子の内部又は付近では切断しないので、遺伝子の小片は検出可能でない。図8では、読み取り値がない遺伝子座におけるV遺伝子は、常にV偽遺伝子であり、これは、VDJ組み換えを妨げるという欠点を有するので、レパートリーには寄与しない。
【０１３２】
(実施例3:オリゴヌクレオチド及びRNAハイブリダイゼーション)
実施例3は、以下を除いて実施例1及び2と同様に実施することができる:
代替手段は、DNAの非組み換えセグメントを除去しかつV(D)J組み換え領域について濃縮するためにプライマー伸長を使用する代わりに、戦略的に配置されたビオチン標識されたオリゴヌクレオチド又はビオチン標識されたRNAのセットとのハイブリダイゼーション、それに続くストレプトアビジン磁気ビーズを使用する分離を使用することによって、非組み換え領域を優先的に除去し、かつV(D)J組み換えDNAについて濃縮することとなるであろう。
【０１３３】
((i)オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション)
ビオチン標識オリゴヌクレオチド方法論では、実施例1及び2における除去及び濃縮のために使用されるオリゴヌクレオチドと位置が同じ一連のオリゴヌクレオチドを、変性させたゲノムDNAとハイブリッド形成させ、これを使用して、ストレプトアビジン磁気ビーズを使用して、第1の非組み換えDNA領域、続いて第2の組み換えDNA領域を取り去る。これらのステップに続くライブラリ生成は、本明細書に記載する他の実施例についても同様となるであろう。このステップが、非組み換え領域を除去するためだけに使用され、V(D)J組み換え領域を単離するための標準のプライマー伸長がそれに続く場合、センス鎖のみが、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用するプライマー伸長のための鋳型であるので、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、センス鎖を標的にすることだけが必要となるであろう。同様に、この方法が、J-特異的なオリゴヌクレオチドを用いる濃縮のために使用され、遺伝子間アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する除去がそれに続く場合、J-特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、既に除去されたDNAのセンス鎖を標的にする、したがってV(D)J組み換えDNAについて濃縮することだけが必要となるであろう。
【０１３４】
((ii)RNAハイブリダイゼーション)
除去のためのビオチン標識されたRNA方法論では、各J遺伝子のすぐ上流の領域を、PCRによって増幅し、クローニング部位と隣接するT7プロモーター配列を含有するベクターにクローニングする。次いで、これを、T7配列とは反対側のインサート末端で線状化し、これを鋳型として使用して、T7ポリメラーゼを使用してビオチン標識されたRNAを産生する。この酵素が非常にプロセッシブであるようなこの方式で、鎖に特異的な大量のビオチン標識されたRNAを作製することができる。次いで、このビオチン標識されたRNAを、先に詳述したオリゴヌクレオチドと同様に使用して、変性させたゲノムDNAにおける非組み換え領域とハイブリッド形成させ、これをストレプトアビジン磁気ビーズを使用して除去することができる。これらの領域を除去することによって、これらが、実施例1及び2に詳述する通りの、V(D)J組み換えDNA領域を単離するために使用される下流プライマー伸長反応の標的とはならなくなるであろう。さらに、DNAのアンチセンス鎖は、プライマー伸長のための鋳型ではないので、除去ステップに使用されるだけであれば、アンチセンスRNAを使用して、DNAのセンス鎖を標的にすることだけが必要となるであろう。これはまた、より大きな領域、したがって、より大きなビオチン標識されたRNAを、ハイブリダイゼーション特異性及び効率を促進するべきであるハイブリダイゼーションステップに使用することが可能であることを意味する。RNAは、ハイブリダイゼーション後に、容易に消化及びDNAから除去することができる。
【０１３５】
ビオチン標識されたRNA方法論を使用する濃縮については、J遺伝子及び直後の3'領域(100〜200bp領域)をクローニングし、線状化し、これを使用して、ビオチン標識されたRNAを産生し、次いでこれを上と同様の方式で(ただしこの場合には、V(D)J組み換えDNAについて濃縮するために)ハイブリッド形成させることができる。これは、既に非組み換え領域について除去を行った後に行うことが最良であろう。また、除去ステップと濃縮ステップとの両方において、センス鎖を標的にするために、アンチセンスRNAを使用することが最良であろう。これは、ひいては、上の実施例1及び2に詳述した通りの標準のPCRに基づくVDJ-配列決定ライブラリ作成のための完璧な鋳型であるであろう、非組み換え除去されたV(D)J濃縮されたセンス鎖DNAだけを残すであろうからである。
【０１３６】
(実施例4:RNAを使用するVDJ組み換え産物特定法)
((A)方法)
((i)サンプル材料)
マウスの骨髄若しくは脾臓から、又はヒト末梢血から、B細胞を単離する。RNeasy又はTrizolによってRNAを単離し、DNase消化する。1ライブラリ調製あたり、1〜10μg RNAを使用する。
【０１３７】
((ii)逆転写及びRNA分解)
1. Superscript III(Invitrogen社)プロトコルに基づいて、0.5mlチューブ内にRT反応物を準備する。
5μl RNA 1〜10μg(最大10μl)
1μl dNTP(各10mM)
1μl プライマーミックス*(2μM)
6μl 水(13μlまで)
合計:体積13μl
【表９】
0006513949.tif 000022
【０１３８】
2. 70℃で5分間、次いで55℃で5分間インキュベートする。
【０１３９】
3.チューブを55℃に保ちながら、以下のミックスを添加する:
4μl 5×FSバッファー
1μl DTT
1μl RNasin
1μl SSIII
合計:体積20μl
【０１４０】
4. 混合し、55℃で60分間、次いで70℃で15分間インキュベートする。
【０１４１】
5. 1μl RNase H又はA/Tミックスを添加する。
【０１４２】
6. 37℃で20分間インキュベートする。
【０１４３】
7. 1.0×SPRIビーズを使用して反応物を精製し、20μlの水中で溶出する。
【０１４４】
((iii)PE2を3’末端cDNAに付加するためのランダムオクタマー)
8. 0.5mlチューブ内に20μlクレノウエキソ-反応物を準備する(開始するためのクレノウを含まない)。オリゴを含まない陰性対照として半分の反応物を使用する、又は、どちらもオリゴを含む2×反応物を準備する。
10μl cDNA
2μl 10×NEBバッファー2
1μl dNTP(各2mM、したがって通常濃度の1:5希釈)
1μl ランダムオクタマー+PE2(100μM)
5μl 水(19μlまで)
【表１０】
0006513949.tif 000023
【０１４５】
9. 65℃まで5分間(二次構造を変性させる)、次いで22℃まで5分間(オクタマーをアニーリングさせる)加熱する。
【０１４６】
10. 1μlクレノウエキソ-を添加する。
【０１４７】
11. 37℃で30分間、次いで95℃で5分間インキュベートし、反応を停止させ、cDNA由来のオクタマーを変性させる。
【０１４８】
12. 直ちに氷に移す(5分間)。
【０１４９】
13. PCR精製プロトコルを使用してQiagen QIAquickカラムを使用して、又は1.0×SPRIビーズを用いて反応物を精製する。46μl EBに溶出する。
【０１５０】
((iv)第2の鎖を産生する及びVDJ配列を濃縮するためのPCR)
14. ビオチン標識された定常領域プライマーと共にPwoマスター(Roche社)を使用して、PCRを実施する。PCRチューブ内で反応物を構築する。ライブラリの多様性を増大させるために、各サンプルを、4つの別々の25μl PCR反応物に分ける。DNAの代わりに11.5μlの水を使用することによる、PCRコンタミネーションについての陰性対照を含める。
【表１１】
0006513949.tif 000024
【０１５１】
以下の条件を使用するPTC100上に乗せる:
94℃2分間; 94℃15秒間、58℃30秒間、72℃45秒間を12〜15サイクル;続いて72℃5分間、及び4℃の休止。必要とされるPCRサイクルの最終数は、最適な増幅を実現するために、数決定を必要とし得る。
【０１５２】
プライマー配列は、プライマーミックス中に対象の定常領域プライマーのみを含む。これらは、実施の開始時に複雑性を増大させるための8種のランダムヌクレオチドを含有する。短鎖PE2プライマーTm:61.87℃;定常-JプライマーTm範囲:61〜63℃。
【表１２】
0006513949.tif 000025
【０１５３】
15. 4つの別々のPCR反応物を、単一の1.5mlチューブにプールする。0.8×SPRIビーズを使用して精製して、サイズ選択及びプライマー/プライマーダイマーの除去を行う。46μlの水に溶出する。
【０１５４】
16. Dynabeads MyOne Streptavidin C1ビーズ(Invitrogen社)を調製する。Dynabeadストックをボルテックス処理し、20μlをエッペンドルフに移し、1ml 1×B&W+Tweenバッファー*を添加し、混合し、チューブを磁石上に2分間置き、上清を捨てる。ビーズを20μlの1×B&W+Tweenバッファーに再懸濁し、磁石上に置き、上清を捨てる。20μlの洗浄を、再び繰り返す。ビーズを20μlの1×B&W(Tween無し)バッファーに再懸濁し、磁石上に置き、上清を捨てる。ビーズを40μlの2×B&W(Tween無し)バッファーに再懸濁する。
*2×B&W(結合及び洗浄用)バッファー(Tween-20を含む及び含まない)
【表１３】
0006513949.tif 000026
【０１５５】
17. 40μlのDNAサンプル(ステップ15)をビーズに添加し、混合し、回転装置上で室温で60分間又は一晩インキュベートする。
【０１５６】
18. サンプルを磁石上に5分間置き、上清を捨てる。ビーズを100μl 1×B&W(Tween無し)バッファー中で2回洗浄し、100μl EB(Qiagen社)中で1回洗浄する。ビーズを50μlバッファーEBに再懸濁する。
【０１５７】
19. 短鎖PCR 1から短鎖PCR 2プライマーと共にExpand Taq(Roche社)を使用するPCR。200μlチューブ内で反応物を構築する。ライブラリの多様性を増大させるために、各サンプルを、4つの別々の50μl PCR反応物に分ける。
【表１４】
0006513949.tif 000027
【０１５８】
25μlのミックス1を、氷上の4つの別々のPCRチューブに分注し、25μlミックス2を添加し、混合し、以下の条件を使用するサーマルサイクラー上に直ちに乗せる:
94℃2分; 94℃15秒、55℃30秒、72℃45秒を5サイクル;続いて72℃5分間、及び4℃の休止。
*プライマー配列、それぞれTm 61.8℃及び58.2℃:
短鎖PCRプライマー2.0
【化１２】
0006513949.tif 000028
短鎖PCRプライマー1.0
【化１３】
0006513949.tif 000029
【０１５９】
20. PCRが完了したら、4つの反応物を単一の1.5mlチューブに合わせる。サンプルを磁石上に5分間置き、上清を清潔なエッペンドルフにピペットで移す。30μl EBバッファーに再懸濁させることによってビーズを洗浄し、磁石上に5分間置き、上清を先述のと同じチューブに移す。ビーズを含有するチューブは、捨てる(又は50μl EBに再懸濁して保存する)ことが可能である。
【０１６０】
21. PCR精製プロトコルを使用してQiagen QIAquickカラムを使用して反応物を精製し、40μlバッファーEBに溶出する。
【０１６１】
((v)PCRによるフローセル結合及びバーコーディング配列の組み込み)
22. サンプルごとに12種のインデックスプライマーのうちの1つ+PE2と組み合わせたユニバーサルフローセルPE1プライマーと共に、Pwoマスター(Roche社)を使用するPCR。ライブラリの多様性を増大させるために、各サンプルを、4つの別々の25μl PCR反応物に分ける。DNAの代わりに11.5μlの水を用いる陰性対照を含める。
【表１５】
0006513949.tif 000030
【０１６２】
以下の条件を使用するPTC100上に乗せる:
94℃2分間; 94℃15秒間、55℃30秒間、72℃45秒間を7〜9サイクル;続いて72℃5分間、及び4℃の休止。PCRサイクルの最終数は、最適な増幅を実現するために、数決定を必要とすることとなる。標的とアニーリングする領域のTmは、PE1については58.2℃、PE2については61.9℃である。
【表１６】
0006513949.tif 000031
【０１６３】
23. 0.8×SPRIビーズを使用することによって精製してサイズ選択し、プライマー/プライマーダイマーを除去する。
【０１６４】
24. picogreen又はバイオアナライザによって濃度を決定し、QPCRを実施して、VDJ組み換え産物(例えばV4-1からJR)の存在及びハウスキーピング遺伝子(例えばB2M)の非存在について確認する。
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
以下のステップを含む、VDJ組み換え産物を特定する方法:
(a)VDJ組み換え産物を含む核酸サンプルを得ること;
(b)前記核酸サンプルが、DNAを含む場合、超音波処理、又は剪断、又はそれぞれのJ遺伝子の下流又は定常領域の下流の第1の部位と、V遺伝子の内部又はすぐ上流の第2の部位での制限エンドヌクレアーゼ反応を実施することによって、VDJ組み換え産物を断片化して、消化されたVDJ組み換え断片及び非組み換えJ断片を産生すること;
(c)前記核酸サンプルが、DNAを含む場合、前記消化された断片とオリゴヌクレオチドとを、それぞれのJ遺伝子の内部又はすぐ下流のユニーク領域でアニーリングさせること、また、前記核酸サンプルが、cDNA又はRNAである場合、前記VDJ組み換え産物とオリゴヌクレオチドとを、定常領域又はJ遺伝子に対して特異的な位置でアニーリングさせること;
(d)前記核酸サンプルが、DNAを含む場合、非組み換えJ断片及び残りのゲノムから、消化されたVDJ組み換え断片を分離すること;
(e)VDJ組み換え断片又は産物を配列決定すること;及び
(f)配列決定データのデータ処理を行って、各VDJ組み換え産物を特定する及びVDJ組み換え頻度を定量化すること。
（構成２）
VDJ組み換え産物を含む前記核酸サンプルが、細胞集団を含む、構成1記載の方法。
（構成３）
前記細胞集団が、ヒト又はマウス、例えばトランスジェニックマウスから得られる、構成2記載の方法。
（構成４）
前記細胞集団が、免疫グロブリン含有細胞、例えば白血球、特にT細胞又はB細胞などの小リンパ球を含む、構成2又は3記載の方法。
（構成５）
VDJ組み換え産物を含む前記核酸サンプルが、リボソームディスプレイなどのインビトロ抗体産生システムから得られるVDJ組み換え核酸のライブラリを含む、構成1記載の方法。
（構成６）
前記VDJ組み換え産物が、重鎖免疫グロブリンから得られる、構成1から5のいずれか1項記載の方法。
（構成７）
前記VDJ組み換え産物が、軽鎖免疫グロブリンから得られる、構成1から5のいずれか1項記載の方法。
（構成８）
前記VDJ組み換え産物が、T細胞受容体から得られる、構成1から5のいずれか1項記載の方法。
（構成９）
前記核酸が、前記サンプルから得られるDNA又はRNA、例えばcDNA又はmRNA、特にcDNAを含む、構成1から8のいずれか1項記載の方法。
（構成１０）
前記細胞集団が、マウス細胞を含み、かつ前記プライマーが、配列番号:1〜4又は47〜50に記載されたプライマーのいずれかから選択される、構成2から9のいずれか1項記載の方法。
（構成１１）
前記細胞集団が、ヒト細胞を含み、かつ前記プライマーが、配列番号:51〜56に記載されたプライマーのいずれかから選択される、構成2から9のいずれか1項記載の方法。
（構成１２）
前記核酸サンプルが、超音波処理によって断片化される、構成1から11のいずれか1項記載の方法。
（構成１３）
前記核酸サンプルが、制限エンドヌクレアーゼ反応を実施することによって断片化される、構成1から11のいずれか1項記載の方法。
（構成１４）
ステップ(b)で使用される前記制限エンドヌクレアーゼ酵素が、DpnII及び/又はNlaIIIから選択される、構成13記載の方法。
（構成１５）
ステップ(b)が、V遺伝子の上流の領域に対して特異的である酵素などの第3の制限エンドヌクレアーゼ酵素の使用を含む、構成13又は構成14記載の方法。
（構成１６）
ステップ(c)が、プライマー伸長、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、及び/又は逆転写を実施するステップをさらに含む、構成1から15のいずれか1項記載の方法。
（構成１７）
ステップ(c)が、消化された断片を、結合対(例えばビオチンとストレプトアビジン又は抗原と抗体など)の一方のメンバーでタグ付けすることを含む、構成1から16のいずれか1項記載の方法。
（構成１８）
ステップ(c)の後の、前記VDJ組み換え産物の一方の末端への第1のアダプター分子の付加をさらに含む、構成1から16のいずれか1項記載の方法。
（構成１９）
ステップ(b)で使用される前記制限エンドヌクレアーゼ酵素が、NlaIIIであり、かつ、前記アダプター分子が、配列番号:5から選択される、構成18記載の方法。
（構成２０）
ステップ(b)で使用される前記制限エンドヌクレアーゼ酵素が、DpnIIであり、かつ、前記アダプター分子が、配列番号:6から選択される、構成18記載の方法。
（構成２１）
前記VDJ組み換え産物の第2の末端への第2のアダプター分子の付加をさらに含む、構成18から20のいずれか1項記載の方法。
（構成２２）
前記細胞集団が、マウス細胞を含み、かつ、前記第2のアダプターの付加のためのプライマーが、配列番号:7〜11又は57〜65から選択される、構成21記載の方法。
（構成２３）
前記細胞集団が、ヒト細胞を含み、かつ、前記第2のアダプターの付加のためのプライマーが、配列番号:66〜72から選択される、構成21記載の方法。
（構成２４）
ステップ(d)が、両方の鎖上のそれぞれのJ遺伝子の上流領域に対して特異的なオリゴヌクレオチドの使用を含む、構成1から23のいずれか1項記載の方法。
（構成２５）
前記細胞集団が、マウス細胞を含み、かつ、ステップ(d)で使用される前記オリゴヌクレオチドが、配列番号:12〜19又は24〜34から選択される、構成24記載の方法。
（構成２６）
前記細胞集団が、ヒト細胞を含み、かつ、ステップ(d)で使用される前記オリゴヌクレオチドが、配列番号:39〜46から選択される、構成24記載の方法。
（構成２７）
VDJ組み換え産物を特定するためのキットであって、構成1から26のいずれか1項記載の方法に従って前記キットを使用するための説明書を含む、前記キット。
（構成２８）
構成1記載の方法のステップ(a)に必要とされる核酸サンプルを得るために構成された核酸抽出試薬をさらに含む、構成27記載のキット。
（構成２９）
それぞれのJ遺伝子の内部又はすぐ下流の、又は定常領域の内部のユニーク領域に対して特異的なオリゴヌクレオチド又はプライマーをさらに含む、構成27又は構成28記載のキット。
（構成３０）
1以上の制限エンドヌクレアーゼ酵素をさらに含む、構成27から29のいずれか1項記載のキット。
（構成３１）
ステップ(e)で得られた配列決定データを処理し、かつ前記サンプルにおけるVDJ組み換え頻度の視覚的表示を作成するために構成されたコンピュータ可読の記憶媒体をさらに含む、構成27から30のいずれか1項記載のキット。
（構成３２）
構成1から26のいずれか1項記載の方法によって得ることが可能なVDJ組み換え産物。
（構成３３）
免疫不全障害をモニタリングする際に使用するための、構成1から26のいずれか1項記載の方法、又は構成32に記載のVDJ組み換え産物。
（構成３４）
前記免疫不全障害が、リンパ腫又は白血病から選択される、構成33記載の方法又はVDJ組み換え産物。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【配列表】
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