(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  ＴＬＲ９リガンドおよび第一のペプチド性アルファらせんと連結している少なくとも１つの抗ＣＤ３２部分を含む指定のアジュバントであって、前記ＴＬＲ９リガンドがＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドクラスＡ、ＢまたはＣであり、かつ前記抗ＣＤ３２部分がＣＤ３２と結合するタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドであるアジュバントと、
−  少なくとも１つのエピトープ、および前記第一のアルファらせんに巻き付けられた第二のペプチド性アルファらせんを持つ免疫原と
を含み、ここで、前記第一および第二のアルファらせんがコイルドコイル構造をもたらし、それにより、前記指定のアジュバントおよび前記免疫原が互いに結合し、そのコイルドコイル構造は、２つの異なるらせんのヘテロコイルである、免疫調節ワクチン。
【請求項２】
前記第一および第二のアルファらせんのそれぞれが、１０-6Ｍ未満のＫｄで互いに特異的に結合している、アミノ酸モチーフの３〜５の繰り返しを含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記抗ＣＤ３２部分が、抗ＣＤ３２抗体、抗体フラグメントおよびペプチドからなる群から選択される、請求項１または２に記載のワクチン。
【請求項４】
前記免疫原が、
−  がん疾患の免疫療法において使用するための腫瘍関連抗原、または
−  感染性疾患の免疫療法において使用するための病原体、または
−  アレルギー疾患の免疫療法において使用するためのアレルゲン
の何れかに由来する、請求項１〜３の何れかに記載のワクチン。
【請求項５】
前記抗ＣＤ３２部分がＣＤ３２ａを標的としている、請求項１〜３の何れかに記載のワクチン。
【請求項６】
前記免疫原がアレルギー疾患の免疫療法において使用するためのアレルゲンに由来し、前記抗ＣＤ３２部分がＣＤ３２ａおよびＣＤ３２ｂを標的としている、請求項１〜３の何れかに記載のワクチン。
【請求項７】
−  配列番号７０の配列を含むまたはそれからなる、前記第一のアルファらせんと連結している抗ＣＤ３２部分から構成され、配列番号７０の配列が、好ましくは１：１〜１８の比（１分子当たりの分子）で、配列番号６９のＴＬＲ９リガンドとカップリングしている、指定のアジュバントであって、前記抗ＣＤ３２部分がＣＤ３２と結合するタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドであるアジュバントと、
−  前記第二のアルファらせんと連結している免疫原である配列番号３０の免疫原を含む若しくはそれからなる免疫原、好ましくは配列番号７５の免疫原、または、機能的に活性なその変異体、好ましくはここでＣｙｓ３７９は除去されている変異体
とを含み、前記指定のアジュバントおよび前記免疫原が、前記第一および第二のアルファらせんのコイルドコイル構造によって互いに結合している、
請求項１〜６の何れかに記載のワクチン。
【請求項８】
下記の成分
−  ＴＬＲ９リガンドおよび第一のペプチド性アルファらせんと連結している少なくとも１つの抗ＣＤ３２部分を含む指定のアジュバントであって、前記ＴＬＲ９リガンドがＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドクラスＡ、ＢまたはＣであり、かつ前記抗ＣＤ３２部分がＣＤ３２と結合するタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドであるアジュバントと、
−  少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、および前記第一のアルファらせんと整合している第二のペプチド性アルファらせんを持つ免疫原と
を含む、請求項１〜７の何れかに記載のワクチンを調製するためのキット。
【請求項９】
医薬製剤中に、ＴＬＲ９リガンドおよびペプチド性アルファらせんと連結している少なくとも１つの抗ＣＤ３２部分を含み、前記ＴＬＲ９リガンドがＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドクラスＡ、ＢまたはＣであり、かつ前記抗ＣＤ３２部分がＣＤ３２と結合するタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである、感作ワクチン。
【請求項１０】
前記アルファらせんがコイルドコイル二重らせんである、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
患者を、前記患者の免疫療法前に、請求項１〜７の何れかに記載の免疫調節ワクチンで予め免疫化するのに使用するための、請求項９または１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
−  ＴＬＲ９リガンドと連結している少なくとも１つの抗ＣＤ３２部分を含む指定のアジュバントであって、前記ＴＬＲ９リガンドがＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドクラスＡ、ＢまたはＣであり、かつ前記抗ＣＤ３２部分がＣＤ３２と結合するタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドであるアジュバントと、
−  好ましくは連結または親和性結合によって、前記指定のアジュバントと結合している免疫原と、
−  ここで、前記アジュバントは第一のペプチド性アルファらせんを有し、および前記免疫原は前記第一のアルファらせんと整合する第二のペプチド性アルファらせんを有する、
を含む免疫原性組成物を含み、
好ましくはワクチン接種時に誘導される特異的な最大ＩｇＧ力価での、一過性である免疫原に向けられるＩｇＧ免疫応答、続いて、少なくとも３０％、好ましくは、少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または最大１００％の力価低減を、ワクチン接種６か月以内に引き出すために、対象を治療するのに使用するための、ワクチン。
【請求項１３】
前記力価低減が、一連のワクチン接種における最終ワクチン接種時のものである、請求項１２に記載の使用のためのワクチン。
【請求項１４】
前記免疫原が、自己抗原の抗原またはエピトープであるまたはそれを含む、請求項１２または１３に記載の使用のためのワクチン。
【請求項１５】
前記自己抗原が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、好ましくは腫瘍細胞表面受容体または腫瘍細胞によって産生される可溶性抗原、たとえばＨｅｒ２／ｎｅｕ、インターフェロンアルファ（ＩＮＦα）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦ−Ｒ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＭＵＣ−１またはルイスＹ、プレホルモンおよびホルモン、たとえばガストリン、セクレチンもしくはインスリンを包含する消化ホルモン、甲状腺ホルモンまたは性ホルモンの何れかからなる群から選択される、請求項１４に記載の使用のためのワクチン。
【請求項１６】
前記対象がヒトであり、前記自己抗原がヒト起源である、請求項１４または１５に記載の使用のためのワクチン。
【請求項１７】
前記ＩｇＧ免疫応答が可逆的なものである、請求項１２〜１６の何れかに記載の使用のためのワクチン。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
本発明は、免疫原およびそれと連結している指定のアジュバントを含み、それによって免疫原への免疫応答を調整する、免疫調節ワクチンに関する。本発明はさらに、
−  ＴＬＲ９リガンドと連結している少なくとも１つの抗ＣＤ３２部分を含む指定のアジュバントと、
−  指定のアジュバントと結合している免疫原と
を含む免疫原性組成物を含み、免疫原に向けられる一過性ＩｇＧ免疫応答を引き出すために、対象を治療するのに使用するための、ワクチンに関する。
【背景】
【０００２】
アレルギー、がんおよび自己免疫疾患を包含する免疫疾患のために、Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７／Ｔｒｅｇ細胞によって調節される免疫バランスの調節のための中心的役割、および新規免疫療法の開発へのその適用がある。
【０００３】
Ｔｈ１細胞（１型ヘルパーＴ細胞）は、炎症促進性サイトカイン、たとえばＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＴＮＦ−βの産生を特徴とする。Ｔｈ１細胞は、細胞媒介性免疫に関与する。Ｔｈ１細胞によって産生されたサイトカインは、微生物病原体の食作用および破壊を刺激する。数種の慢性炎症性疾患は、Ｔｈ１優位疾患、すなわち多発性硬化症、糖尿病および関節リウマチとして記述されてきた。
【０００４】
Ｔｈ２細胞（２型ヘルパーＴ細胞）は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３の産生を特徴とする。Ｔｈ２細胞は、アレルギー応答において役割を果たすと考えられている。サイトカイン、たとえばＩＬ−４は、概して抗体の産生を刺激する。ＩＬ−５は、免疫応答の一部でもある好酸球応答を刺激する。アトピーおよびアレルギーは、Ｔｈ２優位状態であると考えられている。
【０００５】
Ｔｈ１／Ｔｈ２またはＴｈ１７／Ｔｒｅｇ免疫の不均衡は、種々の免疫疾患の原因となる。
【０００６】
アレルギーは、環境におけるタンパク質への過敏反応であるとみなされる。アレルゲンは、アトピー患者がＩｇＥ抗体応答で応答し、その後アレルギー反応につながる抗原である。複合体または融合タンパク質中の抗原は、環境アレルゲン（たとえば、イエダニ、カバノキ花粉、草花粉、ネコ抗原、ゴキブリ抗原）もしくは食物アレルゲン（たとえば、牛乳、ピーナッツ、エビ、大豆）、または両方の組合せであり得る。ＩｇＥ分子は重要であり、これはエフェクター細胞（マスト細胞、好塩基球および好酸球）活性化におけるそれらの役割のためである。ＩｇＥは、アレルギー性疾患の誘導期においても、Ｂ細胞および樹状細胞（ＤＣ）の抗原捕捉可能性を、低親和性（ＣＤ２３）と高親和性受容体（ＦｃｅＲＩ）の両方を介して上方調節することによって重要な役割を果たすことが概して認められている。ＩｇＥ抗体の負の機能は、アレルゲン特異的ＩｇＧ抗体によって対抗されることがあり、これは、たとえば、該抗体がＢ細胞から離れて単球およびＤＣへ免疫応答を向け、ＦｃεＲＩをこれらの細胞上のＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）と共架橋することを介してエフェクター細胞のＩｇＥ受容体媒介活性を下方制御することができるからである。加えて、該抗体は、アレルゲン結合部位をめぐってＩｇＥ分子と競合する。したがって、アレルギーは、アレルゲン特異的ＩｇＧ分子、とりわけＩｇＧ１の誘導によって、治療し、治癒させ、予防することができる。
【０００７】
ＩｇＧ分子は、ＩｇＥ分子のほぼ３日と比較して、およそ３週間の血清中半減期を有する。ＩｇＥ分子は、（未感作）Ｂ細胞とＴｈ２細胞との間の相互作用によって誘導され、これが、記憶Ｂ細胞および形質細胞においてＩｇＥへのクラススイッチを誘導するために必要なＣＤ４０Ｌ発現と一緒にＩＬ−４およびＩＬ−１３を提供する。対照的に、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２を産生するＴｈ１細胞は、ＩｇＧへのクラススイッチを誘導する。したがって、Ｔｈ１の誘導は、アレルゲンに対するＴｈ２ヘルパーＴ細胞応答よりもむしろ、アレルギー性疾患の予防、治療および治癒に有益である。
【０００８】
これまで、アレルゲンを使用する数種の形態の活性ワクチン接種が使用されている。最も一般的なのはいわゆる「免疫療法」であり、これは比較的高濃度のアレルゲンによる頻繁な免疫化によって決まる。この技術は、少数のアレルギー性疾患、たとえば蜂毒アレルギーにおいてならびに鼻炎および結膜炎のいくつかの症例において適度に有効なだけであり、最近、いくつかの報告は、より軽度な形態の喘息およびアトピー性皮膚炎における有効性を示した。より最近では、漸増量のアレルゲンが比較的短い時間枠で注射される急速免疫療法が適用され、わずかに良好な結果となっている。通常、皮下経路がアレルゲンの投与に使用されるが、最近この経路は経口適用またはさらには局所適用と比較されており、結果は概して陽性であるが常に一貫性があるとは限らない。免疫療法のための異なる技術は、Ｓａｉｎｔ−Ｒｅｍｙ（ＥＰ０１７８０８５およびＥＰ０２８７３６１）によって記述されているものであり、これは、関連アレルゲンとインビトロ複合体形成されている自己ＩｇＧ抗体を活用する。この技術は、はるかに少ない量のアレルゲンがより少ない副作用で適用されることを可能にする。
【０００９】
これらの療法の背後にある機序は不明である。伝統的な療法において、療法が特異的ＩｇＧ抗体の増大を誘導するならば有益な効果があると思われるが、特異的ＩｇＧの著しい増大すべてが、成功する免疫療法と相関しているとは限らない。なぜそうなるのか考えられる論拠は、Ｂ細胞、単球およびマスト細胞上のＣＤ３２に対するＩｇＧ抗体の比較的低い親和性である。Ｓａｉｎｔ−Ｒｅｍｙアプローチでは、患者から特異的ＩｇＧ抗体を選択し、これをその後関連アレルゲンとインビトロで混合する。このように、彼らは、アレルゲンが、細胞、または細胞上の他の抗体アイソタイプ、たとえばマスト細胞上のＩｇＥと自由に反応できないことを保証している。加えて、彼らは、抗イディオタイプ抗体が特異的ＩｇＧ分子に対して上昇し、これが将来アレルギーを予防することを主張している。
【００１０】
ＷＯ９７／０７２１８において、アレルゲン−抗ＣＤ３２融合タンパク質について記述されている。この公報では、特異的ＩｇＧ分子を単離することおよびＣＤ３２に対するこれらのＩｇＧ抗体の低親和性に関する問題が避けられ、完全な「ＩｇＥ結合」アレルゲンを使用する伝統的な免疫療法のリスク因子が低減している。しかしながら、抗ＣＤ３２含有ワクチンを樹状細胞に向けることだけによるＴｈ１記憶応答の特許請求されている誘導は、立証されていない。
【００１１】
ＷＯ２００７０９８９３４Ａ１は、ＴＬＲ９と、および少なくとも１つの抗原の少なくとも１つのエピトープを含むＣＤ３２と結合することができる分子、その産生、ならびに、とりわけアレルギーの治療のための薬剤としてのその使用について記述している。
【００１２】
免疫調節は、アレルギー性疾患の症例だけでなく、一連の他の疾患において動作していてもよい。
【００１３】
感染因子、たとえば微生物病原体に対する免疫応答を強化することが、防護的または治療的抗感染性免疫療法の目標である。
【００１４】
腫瘍免疫療法においては、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に加えて腫瘍抗原特異的Ｔヘルパー１型（Ｔｈ１）細胞を使用するという目標もある。
【００１５】
悪性新生物として医学的に公知であるがんは、種々の疾患の広範な群であり、何れも無調節な細胞成長を伴う。がんにおいて、細胞は制御不能に分割および成長して悪性腫瘍を形成し、体の近隣各部に侵入する。がんは、リンパ系または血流を介して体のより遠い各部に拡散していてもよい。すべての腫瘍ががん性とは限らない。良性腫瘍は制御不能に成長せず、隣接する組織に侵入せず、体全体にわたって拡散しない。２００を超える異なる公知のがんがあり、ヒトを苦しめている。
【００１６】
がんを引き起こす原因を決定することは複雑である。喫煙、ある特定の感染症、放射線、身体活動の欠乏、肥満および環境汚染物質を包含する多くのものが、がんのリスクを増大させることが公知である。これらは、遺伝子を直接損傷させるか、または疾患を引き起こす細胞内の現存する遺伝子異常と組み合わさることができる。がんのおよそ５から１０パーセントは、完全に遺伝性である。
【００１７】
がんは、ある特定の兆候および症状の存在、スクリーニング試験または医療撮像を包含する多数の手法で検出され得る。考えられるがんが検出されたら、組織試料の顕微鏡検査によって診断する。がんは、通常、化学療法、放射線療法および手術で治療される。疾患からの生存の可能性は、がんの種類および位置ならびに治療開始時における疾患の程度によって大きく変動する。がんはあらゆる年齢の人々に影響を及ぼし得、数種類のがんは小児においてより一般的であるが、がんを発症するリスクは概して年齢とともに増大する。２００７年、がんは世界中ですべてのヒトの死の約１３％（７９０万人）を引き起こした。老齢まで生きる人々が増えるにつれて、および発展途上世界において庶民のライフスタイルの変化が出現するにつれて、比率は増加する。
【００１８】
免疫系は環境因子に応答するため、自己と非自己との間の識別に基づいて、多くの種類の腫瘍細胞に遭遇し、これらはがんの発病が患者自身の免疫系によって多かれ少なかれ忍容されたことの結果として生じるものであり、何故なら腫瘍細胞は本質的に、適正な調節制御なしに、成長、分割および拡散している患者自身の細胞であるからである。
【００１９】
免疫寛容または免疫学的寛容は、免疫系が抗原を攻撃しないプロセスである。自然または自己寛容において、体は自己抗原に対して免疫応答をマウントしない。これは３つの形態：中枢性寛容、末梢性寛容および獲得寛容で出現する。
【００２０】
中枢性寛容1：
中枢性寛容は、リンパ球分化中に出現し、胸腺および骨髄において作用する。ここで、自己抗原を認識するＴおよびＢリンパ球は、それらが完全に免疫担当細胞に進化する前に欠失して、自己免疫を予防する。このプロセスは、胎児期において最も活動的であるが、未熟リンパ球が産生されるのに伴い、生涯を通じて続く。
【００２１】
末梢性寛容2：
末梢性寛容は、ＴおよびＢ細胞が成熟し末梢に入った後に発達する免疫学的寛容である。胸腺から出るＴ細胞は、比較的にではあるが、完全に安全とは限らない。受容体（ＴＣＲ）を有するものもあり、これは、Ｔ細胞が胸腺において遭遇しなかった「弱い」受容体（たとえば組織特異的分子、たとえばランゲルハンス島、脳または脊髄内のもの）と結合できるような高濃度で存在する自己抗原に応答することができる。胸腺における胸腺内陰性選択を免れたそれらの自己反応性Ｔ細胞は、末梢組織において欠失するかまたは有効に封じられない限り、細胞傷害を負わせることができる。そのような潜在的に自己反応性のＴ細胞を鎮めるための数種のフィードバック機構が存在することが公知である。それらは、下記：アネルギー、活性化誘導性細胞死、末梢抑制を包含する。
【００２２】
獲得または誘導寛容3：
獲得または誘導寛容は、他の状況においてはおそらく細胞媒介性または液性免疫を誘導する所与の抗原に対する、リンパ系組織の特異的非反応性を特徴とする外部抗原への、免疫系の適合を指す。最も重要な自然種の獲得寛容の１つは、妊娠における免疫寛容であり、ここで、胎児および胎盤は、母体の免疫系によって忍容されなくてはならない。
【００２３】
腫瘍関連抗原を標的とする免疫療法：
がん免疫療法は、がんを拒絶するための免疫系の使用である。大前提は、患者の免疫系を刺激して、疾患の原因となる悪性腫瘍細胞を攻撃することである。これは、患者自身の免疫系が腫瘍細胞を破壊すべき標的として認識するように訓練されている事例においては患者の能動免疫化を介して（たとえば、細胞がんワクチン、たとえばプロベンジ、Ｄｅｎｄｒｅｏｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＵＳを投与することによって）4、または患者の免疫系が治療抗体によって腫瘍細胞を破壊するように動員される事例においては薬物としての治療抗体の投与を介しての何れかで為され得る。患者の免疫系を腫瘍に対して活性化するための別のアプローチは、いわゆる腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を活用することであり、該抗原は、健康な正常細胞上ではある程度（extend）まで発現されるが腫瘍細胞上では過剰発現される自己タンパク質であるか、または腫瘍細胞が増殖する細胞ホルモン／成長因子を含む5。これらのＴＡＡは、免疫系が、これらのタンパク質が自己であるという事実にもかかわらず応答を作るような免疫原性の態様で構築され、体に提示される。明らかに、このアプローチは、患者が末梢性または獲得寛容を発達させたＴＡＡにのみ有用となる。ＴＡＡを認識するＴおよびＢ細胞が免疫学的レパートリーから欠失している場合、活性がん免疫療法という選択肢はない。
【００２４】
ガストリン：
消化管がん、たとえば膵臓がんの治療のための標的として使用されていてもよい自家抗原（autoantigen）（ホルモン／成長因子）の例は、リトルガストリン（Ｇ１７）6〜9である。加えて、Ｇ１７の中和化学反応は、胃潰瘍、胃食道逆流性疾患（ＧＥＲＤ）10を包含する任意のガストリン関連疾患状態において、胃のｐＨがガストリンによって調節されているために、および末期腎不全（ＥＳＲＦ）11に、ガストリンがＥＳＲＦ患者において正常より高い濃度で循環しているために、有益となり得る。
【００２５】
ＵＳ５０２３０７７は、胃および十二指腸潰瘍疾患の治療および予防のための免疫原性組成物および方法について記述しており、この免疫原性組成物は、ガストリンペプチドに基づき、免疫原性担体、たとえばジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニンまたはウシ血清アルブミンとカップリングする。
【００２６】
ガストリンは、消化管において数種の重要な機能を有し、２つの最も重要なものは、消化管における酸分泌の刺激および細胞の成長の刺激である。ホルモンは、各分子内のアミノ酸残基（「ＡＡ」）の数によって命名された、少なくとも２つの分子形態、ヘプタデカガストリン、いわゆるリトルガストリン（「Ｇ１７」）、およびテトラトリアコンタガストリン（「Ｇ３４」）で存在し、ここで、Ｇ１７はＧ３４の１７アミノ末端（「Ｎ−末端」）残基を構成する。
【００２７】
ＵＳ５６０９８７０は、抗Ｇ１７免疫原の調製について記述しており、これは、哺乳動物における抗体を、自身のＧ１７に対して上昇させるものであり、Ｇ１７は、Ｇ１７から最大アミノ酸残基数１２までのＮ−末端アミノ酸配列のフラグメントに対応する配列からなるペプチドを、そのＣ−末端によって、免疫原性担体、たとえばジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニンおよびウシ血清アルブミンとコンジュゲートしているスペーサーペプチドとコンジュゲートさせることを含み、Ｇ３４と反応しない。
【００２８】
免疫バランス：
Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７／Ｔｒｅｇ細胞によって調節される免疫バランスは、免疫療法の開発においてかなりの部分を担う。
【００２９】
自己免疫疾患において、Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７／Ｔｒｅｇ不均衡を、すなわち免疫系が自己組織を攻撃する状態において、調節する必要性がある。
【００３０】
ＴＬＲ９の役割：
トール様受容体（ＴＬＲ）は、先天性免疫系において主要な役割を果たすタンパク質のクラスである。これらは、細胞表面上、ならびに前哨細胞、たとえばマクロファージおよび樹状細胞の細胞内区画内に通常発現される、単一の膜貫通非触媒受容体である。ＴＬＲは、微生物に由来する構造的に保存された分子である病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識し、先天性免疫およびその後の適応免疫に必要なサイトカインの産生を誘導するようにシグナル伝達を開始する。
【００３１】
種々のＴＬＲは、異なるパターンの発現を呈する。この遺伝子は、免疫細胞リッチ組織、たとえば脾臓、リンパ節、骨髄および末梢血白血球において優先的に発現される。
【００３２】
１３のＴＬＲ（単純にＴＬＲ１からＴＬＲ１３と命名されている）がヒトおよびマウスを一緒にして同定されており、これらの多くの同等の形態が他の哺乳類種において見られた。しかしながら、マウスにおけるすべてのＴＬＲ受容体がヒトにおいても見られる、またはその逆であるとは限らない。加えて、すべてのＴＬＲ受容体についてリガンドおよび機能が公知であるとは限らず、たとえば、ＴＬＲ１０は未知の機能を持つオーファン受容体である。
【００３３】
ＴＬＲ受容体の活性化は、種々の疾患の治療に使用されてきており、たとえば医薬品によるＴＬＲ９の活性化は、アレルギーの治療および腫瘍学において有益であることが示されている。マウスおよびヒトにおける研究は、ＴＬＲ９の天然リガンドがＤＮＡ分子内の非メチル化ＣｐＧ配列であることを指示している。ＣｐＧ部位は、脊椎動物ゲノム上において、細菌ゲノムまたはウイルスのＤＮＡと比較すると、比較的まれ（約１％）である。ＴＬＲ９は、免疫系の多数の細胞、たとえば樹状細胞、Ｂリンパ球、単球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によって発現される。しかしながら、健康なヒトにおいて、ＴＬＲ９の発現は、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）およびＢ細胞に制限される。発現は、細胞内、エンドソーム区画内のものであり、ＣｐＧモチーフ内のＤＮＡリッチと結合することにより、ウイルスおよび細菌感染症の免疫系に警告するように機能する。しかしながら、病的（pathologiocal）状態下では、ＴＬＲ９発現は細胞の細胞表面上でも報告されている12〜14。
【００３４】
多くの異なる合成ＴＬＲ９アゴニスト分子が報告されている。アゴニストリガンド（ＴＬＲ９活性化）は、３つの群に分類されている：
ＣｐＧクラスＡ、特に、「Ｄ」型ＯＤＮとしても公知のＣｐＧ−Ａ（Ｄ）15オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）からなる群。そのようなＴＬＲ９アゴニストは、強いＩＦＮａ誘導および樹状細胞の最小成熟を誘導し、ここでは「群１」ＴＬＲ９リガンドと呼ばれる。例は、ＯＤＮ２２１６16：ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号４８）である。
【００３５】
ＣｐＧクラスＢ、特に、「Ｋ」型ＯＤＮとしても公知であるＣｐＧ−Ｂ（Ｋ）17オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）からなる群。そのようなＴＬＲ９アゴニストは、弱いＩＦＮａ誘導および樹状細胞の成熟を誘導し、ここでは「群２」ＴＬＲ９リガンドと呼ばれる。例は、ＯＤＮ２００６18;19：ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ（配列番号４９）である。
【００３６】
ＣｐＧ−Ｃ20オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）としても公知であるＣｐＧクラスＣからなる群。そのようなＴＬＲ９アゴニストは、ＩＦＮａおよび未熟樹状細胞の成熟を誘導し、ここでは「群３」ＴＬＲ９リガンドと呼ばれる。例は、ＯＤＮＭ３６２21：
ＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＡＣＧＴＴＧＡＴ（配列番号６９）である。
【００３７】
これまで記述されているＴＬＲ９について、リガンドはすべてヌクレオチドに基づいている。ＴＬＲ９に特異的な抗体が報告され、受容体の存在および位置を実証するために使用されているが、これらの分子はＴＬＲ９のためのリガンドとして記述されたものではなく、活性化するまたは活性を阻害するいかなるＴＬＲ９の報告もなかった。
【００３８】
ＣＤ３２の役割：
ＣＤ３２は、単球／樹状細胞およびＢ細胞上において強く発現され、故に、そのような分子は、免疫応答をこれらの重要な免疫学的細胞に向けるように設計され、その意図は、Ｂ細胞による抗原提示を予防しながら、とりわけ樹状細胞（ＤＣ）による抗原提示を促進することであり、後者は、充分に刺激された場合、抗原に対するＴｈ１応答の誘導につながる。少なくとも２種類のＤＣ：骨髄性（ｍＤＣ）および形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）があり、これは、ＤＣ１およびＤＣ２細胞の新たな概念につながった。この概念において、ＤＣ１細胞は、抗原特異的な刺激の後にＴｈ１細胞発達の誘導を促進し、ＤＣ２細胞は、Ｔｈ２細胞の発達を支持する。単球由来ＤＣ（またはｍＤＣ）は概してＤＣ１型とみなされるのに対し、ｐＤＣはＤＣ２型とみなされる。両方の種類のＤＣは、ＣＤ３２ａを発現し、抗原特異的なＴ細胞応答を誘導することになるが、成果がＴｈ１型のものとなることは保証されていない。実際に、アレルギー性ドナーにおいて、Ｔｈ２応答はより起こりやすい。重要なことには、ｐＤＣはＴＬＲ９受容体を発現し、これがＣｐＧ−ＯＤＮ（非メチル化ＣｐＧモチーフを含有するオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ））と結合する。ｐＤＣにおけるこの受容体の活性化は、ＩＦＮ−アルファおよびＩＬ−１２の非常に強い産生につながり、これがＴｈ１誘導を促進し、故に潜在的なＤＣ２をＤＣ１細胞に転換する。
【００３９】
故に、そのような分子は、ｐＤＣにおけるＴＬＲ９受容体の活性化を、抗原特異的なＴｈ１細胞の特異的な刺激および誘導と組み合わせることができる。
【００４０】
腫瘍免疫療法において、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に加えて腫瘍抗原特異的なＴヘルパー１型（Ｔｈ１）細胞を使用するという特定の目標がある。
【００４１】
コイルドコイル：
コイルドコイルはタンパク質内の構造的モチーフからなり、ここで２〜７つのアルファらせんがロープのストランドのように一緒に巻き付けられており、二量体および三量体が最も一般的な種類である。コイルドコイルらせんは、Ｆｖ抗体フラグメントを安定させてヘテロ二量体性コイルドコイルドメイン22をもたらすために使用されている。
【００４２】
複合タンパク質性分子の安定性および折りたたみ構造は、免疫原を設計する際に重大である。故に、本発明の目的は、特異的な免疫原に対する免疫応答を調節するための、安定性および構造が改良されたワクチンを提供することである。
【００４３】
さらに、ガストリンおよびガストリン依存性疾患状態を標的とする改良された免疫療法を提供する必要性がある。故に、本発明の目的は、特異的なガストリンエピトープに対する免疫応答を調節するための、免疫原性、安定性および構造が改良されたワクチンを提供することである。
【本件発明】
【００４４】
目的は、特許請求されている通りの主題によって解決される。
【００４５】
本発明によれば、
−  ＴＬＲ９リガンドおよび第一のペプチド性アルファらせんと連結している少なくとも１つの抗ＣＤ３２部分を含む指定のアジュバントと、
−  少なくとも１つのエピトープ、および第一のアルファらせんに巻き付けられた第二のペプチド性アルファらせんを持つ免疫原と
を含む、免疫調節ワクチンが提供される。
【００４６】
具体的に、エピトープは、Ｔ細胞および／またはＢ細胞エピトープである。
【００４７】
本発明の具体的な側面によれば、前記第一および第二のアルファらせんのそれぞれは、１０-6Ｍ未満のＫｄで、好ましくは１０-7Ｍ未満、より好ましくは１０-8Ｍまたは１０-9Ｍ未満のＫｄで互いに特異的に結合している、アミノ酸モチーフの３〜５アミノ酸繰り返しを含む。
【００４８】
本発明のさらなる具体的な側面によれば、前記抗ＣＤ３２部分は、好ましくはＣＤ３２ａを標的としている、抗ＣＤ３２抗体、抗体フラグメントおよびペプチドからなる群から選択される。抗体フラグメントは、具体的に、たとえばＦａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ）２もしくはＦｃａｂフラグメント、または受容体と特異的に結合し、結合後に内在化される限り、任意の他の考えられる結合実体であってもよい。
【００４９】
本発明の別の側面によれば、ＴＬＲ９リガンドは、ＣｐＧクラスＡ、特に、「Ｄ」型ＯＤＮとしても公知であるＣｐＧ−Ａ（Ｄ）23オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）からなる群から選択されるＴＬＲ９アゴニストである。そのようなＴＬＲ９アゴニストは、強いＩＦＮａ誘導および樹状細胞の最小成熟を誘導し、ここでは「群１」ＴＬＲ９リガンドと呼ばれる。
【００５０】
本発明の別の側面によれば、ＴＬＲ９リガンドは、ＣｐＧクラスＢ、特に、「Ｋ」型ＯＤＮとしても公知であるＣｐＧ−Ｂ（Ｋ）24オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）からなる群から選択されるＴＬＲ９アゴニストである。そのようなＴＬＲ９アゴニストは、弱いＩＦＮａ誘導および樹状細胞の成熟を誘導し、ここでは「群２」ＴＬＲ９リガンドと呼ばれる。
【００５１】
本発明の別の側面によれば、前記ＴＬＲ９リガンドは具体的に、ＣｐＧ−Ｃ25;26オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）としても公知であるＣｐＧクラスＣからなる群から選択されるＴＬＲ９アゴニストである。そのようなＴＬＲ９アゴニストは、ＩＦＮａおよび未熟樹状細胞の成熟を誘導し、ここでは「群３」ＴＬＲ９リガンドと呼ばれる。
【００５２】
本発明の別の側面によれば、前記ＴＬＲ９リガンドは具体的に、ＣｐＧクラスＡ、ＢまたはＣオリゴデオキシヌクレオチドの何れかを模倣している免疫刺激ペプチド、すなわち、活性化しているアゴニスト機能によりＴＬＲ９と特異的に結合しているペプチドである。
【００５３】
本発明の別の側面によれば、ＴＬＲ９リガンドは、阻害ＯＤＮ27;28オリゴデオキシヌクレオチド（時に阻害ＣＰＧと呼ばれる）からなる群から選択されるＴＬＲ９アンタゴニスト、たとえばＣＣｘ（非−Ｃ）（非−Ｃ）ｘｘＧＧＧ（ｘ＝任意の塩基）29からなる阻害モチーフを含有するものである。特異的阻害ＯＤＮは、ＩＦＮａを誘導せず、樹状細胞の成熟を誘導しないことが証明されており、またＴＬＲ９のアゴニストを介して活性化を遮断する。
【００５４】
そのようなＴＬＲ９アゴニストまたはアンタゴニストは、好適な細胞ベースアッセイにおいて決定することができ、これは、未熟樹状細胞（ＤＣ）の成熟を反映する、ＩＦＮａ、またはマーカーＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６の少なくとも１つの何れかの安定発現を測定するものである。この目的のために、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）を、健康なドナーの血液からＴｅｌら30によって記述されている通りに精製し、その後、適切な濃度のＴＬＲ９リガンドとともにインキュベートする。２４時間後、ＩＦＮａを、上清中、標準的なＥＬＩＳＡプロトコールを使用して測定する。細胞の成熟状態の決定のために、ｐＤＣを、ＣＤ８０、ＣＤ８３またはＣＤ８６の発現について、標準的なＦＡＣＳ手順を使用し、市販の特異的な抗体で、ＴＬＲ９リガンドとのインキュベーション前後に染色する。
【００５５】
ＩＦＮａの誘導は、ＩＦＮａ発現のレベルおよび基準レベルに対するそれぞれの増大によって決定されていてもよい。非刺激細胞と比べた増大を、群１、２または３のＴＬＲ９リガンドによって定義される通りの各種のＣｐＧについて確立された基準により誘導された誘導レベルと比較してもよく、典型的にはそれぞれの基準の３０％乃至３００％、好ましくは少なくとも１００％、より好ましくは少なくとも１２０％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％または少なくとも２５０％である。
【００５６】
未熟樹状細胞の成熟は、マーカーＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６の何れかの発現のレベルによって決定されていてもよい。非刺激細胞と比べたそれぞれの増大を、群１、２または３のＴＬＲ９リガンドによって定義される通りの各種のＣｐＧについて確立された基準によって誘導された誘導レベルと比較してもよく、典型的にはそれぞれの基準の３０％乃至３００％、好ましくは少なくとも１００％、より好ましくは少なくとも１２０％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％または少なくとも２５０％である。
【００５７】
具体的に、群１および３のＴＬＲ９アゴニストは、ＩＦＮａ発現の増大をもたらし、群２および３のＴＲＬ９アゴニストは、ＤＣ成熟因子ＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６の何れかの発現の増大をもたらす。ＴＬＲ９アンタゴニストは、ＩＦＮａ発現の低減ならびにＤＣ成熟因子ＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６の何れかの発現の低減を、群１〜３何れかのＴＬＲ９アゴニストの存在下であってももたらす。
【００５８】
本発明の具体的な態様によれば、免疫原は、
−  がん疾患の免疫療法において使用するための腫瘍関連抗原、または
−  感染性疾患の免疫療法において使用するための病原体、または
−  アレルギー疾患の免疫療法において使用するためのアレルゲン
の何れかに由来する。
【００５９】
そのようなワクチンは、典型的には免疫刺激ワクチンであり、たとえば液性およびＴ細胞（Ｔｈ１）免疫応答を刺激する。
【００６０】
免疫刺激ワクチンのこの態様は、ＴＬＲ９アゴニストであるＴＬＲ９リガンドを具体的に用いる。この事例において、ワクチンは、免疫原に対するＴｈ１応答を主に誘導する。
【００６１】
具体的に、前記抗ＣＤ３２部分は、ＣＤ３２ａを、好ましくは１０-6Ｍ以下、より好ましくは１０-7Ｍ未満または１０-8Ｍ未満のＫｄの高親和性で標的としている。
【００６２】
より具体的に、前記抗ＣＤ３２部分は、特異的または選択的ＣＤ３２ａバインダーであり、すなわち、ＣＤ３２ｂを標的としていないか、またはＣＤ３２ｂを、１０-6Ｍ超、好ましくは１０-5Ｍより高い、より好ましくは１０-4Ｍより高いＫｄの低親和性で標的としている。ＣＤ３２ａおよびＣＤ３２ｂと結合する差分親和性は、好ましくは少なくとも１対数、より好ましくは少なくとも２対数もしくは少なくとも３対数、またはＫｄ値におけるより高い差異である。
【００６３】
ＣＤ３２ｂよりもＣＤ３２ａと結合するための抗ＣＤ３２部分の具体的に好ましい高親和性または高差分親和性は、典型的には、ＴＬＲ９アゴニストをさらに用いる免疫刺激ワクチンにおいて使用される。そのようなワクチンは、一連の腫瘍学標的または病原性標的から選択される免疫原を用いることがさらに好ましく、ここで、Ｔｈ１応答および特異的ＩｇＧ抗体は、疾患と有効に闘うことが必要である。
【００６４】
代替的な態様によれば、前記抗ＣＤ３２部分は、ＣＤ３２ａとＣＤ３２ｂの両方を、Ｋｄ≦１０-6Ｍの高親和性、好ましくは１０-7Ｍより高い親和性、より好ましくは１０-8Ｍより高い親和性で標的としている。ＣＤ３２ａとＣＤ３２ｂの両方と結合するための抗ＣＤ３２部分の具体的に好ましい高親和性は、典型的には、ＴＬＲ９アゴニストをさらに用いるワクチンにおいて使用される。そのようなワクチンは、一連のアレルギー標的から選択される免疫原を用いることがさらに好ましく、ここで、Ｔｈ１応答を取得するためのＴｈ２応答の向け直しが取得される。典型的には、ワクチン自体に対する抗体は好ましくない。さらに、ＣＤ３２ａとほぼ同じ親和性でＣＤ３２ｂと結合する特異的ワクチンが好ましい。
【００６５】
ＣＤ３２ａもしくはＣＤ３２ｂの何れか、またはＣＤ３２ａとＣＤ３２ｂの両方を特異的に標的としている抗ＣＤ３２部分の結合親和性は、好適なアッセイ、たとえば典型的なＥＬＩＳＡにおいて、市販のＨＩＳタグ付き組み換え形態のＣＤ３２ａおよびＣＤ３２ｂを、Ｎｉ−ＮＴＡ  ＥＬＩＳＡプレート、たとえばＮｉ−ＮＴＡ  ＨｉｓＳｏｒｂプレート（Ｑｉａｇｅｎ、Ａｕｓｔｒｉａ）にコーティングしたものを使用して決定することができる。抗ＣＤ３２部分は、ビオチン化されていてもよく、そのため、ストレプトアビジン（streptavidine）−ＨＲＰまたはストレプトアビジンＡＰおよび適切な基質を使用して検出してもよい。代替として、部分は、ＦＡＣＳアッセイにおいて、ＣＤ３２ａを発現しているがＣＤ３２ｂを発現していないＵ９３７細胞（たとえばＡＴＣＣ：ＣＲＬ１５９３）、およびＥＢＶ転換Ｂ細胞、たとえば、ｖａｎ  Ｒｅｉｊｓｅｎら31によって記述されている通りのＣＤ３２ｂを発現しているがＣＤ３２ａを発現していないＣＦＢ４：２を使用して、試験されてもよい。
【００６６】
本発明のさらなる態様によれば、免疫原は、
−  アレルギー疾患の免疫療法において使用するためのアレルゲン、または
−  自己免疫疾患の免疫療法において使用するためのヒト自家抗原
の何れかに由来する。
【００６７】
自己免疫疾患において使用するためのそのようなワクチンは、典型的には免疫寛容ワクチンであり、たとえば、免疫原に対するＴ細胞寛容を調節Ｔ細胞によって誘導し、液性免疫応答を下方調整する。
【００６８】
免疫寛容のこの態様は、群１のＴＬＲ９アゴニストであるかまたはＴＬＲ９アンタゴニストであるＴＬＲ９リガンドを具体的に用いる。この事例において、ワクチンは免疫原に対するＴｈ１／２／１７応答を主に下方調節するが、Ｔｒｅｇ細胞を活性化する。
【００６９】
アレルギーにおいて使用するためのそのようなワクチンは：
−  たとえば、免疫原に対するＴ細胞寛容を調節Ｔ細胞によって誘導し、液性免疫応答を下方調整し、群１のＴＬＲ９アゴニストであるかまたはＴＬＲ９アンタゴニストであるＴＬＲ９リガンドを用いる、免疫寛容（immuntolerance）ワクチン。この事例において、ワクチンは、免疫原に対するＴｈ１／２／１７応答を主に下方調節するが、Ｔｒｅｇ細胞を活性化する；
または
−  免疫原に対するＴｈ１応答を誘導しながら、ワクチンに対する液性免疫応答を予防し、群３のＴＬＲ９アゴニストであるＴＬＲ９リガンドを用いる、免疫刺激ワクチン
の何れかであってよい。
【００７０】
免疫寛容ワクチンのこの態様によれば、前記抗ＣＤ３２部分は、ＣＤ３２ｂ、またはＣＤ３２ａとＣＤ３２ｂの両方の何れかを、Ｋｄ≦１０-6Ｍの高親和性で、好ましくはＫｄ≦１０-7Ｍ、より好ましくはＫｄ≦１０-8Ｍのより高い親和性で特異的に標的としている。抗ＣＤ３２部分は、ＣＤ３２ａとＣＤ３２ｂの両方を特異的に標的としていることが好ましい。
【００７１】
また、アレルギーにおいて使用するための免疫刺激ワクチンについて、前記抗ＣＤ３２部分は、ＣＤ３２ａおよびＣＤ３２ｂを、Ｋｄ≦１０-6Ｍの高親和性で、好ましくはより高い親和性、たとえばＫｄ≦１０-7Ｍ、より好ましくはＫｄ≦１０-8Ｍで、特異的に標的としている。抗ＣＤ３２部分は、ＣＤ３２ａとＣＤ３２ｂの両方を特異的に標的としていることが好ましい。
【００７２】
具体的に、本発明によるワクチンが提供され、ここで、前記免疫原は、アレルギー疾患の免疫療法において使用するためのアレルゲンに由来し、前記抗ＣＤ３２部分は、ＣＤ３２ａおよびＣＤ３２ｂを標的としている。
【００７３】
本発明の具体的な態様は、下記の表から描写されていてもよく、これは、ＣＤ３２ａおよび／またはＣＤ３２ｂと結合するその特異性および親和性、ＴＬＲ９リガンドの種類ならびに免疫原の種類による、抗ＣＤ３２部分の選択を示すものである。
【表１】
0006466327.tif 000002
【００７４】
列２および３は、ＣＤ３２ａおよびＣＤ３２ｂの何れかと結合している抗ＣＤ３２部分の選択性および／または親和性：
ＣＤ３２ａとの選択的結合を意味するＣＤ３２ａ＞＞ＣＤ３２ｂ（結合親和性における差異／少なくとも１対数のＫｄ）；
ＣＤ３２ａとＣＤ３２ｂの両方とのある程度までの結合を意味するＣＤ３２ｂ＝ＣＤ３２ａ（結合親和性における差異／１対数未満のＫｄ）
を指す。
【００７５】
特に、抗アレルギーワクチン、すなわちアレルギー性疾患状態の治療のための免疫寛容ワクチン、または抗自己免疫疾患ワクチン、すなわち自己免疫疾患状態の治療のための免疫寛容ワクチンを提供する場合、抗ＣＤ３２部分は、ＣＤ３２ａとＣＤ３２ｂの両方を、ほぼ等しい高親和性、たとえばＣＤ３２ａおよびＣＤ３２ｂ標的のそれぞれとの結合の、Ｋｄ値における差異が、２対数未満、好ましくは１対数未満の差分親和性で、特異的に標的としている。
【００７６】
本発明によれば、
ａ．ＴＬＲ９リガンドおよび第一のペプチド性アルファらせんと連結している少なくとも１つの抗ＣＤ３２部分を含む指定のアジュバントと；
ｂ．第一のアルファらせんに巻き付けられた第二のペプチド性アルファらせんと連結しているガストリン−１７ペプチド免疫原と
を含み、該ペプチド免疫原が、
（ｉ）配列番号７８のアミノ酸配列、もしくは配列番号７９のアミノ酸配列を含むそのフラグメント、もしくは配列番号７９の少なくとも４つのＮ−末端アミノ酸を含む、ヒトガストリン−１７；
（ｉｉ）（ｉ）の、好ましくはアカゲザルもしくはネズミ起源の、類似体；および／または
（ｉｉｉ）配列番号７９のアミノ酸配列中に、１、２、３もしくは４つの点突然変異を持つ、（ｉ）もしくは（ｉｉ）の何れかの機能的に活性な変異体
の何れかである、
免疫原性組成物がさらに提供される。
【００７７】
具体的に、前記ペプチド免疫原は、
（ｉ）配列番号８０、好ましくは配列番号８１のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号８２、好ましくは配列番号８３のアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号８４、好ましくは配列番号８５のアミノ酸配列；または
（ｉｉｉ）配列番号７９もしくは８６のアミノ酸配列
を含む、またはそれらからなる、直鎖状ペプチドである。
【００７８】
本発明の免疫原性組成物は、第二のペプチド性アルファらせんと連結しているペプチド免疫原の少なくとも２つ、好ましくはペプチド免疫原の２、３または４つを含むことが好ましい。
【００７９】
１つを超えるペプチド免疫原が第二のアルファらせんと結合している場合、ペプチド免疫原は、たとえばアルファらせんと連続的にコンジュゲートしていてもよい、すなわち、ペプチド免疫原（imunogens）を１列に連結している、たとえば第一のペプチド免疫原のＣ−末端を第二のペプチド免疫原のＮ−末端と連結しており、ここで第一および第二のペプチド免疫原は、互いに同一であるかまたは異なっている。
【００８０】
代替として、または加えて、さらなるペプチド免疫原が、本発明の免疫原性組成物に、架橋によって組み込まれていてもよく、たとえば、互いに同一であるかまたは異なっている２つ以上のペプチド免疫原が、同じアルファらせんと、化学反応、たとえば分子間架橋の確立を可能にする化学的架橋により、たとえば、ホモ二官能性試薬、たとえばアジプイミド酸ジメチル（ＤＭＡ）、スベルイミド酸ジメチル（ＤＭＳ）またはグルタルアルデヒドを用いて連結される。たとえば、そのような架橋は、グルタルアルデヒド架橋を用い、それぞれアルファらせんまたはスペーサー／リンカーの遊離リジン基によって実施されていてもよい。それによって、本発明に従って使用される通りの２つ以上のペプチド免疫原は、アルファらせんと、並列に、または隣り合ってカップリングされる。
【００８１】
本発明のさらなる具体的な側面によれば、免疫原性組成物は、グリシンおよび／またはセリンおよび／またはリジン残基、好ましくは配列番号８９または９０のアミノ酸配列から好ましくは構成される、１つ以上のリンカー配列を含む。リンカー配列は、たとえば２つ以上のペプチドまたはポリペプチド実体の間に連結または架橋を提供するために、直鎖状であっても分枝であってもよい。
【００８２】
本発明のさらなる具体的な側面によれば、免疫原性組成物は、配列番号８７または配列番号８８のアミノ酸配列を含む、またはそれらからなる。
【００８３】
本発明によれば、本発明の免疫原性組成物と薬学的に許容される担体とを含むワクチンがさらに提供される。そのようなワクチンは、典型的には免疫刺激ワクチンであり、たとえば液性およびＴ細胞（Ｔｈ１）免疫応答を刺激する。
【００８４】
好ましい態様によれば、液性およびＴ細胞（Ｔｈ１）免疫応答は一過性であり、たとえばワクチン接種時に誘導される特異的な最大ＩｇＧ力価を持ち、これは、典型的にはワクチン接種２から８週間以内に、続いて、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または最大１００％の力価低減が、ワクチン接種６か月以内、好ましくは５か月以内、または４か月以内、または３か月以内、または２か月以内に達成される。そのような低減された力価は、ブースター注射時に再度増大していてもよい。一連のワクチン接種において、一過性免疫応答は、免疫原性組成物またはワクチンの最終注射時に決定される可能性がある。一過性免疫応答は、たとえば、治療を必要に応じて中断するまたは中止する可能性がある、制御された治療の利点を有する。
【００８５】
本発明は特に、
−  ＴＬＲ９リガンドと連結している少なくとも１つの抗ＣＤ３２部分を含む指定のアジュバントと、
−  好ましくは連結または親和性結合；たとえば組み換えＤＮＡ技術による融合によって、指定のアジュバントと結合している、または化学的にコンジュゲートされている免疫原と
を含む免疫原性組成物を含み、
好ましくはワクチン接種時に誘導される特異的な最大ＩｇＧ力価での、典型的にはワクチン接種２から８週間以内に達成される、一過性である免疫原に向けられるＩｇＧ免疫応答、続いて、少なくとも３０％、好ましくは、少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または最大１００％の力価低減を、ワクチン接種６か月以内、たとえば一連のワクチン接種における最終ワクチン接種時に引き出すために、対象を治療するのに使用するための、
ワクチンを提供する。
【００８６】
そのようなワクチンは、好ましくは免疫原とともに使用され、これは、たとえば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、好ましくは腫瘍細胞表面受容体または腫瘍細胞によって産生される可溶性抗原、たとえばＨｅｒ２／ｎｅｕ、ガストリン、インターフェロンアルファ（ＩＮＦα）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦ−Ｒ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＭＵＣ−１またはルイスＹ、プレホルモンおよびホルモン、たとえば、セクレチンもしくはインスリンを包含する消化ホルモン、甲状腺ホルモンまたは性ホルモンの何れかからなる群から選択される、自己抗原の抗原またはエピトープであるかまたはそれを含む。
【００８７】
自己抗原は、ヒト対象を治療する場合、特にヒト起源のものである。
【００８８】
この種類のワクチンによって誘導される一過性Ｔｈ１免疫応答により、不可逆的な自己免疫応答はないが可逆的なものはあり、これは、具体的な循環ＩｇＧのレベル、たとえば５０％未満、好ましくは６０％未満、好ましくは７０％未満、好ましくは８０％未満、または９０％未満、さらには最大１００％の循環ＩｇＧの低減により、ＩｇＧが誘導された後に指示される。ＩｇＧ誘導に続いて、典型的には、具体的な期間以内、たとえば最終免疫化後１年以内、または６か月以内、または３か月以内に、ＩｇＧ低減がある。
【００８９】
これに関して、本発明はさらに、有効量のワクチンを対象に、たとえば１以上の用量で投与することによって、自己抗原または自家抗原の一過性低減を必要としている対象を治療する方法であって、少なくとも最終用量が一過性効果を提供する方法を提供する。
【００９０】
本発明によれば、本発明の免疫原性組成物を調製するためのキットであって、下記の成分
ａ．ＴＬＲ９リガンドおよび第一のペプチド性アルファらせんと連結している少なくとも１つの抗ＣＤ３２部分を含む指定のアジュバントと；
ｂ．第一のアルファらせんと整合している第二のペプチド性アルファらせんと連結しているガストリン−１７ペプチド免疫原と
を含み、該ペプチド免疫原が、
（ｉ）配列番号７８のアミノ酸配列、もしくは配列番号７９のアミノ酸配列を含むそのフラグメント、もしくは配列番号７９の少なくとも４つのＮ−末端アミノ酸を含む、ヒトガストリン−１７；
（ｉｉ）（ｉ）の、好ましくはアカゲザルもしくはネズミ起源の、類似体；および／または
（ｉｉｉ）配列番号７９のアミノ酸配列中に、１、２、３もしくは４つの点突然変異を持つ、（ｉ）もしくは（ｉｉ）の何れかの機能的に活性な変異体
の何れかである、キットがさらに提供される。
【００９１】
キットは、具体的に、予め形成された指定のアジュバント成分を、対象群または個々の対象の必要性に応じて提供されていてもよい免疫原との組合せに使用することにより、ワクチンの産生を容易にするために使用されていてもよい。
【００９２】
本発明によれば、ガストリン依存性疾患または疾患状態に罹患している対象を治療するのに使用するための、免疫原性組成物がさらに提供される。そのような疾患または疾患状態は、対象における内因性ガストリン産生または過剰産生によって主として引き起こされるかまたはそれらに関連している。ガストリン依存性疾患または疾患状態は、具体的に、ガストリン依存性腫瘍またはガストリン依存性がん、たとえば膵臓がん、または消化管がん、胃潰瘍、胃食道逆流性疾患（ＧＥＲＤ）、末期腎不全（ＥＳＲＦ）、または肥満を包含する。
【００９３】
故に、本発明は、具体的に、ガストリン依存性疾患、たとえばガストリン依存性腫瘍もしくはガストリン依存性がん、たとえば膵臓がん、または消化管がん、胃潰瘍、胃食道逆流性疾患（ＧＥＲＤ）、末期腎不全（ＥＳＲＦ）、または肥満に罹患している対象を治療する方法であって、該対象に、有効量の免疫原性組成物または本発明のワクチンを、防護的に、たとえば疾患もしくは疾患状態の発生または疾患の進行を予防するために、または治療的に、たとえば疾患もしくは疾患状態を寛解させるためにの何れかで投与することによる方法を提供する。
【００９４】
具体的に、組成物は、対象に有効量で、プライム・ブースト戦略を用いて投与される。
【００９５】
具体的に、有効量は、１回投与当たり０．０００１乃至２ｍｇ、好ましくは１用量当たり０．００１乃至２ｍｇの範囲である。
【００９６】
本発明の具体的な態様によれば、対象は、化学療法によって、たとえばガストリン依存性がんを治療する過程においてさらに治療される。
【００９７】
具体的に、本発明の免疫原性組成物は、対象における保護免疫応答を、好ましくは少なくとも１／１０００、好ましくは少なくとも１／１０4、好ましくは少なくとも１／１０5、好ましくは少なくとも１／１０6以下のヒトガストリン−１７に対する血清中ＩｇＧ力価でトリガーし、故に、より高い希釈で検出可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図１は、本発明において使用されているコイルドコイルの高親和性相互作用を示す（例４）。
【００９９】
コイル−Ｋを持つ免疫原をＢＩＡコアチップにコーティングし、コイル−Ｅを持つ弾頭を流動緩衝液に入れる。各コイルは、５×ヘプタッド繰り返し（5 time heptad repeat）アルファらせんを含む。
【０１００】
・  データは、２つのコイルの互いの極端な親和性を裏付けるものである（低オフレートにより可視化される）32。
【０１０１】
・  免疫原コイルの弾頭コイルとの結合は特異的であり、免疫原とのプレインキュベーションによって遮断することができる。
【図２】図２は、免疫原３誘導性Ｔ細胞反応性を示す（例６）。
【０１０２】
Ｄｅｒ  ｐ１感作アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）からのＰＢＭＣを、Ｄｅｒ  ｐ１または免疫原３とともに３連で培養した。増殖を［3Ｈ］−チミジンの組み込みによってアッセイした。結果を、１分当たりの計数として示す。加えて、上清をＩＬ−１０およびＧＭ−ＣＳＦレベルについてアッセイし、それぞれｐｇ／ｍｌとして指示した。
【０１０３】
・  Ｄｅｒ  ｐ１または免疫原３に対する応答の間に著しい差異はなく、増殖にもサイトカイン産生にもなく、これは、ヒトＨＬＡクラスＩＩ発現に基づいて選択された免疫原３におけるＴ細胞エピトープが、アカゲザルクラスＩＩ分子によって等しく良好に提示されており、等しく強いＴ細胞応答を誘導することを指示している。
【図３】図３は、弾頭媒介性の強化された抗原提示を示す（例７）。
【０１０４】
それぞれ弾頭およびＤｅｒ  ｐ１または弾頭および免疫原３との氷上での３０分間にわたるプレインキュベーション後の、アカゲザル（ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）Ｔ細胞の２４時間増殖（［3Ｈ］−チミジンの組み込みによってアッセイした）。各プレインキュベーション後、細胞を洗浄した（ｂｄｌ＝検出限界未満）。
【０１０５】
・  免疫原がそのコイル（免疫原３）を介して弾頭と相互作用できた場合のみ、用量依存の態様でのＴ細胞増殖が見られた。Ｄｅｒ  ｐ１は、弾頭とともにプレインキュベートした場合、応答を示さなかった。陽性対照として、Ｄｅｒ  ｐ１は、終夜のインキュベーション（洗浄なし）後に反応性であることが示される。
【０１０６】
・  弾頭媒介性抗原取り込みは、飲作用を介する取り込みよりも効率的である。
【図４】図４は、ＣｐＧとカップリングされている自家抗原によって誘導された自己免疫応答を示す（例８）。
【０１０７】
ＰＢＭＣアカゲザル（ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）および正常ヒトＰＢＭＣを、ＣｐＧまたはＣｐＧ−ビオチンまたはａＣＤ３２−ビオチン＋ＣｐＧとともに２４時間培養した。上清を収穫し、ＩＬ−４およびＩＦＮｇについてアッセイした（それぞれｐｇ／ｍｌとして指示されている）。
【０１０８】
・  ＣｐＧをビオチンとカップリングした場合（ＣｐＧ−ビオチン）、ビオチンのないＣｐＧと比較して強いＩＬ−４（アカゲザルおよびヒトＰＢＭＣ）が誘導された。ヒトＰＢＭＣは、ＣｐＧ−ビオチンに対しても強いＩＦＮｇ応答を示した。ビオチンおよびＣｐＧをカップリングしなかった場合（ａＣＤ３２−ビオチン＋ＣｐＧ）、ヒトまたはアカゲザルＰＢＭＣにおけるＣｐＧと比較して応答の増大は見られなかった。
【図５】図５は、免疫原５誘導性Ｔ細胞反応性を示す（例１０）。
【０１０９】
健康なヒトドナーのＰＢＭＣを、Ｄｅｒ  ｐ１または免疫原５とともに３連で２４時間培養した。上清を収穫し、ＩＬ−１０およびＧＭ−ＣＳＦレベルについてアッセイした（それぞれｐｇ／ｍｌとして指示されている；ＢＤＬ＝検出限界未満）。
【０１１０】
・  ヒトＴ細胞は、ＩＬ−１０およびＩＦＮｇ誘導によって測定される通り、Ｄｅｒ  ｐ１についての免疫原５と等しく良好に応答する。
【図６】図６は、弾頭ＳＧ１００免疫化による自己免疫応答の誘導を示しており、弾頭は、ＳｃＦＶ−１−コイルおよびｍＡｂ  ＩＶ．３に対して強いＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ応答を２８日目に誘導した。陽性応答は、ミョウバンの存在とは無関係に見られた。ＳｃＦＶ−１−コイルによる免疫化だけが、ＳｃＦＶ−１−コイルに対するＩｇＧ１応答を誘導し、ミョウバンの存在下でのみ、ＩｇＧ２ａ応答は誘導されなかった。
【図７】図７（例１２．８）  強いＩｇＧ応答が弾頭およびＳＧ１００の免疫原に対して測定されたが、Ｄｅｒ  ｐ１、Ｄｅｒ  ｐ２、Ｄｅｒ  ｐ５またはＤｅｒ  ｐ７に対して抗体は検出されず、これは、動物が被験ＨＤＭアレルゲンについて未感作であったこと、およびＳＧ１００がＢ細胞エピトープを含有せず、これが被験ＨＤＭアレルゲンと交差反応することを指示している。
【図８】図８（例１２．８）  動物は、弾頭、ｉｍｍｏ５、Ｄｅｒ  ｐ１、Ｄｅｒ  ｐ２、Ｄｅｒ  ｐ７によりインビトロで刺激した場合に強い増殖を示したが、Ｄｅｒ  ｐ５に対しては示さなかった。Ｄｅｒ  ｐ５はｉｍｍｏ５の一部ではない。
【図９】図９（例１２．８）  動物は、弾頭、ｉｍｍｏ５、Ｄｅｒ  ｐ１、Ｄｅｒ  ｐ２、Ｄｅｒ  ｐ７による刺激後にＩＬ−４のないＩＦＮγを産生したが、Ｄｅｒ  ｐ５ではしなかった。Ｄｅｒ  ｐ５はｉｍｍｏ５の一部ではない。
【図１０】図１０は、カニクイザルにおける抗体（ＩｇＧ誘導）を示す。０日目、１４日目および２８日目にワクチン（ＴＹＧ１００＿２ＲＭ）を３回注射後の、時間曲線ＩｇＧ抗Ｇ１７誘導。
【０１１１】
・  著しいＩｇＧ誘導がＳｃＦＶ−コイル１およびＧ１７ＲＭおよびＧ１７Ｈに対して見られた。同様の分子量の対照ペプチドに対して、または動物を弾頭の存在なしにＧ１７ＲＭ＿２で免疫化した場合には、応答は見られなかった。すべての特異的ＩｇＧ力価は最終免疫化の４週間後に降下し、これは、ＩｇＧレベルを維持するためにブースター注射が必要であることを指示している。加えて、天然Ｇ１７ＲＭの存在は応答をブーストせず、Ｇ１７ＲＭに対するＩｇＧの減少はＳｃＦＶ−コイル１についてのものよりも著しく高いため、誘導された免疫応答は可逆的であると結論付けてもよい。
【図１１】図１１は、抗ガストリン免疫化時の重量損失を示す。
【０１１２】
・  ６匹の動物のうち４匹は、ＴＹＧ１００＿２ＲＭによる免疫化後に著しい時間依存性重量損失を示した。動物世話係により、これらの動物は午後の軽食後への食欲を失ったが、通常の日常食への興味は失わなかったことが観察された。そのような観察は、他のワクチンでは決して為されず、したがって、本発明の抗ガストリンワクチンを使用して、肥満を制御することができる。
【図１２−１】図１２は、配列番号７８：ヒトリトルガストリン、Ｇ１７；配列番号７９：ヒトガストリンペプチド、リトルガストリンの最初の（Ｎ−末端）１２ＡＡ（アミノ酸）、Ｇ１２；配列番号８０：点突然変異を持つ特異的な機能的に活性な変異体を包含する、リトルガストリンのＮ−末端エピトープ、最初の（Ｎ−末端）４ＡＡ；配列番号８１：点突然変異を持つより特異的な機能的に活性な変異体を包含する、リトルガストリンのＮ−末端エピトープ、最初の（Ｎ−末端）４ＡＡ；配列番号８２：点突然変異を持つ特異的な機能的に活性な変異体を包含する、リトルガストリンのＮ−末端エピトープ、最初の（Ｎ−末端）１２ＡＡ；配列番号８３：点突然変異を持つより特異的な機能的に活性な変異体を包含する、リトルガストリンのＮ−末端エピトープ、最初の（Ｎ−末端）１２ＡＡ；配列番号８４：点突然変異を持つ特異的な機能的に活性な変異体を包含する、リトルガストリンのＮ−末端エピトープ、最初の（Ｎ−末端）１３ＡＡ；配列番号８５：点突然変異を持つより特異的な機能的に活性な変異体を包含する、リトルガストリンのＮ−末端エピトープ、最初の（Ｎ−末端）１３ＡＡ；配列番号８６：ヒトガストリンペプチド、リトルガストリンの最初の（Ｎ−末端）１３ＡＡ（アミノ酸）、Ｇ１３；配列番号８７：ＴＹＧ１００＿１Ｈの免疫原成分：配列番号８６の１つのヒトガストリンペプチドと、リンカー配列と、ペプチドアルファらせん（ＴＹＧ１００＿１Ｈ）とを含む、本発明の免疫原性組成物の一部。この部分は、コイルドコイル連結によって好適な指定のアジュバントと連結していてもよい。
【０１１３】
・  太字はペプチド免疫原であり、斜字はリンカーであり、下線はコイルである。
【０１１４】
配列番号８８：ＴＹＧ１００＿２Ｈの免疫原成分：配列番号８６の２つのヒトガストリンペプチドと、分枝リンカー配列と、ペプチドアルファらせん（ＴＹＧ１００＿２Ｈ）とを含む、本発明の免疫原性組成物の一部。この部分は、コイルドコイル連結によって好適な指定のアジュバントと連結していてもよい。
【０１１５】
・  太字はペプチド免疫原であり、斜字はリンカーであり、下線はコイルである。
【０１１６】
配列番号８９：直鎖状リンカー配列；
配列番号９０：分枝リンカー配列
の配列情報を示す。
【図１２−２】図１２は、配列番号７８：ヒトリトルガストリン、Ｇ１７；配列番号７９：ヒトガストリンペプチド、リトルガストリンの最初の（Ｎ−末端）１２ＡＡ（アミノ酸）、Ｇ１２；配列番号８０：点突然変異を持つ特異的な機能的に活性な変異体を包含する、リトルガストリンのＮ−末端エピトープ、最初の（Ｎ−末端）４ＡＡ；配列番号８１：点突然変異を持つより特異的な機能的に活性な変異体を包含する、リトルガストリンのＮ−末端エピトープ、最初の（Ｎ−末端）４ＡＡ；配列番号８２：点突然変異を持つ特異的な機能的に活性な変異体を包含する、リトルガストリンのＮ−末端エピトープ、最初の（Ｎ−末端）１２ＡＡ；配列番号８３：点突然変異を持つより特異的な機能的に活性な変異体を包含する、リトルガストリンのＮ−末端エピトープ、最初の（Ｎ−末端）１２ＡＡ；配列番号８４：点突然変異を持つ特異的な機能的に活性な変異体を包含する、リトルガストリンのＮ−末端エピトープ、最初の（Ｎ−末端）１３ＡＡ；配列番号８５：点突然変異を持つより特異的な機能的に活性な変異体を包含する、リトルガストリンのＮ−末端エピトープ、最初の（Ｎ−末端）１３ＡＡ；配列番号８６：ヒトガストリンペプチド、リトルガストリンの最初の（Ｎ−末端）１３ＡＡ（アミノ酸）、Ｇ１３；配列番号８７：ＴＹＧ１００＿１Ｈの免疫原成分：配列番号８６の１つのヒトガストリンペプチドと、リンカー配列と、ペプチドアルファらせん（ＴＹＧ１００＿１Ｈ）とを含む、本発明の免疫原性組成物の一部。この部分は、コイルドコイル連結によって好適な指定のアジュバントと連結していてもよい。
【０１１７】
・  太字はペプチド免疫原であり、斜字はリンカーであり、下線はコイルである。
【０１１８】
配列番号８８：ＴＹＧ１００＿２Ｈの免疫原成分：配列番号８６の２つのヒトガストリンペプチドと、分枝リンカー配列と、ペプチドアルファらせん（ＴＹＧ１００＿２Ｈ）とを含む、本発明の免疫原性組成物の一部。この部分は、コイルドコイル連結によって好適な指定のアジュバントと連結していてもよい。
【０１１９】
・  太字はペプチド免疫原であり、斜字はリンカーであり、下線はコイルである。
【０１２０】
配列番号８９：直鎖状リンカー配列；
配列番号９０：分枝リンカー配列
の配列情報を示す。
【発明の詳細な説明】
【０１２１】
具体的な用語は、本明細書全体にわたって使用される場合、下記の意味を有する。
【０１２２】
用語「アジュバント」は、ここで使用される場合、ワクチンの統合されたまたは共投与された成分を意味するものとし、これは：
−  特異的な免疫原、たとえば抗原またはハプテンに対する免疫応答を強化する。免疫応答は、典型的には、アジュバントなしに投与される同等量の免疫原性組成物によって引き出される免疫応答よりも大きい、
および／または
−  アジュバントは、免疫原に対して特定の型またはクラスの免疫応答、たとえばＴｈ１またはＴｒｅｇ型の免疫応答を向けるために使用され、ここでは「指定のアジュバント」と理解されている。
【０１２３】
本発明のアジュバントの「有効量」は、具体的に、免疫原に対する免疫学的応答を強化する量、たとえば、より低いまたはより少ない用量の免疫原性組成物が、意図されているクラスの効率的な免疫応答を生成するために必要とされるようなものである。
【０１２４】
本発明による指定のアジュバントは、効率的な免疫応答だけでなく、所望の手法での免疫応答の調節も媒介する。免疫原を、その内在化およびさらなる処理のために適切な免疫細胞に向けることにより、特に群３のＴＬＲ９アゴニストであるＴＬＲ９リガンドを用いる場合、Ｔｈ１免疫応答がＴｈ２免疫応答よりも誘導される。ＴＬＲ９アンタゴニストがワクチン組成物において使用されるならば、それぞれの免疫応答はいずれの場合も下方調整される。群１のＴＬＲ９アゴニストが、ＣＤ３２ｂと結合する抗ＣＤ３２部分と組み合わせられるならば、Ｔｒｅｇ細胞の誘導が通常予想される。
【０１２５】
本発明のアジュバントの「有効量」は、具体的に、免疫原に対する免疫学的応答を強化する量、たとえば、より低いまたは少ない用量の免疫原性組成物が、意図されているクラスの効率的な免疫応答を生成するために必要とされるようなものである。
【０１２６】
本発明による指定のアジュバントは、効率的な免疫応答だけでなく、所望の手法での免疫応答の調節も媒介する。免疫原を、その内在化およびさらなる処理のために適切な免疫細胞に向けることにより、特に群３のＴＬＲ９アゴニストであるＴＬＲ９リガンドを用いる場合、Ｔｈ１免疫応答がＴｈ２免疫応答よりも誘導される。群１のＴＬＲ９アゴニストが、ＣＤ３２ｂと結合する抗ＣＤ３２部分と組み合わせられるならば、Ｔｒｅｇ細胞の誘導が通常予想される。
【０１２７】
免疫原性組成物の「有効量」は、たとえば本発明のワクチンにおいて使用される場合、ワクチン接種投薬レジメンの一部として投与された際に、治療されている対象において意義ある利益を示すのに十分な量を指す。当業者であれば、いくつかの態様において、特定の組成物は、それが具体的な投薬レジメンにおいて投与される単位剤形に適切な量を含有するならば、そのような量が単一の単位用量として投与された場合には意義ある利益を達成するために不十分になり得るとしても、防護的にまたは治療的に有効な量を含有するとみなされていてもよいことを理解する。当業者であれば、免疫原性組成物の有効量は、組成物を受けている異なる対象ごとに、たとえば次のような要因、たとえば所望の生物学的エンドポイント、組成物の性質、投与経路、治療されている対象の、健康、大きさおよび／または年齢等に応じて異なっていてもよいことをさらに理解する。いくつかの態様において、有効量は、特定の投薬レジメンの一部、たとえば単回投与または一連の投与として、たとえば「ブースティング」レジメンで投与された場合の有益な効果と相関しているとされてきたものである。
【０１２８】
用語「ペプチド性アルファらせん」は、ここで使用される場合、多数の繰り返しを含むペプチド配列に基づくコイルド構造的モチーフを意味するものとし、コイル繰り返しとも呼ばれる。そのようなアルファらせんは、同じ種類の整合アルファらせんとも呼ばれる別の対応物と結合して、コイルドコイルとも呼ばれる、二量体、三量体またはさらなるオリゴマーを形成することができる。
【０１２９】
コイルドコイルはポリペプチドまたはペプチド中の構造的モチーフであり、ここで、２から７つのアルファらせんが一緒に巻き付けられてロープのストランドのようになっている。いくつかの態様において、ワクチンのコイルドコイルは、２つのアルファらせんが一緒に巻き付けられたものである。そのようなアルファらせん領域は、コイルドコイル構造を形成しやすく、好適なコイルドコイル相互作用結合アッセイにおいて測定される通り、コイル繰り返しのオリゴマー化に関与していてもよい。
【０１３０】
具体的に、アルファらせんの二量体は、２つの単量体を接触させることによって形成され得るため、二量体は２つのアルファらせんコイルドコイルドメインとの相互作用を介して形成される。いくつかの態様において、コイルは、ペプチドを、配列番号：１または２において説明されている通りのアミノ酸配列（コイルおよび反コイル）とともに含み、これはｘ回の繰り返しを包含する。
【０１３１】
ＥＶＳＡＬ（配列番号９７）
Ｅ５：ＥＶＳＡＬＥＫＥＶＳＡＬＥＫＥＶＳＡＬＥＫＥＶＳＡＬＥＫＥＶＳＡＬＥＫ−ＮＨ２（配列番号１）
ＫＶＳＡＬ（配列番号９８）
Ｋ５：ＫＶＳＡＬＫＥＫＶＳＡＬＫＥＫＶＳＡＬＫＥＫＶＳＡＬＫＥＫＶＳＡＬＫＥ−ＮＨ２（配列番号２）
代替として、特異的なコイルドコイル型の連結を生成する、Ｃｈａｏら33もしくはＬｉｔｏｗｓｋｙら34によって記述されている配列または機能的等価物の何れかを使用してもよい：
【表Ａ】
0006466327.tif 000003
【０１３２】
本発明の目的のために、好ましい種類のコイルドコイルは二量体であり、コイル繰り返し配列において少なくとも１個のアミノ酸が異なる、整合以外の２つの異なるらせんのヘテロ二量体（ヘテロコイル）、または、２つの同一の整合らせんのホモ二量体、すなわち整合コイル繰り返し配列を含むもの（「コイル」）の何れかである。
【０１３３】
コイル繰り返しの好ましい数は、３〜５、好ましくは組合せ３＋３、３＋４、３＋５、４＋４、４＋５、５＋５、４＋３、５＋３または５＋４の何れかである。
【０１３４】
ヘプタッド繰り返し（７個のアミノ酸からなるアミノ酸配列の繰り返し、７−ｍｅｒｓ）の代替として、６−ｍｅｒｓ、８−ｍｅｒｓまたは９−ｍｅｒｓが使用されていてもよい。
【０１３５】
ホモ二量体性コイルドコイルの事例において、コイル繰り返しの典型的な数は具体的に５以下であり、これは構造の望ましくない不整合を回避するためである。ヘテロ二量体性コイルドコイルの事例において、典型的には、少なくとも３つのコイルを持つペプチド配列の長さを用いることが望ましい。それによって、ワクチンの成分、すなわち指定のアジュバントおよび免疫原成分の互いに対する結合は、典型的には、１０-7Ｍ未満、より好ましくは１０-8Ｍまたは１０-9Ｍ未満のＫｄの好ましい高親和性で達成される。しかしながら、繰り返しが多くなるにつれて親和性は増大するが、これはホモ二量体化の増大という代償を払う場合がある。
【０１３６】
本発明の免疫原性組成物の成分は、抗ＣＤ３２部分および／またはＴＬＲ９リガンドと連結するためのペプチドスペーサー、ならびに任意に、それぞれコイル繰り返しを持つ（たとえばペプチド免疫原の）エピトープも含んでいてもよい。たとえば、ペプチドスペーサーは、コイルドコイルの何れかまたは両方の端部上にあってよい。ペプチドスペーサーのそれぞれは、コイルドコイルの単一のアルファらせんコイルドコイルドメインに付着していてよい。
【０１３７】
ペプチドスペーサーは、たとえば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸以上の、直鎖状または分枝の何れか、たとえば２、３、４またはそれ以上の分枝を提供する、ペプチドであってよい。ペプチドスペーサー中におけるアミノ酸の数は、いくつかの態様において、特定の配列およびコイルの長さに応じて、２０アミノ酸または最大１０アミノ酸超または未満であってもよい。
【０１３８】
用語「抗ＣＤ３２部分」は、ここで使用される場合、細胞内標的ＣＤ３２、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、またはＣＤ３２ａとＣＤ３２ｂの両方の何れかと、特異的に結合するリガンドを意味するものとする。該部分は、任意の結合構造、たとえばタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに由来するものであってよく、これは、抗体および抗体フラグメント、または結合部との複合分子を包含する。本発明の分子または分子複合体の結合部は、タンパク質、たとえば抗体もしくは抗体フラグメント、たとえばＦａｂ、Ｆｖ、ＶＨ／ＶＬ二量体、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ）２、ミニボディ、小突然変異免疫グロブリンドメイン、Ｆｃａｂ、Ｍａｂ2、または他の生物学的バインダー、たとえば可溶性Ｔ細胞受容体、ダルピン等から構成されていてよい。抗体および抗体フラグメントおよび誘導体が生成され、公知の方法、たとえばハイブリドーマ技術、Ｂ細胞クローニング、ファージ提示法、酵母提示法、抗体ライブラリーのリボソーム提示法または細胞表面提示法、変異抗体のアレイスクリーニングによるＣＤ３２との結合のために選択されていてもよい。例示的な抗ＣＤ３２部分は、抗ＣＤ３２モノクローナル抗体ＡＴ−１０35、ＩＶ．３36、２Ｅ６37または任意の他のａＣＤ３２モノクローナル抗体に由来するｓｃＦｖである。
【０１３９】
特異的結合は、好適な結合アッセイ、たとえば従来のイムノアッセイにおいて決定されていてもよい。
【０１４０】
イムノアッセイにおいて結合を検出するための、当技術分野において公知である多数の方法がある。当技術分野において公知である種々のイムノアッセイが使用され得、これは、技術、たとえばラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着アッセイ）、免疫放射定量アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、ウエスタンブロット法、ＢＩＡコア等を使用する競合および非競合アッセイシステムを包含する。
【０１４１】
抗原または抗体に関する用語「交差反応性」は、ここで使用される場合、異なる起源の、たとえば、ヒト、アカゲザルまたはマウス起源の抗原間で共有されているエピトープを指すものとする。Ｇ１７の最初の４ＡＡからなる、またはそれらを含むＮ−末端エピトープは、種々の起源のペプチドにおいて交差反応性であることが分かっており、このエピトープは、免疫応答、およびエピトープと交差反応性であるＩｇＧ抗体をトリガーする。
【０１４２】
本発明の免疫原性組成物は、具体的に、過剰なガストリンに関連するガストリン依存性疾患または疾患状態、たとえばガストリン依存性腫瘍もしくはガストリン依存性がん、たとえば膵臓がん、胃潰瘍、胃食道逆流性疾患（ＧＥＲＤ）、末期腎不全（ＥＳＲＦ）、または肥満を治療するために有用である。
【０１４３】
用語「ガストリン依存性腫瘍」または「ガストリン依存性がん」は、ここで使用される場合、たとえば、ガストリン依存性結腸直腸腺癌ならびに他のガストリン依存性がん、たとえば胃、肝臓、膵臓および肺の小細胞癌の、腫瘍またはそれに関連する疾患もしくは疾患状態を指すものとする。該用語は、具体的に、腫瘍疾患進行を予防するため、陽性腫瘍応答のため、または腫瘍縮小のために、腫瘍を治療することに関して、ここで使用される。該用語は、微小残存病変にも適用され、これは成功裏に治療される、たとえば循環腫瘍細胞を標的として、それらの数をある特定の閾値未満に、たとえば検出限界未満に低減させる。
【０１４４】
胃潰瘍疾患は、胃酸の増大、および通常は胃粘膜を酸による損傷から保護している複雑な胃の防御の破綻によって引き起こされ得る。２つの状態は異なる病因を有するが、何れも胃酸分泌の低減から恩恵を受ける。胃酸は、特殊な胃細胞、壁細胞において産生される。壁細胞は、アセチルコリン、ヒスタミンおよびガストリンにより、これらの化合物のそれぞれと細胞の表面上の特異的な受容体との結合時に刺激されて、酸を分泌することができる。これらのうち、酸分泌の最も強力な刺激剤は、ペプチドホルモンガストリンである。ここで記述されている通りの抗ガストリン免疫療法療法は、胃潰瘍疾患状態を寛解させる。
【０１４５】
用語「ガストリン−１７ペプチド」または「Ｇ１７ペプチド」または「Ｇ１７」は、ここで使用される場合、リトルガストリンＧ１７を指すものとし、これは、ガストリンのＮ−末端１７ＡＡからなる。Ｇ１７ペプチドは、ヒト起源またはアカゲザルもしくはマウスを包含する哺乳類起源のものであってもよく、故に、ヒトもしくは他の哺乳類配列を有するか、または、たとえば天然（自然発生的な）Ｇ１７配列中のアミノ酸残基の種類および／または配列を変更することによって取得された人工的配列を組み込むために、人工的構築物であってもよい。該用語は、具体的に、配列番号７８のアミノ酸配列またはそのフラグメントを持つが、異なる種の相同配列に由来するという点でそのペプチド配列とは異なる、ヒトＧ１７の変異体を包含するものとする。これらは、自然発生的な変異体または類似体と称される。用語「類似体」は、２つ以上の起源に起因するキメラ構築物も指すものとし、ここで、少なくとも一部は、自然発生的である、たとえば、ペプチド免疫原の大部分（少なくとも５０％）を構成し、別の部分はそれとは異なり、自然発生的または合成（人工的）の何れかである。
【０１４６】
該用語は、具体的に、Ｇ１７のフラグメントまたは機能的に活性な変異体、たとえば、追加の１個以上のアミノ酸残基または配列によりＮ−末端および／またはＣ−末端を伸長させることによって、１つ以上の点突然変異、またはＧ１７のほかにさらなるアミノ酸配列を含むペプチドもしくはポリペプチドを含むものを包含するものとする。Ｃ−末端の伸長は、たとえば同一であるかもしくはそうでないか何れかのＧ１７配列の繰り返し、またはガストリンのさらなるアミノ酸配列を持つのが好ましい。
【０１４７】
該用語は、具体的に、１つ以上の修飾されたアミノ酸残基を持つペプチドを包含するものとする。一般的な修飾は、リン酸化、メチル化、アセチル化、アミド化、ピロリドンカルボン酸の形成、異性化、ヒドロキシル化、硫酸化、フラビン結合、システイン酸化およびニトロシル化を包含する。ここで記述されている通りの例示的な修飾は、Ｇ１７のＮ−末端グルタミン酸の修飾、すなわち１位におけるピロＧｌｕであり、これは「ピロリドンカルボン酸（Ｇｌｕ）」またはｐＧｌｕまたはｐＥとしても公知である。
【０１４８】
用語「機能的に活性な変異体」は、本発明のペプチド免疫原に関してここで使用される場合、この配列（親配列）の修飾から、たとえば１個以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換によって、たとえば、アミノ酸配列中の１個以上のアミノ酸残基、またはコーディングヌクレオチド配列内または配列の遠位端の何れかもしくは両方におけるヌクレオチドの、組み換え技術または化学誘導体化によって生じる配列を意味するものとし、この修飾は、この配列の活性に影響を及ぼす（特に損なう）ことがない。ガストリンを標的とするためにある特定の免疫応答を引き出すペプチド免疫原の事例において、ペプチド免疫原の機能的に活性な変異体は、抗原決定基またはエピトープを依然として組み込むが、これは、たとえば免疫原性を増大させるように変更され得る。具体的に、Ｇ１７ペプチド免疫原の機能的に活性な変異体、またはそのフラグメント、たとえばＧ１２もしくはＧ１３フラグメントは、治療されている対象においてＩｇＧ抗ガストリン抗体を引き出すための効力を有し、この抗体は、対象の内因性ガストリンと交差反応する。
【０１４９】
機能的に活性な変異体は、交差反応性エピトープを実質的に損なわない１つ以上の修飾を導入して、実質的に同じ免疫原性を持つ分子を取得することによって、親ペプチド、たとえばヒト、アカゲザルもしくはネズミＧ１７ペプチド、またはそのフラグメント、たとえばＧ１２もしくはＧ１３ペプチドの配列を変更することにより、取得してもよい。用語「実質的に同じ免疫原性」は、ここで使用される場合、免疫原性組成物で治療されている対象において誘導される免疫応答または抗ガストリンＩｇＧ抗体の量を指し、この量は、親ペプチドについて決定された通りの量の、好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％またはさらには少なくとも１００％または少なくとも１１０％、または少なくとも１２０％、または少なくとも１３０％、または少なくとも１４０％、または少なくとも１５０％、または少なくとも１６０％、または少なくとも１７０％、または少なくとも１８０％、または少なくとも１９０％、たとえば最大２００％である。
【０１５０】
好ましい態様において、親ペプチドの機能的に活性な変異体は、
ａ）ペプチドから、少なくとも１個のアミノ酸置換、挿入（付加）および／または欠失により、たとえば１つ以上の点突然変異を含んで導出され、ここで、機能的に活性な変異体は、親分子との具体的な配列同一性、たとえば少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、なお一層好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有し；かつ／または
ｂ）ペプチドおよび加えて該ペプチドと非相同の少なくとも１個のアミノ酸からなる。
【０１５１】
機能的に活性な変異体は、ペプチド配列中における配列改変によって、たとえば１つ以上の点突然変異によって取得してもよく、ここで、配列改変は、本発明に従って使用される場合、改変されていないペプチド配列の機能を実質的に保持している。そのような配列改変または点突然変異は、（保存的）置換、付加、欠失、突然変異および挿入、たとえば１、２、３もしくは４個のアミノ酸の改変、または１から数個のアミノ酸、たとえば１、２、３もしくは４個のアミノ酸の付加もしくは挿入による、または１から数個のアミノ酸、たとえば１、２、３もしくは４個またはそれらの組合せの化学誘導体化による、好ましくは近接していない点突然変異によるものを包含し得るがこれらに限定されない。アミノ酸残基中における置換は保存的置換であってもよく、たとえば、１個の疎水性アミノ酸を代替的な疎水性アミノ酸で置換する。
【０１５２】
保存的置換は、それらの側鎖および化学的特性に関係するアミノ酸のファミリー内で起こるものである。そのようなファミリーの例は、塩基性側鎖を持つ、酸性側鎖を持つ、非極性脂肪族側鎖を持つ、非極性芳香族側鎖を持つ、非荷電極性側鎖を持つ、小型側鎖を持つ、大型側鎖を持つ等のアミノ酸である。
【０１５３】
好ましい点突然変異は、同じ極性および／または電荷のアミノ酸の交換を指す。これに関して、アミノ酸は、６４のトリプレットコドンによってコードされている２０個の自然発生的なアミノ酸を指す。これらの２０個のアミノ酸は、中性電荷、正電荷および負電荷を有するものに分けることができる：
「中性」アミノ酸を、それぞれの３文字および１文字コードならびに極性とともに以下に示す：
アラニン：（Ａｌａ、Ａ）非極性、中性；
アスパラギン：（Ａｓｎ、Ｎ）極性、中性；
システイン：（Ｃｙｓ、Ｃ）非極性、中性；
グルタミン：（Ｇｌｎ、Ｑ）極性、中性；
グリシン：（Ｇｌｙ、Ｇ）非極性、中性；
イソロイシン：（Ｉｌｅ、Ｉ）非極性、中性；
ロイシン：（Ｌｅｕ、Ｌ）非極性、中性；
メチオニン：（Ｍｅｔ、Ｍ）非極性、中性；
フェニルアラニン：（Ｐｈｅ、Ｆ）非極性、中性；
プロリン：（Ｐｒｏ、Ｐ）非極性、中性；
セリン：（Ｓｅｒ、Ｓ）極性、中性；
トレオニン：（Ｔｈｒ、Ｔ）極性、中性；
トリプトファン：（Ｔｒｐ、Ｗ）非極性、中性；
チロシン：（Ｔｙｒ、Ｙ）極性、中性；
バリン：（Ｖａｌ、Ｖ）非極性、中性；および
ヒスチジン：（Ｈｉｓ、Ｈ）極性、正（１０％）中性（９０％）。
【０１５４】
「正に」荷電したアミノ酸は：
アルギニン：（Ａｒｇ、Ｒ）極性、正；および
リジン：（Ｌｙｓ、Ｋ）極性、正
である。
【０１５５】
「負に」荷電したアミノ酸は：
アスパラギン酸：（Ａｓｐ、Ｄ）極性、負；および
グルタミン酸：（Ｇｌｕ、Ｅ）極性、負
である。
【０１５６】
ここで記述されているペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、候補配列中におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義されており、このアミノ酸該残基は、最大パーセントの配列同一性を達成するために必要ならば配列を整列し間隙を導入した後の、特異的なペプチド配列中におけるアミノ酸残基と同一であり、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とはみなさない。当業者であれば、比較されている配列の全長にわたって最大アライメントを達成するために必要とされるあらゆるアルゴリズムを包含する、アライメントを測定するために適切なパラメーターを決定することができる。
【０１５７】
機能的に活性な変異体は、所望の位置における点突然変異を包含する公知の突然変異誘発方法の何れかによって取得、たとえば無作為化技術によって取得してもよい。いくつかの事例において、位置は、無作為に、たとえばペプチド配列を無作為化するために考えられるアミノ酸の何れかまたは好ましいアミノ酸の選択の何れかを用いて選択される。これに関して、用語「突然変異誘発」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を改変するための任意の当技術分野において承認されている技術を指す。
【０１５８】
用語「免疫原」は、ここで使用される場合、対象において免疫応答をトリガーする１つ以上の抗原を意味するものとする。用語「抗原」は、ここで使用される場合、任意の抗原決定基を特に指すものとし、これは、抗体の結合部位によって認識され得るかもしれず、ＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子のペプチド溝と結合することができるため、特異的なＴ細胞のための刺激薬として役立ち得る。標的抗原は、標的分子全体として、またはそのような分子のフラグメント、とりわけ基礎構造、たとえば、免疫学的に関連する、概して「エピトープ」、たとえばＢ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープ）と称される標的のポリペプチドもしくは炭水化物構造としての何れかで認識され、すなわち天然またはモノクローナル抗体によっても認識可能である。ここでは、たとえばアレルギーワクチンを提供するために、Ｔ細胞エピトープの使用が好ましい。
【０１５９】
用語「ペプチド免疫原」は、ここで使用される場合、ペプチド性構造の抗原または免疫原、特に、特異的なアミノ酸配列のペプチドを含むまたはそれらからなる免疫原を意味するものとし、これは、自然発生的なアミノ酸残基または修飾されたものを含む直鎖状ペプチドまたは分枝ペプチドとしての何れかで提供され、たとえば、修飾または化学誘導体化によって、たとえばリン酸化、メチル化、アセチル化、アミド化、ピロリドンカルボン酸の形成、異性化、ヒドロキシル化、硫酸化、フラビン結合、システイン酸化およびニトロシル化によって取得される誘導体である。
【０１６０】
ペプチド免疫原は、具体的に、対象において免疫応答をトリガーするように設計され、特に１つ以上の抗原決定基を包含し、これは、抗体の結合部位によっておそらくは認識され得、ＨＬＡクラスＩもしくはクラスＩＩ分子のペプチド溝、または分子、たとえばＣＤ１を提示している他の抗原と結合することができるため、特異的なＴ細胞のための刺激薬として役立ち得る。標的抗原は、標的分子全体として、またはそのような分子のフラグメント、とりわけ基礎構造、たとえば、免疫学的に関連する、概して「エピトープ」、たとえばＢ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープと称される標的のポリペプチドまたは炭水化物構造としての何れかで認識され、すなわち天然またはモノクローナル抗体によっても識別可能である。ここでは、たとえば腫瘍学ワクチンを提供するために、Ｂ細胞エピトープの使用が好ましい。
【０１６１】
用語「エピトープ」は、本発明に従ってここで使用される場合、特に、特異的結合パートナーを完全に占めていてもよい、または本発明のモジュラー抗体の結合部位との特異的結合パートナーの一部であってもよい、分子構造を指すものとする。エピトープという用語は、ハプテンを指していてもよい。化学的に、エピトープは、炭水化物、ペプチド、脂肪酸、有機、生化学的もしくは無機物質またはそれらの誘導体およびそれらの任意の組合せの何れかから構成されていてもよい。エピトープがポリペプチドであれば、これは通常、少なくとも３個のアミノ酸、好ましくは少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３個のアミノ酸を包含することになる。ペプチドの長さに臨界上限はなく、これはタンパク質のほぼ完全長のポリペプチド配列を含み得る。エピトープは、直鎖状または配座エピトープの何れかであってよい。直鎖状エピトープは、ポリペプチドまたは炭水化物鎖の一次配列の単一セグメントから構成される。直鎖状エピトープは、近接または重複していてよい。配座エピトープは、ポリペプチドの折りたたみで三次構造を形成することによって一緒になったアミノ酸または炭水化物から構成され、アミノ酸は、直鎖状配列中において必ずしも互いに隣接しているとは限らない。具体的に、エピトープは、診断に関連する分子の少なくとも一部である、すなわち、試料中におけるエピトープの非存在または存在は、疾患または患者の健康状況または製造における処理状況または環境および食事状況の何れかと、定性的にまたは定量的に相関している。エピトープは、治療に関連する分子、すなわち、疾患の過程を変更する特異的結合ドメインによって標的とされ得る分子の少なくとも一部であってもよい。
【０１６２】
同じ抗原または異なる抗原の１つ以上のエピトープが本発明に従って使用されていてもよく、これは、免疫応答の調節が望ましい、すべての自己抗原、病原体、アレルゲンまたは自家抗原の抗原を包含し得、たとえばそれらに対して、宿主における実質的なＴｈ１型応答またはＴｒｅｇ応答（ワクチンの種類に応じて）の誘導が望ましい。
【０１６３】
がん疾患においては、自己抗原に対する免疫応答が望ましい。用語「自己抗原」は、ここで使用される場合、正常な健康な対象によって産生される任意の抗原、具体的にはポリペプチドまたはペプチドを意味し、それ自体は免疫応答を引き出さない。これらの自己抗原は、がん疾患を包含するある特定の病状において異常なまたは高いレベルで産生され得るため、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と呼ばれる。ここで、ヒトガストリンまたはヒトＧ１７は、ヒト対象における自己抗原として、具体的にはガストリン依存性腫瘍に罹患している対象におけるＴＡＡとして理解されている。自己免疫疾患に関連する自己抗原は、ここでは自家抗原と呼ばれる。
【０１６４】
自己抗原は、自然発生的、組み換え的にまたは合成的に産生され得ることが理解される。自己抗原は、自然に産生された抗原と同一である必要はなく、むしろある特定の配列同一性、類似性または相同性を有するその変形形態を包含し得ることも理解される。
【０１６５】
がん療法において使用するための自己抗原の選択は、がん疾患の種類および病期によって、特にがん細胞、たとえば腫瘍または転移に由来するものの発現パターンによって決まる。本発明によるワクチンにおいて使用される可能性のある選択された腫瘍関連抗原の具体例は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ルイスＹ、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）および癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＭＵＣ−１等である。
【０１６６】
自己免疫疾患の療法において使用するための自家抗原の選択は、自己免疫疾患の種類によって決まる。本発明によるワクチンにおいて使用される可能性のある選択された自己免疫疾患関連抗原の具体例は、Ｃ１ｑ、ＡＤＡＭＴＳ１３、デスモゲリン（Desmogelin）３、ケラチン、ガングリオシド（たとえばＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＱ１ｂ）、ＩＶ型コラーゲン、ＩｇＭ、カルジオリピン、アネキシンＡ５等である。
【０１６７】
いくつかの態様において、免疫原は、１つ以上の特異的なアレルゲンを含む。「アレルゲン」は、過敏性の状態を開始し得る、またはアレルゲンで既に感作された対象において即時型過敏性反応を招き得る抗原である。アレルゲンは、一般に、アレルギー性の特性を有するタンパク質と結合しているタンパク質または化学物質である。しかしながら、アレルゲンは、様々な合成または天然源、たとえば植物材料、金属、化粧品または洗剤の原料、ラテックス等に由来する有機または無機材料も包含し得る。
【０１６８】
抗アレルギー療法において使用するためのアレルゲンの選択は、アレルギーの種類および重症度によって決まる。本発明によるワクチンにおいて使用される可能性のある選択されたアレルギー関連抗原の具体例は、免疫原として従来使用される任意のアレルゲン、具体的にはイエダニアレルゲン（たとえば、Ｄｅｒ  ｐ１、Ｄｅｒ  ｐ２、Ｄｅｒ  ｐ３／−−−−−−Ｄｅｒ  ｐ２３、Ｄｅｒ  ｆ１、Ｄｅｒ  ｆ２、Ｄｅｒ  ｆ３／−−−Ｄｅｒ  ｆ２３）、ネコのフケ、草花または樹木花粉、ゴキブリアレルゲン等である。
【０１６９】
感染性疾患の防護または療法において使用するための病原体に対する免疫応答を特異的に誘導する抗原の選択は、病原体、たとえば微生物またはウイルス感染性因子の種類によって決まる。本発明によるワクチンにおいて使用される可能性のある選択された病原体由来抗原の具体例は、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、コレラ、ＨＩＶ、百日咳、インフルエンザ、腸チフス等である。
【０１７０】
本発明によるワクチンにおいて使用されるペプチド免疫原または免疫原性組成物は、有効量のワクチンに通常含有されており、これは、ここでは具体的に、「免疫学的有効量」として理解されている。「免疫学的有効量」は、該量の対象への、単回用量でまたは一連の用量の一部としての何れかでの投与が、治療的または防護的目的に基づいて有効であることを意味している。この量は、治療される対象の健康および身体的状態、年齢、対象の免疫系の抗体を合成する能力、所望される免疫応答の程度、ワクチンの製剤、および他の条件に応じて変動することになる。
【０１７１】
本発明は、対象を治療するためまたは対象において免疫応答を上昇させるための方法であって、免疫学的有効量の、本発明のペプチド免疫原、免疫原性組成物またはワクチンを投与する工程を含む方法も提供する。
【０１７２】
有効量または投薬量は、それを必要としている対象、たとえば成人ヒト対象に投与される免疫原性組成物の、０．０００１から２ｍｇまで、たとえば０．００１乃至２ｍｇの範囲であってもよい。有効投薬量の免疫原性組成物は、患者において有効レベルの抗体力価の免疫応答を引き出して、内因性成熟および前駆体Ｇ１７を、たとえば免疫化後１〜３か月にわたって結合し中和することができる。療法の有効性は、対象から採取した血液試料中の抗ガストリン抗体力価によってアッセイしてもよい。
【０１７３】
用語「ＴＬＲ９リガンド」は、ここで使用される場合、下記のように理解される。
【０１７４】
トール様受容体９（ＴＬＲ９）は、非メチル化細菌ＣｐＧ  ＤＮＡを認識し、炎症促進性サイトカインの産生につながるシグナル伝達カスケードを開始する。ＴＬＲ９のリガンドとして作用する、すなわち、この受容体と結合し、それによって、ＴＬＲ９を活性化する（刺激する、上方調節する、ＴＬＲ９アゴニスト）か、または失活させる（下方調節する、ＴＬＲ９アンタゴニスト）かの何れかであることが示されている、多数の構造または配列がある。たとえば、微生物ＤＮＡまたは合成ＤＮＡ、たとえば合成ＣｐＧ  ＯＤＮは、ＣｐＧ二量体の数および位置における変動、ならびにＣｐＧ二量体の側面に正確な塩基配列を持つＴＬＲ９を刺激し得る。合成ＣｐＧ  ＯＤＮは、典型的なリン酸ジエステル骨格の代わりに部分的にまたは完全にホスホロチオエート化された骨格を有し、３’端、５’端、または両方にポリＧテールを有していてもいなくてもよいという点で、微生物ＤＮＡとは異なる。
【０１７５】
用語「アゴニスト」は、ＴＬＲ９リガンドと併せてここで使用される場合、具体的に、細胞ベースアッセイにおけるＴＬＲ９の結合および活性化を指すものとする。
【０１７６】
ヌクレオチド配列から構成されるＴＬＲ９リガンドは、典型的には、本免疫原性組成物の指定のアジュバント成分と、化学的カップリングによって、たとえばＳｏｌｕｌｉｎｋから市販されているＫＩＴを使用して、カップリングされている。ペプチド性ＴＬＲ９リガンドは、標準的なペプチド化学を使用してカップリングされていてもよく、または組み換えＤＮＡ技術を使用して統合されていてもよい。
【０１７７】
例示的なＴＬＲ９リガンドは、ＯＤＮ２２１６38（群１）、ＯＤＮ２００６／ＯＤＮ２００７39（群２）およびＣｐＧ−Ｍ３６２40（群３）である。
【０１７８】
さらなる例示的なＴＬＲ９リガンドは、たとえばペプチドライブラリーによって同定されるまたはそこから取得される、ＣｐＧ  ＴＬＲ９アゴニストの作用を模倣するペプチド（これは、ＴＬＲ９と結合するための親和性のために選択され、アゴニスト活性が証明されている）、または特異的な抗体を包含するタンパク質リガンドであってもよい。
【０１７９】
具体的なＴＬＲ９リガンドは、免疫刺激ペプチド、たとえば、ＣｐＧクラスの何れかを模倣するもの、たとえば好適なペプチドライブラリーから選択されるペプチドである。例示的な免疫刺激ペプチドは、ＥＳＷＤＫＦＬＳＨＹＬＰ（配列番号５０）、ＴＤＷＳＷＦＹ（配列番号５１）、ＹＰＶＹＷＰＷ（配列番号５２）、ＥＷＷＦＹＷＰ（配列番号５３）、ＷＦＰＩＥＷＷ（配列番号５４）、ＤＱＶＤＩＧＹ（配列番号５５）、ＴＨＱＶＹＩＳ（配列番号５６）、ＷＦＰＩＥＷＷＦＹＷＰ（配列番号５７）、ＤＳＷＱＡＦＬＴＫＦＶＬ（配列番号５８）、ＨＤＩＱＷＦＷＱＨＷＮＳ（配列番号５９）、ＷＳＷＷＤＨＴＦＮＹＭＬ（配列番号６０）、ＴＴＱＱＴＷＮＶＲＹＰＹ（配列番号６１）、ＤＨＴＭＰＷＴＲＮＡＫＮ（配列番号６２）、ＳＷＤＰＹＷＰＦＰＷＦＳ（配列番号６３）、ＡＩＹＹＶＰＳＰＭＦＴＶ（配列番号６４）、ＥＴＴＬＬＫＭＷＬＡＱＭ（配列番号６５）、ＹＰＷＬＤＶＡＶＶＳＬＹ（配列番号６６）、ＶＰＧＷＨＹＬＡＴＬＲＡ（配列番号６７）およびＦＤＰＬＧＳＲＤＩＫＧＳ（配列番号６８）、ならびに機能的に活性なその変異体からなる群から選択され、該変異体は、そのフラグメント、突然変異体またはハイブリッドである。
【０１８０】
より具体的には、機能的に活性な変異体はｐＤＣを刺激し、それによって陰性対照と比較して増大したレベルのＩＬ−６およびＴＮＦアルファを誘導する。
【０１８１】
具体的に、機能的に活性な変異体は、
ａ）配列番号５０〜６８のペプチドの何れかと少なくとも６０％の相同性を有する；
ｂ）親アミノ酸配列を、配列内または配列の遠位端の何れかもしくは両方における１個以上のアミノ酸の、挿入、欠失または置換によって修飾することにより取得可能な、配列番号５０〜６８のペプチドの何れかの突然変異体である；あるいは
ｃ）少なくとも５個のアミノ酸を含む配列番号５０〜６８のペプチドの何れかのフラグメントである。
【０１８２】
具体的な免疫刺激ペプチドは、ＥＷＷＦＹＷＰ（配列番号５３）、ＥＷＷ（配列番号１２５）、ＷＦＹ（配列番号１２６）、ＹＷＰ（配列番号１２７）、およびＱＶｘＩ（ｘは任意のアミノ酸である）（配列番号１２８）からなる群から選択されるモチーフを含む。
【０１８３】
ＴＬＲ９リガンドまたはアゴニストまたはアンタゴニストの機能は、好適なアッセイにおいて、たとえば下記のように決定してもよい：ｐＤＣを、健康なドナーの血液からＴｅｌら41によって記述されている通りに精製し、その後、適切な濃度のＴＬＲ９リガンドとともにインキュベートする。２４時間後、ＩＦＮａを、上清中、標準的なＥＬＩＳＡプロトコールを使用して測定する。細胞の成熟状態の決定のために、ｐＤＣを、ＣＤ８０、ＣＤ８３またはＣＤ８６の発現について、標準的なＦＡＣＳ手順を使用し、市販の特異的な抗体で、ＴＬＲ９リガンドとのインキュベーション前後に染色する。
【０１８４】
本発明によるワクチンへの暴露時に活性化される反応性Ｔ細胞の数は、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＦＡＣＳ分析、サイトカイン放出またはＴ細胞増殖アッセイを包含する多数の方法によって決定してもよい。
【０１８５】
ここで使用される場合、用語「特異性」または「特異的結合」は、分子の不均一集団において関心対象の同族リガンドを決定する結合反応を指す。故に、定められた条件（たとえばイムノアッセイ条件）下において、１つ以上の抗原は、バインダーのそれぞれの結合部位によって特異的に結合されており、試料中に存在する他の分子とは有意な量で結合しない。特異的結合は、結合が、選択される際の、標的同定、高、中もしくは低結合親和性または親和力の観点から、選択的であることを意味する。選択的結合は通常、結合定数または結合動力学が少なくとも１０倍異なっていれば、好ましくは差異が少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも（a least）１０００倍であれば、達成される。該用語は、１つ以上の異なる抗原を特異的に認識する交差反応性または多特異的バインダーを指すものでもあることが、よく理解される。
【０１８６】
用語「治療」は、ここで使用される場合、防護的（すなわち感染症および／または疾患状況を予防するため）または治療的（すなわちその病因にかかわらず疾患を治療するため）目的のために対象を治療することを常に指すものとする。対象の治療は、典型的には、アレルギー、自己免疫もしくはがん疾患状態の事例においては治療的、または感染性疾患状態を治療する際には防護的となる。対象の治療は、典型的には、ガストリン依存性腫瘍またはガストリン依存性がんを包含するがん疾患状態の事例においては治療的となる。しかしながら、疾患進行のリスクがある、または続発性疾患状態もしくは副反応を発症するリスクがある、たとえばガストリン効果の内因性ガストリン産生に依存している原発性疾患に罹患している患者の事例においては、治療は防護的であってもよい。
【０１８７】
たとえばアレルギーの家族歴によって疾患を発症するリスクがあるアレルギー患者の事例においても、治療は防護的であってもよい。
【０１８８】
そのような治療は、唯一の防護もしくは治療剤としての、または、たとえば化学療法、もしくは制酸薬の使用を包含する任意の好適な手段と組み合わせた、本発明によるワクチンを用いて実行されていてもよい。
【０１８９】
用語「組合せ」は、これに関して、たとえば化合物または治療の組合せに関して使用される場合、具体的に、対象の、併用、同時、並行または連続治療を指す。
【０１９０】
下記の具体的なアレルギー性疾患は、本発明に従って治療される：アレルギー性鼻炎結膜炎（花粉症）、アレルギー性喘息、アレルギー性湿疹、たとえばアトピー性湿疹またはアトピー性皮膚炎。
【０１９１】
アレルギー療法では、特定の追加の治療的処置は、アレルギー性喘息における気管支拡張薬と組み合わせた（吸入）コルチコステロイドの適用、ステロイド含有クリーム（アトピー性湿疹）、ならびにより軽度な形態のアレルギー（たとえば花粉症）においては、抗ヒスタミン薬および特異的免疫療法を包含する。
【０１９２】
偏向したＴｈ２応答、豊富なＩＬ−４／ＩＬ−１３分泌およびＩｇＥ抗体応答が不適切かつ有害であるアレルギーは、免疫応答の衰えのほんの一例である。他の例は、全身性自己免疫疾患に関係するＴｈ１媒介性状態を特徴とする。
【０１９３】
本発明によるワクチンでの自己免疫疾患の治療は、他の例の中でも具体的に、糖尿病、ギラン・バレー症候群、全身性エリテマトーデス（Erythematosis）、多発性硬化症または血小板減少症を指していてもよい。
【０１９４】
本発明によるワクチンを用いる感染性疾患の防護または療法は、具体的に、病的状態、たとえば微生物感染症、すなわち、細菌、ウイルス、真菌、原生動物または蠕虫病原体によって引き起こされた状態を指す。本発明の目的のために、用語「病原体」は、広義で、疾患または状態の具体的な原因物質を指すために使用され、免疫応答を引き出す任意の作用物質を包含する。病原体は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、寄生虫等を包含する。典型的には、免疫原は、病原体によって産生される、１つ以上のペプチド、ポリペプチド、タンパク質または炭水化物抗原に由来する。好適な抗原を同定し、そのような分子を取得し調製するための方法は、当技術分野において周知である。
【０１９５】
病原体によって引き起こされた感染性疾患の治療は、具体的に、たとえばＢ型肝炎、Ｃ型肝炎、コレラ、ＨＩＶ、百日咳、インフルエンザまたは腸チフスを指す。
【０１９６】
ここで記述されている通りの腫瘍を治療する免疫治療方法は、具体的に、頸部、乳、結腸直腸、前立腺、肺がんおよび黒色腫を治療するための本発明による方法およびワクチンを指す。
【０１９７】
がん療法において、追加の治療的処置は、たとえば、外科的切除、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、抗腫瘍ワクチン、抗体ベース療法、全身照射法、骨髄移植、末梢血幹細胞移植、および化学療法剤の投与を包含する。
【０１９８】
治療のために、免疫原性組成物または本発明によるワクチンは、一度に投与されてもよく、または、個々の成分および／もしくは時間間隔を置いて投与される若干数のより小さい用量に分割されてもよい。ワクチンは、典型的には、０．１から５００μｇ／ｍＬの濃度で、たとえば、皮下に、皮内、筋肉内に、静脈内、経口的に、吸入を介してまたは鼻腔内にの何れかで、追加のアジュバント、たとえばミョウバンを加えてまたは加えずに、投与される。治療の正確な投薬量および持続時間は、治療されている疾患の関数であり、公知の試験プロトコールを使用して、またはインビボもしくはインビトロ試験データからの外挿によって、実験的に決定されてもよいことが理解される。
【０１９９】
免疫原性組成物または本発明のワクチンは、たとえば、非経口（皮下、筋肉内、静脈内および皮内を包含する）注射、または患部、たとえば関節もしくは腫瘍内もしくは周囲への局所注射の何れかのためのものを包含するがこれらに限定されない、任意の好適な手段およびそれぞれの製剤によって投与され得る。好ましい態様において、ワクチンは、筋肉内、皮下または皮内注射用の製剤で提供される。
【０２００】
本発明は、送達デバイス、たとえば本発明によるワクチンを予め充填したシリンジも提供する。
【０２０１】
典型的には、本発明によるワクチンの第一回注射によって対象に抗原刺激を与えた際、１回以上のブースター注射が、ある期間にわたって、同じまたは異なる投与経路により実施されてもよい。頻回注射が使用される場合、その後の注射は、たとえば前回の注射の１から５２週以内、またはさらに後に為されてもよい。
【０２０２】
ワクチンは、典型的には、賦形剤、たとえば水、生理食塩水、グリセロール、エタノール等を含有していてもよい。加えて、賦形剤の中でも、補助物質として、たとえば湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質等が存在していてもよい。典型的には、本発明によるワクチンは、注射用物質として、液体溶液もしくは懸濁液、液体ビヒクル中の溶液もしくは懸濁液に好適な固体形態の何れかとして、投与の前に調製される。調製物は、リポソーム中で乳化またはカプセル化されていてもよい。
【０２０３】
本発明によるワクチンの投与は、ＴＬＲ９アゴニストもしくはアンタゴニスト、および／または免疫調節効果もしくは免疫応答を強化するためのさらなるアジュバント処置の何れかと、適宜追加で組み合わせられていてもよい。強化された免疫応答は、強化されたＴｈ１免疫応答、Ｔｈ２免疫応答、Ｔｈ１７免疫応答またはＴｒｅｇ免疫応答の１つ以上を包含していてもよい。
【０２０４】
強化されたＴｈ１免疫応答は、Ｔｈ１免疫応答（たとえばＩＦＮγ）に関連するサイトカインの１つ以上における増大、および活性化マクロファージにおける増大を包含していてもよい。
【０２０５】
強化されたＴｈ１免疫応答は、抗原特異的ＩｇＧ抗体、とりわけＩｇＧ１抗体における増大の１つ以上を包含していてもよい。
【０２０６】
たとえば、免疫原性組成物または本発明のワクチンは、１つ以上のアジュバントおよび／または薬学的に許容される賦形剤と会合（たとえば、化学的にまたは組み換え的に連結、親和性結合または別個の成分の混合物によって結合）していてもよい。本発明によるワクチンは、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤またはビヒクル、たとえば水、生理食塩水、グリセロール、エタノール等を包含していてもよい。加えて、補助物質、たとえば湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質等が、そのようなビヒクル中に存在していてもよい。アジュバントは、具体的に、ワクチンの有効性を強化するために使用されていてもよい。アジュバントは、ワクチン組成物に直接添加されていてもよく、またはワクチンの投与と同時発生的にまたはその直後にの何れかで、別個に投与され得る。
【０２０７】
好適なアジュバントは、サイトカイン、および免疫原に対する免疫応答を組織化する助けとなる同様の化合物を包含する。ここで使用される場合、用語「サイトカイン」は、ナノからピコモル濃度で液性調節剤として作用し、正常または病的状態下の何れかで、個々の細胞および組織の機能活性を調整する、可溶性タンパク質およびペプチドの多様な群を表す一般名として使用される。これらのタンパク質はまた、細胞間の相互作用を直接媒介し、細胞外環境において起こるプロセスを調節する。
【０２０８】
サイトカインの例は、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＴＮＦα、ＩＦＮα、ＩＮＦγ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦを包含する。
【０２０９】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドも、それぞれのエピトープの提示と合わせて、アジュバントとして使用され得る。他のアジュバントは、ミョウバン、（不）完全フロイントアジュバント、百日咳（B. pertussis）またはその毒素、ＩＣ３１等を包含する。
【０２１０】
免疫原性組成物の成分、すなわち指定のアジュバント成分、たとえば、ＴＬＲ９リガンドおよび第一のペプチド性アルファらせんと連結している抗ＣＤ３２部分、および、たとえば第一のらせんと整合している第二のペプチド性アルファらせんと連結しているペプチド免疫原を含む、免疫原成分、ならびに、免疫原性組成物もしくはワクチン、またはその結合部分もしくはリガンドおよびコイル繰り返しがあるもしくはない免疫原の何れかは、当技術分野において公知である種々の方法によって、たとえば細胞培養物からの精製もしくは単離、組み換え技術によって、または化学合成によって取得してもよい。
【０２１１】
具体的な態様によれば、免疫原性組成物ならびに／またはその指定のアジュバント成分および／もしくは免疫原成分は、組み換えポリペプチドとして、たとえば組み換えＤＮＡ技術によって産生される。ここで使用される場合、用語「組み換え」は、宿主細胞において自然発生しない分子または構築物を指す。いくつかの態様において、組み換え核酸分子は、２つ以上の自然発生的な配列を含有し、これらは自然発生しない手法で一緒に連結されている。組み換えタンパク質は、組み換え核酸によってコードされ、かつ／または発現されているタンパク質を指す。いくつかの態様において、「組み換え細胞」は、細胞のネイティブ（すなわち非組み換え）形態内に同一形態では見られない遺伝子を発現しているか、かつ／または、そうでなければ異常に過剰発現された、発現不足の、および／もしくは故意のヒト介入により全く発現されていない、ネイティブ遺伝子を発現している。組み換え細胞は、少なくとも１つの組み換えポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含有する。「組み換え」、「組み換えること」および「組み換えられた」核酸を生成することは、概して、少なくとも２つの核酸フラグメントの集合を包括する。ある特定の態様において、組み換えタンパク質および組み換え核酸は、機能的なままである、すなわち、宿主細胞において、活性を保持している、または強化された活性を呈する。
【０２１２】
故に、本発明はさらに、免疫原性組成物またはその成分の産生、ならびに、そのような産生のための組み換え手段であって、アミノ酸配列をコードする核酸と、発現カセットと、発現されるアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクターまたはプラスミドと、任意のそのような手段を含む宿主細胞とを包含する手段を指す。好適な標準的な組み換えＤＮＡ技術は、当技術分野において公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（１９８９）、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ）においてとりわけ記述されている。
【０２１３】
用語「感作ワクチン」は、ここでは下記のように理解される。対象は、免疫原とは別にワクチン成分に対する特異的感作を受けていてもよく、それにより、特異的な液性免疫応答を誘導する。本発明によれば、対象は、指定のアジュバントおよびペプチド性アルファらせん、好ましくは分子を安定させるためにコイルドコイルまたは二重らせんを含む、本発明による感作ワクチンでの処置によって感作される。故に、免疫原は、本発明による免疫調節ワクチンにおいて使用される場合、具体的に、そのような感作ワクチンにおいて用いられない。そのような感作ワクチンを対象に投与すると、対象は、感作ワクチンのエピトープに対する免疫応答を発達させ得る。本発明による免疫調節ワクチンでの同じ対象のさらなる処置は、次いで、疾患の治療または予防に必要とされる免疫原に対する特異的免疫応答を誘導することになる。感作のおかげで、たとえばアレルギー患者の場合、免疫原の部分に対する潜在的に有害な現存する免疫記憶は、免疫化前は患者が未感作であるワクチンの部分に対する不要な免疫反応を誘導しない。
【０２１４】
ここで、用語「対象」は、具体的な疾患状態に罹患している患者または健康な対象の何れかである、家畜動物、コンパニオンアニマルおよび実験動物を包含する、ヒトまたは哺乳類対象、特にヒトを含むと理解される。
【０２１５】
本発明はさらに、本発明の免疫原性組成物を調製するための成分のキット、たとえば成分を充填した１つ以上の容器を含む医薬キットを提供する。キットは、上述の方法において使用され得る。特定の態様において、キットは、免疫原性組成物の成分または本発明の調製された免疫原性組成物もしくはワクチンを使用するための説明書をさらに含む。
【０２１６】
ワクチン成分、すなわち指定のアジュバント成分および免疫原成分、ならびにワクチン、またはその結合部分もしくはリガンドおよびコイル繰り返しがあるもしくはない免疫原の何れかは、当技術分野において公知である種々の方法によって、たとえば細胞培養物からの精製もしくは単離、組み換え技術によって、または化学合成によって取得してもよい。
【０２１７】
したがって、本発明は、独自のワクチンおよびそれぞれの適用を提供する。
【０２１８】
具体例によれば、本発明によるワクチンは、
配列番号１９：
【化１】
0006466327.tif 000004
【０２１９】
の組み換えポリペプチドを含む。
【０２２０】
下線を引いたＮ−末端：ＣＤ３２ａと特異的に結合しているＳｃＦＶの配列；
斜字：リンカー；ｓｃＦｖ調製物において一般に使用される任意の代替的なリンカーが使用されていてもよい。
【０２２１】
太字：精製のためのストレップタグＩＩ、任意の代替的なタグ、たとえばフラッグタグまたはＨＩＳタグが使用されていてもよい。
【０２２２】
二重線を引いたＣ−末端：免疫原中のカウンターヘプタッド繰り返しアルファらせん（ｐｅｐＫ）とコイルドコイルを形成するためのヘプタッド繰り返しアルファらせん（ｐｅｐＥ）。
【０２２３】
この例（配列番号１９）においては５つの繰り返しが使用されており；より多くの繰り返しは自己凝集を引き起こし得、より少ない繰り返しは親和性を低減させ得る。使用されているコイルのための繰り返しの好ましい最小機能数は３であり、好ましい最大機能数は５42〜44であるが、どの種類のアルファらせんが使用されているかに応じてより多くの繰り返しが実現可能である。限界は、ホモ二量体化を誘導し始める繰り返しの数である。故に、ホモ二量体化は具体的に除外されている。
【０２２４】
同様のポリペプチドは、リーダー配列、特異的抗ＣＤ３２部分のアミノ酸配列を含んでいてもよく、これは、たとえば、組み換えｓｃＦｖ、リンカー、精製目的のためのタグ、およびペプチド性アルファらせんｐｅｐＥの配列である。ＴＬＲ９リガンドを持つまたは持たないこの構築物は、「弾頭」とも呼ばれ、これは、次いで、カウンターアルファらせんｐｅｐＫに連結された免疫原との組合せにより、ワクチンを構築するために使用されてもよい。
【０２２５】
別の具体例によれば、抗ＣＤ３２部分は、ＳｃＦｖの代替として使用される配列番号２０の配列：ＡＤＧＡＷＡＷＶＷＬＴＥＴＡＶＧＡＡ45を持つ抗ＣＤ３２ａペプチドである。
【０２２６】
さらなる例によれば、アレルゲン、たとえばＤｅｒ  Ｐ１およびＤｅｒ  Ｐ２Ｔ細胞エピトープを含む、免疫原含有コイルが調製される。ペプチド性アルファらせんは、リンカーによって免疫原と適宜連結し、柔軟性を可能にしている。
【０２２７】
さらなる例によれば、安定なコイルドコイルは、弾頭ｓｃＦｖと免疫原との間に確立されている。
【０２２８】
別の例によれば、免疫原含有コイルは、アレルゲンの約２９の異なるＴ細胞エピトープを含んで調製される。
【０２２９】
さらなる例において、弾頭が、強化された抗原提示を媒介したことが示され得る。Ｔ細胞は、コイル（ｐｅｐＫコイル）を持つ免疫原が、対応コイル（ｐｅｐＥコイル）を含有する弾頭と相互作用した場合に、有効に刺激された。
【０２３０】
さらなる例において、ＴＬＲ９アゴニストＣｐＧが、自己免疫反応性Ｔ細胞の活性化を媒介することが証明されている。
【０２３１】
しかし、別の例において、コイルドコイルによってアレルゲン特異的免疫原と連結された抗ＣＤ３２  ｓｃＦｖまたは抗ＣＤ３２ａペプチドの何れかを用いる弾頭を使用する、アレルギーの治療について記述されている。
【０２３２】
さらなる例によれば、安定なコイルドコイルは、弾頭ｓｃＦｖと免疫原との間に確立されている。
【０２３３】
ＰＢＭＣは、そのような免疫原またはワクチンで有効に刺激され得ることが証明された。
【０２３４】
さらなる例において、弾頭が、強化された抗原提示を媒介することを示し得た。Ｔ細胞は、コイル（ｐｅｐＫコイル）を持つ免疫原が、対応コイル（ｐｅｐＥコイル）を含有する弾頭と相互作用した場合に、有効に刺激された。
【０２３５】
さらなる例において、コイルドコイルによってＧ１３ペプチド免疫原と連結された抗ＣＤ３２  ｓｃＦｖまたは抗ＣＤ３２ａペプチドの何れかを用いる弾頭を使用する、マウスモデルおよびアカゲザルモデルにおける膵臓がんの治療について記述されている。食欲低減および食欲制御については、アカゲザルモデルにおいて記述されている。
【０２３６】
したがって、本発明は、独自の免疫原性組成物およびワクチン、ならびにそれぞれの適用を提供する。
【０２３７】
前述の記述は、下記の例を参照してより完全に理解される。しかしながら、そのような例は、本発明の１つ以上の態様を実践する方法の代表に過ぎず、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０２３８】
［実施例］
例１：ＳｃＦＶ弾頭含有コイル
アミノ酸配列１．（配列番号２１）
【化２】
0006466327.tif 000005
【０２３９】
ＡＡ１〜１９：リーダー配列（産生物を分泌するため）
ＳｃＦＶのＩＡＡ２０〜２７１配列（ＶＨドメインには下線が引かれており、Ｖｌには二重下線が引かれており）、ＶＨおよびＶＬドメインの順序は入れ替えられていてもよい）
ＩＡＡ１４０〜１５４リンカーは、ＳｃＦＶ調製において使用される任意のリンカーに変更されていてもよい。
【０２４０】
ＡＡ２７２〜２７９：精製のためのストレップタグＩＩは、任意の種類のタグ、たとえばフラッグタグまたはＨＩＳタグと交換されていてもよい。
【０２４１】
ＡＡ２８０〜２８１：短リンカー（長くなることもある）
ＡＡ２８２〜３１６：免疫原中におけるカウンターヘプタッド繰り返しアルファらせん（ｐｅｐＫ）とコイルドコイルを形成するためのヘプタッド繰り返しアルファらせん（ｐｅｐＥ）。例においては５つの繰り返しが使用されており、より多くの繰り返しは自己凝集を引き起こし得、より少ない繰り返しは親和性を低減させることになるが、４つの繰り返しは依然として機能的である。使用されているコイルのための繰り返しの最小機能数は、３および５46〜48である。
【０２４２】
ＴＲＬ９アゴニスト、たとえばＣｐＧは、弾頭と、化学的カップリングを使用して、たとえばＳｏｌｕｌｉｎｋ抗体−オリゴカップリングＫＩＴを使用してカップリングされていてもよい。ペプチド性ＴＲＬ９アゴニストは、標準的なペプチド化学を使用してカップリングされていてもよい。
【０２４３】
例２：ペプチド弾頭含有コイルドコイル
アミノ酸配列２（配列番号２２）：
【化３】
0006466327.tif 000006
【０２４４】
ＡＡ１〜１９  Ｂｅｒｎｔｚｅｎら45によって公開されたａＣＤ３２ａペプチドの配列
ＩＡＡ２０〜２４およびＡＡ３２〜３３：リンカーは、任意のリンカー、また２つの接続された配列間の柔軟性を可能にするより長いリンカーに変更されていてもよい。
【０２４５】
ＡＡ２４〜３１：精製のためのストレップタグＩＩは、任意の種類のタグ、たとえばフラッグタグまたはＨＩＳタグと交換されていてもよい。
【０２４６】
ＡＡ３４〜６８：免疫原中におけるカウンターヘプタッド繰り返しアルファらせん（ｐｅｐＫ）とコイルドコイルを形成するためのヘプタッド繰り返しアルファらせん（ｐｅｐＥ）。例においては５つの繰り返しが使用されており、より多くの繰り返しは自己凝集を引き起こし得、より少ない繰り返しは親和性を低減させることになるが、４つの繰り返しは依然として機能的である。使用されているコイルのための繰り返しの最小機能数は、３および５49〜51である。
【０２４７】
ＴＲＬ９アゴニスト、たとえばＣｐＧは、弾頭と、化学的カップリングを使用して、たとえばＳｏｌｕｌｉｎｋ抗体−オリゴカップリングＫＩＴを使用してカップリングされていてもよい。ペプチド性ＴＲＬ９アゴニストは、標準的なペプチド化学を使用してカップリングされていてもよい。
【０２４８】
例３：免疫原３含有コイル（ヒトクラスＩＩ発現に基づくＤｅｒ  Ｐ１およびＤｅｒ  Ｐ２Ｔ細胞エピトープ）
アミノ酸配列３（配列番号２３）：
【化４】
0006466327.tif 000007
【０２４９】
ＡＡ１〜６  精製のためのＨｉｓタグは、任意の種類のタグ、たとえばフラッグタグまたはストレップタグＩＩと交換されていてもよい。タグは、リンカーとアルファらせんとの間に位置していてもよい例４を参照）。Ｃ末端は好ましくなく、それは、これがコイルドコイルの機能性を妨げ得るからである。
【０２５０】
ＡＡ２０８〜２１９：アレルゲンペプチドとリンカーとの間のリンカー（２つの接続された配列間の柔軟性を可能にする任意の他のリンカーに交換されていてもよい。下線が引かれたシステインは、配列から除去されていてもよい。
【０２５１】
ＡＡ２２０〜２５４：弾頭中におけるカウンターヘプタッド繰り返しアルファらせん（ｐｅｐＥ）とコイルドコイルを形成するためのヘプタッド繰り返しアルファらせん（ｐｅｐＫ）。例においては５つの繰り返しが使用されており、より多くの繰り返しは自己凝集を引き起こし得、より少ない繰り返しは親和性を低減させることになるが、４つの繰り返しは依然として機能的である。使用されているコイルのための繰り返しの最小機能数は、３および５52〜54である。
【０２５２】
ＡＡ６〜５４：Ｄｅｒ  ｐ１からのＴ細胞エピトープ（ネイティブタンパク質のＡＡ１８１〜２２０）：
【化５】
0006466327.tif 000008
【０２５３】
（配列番号２４）
太字および斜字は、ＨＬＡクラスによって提示される予測Ｔ細胞エピトープである。
【０２５４】
ＡＡ５５〜８８：Ｄｅｒ  ｐ１からのＴ細胞エピトープ（９５〜１２８）：
【化６】
0006466327.tif 000009
【０２５５】
（配列番号２５）
太字および斜字は、ＨＬＡクラスによって提示される予測Ｔ細胞エピトープである。
【０２５６】
ＡＡ８９〜１０８：Ｄｅｒ  ｐ２からのＴ細胞エピトープ：（ネイティブタンパク質のＡＡ８５〜１０４）：
【化７】
0006466327.tif 000010
【０２５７】
（配列番号２６）
太字および斜字は、ＨＬＡクラスによって提示される予測Ｔ細胞エピトープである。
【０２５８】
ＡＡ１０９〜１３４：Ｄｅｒ  ｐ２からのＴ細胞エピトープ：（ネイティブタンパク質のＡＡ１０５〜１３０）：
【化８】
0006466327.tif 000011
【０２５９】
（配列番号２７）
太字および斜字は、ＨＬＡクラスによって提示される予測Ｔ細胞エピトープである。
【０２６０】
ＡＡ１３５〜１８３：Ｄｅｒ  ｐ１からのＴ細胞エピトープ（ネイティブタンパク質のＡＡ２２８〜２７６）：
【化９】
0006466327.tif 000012
【０２６１】
（配列番号２８）
太字および斜字は、ＨＬＡクラスによって提示される予測Ｔ細胞エピトープである。
【０２６２】
ＡＡ１８４〜２０８：ＤｅｒＰ２からのＴ細胞エピトープ：（ネイティブタンパク質のＡＡ１１〜４５）：
【化１０】
0006466327.tif 000013
【０２６３】
（配列番号２９）
太字および斜字は、ＨＬＡクラスによって提示される予測Ｔ細胞エピトープである。
【０２６４】
例４：弾頭ＳｃＦＶと免疫原３との間における安定なコイルドコイルの形成。
【０２６５】
免疫原３を、フローセル１、２、３チップ上のＢＩＡコアＣＭ５に、標準的な手順を使用して固定して、約７００の応答単位をもたらし、その後、弾頭（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ）をフローセル１に注射し、時間依存性質量増大を測定し（オンレート）、約１６０秒後、緩衝液をＰＢＳのみに変更した。オフレートは、ＰＢＳのみが注射された弾頭と免疫原細胞との間の結合の安定性を指示している。弾頭をｐｅｐＫコイルとともにプレインキュベートし、その後フローセル２に注射した場合、弾頭とチップとの結合は見られなかった。同様に、弾頭の注射前にチップをｐｅｐ  Ｅ（フローセル３）とともにプレインキュベートした場合、弾頭と免疫原との結合は見られなかった（図１参照）。
【０２６６】
例５：免疫原５〜１２含有コイル（ヒトクラスＩＩ発現に基づく、Ｄｅｒ  ｐ１、Ｄｅｒ  ｐ２、Ｄｅｒ  ｐ３、Ｄｅｒ  ｐ４、Ｄｅｒ  ｐ７、Ｄｅｒ  ｐ９、Ｄｅｒ  ｐ１０、Ｄｅｒ  ｐ１１、Ｄｅｒ  ｐ１４、Ｄｅｒ  ｐ１５の約２９のＴ細胞エピトープ）
アミノ酸配列３（配列番号３０）：
免疫原５〜１２：
【化１１】
0006466327.tif 000014
【０２６７】
ＡＡ１３６９〜２７４  精製のためのＨｉｓタグは、任意の種類のタグ、たとえばフラッグタグまたはストレップタグＩＩと交換されていてもよい。タグは、リンカーとアルファらせんとの間に位置していてもよい例４を参照）。Ｃ末端は好ましくなく、何故なら、これがコイルドコイルの機能性を妨げ得るからである。
【０２６８】
ＡＡ３６５〜３６８および３７５〜３８１：アレルゲンペプチドＨＩＳタグとｐｅｐＫとの間のリンカー。リンカー（２つの接続された配列間の柔軟性を可能にする任意の他のリンカーに交換されていてもよい。下線が引かれたシステイン（Ｃｙｓ３７９）は、好ましくは配列から除去されている。
【０２６９】
ＡＡ３８２〜４１６：弾頭中におけるカウンターヘプタッド繰り返しアルファらせん（ｐｅｐＥ）とコイルドコイルを形成するためのヘプタッド繰り返しアルファらせん（ｐｅｐＫ）。例においては５つの繰り返しが使用されており、より多くの繰り返しは自己凝集を引き起こし得、より少ない繰り返しは親和性を低減させることになるが、４つの繰り返しは依然として機能的である。使用されているコイルのための繰り返しの最小機能数は、３および５55〜57である。
【０２７０】
弾頭（ＳｃＦＶコイル１  ＩＶ．３＋ＯＤＮＭ３６２に基づく）を、免疫原５〜１２と、弾頭の１０％から１００％が免疫原とコイルドコイル構造によって結合されていることを指示する比で混合し、好ましくは遊離した免疫原はないかまたは５０％未満であり、ミョウバン上に構築される。
【０２７１】
例として、以下でさらに記述する通り、好ましい態様によれば、本発明はワクチンを提供し、本発明の免疫調節ワクチンは、
−  配列番号７０の配列を含むまたはそれらからなる第一のアルファらせんと連結している抗ＣＤ３２部分から構成され、配列番号７０が、たとえば１：１〜１８の比（１分子当たりの分子）で、配列番号６９のＴＬＲ９リガンドとカップリングしている、指定のアジュバントと；
−  第二のアルファらせん、好ましくは配列番号７５、または機能的に活性なその変異体、好ましくは変異体と連結しており、ここでＣｙｓ３７９は除去されているまたはアレルゲン由来ペプチドの順序が変更されている、配列番号３０の免疫原を含むまたはそれらからなる免疫原と
を含み、
指定のアジュバントおよび免疫原が、第一および第二のアルファらせんによって形成されたコイルドコイル構造によって互いに結合している。
【０２７２】
Ｔ細胞エピトープ（ｉｍｍｏ５〜１２には、１５のアレルゲン由来ペプチドがある：１−２−３−４−５−６−７−８−９−１０−１１−１２−１３−１４−１５）。ＨＤＭアレルゲンに由来するペプチドの順序は、溶解性のために最適化したが、任意の他の順序も可能となる。
【化１２】
0006466327.tif 000015
【化１３】
0006466327.tif 000016
【０２７３】
例６：免疫原３によるサルＰＢＭＣの刺激
ＰＢＭＣ（１００．０００／ウェル）のＤｅｒ  ｐ１感作アカゲザル（ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）を、３連で、培地、３Ｄｅｒ  ｐ１または３および５μｇ／ｍｌの免疫原３を用い、３７℃／５％ＣＯ2、２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養した。増殖は、［3Ｈ］−チミジン（０．５μＣｉ／ウェル）の組み込みにより、２日間の培養の最後の１８時間の間にアッセイした。細胞を、β−シンチレーション計数（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ  ＮＸＴ、Ｐａｃｋａｒｄ、Ｒａｍｓｅｙ、ＭＮ、ＵＳＡ）のために収穫した。結果は１分当たりの計数として示されている。加えて、並行培養物から、上清を、ＩＬ−１０およびＧＭ−ＣＳＦレベルについて、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｕ−Ｃｙｔｅｃｈ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）をメーカーの指示に従って使用して、２連でアッセイした。図２を参照。
【０２７４】
Ｄｅｒ  ｐ１または免疫原３に対する応答間には、増殖においてもサイトカイン産生においても著しい差異がなく、これは、ヒトＨＬＡクラスＩＩ発現に基づいて選択された免疫原３におけるＴ細胞エピトープが、アカゲザルクラスＩＩ分子によっても等しく良好に提示されていることを指示している。
【０２７５】
例７：ＷＨ媒介性の強化された抗原提示
ＰＢＭＣ（１００．０００／ウェル）のＤｅｒ  ｐ１感作アカゲザル（ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）を、１μｇ／ｍｌの弾頭ＳｃＦＶとともに（氷上で３０分間）プレインキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄するか、またはＰＢＳのみとともにプレインキュベートし、３回洗浄した。その後、これらの細胞を、異なる濃度の免疫原３または３μｇ／ｍｌのＤｅｒ  Ｐ１とともに（氷上で３０分間）インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、その後、細胞を、３７℃／５％ＣＯ2で、２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下、４８時間培養した。陽性対照として、ＰＢＭＣ（弾頭プレインキュベーションなし）を、３μｇ／ｍｌのＤｅｒ  Ｐ１とともにインキュベートし、洗浄せずに、３７℃／５％ＣＯ2、２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養した。増殖は、［3Ｈ］−チミジン（０．５μＣｉ／ウェル）の組み込みにより、２日間の培養の最後の１８時間の間にアッセイした。細胞を、β−シンチレーション計数（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ  ＮＸＴ、Ｐａｃｋａｒｄ、Ｒａｍｓｅｙ、ＭＮ、ＵＳＡ）のために収穫した。結果は１分当たりの計数として示されている。図３を参照。
【０２７６】
Ｔ細胞を刺激するために、抗原提示細胞によって抗原を内在化し、処理する必要がある。これは、Ｔ細胞およびＡＰＣを抗原の存在下で培養することによって、または、抗原に、内在化してリソソーム内に移転することができる細胞表面受容体58〜62を標的とさせることによって達成され得る。文献と一致して、弾頭の非存在下におけるプレインキュベートした免疫原によるＰＢＭＣの刺激は、増殖につながらなかった（データは示されていない）。弾頭の存在下におけるＤｅｒ  ｐ１とのプレインキュベーションも、増殖につながらなかった。しかしながら、ＰＢＭＣを１μｇ／ｍｌの弾頭ＳｃＦＶとともにプレインキュベートし、洗浄し、その後異なる免疫原３濃度でインキュベートし、洗浄した場合、用量依存性刺激が見られ、これは、ＰＢＭＣを３μｇ／ｍｌのＤｅｒ  ｐ１の存在下で４８時間培養し、洗浄しなかった場合の陽性対照よりもはるかに高かった。そこで、安定なコイルドコイルが形成されるように、免疫原（ｐｅｐＫコイルを含有する）が弾頭（ｐｅｐＥコイルを含有する）と相互作用できるようにすると、刺激が見られた。Ｄｅｒ  Ｐ１と組み合わせた弾頭は刺激につながらなかったが、これは、Ｄｅｒ  Ｐ１がコイルを欠いており、ＰＢＭＣと結合しないためである。
【０２７７】
例８．自己免疫反応性Ｔ細胞のＣｐＧ媒介性活性化
ＰＢＭＣ（１００．０００／ウェル）のアカゲザル（ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）または正常ヒトドナーを、５０μＭのＣｐＧまたはＣｐＧ−ビオチンとともに３連でインキュベートした。並行して、ＰＢＭＣを、１μｇ／ｍｌのビオチン化した弾頭ＳｃＦＶとともに（氷上で３０分間）プレインキュベートし、３回洗浄し、その後、５０μＭのＣｐＧとともにインキュベートした。上清を、ＩＬ−４およびＩＦＮガンマレベルについて、市販のＥＬＩＳＡキットをメーカーの指示に従って使用して、２連でアッセイした。図４を参照。
【０２７８】
ＣｐＧは、サルまたはヒト細胞において特異的なＴ細胞応答を誘導せず（左のバー）、共投与したビオチン化タンパク質に対するＴ細胞応答を強化または誘導することもなかった（右のバー）。ＣｐＧおよびビオチンが物理的に連結している場合（緑色のバー）のみ、ビオチンに対する特異的応答が誘導された。ビオチン（ビタミンｂ７、ビタミンＨまたはビタミンＢ８とも呼ばれる）は自己分子であるため、免疫応答は発生しないはずである。しかしながら、ビオチンがＴＬＲ９活性化ＡＰＣによって提示されている場合、Ｔ細胞寛容は破壊されており、これは、ＴＬＲ９アゴニストを自己タンパク質として物理的に連結させることが免疫応答につながり、この事例では、自己タンパク質が、がんを治療するために使用され得る腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であることを指示している。物理的に連結しているとは、ＴＡＡと直接、または弾頭のコイルと相互作用するコイルとカップリングされた（を含有する）弾頭およびＴＡＡを使用して間接的にの何れかで連結していることを意味する。後者が好ましい。ＴＬＲ９アゴニストおよびＴＡＡが同じＡＰＣによって取り込まれることが保証される限り、ＴＲＬ９アゴニストおよびＴＡＡとの間の複合体の任意の他の形態を使用してもよい。
【０２７９】
例９：がん治療
アレルギーを治療することとは対照的に、がんの治療に使用される弾頭は、ＣＤ３２ａと主に結合するべきであって、ＣＤ３２ｂとは結合すべきではない。例１および２からの弾頭は、がん治療において使用するのに好ましい。
【０２８０】
例１０：免疫原５〜１２によるヒトＰＢＭＣの刺激
ＰＢＭＣ（１００．０００／ウェル）のＤｅｒ  ｐ１感作正常ドナーを、３連で、培地、３μｇ／ｍｌのＤｅｒ  ｐ１または５、１または０．５μｇ／ｍｌの免疫原５〜１２（Ｉｍｍｏ５−１２）を用い、３７℃／５％ＣＯ2で２４時間培養した。上清を、ＩＬ−１０およびＩＦＮｇレベルについて、市販のＥＬＩＳＡキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）をメーカーの指示に従って使用して、２連でアッセイした。図５を参照。
【０２８１】
例１１：自己免疫疾患の治療
ＣＤ３２ａおよびＣＤ３２ｂを認識する弾頭、コイルドコイル、ならびに自家抗原と組み合わせられた阻害ＴＬＲ９シグナル伝達（基準）を誘導するＴＬＲ９アンタゴニストまたはアゴニストを含む、ワクチン。そのようなワクチンは、自家抗原を包含するワクチンのいかなる部分に対しても新たな抗体を誘導せず、したがって、そのような患者において使用するのに安全である。このワクチンにおける阻害ＣｐＧ（阻害ＯＤＮ）の使用は、自家抗原を包含するワクチンに対してＴ  ｒｅｇ細胞を誘導することになる。群１または２のＣｐＧアゴニストを使用した場合にも、同じことが起こる。群３のＴＬＲ９アゴニストは好ましくなく、さらなる自己免疫の誘導につながることになる。図４を参照。
【０２８２】
例１２：例示的なバインダー
１２．１．ここでは抗ＣＤ３２部分またはＣＤ３２バインダーとも呼ばれるＣＤ３２結合領域
ＣＤ３２ａバインダー：
ＣＤ３２ａと特異的に結合している抗体：ｍＡｂ  ＩＶ．３（Ｓｔｕａｒｔら（１９８７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１６６８）
ｍＡｂ  ＩＶ．３に由来するＳｃＦＶ（ＶＨ−リンカー−ＶＬ）：（配列番号４４）
【化１４】
0006466327.tif 000017
【０２８３】
下線：ＶＨドメイン
太字：ＨＬドメイン
通常の型設定。柔軟なリンカー（いかなるリンカーであってもよい）
抗ＣＤ３２ａペプチド：Ｂｅｒｎｔｚｅｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００９）２８４：１１２６〜１１３５）：
（配列番号４５）
ＡＤＧＡＷＡＷＶＷＬＴＥＴＡＶＧＡＡＫ
群ＣＤ３２ａ＋ｂバインダー：
ＣＤ３２ａおよびＣＤ３２ｂと特異的に結合している抗体：ｍＡｂ  ＡＴ−１０（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）
ｍＡｂ  ＡＴ−１０に由来するＳｃＦＶ（ＶＨ−リンカー−ＶＬ）：（配列番号４６）
【化１５】
0006466327.tif 000018
【０２８４】
下線：ＶＨドメイン
太字：ＨＬドメイン
通常の型設定。柔軟なリンカー（いかなるリンカーであってもよい）
ＩｇＧ１  Ｆｃフラグメント（ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン）：（配列番号４７）
【化１６】
0006466327.tif 000019
【０２８５】
（）間は、省略されていてもよい蝶番領域である
下線：ＣＨ２ドメイン
太字：ＣＨ３ドメイン
１２．２  ここではＴＬＲ９バインダーまたはＴＬＲ９リガンドとも呼ばれる、ＴＬＲ９結合領域または部分
ＣｐＧクラスＡ
群ＣｐＧ−Ａ：
ＯＤＮ２２１６：（配列番号４８）
ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ
ＣｐＧクラスＢ
群ＣｐＧ−Ｂ：
天然リガンド：
ＯＤＮ２００６：（配列番号４９）
ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ
ペプチド性リガンド（免疫刺激ペプチド）：
【表Ｂ】
0006466327.tif 000020
【０２８６】
そのような免疫刺激ペプチドは、好ましくはＣｐＧ模倣体として使用されていてもよい。同様に、機能的に活性なその変異体が使用されていてもよく、これは、フラグメント、突然変異体またはハイブリッドであり、それらの組合せを包含する。
【０２８７】
機能的に活性な変異体は、具体的に、ｐＤＣを刺激し、それによって、陰性対照と比較して増大したレベルのＩＬ−６および／またはＴＮＦアルファおよび／またはＩＦＮアルファを誘導することを特徴とする。
【０２８８】
免疫刺激ＴＬＲ９結合ペプチドの機能的に活性な変異体は、具体的に、
ａ）配列番号７３〜９１のペプチドの何れかと、少なくとも６０％、好ましくは、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の相同性または配列同一性を有する；
ｂ）配列番号５０〜６８のペプチドの何れかの突然変異体であり、これは、親アミノ酸配列を、配列内、または配列の遠位端の何れかもしくは両方における、１個以上のアミノ酸の、挿入、欠失または置換、好ましくは５、４、３、２または１つ未満の点突然変異により、修飾することによって取得可能である；あるいは
ｃ）配列番号５０〜６８のペプチドの何れかのフラグメントであり、これは、親配列の少なくとも５０％、または、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％；あるいは、少なくとも５個のアミノ酸、好ましくは少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０または少なくとも１１個のアミノ酸を含む。
【０２８９】
ＣｐＧクラスＣ
群ＣｐＧ−Ｃ
ＯＤＮＭ３６２：（配列番号６９）
ＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＡＣＧＴＴＧＡＴ
１２．３  コイルを持つ例示的なＣＤ３２結合生成物
ＳｃＦＶ−コイル１（ＩＶ．３）：（配列番号７０）
【化１７】
0006466327.tif 000021
【０２９０】
下線：ＶＨドメイン
太字：ＨＬドメイン
通常の型設定。柔軟なリンカー（いかなるリンカーであってもよい）
斜字：ｐｅｐＥコイル＋Ｃ’ストレップタグＩＩ配列および「ＧＰ」リンカーは、いかなる柔軟なリンカーであってもよい（ストレップタグＩＩは、除去されているか、またはＨＩＳタグもしくは任意の他のタグによって置きかえられていてもよい）
ＳｃＦＶ−コイル２（ＡＴ１０）：（配列番号７１）
【化１８】
0006466327.tif 000022
【０２９１】
下線：ＶＨドメイン
太字：ＨＬドメイン
通常の型設定。柔軟なリンカー（いかなるリンカーであってもよい）
斜字：ｐｅｐＥコイル＋Ｃ’ストレップタグＩＩ配列および「ＧＰ」リンカーは、いかなる柔軟なリンカーであってもよい（ストレップタグＩＩは、除去されているか、またはＨＩＳタグもしくは任意の他のタグによって置きかえられていてもよい）
ペプチド−コイル：（配列番号７２）
【化１９】
0006466327.tif 000023
【０２９２】
斜字：ｐｅｐＥコイル＋「ＧＰ」リンカーは、いかなる柔軟なリンカーであってもよい
ＩｇＧ１  Ｆｃフラグメント−コイル：（配列番号７３）
【化２０】
0006466327.tif 000024
【０２９３】
（）間は、省略されていてもよい蝶番領域である
下線：ＣＨ２ドメイン
太字  ＣＨ３ドメイン
斜字：ｐｅｐＥコイル＋「ＧＰ」リンカーは、いかなる柔軟なリンカーであってもよい
１２．４．ＣＤ３２バインダーとの化学的架橋のためのＳＨ基を持つ例示的なＴＬＲ９結合生成物
群ＣｐＧ−Ａ：
ＯＤＮ２２１６＿ＳＨ：（配列番号４８）
【化２１】
0006466327.tif 000025
【０２９４】
太字  ＳｃＦＶ−コイルとの化学的架橋のためのＳＨ基を持つ柔軟なリンカー（任意のリンカーおよび化学的反応基、たとえば、化学的架橋に適しているＮＨ２であってもよい）
群ＣｐＧ−Ｂ：
天然リガンド：
ＯＤＮ２００６＿ＳＨ：（配列番号４９）
【化２２】
0006466327.tif 000026
【０２９５】
ペプチド性リガンド＿ＳＨ：
【表Ｃ】
0006466327.tif 000027
【０２９６】
太字  ＳｃＦＶ−コイルとの化学的架橋のためのＳＨ基を持つ柔軟なリンカー（任意のリンカーおよび化学的反応基、たとえば、化学的架橋に適しているＮＨ２であってもよい）
群ＣｐＧ−Ｃ
ＯＤＮＭ３６２＿ＳＨ：（配列番号６９）
【化２３】
0006466327.tif 000028
【０２９７】
太字  ＳｃＦＶ−コイルとの化学的架橋のためのＳＨ基を持つ柔軟なリンカー（任意のリンカーおよび化学的反応基、たとえば、化学的架橋に適しているＮＨ２であってもよい）
１２．５  例示的な弾頭、すなわち、ＣＤ３２バインダーおよびＴＬＲ９バインダーを含む構造
任意の方法によってＴＬＲ９バインダーの群の任意の代表と化学的に連結されたＣＤ３２バインダーの群からの任意の代表、ここで、好ましくは、ＴＬＲ９バインダーは、ＣＤ３２バインダー中の利用可能なリジン（Ｋ）とカップリングされている。たとえば、異なるＴＬＲ９バインダーの混合物、たとえばＣｐＧ−Ｂ天然またはペプチド性バインダーも、カップリングされていてもよい。
【０２９８】
ＳｃＦＶ−コイル１（ＩＶ．３）（配列番号７０）
【化２４】
0006466327.tif 000029
【０２９９】
コイル構造内のリジン（斜字）が好ましい
または
ペプチド−コイル：（配列番号７２）
【化２５】
0006466327.tif 000030
【０３００】
コイル構造内のリジン（斜字）が好ましい
１２．６．ここでは抗原とも呼ばれる、例示的な免疫原
免疫原３含有コイル（ヒトクラスＩＩ発現に基づくＤｅｒ  Ｐ１およびＤｅｒ  Ｐ２Ｔ細胞エピトープ）
（配列番号７４）
【化２６】
0006466327.tif 000031
【０３０１】
下線：ＨＩＳタグ（除去されていてもよい）
太字：リンカー（任意のリンカーであり得る）
斜字：弾頭との相互作用ためのｐｅｐＫコイル
免疫原含有５〜１２コイル（ヒトクラスＩＩ発現に基づくＤｅｒ  ｐ１、Ｄｅｒ  ｐ２、Ｄｅｒ  ｐ３、Ｄｅｒ  ｐ４、Ｄｅｒ  ｐ７、Ｄｅｒ  ｐ９、Ｄｅｒ  ｐ１０、Ｄｅｒ  ｐ１１、Ｄｅｒ  ｐ１４、Ｄｅｒ  ｐ１５の約２９のＴ細胞エピトープ）
（配列番号７５）
【化２７】
0006466327.tif 000032
【０３０２】
下線：ＨＩＳタグ（除去されていてもよい）
太字：リンカー（任意のリンカーであり得る）
斜字：弾頭との相互作用ためのｐｅｐＫコイル
１２．７  イエダニ（ＨＤＭ）に対する例示的なアレルギーワクチンＳＧ１００
例示的な分子複合体は、化学的連結（linkeage）、融合および／または親和性結合によって、特にコイルドコイル構造によって形成される。
【０３０３】
弾頭（ＳｃＦＶコイル１  ＩＶ．３＋ＯＤＮＭ３６２に基づく）を、免疫原５〜１２と、弾頭の９０％が免疫原と複合され、遊離した免疫原はないことを指示する比（約１：１．５のモル比）で混合し、ミョウバン上に構築する。
【０３０４】
１２．８  アカゲザルにおけるＳＧ１００の効能：
方法：
５匹の健康なイエダニ（ＨＤＭ）未感作アカゲザルを、ＳＧ１００（１００μｇ／ショット）をミョウバンに吸収させたもの）で３回、０日目、１４日目および２８日目に免疫化した。０日目および４９日目に、血液試料をＴ細胞活性化および抗体産生のために採取した。
【０３０５】
抗体免疫応答：
血清試料を、標準的なＥＬＩＳＡにおいて、弾頭、ｉｍｍｏ５〜１２（Ｉｍｍｏ５）、Ｄｅｒ  ｐ１、Ｄｅｒ  ｐ２、Ｄｅｒ  ｐ５およびＤｅｒ  ｐ７に対するＩｇＧ抗体について試験した。抗原を、マキシソーブ（maxisorb）プレート（１μｇ／ｍｌのＩ  ＰＢＳ）に４℃で終夜コーティングし、２回洗浄し、ＰＢＳ  １％ＢＳＡで遮断し、２回洗浄し、血清とともに１：１０００希釈で４℃で１時間インキュベートし、２回洗浄し、その後、抗ヒトＩｇＧ−ＰＯ（アカゲザルＩｇＧと交差反応性）で検出した。
【０３０６】
細胞免疫応答：
増殖：ＰＢＭＣ（１０5／ウェル）を、８連で、培地、弾頭（２μｇ／ｍｌ）、免疫原（２μｇ／ｍｌ）、Ｄｅｒ  ｐ１（２μｇ／ｍｌ）、Ｄｅｒ  ｐ２（２μｇ／ｍｌ）、Ｄｅｒ  ｐ５（２μｇ／ｍｌ）およびＤｅｒ  ｐ７（２μｇ／ｍｌ）を用い、４日間培養した（３７℃／５％ＣＯ2／９９％湿度）。陽性対照として、Ｃｏｎ  Ａ（コンカナバリン（Concanavaline）Ａ、Ｓｉｇｍａ）を使用した。増殖は、［3Ｈ］−チミジン（０．５μＣｉ／ウェル）により、４日間の培養の最後の１８時間の間に測定した。細胞を、β−シンチレーション計数（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ  ＮＸＴ、Ｐａｃｋｅｒｄ、Ｒａｍｓｅｙ、ＭＮ、ＵＳＡ）のために収穫した。正味の１分当たりの計数は、培地対照の計数を、異なる抗原によって誘導された計数から減算することによって算出した。
【０３０７】
サイトカイン産生：
増殖実験の８連刺激の各ウェルから、５０μｌの上清を２４時間後に採取し、プールした。プールした上清を、ＩＦＮγおよびＩＬ−４の存在について、市販のＥＬＩＳＡキットＵ−Ｃｙｔｅｃｈ、Ｕｔｒｅｃｈｔ  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ製）を使用して試験した。
【０３０８】
結果：
抗体応答：
強いＩｇＧ応答を弾頭およびＳＧ１００の免疫原に対して測定したが、Ｄｅｒ  ｐ１、Ｄｅｒ  ｐ２、Ｄｅｒ  ｐ５またはＤｅｒ  ｐ７に対しては抗体が検出されず（図７）、これは、動物が被験ＨＤＭアレルゲンに対して未感作であったこと、および、ＳＧ１００が、被験ＨＤＭアレルゲンと交差反応するＢ細胞エピトープを含有していないことを示している。
【０３０９】
Ｔ細胞応答：
図８において、動物は、弾頭、ｉｍｍｏ５、Ｄｅｒ  ｐ１、Ｄｅｒ  ｐ２、Ｄｅｒ  ｐ７によりインビトロで刺激された場合に強い増殖を示したが、Ｄｅｒ  ｐ５に対しては示さなかったことが分かる。また、ＩＬ−４のないＩＦＮγが、インビトロ培養物からの上清中、弾頭、ｉｍｍｏ５、Ｄｅｒ  ｐ１、Ｄｅｒ  ｐ２、Ｄｅｒ  ｐ７により測定されたが、Ｄｅｒ  ｐ５に対しては測定されなかった（図９）。ＩＬ−４は、Ｃｏｎ  Ａによる刺激後に見られた（データは示されていない）。
【０３１０】
結論：
ＳＧ１００による免疫化は、ＩｇＧ抗体の存在およびＴ細胞の誘導によって指示される通り、ワクチンに対するＴｈ１型記憶応答を誘導し、弾頭またはＩｍｍｏ５によって刺激された場合にＩＦＮγを産生するがＩＬ−４は産生しない。予測通り、Ｄｅｒ  ｐ１、Ｄｅｒ  ｐ２、Ｄｅｒ  ｐ５またはＤｅｒ  ｐ７に対するＩｇＧ（＝Ｂ細胞記憶）は誘導されず、何故なら、ワクチンがこれらのアレルゲンからのＢ細胞（ell）エピトープを含有しないからである。しかしながら、Ｔｈ１型記憶は、ワクチン中に存在しているイエダニアレルゲンのＴ細胞エピトープ、Ｄｅｒ  ｐ１、Ｄｅｒ  ｐ２、Ｄｅｒ  ｐ７に対して誘導された。Ｔｈ１型記憶は、ワクチン中に包含されていないＤｅｒ  ｐ５に対しては誘導されなかった。
【０３１１】
これは、ＳＧ１００の概念を裏付けるものである。
【０３１２】
１２．９  腫瘍学において使用するための例示的なワクチン、弾頭
ＳｃＦＶ−コイル１（ＩＶ．３）：（配列番号７０）
【化２８】
0006466327.tif 000033
【０３１３】
下線：ＶＨドメイン
太字：ＨＬドメイン
通常の型設定。柔軟なリンカー（いかなるリンカーであってもよい）
斜字：ｐｅｐＥコイル＋Ｃ’ストレップタグＩＩ配列および「ＧＰ」リンカーは、いかなる柔軟なリンカーであってもよい（ストレップタグＩＩは、除去されていても、またはＨＩＳタグもしくは任意の他のタグによって置きかえられていてもよい）
ＯＤＮＭ３６２を持つ弾頭：
【化２９】
0006466327.tif 000034
【化３０】
0006466327.tif 000035
【０３１４】
ＯＤＮ−Ｍ３６２は、ＳｃＦＶ−１−コイル内の利用可能なリジンの何れかとカップリングされていてもよい。
【０３１５】
弾頭（ＳＧ１００）：
ＯＤＮ−Ｍ３６２−ＳＨと化学的に連結されているＳｃＦＶ−１−コイル。調製物は、１から１８分子のＯＤＮ−Ｍ３６２と連結されているＳｃＦＶ−１−コイルの混合物であり、ＳｃＦＶ−１−コイルとカップリングされている１〜６分子のＯＤＮ−Ｍ３６２との混合物が好ましい。これらの混合物はすべて、弾頭またはＳｃＦＶ−１−コイル−Ｍ３６２と命名されていてもよい。
【０３１６】
背景：
活性免疫療法のための腫瘍学的標的は、腫瘍細胞において過剰発現されたほぼ定義通りの自家抗原である。これらの抗原は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と呼ばれ、免疫系はこれらの抗原に対して応答することができず、何故ならそれらが自己として認識されるからである。免疫系が自家抗原に対して特異的な抗体および／または細胞免疫応答を生成することを可能にするワクチン製剤は、抗腫瘍ワクチン接種として使用するのに潜在的に適している。
【０３１７】
ＳＧ１００の弾頭は、自己免疫応答を可能にする：
２４匹のマウス（６匹／群）を、１５０μｌのＳｃＦＶ−１−コイル中３５μｇ、またはミョウバン上で構築したかもしくはＰＢＳ中で希釈したかの何れかの弾頭（ＳｃＦＶ−１−コイル−Ｍ３６２）で、２回ｓ．ｃ．免疫化した。免疫化を０日目および１４日目に行い、血清を０日目（免疫化前）および２８日目に採取し、ＳｃＦＶ−１−コイル（ＳｃＦＶとして指示されている）およびｍＡｂ  ＩＶ．３に対するＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａについて、標準的なＥＬＩＳＡにより分析した。図６を参照。
【０３１８】
図６において見られる通り、弾頭による免疫化は、ＳｃＦＶ−１−コイルに対しておよびｍＡｂ  ＩＶ．３に対して、２８日目に強いＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ応答を誘導した。陽性応答は、ミョウバンの存在とは無関係に見られた。ＳｃＦＶ−１−コイルによる免疫化は、ＳｃＦＶ−１−コイルに対するＩｇＧ１応答のみを誘導し、ミョウバンの存在下でのみ、ＩｇＧ２ａ応答は誘導されなかった。これらのデータは、ＣｐＧ（Ｍ３６２）がＴｈ１型応答（ＩｇＧ２ａ）を誘導し、ミョウバンがＴＨ２型応答（ＩｇＧ１）を誘導するという概念と合致している。ＳｃＦＶ−１−コイルに対する応答は、このタンパク質がマウスにおいて免疫原性であることを指示しており、実際に、ストレップタグＩＩ（アミノ酸配列「ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ」（配列番号７６））とｐｅｐＥ（アミノ酸配列「ＥＶＳＡＬＥＫＥＶＳＡＬＥＫＥＶＳＡＬＥＫＥＶＳＡＬＥＫＥＶＳＡＬＥＫ」配列番号７７）の両方がＩｇＧ応答の標的であった（データは示されていない）。しかしながら、ＳｃＦＶ−１−コイルは「マウス自己配列」も含有し、これは、ＳｃＦＶがマウスｍＡｂ  ＩＶ．３のＶＨおよびＶＬドメインを含有するからである。したがって、ＩＶ．３に対する免疫応答は、自己免疫抗体の存在を指示している。実際に、弾頭のみが、ミョウバンの有無にかかわらず、この種類の免疫応答を誘導することができた。それ故、ＳｃＦＶ−１−コイル上におけるＭ３６２の存在は、親抗体の自家抗原ＶＨおよびＶＬドメインに対する寛容を破壊することができる。自家抗原、たとえばＴＡＡを、弾頭のｐｅｐＥとの高親和性相互作用を介して組み合わせることにより、弾頭は、ＴＡＡに対する必要な自己免疫応答を誘導することができる。弾頭（ＳｃＦＶ−１−コイル−Ｍ３６２）とＴＡＡとの複合体は、ワクチンにおいてＴＡＡの過剰発現があるがんの治療のための強力なワクチンを形成する。そのようなワクチンは、任意のアジュバントとともに、たとえばミョウバン上に構築されていてもよい。
【０３１９】
例１３：腫瘍学における技術プラットフォーム、免疫原Ｇ１７を使用する。
【０３２０】
ＳｃＦＶ−コイル１（ＩＶ．３）＋ＯＤＮＭ３６２に基づく弾頭、ならびにアカゲおよびカニクイザル由来の免疫原Ｇ１７（Ｇ１７ＲＭ）。下記において、ｐＥはピロＧｌｕとして理解される。
【０３２１】
ヒト免疫原リトルガストリンの配列（Ｇ１７Ｈ、最初の１３ＡＡ、配列番号８６）：
【化３１】
0006466327.tif 000036
【０３２２】
アカゲおよびカニクイザル免疫原リトルガストリンの配列
（Ｇ１７ＲＭ、最初の１３ＡＡ、配列番号９９：
ｐＥＧＰＷＭＥＥＥＥＡＡＹＧ
マウス免疫原リトルガストリンの配列（Ｇ１７Ｍ、最初の１３ＡＡ、配列番号１００）：
【化３２】
0006466327.tif 000037
【０３２３】
Ｇ１７ＲＭとの差異は太字箇所
最終生成物免疫原Ｇ１７ＲＭ＿１−コイルおよびＧ１７Ｈ＿１−コイル：
Ｇ１７ＲＭ＿１−コイル、配列番号１０１：
【化３３】
0006466327.tif 000038
【０３２４】
Ｇ１７Ｈ＿１−コイル、配列番号１０２
【化３４】
0006466327.tif 000039
【０３２５】
太字：リンカー（任意のリンカーであり得る）
斜字：弾頭との相互作用ためのｐｅｐＫコイル
使用準備済みの（最終生成物）ＴＹＧ１００＿１ＲＭおよびＴＹＧ１００＿１Ｈ
上述した通りの弾頭（ＳｃＦＶ−コイル１に基づく  ＩＶ．３）を、Ｇ１７ＲＭ＿１−コイルまたはＧ１７Ｈ＿１−コイルと、弾頭の１００％がＧ１７ＲＭ＿１−コイルまたはＧ１７Ｈ＿１−コイルと複合されており、Ｇ１７遊離免疫原が存在しないことを指示する比（約１：１のモル比）で混合し、ミョウバン上で構築する。それによって、ＴＹＧ１００＿１ＲＭおよびＴＹＧ１００＿１Ｈが産生される。
【０３２６】
例１４：ガストリン依存性がん、たとえば膵臓がんの治療のためのＴＹＧ１００＿１ＲＭ：
６匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、０日目、１４日目および３５日目に３回、アカゲザルＧ１７（０．５ｍｌ中５８，４μｇ／ショット）を含有するＴＹＧ１００＿１ＲＭまたはＧ１７＿１ＲＭ（弾頭なし）で免疫化した。最終免疫化の２週間後、血清を採取し、Ｇ１７ＲＭ、Ｇ１７ＨおよびＧ１７Ｍ（＝マウス由来のＧ１７）に対するＩｇＧ抗体の存在について分析した。
【表２】
0006466327.tif 000040
【０３２７】
表２は、すべてのマウスが、ワクチンの２成分（弾頭およびＧ１７ＲＭ）に対してＩｇＧで応答したことを示す。重要なことには、すべてのマウスがＩｇＧを産生し、これは、ヒトＧ１７と、および程度（extend）は低くなるが、マウスＧ１７（Ｇ１７Ｍ）と交差反応するものであった。後者は注目に値し、何故なら、マウスＧ１７の最初の１３のイムノ酸（immuno acids）
【化３５】
0006466327.tif 000041
【０３２８】
が３ＡＡにおいてＧ１７ＲＭとは異なっており（差異は太字および下線として指示されている）、Ｇ１７Ｍがマウスのための自家抗原であるからである。したがって、Ｇ１７Ｍを認識している抗体は自己抗体であり、ＴＹＧ１００＿１ＲＭが、自家抗原Ｇ１７Ｍに対する自然寛容を破壊できたことを指示している。Ｇ１７−ペプチドを弾頭なしで免疫化した場合、Ｇ１７に対する応答はなかった。
【０３２９】
自己免疫応答を誘導するワクチンの能力は、抗がんワクチンの必須条件であり、ここで、すべての腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、過剰発現された、たとえば腫瘍細胞において過剰発現された自家抗原である。それ故、免疫原としてのヒトＧ１７と組み合わせられたＴＹＧ１００＿１ＲＭの弾頭から構成されるワクチンは、ガストリン依存性腫瘍、たとえば膵臓がんの治療のためのワクチンとして使用され得る。
【０３３０】
例１５：ペプチド免疫原（immungen）の二量体を包含する例示的な生成物
最終生成物免疫原Ｇ１７ＲＭ＿２−コイルおよびＧ１７Ｈ＿２−コイル：
Ｇ１７ＲＭ（リトルガストリンの最初の１３ＡＡ）の二量体は、２つのペプチドを１つのｐｅｐＫコイルと接続する特殊な柔軟なリンカーを使用して、化学的に合成した。
【０３３１】
Ｇ１７ＲＭ＿２−コイル：（配列番号１０３：２つの配列番号９９のアカゲザルガストリンペプチドと、分枝リンカー配列と、ペプチドアルファらせん（ＴＹＧ１００＿２ＲＭ）とを含む、本発明の免疫原性組成物の部分。この部分は、コイルドコイル連結によって好適な指定のアジュバントと連結されていてもよい）
【化３６】
0006466327.tif 000042
【０３３２】
太字  特殊な柔軟なリンカー（３つのペプチドを接続する任意のリンカーであり得る）
斜字  弾頭との相互作用のためのｐｅｐＫコイル
Ｇ１７Ｈ＿２−コイル：（配列番号８８：２つの配列番号８６のヒトガストリンペプチドと、分枝リンカー配列と、ペプチドアルファらせん（ＴＹＧ１００＿２Ｈ）とを含む、本発明の免疫原性組成物の部分。この部分は、コイルドコイル連結によって好適な指定のアジュバントと連結されていてもよい）
【化３７】
0006466327.tif 000043
【０３３３】
太字  特殊な柔軟なリンカー（３つのペプチドを接続する任意のリンカーであり得る）
斜字  弾頭との相互作用のためのｐｅｐＫコイル
最終生成物ＴＹＧ１００＿２ＲＭおよびＴＹＧ１００＿２Ｈ
上述した通りの弾頭（ＳｃＦＶ−コイル１に基づく；ＩＶ．３）を、Ｇ１７ＲＭ＿２−コイルまたはＧ１７Ｈ＿２−コイルと、弾頭の１００％がＧ１７ＲＭ＿２−コイルまたはＧ１７Ｈ＿２−コイル免疫原と複合され、Ｇ１７遊離免疫原が存在しないことを指示する比（約１：１のモル比）で混合し、ミョウバン上に構築する。それによって、ＴＹＧ１００＿２ＲＭおよびＴＹＧ１００＿２Ｈが産生される。
【０３３４】
例１６：ガストリン依存性がん、たとえば膵臓がんの治療のためのＴＹＧ１００＿２ＲＭ：
６匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、０日目、１４日目および３５日目に３回、アカゲザルＧ１７の最初の１３のイムノ酸（０．５ｍｌ中６６．８μｇ／ショット）を含有するＴＹＧ１００＿２ＲＭで免疫化した。［０］最終免疫化の２週間後、血清を採取し、Ｇ１７ＲＭ、Ｇ１７ＨおよびＧ１７Ｍ（＝マウス由来のＧ１７）に対するＩｇＧ抗体の存在について分析した。
【表３】
0006466327.tif 000044
【０３３５】
表３は、すべてのマウスが、ワクチンの２成分（弾頭およびＧ１７ＲＭ）に対してＩｇＧで応答したことを示す。重要なことには、すべてのマウスがＩｇＧを産生し、これは、ヒトＧ１７と、および程度（extend）は低くなるがマウスＧ１７（Ｇ１７Ｍ）と交差反応するものであった。後者は注目に値し、何故なら、マウスＧ１７の最初の１３のイムノ酸
【化３８】
0006466327.tif 000045
【０３３６】
が３ＡＡにおいてＧ１７ＲＭとは異なっており（差異は太字および下線として指示されている）、Ｇ１７Ｍがマウスのための自家抗原であるからである。したがって、Ｇ１７Ｍを認識している抗体は自己抗体であり、ＴＹＧ１００＿２ＲＭが、自家抗原Ｇ１７Ｍに対する自然寛容を破壊できたことを指示している。Ｇ１７ペプチドを弾頭なしで免疫化した場合、Ｇ１７に対する応答はなかった。
【０３３７】
自己免疫応答を誘導するワクチンの能力は、抗がんワクチンの必須条件であり、ここで、すべての腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、腫瘍細胞上に過剰発現された自家抗原である。それ故、免疫原としてのヒトＧ１７と組み合わせられたＴＹＧ１００＿２ＲＭの弾頭から構成されるワクチンは、ガストリン依存性腫瘍、たとえば膵臓がんの治療のためのワクチンとして使用され得る。ＴＹＧ１００＿２ＲＭによって誘導された３種のＧ１７すべてに対する応答は、ＴＹＧ１００＿１ＲＭによって誘導されたもの（表２）よりも強く、二量体がワクチンにおいて好ましいことを指示していた。
【０３３８】
例１７：ガストリン依存性がん、たとえば膵臓がんの治療のためのＴＹＧ１００＿２ＲＭ：
０日目、１４日目および２８日目に、６匹のカニクイザルをＴＹＧ１００＿２ＲＭで免疫化し、６匹をＧ１７ＲＭ＿２−コイルで免疫化した。０日目、１４日目、２８日目、４２日目および５６日目に、血清を、自己リトルガストリン（Ｇ１７ＲＭ）、ヒト由来のリトルガストリン（Ｇ１７Ｈ）、ガストリン（対照ペプチド）と同様のＭＷの無関係な対照ペプチドに対する、または弾頭（ＳｃＦＶ−コイル１）に対するＩｇＧ抗体の存在について、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）の多重ＥＬＩＳＡシステムをＭＳＤマニュアルに従って使用して分析した。図１０において、６匹すべての動物が、弾頭（ＳｃＦＶ−コイル１）に対してならびにＧ１７ＲＭおよびＧ１７Ｈに対して強い時間依存性ＩｇＧ応答を示し、対照ペプチドに対しては応答が見られなかったことが分かる。３回の免疫化後のＧ１７ＲＭに対する応答は、ＳｃＦＶ−コイル１に対する応答の７５％であった。Ｇ１７ＲＭがわずか約１．２ｋＤａの１００％自己のタンパク質であるのに対し、ＳｃＦＶ−コイル１は３０ｋＤａ超の１００％同種異系のタンパク質であるため、これは注目に値する。抗Ｇ１７ＲＭ抗体は、Ｇ１７Ｈと強く交差反応した。Ｇ１７ＲＭ＿２−コイルペプチドを弾頭なしで使用した場合、Ｇ１７ＲＭに対する応答はなかった。４２乃至５６日目におけるＩｇＧ力価の減少は、Ｇ１７ＲＭについて、ＳｃＦＶについてのものよりも強く、ＩｇＧ抗体の一部が内因性Ｇ１７によって中和されたことを指示していた。重要なことには、内因性Ｇ１７の存在は、Ｇ１７ＲＭに対する応答をブーストしなかった。
【０３３９】
図１０中のデータは、ワクチンが、可逆的である真正な（bonavide）自己抗体応答を誘導できたことを示している。これは、抗がんワクチンの必須条件であり、何故なら、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、過剰発現された、たとえば腫瘍細胞において過剰発現された自家抗原であるだけでなく、正常な健康細胞においてはより低い発現レベルでも存在するからである。それ故、ワクチン、たとえばＴＹＧ１００＿２ＲＭまたはＴＹＧ１００＿２Ｈは、ガストリン依存性腫瘍、たとえば膵臓がんの治療に使用され得る。がんが完全に治癒したら、治療を中止してもよく、誘導された抗Ｇ１７抗体は血液循環から取り除かれる。定常状態を（治療の間）維持するために、ワクチンの繰り返し注射によって自己免疫応答をブーストする必要がある。不可逆的な自己免疫疾患は、この種類のワクチンでは誘導されない。
【０３４０】
例１８：肥満の治療のためのＴＹＧ１００＿２ＲＭ：
例１４からの動物を食欲についてモニターし、０日目、１４日目、２８日目、４２日目および５６日目に体重を測定した。ＴＹＧ１００＿２ＲＭを２回注射後、６匹の動物のうち４匹が日常の軽食（ビスケット）への興味を失ったのに対し、基本的な食物摂取量は正常なままであった。これには著しい重量損失が付随していた（図１１）が、不要な副作用は記録されなかった。これまでのところ、そのような観察は、弾頭およびコイルドコイル相互作用、たとえばガストリン免疫原以外の標的免疫原に基づくワクチンを用いる他のワクチン接種では決して為されていない（データは示されていない）
これらのデータは、ＴＹＧ１００＿２ＲＭが、健康な生活に必要とされる基本的な食物摂取量に影響を与えることなく、軽食（食間）への切望を低減させることを指示している。動物は通常活動的かつ上機嫌であった。したがって、ＴＹＧ１００＿２ＲＭは、肥満の治療に使用されていてもよい。
以下に、本願の出願当初の請求項を実施の態様として付記する。
［１］  −  ＴＬＲ９リガンドおよび第一のペプチド性アルファらせんと連結している少なくとも１つの抗ＣＤ３２部分を含む指定のアジュバントと、
−  少なくとも１つのエピトープ、および前記第一のアルファらせんに巻き付けられた第二のペプチド性アルファらせんを持つ免疫原と
を含む、免疫調節ワクチン。
［２］  前記第一および第二のアルファらせんのそれぞれが、１０-6Ｍ未満のＫｄで互いに特異的に結合している、アミノ酸モチーフの３〜５アミノ酸繰り返しを含む、［１］に記載のワクチン。
［３］  前記抗ＣＤ３２部分が、抗ＣＤ３２抗体、抗体フラグメントおよびペプチドからなる群から選択される、［１］または［２］に記載のワクチン。
［４］  前記ＴＬＲ９リガンドが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドクラスＡ、ＢおよびＣ、または前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの何れかを模倣している免疫刺激ペプチドからなる群から選択されるＴＬＲ９アゴニストである、［１］〜［３］の何れかに記載のワクチン。
［５］  前記免疫原が、
−  がん疾患の免疫療法において使用するための腫瘍関連抗原、または
−  感染性疾患の免疫療法において使用するための病原体、または
−  アレルギー疾患の免疫療法において使用するためのアレルゲン
の何れかに由来する、［４］に記載のワクチン。
［６］  前記抗ＣＤ３２部分がＣＤ３２ａを標的としている、［４］に記載のワクチン。
［７］  前記免疫原がアレルギー疾患の免疫療法において使用するためのアレルゲンに由来し、前記抗ＣＤ３２部分がＣＤ３２ａおよびＣＤ３２ｂを標的としている、［４］に記載のワクチン。
［８］  前記ＴＬＲ９リガンドが、阻害ＯＤＮからなる群から選択されるＴＬＲ９アンタゴニストである、［１］〜［３］の何れかに記載のワクチン。
［９］  前記免疫原が、
−  アレルギー疾患の免疫療法において使用するためのアレルゲン、または
−  自己免疫疾患の免疫療法において使用するためのヒト自家抗原
の何れかに由来する、［８］に記載のワクチン。
［１０］  前記抗ＣＤ３２部分が、ＣＤ３２ｂ、またはＣＤ３２ａおよびＣＤ３２ｂを標的としている、［９］に記載のワクチン。
［１１］  前記抗ＣＤ３２部分がＣＤ３２ａおよびＣＤ３２ｂを標的としている、アレルギー疾患の免疫療法において使用するための、［９］または［１０］に記載のワクチン。
［１２］  −  配列番号７０の配列を含むまたはそれからなる前記第一のアルファらせんと連結している抗ＣＤ３２部分から構成され、配列番号７０の配列が、好ましくは１：１〜１８の比（１分子当たりの分子）で、配列番号６９のＴＬＲ９リガンドとカップリングしている、指定のアジュバントと、
−  前記第二のアルファらせん、好ましくは配列番号７５、または機能的に活性なその変異体、好ましくは変異体と連結しており、ここでＣｙｓ３７９は除去されている、配列番号３０の免疫原を含むまたはそれからなる免疫原
とを含み、前記指定のアジュバントおよび前記免疫原が、前記第一および第二のアルファらせんのコイルドコイル構造によって互いに結合している、
［９］〜［１１］の何れかに記載のワクチン。
［１３］  下記の成分
−  ＴＬＲ９リガンドおよび第一のペプチド性アルファらせんと連結している少なくとも１つの抗ＣＤ３２部分を含む指定のアジュバントと、
−  少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、および前記第一のアルファらせんと整合している第二のペプチド性アルファらせんを持つ免疫原と
を含む、［１］〜［１２］の何れかに記載のワクチンを調製するためのキット。
［１４］  医薬製剤中に、ＴＬＲ９リガンドおよびペプチド性アルファらせんと連結している少なくとも１つの抗ＣＤ３２部分を含む、感作ワクチン。
［１５］  前記アルファらせんがコイルドコイル二重らせんである、［１４］に記載のワクチン。
［１６］  前記ＴＬＲ９リガンドが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドクラスＡ、ＢおよびＣ、または前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの何れかを模倣している免疫刺激ペプチドからなる群から選択されるＴＬＲ９アゴニストである、［１４］または［１５］に記載のワクチン。
［１７］  患者を、前記患者の免疫療法前に、［１］〜［１０］の何れかに記載の免疫調節ワクチンで予め免疫化するのに使用するための、［１４］〜［１６］の何れかに記載のワクチン。
［１８］  −  ＴＬＲ９リガンドと連結している少なくとも１つの抗ＣＤ３２部分を含む指定のアジュバントと、
−  好ましくは連結または親和性結合によって、前記指定のアジュバントと結合している免疫原
とを含む免疫原性組成物を含み、
好ましくはワクチン接種時に誘導される特異的な最大ＩｇＧ力価での、一過性である免疫原に向けられるＩｇＧ免疫応答、続いて、少なくとも３０％、好ましくは、少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または最大１００％の力価低減を、ワクチン接種６か月以内に引き出すために、対象を治療するのに使用するための、ワクチン。
［１９］  前記力価低減が、一連のワクチン接種における最終ワクチン接種時のものである、［１８］に記載の使用のためのワクチン。
［２０］  前記免疫原が、自己抗原の抗原またはエピトープであるまたはそれを含む、［１８］または［１９］に記載の使用のためのワクチン。
［２１］  前記自己抗原が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、好ましくは腫瘍細胞表面受容体または腫瘍細胞によって産生される可溶性抗原、たとえばＨｅｒ２／ｎｅｕ、インターフェロンアルファ（ＩＮＦα）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦ−Ｒ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＭＵＣ−１またはルイスＹ、プレホルモンおよびホルモン、たとえばガストリン、セクレチンもしくはインスリンを包含する消化ホルモン、甲状腺ホルモンまたは性ホルモンの何れかからなる群から選択される、［２０］に記載の使用のためのワクチン。
［２２］  前記対象がヒトであり、前記自己抗原がヒト起源である、［２０］または［２１］に記載の使用のためのワクチン。
［２３］  前記ＩｇＧ免疫応答が可逆的なものである、［１８］〜［２２］の何れかに記載の使用のためのワクチン。
【０３４１】
参考文献一覧
【表Ｄ】
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【表Ｅ】
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【表Ｆ】
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【表Ｇ】
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【表Ｈ】
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【表Ｉ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【配列表】
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