(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式(I):
【化１】
0006599371.tif 000025
(式中、
・R1はアリール基であり、1つ又は複数の(C1〜C2)アルキル基、1つ又は複数のハロゲン、1つ又は複数の-OH、-CN又はCF3基、及びそれらの組合せによって置換されていてもよく、
・R2は(C1〜C6)アルキル基又はヒドロキシ(C1〜C6)アルキル基又は(C1〜C4)アルコキシ(C1〜C6)アルキル基である)
の化合物、又は薬学的に許容されるその水和物若しくは溶媒和物。
【請求項２】
R1はフェニルであり、R2は(C1〜C6)アルキル基、ヒドロキシ(C1〜C6)アルキル基、又は(C1〜C4)アルコキシ(C1〜C6)アルキル基であることを特徴とする、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
以下の式(Ia)、(Ib)及び(Ic):
【化２】
0006599371.tif 000026
の化合物、並びに薬学的に許容されるその水和物及び溶媒和物から選択される、請求項1又は2に記載の化合物。
【請求項４】
請求項1から3のいずれか一項に記載の化合物を含む薬剤。
【請求項５】
プロドラッグとして使用するための、請求項4に記載の薬剤。
【請求項６】
前記プロドラッグが二量体化によって活性化されることを特徴とする、請求項5に記載の薬剤。
【請求項７】
前記プロドラッグが酸化的カップリングによる二量体化によって活性化されることを特徴とする、請求項6に記載の薬剤。
【請求項８】
前記二量体化がスーパーオキシドアニオンの存在下で起こることを特徴とする、請求項6又は7に記載の薬剤。
【請求項９】
前記二量体化によって、一般式 (IV):
【化３】
0006599371.tif 000027
(式中、R1及びR2は請求項1又は2のいずれか一項に定義の通りである)
の化合物がもたらされることを特徴とする、請求項6から8のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１０】
前記二量体化が、一般式(IIa):
【化４】
0006599371.tif 000028
の化合物をもたらすことを特徴とする、請求項9に記載の薬剤。
【請求項１１】
以下の式 (IV):
【化５】
0006599371.tif 000029
(式中、
・R1はアリール基であり、1つ又は複数の(C1〜C2)アルキル基、1つ又は複数のハロゲン、1つ又は複数の-OH、-CN又はCF3基、及びそれらの組合せによって置換されていてもよく、
・R2は(C1〜C6)アルキル基、ヒドロキシ(C1〜C6)アルキル基、又は(C1〜C4)アルコキシ(C1〜C6)アルキル基である)
の化合物、又は薬学的に許容されるその水和物又は溶媒和物。
【請求項１２】
請求項11に記載の化合物を含む薬剤。
【請求項１３】
がん及び過剰な血管新生に関連する疾患の治療に使用するための、請求項4から10及び12のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１４】
プロドラッグとしての式(I)又は(II)の請求項1から3及び11のいずれか一項に記載の化合物の少なくとも1つと、及び薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１５】
がん及び過剰な血管新生に関連する疾患の治療に使用するための、請求項14に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項1から3及び11のいずれか一項に記載の化合物を調製する方法であって、以下の式(V):
【化６】
0006599371.tif 000030
(式中、Xはハロゲンである)
の化合物を、以下の式(VI)の化合物及び以下の式(VII)の化合物:
【化７】
0006599371.tif 000031
(式中、R1及びR2は請求項1に定義の通りである)
と縮合反応させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規化合物3-アリール-4-カテコール-N-1H-ピロール及びその誘導体、それらを調製する方法、それらを含む医薬組成物、並びに特にがん及び過剰な血管新生に関連する疾患を治療するための薬剤としての該医薬組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍の発現は、少なくとも3つの主な生物学的現象を集約している。
1.アポトーシスの阻害並びに生存及び増殖経路の活性化に関連する腫瘍細胞の制御されない増殖
2.異常な腫瘍周囲の血管新生
3.癌細胞の表現型の変化、しばしば化学療法の抵抗性の機序の起源となる、血管から遠位にある腫瘍の中心における低酸素領域の存在
【０００３】
第一の現象を標的とする現在の抗癌治療は、抗アポトーシス因子の阻害又は細胞分化若しくは生存プロセスの阻害のいずれかによって、癌細胞の制御されない増殖をブロックする。複数の治療アプローチの一部であることが多いこれらの治療は癌治療に実利益をもたらしているが、腫瘍の増殖に寄与する機序の一部だけを標的としているため、全ての癌細胞を根絶するのに十分ではない。正常な細胞と比較した標的特異性の問題、及び抵抗性の機序が、この欠点に加えられる。
【０００４】
最近の研究は、腫瘍周囲の血管新生プロセスの阻害を目的とする新しい治療法を確立している。確かに、血管新生は、酸素正常状態及び低酸素状態の両方における腫瘍増殖に欠くことのできないものである。血管新生は、腫瘍細胞による血管内皮増殖因子(VEGF)の分泌によって促進され、転写因子HIFαの合成に起因して低酸素状態によって増幅される。使用されている抗血管新生薬の大部分は、VEGFに対して向けられる抗体、又はVEGF受容体に対して向けられる化合物のいずれかに対応する。残念ながら抗血管新生治療の臨床結果は、とても限られており、抵抗性の機序並びに浸潤及び転移のリスクの増加に関連することが多い。確かに腫瘍周囲の血管は、構造的、機能的に異常であり、血管異常を悪化させる逆の適応応答、及び低酸素が増加したこれらの状態に腫瘍細胞を適応させることにつながる(Nature Reviews-Cancer; 10、417-427頁、2011年)。正常な血管新生と腫瘍の血管新生との間のこれらの構造的な差に基づいた、特定の血管破壊薬(VDA)の抗腫瘍効果を追跡する臨床研究が継続されている。しかしながら、潜在的な心血管性の影響があるため、ある種の慎重を期さなければならない。したがって、腫瘍周囲の血管新生だけでなく加齢黄斑変性(ARMD)等の過剰な異常血管新生に関連する疾患を治療するための新しい抗血管新生又は抗血管性化合物を開発することが必要であると思われる。
【０００５】
腫瘍増殖の第三の要素は、前述の腫瘍内の低酸素状態をもたらす腫瘍の中心における酸素の分圧(pO2)の減少に関連する。この低酸素状態は、生存につながるシグナル伝達経路の活性化及び腫瘍血管新生の活性化をもたらす代謝及び遺伝的な細胞修飾を特徴とする。これらの修飾は、現在の化学療法に対する抵抗性の現象の部分的な原因になる。低酸素状態の癌細胞を排除するために現在開発されている薬剤は、2つのグループに分けられ、第一は1又は2電子酵素システムによる生体内還元性のプロドラッグであり、第二は、低酸素状態の癌細胞の生存を可能にする、低酸素状態に対する細胞応答で過剰発現した薬物標的因子(HIFα、UPR、チオレドキシン)である(Nature Reviews-Cancer、11、393-410頁、2011年)。第一のカテゴリーの生体内還元性のプロドラッグは、主にDNAに作用するキノン(α1-4)(アパジコン、RH1)又はニトロ化合物(TH-302、PR-104)である。第I相及び第II相臨床試験の最中に示される第一のカテゴリーの化合物の主要な副作用は、それらの毒性及びそれらの限定された血管外の侵入に起因し、この副作用は、血管からの低酸素細胞の距離が増加するにつれてより一層目立つ。チオレドキシン経路(PX12、モテクサフィンガドリニウム)及び転写因子HIFα経路(PX-478、PX12)に作用するその他の薬剤について、臨床評価が行われている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nature Reviews-Cancer; 10、 417-427頁、2011年
【非特許文献２】Nature Reviews-Cancer、11、393-410頁、2011年
【非特許文献３】Nature Reviews-Drug Discovery、8、579-591頁、2009年
【非特許文献４】Nature Reviews-Cancer、12、627-637頁、2012年
【非特許文献５】Greene T.W.ら、Protecting Groups in Organic Synthesis、第3版、1999年、John Wiley & Sons
【非特許文献６】Rockenbauer, A.; Korecz, L. Automatic computer simulations of ESR spectra.Appl.Magn.Reson.10:29-43頁; 1996年
【非特許文献７】Liptakら(J. Am. Chem.Soc.2002、124、6421-6427頁)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これまで、癌化学療法に使用された薬剤は全て、このように一度に1つの生物学的現象のみを標的とし、治療特異性は弱いままである。そのため、腫瘍発現の3つの要素に同時に作用するより特異的な新しい抗腫瘍化合物を見つけることが重要であると思われる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の発明者らはこの必要性に応える新規のクラスの化合物を発見した。
【０００９】
その目的のために、本発明者らは、癌細胞及び異常な腫瘍周囲の血管新生に関連する内皮細胞によって修飾された共通の分子の性質を見つけるために、酸素正常状態及び低酸素状態の癌細胞の生物学的、生化学的及び遺伝的特徴に関するデータを分析した。
【００１０】
本発明者らは、このようにして、酸素正常状態及び低酸素状態の癌細胞が、強力なNADPHオキシダーゼ(NOX)の活性によって引き起こされるスーパーオキシドアニオンの著しい産生によって特に特徴付けられるということが、これらのデータの全ての分析によって示されることを発見した(Nature Reviews-Drug Discovery、8、579-591頁、2009年; Nature Reviews-Cancer、12、627-637頁、2012年)。このスーパーオキシドアニオンの過剰産生は、一般的な「レドックス」調節不全に関連し、H2O2を分解する低い酵素活性(カタラーゼ、ペルオキシレドキシン、グルタチオンペルオキシダーゼ)、並びに特にペルオキシレドキシンのレドックス状態及びHIFαの活性を制御するチオレドキシン(TRX)-チオレドキシン還元酵素(TRX-R)システムの強力な活性化に関連する。癌細胞は、そのため、自らの生存のために「活性酸素種」(O2Ｏ−/H2O2)にかなり依存している。この酸化ストレスは、癌細胞の「アキレス腱」とされている。スーパーオキシドアニオンの過剰産生は、血管新生の最中の高いNADPHオキシダーゼ(NOX)の活動によって引き起こされる増殖期の活性な内皮細胞にも認められる。内皮細胞の主要なアイソフォームは、増殖期の最中に、c-Src及びAkt経路を経由するVEGFによって制御されるNOX2である。更に、本発明者らは、副作用のない抗癌プロドラッグを探すなかで、当該共通の分子属性がプロドラッグの活性化に介入して、3つの腫瘍成分及び過剰な血管新生に関連する疾患に作用することができる活性薬を形成することもできることを発見した。
【００１１】
スーパーオキシドアニオンは、そのため、酸素正常条件及び低酸素条件状態下の癌細胞並びに内皮細胞において、共通の性質であると思われる。更に、スーパーオキシドアニオンはプロドラッグの酸化活性化因子の役割を担うことができる。
【００１２】
本発明者らは、そこでスーパーオキシドアニオン(O2Ｏ−)によって特異的に活性化することができる新規化合物(プロドラッグ)を見つけるために、腫瘍及び内皮細胞によるO2Ｏ−の過剰産生を基準として選択した。ICSN化合物ライブラリーのスクリーニングによって、抗癌及び抗血管活性が以下のように発現される化合物を選択することができる。
-  生理学的血管新生に影響しない腫瘍血管新生の阻害、血管の「de novo」増殖の阻害、増殖期にのみ内皮細胞に対する細胞毒性
-  O2Ｏ−存在下のみの、酸素正常状態の癌細胞に対する細胞毒性
-  O2Ｏ−存在下のみの、低酸素状態の癌細胞に対する細胞毒性
【００１３】
スーパーオキシドアニオンのプロドラッグとの反応後に得られる活性産物の構造を決定するために、新規化合物をスーパーオキシドアニオンにin vitroで曝露した。新規化合物は、キノン部分を含む二量体化合物が酸化的カップリングによって形成され、その抗癌活性は、正常酸素状態及び低酸素状態の癌細胞に対する細胞毒性として発現される。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、以下の一般式(I)の新規な3-アリール-4-カテコール-ピロール-N-プロパノール化合物及びその誘導体、それらの調製、スーパーオキシドアニオンに関するそれらの特定の反応性、正常酸素状態及び低酸素状態の癌細胞、腫瘍及び生理学的血管新生に対するそれらの作用、血管内皮細胞に対するそれらの毒性、血管の形成に対するそれらの作用、並びに酸化的カップリングによるそれらの二量体化及び腫瘍細胞に対するこれらの二量体の作用に関する。結果として、これらはがん及び過剰な血管新生に関連する疾患を治療するために使用することができる。
【００１５】
このように、本発明は、以下の一般式(I):
【００１６】
【化１】
0006599371.tif 000002
【００１７】
(式中、
・R1は、アリール基、特にフェニルであり、1つ又は複数の(C1〜C2)アルキル基、1つ又は複数のハロゲン、1つ又は複数の-OH、-CN又はCF3基、及びそれらの組合せによって置換されていてもよく、
・R2は(C1〜C6)アルキル基又はヒドロキシ(C1〜C6)アルキル基又は(C1〜C4)アルコキシ(C1〜C6)アルキル基である)
の新規化合物3-アリール-4-カテコール-ピロール-N-プロパノール及びその誘導体、又は薬学的に許容されるその水和物若しくは溶媒和物を提供する。
【００１８】
本発明では、「薬学的に許容される」とは、医薬組成物を調製するのに有用であり、一般的に安全であり、非毒性であり、生物学的にもその他においても望ましく、獣医用にもヒトへの医薬的使用にも許容されることを意味する。
【００１９】
本発明では、化合物の「薬学的に許容される溶媒和物」という用語は、本発明に記載の化合物の医薬的使用に許容される溶媒和物を指すことを意図し、本発明に記載の化合物を、反応溶媒で調製する方法の最後の工程の最中に形成される溶媒和物等の従来の溶媒和物を含む。例えば、水で形成された溶媒和物(一般に水和物と呼ばれる)又はエタノールで形成された溶媒和物を挙げることができる。
【００２０】
「アリール」とは、本発明の意味では、好ましくは6〜10個の炭素原子を有し、1つ又は複数、特に1つ又は2つの縮合環を含む芳香族炭化水素基、例えばフェニル又はナフチル基等を意味する。有利には、アリールはフェニルである。
【００２１】
「(C1〜C6)アルキル」基とは、本発明の意味では、1〜6個、特に1〜4個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖飽和炭化水素を意味する。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基又はヘキシル基を挙げることができる。
【００２２】
「(C1〜C2)アルキル」基とは、本発明の意味では、1〜2個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖飽和炭化水素を意味する。例えば、メチル基及びエチル基を挙げることができる。
【００２３】
「(C1〜C4)アルコキシ」基とは、本発明の意味では、酸素原子を介して分子の残部と結合する上述の(C1〜C4)アルキル基を意味する。例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基又はtert-ブトキシ基を挙げることができる。
【００２４】
「ヒドロキシ(C1〜C6)アルキル」基とは、本発明の意味では、上述の(C1〜C6)アルキル基を介して分子と結合するヒドロキシ基(-OH)を意味する。例えば、3-ヒドロキシプロピル基を挙げることができる。
【００２５】
「(C1〜C4)アルコキシ(C1〜C6)アルキル」基とは、本発明の意味では、上述の(C1〜C6)アルキル基を介して分子と結合する上述の(C1〜C4)アルコキシ基を意味する。例えば、3-エトキシプロピル基を挙げることができる。
【００２６】
「ハロゲン原子」とは、本発明の意味では、フッ素、塩素、臭素及びヨード原子を意味する。
【００２７】
有利な実施形態では、
・R1は、1つ又は複数の(C1〜C2)アルキル基、1つ又は複数のハロゲン、1つ又は複数の-OH、-CN又はCF3基及びそれらの組合せによって置換されてもよいフェニルであり、
・R2は(C1〜C6)アルキル基又はヒドロキシ(C1〜C6)アルキル基又は(C1〜C6)アルコキシ(C1〜C6)アルキル基であり、
有利には、R1はフェニルであり、R2は(C1〜C6)アルキル基又はヒドロキシ(C1〜C6)アルキル基又は(C1〜C4)アルコキシ(C1〜C6)アルキル基である。
【００２８】
より有利には、R1はフェニルであり、R2は(C1〜C4)アルキル基又はヒドロキシ(C1〜C4)アルキル基又は(C1〜C2)アルコキシ(C1〜C4)アルキル基である。
【００２９】
特定の実施形態では、R1はフェニルであり、R2はヒドロキシ(C1〜C6)アルキル基である。
【００３０】
特に、本発明の化合物は、以下の式(Ia)、(Ib)及び(Ic)の化合物、並びにDMSOで得られる溶媒和物等の薬学的に許容されるその溶媒和物及び水和物から選択することができる。
【００３１】
【化２】
0006599371.tif 000003
【００３２】
本発明は、特にがんを治療することを意図した薬剤として使用される、以下の一般式(I):
【００３３】
【化３】
0006599371.tif 000004
【００３４】
(式中、
・R1は、アリール基、特にフェニルであり、1つ又は複数の(C1〜C2)アルキル基、1つ又は複数のハロゲン、1つ又は複数の-OH、-CN又はCF3基及びそれらの組合せによって置換されていてもよく、
・R2は(C1〜C6)アルキル基又はヒドロキシ(C1〜C6)アルキル基又は(C1〜C4)アルコキシ(C1〜C6)アルキル基である)
の化合物、又は薬学的に許容されるその水和物若しくは溶媒和物も提供する。
【００３５】
薬剤として使用される、本発明に記載の一般式(I)の化合物は、以下の式(Ia)、(Ib)及び(Ic):
【００３６】
【化４】
0006599371.tif 000005
【００３７】
の化合物から選択することができる。
【００３８】
本発明の態様に従って、本発明に記載の一般式(I)の化合物は、特に酸化的カップリングによって二量体化することができる。特に、本発明に記載の化合物の二量体化はスーパーオキシドアニオンの存在下で誘導される。
【００３９】
そのため、本発明はまた、スーパーオキシドアニオンとの相互作用によってそれを二量体化することによって活性化される非毒性のプロドラッグとして、本発明に記載の一般式(I)の化合物を提供する。
【００４０】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、特にがん及び過剰な血管新生に関連する疾患を治療するために、二量体化、特に酸化的カップリングによって活性化されるプロドラッグとして使用される本発明に記載の化合物に関する。
【００４１】
二量体化は、スーパーオキシドアニオンの存在下で行われることが好ましく、一般式(II)、(III)又は(IV):
【００４２】
【化５】
0006599371.tif 000006
【００４３】
(式中、R1及びR2は上述の通りである)
の化合物の少なくとも1つ、又は薬学的に許容されるその水和物若しくは溶媒和物をもたらすことが好ましい。
【００４４】
有利には、二量体化によって一般式(II)がもたらされる。より有利には、二量体化によって以下の式(IIa):
【００４５】
【化６】
0006599371.tif 000007
【００４６】
の化合物がもたらされる。
【００４７】
そのため、本発明は、また、上述の一般式(II)(式中、R1及びR2は上述の通りである)の化合物、又は薬学的に許容されるその水和物若しくは溶媒和物を提供する。
【００４８】
有利には、本発明に記載の一般式(II)の二量体は、式(IIa)の化合物である。
【００４９】
本発明はまた、薬剤として使用される、一般式(II)(式中R1及びR2は上述の通りである)の化合物、特に、式(IIa)の化合物、又は薬学的に許容されるその水和物若しくは溶媒和物に関する。
【００５０】
本発明はまた、特にがんを治療することを意図した薬剤を製造するための、本発明に記載の式(I)又は(II)の化合物の使用に関する。
【００５１】
本発明はまた、がんを治療する方法に関し、それを必要とする患者に、有効量の本発明に記載の式(I)又は(II)の少なくとも1つの化合物を投与することを含む。
【００５２】
がんは、メラノーマ、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、肝臓癌、乳癌、子宮癌、胃癌、膵臓癌、膀胱癌、卵巣癌、頭頸部癌、脳癌、白血病、リンパ腫(バーキットリンパ腫を含む)及び骨髄腫等の特に固形又は非固形腫瘍であってもよい。
【００５３】
本発明はまた、以下の一般式(I)又は(II):
【００５４】
【化７】
0006599371.tif 000008
【００５５】
(式中、
・R1は、アリール基、特にフェニルであり、1つ又は複数の(C1〜C2)アルキル基、1つ又は複数のハロゲン、1つ又は複数の-OH、-CN又はCF3基及びそれらの組合せによって置換されていてもよく、
・R2は(C1〜C6)アルキル基又はヒドロキシ(C1〜C6)アルキル基又は(C1〜C4)アルコキシ(C1〜C6)アルキル基、特にヒドロキシ(C1〜C6)アルキル基である)
の少なくとも1つの化合物、又は薬学的に許容されるその水和物若しくは溶媒和物、
及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。
【００５６】
本発明に記載の化合物を経口、舌下、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、経皮的、局所的、又は直腸性に投与してもよい。
【００５７】
経口、舌下、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、経皮的、局所的又は直腸性投与のための本発明の医薬組成物では、有効成分は、動物又はヒトに、通常の薬学的担体と混合した単位剤形で投与してもよい。適切な単位剤形として、錠剤、カプセル、粉末、顆粒剤及び経口溶液又は懸濁液等の経口剤形、舌下及びバッカル剤形、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内又は眼内剤形並びに直腸性剤形が挙げられる。
【００５８】
本発明に記載の化合物は、抗体-薬物複合体(ADC)を形成するために、腫瘍マーカー(例えば、理想的には腫瘍細胞中又はその上にのみ見つけられるはずのタンパク質)を特異的に標的とする抗体と結合させることができる。同様に、本発明に記載の化合物は、癌細胞を標的とするための任意のその他のベクターと結合させることができる。当該ベクターの中で、ウイルスベクター若しくはレトロウイルス等の生物由来のベクター、リポソーム若しくはナノ粒子、とりわけ特定の二酸化チタンナノ粒子等の合成ベクター、又は電気穿孔法等の物理的方法を言及することができる。
【００５９】
本発明の化合物は、所望の効果、治療期間及び使用する投与経路に依存する投与量で使用することができる。当業者はまた、対象及び治療対象の疾患に最も適した投与経路及び投与量を選択する。一般的に、医師は、年齢、体重、治療対象に特定のその他の要因の関数として投与計画を決定する。
【００６０】
薬学的に許容される賦形剤は当業者に周知であり、医薬組成物の投与様式に従って選択される。例えば、薬学的に許容される賦形剤は、希釈剤、結合剤、崩壊剤、着色剤、潤滑剤、可溶化剤、吸収促進剤、膜形成剤、ゲル化剤及びそれらの混合物から成る群から選択することができる。
【００６１】
上述の医薬組成物はがんを治療するのに有用でありうる。
【００６２】
本発明はまた、がんを治療することを意図した薬剤を製造するための上述の医薬組成物の使用に関する。
【００６３】
本発明はまた、がんを治療する方法に関し、それを必要とする患者に、有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む。
【００６４】
本発明に記載の医薬組成物に使用される本発明に記載の一般式(I)の化合物は、以下の式(Ia)、(Ib)及び(Ic):
【００６５】
【化８】
0006599371.tif 000009
【００６６】
の化合物から選択することができる。
【００６７】
本発明はまた、以下の一般式(I):
【００６８】
【化９】
0006599371.tif 000010
【００６９】
(式中、
・R1はアリール基、特にフェニルであり、1つ又は複数の(C1〜C2)アルキル基、1つ又は複数のハロゲン、1つ又は複数の-OH、-CN又はCF3基、及びそれらの組合せによって置換されていてもよく、
・R2は(C1〜C6)アルキル基又はヒドロキシ(C1〜C6)アルキル基又は(C1〜C4)アルコキシ(C1〜C6)アルキル基である)
の化合物、又は薬学的に許容されるその水和物若しくは溶媒和物を調製する方法を提供し、主要な工程として、以下の式(V):
【００７０】
【化１０】
0006599371.tif 000011
【００７１】
(式中、Xはハロゲン、特に塩素原子である)
の化合物を、以下の式(VI): 
【００７２】
【化１１】
0006599371.tif 000012
【００７３】
の化合物、及び以下の式(VII):
【００７４】
【化１２】
0006599371.tif 000013
【００７５】
の化合物(式中、R1及びR2は上述の通りである)
と縮合反応させることを含む。
【００７６】
好ましい実施形態では、本発明に記載の化合物は、有利には、以下のダイアグラム1〜5に記載の反応条件下で調製される。
【００７７】
本発明に記載の化合物を調製する方法は、任意選択で当業者に周知の二次反応を避けるために追加の保護及び/又は脱保護反応を含んでいてもよい。これはGreene T.W.ら、Protecting Groups in Organic Synthesis、第3版、1999年、John Wiley & Sonsにとりわけ記載されている幅広い保護基の選択を有する。
【００７８】
本発明に記載の化合物は更に当業者に周知の方法によって精製することができる。例えば、結晶化、クロマトグラフィー又は抽出による精製方法を挙げることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１Ａ】捕獲試薬BMPOとの競合法及び電子常磁性共鳴(EPR)によるモニタリングによる、スーパーオキシドアニオンとの化合物(1)の反応性の試験。スーパーオキシドアニオンは、DMSO中に超酸化カリウム(KO2)を溶解させることによって、有機相で産生される。
【図１Ｂ】捕獲試薬BMPOとの競合法及び電子常磁性共鳴(EPR)によるモニタリングによる、スーパーオキシドアニオンとの化合物(1)の反応性の試験。スーパーオキシドアニオンは、キサンチンオキシダーゼ(XO)とキサンチン(X)との酵素反応によって、水性相で産生される。
【図２Ａ】化合物(1)と、DMSO中へのKO2の超音波処理による溶解によって産生されるスーパーオキシドアニオンとを反応させる、電子常磁性共鳴(EPR)による試験。添加された化合物(1)の濃度の関数としての、液体窒素の温度(77K)でのO2Ｏ−のEPRシグナルの減少のモニタリング。
【図２Ｂ】化合物(1)と、DMSO中へのKO2の超音波処理による溶解によって産生されるスーパーオキシドアニオンとを反応させる、電子常磁性共鳴(EPR)による試験。室温で観察したラジカル中間体のEPRスペクトル及び同ラジカル中間体のシミュレーション。
【図３Ａ】有機相(DMSO)中、化合物(1)をスーパーオキシドアニオン(KO2)と反応させた後のキノン中間体の形成。LC-TRAPのHPLC-MSによる分析。
【図３Ｂ】有機相(DMSO)中、化合物(1)をスーパーオキシドアニオン(KO2)と反応させた後のキノン中間体の形成。500MHzのNMR(13C)のHPLC-MSによる分析。
【図４Ａ１】キサンチンオキシダーゼ(HPLC-TRAPによる分析)によって産生されたスーパーオキシドアニオンの存在下での酸化的カップリングによる二量体化合物の形成。
【図４Ａ２】キサンチンオキシダーゼ(HPLC-TRAPによる分析)によって産生されたスーパーオキシドアニオンの存在下での酸化的カップリングによる二量体化合物の形成（続き）。
【図４Ｂ】pKa(8.89)に相当するpH(UHPLCによる分析)での酸化的カップリングによる二量体化合物の形成。
【図４Ｃ】pH9.4での酸化的カップリングによって得られた二量体化合物MH+ 631のUVスペクトル。
【図５Ａ】腫瘍血管新生(鶏胚漿尿膜上に移植されたヒト神経膠芽腫)に対する化合物(1)の阻害効果。
【図５Ｂ】酸素正常条件及び低酸素条件(2%のO2)下でのU87及びHCT-116細胞によるVEGF分泌に対する化合物(1)の用量依存的な効果の試験。
【図６Ａ】鶏胚漿尿膜モデルにおけるin ovo試験の生理学的血管新生に対する化合物(1)の効果の不在。
【図６Ｂ】マトリゲルで培養された内皮細胞から始まる血管の形成に対する化合物(1)の効果。
【図６Ｃ】増殖期又は静止期に48時間培養された内皮細胞(HUVEC)の生存に対する化合物(1)の効果。
【図７Ａ】酸素正常状態における化合物(1)の生物活性の評価。酸素正常状態における72時間の処理後のHCT 116、U87、MDA-MB-231、A549、MCF-7、K562及びK562 R癌細胞の増殖及び細胞毒性(IC50)に対する化合物(1)の効果。
【図７Ｂ】酸素正常状態における化合物(1)の生物活性の評価。酸素正常状態における72時間の処理後のHCT-116細胞の増殖に対する化合物(2)、(3)、(4)及び(5)の効果。
【図８Ａ】酸素正常状態における48時間の処理後のHCT-116癌細胞の増殖(IC50)に対する化合物(1)及び二量体化合物MH+=631の効果。
【図８Ｂ】低酸素状態における48時間の処理後のHCT-116癌細胞の増殖(IC50)に対する化合物(1)及び二量体化合物MH+=631の効果。
【図９】酸素正常状態におけるHCT-116、U87及びHL60癌細胞で評価されたカスパーゼ3及び7の活性に対する化合物(1)の効果。
【図１０】酸素正常状態における化合物(1)によるHCT-116細胞の細胞性スーパーオキシドアニオンのシグナルの抑制。プローブのジヒドロエチジウム(DHE)の存在下のHPLC蛍光定量法による分析。実線:対照、破線:化合物(1)で処理。
【図１１Ａ】正常酸素状態及び低酸素状態における細胞毒性効果についての、細胞外/膜スーパーオキシドアニオンへの化合物(1)の依存性。50U/mlのSODの効果。
【図１１Ｂ】正常酸素状態、クロマチン縮合におけるアポトーシス促進性効果についての、細胞外/膜スーパーオキシドアニオンへの化合物(1)の依存性。50U/mlのSODの効果。
【図１１Ｃ】カスパーゼ3-7活性についての、細胞外/膜スーパーオキシドアニオンへの化合物(1)の依存性。50U/mlのSODの効果。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
本発明は以下の非限定的な実施例によってより理解される。
【実施例】
【００８１】
使用する略語:
AcOEt  酢酸エチル
BMPO  5-tert-ブトキシカルボニル-5-メチル-1-ピロリン-N-酸化物
IC50  半数阻害濃度
DHE  ジヒドロエチジウム
DMSO  ジメチルスルホキシド
DPBS  ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水
HClO4  過塩素酸
HPLC  高速液体クロマトグラフィー
Na2SO4  硫酸ナトリウム
NaCl  塩化ナトリウム
NaHCO3  炭酸水素ナトリウム
NaI  ヨウ化ナトリウム
PBS  リン酸緩衝生理食塩水
NMR  核磁気共鳴
EPR  電子常磁性共鳴
SOD  スーパーオキシドジスムターゼ
RT  室温
THF  テトラヒドロフラン
【００８２】
(実施例1)
本発明の化合物4-(1-(3-ヒドロキシプロピル)-4-フェニル-1H-ピロール-3-イル)ベンゼン-1,2-ジオール)(1)の合成
【００８３】
【化１３】
0006599371.tif 000014
【００８４】
化合物4-(1-(3-ヒドロキシプロピル)-4-フェニル-1H-ピロール-3-イル)ベンゼン-1,2-ジオール)(1)を、ダイアグラム1に従って、2-クロロ-3',4'-ジヒドロキシアセトフェノンを3-アミノプロパン-1-オール及びフェニルアセトアルデヒドと縮合させることによって調製した。
【００８５】
【化１４】
0006599371.tif 000015
【００８６】
THF(20ml)中の2-クロロ-3',4'-ジヒドロキシアセトフェノン(785mg、4.2mmol)及びNaI(3.15g、21mmol)の混合物を室温で25分間攪拌する。3-アミノプロパン-1-オール(320μL、4.2mmol)、次にNaHCO3(1.5g、18mmol)を添加し、混合物を室温で1時間攪拌する。メタノール(30ml)中のフェニルアセトアルデヒド(500μL、4.2mmol)の溶液を添加し、混合物を30分間攪拌する。トリエチルアミン(600μL、4.2mmol)を添加し、混合物を45℃で16時間攪拌する。生成物をエーテル/クロロホルム混合物(5:1)で抽出し、有機相をNaHCO3/NaClの溶液及びブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で蒸発させ、シリカゲルでクロマトグラフィーを実施して(ペンタンからTHFへの勾配で溶出)、非晶質の半固体の形態の428mg(33%)のピロール1を得る。1H NMR (CD3OD; 300MHz) δ (ppm) 7.15-6.92 (5H; m); 6.68 (1H; d; J=2.4Hz); 6.59 (1H; d; J=2.4Hz); 6.56-6.50 (2H; m); 6.44 (1H; dd; J=8.1; 2.1Hz); 3.89 (2H; t; J=6.9Hz); 3.48 (2H; t; J=6.9Hz); 1.89 (2H; 五重線; J=6.9Hz). 13C NMR (CD3OD; 75MHz) δ (ppm) 145.8; 144.4; 138.0; 129.9; 129.2; 129.0; 126.1; 124.5; 124.1; 121.2; 121.1; 121.0; 117.0; 116.1; 59.7; 47.0; 35.3. IR (未稀釈) νmax cm-1 3337; 2946; 1599; 1542; 1435; 1395; 1354; 1286; 1257; 1190; 1163; 1111; 1057; 770; 700. HRMS (ES) (m/z) [M+H]+ C19H20NO3の計算値310.1443; 実測値310.1457.
【００８７】
3-(3-(2,3-ジヒドロベンゾ[b][1,4]ジオキシン-6-イル)-4-フェニル-1H-ピロール-1-イル)プロパン-1-オール(2)
【００８８】
【化１５】
0006599371.tif 000016
【００８９】
化合物3-(3-(2,3-ジヒドロベンゾ[b][1,4]ジオキシン-6-イル)-4-フェニル-1H-ピロール-1-イル)プロパン-1-オール(2)を、ダイアグラム2に従って、6-クロロアセチル-1,4-ベンゾジオキサンを、3-アミノプロパン-1-オール及びフェニルアセトアルデヒドと縮合させることによって調製した。
【００９０】
【化１６】
0006599371.tif 000017
【００９１】
THF(23ml)中の6-クロロアセチル-1,4-ベンゾジオキサン(1.0g、4.56mmol)及びNaI(3.453g、22.8mmol)の混合物を室温で25分間攪拌する。3-アミノプロパン-1-オール(350μL、4.56mmol)、次にNaHCO3(1.64g、19.6mmol)を添加し、混合物を室温で1時間攪拌する。メタノール(32ml)中のフェニルアセトアルデヒド(566μL、4.56mmol)の溶液を添加し、混合物を30分間攪拌する。トリエチルアミン(636μL、4.56mmol)を添加し、混合物を45℃で16時間攪拌する。生成物をエーテル/クロロホルム混合物(5:1)で抽出し、有機相をNaHCO3/NaCl及びブラインの溶液で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で蒸発させ、シリカゲルでクロマトグラフィーを実施して(ペンタン/AcOEt 6:4)、394mg(25%)のピロール2を得る。
【００９２】
3-(3,4-ジフェニル-1H-ピロール)プロパン-1-オール(3)
【００９３】
【化１７】
0006599371.tif 000018
【００９４】
化合物3-(3,4-ジフェニル-1H-ピロール)プロパン-1-オール(3)を、ダイアグラム3に従って、2-ブロモアセトフェノンを3-アミノプロパン-1-オール及びフェニルアセトアルデヒドと縮合させることによって調製した。
【００９５】
【化１８】
0006599371.tif 000019
【００９６】
室温で攪拌した15mlのTHF中の2-ブロモアセトフェノン(597.2mg、3mmol)の溶液に、3-アミノプロパン-1-オール(233.9μL、3mmol)、次に炭酸水素ナトリウム(1.086g、12.9mmol)を添加する。室温で1時間攪拌後、21.4mlのメタノール中の90%のフェニルアセトアルデヒド(390μL、3mmol)の溶液を滴下添加する。30分の攪拌後、トリエチルアミン(418.2μL、3mmol)を添加する。得られた溶液を45℃で20時間攪拌する。水を添加後、生成物をジクロロメタンで抽出する。飽和NaHCO3及びNaCl溶液の1:1の混合物で有機相を洗浄し、次にMgSO4で乾燥し、次にベーンポンプの真空下で蒸発させ、放置して、オレンジ色の油状物の形態の粗生成物(881mg)を製造する。シリカでのクロマトグラフィー(ヘプタン/AcOEt 1:1で濃縮した60A、カラムの高さ25cm、直径2cm、酢酸エチルの導入)の後、回収した画分によってNMRよる約25%の収率を推測できるようになる。純粋な画分をアセトニトリル中に吸い上げ、ペンタンで洗浄して、分析のために44mgの純粋な生成物(オレンジ色の油状物)を製造する。1H NMR (CDCl3; 500MHz) δ (ppm) 2.05 (m; 2H); 3.70 (t; J=6.0Hz; 2H); 4.05 (t; J=6.9Hz; 2H); 6.79 (sl; 2H); 7.18 (m; 2H); 7.27 (m; 4H). 7.31 (m; 4H). 13C NMR (CDCl3; 125MHz) δ (ppm) 33.9; 46.3; 59.6; 120.4; 123.3; 125.6; 128.2; 128.5; 136.1. IR (フィルム) νmax cm-1 3315; 3057; 2932; 1697; 1601. MS (ES+) (m/z) 278 (100%. [M+H]+). HRMS (ES) (m/z) (278.1542; [M+H]+); C19H20NOの計算値: 278.1545.
【００９７】
4-(1-(3-エトキシプロピル)-4-フェニル-1H-ピロール-3-イル)ベンゼン-1,2-ジオール)(4)
【００９８】
【化１９】
0006599371.tif 000020
【００９９】
化合物4-(1-(3-エトキシプロピル)-4-フェニル-1H-ピロール-3-イル)ベンゼン-1,2-ジオール)(4)を、ダイアグラム4に従って、2-クロロ-3',4'-ジヒドロキシアセトフェノンを3-エトキシプロピルアミン及びフェニルアセトアルデヒドと縮合させることによって調製した。
【０１００】
【化２０】
0006599371.tif 000021
【０１０１】
THF(25.9ml)中の2-クロロ-3',4'-ジ'ヒドロキシアセトフェノン(1.0g、5.2mmol)及びNaI(3.94g、26mmol)の混合物を室温で25分間攪拌する。3-エトキシプロピルアミン(630μL、5.2mmol)、次にNaHCO3(1.88g、22.4mmol)を添加し、混合物を室温で1時間攪拌する。メタノール(37ml)中のフェニルアセトアルデヒド(650μL、5.2mmol)の溶液を添加し、混合物を30分間攪拌する。トリエチルアミン(720μL、5.2mmol)を添加し、混合物を45℃で16時間攪拌する。生成物をエーテル/クロロホルム混合物(5:1)で抽出し、有機相をNaHCO3/NaClの溶液及びブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で蒸発させ、シリカゲルでクロマトグラフィーを実施する。
【０１０２】
4-(1-(3-ヒドロキシプロピル)-4-ブチル-1H-ピロール-3-イル)ベンゼン-1,2-ジオール)(5)
【０１０３】
【化２１】
0006599371.tif 000022
【０１０４】
化合物4-(1-ブチル-4-フェニル-1H-ピロール-3-イル)ベンゼン-1,2-ジオール)(1)を、以下のダイアグラムに従って、2-クロロ-3',4'-ジヒドロキシアセトフェノンを3-アミノプロパン-1-オール及びフェニルアセトアルデヒドと縮合させることによって調製した。
【０１０５】
【化２２】
0006599371.tif 000023
【０１０６】
THF(7.5ml)中の2-クロロ-3',4'-ジヒドロキシアセトフェノン(279.9mg、1.5mmol)及びNaI(224.9mg、1.5mmol)の混合物を室温で30分間攪拌する。ブチルアミン(148μL、1.5mmol)、次にNaHCO3(542.8mg、6.46mmol)を添加し、混合物を室温で1時間攪拌する。メタノール(10.7ml)中の90%のフェニルアセトアルデヒド(195μL、1.5mmol)の溶液を滴下添加し、混合物を30分間攪拌する。トリエチルアミン(209μL、1.5mmol)を添加し、混合物を45℃で20時間攪拌する。水を添加後、生成物をエーテル/クロロホルム混合物(5:1)で抽出し、有機相を飽和NaHCO3/飽和NaClの溶液(1:1)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で蒸発させて、20%のピロール1を含む511mgの黒色の油状物(NMRで推測)を得る。シリカゲルでのクロマトグラフィー(7:3→1:1のヘプタン/酢酸エチル勾配で溶出)の後、生成物をHPLCで精製した。オレンジ色の油状物の形態の1の純粋なサンプルを得た。1H NMR (CDCl3; 500MHz) δ (ppm) 7.19-7.33 (4H; m); 7.15 (1H; m); 6.66-6.78 (5H; m); 3.88 (2H; t; J=7.6Hz); 1.81 (2H; 五重線; J=7.6Hz); 1.40 (2H; 六重線; J=7.6Hz); 0.96 (3H; t; J=7.6Hz). 13C NMR (CDCl3; 125MHz) δ (ppm) 143.1; 141.8; 136.2; 129.6; 128.5 (2 C); 128.3 (2 C); 125.6; 122.9; 122.6; 121.5; 120.2; 120.0; 115.7; 115.4; 49.7; 33.6; 20.2; 13.8. IR (未稀釈) νmax cm-1 3372; 2958; 1673; 1601. MS (ES-) (m/z) 306 [M-H]-. HRMS (ES) (m/z) [M-H]- C20H20NO2の計算値306.1494; 実測値306.1483.
【０１０７】
(実施例2)
化合物(1)とスーパーオキシドアニオンとのin vitroでの反応性、BMPO存在下での電子常磁性共鳴(EPR)による試験。IC50の決定
有機相中の化合物(1)とスーパーオキシドアニオンとの反応性を、スーパーオキシド捕獲試薬BMPO(5-tert-ブトキシカルボニル-5-メチル-1-ピロリンN-酸化物)(図1A)での競合法を使用して、室温でEPRによって試験した。スーパーオキシドアニオン源は、超音波で補助された分解後にDMSO中の5mMで使用したカリウム塩(KO2)である。化合物(1)に使用する濃度は、0.31〜40μMである。捕獲試薬BMPOは25mMの最終濃度で使用する。これらの実験はMiniScope MS 100 EPR分光計(Magnettech GmbH社、Germany)で実施し、以下のパラメータで9.5GHz(Xバンド)の周波数で操作した。磁場:336.0±9.9mT、スイープ時間:20秒、サンプリング:4096地点、変調振幅:0.10mT、変調周波数: 100kHz、ゲイン:900、マイクロ波電力:100mW。BMPOスーパーオキシド付加物の形成の阻害は、当該種のEPRスペクトルの強度の減少として現れ、適用される化合物(1)の量に依存し、2.5μMの半数阻害濃度(IC50)を生み出す。
【０１０８】
水性相中の化合物(1)とスーパーオキシドアニオンとの反応性はまた、50mMの捕獲試薬BMPOと同じ競合法を使用して、室温でEPRによって試験した(図1B)。この場合、スーパーオキシドアニオンは、0.1mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含むPBS(pH7.4)中でのキサンチンオキシダーゼ(XO、53mU/mL)とキサンチン(X、250μM)との酵素反応によって製造される。化合物(1)に使用した濃度は、0.34μM〜43.1μMである。これらの実験はELEXSYS E500 EPR分光計(Bruker社、Wissembourg、France)で実施し、以下のパラメータで9.82GHz(Xバンド)の周波数で操作した。磁場: 349.0±6.6mT、スイープ時間:41.94秒、サンプリング:1024地点、時定数:40.96ミリ秒、変換時間:40.96ミリ秒、変調振幅: 0.10mT、変調周波数:100kHz、ゲイン:60dB、マイクロ波電力:10mW。BMPOスーパーオキシド付加物の形成の阻害は、10分のインキュベーション後に当該種のEPRスペクトルの強度の減少として現れ、使用した化合物(1)の濃度に依存し、3.2μMのIC50を測定する。
【０１０９】
化合物(1)とBMPOスーパーオキシド付加物との直接的な反応は、X/XO系でのプレインキュベーションによって形成されるBMPO付加物の安定性が化合物(1)の存在下では改変されないことを確認することによって、除外された(結果は示さず)。
【０１１０】
(実施例3)
化合物(1)とスーパーオキシドアニオンのin vitroでの反応性、化合物(1)の存在下でのO2Ｏ−シグナルの消失の電子常磁性共鳴(EPR)による試験、及びラジカル中間体の形成の実証
化合物(1)とスーパーオキシドアニオンとの直接的な相互作用を追跡するために、固体の超酸化カリウム(KO2)をDMSO(最終濃度2.5mM)中の超音波処理によって溶解し、次に化合物(1)と混合し、液体窒素に浸漬することによってすぐに冷却した。77K(液体窒素)でのEPR分析は、MiniScope MS 100 EPR分光計で実施し、以下のパラメータで9.5GHz(Xバンド)の周波数で操作した。磁場:336.0±49.8mT、スイープ時間:20秒、サンプリング:4096地点、変調振幅:0.10mT、変調周波数:100kHz、ゲイン:900、マイクロ波電力:6mW。結果は、化合物(1)の濃度に依存してスーパーオキシドアニオンのEPRシグナルの減少を示している(図2A)。
【０１１１】
化合物(1)(40μM)とスーパーオキシドアニオン(超音波処理によってDMSOに溶解された0.5mMのKO2)との反応によって形成されたラジカルのEPRスペクトルは、室温で記録した(図2B)。当該EPR分析はMiniScope MS 100 EPR分光計で実施し、以下のパラメータで9.5GHz(Xバンド)の周波数で操作した。磁場:336.0±1.9mT、スイープ時間:20秒、サンプリング:4096地点、変調振幅:0.05mT、変調周波数:100kHz、ゲイン:900、マイクロ波電力:100mW。当該フェノキシルラジカルスペクトルは、g=2.00を中心とし、Rockenbauer及びKoreczソフトウェアを使用してシミュレートし(Rockenbauer, A.; Korecz, L. Automatic computer simulations of ESR spectra.Appl.Magn.Reson.10:29-43頁; 1996年)、0.33、0.16、0.08及び0.08mTに等しい4つのプロトンカップリング定数を考慮した。これらのカップリングの最も可能性が高い属性は、カテコール芳香族系の3つのプロトン及びピロールの1つのプロトンに対応する。他のプロトン及びピロール環の窒素とのカップリングは分解されない。
【０１１２】
(実施例4)
化合物(1)とスーパーオキシドアニオン(O2Ｏ−)との反応によるキノン中間体の形成
有機相(DMSO中の超音波処理によって溶解したKO2)中のスーパーオキシドアニオンによる化合物(1)の酸化の生成物を、HPLC(LC-Trap、Surveyor、Thermo社)によって特徴付けた。反応混合物(最終容量200μL)は、KO2、10μL(5mM)で処理した又は処理しなかった1.6×10-3M(DMSO中の20μL)の化合物(1)から構成される。反応混合物(20μL)をGeminiカラム(C18、2×150mm、5μm、Phenomenex社)に注入し、最初は98%の溶媒A(A=H2O、0.1%のギ酸)及び2%の溶媒B(アセトニトリル、0.1%のギ酸)で、流速0.2ml/分であった。5分後、勾配は20分間で0%のA及び100%のBに変化した。得られた結果(図3A)は、19.88と等しい保持時間及びm/z=310.20(MH+)を有する化合物(1)が、特に20.29と等しい保持ピーク及びm/z=308.17(MH+)を有する化合物に部分的に変換されることを示している。これらの結果はスーパーオキシドアニオンによる化合物(1)の酸化を示唆している。
【０１１３】
KO2によって生じたスーパーオキシドアニオンによる化合物(1)の酸化生成物を、Brucker AVANCE-500分光計の13C NMRによって分析した。結果(図3)は、化合物(1)の炭素5及び6に対応するシグナルの抑制並びに処理した化合物(1)の2つの炭素5及び6についてキノンに特有の182ppm及び188.5ppmの化学シフトを有する2つのシグナルの形成を示している。
【０１１４】
(実施例5)
化合物(1)とスーパーオキシドアニオン(O2Ｏ−)との反応又はpH=pKa=8.89での「in vitro」での二量体化合物MH+=631の形成
二量体化合物を、化合物(1)(0.3×10-3M)とキサンチン-キサンチンオキシダーゼ複合体によって生成されたスーパーオキシドアニオンとのPBS-EDTA溶媒中での反応後に、形成した。
【０１１５】
二量体化合物MH+631の形成は、LCQ Deca(Thermo社)と連結したHPLC Surveyor (Thermo社)でモニターした。反応混合物(10μL)を、最初は98%の溶媒A(A=H2O、0.1%のギ酸)及び2%の溶媒B(アセトニトリル、0.1%のギ酸)で、流速0.2ml/分で、Geminiカラム(C18、2×150mm、5μm、Phenomenex社)に注入した。5分後、勾配は20分間で0%のA及び100%のBに変化した。得られた結果(図4A1及び図4A2)は、19.71と等しい保持時間及びm/z=310.19(MH+)を有する化合物(1)が、とりわけ20.63に相当する保持ピーク及びm/z=631.16(MH+)を有する化合物に変換されることを示している。スーパーオキシドジスムターゼ及びカタラーゼの存在下で、二量体化合物は形成しない(結果は示さず)。これらの結果は、スーパーオキシドアニオンの存在下で化合物(1)の二量体化を支持している。
【０１１６】
化合物のpKa値と等しいpHで酸化的カップリングによる化合物(1)の二量体化を実施するために、pKaの理論値を、Gaussian03ソフトウェア(Gaussian, Inc.社、Wallingford CT、2004)を使用した量子計算及びLiptakら(J. Am. Chem.Soc.2002、124、6421-6427頁)から改変した方法、特にPCMDOC、RADII、SCFVAC及びTSAREパラメータのデフォルト値を最初の出版で使用したソフトウェアであるGaussian98の値に適合させるように修正することによって、決定した。当該方法によって得られたpKa値は8.89であり、当該値は、その後、化合物(1)の二量体化反応のための、トリス-HCl、0.15M、DMSOの10%溶液のpHを最終0.3×10-2Mに調節するために使用した。反応混合物(10μL)に対しHSS C18カラム(Waters社、2.1×50mm、1.8μm)のUHPLC(Waters社、TQD、PDA、ELSD)によってクロマトグラフィーを実施し、当該クロマトグラフィーは最初に95%のA(H2O、0.1%のギ酸)及び5%のB(アセトニトリル、0.1%のギ酸)を含む勾配の溶媒で、次に6.5分で100%の溶媒Bで、流速0.6ml/分であった。図4Bに示される結果は、3.04の保持時間(tR)及びm/z=310.19(MH+イオンに対応する)で、単一ピークを有する化合物(1)が、保持時間がtR=3.46であり、m/z=631.40(MH+)である化合物に変換されることを示している。これらの結果は、化合物(1)が酸化し二量体化することを示唆している。
【０１１７】
二量体の構造を決定するために十分な量で二量体MH+631を得るために、トリス-HCl、0.15M、pH9.4、DMSO溶液(最終15%)中の12mgの化合物(1)の酸化的カップリングを実施した。48時間後、数滴の0.1N HClによって反応を止めた。二量体MH+631をC18カラム、分取HPLC(ACN、H2O、0.1%のギ酸)で分け、次にアセトニトリル(50%)及びエーテル(50%)の混合物の存在下で抽出した。蒸発後、二量体化合物を重水素化アセトニトリルに溶解し、NMR(1H、13C、COSY、HMBC、HSQC)(Brucker 600)で分析した。
1H NMR (CD3CN; 263K; 600MHz) δ (ppm) 〜7.5 (1H; sl); 7.33 (2H; m); 7.26 (3H; m); 7.17 (2H; m); 7.13 (2H; m); 7.05 (1H; m); 〜7.0 (2H; sl); 6.78 (2H; m); 6.77 (1H; s); 6.55 (1H; s); 6.51 (1H; d; J=2Hz); 6.42 (1H; d; J=2Hz); 6.02 (1H; s); 3.87 (2H; t; J=7.2Hz); 3.84 (2H; t; J=7.2Hz); 3.42; (2H; t; J=5.4Hz); 3.31; (2H; t; J=5.4Hz); 3.05 (1H; sl); 2.97 (1H; sl); 1.82; (2H; 五重線; J=6.6Hz); 1.70; (2H; 五重線; J=6.6Hz).
13C NMR (CD3CN; 263K; 150MHz) δ (ppm) 188.1; 182.8; 151.6; 145.1; 144.3; 143.1; 137.1; 136.1; 129.8; 129.54; 129.48; 129.4; 129.1; 128.8; 128.2; 127.3; 126.0; 125.4; 124.0; 123.8; 123.3; 123.1; 123.0; 122.6; 122.2; 120.6; 118.1; 114.5; 58.9; 58.8; 47.1; 46.7; 34.9; 34.2.
【０１１８】
推測される二量体の構造は以下の通りである。
【０１１９】
【化２３】
0006599371.tif 000024
【０１２０】
二量体(MH+:631.2428)(C38H35N2O7)の精密な質量の測定は、LCT Premier time-of-flight質量分析計(Waters社)で実施した。二量体化合物のUVスペクトルは、ダイオードアレイUV検出器(Acquity PDA検出器)を備えたAcquity system(Waters社)で得られたクロマトグラムから抽出した(図4C)。
【０１２１】
(実施例6)
腫瘍血管新生に対する化合物(1)の効果のin ovo試験
腫瘍血管新生に対する化合物(1)の効果を、鶏胚漿尿膜モデル(CAM)に移植されたヒト腫瘍に基づくin ovoモデルを使用して評価した。当該実験法によって、2、3日で腫瘍の進行及び血管新生のレベルを評価することができるようになった。
【０１２２】
胚発生の10日目に、神経膠芽腫細胞(U87、20μL中5×106)を漿尿膜に沈着させた。移植から2日後、容量20μL中、50μMの濃度で化合物(1)を形成された腫瘍の表面に沈着させた。この処理を24時間毎に5日間繰り返した。対照群は溶媒で処理した。試験は、各群について、神経膠芽腫細胞を有する20個の卵で実施した。腫瘍の発現から3日目(処理24時間後)、5日目(処理3日後)、及び7日目(処理5日後)に腫瘍を撮像した。図5Aに示された結果は、対照群に比べ、3日連続の処理後(5日目)に腫瘍血管新生の阻害を示している。腫瘍発現の7日目にも観察された腫瘍血管新生のこの減少は、処理した腫瘍の増殖の有意な阻害と関連している。これらの結果は腫瘍周囲の抗血管新生及び化合物(1)の抗腫瘍活性を示している。化合物(1)の抗血管新生の機序を決定するために、VEGFを、酸素正常条件及び低酸素条件下で、U87及びHCT-116細胞の培養上清から、ELISA法(Invitrogen社、Novex technology社)によってアッセイした。結果は、5〜50μMの濃度の化合物(1)が細胞の処理から24時間後にVEGF分泌を変性しないことを示している(図5B)。これらの結果は、化合物(1)の腫瘍周囲の血管新生阻害の機序が内皮細胞への直接的な作用でありうることを示唆している。
【０１２３】
(実施例7)
生理学的血管新生、既に形成された脈管構造に対する化合物(1)の効果のin ovo試験
生理学的血管新生に対する化合物(1)の効果を、豊富に血管新生された組織を構成する鶏胚漿尿膜(CAM)モデルを使用して評価した。
【０１２４】
胚発生の7日目に、20μLの化合物(1)の50μM溶液を漿尿膜に沈着させ、一方で対照の膜は溶媒で処理した。図6Aに示される結果は、対照群に比べ、生理学的血管新生に対する化合物(1)の効果の不在を示している。これらの結果は、化合物(1)が抗血管性薬として作用するようには見えず、既に形成された脈管構造を変性しないことを示唆している。
【０１２５】
(実施例8)
血管の「de novo」形成に対する化合物(1)の効果のin vitro試験
血管の「de novo」形成に対する化合物(1)の効果をモニターするために、ヒト内皮細胞(HUVEC)を化合物(1)の存在下又は非存在下で、マトリックス(Matrigel社)に培養した。24時間後、化合物(1)の効果を光学顕微鏡で分析し、写真で示す。結果(図6B)は、化合物(1)が毛細血管(内皮細胞から形成された管)の形成を防いでいることを示している。したがって、化合物(1)は、既に形成された毛細血管ネットワークへの効果が存在しない場合と対照的に、「静止」状態において、毛細血管の形成をブロックすることによって、内皮細胞の増殖に直接的に作用している。
【０１２６】
(実施例9)
静止又は増殖している内皮細胞に対する化合物(1)の効果のin vitro試験
脈管構造が既に形成されているか、又は「de novo」で増殖しているかに従って、化合物(1)の観察される効果に差があることを理解するために、血管内皮細胞を、増殖期の細胞又は静止している細胞を得るために、2つの異なる細胞密度で培養し、次に10μM(IC50値:8μM)で、48時間、化合物(1)で処理するか、又は処理しなかった。図6Cの結果は、化合物(1)が増殖期では内皮細胞にのみ作用することを示している(78%の阻害)。この結果から、したがって、腫瘍周囲の血管新生、血管の「de novo」形成、又は培地における内皮細胞の増殖の最中といった集中的な増殖期における内皮細胞に関して、化合物(1)の作用の特異性を明らかにすることが可能である。したがって、化合物(1)は、がん又はARMD等の過剰及び異常な血管新生に関連する疾患を治療するために使用することが可能である。
【０１２７】
(実施例10)
癌細胞に対するin vitro生物学的試験
化合物(1)並びにその構造的類似体の生物学的活性を、7つの異なる癌細胞株で、in vitroで試験した。
-  HCT-116(結腸直腸癌)
-  U87(神経膠芽腫)
-  K562(骨髄性白血病)及びK562 R
-  MDA-MB 231(乳腺腺癌)
-  MCF-7(乳腺腺癌)
-  A549(肺胞腺癌)
【０１２８】
当該試験のために選択した細胞を、様々な濃度及び様々な時間で培養培地に添加した化合物(1)の存在下で、37℃でインキュベートした。実施した実験のセットによって、試験対象の化合物の細胞毒性(IC50)の程度、つまりその活性化について細胞外スーパーオキシドアニオンに密接に依存したアポトーシスによる細胞死を誘発するその能力を決定することができた。
【０１２９】
1.細胞増殖に対する化合物(1)の効果の試験
正常酸素状態で培養されたHCT-116、U87、K562、K562R、MDA-MB 231、MCF-7及びA549細胞の増殖に対する化合物(1)の効果を、細胞増殖試験(CellTiter-Blue(商標)Cell Viability Assay、Promega社)を使用して評価した。
【０１３０】
図7Aに示した結果は、IC50値(50%の細胞増殖の低下を誘導する化合物の濃度)が化合物(1)の処理から72時間後に確定したことを示している。IC50値は、HCT-116細胞については7.5μM、U87については7μM、MDA-MBについては20μM、K562については231.6μM、K562Rについては12.5μM、MCF-7については15μM、A549については15μMである。図7Bに示した結果は、正常酸素状態で72時間培養されたHCT-116細胞に対する、化合物(2)、(3)、(4)及び(5)の用量依存的な細胞毒性効果を示している。カテコールの不在によって、化合物(2)及び(3)の細胞毒性の喪失が導かれ、ブチル(5)又はＯ−エトキシ(4)鎖による側鎖の変性がIC50値を実質的に変化させることはない。
【０１３１】
図8Aに示した結果は、正常酸素状態で48時間培養されたHCT-116細胞に対する、化合物(1)及び化合物(1)の酸化的カップリングによって以前に得られた二量体MH+631の比較上の細胞毒性を示している。二量体は毒性であり、7.5μMのIC50値であり、この値は、化合物(1)が二量体の2倍の分子量(MW=630d)であるために、化合物(1)の半分である。図8B示した結果は、低酸素状態(2%のO2)で48時間培養されたHCT-116細胞に対する、化合物(1)及び二量体MH+631の比較上の細胞毒性を示している。二量体はIC50値が10μMで毒性であり、この値は、二量体が2倍の分子量であるために、化合物(1)のだいたい半分である。
【０１３２】
2.正常酸素状態のアポトーシスの誘導に対する化合物(1)の効果の試験
化合物(1)がアポトーシスの細胞死を導くがどうかを特定するために、アポトーシスのマーカー酵素であるカスパーゼ3及び7の活性を、1μM〜50μMに変化させた濃度の化合物(1)で、正常酸素状態で24時間処理したHCT-116、U87及びHL60細胞において、ApＯ−ONE試験(Promega社)を使用して測定した。図9に示した結果は、化合物(1)で細胞を処理することによって、細胞株にかかわらず、両方のカスパーゼの有意な活性化を促すことを示している。最も強力な活性化を得たのはHL60細胞であった。
【０１３３】
3.化合物(1)による細胞性スーパーオキシドアニオンのシグナルの抑制
スーパーオキシドアニオンに対する化合物(1)の効果を、50μMの化合物(1)でHCT-116細胞を3時間処理し、次に、プローブのジヒドロエチジウム(DHE)(10μM)で20分間インキュベーションを行うことで試験した。培養培地を除去し、氷冷のDPBSで洗浄した後に、細胞を1mlの冷たいDPBSに回収した。1000gで5分間遠心分離にかけた後、ペレットをTriton X100(0.1%)を有する150μlのPBS中に吸い上げ、振盪し、1000gで5分間遠心分離にかけた。上清をメタノール中のHClO4の0.2M溶液で混合し、振盪し、2時間氷に置いた。20000gで30分間遠心分離にかけた後、上清を蛍光(λex=510nm、λem=595nm)と連結したHPLCによって分析する。未処理の細胞(実線)では、tR=5.16分での第一のピークは、ペルオキシダーゼによる酸化の生成物である酸化形態「E+」と対応し、tR=5.71分での第二のピークは、スーパーオキシドアニオンとの相互作用に特有の酸化形態2-OH E+に対応している。処理された細胞では、酸化形態「E+」に対応するtR=5.29分での第一のピークが増加し、スーパーオキシドアニオンとの相互作用に特有の酸化形態2-OH E+に対応するtR=5.71分での第二のピークは抑制された。得られた結果は、スーパーオキシドアニオンによるDHEの酸化形態に対応する2OH E+シグナルを阻害し、H2O2によって活性化するペルオキシダーゼ又はカタラーゼによるDHEの酸化に対応するE+シグナルが増加することを示している(図10)。
【０１３４】
4.細胞毒性及びアポトーシス促進活性についての細胞外/膜スーパーオキシドアニオンへの化合物(1)の依存性
化合物(1)の活性化において、細胞によって産生されるスーパーオキシドアニオンの役割を決定するために、HCT-116細胞を、50U/mlの酵素スーパーオキシドジスムターゼ(SOD1)で1時間にわたり前処理し、次に、化合物(1)で処理した。正常酸素状態(72時間の処理)及び低酸素状態(48時間の処理)における細胞生存を第一に評価するために細胞を分析した。第二に、正常酸素状態の濃縮したクロマチンの形態並びに正常酸素状態のカスパーゼ3及び7の活性を評価した。図11Aに示した結果は、SODで処理した後のスーパーオキシドアニオンの抑制が、正常酸素状態で10μM、低酸素状態で25μMの化合物(1)の細胞毒性効果を完全にブロックすることを示している。同様に、SODによる前処理は、正常酸素状態の濃縮したクロマチンの増加を完全に抑制し、このことはHoechst 33258による染色後に描出されている(図11B)。同様に、正常酸素状態のカスパーゼ3-7の活性に対する化合物(1)の活性化は、SODの活性によって完全に抑制されている(図11C)。これらの結果は、化合物(1)がスーパーオキシドアニオンによって特異的に活性化することができるプロドラッグであることを示唆している。
【図１Ａ】
0006599371.tif 000032
【図１Ｂ】
0006599371.tif 000033
【図２Ａ】
0006599371.tif 000034
【図２Ｂ】
0006599371.tif 000035
【図３Ａ】
0006599371.tif 000036
【図３Ｂ】
0006599371.tif 000037
【図４Ａ１】
0006599371.tif 000038
【図４Ａ２】
0006599371.tif 000039
【図４Ｂ】
0006599371.tif 000040
【図４Ｃ】
0006599371.tif 000041
【図５Ａ】
0006599371.tif 000042
【図５Ｂ】
0006599371.tif 000043
【図６Ａ】
0006599371.tif 000044
【図６Ｂ】
0006599371.tif 000045
【図６Ｃ】
0006599371.tif 000046
【図７Ａ】
0006599371.tif 000047
【図７Ｂ】
0006599371.tif 000048
【図８Ａ】
0006599371.tif 000049
【図８Ｂ】
0006599371.tif 000050
【図９】
0006599371.tif 000051
【図１０】
0006599371.tif 000052
【図１１Ａ】
0006599371.tif 000053
【図１１Ｂ】
0006599371.tif 000054
【図１１Ｃ】
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