(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体であって、
１）配列番号４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号９９から１０９までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域、並びに配列番号６のアミノ酸番号２４から３９までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸番号５５から６１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸番号９４から１０２までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域；並びに
２）配列番号４のアミノ酸番号５２１から５２５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５４０から５５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号５８９から５９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域、並びに配列番号４のアミノ酸番号６４８から６５８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号６７４から６８０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号７１３から７２１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域
を含む二重特異的抗体。
【請求項２】
以下の（１）又は（２）から選択される、請求項１に記載の二重特異的抗体：
（１）ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体であって、
１）配列番号４のアミノ酸番号１から１２０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域、及び配列番号６のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域、並びに
２）配列番号４のアミノ酸番号４９１から６０９までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸番号６２５から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域、
を含む、二重特異的抗体；又は
（２）（１）の二重特異的抗体の翻訳後修飾により生じた二重特異的抗体である、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体。
【請求項３】
以下の（１）又は（２）から選択される、請求項２に記載の二重特異的抗体：
（１）抗ヒトＴＬＲ２抗体及び抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントを含む二重特異的抗体であって、
該抗ヒトＴＬＲ２抗体はＩｇＧ抗体であり、かつ、配列番号４のアミノ酸番号１から１２０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域、及び配列番号６のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域を含み、
該抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントは一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）であり、かつ、配列番号４のアミノ酸番号４９１から６０９までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸番号６２５から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域を含む、
二重特異的抗体；又は
（２）（１）の二重特異的抗体の翻訳後修飾により生じた二重特異的抗体である、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体。
【請求項４】
以下の（１）又は（２）から選択される、請求項３に記載の二重特異的抗体：
（１）ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体であって、抗ヒトＴＬＲ２抗体が、配列番号４のアミノ酸番号１から４５０までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６のアミノ酸配列からなる軽鎖を含み、抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントが、配列番号４のアミノ酸番号４９１から７３２までのアミノ酸配列からなるｓｃＦｖであり、該抗ヒトＴＬＲ２抗体の各重鎖のＣ末端に該抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントのＮ末端がリンカーを介して連結されている二重特異的抗体；又は
（２）（１）の二重特異的抗体の翻訳後修飾により生じた二重特異的抗体である、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体。
【請求項５】
配列番号４のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖―抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体、及び配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖を含む、請求項４に記載の二重特異的抗体。
【請求項６】
配列番号４のアミノ酸配列からなり、配列番号４のアミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体、及び配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖を含む、請求項４に記載の二重特異的抗体。
【請求項７】
以下の（ａ）及び（ｂ）を含む、発現ベクター：
（ａ）請求項２に記載の二重特異的抗体の抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域、抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域、及び抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；並びに
（ｂ）請求項２に記載の二重特異的抗体の抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項８】
以下の（ａ）及び（ｂ）を含む、発現ベクター：
（ａ）配列番号４のアミノ酸番号１から４５０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖のＣ末端に配列番号４のアミノ酸番号４９１から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントのＮ末端がリンカーを介して連結されている抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；及び
（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項９】
以下の（ａ）及び（ｂ）を含む、発現ベクター：
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｂ）からなる群より選択される宿主細胞：
（ａ）配列番号４のアミノ酸番号１から４５０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖のＣ末端に配列番号４のアミノ酸番号４９１から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントのＮ末端がリンカーを介して連結されている抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞；並びに
（ｂ）配列番号４のアミノ酸番号１から４５０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖のＣ末端に配列番号４のアミノ酸番号４９１から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントのＮ末端がリンカーを介して連結されている抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
【請求項１１】
以下の（ａ）〜（ｂ）からなる群より選択される宿主細胞：
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞；並びに
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
【請求項１２】
以下の（ａ）〜(ｃ)からなる群より選択される宿主細胞を培養し、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体を発現させる工程を包含する、抗ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体を生産する方法：
（ａ）配列番号４のアミノ酸番号１から４５０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖のＣ末端に配列番号４のアミノ酸番号４９１から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントのＮ末端がリンカーを介して連結されている抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸番号１から４５０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖のＣ末端に配列番号４のアミノ酸番号４９１から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントのＮ末端がリンカーを介して連結されている抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞；並びに 
（ｃ）配列番号４のアミノ酸番号１から４５０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖のＣ末端に配列番号４のアミノ酸番号４９１から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントのＮ末端がリンカーを介して連結されている抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
【請求項１３】
以下の（ａ）〜(ｃ)からなる群より選択される宿主細胞を培養し、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体を発現させる工程を包含する、抗ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体を生産する方法：
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞； 並びに
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞、及び、配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
【請求項１４】
請求項５に記載の二重特異的抗体、及び/又は、請求項６に記載の二重特異的抗体、及び、薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔｏｌｌ様受容体２（Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２；ＴＬＲ２）及びＴｏｌｌ様受容体４（Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４；ＴＬＲ４）は、マクロファージ及び好中球等の免疫担当細胞、血管内皮細胞、尿細管上皮細胞等の腎固有細胞を含む広範な細胞並びに組織に発現する一回膜貫通型の蛋白質である（Ｆｏｌｉａ  Ｂｉｏｌ  （Ｐｒａｈａ）．、２００５、Ｖｏｌ．５１、Ｎｏ．６、ｐ．１８８−１９７）。ＴＬＲ２はＴＬＲ１又はＴＬＲ６と複合体を形成し、ペプチドグリカンやリポ蛋白質等の細菌成分と反応する。一方、ＴＬＲ４は、ミエロイド系分化因子２（ＭＤ２）蛋白質やＣＤ１４蛋白質等と複合体を形成し、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）を代表とするリポ多糖等の細菌成分と反応する。また、これらの受容体は内在性の組織傷害因子であるダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰｓ）に結合することで活性化され、細胞内にシグナルを伝達する。ＴＬＲ２及びＴＬＲ４の活性化は、例えば転写因子である核内因子κＢ（ＮＦ−κＢ）の活性化を介して、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）やインターロイキン６（ＩＬ−６）等の炎症性のサイトカインの発現を誘導し、炎症応答を惹起する（Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１０、Ｖｏｌ．１１、Ｎｏ．５、ｐ．３７３−３８４）。【０００３】
このようなＴＬＲ２及びＴＬＲ４を介した各種細胞の活性化は、免疫炎症性疾患、例えば、敗血症、急性腎障害、慢性腎臓病、急性呼吸促迫症候群、強皮症、急性膵炎、慢性閉塞性肺疾患等の疾患に関与することが知られている。【０００４】
敗血症との関連としては、敗血症モデルであるサルモネラ菌感染モデルにおいてＴＬＲ２の遺伝的欠損動物（ノックアウトマウス）が生存率改善を示し、大腸菌感染モデルにおいてＴＬＲ４ノックアウトマウスが生存率改善を示し、さらに、各モデルにおいてＴＬＲ２及びＴＬＲ４のダブルノックアウトマウスがＴＬＲ２又はＴＬＲ４の単独ノックアウトマウスと比較して生存率が大幅に改善することが報告されている（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２００８、Ｖｏｌ．２０５、ｐ．１７４７−１７５４）。また、前記２つのモデルにおいて抗ＴＬＲ２抗体（Ｔ２．５）又は抗ＴＬＲ４抗体（１Ａ６）の単独投与では生存率は改善しないのに対し、両抗体の併用投与により生存率が改善することが報告されている（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２００８、Ｖｏｌ．２０５、ｐ．１７４７−１７５４）。【０００５】
急性膵炎との関連としては、タウロコール酸誘発膵炎モデルにおいてＴＬＲ４のノックアウトマウスが血中アミラーゼ、膵臓ミエロペルオキシダーゼ、及び膵臓組織傷害を低下することが報告されている（Ｉｎｆｌａｍｍ. Ｒｅｓ. 、２０１１、Ｖｏｌ．６０、ｐ．１０９３‐１０９８）。また、セルレイン誘発膵炎モデルでは、膵臓において、ＴＬＲ２及びＴＬＲ４の発現量上昇が報告されている（Ｐａｎｃｒｅａｓ、２０１３、Ｖｏｌ．４２、ｐ．１１４−１２２）。【０００６】
ヒトＴＬＲ２に結合する抗体としては、マウスモノクローナル抗体Ｔ２．５（特許文献１）、マウスモノクローナル抗体１１Ｇ７（特許文献２）、及びＴ２．５のヒト化モノクローナル抗体ＯＰＮ３０５（特許文献３）が報告されている。これらのうち、１１Ｇ７はＴＬＲ２／ＴＬＲ１シグナルは阻害するが、ＴＬＲ２／ＴＬＲ６シグナルは阻害しないのに対して、ＯＰＮ３０５は両シグナルとも阻害することが報告されている。具体的には、ＯＰＮ３０５はヒト単球系細胞ＴＨＰ−１細胞を用いた実験において、Ｐａｍ３ＣＳＫ４（ＴＬＲ２／ＴＬＲ１アゴニスト）刺激及びＦＳＬ−１（ＴＬＲ２／ＴＬＲ６アゴニスト）刺激の両方に対して中和活性を有し、さらにＰａｍ３ＣＳＫ４投与によって誘発されるマウス血中炎症性サイトカイン濃度上昇を抑制することが報告されている（特許文献３）。【０００７】
ヒトＴＬＲ４に結合する抗体としては、マウスモノクローナル抗体ＨＴＡ１２５（非特許文献１）、マウスモノクローナル抗体１８Ｈ１０、１６Ｇ７、１５Ｃ１及び７Ｅ３（特許文献４）、１５Ｃ１のヒト化モノクローナル抗体ｈｕ１５Ｃ１（特許文献５）、並びに、ｈｕ１５Ｃ１の相補性決定領域へのランダム変異により見出されたヒト化モノクローナル抗体１Ａ６及び１Ｅ１１．Ｃ２Ｅ３等（特許文献６）が報告されている。これらのうち、マウスモノクローナル抗体については、１５Ｃ１がヒト血液を用いた実験結果から中和活性が最も高いことが示されており（特許文献４）、１５Ｃ１のヒト化モノクローナル抗体ｈｕ１５Ｃ１が同様のヒト血液を用いた実験により中和活性を有することが確認されている（特許文献５）。さらにヒト化モノクローナル抗体１Ｅ１１．Ｃ２Ｅ３はｈｕ１５Ｃ１よりもヒト血液を用いた実験において優れた中和活性を有することが報告されている（特許文献６）。【０００８】
また、ヒト血液を用いた加熱処理の大腸菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ刺激に対するＩＬ−６産生評価系において、抗ヒトＴＬＲ２抗体（Ｔ２．５）はＩＬ−６産生を弱く阻害し、抗ヒトＴＬＲ４抗体（１５Ｃ１）はＩＬ−６産生を約５０％阻害する程度であるのに対し、両抗体の併用添加によりＩＬ−６産生がほぼ完全に阻害されることが報告されている（特許文献７）。【０００９】
しかし、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体はこれまで報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００５／０２８５０９号
【特許文献２】国際公開第２００５／０１９４３１号
【特許文献３】国際公開第２０１１／００３９２５号
【特許文献４】国際公開第２００５／０６５０１５号
【特許文献５】国際公開第２００７／１１０６７８号
【特許文献６】国際公開第２０１３／１４９１１１号
【特許文献７】国際公開第２００６／０７７４７１号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】「ザ  ジャーナル  オブ  エクスペリメンタル  メディシン（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、（米国）、１９９９、Ｖｏｌ．１８９、Ｎｏ．１１、ｐ．１７７７−１７８２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４の両方に結合し、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４を介する免疫炎症作用を阻害することにより免疫炎症性疾患を予防又は治療する二重特異的抗体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体の作製において相当の創意検討を重ねた結果、１）配列番号４のアミノ酸番号１から１２０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域、及び配列番号６のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域；並びに２）配列番号４のアミノ酸番号４９１から６０９までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸番号６２５から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域を含む、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体を作製し（実施例１〜８）、当該二重特異的抗体が、ＴＬＲ２及びＴＬＲ４に反応する臨床分離株由来の緑膿菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ−１の加熱処理死菌体（以後死菌と呼ぶ）によって誘導される炎症性サイトカインであるＴＮＦα産生を阻害すること（実施例１０）を見出した。これらの結果、前記ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体を提供し、本発明を完成した。また、臨床分離株由来の大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ２１００６の死菌によって誘導されるＴＮＦα産生も当該二重特異的抗体が阻害すること（実施例１１）を見出した。【００１４】
すなわち、本発明は、医学上又は産業上有用な物質又は方法として以下の発明を含むものである。
［１］以下の（１）又は（２）から選択される、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体。
（１）ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体であって、
１）配列番号４のアミノ酸番号１から１２０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域、及び配列番号６のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域、並びに
２）配列番号４のアミノ酸番号４９１から６０９までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸番号６２５から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域、
を含む、二重特異的抗体；又は
（２）（１）の二重特異的抗体の翻訳後修飾により生じた二重特異的抗体である、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体。
［２］以下の（１）又は（２）から選択される、［１］に記載の二重特異的抗体。
（１）抗ヒトＴＬＲ２抗体及び抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントを含む二重特異的抗体であって、
該抗ヒトＴＬＲ２抗体はＩｇＧ抗体であり、かつ、配列番号４のアミノ酸番号１から１２０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域、及び配列番号６のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域を含み、
該抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントは一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）であり、かつ、配列番号４のアミノ酸番号４９１から６０９までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸番号６２５から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域を含む、
二重特異的抗体；又は
（２）（１）の二重特異的抗体の翻訳後修飾により生じた二重特異的抗体である、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体。
［３］［２］に記載の二重特異的抗体であって、該二重特異的抗体は、抗ヒトＴＬＲ２抗体及び抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントを含み、
該抗ヒトＴＬＲ２抗体はＩｇＧ抗体であり、かつ、配列番号４のアミノ酸番号１から１２０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域、及び配列番号６のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域を含み、
該抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントはｓｃＦｖであり、かつ、配列番号４のアミノ酸番号４９１から６０９までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸番号６２５から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域を含む、
二重特異的抗体。
［４］翻訳後修飾が、抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域アミノ末端（Ｎ末端）のピログルタミル化、抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖カルボキシ末端（Ｃ末端）のリジン欠失、及び／又は抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントの重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化である、［２］に記載の二重特異的抗体。
［５］抗ヒトＴＬＲ２抗体がヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域を含む、［２］〜［４］のいずれかに記載の二重特異的抗体。
［６］ヒトＩｇγ１定常領域がＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａのアミノ酸変異又はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＩ２５３Ａのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である、［５］に記載の二重特異的抗体。
［７］抗ヒトＴＬＲ２抗体がヒトＩｇκ定常領域である軽鎖定常領域を含む、［２］〜［４］のいずれかに記載の二重特異的抗体。
［８］抗ヒトＴＬＲ２抗体がヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域及びヒトＩｇκ定常領域である軽鎖定常領域を含む、［２］〜［４］のいずれかに記載の二重特異的抗体。
［９］ヒトＩｇγ１定常領域がＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａのアミノ酸変異又はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＩ２５３Ａのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である、［８］に記載の二重特異的抗体。
［１０］抗ヒトＴＬＲ２抗体が、配列番号４のアミノ酸番号１から４５０までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、［２］又は［３］に記載の二重特異的抗体。
［１１］抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントが、重鎖可変領域のＣ末端に軽鎖可変領域のＮ末端がリンカーを介して連結された構造を有するｓｃＦｖである、［２］〜［１０］のいずれかに記載の二重特異的抗体。
［１２］抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントが、配列番号４のアミノ酸番号４９１から７３２までのアミノ酸配列からなるｓｃＦｖである、［２］〜［１１］のいずれかに記載の二重特異的抗体。
［１３］抗ヒトＴＬＲ２抗体が、配列番号４のアミノ酸番号１から４５０までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６のアミノ酸配列からなる軽鎖を含み、抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントが、配列番号４のアミノ酸番号４９１から７３２までのアミノ酸配列からなるｓｃＦｖである、［２］又は［３］に記載の二重特異的抗体。
［１４］抗ヒトＴＬＲ２抗体の各重鎖のＣ末端に抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントのＮ末端がリンカーを介して連結されている、［２］〜［１３］のいずれかに記載の二重特異的抗体。
［１５］抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖と抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントを連結するリンカーがＧＳリンカーからなる、［１４］に記載の二重特異的抗体。
［１６］ＧＳリンカーが配列番号９のアミノ酸配列からなる、［１５］に記載の二重特異的抗体。
［１７］抗ヒトＴＬＲ２抗体が、配列番号４のアミノ酸番号１から４５０までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６のアミノ酸配列からなる軽鎖を含み、抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントが、配列番号４のアミノ酸番号４９１から７３２までのアミノ酸配列からなるｓｃＦｖであり、該抗ヒトＴＬＲ２抗体の各重鎖のＣ末端に該抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントのＮ末端がリンカーを介して連結されている、［２］又は［３］に記載の二重特異的抗体。
［１８］抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖と抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントを連結するリンカーがＧＳリンカーからなる、［１７］に記載の二重特異的抗体。
［１９］ＧＳリンカーが配列番号９のアミノ酸配列からなる、［１８］に記載の二重特異的抗体。
［２０］［１７］〜［１９］のいずれかに記載の二重特異的抗体の翻訳後修飾により生じた二重特異的抗体。
［２１］［１］に記載の二重特異的抗体の抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域、抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域、抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域、及び／又は抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
［２２］［１７］〜［１９］のいずれかに記載の二重特異的抗体の抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖のＣ末端に抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントのＮ末端がリンカーを介して連結されている融合体をコードする塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
［２３］配列番号４のアミノ酸配列からなる前記融合体をコードする塩基配列を含む、［２２］に記載のポリヌクレオチド。
［２４］［１７］〜［１９］のいずれかに記載の二重特異的抗体の抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
［２５］［２１］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
［２６］［２２］、［２３］、及び／又は［２４］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
［２７］以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、［２５］に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
（ａ）配列番号４のアミノ酸番号１から１２０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号４のアミノ酸番号４９１から６０９までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号４のアミノ酸番号６２５から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、配列番号６のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸番号１から１２０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号４のアミノ酸番号４９１から６０９までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号４のアミノ酸番号６２５から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号６のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸番号１から１２０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号４のアミノ酸番号４９１から６０９までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号４のアミノ酸番号６２５から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞；並びに
（ｄ）配列番号６のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
［２８］以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、［２６］に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
（ａ）［２２］又は［２３］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターと［２４］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）［２２］又は［２３］に記載のポリヌクレオチドと［２４］に記載のポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）［２２］又は［２３］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｄ）［２４］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
［２９］以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体を発現させる工程を包含する、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体を生産する方法。
（ａ）配列番号４のアミノ酸番号１から１２０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号４のアミノ酸番号４９１から６０９までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号４のアミノ酸番号６２５から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、配列番号６のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸番号１から１２０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号４のアミノ酸番号４９１から６０９までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号４のアミノ酸番号６２５から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号６のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞；並びに
（ｃ）配列番号４のアミノ酸番号１から１２０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号４のアミノ酸番号４９１から６０９までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号４のアミノ酸番号６２５から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞、並びに、配列番号６のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
［３０］以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体を発現させる工程を包含する、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体を生産する方法。
（ａ）［２２］又は［２３］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターと［２４］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）［２２］又は［２３］に記載のポリヌクレオチドと［２４］に記載のポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｃ）［２２］又は［２３］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、［２４］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
［３１］［２９］に記載の方法で生産されたヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体。
［３２］［３０］に記載の方法で生産されたヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体。
［３３］［１］〜［２０］、［３１］及び［３２］のいずれかに記載の二重特異的抗体及び薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物。
［３４］免疫炎症性疾患の予防又は治療用医薬組成物である、［３３］に記載の医薬組成物。
［３５］免疫炎症性疾患が敗血症又は急性膵炎である、［３４］に記載の医薬組成物。
［３６］［１］〜［２０］、［３１］及び［３２］のいずれかに記載の二重特異的抗体の治療有効量を投与する工程を包含する、免疫炎症性疾患を予防又は治療する方法。
［３７］免疫炎症性疾患が敗血症又は急性膵炎である、［３６］に記載の予防又は治療する方法。
［３８］免疫炎症性疾患の予防又は治療に使用するための、［１］〜［２０］、［３１］及び［３２］のいずれかに記載の二重特異的抗体。
［３９］免疫炎症性疾患が敗血症又は急性膵炎である、［３８］に記載の二重特異的抗体。
［４０］免疫炎症性疾患の予防又は治療用医薬組成物製造における［１］〜［２０］、［３１］及び［３２］のいずれかに記載の二重特異的抗体の使用。
［４１］免疫炎症性疾患が敗血症又は急性膵炎である、［４０］に記載の二重特異的抗体の使用。
［４２］以下の（１）又は（２）から選択される、抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメント。
（１）配列番号８のアミノ酸番号１から１２０までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号６のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメント；又は
（２）（１）の抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントの翻訳後修飾により生じた抗体又はその抗原結合フラグメントである、抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメント。
［４３］配列番号８のアミノ酸番号１から１２０までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号６のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、［４２］に記載の抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメント。
［４４］配列番号８のアミノ酸番号１から１２０までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号６のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントの翻訳後修飾により生じた抗体又はその抗原結合フラグメントである、［４２］に記載の抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメント。
［４５］翻訳後修飾が重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端のリジン欠失である、［４２］又は［４４］に記載の抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメント。
［４６］ヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域を含む、［４２］〜［４５］のいずれかに記載の抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメント。
［４７］ヒトＩｇγ１定常領域がＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａのアミノ酸変異又はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＩ２５３Ａのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である、［４６］に記載の抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメント。
［４８］ヒトＩｇκ定常領域である軽鎖定常領域を含む、［４２］〜［４５］のいずれかに記載の抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメント。
［４９］ヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域及びヒトＩｇκ定常領域である軽鎖定常領域を含む、［４２］〜［４４］のいずれかに記載の抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメント。
［５０］ヒトＩｇγ１定常領域がＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、又はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＩ２５３Ａのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である、［４９］に記載の抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメント。
［５１］配列番号８のアミノ酸番号１から４５０までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、［４２］又は[４３］に記載の抗ヒトＴＬＲ２抗体。
［５２］一本鎖可変領域フラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）2である、［４２］〜［５０］のいずれかに記載の抗原結合フラグメント。
［５３］［５１］に記載の抗ヒトＴＬＲ２抗体の翻訳後修飾により生じた抗体である、抗ヒトＴＬＲ２抗体。
［５４］翻訳後修飾が、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端のリジン欠失である、［５３］に記載の抗ヒトＴＬＲ２抗体。
［５５］配列番号８のアミノ酸番号１から４４９までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、［４２］又は[４４］に記載の抗ヒトＴＬＲ２抗体。
［５６］以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる工程を包含する、抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法。
（ａ）［４３］に記載の抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞； 
（ｂ）［４３］に記載の抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）［４３］に記載の抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
［５７］以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＴＬＲ２抗体を発現させる工程を包含する、抗ヒトＴＬＲ２抗体を生産する方法。
（ａ）［５１］に記載の抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞； 
（ｂ）［５１］に記載の抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）［５１］に記載の抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
［５８］［５６］に記載の方法で生産された抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメント。
［５９］［５７］に記載の方法で生産された抗ヒトＴＬＲ２抗体。
［６０］［４２］〜［５５］、［５８］、及び［５９］のいずれかに記載の抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメント及び薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物。
［６１］［４３］に記載の抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメント、［４４］に記載の抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメント、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
［６２］［５１］に記載の抗ヒトＴＬＲ２抗体、［５５］に記載の抗ヒトＴＬＲ２抗体、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
［６３］がんの予防又は治療用医薬組成物である、［６０］〜［６２］のいずれかに記載の医薬組成物。
［６４］［４２］〜［５５］、［５８］、及び［５９］のいずれかに記載の抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントの治療有効量を投与する工程を包含する、がんを予防又は治療する方法。
［６５］がんの予防又は治療に使用するための、［４２］〜［５５］、［５８］、及び［５９］のいずれかに記載の抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメント。
［６６］がんの予防又は治療用医薬組成物製造における［４２］〜［５５］、［５８］、及び［５９］のいずれかに記載の抗ヒトＴＬＲ２又はその抗原結合フラグメントの使用。【００１５】
前記ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体並びに抗ヒトＴＬＲ２抗体及びその抗原結合フラグメントには、他のペプチド及び蛋白質との融合抗体や、修飾剤を結合させた修飾抗体も含まれる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の二重特異的抗体は、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４の機能阻害により、強力な抗免疫炎症作用を有するものであり、免疫炎症性疾患の予防又は治療剤として使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＩｇＧ抗体である抗ヒトＴＬＲ２抗体の各重鎖のＣ末端に抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖのＮ末端がリンカーを介して連結された、本発明の二重特異的抗体の構造の一例を示す。
【図２】ＴＨＰ１−ｘＢｌｕｅ細胞へのＰａｍ２ＣＳＫ４（ＴＬＲ２／６アゴニスト）誘発アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）産生に対する、各抗ヒトＴＬＲ２抗体の抑制効果を示す。
【図３】正常ヒト末梢血単核球への大腸菌死菌誘発ＴＮＦα産生に対する、各二重特異的抗体の抑制効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に、本発明について詳述する。
【００１９】
抗体にはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥの５つのクラスが存在する。抗体分子の基本構造は、各クラス共通で、分子量５万〜７万の重鎖と２万〜３万の軽鎖から構成される。重鎖は、通常約４４０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥに対応してＩｇγ、Ｉｇμ、Ｉｇα、Ｉｇδ、Ｉｇεとよばれる。さらにＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のサブクラスが存在し、それぞれに対応する重鎖はＩｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３、Ｉｇγ４とよばれている。軽鎖は、通常約２２０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、Ｌ型とＫ型の２種が知られており、それぞれＩｇλ、Ｉｇκとよばれる。抗体分子の基本構造のペプチド構成は、それぞれ相同な２本の重鎖及び２本の軽鎖が、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）及び非共有結合によって結合され、分子量１５万〜１９万である。２種の軽鎖は、どの重鎖とも対をなすことができる。個々の抗体分子は、常に同一の軽鎖２本と同一の重鎖２本からできている。
【００２０】
鎖内Ｓ−Ｓ結合は、重鎖に四つ（μ、ε鎖には五つ）、軽鎖には二つあって、アミノ酸１００〜１１０残基ごとに一つのループを成し、この立体構造は各ループ間で類似していて、構造単位あるいはドメインとよばれる。重鎖、軽鎖ともにＮ末端に位置するドメインは、同種動物の同一クラス（サブクラス）からの標品であっても、そのアミノ酸配列が一定せず、可変領域とよばれており、各ドメインは、それぞれ、重鎖可変領域（ＶH）及び軽鎖可変領域（ＶL）とよばれている。可変領域よりＣ末端側のアミノ酸配列は、各クラスあるいはサブクラスごとにほぼ一定で定常領域とよばれている（各ドメインは、それぞれ、ＣH１、ＣH２、ＣH３あるいはＣLと表される）。
【００２１】
抗体の抗原決定部位はＶH及びＶLによって構成され、結合の特異性はこの部位のアミノ酸配列によっている。一方、補体や各種細胞との結合といった生物学的活性は各クラスＩｇの定常領域の構造の差を反映している。軽鎖と重鎖の可変領域の可変性は、どちらの鎖にも存在する３つの小さな超可変領域にほぼ限られることがわかっており、これらの領域を相補性決定領域（ＣＤＲ；重鎖、軽鎖それぞれＮ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）とよんでいる。可変領域の残りの部分はフレームワーク領域（ＦＲ）とよばれ、比較的一定である。
【００２２】
抗体のＶH及びＶLを含む各種抗体フラグメントも抗原結合活性を有し、このような代表的な抗体フラグメントとして、一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2が挙げられる。Ｆａｂは、軽鎖と、ＶH、ＣH１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖フラグメントから構成される、一価の抗体フラグメントである。Ｆａｂ'は、軽鎖と、ＶH、ＣH１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖フラグメントから構成される、一価の抗体フラグメントであり、このヒンジ領域の部分には重鎖間Ｓ−Ｓ結合を構成していたシステイン残基が含まれる。Ｆ（ａｂ'）2フラグメントは、２つのＦａｂ'フラグメントがヒンジ領域中の重鎖間Ｓ−Ｓ結合で結合した二価の抗体フラグメントである。ｓｃＦｖは、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）で連結されたＶHとＶLから構成される、一価の抗体フラグメントである。
【００２３】
二重特異的抗体は、２つの異なる抗原を認識し、それぞれの抗原に結合する２つの抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗体である。二重特異的抗体には種々のフォーマット（構造）が報告されている（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２０１０、Ｖｏｌ．３、Ｎｏ．４、ｐ．４９１−５０８）。例えば、一方の抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のＮ末端にリンカーを介してもう一方の抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のＣ末端がそれぞれ連結された、四価の二重特異的抗体、各抗体の重鎖及び軽鎖をｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ技術によりＣＨ３を介して接合した、二価の二重特異的抗体、並びに、一方の抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端にリンカーを介してもう一方の抗体のｓｃＦｖのＣ末端が連結された、若しくは、一方の抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端にリンカーを介してもう一方の抗体のｓｃＦｖのＮ末端が連結された、四価の二重特異的抗体（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１９９７、Ｖｏｌ．１５、ｐ．１５９−１６３）等が報告されている。
【００２４】
＜本発明の二重特異的抗体＞
本明細書中で「ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体」とは、ヒトＴＬＲ２に対する結合活性及びヒトＴＬＲ４に対する結合活性を有する二重特異的抗体を意味し、具体的には、本発明の二重特異的抗体には、以下の特徴を有する二重特異的抗体が含まれる：
ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体であって、
１）配列番号４のアミノ酸番号１から１２０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域、及び配列番号６のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域；並びに
２）配列番号４のアミノ酸番号４９１から６０９までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸番号６２５から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域、
を含む、二重特異的抗体。
【００２５】
本明細書中で「抗ヒトＴＬＲ２抗体」とは、ヒトＴＬＲ２に結合する抗体を意味し、「抗ヒトＴＬＲ４抗体」とは、ヒトＴＬＲ４に結合する抗体を意味する。本発明の二重特異的抗体は、抗ヒトＴＬＲ２抗体及び抗ヒトＴＬＲ４抗体の各々の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有すればよく、例えば、抗ヒトＴＬＲ２抗体又はヒトＴＬＲ２に対する結合活性を有する抗ヒトＴＬＲ２抗体フラグメントと、抗ヒトＴＬＲ４抗体又はヒトＴＬＲ４に対する結合活性を有する抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントを含む、任意の二重特異的抗体の構造を有しうる。このような構造としては、例えば、一方の抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のＮ末端にリンカーを介してもう一方の抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のＣ末端がそれぞれ連結された二重特異的抗体（ＤＶＤ−Ｉｇ）、各抗体の重鎖及び軽鎖をｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ技術によりＣＨ３を介して接合した二重特異的抗体、並びに一方の抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端にリンカーを介してもう一方の抗体のｓｃＦｖのＣ末端が連結された、若しくは、一方の抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端にリンカーを介してもう一方の抗体のｓｃＦｖのＮ末端が連結された四価の二重特異的抗体等が挙げられる。
【００２６】
好ましくは、本発明の二重特異的抗体は、抗ヒトＴＬＲ２抗体及び抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントを含み、該抗ヒトＴＬＲ２抗体がＩｇＧ抗体であり、かつ、該抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントがｓｃＦｖである、四価の二重特異的抗体である。以下、当該構造の四価の二重特異的抗体を、ＩｇＧ（ＴＬＲ２）−ｓｃＦｖ（ＴＬＲ４）とも称する。
【００２７】
本発明の二重特異的抗体がＩｇＧ（ＴＬＲ２）−ｓｃＦｖ（ＴＬＲ４）である場合、抗ヒトＴＬＲ２抗体の定常領域としては、どのようなサブクラスの定常領域（例えば、重鎖としてＩｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３又はＩｇγ４、軽鎖としてＩｇλ又はＩｇκの定常領域）も選択可能であり得るが、重鎖定常領域としては、ヒトＩｇγ１定常領域が好ましく、軽鎖定常領域としては、ヒトＩｇκ定常領域が好ましい。
【００２８】
抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖定常領域として用いるヒトＩｇγ１定常領域としては、例えば、配列番号８のアミノ酸番号１２１から４５０からなるアミノ酸配列が挙げられる。
【００２９】
抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖定常領域としてヒトＩｇγ１定常領域を用いる場合、抗体の抗体依存細胞傷害活性や補体依存傷害活性を低下させるためにＬ２３４Ａ（ＫａｂａｔらのＥＵインデックスに従うアミノ酸２３４位のロイシンのアラニンでの置換）、Ｌ２３５Ａ（ＫａｂａｔらのＥＵインデックスに従うアミノ酸２３５位のロイシンのアラニンでの置換）等のアミノ酸変異を導入したヒトＩｇγ１定常領域を用いることもできる（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９２、Ｖｏｌ．２９、Ｎｏ．５、ｐ．６３３−６３９）。また、体内動態の観点から、血液中より抗体を速やかに消失させるためにＩ２５３Ａ（ＫａｂａｔらのＥＵインデックスに従うアミノ酸２５３位のイソロイシンのアラニンでの置換）等のアミノ酸変異を導入したヒトＩｇγ１定常領域を用いることもできる（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７、Ｖｏｌ．１５８、ｐ．２２１１−２２１７）。本明細書中で使用される抗体の定常領域におけるアミノ酸変異導入に関する残基番号については、ＥＵインデックス（Ｋａｂａｔら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、  ５ｔｈ  Ｅｄ．、  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、  Ｂｅｔｈｅｓｄａ）に従う。
【００３０】
好ましくは、抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖定常領域は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域又はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＩ２５３Ａのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である。より好ましくは、抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖定常領域は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＩ２５３Ａのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域であり、このようなヒトＩｇγ１定常領域としては、例えば、配列番号４のアミノ酸番号１２１から４５０からなるアミノ酸配列が挙げられる。
【００３１】
抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖定常領域として用いるヒトＩｇκ定常領域としては、例えば、配列番号６のアミノ酸番号１１４から２１９からなるアミノ酸配列が挙げられる。
【００３２】
好ましくは、抗ヒトＴＬＲ２抗体は、ヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域及びヒトＩｇκ定常領域である軽鎖定常領域を含む抗ヒトＴＬＲ２抗体であり、より好ましくは、該ヒトＩｇγ１定常領域が、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＩ２５３Ａのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域である。
【００３３】
例えば、抗ヒトＴＬＲ２抗体としては、配列番号４のアミノ酸番号１から４５０までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＴＬＲ２抗体が挙げられる。
【００３４】
本発明の二重特異的抗体がＩｇＧ（ＴＬＲ２）−ｓｃＦｖ（ＴＬＲ４）である場合、抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントは、重鎖可変領域のＣ末端に軽鎖可変領域のＮ末端がリンカーを介して連結された構造（重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域）を有するｓｃＦｖ、及び軽鎖可変領域のＣ末端に重鎖可変領域のＮ末端がリンカーを介して連結された構造（軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域）を有するｓｃＦｖのいずれであってもよく、好ましくは、重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域の構造を有するｓｃＦｖである。ｓｃＦｖ中の「リンカー」は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを連結する任意の長さのペプチド（ペプチドリンカー）であり、好ましくは、少なくとも５個、より好ましくは、少なくとも１０個、さらに好ましくは、１５〜５０個のアミノ酸を有するペプチドである。好ましいペプチドリンカーとしては、アミノ酸配列ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（（Ｇｌｙ）4Ｓｅｒとも表す）を含むペプチドリンカー（本明細書中「ＧＳリンカー」と称する）であり、好ましくは、複数の、より好ましくは、３〜５個の（Ｇｌｙ）4Ｓｅｒを含む。
【００３５】
例えば、抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントとしては、配列番号４のアミノ酸番号４９１から７３２までのアミノ酸配列からなるｓｃＦｖである、抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントが挙げられる。
【００３６】
１つの実施形態において、ＩｇＧ（ＴＬＲ２）−ｓｃＦｖ（ＴＬＲ４）である本発明の二重特異的抗体としては、抗ヒトＴＬＲ２抗体が、配列番号４のアミノ酸番号１から４５０までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６のアミノ酸配列からなる軽鎖を含み、抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントが、配列番号４のアミノ酸番号４９１から７３２までのアミノ酸配列からなるｓｃＦｖである、二重特異的抗体である。
【００３７】
好ましくは、ＩｇＧ（ＴＬＲ２）−ｓｃＦｖ（ＴＬＲ４）である本発明の二重特異的抗体において、抗ヒトＴＬＲ２抗体の各重鎖のＣ末端に抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントのＮ末端がリンカーを介して連結されている。このような二重特異的抗体の構造を図１に示す。
【００３８】
抗ヒトＴＬＲ２抗体の各重鎖のＣ末端に抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントのＮ末端を連結するリンカーは、両方を連結する任意の長さのペプチド（ペプチドリンカー）であり、好ましくは、少なくとも５個、より好ましくは、少なくとも１０個、さらに好ましくは、１５〜５０個のアミノ酸を有するペプチドである。好ましいペプチドリンカーとしては、ＧＳリンカーであり、好ましくは、複数の、より好ましくは、５〜１０個の（Ｇｌｙ）4Ｓｅｒを含む。このようなリンカーとしては、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカーが挙げられる。
【００３９】
１つの実施形態において、ＩｇＧ（ＴＬＲ２）−ｓｃＦｖ（ＴＬＲ４）である本発明の二重特異的抗体としては、抗ヒトＴＬＲ２抗体が、配列番号４のアミノ酸番号１から４５０までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６のアミノ酸配列からなる軽鎖を含み、抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントが、配列番号４のアミノ酸番号４９１から７３２までのアミノ酸配列からなるｓｃＦｖであり、該抗ヒトＴＬＲ２抗体の各重鎖のＣ末端に該抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントのＮ末端がリンカーを介して連結されている、二重特異的抗体である。抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖のＣ末端に抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントのＮ末端がリンカーを介して連結されている融合体を、「抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体」とも称する。好ましくは、該二重特異的抗体において、該抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖と抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントを連結するリンカーがＧＳリンカーであり、より好ましくは、該ＧＳリンカーが配列番号９のアミノ酸配列からなる。このような本発明の二重特異的抗体としては、配列番号４のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体、及び配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖を含む、二重特異的抗体が挙げられる。
【００４０】
一般的に、抗体は、細胞で発現させた場合、翻訳後に修飾を受けることが知られている。翻訳後修飾の例としては、重鎖Ｃ末端のリジンのカルボキシペプチダーゼによる切断、重鎖及び軽鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾等が挙げられ、種々の抗体において、重鎖Ｃ末端のリジンが欠失することや重鎖Ｎ末端のグルタミンの大部分がピログルタミン酸への修飾を受けることが知られている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２００８、Ｖｏｌ．９７、ｐ．２４２６−ｐ２４４７）。
【００４１】
本発明のヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体には、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する、翻訳後修飾を受けた二重特異的抗体も含まれる。例えば、完全長の重鎖を有する二重特異的抗体だけではなく、Ｃ末端のリジンを欠く重鎖を有する二重特異的抗体も含まれる。また、Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸がピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾を受けた二重特異的抗体も含まれる。このようなＮ末端のピログルタミル化又はＣ末端側リジン欠失による翻訳後修飾が抗体の活性に影響を及ぼすものではないことも当該分野で知られている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．３４８、２００６、ｐ．２４−３９）。
【００４２】
一つの実施形態において、本発明のヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体には、以下に記載の二重特異的抗体も含まれる。
配列番号４のアミノ酸配列からなり、配列番号４のアミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体、及び配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖を含む、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体。
【００４３】
本発明は、以下の特徴を有するヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体をも包含する。
ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体であって、
１）配列番号４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号９９から１０９までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域、並びに配列番号６のアミノ酸番号２４から３９までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸番号５５から６１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸番号９４から１０２までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域；並びに
２）配列番号４のアミノ酸番号５２１から５２５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５４０から５５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号５８９から５９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域、並びに配列番号４のアミノ酸番号６４８から６５８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号６７４から６８０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号７１３から７２１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域
を含む、二重特異的抗体。
【００４４】
本発明の二重特異的抗体の活性を評価する方法として、ヒトＴＬＲ２及び／又はヒトＴＬＲ４に対する結合活性や中和活性を評価する方法が挙げられる。
【００４５】
ヒトＴＬＲ２又はヒトＴＬＲ４に対する結合活性を有するか否かは、当該分野で公知の測定方法を用いて確認することができる。このような測定方法として、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析、Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）等の方法が挙げられる。例えば、ヒトＴＬＲ２に対する結合活性についてＳＰＲ解析を行う場合、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥヘルスケア社）を用いることができ、この場合、ヒトＴＬＲ２蛋白質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）をセンサーチップの表面に固相化し、被験抗体を流路に添加して、被験抗体とヒトＴＬＲ２蛋白質との解離定数（ＫＤ）を解析することによって、被験抗体のヒトＴＬＲ２に対する結合活性を評価することができる。具体的な評価方法としては、例えば、後記実施例５に記載されるような方法を用いることができる。別の例として、ヒトＴＬＲ４に対する結合活性についてＥＬＩＳＡを用いて評価する場合、ヒトＴＬＲ４及びＭＤ２複合体（以下、ヒトＴＬＲ４／ＭＤ２と称する）蛋白質をＥＬＩＳＡ用プレートに固定化し、これに対して被験抗体を添加して反応させた後、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の酵素で標識した抗ＩｇＧ抗体等の二次抗体を反応させ、洗浄した後、その活性を検出する試薬（例えば、ＨＲＰ標識の場合、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；ＭＯＳ社））等を用いた活性測定により二次抗体の結合を同定することによって、被験抗体のヒトＴＬＲ４に対する結合活性を評価することができる。具体的な評価方法としては、例えば、後記実施例９に記載されるような方法を用いることができる。
【００４６】
ヒトＴＬＲ２に対する抗体の中和活性とは、ヒトＴＬＲ２への結合によりヒトＴＬＲ２を介してもたらされる任意の生物活性を阻害する活性を意味し、これらの１つ又は複数の生物活性を指標に評価することができる。例えば、このようなヒトＴＬＲ２に対する中和活性としては、ヒト単球系細胞ＴＨＰ１−ｘＢｌｕｅ細胞におけるＰａｍ２ＣＳＫ４誘発性のＡＰ産生を阻害する活性が挙げられ、活性の具体的な評価方法としては、例えば、後記実施例６に記載されるような方法を用いることができる。
【００４７】
ヒトＴＬＲ４に対する中和活性とは、ヒトＴＬＲ４への結合によりヒトＴＬＲ４を介してもたらされる任意の生物活性を阻害する活性を意味し、これらの１つ又は複数の生物活性を指標に評価することができる。例えば、このようなヒトＴＬＲ４に対する中和活性としては、ヒト単球系細胞株であるＵ９３７細胞におけるＬＰＳ誘発性のＩＬ−６産生を阻害する活性が挙げられる。
【００４８】
本発明の二重特異的抗体は、ヒトＴＬＲ２とヒトＴＬＲ４に対する中和活性を有する。ヒトＴＬＲ２とヒトＴＬＲ４に対する中和活性を有するとは、ヒトＴＬＲ２に対する中和活性とヒトＴＬＲ４に対する中和活性の両方を有することを意味する。ヒトＴＬＲ２とヒトＴＬＲ４に対する中和活性を有するか否かは、前記ヒトＴＬＲ２又はヒトＴＬＲ４に対する中和活性の評価方法をそれぞれ用いて評価してもよく、ヒトＴＬＲ２とヒトＴＬＲ４の両方を発現する細胞を用いてヒトＴＬＲ２とヒトＴＬＲ４を介する該細胞の１つ又は複数の生物活性を阻害する活性を評価してもよい。後者の評価方法の例としては、例えば、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４を発現するヒト末梢血単核球細胞における敗血症の原因菌である緑膿菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ−１（例えば、ＡＴＣＣ：ＢＡＡ−４７）誘発性のＴＮＦα産生を阻害する活性が挙げられる。このような活性を有する抗体は、ヒトＴＬＲ２とヒトＴＬＲ４に対する中和活性を有する抗体であると判断することができる。具体的な評価方法としては、例えば、後記実施例１０に記載されるような方法を用いることができる。
【００４９】
本発明のヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体は、本明細書に開示される、本発明の二重特異的抗体に含まれる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、並びに抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。本発明のヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体は、特に限定されるものではないが、例えば、後述の＜本発明の二重特異的抗体を生産する方法及び該方法により生産された二重特異的抗体＞に記載の方法に従い製造することができる。
【００５０】
本発明のヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体は、必要によりさらに精製された後、常法に従って製剤化され、免疫炎症性疾患、例えば、敗血症、急性腎障害、慢性腎臓病、急性呼吸促迫症候群、強皮症、急性膵炎、慢性閉塞性肺疾患等のヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４が病態形成に関与する疾患の予防又は治療に用いることができる。
【００５１】
＜本発明のポリヌクレオチド＞
本発明のポリヌクレオチドには、本発明のヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体に含まれる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域（配列番号４のアミノ酸番号１から１２０までのアミノ酸配列からなる）をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、該二重特異的抗体に含まれる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域（配列番号６のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる）をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、該二重特異的抗体に含まれる抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域（配列番号４のアミノ酸番号４９１から６０９までのアミノ酸配列からなる）をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は該二重特異的抗体に含まれる抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域（配列番号４のアミノ酸番号６２５から７３２までのアミノ酸配列からなる）をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。
【００５２】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体に含まれる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドであるか、該二重特異的抗体に含まれる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドであるか、該二重特異的抗体に含まれる抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドであるか、該二重特異的抗体に含まれる抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。例えば、該抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、配列番号３の塩基番号１から３６０までの塩基配列を含むポリヌクレオチド、該抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、配列番号５の塩基番号１から３３９までの塩基配列を含むポリヌクレオチド、該抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、配列番号３の塩基番号１４７１から１８２７までの塩基配列を含むポリヌクレオチド、該抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、配列番号３の塩基番号１８７３から２１９６までの塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００５３】
好ましい本発明のポリヌクレオチドとしては、例えば、本発明の二重特異的抗体がＩｇＧ（ＴＬＲ２）−ｓｃＦｖ（ＴＬＲ４）をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである、配列番号４のアミノ酸番号１から４５０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖のＣ末端に配列番号４のアミノ酸番号４９１から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントのＮ末端がリンカーを介して連結されている抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。前記抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、配列番号４のアミノ酸配列からなる該融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが好ましい。
【００５４】
１つの実施形態において、配列番号４のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられ、配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖のポリヌクレオチドとしては、配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００５５】
本発明のポリヌクレオチドは、その塩基配列に基づき、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。例えば、当該分野で公知の遺伝子合成方法を利用して合成することが可能である。このような遺伝子合成方法としては、ＷＯ９０／０７８６１に記載の抗体遺伝子の合成方法等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。また、本発明のポリヌクレオチドを一旦取得すれば、このポリヌクレオチドの所定の部位に変異を導入することによって、本発明の他のポリヌクレオチドを取得することも可能である。このような変異導入方法としては、部位特異的変異誘発法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．、１９８７、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ８．１−８．５）等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。
【００５６】
＜本発明の発現ベクター＞
本発明の発現ベクターには、本発明のヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体に含まれる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、該二重特異的抗体に含まれる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、該二重特異的抗体に含まれる抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び／又は該二重特異的抗体に含まれる抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターであって、本発明のヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体の生産に使用され得るベクターが含まれる。当該分野において種々のフォーマットの二重特異的抗体及びその生産方法が公知であり、本発明の発現ベクターは、これらの生産方法に従って、発現させる二重特異的抗体のフォーマットに応じて当業者に容易に構築され得る。
【００５７】
例えば、ＩｇＧ（ＴＬＲ２）−ｓｃＦｖ（ＴＬＲ４）である本発明の二重特異的抗体を生産するために使用される発現ベクターとしては、該二重特異的抗体に含まれる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域、該二重特異的抗体に含まれる抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域、及び該二重特異的抗体に含まれる抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと、該二重特異的抗体に含まれる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドのいずれか又は両方を含む発現ベクターが好ましい。
【００５８】
より好ましくは、ＩｇＧ（ＴＬＲ２）−ｓｃＦｖ（ＴＬＲ４）である本発明の二重特異的抗体を生産するために使用される発現ベクターは、配列番号４のアミノ酸番号１から４５０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖のＣ末端に配列番号４のアミノ酸番号４９１から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントのＮ末端がリンカーを介して連結されている抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと、配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドのいずれか又は両方を含む発現ベクターである。
【００５９】
さらに好ましくは、ＩｇＧ（ＴＬＲ２）−ｓｃＦｖ（ＴＬＲ４）である本発明の二重特異的抗体を生産するために使用される発現ベクターは、配列番号４のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと、配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドのいずれか又は両方を含む発現ベクターである。
【００６０】
ポリヌクレオチドを発現させるために用いる発現ベクターとしては、真核細胞（例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母）及び／又は原核細胞（例えば、大腸菌）の各種の宿主細胞中で、本発明のヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体に含まれる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、該二重特異的抗体に含まれる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、該二重特異的抗体に含まれる抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び／又は該二重特異的抗体に含まれる抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを発現し、これらポリペプチドを産生できるものである限り、特に制限されるものではないが、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）等が挙げられ、好ましくは、ｐＥＥ６．４やｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ社）を使用することができる。また、ＡＧ−γ１やＡＧ−κ（例えば、ＷＯ９４／２０６３２を参照）等の予めヒトＩｇ定常領域遺伝子を有する発現ベクターに可変領域遺伝子断片を導入して抗体遺伝子を発現することもできる。
【００６１】
宿主細胞として、動物細胞、昆虫細胞、又は酵母を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドンを含み得る。また、この場合、エンハンサー配列、本発明の二重特異的抗体又はその重鎖可変領域若しくは軽鎖可変領域をコードする遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域、分泌シグナル配列、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、あるいは複製可能単位などを含んでいてもよい。一方、宿主細胞として、大腸菌を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドン、ターミネーター領域及び複製可能単位を含み得る。また、本発明の発現ベクターは、目的に応じて通常用いられる選択マーカー（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子）を含んでいてもよい。
【００６２】
本発明の発現ベクターは、ポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。動物細胞で本発明のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０などのウイルス由来プロモーター、アクチンプロモーター、ＥＦ（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）１αプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。宿主細胞が大腸菌（例えば、エシェリキア属菌）の場合、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、ｔａｃプロモーターなどが挙げられる。また、酵母中での発現用プロモーターとしては、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが挙げられる。
【００６３】
＜本発明の形質転換された宿主細胞＞
本発明の形質転換された宿主細胞は、本発明の発現ベクターで形質転換されている限り、特に限定されるものではないが、例えば、ＩｇＧ（ＴＬＲ２）−ｓｃＦｖ（ＴＬＲ４）である本発明の二重特異的抗体を生産するために使用される、本発明の形質転換された宿主細胞として、該二重特異的抗体に含まれる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域、該二重特異的抗体に含まれる抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域、及び該二重特異的抗体に含まれる抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと、該二重特異的抗体に含まれる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドのいずれか又は両方を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞が挙げられる。
【００６４】
ＩｇＧ（ＴＬＲ２）−ｓｃＦｖ（ＴＬＲ４）である本発明の形質転換された宿主細胞には、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞が含まれる。
（ａ）配列番号４のアミノ酸番号１から１２０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号４のアミノ酸番号４９１から６０９までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号４のアミノ酸番号６２５から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、配列番号６のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸番号１から１２０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号４のアミノ酸番号４９１から６０９までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号４のアミノ酸番号６２５から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号６のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞； 
（ｃ）配列番号４のアミノ酸番号１から１２０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号４のアミノ酸番号４９１から６０９までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号４のアミノ酸番号６２５から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞；並びに
（ｄ）配列番号６のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
【００６５】
１つの実施形態において、本発明の形質転換された宿主細胞は、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞である。
（ａ）配列番号４のアミノ酸番号１から４５０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖のＣ末端に配列番号４のアミノ酸番号４９１から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントのＮ末端がリンカーを介して連結されている抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸番号１から４５０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖のＣ末端に配列番号４のアミノ酸番号４９１から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントのＮ末端がリンカーを介して連結されている抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
（ｃ）配列番号４のアミノ酸番号１から４５０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖のＣ末端に配列番号４のアミノ酸番号４９１から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントのＮ末端がリンカーを介して連結されている抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞；及び
（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
【００６６】
１つの実施形態において、本発明の形質転換された宿主細胞は、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞である
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞；及び
（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
【００６７】
好ましくは、ＩｇＧ（ＴＬＲ２）−ｓｃＦｖ（ＴＬＲ４）である本発明の形質転換された宿主細胞としては、配列番号４のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞、及び、配列番号４のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞が挙げられる。
【００６８】
本発明のＩｇＧ（ＴＬＲ２）−ｓｃＦｖ（ＴＬＲ４）を生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、ＩｇＧ（ＴＬＲ２）−ｓｃＦｖ（ＴＬＲ４）を発現させる工程を包含している限り、特に限定されるものではない。該方法で使用される好ましい宿主細胞としては、前述の好ましい本発明の形質転換された宿主細胞が挙げられる。
【００６９】
形質転換する宿主細胞としては、使用する発現ベクターに適合し、該発現ベクターで形質転換されて、抗体を発現することができるものである限り、特に限定されるものではないが、例えば、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞あるいは人工的に樹立された細胞など種々の細胞（例えば、動物細胞（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、大腸菌（エシェリキア属菌など）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）など）が挙げられ、好ましくは、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、２９３細胞、ＮＳ０細胞等の培養細胞を使用することができる。
【００７０】
宿主細胞を形質転換する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等を用いることができる。
【００７１】
＜本発明の二重特異的抗体を生産する方法及び該方法により生産された二重特異的抗体＞
本発明のヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体を生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体を発現させる工程を包含している限り、特に限定されるものではない。該方法で使用される好ましい宿主細胞としては、前述の好ましい本発明の形質転換された宿主細胞が挙げられる。
【００７２】
一つの実施形態において、ＩｇＧ（ＴＬＲ２）−ｓｃＦｖ（ＴＬＲ４）である本発明の二重特異的抗体を生産する方法には、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体を発現させる工程を包含するヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体を生産する方法が含まれる。
（ａ）配列番号４のアミノ酸番号１から１２０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号４のアミノ酸番号４９１から６０９までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号４のアミノ酸番号６２５から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、配列番号６のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸番号１から１２０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号４のアミノ酸番号４９１から６０９までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号４のアミノ酸番号６２５から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号６のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞；並びに 
（ｃ）配列番号４のアミノ酸番号１から１２０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号４のアミノ酸番号４９１から６０９までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号４のアミノ酸番号６２５から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞、並びに、配列番号６のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
【００７３】
１つの実施形態において、本発明のヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体を生産する方法には、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体を発現させる工程を包含する、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体を生産する方法が含まれる。
（ａ）配列番号４のアミノ酸番号１から４５０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖のＣ末端に配列番号４のアミノ酸番号４９１から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントのＮ末端がリンカーを介して連結されている抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸番号１から４５０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖のＣ末端に配列番号４のアミノ酸番号４９１から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントのＮ末端がリンカーを介して連結されている抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞；並びに
（ｃ）配列番号４のアミノ酸番号１から４５０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖のＣ末端に配列番号４のアミノ酸番号４９１から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体フラグメントのＮ末端がリンカーを介して連結されている抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞、及び、配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
【００７４】
１つの実施形態において、本発明のヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体を生産する方法には、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体を発現させる工程を包含する、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体を生産する方法が含まれる。
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞；及び
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞、及び、配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
【００７５】
形質転換された宿主細胞の培養は公知の方法により行うことができる。培養条件、例えば、温度、培地のｐＨ、及び培養時間は、適宜選択される。宿主細胞が動物細胞の場合、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９５９、Ｖｏｌ．１３０、Ｎｏ．３３７３、ｐ．４３２−７）、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９５９、Ｖｏｌ．８、ｐ．３９６）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．、１９６７、Ｖｏｌ．１９９、ｐ．５１９）、１９９培地（Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、１９５０、Ｖｏｌ．７３、ｐ．１−８）等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行われる。宿主細胞が昆虫細胞の場合、培地としては、例えば、胎児牛血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８５、Ｖｏｌ．８２、ｐ．８４０４）等を用いることができる。培地のｐＨは約５〜８であるのが好ましく、培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約２０〜４０℃で約１５〜１００時間行われる。宿主細胞が大腸菌又は酵母である場合、培地としては、例えば、栄養源を含有する液体培地が適当である。栄養培地は、形質転換された宿主細胞の生育に必要な炭素源、無機窒素源又は有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源又は有機窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが挙げられる。所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類など）、抗生物質（例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）を含んでいてもよい。培地のｐＨは約５〜８であるのが好ましい。宿主細胞が大腸菌の場合、好ましい培地としては、例えば、ＬＢ培地、Ｍ９培地（Ｍｏｌ．Ｃｌｏ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｖｏｌ．３、Ａ２．２）等を用いることができる。培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約１４〜３９℃で約３〜２４時間行われる。宿主細胞が酵母の場合、培地としては、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８０、Ｖｏｌ．７７、ｐ．４５０５）等を用いることができる。培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行われる。上述のような培養により、本発明のヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体を発現させることができる。
【００７６】
本発明のヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体を生産する方法は、上述のような形質転換された宿主細胞を培養し、本発明の二重特異的抗体を発現させる工程に加えて、さらには、該形質転換された宿主細胞から本発明の二重特異的抗体を回収、好ましくは単離又は精製する工程を含むことができる。単離又は精製方法としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過など、分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。好ましくは、培養上清中に蓄積された抗体は、各種クロマトグラフィー、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムを用いた各種カラムクロマトグラフィーにより精製することができる。
【００７７】
＜本発明の医薬組成物＞
本発明の医薬組成物には、本発明のヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体及び薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物が含まれる。本発明の医薬組成物は、当該分野において通常用いられている賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。これら医薬組成物の剤型の例としては、例えば、注射剤、点滴用剤等の非経口剤が挙げられ、静脈内投与、皮下投与等により投与することができる。また、製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた担体や添加剤を使用することができる。
【００７８】
本発明の医薬組成物は、複数種の本発明のヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体を含み得る。例えば、翻訳後修飾を受けていない抗体、及び、該抗体の翻訳後修飾により生じた抗体を含有する医薬組成物も本発明に含まれる。
【００７９】
１つの実施形態において、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体を含有する本発明の医薬組成物には、下記に記載の医薬組成物も含まれる。
１）配列番号４のアミノ酸番号１から１２０までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域、及び配列番号６のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域、並びに
２）配列番号４のアミノ酸番号４９１から６０９までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸番号６２５から７３２までのアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域、
を含む、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体、並びに、
該二重特異的抗体の翻訳後修飾により生じた二重特異的抗体である、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体、
を含有する医薬組成物。
【００８０】
本発明の医薬組成物には、重鎖Ｃ末端リジンの欠失した二重特異的抗体、Ｎ末端翻訳後修飾を受けた二重特異的抗体、重鎖Ｃ末端リジンを欠失しＮ末端翻訳後修飾を受けた二重特異的抗体及び／又は重鎖Ｃ末端リジンを有しＮ末端翻訳後修飾を受けていない二重特異的抗体を含有する医薬組成物も含まれる。
【００８１】
１つの実施形態において、下記（１）及び（２）のヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体を含有する医薬組成物も本発明に含まれる。
（１）配列番号４のアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体、及び配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖を含む、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体。
（２）配列番号４のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体、及び配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖を含む、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体。
【００８２】
さらに１つの実施形態において、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体を含有する本発明の医薬組成物には、下記に記載の医薬組成物も含まれる。
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖を含むヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【００８３】
上記製剤化に当たっての本発明のヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体の添加量は、患者の症状の程度や年齢、使用する製剤の剤型、あるいは抗体の結合力価等により異なるが、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ程度を用いることができる。
【００８４】
本発明の医薬組成物は、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４が病態形成に関与する免疫炎症性疾患、例えば、敗血症、急性腎障害、慢性腎臓病、急性呼吸促迫症候群、強皮症、急性膵炎、慢性閉塞性肺疾患等の予防又は治療剤として用いることができる。
【００８５】
本発明には、本発明のヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体を含む、免疫炎症性疾患の予防又は治療用医薬組成物が含まれる。また、本発明には、該二重特異的抗体の治療有効量を投与する工程を包含する、免疫炎症性疾患を予防又は治療する方法が含まれる。また、本発明には、免疫炎症性疾患の予防又は治療に使用するための、本発明の二重特異的抗体が含まれる。さらに、本発明には免疫炎症性疾患の予防又は治療用医薬組成物製造における、本発明の二重特異的抗体の使用が含まれる。
【００８６】
＜本発明の抗ヒトＴＬＲ２抗体及びそれを含有する医薬組成物＞
本発明は、配列番号８のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸番号９９から１０９までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域、並びに、配列番号６のアミノ酸番号２４から３９までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸番号５５から６１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸番号９４から１０２までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントを包含する。
【００８７】
また、本発明は、配列番号８のアミノ酸番号１から１２０までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号６のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメント、並びに、該抗体又はその抗原結合フラグメントの翻訳後修飾により生じた抗体又はその抗原結合フラグメントも含む。翻訳後修飾の例として、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端のリジン欠失が挙げられる。本発明の抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントにおいて好ましい重鎖定常領域及び軽鎖定常領域は、前述の＜本発明の二重特異的抗体＞における抗ヒトＴＬＲ２抗体について記載したものと同様である。
【００８８】
一つの実施形態において、本発明の抗ヒトＴＬＲ２抗体は、下記の特徴を有する抗ヒトＴＬＲ２抗体である。
配列番号８のアミノ酸番号１から４５０までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＴＬＲ２抗体。
【００８９】
さらに一つの実施形態において、本発明の抗ヒトＴＬＲ２抗体は、下記の特徴を有する抗ヒトＴＬＲ２抗体である。
配列番号８のアミノ酸番号１から４４９までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＴＬＲ２抗体。
【００９０】
本発明の抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントは、前述の本発明の二重特異的抗体に含まれる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を各々コードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、前述の＜本発明の発現ベクター＞、＜本発明の形質転換された宿主細胞＞及び＜本発明の二重特異的抗体を生産する方法及び該方法により生産された二重特異的抗体＞の記載を参照して、当業者に容易に生産され得る。
【００９１】
本発明には、本発明の抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメント、及び薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物も含まれる。本発明の医薬組成物は、当該分野において通常用いられている賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。これら医薬組成物の剤型の例としては、例えば、注射剤、点滴用剤等の非経口剤が挙げられ、静脈内投与、皮下投与等により投与することができる。製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、添加剤等を使用することができる。
【００９２】
本発明の医薬組成物は、複数種の本発明の抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントを含み得る。例えば、翻訳後修飾を受けていない抗体又はその抗原結合フラグメント、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの翻訳後修飾により生じた抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する医薬組成物も本発明に含まれる。
【００９３】
１つの実施形態において、抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する本発明の医薬組成物には、下記に記載の医薬組成物も含まれる。
配列番号８のアミノ酸番号１から１２０までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号６のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメント、並びに、該抗体又はその抗原結合フラグメントの翻訳後修飾により生じた抗体又はその抗原結合フラグメントである、抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する医薬組成物。
【００９４】
１つの実施形態において、抗ヒトＴＬＲ２抗体を含有する本発明の医薬組成物には、下記（１）から（４）までのヒトＴＬＲ２に結合する抗体を含有する医薬組成物も本発明に含まれる。
（１）配列番号８のアミノ酸番号１から４４９までのアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＴＬＲ２抗体。
（２）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＴＬＲ２抗体。
（３）配列番号８のアミノ酸番号１から４４９までのアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＴＬＲ２抗体。
（４）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＴＬＲ２抗体。
【００９５】
さらに一つの実施形態において、抗ヒトＴＬＲ２抗体を含有する本発明の医薬組成物には、下記のヒトＴＬＲ２に結合する抗体を含有する医薬組成物も本発明に含まれる。
配列番号８のアミノ酸番号１から４５０までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＴＬＲ２抗体、配列番号８のアミノ酸番号１から４４９までのアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号６のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＴＬＲ２抗体、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【００９６】
上記製剤化に当たっての本発明の抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントの添加量は、患者の症状の程度や年齢、使用する製剤の剤型、あるいは抗体の結合力価等により異なるが、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ程度を用いることができる。
【００９７】
本発明の抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントは、必要によりさらに精製された後、常法に従って製剤化され、敗血症、がん等のヒトＴＬＲ２が病態形成に関与する疾患の治療に用いることができる。
【００９８】
＜融合抗体及び修飾抗体＞
当業者であれば、当該分野で公知の方法を用いて、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体、抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントを、他のペプチド又は蛋白質を融合した融合抗体として作製することや、修飾剤を結合させた修飾抗体として作製することも可能である。本発明のヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体、抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントには、このような融合体や修飾体の形態の抗体又は抗原結合フラグメントも含まれる。本発明のヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体が融合抗体としてヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４への結合活性を有している、或いは本発明の抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントが融合抗体としてヒトＴＬＲ２への結合活性を有している限り、融合に用いられる他のペプチド又は蛋白質は特に限定されず、例えば、ヒト血清アルブミン、各種タグペプチド、人工ヘリックスモチーフペプチド、マルトース結合蛋白質、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、各種毒素、その他多量体化を促進しうるペプチド又は蛋白質等が挙げられる。本発明のヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体が融合抗体としてヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４への結合活性を有している、或いは本発明の抗ヒトＴＬＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントが修飾抗体としてヒトＴＬＲ２への結合活性を有している限り、修飾に用いられる修飾剤は特に限定されず、例えば、ポリエチレングリコール、糖鎖、リン脂質、リポソーム、低分子化合物等が挙げられる。
【００９９】
本発明についてさらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供するが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１００】
市販のキット又は試薬等を用いた部分については、特に断りのない限り添付のプロトコールに従って実験を行った。また、便宜上、濃度ｍｏｌ／ＬをＭとして表す。例えば、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液は１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液であることを意味する。【０１０１】
（実施例１：抗ヒトＴＬＲ２抗体産生ハイブリドーマの作製）
ヒトモノクローナル抗体開発技術「ベロシミューン」（ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ社（米国特許６５９６５４１号））マウスを用いて抗ヒトＴＬＲ２抗体を作製した。ベロシミューンマウスに、免疫反応を惹起するアジュバントと共に、ヒトＴＬＲ２蛋白質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社、２６１６‐ＴＲ‐０５０）を免疫した。常法に従い、免疫したマウスの脾臓やリンパ節等を摘出しリンパ球を収集し、これをマウスミエローマ細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８１）と細胞融合することでハイブリドーマを作製した。モノクローン化を行い無血清培地であるＣＤハイブリドーマメディウム（ライフテクノロジーズ社）で培養した。得られた培養上清からプロテインＧカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いて抗体を精製した。ベロシミューン技術では、内因性の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域が対応するヒト可変領域で置換されたトランスジェニックマウスを用いるため、得られた抗体は、ヒト抗体の可変領域とマウス抗体の定常領域を有する抗体（キメラ抗体とも称する）である。【０１０２】
（実施例２：抗ヒトＴＬＲ２抗体の中和活性評価）
実施例１で同定した抗ヒトＴＬＲ２抗体の中和活性を評価するために、ヒトＴＬＲ２を内在的に発現するヒト単球系細胞であるＴＨＰ１−ｘＢｌｕｅ細胞を用いて、ＴＬＲ２／６アゴニストであるＰａｍ２ＣＳＫ４誘発アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）産生阻害アッセイを実施した。【０１０３】
その結果、３１−５Ｆ５−２Ｆ３と命名した抗ヒトＴＬＲ２抗体（キメラ抗体）がＡＰ産生を阻害し、ヒトＴＬＲ２に対する中和活性を有することが明らかとなった。【０１０４】
（実施例３：抗ヒトＴＬＲ２抗体の配列決定及び改変体作製）
抗ヒトＴＬＲ２抗体３１−５Ｆ５−２Ｆ３を産生するハイブリドーマから抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子の配列を解析し、配列決定を行った。【０１０５】
抗体の配列決定後、抗体の物性及び安定性向上のために、３１−５Ｆ５−２Ｆ３の重鎖及び軽鎖のＦＲを他のヒト抗体のＦＲと置き換え、抗ヒトＴＬＲ２抗体３１−５Ｆ５−２Ｆ３．ｍ１を作製した。【０１０６】
（実施例４：完全ヒト型抗ヒトＴＬＲ２抗体の作製）
実施例３で作製した抗体は、可変領域がヒト由来であり、定常領域がマウス由来の抗体である。そこで、哺乳細胞発現用ベクターＧＳベクター（Ｌｏｎｚａ社）を用いて、重鎖及び軽鎖の両遺伝子を含む発現ベクターを構築し、完全ヒト型抗体を作製した。具体的には、３１−５Ｆ５−２Ｆ３．ｍ１の抗体の重鎖可変領域遺伝子の５’側にシグナル配列（Ｎｉｇｅｌ  Ｗｈｉｔｔｌｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１９８７、Ｖｏｌ．１、Ｎｏ．６、ｐ．４９９−５０５．）をコードする遺伝子を、そして３’側にヒトＩｇγ１定常領域遺伝子（配列番号７の塩基番号３６１から１３５０までの塩基配列からなる）をそれぞれ繋げ、この重鎖遺伝子をＧＳベクターｐＥＥ６．４に挿入した。また軽鎖可変領域遺伝子の５’側にシグナル配列（Ｎｉｇｅｌ  Ｗｈｉｔｔｌｅら、前出）をコードする遺伝子を、そして３’側にヒトκ鎖の定常領域遺伝子（配列番号５の塩基番号３４０から６５７までの塩基配列からなる）をそれぞれ繋げ、この軽鎖遺伝子をＧＳベクターｐＥＥ１２．４に挿入した。【０１０７】
ｐＥＥ６．４に挿入した抗体の重鎖遺伝子配列、ｐＥＥ１２．４に挿入した抗体の軽鎖遺伝子配列をシーケンサーで解析し、その結果得られたアミノ酸配列から、Ｋａｂａｔらのデータベース（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＵＳ  Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ）を参照してＣＤＲ配列を決定した。【０１０８】
作製した３１−５Ｆ５−２Ｆ３．ｍ１の完全ヒト型抗体（完全ヒト型３１−５Ｆ５−２Ｆ３．ｍ１）の重鎖の塩基配列を配列番号７に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号８に、該抗体の軽鎖の塩基配列を配列番号５に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号６にそれぞれ示す。【０１０９】
配列番号８で示される重鎖の可変領域は、配列番号８のアミノ酸番号１から１２０までのアミノ酸配列からなり、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号８のアミノ酸番号３１から３５、５０から６６、９９から１０９までのアミノ酸配列からなる。配列番号６で示される軽鎖の可変領域は、配列番号６のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなり、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６のアミノ酸番号２４から３９、５５から６１、９４から１０２までのアミノ酸配列からなる。【０１１０】
抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子がそれぞれ挿入された前述のＧＳベクターを用いて、一過性発現及び恒常的発現の２種類の方法で抗体発現を行った。一過性発現については、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（ライフテクノロジーズ社）で約１００万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに培養されたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３細胞（ライフテクノロジーズ社）に対し、前述の重鎖及び軽鎖の両発現ベクターを遺伝子導入試薬２９３フェクチン（ライフテクノロジーズ社）を用いてトランスフェクトし、７日間培養した。又は、Ｅｘｐｉ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（ライフテクノロジーズ社）で約３００万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに培養されたＥｘｐｉ２９３細胞（ライフテクノロジーズ社）に対し、前述の重鎖及び軽鎖の両発現ベクターを遺伝子導入試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３（ライフテクノロジーズ社）を用いてトランスフェクトし、７日間培養した。又は、ＣＤ−ＣＨＯ  ｍｅｄｉｕｍ（ライフテクノロジーズ社）で約１０００万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに培養されたＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞（Ｌｏｎｚａ社）に対して、前述の重鎖及び軽鎖の両発現ベクターをエレクトロポレーション法を用いてトランスフェクトし、７日間培養した。培養上清をプロテインＡ又はプロテインＧカラム（共にＧＥヘルスケア社）を用いて精製し、完全ヒト型抗体の精製抗体を得た。恒常的発現については、抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子がそれぞれ挿入された前述のＧＳベクターをＮｏｔＩとＰｖｕＩで制限酵素切断し、ライゲーション用キットＬｉｇａｔｉｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ  Ｋｉｔ（ＮＩＰＰＯＮＧＥＮＥ社）又はライゲーション試薬Ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いてライゲーションを行い、重鎖と軽鎖の両遺伝子が挿入されたＧＳベクターを構築した。この発現ベクターは、完全長の重鎖及び軽鎖とグルタミン合成酵素をコードしており、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞へのトランスフェクションにより抗体を発現させた。培養上清をプロテインＡカラム又はプロテインＧカラムで精製し、完全ヒト型抗体の精製抗体を得た。【０１１１】
（実施例５：完全ヒト型抗ヒトＴＬＲ２抗体の結合活性評価）
実施例４で作製した完全ヒト型３１−５Ｆ５−２Ｆ３．ｍ１のヒトＴＬＲ２への結合活性を評価するために、ＳＰＲ解析を実施した。【０１１２】
ＳＰＲ解析においては、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥヘルスケア社）を用いた。ＣＭ５センサーチップ（ＧＥヘルスケア社、ＢＲ−１００５−３０）にＨｉｓ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社、２８−９９５０−５６）とＡｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社、ＢＲ−１０００−５０）を用いてＡｎｔｉ−Ｈｉｓ  ＩｇＧ（Ｈｉｓ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ付属）を固定した。流路Ｎｏ．１をリファレンスとし、この流路にはヒトＴＬＲ２蛋白質を結合させず、その他の流路（Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４）それぞれに、ＨＢＳ−ＥＰ＋  ｂｕｆｆｅｒ（ＧＥヘルスケア社、ＢＲ−１００６−６９）で０．６６μｇ／ｍＬに希釈したヒトＴＬＲ２蛋白質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社、２６１６−ＴＲ−０５０）を流速５μＬ／分にて２分間添加し固相化させた。その後、完全ヒト型３１−５Ｆ５−２Ｆ３．ｍ１をＨＢＳ−ＥＰ＋  ｂｕｆｆｅｒで２００ｎＭに希釈した溶液を、流速５０μＬ／分にて２分間添加し、完全ヒト型抗体とヒトＴＬＲ２の結合を測定した。次に、ＨＢＳ−ＥＰ＋  ｂｕｆｆｅｒを流速５０μＬ／分にて５分間添加し、完全ヒト型抗体とヒトＴＬＲ２の解離を測定した。Ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎａｌｙｔｅ  ｍｏｄｅｌ、ＲｍａｘをＦｉｔ  ｌｏｃａｌで解析し、結合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ）を算出し、ｋｄをｋａで割ることによって結合解離定数（ＫＤ）を算出した。【０１１３】
その結果、ＫＤは８８．５ｐＭであり、完全ヒト型３１−５Ｆ５−２Ｆ３．ｍ１がヒトＴＬＲ２に対する結合活性を有することが明らかとなった。【０１１４】
（実施例６：完全ヒト型抗ヒトＴＬＲ２抗体の中和活性評価）
実施例４で作製した完全ヒト型３１−５Ｆ５−２Ｆ３．ｍ１のヒトＴＬＲ２に対する中和活性を評価するために、ＴＨＰ１−ｘＢｌｕｅ細胞を用いて、Ｐａｍ２ＣＳＫ４誘発ＡＰ産生阻害アッセイを実施した。ＴＨＰ１−ｘＢｌｕｅ細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社、ｔｈｐｘ−ｓｐ）を、５×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように、９６ウェルプレート（ベクトンディッキンソン社）に７５μＬ／ウェルにてＲＰＭＩ１６４０培地（ライフテクノロジーズ社）下で播種した。細胞播種後すぐに、８５５ｎＭから２．１９ｐＭの範囲で９段階にＲＰＭＩ１６４０培地で希釈した完全ヒト型３１−５Ｆ５−２Ｆ３．ｍ１を２５μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で３０分間培養した。さらに、ＲＰＭＩ１６４０培地で希釈したＰａｍ２ＣＳＫ４（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社、ｔｌｒｌ−ｐｍ２ｓ；最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ）を２５μＬ添加した。コントロールとして、抗体の代わりにＲＰＭＩ１６４０培地を添加したウェル、Ｐａｍ２ＣＳＫ４の代わりにＲＰＭＩ１６４０培地を添加したウェルをそれぞれ準備した。一晩３７℃、５％ＣＯ2条件下で培養した後、培養上清を回収し、培養上清に含まれるＡＰ濃度を市販のＱｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）を用いて測定した。さらに抗体のＰａｍ２ＣＳＫ４誘発ＡＰ産生に対するＩＣ５０値を算出した。ＩＣ５０値算出にあたっては、抗体の代わりにＲＰＭＩ１６４０培地を添加したウェルを０％抑制コントロールとし、Ｐａｍ２ＣＳＫ４の代わりにＲＰＭＩ１６４０培地を添加したウェルを１００％抑制コントロールとして設定した。４パラメーターロジスティック曲線当てはめにより、ＩＣ５０値を算出した。【０１１５】
その結果、完全ヒト型３１−５Ｆ５−２Ｆ３．ｍ１はＡＰ産生を阻害し、ＩＣ５０値は９７．７ｐＭであった。完全ヒト型３１−５Ｆ５−２Ｆ３．ｍ１がヒトＴＬＲ２に対する中和活性を有することが明らかとなった。【０１１６】
（実施例７：完全ヒト型抗ヒトＴＬＲ２抗体の中和活性評価（２））
実施例４で作製した完全ヒト型３１−５Ｆ５−２Ｆ３．ｍ１のヒトＴＬＲ２に対する中和活性を評価するために、ＴＨＰ１−ｘＢｌｕｅ細胞を用いて、Ｐａｍ２ＣＳＫ４誘発ＡＰ産生阻害アッセイを実施した。比較抗体として、抗ヒトＴＬＲ２抗体である、Ｔ２．５（特許文献１）及びＯＰＮ３０５（特許文献３）を使用した。【０１１７】
実施例６と同様の実験を、完全ヒト型３１−５Ｆ５−２Ｆ３．ｍ１(８５５ｎＭから２．１９ｐＭの範囲で９段階ＲＰＭＩ１６４０培地希釈)、Ｔ２．５(８３３ｎＭから２．１３ｐＭの範囲で９段階ＲＰＭＩ１６４０培地希釈)、及びＯＰＮ３０５(８６１ｎＭから２．２０ｐＭの範囲で９段階ＲＰＭＩ１６４０培地希釈)の３種類の抗体に対して実施し、４パラメーターロジスティック曲線当てはめにより、ＩＣ５０値を算出した。【０１１８】
その結果、完全ヒト型３１−５Ｆ５−２Ｆ３．ｍ１はＰａｍ２ＣＳＫ４誘発によるＡＰ産生を完全に阻害し、ＩＣ５０値は１３０ｐＭであった。一方、Ｔ２．５及びＯＰＮ３０５のＰａｍ２ＣＳＫ４誘発によるＡＰ産生阻害は、部分的であった（図２）。【０１１９】
（実施例８：ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体の作製）
抗ヒトＴＬＲ２抗体（ＩｇＧ抗体）と抗ヒトＴＬＲ４抗体一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、２種の抗ヒトＴＬＲ２及び抗ヒトＴＬＲ４二重特異的抗体を作製した。本実施例で作製した二重特異的抗体は、前述のＩｇＧ（ＴＬＲ２）−ｓｃＦｖ（ＴＬＲ４）型の二重特異的抗体であり、抗ヒトＴＬＲ２抗体の各重鎖のＣ末端に抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖのＮ末端がリンカーを介して連結された構造を有する（図１）。【０１２０】
実施例４で作製した完全ヒト型３１−５Ｆ５−２Ｆ３．ｍ１の重鎖遺伝子の３’末端にＧＳリンカー（配列番号９）をコードする遺伝子をＰＣＲ法を用いて連結し、さらに当該ＧＳリンカーをコードする遺伝子の３’末端に抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖをコードする遺伝子をＰＣＲ法を用いて連結し、完全ヒト型３１−５Ｆ５−２Ｆ３．ｍ１の重鎖のＣ末端と抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖのＮ末端を当該ＧＳリンカーで連結した、抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体をコードする遺伝子を作製した。この遺伝子にコードされる該融合体に含まれる抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖは、配列番号４のアミノ酸番号４９１から７３２までのアミノ酸配列からなり、配列番号４のアミノ酸番号４９１から６０９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣ末端に配列番号４のアミノ酸番号６２５から７３２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のＮ末端がＧＳリンカー（配列番号１０）を介して連結された構造を有する。作製した抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体を、ＩＣＵ−１−Ｉｇγ１重鎖と称する。ＩＣＵ−１−Ｉｇγ１重鎖遺伝子の５’側にシグナル配列（Ｎｉｇｅｌ  Ｗｈｉｔｔｌｅら、前出）をコードする遺伝子を繋げ、ｐＥＥ６．４ベクターに挿入した。【０１２１】
また、ＩＣＵ−１−Ｉｇγ１重鎖のヒトＩｇγ１重鎖定常領域にＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＩ２５３Ａのアミノ酸変異を導入した改変型のＩＣＵ−１−Ｉｇγ１重鎖（ＩＣＵ−１−Ｉｇγ１−ＬＡｓｈ重鎖と称する）の遺伝子を作製し、当該遺伝子をｐＥＥ６．４ベクターに挿入した。【０１２２】
ＩＣＵ−１−Ｉｇγ１重鎖遺伝子又はＩＣＵ−１−Ｉｇγ１−ＬＡｓｈ重鎖遺伝子が挿入されたｐＥＥ６．４ベクターと、実施例４で作製した完全ヒト型３１−５Ｆ５−２Ｆ３．ｍ１の軽鎖遺伝子が挿入されたｐＥＥ１２．４を組み合わせて、実施例４に記載の抗体の発現及び精製法と同様の方法を用いて、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体を２種作製した。【０１２３】
ＩＣＵ−１−Ｉｇγ１重鎖と完全ヒト型３１−５Ｆ５−２Ｆ３．ｍ１の軽鎖を含む二重特異的抗体を完全ヒト型ＩＣＵ−１−Ｉｇγ１と称し、ＩＣＵ−１−Ｉｇγ１−ＬＡｓｈ重鎖と完全ヒト型３１−５Ｆ５−２Ｆ３．ｍ１の軽鎖を含む二重特異的抗体を完全ヒト型ＩＣＵ−１−Ｉｇγ１−ＬＡｓｈと称する。【０１２４】
完全ヒト型ＩＣＵ−１−Ｉｇγ１のＩＣＵ−１−Ｉｇγ１重鎖の塩基配列を配列番号１に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号２にそれぞれ示す。完全ヒト型ＩＣＵ−１−Ｉｇγ１−ＬＡｓｈのＩＣＵ−１−Ｉｇγ１−ＬＡｓｈ重鎖の塩基配列を配列番号３に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号４にそれぞれ示す。【０１２５】
配列番号２で示される抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体に含まれる抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖は、配列番号２のアミノ酸番号１から４５０までのアミノ酸配列からなる。【０１２６】
配列番号４で示される抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体に含まれる抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖は、配列番号４のアミノ酸番号１から４５０までのアミノ酸配列からなる。【０１２７】
配列番号２及び配列番号４で示される前記２つの抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体に含まれる抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖の可変領域は共通で、配列番号４のアミノ酸番号１から１２０までのアミノ酸配列からなり、該重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４のアミノ酸番号３１から３５、５０から６６、９９から１０９までのアミノ酸配列からなる。【０１２８】
配列番号２及び配列番号４で示される前記２つの抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体に含まれる抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖは共通で、配列番号４のアミノ酸番号４９１から７３２までのアミノ酸配列からなり、該抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖを構成する抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域は、配列番号４のアミノ酸番号４９１から６０９までのアミノ酸配列からなり、該重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４のアミノ酸番号５２１から５２５、５４０から５５６、５８９から５９８までのアミノ酸配列からなる。該抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖを構成する抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域は、配列番号４のアミノ酸番号６２５から７３２までのアミノ酸配列からなり、該軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４のアミノ酸番号６４８から６５８、６７４から６８０、７１３から７２１までのアミノ酸配列からなる。【０１２９】
完全ヒト型ＩＣＵ−１−Ｉｇγ１及び完全ヒト型ＩＣＵ−１−Ｉｇγ１−ＬＡｓｈの軽鎖の塩基配列は共通で、その塩基配列を配列番号５に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号６にそれぞれ示す。配列番号６で示される抗ヒトＴＬＲ２抗体軽鎖の可変領域は、配列番号６のアミノ酸番号１から１１３までのアミノ酸配列からなり、該軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６のアミノ酸番号２４から３９、５５から６１、９４から１０２までのアミノ酸配列からなる。【０１３０】
（実施例９：ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体の結合活性評価）
実施例８で作製した２種の二重特異的抗体のヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に対する各々の結合活性を評価するために、ヒトＴＬＲ２蛋白質及びヒトＴＬＲ４／ＭＤ２蛋白質を用いて、ＥＬＩＳＡを行った。マキシソープ３８４ウェルプレートクリアー（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に、ＰＢＳ（ライフテクノロジーズ社、１００１０−０２３）で１０μｇ／ｍＬの濃度に希釈したヒトＴＬＲ２蛋白質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社、２６１６−ＴＲ−０５０）を、１５μＬ／ウェル添加し、室温で１時間固相化した。同様にヒトＴＬＲ４／ＭＤ２蛋白質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社、３１４６−ＴＭ／ＣＦ）を１０μｇ／ｍＬで１５μＬ／ウェル添加し、室温で１時間固相化した。１時間後に洗浄液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ））で３回ウェルを洗浄し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ（ナカライテスク社、０３９５３−９５）を１００μＬ／ウェル添加し室温で１時間ブロッキングを行った。再び洗浄液で３回洗浄し、実施例８で作製した２種の二重特異的抗体をヒトＴＬＲ２蛋白質を固相化したウェル、ヒトＴＬＲ４／ＭＤ２蛋白質を固相化したウェルそれぞれに対して１５μＬ／ウェル添加した。これらの抗体の希釈はＰＢＳ及びＢｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅを等量混合した反応緩衝液を用いて行い、７５．０ｎＭから４．４７ｆＭまで１３段階に希釈した。室温で１時間静置した後に、洗浄液で３回洗浄を行った。Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ−ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｃｒｏｓｓ−ａｄｓｏｒｂｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢＥＴＨＹＬ社、Ａ８０−２１９Ｐ）を４０００倍に反応緩衝液で希釈したものを１５μＬ／ウェル添加し、室温で１時間静置した。洗浄液で３回洗浄し、ＴＭＢ  ＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ  ＳＵＢＳＴＲＡＴＥ  ＥＬＩＳＡ（ＭＯＳＳ社、＃ＴＭＢＥ−５００）を１５μＬ／ウェル添加した。ヒトＴＬＲ２蛋白質を固相化したウェルは１５分後に１Ｍ硫酸（和光純薬工業社、１９８−０９５９５）を１５μＬ／ウェル添加して反応を停止した。ヒトＴＬＲ４／ＭＤ２蛋白質を固相化したウェルは５分後に１Ｍ硫酸を１５μＬ／ウェル添加して反応を停止した。Ｓａｆｉｒｅ２（ＴＥＣＡＮ社）で吸光度４５０ｎｍを測定し、ヒトＴＬＲ２蛋白質及びヒトＴＬＲ４／ＭＤ２蛋白質に対する各抗体のＥＣ５０値をそれぞれ算出した。ＥＣ５０値算出にあたっては、縦軸を測定値、横軸を抗体濃度値で描いたグラフ上のシグモイド曲線の形状から、抗体濃度の上昇に伴い測定値が収束値に達したと判断できる各抗体の測定値の最大値を１００％、抗体濃度の下降に伴い測定値が収束値に達したと判断できる各抗体の測定値の最小値を０％に設定した。４パラメーターロジスティック曲線当てはめにより算出したＥＣ５０値を次に示す（表１、表２）。
表１：ヒトＴＬＲ２蛋白質に対する結合活性
【表１】
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表２：ヒトＴＬＲ４／ＭＤ２蛋白質に対する結合活性
【表２】
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【０１３１】
その結果、完全ヒト型ＩＣＵ−１−Ｉｇγ１及び完全ヒト型ＩＣＵ−１−Ｉｇγ１−ＬＡｓｈは、ヒトＴＬＲ２蛋白質及びヒトＴＬＲ４／ＭＤ２蛋白質の両方に結合することが明らかとなった。【０１３２】
（実施例１０：ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体の正常ヒト末梢血単核球緑膿菌死菌誘発ＴＮＦα産生阻害アッセイ）
実施例８で作製した二重特異的抗体の中和活性を評価するために、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４／ＭＤ２を内在的に発現するヒト末梢血単核球を用いて、緑膿菌死菌誘発ＴＮＦα産生阻害アッセイを実施した。緑膿菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは敗血症の原因菌の一つであり、ヒト末梢血単核球上のＴＬＲ２とＴＬＲ４を刺激しＴＮＦαを産生することが知られている（Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００８、Ｖｏｌ．６７、Ｎｏ．２、ｐ．１９３−２０３）。【０１３３】
正常ヒト末梢血単核球（Ｌｏｎｚａ社、ＣＣ−２７０２）を３８４ウェルプレート（ヌンク社）に１．８７５×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように、終濃度１０〜３０％に適宜調製したヒト血清（Ｌｏｎｚａ社、１４−４９０Ｅ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ライフテクノロジーズ社）を用いて３０μＬ／ウェルで播種した。その後すぐに３７５ｎＭから７．６８０ｆＭの範囲で１２段階にＲＰＭＩ１６４０培地で希釈した精製抗体完全ヒト型ＩＣＵ−1−Ｉｇγ１又は５００ｎＭから１０．２４ｆＭの範囲で１３段階にＲＰＭＩ１６４０培地で希釈した完全ヒト型ＩＣＵ−1−Ｉｇγ１−ＬＡｓｈを１０μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で３０分間培養した。さらに、臨床分離株の緑膿菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ−１の加熱処理死菌をＲＰＭＩ１６４０培地で希釈して、終濃度１×１０6ＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）／ｍＬとなるように１０μＬ添加した。コントロールとして、抗体の代わりにＲＰＭＩ１６４０培地を添加したウェル、緑膿菌死菌の代わりにＲＰＭＩ１６４０培地を添加したウェルをそれぞれ準備した。３７℃、５％ＣＯ2条件下で一晩培養した後、培養上清を回収し、培養上清に含まれるＴＮＦα濃度を市販のＡｌｐｈａＬＩＳＡ  ＴＮＦαキット（パーキンエルマー社、ＡＬ２０８Ｃ）を用いて測定した。さらに各抗体の緑膿菌死菌誘発ＴＮＦα産生に対するＩＣ５０値を算出した。ＩＣ５０値算出にあたっては、抗体の代わりにＲＰＭＩ１６４０培地を添加したウェルを０％抑制コントロールとし、緑膿菌死菌の代わりにＲＰＭＩ１６４０培地を添加したウェルを１００％抑制コントロールとして設定した。４パラメーターロジスティック曲線当てはめにより算出したＩＣ５０値を次に示す（表３）。
表３：正常ヒト末梢血単核球緑膿菌死菌誘発ＴＮＦα産生阻害活性
【表３】
0006579097.tif 000004
【０１３４】
その結果、完全ヒト型ＩＣＵ−１−Ｉｇγ１及び完全ヒト型ＩＣＵ−１−Ｉｇγ１−ＬＡｓｈはＴＮＦα産生を阻害し、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に対する中和活性を有することが明らかとなった。【０１３５】
（実施例１１：正常ヒト末梢血単核球大腸菌死菌誘発ＴＮＦα産生阻害アッセイ）
正常ヒト末梢血単核球（Ｌｏｎｚａ社、ＣＣ−２７０２）を３８４ウェルプレート（ヌンク社）に１×１０4Ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように、終濃度１０％に適宜調製したヒト血清（Ｌｏｎｚａ社、１４−４９０Ｅ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ライフテクノロジーズ社）を用いて３０μＬ／ウェルで播種した。その後すぐに２．５００μＭから２０．００ｆＭの範囲で１２段階にＲＰＭＩ１６４０培地で希釈した精製完全ヒト型ＩＣＵ−１−Ｉｇγ１又は完全ヒト型ＩＣＵ−１−Ｉｇγ１−ＬＡｓｈを１０μＬ添加した。また比較抗体として７．７５８μＭから５２．９６ｆＭの範囲で１３段階にＲＰＭＩ１６４０培地で希釈した精製抗ヒトＴＬＲ４抗体１Ｅ１１．Ｃ２Ｅ３（特許文献６）及び抗ヒトＴＬＲ２抗体ＯＰＮ３０５（特許文献３）の混合溶液１０μＬを添加した。その後３７℃、５％ＣＯ2条件下で３０分間培養した。さらに、臨床分離株の大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（２１００６）の加熱処理死菌をＲＰＭＩ１６４０培地で希釈して、終濃度１×１０6ＣＦＵ／ｍＬとなるように１０μＬ添加した。コントロールとして、抗体の代わりにＲＰＭＩ１６４０培地を添加したウェル、大腸菌死菌の代わりにＲＰＭＩ１６４０培地を添加したウェルをそれぞれ準備した。３７℃、５％ＣＯ2条件下で一晩培養した後、培養上清を回収し、培養上清に含まれるＴＮＦα濃度を市販のＡｌｐｈａＬＩＳＡ  ＴＮＦαキット（パーキンエルマー社）を用いて測定した。さらに各抗体の大腸菌死菌誘発ＴＮＦα産生に対するＩＣ５０値を算出した。ＩＣ５０値算出にあたっては、抗体の代わりにＲＰＭＩ１６４０培地を添加したウェルを０％抑制コントロールとし、大腸菌死菌の代わりにＲＰＭＩ１６４０培地を添加したウェルを１００％抑制コントロールとして設定した。４パラメーターロジスティック曲線当てはめにより算出したＩＣ５０値を次に示す（表４、図３）。
表４：正常ヒト末梢血単核球大腸菌死菌誘発ＴＮＦα産生阻害活性
【表４】
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【０１３６】
その結果、完全ヒト型ＩＣＵ−１−Ｉｇγ１及び完全ヒト型ＩＣＵ−１−Ｉｇγ１−ＬＡｓｈは１Ｅ１１．Ｃ２Ｅ３及びＯＰＮ３０５の併用よりも約１０倍の効力（ポテンシー）のＴＮＦα産生阻害活性を有していることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１３７】
本発明のヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体は、ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４を介した病態形成に関与する各種疾患の予防又は治療に有用である。また、本発明のポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換された宿主細胞、及び二重特異的抗体を生産する方法は、前記ヒトＴＬＲ２及びヒトＴＬＲ４に結合する二重特異的抗体を生産するのに有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１３８】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には配列表の配列番号１で表される塩基配列は、完全ヒト型ＩＣＵ−１−Ｉｇγ１の抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体の塩基配列であり、配列番号２で表されるアミノ酸配列は、配列番号１によりコードされる抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体のアミノ酸配列である。配列表の配列番号３で表される塩基配列は、完全ヒト型ＩＣＵ−１−Ｉｇγ１−ＬＡｓｈの抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体の塩基配列であり、配列番号４で表されるアミノ酸配列は、配列番号３によりコードされる抗ヒトＴＬＲ２抗体重鎖−抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ融合体のアミノ酸配列である。配列表の配列番号５で表される塩基配列は、完全ヒト型ＩＣＵ−１−Ｉｇγ１及び完全ヒト型ＩＣＵ−１−Ｉｇγ１−ＬＡｓｈの抗ヒトＴＬＲ２抗体軽鎖、並びに完全ヒト型３１−５Ｆ５−２Ｆ３．ｍ１の軽鎖の塩基配列であり、配列番号６で表されるアミノ酸配列は、配列番号５によりコードされる抗ヒトＴＬＲ２抗体軽鎖のアミノ酸配列である。配列表の配列番号７で表される塩基配列は、完全ヒト型３１−５Ｆ５−２Ｆ３．ｍ１の重鎖の塩基配列であり、配列表の配列番号８で表されるアミノ酸配列は、配列番号７によりコードされる重鎖のアミノ酸配列である。配列表の配列番号９で表されるアミノ酸配列は、完全ヒト型ＩＣＵ−１−Ｉｇγ１及び完全ヒト型ＩＣＵ−１−Ｉｇγ１−ＬＡｓｈに含まれる抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖定常領域のＣ末端と抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖのＮ末端とを連結するＧＳリンカーのアミノ酸配列である。配列表の配列番号１０で表されるアミノ酸配列は、完全ヒト型ＩＣＵ−１−Ｉｇγ１及び完全ヒト型ＩＣＵ−１−Ｉｇγ１−ＬＡｓｈに含まれる抗ヒトＴＬＲ４抗体ｓｃＦｖ中の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを連結するＧＳリンカーのアミノ酸配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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