(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)を含み、
前記VHは、VH CDR1、VH CDR2及びVH CDR3を含み、
前記VLは、VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3を含み、
前記VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3は、それぞれ、配列番号: 6、配列番号: 7及び配列番号: 8のアミノ酸配列を含み、
前記VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3は、それぞれ、配列番号: 9、Asp Ala Ser及び配列番号: 10又は73のアミノ酸配列を含む、
抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項２】
前記VL CDR3は、配列番号: 73のアミノ酸配列を含む、
請求項1に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項３】
(a)前記VHは、配列番号: 76のアミノ酸配列を含み、
(b)前記VLは、配列番号: 77又は78のアミノ酸配列を含む、
請求項1に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項４】
前記抗体又はその抗原結合性断片は、単鎖可変断片、Fab断片又はFv断片である、
請求項1に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項５】
前記抗体は、完全ヒト抗体である、
請求項1、3及び4のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項６】
治療上有効量の請求項5に記載の抗体又はその抗原結合性断片及び医薬的に許容可能なビヒクル又はキャリアを含む、組成物。
【請求項７】
治療上有効量の化学療法剤を更に含む、
請求項6に記載の組成物。
【請求項８】
腫瘍成長、腫瘍血管新生の阻害及び/又はがん細胞に対する細胞毒性の誘導での治療のための医薬を必要とする対象におけるそれらの阻害及び/又はそれの誘導での治療のための医薬の製造における請求項5に記載抗体若しくはその抗原結合性断片又は請求項7に記載の組成物の使用。
【請求項９】
腫瘍成長、腫瘍血管新生の阻害及び/又はがん細胞に対する細胞毒性の誘導での治療のための医薬を必要とする対象におけるそれらの阻害及び/又はそれの誘導での治療のための医薬の製造における請求項2に記載の抗体又はその抗原結合性断片の使用であって、
前記抗体は、完全ヒト抗体である、使用。
【請求項１０】
前記腫瘍又はがんは、膵臓、胸部、肺、白血病、前立腺及び卵巣がんからなる群より選択される少なくとも1つである、請求項8又は9に記載の使用。
【請求項１１】
生体試料における腫瘍血管内皮細胞又はがん細胞でのVEGFR2の存在を検出する方法であって、
(i)請求項1、3及び4のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合性断片を生体試料と混合するステップと、
(ii)前記抗体又はその抗原結合性断片と前記生体試料における前記腫瘍血管内皮細胞又はがん細胞での前記VEGFR2とを相互作用させて複合体を形成させるステップと、
(iii)前記複合体における前記腫瘍血管内皮細胞又はがん細胞でのVEGFR2の存在を検出するステップと、を有する方法。
【請求項１２】
生体試料における腫瘍血管内皮細胞又はがん細胞でのVEGFR2の存在を検出する方法であって、
(i)請求項2又は3に記載の抗体又はその抗原結合性断片を生体試料と混合するステップと、
(ii)前記抗体又はその抗原結合性断片と前記生体試料における前記腫瘍血管内皮細胞又はがん細胞での前記VEGFR2とを相互作用させて複合体を形成させるステップと、
(iii)前記複合体における前記腫瘍血管内皮細胞又はがん細胞でのVEGFR2の存在を検出するステップと、を有する方法。
【請求項１３】
腫瘍成長、腫瘍血管新生の阻害及び/又はがん細胞に対する細胞毒性の誘導での治療を必要とする対象におけるそれらの阻害及び/又はそれの誘導での治療のために使用される、請求項5に記載の抗体若しくはその抗原結合性断片又は請求項7に記載の組成物。
【請求項１４】
腫瘍成長、腫瘍血管新生の阻害及び/又はがん細胞に対する細胞毒性の誘導での治療を必要とする対象におけるそれらの阻害及び/又はそれの誘導での治療のために使用される、請求項2に記載の抗体又はその抗原結合性断片であって、
前記抗体は、完全ヒト抗体である、抗体又はその抗原結合性断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、抗がん活性を有する抗体に関する。より詳しくは、本発明は、抗VEGFR2抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、成人の健常な組織ではまず起こらない。血管内皮成長因子受容体2(VEGFR2)は、腫瘍関連内皮細胞と比較すると、正常内皮細胞ではほとんど発現せず、その発現レベルも低い。VEGFR2発現は、腫瘍血管において正常血管よりも3〜5倍高い。がん患者の生検での免疫組織化学において、VEGFR2発現は、腫瘍領域に隣接する正常組織の血管内皮と比較すると、腫瘍血管において著しく上昇することが更に確認された。特に、VEGFR2の発現は、低転移性腫瘍血管よりも高転移性腫瘍血管において大きい。
【０００３】
VEGFR2発現は、最初は、腫瘍組織の血管に限定されることを示していた。しかしながら、最近の調査では、VEGFR2が悪性腫瘍細胞にも存在していることが証明された。乳がん患者の血液における循環腫瘍上皮細胞は、VEGFR2が発現していることが明らかになったことから、かかる発現は、腫瘍転移及び予後に関係している。従って、VEGFR2媒介シグナル伝達トランスダクションをブロックして内皮腫瘍及び悪性細胞を同時に阻害することは、抗がん治療を発展させる優れた戦略と考えられている。
【０００４】
臨床試験の結果から、VEGFR2に対するヒト治療用抗体が完全に安全で十分に通用することが示されている。それらは、腫瘍血管新生をブロックすることによるがんの新たな治療法として有望であることを示している。従って、治療の有効性が高い新規の抗VEGFR2ヒト抗体の開発は、がん患者に有益である。
【０００５】
発明の要約
一態様において、本発明は、ヒト血管内皮成長因子受容体2(VEGFR2;配列番号: 74)のドメイン1又はドメイン3内に位置するエピトープに特異的な結合親和性を有する単離した抗体又はその抗原結合性断片に関するものであり、VEGFR2のドメイン3内のエピトープは、配列番号: 74のアミノ酸残基250から270の間に位置する。
【０００６】
本発明の一実施形態において、エピトープは、NWEYPS(配列番号: 66)のアミノ酸配列を含む。エピトープは、GID、KH又はGLMTK(配列番号: 75)のアミノ酸配列を含まない。
【０００７】
本発明の別の実施形態において、抗体又はその抗原結合性断片は、腫瘍血管内皮細胞に特異的な結合親和性を示す。
【０００８】
本発明の抗体又はその抗原結合性断片は、重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)を含み、
上記VHは、VH CDR1、VH CDR2及びVH CDR3を含み、
上記VLは、VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3を含み、
(i)
上記VH CDR1、VH CDR2及びVH CDR3は、それぞれ、配列番号: 1、配列番号: 2及び配列番号: 3のアミノ酸配列を含み、
上記VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3は、それぞれ、配列番号: 4、Ala Ala Ser及び配列番号: 5のアミノ酸配列を含む、
又は
(ii)
上記VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3は、それぞれ、配列番号: 6、配列番号: 7及び配列番号: 8のアミノ酸配列を含み、
上記VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3は、それぞれ、配列番号: 9、Asp Ala Ser及び配列番号: 10又は73のアミノ酸配列を含む、
又は
(iii)
上記VH CDR1、VH CDR2及びVH CDR3は、それぞれ、配列番号: 11、配列番号: 12及び配列番号: 13のアミノ酸配列を含み、
上記VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3は、それぞれ、配列番号: 14、Asp Ala Ser及び配列番号: 15のアミノ酸配列を含む、
又は
(iv)
上記VH CDR1、VH CDR2及びVH CDR3は、それぞれ、配列番号: 16、配列番号: 17及び配列番号: 18のアミノ酸配列を含み、
上記VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3は、それぞれ、配列番号: 19、Gly Ala Ser及び配列番号: 20のアミノ酸配列を含む、
又は
(v)
上記VH CDR1、VH CDR2及びVH CDR3は、それぞれ、配列番号: 21、配列番号: 22及び配列番号: 23のアミノ酸配列を含み、
上記VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3は、それぞれ、配列番号: 24、Asp Ala Ser及び配列番号: 25のアミノ酸配列を含む。
【０００９】
本発明の別の実施形態において、上記VH CDR1、VH CDR2及びVH CDR3は、それぞれ、配列番号: 6、配列番号: 7及び配列番号: 8のアミノ酸配列を含み、上記VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3は、それぞれ、配列番号: 9、Asp Ala Ser及び配列番号: 10又は73のアミノ酸配列を含む。
【００１０】
本発明の別の実施形態において、抗体又はその抗原結合性断片は、(a) 配列番号: 76のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH)と、(b) 配列番号: 77又は78のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)と、を含む。
【００１１】
本発明の別の実施形態において、抗体又はその抗原結合性断片は、単鎖可変断片、Fab断片又はFv断片である。
【００１２】
本発明の別の実施形態において、抗体又はその抗原結合性断片は、完全ヒト抗体である。
【００１３】
本発明の別の実施形態において、抗体又はその抗原結合性断片は、検出可能な化合物又は酵素で標識化されている。
【００１４】
別の態様においては、本発明は、治療上有効量の本発明の抗体又はその抗原結合性断片及び医薬的に許容可能なビヒクル又はキャリアを含む組成物に関する。
【００１５】
本発明の一実施形態において、上記組成物は、化学療法剤を更に含む。本発明の一実施形態において、上記化学療法剤は、ドセタキセルである。
【００１６】
更に別の態様においては、本発明は、腫瘍成長、腫瘍血管新生を阻害する及び/又はがん細胞に対する細胞毒性を誘導する医薬を必要とする対象におけるそれらを阻害及び/又はそれを誘導する医薬の製造における本発明の抗体若しくはその抗原結合性断片又は組成物の使用に関する。
【００１７】
本発明の一実施形態において、腫瘍又はがん細胞は、VEGFR2を発現する。抗体又はその抗原結合性断片の使用は、腫瘍成長、腫瘍血管新生を阻害する及び/又はがん細胞に対する細胞毒性を誘導する医薬を必要とする対象におけるそれらを阻害及び/又はそれを誘導する医薬の製造における追加の化学療法剤(例えばドセタキセル)の使用を更に含む。
【００１８】
あるいは、本発明は、腫瘍成長、腫瘍血管新生を阻害する及び/又はがん細胞に対する細胞毒性を誘導する必要がある対象におけるそれらの阻害及び/又はそれの誘導で使用するための、本発明の抗体若しくはその抗原結合性断片又は組成物に関する。
【００１９】
また、本発明は、腫瘍成長、腫瘍血管新生を阻害する及び/又はがん細胞に対する細胞毒性を誘導する方法であって、
治療上有効量の本発明の単離した抗体又はその抗原結合性断片及び医薬的に許容可能なキャリアを含む組成物を、それを必要とする対象に投与し、腫瘍成長、腫瘍血管新生を阻害及び/又はがん細胞に対する細胞毒性を誘導させる必要がある対象にそれらを阻害及び/又はそれを誘導させるステップを有する方法に関する。
【００２０】
本発明の方法は、治療上有効量の化学療法剤(例えばドセタキセル)を含む組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを更に含むことができる。本発明の一実施形態において、化学療法剤は、それを必要とする対象に同時に投与される。
【００２１】
本発明の一実施形態において、腫瘍又はがんは、膵臓、胸部、肺、白血病、前立腺及び卵巣がんからなる群より選択される少なくとも1つである。
【００２２】
更に別の態様においては、本発明は、生体試料における腫瘍血管内皮細胞又はがん細胞でのVEGFR2の存在を検出する方法であって、
(i) 本発明の抗体又はその抗原結合性断片を生体試料と混合するステップと、
(ii)上記抗体又はその抗原結合性断片と上記生体試料における上記腫瘍血管内皮細胞又はがん細胞での上記VEGFR2とを相互作用させて複合体を形成させるステップと、
(iii) 上記複合体における上記腫瘍血管内皮細胞又はがん細胞でのVEGFR2の存在を検出するステップと、
を有する方法に関する。
【００２３】
本発明の一実施形態において、上記生体試料は、患者からの組織試料である。
【００２４】
本発明の別の実施形態において、上記複合体における上記腫瘍血管内皮細胞又はがん細胞でのVEGFR2の存在は、免疫学的測定法によって検出される。
【００２５】
これらの態様及び他の態様は、以下の図面に関連する好適な実施形態に関する以下の記述から明らかになるだろう。但し、その中の変更形態及び修正形態は、開示する新規の概念の精神と範囲から逸脱することなく作用し得るものである。
【００２６】
添付の図面は、本発明の1又は複数の実施形態を例示して、明細書と共に本発明の原理を説明するのに役立つ。可能限り、同じ参照番号を図面の全体にわたって使用して、実施形態における同一又は類似の構成要素を指す。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図1A-Eは、VEGFR2に対するバクテリオファージ提示scFvの選別及び同定の結果を示している。(A) ファージ提示は、VEGFR2-Fc組換え型タンパク質のためのバイオパニングである。4回のバイオパニングの後、ファージの回収率は、1回目よりも3,455倍増加した。cfuは、コロニー形成ユニットである。(B) 1X109cfuファージ力価を用いた、ELISAによるVEGFR2-Fcタンパク質に対する選別されたファージクローンの結合に関する比較。(C) ファージクローンの細胞性VEGFR2結合親和性を、1X1010cfuを用いたフローサイトメトリーによってHUVECにて評価した。(D) 可溶性抗VEGFR2 scFvを、クマシーブルー染色を用いてSDS-PAGEによって精製して分析した。(E) ヒト腫瘍血管系に対する免疫蛍光染色。肺がん患者の外科的試料の凍結切片を、抗VEGFR2 scFvを用いて調査し、抗Eタグ抗体及びローダミン共役二次抗体染色を行った。血管内皮は、抗ヒトCD31抗体で染色し、FITC共役二次抗体と共にインキュベートした。核は、DAPIで染色した。Con-scFvは、コントロールscFvである。
【００２８】
【図２】図2A-Fは、抗VEGFR2 scFvがHUVECにおけるVEGFR2のVEGF-A結合及び活性化を抑制することを示している。(A) ELISAによるVEGF-Aを用いた抗VEGFR2 scFvの競合能力に関する分析。競合物質の非存在下で固定化VEGFR2に結合するVEGF-Aの量を100%とした。(B) VEGF-A及びscFv競合物質で処理されたHUVECのリン酸化VEGFR2(Pho. VEGFR2)発現は、ウェスタンブロットによって検出した。リン酸化VEGFR2の定量化は、発光強度に基づくものであり、総VEGFR2に対して正規化した。(CからF)R2S12のエピトープマッピング。(C) ヒトVEGFR2ドメイン3(VEGFR2-D3)(配列番号: 74の221a.a.から320a.a.)及びマウスVEGFR2ドメイン3(VEGFR2-D3)(配列番号: 80の223a.a.から322a.a.)の配列アライメント。2つの種間で異なる残基は、枠で囲んでいる。変異体M1及びM2に関する残基には、下線を引いている。黒丸と白丸は、それぞれ、1121B及び6.64の抗体と接触するヒトVEGFR2-D3残基を示すために用いている。(D) VEGFR2-D3主鎖を表す図である。R2S12結合の原因となるNWEYPS(配列番号: 66)残基(M1)を強調している。(E) VEGFR2-D3の表面のモデル。NWEYPS(配列番号: 66)残基(即ち、M1領域)は、黒線によって詳細に描写している。(F) VEGFR2-D3の表面上の1121B及び6.64と接触する残基を明示している。M1領域に局在している1121Bの接触残基も明示している。(Nは、N末端であり、Cは、C末端である。)
【００２９】
【図３】図3A-Dは、抗VEGFR2 hAbの親和性成熟及び抗-VEGFR2-AF hAb活性の分析を示している。(A) R2S12(配列番号: 10)及びR2S12AF(配列番号: 73)のCDR3の軽鎖可変ドメイン(VL-CDR3)のアミノ酸。R2S12とR2S12AFとの間で異なる残基は、枠で囲んでいる。(B) 精製IgG及びBIACORE T100TMを用いて決定した抗VEGFR2及び抗-VEGFR2-AF hAbのカイネティック定数。Kd値は、BIACORE T100TMの評価ソフトを使用して算出した。(C) 競合ELISAは、ヒト抗体によるVEGFR2に対するVEGF-A結合の用量依存的阻害を検討するために実行した。100%の値は、競合物質の非存在下での固定化VEGFR2に対する4nM VEGF-Aの結合とした。エラーバーは、SDであり、n=4である。(D) フローサイトメトリー分析によるHUVECに対する抗VEGFR2抗体の結合活性の測定。抗体濃度: 0.1μg/ml。
【００３０】
【図４】図4A-Bは、抗-VEGFR2-AF hAbがVEGFR2シグナル伝達経路を阻害して、HUVECの毛細血管の構造形成を破壊することを示している。(A) 毛細血管の構造形成アッセイは、MATRIGEL(登録商標)コートμスライドを使用して実行した。HUVEC(ウェル当たり4X104細胞)を、0.2%FBSでインキュベートし、40ng/mlのVEGF-A又はNHIgG、IMC-1121B又は抗-VEGFR2-AF抗体と共に40ng/mlのVEGF-Aを用いて37℃で5時間処理した。チューブ状の構造は、位相差下で観察され、相対的新芽長(下部パネル)及び分枝点(上部パネル)は、ImageJソフトウェアによって量的に測定した。全てのデータは、3つの独立した実験から得た。(B) HUVECを37℃で10分間50ngのVEGF-A又は100nMの抗-VEGFR2-AF又はIMC-1121Bで処理した。総タンパクを、処理したHUVECから作成して、ウェスタンブロット解析によって分析した。α-チューブリンをローディングコントロールとして用いた。
【００３１】
【図５】図5A-Fは、ヒト前立腺がん細胞におけるVEGFR2活性の特性評価を示している。(A) 定量的RT-PCRによる、明示した細胞株におけるVEGFR2発現の分析。293T細胞を、ネガティブコントロールとして用いた。VEGFR2の発現は、GAPDHの発現について正規化した。(B) VEGF-Aで処理したPC-3細胞に、コロニー形成、MTT及び浸潤アッセイを行った。各グループはn=6とした。(C) PC-3細胞をVEGFR2標的shRNA(shVEGFR2)で処理して、VEGFR2発現を定量的RT-PCRによって分析した。ルシフェラーゼshRNA(shLuc)を、ネガティブコントロールとして用いた。(D) MTT、コロニー形成及びトランスウェル浸潤アッセイを、VEGF-Aで処理したshVEGFR2-PC-3細胞を分析するために実行した。(E) 公衆マイクロアレイデータベースを使用して決定した、良性及び一次腫瘍と比較して転移性前立腺腫瘍における相対的VEGFR2発現を示すボックスプロット。(F) ヒト正常及び腫瘍前立腺組織におけるVEGFR2タンパク質発現を分析するために抗VEGFR2抗体(55B11、細胞シグナリング)を使用したヒト前立腺がん組織アレイ(PRC481、Pantomics)での免疫組織化学的染色。
【００３２】
【図６】図6A-Eは、PC-3マウス異種移植片モデルにおける抗-VEGFR2-AF hAbでの治療の有効性の分析を示している。(A) 治療スケジュール。(B) 各グループのマウスの腫瘍成長プロファイル。(C) 各グループの体重。(D) 治療期間の終わりに、腫瘍の塊を各マウスから切り出した。(E)腫瘍重量は、治療期間の終わりに測定した。全てのデータは、グループ当たりの9匹のマウスの平均として示している。バーは、SEを示す。*は、P < 0.05を示す。
【００３３】
【図７】図7A-Eは、抗-VEGFR2-AF hAbがHL60マウス異種移植片モデルにおいてIMC-1121Bよりも大きな抗腫瘍活性を示すことを示している。(A) 各グループのマウスのカプラン-マイヤー生存率分析。生存は、ログランク検定(P =0.0284)に基づいて、IMC-1121B群と比較して、抗-VEGFR2-AF hAbグループで著しく延びた。(B) 各グループのマウスの体重。(C) 卵巣は、死後、各マウスから切り出した。白血病を患っていないNSGマウス由来の卵巣を正常コントロールとして用いた。(D) IMC-1121B又は抗-VEGFR2-AFで処理したマウスの卵巣体積。(E) リンパノード(LN)の形態分析結果は、白血病-腫瘍マウスにおいて変化する。リンパ節に転移した白血病細胞は、明示のグループ(各グループはn=9)のマウスから取り出した。
【００３４】
【図８】図8は、VEGFR2発現しているベクターの構造を示している。ヒトVEGFR2ドメインの欠失又は置換変異体を表す構築物の模式図。IからVIIとラベルしている、VEGFR2の細胞外の領域の7つの免疫グロブリン様ドメインが存在する。TMは、膜貫通ドメインである。259NWEYPS264、261TWHSPP266、279TQSGSEM285及び281PFPGTVA287の配列名は、それぞれ、配列番号66、配列番号68、配列番号67及び配列番号69である。
【００３５】
【図９】図9A-Bは、ファージ提示合成scFvライブラリーを用いたVEGFR2に対するscFvの選択及び同定の結果を示している。(A) R2S12に関する親和性成熟。ファージ提示R2S12-VL-CDR3変異scFvライブラリーを、プロテインG DYNABEADS(登録商標)に固定された0.1μgのVEGFR2-Fcと共に4℃で1時間インキュベートした。その後、ビーズを、1%TWEE1TM20含有PBSによって、4回洗浄した。4回のバイオパニングの後、ファージの回収率は、1回目よりも929倍増加した。(B) ELISAによるアッセイでの、VEGFR2-Fcタンパク質に対する明示の濃度のR2S12及びR2S12-AF scFvの結合活性の比較。エラーバーは、SEを示す。
【００３６】
【図１０】図10A-Cは、抗-VEGFR2-AF hAbがPC-3細胞のVEGF-A媒介細胞活性に拮抗したことを示している。(A) トランスウェルアッセイを行って、明示の処理を受けたPC-3細胞の浸潤力を検討した。上側パネルは、侵襲性細胞のギムザ染色を示す。倍率は、100Xとし、各グループは、n=3とした。スケールバーは、150μmである。(B) 合計1X103個のPC-3細胞を、6ウェルプレートに播種して、100ng/mlのVEGF-A及び10μg/mlのNHIgG、IMC-1121B又は抗-VEGFR2-AF抗体の有り無しで処理した。コロニーを形成させるために、プレートを7日間インキュベートした。細胞コロニーを、クリスタルバイオレット染色によって視覚化した。クリスタルバイオレット溶液の溶出の後、相対的コロニー数をウェル毎に算出した。各グループはn=3とした。(C) 創傷治癒アッセイ。PC-3細胞を、2%FBSを有するRPMIでインキュベートして、10μg/mlのNHIgG、IMC-1121B又は抗-VEGFR2-AFの存在又は非存在下で100ng/mlのVEGF-Aでの処理によって個々に刺激した。0、16及び36時間のインキュベーションの後、画像を撮影した。スケールバーは、150μmである。各グループにおいてn=3である。エラーバーは、SEである。
【００３７】
【図１１】図11A-Bは、薬物療法の後の、腫瘍組織における血管内皮及びアポトーシス細胞の調査を示している。治療期間の終わりに、凍結腫瘍切片を各グループのマウスから作成した。(A) 切片を抗CD31抗体で染色して、腫瘍血管を視覚化した。ImageJソフトウェアを使用して、CD31-ポジティブ内皮を量的に測定した。(B) 凍結腫瘍切片のアポトーシス細胞を、TUNELアッセイを使用して分析した。ImageJソフトウェアを使用して、アポトーシス細胞を定量化した。切片を、全ての細胞を検出するためのDAPIによって染色した。n=5である;スケールバーは、100μmである。倍率は、200Xである。エラーバーは、SEである。**は、P < 0.01である。***は、P < 0.001である。
【００３８】
【図１２】図12A-Bは、抗体治療後のヒト白血病異種移植片マウスの卵巣の組織病理学的表現型を示している。卵巣を、生理食塩水、NHIgG、IMC-1121B又は抗-VEGFR2-AF hAbで処理した後、HL-60腫瘍マウスから収集した。組織をスライスして、ヘマトキシリン-エオジン(H&E)で染色し、白血病細胞の浸潤を明らかにした。抗VEGFR2-AFで処理したグループは、血管が少なく、いくつかの一次卵母細胞を保持していた。各グループはn=9である。(A) 卵巣の倍率は、200Xである。スケールバーは、500μmである。(B) スケールバーは、150μmである。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
発明の詳細な説明
以下で、本発明の様々な実施形態の詳細について説明する。図面を参照する。同じ数は、図の全体にわたって同じ要素を指す。本願明細書の記述で、及び添付の特許請求の範囲の全体にわたって用いられている通り、「a」、「an」及び「the」の意味は、別途文脈で明確に示していない限り、複数の意味を含む。また、本願明細書の記述で、及び添付の特許請求の範囲の全体にわたって用いられている通り、「in」の意味は、別途文脈で明確に示していない限り、「in」及び「on」の意味を含む。加えて、この明細書において使用するいくつかの用語は、以下でより詳しく規定している。
【００４０】
定義
この明細書において使用する用語は、本発明の文脈の中で、及び、それぞれの用語が使われている特定の文脈において、一般的な従来技術での通常の意味を有する。本発明を記述するために用いるある種の用語は、明細書の以下に、又は他の箇所に記述して、本発明の記述に関して実践者に追加のガイダンスを提供する。便宜上、ある種の用語は、強調することができ、例えばイタリック及び/又は引用符を使用することができる。強調表示の使用は、用語の範囲及び意味に影響を及ぼすものではない。それが強調されようとも、用語の範囲及び意味は、同じ文脈において、同じである。同じことを複数の方法で述べることができることはいうまでもない。その結果、他の言葉及び同義語は、任意の1又は複数の用語として用いてもよく、用語が本願明細書に詳しく述べられているか記載されているかにかかわらず特別な意味は有さない。ある種の用語の同義語が提供される。1又は複数の同義語の記述は、他の同義語の使用を排除しない。本明細書中に記載されている任意の用語の例を含む例の使用は、例示的なものに過ぎず、決して本発明又は例示される用語の範囲及び意味を限定するものではない。同様に、本発明は、この明細書において与えられている様々な実施形態に限定されない。
【００４１】
別途規定されない限り、本願明細書において用いられる全ての技術的及び科学的な用語は一般的に、本発明が関係する当業者が理解するのと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本書を優先する。
【００４２】
「治療」又は「処理」という用語は、有効量の化合物を、それを必要とする(がん又はかかる疾患の症状若しくは傾向を患っている)対象に、疾患、その症状又はその傾向の治癒、緩和、軽減、治療、改善又防止の目的で投与することを指す。かかる対象は、任意の適切な診断法からの結果に基づいてヘルスケアの専門家によって特定することができる。
【００４３】
「有効量」とは、治療する対象に治療効果を与えるのに必要な活性化合物の量を指す。当業者が認識しているように、有効用量は、他の治療的処理との共使用の可能性、賦形剤使用及び投与ルートに応じて変えられる。
【００４４】
「化学療法剤」という用語は、がんの治療において使用されることが知られている薬理学的薬剤を指す。
【００４５】
米保健社会福祉省食品・医薬品局によって発行されている「Guidance for Industry and Reviewers Estimating the Safe Starting Dose in Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers」は、「治療上有効量」の算出を以下の化学式から得られることを開示している。
HED =動物への投与量(mg/kg)×(動物体重(kg)/ヒト体重(kg))0.33
【００４６】
ラムシルマブ(即ち、IMC-1121B)の商品名は、サイラムザ(登録商標)である。
【００４７】
ヒト血管内皮成長因子受容体2(VEGFR2)ドメイン1領域は、45a.a.から110a.a.であり、ドメイン3は、224a.a.から320a.aである。
【００４８】
配列名:
QQLDDIPIT(R2S12AF可変軽鎖CDR3;配列番号: 73)
VGFR2(ヒト血管内皮生長因子受容体2;配列番号: 74);GLMTKK(配列番号: 75)
【００４９】
R2S12及びR2S12-AFのVH領域は、同じ(配列番号: 76)である:
0006542383.tif 000002
【００５０】
R2S12のVL領域(配列番号: 77):
0006542383.tif 000003
【００５１】
R2S12AFのVL領域(配列番号: 78):
0006542383.tif 000004
【００５２】
R2S12 VLとR2S12AF VLとの間で異なるアミノ酸残基には、下線を引いている。
【００５３】
ヒトIgG1定常領域(配列番号: 79);マウスVEGFR2アミノ酸配列(配列番号: 80)。
【００５４】
略称:相補性決定領域(CDR);Fab(断片、抗原結合性領域);FV領域(可変ドメイン)。
【実施例】
【００５５】
本発明の範囲を制限すること意図するものではないが、例示的な機器、装置、方法及び本発明の実施形態によるそれらの関連した結果を以下に示す。表題又は副題は、読み手の便宜のために例として用いているものであり、本発明の範囲を決して限定するものではない点に留意されたい。さらに、ある種の理論は、本願明細書に提唱され開示されているが、それらが正しいかろうが間違っていようが、作用に関する如何なる特定の理論にもスキームにも関係なく、本発明が本発明によって実行される限り、本発明の範囲が限定されることはない。
【００５６】
素材及び方法
ファージ提示scFvライブラリーからのVEGFR2に結合するファージの分離
我々の研究室が以前確立した複雑度（complexity）が6X1010のヒトナイーブファージ提示scFvライブラリーを選択のために用いた。scFvライブラリーは、タンパク質G DYNABEADS(登録商標)(Invitrogen)を用いて非特異的結合を取り除いて、VEGFR2-Fc組換えタンパク質(R&D Systems)固定DYNABEADS(登録商標)と共にインキュベートした。0.1%のTWEENTM20を含むPBS(PBST0.1)を用いた洗浄の後、VEGFR2-Fcに結合したファージを、大腸菌TG1細胞に感染させることによって回収した。ファージ力価の測定の後、次のバイオパニングを行った。
【００５７】
競合VEGF結合アッセイ
様々な濃度の抗VEGFR2 scFvを、3nMヒトVEGF-A(Peprotech)を混合して、1mg/mlのVEGFR2-Fcでコートされた９６ウェルプレートに加え、1%のBSAで前もってブロッキングした。RTで1時間インキュベーションしてPBSTで洗浄した後、結合したVEGF分子を、抗VEGF mAb(GeneTex)及びHRP標識ヤギ抗マウスIgGを使用して検出した。反応は、OPD及びH2O2の混合物によって進行させ、3N HClによって停止させた。吸光度を、490nmでマイクロプレートリーダーを使用して決定した。
【００５８】
抗VEGFR2 scFvsでのヒト腫瘍血管系染色
ヒト肺がん外科的試料を、国立台湾大学病院の病理部から得た。凍結切片スライドをPBSによって洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定した。PBSでの洗浄の後、スライドを、正常ウマ血清(Vector)でブロッキングして、scFvと共にインキュベートした。PBSTでの洗浄の後、ラビット抗Eタグ抗体(Bethyl Laboratories)及びマウス抗ヒトCD31 mAb(BD)の混合物を加えて、スライドを1時間インキュベートした。カバーグラスを、FITC標識抗マウスIgG、ローダミン標識ヤギ抗ラビットIgG及びDAPIで1時間染色し、倒立型蛍光顕微鏡(Zeiss、Axiovert 200M)を使用して捕捉した。
【００５９】
チューブ形成アッセイ
MATRIGEL(登録商標)(BD Biosciences)を一晩4℃で解凍し、10μlのMATRIGEL(登録商標)を予め冷却しておいたμ-スライド血管新生(Ibidi)の各ウェルに加え、スライドを37℃で15分間インキュベートした。飢餓状態のHUVEC(4X104細胞)を、40ng/mlのVEGF-A及び抗VEGFR2抗体有り無しの0.2%血清含有EBM-2に加えた。24時間のインキュベーション後、内皮細胞チューブ形成をOLYMPUS倒立型顕微鏡及びデジタルカメラ(OLYMPUS、DP-12)で評価した。チューブの長さ及び分枝点は、ImageJソフトウェアによって量的に評価した。抗体による阻害パーセントは、競合物質のないVEGF-A処理ウェルでのパーセントとして表している。
【００６０】
臨床データセット分析Rawマイクロアレイデータは、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)ウェブサイトのGene Expression Omnibusからダウンロードした。Rawデータを正規化した。GEOプロファイルGDS2545/1954_at/KDRを転移性前立腺がん分析のために使用した。
【００６１】
抗VEGFR2ヒト抗体の構造及び発現
R2S12、R2S12-AF及びIMC-1121BのVH領域は、AgeI及びNheIサイトを使用して、シグナルペプチド及びヒトIgG1定常領域を有する改変型発現ベクターpcDNA5-FRT-Gamma1に別々にクローニングした。加えて、R2S12、R2S12-AF及びIMC-1121BのVL領域は、AgeI及びEcoRVサイトを使用して、改変型発現ベクターp-カッパ-HuGsに別々にクローニングした。重鎖遺伝子含有プラスミドと軽鎖遺伝子含有プラスミドをバイシストロン性ベクターと組み合わせて、単一のベクターシステムを作成した。プラスミドを、FLPINTM-CHO細胞(Invitrogen)にトランスフェクションした。2-3週間後に、トランスフェクト細胞を、ヒグロマイシンBを使用して選別し、安定クローンを確立した。これらのクローンをSFM4CHO培地(Thermo Scientific)で培養して、ヒト抗体を生産した。2週間のインキュベーションの後、安定クローンの培養培地を集めて、遠心分離し、0.45μm膜でろ過した。そして、抗VEGFR2ヒトIgGの精製のためのタンパク質Gカラムクロマトグラフィー(GE healthcare)に上清をかけた。PBSを用いて溶出液を透析した後、抗体量を、ブラッドフォード試薬(Thermo Scientific)及び分光測光を使用して評価した。
【００６２】
抗VEGFR2ヒトIgGの親和性成熟
親和性成熟は、前述したように実行した。簡潔に言えば、VL-CDR3の7つのアミノ酸残基に導入されたランダム変異を用いて、R2S12のVH及びVL遺伝子レパートリーから成る合成ファージ提示scFvライブラリーを構成した。この合成ライブラリーを用いて、VEGFR2-Fc固定DYNABEADS(登録商標)についてバイオパニングを行った。4から5回のストリンジェントなインビトロバイオパニングの後、陽性クローンをスクリーニングして、ELISAによって同定した。優れたVEGFR2-結合クローンを、それぞれの親クローンとの比較によって同定した。
【００６３】
結合カイネティクスの測定値
抗VEGFR2抗体の親和性及びカイネティクスを、BIACORE T100TM (GE healthcare)にて表面プラズモン共鳴で測定した。VEGFR2-Fcタンパク質を、製造業者の指示に従ってBIACOREフローセルのEDC及びNHS活性CM5センサーチップに結合し、エタノールアミンによってブロッキングした。結合及び解離フェーズを、0.1から100nMにわたる抗体濃度を使用して、30μl/分の連続フロー下で5分間モニターした。再生は、再生バッファー(0.2MのNaCl、10mMのグリシン、pH 2.7)の注入によって行った。結合定数を決定するために、センサーグラムを、BIAevaluationソフトウェア(GE healthcare)を使用してサンプル1:1相互作用モデルにグローバルに設定した。
【００６４】
動物モデル
動物及びそれらのケアに関する手順は、国家的及び国際的な法律及び方針に従いAcademia Sinica Institutional Animal Care及びUtilization委員会のガイドラインに沿って行った。非肥満性糖尿病性重症複合型免疫不全(NOD/SCID)マウスを国立研究所動物センター(台湾)から購入した。ヒト前立腺がん異種移植片腫瘍モデルは、6週齢雄マウスの背中側脇腹に2X106個のPC-3細胞を皮下に注入することによって開発した。動物は、一般的な健康状態について毎日モニターし、体重は、週２回測定した。腫瘍サイズは、ノギスによって測定し、長さX幅2 X 0.52として算出した。サイズがマッチした腫瘍(50のmm3)をもつマウスを、種々の治療グループ(n=9)に無作為に分けて、正常ヒトIgG(NHIgG; Jackson ImmunoResearch)、IMC-1121B、抗-VEGFR2-AF抗体又は等価な量のPBSを、尾静脈を通じて静脈内に注射した。20mg/kgの抗体用量を4週間で週に２回注射した。また、併用療法のために、ドセタキセル(ScinoPharm Taiwan)を3週間で週に1回、5mg/kgの用量で静脈内に投与した。実験終了後、腫瘍組織及び内臓器官を組織学的分析のために取り出して固定した。
【００６５】
全身性白血病移植調査のために、NOD/SCID/IL2Rγ-/-(NSG)マウスを、Cellular and Organismic Biology研究所の動物センター(Academia Sinica)から得た。6週齢の雌に、5X106個のHL-60細胞を、尾静脈を通じて静脈内に注射した。動物は、一般的な健康状態について毎日モニターし、体重を週２回測定した。腫瘍播種の3日後、マウスを、週２回の20mg/kgのNHIgG、IMC-1121B、抗-VEGFR2-AF抗体又は等価量のPBSを静脈内に注射するためにランダムに選択した(n=9)。マウスの毒性兆候を毎日観察して、生存期間を記録した。治療のエンドポイントで、各マウスの内臓器官を更なる組織学的検査のために取り出して固定した。
【００６６】
細胞培養
HUVEC(ヒト臍血管内皮細胞)をLONZAから購入した。HL-60(ヒト前骨髄球性白血病)、PC-3(ヒト前立腺がん)、EA.hy926(ヒト臍静脈細胞株)及び293T(ヒト胎児腎臓細胞)の細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC(登録商標))から得た。hESC-H9(ヒト胚性幹細胞)株は、WiCellから購入し、FLP-INTM-CHO細胞は、Invitrogenから得た。HUVECは、内皮成長培地(EBM-2、LONZA)で培養した。HL-60及びPC-3細胞は、RPMI 1640培地(GIBCOTM)で培養した。EA.hy926及び293T細胞は、DMEM(GIBCOTM)で培養した。FLP-INTM-CHO細胞は、ハムF12培地に維持した。hESC-H9株は、前述の通り培養した。全ての細胞株は、37℃、5%のCO2加湿インキュベーターにおいて、10%のウシ胎児血清(FBS; GIBCOTM)及び100μg/mlペニシリン/ストレプトマイシン(P/S; GIBCOTM)補充条件培地に維持した。
【００６７】
ELISAによる抗VEGFR2ファージクローンスクリーニング
選別したファージを、ELISAスクリーニングによって更に検討した。９６ウェルプレートを、4℃一晩、0.1Mの重炭酸ナトリウムにおいて1mg/mlのVEGFR2-Fc、Met-Fc(R&D)又はBSA(Sigma)タンパク質でコートした。室温で2時間、1%BSA含有PBS(w/v)でブロッキングの後、ランダムに選別した70個のファージクローンを1%のBSAにて1:2の希釈度でプレートに加えて、室温で1時間インキュベートした。PBSTでの洗浄後、プレートを、1:2000の希釈度のワサビペルオキシダーゼ(HRP)-共役マウス抗M１３ファージ抗体(GE)と共に1時間インキュベートした。PBSTでの洗浄の後、比色反応を、ペルオキシダーゼ基質オルトフェニレンジアミン(OPD; Sigma)とH2O2で15分間進め、3N HClの添加によって停止させた。490nmの吸光度をマイクロプレートリーダー(SpectraMax, Molecular Devices)を使用して決定した。ポジティブクローンのプラスミドDNAを、pCANTAB5配列決定プライマーセットを使用して単離し、配列を決定した。
【００６８】
プラスミド構造
VEGFR2全長配列(NM_002253.2)をエンコードしているヒトcDNAクローンを、Thermo Scientificsから購入し、以下の構築物のPCRテンプレートとして用いた。シグナルペプチドを有するVEGFR2細胞外領域、膜貫通ドメイン及び切り詰めた細胞質ドメインの様々な長さを、以下の通り構成した(また、図8を参照)。VEGFR2(1-7)は、VEGFR2の全長細胞外領域であり、残基Met1からLeu813のドメイン1-7からなる。VEGFR2(2-7)は、残基Ala111からLeu813のドメイン2-7を含む。VEGFR2(3-7)は、残基Ser208からLeu813のドメイン3-7を含む。VEGFR2(4-7)は、残基Phe321からLeu813のドメイン4-7を含む。VEGFR2(del2-3)は、 VEGFR2のドメイン2及び3がドメイン1(Met1からGlu140)及びドメイン4-7(Phe321からLeu813)をエンコードしている2つの断片のライゲーションによって削除されている。VEGFR2(del3)は、 VEGFR2のドメイン3がドメイン1-2(Met1からArg222)及び4-7(Phe321からLeu813)をエンコードしている2つの断片のライゲーションによって削除されている。VEGFR2(M1)は、VEGFR2の全長細胞外領域の7つ全てのドメイン(Met1からLeu813)を含む変異構築物であり、ドメイン3の259NWEYPS264（配列番号66）は、マウスホモログの261TWHSPP266（配列番号68）に置換されている。VEGFR2(M2)は、VEGFR2の全長細胞外領域の7つ全てのドメイン(Met1からLeu813)を含む変異構築物であり、ドメイン3の279TQSGSEM285（配列番号67）は、マウスホモログの281PFPGTVA287（配列番号69）に置換されている。
【００６９】
可溶性scFvの発現及び精製
大腸菌株HB2151を抗VEGFR2 scFvファージクローンPC-8、12、28、29又は45に感染させ、細菌の細胞膜周辺抽出物を調整した。可溶性scFvを、製造業者の指示に従ってタンパク質Lアガロースカラム(Thermo Scientific)を使用して細胞膜周辺抽出物において精製した。精製されたscFvsを、PBSで完全に透析し、還元SDS-PAGEを行い次にクマシーブルー染色を行って分析した。
【００７０】
増殖アッセイ
合計で1X104個のHUVECを、９６ウェルプレートに播種して一晩おいた。そして、細胞を一晩無血清EBM-2において飢餓状態にした。その後、8μg/mlの選別したscFvを、40ng/mlのVEGF含有低血清EBM-2(0.2%)と共にウェルに加え、48時間インキュベートした。細胞増殖は、製造業者の指示に従って、MTT試薬(Invitrogen)を使用して評価した。
【００７１】
フローサイトメトリー
分析約1X104個のHUVECを、FACSバッファー(1%のウシ胎児血清を含むPBS)において、選別した抗VEGFR2ファージクローンと共に4℃で1時間インキュベートした。細胞をFACSバッファーで洗浄した後、それらを、まず、マウス抗M１３ファージAbと共に4℃で1時間インキュベートし、次に、R-フィコエリトリン共役ヤギ抗マウスIgG(Jackson Immuno Research)と共に4℃で30分間インキュベートした。フローサイトメトリーを、FACSCantoII(BD)を用いて行い、放出蛍光強度をFACS Divaソフトウェア(BD)によって測定し結合親和性を量的に比較した。
【００７２】
レンチウイルス媒介ショートヘアピンRNA(shRNA)ノックダウン
shRNA配列(ccggcgctgacatgtacggtc tat gctcgagca tag accgta cat gtcagcgttttttg(配列番号: 70))をエンコードしており、そして、標的ヒトVEGFR2でもあるレンチウイルスベクターpLKO_TRCN0000199129は、国立RNAi Core Facility(Academia Sinica, Taiwan)から得た。ホタルルシフェラーゼに対するshRNAをエンコードしているpLKO_TRCN0000072249ベクターをネガティブコントロールとして用いた。ウイルス生産のために、pLKOベクター、エンベローププラスミドpMD.G及びパッキングプラスミドpCMV-R8.91を、LIPOFECTAMINE(登録商標)2000 (Invitrogen)を使用して293T細胞に、10:1:9の比率で共トランスフェクションした。形質移入の18時間後、培養液を、10%のFBS及び1%のBSAを含む新鮮なDMEMに置換した。ウイルス粒子を含む上清を、24及び48時間のインキュベーションの後に回収した。
【００７３】
レンチウイルストランスダクションの1日前に、PC-3細胞を60mmのシャーレに1X106セルの密度で播種した。8μg/mlのポリブレン(Sigma-Aldrich)を補充したウイルス含有培地に PC-3細胞を加えて、24時間インキュベートした。その後、形質導入された細胞を、2μg/mlピューロマイシン含有成長培地での3日間のインキュベーションによって選別した。
【００７４】
免疫組織化学的染色
免疫組織化学的染色を、前述の通り行った。簡潔に述べると、切片を脱パラフィンして、再水和し、抗原回収を、トリロジーバッファー(Cell Marque)を使用して同時に行った。そして、内因性ペルオキシダーゼ活性を、3%のH2O2含有メタノール中でのインキュベーションによって30分間ブロッキングした。PBSでの洗浄の後、切片を、1%のBSAで30分間インキュベートして、非特異的結合のブロッキングを行った。そして、切片を、抗VEGFR2抗体(55B11、Cell Signaling)と共に室温で1時間インキュベートした。PBST0.1での洗浄の後、切片を、製造業者の指示に従ってポリマー系Super Sensitive IHC検出システム(Biogenex, San Ramon)で処理した。ワサビペルオキシダーゼ活性は、色素基質であるジアミノベンジジン塩酸塩(DAB)(0.02%)を用いた発色によって検出した。スライドを、ヘマトキシリン(Sigma-Aldrich)で軽く対比染色して、Permount(Fisher Scientific)と共にマウントし、光学顕微鏡によって調べた。
【００７５】
ウェスタンブロット解析
ウェスタンブロットは、前述した通り、標準プロトコールを使用して行った。一次抗体は、Cell Signaling Technologyから購入し、タンパク質検出のために1,000倍希釈で用いた。使用した抗体は、以下の通りである:抗VEGFR2(クローン55B11)、抗ホスホVEGFR2(Tyr1175;クローン19A10)、抗FAK、抗ホスホFAK(Tyr397; クローンD20B1)、抗p42/44 MAPK、抗ホスホp42/44 MAPK(Thr202/Tyr204; クローンD13.14.4E)、抗Akt及び抗-ホスホAkt(Ser473)。
【００７６】
凍結組織切片の免疫蛍光法アッセイ
腫瘍血管調査のために、サンプルをOCTに固定した。凍結ブロックを50μmの切片に切り分けて、凍結腫瘍組織切片を1%のパラホルムアルデヒドで固定し、0.1%のTRITONTM-X 100で透過処理して、正常ウマ血清(Vector)でブロッキング処理を施し、そして、1:100希釈の一次抗体(ラット抗マウスCD31(PECAM-1);BD Bioscience)と共に室温(RT)で1時間インキュベートした。その後、組織切片を、Alexa 549共役ヤギ抗ラット抗体(Invitrogen)と共に室温で1時間インキュベートした。核を、DAPIで染色し、切片を蛍光マウンティング溶液にマウントした。免疫蛍光画像を、Zeiss Axiovert 200M顕微鏡を使用して取得した。CD31内皮細胞のポジティブ領域を、ピクセル領域計数によって定量化し、ImageJソフトウェアを低倍率下で使用し、DAPI染色について正規化した。
【００７７】
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介dUTPニックエンドラベリング(TUNEL)
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介dUTPニックエンドラベリング反応混合物(Roche Diagnostics)と共に37℃で1時間インキュベートする前に、凍結腫瘍組織切片を、1%のパラホルムアルデヒドで固定し、0.1%のTRITONTM-X 100で透過処理を施した。PBSで3回洗浄した後、スライドを、FITC-抗-DIG抗体(1:2000)及びDAPI(1:500)と共にインキュベートした。スライドをマウンティング溶液にマウントして蛍光顕微鏡下で視覚化した。3つ独立したスライドを、他と関係なく検討した。TUNELポジティブ細胞を有する領域を、ピクセル領域計数によって定量化し、ImageJソフトウェアを使用してDAPI染色について正規化した。
【００７８】
ヘマトキシリン及びエオジン(H&E)染色
腫瘍及び明示した臓器をマウスから取り出して、4%のパラホルムアルデヒドにおいて一晩固定した。試料の固定及び処理を標準手順に従って実行した。試料をパラフィンに包埋して、50μm切片に切り分けた。再水和したパラフィン包埋組織切片を、マイヤーヘマトキシリン溶液(Wako)で5分間染色し、水で1-2分間洗浄した。そして、スライドを、エオジン液(Wako)で10分間染色した。組織を、Tissue Gnostics顕微鏡で視覚化した。
【００７９】
定量RT-PCR
全RNA抽出を、TrizolRNA単離試薬(Invitrogen)を使用して実行した。その後、cDNAを製造業者の指示に従ってオリゴ(dT)プライマー(Fermentas)及びSuper Script III逆転写酵素(Invitrogen)を使用して合成した。PCRによるVEGFR2 cDNAを増幅するために用いる順方向及び逆方向プライマーは、以下の通りである:VEGFR2-F:gaacatttgggaaatctcttgc(配列番号: 71);VEGFR2-R:cggaagaacaatgtagtctttgc(配列番号: 72)。定量PCRを、LightCycler480システムを使用して実行した(Roche Applied Science)。VEGFR2の転写産物レベルは、同じサンプル中のGAPDHについて正規化した。比率は、サンプルごとに算出した。反応は、3つ一組で実行した。
【００８０】
結果
VEGFR2に結合するファージ提示scFvの同定
ファージ提示ヒトナイーブscFvライブラリーを用いて、VEGFR2組換え型タンパク質に結合するファージを単離した。4回の親和性選択(バイオパニング)の後、結合したファージの力価は、3,455倍も増加した(図1A)。ELISAスクリーニング及びDNA塩基配列決定を通じて、c-Met-Fcコントロールタンパク質ではなくVEGFR2-Fcによく結合する5つの互いに異なるファージクローン(R2PC8、R2PC12、R2PC28、R2PC29、R2PC45;表1)を同定した(図1B)。次に、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)のFACSアッセイを用いて、5つ全てのクローンが細胞表面上のVEGFR2に結合する能力を有することを確認したところ、5つのクローンのうち、R2PC12が最も大きな反応性を示した(図1C)。表1は、VHのアミノ酸配列及び抗VEGFR2 scFvのVLドメインを示している。
【００８１】
【表１】
0006542383.tif 000005
0006542383.tif 000006
【００８２】
その後、5つのVEGFR2-結合ファージクローン(R2S8、R2S12、R2S28、R2S29及びR2S45)から可溶性scFvタンパク質を生じさせた(図1D)。ヒト肺がん外科的試料の腫瘍血管内皮に対する抗VEGFR2 scFvの結合能力を、免疫蛍光染色アッセイを用いて調査した。抗VEGFR2 scFvの蛍光シグナルは、内皮細胞マーカーCD31と明らかに共局在していることが観察された(図1E)ことから、これらのscFvは、腫瘍血管系を特異的に認識できることが示された。
【００８３】
抗VEGFR2 scFvは、VEGF-A/VEGFR2相互作用及びVEGF-A誘導VEGFR2リン酸化に拮抗した。
抗VEGFR2 scFvがVEGFR2へのVEGF-Aの結合をブロックすることができるか否かを決定するために、固定化VEGFR2への結合がscFvの濃度増大でVEGF-Aと競合するプレートベース競合結合アッセイを実行した。VEGFR2とのVEGF-Aの相互作用は、R2S8及びR2S12によってそれぞれ7.03及び3.26nMの最大半減阻害濃度(IC50)で強く抑制された一方でR2S28及びR2S29は、比較的弱い競合能力を示した(図2A)。次に、scFvがHUVECにおけるVEGFR2のVEGF-A媒介活性を拮抗することができるか否かを調査した。R2S8及びR2S12は、VEGF-AによるVEGFR2のチロシンリン酸化を明らかに阻害し、R2S12は最も強い阻害活性を示した(図2B)。
【００８４】
抗VEGFR2 scFvのエピトープ結合の同定
抗VEGFR2 scFvの役割を果す結合ドメインをマッピングするために、シグナルペプチド及び膜貫通ドメインをからなる一連のVEGFR2欠失変異体を作成した(図8)。これらのタンパク質変異体を293T細胞において異所的に発現させ、R2S8、R2S12及びR2S28を用いて免疫蛍光染色によって検討した(表2)。R2S28は、VEGFR2(1-7)を発現している細胞に結合したが、VEGFR2(2-7)又はVEGFR2(4-7)を発現している細胞には結合しなかったことから、VEGFR2のドメイン1は、R2S28結合に必要であることが示された。R2S8及びR2S12は、VEGFR2(1-7)及びVEGFR2(2-7)を発現している293T細胞に結合するが、ドメイン3を欠いている構築物(例えば、VEGFR2(4-7)、VEGFR2(del2-3)又はVEGFR2(del3))を発現している細胞に結合しないことから、それらの結合エピトープは、ドメイン3の中に位置していることが更に示された。表2は、抗VEGFR2 scFvのエピトープマッピングを示している。
【００８５】
【表２】
0006542383.tif 000007
【００８６】
更に、両方の中和scFv(R2S8及びR2S12)がマウスのVEGFR2タンパク質と交差反応しないことも明らかになった。ヒトとマウスのVEGFR2間のアミノ酸配列アライメントから、67%の同一性だけを有するドメイン3がVEGFR2の細胞外領域の7つのドメインで最も多様なことが明らかになった。従って、ヒトVEGFR2のドメイン3におけるR2S8及びR2S12の互いに異なるエピトープがマウスのVEGFR2において提示されなかったことが推測された。ヒトとマウスのドメイン3の比較から、30残基が異なっており、これらの残基がクラスターに分類されることが明らかになった。R2S8及びR2S12結合に重要なドメイン3のアミノ酸残基を同定するために、以下の通り、変異誘発のための2つの主要なクラスター(M1及びM2)を選択した。ヒトNWEYPS(配列番号: 66)及びTQSGSEM(配列番号: 67)残基を、それぞれ、マウスTWHSPP(配列番号: 68)及びPFPGTVA(配列番号: 69)残基に置換した(図2C)。免疫蛍光染色の結果は、R2S8及びR2S12はVEGFR2-M1変異タンパク質を発現している293T細胞を認識しないことを示している。対照的に、VEGFR2のM2領域の変異は、R2S8及びR2S12への結合に影響を及ぼさなかった(表2)。
【００８７】
既に報告済みの結晶構造情報及び我々の変異誘発データからVEGFR2ドメイン3の分子モデルを作り上げた。リボン及び表面モデルは、NWEYPS(配列番号: 66)残基(M1領域)がVEGFR2ドメイン3のβ-ストランド及び中央表面に局在することを示している(図2D及び2E)。中和抗VEGFR2抗体(IMC-1121B及び6.64)の接触残基及び結合表面は、VEGFR2ドメイン3に位置する(図2C及び2F)。M1領域がIMC-1121B及び6.64抗体の結合エピトープの近くにあることが観察された。IMC-1121B抗体の2つの結合残基(Asn259及びGlu261)は、M1領域に位置していることが明らかになった。従って、我々の結果は、R2S8及びR2S12の結合エピトープがIMC-1121B及び6.64抗体のものと最も異なっている可能性があることを示唆している。
【００８８】
R2S12の親和性成熟を行って結合活性が高い抗-VEGFR2-AFヒト抗体を作成した。親和性が高い中和抗体は、治療の有効性に重要である。R2S12が、検討したscFvのなかで最も強い結合及び拮抗活性を示したため、ファージ提示に基づく親和性成熟を使用してその結合活性を更に向上させた。4回のストリンジェントなインビトロ選別の後、結合活性が優れたクローン(R2S12AF)を同定した(図9A-B)。R2S12-AFのVL-CDR3中の4つの残基は、その親クローン(R2S12)とは異なる(図3A)。scFvフォーマットは、血清半減期が短く(およそ3.5時間)ヒトエフェクター機能を起こさないため臨床用途としては限られていることを示している。これらの課題を克服するために、R2S12及びR2S12-AF scFvのコード配列をヒトIgG1主鎖に分子的に処理してそれぞれ抗VEGFR2及び抗-VEGFR2-AF完全ヒト抗体(hAb)を作成した。
【００８９】
BIACORE T100TMを使用してVEGFR2に対する両ヒト抗体の親和性を分析した。抗体-抗原のカイネティックパラメーターの測定値は、抗-VEGFR2-AF hAbがサブ-nmol/L親和定数(Kd = 0.264nM)を有し、VEGFR2に対する結合親和性がその親クローン抗VEGFR2 hAbを超える8倍に増加している(Kd = 2.1nM;図3B)ことを示している。固相競合アッセイを実行し、個々の抗体によるVEGF-A/VEGFR2結合の破壊を量的に評価した。図3Cは、VEGFR2に対するVEGF-A結合のIC50値は、抗-VEGFR2-AF hAbに対して0.88nM、抗VEGFR2 hAbに対して1.87nM及びIMC-1121Bに対して1.42nMであった。これらのデータは、抗-VEGFR2-AF hAbがVEGF/VEGFR2相互作用のブロックについてIMC-1121Bより優れていることを示している。HUVECのFACS分析の結果は、抗-VEGFR2-AF hAbが細胞表面VEGFR2に対してIMC-1121Bよりも強い結合を示すことを更に証明するものである(図3D)。
【００９０】
抗-VEGFR2-AF hAbは、VEGFR2媒介シグナル伝達経路の活性を阻害し、HUVECにおける毛細血管の構造形成を破壊する。
抗-VEGFR2-AF hAbの抗血管新生の潜在性を解明するために、HUVEC成長、遊走及びチューブ形成に対する抗-VEGFR2-AF hAbの影響を分析した。抗-VEGFR2-AF hAbが、MTT及び創傷-治癒アッセイを用いてそれぞれVEGF-A誘導HUVEC増殖及び遊走を抑制したことを明らかにした。内皮細胞チューブ形成(血管新生における重要なステップ)に対する抗-VEGFR2-AF hAbの効果を調査するために、VEGF-A及び抗-VEGFR2-AF hAbの存在及び非存在下でMATRIGEL(登録商標)層上のHUVECを調べた(図4A)。遊走及び毛細血管様構造の形成に関する内皮細胞の能力を、倒立型写真用顕微鏡を使用して評価及び定量化した。チューブ長及び分岐点数の測定値に基づいて、抗-VEGFR2-AF hAbがVEGF-A誘発毛細血管様構造の抑制についてIMC-1121Bよりも有効的であることを確かめた。(図4A)。
【００９１】
抗-VEGFR2-AF hAbの抗血管新生特性の基礎をなす分子的機構を調査するために、ウェスタンブロッティングによってシグナル伝達分子及び経路を検討した(図4B)。抗-VEGFR2-AF hAbが、VEGFR-2及びそれらの下流シグナル伝達分子(例えばAkt、MAPK及びFAK)のVEGF-A誘導リン酸化を効率的に減弱させることを明らかにした。特に、抗VEGFR2-AF処理グループにおいてリン酸化されたVEGFR2、Akt及びMAPKのレベルは、IMC-1121B処理グループにおけるものよりも低かった一方で、FAKのリン酸化は、いずれかの抗体での処理によって、わずかに低減されるだけだった(図4B)。この結果は、抗-VEGFR2-AF hAbが血管内皮細胞血管新生のいくつかの基本的ステップを著しく阻害することを示しているため、この抗体がインビボ抗血管新生の潜在性を有する可能性が示唆された。
【００９２】
抗-VEGFR2-AF hAbは、VEGFR2発現ヒト前立腺がん細胞におけるVEGF-A誘導細胞機能を阻害する。
ヒト前立腺がん細胞株PC-3をモデルとして選択し腫瘍成長の阻害について抗-VEGFR2-AF hAbの治療の有効性を調べた。定量逆転写-PCR(qRT-PCR)分析を実行してPC-3細胞におけるVEGFR2の内因性発現を調査した(図5A)。HUVEC、EA.hy926及びhESC-H9細胞は、VEGFR2 mRNAの発現が高いことで知られているため、ポジティブコントロールとして使われている。VEGFR2 mRNAはPC-3細胞において容易に検出可能であるが、ネガティブコントロール293Tの細胞においてかろうじて検出可能であることが明らかになった。
【００９３】
PC-3細胞上のVEGF-A/VEGFR2の機能的な重要性を特徴づけるために、VEGF-A処理に応じてPC-3細胞活性を分析した。VEGF-Aでの処理によってPC-3細胞の様々な細胞活性(増殖、コロニー形成及び侵襲性能力を含む)を強化できることが明らかになった(図5B)。レンチウイルス媒介shRNAをもつVEGFR2-ノックダウンPC-3細胞を確立した(shVEGFR2;図5C)。VEGFR2のノックダウンは、コントロールshRNAに感染したPC-3細胞(shLuc;図5D)と比較して、PC-3細胞の増殖、コロニー形成及び侵襲性能力が低下していることが明らかになった。我々は、PC-3細胞を抗-VEGFR2-AF hAbで処理して、VEGF-A誘導細胞活性が抗-VEGFR2-AF hAbによって抑制できることを証明した(図10A-C)。従って、これらのデータは、VEGF/VEGFR2軸がPC-3細胞のクローン形成及び腫瘍形成能力に重要であることを示している。
【００９４】
一般公開されている関連したマイクロアレイデータセットにおけるVEGFR2発現パターンを調査した。転移性前立腺腫瘍のVEGFR2転写産物量が一次腫瘍(図5E)のものよりも高いことが明らかになった。商用抗VEGFR2抗体を使用してヒト前立腺がん組織アレイを染色することで、VEGFR2が腫瘍細胞において検出可能であり、そして、その発現レベルがグレードIII前立腺腺がんにおいて、グレードIと比較して上昇することが明らかになった(図5F)。通常の前立腺組織試料において、VEGFR2は、正常前立腺細胞ではなく、血管内皮に存在している。
【００９５】
ヒト前立腺がん異種移植片における抗-VEGFR2-AF治療の有効性
抗-VEGFR2-AF hAb対IMC-1121Bのインビボ抗腫瘍活性を明らかにするために、PC-3異種移植片前立腺腫瘍モデルを使用した。ドセタキセルは、転移性去勢療法抵抗性前立腺がんを患っている患者に最初に使用される化学療法剤である。従って、ドセタキセル及び抗-VEGFR2-AF hAb又はIMC-1121Bの併用治療効果を調査した。PC-3異種移植片を有するNOD/SCIDマウスに、IMC-1121B、抗-VEGFR2-AF hAb、ドセタキセル、抗-VEGFR2-AF hAb及びドセタキセル又はIMC-1121B及びドセタキセルを投与した(図6A)。38日目で、腫瘍成長減退は、抗-VEGFR2-AF hAbとドセタキセルとの併用で治療したマウスで90%、IMC-1121Bとドセタキセルとの併用で治療したマウスで82%、ドセタキセルで治療したマウスで70%、抗-VEGFR2-AF hAbで治療したマウスで52%、そして、IMC-1121Bで治療したマウスで45%に達した(図6B)。体重を、マウスの健康状態の代わりの指標として用いた(図6C)。抗-VEGFR2-AF hAb及びIMC-1121Bグループは、NHIgGグループと比較して、治療期間の間、体重に有意な変化を示さなかった。ドセタキセル単独での治療は、体重を著しく減少(約20%)させた。他の抗体と併用してドセタキセルで治療したマウスは、ドセタキセル単独で治療したマウスと同様に体重を失った。これは、抗-VEGFR2-AF hAb及びIMC-1121Bがドセタキセル誘導毒性を高めないことを示している。
【００９６】
腫瘍重量を計量して、腫瘍体積に合致していることが明らかになった(図6D及び6E)。腫瘍血管を検出する抗CD31抗体及びアポトーシス細胞を同定するTUNELアッセイを用いて各グループの腫瘍組織を更に検討した。抗-VEGFR2-AFhAbが腫瘍血管の密度を低下させてがん細胞アポトーシスを高める点でIMC-1121Bよりも優れていることが明らかになった(図11A及び11B)。これらの結果は、抗-VEGFR2-AF hAbが腫瘍成長を低下させる点でIMC-1121Bよりも有効であり、抗-VEGFR2-AF hAbがマウスでのヒト前立腺腫瘍の治療におけるドセタキセルの効果を著しく高めることを示している。
【００９７】
抗-VEGFR2-AF hAbは、HL-60白血病異種移植片を有するマウスの生存期間を延ばす。
VEGF-A/VEGFR2経路は、固形腫瘍だけでなく、液腫瘍(例えば白血病又はリンパ腫)においても重要な機能を有する。以前の調査で、IMC-1121BがHL-60白血病成長を阻害して、マウスモデルの生存期間を延ばす根拠が示された。IMC-1121Bの抗白血病効果と抗-VEGFR2-AF hAbの抗白血病効果とを比較するために、NSGマウスのHL-60白血病異種移植片モデルを開発した。マウスに、5X106個のHL-60細胞を静脈内に注射して、3日後にIMC-1121B、抗-VEGFR2-AF、NHIgG又はPBSで治療した。図7Aに示すように、全てのPBS又はNHIgG処理マウスは、36日以内に死んだ。しかしながら、VEGFR2に対する抗体で治療した白血病マウスは、生存期間が著しく伸びることが示された。抗-VEGFR2-AF hAbで治療したマウスは、IMC-1121Bで治療したマウス(56日;中央値= 43日)よりも長く生存した(70日;中央値= 53日)。体重の有意な変化は、グループ間で観察されなかった(図7B)。
【００９８】
全てのマウスの死後組織病理検査からは、各グループにおけるマウスの肝臓、脾臓、心臓又は腎臓で明らかな病理学的変化が見つからないことが示された。白血病マウスの卵巣は、正常卵巣と比較して、肥大していた(図7C)。H&E染色から、転移性白血病細胞が卵巣に浸潤していることが明らかになった(図12A及び12B)。抗-VEGFR2-AF hAbで治療したグループの平均卵巣体積は、IMC-1121Bで治療したグループよりも著しく小さかった(図7D)。
【００９９】
更に、白血病細胞が浸潤しているリンパ節が、抗-VEGFR2-AF hAbで治療した9匹のマウスのうちの1匹において認められた一方で、白血病細胞が浸潤しているリンパ節が、IMC-1121Bで治療した9匹のマウスのうちの5匹に存在していた(図7E)。
【０１００】
腫瘍内皮に対するVEGFR2の抗-VEGFR2-AF hAb媒介ターゲッティングがVEGF-A誘導シグナル伝達を阻害するだけでなく、直接目標とされた細胞を殺す抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)又は補体依存性細胞傷害(CDC)を引き起こす。これは、現在の抗血管新生治療を強化することができる。
【０１０１】
抗-VEGFR2-AF hAbは、腫瘍細胞もVEGFR2を発現するため、腫瘍血管及び悪性細胞の両方に対する二重ターゲッティング及び阻害効果を発揮できる可能性がある。二重ターゲッティング能力は、がん療法において相乗効果を発揮することができる。完全ヒト抗体である抗-VEGFR2-AFを生産した。これは、VEGFR2に対する優れた結合性を示し、この受容体の活性に拮抗した。IMC-1121Bと同様、抗-VEGFR2-AF hAbは、マウスVEGFR2を除く、ヒトVEGFR2に特異的に結合した。IMC-1121Bと比較して、抗-VEGFR2-AF hAbは、VEGF-A/VEGFR2軸媒介シグナル伝達を遮断することによって、インビトロ及びインビボでより大きな抗腫瘍効果を呈した。我々は、抗VEGFR2抗体が前立腺がんの治療におけるドセタキセルでの治療の有効性を向上できることを初めて証明した。この発見は、抗-VEGFR2-AF hAbを血管新生及びVEGFR2発現腫瘍細胞を同時且つ直接的に阻害することによってがん治療用治療抗体として潜在的に用いることができることを示唆している。
【０１０２】
要約すると、FDA認可の抗VEGFR2ヒト抗体IMC-1121B(ラムシルマブ)と比較して、抗-VEGFR2-AF hAbは、著しく優れた活性を有し、インビトロでVEGF-A媒介毛細血管構造形成を抑制した。我々は、ヒト前立腺がん細胞株(PC-3)及び白血病細胞株(HL-60)におけるVEGFR2発現が観察され、VEGFR2発現がヒト前立腺がんの転移及び悪性腫瘍に関連していることが示された。PC-3由来異種移植片マウスモデルにおいて、抗-VEGFR2-AF hAbを用いた治療(単独療法又はドセタキセルとの併用療法)は、IMC-1121Bでの治療よりも効果的に腫瘍成長及び血管新生を抑制した。HL-60由来白血病マウスにおいて、抗-VEGFR2-AF hAbは、生存期間を延ばし且つ卵巣及びリンパ節への白血病細胞の転移を低減する点でIMC-1121Bよりも有意な有効性を示した。
【０１０３】
本発明の例示的な実施形態に関する前述の説明は、図示及び説明の目的のためだけに示しており、網羅的であったり開示される厳密な形態に本発明を制限したりすることを意図するものではない。上記説明の観点から多くの修正形態及び変更形態が可能である。この明細書中で引用され議論されている全ての文献は、それらの全体が本願明細書に引用によって組み込まれており、各文献が引用によって個々に組み込まれているのと同程度に組込まれている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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