(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１〜５０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
のいずれかのアミノ酸配列において、３番目のＶａｌに相当するアミノ酸残基のＩｌｅへの置換、５９０番目のＡｌａに相当するアミノ酸残基のＴｈｒへの置換、および６９０番目のＧｌｕに相当するアミノ酸残基のＧｌｙへの置換からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基の置換を含み、かつ、熱安定性が向上している変異型リジン脱炭酸酵素の作用により、Ｌ−リジンおよび／またはその塩から１，５−ペンタメチレンジアミンを生成することを含む、１，５−ペンタメチレンジアミンの製造方法。
【請求項２】
前記変異型リジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された微生物を用いて、Ｌ−リジンおよび／またはその塩から１，５−ペンタメチレンジアミンを生成することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記微生物が熱処理される、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記微生物がエシェリヒア・コリである、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
下記：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１〜５０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
のいずれかのアミノ酸配列において、３番目のＶａｌに相当するアミノ酸残基のＩｌｅへの置換、５９０番目のＡｌａに相当するアミノ酸残基のＴｈｒへの置換、および６９０番目のＧｌｕに相当するアミノ酸残基のＧｌｙへの置換からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基の置換を含み、かつ、熱安定性が向上している変異型リジン脱炭酸酵素。
【請求項６】
請求項５記載の変異型リジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項７記載の発現ベクターを含む微生物。
【請求項９】
前記微生物がエシェリヒア・コリである、請求項８記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱安定性向上リジン脱炭酸酵素変異体を用いる１，５−ペンタジアミンの製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
１，５−ペンタジアミン（カダベリンとも呼ばれる。以下、必要に応じて、「１，５−ＰＤ」と略記する）は、ポリアミド樹脂などの樹脂原料として、あるいは医薬中間体として需要が見込まれる物質である。１，５−ＰＤは、非石油系原料から製造可能であるため、環境負荷の低減という観点からも工業的に注目されている。【０００３】
１，５−ＰＤの生物学的製造方法では、リジン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）が利用されている。ＬＤＣは、リジンから１，５−ＰＤおよびＣＯ２を生成する酵素である。ＬＤＣを用いる１，５−ＰＤの製造方法としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（特許文献１〜３）、シニクイチ（Ｈｅｉｍｉａ  ｓａｌｉｃｏｆｏｌｉａ）（非特許文献１）、大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）（非特許文献２）、ハウチワマメ（Ｌｕｐｉｎｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｙｌｌｕｓ）（非特許文献３）由来のＬＤＣを用いる方法が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開第２００２−２２３７７０号公報
【特許文献２】特開第２００８−１９３８９９号公報
【特許文献３】国際公開第２０１３／１０８８５９号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｐｅｌｏｓｉ，Ｌ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５，２３１５−２３１９（１９８６）
【非特許文献２】Ｋｉｍ，Ｈ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５４，４０−４６（１９９８）
【非特許文献３】Ｈａｒｔｍａｎｎ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１１５，３５−３８（１９８０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＬＤＣは、非分泌タンパク質である。したがって、ＬＤＣを発現する微生物を用いる方法では、微生物内に存在するＬＤＣは、培養液中に添加されたリジンが微生物内に吸収されない限り反応できないことから、１，５−ＰＤを効率的に製造することができない。微生物内に存在するＬＤＣを、培養液中に添加されたリジンと反応させるため、微生物を破砕することは有効であるが、実際の生産現場において大量の微生物を破砕するのは負荷が大きい（例、相当の労力およびコスト）という課題がある。したがって、本発明の目的は、実際の生産現場により適した様式において、１，５−ＰＤを効率的に製造することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意検討した結果、微生物を破砕するのではなく、熱安定性ＬＤＣを用いて微生物を熱処理しても、リジンから１，５−ＰＤを効率良く生成できることを見出した。本発明者らはまた、このような方法に好適に用いることができる熱安定性を示す変異型ＬＤＣを作製することなどに成功し、もって本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕下記：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
のいずれかのアミノ酸配列において、３番目のＶａｌに相当するアミノ酸残基、５９０番目のＡｌａに相当するアミノ酸残基、および６９０番目のＧｌｕに相当するアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基が置換されており、かつ、熱安定性が向上している変異型リジン脱炭酸酵素の作用により、Ｌ−リジンおよび／またはその塩から１，５−ペンタメチレンジアミンを生成することを含む、１，５−ペンタメチレンジアミンの製造方法。
〔２〕前記変異型リジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された微生物を用いて、Ｌ−リジンおよび／またはその塩から１，５−ペンタメチレンジアミンを生成することを含む、上記〔１〕の方法。
〔３〕前記置換が、３番目のＶａｌに相当するアミノ酸残基のＩｌｅへの置換、５９０番目のＡｌａに相当するアミノ酸残基のＴｈｒへの置換、または６９０番目のＧｌｕに相当するアミノ酸残基のＧｌｙへの置換である、上記〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕前記微生物が熱処理される、上記〔２〕または〔３〕の方法。
〔５〕前記微生物がエシェリヒア・コリである、〔２〕〜〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕下記：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
のいずれかのアミノ酸配列において、３番目のＶａｌに相当するアミノ酸残基、５９０番目のＡｌａに相当するアミノ酸残基、および６９０番目のＧｌｕに相当するアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基が置換されており、かつ、熱安定性が向上している変異型リジン脱炭酸酵素。
〔７〕前記置換が、３番目のＶａｌに相当するアミノ酸残基のＩｌｅへの置換、５９０番目のＡｌａに相当するアミノ酸残基のＴｈｒへの置換、または６９０番目のＧｌｕに相当するアミノ酸残基のＧｌｙへの置換である、〔６〕の変異型リジン脱炭酸酵素。
〔８〕〔６〕または〔７〕の変異型リジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチド。
〔９〕〔８〕のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔１０〕〔９〕の発現ベクターを含む微生物。
〔１１〕前記微生物がエシェリヒア・コリである、〔１０〕の微生物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法は、実際の生産現場により適した様式において、１，５−ＰＤを効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、６８℃加熱処理後の野生型酵素および変異型酵素の残存活性を示す図である。ＣａｄＡ２２０：野生型酵素；ＣａｄＡ２３１：Ｖ３Ｉ変異体；ＣａｄＡ２３３：Ａ５９０Ｔ変異体；ＣａｄＡ２３４：Ｖ３Ｉ／Ａ５９０Ｔ変異体。
【図２】図２は、変異型リジン脱炭酸酵素を用いた１，５−ＰＤの製造におけるキレート剤の添加の効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、変異型リジン脱炭酸酵素の作用により、Ｌ−リジンおよび／またはその塩から１，５−ペンタメチレンジアミンを生成することを含む、１，５−ペンタメチレンジアミンの製造方法を提供する。
【００１２】
変異型リジン脱炭酸酵素としては、熱安定性が向上したものを用いることができる。具体的には、このような変異型リジン脱炭酸酵素としては、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
のいずれかのアミノ酸配列において、熱安定性を向上させる１以上のアミノ酸残基の変異を有し、かつ、リジン脱炭酸活性を有するものを用いることができる。
本発明において、リジン脱炭酸活性とは、リジンを１，５−ＰＤに転換する活性をいう。
本発明はまた、このような変異型リジン脱炭酸酵素を提供する。
【００１３】
本発明の変異型リジン脱炭酸酵素は、大腸菌（Ｅｓｃｈｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に由来し得る。大腸菌及び類縁種由来の
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
のいずれかのアミノ酸配列を保有する酵素でリジン脱炭酸活性を有する酵素をもとに、安定性を向上させる１以上のアミノ酸残基の変異を導入することができる。大腸菌由来のリジン脱炭酸酵素は、ＣａｄＡとも呼ばれ、サブユニット分子量８１ｋＤａの単量体から構成される１０量体を形成することが知られている。
【００１４】
上記（ｂ）のアミノ酸配列は、１または数個のアミノ酸残基の変異（例、置換、欠失、挿入、および付加）を含んでいてもよい。変異の数は、例えば１〜５０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、さらにより好ましくは１〜２０個、最も好ましくは１〜１０個（例、１、２、３、４または５個）である。
【００１５】
上記（ｃ）のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上のアミノ酸配列同一性を有していてもよい。アミノ酸配列の同一性パーセントは、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上または９９％以上であってもよい。
【００１６】
アミノ酸配列の同一性は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、ＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、アミノ酸配列の同一性を計算してもよい。また、アミノ酸配列の同一性としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ  Ｓｉｚｅ  ｔｏ  Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＳｉｍｉｌａｒｉｔｙをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。アミノ酸配列の同一性として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。
【００１７】
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、および（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列の調製のため、配列番号１のアミノ酸配列に対して変異が導入され得るアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかであり、例えば、アミノ酸配列のアライメントを参考にして変異を導入することができる。具体的には、当業者は、１）複数のホモログ（既知のリジン脱炭酸酵素）のアミノ酸配列を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、熱安定性を向上させる１以上のアミノ酸残基の変異が導入される、（ｂ）および（ｃ）のアミノ酸配列を決定することができる。
【００１８】
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、および（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列の調製のため、配列番号１のアミノ酸配列に対してアミノ酸残基の変異が導入され、かつ当該アミノ酸残基の変異が置換である場合、アミノ酸残基のこのような置換は、保存的置換であってもよい。用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸および非極性側鎖を有するアミノ酸を包括的に、中性アミノ酸と呼称することがある。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
【００１９】
本発明の変異型リジン脱炭酸酵素は、熱安定性を向上するように少なくとも１つのアミノ酸残基を変異させたものである。アミノ酸残基の変異としては、例えば、置換、欠失、付加および挿入が挙げられるが、置換が好ましい。変異されるべきアミノ酸残基は、天然のＬ−α−アミノ酸である、Ｌ−アラニン（Ａ）、Ｌ−アスパラギン（Ｎ）、Ｌ−システイン（Ｃ）、Ｌ−グルタミン（Ｑ）、Ｌ−イソロイシン（Ｉ）、Ｌ−ロイシン（Ｌ）、Ｌ−メチオニン（Ｍ）、Ｌ−フェニルアラニン（Ｆ）、Ｌ−プロリン（Ｐ）、Ｌ−セリン（Ｓ）、Ｌ−スレオニン（Ｔ）、Ｌ−トリプトファン（Ｗ）、Ｌ−チロシン（Ｙ）、Ｌ−バリン（Ｖ）、Ｌ−アスパラギン酸（Ｄ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｅ）、Ｌ−アルギニン（Ｒ）、Ｌ−ヒスチジン（Ｈ）、またはＬ−リジン（Ｋ）、あるいはグリシン（Ｇ）である。変異が置換、付加または挿入である場合、置換、付加または挿入後のアミノ酸残基は、上述した変異されるべきアミノ酸残基と同様である。以下、アミノ酸の表記について、Ｌおよびαを省略することがある。
【００２０】
熱安定性を向上するアミノ酸残基の変異を含む本発明の変異型リジン脱炭酸酵素は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列、（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、または（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、３番目のＶａｌに相当するアミノ酸残基、５９０番目のＡｌａに相当するアミノ酸残基、および６９０番目のＧｌｕに相当するアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基の置換を含むものであってもよい。（ｂ）および（ｃ）のアミノ酸配列において上記所定のアミノ酸残基に相当する位置は、当業者であれば適宜決定することができる。本発明の変異型リジン脱炭酸酵素は、上記位置の置換を複数（例、２個または３個）組み合わせて含んでいてもよい。３番目のＶａｌに相当するアミノ酸残基は、好ましくは、イソロイシン残基に置換される。５９０番目のＡｌａに相当するアミノ酸残基は、好ましくは、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸残基であり、より好ましくは、スレオニン残基である。６９０番目のＧｌｕに相当するアミノ酸残基は、好ましくは、中性アミノ酸残基であり、より好ましくは、非極性側鎖を有するアミノ酸残基であり、さらにより好ましくは、グリシン残基である。
【００２１】
本発明の変異型リジン脱炭酸酵素はまた、Ｃ末端またはＮ末端に、他のペプチド成分（例、タグ部分）を有していてもよい。本発明の変異型リジン脱炭酸酵素に付加され得る他のペプチド成分としては、例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分（例、ヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ等のタグ部分；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質等の目的タンパク質の精製に汎用されるタンパク質）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分（例、Ｎｕｓ−ｔａｇ）；シャペロンとして働くペプチド成分（例、トリガーファクター）；他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分が挙げられる。
【００２２】
本発明の１，５−ＰＤの製造方法では、上述したような変異型リジン脱炭酸酵素の作用により、Ｌ−リジンおよび／またはその塩から１，５−ＰＤが生成される。Ｌ−リジンの塩としては、無機酸塩（例、塩酸塩）、無機塩基塩（例、アンモニウム塩）、有機酸塩（例、酢酸塩）、および有機塩基塩（例、トリエチルアミン塩）等の非金属塩、ならびにアルカリ金属塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩）、およびアルカリ土類金属塩（例、カルシウム塩、マグネシウム塩）等の金属塩が挙げられる。
【００２３】
好ましくは、１，５−ＰＤの生成は、変異型リジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された微生物（即ち、後述するような本発明の形質転換体）を用いて行われる。本発明の形質転換体を用いて１，５−ＰＤが生成される場合、１，５−ＰＤ生成のための培養条件は、後述するような形質転換体の培養条件と同様である。
【００２４】
本発明の形質転換体を用いて１，５−ＰＤが生成される場合、非分泌タンパク質であるリジン脱炭酸酵素を形質転換体外に放出させるため、本発明の形質転換体を熱処理することができる。熱処理としては、例えば、４０℃以上の温度（例、４０℃〜７０℃、好ましくは５０℃〜６０℃）で１０分〜１２時間（例、１〜６時間、好ましくは１時間〜３時間）の加熱処理が挙げられる。形質転換体の熱処理は、培養後のブロスのままであっても、緩衝液などに再懸濁したものであってもよい。本発明の形質転換体を用いて１，５−ＰＤが生成される場合、１，５−ＰＤの収量を向上させるため、本発明の形質転換体の培養液中にＬ−リジンおよび／またはその塩を追加することができる。
【００２５】
本発明の１，５−ＰＤの製造方法は、金属キレート剤の存在下で行われてもよい。１，５−ＰＤの製造は、鉄を含有する金属性発酵タンク等の鉄含有容器中で行うことができるが、例えば、基質としてリジン塩酸塩を用いた場合、塩化物イオンが鉄含有容器からの鉄の溶離を促進し得る。配列番号１のアミノ酸配列からなるリジン脱炭酸酵素は、鉄により酵素活性が阻害される性質を有するので、上記のとおり溶離した鉄は、本リジン脱炭酸酵素の酵素活性を阻害し得る。したがって、阻害剤として作用する鉄を捕捉するため、金属キレートを利用することができる。金属キレート剤は、鉄を捕捉できるものであれば単座キレート剤であっても多座キレート剤であってもよく、例えば、ポリホスフェート類（例、トリポリリン酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸、酸性ピロリン酸ナトリウム、ピロリン酸ナトリウム、ピロリン酸四ナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム）；アミノカルボン酸類（例、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，２−ビス（２−アミノ−フェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、Ｎ−（ヒドロキシエチル）−エチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｎ−ジヒドロキシエチルグリシン（２−ＨｘＧ）、エチレンビス（ヒドロキシフェニル−グリシン）（ＥＨＰＧ）、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、リジン）；１，３−ジケトン類（例、アセチルアセトン、トリフルオロアセチルアセトン、テノイルトリフルオロアセトン、アスコルビン酸）；ヒドロキシカルボン酸類（例、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、グルコン酸、フェルラ酸、乳酸、グルクロン酸）；ポリアミン類（例、ジエチレントリアミン、トリエチレントリアミン）；アミノアルコール類（例、トリエタノールアミン、Ｎ−ヒドロキシエチレン−ジアミン、アミノエチルエタノールアミン（ＡＥＥＡ）；フェノール類（例、ジスルホピロカテコール、クロモトロプ酸）；アミノフェノール類（例、オキシンスルホン酸）；シッフ塩基（例、ジサリチルアルデヒド１，２−プロピレンジイミン）が挙げられる。金属キレート剤の濃度は、例えば０．１〜１０ｍＭ、好ましくは０．５〜２ｍＭである。
【００２６】
本発明はまた、本発明の変異型リジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。
【００２７】
本発明の変異型リジン脱炭酸酵素は、本発明の変異型リジン脱炭酸酵素を発現する本発明の形質転換体を用いて、または無細胞系等を用いて、調製することができる。本発明の形質転換体は、例えば、本発明の発現ベクターを作製し、次いで、この発現ベクターを宿主に導入することにより作製できる。
【００２８】
本発明の発現ベクターは、本発明の変異型リジン脱炭酸酵素をコードする本発明のポリヌクレオチドを含む。
本発明の発現ベクターとしては、例えば、宿主においてタンパク質を発現させる細胞系ベクター、およびタンパク質翻訳系を利用する無細胞系ベクターが挙げられる。発現ベクターはまた、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクター、または人工染色体であってもよい。組込み型ベクターは、その全体が宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。あるいは、組込み型ベクターは、その一部（例、本発明の変異型リジン脱炭酸酵素をコードする本発明のポリヌクレオチド、およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位）のみが宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。発現ベクターはさらに、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。
本発明の発現ベクターはまた、本発明のポリヌクレオチドに加えて、プロモーター、ターミネーターおよび薬剤（例、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン）耐性遺伝子をコードする領域等の領域をさらに含むことができる。本発明の発現ベクターは、プラスミドであっても組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであってもよい。本発明の発現ベクターはまた、ウイルスベクターであっても無細胞系用ベクターであってもよい。本発明の発現ベクターはさらに、本発明のポリヌクレオチドに対して３’または５’末端側に、本発明の変異型リジン脱炭酸酵素に付加され得る他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、上述したような目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、上述したような目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、シャペロンとして働くペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む種々の発現ベクターが利用可能である。したがって、本発明の発現ベクターの作製のため、このような発現ベクターを利用してもよい。例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＥＴ−１５ｂ、ｐＥＴ−５１ｂ、ｐＥＴ−４１ａ、ｐＭＡＬ−ｐ５Ｇ）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＥＴ−５０ｂ）、シャペロンとして働くペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＣｏｌｄ  ＴＦ）、他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを利用することができる。本発明の変異型リジン脱炭酸酵素とそれに付加された他のペプチド成分との切断をタンパク質発現後に可能にするため、本発明の発現ベクターは、プロテアーゼによる切断部位をコードする領域を、本発明の変異型リジン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドと他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドとの間に含んでいてもよい。
【００２９】
本発明の変異型リジン脱炭酸酵素を発現させるための宿主としては、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、コリネバクテリウム属細菌〔例、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）〕、およびバチルス属細菌〔例、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）〕をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス属細菌〔例、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）〕、ピヒア属細菌〔例、ピヒア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）〕、アスペルギルス属細菌〔例、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）〕をはじめとする種々の真核細胞を用いることができる。宿主としては、所定の遺伝子を欠損する株を用いてもよい。形質転換体としては、例えば、細胞質中に発現ベクターを保有する形質転換体、およびゲノム上に目的遺伝子が導入された形質転換体が挙げられる。
【００３０】
本発明の形質転換体は、所定の培養装置（例、試験管、フラスコ、ジャーファーメンター）を用いて、例えば後述の組成を有する培地において培養することができる。培養条件は適宜設定することができる。具体的には、培養温度は１０℃〜３７℃であってもよく、ｐＨは６．５〜７．５であってもよく、培養時間は１ｈ〜１００ｈであってもよい。また、溶存酸素濃度を管理しつつ培養を行っても良い。この場合、培養液中の溶存酸素濃度（ＤＯ値）を制御の指標として用いることがある。大気中の酸素濃度を２１％とした場合の相対的な溶存酸素濃度ＤＯ値が、例えば１〜１０％を、好ましくは３％〜８％を下回らない様に、通気・攪拌条件を制御することが出来る。また、培養はバッチ培養であっても、フェドバッチ培養であっても良い。フェドバッチ培養の場合は糖源となる溶液やリン酸を含む溶液を培養液に連続的あるいは不連続的に逐次添加して、培養を継続することも出来る。
【００３１】
形質転換される宿主は、上述したとおりであるが、大腸菌について詳述すると、大腸菌Ｋ１２株亜種のエシェリヒア  コリ  ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株などから選択することが出来る。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ（２００１／０１／１５）などにも記載されている。以下、形質転換された大腸菌を作製し、これを用いて所定の酵素を製造する方法を、一例としてより具体的に説明する。
【００３２】
本発明のポリヌクレオチドを発現させるプロモーターとしては、通常Ｅ．ｃｏｌｉにおける異種タンパク質生産に用いられるプロモーターを使用することができ、例えば、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＣ、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、Ｔ５プロモーター等の強力なプロモーターが挙げられ、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＣ、ｌａｃが好ましい。また、ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ（例、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８）、ｐＳＴＶ、ｐＢＲ（例、ｐＢＲ３２２）、ｐＨＳＧ（例、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８）、ＲＳＦ（例、ＲＳＦ１０１０）、ｐＡＣＹＣ（例、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４）、ｐＭＷ（例、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８）、ｐＱＥ（例、ｐＱＥ３０）、およびその誘導体等を用いてもよい。他のベクターとしては、ファージＤＮＡのベクターを利用してもよい。さらに、プロモーターを含み、挿入ＤＮＡ配列を発現させることができる発現ベクターを使用してもよい。好ましくは、ベクターは、ｐＵＣ、ｐＳＴＶ、ｐＭＷであってもよい。
【００３３】
また、本発明のポリヌクレオチドの下流に転写終結配列であるターミネーターを連結してもよい。このようなターミネーターとしては、例えば、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネーターが挙げられる。
【００３４】
本発明のポリヌクレオチドを大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入および／または付加などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。
【００３５】
また、形質転換体を選別するために、ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている〔例、ｐＵＣ系（タカラバイオ社製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）〕。
【００３６】
得られた本発明の発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養することにより、本発明の変異型リジン脱炭酸酵素を得ることができる。
【００３７】
培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。培地は、所定の炭素源、窒素源、補酵素（例、塩酸ピリドキシン）を含有していてもよい。具体的には、ペプトン、酵母エキス、ＮａＣｌ、グルコース、ＭｇＳＯ４、硫酸アンモニウム、リン酸２水素カリウム、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、などを用いても良い。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモーター、宿主菌等の種類に応じて適宜選択される。
【００３８】
本発明の変異型リジン脱炭酸酵素を回収するには、以下の方法などがある。本発明の変異型リジン脱炭酸酵素は、本発明の形質転換体を回収した後、菌体を破砕（例、ソニケーション、ホモジナイゼーション）あるいは溶解（例、リゾチーム処理）することにより、破砕物および溶解物として得ることができる。このような破砕物および溶解物を、抽出、沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法に供することにより、本発明の変異型リジン脱炭酸酵素を得ることができる。あるいは、本発明の変異型リジン脱炭酸酵素の回収は、本発明の形質転換体を、上述したような熱処理に付した後に行うことができる。
【実施例】
【００３９】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００４０】
実施例１：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）のクローニング、変異導入および熱安定性向上変異体のスクリーニング
（１）ｃａｄＡ遺伝子のクローニングと変異型リジン脱炭酸酵素（ＣａｄＡ）発現ライブラリー構築
特開第２００８−１９３８９９号公報の実施例１に記載の方法に従いＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ３９９３６）の染色体を鋳型として、ＰＣＲ法によりリジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）を含むＤＮＡ断片を増幅した。これを改変型Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属酸性フォスファターゼプロモーターと共にプラスミドｐＵＣ１９（タカラバイオ）のＸｂａＩ−ＰｓｔＩサイトに連結した高発現プラスミドを構築し、ｐＣａｄＡ２２０と命名した。【００４１】
ｐＣａｄＡ２２０で、ランダム突然変異導入に用いられるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｒｅｄ  コンピテントセル（アジレント・テクノロジー）を形質転換し、形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地３ｍｌに接種し、３０℃で２４時間培養した。この菌体よりランダム突然変異の導入されたプラスミドを回収し、次いで本プラスミドでＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株を形質転換した。形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地にプレーティングし、変異型ＣａｄＡ発現ライブラリーを構築した。【００４２】
（２）熱安定性向上変異体の取得
変異型リジン脱炭酸酵素遺伝子を導入した各形質転換体のコロニーを釣菌し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１ｍｌに接種し、３０℃で２４時間培養した。この培養液１０μｌに１００ｍＭ  ２−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）  ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＭＥＳ）−ＮａＯＨ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）  １８μｌ、ＦａｓｔＢｒｅａｋ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）２．７μｌを添加し、３７℃で３０分保温して菌体を溶菌させた。次いで、この溶菌液を６５℃まで加熱し、２時間保温した。加熱処理後、リジンＨＣｌ塩  １０ｇ／ｌ、ＭＥＳ  ２１．３ｇ／ｌ（１００ｍＭ）、Ｐｙｒｉｄｏｘａｌ−５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＰＬＰ）  ２６．５ｍｇ／ｌ、Ｂｒｏｍｏｃｒｅｓｏｌ  ｐｕｒｐｌｅ  ２０ｍｇ／ｌを含む反応液１９０μｌ（ｐＨ５．５）を添加し、３７℃で４０分反応させた。この条件では野生型酵素は失活し、脱炭酸反応が進まなくなる。上記条件で熱処理後も活性を保持し、野生型酵素発現菌よりも多く１，５−ＰＤを生成することを指標に、熱安定向上ＣａｄＡを発現した候補株３株を得た。これらのＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株の形質転換体を順にＣａｄＡ２３１、ＣａｄＡ２３２、ＣａｄＡ２３３株と命名した。【００４３】
リジン脱炭酸酵素活性は、特開第２００８−１９３８９９号公報に記載の方法に準じて測定した。１０ｇ／ｌ（５５ｍＭ）Ｌ−リジンＨＣｌ塩、および２６．５ｍｇ／ｌ（０．１ｍＭ）  ＰＬＰを含む１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０）を含む反応液１ｍｌに菌体懸濁液またはその処理物０．１ｍｌを添加して３７℃で５分間反応した。反応液０．１ｍｌを採取して１ｍｌの１％（ｖ／ｖ）リン酸に添加し、反応を停止した。リジンおよび１，５−ＰＤをポストカラムＯＰＡ法（Ｓ．Ｒ．Ｖａｌｅ  ａｎｄ  Ｍ．Ｂ．Ｇｌｏｒｉａ，Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（１９９７）  ｖｏｌ．８０，ｐ．１００６−１０１２）によりＨＰＬＣで定量する方法、もしくは残存するＬ−リジンをバイオセンサＢＦ−５（王子計測機器株式会社）にて定量する方法で測定した。本条件で１分間に１μｍｏｌの１，５−ＰＤを生成する活性を１ｕｎｉｔとした。【００４４】
実施例２：変異型リジン脱炭酸酵素（ＣａｄＡ）の変異部位の解析および安定性評価
（１）変異型リジン脱炭酸酵素の変異部位解析
実施例１にて取得した変異型ｃａｄＡ遺伝子を保持するＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９形質転換体の培養液から、プラスミドを調製し、それぞれｐＣａｄＡ２３１、ｐＣａｄＡ２３２、ｐＣａｄＡ２３３と命名した。
ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ）を用いたＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法により、３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ）にてヌクレオチド配列を決定し、導入された変異とアミノ酸残基の置換部位を確認した。ヌクレオチド配列の解析には表１に示すプライマーを用いた。【００４５】
【表１】
0006460092.tif 000002
【００４６】
その結果、安定性の向上した変異型酵素では、表２に示すヌクレオチド残基の置換により、対応するアミノ酸残基が置換されていることが確認された。【００４７】
【表２】
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【００４８】
（２）変異型リジン脱炭酸酵素の安定性評価
各形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬ培地５０ｍｌを入れた５００ｍｌ容坂口フラスコに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。該培養液から遠心分離により菌体を集め、生理食塩水で１回洗浄した後、菌体を５ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、４℃で２０分間超音波処理を行い破砕した。処理液を８，０００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心分離して不溶性画分を除き、無細胞抽出液を調製した。【００４９】
得られた無細胞抽出液を１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０）で２０倍に希釈し、この粗酵素液を６５℃で保温して、３および５時間後の残存活性を実施例１に記載の方法で測定した。その結果、熱処理前に変異型酵素発現株の粗酵素液の活性は野生型酵素発現株とほぼ同等の値を示した（表３）。５ｈの熱処理で野生型酵素は熱処理前の約半分に残存活性が低下したが、得られた変異型酵素はいずれも残存活性が高く維持されていた（表３）ことから、熱安定性が向上していることが示された。【００５０】
【表３】
0006460092.tif 000004
【００５１】
実施例３：組み合わせ変異体の構築および安定性評価
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＣａｄＡ発現量を上昇させる為に組み合わせ変異体を構築した。プラスミドｐｃａｄＡ２３３を鋳型に、プライマーとしてｖ３ｉ＿ｒ（５’−ｃａｔ  ｇｔｇ  ａｔｔ  ｃａａ  ｔａｔ  ｔｇｃ  ａａｔ  ａａｔ  ｇｔｔ  ｃａｔ  ｃｔａ  ｃａｔ  ｔｃｃ  ｔｃｃ  ｔｔａ  ｃｇ−３’（配列番号１１））およびｖ３ｉ＿ｆ（５’−ｃｇｔ  ａａｇ  ｇａｇ  ｇａａ  ｔｇｔ  ａｇａ  ｔｇａ  ａｃａ  ｔｔａ  ｔｔｇ  ｃａａ  ｔａｔ  ｔｇａ  ａｔｃ  ａｃａ  ｔｇ−３’（配列番号１２））オリゴヌクレチドを用いてプロトコールに従って操作をし、三番目のアミノ酸残基がＶａｌ（ＧＴＴ）からＩｌｅ（ＡＡＴ）に変わるよう変異を導入した。実施例２記載の方法にて構築したプラスミドのヌクレオチド配列を決定し、目的の変異が導入されていることを確認し、本プラスミドをｐＣａｄＡ２３４と命名した。本願に関連して作成された変異型酵素をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドの概要を表４に示す。本二重変異体ＣａｄＡ高発現菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＣａｄＡ２３４を実施例２と同様の方法にて培養して無細胞抽出液を調製した。無細胞抽出液の活性は６６３ｕ／ｍｌで野生型酵素発現菌とほぼ同等の活性を示した。【００５２】
【表４】
0006460092.tif 000005
【００５３】
得られた無細胞抽出液を０．１Ｍ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０）で２０倍に希釈し、それぞれの粗酵素液を実施例２より高温の６８℃で保温し、残存活性を経時的に測定した結果を図１に示した。６８℃，１ｈ処理で、野生株は２７％まで活性が低下し、単独変異体はＶ３Ｉが４７％、Ａ５９０Ｔは２７％まで失活したのに対し、二重変異体は７０％の活性を維持し３ｈ後でも約６０％の活性が残存した（図１）。したがって、二重変異の相乗効果により、さらに熱安定性が向上したことが示された。【００５４】
実施例４：変異型リジン脱炭酸酵素発現菌の熱処理
実施例３の方法にて野生型および二重変異体ＣａｄＡを保有するＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＣａｄＡ２２０およびＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＣａｄＡ２３４株をＬＢ培地で培養した後、１５ｍｌの培養液を３００ｍｌの菌培養培地（グルコース２５ｇ／ｌ，硫酸アンモニウム  ５ｇ／ｌ，リン酸カリウム  ２ｇ／ｌ，硫酸マグネシウム七水和物  １ｇ／ｌ，硫酸鉄七水和物  ２０ｍｇ／ｌ，硫酸マンガン五水和物  ２０ｍｇ／ｌ，チアミン塩酸塩  １ｍｇ／ｌ，大豆加水分解物  ０．４５ｇ／ｌ，ｐＨ７）が入った５００ｍｌ容ジャーファーメンター（エイブル社製）に接種し、通気量３００ｍｌ／分、３０℃、２５０ｒｐｍで１２時間通気攪拌培養した。乾燥菌体量換算でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＣａｄＡ２２０は１０．１ｇ／ｌ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＣａｄＡ２３４株は１０．９ｇ／ｌの菌体を含む培養液が調製できた。基質透過性改善を目的に、培養液のｐＨを５．５に調整した後に５５℃および６０℃で保温し、培養液をそのまま用いて保温後の活性を測定した。結果を表５に示す。【００５５】
リジン脱炭酸酵素は菌体内に発現するため、菌体をそのまま用いても、基質のリジンが酵素に作用できず、脱炭酸反応効率は非常に悪かった。いずれの培養液も６０℃で３ｈ程度の加熱処理を行えば酵素反応に用いることができたが、野生型酵素は過剰に加熱すると、保温中に失活が起こった。耐熱性向上変異型酵素では実施例２に示した野生型酵素が失活しやすい条件でも安定に活性を保持でき、菌体を用いる場合には短時間に効率的な処理が可能であった。これより変異型酵素は反応時の温度を高く出来るだけでなく、菌体をそのまま使用する場合にも使用しやすいことが示された。【００５６】
【表５】
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【００５７】
実施例５：鉄イオンによる酵素活性の阻害とキレート剤添加効果
実施例２および３と同様の方法にて野生型ＣａｄＡおよび二重変異体ＣａｄＡ高発現菌から無細胞抽出液を調製した。得られた無細胞抽出液を用い、実施例１中で示した組成に終濃度で硫酸鉄七水和物（ナカライテスク）５．６５ｍｇ／ｌ（２ｍＭ）を加え、阻害効果を測定した。一方、Ｅ．ｃｏｌｉ由来リジン脱炭酸酵素には鉄イオンによる阻害は知られていなかったが、表６に示すように、野生型酵素、変異型酵素共に２ｍＭ鉄イオン添加によって無添加時の４６．８％および６４．７％まで活性が阻害された。【００５８】
次いで、鉄イオンを含む反応液にエチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム（ＥＤＴＡ）（ナカライテスク）を終濃度で１から５ｍＭとなるように添加し、添加効果を検討した。表６に示すようにキレート剤のＥＤＴＡの添加により鉄イオン添加による阻害が回復した。【００５９】
【表６】
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【００６０】
実施例６：キレート剤存在下でのリジン脱炭酸反応
実施例４と同様の方法にて培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＣａｄＡ２３４株（二重変異体ＣａｄＡ高発現株）を培養し、培養液を調製し、培養終了後に６０℃で一時間加熱処理した。加熱後の活性を測定し、酵素活性が３８０ｕｎｉｔ／ｍｌとなるよう希釈した。この酵素培養液３０ｍｌをリジン塩酸塩（味の素）２５０ｇ／ｌ、ピリドキサルリン酸  ２６．５ｍｇ／ｌ、硫酸鉄七水和物  ２７．８ｍｇ／ｌ（０．１ｍＭ）、エチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム（ＥＤＴＡ）１１１．６ｍｇ／ｌ（０．３ｍＭ）を含む反応液２７０ｍｌに添加し、３７℃で１６時間反応を行った。対照はＥＤＴＡを添加せずに反応を行った。反応開始時のｐＨは５．３で反応の進行とともに上昇したが、ｐＨ７．０となった時点で３０％（ｖ／ｖ）硫酸を添加し７．０になるようｐＨを維持した。
各反応条件でのリジンの消費経過を図２に示した。ＥＤＴＡを添加しない条件では反応が阻害されるのに加え、途中で反応が進まなくなった。一方、ＥＤＴＡ添加区では活性阻害が回復し、完全にリジンが消費された。ＥＤＴＡ添加区では、１３５ｇ／ｌの１，５−ＰＤが生成し、９８％の収率でリジンが変換された。一方、ＥＤＴＡ未添加区で反応液の１，５−ＰＤ濃度は４１．８ｇ／ｌに留まった。また、鉄イオン、ＥＤＴＡ共に無添加の反応はＥＤＴＡ添加区と全く同等であった。高濃度の塩素イオンを含む溶液を金属に接触させた場合には、溶出した金属イオンにより反応阻害が起こりうるが、このモデル反応から、キレート剤の添加によって反応の安定性が改善することが示唆された。【００６１】
＜１，５−ＰＤの分析条件＞
カラム；Ａｓａｈｉｐａｋ  ＯＤＰ−５０  ４Ｅ（昭和電工社製）
カラム温度；４０℃
溶離液；０．２Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．７）＋２．３ｍＭ  １−オクタンスルホン酸ナトリウム
溶離液の流量；０．５ｍｌ／ｍｉｎ／ｍｉｎ
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明は、ポリアミド樹脂などの樹脂原料として、あるいは医薬中間体として利用できる１，５−ＰＤの製造に有用である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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