(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞、第２の標的および非標的細胞を含む試料の中の標的細胞を非標的細胞から分離するための選択法であって：
ａ）前記標的細胞と前記第２の標的の免疫ロゼット形成が可能な条件下で、（ｂ）前記第２の標的に結合する少なくとも１つの抗体に直接的または間接的に連結された（ａ）前記標的細胞に結合する少なくとも１つの抗体を含む一次抗体複合体と前記試料を接触させること、
ｂ）前記免疫ロゼットおよび／または前記第２の標的への粒子の結合を可能にする条件下で、
（ｉ）（ｂ）前記粒子に結合する少なくとも１つの抗体に直接的または間接的に連結された（ａ）前記第２の標的に単独でまたは前記免疫ロゼット内で結合する少なくとも１つの抗体、
（ｉｉ）（ｂ）前記第２の標的に結合する少なくとも１つの抗体に直接的または間接的に連結された（ａ）前記第２の標的に単独でまたは前記免疫ロゼット内で結合する少なくとも１つの抗体、を含む単一特異的抗体複合体であって、前記粒子に結合される単一特異的抗体複合体、または
（ｉｉｉ）前記粒子に直接結合された少なくとも１つの抗体であって前記第２の標的に結合する抗体、
を含む二次抗体複合体と前記試料を接触させること、ならびに
ｃ）前記標的細胞を前記非標的細胞から分離するために、免疫ロゼット−粒子複合体および／または第２の標的−粒子複合体を前記試料から分離すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記二次抗体複合体が、前記試料との接触の前に前記粒子に結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記粒子に結合した前記二次抗体複合体が、前記一次抗体複合体と前記試料を接触させる前に前記試料に添加される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の標的が赤血球である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の標的が顆粒球である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の標的がビーズである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ビーズがポリスチレンビーズである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリスチレンビーズがポリマーでコーティングされている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の標的が分離前に前記試料に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記粒子が磁性粒子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記粒子が非磁性粒子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記選択法が、所望の細胞を選択するためのポジティブ選択法であり、前記標的細胞が前記所望の細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記選択法が、前記試料から不要な細胞を除去するためのネガティブ選択法であり、前記標的細胞が前記不要な細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２の標的が細胞と類似の密度を有し、前記粒子が細胞とは異なる密度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
免疫ロゼット−磁性粒子複合体および／または第２の標的−磁性粒子複合体が、前記免疫ロゼット−磁性粒子複合体および／または前記第２の標的−磁性粒子複合体を前記試料から分離するのに十分な強度の磁場勾配に前記試料を置くことによって、ステップｃ）で前記試料から分離される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記免疫ロゼット−粒子複合体が、密度分離によりステップｃ）で前記試料から分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記免疫ロゼット−粒子複合体が、沈降によりステップｃ）で前記試料から分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が、
ｄ）前記免疫ロゼット−磁性粒子複合体から前記標的細胞を分離すること
をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的細胞が、物理的、化学的、酵素的または熱による解離によって前記免疫ロゼット−磁性粒子複合体から分離される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法が、
ｄ．前記免疫ロゼット中での前記赤血球の溶解、および
ｅ．前記溶解した赤血球および前記粒子からの前記標的細胞の分離、
をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項２１】
前記試料が、血液、全血、骨髄、胎児肝臓、臍帯血、バフィーコート懸濁液、白血球除去試料、胸膜および腹水、または胸腺細胞および脾臓細胞の試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記標的細胞が、幹細胞、前駆細胞、単球、リンパ球または顆粒球である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記リンパ球がＴ細胞、Ｂ細胞またはＮＫ細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記顆粒球が、好中球、好塩基球または好酸球である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記一次抗体複合体が、二重特異性四量体抗体複合体である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記二次抗体複合体が、単一特異的四量体抗体複合体である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記単一特異的四量体抗体複合体が、赤血球に結合する抗体を含む、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、免疫ロゼットおよび磁性粒子を用いて細胞を分離するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの用途では、生体試料中の特定の細胞集団を濃縮、あるいは枯渇することが望ましい。血液学、免疫学および腫瘍学の分野は、骨髄、脾臓、胸腺および胎児の肝臓などの関連組織からの末梢血ならびに細胞懸濁液の試料に依存している。これらの不均質な試料からの特定の細胞型の分離が、これらの分野の研究の鍵となっている。Ｔ細胞およびＢ細胞などの免疫細胞の精製された集団は、免疫機能の研究に必要であり、免疫療法に使用されている。細胞、分子および生化学的プロセスの研究は、単離された特定の細胞型の分析を必要とする。Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのリンパ球サブセット、ならびに好中球、好塩基球および好酸球などの顆粒球を単離するために、多くの技術が使用されてきた。
【０００３】
造血細胞および免疫細胞は、密度などの物理的特性に基づいて、かつ磁性粒子を用いて直接標的化することにより分離されてきた。細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体の登場が、異なる細胞型の識別および分離の可能性を大いに広げた。モノクローナル抗体を用いた血液および関連細胞懸濁液からの細胞集団の分離には、２つの基本的なアプローチがある。それらは、抗体（複数可）で識別／標識される細胞が所望の細胞であるか、または不要な細胞であるかという点で異なる。ポジティブ選択法では、所望の細胞は抗体で標識され、残りの非標識細胞／不要な細胞から除去される。ネガティブ選択では、不要な細胞が標識され、除去される。抗体補体処理および免疫毒素の使用はネガティブ選択法であるが、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）およびほとんどのバルク免疫吸着法は、ポジティブ選択とネガティブ選択の両方に適合できる。免疫吸着法では、細胞をモノクローナル抗体で選択し、残りの細胞から除去され得る表面、例えば、ビーズカラム、フラスコ、磁性粒子に優先的に結合させる。免疫吸着法は、モノクローナル抗体で細胞を標的化するのに高い特異性を維持し、ＦＡＣＳとは異なり、臨床採取で多数の細胞を直接処理するためにスケールアップすることができ、かつ免疫毒素などの細胞毒性試薬および補体を使用する危険性を回避できるため、臨床および研究で支持を獲得している。しかし、免疫吸着法は、「デバイス」、すなわちビーズカラム、パニングフラスコまたは磁石などの細胞分離用の表面の使用を必要とする。
【０００４】
密度分離は、顆粒球および赤血球から末梢血単核細胞を単離するために一般的に使用されている。フィコール（ＧＥヘルスケアライフサイエンス社、チャルフォント、英国）がこの用途に使用される最も人気のある密度溶液である。フィコール密度分離において、全血をフィコール上に重層し、その後遠心分離する。赤血球および顆粒球はペレットとして沈降し、単核細胞はフィコールと血漿の界面に残留する。この技術の成功は、単核細胞と顆粒球の間の密度の差に依る。全血が２４時間より長く保存された場合には、顆粒球の密度は変化し、赤血球と共にペレットにならない。保存血液または細胞密度が変化した試料からは、１回の密度分離で純粋な単核細胞の懸濁液を得ることはできない。ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐは、ＳＴＥＭＣＥＬＬテクノロジー社（バンクーバー、カナダ）から市販されている免疫密度細胞分離製品であり、密度勾配遠心分離を利用して、赤血球と共に不要な有核細胞間に免疫ロゼットを形成することによって、ヒト末梢全血などの赤血球含有試料から細胞を濃縮する。免疫密度細胞分離は、ヒト末梢全血から有核細胞集団を効率的に濃縮できるが、最終的に濃縮された細胞試料中に残留赤血球の混入があり得る。免疫ロゼットの分離のための密度勾配遠心分離の使用についての詳細は、参照により本明細書に組み込まれるＴｈｏｍａｓの米国特許第６，４４８，０７５号を参照されたい。
【０００５】
免疫細胞、造血幹細胞および循環上皮腫瘍細胞を単離するために免疫磁気ネガティブ選択法を用いる現在の細胞分離方法は、典型的には、赤血球を枯渇させ、次にデバイスすなわち人工粒子に抗体を介して付着させる初期ステップを含む。免疫磁気細胞分離の前に低張性赤血球溶解、フィコール密度遠心分離または重力沈降法などの末梢全血の赤血球含量を減少させる前処理ステップを利用するいくつかの市販の細胞分離製品が利用可能である（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．，Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ．，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ．，ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）。最近、末梢ヒト全血から所望の細胞を濃縮するために、単一ステップにおいて免疫磁気細胞分離と赤血球の重力沈降を組み合わせた新しい方法が記載されている（参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０７３０８３を参照されたい）。しかし、この方法は、濃縮された試料中の赤血球の混入をさらに低減するための追加の免疫磁気枯渇ステップを必要とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述のことを考慮して、前処理の必要もなく、時間のかかる重力沈降アプローチも用いることなく、赤血球の除去を向上させ、所望の細胞を分離するか、または赤血球を含む生体試料から不要な細胞を除去するための新規方法を提供することが当技術分野で必要とされている。免疫磁気細胞分離の前か、または免疫磁気細胞分離と組み合わせて、全血の密度遠心分離、凝集または低張溶解により赤血球含量を減少させることなく、限定されないがヒト末梢全血などの赤血球含有試料から細胞を直接ネガティブ選択するための免疫磁気細胞分離法は、現在存在しない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、既に存在するか、または試料に添加された赤血球などの第２の標的と標的細胞を免疫ロゼット形成させ、その後、免疫ロゼット粒子複合体の除去を促進する粒子で免疫ロゼットを標識することにより標的細胞を分離するための方法を開発した。一実施形態において、この粒子は磁性粒子である。
【０００８】
本開示の方法は、既存の方法に比べて赤血球枯渇を向上させ、複合試料から標的細胞を効率よく分離できる。本開示によって、試料を免疫磁気細胞分離手順に供する前に、極めて高い赤血球含量（有核細胞あたり１個を上回る赤血球）を有する試料を前処理する必要はない。磁性粒子アプローチのさらなる利点は、それが免疫磁気細胞分離アプローチであるので、完全に自動化でき、それによって試料処理をさらに減少させ、ウイルスまたは寄生虫などの血液媒介病原体への曝露を最小限に抑えることができることである。
【発明の効果】
【０００９】
したがって、一実施形態において、本開示は、標的細胞、第２の標的および非標的細胞を含む試料中の標的細胞を非標的細胞から分離するための選択法であって、以下を含む方法を提供する：
ａ．標的細胞と第２の標的の免疫ロゼット形成が可能な条件下で、（ｂ）第２の標的に結合する少なくとも１つの抗体に直接的または間接的に連結された（ａ）標的細胞に結合する少なくとも１つの抗体を含む一次抗体組成物と試料を接触させること、
ｂ．免疫ロゼットおよび／または第２の標的への粒子の結合を可能にする条件下で、（ｂ）粒子に結合する少なくとも１つの抗体に直接的または間接的に連結された（ａ）第２の標的に単独でまたは免疫ロゼット内で結合する少なくとも１つの抗体を含む二次抗体組成物と試料を接触させること、ならびに
ｃ．標的細胞について濃縮された試料を得るために、免疫ロゼット−粒子複合体および／または第２の標的−粒子複合体を試料から分離すること。
【００１０】
一実施形態において、第２の標的は赤血球である。
【００１１】
別の実施形態において、第２の標的は顆粒球である。
【００１２】
別の実施形態において、第２の標的はビーズ、必要に応じてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマーでコーティングされたポリスチレンビーズである。
【００１３】
別の実施形態において、第２の標的は、分離前に試料に添加される。
【００１４】
別の実施形態において、粒子は磁性粒子である。
【００１５】
別の実施形態において、粒子は非磁性粒子である。
【００１６】
別の実施形態において、第２の標的は細胞と類似の密度を有し、粒子は細胞とは異なる密度を有する。
【００１７】
別の実施形態において、選択法は、所望の細胞について選択するためのポジティブ選択法であり、標的細胞は所望の細胞である。
【００１８】
別の実施形態において、選択法は、試料から不要な細胞を除去するためのネガティブ選択法であり、標的細胞は不要な細胞である。
【００１９】
別の実施形態において、免疫ロゼット−磁性粒子複合体および／または第２の標的−磁性粒子複合体は、免疫ロゼット−磁気粒子複合体および／または第２の標的−磁性粒子複合体を試料から分離するのに十分な強度の磁場勾配に試料を配置することによって、ステップｃ）で試料から分離される。
【００２０】
別の実施形態において、免疫ロゼット−磁性粒子複合体は、密度分離によってステップｃ）で試料から分離される。
【００２１】
別の実施形態において、免疫ロゼット−磁性粒子複合体は、沈降によって、ステップｃ）で試料から分離される。
【００２２】
別の実施形態において、本方法は、
ｄ．免疫ロゼット−磁性粒子複合体から標的細胞を分離すること、
をさらに含む。
【００２３】
別の実施形態において、標的細胞は、物理的、化学的、酵素的または熱による解離によって免疫ロゼット−磁性粒子複合体から分離される。
【００２４】
別の実施形態において、本方法は、
ｄ．免疫ロゼット中の赤血球の溶解、および
ｅ．溶解した赤血球および磁性粒子からの標的細胞の分離、
をさらに含む。
【００２５】
別の実施形態において、試料は、全血、骨髄、胎児肝臓、臍帯血、バフィーコート懸濁液、白血球除去試料、胸膜および腹水、または胸腺細胞および脾臓細胞の試料である。
【００２６】
本開示を、これから以下の図面に関連して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】Ａ）末梢ヒト全血、Ｂ）末梢ヒト全血と免疫ロゼット、Ｃ）磁性粒子が結合した免疫ロゼットおよびＤ）矢印で示されている磁性粒子が結合した免疫ロゼットの拡大画像の明視野像を示す。
【図２】ペグ化ポリスチレンビーズを用いた赤血球枯渇ヒト末梢血単核細胞からのヒトＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮を示す。
【図３】（Ａ〜Ｃ）は、実施例４および５による免疫ロゼットの免疫磁気細胞分離を用いたヒト末梢全血からのヒトＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮を示す。試料を抗ヒトＣＤ４５ ＦＩＴＣ、ＣＤ４ ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５およびＣＤ３ ＡＰＣで染色し、フローサイトメトリーで分析した。Ａ）ヒト末梢血中の赤血球の低張溶解後に、細胞の９９．９％はＣＤ４５＋であり、そのうちの１２．７％はＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞である。Ｂ）実施例４による免疫磁気細胞分離後に、細胞の９６．０％はＣＤ４５＋であり、そのうちの９４．６％はＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞である。Ｃ）実施例５による免疫磁気細胞分離後に、細胞の９９．８％はＣＤ４５＋であり、そのうちの９４．６％はＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞である。
【図４】実施例３による免疫ロゼットの免疫磁気細胞分離を用いたヒト末梢全血からのヒトＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３−ＣＤ１９＋Ｂ細胞およびＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の濃縮を示す。実施例３による免疫磁気細胞分離後に、上記で示したそれぞれの細胞型の平均純度は、それぞれ９７．２％、９２．０％、７３．９％および６８．５％であり、回収率は、それぞれ４０．７％、３５．２％、２９．９％、および３６．６％であった。
【図５】追加の免疫磁気赤血球枯渇ステップがある場合とない場合の、市販の赤血球凝集および免疫磁気分離法ＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓを用いたヒト末梢全血からのヒトＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮を示す。
【図６】実施例３によるＡ）塩化アンモニウム溶解、Ｂ）免疫ロゼットと密度分離、Ｃ）赤血球凝集と免疫磁気分離、またはＤ）免疫ロゼットと免疫磁気分離のいずれかを用いたヒト末梢全血からのヒトＣＤ３＋Ｔ細胞の濃縮を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本開示の方法
本開示は、第２の標的と標的細胞を免疫ロゼット形成させ、その後、前記免疫ロゼットと第２の標的を粒子に結合させることにより、標的細胞、第２の標的および非標的細胞を含む試料から標的細胞と非標的細胞を分離するための方法に関する。
【００２９】
一態様において、本開示は、標的細胞、第２の標的および非標的細胞を含む試料中の標的細胞と非標的細胞を分離するための選択法であって、以下を含む方法を提供する：
ａ）標的細胞と第２の標的の免疫ロゼット形成が可能な条件下で、（ｂ）第２の標的に結合する少なくとも１つの抗体に直接的または間接的に連結された（ａ）標的細胞に結合する少なくとも１つの抗体を含む一次抗体組成物と試料を接触させること、
ｂ）免疫ロゼットおよび／または第２の標的への粒子の結合を可能にする条件下で、（ｂ）粒子に結合する少なくとも１つの抗体に直接的または間接的に連結された（ａ）第２の標的に単独でまたは免疫ロゼット内で結合する少なくとも１つの抗体を含む二次抗体組成物と試料を接触させること、ならびに
ｃ）非標的細胞について濃縮された試料を得るために、免疫ロゼット−粒子複合体および／または第２の標的−粒子複合体を試料から分離すること。
【００３０】
本方法は、ポジティブとネガティブの選択プロトコルの両方で使用できる。ポジティブ選択プロトコルでは、所望の細胞は、標的細胞であり、試料から除去される。ネガティブ選択プロトコルでは、所望の細胞は、非標的細胞であり、選択プロトコル後に試料中に残り、その結果、残りの試料が所望の細胞について濃縮される。
【００３１】
本明細書で使用する用語「標的細胞」は、一次抗体組成物に結合することによって標的化される細胞である。標的細胞は、必要に応じて有核細胞である。ポジティブ選択プロトコルでは、所望の細胞は標的細胞である。ネガティブ選択プロトコルでは、所望の細胞は標的細胞ではない。むしろ、所望の細胞は非標的細胞である。
【００３２】
本明細書で使用する用語「非標的細胞」は、一次または二次抗体組成物に結合しない試料中の細胞である。ポジティブ選択法では、非標的細胞は所望の細胞ではない。ネガティブ選択法では、非標的細胞は所望の細胞である。
【００３３】
本明細書で使用する用語「第２の標的」は、一次および二次抗体組成物に結合し、試料から除去される細胞または粒子、ビーズもしくは凝集体などの他の物体である。第２の標的は、ポジティブとネガティブの両方の選択プロトコルにおいて試料から除去される。一実施形態において、第２の標的は赤血球である。別の実施形態において、第２の標的は顆粒球である。別の実施形態において、第２の標的は、ポリスチレンビーズなどのビーズである。ビーズは、ＰＥＧなどのポリマーでコーティングされていてもよい。いくつかの実施形態において、第２の標的は、選択法を実施する前に試料に添加される。例えば、ビーズが試料に添加されてもよい。
【００３４】
一実施形態において、粒子は磁性粒子である。別の実施形態において、粒子は非磁性粒子である。本明細書に記載の方法において有用な非磁性粒子の一例としては、浮遊性粒子が挙げられる。適切な緩衝液中に置かれたときに浮遊性粒子を含む免疫ロゼットが浮き、それによって試料から免疫ロゼットの分離が可能になる。
【００３５】
ネガティブ選択プロトコルでは、所望の細胞は免疫ロゼット形成されず、試料中に残り、その後、粒子で標識された免疫ロゼットが除去される。したがって、不要な細胞は、第２の標的と共に試料から除去される「標的細胞」であり、所望の細胞は「非標的細胞」である。ネガティブ選択では、抗体組成物は、試料から除去したい細胞に特異的な少なくとも１つの抗体を含む。したがって、本開示は、所望の細胞、第２の標的、および不要な細胞を含む試料中の所望の細胞を濃縮および回収するためのネガティブの選択法であって、以下を含む方法を提供する：
ａ）不要な細胞と第２の標的の免疫ロゼット形成が可能な条件下で、（ｂ）第２の標的に結合する少なくとも１つの抗体に直接的または間接的に連結された（ａ）不要な細胞に結合する少なくとも１つの抗体を含む一次抗体組成物と試料を接触させること、
ｂ）免疫ロゼットおよび／または第２の標的への粒子の結合を可能にする条件下で、（ｂ）粒子に結合する少なくとも１つの抗体に直接的または間接的に連結された（ａ）第２の標的に単独でまたは免疫ロゼット内で結合する少なくとも１つの抗体を含む二次抗体組成物と試料を接触させること、ならびに
ｃ）所望の細胞について濃縮された試料を得るために、免疫ロゼット−粒子複合体および／または第２の標的−粒子複合体を試料から分離すること。
【００３６】
ポジティブ選択プロトコルでは、所望の細胞は標的細胞である。所望の細胞は、第２の標的に免疫ロゼット形成され、その後、粒子に結合する。このような実施形態において、本方法は、免疫ロゼットから所望の細胞を分離するステップをさらに含むことができる。ポジティブ選択では、抗体組成物は、試料から除去したい所望の細胞に特異的な少なくとも１つの抗体を含む。したがって、本開示は、所望の細胞、第２の標的、および不要な細胞を含む試料から所望の細胞を回収するためのポジティブ選択法であって、以下を含む方法を提供する：
ａ）所望の細胞と第２の標的の免疫ロゼット形成が可能な条件下で、（ｂ）第２の標的に結合する少なくとも１つの抗体に直接的または間接的に連結された（ａ）所望の細胞に結合する少なくとも１つの抗体を含む一次抗体組成物と試料を接触させること、
ｂ）免疫ロゼットおよび／または第２の標的への粒子の結合を可能にする条件下で、（ｂ）粒子に結合する少なくとも１つの抗体に直接的または間接的に連結された（ａ）第２の標的に単独でまたは免疫ロゼット内で結合する少なくとも１つの抗体を含む二次抗体組成物と試料を接触させること、ならびに
ｃ）免疫ロゼット−粒子複合体内の所望の細胞について濃縮された試料を得るために、免疫ロゼット−粒子複合体および／または第２の標的−粒子複合体を試料から分離すること。
【００３７】
一実施形態において、ポジティブ選択法は、限定されないが、物理的、化学的、酵素的、または熱による解離を通じて免疫ロゼット−粒子複合体から所望の細胞を分離するための免疫ロゼット−粒子複合体の分解を含む。一実施形態において、第２の標的が赤血球である場合、さらなるステップは、免疫ロゼット中の赤血球の低張溶解および溶解した赤血球および磁性粒子からの所望の細胞の分離を含む。結果として生じるポジティブ選択された所望の細胞は、結合した磁性粒子を含まない。
【００３８】
ネガティブ選択またはポジティブ選択のいずれかの上記のステップ（ｂ）で形成された粒子に結合した免疫ロゼットは、様々な技術を用いて非磁性非標的細胞から分離できる。
【００３９】
好ましい実施形態において、粒子は磁性粒子であり、磁性粒子で標識された免疫ロゼットを含む試料は磁場の中に置かれる。磁性粒子で標識された免疫ロゼットは、磁場に向かって移動し、非磁性非標的細胞が磁性粒子で標識された免疫ロゼットから容易に分離可能な位置で保持される。
【００４０】
別の実施形態において、粒子で標識された免疫ロゼットを含む試料は、（フィコールなどの）浮遊密度液上に重層され、遠心分離される。粒子で標識された免疫ロゼットは、それらの密度の増加によりペレット化され、標的細胞は、浮遊密度液と試料の界面に残る。その後、標的細胞は、さらなる使用のために界面から除去される。
【００４１】
別の実施形態において、ステップ（ａ）で得られた免疫ロゼットを含む試料またはステップ（ｂ）で得られた免疫ロゼット−粒子複合体は、（ヒドロキシエチルデンプン、ゼラチンまたはメチルセルロースなどの）沈殿試薬と混合され、免疫ロゼットまたは免疫ロゼット−粒子複合体が沈降可能になる。所望の細胞は懸濁液中に残り、さらなる使用のために除去される。
【００４２】
本開示の方法は、血液（特に、臍帯血および全血）、骨髄、胎児肝臓、バフィーコート懸濁液、白血球除去試料、胸膜および腹膜滲出液、ならびに胸腺細胞および脾臓細胞の懸濁液を含む赤血球含有生体試料の処理に使用されてもよい。本方法を用いて、前処理をする必要性も、または時間のかかる重力沈降アプローチを使用する必要性もなく、免疫磁気細胞分離アプローチの前またはそれと組み合わせて、全血もしくは全骨髄などの赤血球を含む生体試料から所望の細胞を分離するか、または不要な細胞を除去することができる。これは、従来技術の方法を超える本開示の方法の重要な利点を提供する。特に、本開示は、最終赤血球含量を最終濃縮集団の５％未満に減少させることができ、既存の方法を改善している。さらに、全体の手順は、密度勾配遠心分離、密度沈降または低張溶解などの非磁性赤血球枯渇法の助けを借りずに免疫磁気細胞分離のみを用いて行うことができる。好ましい実施形態は、磁気標識免疫ロゼットを分離するために磁場のみを使用するが、現在の手順は、密度勾配遠心分離法または沈降試薬を使用するため、その有用性をなおも保持している。
【００４３】
本開示の方法を用いて、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、好塩基球、マスト細胞、前駆細胞、幹細胞および腫瘍細胞を含むが、これらに限定されない任意の細胞型の濃縮試料を調製することができる。
【００４４】
一実施形態において、本開示の方法を用いて、血液および骨髄などの試料からＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、好塩基球および形質細胞などの選択された分化細胞型が濃縮された細胞調製物を調製してもよい。これは、増殖因子の産生および増殖因子に対する応答を含む特定の細胞間相互作用の研究を可能にする。これはまた、特定の細胞型の分子的および生化学的分析も可能にする。ＮＫ細胞、樹状細胞およびＴ細胞が濃縮された細胞調製物はまた、特定の悪性腫瘍に対する免疫療法で使用されてもよい。
【００４５】
抗体と粒子の組成物
本開示は、本明細書に記載の方法で使用するための抗体と粒子の組成物を含む。一次抗体組成物は、（ｂ）第２の標的に結合する少なくとも１つの抗体に直接的または間接的に連結された（ａ）標的細胞上の抗原に結合する少なくとも１つの抗体を含む。
【００４６】
一実施形態において、二次抗体組成物は、（ｄ）粒子に結合する少なくとも１つの抗体に（ｃ）直接または間接的に連結された第２の標的に結合する少なくとも１つの抗体を含む。
【００４７】
好ましい実施形態において、二次抗体組成物は、物理吸着または化学的共役などの当業者なら容易に分かる従来の技術を使用して粒子に直接結合される。一態様において、粒子に結合した二次抗体組成物は、（ｄ）同じ第２の標的に結合する少なくとも１つの抗体に直接または間接的に結合された（ｃ）第２の標的に結合する少なくとも１つの抗体を含む。別の態様において、二次抗体組成物は、物理吸着または化学的共役などの当業者なら容易に分かる従来の技術を使用して（ｃ）粒子に直接結合している第２の標的に結合する少なくとも１つの抗体を含む。
【００４８】
用語「少なくとも１つの抗体」は、抗体組成物が、（少なくとも１つの抗体分子とは対照的に）少なくとも１種類の抗体を含むことを意味する。１種類の抗体は、特定の抗原に結合する抗体を意味する。例えば、抗原ＣＤ３に結合する抗体は、１種類の抗体であると考えられる。好ましくは、本開示の抗体組成物は、（ａ）標的細胞に結合する２種類以上の抗体を含む。
【００４９】
一態様において、本開示の一次抗体組成物は、（ａ）標的細胞に特異的な少なくとも１つの抗体および（ｂ）第２の標的に特異的な少なくとも１つの抗体を含む。「間接的に連結された」とは、抗体（ａ）および抗体（ｂ）は、互いに直接共有結合していないが、免疫複合体などの連結部分を介して結合していることを意味する。好ましい実施形態において、一次抗体組成物は、二重特異性四量体抗体複合体を調製することにより、第２の標的に特異的な少なくとも１つの抗体（ｂ）に間接的に連結されている標的細胞に対する少なくとも１つの抗体（ａ）を含む。二重特異的四量体抗体複合体は、（ａ）標的細胞に結合することができる第１のモノクローナル抗体と、（ｂ）第２の標的細胞に結合することができる第２のモノクローナル抗体を混合することによって調製され得る。一次および二次モノクローナル抗体は、第１の動物種由来のものである。一次および二次抗体を、第１の動物種の抗体のＦｃ断片に対して作られた第２の動物種のモノクローナル抗体のほぼ等モル量と反応させる。一次および二次抗体を、第１の動物種の抗体のＦｃ断片に対して作られた第２の動物種のモノクローナル抗体の全長またはＦ（ａｂ’）２断片の約等モル量と反応させてもよい（四量体抗体複合体および四量体抗体複合体を調製するための方法について記載の、参照により本明細書に組み込まれるＬａｎｓｄｏｒｐの米国特許第４，８６８，１０９号を参照されたい）。
【００５０】
本開示の二次抗体組成物は、（ｃ）第２の標的細胞に特異的な少なくとも１つの抗体および（ｄ）粒子に特異的な少なくとも１つの抗体を含む。「間接的に連結された」とは、抗体（ｃ）および抗体（ｄ）は、互いに直接共有結合していないが、免疫複合体などの連結部分を介して結合していることを意味する。二次抗体組成物は、一次抗体組成物について記載したように二重特異的四量体抗体複合体を調製することにより、粒子に特異的な少なくとも１つの抗体（ｄ）に間接的に連結された第２の標的細胞に対する少なくとも１つの抗体（ｃ）を含む。
【００５１】
別の実施形態において、本開示の二次抗体組成物は、（ｃ）第２の標的細胞に特異的な少なくとも１つの抗体および（ｄ）単一特異的四量体抗体複合体を調製することによって間接的に連結された同じ第２の標的に特異的な少なくとも１つの抗体を含む。単一特異的四量体抗体複合体は、第１の動物種由来の第２の標的細胞に結合することができるモノクローナル抗体と、第１の動物種の抗体のＦｃ断片に対して作られた第２の動物種の等モル量のモノクローナル抗体を混合することによって調製され得る。第１の動物種由来の抗体は、第１の動物種の抗体のＦｃ断片に対して作られた第２の動物種の約等モル量のモノクローナル抗体の全長またはＦ（ａｂ’）２断片とも反応し得る。
【００５２】
好ましい実施形態において、第２の標的に特異的な単一特異的四量体抗体複合体を含む二次抗体組成物は、物理吸着または化学的共役などの、当業者なら容易に分かる従来の技術を使用して直接粒子に結合される。
【００５３】
別の実施形態において、標的細胞に特異的な抗体は第２の標的に特異的な抗体に直接連結され、第２の標的に特異的な抗体は磁性粒子に特異的な抗体に直接連結される。一実施形態において、本開示の抗体組成物は、（ｂ）第２の標的に特異的な少なくとも１つの抗体に直接連結された（ａ）標的細胞に特異的な少なくとも１つの抗体を含む二機能性抗体と、（ｄ）粒子に特異的な少なくとも１つの抗体に直接連結された（ｃ）第２の標的に特異的な少なくとも１つの抗体を含む第２の二機能性抗体と、を含む。二機能性抗体は、ＥｌｌｅｒｍａｎおよびＳｃｈｅｅｒ［１］に開示されるものなどの、当業者なら容易に分かる従来の技術を使用して、一方の抗体を他方の抗体に化学的にカップリングさせることによって調製され得る。
【００５４】
別の実施形態において、抗体組成物は二重特異性抗体を含む。第１の二重特異性抗体は、第２の標的に特異的な抗体の可変領域と、分離される標的細胞の表面上の少なくとも１つの抗原に特異的な可変領域と、を含む。第２の二重特異性抗体は、第２の標的および粒子に特異的な抗体の可変領域を含む。二重特異性抗体は、ハイブリッドハイブリドーマを形成することによって調製され得る。ハイブリッドハイブリドーマは、Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ［２］に記載のものなどの当技術分野で公知の手順を用いて調製され得る。二重特異性抗体はまた、Ｃｈａｎｇ、Ｒｏｓｓｉ、およびＳｈａｒｋｅｙ［３］に記載の組換え免疫グロブリン遺伝子構築物の発現によっても構築され得る。
【００５５】
一実施形態において、第２の標的は赤血球であり、赤血球に特異的な抗体は抗グリコホリンＡである。本開示の抗体組成物に含まれる抗グリコホリンＡ抗体は、赤血球に結合するために使用される。グリコホリンＡに特異的なモノクローナル抗体の例としては、１０Ｆ７ＭＮ（米国特許第４，７５２，５８２号、細胞株：ＡＴＣＣ受入番号ＨＢ−８１６２）、およびＤ２．１０（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，マルセイユ、フランス）が挙げられる。好ましくは、標的細胞に特異的な抗体は、抗体の組み合わせである。多くの標的細胞型が試料から除去され得るように、抗体の組み合わせはいくつかの細胞型に特異的であってもよい。抗体の組み合わせを使用する場合、それぞれの抗体は赤血球に特異的な抗体に（直接的または間接的に）連結される。
【００５６】
一実施形態において、粒子は磁性粒子であり、第２の標的に特異的な単一特異的四量体抗体複合体は、当業者なら容易に分かる物理吸着または化学的結合などの従来の技術を用いて磁気粒子に直接結合される。
【００５７】
別の実施形態において、粒子は磁性粒子であり、第２の標的に特異的な抗体は、当業者なら容易に分かる物理的吸着または化学的結合などの従来の技術を用いて磁性粒子に直接結合される。
【００５８】
別の実施形態において、粒子は磁性粒子であり、磁性粒子に特異的な抗体は抗デキストランである。本開示の抗体組成物に含まれる抗デキストラン抗体は、デキストランポリマーでコーティングされた磁性粒子に結合するために使用される。
【００５９】
別の実施形態において、一次抗体組成物は、（ａ）赤血球に結合する抗グリコホリンＡ抗体、（ｂ）免疫ロゼット形成が望まれる標的細胞型に結合する抗体ならびに（ｃ）（ａ）および（ｂ）の両方のＦｃ部分に結合する抗体、必要に応じて、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片を含む四量体複合体である。（ａ）:（ｂ）:（ｃ）のモル比は、約１：３：４であり得る。いくつかの細胞型が分離される場合、複合体は、いくつかの抗標的細胞抗体（ｂ）で作られる。その後、複合体は、本開示の方法で使用するための抗体組成物を形成するために一緒に混合され得る。二次抗体組成物は、（ａ）免疫ロゼット内の赤血球に結合する抗グリコホリンＡ抗体、および（ｃ）（ａ）のＦｃ部分に結合する抗体、必要に応じてＦ（ａｂ’）２抗体断片を含む単一特異的四量体複合体である。（ａ）:（ｃ）のモル比は約１：１であり得る。第２の標的に特異的な単一特異的四量体複合体は、従来の技術を用いて磁性粒子に直接結合する。
【００６０】
別の実施形態において、一次抗体組成物は、（ａ）赤血球に結合する抗グリコホリンＡ抗体、（ｂ）免疫ロゼット形成することが望まれる標的細胞型に結合する抗体ならびに（ｃ）（ａ）および（ｂ）の両方のＦｃ部分に結合する抗体、必要に応じて、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片を含む四量体複合体である。（ａ）:（ｂ）:（ｃ）のモル比は、約１：３：４であり得る。いくつかの細胞型が分離される場合、複合体は、いくつかの抗標的細胞抗体（ｂ）で作られる。その後、複合体は、本開示の方法で使用するための抗体組成物を形成するために一緒に混合され得る。二次抗体組成物は、個々の赤血球および免疫ロゼット内の赤血球に結合できる磁性粒子に直接結合した抗グリコホリンＡ抗体である。
【００６１】
別の実施形態において、一次抗体組成物は、（ａ）赤血球に結合する抗グリコホリンＡ抗体、（ｂ）免疫ロゼット形成することが望まれる標的細胞型に結合する抗体ならびに（ｃ）（ａ）および（ｂ）の両方のＦｃ部分に結合する抗体、必要に応じて、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片を含む四量体複合体である。（ａ）:（ｂ）:（ｃ）のモル比は、約１：３：４であり得る。いくつかの細胞型が分離される場合、複合体は、いくつかの抗標的細胞抗体（ｂ）で作られる。その後、複合体は、本開示の方法で使用するための抗体組成物を形成するために一緒に混合され得る。二次抗体組成物は、（ａ）免疫ロゼット内の赤血球に結合するための抗グリコホリンＡ抗体、（ｄ）磁性粒子に結合する抗デキストラン抗体、ならびに（ｃ）（ａ）および（ｄ）の両方のＦｃ部分に結合する抗体、必要に応じてＦ（ａｂ’）２抗体断片を含む四量体複合体である。（ａ）:（ｄ）:（ｃ）のモル比は、約１：３：４であり得る。
【００６２】
一実施形態において、二次抗体組成物は、（ａ）免疫ロゼット内の赤血球に結合する抗グリコホリンＡ抗体、（ｂ）磁性粒子に結合する抗デキストラン抗体ならびに（ｃ）（ａ）および（ｄ）の両方のＦｃ部分を結合する抗体、必要に応じてＦ（ａｂ’）２抗体断片を含む四量体抗体複合体である。（ａ）:（ｄ）:（ｃ）のモル比は、約１：３：４であり得る。二次抗体組成物は、試料に加えられる前に磁性粒子上に予め添加される。
【００６３】
本開示の文脈において、抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、抗体断片（例えば、Fａｂ、およびＦ（ａｂ’）２）、キメラ抗体、二機能性または二重特異性抗体ならびに四量体抗体複合体を含むと理解される。抗体は、それらが適切な親和性（結合定数）、例えば、１０７Ｍ−１以上で結合する場合、標的細胞または赤血球の表面上の選択された抗原に対して反応性があると理解される。
【００６４】
モノクローナル抗体は、好ましくは、本開示の抗体組成物に使用される。有核細胞の表面上の選択された抗原に特異的なモノクローナル抗体は、当業者なら容易に分かる従来の技術を用いて容易に作製され得る。
【００６５】
本開示はまた、アプタマーまたはキメラ抗体誘導体、すなわち非ヒト動物可変領域とヒト定常領域を組み合わせた抗体分子も企図する。キメラ抗体分子は、例えば、ヒト定常領域を有するマウス、ラットまたは他の種の抗体由来の抗原結合ドメインを含み得る。キメラ抗体を作製するための様々なアプローチが記載されており、分化細胞または腫瘍細胞の表面上の選択された抗原を認識する免疫グロブリン可変領域を含むキメラ抗体を作製するために使用できる。例えば、ＫｉｍおよびＨｏｎｇ［４］を参照されたい。
【００６６】
以下の非限定的な実施例は、本開示を例示するものである。
【００６７】
実施例
実施例１
四量体抗体複合体の調製
本開示の方法で使用するための四量体抗体複合体を調製するために、以下のプロトコルを使用することができる：（ａ）ロゼット形成させる細胞に特異的な抗体（例えば、抗ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂなど）１ｍｇを取る；（ｂ）（赤血球に対する）抗グリコホリンＡ抗体３ｍｇを添加する；十分に混合し、その後、（ｃ）Ｐ９抗体４．０ｍｇまたはＰ９Ｆ（ａｂ’）２抗体断片２．７２ｍｇを添加する。３７℃で一晩インキュベートする。Ｐ９抗体は、ステップ（ａ）および（ｂ）で添加される抗体のＦｃ部分に結合し、四量体抗体複合体をもたらす。二次抗体組成物については、以下のプロトコルを使用することができる：（ａ）赤血球に特異的な抗体（抗グリコホリンＡ）１ｍｇを取る；（ｂ）Ｐ９抗体１ｍｇまたはＰ９Ｆ（ａｂ’）２抗体断片０．６８ｍｇを添加する。もう１つの方法として、（ａ）赤血球に特異的な抗体（抗グリコホリンＡ）１ｍｇを取る；（ｂ）抗デキストラン抗体３ｍｇを添加する；十分に混合し、その後、（ｃ）Ｐ９抗体４．０ｍｇまたはＰ９Ｆ（ａｂ’）２抗体断片２．７２ｍｇを添加する。３７℃で一晩インキュベートする。四量体の調製の詳細については、参照により本明細書に組み込まれるＬａｎｓｄｏｒｐの米国特許第４，８６８，１０９号を参照されたい。有核細胞上で発現する抗原に対する異なる抗体を組み込んだ四量体抗体複合体を別々に調製し、その後混合する。
【００６８】
抗体組成物は、枯渇が望まれる細胞に応じて様々な四量体抗体複合体を組み合わせることによって作製される。様々な四量体抗体複合体の濃度は変化する：典型的には、有核細胞上で発現する抗原に対する抗体は、四量体複合体中１０〜４０μｇ／ｍＬである。その後、組成物を細胞に１／２０希釈すると、細胞懸濁液中の各抗有核細胞抗体の最終濃度は０．５〜２．０μｇ／ｍＬになる。
【００６９】
一実施形態において、単一特異的四量体抗体複合体中の抗グリコホリンＡ抗体で構成される二次抗体組成物は、２０〜４００μｇ／ｍＬの濃度である。第２の組成物を、当業者なら容易に分かる物理的吸着または化学的共役などの従来の技術を用いて粒子に直接結合させる。その後、粒子に直接結合させた二次抗体組成物を試料に１／２０希釈すると、試料中の抗グリコホリンＡの最終濃度は１〜２０μｇ／ｍＬになる。
【００７０】
別の実施形態において、抗グリコホリンＡ抗体で構成される二次抗体は、２０〜４００μｇ／ｍＬの濃度である。二次抗体を、当業者なら容易に分かる物理的吸着または化学的結合などの従来の技術を用いて粒子に直接結合させる。その後、粒子に直接結合させた二次抗体組成物を試料に１／２０希釈すると、試料中の抗グリコホリンＡの最終濃度は１〜２０μｇ／ｍＬになる。
【００７１】
別の実施形態において、抗グリコホリンＡおよび抗デキストラン抗体で構成される二次抗体組成物は、２０〜４００μｇ／ｍＬの濃度である。その後、第２の組成物を免疫ロゼット細胞に１／２０に希釈すると、細胞懸濁液中の抗グリコホリンＡの最終濃度は１〜２０μｇ／ｍＬになる。
【００７２】
実施例２
四量体抗体複合体または第２の標的に対する抗体が結合した粒子の調製
本開示の方法で使用するための四量体抗体複合体が結合した粒子を調製するために、以下のプロトコルを使用することができる：（ａ）Ｐ９抗体２００μｇと共に、四量体抗体複合体に結合した抗グリコホリンＡ抗体２００μｇを取る；（ｂ）カルボキシデキストラン磁性粒子８０ｍｇを添加し、（ｃ）１５℃〜３７℃で一晩インキュベートする。その後、組成物を試料に１／２０に希釈すると、抗グリコホリンＡ抗体の最終濃度は１〜１０μｇ／ｍＬになる。
【００７３】
別の実施形態において、磁性粒子への抗グリコホリンＡの物理的吸着または化学的架橋を、当業者なら容易に分かる従来の技術を用いて行う。本開示の例示的で非限定的な例としては、カルボキシデキストラン磁性粒子への抗グリコホリンＡ抗体のＥＤＣ−ＮＨＳ架橋が挙げられる。その後、組成物を試料に１／２０希釈すると、抗グリコホリンＡ抗体の最終濃度は、１〜１０μｇ／ｍＬになる。
【００７４】
別の実施形態において、（ａ）抗デキストラン抗体６００μｇとＰ９抗体６００μｇまたはＰ９（Ｆ（ａｂ’）２抗体断片４０８μｇと共に、四量体抗体複合体に結合した抗グリコホリンＡ抗体１００μｇを取る；その後、（ｂ）デキストランコーティング磁性粒子１３．３ｍｇを添加する；（ｃ）室温で５分間インキュベートする。その後、組成物を細胞に１／２０希釈すると、グリコホリンＡ抗体の最終濃度は、１〜１０μｇ／ｍＬになる。
【００７５】
実施例３
磁性粒子に直接結合した第２の標的に特異的な単一特異的四量体抗体複合体を用いたヒト末梢全血からの免疫ロゼットの免疫磁気細胞分離法
磁気細胞分離を用いたヒト末梢全血からの免疫ロゼット形成細胞のネガティブ選択プロトコルを以下に記載する。
１．ヒト末梢全血１ｍＬ当たり一次抗体組成物５０μＬを添加する。
２．ヒト末梢全血１ｍＬ当たり磁性粒子に直接結合した二次抗体組成物５０μＬを添加する。
３．室温で５分間インキュベートする。
４．等量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で試料を希釈し、穏やかに混合する。
５．試料を含むチューブを磁石の中に置く。
６．室温で５分間インキュベートする。
７．試料チューブを磁石内に保持しながら、濃縮細胞を試料から除去する。
８．ステップ２のように、磁性粒子に直接結合した等量の二次抗体組成物を希釈した濃縮試料に添加する。
９．室温で５分間インキュベートする。
１０．試料を含むチューブを磁石の中に置く。
１１．室温で５分間インキュベートする。
１２．試料チューブを磁石内に保持しながら、濃縮細胞を試料から除去する。
【００７６】
それぞれが標的細胞およびグリコホリンＡ（第２の標的）に対する抗体を含む四量体抗体複合体のカクテルからなる、ヒト末梢全血からのａ）ＣＤ３＋Ｔ細胞、ｂ）ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ｃ）ＣＤ３−ＣＤ１９＋Ｂ細胞、およびｄ）ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の濃縮のための一次抗体組成物を調製した。カルボキシデキストラン磁性粒子に結合したグリコホリンＡに対する抗体を含む単一特異的四量体抗体複合体からなる二次抗体組成物を調製した。本開示の方法に従うと、上記に示した各細胞型の平均純度は、図４に示すとおり、それぞれａ）９７．２％，ｂ）９２．０％、ｃ）７３．９％およびｄ）６８．５％であり、回収率はａ）４０．７％、ｂ）３５．２％、ｃ）２９．９％、およびｄ）３６．６％であった。
【００７７】
実施例４
磁性粒子上に予め添加した第２の標的および磁性粒子に特異的な四量体抗体複合体を用いたヒト末梢全血からの免疫ロゼットの免疫磁気細胞分離法
磁気細胞分離を用いたヒト末梢全血からの免疫ロゼット形成細胞のネガティブ選択プロトコルを以下に記載する。
１．ヒト末梢全血１ｍＬ当たり一次抗体組成物５０μＬを添加する。
２．ヒト末梢全血１ｍＬ当たり磁性粒子上に予め添加された二次抗体組成物５０μＬを添加する。
３．室温で５分間インキュベートする。
４．等量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で試料を希釈し、穏やかに混合する。
５．試料を含むチューブを磁石の中に置く。
６．室温で５分間インキュベートする。
７．試料チューブを磁石内に保持しながら、濃縮細胞を試料から除去する。
８．ステップ２のように、磁性粒子上に予め添加した等量の二次抗体組成物を希釈した濃縮試料に添加する。
９．室温で５分間インキュベートする。
１０．試料を含むチューブを磁石の中に置く。
１１．室温で５分間インキュベートする。
１２．試料チューブを磁石内に保持しながら、濃縮細胞を試料から除去する。
【００７８】
ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂ、ＴＣＲγδおよびグリコホリンＡに対する抗体を含む四量体抗体複合体のカクテルからなる、ヒト末梢全血からのＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮のための一次抗体組成物を調製した。グリコホリンＡおよびデキストランに対する抗体を含む四量体抗体複合体からなる二次抗体組成物を調製し、カルボキシデキストラン磁性粒子上に予め添加した。本開示の方法に従うと、図３Ｂに示すとおり、細胞の９６．０％はＣＤ４５＋であり、そのうちの９４．６％がＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞であった。
【００７９】
実施例５
磁性粒子に化学的にコンジュゲートした第２の標的に特異的な抗体を用いたヒト末梢全血からの免疫ロゼットの免疫磁気細胞分離法
磁気細胞分離を用いたヒト末梢全血からの免疫ロゼット形成細胞のネガティブ選択プロトコルを以下に記載する。
１．ヒト末梢全血１ｍＬ当たり一次抗体組成物５０μＬを添加する。
２．ヒト末梢全血１ｍＬ当たり磁性粒子に化学的にコンジュゲートされた二次抗体組成物５０μＬを添加する。
３．ヒト末梢血１ｍＬ当たりデキストランコーティング磁性粒子５０μＬを添加する。
４．室温で１０分間インキュベートする。
５．等量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で試料を希釈し、穏やかに混合する。
６．試料を含むチューブを磁石の中に置く。
７．室温で５分間インキュベートする。
８．試料チューブを磁石内に保持しながら、濃縮細胞を試料から除去する。
９．ステップ３のように、等量のデキストランコーティング磁性粒子を希釈した濃縮試料に添加する。
１０．室温で５分間インキュベートする。
１１．試料を含むチューブを磁石の中に置く。
１２．室温で５分間インキュベートする。
１３．試料チューブを磁石内に保持しながら、濃縮細胞を試料から除去する。
【００８０】
ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂ、ＴＣＲγδおよびグリコホリンＡに対する抗体を含む四量体抗体複合体のカクテルからなる、ヒト末梢全血からのＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮のための一次抗体組成物を調製した。カルボキシデキストラン磁性粒子に化学的にコンジュゲートされたグリコホリンＡに対する抗体からなる二次抗体組成物を調製した。本開示の方法に従うと、図３Ｃに示すように、細胞の９９．８％はＣＤ４５＋であり、そのうちの９４．６％がＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞であった。
【００８１】
実施例６
カルボキシデキストランコーティング磁性粒子を用いたヒト末梢全血からの免疫ロゼットの免疫磁気細胞分離法
磁気細胞分離を用いたヒト末梢全血からの免疫ロゼット形成細胞のネガティブ選択プロトコルを以下に記載する。
１．ヒト末梢全血１ｍＬ当たり一次抗体組成物５０μＬを添加する。
２．ヒト末梢血１ｍＬ当たり二次抗体組成物５０μＬを添加する。
３．室温で１０分間インキュベートする。
４．ヒト末梢血１ｍＬ当たりカルボキシデキストランコーティング磁性粒子５０μＬを添加する。
５．室温で５分間インキュベートする。
６．等量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で試料を希釈し、穏やかに混合する。
７．試料を含むチューブを磁石の中に置く。
８．室温で５分間インキュベートする。
９．試料チューブを磁石内に保持しながら、濃縮細胞を試料から除去する。
１０．希釈した濃縮試料１ｍＬ当たりカルボキシデキストランコーティング磁性粒子５μＬを添加する。
１１．室温で５分間インキュベートする。
１２．試料を含むチューブを磁石の中に置く。
１３．室温で５分間インキュベートする。
１４．試料チューブを磁石内に保持しながら、濃縮細胞を試料から除去する。
【００８２】
ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂ、ＴＣＲγδおよびグリコホリンＡに対する抗体を含む四量体抗体複合体のカクテルからなる、ヒト末梢全血からのＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮のための一次抗体組成物を調製した。グリコホリンＡおよびデキストランに対する抗体を含む四量体抗体複合体からなる二次抗体組成物を調製した。本開示の方法に従うと、表１に示すように、２４．７％の回収率で、ＣＤ４＋Ｔ細胞の純度が９２．６％に達した。
【００８３】
実施例７
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からの免疫ロゼットの免疫磁気細胞分離法
磁気細胞分離を用いた赤血球枯渇ヒトＰＢＭＣからの免疫ロゼット形成細胞のネガティブ選択プロトコルを以下に記載する。
１．赤血球枯渇ヒトＰＢＭＣ試料に同量以上の非磁性粒子を添加する。
２．試料１ｍＬ当たり一次抗体組成物５０μＬを添加する。
２．試料１ｍＬ当たり二次抗体組成物５０μＬを添加する。
４．室温で１０分間インキュベートする。
５．試料１ｍＬ当たり磁性粒子５０μＬを添加する。
６．室温で５分間インキュベートする。
７．等量のＰＢＳ＋２％ＦＢＳで試料を希釈し、穏やかに混合する。
８．試料を含むチューブを磁石の中に置く。
９．室温で５分間インキュベートする。
１０．試料チューブを磁石内に保持しながら、濃縮細胞を試料から除去する。
１１．希釈した濃縮試料１ｍＬ当たり磁性粒子５μＬを添加する。
１２．室温で５分間インキュベートする。
１３．試料を含むチューブを磁石の中に置く。
１４．室温で５分間インキュベートする。
１５．試料チューブを磁石内に保持しながら、濃縮細胞を試料から除去する。
【００８４】
ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂ、ＴＣＲγδおよび抗ＰＥＧに対する抗体を含む四量体抗体複合体のカクテルからなる、ヒト末梢血単核細胞からのＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮のための一次抗体組成物を調製した。ＰＥＧおよびデキストランに対する抗体を含む四量体抗体複合体からなる二次抗体組成物を調製した。本開示の方法に従うと、図２Ｃに示すように、細胞の９６．６％がＣＤ４５＋であり、そのうちの９６．３％がＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞であった。
【００８５】
実施例８
免疫ロゼットの密度勾配遠心分離または免疫磁気分離を用いた末梢全血からのヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮
この実施例は、密度勾配遠心分離を用いて単離した免疫ロゼットを使用して濃縮したＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、実施例６に記載の方法を用いた末梢全血からのＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮を示す（表１）。ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂ、ＴＣＲγδおよびグリコホリンＡに対する抗体を含む四量体抗体複合体のＣＤ４＋Ｔ細胞濃縮カクテルを調製した。グリコホリンＡおよびデキストランに対する抗体を含む四量体の二次抗体複合体を作製した。表１に示す結果は、本開示の方法によると、２４．７％の回収率で、ＣＤ４＋Ｔ細胞の純度が９２．６％になることを示す。比較して、免疫ロゼットの密度勾配遠心分離では、主に最終濃縮画分における残留赤血球の存在により、２３．２％の回収率で、ＣＤ４＋Ｔ細胞の純度は８０．６％になる（８４．５％対９７．５％のＣＤ４５＋純度）。
【００８６】
【表１】
0006466350.tif 000002
【００８７】
実施例９
ＰＥＧ化ポリスチレンビーズを用いたヒトＰＢＭＣからのヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮
この実施例は、実施例７（図２）に記載の方法を用いた末梢全血からのＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮を示す。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で官能化した７μｍのポリスチレンビーズを赤血球枯渇ＰＢＭＣ試料に１個の有核細胞に対して１０個のビーズの最終比で添加した。ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂ、ＴＣＲγδおよびＰＥＧに対する抗体を含む四量体抗体複合体のＣＤ４＋Ｔ細胞濃縮カクテルを調製した。ＰＥＧおよびデキストランに対する抗体を含む四量体の二次抗体複合体を調製した。Ａ）フィコール処理したＰＢＭＣは、７１．５％がＣＤ４５＋細胞であり、約４７．６％がＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞である。Ｂ）７μｍのＰＥＧポリスチレンビーズを１０倍過剰添加すると、ＣＤ４５＋画分は７．２％に低下し、８３．６％はビーズである。シングレット画分中のＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合は４４．４％でＰＢＭＣ試料と同様である。Ｃ）実施例６に概説したように、本開示の方法に従うと、最終的なＣＤ４５＋純度は９６．６％であり、シングレットの９６．３％がＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞である。ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の回収率は２３．６％であった。
【００８８】
実施例１０
免疫磁気細胞分離を用いた追加の赤血球枯渇がある場合とない場合におけるＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓを用いたヒトＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮
この実施例は、製造業者により推奨される追加の赤血球免疫枯渇ステップを行った場合と行わなかった場合の、市販の赤血球凝集試薬および免疫磁気分離システム（ＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓ（登録商標）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いたヒト末梢全血２ｍＬからのＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のネガティブ濃縮を示す（図５）。試料を、抗ヒトＣＤ４  ＦＩＴＣ、ＣＤ３ ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５およびＣＤ４５ ＡＰＣで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。Ａ）ヒト末梢全血中の赤血球を塩化アンモニウムを用いて溶解すると、８５．０％のＣＤ４５＋細胞が得られ、そのうちの２９．０％はＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞であった。Ａ）製造業者により推奨される赤血球凝集および免疫磁気濃縮プロトコル後に、分離管の画像に示されるように、細胞懸濁液は明白に赤である。試料の分析時に、回収した細胞のわずか７．７％がＣＤ４５＋であり、そのうちの７２．１％がＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞であった。Ｂ）製造業者の推奨による追加の免疫磁気赤血球枯渇プロトコル後には、細胞懸濁液には残留赤血球が無い。試料の分析時に、回収した細胞の９８．６％はＣＤ４５＋であり、そのうちの９８．７％がＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞であった。この実施例では、市販の赤血球凝集試薬および免疫磁気分離プラットフォームＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓが共に、ヒト末梢全血から赤血球を完全に除去するために免疫磁気赤血球枯渇ステップを含む第２のステップと組み合わせて赤血球を沈降するための赤血球凝集試薬を必要とすることを示す。
【００８９】
実施例１１
免疫ロゼットの密度勾配もしくは免疫磁気分離、または赤血球凝集と免疫磁気分離を組み合わせた方法のいずれかを用いたヒト末梢全血からのヒトＣＤ３＋Ｔ細胞の濃縮
この実施例は、Ａ）塩化アンモニウム溶解、Ｂ）免疫ロゼットと密度分離（ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｃ）赤血球凝集と免疫磁気分離（ＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、またはＤ）実施例３による免疫ロゼットと免疫磁気分離のいずれかを用いたヒト末梢全血（ｎ＝３）１５ｍＬからのＣＤ３＋Ｔ細胞のネガティブ濃縮を示す（図６）。Ａ）ヒト末梢血の塩化アンモニウム溶解は、末梢血有核細胞の平均２６．６％が、全血１ｍＬあたり１×１０６細胞で存在するＣＤ３＋Ｔ細胞であることを示す。Ｂ）ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂ、およびグリコホリンＡに対する抗体を含む四量体抗体複合体のカクテルからなる、ＣＤ３＋Ｔ細胞の濃縮のための一次抗体組成物を調製した。米国特許第６４４８０７５Ｂ１号に従って免疫密度分離した後、残留赤血球を含む全細胞内のＣＤ３＋Ｔ細胞の平均の純度は８８．７％であり、全血１ｍＬあたり３．６×１０５個のＣＤ３＋Ｔ細胞を回収した。Ｃ）市販の赤血球凝集試薬および免疫磁気分離製品（ＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いたＣＤ３＋Ｔ細胞のネガティブ選択ならびに免疫磁気細胞分離（ＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓ）を用いた追加の赤血球枯渇ステップ後では、残留赤血球を含む全細胞内のＣＤ３＋Ｔ細胞の平均の純度は９８．５％であり、全血１ｍＬあたり４．５×１０５個のＣＤ３＋Ｔ細胞を回収した。Ｄ）実施例３で開示した方法に従って、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂ、およびグリコホリンＡに対する抗体を含む四量体抗体複合体のカクテルからなるＣＤ３＋Ｔ細胞の濃縮のための一次抗体組成物を調製した。カルボキシデキストラン磁性粒子に結合したグリコホリンＡに対する抗体を含む単一特異的四量体抗体複合体からなる二次抗体組成物を調製した。本開示の方法に従うと、残留赤血球を含む全細胞内のＣＤ３＋Ｔ細胞の平均純度は９６．８％であり、全血１ｍＬあたり３．６×１０５個のＣＤ３＋Ｔ細胞を回収した。方法Ｃ）とＤ）の間で純度またはＣＤ３＋Ｔ細胞回収率のいずれにおいても有意差はなかった。実施例３で開示した方法は、単に全ヒト末梢血からのＣＤ３＋Ｔ細胞の濃縮のための免疫磁気ネガティブ選択法であった。
【００９０】
参考文献
１．Ｒ．Ｅ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ（編），Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（第１版，ｐｐ．４７−６３）ハイデルベルグ：スプリンガー  ベルリンの中のＥｌｌｅｒｍａｎ，Ｄ．およびＳｃｈｅｅｒ，Ｊ．Ｍ．（２０１１）．化学結合による２重特異的抗体の作製（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）．
２．Ｒ．Ｅ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ（編），Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（第１版，ｐｐ．２９−４６）ハイデルベルグ：スプリンガー  ベルリンの中のＭｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ，Ｇ．（２０１１）．ハイブリッドハイブリドーマ由来の２重特異性抗体（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｈｙｂｒｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）．
３．Ｒ．Ｅ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ（編），Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（第１版，ｐｐ．１９９−２１６）ハイデルベルグ：スプリンガー  ベルリンの中のＣｈａｎｇ，Ｃ，Ｒｏｓｓｉ，Ｅ．Ａ．，およびＳｈａｒｋｅｙ，Ｒ．Ｍ．（２０１１）．新規２重特異性抗体へのドックアンドロックアプローチ（Ｔｈｅ Ｄｏｃｋ−ａｎｄ−Ｌｏｃｋ（ＤＮＬ）Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）．
４．Ｐ．Ｃｈａｍｅｓ（編），抗体エンジニアリング：方法およびプロトコル（第２版，ｐｐ．２３７−２４５）．ニューヨーク：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ社の中のＫｉｍ，Ｊ．Ｈ．，およびＨｏｎｇ，Ｈ．Ｊ．（２０１２）．ＣＤＲ移植および特異性決定残基の移植によるヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ＣＤＲ Ｇｒａｆｔｉｎｇ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ−Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｓｉｄｕｅ Ｇｒａｆｔｉｎｇ）．
【図１】
0006466350.tif 000003
【図２】
0006466350.tif 000004
【図３】
0006466350.tif 000005
【図４】
0006466350.tif 000006
【図５】
0006466350.tif 000007
【図６】
0006466350.tif 000008