(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．水性媒質；並びに
ｂ．セルロースナノフィブリル及び／又はその誘導体を含む、水性媒質中に懸濁されたヒドロゲル塊であって、ヒドロゲルが、分離したヒドロゲル塊又は相互に接続したヒドロゲル塊として存在する、ヒドロゲル塊
を含む、細胞培養用の不連続性三次元体。
【請求項２】
不連続性三次元体の全体積に対する、ヒドロゲル塊の全体積の比率が、１０％〜９９％（ｖ／ｖ）である、請求項１に記載の不連続性三次元体。
【請求項３】
ヒドロゲル塊が相互接続されている、請求項１又は２に記載の不連続性三次元体。
【請求項４】
同一条件において、不連続性三次元体の降伏応力が、対応する連続性のヒドロゲルの降伏応力よりも小さい、請求項１〜３のいずれか１項に記載の不連続性三次元体。
【請求項５】
同一条件において、不連続性三次元体の降伏応力が、対応する連続性のヒドロゲルの降伏応力の１〜９５％である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の不連続性三次元体。
【請求項６】
セルロースナノフィブリルが植物由来である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の不連続性三次元体。
【請求項７】
セルロースナノフィブリルの直径が１μｍ未満である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の不連続性三次元体。
【請求項８】
セルロースナノフィブリルが、イオン交換された天然のセルロースナノフィブリル誘導体又はナノフィブリル束、化学的に修飾されたセルロースナノフィブリル誘導体又はナノフィブリル束、或いは物理的に修飾されたセルロースナノフィブリル誘導体又はナノフィブリル束を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の不連続性三次元体。
【請求項９】
水性媒質が、少なくとも１の栄養源及び未分化、分化中又は分化後の持続的細胞増殖に必要な、少なくとも１の構成成分を含む細胞培養培地である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の不連続性三次元体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の不連続性三次元体並びに細胞及び／又は組織を含む細胞培養マトリクスであって、細胞及び／又は組織が、三次元又は二次元の配置で、少なくとも部分的に該体に埋め込まれて存在する、細胞培養マトリクス。
【請求項１１】
細胞が、分化した哺乳動物細胞又は未分化の哺乳動物細胞である、請求項１０に記載の細胞培養マトリクス。
【請求項１２】
細胞が未分化の幹細胞である、請求項１０に記載の細胞培養マトリクス。
【請求項１３】
細胞が、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の細胞培養マトリクス。
【請求項１４】
細胞が、ヒト細胞又は非ヒト細胞である、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の細胞培養マトリクス。
【請求項１５】
細胞が、非ヒト胚性幹細胞又は非ヒト人工多能性幹細胞である、請求項１４に記載の細胞培養マトリクス。
【請求項１６】
ａ．表面を有する基材；
ｂ．請求項１〜９のいずれか１項に記載の不連続性三次元体、或いは脱水形態の請求項１〜９のいずれか１項に記載の不連続性三次元体；及び
ｃ．細胞培養培地、細胞外マトリクス構成成分、血清、増殖因子、タンパク質、抗生物質、保存剤から成る群から選択される、少なくとも１の構成成分
を含む、細胞培養用製品。
【請求項１７】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の不連続性三次元体、或いは請求項１６に記載の製品の、細胞培養又は組織培養への使用。
【請求項１８】
細胞の移送方法であって、細胞が、請求項１〜９のいずれか１項に記載の不連続性三次元体中、又は
ａ．表面を有する基材；
ｂ．請求項１〜９のいずれか１項に記載の不連続性三次元体；及び
ｃ．細胞培養培地、細胞外マトリクス構成成分、血清、増殖因子、タンパク質、抗生物質、保存剤から成る群から選択される、少なくとも１の構成成分
を含む、細胞培養用製品中で移送される、方法。
【請求項１９】
細胞又は組織の三次元培養方法又は二次元培養方法であって、請求項１〜９のいずれか１項に記載の不連続性三次元体、或いは請求項１６に記載の製品を提供すること、不連続性三次元体に少なくとも１の細胞を播種すること；及び培養して細胞塊を得ることを含む、方法。
【請求項２０】
由来が異なる少なくとも２細胞種が共培養として培養される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
細胞がヒドロゲル塊と複合体を形成する、請求項１９〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
培養の間に、培養細胞を少なくとも１回継代させることにより、少なくとも１の継代培養が行われる、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
継代が、不連続性三次元体からの細胞塊の分離を含み、不連続性三次元体が酵素で処理される、請求項１９〜２１に記載の方法。
【請求項２４】
細胞塊を、少なくとも部分的に切り離すのに十分な時間、不連続性三次元体がセルラーゼで酵素的に処理される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
セルラーゼが、酵素処理後に不活化されるか、又は細胞塊から取り除かれる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
細胞が幹細胞等の未分化細胞を含み、且つ、細胞が継代の間に未分化に維持される、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
細胞塊又は細胞が細胞培養液から収集され、細胞増殖を維持して三次元培養を提供するのに好適な培地中で、請求項１〜９のいずれか１項に記載の不連続性三次元体と混合され；且つ培養液が、細胞増殖の促進に十分な条件及び時間でインキュベーションされ、それによってスフェロイドが形成される、請求項１８〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
細胞を化学的に分化させることを含む、請求項１９〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
分化が胚様体の形成を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
細胞の分化が、多能性を示す遺伝子、初期分化マーカー、及び後期分化マーカーの群から選択される少なくとも１のマーカーの発現等のバイオマーカーを観察することによってモニターされる、請求項１８〜２９に記載の方法。
【請求項３１】
第一の容器及び第二の容器を含むキットであって、第一の容器が、請求項１〜９のいずれか１項に記載の不連続性三次元体、或いは乾燥粉末、濃縮顆粒、又は濃縮ヒドロゲル塊等の、脱水形態の請求項１〜９のいずれか１項に記載の不連続性三次元体を含み、且つ第二の容器がセルラーゼを含む、キット。
【請求項３２】
細胞培養培地、細胞外マトリクス構成成分、血清、増殖因子、タンパク質、抗生物質、及び保存剤から成る群から選択される、１以上の構成成分を更に含む、請求項１の不連続性三次元体。
【請求項３３】
ヒドロゲル塊が、緩く接続し、水性媒体中に浮遊している、請求項１の不連続性三次元体。
【請求項３４】
細胞を更に含み、ヒドロゲル塊が細胞を介して互いに間接的に接続している、請求項１の不連続性三次元体。
【請求項３５】
不連続性三次元体中にプロテアーゼが検出できない、請求項１の不連続性三次元体。
【請求項３６】
セルロースナノフィブリルが滅菌されている、請求項１の不連続性三次元体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明分野
本発明は細胞培養系及び細胞工学の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）１及びヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）２，３は、生体中の多くの細胞腫に分化することができる、自己複製する多能性細胞である。これらは、例えば細胞療法、薬物研究及び組織工学に関して、大きな可能性を秘めている。更に、治療目的で人体に移植され得る分化細胞又は分化組織を開発するため、ヒト人工多能性幹細胞、複能性細胞及び他の未分化細胞は、将来、増殖させられ、特定の系統に分化するよう方向付けられることが想定される。ヒト多能性幹細胞及びこれから得られ得る分化細胞は、ヒトの細胞システム及び発生システムの研究にとっての、強力な科学的ツールでもある。
【０００３】
ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣを増殖させ、これらの自発的分化を防止するため、いくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系が開発されている。それらの系では、従来、細胞はフィーダー細胞上で培養された１が、後にマトリゲルコーティング４が、馴化培地又は既知組成培地（例えば、ｍＴｅＳＲ１培地５）の使用と組合せて導入され、フィーダー細胞と置き換えられた。しかし、マトリゲルは、ほとんど明らかにされていないマトリクス構成成分を含み、バッチごとに物質のばらつきがあるため、至適な細胞培養の再現が困難である。より最近になり、ビトロネクチン（ＶＮ）６、ラミニン−５１１（ＬＭ−５１１）７、ＬＭ−５２１、合成ペプチド−アクリレート表面８又は合成ポリマーコーティング９を用いるいくつかの研究によって、ｈＥＳＣｓ及びｈｉＰＳＣの未分化状態での増殖のための、既知組成のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系開発に進展があった。しかし、それらの培養系はすべて二次元（２Ｄ）の表面を用いており、幹細胞ニッチと称する、幹細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ環境を模倣してはいない。更に、２Ｄ表面上で培養された細胞は、例えば、治療及び研究に必要な、より大規模な量へと拡張（ｓｃａｌａｂｌｅ）することが容易でない。
【０００４】
成体幹細胞、即ち体性幹細胞は、分化後、生体の至る所で見られる未分化細胞である。これらは、例えば器官再生に関与し、多能性又は複能性の状態で分裂して、分化細胞の系統に分化することができる。
【０００５】
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）は、非常に高度な可塑性を示し、事実上すべての器官に見られるが、骨髄での密度が最も高い。ＨＭＳＣは、間葉系細胞の複製可能なソースとして機能し、適切な刺激後ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、及び移植後ｉｎ  ｖｉｖｏで、いくつかの細胞（骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨格筋細胞及び心筋細胞、内皮細胞、並びに神経細胞が挙げられる）系統に分化する多能性分化能を有する。
【０００６】
幹細胞ニッチは、明確に定義された、３Ｄの複雑な微環境であり、空間的に存在する生化学的及び物理的なシグナルにより、幹細胞の運命を制御する。生理的な条件下での細胞は、互いの間でのクロストークを行うのみではなく、それらの微環境及び細胞外マトリクス（ＥＣＭ）とも相互作用する。ＥＣＭは、細胞に対し構造的な支持を提供し、また、シグナル伝達及び細胞運命の方向づけにも関与する。ＥＣＭは、主に、グリコサミノグリカン、並びに、ナノファイバーネットワークに自己集合した、コラーゲン、エラスチン、ラミニン及びフィブロネクチン等の繊維性タンパク質で構成される。
【０００７】
３Ｄ細胞培養においては、好適な培養用マトリクスは、天然のＥＣＭ構成成分を模倣して、天然のＥＣＭに類似の特性（細胞への構造的支持並びに効率的な細胞移動及び細胞への栄養分移送のための、相互接続した細孔のネットワーク等）を有する足場を提供できなくてはならない。
【０００８】
ヒドロゲル（合成及び天然起源の両方）は、近年、３Ｄ細胞培養に好適な足場として認められてきた。ヒドロゲル中の相互に接続した細孔のネットワークは、大量の生体液の保持を可能にし、酸素、栄養分、及び老廃物の輸送を容易にする。更に、ほとんどのヒドロゲルは、穏やかな細胞適合性の条件下で形成され得、界面化学によりその生物学的特性を調節し得る。
【０００９】
修飾された機械的、化学的、及び生物学的特性を有する、改変ヒドロゲルは、ＥＣＭを模倣する可能性を有するため、３Ｄ細胞培養においてその有用性が認められている。３Ｄ細胞培養のための市販の生産品（ｐｒｏｄｕｃｔｓ）は、例えば、細胞培養マトリクスのＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（商標）（３ＤＭ  Ｉｎｃ．）及びＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（商標）は、繊維径５〜１０ｎｍを有する、ＥＣＭにおける天然の繊維状コラーゲンの構造に似た、自己集合したペプチドナノファイバーのヒドロゲルである。これは、水分含量も高い（通常９９．５％）。米国特許第７，４４９，１８０号及び国際特許出願公開第２００４／００７６８３号は、ペプチドヒドロゲルを開示している。マトリゲルは、マウス腫瘍細胞により分泌されるゼラチン状のタンパク質混合物である。該混合物は、多くの組織において見られる複雑な細胞外環境と類似し、細胞生物学者により、細胞培養のための基質として使用されている。ヒトＥＣＭ構成成分の混合物を含むＭａｘＧｅｌ（商標）ＥＣＭ  Ｍａｔｒｉｘ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）は、常温でゲルを形成する。これらの系においては、多能性細胞は、通常、細胞培養マトリクス及び隣接細胞に付着するために細胞に用いられる細胞外タンパク質ネットワークを切断するプロテアーゼ処理によって、細胞培養マトリクスから分離される。
【００１０】
細菌性セルロース（ＢＣ）は、創傷治癒膜中に、また細胞培養における足場として、使用されている。幹細胞培養で使用される細菌性セルロースの欠点は、発酵した原料の特有の構造にある。つまり、培養の際、発酵槽内で、空気と水の界面において、ＢＣが非常に堅固な膜として形成される。形成された膜は、過度に堅固であり、３Ｄ細胞培養及び種々の修飾は困難である。細胞培養マトリクスとして用いられた場合、細胞の侵入及び細胞クラスターの形成に十分なように、ＢＣマトリクスの多孔性を増大させなければならない。
【００１１】
米国特許第５，２５４，４７１号は、超微細繊維で構成された、細胞培養用の担体を開示している。国際特許出願公開第２００９／１２６９８０号は、骨格物質がセルロースから実質的に、又は完全に成り、且つ有機溶媒からの再構成によって形成される、セルロースベースのヒドロゲルを開示している。欧州特許第１９７０４３６Ｂ１号は、未分化細胞の培養用の担体物質を開示している。幹細胞等の多能性細胞の培養用の、現在の２Ｄ及び３Ｄの細胞培養システムは、動物ベースの物質を利用している。細胞培養環境中に動物ベースの化合物があると、細胞培養及び派生的用途（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）において、免疫反応及び種々の毒性が問題となるリスクが生じる。更に、タンパク質性物質で構成される細胞培養マトリクスから細胞を収集するには、細胞培養液をプロテアーゼ等のタンパク質分解酵素で処理する必要があるが、該酵素は培養細胞の細胞外構造も加水分解する。
【発明の概要】
【００１２】
発明の簡単な説明
未分化細胞用の細胞培養系においては、多大な進展がなされてきたにもかかわらず、従前の方策では、拡張可能な３Ｄ培養並びに未分化細胞及びスフェロイドの収集を可能にする細胞培養系を提供することはできなかった。更に、以前の方策では、細胞の成長及び増殖を維持するために、生体物質性の培地において、動物ベースの化学物質又は化合物の使用が必要である。幹細胞を多能性の状態に維持するには手がかかり、培養条件、物質及び細胞の取り扱いの慎重な制御が必要である。更に、多能性細胞の培養液を、更なる培養のため、ある実験所から他に移送することにはリスクが伴い、一部の細胞のみしか、生存して多能性の状態で増殖を継続できないことがよくある。細胞培養培地と共に用いられるマトリクスに関しては、現在、多能性の状態での幹細胞の増殖、並びに細胞間ネットワークの形成及びそれを破壊することなく細胞及び細胞スフェロイドを収集することを可能にする、簡易な方策は存在しない。
【００１３】
本発明者らは、例えば、多能性ｈＥＳＣを３Ｄ環境で培養すること及び増殖させることを可能にする、拡張可能な幹細胞組成物、培養系及び培養方法を開発した。本発明では、細胞培養マトリクス中で、ナノメートル範囲の繊維径及びマイクロメートル範囲の繊維長を有する、非動物由来原料のセルロースナノフィブリル（ＣＮＦ）を使用する。これらのセルロースナノフィブリルは、整列したβ−Ｄ−（１→４）グルコピラノース多糖鎖で構成される１０。ＣＮＦは、例えば、木本、他の植物、及び特定の細菌の細胞壁から単離され得る。ＣＮＦは、調節可能な物理的及び化学的特性を有するヒドロゲルを形成し１１，１２、多様な医薬的及び生物医学的な用途を生み出す。
【００１４】
一態様においては、水性媒質並びにセルロースナノフィブリル及び／又はその誘導体を含む、水性媒質中に懸濁されたヒドロゲル塊を含む、細胞培養用の不連続性三次元体（ｔｈｒｅｅ  ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｅｎｔｉｔｙ）が提供される。
【００１５】
他の態様においては、不連続性三次元体及びその製造方法が提供され、細胞培養用の不連続性三次元体の製造方法は、ａ．セルロースナノフィブリル及び／又はその誘導体をｉ．均質性のヒドロゲル；ｉｉ．均質性のヒドロゲルと水性媒質との組合せ；及び／又はｉｉｉ．水性媒質中で水和された、脱水ゲル塊又は乾燥粒状化セルロースナノフィブリル又はそれらの誘導体の形態で提供すること；及びｂ．ヒドロゲルの均質性の構造の機械的な破壊に好適な条件において混合し、ヒドロゲル塊の懸濁液を不連続性三次元体として得ることを含む。
【００１６】
他の態様においては、細胞培養マトリクス及びその製造方法であって、前記態様の方法において、細胞が加えられ、且つ水性媒質が細胞培養培地である、方法が提供される。
【００１７】
一態様においては、ａ．表面を有する基材；ｂ．水性媒質並びにセルロースナノフィブリル及び／又はその誘導体を含む、水性媒質中に懸濁されたヒドロゲル塊を含む、不連続性三次元体、又は水性媒質並びにセルロースナノフィブリル及び／又はその誘導体を含む、脱水形態で水性媒質中に懸濁されたヒドロゲル塊を含む、不連続性三次元体；ｃ．及び必要に応じて、細胞培養培地、細胞外マトリクス構成成分、血清、増殖因子、タンパク質、抗体、保存剤から成る群から選択される、少なくとも１の構成成分を含む、細胞培養用製品及び該製品の使用が提供される。本発明の不連続性三次元体を含む製品は、細胞培養ボトル、プレート及びディッシュ、マルチウェル培養プレート、マイクロタイタープレート、ハイスループットプレート等の、細胞培養に好適な任意の製品であり得る。好ましくは、該製品は細胞培養グレードである。
【００１８】
一態様においては、前記不連続性三次元体の、細胞培養又は組織培養への使用が提供される。
【００１９】
一態様においては、細胞の移送方法であって、細胞が、上記不連続性三次元体中で移送される、方法が提供される。
【００２０】
一態様においては、細胞又は組織の三次元培養方法又は二次元培養方法であって、上記不連続性三次元体を提供すること、不連続性三次元体に少なくとも１の細胞を播種すること；及び培養して細胞塊を得ることを含む、方法が提供される。
【００２１】
一態様においては、第一の容器及び第二の容器を含むキットであって、第一の容器が、上記不連続性三次元体、或いは乾燥粉末、濃縮顆粒、又は濃縮ヒドロゲル塊等の、脱水形態の上記不連続性三次元体を含み、且つ第二の容器がセルラーゼを含む、キットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
図面の簡単な説明
【図１】図１は、ＷＡ０７細胞及びｉＰＳ（ＩＭＲ９０）−４細胞が正常な核型を有することを示す。細胞は、まず本発明の不連続性３Ｄ体中で培養され、次いで核型解析のために２Ｄのマトリゲルプラットフォームに移し替えられた。
【図２】図２は、本発明の不連続性３Ｄ体中での３Ｄ培養から、２Ｄの、ラミニン５１１コーティング、ラミニン５２１コーティング、ビトロネクチンコーティング及びマトリゲルコーティングしたディッシュに移し替えたＷＡ０７細胞及びｉＰＳ（ＩＭＲ９０）−４細胞が、幹細胞の典型的な形態を示すことを示す。倍率：１０ｘ。
【図３】図３は、２％  ｗ／ｖセルロースナノフィブリルヒドロゲルを希釈及び混合して０．５％  ｗ／ｖとすることにより得られた、本発明の不連続性３Ｄ体中で９日間培養したＷＡ０７及びｉＰＳ（ＩＭＲ９０）−４の生／死細胞の染色を示す。クラスター中の細胞はほとんどが生きており（緑色）、ウェル底の単細胞は死んでいるように見える（赤色）。スケールバー：１００μｍ。
【図４】図４は、セルラーゼ濃度の至適化を示す。２００μｇセルラーゼ／ｍｇセルロースでは毒性が無いようである。３００−５００μｇセルラーゼ／ｍｇセルロースでは、細胞生存率に対する悪影響は極めて少ない。細胞の増殖及び生存は、ＡｌａｒｍａＢｌｕｅアッセイによりモニターした。
【図５】図５は、３Ｄ培養から、本発明の不連続性３Ｄ体中での新たな培養へと継代培養されたｉＰＳ（ＩＭＲ９０）−４細胞が、スフェロイドを形成できたことを示す。
【図６】図６は、本発明の不連続性３Ｄ体中で培養されたｉＰＳ（ＩＭＲ９０）−４細胞から形成されたＥＢを示す。細胞は浮遊培養で培養されてＥＢを形成したか、又はＣＮＦなしの２Ｄコーティング上で培養されたかのいずれかであった。
【図７】図７は、本発明の不連続性３Ｄ体中での３Ｄ培養から、２Ｄのラミニン５１１に移し替えたｉＰＳ（ＩＭＲ９０）−４細胞が、ＳＳＥＡ４及びＯＣＴ４は発現するが、ベータチューブリンＩＩＩ、筋肉アクチン及びＨＮＦ３Ｂは発現しないことを示す。スケールバー：１００μｍ。
【図８】図８は、本発明の不連続性３Ｄ体中での３Ｄ培養から、２Ｄのラミニン５２１に移し替えたｉＰＳ（ＩＭＲ９０）−４細胞が、ＳＳＥＡ４及びＯＣＴ４は発現するが、ベータチューブリンＩＩＩ、筋肉アクチン及びＨＮＦ３Ｂは発現しないことを示す。スケールバー：１００μｍ。
【図９】図９は、本発明の不連続性３Ｄ体中での３Ｄ培養から、２Ｄのマトリゲルに移し替えたｉＰＳ（ＩＭＲ９０）−４細胞が、ＳＳＥＡ４及びＯＣＴ４は発現するが、ベータチューブリンＩＩＩ、筋肉アクチン及びＨＮＦ３Ｂは発現しないことを示す。スケールバー：１００μｍ。
【図１０】図１０は、本発明の不連続性３Ｄ体中での３Ｄ培養から、２Ｄのビトロネクチンに移し替えたｉＰＳ（ＩＭＲ９０）−４細胞が、ＳＳＥＡ４及びＯＣＴ４は発現するが、ベータチューブリンＩＩＩ、筋肉アクチン及びＨＮＦ３Ｂは発現しないことを示す。スケールバー：１００μｍ。
【図１１】図１１は、本発明の不連続性３Ｄ体中での３Ｄ培養から、２Ｄのラミニン５１１に移し替えたＷＡ０７細胞が、ＳＳＥＡ４及びＯＣＴ４は発現するが、ベータチューブリンＩＩＩ、筋肉アクチン及びＨＮＦ３Ｂは発現しないことを示す。スケールバー：５０μｍ。
【図１２】図１２は、本発明の不連続性３Ｄ体中での３Ｄ培養から、２Ｄのラミニン５２１に移し替えたＷＡ０７細胞が、ＳＳＥＡ４及びＯＣＴ４は発現するが、ベータチューブリンＩＩＩ、筋肉アクチン及びＨＮＦ３Ｂは発現しないことを示す。スケールバー：５０μｍ。
【図１３】図１３は、本発明の不連続性３Ｄ体中での３Ｄ培養から、２Ｄのマトリゲルに移し替えたＷＡ０７細胞が、ＳＳＥＡ４及びＯＣＴ４は発現するが、ベータチューブリンＩＩＩ、筋肉アクチン及びＨＮＦ３Ｂは発現しないことを示す。スケールバー：５０μｍ。
【図１４】図１４は、本発明の不連続性３Ｄ体中での３Ｄ培養から、２Ｄのビトロネクチンに移し替えたＷＡ０７細胞が、ＳＳＥＡ４及びＯＣＴ４は発現するが、ベータチューブリンＩＩＩ、筋肉アクチン及びＨＮＦ３Ｂは発現しないことを示す。スケールバー：５０μｍ。
【図１５】図１５は、ｉＰＳ（ＩＭＲ９０）−４細胞の、ＥＢ形成を介したｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化を示す。まず、ｉＰＳ（ＩＭＲ９０）−４細胞は、本発明の不連続性３Ｄ体中で培養され、マトリゲルでコーティングしたディッシュ上で培養が継続された。胚様体は浮遊培養において形成された。分化細胞はベータチューブリン−ＩＩＩ、筋肉アクチン及びＨＮＦ３Ｂを発現する。スケールバー：５０μｍ。
【図１６】図１６  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、本発明の不連続性３Ｄ体中での３Ｄ培養から、４種の２Ｄプラットフォーム（ｐｌａｔｅｆｏｒｍｓ）（ＬＭ５１１：ラミニン−５１１；ＬＭ５２１：ラミニン−５２１；ＶＮ：ビトロネクチン；Ｍ：マトリゲル）に移し替えたＷＡ０７細胞及びｉＰＳ（ＩＭＲ９０）−４細胞が、従来のマトリゲルプラットフォーム（Ｍ  ｃｔｒｌ）中で培養された該細胞と同レベルのＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４を発現することを示す（ｎ＝３）。
【図１７】図１７は、連続性のヒドロゲル構造（Ａ）及び本発明の不連続性３Ｄ体（Ｂ）のフロープロファイルを示す。ＡとＢの両方について、イオン交換された天然のセルロースナノフィブリルを、水系中０．５％  ｗ／ｖで用いた。
【図１８】図１８は、連続性のヒドロゲル構造（Ａ）及び本発明の不連続性３Ｄ体（Ｂ）のフロープロファイルを示す。ＡとＢの両方について、陰イオン修飾した天然セルロースナノフィブリルを、水系中０．５％  ｗ／ｖで用いた。
【図１９】図１９は、０．５％  ｗ／ｖで水中に分散した、イオン交換された天然のセルロースナノファイバーに関する、連続性（上）及び不連続性（下）のゲル構造の位相差光学顕微鏡像を示す。不連続性のゲル構造は、２％のゲル試料を０．５％に希釈し、続いてピペットで（５０ｍＬバイアル中、直径０．２ｃｍの３ｍＬパスツールピペットにより）５回混合することによって作製される。
【図２０】図２０は、０．５％  ｗ／ｖで水中に分散した、陰イオン修飾セルロースナノフィブリルに関する、連続性（上）及び不連続性（下）のゲル構造の汎用顕微鏡像を示す。不連続性のゲル構造は、１〜３ｍｍの大きさの２７％  ｗ／ｖ試料を０．５％に希釈し、続いてマグネティックスターラーで（４００ｍｌのデカンターグラス、３００ｒｐｍ、５分）混合することによって作製される。
【図２１】図２１  本発明の不連続性３Ｄ体中で培養されたＨ９−ＧＦＰ細胞は、強烈なＯＣＴ４染色を示す。ＯＣＴ４発現は、セルラーゼ処理によって減弱されなかった。細胞は緑色で示され、ＯＣＴ４は赤色に染色される。スケールバー：５０μｍ。
【図２２】図２２  Ｈ９−ＧＦＰ細胞を、まず、本発明の不連続性３Ｄ体中で培養し、次いで、２Ｄのラミニン５１１コーティング、ラミニン５２１コーティング、ビトロネクチンコーティング及びマトリゲルコーティングしたディッシュ（ｄｉｓｈｅｄ）上に移し替えた。細胞は緑色で表され、ＯＣＴ４は赤色に染色される。スケールバー：５０μｍ。
【図２３】図２３  共焦点顕微鏡を用いる、ＣＮＦ染色及び生細胞イメージング。緑色で示されるＨ９−ＧＦＰ細胞を、本発明の不連続性３Ｄ体中で培養した。該培養中のＣＮＦを青色で示す。セルラーゼ処理後、青色染色は濃度依存的に低減した。スケールバー：５０μｍ。
【図２４】図２４  セルロースナノフィブリルで作製された、種々の不連続性ヒドロゲル３Ｄ体の模式図。
【図２５】図２５  セルラーゼで処理したＨ９−ＧＦＰ細胞のミトコンドリア代謝活性。マトリゲルプラットホーム上で培養したＨ９−ＧＦＰ細胞を、図２５の０、５０、１００、２００、３００、４００及び５００μｇ／ｍｇでセルラーゼ処理した。セルラーゼで処理したＨ９−ＧＦＰ細胞のミトコンドリア代謝活性。マトリゲルプラットホーム上で培養したＨ９−ＧＦＰ細胞を、０、５０、１００、２００、３００、４００及び５００μｇ／ｍｇＣＮＦで、３７℃で２４時間セルラーゼ処理した。ミトコンドリアの相対代謝活性を、酵素処理の１日前及び１日後に、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）アッセイによって測定した。増加蛍光強度の平均を、独立した３実験から算出した。各条件について６つの試料を、並行して調製した。結果を平均±標準偏差（ｎ＝３）で表示する。ＣＦＮは３７℃で２４時間。ミトコンドリアの相対代謝活性を、酵素処理の１日前及び１日後に、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）アッセイによって測定した。増加蛍光強度の平均を、独立した３実験から算出した。各条件について６つの試料を、並行して調製した。結果を平均±標準偏差（ｎ＝３）で表示する。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明の態様は、細胞培養組成物、不連続性三次元体、並びに細胞の培養及び移送においてそれらを製造及び使用する方法に関する。本発明による使用のためのセルロースナノフィブリルは、植物又は微生物等の、非動物性の原料から得ることができるか、又は細菌の発酵過程に由来し得る。該組成物及び系は、哺乳動物の胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞等の細胞の、培養に用いられ得る。一態様においては、細胞はヒト由来であり得る。他の態様においては、細胞は非ヒト由来であり得る。
【００２４】
特記しない限り、本明細書及び特許請求の範囲で用いられる用語は、細胞培養において一般的に用いられる意味を有する。特に、次の用語は、以下に示す意味を有する。
【００２５】
用語「不連続性三次元体」は、三次元的に不連続な構造を有する系を指す。該体は、水性媒質及び水性媒質中に懸濁された、セルロースナノフィブリル及び／又はその誘導体を含むヒドロゲル塊を含む。
【００２６】
「水性媒質」は、細胞又は組織を維持し、移送し、単離し、培養し、増殖させ、継代させ、又は分化させるのに好適な水、脱イオン水、緩衝溶液、又は栄養培地等の任意の水性媒質を指す。水性媒質は、特別な追加的細胞マトリクスの構成成分、血清、増殖因子、抗生物質、保存剤及びタンパク質等の様々な添加剤を、更に含有し得る。当該技術分野で公知のように、細胞培養培地の選定は培養する細胞種に左右される。細胞の未分化増殖又は分化中増殖を下支えする、市販の細胞培養培地が多く存在する。本発明において好適な細胞培養培地の例としては、ｍＴｅＳＲ１（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、間葉系幹細胞培地（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，＃ＰＴ−３００１）、ＳＴＥＭＰＲＯ  ｈＥＳＣ  ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び分化培地が挙げられる。
【００２７】
「不連続性」は、前記体の不均質性の構造或いは前記体内の物理的連続性の途切れ、例えばヒドロゲル塊による水性媒質の途切れ、又は水性媒質によるヒドロゲル塊中及び／若しくはその間の途切れを指す。
【００２８】
「ヒドロゲル」又は「ゲル」又は「セルロースナノフィブリルヒドロゲル」は、均質性且つ連続性のゲル構造を有する、セルロースナノフィブリルの水分散物をいう。ヒドロゲルは、セルロースナノフィブリルと、例えば水、緩衝溶液又は細胞培養培地又は必要に応じて添加剤を補充した、他の任意の水溶液とを混合することによって形成され得る。
【００２９】
「ヒドロゲル塊」及び「ヒドロゲル領域」は、ヒドロゲルの分割量（ａｌｉｑｕｏｔ）、分割物（ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、領域（ｄｏｍａｉｎ）、画分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）、部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）又は用量（ｄｏｓｅ）を指す。ヒドロゲル塊は、明確な定形の形状、不定形状、対称形状又は非対称形状を有し得る。
【００３０】
「懸濁された」又は「懸濁」は、不連続性三次元体及びヒドロゲル塊の関連で用いられる場合、水性媒質とヒドロゲルとの不均質性の混合物を指し、ヒドロゲルは分離したヒドロゲル塊又は相互に接続したヒドロゲル塊として存在し得る。
【００３１】
「相互に接続した」及び「相互接続」は、ヒドロゲル塊の関連で用いられる場合、ヒドロゲル塊が互いに連絡している（ｉｎ  ｃｏｎｔａｃｔｗｉｔｈ）系を指す。連絡は、ヒドロゲル塊間の直接的な接続であってもよい。又は、ヒドロゲル塊は緩く接続していてもよい。ヒドロゲルの均質性の構造が、例えば混合により破壊される場合、得られる不連続性の構造は、ヒドロゲル塊の大きさ及び形態が異なることを特徴とする。一態様においては（Ｉ  ｏｎｅ  ａｓｐｅｃｔ）、得られる系は、相互接続されたゲル塊間に、水を含む腔（ａｑｕｅｏｕｓ  ｃａｖｉｔｉｅｓ）を含有していてもよい。又は、緩く接続したヒドロゲル塊は、互いに連絡して、水性媒質中に「浮遊」していてもよい。一態様においては、ヒドロゲル塊は、系中に存在する、例えば細胞又は他の構成要素を介して、間接的に接続していてもよい。
【００３２】
用語「細胞培養マトリクス」は、細胞及び／又は組織並びに不連続性三次元体を含む系を指し、細胞及び／又は組織は、少なくとも一部が、三次元又は二次元の配置で該体中に埋め込まれて存在する。細胞培養の関連では、三次元及び二次元は、細胞配置の状態を指し、例えば３Ｄはクラスター様又はスフェロイド様の配置、また２Ｄは単一又は層状の配置を指し得る。
【００３３】
用語「細胞培養」又は「細胞の培養」は、細胞又は組織の維持、移送、単離、培養、増殖、継代又は分化を指す。細胞は、個々の細胞、単層、細胞クラスター又はスフェロイド或いは組織等の、任意の体制であり得る。
【００３４】
用語「セルロース原料」は、セルロースパルプ、精製パルプ及びセルロースナノフィブリルの生産に使用できる、セルロース原料の任意のソースを指す。該原料は、セルロースを含む任意の植物性原料ベースであり得る。該原料は、また、特定の細菌発酵の過程に由来し得る。植物性原料は木本であり得る。木本は、トウヒ、マツ、モミ、カラマツ、ベイマツ若しくはツガ等の針葉樹由来、又はカバノキ、アスペン、ポプラ、ハンノキ、ユーカリ若しくはアカシア等の広葉樹由来、或いは針葉樹材及び広葉樹材の混合材由来であり得る。非木本原料は、農業残留物、草本又は他の植物性物質（わら、葉、樹皮、種子、殻、花、野菜又は果実であって、綿、トウモロコシ、小麦、カラス麦、ライ麦、大麦、米、亜麻、麻、マニラ麻、サイザル麻、ジュート、ラミー、ケナフ、バガス、竹又は葦に由来するもの等）であり得る。セルロース原料はまた、セルロースを生産する微生物由来であり得る。微生物は、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｏｒ）属又はアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、好ましくはアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、より好ましくはアセトバクター・キシリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍｏｒ）種又はアセトバクター・パスツリアナス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）種であり得る。
【００３５】
用語「セルロースパルプ」とは、化学的、機械的、熱機械的又は化学−熱機械的パルピングプロセスを用いて、任意のセルロース原料から分離したセルロースファイバーをいう。通常、ファイバーの直径は、１５〜２５μｍの間で様々であり、長さは５００μｍ超であるが、本発明をこれらのパラメータに限定することは意図されていない。
【００３６】
用語「セルロースナノフィブリル」は、単離したセルロースナノフィブリル（ＣＮＦ）の集まり、又はセルロース原料若しくはセルロースパルプ由来のナノファイバーの束を指す。通常、ナノフィブリルは、アスペクト比が高い。つまり、数平均直径は通常２００ｎｍ未満であるが、長さは１マイクロメートルを超え得る。ナノファイバーの束の直径は、より大きい場合があるが、一般的には１μｍ未満である。最も小さいナノフィブリルは、通常直径２〜１２ｎｍであるいわゆるエレメンタリーフィブリル（ｅｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｆｉｂｒｉｌ）に類似する。フィブリル又はフィブリルの束の大きさは、原料及び分解方法に左右される。セルロースナノフィブリルは、いくらかのヘミセルロースも含有し得、その量は植物ソースによる。セルロース原料、セルロースパルプ、又は精製パルプ由来のセルロースナノフィブリルの機械的分解は、精製機、グラインダー、ホモジナイザー、コロイダー（ｃｏｌｌｏｉｄｅｒ）、摩擦グラインダー、超音波処理装置、マイクロフリューダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）、マクロフリューダイザー（ｍａｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）又は流動化型ホモジナイザーなどのフリューダイザー等の適切な機器により行われる。一態様においては、セルロースナノフィブリルは植物由来である。「セルロースナノフィブリル」は、特定の発酵過程から直接的に単離することもできる。セルロースを生産する、本発明の微生物は、アセトバクター属、アグロバクテリウム属、リゾビウム属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｏｒ）属又はアルカリゲネス属、好ましくはアセトバクター属、より好ましくはアセトバクター・キシリナム（ｘｙｌｉｎｕｍｏｒ）種又はアセトバクター・パスツリアナス種であり得る。セルロースナノフィブリルは、水又は他の極性溶媒における、非常に高い保水値、高度の化学アクセシビリティ及び安定なゲル（ヒドロゲル）を形成する能力を特徴とする。セルロースナノフィブリルの生成物は、通常、高度に細繊化したセルロースの、密なネットワークである。
【００３７】
セルロースナノフィブリルを得るために、精製機、グラインダー、ホモジナイザー、コロイダー、摩擦グラインダー、超音波処理装置、マイクロフリューダイザー（、マクロフリューダイザー又は流動化型ホモジナイザー等のフリューダイザー等の適切な機器を用いて、セルロースパルプ又は酸化セルロース原料の機械的分解が行われる。好ましくは、機械的に分解したセルロースナノフィブリルが用いられる。
【００３８】
グレードが異なる何種類かのセルロースナノフィブリルが、様々な生産技術を用いて開発されている。該グレードは、製造方法、フィブリル化の程度及び化学組成に応じて、特性が異なる。該グレードの化学組成もまた様々である。原料のソース、例えば、広葉樹パルプか針葉樹パルプかによって、セルロースナノフィブリル最終産物中の多糖組成は異なる。通常、非イオン性又は天然のグレードは、フィブリル径がより幅広い一方で、化学修飾（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ）したグレードは、はるかに細く、且つネットワークが連続している。セルロースナノフィブリルの数平均フィブリル径は、好適には１〜２００ｎｍであり、好ましくは、天然グレードの数平均フィブリル径は、１〜１００ｎｍであり、化学修飾グレードにおいては、１〜２０ｎｍである。修飾グレードについては、サイズ分布もより狭い。天然のイオン交換されたセルロースナノフィブリルは、部分的に不均質性で、不連続性の構造を示す。細胞培養用途のためには、セルロースナノフィブリルは、好ましくは細胞に対して無毒である。
【００３９】
セルロースナノフィブリルの誘導体は、セルロースナノフィブリル又はナノファイバー束の、化学的又は物理的に修飾された任意の誘導体であり得る。化学的修飾は、例えば、セルロース分子のカルボキシメチル化、酸化、エステル化、又はエーテル化の反応に基づき得る。修飾は、セルロース表面上の、アニオン性、カチオン性、若しくは非イオン性物質、又はこれらの任意の組み合わせの物理的吸着によっても実現することができる。前記修飾は、セルロースナノフィブリルの製造前、製造後、又は製造中に行うことができる。特定の修飾は、ヒトの体内で分解可能なＣＮＦ原料をもたらし得る。
【００４０】
セルロースナノフィブリル及びそれを含有するヒドロゲルの微生物純度は、細胞培養の成果にとって極めて重要である。従って、セルロースナノフィブリルを、ヒドロゲルの形態で細胞培養実験の前に滅菌してもよい。それに加え、細繊維化の前及び細繊維化中に該産物の微生物混入を最少限に抑えることが重要である。細繊維化に先立って、パルプがまだ無菌である漂白工程の後すぐに、セルロースパルプを、パルプ製造機から無菌的に回収することが好都合である。
【００４１】
広く使用されているセルロースナノフィブリルの同義語がいくつか存在する。例えば：ナノセルロース、ナノフィブリル化セルロース（ｎａｎｏｆｉｂｒｉｌｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＮＦ）、ナノフィブリルセルロース（ｎａｎｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、セルロースナノファイバー、ナノスケールフィブリル化セルロース、ミクロフィブリルセルロース（ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ミクロフィブリル化セルロース（ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＭＦＣ）、又はセルロースミクロフィブリル（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌ）。また、特定の微生物により生産されたセルロースナノフィブリルも、細菌性セルロース、微生物性セルロース（ＭＣ）、バイオセルロース、ナタデココ（ＮＤＣ）、又はココデナタ（ｃｏｃｏ  ｄｅ  ｎａｔａ）等の様々な同義語を有する。
【００４２】
化学的には、巨大セルロース分子は非常に安定な分子であることが知られている。セルロース加水分解には過酷な条件を用いることが必要であり、通常、強酸（５６％硫酸など）が用いられる。
【００４３】
個々のセルロースナノフィブリルの径は、ＥＣＭ中のコラーゲン繊維の径、即ち４〜１０ｎｍに近い。従って、ＣＮＦベースのヒドロゲルは、３Ｄの細胞培養マトリクス中で用いられ得る。
【００４４】
本発明の細胞培養実験においては、２種類のセルロースナノフィブリル、つまり不透明なヒドロゲルを形成する天然のＣＮＦ、及び光学的に透明なヒドロゲルを形成する、化学修飾された陰イオン性ＣＮＦを用いた。原料の詳細な説明は、実施例、材料と方法の節に提示する。ヒドロゲル中のＣＮＦ濃度は、培養する細胞に好適な濃度に適合させる。全体積中のＣＮＦ濃度は、例えば、細胞種及び細胞株に応じて、０．０１〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲で様々であり得る。幹細胞培養においては、通常、下限での濃度が好ましいが、肝細胞等の分化細胞が培養される場合は、より高い濃度が一般的である。不連続性三次元体においては、ＣＮＦヒドロゲルの不連続的特性のため、総ＣＮＦ濃度は、局所的なＣＮＦ濃度とは異なり得る。多能性細胞に対しては、不連続性三次元体の全体積中で、０．０５、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．５５％、０．６％、０．６５％、０．７％、０．７５％、０．８％、０．８５％、０．９％、０．９５％、１％、１．０５％、１．１％、１．１５％、１．２％、１．２５％、１．３％、１．３５％、１．４％、１．４５％又は１．５％等の濃度（ｗ／ｖ）の、０．０５〜１．５％（ｗ／ｖ）の範囲のＣＮＦ濃度が用いられ得る。総ＣＮＦ濃度は、また、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５、又は１０％であり得る。本発明による不連続性三次元体の構造を考慮すると、上記ＣＦＮ濃度は、不連続性三次元体の全体積中のＣＦＮ濃度を指し、局所的なＣＦＮ濃度は、不連続性三次元体の種々の部位で異なることは自明である。本発明による不連続性三次元体の特性を適切に理解するためには、対象領域がヒドロゲル塊で完全に満たされているとすると、特別な場合には、局所的なＣＮＦ濃度は、全体積中の濃度よりもはるかに高くなり得ることを認識しなければならない。他方、対象領域が不連続性のＣＮＦヒドロゲルによって囲まれた、水を含む腔にある場合は、局所的なＣＦＮ濃度は０％であり得る。（図２４を参照）。
【００４５】
不連続性三次元体を含むゲル塊の断片の体積は、不連続性三次元体の全体積中、５０％及び９９％の間で様々であり得る。従って、ＣＮＦの局所的濃度は、全体のＣＦＮ濃度よりも高いか、又は低い場合がある。ゲル塊の断片の体積は、例えば、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であり得る。ゲル塊の断片は、例えば、顕微鏡下での検査によるか、又は沈降分析により、定性的に容易に測定し得る。
【００４６】
降伏応力又は降伏点は、物質が塑性変形を開始する応力を指す。降伏応力は当該技術分野で公知の、任意の方法により規定され得る（ｍａｙ  ｂｅ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ａｎｙ  ｍｅｔｈｏｄ）。単一ヒドロゲル塊の降伏応力は、均質性のセルロースナノファイバーヒドロゲルの降伏応力と実質的に同一である。
【００４７】
本発明のセルロースナノフィブリル又はその誘導体は、セルロースのナノフィブリル又はナノファイバー束の、化学的又は物理的に改変された誘導体を含み得る。
【００４８】
用語「細胞培養マトリクス」は、細胞培養用に、及び、組織の基礎構造を模倣するため、細胞の接着のために利用できる付着表面を増大させる、成長マトリクスの提供用に構成された原料を指す。
【００４９】
用語「細胞培養製品」は、細胞培養に好適な任意の製品を指し、シングルウェル及びマルチウェルのプレート（６、１２、９６、３８４、及び１５３６ウェルプレート等）、広口瓶、ペトリ皿、フラスコ、多層フラスコ、ビーカー、プレート、ローラーボトル、スライド（チャンバー培養スライド及びマルチチャンバー培養スライド等）、チューブ、カバーガラス、バッグ、メンブレン、中空糸、ビーズ及びマイクロキャリア、カップ、スピナーボトル、灌流チャンバー、シリンジ、バイオリアクター及び発酵槽が挙げられる。
【００５０】
「脱水型で」は、対象の物質から、すべてとは限らないが、いくらかの水が除去された、物質の形態を指す。従って、用語、脱水は、例えば濃縮されたスラリー、顆粒、フレーク、及び粉末を包含する。
【００５１】
用語「キット」は、それを用いる、細胞培養のための方法、アッセイ、又は不連続性三次元体若しくは製品の操作を容易にする、製品又は容器の組合せを指す。キットは、必要に応じて、いかにして該キットを使用するかを説明した指示書（例、本発明の方法を説明する指示書）、薬包、混合ステーション、化学試薬、及び他の構成要素を含有し得る。キットの構成要素は、発送、保存、又は使用のために、１の容器（例、箱及び包装紙等）中に一緒に包装されていてもよく、２以上の容器中に包装されていてもよい。
【００５２】
本発明の不連続性三次元体、細胞培養マトリクス又は細胞培養用製品は、栄養素、緩衝剤、ｐＨ指示薬、細胞外マトリクス構成成分、血清、増殖因子、抗生物質、保存剤及びタンパク質から成る群から選択される、好適な添加剤を更に含み得る。
【００５３】
本発明の不連続性三次元体及び細胞培養用製品を用いて、任意の細胞が培養され得る。不連続性三次元体及び製品を用いて、動物細胞（例、哺乳動物細胞）、植物細胞、藻類及び菌類の細胞等の真核細胞、並びに細菌細胞等の原核細胞が増殖し得る。一態様においては、細胞は任意の種類の正常又は非正常の組織由来のヒト一次細胞、任意の種類の組織由来のヒト二次細胞株、ヒト不死化細胞株、一次腫瘍又は転移性腫瘍のいずれか由来のヒト癌細胞であり得る。一態様においては、細胞は、胚性幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、体性複能性幹細胞、体性多能性幹細胞、組織特異的幹細胞、間葉系幹細胞、若しくは前駆細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、又は内皮幹細胞を含む、多能性細胞、複能性細胞、少能性細胞或いは単能性細胞等の、任意の未分化細胞であり得る。本発明の不連続性三次元体又は製品を用いて培養される好適な細胞は、ヒト又は非ヒトＥＳＣである。ヒト又は非ヒトのｉＰＳＣもまた好適である。一態様においては、本発明による生産品中で用いられる細胞は、一般に公開されている、樹立されたｈＥＳ細胞株由来であるか、又は当該生産品が由来するヒト胚の破壊のみを含むわけではない方法により得られた、任意の幹細胞である。一態様においては、由来が異なる、１を超える細胞種が、共培養として培養される。
【００５４】
本発明の不連続性三次元体、製品及び方法は、期間が長い細胞培養を提供する。未分化細胞が培養された場合、これらは増殖し、数回継代できるが、細胞塊の多能性は維持される。このことにより、多能性細胞塊を、例えば、治療法に必要な、より大規模な量へと増加させることが可能になる。
【００５５】
本発明の不連続性三次元体、製品及び方法を用いて培養された細胞は、培養系又は製品中で移送され得、移送前に細胞を凍結することを必要としない。本発明の系及び用途においては、培養細胞は、例えば＋３７℃でその培養後直接に、追加的な工程を伴わずに不連続性三次元体中又は製品中で移送され得、移送された細胞の培養は、移送において用いられた、同一の系及び装置を用いて継続され得る。移送された細胞はマトリクスから収集され得、培養は２Ｄ培養又は３Ｄの培養で継続され得る。
【００５６】
細胞株及び培養細胞の意図した用途に応じて、２Ｄ又は３Ｄで培養が行われ得る。細胞は、不連続性三次元体又は製品の上又はそれらの中に分散又は播種され、ヒドロゲル塊上での、細胞の２Ｄ又は３Ｄの増殖、並びに増殖細胞及び培養細胞の細胞外構造の、ヒドロゲル塊内部への侵入が可能になる。
【００５７】
セルロースナノファイバーの除去は、その中の、例えばセルロース分子及びヘミセルロース等の、樹木由来の他の成分の完全分解に必要な全酵素を含む酵素混合物により、行われ得る。適切な酵素は、例えば、対象のＣＦＮ用に開発された酵素混合物及び市販のセルラーゼ−ヘミセルラーゼ標品である。混合物の組成は、該ＣＦＮの産生用に用いられた原料の化学組成に応じて異なり得る。例えば、ＣＦＮ産生にカバノキのパルプが用いられる場合、混合物は、少なくとも、無傷のエンドセルラーゼ及びエキソセルラーゼ又はそれらの一部、エンドキシラナーゼ及びβ−Ｄ−グリコシダーゼ及びβ−Ｄ−キシロシダーゼを含む。針葉樹由来ＣＦＮの加水分解のためには、混合物に、少なくともエンドマンナナーゼ及びβ−Ｄ−マンノシダーゼを補充する必要がある。精製酵素成分を集積した開発混合物の利点は、それが更なるタンパク質や、他の、副作用、培養生物由来の残骸又は培養液由来の残渣等の（市販の酵素標品にはよくある）不必要な成分を含有していないことである。標品が、培養細胞表面を攻撃し得るプロテアーゼを含んでいる場合は、特に有害である。植物ベース原料の完全加水分解用に指定された、市販の酵素混合物もＣＮＦの加水分解に用いられ得るが、少なくとも、ゲル濾過又は透析等の粗製精工程後がより好ましい。酵素標品（開発したか、又は市販のいずれかの混合物）にかかわらず、構成成分は、例えばｐＨ、温度及びイオン強度に関して、ＣＮＦを至適に分解できるよう、選択される。市販の標品も利用可能であり、該標品は酸性ｐＨ値（ｐＨ３．５〜５）又は塩基性ｐＨ値（ｐＨ６〜８）のいずれかで、且つ室温から最大６０〜８０℃までの温度で作用している。細胞は、極めて頻繁に、３７℃で生育されるが、これは、大抵のセルラーゼ及びヘミセルラーゼにとって至適温度である。
【００５８】
また、培養された細胞株は、必要とする酵素タンパク質を培養系に産生するよう、遺伝学的に改変され得る。
【００５９】
ＣＮＦヒドロゲルの酵素的分解は、開発された酵素標品（それぞれ（タンパク質の割合で）５０％、２０％、１３％及び５％のＣＢＨ  Ｉ、ＣＢＨ  ＩＩ、ＥＧ  Ｉ及びＥＧ  ＩＩセルラーゼ、及びそれぞれ１０％及び２％のエンドキシラナーゼ及びβ−Ｄ−キシロシダーゼ（混合物の全タンパク質含量から算出）を含有する）による加工によって、カバノキのパルプから作製された、０．５％ヒドロゲルを含有するグラベル（ｇｒａｖｅｌ）を加水分解することにより実証された。他の原料由来のＣＮＦが培養に用いられる場合、混合物の組成は、それぞれ、適切な酵素によりカスタマイズされる。Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ  １．５  ＬＦＧ，ＣＣＮ０３６７（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，至適ｐＨ  ５），タンパク質濃度９０ｍｇ／ｍｌ。天然のＣＮＦの分解は、ｐＨ５、５０℃で４日間、透明ＣＮＦの分解はｐＨ７、２１℃で１時間行われた。酵素の投与量は、１グラムのＣＮＦに対し酵素５ｍｇとした。
【００６０】
酵素的加水分解。特定の酵素、セルラーゼは、セルロース中の［β］−（１−４）−結合を加水分解できることが、一般的に知られている。例えば、鎖端から離れた任意の位置のセルロース鎖を標的とするエンド−ｌ，４−ｐ−グルカナーゼ（ＥＧ）；鎖の両端から分子を切り離すことによってセルロースを分解し、セロビオース２量体を産生するエキソグルカナーゼ又はエキソセロビオヒドロラーゼ（ＣＨＢ）；及び産生されたオリゴ糖及びセロビオース単位（ＥＧ及びＣＢＨの攻撃の間に産生される）をグルコースに加水分解する［ベータ］−グルコシダーゼ（ＢＬＧ）。セルラーゼにより、それぞれのセルロースナノファイバーの、グルコースへの酵素的加水分解が促進され得る（Ａｈｏｌａ，Ｓ．，Ｔｕｒｏｎ，Ｘ．，Ｏｓｔｅｒｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｌａｉｎｅ，Ｊ．，Ｒｏｊａｓ，Ｏ．Ｊ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００８，２４，１１５９２−１１５９９）。ＣＦＮの、単糖類への完全分解には、キシラナーゼ及びマンナナーゼ、及びβ−Ｄ−グリコシダーゼ、β−Ｄ−キシロシダーゼ、及び−Ｄ−マンノシダーゼ等の、エンドに作用するヘミセルラーゼも、酵素混合物に含まれている必要がある。例えば、ヒドロゲルの粘度を低下させるために、部分的加水分解のみが目的とされる場合、酵素混合物の組成は、今度はエンドグルカナーゼを過剰に含め、セロビオヒドロラーゼは、より少量含めるか又は含めなくし得る。後者の場合、ヘミセルラーゼは、セルラーゼの加水分解作用を亢進させるので、混合物に含められ得る。様々な理由で、セルロースの酵素的加水分解が、セルロースナノファイバーを含有する細胞培養系において利用され得る。ＣＮＦヒドロゲルの加水分解に際して、媒質粘度は劇的に低下するので、例えば染色に関しては、培養細胞の構造物には容易にアクセスできる。また、加水分解後は、細胞構造物はセルロース含有原料無しで移し替え又は移植することができる。分解産物のグルコースは、通常、細胞に対して無毒であり、細胞培養において栄養素として利用され得る。
【００６１】
セルロースナノファイバーの酵素的加水分解の実行は、種々の環境において、種々のセルラーゼにより促進することができる。図１４においては、ゲルの懸濁力に対する、市販のＣｅｌｌｕｃｌａｓｔ酵素群の効果が実証される。天然の及び透明なＣＮＦヒドロゲルの両方が、ゲル構造の酵素的分解に起因して、懸濁力を弱める。また、培養細胞株は、必要とされる酵素タンパク質を培養系に産生するよう、遺伝学的に操作されてもよい。
【００６２】
酵素的加水分解の場合、ＣＮＦヒドロゲルの破壊にセルラーゼ等が用いられ、該酵素は不活性化されてもよく、細胞培養系から除去されてもよい。当業者は、酵素を不活性化又は除去するための、適切な任意の方法を容易に選択することができる。好適な方法の例としては、阻害剤又は中和抗体による不活性化、及び洗浄、濾過、アフィニティー精製によるセルラーゼの除去、又は選択された用途に好適な、他の任意の方法が挙げられる。酵素処理後に、細胞をＣＮＦベースのマトリクス中で培養する場合、ＣＮＦゲル構造を破壊し得る、活性のある酵素の存在が、酵素の不活性化又は除去により、阻止される。培養細胞の特定の派生的用途においては、酵素の除去も必要であり得る。
【００６３】
細胞分化は、当該技術分野で公知の、任意のマーカー遺伝子の発現を追跡してモニターされ得る。例えば、特定の用途及び細胞種に応じて、例えば、初期又は後記のマーカーが用いられ得る。表１に、本発明による方法及び製品を用いる場合にモニターされ得るマーカー例を列挙する。
【００６４】
【表１−１】
0006513023.tif 000002
【００６５】
【表１−２】
0006513023.tif 000003
【００６６】
細胞は、公知の任意の検出手段又は当該技術分野で公知の色素を用いて、培養液中で検出され得る。
【００６７】
態様１においては、本発明は、
ａ．水性媒質；並びに
ｂ．セルロースナノフィブリル及び／又はその誘導体を含む、水性媒質中に懸濁されたヒドロゲル塊
を含む、細胞培養用の不連続性三次元体を提供する。
【００６８】
態様２は、不連続性三次元体の全体積に対するヒドロゲル塊の全体積の比率が１０％〜９９％（ｖ／ｖ）、好ましくは５０％〜９５％（ｖ／ｖ）である、態様１に記載の不連続性三次元体を提供する。
【００６９】
態様３は、ヒドロゲル塊が相互接続されている、態様１又は２に記載の不連続性三次元体を提供する。
【００７０】
態様４は、ＣＮＦ濃度等が同一の条件において、不連続性三次元体の降伏応力が、対応する連続性のヒドロゲルの降伏応力よりも小さい、態様１〜３のいずれか１に記載の不連続性三次元体を提供する。
【００７１】
態様５は、同一条件において、不連続性三次元体の降伏応力が、対応する連続性のヒドロゲルの降伏応力の１〜９５％である、態様１〜４のいずれか１に記載の不連続性三次元体を提供する。
【００７２】
態様６は、セルロースナノフィブリルが植物由来である、態様１〜５のいずれか１に記載の不連続性三次元体を提供する。
【００７３】
態様７は、セルロースナノフィブリルの直径が１μｍ未満、好ましくは２００ｎｍ未満、より好ましくは１００ｎｍ未満である、態様１〜６のいずれか１に記載の不連続性三次元体を提供する。
【００７４】
態様８は、セルロースナノフィブリルが、イオン交換された天然のセルロースナノフィブリル誘導体又はナノフィブリル束、化学的に修飾されたセルロースナノフィブリル誘導体又はナノフィブリル束、或いは物理的に修飾されたセルロースナノフィブリル誘導体又はナノフィブリル束を含む、態様１〜７のいずれか１に記載の不連続性三次元体を提供する。
【００７５】
態様９は、水性媒質が、少なくとも１の栄養源及び未分化、分化中又は分化後の持続的細胞増殖に必要な、少なくとも１の構成成分を含む細胞培養培地である、態様１〜８のいずれか１に記載の不連続性三次元体を提供する。
【００７６】
態様１０は、細胞培養用の不連続性三次元体の製造方法であって：
ａ．セルロースナノフィブリル及び／又はその誘導体を
ｉ．均質性のヒドロゲル；
ｉｉ．均質性のヒドロゲルと水性媒質との組合せ；及び／又は
ｉｉｉ．水性媒質中で水和された、脱水ゲル塊
の形態で提供すること；及び
ｂ．ヒドロゲルの均質性の構造の機械的な破壊に好適な条件において混合し、ヒドロゲル塊の懸濁液を不連続性三次元体として得ること
を含む、方法を提供する。
【００７７】
態様１１は、工程ａが、セルロースナノフィブリルが均質性のヒドロゲルと水性媒質との組合せの形態で提供されることを含み、且つ、必要に応じて過剰な水性媒質が除去される、態様１０に記載の方法を提供する。
【００７８】
態様１２は、細胞培養マトリクスの製造方法であって、態様１０又は１１に記載の方法において、細胞が加えられ、且つ水性媒質が細胞培養培地である、方法を提供する。
【００７９】
態様１３は、態様１０〜１２のいずれか１に記載の方法を用いて製造された不連続性三次元体又は細胞培養マトリクスを提供する。
【００８０】
態様１４は、態様１〜９又は１３のいずれか１に記載の細胞及び／又は組織並びに不連続性三次元体を含む細胞培養マトリクスであって、細胞及び／又は組織が、三次元又は二次元の配置で、少なくとも部分的に該体に埋め込まれて存在する、細胞培養マトリクスを提供する。
【００８１】
態様１５は、細胞が、分化した哺乳動物細胞又は未分化の哺乳動物細胞である、態様１４に記載の細胞培養マトリクスを提供する。
【００８２】
態様１６は、細胞が未分化の幹細胞である、態様１４に記載の細胞培養マトリクスを提供する。
【００８３】
態様１７は、細胞が、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞である、態様１４〜１６のいずれか１に記載の細胞培養マトリクスを提供する。
【００８４】
態様１８は、細胞が、ヒト細胞又は非ヒト細胞である、態様１４〜１７のいずれか１に記載の細胞培養マトリクスを提供する。
【００８５】
態様１９は、細胞が、非ヒト胚性幹細胞又は非ヒト人工多能性幹細胞である、態様１８に記載の細胞培養マトリクスを提供する。
【００８６】
態様２０は、
ａ．表面を有する基材；
ｂ．請求項１〜９又は１３のいずれか１項に記載の不連続性三次元体、或いは脱水形態の請求項１〜９又は１３のいずれか１項に記載の不連続性三次元体；
ｃ．及び必要に応じて、細胞培養培地、細胞外マトリクス構成成分、血清、増殖因子、タンパク質、抗体、保存剤から成る群から選択される、少なくとも１の構成成分
を含む、細胞培養用製品を提供する。
【００８７】
態様２１は、態様１〜９又は１３のいずれか１に記載の不連続性三次元体、或いは態様２０に記載の製品の、細胞培養又は組織培養への使用を提供する。
【００８８】
態様２２は、細胞の移送方法であって、細胞が、態様１〜９又は１３のいずれか１に記載の不連続性三次元体中、或いは態様２０に記載の製品中で移送される、方法を提供する。
【００８９】
態様２３は、細胞又は組織の三次元培養方法又は二次元培養方法であって、態様１〜９又は１３のいずれか１に記載の不連続性三次元体、或いは態様２０に記載の製品を提供すること、不連続性三次元体に少なくとも１の細胞を播種すること；及び培養して細胞塊を得ることを含む、方法を提供する。
【００９０】
態様２４は、由来が異なる少なくとも２細胞腫が共培養として培養される、態様２３に記載の方法を提供する。
【００９１】
態様２５は、細胞がヒドロゲル塊と複合体を形成する、態様２３〜２４のいずれか１に記載の方法を提供する。
【００９２】
態様２６は、培養の間に、培養細胞を少なくとも１回継代させることにより、少なくとも１の継代培養が行われる、態様２３〜２５のいずれか１に記載の方法を提供する。
【００９３】
態様２７は、継代が、不連続性三次元体からの細胞塊の分離を含み、不連続性三次元体が酵素で処理される、態様２５又は２６に記載の方法を提供する。
【００９４】
態様２８は、細胞塊を、少なくとも部分的に切り離すのに十分な時間、不連続性三次元体がセルラーゼで酵素的に処理される、態様２７に記載の方法を提供する。
【００９５】
態様２９は、セルラーゼが、酵素処理後に不活化されるか、又は細胞塊から取り除かれる、態様２８に記載の方法を提供する。
【００９６】
態様３０は、細胞が幹細胞等の未分化細胞を含み、且つ、細胞が継代の間に未分化に維持される、態様２２〜２９のいずれか１に記載の方法を提供する。
【００９７】
態様３１は、細胞塊又は細胞が細胞培養液から収集され、細胞増殖を維持して三次元培養を提供するのに好適な培地中で、態様１〜９又は１３のいずれか１に記載の不連続性三次元体と混合され；且つ培養液が、細胞増殖の促進に十分な条件及び時間でインキュベーションされ、それによってスフェロイドが形成される、態様２２〜３０のいずれか１に記載の方法を提供する。
【００９８】
態様３２は、細胞を化学的に分化させることを含む、態様２３〜３１のいずれか１に記載の方法を提供する。
【００９９】
態様３３は、分化が胚様体の形成を含む、態様３２に記載の方法を提供する。
【０１００】
態様３４は、細胞の分化が、多能性を示す遺伝子、初期分化マーカー、及び後期分化マーカーの群から選択される少なくとも１のマーカーの発現等のバイオマーカーを観察することによってモニターされる、態様２２〜２３に記載の方法を提供する。
【０１０１】
態様３５は、第一の容器及び第二の容器を含むキットであって、第一の容器が、態様１〜９若しくは１３のいずれか１に記載の不連続性三次元体、或いは乾燥粉末、濃縮顆粒、又は濃縮ヒドロゲル塊等の、脱水形態の態様１〜９若しくは１３のいずれか１に記載の不連続性三次元体を含み、且つ第二の容器がセルラーゼを含む、キットを提供する。
【実施例】
【０１０２】
実施例
以下の実施例は、専ら本発明の多様な態様を説明する目的のために開示するのであり、これらは決して本発明を限定することを意味しない。
【０１０３】
試薬
ディスパーゼ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）及びｍＴｅＳＲ１培地はＳｔｅｍｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地、Ｖｅｒｓｅｎｅ  １：５０００、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）試薬、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４及びＳＹＴＯＸ  ＧｒｅｅｎはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）基底膜マトリクスグロースファクターリデュースト（ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｄｕｃｅｄ）はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）から、組換えヒトビトロネクチンはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから、組換えヒトＬＭ−５１１及びＬＭ−５２１はＢｉｏＬａｍｉｎａ（Ｓｕｎｄｂｙｂｅｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ）から購入した。セルロースナノフィブリル（ＣＮＦ）ヒドロゲルはＵＰＭ−Ｋｙｍｍｅｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）の好意により、セルラーゼはＶＴＴ（Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）の好意によりいただいた。カルコフロールホワイト染色液、モノクローナル抗−β−チューブリンＩＩＩ（Ｔ５０７６）、モノクローナル抗−α−フェトプロテイン（Ａ８４５２）はＳｉｇｍａ  ＦＬＵＫＡから、Ｏｃｔ−３／４抗体（ｓｃ−９０８１）ＨＮＦ３Ｂ（ＦＯＸＡ２，ｓｃ−６５５４とも称する）、対照のウサギＩｇＧ、マウスＩｇＧ及びヤギＩｇＧはＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＵＳＡ）から、モノクローナルのマウス抗−ヒト筋肉アクチン（ＩＳ７００）はＤａｋｏから、抗−ＳＳＥＡ−４はＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ（ＩＡ，ＵＳＡ）から、ヤギ及びロバの通常血清はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）から、ＶＥＣＴＡＳＨＥＩＬＤ封入剤は（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）から、Ｈｉｇｈ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ  ｋｉｔ及びｆａｓｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔはＱｉａｇｅｎから購入した。
【０１０４】
ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣのコロニー密度は、０．５％  ｗ／ｖのＣＮＦヒドロゲル中では、２Ｄマトリゲルプラットフォーム中よりも５倍高かった。ＣＮＦヒドロゲル貯蔵液（１．８％  ｗ／ｖ）をｍＴｅＳＲ１培地中で希釈し、幹細胞コロニーと混合した。細胞−ヒドロゲル混合物の頂部に同量のｍＴｅＳＲ１培地を加えた。培地は毎日新しくした。
【０１０５】
高精製度のカバノキ漂白パルプの高圧均質化（５サイクルが続く）により、天然のセルロースナノフィブリルを製造し、続いてオートクレーブ滅菌した。流動化後、セルロースナノフィブリルは低濃度ヒドロゲル（２重量％）状となった。イオン交換された天然のセルロースナノフィブリルは、同様にして得たが、フィブリル化の前に、多価陽イオン除去のため更に酸塩基処理に付した（前節に記載の方法）。イオン交換されたセルロースナノフィブリルは、高圧均質化後（１５サイクルが続く）、他の試料と比べて濁度が低い、強固なヒドロゲルを形成する。必要な場合、オートクレーブによりセルロースナノフィブリルを滅菌した。同様の、化学修飾されたセルロースパルプ（ＴＥＭＰＯ酸化セルロースパルプ）の均質化過程により、透明な陰イオン性フィブリルセルロースを、ヒドロゲル（２重量％）として得た。
【０１０６】
ヒドロゲル構造
セルロースナノファイバーは、グルコシド環中の水酸基及びヘミセルロース部分の一部の電荷のため、通常は非常に親水性の物質である。従って、フィブリルは、重なり合う濃度、即ち、典型的には０．０５〜０．２％  ｗ／ｖよりも高濃度で水中に分散した場合、ヒドロゲル構造を形成する。ヒドロゲル構造は、試料のせん断履歴に非常に影響を受ける。つまり、希釈後の混合方法によって連続性又は不連続性のいずれの構造も実現できる。
【０１０７】
不連続性三次元体は、セルロースナノフィブリル及び／又はその誘導体を提供する工程；該セルロースナノフィブリル及び／又はその誘導体と第一の水性媒質とを混合し、ヒドロゲルを得る工程、及び該ヒドロゲルと第二の媒質とを混合し、第二の水性媒質中にヒドロゲル塊の懸濁液を得る工程を含む方法によって得ることができる。第一及び第二の水性媒質は同一タイプの媒質でも、異なったタイプでもよく、第一の媒質が、例えば水で、第二の媒質が細胞培養培地であってもよい。不連続性三次元体は、濃縮セルロースナノフィブリルヒドロゲル又は乾燥セルロースナノフィブリルからでも、濃縮ヒドロゲル又は乾燥セルロースナノフィブリルを粒子化して粒子を得、粒子を水性媒質中で水和し、水和した粒子を、必要に応じて水性媒質を加えて混合し、ヒドロゲル塊の懸濁液を得ることによっても作製できる。ヒドロゲルの不連続性の構造は、例えば、単純な顕微鏡解析又は降伏応力測定及び対応するＣＮＦ濃度を有する均質性のヒドロゲルとの比較により、確認できる。
【０１０８】
均質性且つ連続性のゲル構造では、通常、低濃度であっても降伏応力が高い。不連続性のゲル構造では、活性化が十分な事例と比較した場合、同一濃度であっても、通常は降伏応力値がより低い。図１７及び１８中のフロープロファイルにおいて、０．５％  ｗ／ｖの２種類のセルロースナノファイバーヒドロゲルに関して、この相違を示す。試料は、均質性の２％ゲル試料から希釈していき、その後混合した。図１７は、イオン交換された天然のセルロースナノファイバーについてのフロープロファイルを示す。２％から０．５％に希釈後、高速ブレンダーにより、ゲル構造が十分に均質化され、連続性のゲル構造となっている（曲線Ａ）。図１７においては、不連続性のゲル構造のフロープロファイルも示す（曲線Ｂ）。明らかに、不連続性のゲルの試料、即ち、事例（Ｂ）についての降伏応力がより小さい。不連続性のゲル構造は、試料を２％から０．５％へと希釈後、例えば磁石による撹拌又はピペッティングといった、弱い混合法を用いることによってのみ作製された。化学的に修飾されたセルロースナノファイバーヒドロゲルについても、同様の観察がなされ得る。図１８には、水中に０．５％  ｗ／ｖで分散させた陰イオン修飾ナノファイバーについての、対応するフロープロファイルが、連続性及（Ａ）び不連続性（Ｂ）のヒドロゲルについて示されている。
【０１０９】
イオン交換された天然のフィブリルセルロースは、同様にして得たが、フィブリル化の前に、多価陽イオン除去のため更に酸塩基処理に付した（前節に記載の方法）。イオン交換されたフィブリルセルロースは、高圧均質化後（１５サイクルが続く）、他の試料と比べて濁度が低い強固なヒドロゲルを形成する。必要な場合、オートクレーブによりセルロースナノフィブリルを滅菌した。酸化セルロースパルプの均質化過程と同様の過程により、透明な陰イオン修飾セルロースナノフィブリルを、ヒドロゲル（０．９重量％）として得た。
【０１１０】
ヒドロゲル試料は、均質性の２％ゲル試料から希釈し、その後に活性化又は混合した。図１７は、イオン交換された天然のセルロースナノフィブリルについてのフロープロファイルを示す。２％から０．５％に希釈後、高速ブレンダーにより、ゲル構造が十分に均質化され、連続性のゲル構造となっている（曲線Ａ）。図１７においては、不連続性三次元体の不連続性のゲル構造のフロープロファイルも示す（曲線Ｂ）。明らかに、不連続性のゲルの試料、即ち、事例（Ｂ）についての降伏応力がより小さい。不連続性のゲル構造は、試料を２％から０．５％へと希釈後、例えば磁石による撹拌又はピペッティングといった、弱い活性化法を用いることによってのみ作製した。化学的に修飾されたセルロースナノフィブリルヒドロゲルについても、同様の観察がなされ得る。図１８は、水中に０．５％  ｗ／ｖで分散させた陰イオン修飾ナノフィブリルについての、対応するフロープロファイルを、連続性及（Ａ）び不連続性（Ｂ）のヒドロゲルについて示す。
【０１１１】
ゲル構造の相違は光学顕微鏡像からも可視化し得る。図１９には、水中に分散した、イオン交換された天然のセルロースナノファイバーの、連続性（上）及び不連続性（下）の構造に関する、ゲル構造の相違が示されている。不連続性のゲル構造においては、ナノファイバー相間の間隙がよく見える。０．５％  ｗ／ｖの分散では、水に富む腔の直径は通常１０〜２００ミクロメーターである。不連続性の構造は、図２３の細胞培養顕微鏡像からも確認できる。セルロースナノファイバーが、細胞の周囲に凝集領域を形成している。
【０１１２】
間隙の相対分布、及び実際の大きさには、出発濃度、総濃度、及び混合方法が影響する。例えば、総濃度（ｔｏｔａｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ）がゲル濃度（通常０．０５〜０．２％  ｗ／ｖ未満）よりも低い場合、セルロースナノフィブリルは、水を含有する腔をある程度含み、互いに緩く連絡するゲル団塊を形成する。総濃度が、均質性のゲルのゲル濃度よりも高ければ、過剰な水又は媒質が系にゆっくり分散する場合は、間隙により、図１９に記載の多孔性の構造を形成する。間隙率は、ゲルドメインの強度を改変することによって、即ち、フィブリルが存在する領域中の濃度を増大させ、過剰量の水／媒質（可変量）を、構造体に混合することによって調整し得る。
【０１１３】
不連続性のゲル構造は、濃縮（例、１０〜３０％  ｗ／ｖ）されたか、又は乾燥すらした、セルロースナノファイバー試料からも形成し得る。乾燥原料又は濃縮原料を用いる場合、まず試料を粒状化して適切な大きさ（例、０．１〜２ｍｍ）にし、水又は細胞培養培地中で水和させ、次いで、適切な方法を用いて連続性又は不連続性のいずれかの形態へと活性化する。スプレー乾燥した粒子（大きさは２〜２０ミクロメートル）も、出発原料として用い得る。これらの種類の不連続性のゲルにおける間隙率の制御には、粒子の大きさ及び総濃度、即ち膨潤したゲルドメイン間又はゲル塊間の距離が影響する（図２０及び２４を参照）。
【０１１４】
上述の構造についての製造過程の好適な例を、図２４に模式的に示した。事例１は図１９において可視化した状況にも相当する。つまり、不連続性のゲル構造は、均質性のヒドロゲルを、ヒドロゲル中に、水に富む空洞を生じさせる方法により、水／媒質で希釈することによって作製する。希釈及び混合の段階の間か、又は後に、細胞を取り込み得る。事例２では、水／媒質の相対的な体積が事例１よりも大きい状況を説明する。水の割合を高くすると、ゲル粒子の接続が緩くなる。希釈及び混合の段階の間か、又は後のいずれかに、細胞を取り込み得る。例えば、必要な場合は、軽度の遠心分離サイクル又はデカンテーション又は濾過により、過剰の水／媒質を除去し得る（事例２ｂ）。この段階でも、細胞を投入し得る。事例３では、濃縮ＣＮＦ（ＮＦＣ）ゲル粒子又は乾燥すらした粒子から、所望の構造を作製する過程を説明する。乾燥又は濃縮した粒子は、通常、まず水／媒質により水和させ（３ａ）、続いて、必要に応じて過剰な水を除去する（３ｂ）。細胞は、水和段階の間か、又は後、或いは必要に応じた水の除去段階の後に、投入し得る。例えば、遠心分離又はデカンテーション又は濾過により、過剰の水を除去し得る。事例２及び３は、図２０中の顕微鏡像中で見ることができる。
【０１１５】
実施例１．０．５％ヒドロゲル中のｈＰＳＣ継代培養及び３Ｄ培養の２Ｄプラットフォームへの回収
３ＤのｈＰＳＣを継代培養し、スフェロイドを３Ｄヒドロゲルから２Ｄプラットフォームへと回収するため、セルラーゼを用いた。セルラーゼ処理の前に、ｍＴｅＳＲ１培地を除去し、新鮮なｍＴｅＳＲ１培地に希釈した酵素を加え、細胞−ヒドロゲルの混合物と共に３７℃で２４時間インキュベーションした。
【０１１６】
酵素処理によってＣＮＦを取り除いてすぐ、幹細胞スフェロイドを１００μｍセルストレーナーにより回収してセルラーゼを除去し、次いでＶｅｒｓｅｎｅ  １：５０００で７分間処理し、その大きさを減少させた。継代培養のために、小さめの細胞コロニーを、上記の通り０．５％  ｗ／ｖ  ＣＮＦヒドロゲルと混合した（図５）。細胞を２Ｄプラットフォームに移し替えるため、小さめの細胞コロニーを、異なる４種のコーティング（つまり、マトリゲル、ＶＮ、ＬＭ−５１１及びＬＭ−５２）上に播種した。マトリゲルのコーティングは通常通り調製した。ＬＭ−５１１及びＬＭ−５２１のコーティングは、タンパク質溶液（ＬＭ−５１１  ２０μｇ／ｍｌ又はＬＭ−５２１  ２０μｇ／ｍｌ）を３７℃で２時間、次いで４℃で一晩インキュベーションすることにより調製した。ＶＮのコーティングは、５μｇ／ｍｌ  ＶＮを４℃で一晩インキュベーションすることにより調製した（図２）。
【０１１７】
実施例２．ミトコンドリア代謝活性
毒性のない酵素濃度を選択するため、酵素処理の前後で、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）試薬を用いて幹細胞のミトコンドリア代謝活性を測定した（図４）。０．５％  ｗ／ｖ  ＣＮＦヒドロゲルにおける細胞培養の間も、様々な濃度のセルラーゼ酵素による処理の前後で、２．５％  ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）試薬を用いた。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）試薬をｍＴｅＳＲ１培地に加え、細胞と共に３７℃で２４時間インキュベーションした。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）代謝産物の蛍光を、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ  Ｆｌａｓｈ  ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  ｒｅａｄｅｒ  ２．４．２（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により励起波長５７０ｎｍ及び蛍光波長５８５ｎｍで測定した。
【０１１８】
実施例３．共焦点顕微鏡を用いたＣＮＦ染色及び生細胞イメージング
ＣＮＦの酵素的除去を評価するため、カルコフロールホワイト染色液を培養液に加え、セルロースを染色した。生細胞のＧＦＰ蛍光及び染色されたＣＮＦを、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５ＩＩ  ＨＣＳ  Ａ共焦点顕微鏡下、３７°Ｃ、５％ＣＯ２で、４８８ｎｍのアルゴンレーザー及び４０５ｎｍのＵＶレーザーを用いてそれぞれ観察した（図３）。
【０１１９】
実施例４．免疫染色
ＣＮＦヒドロゲル中（図２１）又は異なるタンパク質でコーティングしたウェル上（図７〜１４、２２）のいずれかで培養した幹細胞を、３．７％パラホルムアルデヒドで１０〜３０分間、室温で固定し、その後０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００又は０．５％サポニンで１０〜３０分間透過処理した。１０％正常ヤギ血清又は正常ロバ血清によるブロッキング後、細胞を抗−Ｏｃｔ−３／４、抗−ＳＳＥＡ−４、抗−β−チューブリンアイソタイプＩＩＩ、抗−筋肉アクチン、抗−ＦＯＸＡ２と共に４℃で一晩インキュベーションした。並行して、対照のウサギＩｇＧ、マウスＩｇＧ又はヤギＩｇＧと共にインキュベーションした陰性対照試料を調製した。抗−ウサギ  ヤギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、抗−マウス  ヤギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４又は抗−ヤギ  ロバＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４のいずれかの二次抗体を、１：４００希釈、室温で、１時間（２Ｄ）又は６時間（３Ｄ）使用した。ＰＢＳ−０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を用いる洗浄は、すべて３回（各５分）反復した。免疫染色後、ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎで核を染色した。次いで、ＶＥＣＴＡＳＨＥＩＬＤ封入剤により細胞を封入した。ＧＦＰ及びＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ及びについては４８８ｎｍのアルゴンレーザー、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４については５６１ｎｍのＤＰＳＳレーザーを用いて、染色像をＬｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５ＩＩ  ＨＣＳ  Ａ共焦点顕微鏡下で観察した。Ｉｍａｒｉｓ  ７．４  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により共焦点像を解析した。
【０１２０】
実施例５．ＲＮＡ抽出及び定量的リアルタイムＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、メーカーの使用説明書に従って全ＲＮＡを抽出した。ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ，ＵＳＡ）を用いてＲＮＡ試料を定量した。同一の逆転写活性を確保するため、すべてのＲＮＡ試料を同一実験でｃＤＮＡに変換した。ｃＤＮＡ合成はＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いることにより行った。ｃＤＮＡ試料はすべて、Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）でデュプリケートで解析した。各遺伝子について、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧに対して標準曲線を作成した。ＰＣＲ産物のクオリティーは、ＰＣＲ後の解離曲線解析を用いてモニターした（図１６）。プライマーはすべて、Ｏｌｉｇｏｍｅｒ  Ｏｙ，Ｆｉｎｌａｎｄにより合成した。内生対照としてハウスキーピング遺伝子ＲＰＬＰ０を用いた。ＰＣＲのサイクル条件は：９５℃３秒及び６０℃でのアニーリング／伸長３０秒を４０サイクルとした。プライマー配列を表２に示した。
【０１２１】
【表２】
0006513023.tif 000004
【０１２２】
実施例６．核型解析
核型解析のために、上記手順を経て、細胞コロニーをヒドロゲルからマトリゲルでコーティングしたディッシュに回収した。Ｙｈｔｙｎｅｅｔ  Ｍｅｄｉｘ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｏｔ，Ｆｉｎｌａｎｄにおいて染色体Ｇバンド解析を行った。試験したすべての細胞（ＷＡ０７及びｉＰＳ−ＩＭＲ９１−４）において、正常な核型を観察した（図１）。
【０１２３】
実施例７．胚様体形成
胚様体を形成するために、２つの方法を用いた。直接法においては、ＣＮＦヒドロゲルから回収した細胞スフェロイドを直接、１５％  ＨｙＣｌｏｎｅ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ培地中で４週間培養した。間接法においては、まずＣＮＦヒドロゲルから細胞を回収し、次いでマトリゲルでコーティングしたディッシュ中で培養した。次いで、二次元の細胞コロニーを、マトリゲルでコーティングしたディッシュ上、１５％  ＨｙＣｌｏｎｅ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ培地中で胚様体を形成するために、４週間用いた（図６及び１５）。
【０１２４】
実施例８．奇形腫形成
セルラーゼ（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）処理後に３Ｄ培養由来の細胞スフェロイドを収集し、チューブに回収し、遠心によりペレット化した。奇形腫試験はＢｉｏｍｅｄｉｃｕｍ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｃｅｎｔｒｅ，Ｆｉｎｌａｎｄで行った。
【０１２５】
参考文献
１．  Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２，１１４５−１１４７（１９９８）．
２．  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｂｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ  １３１，８６１−８７２（２００７）．
３．  Ｙｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８，１９１７−１９２０（２００７）．
４．  Ｘｕ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９，９７１−９７４（２００１）．
５．  Ｌｕｄｗｉｇ，Ｔ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４，１８５−１８７（２００６）．
６．  Ｂｒａａｍ，Ｓ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｉｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｔｈａｔ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ｖｉａ  ａｌｐｈａｖｂｅｔａ５  ｉｎｔｅｇｒｉｎ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２６，２２５７−２２６５（２００８）．
７．  Ｒｏｄｉｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｌａｍｉｎｉｎ−５１１．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８，６１１−６１５（２０１０）．
８．  Ｍｅｌｋｏｕｍｉａｎ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ａｃｒｙｌａｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅｓ  ｆｏｒ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８，６０６−６１０（２０１０）．
９．  Ｖｉｌｌａ−Ｄｉａｚ，Ｌ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｏａｔｉｎｇｓ  ｆｏｒ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８，５８１−５８３（２０１０）．
１０．  Ｗａｌｔｈｅｒ，Ａ．，Ｔｉｍｏｎｅｎ，Ｊ．Ｖ．，Ｄｉｅｚ，Ｉ．，Ｌａｕｋｋａｎｅｎ，Ａ．＆  Ｉｋｋａｌａ，Ｏ．Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｂｉｏｆｉｂｅｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｗｅｔ−ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  ｎａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｎａｎｏｆｉｂｒｉｌｓ．Ａｄｖ  Ｍａｔｅｒ  ２３，２９２４−２９２８（２０１１）．
１１．  Ｐａｈｉｍａｎｏｌｉｓ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｕｒｆａｃｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｎｏｆｉｂｒｉｌｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ｃｌｉｃｋ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｍｅｄｉａ．Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  １８，１２０１−１２１２（２０１１）．
１２．  Ｆｉｌｐｐｏｎｅｎ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｍｅｄｉｕｍ  ｂｙ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  “ｃｌｉｃｋ”  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １３，７３６−７４２（２０１２）．
１３．  Ｙｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｅｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４，７９７−８０１（２００９）．
【図１】
0006513023.tif 000005
【図２】
0006513023.tif 000006
【図３】
0006513023.tif 000007
【図４】
0006513023.tif 000008
【図５】
0006513023.tif 000009
【図６】
0006513023.tif 000010
【図７】
0006513023.tif 000011
【図８】
0006513023.tif 000012
【図９】
0006513023.tif 000013
【図１０】
0006513023.tif 000014
【図１１】
0006513023.tif 000015
【図１２】
0006513023.tif 000016
【図１３】
0006513023.tif 000017
【図１４】
0006513023.tif 000018
【図１５】
0006513023.tif 000019
【図１６】
0006513023.tif 000020
【図１７】
0006513023.tif 000021
【図１８】
0006513023.tif 000022
【図１９】
0006513023.tif 000023
【図２０】
0006513023.tif 000024
【図２１】
0006513023.tif 000025
【図２２】
0006513023.tif 000026
【図２３】
0006513023.tif 000027
【図２４】
0006513023.tif 000028
【図２５】
0006513023.tif 000029
【配列表】
0006513023000001.app