(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
iRhom2ポリペプチドのタンパク質分解活性を調節する化合物を同定する方法であって、
（a）iRhom2ポリペプチド及びEGFRリガンドを発現する細胞をインビトロで試験化合物に接触させることと
（b）対照と比較した、可溶性EGFRリガンドのレベルを決定することと、
を含み、
前記対照と比較した可溶性EGFRリガンドの増加は、前記化合物が、前記iRhom2ポリペプチドのタンパク質分解活性を増加させることを示し、かつ、前記対照と比較した可溶性EGFRリガンドの減少は、前記化合物が、前記iRhom2ポリペプチドのタンパク質分解活性を減少させることを示す方法。
【請求項２】
（a）前記iRhom2ポリペプチドのタンパク質分解活性の減少は、前記化合物が、対象者における腫瘍増殖の低減、腫瘍進行の低減、癌の治療、及び発毛の促進のうち1つ以上が可能であることを示し、かつ、（b）前記iRhom2ポリペプチドのタンパク質分解活性の増加は、前記化合物が対象者における創傷治癒を加速することが可能であることを示す、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記EGFRリガンドは、AREG、HB-EGF、TGFα、及びEPGNからなる群から選択される、請求項1、又は2記載の方法。
【請求項４】
前記iRhom2ポリペプチドは、ヒトiRhom2ポリペプチド又はマウスiRhom2ポリペプチドである、請求項1乃至3の何れかに記載の方法。
【請求項５】
前記試験化合物は、小分子、ペプチド、ポリペプチドデコイ、miRNA分子、siRNA分子、shRNA分子、dsRNA分子、アンチセンス分子、Rhbdf2に特異的なリボザイム、又はmiRNA、siRNA、shRNA、dsRNAをコードするポリヌクレオチド、その任意の2つ以上の組み合わせ、及び、その任意の1つ以上の生物学的等価物からなる群から選択される、請求項1乃至4の何れかに記載の方法。
【請求項６】
広域メタロプロテアーゼ阻害剤の存在下で実施される、請求項1に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[関連出願の相互参照]
本願は、出典を明記することによりその開示内容全体を共に本願明細書の一部とする2014年5月9日出願及び2014年5月12日出願の米国仮特許出願第61/991,423号及び第61/992,152号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
[助成金について]
本発明は、米国国立衛生研究所が授与したGrant No.CA034196、HLO77642、及びDK057199の下、政府の支援を受けて成されたものである。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本明細書では、iRhomポリペプチドの活性を変化させる化合物を同定する方法及びその使用を開示する。特定の態様によれば、本明細書では、iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性の増加、刺激、低減、阻害、又は消失等、iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を調節する化合物を同定する方法を、その使用と共に開示する。
【背景技術】
【０００４】
ロンボイドプロテアーゼは、ほぼ全ての種に存在する酵素のファミリーである。ロンボイドは、膜内セリンプロテアーゼであり、ロンボイドプロテアーゼによるタンパク質切断は、細胞制御にとって重要となる。膜内プロテアーゼの活性部位は、細胞膜の脂質二重層に埋め込まれており、膜内プロテアーゼは、その膜貫通ドメイン内の他の膜貫通タンパク質を切断する。
【０００５】
不活性ロンボイド(iRhom/iRhoms)は、高度に保存された膜内タンパク質である。本発明の発見以前、iRhomは、推定活性部位においてセリン残基が欠如していることから、タンパク分解性に不活性であると考えられていた。
【発明の概要】
【０００６】
一態様において、本発明は、iRhomsは、短寿命タンパク質であるものの、優性突然変異により、そのタンパク質安定性が増加し、特異的EGFファミリーリガンドであるアンフィレグリンの分泌が、メタロプロテアーゼ活性に依存せず刺激するという発見に基づく。他の態様において、本発明は、哺乳類iRhomが、創傷治癒の加速を促進すると共に腫瘍形成を引き起こすEGFRシグナル伝達事象の制御において機能するという発見に基づく。更に他の態様において、本発明は、少なくとも部分的には、iRhomがメタロプロテアーゼと並行してEGFRシグナル伝達を制御する能力を有し、創傷治癒不良及び癌における治療標的の役割を果たし得るという発見に基づく。
【０００７】
一態様において、本発明は、基質に対するiRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を活性化する化合物を同定する方法であって、a)iRhomポリペプチドを発現する細胞を試験化合物に接触させることと、b)適切な対照と比較した前記iRhomポリペプチドの安定性の増加を決定することと、を含み、前記iRhomポリペプチドの安定性の増加は、前記化合物が、基質に対する前記iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を活性化したことを示す、方法を提供する。
【０００８】
他の態様において、本発明は、対象者における創傷治癒又は組織修復を加速することが可能な化合物を同定する方法であって、a)iRhomポリペプチド及びEGFRリガンドを発現する細胞を試験化合物に接触させることと、b)適切な対照と比較した前記iRhomポリペプチドの安定性の増加を決定することと、c)適切な対照と比較した前記細胞によるEGFRリガンドの分泌の増加を決定することと、を含み、前記iRhomポリペプチドの安定性の増加及び前記細胞によるEGFRリガンドの分泌の増加は、前記化合物が創傷治癒を加速可能であることを示す、方法を提供する。
【０００９】
他の態様において、本発明は、iRhomポリペプチドの細胞質ドメインを阻害する化合物を同定する方法であって、a)iRhomポリペプチドを発現する細胞を試験化合物に接触させることと、b)適切な対照と比較した前記iRhomポリペプチドの安定性の増加を決定することと、を含み、前記iRhomポリペプチドの安定性の増加は、前記化合物が前記iRhomポリペプチドの細胞質ドメインを阻害したことを示す、方法を提供する。
【００１０】
一実施形態において、方法は、更に、前記iRhomポリペプチドの安定性の増加は、前記化合物に晒した後で前記iRhomポリペプチドの半減期を分析することにより決定されることを提供する。
【００１１】
一部の実施形態において、前記基質は、EGFRリガンド又はEGF様基質である。
【００１２】
他の実施形態において、前記iRhomポリペプチドの安定性の増加は、EGFRリガンドの分泌の増加を検出することにより決定される。他の実施形態において、iRhomポリペプチドの安定性の増加は、可溶性EGFRリガンドのレベルの増加を検出することにより決定される。一部の実施形態において、前記EGFRリガンドは、AREG、HB-EGF、TGFα、及びEPGNからなる群から選択される。
【００１３】
他の実施形態において、iRhomポリペプチドの安定性の増加は、EGFRシグナル伝達活性の増加を検出することにより決定される。
【００１４】
更に他の実施形態において、本発明の化合物は、前記iRhomポリペプチドとプロテアソームとの間の相互作用を阻害する。
【００１５】
更に他の実施形態において、前記化合物は、iRhomポリペプチドの細胞質ドメインを不活性化する。一部の実施形態において、前記細胞質ドメインの不活性化は、一過性である。
【００１６】
一実施形態において、本発明の化合物は、iRhomポリペプチドの細胞質ドメインを切断及び/又は除去し、前記ポリペプチドがタンパク質分解活性又は変化した生物活性を有するようにする。一部の実施形態において、マウスiRhom2は、アミノ酸残基1と268との間で切断され、又はヒトiRhom2は、アミノ酸残基1と298との間で切断される。他の実施形態において、マウスiRhom1は、アミノ酸残基1と272との間で切断され、又はヒトiRhom1は、アミノ酸残基1と316との間で切断される。他の実施形態において、前記化合物は、iRhomポリペプチドのペプチダーゼドメインを活性化する。
【００１７】
一実施形態において、前記iRhomポリペプチドは、iRhom1又はiRhom2である。他の実施形態において、前記iRhomポリペプチドは、ヒト又はマウスiRhomポリペプチドである。
【００１８】
一実施形態において、本発明の化合物は、小分子、ペプチド、又はポリペプチドデコイからなる群から選択される。他の実施形態において、前記化合物は、細胞透過性ペプチドに付着している。他の実施形態において、前記化合物は、細胞透過性である。更に他の実施形態において、前記化合物は、ユビキチンプロテアーゼ阻害剤である。
【００１９】
一実施形態において、本発明の化合物は、ケラチノサイトの移動を加速する。更に他の実施形態において、前記化合物は、線維芽細胞の増殖を加速する。
【００２０】
一態様において、本発明は、基質に対するiRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を阻害する化合物を同定する方法であって、a)iRhomポリペプチドを発現する細胞を試験化合物に接触させることと、b)適切な対照と比較した前記iRhomポリペプチドの生理学的標的の分泌の減少又は適切な対照と比較したEGFR活性の減少を決定することと、を含み、前記iRhomポリペプチドの生理学的標的の分泌の減少又はEGFR活性の減少は、前記化合物が基質に対する前記iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を阻害することを示す、方法を提供する。
【００２１】
他の態様において、本発明は、対象者において腫瘍増殖及び/又は腫瘍進行を低減すること又は癌を治療することが可能な化合物を同定する方法であって、a)iRhomポリペプチドを発現する細胞を試験化合物に接触させることと、b)適切な対照と比較した前記iRhomポリペプチドの生理学的標的の分泌の減少又は適切な対照と比較したEGFR活性の減少を決定することと、を含み、前記iRhomポリペプチドの生理学的標的の分泌の減少又はEGFR活性の減少は、前記化合物が、前記対象者において腫瘍増殖及び/又は腫瘍進行を低減すること又は癌を治療することが可能であることを示す、方法を提供する。
【００２２】
他の態様において、本発明は、対象者において発毛を促進することが可能な化合物を同定する方法であって、a)iRhomポリペプチドを発現する細胞を試験化合物に接触させることと、b)適切な対照と比較した前記iRhomポリペプチドの生理学的標的の分泌の減少又は適切な対照と比較したEGFR活性の減少を決定することと、を含み、前記iRhomポリペプチドの生理学的標的の分泌の減少又はEGFR活性の減少は、前記化合物が対象者において発毛を促進することが可能であることを示す、方法を提供する。
【００２３】
一実施形態において、前記腫瘍は、固形腫瘍である。一部の実施形態において、前記癌は、上皮癌である。他の実施形態において、前記癌は、食道、肺、脳、結腸、腎臓、前立腺、皮膚、肝臓、脾臓、胃、子宮、卵巣、乳房、リンパ腺、又は膀胱の癌である。
【００２４】
一実施形態において、前記基質は、EGFRリガンド又はEGF様基質である。
【００２５】
他の実施形態において、前記iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性の阻害は、前記iRhomポリペプチドの生理学的標的の分泌の減少を検出することにより決定される。一部の実施形態において、前記iRhomポリペプチドの生理学的標的は、EGFRリガンドである。一実施形態において、前記iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性の阻害は、可溶性EGFRリガンドのレベルの検証を検出することにより決定される。更に他の実施形態において、前記EGFRリガンドは、AREG、HB-EGF、TGFα、及びEPGNからなる群から選択される。
【００２６】
一実施形態において、iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性の阻害は、EGFR活性の減少を検出することにより決定される。
【００２７】
他の実施形態において、前記化合物は、iRhomポリペプチドのペプチダーゼドメインを阻害する。
【００２８】
更に他の実施形態において、前記化合物は、iRhomポリペプチド ペプチダーゼドメインのタンパク質分解部位において1個以上のアミノ酸残基を不活性化することによりiRhomポリペプチドの活性に影響を与える。一実施形態において、前記iRhomポリペプチドは、マウスiRhom2であり、前記化合物は、TMヘリックス2上のヒスチジン635、TMヘリックス4上のグルタミン695、TMヘリックス4上のシステイン701、及びTMヘリックス6上のヒスチジン744からなる群から選択されるマウスiRhom2のタンパク質分解部位において、1個以上のアミノ酸残基を不活性化する。他の実施形態において、前記iRhomポリペプチドは、ヒトiRhom2であり、前記化合物は、TMヘリックス2上のヒスチジン664、TMヘリックス4上のグルタミン724、TMヘリックス4上のシステイン730、及びTMヘリックス6上のヒスチジン773からなる群から選択されるヒトiRhom2のタンパク質分解部位において、1個以上のアミノ酸残基を不活性化する。
【００２９】
一実施形態において、iRhomファミリーメンバーは、iRhom1又はiRhom2である。他の実施形態において、iRhomファミリーメンバーは、ヒト又はマウスiRhomファミリーメンバーである。
【００３０】
一実施形態において、本発明の化合物は、小分子、ポリペプチドデコイ、miRNA分子、siRNA分子、shRNA分子、dsRNA分子、アンチセンス分子、Rhbdf2に特異的なリボザイム、若しくは前記miRNA、siRNA、shRNA、dsRNAをコードするポリヌクレオチド、又はそのそれぞれの生物学的等価物からなる群から選択される。他の実施形態において、前記化合物は、細胞透過性ペプチドに付着している。一部の実施形態において、前記化合物は、細胞透過性である。
【００３１】
一態様において、本発明は、変異体iRhomポリペプチドを含む単離ポリペプチドを提供する。
【００３２】
他の態様において、本発明は、サイトゾルN末端ドメインを欠失するヒトiRhom2を含む単離ポリペプチドを提供する。
【００３３】
他の態様において、本発明は、サイトゾルN末端ドメインを欠失するマウスiRhom2を含む単離ポリペプチドを提供する。
【００３４】
更に他の態様において、本発明は、TMヘリックス2上のヒスチジン635、TMヘリックス4上のグルタミン695、TMヘリックス4上のシステイン701、及びTMヘリックス6上のヒスチジン744からなる群から選択されるマウスiRhom2のタンパク質分解部位における1個以上のアミノ酸残基での突然変異を含む、単離マウスiRhom2ポリペプチドを提供する。
【００３５】
他の態様において、本発明は、TMヘリックス2上のヒスチジン664、TMヘリックス4上のグルタミン724、TMヘリックス4上のシステイン730、及びTMヘリックス6上のヒスチジン773からなる群から選択されるヒトiRhom2のタンパク質分解部位における1個以上のアミノ酸残基での突然変異を含む、単離ヒトiRhom2ポリペプチドを提供する。
【００３６】
一実施形態において、本発明は、上述したポリペプチドの何れか一つをコードする単離核酸分子を提供する。他の実施形態において、本発明は、上述した核酸分子を含むベクタを提供する。他の実施形態において、本発明は、上述したベクタを発現する宿主細胞を提供する。
特定の実施形態において、例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
iRhomポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する方法であって、
iRhomポリペプチドを発現する細胞を試験化合物に接触させることと
前記iRhomポリペプチドの活性に対する前記試験化合物の効果を決定することと、を含む方法。
（項目２）
前記iRhomポリペプチドの活性に対する前記試験化合物の効果を決定することは、適切な対照と比較した前記iRhomポリペプチドの安定性を決定することを含む、項目1記載の方法。
（項目３）
前記iRhomポリペプチドの活性に対する前記試験化合物の効果を決定することは、適切な対照と比較した前記iRhomポリペプチドの生理学的標的の分泌のレベルを決定することを含む、項目1記載の方法。
（項目４）
前記iRhomポリペプチドの活性に対する前記試験化合物の効果を決定することは、適切な対照に対するEGFR活性のレベルを決定することを含む、項目1記載の方法。
（項目５）
前記iRhomポリペプチドの活性に対する試験化合物の効果を決定することは、適切な対照と比較した可溶性EGFRリガンドのレベルを決定することを含む、項目1記載の方法。
（項目６）
前記iRhomポリペプチドの活性は、基質を切断するタンパク質分解活性である、項目1乃至5の何れかに記載の方法。
（項目７）
前記iRhomポリペプチドの活性に対する前記試験化合物の効果を決定することは、適切な対照と比較した、基質をタンパク分解性に切断する前記iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を検出することを含む、項目1記載の方法。
（項目８）
前記iRhomポリペプチドの安定性の減少は、前記化合物が前記iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を減少させることを示し、前記iRhomポリペプチドの安定性の増加は、前記化合物が前記iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を増加させることを示す、項目2記載の方法。
（項目９）
前記iRhomポリペプチドの生理学的標的の分泌の増加は、前記化合物が前記iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を増加させることを示し、前記iRhomポリペプチドの生理学的標的の分泌の減少は、前記化合物が前記iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を阻害することを示す、項目3記載の方法。
（項目１０）
EGFR活性の増加は、前記化合物が、基質をタンパク分解性に切断する前記iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を増加させることを示し、EGFR活性の減少は、前記化合物が前記iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を阻害することを示す、項目4記載の方法。
（項目１１）
前記可溶性EGFRリガンドの増加は、前記化合物が前記iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を増加させることを示し、可溶性EGFRリガンドの減少は、前記化合物が前記iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を阻害することを示す、項目5記載の方法。
（項目１２）
前記iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性の減少は、前記化合物が、腫瘍増殖の低減、腫瘍進行の低減、癌の治療、及び発毛の促進のうち1つ以上が可能であることを示し、前記iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性の増加は、前記化合物が対象者における創傷治癒を加速することが可能であることを示す、項目1乃至11の何れかに記載の方法。
（項目１３）
前記細胞は、EGFRリガンドを発現する、項目1乃至12の何れかに記載の方法。
（項目１４）
前記基質は、EGFRリガンド又はEGF様基質である、項目6、7、又は10記載の方法。
（項目１５）
前記生理学的標的は、EGFRリガンドである、項目3又は9記載の方法。
（項目１６）
前記EGFRリガンドは、AREG、HB-EGF、TGFα、及びEPGNからなる群から選択される、項目5、11、13、14、又は15記載の方法。
（項目１７）
前記細胞は、試験管内である、項目1乃至16の何れかに記載の方法。
（項目１８）
前記iRhomポリペプチドは、iRhom1又はiRhom2である、項目1乃至17の何れかに記載の方法。
（項目１９）
前記iRhomポリペプチドは、ヒト又はマウスiRhomである、項目1乃至18の何れかに記載の方法。
（項目２０）
前記試験化合物は、小分子、ペプチド、ポリペプチドデコイ、miRNA分子、siRNA分子、shRNA分子、dsRNA分子、アンチセンス分子、Rhbdf2に特異的なリボザイム、又はmiRNA、siRNA、shRNA、dsRNAをコードするポリヌクレオチド、その任意の2つ以上の組み合わせ、その任意の1つ以上の生物学的等価物を含む、項目1乃至19の何れかに記載の方法。
（項目２１）
実質的に本明細書に図示又は記載されたiRhomポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する方法。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】図1Aは、本明細書に記載の増殖アッセイを用いたMEFの定量を示すグラフである。細胞をX軸に示した数で播種して、24時間インキュベートし、蛍光の範囲が全細胞DNAの量に比例するようにした。データは、平均±標準偏差として示している。
【図１Ｂ】図1Bは、本明細書に記載のスクラッチ傷アッセイを用いた、cub/cub mcub/mcub及び+/+ mcub/mcub MEFの移動の定量を示すグラフである。スクラッチ傷の幅を時間0に測定し(100％開放)、各時点での傷の閉鎖の増加を、最初の幅のパーセントとして計算した。データは、平均±標準偏差として示している。
【図１Ｃ】図1Cは、EGFRシグナル伝達の様々なマーカーに対するcub/cub mcub/mcub又は+/+ mcub/mcub MEFの免疫ブロット解析を示す画像であり、細胞ライセートは、二重に泳動し、アクチンをローディング対照とした。
【図１Ｄ】図1Dは、6乃至40週齢雌cub/cub mcub/mcub及び+/+ mcub/mcubマウス(1群当たりn=3)における損傷後0、7、14、21、及び28日目の耳組織の再生の代表画像を示す図である。
【図１Ｅ】図1Eは、図1Dに示した耳穴の閉鎖の定量化を示すグラフである。データは、平均±標準偏差として示している。
【図１Ｆ】図1Fは、損傷後0、7、及び14日目のcub/cub mcub/mcub及び+/+ mcub/mcubマウスの耳の断面をヘマトキシリン・エオシンにより染色した画像(元倍率、×10)を示す図である。未分化の厚化した表皮(E)(10乃至12の有核層)及び広範囲の増殖(M)がcub/cub mcub/mcubマウスの耳において見られる。点線は、切除の部位を示す。
【図２Ａ】図2Aは、cub突然変異が、マウスRhbdf2遺伝子における12,681bpの欠失であり、欠失がエクソン1と2との中間で開始され、エクソン2乃至6を含み、エクソン6の直後で終了することを示す図である。
【図２Ｂ】図2Bは、エクソン2、5、12、及び19に対してプライマーを用いた、+/+ mcub/mcub、+/cub mcub/mcub及びcub/cub mcub/mcubマウス由来のMEFに対する逆転写酵素PCRの結果の画像を示す図である。ntcは、No Template Control(テンプレート対照無し)を表す。
【図２Ｃ】図2Cは、アクチンを内在性対照とした表示エクソン境界に対するTaqMan遺伝子発現アッセイを用いた、皮膚組織から抽出したcDNAに対するqPCRの結果を示すグラフである。データは、+/+ mcub/mcubのアクチンレベルに対して規準化しており、試料は、4つの生物学的複製で3つ組で泳動した。データは、平均±標準偏差として示している。
【図２Ｄ】図2Dは、エクソン1-エクソン7境界を有する転写物を検出するカスタムTaqMan遺伝子発現アッセイを用いたqPCRの結果を示すグラフである。試料は、3つの生物学的複製で3つ組で泳動した(各バーは、個別のマウスを表す)。データは、平均±標準偏差として示している。
【図２Ｅ】図2Eは、アクチンをローディング対照として、Flagタグ付きHuWt(ヒト全長RHBDF2 cDNA)及びHuCub(ヒトのcub cDNA)を一過性に発現するHEK293細胞の抗Flag免疫ブロットの画像である。
【図２Ｆ】図2Fは、Flag特異的抗体を用いて染色し、DAPIを用いて核を対比染色した、Flagタグ付きHuWt及びHuCub発現B6初代MEFの代表画像を示す図である。矢印は、全長及び変異タンパク質の両方の細胞質発現を表す。
【図３Ａ】図3Aは、予想される産物の長さが2181bpであるKOMP Rhbdf2ノックアウトマウスの野生型産物に対するPCRの結果を示す画像である。Lは、New England Biolabsから入手した 1kb DNAラダーを表し、ntcは、No Template Control(テンプレート対照無し)を表す。
【図３Ｂ】図3Bは、Rhbdf2発現のレポータ遺伝子解析の画像を示す図である。ホールマウントX-gal染色E18.5 Rhbdf2-/-の胚は、表皮においてβ-galの強い発現を示し(矢じり)(元倍率、×2.5)、X-gal染色した2週齢雌Rhbdf2-/-の皮膚は、毛包の内外鞘層においてβ-gal陽性を示す(矢印)(元倍率、×5)。毛幹では染色は観察されなかった。スケールバー、1mm。
【図３Ｃ】図3Cは、Rhbdf2のヌル突然変異を有するマウスでは、Rhbdf2cub/cubマウスのものと比較して、6乃至8週齢雌Rhbdf2-/-マウスでの耳の創傷閉鎖の有意な遅延で実証されるように、再生表現型が欠如していることを示すグラフである。
【図３Ｄ】図3Dは、Rhbdf2のヌル突然変異を有するマウスが、正常な皮膚及び毛の形態を有することを実証する画像を示す図である。、損傷後に表示の時点で取り出したRhbdf2cub/cub及びRhbdf2-/-マウス由来の成体皮膚のH&E染色断面であり、成体のRhbdf2cub/cubの皮膚は、薄い皮下脂肪層(F)、異常な毛包(H)、厚い表皮(E)、拡大した皮脂腺(SG)、密に絡み合ったコラーゲン線維の束(C)、及び毛包と毛球との完全な分化の欠如(HF)を示す。成体のRhbdf2-/-の皮膚は、正常な表皮及び毛包を示す。スケールバー、100μm。元倍率、×10及び×40。
【図３Ｅ】図3Eは、Rhbdf2-/-マウスでは正常な被毛(矢じり)が生じる一方、化合物変異Rhbdf2-/cubマウスが疎らな被毛(矢印)となることを示す画像である。
【図４Ａ】図4Aは、Mcubが、Areg遺伝子における正常なドナースプライス部位(エクソン1)を破壊し、代替の下流スプライス部位の使用を引き起こすTからGへの点突然変異であることを示す図である。
【図４Ｂ】図4Bは、6乃至8週齢雌Rhbdf2+/+ Areg+/+、Rhbdf2cub/cub Areg+/+、及びRhbdf2cub/cub AregMcub/Mcubマウス(1群当たりn=3匹)における耳穴の治癒を28日間に亘り示すグラフである。データは、平均±標準偏差として示している。
【図４Ｃ】図4Cは、点線により切除部位を示したRhbdf2cub/cub AregMcub/Mcubマウスの耳穴の切除後の治癒を表すヘマトキシリン・エオシン染色断面の画像を示す図である。元倍率、×10。Eは、表皮、Mは、増殖を表す。図1Fと比較されたい。
【図４Ｄ】図4Dは、同齢のRhbdf2+/+ Areg+/+、Rhbdf2cub/cub Areg+/+、及びRhbdf2cub/cub AregMcub/Mcub雌マウスにおける血清AREGレベルを示すグラフであり、AREGは、Rhbdf2cub/cub AregMcub/Mcubマウスの血清では未検出(n.d.)となった。データは、3回の独立した実験の平均±標準偏差として示している。***p<0.001。
【図４Ｅ】図4Eは、Rhbdf2+/+ Areg+/+、Rhbdf2cub/cub Areg+/+、及びRhbdf2cub/cub AregMcub/Mcubマウスから単離した、培養マウス表皮ケラチノサイト(MEK)の上清におけるAREGレベルのELISA定量のグラフであり、AREGは、Rhbdf2cub/cub AregMcub/Mcubマウス由来のMEKでは未検出(n.d.)となった。データは、3回の独立した実験の平均±標準偏差として示している。***p<0.001。
【図４Ｆ】図4Fは、EGFRリガンドのqPCRから得られた結果を示すグラフである。cDNAは、アクチンを内在性対照としたTaqMan遺伝子発現アッセイを用いて、Rhbdf2cub/cub Areg+/+及びRhbdf2+/+ Areg+/+の皮膚組織から抽出した。データは、Rhbdf2+/+ Areg+/+のアクチンレベルに対して規準化しており、データは、3回の独立した実験の平均±標準偏差として示している。*p<0.05。
【図５Ａ】図5Aは、全長ヒトRHBDF2(HuWt)遺伝子及びマウスRhbdf2cub遺伝子を模倣するヒト構築物(HuCub)の模式的表現を示す図である。
【図５Ｂ】図5Bは、293T細胞におけるHuWt又はHuCubのAREG遺伝子との同時発現後の切断AREGのELISA定量を示すグラフである。トランフェクションの24時間後に、細胞をDMSO又は10μMマリマスタット(MM)の何れかと24時間インキュベートし、AREGレベルを馴化培地において分析しており、トランフェクションは2回実施し、馴化培地は5倍に希釈した。
【図５Ｃ】図5Cは、表示した遺伝子型の8乃至12週齢雌マウスのLPS注射後3時間でのELISAによる血清TNFαレベルの定量を示すグラフであり、TNFαは、LPS注射をしないRhbdf2+/+マウス血清において未検出(n.d.)となった。*p<0.05。
【図５Ｄ】図5Dは、ヒトRHBDL2(HuRHBDL2)遺伝子のAREG又はHB-EGF又はEGF遺伝子との同時発現後の切断AREG/HB-EGF/EGFのELISA定量を示すグラフである。トランフェクションの24時間後に、細胞を10μMマリマスタット(MM)と24時間インキュベートし、AREG/HB-EGF/EGFレベルを馴化培地において分析しており、HB-EGF及びEGF馴化培地は希釈せず、AREG培地は5倍に希釈した。データは、3回の独立した実験の平均±標準偏差を表す。***p<0.001。
【図５Ｅ】図5Eは、HuWt又はHuCubのHB-EGF遺伝子との293T細胞における同時発現後の切断HB-EGFのELISA定量を示すグラフである。トランフェクションの24時間後に、細胞を10μMマリマスタット(MM)と24時間インキュベートし、HB-EGFレベルを馴化培地において分析した。***p<0.001。
【図５Ｆ】図5Fは、HuWt又はHuCubのEGF遺伝子との293T細胞における同時発現後の切断EGFのELISA定量を示すグラフである。トランフェクションの24時間後に、細胞をDMSO又は10μMマリマスタット(MM)の何れかと24時間インキュベートし、EGFレベルを馴化培地において分析した。**p<0.01。
【図５Ｇ】図5Gは、ペプチダーゼドメインの無いHuCub(HuCubΔPD)又はHuCubのAREG遺伝子との293T細胞における同時発現後の切断AREGのELISA定量を示すグラフである。トランフェクションの24時間後に、細胞を10μMマリマスタット(MM)と24時間インキュベートし、AREGレベルを馴化培地において分析した。***p<0.001。
【図５Ｈ】図5Hは、個別のアラニン突然変異を有するHuCub又はHuCubのAREG遺伝子との293T細胞における同時発現後の切断AREGのELISA定量を示すグラフである。トランフェクションの24時間後に、細胞を10μMマリマスタット(MM)と24時間インキュベートし、AREGレベルを馴化培地において分析した。***p<0.001。
【図５Ｉ】図5Iは、個別のアラニン突然変異を有するHuWt又はHuCub又はHuCubのEGF遺伝子との293T細胞における同時発現後の切断EGFのELISA定量を示すグラフである。トランフェクションの24時間後に、細胞を10μMマリマスタット(MM)と24時間インキュベートし、EGFレベルを馴化培地において分析した。**p<0.001。
【図５Ｊ】図5Jは、Rhbdf2cubの膜トポロジを示す図であり、図示したアミノ酸がRhbdf2cubによるEGFRリガンド生産の制御に極めて重要となる。
【図６Ａ】図6Aは、AREGと、ヒトRHBDF2 p.I186T突然変異体、HuWt又はHuCubの何れかとにより、10μMマリマスタット(MM)の存在下でトランスフェクトしたHEK293細胞の馴化培地でのELISAによる切断AREGの定量を示すグラフである。**p<0.01。
【図６Ｂ】図6Bは、AREGとHuCub、HuWt、又はp.I186Tの何れかとによりコトランスフェクトし、DMSO又はMMとインキュベートし、HA-AREGについて免疫ブロットしたHEK293細胞のウェスタンブロットを示し、AREG及びHuCub又はp.I186Tの同時発現が、pro-AREGの細胞内レベルを、AREG/HuWt又はAREG単独でのものと比較して、10μM MMの存在下であっても、有意に減少させることを示す画像である。
【図６Ｃ】図6Cは、様々なRHBDF2 P.I186T点突然変異を発現し、AREG遺伝子又は空のベクタによりコトランスフェクトされた細胞におけるAREGレベルを示すグラフである。各残基は、アラニンに変異した。細胞は、10μM MMと24時間インキュベートし、AREGレベルを馴化培地において分析した。
【図６Ｄ】図6Dは、中部及び上部絨毛領域におけるレポータ遺伝子β-galの発現を示す、X-gal染色した2週齢雌Rhbdf2-/-の腸の画像である。元倍率、×2.5。
【図６Ｅ】図6Eは、ApcMin/+ Rhbdf2+/+(n=28)及びApcMin/+ Rhbdf2+/cub(n=23)マウスのカプラン・マイヤー生存曲線を示すグラフであり、ApcMin/+ Rhbdf2+/+マウスの生存期間中央値が172日となり、一方ApcMin/+ Rhbdf2+/cubマウスでは135日となった。
【図６Ｆ】図6Fは、3ヶ月齢の表示した遺伝子型のマウス由来の腸組織のヘマトキシリン・エオシン染色断面の画像を示す図である。元倍率、×2.5。
【図６Ｇ】図6Gは、3ヶ月齢のマウスの表示した遺伝子型のマウス当たりのポリープのサイズを示すグラフである。平均腫瘍サイズは、ApcMin/+ Rhbdf2+/+及びApcMin/+ Rhbdf2+/cubマウスで、それぞれ1.8mm2及び3.7mm2となった。
【図６Ｈ】図6Hは、3ヶ月齢のマウスの表示した遺伝子型のマウス当たりのポリープ数を示すグラフである。ポリープの平均数は、ApcsMin/+ Rhbdf2+/+及びApcMin/+ Rhbdf2+/cubマウスで、それぞれ12個及び21個となった。
【図７Ａ】図7Aは、ヒトiRhom2-AREG複合体の免疫共沈降の画像であり、COS7細胞由来のライセートをFlagタグ付きHuWt又はFlagタグ付きHuCub又はFlagタグ付きp.I186Tとコトランスフェクトし、HAタグ付きAREGを抗Flag磁気ビーズにより免疫沈降させ、抗Flag及び抗HA抗体によりプローブした。
【図７Ｂ】図7Bは、表示したFlagタグ付き遺伝子によりトランスフェクトし、Flag特異的PE標識抗体を用いてトランスフェクションの48時間後に免疫標識した293T又はCOS7(図14)細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図７Ｃ】図7Cは、図7Bにおいて得られたデータの定量化を示すグラフである。
【図７Ｄ】図7Dは、一過性にトランスフェクトしたCOS7細胞を、150μg/mlのタンバク質合成阻害剤シクロヘキサミドにより表示した時間に亘り追跡し、Flag特異的PE標識抗体を用いてタンパク質発現を評価した試験の結果を示す図である。データは、合計3回の実験のうちの1つを表す。
【図７Ｅ】図7Eは、図7Dにおいて得られたデータの定量化を示すグラフである。
【図７Ｆ】図7Fは、一過性にトランスフェクトしたCOS7細胞を、10μM MG-132、細胞透過性プロテアーゼ阻害剤と4時間プレインキュベートした後、150μg/mlのシクロヘキサミドにより、MG-132の存在下で表示した時間に亘り追跡した試験の結果を示す図である。タンパク質発現は、図7Dにおいて説明したように決定した。***p<0.001。
【図８】図8は、野生型iRhom2が短寿命のタンパク質であり、上皮癌の根底にあるものを含め、そのN末端の喪失又はそのN末端ドメインにおける突然変異がタンパク質安定性を増加させ、これにより、AREGを含む選択的なEGFファミリーリガンドの分泌を増大させることを示す図である。ADAM17の阻害は、AREGの分泌に影響しないが、iRhom2のペプチダーゼドメインにおけるアミノ酸H366、Q426、C432、及びH475の喪失は、AREGの分泌を抑止し、反対に、AREGの分泌促進は、EGFRシグナル伝達の過剰活性化につながり、これにより細胞の増殖及び移動が増加する。
【図９Ａ】図9Aは、cub/cub mcub/mcub(矢印)及びcub/cub Mcub/mcub(矢じり)マウスを示す画像である。
【図９Ｂ】図9Bは、+/cub mcub/mcubにおける創傷治癒が、cub/cub mcub/mcub及び+/+マウスの中間に現れることを示すグラフである。6乃至40週齢雌+/+ mcub/mcub、+/cub mcub/mcub、及びcub/cub mcub/mcubマウス(1群当たりn=3)の損傷後0、7、14、及び21日目の耳穴閉鎖率の定量化を示す(2mm貫通穴)。データは、平均±標準偏差として示している。
【図１０Ａ】図10Aは、Flagタグ付き全長(HuWt)及びcub(HuCub)Rhbdf2クローンのB6初代MEFにおけるインビトロ発現後の、Flag特異的抗体及び核のDAPI対比染色によるタンパク質発現の免疫化学的評価を示すと共に、全長及び変異タンパク質の両方がERマーカー、カルネキシンと共局在することを表す画像を示す図である。
【図１０Ｂ】図10Bは、Flagタグ付き全長(HuWt)及びcub(HuCub)Rhbdf2クローンのB6初代MEFにおけるインビトロ発現後の、Flag特異的抗体及び核のDAPI対比染色によるタンパク質発現の免疫化学的評価を示すと共に、全長及び変異タンパク質の両方がゴルジマーカー、ギアンチンと共局在しないことを表す画像を示す図である
【図１１】図11は、TからGへの点突然変異が、22個の追加ヌクレオチドをAreg転写物に追加し、16個の誤ったアミノ酸をタンパク質に追加する代替スプライス部位につながる元のスプライス部位(エクソン1)を破壊し、未成熟終止コドンを導入することを示す図である。
【図１２Ａ】図12Aは、細胞ライセートを二重に泳動し、アクチンをローディング対照とした、cub/cub Mcub/Mcub又はcub/cub mcub/mcubのMEFの、表示したマーカーに対する免疫ブロット解析の画像である。
【図１２Ｂ】図12Bは、スクランブルshRNA又はマウスAreg shRNAレンチウイルス感染Rhbdf2+/+又はRhbdf2cub/cub MEFにおけるAregの発現の定量RT-PCRによる判定を示すグラフである。
【図１２Ｃ】図12Cは、スクランブルshRNA又はマウスAreg shRNAによる感染後に、本明細書に記載の増殖アッセイを用いた、Rhbdf2+/+ MEFの定量を示すグラフであり、細胞はX軸に示した数で播種して、24時間インキュベートした。蛍光の範囲は、全細胞DNAの量に比例する。
【図１２Ｄ】図12Dは、スクランブルshRNA又はマウスAreg shRNAによる感染後に、本明細書に記載の増殖アッセイを用いた、Rhbdf2cub/cub MEFの定量を示すグラフであり、細胞はX軸に示した数で播種して、24時間インキュベートした。蛍光の範囲は、全細胞DNAの量に比例する。
【図１３Ａ】図13Aは、マウスRhbdf1又はN末端欠損マウスRhbdf1(ΔN-iRhom1)又はΔN-iRhom1突然変異体により、AREG遺伝子と共に、10μMマリマスタット(MM)の存在下でトランスフェクトしたHEK 293T細胞の馴化培地由来の分泌AREGのELISA定量を示すグラフである。***p<0.001。
【図１３Ｂ】図13Bは、マウスRhbdf1又はN末端欠損マウスRhbdf1(ΔN-iRhom1)により、EGF遺伝子と共に、10μMマリマスタット(MM)の存在下でトランスフェクトしたHEK 293T細胞の馴化培地由来の切断EGFのELISA定量を示すグラフである。***p<0.001。
【図１３Ｃ】図13Cは、ヒトiRhom2及びRHBDL2並びにヒト及びマウスiRhomのペプチダーゼドメイン配列のアミノ酸のアラインメントの画像である。
【図１３Ｄ】図13Dは、個別のアラニン突然変異を有するHuCub又はHuCubのAREG遺伝子との293T細胞における同時発現後の分泌AREGのELISA定量を示すグラフである。トランフェクションの24時間後に、細胞を10μMマリマスタット(MM)と24時間インキュベートし、AREGレベルを馴化培地において分析した。データは、3回の独立した実験の平均±標準偏差として示している。
【図１３Ｅ】図13Eは、iRHOM1及びiRHOM2、活性ロンボイドRHBDL2、C.elegans不活性ロンボイドROM3及びROM4、並びにDrosophila iRhomのペプチダーゼドメインのアミノ酸の配列アラインメントを示す図であり、アスタリスクは、iRHOM2によるEGFRリガンドの制御にとって重要な保存されたアミノ酸を表す。
【図１４】図14は、表示したFlagタグ付き遺伝子によりトランスフェクトし、Flag特異的PE標識抗体を用いてトランスフェクションの48時間後に免疫標識したCOS7細胞のフローサイトメトリーの結果の画像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本明細書に用いた科学用語及び技術用語は、当業者が通常理解する意味を有するものとする。こうした用語は、以下を例として含む様々な標準的参考文献の文中で定義及び使用されている:J. Sambrook and D.W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd Ed., 2001; F.M. Ausubel, Ed., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols; 5th Ed., 2002; B. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 4th Ed., Garland, 2002; D.L. Nelson and M.M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, 4th Ed., W.H. Freeman & Company, 2004; Engelke, D.R., RNA Interference (RNAi): Nuts and Bolts of RNAi Technology, DNA Press LLC, Eagleville, PA, 2003; Herdewijn, P. (Ed.), Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications, Methods in Molecular Biology, Humana Press, 2004; A. Nagy, M. Gertsenstein, K. Vintersten, R. Behringer, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; December 15, 2002, ISBN-10: 0879695919; Kursad Turksen (Ed.), Embryonic stem cells: methods and protocols in Methods Mol Biol. 2002;185, Humana Press; Current Protocols in Stem Cell Biology, ISBN: 9780470151808; Chu, E. and Devita, V.T., Eds., Physicians’ Cancer Chemotherapy Drug Manual, Jones & Bartlett Publishers, 2005; J.M. Kirkwood et al., Eds., Current Cancer Therapeutics, 4th Ed., Current Medicine Group, 2001; Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins, 21st Ed., 2005; L.V. Allen, Jr. et al., Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 8th Ed., Philadelphia, PA: Lippincott, Williams & Wilkins, 2004; and L. Brunton et al., Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill Professional, 12th Ed., 2011。
【００３９】
単数の用語である「a」、「an」、及び「the」は、限定的ではなく、特に明記されていない限り、或いは文脈から明らかとなる場合を除き、複数の指示物を含むものとする。
【００４０】
不活性ロンボイド(iRhom)は、以前はタンパク分解性に不活性であると考えられていた、高度に保存された膜内タンパク質である。iRhomは、長いサイトゾルN末端ドメイン、保存されたシステインリッチな不活性ロンボイド相同ドメイン(IRHD)、ペプチダーゼドメイン内の活性部位セリン残基が欠如した休眠状態のタンパク質分解部位により特徴付けられる。
【００４１】
iRhomは、多様な種において様々な範囲の機能に関与し、これにはDrosophila melanogasterにおける上皮成長因子受容体(EGFR)シグナル伝達の制御、ヒト扁平上皮癌細胞の生存、哺乳類細胞株における小胞体膜からのミスフォールドタンパク質のクリアランス、初代マウスケラチノサイトにおける移動の誘導、マウスにおける可溶性TNFαの分泌、及びマウス胚性線維芽細胞における刺激ADAM17媒介メタロプロテアーゼ分断の基質選択性の制御が含まれる。EGF様リガンドは、iRhomファミリーメンバーに対する基質の役割を果たし得る。
【００４２】
Rhbdf2遺伝子は、これまで機能が知られていない長いサイトゾルN末端及び休眠状態のペプチダーゼドメインを含む酵素のファミリーの1つである、不活性ロンボイドプロテアーゼiRhom2をコードする。本発明は、iRhom2がEGFRシグナル伝達の構成的活性化を介して上皮再生及び癌増殖において機能し得ることを提供する。
【００４３】
本発明の態様は、少なくとも部分的には、Rhbdf2突然変異が、アンフィレグリンの分泌促進により、iRhom2タンパク質安定性を増加させ、EGFRの過剰活性化を引き起こすという発見に基づく。
【００４４】
本発明の態様は、少なくとも部分的には、iRhom2が、N末端ドメインにおける選択突然変異により、その安定性を増加させることが可能な、短寿命タンパク質であるという発見に基づく。更に、これらの安定した変異体は、メタロプロテアーゼADAM17活性に依存せず、アンフィレグリンを含むEGFファミリーリガンドの分泌を増大させるように機能する。生体内では、N末端iRhom2突然変異は、創傷治癒の加速及び腫瘍形成の促進を誘発するが、自発的な腫瘍の発生は引き起こさない。したがって、本発明は、少なくとも部分的には、創傷治癒及び腫瘍性成長に関与するEGFRシグナル伝達事象の制御におけるiRhom2の生理学的卓越性と、重要なiRhom2ドメインの機能とに基づいている。
【００４５】
上皮成長因子受容体(EGFR)シグナル伝達は、哺乳類細胞の成長、増殖、及び分化において大きな役割を果たす。標準のEGFRリガンドは、EGF、AREG、及びHB-EGFを含め、細胞表面に発現するプロタンパク質として存在しており、EGFRと結合するためには、細胞外区画内へ放出される必要がある。様々なクラスのプロテアーゼが、膜に繋ぎ止められたEGFRプロリガンドを切断し、様々な発生段階の間に広範な生物活性を制御する。
【００４６】
一態様において、本発明は、少なくとも部分的には、iRhom2のサイトゾルN末端ドメインの喪失により毛包の発生、創傷治癒、及び腫瘍形成に対する後続効果が生じるcurly bare(cub)突然変異の根底にあるのが、マウスにおけるRhbdf2遺伝子内での自発的な欠失であるという発見に基づく。更に、cubの修飾因子(Mcub)は、脱毛を治療又は矯正し、及び/又は発毛を促進する(実施例1)。他の態様において、本発明は、少なくとも部分的には、iRhom2は短寿命タンパク質であるが、N末端における機能獲得型突然変異(肥厚)又はN末端の喪失(cub突然変異)は、EGFRリガンド、アンフィレグリン(AREG)のメタロプロテアーゼ非依存性分泌につながる変異タンパク質安定性を増加させるという発見に基づく。cub表現型の遺伝的修飾因子(Mcub)を用いて、AREGがiRhom2の生理学的標的であることが実証された。他の態様において、本発明は、少なくとも部分的には、AREG分泌に必要なiRhom2のペプチダーゼドメインにおける重要なアミノ酸の同定に基づき、この疑酵素のペプチダーゼドメインが、推定活性部位におけるセリン残基の欠如にも拘わらず機能性となり得ることを示す。したがって、本発明は、重要なiRhomドメインの機能を提供すると共に、iRhomと、EGFRシグナル伝達と、創傷治癒及び腫瘍形成に関与する生物学的プロセスとの関係を理解する枠組みを構築する。
【００４７】
iRhomファミリーメンバー
【００４８】
iRhom1及びiRhom2
【００４９】
ロンボイドプロテアーゼは、ほぼ全ての種に存在する酵素のファミリーである。ロンボイドは、膜内セリンプロテアーゼであり、ロンボイドプロテアーゼによるタンパク質切断は、細胞制御にとって重要となる。膜内プロテアーゼの活性部位は、細胞膜の脂質二重層内に埋め込まれており、膜内プロテアーゼは、その膜貫通ドメイン内の他の膜貫通タンパク質を切断する。
【００５０】
iRhom又は「不活性ロンボイド」は、本発明以前には、タンパク質分解活性が欠如していると考えられていたロンボイドプロテアーゼのサブファミリーである。iRhomは、長いサイトゾルN末端ドメイン、保存されたシステインリッチな不活性ロンボイド相同ドメイン(IRHD)、ペプチダーゼドメイン内の活性部位セリン残基が欠如した休眠状態のタンパク質分解部位により特徴付けられる、高度に保存された膜内タンパク質である。本発明での使用に適したiRhomファミリーメンバーには、iRhom1(RHBDF1)及びiRhom2(RHBDF2)が含まれる。本発明で用いるiRhom1及び/又はiRhom2は、真核生物、原核生物、又は哺乳動物のものにすることができる。加えて、本発明で用いるiRhom1及び/又はiRhom2は、ヒト、霊長類、齧歯類(例えば、マウス、ラット、モルモット)、ウシ、ウマ、ロバ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ブタ、ショウジョウバエ、C.elegans、又はE.coliに由来するものにすることができる。
【００５１】
野生型iRhomは、本明細書において、マウスiRhom2(SEQ ID No:1)、マウスiRhom1(SEQ ID No:3)、ヒトiRhom2(SEQ ID No:5)、及びヒトiRhom1(SEQ ID No:7)として例示される。iRhomの単離された突然変異配列は、本明細書において、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8として例示される。
【００５２】
当業者は、本明細書にSEQ ID NO:1乃至8として示した、iRhomポリペプチドをコードする核酸配列を容易に認識するであろう。遺伝コードの縮退の性質のため、2つ以上の核酸配列が特定のiRhomポリペプチド又は変異体をコードし、こうした核酸配列を発現させて、所望のiRhomを生成し得ると理解される。
【００５３】
iRhom1及びiRhom2変異体は、一般に、本願に記載した野生型iRhom1及びiRhom2の配列に対して、少なくとも50％、例として少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％の配列同一性を有する。
【００５４】
一態様において、本発明のiRhom変異体における変化、例えば、置換、挿入、又は欠失の数は、対応する野生型iRhom1又はiRhom2と比較して、1乃至20個であり、例えば、1乃至10個及び1乃至5個、例として1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個である。
【００５５】
作用機序
【００５６】
iRhomは、多様な種において様々な範囲の機能に関与し、これにはDrosophila melanogasterにおける上皮成長因子受容体(EGFR)シグナル伝達の制御、ヒト扁平上皮癌細胞の生存、哺乳類細胞株における小胞体膜からのミスフォールドタンパク質のクリアランス、初代マウスケラチノサイトにおける移動の誘導、マウスにおける可溶性TNFαの分泌、及びマウス胚性線維芽細胞における刺激ADAM17媒介メタロプロテアーゼ分断の基質選択性の制御が含まれる。
【００５７】
一実施形態において、本発明では、iRhom2のサイトゾルN末端ドメインの喪失により毛包の発生、創傷治癒、及び腫瘍形成に対する後続効果が生じるcurly bare(cub)突然変異の根底にあるのが、マウスにおけるRhbdf2遺伝子内での自発的な欠失であることを実証する。他の実施形態において、本発明では、iRhom2は短寿命タンパク質であるが、N末端における機能獲得型突然変異又はN末端の喪失は、EGFRリガンド、アンフィレグリン(AREG)のメタロプロテアーゼ非依存性分泌につながる変異タンパク質安定性を増加させることを実証する。cub表現型の遺伝的修飾因子(Mcub)を用いて、本発明では、AREGがiRhom2の生理学的標的であることを実証する。更に他の実施形態において、AREG分泌に必要なiRhom2のペプチダーゼドメイン内の重要なアミノ酸(H、C、Q、H)が同定され、この疑酵素のペプチダーゼドメインが、推定活性部位におけるセリン残基の欠如にも拘わらず機能性となり得ることが示される。
【００５８】
iRhomファミリーメンバーの突然変異型
【００５９】
本発明は、iRhomファミリーメンバーの突然変異型にも関する。一実施形態において、iRhom1又はiRhom2のサイトゾルN末端が欠失する。サイトゾルN末端の欠失は、iRhomポリペプチドのペプチダーゼドメイン内の休眠状態のタンパク質分解部位を活性化する。一実施形態において、iRhom1又はiRhom2のサイトゾル末端は、膜貫通ドメインがタンパク質分解活性を有するように切断される。一実施形態において、マウスiRhom1が残基1と272との間で切断され、及び/又は、ヒトiRhom1が残基1と316との間で切断され、膜貫通ドメインがタンパク質分解活性を有するようになる。他の実施形態において、マウスiRhom2が残基1と268との間で切断され、及び/又は、ヒトiRhom2が残基1と298との間で切断され、膜貫通ドメインがタンパク質分解活性を有するようになる。
【００６０】
iRhomポリペプチドは、膜貫通ドメインのタンパク質分解部位において突然変異を含んでもよい。一実施形態において、マウスiRhom2ポリペプチドは、TMヘリックス2上のヒスチジン635、TMヘリックス4上のグルタミン695、膜貫通ヘリックス4上のシステイン701、及びヒスチジン744からなる群から選択される膜貫通ドメインのタンパク質分解部位(ペプチダーゼドメイン)において1つ以上の重要なアミノ酸の突然変異を含み、膜貫通ドメインがタンパク質分解活性を有するようになる。他の実施形態において、ヒトiRhom2ポリペプチドは、TMヘリックス2上のヒスチジン664、TMヘリックス4上のグルタミン724、膜貫通ヘリックス4上のシステイン730、及びTMヘリックス6上のヒスチジン773からなる群から選択される膜貫通ドメインのタンパク質分解部位において1つ以上の突然変異を含み、膜貫通ドメインがタンパク質分解活性を有するようになる。
【００６１】
スクリーニングアッセイ
【００６２】
本発明は、iRhomポリペプチド、例えば、iRhom1又はiRhom2の活性を変化させる化合物を同定する方法を提供する。iRhomポリペプチドは、変異体iRhomポリペプチドであってよい。例えば、iRhomポリペプチドは、そのN末端細胞質ドメインにおいて欠失を含み得る。iRhomポリペプチドは、膜貫通ペプチダーゼドメイン内に突然変異を含み得る。加えて、iRhomポリペプチドは、そのN末端細胞質ドメインにおける欠失と、膜貫通ペプチダーゼドメイン内の突然変異とを含み得る。
【００６３】
一態様において、本発明の方法は、一般に、基質に対するiRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を活性化する化合物を同定することを含む。一実施形態において、方法は、iRhomポリペプチドを発現する細胞を試験化合物に接触させることと、適切な対照と比較したiRhomポリペプチドの安定性の増加を決定することと、を含み、iRhomポリペプチドの安定性の増加は、化合物が、基質に対するiRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を活性化したことを示す。一実施形態において、基質は、EGFRリガンド又はEGF様基質にしてよい。
【００６４】
他の態様において、本発明の方法は、一般に、基質に対するiRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を阻害する化合物を同定する方法を含む。一実施形態において、方法は、iRhomポリペプチドを発現する細胞を試験化合物に接触させることと、適切な対照と比較したiRhomポリペプチドの生理学的標的の分泌の減少又は適切な対照と比較したEGFR活性の減少を決定することと、を含み、iRhomポリペプチドの生理学的標的の分泌の減少又はEGFR活性の減少は、化合物が基質に対するiRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を阻害することを示す一実施形態において、基質は、EGFRリガンド又はEGF様基質にしてよい。
【００６５】
上皮成長因子受容体(EGFR)シグナル伝達は、哺乳類細胞の成長、増殖、及び分化において大きな役割を果たすと考えられている。本発明により、iRhomsは、短寿命タンパク質であるものの、優性突然変異により、そのタンパク質安定性が増加し、特異的EGFファミリーリガンドであるアンフィレグリンの分泌を、メタロプロテアーゼ活性に依存せず刺激することが明らかとなる。本発明は、創傷治癒の加速を促進し、腫瘍形成を引き起こすEGFRシグナル伝達事象を制御する上での哺乳類iRhomの意義を実証する。本発明は、更に、iRhomがメタロプロテアーゼと並行してEGFRシグナル伝達を制御し得ることを提供する。したがって、本発明は、iRhomを創傷治癒不良及び癌における新規の治療標的として用いるための新たな戦略を提供する。
【００６６】
本発明の様々な態様は、スクリーニング及びアッセイの方法及び手段と、それにより同定される物質とに関し、例えば、基質に対するiRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を活性化又は阻害する化合物のためのアッセイに関する。基質は、EGFRリガンド又はEGF様基質である。
【００６７】
他のアッセイは、iRhomポリペプチドと相互作用又は結合し、そのタンパク質分解活性を調節する、即ち、増加させる、刺激する、減少させる、阻害する、又は消失させる化合物又は物質のためのものである。
【００６８】
対照は、当該技術分野において周知であり、当業者は、適切な対照を容易に認識し、本発明の方法に適切な対照を日常の実験のみで決定することができるであろう。
【００６９】
iRhomポリペプチドを発現する細胞を試験化合物に接触させることと、iRhomポリペプチドの活性に対する試験化合物の効果を決定することとを含む本発明の態様によるiRhomポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する方法の態様によれば、適切な対照は、同一又は類似条件下でiRhomポリペプチドを発現する細胞を試験化合物に接触させない場合のiRhomポリペプチドの活性を決定している。
【００７０】
適切な対照は、iRhomポリペプチドの活性、iRhomポリペプチドの安定性レベル、iRhomポリペプチドの生理学的標的の分泌レベル、適切な対照と比較したEGFR活性のレベル、及び/又は可溶性EGFRリガンド等の基準レベルなどの変数の参照レベルであってよく、当該参照レベルは、予め決定され印刷物又は電子媒体に保存され、呼び戻されて、iRhomポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する本発明の方法の一態様に従って、iRhomポリペプチドの活性に対する試験化合物の決定された効果と比較される。
【００７１】
Rhomポリペプチドのモジュレータを同定するためのアッセイ方法は、本明細書に記載のiRhomポリペプチドと試験化合物とを接触させることと、試験化合物のiRhomポリペプチドに対する結合を決定することと、iRhomポリペプチドに結合する試験化合物の存在及び不在下でのiRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を決定することとを含み得る。タンパク質分解活性は、以下に記載されるように基質の切断を決定することによって決定し得る。iRhomポリペプチドは、単離されていても、リポソーム又は細胞に含まれていてもよい。
【００７２】
iRhomポリペプチドの活性を調節する物質/化合物をスクリーニング及び/又は取得する方法は、1つ以上の試験物質又は化合物をiRhomポリペプチドと適切な反応媒体中で接触させることと、処理されたポリペプチドの活性を決定することと、その活性を、試験物質又は物質群により処理されていない同等の反応媒体中のポリペプチドの活性と比較することとを含み得る。iRhomポリペプチドは、単離された形態の反応媒体中に存在してもよく、又はリポソーム又は細胞に含まれていてもよい。
【００７３】
処理済み及び未処理のiRhomポリペプチド間の活性の差は、関連する試験物質又は物質群の調節効果、例えば、阻害又は増強効果を示す。
【００７４】
iRhomポリペプチドの活性は、タンパク分解性に切断された基質の生産を決定することにより決定し得る。iRhomポリペプチドは、例えば、膜結合基質に作用して、検出される可溶性産物を生成し得る。
【００７５】
本発明の他の態様によれば、iRhomポリペプチドのモジュレータを同定及び/又は取得するためのアッセイ方法が提供され、この方法は、(a)iRhomポリペプチドと試験化合物とを、ポリペプチド基質の存在下で接触させることと、(b)ポリペプチド基質のタンパク質切断を決定することとを含む。
【００７６】
基質の切断は、試験化合物の存在下及び/又は不在下で決定し得る。試験化合物の不在下に対する試験化合物の存在下での切断の差は、試験化合物がiRhomプロテアーゼ活性のモジュレータであることを示し得る。
【００７７】
iRhomポリペプチドによりタンパク分解性に切断される任意のポリペプチド基質は、本明細書に記載のアッセイ方法において使用し得る。このような基質は、標準的な手法を用いて容易に同定される。ポリペプチド基質は、AREG又はHB-EGF等のEGFRリガンドであってよい。
【００７８】
適切な基質は、緑色蛍光タンパク質(GFP)、ルシフェラーゼ又はアルカリホスファターゼ等の検出可能な標識を含み得る。これにより、可溶性切断産物の簡便な検出が可能となり、自動化アッセイにおいて特に有用となる。
【００７９】
本アッセイでの使用に適したEGFRリガンドは、当該技術分野において十分に特徴付けられており、1つ以上の上皮成長因子(EGF)ドメイン及び単一の膜貫通ドメインを含む構造を有し得る。
【００８０】
好ましくは、適切なEGFRリガンドは、脊椎動物EGFRリガンドに対して50％を超える相同性、60％を超える相同性、70％を超える相同性、80％を超える相同性、90％を超える相同性、又は95％を超える相同性を有する。
【００８１】
キメラリガンドは、本明細書に記載の方法において特性が向上する場合があり、例えば、より効率的にiRhomポリペプチドにより切断される場合、分泌特性が向上する場合、又はより容易に検出される場合がある。
【００８２】
本発明の他の態様は、2つ以上のEGFRリガンドからの配列を含むキメラEGFRリガンドを提供し、例えば、キメラリガンドは、第1のEGFRリガンドの膜貫通ドメインと、第2のEGFRリガンドの細胞内及び細胞外ドメインとを含み得る。キメラ基質は、更に、ルシフェラーゼ、GFP、又はアルカリホスファターゼ等の検出可能な標識を含んでもよい。
【００８３】
本発明によるiRhom活性のモジュレータを取得又は同定するためのアッセイ方法又は他の方法は、インビボ細胞アッセイ又はインビトロ非細胞アッセイとなり得る。
【００８４】
方法は、バチマスタットの存在下で、ロンボイド以外又はiRhom以外に依存する基質の分断を阻害し、これによりバックグラウンドを減少させるように実施し得る。
【００８５】
インビトロアッセイにおいて、iRhomポリペプチドは、単離されていても、又はリポソーム中に含まれていてもよい。リポソームに基づくアッセイは、当該技術分野で周知の方法を用いて実施し得る。
【００８６】
インビトロアッセイに適した細胞型には、哺乳動物細胞、例えばマウス胚性線維芽細胞、ケラチノサイト、HEK293、CHO、HeLa、及びCOS細胞が含まれる。
【００８７】
本発明のインビトロ又はインビボアッセイに全長タンパク質全体を使用する必要はない。全長タンパク質の活性を保持する、本明細書に記載のポリペプチドフラグメントは、当業者に公知である任意の適切な形で生成及び使用することができる。断片を生成する適切な方法には、限定では無いが、コードするDNAからのフラグメントの組換え発現が含まれる。このようなフラグメントは、コードするDNAを取り出し、発現される部分の何れかの側の適切な制限酵素認識部位を同定し、その部分をDNAから切り取ることにより生成し得る。この部分は、その後、標準的な市販の発現系において、適切なプロモータに対して適切に作用可能に連結し得る。他の組換え手法は、適切なPCRプライマーによりDNAの関連部分を増幅することである。小さなフラグメント(例えば、アミノ酸約20又は30個まで)も、当該分野において周知のペプチド合成方法を用いて生成し得る。
【００８８】
本発明のアッセイの正確なフォーマットは、当業者が日常的な技能及び知識を用いて変更し得る。例えば、ポリペプチド間の相互作用は、検出可能な標識で一方を標識し、それを固体支持体上に不動化した他方と接触させることにより、インビトロで研究し得る。適切な検出可能標識には、組換え生産されたペプチド及びポリペプチドに組み込み得る35Sメチオニンが含まれる。組換え生産されたペプチド及びポリペプチドは、抗体により標識可能なエピトープを含む融合タンパク質として発現させ得る。
【００８９】
組換えタンパク質のN末端又はC末端の何れかに6個のヒスチジン残基を組み込んだ融合タンパク質を生成し得る。このようなヒスチジンタグは、ニッケル又はコバルトの何れかの金属イオンを含む市販のカラムを用いてタンパク質の精製に使用し得る。これらのタグは、6個のヒスチジン残基を対象とする市販のモノクローナル抗体を用いてタンパク質を検出するのにも役立つ。
【００９０】
本発明によるアッセイは、インビトロアッセイの形態を取り得る。インビトロアッセイは、関連するポリペプチド又はペプチドが細胞に導入された1個以上のベクタから発現される酵母株、昆虫細胞株、又は哺乳動物細胞株等の細胞株において実施し得る。
【００９１】
このような実施形態によるアッセイ及び他の方法では、iRhomポリペプチドを、EGFRリガンド等の基質の存在下で試験化合物に接触させ得る。そのような方法において、iRhomポリペプチド及び基質は、細胞内に存在し得る。これは、例えば、形質転換により細胞に導入された1つ以上の発現ベクタからポリペプチドを発現させることにより達成し得る。
【００９２】
したがって、iRhomタンパク質分解活性のモジュレータを同定及び/又は取得するためのアッセイ方法は、(a)iRhomポリペプチド及び試験化合物をEGFRリガンドポリペプチドの存在下で接触させることと、(b)EGFRリガンドの切断を決定することと、を含む。
【００９３】
切断は、試験化合物の存在下及び不在下で決定し得る。試験化合物の不在下と比較した、存在下での切断の差は、化合物がモジュレータ、即ちiRhom活性の増強剤又は阻害剤であることを示す。
【００９４】
上述したiRhomポリペプチド及び/又はポリペプチド基質をコードする核酸は、複製可能なベクタ、特に、コードされたポリペプチドが適切な条件下で発現され得る任意の発現ベクタの一部、及びこのようなベクタ又は核酸を含む宿主細胞として提供し得る。これに関連する発現ベクタは、対象のポリペプチドをコードする核酸と、ポリペプチドの発現に適した調節配列とを含む、インビトロ発現系内、例えば網状赤血球ライセート内、又はインビボ、例えば、HEK、COS、又はCHO細胞等の真核細胞又はE.coli等の原核細胞内の核酸分子である。これについては更に後述する。
【００９５】
コンビナトリアルライブラリ技術は、ポリペプチドの活性を調節する能力について、膨大な数となり得る様々な物質を試験する効率的な方法をもたらす。活性の調節に関するスクリーニング前又はスクリーニング中に、ポリペプチドと相互作用する能力について、例えば酵母ツーハイブリッド系(ポリペプチドと被験物質との両方が、コードする核酸から酵母において発現可能である必要がある)において、試験物質をスクリーニングしてもよい。これは、ポリペプチドの活性を調節する実際の能力について物質を試験する前に、粗いスクリーンとして使用し得る。
【００９６】
本発明のアッセイに付与し得る被験物質又は化合物の量は、通常、使用される化合物の種類に応じて試行錯誤により決定される。一般には、約0.01乃至100nM、例えば0.1乃至10nMの推定阻害剤又は活性剤化合物濃度を使用し得る。細胞に基づくアッセイを利用する場合、試験物質又は化合物は、iRhomポリペプチドにアクセスするために、膜透過性であることが望ましい。
【００９７】
試験化合物は、薬物スクリーニングプログラムで用いられる天然又は合成化学化合物にしてよい。特徴付けされた又は特徴付けられていない幾つかの成分を含む植物の抽出物を用いてもよい。更なるクラスの推定阻害剤又は活性剤化合物を、iRhomポリペプチド及び/又は結合するリガンドから誘導することができる。5乃至40個のアミノ酸、例えば6乃至10個のアミノ酸の膜透過性ペプチドフラグメントを、このような相互作用又は活性を破壊する能力について試験し得る。
【００９８】
一実施形態において、iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を調節する(例えば、増加又は減少させる)化合物は、小分子化合物となり得る。他の実施形態において、化合物は、細胞透過性である。例えば、化合物は、ユビキチンプロテアーゼ阻害剤であってよい。他の実施形態において、化合物は、細胞浸透性ペプチドに付着する。細胞浸透性ペプチドは、リジン又はアルギニンリッチ配列を含み得る。例えば、細胞浸透性ペプチドは、tatであり得る。
【００９９】
他の試験化合物は、ポリペプチド又はペプチドフラグメントの3次元構造をモデル化し、合理的薬物設計を用いて潜在的な阻害剤化合物に特定の分子形状、サイズ、及び電荷特性を与えることに基づくものにし得る。
【０１００】
ポリペプチド活性を調節する、又はこれに影響する物質の同定後、物質を更に精査し得る。更に、薬剤、医薬組成物、又は薬物等の組成物の調製、即ち製造又は製剤において、製造及び/又は使用し得る。これらは個体に投与し得る。
【０１０１】
本発明の他の態様は、iRhomタンパク質分解活性のモジュレータ、例えば阻害剤を取得又は同定する方法における、本明細書に記載のiRhomポリペプチドの使用を提供する。また、ポリペプチド基質の膜貫通ドメインのタンパク質切断におけるiRhomポリペプチドの方法及び使用も提供される。
【０１０２】
iRhom活性のモジュレータ、特に阻害剤は、癌、例えば食道、肺、脳、結腸、腎臓、前立腺、皮膚、肝臓、膵臓、胃、子宮、卵巣、リンパ腺、又は膀胱の癌の治療に有用となり得る。
【０１０３】
iRhom活性のモジュレータ、特に活性剤は、皮膚、肝臓、心臓、筋肉、又は腎臓等の組織における、不良な創傷治癒の促進において有用となり得る。
【０１０４】
iRhom活性のモジュレータは、更に、関節リウマチ及び自己免疫疾患等の炎症性障害又は疾患の治療に有用となり得る。
【０１０５】
したがって、本発明は、様々な態様において、本明細書の開示内容に従ってiRhom活性のモジュレータとして同定された物質だけでなく、このような物質を含む医薬組成物、薬剤、薬物、又は他の組成物と、例えば癌、冠動脈アテローム性硬化、乾癬、創傷治癒、発毛、脱毛の治癒及び/又は矯正等のErbB又はEGF受容体活性異常に関連する病原性感染又は状態の治療(予防的処置を含む得る)のために、このような組成物を患者に投与することを含む方法と、例えば癌、冠動脈アテローム性硬化、乾癬、創傷治癒、発毛、脱毛の治癒及び/又は矯正等のErbB又はEGF受容体活性異常に関連する病原性感染又は状態の治療のために投与する組成物の製造における、このような物質の使用と、このような物質を医薬的に許容可能な賦形剤、ビヒクル、又は担体、及び任意に他の成分と混合することを含む、医薬組成物の製造方法とにまで及ぶ。
【０１０６】
本明細書に記載のアッセイを用いてポリペプチド又はプロモータ機能のモジュレータとして同定された物質は、本質的にペプチド又は非ペプチドとなり得る。非ペプチド「小分子」は、多くのインビボでの医薬用途において好適となる場合が多い。したがって、物質(特にペプチドの場合)のミメティック又は模倣物を、医薬用途のために設計し得る。
【０１０７】
公知の医薬的活性化合物に対するミメティックの設計は、「リード」化合物に基づく医薬品の開発に対する公知のアプローチである。これは、活性化合物の合成が困難若しくは高価である時又は特定の投与方法に適さない時に望ましい場合がある。
【０１０８】
ミメティックの設計、合成、及び試験を用いて、標的特性について多数の分子をランダムにスクリーニングすることを回避し得る。
【０１０９】
iRhomファミリーのポリペプチドの必須触媒残基は、マウスiRhom2ポリペプチドのTMヘリックス2上のヒスチジン635、TMヘリックス4上のグルタミン695、TMヘリックス4上のシステイン701、及びTMヘリックス6上のヒスチジン744に対応する。iRhomファミリーにおけるポリペプチドの必須触媒残基は、更に、ヒトiRhom2ポリペプチドのTMヘリックス2上のヒスチジン664、TMヘリックス4上のグルタミン724、TMヘリックス4上のシステイン730、及びTMヘリックス6上のヒスチジン773に対応する。
【０１１０】
本発明によるポリペプチドの活性を調節することが可能な化合物、ポリペプチド、ペプチド、又は物質は、例えば、その内容物を外部環境から保護する適切な容器に密封されたキットにおいて提供し得る。このようなキットは、使用説明書を含み得る。
【０１１１】
個体に投与すべき本発明によるポリペプチド、抗体、ペプチド、核酸分子、小分子、又は他の医薬的に有用な化合物であるかにかかわらず、投与は、好ましくは、「予防有効量」又は「治療有効量」(場合により、予防は治療と見做し得る)で行われ、これは個体に対する恩恵を示すのに十分なものとなる。実際の投与量、及び投与の速度及び経時変化は、治療されるものの性質及び重症度により決まる。治療の処方、例えば、投与量の決定等は、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内にある。
【０１１２】
組成物は、単独で又は他の治療と組み合わせて、治療対象の状態に応じて同時に又は連続して投与し得る。
【０１１３】
本発明の化合物
【０１１４】
iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を変化させる化合物
【０１１５】
本発明の化合物又は試験化合物は、iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を変化させ得る。一実施形態において、化合物は、iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性の活性剤又は阻害剤を含む。
【０１１６】
一実施形態において、化合物は、iRhomポリペプチドに結合する小分子である。他の実施形態において、化合物は、iRhomポリペプチドの活性を阻害する小分子である。更に他の実施形態において、化合物は、iRhomポリペプチドの活性を活性化する小分子である。これらの小分子は、例えば、ペプチド、ペプチドミメティック、有機化合物等を含み得る。一実施形態において、小分子化合物は原形質膜を介して移動し、iRhomポリペプチドと相互作用することが可能である。一部の実施形態において、小分子化合物は、iRhomポリペプチドの細胞質尾部と相互作用する。他の実施形態において、小分子化合物は、iRhomポリペプチドのタンパク質分解ドメインと相互作用する。
【０１１７】
一実施形態において、化合物はユビキチナーゼ阻害剤である。
【０１１８】
別の実施形態において、iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を変化させる化合物は、例えば、iRhom DNA又はmRNAに対するmiRNA、siRNA、shRNA、dsRNA、若しくはアンチセンスRNA、又はmiRNA、siRNA、shRNA、dsRNA、若しくはアンチセンスRNAをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むベクタを含み得る。更に他の実施形態において、iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を変化させる化合物には、例えば、抗体、抗体フラグメント、ペプチド又はポリペプチドデコイが含まれる。追加の化合物は、コンビナトリアルケミストリの阻害剤ライブラリからスクリーニングにより同定した後、化学変成により更に最適化し得る。
【０１１９】
他の実施形態において、化合物は、更に細胞透過性ペプチドを含む。一態様において、細胞透過性ペプチドは、HIV-TATペプチドを含む。
【０１２０】
医薬組成物
【０１２１】
iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を変化させる本発明の化合物は、医薬組成物を用いて投与し得る。適切な医薬組成物は、本明細書に記載の化合物(又はその医薬的に許容可能な塩若しくはエステル)の何れか1つを含み、医薬的に許容可能な担体を任意に含む。特定の実施形態において、これらの組成物は、更に、1つ以上の付加的な治療剤を任意に含む。
【０１２２】
許容可能な「医薬担体」は、当業者に周知であり、限定では無いが、リン酸緩衝化生理食塩水、水、及び油-水エマルション等のエマルション、並びに様々な種類の湿潤剤等、標準的な医薬担体のいずれかを含むことができる。
【０１２３】
本明細書での使用において、「医薬的に許容可能な塩」は、適切な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギ反応等なしに、ヒト及び下等動物の組織と接触させて用いるのに適した塩であって、妥当な利益/リスク比に見合うものを示す。アミン、カルボン酸、及び他の種類の化合物の医薬的に許容可能な塩は、当該技術分野において周知である。例えば、S.M. Berge, et al.は、出典を明記することにより本願明細書の一部とするdescribe pharmaceutically acceptable salts in detail in J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19 (1977) において医薬的に許容可能な塩について詳述している。塩は、本発明の化合物の最終的な単離及び精製中に原位置で、又は遊離塩基若しくは遊離酸官能基を適切な試薬と反応させることにより別個に、以下に概要を記載したように調製することができる。
【０１２４】
例えば、遊離塩基官能基を適切な酸と反応させることができる。更に、本発明の化合物が酸性部分を有する場合、その適切な医薬的に許容可能な塩は、アルカリ金属塩、例えばナトリウム塩又はカリウム塩、及びアルカリ土類金属塩、例えばカルシウム塩又はマグネシウム塩等の金属塩を含み得る。医薬的に許容可能な非毒性の酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、及び過塩素酸等の無機酸、又は酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、又はマロン酸等の有機酸により形成された、又はイオン交換等の当該技術分野で使用される他の方法を用いて形成されたアミノ基の塩である。他の医薬的に許容可能な塩には、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、ショウノウスルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、2-ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3-フェニルプロピオン酸、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等が含まれる。代表的なアルカリ又はアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等が含まれる。適切である場合、他の医薬的に許容可能な塩には、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、低級アルキルスルホン酸塩、及びアリールスルホン酸塩等の対イオンを用いて形成される非毒性アンモニウム、第4級アンモニウム、及びアミンカチオンが含まれる。
【０１２５】
本明細書で使用される「医薬的に許容可能なエステル」という用語は、インビボで加水分解するエステルであり、人体において容易に分解され親化合物又はその塩を残すものを含むエステルを示す。適切なエステル基は、例えば、医薬的に許容可能な脂肪族カルボン酸、特にアルカン酸、アルケン酸、シクロアルカン酸、及びアルカン二酸から誘導されたものを含み、各アルキル又はアルケニル部分が6個以下の炭素原子を有することが有利となる。特定のエステルの例には、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、アクリル酸塩、及びエチルコハク酸塩が含まれる。
【０１２６】
上述したように、医薬組成物は、医薬的に許容可能な担体を更に含み得る。このような担体には、特定の所望の剤形に適した、あらゆる溶媒、希釈剤又は他の液体ビヒクル、分散又は懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤又は乳化剤、保存剤、固体結合剤等が含まれる。Remington’s Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980) には、医薬組成物の製剤化に用いられる様々な担体及びその調製のための公知の手法が開示されている。任意の従来の担体媒体は、任意の望ましくない生物学的効果を発生させること、或いは医薬組成物の他の成分(群)と有害な形で相互作用すること等により、化合物に適合しない場合を除き、その使用は、本発明の範囲に含まれるものとする。医薬的に許容可能な担体の役割を果たすことが可能な材料の幾つかの例には、限定では無いが、ラクトース、グルコース、及びスクロース等の糖類、コーンスターチ及びジャガイモデンプン等のデンプン、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、及び酢酸セルロース等のセルロース及びその誘導体、トラガント末、麦芽、ゼラチン、タルク、カカオバター及び座剤ワックス等の賦形剤、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、及び大豆油等の油類、プロピレングリコール等のグリコール、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル等のエステル類、寒天、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム等の緩衝剤、アルギン酸、パイロジェンフリー水、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、並びにリン酸塩緩衝液と、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム等の他の無毒性の適合潤滑剤とが含まれると共に、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤及び芳香剤、防腐剤及び酸化防止剤も、処方者の判断により組成物中に存在させることが可能である。
【０１２７】
本発明において使用する組成物は、任意の濃度の所望の化合物を有するように製剤化し得る。一部の実施形態において、組成物は、iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を変化させる、少なくとも治療有効量の化合物を含むように処方される。治療有効量は、癌の治療、創傷治癒の加速、又は炎症状態の治療に十分な量等、投与条件下で所望の治療効果を達成するのに十分な量である。一部の実施形態において、組成物は、1つ以上の望ましくない副作用を引き起こさない量を含むように処方される。特定の実施形態において、組成物は、化合物が約1mg/mL乃至約20mg/mL、約1mg/mL乃至約15mg/mL、約1mg/mL乃至約10mg/mL、約2mg/mL乃至約9mg/mL、約3mg/mL乃至約8mg/mL、約4mg/mL乃至約7mg/mL、約4mg/mL乃至約6mg/mLの濃度で存在するように処方される。特定の実施形態において、組成物は、化合物が約5mg/mLの濃度で存在するように処方される。
【０１２８】
キット
【０１２９】
本発明は、更に、iRhomポリペプチドの活性を変化させて、対象者における創傷治癒を加速、癌を治療、又は炎症性疾患を治療する化合物の能力を予測するための、又は対象者の癌が化合物による治療に対して感受性を有するかを判断するための、組成物及びキットを提供する。これらのキットは、試料、例えば皮膚生検、腫瘍生検、又は血液試料を取得及び/又は調製するための試薬と、試料がiRhomタンパク質分解活性を示すかを判断するための試薬と、試料が遺伝子、例えばRhbdf1又はRhbdf2遺伝子の突然変異を示すかを判断するためのプローブ及び試薬と、試料が遺伝子、例えばRhbdf1又はRhbdf2遺伝子の野生型の配列を示すかを判断するためのプローブ及び試薬と、試料中のiRhomポリペプチドの半減期を決定するための試薬と、試料によるEGFRリガンドの分泌を決定するための試薬と、使用説明書とのうち1つ以上を含む。
【０１３０】
本発明のキットは、本発明の方法を実施するのに有用な追加的な成分を任意に含むことができる。一例として、キットは、相補性核酸のアニーリング又は特異的に結合するタンパク質との抗体の結合に適した流体(例えば、SSC緩衝液)、1つ以上の試料コンパートメント、本発明の方法の性能を説明する資料、正常細胞の試料、癌細胞の試料、創傷細胞の試料、炎症細胞の試料等を含み得る。
【０１３１】
適応症
【０１３２】
創傷治癒
【０１３３】
創傷治癒は、皮膚又は他の器官組織が損傷後に自己修復するプロセスである。一実施形態において、本発明は、iRhomポリペプチドのタンパク質分解部位を活性化することにより、対象者における創傷治癒を加速する化合物を同定するために使用し得る。
【０１３４】
本発明の方法は、対象者における創傷治癒を加速する化合物を同定するために使用し得る。一実施形態において、化合物は、創傷閉鎖が達成されるように創傷治癒を加速する。一実施形態において、創傷は、火傷、化学(例えば、アルカリ)火傷により生じる創傷、身体外傷による創傷、神経障害性潰瘍、褥瘡、静脈うっ血潰瘍、及び糖尿病性潰瘍等の開放皮膚創傷であり得る。
【０１３５】
別の実施形態において、本発明は、iRhomポリペプチドのタンパク質分解部位を活性化して被験体の創傷治癒を加速、促進、又は増強する化合物又は医薬組成物を提供する。
【０１３６】
一部の実施形態において、本発明は、iRhomポリペプチドのタンパク質分解部位を活性化して創傷の治癒を加速する、又は創傷環境若しくは創傷に近接した場所において細胞の1つ以上の特性を調節するための、上述又は本明細書の他の箇所に記載した化合物の何れかの使用を提供する。一部の実施形態において、本発明は、創傷環境又は創傷に近接した場所において、創傷の治癒を増強する、又は細胞の1つ以上の特性を調節するための、上述した組成物の使用を提供する。
【０１３７】
癌
【０１３８】
本発明の化合物は、対象者において癌を治療するために有用となり得る。本発明の化合物は、対象者において腫瘍増殖及び/又は腫瘍進行を減少させるのにも有用となり得る。
【０１３９】
一実施形態において、本発明は、対象者において腫瘍増殖及び/又は腫瘍進行を減少させること又は癌を治療することが可能な化合物を同定するために使用し得る。一実施形態において、化合物は、iRhomポリペプチドのタンパク質分解部位を阻害し、これによりiRhomポリペプチドの生理学的標的の分泌を減少させ、及び/又はEGFR活性を減少させることで、腫瘍増殖及び/又は腫瘍進行を低下させる。他の実施形態において、化合物は、iRhomポリペプチドのタンパク質分解部位を阻害し、これによりiRhomポリペプチドの生理学的標的の分泌を減少させ、及び/又はEGFR活性を減少させることで、癌を治療する上で有用となる。
【０１４０】
一部の実施形態において、iRhom2をコードする遺伝子であるRHBDF2(p.I186T、p.P189L、p.D188N)におけるミスセンス突然変異は、掌蹠及び口腔の角質増殖を特徴とするヒト食道癌による肥厚を発生させる場合がある。
【０１４１】
本発明の化合物は、様々な癌の治療に有用となり得る。一実施形態において、癌は、上皮癌である。他の実施形態において、癌は、食道、肺、脳、結腸、腎臓、前立腺、皮膚、肝臓、膵臓、胃、子宮、卵巣、乳房、リンパ腺、又は膀胱の癌である。
【０１４２】
本発明の化合物は、更に、様々な腫瘍の治療に有用となり得る。一実施形態において、腫瘍は、固形腫瘍である。
【０１４３】
炎症
【０１４４】
本発明の化合物は、対象者における炎症を減少させるのに有用となり得る。本発明の化合物は、炎症性疾患及び/又は障害の治療に有用となり得る。炎症性疾患及び/又は障害には、例えば、全身性エリテマトーデス(SLE)、ループス腎炎、クリオグロブリン血症、血管炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群、ブドウ膜炎、脊椎関節炎、流産、子癇前症、尋常性座瘡、喘息、自己免疫疾患、セリアック病、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む)、骨盤内炎症性疾患、再灌流損傷、関節リウマチ、サルコイドーシス、移植拒絶、血管炎、間質性膀胱炎、アテローム性動脈硬化、アレルギ、ミオパチ、白血球障害、多発性硬化症、及び癌が含まれる。
【０１４５】
一実施形態において、本発明は、対象者において炎症を低減すること又は炎症性障害を治療することが可能な化合物を同定するために使用し得る。一実施形態において、化合物は、iRhomポリペプチドの生理学的標的の分泌の減少及び/又はTNFαの分泌の減少が生じ、これにより炎症が減少するように、iRhomポリペプチドのタンパク質分解ドメインの活性を減少させる。他の実施形態において、化合物は、iRhomポリペプチドの生理学的標的の分泌の減少及び/又はTNFαの分泌の減少が生じるようにiRhomポリペプチドのタンパク質分解ドメインの活性を減少させることにより、炎症性障害又は疾患の治療において有用となる。更に他の実施形態において、本発明の化合物は、サイトゾルドメイン又は膜貫通ペプチダーゼドメインを標的とすることによってTNFαの分泌を減少させることにより、対象者において炎症を低減するのに有用となる。
【０１４６】
様々な試験を利用して、炎症性障害を治療する際の化合物の有効性を測定することができる。
【０１４７】
発毛
【０１４８】
本発明の化合物は、対象者における脱毛の治療及び/又は発毛の促進に有用となり得る。抜け毛又は脱毛(例えば、脱毛症)は、頭部又は身体からの毛の喪失である。脱毛は、一般的な抜け毛、男性型脱毛症、又は女性の抜け毛を示す場合がある。幾つかの種類の脱毛症は、円形脱毛症、自己免疫疾患により生じる場合がある。脱毛症の極端な形態には、全ての頭髪の喪失を伴う全頭脱毛症と、頭部及び身体からの全ての毛の喪失を伴う汎発性脱毛症とがある。
【０１４９】
一実施形態において、本発明は、cub突然変異が脱毛を引き起こすという発見に基づいている。他の実施形態において、本発明は、cubの修飾因子(Mcub)が発毛の促進、脱毛の治癒、脱毛の矯正、又は脱毛の低減を行うという発見に基づいている(実施例1)。
【０１５０】
一実施形態において、本発明は、対象者において発毛を促進することが可能な化合物を同定するために使用し得るものであり、iRhomポリペプチドを発現する細胞を試験化合物に接触させることと、適切な対照と比較したiRhomポリペプチドの生理学的標的の分泌の減少又は適切な対照と比較したEGFR活性の減少を決定することと、を含み、iRhomポリペプチドの生理学的標的の分泌の減少又はEGFR活性の減少は、化合物が対象者において発毛の促進が可能であることを示す。
【０１５１】
他の実施形態において、本発明は、対象者において脱毛の治癒及び/又は矯正が可能な化合物を同定するために使用し得るものであり、iRhomポリペプチドを発現する細胞を試験化合物に接触させることと、適切な対照と比較したiRhomポリペプチドの生理学的標的の分泌の減少又は適切な対照と比較したEGFR活性の減少を決定することと、を含み、iRhomポリペプチドの生理学的標的の分泌の減少又はEGFR活性の減少は、化合物が対象者において脱毛の治癒及び/又は矯正が可能であることを示す。
【０１５２】
本発明を以下の実施例により更に説明するが、これらの実施例は、限定的なものと解釈するべきではない。 本願の全体で引用される全ての参考文献、特許、及び公開特許出願の全内容は、出典を明記することにより本願明細書の一部とする。
【実施例】
【０１５３】
実施例1:cub突然変異は、EGFRシグナル伝達経路の過剰活性化につながる
【０１５４】
curly-bare(cub)と命名された劣性マウス突然変異は、無毛の表現型を特徴とする。cub/cub遺伝子型と組み合わせた優性Mcub対立遺伝子の単一コピーは、cub/cub mcub/mcubマウスの無毛の外被ではなく、完全な波状の外被をもたらす。我々は、cub/cub mcub/mcub遺伝子型が、細胞増殖及び細胞移動等、EGFRシグナル伝達が変化した状況に関連し得るかを調べた。
【０１５５】
cub/cub mcub/mcub及び対照(+/+ mcub/mcub)マウスから単離したマウス胚性線維芽細胞(MEF)に対して、増殖、細胞移動(スクラッチ創傷治癒)、及び免疫ブロットアッセイを行った。図1A乃至1Fは、cub突然変異が、皮膚の治癒と共に、EGFR関連細胞増殖及び移動を加速することを示す。
【０１５６】
cub/cub mcub/mcub MEFは、対照MEF(図1A及び1B)と比較して、増殖及び移動の速度が有意に高かった。これらの変化は、Akt、S6、mTOR、及びp38を含むEGFR経路の標準シグナル伝達タンパク質のリン酸化の有意な増加に関連していた(図1C)。更に、EGFRシグナル伝達の内在化及び構成的活性化を示す、cub/cub mcub/mcub MEFにおける細胞表面EGFRレベルの有意な低下が観察された(図1C)。
【０１５７】
EGFRシグナル伝達の増加が上皮増殖の変化に対応するかを試験するために、6乃至40週齢のcubマウスの耳に2mmの貫通穴を穿孔して、その後の期間に閉鎖率をモニタする創傷治癒アッセイを行った(図1D乃至1F)。14日以内に、cub/cub mcub/mcubマウスは、対照の+/+ mcub/mcub同腹仔と比較して、閉鎖の加速を示した。図9A及び9Bに示したように、+/cub mcub/mcubマウス(正常な外被を有する)は、対照マウスと比較して、損傷後14日でより速い治癒を示し(図9A及び9B参照)、単一の突然変異cub対立遺伝子がEGFRシグナル伝達の増加を引き起こすことが可能であることを示したが、毛包誘導を阻止する上で十分に高いレベルではなかった。これらのデータは、cub/cub mcub/mcub遺伝子型が、機能亢進EGFR表現型をもたらすことを示している。
【０１５８】
実施例2:cubは、iRhom2をコードするRhbdf2遺伝子の突然変異である
【０１５９】
次に、iRhom2遺伝子Rhbdf2を、cub突然変異の候補として調査した。cub/cubマウスのDNA配列決定により、エクソン2乃至6の喪失をもたらすRhbdf2遺伝子における12,681塩基対(bp)の欠失を同定した(図2A)。この欠失が異常なRhbdf2転写物を生み出すかを試験するため、エクソン2、5、12、及び19を増幅するように設計されたプライマーを用いて、野生型及びcub/cub mcub/mcub MEF由来のRNAに対して、逆転写酵素PCR(RT-PCR)を実施した。cub転写物は、エクソン12及び19を含むが、エクソン2及び5は欠如していた(図2B)。更に、cub/cub mcub/mcub及び+/+ mcub/mcubの皮膚からのRNAに対する定量的RT-PCR(qPCR)により増幅したcub転写物では、エクソン2乃至6は欠失していたが、残りのエクソンは発現しており、残りのcub遺伝子がcubマウスにおいて転写されることを示した(図2C)。cub転写産物がエクソン1から7へのスプライシングをもたらすかを試験するために、エクソン7に対してスプライスされたエクソン1を含む転写物のみを増幅するように特異的に設計されたプローブによりqPCRを行った。このプローブを用いて、+/+ mcub/mcubマウスには存在しないが、cub/cub mcub/mcubマウスに存在するPCR産物を検出した(図2D)。これらの発見により、cubは、Rhbdf2遺伝子の突然変異であることが確認され、以後、これをRhbdf2cubと呼ぶ。
【０１６０】
エクソン3の正常な翻訳開始部位がRhbdf2cub転写物に欠如していることから、次に、これらの突然変異転写物が変異iRhom2タンパク質を生産可能であるかを試験した。Rhbdf2cub DNAの配列分析により、次のインフレーム翻訳開始部位(ATG)が約63.5kDaのタンパク質をもたらすエクソン8にあることが明らかとなった。iRhom2に対する抗体が無かったため、全長野生型ヒトRHBDF2 cDNA(HuWt)と変異体Rhbdf2cub転写物(HuCub)を模倣したバージョンとの両方をC末端Flagタグ付き発現ベクタへクローニングすることにより、Rhbdf2cub転写物がインビトロでタンパク質を生産可能であるかを試験した。まず、免疫ブロッティングを用いて、HuWtクローンが約100kDaのタンパク質産物を生成する一方、HuCub突然変異体構築物は、約67kDaの産物を生成しており、タグ付きタンパク質の予想される分子量と一致すると判断した(図2E)。更に、HuWtクローン内にタンパク質産物の短縮の証拠は存在しなかった。次に、免疫染色を用いて、B6 MEF(図2F並びに図10A及び10B)をHuWt又はHuCubクローンの何れかによりトランスフェクションした後の両形態のタンパク質の局在パターンを調べた。どちらの形態も小胞体で発現し、ゴルジ又は核の何れにも染色は観察されず(図10A及び10B)、突然変異がタンパク質局在の変化につながらないことを示した。
【０１６１】
実施例3:遺伝的非相補性(genetic non-complementation)により、cubがRhbdf2遺伝子の突然変異対立遺伝子であり、機能獲得型突然変異であることが確認される
【０１６２】
Rhbdf2cubがヌル突然変異ではなく機能獲得型であるかを試験するために、我々は、lacZ発現が内因性Rhbdf2プロモータの制御下にあるノックアウトマウスプロジェクト(KOMP)リポジトリからのES細胞を用いて、Rhbdf2ノックアウト(Rhbdf2-/-)マウスを作成した(図3A)。Rhbdf2プロモータ駆動lacZ発現は、皮膚の表皮及び毛包の内外鞘層において主に観察された(図3B)。しかしながら、Rhbdf2cub/cubマウスで観察された創傷治癒(図3C)及び脱毛(図3D)表現型は、Rhbdf2-/-マウスでは見られず、それ以外は正常に見えた。Rhbdf2cub/cub及びRhbdf2-/-マウス間の対立遺伝子試験交配では、疎らな被毛を有する複合突然変異体(Rhbdf2-/cub)マウスが生じ(図3E)、遺伝的非相補性が示唆され、cubがRhbdf2遺伝子の突然変異対立遺伝子であることが確認された。加えて、Rhbdf2-/cub複合突然変異マウスの発毛レベルは、Rhbdf2cub/cubとRhbdf2+/+又はRhbdf2-/-マウスとの中間であり、Rhbdf2欠損ではなく、突然変異Rhbdf2cubタンパク質産物の発現が、Rhbdf2cub/cub表現型を発生させることが確認された。
【０１６３】
実施例4:Rhbdf2cub表現型の遺伝的修飾因子(Mcub)は、Areg遺伝子の機能喪失型突然変異である
【０１６４】
次に、Rhbdf2cub修飾遺伝子(Mcub)の根底にある突然変異をマッピングすることを目指した。Mcub突然変異の候補遺伝子座として、4つのEGFRリガンドコード遺伝子(Epng、Ereg、Areg、及びBtc)を調べた。Mcub/Mcub Rhbdf2cub/cubマウスの各遺伝子のエクソン及びフランキング領域の配列を決定することにより(表II参照)、Mcbが、図4Aの自己分泌ケラチノサイト成長因子アンフィレグリン(本明細書ではAREGと呼ぶ)をコードする遺伝子であるAregの機能喪失型突然変異であることを見出した。
【０１６５】
Mcbは、エクソン1の標準ドナースプライス部位を破壊するTからGへの点突然変異であり、22個の余分なヌクレオチドをAreg転写物に付加する代替下流スプライス部位の排他的使用につながり、これにより読み枠は破壊され、未成熟終止コドンが導入される(図11)。この突然変異を、以後AregMcubと呼ぶ。特に、機能亢進EGFRシグナル伝達(図12A)とRhbdf2cub/cubマウスの迅速創傷閉鎖能力とは、有意に減少し(図4B及び4C)、優性AregMcub対立遺伝子の単一コピーが存在する場合、脱毛表現型が防止された。優性AregMcub突然変異は、Rhbdf2cub/cubマウスに正常な被毛を与えず、代わりに波毛表現型を与え、EGFR経路に異常が残っていることを示した。
【０１６６】
次に、Rhbdf2cub/cub Areg+/+、Rhbdf2cub/cub AregMcub/Mcub、及びRhbdf2+/+ Areg+/+マウスにおけるAREGの血清レベルを測定した。Rhbdf2cub/cub AregMcub/Mcubマウスの血清では検出可能なAREGは見つからなかったが、Rhbdf2cub/cub Areg+/+マウスの血清AREGレベルは、Rhbdf2+/+ Areg+/+マウスと比較して劇的な増加が観察された(図4D)。
【０１６７】
Rhbdf2cub/cub Areg+/+、Rhbdf2cub/cub AregMcub/Mcub、及びRhbdf2+/+ Areg+/+マウスの培養マウス表皮ケラチノサイト(MEK)の上清AREGレベルの測定では、同様の結果が得られた(図4E)。AREGは、正常な皮膚で豊富に発現されているため、次に、Rhbdf2cub/cub Areg+/+、及びRhbdf2+/+ Areg+/+マウスからの皮膚試料に対してqPCRを実施して、Aregと、EGFRリガンドをコードすることが知られている他の6つの遺伝子(Egf、Tgfα、Btc、Epgn、Ereg、及びHbegf)との転写物レベルを測定した。対照と比較して、Rhbdf2cub/cub Areg+/+マウスでは、4倍の増加がAregにおいて、微少だが統計的に有意な増加がEpgn及びHbegf mRNAにおいて観察された。更に、Btc及びEgf転写物レベルは、統計的に有意に減少した(図4F)。
【０１６８】
最後に、AREGが機能亢進EGFR表現型を仲介するかを調べるために、レンチウイルスshRNAを用いて、Rhbdf2+/+、及びRhbdf2cub/cub MEFにおけるAregの発現のサイレンシングを行い(図12B)、増殖アッセイを行った。Aregのサイレンシングは、Rhbdf2+/+ MEFの増殖に対する影響は僅かだったが(図12C)、Rhbdf2cub/cub MEFの増殖速度は有意に減少した(図12D)。まとめると、これらのデータは、AREGレベルの亢進がEGFRシグナル伝達の増加を介して、Rhbdf2cub/cubマウスの突然変異表現型を仲介することを示唆している。更に、我々のデータから、Rhbdf2cub表現型がAregMcubの発現により修飾されることが明らかとなる。
【０１６９】
実施例5:N末端短縮iRhom2(Rhbdf2cub)のペプチダーゼドメインは、ADAM17に依存しないEGFRリガンドの基質特異的分泌を誘導する
【０１７０】
短いN末端ドメインを有するRhbdf2cubがメタロプロテアーゼ活性に依存せずにAREGの分泌を誘導することができるかを試験するために、ADAM17及びADAM10依存性の基質の分断を共に阻害することが可能な、強力な広域メタロプロテアーゼ阻害剤であるマリマスタット(MM)の存在下又は不在下でインビトロ切断アッセイを行った。マウス及びヒトRHBDF2遺伝子間の有意な相同性のため、293T細胞をヒトAREGにより単独で、又はヒト野生型(HuWt)又はヒトCub(HuCub)RHBDF2遺伝子(図5A)と共に、トランスフェクトし、馴化培地においてAREGレベルを測定した。MMが不在の場合、AREG発現及びAREG/HuCub同時発現細胞間にAREGレベルの差は観察されなかったが、HuWtとAREGとの同時発現は、AREGレベルを約60％低下させた(図5B)。MMの存在下では、HuWt及びAREG又はAREG単独でトランスフェクトした細胞と比較して、HuCub/AREGコトランスフェクト細胞では、AREGレベルが約2倍となった(図5B)。これらのデータは、N末端短縮iRhom2がAREG分泌を増強可能であることを示唆しており、これはメタロプロテアーゼ活性が減少した場合にのみ明らかとなる。
【０１７１】
ADAM17活性は、マウスにおいて、細菌内毒素であるリポ多糖(LPS)による刺激後に腫瘍壊死因子α(TNFα)の分泌を調べることにより測定することができる。このアプローチを用いて、Rhbdf2cub/cub、Rhbdf2-/-、及びRhbdf2+/+マウスにLPSを注入し、血清TNFαレベルを測定することにより、Rhbdf2cubマウスにおけるADAM17活性の変化を試験した。LPSを注射したRhbdf2cub/cub及びRhbdf2-/-マウスは共に、LPSを注射したRhbdf2+/+マウスと比較して、TNFαの誘導を著しく低下させることが分かった(図5C)。これらの結果は、ADAM17活性がRhbdf2cub/cub及びRhbdf2-/-において有意に減弱されることを示唆すると共に、ADAM17依存性のTNFα放出の制御におけるiRhom2のN末端ドメインの役割を意味している。特に、LPS刺激Rhbdf2cub/cubマウスにおける血清TNFαレベルは完全には抑止されておらず、これはADAM17活性が減弱はされるが、除去されなかったことを示している。Rhbdf2cub/cubマウスにおいてADAM17活性が減弱されるという観察は、Adam17-/-マウス又はアンフィレグリンを過剰発現するトランスジェニックマウスと比較したRhbdf2-/-及びRhbdf2cub/cubマウスにおける非致死性又は非炎症性の皮膚表現型を説明するものである。
【０１７２】
次に、他のEGF様基質に対する活性ロンボイドプロテアーゼのプロテアーゼ選択性と共に、これらがHuCubと異なるかを評価した。空ベクタをトランスフェクトした対照と比較して、RHBDL2は、EGFの分泌を選択的に増加させたが、AREG又はHB-EGFを選択的に増加させなかったことが分かった(図5D)。一方、HuCubは、空ベクタをトランスフェクとした細胞と比較して、AREG及びHB-EGFの分泌を選択的に増加させたが、EGFは選択的に増加させなかった(図5E乃至5G)。これらの結果は、ロンボイドペプチダーゼドメインが基質選択性を与えることを示唆している。EGFではなくAREGの分泌を誘導するN末端短縮iRhom1の能力は、この主張と一致する(図13A及び13B)。
【０１７３】
iRhom2ペプチダーゼドメインがEGF様基質の分泌の制御をどのように支援するかを判断するために、最初に、ヒト及びマウスiRhomsのペプチダーゼドメインのアミノ酸の配列をアラインメントした。ヒトiRhom2及びRHBDL2のペプチダーゼドメイン間のタンパク質配列相同性に有意差があることを見出した(図13C)。対照的に、iRhom1及び2のペプチダーゼドメインは、96％の相同性を示す。まとめると、これは、活性部位を形成する残基又は基質の認識において役割を果たす残基が、活性及び非活性ロンボイド間で有意に異なることを示唆している。更に、HuCubペプチダーゼドメインの欠失が、天然のHuCubと比較してAREG分泌を有意に減少させることを見出し(図5G)、これはペプチダーゼドメインがEGF様基質の分泌に必須であることを示している。重要な残基を同定するために、HuCubペプチダーゼドメイン内の重要な残基がアラニンに変異するような部位特異的突然変異誘発を行った。膜貫通ドメイン4のグルタミン426及びシステインC432、並びに膜貫通ドメイン2及び6のそれぞれのヒスチジン366及び475は、AREG/HB-EGFの分泌増強の媒介だけでなく、EGFの抑制にも極めて重要であることが分かった(図5H、5I)。しかしながら、セリンS362A、402A、及び425A、グルタミン酸E436A、及びグルタミンQ439Aの突然変異は、AREG分泌を変化させなかった(図13D)。まとめると、これらの結果は、N末端短縮iRhomのペプチダーゼドメインにおける重要な残基(図5J及び図13E)が、メタロプロテアーゼ活性に依存にしないEGF様基質の分泌を制御することを示唆している。
【０１７４】
実施例6:N末端短縮iRhom2(Rhbdf2cub)は、上皮癌に対する感受性を増加させる
【０１７５】
RHBDF2におけるミスセンス突然変異(p.1186T、p.P189L、及びp.D188N)は、食道癌症候群(TOC)による家族性肥厚の基盤となり得る。RHBDF2における優性N末端変異によるAREG分泌の増加が、こうしたヒトの病理学的変化をインビトロで引き起こすかを試験するために、AREGをヒトミスセンス突然変異(RHBDF2 p.I186T)、HuCub、又はHuWtを含むHuWtクローンと293T細胞において同時発現させた。RHBDF2 p.I186T又はHuCubの発現は、HuWtと比較して、馴化培地においてAREGのレベルが高くなり、細胞内レベルは低くなった(図6A及び6B)。更に、RHBDF2 p.I186Tは、HuCubにより生じたものと同等のAREGレベルを発生させ、iRhom2のN末端の喪失又は優性変異が、AREG分泌の増加につながることを示した。加えて、RHBDF2 p.I186T突然変異体のペプチダーゼドメインにおける4つの重要な残基(H、C、Q、及びH)の少なくとも1つの消失が、AREG分泌の有意な減少をもたらすことを見出した(図6C)。
【０１７６】
Rhbdf2cub対立遺伝子が腫瘍感受性を高めるかを判断するため、その発現がヒト家族性大腸腺腫症のマウスモデルであるApcMin/+マウスにおける腺腫形成に影響するかを調べた。ApcMin/+マウスにおいて、1つの野生型Apc対立遺伝子の自然欠失は、腸上皮腺腫形成と、日齢中央値169日での早期死亡とを誘発した。特に、Rhbdf2(図6D)及びAregの発現が小腸で観察され、潜在的な機能的関係が示唆された。ApcMin/+ Rhbdf2+/cub及びApcMin/+ Rhbdf2+/+マウスを発生させ観察したが、致死率の増加のため、意味のある比較に十分なApcMin/+ Rhbdf2cub/cubマウスは生成できなかった。それにもかかわらず、ApcMin/+ Rhbdf2+/+(172日)及びApcMin/+ Rhbdf2+/cub(135日)マウスの生存日齢中央値には有意な差が観察された(図6E)。3ヶ月齢のApcMin/+ Rhbdf2+/+及びApcMin/+ Rhbdf2+/cubマウスの剖検により、単一Rhbdf2cub対立遺伝子の存在が、ApcMin/+マウスにおいてポリープの数(図6F及び6G)及び腺腫のサイズ(図6F及び6H)を有意に増加させることが明らかとなり、cub突然変異が上皮性腫瘍増殖を増加させることが示された。しかしながら、2歳までの年齢のRhbdf2cub/cubマウスにおいて、癌は自然発生しておらず、Rhbdf2cub突然変異が腫瘍形成を導く環境を形成するが、これを単独では引き起こさないことが示された。
【０１７７】
実施例7:RHBDF2遺伝子のサイトゾルN末端の喪失又はN末端における優性突然変異は、そのタンパク質安定性を増加させる
【０１７８】
iRhom2は、プロテアソーム経路によるEGF様リガンドの分解を促進することにより、EGFRシグナル伝達を負に調節する。我々は、サイトゾルN末端が欠如している場合、iRhomがAREG/HB-EGFの分泌を誘導すると判断した(図5)。iRhom2のアミノ末端の機能獲得型突然変異がプロテアソームのプロセシングに干渉することにより、その安定性を増加させるかを試験するため、肥厚型のRHBDF2突然変異p.I186Tが、AREGと相互作用する能力を有するかを調べた。HuWt及びHuCubと同様に、p.I186TがAREGと物理的な複合体を形成することを見出した(図7A)。次に、293T及びCOS7細胞におけるHuWt、HuCub、及びp.I186Tのタンパク質発現レベルを、免疫細胞化学及びフローサイトメトリーにより比較した。HuWtタンパク質発現が、HuCub及びp.1186Tの両方と比較して有意に低いことが観察された(図7B、7C)。更に、表示した時間に亘りCOS7細胞に対してシクロヘキサミド(タンパク質合成阻害剤)による追跡を行った際には、1時間以内に、HuCub又はpI186Tの何れかと比較して、HuWtについて免疫反応性の略50％の低下が観察された(図7D、7E)。
【０１７９】
iRhom2がプロテアソーム分解の標的であるかを試験するために、強力なプロテアソーム阻害剤MG-132の存在下でのHuWt及びHuCubのタンパク質半減期を決定した。予想通り、HuCubではなくHuWtのタンパク質半減期が有意に増加し(図7F)、iRhom2のプロテアソーム分解がそのタンパク質安定性に影響を与え得ることが示された。我々は、iRhom2のアミノ末端におけるミスセンス突然変異が、Rhbdf2cub突然変異と同様に、その安定性を増加させ、メタロプロテアーゼ活性に依存しないAREG分泌の増強に寄与すると結論付ける。
【０１８０】
実施例8
【０１８１】
我々は、ショウジョウバエにおけるEGFRシグナル伝達の制御因子として周知のロンボイドプロテアーゼファミリーの一員であるiRhom2が、皮膚の治癒及び腫瘍形成中のEGFRシグナル伝達を制御する能力を有することを報告する。iRhom2がN末端ドメインにおける選択突然変異により、その安定性を増加させることが可能な短寿命タンパク質であることを示す。次に、これらの安定変異体は、メタロプロテアーゼ活性に依存しないAREG分泌を増強する機能を果たす。我々は、EGFR依存性の細胞増殖及び創傷治癒におけるiRhomの重要な役割を特定し、適正な状況下でEGFRシグナル伝達を増加させるiRhom2突然変異が癌発生をどのように促進することが可能かを示す。
【０１８２】
N末端及びペプチダーゼドメインは、EGFRシグナル伝達の制御において別個の機能を有する
【０１８３】
iRhomは、長いサイトゾルN末端、休眠状態のペプチダーゼドメイン及び保存されたiRhom相同ドメイン(IRHD)を含む複雑なマルチドメイン酵素であり、これらのドメインの機能は未だに知られていない。通常の状況下において、iRhomは、EGF様基質の分解を促進することによって、EGFRシグナル伝達を負に調節する。しかしながら、Rhbdf2cub突然変異は、単に機能喪失型突然変異である可能性は低い。Rhbdf2-/-マウスは、Rhbdf2cub表現型を再現できなかった。加えて、我々は、Rhbdf2cub突然変異と同様に、iRhom2のN末端における優性ミスセンス突然変異が、AREG及びHB-EGFの分泌を、ペプチダーゼドメインの膜貫通ヘリックス2、4、及び6の重要なアミノ酸により媒介される形で誘導することを実証している。したがって、我々の結果は、iRhom2のサイトゾルN末端が、ペプチダーゼドメインと、結果としてAREG/HB-EGFの分泌とを抑制することにより、EGFRシグナル伝達を負に調節することを示唆している(図8)。我々の発見は、更に、Rhbdf2cub等のN末端突然変異に隠されていた、より微細なiRhom2の調節機能を明らかにする。
【０１８４】
Rhbdf2cubは、機能獲得型突然変異と見做し得る。この結論は、いくつかの証拠により裏付けられる。第1に、Rhbdf2-/-マウスは、Rhbdf2cub突然変異と組み合わせた場合を除き、明白な「EGFR機能亢進」表現型を示さないため、iRhom2の負の調節的役割は最小限であると思われる。第2に、HuCub及びAREGのコトランスフェクションは、HuWt及びAREG又はAREG単独のトランスフェクションと比較して、略2乃至3倍高いレベルのAREGをもたらす。第3に、HuCubの発現は、メタロプロテアーゼ活性に依存せずに、膜アンカAREG及びHB-EGFの分泌を誘導した。第4に、突然変異iRhom2対立遺伝子は、ペプチダーゼドメイン不在下でAREG/HB-EGFの分泌を誘導することができない。これらの観察と一致して、N末端短縮型であって、完全長ではないRHBDF1のトランスジェニック発現は、ショウジョウバエにおいて強力なEGFRシグナル伝達関連した翅表現型を誘導する。加えて、切断されたRHBDF1とHB-EGFとの同時発現は、ショウジョウバエにおける翅表現型の変化を増大させ、切断されたiRhom1がHB-EGFの分泌を誘発し、これによりEGFRシグナル伝達を活性化する可能性があることを示す。これらの結果は、サイトゾルN末端がEGFファミリーリガンドのiRhom誘発ユビキチンプロセシングに寄与する一方、iRhomペプチダーゼドメインがN末端により抑制されない場合にEGFRシグナル伝達を刺激するという概念を立証するものである。
【０１８５】
我々は、突然変異iRhom2対立遺伝子が、強力な広域メタロプロテアーゼ阻害剤であるマリマスタットの飽和濃度での存在下で、AREG及びHB-EGFの分泌を誘導することを見出した。ADAMファミリーの他のメンバーの成熟は、両方のiRhomの欠損に影響されない。更に、我々は、ADAM17活性が、Rhbdf2cubマウスにおいて減弱することを実証している。したがって、我々は、Rhbdf2cub及びチロシン突然変異は、メタロプロテアーゼ活性に依存しないAREG及びHB-EGFの分泌を選択的に誘導し、この機能には膜貫通ペプチダーゼドメインが必要であると結論付ける。
【０１８６】
機能亢進EGFR経路は、Rhbdf2cubマウスにおける皮膚治癒加速の根底にある
【０１８７】
創傷治癒は、生物学的に複雑である。ヒトにおいて、成人の創傷は、非機能性の線維化組織形成に対して脆弱であり、一方、出生前の創傷は、完全な再生を果たし、アホロートル及びプラナリア等の脊椎動物における瘢痕の無い治癒に類似している。
【０１８８】
組織再生及びリモデリングの分野は、未だに幼年期にある。ヒトケラチノサイト細胞株において実施されたインビトロ創傷治癒アッセイは、RHBDL2の発現が、無傷の対照と比較して、創傷後に有意に上方制御されることを示している。
【０１８９】
著しい瘢痕形成なしに創傷を迅速に治癒するRhbdf2cubマウスの能力は、減弱したADAM17活性によるTNFα分泌の減少と、AREG生産/EGFR機能亢進の増大により誘導される迅速な再上皮形成との組み合わせによるものである可能性がある。我々は、減少したTNFαが炎症の程度の低下に寄与する一方、AREGの生産増加が、Rhbdf2cubマウスにおけるケラチノサイトの増殖及び創傷部位への移動の加速を促進するということを提案する。更に、iRhom2は、主に皮膚において発現され、皮膚創傷治癒不良において潜在的な新規の治療標的となる。
【０１９０】
iRhom2-AREG-EGFR経路は、一部の上皮癌において構成的活性を示す
【０１９１】
本研究では、N末端短縮iRhom2が、ADAM17活性に依存しないAREG産生の増加を促進し、これによりEGFR活性化を誘導することを見出した。特に、ApcMin/+ Rhbdf2+/cubマウスの表現型は、優性RHBDF2変異を有する患者に見られる上皮癌に対する感受性の増大を再現する。しかしながら、Rhbdf2cub/cubマウスは、自発的に腫瘍を形成しておらず、これは、Rhbdf2cub突然変異が癌形成を引き起こさないが、代わりに助長的環境を形成することにより、腫瘍増殖及び進行を促進する可能性があることを示している。
【０１９２】
材料及び方法
【０１９３】
Jackson Laboratory(メイン州バーハーバー)において、マウスを取得、飼育、及び修正バリア条件下で維持した。全ての遺伝子型は、cub及びMcubを含め、C57BL/6J(B6)の遺伝的背景で維持した。Rhbdf2-/-マウスを生成するために、ノックアウトマウスプログラム(KOMP)リポジトリから取得したES細胞クローン(EPD0208_1_A09)をB6-Tyrc(B6 albino)胚盤胞に注入した。50％超のキメラ化を示す雄を、B6 albinoの雌と交配させ、黒色の子孫の遺伝子型をPCRにより同定した。ヘテロ接合体を互いに交配させてホモ接合体を作製し、或いはRhbdf2cub/cubマウスと交配させて、Rhbdf2-/cubマウスを作製した。Jackson Laboratoryの動物実験委員会は、全ての実験手順を承認した。
【０１９４】
細胞培養及び試薬--MEFは、以前の記載のように単離した。マウスの表皮ケラチノサイト(MEK)は、製造者の指示(CELLnTEC/Zenbio、ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パーク)に従って単離した。細胞を加湿室内で37℃、5％CO2で増殖させた。MEF試薬(リン酸緩衝食塩水(PBS)、HyCloneダルベッコ改変イーグル培地、高グルコース(DMEM)、ペニシリン-ストレプトマイシン、及びHyCloneウシ胎仔血清)及びMEK試薬(前駆体標的培地CnT-07、抗生物質/抗真菌剤溶液ABM、及びプロテアーゼ、ディスパーゼ)は、それぞれFisher Scientific(マサチューセッツ州ボストン)及びZen-Bio(ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パーク)から購入した。TrypLETM Selectは、Life technologies(イリノイ州シカゴ)から入手した。293T及びCOS7細胞は、それぞれDMEM及びRPMI培地で増殖させた。
【０１９５】
組織学--組織学的検査用の組織の調製は、以前に記載したように行った。
【０１９６】
耳穴の閉鎖:外科用の耳パンチ装置Napox KN-292Bを用いてマウスを傷つけ、左耳中央に2mmの貫通穴を形成し、閉鎖率を28日間に亘り分析した。表示した時間において、マウスを安楽死させ、4×対物レンズ(Olympus BX41顕微鏡)を用いて耳穴及び周囲組織の画像を取り込んだ。ImageJソフトウェアにより、創傷面積を分析した。耳は、10％中性緩衝ホルマリン(NBF)中で24時間、室温で固定し、パラフィン包埋及び切片用に処理した。0日目に物理的創傷面積を測定し、その後の全ての時点での測定値は、元の面積のパーセントとして計算した。
【０１９７】
増殖及びスクラッチ傷アッセイ:両アッセイは、MEFを用いて実施した。増殖アッセイ用には、表示した数の細胞を、コラーゲン被覆96ウェルプレートにおいて37℃で増殖させた。24時間のインキュベーション後、増殖培地を除去し、プレートを使用まで-80℃で凍結させた。CyQUANT(登録商標) Cell Proliferationキットを用いて、相対細胞数を決定した(Life technologies)。蛍光強度は、Victor3マルチラベルプレートリーダ(PerkinElmer、マサチューセッツ州ボストン)を用いて測定した。スクラッチ傷アッセイ用に、MEFは、コラーゲン被覆6穴プレート中でコンフルエントになるまで増殖させ、ウェルを横切って滅菌p200ピペットチップを引き動かすことにより、コンフルエントな単層から細胞のストリップを取り除いた。スクラッチは、Zeiss Observer位相差顕微鏡の5倍対物レンズとAxio Vision 4.6.3ソフトウェアとを用いて、0、3、6、9、及び12時間後に画像化した。GRIDプラグインを用いて、各画像にグリッドを重ねた。グリッドサイズは、スクラッチ画像を二分する少なくとも10本の線が存在する大きさとした。各スクラッチの幅を集計し、平均化した。ImageJソフトウェアにより、0、3、6、9、及び12時間の時系列で取り込んだ画像を分析した。
【０１９８】
ヒトAREG、HB-EGF、及びEGF ELISA:一過性トランスフェクションを、24ウェルプレートに播種した293T細胞において実施した。リポフェクタミンLTXをPlus試薬と共に用いて、16.5fmolのHuWt又はHuCubを、25ngのAREG又は50ngのHB-EGF又は200ngのEGFによりコトランスフェクトした。トランスフェクトされたDNAの全量は、pCMV6-AC-HAベクタにより、1ウェル当たりで等しい量にした。24時間後、1mlの新鮮な培地中のDMSO又は10μMのMMを、古い培地と置き換えた。24時間後、100μlの上清を希釈せず(HB-EGF及びEGF)又は5倍に希釈して(AREG)、製造業者の指示(DY262、DY259、及びDY236)に従ってELISAを行った。
【０１９９】
ヒトAREG(RC203150)、ヒトHB-EGF(SC108485)、ヒトEGF(SC127840)、ヒトRHBDF2(RC203923)、マウスRhbdf1(MC205414)、及びヒトRHBDL2(RC219882)をコードするcDNAを含んだ発現プラスミドを、OriGene(メリーランド州ロックビル)から入手した。全長RHBDF2又はマウスRhbdf1における突然変異(欠失又は挿入)を、QuikChange II XL突然変異誘発キット(Agilent Technologies、カリフォルニア州サンタクララ)を用いて製造者の指示に従い導入し、DNA配列決定により検証した。部位特異的突然変異誘発用のプライマーは、Primer Design Program(QuikChange(登録商標) Primer Design、Agilent Technologies)を用いて生成した。
【０２００】
免疫化学:BD BioCoatTMコラーゲンIの2ウェル培養スライドにプレーティングしたMEFを、約60％コンフルエントまで増殖させ、LipofectamineTM LTX(Life technologies)により製造業者の指示に従い、一過性トランスフェクトを行った。48時間後、MEFをアセトン中に固定し、免疫細胞化学的に処理した。簡単に説明すると、1×氷冷PBS中で洗浄した細胞を、アセトン中において-20℃で10分間固定した後、PBS中で更に3回洗浄した。内在性ペルオキシダーゼ活性を、3％H2O2によりブロックし、その後、ブロッキング緩衝液(PBST、10％ヤギ血清及び1％BSA)中で1時間、DDK特異的抗体(Origene)において一晩4℃でインキュベートした。翌日、細胞をPBST中で25分間洗浄し、HRP結合二次抗体中で30分間、室温でインキュベートした。PBST中で3回洗浄後、細胞をDAPI溶液(IHC World、メリーランド州ウッドストック)中で10分間インキュベートし、カバーガラスをかけてスライドを密封した。カルネキシン及びジアチン抗体は、Abcam(マサチューセッツ州ケンブリッジ)から入手した。二次抗体は、Life Technologiesから入手した。
【０２０１】
免疫沈降:293T及びCOS7細胞のトランスフェクションを、製造業者の指示(Life technologies)に従って実施した。6ウェルプレートにプレーティングした細胞を、コンプリートミニプロテアーゼインヒビタ(Roche Applied Science、インディアナ州インディアナポリス)を含む400μlのCell Lysis Buffer(Cell Signaling、マサチューセッツ州ダンバース)により処理し、氷上で10分間インキュベートし、低温室において14,000gで10分間遠心分離した。細胞上清を、抗DDK抗体(Origene)を結合させた20μlの磁気ビーズと共に、低温室においてロッキングプラットフォーム上で一晩インキュベートした。一晩インキュベート後、ビーズ/スラリをTBS-Tにより3回洗浄し、2×SDS-PAGEローディングバッファを用いてタンパク質を採取した。
【０２０２】
SDS-PAGE及び免疫ブロッティング:細胞を氷冷PBSで1回洗浄し、コンプリートミニプロテアーゼインヒビタ(Roche Applied Science、インディアナ州インディアナポリス)を含むRIPAバッファ(Cell Signaling、マサチューセッツ州ダンバース)と共に氷上で10分間インキュベートした。細胞ライセートを14,000gで10分間、4℃で遠心分離した。上清を採取し、更に使用するまで-80℃で保存した。タンパク質の総量を、Qubit Fluorometer(Life technologies)を用いて定量し、10μgのタンパク質を4乃至12％プレキャストゲル(Lonza、ニュージャージ州アレンデール)上にロードし、低分子量のプレシジョンplusプロテインスタンダード(Bio-Rad)がゲルの底に達するまで140Vで実施した。溶解したタンパク質を、iBLOT(Life technologies)を用いてPVDF膜上に電気泳動転写した後、TBST(20mM Tris、137mM塩化ナトリウム、0.1％Tween-20)中の5％BSA(Cell Signaling Technology)において、室温で1時間ブロッキングした。次に、メンブレンを一次抗体(1:1000)において一晩4℃でインキュベートした後、TBST中で15分間の洗浄を3回行い、二次抗体(1:2000)において1時間室温でインキュベートした。TBST中で更に90分間洗浄した後、膜をSuperSignal West Femto Substrate(Fisher Scientific)に5分間晒し、西洋ワサビペルオキシダーゼ生成シグナルを検出した。膜は、アクチン特異的抗体により再検出した。全ての抗体は、Cell Signaling Technology(マサチューセッツ州ダンバース)から購入した。DDK抗体は、Origene(メリーランド州ロックビル)から入手した。
【０２０３】
初代MEFにおけるアンフィレグリンのサイレンシング:マウスAreg shRNAクローンTRCN0000089050(レンチウイルスベクタpLKO.1中)及びpLKO.1中のスクランブル対照shRNA(プラスミド#1864)を、Sigma Aldrich(ミズーリ州セントルイス)及びAddgene(マサチューセッツ州ケンブリッジ)から入手した。レンチウイルス粒子は、293T/17細胞(ATCC)において、プラスミドpMDLg/pRRE、pRSV-rev、及びpMD2.g(Addgene)を用いて作成した。レンチウイルス上清を48時間及び60時間において収集し、組み合わせ、0.45μmのPVDFフィルタで濾過した。MEFは、5μg/mlのポリブレンの存在下で、レンチウイルス上清に2日連続して感染させた後、後続の実験で使用する前にピューロマイシン(2μg/ ml)により72時間に亘り選択した。
【０２０４】
ポリープ数及び腫瘍面積――安楽死させた12週齢のマウスから取り出した腸管をフラッシュし、10％中性緩衝ホルマリン中で少なくとも24時間固定し、ポリープの計数又は組織学的検査を行った。H&E染色したスライドを、デジタルスキャナNanoZoomer 2.0HT(浜松、日本)を用いてスキャンした。ポリープは、解剖顕微鏡下で又はスキャンしたデジタル画像から直接計数した。特に、2つの方法の間にポリープ数の有意な差は無かった。腫瘍面積も、NanoZoomer 2.0HTソフトウェアを用いて、スキャンしたデジタル画像から測定した。
【０２０５】
定量的リアルタイムPCR(qPCR)――皮膚由来の精製RNAを、TRIzol(登録商標) Plus RNA精製キット(Life Technologies、イリノイ州シカゴ)を用いて、製造者の指示に従って単離した。Agilent 2100 Bioanalyzerにより、精製RNAの品質を決定した。qPCRサイクリング条件は、以前に公開されている。予め設計された以下のTaqMan遺伝子発現アッセイのリストをLife Technologies(イリノイ州シカゴ)から取得した(表I)。
【０２０６】
【表１】
0006602317.tif 000002
【０２０７】
マウスTNFα及びAREG ELISA――表示した遺伝子型の8乃至12週齢の雌マウスに、E.coli O111:B4(Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス)由来のリポ多糖70μgを静脈注射した。血清を3時間後に採取し、-80℃で凍結した。AREG ELISAのために、全ての遺伝子型から採取した血清は、直ちに用いるか、又は24時間以内での保存を-20℃で行った。試料は、DuoSet ELISA Developmentalキット(R&D Systems、ミネソタ州ミネアポリス)を用いて、製造業者の指示(DY989及びDY410)に従ってアッセイした。
【０２０８】
フローサイトメトリー――6ウェルプレートにプレーティングした293T及びCOS7細胞を、600ngのHuWt又はHuCub又はHuWt p.I186T cDNAにより、リポフェクタミンTMLTX試薬を用いて一過性にトランスフェクトした。40時間後、細胞を150μg/mlのシクロヘキサミド中で0、0.5、1、2、及び4時間インキュベートした。続いて、150μlの新たに調製した低温の4％PFA中において、細胞を40分間室温で固定した。細胞を2mlのPBSTにより1回洗浄し、150μlのPBST中に、室温で15分間、暗所で再懸濁した。更に洗浄後、細胞を、フィコエリトリン標識抗DDK一次抗体(1:50)を含有する125μlのPBST中に、氷上で30分間再懸濁した。最終洗浄後、細胞をFACS緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリー解析(BD FACSCalibur)を行った。
【０２０９】
逆転写酵素PCR(RT-PCR)――RNAqueousTM-4PCR(Ambion)を製造業者のプロトコルに従って用いて、RNAをMEFから抽出した。逆転写酵素(Promega reverse transcription systems、Promega)を用いて1μgのRNAからcDNAを合成した。cDNAは、特異的プライマーを用いて、HotMaster TAQ(5-Prime Inc.)により増幅した。
【０２１０】
統計分析――GraphPad Prism v4(GraphPad Software、カリフォルニア州サンディエゴ)を用いてカプラン・マイヤー生存曲線を生成し、タンパク質半減期(1相指数関数的減衰式)を計算した。一元配置ANOVA及びt検定により、統計的差異を決定した。0.05未満のP値を統計的に有意と見做した。
【０２１１】
項目
【０２１２】
1.基質に対するiRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を活性化する化合物を同定する方法であって、
a)iRhomポリペプチドを発現する細胞を試験化合物に接触させることと、
b)適切な対照と比較した前記iRhomポリペプチドの安定性の増加を決定することと、を含み、前記iRhomポリペプチドの安定性の増加は、前記化合物が、基質に対する前記iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を活性化したことを示す、方法。
2.前記iRhomポリペプチドの安定性の増加は、前記化合物への曝露後の前記iRhomポリペプチドの半減期を分析することにより決定される、項目1記載の方法。
3.前記基質は、EGFRリガンド又はEGF様基質である、項目1記載の方法。
4.前記iRhomポリペプチドの安定性の増加は、EGFRリガンドの分泌の増加を検出することにより決定される、項目1記載の方法。
5.前記EGFRリガンドは、AREG、HB-EGF、TGFα、及びEPGNからなる群から選択される、項目4記載の方法。
6.iRhomポリペプチドの安定性の増加は、可溶性EGFRリガンドのレベルの増加を検出することにより決定される、項目1記載の方法。
7.前記EGFRリガンドは、AREG、HB-EGF、TGFα、及びEPGNからなる群から選択される、項目6記載の方法。
8.iRhomポリペプチドの安定性の増加は、EGFRシグナル伝達活性の増加を検出することにより決定される、項目1記載の方法。
9.前記化合物は、前記iRhomポリペプチドとプロテアソームとの間の相互作用を阻害する、項目1記載の方法。
10.前記化合物は、iRhomポリペプチドの細胞質ドメインを不活性化する、項目1記載の方法。
11.前記細胞質ドメインの不活性化は、一過性である、項目10記載の方法。
12.前記化合物は、iRhomポリペプチドの細胞質ドメインを切断し及び/又は欠失させ、前記ポリペプチドがタンパク質分解活性又は変化した生物学的活性を有するようにする、項目1記載の方法。
13.マウスiRhom2は、アミノ酸残基1と268との間で切断され、又はヒトiRhom2は、アミノ酸残基1と298との間で切断される、項目12記載の方法。
14.マウスiRhom1は、アミノ酸残基1と272との間で切断される、又はヒトiRhom1は、アミノ酸残基1と316との間で切断される、項目12記載の方法。
15.前記化合物は、iRhomポリペプチドのペプチダーゼドメインを活性化する、項目1記載の方法。
16.前記iRhomポリペプチドは、iRhom1又はiRhom2である、項目1乃至15の何れかに記載の方法。
17.前記iRhomポリペプチドは、ヒト又はマウスのiRhomポリペプチドである、項目15記載の方法。
18.前記化合物は、小分子、ペプチド、又はポリペプチドデコイからなる群から選択される、項目1記載の方法。
19.前記化合物は、細胞透過性ペプチドに付着している、項目18記載の方法。
20.前記化合物は、ケラチノサイトの移動を加速する、項目1記載の方法。
21.前記化合物は、線維芽細胞の増殖を加速する、請求項1記載の方法。
22.前記化合物は、細胞透過性である、項目1記載の方法。
23.前記化合物は、ユビキチンプロテアーゼ阻害剤である、項目1記載の方法。
24.基質に対するiRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を阻害する化合物を同定する方法であって、
a)iRhomポリペプチドを発現する細胞を試験化合物に接触させることと、
b)適切な対照と比較した前記iRhomポリペプチドの生理学的標的の分泌の減少又は適切な対照と比較したEGFR活性の減少を決定することと、を含み、前記iRhomポリペプチドの生理学的標的の分泌の減少又はEGFR活性の減少は、前記化合物が基質に対する前記iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性を阻害することを示す、方法。
25.前記基質は、EGFRリガンド又はEGF様基質である、項目24記載の方法。
26.iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性の阻害は、前記iRhomポリペプチドの生理学的標的の分泌の減少を検出することにより決定される、項目24記載の方法。
27.前記iRhomポリペプチドの前記生理学的標的は、EGFRリガンドである、項目26記載の方法。
28.前記EGFRリガンドは、AREG、HB-EGF、TGFα、及びEPGNからなる群から選択される、項目27記載の方法。
29.前記iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性の阻害は、可溶性EGFRリガンドのレベルの減少を検出することにより決定される、請求項24記載の方法。
30.前記EGFRリガンドは、AREG、HB-EGF、TGFα、及びEPGNからなる群から選択される、項目29記載の方法。
31.iRhomポリペプチドのタンパク質分解活性の阻害は、EGFR活性の減少を検出することにより決定される、請求項24記載の方法。
32.前記化合物は、iRhomポリペプチドのペプチダーゼドメインを阻害する、請求項24に記載の方法。
33.前記化合物は、前記iRhomポリペプチドのペプチダーゼドメインのタンパク質分解部位において1個以上のアミノ酸残基を不活性化することにより、iRhomポリペプチドの活性に影響を与える、項目24記載の方法。
34.前記iRhomポリペプチドは、マウスiRhom2であり、前記化合物は、TMヘリックス2上のヒスチジン635、TMヘリックス4上のグルタミン695、膜貫通ヘリックス4上のシステイン701、及びTMヘリックス6上のヒスチジン744からなる群から選択されるマウスiRhom2のタンパク質分解部位において、1個以上のアミノ酸残基を不活性化する、項目33記載の方法。
35.前記iRhomポリペプチドは、ヒトiRhom2であり、前記化合物は、TMヘリックス2上のヒスチジン664、TMヘリックス4上のグルタミン724、膜貫通ヘリックス4上のシステイン730、及びTMヘリックス6上のヒスチジン773から選択されたヒトiRhom2のタンパク質分解部位において、1個以上のアミノ酸残基を不活性化する、項目33記載の方法。
36.前記iRhomファミリーメンバーは、iRhom1又はiRhom2である、項目24乃至33の何れかに記載の方法。
37.前記iRhomファミリーメンバーは、ヒト又はマウスiRhomファミリーメンバーである、請求項33記載の方法。
38.前記化合物は、小分子、ペプチド、又はポリペプチドデコイからなる群から選択される、項目24記載の方法。
39.前記化合物は、細胞透過性ペプチドに付着している、項目38記載の方法。
40.前記化合物は、細胞透過性である、項目24記載の方法。
41.対象者における創傷治癒又は組織修復を加速することが可能な化合物を同定する方法であって、a)iRhomポリペプチド及びEGFRリガンドを発現する細胞を試験化合物に接触させることと、b)適切な対照と比較した前記iRhomポリペプチドの安定性の増加を決定することと、c)適切な対照と比較した前記細胞によるEGFRリガンドの分泌の増加を決定することと、を含み、前記iRhomポリペプチドの安定性の増加及び前記細胞によるEGFRリガンドの分泌の増加は、前記化合物が創傷治癒を加速可能であることを示す、方法。
42.前記iRhomファミリーメンバーは、iRhom1又はiRhom2である、項目41記載の方法。
43.前記iRhomファミリーメンバーは、ヒト又はマウスiRhomファミリーメンバーである、項目41記載の方法。
44.対象者において腫瘍増殖及び/又は腫瘍進行を低減すること又は癌を治療することが可能な化合物を同定する方法であって、a)iRhomポリペプチドを発現する細胞を試験化合物に接触させることと、b)適切な対照と比較した前記iRhomポリペプチドの生理学的標的の分泌の減少又は適切な対照と比較したEGFR活性の減少を決定することと、を含み、前記iRhomポリペプチドの生理学的標的の分泌の減少又はEGFR活性の減少は、前記化合物が、前記対象者において腫瘍増殖及び/又は腫瘍進行を低減すること又は癌を治療することが可能であることを示す、方法
45.前記腫瘍は、固形腫瘍である、項目44記載の方法。
46.前記癌は、上皮癌である、項目44記載の方法。
47.前記癌は、食道、肺、脳、結腸、腎臓、前立腺、皮膚、肝臓、膵臓、胃、子宮、卵巣、乳房、リンパ腺、又は膀胱の癌である、項目44記載の方法。
48.iRhomポリペプチドの細胞質ドメインを阻害する化合物を同定する方法であって、a)iRhomポリペプチドを発現する細胞を試験化合物に接触させることと、b)適切な対照と比較した前記iRhomポリペプチドの安定性の増加を決定することと、を含み、前記iRhomポリペプチドの安定性の増加は、前記化合物が前記iRhomポリペプチドの細胞質ドメインを阻害したことを示す、方法。
49.前記iRhomファミリーメンバーは、iRhom1又はiRhom2である、項目44乃至48の何れかに記載の方法。
50.前記iRhomファミリーメンバーは、ヒト又はマウスiRhomファミリーメンバーである、項目44乃至48の何れかに記載の方法。
51.前記化合物は、小分子、ポリペプチドデコイ、miRNA分子、siRNA分子、shRNA分子、dsRNA分子、アンチセンス分子、Rhbdf2に特異的なリボザイム、若しくはmiRNA、siRNA、shRNA、dsRNAをコードするポリヌクレオチド、又はそのそれぞれの生物学的等価物からなる群から選択される、項目41記載の方法。
52.変異体iRhomポリペプチドを含む単離ポリペプチド。
53.サイトゾルN末端ドメインを欠失するヒトiRhom2を含む単離ポリペプチド。
54.サイトゾルN末端ドメインを欠失するマウスiRhom2を含む単離ポリペプチド。
55.TMヘリックス2上のヒスチジン635、TMヘリックス4上のグルタミン695、TMヘリックス4上のシステイン701、及びTMヘリックス6上のヒスチジン744からなる群から選択されるマウスiRhom2のタンパク質分解部位における1個以上のアミノ酸残基での突然変異を含む、単離マウスiRhom2ポリペプチド。
56.TMヘリックス2上のヒスチジン664、TMヘリックス4上のグルタミン724、TMヘリックス4上のシステイン730、及びTMヘリックス6上のヒスチジン773からなる群から選択されるヒトiRhom2のタンパク質分解部位における1個以上のアミノ酸残基での突然変異を含む、単離ヒトiRhom2ポリペプチド。
57.項目52乃至56の何れかに記載のポリペプチドをコードする単離核酸分子。
58.項目57記載の核酸分子を含むベクタ。
59.項目58記載のベクタを発現する宿主細胞。
60.対象者において発毛を促進することが可能な化合物を同定する方法であって、a)iRhomポリペプチドを発現する細胞を試験化合物に接触させることと、b)適切な対照と比較した前記iRhomポリペプチドの生理学的標的の分泌の減少又は適切な対照と比較したEGFR活性の減少を決定することと、を含み、前記iRhomポリペプチドの生理学的標的の分泌の減少又はEGFR活性の減少は、前記化合物が対象者において発毛を促進することが可能であることを示す、方法。
【０２１３】
配列
【０２１４】
マウスiRhom2タンパク質配列全長SEQ ID NO:1
MASADKNGSNLPSVSGSRLQSRKPPNLSITIPPPESQAPGEQDSMLPERRKNPAYLKSVSLQEPRGRWQEGAEKRPGFRRQASLSQSIRKSTAQWFGVSGDWEGKRQNWHRRSLHHCSVHYGRLKASCQRELELPSQEVPSFQGTESPKPCKMPKIVDPLARGRAFRHPDEVDRPHAAHPPLTPGVLSLTSFTSVRSGYSHLPRRKRISVAHMSFQAAAALLKGRSVLDATGQRCRHVKRSFAYPSFLEEDAVDGADTFDSSFFSKEEMSSMPDDVFESPPLSASYFRGVPHSASPVSPDGVHIPLKEYSGGRALGPGTQRGKRIASKVKHFAFDRKKRHYGLGVVGNWLNRSYRRSISSTVQRQLESFDSHRPYFTYWLTFVHIIITLLVICTYGIAPVGFAQHVTTQLVLKNRGVYESVKYIQQENFWIGPSSIDLIHLGAKFSPCIRKDQQIEQLVRRERDIERTSGCCVQNDRSGCIQTLKKDCSETLATFVKWQNDTGPSDKSDLSQKQPSAVVCHQDPRTCEEPASSGAHIWPDDITKWPICTEQAQSNHTGLLHIDCKIKGRPCCIGTKGSCEITTREYCEFMHGYFHEDATLCSQVHCLDKVCGLLPFLNPEVPDQFYRIWLSLFLHAGIVHCLVSVVFQMTILRDLEKLAGWHRISIIFILSGITGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGLLACLFVELFQSWQLLERPWKAFFNLSAIVLFLFICGLLPWIDNIAHIFGFLSGMLLAFAFLPYITFGTSDKYRKRALILVSLLVFAGLFASLVLWLYIYPINWPWIEYLTCFPFTSRFCEKYELDQVLH
【０２１５】
Rhbdf2cubマウス突然変異SEQ ID NO:2
MSSMPDDVFESPPLSASYFRGVPHSASPVSPDGVHIPLKEYSGGRALGPGTQRGKRIASKVKHFAFDRKKRHYGLGVVGNWLNRSYRRSISSTVQRQLESFDSHRPYFTYWLTFVHIIITLLVICTYGIAPVGFAQHVTTQLVLKNRGVYESVKYIQQENFWIGPSSIDLIHLGAKFSPCIRKDQQIEQLVRRERDIERTSGCCVQNDRSGCIQTLKKDCSETLATFVKWQNDTGPSDKSDLSQKQPSAVVCHQDPRTCEEPASSGAHIWPDDITKWPICTEQAQSNHTGLLHIDCKIKGRPCCIGTKGSCEITTREYCEFMHGYFHEDATLCSQVHCLDKVCGLLPFLNPEVPDQFYRIWLSLFLHAGIVHCLVSVVFQMTILRDLEKLAGWHRISIIFILSGITGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGLLACLFVELFQSWQLLERPWKAFFNLSAIVLFLFICGLLPWIDNIAHIFGFLSGMLLAFAFLPYITFGTSDKYRKRALILVSLLVFAGLFASLVLWLYIYPINWPWIEYLTCFPFTSRFCEKYELDQVLH
【０２１６】
マウスiRhom1タンパク質配列全長SEQ ID NO:3
MSEARRDSTSSLQRKKPPWLKLDIPAAVPPAAEEPSFLQPLRRQAFLRSVSMPAETARVPSPHHEPRRLVLQRQTSITQTIRRGTADWFGVSKDSDSTQKWQRKSIRHCSQRYGKLKPQVIRELDLPSQDNVSLTSTETPPPLYVGPCQLGMQKIIDPLARGRAFRMADDTADGLSAPHTPVTPGAASLCSFSSSRSGFNRLPRRRKRESVAKMSFRAAAALVKGRSIRDGTLRRGQRRSFTPASFLEEDMVDFPDELDTSFFAREGVLHEEMSTYPDEVFESPSEAALKDWEKAPDQADLTGGALDRSELERSHLMLPLERGWRKQKEGGPLAPQPKVRLRQEVVSAAGPRRGQRIAVPVRKLFAREKRPYGLGMVGRLTNRTYRKRIDSYVKRQIEDMDDHRPFFTYWLTFVHSLVTILAVCIYGIAPVGFSQHETVDSVLRKRGVYENVKYVQQENFWIGPSSEALIHLGAKFSPCMRQDPQVHSFILAAREREKHSACCVRNDRSGCVQTSKEECSSTLAVWVKWPVHPSAPDLAGNKRQFGSVCHQDPRVCDEPSSEDPHEWPEDITKWPICTKSSAGNHTNHPHMDCVITGRPCCIGTKGRCEITSREYCDFMRGYFHEEATLCSQVHCMDDVCGLLPFLNPEVPDQFYRLWLSLFLHAGILHCLVSVCFQMTVLRDLEKLAGWHRIAIIYLLSGITGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGILACLFVELFQSWQILARPWRAFFKLLAVVLFLFAFGLLPWIDNFAHISGFVSGLFLSFAFLPYISFGKFDLYRKRCQIIIFQVVFLGLLAGLVVLFYFYPVRCEWCEFLTCIPFTDKFCEKYELDAQLH
【０２１７】
マウスiRhom1 N末端欠損タンパク質配列(Rhbdf2cub突然変異と同等――サイトゾルドメインは無いが、膜貫通ペプチダーゼドメインを保持)SEQ ID NO:4
MSTYPDEVFESPSEAALKDWEKAPDQADLTGGALDRSELERSHLMLPLERGWRKQKEGGPLAPQPKVRLRQEVVSAAGPRRGQRIAVPVRKLFAREKRPYGLGMVGRLTNRTYRKRIDSYVKRQIEDMDDHRPFFTYWLTFVHSLVTILAVCIYGIAPVGFSQHETVDSVLRKRGVYENVKYVQQENFWIGPSSEALIHLGAKFSPCMRQDPQVHSFILAAREREKHSACCVRNDRSGCVQTSKEECSSTLAVWVKWPVHPSAPDLAGNKRQFGSVCHQDPRVCDEPSSEDPHEWPEDITKWPICTKSSAGNHTNHPHMDCVITGRPCCIGTKGRCEITSREYCDFMRGYFHEEATLCSQVHCMDDVCGLLPFLNPEVPDQFYRLWLSLFLHAGILHCLVSVCFQMTVLRDLEKLAGWHRIAIIYLLSGITGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGILACLFVELFQSWQILARPWRAFFKLLAVVLFLFAFGLLPWIDNFAHISGFVSGLFLSFAFLPYISFGKFDLYRKRCQIIIFQVVFLGLLAGLVVLFYFYPVRCEWCEFLTCIPFTDKFCEKYELDAQLH
【０２１８】
ヒトiRhom2タンパク質配列全長SEQ ID NO:5
MASADKNGGSVSSVSSSRLQSRKPPNLSITIPPPEKETQAPGEQDSMLPEGFQNRRLKKSQPRTWAAHTTACPPSFLPKRKNPAYLKSVSLQEPRSRWQESSEKRPGFRRQASLSQSIRKGAAQWFGVSGDWEGQRQQWQRRSLHHCSMRYGRLKASCQRDLELPSQEAPSFQGTESPKPCKMPKIVDPLARGRAFRHPEEMDRPHAPHPPLTPGVLSLTSFTSVRSGYSHLPRRKRMSVAHMSLQAAAALLKGRSVLDATGQRCRVVKRSFAFPSFLEEDVVDGADTFDSSFFSKEEMSSMPDDVFESPPLSASYFRGIPHSASPVSPDGVQIPLKEYGRAPVPGPRRGKRIASKVKHFAFDRKKRHYGLGVVGNWLNRSYRRSISSTVQRQLESFDSHRPYFTYWLTFVHVIITLLVICTYGIAPVGFAQHVTTQLVLRNKGVYESVKYIQQENFWVGPSSIDLIHLGAKFSPCIRKDGQIEQLVLRERDLERDSGCCVQNDHSGCIQTQRKDCSETLATFVKWQDDTGPPMDKSDLGQKRTSGAVCHQDPRTCEEPASSGAHIWPDDITKWPICTEQARSNHTGFLHMDCEIKGRPCCIGTKGSCEITTREYCEFMHGYFHEEATLCSQVHCLDKVCGLLPFLNPEVPDQFYRLWLSLFLHAGVVHCLVSVVFQMTILRDLEKLAGWHRIAIIFILSGITGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGLLACLFVELFQSWPLLERPWKAFLNLSAIVLFLFICGLLPWIDNIAHIFGFLSGLLLAFAFLPYITFGTSDKYRKRALILVSLLAFAGLFAALVLWLYIYPINWPWIEHLTCFPFTSRFCEKYELDQVLH
【０２１９】
ヒト欠損iRhom2(Rhbdf2cub突然変異と同等――サイトゾルドメインは無いが、膜貫通ペプチダーゼドメインを保持)SEQ ID NO:6
MSSMPDDVFESPPLSASYFRGIPHSASPVSPDGVQIPLKEYGRAPVPGPRRGKRIASKVKHFAFDRKKRHYGLGVVGNWLNRSYRRSISSTVQRQLESFDSHRPYFTYWLTFVHVIITLLVICTYGIAPVGFAQHVTTQLVLRNKGVYESVKYIQQENFWVGPSSIDLIHLGAKFSPCIRKDGQIEQLVLRERDLERDSGCCVQNDHSGCIQTQRKDCSETLATFVKWQDDTGPPMDKSDLGQKRTSGAVCHQDPRTCEEPASSGAHIWPDDITKWPICTEQARSNHTGFLHMDCEIKGRPCCIGTKGSCEITTREYCEFMHGYFHEEATLCSQVHCLDKVCGLLPFLNPEVPDQFYRLWLSLFLHAGVVHCLVSVVFQMTILRDLEKLAGWHRIAIIFILSGITGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGLLACLFVELFQSWPLLERPWKAFLNLSAIVLFLFICGLLPWIDNIAHIFGFLSGLLLAFAFLPYITFGTSDKYRKRALILVSLLAFAGLFAALVLWLYIYPINWPWIEHLTCFPFTSRFCEKYELDQVLH
【０２２０】
ヒトiRhom1タンパク質配列全長SEQ ID NO:7
MSEARRDSTSSLQRKKPPWLKLDIPSAVPLTAEEPSFLQPLRRQAFLRSVSMPAETAHISSPHHELRRPVLQRQTSITQTIRRGTADWFGVSKDSDSTQKWQRKSIRHCSQRYGKLKPQVLRELDLPSQDNVSLTSTETPPPLYVGPCQLGMQKIIDPLARGRAFRVADDTAEGLSAPHTPVTPGAASLCSFSSSRSGFHRLPRRRKRESVAKMSFRAAAALMKGRSVRDGTFRRAQRRSFTPASFLEEDTTDFPDELDTSFFAREGILHEELSTYPDEVFESPSEAALKDWEKAPEQADLTGGALDRSELERSHLMLPLERGWRKQKEGAAAPQPKVRLRQEVVSTAGPRRGQRIAVPVRKLFAREKRPYGLGMVGRLTNRTYRKRIDSFVKRQIEDMDDHRPFFTYWLTFVHSLVTILAVCIYGIAPVGFSQHETVDSVLRNRGVYENVKYVQQENFWIGPSSEALIHLGAKFSPCMRQDPQVHSFIRSAREREKHSACCVRNDRSGCVQTSEEECSSTLAVWVKWPIHPSAPELAGHKRQFGSVCHQDPRVCDEPSSEDPHEWPEDITKWPICTKNSAGNHTNHPHMDCVITGRPCCIGTKGRCEITSREYCDFMRGYFHEEATLCSQVHCMDDVCGLLPFLNPEVPDQFYRLWLSLFLHAGILHCLVSICFQMTVLRDLEKLAGWHRIAIIYLLSGVTGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGILACLFVELFQSWQILARPWRAFFKLLAVVLFLFTFGLLPWIDNFAHISGFISGLFLSFAFLPYISFGKFDLYRKRCQIIIFQVVFLGLLAGLVVLFYVYPVRCEWCEFLTCIPFTDKFCEKYELDAQLH
【０２２１】
ヒトiRhom1 N末端欠損タンパク質配列(Rhbdf2cub突然変異と同等――サイトゾルドメインは無いが、膜貫通ペプチダーゼドメインを保持)SEQ ID NO:8
MLPLERGWRKQKEGAAAPQPKVRLRQEVVSTAGPRRGQRIAVPVRKLFAREKRPYGLGMVGRLTNRTYRKRIDSFVKRQIEDMDDHRPFFTYWLTFVHSLVTILAVCIYGIAPVGFSQHETVDSVLRNRGVYENVKYVQQENFWIGPSSEALIHLGAKFSPCMRQDPQVHSFIRSAREREKHSACCVRNDRSGCVQTSEEECSSTLAVWVKWPIHPSAPELAGHKRQFGSVCHQDPRVCDEPSSEDPHEWPEDITKWPICTKNSAGNHTNHPHMDCVITGRPCCIGTKGRCEITSREYCDFMRGYFHEEATLCSQVHCMDDVCGLLPFLNPEVPDQFYRLWLSLFLHAGILHCLVSICFQMTVLRDLEKLAGWHRIAIIYLLSGVTGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGILACLFVELFQSWQILARPWRAFFKLLAVVLFLFTFGLLPWIDNFAHISGFISGLFLSFAFLPYISFGKFDLYRKRCQIIIFQVVFLGLLAGLVVLFYVYPVRCEWCEFLTCIPFTDKFCEKYELDAQLH
【０２２２】
【表２．１】
0006602317.tif 000003
【表２．２】
0006602317.tif 000004
【表２．３】
0006602317.tif 000005
【表２．４】
0006602317.tif 000006
【０２２３】
当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識し、又は日常的な実験のみを用いて確認することが可能であろう。 このような等価物は、以下の請求の範囲に含まれるものとする。
【符号の説明】
【０２２４】
[図1A]
Relative fluorescence units: 相対蛍光単位
Number of MEFs: MEF数
[図1B]
Percent closure: 閉鎖パーセント
Time: 時間
[図1C]
actin: アクチン
[図1D]
Day 0: 0日目
Day 7: 7日目
Day 14: 14日目
Day 21: 21日目
Day 28: 28日目
[図1E、3C、4B、9B]
% Hole remaining: 穴残存％
Days: 日数
[図1F]
0 Days: 0日目
7 Days: 7日目
14 Days: 14日目
[図2A]
deletion: 欠失
[図2B]
Exon 2: エクソン2
Exon 5: エクソン5
Exon 12: エクソン12
Exon 19: エクソン19
[図2C]
mRNA fold change: mRNAの倍数変化
Exon boundaries: エクソン境界
[図2D]
Relative fold change: 相対倍数変化
[図2E]
Actin: アクチン
[図4A]
genomic DNA: ゲノムDNA
normal donor splice site: 正常なドナースプライス部位
Mcub mutation: Mcub突然変異
Areg genomic region: Aregゲノム領域
exon 1: エクソン1
Mcub donor splice site: Mcubドナースプライス部位
[図4C]
day 0: 0日目
day 7: 7日目
day 14: 14日目
[図4D]
Serum Areg: 血清Areg
[図4E]
Supernatant AREG: 上清AREG
[図4F]
mRNA (normalized to wild-type actin): mRNA(野生型アクチンに対して規準化)
Epigen: エピジェン
Epiregulin: エピレグリン
[図5A]
C-terminus: C末端
Peptidase domain: ペプチダーゼドメイン
[図5B、5D、5E、5F、5G、5I、7B、13A、13B、14]
Empty: 空
[図5C]
Relative serum TNFα: 相対血清TNFα
(no LPS): (LPS無し)
[図6B]
AREG alone: AREGのみ
Lysate Anti-HA: ライセート抗HA
Actin: アクチン
[図6E]
Survival: 生存
Days: 日数
[図6G]
Tumor area: 腫瘍面積
[図6H]
Number of polyps: ポリープ数
[図7A]
Anti-Flag: 抗Flag
Anti-HA: 抗HA
[図7C]
DDK-Immunoreactive cells/Total cells: DDK免疫反応細胞/総細胞
Empty: 空
[図7D]
0 min: 0分
60 min: 60分
240 min: 240分
[図7E、7F]
% Immunoreactivity remaining: 免疫反応性残存％
Time: 時間
[図8]
Wyldtype: 野生型
Mutant: 変異型
sheddase: シェダーゼ
Proteasome: プロテアソーム
Nucleus: 核
Increased Secresion: 分泌増加
Increased Proliferation & Migration. Hyperplasia & Tumorigenesis: 増殖及び移動増加。過形成及び腫瘍発生
[図10A]
ER-marker: ERマーカー
merge: 併合
[図10B]
Golgi-marker: ゴルジマーカー
merge: 併合
[図11]
genomic DNA: ゲノムDNA
normal donor splice site: 正常なドナースプライス部位
Mcub mutation: Mcub突然変異
Areg genomic region: Aregゲノム領域
exon 1: エクソン1
Mcub donor splice site: Mcubドナースプライス部位
22 extra nucleotides: 22個の余分なヌクレオチド
exon 1: エクソン1
exon 2: エクソン2
protein translation: タンパク質翻訳
premature stop codon: 未成熟終止コドン
16 incorrect amino acids: 16個の誤ったアミノ酸
[図12B]
Areg Fold change: Aregの倍数変化
Scrambled: スクランブル
[図12C]
Scramble shRNA: スクランブルshRNA
Relative fluorescence units: 相対蛍光単位
Number of Rhbdf2+/+ MEFs: Rhbdf2+/+ MEFの数
[図12D]
Scramble shRNA: スクランブルshRNA
Relative fluorescence units: 相対蛍光単位
Number of Rhbdf2cub/cub MEFs: Rhbdf2cub/cub MEFの数
【図１ＡＢＣ】
0006602317.tif 000007
【図１Ｄ】
0006602317.tif 000008
【図１ＥＦ】
0006602317.tif 000009
【図２Ａ】
0006602317.tif 000010
【図２ＢＣ】
0006602317.tif 000011
【図２ＤＦ】
0006602317.tif 000012
【図２Ｅ】
0006602317.tif 000013
【図３ＡＢＤ】
0006602317.tif 000014
【図３ＣＥ】
0006602317.tif 000015
【図４ＡＣ】
0006602317.tif 000016
【図４ＢＤ】
0006602317.tif 000017
【図４ＥＦ】
0006602317.tif 000018
【図５ＡＢ】
0006602317.tif 000019
【図５Ｃ】
0006602317.tif 000020
【図５ＤＥ】
0006602317.tif 000021
【図５ＦＧ】
0006602317.tif 000022
【図５ＨＩＪ】
0006602317.tif 000023
【図６ＡＣＤ】
0006602317.tif 000024
【図６Ｂ】
0006602317.tif 000025
【図６ＥＦ】
0006602317.tif 000026
【図６ＧＨ】
0006602317.tif 000027
【図７ＡＣ】
0006602317.tif 000028
【図７Ｂ】
0006602317.tif 000029
【図７Ｄ】
0006602317.tif 000030
【図７ＥＦ】
0006602317.tif 000031
【図８】
0006602317.tif 000032
【図９ＡＢ】
0006602317.tif 000033
【図１０Ａ】
0006602317.tif 000034
【図１０Ｂ】
0006602317.tif 000035
【図１１】
0006602317.tif 000036
【図１２ＡＢ】
0006602317.tif 000037
【図１２ＣＤ】
0006602317.tif 000038
【図１３ＡＢ】
0006602317.tif 000039
【図１３Ｃ】
0006602317.tif 000040
【図１３Ｄ】
0006602317.tif 000041
【図１３Ｅ】
0006602317.tif 000042
【図１４】
0006602317.tif 000043
【配列表】
0006602317000001.app