(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞を含む試料から微生物を単離する方法であって、
ａ）試料をBenzonase（登録商標）Nucleaseを含む溶解緩衝液と接触させること、および
ｂ）哺乳動物細胞を除去することにより微生物を得ること
を含み、
試料がバイオリアクター中の培養から得られた試料であり、
哺乳動物細胞の試料中の量が、少なくとも１０６細胞であり、
溶解緩衝液が以下の成分：
−  ０．０５〜０．５重量％のＳＤＳ
−  ０．５Ｍ〜４Ｍの尿素
−  ０．５ｍＭ〜１０ｍＭのＭｇＣｌ２
−  ２．５〜１７５ＵのBenzonase（登録商標）Nuclease
−  ＰＢＳ  １Ｘ〜ＰＢＳ  １／８Ｘ
を含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
哺乳動物細胞を含む試料から微生物を単離し、検出する方法であって、
ａ）試料をBenzonase（登録商標）Nucleaseを含む溶解緩衝液と接触させること、ｂ）哺乳動物細胞を除去することにより微生物を得ること、
ｃ）微生物に対してユニバーサルな溶解を行うこと、および
ｄ）微生物を検出するための特定的な、またはユニバーサルな検出方法を行うこと
を含み、
試料がバイオリアクター中の培養から得られた試料であり、
哺乳動物細胞の試料中の量が、少なくとも１０６細胞であり、
溶解緩衝液が以下の成分：
−  ０．０５〜０．５重量％のＳＤＳ
−  ０．５Ｍ〜４Ｍの尿素
−  ０．５ｍＭ〜１０ｍＭのＭｇＣｌ２
−  ２．５〜１７５ＵのBenzonase（登録商標）Nuclease
−  ＰＢＳ  １Ｘ〜ＰＢＳ  １／８Ｘ
を含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項３】
試料の容積が少なくとも５ｍｌであることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
溶解緩衝液がBenzonase（登録商標）Nucleaseを試料当たり２．５Ｕ〜１７５Ｕの濃度において含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物細胞が、懸濁培養中で成長する細胞、マイクロキャリア上で成長する細胞および／またはハイブリドーマ細胞系からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物細胞が、ＣＲＬ−８０１８細胞、ＣＦ−１０Ｈ５細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＨＴ−１０８０細胞、ＭＤＣＫ細胞、HeLa細胞またはベロ細胞の群から選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
微生物が、細菌、酵母、菌類および／またはそれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップｂ）において遠心分離を使用することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップｃ）において超音波処理を使用することを特徴とする、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップｄ）においてＰＣＲを使用することを特徴とする、請求項２〜９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物細胞を含む試料から微生物を単離し、任意に検出する方法であって、Benzonase（登録商標）Nucleaseを含む溶解緩衝液の使用を含む、前記方法に関する。本発明はさらに、Benzonase（登録商標）Nucleaseを含む溶解緩衝液およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物のバイオバーデンのモニタリングおよび適時の結果は、バイオリアクターから来る組換えタンパク質または他の生物工学的生成物の生産の間の品質制御のために重大である。
【０００３】
典型的に、バイオリアクター試料のバイオバーデンレベルは、膜ろ過および培養培地上でのその後のインキュベーションまたは乏しいプレーティングによって決定される。バイオリアクター試料の微粒子含量により、特に高いレベルの哺乳動物細胞がバイオリアクター中に存在する場合、少量の試料のみをろ過することができ（１ｍｌ〜２ｍｌまたはさらに少量）、各試料の代表的な容積を試験することができるために多数のろ過ステップが必要である。
【０００４】
この方法を、哺乳動物細胞および微生物を分離するための分画遠心ステップを加えることにより改善することができる。この場合において、微生物を含む上清を、薄膜上でろ過し、培養培地上でインキュベートする。この方法の欠点は、哺乳動物細胞で捕獲されるかまたはそれに固着し得る数種の汚染物質の損失の可能性である。
【０００５】
診断目的のために、高い試料容積が、低レベルの汚染を検出することができるために必要である。不満足な膜ろ過性の結果、臨床的試料の真核細胞を、含まれる微生物を溶解せずに差別的に溶解することができる溶解緩衝液の開発がもたらされた。溶解緩衝液処理の後、試料をろ過し、膜を培養培地上でインキュベートする。ある場合において、分子法を、微生物のより迅速な検出のために使用する。この場合において、特定の処理を、真核細胞の溶解の後に適用して、検出方法に干渉し得る高い含量の真核生物ＤＮＡを除去する必要がある。後続のステップにおいて、微生物を溶解して、それらのＤＮＡを放出させる。このＤＮＡを精製し、次に分子法、例えばＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲによって検出する。すべてのこれらのステップの組み合わせは、多大な時間を必要とし、多くの手動の取り扱いステップのため骨の折れるものである。
【０００６】
最先端技術において、哺乳動物細胞を選択的に溶解することにより哺乳動物細胞試料の微生物汚染を単離し、検出するための溶液が、記載されている。これらの刊行物は、臨床的試料、例えば体液、特に血液における微生物汚染の検出に関する。
例えば、WO 2009/015484 A1には、微生物および微生物核酸を血液から、血液細胞を選択的に溶解し、その間微生物細胞をサポニン配合物を使用して保護することにより単離し、検出するための迅速な方法が開示されている。
【０００７】
WO 2011/070507 A1において、試料中の血液細胞の選択的な溶解は、非イオン性洗浄剤中の試料をアルカリ性条件下でインキュベートすることにより達成される。
US 2008/0131955 A1には、哺乳動物細胞を選択的に溶解するステップを含む、標的ＤＮＡを体液試料中の混合ＤＮＡから分離する方法が記載されている。
EP 0745849 A2には、赤血球を選択的に溶解する、試料中に存在し得る微生物の核酸分析のための全血を処理する方法が開示されている。
【０００８】
しかしながら、大量の複雑なバイオリアクター試料および高い細胞密度によって、尚微生物汚染の検出に関して難題がもたらされている。本発明の目的は、したがって、哺乳動物細胞を含む複雑な試料中の微生物汚染を単離し、かつ／または検出する方法の開発であった。
【発明の概要】
【０００９】
第１の観点において、本発明は、哺乳動物細胞を含む試料から微生物を単離する方法であって、
ａ）試料をBenzonase（登録商標）Nucleaseを含む溶解緩衝液と接触させること、
ｂ）哺乳動物細胞を除去することにより微生物を得ること
を含む、前記方法に関する。      
【００１０】
第２の観点において、本発明は、哺乳動物細胞を含む試料から微生物を単離し、検出する方法であって、
ａ）試料をBenzonase（登録商標）Nucleaseを含む溶解緩衝液と接触させること、
ｂ）哺乳動物細胞を除去することにより微生物を得ること、
ｃ）微生物に対してユニバーサルな溶解を行うこと、
ｄ）微生物を検出するための特定的な、またはユニバーサルな検出方法を行うこと
を含む、前記方法に関する。      
【００１１】
本発明による方法は、いくつかの利点を提供する：
−  大量の試料（５０ｍｌまで；２０分未満における細菌の単離）の迅速な分析、
−  高い量の哺乳動物細胞（合計５*１０８までの細胞）の試料中での良好な感受性を伴う微生物の検出、
−  単純であり、限定された手動操作。
【００１２】
哺乳動物細胞を含む試料は、微生物の存在および／または成長が疑われるか、または疑われ得るあらゆる臨床的な、または非臨床的な試料、ならびに微生物の存在について常習的に、または時々試験される材料の試料であり得る。試料は、新鮮な、または凍結された試料であり得る。好ましい態様において、試料は、バイオリアクター試料である。
【００１３】
あらゆる種類のバイオリアクターを、本発明の観点において考慮することができる。
試料を、バイオリアクターから、当業者に知られている任意の方法によって、例えば少量の細胞培養物を容器中に移送することによって得ることができる。容器は、方法に適している任意のチューブまたは反応容器であってもよい。
【００１４】
典型的には、哺乳動物細胞の試料中の量は、少なくとも１０６細胞である。好ましい態様において、哺乳動物細胞の試料中の量は、少なくとも１０７細胞である。
全哺乳動物細胞の試料中の量についての典型的な範囲は、１０６細胞〜５*１０８細胞、例えば約１０７細胞、５*１０７細胞または１０８細胞である。
【００１５】
利用される試料の量は、方法の多用途性および感受性により大幅に変化し得る。適切な容積は、試料の源および微生物の試料中の予期されるレベルに依存するだろう。本発明による方法は、より小さな、およびより大きな試料容積に適している。
【００１６】
本発明の好ましい態様において、分析するべき試料の容積は、少なくとも５ｍｌである。より好ましくは、試料の容積は、５〜５０ｍｌ、好ましくは５〜３０ｍｌの範囲内である。本発明の利点は、大容積の試料さえも高い感受性で分析することができるという事実である。本発明のさらなる態様において、容積試料は、少なくとも１０ｍｌまたは少なくとも２０ｍｌである。
【００１７】
本発明による方法の第１のステップにおいて、試料を、Benzonase（登録商標）Nucleaseを含む溶解緩衝液と接触させる。
【００１８】
Benzonase（登録商標）Nucleaseは、すべての形態のＤＮＡおよびＲＮＡを非特異的に分解する、Serratia marcescensからの遺伝子改変のエンドヌクレアーゼである。酵素は、各々３０ｋＤａの２つのサブユニットからなる。Benzonase（登録商標）Nucleaseは、Merck Milliporeから商業的に入手できる（品物番号７０６６４−３、７１２０６−３）。
【００１９】
溶解緩衝液効率は、試料の細胞量に関連する。溶解緩衝液は、したがって典型的に、Benzonase（登録商標）Nucleaseを試料当たり２．５Ｕ〜１７５Ｕの濃度で含む（試料への添加後の最終濃度に関して）。好ましくは、濃度は、２．５〜１００Ｕ、より好ましくは２．５〜５０Ｕおよび最も好ましくは１０〜３０Ｕである。Benzonase（登録商標）Nucleaseの極めて好ましい濃度は、約２２．５Ｕである。１Ｕ（単位）のBenzonase（登録商標）Nucleaseを、３０分において１．０のΔＡ２６０をもたらす酵素の量として定義し、それは、３７μｇのＤＮＡの完全な消化に相当する。
【００２０】
細胞溶解のために使用する溶解緩衝液の所要の成分は、試料中の溶解するべき哺乳動物細胞のタイプに依存する。Benzonase（登録商標）Nucleaseに加えて、溶解緩衝液の典型的なさらなる成分は、例えばＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水；ＰＢＳ  １Ｘ：１３７ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸塩、２．７ｍｌのＫＣｌ、ｐＨ７．４）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、尿素、ＭｇＣｌ２である。
【００２１】
代替の態様において、ＳＤＳを、同様の物質、例えばドデシル硫酸リチウムによって置き換えることができる。
本発明の好ましい態様において、緩衝液は、トリスＨＣｌ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、トリトンＸおよび／またはＮＰ  ４０を含まない。かかる緩衝液は、細菌、酵母およびカビの破壊が回避されるので、有利である。
【００２２】
本発明の１つの態様において、溶解緩衝液は、以下の成分を含み、ここですべての濃度は、試料への添加の後の最終濃度を指す：
−  ０．０５〜０．５重量％、好ましくは０．５％のＳＤＳ、
−  ０．５Ｍ〜４Ｍ、好ましくは０．５Ｍの尿素、
−  ０．５ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは２ｍＭのＭｇＣｌ２、
−  ２．５〜１７５Ｕ、好ましくは２２．５ＵのBenzonase（登録商標）Nuclease、
−  ＰＢＳ  １Ｘ〜ＰＢＳ  １／８Ｘ、好ましくは１／８Ｘ。
【００２３】
溶解緩衝液の調製は、当業者に一般的である。典型的には、成分を溶解し、混合する。酵素を有しない緩衝液を、典型的にはその使用の前にろ過および／または加熱する。酵素を、次に第２のステップにおいて加える。
【００２４】
試料の哺乳動物細胞は、典型的には懸濁培養において、つまり表面に付着させずに成長する細胞である。かかる細胞は、懸濁液、例えば血液細胞中に天然に生存する細胞、または懸濁培養中で高密度において生存することができるように修正された細胞であり得る。あるいはまた、マイクロキャリア上で成長する細胞系を、使用することができる。
【００２５】
本明細書中で使用する用語「哺乳動物細胞」は、ヒト、非ヒト霊長類、畜牛、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、げっ歯動物（例えばラットまたはマウス）などを含むが、これらに限定されない哺乳動物対象に由来する任意の細胞を指す。
【００２６】
本発明に従って使用することができる哺乳動物細胞系の例は、ハイブリドーマ細胞系：例えばＣＲＬ−８０１８、ＣＦ−１０Ｈ５および多くの他の細胞タイプ：例えばＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ＮＳＯ細胞（マウス骨髄腫細胞系）、Ｓｐ２／０細胞（マウス骨髄腫細胞系）、ＨＴ−１０８０細胞（線維肉腫細胞系）、ＭＤＣＫ（メイディンダービーイヌ腎臓）、ＨｅＬａ（ヒト上皮細胞）またはベロ（腎臓上皮細胞）である。
【００２７】
分析するべき試料は、微生物を含むか、または含むことが疑われる。微生物は、バイオリアクター培地中に、および／または哺乳動物細胞（宿主細胞）中に内生的に存在し得る。本発明の方法に従って単離および／または検出される微生物は、細菌、酵母、菌類および／またはそれらの組み合わせであってもよい。微生物は、好気性および／または嫌気性であってもよい。本発明の微生物は、Acinetobacter属、Bacteroides属、Burkholderia属、Capnocytophaga属、Clostridium属、Corynebacterium属、Citrobacter属、Enterobacter属、Enterococcus属、Escherichia属、Haemophilus属、Klebsiella属、Proteus属、Pseudomonas属、Salmonella属、Serratia属、Staphylococcus属、Stenotrophomona属、Streptococcus属、Saccharomyces属、Zygosaccharomyces属、Penicillium属、Aspergillus属および／またはCandida属を含むが、それらには限定されない。
【００２８】
例示的な微生物は、Escherichia coli、Enterococcus faecalis、Salmonella enterica、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Pseudomonas aerugionosaであってもよい。酵母の例は、Candida albicans、Saccharomyces cerevisiae、Zygosaccharomyces bailii、Dekkera anomalaである。菌類の例は、Aspergillus brasiliensis、Penicillium chrysogenumである。
【００２９】
ステップａ）において、試料を、Benzonase（登録商標）Nucleaseを含む溶解緩衝液と接触させる。当該容積の溶解緩衝液を、試料に、１つまたはいくつかのステップにおいて加えることができる。同様に、溶解緩衝液の成分を１つまたはいくつかのステップにおいて試料に加えることが、可能である。例えば、Benzonase（登録商標）Nucleaseを、第１のステップにおいて加え、続いて残りの溶解緩衝液成分を第２のステップにおいて加えてもよい。
【００３０】
典型的に、試料を溶解緩衝液と接触させた後に、試料を、例えば容器を数回逆転させ、かつ／または容器をボルテックスすることによって均質化するかまたは混合する。さらに、撹拌を伴わないインキュベーションステップを、例えば２〜１０分間、好ましくは約５分行うことができる。
【００３１】
本発明による方法のステップｂ）において、微生物は、哺乳動物細胞を除去することにより得られる。このステップは、いくつかの洗浄および濃縮ステップを含んでもよい。濃縮方法は、例えば遠心分離、ろ過、表面結合および／または磁気的捕獲を含んでもよい。
【００３２】
好ましい態様において、微生物を採集するために、哺乳動物細胞を、例えば１００００〜２００００ｇ、好ましくは１５０００ｇで、５〜１５分、好ましくは約８分間の遠心分離によって除去する。次のステップにおいて、上清を、例えばピペットを使用することによって、またはデカントステップによって除去する。残りのペレットペレットは、微生物を含む。
【００３３】
任意に、洗浄ステップを、試料のタイプに依存して後続させてもよい。典型的には、好適な洗浄緩衝液（例えばトリス）を、好適な量（例えば５〜２０ｍｌ）において加える。試料を次に遠心分離し、上清をペレットから除去する。
本発明において、ステップｂ）の後に単離した微生物を、任意に２つの追加のステップｃ）およびｄ）において検出してもよい：
【００３４】
ステップｃ）において、ユニバーサルな溶解を、それらの核酸を抽出し、かつ／または精製するために微生物に対して行う。当該分野において知られている様々な方法を使用して、ＤＮＡを抽出してもよく、例えばSambrook et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に開示されている方法である。細胞溶解を、標準的な方法によって、例えば酵素的方法、ビーズ方法、超音波処理、洗浄剤方法またはそれらの組み合わせによって遂行してもよい。
【００３５】
酵素的細胞溶解に適している酵素は、例えばリゾチーム、リソフスタフィン、ザイモラーゼ(zymolase)、ムタノリシン(mutanolysin)、グリカナーゼ、プロテアーゼである。
細胞破壊に適しているビーズは、ガラス、セラミックス、ジルコニウムまたは鋼製である。ビーズの細胞への添加の後、混合物の撹拌または振盪によるかきまぜを、適用する。かきまぜを、例えば一般的な研究室ボルテックスミキサーによって、または特別に設計されたクランプにおいて適用することができる。
【００３６】
洗浄剤に基づいた細胞溶解の結果、細胞を包囲する脂質関門の破壊がもたらされる。好適な洗浄剤を、非イオン性、両性イオン性およびイオン性洗浄剤、例えばCHAPS、Triton（登録商標）XまたはTWEEN（登録商標）から選択してもよい。
好ましくは、イオン性洗浄剤を使用する。好適なイオン性洗浄剤についての例は、ＳＤＳである。
【００３７】
洗浄剤の選択に加えて、最適な細胞溶解についての他の重要な検討事項は、緩衝液、ｐＨ、イオン強度および温度を含む：
溶菌液は、典型的には、５より高く９より低い、好ましくは６より高く８より低い、より好ましくは６．５〜７．５のｐＨ値を有する。
【００３８】
使用してもよい緩衝液は、好ましくはリン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液（ＰＢＳ）、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）緩衝液、トリス緩衝生理食塩水緩衝液（ＴＢＳ）およびトリス／ＥＤＴＡ（ＴＥ）の群から選択される。
【００３９】
任意に、１種または２種以上のキレート試薬を、溶菌液に加えて、２価のカチオンを隔離することができる。好適なキレート剤は、例えばＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸、ＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）またはエチレンジアミンである。好ましくは、ＥＤＴＡを使用する。
【００４０】
本発明の好ましい態様において、溶解を、機械的に、特に好ましくは超音波処理によって行う。超音波処理の前に、ペレットを、典型的には、上に記載したように再懸濁させ、かつ／または好適な緩衝液で洗浄する。
【００４１】
超音波処理を、一般に試料に対する超音波適用（典型的に２０〜５０ｋＨｚ）を伴うソニケーター中で達成する。細胞溶解に適しているあらゆるソニケーターを、本発明に従って使用することができ、それは、試料と直接接触するプローブを備えたソニケーター、および力を試料に外部的に適用するソニケーターを含む。好ましくは、外部適用を伴うソニケーターを、試料汚染を回避するために使用する。例として、未公表のEP 13290200.8に開示されているソニケーターを、使用することができる。本発明に従って使用することができるさらなるソニケーターは、商業的に入手でき、例えばVialTweeter (Hielscher)またはBioruptor（登録商標）Picoである。
超音波処理のための典型的なパラメーターは、当業者によって容易に選択され得る。
【００４２】
溶解方法に依存して、遠心分離ステップが後続してもよい：溶解を機械的に、例えば超音波処理によって行う場合、遠心分離は、溶解物をチューブの底で採集するために必要である。ビーズを溶解のために使用する場合、遠心分離ステップはまた、ビーズをチューブの底で採集し、それらを溶解物から分離するために必要である。当業者は、遠心分離のためのパラメーターを容易に決定することができる。典型的には、遠心分離を、Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Yに開示されているように行う。
遠心分離ステップは、溶解を化学的に、例えば酵素を使用することによって行う場合には必要ではない。
【００４３】
細胞溶解の後、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）を、アルコール、好ましくはエタノールまたはイソプロパノールを加えることにより沈殿させてもよい。さらに、ＤＮＡまたはＲＮＡを、商業的に入手できるＤＮＡまたはＲＮＡ単離キット、例えばグラム陽性菌のためのNucleoSpin（登録商標）組織キットおよび支持プロトコル（Machery-Nagel, Dueren、ドイツ）、細菌からのゲノムＤＮＡのためのNexttec（登録商標）キット（Nexttec GmbH Biotechnologie, Leverkusen、ドイツ）、ＤＮＡ精製のための電磁ビーズ（Merck MilliporeによるMilliPrep（登録商標）キット）、QIAampＤＮＡミニキット(Qiagen)またはRNeasy Protect Bacteria Mini kit (Qiagen)を使用する増幅に適している形態で提供することができる。
【００４４】
ステップｄ）において、特定の、またはユニバーサルな検出方法を、微生物を検出するために行う。検出方法は、例えば微生物の核酸を増幅することおよび核酸を検出することを含んでもよい。核酸配列の増幅を、当該分野において知られている任意のin vitro核酸増幅手法によって遂行してもよい。かかる手法は、温度サイクルを必要とする方法（例えばＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応、転写に基づいた増幅）、および／または等温増幅系を含んでもよい。
【００４５】
本発明の好ましい態様において、微生物の核酸の増幅を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／またはその任意の変形によって行う。
【００４６】
好ましくは、リアルタイムＰＣＲ（ｒｔＰＣＲまたはｑＰＣＲ）を、適用する。リアルタイムＰＣＲは、ＰＣＲの各サイクル中に生成した生成物を検出し、測定するための方法であり、それは、ＰＣＲの開始前の鋳型核酸の量に比例する。得られた情報、例えば増幅曲線を使用して、鋳型核酸配列の初期量を定量することができる。
【００４７】
検出は、好ましくは、設定した温度でのすべてのサイクルでの蛍光をモニタリングすることに基づく。蛍光を、通常光学的デバイスを使用してモニタリングして、試料中に存在する特定の蛍光染料についての特定の励起および発光波長でのデータを採集する。試料からの蛍光が背景の上の蛍光の検出についてのしきい値と交差するサイクルは、サイクルしきい値、Ｃｔと称され、出発鋳型の定量を可能にする。
【００４８】
ＰＣＲ条件は、特定的に限定されないが、最適な条件を、各ＰＣＲ装置について選択してもよい。例えば、以下の条件を使用してもよい：
−  二本鎖ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡへの熱変性：加熱を、一般に約９０〜９８℃で、好ましくは約９２〜９６℃で、一般に約３秒〜１分間、好ましくは約３０秒〜１分間行う。
−  アニーリング：加熱を、一般に約４０〜７０℃で、好ましくは５５〜６５℃で、一般に約５秒〜２分、好ましくは約３０秒〜９０秒間行う。
【００４９】
−  ＤＮＡ伸長反応：加熱を、一般に約６０〜７５℃で、好ましくは約７０〜７４℃で、一般に約１０秒〜３分間、好ましくは約３０秒〜２分間行う。
−  反応液体中のＭｇイオン濃度：一般に約１〜５ｍＭ、好ましくは約１．５〜３．５ｍＭ。
【００５０】
この反応を、典型的には約２０〜５０サイクルにおいて、好ましくは約４５サイクルにおいて行い、それによって標的ＤＮＡを、検出可能なレベルに増幅することができる。
リアルタイム逆転写ＰＣＲの場合において、追加のステップを、逆転写酵素の結果ＲＮＡをＤＮＡに転写し、したがってＲＮＡ分子のＰＣＲ分析を可能にするために、古典的ＰＣＲ条件の前に行う。
【００５１】
あらゆる商業的なＰＣＲ装置を、使用することができる。増幅を、プライマーおよび／または少なくとも１種の微生物の核酸への特異的結合が可能なものから選択され得るプライマーのコレクションを使用して行ってもよい。一般に、用語「プライマー」は、標的核酸のらせんに沿った区分に相補的である短い核酸分子、例えば長さが９つのヌクレオチドまたはそれ以上のＤＮＡオリゴヌクレオチドを指し、ここでプライマーの目的は、らせんに沿ったより長い核酸の核酸複製を開始することである。好適なプライマーは、当業者によって容易に同定され得る。
【００５２】
微生物の増幅された核酸を、増幅された核酸に特異的に結合する（ハイブリッド形成する）ことができるプローブおよび／またはプローブのコレクションをハイブリッド形成することにより検出してもよい。
本発明において、用語「ハイブリッド形成する」は、検出可能に、かつ特異的に結合することを意味する。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびそれらの断片は、非特異性核酸への相当な量の検出可能な結合を最小化するハイブリッド形成条件の下で、核酸鎖に選択的にハイブリッド形成する。
【００５３】
典型的にリアルタイムＰＣＲに使用する蛍光標識したプローブは、例えば  LightCycler（ハイブリッド形成）プローブ、分子指標または加水分解プローブ（またTaqMan（登録商標）プローブと称される）である。
LightCyclerプローブは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の手法を利用する。この方法のために、それぞれＦＲＥＴ供与体およびＦＲＥＴ受容体に結合する２種の異なるオリゴヌクレオチドプローブを、各標的配列のために使用する。これらのプローブは、標的配列に並んで結合し、フルオロフォアを近接させる。
【００５４】
分子指標(Tyagi et al., Nat. Biotechnol. 14:303-8, 1996)は、レポーターフルオロフォアおよびクエンチャーに結合するオリゴヌクレオチドプローブである。５’末端上のヌクレオチドは、３’末端上のヌクレオチドに相補的であり、ステムループ構造を形成する。フルオロフォアおよびクエンチャーの近接のために、蛍光は観察されない。プローブの標的配列とのリアルタイムＰＣＲの間のハイブリッド形成によって、レポーター−クエンチャー距離の増大がもたらされ、レポーターの蛍光がもたらされる。
【００５５】
好ましくは、加水分解プローブ（TaqMan（登録商標）プローブ）を、使用する(Lee et al., Nucleic Acids Res. 21:3761-6, 1993)。これらのプローブは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の手法を同様に利用する。プローブは、一方の末端で蛍光レポーターを、および対向する末端で蛍光のクエンチャーを示す。レポーターのクエンチャーへの密接な近接のために、レポーター蛍光の検出は、抑制される。ＰＣＲのアニーリング段階中に、プライマーおよびプローブの両方を、ＤＮＡ標的にアニールする。新たなＤＮＡ鎖の重合によって、ポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によるプローブの分解および蛍光レポーターのクエンチャーからの物理的な分離がもたらされ、蛍光の増大がもたらされる。蛍光を、リアルタイムＰＣＲサーモサイクラー(thermocycler)において検出し、測定することができ、生成物の指数関数的な増大に相当するその幾何学的な増大を使用して、各反応におけるしきい値サイクル（Ｃｔ）を決定する（以下を参照）。
【００５６】
例示的なレポーターは、以下のものを含むが、それらには限定されない：６−カルボキシフルオレセイン；カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）；ホウ素ジピロメテンジフルオリド（ＢＯＤＩＰＹ）；アクリジン、スチルベン、６−カルボキシ−フルオレセイン（ＨＥＸ）、ＴＥＴ（テトラメチルフルオレセイン）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、ローダミン−６Ｇ、テキサスレッド、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、Cy（登録商標）3、Cy（登録商標）5、VIC（登録商標）(Applied Biosystems)、ＬＣレッド６４０、ＬＣレッド７０５、テキサスレッド、Yakima Yellow（登録商標）およびそれらの誘導体。
【００５７】
例示的なクエンチャーは、Black Hole Quenchers (WO 01/86001 A1)、例えばBHQ1（商標）およびBHQ2（商標）、ＭＧＢ(Minor-groove-binder、EP 0819133 B1)、Ｎ、Ｎ、Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、Eclipse（登録商標）Dark Quencher、ＤＡＢＣＹＬ、ＤＡＢＳＹＬ、ＤＤＱ  ＩおよびＤＤＱ  ＩＩを含むが、それらには限定されない。
【００５８】
当業者は、好適なレポーター−クエンチャーの組み合わせを容易に選択することができる。典型的には、クエンチャーの吸収スペクトルは、最適なクエンチングを可能にするためにレポーターの発光スペクトルとの良好な重複を有する必要がある。
【００５９】
発生した蛍光信号を、次に定性的に、かつ／または定量的に分析してもよい。検出は、好ましくは、蛍光をすべてのサイクルで設定した温度でモニタリングすることに基づく。蛍光を、通常光学的デバイスを使用してモニタリングして、試料中に存在する特定のフルオロフォアについての特定の励起および発光波長でのデータを収集する。
【００６０】
本発明は、哺乳動物細胞の試料中の微生物の単離および任意に検出についての高い感受性を提供する。この方法の特定の利点は、検出の感受性が、極めて高い量の哺乳動物細胞の試料を分析するべきである場合（５０ｍｌまでの試料中で合計で５*１０８までの細胞）、および／または試料がいかなる微生物汚染をもほとんど含まない場合においても付与されることである。方法は、極めて迅速であり、単純である：微生物を、２０分未満においてわずかな手動操作を伴うのみで単離することができる。全体の試料調製を、１時間未満において行うことができる。本発明の方法は、ｑＰＣＲ感受性に影響せずに新鮮な、および凍結された試料に対して作動し、一方最先端技術による多くの方法は、凍結された試料に対して貧弱な性能を示す。
【００６１】
本発明のさらなる観点は、以下の成分を含む溶解緩衝液に言及する：
−  ＳＤＳ
−  尿素  
−  ＭｇＣｌ２
−  Benzonase（登録商標）Nuclease 
−  ＰＢＳ。
【００６２】
好ましい態様において、溶解緩衝液の成分を、溶解緩衝液の試料への添加の後のそれらの最終濃度が以下の通りであるように調節する：
−  ０．０５〜０．５重量％のＳＤＳ
−  ０．５Ｍ〜４Ｍの尿素
−  ０．５ｍＭ〜１０ｍＭのＭｇＣｌ２
−  ２．５〜１７５ＵのBenzonase（登録商標）Nuclease
−  ＰＢＳ  １Ｘ〜ＰＢＳＸ１／８。
【００６３】
より好ましい態様において、成分の最終濃度は、以下のとおりである：
−  ０．５％のＳＤＳ、
−  ０．５Ｍの尿素、
−  ２ｍＭのＭｇＣｌ２、
−  ２２．５ＵのBenzonase（登録商標）Nuclease、
−  ＰＢＳ  １／８Ｘ。
【００６４】
１つの態様において、予め混合した溶解緩衝液は、以下の成分を含んでもよい（濃度は試料への添加前の予め混合した溶解緩衝液に関する）：
−  ４％のＳＤＳ、
−  ４Ｍの尿素、
−  １６ｍＭのＭｇＣｌ２、
−  ＰＢＳ  １Ｘ。
Benzonase（登録商標）Nucleaseを、試料に好適な量において別個に加えて、好ましくは２２．５Ｕの最終的な使用濃度を得てもよい。
【００６５】
さらなる観点において、本発明は、上に記載した溶解緩衝液の上に記載した方法における使用に関する。
以下の例は、本発明の実際の適用を記載する。
【００６６】
例：
例１：マトリックス溶解プロトコル
種々の容積の哺乳動物細胞試料を、以下のプロトコルによって試験する：
微生物細胞の単離：
Ｘｍｌ（表１を参照）のＣＨＯ細胞試料を、５０ｍｌのCorningチューブ中に満たす。
試料を微生物で汚染させ、チューブを数回逆転させることにより均質化する。
２２．５ＵのBenzonase（登録商標）Nuclease（Merck Milliporeから入手できる、品物番号７０６６４−３または７１２０６−３）を加え（この酵素を、十分な容積を加えるためにヌクレアーを含まない水で希釈しなければならない）、試料を、５０ｍｌのチューブを数回逆転させることにより均質化する。
【００６７】
チューブを、Ｙｍｌの緩衝液（４Ｍの尿素、４％のＳＤＳ、１６ｍＭのＭｇＣｌ２、ｘ１  ＰＢＳ）で満たして、試料中で緩衝液の最終濃度を得る：０．５Ｍの尿素、０．５％のＳＤＳ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１／８  ＰＢＳ（表１を参照）。試料を、チューブを数回逆転させることにより均質化し、かきまぜを伴わない室温での５分間のインキュベーションステップを後続させる。懸濁液中に何らかの粒子がある場合、粒子を溶解するための迅速なボルテックスステップを、適用する。試料を、１５０００ｇで８分間遠心分離する。上清を、ピペットで除去する。
１０ｍｌの１０ｍＭのトリス  ｐＨ７を加え、試料をボルテックスする。
【００６８】
微生物細胞の検出：
試料を、１５０００ｇで６分間遠心分離する。上清を除去する。５００μｌの緩衝液（１ＭのグアニジンＨＣｌ、５ｍＭのトリス  ｐＨ８（＋０．５ｍＭのＥＤＴＡ）、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＮＬＳ（Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩溶液））を加え、試料をボルテックスする。
チューブを、３分間超音波処理する。
チューブを、３０００ｇで１分間遠心分離し（任意）、核酸精製機器(Kingfisher（商標）, ThermoScientific)中に移送する。
ＤＮＡを、マイコプラズマのためのMilliPrep電磁ビーズキット（Merck-Millipore、品物番号ＭＰＲＰＢＤ０４８）でさらに精製する（５０μｌ中への溶出）。
【００６９】
【表１】
0006466437.tif 000002
【００７０】
0006466437.tif 000003
【００７１】
例２：
以下の例は、極めて低い微生物汚染に関する方法の感受性を例示する。数種の微生物（表２を参照）を、高度に濃縮された新鮮なＣＨＯ細胞試料中に添加する（表２を参照）。微生物およびそれらのＤＮＡを単離するために、例１のプロトコルに従う。その後、微生物を、特異的なリアルタイムＰＣＲ（２５μｌ、SYBR（登録商標）Green Mastermix QuantiTect (Qiagen)で行う）を使用することにより検出する。
結果を、以下の表２に示す：
【００７２】
【表３】
0006466437.tif 000004
【００７３】
結果は、本発明の方法が、２〜３*１０８の新鮮なＣＨＯ細胞の存在下で５５ｃｆｕまで細菌、酵母および菌類を検出することができることを示す。
【００７４】
例３：
以下の例は、凍結されたＣＨＯ細胞の試料についての極めて低い微生物汚染に関する方法の感受性を例示する。数種の微生物（表３を参照）を、高度に濃縮された凍結されたＣＨＯ細胞試料中に添加する（表３を参照）。微生物およびそれらのＤＮＡを単離するために、例１のプロトコルに従う。その後、微生物を、ユニバーサルな酵母およびカビリアルタイムＰＣＲ（２５μｌ、TaqMan（登録商標）PCR (Biotecon)）を使用することにより検出する。
結果を、以下の表３に示す：
【００７５】
【表４】
0006466437.tif 000005
【００７６】
結果は、本発明の方法が、３*１０８の凍結されたＣＨＯ細胞の存在下で２８ｃｆｕまで酵母および菌類を検出することができることを示す。