(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マススペクトロメトリーの内部標準として使用するための同位体標識されたグリカンを合成するための方法であって、該方法は、
オリゴ糖のコア構造を同位体標識されたアシル化剤でアシル化して、
【化１】
0006602747.tif 000024
［式中、各Ａｃ＊は、同位体標識されている］
から選択される同位体標識されたオリゴ糖のコア構造を得る工程であり、ここでオリゴ糖のコア構造は、１つまたはそれより多くの保護基で保護されていてもよい、工程；および
得られた同位体標識されたオリゴ糖のコア構造を酵素により誘導体化して、同位体標識されたグリカンを得る工程を含み、該グリカンが同位体標識されたオリゴ糖のコア構造をモチーフとして含むグリカンである、上記方法。
【請求項２】
酵素による誘導体化が、末端の糖単位を除去するための酵素加水分解工程を含む、および／または
グリコシルトランスフェラーゼおよび好適な糖ドナーを用いた酵素による伸長工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
同位体標識されたオリゴ糖のコア構造が、酵素による誘導体化中に、１つまたはそれより多くの保護基で保護されている、または
同位体標識されたオリゴ糖のコア構造が、１つまたはそれより多くの、置換されていてもよいベンジル基で保護されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
オリゴ糖のコア構造が、二糖モチーフを含み、二糖モチーフは、第一の単糖単位および第二の単糖単位を含み、ここで第一の単糖単位および／または第二の単糖単位の少なくとも１つはアミノ基を含み、アシル化はアミノ基で起こる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
オリゴ糖のコア構造が、二糖モチーフを含み、二糖モチーフは、第一の単糖単位および第二の単糖単位を含み、ここで第一の単糖単位は、
ＧｌｃＮ、ＧａｌＮ、ＭａｎＮ、ＦｒｕＮ、ＦｕｃＮ、Ｍｕｒ、またはＮｅｕから選択され；
第二の単糖単位は、
Ｇｌｃ、Ｇａｌ、Ｍａｎ、Ｒｈａ、Ｆｒｕ、Ｆｕｃ、ＧｌｃＮ、ＧａｌＮ、ＭａｎＮ、ＦｒｕＮ、ＦｕｃＮ、Ｍｕｒ、Ｎｅｕ、ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ、ＦｒｕＮＡｃ、ＦｕｃＮＡｃ、ＭｕｒＮＡｃ、ＮｅｕＮＡｃ、シアル酸、またはイノシトール
から選択され；
ここで第一の単糖の糖および第二の単糖の糖単位は、配列：
第一の単糖−第二の単糖、または
第二の単糖−第一の単糖
で連結される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、
ＧｌｃＮ−ＧｌｃＮ
Ｇａｌ−ＧａｌＮ
ＧａｌＮ−ＧｌｃＮ
から選択されるモチーフを含むオリゴ糖のコア構造を、同位体標識されたアシル化剤と反応させることを含む；または
前記方法が、モチーフ：
Ｍａｎ−ＧｌｃＮ−ＧｌｃＮ
を含むオリゴ糖のコア構造を、同位体標識されたアセチル化剤と反応させて、モチーフ：
Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ＊−ＧｌｃＮＡｃ＊
を含むオリゴ糖を得ることを含み、式中、Ａｃ＊は、同位体標識されたアセチル基である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、式（Ｂ）の同位体標識されたオリゴ糖のコア構造を形成するのに好適な条件下で、式（Ａ）のオリゴ糖を、同位体標識されたアセチル化剤と反応させることを含み：
【化２】
0006602747.tif 000025
式中、
各Ｒ１は、独立して、Ｈまたは保護基であり；
Ｒ２は、独立して、Ｈまたは保護基であり；
各Ｒ３は、独立して、Ｈ、保護基、または（Ｓａｃ）ｍであり、ここで各Ｓａｃは単糖単位であり、ｍは、１〜５の数値である；または
前記方法が、式（Ｄ）の同位体標識されたオリゴ糖のコア構造を形成するのに好適な条件下で、式（Ｃ）のオリゴ糖を、同位体標識されたアセチル化剤と反応させることを含み：
【化３】
0006602747.tif 000026
式中、
各Ｒ１は、独立して、Ｈまたは保護基であり；
Ｒ２は、独立して、Ｈまたは保護基であり；
各Ｒ３は、独立して、Ｈ、保護基、または（Ｓａｃ）ｍであり、ここで各Ｓａｃは単糖単位であり、ｍは、１〜５の数値である；
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
同位体標識されたアセチル化剤が、同位体標識された無水酢酸である；または、
同位体標識されたアセチル化剤が、
（１３ＣＨ３１３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（１３ＣＨ３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（ＣＨ３１３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（ＣＤ３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（１３ＣＤ３１３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（１３ＣＤ３Ｃ＝Ｏ）２Ｏまたは（ＣＤ３１３Ｃ＝Ｏ）２Ｏから選択される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
各Ａｃ＊が、−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）ＣＤ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＤ３、−（Ｃ＝Ｏ）１３ＣＤ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）ＣＤ３、−（１４Ｃ＝Ｏ）１４ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）１４ＣＨ３、−（１４Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝１７Ｏ）ＣＨ３、または−（Ｃ＝１８Ｏ）ＣＨ３から選択される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、同位体標識されたオリゴ糖中のアセチル−ヘキソサミン単位の遊離のアノマー位でオキサゾリンを形成することをさらに含む、
および／または
前記方法が、ペプチド、脂質またはタンパク質をグリコシル化して、同位体標識されたオリゴ糖を含む同位体標識された糖ペプチド、ペプチドグリカン、グリコリピド、糖タンパク質を得ることをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
【化４】
0006602747.tif 000027
［式中、各Ａｃ＊は、同位体標識されている］
から選択される同位体標識されたオリゴ糖のコア構造の酵素反応生成物であるグリカン。
【請求項１２】
各Ａｃ＊が、−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）ＣＤ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＤ３、−（Ｃ＝Ｏ）１３ＣＤ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）ＣＤ３、−（１４Ｃ＝Ｏ）１４ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）１４ＣＨ３、−（１４Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝１７Ｏ）ＣＨ３、−（１３Ｃ＝１７Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝１７Ｏ）１３ＣＨ３、−（１３Ｃ＝１７Ｏ）１３ＣＨ３、−（Ｃ＝１８Ｏ）ＣＨ３、−（１３Ｃ＝１８Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝１８Ｏ）１３ＣＨ３、−（１３Ｃ＝１８Ｏ）１３ＣＨ３から選択される、請求項１１に記載のグリカン。
【請求項１３】
サンプル中のグリカンを同定する方法であって、該方法は、請求項１１または１２に記載のグリカンを含むタグ付けされた標準をサンプルに添加して、ドープしたサンプルを得ること、およびドープしたサンプルを、マススペクトロメトリーを使用して分析することを含む、上記方法。
【請求項１４】
前記方法が、（ｉ）１種またはそれより多くの同位体標識されたグリカンを含むタグ付けされた標準を選択すること；（ｉｉ）タグ付けされた標準をサンプルに添加して、ドープしたサンプルを得ること；（ｉｉｉ）ドープしたサンプルをマススペクトロメトリーを使用して分析して、イオンのピークを得ること；（ｉｖ）タグ付けされた標準に関連するイオンのピークの同一性および強度を、ドープしたサンプルのスペクトル中の追加のイオンのピークと比較することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
タグ付けされた標準が、分析物であるグリカンの複数のより高分子量の同位体標識されたアイソトポログを含み、ここで該方法の工程（ｉｖ）は、以下：
（ａ）より高分子量の同位体標識された各アイソトポログに関連するイオンのピークの相対的な強度（Ｉｊ＊）を、標準中のそのグリカンの既知の存在度（ｍｊ＊）と関連付けて、ｍｊの一次関数としてＩｊを得る工程；
（ｄ）前記関数を使用して、分析物であるグリカンの非同位体標識アイソトポログの量を計算する工程；
の工程を包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）と（ｄ）の間に、工程（ｂ）および（ｃ）：
（ｂ）関連付けに関する決定係数Ｒ２を計算して、Ｒ２値が事前に決定された値より高い場合、最も豊富なイオンのピークを除外する工程；
（ｃ）工程（ｉｉ）を１回またはそれより多く繰り返す工程；
のいずれかまたは両方をおこなう；および／または
（ｄ）の後に工程（ｅ）：
（ｅ）分析物であるグリカンの非同位体標識アイソトポログの総量を使用して、存在する分析物であるグリカンの総量を決定する工程；
をおこなう、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
サンプル中のグリカンが、組換え糖タンパク質または抗体から放出されたグリカンである、および／またはサンプル中のグリカンが、医学的疾患もしくは障害、または生物学的プロセスに関連するバイオマーカーである、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が、医学的疾患もしくは障害、または生物学的プロセスのインジケーターとして、１種またはそれより多くのグリカンの存在または量を関連付けることをさらに含む、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
診断方法で使用するための請求項１１または１２に記載のグリカンを含む組成物であって、該方法は、
（ｉ）疾患または障害に関連するグリカンを含有する疑いのあるサンプルを患者から得ること；
（ｉｉ）疾患または障害に関連するグリカンに対応する同位体標識されたグリカンを含むタグ付けされた標準を選択すること；
（ｉｉｉ）タグ付けされた標準をサンプルに添加して、ドープしたサンプルを得ること；
（ｉｖ）ドープしたサンプルをマススペクトロメトリーを使用して分析して、イオンのピークを得ること；
（ｖ）タグ付けされた標準に関連するイオンのピークの同一性および強度を、ドープしたサンプルのスペクトル中の追加のイオンのピークと比較して、サンプル中の１種またはそれより多くのグリカンの存在を同定すること；
（ｖｉ）前記１種またはそれより多くのグリカンの存在を使用して、疾患または障害を診断すること
を含む、上記組成物。
【請求項２０】
サンプル中のグリカンを同定するためのキットであって、該キットは、
（ａ）１種またはそれより多くの請求項１１または１２に記載のグリカンを含む、タグ付けされた標準；および
（ｂ）グリカンを含有する疑いのあるサンプルをタグ付けされた標準でドープして、ドープしたサンプルを得て、ドープしたサンプルをマススペクトロメトリーを使用して分析するための説明書を含む、上記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴ糖および多糖のアイソトポログに関する。具体的には、本発明は、同位体標識されたグリカンの合成、およびグリカン混合物のマススペクトロメトリーによる分析における標準としてのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
グリコシル化は、真核細胞系において最も一般的な翻訳後タンパク質修飾の１つである。全ての哺乳動物タンパク質の過半数が、それらが存在する間のどこかの時期でグリコシル化されており、実質的に全ての膜および分泌タンパク質がグリコシル化されていると推定される。グリコシル化は、非テンプレート駆動型プロセス（non-template-driven process）であり、より高次の生物における複雑なプロセスに必要な高レベルの可変性を導入すると考えられる。グリカンは、主要な高分子の相互作用への参加に加えて、タンパク質のフォールディング、トラフィッキング、および安定性に寄与することが示されている。
【０００３】
Ｎ−グリカンは、トリペプチド配列であるＡｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（式中Ｘは、プロリンを除くあらゆるアミノ酸である）の一部であるアスパラギン残基を介してタンパク質骨格に連結される。Ｎ−グリカンは、末端の糖残基に応じて、複合型、高マンノース型、およびハイブリッド型Ｎ−グリカンに分類される。この分類は、ほとんどのＮ−グリカンが共有する共通の五糖モチーフに基づく。Ｏ−グリカンは、セリンまたはスレオニン残基を介してタンパク質に連結される。多数のＯ−グリカンのコア構造があり、最も一般的なものは、コア１、コア２、コア３、およびコア４である。
【０００４】
多数の疾患が、グリコシル化および／またはグリカンの認識における後天的変化を伴うことが知られている。例えば、グリコシル化の変更は、がん細胞の普遍的な特色であり、いくつかのグリカン構造は、腫瘍および腫瘍の進行に関する周知のマーカーである。結果として、科学界は、タンパク質のグリコシル化およびグリカン組成を総合的に分析する方法に関心を寄せている。
【０００５】
ほとんどのグリコールのプロファイリング法で、グリカンは、ヒドラジン分解かまたは特異的なペプチドグリコシダーゼ（例えばＰＮＧａｓｅ  Ｆ）での処置のいずれかによってタンパク質から除去される。結果得られた複雑な混合物の分析には、低濃度でも高感度であることからマススペクトロメトリーが使用されることが多い。しかしながら、特定の分析物のシグナル強度は、他の多くの因子のなかでも分析物の物理的特性（イオン化の可能性、フラグメント化する傾向など）に依存することから、あらゆる相対的な定量化、時には同定でさえも極めて困難になる。
【０００６】
２つのサンプルに共通するグリカンの同定およびそれらの相対的な定量化は、同位体タグを取り入れるためのグリカン混合物の誘導体化を使用することによって容易にすることができる。２つのサンプルは、標識化試薬の軽い形態および重い形態で標識され、次いで混合されて、その後マススペクトロメトリーを使用して分析される。糖タンパク質から単離されたグリカン混合物に同位体タグを取り入れるための誘導体化は、過メチル化（permethylation）技術または還元的アミノ化を使用してタグが導入されるグリカン還元同位体標識化を使用して達成されている（Atwood、2007；Bowman、2007、2010；Botelho、2008；Hitchcock、2006；Hsu、2006；Kang、2007；Lawrence、2008；Ridlova、2008；Yuan、2005；Zhang、2003）。
【０００７】
還元的アミノ化は、典型的にはグリカンの還元末端で起こり、同位体標識されたアニリン、アミノピリジンまたはアントラニル酸を使用する可能性がある。例えば、Xiaら（2009）は、ヒトおよびマウス血清から放出されたグリカン混合物中の差を比較するための同位体標識されたアニリンタグの使用を実証した。グリカンをＰＮＧａｓｅ  Ｆによって放出させ、次いで結果得られた混合物を、１２Ｃ６−アニリンまたは１３Ｃ６−アニリンを用いた還元的アミノ化によって別々に誘導体化した。著者らは、マウス血清からの１２Ｃ６−アニリンで誘導体化されたグリカン混合物とヒト血清からの１３Ｃ６−アニリンで誘導体化されたグリカン混合物との等モルの組合せを分析することによって、６Ｄａの質量差で隔てられた一対の質量ピークを同定して、両方のサンプルに共通するグリカンに関する妥当な構造を割り当てることができることを報告した。著者らは、これらのピークの相対的な強度を比較することによって、１つのサンプル中に存在する特定の共通するグリカンの量を他方と比較して決定できることを報告した。
【０００８】
しかしながら、これらの方法では半定量的な結果しか得られない。さらに結果は、タグ付け手法の再現性、ならびに副反応、酸化的分解反応および「ピーリング反応（peeling reactions）」（これらは、水溶液中の所定の反応条件によって起こる可能性がある）によって引き起こされる問題の影響を受け、重要な官能化が誘導体化工程中に失われる可能性がある。
【０００９】
また同位体タグは、プロテオミクスでも使用されてきた。Breidenbachら（2012）は、ろ過を利用したサンプル調製法を使用して、同位体標識されたＧｌｃＮＡｃが酵母のＮ−グリカンに代謝によって取り入れられることを実証した。二臭化物同位体の三重項パターンを模擬するために、天然の同位体存在度のＧｌｃＮＡｃ、１３Ｃ２−ＧｌｃＮＡｃおよび１３Ｃ４１５Ｎ１−ＧｌｃＮＡｃを１：２：１の比率で含むＧｌｃＮＡｃイソミックス（isomix）を使用した。結果得られたイソミックスを含有するグリコールコンジュゲートをＦＡＳＰ消化およびＥｎｄｏＨ脱グリコシルで処理して、グリコシドの同定を容易にするために自動同位体エンベロープパターン検索を使用して（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験で）分析した。この方法により、著者らは、サンプル中の他のイオンに対する糖ペプチドイオンの相対的な強度に関係なく、フラグメンテーションの優先度を糖ペプチドイオンにおくことができた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】J. A. Atwood III, L. Cheng, G. Alvarez-Manilla, N. L. Warren, W. S. York, R. Orlando, Journal of proteome research 2007, 7, 367-374
【非特許文献２】M. J. Bowman, J. Zaia, Analytical chemistry 2007, 79, 5777-5784
【非特許文献３】M. J. Bowman, J. Zaia, Analytical chemistry 2010, 82, 3023-3031
【非特許文献３】J. C. Botelho, J. A. Atwood III, L. Cheng, G. Alvaez-Manilla, W. S. York, R. Orlando, International Journal of Mass Spectrometry 2008, 278, 137-142
【非特許文献４】A. M. Hitchcock, C. E. Costello, J Zaia, Biochemistry 2006, 45, 2350-2361
【非特許文献５】J. Hsu, S. J. Chang, A. H. Franz, American Society for Mass Spectrometry 2006, 17, 194-204
【非特許文献６】P. Kang, Y. Mechref, Z. Kyselova, J. A. Goetz, M. V. Novotny, Analytical chemistry 2007, 79, 6064-6073
【非特許文献７】R. Lawrence, S. K. Olson, R. E. Steele, L. Wang, R. Warrior, R. D. Cummings, J. D., Esko Journal of biological chemistry 2008, 283, 33674-33684
【非特許文献８】G. Ridlova, J. C. Mortimer, S. L. Maslen, P. Dupree, e. Stephens, Rapid Communications in Mass Spectrometry 2008, 22, 2723-2730
【非特許文献９】J. Yuan, N. Hashii, N. Kawasaki, S. Itoh, T. Kawanishi, T. Hayakawa, journla of chrmoatography A 2005, 1067, 145-152
【非特許文献１０】H. Zhang, X.-J. Li, D. B. Martin, R. Aebersold, Nature biotechnology 2003, 21, 660-6
【非特許文献１１】B. Xia, C. L. Feasley, G. P. Sachdev, D. F. Smith, R. D. Cummings, Analytical biochemistry 2009, 387, 162-170
【非特許文献１２】M. A. Breidenbach, K. K. Palaniappan, A. A. Pitcher, C. R. Bertozzi, Molecular & Cellular Proteomics 11.6, 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
放出されたグリカン混合物の内容物を迅速且つ容易に分析するための改善された方法、具体的には前述された従来技術の不利益を被らない方法に対する未だ満たされていない必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、マススペクトロメトリーで標準として使用される個々のグリカンおよび複合糖質の安定なアイソトポログは、複雑な混合物の定性および定量分析において有用性を有する可能性があるという発明者らの知見に基づく。具体的には、本発明は、タンパク質からの除去の間またはその後のいずれかにタグを取り入れるためにグリカン混合物を誘導体化する当業界において公知の同位体によるグリカンのタグ付け法に関連する、再現性および機能的情報の喪失の問題に取り組むものである。本発明者らは、同位体標識されたグリカンを合成的に生成する方法を提供し、それによって上記グリカンを分析物サンプルにドープして、マススペクトロメトリーで分析することを可能にする。これらの方法は、残存するマススペクトロメトリーピークに関連する（サンプルに関連する）マススペクトロメトリーエンベロープの比較により、分析物サンプル中の既知の構造を有するグリカンを同定することを可能にする。
【００１３】
さらに、本発明は、既知量の標準を添加することにより、サンプル内の特定のグリカンを絶対的に定量化することを可能にし、半定量的データしか得られない当業界において公知の方法を超える顕著な利点をもたらす。本発明は、マススペクトロメトリーを使用した複雑なグリカン混合物の定性および定量分析で使用するための、同位体標識されたグリカン標準（いわゆる「タグ付けされた標準」）のライブラリーを提供する。さらに、これらの標準を使用して、複雑なグリカン混合物の組成を定性的および／または定量的に分析するための方法が提供される。これらの分析方法は、特定の障害および病態ならびに他の生物学的プロセスに関連するグリカンマーカーの同定において有用であり得る。
【００１４】
本発明は、広義には、少なくとも２つの糖単位を含むグリカンを同位体標識されたアシル化剤で処置して、グリカン構造に同位体標識を取り入れることを含む、同位体標識されたグリカン（複合糖質を包含する）を合成するための方法を包含する。
【００１５】
これらの同位体標識されたオリゴ糖は、オリゴ糖のコア構造であり、次いでこれは、酵素による誘導体化工程、すなわち１回またはそれより多くの酵素触媒工程による多様化を介して、同位体標識されたグリカン標準のライブラリーを合成するのに使用することができる。これは、特定のグリカンを定性的（および定量的）に検出するための方法における飛躍的進歩を象徴する。
【００１６】
したがって、第一の形態において、本発明は、同位体標識されたオリゴ糖を合成するための方法であって、該方法は、オリゴ糖を同位体標識されたアシル化剤でアシル化することを含み、ここでオリゴ糖は、場合により１つまたはそれより多くの保護基で保護されている、上記方法に関する。
【００１７】
第一の形態において、本発明は、マススペクトロメトリーの内部標準として使用するための同位体標識されたグリカンを合成するための方法であって、該方法は、
オリゴ糖のコア構造を同位体標識されたアシル化剤でアシル化して、同位体標識されたオリゴ糖のコア構造を得る工程であり、ここでオリゴ糖のコア構造は、場合により１つまたはそれより多くの保護基で保護されている、工程；および
得られた同位体標識されたオリゴ糖を酵素により誘導体化して、同位体標識されたグリカンを得る工程
を含む、上記方法を提供する。
【００１８】
酵素による誘導体化は、酵素による多様化と称される場合もあり、本明細書で使用される場合、本明細書で説明されているようにオリゴ糖を酵素触媒反応で処理することを指す。好適な酵素による誘導体化（derivitisation）／多様化反応としては、以下が挙げられる：
−  伸長：オリゴ糖へのさらなる糖単位の添加であり、典型的には、グリコシルトランスフェラーゼを使用した好適な糖ドナーとの縮合反応を介する。伸長は、オリゴ糖の末端で、または中間の糖単位に対して起こすことができる。
【００１９】
−  トランケーション：オリゴ糖の末端からの糖単位の除去。これは、典型的には、ヒドロラーゼを用いた加水分解反応を介する。
【００２０】
−  エピマー化：分子中の立体中心の全体的または部分的な転化。これは、典型的には、エピメラーゼによって触媒される。
【００２１】
−  糖転移（グリコシル転移反応）：ドナーからアクセプターへの糖単位の転移；すなわち、あるオリゴ糖が糖単位を失うことであり、すなわちトランケートされ、一方で別のオリゴ糖が糖単位を獲得する（すなわち伸長される）。これらの反応は、シンセターゼまたはトランスグリコシダーゼによって触媒され得る。
【００２２】
−  翻訳後修飾：酵素による誘導体化中に、他の官能化を取り入れることができる。一般的な翻訳後修飾は当業界において公知であり、例えば、これらに限定されないが、リン酸化、硫酸化およびアシル化が挙げられる。
【００２３】
典型的には、このような酵素触媒による誘導体化工程は、化学選択的である。本発明の第一の形態は、本明細書で説明されているように、マススペクトロメトリーの内部標準として使用するための莫大な数の同位体標識されたグリカン構造を、比較的小さい「コア」のオリゴ糖から開始して都合よく生成するための方法を提供することが理解されよう。
【００２４】
いくつかの実施態様において、酵素による誘導体化工程は、末端の糖単位を除去するための酵素加水分解工程を含む。それにより、例えば、本明細書で説明されているように合成された二分岐した七糖のＮ−グリカンコアから得られた非対称な標準が利用可能になる。
【００２５】
いくつかの実施態様において、酵素による誘導体化工程は、グリコシルトランスフェラーゼおよび好適な糖ドナーを用いた、得られたグリカンの酵素による伸長工程を含む。好適な酵素による伸長方法は当業界において公知であり（Blixt、2006；Ruiz、2001；Serna、2010、Zou、2011）、さらに後述される。好適な糖ドナーは、単糖、オリゴ糖または多糖であり得る。いくつかの実施態様において、酵素による伸長工程は、１回またはそれより多く繰り返される。酵素による伸長工程が繰り返される実施態様において、各工程における糖ドナーは、好ましくは、好適な単糖の糖ドナーである。
【００２６】
いくつかの実施態様において、酵素による伸長工程における糖ドナーは、同位体標識されている。酵素による伸長工程が繰り返される実施態様において、酵素による伸長工程における糖ドナーは、同位体標識されていてもよく、これは、他のあらゆる酵素による伸長工程における糖ドナーが同位体標識されているかまたはそうでないかとは無関係である。糖ドナーは、原子のあらゆる好適な同位体の形態で、あらゆる好適な位置で同位体標識されていてもよい。この方法において、追加の同位体標識された単糖単位が、同位体標識されたオリゴ糖に取り入れられてもよい。これは、ＭＳ−ＭＳ法で得られたフラグメンテーションパターンを使用したグリカンの分析において、さらに、後述するように正確な定量分析を補助するために特定のグリカン構造の異なるアイソトポログを生成することに関して有用な場合がある。
【００２７】
酵素による誘導体化工程は、単回の酵素触媒工程を含んでいてもよいし、または１回より多くの酵素触媒工程を逐次的に包含していてもよいことが理解されよう。例えば、酵素による誘導体化工程は、単回の加水分解または伸長工程であってもよいし、または望ましいグリカン構造を生成するのに１回より多くの加水分解および／または伸長工程を包含していてもよい。例えば、同位体標識されたオリゴ糖のコアを逐次的に伸長またはトランケートさせ、次いで（逐次的に）伸長させてもよい。また同位体標識されたオリゴ糖を、異なる位置で伸長させ、次いでトランケートさせてもよい。使用される酵素の特異性を適合させるために、工程の異なる順番が望ましい場合がある。ここで代表的な非限定的な例を示す。
【００２８】
オリゴ糖という用語は、本明細書で使用される場合、少なくとも２つの単糖（単糖単位）を含む糖類高分子に関する。いくつかの実施態様において、オリゴ糖は、二糖である。いくつかの実施態様において、オリゴ糖は、三糖である。いくつかの実施態様において、オリゴ糖は、四糖である。いくつかの実施態様において、オリゴ糖は、五糖である。いくつかの実施態様において、オリゴ糖は、六糖である。いくつかの実施態様において、オリゴ糖は、七糖である。いくつかの実施態様において、オリゴ糖は、より高次のオリゴマーである。オリゴ糖は、直鎖状であってもよいし、または分岐状（また、枝分かれ（antennary）とも称される）であってもよい。
【００２９】
オリゴ糖は、１つまたはそれより多くのヒドロキシルまたはアミノ基を含んでいてもよく、これらはそれぞれ独立して保護基で保護されていてもよい。いくつかの実施態様において、遊離のヒドロキシルおよび／またはアミノ基は、保護されていない。他の実施態様において、存在するヒドロキシル基の一部または全部が、保護されている。いくつかの実施態様において、少なくとも１つの保護された第一および／または第二アミノ基が存在する。
【００３０】
ヒドロキシルおよびアミノ基に好適な保護基は当業界において公知である。単なる一例として、これらに限定されないが、本発明で使用するのに適した好適な保護基を以下で論じる。いくつかの実施態様において、オリゴ糖上の望ましい位置での選択的な脱保護および化学的操作を容易にするために、保護基は互いにオルソゴナルになるように選択される。
【００３１】
好ましくは、オリゴ糖は、少なくとも１つの遊離の−ＮＨ２基を含み、アシル化は、遊離の−ＮＨ２基で起こる。１個より多くの遊離の−ＮＨ２基が存在する場合、アシル化は、それぞれの遊離の−ＮＨ２基で起こる可能性がある。
【００３２】
本発明者らは、部分的に保護されたコアモチーフが、化学選択的な酵素による誘導体化に好適な基質であることを見出した。さらに、保護基の存在は、特定の利点を有する可能性がある。例えば、本明細書で説明されているように、ベンジルを含む基は、ＨＰＬＣ分析および精製中にピークを検出するための発色団として作用する可能性があり、異なる生成物、例えば異性グリカンの分離を補助する可能性がある。
【００３３】
したがって、本明細書で説明されるいくつかの方法において、同位体標識されたオリゴ糖のコアは、酵素による誘導体化工程中に部分的に保護される。好適には、保護基は、場合により１つまたはそれより多くのヒドロキシル基上に存在する、置換されたベンジル基、好ましくは−ＣＨ２Ｐｈ基であってもよい。
【００３４】
例えば、本明細書で説明される方法は、同位体標識され部分的に保護されたオリゴ糖に対する、少なくとも１回の酵素による誘導体化工程、それに続く脱保護工程を包含していてもよい。次いで、追加の酵素による誘導体化工程が行われてもよい。例えば、部分的に保護されたオリゴ糖は、部分的にベンジル化されてもよい。好適には、オリゴ糖が１つまたはそれより多くのベンジル基を有する場合、脱保護工程は、水素添加であってもよい。
【００３５】
いくつかの実施態様において、オリゴ糖は、二糖モチーフを含み、二糖モチーフは、第一の単糖単位および第二の単糖単位を含み、ここで第一の単糖単位および／または第二の単糖単位の少なくとも１つはアミノ基を含み、アシル化はアミノ基で起こる。オリゴ糖が２つより多くの単糖単位を含む実施態様において、二糖モチーフは、糖鎖の末端に配置されていてもよく、該末端は、還元末端であってもよいし、または非還元末端であってもよい。オリゴ糖が４より多くの単糖単位を含む実施態様において、二糖モチーフは、末端または鎖内の中間の位置に配置されていてもよい。
【００３６】
アミノ基を含む単糖は、好ましくはアミノ糖単糖である。概して、少なくとも１つの−ＮＨ２基を有するあらゆるアミノ糖単糖が、本発明の第一の形態の方法における第一の単糖単位および／または第二の単糖単位の少なくとも１つとして好適な可能性がある。好適なアミノ糖の例としては、これらに限定されないが、ヘキソサミンおよびそれらの誘導体が挙げられる。好適なアミノ糖単糖の例としては、これらに限定されないが、グルコサミン（ＧｌｃＮ）、ガラクトサミン（ＧａｌＮ）、マンノサミン（ＭａｎＮ）、フルクトサミン（ＦｒｕＮ）、フコサミン（fucosamine）（ＦｕｃＮ）、ムラミン酸（Ｍｕｒ）、ノイラミン酸（Ｎｅｕ）、ダウノサミン、およびペロサミン（perosamine）が挙げられる。
【００３７】
また他のアミノ糖誘導体も、本発明に係る使用に好適である可能性がある。したがって、いくつかの実施態様において、第一の単糖単位および／または第二の単糖単位は、Ｎ−アセチルアミノ糖の脱アセチル誘導体である。上記で列挙したものに加えて、好適な例としては、例えば、脱アセチルアスパルチルグルコサミンが挙げられる。また単糖単位は、さらに置換されて、例えばグリコシドの一部を含んでいてもよい。
【００３８】
第二の単糖単位は、第二のアミノ糖、Ｎ−アセチルアミノ糖、または他の糖単位であってもよい。例えば、ただしこれらに限定されないが、第二の単糖単位は、ヘキソースもしくはペントースまたはそれらのアミノ糖であってもよいし、例えば脂肪酸鎖でさらに置換されていてもよい（例えば、第二の単糖単位は、リピドＡであってもよい）。
【００３９】
オリゴ糖が二糖モチーフを含むいくつかの実施態様において、第一の単糖単位は、
ＧｌｃＮ、ＧａｌＮ、ＭａｎＮ、ＦｒｕＮ、ＦｕｃＮ、Ｍｕｒ、またはＮｅｕ
から選択され；
第二の単糖単位は、
Ｇｌｃ、Ｇａｌ、Ｍａｎ、Ｒｈａ、Ｆｒｕ、Ｆｕｃ、ＧｌｃＮ、ＧａｌＮ、ＭａｎＮ、ＦｒｕＮ、ＦｕｃＮ、Ｍｕｒ、Ｎｅｕ、ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ、ＦｒｕＮＡｃ、ＦｕｃＮＡｃ、ＭｕｒＮＡｃ、ＮｅｕＮＡｃ、シアル酸、またはイノシトール
から選択される。
【００４０】
第一の単糖の糖単位および第二の単糖の糖単位は、還元末端から非還元末端への配列で、第一の単糖単位に続いて第二の単糖単位、または第二の単糖単位に続いて第一の単糖単位の配列で並べられていてもよい。
【００４１】
一実施態様において、上記配列は、
第一の単糖−第二の単糖
である。
【００４２】
一実施態様において、上記配列は、
第二の単糖−第一の単糖
である。
【００４３】
いくつかの好ましい実施態様において、オリゴ糖の二糖モチーフの第一および第二の単糖単位は、Ｎ−およびＯ−グリカンコアならびにそれらの脱アセチル型に会合した単糖単位から選択することができる。したがって、いくつかの実施態様において、第一の単糖単位は、グルコサミンまたはガラクトサミンであり、第二の単糖単位は、マンノース、ガラクトース、グルコサミン、ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、またはＮ−アセチル−ガラクトサミンから選択される。いくつかの実施態様において、第一の単糖単位はグルコサミンであり、第二の単糖単位は、マンノース、ガラクトース、グルコサミン、ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、またはＮ−アセチル−ガラクトサミンから選択され、好ましくはマンノースまたはグルコサミンから選択される。いくつかの実施態様において、第一の単糖単位はガラクトサミンであり、第二の単糖単位は、マンノース、ガラクトース、グルコサミン、ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、またはＮ−アセチル−ガラクトサミンから選択され、好ましくはマンノースまたはグルコサミンから選択される。
【００４４】
いくつかの実施態様において、本方法は、
ＧｌｃＮ−ＧｌｃＮ
Ｇａｌ−ＧａｌＮ
ＧａｌＮ−ＧｌｃＮ
から選択されるモチーフを含むオリゴ糖を、同位体標識されたアシル化剤と反応させることを含む。還元および／または非還元末端にさらなる単糖単位が存在していてもよい。
【００４５】
いくつかの実施態様において、本方法は、モチーフ：
Ｍａｎ−ＧｌｃＮ−ＧｌｃＮ
を含むオリゴ糖を、同位体標識されたアシル化剤と反応させることを含む。還元および／または非還元末端にさらなる単糖単位が存在していてもよい。
【００４６】
好ましい実施態様において、本方法は、モチーフ：
Ｍａｎ−ＧｌｃＮ−ＧｌｃＮ
を含むオリゴ糖を、同位体標識されたアセチル化剤と反応させて、モチーフ：
Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ＊−ＧｌｃＮＡｃ＊
を含むオリゴ糖を得ることを含み、式中、Ａｃ＊は、同位体標識されたアセチル基である。
【００４７】
いくつかの実施態様において、本方法は、式（Ｂ）のオリゴ糖を形成するのに好適な条件下で、式（Ａ）のオリゴ糖を、同位体標識されたアセチル化剤と反応させることを含み：
【００４８】
【化１】
0006602747.tif 000002
【００４９】
式中、
各Ｒ１は、独立して、Ｈまたは保護基であり；
Ｒ２は、独立して、Ｈまたは保護基であり；
各Ｒ３は、独立して、Ｈ、保護基、または（Ｓａｃ）ｍであり、ここで各Ｓａｃは単糖単位であり、ｍは１〜５０の数値である。
【００５０】
いくつかの実施態様において、本方法は、式（Ｄ）のオリゴ糖を形成するのに好適な条件下で、式（Ｃ）のオリゴ糖を、同位体標識されたアセチル化剤と反応させることを含み：
【００５１】
【化２】
0006602747.tif 000003
【００５２】
式中、
各Ｒ１は、独立して、Ｈまたは保護基であり；
Ｒ２は、独立して、Ｈまたは保護基であり；
各Ｒ３は、独立して、Ｈ、保護基、または（Ｓａｃ）ｍであり、ここで各Ｓａｃは単糖単位であり、ｍは１〜５０の数値である。
【００５３】
上記で定義したように、いくつかの実施態様において、各Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、保護基であってもよい。保護基は、同一なものであってもよいし、または異なるものであってもよい。例えば、１つより多くのＲ３が保護基である場合、各Ｒ３は、他のいずれかの保護基と同じものであってもよいし、または異なるものであってもよい。いくつかの実施態様において、少なくとも１つのＲ３は、（Ｓａｃ）ｍであり、ここでｍは１〜５０の数値である。１つより多くのＲ３が（Ｓａｃ）ｍである実施態様において、各（Ｓａｃ）ｍは、独立して、分子中の他のいずれかの（Ｓａｃ）ｍと同一なものであってもよいし、または異なるものであってもよい。
【００５４】
いくつかの実施態様において、ｍは、１〜２０の数値である。
【００５５】
いくつかの実施態様において、ｍは、１〜１０の数値である。
【００５６】
いくつかの実施態様において、ｍは、１〜５の数値である。
【００５７】
いくつかの実施態様において、ｍは、１または２である。
【００５８】
いくつかの実施態様において、Ｒ２は、Ｈである。いくつかの実施態様において、各Ｒ３は、Ｈである。好ましい実施態様において、各Ｒ１はベンジルであり、Ｒ２はＨであり、各Ｒ３はＨである。
【００５９】
いくつかの実施態様において、本方法は、
式（Ｉ）：
【００６０】
【化３】
0006602747.tif 000004
【００６１】
［式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、およびＰ５のそれぞれは、独立して、保護基であるか、または場合によりＰ４およびＰ５は、一緒になってアセタール基を形成する］
のオリゴ糖を、一般式（ＩＩ）：
（Ｓａｃ）ｎ−Ｓａｃ−ＬＧ（ＩＩ）
［式中、各Ｓａｃは単糖単位であり、ｎは、０〜５０の数値であり、−ＬＧは、好適な脱離基でプライミングしたドナー−糖のグリコシル化されていないアノマー位を表す］
の糖ドナーでグリコシル化して、式（ＩＩＩ）：
【００６２】
【化４】
0006602747.tif 000005
【００６３】
のオリゴ糖を得ること；
Ｐ４を除去して、ヒドロキシル基を露出させ、結果得られたヒドロキシル基を一般式（ＩＩ）の糖ドナーでグリコシル化すること；
各Ｐ３基を除去して、遊離のアミノ基を露出させ、得られた遊離のアミノ基それぞれを同位体標識されたアセチル化剤でアセチル化すること
を含む。
【００６４】
いくつかの実施態様において、ｎは、０〜２０の数値である。
【００６５】
いくつかの実施態様において、ｎは、０〜１０の数値である。
【００６６】
いくつかの実施態様において、ｎは、０〜５の数値である。
【００６７】
いくつかの実施態様において、ｎは、０または１である。
【００６８】
好適な糖ドナーは当業界において公知であり、その例としては、これらに限定されないが、ハロゲン化グリコシル、例えば、フッ化グリコシルおよび臭化グリコシル；リン酸グリコシル、グリコシルトリハロアセトイミデート、ｎ−ペンテニルグリコシド（より一般的には、好適なヘミアセタール、オルトエステルおよび１個の酸素が置換されたグリコシルドナー）およびチオグリコシドを挙げることができる。糖ドナーの反応性は、いずれかの存在する保護基の性質に依存する可能性がある。糖ドナーは、ディスアームド（disarmed）（例えば、アセチル基での保護によって）、アームド（armed）（例えば、ベンジル基での保護によって）またはスーパーアームド（super-armed）（例えば、嵩高なシリル基での保護によって）であってもよい。
【００６９】
いくつかの好ましい実施態様において、糖ドナーの脱離基は、トリハロアセトイミデート基、好ましくはトリフルオロアセトイミデート基、例えば：
【００７０】
【化５】
0006602747.tif 000006
【００７１】
を含む。
【００７２】
いくつかの実施態様において、本方法は、単糖単位ＡのＣ２位をグリコシル化して、二分岐グリカンを得る工程を含む。いくつかの実施態様において、本方法は、単糖単位ＡのＣ４位をグリコシル化する工程を含む。Ｃ２位におけるグリコシル化の後、Ｃ４位におけるグリコシル化を行って三分岐グリカンを得てもよいし、または先行のＣ２グリコシル化工程を行わずに、Ｃ４位におけるグリコシル化を行って二分岐グリカンを得てもよい。単糖単位ＡのＣ２およびＣ４の両方でのグリコシル化を含む方法の実施態様において、グリコシル化工程は、どちらの順番で行ってもよい。
【００７３】
化学選択的なグリコシル化は、酵素触媒によってなされてもよいし、ならびに／または選択的な保護および／もしくは保護基方策によって容易になされてもよい。
【００７４】
好ましくは、酵素による誘導体化に使用されるオリゴ糖のコアは、３〜９個の単糖単位を含む。
【００７５】
本発明の方法のいくつかの実施態様において、同位体標識されたアシル化剤は、ハロゲン化アシルまたは好適なカルボン酸の無水物であってもよい。いくつかの好ましい実施態様において、同位体標識されたアシル化剤は、同位体標識された無水酢酸、好ましくは（１３ＣＨ３１３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（１３ＣＨ３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（ＣＨ３１３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（ＣＤ３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（１３ＣＤ３１３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（１３ＣＤ３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、または（ＣＤ３１３Ｃ＝Ｏ）２Ｏである。いくつかの実施態様において、同位体標識されたアシル化剤は、（１３ＣＨ３１３Ｃ＝Ｏ）２Ｏである。 
【００７６】
本発明のいくつかの実施態様において、各Ａｃ＊は、存在する場合、−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）ＣＤ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＤ３、−（Ｃ＝Ｏ）１３ＣＤ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）ＣＤ３、−（１４Ｃ＝Ｏ）１４ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）１４ＣＨ３、−（１４Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝１７Ｏ）ＣＨ３、−（１３Ｃ＝１７Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝１７Ｏ）１３ＣＨ３、−（１３Ｃ＝１７Ｏ）１３ＣＨ３、−（Ｃ＝１８Ｏ）ＣＨ３、−（１３Ｃ＝１８Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝１８Ｏ）１３ＣＨ３、−（１３Ｃ＝１８Ｏ）１３ＣＨ３から選択される。
【００７７】
本発明のいくつかの実施態様において、各Ａｃ＊は、存在する場合、−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）ＣＤ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＤ３、−（Ｃ＝Ｏ）１３ＣＤ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）ＣＤ３、−（１４Ｃ＝Ｏ）１４ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）１４ＣＨ３、−（１４Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝１７Ｏ）ＣＨ３、または−（Ｃ＝１８Ｏ）ＣＨ３から選択される。
【００７８】
本発明のいくつかの実施態様において、各Ａｃ＊は、存在する場合、−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）ＣＤ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＤ３、−（Ｃ＝Ｏ）１３ＣＤ３または−（１３Ｃ＝Ｏ）ＣＤ３から選択される。本発明のいくつかの実施態様において、各Ａｃ＊は、存在する場合、−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、または−（１３Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３から選択される。本方法のいくつかの実施態様において、各Ａｃ＊は、存在する場合、−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３である。
【００７９】
いくつかの実施態様において、第一の形態に係る方法は、同位体標識されたオリゴ糖中のアセチル−ヘキソサミン単位の遊離のアノマー位でオキサゾリンを形成することをさらに含む。次いで得られた同位体標識されたグリカンオキサゾリンを使用して、同位体標識された複合糖質を調製することができる。
【００８０】
いくつかの実施態様において、第一の形態に係る方法は、同位体標識されたオリゴ糖を含むペプチド、脂質またはタンパク質をグリコシル化して、同位体標識された糖ペプチド、ペプチドグリカン、グリコリピド、糖タンパク質を得ることをさらに含む。
【００８１】
さらなる形態において、本発明は、第一の形態に係る方法によって入手できる同位体標識されたオリゴ糖または複合糖質を提供する。
【００８２】
さらなる形態において、本発明は、
【００８３】
【化６】
0006602747.tif 000007
【００８４】
から選択されるモチーフを含むグリカンを提供し、式中、各Ａｃ＊は、同位体標識されている。グリカンという用語は、本明細書で使用される場合、遊離の形態の、または複合糖質の炭水化物部分を形成するあらゆる糖を指す。
【００８５】
いくつかの実施態様において、モチーフは、
Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ＊−ＧｌｃＮＡｃ＊
であり、式中、各Ａｃ＊は、同位体標識されている。
【００８６】
いくつかの実施態様において、グリカンは、モチーフ：
【００８７】
【化７】
0006602747.tif 000008
【００８８】
を含み、式中、各Ａｃ＊は、同位体標識されている。
【００８９】
いくつかの実施態様において、各Ａｃ＊は、存在する場合、−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）ＣＤ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＤ３、−（Ｃ＝Ｏ）１３ＣＤ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）ＣＤ３、−（１４Ｃ＝Ｏ）１４ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）１４ＣＨ３、−（１４Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝１７Ｏ）ＣＨ３、または−（Ｃ＝１８Ｏ）ＣＨ３から選択される。
【００９０】
いくつかの実施態様において、グリカンは、１つまたはそれより多くのさらなる単糖単位を含み、ここでさらなる単糖のそれぞれは、存在する場合、独立して同位体標識されていてもよい。
【００９１】
いくつかの実施態様において、さらなる単糖単位の数は、１０より多い。
【００９２】
いくつかの実施態様において、さらなる単糖単位の数は、３０より多い。
【００９３】
いくつかの実施態様において、さらなる単糖単位の数は、５０より多い。
【００９４】
いくつかの実施態様において、さらなる単糖単位の数は、１００より多い。
【００９５】
いくつかの実施態様において、本発明は、以下の構造を有するグリカンを提供する：
【００９６】
【化８】
0006602747.tif 000009
【００９７】
この構造は、様々な同位体標識されたＮ−グリカンをもたらすための酵素による誘導体化に特に好適なコアオリゴ糖基質である。
【００９８】
各Ａｃ＊が−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３である場合、この構造は、本明細書では１３Ｃ８−Ｇ０と表される。本明細書で説明したように、酵素による誘導体化の基質として部分的に保護されたコアオリゴ糖を使用することが有利な可能性がある。したがって、いくつかの実施態様において、ＧｌｃＮＡｃ＊−ＧｌｃＮＡｃ＊還元末端における５つのヒドロキシル部分は、場合により置換されたベンジル基を有する。各Ａｃ＊が−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３であり、これらの５つのヒドロキシルがそれぞれＰｈＣＨ２−部分を有する場合、その構造は、本明細書では１３Ｃ８−Ｇ０（Ｂｎ５）と表される。
【００９９】
さらなる形態において、本発明は、サンプル中のグリカンを同定する方法であって、該方法は、同位体標識されたグリカンを含むタグ付けされた標準をサンプルに添加して、ドープしたサンプルを得ること、およびドープしたサンプルを、マススペクトロメトリーを使用して分析することを含む、方法を提供する。好ましい実施態様において、同位体標識されたグリカンは、本発明に係る同位体標識されたグリカンであるか、および／または本明細書で説明されているようにして入手可能である。
【０１００】
好ましくは、タグ付けされた標準は、サンプル中に存在する疑いのあるグリカンのアイソトポログである、同位体標識されたグリカンを含む。いくつかの実施態様において、タグ付けされた標準は、１種より多くの同位体標識されたグリカンを含む。いくつかの実施態様において、１種より多くのタグ付けされた標準をサンプルに添加して、ドープしたサンプルを得てもよい。いくつかの実施態様において、１種より多くの同位体標識されたグリカンを添加して、サンプル中の複数のグリカンの同時の同定を容易にすることもできる。
【０１０１】
当業界において公知の方法に勝る本発明の方法の利点は、タグを取り入れるためのサンプル中のグリカンのタグ付けは必ずしも必要ではなく、タグ付け法の再現性および副反応の問題が回避されることである。さらに、同位体標識されたグリカン（タグ付けされた標準中）と分析物の両方が、同じ実験で分析されて同じ手法を使用して処置されることから、当業界において公知の方法で起こり得る実験的なばらつきの原因が排除される。各同位体標識されたグリカンは、対応する分析物と同じ効率でイオン化するが、その固定の質量増分によって容易に同定可能である。いくつかの実施態様において、タグ付けされた標準は、事前に決定されたマススペクトロメトリースペクトルを有しており、これは、同位体標識されたグリカンに関連するイオンのピークを容易に同定できるようにすることによって、ドープしたサンプルの分析に役立つ可能性がある。
【０１０２】
好ましい実施態様において、グリカンおよび同位体標識されたグリカンに関連するイオンのピークの相対的な強度を比較することによって、サンプルのグリカン含量を定量化できるように、既知量の同位体標識されたグリカンがサンプルに添加される。以下に、グリカン含量の定量化に関するさらなる詳細を示す。したがって、既知量の同位体標識されたグリカンを添加することによって、複雑な生体液中であっても分析物を絶対的に定量化することができる。いくつかの実施態様において、既知量の１種より多くの同位体標識されたグリカンを添加することによって、サンプル中の複数種のグリカンの同時の同定および定量化を容易にすることができる。
【０１０３】
いくつかの実施態様において、本方法は、
（ｉ）１種またはそれより多くの同位体標識されたグリカンを含むタグ付けされた標準を選択すること；
（ｉｉ）タグ付けされた標準をサンプルに添加して、ドープしたサンプルを得ること；
（ｉｉｉ）ドープしたサンプルをマススペクトロメトリーを使用して分析して、イオンのピークを得ること；
（ｉｖ）タグ付けされた標準に関連するイオンのピークの同一性および強度を、ドープしたサンプルのスペクトル中の追加のイオンのピークと比較すること
を含む。
【０１０４】
いくつかの好ましい実施態様において、タグ付けされた標準は、サンプルの疑いのあるグリカン内容物に対応するように選択される。例えば、ただしこれらに限定されないが、サンプルが３種のグリカン種の組合せを含む疑いがある場合、これらの３種のグリカンのアイソトポログを含むタグ付けされた標準を選択してもよい。
【０１０５】
ドープしたサンプルを分析する前に、グリカンを誘導体化してもよい。誘導体化工程は、例えば、シアル酸残基が存在する場合、シアル酸残基の過メチル化または誘導体化を包含していてもよく、さらに浄化工程を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、誘導体化は、シアル酸または他の末端の糖単位を除去するためにグリコシダーゼ処置を含む。
【０１０６】
いくつかの好ましい実施態様において、マススペクトロメトリーは、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、直接注入ＥＳＩ−ＴｏＦまたはＬＣ−ＭＳであり、分析物の同定を容易にし、複雑な混合物中で同重体の分析物の区別を可能にするタンデムマススペクトロメトリー（時にはＭＳ−ＭＳとも称される）によるフラグメンテーションをさらに含んでいてもよい。フラグメンテーションは、例えば、衝突誘導解離（ＣＩＤ）、電子捕獲解離（ＥＣＤ）、電子移動解離（ＥＴＤ）、赤外多光子解離（ＩＲＭＰＤ）、黒体赤外放射解離（ＢＩＲＤ）、電子脱離解離（ＥＤＤ）または表面誘起解離（ＳＩＤ）、または他のあらゆる好適な方法を使用して達成することができる。
【０１０７】
いくつかの実施態様において、サンプルは、複雑な生体液であり、サンプル中のグリカンは、例えば、組換え糖タンパク質または抗体から放出されたグリカンであり得る。サンプル中のグリカンは、医学的疾患もしくは障害、または生物学的プロセスに関連するバイオマーカーであってもよく、いくつかの好ましい実施態様において、本方法は、医学的疾患もしくは障害、または生物学的プロセスのインジケーターとして、１種またはそれより多くのグリカンの存在または量を関連付けることをさらに含む。医学的疾患または障害は、これらに限定されないが、がん、心臓血管疾患、炎症性の皮膚疾患、糖尿病、胃腸障害、肝臓障害、貧血、免疫疾患または障害、自己免疫疾患、関節リウマチなどの関節炎、感染症、腎症、神経障害、肺障害またはグリコシル化の先天性障害から選択することができる。
【０１０８】
これらの方法は、インビトロで行ってもよい。
【０１０９】
したがって、さらなる形態において、本発明は、グリカンに関連する疾患を有する疑いのある患者を診断するための方法であって、該方法は、
（ｉ）グリカンを含有する疑いのあるサンプルを得ること；
（ｉｉ）疾患に関連するグリカンに対応する同位体標識されたグリカンを含むタグ付けされた標準を選択すること；
（ｉｉｉ）タグ付けされた標準をサンプルに添加して、ドープしたサンプルを得ること；
（ｉｖ）ドープしたサンプルをマススペクトロメトリーを使用して分析して、イオンのピークを得ること；
（ｖ）タグ付けされた標準に関連するイオンのピークの同一性および強度を、ドープしたサンプルのスペクトル中の追加のイオンのピークと比較すること；
（ｖｉ）前記グリカンの存在を使用して、疾患または障害の診断を補助すること
を含む、上記方法を提供する。
【０１１０】
さらなる形態において、本発明は、本明細書で説明されているような診断方法で使用するための同位体標識されたグリカンであって、該方法は、：
（ｉ）疾患または障害に関連するグリカンを含有する疑いのあるサンプルを患者から得ること；
（ｉｉ）疾患または障害に関連するグリカンに対応する同位体標識されたグリカンを含むタグ付けされた標準を選択すること；
（ｉｉｉ）タグ付けされた標準をサンプルに添加して、ドープしたサンプルを得ること；
（ｉｖ）ドープしたサンプルをマススペクトロメトリーを使用して分析して、イオンのピークを得ること；
（ｖ）タグ付けされた標準に関連するイオンのピークの同一性および強度を、ドープしたサンプルのスペクトル中の追加のイオンのピークと比較して、サンプル中の１種またはそれより多くのグリカンの存在を同定し、場合により定量化すること；
（ｖｉ）前記１種またはそれより多くのグリカンの存在を使用して、疾患または障害を診断すること
を含む、上記グリカンを提供する。
【０１１１】
さらなる形態において、本発明は、本明細書で説明されているような診断方法および複数の診断方法で使用するための同位体標識されたグリカンであって、該方法は、
（ｉ）疾患または障害に関連するグリカンに対応する同位体標識されたグリカンを含むタグ付けされた標準を選択すること；
（ｉｉｉ）タグ付けされた標準を患者から得られたサンプルに添加して、ドープしたサンプルを得ること；
（ｉｖ）ドープしたサンプルをマススペクトロメトリーを使用して分析して、イオンのピークを得ること；
（ｖ）タグ付けされた標準に関連するイオンのピークの同一性および強度を、ドープしたサンプルのスペクトル中の追加のイオンのピークと比較して、サンプル中の１種またはそれより多くのグリカンの存在を同定し、場合により定量化すること；
（ｖｉ）前記１種またはそれより多くのグリカンの存在を使用して、疾患または障害を診断すること
を含む、上記グリカンを提供する。
【０１１２】
患者から得られたサンプルは、当業界において公知の方法を使用して得てもよい。患者から採取された生物学的材料中のグリカンはタンパク質骨格にコンジュゲートしている可能性があるため、好適には、患者から生物学的材料を採取して、酵素的または化学的な（ヒドラジン分解）処置によってタンパク質骨格からグリカン材料を除去することによりサンプルを得てもよい。好適には、得られた材料は、精製されてもよい。
【０１１３】
さらなる形態において、本発明は、サンプル中のグリカンを同定するためのキットであって、該キットは、
（ａ）１種またはそれより多くの同位体標識されたグリカンを含む、タグ付けされた標準；（ｂ）グリカンを含有する疑いのあるサンプルをタグ付けされた標準でドープして、ドープしたサンプルを得て、ドープしたサンプルをマススペクトロメトリーを使用して分析するための説明書
を含む、上記キットを提供する。
【０１１４】
場合により、本キットは、タグ付けされた標準に関するマススペクトロメトリーデータを包含していてもよく、このようなデータは、タグ付けされた標準に関連するイオンのピークの簡単な同定を介してサンプル中の分析物の同定を容易にすることができる。
【０１１５】
説明書は、タグ付けされた標準に関連するイオンのピークを、マススペクトル中の追加のイオンのピークと比較する工程をさらに含んでいてもよい。
【０１１６】
いくつかの実施態様において、タグ付けされた標準は、特定の疾患、障害または生物学的プロセスに関連する組合せであることが公知の同位体標識されたグリカンの混合物である。
【０１１７】
ここで本発明の実施態様を添付の図面を参照しながら一例として説明するが、これらに限定されないものとする。しかしながら、本発明の開示を考慮すれば、本発明の様々な追加の形態および実施態様は当業者に明らかであると予想される。
【０１１８】
「および／または」は、本明細書で使用される場合、特定された２つの特色または構成要素のどちらかが他方を伴うか伴わないことを示す具体的な開示と解釈される。例えば「Ａおよび／またはＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢのそれぞれが、それぞれが本明細書において個々に明示されたかのように具体的に開示されていると解釈されるべきである。
【０１１９】
文脈上他の指定がない限り、上述された特色の説明および定義は、本発明のいずれの特定の形態または実施態様に限定されず、説明されている全ての形態および実施態様に等しく適用される。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】図１は、同位体標識されたグリカンおよび対応する分析物に関連するイオンのピークを示す、ドープしたサンプルのマススペクトルの代表的な部分を示す図である。ピークは、タグ付けされた標準の同位体標識されたグリカンおよびサンプルの対応する分析物であるグリカンに関連する、測定されたイオンのピーク強度を示す。
【図２】図２は、同位体標識されたＮ−グリカンを得るための酵素による伸長工程の可能性のある組合せの概略図である。
【図３ａ】図３ａは、同位体標識された［（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→６）］−［２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル−（１→３）］−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−２−デオキシ−α，β−Ｄ−グルコピラノースの合成を示す図であり、ここで各アセチル基は、１３Ｃ２で同位体標識されている。
【図３ｂ】図３ｂは、同位体標識された［（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→６）］−［２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル−（１→３）］−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−２−デオキシ−α，β−Ｄ−グルコピラノースの合成を示す図であり、ここで各アセチル基は、１３Ｃ２で同位体標識されている。
【図３ｃ】図３ｃは、同位体標識された［（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→６）］−［２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル−（１→３）］−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−２−デオキシ−α，β−Ｄ−グルコピラノースの合成を示す図であり、ここで各アセチル基は、１３Ｃ２で同位体標識されている。
【図４ａ】図４ａは、同位体標識された三分岐［（２−アセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル］−（１→６）−［ジ−（２−アセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→２）−（１→４）−α−Ｄ−マンノピラノシル］−（１→３）−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−１，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドの合成を示す図であり、ここで各アセチル基は、１３Ｃ２で同位体標識されている。
【図４ｂ】図４ｂは、同位体標識された三分岐［（２−アセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル］−（１→６）−［ジ−（２−アセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→２）−（１→４）−α−Ｄ−マンノピラノシル］−（１→３）−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−１，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドの合成を示す図であり、ここで各アセチル基は、１３Ｃ２で同位体標識されている。
【図５】図５は、化学酵素合成により得られたグリカン：１３Ｃ８−Ｇ０の酵素によるトランケーションを示す図である。
【図６】図６は、化学酵素合成により得られたグリカン：１３Ｃ６−ＭＧｎ３のフコシル化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１２１】
定義
同位体標識
同位体標識すること、同位体標識された、および他の類似の用語は、本明細書で使用される場合、当業界において認識されている通りに使用される。具体的には、同位体標識化合物は、既知の位置の少なくとも１つの原子が、その元素に関して最も豊富な天然に存在する同位体以外の同位体で高度に置き換えられた化合物である。例えば、メタンは、１３Ｃで同位体標識されてもよいし、構造１３ＣＨ４を有していてもよいし、または重水素で標識されていてもよい。重水素標識メタンは、メタンに結合する４つの水素原子の位置の１つまたはそれより多くが２Ｈ（Ｄ）で高度に置き換えられた化合物を指す場合もある。一般的な重水素標識メタンの構造としては、ＣＤＨ３およびＣＤ４が挙げられる。
【０１２２】
同位体標識は、天然の存在度より高度に同位体で置き換えることを指す。好ましくは、高度に置き換えられた位置における同位体の純度は、５０％より高い。これは、例えば１３Ｃ同位体標識メタンの場合、個々の分子の５０％またはそれより多くが１３Ｃ原子を含むことを意味する。本発明の実施態様において、高度に置き換えられた位置における同位体の純度は、好ましくは８０％より高い。より好ましくは、高度に置き換えられた位置における同位体の純度は、９０％より高い。
【０１２３】
いくつかの好ましい実施態様において、高度に置き換えられた位置における同位体の純度は、９５％より高い。
【０１２４】
いくつかの好ましい実施態様において、高度に置き換えられた位置における同位体の純度は、９７％より高い。
【０１２５】
いくつかの好ましい実施態様において、高度に置き換えられた位置における同位体の純度は、９８％より高い。
【０１２６】
いくつかの好ましい実施態様において、高度に置き換えられた位置における同位体の純度は、９９％より高い。
【０１２７】
アシル基
本明細書で使用される場合、アシル基は、カルボン酸からヒドロキシル基を除去することによって誘導された官能基である。一般的なアシル基としては、ホルミル（メタノイル）、アセチル（エタノイル）、プロピオニル（プロパノイル）、ベンゾイル、およびアクリリル（プロペノイル）が挙げられる。生物学的関連性を有する他のアシル基としては、これらに限定されないが、Ｃ４〜１８−脂肪酸から誘導されたヒドロキシエタノイル（グリコリル）およびアシル基（例えば、ブタノイル、ヘキサノイル、オクタノイル、デカノイルなど）ならびにヒドロキシル化された脂肪酸が挙げられる。
【０１２８】
アシル化は、アシル化剤を使用して化合物にアシル基を付加するプロセスである。本発明の内容において、アシル化は、求核性官能基、例えばアミノ基またはヒドロキシル基で起こる。１つより多くの求核性基が存在する場合、基がアシル化される順番は、求核性度および立体因子によって決定される。一般的なアシル化剤としては、塩化アシルおよび酸無水物が挙げられる。
【０１２９】
同位体標識されたアシル基は、本明細書において定義されたように、既知の位置の少なくとも１つの原子が、その元素に関して最も豊富な天然に存在する同位体以外の同位体で高度に置き換えられたアシル基である。例としては、これらに限定されないが、利用可能なホルミル、アセチル、プロピオニル、ベンゾイル、およびアクリリル基の１２Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１６Ｏ、１８Ｏ、ＨおよびＤの全ての組合せが挙げられる。必要に応じて、他の同位体標識されたアシル基も本発明の方法で使用が可能である。例えば、同位体標識されたヒドロキシエタノイル基（例えば、１−１３Ｃ１−または１３Ｃ２−ヒドロキシルエタノイル（hydroxylethanolyl）など）を使用して、Ｎ−グリコリルノイラミン酸単位を含有するグリカンのアイソトポログを提供することができる。同様に、脂肪酸から誘導された同位体標識されたアシル基を使用して、例えばリピドＡのアイソトポログを提供することができる。
【０１３０】
いくつかの実施態様において、同位体標識されたアシル基は、同位体標識されたアセチル基である。
好ましい同位体標識されたアセチル基Ａｃ＊としては、以下が挙げられる：
−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、
−（Ｃ＝Ｏ）ＣＤ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＤ３、−（Ｃ＝Ｏ）１３ＣＤ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）ＣＤ３，
−（１４Ｃ＝Ｏ）１４ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）１４ＣＨ３、−（１４Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、
−（Ｃ＝１７Ｏ）ＣＨ３、または−（Ｃ＝１８Ｏ）ＣＨ３。
【０１３１】
本発明の好ましい実施態様において、同位体標識されたアセチル基Ａｃ＊は、−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、または−（１３Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３から選択される。本発明の特に好ましい実施態様において、同位体標識されたアセチル基Ａｃ＊は、−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３である。
【０１３２】
アシル化剤は、本明細書で使用される場合、当業界において認識されている通りに、すなわちアシル基を提供する化学試薬として使用される。一般的に使用されるアシル化剤としては、塩化アシルおよびカルボン酸の無水物が挙げられるが、他のアシル化剤および方法も当業者には明らかであると予想され、このようなものとしては、例えば、カルボン酸試薬と好適なカップリング試薬との反応生成物が挙げられる。いくつかの実施態様において、同位体標識されたアシル化剤は、塩化アシルである。好適な塩化アシルは、市販のものでもよいし、または当業界において公知の方法を使用して、例えば対応するカルボン酸を塩化チオニルまたは塩化オキサリルで処置することによって得てもよい。
【０１３３】
他の実施態様において、同位体標識されたアシル化剤は、カルボン酸の無水物、好ましくは酢酸の無水物である。いくつかの実施態様において、同位体標識されたアセチル化剤は、（１３ＣＨ３１３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（１３ＣＨ３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（ＣＨ３１３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（ＣＤ３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（１３ＣＤ３１３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、（１３ＣＤ３Ｃ＝Ｏ）２Ｏ、または（ＣＤ３１３Ｃ＝Ｏ）２Ｏから選択される。いくつかの好ましい実施態様において、同位体標識されたアセチル化剤は、（１３ＣＨ３１３Ｃ＝Ｏ）２Ｏである。 
【０１３４】
いくつかの実施態様において、１４Ｃ−アシル化剤、好ましくは１４Ｃ標識無水酢酸を使用することができる。得られた１４Ｃ標識グリカンは、オートラジオグラフィを使用したグリカン定量化のための標準として有用である可能性がある。
【０１３５】
保護基
保護基は、本明細書で使用される場合、後続の反応中において化学選択性を得るために、または後続の反応中において不要な分解または副反応を防ぐために、官能基の化学修飾によって分子に導入される部分を指す。また保護基は、マスク基もしくはマスキング基、またはブロック基もしくはブロッキング基と称される場合もある。反応性官能基を保護することによって、他の保護されていない反応性官能基が関与する反応を、保護基に影響を及ぼすことなく行うことができる。通常は、分子の残部に実質的に影響を及ぼすことなく、後続の工程で保護基を除去することができる。例えば、「Protective Groups in Organic Synthesis」（T. GreenおよびP. Wuts、Wiley、1999）を参照されたい。
【０１３６】
保護基の例は当業界において周知であり、例証のために以下の例が示されるが、これらに限定されない。
【０１３７】
例えば、ヒドロキシ基は、エーテル（−ＯＲ）またはエステル（−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ）として保護されてもよく、例えば：ｔ−ブチルエーテル；メトキシメチル（ＭＯＭ）またはメトキシエトキシメチル（ＭＥＭ）エーテル；ベンジル（Ｂｎ）、ベンズヒドリル（ジフェニルメチル）、またはトリチル（トリフェニルメチル）エーテル；トリメチルシリルまたはｔ−ブチルジメチルシリルエーテル；またはアセチルエステル（−ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ３、−ＯＡｃ）またはベンゾイルエステル（−ＯＣ（＝Ｏ）Ｐｈ、Ｂｚ）として保護されてもよい。
【０１３８】
例えば、アルデヒドまたはケトン基は、それぞれアセタールまたはケタールとして保護されてもよく、その場合、カルボニル基（＞Ｃ＝Ｏ）が、例えば第一アルコールとの反応によってジエーテル（＞Ｃ（ＯＲ）２）に変換される。またチオアセタールおよびチオケタールも当業界において公知である。
【０１３９】
例えば、多価の部分が、アセタール基として保護されてもよく、その場合、以下に示すように、例えば互いに隣接する炭素原子上の２つのヒドロキシル基（ＨＯ−ＣＲ２ＣＲ２−ＯＨ；グリコール基と呼ばれることが多い）がアルデヒドまたはケトンと反応して、−Ｏ−ＣＲ２−Ｏ−結合を含む環を形成する。
【０１４０】
【化９】
0006602747.tif 000010
【０１４１】
アセタールは、典型的には、脱水条件下で（例えば、ディーン−スターク条件下で、またはソックスレー抽出器を使用して）酸の触媒作用を用いて形成され、酸の触媒作用および過量の水によって、または当業界において公知の他の方法によって除去することもできる。
【０１４２】
例えば、アミン基は、アミドまたはウレタンとして、例えば：メチルアミド（−ＮＨＣＯ−ＣＨ３）；ベンジルオキシアミド（−ＮＨＣＯ−ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＮＨ−Ｃｂｚ）；ｔ−ブトキシアミド（−ＮＨＣＯ−ＯＣ（ＣＨ３）３、−ＮＨ−Ｂｏｃ）；２−ビフェニル−２−プロポキシアミド（−ＮＨＣＯ−ＯＣ（ＣＨ３）２Ｃ６Ｈ４Ｃ６Ｈ５、−ＮＨ−Ｂｐｏｃ）、９−フルオレニルメトキシアミド（−ＮＨ−Ｆｍｏｃ）、６−ニトロベラトリルオキシアミド（−ＮＨ−Ｎｖｏｃ）、２−トリメチルシリルエチルオキシアミド（−ＮＨ−Ｔｅｏｃ）、２，２，２−トリクロロエチルオキシアミド（−ＮＨ−Ｔｒｏｃ）、アリルオキシアミド（−ＮＨ−Ａｌｌｏｃ）、２（−フェニルスルホニル）エチルオキシアミド（−ＮＨ−Ｐｓｅｃ）として保護されていてもよいし、または好適なケースにおいて、Ｎ−酸化物（＞ＮＯ−）もしくはアジ化物として保護されていてもよい。
【０１４３】
本発明のいくつかの実施態様において、ヘキソサミン糖ドナーにおけるアミンの機能は、フタルイミド、ＴＲｏｃ、トリクロロアセチル、ジメチルアセチル基によって保護される。これは、β−選択的なグリコシド結合の形成を容易にし、これらの反応において不要なオキサゾリン形成を防ぐ。いくつかの実施態様において、アミンの機能は、アジ化物として保護されていてもよく、これは、立体選択的なα−グリコシド結合形成を容易にする可能性がある。
【０１４４】
例えば、カルボン酸基は、エステルとして、例えば：Ｃ１〜７アルキルエステル（例えばメチルエステル；ｔ−ブチルエステル）；Ｃ１〜７ハロアルキルエステル（例えば、Ｃ１〜７トリハロアルキルエステル）；トリＣ１〜７アルキルシリル−Ｃ１〜７アルキルエステル；またはＣ５〜２０アリール−Ｃ１〜７アルキルエステル（例えばベンジルエステル；ニトロベンジルエステル）；またはアミド、例えばメチルアミドとして保護されていてもよい。
【０１４５】
いくつかの実施態様において、本発明は、オリゴ糖およびオリゴ糖を含有する構造を組み立てるのにオルソゴナルな保護基の方策を使用する。オルソゴナルな保護は当業界において公知の方策であり、分子中の他所にある他の保護基に影響を与える所定用途専用の一連の反応条件を使用して、分子の１つまたはそれより多くの官能基の脱保護を可能にする複数の保護基を慎重に選択することを含む。例えば、使用される一方の保護基が、酸不安定性であってもよく（例えばアセタール）、使用される他方の保護基が、塩基不安定性であってもよく（例えばＦＭＯＣ基）、一方で使用されるさらなる保護基が、水素添加条件を使用して除去可能であってもよい（例えばベンジルエーテル）。本明細書で説明されるように、構造内の複数の位置がそれぞれ独立して保護基であり得る場合、前記保護基は、同一なものであってもよいし、または異なるものであってもよい。異なる保護基が互いにオルソゴナルであってもよく、その結果として、一方の保護基を他方の保護基の存在下で選択的に脱保護することにより化学選択的な反応が容易になる。単なる一例として、オリゴ糖は、モチーフ
【０１４６】
【化１０】
0006602747.tif 000011
【０１４７】
を含み、式中、各Ｒ３は独立して保護基であり、各Ｒ３は同じタイプの保護基であってもよく、または各Ｒ３は、独立して他のいずれかのＲ３基と同一なものでもよいし、または異なっていてもよい。オルソゴナルなＲ３保護基を使用することにより、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４またはＣ６において選択的な脱保護および反応を起こすことができる。
【０１４８】
同位体の希釈を使用する濃度計算
本発明に係る方法および本発明によって提供される同位体標識されたグリカンは、サンプル中の対象の分析物、例えば天然グリカンの濃度を決定するのに使用できる。好適なサンプルは、タンパク質、天然の複合糖質、および組換えタンパク質生産の生成物から放出されたグリカンを包含していてもよい。
【０１４９】
本発明に係るいくつかの方法において、少なくとも１種のグリカンを含有する疑いのあるサンプルは、例えば、ヒドラジン分解によるタンパク質からの放出、またはペプチドグリコシダーゼを用いた酵素的切断の後に得られる。このサンプルに、既知量の「タグ付けされた標準」を添加して、ドープしたサンプルを得る。タグ付けされた標準は、濃度が既知の少なくとも１種の同位体標識されたグリカンを含み、いくつかの実施態様では、全ての構成要素の濃度が既知の同位体標識されたグリカンの混合物を含む。
【０１５０】
次いでドープしたサンプルをマススペクトロメトリーを使用して分析して、スペクトルを獲得する。場合により、分析および獲得の間に、選択されたイオンのフラグメンテーションに関する情報を得てもよい。このフラグメンテーション分析は、対象のグリカンの全体構造と存在する結合の相対的および絶対的な弱さの両方の決定を助ける可能性がある。これは、例えば本明細書で説明されているような化学酵素法使用して、オリゴ糖配列中の１つまたはそれより多くの事前に決定された位置で同位体標識された単糖単位が同位体標識されたグリカンに導入された本発明の方法および実施態様と特別な関連性がある。
【０１５１】
次いで獲得されたスペクトル中のイオンのピークを割り当て（固定の質量増分のために同定可能である）、タグ付けされた標準に関連することが既知のイオンのピークと比較することにより定量化することができる。
【０１５２】
例えば、［（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→６）］−［２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル−（１→３）］−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−２−デオキシ−α，β−Ｄ−グルコピラノースモチーフを有する特定の天然Ｎ−グリカンは、本明細書で説明したようにして得ることが可能な、この七糖モチーフ中のアセチル基がそれぞれ１３Ｃ２−同位体標識されているアイソトポログを含むタグ付けされた標準の使用によって同定することができる。これにより、同位体標識されたＮ−グリカンが、天然Ｎ−グリカンと比べて８Ｄａ増えた質量を有するが、対応する関連のマススペクトロメトリーイオンエンベロープを有することが示される（図１で示される通り）。
【０１５３】
さらに、分析物であるグリカンの量は、イオンのピーク強度の比較を介して定量化することができ、それによって分析物（analtye）であるグリカンの量を定量化することが可能になる（各アイソトポログのピーク強度は、サンプル中のそれらの量に比例する）。同位体標識されたグリカンが、対応する分析物であるグリカンと同じ効率でイオン化するために、相対的な強度は、それらの相対濃度に比例する（方程式１）。本方法はさらに、複数種のグリカンを含む複雑な混合物中の分析物を、量と相対的存在度の両方に関して定量化することを可能にする（方程式２、３、および４）。本発明の方法およびこれらの方程式を使用して、複雑な混合物中の分析物を定量化することができる。方程式１〜４の使用は、一般的に本発明の方法に適用可能であること、方程式１〜４は、これらに限定されないがこの実施例の方法を参照しながら説明されることが理解されよう。わかりやすくするために、「軽い」は、非同位体標識グリカンを指し、「重い」は、対応するより高分子量の同位体標識されたグリカンを指す。
【０１５４】
ｌｉ  「軽い」アイソトポログｉのピーク強度
ｌｊ＊  「重い」アイソトポログｊのピーク強度
ｍｉ  「軽い」アイソトポログｉの量
ｍｊ＊  「重い」アイソトポログｊの量
ｍＴ  サンプル中の「軽い」グリカンの総量
ｍＴ＊  サンプル中の「重い」グリカンの総量
Ｘｉ  非同位体分析物であるグリカン中の「軽い」アイソトポログｉの相対的な存在度
Ｘｊ＊  同位体標識されたグリカン中の「重い」アイソトポログｊの相対的な存在度。
【０１５５】
【数１】
0006602747.tif 000012
【０１５６】
上記の方程式は、飽和濃度で所定のピークが検出される複雑な混合物およびスペクトルに関して、それらの対応する「重い」アイソトポログ標準と比較することによりサンプル中のグリカンの理にかなった定量化を提供するものであるが、より詳細な方法が望ましい場合もあることが理解されよう。例えば、標準の最も豊富なピークが飽和している場合、単に上記の方程式でそのピークを使用すれば、不正確な定量化になる可能性がある。この問題に取り組むために、以下に、同位体の希釈分析（サンプル中のグリカン濃度を計算するための内部標準アイソトポログの直線性および選択の研究）の詳細を示す。この方法は、関数を計算するために異なる「重い」アイソトポログに関連するイオンのピークを使用する。この関数は、定量化しようとするピークのピーク強度と、そのピークに関連するアイソトポログの量とを関連付けるのに使用することができ、それによってこのような起こり得る不正確さが軽減される。ここで再度、以下に例示を示すが、これらに限定されない。
【０１５７】
Ｉ．直線性の決定
サンプルに添加された所与のグリカンに関する「重い」アイソトポログの総量（ｍＴ＊）とその成分である「重い」アイソトポログそれぞれの対応する相対的な存在度（Ｘｊ＊）とを知ることで、方程式３を使用してサンプル中の各「重い」アイソトポログ（ｍｊ＊）の量を計算することが可能になる。これは、異なる合成の「重い」アイソトポログが、例えば、異なって同位体標識されたアセチル基、および／または所与の「重い」グリカンの同位体エンベロープに関連する様々なピークを有することの説明になり得る。好適には、同位体エンベロープに関連する様々なピークが使用される。これらの同位体エンベロープのピークの理論上の存在度は、分子の実験式を考慮した確率として計算された公知の様々な同位体の天然の存在度から誘導することができる。
【０１５８】
同位体標識された標準において、これらの異なるグリカンの「重い」アイソトポログに関して得られたイオンのピーク強度（Ｉｊ＊）およびそれらの相対的存在度（ｍｊ＊）を使用することによって、ピーク強度とグリカン量とを関連付ける関数は、線形回帰によって計算することができ（Ｉは、ｍの関数である）：
［方程式５］：Ｉ＝ｂｍ＋ａ
式中、係数ｂおよびａはそれぞれ傾きおよび切片に対応し、これらは、最小二乗適合（方程式６および７）によって計算された。
【０１５９】
【数２】
0006602747.tif 000013
【０１６０】
また決定係数Ｒ２を計算して、適合品質の尺度として使用することもできる。Ｒ２が所与の値よりも低い場合、例えば、Ｒ２が０．９９未満である場合、最も豊富な「重い」アイソトポログに対応するデータポイントを捨てて、関数およびＲ２を再度線形回帰により計算してもよい。Ｒ２に関して定義された全ての直線性条件がマッチするまで、このプロセスを繰り返してもよい。この繰り返しのプロセスは関数の精度を改善する。
【０１６１】
適切なＲ２を有する関数が得られたら、規定された直線性の範囲が、最大および最小のピーク強度および対応するグリカンアイソトポログ量の値の限界である。この直線範囲内の全てのピークは、極めて正確な定量化をもたらすのに十分な品質を有するとみなすことができる。
【０１６２】
ＩＩ．サンプル中の未標識のグリカンの量の計算
説明したように、一次関数は、タグ付けされた標準である「重い」グリカンのアイソトポログ混合物の既知の特性を使用して得ることができる。これらの「重い」グリカンは、これまでに確立された直線範囲内で、好適な最小のシグナル対ノイズ比、例えば５より高いシグナル対ノイズ比でピーク強度を示すと予想される。
【０１６３】
この方法では、上記の基準（最大および最小のピーク強度内）を満たす個々の「軽い」グリカンのアイソトポログの量（ｍｉ）は、上述したように得られ、上述した線形回帰での繰り返しの改善によって改善された関数から計算することができる。
【０１６４】
【数３】
0006602747.tif 000014
【０１６５】
「軽い」グリカンそれ自体は、その親のマススペクトロメトリーピークに関連する同位体エンベロープ（例えば、１３Ｃの天然の存在度）を有することから、分析物であるグリカン総量のより正確な分析はその「正確な質量の」アイソトポログの理論上の天然の存在度（Ｘｉ）を使用してそれを補正し、ここで理論上の天然の存在度は、存在しているこれらの同位体の統計的確率を使用して容易に論理上計算することができる。
【０１６６】
したがって、「軽い」アイソトポログの量（ｍｉ）を計算して、そのアイソトポログの相対的な存在度（Ｘｉ）を知ることになったら、サンプル中の分析物であるグリカン（ｍＴ）を計算することができる：
【０１６７】
【数４】
0006602747.tif 000015
【０１６８】
したがって、いくつかの実施態様において、サンプル中の分析物であるグリカン含量を定量的に決定する方法は、分析物である前記グリカンの複数の「重い」アイソトポログを含むタグ付けされた標準を使用することができ、本方法は、
（ｉ）各「重い」アイソトポログに関連するイオンのピークの相対的な強度（Ｉｊ＊）を、そのグリカンの標準中の既知の存在度（ｍｊ＊）と関連付けて、ｍｊの一次関数としてＩｊを得る工程；
（ｉｉ）場合により、前記関連付けに関する決定係数Ｒ２を計算して、Ｒ２値が事前に決定された値より高い場合、最も豊富なイオンのピークを除外する工程；
（ｉｉｉ）場合により、工程（ｉｉ）を１回またはそれより多く繰り返す工程；
（ｉｖ）前記関数を使用して、分析物であるグリカンの「軽い」アイソトポログの量を計算する工程；
（ｖ）場合により、分析物であるグリカンの「軽い」アイソトポログの総量を使用して、存在する分析物であるグリカンの総量を決定する工程
を包含する。
【０１６９】
好適には、Ｒ２値は、０．９９よりも大きいかまたはそれに等しくてもよい。
【０１７０】
その上、本発明はさらに、サンプル中の「軽い」アイソトポログを同定する方法であって、該方法は、複数の対応する「重い」アイソトポログを含む既知量のタグ付けされた標準を添加すること（前記「重い」アイソトポログは、同位体標識されている）、マススペクトロメトリーによって混合物を分析し、「重い」アイソトポログおよび「軽い」アイソトポログに関連するイオンのピークの相対的な強度を比較することによって、「軽い」アイソトポログの量を定量化することを含む、上記方法を提供する。
【０１７１】
この定量化は、
（ａ）各「重い」アイソトポログに関連するイオンのピークの相対的な強度（Ｉｊ＊）を、そのアイソトポログの標準中の既知の存在度（ｍｊ＊）と関連付けて、ｍｊの一次関数としてＩｊを得る工程；
（ｂ）場合により、前記関連付けに関する決定係数Ｒ２を計算して、Ｒ２値が事前に決定された値より高い場合、最も豊富なイオンのピークを除外する工程；
（ｃ）場合により、工程（ｉｉ）を１回またはそれより多く繰り返す工程；
（ｄ）前記関数を使用して、分析物サンプル中の分析物である「軽い」アイソトポログの量を計算する工程；
（ｖ）場合により、「軽い」アイソトポログの総量を使用して、存在する分析物であるグリカンの総量を決定する工程
を包含していてもよい。
【０１７２】
本方法は、同位体標識された形態で利用可能なあらゆる好適な分子に適用することができ、本方法は、本明細書で説明されるグリカン標準に好適であるが、必ずしもグリカン分子に限定されないことが理解されよう。
【０１７３】
フラグメンテーション
マススペクトロメトリー実験における分子のフラグメントイオンの生成および分析は、構造的な決定において極めて有用である。このようなフラグメントイオンの生成および検出に関する様々な技術は当業界において公知であり、その例としては、これらに限定されないが、衝突誘起解離（ＣＩＤ）およびタンデムマススペクトロメトリー（またＭＳ／ＭＳやＭＳ２のように様々に称される）が挙げられる。これらのフラグメントの分析および定量化は、部分的または完全な構造決定を助けることができ、概念上同じ分子量を有する他の分子の存在下で所与の分子を検出する場合に特に有用である可能性がある。本発明の分野の状況において、フラグメント分析を使用して、分析物中のより弱い結合である連結を同定して、同重体構造間で区別することも可能である。
【０１７４】
本発明のいくつかの実施態様において、同位体標識された単糖単位は、例えば本明細書で説明される酵素による伸長方法を使用して、グリカン構造に化学酵素的に取り入れることができる。フラグメンテーションパターンを生成するためのこれらのグリカンの使用は、マススペクトロメトリー技術を使用して同重体のグリカン構造間で区別するのに特に有用である。これは、診断フラグメントの同定および／もしくは割り当て、ならびに／または特定の異性体における最も弱い連結の決定を介して達成することができる。
【０１７５】
糖の略語
糖類の略語は、本明細書で使用される場合、当業界で一般的に理解されているのと同様にして使用される。接尾辞「Ｎ」は、対応するアミノ糖を提示し、一方で「ＮＡｃ」は、対応するＮ−アセチルアミノ糖を提示する。
Ｇｌｃ  −  グルコース
Ｇａｌ  −  ガラクトース
Ｍａｎ  −  マンノース
Ｒｈａ  −  ラムノース
Ｆｒｕ  −  フルクトース
Ｆｕｃ  −  フコース
Ｍｕｒ  −  ムラミン酸
Ｎｅｕ  −  ノイラミン酸
Ｋｄｏ  −  ケトデオキシオクツロソネート（keto-deoxyoctulosonate）。
【０１７６】
グリカン
グリカンという用語は、遊離の形態の、または糖タンパク質、プロテオグリカンもしくはグリコリピドなどの複合糖質分子の炭水化物部分を形成するあらゆる糖類（モノ−、オリゴ−またはポリ−）を指すのに使用できる。グリカンは、実質的に全ての生物学的構造およびプロセスに関与する重要な分子である。成分としての単糖は、核酸またはアミノ酸よりかなり大きい組合せの多様性をもたらし、グリカンの共有結合を改変することによりさらなる多様性がもたらされる。したがって、所与の生物のグリカンの総レパートリー（グライコーム）は、ゲノムまたはプロテオームよりもかなり複雑で動的である。
【０１７７】
単糖間の結合は、α−またはβ−形態であってもよく、鎖は、直鎖状または分岐状であってもよく、グリカン修飾は、アセチル化および硫酸化を包含していてもよい。糖タンパク質は、ＮまたはＯ結合を介してポリペプチドに共有結合で付着した１つまたはそれより多くのグリカンを有する。
【０１７８】
Ｏ−グリカンは、セリンまたはスレオニン残基のヒドロキシル基に連結される。Ｎ−グリカンは、側鎖の窒素（Ｎ）を介してアスパラギン残基に連結された糖鎖である。これらは、２つのマンノース残基がα１−３およびα１−６結合で中央のマンノースに別々に連結され、順に２つのβ１−４結合ＧｌｃＮＡｃ残基からなるキトビオースコアにβ１−４結合で連結された一般的な五糖領域を共有する。五糖のさらなるプロセシングに基づき、Ｎ−グリカンは、３つの主要なクラス：（ｉ）高マンノース型、（ｉｉ）複合型、（ｉｉｉ）ハイブリッド型に分類される。
【０１７９】
高マンノース型Ｎ−グリカンは、キトビオースコアに付着した非置換のマンノース残基（典型的には５〜９個）のみを有する。ハイブリッド型Ｎ−グリカンは、非置換の末端マンノース残基と、追加の単糖を付加することができる「枝分かれ」の始点であるＧｌｃＮＡｃを有するマンノース残基の両方を含有する。複合型Ｎ−グリカンは、α３およびα６マンノース部位の両方に付加されたＧｌｃＮＡｃ残基を有するが、余分な五糖マンノース残基を有さず、二、三および四分岐の形態で見出される。
【０１８０】
プロテオグリカンは、キシロースで終わっているコア領域を介してセリン残基のヒドロキシル基に付着した１つまたはそれより多くのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖を有する。最も重要なグリコリピドは、グリコスフィンゴリピドであり、これは、通常グルコースまたはガラクトースを介して、長鎖アミノアルコールであるスフィンゴシンおよび脂肪酸で構成されるセラミド脂質部分の末端ヒドロキシル基に連結されたグリカンからなる。
【０１８１】
グリカン結合タンパク質
グリカンの特異的な生物学的な役割の多くは、グリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）による認識によって媒介される。ＧＢＰは、レクチン、グリコサミノグリカン結合タンパク質およびグリカン特異的抗体を包含する。レクチンは、炭水化物認識ドメインを介してグリカン鎖の末端領域に結合することが多い。低い親和性の結合のために、多価ＣＲＤ−グリカン相互作用が、生物学的関連性との相互作用に必要であることが多い。
【０１８２】
グリカンのプロセシング
グリカンは、主として、単糖部分をグリカン鎖に組み立てるグリコシルトランスフェラーゼ酵素によって合成される。グリコシルトランスフェラーゼ酵素は、共通して、単純なヌクレオチド糖ドナー（例えば、ＵＤＰ−Ｇａｌ、ＧＤＰ−ＦｕｃまたはＣＭＰ−Ｓｉａ）の単糖をアクセプター基質に転移させることを触媒できるという特性を有する。
【０１８３】
複合糖質の生合成は、ポリペプチド側鎖またはスフィンゴ脂質の塩基に糖類を付着させるグリコシルトランスフェラーゼ酵素によって開始される。例えば、Ｎ−グリカンのケースでは、オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、グリカンのＧｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２をアスパラギンの側鎖に転移させる。
【０１８４】
グリコシルトランスフェラーゼの大部分が、グリカン鎖を伸長させる。しばしば別個のグリコシルトランスフェラーゼによる逐次的なグリコシル化によって、直鎖状または分岐状の鎖が構築される。すなわち、１種の酵素によるグリコシル化の生成物が、他の酵素にとって好ましい基質をもたらす。グリコシルトランスフェラーゼの例としては、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、Ｎ−アセチルガラクトサミニル（acetylgalatosaminyl）−トランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃＴ）、フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕＴ）およびシアリルトランスフェラーゼ（ＳｉａｌＴ）が挙げられ、これらはそれぞれ、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコースおよびシアル酸残基の付加を触媒する。
【０１８５】
グリコシダーゼは、グリカンをプロセシングする酵素であり、グリコシダーゼはグリカンから単糖部分を除去して中間体を形成し、次いでこの中間体はグリコシルトランスフェラーゼによって処理される。このタイプのプロセシングは、Ｎ−グリカンの生合成において特に重要であり、すなわちＧｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２へのグリコシダーゼ酵素の作用は、最終的に上述した高マンノース型、複合型およびハイブリッド型Ｎ−グリカンにプロセシングするのに必要な中間体の形成を可能にする。
【０１８６】
同位体標識されたグリカンの化学酵素合成
微生物資源および改善された哺乳動物酵素生産の調査における進歩のため、グリカン合成のための効率的なツールとしてのグリコシルトランスフェラーゼの使用が確立された（Blixt、2006；Ruiz、2001；Serna、2010、Zou、2011）。部位および立体特異的トランスフェラーゼ酵素と糖ドナーのビルディングブロックとの適切な配列を使用すれば、逐次的な酵素による伸長によって複雑なグリカン構造を組み立てることができる。同様に、例えば、二分岐した七糖１８１３Ｃ８Ｇ０（Ｂｎ５）から誘導された非対称な同位体標識されたグリカン標準の調製を容易にするために、最初にコアモチーフをトランケートすることが望ましい場合がある。このトランケーションは、酵素加水分解によって達成することができる。
【０１８７】
したがって、マススペクトロメトリー用の標準として使用するために、本明細書で説明される同位体標識されたグリカンを合成するための方法は、酵素による誘導体化工程を包含する。
【０１８８】
いくつかの実施態様において、同位体標識されたグリカンを合成するための方法は、同位体標識されたオリゴ糖をトランケートするために、本明細書で説明されているような同位体標識されたオリゴ糖に適切なヒドロラーゼを使用することを包含する。言い換えれば、本発明は、同位体標識されたオリゴ糖のコアモチーフから１つまたはそれより多くの糖単位を酵素によりトランケーションするための方法を提供することができる。
【０１８９】
次いで、得られたトランケートされたオリゴ糖は、それ自体酵素による伸長を受けて、１つまたはそれより多くのさらなる糖単位を取り入れてもよい。
【０１９０】
本発明のいくつかの実施態様において、同位体標識されたグリカンを組み立てるために、好適な糖ドナーと組み合わせた適切なトランスフェラーゼは、段階的な様式で逐次的に使用される。トランスフェラーゼは、組換えグリコシルトランスフェラーゼ、トランスグリコシダーゼ、エンドグリコシダーゼまたは突然変異グリコシダーゼであってもよい。得られたグリカンは、本明細書で説明される本発明の方法において有用性を有する可能性がある。いくつかの実施態様において、酵素による伸長工程は、本明細書で説明されているような同位体標識されたモチーフを含むオリゴ糖に対して行われ、このようなオリゴ糖は、コアオリゴ糖、コアモチーフ、および同位体標識された開始のオリゴ糖と様々に称される場合がある。言い換えれば、本発明のいくつかの方法において、同位体標識された開始のオリゴ糖を化学選択的に伸長させて追加の糖単位を取り入れることによって、マススペクトロメトリーで使用するためのさらなる同位体標識されたグリカン標準が得られる。
【０１９１】
各伸長工程で使用される糖ドナーは、場合により同位体標識されていてもよい。いくつかの実施態様において、元の同位体標識されたモチーフのみが、得られたグリカンにおいて同位体標識されている。他の実施態様において、少なくとも１種の同位体標識された糖単位が、酵素による伸長工程中に取り入れられる。上記で論じられたように、特異的な位置における特異的な同位体標識された糖単位の取り入れは、マススペクトロメトリーにおけるフラグメンテーションパターンの分析において有用性を有する。
【０１９２】
その代わりに、酵素による伸長は、同位体標識されていないモチーフに対して行われる。その代わりに、本明細書で説明されているようなサンプル中のグリカンを同定する方法で必要に応じて使用される可能性がある同位体標識されたグリカンを得るために、酵素による伸長工程中に、１種またはそれより多くの同位体標識された糖単位が取り入れられる。
【０１９３】
化学酵素的な伸長工程は、複数回繰り返してもよい。例えば、単糖の糖ドナーを使用して、２０サイクルの化学酵素的な伸長は、追加の２０個の単糖単位を導入することができる。枝分かれの末端にさらなる単位が取り入れられてもよいし、またはコアオリゴ糖の糖単位の１つに取り入れられてもよいことが理解されよう。
【０１９４】
いくつかの実施態様において、化学酵素的な伸長工程は、二糖またはオリゴ糖である糖ドナー、および／または脂質、ペプチドもしくはタンパク質にコンジュゲートしている糖ドナーを利用してもよい。
【０１９５】
いくつかの実施態様において、酵素による誘導体化工程は、エピマー化工程、糖転移工程、または翻訳後修飾工程のうち１つまたはそれより多くを含んでいてもよい。これらは、伸長またはトランケーションに加えてなされてもよい。
【０１９６】
図２は、様々なグリカンおよびグリカン混合物を組み立てる方法の使用を実証する。いずれの糖単位が同位体標識されていてもよい。いくつかの好ましい実施態様において、開始の七糖である、［（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→６）］−［２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル−（１→３）］−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−２−デオキシ−α，β−Ｄ−グルコピラノースにおける各アセチル基が同位体標識されている。この同位体標識された出発原料の化学合成は、後述される。この同位体標識された開始のコアオリゴ糖は、本明細書では１３Ｃ８−Ｇ０と称される。
【０１９７】
図２は、この開始の七糖１３Ｃ８−Ｇ０から始まる一連の配列を示す。組換えコアα１，６フコシルトランスフェラーゼとのインキュベートにより、コアにフコシル化した構造Ａが付与され、これをさらにガラクトシル化（パネルＣ）およびシアル化（パネルＤ）してもよい。ＵＤＰ−ガラクトースの存在下で牛乳のガラクトシルトランスフェラーゼを用いて開始の七糖を直接ガラクトシル化することにより、モノガラクトシル化された異性体および完全にガラクトシル化されたＮ−グリカン（パネルＥ）の両方が得られる。組換えα２，６シアリルＴでのさらなる処置により、パネルＦの化合物が供給される。分岐しているＧｌｃＮＡｃ残基は、組換えＧｎＴＩＩＩ（化合物Ｂ）により導入されてもよい。次いでこの生成物のガラクトシル化により、パネルＧの分岐している化合物が生じ、それに続いてシアル化によりパネルＨの化合物が得られる。分岐している化合物Ａのα−１，６フコシル化により分岐しているコアのフコシル化グリカンＩが生じ、これをガラクトシル化してパネルＪにし、最終的にシアル化して、化合物（パネルＫ）を得てもよい。
【０１９８】
合成により供給された同位体標識されたコアオリゴ糖は、酵素による誘導体化工程中に保護されていてもよく、すなわち上記コアオリゴ糖は、１つまたはそれより多くの保護基を有する可能性がある。例えば、本明細書で説明されているように、１３Ｃ８−Ｇ０は、本明細書では１３Ｃ８−Ｇ０（Ｂｎ５）と称される、１３Ｃ８−ベンジル［（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→６）］−［２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル−（１→３）］−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドを介して得ることもできる。このベンジル化された七糖はそれ自体、酵素による誘導体化工程のための同位体標識されたコアモチーフとして使用することができる。本明細書で説明されているように、部分的に保護されたコアモチーフは、化学選択的な酵素による伸長に好適な基質である可能性があり、保護基の存在は、例えば、ＨＰＬＣ分析および精製中にピーク検出のための発色団として作用することや、異なる生成物、例えば異性グリカンの分離を補助することによって、特定の利点を有する可能性がある。
【０１９９】
類似の様式で、加えて、上述したようにマススペクトロメトリー実験において容易に検出可能な固定の質量増分を有する同位体標識化合物として得られた同位体標識されたモチーフを用いて開始することによって、他の非ヒト、例えば植物または寄生体特異的なグリカンを査定できることが理解されよう。同様に、枝分かれの数、分岐パターンおよびコア修飾の系統的なバリエーションを有するより高次に分岐した複合型、ハイブリッド型および高マンノース型グリカンを包含するより大きいＮ−グリカンライブラリーの化学合成的な調製が、本発明に係る方法を使用して入手できる極めて少数のコア構造、好ましくは同位体標識されている、から開始して得ることができる。これらのコア構造をベースとしたライブラリーは、真核性の糖タンパク質に見出されるＮ−グリカンの構造的なバリエーションおよび組換え糖タンパク質に存在する最も一般的なグリカン構造を反映する。
【０２００】
以下の検討は、本明細書では１３Ｃ８−Ｇ０と称される七糖Ｎ−グリカンコアの修飾に関する。これは例証のために示されるものであり、本発明を限定する意図はない。他のグリカンコアも同様に想定することができる。
【０２０１】
部分的に脱保護された１３Ｃ標識Ｎ−グリカンである１３Ｃ８−Ｇ０（Ｂｎ５）（１３）を、非対称Ｎ−グリカン構造の調製および単離のための前駆体として評価した。本発明者らは、ペンタベンジル化グリカンの疎水性およびＵＶ吸光度の利点を生かすことにより、コアのＮ−グリカン構造中にこれらの５つのベンジル基が存在することが、異なるグリカンのクロマトグラフィーによる分離を容易にし、さらに部分的な酵素による伸長後の異性体構造の分離をも容易にすることを見出した。
【０２０２】
牛乳のβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを用いた基質の部分的なガラクトシル化を制御するための一連の実験を行ったところ、当該酵素にとって部分的に保護されたＮ−グリカン１３Ｃ８−Ｇ０（Ｂｎ５）が好適な基質であったことに加えて、全て１３Ｃ標識されたＧ０−Ｇ１−Ｇ２構造の混合物が得られる可能性も示された。Ｃ１８カラムを使用した逆相におけるＵＰＬＣ−ＭＳでこの混合物を分析したところ、異なる化合物の分離に加えて、モノガラクトシル化Ｎ−グリカン１３Ｃ８−Ｇ１（Ｂｎ５）の２種の異性体の分離も達成され、ＵＶ−検出器の使用によりそれらの相対的な組成も定量化された。１３Ｃ８−Ｇ０（Ｂｎ５）の酵素による変換中に適した条件を使用することにより、モノガラクトシル化された二分岐Ｎ−グリカン１３Ｃ８−Ｇ１（Ｂｎ５）が、その２種の異なる異性体である３−ＬａｃＮＡｃおよび６−ＬａｃＮＡｃの形態で、４５％より高い収量で得られた。
【０２０３】
ＭＡＬＤＩ分析およびＮＭＲ分析で確認したところ、モノガラクトシル化異性体の両方がミリグラムスケールでのセミ分取ＨＰＬＣによって別々に精製されることが達成された。水素化分解でコアを完全に脱保護することによって、Ｎ−グリカンの定量分析で使用するための、２種の異性体の１３Ｃ標識標準１３Ｃ８−Ｇ１３および１３Ｃ８−Ｇ１６が得られた。また、ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ  ＭＳで確認したところ、異性体の１３Ｃ８−Ｇ１６も、標準１３Ｃ８−Ｇ１６Ｆの調製のために酵素的にフコシル化することができた。
【０２０４】
マススペクトロメトリー用の標準として使用するための、異性体の非対称の同位体標識されたＮ−グリカンを得るための別の方策は、ビスガラクトシル化１３Ｃ８−Ｇ２（Ｂｎ５）化合物にアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来β−ガラクトシダーゼを使用することからなっていた（表１）。この変換中に異なる分布のグリカンが観察され、ここで発明者らは、２つの異性体のモノガラクトシル化構造に対するこの加水分解酵素（hydrolase）の異なる活性を決定することができた。この酵素の異なる特異性により、モノガラクトシル化化合物の一方のみを５０％近い収量で、さらに非ガラクトシル化化合物の１３Ｃ８−Ｇ０（Ｂｎ５）が得られた。
【０２０５】
【表１】
0006602747.tif 000016
【０２０６】
同じ方策を採用して、大腸菌（E. coli）で発現させたパスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）由来α−２，３−シアリルトランスフェラーゼを使用して、ビスガラクトシル化１３Ｃ８−Ｇ２（Ｂｎ５）から様々な１３Ｃ標識シアル化標準を調製して、二分岐構造から誘導された、２種のモノシアル化グリカンおよびビスシアル化グリカンを得た。この部分的に保護された化合物の混合物をＵＰＬＣ−ＭＳによって解析したところ、発明者らは、それらの相対的な組成を決定することができた（表２）。
【０２０７】
【表２】
0006602747.tif 000017
【０２０８】
またこの反応を、前に得られた部分的にガラクトシル化した化合物Ｇ０／Ｇ１／Ｇ２の混合物にも適用した。この混合物の部分的なα−２，３−シアル化により９種の構造を有する混合物が生産され、これらをＵＰＬＣ−ＭＳで解析したところ、１３Ｃ８−Ｇ０（Ｂｎ５）および１３Ｃ８−Ｇ２（Ｂｎ５）、モノガラクトシル化化合物１３Ｃ８−Ｇ１（Ｂｎ５）の両方の異性体、モノシアル化化合物１３Ｃ８−Ｇ１Ａ１（Ｂｎ５）の両方の異性体、モノシアル化化合物１３Ｃ８−Ｇ２Ａ１（Ｂｎ５）の両方の異性体、およびビス−シアル化された二分岐構造１３Ｃ８−Ｇ２Ａ２（Ｂｎ５）の存在を同定することができた。それゆえにこの方策は、精製および脱保護後に、最大５種の新規のシアル化１３Ｃ標識Ｎ−グリカンを得るのに使用することができる。
【０２０９】
次いで対応するシアル化標準を得るために、シアル化反応をｍｇスケールで行った。前に調製された部分的に保護された１３Ｃ８−Ｇ１３Ｂｎ５をＰ．ムルトシダ由来α−２，３−シアリルトランスフェラーゼでシアル化し、シアル化化合物１３Ｃ８−Ｇ１３Ｂｎ５を得た。反応は完了しなかったが、シアル化化合物をセミ分取ＨＰＬＣによって単離することができた。またｍｇスケールでの１３Ｃ８−Ｇ２（Ｂｎ５）のシアル化によっても、シアル化標準１３Ｃ８−Ｇ２Ａ１３（Ｂｎ５）、１３Ｃ８−Ｇ２Ａ１６（Ｂｎ５）および１３Ｃ８−Ｇ２Ａ２（Ｂｎ５）の混合物が得られ、これもセミ分取ＨＰＬＣによって分離することができた。
【０２１０】
また組換えＣＨＯ細胞で発現されたヒトα−２，６−シアリルトランスフェラーゼでの１３Ｃ８−Ｇ２（Ｂｎ５）のシアル化反応も、対応するモノおよびビスシアル化構造を得るために制御した。基質として部分的に保護された１３Ｃ８−Ｇ２（Ｂｎ５）および唯一の当量のシアル酸ドナーを使用した反応により、モノシアル化化合物が２６％の収量で得られた。それに対して、過量のドナーを使用したところ、唯一の生成物としてビスシアル化化合物が得られた。両方の化合物、モノおよびビスシアル化化合物をＵＰＬＣ−ＭＳで解析することができた。またこの反応は、前に部分的なガラクトシル化によって得られたＧ０／Ｇ１／Ｇ２混合物にも行われた。α−２，３−シアリルトランスフェラーゼを用いた前の結果と類似して、３種のガラクトシル化化合物を含有する混合物の部分的なシアル化により、４種の新規な１３Ｃ標識２，６−シアル化Ｎ−グリカンの混合物が得られ、これはＵＰＬＣ−ＭＳで解析することができた。混合物の相対的な組成が決定され、ビス−２，６−シアル化二分岐Ｎ−グリカン１３Ｃ８−Ｇ２Ｓ２（Ｂｎ５）、モノ−２，６−シアル化化合物１３Ｃ８−Ｇ１Ｓ１（Ｂｎ５）がその２種の異性体の形態として別々に同定され、さらに他のモノシアル化化合物１３Ｃ８−Ｇ２Ｓ１（Ｂｎ５）が同定された（表３）。
【０２１１】
【表３】
0006602747.tif 000018
【０２１２】
二分岐構造から誘導された、ただし末端ＧｌｃＮＡｃを１つのみ有する他の非対称グリカン標準の調製ために、コアオリゴ糖１３Ｃ８−Ｇ０（Ｂｎ５）を修飾することもできる。これらのトランケートされた一分岐構造は、１３Ｃ８−Ｇ０（Ｂｎ５）中の末端グルコサミンの酵素加水分解によって得ることができる。ここでも開始の分子に存在するベンジル基は、酵素加水分解後に結果得られた構造を精製するのに役立つ。この目的のために、タチナタマメ（Conavalia ensiformis）由来Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを部分的に保護された基質１３Ｃ８−Ｇ０（Ｂｎ５）に使用した。反応を最適化することで、発明者らは、出発原料、一分岐構造の１３Ｃ６−ＭＧｎ３（Ｂｎ５）および１３Ｃ６−ＭＧｎ６（Ｂｎ５）それぞれの２種の異性体、ならびに１３Ｃ４−Ｍａｎ３（Ｂｎ５）を二重に加水分解した生成物の混合物を得ることができた。グルコサミニダーゼが１３Ｃ標識ＧｌｃＮＡｃ部分を除去するために、結果得られたグリカンは、異なる程度の標識付けを有し、２種の異性体の、６個の１３Ｃ原子が結合した一分岐構造と、元の８個の原子の代わりに４個の１３Ｃ原子を有するトリマンノースグリカンとが得られる。
【０２１３】
３ｍｇの１３Ｃ８−Ｇ０（Ｂｎ５）を使用して加水分解反応をスケールアップさせた。この混合物は、セミ分取用ＨＰＬＣで解析でき、３種の新規の化合物をｍｇスケールで単離した。これらの化合物をベンジル基の除去ために水素化分解処理し、対応する１３Ｃ標識グリカン１３Ｃ６−ＭＧｎ３、１３Ｃ６−ＭＧｎ６および１３Ｃ４−Ｍａｎ３を得た（図５）。また１３Ｃ６−ＭＧｎ３の酵素によるフコシル化によっても、標準１３Ｃ６−ＭＧｎ３Ｆが定量的に生産された（図６）。
【０２１４】
上述したように、部分的にベンジル化された化合物を、酵素反応によって誘導体化することができた。この部分的な保護は、得られた混合物のＨＰＬＣによる分離を可能にすることから、例えば部分的なガラクトシル化によって、対応する反応が１種より多くの生成物を生じる場合に、この部分的な保護は特に有用である。
【０２１５】
三分岐Ｎ−グリカン２２は、ガラクトシル化可能な３つの異なる位置を有する。部分的なガラクトシル化は、一回の反応で、７種の新規な同位体標識されたグリカン標準、すなわち完全にガラクトシル化されたＮ−グリカン（Ｇ３）、２つのガラクトース残基を有する３種の化合物（Ｇ２ａ、Ｇ２ｂ、Ｇ２ｃ）、および単一のガラクトース残基を有する３種の化合物（Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ、Ｇ１ｃ）を生産する。
【０２１６】
場合により行われるオキサゾリン形成
本発明のいくつかの実施態様において、合成方法は、オリゴ糖中のアセチル−ヘキソサミン単位の遊離のアノマー位でオキサゾリンを形成する工程をさらに含む。
【０２１７】
【化１１】
0006602747.tif 000019
【０２１８】
この合成工程に好適な方法は当業界において公知であり、ＣＤＩ、ＤＣＣ、ＥＤＣ、およびＤＭＣなどのカップリング試薬の使用；または好適なルイス酸試薬の使用を包含する。これに限定されないが、クロロホルムアミジウム（chloroformamidium）タイプの試薬と酸との組合せなどの他の脱水試薬または条件も使用が可能である。
【０２１９】
次いで得られた同位体標識されたグリカンオキサゾリンを使用して、同位体標識された複合糖質を調製することができる。好適なプロトコールは当業界において公知である（例えば、Rising、2008を参照）。好ましい複合糖質としては、糖タンパク質、グリコフォーム、糖ペプチド、ペプチドグリカン、グリコリピド、グリコシドおよびリポ多糖が挙げられる。
【０２２０】
いくつかの好ましい実施態様において、合成方法は、モチーフ［（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→６）］−［２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル−（１→３）］−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−２−デオキシ−α，β−Ｄ−グルコピラノースを含むグリカンを含み、ここでモチーフ中の各アセチル基は、同位体標識されている。グリカンは、さらなる枝分かれした糖単位を含んでいてもよい。このグリカンの遊離のアノマー位におけるオキサゾリン形成は、天然複合糖質に対して少なくとも８Ｄａの固定の質量増分を有する複合糖質のアイソトポログの調製を可能にする。いくつかの好ましい実施態様において、さらなる枝分かれした糖単位はいずれも同位体標識されておらず、得られた同位体標識された複合糖質は、天然複合糖質に対して８Ｄａの固定の質量増分を有する。
【０２２１】
疾患および障害におけるグリカンマーカー
グリカンの生合成は、グリコシルトランスフェラーゼを含む多数の高度に競合的なプロセスに頼っている。結果として、グリコシル化は生化学的環境の性質に高度な感受性を有し、グリコシル化およびグリコシル化の変化は、多くの疾患および障害と関係するとされてきた。したがって、いくつかの形態において、本発明は、いわゆるグリカンマーカー（疾患または障害に関連することが公知の特定のグリカン構造）をうまく同定するための方法を対象とする。いくつかの実施態様において、本発明は、複雑な混合物中の単一のグリカンマーカーの同定および定量化を提供しているが、他の実施態様において、一回の実験で、１種またはそれより多くの疾患または障害に関連する多数のグリカンマーカーを同定して定量化することができる。
【０２２２】
特定の疾患または障害に関連するグリカンマーカーの指標の組合せの同定を助けるために、いくつかの好ましい実施態様において、タグ付けされた標準は、組み合わされた、場合により適切な比例的な量での、疾患または障害に関連することが公知の同位体標識されたアイソトポログを含む混合物である。この方式において、予備混合された１種またはそれより多くの同位体標識されたグリカンを含むタグ付けされた標準は、特定のグリカン指標の存在を決定するための本発明の方法で、さらにその結果としてそのような指標に関連する疾患および障害の診断方法で使用することができる。
【０２２３】
１種またはそれより多くの同位体標識されたグリカンを含む好適なタグ付けされた標準を使用することができる疾患および障害としては、以下が挙げられる：
がん；
心臓血管疾患、例えば卒中、心筋梗塞、血液量減少性の卒中、アテローム性動脈硬化症；
炎症性の皮膚疾患；
糖尿病；
胃腸障害、例えば潰瘍性大腸炎；
肝臓障害および疾患；
貧血；
免疫疾患および障害、例えば、ウィスコット・アルドリッチ症候群；
自己免疫疾患；
関節リウマチなどの関節炎；
感染症；
腎症；
神経障害、例えばアルツハイマー病；
肺障害；および
グリコシル化の先天性障害。
【０２２４】
上記に示された列挙は限定のためではなく、本明細書で説明される方法は、疾患または障害に関連することが公知のあらゆるグリカンバイオマーカーの検出、同定、および／または定量化に関連するものであることが理解されよう。
【０２２５】
本発明は、生物薬剤学的なグリコールのプロファイリングにおいて多くの有用な用途を提供するものであることが理解されよう。以下の説明に役立つ例は、本明細書で説明されるアイソトポログおよび方法を適用することができる様々な使用を例示するために示される。
【０２２６】
・所与の製品ごとの定量的な唯一のグリカンのフィンガープリントによる、生産バッチおよび生産場所の迅速な同定。これは、オリジナルとしてパッケージ化されたバイオ後続品（biosimilar）を同定して、バッチのオリジナルと同一性を追跡することに役立つ可能性がある。
【０２２７】
・公知のエフェクター機能（Ｆｃ部分のＦｃ受容体への結合に影響を与える）を有するｍＡｂグリカン、または血液循環半減期への重要な作用の正確且つ定量的な検出。このようなものとしては、コアフコース、末端ガラクトース、末端シアル酸および高マンノース型グリカンを有するグリカンが挙げられる（後者は、例えばマクロファージのマンノース受容体と選択的にかみ合って、血液循環から薬物を除去させるであろう）。
【０２２８】
・クローン選択、プロセス開発、バッチリリースからＩＮＤ申請のようなバイオ医薬産業における、ハイスループット用途での、全体的な迅速且つ定量的なグリカンのプロファイリング、および単糖の組成、分岐の程度、シアル化、フコース含量など。
【０２２９】
・これらの単糖の損失または移動を定量化してモニターするための、さらにアクイジションパラメーター（acquisition parameters）を最適化してこれらの残基の損失を回避するための、ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ  ＭＳによるグリカンのプロファイリングにおける内部標準としての、フコシル化およびシアル化したグリカン標準または他のあらゆる不安定性のグリカンの特定の使用。
【０２３０】
・クローン選択およびプロセス開発においてバイオ後続品生産者を導くための、オリジナルの生産者の治療的ｍＡｂまたは糖タンパク質の正確なグリカン組成を有するキットの生産。
【０２３１】
・混合物内のグリコフォームの絶対的な定量化のための内部標準の使用であって、効能実験をグリコシル化に関連付けて、最終的に特定のグリコフォームの効能を決定するのに役立つ使用。
【実施例】
【０２３２】
以下の実施例は、本発明をどのように実施するかの十分な開示と説明を当業者に提供するために記載されたものであり、本発明の範囲を限定することは意図しない。
【０２３３】
Ｎ−グリカンの七糖コアの合成
以下の合成は、図３に示される対応する化学物質の構造に対して番号付けされている。
【０２３４】
ベンジル４−Ｏ−アセチル−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシド（２）
乾燥ＤＣＭ中の、分子篩を含むベンジルアルコール（５４μＬ、０．５２５ｍｍｏｌ、１．５当量）および１（２５０ｍｇ、０．３５０ｍｍｏｌ、Serna S.、Kardak B.、Reichardt N.、Martin-Lomas M.、Tetrahedron Asymmetry、2009、20、851〜856に従って合成された）の溶液を室温で４５分間攪拌した。混合物を０℃に冷却し、ＴＭＳＯＴｆ（６μＬ、０．０３５ｍｍｏｌ、０．１当量）を添加した。１時間後、反応液をトリエチルアミンでクエンチし、セライトのプラグを通過させてろ過し、濃縮した。未精製の残留物を、９：１のヘキサン：ＥｔＯＡｃでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、表題の化合物を得た（１９８ｍｇ、９０％）。
【０２３５】
Rf 0.39 (トルエン:EtOAc 9:1); [α]D20=+9.2 (c=0.5, CHCl3); 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.87−7.48 (m, 4H, Phth), 7.40−7.27 (m, 5H, Ph), 7.13−6.96 (m, 7H, Ph), 6.95−6.85 (m, 3H, Ph), 5.19−5.09 (m, 2H, H-1, H-4), 4.81 (d, J = 12.3 Hz, 1H, CH2 Bn), 4.61−4.54 (m, 3H, CH2 Bn), 4.50 (d, J = 12.4 Hz, 1H, CH2 Bn), 4.42 (dd, J = 10.7, 8.9 Hz, 1H, H-3), 4.34−4.27 (m, 2H, H-2, CH2 Bn), 3.75 (dt, J = 9.7, 4.6 Hz, 1H, H-5), 3.68−3.60 (m, 2H, h-6), 1.94 (s, 3H, CH3 Ac); 13C NMR (CDCl3) δ:169.8, 138.1, 137.9, 137.1, 133.9, 131.7, 128.5, 128.3, 128.2, 128.0, 127.9, 127.8, 127.8, 127.8, 127.5, 123.4, 123.4, 97.3(C-1), 73.9, 73.8, 73.6, 72.6, 71.0, 69.9, 55.6, 21.0; HRMS (ESI): m/z: 計算値C37H35NO8Na: 644.2260 [M+Na]+, 実測値644.2294。
【０２３６】
ベンジル３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシド（３）
２：１のＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２（６ｍＬ）中の２（６０８ｍｇ、０．９７８ｍｍｏｌ）の溶液に、０．２５ＭのＮａＯＭｅ（３００μＬ、２０％）を添加した。１時間攪拌した後、酸性イオン交換樹脂をｐＨ７になるまで添加した。溶液をろ過し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製して、表題の化合物を得た（４３０ｍｇ、７６％）。
【０２３７】
Rf (ヘキサン:EtOAc); [α]D20=+9.4 (c=0.5, CHCl3); 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.89−7.50 (m, 4H, Phth), 7.42−7.29 (m, 5H, Ph), 7.13−7.01 (m, 7H, Ph), 6.98−6.89 (m, 3H, Ph), 5.20−5.12 (m, 1H, H-1), 4.79 (d, J= 12.3 Hz, 1H, CH2 Bn), 4.73 (d, J = 12.2 Hz, 1H, CH2 Bn), 4.67 (d, J = 11.9 Hz, 1H, CH2 Bn), 4.61 (d, J = 12.0 Hz, 1H, CH2Bn), 4.52 (d, J = 12.3 Hz, 1H, CH2Bn), 4.48 (d, J = 12.3 Hz, 1H, CH2Bn), 4.29−4.19 (m, 2H, H-2, H-3), 3.90−3.78 (m, 3H, H-6, H-6, H-4), 3.65 (dt, J = 9.7, 4.9 Hz, 1H, H-5), 2.96 (br s, 1H, OH); 13C NMR (CDCl3) δ:168.1, 167.8, 138.3, 137.8, 137.2, 133.8, 131.7, 128.6, 128.2, 128.0, 128.0, 127.9, 127.7, 127.7, 127.5, 123.4, 123.3, 97.5(C-1), 78.7, 74.4, 73.9, 73.7, 70.9, 70.8, 55.5; HRMS (ESI): m/z: 計算値C35H33NO7Na: 602.2155 [M+Na]+, 実測値602.2128。
【０２３８】
ベンジル２−Ｏ−アセチル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−３−Ｏ−（２−ナフチルメチル）−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシド（５）
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中の、３Åの分子篩を含む１（４００ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）および４（９０５ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ、１．２当量、Serna S.、Kardak B.、Reichardt N.、Martin-Lomas M.、Tetrahedron Asymmetry、2009、20、851〜856に従って合成された）の溶液を室温で１時間攪拌した。この混合物に、ＴＭＳＯＴｆ（１２μＬ、０．０７ｍｍｏｌ、１０％）を室温で添加し、ＴＬＣが出発原料の完全な変換を示すまで（１時間）反応液を攪拌した。反応液をトリエチルアミン（２０μＬ）の添加によってクエンチし、セライトのプラグを通過させてろ過し、濃縮した。未精製の残留物をフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、表題の化合物を得た（７５０ｍｇ、７３％）。
【０２３９】
Rf 0.17 (ヘキサン:EtOAc 3:1); [α]D20=-4.9 (c=0.5, CHCl3); 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.91−7.58 (m, 10H), 7.57−7.28 (m, 12H), 7.23−7.13 (m, 4H), 7.12−6.87 (m, 13H), 6.81−6.68 (m, 3H), 5.53 (s, 1H, CHPh), 5.51 (dd, J = 3.3, 1.3 Hz, 1H, H-2C), 5.27 (d, J = 8.3 Hz, 1H, H-1B), 4.95 (d, J = 8.4 Hz, 1H, H-1A), 4.88 (d, J = 12.1 Hz, 1H, CH2 Bn), 4.83 (d, J = 12.8 Hz, 2H, 2 x CH2Bn), 4.7−4.67 (m, 3H, 2 x CH2 Bn, H-1C ), 4.57−4.47 (m, 4H, 2 x CH2 Bn), 4.42 (d, J = 12.1 Hz, 1H, 1 x CH2Bn), 4.40−4.35 (m, 2H, 2 x CH2 Bn), 4.29 (dd, J = 10.7, 8.5 Hz, 1H, H-3B), 4.25−4.08 (m, 6H, H2A, H2B, H-4A, H-4B, H-3A, H-6Ca), 3.90 (t, J = 9.6 Hz, 1H, H-4C), 3.68−3.59 (m, 2H, H-6Ba, H-6Bb), 3.59−3.50 (m, 3H, H-6C-b, H-6Aa, H-3C), 3.43 (dd, J= 11.1, 3.8 Hz, 1H, H-6Ab), 3.30 (ddd, J= 9.9, 3.9, 1.7 Hz, 1H, H-5A), 3.23 (dt, J= 9.9, 2.2 Hz, 1H, H-5B), 3.13 (td, J= 9.7, 4.9 Hz, 1H, H-5C), 2.22 (s, 3H, CH3 Ac); 13C NMR (CDCl3) δ:170.3, 168.6, 167.7, 167.6, 138.7, 138.7, 138.5, 137.9, 137.6, 137.3, 135.4, 134.1, 133.9, 133.5, 133.4, 133.1, 131.9, 131.8, 131.5, 129.1, 128.6, 128.4, 128.3, 128.2, 128.1, 128.1, 127.9, 127.8, 127.7, 127.7, 127.6, 127.6, 127.5, 127.3, 126.9, 126.3, 126.1, 126.0, 125.5, 123.8, 123.2, 101.7, 99.4(C-1C), 97.2(C-1A), 97.1(C-1B), 79.0, 77.9, 77.0, 76.6, 75.9, 75.8, 74.7, 74.6, 74.4, 74.3, 73.2, 72.9, 71.6, 70.6, 69.2, 68.5, 68.3, 67.9, 67.0, 56.6, 55.8, 21.2; HRMS (ESI): m/z: 計算値C89H82N2O19Na: 1506.5443 [M+Na]+, 実測値1506.5481。
【０２４０】
ベンジル２−Ｏ−アセチル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシド（６）
４：１のＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ（１．２ｍＬ）中の５（３００ｍｇ、０．２０２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＤＱ（１３８ｍｇ、０．６０６ｍｍｏｌ、３当量）を添加した。２時間後、混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３、水およびブラインで洗浄した。溶液を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製して、表題の化合物を得た（１７６ｍｇ、６５％）。
【０２４１】
Rf 0.37 (ヘキサン:EtOAc 3:2); [α]D20= -4.6 (c=1, CHCl3); 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.94−7.57 (m, 8H, Phth), 7.50−7.27 (m, 15H, Ph), 7.11−6.88 (m, 12H, Ph), 6.82−6.68 (m, 3H, Ph), 5.47 (s, 1H, CHPh), 5.31 (dd, J = 3.1, 1.2 Hz, 1H, H-2C), 5.26 (d, J= 8.2 Hz, 1H, H-1B), 4.95 (d, J= 8.4 Hz, 1H, H-1A), 4.85 (t, J= 12.4 Hz, 2H, CH2Ph), 4.76 (d, J = 1.3 Hz, 1H, H-1C), 4.70 (d, J = 12.4 Hz, 1H, アノマーのCH2Ph), 4.62 (d, J = 12.0 Hz, 1H, CH2Ph), 4.50 (d, J = 13.3 Hz, 3H, CH2Ph), 4.47 (d, J = 12.0 Hz, 1H, CH2Ph), 4.41 (d, J = 12.1 Hz, 1H, アノマーのCH2Ph), 4.37 (d, J= 12.4 Hz, 1H, CH2Ph), 4.30-4.23 (m, 1H, H-3B), 4.23−4.08 (m, 6H, H-2B, H-4A, H-2A, H-4B, H-3A, H-6Ca), 3.75−3.67 (m, 2H, H-4C, H-3C), 3.63 (dd, J = 7.2, 2.3 Hz, 2H, H-6Ba, H-ABb), 3.59−3.50 (m, 2H, H-6Cb, H-6Aa), 3.43 (dd, J = 11.1, 3.8 Hz, 1H, H-6Ab), 3.33−3.27 (m, 1H, H-5A), 3.23−3.18 (m, 1H, H-5B), 3.15 (dd, J = 15.0, 8.2 Hz, 1H, H-5C), 2.20 (s, 3H, CH3 Ac); 13C NMR (CDCl3) δ:170.6, 168.5, 167.7, 138.7, 138.4, 138.0, 137.3, 137.1, 134.1, 133.9, 133.5, 131.8, 131.5, 129.3, 128.6, 128.4, 128.4, 128.1, 128.1, 127.9, 127.9, 127.7, 127.6, 127.5, 127.3, 126.9, 126.3, 123.7, 123.2, 102.1, 99.3(C-1C), 97.2(C-1A), 97.0(C-1B), 79.1, 78.6, 76.6, 75.7, 74.6, 74.6, 74.4, 74.4, 73.3, 72.9, 71.4, 70.5, 69.9, 68.5, 68.3, 67.8, 66.7, 56.6, 55.8, 21.1; HRMS (ESI): m/z: 計算値C78H74N2O19Na: 1365.4784 [M+Na]+, 実測値1365.4840。
【０２４２】
ベンジル（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→３）−２−Ｏ−アセチル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシド（８）
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中の、分子篩を含む６（１００ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）および７（８０ｍｇ、０．０８９ｍｍｏｌ、１．２当量、Unverzagt, C.； Eller, S.；Mezzato, S.； Schuberth, R. Chem. Eur. J.2007、14、1304〜1311に従って合成された）の溶液を室温で１時間攪拌した。この混合物に、ＴＭＳＯＴｆ（１．６μＬ、０．００７ｍｍｏｌ、１０％）を添加し、ＴＬＣが出発原料の完全な変換を示すまで（１時間）攪拌した。反応液をトリエチルアミン（２０μＬ）の添加によってクエンチし、セライトのプラグを通過させてろ過し、ろ液を濃縮した。未精製の残留物をフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、表題の化合物を得た（１１６ｍｇ、７６％）。
【０２４３】
Rf 0.13 (ヘキサン:EtOAc 1:1); [α]D20=-15.8 (c=0.5, CHCl3);1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.95−7.51 (m, 16H), 7.51−7.27 (m, 11H), 7.08−6.89 (m, 12H), 6.84−6.68 (m, 3H), 5.48−5.40 (m, 2H, H-3E, CHPh), 5.23 (d, J = 7.9 Hz, 1H, H-1B), 5.16 (d, J = 4.0 Hz, 1H, H-2C), 5.02 (t, J = 10.2 Hz, 1H, H-4D), 4.99-4.89 (m, 3H, H-4D, H-1A, H-1D), 4.89−4.77 (m, 4H, H-1E, 2 x CH2Ph, H-3D), 4.68 (d, J = 12.2 Hz, 2H, アノマーのCH2Ph, CH2Ph), 4.54−4.46 (m, 4H, 3x CH2Ph, H-1C), 4.41−4.30 (m, 3H, アノマーのCH2Ph, 2 x CH2Ph), 4.28−4.05 (m, 8H, H-2E, H-3B, H-4A, H-2B, H-2A, H-3A, H-4B, H-6Ca), 4.00 (dd, J = 3.0, 1.7 Hz, 1H, H-2D), 3.93 (dd, J = 12.3, 3.3 Hz, 1H, H-6Ea), 3.83 (dt, J = 9.8, 3.7 Hz, 1H, H-5D), 3.73 (t, J = 9.6 Hz, 1H, H-4C), 3.70−3.62 (m, 4H, H-6Eb, H-6Da, H-6Db, H-6Ba), 3.60-3.51 (m, 3H, H-6Bb, H-6Aa, H-3C), 3.48 (t, J = 10.3 Hz, 1H, H-6Cb), 3.38 (dd, J = 11.1, 3.6 Hz, 1H, H-6Ab), 3.29 (dd, J = 9.8, 3.1 Hz, 1H, H-5A), 3.15 (dd, J = 9.9, 2.1 Hz, 1H, H-5B), 3.00 (td, J = 9.7, 5.0 Hz, 1H, H-5C), 2.15 (s, 4H, CH3 Ac, H-5E), 2.05 (d, J = 5.8 Hz, 6H, CH3Ac), 1.99 (d, J = 11.5 Hz, 5H, CH3Ac), 1.86 (d, J = 4.8 Hz, 6H, CH3Ac); 13C NMR (CDCl3) δ:170.6, 170.6, 170.5, 170.2, 170.1, 169.5, 169.2, 167.7, 167.6, 138.8, 138.7, 138.5, 137.9, 137.4, 137.3, 134.3, 134.1, 133.9, 133.5, 131.8, 131.8, 131.5, 130.2, 129.0, 128.8, 128.6, 128.3, 128.1, 128.1, 127.9, 127.7, 127.6, 127.6, 127.6, 127.3, 127.0, 126.9, 123.8, 123.7, 123.2, 102.4, 98.5 (C-1C), 98.0 (C-1D), 97.2 (C-1A, C-1B), 95.8 (C-1E), 78.8, 78.3, 76.7, 76.5, 75.9, 75.3, 74.6, 74.5, 74.4, 74.3, 73.5, 72.9, 71.2, 70.6, 70.6, 70.5, 69.4, 68.9, 68.6, 68.5, 68.3, 67.5, 66.2, 65.5, 62.9, 61.1, 56.6, 55.8, 54.1, 20.9, 20.7, 20.6, 20.6; HRMS (ESI): m/z: 計算値C110H109N3O36Na: 2070.6689 [M+Na]+, 実測値2070.6689。
【０２４４】
ベンジル（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→３）２−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシド（９）
ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）中の８（１００ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で、エタンチオール（１７μＬ、０．２４４ｍｍｏｌ、５当量）および三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート（１μＬ、２０％）を添加した。２時間後、トリエチルアミンを添加した。混合物を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製して（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、３：１）、表題の化合物を得た（７５ｍｇ、８３％）。
【０２４５】
Rf 0.1 (ヘキサン:EtOAc 1:2); [α]D20=-3.9 (c=0.5, CHCl3); 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.94 - 7.41 (m, 12H, Phth), 7.35−7.22 (m, 10H, Phth, Ph), 7.16 (m, 1H, Ph), 7.07−6.93 (m, 12H, Ph), 6.74 (m, 3H, Ph), 5.72 (dd, J = 10.7, 9.1 Hz, 1H, H-3E), 5.36 (d, J = 8.5 Hz, 1H, H-1E), 5.25 (d, J = 8.1 Hz, 1H, H-1B), 5.18−5.10 (m, 3H, H-4D, H-4E, H-2C), 4.96−4.91 (m, 2H, H-1D, H-1A), 4.91−4.81 (m, 3H, 2 x CH2Bn, H-3D), 4.68 (d, J = 12.4 Hz, 1H, CH2Ph), 4.60 (d, J= 12.1 Hz, 1H, CH2Ph), 4.54 (s, 1H, H-1D), 4.53−4.46 (m, 3H, 3 x CH2 Bn), 4.43−4.34 (m, 4H, 3 x CH2 Bn, H-2E), 4.29 (dd, J = 12.3, 4.8 Hz, 1H, H-6E), 4.27−4.13 (m, 5H, H-2B, H-3B, H-4A, H-2D, H-2A), 4.13−4.06 (m, 3H, H-6E, H-3A, H-4B), 3.85−3.77 (m, 4H, H-5E, H-5D, H-6Da, H-6Db), 3.75 (t, J = 9.5 Hz, 1H, H-4C), 3.68 (dd, J = 11.8, 3.4 Hz, 1H, H-6Ca), 3.62 (dd, J = 11.6, 1.7 Hz, 1H, H-6Ba), 3.57−3.50 (m, 3H, H-6Aa,H-6Bb, H-6Cb), 3.42 (dd, J = 11.1, 3.8 Hz, 1H, H-6Ab), 3.34 (dd, J = 9.4, 3.5 Hz, 1H, H-3C), 3.31−3.26 (m, 1H, H-5A), 3.22−3.16 (m, 1H, H-5B), 2.98 (dt, J= 8.9, 4.1 Hz, 1H, H-5C), 2.11 (2 x s, J= 1.3 Hz, 6H, 2 x CH3 Ac), 2.06−2.00 (3 x s, 9H, 3 x CH3 Ac), 1.98 (s, 3H, CH3 Ac), 1.86 (s, 3H, CH3Ac); 13C NMR (CDCl3) δ:170.9, 170.8, 170.7, 170.3, 170.2, 169.5, 169.5, 168.6, 167.7, 138.7, 138.5, 138.4, 137.8, 137.3, 134.5, 133.5, 131.8, 131.4, 128.7, 128.4, 128.3, 128.2, 128.2, 128.1, 127.9, 127.6, 127.6, 127.5, 127.4, 126.9, 123.8, 123.7, 123.3, 123.2, 98.4(C-1D), 97.7(C-1C), 97.2(C-1E), 97.2(C-1A), 97.1(C-1B), 77.6, 77.5, 76.7, 75.4, 74.6, 74.6, 74.5, 74.5, 74.4, 73.4, 72.9, 72.0, 70.7, 70.6, 70.5, 69.9, 69.1, 69.0, 68.5, 68.2, 65.5, 62.5, 62.1, 62.1, 56.5, 55.8, 54.4, 21.0, 20.9, 20.8, 20.7, 20.7, 20.5; HRMS (ESI): m/z: 計算値C103H105N3O36Na: 1982.6376 [M+Na]+, 実測値1982.6331。
【０２４６】
ベンジル［（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→６）］−［（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→３）］−２−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシド（１１）
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（６ｍＬ）中の、分子篩を含む９（４５ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）および１０（３０ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ、１．２当量、Unverzagt, C.； Eller, S.； Mezzato, S.； Schuberth, R. Chem. Eur. J.2007、14、1304〜1311に従って合成された）の溶液を室温で１時間攪拌した。この混合物を−４０℃に冷却し、ＴＭＳＯＴｆ（１μＬ、０．００７ｍｍｏｌ、２５％）を添加し、反応液をこの温度でＴＬＣが出発原料の完全な変換を示すまで（１時間）攪拌した。反応液をトリエチルアミン（５μＬ）の添加によってクエンチし、セライトのプラグを通過させてろ過し、濃縮した。未精製の残留物をフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、分取用プレートにより表題の化合物を得た（４５ｍｇ、７４％）。
【０２４７】
Rf 0.28 (ヘキサン:アセトン1:1); [α]D20=-2.8 (c=0.5, CHCl3); 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.88−7.55 (m, 15H, Phth), 7.40 (m, J = 7.1 Hz, 1H Phth), 7.33−7.20 (m, 9H, Ph), 7.14 (m, J= 5.3, 2.8 Hz, 1H, Ph), 7.06−6.97 (m, 3H, Ph), 6.98−6.88 (m, 6H, Ph), 6.84 (m, J= 7.3 Hz, 2H, Ph), 6.81−6.67 (m, 4H, Ph), 5.69 (dd, J = 10.8, 9.1 Hz, 1H, H-1E), 5.61 (dd, J = 10.8, 9.2 Hz, 1H, H-1E’), 5.40 (d, J = 8.5 Hz, 1H, H-1E), 5.22-5.14 (m, 4H, H-4D, H-4E, H-1B, H-1E’), 5.14−5.05 (m, 3H, H-4D’, H-2C, H-4E’), 4.94 (dd, J = 10.2, 3.4 Hz, 1H, H-3D’), 4.90−4.86 (m, 2H, H-1D, H-1A), 4.83 (dd, J = 10.2, 3.2 Hz, 1H, H-3D), 4.78 (d, J = 12.9 Hz, 1H, CH2 Bn), 4.72 (d, J= 12.7 Hz, 1H, CH2 Bn), 4.68−4.60 (m, 2H, CH2Bn), 4.53 (s, 1H, H-1C), 4.52−4.36 (m, 7H, 5 x CH2Bn, H-2E, H-1D’), 4.36-4.25 (m, 4H, H-2E’, アノマーのH-6aE CH2 Bn, H-4D), 4.23-4.14 (m, 3H, H-3B, H-4A, H-6aE’), 4.14−4.00 (m, 6H, H-2A, H-2B, H-2D’, H-3A, H-4B, H-6bE), 3.90−3.83 (m, 2H, H-5E, H-6aD), 3.84−3.70 (m, 7H, H-6bE’, H-4C, H-5D, H-6bD, H-6aD’, H-6bD’, H-6aC), 3.67 (d, J = 9.9 Hz, 1H, H-5D), 3.62−3.45 (m, 3H, H-6aB, H-6bB, H-6aA), 3.36−3.27 (m, 4H, H-6BA, H-6BC, H-3C, H-5E’), 3.24 (d, J = 8.0 Hz, 1H, H-5A), 3.15 (d, J = 9.3 Hz, 1H, H-5B), 3.10 (dt, J = 8.4, 3.9 Hz, 1H, H-5C), 2.13 (s, 3H, CH3 Ac), 2.09 (s, 3H, CH3 Ac), 2.02 (3 x s, 9H, 3 x CH3 Ac), 2.01−1.97 (m, 15H, 5 x CH3 Ac), 1.93 (s, 3H, CH3Ac), 1.85 (d, J = 2.3 Hz, 6H, CH3Ac); 13C NMR (CDCl3) δ:171.0, 170.9, 170.8, 170.8, 170.7, 170.4, 170.3, 170.2, 169.5, 169.4, 168.3, 167.7, 167.5, 138.8, 138.7, 138.4, 138.0, 137.2, 134.5, 134.1, 133.8, 133.5, 131.8, 131.7, 131.5, 131.4, 128.7, 128.3, 128.2, 128.1, 128.1, 128.0, 127.9, 127.6, 127.5, 127.3, 126.9, 123.7, 123.7, 123.6, 123.2, 99.0(C-1D), 98.1(C-1C), 97.8(C-1D’), 97.2(C-1E), 97.2, 97.1, 97.0,(C-1A, C-1B, C-1E’) 78.2, 78.1, 76.7, 75.8, 74.5, 74.4, 74.4, 74.3, 73.3, 73.2, 72.8, 71.8, 71.7, 70.7, 70.6, 70.5, 70.4, 70.0, 69.3, 69.1, 68.9, 68.5, 68.1, 68.1, 67.3, 65.7, 65.4, 62.5, 62.4, 61.8, 61.6, 56.5, 55.7, 54.5, 20.9, 20.9, 20.8, 20.7, 20.7, 20.5; HRMS (ESI): m/z: 計算値C135H140N4O53Na: 2687.8275 [M+Na]+, 実測値2687.8379。
【０２４８】
ベンジル［（２−アミノ−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→６）］−［２−アミノ−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル−（１→３）］−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−２−アミノ−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−２−アミノ−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（１２）
２：１のＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２中の七糖１１（３２ｍｇ、１２μｍｏｌ）の溶液に、ＮａＯＭｅ（３０μＬ、０．５Ｍ、１．２５当量）を添加した。室温で１時間攪拌した後、ＭｅＯＨ（４００μＬ）およびエチレンジアミン（３００μＬ）を添加し、混合物を、マイクロ波により１２０℃で３０分間の３サイクルで加熱した。混合物を、トルエンおよびエタノールを使用して乾燥するまで濃縮した。未精製の残留物をセファデックス（Sephadex）ＬＨ−２カラム（２：１のＭｅＯＨ：ＤＣＭ）で精製し、表題の化合物を得た（１７ｍｇ、８３％）。
【０２４９】
1H NMR (500 MHz, MeOD) δ 7.52 (d, J = 7.1 Hz, 2H, Ph), 7.46-7.25 (m, 21, Ph), 7.21 (dd, J = 4.7, 2.0 Hz, 2H, Ph), 5.22 (dd, J = 6.8, 4.8 Hz, 2H, CH2Bn, H-1 Man), 5.17 (d, J = 11.5 Hz, 1H, CH2Bn), 4.98 (d, J= 1.9 Hz, 1H, H-1 Man), 4.70−4.56 (m, 5H, 4 CH2Bn, H-1 Man), 4.50 (s, 2H, CH2Bn), 4.47 (d, J = 8.2 Hz, 1H, H-1 GlcN), 4.43 (d, J = 7.8 Hz, 1H, H-1 GlcN), 4.39 (d, J = 7.9 Hz, 1H, H-1 GlcN), 4.30 (d, J = 8.1 Hz, 1H, H-1 GlcN), 4.25−4.12 (m, 3H), 4.08 (t, J = 9.2 Hz, 1H, H-4 GlcN), 4.02−3.96 (m, 1H, H-6 Glc), 3.96−3.76 (m, 12H), 3.76−3.61 (m, 10H), 3.58 (m, 2H), 3.52 (m, 1H), 3.48-3.42 (m, 1H), 3.41−3.32 (m, 5H), 3.31−3.19 (m, 4H), 2.83 (td, J = 10.7, 8.1 Hz, 2H, H-2 GlcN), 2.77 (d, J = 8.4 Hz, 1H, H-2, GlcN), 2.67 (dd, J = 9.7, 8.0 Hz, 1H, H-2 GlcN); HSQC実験からの13C NMR (126 MHz, MeOD) δ 128.48, 127.90, 127.93, 127.38, 127.89, 100.48, 74.34, 74.41, 97.67, 70.66, 74.24, 72.70, 99.85, 70.73, 74.33, 72.71, 72.90, 101.50, 101.71, 101.96, 101.48, 77.11, 74.70, 70.40, 76.35, 77.63, 70.20, 66.17, 61.22, 73.63, 70.36, 66.15, 68.17, 61.02, 68.29, 66.25, 60.84, 67.52, 72.89, 68.48, 75.01, 82.05, 82.63, 82.33, 76.99, 70.04, 75.54, 75.27, 76.85, 56.82, 56.18, 56.16, 56.22。
【０２５０】
ベンジル［（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→６）］−［２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル−（１→３）］−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（１３Ｃ８）１３（１３Ｃ８−Ｇ０（Ｂｎ５））
乾燥ＭｅＯＨ（２ｍＬ）中の七糖１２（１００ｍｇ、６２．５μｍｏｌ）の溶液に、０℃で、無水酢酸１３Ｃ４（４２μＬ、４４４μｍｏｌ）および０．５ＭのＮａＯＭｅ（０．８ｍＬ）を添加した。０oＣで２時間後、混合物を濃縮し、ＨＰＬＣセファデックス（Sepadex）ＬＨ−２０（ＭｅＯＨ）によって精製し、表題の化合物を得た（８０ｍｇ、７２％）。
【０２５１】
1H NMR (500 MHz, MeOD) δ 7.40 - 7.21 (m, 22H, 芳香族), 7.21 - 7.14 (m, 3H, 芳香族), 5.07 (d, J = 1.9 Hz, 1H, H-1D), 4.99 (dd, J = 16.3, 12.0 Hz, 2H, 2 CH2Bn), 4.82 (d, J = 12.5 Hz, 1H, CH2Bn), 4.79 (d, J = 1.8 Hz, 1H, H-1D’), 4.75 (d, J = 12.1 Hz, 1H, CH2Bn), 4.70 - 4.66 (m, 2H, H-1C, H-1B), 4.66 - 4.54 (m, 4H, CH2Bn), 4.46 (dd, J = 13.9, 8.2 Hz, 4H, H-1A, H-1E, 2 CH2Bn), 4.31 (d, J= 8.4 Hz, 1H, H-1E), 4.11 (d, J= 3.1 Hz, 1H, H-2C), 4.08 (dd, J= 3.4, 1.8 Hz, 1H, H-2D), 3.99 (t, J= 8.5 Hz, 2H, H-4A, H-4B), 3.96 - 3.86 (m, 3H, H-2A, H-6Ca, H-6Da), 3.86 - 3.75 (m, 9H, H-6Ea, H-2B, H-4C, H-6Aa, H-6Ab, H-3D, H-3D’, H-2D’, H-5D), 3.75 - 3.53 (m, 14H, H-6E’a,H-6E’b, H-6Eb, H-6D’a, H-6Ba, H-3B, H-2E’, H-2E, H-6Db, H-6D’b, H-6Cb, H-6Bb, H-5D’, H-3A), 3.53 - 3.41 (m, 6H, H-4D’, H-4D, H-5A, H-3E, H-3E’, H-3C), 3.37 - 3.24 (m, 4H, H-4E’, H-4E, H-5B, H-5E), 3.20 - 3.13 (m, 2H, H-3E’, H-5C), 2.11 (t, J = 5.7 Hz, 3H, Ac), 1.95 (dd, J = 18.2, 6.1 Hz, 3H, Ac), 1.88 - 1.83 (m, 3H, Ac), 1.70 (dd, J = 18.1, 5.9 Hz, 3H, Ac); HSQC実験からの13C NMR (126 MHz, MeOD): 127.9, 127.8, 127.7,127.4, 100.5(C-1E’), 100.1(C-1A,C-1B,C-1C,C-1E), 99.6(C-1D), 97.2(C-1D’), 81.5, 80.8, 80.4, 77.6, 77.1, 76.6, 76.1, 75.9, 74.9, 74.9, 74.0, 73.9, 73.8, 73.5, 73.1, 73.0, 72.9, 70.5, 70.3, 70.3, 70.2, 70.2, 68.5, 68.4, 67.8, 65.8, 61.9, 61.7, 61.5, 61.0, 55.8, 55.8, 54.5, 22.1, 22.1, 21.6。
【０２５２】
［（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→６）］−［２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル−（１→３）］−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−２−デオキシ−α，β−Ｄ−グルコピラノース（１３Ｃ８）（１４）（１３Ｃ８−Ｇ０（Ｂｎ５））
七糖１３（１３ｍｇ、７．３μｍｏｌ）を１ｍＬのＭｅＯＨ中に溶解させ、１０％Ｐｄ／Ｃカートリッジおよび溶媒としてＭｅＯＨを使用して、１ｍＬ／分の流速、５０℃で、十分な水素条件を使用して水添器を通過させた。結果得られた混合物を濃縮し、水中に再溶解させ、グラファイトカートリッジで精製し、表題の化合物を得た（７ｍｇ、７２％）。
【０２５３】
1H NMR (500 MHz, D2O) δ 5.20 (d, J = 2.5 Hz, 0.6H, H-1A α-GlcNAc), 5.13 (d, J = 1.8 Hz, 1H,H-1D α-1,3-Man), 4.93 (d, J = 1.8 Hz, 1H, H-1D’ α-1,6-Man), 4.71 (d, J = 8.0 Hz, 0.4H, H-1A β-GlcNAc), 4.62 (dd, J= 7.8, 4.4 Hz, 1H, H-1B β-GlcNAc), 4.57 (d, J = 8.4 Hz, 2H, H-1E β-GlcNAc, H-1E’ β-GlcNAc), 4.26 (d, J = 2.5 Hz, 1H, H-2C), 4.20 (dd, J = 3.4, 1.6 Hz, 1H, H-2D), 4.12 (dd, J = 3.4, 1.7 Hz, 1H, H-2D’), 4.04−3.85 (m, 10H), 3.85−3.39 (m, 30H), 2.25-2.13 (m, 6H, 2Ac), 1.98-1.88 (m, 6H, 2Ac)。13C NMR (126 MHz, D2O) δ 101.4(C-1B β-GlcNAc), 100.4(C-1C β-1,4-Man), 99.6(C-1D α-1,3-Man,C-1E β-GlcNAc,C-1E’ β-GlcNAc), 97.0(C-1D’ α-1,6-Man), 94.8(C-1A β-GlcNAc), 90.4(C-1A α-GlcNAc), 80.4, 79.6, 79.5, 79.2, 76.4, 76.3, 75.8, 75.8, 74.6, 74.4, 74.3, 73.5, 73.4, 73.3, 72.8, 72.5, 72.0, 70.2, 70.0, 69.9, 69.6, 69.4, 69.4, 69.2, 67.3, 67.3, 65.8, 65.7, 61.7, 61.6, 60.6, 60.1, 60.0, 59.9, 56.1, 55.3, 54.9, 53.6; HRMS (ESI): m/z C4213C8H84N4O36Naの計算値: 1347.5031 [M+Na]+, 実測値1347.5131。
【０２５４】
三分岐複合型Ｎ−グリカンコアの合成
以下の合成は、図４に示される対応する化学物質の構造に対して番号付けされている。
【０２５５】
ベンジル［ジ−（Ｏ−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→２）−（１→４）−３，６−ジ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシル］−（１→３）−２−Ｏ−アセチル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシド（１８）
乾燥ＤＣＭ（２ｍＬ）中の、分子篩を含むアクセプター７（０．１８ｇ、０．１３ｍｍｏｌ）およびドナー１７（０．２１ｇ、０．１６ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液を室温で１時間攪拌した。ＴＭＳＯＴｆ（２μＬ、１３μｍｏｌ、１０％）を添加し、反応液を室温で１時間攪拌した。反応液を、Ｅｔ３Ｎ（２５μＬ）の添加によってクエンチし、セライトのプラグを通過させてろ過し、ろ液を濃縮した。未精製の残留物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（２：３のヘキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製し、表題の化合物を得た（０．２７ｇ、８２％）。[α]20D: - 24.0 (c 1.05, CH3Cl)。1H NMR (500 MHz, CDCl3): 7.90-7.65 (m, 17H, H-芳香族), 7.54 (m, 2H, H-芳香族), 7.42-7.26 (m, 13H, H-芳香族), 7.06-6.96 (m, 11H, H-芳香族), 6.79 (m, 3H, H-芳香族), 5.76 (dd, J =9.0, 10.7Hz, 1H, H-3E’), 5.44 (m, 3H, H-1E’, H-3E, CHPh), 5.27 (d, J =7.8Hz, 1H, H-1A), 5.18 (m, 2H, H-2C, H-4E’), 4.96 (d, J = 8.5Hz, 1H, H-1B), 4.83 (m, 6H, H-4E, 2xCH2 Bn, H-3D, H-1D, H-1E), 4.71, 4.65 (d, J =12.0Hz, 1H, CH2Bn), 4.52 (m, 4H, H-1C, 3xCH2 Bn), 4.39 (m, 3H, 3xCH2 Bn), 4.29-4.07 (m, 13H, H-2E’, 2xH-6E’, H-2A, H-2B, H-3A, H-3B, H-4A, H-4B, H-6Ca, H-5E’, H-2E, H-6Da), 3.98 (m, 3H, H-5D, H-6Ea, H-2D), 3.82 (t, J =10.3Hz, 1H, H-4D), 3.73 (t, J =8.5Hz, 1H, H-4C), 3.75-3.39 (m, 8H, 2xH-6A, H-6Eb, 2xH-6B, H-3C, H-6Cb, H-6Db), 3.32 (m, 1H, H-5B), 3.19 (m, 1H, H-5A), 2.99 (m, 1H, H-5C), 2.26, 2.12 (s, 3H, CH3 Ac), 2.08 (m, 1H, H-5E), 2.04, 2.03, 2.02, 1.84, 1.83, 1.72, 1.54 (s, 3H, CH3 Ac)。13C NMR (126 MHz, CDCl3): 170.8, 170.5, 170.4, 170.2, 170.1, 170.0, 169.5, 169.2, 167.3 138.7, 138.6, 138.4, 137.8, 137.3, 137.2 , 134.3, 134.0, 133.5, 131.7, 131.4, 128.9, 128.7, 128.5, 128.2, 128.1, 127.0, 127.7, 127.6, 127.5, 127.4, 127.2, 126.9, 126.8, 123.8, 123.4, 102.3, 98.1 (C-1C), 97.6 (C-1D), 97.1 (C-1A, C-1B), 95.8 (C-1E), 94.8 (C-1E’), 78.8, 77.8, 76.6, 75.9, 75.1, 74.5, 74.3, 74.2, 73.3, 72.8, 72.7, 71.8, 71.0, 70.8, 70.5, 70.4, 68.6, 68.5, 68.4, 68.1, 67.4, 66.0, 63.6, 61.6, 61.1, 56.5, 55.7, 54.8, 54.0, 20.9, 20.7, 20.6, 20.4, 20.2。
【０２５６】
ベンジル［ジ−（Ｏ−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→２）−（１→４）−３，６−ジ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシル］−（１→３）−２−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシド（１９）
ＥｔＳＨ（３１μＬ、０．２５ｍｍｏｌ、５当量）およびＢＦ３・ＯＥｔ２（２μＬ、１０μｍｏｌ、２０％）を、０℃で、ＤＣＭ（２ｍＬ）中の六糖１８（０．１４ｇ、０．０５ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。反応混合物を、室温で変換が完了するまで（２時間）攪拌した。次いで、これをＥｔ３Ｎでクエンチし、濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し（１：３のヘキサン：ＥｔＯＡｃ）、表題の化合物を得た（０．１２ｇ、８８％）。
【０２５７】
[α]20D: +1.9 (c 0.93, CDCl3)。1H NMR (500 MHz, CDCl3): 7.90-7.66 (m, 15H, H-芳香族), 7.32-7.24 (m, 12H, H-芳香族), 7.17 (m, 1H, H-芳香族), 7.02-6.98 (m, 10H, H-芳香族), 6.76 (m, 3H, H-芳香族), 5.78 (dd, J = 9.1, 10.7Hz, 1H, H-3E), 5.73 (m, dd, J = 9.1, 10.8Hz, 1H, H-3E’), 5.48 (d, J =7.8Hz, 1H, H-1E’), 5.27 (m, 2H, H-1E, H-1A), 5.22 (t, J =9.8Hz, 1H, H-4E’), 5.15 (d, J =3.4Hz, 1H, H-2C), 5.10 (t, J =9.7Hz, 1H, H-4E), 5.05 (dd, J =3.0, 8.5Hz, 1H, H-3D), 4.96 (d, 1H, J=8.2Hz, H-1B), 4.86 (m, 3H, CH2 Bn, H-1D), 4.70 (d, J =12.0Hz, 1H, 1xCH2 Bn), 4.58 (d, J =12.0Hz, 1H, 1xCH2 Bn), 4.52 (m, 4H, H-1C, 3xCH2 Bn), 4.45 (m, 1H, H-6E’a), 4.39 (m, 3H, 3xCH2 Bn), 4.34-4.04 (m, 15H, H-2E, H-2E’, 2xH-6E, H-6E’b, H-2A, H-2B, H-3A, H-3B, H-4A, H-4B, H-2D, H-5E’, H-6Da, H-4D), 3.82 (m, 1H, H-5E), 3.78 (m, 1H, H-5D), 3.69 (m, 2H, H-4C, H-6Ca), 3.62-3.48 (m, 5H, H-6Aa, H-6Ba, H-6Cb, H-6Ab, H-6Db), 3.44 (dd, J =3.9, 11.3Hz, 1H, H-6Bb), 3.31 (m, 2H, H-5B, H-3C), 3.20 (m, 1H, H-5A), 2.94 (m, 1H, H-5C), 2.19, 2.15, 2.11, 2.07, 2.04, 2.02, 1.88, 1.85 (s, 3H, CH3 Ac)。13C NMR (126 MHz, CDCl3): 170.7, 170.2, 170.1, 170.0, 169.5, 167.6, 138.6, 138.5, 138.3, 137.8, 137.2, 134.4, 134.3, 131.6, 131.3, 128.6, 128.2, 128.1, 128.0, 127.9, 127.8, 127.5, 127.4, 127.3, 127.2, 126.8, 123.7, 123.1, 98.1 (C-1D), 97.4 (C1E, C-1C), 97.1 (C-1A, C-1B), 95.9 (C-1E’), 77.2, 76.5, 75.9, 75.3, 75.2, 74.5, 74.4, 74.3, 73.1, 72.8, 71.8, 71.3, 70.7, 70.5, 70.4, 68.9, 68.8, 68.5, 68.3, 68.1, 67.1, 62.7, 62.0, 61.1, 56.5, 55.7, 54.8, 54.4, 20.8, 20.7, 20.6, 20.4。
【０２５８】
ベンジル［ジ−（Ｏ−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→２）−（１→４）−３，６−ジ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシル］−（１→３）−［Ｏ−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシル］−（１→６）−２−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシド（２０）
乾燥ＤＣＭ（９．８ｍＬ）中の、アクセプター１９（７５ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）、ドナー１１（４１ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ、１.５当量、Unverzagt, C.；Eller, S.； Mezzato, S.； Schuberth, R. Chem. Eur. J.2007、14、1304〜1311に従って合成した）および分子篩の懸濁液を室温で１時間攪拌した。混合物を−４０℃に冷却し、ＴｆＯＨ（１μＬ、０．０１μｍｏｌ、３３％）を添加した。反応混合物を−４０℃でドナーがなくなるまで（１時間）攪拌した。次いで、反応液をＥｔ３Ｎでクエンチし、セライトのプラグでろ過し、濃縮した。残留物を、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、表題の化合物を得た（６０ｍｇ、６２％）。
【０２５９】
[α]20D: +2.1 (c 0.53, CH3Cl)。1H NMR (500 MHz, CDCl3): 7.88-7.61 (m, 19H, H-芳香族), 7.30-7.23 (m, 11H, H-芳香族), 7.18, 7.04 (m, 1H, H-芳香族), 7.01-6.93 (m, 7H, H-芳香族), 6.85, 6.75 (m, 3H, H-芳香族), 5.79 (dd, J =9.0, 10.7Hz, 1H, H-3E’), 5.70 (m, 2H, H-3E, H-3E”), 5.45 (d, J =8.2Hz, 1H, H-1E’), 5.33 (d, J =8.4Hz, 1H, H-1E), 5.24-5.09 (m, 7H, H-1E”, H-1A, H-4E’, H-4D’, H-2C, H-4E, H-4E”), 4.98 (m, 2H, H-3D, H-3D’), 4.94 (d, J =8.5Hz, 1H, H-1B), 4.83 (d, J =12.0Hz, 1H, 1xCH2 Bn), 4.78 (d, J =1.8Hz, 1H, H-1D), 4.71 (m, 2H, 2xCH2 Bn), 4.59 (d, J=12.0Hz, 1H, 1xCH2 Bn), 4.51-3.98 (m, 27H, H-1C, 6xCH2 Bn, 2XH-6E’, H-1D’, H-2E”, H-2E, 2xH-6E, H-2E’, H-6E”a, H-2D, H-2D’, H-2B, H-3B, H-4B, H-2A, H-3A, H-4A, H-5E’, H-6Da, H-4D), 3.87 (m, 2H, H-6E”b, H-5E), 3.81-3.69 (m, 6H, H-5D, H-6D’a, H-4C, H-6Ca, H6Db, H5D’), 3.59-3.45 (m, 5H, 2xH-6Aa, H-6Ba, H-6D’b, H-5E”), 3.39 (dd, J =4.0, 11.5Hz, 1H, H-6Bb), 3.33 (dd, J =5.0, 10.3Hz, 1H, H-6Cb), 3.26 (m, 2H, H-5B, H-3C), 3.17 (m, 1H, H-5A), 3.01 (m, 1H H-5C), 2.15, 2.09, 2.09, 2.05, 2.04, 2.01, 2.01, 2.00, 1.95, 1.89, 1.88, 1.87, 1.85, 1.85 (s, 3H, CH3 Ac)。13C NMR (126 MHz, CDCl3): 170.8, 170.7, 170.6, 170.5, 170.3, 170.2, 170.1, 170.0, 169.9, 169.4, 169.3, 169.2, 167.6, 167.4, 138.8, 138.6, 138.3, 138.0, 137.2, 134.3, 133.4, 131.7, 131.3, 128.5, 128.2, 128.1, 128.0, 127.9, 127.8, 127.7, 127.4, 127.2, 126.8, 123.7, 123.5, 123.0, 98.6 (C-1D), 97.7 (C-1C, C-1D’), 97.3 (C-1E), 97.2 (C-1E”), 97.1 (C-1A, C-1B), 95.9 (C-1E’), 77.7, 76.5, 75.8, 75.0, 74.5, 74.3, 73.0, 72.8, 72.4, 71.7, 71.2, 70.7, 70.6, 70.4, 70.2, 70.0, 69.6, 69.0, 68.9, 68.8, 68.6, 68.3, 68.1, 65.5, 62.7, 62.4, 61.9, 61.7, 61.5, 61.2, 56.5, 55.7, 54.9, 54.4, 20.7, 20.6, 20.5, 20.4, 20.3。
【０２６０】
［（２−アセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル］−（１→６）−［ジ−（２−アセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→２）−（１→４）−α−Ｄ−マンノピラノシル］−（１→３）−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−１，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（１３Ｃ１０）（２２）
２：１のＭｅＯＨ：ＤＣＭ（３００：１５０μＬ）中の化合物２０（４３ｍｇ、１４．１μｍｏｌ）の溶液に、ＮａＯＭｅ（４２μＬ、２１．２μＬ、１．５当量）を添加した。室温で１時間攪拌した後、ＭｅＯＨ（３００μＬ）およびエチレンジアミン（３００μＬ）を添加し、混合物を、マイクロ波により１２０℃で３０分の３サイクルで加熱した。混合物を、トルエンおよびエタノールを使用して乾燥するまで濃縮した。未精製の残留物を、セファデックスＬＨ−２０カラム（ＭｅＯＨ）によって精製し、化合物２１を得た。化合物２１を０℃でＭｅＯＨ（２００μＬ）中に溶解させ、無水酢酸１３Ｃ４を添加した。２時間後、ＥｔＯＨを添加し、混合物を濃縮し、セファデックスＬＨ−２０カラム（ＭｅＯＨ）によって精製し、表題の化合物を得た（１１ｍｇ、４０％、２工程）。
【０２６１】
1H NMR (500 MHz, MeOD): 7.41-7.27 (m, 22H, H-芳香族), 7.19 (m, 3H, H-芳香族), 5.03 (m, 3H, H-1D, 2xCH2 Bn), 4.85 (d, J= 12.0Hz, 1H, 1xCH2 Bn), 4.80 (d, J= 1.9Hz, 1H, H-1D’), 4.77 (d, J= 12.0Hz, 1H, 1xCH2 Bn), 4.68-4.57 (m, 6H, H-1C, H-1B, 4xCH2 Bn), 5.50 (m, 2H, H-1E”, H-1A), 4.46 (s, 2H, 2xCH2 Bn), 4.43 (d, J=8.3Hz, 1H, H-1E), 4.32 (d, J= 8.3Hz, 1H, H-1E’), 4.13 (m, 1H, H-2D), 4.08 (m, 2H, H-3D, H-2C), 4.02 (m, 2H, H-4A, H-4B), 3.95-3.58 (m, 30H, H-2A, 2xH-6C, 2xH-6E, 2xH-6E”, 2xH-6E’, 2xH-6D, 2xH-6D’, H-5D, H-2D’, H-2B, H-4C, H-3D’, 2xH-6B, 2xH-6A, H-2E, H-4D, H-3B, H-2B, H-3A, H-2E’, H-5D’, H-4D’), 3.52-3.43 (m, 5H, H-5A, H-3E, H-3E’, H-3E”, H-3C), 3.36 (m, 3H, H-5E”, H-4E’, H-4E”), 3.33 (m, 2H, H-5B, H-4E), 3.26 (m, 1H, H-5E), 3.18 (m, 2H, H-5C, H-5E’), 2.14 (m, 4.5H, 13CH3Ac), 1.97 (dd, J= 6.4, 17.8Hz, 3H, 13CH3 Ac), 1.89 (m, 4.5H, 13CH3 Ac), 1.72 (dd, J = 6.4, 17.8Hz, 3H, 13CH3Ac)。13C NMR (126 MHz, MeOD, HSQC): 128.2-126.6, 101.6 (C-1E”), 100.5 (C-1E, C-1E”), 100.2 (C-1A), 100.0 (C-1C, C-1B), 99.6 (C-1D), 97.1 (C-1D’), 82.0, 81.0, 80.4, 78.1, 77.7, 76.5, 75.6, 75.2, 74.7, 73.9, 73.1, 72.2, 70.3, 68.3, 67.6, 65.8, 61.2, 55.7, 54.6, 22.3 (13CH3)。
【０２６２】
酵素による伸長
［β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→６）］−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル−（１→３）］−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−２−デオキシ−α，β−Ｄ−グルコピラノース（１５）
７７０μＬのＨｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）中の、１４（２．１２６ｍｇ、１．６μｍｏｌ）、ウリジン５’−ジホスホ−α−Ｄ−ガラクトース二ナトリウム塩ＵＤＰ−Ｇａｌ（２．２８０ｍｇ、３．７４μｍｏｌ、２．４当量）、ウシ血清アルブミンＢＳＡ（１ｍｇ）、２００ｍＵの牛乳のβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ２．４．４．２２、９．２Ｕのアルカリホスファターゼ３．１．３．１、およびＭｎＣｌ２（１０ｍＭ）の溶液（１ｍＬ）を３７℃で１８時間インキュベートした。結果得られた混合物を９５℃で５分間加熱して、酵素を沈殿させた。遠心分離後、グラファイトカートリッジによって上清を精製し、表題の化合物を得た（２．０９、７８％）。
【０２６３】
1H NMR (500 MHz, D2O) δ 5.12 (d, J = 2.7 Hz, 0.6H, H-1α-GlcNAc), 5.05 (d, J = 1.4 Hz, 1H, H-1α-1,3-Man), 4.86 (d, J = 1.6 Hz, 1H, H-1α-1,6-Man), 4.66−4.59 (m, 0.4H, H-1β-GlcNAc), 4.53 (dd, J = 15.9, 7.9 Hz, 3H, H-1β-GlcNAc), 4.40 (dd, J= 7.8, 3.1 Hz, 2H, H-1β-Gal), 4.18 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 4.12 (dd, J = 3.3, 1.6 Hz, 1H), 4.08−4.00 (m, 1H), 3.95−3.36 (m, 60H), 2.17−2.04 (m, 6H, Ac), 1.93−1.78 (m, 6H, Ac)。HSQC実験からの13C NMRの選択されたピーク(126 MHz, D2O) δ = 102.9 (C-1β-Gal), 101.3 (H-1β-GlcNAc), 100.4 (C-1β-Man), 99.6(C-1α-1,3-Man), 99.5(C-1β-GlcNAc), 97.1(C-1α-1,6-Man), 94.8 (C-1β-GlcNAc), 90.4 (C-1α-GlcNAc)。
【０２６４】
［（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→６）］−［２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル−（１→３）］−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−［α−Ｌ−フコピラノシル−（１→６）］−２−アセトアミド−２−デオキシ−α，β−Ｄ−グルコピラノース（１６）
７７０μＬのＭＥＳ緩衝液（８０ｍＭ、ｐＨ＝６．５）中の、１４（３．０３０、ｍｇ、２．２８μｍｏｌ）、グアノシン５’−ジホスホ−β−Ｌ−フコース二ナトリウム塩ＧＤＰ−Ｆｕｃ（１．７６０ｍｇ、２．７７μｍｏｌ、１．２当量）、ウシ血清アルブミンＢＳＡ（１ｍｇ）、コアのα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（５０μＬ、０．６６ｍｇ／ｍＬ）およびＭｎＣｌ２（２０ｍＭ）の溶液（１ｍＬ）を室温で１８時間インキュベートした。結果得られた混合物を９５℃で５分間加熱して、酵素を沈殿させた。遠心分離後、グラファイトカートリッジによって上清を精製し、表題の化合物を得た（２．７３ｍｇ、８２％）。
【０２６５】
1H NMR (500 MHz, D2O) δ 5.11 (d, J = 3.2 Hz, 0.6H, H-1α-GlcNAc), 5.04 (d, J = 1.8 Hz, 1H, H-1α-1,3-Man), 4.88−4.79 (m, 2H, H-1α-1,6-Man, H-1α-Fuc), 4.64−4.55 (m, 0.4H+1H, H-1β-GlcNAc ), 4.48 (d, J = 8.4 Hz, 2H, H-1β-GlcNAc), 4.18 (d, J= 2.4 Hz, 1H), 4.11 (dd, J = 3.3, 1.6 Hz, 1H), 4.09−3.98 (m, 2H), 3.98−3.75 (m, 11H), 3.75−3.31 (m, 33H), 2.25−2.04 (m, 6H, Ac), 1.95−1.78 (m, 6H, Ac), 1.14 (dd, J = 6.6, 4.8 Hz, 3H, CH3Fuc)。HSQC実験から選択された13C NMR (126 MHz, D2O) δ = 101.0 (C-1β-GlcNAc), 100.3 (C-1βMan), 99.6 (C-1β-GlcNAc), 99.5 (C-1α-1,3-Man), 99.5 (C-1α-Fuc), 97.0(C-1α-1,6-Man), 94.8 (C-1β-GlcNAc) , 90.4 (C-1α-GlcNAc, 15.4 (CH3Fuc)。
【０２６６】
［β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→６）］−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル−（１→３）］−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−［α−Ｌ−フコピラノシル−（１→６）］−２−アセトアミド−２−デオキシ−α，β−Ｄ−グルコピラノース（１７）
４５０μＬのＨｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）中の、１６（１．８３６ｍｇ、１．６μｍｏｌ）、ウリジン５’−ジホスホ−α−Ｄ−ガラクトース二ナトリウム塩ＵＤＰ−Ｇａｌ（２．２１０ｍｇ、３．６２μｍｏｌ、２．９当量）、ウシ血清アルブミンＢＳＡ（１ｍｇ）、２００ｍＵの牛乳のβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ２．４．４．２２、９．２Ｕのアルカリホスファターゼ３．１．３．１、およびＭｎＣｌ２（１０ｍＭ）の溶液（０．５ｍＬ）を３７℃で１８時間インキュベートした。結果得られた混合物を９５℃で５分間加熱して、酵素を沈殿させた。遠心分離後、グラファイトカートリッジによって上清を精製して、表題の化合物を得た（１．８０ｍｇ、８０％）。
【０２６７】
1H NMR (500 MHz, D2O) δ 5.11 (d, J = 3.1 Hz, 0.6H, H-1α-GlcNAc), 5.05 (d, J = 1.5 Hz, 1H, H-1α-1,3-Man), 4.85 (s, 1H, H-1α-1,6-Man), 4.82 (t, J = 3.7 Hz, 1H, H-1α-Fuc), 4.62 (d, J = 7.9 Hz, 0.4H, H-1β-GlcNAc), 4.59 (d, J = 7.7 Hz, 1H, H-1β-GlcNAc), 4.51 (d, J = 7.7 Hz, 2H, H-1β-GlcNAc), 4.40 (dd, J = 7.8, 2.7 Hz, 2H, H-1β-Gal), 4.18 (s, 1H), 4.12 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 4.08−4.00 (m, 2H), 3.97−3.39 (m, 54H), 2.18−2.07 (m, 6H), 1.92−1.81 (m, 6H, Ac), 1.14 (dd, J = 6.6, 5.0 Hz, 3H, CH3 Fuc)。HSQC実験から選択された13C NMRピーク (126 MHz, D2O) δ = 102.9 (H-1β-Gal), 101.0 (H-1β-GlcNAc), 100.4 (H-1β-Man), 99.5 (H-1β-GlcNAc), 99.5 (H-1α-1,3-Man), 99.3 (H-1α-Fuc), 96.8 (H-1α-1,6-Man), 94.8 (H-1β-GlcNAc), 90.4 (C-1α-GlcNAc), 15.5 (CH3, Fuc)。
【０２６８】
非対称モノガラクトシル化グリカン標準の調製
１３Ｃ８−Ｇ０（Ｂｎ５）のガラクトシル化
部分的に脱保護された１３Ｃ８−Ｇ０（Ｂｎ５）標準１３（１．１ｍｇ）を、２ｍＭのＭｎＣｌ２とＢＳＡとを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中の、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（２００ｍＵ）およびウリジン二リン酸ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ、１．２５当量）で処置した。３７℃で１時間反応させた後、９５℃で５分間加熱することによってタンパク質画分を沈殿させ、ろ過によって除去した。この溶液をＵＰＬＣ−ＭＳによって直接分析したところ、それぞれ１３Ｃ８−Ｇ１６（Ｂｎ５）および１３Ｃ８−Ｇ１３（Ｂｎ５）への２３％および２６％の変換が示された。この反応は、アクセプターとして１０ｍｇの１３Ｃ８−Ｇ０（Ｂｎ５）を使用するスケールに高めることができた。
【０２６９】
１０ｍｇの１３Ｃ８−Ｇ０（Ｂｎ５）の酵素による伸長からのタンパク質沈殿後の反応粗生成物を蒸発させ、次いで異なる化合物を、水／ＡＣＮの逆相のＣ１８セミ分取用カラムでのＨＰＬＣによって精製し、化合物１３Ｃ８−Ｇ１３（Ｂｎ５）（２．４ｍｇ）、１３Ｃ８−Ｇ１６（Ｂｎ５）（２．２ｍｇ）および１３Ｃ８−Ｇ２（Ｂｎ５）（２．０ｍｇ）を純粋な形態で得た（ここでＧ１３およびＧ１６は、それぞれのモノガラクトシル化化合物を示し、Ｇ２は、ビス−ガラクトシル化化合物を示す）。
【０２７０】
異性体のモノガラクトシル化化合物の両方を、１０％Ｐｄ／Ｃカートリッジを備えたＨ−Ｃｕｂｅ流通反応装置において、１気圧のＨ２ガスを使用して、ＭｅＯＨ中で水素化分解処理して、１３Ｃ標識Ｎ−グリカン１３Ｃ８−Ｇ１３（１．２ｍｇ）および１３Ｃ８−Ｇ１６（１．１ｍｇ）を純粋な形態で得た。
【０２７１】
１３Ｃ８−Ｇ１６のフコシル化
化合物１３Ｃ８−Ｇ１６（１．１ｍｇ）を、２ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中の、コアのα−１，６−フコシルトランスフェラーゼおよびグアノシン二リン酸フコース（ＧＤＰ−Ｆｕｃ、１．１０当量）で処置した。３０℃で１８時間反応させた後、９５℃で５分間加熱することによってタンパク質画分を沈殿させ、ろ過して除いた。グリカン１３Ｃ８−Ｇ１６Ｆを黒鉛化炭素カートリッジで精製した。
【０２７２】
１３Ｃ８−Ｇ０（Ｂｎ５）のガラクトシル化
部分的に脱保護された１３Ｃ８−Ｇ０（Ｂｎ５）標準（２０μｇ）を、２ｍＭのＭｎＣｌ２とＢＳＡとを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中の、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（２００ｍＵ）およびウリジン二リン酸ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ、６．０当量）で処置した。３７℃で１時間反応させた後、９５℃で５分間加熱することによってタンパク質画分を沈殿させ、ろ過して除いた。この溶液をＵＰＬＣ−ＭＳによって直接分析したところ、１３Ｃ８−Ｇ２（Ｂｎ５）への完全な変換が示された。
【０２７３】
ビス−ガラクトシル化化合物１３Ｃ８−Ｇ２（Ｂｎ５）（２０μｇ）を、５０ｍＭのリン酸／クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）中のＡ．オリゼ由来β−１，４−ガラクトシダーゼ（１５ｍＵ）で３０℃で１８時間処置し、反応液を、ＭｅＯＨ（２０μＬ）の添加によってクエンチした。この溶液をＵＰＬＣ−ＭＳによって直接分析したところ、それぞれモノガラクトシル化化合物１３Ｃ８−Ｇ１６（Ｂｎ５）および１３Ｃ８−Ｇ１３（Ｂｎ５）への１０％および４６％の変換が示された。
【０２７４】
非対称α−２，３−シリル化グリカン標準の調製
１３Ｃ８−Ｇ２（Ｂｎ５）のシリル化
前に調製されたビス−ガラクトシル化二分岐１３Ｃ８−Ｇ２（Ｂｎ５）（１０ｎｍｏｌ）から、分析スケールで反応を行った。この化合物を、２０ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する１００ｍＭのトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中の、１０ｍＵのＰ．ムルトシダ由来α−２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびシチジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＮＡｃ、４当量）で、３７℃で３０分間処置した。反応液を、ＭｅＯＨ（２０μＬ）の添加によってクエンチした。この溶液をＵＰＬＣ−ＭＳによって直接分析したところ、２つの異性体ピーク（これらは、対応する３−および６−モノ−シリル化生成物である）に分離したモノ−シアル化化合物１３Ｃ８−Ｇ２Ａ１（Ｂｎ５）への４６％の変換が示され、ビス−シアル化化合物１３Ｃ８−Ｇ２Ａ２（Ｂｎ５）への３２％の変換が示された。
【０２７５】
前に調製されたビス−ガラクトシル化二分岐１３Ｃ８−Ｇ２（Ｂｎ５）から、分取用スケールで反応を行った。５００μＬのトリス・ＨＣｌ緩衝液（１Ｍ、ｐＨ＝８）中の、１３Ｃ８−Ｇ２Ｂｎ５（１．０ｍｇ、０．４８μｍｏｌ）、シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ナトリウム塩ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ（０．７２ｍｇ、０．９６μｍｏｌ、２当量）、１００ｍＵのパスツレラ・ムルトシダ２．４．９９．４由来α−２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびＭｇＣｌ２（１００ｍＭ）の溶液（１００μＬ）を３７℃で３０分間インキュベートした。ＭｅＯＨ（５００μＬ）を結果得られた混合物に添加して、酵素を沈殿させた。遠心分離後、上清を、水／ＡＣＮの逆相のＣ１８セミ分取用カラムでのＨＰＬＣによって精製し、３種の新規な同位体標識されたグリカン標準、２種の１３Ｃ８−Ｇ２Ａ１（Ｂｎ５）化合物と１３Ｃ８−Ｇ２Ａ２（Ｂｎ５）とを得た。
【０２７６】
１３Ｃ８−Ｇ１Ａ１３Ｂｎ５の合成
５００μＬのトリス・ＨＣｌ緩衝液（１Ｍ、ｐＨ＝８）中の、１３Ｃ８−Ｇ１３（Ｂｎ５）（１．０ｍｇ、０．５２μｍｏｌ）、シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ナトリウム塩ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ（０．７８ｍｇ、１．０４μｍｏｌ、２当量）、１００ｍＵのパスツレラ・ムルトシダ２．４．９９．４由来α−２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびＭｇＣｌ２（１００ｍＭ）の溶液（１００μＬ）を３７℃で３０分間インキュベートした。ＭｅＯＨ（５００μＬ）を結果得られた混合物に添加して、酵素を沈殿させた。遠心分離後、上清を、水／ＡＣＮの逆相のＣ１８セミ分取用カラムでのＨＰＬＣによって精製し、化合物１３Ｃ８−Ｇ１Ａ１３（Ｂｎ５）を得た（０．６８ｍｇ、５９％収量）。
【０２７７】
α−２，６−シリル化グリカン標準の調製
前に調製されたビス−ガラクトシル化二分岐１３Ｃ８−Ｇ２（Ｂｎ５）（５ｎｍｏｌ）から、分析用スケールで反応を行った。この化合物を、２ｍＭのＭｎＣｌ２を含有する５０ｍＭのカコジル酸緩衝液（ｐＨ６．１）中の、０．２５ｍＵのヒトα−２，６−シアリルトランスフェラーゼおよびシチジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＮＡｃ、１−４当量）で３７℃で２〜４時間処置した。反応液を、ＭｅＯＨ（２０μＬ）の添加によってクエンチした。この溶液をＵＰＬＣ−ＭＳによって直接分析し、結果を表３に示した。
【０２７８】
トランケートされたＮ−グリカン標準の調製
１３Ｃ８−Ｇ０（Ｂｎ５）（３ｍｇ）を、５０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．５）中の１００ｍＵのタチナタマメ由来Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼで室温で６時間処置した。反応液を、ＭｅＯＨ（２０μＬ）の添加によってクエンチした。この溶液をＵＰＬＣ−ＭＳによって直接分析したところ、それぞれ１３Ｃ６−ＭＧｎ３（Ｂｎ５）、１３Ｃ６−ＭＧｎ６（Ｂｎ５）および１３Ｃ４−Ｍａｎ３（Ｂｎ５）の２０％、２６％および２５％の変換が達成された。セミ分取用ＨＰＬＣ精製後、純粋な化合物１３Ｃ６−ＭＧｎ３（Ｂｎ５）（２．２ｍｇ）、１３Ｃ６−ＭＧｎ６（Ｂｎ５）（２．０ｍｇ）および１３Ｃ４−Ｍａｎ３（Ｂｎ５）（１．７ｍｇ）を得た。
【０２７９】
３種の単離された化合物を、１０％Ｐｄ／Ｃカートリッジを備えたＨ−Ｃｕｂｅ流通反応装置において、１気圧のＨ２ガスを使用して、ＭｅＯＨ中で水素化分解処理して、１３Ｃ標識Ｎ−グリカン１３Ｃ６−ＭＧｎ３（１．２ｍｇ）および１３Ｃ６−ＭＧｎ６（１．１ｍｇ）および１３Ｃ４−Ｍａｎ３（０．７ｍｇ）を純粋な形態で得た。
【０２８０】
１３Ｃ６−ＭＧｎ３のフコシル化
化合物１３Ｃ６−ＭＧｎ３（１．２ｍｇ）を、２ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中の、コアα−１，６−フコシルトランスフェラーゼおよびグアノシン二リン酸フコース（ＧＤＰ−Ｆｕｃ、１．１０当量）で処置した。３０℃で１８時間反応させた後、９５℃で５分間加熱することによってタンパク質画分を沈殿させ、ろ過して除いた。グリカン１３Ｃ６−ＭＧｎ３Ｆを黒鉛化炭素カートリッジで精製した。
【０２８１】
部分的に保護された三分岐コア２２のガラクトシル化
３００μＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）中の、三分岐２２（１２０μｇ、０．０６μｍｏｌ）、ウリジン５’−ジホスホ−α−Ｄ−ガラクトース二ナトリウム塩ＵＤＰ−Ｇａｌ（５５μｇ、０．０９μｍｏｌ、１．５当量）、２４ｍＵの牛乳のβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ２．４．４．２２およびＭｎＣｌ２（１０ｍＭ）の溶液（２４μＬ）を３７℃で１時間インキュベートした。結果得られた混合物を９５℃で５分間加熱して、酵素を沈殿させた。遠心分離後、上清をＵＰＬＣ−ＭＳで直接分析した。ガラクトシル化されなかった出発原料に加えて、７種全ての生じ得るガラクトシル化生成物が検出された（トリス、３種全てのビス、および３種全てのモノ）。
【０２８２】
参考文献：
本明細書で引用された、または本出願と共に提出された全ての出版物、特許および特許出願、例えば情報開示の記述の一環として提出された参考文献などは、参照によりそれら全体が開示に組み入れられる。
【０２８３】
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本明細書は以下の発明の開示を包含する：
［１］マススペクトロメトリーの内部標準として使用するための同位体標識されたグリカンを合成するための方法であって、該方法は、
オリゴ糖のコア構造を同位体標識されたアシル化剤でアシル化して、同位体標識されたオリゴ糖のコア構造を得る工程であり、ここでオリゴ糖のコア構造は、場合により１つまたはそれより多くの保護基で保護されている、工程；および
得られた同位体標識されたオリゴ糖を酵素により誘導体化して、同位体標識されたグリカンを得る工程
を含む、上記方法。
［２］酵素による誘導体化が、末端の糖単位を除去するための酵素加水分解工程を含む、［１］に記載の方法。
［３］酵素による誘導体化が、グリコシルトランスフェラーゼおよび好適な糖ドナーを用いた酵素による伸長工程を含み、場合により酵素による伸長工程が、それ自体同位体標識された糖単位を取り入れる、［１］または［２］に記載の方法。
［４］同位体標識されたオリゴ糖のコア構造が、酵素による誘導体化中に、１つまたはそれより多くの保護基で保護される、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］同位体標識されたオリゴ糖のコア構造が、１つまたはそれより多くの場合により置換されていてもよいベンジル基で保護されている、［４］に記載の方法。
［６］オリゴ糖のコア構造が、二糖モチーフを含み、二糖モチーフは、第一の単糖単位および第二の単糖単位を含み、ここで第一の単糖単位および／または第二の単糖単位の少なくとも１つはアミノ基を含み、アシル化はアミノ基で起こる、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］オリゴ糖のコア構造が、二糖モチーフを含み、二糖モチーフは、第一の単糖単位および第二の単糖単位を含み、ここで第一の単糖単位は、
ＧｌｃＮ、ＧａｌＮ、ＭａｎＮ、ＦｒｕＮ、ＦｕｃＮ、Ｍｕｒ、またはＮｅｕ
から選択され；
第二の単糖単位は、
Ｇｌｃ、Ｇａｌ、Ｍａｎ、Ｒｈａ、Ｆｒｕ、Ｆｕｃ、ＧｌｃＮ、ＧａｌＮ、ＭａｎＮ、ＦｒｕＮ、ＦｕｃＮ、Ｍｕｒ、Ｎｅｕ、ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ、ＦｒｕＮＡｃ、ＦｕｃＮＡｃ、ＭｕｒＮＡｃ、ＮｅｕＮＡｃ、シアル酸、またはイノシトール
から選択され；
ここで第一の単糖の糖および第二の単糖の糖単位は、配列：
第一の単糖−第二の単糖、または
第二の単糖−第一の単糖
で連結される、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記方法が、
ＧｌｃＮ−ＧｌｃＮ
Ｇａｌ−ＧａｌＮ
ＧａｌＮ−ＧｌｃＮ
から選択されるモチーフを含むオリゴ糖のコア構造を、同位体標識されたアシル化剤と反応させることを含む、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前記方法が、モチーフ：
Ｍａｎ−ＧｌｃＮ−ＧｌｃＮ
を含むオリゴ糖のコア構造を、同位体標識されたアセチル化剤と反応させて、モチーフ：
Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ＊−ＧｌｃＮＡｃ＊
を含むオリゴ糖を得ることを含み、式中、Ａｃ＊は、同位体標識されたアセチル基である、［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］前記方法が、式（Ｂ）の同位体標識されたオリゴ糖のコア構造を形成するのに好適な条件下で、式（Ａ）のオリゴ糖を、同位体標識されたアセチル化剤と反応させることを含み：
【化１２】
0006602747.tif 000020
式中、
各Ｒ１は、独立して、Ｈまたは保護基であり；
Ｒ２は、独立して、Ｈまたは保護基であり；
各Ｒ３は、独立して、Ｈ、保護基、または（Ｓａｃ）ｍであり、ここで各Ｓａｃは単糖単位であり、ｍは、１〜５の数値である、［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］前記方法が、式（Ｄ）の同位体標識されたオリゴ糖のコア構造を形成するのに好適な条件下で、式（Ｃ）のオリゴ糖を、同位体標識されたアセチル化剤と反応させることを含み：
【化１３】
0006602747.tif 000021
式中、
各Ｒ１は、独立して、Ｈまたは保護基であり；
Ｒ２は、独立して、Ｈまたは保護基であり；
各Ｒ３は、独立して、Ｈ、保護基、または（Ｓａｃ）ｍであり、ここで各Ｓａｃは単糖単位であり、ｍは、１〜５の数値である、［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］Ｒ２がＨである、［１０］または［１１］に記載の方法。
［１３］各Ｒ１がベンジルであり、Ｒ２がＨであり、各Ｒ３がＨである、［１０］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］同位体標識されたアシル化剤が、同位体標識された無水酢酸である、［１３］に記載の方法。
［１５］同位体標識されたアセチル化剤が、
（１３ＣＨ３１３Ｃ＝Ｏ）２、（１３ＣＨ３Ｃ＝Ｏ）２、（ＣＨ３１３Ｃ＝Ｏ）２、（ＣＤ３Ｃ＝Ｏ）２、（１３ＣＤ３１３Ｃ＝Ｏ）２、（１３ＣＤ３Ｃ＝Ｏ）２または（ＣＤ３１３Ｃ＝Ｏ）２
から選択される、［１４］に記載の方法。
［１６］各Ａｃ＊が、−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）ＣＤ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＤ３、−（Ｃ＝Ｏ）１３ＣＤ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）ＣＤ３、−（１４Ｃ＝Ｏ）１４ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）１４ＣＨ３、−（１４Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝１７Ｏ）ＣＨ３、または−（Ｃ＝１８Ｏ）ＣＨ３から選択される、［９］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１７］前記方法が、同位体標識されたオリゴ糖中のアセチル−ヘキソサミン単位の遊離のアノマー位でオキサゾリンを形成することをさらに含む、［１］〜［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］前記方法が、ペプチド、脂質またはタンパク質をグリコシル化して、同位体標識された糖ペプチド、ペプチドグリカン、グリコリピド、同位体標識されたオリゴ糖を含む糖タンパク質を得ることをさらに含む、［１］〜［１７］のいずれかに記載の方法。
［１９］［１］〜［１８］のいずれかに記載の方法によって入手できる同位体標識されたオリゴ糖または複合糖質。
［２０］
【化１４】
0006602747.tif 000022
［式中、各Ａｃ＊は、同位体標識されている］
から選択されるモチーフを含むグリカン。
［２１］モチーフが、
Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ＊−ＧｌｃＮＡｃ＊
であり、式中、各Ａｃ＊は、同位体標識されている、［２０］に記載のグリカン。
［２２］グリカンが、モチーフ：
【化１５】
0006602747.tif 000023
を含み、式中、各Ａｃ＊は、同位体標識されている、［２１］に記載のグリカン。
［２３］各Ａｃ＊が、−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）１３ＣＨ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）ＣＤ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）１３ＣＤ３、−（Ｃ＝Ｏ）１３ＣＤ３、−（１３Ｃ＝Ｏ）ＣＤ３、−（１４Ｃ＝Ｏ）１４ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）１４ＣＨ３、−（１４Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝１７Ｏ）ＣＨ３、−（１３Ｃ＝１７Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝１７Ｏ）１３ＣＨ３、−（１３Ｃ＝１７Ｏ）１３ＣＨ３、−（Ｃ＝１８Ｏ）ＣＨ３、−（１３Ｃ＝１８Ｏ）ＣＨ３、−（Ｃ＝１８Ｏ）１３ＣＨ３、−（１３Ｃ＝１８Ｏ）１３ＣＨ３から選択される、［２０］〜［２２］のいずれかに記載のグリカン。
［２４］グリカンが、１つまたはそれより多くのさらなる単糖単位を含む、［２０］〜［２３］のいずれかに記載のグリカン。
［２５］サンプル中のグリカンを同定する方法であって、該方法は、［１９］〜［２４］のいずれかに記載の同位体標識されたグリカンを含むタグ付けされた標準をサンプルに添加して、ドープしたサンプルを得ること、およびドープしたサンプルを、マススペクトロメトリーを使用して分析することを含む、上記方法。
［２６］分析物であるグリカンに関連するイオンのピークと、同位体標識されたグリカンに関連するイオンのピークとの相対的な強度を比較することによって、サンプル中のグリカンが定量化できるように、既知量の同位体標識されたグリカンがサンプルに添加される、［２５］に記載の方法。
［２７］前記方法が、（ｉ）１種またはそれより多くの同位体標識されたグリカンを含むタグ付けされた標準を選択すること；（ｉｉ）タグ付けされた標準をサンプルに添加して、ドープしたサンプルを得ること；（ｉｉｉ）ドープしたサンプルをマススペクトロメトリーを使用して分析して、イオンのピークを得ること；（ｉｖ）タグ付けされた標準に関連するイオンのピークの同一性および強度を、ドープしたサンプルのスペクトル中の追加のイオンのピークと比較することを含む、［２５］または［２６］に記載の方法。
［２８］タグ付けされた標準が、分析物であるグリカンの複数の同位体標識された「重い」アイソトポログを含み、ここで該方法の工程（ｉｖ）は、以下：
（ａ）重い各アイソトポログに関連するイオンのピークの相対的な強度（Ｉｊ＊）を、そのグリカンの標準中の既知の存在度（ｍｊ＊）と関連付けて、ｍｊの一次関数としてＩｊを得る工程；
（ｂ）場合により、関連付けに関する決定係数Ｒ２を計算して、Ｒ２値が事前に決定された値より高い場合、最も豊富なイオンのピークを除外する工程；
（ｃ）場合により、工程（ｉｉ）を１回またはそれより多く繰り返す工程；
（ｄ）前記関数を使用して、分析物であるグリカンの「軽い」アイソトポログの量を計算する工程；
（ｅ）場合により、分析物であるグリカンの「軽い」アイソトポログの総量を使用して、存在する分析物であるグリカンの総量を決定する工程
の工程を包含する、［２７］に記載の方法。
［２９］前記方法が、ドープしたサンプルを分析する前に、グリカンを誘導体化することをさらに含む、［２８］に記載の方法。
［３０］マススペクトロメトリーが、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、直接注入ＥＳＩ−ＴｏＦまたはＬＣ−ＭＳである、［２５］〜［２９］のいずれかに記載の方法。
［３１］前記方法が、マススペクトロメトリーを使用した分析中にタンデムマススペクトロメトリーによるフラグメンテーションをさらに含む、［２５］〜［３０］のいずれかに記載の方法。
［３２］サンプル中のグリカンが、組換え糖タンパク質または抗体から放出されたグリカンである、［２５］〜［３１］のいずれかに記載の方法。
［３３］サンプル中のグリカンが、医学的疾患もしくは障害、または生物学的プロセスに関連するバイオマーカーである、［２５］〜［３２］のいずれかに記載の方法。
［３４］前記方法が、医学的疾患もしくは障害、または生物学的プロセスのインジケーターとして、１種またはそれより多くのグリカンの存在または量を関連付けることをさらに含む、［２５］〜［３３］のいずれかに記載の方法。
［３５］医学的疾患または障害が、がん、心臓血管疾患、炎症性の皮膚疾患、糖尿病、胃腸障害、肝臓障害、貧血、免疫疾患または障害、自己免疫疾患、関節リウマチなどの関節炎、感染症、腎症、神経障害、肺障害またはグリコシル化の先天性障害から選択される、［３４］に記載の方法。
［３６］診断方法で使用するための［１９］〜［２４］のいずれかに記載の同位体標識されたグリカンであって、該方法は、
（ｉ）疾患または障害に関連するグリカンを含有する疑いのあるサンプルを患者から得ること；
（ｉｉ）疾患または障害に関連するグリカンに対応する同位体標識されたグリカンを含むタグ付けされた標準を選択すること；
（ｉｉｉ）タグ付けされた標準をサンプルに添加して、ドープしたサンプルを得ること；
（ｉｖ）ドープしたサンプルをマススペクトロメトリーを使用して分析して、イオンのピークを得ること；
（ｖ）タグ付けされた標準に関連するイオンのピークの同一性および強度を、ドープしたサンプルのスペクトル中の追加のイオンのピークと比較して、サンプル中の１種またはそれより多くのグリカンの存在を同定し、場合により定量すること；
（ｖｉ）前記１種またはそれより多くのグリカンの存在を使用して、疾患または障害を診断すること
を含む、上記グリカン。
［３７］医学的疾患または障害が、がん、心臓血管疾患、炎症性の皮膚疾患、糖尿病、胃腸障害、肝臓障害、貧血、免疫疾患または障害、自己免疫疾患、関節リウマチなどの関節炎、感染症、腎症、神経障害、肺障害またはグリコシル化の先天性障害から選択される、［３６］に記載の方法で使用するためのグリカン。
［３８］サンプル中のグリカンを同定するためのキットであって、該キットは、（ａ）１種またはそれより多くの同位体標識されたグリカンを含む、タグ付けされた標準；（ｂ）グリカンを含有する疑いのあるサンプルをタグ付けされた標準でドープして、ドープしたサンプルを得て、ドープしたサンプルをマススペクトロメトリーを使用して分析するための説明書を含む、上記キット。
［３９］説明書が、タグ付けされた標準に関するマススペクトロメトリーデータを包含する、［３８］に記載のキット。
［４０］説明書が、タグ付けされた標準に関連するイオンのピークを、マススペクトル中の追加のイオンのピークと比較する工程を包含する、［３８］または［３９］に記載のキット。
［４１］［３８］、［３９］または［４０］のいずれかに記載のキットにおける、［１９］〜［２４］のいずれかに記載の同位体標識されたグリカンの使用。
【図１】
0006602747.tif 000028
【図２】
0006602747.tif 000029
【図３ａ】
0006602747.tif 000030
【図３ｂ】
0006602747.tif 000031
【図３ｃ】
0006602747.tif 000032
【図４ａ】
0006602747.tif 000033
【図４ｂ】
0006602747.tif 000034
【図５】
0006602747.tif 000035
【図６】
0006602747.tif 000036