(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の構造
【化１】
0006532880.tif 000006
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｆ、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、およびＣ１〜Ｃ４アルキルからなる群から選択され；
Ｒ２〜Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、フッ素、ヒドロキシ、およびＣ１〜Ｃ６アルコキシからなる群から選択される］
を有する化合物、ならびに化合物（Ｉ）の薬学的に許容される酸付加塩、化合物（Ｉ）のラセミ混合物、または化合物（Ｉ）の対応する鏡像異性体および／または光学異性体、および化合物（Ｉ）の多形体、および化合物（Ｉ）の互変異性体。
【請求項２】
Ｒ１〜Ｒ１１がＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記化合物が（３ａＳ，６ａＳ）−４−（７，８−ジメトキシキナゾリン−４−イル）ヘキサヒドロ−２Ｈ−フロ［３，２−ｂ］ピロールである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記化合物が（３ａＲ，６ａＲ）−４−（７，８−ジメトキシキナゾリン−４−イル）ヘキサヒドロ−２Ｈ−フロ［３，２−ｂ］ピロールである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ２およびＲ７の少なくとも一方はＣＨ３である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ２とＲ７は両方ともＣＨ３である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ１がアルキルまたはシクロアルキルである場合、Ｒ１はフッ素で１回、２回、または３回置換されている、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ１およびＲ３〜Ｒ１１はＨであり、Ｒ２はＣＨ３である、請求項５に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ１〜Ｒ６およびＲ８〜Ｒ１１はＨであり、Ｒ７はＣＨ３である、請求項５に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ１、Ｒ３〜Ｒ６およびＲ８〜Ｒ１１はＨである、請求項６に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ２〜Ｒ１１の１つ以上は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、およびＣ３〜Ｃ６シクロアルコキシからなる群から互いに独立して選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ２〜Ｒ１１の１つ以上は、Ｃ１〜Ｃ３アルキルおよびＣ３〜Ｃ６シクロアルキルからなる群から互いに独立して選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ２〜Ｒ１１の１つ以上は、Ｆおよびアルコキシからなる群から選択される置換基で互いに独立して置換されている、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ２〜Ｒ１１の１つ以上の置換基はＣ１〜Ｃ３アルコキシである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｃ１〜Ｃ３アルコキシはさらにフッ素で１回以上置換されている、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｃ１〜Ｃ３アルコキシはさらにフッ素で１回置換されている、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
医薬として使用される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８】
神経障害または精神障害を治療するための請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項１９】
統合失調症を治療するための請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項２０】
統合失調症に関連する認知障害を治療するための請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項２１】
注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）を治療するための請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項２２】
アルツハイマー病を治療するための請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項２３】
パーキンソン病を治療するための請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項２４】
ハンチントン病を治療するための請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項２５】
医療有効量の請求項１に記載の化合物と、薬学的に許容される１種以上の担体、賦形剤、または医薬品添加物とを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＤＥ１酵素阻害剤である化合物、ならびに医薬、特に神経変性障害および精神障害を治療する医薬としてのそれらの使用を提供する。本発明は、本発明の化合物を含む医薬組成物および本発明の化合物を使用する障害の治療方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
本願全体を通して、様々な刊行物の内容全体を参照する。これらの刊行物の開示は、本発明が関係する技術の現状をより詳細に説明するために、参照により本願に援用される。
【０００３】
セカンドメッセンジャー環状ヌクレオチド（ｃＮ）である環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）および環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）は、ｃＮ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡおよびＰＫＧ）、ＥＰＡＣ（ｃＡＭＰにより活性化される交換タンパク質）、リンタンパク質ホスファターゼ、および／またはｃＮ感受性カチオンチャネルを調節することにより、細胞内シグナル伝達カスケードで主要な役割を果たす。ニューロンでは、これにはｃＡＭＰ依存性キナーゼおよびｃＧＭＰ依存性キナーゼの活性化と、それに続く、シナプス伝達の急性調節ならびにニューロンの分化および生存に関与するタンパク質のリン酸化が含まれる。ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの細胞内濃度は、シクラーゼによる生合成速度とホスホジエステラーゼによる分解速度とにより厳密に調節される（ＰＤＥ、ＥＣ３．１．４．１７）。ＰＤＥは、３’−エステル結合を触媒作用により加水分解し、不活性な５’−一リン酸を形成することによりｃＡＭＰ／ｃＧＭＰを不活性化させる二元金属加水分解酵素である。ＰＤＥは、細胞内の環状ヌクレオチドであるｃＡＭＰおよびｃＧＭＰを分解する唯一の手段となるため、ＰＤＥは環状ヌクレオチドシグナル伝達に重要な役割を果たす。ＰＤＥの触媒活性により、全ての細胞で様々な濃度のｃＮが分解され、それらの様々な調節機構により無数のシグナル伝達経路との統合やクロストークが生じる。特定のＰＤＥは、それらがｃＮレベルを制御し、種々のｃＮシグナロソームのための微小環境を形作る細胞内の個別の区画を標的にする（（非特許文献１））。
【０００４】
基質特異性に基づいて、ＰＤＥファミリーは：１）ＰＤＥ４、ＰＤＥ７、およびＰＤＥ８を含むｃＡＭＰに特異的なＰＤＥと、２）ｃＧＭＰ選択性酵素であるＰＤＥ５およびＰＤＥ９と、３）二重基質ＰＤＥであるＰＤＥ１、ＰＤＥ２、ＰＤＥ３、ならびにＰＤＥ１０およびＰＤＥ１１の３つの群に分類することができる。
【０００５】
以前命名されたカルモジュリン刺激ＰＤＥ（ＣａＭ−ＰＤＥ）であるＰＤＥ１は、それが、４つのＣａ２＋と複合体化するカルモジュリン（ＣａＭ、１６ｋＤａのＣａ２＋結合タンパク質）を介してＣａ２＋依存性に調節されるという点が独特である（概説については、（非特許文献１）を参照されたい）。従って、このファミリーは、環状ヌクレオチドと細胞内Ｃａ２＋との興味深い調節リンクである。ＰＤＥ１ファミリーは、ＰＤＥ１Ａ（ヒト染色体２ｑ３２上にマッピングされる）と、ＰＤＥ１Ｂ（ヒト染色体位置、ｈｃｌ：１２ｑ１３）と、ＰＤＥ１Ｃ（ｈｃｌ：７ｐ１４．３）の３つの遺伝子によりコードされる。それらは代替のプロモーターを有し、調節特性、基質親和性、比活性、ＣａＭの活性化定数、組織分布および分子量が異なる多数のタンパク質を代替のスプライシングにより生じさせる。１０より多くのヒトアイソフォームが同定されている。それらの分子量は、１モノマー当たり５８〜８６ｋＤａの範囲である。２つのＣａ２＋／ＣａＭ結合ドメインを含むＮ末端調節ドメインと２つのリン酸化部位はそれらの対応するタンパク質を識別し、それらの生化学的機能を調節する。ＰＤＥ１は二重基質ＰＤＥであり、ＰＤＥ１ＣサブタイプはｃＡＭＰとｃＧＭＰに対して同等の活性を有する（Ｋｍ≒１〜３μＭ）が、サブタイプＰＤＥ１ＡとＰＤＥ１ＢはｃＧＭＰに対する親和性の方が高い（ｃＧＭＰに対するＫｍ≒１〜３μＭ、ｃＡＭＰに対するＫｍ≒１０〜３０μＭ）。
【０００６】
ＰＤＥ１サブタイプは脳に高濃度で存在し、とりわけ線条体（ＰＤＥ１Ｂ）、海馬（ＰＤＥ１Ａ）および皮質（ＰＤＥ１Ａ）に局在化しており、この局在化は種を超えて保存されている（（非特許文献２））。皮質では、ＰＤＥ１Ａは主に深部皮質層５および６（出力層）に存在し、深部皮質層に対する特異的マーカーとして使用される。ＰＤＥ１阻害剤はセカンドメッセンジャーであるｃＮのレベルを上昇させ、それにより神経興奮性が増強される。
【０００７】
従って、ＰＤＥ１は、細胞内シグナル伝達経路、好ましくは神経系の細胞内シグナル伝達経路を調節するための治療標的であり、ＰＤＥ１阻害剤はセカンドメッセンジャーであるｃＡＭＰ／ｃＧＭＰのレベルを上昇させることができ、それにより神経過程が調節され、神経可塑性関連遺伝子、神経栄養因子、および神経保護分子が発現する。これらの神経可塑性増強特性とシナプス伝達の調節とにより、ＰＤＥ１阻害剤は多くの神経病態および精神病態の優れた治療薬候補となる。動物モデルにおけるＰＤＥ１阻害剤の評価（概説については、例えば、（非特許文献３）；および（非特許文献４）を参照されたい）は、ＰＤＥ１阻害剤を、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病のような神経障害、ならびに、例えば注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）、下肢静止不能症候群、うつ病、ナルコレプシー、認知障害および統合失調症に関連する認知障害（ＣＩＡＳ）のような精神障害の治療に使用できる可能性を示唆した。ＰＤＥ１阻害剤が、女性性機能不全などの、プロゲステロンによるシグナル伝達の増強により軽減することができる疾患に有用であると主張する特許出願もあった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｈａｒｒｏｎ  Ｈ．Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｍｉｔｓｉ  Ａ．Ｂｌｏｕｎｔ，ａｎｄ  Ｊａｃｋｉｅ  Ｄ．Ｃｏｒｂｉｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２０１１，９１：６５１−６９０
【非特許文献２】Ａｍｙ  Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ  ２０１２，７３，１０８３−１０９９
【非特許文献３】Ｂｌｏｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐａｔｅｎｔｓ（２０１２），２２（４），３４９−３５４
【非特許文献４】Ｍｅｄｉｎａ，Ａ．Ｅ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（２０１１），５（Ｆｅｂ．），２１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の化合物は、全ての患者に効能があるわけではない現在販売されている神経変性障害および／または精神障害の治療薬の代替品を提供することができる。従って、代替の治療方法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ＰＤＥ１酵素は中枢神経系（ＣＮＳ）に発現するため、この遺伝子ファミリーは精神障害および神経変性障害を治療するための魅力的な新規な標的源となる。
【００１１】
本発明の目的は、ＰＤＥ１阻害剤となり、このようなものとして神経変性障害および精神障害の治療に有用な化合物を提供することである。好ましい実施形態では、化合物は選択的ＰＤＥ１阻害剤である。
【００１２】
従って、本発明は、式（Ｉ）
【化１】
0006532880.tif 000002
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｆ、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、およびＣ１〜Ｃ４アルキルからなる群から選択され、上式中、アルキルおよびシクロアルキルはフッ素で１回、２回、または３回置換されていてもよく；
Ｒ２〜Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、フッ素、ヒドロキシ、およびＣ１〜Ｃ６アルコキシからなる群から選択される］
の化合物、ならびに化合物（Ｉ）の薬学的に許容される酸付加塩、化合物（Ｉ）のラセミ混合物、または化合物（Ｉ）の対応する鏡像異性体および／または光学異性体、および化合物（Ｉ）の多形体、および化合物（Ｉ）の互変異性体に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
第１の実施形態（Ｅ１）では、本発明は、式（Ｉ）
【化２】
0006532880.tif 000003
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｆ、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、およびＣ１〜Ｃ４アルキルからなる群から選択され；
Ｒ２〜Ｒ１１は、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６アルコキシからなる群から選択される］
の化合物（化合物（Ｉ））に関する。
【００１４】
（Ｅ１）の一実施形態（Ｅ２）では、Ｒ１〜Ｒ１１はＨである。
【００１５】
（Ｅ１）の一実施形態（Ｅ３）では、Ｒ２およびＲ７の少なくとも一方はＣＨ３である。
【００１６】
（Ｅ３）の一実施形態（Ｅ４）では、Ｒ２とＲ７は両方ともＣＨ３である。
【００１７】
（Ｅ１）の一実施形態（Ｅ５）では、Ｒ１がアルキルまたはシクロアルキルである場合、Ｒ１はフッ素で１回、２回、または３回置換されている。
【００１８】
（Ｅ３）の一実施形態（Ｅ６）では、Ｒ１およびＲ３〜Ｒ１１はＨであり、Ｒ２はＣＨ３である。
【００１９】
（Ｅ３）の一実施形態（Ｅ７）では、Ｒ１〜Ｒ６およびＲ８〜Ｒ１１はＨであり、Ｒ７はＣＨ３である。
【００２０】
（Ｅ４）の一実施形態（Ｅ８）では、Ｒ１、Ｒ３〜Ｒ６およびＲ８〜Ｒ１１はＨである。
【００２１】
（Ｅ１）の一実施形態（Ｅ９）では、Ｒ２〜Ｒ１１の１つ以上は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、およびＣ３〜Ｃ６シクロアルコキシからなる群から互いに独立して選択される。
【００２２】
（Ｅ１）の一実施形態（Ｅ１０）では、Ｒ２〜Ｒ１１の１つ以上は、Ｃ１〜Ｃ３アルキルおよびＣ３〜Ｃ６シクロアルキルからなる群から互いに独立して選択される。
【００２３】
（Ｅ１０）の一実施形態（Ｅ１１）では、Ｒ２〜Ｒ１１の１つ以上は、Ｆおよびアルコキシからなる群から選択される置換基で互いに独立して置換されている。
【００２４】
（Ｅ１１）の一実施形態（Ｅ１２）では、Ｒ２〜Ｒ１１の１つ以上の置換基はＣ１〜Ｃ３アルコキシである。
【００２５】
（Ｅ１２）および（Ｅ１１）のいずれかの一実施形態（Ｅ１３）では、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシはさらにフッ素で１回以上置換されている。
【００２６】
（Ｅ１３）の一実施形態（Ｅ１４）では、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシはさらにフッ素で１回置換されている。
【００２７】
（Ｅ１）〜（Ｅ１４）のいずれかの一実施形態（Ｅ１５）では、化合物はＰＤＥ１Ａ阻害剤である。
【００２８】
（Ｅ１）〜（Ｅ１４）のいずれかの一実施形態（Ｅ１６）では、化合物はＰＤＥ１Ｂ阻害剤である。
【００２９】
（Ｅ１）〜（Ｅ１４）のいずれかの一実施形態（Ｅ１７）では、化合物はＰＤＥ１Ｃ阻害剤である。
【００３０】
（Ｅ１）〜（Ｅ１７）のいずれかの一実施形態（Ｅ１８）では、化合物は医薬として使用される。
【００３１】
定義
ＰＤＥ１酵素
ＰＤＥ１アイソザイムファミリーは、多数のスプライスバリアントであるＰＤＥ１アイソフォームを含む。それは３種のサブタイプ、ＰＤＥ１Ａ、ＰＤＥ１Ｂ、およびＰＤＥ１Ｃを有し、これらはさらに様々なアイソフォームに分類される。本発明に関して、ＰＤＥ１とＰＤＥ１酵素は同義であり、ＰＤＥ１Ａ酵素、ＰＤＥ１Ｂ酵素およびＰＤＥ１Ｃ酵素ならびにそれらのアイソフォームを指す。
【００３２】
置換基
本発明に関して使用する場合、「ハロ」および「ハロゲン」という用語は互換的に使用され、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を指す。
【００３３】
「Ｃ１〜Ｃ３アルキル」、「Ｃ１〜Ｃ４アルキル」、「Ｃ１〜Ｃ５アルキル」および「Ｃ１〜Ｃ６アルキル」という用語は、炭素数１〜６（両端値を含む）の直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素を指す。このような基の例としては、メチル、エチル、１−プロピル、２−プロピル、１−ブチル、２−ブチル、２−メチル−２−プロピル、２−メチル−１−ブチル、およびｎ−ヘキシルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
「Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル」という用語は、典型的には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルを指す。
【００３５】
「Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ」という表現は、酸素上の結合価が空いている（ｏｐｅｎ  ｖａｌｅｎｃｙ）、炭素数１〜６（両端値を含む）の直鎖、分岐鎖または環式の飽和アルコキシ基を指す。このような基の例としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−ブトキシ、２−メチルペントキシおよびｎ−ヘキシルオキシが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
「シクロアルコキシ」という用語は、酸素の原子価が開いている、酸素原子に結合した前述の「Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル」を形成する、アルコキシ基の炭素数が３以上の、特に炭素数が３〜６（両端値を含む）の前述の「アルコキシ」の特定の実施形態を指す。
【００３７】
「アリール」という用語は、前述のハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシまたはハロ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルで任意選択により置換されたフェニル環を指す。
【００３８】
「ヘテロアリール」という用語は、炭素原子、水素原子、ならびに窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１個以上のヘテロ原子、好ましくは１〜３個のヘテロ原子などの１〜４個のヘテロ原子、好ましくは２個または１個のヘテロ原子を含む単環式または多環式芳香環を指す。ヘテロアリール基の例示的な例としては、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジル、ピラジル、トリアジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、（１，２，３，）および（１，２，４）−トリアゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソキサゾリル、チアゾリル、フェニル、イソキサゾリル、およびオキサゾリルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ヘテロアリール基は、置換されていなくてもまたは１個または２個の好適な置換基で置換されていてもよい。好ましくは、本発明のヘテロアリールは５員または６員の単環式ヘテロアリールであり、この環は２〜５個の炭素原子と１〜３個のヘテロ原子とを含み、本明細書では「５員または６員の単環式ヘテロアリール」とも称される。
【００３９】
異性体
本発明の化合物が１つ以上のキラル中心を含有する場合、化合物のいずれかについての言及は、特記しない限り、鏡像異性的にまたはジアステレオマー的に純粋な化合物、ならびに鏡像異性体またはジアステレオマーの任意の比での混合物を包含する。
【００４０】
上記はまた、本発明の化合物が２つ以上のキラル中心を含有する場合にも当てはまる。
【００４１】
ＰＤＥ１阻害剤
本発明に関して、化合物は、ＰＤＥ１ＢのＩＣ５０レベルに達するのに必要な量が５μＭ以下、好ましくは４μＭ未満、例えば３μＭ以下、より好ましくは２μＭ以下、例えば１μＭ以下、特に５００ｎＭ以下である場合、ＰＤＥ１阻害剤であると見なされる。好ましい実施形態では、ＰＤＥ１ＢのＩＣ５０レベルに達するのに必要なＰＤＥ１阻害剤の量は４００ｎＭ以下、例えば３００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、またはさらには８０ｎＭ以下、例えば５０ｎＭ以下、例えば２５ｎＭ以下である。
【００４２】
薬学的に許容される塩
本発明はまた、化合物の塩、典型的には、薬学的に許容される塩を含む。このような塩には、薬学的に許容される酸付加塩が含まれる。酸付加塩には、無機酸および有機酸の塩が含まれる。
【００４３】
好適な無機酸の代表例としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硫酸、スルファミン酸、および硝酸等が挙げられる。好適な有機酸の代表例としては、ギ酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、安息香酸、ケイ皮酸、クエン酸、フマル酸、グリコール酸、イタコン酸、乳酸、メタンスルホン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、シュウ酸、ピクリン酸、ピルビン酸、サリチル酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、酒石酸、アスコルビン酸、パモ酸、ビスメチレンサリチル酸、エタンジスルホン酸、グルコン酸、シトラコン酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ＥＤＴＡ、グリコール酸、ｐ−アミノ安息香酸、グルタミン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、テオフィリン酢酸、および、８−ハロテオフィリン、例えば、８−ブロモテオフィリン等が挙げられる。薬学的に許容される無機酸付加塩または有機酸付加塩のその他の例としては、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１９７７，６６，２に記載の薬学的に許容される塩が挙げられ、その内容は参照により本明細書に援用される。
【００４４】
さらに、本発明の化合物は、溶媒和していない形態で存在しても、水およびエタノール等の薬学的に許容される溶媒と溶媒和した形態で存在してもよい。一般的に、本発明の目的では、溶媒和した形態は、溶媒和していない形態と同等であると見なされる。
【００４５】
治療有効量
本発明に関して、「治療有効量」の化合物という用語は、前記化合物の投与を含む治療介入において所定の疾患およびその合併症の臨床症状を治癒する、軽減する、またはその進行を部分的に阻止するのに十分な量を意味する。これを達成するのに十分な量を「治療有効量」と定義する。各目的に有効な量は、疾患または傷害の重症度ならびに対象の体重および全身状態に依存する。適切な投与量の決定は、値のマトリックスを形成し、マトリックス中の様々な点を試験することにより通常の実験法を用いて行ってもよく、それは全て熟練した医師の通常の技術の範囲内にあることが理解されるであろう。
【００４６】
本発明に関して、「治療」および「治療する」という用語は、疾患または障害などの病態と闘うための患者の管理およびケアを意味する。この用語は、患者が罹患している所定の病態のあらゆる治療、例えば、症状または合併症を軽減するための、疾患、障害または病態の進行を遅延させるための、症状および合併症を軽減または緩和するための、および／または疾患、障害または病態を治癒するまたは取り除くための、ならびに病態を予防するための生理活性化合物の投与を含むものとし、予防は、疾患、病態、または障害と闘うための患者の管理およびケアと理解することができ、症状または合併症の発症を予防するための生理活性化合物の投与を含む。それにもかかわらず、疾患予防的（予防的）治療および治療的（治癒的）治療は、本発明の２つの別々の態様である。治療される患者は、好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
【００４７】
医薬組成物
本発明はさらに、治療有効量の式（Ｉ）の化合物と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。本発明はまた、本明細書の実験の項に開示されている特定の化合物の１つを治療有効量と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物も提供する。
【００４８】
本発明の化合物は、単独で、または薬学的に許容される担体、賦形剤もしくは医薬品添加物と組み合わせて、１回の投与または複数回の投与のいずれかで投与することができる。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤、ならびに他の任意の公知の補助剤および医薬品添加物と共に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５に開示されているものなどの従来技術により製剤化することができる。
【００４９】
医薬組成物は、経口、経直腸、経鼻、経肺、局所（口腔粘膜および舌下を含む）、経皮、槽内、腹腔内、経膣および非経口（皮下、筋肉内、髄腔内、静脈内および皮内を含む）経路などの任意の適切な経路で投与されるように、特に製剤化されてもよい。経路は、治療される対象の全身状態および年齢、治療される病態の性質ならびに有効成分に依存することが理解される。
【００５０】
経口投与用の医薬組成物には、カプセル剤、錠剤、糖衣錠、丸剤、ロゼンジ剤、散剤および顆粒剤などの固体剤形が含まれる。組成物は、適宜、腸溶性コーティングなどのコーティングで被覆して製造されてもよく、または組成物は、当技術分野で周知の方法により、有効成分を放出制御する、例えば、徐放または持続放出するように製剤化されてもよい。経口投与用の液体剤形には、溶液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤が含まれる。
【００５１】
非経口投与用の医薬組成物には、水性および非水性の滅菌注射用溶液剤、分散液剤、懸濁剤または乳剤、および使用前に滅菌注射用溶液剤または分散液剤中で再構成される滅菌粉末剤も含まれる。他の適切な投与形態としては、坐剤、スプレー剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、吸入剤、皮膚貼付剤および埋め込み剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
典型的な経口投与量は、一日当たり約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。典型的な経口投与量はまた、一日当たり約０．０１〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。典型的な経口投与量はさらに、一日当たり約０．０５〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。経口投与量は、通常、１日当たり１回以上の投与で、典型的には１〜３回の投与で投与される。正確な投与量は、投与頻度および投与方法、治療される対象の性別、年齢、体重、全身状態、治療される病態の性質および重症度ならびに治療される任意の併存症（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）ならびに当業者に明らかなその他の要因に依存する。
【００５３】
本製剤はまた、当業者に公知の方法により単位剤形で提供されてもよい。例えば、経口投与用の典型的な単位剤形は、約０．０１〜約１０００ｍｇ、約０．０５〜約５００ｍｇ、または約０．５ｍｇ〜約２００ｍｇを含有することができる。
【００５４】
静脈内、髄腔内、筋肉内および同様の投与などの非経口経路では、典型的な用量は、経口投与に使用される用量の約半分である。
【００５５】
本発明はまた、治療有効量の式（Ｉ）の化合物と、少なくとも１種の薬学的に許容される担体または賦形剤とを混合することを含む、医薬組成物の製造方法も提供する。本発明の一実施形態では、前述の方法に使用される化合物は、本明細書の実験の項に開示される特定の化合物の１つである。
【００５６】
本発明の化合物は、一般的に、遊離物質としてまたはその薬学的に許容される塩として使用される。一例としては、遊離塩基の有用性を有する化合物の酸付加塩がある。式（Ｉ）の化合物が遊離塩基を含有する場合、このような塩は、式（Ｉ）の遊離塩基の溶液または懸濁液を１モル当量の薬学的に許容される酸で処理することによる従来の方法で製造される。好適な有機酸および無機酸の代表例は、前述されている。
【００５７】
非経口投与では、式（Ｉ）の化合物を滅菌水溶液、水性プロピレングリコール、水性ビタミンＥまたはゴマ油もしくはピーナッツ油に溶解した溶液を使用してもよい。このような水溶液に、必要に応じて、緩衝剤を適切に添加すべきであり、液体賦形剤を、まず、十分な生理食塩水またはグルコースで等張にすべきである。水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に好適である。当業者に公知の標準的な技術を使用して、式（Ｉ）の化合物を公知の滅菌水性媒体中に容易に混合することができる。
【００５８】
好適な医薬担体としては、不活性な固体賦形剤または充填剤、滅菌水溶液および様々な有機溶媒が挙げられる。固体担体の例としては、乳糖、白土、ショ糖、シクロデキストリン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸およびセルロースの低級アルキルエーテルが挙げられる。液体担体の例としては、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、リン脂質、脂肪酸、脂肪酸アミン、ポリオキシエチレンおよび水が挙げられるが、これらに限定されるものではない。同様に、担体または賦形剤は、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの当技術分野で公知の任意の徐放性材料を単独で含んでもまたはワックスと混合して含んでもよい。式（Ｉ）の化合物と薬学的に許容される担体とを組み合わせることにより形成される医薬組成物は、開示されている投与経路に適切な、様々な剤形で容易に投与される。製剤は、好都合には、薬学の技術分野で公知の方法により単位剤形で提供することができる。
【００５９】
経口投与に適切な本発明の製剤は、それぞれが所定量の有効成分と、任意選択により好適な医薬品添加物とを含有するカプセル剤または錠剤などの個別の単位として提供することができる。さらに、経口用製剤は、散剤もしくは顆粒剤、水性もしくは非水性液体に溶解もしくは懸濁した溶液剤もしくは懸濁剤、または水中油型もしくは油中水型の液体乳剤の形態であってもよい。
【００６０】
経口投与用に固体担体を使用する場合、製剤は錠剤化されても、粉末もしくはペレットの形態で硬ゼラチンカプセルに封入されてもよく、または製剤は、トローチ剤もしくはロゼンジ剤の形態であってもよい。固体担体の量は非常に様々となるが、投与単位当たり約２５ｍｇ〜約１ｇの範囲となる。液体担体を使用する場合、製剤は、シロップ剤、乳剤、軟ゼラチンカプセル剤、または水性もしくは非水性の液体懸濁剤もしくは溶液剤などの滅菌注射用液剤の形態であってもよい。
【００６１】
本発明の医薬組成物は、当技術分野の従来の方法で製造することができる。例えば、錠剤の製造は、有効成分を通常の補助剤および／または賦形剤と混合した後、従来の打錠機で混合物を圧縮して錠剤を製造することにより行うことができる。補助剤または賦形剤の例には、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ゼラチン、乳糖、およびゴム等が含まれる。着色剤、香味剤、保存剤等のこのような目的に通常使用されるその他の任意の補助剤または添加剤を使用することができるが、但し、それらは有効成分と適合性があるものとする。
【００６２】
障害の治療
前述のように、式（Ｉ）の化合物はＰＤＥ１酵素阻害剤であり、このようなものとして、関連する神経障害および精神障害の治療に有用である。
【００６３】
従って、本発明は、ヒトを含む哺乳動物における神経変性障害、精神障害または薬物嗜癖の治療に使用される、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される酸付加塩、およびこのような化合物を含有する医薬組成物を提供し；神経変性障害は、アルツハイマー病、多発梗塞性認知症、アルコール性認知症または他の薬物に関連する認知症、頭蓋内腫瘍または脳外傷に関連する認知症、ハンチントン病もしくはパーキンソン病に関連する認知症、またはＡＩＤＳに関連する認知症；せん妄；健忘障害；外傷後ストレス障害；精神遅滞；学習障害、例えば、読字障害、算数障害、または筆字表出障害；注意欠陥多動障害；および、加齢性認知低下からなる群から選択され；精神障害は、例えば、妄想型、破瓜型、緊張型、鑑別不能型、または残遺型の統合失調症；統合失調症様障害；統合失調感情障害、例えば、妄想型またはうつ病型の統合失調感情障害；妄想性障害；物質誘発性精神病性障害、例えば、アルコール、アンフェタミン、大麻、コカイン、幻覚剤、吸入剤、オピオイドまたはフェンシクリジンにより誘発される精神病；妄想型の人格障害；および統合失調型の人格障害からなる群から選択され；薬物嗜癖はアルコール、アンフェタミン、コカイン、またはオピエート嗜癖である。
【００６４】
式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩は、本発明の化合物が有用性を有する疾患または病態の治療に、他の１種または複数種の薬物と併用することができ、薬物を併用する方が、いずれかの薬物を単独で使用する場合よりも安全性または有効性が高い。さらに、本発明の化合物は、本発明の化合物の副作用または毒性を治療する、予防する、管理する、寛解する、またはそのリスクを低減する他の１種または複数種の薬物と併用することができる。本発明の組み合わせ、使用および治療方法は、他の既知の治療に十分に応答しない患者またはそれに抵抗性を示す患者の治療にも有利となり得る。他のこのような薬物は、そのために一般的に使用される経路および量で、本発明の化合物と同時にまたは順次投与することができる。従って、本発明の医薬品組成物には、本発明の化合物の他に、１種または複数種の他の薬理活性成分を含有するものが含まれる。
【００６５】
本発明は、対象に治療有効量の式（Ｉ）の化合物を投与することを含む、認知障害または運動障害から選択される神経変性障害に罹患しているヒトを含む哺乳動物の治療方法を提供する。
【００６６】
本発明はさらに、前記哺乳動物にＰＤＥ１を阻害するのに有効な量の式（Ｉ）の化合物を投与することを含む、ヒトを含む哺乳動物の神経変性障害または病態の治療方法も提供する。
【００６７】
本発明は、対象に治療有効量の式（Ｉ）の化合物を投与することを含む、精神障害に罹患している対象の治療方法も提供する。本発明により治療することができる精神障害の例としては、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）、統合失調症、例えば、妄想型、破瓜型、緊張型、鑑別不能型、または残遺型の統合失調症；統合失調症様障害；統合失調感情障害、例えば、妄想型またはうつ病型の統合失調感情障害；妄想性障害；物質誘発性精神病性障害、例えば、アルコール、アンフェタミン、大麻、コカイン、幻覚剤、吸入剤、オピオイドまたはフェンシクリジンにより誘発される精神病；妄想型の人格障害；および統合失調型の人格障害が挙げられるが、これらに限定されるものではなく；不安障害は、パニック障害；広場恐怖症；特定の恐怖症；社交恐怖症；強迫性障害；外傷後ストレス障害；急性ストレス障害；および全身性不安障害から選択される。
【００６８】
統合失調症などの精神障害の治療成績を向上するために、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩を有利には少なくとも１種の神経遮断剤（定型抗精神病剤であってもまたは非定型抗精神病剤であってもよい）と併用投与できることが判明した。本発明の組み合わせ、使用および治療方法は、他の既知の治療に十分に応答しない患者またはそれに抵抗性を示す患者の治療にも有利となり得る。
【００６９】
従って、本発明は、哺乳動物に治療有効量の式（Ｉ）の化合物を単独でまたは併用療法として少なくとも１種の神経遮断剤と共に投与することを含む、統合失調症などの精神障害に罹患している哺乳動物の治療方法を提供する。
【００７０】
「神経遮断剤」という用語は、本明細書で使用する場合、精神病患者の錯乱、妄想、幻覚および精神運動性激越を低減する抗精神病剤薬物の認知および行動に対する効果を有する薬物を指す。主要な精神安定剤および抗精神病薬としても知られている神経遮断剤としては、脂肪族側鎖群、ピペリジン側鎖群、およびピペラジン側鎖群に細分されるフェノチアジン系、チオキサンテン系（例えば、シソルジノール（ｃｉｓｏｒｄｉｎｏｌ））、ブチロフェノン系（例えば、ハロペリドール）、ジベンゾキサゼピン系（例えば、ロキサピン）、ジヒドロインドロン系（例えば、モリンドン）、ジフェニルブチルピペリジン系（例えば、ピモジド）を含む定型抗精神病薬、ならびにベンゾイソオキサゾール系（例えば、リスペリドン）、セルチンドール、オランザピン、クエチアピン、オサネタントおよびジプラシドンを含む非定型抗精神病薬が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７１】
本発明に使用される特に好ましい神経遮断剤は、セルチンドール、オランザピン、リスペリドン、クエチアピン、アリピプラゾール、ハロペリドール、クロザピン、ジプラシドンおよびオサネタントである。
【００７２】
本発明はさらに、対象に治療有効量の式（Ｉ）の化合物を投与することを含む、認知障害に罹患している対象の治療方法も提供する。本発明により治療することができる認知障害の例としては、アルツハイマー病、多発梗塞性認知症、アルコール性認知症または他の薬物に関連する認知症、頭蓋内腫瘍または脳外傷に関連する認知症、ハンチントン病もしくはパーキンソン病に関連する認知症、またはＡＩＤＳに関連する認知症；せん妄；健忘障害；外傷後ストレス障害；精神遅滞；学習障害、例えば、読字障害、算数障害、または筆字表出障害；注意欠陥多動障害；および加齢性認知低下が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７３】
本発明は、対象に治療有効量の式（Ｉ）の化合物を投与することを含む、運動障害の治療方法も提供する。本発明により治療することができる運動障害の例としては、ハンチントン病、およびドーパミン作動薬療法に関連するジスキネジアが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明はさらに、対象に治療有効量の式（Ｉ）の化合物を投与することを含む、パーキンソン病および下肢静止不能症候群から選択される運動障害の治療方法も提供する。
【００７４】
本発明はまた、対象に治療有効量の式（Ｉ）の化合物を投与することを含む、気分障害の治療方法も提供する。本発明により治療することができる気分障害および気分エピソードの例としては、軽度、中等度または重度の大抗うつ病性エピソード、躁病性または混合性気分エピソード、軽躁病性気分エピソード；非定型の特徴を有するうつ病性エピソード；憂うつ質の特徴を有するうつ病性エピソード；緊張型の特徴を有するうつ病性エピソード；産後に発症する気分エピソード；脳卒中後うつ病；大抗うつ病性障害；気分変調性障害；小うつ病性障害；月経前不快気分障害；統合失調症の精神病後うつ病性障害；大うつ病性障害が妄想性障害または統合失調症などの精神病性障害に重なったもの；双極性障害、例えば、双極性Ｉ型障害、双極性ＩＩ型障害、および気分循環性障害が挙げられるが、これらに限定されるものではない。気分障害は精神障害であると理解される。
【００７５】
本発明はさらに、ヒトを含む哺乳動物における注意および／または認知の欠陥を症状として含む障害の治療方法も提供し、本方法は前記哺乳動物に前記障害の治療に有効な量の式（Ｉ）の化合物を投与することを含む。
【００７６】
本発明により治療することができる他の障害は、強迫性障害、トゥレット症候群および他のチック障害である。
【００７７】
本明細書で使用する場合、特記しない限り、「神経変性障害または病態」は、中枢神経系のニューロンの機能障害および／または死によって起こる障害または病態を指す。これらの障害および病態の治療は、これらの障害もしくは病態のリスクがあるニューロンの機能障害または死を予防する、および／またはリスクがあるニューロンの機能障害もしくは死によって起こる機能喪失を補償するように、損傷したニューロンもしくは健常なニューロンの機能を高める薬剤の投与により促進することができる。「神経栄養剤」という用語は、本明細書中で使用する場合、これらの特性の一部または全部を有する物質または薬剤を指す。
【００７８】
本発明により治療することができる神経変性障害および病態の例としては、パーキンソン病；ハンチントン病；認知症、例えば、アルツハイマー病、多発梗塞性認知症、ＡＩＤＳに関連する認知症、および前頭側頭葉型認知症；脳外傷に関連する神経変性；脳卒中に関連する神経変性、脳梗塞に関連する神経変性；低血糖により誘発される神経変性；てんかん発作に関連する神経変性；神経毒中毒に関連する神経変性；および多系統萎縮症が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７９】
本発明の一実施形態では、神経変性障害または病態は、ヒトを含む哺乳動物における線条体中型有棘ニューロンの神経変性を含む。
【００８０】
本発明の別の実施形態では、神経変性障害または病態はハンチントン病である。
【００８１】
明細書中に引用されている刊行物、特許出願および特許を含む全ての参考文献は、参照によりその内容全体が本明細書に援用され、各参考文献が参照により援用されることが個々に且つ明確に示され、その内容全体が記載されているのと同程度まで（法で認められる最大限まで）、本明細書に援用される。
【００８２】
見出しおよび小見出しは、便宜上本明細書に使用されるに過ぎず、決して本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【００８３】
本明細書における、あらゆる例の使用、または例示に用いる語（「例えば（ｆｏｒ  ｉｎｓｔａｎｃｅ）」、「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」、「例えば（ｅ．ｇ．）」、および「など（ａｓ  ｓｕｃｈ）」を含む）は、発明をより分かり易くすることを目的とするに過ぎず、特記しない限り、発明の範囲を限定するものではない。
【００８４】
本明細書における特許文献の引用および援用は、便宜上行われるに過ぎず、決してこのような特許文献の有効性、特許性および／または法的強制力についての見解を反映するものではない。
【００８５】
本発明は、適用法により認められている通り、本明細書に添付される特許請求の範囲に記載の対象の変更および均等物を全て含むものとする。
【００８６】
本発明の化合物
【表１】
0006532880.tif 000004
【００８７】
実験の項
本発明の化合物の製造
一般的方法
後述の方法の１つを使用してＬＣ−ＭＳ分析データを得た。
【００８８】
方法１：ＥＬＳ検出器を備えるＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＬＣＭＳシステムを使用した。カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  ＴＣ−Ｃ１８  ５μｍ；２．１×５０ｍｍ；カラム温度：５０℃；溶媒系：Ａ＝水／トリフルオロ酢酸（９９．９：０．１）、およびＢ＝アセトニトリル／トリフルオロ酢酸（９９．９５：０．０５）；方法：４．０分でＡ：Ｂ＝９９：１から０：１００に変化し、流速０．８ｍＬ／分の直線勾配溶出。
【００８９】
分取ＳＦＣはＴｈａｒ  ８０装置で行った。例示条件は：カラムＡＤ  ２５０×３０ｍｍ、粒径２０μｍ；カラム温度：３８℃、移動相：超臨界ＣＯ２／ＥｔＯＨ（０．２％ＮＨ３Ｈ２Ｏ）＝４５／５５であってもよいが、これに限定されるものではない。
【実施例】
【００９０】
実施例１：
【化３】
0006532880.tif 000005
ｃｉｓ−４−（７，８−ジメトキシキナゾリン−４−イル）ヘキサヒドロ−２Ｈ−フロ［３，２−ｂ］ピロール：
４−クロロ−７，８−ジメトキシキナゾリン（２．０ｇ、８．９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５０ｍＬ）溶液に、ｃｉｓ−ヘキサヒドロ−２Ｈ−フロ［３，２−ｂ］ピロール（９００ｍｇ、８．１０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（３．４５ｇ、２６．７ｍｍｏｌ）を添加し、それを１２時間還流撹拌した。混合物を濃縮し、分取ＨＰＬＣ（カラムＣ１８、溶離液ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ  ３８／６２〜５８／４２、０．０５％アンモニア溶液）で精製し、ｃｉｓ−４−（７，８−ジメトキシキナゾリン−４−イル）ヘキサヒドロ−２Ｈ−フロ［３，２−ｂ］ピロール（１．３１ｇ、収率：５４．２％）を白色固体として得た。
【００９１】
生成物をＳＦＣでさらに精製し、溶出順に従って番号を付けた。
立体異性体１（ＳＦＣで最初に溶出）：白色固体として４０６ｍｇ（３１％）、
ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）３０２．１（ＭＨ＋）、ｔＲ（分、方法１）＝１．９１２．
［α］２０Ｄ＝３４４．０（ｃ＝０．１ｍｇ／ｍＬ、ＣＨＣｌ３）
【００９２】
この立体異性体は、ＰＤＥ１Ｂ酵素と共結晶化することにより（３ａＳ，６ａＳ）−４−（７，８−ジメトキシキナゾリン−４−イル）ヘキサヒドロ−２Ｈ−フロ［３，２−ｂ］ピロールであると同定された。
【００９３】
立体異性体２（ＳＦＣで２番目に溶出）：白色固体として４１４ｍｇ（３３％）。
ＬＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）３０２．１（ＭＨ＋）、ｔＲ（分、方法１）＝１．９１３．
［α］２０Ｄ＝−３３６．０（ｃ＝０．１ｍｇ／ｍＬ、ＣＨＣｌ３）
【００９４】
これは、立体異性体（３ａＲ，６ａＲ）−４−（７，８−ジメトキシキナゾリン−４−イル）ヘキサヒドロ−２Ｈ−フロ［３，２−ｂ］ピロールである。
【００９５】
ＰＤＥ１阻害アッセイ
ＰＤＥ１Ａ、ＰＤＥ１ＢおよびＰＤＥ１Ｃアッセイは次のように行った：アッセイは、一定量のＰＤＥ１酵素（環状ヌクレオチド基質の２０〜２５％を変換するのに十分な量）と、緩衝剤（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．６；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０）と、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡと、１５ｎＭトリチウム標識ｃＡＭＰと、様々な量の阻害剤とを含有する６０μＬの試料で行った。環状ヌクレオチド基質を添加することにより反応を開始し、反応を室温で１時間進行させた後、２０μＬ（０．２ｍｇ）のケイ酸イットリウムＳＰＡビーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）と混合することにより終了させた。ビーズを暗所で１時間沈降させた後、プレートをＷａｌｌａｃ  １４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ計数器で計数した。測定したシグナルを非阻害対照（１００％）に対する活性に換算し、ＸｌＦｉｔ（モデル２０５、ＩＤＢＳ）を用いてＩＣ５０値を算出した。