(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト細胞死受容体５（ＤＲ５）の２つの異なるエピトープに同時に結合できる二重特異性結合分子である多価ＤＲ５結合分子であって、
前記多価ＤＲ５結合分子は、それぞれがヒトＤＲ５に結合できる４つの抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインの少なくとも一つは３つの軽鎖ＣＤＲドメイン（ＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３）及び３つの重鎖ＣＤＲドメイン（ＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３）を含み、
（ｉ）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を含み、且つ前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、それぞれ配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む；又は
（ｉｉ）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、それぞれ配列番号１４又は１６５、配列番号１５及び配列番号１６のアミノ酸配列を含み、且つ前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む、多価ＤＲ５結合分子。
【請求項２】
ヒトＤＲ５の１つのエピトープに結合できる単一特異性結合分子である多価ＤＲ５結合分子であって、
前記多価ＤＲ５結合分子は、それぞれがヒトＤＲ５に結合できる４つの抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインは３つの軽鎖ＣＤＲドメイン（ＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３）及び３つの重鎖ＣＤＲドメイン（ＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３）を含み、
（ｉ）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を含み、且つ前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、それぞれ配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む；又は
（ｉｉ）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、それぞれ配列番号１４又は１６５、配列番号１５及び配列番号１６のアミノ酸配列を含み、且つ前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む、多価ＤＲ５結合分子。
【請求項３】
前記多価ＤＲ５結合分子は、２つ、３つ又は４つのヒトＤＲ５ポリペプチドに同時に結合できる、請求項１又は２に記載の多価ＤＲ５結合分子。
【請求項４】
前記多価ＤＲ５結合分子は、Ｆｃ領域含有ダイアボディであり、
前記ダイアボディは、２ペアのポリペプチドを含む共有結合複合体であり、
各前記ペアは、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の多価ＤＲ５結合分子。
【請求項５】
（Ａ）前記第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）第１のＤＲ５エピトープに結合できるモノクローナル抗体の可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン（ＶＬ１）；
（ｉｉ）第１のペプチドリンカー（リンカー１）；
（ｉｉｉ）第２のＤＲ５エピトープに結合できるモノクローナル抗体の可変重鎖（ＶＨ）ドメイン（ＶＨ２）；
（ｉｖ）第２のペプチドリンカー（リンカー２）；
（ｖ）Ｅコイルドメイン又はＫコイルドメインを含むヘテロ二量体促進ドメイン；
（ｖｉ）第３のペプチドリンカー（リンカー３）；並びに
（ｖｉｉ）ＩｇＧ免疫グロブリンＦｃ領域のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有するＩｇＧ  Ｆｃ領域のポリペプチド部分
を含み；
（Ｂ）前記第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）前記第２のＤＲ５エピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬ２）；
（ｉｉ）第１のペプチドリンカー（リンカー１）；
（ｉｉｉ）前記第１のＤＲ５エピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨ１）；
（ｉｖ）第２のペプチドリンカー（リンカー２）；並びに
（ｖ）Ｅコイルドメイン又はＫコイルドメインを含むヘテロ二量体促進ドメイン
を含み、前記第１のポリペプチド鎖の前記ヘテロ二量体促進ドメイン及び前記第２のポリペプチド鎖の前記ヘテロ二量体促進ドメインは、両方共がＥコイルドメインではなく、又は両方共がＫコイルドメインではなく；
（ａ）前記第１のポリペプチド鎖の前記ＶＬ１ドメイン及び前記第２のポリペプチド鎖の前記ＶＨ１ドメインは、ＤＲ５の第１のエピトープに特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成し；
（ｂ）前記第１のポリペプチド鎖の前記ＶＨ２ドメイン及び前記第２のポリペプチド鎖の前記ＶＬ２ドメインは、ＤＲ５の第２のエピトープに特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成し；
（ｃ）前記第１のポリペプチド鎖のペアの前記ＣＨ２‐ＣＨ３部分は、ＩｇＧ  Ｆｃ領域を形成する、請求項４に記載の多価ＤＲ５結合分子。
【請求項６】
前記ＶＬ２は、それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインを含み、且つ前記ＶＨ２は、それぞれ配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインを含み、及び
前記ＶＬ１は、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインを含み、
前記ＶＨ１は、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインを含み：
（ｉ）前記ＶＬ１の前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＨ１の前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、それぞれ配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む；又は
（ｉｉ）前記ＶＬ１の前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、それぞれ配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６のアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＨ１の前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む；又は
（ｉｉｉ）前記ＶＬ１の前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、それぞれ配列番号１６５、配列番号１５及び配列番号１６のアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＨ１の前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の多価ＤＲ５結合分子。
【請求項７】
前記ＶＬ２は、それぞれ配列番号１４又は１６５、配列番号１５及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインを含み、且つ前記ＶＨ２は、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインを含み、及び
前記ＶＬ１は、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインを含み、
前記ＶＨ１は、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインを含み：
（ｉ）前記ＶＬ１の前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＨ１の前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、それぞれ配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む；又は
（ｉｉ）前記ＶＬ１の前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、それぞれ配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６のアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＨ１の前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む；又は
（ｉｉｉ）前記ＶＬ１の前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、それぞれ配列番号１６５、配列番号１５及び配列番号１６のアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＨ１の前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の多価ＤＲ５結合分子。
【請求項８】
前記ＶＬ１は、それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインを含み、且つ前記ＶＨ１は、それぞれ配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインを含み、及び
前記ＶＬ２は、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインを含み、
前記ＶＨ２は、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインを含み：
（ｉ）前記ＶＬ２の前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＨ２の前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、それぞれ配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む；又は
（ｉｉ）前記ＶＬ２の前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、それぞれ配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６のアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＨ２の前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む；又は
（ｉｉｉ）前記ＶＬ２の前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、それぞれ配列番号１６５、配列番号１５及び配列番号１６のアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＨ２の前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の多価ＤＲ５結合分子。
【請求項９】
前記ＶＬ１は、それぞれ配列番号１４又は１６５、配列番号１５及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインを含み、且つ前記ＶＨ１は、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインを含み、及び
前記ＶＬ２は、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインを含み、
前記ＶＨ２は、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインを含み：
（ｉ）前記ＶＬ２の前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＨ２の前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、それぞれ配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む；又は
（ｉｉ）前記ＶＬ２の前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、それぞれ配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６のアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＨ２の前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む；又は
（ｉｉｉ）前記ＶＬ２の前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、それぞれ配列番号１６５、配列番号１５及び配列番号１６のアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＨ２の前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の多価ＤＲ５結合分子。
【請求項１０】
前記ＶＬ１及び前記ＶＬ２は、同一のＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインを含み、
前記ＶＨ１及び前記ＶＨ２は、同一のＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインを含む、請求項６〜９のいずれか１項に記載の多価ＤＲ５結合分子。
【請求項１１】
前記ＶＬ２の前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を含み；且つ前記ＶＨ２の前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、それぞれ配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の多価ＤＲ５結合分子。
【請求項１２】
前記ＶＬ２の前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、それぞれ配列番号１４又は１６５、配列番号１５及び配列番号１６のアミノ酸配列を含み、且つ前記ＶＨ２の前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の多価ＤＲ５結合分子。
【請求項１３】
前記ＶＬ１及び前記ＶＬ２は、同一のＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインを含まず、
前記ＶＨ１及び前記ＶＨ２は、同一のＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインを含まない、請求項６〜９のいずれか１項に記載の多価ＤＲ５結合分子。
【請求項１４】
（ｉ）ＶＬ１の前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を含み、且つＶＨ１の前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、それぞれ配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｉｉ）ＶＬ２の前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、それぞれ配列番号１４又は１６５、配列番号１５及び配列番号１６のアミノ酸配列を含み、且つＶＨ２の前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の多価ＤＲ５結合分子。
【請求項１５】
（ｉ）ＶＬ１の前記ＣＤＲＬ１ドメイン、前記ＣＤＲＬ２ドメイン及び前記ＣＤＲＬ３ドメインは、それぞれ配列番号１４又は１６５、配列番号１５及び配列番号１６のアミノ酸配列を含み；且つＶＨ１の前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｉｉ）ＶＬ２の前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を含み；且つＶＨ２の前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、それぞれ配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の多価ＤＲ５結合分子。
【請求項１６】
前記ＶＬ２は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ２は、配列番号８のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｉ）前記ＶＬ１は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ１は、配列番号８のアミノ酸配列を含む；又は
（ｉｉ）前記ＶＬ１は、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ１は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む；又は
（ｉｉｉ）前記ＶＬ１は、配列番号２３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ１は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む；又は
（ｉｖ）前記ＶＬ１は、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ１は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む；又は
（ｖ）前記ＶＬ１は、配列番号２７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ１は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む；又は
（ｖｉ）前記ＶＬ１は、配列番号２９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ１は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の多価ＤＲ５結合分子。
【請求項１７】
前記ＶＬ２は、配列番号１３、２３、２５、２７又は２９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ２は、配列番号１８又は３１のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｉ）前記ＶＬ１は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ１は、配列番号８のアミノ酸配列を含む；又は
（ｉｉ）前記ＶＬ１は、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ１は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む；又は
（ｉｉｉ）前記ＶＬ１は、配列番号２３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ１は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む；又は
（ｉｖ）前記ＶＬ１は、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ１は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む；又は
（ｖ）前記ＶＬ１は、配列番号２７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ１は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む；又は
（ｖｉ）前記ＶＬ１は、配列番号２９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ１は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の多価ＤＲ５結合分子。
【請求項１８】
前記ＶＬ１は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ１は、配列番号８のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｉ）前記ＶＬ２は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ２は、配列番号８のアミノ酸配列を含む；又は
（ｉｉ）前記ＶＬ２は、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ２は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む；又は
（ｉｉｉ）前記ＶＬ２は、配列番号２３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ２は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む；又は
（ｉｖ）前記ＶＬ２は、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ２は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む；又は
（ｖ）前記ＶＬ２は、配列番号２７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ２は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む；又は
（ｖｉ）前記ＶＬ２は、配列番号２９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ２は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の多価ＤＲ５結合分子。
【請求項１９】
前記ＶＬ１は、配列番号１３、２３、２５、２７又は２９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ１は、配列番号１８又は３１のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｉ）前記ＶＬ２は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ２は、配列番号８のアミノ酸配列を含む；又は
（ｉｉ）前記ＶＬ２は、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ２は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む；又は
（ｉｉｉ）前記ＶＬ２は、配列番号２３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ２は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む；又は
（ｉｖ）前記ＶＬ２は、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ２は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む；又は
（ｖ）前記ＶＬ２は、配列番号２７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ２は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む；又は
（ｖｉ）前記ＶＬ２は、配列番号２９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ２は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の多価ＤＲ５結合分子。
【請求項２０】
前記ＶＬ１及び前記ＶＬ２は、同一のアミノ酸配列を含み、
前記ＶＨ１及び前記ＶＨ２は、同一のアミノ酸配列を含む、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の多価ＤＲ５結合分子。
【請求項２１】
前記ＶＬ１及び前記ＶＬ２が同一のアミノ酸配列を含まず、前記ＶＨ１及び前記ＶＨ２が同一のアミノ酸配列を含まない、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の多価ＤＲ５結合分子。
【請求項２２】
（ｉ）前記リンカー１は、配列番号３３のアミノ酸配列を含み、
（ｉｉ）前記リンカー２は、配列番号４７のアミノ酸配列を含み、
（ｉｉｉ）前記Ｅコイルドメインは、は、配列番号４１のアミノ酸配列を含み、
（ｉｖ）前記Ｋコイルドメインは、配列番号４２のアミノ酸配列を含み、
（ｖ）前記リンカー３は、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、
（ｖｉ）前記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、配列番号１又は配列番号１０２のアミノ酸配列を含み、Ｃ末端残基が任意に含まれる、請求項５〜２１のいずれか１項に記載の多価ＤＲ５結合分子。
【請求項２３】
前記Ｆｃ領域は、ＦｃγＲに関する変異体Ｆｃ領域の親和性を低減するか又は前記Ｆｃ領域を安定化する、１つ又は複数のアミノ酸修飾を含む、請求項４〜２２のいずれか１項に記載の多価ＤＲ５結合分子。
【請求項２４】
前記修飾は、Ｌ２３４Ａ；Ｌ２３５Ａ；又はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの置換を含み、前記番号付与はＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスである、請求項２３に記載の多価ＤＲ５結合分子。
【請求項２５】
（ｉ）前記第１のポリペプチド鎖は配列番号１１６若しくは配列番号１２０のアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は配列番号１１８のアミノ酸配列を含む；又は
（ｉｉ）前記第１のポリペプチド鎖は配列番号１２２若しくは配列番号１２６のアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は配列番号１２４のアミノ酸配列を含む；又は
（ｉｉｉ）前記第１のポリペプチド鎖は配列番号１２８若しくは配列番号１３２のアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は配列番号１３０のアミノ酸配列を含む；又は
（ｉｖ）前記第１のポリペプチド鎖は配列番号１３４若しくは配列番号１３８のアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は配列番号１３６のアミノ酸配列を含む；又は
（ｖ）前記第１のポリペプチド鎖は配列番号１４０若しくは配列番号１４４のアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は配列番号１４２のアミノ酸配列を含む；又は
（ｖｉ）前記第１のポリペプチド鎖は配列番号１４６若しくは配列番号１５０のアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は配列番号１４８のアミノ酸配列を含む；又は
（ｖｉｉ）前記第１のポリペプチド鎖は配列番号１５２若しくは配列番号１５６のアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は配列番号１５４のアミノ酸配列を含む；又は
（ｖｉｉｉ）前記第１のポリペプチド鎖は配列番号１５８若しくは配列番号１６２のアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は配列番号１６０のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の多価ＤＲ５結合分子。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の多価ＤＲ５結合分子及び賦形剤を含む、組成物。
【請求項２７】
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を更に含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
細胞を前記分子に曝露することによって細胞死を促進するための薬剤の製造における、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の多価ＤＲ５結合分子、又は請求項２６若しくは２７に記載の組成物の使用。
【請求項２９】
前記細胞は腫瘍細胞である、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記腫瘍細胞は、癌幹細胞様細胞である、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記細胞は更に、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤に曝露される、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３２】
癌の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の多価ＤＲ５結合分子、又は請求項２６若しくは２７に記載の組成物の使用。
【請求項３３】
前記薬剤は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤と組み合わせて使用するためのものである、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
癌の診断又は予後のための薬剤の製造における使用であって、前記分子は検出可能に標識される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の多価ＤＲ５結合分子、又は請求項２６若しくは２７に記載の組成物の使用。
【請求項３５】
前記癌は、副腎腫瘍；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星状細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄の癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；嫌色素性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；胆嚢又は胆管癌；消化器癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；膵島細胞腫瘍；カポジ肉腫；腎癌；白血病；脂肪肉腫／悪性脂肪腫；肝癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；卵巣癌；膵臓癌；甲状腺乳頭癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移癌；並びに子宮癌からなる群から選択される、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３６】
前記癌は、結腸直腸癌；肝細胞癌；神経膠腫；腎癌；乳癌；多発性骨髄腫；膀胱癌；神経芽細胞腫；肉腫；非ホジキンリンパ腫；非小細胞肺癌；卵巣癌；膵臓癌並びに直腸からなる群から選択される、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３７】
前記癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；；急性Ｂリンパ芽球性白血病（Ｂ‐ＡＬＬ）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；有毛細胞白血病（ＨＣＬ）；芽形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）；マントル細胞白血病（ＭＣＬ）及び小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）を含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；ホジキンリンパ腫；全身性肥満細胞症；並びにバーキットリンパ腫からなる群から選択される、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３８】
ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインを含むＶＬドメイン、並びにＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインを含むＶＨドメインを有する多価ＤＲ５結合分子であって、
（ｉ）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を含み、且つ前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、それぞれ配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む；又は
（ｉｉ）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、それぞれ配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６のアミノ酸配列を含み、且つ前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む；又は
（ｉｉｉ）前記ＣＤＲL１ドメイン、前記ＣＤＲL２ドメイン及び前記ＣＤＲL３ドメインは、それぞれ配列番号１６５、配列番号１５及び配列番号１６のアミノ酸配列を含み、且つ前記ＣＤＲH１ドメイン、前記ＣＤＲH２ドメイン及び前記ＣＤＲH３ドメインは、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む、多価ＤＲ５結合分子。
【請求項３９】
請求項３８に記載の多価ＤＲ５結合分子及び賦形剤を含む、組成物。
【請求項４０】
前記多価ＤＲ５結合分子は、Ｆｃ領域含有ダイアボディであり、
前記ダイアボディは、２ペアのポリペプチドを含む共有結合複合体であり、
各前記ペアは、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含む、請求項３８に記載の多価ＤＲ５結合分子。
【請求項４１】
前記Ｆｃ領域は、ＦｃγＲに関する変異体Ｆｃ領域の親和性を低減するか又は前記Ｆｃ領域を安定化する、１つ又は複数のアミノ酸修飾を含む、請求項４０に記載の多価ＤＲ５結合分子。
【請求項４２】
前記修飾は、Ｌ２３４Ａ；Ｌ２３５Ａ；又はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの置換を含み、前記番号付与はＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスである、請求項４１に記載の多価ＤＲ５結合分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許出願第６２／１４９、１３９号（２０１５年４月１７日出願；係属）及び米国特許出願第６２／１０７，８７１号（２０１５年１月２６日出願；係属）に対する優先権を主張するものであり、上述の特許出願はそれぞれ、参照によりその全体が本出願に援用される。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、連邦規則法典第３７巻第１．８２１節以下による１つ又は複数の配列表を含み、これらの配列表は、コンピュータ可読媒体（ファイル名：１３０１＿０１１８ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、２０１５年５月１８日作成、サイズ：２１５，０８４バイト）において開示されており、上記ファイルは、参照によりその全体が本出願に援用される。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、抗ＤＲ５抗体の１つ又は複数の結合ドメイン、特に抗ヒトＤＲ５抗体の１つ又は複数の結合ドメインを含む、多価ＤＲ５結合分子を対象とする。本発明のＤＲ５結合分子は、２つ、３つ又は４つのＤＲ５結合ドメインを有する２価及び４価分子を含み、上記ＤＲ５結合ドメインはそれぞれ、ヒトＤＲ５に結合できる。特に本発明は、ダイアボディ、より詳細には２つ以上のポリペプチド鎖の共有結合複合体を含むダイアボディを含む、多価ＤＲ５結合分子を対象とする。本発明は特に、抗ＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １及び／若しくはＤＲ５  ｍＡｂ  ２、並びに／又は上記抗体のヒト化及びキメラバージョンの断片を含む、上記多価ＤＲ５結合分子に関係する。
【０００４】
Ｉ．細胞死受容体５（「ＤＲ５」）
健康な動物は、腫瘍細胞に対する継続的な免疫監視を維持している。様々な成長因子、サイトカイン及びホルモンの相互作用により、このような動物は、遭遇した損傷細胞のプログラム死（アポトーシス）を仲介できる。この細胞死プロセスに対する抵抗性を獲得し、また制御されない様式での複製の能力を獲得している損傷細胞は、腫瘍細胞となり得、癌につながり得る（非特許文献１〜４）。
【０００５】
細胞死経路を選択的に標的化して、正常な細胞を保護しながら、癌細胞の殺滅における上記経路の有効性を増大させる方法は、癌の治療において特に関心を集めている。Ｆａｓリガンド、ＴＮＦ及びＴＮＦ関連アポトーシス誘発リガンド（ＴＲＡＩＬ）を含む、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバーが、癌の生物療法の標的として同定されている（非特許文献５、６、１）。ＴＲＡＩＬは、エフェクタリンパ球が発現するサイトカインである。ＴＲＡＩＬは、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、樹状細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞等の免疫エフェクタ細胞の表面において、サイトカイン、特にＴＲＡＩＬ遺伝子プロモータに応答要素を有するインターフェロンγに応答して発現する（非特許文献７）。その発現レベルは、新しく単離されたリンパ球では極めて低く、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のごく一部のみが、検出可能なＴＲＡＩＬを発現する。ＴＲＡＩＬは、インターフェロンが関与する先天的免疫応答を調節し、腫瘍細胞に対する宿主応答を高め、腫瘍微小環境を変化させることによって、抗原提示を増強し、ＮＫ細胞及び他の免疫系細胞による組織浸潤を促進する役割を果たすと考えられている。
【０００６】
ＴＲＡＩＬ誘発型アポトーシスと、従来の化学療法及び放射線療法によって誘発されるアポトーシスとの重要な１つの差異は、後者が、例えばｐ５３腫瘍抑制因子タンパク質による細胞損傷認識に大きく依存することである（非特許文献８）。アポトーシス応答の誘発のためにｐ５３に依存することは、癌治療において問題を提起する。というのは、不活性化突然変異により、全癌細胞の半分以上においてｐ５３の喪失が発生するためである（非特許文献９）。
【０００７】
ＴＲＡＩＬは、２８１個のアミノ酸残基を有するＩＩ型タンパク質であり、ＴＮＦ‐α及びＦａｓＬ（ＣＤ９５Ｌ）と相同性を有する（非特許文献４）。ＴＲＡＩＬは、細胞外ＴＮＦ様ドメイン、細胞外ストーク、膜貫通ヘリックス及び細胞質ドメインからなる。ＴＲＡＩＬは、２つの異なる受容体：ＴＲＡＩＬ誘発型アポトーシスをトリガする細胞死受容体（ＤＲ）、及びこの経路を阻害するデコイ受容体に結合する。現在までに、ＴＲＡＩＬに対して特異的な２つのヒト細胞死受容体：ＴＲＡＩＬ‐Ｒ１（ＤＲ４としても知られる）及びＴＲＡＩＬ‐Ｒ２（ＤＲ５としても知られる）が認識されている。更に、３つの推定デコイ受容体：ＴＲＡＩＬ‐Ｒ３（ＤｃＲ１）、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ４（ＤｃＲ２）及びオステオプロテゲリンが同定されている（非特許文献４、３、７）。ＴＲＡＩＬ‐Ｒ１（ＤＲ４）は、脾臓、胸腺、肝臓、末梢血白血球、活性化Ｔ細胞、小腸及びいくつかの腫瘍細胞株を含むほとんどのヒト組織において、極めて低レベルで発現する。対照的に、ＴＲＡＩＬ‐Ｒ２（ＤＲ５）は、正常な細胞株及び腫瘍細胞株の両方に広範に分布しているが、脾臓、末梢血白血球、活性化リンパ球及び肝細胞において、より豊富である（非特許文献１）。
【０００８】
ＤＲ４及びＤＲ５は、シングルパスＩ型膜タンパク質であり、染色体８ｐ上に位置する２つの遺伝子によってコードされる。ＤＲ４及びＤＲ５はそれぞれ細胞外領域を含有し、上記細胞外領域は、受容体の細胞質部分内に位置するシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）、膜貫通ドメイン及び細胞死ドメインを含む。ＤＲ５の２つのスプライス変異体：長ＤＲ５（ＤＲ５（Ｌ））及び短ＤＲ５（ＤＲ５（Ｓ））が同定されている。これらの変異体は、受容体のＣＲＤと膜貫通ドメインとの間に位置する２９個のアミノ酸のストレッチが異なる。ＤＲ４及びＤＲ５は、ＴＲＡＩＬ結合に続いてアポトーシスシグナルを伝達できる（非特許文献１０）。
【０００９】
ＴＲＡＩＬがＤＲ４又はＤＲ５に結合すると、受容体がホモ三量化し、これにより受容体の細胞死ドメインは、アダプタタンパク質Ｆａｓ関連細胞死細胞と、カスパーゼ８の不活性な非切断形態（プロカスパーゼ８）又はカスパーゼ１０の不活性な非切断形態（プロカスパーゼ１０）とを動員できる。受容体、細胞死ドメインを有するＦａｓ関連タンパク質、及びプロカスパーゼ８又はプロカスパーゼ１０は共に、細胞死誘発シグナリング複合体（ＤＩＳＣ）を形成する。ＤＩＳＣにおいてプロカスパーゼ８は、二量体化及び切断の両方に依存するプロセスにおいて活性化される。次に、活性化されたカスパーゼ８は、下流の基質を切断し、これは最終的にエフェクタカスパーゼ３の切断及び活性化をもたらす。カスパーゼ３の活性化は、一連の分子活性化イベントを開始させ、これは最終的に細胞死基質の産生につながる（非特許文献１１、１２、６、１３、１４、８、１５、１６、２、１７）。上記３つのデコイ受容体は、デコイとして作用するか、又は抗アポトーシスシグナルを伝達する（非特許文献３）。
【００１０】
このような「外因性（ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ）」経路に加えて、ＴＲＡＩＬは「内因性（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ）」経路を介して細胞死を仲介し得る（非特許文献３、１６、１５）。この内因性経路は、プロアポトーシスタンパク質Ｂｉｄの切断活性化によって仲介され、上記プロアポトーシスタンパク質Ｂｉｄはその後、他のプロアポトーシスタンパク質と結合して、ミトコンドリアからのチトクロームｃの放出を仲介する複合体を形成する。このような放出は、細胞死につながる一連のカスパーゼ放出及び活性化をトリガする（非特許文献１８、１９）。
【００１１】
しかしながら上記分子経路は複雑である。細胞のタイプ、リガンド信号の相対強度及び持続時間、並びにＴＲＡＩＬ受容体の下流に信号送信する細胞内タンパク質の存在、不在又は活性化に応じて、ＴＲＡＩＬによる処置は、アポトーシスを刺激する場合もあり、又は稀な例ではあるが細胞増殖を刺激する場合もある（非特許文献１、２）。更に、特定の癌は、アポトーシスの誘発のためのＤＲ選好（即ちＤＲ４又はＤＲ５）を有するが、他の腫瘍タイプはこれを有しない（非特許文献１０）。
【００１２】
ＩＩ．ＴＲＡＩＬタンパク質及び抗ＤＲ抗体の治療における使用
ＴＲＡＩＬは、正常な細胞を保護しながら損傷細胞を認識及び殺滅する能力において極めて選択的であるため、可溶性組み換えＴＲＡＩＬは、癌（例えば結腸直腸癌、肝細胞癌、神経膠腫、腎臓癌、乳癌、多発性骨髄腫、膀胱癌、神経芽細胞腫、肉腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌及び直腸癌）の治療に潜在的な有用性を有すると言われてきた（非特許文献２０、１２、１６、２１、１５、１、２２〜３２を参照）。
【００１３】
ＴＲＡＩＬのシグナリングを模倣できる抗ＤＲ４及び抗ＤＲ５モノクローナル抗体が、より高い選択性を提供するものとして提案されている（非特許文献１６、３３〜３５）。
【００１４】
抗ＤＲ４アゴニスト抗体であるマパツムマブ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の３つの第ＩＩ相臨床試験は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、結腸直腸癌（ＣＲＣ）及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に罹患した患者において、治療効果を示すことが報告されている（非特許文献３６、３７、１２）。ヒト化抗ＤＲ５抗体であるＴＲＡ‐８／ＣＳ‐１００８（第一三共（日本、東京））は、インビトロの星状細胞腫及び白血病細胞、並びにインビボの生着させた乳癌細胞に対して、高い抗腫瘍活性を示したことが報告されている（非特許文献３８〜４０）。マウス抗ヒト抗ＤＲ５モノクローナル抗体であるｍＤＲＡ‐６（ＩｇＧ１‐ｋ）（Ｈｅｎａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）は、ＴＲＡＩＬ外因性経路を介して、Ｊｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスを誘発できることが報告されている（非特許文献４１）。キメラＤＲ‐５標的化抗体ＬＢＹ１３５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）は、４０個のヒト結腸癌細胞株の５０％においてアポトーシスを誘発すること（ＩＣ５０＝１０ｎＭ以下）、及びマウスにおける結腸直腸異種移植モデルにおいてインビボ抗腫瘍活性が確認されたことが報告されている（非特許文献４２、４３）。臨床開発中の更なる抗ＤＲ抗体としては：ＡｐｏｍＡｂ（非特許文献４４、４５）；ＡＭＧ６５５（非特許文献４６）；コナツムマブ（非特許文献４７）；抗ＤＲ５アゴニスト抗体であるレキサツムマブ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（非特許文献４８）；ドロジツマブ（非特許文献４９〜５２）及びＫＭＴＲ２（非特許文献５３、５４）が挙げられる。
【００１５】
抗ＤＲ抗体の使用は、以下に概説されている：非特許文献１２、２３、２５、２６、２８、３０、５５、３４、２０、１０。
【００１６】
現在のデータは、このような作用剤は耐用性が高く、１２日未満の血漿中半減期を有することを示唆しているが、この療法の潜在的な用途は、いくつかの原発性癌細胞が、化学療法との併用治療後でさえ、ＴＲＡＩＬアポトーシスに対する耐性を有するという事実によって制限される（非特許文献１５、１２、５６）。
【００１７】
このような抗体療法の見込みにもかかわらず、研究により、いくつかの抗ＤＲモノクローナル抗体は臨床使用に十分な選択性を示さないことが示されている。これは、報告されている９個の変異体のうち１つの特定のアイソフォームのみがこのような選択性を示すという事実を反映したものであり得る（非特許文献７）。いくつかのｒＴＲＡＩＬ及び抗ＤＲモノクローナル抗体による、幹細胞又はケラチノサイト等の正常なヒト細胞におけるアポトーシスの誘発が、インビトロで観察されている（非特許文献５７〜６０）。より高い用量（２０ｍｇ／ｋｇ）のＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓからのレキサツムマブ抗ＤＲ５アゴニスト抗体で処置した場合に、少数の患者において、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ及びビリルビンの増加を伴う肝毒性が報告されている（非特許文献４８）。
【００１８】
抗ＤＲ抗体は、特許文献１〜５８において開示されている。
【００１９】
腫瘍抗原に結合できるｓｃＦｖドメインと、細胞死受容体又はＦａｓに結合できる可溶性ＴＲＡＩＬ（ｓＴＲＡＩＬ）又はＦａｓ（ＣＤ９５）リガンド（ＦａｓＬ）ドメインとを有する二重特異性抗体分子も提案されている（非特許文献２１参照）。ｓＴＲＡＩＬ及びｓＦａｓＬへの腫瘍選択性抗体断片のこのような遺伝子的融合は、好ましい抗癌特性を伴う高選択性抗癌療法をもたらした。しかしながら、採用された融合タンパク質のサイズは、非標的化可溶性リガンドの２倍であった。従ってこのアプローチは、融合タンパク質を複数の細胞を通して拡散させて固形腫瘍に侵入させるのが比較的困難であることにより、制限されるように思われる（非特許文献３５）。ＤＲ５に結合できる二重特異性抗体分子は、特許文献１８、１９、２５、２７、３５、３８、３９、４３、４８、５２、５３、５４、５６、５８に開示されている。
【００２０】
ＴＲＡＩＬは、癌の治療におけるその能力に加えて、細菌性病原体の治療のための潜在的な治療薬として提案されている（非特許文献６１）。ＴＲＡＩＬはまた、好酸球を含む様々な炎症細胞によって発現されるため、喘息の気道の構造的変化に関与し得る（非特許文献４）。可溶性ＴＲＡＩＬ調製物の使用の１つの欠点は、インビボ半減期が比較的短い（およそ３０分：非特許文献６２）である。更に、可溶性組み換えＴＲＡＩＬは、ＴＲＡＩＬ受容体に結合でき（従って癌治療を促進し）、またＴＲＡＩＬデコイ受容体に結合できる（従って治療上の利益をもたらさないと推定される）。ＴＲＡＩＬはまた、心血管疾患（非特許文献６３）及び炎症（非特許文献５）にも関与し得る。
【００２１】
ＴＲＡＩＬ療法を使用した臨床試験は患者において低い毒性を示したが、残念なことに、ＴＲＡＩＬアゴニストを単剤療法として使用した場合、観察された治療効果は小さかった（非特許文献８）。この結論は、腫瘍細胞に進化した損傷細胞のかなりの部分がＴＲＡＩＬ耐性であることが判明したことを反映している。このような経験から、ＴＲＡＩＬ療法は非常に有益であり得るものの、それは患者のごく一部に対してのみであるという結論がもたらされた（非特許文献８）。
【００２２】
ＴＲＡＩＬ耐性の複数の機序が同定されている（非特許文献５６、８、６４、６５）。仮説の中には、ＴＲＡＩＬ耐性腫瘍細胞による特定のカスパーゼ（例えばカスパーゼ８）の発現の低下、又は上記細胞によるカスパーゼ阻害剤（例えばＸＩＡＰ、ｃＩＡＰ）の発現の増加、若しくはアポトーシスの阻害剤（例えばＢｃｌ‐２、Ｍｃｌ‐１等）の発現の増加がある（非特許文献１、１６）。あるいはＴＲＡＩＬ耐性は、腫瘍細胞におけるＴＲＡＩＬ受容体の欠陥の存在、又はＦＬＩＰ若しくは受容体ＴＲＡＩＬ‐Ｒ３及びＴＲＡＩＬ‐Ｒ４等の細胞死受容体に対して高い選択性を有する阻害剤の発現の増加を反映したものであり得る。非特許文献１を参照。このような耐性に鑑みて、ＴＲＡＩＬ系療法は典型的には、他の化学療法剤と共に供給される作用剤としてのみ提案されている（非特許文献１６）。
【００２３】
従って、過去のあらゆる進歩にもかかわらず、癌又は他の疾患又は状態に罹患した患者に改善された治療的価値を提供できる、抗ＤＲ５抗体、及びＤＲ５結合ドメインを含む分子が、必要とされ続けている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２４】
【特許文献１】米国特許第８，７９０，６６３号
【特許文献２】米国特許第８，７１５，６６８号
【特許文献３】米国特許第８，７０３，７１２号
【特許文献４】米国特許第８，４６１，３１１号
【特許文献５】米国特許第８，４０９，５７０号
【特許文献６】米国特許第８，３７２，３９６号
【特許文献７】米国特許第８，３２９，１８０号
【特許文献８】米国特許第８，１７３，１２８号
【特許文献９】米国特許第８，０９７，７０４号
【特許文献１０】米国特許第８，０６７，００１号
【特許文献１１】米国特許第８，０３０，０２３号
【特許文献１２】米国特許第８，０２９，７８３号
【特許文献１３】米国特許第７，９８１，４２１号
【特許文献１４】米国特許第７，８９７，７３０号
【特許文献１５】米国特許第７，８９３，２１６号
【特許文献１６】米国特許第７７０４５０２号
【特許文献１７】米国特許第７，４７６，３８３号
【特許文献１８】米国公開特許第２０１４／０３７００１９号
【特許文献１９】米国公開特許第２０１４／０３０８２８８号
【特許文献２０】米国公開特許第２０１４／０１０５８９８号
【特許文献２１】米国公開特許第２０１４／０００４１２０号
【特許文献２２】米国公開特許第２０１４／００１０８１２号
【特許文献２３】米国公開特許第２０１３／０３２４４３３号
【特許文献２４】米国公開特許第２０１３／０２８０２８２号
【特許文献２５】米国公開特許第２０１３／０２４３７８０号
【特許文献２６】米国公開特許第２０１３／００６４８３８号
【特許文献２７】米国公開特許第２０１２／０１８４７１８号
【特許文献２８】米国公開特許第２０１２／００８７９２２号
【特許文献２９】米国公開特許第２０１２／００７０４３２号
【特許文献３０】米国公開特許第２０１１／００７０２４８号
【特許文献３１】米国公開特許第２０１０／００８０８０６号
【特許文献３２】米国公開特許第２００９／０３１７３８４号
【特許文献３３】米国公開特許第２００９／０３１７３９６号
【特許文献３４】米国公開特許第２００９／０２０８４８３号
【特許文献３５】米国公開特許第２００９／０１７５８５４号
【特許文献３６】米国公開特許第２００９／０１３６５０３号
【特許文献３７】欧州公開特許第２０２１３７０号
【特許文献３８】欧州公開特許第１７９０６６３号
【特許文献３９】欧州公開特許第２０５９５３３号
【特許文献４０】欧州公開特許第１５０６２８５号
【特許文献４１】欧州公開特許第１５７６１７９号
【特許文献４２】欧州公開特許第２６３６７３６号
【特許文献４３】欧州公開特許第２６８４８９６号
【特許文献４４】欧州公開特許第２５６９３３６号
【特許文献４５】欧州公開特許第２０４６８３６号
【特許文献４６】欧州公開特許第２４８０２３０号
【特許文献４７】欧州公開特許第２３６８９１０号
【特許文献４８】欧州公開特許第２３５０６４１号
【特許文献４９】欧州公開特許第２２９２７９４号
【特許文献５０】欧州公開特許第２２８７２８５号
【特許文献５１】欧州公開特許第２０２１３７０号
【特許文献５２】国際公開第２０１４／１５９５６２号
【特許文献５３】国際公開第２０１４／１６１８４５号
【特許文献５４】国際公開第２０１４／０５０７７９号
【特許文献５５】国際公開第２０１４／０３５４７４号
【特許文献５６】国際公開第２０１４／００９３５８号
【特許文献５７】国際公開第２０１３／１６３２２９号
【特許文献５８】国際公開第２０１３／１４８８７７号
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】Abdulghani, J. et al. (2010) “TRAIL Receptor Signaling And Therapeutics,” Expert Opin. Ther. Targets 14(10):1091-1108
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【非特許文献６５】Whiteside, T.L. (2007) “The Role of Death Receptor Ligands in Shaping Tumor Microenvironment,” Immunol. Investig. 36:25-46
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明は、抗ＤＲ５抗体の１つ又は複数の結合ドメイン、特に抗ヒトＤＲ５抗体の１つ又は複数の結合ドメインを含む、多価ＤＲ５結合分子を対象とする。本発明のＤＲ５結合分子は、２つ、３つ又は４つのＤＲ５結合ドメインを有する２価及び４価分子を含み、上記ＤＲ５結合ドメインはそれぞれ、ヒトＤＲ５に結合できる。特に本発明は、ダイアボディ、より詳細には２つ以上のポリペプチド鎖の共有結合複合体を含むダイアボディを含む、多価ＤＲ５結合分子を対象とする。本発明は特に、抗ＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １及び／若しくはＤＲ５  ｍＡｂ  ２、並びに／又は上記抗体のヒト化及びキメラバージョンの断片を含む、上記多価ＤＲ５結合分子に関係する。
【００２７】
詳細には、本発明は、ヒト細胞死受容体５（ＤＲ５）の２つの異なるエピトープに同時に結合できる二重特異性結合分子である多価ＤＲ５結合分子を提供し、上記多価ＤＲ５結合分子は、それぞれがヒトＤＲ５に結合できる４つの抗原結合ドメインを含む。本発明はまた、ヒトＤＲ５の１つのエピトープに結合できる単一特異性結合分子である多価ＤＲ５結合分子も提供する。上記多価ＤＲ５結合分子は、それぞれがヒトＤＲ５に結合できる４つの抗原結合ドメインを含む。本発明は特に、２つ、３つ又は４つのヒトＤＲ５ポリペプチドに同時に結合できる、全ての上記多価ＤＲ５結合分子の実施形態に関する。
【００２８】
本発明は更に、上記多価ＤＲ５結合分子がＦｃ領域含有ダイアボディであり、上記ダイアボディが、２ペアのポリペプチドを含む共有結合複合体であり、各ペアが第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含む、上記多価ＤＲ５結合分子の実施形態に関する。
【００２９】
本発明は更に、以下のような、上記多価ＤＲ５結合分子の実施形態に関する：
（Ａ）上記第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）第１のＤＲ５エピトープに結合できるモノクローナル抗体の可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン（ＶＬ１）；
（ｉｉ）第１のペプチドリンカー（リンカー１）；
（ｉｉｉ）第２のＤＲ５エピトープに結合できるモノクローナル抗体の可変重鎖（ＶＨ）ドメイン（ＶＨ２）；
（ｉｖ）第２のペプチドリンカー（リンカー２）；
（ｖ）Ｅコイルドメイン又はＫコイルドメインを含むヘテロ二量体促進ドメイン；
（ｖｉ）第３のペプチドリンカー（リンカー３）；並びに
（ｖｉｉ）ＩｇＧ免疫グロブリンＦｃ領域のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有するＩｇＧ  Ｆｃ領域のポリペプチド部分
を備え；
（Ｂ）上記第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）上記第２のＤＲ５エピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬ２）；
（ｉｉ）第１のペプチドリンカー（リンカー１）；
（ｉｉｉ）上記第１のＤＲ５エピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨ１）；
（ｉｖ）第２のペプチドリンカー（リンカー２）；並びに
（ｖ）Ｅコイルドメイン又はＫコイルドメインを備えるヘテロ二量体促進ドメイン
を備え、上記第１のポリペプチド鎖の上記ヘテロ二量体促進ドメイン及び上記第２のポリペプチド鎖の上記ヘテロ二量体促進ドメインは、両方共がＥコイルドメインではなく、又は両方共がＫコイルドメインではなく；
（ａ）上記第１のポリペプチド鎖の上記ＶＬ１ドメイン及び上記第２のポリペプチド鎖の上記ＶＨ１ドメインは、ＤＲ５の第１のエピトープに特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成し；
（ｂ）上記第１のポリペプチド鎖の上記ＶＨ２ドメイン及び上記第２のポリペプチド鎖の上記ＶＬ２ドメインは、ＤＲ５の第２のエピトープに特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成し；
（ｃ）上記第１のポリペプチド鎖のペアの上記ＣＨ２‐ＣＨ３部分は、ＩｇＧ  Ｆｃ領域を形成する。
【００３０】
本発明は更に、以下のような、上記多価ＤＲ５結合分子の実施形態に関する：
（ｉ）上記リンカー１は、配列番号３３のアミノ酸配列を有し、
（ｉｉ）上記リンカー１は、配列番号４７のアミノ酸配列を有し、
（ｉｉｉ）上記Ｅコイルドメインは、は、配列番号４１のアミノ酸配列を有し、
（ｉｖ）上記Ｋコイルドメインは、配列番号４２のアミノ酸配列を有し、
（ｖ）上記リンカー３は、配列番号５１のアミノ酸配列を有し、
（ｖｉ）上記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、配列番号１又は配列番号１０２のアミノ酸配列を有し、Ｃ末端残基が任意に含まれる。
【００３１】
本発明は更に、上記Ｆｃ領域が、ＦｃγＲに関する変異体Ｆｃ領域の親和性を低減するか又は上記Ｆｃ領域を安定化する、１つ又は複数のアミノ酸修飾を含む、全ての上記多価ＤＲ５結合分子の実施形態に関する。本発明は更に、上記修飾がＬ２３４Ａ；Ｌ２３５Ａ；又はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの置換を含む、全ての上記多価ＤＲ５結合分子の実施形態に関する。
【００３２】
本発明は特に、上記ＶＬ１がＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインを含み、上記ＶＨ１がＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインを含み：
（ｉ）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  １の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号４、配列番号５及び配列番号６を有し、また上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  １の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１を有する；又は
（ｉｉ）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６を有し、また上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１を有する；又は
（ｉｉｉ）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメインは、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐３の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１６２、配列番号１５及び配列番号１６を有し、また上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメインは、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＨ‐３の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１を有する；又は
（ｉｖ）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号５５、配列番号５６及び配列番号５７を有し、また上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号５９、配列番号６０及び配列番号６１を有する；又は
（ｖ）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号６３、配列番号６４及び配列番号６５を有し、また上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号６７、配列番号６８及び配列番号６９を有する；又は
（ｖｉ）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号７１、配列番号７２及び配列番号７３を有し、また上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号７５、配列番号７６及び配列番号７７を有する；又は
（ｖｉｉ）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号７９、配列番号８０及び配列番号８１を有し、また上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号８３、配列番号８４及び配列番号８５を有する；又は
（ｖｉｉｉ）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号８７、配列番号８８及び配列番号８９を有し、また上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号９１、配列番号９２及び配列番号９３を有する；又は
（ｉｘ）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号９５、配列番号９６及び配列番号９７を有し、また上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号９９、配列番号１００及び配列番号１０１を有する、多価ＤＲ５結合分子の実施形態に関する。
【００３３】
本発明は特に、上記ＶＬ２がＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインを含み、上記ＶＨ２がＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインを含み：
（ｉ）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  １の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号４、配列番号５及び配列番号６を有し、また上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  １の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１を有する；又は
（ｉｉ）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６を有し、また上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１を有する；又は
（ｉｉｉ）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１６２、配列番号１５及び配列番号１６を有し、また上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１を有する；又は
（ｉｖ）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号５５、配列番号５６及び配列番号５７を有し、また上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号５９、配列番号６０及び配列番号６１を有する；又は
（ｖ）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号６３、配列番号６４及び配列番号６５を有し、また上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号６７、配列番号６８及び配列番号６９を有する；又は
（ｖｉ）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号７１、配列番号７２及び配列番号７３を有し、また上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号７５、配列番号７６及び配列番号７７を有する；又は
（ｖｉｉ）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号７９、配列番号８０及び配列番号８１を有し、また上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号８３、配列番号８４及び配列番号８５を有する；又は
（ｖｉｉｉ）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号８７、配列番号８８及び配列番号８９を有し、また上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号９１、配列番号９２及び配列番号９３を有する；又は
（ｉｘ）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号９５、配列番号９６及び配列番号９７を有し、また上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号９９、配列番号１００及び配列番号１０１を有する、多価ＤＲ５結合分子の実施形態に関する。
【００３４】
本発明は更に、上記ＶＬ１及び上記ＶＬ２が同一のＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインを含み、上記ＶＨ１及び上記ＶＨ２が同一のＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインを含む、上記多価ＤＲ５結合分子の実施形態に関し、また特に、以下のような上記多価ＤＲ５結合分子の実施形態に関する：
（ｉ）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  １の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号４、配列番号５及び配列番号６を有し、また上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  １の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１を有する；又は
（ｉｉ）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメインは、ＤＲ５  ｍａｂ  ２の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６を有し、また上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１を有する；又は
（ｉｉｉ）上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１６２、配列番号１５及び配列番号１６を有し、また上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１を有する。
【００３５】
本発明は更に、上記ＶＬ１及び上記ＶＬ２が同一のＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインを含まず、上記ＶＨ１及び上記ＶＨ２が同一のＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインを含まない、上記多価ＤＲ５結合分子の実施形態に関し、また特に、以下のような上記多価ＤＲ５結合分子の実施形態に関する：
（ｉ）ＶＬ１の上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  １の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号４、配列番号５及び配列番号６を有し、またＶＨ１の上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  １の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１を有し；またＶＬ２の上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６を有し、またＶＨ２の上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１を有する；又は
（ｉｉ）ＶＬ１の上上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６を有し、またＶＨ１の上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１を有し；またＶＬ２の上記ＣＤＲL１ドメイン、上記ＣＤＲL２ドメイン及び上記ＣＤＲL３ドメインドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  １の軽鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号４、配列番号５及び配列番号６を有し、またＶＨ２の上記ＣＤＲH１ドメイン、上記ＣＤＲH２ドメイン及び上記ＣＤＲH３ドメインは、ＤＲ５  ｍＡｂ  １の重鎖ＣＤＲであり、それぞれアミノ酸配列：配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１を有する。
【００３６】
本発明は更に、以下のような上記多価ＤＲ５結合分子の実施形態に関する：
（Ａ）（ｉ）上記ＶＬ１は、配列番号３のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨ１は、配列番号８のアミノ酸配列を有し；又は
（ｉｉ）上記ＶＬ１は、配列番号１３のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨ１は、配列番号１８のアミノ酸配列を有し；又は
（ｉｉｉ）上記ＶＬ１は、配列番号２３のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨ１は、配列番号３１のアミノ酸配列を有し；又は
（ｉｖ）上記ＶＬ１は、配列番号２５のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨ１は、配列番号３１のアミノ酸配列を有し；又は
（ｖ）上記ＶＬ１は、配列番号２７のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨ１は、配列番号３１のアミノ酸配列を有し；又は
（ｖｉ）上記ＶＬ１は、配列番号２９のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨ１は、配列番号３１のアミノ酸配列を有し；又は
（ｖｉｉ）上記ＶＬ１は、配列番号５４のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨ１は、配列番号５８のアミノ酸配列を有し；又は
（ｖｉｉｉ）上記ＶＬ１は、配列番号６２のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨ１は、配列番号６６のアミノ酸配列を有し；又は
（ｉｘ）上記ＶＬ１は、配列番号７０のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨ１は、配列番号７４のアミノ酸配列を有し；又は
（ｘ）上記ＶＬ１は、配列番号７８のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨ１は、配列番号８２のアミノ酸配列を有し；又は
（ｘｉ）上記ＶＬ１は、配列番号８６のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨ１は、配列番号９０のアミノ酸配列を有し；又は
（ｘｉｉ）上記ＶＬ１は、配列番号９４のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨ１は、配列番号９８のアミノ酸配列を有し、また
（Ｂ）（ｉ）上記ＶＬ２は、配列番号３のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨ２は、配列番号８のアミノ酸配列を有し；又は
（ｉｉ）上記ＶＬ２は、配列番号１３のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨ２は、配列番号１８のアミノ酸配列を有し；又は
（ｉｉｉ）上記ＶＬ２は、配列番号２３のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨ２は、配列番号３１のアミノ酸配列を有し；又は
（ｉｖ）上記ＶＬ２は、配列番号２５のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨ２は、配列番号３１のアミノ酸配列を有し；又は
（ｖ）上記ＶＬ２は、配列番号２７のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨ２は、配列番号３１のアミノ酸配列を有し；又は
（ｖｉ）上記ＶＬ２は、配列番号２９のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨ２は、配列番号３１のアミノ酸配列を有し；又は
（ｖｉｉ）上記ＶＬ２は、配列番号５４のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨ２は、配列番号５８のアミノ酸配列を有し；又は
（ｖｉｉｉ）上記ＶＬ２は、配列番号６２のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨ２は、配列番号６６のアミノ酸配列を有し；又は
（ｉｘ）上記ＶＬ２は、配列番号７０のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨ２は、配列番号７４のアミノ酸配列を有し；又は
（ｘ）上記ＶＬ２は、配列番号７８のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨ２は、配列番号８２のアミノ酸配列を有し；又は
（ｘｉ）上記ＶＬ２は、配列番号８６のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨ２は、配列番号９０のアミノ酸配列を有し；又は
（ｘｉｉ）上記ＶＬ２は、配列番号９４のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨ２は、配列番号９８のアミノ酸配列を有する。
【００３７】
本発明は更に、上記ＶＬ１及び上記ＶＬ２が同一のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨ１及び上記ＶＨ２が同一のアミノ酸配列を有する、上記多価ＤＲ５結合分子の実施形態に関する。
【００３８】
本発明は更に、上記ＶＬ１及び上記ＶＬ２が同一のアミノ酸配列を有さず、上記ＶＨ１及び上記ＶＨ２が同一のアミノ酸配列を有しない、上記多価ＤＲ５結合分子の実施形態に関する。
【００３９】
本発明は更に、上記多価ＤＲ５結合分子がＦｃ領域含有ダイアボディであり、上記ダイアボディが２ペアのポリペプチドを含む共有結合複合体であり、また：
（ｉ）上記第１のポリペプチド鎖は配列番号１１６若しくは配列番号１２０のアミノ酸配列を有し、上記第２のポリペプチド鎖は配列番号１１８のアミノ酸配列を有する；又は
（ｉｉ）上記第１のポリペプチド鎖は配列番号１２２若しくは配列番号１２６のアミノ酸配列を有し、上記第２のポリペプチド鎖は配列番号１２４のアミノ酸配列を有する；又は
（ｉｉｉ）上記第１のポリペプチド鎖は配列番号１２８若しくは配列番号１３２のアミノ酸配列を有し、上記第２のポリペプチド鎖は配列番号１３０のアミノ酸配列を有する；又は
（ｉｖ）上記第１のポリペプチド鎖は配列番号１３４若しくは配列番号１３８のアミノ酸配列を有し、上記第２のポリペプチド鎖は配列番号１３６のアミノ酸配列を有する；又は
（ｖ）上記第１のポリペプチド鎖は配列番号１４０若しくは配列番号１４４のアミノ酸配列を有し、上記第２のポリペプチド鎖は配列番号１４２のアミノ酸配列を有する；又は
（ｖｉ）上記第１のポリペプチド鎖は配列番号１４６若しくは配列番号１５０のアミノ酸配列を有し、上記第２のポリペプチド鎖は配列番号１４８のアミノ酸配列を有する；又は
（ｖｉｉ）上記第１のポリペプチド鎖は配列番号１５２若しくは配列番号１５６のアミノ酸配列を有し、上記第２のポリペプチド鎖は配列番号１５４のアミノ酸配列を有する；又は
（ｖｉｉｉ）上記第１のポリペプチド鎖は配列番号１５８若しくは配列番号１６２のアミノ酸配列を有し、上記第２のポリペプチド鎖は配列番号１６０のアミノ酸配列を有する、上記多価ＤＲ５結合分子の実施形態に関する。
【００４０】
本発明は更に、上述の多価ＤＲ５結合分子のいずれ及び賦形剤を含む組成物に関する。本発明は更に、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を更に含む、上記組成物に関する。
【００４１】
本発明は更に、細胞を上述の多価ＤＲ５結合分子のいずれに曝露することを含む、細胞死を促進する方法に関する。特に、上記細胞が腫瘍細胞である場合に関する。本発明は更に、上記細胞をヒストンデアセチラーゼ阻害剤に曝露することを含む、細胞死を促進する上記方法に関する。
【００４２】
本発明は更に、上述の多価ＤＲ５結合分子のいずれを癌の治療に用いる実施形態に関する。本発明は更に、上述の多価ＤＲ５結合分子のいずれを、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤と組み合わせて、癌の治療に用いる実施形態に関する。
【００４３】
本発明は更に、上述の多価ＤＲ５結合分子のいずれを検出可能に標識して、癌の診断又は予後に使用する実施形態に関する。
【００４４】
本発明は特に、癌の治療又は診断若しくは予後における上述の多価ＤＲ５結合分子のいずれの上記使用に関し、上記癌は、以下の細胞：副腎腫瘍；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星状細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄の癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；嫌色素性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚の良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成；胆嚢又は胆管癌；消化器癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；膵島細胞腫瘍；カポジ肉腫；腎癌；白血病；脂肪腫／良性脂肪腫；脂肪肉腫／悪性脂肪腫；肝癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；卵巣癌；膵臓癌；甲状腺乳頭癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；希少な血液学的障害；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移癌；並びに子宮癌からなる群から選択された癌細胞の存在を特徴とする。
【００４５】
本発明は特に、癌の治療又は診断若しくは予後における上述の多価ＤＲ５結合分子のいずれの上記使用に関し、上記癌は：結腸直腸癌；肝細胞癌；神経膠腫；腎癌；乳癌；多発性骨髄腫；膀胱癌；神経芽細胞腫；肉腫；非ホジキンリンパ腫；非小細胞肺癌；卵巣癌；膵臓癌又は直腸癌である。
【００４６】
本発明は特に、癌の治療又は診断若しくは予後における上述の多価ＤＲ５結合分子のいずれの上記使用に関し、上記癌は：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；；急性Ｂリンパ芽球性白血病（Ｂ‐ＡＬＬ）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；有毛細胞白血病（ＨＣＬ）；芽形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）；マントル細胞白血病（ＭＣＬ）及び小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）を含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；ホジキンリンパ腫；全身性肥満細胞症；又はバーキットリンパ腫である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、２つのポリペプチド鎖からなる２つのエピトープ結合部位を有する、代表的な共有結合ダイアボディの概略図を提供し、上記ポリペプチド鎖はそれぞれ、Ｅコイル又はＫコイルヘテロ二量体促進ドメインを有する。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同じように影を付けて示されている。特定の実施形態では、上記エピトープは同一の抗原の異なるエピトープであり、各エピトープに関して１価であるものの上記抗原（例えばＤＲ５）に対して２価である二重特異性分子をもたらす。特定の実施形態では、上記エピトープは同一のエピトープであり（例えば各鎖において同一のＶＬドメインＣＤＲ及びＶＨドメインＣＤＲが使用され）、これは２価の単一特異性分子をもたらす。
【図２】図２は、２つのポリペプチド鎖からなる２つのエピトープ結合部位を有する、代表的な共有結合ダイアボディの概略図を提供し、上記ポリペプチド鎖はそれぞれ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有し、これにより、上記関連する鎖は自然発生するＦｃ領域の全体又は一部を含むＦｃ領域を形成する。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同じように影を付けて示されている。特定の実施形態では、上記エピトープは同一の抗原の異なるエピトープであり、各エピトープに関して１価であるものの上記抗原（例えばＤＲ５）に対して２価である二重特異性分子をもたらす。特定の実施形態では、上記エピトープは同一のエピトープであり（例えば各鎖において同一のＶＬドメインＣＤＲ及びＶＨドメインＣＤＲが使用され）、これは２価の単一特異性分子をもたらす。
【図３】図３は、２ペアのポリペプチド鎖（即ち全部で４つのポリペプチド鎖）からなる代表的な４価ダイアボディ分子の概略図を提供する。各ペアの１つのポリペプチドはＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有し、これにより、上記関連する鎖は自然発生するＦｃ領域の全体又は一部を含むＦｃ領域を形成する。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同じように影を付けて示されている。上記２ペアのポリペプチド鎖は同一であってよい。上記ＶＬ及びＶＨドメインが異なるエピトープを認識する実施形態（図示）では、得られる分子は二重特異性であり、結合した各エピトープに対して２価である。上記ＶＬ及びＶＨドメインが同一のエピトープを認識する（例えば両方の鎖において同一のＶＬドメインＣＤＲ及びＶＨドメインＣＤＲが使用される）実施形態では、得られる分子は単一特異性であり、単一のエピトープに対して４価である。あるいは上記２ペアのポリペプチドは異なっていてよい。ポリペプチドの各ペアのＶＬ及びＶＨドメインが異なるエピトープを認識する実施形態（図示）では、得られる分子は四重特異性であり、結合した各エピトープに対して１価である。上記エピトープが全て同一の抗原のエピトープである実施形態では、得られる分子は抗原（例えばＤＲ５）に対して４価である。上記エピトープが同一のエピトープである（例えば各鎖において同一の３ＣＤＲL及び同一の３ＣＤＲHドメインが使用される）特定の実施形態では、得られる分子は単一特異性かつ４価である。
【図４】図４Ａ及び４Ｂは、これもまた２ペアのポリペプチド鎖（即ち全部で４つのポリペプチド鎖）からなる代替例の４価ダイアボディ分子の概略図を提供する。各ペアの１つのポリペプチドはＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有し、これにより、上記関連する鎖は自然発生するＦｃ領域の全体又は一部を含むＦｃ領域を形成する。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同じように影を付けて示されている。上記２ペアのポリペプチド鎖は同一であってよい。上記ＶＬ及びＶＨドメインが異なるエピトープを認識する実施形態（図示）では、得られる分子は二重特異性であり、結合した各エピトープに対して２価である。上記ＶＬ及びＶＨドメインが同一のエピトープを認識する（例えば両方の鎖において同一のＶＬドメインＣＤＲ及びＶＨドメインＣＤＲが使用される）実施形態では、得られる分子は単一特異性であり、単一のエピトープに対して４価である。あるいは上記２ペアのポリペプチドは異なっていてよい。上記ＶＬ及びＶＨドメインが異なるエピトープを認識する実施形態では、得られる分子は四重特異性であり、結合した各エピトープに対して１価である。上記エピトープが全て同一の抗原のエピトープである実施形態では、得られる分子は抗原（例えばＤＲ５）に対して４価である。図４Ａの構成のダイアボディ部分はＦｃ含有ダイアボディを示し、これは、システイン残基を含むペプチドヘテロ二量体促進ドメインを含有する。図４Ｂは、システイン残基及び（任意のシステイン残基を有する）リンカーを含むＥコイル及びＫコイルヘテロ二量体促進ドメインを含有する、Ｆｃ含有ダイアボディを示す。
【図５】図５は、抗ヒトＤＲ５モノクローナル抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２の、ヒトＤＲ５及びカニクイザルのＤＲ５に結合する能力を示す。
【図６】図６、パネルＡ〜Ｈは、ヒトＤＲ５（パネルＡ〜Ｄ）及びカニクイザルＤＲ５（パネルＥ〜Ｈ）に関する、ＤＲ５  ｍＡｂ  １（パネルＡ及びＥ）、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２（パネルＢ及びＦ）、ＤＲ５  ｍＡｂ  ３（パネルＣ及びＧ）並びにＤＲ５  ｍＡｂ  ４（パネルＤ及びＨ）の結合のキネティクスを示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｂは、腫瘍細胞に様々に結合するＤＲ５  ｍＡｂ  １の能力を示す。図７Ａは、正常な結腸（パネルＡ及びＧ）、肝臓（パネルＢ及びＨ）、肺（パネルＣ及びＩ）、膵臓（パネルＤ及びＪ）、腎臓（パネルＥ及びＫ）並びに心臓（パネルＦ及びＬ）組織の組織学的染色を示す。図７Ａ、パネルＡ〜Ｆは、標識ＤＲ５  ｍＡｂ  １（５μｇ／ｍＬ）でインキュベートした組織の結果を示す。図７Ａ、パネルＧ〜Ｌは、標識アイソタイプ対照ｍＡｂ（５μｇ／ｍＬ）で標識した組織の結果を示す。図７Ｂは、腫瘍結腸（パネルＡ及びＣ）並びに腫瘍肺（パネルＢ及びＤ）の組織学的染色を示す。図７Ｂ、パネルＡ〜Ｂは、標識ＤＲ５  ｍＡｂ  １（５μｇ／ｍＬ）でインキュベートした組織の結果を示す。図７Ｂ、パネルＣ〜Ｄは、標識アイソタイプ対照ｍＡｂ（５μｇ／ｍＬ）でインキュベートした組織の結果を示す。
【図８】図８Ａ〜８Ｂは、腫瘍細胞に様々に結合するＤＲ５  ｍＡｂ  ２の能力を示す。図８Ａは、標識ＤＲ５  ｍＡｂ  ２（５μｇ／ｍＬ）でインキュベートした正常な結腸（パネルＡ）、腎臓（パネルＢ）、肺（パネルＣ）、心臓（パネルＤ）、肝臓（パネルＥ）及び膵臓（パネルＦ）組織の組織学的染色を示す。標識ＤＲ５  ｍＡｂ  １（５μｇ／ｍＬ）でインキュベートした組織の結果を示す。図８Ｂは、腫瘍結腸（パネルＡ及びＢ）並びに腫瘍肺（パネルＣ及びＤ）の組織学的染色を示す。図８Ｂ、パネルＡ及びＣは、標識ＤＲ５  ｍＡｂ  ２（５μｇ／ｍＬ）でインキュベートした組織の結果を示す。図８Ｂ、パネルＢ及びＤは、標識アイソタイプ対照ｍＡｂ（５μｇ／ｍＬ）でインキュベートした組織の結果を示す。
【図９】図９Ａ〜９Ｋは、７８６Ｏ腎細胞腺癌細胞（図９Ａ）、Ａ４９８腎癌細胞（図９Ｂ）、ＡｓＰＣ１膵臓腺癌細胞（図９Ｃ）、ＬＮＣａｐアンドロゲン感受性ヒト前立腺腺癌細胞（図９Ｄ）、ＳＷ４８結腸直腸腺癌細胞（図９Ｅ）、Ａ５４９腺癌ヒト肺胞底皮細胞（図９Ｆ）、ＳＫＭＥＳヒト肺癌細胞（図９Ｇ）、ＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞（図９Ｈ）、Ａ３７５ヒト悪性黒色腫細胞（図９Ｉ）、ＳＫＢＲ３ヒトＨＥＲ２過剰発現乳癌細胞（図９Ｊ）及びＪＩＭＴヒト乳癌細胞（図９Ｋ）の細胞傷害を仲介する、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２ダイボディの能力を示す。このような標的細胞を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の存在下で、エフェクタ：標的細胞比２０：１又は３０：１において２４時間インキュベートした。標的細胞の％細胞傷害を、損傷細胞による培地中への乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を測定することによって決定した。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｆは、ＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２の、予想外の優越性を示す。優越性は、ＤＲ５  ｍＡｂ  １、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２、ＤＲ５  ｍＡｂ  ３又はＤＲ５  ｍＡｂ  ４のＶＬ及びＶＨドメインを有するＤＲ５×ＣＤ３ダイアボディの、腫瘍細胞の細胞傷害性を仲介する能力を比較することによって評価した。採用された標的腫瘍細胞は、Ａ５４９腺癌ヒト肺胞底皮細胞（図１０Ａ）、ＳＫＭＥＳヒト肺癌細胞（図１０Ｂ）、ＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞（図１０Ｃ）、Ａ３７５ヒト悪性黒色腫細胞（図１０Ｄ）、ＳＫＢＲ３ヒトＨＥＲ２過剰発現乳癌細胞（図１０Ｅ）及びＪＩＭＴヒト乳癌細胞（図１０Ｆ）であった。
【図１１】図１１は、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２ダイアボディ及びそのヒト化誘導体：ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２（２．２）×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２（２．３）×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２（２．４）×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２又はｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２（２．５）×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２の、ＤＲ５及びＣＤ３に同時に結合する能力を示す。
【図１２】図１２は、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２ダイアボディ及びそのヒト化誘導体：ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２（２．２）×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２（２．３）×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２（２．４）×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２又はｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２（２．５）×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２の、Ｃｏｌｏ２０５結腸直腸癌細胞の細胞傷害を仲介する能力を示す。
【図１３】図１３は、ＤＲ５  ｍＡｂ  １、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２、架橋ＤＲ５  ｍＡｂ  １、架橋ＤＲ５  ｍＡｂ  ２又は架橋していないＤＲ５  ｍＡｂ  １とＤＲ５  ｍＡｂ  ２との組み合わせで処置したＣＯＬＯ２０５細胞の成長阻害曲線を示す。架橋ＤＲ５  ｍＡｂ  １、架橋ＤＲ５  ｍＡｂ  ２及び架橋していないＤＲ５  ｍＡｂ  １とＤＲ５  ｍＡｂ  ２との組み合わせは、ＣＯＬＯ２０５細胞の成長を阻害できる。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｃは、架橋ＤＲ５  ｍＡｂ  １及び架橋ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の両方が、ヌクレオソーム産生の増大（図１４Ａ）、切断ＰＡＲＰの増加（図１４Ｂ）及び活性カスパーゼ３の増加（図１４Ｃ）によって測定されるアポトーシスを誘発することを示す。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｂは、代表的な４価ＤＲ５結合分子（「ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディ」と呼ばれる、ＤＲ５に関して４価の二重特異性Ｅコイル／ＫコイルＦｃ領域含有ダイアボディ）が正常な組織に結合しないことを示す。図１５Ａは、正常な結腸（パネルＡ及びＧ）、肝臓（パネルＢ及びＨ）、肺（パネルＣ及びＩ）、膵臓（パネルＤ及びＪ）、腎臓（パネルＥ及びＫ）並びに心臓（パネルＦ及びＬ）組織の組織学的染色を示す。図１５Ａ、パネルＡ〜Ｆは、標識４価ＤＲ５結合分子（ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディ、０．６２５μｇ／ｍＬ）でインキュベートした組織の結果を示す。図１５Ａ、パネルＧ〜Ｌは、標識対照ダイアボディ（４‐４‐２０×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２、０．６２５μｇ／ｍＬ）でインキュベートした組織の結果を示す。図１５Ｂは、更なる正常な肝臓試料の、代表的な組織学的染色を示す。図１５Ｂ、上パネルは、標識４価ＤＲ５結合分子（ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディ、０．６２５μｇ／ｍＬ）でインキュベートした組織の結果を示す。図１５Ｂ、下パネルは、標識対照ダイアボディ（４‐４‐２０×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２、０．６２５μｇ／ｍＬ）でインキュベートした組織の結果を示す。
【図１６】図１６は、代表的な４価ＤＲ５結合分子（ＤＲ５に関して４価の二重特異性Ｅコイル／ＫコイルＦｃ領域含有ダイアボディ）が腫瘍組織に強固に結合することを示す。図１６は、腫瘍乳房（パネルＡ及びＥは）、腫瘍結腸（パネルＢ及びＦ）、腫瘍肺（パネルＣ及びＧ）並びに腫瘍前立腺（パネルＤ及びＨ）組織の組織学的染色を示す。図１６、パネルＡ〜Ｄは、標識４価ＤＲ５結合分子（ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディ、０．６２５μｇ／ｍＬ）でインキュベートした組織の結果を示す。図１６、パネルＥ〜Ｈは、標識対照ダイアボディ（４‐４‐２０×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２、０．６２５μｇ／ｍＬ）でインキュベートした組織の結果を示す。
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｃは、ＦｃγＲｓへの結合が低下しかつエフェクタ機能活性が低下したＦｃ領域変異体を含む２つを含む６つの異なる代表的な４価ＤＲ５結合分子（ＤＲ５に関して４価の単一特異性又は二重特異性Ｅコイル／ＫコイルＦｃ領域含有ダイアボディ）で処置した、ＣＯＬＯ２０５（図１７Ａ）、Ａ４９８（図１７Ｂ）及びＳＫＭＥＳ（図１７Ｃ）細胞の、成長阻害曲線を示す。全ての上記４価ＤＲ５結合分子はこれらの細胞において強力な細胞傷害性を有し、ＴＲＡＩＬ‐Ｈｉｓ陽性対照より強力であった。
【図１８】図１８は、代表的な４価ＤＲ５結合分子（ＤＲ５に関して４価の単一特異性又は二重特異性Ｅコイル／ＫコイルＦｃ領域含有ダイアボディ）が、ヌクレオソーム産生の増大によって測定されるアポトーシスを誘発することを示す。
【図１９】図１９は、３つの異なる代表的な４価ＤＲ５結合分子（ＤＲ５に関して４価の単一特異性又は二重特異性Ｅコイル／ＫコイルＦｃ領域含有ダイアボディ）を含む異なるＤＲ５結合分子；並びに２つの異なる抗ＤＲ５抗体（ＤＲ５  ｍＡｂ  ８（ＫＭＴＲ２）；並びに架橋した及び架橋していないＤＲ５  ｍＡｂ  ４（コナツムマブ））で処置した、ＣＯＬＯ２０５細胞の、成長阻害曲線を示す。試験した各ＤＲ５結合分子は、ＦｃγＲｓへの結合が低下しかつエフェクタ機能活性が低下したＦｃ領域変異体を含んでいた。上記４価ＤＲ５結合分子の細胞傷害活性は、架橋とは無関係であり、抗ＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ４及びＤＲ５  ｍＡｂ  ８より強力であった。
【図２０】図２０は、３つの異なる代表的な４価ＤＲ５結合分子（ＤＲ５に関して４価の単一特異性又は二重特異性Ｅコイル／ＫコイルＦｃ領域含有ダイアボディ）を含む複数の異なるＤＲ５結合分子；並びに２つの異なる抗ＤＲ５抗体（ＤＲ５  ｍＡｂ  ８（ＫＭＴＲ２）；及びＤＲ５  ｍＡｂ  ４（コナツムマブ））の、癌幹細胞様（ＣＳＬＣ）ＲＥＣＡ０２０１細胞に対する細胞傷害活性を示す。試験した各ＤＲ５結合分子は、ＦｃγＲｓへの結合が低下しかつエフェクタ機能活性が低下したＦｃ領域変異体を含んでいた。全ての上記４価ＤＲ５結合分子はこれらの細胞において強力な細胞傷害性を有し、抗ＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ４及びＤＲ５  ｍＡｂ  ８より強力であった。
【図２１】図２１は、ＣＯＬＯ２０５細胞を移植したマウスにおける経時的な腫瘍体積の変化を示す。０日目に、メスのｈＣＤ１６Ａ  ＦＯＸ  Ｎ１マウス（ｎ＝７／群）にＣＯＬＯ２０５細胞を皮下（ＳＣ）移植した。次に上記マウスを、週２回、代表的な４価ＤＲ５結合分子（単一特異性４価ＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディ（ＡＡ）、０．５、０．０５、０．００５ｍｇ／ｋｇ）；２つの異なるＤＲ５抗体（ＤＲ５  ｍＡｂ  ４（ＡＡ）、５ｍｇ／ｋｇ；ＤＲ５  ｍＡｂ  ８（ＡＡ）、０．５、０．０５、０．００５ｍｇ／ｋｇ）又はビヒクルで処置した。腫瘍体積を、群の平均±ＳＥＭとして示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明は、抗ＤＲ５抗体の１つ又は複数の結合ドメイン、特に抗ヒトＤＲ５抗体の１つ又は複数の結合ドメインを含む、多価ＤＲ５結合分子を対象とする。本発明のＤＲ５結合分子は、２つ、３つ又は４つのＤＲ５結合ドメインを有する２価及び４価分子を含み、上記ＤＲ５結合ドメインはそれぞれ、ヒトＤＲ５に結合できる。特に本発明は、ダイアボディ、より詳細には２つ以上のポリペプチド鎖の共有結合複合体を含むダイアボディを含む、多価ＤＲ５結合分子を対象とする。本発明は特に、抗ＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １及び／若しくはＤＲ５  ｍＡｂ  ２、並びに／又は上記抗体のヒト化及びキメラバージョンの断片を含む、上記多価ＤＲ５結合分子に関係する。
【００４９】
Ｉ．抗体及びその結合ドメイン
本発明の抗体は、当該免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位によって、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の標的に特異的に結合できる、免疫グロブリン分子である。本明細書において使用される場合、用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ及びａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、ラクダ化抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合二重特異性Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、細胞内抗体、及び以上のうちのいずれかのエピトープ結合断片を包含する。特に抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の断片、即ち抗原結合部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子は、いずれのタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスのものとすることができる。抗体は、診断学におけるその公知の使用法に加えて、治療剤として有用であることが示されている。この数十年、抗体の治療的潜在能力に対する関心が再び高まっており、抗体は、生命工学由来の薬剤の筆頭となるクラスの１つとなっている（Chan, C.E. et al. (2009) “The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases,” Singapore Med. J. 50(7):663-666）。２００近くの抗体系薬剤が使用認可済み、又は開発中である。
【００５０】
用語「モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は均質な抗体の集団を指し、上記モノクローナル抗体は、抗原の選択的結合に関わる（自然に発生する又は自然に発生しない）アミノ酸から構成される。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一のエピトープ（又は抗原部位）に対して指向性を有する。用語「モノクローナル抗体」は、完全なモノクローナル抗体及び完全長モノクローナル抗体だけでなく、これらの断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）2、Ｆｖ等）、単鎖（ｓｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を備える融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、及び必要な特異性及び抗原への結合能力を有する抗原認識部位を備える免疫グロブリン分子の他のいずれの修飾構成を包含する。抗原の源又は抗原を作製する方法（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現、遺伝子導入動物等による）に関して、限定は意図されていない。この用語は、免疫グロブリン全体、及び「抗体」の定義において上述した断片等を含む。モノクローナル抗体の作製方法は当該技術分野において公知である。採用してよい１つの方法は、Kohler, G. et al. (1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity,” Nature 256:495-497の方法又はその修正例である。典型的には、モノクローナル抗体はマウス、ラット又はウサギにおいて発現する。上記抗体は、動物を、所望のエピトープを含有する免疫原性量の細胞、細胞抽出物又はタンパク製剤で免疫化することによって産生される。免疫原は、一次細胞、培養された細胞株、癌細胞、タンパク質、ペプチド、核酸又は組織とすることができるが、これらに限定されない。免疫化に使用してよい細胞は、これらを免疫原として使用するよりもある期間（例えば少なくとも２４時間）だけ前に、培養してよい。細胞は単独で、又はＲｉｂｉ等の非変性アジュバントと組み合わせて、免疫原として使用してよい（Jennings, V.M. (1995) “Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production,” ILAR J. 37(3):119-125参照）。一般に細胞は、免疫原として使用される際、完全な状態、及び好ましくは生存できる状態に維持しなければならない。完全な細胞は、破裂した細胞よりも、免疫性を与えられた動物が抗原をより良好に検出できるようにすることができる。変性又は強いアジュバント、例えばフロイントアジュバントの使用は、細胞を破裂させる場合があり、従って推奨されない。免疫原は、２週間に１回若しくは１週間に１回等、周期的な間隔で複数回投与してよく、又は動物中（例えば組織組み換え中）に生存能力を維持できるように投与してよい。あるいは、所望の病原性エピトープに対する免疫特異性を有する既存のモノクローナル抗体及び他の同等の抗体は、当該技術分野で公知のいずれの手段によって、組み換え配列及び産生できる。一実施形態では、このような抗体を配列し、続いてポリヌクレオチド配列を発現又は繁殖のためのベクターにクローン化する。関心対象の抗体をエンコードする配列は、宿主細胞中のベクター中に保持され、続いて上記宿主細胞を、将来使用するために膨張させて冷凍できる。このような抗体のポリヌクレオチド配列は、本発明の多重特異性（例えば二重特異性、三重特異性及び四重特異性）分子���並びに親和性最適化済みキメラ抗体、ヒト化抗体若しくはイヌ化抗体を生成することによって、抗体の親和性若しくは他の特徴を改善するための、遺伝子操作のために使用してよい。抗体をヒト化する際の一般原理は、抗体の抗原結合部分の塩基配列を保持しながら、抗体の非ヒト残部をヒト抗体配列と交換するステップを伴う。
【００５１】
天然抗体（ＩｇＧ抗体等）は、２つの重鎖と複合体化した２つの軽鎖からなる。各軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）を含有する。各重鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）、並びにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に位置するヒンジドメインを含有する。従って、自然に発生する免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）の基本構造単位は、通常は約１５０，０００Ｄａの糖タンパク質として発現される、軽鎖及び２つの重鎖を有する三量体である。各鎖のアミノ末端（「Ｎ」）部分は、抗原認識に主要な役割を果たす約１００〜１１０個の可変ドメインを含む。各鎖のカルボキシ末端（「Ｃ」）部分は定常領域を画定し、軽鎖は単一の定常ドメインを有し、重鎖は通常３つの定常ドメイン及び１つのヒンジ領域を有する。従って、ＩｇＧ分子の軽鎖の構造はｎ‐ＶＬ‐ＣＬ‐ｃであり、ＩｇＧ重鎖の構造はｎ‐ＶＨ‐ＣＨ１‐Ｈ‐ＣＨ２‐ＣＨ３‐ｃである（ここでＨはヒンジ領域であり、ｎ及びｃはそれぞれ、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端を表す）。ＩｇＧ分子の可変ドメインは、エピトープと接触した残基を含有する複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）、及びフレームワークセグメント（ＦＲ）と呼ばれる非ＣＤＲセグメントからなり、上記フレームワークセグメントは、一般にＣＤＲループの構造を維持してＣＤＲの位置を決定することにより、このような接触を可能とする（ただし特定のフレームワーク残基も抗原に接触し得る）。従って、ＶＬ及びＶＨドメインは、構造ｎ‐ＦＲ１‐ＣＤＲ１‐ＦＲ２‐ＣＤＲ２‐ＦＲ３‐ＣＤＲ３‐ＦＲ４‐ｃを有する。抗体軽鎖の第１、第２及び第３のＣＤＲである（又は第１、第２及び第３のＣＤＲとして機能し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインと呼ばれる。同様に、抗体重鎖の第１、第２及び第３のＣＤＲである（又は第１、第２及び第３のＣＤＲとして機能し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインと呼ばれる。よって、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン、ＣＤＲL３ドメイン、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン、及びＣＤＲH３ドメインという用語は、あるタンパク質に組み込まれた場合に、当該タンパク質が、軽鎖及び重鎖若しくはダイアボディ若しくは単鎖結合分子（例えばｓｃＦｖ、ＢｉＴｅ等）を有する抗体であるか、又は別のタイプのタンパク質であるかにかかわらず、当該タンパク質を、特定のエピトープに結合できるようにする、ポリペプチドを対象としている。
【００５２】
本発明は、本発明の抗ＤＲ５抗体の単鎖可変ドメイン断片（「ｓｃＦｖ」）を含む、多価ＤＲ５結合分子も包含する。単鎖可変ドメイン断片は、軽鎖及び／又は重鎖可変ドメインを、短い連鎖ペプチドを用いて連結することによって作製される。Bird et al. (1988)（“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,” Science 242:423-426）は、一方の可変ドメインのカルボキシ末端と他方の可変ドメインのアミノ末端との間の約３．５ｎｍを埋める連結ペプチドの例を記載している。他の配列のリンカーも設計及び使用されている（Bird et al. (1988) “Single-Chain Antigen-Binding Proteins,” Science 242:423-426）。リンカーは、薬剤の付着又は剛性支持体の付着といった追加の機能のために修飾できる。単鎖変異体は、組み換えによって又は合成によって産生できる。ｓｃＦｖの合成産生に関しては、自動化されたシンセサイザを使用できる。ｓｃＦｖの組み換え産生に関しては、ｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドを含有する好適なプラスミドを、酵母、植物、昆虫若しくは哺乳類細胞等の真核細胞又は大腸菌等の原核細胞である好適な宿主細胞に導入できる。関心対象のｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーション等の従来の操作によって作製できる。得られたｓｃＦｖは、当該技術分野で公知の標準的なタンパク質精製技術を用いて単離できる。
【００５３】
本発明はまた特に、本発明の抗ＤＲ５抗体のヒト化変異体を含む、多価ＤＲ５結合分子も包含する。用語「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）」抗体は、キメラ分子であって、一般に組み換え技術を用いて調製され、非ヒト種からの免疫グロブリンに由来する抗原結合部位と、残りの、ヒト免疫グロブリンの構造及び／又は配列に基づく分子の免疫グロブリン構造とを有する、キメラ分子を指す。
【００５４】
本発明の抗ヒトＤＲ５抗体は、抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １又はＤＲ５  ｍＡｂ  ２のヒト化、キメラ又はイヌ化誘導体を含む。このような抗体の可変ドメインのポリヌクレオチド配列は、上記誘導体を生成するため及び上記抗体の親和性又は他の特徴を改善するための遺伝子操作のために使用できる。抗体をヒト化する際の一般原理は、抗体の抗原結合部分の塩基配列を保持しながら、抗体の非ヒト残部をヒト抗体配列と交換するステップを伴う。モノクローナル抗体をヒト化するためには、４つの一般的なステップが存在する。上記ステップは以下の通りである：（１）開始抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインのヌクレオチド及び予測されるアミノ酸配列を決定するステップ；（２）ヒト化抗体を設計するステップ、即ちヒト化プロセス中に使用する抗体フレームワーク領域を決定するステップ；（３）実際のヒト化法／技術；並びに（４）ヒト化抗体のトランスフェクション及び発現。例えば米国特許第４，８１６，５６７号、米国特許第５，８０７，７１５号、米国特許第５，８６６，６９２号、及び米国特許第６，３３１，４１５号を参照。
【００５５】
抗原結合部位は、定常ドメインに融合した完全な可変ドメイン、又は可変ドメイン内の適切なフレームワーク領域上に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを備えてよい。抗原結合部位は野生型であってよく、又は１つ若しくは複数のアミノ酸置換によって修飾されてよい。これにより、ヒト個体の免疫原としての不変領域が削減されるが、外来の可変ドメインに対する免疫応答の可能性は残る（LoBuglio, A.F. et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224）。別のアプローチは、ヒト由来不変領域を提供することだけでなく、可変ドメインを修飾して、ヒト型に可能な限り近くなるように再成形することに焦点を当てている。重鎖及び軽鎖両方の可変ドメインは、問題となる抗原に応答して変化して結合能力を決定する、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）が隣接する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を内包することが知られており、上記フレームワーク領域は、ある所与の種において相対的に保存され、またＣＤＲのための足場を提供するものと推定される。ある特定の抗原に対して非ヒト抗体を調製する際、非ヒト抗体由来のＣＤＲを、修飾されるヒト抗体内に存在するＦＲに移植することによって、可変ドメインを「再成形」又は「ヒト化」できる。様々な抗体に対するこのアプローチの適用は、Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851-856；Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323-327；Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534-1536；Kettleborough, C. A. et al. (1991) “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation,” Protein Engineering 4:773-3783；Maeda, H. et al. (1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity,” Human Antibodies Hybridoma 2:124-134；Gorman, S. D. et al. (1991) “Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185；Tempest, P.R. et al. (1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo,” Bio/Technology 9:266-271；Co, M. S. et al. (1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873；Carter, P. et al. (1992) “Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289；及びCo, M.S. et al. (1992) “Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen,” J. Immunol. 148:1149-1154によって報告されている。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は全てのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体からの６つのＣＤＲ全てを含有するヒト化マウス抗体）。他の実施形態では、ヒト化抗体は、オリジナルの抗体に対して配列が異なる、オリジナルの抗体に対して改変された１つ又は複数のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つ）を有する。
【００５６】
非ヒト免疫グロブリン由来の抗原結合部位を備える多数の「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）」抗体分子が説明されており、これらは、げっ歯類又は修飾げっ歯類Ｖ領域と、ヒト定常ドメインに融合した、これらに関連する相補性決定領域（ＣＤＲ）とを有するキメラ抗体を含む（例えばWinter et al. (1991) “Man-made Antibodies,” Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989), Shaw et al. (1987) “Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen,” J. Immunol. 138:4534-4538,及びBrown et al. (1987) “Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody,” Cancer Res. 47:3577-3583を参照）。他の参照文献は、適切なヒト抗体定常ドメインと融合する前にヒト支持性フレームワーク領域（ＦＲ）にグラフと重合される、げっ歯類ＣＤＲについて説明している（例えば、Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534-1536; and Jones et al. (1986) “Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse,” Nature 321:522-525を参照）。別の参照文献は、組み換えによってベニアリングされたげっ歯類フレームワーク領域によって支持されたげっ歯類ＣＤＲについて説明している。例えば欧州公開特許第５１９，５９６号を参照。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントのこれらの部分の治療的応用の期間及び効果を制限する、げっ歯類抗ヒト抗体分子に対する望ましくない免疫学的応答を最小化するよう設計される。抗体をヒト化するために利用してよい他の方法は、Daugherty et al. (1991) “Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins,” Nucl. Acids Res. 19:2471-2476、並びに米国特許第６，１８０，３７７号、米国特許第６，０５４，２９７号、米国特許第５，９９７，８６７号及び米国特許第５，８６６，６９２号によって開示されている。
【００５７】
ＩＩ．Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）
２つの重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、相互作用してＦｃ領域を形成し、これは細胞Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）によって認識されるドメインである。本明細書において使用される場合、用語「Ｆｃ領域（Ｆｃ  ｒｅｇｉｏｎ）」は、ＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。例示的なヒトＩｇＧ１のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１）：
231          240          250          260         270
APELLGGPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSHED   PEVKFNWYVD
280          290          300          310          320
GVEVHNAKTK   PREEQYNSTY   RVVSVLTVLH   QDWLNGKEYK   CKVSNKALPA
330         340           350          360          370
PIEKTISKAK   GQPREPQVYT   LPPSREEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDIAVE
380          390          400          410          420
WESNGQPENN   YKTTPPVLDS   DGSFFLYSKL   TVDKSRWQQG   NVFSCSVMHE
430          440   447
ALHNHYTQKS   LSLSPGK
【００５８】
例示的なヒトＩｇＧ２のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１６４）：
231           240          250          260          270
APPVA‐GPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSHED   PEVQFNWYVD 
280          290          300          310          320
GVEVHNAKTK   PREEQFNSTF   RVVSVLTVVH   QDWLNGKEYK   CKVSNKGLPA
330          340          350          360          370
PIEKTISKTK   GQPREPQVYT   LPPSREEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDISVE
380          390          400          410          420
WESNGQPENN   YKTTPPMLDS   DGSFFLYSKL   TVDKSRWQQG   NVFSCSVMHE
430          440    447
ALHNHYTQKS   LSLSPGK
【００５９】
例示的なヒトＩｇＧ３のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１６８）：
231          240          250          260          270
APELLGGPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSHED   PEVQFKWYVD 
280          290          300          310          320
GVEVHNAKTK   PREEQYNSTF   RVVSVLTVLH   QDWLNGKEYK   CKVSNKALPA
330          340          350          360          370
PIEKTISKTK   GQPREPQVYT   LPPSREEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDIAVE
380          390          400          410          420
WESSGQPENN   YNTTPPMLDS   DGSFFLYSKL   TVDKSRWQQG   NIFSCSVMHE
430          440   447
ALHNRFTQKS   LSLSPGK
【００６０】
例示的なヒトＩｇＧ４のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１０３）：
231          240          250          260          270
APEFLGGPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSQED   PEVQFNWYVD 
280          290          300          310          320 
GVEVHNAKTK   PREEQFNSTY   RVVSVLTVLH   QDWLNGKEYK   CKVSNKGLPS 
330          340          350          360          370
SIEKTISKAK   GQPREPQVYT   LPPSQEEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDIAVE 
380          390          400          410          420
WESNGQPENN   YKTTPPVLDS   DGSFFLYSRL   TVDKSRWQEG   NVFSCSVMHE 
430          440   447
ALHNHYTQKS   LSLSLGK
【００６１】
本明細書全体を通して、ＩｇＧ重鎖の番号付与は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991)中のもののようなＥＵインデックスの番号付与であり、上記文献は参照により、本出願に明示的に援用される。「Ｋａｂａｔ中のもののようなＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の番号付与を表す。免疫グロブリンの成熟重鎖及び軽鎖の可変ドメインからのアミノ酸は、鎖中のアミノ酸の位置によって表される。Ｋａｂａｔは、抗体に関する多数のアミノ酸配列を記載し、各サブグループに関するアミノ酸コンセンサス配列を識別し、また各アミノ酸に残基番号を割り当てている。Ｋａｂａｔの番号付与スキームは、保存されたアミノ酸を参照して、問題となる抗体を、Ｋａｂａｔ中のコンセンサス配列のうちの１つと整列させることによって、Ｋａｂａｔの概要に含まれていない抗体にまで拡張可能である。残基番号を割り当てるための上記方法は、当該技術分野において標準的なものとなっており、キメラ又はヒト化変異体を含む異なる抗体中の同等の位置のアミノ酸を容易に識別する。例えば、ヒト抗体軽鎖の５０位のアミノ酸は、マウス抗体軽鎖の５０位のアミノ酸と同等の位置を占有する。
【００６２】
多型は、抗体定常領域内の多数の異なる位置（例えばＫａｂａｔに記載されているようなＥＵインデックスによる番号付与で２７０位、２７２位、３１２位、３１５位、３５６位及び３５８位を含むがこれらに限定されないＦｃ位置）において観察されており、従って、本発明の配列と従来技術の配列との間に僅かな差異が存在し得る。ヒト免疫グロブリンの多型形態は、十分に特性決定されている。現在、１８個のＧｍアロタイプが公知である：Ｇ１ｍ（１，２，３，１７）又はＧ１ｍ（ａ，ｘ，ｆ，ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）又はＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５，６，１０，１１，１３，１４，１５，１６，２１，２４，２６，２７，２８）又はＧ３ｍ（ｂ１，ｃ３，ｂ３，ｂ０，ｂ３，ｂ４，ｓ，ｔ，ｇ１，ｃ５，ｕ，ｖ，ｇ５）（Lefranc, et al., The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, pp. 43‐78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199‐211）。特に、本発明の抗体が、いずれの免疫グロブリン遺伝子のいずれのアロタイプ、アイソアロタイプ又はハプロタイプを組み込むことができ、本明細書中で提供される配列のアロタイプ、アイソアロタイプ又はハプロタイプに限定されないと考えられる。更に、いくつかの発現系では、ＣＨ３ドメインのＣ末端アミノ酸残基（上記太字部分）は、翻訳後に除去され得る。従ってＣＨ３ドメインのＣ末端残基は、本発明の多価ＤＲ５結合分子において任意のアミノ酸残基である。配列番号１のＣ末端残基を有しない例示的な多価ＤＲ５結合分子を以下に提供する。本発明は具体的には、Ｃ末端残基を含むこのような構成も包含する。
【００６３】
活性化信号及び阻害信号は、Ｆｃ領域へのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）の結紮に続いて、Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）を通して伝達される。これらの全く異なる機能は、異なる受容体アイソフォーム間の構造的差異に起因する。免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）又は免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）と呼ばれる細胞質シグナリングドメイン内の２つの別個のドメインは、異なる応答の原因となる。これらの構造に対する異なる細胞質酵素の補充は、ＦｃγＲ仲介細胞応答の結果を決定づける。ＩＴＡＭ含有ＦｃγＲ複合体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡを含み、その一方でＩＴＩＭ含有複合体はＦｃγＲＩＩＢしか含まない。ヒト好中球は、ＦｃγＲＩＩＡ遺伝子を発現する。免疫複合体又は特異性抗体架橋によるＦｃγＲＩＩＡのクラスタリングは、ＩＴＡＭを、ＩＴＡＭリン酸化を促進する受容体関連キナーゼと凝集させる役割を果たす。ＩＴＡＭリン酸化は、Ｓｙｋキナーゼのドッキング部位として役立ち、その活性化は、下流基質（例えばＰＩ３Ｋ）の活性化をもたらす。細胞活性化は、炎症促進性メディエータの放出につながる。ＦｃγＲＩＩＢ遺伝子は、Ｂリンパ球上で発現し、その細胞外ドメインはＦｃγＲＩＩＡと９６％同一であり、またＩｇＧ複合体に、区別できない様式で結合する。ＦｃγＲＩＩＢの細胞質ドメイン中のＩＴＩＭの存在は、ＦｃγＲの上述の阻害型サブクラスを定義する。最近、この阻害の分子的基礎が確率された。活性化ＦｃγＲと共同結紮すると、ＦｃγＲＩＩＢ中のＩＴＩＭはリン酸化され、ポリリン酸イノシトール５’‐ホスファターゼ（ＳＨＩＰ）のＳＨ２ドメインを誘引し、これは、ＩＴＡＭ含有ＦｃγＲ仲介チロシンキナーゼ活性化の結果として放出されたホスホイノシトールを加水分解し、その結果、細胞内Ｃａ++の流入を防止する。従って、ＦｃγＲＩＩＢの架橋は、ＦｃγＲ結紮に対する活性化応答を弱め、細胞応答性を阻害する。このようにして、Ｂ細胞活性化、Ｂ細胞増殖及び抗体分泌が中断される。
【００６４】
ＩＩＩ．多価抗体、多価ダイアボディ及びＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディ
抗体が抗原のエピトープに結合する能力は、抗体のＶＬ及びＶＨドメインの存在並びにアミノ酸配列に依存する。抗体軽鎖と抗体重鎖との相互作用、特にそのＶＬドメインとＶＨドメインとの相互作用は、天然抗体の２つのエプトープ結合部位のうちの１つを形成する。天然抗体は、１つのエピトープ種にのみ結合できる（即ちこれらは単一特異性である）が、これらは上記種の複数の複製に結合できる（即ち２価性又は多価性を示す）。
【００６５】
本発明の結合ドメインは、エピトープに、「免疫特異的な」様式で結合する。本明細書において使用される場合、抗体、ダイアボディ又は他のエピトープ結合分子は、代替的なエピトープに比べて、より頻繁に、より迅速に、より長期間、及び／又はより高い親和性で当該エピトープと反応又は連結する場合、別の分子のある領域（即ちエピトープ）に「免疫特異的に」結合する、と言い表される。例えば、あるウイルスエピトープに免疫特異的に結合する抗体は、他のウイルスエピトープ又は非ウイルスエピトープに免疫特異的に結合するよりも、より高い親和性、結合活性で、より容易に、及び／又はより長い期間、当該ウイルスエピトープに結合する抗体である。この定義を読めば、例えば第１の標的に免疫特異的に結合する抗体（又は部分若しくはエピトープ）は、第２の標的に特異的又は優先的に結合してもしなくてもよいことも理解される。従って「特異的結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、排他的結合を必ずしも必要としない（ただし含むことはできる）。一般に、ただし必ずしもそうではないが、結合に関する言及は「特異的」結合を意味する。２つの分子は、これらの結合が、これら２つの分子それぞれのリガンドに受容体が結合する特異性を呈する場合に、「生理学的に特異的な（ｐｈｙｓｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）」様式で互いに結合できると言い表される。
【００６６】
抗体の機能性は、２つの別個の異なる抗原（若しくは同一の抗原の異なるエピトープ）に同時に結合できる多重特異性抗体ベースの分子を生成することにより、並びに／又は同一のエピトープ及び／若しくは抗原に関してより高い価（即ち３つ以上の結合部位）を有する抗体ベースの分子を生成することにより、増強できる。
【００６７】
天然の抗体より高い能力を有する分子を提供するために、幅広い組み換え二重特異性抗体フォーマットが開発されており（例えば国際公開第２００８／００３１１６号、国際公開第２００９／１３２８７６号、国際公開第２００８／００３１０３号、国際公開第２００７／１４６９６８号、国際公開第２００９／０１８３８６号、国際公開第２０１２／００９５４４号、国際公開第２０１３／０７０５６５号参照）、その殆どは、抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭ）に対して若しくは抗体コア内で更なる結合タンパク質（例えばｓｃＦｖ、ＶＬ、ＶＨ等）を融合させるため、又は複数の抗体結合部分、例えば２つのＦａｂ断片若しくはｓｃＦｖを融合させるために、リンカーペプチドを使用する。代替的なフォーマットは、結合タンパク質（例えばｓｃＦｖ、ＶＬ、ＶＨ等）を、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン又は代替となるポリペプチド等の二量体化ドメインに融合させるために、リンカーペプチドを使用する（国際公開第２００５／０７０９６６号、国際公開第２００６／１０７７８６Ａ号、国際公開第２００６／１０７６１７Ａ号、国際公開第２００７／０４６８９３号）。典型的には、このようなアプローチは妥協及びトレードオフを伴う。例えば国際公開第２０１３／１７４８７３号、国際公開第２０１１／１３３８８６号及び国際公開第２０１０／１３６１７２号は、リンカーの使用によって、治療的設定に問題が生じる場合があることを開示しており、２つ以上の抗原に結合できるように、ＣＬ及びＣＨ１ドメインがそれぞれの自然位置から切り替わり、かつＶＬ及びＶＨドメインが多様化されている、三重特異性抗体を教示している（国際公開第２００８／０２７２３６号、国際公開第２０１０／１０８１２７号）。従って、これらの文書に開示されている分子は、結合特異性を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。国際公開第２０１３／１６３４２７号及び国際公開第２０１３／１１９９０３号は、ＣＨ２ドメインを修飾して、結合ドメインを備える融合タンパク付加物を含有させるステップを開示している。この文書は、ＣＨ２が、エフェクタ機能の仲介において最低限の役割しか果たさないらしいことを記載している。国際公開第２０１０／０２８７９７号、国際公開第２０１００２８７９６号、及び国際公開第２０１０／０２８７９５号は、Ｆｃ領域が追加のＶＬ及びＶＨドメインで置換されて、３価結合分子を形成している、組み換え抗体を開示している。国際公開第２００３／０２５０１８号及び国際公開第２００３／０１２０６９号は、個々の鎖がｓｃＦｖ領域を含有する組み換えダイアボディを開示している。国際公開第２０１３／００６５４４号は、単一のポリペプチド鎖として合成された後、タンパク質分解に供されることによってヘテロ二量体構造が得られる、多価ｆａｂ分子を開示している。従って、これらの文書に開示されている分子は、エフェクタ機能を仲介する能力の全て又はある程度を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。国際公開第２０１４／０２２５４０号、国際公開第２０１３／００３６５２号、国際公開第２０１２／１６２５８３号、国際公開第２０１２／１５６４３０号、国際公開第２０１１／０８６０９１号、国際公開第２００８／０２４１８８号、国際公開第２００７／０２４７１５号、国際公開第２００７／０７５２７０号、国際公開第１９９８／００２４６３号、国際公開第１９９２／０２２５８３号、及び国際公開第１９９１／００３４９３は、追加の結合ドメイン又は官能基を抗体又は抗体部分に付加するステップ（例えば抗体の軽鎖にダイアボディを付加するステップ、又は抗体の軽鎖及び重鎖に追加のＶＬ及びＶＨドメインを付加するステップ、又は異種融合タンパク質を互いに対して付加するステップ若しくは複数のＦａｂドメインを互いに対して連鎖させるステップ）を開示している。従って、これらの文書に開示されている分子は、ナイーブ抗体構造を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。
【００６８】
本技術分野は更に、２つ以上の異なるエピトープ種と結合できる（即ち２価性又は多価性に加えて二重特異性又は多重特異性を呈することができる）という点でこのような天然抗体とは異なるダイアボディを産生できる可能性に注目している（例えばHolliger et al. (1993) “’Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448;米国公開特許第２００４／００５８４００号(Hollinger et al.)；米国公開特許第２００４／０２２０３８８号(Mertens et al.); Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672;国際公開第０２／０２７８１号(Mertens et al.); Olafsen, T. et al. (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Protein Eng. Des. Sel. 17(1):21-27; Wu, A. et al. (2001) “Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange,” Protein Engineering 14(2):1025-1033; Asano et al. (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J.Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) “Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy,” Cancer Res. 69(12):4941-4944参照）。
【００６９】
ダイアボディの設計は、単鎖可変ドメイン断片（ｓｃＦｖ）として公知の抗体誘導体に基づく。このような分子は、軽鎖及び／又は重鎖可変ドメインを、短い連鎖ペプチドを用いて連結することによって作製される。Bird et al. (1988) (“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,” Science 242:423-426)は、一方の可変ドメインのカルボキシ末端と他方の可変ドメインのアミノ末端との間の約３．５ｎｍを埋める連結ペプチドの例を記載している。他の配列のリンカーも設計及び使用されている（Bird et al. (1988) “Single-Chain Antigen-Binding Proteins,” Science 242:423-426）。リンカーは、薬剤の付着又は剛性支持体の付着といった追加の機能のために修飾できる。単鎖変異体は、組み換えによって又は合成によって産生できる。ｓｃＦｖの合成産生に関しては、自動化されたシンセサイザを使用できる。ｓｃＦｖの組み換え産生に関しては、ｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドを含有する好適なプラスミドを、酵母、植物、昆虫若しくは哺乳類細胞等の真核細胞又は大腸菌等の原核細胞である好適な宿主細胞に導入できる。関心対象のｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーション等の従来の操作によって作製できる。得られたｓｃＦｖは、当該技術分野で公知の標準的なタンパク質精製技術を用いて単離できる。
【００７０】
非単一特異性ダイアボディの提供は、抗体に対して、異なるエピトープを発現する複数の細胞を共連結（ｃｏ‐ｌｉｇａｔｅ）して共存させる能力、並びに同一の抗原の異なる複数のエピトープに結合することによって分子間及び／又は分子内相互作用を形成する能力を含むがこれらに限定されない、有意な利点を提供する。従って２価ダイアボディは、療法及び免疫診断を含む広範な用途を有する。二重特異性は、様々な用途におけるダイアボディの設計及び加工の大幅な柔軟性を可能とし、これにより、多量体抗原の結合活性の上昇、異なる複数の抗原の架橋、及び両標的抗原の存在に基づく特定の細胞タイプに対する指向性標的化を提供する。当該技術分野において公知のダイアボディ分子は、（〜５０ｋＤａ以下の小さいサイズのダイアボディに関して）その高い結合価、低い解離率及び循環からの迅速な排除により、腫瘍撮像の分野での特定の使用も示している（Fitzgerald et al. (1997) “Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,” Protein Eng. 10:1221）。特に重要なのは、異なる細胞の共連結、例えば細胞傷害性Ｔ細胞と腫瘍細胞との架橋である（Staerz et al. (1985) “Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells,” Nature 314:628-631, and Holliger et al. (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305; Marvin et al. (2005) “Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies,” Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658）。
【００７１】
しかしながら、上述の利点は顕著なコストにつながる。このような非単一特異性ダイアボディの形成は、２つ以上の別個の異なるポリペプチドの良好な集合を必要とする（即ち上記形成は、ダイアボディが、異なるポリペプチド鎖種のヘテロ二量体形成によって形成されることを必要とする）。この事実は、同一のポリペプチド鎖のホモ二量体形成によって形成される単一特異性ダイアボディとは対照的である。非単一特異性ダイアボディを形成するために少なくとも２つの異なるポリペプチド（即ち２つのポリペプチド種）を提供しなければならないため、及びこのようなポリペプチドのホモ二量体形成は不活性分子をもたらす（Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588）ため、このようなポリペプチドの産生は、同一種のポリペプチド間での共有結合を防止するような（即ちホモ二量体化を防止するような）方法で達成しなければならない（Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588）。従って本技術分野は、このようなポリペプチドの非共有結合的連結を教示している（例えばOlafsen et al. (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588; Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672参照）。
【００７２】
しかしながら、本技術分野は、非共有結合的に連結したポリペプチドで構成される二重特異性ダイアボディが不安定であり、非機能性モノマーへと容易に分解することを認識している（例えばLu, D.  et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672参照）。
【００７３】
この課題をものともせず、本技術分野は、ＤＡＲＴ（商標）（Ｄｕａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅ‐Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ：二重親和性再標的化試薬）ダイアボディと呼ばれる、安定した共有結合ヘテロ二量体性非単一特異性ダイアボディの開発に成功した（例えば米国公開特許第２０１３‐０２９５１２１号；米国公開特許第２０１０‐０１７４０５３号及び米国公開特許第２００９‐００６０９１０号；  欧州公開特許第２７１４０７９号；欧州公開特許第２６０１２１６号；欧州公開特許第２３７６１０９号；欧州公開特許第２１５８２２１号、並びに国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号；並びにMoore, P.A.  et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. et al. (2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,” Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; Johnson, S.  et al. (2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion,” J. Mol. Biol. 399(3):436-449参照）。このようなダイアボディは、２つ以上の共有結合的に複合体化したポリペプチドを備え、１つ又は複数のシステイン残基を、ジスルフィド結合を形成でき、これによって２つのポリペプチド鎖を共有結合させる、採用したポリペプチド種それぞれの中へと加工するステップを伴う。例えば、このような構造のＣ末端へのシステイン残基の追加は、ポリペプチド鎖間のジスルフィド結合を可能とすることが分かっており、これは、２価分子の結合特性に干渉することなく、得られるヘテロ二量体を安定化させる。
【００７４】
最も単純な二重特異性ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディの２つのポリペプチドはそれぞれ、３つのドメインを含む。第１のポリペプチドは（Ｎ末端からＣ末端への方向に）：（ｉ）第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域を含む第１のドメイン（ＶＬ１）、（ｉｉ）第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域を含む第２のドメイン（ＶＨ２）、並びに（ｉｉｉ）システイン残基（又はシステイン含有ドメイン）と、上記ダイアボディの上記第２のポリペプチドとのヘテロ二量体化を促進し、上記ダイアボディの上記第１及び第２のポリペプチドを互いに対して共有結合させる役割を果たす、ヘテロ二量体促進ドメインとを含有する、第３のドメインを含む。上記第２のポリペプチドは（Ｎ末端からＣ末端への方向に）：（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域を含む第１のドメイン（ＶＬ２）、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域を含む第２のドメイン（ＶＨ１）、及び（ｉｉｉ）システイン残基（又はシステイン含有ドメイン）と、上記第１のポリペプチド鎖の上記ヘテロ二量体化促進ドメインと複合体化して、上記第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化を促進する、相補的ヘテロ二量体化促進ドメインとを含有する、第３のドメインを含む。第２のポリペプチドの第３のドメインのシステイン残基（又はシステイン含有ドメイン）は、ダイアボディの第１のポリペプチド鎖に対する第２のポリペプチド鎖の共有結合を促進する役割を果たす。このような分子は、安定かつ強力であり、２つ以上の異なる抗原又は同一の抗原上の２つの異なるエピトープに同時に結合する能力を有する。一実施形態では、第１及び第２のポリペプチドの第３のドメインはそれぞれ、システイン残基を含有し、このシステイン残基は、ジスルフィド結合を介してポリペプチドを一体に結合させる役割を果たす。図１はこのようなダイアボディの概略図を提供し、上記ダイアボディは、Ｅコイル／Ｋコイルヘテロ二量体化ドメインと、共有結合のためのシステイン含有リンカーとを利用する図２〜４において提供されているように、上記ポリペプチドのうちの一方又は両方は更に、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの配列を有してよく、これにより、２つのダイアボディポリペプチドの複合体化によって、細胞（Ｂリンパ球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球及び肥満細胞等）のＦｃ受容体に結合できるＦｃ領域が形成される。以下においてより詳細に提供されるように、このようなポリペプチド鎖のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインは、同一の配列である必要はなく、有利には、２つのポリペプチド鎖間の複合体化を促進するために修飾される。
【００７５】
このような分子の多数の変形例が記載されている（例えば米国公開特許第２０１３‐０２９５１２１号；米国公開特許第２０１０‐０１７４０５３号；米国公開特許第２００９‐００６０９１０号；欧州公開特許第２７１４０７９号；欧州公開特許第２６０１２１６号；欧州公開特許第２３７６１０９号；欧州公開特許第２１５８２２１号；国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号参照）。これらのＦｃ領域含有ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディは、２ペアのポリペプチド鎖を含んでよい。第１のポリペプチドは（Ｎ末端からＣ末端への方向に）：（ｉ）第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域を含む第１のドメイン（ＶＬ１）、（ｉｉ）第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域を含む第２のドメイン（ＶＨ２）、（ｉｉｉ）システイン残基（又はシステイン含有ドメイン）と、上記ダイアボディの上記第２のポリペプチドとのヘテロ二量体化を促進し、上記第１のダイアボディの上記第１及び第２のポリペプチドを互いに対して共有結合させる役割を果たす、ヘテロ二量体化促進ドメインとを含有する、第３のドメイン、並びに（ｉｖ）ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを含む。上記第２のポリペプチドは（Ｎ末端からＣ末端への方向に）：（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域を含む第１のドメイン（ＶＬ２）、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域を含む第２のドメイン（ＶＨ１）、並びに（ｉｉｉ）システイン残基（又はシステイン含有ドメイン）と、上記第１のポリペプチド鎖の上記第３のドメインと相互作用して、上記２つのポリペプチド鎖間のヘテロ二量体化及び共有結合を促進できる、ヘテロ二量体化促進ドメインとを含有する、第３のドメインを含む。ここで２つの第１のポリペプチドは、互いと複合体化して、Ｆｃ領域を形成する。図３及び４Ａ〜４Ｂは、異なるヘテロ二量体促進ドメインを利用するこのようなダイアボディの３つの変形例の概略図を提供する。他のＦｃ領域含有ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディは、３つのポリペプチド鎖を含有してよい。このようなＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディの第１のポリペプチドは、３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。このようなＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディの第２のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）ダイアボディの第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメインを含有する。このようなＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディの第３のポリペプチドは、ＣＨ２‐ＣＨ３配列を備える。従って、このようなダイアボディの第１及び第２のポリペプチド鎖は、一体として連結して、エピトープに結合可能なＶＬ１／ＶＨ１結合部位、及び第２のエピトープに結合可能なＶＬ２／ＶＨ２結合部位を形成する。このようなより複雑な複合体もまた、共有結合複合体を形成するよう機能するシステイン含有ドメインを有する。従って上記第１及び第２のポリペプチドは、それぞれの第３のドメイン内のシステイン残基が関与するジスルフィド結合を介して、互いに結合される。特に、第１及び第３のポリペプチド鎖は互いと複合体化して、ジスルフィド結合によって安定化されたＦｃ領域を形成する。
【００７６】
４価分子が望ましいもののＦｃは必要ない場合の用途のために、代替的な構成が当該技術分野において公知であり、これは、ＶＨ１、ＶＬ２、ＶＨ２、及びＶＬ２ドメインをそれぞれ有する２つの同一の鎖のホモ二量体化によって形成される「ＴａｎｄＡｂ」とも呼ばれる４価タンデム抗体を含むが、これに限定されない（例えば米国公開特許第２００５‐００７９１７０号、米国公開特許第２００７‐００３１４３６号、米国公開特許第２０１０‐００９９８５３号、米国公開特許第２０１１‐０２０６６７号、米国公開特許第２０１３‐０１８９２６３号；欧州公開特許第１０７８００４号、欧州公開特許第２３７１８６６号、欧州公開特許第２３６１９３６号及び欧州公開特許第１２９３５１４号；国際公開第１９９９／０５７１５０号、国際公開第２００３／０２５０１８号及び国際公開第２０１３／０１３７００号参照）。
【００７７】
ＩＶ．本発明の抗ヒトＤＲ５結合分子
本発明の好ましい多価ＤＲ５結合分子は、ヒトＤＲ５の連続又は不連続（例えば配座）部分（エピトープ）に結合できる。本発明のＤＲ５結合分子は好ましくは、１つ又は複数の非ヒト種、特にマウス、げっ歯類、イヌ及び霊長類種のＤＲ５分子に結合する能力も呈する。ヒトＤＲ５前駆体のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＮＰ＿００３８３３．４）（配列番号２）は、以下の通りである：
MEQRGQNAPA ASGARKRHGP GPREARGARP GLRVPKTLVL VVAAVLLLVS
AESALITQQD LAPQQRVAPQ QKRSSPSEGL CPPGHHISED GRDCISCKYG
QDYSTHWNDL LFCLRCTRCD SGEVELSPCT TTRNTVCQCE EGTFREEDSP
EMCRKCRTGC PRGMVKVGDC TPWSDIECVH KESGTKHSGE APAVEETVTS
SPGTPASPCS LSGIIIGVTV AAVVLIVAVF VCKSLLWKKV LPYLKGICSG
GGGDPERVDR SSQRPGAEDN VLNEIVSILQ PTQVPEQEME VQEPAEPTGV
NMLSPGESEH LLEPAEAERS QRRRLLVPAN EGDPTETLRQ CFDDFADLVP
FDSWEPLMRK LGLMDNEIKV AKAEAAGHRD TLYTMLIKWV NKTGRDASVH
TLLDALETLG ERLAKQKIED HLLSSGKFMY LEGNADSAMS
【００７８】
ＤＲ５の４４０個のアミノ酸残基（配列番号２）のうち、残基１〜５５はシグナル配列であり、残基５７〜９４は第１のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）であり、残基９７〜１３７は第２のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）であり、残基１３８〜１７８は第３のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）であり、残基２１１〜２３１は膜貫通ドメインであり、残基２３２〜４４０は、（受容体の細胞死ドメインを含有する）細胞質ドメインである。
【００７９】
本発明は、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも４つのＤＲ５結合部位を有する多価ＤＲ５結合分子を含む。ＤＲ５結合部位は、同一のＤＲ５エピトープ又は異なるＤＲ５エピトープに結合してよい。従って本発明の多価ＤＲ５結合分子は、ＤＲ５の１つのエピトープのみに結合する単一特異性であってよく、又はＤＲ５の異なる複数のエピトープに結合する多重特異性であってよい。
【００８０】
本発明の例示的な多価ＤＲ５結合分子は、「第１のＤＲ５エピトープ」に結合する少なくとも１つの「第１の結合部位」及び「第２のＤＲ５エピトープ」に結合する少なくとも１つの「第２の結合部位」を有する、二重特異性分子（例えば二重特異性抗体、非単一特異性ダイアボディ等）を含む。このような分子は、上記第１のＤＲ５エピトープ及び第２のＤＲ５エピトープに対して二重特異性であり、またＤＲ５に対して少なくとも２価である。１つ又は複数の更なる第１の結合部位及び／又は第２の結合部位の追加によって、ＤＲ５に対してより高い価数を呈する二重特異性多価ＤＲ５結合分子を生成できる。本発明の例示的な多価ＤＲ５結合分子はまた、少なくとも３つ、又は少なくとも４つ、又はそれ以上の異なる結合部位を有する多重特異性分子も含み、上記結合部位はそれぞれ異なるＤＲ５エピトープと結合する。このような分子は、上記ＤＲ５エピトープに対して多重特異性であり、ＤＲ５に対して多価である。
【００８１】
本発明の１つの例示的な二重特異性多価ＤＲ５結合分子は、第１のＤＲ５エピトープに結合する２つの第１の結合部位と、第２のＤＲ５エピトープに結合する２つの第２の結合部位とを有する。このようなＤＲ５結合分子は、上記第１及び第２のＤＲ５エピトープに対して二重特異性であり、ＤＲ５に対して４価である。
【００８２】
好ましくは、本発明の多重特異性多価（例えば二重特異性２価）ＤＲ５結合分子は、異なる複数のＤＲ５エピトープに同時に結合できる。このような結合は、分子内（即ち単一のＤＲ５ポリペプチド上の異なる複数のＤＲ５エピトープに対するもの）及び／又は分子間（即ち別個のＤＲ５ポリペプチド上の異なる複数のＤＲ５エピトープに対するもの）であってよい。
【００８３】
本発明の例示的な多価ＤＲ５結合分子はまた、同一のＤＲ５エピトープと結合する少なくとも２つ、好ましくは少なくとも４つの結合部位を有する単一特異性分子（例えば二重特異性抗体、単一特異性ダイアボディ等）を含む。このような分子は、上記ＤＲ５エピトープに対して単一特異性であり、ＤＲ５に対して少なくとも２価、好ましくは４価である。なお、同一のＤＲ５エピトープに結合する３つ以上の結合部位が存在する場合、上記多価ＤＲ５結合分子は、上記エピトープに対して単一特異性のままであるが、ＤＲ５に対してより高い価数を示すことになる。
【００８４】
本発明の１つの例示的な単一特異性多価ＤＲ５結合分子は、同一のＤＲ５エピトープに結合する４つの結合部位を有し、上記ＤＲ５エピトープに対して単一特異性であり、ＤＲ５に対して４価である。
【００８５】
好ましくは、本発明の単一特異性多価（例えば単一特異性２価）ＤＲ５結合分子は、ＤＲ５エピトープに同時に結合できる。このような結合は分子間（即ち別個のＤＲ５ポリペプチド上の異なる複数のＤＲ５エピトープに対するもの）である。
【００８６】
本発明の多価ＤＲ５結合分子は、本明細書中で開示されている抗ＤＲ５抗体のうちの１つ又は複数のＶＬ及び／又はＶＨドメインを有してよい。本発明の好ましい多価ＤＲ５結合分子は、抗ヒトＤＲ５モノクローナル抗体「ＤＲ５  ｍＡｂ  １」及び／又は「ＤＲ５  ｍＡｂ  ２」及び／又は「ｈＤＲ５  ｍａｂ  ２」のＶＬ及び／又はＶＨドメインを有し、より好ましくはこのような抗ヒトＤＲ５モノクローナル抗体の上記ＶＬドメインのＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て、及び／又は上記ＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを有する。特定の抗ＤＲ５結合分子のアミノ酸配列、及びこれをコードするポリヌクレオチドは、以下に提供されている。本発明はまた、サブクローニングを促進するために導入できるＣ末端及び／又はＮ末端アミノ酸残基のアミノ酸置換を含む、これらの配列の若干の変形も包含する。
【００８７】
Ａ．抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １
ＤＲ５  ｍＡｂ  １  のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号３）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS SSGYSYMHWY QQKPGQPPKV 
LIFLSSNLDS GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEDGDAATY YCQHSRDLPP 
TFGGGTKLEI K
ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＣＤＲL１（配列番号４）：RASKSVSSSGYSYMH
ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＣＤＲL２（配列番号５）：LSSNLDS
ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＣＤＲL３（配列番号６）：QHSRDLPPT
【００８８】
ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＬドメインは好ましくは、以下に示す配列を有するポリヌクレオチド（配列番号７）によってコードされる（ＣＤＲL残基をコードするポリヌクレオチドは、下線を付して示す）：
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca 
gagggccacc atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct 
atagttatat gcactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaagtc 
ctcatctttc tttcatccaa cctagattct ggggtccctg ccaggttcag 
tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg 
atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg 
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa
【００８９】
ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号８）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）。Ｃ末端アミノ酸をアラニンで置換することにより、このＶＨドメインのサブクローニングを促進してよい：
EVKFLESGGG LVQPGGSLKL SCVASGFDFS RYWMSWVRQA PGKGLEWIGE 
INPDSNTINY TPSLKDKFII SRDNAKNTLY LQMTKVRSED TALYYCTRRA 
YYGNPAWFAY WGQGTLVTVSS
ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＣＤＲH１（配列番号９）：GFDFSRYWMS
ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＣＤＲH２（配列番号１０）：EINPDSNTINYTPSLKD
ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＣＤＲH３（配列番号１１）：RAYYGNPAWFAY
【００９０】
ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＨドメインは好ましくは、以下に示す配列を有するポリヌクレオチド（配列番号１２）によってコードされる（ＣＤＲH残基をコードするポリヌクレオチドは、下線を付して示す）：
gaggtgaagt ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc 
cctgaaactc tcctgtgtag cctcaggatt cgattttagt agatactgga 
tgagttgggt ccggcaggct ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa 
attaatccag atagcaatac gataaactat acgccatctc taaaggataa 
attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtat ctgcaaatga 
ccaaagtgag atctgaggac acagcccttt attattgtac aagaagggcc 
tactatggta acccggcctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt 
cactgtctct tcc
【００９１】
Ｂ．抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２
１．マウス抗ヒト抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２
ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１３）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GQSPKLLIYW 
ASTRHTGVPD RFTGSGSGTD YTLTIKSVQA EDLTLYYCQQ HYITPWTFGG 
GTKLEIK
ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＣＤＲL１（配列番号１４）：KASQDVNTAVA
ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＣＤＲL２（配列番号１５）：WASTRHT
ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＣＤＲL３（配列番号１６）：QQHYITPWT
【００９２】
ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬドメインは好ましくは、以下に示す配列を有するポリヌクレオチド（配列番号１７）によってコードされる（ＣＤＲL残基をコードするポリヌクレオチドは、下線を付して示す）：
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccactt cagtaggaga 
cagggtcagc atcacctgca aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag 
cctggtatca acaaaaacca gggcaatctc ctaaactact gatttactgg 
gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc 
tgggacagat tatacactca ccatcaaaag tgtgcaggct gaagacctga 
cactttatta ctgtcagcaa cactatatca ctccgtggac gttcggtgga 
ggcaccaagc tggaaatcaaa
【００９３】
ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１８）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
KVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCKASGYTFT EYILHWVKQK SGQGLEWIGW 
FYPGNNNIKY NEKFKDKATL TADKSSSTVY MELSRLTSED SAVYFCARHE 
QGPGYFDYWG QGTTLTVSS
ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＣＤＲH１（配列番号１９）：GYTFTEYILH
ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＣＤＲH２（配列番号２０）：WFYPGNNNIKYNEKFKD
ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＣＤＲH３（配列番号２１）：HEQGPGYFDY
【００９４】
ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＨドメインは好ましくは、以下に示す配列を有するポリヌクレオチド（配列番号２２）によってコードされる（ＣＤＲH残基をコードするポリヌクレオチドは、下線を付して示す）：
aaggtccagc tgcagcagtc tggagctgaa ctggtgaaac ccggggcatc 
agtgaagctg tcctgcaagg cttctgggta caccttcact gagtatattt 
tacactgggt aaagcagaag tctggacagg gtcttgagtg gattgggtgg 
ttttatcctg gaaataataa tataaagtac aatgagaaat tcaaggacaa 
ggccacactg actgcggaca aatcctccag cacagtctat atggaactta 
gtagattgac atctgaagac tctgcggtct atttctgtgc aagacacgaa
caaggaccag gttactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt 
ctcctcc
【００９５】
（２）「ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２」を形成するための、抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のヒト化
上述のマウス抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２をヒト化することによって、ヒトレシピエントへの投与の際の抗原性を低減するための、抗ヒトＤＲ５抗体のヒト化能力を実証した。上記ヒト化により、本明細書において「ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐２」、「ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐３」、「ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐４」及び「ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐５」と称される４つのヒト化ＶＬドメイン、並びに本明細書において「ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＨ‐２」と称される１つのヒト化ＶＨドメインが得られた。いずれの上記ヒト化ＶＬドメインを上記ヒト化ＶＨドメインとペアリングしてよい。従って、上記ヒト化ＶＨドメインとペアリングされた上記ヒト化ＶＬドメインのうちの１つを備えるいずれの抗体は、一般的に「ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２」と呼ばれ、ヒト化ＶＬ／ＶＨドメインの特定の組み合わせは、ＶＬドメインを参照することによって呼称される。
【００９６】
ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２３）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW 
ASTRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQQ HYITPWTFGG 
GTKLEIK
【００９７】
ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐２は好ましくは、以下に示す配列を有するポリヌクレオチド（配列番号２４）によってコードされる：
gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga 
ccgcgtgact attacttgta aagcttctca ggatgtcaac accgccgtgg 
cttggtacca gcagaagccc ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg 
gccagcactc ggcacaccgg agtcccatct aggttctctg gcagtggatc 
agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc gaggatgtgg 
ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg 
ggcacaaaac tggaaatcaa a
【００９８】
ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW 
ASTRHTGVPD RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQQ HYITPWTFGG 
GTKLEIK
【００９９】
ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐３は好ましくは、以下に示す配列を有するポリヌクレオチド（配列番号２６）によってコードされる：
gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga 
ccgcgtgact attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg 
cttggtacca gcagaagccc ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg 
gccagcactc ggcacaccgg agtcccagat aggttctctg gcagtggatc 
agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc gaggatgtgg 
ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg 
ggcacaaaac tggaaatcaa a
【０１００】
ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐４のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２７）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW ASTRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ HYITPWTFGG GTKLEIK
【０１０１】
ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐４は好ましくは、以下に示す配列を有するポリヌクレオチド（配列番号２８）によってコードされる：
gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga 
ccgcgtgact attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg 
cttggtacca gcagaagccc ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg 
gccagcactc ggcacaccgg agtcccatct aggttctctg gcagtggatc 
agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagcca gaggatatcg 
ctacatacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg 
ggcacaaaac tggaaatcaa a
【０１０２】
ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐５のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２９）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW ASTRHTGVPD RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ HYITPWTFGG GTKLEIK
【０１０３】
ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐５は好ましくは、以下に示す配列を有するポリヌクレオチド（配列番号３０）によってコードされる：
gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga 
ccgcgtgact attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg 
cttggtacca gcagaagccc ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg 
gccagcactc ggcacaccgg agtcccagat aggttctctg gcagtggatc 
agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc gaggatatcg 
ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg 
ggcacaaaac tggaaatcaa a
【０１０４】
ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐３、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐４及びｈＤＲ５  ｍＡｂ  ＶＬ‐５のＶＬドメインのＣＤＲL１は、アミノ酸配列RASQDVNTAVA（配列番号１６５）を有する。
【０１０５】
ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＨ‐２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号３１）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT EYILHWVRQA PGQGLEWMGW 
FYPGNNNIKY NEKFKDRVTI TADKSTSTVY MELSSLRSED TAVYYCARHE
QGPGYFDYWG QGTLVTVSS
【０１０６】
ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＨ‐２は好ましくは、以下に示す配列を有するポリヌクレオチド（配列番号３２）によってコードされる：
caggtccagc tggtgcagag tggggcagag gtgaaaaagc caggggcatc 
agtgaaagtg tcttgtaaag catcaggtta tacatttact gagtacatcc 
tgcactgggt gcgacaggca ccaggacagg gactggaatg gatggggtgg 
ttctaccctg gcaacaacaa cattaagtac aacgagaagt ttaaagaccg 
ggtgaccatc acagcggata agtctaccag tacagtctat atggagctga 
gctccctgag aagcgaagac accgccgtct actattgcgc tcgccacgaa 
cagggtccag gttactttga ttattggggg cagggaactc tggtcacagt 
cagctcc
【０１０７】
Ｃ．更なる抗ヒトＤＲ５抗体
上記新規の抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２に加えて、ドロジツマブ（本明細書では「ＤＲ５  ｍＡｂ  ３」と呼ぶ）、コナツムマブ（本明細書では「ＤＲ５  ｍＡｂ  ４」と呼ぶ）、チガツズマブ（本明細書では「ＤＲ５  ｍＡｂ  ５」と呼ぶ）、ＬＢＹ１３５‐１（本明細書では「ＤＲ５  ｍＡｂ  ６」と呼ぶ）、ＬＢＹ１３５‐２（本明細書では「ＤＲ５  ｍＡｂ  ７」と呼ぶ）及びＫＭＴＲ２（本明細書では「ＤＲ５  ｍＡｂ  ８」と呼ぶ）を含む、多数の更なる抗ヒトＤＲ５抗体が公知である。具体的には、本発明の多価ＤＲ５結合分子は、ＤＲ５  ｍＡｂ  １、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２、ｈＤＲ５  ｍａｂ  ２、ＤＲ５  ｍＡｂ  ３、ＤＲ５  ｍＡｂ  ４、ＤＲ５  ｍＡｂ  ５、ＤＲ５  ｍＡｂ  ６、ＤＲ５  ｍＡｂ  ７及びＤＲ５  ｍＡｂ  ８のうちの１つ又は複数からのＶＬ及び／又はＶＨ  ドメインのＣＤＲを含んでよいと考えられる。あるいは、又は任意に、本発明の多価ＤＲ５結分子は、ＤＲ５  ｍＡｂ  １、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２、ｈＤＲ５  ｍａｂ  ２、ＤＲ５  ｍＡｂ  ３、ＤＲ５  ｍＡｂ  ４、ＤＲ５  ｍＡｂ  ５、ＤＲ５  ｍＡｂ  ６、ＤＲ５  ｍＡｂ  ７及びＤＲ５  ｍＡｂ  ８のうちの１つ又は複数からの少なくとも１つの抗原結合部分を含んでよい。一実施形態では、本発明の多価ＤＲ５結合分子は、ＤＲ５  ｍＡｂ  １及び／又はＤＲ５  ｍＡｂ  ２からの少なくとも１つの抗原結合部分を含む。
【０１０８】
１．ドロジツマブ（「ＤＲ５  ｍＡｂ  ３」）
ドロジツマブ（「ＤＲ５  ｍＡｂ  ３」）のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号５４）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
SELTQDPAVS VALGQTVRIT CSGDSLRSYY ASWYQQKPG QAPVLVIYGA 
NNRPSGIPDR FSGSSSGNTA SLTITGAQAE DEADYYCNSA DSSGNHVVFG 
GGTKLTVLG
ＤＲ５  ｍＡｂ  ３のＣＤＲL１（配列番号５５）：SGDSLRSYYAS
ＤＲ５  ｍＡｂ  ３のＣＤＲL２（配列番号５６）：GANNRPS
ＤＲ５  ｍＡｂ  ３のＣＤＲL３（配列番号５７）：NSADSSGNHVV
【０１０９】
ドロジツマブ（「ＤＲ５  ｍＡｂ  ３」）のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号５８）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
EVQLVQSGGG VERPGGSLRL SCAASGFTFD DYAMSWVRQA PGKGLEWVSG 
INWQGGSTGY ADSVKGRVTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKIL 
GAGRGWYFDY WGKGTTVTVS S
ＤＲ５  ｍＡｂ  ３のＣＤＲH１（配列番号５９）：GFTFDDYAMS
ＤＲ５  ｍＡｂ  ３のＣＤＲH２（配列番号６０）：INWQGGSTGYADSVKG
ＤＲ５  ｍＡｂ  ３のＣＤＲH３（配列番号６１）：ILGAGRGWYFDY
【０１１０】
２．コナツムマブ（「ＤＲ５  ｍＡｂ  ４」）
コナツムマブ（「ＤＲ５  ｍＡｂ  ４」）のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号６２）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQGIS RSYLAWYQQK PGQAPSLLIY 
GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QFGSSPWTFG 
QGTKVEIK
ＤＲ５  ｍＡｂ  ４のＣＤＲL１（配列番号６３）：RASQGISRSYLA
ＤＲ５  ｍＡｂ  ４のＣＤＲL２（配列番号６４）：GASSRAT
ＤＲ５  ｍＡｂ  ４のＣＤＲL３（配列番号６５）：QQFGSSPWT
【０１１１】
コナツムマブ（「ＤＲ５  ｍＡｂ  ４」）のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号６６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
QVQLQESGPG LVKPSQTLSL TCTVSGGSIS SGDYFWSWIR QLPGKGLEWI 
GHIHNSGTTY YNPSLKSRVT ISVDTSKKQF SLRLSSVTAA DTAVYYCARD 
RGGDYYYGMD VWGQGTTVTV SS
ＤＲ５  ｍＡｂ  ４のＣＤＲH１（配列番号６７）：GGSISSGDYFWS
ＤＲ５  ｍＡｂ  ４のＣＤＲH２（配列番号６８）：HIHNSGTTYYNPSLKS
ＤＲ５  ｍＡｂ  ４のＣＤＲH３（配列番号６９）：DRGGDYYYGMDV
【０１１２】
３．チガツズマブ（「ＤＲ５  ｍＡｂ  ５」）
チガツズマブ（「ＤＲ５  ｍＡｂ  ５」）のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号７０）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVG TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW 
ASTRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSSYRTFGQG 
TKVEIK
ＤＲ５  ｍＡｂ  ５のＣＤＲL１（配列番号７１）：KASQDVGTAVA
ＤＲ５  ｍＡｂ  ５のＣＤＲL２（配列番号７２）：WASTRHT
ＤＲ５  ｍＡｂ  ５のＣＤＲL３（配列番号７３）：QQYSSYRT
【０１１３】
チガツズマブ（「ＤＲ５  ｍＡｂ  ５」）のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号７４）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYVMSWVRQA PGKGLEWVAT 
ISSGGSYTYY PDSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARRG 
DSMITTDYWG QGTLVTVSS
ＤＲ５  ｍＡｂ  ５のＣＤＲH１（配列番号７５）：GFTFSSYVMS
ＤＲ５  ｍＡｂ  ５のＣＤＲH２（配列番号７６）：TISSGGSYTYYPDSVKG
ＤＲ５  ｍＡｂ  ５のＣＤＲH３（配列番号７７）：RGDSMITTDY
【０１１４】
４．ＬＢＹ１３５‐１（「ＤＲ５  ｍＡｂ  ６」）
ＬＢＹ１３５‐１（「ＤＲ５  ｍＡｂ  ６」）のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号７８）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIAMTQSHKF MSTLVGDRVS ITCKASQDVN TAIAWYQQKP GQSPKLLIYW 
ASTRHTGVPD RFYGSGSGTD YTLTISSMEA EDAATYYCQQ WSSNPLTFGA 
GTKLELKRA
ＤＲ５  ｍＡｂ  ６のＣＤＲL１（配列番号７９）：QDVNTAIA
ＤＲ５  ｍＡｂ  ６のＣＤＲL２（配列番号８０）：WASTRHT
ＤＲ５  ｍＡｂ  ６のＣＤＲL３（配列番号８１）：QQWSSNPLT
【０１１５】
ＬＢＹ１３５‐１（「ＤＲ５  ｍＡｂ  ６」）のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号８２）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
KVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCKASGYTFT DYTIHWVKQR SGQGLEWIGW 
FYPGGGYIKY NEKFKDRATL TADKSSNTVY MELSRLTSEG SAVYFCARHE 
EGIYFDYWGQ GTTLTVSS
ＤＲ５  ｍＡｂ  ６のＣＤＲH１（配列番号８３）：GYTFTDYTIH
ＤＲ５  ｍＡｂ  ６のＣＤＲH２（配列番号８４）：WFYPGGGYIKYNEKFKD
ＤＲ５  ｍＡｂ  ６のＣＤＲH３（配列番号８５）：HEEGIYFDY
【０１１６】
５．ＬＢＹ１３５‐２（「ＤＲ５  ｍＡｂ  ７」）
ＬＢＹ１３５‐２（「ＤＲ５  ｍＡｂ  ７」）のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号８６）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAIAWYQQKP GQSPKLLIYW 
ASTRHTGVPD RFTGSGSGTD YTLTISSVQA EDLALYYCQQ HYTTPFTFGS 
GTKL
ＤＲ５  ｍＡｂ  ７のＣＤＲL１（配列番号８７）：KASQDVNTAIA
ＤＲ５  ｍＡｂ  ７のＣＤＲL２（配列番号８８）：WASTRHT
ＤＲ５  ｍＡｂ  ７のＣＤＲL３（配列番号８９）：QQHYTTPFT
【０１１７】
ＬＢＹ１３５‐２（「ＤＲ５  ｍＡｂ  ７」）のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号９０）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
KVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCKASGYTFT DYTIHWVKQR SGQGLEWIGW 
FYPGGGYIKY NEKFKDRATL TADKSSNTVY MELSRLTSED SAVYFCARHE 
EGIYFDYWGQ GTTLTVSS
ＤＲ５  ｍＡｂ  ７のＣＤＲH１（配列番号９１）：GYTFTDYTIH
ＤＲ５  ｍＡｂ  ７のＣＤＲH２（配列番号９２）：WFYPGGGYIKYNEKFKD
ＤＲ５  ｍＡｂ  ７のＣＤＲH３（配列番号９３）：HEEGIYFDY
【０１１８】
６．ＫＭＴＲ２（「ＤＲ５  ｍＡｂ  ８」）
ＫＭＴＲ２（「ＤＲ５  ｍＡｂ  ８」）のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号９４）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD 
ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPLTFGG 
GTKVEIKR
ＤＲ５  ｍＡｂ  ８のＣＤＲL１（配列番号９５）：RASQSVSSYLA
ＤＲ５  ｍＡｂ  ８のＣＤＲL２（配列番号９６）：DASNRAT
ＤＲ５  ｍＡｂ  ８のＣＤＲL３（配列番号９７）：QQRSNWPLT
【０１１９】
ＫＭＴＲ２（「ＤＲ５  ｍＡｂ  ８」）のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号９８）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
QVQLVQSGAE MKKPGASVKV SCKTSGYTFT NYKINWVRQA PGQGLEWMGW
MNPDTDSTGY PQKFQGRVTM TRNTSISTAY MELSSLRSED TAVYYCARSY
GSGSYYRDYY YGMDVWGQGT TVTVSS
ＤＲ５  ｍＡｂ  ８のＣＤＲH１（配列番号９９）：GYTFTNYKIN
ＤＲ５  ｍＡｂ  ８のＣＤＲH２（配列番号１００）：WMNPDTDSTGYPQKFQG
ＤＲ５  ｍＡｂ  ８のＣＤＲH３（配列番号１０１）：SYGSGSYYRDYYYGMDV
【０１２０】
Ｄ．操作されたＦｃ領域を有する多価ＤＲ５結合分子
従来の免疫機能では、抗体‐抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用は、抗体依存性細胞傷害性、肥満細胞脱顆粒及び食作用等のエフェクタ機能から、リンパ球増殖及び抗体分泌を制御するもの等の免疫調節性信号にまで及ぶ、広範な応答をもたらす。これらの相互作用は全て、抗体又は免疫複合体のＦｃ領域の、造血細胞上の特殊化された細胞表面受容体への結合によって開始される。抗体及び免疫複合体によってトリガされる細胞応答の多様性は、３つのＦｃ受容体：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の構造不均質性によって得られる。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は活性化（即ち免疫系増強）受容体であり；ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）は阻害性（即ち免疫系減衰）受容体である。例示的なＩｇＧ１  Ｆｃ領域のアミノ酸配列（配列番号１）は既に上に提示されている。
【０１２１】
Ｆｃ領域の修飾は通常、表現型の変化、例えば血清半減期の変化、安定性の変化、細胞酵素に対する感受性の変化又はエフェクタ機能の変化につながる。本発明の抗体をエフェクタ機能に関して修飾して、例えば癌の治療における抗体の有効性を増強することが望ましい場合がある。例えば、作用機序が、標的抗原を担持する細胞の殺滅ではなく遮断又は拮抗作用を伴う抗体の場合といった、特定の場合においては、エフェクタ機能の低減又は削減が望ましい。エフェクタ機能の上昇は、ＦｃγＲが低いレベルで発現する腫瘍及び外来細胞、例えばＦｃγＲＩＩＢのレベルが低い腫瘍特異性Ｂ細胞（例えば非ホジキンリンパ腫、ＣＬＬ及びバーキットリンパ腫）といった、望ましくない細胞を対象とする場合に一般に望ましい。上記実施形態では、エフェクタ機能活性が与えられた又は変更された本発明の分子は、エフェクタ機能活性の効率の増強が望ましい疾患、障害又は感染の治療及び／又は予防のために有用である。
【０１２２】
特定の実施形態では、本発明の多価ＤＲ５結合分子は、野生型Ｆｃ領域（配列番号１）のアミノ酸の配列に対する１つ又は複数の修飾（例えば置換、欠失又は挿入）を有するＦｃ領域を備え、上記修飾は、上記Ｆｃ領域の、従って本発明の分子の、１つ又は複数のＦｃγＲ受容体に対する親和性及び結合活性を低下させる。他の実施形態では、本発明の多価ＤＲ５結合分子は、野生型Ｆｃ領域のアミノ酸に対する１つ又は複数の修飾を有するＦｃ領域を備え、上記修飾は、上記Ｆｃ領域の、従って本発明の分子の、１つ又は複数のＦｃγＲ受容体に対する親和性及び結合活性を上昇させる。他の実施形態では、上記多価ＤＲ５結合分子は変異型Ｆｃ領域を含み、ここで上記変異型は、Ｆｃ領域を含まない、又は野生型Ｆｃ領域を含む分子に対して、ＡＤＣＣ活性の上昇、及び／又はＦｃγＲＩＩＡへの結合の増大を与える、又は仲介する。代替実施形態では、上記分子は変異型Ｆｃ領域を含み、ここで上記変異型は、Ｆｃ領域を含まない、又は野生型Ｆｃ領域を含む分子に対して、ＡＤＣＣ活性（若しくは他のエフェクタ機能）の低下、及び／又はＦｃγＲＩＩＢへの結合の増大を与える、又は仲介する。いくつかの実施形態では、本発明は、変異型Ｆｃ領域を含む多価ＤＲ５結合分子を包含し、上記変異型Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃドメインを含む同等の分子と比べて、いずれのＦｃγＲに対する検出可能な結合を示さない。他の実施形態では、本発明は、変異型Ｆｃ領域を含む多価ＤＲ５結合分子を包含し、上記変異型Ｆｃ領域は、単一のＦｃγＲ、好ましくはＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、又はＦｃγＲＩＩＩＡのうちの１つにしか結合しない。あるいは、本発明の多価ＤＲ５結合分子は、ＦｃγＲに対する低減された親和性、及び／又は（野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ２（配列番号１５４）又はＩｇＧ４（配列番号１０３）からのＦｃ領域が示す結合に対して）低減されたＡＤＣＣ活性を元来示すＦｃ領域を含む。このような親和性及び／又は結合活性の変化は好ましくは、当該細胞内において（修飾されたＦｃ領域を有しない）親分子の結合活性が検出できない場合に低いレベルのＦｃγＲを発現する細胞における、検出可能なＦｃγＲへの結合又はＦｃγＲ関連活性の程度をインビトロで測定することによって評価される。他の実施形態では、上記就職された分子は、３００００〜２００００分子／細胞の密度、２００００〜１００００分子／細胞の密度、１００００〜５０００分子／細胞の密度、５０００〜１０００分子／細胞の密度、１０００〜２００分子／細胞の密度、若しくは２００分子／細胞以下（ただし少なくとも１０、５０、１００若しくは１５０分子／細胞）の密度で非ＦｃγＲ受容体標的抗原を発現する細胞において、検出可能な結合を示す。
【０１２３】
本発明の多価ＤＲ５結合分子は、活性化及び／又は阻害性Ｆｃγ受容体に対する親和性が変化し得る。一実施形態では、上記多価ＤＲ５結合分子は、野生型Ｆｃ領域を有する同等の分子と比べて、ＦｃγＲＩＩＢに対する親和性が上昇し、かつＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＡに対する親和性が低下した、変異型Ｆｃ領域を含む。別の実施形態では、本発明の多価ＤＲ５結合分子は、野生型Ｆｃ領域を有する同等の分子と比べて、ＦｃγＲＩＩＢに対する親和性が低下し、かつＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＡに対する親和性が上昇した、変異型Ｆｃ領域を含む。更に別の実施形態では、本発明の三多価ＤＲ５結合分子は、野生型Ｆｃ領域を有する同等の分子と比べて、ＦｃγＲＩＩＢに対する親和性が低下し、かつＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＡに対する親和性が低下した、変異型Ｆｃ領域を含む。また更に別の実施形態では、本発明の多価ＤＲ５結合分子は、野生型Ｆｃ領域を有する同等の分子と比べて、ＦｃγＲＩＩＢに対する親和性が変化せず、かつＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＡに対する親和性が低下（又は上昇）した、変異型Ｆｃ領域を含む。
【０１２４】
特定の実施形態では、本発明の多価ＤＲ５結合分子は、免疫グロブリンが増強されたエフェクタ機能、例えば抗体依存性細胞仲介細胞傷害性を有するように、ＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＡに対する親和性が変化した変異型Ｆｃ領域を含む。エフェクタ細胞機能の非限定的な例としては、抗体依存性細胞仲介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用、食作用、オプソニン作用、オプソニン食作用、細胞結合、ロゼット形成、Ｃ１ｑ結合、及び相補性決定細胞仲介細胞傷害性が挙げられる。
【０１２５】
ある好ましい実施形態では、親和性又はエフェクタ機能の変化は、野生型Ｆｃ領域を含む同等の分子に対して少なくとも２倍、好ましくは少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、又は少なくとも１００倍である。本発明の他の実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域を含む分子に対して少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、又は２５０％高い親和性で、１つ又は複数のＦｃＲに免疫特異的に結合する。このような測定は、インビボ又はインビトロアッセイとすることができ、好ましい実施形態では、ＥＬＩＳＡ又は表面プラズモン共鳴アッセイ等のインビトロアッセイである。
【０１２６】
様々な実施形態において、本発明の多価ＤＲ５結合分子は、変異型Ｆｃ領域を含み、上記変異型Ｆｃ領域は、ＦｃγＲ受容体の少なくとも１つの活性を刺激するか、又はＦｃγＲ受容体の少なくとも１つの活性に拮抗する。好ましい実施形態では、上記分子は、ＦｃγＲＩＩＢの１つ又は複数の活性、例えば、Ｂ細胞受容体‐仲介型シグナリング、Ｂ細胞の活性化、Ｂ細胞増殖、抗体産生、Ｂ細胞の細胞内カルシウム流入、細胞周期進行、ＦｃεＲＩシグナリングのＦｃγＲＩＩＢ‐仲介型阻害、ＦｃγＲＩＩＢのリン酸化、ＳＨＩＰ動員、ＳＨＩＰリン酸化及びＳｈｃとの連結、又はＦｃγＲＩＩＢシグナル伝達経路中の１つ若しくは複数の下流分子の活性（例えばＭＡＰキナーゼ、ＪＮＫ、ｐ３８若しくはＡｋｔ）に拮抗する変異型Ｆｃ領域を含む。別の実施形態では、本発明の多価ＤＲ５結合分子は、ＦｃεＲＩの１つ又は複数の活性、例えば肥満細胞活性化、カルシウム可動化、脱顆粒、サイトカイン産生又はセロトニン放出を刺激する変異型Ｆｃ領域を含む。
【０１２７】
特定の実施形態では、上記分子は、２つ以上のＩｇＧアイソタイプ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）からのＦｃ領域含有領域を含む。上記様々なＩｇＧアイソタイプは、例えばFlesch, and Neppert (1999) J. Clin. Lab. Anal. 14: 141-156; Chappel et al. (1993) J. Biol. Chem. 33:25124-25131; Chappel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:9036-9040; 又はBruggemann et al. (1987) J. Exp. Med 166: 1351-1361に記載されているような、そのヒンジ及び／又はＦｃ領域のアミノ酸配列の違いにより、血清半減期、補体結合、ＦｃγＲ結合親和性及びエフェクタ機能活性（例えばＡＤＣＣ、ＣＤＣ等）を含む様々な物理的及び機能的特性を呈する。このタイプの変異型Ｆｃ領域を、単独で、又はアミノ酸修飾と組み合わせて使用して、Ｆｃ仲介型エフェクタ機能及び／又は結合活性に影響を及ぼすことができる。組み合わせにおいて、アミノ酸修飾及びＩｇＧヒンジ／Ｆｃ領域は、同様の機能性（例えばＦｃγＲＩＩＡに対する親和性の上昇）を示すことができ、また相加的に、又はより好ましくは相乗的に作用して、野生型Ｆｃ領域を含む本発明の分子と比べて、本発明の分子のエフェクタ機能性を修飾できる。他の実施形態では、アミノ酸修飾及びＩｇＧ  Ｆｃ領域は反対の機能性（例えばそれぞれＦｃγＲＩＩＡに対する親和性の上昇及び低下）を示すことができ、また、同一のアイソタイプの、Ｆｃ領域を含まない又は野生型Ｆｃ領域を含む本発明の分子と比べて、本発明の分子の特異的機能性を選択的に調節又は低下させるよう作用できる。
【０１２８】
好ましい具体的実施形態では、本発明の多価ＤＲ５結合分子は、変異型Ｆｃ領域を含み、上記変異型Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域に対する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、これにより、上記変異体Ｆｃ領域が、Sondermann et al. (2000) Nature 406:267-73に開示されているもののようなＦｃ‐ＦｃＲ相互作用の結晶学的及び構造的分析に基づいて、ＦｃγＲと直接接触する位置において置換を有しない場合に上記分子のＦｃＲに対する親和性が変化する。ＦｃγＲと直接接触するＦｃ領域の位置の例は、アミノ酸残基２３４‐２３９（ヒンジ領域）、アミノ酸残基２６５‐２６９（Ｂ／Ｃループ）、アミノ酸残基２９７‐２９９（Ｃ’／Ｅループ）及びアミノ酸残基３２７‐３３２（Ｆ／Ｇループ）である。いくつかの実施形態では、本発明の分子は、構造的及び結晶学的分析に基づいてＦｃγＲと直接接触しない、例えばＦｃ‐ＦｃγＲ結合部位内にない、少なくとも１つの残基の修飾を含む、変異型Ｆｃ領域を含む。
【０１２９】
変異型Ｆｃ領域は当該技術分野において公知であり、例えばＮＫ依存性又はマクロファージ依存性アッセイにおいて機能的にアッセイされるような、Ｆｃ領域（若しくはその一部）を備える本発明の分子が呈するエフェクタ機能を付与又は改変するために、いずれの公知のＦｃ変異体を本発明において使用してよい。例えば、変化したエフェクタ機能として識別されるＦｃ領域変異体は、抗体工学技術の分野において開示されており、開示されているいずれの好適な変異体を、本発明の分子において使用してよい。
【０１３０】
特定の実施形態では、本発明の多価ＤＲ５結合分子は、１つ又は複数の領域において１つ又は複数のアミノ酸修飾を有する変異型Ｆｃ領域を含み、上記１つ又は複数の修飾は、変異型Ｆｃ領域の、阻害型ＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＩＢ等）に対する親和性に対する活性化ＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＩＡ又はＦｃγＲＩＩＩＡ等）に対する親和性の比率を、（野生型Ｆｃ領域に対して）変化させる：
【０１３１】
【数１】
0006602875.tif 000002
【０１３２】
（野生型Ｆｃ領域に対して）Ｆｃ変異体の親和性の比率が１を超える変異型Ｆｃ領域を有する本発明の多価ＤＲ５結合分子が特に好ましい。このような分子は、例えば癌又は感染症といった、ＦｃγＲが仲介するエフェクタ細胞機能（例えばＡＤＣＣ）の効率の増強が望まれる疾患、障害、若しくは感染の治療的若しくは予防的処置、又はその症状の寛解を提供するにあたって特定の用途を有する。対照的に、親和性の比率が１未満であるＦｃ変異体は、エフェクタ細胞機能の効率の低下を仲介する。テーブル１は、例示的な単一、二重、三重、四重及び五重突然変異を、その親和性の比率が１を超えるか１未満であるかによって列挙している。
【０１３３】
【表１】
0006602875.tif 000003
【０１３４】
ある具体的な実施形態では、変異型Ｆｃ領域において、２３５、２４０、２４１、２４３、２４４、２４７、２６２、２６３、２６９、２９８、３２８、又は３３０位のうちのいずれにおけるいずれのアミノ酸修飾（例えば置換）、及び好ましくは以下の残基：Ａ２４０、Ｉ２４０、Ｌ２４１、Ｌ２４３、Ｈ２４４、Ｎ２９８、Ｉ３２８又はＶ３３０のうちの１つ又は複数。異なる具体的な実施形態では、変異型Ｆｃ領域において、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８３、２８５、２８６、２８９、２９２、２９３、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８又は４３９位のうちのいずれにおけるいずれのアミノ酸修飾（例えば置換）、好ましくは以下の残基：Ｈ２８０、Ｑ２８０、Ｙ２８０、Ｇ２９０、Ｓ２９０、Ｔ２９０、Ｙ２９０、Ｎ２９４、Ｋ２９５、Ｐ２９６、Ｄ２９８、Ｎ２９８、Ｐ２９８、Ｖ２９８、Ｉ３００又はＬ３００。
【０１３５】
ある好ましい実施形態では、変化した親和性でＦｃγＲに結合する変異型Ｆｃ領域において、２５５、２５６、２５８、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３００、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３２０、３２２、３２６、３２９、３３０、３３２、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３３９、３４０、３５９、３６０、３７３、３７６、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８又は４３９位のうちのいずれにおけるいずれのアミノ酸修飾（例えば置換）。好ましくは、上記変異型Ｆｃ領域は、以下の残基のうちのいずれか１つを有する：Ａ２５６、Ｎ２６８、Ｑ２７２、Ｄ２８６、Ｑ２８６、Ｓ２８６、Ａ２９０、Ｓ２９０、Ａ２９８、Ｍ３０１、Ａ３１２、Ｅ３２０、Ｍ３２０、Ｑ３２０、Ｒ３２０、Ｅ３２２、Ａ３２６、Ｄ３２６、Ｅ３２６、Ｎ３２６、Ｓ３２６、Ｋ３３０、Ｔ３３９、Ａ３３３、Ａ３３４、Ｅ３３４、Ｈ３３４、Ｌ３３４、Ｍ３３４、Ｑ３３４、Ｖ３３４、Ｋ３３５、Ｑ３３５、Ａ３５９、Ａ３６０又はＡ４３０。
【０１３６】
異なる実施形態では、低下した親和性で（そのＦｃ領域を介して）ＦｃγＲに結合する変異型Ｆｃ領域において、２５２、２５４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７８、２８９、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３００、３０１、３０３、３２２、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１４、４１６、４１９、４３４、４３５、４３７、４３８、又は４３９位のうちのいずれにおけるいずれのアミノ酸修飾（例えば置換）。
【０１３７】
異なる実施形態では、増強された親和性で（そのＦｃ領域を介して）ＦｃγＲに結合する変異型Ｆｃ領域において、２８０、２８３、２８５、２８６、２９０、２９４、２９５、２９８、３００、３０１、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３３１、３３３、３３４、３３７、３４０、３６０、３７８、３９８、又は４３０位のうちのいずれにおけるいずれのアミノ酸修飾（例えば置換）。異なる実施形態では、増強された親和性でＦｃγＲＩＩＡに結合する変異型Ｆｃ領域において、以下の残基のうちのいずれか１つ：Ａ２５５、Ａ２５６、Ａ２５８、Ａ２６７、Ａ２６８、Ｎ２６８、Ａ２７２、Ｑ２７２、Ａ２７６、Ａ２８０、Ａ２８３、Ａ２８５、Ａ２８６、Ｄ２８６、Ｑ２８６、Ｓ２８６、Ａ２９０、Ｓ２９０、Ｍ３０１、Ｅ３２０、Ｍ３２０、Ｑ３２０、Ｒ３２０、Ｅ３２２、Ａ３２６、Ｄ３２６、Ｅ３２６、Ｓ３２６、Ｋ３３０、Ａ３３１、Ｑ３３５、Ａ３３７又はＡ４３０。
【０１３８】
好ましい変異体は、２２８、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２７１、２７３、２７５、２８１、２８４、２９１、２９６、２９７、２９８、２９９、３０２、３０４、３０５、３１３、３２３、３２５、３２６、３２８、３３０又は３３２位のうちのいずれにおける１つ又は複数の修飾を含む。
【０１３９】
特に好ましい変異体は、群Ａ〜ＡＩから選択された１つ又は複数の修飾を含む：
【０１４０】
【表２】
0006602875.tif 000004
【０１４１】
更に特に好ましい変異体は、群１〜１０５から選択された１つ又は複数の修飾を含む：
【０１４２】
【表３】
0006602875.tif 000005
0006602875.tif 000006
【０１４３】
一実施形態では、本発明の多価ＤＲ５結合分子は、Ｆｃ領域において少なくとも１つの修飾を有する変異型Ｆｃ領域を含む。特定の実施形態では、上記変異型Ｆｃ領域は、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、及びＰ３９６Ｌからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含み、ここで上記番号付与は、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスの番号付与である。
【０１４４】
ある具体的実施形態では、変異型Ｆｃドメインは以下を含む：
（Ａ）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、及びＰ３９６Ｌからなる群から選択される、少なくとも１つの置換；
（Ｂ）（１）Ｆ２４３Ｌ及びＰ３９６Ｌ；
（２）Ｆ２４３Ｌ及びＲ２９２Ｐ；並びに
（３）Ｒ２９２Ｐ及びＶ３０５Ｉ；
からなる群から選択される、少なくとも２つの置換；
（Ｃ）（１）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＹ３００Ｌ；
（２）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＶ３０５Ｉ；
（３）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＰ３９６Ｌ；並びに
（４）Ｒ２９２Ｐ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ；
からなる群から選択される、少なくとも３つの置換；
（Ｄ）（１）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ及びＰ３９６Ｌ；並びに
（２）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ；
からなる群から選択される、少なくとも４つの置換；又は
（Ｅ）（１）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ；並びに
（２）Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ及びＰ３９６Ｌ
からなる群から選択される、少なくとも５つの置換。
【０１４５】
別の具体的実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、以下の置換を含む：
（Ａ）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、及びＹ３００Ｌ；
（Ｂ）Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、及びＰ３９６Ｌ；又は
（Ｃ）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、及びＰ３９６Ｌ。
【０１４６】
他の実施形態では、本発明は：Jefferis, B.J. et al. (2002) Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR: Current Models," Immunol. Lett. 82:57-65; Presta, L.G. et al. (2002) "Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function " Biochem. Soc. Trans. 30:487-90; Idusogie, E.E. et al. (2001) "Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement," J. Immunol. 166:2571-75; Shields, R.L. et al. (2001) "High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgGl For Fc Gamma RI, Fc Gamma RII, Fc Gamma RIII, And FcRn And Design Of IgGl Variants With Improved Binding To The Fc gamma R " J. Biol. Chem. 276:6591-6604; Idusogie, E.E. et al. (2000) "Mapping Of The Clq Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc," J. Immunol. 164:4178-84; Reddy, M.P. et al. (2000) "Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4 " J. Immunol. 164: 1925-1933; Xu, D. et al. (2000) "In Vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies " Cell. Immunol. 200: 16-26; Armour, K.L. et al. (1999) "Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities " Eur. J. Immunol. 29:2613-24; Jefferis, R. et al. (1996) "Modulation Of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions " Immunol. Lett. 54: 101-04; Lund, J. et al. (1996) "Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains " J. Immunol. 157:4963-4969; Hutchins et al. (1995) "Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-IH," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92: 11980-84; Jefferis, R. et al. (1995) "Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation," Immunol. Lett. 44: 111-17; Lund, J. et al. (1995) "Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors " FASEB J. 9: 115-19; Alegre, M . et al. (1994) "A Non-Activating "Humanized" Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo," Transplantation 57: 1537-1543; Lund et al. (1992) "Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma RII," Mol. Immunol. 29:53-59; Lund et al. (1991) "Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG," J. Immunol. 147:2657-2662; Duncan, A.R. et al. (1988) "Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG," Nature 332:563-564；米国特許第５，６２４，８２１号；米国特許第５，８８５，５７３号；米国特許第６，１９４，５５１号；米国特許第７，２７６，５８６号；及び米国特許第７，３１７，０９１号；並びに国際公開第００／４２０７２号及び国際公開第９９／５８５７２号に開示されているもの等の、公知のいずれのＦｃ変異体の使用を包含する。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、本発明の分子は更に、１つ又は複数のグリコシル化部位を備えてよく、これにより、１つ又は複数の炭水化物部分は上記分子に共有結合によって付着する。好ましくは、Ｆｃ領域に１つ若しくは複数のグリコシル化部位及び／又は１つ若しくは複数の修飾を有する、本発明の分子は、未修飾分子と比べて、増強された抗体仲介性エフェクタ機能、例えば増強されたＡＤＣＣ活性を与える、又は有する。いくつかの実施形態では、本発明は更に、Ｆｃ領域の炭水化物部分と直接的又は間接的に相互作用することが分かっている、２４１、２４３、２４４、２４５、２４９、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６５、２９６、２９９、及び３０１位のアミノ酸を含むがこれらに限定されないアミノ酸の１つ又は複数の修飾を含む、分子を含む。Ｆｃ領域の炭水化物部分と直接的又は間接的に相互作用するアミノ酸は当該技術分野において公知であり、例えばJefferis et al. (1995) Immunology Letters, 44: 111-7（この文献は参照によりその全体が本出願に援用される）を参照されたい。
【０１４８】
別の実施形態では、本発明は、好ましくは当該分子の機能性、例えば標的分子又はＦｃγＲへの結合活性を変化させることなく、１つ又は複数のグリコシル化部位を、当該分子の１つ又は複数の部位に導入することによって修飾された、分子を包含する。グリコシル化部位は、本発明の分子の可変及び／又は定常領域に導入してよい。本明細書において使用される場合、「グリコシル化部位（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）」は、オリゴ糖（即ち一体に連結した２つ以上の単糖を含有する炭水化物）が特異的に共有結合によって付着する、抗体中のいずれの具体的なアミノ酸配列を含む。オリゴ糖側鎖は典型的には、Ｎ結合又はＯ結合を介して抗体のバックボーンに連結する。Ｎ結合グリコシル化は、アスパラギン残基の側鎖へのオリゴ糖部分の付着を表す。Ｏ結合グリコシル化は、例えばセリン、トレオニンといったヒドロキシアミノ酸へのオリゴ糖部分の付着を表す。本発明の分子は、Ｎ結合及びＯ結合グリコシル化部位を含む、１つ又は複数のグリコシル化部位を備えてよい。当該技術分野において公知のＮ結合又はＯ結合グリコシル化のためのいずれのグリコシル化部位を、本発明に従って使用してよい。本発明の方法に従って使用できる例示的なＮ結合グリコシル化部位は、アミノ酸配列：Ａｓｎ‐Ｘ‐Ｔｈｒ／Ｓｅｒであり、ここでＸはいずれのアミノ酸であってよく、Ｔｈｒ／Ｓｅｒはトレオニン又はセリンを示す。このような１つ又は複数の部位は、本発明が関与する技術分野において公知の方法を用いて、本発明の分子に導入してよい（例えばIN VITRO MUTAGENESIS, RECOMBINANT DNA: A SHORT COURSE, J. D. Watson, et al. W.H. Freeman and Company, New York, 1983, chapter 8, pp. 106-116（その全体は参照によって本出願に援用される）を参照のこと）。グリコシル化部位を本発明の分子に導入するための例示的な方法は：分子のアミノ酸配列を修飾するか若しくは突然変異させて、所望のＡｓｎ‐Ｘ‐Ｔｈｒ／Ｓｅｒ配列を得るステップを含んでよい。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、本発明は、グリコシル化部位を追加又は欠失することによって、本発明の分子の炭水化物含量を改変する方法を包含する。抗体（及び抗体ドメイン、例えばＦｃドメインを含む分子）の炭水化物含量を改変する方法は、当該技術分野において公知であり、本発明に包含される。例えば米国特許第６，２１８，１４９号；欧州特許第０３５９０９６Ｂ１号；米国特許出願第２００２／００２８４８６号；国際公開第０３／０３５８３５号；米国特許出願第２００３／０１１５６１４号；米国特許第６，２１８，１４９号；米国特許第６，４７２，５１１号（これらの全体は参照によって本出願に援用される）を参照されたい。他の実施形態では、本発明は、当該分子の１つ又は複数の内因性炭水化物部分を欠失することによって、本発明の分子の炭水化物含量を改変する方法を包含する。ある具体的実施形態では、本発明は、２９７位に隣接する位置を修飾することによって、抗体のＦｃ領域のグリコシル化部位をシフトするステップを包含する。ある具体的実施形態では、本発明は２９６位を修飾することによって、２９７位ではなく２９６位をグリコシル化するステップを包含する。
【０１５０】
エフェクタ機能はまた、Ｆｃ領域に１つ又は複数のシステイン残基を導入することによって、この領域における鎖間ジスルフィド結合を可能とし、その結果として吸収能力が改善され得る、並びに／又は補体仲介型細胞殺滅及びＡＤＣＣが増大し得るホモ二量体抗体を生成することにより、修飾できる（Caron, P.C. et al. (1992) "Engineered Humanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies J. Exp. Med. 176: 1191-1195; Shopes, B. (1992) "A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced Cytolytic Activity," J. Immunol. 148(9):2918-2922）。抗腫瘍活性が増強されたホモ二量体抗体はまた、Wolff, E.A. et al. (1993) "Monoclonal Antibody Homodimers: Enhanced Antitumor Activity In Nude Mice," Cancer Research 53:2560-2565に記載されているようなヘテロ二機能性クロスリンカーを用いて調製できる。あるいは、二重Ｆｃ領域を有し、それによって補体溶解及びＡＤＣＣ能力が増強され得る抗体を加工できる（Stevenson, G.T. et al. (1989) "A Chimeric Antibody With Dual Fc Regions (bisFabFc) Prepared By Manipulations At The IgG Hinge "Anti-Cancer Drug Design 3:219-230）。
【０１５１】
Ｅ．ダイアボディを含む多価ＤＲ５結合分子
１．Ｆｃ領域を含まないダイアボディを含む多価ＤＲ５結合分子
本発明の一実施形態は、第１のエピトープ（「エピトープ１」）及び第２のエピトープ（「エピトープ２」）に結合できる二重特異性ダイアボディを含む、又は上記二重特異性ダイアボディからなる、多価ＤＲ５結合分子に関し、上記第１のエピトープはヒトＤＲ５のエピトープであり、上記第２のエピトープはＤＲ５の異なるエピトープである。好ましくは、このようなダイアボディは、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含み、最も好ましくは第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖からなり、上記第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖の配列は、上記ポリペプチド鎖が互いに共有結合して、第１のＤＲ５エピトープ及び第２のＤＲ５エピトープに同時に結合できる共有結合複合体を形成することを可能とする配列である。従ってこのようなダイアボディは、単一のＤＲ５ポリペプチド上の第１及び第２のエピトープに結合してよく（即ち分子内で結合してよく）、又はこれらは、あるＤＲ５ポリペプチド上の第１のエピトープと、別のＤＲ５ポリペプチド上の第２のエピトープとに結合してよい（即ち（分子間で結合してよい）。好ましくは、このようなダイアボディは、細胞の表面上に配列されたＤＲ５分子を架橋させる。
【０１５２】
一実施形態では、このような二重特異性ダイアボディの上記第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；第１又は第２のエピトープに結合できる第１のモノクローナル抗体のＶＬドメイン（即ちＶＬepitope1又はＶＬepitope2）；第１の介在スペーサペプチド（リンカー１）；（上記第１のポリペプチド鎖がＶＬepitope1を含有する場合は）第２のエピトープ又は（上記第１のポリペプチド鎖がＶＬepitope2を含有する場合は）第１のエピトープに結合できる第２のモノクローナル抗体のＶＨドメイン；任意にシステイン残基を含有する第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）；ヘテロ二量体促進ドメイン；及びＣ末端を含む（図１）。表記法「ＶＬ１」及び「ＶＨ１」はそれぞれ、第１のモノクローナル抗体の可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインを指す。同様に、表記法「ＶＬ２」及び「ＶＨ２」はそれぞれ、第２の抗体の可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインを指す。
【０１５３】
二重特異性ダイアボディのこの実施形態の第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；第１又は第２のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（即ちＶＬepitope1又はＶＬepitope2、かつ上記ダイアボディの上記第１のポリペプチド鎖に含むために選択されていないＶＬドメイン）；第１の介在リンカーペプチド（リンカー１）；（上記第２のポリペプチド鎖がＶＬepitope1を含有する場合は）第２のエピトープ又は（上記第２のポリペプチド鎖がＶＬepitope2を含有する場合は）第１のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン；任意にシステイン残基を含有するスペーサペプチド（リンカー２）；ヘテロ二量体促進ドメイン；及びＣ末端を含む（図１）。
【０１５４】
上記第１のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、上記第２のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、ＤＲ５（即ち上記第１又は第２のエピトープ）に対して特異的な第１の機能性抗原結合部位を形成する。同様に、上記第２のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、上記第１のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、これもまたＤＲ５（即ち上記第２又は第１のエピトープ）に対して特異的な第２の機能性抗原結合部位を形成する。従って、第１及び第２のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインの選択は、上記ダイアボディの上記２つのポリペプチド鎖が合わせて、ＤＲ５の第１のエピトープ及びＤＲ５の第２のエピトープ両方に結合できるＶＬ及びＶＨドメインを含む（即ち上記２つのポリペプチド鎖がＶＬepitope1／ＶＬepitope1及びＶＬepitope2／ＶＨepitope2を含む）ように、協調される。
【０１５５】
最も好ましくは、介在リンカーペプチド（ＶＬ及びＶＨドメインを隔てるリンカー１）の長さを、上記ポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインが互いに結合するのを実質的に又は完全に防止するよう選択する。これにより、上記第１のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、互いに結合することが実質的に又は完全に不可能となる。同様に、上記第２のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、互いに結合することが実質的に又は完全に不可能となる。好ましい介在スペーサペプチド（リンカー１）は、配列（配列番号３３）：GGGSGGGGを有する。
【０１５６】
第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）は任意に、１つ、２つ、３つ又は４つ以上のシステインを含有する。好ましいシステイン含有介在スペーサペプチド（リンカー２）は、配列番号３４：GGCGGGの配列を有する。あるいは、リンカー２はシステインを含まず、以下で説明するように、システイン含有ヘテロ二量体促進ドメインが使用される。任意に、システイン含有リンカー２及びシステイン含有ヘテロ二量体促進ドメインの両方が使用される。
【０１５７】
上記ヘテロ二量体促進ドメインは、一方のポリペプチド鎖においてGVEPKSC（配列番号３５）VEPKSC（配列番号３６）又はAEPKSC（配列番号１６９）、他方のポリペプチド鎖においてGFNRGEC（配列番号３７）又はFNRGEC（配列番号３８）であってよい（米国公開特許第２００７／０００４９０９号）。
【０１５８】
しかしながら、より好ましくは、このようなダイアボディの上記ヘテロ二量体促進ドメインは、少なくとも６つ、少なくとも７つ又は少なくとも８つの荷電アミノ酸残基の配列を含む、反対の電荷の１つ、２つ、３つ又は４つのタンデム反復コイルドメインから形成される（Apostolovic, B. et al. (2008) “pH-Sensitivity of the E3/K3 Heterodimeric Coiled Coil,” Biomacromolecules 9:3173-3180; Arndt, K.M. et al. (2001) “Helix-stabilized Fv (hsFv) Antibody Fragments: Substituting the Constant Domains of a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled-coil Domain,” J. Molec. Biol. 312:221-228; Arndt, K.M. et al. (2002) “Comparison of In Vivo Selection and Rational Design of Heterodimeric Coiled Coils,” Structure 10:1235-1248; Boucher, C. et al. (2010) “Protein Detection By Western Blot Via Coiled-Coil Interactions,” Analytical Biochemistry 399:138-140; Cachia, P.J. et al. (2004) “Synthetic Peptide Vaccine Development: Measurement Of Polyclonal Antibody Affinity And Cross-Reactivity Using A New Peptide Capture And Release System For Surface Plasmon Resonance Spectroscopy,” J. Mol. Recognit. 17:540-557; De Crescenzo, G.D. et al. (2003) “Real-Time Monitoring of the Interactions of Two-Stranded de novo Designed Coiled-Coils: Effect of Chain Length on the Kinetic and Thermodynamic Constants of Binding,” Biochemistry 42:1754-1763; Fernandez-Rodriquez, J. et al. (2012) “Induced Heterodimerization And Purification Of Two Target Proteins By A Synthetic Coiled-Coil Tag,” Protein Science 21:511-519; Ghosh, T.S. et al. (2009) “End-To-End And End-To-Middle Interhelical Interactions: New Classes Of Interacting Helix Pairs In Protein Structures,” Acta Crystallographica D65:1032-1041; Grigoryan, G. et al. (2008) “Structural Specificity In Coiled-Coil Interactions,” Curr. Opin. Struc. Biol. 18:477-483; Litowski, J.R. et al. (2002) “Designing Heterodimeric Two-Stranded α-Helical Coiled-Coils: The Effects Of Hydrophobicity And α-Helical Propensity On Protein Folding, Stability, And Specificity,” J. Biol. Chem. 277:37272-37279; Steinkruger, J.D. et al. (2012) “The d′--d--d′ Vertical Triad is Less Discriminating Than the a′--a--a′ Vertical Triad in the Antiparallel Coiled-coil Dimer Motif,” J. Amer. Chem. Soc. 134(5):2626-2633; Straussman, R. et al. (2007) “Kinking the Coiled Coil - Negatively Charged Residues at the Coiled-coil Interface,” J. Molec. Biol. 366:1232-1242; Tripet, B. et al. (2002) “Kinetic Analysis of the Interactions between Troponin C and the C-terminal Troponin I Regulatory Region and Validation of a New Peptide Delivery/Capture System used for Surface Plasmon Resonance,” J. Molec. Biol. 323:345-362; Woolfson, D.N. (2005) “The Design Of Coiled-Coil Structures And Assemblies,” Adv. Prot. Chem. 70:79-112; Zeng, Y. et al. (2008) “A Ligand-Pseudoreceptor System Based On de novo Designed Peptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With Altered Tropism,” J. Gene Med. 10:355-367）。
【０１５９】
このような反復コイルドメインは、完全な反復であってよく、又は置換を有してよい。例えば、第１のポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインは、８つの負帯電アミノ酸残基のシーケンスを含んでよく、第２のポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインは、８つの負帯電アミノ酸残基のシーケンスを含んでよい。反対の極のコイルを他方のポリペプチド鎖に対して使用する場合、第１又は第２のポリペプチド鎖にどのコイルを設けるかは重要ではない。正帯電アミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒスチジン等であってよく、及び／又は負帯電アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸等であってよい。正帯電アミノ酸は好ましくはリジンであり、及び／又は負帯電アミノ酸は好ましくはグルタミン酸である。（このようなドメインはホモ二量体化を阻害し、これによってヘテロ二量体化を促進するため）単一のヘテロ二量体促進ドメインしか採用できないが、本発明のダイアボディの第１及び第２のポリペプチド鎖両方が、ヘテロ二量体促進ドメインを含有することが好ましい。
【０１６０】
ある好ましい実施形態では、ヘテロ二量体促進ドメインのうちの一方は、４つのタンデム「Ｅコイル」螺旋形ドメイン（配列番号３９：EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK）を備え、そのグルタミン酸残基はｐＨ７において負電荷を形成し、その一方で、ヘテロ二量体促進ドメインのうちのもう一方は、４つのタンデム「Ｋコイル」ドメイン（配列番号４０：KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE）を備え、そのリジン残基はｐＨ７において正電荷を形成する。このような帯電ドメインの存在は、第１及び第２のポリペプチド間の連結を促進し、ヘテロ二量体化を助長する。特に好ましいのは、配列番号３９の４つのタンデム「Ｅコイル」螺旋形ドメインのうちの１つが、システイン残基EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号４１）を含有するように修飾された、ヘテロ二量体促進ドメインである。同様に、特に好ましいのは、配列番号４０の４つのタンデム「Ｋコイル」螺旋形ドメインのうちの１つが、システイン残基KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号４２）を含有するように修飾された、ヘテロ二量体促進ドメインである。
【０１６１】
国際公開第２０１２／０１８６８７号に開示されているように、ダイアボディのインビボ薬物動態特性を改善するために、ダイアボディを、ダイアボディの末端のうちの１つ又は複数に血清結合タンパク質のポリペプチド部分を含有するように修飾してよい。最も好ましくは、このような血清結合タンパク質のポリペプチド部分は、ダイアボディのＣ末端に配置されることになる。アルブミンは、血漿中に最も豊富なタンパク質であり、ヒトにおいて１９日の半減期を有する。アルブミンは複数の小さな分子結合部位を有し、これによりアルブミンは他のタンパク質に非共有結合して血清半減期を延長できる。連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）は、安定した３重螺旋束を形成する４６個のアミノ酸残基からなり、広範なアルブミン結合特異性を有する（Johansson, M.U. et al. (2002) “Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules,” J. Biol. Chem. 277(10):8114‐8120）。従って、ダイアボディのインビボ薬物動態特性を改善するための、血清結合タンパク質の特に好ましいポリペプチド部分は、連鎖球菌タンパク質Ｇからのアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、及びより好ましくは、連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）（配列番号４３）：LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALPである。
【０１６２】
国際公開第２０１２／１６２０６８号（参照により本出願に援用される）に開示されているように、配列番号４３の「脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）」変異体は、ＭＨＣクラスＩＩ結合を減衰させる又は除去する能力を有する。組み合わせ突然変異の結果に基づき、以下の置換の組み合わせが、上述のような脱免疫化アルブミン‐結合ドメインを形成するための好ましい置換であると考えられる：６６Ｓ／７０Ｓ＋７１Ａ；６６Ｓ／７０Ｓ＋７９Ａ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｓ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｄ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｅ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｓ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｄ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｅ。修飾Ｌ６４Ａ、Ｉ６５Ａ及びＤ７９Ａ又は修飾Ｎ６６Ｓ、Ｔ７０Ｓ及びＤ７９Ａを有する変異型ＡＢＤ。アミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNA64A65NNAKT VEGVKALIA79E ILAALP（配列番号４４）、
又はアミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIS66NAKS70 VEGVKALIA79E ILAALP（配列番号４５）
を有する変異型脱免疫化ＡＢＤは、上述のような脱免疫化アルブミン‐結合ドメインが、ＭＨＣクラスＩＩ結合の減衰を提供しながら、実質的に野生型の結合を呈するため、特に好ましい。従って、アルブミン結合ドメインを有する上述のようなダイアボディの第１のポリペプチド鎖は、好ましくは上記ポリペプチド鎖のＥコイル（又はＫコイル）ドメインのＣ末端に位置決めされることによって、上記Ｅコイル（又はＫコイル）ドメインと上記アルブミン結合ドメイン（これは好ましくは脱免疫化アルブミン結合ドメインである）との間に介在する、第３のリンカー（リンカー３）を含有する。上記リンカー３に関して好ましい配列は、配列番号４６：GGGSである。
【０１６３】
本発明の別の実施形態は、ＤＲ５の１つのエピトープに結合できる単一特異性ダイアボディを含む、又は上記単一特異性ダイアボディからなる、多価ＤＲ５結合分子に関する。好ましくは、このようなダイアボディは、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含み、最も好ましくは第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖からなり、上記第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖の配列は、上記ポリペプチド鎖が互いに共有結合して、同一のＤＲ５エピトープにそれぞれ結合できる２つの結合ドメインを有する共有結合複合体を形成することを可能とする配列である。好ましくは、このようなダイアボディは、２つの別個のＤＲ５ポリペプチド上の同一のＤＲ５エピトープに同時に結合できる。好ましくは、このようなダイアボディは、細胞の表面上のＤＲ５分子を架橋させる。
【０１６４】
単一特異性ダイアボディは、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＤＲ５のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン；第１の介在スペーサペプチド（リンカー１）；ＤＲ５のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメインを含む、ポリペプチド鎖のホモ二量体化から容易に生成できる。上で詳述したように、介在リンカーペプチド（ＶＬ及びＶＨドメインを隔てるリンカー１）の長さを、上記ポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインが互いに結合するのを実質的に又は完全に防止するよう選択する。上記ポリペプチド鎖は任意に、ポリペプチドのペアの間の共有ジスルフィド結合を形成できるシステイン含有ペプチドを含んでよい。
【０１６５】
あるいは、単一特異性２価ダイアボディは、上で詳述したように、上記第１のモノクローナル抗体及び上記第２のモノクローナル抗体が同一のエピトープを認識する場合、又は上記第１及び第２のポリペプチド鎖の両方において同一のＶＬ及びＶＨドメインが使用される場合、例えば第１及び第２のポリペプチドのヘテロ二量体化によって容易に生成できる。
【０１６６】
２．Ｆｃ領域含有多価ＤＲ５結合分子
本発明の一実施形態は、Ｆｃ領域含有多価ＤＲ５結合分子に関する。ダイアボディポリペプチド鎖のうちの一方又は両方にＩｇＧ  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを追加することによって、これらダイアボディ鎖の複合体化によってＦｃ領域の形成がもたらされるようにすることで、上記ダイアボディの生物学的半減期が増大する、及び／又は上記ダイアボディの価数が変化する。
【０１６７】
両方のダイアボディポリペプチドにＩｇＧ  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを組み込むことにより、２本鎖Ｆｃ含有ダイアボディの形成が可能となる（図２）。上述のように、このようなダイアボディは、ＶＬ及びＶＨドメインの選択に応じてＤＲ５エピトープに関して二重特異性又は単一特異性となり、またＤＲ５抗原に対して２価となる。
【０１６８】
あるいは、ダイアボディポリペプチドのうちの一方のみにＩｇＧ  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを組み込むことにより、４本鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディの形成が可能となる（図３及び図４）。各ダイアボディ部分が二重特異性、かつ異なるＤＲ５エピトープに関して１価である場合、得られる４本鎖分子は、二重特異性、かつ２つの異なるＤＲ５エピトープそれぞれに関してかつ２価となり、ＤＲ５抗原に対して４価となる（図４）。あるいは、２つの異なる二重特異性１価ダイアボディを組み合わせる場合、得られる４本鎖分子は、四重特異性、かつ４つの異なるＤＲ５エピトープに対して１価となり、ＤＲ５抗原に対して１価となる（図３）。各ダイアボディ部分が１つのＤＲ５エピトープに関して単一特異性かつ２価である場合、得られる４本鎖分子は、１つのＤＲ５エピトープ及びＤＲ５抗原に対して単一特異性かつ４価となる。図３は、定常軽鎖（ＣＬ）ドメイン及び定常重鎖１（ＣＨ１）ドメインを有するダイアボディを示しているが、代わりに図４に概略図で示すように、このようなドメインの断片及び他のポリペプチドをヘテロ二量体促進ドメインとして用いてよい（例えば米国公開特許第２０１３‐０２９５１２１号；米国公開特許第２０１０‐０１７４０５３号；米国公開特許第２００９‐００６０９１０号；欧州公開特許第２７１４０７９号；欧州公開特許第２６０１２１６号；欧州公開特許第２３７６１０９号；欧州公開特許第２１５８２２１号；国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号参照）。よって例えば、ＣＨ１ドメインの代わりに、ヒトＩｇＧのヒンジドメイン由来の、アミノ酸配列GVEPKSC（配列番号３５）又はVEPKSC（配列番号３６）を有するペプチドを用いてよく、またＣＬドメインの代わりに、ヒトκ軽鎖のＣ末端６アミノ酸GFNRGEC（配列番号３７）又はFNRGEC（配列番号３８）を用いてよい。４本鎖ダイアボディを含有する代表的なペプチドを図４Ａに示す。あるいは、又は更に、「Ｅコイル」螺旋ドメイン（配列番号３９：EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK又は配列番号４１：EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK）；及び「Ｋコイル」ドメイン（配列番号４０：KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE又は配列番号４２：KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE）等の反対の電荷のタンデムコイルドメインを含むペプチドを用いてよい。４本鎖ダイアボディを含有する代表的なコイルドメインを図４Ｂに示す。
【０１６９】
本発明のＦｃ領域含有ダイアボディ分子中で使用してよい追加の又は代替的なリンカーとしては：ASTKG（配列番号４７）、DKTHTCPPCP（配列番号４８）、LEPKSS（配列番号４９）、及びAPSSSPME（配列番号５０）、GGC及びGGGが挙げられる。クローニングの容易さのために、GGG又はGGCの代わり配列番号４９を用いてよい。更に、配列番号４９のすぐ後に配列番号４７を続けて、代替的なリンカー（LEPKSSDKTHTCPPCP；配列番号５１）を形成してよい。
【０１７０】
図３及び図４Ａ〜４Ｂにおいて提供されているように、本発明のダイアボディは、４つの異なる鎖を含んでよい。このようなダイアボディの第１及び第３のポリペプチド鎖は、４つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン、（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン、（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメイン及び（ｉｖ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。第２及び第４のポリペプチドは、：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン、（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン及び（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを含有し、上記ヘテロ二量体促進ドメインは、第１の／第３の鎖と第２の／第４の鎖との二量体化を促進する。第３及び第４のポリペプチド鎖のＶＬ及び／又はＶＨドメイン、並びに第１及び第２のポリペプチド鎖のＶＬ及び／又はＶＨドメインは、同一であってよく、又は単一特異性、二重特異性若しくは四重特異性の４価結合を可能とするために異なっていてよい。本発明の代表的な４本鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディのポリペプチド鎖の一般的構造をテーブル２において提供する：
【０１７１】
【表４】
0006602875.tif 000007
【０１７２】
ＤＲ５に関して４価である（即ちそれぞれヒトＤＲ５に結合できる４つの抗原結合ドメインを有する）本発明の代表的なＦｃ領域含有ダイアボディの第１及び第２のポリペプチド鎖の構造を、テーブル３において提供する。各Ｆｃ領域含有ダイアボディは、２ペアの共有結合した第１及び第２のポリペプチド鎖を含み、これにより：
（ａ）上記第１のポリペプチド鎖のＶＬ１ドメイン及び上記第２のポリペプチド鎖のＶＨ１ドメインは、ＤＲ５の第１のエピトープに特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成し；
（ｂ）上記第１のポリペプチド鎖のＶＨ２ドメイン及び上記第２のポリペプチド鎖のＶＬ１ドメインは、ＤＲ５の第２のエピトープに特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成し；
（ｃ）第１のポリペプチド鎖のペアのＣＨ２‐ＣＨ３部分は、ＩｇＧ  Ｆｃ領域を形成する。
【０１７３】
本明細書に記載されているように、Ｆｃ領域（即ちＩｇＧ重鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン）は、ＦｃγＲに関する変化した親和性及び／又は変化したエフェクタ機能及び／又は変化した血漿中半減期を有する、変異型Ｆｃ領域であってよい。いくつかの実施形態では、上記Ｆｃ領域は、Ｃ末端残基を有しない変異体であってよい。
【０１７４】
【表５】
0006602875.tif 000008
0006602875.tif 000009
0006602875.tif 000010
【０１７５】
本発明のＦｃ領域含有ダイアボディのＦｃ領域は、完全Ｆｃ領域（例えば完全ＩｇＧ  Ｆｃ領域）であってよく、又は完全Ｆｃ領域の断片でしかなくてもよい。本発明のFc領域含有ダイアボディのＦｃ領域は、１つ又は複数のＦｃ受容体（例えば１つ又は複数のＦｃγＲ）に結合できる能力を有してよく、より好ましくは、上記Ｆｃ領域は、（野生型Ｆｃ領域が示す結合に比べて）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）若しくはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合の変化を引き起こし、又は上記Ｆｃ領域の、１つ若しくは複数の阻害性受容体に結合する能力を有意に低減する。従って本発明のFc領域含有ダイアボディのFc領域は、完全Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのうちのある程度若しくは全体及び／若しくはＣＨ３ドメインのうちのある程度若しくは全体を含んでよく、又は（例えば完全Ｆｃ領域のＣＨ２若しくはＣＨ３ドメインに対する１つ若しくは複数の挿入及び／若しくは１つ若しくは複数の欠失を含んでよい）変異型ＣＨ２及び／若しくは変異型ＣＨ３配列を備えてよい。このようなＦｃ領域は、非Ｆｃポリペプチド部分を備えてよく、又は自然に発生しない完全Ｆｃ領域の部分を備えてよく、又はＣＨ２及び／若しくはＣＨ３ドメインの自然に発生しない配向を備えてよい（例えば２つのＣＨ２ドメイン若しくは２つのＣＨ３領域、若しくはＮ末端からＣ末端への方向において、ＣＨ３ドメインと、これが連結したＣＨ２ドメイン、等）。
【０１７６】
特に、本発明のＦｃ領域含有ダイアボディのポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに関して、（野生型ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（配列番号１）が示す結合と比べて）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が低下する（又は結合を実質的に示さない）ことが好ましい。このような変化した結合を仲介できるＦｃ変異型及び突然変異型については、上述されている。ある具体的な実施形態では、本発明のＦｃ領域含有ダイアボディのポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、ＡＤＣＣエフェクタ機能をほとんど又は全く仲介しないＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む。好ましい実施形態では、このようなダイアボディの第１及び／又は第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ｑ及びＮ２９７Ｇの置換のうちのいずれの１つ、２つ又は３つを含む。別の実施形態では、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域変異体は、Ｎ２９７Ｑ置換、Ｎ２９７Ｇ置換、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換、又はＤ２６５Ａ置換を含有する。というのは、これらの突然変異がＦｃＲ結合を消失させるためである。
【０１７７】
Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換を含む例示的なヒトＩｇＧ１のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１０２）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSPGK
【０１７８】
あるいは、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）に対する結合の低下（若しくは実質的に結合しない）及び／又は（野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号１）が示す結合に対する）エフェクタ機能の低減を元来示すＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを利用する。ある具体的実施形態では、本発明のＦｃ領域含有ダイアボディは、任意にＣ末端アミノ酸残基を含まない、ＩｇＧ２  Ｆｃ領域（配列番号１６４）又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域（配列番号１０３）を含む。ＩｇＧ４  Ｆｃ領域が利用される場合、本発明は、Ｋａｂａｔに記載されているようなＥＵインデックスによる番号付与（Lu et al., (2008) “The Effect Of A Point Mutation On The Stability Of Igg4 As Monitored By Analytical Ultracentrifugation,” J Pharmaceutical Sciences 97:960-969）でＳ２２８Ｐ等の安定化突然変異の導入も包含し、これによって鎖の交換の発生を低減する。当該技術分野において公知の他の安定化突然変異も、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域に導入してよい（Peters, P et al., (2012) “Engineering an Improved IgG4 Molecule with Reduced Disulfide Bond Heterogeneity and Increased Fab Domain Thermal Stability,” J. Biol. Chem. 287:24525-24533；国際公開第２００８／１４５１４２号）。Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｑ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＤ２６５Ａ置換はエフェクタ機能を消失させるため、エフェクタ機能が望まれる状況では、これらの置換は好ましくは採用されない。上述のように、いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域はＣ末端アミノ酸残基を含まない。
【０１７９】
このようなポリペプチド鎖のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインは配列において同一である必要はなく、有利には２つのポリペプチド鎖間の錯体形成を促進するために修飾される。例えば、ＣＨ２又はＣＨ３ドメインにアミノ酸置換（好ましくは「ノブ（ｋｎｏｂ）」を形成する嵩高な側鎖基、例えばトリプトファンを含むアミノ酸による置換）を導入して、立体障害により、同様に突然変異させたドメインとの相互作用を防止し、上記突然変異させたドメインを、相補的な又は適応した突然変異（例えばグリシンによる置換）を施されたドメイン、即ち「ホール（ｈｏｌｅ）」とペアにすることができる。このような一連の突然変異は、Ｆｃ領域を形成するＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドのいずれのペアに施すことができ、また更に、上記ペアのポリペプチド鎖のいずれの部分に施すことができる。ホモ二量体化を抑えてヘテロ二量体化を促進するためのタンパク質加工の方法は、特に免疫グロブリン様分子の加工に関して当該技術分野で公知であり、本明細書に包含される（例えばRidgway et al. (1996) “‘Knobs‐Into‐Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617‐621; Atwell et al. (1997) “Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26‐35;及びXie et al. (2005) “A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95‐101を参照（これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される））。好ましくは、「ノブ」は第１のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに加工され、「ホール」は第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに加工される。従って「ノブ」は、第１のポリペプチド鎖がそのＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを介してホモ二量体化するのを防止する役割を果たすことになる。第３のポリペプチド鎖は好ましくは「ホール」置換基を含有するため、「ノブ」を含む第１のポリペプチド鎖とヘテロ二量体化し、かつそれ自体とホモ二量体化する。
【０１８０】
好ましいノブは、天然ＩｇＧ  Ｆｃ領域を修飾して修飾基Ｔ３６６Ｗを含有させることによって生成される。好ましいホールは、天然ＩｇＧ  Ｆｃ領域を修飾して修飾基Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含有させることによって生成される。上記ホモ二量体を、最終的なヘテロ二量体Ｆｃ領域含有ダイアボディから精製するのを補助するために、好ましくは、１つの鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインのタンパク質Ａ結合部位を、「ホール」置換を含有する上記第３のポリペプチド上の位置４３５（Ｈ４３５Ｒ）におけるアミノ酸置換によって突然変異させる。このようにして、「ホール」置換を含有する第３のポリペプチド鎖のホモ二量体はタンパク質Ａに結合せず、その一方でヘテロ二量体は、第１のポリペプチド鎖のタンパク質Ａ結合部位を介してタンパク質Ａに結合する能力を有したままとなる。
【０１８１】
本発明のＦｃ領域含有ダイアボディの第１のポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましい配列は、「ノブ担持」配列（配列番号５２）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSPGK
を有する。
【０１８２】
２つのポリペプチド鎖を有する本発明のＦｃ領域含有ダイアボディの第２のポリペプチド鎖（又は３つのポリペプチド鎖を有するＦｃ領域含有ダイアボディの第３のポリペプチド鎖）のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましい配列は、「ホール担持」配列（配列番号５３）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNRYTQKS LSLSPGK
を有する。
【０１８３】
上述のように、配列番号５２及び配列番号５３のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、アラニンによる２３４位の置換及びアラニンによる２３５位の置換を含み、従って、（野生型Ｆｃ領域（配列番号１）が示す結合と比べて）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が低下した（又は結合を実質的に示さない）Ｆｃ領域を形成する。Ｃ末端残基が任意に含まれる。
【０１８４】
第１のポリペプチド鎖が、配列番号５２のもの等の「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３配列を有することが好ましい。しかしながら、理解されるように、第１のポリペプチド鎖中に「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号５３）を採用でき、この場合「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号５２）は、２つのポリペプチド鎖を有する本発明のＦｃ領域含有ダイアボディの第２のポリペプチド鎖（又は３つ若しくは４つのポリペプチド鎖を有するＦｃ領域含有ダイアボディの第３のポリペプチド鎖）中に採用される。配列番号５２及び／又は配列番号５３のＣ末端残基が任意に含まれる。
【０１８５】
Ｖ．基準抗体
Ａ．基準抗ヒトＣＤ３抗体
ＣＤ３は、４つの別個の鎖からなるＴ細胞共受容体である(Wucherpfennig, K.W. et al. (2010) “Structural Biology Of The T‐Cell Receptor: Insights Into Receptor Assembly, Ligand Recognition, And Initiation Of Signaling,” Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2(4):a005140; pages 1‐14)。哺乳類では、上記複合体ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖及び２つのＣＤ３ε鎖を含有する。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）として公知である分子と連結して、Ｔリンパ球の活性化信号を生成する。ＣＤ３が存在しない場合、ＴＣＲは適切に集合せず、劣化する（Thomas, S. et al. (2010) “Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T‐Cell Receptor Gene Transfer,” Immunology 129(2):170-177）。ＣＤ３は、全ての成熟Ｔ細胞の膜に結合し、実質的に他の細胞タイプには結合しないことが分かっている（Janeway, C.A. et al. (2005) In: Immunobiology: The Immune System In Health And Disease,” 6th ed. Garland Science Publishing, NY, pp. 214‐ 216; Sun, Z. J. et al. (2001) “Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3ε:γ Heterodimer,” Cell 105(7):913‐923; Kuhns, M.S. et al. (2006) “Deconstructing The Form And Function Of The TCR/CD3 Complex,” Immunity. 2006 Feb;24(2):133‐139を参照）。
【０１８６】
以下で議論するように、本発明を説明するために、二重特異性抗ヒトＣＤ３×抗ヒトＤＲ５結合分子を産生した。このような構成のために使用される抗ヒトＣＤ３抗体を、本明細書では「ＣＤ３  ｍＡｂ  ２」と称する。ＣＤ３  ｍＡｂ  ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０４）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI 
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF 
GGGTKLTVLG
ＣＤ３  ｍＡｂ  ２のＣＤＲL１（配列番号１０５）：RSSTGAVTTSNYAN
ＣＤ３  ｍＡｂ  ２のＣＤＲL２（配列番号１０６）：GTNKRAP
ＣＤ３  ｍＡｂ  ２のＣＤＲL３（配列番号１０７）：ALWYSNLWV
【０１８７】
ＣＤ３  ｍＡｂ  ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１０８）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR 
IRSKYNNYAT YYADSVKDRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR 
HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
ＣＤ３  ｍＡｂ  ２のＣＤＲH１（配列番号１０９）：TYAMN
ＣＤ３  ｍＡｂ  ２のＣＤＲH２（配列番号１１０）：RIRSKYNNYATYYADSVKD
ＣＤ３  ｍＡｂ  ２のＣＤＲH３（配列番号１１１）：HGNFGNSYVSWFAY
【０１８８】
上記ＣＤ３構成のうちのいくつかにおいて、ＣＤ３  ｍＡｂ  ２に関して変異型ＶＨドメインを採用した。上記変異型ＶＨドメインは、Ｄ６５Ｇ置換を有し、従って以下に示すアミノ酸配列（配列番号１１２）を有する（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR 
IRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR 
HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
【０１８９】
上記置換により、ＣＤＲH２がアミノ酸配列（配列番号１１３）RIRSKYNNYATYYADSVKGを有するようになる。置換された位置（Ｄ６５Ｇ）は二重線を付して示す。
【０１９０】
ここで使用される第２の抗ＣＤ３抗体は、抗体ムロモナブ‐ＣＤ３「ＯＫＴ３」（Xu et al. (2000) “In Vitro Characterization Of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies,” Cell. Immunol. 200:16‐26); Norman, D.J. (1995) “Mechanisms Of Action And Overview Of OKT3,” Ther. Drug Monit. 17(6):615‐620; Canafax, D.M. et al. (1987) “Monoclonal Antilymphocyte Antibody (OKT3) Treatment Of Acute Renal Allograft Rejection,” Pharmacotherapy 7(4):121‐124; Swinnen, L.J. et al. (1993) “OKT3 Monoclonal Antibodies Induce Interleukin‐6 And Interleukin‐10: A Possible Cause Of Lymphoproliferative Disorders Associated With Transplantation,” Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2(4):670‐678）である。ＯＫＴ３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１６６）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCSASSSVS YMNWYQQKSG TSPKRWIYDT 
SKLASGVPAH FRGSGSGTSY SLTISGMEAE DAATYYCQQW SSNPFTFGSG 
TKLEINR
【０１９１】
ＯＫＴ３（配列番号１６７）のＶＨドメインのアミノ酸配列を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
QVQLQQSGAE LARPGASVKM SCKASGYTFT RYTMHWVKQR PGQGLEWIGY 
INPSRGYTNY NQKFKDKATL TTDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARYY 
DDHYCLDYWG QGTTLTVSSA KTTAPSVYPL APVCGDTTGS SVTLGCLVKG
YFPEPVTLTW NSGSLSSGVH TFPAVLQSDL YTLSSSVTVT SS
【０１９２】
Ｂ．基準抗フルオレセイン抗体
抗フルオレセイン抗体４‐４‐２０（Gruber, M. et al. (1994) “Efficient Tumor Cell Lysis Mediated By A Bi‐specific Single Chain Antibody Expressed In Escherichia coli,” J. Immunol. 152(11):5368‐5374; Bedzyk, W.D. et al. (1989) “Comparison Of Variable Region Primary Structures Within An Anti‐Fluorescein Idiotype Family,” J. Biol. Chem. 264(3): 1565‐1569）を、対照ダイアボディとして使用した。上記抗フルオレセイン抗体４‐４‐２０の可変軽鎖及び可変重鎖ドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである：
【０１９３】
上記抗フルオレセイン抗体４‐４‐２０の可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列（配列番号１１４）（ＣＤＲL残基には下線を付す）：
DVVMTQTPFS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSNGNTYLRW YLQKPGQSPK 
VLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP 
WTFGGGTKLE IK
【０１９４】
上記抗フルオレセイン抗体４‐４‐２０の可変重鎖ドメインのアミノ酸配列（配列番号１１５）（ＣＤＲH残基には下線を付す）：
EVKLDETGGG LVQPGRPMKL SCVASGFTFS DYWMNWVRQS PEKGLEWVAQ 
IRNKPYNYET YYSDSVKGRF TISRDDSKSS VYLQMNNLRV EDMGIYYCTG 
SYYGMDYWGQ GTSVTVSS
【０１９５】
ＶＩ．例示的な多価ＤＲ５結合分子
上述のように、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも４つのＤＲ５結合部位を有する多価ＤＲ５結合分子は、様々な構造を有してよい。特に、ＩｇＧ系二重特異性抗体を含むがこれに限定されない免疫グロブリンの抗原結合部分、及びダイアボディを含む分子を含む構造が好ましい。ダイアボディを含む多価ＤＲ５結合分子の具体的かつ非限定的な例が提供される。しかしながら、上で開示されているもの（例えば図１〜４参照）又はそうでなくても当業者に明らかであるものを含む代替的な構造が、本発明に包含される。
【０１９６】
Ａ．ＤＲ５に関して４価である、ＤＲ５×ＤＲ５二重特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディ
１．ＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃ領域含有ダイアボディ
抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＬ及びＶＨドメイン並びにＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬ及びＶＨドメインを有する、２ペアのポリペプチド鎖からなる、ＤＲ５に関して４価である例示的な二重特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディを構成する。「ＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディ」と呼ばれる１つのＦｃ領域含有ダイアボディは、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含有する。このＦｃ領域含有ダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１１６）：
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS SSGYSYMHWY QQKPGQPPKV
LIFLSSNLDS GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEDGDAATY YCQHSRDLPP
TFGGGTKLEI KGGGSGGGGK VQLQQSGAEL VKPGASVKLS CKASGYTFTE
YILHWVKQKS GQGLEWIGWF YPGNNNIKYN EKFKDKATLT ADKSSSTVYM
ELSRLTSEDS AVYFCARHEQ GPGYFDYWGQ GTTLTVSSAS TKGEVAACEK
EVAALEKEVA ALEKEVAALE KLEPKSSDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE
EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP
REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT
TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL
SPG
【０１９７】
配列番号１１６では、アミノ酸残基１〜１１１は、ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号３）に対応し、残基１１２〜１１９は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１２０〜２３８は、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１８）に対応し、残基２３９〜２４３は、ASTKGリンカー（配列番号４７）に対応し、残基２４４〜２７１は、システイン含有Ｅコイルドメイン（配列番号４１）に対応し、残基２７２〜２７７は、LEPKSSリンカー（配列番号４９）に対応し、残基２７８〜２８７は、ＩｇＧ１ヒンジドメイン由来のリンカー（DKTHTCPPCP；配列番号４８）に対応し、残基２８８〜５０３は、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号１；Ｃ末端アミノ酸残基を含まない）に対応する。配列番号１１６をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１１７：
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca
gagggccacc atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct
atagttatat gcactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaagtc
ctcatctttc tttcatccaa cctagattct ggggtccctg ccaggttcag
tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg
atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaaggaggcg gatccggcgg
cggaggcaag gtccagctgc agcagtctgg agctgaactg gtgaaacccg
gggcatcagt gaagctgtcc tgcaaggctt ctgggtacac cttcactgag
tatattttac actgggtaaa gcagaagtct ggacagggtc ttgagtggat
tgggtggttt tatcctggaa ataataatat aaagtacaat gagaaattca
aggacaaggc cacactgact gcggacaaat cctccagcac agtctatatg
gaacttagta gattgacatc tgaagactct gcggtctatt tctgtgcaag
acacgaacaa ggaccaggtt actttgacta ctggggccaa ggcaccactc
tcacagtctc ctccgcctcc accaagggcg aagtggccgc atgtgagaaa
gaggttgctg ctttggagaa ggaggtcgct gcacttgaaa aggaggtcgc
agccctggag aaactggagc ccaaatcttc tgacaaaact cacacatgcc
caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac
atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact
ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag
gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca
ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag
ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa
gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca
tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc
acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct
caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg
tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg
tctccgggt
である。
【０１９８】
上記ＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１１８）：
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GQSPKLLIYW
ASTRHTGVPD RFTGSGSGTD YTLTIKSVQA EDLTLYYCQQ HYITPWTFGG
GTKLEIKGGG SGGGGEVKFL ESGGGLVQPG GSLKLSCVAS GFDFSRYWMS
WVRQAPGKGL EWIGEINPDS NTINYTPSLK DKFIISRDNA KNTLYLQMTK
VRSEDTALYY CTRRAYYGNP AWFAYWGQGT LVTVSAASTK GKVAACKEKV
AALKEKVAAL KEKVAALKE
【０１９９】
配列番号１１８では、アミノ酸残基１〜１０７は、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１３）に対応し、残基１０８〜１１５は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１６〜２３６は、配列番号８のＣ末端セリン残基をアラニン残基で置換した以外は、ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号８）に対応し、残基２３７〜２４１は、ASTKGリンカー（配列番号４７）に対応し、残基２４２〜２６９は、システイン含有Ｋコイルドメイン（配列番号４２）に対応する。配列番号１１８をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１１９：
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccactt cagtaggaga
cagggtcagc atcacctgca aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag
cctggtatca acaaaaacca gggcaatctc ctaaactact gatttactgg
gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc
tgggacagat tatacactca ccatcaaaag tgtgcaggct gaagacctga
cactttatta ctgtcagcaa cactatatca ctccgtggac gttcggtgga
ggcaccaagc tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggcgaggt
gaagtttctc gagtctggag gtggcctggt gcagcctgga ggatccctga
aactctcctg tgtagcctca ggattcgatt ttagtagata ctggatgagt
tgggtccggc aggctccagg gaaagggcta gaatggattg gagaaattaa
tccagatagc aatacgataa actatacgcc atctctaaag gataaattca
tcatctccag agacaacgcc aaaaatacgc tgtatctgca aatgaccaaa
gtgagatctg aggacacagc cctttattat tgtacaagaa gggcctacta
tggtaacccg gcctggtttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg
tctctgcagc ctccaccaag ggcaaagtgg ccgcatgtaa ggagaaagtt
gctgctttga aagagaaggt cgccgcactt aaggaaaagg tcgcagccct
gaaaga
である。
【０２００】
「ＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディ（ＡＡ）」と呼ばれる別のＦｃ領域含有ダイアボディは、Ｆｃ領域が、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を低減／排除してエフェクタ機能を低減／排除するＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ二重突然変異（下線）を有する変異体であることを除いて、ＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディと同一である。このＦｃ領域含有ダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１２０）：
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS SSGYSYMHWY QQKPGQPPKV
LIFLSSNLDS GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEDGDAATY YCQHSRDLPP
TFGGGTKLEI KGGGSGGGGK VQLQQSGAEL VKPGASVKLS CKASGYTFTE
YILHWVKQKS GQGLEWIGWF YPGNNNIKYN EKFKDKATLT ADKSSSTVYM
ELSRLTSEDS AVYFCARHEQ GPGYFDYWGQ GTTLTVSSAS TKGEVAACEK
EVAALEKEVA ALEKEVAALE KLEPKSSDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE
EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP
REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT
TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL
SPG
【０２０１】
配列番号１２０をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１２１：
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca
gagggccacc atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct
atagttatat gcactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaagtc
ctcatctttc tttcatccaa cctagattct ggggtccctg ccaggttcag
tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg
atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaaggaggcg gatccggcgg
cggaggcaag gtccagctgc agcagtctgg agctgaactg gtgaaacccg
gggcatcagt gaagctgtcc tgcaaggctt ctgggtacac cttcactgag
tatattttac actgggtaaa gcagaagtct ggacagggtc ttgagtggat
tgggtggttt tatcctggaa ataataatat aaagtacaat gagaaattca
aggacaaggc cacactgact gcggacaaat cctccagcac agtctatatg
gaacttagta gattgacatc tgaagactct gcggtctatt tctgtgcaag
acacgaacaa ggaccaggtt actttgacta ctggggccaa ggcaccactc
tcacagtctc ctccgcctcc accaagggcg aagtggccgc atgtgagaaa
gaggttgctg ctttggagaa ggaggtcgct gcacttgaaa aggaggtcgc
agccctggag aaactggagc ccaaatcttc tgacaaaact cacacatgcc
caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac
atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact
ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag
gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca
ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag
ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa
gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca
tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc
acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct
caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg
tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg
tctccgggt
である。
【０２０２】
ＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディ（ＡＡ）の第２のポリペプチド鎖もまた、上で詳述した（配列番号１１９によってコードされる）配列番号１１８である。
【０２０３】
あるいは、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の低減／排除、及び／又はエフェクタ機能の低減／排除が望まれる場合、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４のＣＨ２‐ＣＨ３領域を用いてよい。このようなＦｃ領域含有ダイアボディでは、配列番号１１６又は１２０のアミノ酸残基２８８〜５０４は、配列番号１６４（ＩｇＧ２のＣＨ２‐ＣＨ３）又は配列番号１０３（ＩｇＧ４のＣＨ２‐ＣＨ３）で置換され、任意にＣ末端アミノ酸残基を含まない。
【０２０４】
２．ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃ領域含有ダイアボディ
抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬ及びＶＨドメイン並びにＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＬ及びＶＨドメインを有する、２ペアのポリペプチド鎖からなる、ＤＲ５に関して４価である例示的な二重特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディを構成する。「ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディ」と呼ばれる１つのＦｃ領域含有ダイアボディは、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含有する。このＦｃ領域含有ダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１２２）：
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GQSPKLLIYW
ASTRHTGVPD RFTGSGSGTD YTLTIKSVQA EDLTLYYCQQ HYITPWTFGG
GTKLEIKGGG SGGGGEVKFL ESGGGLVQPG GSLKLSCVAS GFDFSRYWMS
WVRQAPGKGL EWIGEINPDS NTINYTPSLK DKFIISRDNA KNTLYLQMTK
VRSEDTALYY CTRRAYYGNP AWFAYWGQGT LVTVSAASTK GEVAACEKEV
AALEKEVAAL EKEVAALEKL EPKSSDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP
KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ
YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE
PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP
PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP
G
【０２０５】
配列番号１２２では、アミノ酸残基１〜１０７は、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１３）に対応し、残基１０８〜１１５は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１６〜２３６は、配列番号８のＣ末端セリン残基をアラニン残基で置換した以外は、ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号８）に対応し、残基２３７〜２４１は、ASTKGリンカー（配列番号４７）に対応し、残基２４２〜２６９は、システイン含有Ｅコイルドメイン（配列番号４１）に対応し、残基２７０〜２７５は、LEPKSSリンカー（配列番号４９）に対応し、残基２７６〜２８５は、ＩｇＧ１ヒンジドメイン由来のリンカー（DKTHTCPPCP；配列番号４８）に対応し、残基２８６〜５０１は、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号１；Ｃ末端アミノ酸残基を含まない）に対応する。配列番号１２２をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１２３：
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccactt cagtaggaga
cagggtcagc atcacctgca aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag
cctggtatca acaaaaacca gggcaatctc ctaaactact gatttactgg
gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc
tgggacagat tatacactca ccatcaaaag tgtgcaggct gaagacctga
cactttatta ctgtcagcaa cactatatca ctccgtggac gttcggtgga
ggcaccaagc tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggcgaggt
gaagtttctc gagtctggag gtggcctggt gcagcctgga ggatccctga
aactctcctg tgtagcctca ggattcgatt ttagtagata ctggatgagt
tgggtccggc aggctccagg gaaagggcta gaatggattg gagaaattaa
tccagatagc aatacgataa actatacgcc atctctaaag gataaattca
tcatctccag agacaacgcc aaaaatacgc tgtatctgca aatgaccaaa
gtgagatctg aggacacagc cctttattat tgtacaagaa gggcctacta
tggtaacccg gcctggtttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg
tctctgcagc ctccaccaag ggcgaagtgg ccgcatgtga gaaagaggtt
gctgctttgg agaaggaggt cgctgcactt gaaaaggagg tcgcagccct
ggagaaactg gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt
gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca
aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt
ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg
tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga
ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc
cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa
ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca
ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg
tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt
ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc
atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg
ggt
である。
【０２０６】
上記ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１２４）：
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS SSGYSYMHWY QQKPGQPPKV
LIFLSSNLDS GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEDGDAATY YCQHSRDLPP
TFGGGTKLEI KGGGSGGGGK VQLQQSGAEL VKPGASVKLS CKASGYTFTE
YILHWVKQKS GQGLEWIGWF YPGNNNIKYN EKFKDKATLT ADKSSSTVYM
ELSRLTSEDS AVYFCARHEQ GPGYFDYWGQ GTTLTVSSAS TKGKVAACKE
KVAALKEKVA ALKEKVAALK E
【０２０７】
配列番号１２４では、アミノ酸残基１〜１１１は、ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号３）に対応し、残基１１２〜１１９は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１２０〜２３８は、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１８）に対応し、残基２３９〜２４３は、ASTKGリンカー（配列番号４７）に対応し、残基２４４〜２７１は、システイン含有Ｋコイルドメイン（配列番号４２）に対応する。配列番号１２４をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１２５：
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca
gagggccacc atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct
atagttatat gcactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaagtc
ctcatctttc tttcatccaa cctagattct ggggtccctg ccaggttcag
tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg
atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaaggaggcg gatccggcgg
cggaggcaag gtccagctgc agcagtctgg agctgaactg gtgaaacccg
gggcatcagt gaagctgtcc tgcaaggctt ctgggtacac cttcactgag
tatattttac actgggtaaa gcagaagtct ggacagggtc ttgagtggat
tgggtggttt tatcctggaa ataataatat aaagtacaat gagaaattca
aggacaaggc cacactgact gcggacaaat cctccagcac agtctatatg
gaacttagta gattgacatc tgaagactct gcggtctatt tctgtgcaag
acacgaacaa ggaccaggtt actttgacta ctggggccaa ggcaccactc
tcacagtctc ctccgcctcc accaagggca aagtggccgc atgtaaggag
aaagttgctg ctttgaaaga gaaggtcgcc gcacttaagg aaaaggtcgc
agccctgaaa gag
である。
【０２０８】
「ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディ（ＡＡ）」と呼ばれる別のＦｃ領域含有ダイアボディは、Ｆｃ領域が、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を低減／排除してエフェクタ機能を低減／排除するＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ二重突然変異（太字）を有する変異体であることを除いてＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディと同一である。このＦｃ領域含有ダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１２６）：
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GQSPKLLIYW
ASTRHTGVPD RFTGSGSGTD YTLTIKSVQA EDLTLYYCQQ HYITPWTFGG
GTKLEIKGGG SGGGGEVKFL ESGGGLVQPG GSLKLSCVAS GFDFSRYWMS
WVRQAPGKGL EWIGEINPDS NTINYTPSLK DKFIISRDNA KNTLYLQMTK
VRSEDTALYY CTRRAYYGNP AWFAYWGQGT LVTVSAASTK GEVAACEKEV
AALEKEVAAL EKEVAALEKL EPKSSDKTHT CPPCPAPEAAGGPSVFLFPP
KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ
YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE
PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP
PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP
G
【０２０９】
配列番号１２６をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１２７：
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccactt cagtaggaga
cagggtcagc atcacctgca aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag
cctggtatca acaaaaacca gggcaatctc ctaaactact gatttactgg
gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc
tgggacagat tatacactca ccatcaaaag tgtgcaggct gaagacctga
cactttatta ctgtcagcaa cactatatca ctccgtggac gttcggtgga
ggcaccaagc tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggcgaggt
gaagtttctc gagtctggag gtggcctggt gcagcctgga ggatccctga
aactctcctg tgtagcctca ggattcgatt ttagtagata ctggatgagt
tgggtccggc aggctccagg gaaagggcta gaatggattg gagaaattaa
tccagatagc aatacgataa actatacgcc atctctaaag gataaattca
tcatctccag agacaacgcc aaaaatacgc tgtatctgca aatgaccaaa
gtgagatctg aggacacagc cctttattat tgtacaagaa gggcctacta
tggtaacccg gcctggtttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg
tctctgcagc ctccaccaag ggcgaagtgg ccgcatgtga gaaagaggtt
gctgctttgg agaaggaggt cgctgcactt gaaaaggagg tcgcagccct
ggagaaactg gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt
gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca
aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt
ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg
tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga
ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc
cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa
ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca
ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg
tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt
ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc
atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg
ggt
である。
【０２１０】
ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディ（ＡＡ）の第２のポリペプチド鎖もまた、上で詳述した（配列番号１２５によってコードされる）配列番号１２４である。
【０２１１】
あるいは、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の低減／排除、及び／又はエフェクタ機能の低減／排除が望まれる場合、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４のＣＨ２‐ＣＨ３領域を用いてよい。このようなＦｃ領域含有ダイアボディでは、配列番号１２２又は１２６のアミノ酸残基２８６〜５０２は、配列番号１６４（ＩｇＧ２のＣＨ２‐ＣＨ３）又は配列番号１０３（ＩｇＧ４のＣＨ２‐ＣＨ３）で置換され、任意にＣ末端アミノ酸残基を含まない。
【０２１２】
Ｂ．ＤＲ５に関して２価である、ＤＲ５×ＤＲ５二重特異性ダイアボディ
１．ＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２ダイアボディ
抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬ及びＶＨドメインを有する、２つのポリペプチド鎖からなるＦｃ領域を含まない、ＤＲ５に関して二重特異性である例示的な二重特異性ダイアボディを構成する。このダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述の配列番号１１６のアミノ酸残基１〜２７１を含む。このダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述の配列番号１１８を含む。
【０２１３】
抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬ及びＶＨドメインを有する、２つのポリペプチド鎖からなるＦｃ領域を含む、ＤＲ５に関して二重特異性である他の例示的な二重特異性ダイアボディを構成する。このダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述の配列番号１１６又は配列番号１２０を含む。このダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１１８を含み、またアミノ酸残基LEPKSSDKTHTCPPCP（配列番号５１）を有するリンカーを更に含み、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、配列番号１又は配列番号１０２のアミノ酸配列を有し、任意にＣ末端アミノ酸残基を含まない。
【０２１４】
２．ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  １ダイアボディ
抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＬ及びＶＨドメインを有する、２つのポリペプチド鎖からなるＦｃ領域を含まない、ＤＲ５に関して２価である例示的な二重特異性ダイアボディを構成する。このダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述の配列番号１２２のアミノ酸残基１〜２６９を含む。このダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述の配列番号１２４を含む。
【０２１５】
抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＬ及びＶＨドメインを有する、２つのポリペプチド鎖からなるＦｃ領域を含有する、ＤＲ５に関して２価である他の例示的な二重特異性ダイアボディを構成する。このダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述の配列番号１２２又は配列番号１２６を含む。このダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１２４を含み、またアミノ酸残基LEPKSSDKTHTCPPCP（配列番号５１）を有するリンカーを更に含み、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、配列番号１又は配列番号１０２のアミノ酸配列を有し、任意にＣ末端アミノ酸残基を含まない。
【０２１６】
Ｃ．ＤＲ５に関して４価である、ＤＲ５×ＤＲ５単一特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディ
１．ＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃ領域含有ダイアボディ
抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＬ及びＶＨドメインを有する、２ペアのポリペプチド鎖からなる、ＤＲ５に関して４価である例示的な単一特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディを構成する。「ＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディ」と呼ばれる１つのＦｃ領域含有ダイアボディは、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含有する。このＦｃ領域含有ダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１２８）：
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS SSGYSYMHWY QQKPGQPPKV
LIFLSSNLDS GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEDGDAATY YCQHSRDLPP
TFGGGTKLEI KGGGSGGGGE VKFLESGGGL VQPGGSLKLS CVASGFDFSR
YWMSWVRQAP GKGLEWIGEI NPDSNTINYT PSLKDKFIIS RDNAKNTLYL
QMTKVRSEDT ALYYCTRRAY YGNPAWFAYW GQGTLVTVSA ASTKGEVAAC
EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKLEPKSSD KTHTCPPCPA PELLGGPSVF
LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP
REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG
QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY
KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL
SLSPG
【０２１７】
配列番号１２８では、アミノ酸残基１〜１１１は、ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号３）に対応し、残基１１２〜１１９は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１２０〜２４０は、配列番号８のＣ末端セリン残基をアラニン残基で置換した以外は、ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号８）に対応し、残基２４１〜２４５は、ASTKGリンカー（配列番号４７）に対応し、残基２４６〜２７３は、システイン含有Ｅコイルドメイン（配列番号４１）に対応し、残基２７４〜２７９は、LEPKSSリンカー（配列番号４９）に対応し、残基２８０〜２８９は、ＩｇＧ１ヒンジドメイン由来のリンカー（DKTHTCPPCP；配列番号４８）に対応し、残基２９０〜５０５は、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号１；Ｃ末端アミノ酸残基を含まない）に対応する。配列番号１２８をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１２９：
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca
gagggccacc atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct
atagttatat gcactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaagtc
ctcatctttc tttcatccaa cctagattct ggggtccctg ccaggttcag
tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg
atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaaggaggcg gatccggcgg
cggaggcgag gtgaagtttc tcgagtctgg aggtggcctg gtgcagcctg
gaggatccct gaaactctcc tgtgtagcct caggattcga ttttagtaga
tactggatga gttgggtccg gcaggctcca gggaaagggc tagaatggat
tggagaaatt aatccagata gcaatacgat aaactatacg ccatctctaa
aggataaatt catcatctcc agagacaacg ccaaaaatac gctgtatctg
caaatgacca aagtgagatc tgaggacaca gccctttatt attgtacaag
aagggcctac tatggtaacc cggcctggtt tgcttactgg ggccaaggga
ctctggtcac tgtctctgca gcctccacca agggcgaagt ggccgcatgt
gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag gtcgctgcac ttgaaaagga
ggtcgcagcc ctggagaaac tggagcccaa atcttctgac aaaactcaca
catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga
ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt
tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg
cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt
cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca
acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat
gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca
gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac
aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag
caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat
gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc
tccctgtctc cgggt
である。
【０２１８】
上記ＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１３０）：
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS SSGYSYMHWY QQKPGQPPKV
LIFLSSNLDS GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEDGDAATY YCQHSRDLPP
TFGGGTKLEI KGGGSGGGGE VKFLESGGGL VQPGGSLKLS CVASGFDFSR
YWMSWVRQAP GKGLEWIGEI NPDSNTINYT PSLKDKFIIS RDNAKNTLYL
QMTKVRSEDT ALYYCTRRAY YGNPAWFAYW GQGTLVTVSA ASTKGKVAAC
KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKE
【０２１９】
配列番号１３０では、アミノ酸残基１〜１１１は、ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号３）に対応し、残基１１２〜１１９は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１２０〜２４０は、配列番号８のＣ末端セリン残基をアラニン残基で置換した以外は、ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号８）に対応し、残基２４１〜２４５は、ASTKGリンカー（配列番号４７）に対応し、残基２４６〜２７３は、システイン含有Ｋコイルドメイン（配列番号４２）に対応する。配列番号１３０をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１３１：
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca
gagggccacc atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct
atagttatat gcactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaagtc
ctcatctttc tttcatccaa cctagattct ggggtccctg ccaggttcag
tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg
atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaaggaggcg gatccggcgg
cggaggcgag gtgaagtttc tcgagtctgg aggtggcctg gtgcagcctg
gaggatccct gaaactctcc tgtgtagcct caggattcga ttttagtaga
tactggatga gttgggtccg gcaggctcca gggaaagggc tagaatggat
tggagaaatt aatccagata gcaatacgat aaactatacg ccatctctaa
aggataaatt catcatctcc agagacaacg ccaaaaatac gctgtatctg
caaatgacca aagtgagatc tgaggacaca gccctttatt attgtacaag
aagggcctac tatggtaacc cggcctggtt tgcttactgg ggccaaggga
ctctggtcac tgtctctgca gcctccacca agggcaaagt ggccgcatgt
aaggagaaag ttgctgcttt gaaagagaag gtcgccgcac ttaaggaaaa
ggtcgcagcc ctgaaagag
である。
【０２２０】
「ＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディ（ＡＡ）」と呼ばれる別のＦｃ領域含有ダイアボディは、Ｆｃ領域が、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を低減／排除してエフェクタ機能を低減／排除するＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ二重突然変異（下線）を有する変異体であることを除いて、ＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディと同一である。このＦｃ領域含有ダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１３２）：
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS SSGYSYMHWY QQKPGQPPKV
LIFLSSNLDS GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEDGDAATY YCQHSRDLPP
TFGGGTKLEI KGGGSGGGGE VKFLESGGGL VQPGGSLKLS CVASGFDFSR
YWMSWVRQAP GKGLEWIGEI NPDSNTINYT PSLKDKFIIS RDNAKNTLYL
QMTKVRSEDT ALYYCTRRAY YGNPAWFAYW GQGTLVTVSA ASTKGEVAAC
EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKLEPKSSD KTHTCPPCPA PEAAGGPSVF
LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP
REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG
QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY
KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL
SLSPG
【０２２１】
配列番号１３２をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１３３：
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca
gagggccacc atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct
atagttatat gcactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaagtc
ctcatctttc tttcatccaa cctagattct ggggtccctg ccaggttcag
tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg
atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaaggaggcg gatccggcgg
cggaggcgag gtgaagtttc tcgagtctgg aggtggcctg gtgcagcctg
gaggatccct gaaactctcc tgtgtagcct caggattcga ttttagtaga
tactggatga gttgggtccg gcaggctcca gggaaagggc tagaatggat
tggagaaatt aatccagata gcaatacgat aaactatacg ccatctctaa
aggataaatt catcatctcc agagacaacg ccaaaaatac gctgtatctg
caaatgacca aagtgagatc tgaggacaca gccctttatt attgtacaag
aagggcctac tatggtaacc cggcctggtt tgcttactgg ggccaaggga
ctctggtcac tgtctctgca gcctccacca agggcgaagt ggccgcatgt
gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag gtcgctgcac ttgaaaagga
ggtcgcagcc ctggagaaac tggagcccaa atcttctgac aaaactcaca
catgcccacc gtgcccagca cctgaagccg cggggggacc gtcagtcttc
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga
ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt
tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg
cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt
cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca
acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat
gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca
gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac
aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag
caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat
gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc
tccctgtctc cgggt
である。
【０２２２】
ＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディ（ＡＡ）の第２のポリペプチド鎖もまた、上で詳述した（配列番号１３１によってコードされる）配列番号１３０である。
【０２２３】
あるいは、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の低減／排除、及び／又はエフェクタ機能の低減／排除が望まれる場合、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４のＣＨ２‐ＣＨ３領域を用いてよい。このようなＦｃ領域含有ダイアボディでは、配列番号１２８又は１３２のアミノ酸残基２９０〜５０６は、配列番号１６４（ＩｇＧ２のＣＨ２‐ＣＨ３）又は配列番号１０３（ＩｇＧ４のＣＨ２‐ＣＨ３）で置換され、任意にＣ末端アミノ酸残基を含まない。
【０２２４】
２．ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃ領域含有ダイアボディ
抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬ及びＶＨドメインを有する、２ペアのポリペプチド鎖からなる、ＤＲ５に関して４価である例示的な単一特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディを構成する。「ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディ」と呼ばれる第１のＦｃ領域含有ダイアボディは、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含有する。このＦｃ領域含有ダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１３４）：
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GQSPKLLIYW
ASTRHTGVPD RFTGSGSGTD YTLTIKSVQA EDLTLYYCQQ HYITPWTFGG
GTKLEIKGGG SGGGGKVQLQ QSGAELVKPG ASVKLSCKAS GYTFTEYILH
WVKQKSGQGL EWIGWFYPGN NNIKYNEKFK DKATLTADKS SSTVYMELSR
LTSEDSAVYF CARHEQGPGY FDYWGQGTTL TVSSASTKGE VAACEKEVAA
LEKEVAALEK EVAALEKLEP KSSDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP
KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ
VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV
LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG
【０２２５】
配列番号１３４では、アミノ酸残基１〜１０７は、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１３）に対応し、残基１０８〜１１５は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１６〜２３４は、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１８）に対応し、残基２３５〜２３９は、ASTKGリンカー（配列番号４７）に対応し、残基２４０〜２６７は、システイン含有Ｅコイルドメイン（配列番号４１）に対応し、残基２６８〜２７３は、LEPKSSリンカー（配列番号４９）に対応し、残基２７４〜２８３は、ＩｇＧ１ヒンジドメイン由来のリンカー（DKTHTCPPCP；配列番号４８）に対応し、残基２８４〜４９９は、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号１；Ｃ末端アミノ酸残基を含まない）に対応する。配列番号１３４をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１３５：
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccactt cagtaggaga
cagggtcagc atcacctgca aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag
cctggtatca acaaaaacca gggcaatctc ctaaactact gatttactgg
gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc
tgggacagat tatacactca ccatcaaaag tgtgcaggct gaagacctga
cactttatta ctgtcagcaa cactatatca ctccgtggac gttcggtgga
ggcaccaagc tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggcaaggt
ccagctgcag cagtctggag ctgaactggt gaaacccggg gcatcagtga
agctgtcctg caaggcttct gggtacacct tcactgagta tattttacac
tgggtaaagc agaagtctgg acagggtctt gagtggattg ggtggtttta
tcctggaaat aataatataa agtacaatga gaaattcaag gacaaggcca
cactgactgc ggacaaatcc tccagcacag tctatatgga acttagtaga
ttgacatctg aagactctgc ggtctatttc tgtgcaagac acgaacaagg
accaggttac tttgactact ggggccaagg caccactctc acagtctcct
ccgcctccac caagggcgaa gtggccgcat gtgagaaaga ggttgctgct
ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag gaggtcgcag ccctggagaa
actggagccc aaatcttctg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag
cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc
aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt
ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg
gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct
gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc
ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag
gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag
cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt
gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa
gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg
ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggt
である。
【０２２６】
上記ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１３６）：
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GQSPKLLIYW
ASTRHTGVPD RFTGSGSGTD YTLTIKSVQA EDLTLYYCQQ HYITPWTFGG
GTKLEIKGGG SGGGGKVQLQ QSGAELVKPG ASVKLSCKAS GYTFTEYILH
WVKQKSGQGL EWIGWFYPGN NNIKYNEKFK DKATLTADKS SSTVYMELSR
LTSEDSAVYF CARHEQGPGY FDYWGQGTTL TVSSASTKGK VAACKEKVAA
LKEKVAALKE KVAALKE
【０２２７】
配列番号１３６では、アミノ酸残基１〜１０７は、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１３）に対応し、残基１０８〜１１５は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１６〜２３４は、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１８）に対応し、残基２３５〜２３９は、ASTKGリンカー（配列番号４７）に対応し、残基２４０〜２６７は、システイン含有Ｋコイルドメイン（配列番号４２）に対応する。配列番号１３６をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１３７：
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccactt cagtaggaga
cagggtcagc atcacctgca aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag
cctggtatca acaaaaacca gggcaatctc ctaaactact gatttactgg
gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc
tgggacagat tatacactca ccatcaaaag tgtgcaggct gaagacctga
cactttatta ctgtcagcaa cactatatca ctccgtggac gttcggtgga
ggcaccaagc tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggcaaggt
ccagctgcag cagtctggag ctgaactggt gaaacccggg gcatcagtga
agctgtcctg caaggcttct gggtacacct tcactgagta tattttacac
tgggtaaagc agaagtctgg acagggtctt gagtggattg ggtggtttta
tcctggaaat aataatataa agtacaatga gaaattcaag gacaaggcca
cactgactgc ggacaaatcc tccagcacag tctatatgga acttagtaga
ttgacatctg aagactctgc ggtctatttc tgtgcaagac acgaacaagg
accaggttac tttgactact ggggccaagg caccactctc acagtctcct
ccgcctccac caagggcaaa gtggccgcat gtaaggagaa agttgctgct
ttgaaagaga aggtcgccgc acttaaggaa aaggtcgcag ccctgaaaga
g
である。
【０２２８】
「ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディ（ＡＡ）」と呼ばれる別のＦｃ領域含有ダイアボディは、Ｆｃ領域が、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を低減／排除してエフェクタ機能を低減／排除するＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ二重突然変異（下線）を有する変異体であることを除いて、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディと同一である。このＦｃ領域含有ダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１３８）：
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GQSPKLLIYW
ASTRHTGVPD RFTGSGSGTD YTLTIKSVQA EDLTLYYCQQ HYITPWTFGG
GTKLEIKGGG SGGGGKVQLQ QSGAELVKPG ASVKLSCKAS GYTFTEYILH
WVKQKSGQGL EWIGWFYPGN NNIKYNEKFK DKATLTADKS SSTVYMELSR
LTSEDSAVYF CARHEQGPGY FDYWGQGTTL TVSSASTKGE VAACEKEVAA
LEKEVAALEK EVAALEKLEP KSSDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP
KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ
VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV
LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG
【０２２９】
配列番号１３８をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１３９：
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccactt cagtaggaga
cagggtcagc atcacctgca aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag
cctggtatca acaaaaacca gggcaatctc ctaaactact gatttactgg
gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc
tgggacagat tatacactca ccatcaaaag tgtgcaggct gaagacctga
cactttatta ctgtcagcaa cactatatca ctccgtggac gttcggtgga
ggcaccaagc tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggcaaggt
ccagctgcag cagtctggag ctgaactggt gaaacccggg gcatcagtga
agctgtcctg caaggcttct gggtacacct tcactgagta tattttacac
tgggtaaagc agaagtctgg acagggtctt gagtggattg ggtggtttta
tcctggaaat aataatataa agtacaatga gaaattcaag gacaaggcca
cactgactgc ggacaaatcc tccagcacag tctatatgga acttagtaga
ttgacatctg aagactctgc ggtctatttc tgtgcaagac acgaacaagg
accaggttac tttgactact ggggccaagg caccactctc acagtctcct
ccgcctccac caagggcgaa gtggccgcat gtgagaaaga ggttgctgct
ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag gaggtcgcag ccctggagaa
actggagccc aaatcttctg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag
cacctgaagc cgcgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc
aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt
ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg
gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct
gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc
ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag
gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag
cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt
gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa
gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg
ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggt
である。
【０２３０】
ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディ（ＡＡ）の第２のポリペプチド鎖もまた、上で詳述した（配列番号１３７によってコードされる）配列番号１３６である。
【０２３１】
あるいは、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の低減／排除、及び／又はエフェクタ機能の低減／排除が望まれる場合、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４のＣＨ２‐ＣＨ３領域を用いてよい。このようなＦｃ領域含有ダイアボディでは、配列番号１３４又は１３８のアミノ酸残基２８４〜５００は、配列番号１６４（ＩｇＧ２のＣＨ２‐ＣＨ３）又は配列番号１０３（ＩｇＧ４のＣＨ２‐ＣＨ３）で置換され、任意にＣ末端アミノ酸残基を含まない。
【０２３２】
３．ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．２×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．２Ｆｃ領域含有ダイアボディ
抗ヒトＤＲ５抗体ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐２のＶＬドメイン及び抗ヒトＤＲ５抗体ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＨ‐２のＶＨドメインを有する、２ペアのポリペプチド鎖からなる、ＤＲ５に関して４価である例示的な単一特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディを構成する。「ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．２×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．２Ｆｃダイアボディ」と呼ばれる第１のＦｃ領域含有ダイアボディは、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含有する。このＦｃ領域含有ダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１４０）：
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW
ASTRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQQ HYITPWTFGG
GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTEYILH
WVRQAPGQGL EWMGWFYPGN NNIKYNEKFK DRVTITADKS TSTVYMELSS
LRSEDTAVYY CARHEQGPGY FDYWGQGTLV TVSSASTKGE VAACEKEVAA
LEKEVAALEK EVAALEKLEP KSSDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP
KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ
VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV
LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG
【０２３３】
配列番号１４０では、アミノ酸残基１〜１０７は、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２３）に対応し、残基１０８〜１１５は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１６〜２３４は、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＨ‐２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号３１）に対応し、残基２３５〜２３９は、ASTKGリンカー（配列番号４７）に対応し、残基２４０〜２６７は、システイン含有Ｅコイルドメイン（配列番号４１）に対応し、残基２６８〜２７３は、LEPKSSリンカー（配列番号４９）に対応し、残基２７４〜２８３は、ＩｇＧ１ヒンジドメイン由来のリンカー（DKTHTCPPCP；配列番号４８）に対応し、残基２８４〜４９９は、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号１；Ｃ末端アミノ酸残基を含まない）に対応する。配列番号１４０をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４１：
gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga
ccgcgtgact attacttgta aagcttctca ggatgtcaac accgccgtgg
cttggtacca gcagaagccc ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg
gccagcactc ggcacaccgg agtcccatct aggttctctg gcagtggatc
agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc gaggatgtgg
ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg
ggcacaaaac tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt
ccagctggtg cagagtgggg cagaggtgaa aaagccaggg gcatcagtga
aagtgtcttg taaagcatca ggttatacat ttactgagta catcctgcac
tgggtgcgac aggcaccagg acagggactg gaatggatgg ggtggttcta
ccctggcaac aacaacatta agtacaacga gaagtttaaa gaccgggtga
ccatcacagc ggataagtct accagtacag tctatatgga gctgagctcc
ctgagaagcg aagacaccgc cgtctactat tgcgctcgcc acgaacaggg
tccaggttac tttgattatt gggggcaggg aactctggtc acagtcagct
ccgcctccac caagggcgaa gtggccgcat gtgagaaaga ggttgctgct
ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag gaggtcgcag ccctggagaa
actggagccc aaatcttctg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag
cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc
aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt
ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg
gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct
gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc
ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag
gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag
cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt
gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa
gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg
ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggt
である。
【０２３４】
上記ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．２×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．２Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１４２）：
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW
ASTRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQQ HYITPWTFGG
GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTEYILH
WVRQAPGQGL EWMGWFYPGN NNIKYNEKFK DRVTITADKS TSTVYMELSS
LRSEDTAVYY CARHEQGPGY FDYWGQGTLV TVSSASTKGK VAACKEKVAA
LKEKVAALKE KVAALKE
【０２３５】
配列番号１４２では、アミノ酸残基１〜１０７は、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２３）に対応し、残基１０８〜１１５は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１６〜２３４は、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＨ‐２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号３１）に対応し、残基２３５〜２３９は、ASTKGリンカー（配列番号４７）に対応し、残基２４０〜２６７は、システイン含有Ｋコイルドメイン（配列番号４２）に対応する。配列番号１４２をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４３：
gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga
ccgcgtgact attacttgta aagcttctca ggatgtcaac accgccgtgg
cttggtacca gcagaagccc ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg
gccagcactc ggcacaccgg agtcccatct aggttctctg gcagtggatc
agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc gaggatgtgg
ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg
ggcacaaaac tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt
ccagctggtg cagagtgggg cagaggtgaa aaagccaggg gcatcagtga
aagtgtcttg taaagcatca ggttatacat ttactgagta catcctgcac
tgggtgcgac aggcaccagg acagggactg gaatggatgg ggtggttcta
ccctggcaac aacaacatta agtacaacga gaagtttaaa gaccgggtga
ccatcacagc ggataagtct accagtacag tctatatgga gctgagctcc
ctgagaagcg aagacaccgc cgtctactat tgcgctcgcc acgaacaggg
tccaggttac tttgattatt gggggcaggg aactctggtc acagtcagct
ccgcctccac caagggcaaa gtggccgcat gtaaggagaa agttgctgct
ttgaaagaga aggtcgccgc acttaaggaa aaggtcgcag ccctgaaaga
g
である。
【０２３６】
「ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．２×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．２Ｆｃダイアボディ（ＡＡ）」と呼ばれる別のＦｃ領域含有ダイアボディは、Ｆｃ領域が、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を低減／排除してエフェクタ機能を低減／排除するＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ二重突然変異（下線）を有する変異体であることを除いて、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．２×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．２Ｆｃダイアボディと同一である。このＦｃ領域含有ダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１４４）：
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW
ASTRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQQ HYITPWTFGG
GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTEYILH
WVRQAPGQGL EWMGWFYPGN NNIKYNEKFK DRVTITADKS TSTVYMELSS
LRSEDTAVYY CARHEQGPGY FDYWGQGTLV TVSSASTKGE VAACEKEVAA
LEKEVAALEK EVAALEKLEP KSSDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP
KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ
VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV
LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG
【０２３７】
配列番号１４４をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４５：
gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga
ccgcgtgact attacttgta aagcttctca ggatgtcaac accgccgtgg
cttggtacca gcagaagccc ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg
gccagcactc ggcacaccgg agtcccatct aggttctctg gcagtggatc
agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc gaggatgtgg
ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg
ggcacaaaac tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt
ccagctggtg cagagtgggg cagaggtgaa aaagccaggg gcatcagtga
aagtgtcttg taaagcatca ggttatacat ttactgagta catcctgcac
tgggtgcgac aggcaccagg acagggactg gaatggatgg ggtggttcta
ccctggcaac aacaacatta agtacaacga gaagtttaaa gaccgggtga
ccatcacagc ggataagtct accagtacag tctatatgga gctgagctcc
ctgagaagcg aagacaccgc cgtctactat tgcgctcgcc acgaacaggg
tccaggttac tttgattatt gggggcaggg aactctggtc acagtcagct
ccgcctccac caagggcgaa gtggccgcat gtgagaaaga ggttgctgct
ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag gaggtcgcag ccctggagaa
actggagccc aaatcttctg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag
cacctgaagc cgcgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc
aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt
ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg
gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct
gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc
ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag
gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag
cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt
gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa
gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg
ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggt
である。
【０２３８】
ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．２×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．２Ｆｃダイアボディ（ＡＡ）の第２のポリペプチド鎖もまた、上で詳述した（配列番号１４３によってコードされる）配列番号１４２である。
【０２３９】
あるいは、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の低減／排除、及び／又はエフェクタ機能の低減／排除が望まれる場合、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４のＣＨ２‐ＣＨ３領域を用いてよい。このようなＦｃ領域含有ダイアボディでは、配列番号１４０又は１４４のアミノ酸残基２８４〜５００は、配列番号１６４（ＩｇＧ２のＣＨ２‐ＣＨ３）又は配列番号１０３（ＩｇＧ４のＣＨ２‐ＣＨ３）で置換され、任意にＣ末端アミノ酸残基を含まない。
【０２４０】
４．ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．３×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．３Ｆｃ領域含有ダイアボディ
抗ヒトＤＲ５抗体ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐３のＶＬドメイン、及び抗ヒトｈＤＲ５抗体ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＨ‐３のＶＨドメインを有する、２ペアのポリペプチド鎖からなる、ＤＲ５に関して４価である例示的な単一特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディを構成する。「ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．３×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．３Ｆｃダイアボディ」と呼ばれる第１のＦｃ領域含有ダイアボディは、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含有する。このＦｃ領域含有ダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１４６）：
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW
ASTRHTGVPD RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQQ HYITPWTFGG
GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTEYILH
WVRQAPGQGL EWMGWFYPGN NNIKYNEKFK DRVTITADKS TSTVYMELSS
LRSEDTAVYY CARHEQGPGY FDYWGQGTLV TVSSASTKGE VAACEKEVAA
LEKEVAALEK EVAALEKLEP KSSDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP
KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ
VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV
LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG
【０２４１】
配列番号１４６では、アミノ酸残基１〜１０７は、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２５）に対応し、残基１０８〜１１５は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１６〜２３４は、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＨ‐２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号３１）に対応し、残基２３５〜２３９は、ASTKGリンカー（配列番号４７）に対応し、残基２４０〜２６７は、システイン含有Ｅコイルドメイン（配列番号４１）に対応し、残基２６８〜２７３は、LEPKSSリンカー（配列番号４９）に対応し、残基２７４〜２８３は、ＩｇＧ１ヒンジドメイン由来のリンカー（DKTHTCPPCP；配列番号４８）に対応し、残基２８４〜４９９は、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号１；Ｃ末端アミノ酸残基を含まない）に対応する。配列番号１４６をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４７：
gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga
ccgcgtgact attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg
cttggtacca gcagaagccc ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg
gccagcactc ggcacaccgg agtcccagat aggttctctg gcagtggatc
agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc gaggatgtgg
ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg
ggcacaaaac tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt
ccagctggtg cagagtgggg cagaggtgaa aaagccaggg gcatcagtga
aagtgtcttg taaagcatca ggttatacat ttactgagta catcctgcac
tgggtgcgac aggcaccagg acagggactg gaatggatgg ggtggttcta
ccctggcaac aacaacatta agtacaacga gaagtttaaa gaccgggtga
ccatcacagc ggataagtct accagtacag tctatatgga gctgagctcc
ctgagaagcg aagacaccgc cgtctactat tgcgctcgcc acgaacaggg
tccaggttac tttgattatt gggggcaggg aactctggtc acagtcagct
ccgcctccac caagggcgaa gtggccgcat gtgagaaaga ggttgctgct
ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag gaggtcgcag ccctggagaa
actggagccc aaatcttctg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag
cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc
aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt
ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg
gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct
gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc
ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag
gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag
cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt
gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa
gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg
ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggt
である。
【０２４２】
上記ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．３×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．３Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１４８）：
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW
ASTRHTGVPD RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQQ HYITPWTFGG
GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTEYILH
WVRQAPGQGL EWMGWFYPGN NNIKYNEKFK DRVTITADKS TSTVYMELSS
LRSEDTAVYY CARHEQGPGY FDYWGQGTLV TVSSASTKGK VAACKEKVAA
LKEKVAALKE KVAALKE
【０２４３】
配列番号１４８では、アミノ酸残基１〜１０７は、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２５）に対応し、残基１０８〜１１５は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１６〜２３４は、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＨ‐２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号３１）に対応し、残基２３５〜２３９は、ASTKGリンカー（配列番号４７）に対応し、残基２４０〜２６７は、システイン含有Ｋコイルドメイン（配列番号４２）に対応する。配列番号１４８をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４９：
gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga
ccgcgtgact attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg
cttggtacca gcagaagccc ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg
gccagcactc ggcacaccgg agtcccagat aggttctctg gcagtggatc
agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc gaggatgtgg
ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg
ggcacaaaac tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt
ccagctggtg cagagtgggg cagaggtgaa aaagccaggg gcatcagtga
aagtgtcttg taaagcatca ggttatacat ttactgagta catcctgcac
tgggtgcgac aggcaccagg acagggactg gaatggatgg ggtggttcta
ccctggcaac aacaacatta agtacaacga gaagtttaaa gaccgggtga
ccatcacagc ggataagtct accagtacag tctatatgga gctgagctcc
ctgagaagcg aagacaccgc cgtctactat tgcgctcgcc acgaacaggg
tccaggttac tttgattatt gggggcaggg aactctggtc acagtcagct
ccgcctccac caagggcaaa gtggccgcat gtaaggagaa agttgctgct
ttgaaagaga aggtcgccgc acttaaggaa aaggtcgcag ccctgaaaga
g
である。
【０２４４】
「ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．３×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．３Ｆｃダイアボディ（ＡＡ）」と呼ばれる別のＦｃ領域含有ダイアボディは、Ｆｃ領域が、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を低減／排除してエフェクタ機能を低減／排除するＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ二重突然変異（下線）を有する変異体であることを除いて、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．３×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．３Ｆｃダイアボディと同一である。このＦｃ領域含有ダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１５０）：
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW
ASTRHTGVPD RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQQ HYITPWTFGG
GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTEYILH
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LRSEDTAVYY CARHEQGPGY FDYWGQGTLV TVSSASTKGE VAACEKEVAA
LEKEVAALEK EVAALEKLEP KSSDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP
KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ
VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV
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【０２４５】
配列番号１５０をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１５１：
gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga
ccgcgtgact attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg
cttggtacca gcagaagccc ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg
gccagcactc ggcacaccgg agtcccagat aggttctctg gcagtggatc
agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc gaggatgtgg
ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg
ggcacaaaac tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt
ccagctggtg cagagtgggg cagaggtgaa aaagccaggg gcatcagtga
aagtgtcttg taaagcatca ggttatacat ttactgagta catcctgcac
tgggtgcgac aggcaccagg acagggactg gaatggatgg ggtggttcta
ccctggcaac aacaacatta agtacaacga gaagtttaaa gaccgggtga
ccatcacagc ggataagtct accagtacag tctatatgga gctgagctcc
ctgagaagcg aagacaccgc cgtctactat tgcgctcgcc acgaacaggg
tccaggttac tttgattatt gggggcaggg aactctggtc acagtcagct
ccgcctccac caagggcgaa gtggccgcat gtgagaaaga ggttgctgct
ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag gaggtcgcag ccctggagaa
actggagccc aaatcttctg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag
cacctgaagc cgcgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc
aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt
ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg
gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct
gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc
ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag
gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag
cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt
gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa
gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg
ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggt
である。
【０２４６】
ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．３×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．３Ｆｃダイアボディ（ＡＡ）の第２のポリペプチド鎖もまた、上で詳述した（配列番号１４９によってコードされる）配列番号１４８である。
【０２４７】
あるいは、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の低減／排除、及び／又はエフェクタ機能の低減／排除が望まれる場合、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４のＣＨ２‐ＣＨ３領域を用いてよい。このようなＦｃ領域含有ダイアボディでは、配列番号１４６又は１５０のアミノ酸残基２８４〜５００は、配列番号１６４（ＩｇＧ２のＣＨ２‐ＣＨ３）又は配列番号１０３（ＩｇＧ４のＣＨ２‐ＣＨ３）で置換され、任意にＣ末端アミノ酸残基を含まない。
【０２４８】
５．ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．４×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．４Ｆｃ領域含有ダイアボディ
抗ヒトＤＲ５抗体ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐４のＶＬドメイン、及び抗ヒトｈＤＲ５抗体ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＨ‐４のＶＨドメインを有する、２ペアのポリペプチド鎖からなる、ＤＲ５に関して４価である例示的な単一特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディを構成する。「ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．４×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．４Ｆｃダイアボディ」と呼ばれる第１のＦｃ領域含有ダイアボディは、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含有する。このＦｃ領域含有ダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１５２）：
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【０２４９】
配列番号１５２では、アミノ酸残基１〜１０７は、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐４のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２７）に対応し、残基１０８〜１１５は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１６〜２３４は、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＨ‐２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号３１）に対応し、残基２３５〜２３９は、ASTKGリンカー（配列番号４７）に対応し、残基２４０〜２６７は、システイン含有Ｅコイルドメイン（配列番号４１）に対応し、残基２６８〜２７３は、LEPKSSリンカー（配列番号４９）に対応し、残基２７４〜２８３は、ＩｇＧ１ヒンジドメイン由来のリンカー（DKTHTCPPCP；配列番号４８）に対応し、残基２８４〜４９９は、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号１；Ｃ末端アミノ酸残基を含まない）に対応する。配列番号１５２をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１５３：
gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga
ccgcgtgact attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg
cttggtacca gcagaagccc ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg
gccagcactc ggcacaccgg agtcccatct aggttctctg gcagtggatc
agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagcca gaggatatcg
ctacatacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg
ggcacaaaac tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt
ccagctggtg cagagtgggg cagaggtgaa aaagccaggg gcatcagtga
aagtgtcttg taaagcatca ggttatacat ttactgagta catcctgcac
tgggtgcgac aggcaccagg acagggactg gaatggatgg ggtggttcta
ccctggcaac aacaacatta agtacaacga gaagtttaaa gaccgggtga
ccatcacagc ggataagtct accagtacag tctatatgga gctgagctcc
ctgagaagcg aagacaccgc cgtctactat tgcgctcgcc acgaacaggg
tccaggttac tttgattatt gggggcaggg aactctggtc acagtcagct
ccgcctccac caagggcgaa gtggccgcat gtgagaaaga ggttgctgct
ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag gaggtcgcag ccctggagaa
actggagccc aaatcttctg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag
cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc
aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt
ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg
gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct
gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc
ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag
gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag
cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt
gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa
gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg
ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggt
である。
【０２５０】
上記ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．４×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．４Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１５４）：
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LKEKVAALKE KVAALKE
【０２５１】
配列番号１５４では、アミノ酸残基１〜１０７は、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐４のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１７）に対応し、残基１０８〜１１５は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１６〜２３４は、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＨ‐２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号３１）に対応し、残基２３５〜２３９は、ASTKGリンカー（配列番号４７）に対応し、残基２４０〜２６７は、システイン含有Ｋコイルドメイン（配列番号４２）に対応する。配列番号１５４をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１５５：
gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga
ccgcgtgact attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg
cttggtacca gcagaagccc ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg
gccagcactc ggcacaccgg agtcccatct aggttctctg gcagtggatc
agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagcca gaggatatcg
ctacatacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg
ggcacaaaac tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt
ccagctggtg cagagtgggg cagaggtgaa aaagccaggg gcatcagtga
aagtgtcttg taaagcatca ggttatacat ttactgagta catcctgcac
tgggtgcgac aggcaccagg acagggactg gaatggatgg ggtggttcta
ccctggcaac aacaacatta agtacaacga gaagtttaaa gaccgggtga
ccatcacagc ggataagtct accagtacag tctatatgga gctgagctcc
ctgagaagcg aagacaccgc cgtctactat tgcgctcgcc acgaacaggg
tccaggttac tttgattatt gggggcaggg aactctggtc acagtcagct
ccgcctccac caagggcaaa gtggccgcat gtaaggagaa agttgctgct
ttgaaagaga aggtcgccgc acttaaggaa aaggtcgcag ccctgaaaga
g
である。
【０２５２】
「ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．４×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．４Ｆｃダイアボディ（ＡＡ）」と呼ばれる別のＦｃ領域含有ダイアボディは、Ｆｃ領域が、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を低減／排除してエフェクタ機能を低減／排除するＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ二重突然変異（下線）を有する変異体であることを除いて、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．４×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．４Ｆｃダイアボディと同一である。このＦｃ領域含有ダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１５６）：
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【０２５３】
配列番号１５６をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１５７：
gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga
ccgcgtgact attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg
cttggtacca gcagaagccc ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg
gccagcactc ggcacaccgg agtcccatct aggttctctg gcagtggatc
agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagcca gaggatatcg
ctacatacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg
ggcacaaaac tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt
ccagctggtg cagagtgggg cagaggtgaa aaagccaggg gcatcagtga
aagtgtcttg taaagcatca ggttatacat ttactgagta catcctgcac
tgggtgcgac aggcaccagg acagggactg gaatggatgg ggtggttcta
ccctggcaac aacaacatta agtacaacga gaagtttaaa gaccgggtga
ccatcacagc ggataagtct accagtacag tctatatgga gctgagctcc
ctgagaagcg aagacaccgc cgtctactat tgcgctcgcc acgaacaggg
tccaggttac tttgattatt gggggcaggg aactctggtc acagtcagct
ccgcctccac caagggcgaa gtggccgcat gtgagaaaga ggttgctgct
ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag gaggtcgcag ccctggagaa
actggagccc aaatcttctg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag
cacctgaagc cgcgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc
aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt
ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg
gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct
gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc
ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag
gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag
cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt
gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa
gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg
ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggt
である。
【０２５４】
ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．４×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．４Ｆｃダイアボディ（ＡＡ）の第２のポリペプチド鎖もまた、上で詳述した（配列番号１５５によってコードされる）配列番号１５４である。
【０２５５】
あるいは、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の低減／排除、及び／又はエフェクタ機能の低減／排除が望まれる場合、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４のＣＨ２‐ＣＨ３領域を用いてよい。このようなＦｃ領域含有ダイアボディでは、配列番号１５２又は１５６のアミノ酸残基２８４〜５００は、配列番号１６４（ＩｇＧ２のＣＨ２‐ＣＨ３）又は配列番号１０３（ＩｇＧ４のＣＨ２‐ＣＨ３）で置換され、任意にＣ末端アミノ酸残基を含まない。
【０２５６】
６．ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．５×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．５Ｆｃ領域含有ダイアボディ
抗ヒトＤＲ５抗体ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐５のＶＬドメイン、及び抗ヒトｈＤＲ５抗体ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＨ‐５のＶＨドメインを有する、２ペアのポリペプチド鎖からなる、ＤＲ５に関して４価である例示的な単一特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディを構成する。「ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．５×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．５Ｆｃダイアボディ」と呼ばれる第１のＦｃ領域含有ダイアボディは、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含有する。このＦｃ領域含有ダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１５８）：
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LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG
【０２５７】
配列番号１５８では、アミノ酸残基１〜１０７は、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐５のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２９）に対応し、残基１０８〜１１５は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１６〜２３４は、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＨ‐２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号３１）に対応し、残基２３５〜２３９は、ASTKGリンカー（配列番号４７）に対応し、残基２４０〜２６７は、システイン含有Ｅコイルドメイン（配列番号４１）に対応し、残基２６８〜２７３は、LEPKSSリンカー（配列番号４９）に対応し、残基２７４〜２８３は、ＩｇＧ１ヒンジドメイン由来のリンカー（DKTHTCPPCP；配列番号４８）に対応し、残基２８４〜４９９は、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号１；Ｃ末端アミノ酸残基を含まない）に対応する。配列番号１５８をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１５９：
gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga
ccgcgtgact attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg
cttggtacca gcagaagccc ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg
gccagcactc ggcacaccgg agtcccagat aggttctctg gcagtggatc
agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc gaggatatcg
ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg
ggcacaaaac tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt
ccagctggtg cagagtgggg cagaggtgaa aaagccaggg gcatcagtga
aagtgtcttg taaagcatca ggttatacat ttactgagta catcctgcac
tgggtgcgac aggcaccagg acagggactg gaatggatgg ggtggttcta
ccctggcaac aacaacatta agtacaacga gaagtttaaa gaccgggtga
ccatcacagc ggataagtct accagtacag tctatatgga gctgagctcc
ctgagaagcg aagacaccgc cgtctactat tgcgctcgcc acgaacaggg
tccaggttac tttgattatt gggggcaggg aactctggtc acagtcagct
ccgcctccac caagggcgaa gtggccgcat gtgagaaaga ggttgctgct
ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag gaggtcgcag ccctggagaa
actggagccc aaatcttctg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag
cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc
aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt
ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg
gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct
gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc
ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag
gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag
cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt
gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa
gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg
ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggt
である。
【０２５８】
上記ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．５×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．５Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１６０）：
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW
ASTRHTGVPD RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ HYITPWTFGG
GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTEYILH
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LRSEDTAVYY CARHEQGPGY FDYWGQGTLV TVSSASTKGK VAACKEKVAA
LKEKVAALKE KVAALKE
【０２５９】
配列番号１６０では、アミノ酸残基１〜１０７は、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐５のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２９）に対応し、残基１０８〜１１５は、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）（配列番号３３）に対応し、残基１１６〜２３４は、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＨ‐２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号３１）に対応し、残基２３５〜２３９は、ASTKGリンカー（配列番号４７）に対応し、残基２４０〜２６７は、システイン含有Ｋコイルドメイン（配列番号４２）に対応する。配列番号１６０をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１６１：
gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga
ccgcgtgact attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg
cttggtacca gcagaagccc ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg
gccagcactc ggcacaccgg agtcccagat aggttctctg gcagtggatc
agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc gaggatatcg
ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg
ggcacaaaac tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt
ccagctggtg cagagtgggg cagaggtgaa aaagccaggg gcatcagtga
aagtgtcttg taaagcatca ggttatacat ttactgagta catcctgcac
tgggtgcgac aggcaccagg acagggactg gaatggatgg ggtggttcta
ccctggcaac aacaacatta agtacaacga gaagtttaaa gaccgggtga
ccatcacagc ggataagtct accagtacag tctatatgga gctgagctcc
ctgagaagcg aagacaccgc cgtctactat tgcgctcgcc acgaacaggg
tccaggttac tttgattatt gggggcaggg aactctggtc acagtcagct
ccgcctccac caagggcaaa gtggccgcat gtaaggagaa agttgctgct
ttgaaagaga aggtcgccgc acttaaggaa aaggtcgcag ccctgaaaga
g
である。
【０２６０】
「ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．５×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．５Ｆｃダイアボディ（ＡＡ）」と呼ばれる別のＦｃ領域含有ダイアボディは、Ｆｃ領域が、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を低減／排除してエフェクタ機能を低減／排除するＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ二重突然変異（下線）を有する変異体であることを除いて、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．５×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．５Ｆｃダイアボディと同一である。このＦｃ領域含有ダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１６２）：
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW
ASTRHTGVPD RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ HYITPWTFGG
GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTEYILH
WVRQAPGQGL EWMGWFYPGN NNIKYNEKFK DRVTITADKS TSTVYMELSS
LRSEDTAVYY CARHEQGPGY FDYWGQGTLV TVSSASTKGE VAACEKEVAA
LEKEVAALEK EVAALEKLEP KSSDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP
KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ
VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV
LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG
【０２６１】
配列番号１６２をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１６３：
gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga
ccgcgtgact attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg
cttggtacca gcagaagccc ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg
gccagcactc ggcacaccgg agtcccagat aggttctctg gcagtggatc
agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc gaggatatcg
ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg
ggcacaaaac tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt
ccagctggtg cagagtgggg cagaggtgaa aaagccaggg gcatcagtga
aagtgtcttg taaagcatca ggttatacat ttactgagta catcctgcac
tgggtgcgac aggcaccagg acagggactg gaatggatgg ggtggttcta
ccctggcaac aacaacatta agtacaacga gaagtttaaa gaccgggtga
ccatcacagc ggataagtct accagtacag tctatatgga gctgagctcc
ctgagaagcg aagacaccgc cgtctactat tgcgctcgcc acgaacaggg
tccaggttac tttgattatt gggggcaggg aactctggtc acagtcagct
ccgcctccac caagggcgaa gtggccgcat gtgagaaaga ggttgctgct
ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag gaggtcgcag ccctggagaa
actggagccc aaatcttctg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag
cacctgaagc cgcgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc
aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt
ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg
gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct
gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc
ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag
gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag
cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt
gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa
gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg
ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggt
である。
【０２６２】
ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．５×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．５Ｆｃダイアボディ（ＡＡ）の第２のポリペプチド鎖もまた、上で詳述した（配列番号１６１によってコードされる）配列番号１６０である。
【０２６３】
あるいは、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の低減／排除、及び／又はエフェクタ機能の低減／排除が望まれる場合、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４のＣＨ２‐ＣＨ３領域を用いてよい。このようなＦｃ領域含有ダイアボディでは、配列番号１５８又は１６２のアミノ酸残基２８４〜５００は、配列番号１６４（ＩｇＧ２のＣＨ２‐ＣＨ３）又は配列番号１０３（ＩｇＧ４のＣＨ２‐ＣＨ３）で置換され、任意にＣ末端アミノ酸残基を含まない。
【０２６４】
Ｄ．ＤＲ５に関して２価である、ＤＲ５×ＤＲ５単一特異性ダイアボディ
１．ＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  １ダイアボディ
抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＬ及びＶＨドメインを有する、２つのポリペプチド鎖からなるＦｃ領域を含まない、ＤＲ５に関して２価である例示的な単一特異性ダイアボディを構成する。このダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述の配列番号１２８のアミノ酸残基１〜２７３を含む。このダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述の配列番号１３０を含む。
【０２６５】
抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＬ及びＶＨドメインを有する、２つのポリペプチド鎖からなるＦｃ領域を含有する、ＤＲ５に関して２価である他の例示的な単一特異性ダイアボディを構成する。このダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述の配列番号１２８又は配列番号１３２を含む。このダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１３０を含み、またアミノ酸残基LEPKSSDKTHTCPPCP（配列番号５１）を有するリンカーを更に含み、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、配列番号１又は配列番号１０２のアミノ酸配列を有し、任意にＣ末端アミノ酸残基を含まない。
【０２６６】
２．ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２ダイアボディ
抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬ及びＶＨドメインを有する、２つのポリペプチド鎖からなるＦｃ領域を含まない、ＤＲ５に関して２価である例示的な単一特異性ダイアボディを構成する。このダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述の配列番号１３４のアミノ酸残基１〜２６７を含む。このダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述の配列番号１３６を含む。
【０２６７】
抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬ及びＶＨドメインを有する、２つのポリペプチド鎖からなるＦｃ領域を含有する、ＤＲ５に関して２価である他の例示的な単一特異性ダイアボディを構成する。このダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１３４又は配列番号１３８を含む。このダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１３６を含み、またアミノ酸残基LEPKSSDKTHTCPPCP（配列番号５１）を有するリンカーを更に含み、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、配列番号１又は配列番号１０２のアミノ酸配列を有し、任意にＣ末端アミノ酸残基を含まない。
【０２６８】
３．ＤＲ５  ｍＡｂ  ２．２×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２．２ダイアボディ
抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐２のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＨ‐２のＶＬ及びＶＨドメインを有する、２つのポリペプチド鎖からなるＦｃ領域を含まない、ＤＲ５に関して２価である例示的な単一特異性ダイアボディを構成する。このダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述の配列番号１４０のアミノ酸残基１〜２６７を含む。このダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述の配列番号１４２を含む。
【０２６９】
抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐２のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＨ‐２のＶＬ及びＶＨドメインを有する、２つのポリペプチド鎖からなるＦｃ領域を含有する、ＤＲ５に関して２価である他の例示的な単一特異性ダイアボディを構成する。このダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１４０又は配列番号１４４を含む。このダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１４２を含み、またアミノ酸残基LEPKSSDKTHTCPPCP（配列番号５１）を有するリンカーを更に含み、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、配列番号１又は配列番号１０２のアミノ酸配列を有し、任意にＣ末端アミノ酸残基を含まない。
【０２７０】
４．ＤＲ５  ｍＡｂ  ２．３×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２．３ダイアボディ
抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐３のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＨ‐３のＶＬ及びＶＨドメインを有する、２つのポリペプチド鎖からなるＦｃ領域を含まない、ＤＲ５に関して２価である例示的な単一特異性ダイアボディを構成する。このダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述の配列番号１４６のアミノ酸残基１〜２６７を含む。このダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述の配列番号１４８を含む。
【０２７１】
抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐３のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＨ‐３のＶＬ及びＶＨドメインを有する、２つのポリペプチド鎖からなるＦｃ領域を含有する、ＤＲ５に関して２価である他の例示的な単一特異性ダイアボディを構成する。このダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１４６又は配列番号１５０を含む。このダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１４８を含み、またアミノ酸残基LEPKSSDKTHTCPPCP（配列番号５１）を有するリンカーを更に含み、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、配列番号１又は配列番号１０２のアミノ酸配列を有し、任意にＣ末端アミノ酸残基を含まない。
【０２７２】
５．ＤＲ５  ｍＡｂ  ２．４×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２．４ダイアボディ
抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐４のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＨ‐４のＶＬ及びＶＨドメインを有する、２つのポリペプチド鎖からなるＦｃ領域を含まない、ＤＲ５に関して２価である例示的な単一特異性ダイアボディを構成する。このダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述の配列番号１５２のアミノ酸残基１〜２６７を含む。このダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述の配列番号１５４を含む。
【０２７３】
抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐４のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＨ‐４のＶＬ及びＶＨドメインを有する、２つのポリペプチド鎖からなるＦｃ領域を含有する、ＤＲ５に関して２価である他の例示的な単一特異性ダイアボディを構成する。このダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１５０又は配列番号１５６を含む。このダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１５４を含み、またアミノ酸残基LEPKSSDKTHTCPPCP（配列番号５１）を有するリンカーを更に含み、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、配列番号１又は配列番号１０２のアミノ酸配列を有し、任意にＣ末端アミノ酸残基を含まない。
【０２７４】
６．ＤＲ５  ｍＡｂ  ２．５×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２．５ダイアボディ
抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐５のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＨ‐５のＶＬ及びＶＨドメインを有する、２つのポリペプチド鎖からなるＦｃ領域を含まない、ＤＲ５に関して２価である例示的な単一特異性ダイアボディを構成する。このダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述の配列番号１５８のアミノ酸残基１〜２６７を含む。このダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述の配列番号１６０を含む。
【０２７５】
抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐５のＶＬ及びＶＨドメイン、並びにＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＨ‐５のＶＬ及びＶＨドメインを有する、２つのポリペプチド鎖からなるＦｃ領域を含有する、ＤＲ５に関して２価である他の例示的な単一特異性ダイアボディを構成する。このダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１５８又は配列番号１６２を含む。このダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１６０を含み、またアミノ酸残基LEPKSSDKTHTCPPCP（配列番号５１）を有するリンカーを更に含み、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、配列番号１又は配列番号１０２のアミノ酸配列を有し、任意にＣ末端アミノ酸残基を含まない。
【０２７６】
Ｅ．更なるＤＲ５×ＤＲ５ダイアボディ
代替実施形態では、ヒト化抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＬ及びＶＨドメイン並びに／又はヒト化ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬ及びＶＨドメインを有する、本発明のＤＲ５×ＤＲ５ダイアボディを構成する。ある具体的な実施形態では、ｈＤＲ５  ｍａｂ  ２  ＶＬ  ＶＬ‐２（配列番号２３）、ｈＤＲ５  ｍａｂ  ２  ＶＬ  ＶＬ‐３（配列番号２５）、ｈＤＲ５  ｍａｂ  ２  ＶＬ  ＶＬ‐４（配列番号２７）若しくはｈＤＲ５  ｍａｂ  ２  ＶＬ  ＶＬ‐５（配列番号２９）のＶＬドメインを、配列番号１３に代えて上述の構成に組み込み、及び／又はｈＤＲ５  ｍａｂ  ２  ＶＨ‐２（配列番号３１）というＶＨドメインを、配列番号１８に代えて上述の構成に組み込む。あるいは、又は更に、ＤＲ５  ｍＡｂ  １のヒト化ＶＬドメインを、配列番号３に代えて上述の構成に組み込み、及び／又はヒト化ＶＨドメインを、配列番号８に代えて上述の構成に組み込む。
【０２７７】
上述の例示的な多価ＤＲ５結合分子は、各結合ドメインに関して、軽鎖（ＶＬ）の３つのＣＤＲL及び重鎖（ＶＨ）の３つのＣＤＲHを含むが、本発明はまた：
（１）抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＬドメインのＣＤＲLのうちの少なくとも１つ；
（２）抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＬドメインのＣＤＲLのうちの少なくとも２つ；
（３）抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（４）抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＨドメインのＣＤＲHのうちの少なくとも１つ；
（５）抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＨドメインのＣＤＲHのうちの少なくとも２つ；
（６）抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＨドメインの３つのＣＤＲH；
（７）抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＬドメインのＣＤＲLのうちの少なくとも１つ、及び抗ヒトＤＲ５抗体  ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＨドメインのＣＤＲHのうちの少なくとも１つ；
（８）抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＬドメインのＣＤＲLのうちの少なくとも２つ、及び抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＨドメインのＣＤＲHのうちの少なくとも２つ；
（９）抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＬドメインの３つのＣＤＲL、及び抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＨドメインの３つのＣＤＲH；
（１０）抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＬドメイン；
（１１）抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＨドメイン；
（１２）抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １のＶＬ及びＶＨドメイン
を有する；又は
（１３）ヒトＤＲ５への結合に関して抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １と競合し得る；又は
（１４）ヒトＤＲ５への結合に関して（１）〜（１３）のいずれと競合する、多価ＤＲ５結合分子も含むことが認識されるだろう。
【０２７８】
同様に、本発明は：
（１５）抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬドメインのＣＤＲLのうちの少なくとも１つ；
（１６）抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬドメインのＣＤＲLのうちの少なくとも２つ；
（１７）抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（１８）抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＨドメインのＣＤＲHのうちの少なくとも１つ；
（１９）抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＨドメインのＣＤＲHのうちの少なくとも２つ；
（２０）抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＨドメインの３つのＣＤＲH；
（２１）抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬドメインのＣＤＲLのうちの少なくとも１つ、及び抗ヒトＤＲ５抗体  ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＨドメインのＣＤＲHのうちの少なくとも１つ；
（２２）抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬドメインのＣＤＲLのうちの少なくとも２つ、及び抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＨドメインのＣＤＲHのうちの少なくとも２つ；
（２３）抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬドメインの３つのＣＤＲL、及び抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＨドメインの３つのＣＤＲH；
（２４）抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬドメイン；
（２５）抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＨドメイン；
（２６）抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬ及びＶＨドメイン
を有する；
（２７）ヒトＤＲ５への結合に関して抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２と競合する；又は
（２８）ヒトＤＲ５への結合に関して（１）〜（１３）のいずれと競合する、多価ＤＲ５結合分子も含むことが認識されるだろう。
【０２７９】
ＶＩＩ．製造方法
多価ＤＲ５結合分子、並びに他のＤＲ５アゴニスト、アンタゴニスト及びモジュレータは、当該技術分野において公知の方法によって、例えば合成又は組み換えにより、ＤＲ５  ｍＡｂ  １又はＤＲ５  ｍＡｂ  ２抗体のポリヌクレオチド及び／又は配列から生成できる。このようなペプチドアゴニスト、アンタゴニスト及びモジュレータを製造する１つの方法は、ポリペプチドの化学合成と、これに続く、天然立体配座、即ち正しいジスルフィド結合を得るために適切な酸化条件下での処置とを伴う。これは、当業者に公知の方法論を用いて達成できる（例えばKelley, R. F. et al. (1990) In: Genetic Engineering Principles and Methods, Setlow, J.K. Ed., Plenum Press, N.Y., vol. 12, pp 1‐19; Stewart, J.M et al. (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, ILを参照；米国特許第４，１０５，６０３号；米国特許第３，９７２，８５９号；米国特許第３，８４２，０６７号；及び米国特許第３，８６２，９２５号も参照）。
【０２８０】
本発明のポリペプチドは、固相ペプチド合成を用いて便利に調製できる（Merrifield, B. (1986) “Solid Phase Synthesis,” Science 232(4748):341‐347; Houghten, R.A. (1985) “General Method For The Rapid Solid‐Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen‐Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15): 5131‐5135; Ganesan, A. (2006) “Solid‐Phase Synthesis In The Twenty‐First Century,” Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3‐10）。
【０２８１】
更に別の代替例では、ＤＲ５  ｍＡｂ  １若しくはＤＲ５  ｍＡｂ  ２を有する完全なヒト抗体、又はヒトＤＲ５若しくはその可溶性形態への結合に関してＤＲ５  ｍＡｂ  １若しくはＤＲ５  ｍＡｂ  ２と競合する完全なヒト抗体を、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するよう加工された市販のマウスを用いて得ることができる。ヒト化又はヒト抗体の生成のために、より望ましい（例えば完全なヒト抗体）又はよりロバストな免疫応答を生成するよう設計された遺伝子組み換え動物も使用してよい。このような技術の例は、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．，フレモント、ＣＡ）並びにＨＵＭＡｂ‐Ｍｏｕｓｅ（登録商標）及びＴＣ  ＭＯＵＳＥ（商標）（いずれもＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．，プリンストン、ＮＪ）である。
【０２８２】
ある代替案では、当該技術分野において公知の方法を用いて、抗体を組み換えによって作製し、発現させてよい。抗体は、まず宿主動物から作製された抗体を単離し、遺伝子配列を取得し、上記遺伝子配列を使用して宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞）内で抗体を組み換え発現させることによって作製できる。採用できる別の方法は、植物（例えばタバコ）又はトランスジェニックミルク中で抗体配列を発現させることである。植物又はミルク中で抗体を組み換え発現させるための好適な方法は、開示されている（例えばPeeters et al. (2001) "Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants," Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) "Human Antibodies From Transgenic Mice," Int. Rev. Immunol 13:65-93; and Pollock et a/.(1999) "Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies," J. Immunol Methods 231 : 147-157を参照）。例えばキメラ、ヒト化、単鎖等の抗体の誘導体を作製するための好適な方法は、当該技術分野において公知である。別の代替案では、抗体はファージディスプレイ技術によって、組み換えによって作製できる（例えば米国特許第５，５６５，３３２号；米国特許第５，５８０，７１７号；米国特許第５，７３３，７４３号；米国特許第６，２６５，１５０号；及びWinter, G. et al. (1994) "Making Antibodies By Phage Display Technology," Annu. Rev. Immunol. 12.433-455を参照）。
【０２８３】
関心対象の抗体又はタンパク質は、エドマン分解による配列決定に供してよく、これは当業者には公知である。質量分析又はエドマン分解から生成されるペプチド情報を用いて、関心対象のタンパク質をクローニングするために使用されるプローブ又はプライマを設計できる。
【０２８４】
関心対象のタンパク質クローニングの代替的な方法は、ＤＲ５  ｍＡｂ  １若しくはＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＣＤＲのうちの１つ若しくは複数を有する、又はヒトＤＲ５への結合に関してＤＲ５  ｍＡｂ  １若しくはＤＲ５  ｍＡｂ  ２と競合する、関心対象の抗体又はタンパク質を発現する細胞に関して、精製したＤＲ５又はその部分を用いて「パンニング（ｐａｎｎｎｉｎｇ）」することにより、ＤＲ５又は上記所望の癌抗原又はエフェクタ細胞分子に結合できるようにすることによるものである。「パンニング」手順は、ＤＲ５を発現する組織又は細胞からｃＤＮＡライブラリを取得し、上記ｃＤＮＡを第２の細胞タイプにおいて過剰発現させ、ＤＲ５  ｍＡｂ  １又はＤＲ５  ｍＡｂ  ２の存在又は不在下での、ＤＲ５への特異的結合に関して、第２の細胞タイプのトランスフェクト細胞をスクリーニングすることによって、実施してよい。「パンニング」による、細胞表面タンパク質に関する哺乳類遺伝子コーディングのクローニングにおいて使用される方法の詳細な説明は、従来技術中に見ることができる（例えばAruffo, A. et al. (1987) "Molecular Cloning Of A CD28 cDNA By A High-Efficiency COS Cell Expression System " Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:8573-8577 and Stephan, J. et al. (1999) "Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation " Endocrinol. 140:5841-5854を参照）。
【０２８５】
関心対象のポリヌクレオチドを含有するベクターは：電気穿孔；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ‐デキストラン又は他の物質を使用したトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；及び感染（例えばベクターがワクシニアウイルス等の感染性因子である場合）を含む多数の適切な手段のうちのいずれによって、宿主細胞に導入できる。ベクター又はポリヌクレオチドの導入の選択は、宿主細胞の特徴に左右される場合が多い。
【０２８６】
関心対象の抗体、ポリペプチド、又はタンパク質をエンコードする遺伝子を単離する目的で、異種ＤＮＡを過剰発現できるいずれの宿主細胞を使用できる。好適な哺乳類宿主細胞の非限定的な例としては、ＣＯＳ、ＨｅＬａ及びＣＨＯ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、宿主細胞は、対応する関心対象の内因性抗体又はタンパク質（これらが宿主細胞中に存在する場合）より５倍高い、より好ましくは１０倍高い、より好ましくは２０倍高いレベルのｃＤＮＡを発現する。ＤＲ５への特異的結合に関する宿主細胞のスクリーニングは好ましくは、イムノアッセイ又はＦＡＣＳによって実行される。関心対象の抗体又はタンパク質を過剰発現する細胞を識別できる。
【０２８７】
本発明は、本発明の抗体のアミノ酸配列を備えるポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドは、当該技術分野において公知の手順で産生できる。上記ポリペプチドは、抗体のタンパク質分解若しくは他の分解によって、上述のような組み換え法（即ち単一若しくは融合ポリペプチド）によって、又は化学的合成によって産生できる。上記抗体のポリペプチド、特にアミノ酸最高約５０個分の比較的短いポリペプチドは、化学的合成によって便利に作製される。化学的合成方法は当該技術分野において公知であり、市販されている。例えば抗ＤＲ５ポリペプチドは、固相法を採用した自動ポリペプチド合成器によって産生してよい。
【０２８８】
本発明は、ＤＲ５  ｍＡｂ  １又はＤＲ５  ｍＡｂ  ２抗体、及び上記抗体の、ＤＲ５に結合するポリペプチド断片、並びに上記分子のアゴニスト、アンタゴニスト及びモジュレータ（上記分子の特性に有意な影響を及ぼさない、機能的に同等の抗体及び融合ポリペプチド、並びに活性が増強した又は低下した変異体を含む）に対する、いずれの修飾を含んでよい。ポリペプチドの修飾は、当該技術分野において慣用的に実践されており、本明細書で詳細に説明する必要はない。修飾されたポリペプチドの例としては、アミノ酸残基の保存的置換を有するポリペプチド、機能的活性を大きく劣化するように変化させない１つ若しくは複数の欠失若しくは追加、又は化学的類似体の使用が挙げられる。互いを保存的に置換できるアミノ酸残基としては：グリシン／アラニン；セリン／トレオニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；リジン／アルギニン；及びフェニルアラニン／チロシンが挙げられるが、これらに限定されない。これらのポリペプチドとしては、グリコシル化及び非グリコシル化ポリペプチド、並びに例えば異なる複数の糖によるグリコシル化、アセチル化及びリン酸化といった、その他の変換後修飾を有するポリペプチドも挙げられる。好ましくは、アミノ酸置換は保存的であり、即ち置換されたアミノ酸は、オリジナルのアミノ酸と同様の化学的特性を有する。このような保存的置換は当該技術分野において公知であり、その例は上述されている。アミノ酸修飾は、１つ又は複数のアミノ酸を変化させるか又は修飾することから、可変ドメイン等の領域の完全な再設計にまで及んでよい。可変ドメインの変化は、結合親和性及び／又は特異性を変化させる。他の修飾方法としては、酵素的手段、酸化的置換及びキレート化を含むがこれらに限定されない、当該技術分野において公知の連結技術の使用が挙げられる。修飾は例えば、イムノアッセイのための標識の付与、例えばラジオイムノアッセイのための放射性部分の付与等のために使用できる。修飾されたポリペプチドは、当該技術分野において確立された手順を用いて作製され、また当該技術分野において公知の標準的なアッセイを用いてスクリーニングできる。
【０２８９】
本発明はまた、本発明のポリペプチドの１つ若しくは複数又はＤＲ５  ｍＡｂ  １若しくはＤＲ５  ｍＡｂ  ２を備える融合タンパク質も包含する。一実施形態では、軽鎖、重鎖又は軽鎖及び重鎖の両方を備える、融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、異種免疫グロブリン定常領域を含有する。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、公的に寄託されたハイブリドーマから産生された抗体の軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含有する。本発明の目的のために、抗体融合タンパク質は、ＤＲ５、及びネイティブ分子内では上記抗体融合タンパク質が付着しない別のアミノ酸配列、例えば別の領域からの異種配列又は同種配列に特異的に結合する、１つ又は複数のポリペプチドドメインを含有する。
【０２９０】
ＶＩＩＩ．本発明の多価ＤＲ５結合分子の使用
本発明は、本発明の多価ＤＲ５結合分子（例えばＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２等の抗ＤＲ５抗体又はそのヒト化誘導体からの抗原結合ドメインを含む多価ＤＲ５結合分子）、このような分子由来のポリペプチド、このような分子又はポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、並びに本明細書に記載の他の作用剤を含む、医薬組成物を含む組成物を包含する。
【０２９１】
上述のように、ＴＲＡＩＬサイトカインによるＤＲ５の活性化は、腫瘍細胞の極めて選択的な認識及び殺滅をもたらす。本発明の多価ＤＲ５結合分子は、ＴＲＡＩＬを模倣することによってＤＲ５の活性化をもたらすアゴニスト作用剤として作用する能力を有する。従ってＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２等の抗ＤＲ５抗体又はそのヒト化誘導体からの抗原結合ドメインを含む多価ＤＲ５結合分子を、ＴＲＡＩＬの代用物として使用して、ＤＲ５を発現する腫瘍細胞の死を促進できる。ＤＲ５は腫瘍細胞株内に広範に分布しているため、本発明の多価ＤＲ５結合分子は、癌の全般的な治療を提供する。癌に対する一般的な治療を提供する。このような分子で治療できる癌としては、以下の細胞：副腎腫瘍；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星状細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄の癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；嫌色素性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚の良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成；胆嚢又は胆管癌；消化器癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；膵島細胞腫瘍；カポジ肉腫；腎癌；白血病；脂肪腫／良性脂肪腫；脂肪肉腫／悪性脂肪腫；肝癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；卵巣癌；膵臓癌；甲状腺乳頭癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；希少な血液学的障害；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移癌；及び子宮癌からなる群から選択される癌細胞の存在を特徴とする癌が挙げられる。
【０２９２】
特に、本発明の多価ＤＲ５結合分子は：結腸直腸癌；肝細胞癌；神経膠腫；腎癌；乳癌；多発性骨髄腫；膀胱癌；神経芽細胞腫；肉腫；非ホジキンリンパ腫；非小細胞肺癌；卵巣癌；膵臓癌及び直腸癌の治療に使用できる。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、本発明の多価ＤＲ５結合分子を用いて、ヒト癌幹細胞である腫瘍細胞の細胞死を促進できる。癌幹細胞（ＣＳＣ）は、腫瘍成長及び増殖に関与するという仮説が立てられている（Ghotra, V.P. et al. (2009) “The Cancer Stem Cell Microenvironment And Anti-Cancer Therapy,” Int. J. Radiat. Biol. 85(11):955-962; Gupta, P.B. et al. (2009) “Cancer Stem Cells: Mirage Or Reality?” Nat. Med. 15(9):1010-1012; Lawson, J.C. et al. (2009) “Cancer Stem Cells In Breast Cancer And Metastasis,” Breast Cancer Res. Treat. 118(2):241-254; Hermann, P.C. et al. (2009) “Pancreatic Cancer Stem Cells--Insights And Perspectives,” Expert Opin. Biol. Ther. 9(10):1271-1278; Schatton, T. et al. (2009) “Identification And Targeting Of Cancer Stem Cells,” Bioessays 31(10):1038-1049; Mittal, S. et al. (2009) “Cancer Stem Cells: The Other Face Of Janus,” Amer. J. Med. Sci. 338(2):107-112; Alison, M.R. et al. (2009) “Stem Cells And Lung Cancer: Future Therapeutic Targets?” Expert Opin. Biol. Ther. 9(9):1127-1141; Charafe-Jauffret, E. et al. (2009) “Breast Cancer Stem Cells: Tools And Models To Rely On,” BMC Cancer 9:202; Scopelliti, A. et al. (2009) “Therapeutic Implications Of Cancer Initiating Cells,” Expert Opin. Biol. Ther. 9(8):1005-1016; 国際公開第２００８／０９１９０８号）。この仮説では、ＣＳＣは、各腫瘍内に小さな別個の細胞サブセットを含み、これらは、無限の自己再生、及び複製能力が比較的限定された、１つ又は複数のより成熟した腫瘍細胞への進化が可能である。癌幹細胞は、化学療法剤、照射又は他の毒性条件に対する耐性が比較的高くなり得、従って臨床療法後に生存してその後二次腫瘍へと成長し得る、転移し得る、又は再発の原因となり得るという仮説が立てられている。ＣＳＣは、「正常（ｎｏｒｍａｌ）」組織幹細胞から、又はより分化した組織前駆細胞から発生できることが示唆されている。本明細書において実証されているように、本発明の多価ＤＲ５結合分子は、癌幹細胞のように見える細胞（即ち癌幹細胞様（ＣＳＣＬ）細胞）に対して細胞傷害性を有する。従って本発明の多価ＤＲ５結合分子を用いて、ヒト癌細胞の細胞死を促進できる。
【０２９４】
更に、ボリノスタット等のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤は、ＤＲ５経路を介して誘発されるアポトーシスに対して腫瘍細胞を感作することが報告されている（Nakata  et al. (2004) “Histone deacetylase inhibitors upregulate death receptor 5/TRAIL-R2 and sensitize apoptosis induced by TRAIL/APO2-L in human malignant tumor cells,” Oncogene 19:6261-71; Butler et al. (2006) “The histone deacetylase inhibitor, suberoylanilide hydroxamic acid, overcomes resistance of human breast cancer cells to Apo2L/TRAIL,” Int J Cancer. 15:944-54; Shankar et al. (2009) “Suberoylanilide hydroxamic acid (Zolinza/vorinostat) sensitizes TRAIL-resistant breast cancer cells orthotopically implanted in BALB/c nude mice,” Mol Cancer Ther. 8:1596-605）。本明細書において実証されているように、本発明の多価ＤＲ５結合分子の、細胞死を促進する能力は、ＨＤＡＣ阻害剤（例えばボリノスタット）との併用療法によって増強される。従って、多価ＤＲ５結合分子と組み合わせてのＨＤＡＣの使用は、多価ＤＲ５結合分子を単一作用剤として用いた治療に対して感受性でない、ＤＲ５を発現する癌の治療に、特に有用である。
【０２９５】
治療におけるその有用性に加えて、本発明の三重特異性結合分子は、検出可能な標識を付与でき、癌の診断又は腫瘍及び腫瘍細胞の撮像において使用できる。
【０２９６】
ＩＸ．医薬組成物
本発明の組成物は、医薬組成物の製造に使用できるバルク薬剤組成物（例えば不純又は非滅菌組成物）、及び単位剤形の調製に使用できる医薬組成物（即ち被験体又は患者への投与に好適な組成物）を含む。これらの組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明の三重特異性結合分子、又はこのような作用剤と薬学的に許容可能なキャリアとの組み合わせを含む。好ましくは、本発明の組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明の多価ＤＲ５結合分子のうちの1つ又は複数と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。本発明は特に、多価ＤＲ５結合分子が、ＤＲ５  ｍＡｂ  １、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２抗体、ヒト化ＤＲ５  ｍＡｂ  １、ヒト化ＤＲ５  ｍＡｂ  ２抗体、又はこれらの抗体のいずれのＤＲ５結合断片といった、抗ＤＲ５抗体からの抗原結合ドメインを含む。特に包含されるのは、ＤＲ５  ｍＡｂ  １の３つのＣＤＲL及び３つのＣＤＲH；ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の３つのＣＤＲL及び３つのＣＤＲH；並びに／又はｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐３の３つのＣＤＲL及び３つのＣＤＲHを含む分子である。
【０２９７】
本発明は、本発明の多価ＤＲ５結合分子及び薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を包含する。本発明はまた、特定の癌抗原に対して特異的である第２の治療用抗体（例えば腫瘍特異性モノクローナル抗体）、及び薬学的に許容可能なキャリアを更に含む、上記医薬組成物も包含する。
【０２９８】
ある具体的実施形態では、用語「薬学的に許容可能な（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」は、動物、より詳細にはヒトにおける使用に関して、連邦規制当局若しくは州政府によって承認されている、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。用語「キャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）」は、希釈剤、アジュバント（例えばフロイントアジュバント（完全及び不完全））、賦形剤、又は治療薬の投与に用いられるビヒクルを指す。これらの薬学的キャリアは、水及び石油、動物油、植物油若しくは合成油を含む油（例えば落花生油、大豆油、鉱物油、胡麻油等）等の、無菌液体とすることができる。医薬組成物を静脈投与する場合、水が好ましいキャリアである。特に注射用溶液のための液体キャリアとして、食塩水、並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液も採用できる。好適な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。必要な場合は、上記組成物は、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、ピル、カプセル、粉体、徐放性製剤等の形態を取ることができる。
【０２９９】
一般に、本発明の組成物の成分は、例えば活性作用剤の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ中の凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、別個に、又は単位剤形にまとめて混合された状態で供給される。組成物を点滴によって投与する場合、組成物は、滅菌された薬学的グレードの水又は食塩水を内包する点滴ボトルを用いて吐出できる。組成物を注射によって投与する場合、投与前に成分を混合できるように、注射用無菌水又は食塩水のアンプルを提供できる。
【０３００】
本発明の組成物は、中性又は塩形態として処方できる。薬学的に許容可能な塩としては：塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等由来の陰イオンを有して形成されるもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２‐エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等由来の陽イオンを有して形成されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０１】
本発明はまた、本発明の多価ＤＲ５結合分子（並びにより好ましくは、ＤＲ５  ｍＡｂ  １及び／又はＤＲ５  ｍＡｂ  ２抗体及び／又はヒト化ＤＲ５  ｍＡｂ  １及び／又はヒト化ＤＲ５  ｍＡｂ  ２抗体のＣＤＲを含む、４価Ｆｃ領域含有ダイアボディ（特に、４価Ｅコイル／Ｋコイル‐Ｆｃ領域含有ダイアボディ））で充填された１つ又は複数のコンテナを備える、医薬パック又はキットも提供する。特に包含されるのは、ＤＲ５  ｍＡｂ  １の３つのＣＤＲL及び３つのＣＤＲH；ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の３つのＣＤＲL及び３つのＣＤＲH；並びに／又はｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐３の３つのＣＤＲL及び３つのＣＤＲHを、単独で又は上述のような薬学的に許容可能なキャリアと共に、含む分子である。更に、疾患の治療に有用な１つ又は複数の他の予防剤又は治療剤も、上記医薬パック又はキットに含めることができる。本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分のうちの１つ又は複数で充填された１つ又は複数のコンテナを備える、医薬パック又はキットも提供する。任意に、このような１つ又は複数のコンテナは、医薬製品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知と関連するものとすることができ、上記通知は、ヒトへの投与のための製造、使用又は販売の機関による承認を反映したものである。
【０３０２】
本発明は、上述の方法において使用できるキットを提供する。キットは、本発明の多価ＤＲ５結合分子のいずれを含むことができる。このキットは更に、癌の治療に有用な１つ若しくは複数の他の予防剤及び／若しくは治療剤を、１つ若しくは複数のコンテナ内に含むことができ；並びに／又はこのキットは更に、癌に関連する１つ若しくは複数の癌抗原に結合する１つ若しくは複数の細胞傷害性抗体を含むことができる。特定の実施形態では、他の予防剤又は治療剤は、化学療法剤である。他の実施形態では、予防剤又は治療剤は生物学的治療剤又はホルモン療法剤である。
【０３０３】
Ｘ．投与方法
本発明の組成物は、有効量の本発明の融合タンパク質若しくはコンジュゲート分子又は本発明の融合タンパク質若しくはコンジュゲート分子を含む医薬組成物を被験体に投与することによる、疾患、障害又は感染症に関連する１つ又は複数の症状の治療、予防及び改善のために提供できる。好ましい態様では、上記組成物は実質的に精製される（即ち上記組成物の効果を制限する、又は望ましくない副作用を生成する物質を実質的に含まない）。ある具体的実施形態では、被験体は動物、好ましくは非霊長類（例えばウシ属、ウマ科、ネコ科、イヌ科、げっ歯類等）又は霊長類（例えばカニクイザル等のサル、ヒト等）といった哺乳類である。ある好ましい実施形態では、被験体はヒトである。
【０３０４】
例えば抗体又は融合タンパク質を発現できるリポソーム、微粒子マイクロカプセル、組み換え細胞内へのカプセル化；受容体媒介性エンドサイトーシス（例えばWu et al. (1987) “Receptor‐Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System,” J. Biol. Chem. 262:4429‐4432を参照）；レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築等、様々な送達系が公知であり、本発明の組成物の投与に使用できる。
【０３０５】
本発明の分子を投与する方法としては：非経口投与（例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）；硬膜外；並びに粘膜（例えば鼻腔内及び経口経路）が挙げられるがこれらに限定されない。ある具体的実施形態では、本発明の多価ＤＲ５結合分子は、筋肉内、静脈内又は皮下投与される。組成物は、いずれの便利な経路によって、例えば点滴又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜皮膚層（例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等）を通した吸収によって投与してよく、他の生物学的活性作用剤と共に投与してよい。投与は全身性又は局所性とすることができる。更に、例えば吸入器又は噴霧器の使用及びエアロゾル化剤を用いた処方により、肺投与を採用することもできる。例えば米国特許第６，０１９，９６８号；米国特許第５，９８５，３２０号；米国特許第５，９８５，３０９号；米国特許第５，９３４，２７２号；米国特許第５，８７４，０６４号；米国特許第５，８５５，９１３号；米国特許第５，２９０，５４０号；米国特許第４，８８０，０７８号；国際公開第９２／１９２４４号；国際公開第９７／３２５７２号；国際公開第９７／４４０１３号；国際公開第９８／３１３４６号；国際公開第９９／６６９０３を参照（これらはそれぞれ、参照により本出願に援用される）。
【０３０６】
本発明はまた、本発明の多価ＤＲ５結合分子を、この分子の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ内に包装することも提供する。一実施形態では、上記分子は、気密性コンテナ内の滅菌凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として供給され、例えば水又は食塩水を用いて、被験体への投与に適切な濃度へと再構成できる。好ましくは、本発明の多価ＤＲ５結合分子は、少なくとも５μｇ、より好ましくは少なくとも１０μｇ、少なくとも１５μｇ、少なくとも２５μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも１００μｇ又は少なくとも２００μｇの単位剤形で、気密性コンテナ内の滅菌凍結乾燥粉末として供給される。
【０３０７】
凍結乾燥された本発明の多価ＤＲ５結合分子は、その元々のコンテナ内において２〜８℃で保管するべきであり、またこの分子は、再構成後１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内又は１時間以内に投与するべきである。ある代替実施形態では、このような分子は、上記分子、融合タンパク質又はコンジュゲート分子の量及び濃度を示す気密性コンテナ内において、液体形態で供給される。好ましくは、液体形態で提供された場合のこのような多価ＤＲ５結合分子は、少なくとも１μｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも２．５μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ又は少なくとも１００μｇ／ｍｌの濃度でこの分子が存在する気密性コンテナ内に供給される。
【０３０８】
障害に関連する１つ又は複数の症状の治療、予防及び改善に効果的な本発明の組成物の量は、標準的な臨床技術によって決定できる。処方において採用するべき正確な用量は、投与経路及び状態の重篤度にも左右され、施術者の判断及び各患者の状況に従って決定するべきである。効果的な用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られた用量‐応答曲線から外挿できる。
【０３０９】
本発明が包含する多価ＤＲ５結合分子に関して、患者に投与される用量は好ましくは、レシピエント被験者の体重（ｋｇ）に基づいて決定される。投与される用量は典型的には、少なくとも約０．３ｎｇ／ｋｇ／日〜約０．９ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１ｎｇ／ｋｇ／日〜約３ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約３ｎｇ／ｋｇ／日〜約９ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１０ｎｇ／ｋｇ／日〜約３０ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約３０ｎｇ／ｋｇ／日〜約９０ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１００ｎｇ／ｋｇ／日〜約３００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約２００ｎｇ／ｋｇ／日〜約６００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約３００ｎｇ／ｋｇ／日〜約９００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約４００ｎｇ／ｋｇ／日〜約８００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約５００ｎｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約６００ｎｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約７００ｎｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約８００ｎｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約９００ｎｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｎｇ／ｋｇ／日、又は少なくとも約１，０００ｎｇ／ｋｇ／日である。この算出された用量は、ベースラインにおいて患者の体重に応じて投与される。ベースライン又は確立されたプラトー体重からの体重の有意な（≧１０％）変化により、用量を再計算しなければならない。
【０３１０】
別の実施形態では、患者は、上述のような予防的又は治療的有効量の本発明の多価ＤＲ５結合分子の１回又は複数回の用量を含む治療レジメンを投与され、この治療レジメンは、２日、３日、４日、５日、６日又は７日に亘って投与される。特定の実施形態では、治療レジメンは、予防的又は治療的有効量の本発明の多価ＤＲ５結合分子の用量を断続的に投与する（例えば所定の週の１日目、２日目、３日目及び４日目に投与し、同一の週の５日目、６日目及び７日目には、予防的又は治療的有効量の本発明が包含する多価ＤＲ５結合分子(並びに特に、ＤＲ５  ｍＡｂ  １及び／又はＤＲ５  ｍＡｂ  ２抗体及び／又はヒト化ＤＲ５  ｍＡｂ  １及び／又はヒト化ＤＲ５  ｍＡｂ  ２抗体のＣＤＲを含む、４価Ｆｃ領域含有ダイアボディ（特に、４価Ｅコイル／Ｋコイル‐Ｆｃ領域含有ダイアボディ））の用量を投与しない）ことを含む。特に包含されるのは、ＤＲ５  ｍＡｂ  １の３つのＣＤＲL及び３つのＣＤＲH；ＤＲ５  ｍＡｂ  ２の３つのＣＤＲL及び３つのＣＤＲH；並びに／又はｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２  ＶＬ‐３の３つのＣＤＲL及び３つのＣＤＲHの（同一週の５日目、６日目及び７日目における）投与である。典型的には、１、２、３、４、５つ又はそれを超える治療のコースが存在する。各コースは、同一のレジメン又は異なるレジメンであってよい。
【０３１１】
別の実施形態では、投与される用量は、上記多価ＤＲ５結合分子の１日の予防的又は治療的有効量に到達するまで、１つ又は複数のレジメンの最初の１／４、最初の半分又は最初の２／３若しくは３／４に亘って（例えば４コース治療の第１、第２又は第３のレジメンに亘って）漸増する。テーブル４は、典型的な治療コースに関する、上述の異なる投薬レジメンの５つの例を提供する。
【０３１２】
【表６】
0006602875.tif 000011
【０３１３】
本発明の多価ＤＲ５結合分子の投与の用量及び頻度は、例えば脂質化等の改質によって分子の取り込み及び組織貫通を増強することによって低減又は偏向できる。
【０３１４】
患者に投与される本発明の多価ＤＲ５結合分子の投薬量は、単一作用剤による治療としての使用のために計算してよい。あるいは、上記分子は他の治療用組成物と併用され、患者に投与される投薬量は、上記分子を単一作用剤による治療として使用する場合よりも小さくなる。
【０３１５】
本発明の医薬組成物は、治療が必要な領域に局所的に投与してよく、これは、以下に限定されるものではないが、例えば局所的点滴によって、注射によって、又はインプラントを用いて達成してよく、上記インプラントは多孔性、非多孔性又はゼラチン材料性であり、シラスティック膜等の膜又は繊維を含む。好ましくは、本発明の分子を投与する際、この分子が吸収されない材料を使用するよう注意しなければならない。
【０３１６】
本発明の組成物は、小嚢、特にリポソーム中で送達できる（Langer (1990) “New Methods Of Drug Delivery,” Science249:1527-1533); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp.353-365(1989); Lopez-Berestein,同上、pp.317-327参照）。
【０３１７】
本発明の組成物は、放出制御系又は徐放系中で送達できる。１つ又は複数の本発明の多価ＤＲ５結合分子を含む徐放性処方を製造するために、当業者に公知のいずれの技術を使用できる。例えば：米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開第９１／０５５４８号；国際公開第９６／２０６９８号；Ning et al.(1996) “Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,” Radiotherapy & Oncology39:179-189;Song et al.(1995) “Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397;Cleek et al.(1997) “Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854;及びLam et al. (1997) “Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760を参照（これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される）。一実施形態では、放出制御系においてポンプを使用してよい（Langer, supra; Sefton,(1987)“Implantable Pumps,” CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240;Buchwald et al.(1980)“Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis,” Surgery 88:507-516;及びSaudek et al.(1989)“A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery,” N. Engl. J. Med.321:574-579参照）。別の実施形態では、分子の放出制御を達成するためにポリマー材料を使用できる（例えばMedical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984);Levy et al.(1985)“Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate,” Science 228:190-192;During et al.(1989)“Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization,” Ann. Neurol. 25:351-356;Howard et al.(1989)“Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits,” J. Neurosurg. 7(1):105-112)；米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；国際公開第９９／１５１５４号；及び国際公開第９９／２０２５３号参照）。徐放性処方において使用されるポリマーの例としては、ポリ（2‐ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン‐コ‐酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物類、ポリ（Ｎ‐ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド類（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド‐コ‐グリコリド）類（ＰＬＧＡ）及びポリオルトエステル類が挙げられるが、これらに限定されない。放出制御系は、治療標的（例えば肺）の近傍に配置でき、従って全身用量の一部しか必要としない（例えばGoodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol.2, pp.115-138(1984)参照）。放出制御インプラントとして有用なポリマー組成物は、Dunn et al.に従って使用できる（米国特許第５，９４５，１５５号参照）。この特定の方法は、ポリマー系からの生物活性材料のインサイチュ放出制御の治療効果に基づく。埋入は一般に、治療的処置を必要とする患者の身体内のいずれの部位において実施できる。非ポリマー徐放系を使用でき、この場合、被験体の身体内の非ポリマーインプラントを、薬剤送達系として使用する。身体内への埋入後、インプラントの有機溶媒が組成物から周辺の組織液中へと放散、分散又は浸出し、非ポリマー材料は徐々に凝集又は沈殿して、固体の微小細孔性マトリクスを形成する（米国特許第５，８８８，５３３号参照）。
【０３１８】
放出制御系については、Langer(1990,“New Methods Of Drug Delivery,” Science249:1527-1533)による報告中で議論されている。１つ又は複数の本発明の治療剤を含む徐放性処方を製造するために、当業者に公知のいずれの技術を使用できる。例えば：米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開第９１／０５５４８号及び第９６／２０６９８号；Ning et al.(1996)“Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,” Radiotherapy & Oncology39:179-189;Song et al.(1995)“Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology50:372-397;Cleek et al.(1997)“Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854;並びにLam et al.(1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760参照（これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【０３１９】
本発明の組成物が、本発明の多価ＤＲ５結合分子をエンコードする核酸である場合、この核酸は、この核酸がエンコードする多価ＤＲ５結合分子の発現を促進するために、この核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築して、例えばレトロウイルスベクターの使用によって（米国特許第４，９８０，２８６号参照）、又は直接注射によって、又は微粒子衝撃（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用によって、又は脂質若しくは細胞表面受容体若しくは遺伝子導入剤を用いてコーティングすることによって、又は細胞核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドと連鎖させて上記核酸を投与すること（例えばJoliot et al.(1991)“Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis,” Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.)88:1864-1868を参照）等によって、上記核酸を投与することにより、インビボ投与できる。あるいは核酸を細胞内に導入して、相同遺伝子組み換えによる発現のためのホスト細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。
【０３２０】
治療的又は予防的有効量の本発明の多価ＤＲ５結合分子を用いた被験体の治療は、単回治療を含むことができ、又は好ましくは一連の複数回の治療を含むことができる。ある好ましい例では、被験体は、上述のようなダイアボディを用いて、約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間、更に好ましくは約４、５又は６週間に亘って週１回処置される。本発明の医薬組成物は、１日１回、１日２回又は１日３回投与できる。あるいはこの医薬組成物は、１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、１ヶ月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１年に２回又は１年に１回投与できる。治療に使用される上記分子の有効な用量設定は、特定の治療の期間に亘って増減させてよいことも理解されるだろう。
【実施例】
【０３２１】
ＸＩ．実施例
ここまで本発明を概説してきたが、以下の実施例を参照することにより、本発明は更に容易に理解されるだろう。これらの実施例は例示として提供されており、そうでないことが明記されていない限り本発明を制限することを意図したものではない。本開示の範囲から逸脱することなく、材料及び方法の両方に対して多数の修正を実施できることは、当業者には明らかであろう。
【０３２２】
Ａ．実施例１：抗ヒトＤＲ５モノクローナル抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２の特性決定
ヒトＤＲ５に免疫特異的に結合できるものとして２つのモノクローナル抗体を単離し、呼称「ＤＲ５  ｍＡｂ  １」及び「ＤＲ５  ｍＡｂ  ２」を与えた。上述のように、これらの抗体のＣＤＲは異なっていることが分かった。抗体が異なるＤＲ５エピトープに結合するかどうかを決定するために、ヒトＤＲ５‐Ｆｃ融合タンパク質を調製し、不動化された表面にコーティングした。ＤＲ５  ｍＡｂ  １（１μｇ／ｍＬ）をビオチン化し、対照ＩｇＧ又はＤＲ５  ｍＡｂ  ２（１０μｇ／ｍＬ）を用いてインキュベートし、ＩｇＧ又はＤＲ５  ｍＡｂ  ２抗体の、（ヒトＤＲ５‐Ｆｃ融合タンパク質との）結合に関してＤＲ５  ｍＡｂ  １と競合する能力を、不動化されたビオチン化抗体の量を測定することによって評価した。更に、ＩｇＧ又はＤＲ５  ｍＡｂ  １抗体の、結合に関してビオチン化ＤＲ５  ｍＡｂ  ２と競合する能力を評価した。この実験の結果をテーブル５に示す。
【０３２３】
【表７】
0006602875.tif 000012
【０３２４】
この実験の結果は、過剰量の非ビオチン化抗体が存在する場合であっても、ビオチン化抗体がＤＲ５タンパク質に結合できることを示す。従ってこの結果は、ＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２がＤＲ５の異なるエピトープに結合することを示す。
【０３２５】
ＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ  ｍＡｂ  ２抗体の更なる特性決定のために、ＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ  ｍＡｂ  ２抗体の、ＤＲ５とＴＲＡＩＬリガンドとの間の結合をブロックする能力を評価した。従って、ビオチン化ＤＲ５  ｍＡｂ  １、ビオチン化ＤＲ５  ｍＡｂ  ２又はビオチン化ＤＲ５‐Ｆｃ融合タンパク質（それぞれ２μｇ／ｍＬ）を、緩衝液又はヒスチジンタグ付与ＴＲＡＩＬ（２０μｇ／ｍＬ）の存在下で、不動化されたＤＲ５‐Ｆｃ融合タンパク質（１μｇ／ｍＬ）を用いて別個にインキュベートした。不動化されたビオチン化抗体の量を評価した。この実験の結果をテーブル６に示す。
【０３２６】
【表８】
0006602875.tif 000013
【０３２７】
結果は、不動化されたＤＲ５‐Ｆｃに結合するＤＲ５  ｍＡｂ  １又はＤＲ５  ｍＡｂ  ２の量が、ヒスチジンタグ付与ＴＲＡＩＬの存在によって影響されないことを示し、従ってＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２のいずれも、ＤＲ５のＴＲＡＩＬリガンド結合部位をブロックしないことを示す。更に、いずれの抗体も、ヒスチジンタグ付与ＴＲＡＩＬリガンドに結合できなかった。
【０３２８】
Ｂ．実施例２：抗ヒトＤＲ５モノクローナル抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２の種特異性
抗ヒトＤＲ５モノクローナル抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２の種特異性を評価するために、上記抗体の、ヒトＤＲ５に結合する能力を、上記抗体の、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＤＲ５に結合する能力と比較した。この実験の結果を図５に示す。結果は、これらの抗体がいずれもカニクイザルＤＲ５に結合できるものの、それぞれヒトＤＲ５に対してより高い結合親和性を示すことを示す。
【０３２９】
図６に示すように、Ｂｉａｃｏｒｅ分析を用いて結合キネティクスを調査した。二重特異性ＤＲ５×ＣＤ３ダイアボディを、Ｈｉｓ‐タグ付与ＤＲ５を用いてインキュベートし、Ｂｉａｃｏｒｅ分析によって結合キネティクスを決定した。採用したダイアボディは、ＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２（図６、パネルＡ及びＥ）、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２（図６、パネルＢ及びＦ）、ＤＲ５  ｍＡｂ  ３×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２（図６、パネルＣ及びＧ）、並びにＤＲ５  ｍＡｂ  ４×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２（図６、パネルＤ及びＨ）であった。図６、パネルＡ〜Ｄは、ヒトＤＲ５に関する結果を示す。図６、パネルＥ〜Ｈは、カニクイザルＤＲ５に関する結果を示す。算出されたｋａ、ｋｄ及びＫＤをテーブル７に示す。
【０３３０】
【表９】
0006602875.tif 000014
【０３３１】
結果は、ＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２が、基準抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ３及びＤＲ５  ｍＡｂ  ４に対して変化した結合キネティクスを示すことを実証している。
【０３３２】
Ｃ．実施例３：抗ヒトＤＲ５モノクローナル抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２の腫瘍細胞特異性
抗ヒトＤＲ５モノクローナル抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２の腫瘍細胞特異性を調査した。正常な組織を、ＤＲ５  ｍＡｂ  １又はアイソタイプ対照（５μｇ／ｍＬ）と接触させ、染色の程度を可視化した。図７Ａ、パネルＡ〜Ｌに示すように、ＤＲ５  ｍＡｂ  １及びアイソタイプ対照はいずれも、正常組織の細胞を標識しなかった。対照的にＤＲ５  ｍＡｂ  １は、結腸癌組織（図７Ｂ、パネルＡ）及び肺癌組織（図７Ｂ、パネルＢ）の細胞を強力に標識することが分かった。対照的に、アイソタイプ対照は、これらいずれの組織も標識しなかった（図７Ｂ、パネルＣ〜Ｄ）。従って、図７Ａ〜７Ｂに提示された結果は、ＤＲ５  ｍＡｂ  １が癌細胞に特異的に結合できたことを示す。
【０３３３】
同様に、正常な細胞をＤＲ５  ｍＡｂ  ２（５μｇ／ｍＬ）と接触させ、染色の程度を可視化した。図８Ａ、パネルＡ〜Ｆに示すように、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２は正常細胞の組織を標識しなかった。対照的にＤＲ５  ｍＡｂ  ２は、結腸癌組織（図８Ｂ、パネルＡ）及び肺癌組織（図８Ｂ、パネルＣ）の細胞を強力に標識することが分かった。対照的に、アイソタイプ対照は、これらいずれの組織も標識しなかった（図８Ｂ、パネルＢ及びＤ）。従って、図８Ａ〜８Ｂに提示された結果は、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２が癌細胞に特異的に結合できたことを示す。
【０３３４】
Ｄ．実施例４：ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２ダイアボディの腫瘍細胞傷害性
本発明のＤＲ５結合分子の、細胞傷害を仲介する能力を、標的腫瘍細胞及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の存在下で、エフェクタ：標的細胞比３０：１又は２０：１において二重特異性ＤＲ５×ＣＤ３ダイアボディ又は対照ダイアボディを２４時間インキュベートすることによって評価した。％細胞傷害は、損傷細胞による培地中への乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を測定することによって決定した。
【０３３５】
この調査のために、抗ヒトＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬ及びＶＨドメイン並びにＣＤ３  ｍＡｂ  ２のＶＬ及びＶＨドメインを有する、図１の構造を有する「ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２」と呼ばれる例示的な二重特異性ダイアボディを構成した（このダイアボディはＤＲ５及びＣＤ３に関して１価である）。上記ダイアボディは２つのポリペプチド鎖からなる。上記ダイアボディの第１のポリペプチド鎖は、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬドメインのアミノ酸配列に対応するアミノ酸残基１〜１０７（配列番号１３）、介在スペーサペプチド（リンカー１）に対応する残基１０８〜１１５（配列番号３３）、Ｄ６５Ｇ置換を有するＣＤ３  ｍＡｂ  ２のＶＨドメインのアミノ酸配列に対応する残基１１６〜２４０（配列番号１１２）、ASTKGリンカーに対応する残基２４１〜２４５（配列番号４７）、及びシステイン含有Ｅコイルドメインに対応する残基２４６〜２７３（配列番号４１）を含む。
【０３３６】
ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２ダイアボディの第２のポリペプチド鎖は、ＣＤ３  ｍＡｂ  ２のＶＬドメインのアミノ酸配列に対応するアミノ酸残基１〜１１０（配列番号１０４）、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）に対応する残基１１１〜１１８（配列番号３３）、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２  のＶＨドメインのアミノ酸配列に対応する残基１１９〜２３７（配列番号１８）、ASTKGリンカーに対応する残基２３８〜２４２（配列番号４７）、及びシステイン含有Ｋコイルドメインに対応する残基２４３〜２７０（配列番号４２）を含む。
【０３３７】
採用した対照ダイアボディは、抗フルオレセイン抗体４‐４‐２０のＶＬ及びＶＨドメイン（それぞれ配列番号１１４及び１１５）、並びにＣＤ３  ｍＡｂ  ２０のＶＬ及びＶＨドメイン（それぞれ配列番号１０２及び１０８）を含有し、抗フルオレセイン×抗ＣＤ３対照ダイアボディ「４‐４‐２０×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２」と呼ばれる。上記ダイアボディは、２つのポリペプチド鎖からなっていた。上記ダイアボディの第１のポリペプチド鎖は、抗フルオレセイン抗体４‐４‐２０のＶＬドメインに対応するアミノ酸残基１〜１１２（配列番号１１４）、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）に対応する残基１１３〜１２０（配列番号３３）、ＣＤ３  ｍＡｂ  ２のＶＨドメインに対応する残基１２１〜２４５（配列番号１０８）、システイン含有介在スペーサペプチド（GGCGGG）に対応する残基２４６〜２５１（配列番号３４）、及びＥコイルドメインに対応する残基２５２〜２８０（配列番号３９）を含む。
【０３３８】
４‐４‐２０×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２ダイアボディの第２のポリペプチド鎖は、ＣＤ３  ｍＡｂ  ２のＶＬドメインに対応するアミノ酸残基１〜１１０（配列番号１１４）、介在スペーサペプチドGGGSGGGG（リンカー１）に対応する残基１１１〜１１８（配列番号３３）、抗フルオレセイン抗体４‐４‐２０のＶＨドメインに対応する残基１１９〜２３６（配列番号１１５）、システイン含有介在スペーサペプチド（GGCGGG）に対応する残基２３７〜２４２（配列番号３４）、及びＫコイルドメインに対応する残基２４３〜２７０（配列番号４０）を含む。
【０３３９】
この調査の結果を図９Ａ〜９Ｋに示す。採用した標的腫瘍細胞は：７８６Ｏ腎細胞腺癌細胞（図９Ａ）、Ａ４９８腎癌細胞（図９Ｂ）、ＡｓＰＣ１膵臓腺癌細胞（図９Ｃ）、ＬＮＣａｐアンドロゲン感受性ヒト前立腺腺癌細胞（図９Ｄ）、ＳＷ４８結腸直腸腺癌細胞（図９Ｅ）、Ａ５４９腺癌ヒト肺胞底皮細胞（図９Ｆ）、ＳＫＭＥＳヒト肺癌細胞（図９Ｇ）、ＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞（図９Ｈ）、Ａ３７５ヒト悪性黒色腫細胞（図９Ｉ）、ＳＫＢＲ３ヒトＨＥＲ２過剰発現乳癌細胞（図９Ｊ）及びＪＩＭＴヒト乳癌細胞（図９Ｋ）であった。結果は、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２ダイアボディが、癌細胞への強力な細胞傷害性攻撃を仲介できることを示す。
【０３４０】
Ｅ．実施例５：ＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２の予想外の優位性
本発明のＤＲ５結合分子ＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２の、細胞傷害を仲介する能力を、基準抗ＤＲ５抗体：ＤＲ５  ｍＡｂ  ３及びＤＲ５  ｍＡｂ  ４のものと比較した。このような比較を行うために、本質的に上述したように、これらの抗ヒトＤＲ５抗体のＶＬ及びＶＨドメイン並びにＣＤ３  ｍＡｂ  ２のＶＬ及びＶＨドメインを含有する、図１の構造を有する二重特異性  ＤＲ５×ＣＤ３  ダイアボディを調製した。調製された第１及び第２のダイアボディは「ＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２」；「ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２」；「ＤＲ５  ｍＡｂ  ３×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２」；及び「ＤＲ５  ｍＡｂ  ４×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２」と呼ばれる。
【０３４１】
標的腫瘍細胞を、これらのダイアボディのうちの１つ、又は対照ダイアボディ（４‐４‐２０×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２）を用いて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び標的腫瘍細胞の存在下で、エフェクタ：標的細胞比２０：１において２４時間インキュベートした。％細胞傷害を、損傷細胞による培地中への乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を測定することによって決定した。
【０３４２】
この調査の結果を図１０Ａ〜１０Ｆに示す。採用した標的腫瘍細胞は：Ａ５４９腺癌ヒト肺胞底皮細胞（図１０Ａ）、ＳＫＭＥＳヒト肺癌細胞（図１０Ｂ）、ＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞（図１０Ｃ）、Ａ３７５ヒト悪性黒色腫細胞（図１０Ｄ）、ＳＫＢＲ３ヒトＨＥＲ２過剰発現乳癌細胞（図１０Ｅ）及びＪＩＭＴヒト乳癌細胞（図１０Ｆ）であった。結果は、ＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬ及びＶＨドメインが、細胞傷害の誘発において、基準ＤＲ５  ｍＡｂよりも有意かつ予想外に強力であることを示す。
【０３４３】
Ｆ．実施例６：ＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２の二重かつ同時結合
本発明のＤＲ５×ＣＤ３ダイアボディの、ＤＲ５及びＣＤ３に同時に結合する能力を実証するために、可溶性ヒトＤＲ５（ヒスチジンでタグ付けされている）を支持体表面にコーティングした。次に上記支持体を、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２ダイアボディ、又はそのヒト化誘導体：ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２（２．２）×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２（２．３）×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２（２．４）×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２若しくはｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２（２．５）×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２のうちの１つを用いてインキュベートした。その後、ビオチンとコンジュゲートしたＣＤ３を提供し、上記支持体に対して不動化したＣＤ３の量を測定した。
【０３４４】
この実験の結果を図１１に示す。全てのダイアボディは、ＤＲ５及びＣＤ３の両方に同時に結合できることが分かった。
【０３４５】
Ｇ．実施例７：ＤＲ５  ｍＡｂ  ２のヒト化誘導体の細胞傷害性
本発明のヒト化ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＣＤ３ダイアボディの、細胞傷害を仲介する能力を実証するために、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２ダイアボディ、又はそのヒト化誘導体：ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２（２．２）×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２（２．３）×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２、ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２（２．４）×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２若しくはｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２（２．５）×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２のうちの１つを、ｐａｎ  Ｔ細胞と、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）レポータ遺伝子を発現するよう操作された標的Ｃｏｌｏ２０５結腸直腸癌細胞（Ｃｏｌｏ２０５‐Ｌｕｃ細胞）とを用いて、２４時間インキュベートした（エフェクタ：標的細胞比１０：１）。細胞傷害性を、細胞溶解時のルシフェラーゼの放出によって引き起こされるルミネセンスの増加によって測定した。
【０３４６】
この調査の結果を図１２に示す。各上記ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＣＤ３ダイアボディは、結腸直腸癌細胞の細胞傷害性を仲介できることが分かった。
【０３４７】
Ｈ．実施例８：単独の、架橋された、又は組み合わせられた、ＤＲ５  ｍＡｂの細胞傷害性
本発明のＤＲ５結合分子ＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２の細胞傷害性を、非放射性細胞増殖アッセイを用いて、多数の細胞株において試験した。単独の、架橋された、又は組み合わせられた、ＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２の活性を試験した。
【０３４８】
ＡＴＣＣから入手した細胞株を、標準的な組織培養条件下で培養した。各細胞株を、（９６ウェルプレートで）〜２×１０4細胞／ウェルで播種し、１０％ＦＢＳを補充したＦ１２／ＤＭＥＭ培地で一晩インキュベートした。（３個ずつ作製した）個々のウェルを、０若しくは１μｇ／ｍｌのＤＲ５  ｍＡｂ  １又はＤＲ５  ｍＡｂ  ２±ＤＲ５  ｍＡｂを架橋するためにＤＲ５抗体の１時間後に添加した１０μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ抗体（「αｍＦｃ」と呼ばれる）を用いて、又は各１μｍｌのＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２（合計２μｇ／ｍｌの抗ＤＲ５抗体）を用いて、処置し、２日間インキュベートした。細胞生存率を、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｎｏｎ‐Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  （Ｃａｔ＃Ｇ５４３０）を基本的に製造元の説明書に記載されている通りに使用して、ＭＴＳの細胞内減少によって産生される可溶性ホルマザンの量（これは培養物中の生存細胞の個数の指標である）をアッセイすることにより、決定した。簡潔に言うと、ＭＴＳ／ＰＭＳ試薬をウェルに添加し、（６５０ｎｍを基準とした）４９０ｎｍにおける吸光度をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＴｈｅｒｍｏＭａｘマイクロプレートリーダで読み取った。
【０３４９】
試験物品で処置した細胞の細胞生存率を、「％培地対照」を与えるために１００％に設定された陰性対照（培地のみ）に対して正規化する。％阻害＝１００％‐％培地対照であり、これはテーブル８において提供され、大きな値ほど、試験物品の細胞傷害性を反映して成長の阻害が大きいことを示している。同様の研究を、〜１０‐3ｎＭから〜１０2ｎＭの抗ＤＲ５  ｍＡｂ濃度に亘って実施した。本発明の抗体に対して感受性を有する細胞株の代表であるＣＯＬＯ２０５細胞に関するデータが、図１３において提供されている。
【０３５０】
結果は、ＤＲ５  ｍＡｂ  １もＤＲ５  ｍＡｂ  ２も、単独では、検査した細胞株のいずれの細胞成長を阻害できないことを示しており、これはいずれの抗体も単独ではアゴニストでないことを示唆している。しかしながら、ＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２はそれぞれ、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ抗体で架橋した場合には、多数の細胞株において強力な細胞傷害性を示した。特にＣＯＬＯ２０５、ＳＷ４８、ＳＷ９４８、Ａ４９８及びＳＫＭＥＳ細胞株の成長は、本発明の架橋ＤＲ５  ｍＡｂで処置した場合に劇的に低下した。
【０３５１】
驚くべきことに、ＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２の組み合わせもまた、架橋の不在下においていくつかの細胞株（例えばＣＯＬＯ２０５及びＳＷ９４８）の成長を有意に阻害することが観察された。よって、ＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２の組み合わせは、各抗体単独では観察されなかったアゴニスト活性を示す。これらのデータは、抗ＤＲ５抗体の組み合わせを用いて、単一の抗体が無効である治療環境においてＤＲ５を刺激できることを示している。
【０３５２】
【表１０】
0006602875.tif 000015
【０３５３】
Ｉ．実施例９：ＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２の細胞傷害はアポトーシスである
ＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２の細胞傷害機序を調査した。具体的には、アポトーシスの３つの異なる測定：（ｉ）ヌクレオソーム富化、（ｉｉ）ＰＡＲＰ切断、及び（ｉｉｉ）活性カスパーゼ３を、ＤＲ５  ｍＡｂ  １若しくはＤＲ５  ｍＡｂ  ２を単独で又は上記ＤＲ５  ｍＡｂを架橋させるためのαｍＦｃの存在下で用いて処置したＣＯＬＯ２０５細胞に対して採用した。
【０３５４】
全てのアッセイに関して、ＣＯＬＯ２０５細胞を（９６ウェルプレートで）〜１０4細胞／ウェルで播種し、１０％ＦＢＳを補充したＦ１２／ＤＭＥＭ培地で一晩インキュベートした。（３個ずつ作製した）個々のウェルを、０若しくは１μｇ／ｍｌのＤＲ５  ｍＡｂ  １又はＤＲ５  ｍＡｂ  ２±（ＤＲ５抗体の１時間後に添加した）１０μｇ／ｍｌのαｍＦｃを用いて処置し、４時間インキュベートした。
【０３５５】
ヌクレオソーム富化（図１４Ａ）を、Ｒｏｃｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡPLUSアッセイ（Ｃａｔ＃１７７４４２５）を基本的に製造元の説明書に記載されている通りに使用してアッセイし、決定した。簡潔に言うと、インキュベーション後、細胞を溶解バッファ中で溶解させ、透明化した。透明化した溶解物を、ストレプトアビジンコーティングＥＬＩＳＡプレートの抗ヒストン‐ビオチン／抗ＤＮＡ‐ＰＯＤ抗体カクテルでインキュベートし、続いて上記プレートを洗浄し、ＡＢＴＳ試薬を添加して、（４９０ｎｍを基準とした）４０５ｎｍにおける吸光度をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＴｈｅｒｍｏＭａｘマイクロプレートリーダで読み取った。「富化係数＝試料（死滅する／死滅した細胞）のｍＵ／対応する陰性対照（抗体処置されていない細胞）のｍＵ」という式を用いて算出された富化係数（細胞質中へ放出されたヌクレオソームの尺度）（ここでｍＵ＝吸光度［１０‐3］である）が、図１４Ａにプロットされている。
【０３５６】
ＰＡＲＰ切断及び活性カスパーゼ３（それぞれ図１４Ｂ及び１４Ｃ）を、ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ  ＭＡＰ  Ｈｕｍａｎ  Ｌａｔｅ  Ａｐｏｔｏｓｉｓ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄ  ３‐Ｐｌｅｘ  Ｋｉｔ‐Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ａｓｓａｙ（Ｃａｔ．＃４８‐６７０）を基本的に製造元の説明書に記載されている通りに使用してアッセイし、決定した。簡潔に言うと、インキュベーション後、細胞を溶解バッファ中で溶解させ、透明化した。透明化した溶解物を、基準ビーズコンジュゲート１次抗体を用いてインキュベートした後洗浄し、また各ビオチン化２次抗体を用いてインキュベートした。次にプレートを、ストレプトアビジン‐ＰＥ（ＳＡＰＥ）でインキュベートした後洗浄し、アッセイバッファを各ウェルに添加し、プレートを、ＸＹプラットフォームのＬｕｍｉｎｅｘ  ＬＸ‐１００システムにおいて読み取った。結果が図１４Ｂ（切断されたＰＡＲＰ）及び図１４Ｃ（活性カスパーゼ３）にプロットされている。
【０３５７】
アポトーシスの３つの指標全てが、架橋ＤＲ５  ｍＡｂ  １又はＤＲ５  ｍＡｂ  ２で処置した細胞培養物において上昇し、これは、観察された細胞傷害がアポトーシスの結果であることを実証している。
【０３５８】
Ｊ．実施例１０：４価ＤＲ５結合分子
ＤＲ５結合分子に対する価数の影響を検査するために、ＤＲ５に関して４価の分子を生成する。この例では、Ｅコイル／Ｋコイル‐Ｆｃ領域含有ダイアボディを調製する。これらのＥコイル／Ｋコイル‐Ｆｃ領域含有ダイアボディのうちのいくつかは、以下の実施例において特性決定される。各多価ＤＲ５結合分子は、２ペアのポリペプチド鎖からなる。
【０３５９】
第１のポリペプチド鎖は、（ＥＵ番号付与で２３１から始まる）一般配列：［ＶＬ１ドメイン］-［GGGSGGGG］-［ＶＨ２ドメイン］-［ASTKG］-［EVAACEK（EVAALEK）3］-［LEPKSS］-［DKTHTCPPCP］-Ｆｃ領域（野生型又はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ二重突然変異型）を有し、ここでＶＬ１は抗ＤＲ５抗体由来であり、［GGGSGGGG］は配列番号３３であり、ＶＨ２は抗ＤＲ５抗体由来であり、［ASTKG］は配列番号４７であり、［EVAACEK（EVAALEK）3］は配列番号４１であり、［LEPKSS］は配列番号４９であり、［DKTHTCPPCP］は配列番号４８であり、Ｆｃ領域は、配列番号１（野生型）又は配列番号１０２（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｌ突然変異型）であり、及び任意にＣ末端アミノ酸残基を含まない。
【０３６０】
第２のポリペプチド鎖は：［ＶＬ２ドメイン］-［GGGSGGGG］-［ＶＨ１ドメイン］-［ASTKG］-［KVAACKE（KVAALKE）3］を有し、ここでＶＬ２は抗ＤＲ５抗体由来であり、［GGGSGGGG］は配列番号３３であり、ＶＨ１は抗ＤＲ５抗体由来であり、［ASTKG］は配列番号４７であり、［KVAACKE（KVAALKE）3］は配列番号４２である。
【０３６１】
上記鎖は、図４Ｂに示すように会合する。上記第１のポリペプチド鎖のＶＬ１ドメインは、上記第２のポリペプチド鎖のＶＨ１ドメインと相互作用して、ＤＲ５に対して特異的である第１の機能性抗原結合部位を形成する。同様に、上記第２のポリペプチド鎖のＶＬ２ドメインは、上記第１のポリペプチド鎖のＶＨ２ドメインと相互作用して、これもまたＤＲ５に対して特異的である第２の機能性抗原結合部位を形成する。従って、第１及び第２のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインの選択は、上記ダイアボディの上記２つのポリペプチド鎖が合わせて、ＤＲ５の少なくとも１つのエピトープに結合できるＶＬ及びＶＨドメインを含むように、協調される。全ての同一のＶＬ及びＶＨドメインを有する（例えば全てのＶＬ及びＶＨドメインがＤＲ５  ｍＡｂ  １由来であるか又はＤＲ５  ｍＡｂ  ２由来である）分子は、単一特異性であり（即ちＤＲ５の単一のエピトープに結合し）、またＤＲ５に関して４価である。ＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬ及びＶＨドメインを有する分子は二重特異性である（即ちＤＲ５の２つの異なるエピトープに結合する）が、これもまたＤＲ５に関して４価である。ＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬ及びＶＨドメインを有する分子は二重特異性である（即ちＤＲ５の２つの異なるエピトープに結合する）が、ＤＲ５に関して依然として４価である。ＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２のＶＬ及びＶＨドメインを含む例示的なＥコイル／Ｋコイル‐Ｆｃ領域含有ダイアボディを提供する。しかしながら、ＤＲ５に関して４価であるＥコイル／Ｋコイル‐Ｆｃ領域含有ダイアボディは、いずれのＤＲ５抗体のＶＬ及びＶＨドメインを用いて調製できることは理解されるだろう。同様に、本明細書に開示されている１つ又は複数の抗ＤＲ５抗体のＶＬ及びＶＨドメインを含む、上で開示されているような代替的な構成物を調製してよい。
【０３６２】
各Ｅコイル／Ｋコイル‐Ｆｃ領域含有ダイアボディに関して、第１及び第２の鎖のＶＬ、ＶＨ及びＦｃ領域並びに複数の配列番号（ポリペプチド）が、テーブル９にまとめられている。会合した分子の一意の指定子も提供する。ポリペプチド鎖に関する完全な配列、及び上記ポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドも、上で提供されている。テーブル９において提供されている分子のうちのいくつかは二重特異性である、即ちこれらは２つの異なるＤＲ５エピトープに結合するが、これらは全て、ＤＲ５に対して４価である。
【０３６３】
【表１１】
0006602875.tif 000016
0006602875.tif 000017
0006602875.tif 000018
【０３６４】
Ｋ．実施例１１：ＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２を含有する二重特異性４価ＤＲ５結合分子の腫瘍細胞特異性
各二重特異性４価ＤＲ５結合分子（ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディ）の腫瘍細胞特異性を調査した。正常な組織を、０．６２５μｇ／ｍＬの標識ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディ、又は標識対照ダイアボディ（４‐４‐２０×ＣＤ３  ｍＡｂ  ２、実施例４に記載）と接触させ、染色の程度を可視化した。図１５Ａ〜Ｂに示すように、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディ及び対照ダイアボディはいずれも、正常な組織の細胞の標識に失敗した。同様の結果が、図１５Ｂに示す肝臓を含む正常な組織の追加の試料において、観察された。対照的に、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディは、乳癌組織（図１６、パネルＡ）、結腸癌組織（図１６、パネルＢ）、肺癌組織（図１６、パネルＣ）及び前立腺癌組織（図１６、パネルＤ）の細胞を強力に標識することが分かった。対照的に、対照ダイアボディは、いずれの組織の標識にも失敗した（図１６、パネルＥ‐Ｈ）。組織学的観察の概要を、テーブル１０において提供する。従って、図１５Ａ〜１５Ｂ、１６及びテーブル１０の結果は、（ＤＲ５の２つのエピトープに関して二重特異性である）４価ＤＲ５結合分子が癌細胞に特異的に結合できることを示す。
【０３６５】
【表１２】
0006602875.tif 000019
【０３６６】
Ｌ．実施例１２  ４価ＤＲ５結合分子の細胞傷害性
本発明の４価ＤＲ５結合分子の細胞傷害性を調査した。２つの例示的な二重特異性４価Ｅコイル／Ｋコイル‐Ｆｃ領域含有ダイアボディ（ＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディ；及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディ）、並びに４つの例示的な単一特異性４価Ｅコイル／Ｋコイル‐Ｆｃ領域含有ダイアボディ（ＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディ；ＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディ（ＡＡ）；ＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディ；及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディ（ＡＡ）、ここで「ＡＡ」はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異型を表す）の、多数の細胞株に対する活性を、架橋抗体を試験試料のいずれにも添加しないことを除いては基本的に上述のような非放射性細胞増殖アッセイを用いて、検査した。Ｈｉｓ‐タグ付け済みＴＲＡＩＬ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を陽性対照として使用した。
【０３６７】
試験物品で処置した細胞の細胞生存率を、「％培地対照」を与えるために１００％に設定された陰性対照（培地のみ）に対して正規化する。％阻害＝１００％‐％培地対照であり、これはテーブル１１において提供され、大きな値ほど、試験物品の細胞傷害性を反映して成長の阻害が大きいことを示している。同様の研究を、〜１０‐3ｎＭ〜〜１０2ｎＭの抗ＤＲ５  ｍＡｂ濃度に亘って実施した。図１７は、複数の応答性細胞株、ＣＯＬＯ２０５（図１７Ａ）、Ａ４９８（図１７Ｂ）及びＳＫＭＥＳ（図１７Ｃ）に関するデータを示す。
【０３６８】
【表１３】
0006602875.tif 000020
【０３６９】
結果は、全ての４価ＤＲ５結合分子が多数の細胞株において強力な細胞傷害性を有することを示す。実際、全ての４価ＤＲ５結合分子は、ＴＲＡＩＬ自体よりも強力であった。特に、ＣＯＬＯ２０５、ＳＷ４８、ＳＷ９４８、Ａ４９８、ＣａＫｉ２及びＳＫＭＥＳの成長は、本発明の４価ＤＲ５結合分子で処置した場合に劇的に低下した。Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５ＡＦｃ領域を有する４価ＤＲ５結合分子は、野生型Ｆｃ領域を有する対応する分子と同様の、又は上記分子より若干高い、細胞傷害性を示し、これは、ＦｃγＲへの結合及びエフェクタ機能が不要である及び／又は望ましくない場合に、ＦｃγＲへの結合が低下した、及び／又はエフェクタ機能が低下したＦｃ領域を４価ＤＲ５結合分子に組み込むことができることを示している。
【０３７０】
Ｍ．実施例１３：４価ＤＲ５結合分子は、アポトーシスを誘発する
本発明の４価ＤＲ５結合分子の、アポトーシスを誘発する能力を調査した。２つの例示的な二重特異性４価Ｅコイル／Ｋコイル‐Ｆｃ領域含有ダイアボディ（ＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディ；及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディ）、並びに２つの例示的な単一特異性４価Ｅコイル／Ｋコイル‐Ｆｃ領域含有ダイアボディ（ＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディ；及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディ）の活性を、ＣＯＬＯ２０５、Ａ４９６、ＳＫＭＥＳ、ＬＮＣａｐ、ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１及びＨｓ７００Ｔ細胞株において検査した。この調査は、架橋抗体を試験試料のいずれにも添加しないことを除いては基本的に上述のようなヌクレオソーム富化アッセイを用いて、実施した。Ｈｉｓ‐タグ付け済みＴＲＡＩＬ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を陽性対照として使用した。（上述のように算出した）富化係数を図１８にプロットする。
【０３７１】
結果は、全ての４価ＤＲ５結合分子がアポトーシスの強力な誘発因子であることを示している。実際、全ての４価ＤＲ５結合分子は、同一の細胞株において陽性対照に関して観察されるものと同様の富化係数を有していた。 
【０３７２】
Ｎ．実施例１４：４価ＤＲ５結合分子の細胞傷害性
本発明の多価ＤＲ５結合分子の細胞傷害性を、細胞増殖アッセイにおいて既に報告されている抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ８（ＫＭＴＲ２）及びＤＲ５  ｍＡｂ  ４（コナツムマブ）の細胞傷害性と比較した。１つの例示的な二重特異性４価Ｅコイル／Ｋコイル‐Ｆｃ領域含有ダイアボディ（ＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディ（ＡＡ））；２つの例示的な単一特異性４価Ｅコイル／Ｋコイル‐Ｆｃ領域含有ダイアボディ（ＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディ（ＡＡ）；及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディ（ＡＡ））；抗ＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ８（ＡＡ）（ＫＭＴＲ２）；並びに架橋した及び架橋していない抗ＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ４（ＡＡ）（コナツムマブ）（ここで「ＡＡ」はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異型を表す）のＣＯＬＯ２０５に対する活性を、架橋抗体をＤＲ５  ｍＡｂ  ４の１つの試験試料のみに添加したことを除いては基本的に上述のような非放射性細胞増殖アッセイを用いて、およそ１０‐3ｎＭ〜およそ１０2ｎＭの濃度範囲に亘って検査した。Ｈｉｓ‐タグ付け済みＴＲＡＩＬ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を陽性対照として使用した。
【０３７３】
試験物品で処置した細胞の細胞生存率を、「％培地対照」を与えるために１００％に設定された陰性対照（培地のみ）に対して正規化する。％阻害＝１００％‐％培地対照を図１９においてプロットする。
【０３７４】
結果は、試験した全ての４価ＤＲ５結合分子が、架橋とは無関係な、上述の抗ＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ８（ＫＭＴＲ２）；及びＤＲ５  ｍＡｂ  ４（コナツムマブ）を上回る強力な細胞傷害性を有することを示す。特に上記４価ＤＲ５結合分子は、架橋ＤＲ５  ｍＡｂ  ４さえも有意に上回るほど強力であった。
【０３７５】
Ｏ．実施例１５：癌幹細胞様（ＣＳＣＬ）細胞に対する４価ＤＲ５結合分子の細胞傷害性
本発明の多価ＤＲ５結合分子の、癌幹細胞様（ＣＳＣＬ）細胞に対する細胞傷害性を調査した。ＲＥＣＡ０２０１は、中程度に分化した直腸腺癌（突然変異したＡＰＣ及びＫＲＡＳ；ＣＤ４４ｈｉ、ＣＤ１３３＋及びＡ３３＋）から単離されたＣＳＣＬ細胞である。ＲＥＣＡ０２０１細胞は腫瘍形成性であり、インビボでの腫瘍形態及び多系統分化、又はインビトロでのオルガノイド形成を再現できる。
【０３７６】
１つの例示的な二重特異性４価Ｅコイル／Ｋコイル‐Ｆｃ領域含有ダイアボディ（ＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディ（ＡＡ））；２つの例示的な単一特異性４価Ｅコイル／Ｋコイル‐Ｆｃ領域含有ダイアボディ（ＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディ（ＡＡ）；及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディ（ＡＡ））；２つの抗ＤＲ５抗体（ＤＲ５  ｍＡｂ  ８（ＡＡ）（ＫＭＴＲ２）；及びＤＲ５  ｍＡｂ  ４（ＡＡ）（コナツムマブ））（ここで「ＡＡ」はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異型を表す）のＲＥＣＡ０２０１に対する細胞傷害活性を、非放射性細胞傷害性アッセイを用いて、ある範囲の濃度に亘って検査した。簡潔に言うと、恒常的に発現されたルシフェラーゼで安定して形質移入されているＲＥＣＡ０２０１結腸癌ＣＳＣＬ細胞を１ウェルあたり２００００細胞だけ播種し、指示された濃度の試験物品に曝露する。４８時間後、細胞生存率のレベルを、基本的に製造元の記載通りにＶｉｃｔｏｒ  Ｐｌａｔｅリーダに対してＰｒｏｍｅｇａ  ＳＴＥＡＤＹ  ＧＬＯ（登録商標）基質試薬を用いたルシフェラーゼの測定によって、決定する。結果を図２０にプロットする。
【０３７７】
図２０に示すように、４価ＤＲ５結合分子は、ＣＳＣＬ  ＲＥＣＡ０２０１細胞に対する強力な細胞傷害性を示した。実際、結果は、全ての４価ＤＲ５結合分子が、上述の抗ＤＲ５抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  ８（ＫＭＴＲ２）；及びＤＲ５  ｍＡｂ  ４（コナツムマブ）より強力であり、かつＴＲＡＩＬ自体より強力であることを示している。
【０３７８】
Ｐ．実施例１６：ＣＯＬＯ２０５腫瘍細胞を移植されたマウスにおける、４価ＤＲ５結合分子による腫瘍成長の阻害
ある例示的な単一特異性４価Ｅコイル／Ｋコイル‐Ｆｃ領域含有ダイアボディ（ＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディ（ＡＡ））；並びに２つの抗ＤＲ５抗体（ＤＲ５  ｍＡｂ  ８（ＡＡ）（ＫＭＴＲ２）、及びＤＲ５  ｍＡｂ  ４（ＡＡ）（コナツムマブ））（ここで「ＡＡ」はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異型を表す）の抗腫瘍活性を、異種移植腫瘍モデルにおいて評価した。簡潔に言うと、０日目、メスのｈＣＤ１６Ａ  ＦＯＸ  Ｎ１マウス（ｎ＝７／群）に、マトリゲルと１：１で混合した２００μＬのＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地中に懸濁された５００００００個のＣＯＬＯ２０５細胞を皮下（ＳＣ）移植した。カリパスを用いて３〜４日毎に腫瘍を測定した。研究３日目、腫瘍サイズに基づいてマウスをランダム化し、１週間に２回、指示された用量レベルの試験物品又はビヒクル（０．５％のウシ血清アルブミンを含有する無菌生理食塩水）で処置（静脈注射）した。腫瘍の体積を研究の経過全体に亘って監視し、図２１に、群の平均±ＳＥＭとしてプロットした。４価ＤＲ５結合分子は、上記研究の経過全体に亘って腫瘍成長を劇的に阻害することが観察され、また腫瘍は、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇ治療群において退行することが観察された。
【０３７９】
Ｑ．ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、４価ＤＲ５結合分子と相乗効果を示す
ボリノスタット等のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤は、ＤＲ５によって誘発されたアポトーシスに対して腫瘍細胞を感作することが報告されている。ＨＤＡＣ阻害剤ボリノスタットと組み合わせたＤＲ５  ｍＡｂ  １、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２、及び複数の４価ＤＲ５結合分子の細胞傷害活性を、非放射性細胞増殖アッセイを用いて調査した。
【０３８０】
ＤＲ５  ｍＡｂ  １、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２、２つの例示的な二重特異性４価Ｅコイル／Ｋコイル‐Ｆｃ領域含有ダイアボディ（ＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディ；及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディ）、並びに２つの例示的な単一特異性４価Ｅコイル／Ｋコイル‐Ｆｃ領域含有ダイアボディ（ＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディ；及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディ）の活性を、これらの研究において検査した。Ｈｉｓ‐タグ付け済みＴＲＡＩＬ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を陽性対照として使用した。
【０３８１】
第１の研究のために、ＣＯＬＯ２０５細胞を（９６ウェルプレートに）〜２×１０４細胞／ウェルで播種し、１０％ＦＢＳを補充したＦ１２／ＤＭＥＭ培地で一晩インキュベートした。（３個ずつ作製した）個々のウェルを、０若しくは１μｇ／ｍｌのＤＲ５  ｍＡｂ  １若しくはＤＲ５  ｍＡｂ  ２、１０ｎｇ／ｍｌの４価ＤＲ５結合分子（上述の細胞傷害性研究における使用より１００倍少ない）、又はＨｉｓ‐タグ付け済みＴＲＡＩＬ±０．１又は１μＭのボリノスタットを用いて処置し、１日インキュベートした。細胞生存率を、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ‐ＧＬＯ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｃａｔ＃Ｇ５４３０）を基本的に製造元の説明書に記載されている通りに使用して、存在するＡＴＰの量（これは培養物中の生存細胞の個数の指標である）をアッセイすることにより、決定した。簡潔に言うと、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ‐ＧＬＯ（登録商標）試薬をウェルに添加し、２分間混合して細胞溶解を誘発し、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒでルミネセンスを読み取った。
【０３８２】
試験物品で処置した細胞の細胞生存率を、１００％に設定された対応する陰性対照（培地±ボリノスタット）に対して正規化し、各試験作用剤単独に対する％対照、又は各試験作用剤とボリノスタットとの組み合わせに対する％対照として、テーブル１２において報告する。１００％未満の％対照値は、生存率の低下を示し、試験物品単独又はボリノスタットとの組み合わせの細胞傷害性を反映している。
【０３８３】
【表１４】
0006602875.tif 000021
【０３８４】
正味の増分（平均％成長阻害）＝％培地対照（１０％ＦＢＳ）‐％培地対照（１／１０μＭボリノスタット）であり、これは、ボリノスタットと組み合わせた試験物品の、ボリノスタット単独で処置した細胞に対する細胞傷害性の増大を表す。第１の研究に関する正味の増分を、テーブル１３に提供する。
【０３８５】
【表１５】
0006602875.tif 000022
【０３８６】
結果は、ＨＤＡＣ阻害剤が低用量４価ＤＲ５結合分子と相乗効果を示し、４価ＤＲ５結合分子に対して感受性である細胞における上記４価ＤＲ５結合分子の細胞傷害性を増強することを示す。しかしながら、ボリノスタットは、非架橋抗体ＤＲ５  ｍＡｂ  １及びＤＲ５  ｍＡｂ  ２とは相乗効果を示さなかった。
【０３８７】
第２の研究のために、ボリノスタットと組み合わせたＤＲ５  ｍＡｂ  １、ＤＲ５  ｍＡｂ  ２及び複数の４価ＤＲ５結合分子を、多価ＤＲ５結合分子に対して非感受性であることを上に示したいくつかのものを含む多数の細胞株に対して試験した。アッセイは、０又は１μｇ／ｍｌのＤＲ５  ｍＡｂ  １若しくはＤＲ５  ｍＡｂ  ２、又は４価ＤＲ５結合分子、又はＨｉｓ‐タグ付け済みＴＲＡＩＬ±１若しくは１０μＭボリノスタットで細胞を処置したことを除いて基本的に上述のように実施した。
【０３８８】
この研究に関して、成長阻害の（上述のように算出される）正味の増分を、テーブル１４（１０μＭボリノスタットと組み合わせた治療）及びテーブル１５（１μＭボリノスタットと組み合わせた治療）において報告する。
【０３８９】
【表１６】
0006602875.tif 000023
【０３９０】
【表１７】
0006602875.tif 000024
【０３９１】
結果は、ＨＤＡＣ阻害剤ボリノスタットが４価ＤＲ５結合分子と相乗効果を示し、４価ＤＲ５結合分子単独に対して非感受性の細胞を含む細胞に対する上記４価ＤＲ５結合分子の細胞傷害活性を増強することを示す。特に、９種の細胞株（ＭＤＡ‐ＭＢ‐１７５ＶＩＩ、ＳＫＢＲ３、ＮＣＩ‐Ｎ８７、ＡｓＰＣ１、Ｈｓ７００Ｔ、７８６Ｏ、Ｃａｌｕ３、ＳＫＯＶ３及びＰＣ３）は、僅か１μＭのボリノスタットと組み合わせた４価ＤＲ５結合分子に応答することが観察された。別の３種の細胞株（ＢＴ４７４、ＭＤＡ‐ＭＢ‐３６１、Ｈｓ７４６Ｔ、ＨＰＡＦＩＩ、Ａ５４９、ＥＳ２及びＬＮＣａｐ）は、１０μＭのボリノスタットと組み合わせた４価ＤＲ５結合分子に応答することが観察された。
【０３９２】
本明細書において言及されている全ての公刊物及び特許は、個々の公刊物又は特許出願それぞれの全体が参照により本明細書に援用されていることが具体的かつ独立に指示されている場合と同程度に、参照により本明細書に援用されている。本発明をその具体的実施形態に関して説明したが、更なる修正形態が可能であり、本出願は、本発明が属する分野の公知の方法又は慣例の範囲内であるような、及びこれまでに挙げた必須の特徴に適用できるような、本開示からの逸脱を含む、本発明の原理に概ね従う本発明のいずれの変形、使用又は改変を包含することを意図していることを理解されたい。
【配列表フリーテキスト】
【０３９３】
配列表の数字見出し＜２２３＞の記載は以下のとおりである。
配列番号１：ヒト野生型ＩｇＧのＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン
配列番号２：ヒト細胞死受容体５前駆体タンパク質
配列番号３：抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  １軽鎖可変領域
配列番号４：抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  １軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１
配列番号５：抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  １軽鎖可変領域のＣＤＲＬ２
配列番号６：抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  １軽鎖可変領域のＣＤＲＬ３
配列番号７：抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  １軽鎖可変領域をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号８：抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  １重鎖可変領域
配列番号９：抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  １重鎖可変領域のＣＤＲＨ１
配列番号１０：抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  １重鎖可変領域のＣＤＲＨ２
配列番号１１：抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  １重鎖可変領域のＣＤＲＨ３
配列番号１２：抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  １重鎖可変領域をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１３：抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  ２軽鎖可変領域
配列番号１４：抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  ２軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１
配列番号１５：抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  ２軽鎖可変領域のＣＤＲＬ２
配列番号１６：抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  ２軽鎖可変領域のＣＤＲＬ３
配列番号１７：抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  ２軽鎖可変領域をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１８：抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  ２重鎖可変領域
配列番号１９：抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  ２重鎖可変領域のＣＤＲＨ１
配列番号２０：抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  ２重鎖可変領域のＣＤＲＨ２
配列番号２１：抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  ２重鎖可変領域のＣＤＲＨ３
配列番号２２：抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  ２重鎖可変領域をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２３：ヒト化抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  ２軽鎖可変領域変異体２
配列番号２４：ヒト化抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  ２軽鎖可変領域変異体２をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２５：ヒト化抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  ２軽鎖可変領域変異体３
配列番号２６：ヒト化抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  ２軽鎖可変領域変異体３をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２７：ヒト化抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  ２軽鎖可変領域変異体４
配列番号２８：ヒト化抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  ２軽鎖可変領域変異体４をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２９：ヒト化抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  ２軽鎖可変領域変異体５
配列番号３０：ヒト化抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  ２軽鎖可変領域変異体５をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号３１：ヒト化抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  ２重鎖可変領域変異体２
配列番号３２：ヒト化抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  ２重鎖可変領域変異体２をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号３３：リンカー１
配列番号３４：システイン含有ドメイン（リンカー２）
配列番号３５：ヒトＩｇＧのヒンジドメインのシステイン含有部分の変異体
配列番号３６：ヒトＩｇＧのヒンジドメインのシステイン含有部分
配列番号３７：ヒトＣＬドメインのシステイン含有部分の変異体
配列番号３８：ヒトＣＬドメインのシステイン含有部分
配列番号３９：Ｅコイルヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号４０：Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号４１：システイン含有Ｅコイルヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号４２：システイン含有Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号４３：連鎖球菌のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）
配列番号４４：連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）の脱免疫化変異体
配列番号４５：連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）の脱免疫化変異体
配列番号４６：ペプチドリンカー
配列番号４７：ペプチドリンカー
配列番号４８：システイン含有ペプチドリンカー（リンカー３）
配列番号４９：ペプチドリンカー（リンカー３）
配列番号５０：ペプチドリンカー（リンカー３）
配列番号５１：代替的なシステイン含有ペプチドリンカー（リンカー３）
配列番号５２：「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン
配列番号５３：「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン
配列番号５４：ドロジツマブ抗ＤＲ５抗体軽鎖可変領域
配列番号５５：ドロジツマブ抗ＤＲ５抗体軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１
配列番号５６：ドロジツマブ抗ＤＲ５抗体軽鎖可変領域のＣＤＲＬ２
配列番号５７：ドロジツマブ抗ＤＲ５抗体軽鎖可変領域のＣＤＲＬ３
配列番号５８：ドロジツマブ抗ＤＲ５抗体重鎖可変領域
配列番号５９：ドロジツマブ抗ＤＲ５抗体重鎖可変領域のＣＤＲＨ１
配列番号６０：ドロジツマブ抗ＤＲ５抗体重鎖可変領域のＣＤＲＨ２
配列番号６１：ドロジツマブ抗ＤＲ５抗体重鎖可変領域のＣＤＲＨ３
配列番号６２：コナツムマブ抗ＤＲ５抗体軽鎖可変領域
配列番号６３：コナツムマブ抗ＤＲ５抗体軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１
配列番号６４：コナツムマブ抗ＤＲ５抗体軽鎖可変領域のＣＤＲＬ２
配列番号６５：コナツムマブ抗ＤＲ５抗体軽鎖可変領域のＣＤＲＬ３
配列番号６６：コナツムマブ抗ＤＲ５抗体重鎖可変領域
配列番号６７：コナツムマブ抗ＤＲ５抗体重鎖可変領域のＣＤＲＨ１
配列番号６８：コナツムマブ抗ＤＲ５抗体重鎖可変領域のＣＤＲＨ２
配列番号６９：コナツムマブ抗ＤＲ５抗体重鎖可変領域のＣＤＲＨ３
配列番号７０：チガツズマブヒト化抗ＤＲ５抗体軽鎖可変領域
配列番号７１：チガツズマブヒト化抗ＤＲ５抗体軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１
配列番号７２：チガツズマブヒト化抗ＤＲ５抗体軽鎖可変領域のＣＤＲＬ２
配列番号７３：チガツズマブヒト化抗ＤＲ５抗体軽鎖可変領域のＣＤＲＬ３
配列番号７４：チガツズマブヒト化抗ＤＲ５抗体重鎖可変領域
配列番号７５：チガツズマブヒト化抗ＤＲ５抗体重鎖可変領域のＣＤＲＨ１
配列番号７６：チガツズマブヒト化抗ＤＲ５抗体重鎖可変領域のＣＤＲＨ２
配列番号７７：チガツズマブヒト化抗ＤＲ５抗体重鎖可変領域のＣＤＲＨ３
配列番号７８：ＬＢＹ１３５‐１抗ＤＲ５抗体軽鎖可変領域
配列番号７９：ＬＢＹ１３５‐１抗ＤＲ５抗体軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１
配列番号８０：ＬＢＹ１３５‐１抗ＤＲ５抗体軽鎖可変領域のＣＤＲＬ２
配列番号８１：ＬＢＹ１３５‐１抗ＤＲ５抗体軽鎖可変領域のＣＤＲＬ３
配列番号８２：ＬＢＹ１３５‐１抗ＤＲ５抗体重鎖可変領域
配列番号８３：ＬＢＹ１３５‐１抗ＤＲ５抗体重鎖可変領域のＣＤＲＨ１
配列番号８４：ＬＢＹ１３５‐１抗ＤＲ５抗体重鎖可変領域のＣＤＲＨ２
配列番号８５：ＬＢＹ１３５‐１抗ＤＲ５抗体重鎖可変領域のＣＤＲＨ３
配列番号８６：ＬＢＹ１３５‐２抗ＤＲ５抗体軽鎖可変領域
配列番号８７：ＬＢＹ１３５‐２抗ＤＲ５抗体軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１
配列番号８８：ＬＢＹ１３５‐２抗ＤＲ５抗体軽鎖可変領域のＣＤＲＬ２
配列番号８９：ＬＢＹ１３５‐２抗ＤＲ５抗体軽鎖可変領域のＣＤＲＬ３
配列番号９０：ＬＢＹ１３５‐２抗ＤＲ５抗体重鎖可変領域
配列番号９１：ＬＢＹ１３５‐２抗ＤＲ５抗体重鎖可変領域のＣＤＲＨ１
配列番号９２：ＬＢＹ１３５‐２抗ＤＲ５抗体重鎖可変領域のＣＤＲＨ２
配列番号９３：ＬＢＹ１３５‐２抗ＤＲ５抗体重鎖可変領域のＣＤＲＨ３
配列番号９４：ＫＭＴＲ２抗ＤＲ５抗体軽鎖可変領域
配列番号９５：ＫＭＴＲ２抗ＤＲ５抗体軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１
配列番号９６：ＫＭＴＲ２抗ＤＲ５抗体軽鎖可変領域のＣＤＲＬ２
配列番号９７：ＫＭＴＲ２抗ＤＲ５抗体軽鎖可変領域のＣＤＲＬ３
配列番号９８：ＫＭＴＲ２抗ＤＲ５抗体重鎖可変領域
配列番号９９：ＫＭＴＲ２抗ＤＲ５抗体重鎖可変領域のＣＤＲＨ１
配列番号１００：ＫＭＴＲ２抗ＤＲ５抗体重鎖可変領域のＣＤＲＨ２
配列番号１０１：ＫＭＴＲ２抗ＤＲ５抗体重鎖可変領域のＣＤＲＨ３
配列番号１０２：ＩｇＧ１のＦｃ領域Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異体
配列番号１０３：ヒト野生型ＩｇＧ４のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン
配列番号１０４：ヒト化抗ＣＤ３「ｍＡｂ  ２」軽鎖可変ドメイン
配列番号１０５：ヒト化抗ＣＤ３「ｍＡｂ  ２」軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ１
配列番号１０６：ヒト化抗ＣＤ３「ｍＡｂ  ２」軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ２
配列番号１０７：ヒト化抗ＣＤ３「ｍＡｂ  ２」軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ３
配列番号１０８：ヒト化抗ＣＤ３「ｍＡｂ  ２」重鎖可変ドメイン
配列番号１０９：ヒト化抗ＣＤ３「ｍＡｂ  ２」重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ１
配列番号１１０：ヒト化抗ＣＤ３「ｍＡｂ  ２」重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ２
配列番号１１１：ヒト化抗ＣＤ３「ｍＡｂ  ２」重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ３
配列番号１１２：ヒト化抗ＣＤ３「ｍＡｂ  ２」重鎖可変ドメインＤ６５Ｇ変異体
配列番号１１３：ヒト化抗ＣＤ３「ｍＡｂ  ２」重鎖可変ドメインＤ６５Ｇ変異体のＣＤＲＨ２
配列番号１１４：フルオレセイン抗体４‐４‐２０軽鎖可変ドメイン
配列番号１１５：フルオレセイン抗体４‐４‐２０重鎖可変ドメイン
配列番号１１６：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖
配列番号１１７：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１１８：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖
配列番号１１９：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１２０：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２ＦｃダイアボディＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａの第１のポリペプチド鎖
配列番号１２１：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２ＦｃダイアボディＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａの第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１２２：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖
配列番号１２３：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１２４：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖
配列番号１２５：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１２６：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  １ＦｃダイアボディＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａの第１のポリペプチド鎖
配列番号１２７：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  １ＦｃダイアボディＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａの第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１２８：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖
配列番号１２９：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１３０：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖
配列番号１３１：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  １Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１３２：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  １ＦｃダイアボディＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａの第１のポリペプチド鎖
配列番号１３３：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  １×ＤＲ５  ｍＡｂ  １ＦｃダイアボディＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａの第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１３４：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖
配列番号１３５：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１３６：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖
配列番号１３７：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１３８：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２ＦｃダイアボディＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａの第１のポリペプチド鎖
配列番号１３９：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  ２×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２ＦｃダイアボディＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａの第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１４０：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  ２．２×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２．２Ｆｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖
配列番号１４１：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  ２．２×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２．２Ｆｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１４２：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  ２．２×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２．２Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖
配列番号１４３：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  ２．２×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２．２Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１４４：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  ２．２×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２．２ＦｃダイアボディＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａの第１のポリペプチド鎖
配列番号１４５：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  ２．２×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２．２ＦｃダイアボディＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａの第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１４６：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  ２．３×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２．３Ｆｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖
配列番号１４７：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  ２．３×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２．３Ｆｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１４８：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  ２．３×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２．３Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖
配列番号１４９：例示的なＤＲ５  ｍＡｂ  ２．３×ＤＲ５  ｍＡｂ  ２．３Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１５０：例示的なｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．３×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．３ＦｃダイアボディＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａの第１のポリペプチド鎖
配列番号１５１：例示的なｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．３×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．３ＦｃダイアボディＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａの第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１５２：例示的なｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．４×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．４Ｆｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖
配列番号１５３：例示的なｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．４×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．４Ｆｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１５４：例示的なｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．４×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．４Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖
配列番号１５５：例示的なｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．４×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．４Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１５６：例示的なｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．４×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．４ＦｃダイアボディＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａの第１のポリペプチド鎖
配列番号１５７：例示的なｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．４×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．４ＦｃダイアボディＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａの第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１５８：例示的なｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．５×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．５Ｆｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖
配列番号１５９：例示的なｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．５×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．５Ｆｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１６０：例示的なｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．５×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．５Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖
配列番号１６１：例示的なｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．５×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．５Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１６２：例示的なｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．５×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．５ＦｃダイアボディＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａの第１のポリペプチド鎖
配列番号１６３：例示的なｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．５×ｈＤＲ５  ｍＡｂ  ２．５ＦｃダイアボディＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａの第１のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号１６４：ヒト野生型ＩｇＧ２のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン
配列番号１６５：ヒト化抗ＤＲ５抗体ｍＡｂ  ２軽鎖可変領域変異体３，４，５のＣＤＲＬ１
配列番号１６６：ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体軽鎖可変ドメイン
配列番号１６７：ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体重鎖可変ドメイン
配列番号１６８：ヒト野生型ＩｇＧ３のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン
【図１】
0006602875.tif 000025
【図２】
0006602875.tif 000026
【図３】
0006602875.tif 000027
【図４Ａ】
0006602875.tif 000028
【図４Ｂ】
0006602875.tif 000029
【図５】
0006602875.tif 000030
【図６】
0006602875.tif 000031
【図７Ａ】
0006602875.tif 000032
【図７Ｂ】
0006602875.tif 000033
【図８Ａ】
0006602875.tif 000034
【図８Ｂ】
0006602875.tif 000035
【図９Ａ】
0006602875.tif 000036
【図９Ｂ】
0006602875.tif 000037
【図９Ｃ】
0006602875.tif 000038
【図９Ｄ】
0006602875.tif 000039
【図９Ｅ】
0006602875.tif 000040
【図９Ｆ】
0006602875.tif 000041
【図９Ｇ】
0006602875.tif 000042
【図９Ｈ】
0006602875.tif 000043
【図９Ｉ】
0006602875.tif 000044
【図９Ｊ】
0006602875.tif 000045
【図９Ｋ】
0006602875.tif 000046
【図１０Ａ】
0006602875.tif 000047
【図１０Ｂ】
0006602875.tif 000048
【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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