(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の構造式（化１）の化合物とキャリヤータンパク質であるキーホールリンペットヘモシアニンが結合した免疫原。
【化１】
0006493786.tif 000002
【請求項２】
請求項１に記載の免疫原を接種する段階を有することを特徴とするモノクローナル抗体産生細胞ライン作製方法。
【請求項３】
請求項２に記載のモノクローナル抗体産生細胞ライン作製方法により作製され、前記化合物に結合能を有するモノクローナル抗体を産生する細胞ラインである、下記のうちのいずれかのモノクローナル抗体産生細胞ライン、
寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９５５として寄託された細胞ライン、
寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９５６として寄託された細胞ライン、
寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９５７として寄託された細胞ライン。
【請求項４】
請求項３に記載の細胞ラインにより産生されるモノクローナル抗体であって、前記化合物と反応することを特徴とするモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、法的管理および健康管理などの産業分野において、合成カンナビノイドの検出するために必要な抗体、その作製方法、及び免疫原に関する。
【背景技術】
【０００２】
合成カンナビノイドを検出するためには、通常迅速にかつ正確に検出作業を行うことが要請される。また上記合成カンナビノイドの検出においては、微量成分の分析を行うことも要請される。
【０００３】
従来、合成カンナビノイドを検出する方法として、ガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ−ＭＳ）や液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ−ＭＳ）あるいは、特許文献１に開示されているイオナイザ／コレクタ装置による測定方法があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００７−５１５６１９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来法であるＧＣ−ＭＳやＬＣ−ＭＳの感度は約ｐｐｍオーダーであり、さらには不純物が存在した場合には、著しく感度低下を引き起こす課題があった。
【０００６】
そのため、前処理としてある程度の不純物を除去する必要があり、結果として測定時間も長時間（３０分以上）かかるという問題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記従来の課題を解決するために、本発明の免疫原（合成カンナビノイド免疫原）は、構造式（化１）の構造を有した化合物をキャリヤータンパク質であるキーホールリンペットヘモシアニンと結合したものである。
【０００８】
さらに、前記免疫原を動物（マウス、ウサギなど）に免疫し、特異的な抗体を作製することができるモノクローナル抗体産生細胞ライン作製方法を提供することができる。
【０００９】
また、前記モノクローナル抗体産生細胞ライン作製方法により、前記化合物に結合能を有するモノクローナル抗体を産生する細胞ラインである、下記のうちのいずれかのモノクローナル抗体産生細胞ラインを提供することができる。寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９５５として寄託された細胞ライン、寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９５６として寄託された細胞ライン、寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９５７として寄託された細胞ライン。
【００１０】
さらに、前記記載の細胞ラインにより産生される前記化合物と反応するモノクローナル抗体。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の合成カンナビノイド誘導体および抗体作製法より高性能な抗体を作製することが可能となる。また、上記抗体を用いることにより合成カンナビノイドを迅速にかつ正確に分析できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】３種類のモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡによる結合能評価図
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
【００１４】
以下実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。
【００１５】
以下、カルボキシル基を所有した合成カンナビノイド誘導体の作製方法及びこの抗体を用いた合成カンナビノイドの検出方法について説明する。
【００１６】
（１）合成カンナビノイド誘導体の合成
２．５Ｍエチルマグネシウムブロミド（１．６５ｍｍｏｌ）を１．１ｍｌエーテル溶媒中に添加し、しばらく０℃で撹拌した。この溶液に、あらかじめ１．１ｍｌエーテル溶媒で溶解したインドール（１．３ｍｍｏｌ）を徐々に添加し、添加終了後３０分間、室温で撹拌した。
【００１７】
撹拌しながら、予め１ｍｌエーテル溶媒で溶解した２−ナフトイルクロライド（１．４６ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。その反応液は１．５時間、室温で撹拌しながら放置した。その後、飽和塩化アンモニウム水溶液を反応液と同体積添加することにより反応を停止させると共に、微粉末状になるまで撹拌を続けた。この粉末をろ過し、適当量の水で洗浄した後に適当量のエーテルで洗浄した。粉末を１ｍｌメタノールで溶解した後に、１ｍｌ水酸化ナトリウム水溶液（０．４ｇ／ｍｌ）を添加し、室温で１８時間撹拌した。沈殿物をろ過後に適当量のメタノール、水、エーテルで洗浄した。その後、１００℃真空下で乾燥させ、０．２５ｇの３−（２−ナフトイル）インドール混合物を得た。この混合物を精製することなく次の合成ステップに利用した。
【００１８】
０．２ｇ３−（２−ナフトイル）インドール混合物を１．５ｍｌジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）で溶解した後に、０．６ｇ水酸化カリウムを添加した。この反応液に１−ブロモヘプタン酸（５．５ｍｍｏｌ）を徐々に添加し、８５℃で１８時間撹拌した。反応液を適量の水で希釈した後に、適量の酢酸エチルで３度抽出した。抽出物を濃縮後、クロマトグラフィー（シリカ担体、溶出液：石油エーテル／＝７／１）により精製し、０．１ｇ１−ヘプタン酸−３−（２−ナフトイル）インドール（収率：４１％）を得ることができた。
【００１９】
得られた反応生成物の構造は、赤外線スペクトル及びＮＭＲデータにより上記式（化１）であることを同定した。
【００２０】
（２）免疫原の合成
１０ｍｇ合成カンナビノイド誘導体を１ｍｌのＤＭＳＯに溶解後、５ｍｇエチル（ジメチルアミノプロピル）  カルボジイミド（ＥＤＣ）を添加し、１時間、室温で撹拌した。その溶液を、予め１００ｍｇのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を５ｍｌの生理食塩水を含むリン酸緩衝液［（ｐＨ７．４）ＰＢＳバッファ］に溶解した溶液に、撹拌しながら徐々に添加した。その後、更に８時間、室温で撹拌した。
【００２１】
この溶液を予め、０．２５μｍフィルターで沈殿物を除去した後に、セファデックスＧ−２５カラム（溶出液：ＰＢＳバッファ）により未反応物の合成カンナビノイド誘導体を除去することにより、免疫原である合成カンナビノイド誘導体−ＫＬＨ（濃度：１ｍｇ／ｍｌ）を得た。
【００２２】
（３）免疫
上記で作製した１ｍｇ／ｍＬ免疫原に同体積のアジュバント（ヒト結核死菌合有完全フロイントアジュバント、和光純薬製、Ｈ３７Ｒｖ）を添加し、よくホモジナイザ（１０００ｒｐｍ）で乳化した。生後約８週のマウスに、免疫原を含むアジュバントエマルジョンを１００μｌずつ１０箇所に注射した。
【００２３】
２週間後、１ｍｇ／ｍＬ免疫原に同体積の不完全フロイントアジュバントをホモジナイザで乳化し、このエマルジョンをマウスに１００μｌずつ１０箇所に注射したその後、４、６、８週間後に再度  免疫原を含む不完全フロイントアジュバントエマルジョンを同様に注射した。注射後、１週間目に採血し、以下に示す抗体産生を確認した。
【００２４】
（４）血清評価
採取した血清を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により抗体産生の確認をした。固相として０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚ（０．０４重量％ナトリウムアジドＰＢＳ溶液にウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡという）を０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解したもの）で調製した２．５μｇ／ｍＬ合成カンナビノイド誘導体−ＢＳＡを１００μｌ／ウェルずつ使用した。第二抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体またはペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体を使用した。その結果、合成カンナビノイド誘導体抗体の産生が認められるとともに、ＩｇＧ／ＩｇＭ比が１００以上ありクラススイッチが起こっていることを確認した。
【００２５】
（５）細胞融合
免疫したマウスの中で特に力価の高かった２匹の脾臓を肥大させるために、ブースト（弱い免疫原の注射）をした。免疫原は、１ｍｇ／ｍＬ合成カンナビノイド誘導体−ＫＬＨ溶液をアジュバントを、加えずにそのまま用いた。ブースト後３日を経過したマウスの脾臓細胞を摘出し、平均分子量１，５００のポリエチレングリコールを用いた常法により、マウス骨髄腫由来細胞ライン（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）と融合した。フィーダー（成長因子を供給する細胞）として同じマウスの脾臓細胞を用い、９６ウェルプレート２枚の上で１５重量％のウシ胎児血清（以下、ＦＣＳ）を含むイシコフ培地で１日間培養した後（１００μｌ／ウェル）、２倍濃度のヒポキサンチン／アミノブテリン／チミジン（ＨＡＴ）培地を１００μｌ／ウェル添加してＣＯ２インキュベータ（ＣＯ２濃度：５体積％、温度：３７℃、湿度：９５％）内で１週間培養した。その後、培養上清を除いた後、１５重量％のＦＣＳを含むヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ）培地（２５０μｌ／ウェル）と交換した。
【００２６】
（６）細胞選別
ＨＴ培地と交換１週間後、培養上清を２００μｌ／ウェルずつ取り出した。１５重量％のＦＣＳを含むＨＴ培地（２００μｌ／ウェル）を添加し、３日間培養し後培養上清を２００μｌ／ウェルずつ取り出した。合計で培養上清を４００μｌ／ウェルを得ることができた。この培養上清を用いて以下に示すＥＬＩＳＡ法により合成カンナビノイド誘導体−ＢＳＡに対する結合能を測定した。固相として０．１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ・ＰＢＳ・Ａｚで調整した２．５μｇ／ｍＬ合成カンナビノイド誘導体−ＢＳＡ溶液を１００μｌ／ウェルずつ使用した。抗体液として細胞培養上清を使用した。この結果、合成カンナビノイド誘導体−ＢＳＡに対して結合能を示したものは３ウェルあった。
【００２７】
（７）クローニング
上記３ウェルの細胞についてウェルあたり１ケの細胞が含まれる濃度に希釈（限界希釈）し、９６ウェルのマイクロプレート３枚に分注した。フィーダーとして生後５週のマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）の胸線細胞を用いて初期増殖を促した。プレートのサイズを上げながら培養を進め、適時上清についてＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングを繰り返し、合成カンナビノイド誘導体−ＢＳＡに対して高い力価を示し、かつ良好な増殖を示している細胞ラインを最終的に選別し、２００ｍｌ中で５×１０５細胞／ｍＬの濃度に至るまで培養を進めた。最終的に、合成カンナビノイド誘導体−ＢＳＡに対して結合能を示した３株を選定した。
【００２８】
これらの細胞ラインは、寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９５５、寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９５６、寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９５７として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された。受託日（原寄託日）は、２０１４年１０月２７日である。
【００２９】
（８）細胞の保存
最終的に選別された細胞ラインは、上清を遠心分離し、５×１０６  細胞／ｍＬの濃度でＦＣＳ：ジメチルスルフォキシド＝９：１（体積比）の溶液１ｍＬに浮遊させ、−８０℃で凍結した後、−１３５℃に移して長期保存状態にした。
【００３０】
（９）抗体の精製
採取した培養液を遠心分離より単離した後に、その上清についてプロティンＡ結合ゲル（プロティンＡセファロースＣＬ−４Ｂ、ファルマシア製）を用いたアフィニティークロマトグラフィにより、細胞培養上清からモノクローナル抗体を精製した。このモノクローナル抗体はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、標準蛋白との比較から、精製抗体は分子量約５０，０００のＨ鎖と約２５，０００のＬ鎖からなるＩｇＧであることを確認した。
【００３１】
（１０）抗体の評価
上記のアフィニティクロマトグラフィにより精製したモノクローナル抗体について以下に示す酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）で抗体評価を行った。
【００３２】
ＥＬＩＳＡ法
（Ａ）抗原のコーティング
予め合成カンナビノイド誘導体と牛血清アルブミン（ＢＳＡ）とを結合させた２．５μｇ／ｍＬ合成カンナビノイド誘導体―ＢＳＡをマイクロプレート（塩化ビニル製９６ウェルプレート    コスター社製）に抗原溶液を１００μｌ／ウェル注入し、２０度で一晩保存した。実験直前に、アスピレータで抗原溶液を除去した。
【００３３】
（Ｂ）ブロッキング
ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚを２００μｌ／ウェル注入し、３０分間室温で放置した。その後、アスピレータでＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚを除去した。即日に以降の実験を行わないときは、この状態で、水で湿したろ紙と共に４度で保存した。
【００３４】
（Ｃ）抗体の反応
１重量％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで希釈した抗体溶液（希釈倍率：１００〜１００００００倍）を１００μｌ／ウェル振とうしながら加えた。常温で３時間保存した後、アスピレータで抗体溶液を除去し、ＰＢＳで３回洗浄し、アスピレータで残存するＰＢＳを除去した。
【００３５】
（Ｄ）第２抗体の反応
０．２μｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体ヤギ由来（ＫＰＬ社製）を１重量％ＢＳＡのＰＢＳ溶液に溶解したもの、または０．２μｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体ヤギ由来（ＫＰＬ社製）を１重量％ＢＳＡのＰＢＳ溶液に溶解したものを５０μｌ／ウェル注入し、常温で３０分放置した。アスピレータで除去し、ＰＢＳで３回洗浄し、さらにアスピレータで残存するＰＢＳを除去した。
【００３６】
（Ｅ）基質の反応と停止
Ｏ−フェニレンジアミン（生化学用）４０ｍｇを１０ｍＬのクエン酸一リン酸バッファー（ｐＨ５）に溶解し、使用直前に３０重量％過酸化水素水４μＬを加えた溶液（基質溶液）を１００μｌ／ウェル注入し、室温放置した。５分後、４Ｎ硫酸を２５μｌ／ウェル注入して反応を停止した。
【００３７】
（Ｆ）測定
東洋ソーダマイクロプレートリーダを用いて４９２ｎｍの吸光度を測定した。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明は、法的管理および健康管理などの産業分野において、利用されうる。
【図１】
0006493786.tif 000003