(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端ＡＴＡを有する組換えヒトＳＣＧＢ３Ａ２ポリペプチドを含む組成物であって、前記組換えヒトＳＣＧＢ３Ａ２ポリペプチドが配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなる、組成物。
【請求項２】
前記ポリペプチドがＰＬＡ２酵素を阻害する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、等電点電気泳動用ゲルにおいて６．３もしくは６．７または６．３から６．７の間の等電点に対応する位置に移動する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物に含まれている前記ポリペプチドの中、一部がホモ二量体の形態である、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物に含まれている前記ポリペプチドの中、一部が６．７のｐＩを有するホモ二量体の形態である、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
Ｎ末端ＡＴＡを有する組換えヒトＳＣＧＢ３Ａ２ポリペプチドを合成する方法であって、
インタクトなＳＣＧＢ３Ａ２ポリペプチドを放出するために、ＵＢＬ融合パートナーと、前記融合パートナーを認識して融合パートナーとＳＣＧＢ３Ａ２との間で切断するＵＢＬプロテアーゼとを使用する工程を含み、
前記インタクトなＳＣＧＢ３Ａ２ポリペプチドが配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＣＧＢ１Ａ１（CC10）、ＳＣＧＢ３Ａ１、およびＳＣＧＢ３Ａ２を含むセクレトグロビンタンパク質の医薬組成物、製造方法、分析方法、および使用方法に関する。これらのセクレトグロビンの新規な生理学的役割および治療用途が同定された。特に、本発明は、治療過程後１０カ月まで重度の呼吸増悪（severe respiratory exacerbation）による入院を防止または遅延させることにおけるｒｈＣＣ１０、ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２、およびｒｈＳＣＧＢ３Ａ１の新規な使用方法に関する。本発明はまた、安定であり、かつ抗炎症性を有するｒｈＳＣＧＢ３Ａ２の新規な製造方法および医薬組成物にも関する。より具体的には、本発明はさらに、ｒｈＣＣ１０を投与することによって重度の呼吸増悪を防止する方法を提供する。本発明はさらに、ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２を投与することによって気管支拡張症を治療し、気管支拡張症の増悪を防止する方法を提供する。さらにより具体的には、本発明はｒｈＣＣ１０、ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２、またはｒｈＳＣＧＢ３Ａ１を投与することによって慢性肺疾患における気道リモデリングを改善し、急性肺傷害における気道リモデリングを防止する方法を提供する。さらにより具体的には、これらのセクレトグロビンは、正常な数のクララ細胞ならびに気道上皮において抗ＣＧＲＰ１抗体への免疫反応性によって同定される神経上皮小体（NEBとも呼ばれる）または神経内分泌細胞クラスター（NECとも呼ばれる）と呼ばれるそれらの関連構造を回復させることによって、間接的に気道リモデリングを改善する。クララ細胞および他のＣＧＲＰ１＋細胞はその後、これらのセクレトグロビンおよび通常の粘膜環境の他の成分を分泌し、呼吸器粘膜ならびに、その後に吸入された刺激物に対してより耐性となり、重度の増悪を起こしていない上皮のホメオスタシスと正常な機能に寄与する。
【背景技術】
【０００２】
天然のヒトクララ細胞１０ｋＤａタンパク質（CC10）は、ウテログロビン、クララ細胞１６ｋＤａタンパク質（CC16）、クララ細胞分泌タンパク質（CCSP）、ブラストキニン、尿タンパク１、およびセクレトグロビン１Ａ１（SCGB1A1）としても知られ、あらゆる脊椎動物に存在すると考えられているセクレトグロビンと呼ばれる関連するタンパク質のファミリーの一つである。ＳＣＧＢ３Ａ１およびＳＣＧＢ３Ａ２と呼ばれる、気道中においても非常に高いレベルで発現している２つの他のセクレトグロビンがある（Porter, 2002）。これら３つのタンパク質ＳＣＧＢ１Ａ１、ＳＣＧＢ３Ａ１、およびＳＣＧＢ３Ａ２を、ここでは「呼吸器セクレトグロビン」と呼ぶ。表１は、各呼吸器セクレトグロビンのＧｅｎｅｂａｎｋ座位とアミノ酸配列を示している。
【０００３】
【表１】
0006513632.tif 000002
【０００４】
哺乳類における呼吸器セクレトグロビンの主要な供給源は、肺および気管の上皮、特に非繊毛細気管支気道上皮細胞（主にクララ細胞）であり、それらは成人の肺の細胞外液において非常に豊富な、局所的に生成されるタンパク質である。それらはまた、鼻の上皮においても分泌される。このように、呼吸器セクレトグロビンは、気道の上部および下部の両方において高度に発現され、上気道は鼻孔および副鼻腔を含み、下気道は気管、気管支および肺胞を含む。また、相当量の呼吸器セクレトグロビンが血清および尿中にも存在するが、これは主として肺供給源に由来するものである。ＳＣＧＢ３Ａ１はまた、胃、心臓、小腸、子宮および乳腺においても発現され、ＳＣＧＢ３Ａ２は甲状腺において低いレベルで発現される（Porter, 2002）。ＣＣ１０はまた、生殖組織（子宮、精嚢）、外分泌腺（前立腺、乳腺、膵臓）、内分泌腺（甲状腺、下垂体、副腎、および卵巣）によって、ならびに胸腺および脾臓によっても生成される（Mukherjee, 1999; Mukherjee, 2007）。ヒトＣＣ１０のｉｎ  ｖｉｖｏにおける主要な回収可能形態は、２つの同じ７０アミノ酸の単量体から構成され、４．８の等電点を有するホモ二量体である。ＳＤＳ  ＰＡＧＥ上では約１０ｋＤａの見かけの分子量で移動するが、その分子量は１５．８ｋＤａである。単量体は、一方のＮ末端が他方のＣ末端の近傍となる、逆平行の構成で配置され、二量体の完全に酸化された形態では、単量体は２つのジスルフィド結合によって連結されている（Mukherjee, 1999）。しかしながら、ヒトの試料におけるＳＣＧＢ３Ａ２のｉｎ  ｖｉｖｏの分子形態（単量体、二量体、または他の複合体）はまだ特徴付けられていない。３つ全ての呼吸器セクレトグロビンが、合成法（Nicolas, 2005）または組換え法（Mantile, 1993）によって作製されうるが、今日までヒトＳＣＧＢ３Ａ１およびＳＣＧＢ３Ａ２の成功した合成およびこれらのタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける生化学的特徴付けの報告はなかった。
【０００５】
ＣＣ１０は、他のタンパク質との様々な相互作用、受容体および細胞型に関して特徴付けられている抗炎症性および免疫調節性のタンパク質である（Mukherjee, 2007、Mukherjee, 1999、およびPilon, 2000において概説されている）。喘息（Lensmar, 2000; Shijubo, 1999; Van Vyve, 1995）、肺炎（Nomori, 1995）、細気管支炎（Nord, 2002）、サルコイドーシス（Shijubo, 2000）を含む、ある程度の炎症によって特徴付けられる多数の臨床状態について、ならびに再発性副鼻腔炎および鼻ポリープ症を伴う慢性鼻炎を患う患者（Liu, 2004）において、低レベルのＣＣ１０タンパク質またはｍＲＮＡが様々な組織および体液試料中に見出されている。内因性ＣＣ１０の体内の主要な供給源である肺上皮細胞は、しばしばこれらの状況において有害な影響を受け、枯渇し、またはさらには失われている（Shijubo, 1999）。
【０００６】
ＣＣ１０ノックアウト（KO）マウスは、肺のホメオスタシス、生殖、および特定の型の腎疾患におけるＣＣ１０の役割を特徴付ける際に重要であった。各々異なる遺伝子ノックアウトコンストラクトおよび異なる親マウス系統を有する、２つの系統のＣＣ１０  ＫＯマウスが存在する。一方のノックアウト系統は、全身性の炎症、乏しい生殖能力（少ない一腹仔数）、およびヒトＩｇＡ腎症に似た致死的な腎表現型を含む、いくつかの極端な表現型を示す（Zhang, 1997; Zheng, 1999）。もう一方のノックアウト系統は、これらの極端な表現型を有さず、より生存可能で、より多くの数の実験を行うことを可能とする（Stripp, 1997）。両系統のＣＣ１０  ＫＯマウスは、喘息、肺線維症、ならびに発癌、細菌およびウイルス感染、ならびに酸素およびオゾン曝露に対する、より高い感度と著しく上昇した炎症反応を共有している（Plopper, 2006; Lee, 2006; Yang, 2004; Wang, 2003; Harrod, 2002; Chen, 2001; Wang, 2001; Hayashida, 2000; Harrod, 1998）。組換えヒトＣＣ１０（rhCC10）を用いた、これらのノックアウトマウスにおけるＣＣ１０機能の回復は、最長７日のエンドポイントの短期間誘発モデルにおいて、悪化した肺炎症反応を軽減することが示されている（Chen, 2001; Wang, 2003）。本発明に最も関連することとして、両系統は、カルシトニン遺伝子関連タンパク質１（CGRP1）の陽性染色によって同定される、クララ細胞ならびに神経上皮小体（NEB; Castro, 2000）もしくは神経内分泌細胞クラスター（NEC; Hong, 2001; Reynolds, 2000）と呼ばれる関連する構造の著しく減少した数によって特徴付けられる気道上皮表現型を共有している。これらのＫＯマウスにおいては、気道におけるクララ細胞および関連構造のこれらの２〜１０倍の欠損は、あらゆる種類の傷害の非存在下で生じる。
【０００７】
呼吸促迫症候群（RDS）を起こした早産児は、天然のＣＣ１０を欠損している。臨床試験において、単回投与のｒｈＣＣ１０が、出生の日に投与され、肺における３〜７日の強力な短期的抗炎症作用を媒介した。薬物動態学的な分析は、過剰なＣＣ１０は、投与された単回投与の４８時間以内に排除されることを示した。抗炎症作用にも関わらず、ｒｈＣＣ１０は、１）出生後２８日における胸部Ｘ線の不透明性、または２）月経後年齢（PMA）３６週における補充酸素の使用を含む臨床パラメーターによって定義される、新生児気管支肺異形成症（BPD）の発症を防止しなかった（Levine, 2005）。気管吸引液（TAF）において観察された肺炎症の指標が著しく低下したにもかかわらず、ｒｈＣＣ１０は、入院中の時間も人工呼吸器上の日数も減らさなかった。Ｌｅｖｉｎｅら（２００５）が述べているように、１２カ月のエンドポイントでプラセボ、低用量および高用量の治療群の間に差異はなかった。
【０００８】
ＢＰＤを有する早産児は、頻繁かつ重度の呼吸増悪を起こしやすく、生後１〜２年間における再入院率は高い。重度の呼吸増悪は、息切れ、呼吸困難、鼻および胸の鬱血、粘液の過剰産生、および時として呼吸困難によって特徴付けられる。重度の呼吸増悪は、患者が、ほこり、煙、アレルゲン、汚染物質、化学物質、細菌、真菌、およびウイルスの吸入を通じて、環境曝露および感染に遭遇した際に生じる。
【０００９】
気道、胃腸管、尿生殖路の慢性疾患を有する多くのタイプの患者は、環境誘因に曝された場合、重度の増悪を生じやすい。同様に、自己免疫疾患およびアレルギー性疾患を含む免疫疾患を有する患者もまた、環境誘因に曝された場合、重度の増悪を生じやすい。重度または急性の増悪は、ある患者において一年間に３回より多く生じる場合、頻繁であるとみなされる。慢性疾患を有さないが急性肺傷害（ALI）を起こしている患者であっても、傷害後に、重度の呼吸増悪に似た頻繁かつ重度の急性呼吸器エピソードを生じやすい。増悪を誘発させる環境刺激物質は、ほこり、微粒子、煙、アレルゲン、汚染物質、化学物質、夾雑物、細菌、真菌、およびウイルスを含むが、これらに限定されず、それらは、吸入、摂取、嚥下されるか、皮膚から吸収されることができ、または他の方法で患者の体の湿った粘膜表面に局所的に接触されうる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述の事項は、本発明によって達成される目的の非限定的なリストを提供する：
本発明の第１の目的は、セクレトグロビンを投与して、セクレトグロビンが投与された後１０カ月までの間、基礎または慢性疾患の重度の増悪による入院を防止することである。
本発明のさらなる目的は、呼吸器セクレトグロビンを投与して、セクレトグロビンが投与された後１０カ月までの間、基礎または慢性呼吸器疾患の重度の増悪による入院を防止することである。
本発明のさらなる目的は、ｒｈＣＣ１０を投与して、セクレトグロビンが投与された後１０カ月までの間、基礎または慢性呼吸器疾患の重度の増悪による入院を防止することである。
本発明のさらなる目的は、ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２を投与して、セクレトグロビンが投与された後１０カ月までの間、基礎または慢性呼吸器疾患の重度の増悪による入院を防止することである。
本発明のさらなる目的は、ｒｈＳＣＧＢ３Ａ１を投与して、セクレトグロビンが投与された後１０カ月までの間、基礎または慢性呼吸器疾患の重度の増悪による入院を防止することである。
本発明のさらなる目的は、セクレトグロビンを投与して、セクレトグロビンが投与された後少なくとも１カ月間、基礎または慢性疾患の重度の増悪による入院を防止することである。
本発明のさらなる目的は、呼吸器セクレトグロビンを投与して、セクレトグロビンが投与された後少なくとも１カ月間、基礎または慢性呼吸器疾患の重度の増悪による入院を防止することである。
本発明のさらなる目的は、ｒｈＣＣ１０を投与して、セクレトグロビンが投与された後少なくとも１カ月間、基礎または慢性呼吸器疾患の重度の増悪による入院を防止することである。
本発明のさらなる目的は、ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２を投与して、セクレトグロビンが投与された後少なくとも１カ月間、基礎または慢性呼吸器疾患の重度の増悪による入院を防止することである。
本発明のさらなる目的は、ｒｈＳＣＧＢ３Ａ１を投与して、セクレトグロビンが投与された後少なくとも１カ月間、基礎または慢性呼吸器疾患の重度の増悪による入院を防止することである。
本発明のさらなる目的は、セクレトグロビンを投与して、慢性疾患の再発性増悪を典型的に起こしている患者において、ある重度の増悪から次の増悪までの時間間隔を広げることである。
本発明のさらなる目的は、慢性疾患の再発性増悪を起こしている患者において、呼吸器セクレトグロビン治療の投与後または経過後１０カ月までの間、ある重度の増悪から次の増悪までの時間間隔を広げることである。
本発明のさらなる目的は、呼吸器セクレトグロビンを投与して、慢性呼吸器疾患の再発性増悪を起こしている患者において、ある重度の呼吸増悪から次の増悪までの時間間隔を広げることである。
本発明のさらなる目的は、呼吸器セクレトグロビンを投与して、急性肺傷害を起こしたが傷害前に慢性呼吸器疾患の診断を受けていない患者において増悪に似た重度の急性呼吸器エピソードを防止することである。
本発明のさらなる目的は、呼吸器セクレトグロビンを投与して、慢性呼吸器疾患を有する感受性の高い患者において、増悪を誘発することができる吸入された刺激物質に曝露した後の重度の増悪を防止することである。
本発明のさらなる目的は、セクレトグロビンを投与して、慢性自己免疫疾患の再発性増悪を起こしている患者において、ある重度の自己免疫増悪から次の増悪までの時間間隔を広げることである。
本発明のさらなる目的は、呼吸器セクレトグロビンを投与して、慢性呼吸器疾患の頻繁な増悪を起こしている患者において、ある重度の呼吸増悪から次の増悪までの時間間隔を広げることである。
本発明のさらなる目的は、呼吸器セクレトグロビンを投与して、慢性自己免疫疾患の頻繁な増悪を起こしている患者において、ある重度の自己免疫増悪から次の増悪までの時間間隔を広げることである。
本発明のさらなる目的は、前の増悪中または増悪後にセクレトグロビンを投与して、次の増悪を防止することである。
本発明のさらなる目的は、静脈内注射、気管内点滴注入、吸入、鼻腔内点滴注入、経口投与、舌下投与によって、または肛門もしくは膣クリーム、ゲル、もしくは坐薬によって、セクレトグロビンを投与することである。
本発明の第２の目的は、呼吸器セクレトグロビンを投与して、非繊毛性分泌性上皮細胞の数を増加させ、それにより粘膜組織を復旧させることである。
本発明のさらなる目的は、呼吸器セクレトグロビンを投与して、上気道および下気道を含む気道における非繊毛性分泌性上皮細胞（non-ciliated secretory epithelial cells）の数を増加させ、それにより呼吸器粘膜組織および気道を復旧させることである。
本発明のさらなる目的は、呼吸器セクレトグロビンを投与して、気道におけるクララ細胞の数を増加させ、それにより呼吸器粘膜組織および気道を復旧させることである。
本発明のさらなる目的は、呼吸器セクレトグロビンを投与して、気道におけるＮＥＢおよびＮＥＣの数を増加させ、それにより呼吸器粘膜組織および気道を復旧させることである。
本発明のさらなる目的は、呼吸器セクレトグロビンを投与して、血液中を循環する１つまたは複数の天然の呼吸器セクレトグロビンの量を増加させることである。
本発明のさらなる目的は、呼吸器セクレトグロビンを投与して、鼻孔、気管、もしくは肺の気道被覆液（ALF）および／または痰もしくは誘発喀痰中に見出される１つまたは複数の天然の呼吸器セクレトグロビンの量を増加させることである。
本発明のさらなる目的は、呼吸器セクレトグロビンを投与して、気道におけるセクレトグロビン分泌細胞の数を増加させ、それにより呼吸器粘膜組織および気道を復旧させることである。
本発明のさらなる目的は、呼吸器セクレトグロビンを投与して、気道におけるＣＣ１０分泌細胞の数を増加させ、それにより呼吸器粘膜組織および気道を復旧させることである。
本発明のさらなる目的は、呼吸器セクレトグロビンを投与して、気道におけるＳＣＧＢ３Ａ２分泌細胞の数を増加させ、それにより呼吸器粘膜組織および気道を復旧させることである。
本発明のさらなる目的は、呼吸器セクレトグロビンを投与して、気道におけるＳＣＧＢ３Ａ１分泌細胞の数を増加させ、それにより呼吸器粘膜組織および気道を復旧させることである。
本発明のさらなる目的は、呼吸器セクレトグロビンを投与して、女性の尿生殖路におけるＣＣ１０分泌上皮細胞の数を増加させ、それにより膣粘膜組織を復旧させることである。
本発明のさらなる目的は、呼吸器セクレトグロビンを投与して、口、喉、食道、胃、膵臓、胆管、上部および下部腸、ならびに結腸を含む、胃腸管におけるＣＣ１０分泌上皮細胞の数を増加させ、それにより胃腸管粘膜組織を復旧させることである。
本発明のさらなる目的は、ＡＴＡの非天然Ｎ末端を有するヒトＳＣＧＢ３Ａ２の医薬組成物を提供することである。
本発明のさらなる目的は、６．７の等電点を有するヒトＳＣＧＢ３Ａ２の医薬組成物を提供することである。
本発明のさらなる目的は、６．３の等電点を有するヒトＳＣＧＢ３Ａ２の医薬組成物を提供することである。
本発明のさらなる目的は、６．３および６．７の等電点を有するアイソフォームの組み合わせを有するヒトＳＣＧＢ３Ａ２の医薬組成物を提供することである。
本発明のさらなる目的は、別のタンパク質との融合物として合成される組換えヒトＳＣＧＢ３Ａ２の医薬組成物を提供することである。
本発明のさらなる目的は、ユビキチン様タンパク質との融合物として合成される組換えヒトＳＣＧＢ３Ａ２の医薬組成物を提供することである。
本発明のさらなる目的は、ヒト呼吸器セクレトグロビンを投与して、気管支拡張症と診断された患者において気管支拡張症の増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒト呼吸器セクレトグロビンを投与して、ある種の肺線維症と診断された患者において肺線維症の増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒト呼吸器セクレトグロビンを投与して、ある種の嚢胞性線維症と診断された患者において嚢胞性線維症の増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒト呼吸器セクレトグロビンを投与して、ＣＯＰＤと診断された患者においてＣＯＰＤの増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒト呼吸器セクレトグロビンを投与して、慢性気管支炎と診断された患者において慢性気管支炎の増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒト呼吸器セクレトグロビンを投与して、肺気腫と診断された患者において肺気腫の増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒト呼吸器セクレトグロビンを投与して、喘息と診断された患者において喘息の増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒト呼吸器セクレトグロビンを投与して、ＢＰＤと診断された患者においてＢＰＤの増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒト呼吸器セクレトグロビンを投与して、胎便吸引症候群（MAS）と診断された患者においてＭＡＳの増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒトＣＣ１０を投与して、気管支拡張症と診断された患者において気管支拡張の増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒトＣＣ１０を投与して、ある種の肺線維症と診断された患者において肺線維症の増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒトＣＣ１０を投与して、ある種の嚢胞性線維症と診断された患者において嚢胞性線維症の増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒトＣＣ１０を投与して、ＣＯＰＤと診断された患者においてＣＯＰＤの増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒトＣＣ１０を投与して、慢性気管支炎と診断された患者において慢性気管支炎の増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒトＣＣ１０を投与して、肺気腫と診断された患者において肺気腫の増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒトＣＣ１０を投与して、喘息と診断された患者において喘息の増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒトＣＣ１０を投与して、ＢＰＤと診断された患者においてＢＰＤの増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒトＣＣ１０を投与して、胎便吸引症候群（MAS）と診断された患者においてＭＡＳの増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒトＳＣＧＢ３Ａ２を投与して、気管支拡張症と診断された患者において気管支拡張の増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒトＳＣＧＢ３Ａ２を投与して、ある種の肺線維症と診断された患者において肺線維症の増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒトＳＣＧＢ３Ａ２を投与して、ある種の嚢胞性線維症と診断された患者において嚢胞性線維症の増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒトＳＣＧＢ３Ａ２を投与して、ＣＯＰＤと診断された患者においてＣＯＰＤの増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒトＳＣＧＢ３Ａ２を投与して、慢性気管支炎と診断された患者において慢性気管支炎の増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒトＳＣＧＢ３Ａ２を投与して、肺気腫と診断された患者において肺気腫の増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒトＳＣＧＢ３Ａ２を投与して、喘息と診断された患者において喘息の増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒトＳＣＧＢ３Ａ２を投与して、ＢＰＤと診断された患者においてＢＰＤの増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒトＳＣＧＢ３Ａ２を投与して、胎便吸引症候群（MAS）と診断された患者においてＭＡＳの増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒトＳＣＧＢ３Ａ１を投与して、気管支拡張症と診断された患者において気管支拡張の増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒトＳＣＧＢ３Ａ１を投与して、ある種の肺線維症と診断された患者において肺線維症の増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒトＳＣＧＢ３Ａ１を投与して、ある種の嚢胞性線維症と診断された患者において嚢胞性線維症の増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒトＳＣＧＢ３Ａ１を投与して、ＣＯＰＤと診断された患者においてＣＯＰＤの増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒトＳＣＧＢ３Ａ１を投与して、慢性気管支炎と診断された患者において慢性気管支炎の増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒトＳＣＧＢ３Ａ１を投与して、肺気腫と診断された患者において肺気腫の増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒトＳＣＧＢ３Ａ１を投与して、喘息と診断された患者において喘息の増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒトＳＣＧＢ３Ａ１を投与して、ＢＰＤと診断された患者においてＢＰＤの増悪を遅延または防止することである。
本発明のさらなる目的は、ヒトＳＣＧＢ３Ａ１を投与して、胎便吸引症候群（MAS）と診断された患者においてＭＡＳの増悪を遅延または防止することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
気道において発現されるセクレトグロビンタンパク質は、クララ細胞および他の気道上皮細胞ならびに機能的な気道上皮に存在する免疫構造の発生を促進する。ＳＣＧＢ１Ａ１（CC10、ウテログロビン、CCSP、CC16等とも呼ばれる）、ＳＣＧＢ３Ａ２（UGRP1、HIN-2とも呼ばれる）およびＳＣＧＢ３Ａ１（UGRP2、HIN-1とも呼ばれる）を含む、ヒトの気道において高度に発現される３種類のセクレトグロビンが存在する。
【００１２】
本発明は概して、環境曝露によって引き起こされる慢性疾患、特に呼吸器疾患の重度の増悪を遅延および防止するための呼吸器セクレトグロビンの使用に関する。組織レベルにおいて、呼吸器セクレトグロビンは、セクレトグロビン分泌細胞および呼吸器組織における関連する構造の数の増加を媒介し、これは、体液中のセクレトグロビン分泌産物の量の増加を通して間接的に測定することができる。例えば、ｒｈＣＣ１０の投与は、クララ細胞、ＮＥＢ、およびＮＥＣの数の増加を媒介し、気道上皮を回復させる。現在、これは、ＣＣ１０  ＫＯマウスの気道上皮表現型に整合し、重度の呼吸増悪からの非常に強力な長期的保護に関係するが肺線維症の一種である新生児ＢＰＤの防止には関係しない早産児におけるデータを説明する唯一の仮説である。
【００１３】
ｒｈＣＣ１０は新生児ＢＰＤの発症を防がなかったものの、それは再入院を必要とする重度の呼吸増悪からの長期的保護を与え、これは乳児が４０週間の在胎期間後の６カ月齢の時点であった６カ月ＰＭＡにおいて観察された。この試験は２４〜２８週ＰＭＡの乳児を登録していたため、このエンドポイントはｒｈＣＣ１０の単回投与後最長１０カ月である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１：ヒトＳＣＧＢ３Ａ２のアミノ酸配列、予測されるＮ末端と実際のＮ末端との比較を伴うヒトＳＣＧＢ３Ａ２アミノ酸配列のアライメントの図である。
【図２】図２：精製したｒｈＳＣＧＢ３Ａ２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、精製したｒｈＳＣＧＢ３Ａ２のＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である。各々１ｍＭ  ＤＴＴを添加および非添加で５マイクログラムを含む試料がＳＤＳ試料バッファーと混合され、５分間煮沸され、１０〜２０％トリシンゲル上に負荷された。ゲル泳動が行われ、クーマシーＲ２５０により染色された。ゲルは脱染色され、デジタルカメラで画像化された。
【図３】図３：精製ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２の等電点分離、ｒｈＣＣ１０およびＵＢＬおよびＤｅｎ−１と比較した、精製ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２の等電点分離の図である。各々５マイクログラムを含む試料がＮｏｖｅｘ  ＩＥＦゲル上に負荷された。ゲル泳動が行われ、クーマシーＲ２５０により染色された。ゲルは脱染色され、デジタルカメラで画像化された。矢印はＡＴＡ  Ｎ末端を有するｒｈＳＣＧＢ３Ａ２の主要なアイソフォームとマイナーなアイソフォームをあらわす。
【図４】図４：ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２によるｓＰＬＡ２−１Ｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害の図である。パネルＡ：ＵＮＩＢＩＰＹ基質；ＰＬＡ２なし；ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２なし。パネルＢ：ＵＮＩＢＩＰＹ基質＋ＰＬＡ２；ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２なし。パネルＣ：ＵＮＩＢＩＰＹ基質＋ＰＬＡ２＋ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２。ピーク＃１はＵＮＩＢＩＰＹリン脂質基質であり、ピーク＃２はｓＰＬＡ２による切断後の産物である。
【図５】図５：ヒトＴＡＦ中のＳＣＧＢ３Ａ２のウエスタンブロットの図である。抗ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２ウサギポリクローナル抗体を用いた、精製ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２と比較したヒト乳児からの気管吸引液のウエスタンブロット。各々２０マイクロリットルのＴＡＦを含む試料がＮｏｖｅｘ  １０〜２０％トリシンゲル上に負荷された；ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２はレーン１（５ナノグラム）とレーン８（１ナノグラム）である。ゲルは脱染色され、デジタルカメラで画像化された。
【図６】図６：ヒトＳＣＧＢ３Ａ２の競合的ＥＬＩＳＡの検量線の図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
１）早産児において観察されたｒｈＣＣ１０の単回投与による重度の呼吸増悪と再入院からの長期的な保護、２）ＣＣ１０  ＫＯマウスの気道上皮の表現型、および３）ＳＣＧＢ３Ａ２の「増殖因子」性を含む、３つの断片の証拠が組み合わされて、本発明が考案された（Guha, 2012; Kurotani, 2008; Kurotani, 2008a; Inoue, 2008; Niimi, 2001）。長年の研究にもかかわらず、気道上皮におけるＣＣ１０の役割に関しては、それが抗炎症作用を媒介すること以外は、周知のコンセンサスはない。アレルギー性鼻炎の鼻アレルゲン誘発モデルにおける最近の臨床試験の失敗は、そのｉｎ  ｖｉｖｏの抗炎症作用でさえも、あらゆる型の炎症性疾患に対して一貫したものではないことを示した（Widegren, 2009）。そして、完全なＣＣ１０の欠損にもかかわらず、クララ細胞はなおも、ＣＣ１０  ＫＯマウスの両系統の気道において見出される。ＣＣ１０およびＳＣＧＢ３Ａ２は構造的に類似しているものの、またそれゆえ、いくつかの機能を共有すると考えられるものの、ＣＣ１０による気道上皮細胞の増殖または発生の刺激に関する報告はなく、また、ｒｈＣＣ１０は実際のところ、気道上皮細胞株Ａ５４９（Szabo, 1998）を含む上皮起源の腫瘍細胞の増殖を抑制することがよく知られている（Kundu, 1996; Leyton, 1994）。
【００１６】
我々はそれにもかかわらず、出生の日に早産児に投与されたｒｈＣＣ１０が、ＣＣ１０分泌細胞の発生を刺激し、これは次いで、天然のＣＣ１０を生成し、これが、より多くのＣＣ１０分泌細胞の発生などを刺激したと考えている。結末は、あらゆる環境攻撃（ほこり、煙、アレルゲン、ＲＳＶ感染、インフルエンザ感染など）に対して、プラセボ処置乳児よりも耐性のｒｈＣＣ１０処置乳児における、より正常かつ弾力的な気道上皮であった。出生の日におけるｒｈＣＣ１０の単回投与は、重度の呼吸増悪による再入院からの１００％の保護を与えたが、これは、プラセボ処置乳児において観察された５０％の再入院率とは対照をなしている。
【００１７】
我々はさらに、気道上皮におけるＣＣ１０分泌細胞の発生を刺激するためのＣＣ１０の使用が、気道リモデリングがクララ細胞の喪失をもたらしている慢性呼吸器疾患を有する成人においても奏功すると考えている。ｒｈＣＣ１０による治療過程は疾患を治癒させないかもしれないが、しかし、クララ細胞と関連する構造をある程度回復させ、以降の環境攻撃に対して、その後、より耐性を示す、より正常な上皮をもたらすであろうと我々は考えている。すると、ｒｈＣＣ１０処置過程の臨床転帰は、次の重度増悪までの時間間隔の増大となるであろう。
【００１８】
我々はさらに、ＣＣ１０  ＫＯマウスにおけるクララ細胞欠損の気道上皮表現型は、ＣＣ１０がクララ細胞、関連する構造、および気道上皮の他の正常細胞集団の発生に必要とされるオートクリンおよびパラクリン因子であることを示唆していると考えている。我々は、ＣＣ１０が胃腸管および尿生殖路を含む、気道の外側のＣＣ１０分泌細胞の発生および維持に必要とされるオートクリンおよびパラクリン因子であると考えている。セクレトグロビンは構造的な類似性を共有しているため、それらは同様な機能も共有しているとの多くの推論がなされているが、しかしながら、これまでｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれにおいても、２つの何らかのセクレトグロビンの間で何らかの生物学的活性が共有されていることは全く示されていない。ここにおいて、我々は、ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２がブタの膵臓ホスホリパーゼＡ２をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害する能力をＣＣ１０と共有することを報告する。これは、ＣＣ１０以外の何らかの他のセクレトグロビンが、ホスホリパーゼＡ２酵素を実際に阻害する、つまり、何らかの型の抗炎症活性を有することの最初の報告である。これらの結果に基づき、我々は、呼吸器セクレトグロビンを含む、ｒｈＣＣ１０と構造的な類似性を共有する他のセクレトグロビンが、それらを分泌する細胞の発生および維持を刺激して、次の増悪までの時間の増大、次の増悪の重度の減少、および急性傷害後の重度増悪の防止などの、長期的臨床利益をもたらすことができると推論している。
【実施例】
【００１９】
実施例１：ＲＤＳを有する早産児におけるｒｈＣＣ１０による長期的保護
界面活性剤処置後（Levine, 2005）にｒｈＣＣ１０の安全性、薬物動態、抗炎症性が、プラセボ（ｎ＝７）、１．５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８）または５．０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝７）のｒｈＣＣ１０の気管内（IT）投与を受けた平均出生体重９３２ｇおよび平均在胎期間２６．９週間の呼吸促迫症候群（RDS）を有する早産児２２例の無作為化、プラセボ対照、二重盲検、多施設試験において評価された。ｒｈＣＣ１０処置乳児は、生後３日間にわたってＴＡＦ総細胞数（Ｐ＜０．００１）、好中球数（Ｐ＜０．００１）および総タンパク質濃度（Ｐ＜０．０１）における有意な減少、ならびに減少したＩＬ−６（Ｐ＜０．０７）を示した。ｒｈＣＣ１０は安全で、許容性がよかった。
【００２０】
著しいことに、そして少数にもかかわらず、修正在胎月齢（CGA）６カ月における乳児１７例のフォローアップは、表２に示されるように、プラセボを受けた３／６に比べて、ｒｈＣＣ１０を受けた０／１１が呼吸器の原因で病院に再入院したことを明らかにした（P<0.05、フィッシャーの正確確率検定、両側）。
【００２１】
【表２】
0006513632.tif 000003
【００２２】
６カ月ＣＧＡは、この文脈において、乳児の４０週間の妊娠期間後６カ月に対応する時間期間を意味すること、また、この試験の数例の乳児は、出生時に２４週の月経後年齢（PMA）であり、６カ月ＣＧＡのフォローアップ時点は、出生の日に投与されたｒｈＣＣ１０の単回投与後１０カ月も後に生じていることを考慮すると、この結果はさらに注目すべきものである。統計学的な観点からは、結果は、プラセボ群における再入院の少なくとも５７％の発生率に対して、ｒｈＣＣ１０群における少なくとも２７％の発生率を示している。これは非常に強力な長期的効果であり、これらのデータは、ｒｈＣＣ１０の投与の有意かつ前例のない長期的利益を例証している。
【００２３】
過剰なＣＣ１０が投与の４８時間以内に排除され、９〜１１時間の血清半減期を有することを薬物動態分析が示しているときに、このような甚大な長期利益が見られることは、さらに注目すべきことである（Levine, 2005）。有意な量のｒｈＣＣ１０がほぼ２日間、気管吸引液において観察され、６時間までに血清に達していたが、その後、腎臓によって濾過され、１２時間までに尿中に排出されていた。ｒｈＣＣ１０は、肺から血液へ、尿へと自然な生理学的分布経路をたどり、迅速な排除にもかかわらず、長期的利益を示した。
【００２４】
実施例２：ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２のクローニングと発現
図２は、これらの試験のために作製されたｒｈＳＣＧＢ３Ａ２のアミノ酸配列を示している。この配列はＧｅｎｅｂａｎｋ座位ＡＡＱ８９３３８から取得された。ユビキチン様（UBL）融合系を利用し、ＵＢＬプロテアーゼを用いてＵＢＬからｒｈＳＣＧＢ３Ａ２産物を放出させた組換え産物法の結果として、Ｎ末端は、哺乳類分泌タンパク質のコンセンサス単一ペプチド切断部位を用いて天然タンパク質から予測されるＮ末端とは異なっている。またそれは、ヒト体液試料から単離される実際のペプチドのＮ末端とも異なっている。これはヒスチジン精製タグを持たないヒトＳＣＧＢ３Ａ２の合成の最初の記述であり、タンパク質の安定性と活性に対するＮ末端の影響は予測できなかった。ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２のアミノ酸配列は表１に示されており、８１４７．８２ダルトンの予測される分子量と６．１の予測される等電点を有する。
【００２５】
ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２の合成ＤＮＡコード配列は、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌Ｋ１２株における発現に最適化されたコドン使用頻度を用いて、ｊｃａｔを用いて設計された（www.jcat.de）。ＤＮＡ配列が生成された後、ＵＢＬを既に含む細菌発現ベクターｐＴＸＢ１への遺伝子の方向性クローニングを容易にするために、末端に制限部位が付加された。ＳＣＧＢ３Ａ２は、ＵＢＬのＣ末端延長部分としてクローニングされた。方向性クローニングのためにＡｆｌＩＩ部位が５’端に配置され、ＢａｍＨＩ部位が３’端に配置された。
【００２６】
ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２の新たな遺伝子が、ＰＣＲを用いて重複するオリゴヌクレオチドから合成された。ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２遺伝子のＤＮＡ配列は：
CTTAAGAGGTGGTGCTACCGCTTTCCTGATCAACAAAGTTCCGCTGCCGGTTGACAAACTGGCTCCGCTGCCGCTGGACAACATCCTGCCGTTCATGGACCCGCTGAAACTGCTGCTGAAAACCCTGGGTATCTCTGTTGAACACCTGGTTGAAGGTCTGCGTAAATGCGTTAACGAACTGGGTCCGGAAGCTTCTGAAGCTGTTAAAAAACTGCTGGAAGCTCTGTCTCACCTGGTTTAGTAAGGATCC
である。
【００２７】
ＵＢＬ−ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２融合物を含むｐＴＸＢ１プラスミドが、融合タンパク質の誘導性発現を可能とするＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＥ３プロファージを含むＥ．ｃｏｌｉ株ＨＭＳ１７４／ＤＥ３中に形質転換された。融合タンパク質の発現についてコロニーがスクリーニングされ、高発現のものにおいてｒｈＳＣＧＢ３Ａ２遺伝子がＤＮＡ配列決定により再確認された。アンピシリンと共にＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ培地を含む４リットル発酵培養に、最高発現クローンの終夜培養１２０ｍｌが播種され、３７℃で増殖させられた。培養は８．７５のＯＤ６００においてＵＢＬ−ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２融合タンパク質を過剰発現させるために０．３ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導され、さらに２時間増殖させられた。細胞ペーストが遠心により回収され、ウェットな細胞ペースト収量は６７グラムであった。細胞ペーストはその後、ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２の精製のために使用された。
【００２８】
実施例３：ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２の精製
細胞ペーストは２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２に再懸濁され、細胞はその後、粗ライセートを生成するために凍結融解によって破壊された。粗ライセートは４℃、１９，８００×ｇで２０分間の遠心により清澄化された。ＤＮＡ、エンドトキシン、および他の細菌夾雑物は、０．０２５％の濃度のポリエチルイミン（PEI）と４℃、１９，８００×ｇで１０分間の第二の遠心を用いて、清澄化したライセートの上清から沈殿して除かれた。ＰＥＩ上清はその後、０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過され、１０ｍＭイミダゾールが濾液に加えられた。ＵＢＬとＵＢＬプロテアーゼはどちらもヒスチジンタグを含んでおり、そのため、それらは固定化金属アフィニティークロマトグラフィーカラムに結合する。ＵＢＬ−ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２融合タンパク質を含む濾液はその後、あらかじめ２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．２で平衡化したＩＭＡＣカラム（ニッケルキレート化セファロースファーストフロー）を通され、カラムは同じバッファーで洗浄され、その後、ＵＢＬ−ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２融合タンパク質は２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．２によって溶出された。ＩＭＡＣ溶出液はその後、濃縮され、１５ｍＭトリス、１５ｍＭビストリス、４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０の５ｋＤａ  ＮＭＷＣＯフィルターによるタンジェント流濾過を用いてバッファー交換された。夾雑物は結合し、ＵＢＬ−ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２は通過するＭａｃｒｏ  Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑカラム（BioRad）上でＵＢＬ−ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２はさらに精製された。ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２はその後、ＨＣｌで６．５にｐＨを調整した５ｍＭ  ＤＴＴ中のＵＢＬプロテアーゼＤｅｎ−１による３７℃で２時間の消化（１：１００モル比）によってＵＢＬから分離された。ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２はその後、陽イオン交換クロマトグラフィー（GE Sepharose SP High Performance）を用いて消化混合物から精製された。ＳＰカラムは１５ｍＭトリス、１５ｍＭビストリス、４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５で平衡化され、消化混合物が負荷され、夾雑物はカラムに結合する一方、ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２は通過した。ＳＰ通過画分はその後、３．５ｋＤａ  ＭＷＣＯ再生セルロース膜を用いて０．９％  ＮａＣｌに対して徹底的に透析された。試料は遠心濃縮機を用いて濃縮され（３．５ｋＤａ  ＭＷＣＯ）、その後、０．２２ミクロンフィルターを通して濾過された。濾液が精製ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２となった。図２は最終的な精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。それはＳＤＳ−ＰＡＧＥの濃度測定によると＞９７％の純度であり、ほぼ９５％が二量体、５％が単量体である。ｒｈＣＣ１０と同じく、還元剤によって二量体を単量体に完全に還元するのは難しい。
【００２９】
実施例４：ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２の等電点
タンパク質の等電点（pI）は、そのタンパク質の総表面電荷の測定値であり、ｐＩは標準的な等電点分離（IEF）法を用いて測定される。図３に示されているように、ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２のｐＩを決定するために、約５マイクログラムのｒｈＳＣＧＢ３Ａ２、ｒｈＣＣ１０、ＵＢＬ、およびＤｅｎ−１がＩＥＦゲル（Novex）上に負荷された。タンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の単一のバンドとして泳動し、ＩＥＦゲルにおいて複数のバンドが観察される場合、おそらくタンパク質の代替的なアイソフォームが存在する。ｐＩ４．８に単一のバンドを示すｒｈＣＣ１０とは対照的に、ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２はｐＩ６．７と６．３に２つのバンドを示す。我々のｒｈＳＣＧＢ３Ａ２配列の予測されるｐＩは６．１であるが（www.expasy.edu; Protein tool "Compute MW/pI"）、タンパク質の大部分は６．７のｐＩに対応する位置に泳動する。６．３のマイナーなバンドでさえ、予測される６．１のｐＩには対応していない。２つのｒｈＳＣＧＢ３Ａ２  ＩＥＦバンドが存在するということは、代替的な折りたたみのアイソフォームが存在するか、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて可視化されるように、それらが単量体と二量体に相当することのいずれかを意味する。
【００３０】
これらのｐＩはさらに、この調製物が、未知の予測されていない独特なｒｈＳＣＧＢ３Ａ２のアイソフォームであることを示している。組換えタンパク質の独特な折りたたみパターンはしばしば、合成プロセス、今回の場合、Ｎ末端の選択、ユビキチン様タンパク質とのＣ末端融合物としてのタンパク質の発現、融合タンパク質のＩＭＡＣ精製、ＵＢＬからのＳＣＧＢ３Ａ２の切断、ならびにＵＢＬおよびＵＢＬ−プロテアーゼからのＳＣＧＢ３Ａ２の分離によって決定される。よって、この調製物の特有性は、合成プロセス、非天然のＮ末端、またはこれらの組み合わせ、あるいは他の未知の因子によるものであり得る。
【００３１】
実施例５：ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２によるＰＬＡ２の阻害
ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２の生物学的活性は、異なるバッチのｒｈＣＣ１０の力価を評価するために開発された、ブタ膵臓分泌性ＰＬＡ２酵素（ｓＰＬＡ２）の阻害を評価する蛍光および定量的ＨＰＬＣアッセイにおいて評価された。ＰＬＡ２酵素の阻害は、ＣＣ１０の主要な抗炎症作用機序であると考えられている。多くの者が、他のセクレトグロビンもまた、ＣＣ１０とのそれらの構造的な類似性のために、ＰＬＡ２酵素を阻害しうると推測していた。ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２（５．５マイクログラム）が、１００ナノグラムのブタｓＰＬＡ２  １Ｂ（０．１マイクログラム）と混合され、３７℃でインキュベートされた。反応は、蛍光リン脂質アナログである２−デカノイル−１−（Ｏ−（１１−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）アミノ）ウンデシル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（UNIBIPYとも呼ばれる；47.6ナノグラム）の添加を通して開始された。１５分後、反応は２−プロパノール／ｎ−ヘキサンの添加により終結させられた。切断産物はＷａｔｅｒｓ  ＳｐｈｅｒｉｓｏｒｂシリカＨＰＬＣカラム上で基質から分離された。分離の後に続けて、Ｇ１３２１Ａ蛍光検出器が用いられた。
【００３２】
アッセイの結果は図４に示されている。パネルＡは、ｓＰＬＡ２またはｒｈＳＣＧＢ３Ａ２を伴わないＵＮＩＢＩＰＹ基質を示している；パネルＢはＵＮＩＢＩＰＹ基質＋ｓＰＬＡ２を示しており、パネルＣはＵＮＩＢＩＰＹ基質＋ｓＰＬＡ２＋ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２を示している。ｓＰＬＡ２は基質（ピーク＃１）を切断し、産物（ピーク＃２）を生じる。ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２の存在下では、産物のピークは有意に減少する。各反応セットは２回繰り返して実行された。アッセイにおいてｒｈＳＣＧＢ３Ａ２は、ｒｈＣＣ１０タンパク質に匹敵する、ｓＰＬＡ２−１Ｂ活性の８３％の阻害を示した（データは示さず）。
【００３３】
パーセント阻害は以下のようにして計算している：
％阻害＝｛１−（ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２による切断領域の平均／（ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２によらない切断領域の平均）｝×１００
【００３４】
ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２はブタ膵臓ｓＰＬＡ２を阻害し、活性のレベルはｒｈＣＣ１０に匹敵すると結論された。
【００３５】
実施例６：ヒト体液中の天然ＳＣＧＢ３Ａ２に対するｒｈＳＣＧＢ３Ａ２の比較
精製ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２は、標準的な免疫プロトコールを用いて２羽のニュージーランド白ウサギを免疫するために使用された。タンパク質はＫＬＨにコンジュゲートされ、フロイントのアジュバントと混合され、動物に注射された。両方の動物が、非常に高い力価を有する優れた抗体反応を生じた。ＩｇＧはＰｉｅｒｃｅプロテインＡ  ＩｇＧ精製キットを用いて動物の血清の各セットから精製され、精製したＩｇＧはＰＢＳ、ｐＨ７．２中に透析され、分注され、−８０℃で保存された。
【００３６】
抗体は、ヒト早産児から得られた気管吸引液（TAF）を用いて、ウエスタンブロットによって認定された。６例の乳児からの２０マイクロリットルのＴＡＦを含む試料が、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動され、ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２（５ナノグラム）と比較された。ゲルは、ＰＶＤＦ膜に電気ブロットされ、４％脱脂乳でブロッキングされ、その後、最も高い力価のウサギ抗ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２  ＩｇＧ（１：５０００希釈）がブロットと共にインキュベートされ、それにヤギ抗ウサギ−ＨＲＰコンジュゲート（１：２０，０００希釈）が続いた。ブロットは、強化化学ルミネッセンスを用いて現像された（4IPBA-ECL - 100mM Tris/HCl pH8.8、1.25mMルミノール、5.3mM過酸化水素および2mM 4IPBA）。５／６のＴＡＦ試料において免疫反応性のバンドが出現した。試料のうちの２つ（レーン３およびレーン６）は、ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２ホモ二量体と同じ大きさに泳動するバンドを含み、これは、一部の患者ではｒｈＳＣＧＢ３Ａ２調製物が天然のヒトＳＣＧＢ３Ａ２と似ていることを指し示している。動物またはヒトの試験における使用のための組換えタンパク質、特に疎水性タンパク質の異種性発現はしばしば、ミスフォールドしていたり、不活性であったり、免疫原性であったり、または他の理由で使用できない調製物を生じる。天然のＳＣＧＢ３Ａ２の実際のＮ末端が知られておらず、ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２のｐＩが予測と一致しなかったことを考慮すると、少なくとも一部のヒト試料が同様なタンパク質を含んでいたという観察は、我々の合成アプローチとｒｈＳＣＧＢ３Ａ２調製物を確証していた。５つ全ての反応性試料が２００ｋＤａの水準の高分子量種を含んでおり、また、全てが８〜１３ｋＤａサイズ範囲の複数の分離したバンドを含んでいたが、その一部は、単量体、二量体、および代替的なアイソフォームに対応しうる。また、２つの試料（レーン３およびレーン７）は、３．５ｋＤａより低い免疫反応性のスメアも含んでいたが、これはおそらく、ＳＣＧＢ３Ａ２分解産物をあらわしている。これは、天然のＳＣＧＢ３Ａ２がウエスタンブロットによって可視化された最初の例である。ウエスタンブロットに使用された抗ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２抗体は、次いでヒトＳＣＧＢ３Ａ２のＥＬＩＳＡを開発するために使用された。
【００３７】
実施例７：ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２のためのＥＬＩＳＡの開発
標準的な方法を用いて、競合的ＥＬＩＳＡが開発された。競合的なアッセイ形式においては、標的を捕捉する抗体がマイクロタイタープレートのウェル上にコーティングされ、次いで酵素をコンジュゲートさせた標的分子（標識された標的）を用いて、ウェル中の利用可能な部位への結合について、試料中のコンジュゲートされていない標的と競合させる。試料中の標的の濃度が増加するにつれて、ウェルに結合する標識された標的の量が減少する。ウサギ抗ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２抗体は、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｂプレート上にコーティングされ（２００ｎｇ／ｗｅｌｌ）、その後、ウェルは５％ショ糖、ＰＢＳ中２．５％ＢＳＡでブロッキングされ、その後、プレートは乾燥され、４℃で保存された。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）とｒｈＳＣＧＢ３Ａ２のコンジュゲートが作製され（Pierce kit- EZ-Link Maleimide Activated HRP kit, Cat# 31494）、１：１３０，０００希釈でアッセイに使用された。ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２を用いてキャリブレーター（１〜５００ｎｇ）が作製され、図６に示されているように、検量線が生成された。天然のＳＣＧＢ３Ａ２はその後、表３に示されているようにヒトＴＡＦ試料において定量された。
【００３８】
【表３】
0006513632.tif 000004
【００３９】
また、ＳＣＧＢ３Ａ２は、３例のヒト成人血清試料においても測定され、０、２９、および３２ｎｇ／ｍｌの値が返された。ＳＣＧＢ３Ａ２は、濃縮していないヒトの尿、または１０×濃縮の尿においては検出できなかった。アッセイの検出限界は５ｎｇ／ｍｌであった。
【００４０】
実施例８：
ａ）急性肺傷害を有する患者において、投与後１０カ月までの期間、重度の呼吸増悪による入院を防止するためのｒｈＣＣ１０の使用方法。
ｂ）頻繁な増悪を起こしている患者において、投与後少なくとも１カ月間、重度の呼吸増悪を防止するためのｒｈＣＣ１０の使用方法。
ｃ）慢性呼吸器状態（chronic respiratory condition）を有する患者において、投与後少なくとも１カ月の期間、重度の呼吸増悪による入院を防止するためのｒｈＣＣ１０の使用方法。
ｄ）慢性呼吸器状態がＣＯＰＤである、例ａ〜ｃの方法。
ｅ）慢性呼吸器状態が喘息である、例ａ〜ｃの方法。
ｆ）急性肺傷害を有する患者において、投与後１０カ月までの期間、重度の呼吸増悪による入院を防止するためのｒｈＳＣＧＢ３Ａ２の使用方法。
ｇ）頻繁な増悪を起こしている患者において、投与後少なくとも２カ月間、重度の呼吸増悪を防止するためのｒｈＳＣＧＢ３Ａ２の使用方法。
ｈ）慢性呼吸器状態を有する患者において、投与後少なくとも１カ月の期間、重度の呼吸増悪による入院を防止するためのｒｈＳＣＧＢ３Ａ２の使用方法。
ｉ）慢性呼吸器状態を有する患者において、投与後少なくとも２カ月の期間、重度の呼吸増悪による入院を防止するためのｒｈＳＣＧＢ３Ａ２の使用方法。
ｊ）慢性呼吸器状態が肺線維症である、例ｇ〜ｉの方法。
ｋ）慢性呼吸器状態が気管支拡張症である、例ｇ〜ｉの方法。
ＳＣＧＢ３Ａ２：
ｌ）配列番号１を含む、Ｎ末端ＡＴＡを有する組換えヒトＳＣＧＢ３Ａ２タンパク質の組成物。
ｍ）配列番号１に従うインタクトなＳＣＧＢ３Ａ２タンパク質を放出するために、ＵＢＬ融合タンパク質と、融合パートナーを認識し、融合パートナーとＳＣＧＢ３Ａ２の間で切断するＵＢＬプロテアーゼとを使用して、組換えヒトＳＣＧＢ３Ａ２を合成する方法。
ｎ）ＰＬＡ２酵素を阻害する、ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２の医薬組成物。
ｏ）６．３もしくは６．７またはその間の等電点に対応する等電点電気泳動用ゲルにおいて泳動する、ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２の医薬組成物。
ｐ）ホモ二量体を含む、ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２の医薬組成物。
ｑ）ＰＬＡ２酵素を阻害する６．７のｐＩを有するホモ二量体を含む、ｒｈＳＣＧＢ３Ａ２の医薬組成物。
【００４１】
本発明は、最も実際的かつ好ましい態様であると現在考えられるものに関して記述されているが、本発明は開示された態様に限定されるべきものではなく、逆に、添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれる様々な修正形態および均等な構成をカバーすることが意図されていると理解されよう。
【００４２】
略語および定義
ＣＣ１０：クララ細胞１０ｋＤａタンパク質
ＣＣＳＰ：クララ細胞分泌タンパク質
ＣＣ１６：クララ細胞１６ｋＤａタンパク質
ＳＣＧＢ１Ａ１：ＳＣＧＢ１Ａ１遺伝子によってコードされるタンパク質、ＣＣ１０、ＣＣＳＰ、ＣＣ１６、ウテログロビンと同じ
ＳＣＧＢ３Ａ１：ＳＣＧＢ３Ａ１遺伝子によってコードされるタンパク質、ＨＩＮ−１およびＵＧＲＰ２と同じ
ＳＣＧＢ３Ａ２：ＳＣＧＢ３Ａ２遺伝子によってコードされるタンパク質、ＨＩＮ−２およびＵＧＲＰ１と同じ
ＨＩＮ−１：ｈｉｇｈ−ｉｎ−ｎｏｒｍａｌタンパク質１
ＨＩＮ−２：ｈｉｇｈ−ｉｎ−ｎｏｒｍａｌタンパク質２
ＵＧＲＰ１：ウテログロビン遺伝子関連タンパク質１
ＵＧＲＰ２：ウテログロビン遺伝子関連タンパク質２
セクレトグロビン：ジスルフィド結合によって連結された４つのヘリックス束の単量体によって特徴付けられる、構造的に関連したタンパク質のファミリーからのタンパク質
呼吸器セクレトグロビン：ＳＣＧＢ１Ａ１、ＳＣＧＢ３Ａ１、およびＳＣＧＢ３Ａ２を含む、気道において高度に発現され、豊富なセクレトグロビン
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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