(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁気ビルディングブロックの自己組織化方法であって、
それぞれが複数の安定ラジカルを含む複数のビルディングブロックを液体培地に分散させる工程と、
前記複数のビルディングブロックの少なくとも一部と相互作用する磁場を確立する工程と、
前記複数のビルディングブロックの一部を前記液体培地における第１の位置から前記液体培地における第２の位置へと前記磁場により誘導する工程と、
前記第２の位置と近接する前記複数のビルディングブロックの一部を第１のコンストラクトへと組織化する工程と、
前記複数の安定ラジカルの少なくとも一部を中和するために、前記第１のコンストラクトを少なくとも１つの抗酸化剤で処理する工程と
を含む、磁気ビルディングブロックの自己組織化方法。
【請求項２】
前記複数のビルディングブロックを前記複数の安定ラジカルを含む組成物中でインキュベートする工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数のビルディングブロックの一部を前記コンストラクトへと組織化する工程が、前記第１のコンストラクトを含む前記ビルディングブロックの各々を共に架橋する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記複数のビルディングブロックが少なくとも１つの核酸、タンパク質、細胞、及び組織を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記複数のビルディングブロックが鉄、ニッケル及びコバルトを本質的に含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記複数のビルディングブロックの各々の密度が、前記複数のビルディングブロックが前記液体培地の表面に浮くように、前記液体培地の密度未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記複数のビルディングブロックが、少なくとも、第１の密度を有するビルディングブロックの第１の画分と、前記第１の画分との間の浮力に差があるように、前記第１の密度とは異なる第２の密度を有するビルディングブロックの第２の画分とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のコンストラクトを第１の液相に浸漬する工程と、
前記第１の液相の上部に第２の液相を形成する工程と、
第２のコンストラクトが、前記第１のコンストラクトの相対的に上にある前記第２の液相中に組織化されて、前記複数のビルディングブロックの少なくとも第２の部分を含む前記第２のコンストラクトを組織化する工程と、
前記第１の液相及び前記第２の液相の少なくとも１つを移動する工程をさらに含み、３次元構造を形成するために、この移動する工程によって、前記第１のコンストラクト上に前記第２のコンストラクトを積層する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記液体培地が前記複数のビルディングブロックに対する表面張力及び抵抗力を減少するための界面活性剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数の安定ラジカルを含む前記複数のビルディングブロックが常磁性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
磁性ビルディングブロックの自己組織化に対するシステムであって、
液体培地と、
前記液体培地を含有するための貯蔵器と、
前記液体培地中に分散させるための複数のビルディングブロックであって、各々が複数の安定ラジカルを含む複数のビルディングブロックと、
前記貯蔵器に対して確立された磁場であって、前記磁場は複数のビルディングブロックが前記液体培地中に分散されると、前記複数のビルディングブロックの少なくとも一部と相互作用し、前記液体培地の第１の位置から前記液体培地の第２の位置へと前記複数のビルディングブロックの一部を誘導して前記第２の位置に近接する前記複数のビルディングブロックの一部を第１のコンストラクトへと組織化するように操作可能である前記磁場と、
少なくとも前記複数の安定ラジカルの一部を中和するために、前記第１のコンストラクトを処理するための抗酸化剤を含む組成物と
を備える、磁性ビルディングブロックの自己組織化に対するシステム。
【請求項１２】
前記液体培地が前記複数のビルディングブロックに対する前記表面張力及び抵抗力を減少するための界面活性剤を含む、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記複数のビルディングブロックが少なくとも１つの核酸、タンパク質、細胞、及び組織を含む、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記複数のビルディングブロックが本質的に鉄、ニッケル、及びコバルトを含まない、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１５】
前記複数のビルディングブロックが前記液体培地の表面に浮くように、前記複数のビルディングブロックの各々の密度が前記液体培地の密度未満である、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１６】
前記複数のビルディングブロックが、前記第１の画分と前記第２の画分との間の浮力が異なるように、少なくとも、第１の密度を有するビルディングブロックの第１の画分及び前記第１の密度とは異なる第２の密度を有するビルディングブロックの第２の画分を含む、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１７】
前記磁場を確立するための永久磁石をさらに含む、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１８】
前記複数の安定ラジカルを含む前記複数のビルディングブロックが常磁性である、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１９】
前記第１のコンストラクトを含む前記複数のビルディングブロックの一部を架橋するための、少なくとも１つの紫外光源をさらに備える、請求項１１に記載のシステム。
【請求項２０】
磁性ビルディングブロックの自己組織化方法であって、
複数の安定ラジカルを含む組成物中で複数のビルディングブロックをインキュベートする工程と、
液体培地を含む貯蔵器に前記複数のビルディングブロックを分散させる工程と、
磁場が前記複数のビルディングブロックの少なくとも一部を包含し、永久磁石によって前記磁場を確立する工程と、
前記磁場によって前記複数のビルディングブロックの一部を、前記液体培地の第１の位置から前記液体培地の第２の位置へと誘導する工程と、
前記第２の位置に近接する前記複数のビルディングブロックの一部を第１のコンストラクトへと組織化する工程と、
前記第１のコンストラクトを含む前記複数のビルディングブロックの一部を架橋する工程と、
前記複数の安定ラジカルの少なくとも一部を中和するために、少なくとも１つの抗酸化剤で前記第１のコンストラクトを処理する工程
を含み、
前記複数のビルディングブロックが前記液体培地の表面に浮くように、前記複数のビルディングブロックの各々の密度が前記液体培地の密度未満である、磁性ビルディングブロックの自己組織化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１４年２月２６日付で出願された「不均質材料特性を含むコンストラクト及びそれを製造する方法」と題される米国仮特許出願番号第６１／９４４，７８７号、及び２０１４年８月１日付で出願された「可変磁覚ゲルの誘導型磁性自己組織化（Ｇｕｉｄｅｄ  ａｎｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｕｎａｂｌｅ  ｍａｇｎｅｔｏｃｅｐｔｉｖｅ  ｇｅｌｓ）」と題される米国仮特許出願番号第６２／０３２，１３０号に基づき、それらの利益を主張し、それらを参照により本明細書に援用する。
【０００２】
［連邦政府資金による研究開発の記載］
本発明は、全米科学財団によって与えられたＣＡＲＥＥＲ  Ａｗａｒｄ番号第１１５０７３３号、並びに国立衛生研究所によって与えられたＲ０１ＥＢ０１５７７６−０１Ａ１、Ｒ１５ＨＬ１１５５５６、及びＲ２１ＨＬ１１２１１４のもと政府援助により行われた。米国政府は、本発明に関して一定の権利を有する。
【０００３】
本開示は、概して、ビルディングブロックの自己組織化（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ）、より具体的には安定ラジカルを含む磁性ビルディングブロックの誘導型自己組織化に対するシステム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
自己組織化は、様々な微細構造で作られた不均質な機能性システムの並列製造に対する有望で非侵襲的な戦略である。流体力、表面エネルギー、磁気力、重力、静電力、又は毛管力等の原理を利用するいくつかの自己組織化研究が複数の用途に対して提示されてきた。これらの自己組織化方法は、超並列であることが多いため、ロボットアッセンブリ等の決定論的な方法よりも安価で迅速である。しかしながら、組織化の精度及び収率は自己組織化の確率的な特性のため連続したピック・アンド・プレイス・アッセンブリ（ｓｅｒｉａｌ  ｐｉｃｋ−ａｎｄ−ｐｌａｃｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）ほど高くはない。上記アッセンブリの収率を上げるため、組織化領域内で過剰な数の構成要素が使用された。したがって、ほとんどの流動性自己組織化方法で微細構造の冗長な大量加工が必要とされ、高収率の決定論的な組織化及び高スループットの自己組織化の利益が合わさった効率的で安価な自己組織化方法の開発に対するいまだ対処されていない要求がある。
【０００５】
一般的に、磁気を使用する微細成分の操作戦略は汎用性が高く、非接触で安価である。これらの戦略の大半において、磁性のマイクロメートルスケール又はナノメートルスケールのビーズを使用する。商業上の磁気ビーズは、ポリマーシェルにカプセル化されたニッケル及びコバルト等の少量の他の元素と共に、主に酸化鉄で作られる。重金属中毒のリスクについて、臨床用途におけるかかる磁気ビーズの使用及び放出を証明しなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、生物学的用途に対する重金属を含む可能性のない代替的なビーズの開発が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、磁気ビルディングブロックの自己組織化に対するシステム及び方法を提供することによって、上述の欠点を克服する。本開示のある一つの実施形態によれば、磁気ビルディングブロックの自己組織化方法は、液体培地に複数のビルディングブロックを分散させる工程であって、前記複数のビルディングブロックが各々複数の安定ラジカルを含む工程と、前記複数のビルディングブロックの少なくとも一部と相互作用する磁場を確立する工程と、複数のビルディングブロックの一部を前記液体培地における第１の位置から前記液体培地における第２の位置へと前記磁場により誘導する工程と、第２の位置と近接する前記複数のビルディングブロックの一部を第１のコンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）へと組織化する工程と、前記複数の安定ラジカルの少なくとも一部を中和するために前記第１のコンストラクトを少なくとも１つの抗酸化剤で処理する工程を含む。
【０００８】
ある一つの態様では、上記方法は、前記複数のビルディングブロックを前記複数の安定ラジカルを含む組成物中でインキュベートする工程を含む。
【０００９】
別の態様では、前記複数のビルディングブロックの一部を前記コンストラクトへと組織化する工程が、前記第１のコンストラクトを含む前記ビルディングブロックの各々を共に架橋する工程をさらに含む。例えば、ビルディングブロックの自己組織化に続いて、架橋性ポリマーを含む組成物をビルディングブロック上に被覆し、組織化されたコンストラクトを形成してもよい。その後、前記ポリマーを共に架橋することによって、ビルディンブロック間の架橋を形成し、組織化されたコンストラクトを安定化してもよい。
【００１０】
さらに別の態様では、前記複数のビルディングブロックは少なくとも１つの核酸、タンパク質、細胞及び組織を含む。核酸、タンパク質、細胞、又は組織は、ビルディングブロック上に被覆されてもよく、又はそれに組み込まれてもよい。
【００１１】
さらなる態様では、前記複数のビルディングブロックは、鉄、ニッケル、及びコバルトを本質的に含まない。ある一つの例では、前記複数のビルディングブロックが１００万分の約１００部（ｐｐｍ）未満の鉄、ニッケル、及びコバルトを含む場合、その複数のビルディングブロックは鉄、ニッケル及びコバルトを本質的に含まないとしてもよい。別の例では、複数のビルディングブロックが約１ｐｐｍ未満の鉄、ニッケル、及びコバルトを含む場合、その複数のビルディングブロックは鉄、ニッケル及びコバルトを本質的に含まないとしてもよい。さらに別の例では、複数のビルディングブロックが１０億分の約１部（ｐｐｂ）未満の鉄、ニッケル、及びコバルトを含む場合、その複数のビルディングブロックは鉄、ニッケル及びコバルトを本質的に含まないとしてもよい。
【００１２】
さらに別の態様では、前記複数のビルディングブロックの各々の密度は、前記複数のビルディングブロックが前記液体培地の表面に浮くように、前記液体培地の密度未満である。
【００１３】
ある一つの態様では、前記複数のビルディングブロックは、前記第１の画分と第２の画分の間の浮力に差があるように、少なくとも、第１の密度を有するビルディングブロックの第１の画分と、第１の密度とは異なる第２の密度を有するビルディングブロックの第２の画分とを含む。
【００１４】
別の態様では、上記方法は、前記第１のコンストラクトを第１の液相に浸漬する工程と、第１の液相の上部に第２の液相を形成する工程と、複数のビルディングブロックの少なくとも第２の部分を含む第２のコンストラクトを組織化する工程であって、前記第２のコンストラクトが前記第１のコンストラクトの相対的に上にある第２の液相中に組織化される工程と、前記第１の液相及び前記第２の液相の少なくとも１つを移動することによって、前記第１のコンストラクト上に前記第２のコンストラクトを積層して３次元構造を形成する工程をさらに含む。
【００１５】
さらに別の態様では、前記液体培地は前記複数のビルディングブロックに対する表面張力及び抵抗力を減少するための界面活性剤を含む。
【００１６】
さらなる態様では、複数の安定ラジカルを含む前記複数のビルディングブロックは常磁性である。
【００１７】
本開示の別の実施形態によれば、磁性ビルディングブロックの自己組織化に対するシステムは、液体培地と、液体培地を含有するための貯蔵器と、液体培地中に分散させるための複数のビルディングブロックであって、各々が複数の安定ラジカルを含む複数のビルディングブロックと、前記貯蔵器に対して確立された磁場であって、前記複数のビルディングブロックが前記液体培地中に分散されると、前記複数のビルディングブロックの少なくとも一部と相互作用する前記磁場であって、前記液体培地の第１の位置から前記液体培地の第２の位置へと前記複数のビルディングブロックの一部を誘導して前記第２の位置に近接する前記複数のビルディングブロックの一部を第１のコンストラクトへと組織化するように操作可能である前記磁場と、前記第１のコンストラクトを処理して少なくとも前記複数の安定ラジカルの一部を中和するための抗酸化剤を含む組成物、を備える。
【００１８】
ある一つの態様では、液体培地は前記複数のビルディングブロックに対する表面張力及び抵抗力を減少するための界面活性剤を含む。
【００１９】
別の態様では、前記複数のビルディングブロックは少なくとも１つの核酸、タンパク質、細胞、及び組織を含む。
【００２０】
さらに別の態様では、前記複数のビルディングブロックは本質的に鉄、ニッケル、及びコバルトを含まない。
【００２１】
さらなる態様では、前記複数のビルディングブロックが前記液体培地の表面に浮くように、前記複数のビルディングブロックの各々の密度は前記液体培地の密度未満である。
【００２２】
ある一つの態様では、前記複数のビルディングブロックは、前記第１の画分と前記第２の画分との間の浮力が異なるように、少なくとも、第１の密度を有するビルディングブロックの第１の画分及び前記第１の密度とは異なる第２の密度を有するビルディングブロックの第２の画分を含む。
【００２３】
別の態様では、前記システムは磁場を確立するための永久磁石をさらに含む。
【００２４】
さらに別の態様では、複数の安定ラジカルを含む前記複数のビルディングブロックは常磁性である。
【００２５】
さらなる態様では、前記システムは、前記第１のコンストラクトを含む前記複数のビルディングブロックの一部を架橋するための、少なくとも１つの紫外光源をさらに備える。
【００２６】
本開示のさらなる別の実施形態によれば、磁性ビルディングブロックの自己組織化方法は、複数の安定ラジカルを含む組成物中で複数のビルディングブロックをインキュベートする工程と、液体培地を含む貯蔵器に上記複数のビルディングブロックを分散させる工程と、永久磁石によって前記磁場を確立する工程であって、前記磁場が前記複数のビルディングブロックの少なくとも一部を包含する工程と、前記複数のビルディングブロックの一部を前記液体培地の第１の位置から前記液体培地の第２の位置へと前記磁場により誘導する工程と、前記第２の位置に近接する前記複数のビルディングブロックの一部を第１のコンストラクトへと組織化する工程と、前記第１のコンストラクトを含む前記複数のビルディングブロックの一部を架橋する工程、及び少なくとも１つの抗酸化剤で前記第１のコンストラクトを処理して前記複数の安定ラジカルの少なくとも一部を中和する工程、を含む。前記複数のビルディングブロックが前記液体培地の表面に浮くように、前記複数のビルディングブロックの各々の密度が前記液体培地の密度未満である。
【００２７】
本開示のさらなる実施形態によれば、ビルディングブロックの自己組織化方法は、常磁性液体培地中に複数のビルディングブロックを分散させる工程と、前記常磁性液体培地と相互作用する磁場を確立する工程と、前記複数のビルディングブロックの一部を前記液体培地の第１の位置から前記常磁性液体培地の第２の位置へと前記磁場により誘導する工程と、前記第２の位置に近接する前記複数のビルディングブロックの一部を第１のコンストラクトへと組織化する工程とを含む。
【００２８】
本発明の上記の態様及び他の態様、並びに利点は、以下の記載から明らかとなる。本明細書では、本発明の好ましい実施形態の説明として示される、本明細書の一部をなす添付の図面が参照される。しかしながら、かかる実施形態は、必ずしも本発明の全ての範囲を表すものではなく、したがって特許請求の範囲及び本明細書における本発明の範囲の解釈のため参照される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】ＵＶ光架橋による細胞カプセル化ヒドロゲルの微細加工に対するシステムの例の略図である。５０μｌのゲル前駆体溶液をガラススライド上にピペットで移した後、ＵＶ光（５００ｍＷ、ゲルの上５０ｍｍの高さ）に２０秒間暴露した。異なるパターンを有するいくつかの種類のフォトマスクを用いた。
【図１Ｂ】円形（左上）、三角（右上）、ジグザグ形（左下）、及びＬ形（右下）のビルディングブロックを含む４つの実施例群のビルディングブロックの例の平面図を示す略図である。
【図１Ｃ】ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）中のＯｐｔｉＰｒｅｐ（２０〜３０（ｖ／ｖ）％）及びＴｗｅｅｎ−８０（０．００１（ｖ／ｖ）％）で構成される液体貯蔵器で永久ＮｄＦｅＢ磁石を使用するヒドロゲルビルディングブロックの誘導型常磁性自己組織化に対するシステムの例の略図である。組織化に続いて、微量の前駆体溶液をアッセンブリに射出する。二次ＵＶ架橋を行って全体的な形状を安定化させる。ビタミンＥ処理を適用して、組織化されたヒドロゲルの磁気を切り、順にヒドロゲルにカプセル化される細胞の生存率を増す。
【図１Ｄ】磁石と液体培地の表面との間の距離の関数としてのビルディングブロックの操作の略図である。
【図１Ｅ】磁石と液体培地の表面の間の１ｍｍ、２ｍｍ及び３ｍｍの速度距離（ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｄｉｓｔａｎｃｅｓ）の棒グラフである。単一のＰＥＧＤＭＡゲルを磁石の中心から１．５ｃｍ離して置いた。一旦磁石が固定されると、磁石の中心に向かうゲルの運動が記録された。磁石とゲルの間の垂直距離が制御された（１ｍｍ、２ｍｍ、及び３ｍｍ）。ゲルの最初と最後の位置の間の距離を経過時間で除して平均速度を計算した。ゲルの磁化に２００ｍｇ  ｍｌ−１の４−アミノ−ＴＥＭＰＯが使用された。
【図１Ｆ】種々のビタミンＥインキュベーション時間に対するビルディングブロックの平均速度を示す棒グラフである。６０分間のビタミンＥインキュベーションに関し、６つのゲルのうち２つのみが動いた。
【図１Ｇ】アンチヘルムホルツ配置（すなわち、同じ極が向き合う配置）の２つの永久ＮｄＦｅＢ磁石を使用するラジカル溶液中のヒドロゲルの浮揚自己組織化に対するシステムの例の立体視の略図である。ラジカル溶液（χ培地）とゲル（χ対象物）の磁化率（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）の正の差がゲルの浮揚組織化を導く。
【図１Ｈ】アンチヘルムホルツ配置（すなわち、同じ極が向き合う配置）の２つの永久ＮｄＦｅＢ磁石を使用するラジカル溶液中のヒドロゲルの浮揚自己組織化に対するシステムの例の立体視の略図である。ラジカル溶液（χ培地）とゲル（χ対象物）の磁化率（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）の正の差がゲルの浮揚組織化を導く。
【図２Ａ】１０時間〜１５時間にわたって、ＰＢＳ中、０ｍｇ  ｍｌ−１、１０ｍｇ  ｍｌ−１、３０ｍｇ  ｍｌ−１、又は１５０ｍｇ  ｍｌ−１の４−アミノ−ＴＥＭＰＯの安定ラジカルを含む溶液に浸漬した２０％ＰＥＧＤＭＡビルディングブロックに対する磁場強度の関数としての振幅を示す電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトルである。ビルディングブロックは、直径３ｍｍ及び高さ１．５ｍｍを有する円筒であった。
【図２Ｂ】図２Ａで分析されたビルディングブロックの画像である。ビルディングブロックは、ラジカル濃度に依存する変色を示した。
【図２Ｃ】１０時間〜１５時間にわたって、ＰＢＳ中、０ｍｇ  ｍｌ−１、１０ｍｇ  ｍｌ−１、３０ｍｇ  ｍｌ−１、又は１５０ｍｇ  ｍｌ−１の４−アミノ−ＴＥＭＰＯの安定ラジカルを含む溶液に浸漬した５０％ＰＥＧＤＭＡビルディングブロックに対する磁場強度の関数としての振幅を示すＥＰＲスペクトルである。ビルディングブロックは、直径３ｍｍ及び高さ１．５ｍｍを有する円筒であった。
【図２Ｄ】図２Ｃで分析されたビルディングブロックの画像である。ビルディングブロックは、ラジカル濃度に依存する変色を示した。
【図２Ｅ】１０時間〜１５時間にわたって、ＰＢＳ中、０ｍｇ  ｍｌ−１、１０ｍｇ  ｍｌ−１、３０ｍｇ  ｍｌ−１、又は１５０ｍｇ  ｍｌ−１の４−アミノ−ＴＥＭＰＯの安定ラジカルを含む溶液に浸漬した５％ＧｅｌＭＡビルディングブロックに対する磁場強度の関数としての振幅を示すＥＰＲスペクトルである。ビルディングブロックは、直径３ｍｍ及び高さ１．５ｍｍを有する円筒であった。
【図２Ｆ】図２Ｅで分析されたビルディングブロックの画像である。ビルディングブロックは、ラジカル濃度に依存する変色を示した。
【図２Ｇ】ＰＢＳ中、０ｍｇ  ｍｌ−１、１０ｍｇ  ｍｌ−１、３０ｍｇ  ｍｌ−１、又は１５０ｍｇ  ｍｌ−１の４−アミノ−ＴＥＭＰＯの安定ラジカルを含む安定ラジカル溶液に一晩浸漬した後の２０％ＰＥＧＤＭＡ、５０％ＰＥＧＤＭＡ、及び５％ＧｅｌＭＡのビルディングブロックに対するラジカル濃度の関数としてのスピン密度の比較を示す棒グラフである。エラーバーは平均からの標準偏差を表す。
【図２Ｈ】ビルディングブロック試料ｓ１、ｓ２、及びｓ３に対する磁場強度の関数としての振幅を示すＥＰＲスペクトルである。試料ｓ１は、安定ラジカル溶液に浸漬されたＰＥＧＤＭＡヒドロゲルビルディングブロックであった。試料ｓ２は、安定ラジカル溶液に浸漬した後、ＰＢＳ（ビタミンＥを含まない）に移したＰＥＧＤＭＡヒドロゲルビルディングブロックであった。試料ｓ３は、安定ラジカル溶液に浸漬した後、０．５ｍｇ  ｍｌ−１のビタミンＥを含む溶液に移した、ＰＥＧＤＭＡヒドロゲルビルディングブロックであった。
【図２Ｉ】試料ｓ１、ｓ２、及びｓ３に対するスピン密度を示す棒グラフである。台形則を使用して図２ＨのＥＰＲスペクトルを統合することによってコンピューターでスピン密度を計算した。個々の群をつなぐ水平線は、統計学的な有意差（ｐ＜０．０５）を表す。エラーバーは平均からの標準偏差を表す。
【図３Ａ】３０分間に亘るＰＢＳ中に１０ｍｇ  ｍｌ−１、３０ｍｇ  ｍｌ−１、又は１５０ｍｇ  ｍｌ−１の４−アミノ−ＴＥＭＰＯの安定ラジカルを含む溶液に浸漬したヒドロゲルビルディングブロックに対する安定ラジカル濃度の関数としての磁化時間のプロットである。
【図３Ｂ】３０分間、ＰＢＳ中に１０ｍｇ  ｍｌ−１、３０ｍｇ  ｍｌ−１、又は１５０ｍｇ  ｍｌ−１の４−アミノ−ＴＥＭＰＯの安定ラジカルを含む溶液に浸漬したヒドロゲルビルディングブロックに対する安定ラジカル濃度の関数としての１５秒以内の磁場への初期暴露で磁気応答性（ｍａｇｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ）であったヒドロゲルビルディングブロックの画分（％）のプロットである。
【図３Ｃ】３０分間、ＰＢＳ中に１０ｍｇ  ｍｌ−１、３０ｍｇ  ｍｌ−１、又は１５０ｍｇ  ｍｌ−１の４−アミノ−ＴＥＭＰＯの安定ラジカルを含む溶液に浸漬したヒドロゲルビルディングブロックに対する安定ラジカル濃度の関数としての１分以内の磁場への初期暴露で磁気応答性であったヒドロゲルビルディングブロックの画分（％）のプロットである。
【図３Ｄ】３０分間、ＰＢＳ中に４−アミノ−ＴＥＭＰＯの安定ラジカルを含む溶液に浸漬した２０％ＰＥＧＤＭＡヒドロゲルビルディングブロックに対する時間の関数としての磁場への初期暴露の後に磁気応答性であったヒドロゲルビルディングブロックの画分（％）のプロットである。
【図３Ｅ】３０分間、ＰＢＳ中に４−アミノ−ＴＥＭＰＯの安定ラジカルを含む溶液に浸漬した５０％ＰＥＧＤＭＡヒドロゲルビルディングブロックに対する時間の関数としての磁場への初期暴露の後に磁気応答性であったヒドロゲルビルディングブロックの画分（％）のプロットである。
【図３Ｆ】３０分間、ＰＢＳ中に４−アミノ−ＴＥＭＰＯの安定ラジカルを含む溶液に浸漬した５％ＧｅｌＭａヒドロゲルビルディングブロックに対する時間の関数としての磁場への初期暴露の後に磁気応答性であったヒドロゲルビルディングブロックの画分（％）のプロットである。
【図３Ｇ】１日間の１０ｍｇ  ｍｌ−１の４−アミノ−ＴＥＭＰＯの安定ラジカルを含む溶液中の２０％ＰＥＧＤＭＡヒドロゲルビルディングブロックの浸漬後の経過時間の関数としての磁化時間のプロットである。
【図３Ｈ】１日間の３０ｍｇ  ｍｌ−１の４−アミノ−ＴＥＭＰＯの安定ラジカルを含む溶液中の２０％ＰＥＧＤＭＡヒドロゲルビルディングブロックの浸漬後の経過時間の関数としての磁化時間のプロットである。
【図３Ｉ】１日間の１５０ｍｇ  ｍｌ−１の４−アミノ−ＴＥＭＰＯの安定ラジカルを含む溶液中の２０％ＰＥＧＤＭＡヒドロゲルビルディングブロックの浸漬後の経過時間の関数としての磁化時間のプロットである。
【図３Ｊ】図３Ｄ、図３Ｅ、及び図３Ｆによるデータに対してフィットさせた指数曲線を示す経過時間に対する関数としての磁気応答性ゲル（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｇｅｌｓ）の割合のプロットである。
【図４Ａ】本開示によるビルディングブロックから組織化されたコンストラクトの一連の画像である。パネルａ及びｂはＰＥＧＤＭＡ及びＧｅｌＭＡヒドロゲルで構成される棒状のアッセンブリである。パネルｃはＰＥＧＤＭＡのテトリス様のアッセンブリである。パネルｄはＧｅｌＭＡの正方形のアッセンブリである。パネルｅはＰＥＧＤＭＡの花様のアッセンブリである。パネルｆ〜ｈはＰＥＧＤＭＡヒドロゲルの六角形のアッセンブリである。パネルｉ〜ｋはＰＥＧＤＭＡヒドロゲルのより複雑なアッセンブリである。パネルｌ〜ｎはＰＥＧＤＭＡとＧｅｌＭＡの両方を含む不均質なアッセンブリである。パネルｏ〜ｑはショ糖浸出マクロ多孔性及びナノ多孔性のＰＥＧＤＭＡゲルを含む不均質多孔性アッセンブリである。パネルｒ〜ｔは質量密度に不均質性を有する（グラスバブルカプセル化軽ＰＥＧＤＭＡゲル及びより重いＰＥＧＤＭＡゲル共に）アッセンブリである。
【図４Ｂ】３つの連続する時点、ｔ１、ｔ２、及びｔ３でのコンストラクトの自己組織化を示す一連の画像である。スケールバーは１ｍｍを表す。
【図４Ｃ】３層のマクロ多孔性（ｘ形）及びナノ多孔性（ｏ形）の５０％ＰＥＧＤＭＡゲルで構成される３Ｄ不均質ゲルの側面図である。
【図４Ｄ】図４Ｃのゲルの上部平面図である。ゲルの断面は５ｍｍ×５ｍｍである。
【図４Ｅ】標準及びマクロ多孔性のゲルに関するヤング率、終局応力、及び終局歪を示す棒グラフである。エラーバーは平均の標準誤差を示す。
【図４Ｆ】標準（実線）、マクロ多孔性（破線）及び複合体（点線）のヒドロゲルビルディングブロックに対する圧縮歪みの関数としての圧縮応力のプロットである。
【図４Ｇ】ＰＥＧＤＭＡ２０％（左）及びＰＥＧＤＭＡ５０％ゲル（右）の常磁性アッセンブリの画像である。
【図４Ｈ】ビルディングブロックの自己組織化用の貯蔵器の別の実施形態の略図である。円形のウェルは、異なる群のビルディングブロックに対して開始位置を提供する。
【図５Ａ】３０ｍｇ  ｍｌ−１の４−アミノ−ＴＥＭＰＯに３０分間浸漬した対照群（ａ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｒｏｕｐ）（安定ラジカルなし）及びラジカル群について、０日、３日、及び６日（上から下）で示されるＧｅｌＭＡヒドロゲルにカプセル化された３Ｔ３細胞の明視野（対照）及び蛍光画像を含む一連の画像である。
【図５Ｂ】０日、１日、３日、５日、７日の細胞懸濁物の体積に対する添加された安定ラジカル懸濁物の体積の体積対体積の比（体積／体積）の関数としてのＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイの結果を示す棒グラフである。ヒストグラムは、安定ラジカルの存在下での細胞の増殖を示した。陽性対照はラジカルを含まない細胞を表す。陰性対照は、ＭＴＴ試薬のみである。全ての結果を陰性対照に関して正規化した。エラーバーは平均の標準誤差を表す。各群の棒グラフについて左から右へ、０日、１日、３日、５日、及び７日。
【図５Ｃ】０日、３日、５日、及び７日後の細胞成長を示す棒グラフである。ヒドロゲルビルディングブロックを３０ｍｇ  ｍｌ−１の４−アミノ−ＴＥＭＰＯを含む安定ラジカル溶液に３０分間浸漬した後、１％、５％、１０％、又は５０％のビタミンＥを含む抗酸化剤溶液に暴露した。エラーバーは平均からの標準誤差を表す。各群の棒グラフについて左から右へ、１％ビタミンＥ、５％ビタミンＥ、１０％ビタミンＥ、及び５０％ビタミンＥ、陰性対照、陽性対照、及びラジカル対照。
【図５Ｄ】図５Ｃに対応する細胞生存率の％変化を示す棒グラフである。各群の棒グラフについて左から右へ、１％ビタミンＥ、５％ビタミンＥ、１０％ビタミンＥ、及び５０％ビタミンＥ。
【図５Ｅ】０日、１日、３日、５日及び７日後の細胞成長を示す棒グラフである。ヒドロゲルビルディングブロックを１０ｍｇ  ｍｌ−１、３０ｍｇ  ｍｌ−１、又は１５０ｍｇ  ｍｌ−１の４−アミノ−ＴＥＭＰＯを含む安定ラジカル溶液に浸漬し、ビタミンＥ用液（１００％（体積／体積））に暴露した。図の説明中、「１０ｒ」等の「ｒ」による標識は、１０ｍｇ  ｍｌ−１を含む安定ラジカル溶液中に浸漬されたヒドロゲルに対応し、「ｒｖ」による標識は浸漬後にビタミンＥに暴露されたゲルに対応する。結果は、高濃度のラジカル、例えば、１５０ｍｇ  ｍｌ−１（及び３０分間のインキュベーション）について、ビタミンＥは細胞の回復をそれほど補助しないことを示した。エラーバーは平均からの標準誤差を表す。各群の棒グラフについて左から右へ、１０ｒ、１０ｒｖ、３０ｒ、３０ｒｖ、１５０ｒ、１５０ｒｖ、陽性対照、陰性対照。
【図５Ｆ】図５Ｅに対応する細胞生存率における％変化を示す棒グラフである。各群の棒グラフについて左から右へ、１０ｍｇ  ｍｌ−１、３０ｍｇ  ｍｌ−１、及び１５０ｍｇ  ｍｌ−１の４−アミノ−ＴＥＭＰＯ。
【図５Ｇ】３Ｔ３カプセル化ＧｅｌＭＡヒドロゲルビルディングブロックの正方形（左）、棒状形状（中央）、及びＬ形（右）のコンストラクトの一連の蛍光画像である。スケールバーは２００μｍを表す。明確にするため画像を反転した。
【図５Ｈ】安定ラジカルを含まない対照試料に対する心筋細胞カプセル化ＧｅｌＭＡヒドロゲルビルディングブロックの一連の蛍光画像である。細胞をマウス抗−α−アクチニン（サルコメアの）及び抗ＧＡＴＡ−４で染色した。アクチン細胞骨格をファロイジンで可視化し、核対比染色としてＤＡＰＩを使用した。全ての画像を１０日で示した。スケールバーは２００μｍを表す。明確にするため画像を反転した。
【図５Ｉ】安定ラジカル及びビタミンＥ暴露ゲルの倍率４０倍の試料に対する心筋細胞カプセル化ＧｅｌＭＡヒドロゲルビルディングブロックの一連の蛍光画像である。細胞をマウス抗−α−アクチニン（サルコメアの）及び抗ＧＡＴＡ−４で染色した。アクチン細胞骨格をファロイジンで可視化し、核対比染色としてＤＡＰＩを使用した。全ての画像を１０日で示した。スケールバーは１００μｍを表す。明確にするため画像を反転した。
【図５Ｊ】３Ｔ３カプセル化ＧｅｌＭＡヒドロゲルビルディングブロックの免疫細胞化学染色を示す一連の蛍光画像である。ヒドロゲルを１０ｍｇ  ｍｌ−１の４−アミノ−ＴＥＭＰＯ（左上、右上）又は３０ｍｇ  ｍｌ−１の４−アミノ−ＴＥＭＰＯ（左下、右下）のいずれかを含む安定ラジカル溶液に浸漬した後、ビタミンＥを含む溶液に浸漬した。ＧｅｌＭＡヒドロゲル中の細胞をＫｉ６７核増殖特異的マーカーで染色した。ファロイジン  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ６４７及びＤＡＰＩは、それぞれ細胞の細胞骨格及び核を示す。左上及び左下の画像は、ファロイジン及びＫｉ６７により、右上及び右下の画像はＤＡＰＩ及びＫｉ６７による。スケールバーは１００μｍである。
【図５Ｋ】１０ｍｇ  ｍｌ−１、３０ｍｇ  ｍｌ−１、９０ｍｇ  ｍｌ−１、及び１５０ｍｇ  ｍｌ−１の４−アミノ−ＴＥＭＰＯを含む種々の濃度の安定ラジカル溶液とインキュベートした３Ｔ３細胞の生存率、並びに１％、２％、５％、１０％、及び５０％を含む細胞懸濁物の体積に対するラジカル溶液の体積対体積比の範囲について示す棒グラフである。種々の濃度の安定ラジカルとのインキュベーションの直後に３Ｔ３細胞の生存率を分析するため、ＭＴＴアッセイを行った。
【図６Ａ】アンチヘルムホルツ配置の２つの磁石によって作り出された磁場ノルム（輪郭）及び流速密度（矢印）のシミュレーションに対するヒートマップである。
【図６Ｂ−Ｃ】図６Ｂは、アンチヘルムホルツ配置の永久ＮｄＦｅＢ磁石（同じ極が向かい合う）で構成される磁石セットアップに入れる前のラジカル溶液貯蔵器における１×１ｃｍ２の２０％ＰＥＧＤＭＡヒドロゲルの画像である。図６Ｃは、アンチヘルムホルツ配置（同じ極が向かい合う）の永久ＮｄＦｅＢ磁石で構成される磁石セットアップに入れた後の図６Ｂのヒドロゲルの画像である。
【図６Ｄ−Ｅ】図６Ｄは、図６Ｃの磁石セットアップに入れる前のガドリニウム（Ｇｄ）溶液中の非ラジカル化（左）及びラジカル化（右）された１×１ｃｍ２のヒドロゲルの画像である。図６Ｅは、図６Ｃの磁石セットアップに入れた後の図６Ｄのヒドロゲルの画像である。
【図６Ｆ−Ｇ】図６Ｆは、図６Ｃの磁石セットアップに入れる前のＧｄ溶液中の非ラジカル化及びラジカル化された１×１ｍｍ２のヒドロゲルの画像である。図６Ｇは、図６Ｃの磁石セットアップに入れた後の図６Ｆのヒドロゲルの画像である。
【図６Ｈ】Ｇｄ及びラジカル溶液における５００μｍのポリスチレンビーズの浮揚誘導型自己組織化に対する時間の関数としての組織化領域を示すプロットである。エラーバーは、平均からの標準偏差を表す。
【図６Ｉ−Ｊ】図６Ｉは、ラジカル溶液中での組織化の前に撮影された図６Ｈのシステムの画像である。図６Ｊは、ラジカル溶液中での組織化後に撮影した図６Ｈのシステムの画像である。
【図６Ｋ】本開示による浮揚（ｌｅｖｉｔａｔｉｏｎ）に対するシステムの例の概要である。
【図６Ｌ】ビーズと懸濁液の間の密度差（ｐビーズ−ｐｍ）の範囲に対するアンチヘルムホルツ配置の２つの磁石間の距離の関数としての分析的平衡の高さのプロットである。矢印の方向で密度差が増加する。懸濁液は、０．１４１Ｍ  Ｇｄであり、２つの磁石間のギャップ＝２６ｍｍ、底部磁石の上面中心における磁場大きさ＝０．３７５Ｔである。
【図６Ｍ】浮揚自己組織化の高さに対するアンチヘルムホルツ配置の２つの磁石の間の距離の効果を示す棒グラフである。磁石は、チャンバー底面及び上面と接触した。１．５ｃｍ、２．６ｃｍ及び３．６ｃｍを含む距離の範囲について実験を行った。組織化されたビルディングブロックの最も高い点と最も低い点を平均することによって浮揚高さを計算した。
【図６Ｎ】時間の関数として組織化されたビーズ（ビルディングブロック）の数を示すプロットである。全ての実験で４５個のビーズを貯蔵器に入れた。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
また、上で議論されたように、様々な状況において、様々な構成成分の自己組織化に対するシステム及び方法を提供することが有用な可能性がある。ある一つの態様では、自己組織化のプロセスは、長さスケールの範囲にわたって、単純な機能性パターンと複雑な機能性パターンの両方を生み出す場合がある。例えば、マイクロスケールパターンを生み出す自己組織化プロセスは、本質的に共通している。これらのプロセスは、オプトエレクトロニクス、微細加工、センサー、組織工学、コンピュテーション等の多様な分野における使用について、実験室で再現されてきた。しかしながら、多くの自己組織化プロセスは、生体系と適合性でない可能性のある構成成分を含む。ある一つの例では、磁気操作及び組織化に対するビーズ又は他の材料は、１又は複数の重金属を含む場合がある。これらの重金属は、生体組織又は生物と非適合性であると知られている場合がある。代替的には（又は追加的には）、生態系に対する重金属の影響は未知又は予測不可能な可能性があり、それに関して大規模な臨床試験が関与し、重金属材料を含むシステム及び方法の実施を遅延又は阻止する場合がある。さらなる要因として生じ得る様々な他の挑戦が考慮される。
【００３１】
磁性自己組織化のための開示されるシステム及び方法の使用は、これら及び他の問題に対処し得る。ある一つの実施形態では、安定ラジカルを使用して、磁性可変ゲル又は他の磁覚材料の自己組織化を誘導してもよい。本明細書では、「磁覚（ｍａｇｎｅｔｏｃｅｐｔｉｖｅ）」の用語は、形状及び組成によって不均質で複雑な構造へとプログラムされ得る任意の磁気応答性材料又は成分を指す。磁覚材料として、約１００マイクロメートル（μｍ）〜約１ミリメートル（ｍｍ）のオーダーの寸法を有する構造が挙げられる。しかしながら、ある実施形態では、磁覚材料として、約１μｍ〜約１ｃｍのオーダーの寸法を有する構造が挙げられる。
【００３２】
本開示によるシステム及び方法は、単純、複雑、均質、及び不均質の構造の組織化に対する駆動機構としてのフリーラジカルの常磁性を利用してもよい。ある一つの態様では、上記構造は、永久磁石、電磁石、一時磁石、又はそれらの組み合わせによって作られる磁場の存在下で組織化され得る。ある実施形態では、最終構造の全体的な磁気的痕跡（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）は、ビタミンＥ等の抗酸化剤への暴露によって後に減少されるか、又は排除され得る。本開示の実施形態は、材料特性における不均質性（例えば、多孔性、弾性率、及び質量密度）、ボトムアップ組織工学、微小構成成分の浮揚組織化及び選択的組織化等と共にソフトシステムの製造を容易にし得る。
【００３３】
生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）において、機能単位中の細胞は、細胞外マトリクス及び所定の空間的分布を伴う隣接細胞を含む三次元（３Ｄ）微小環境に包埋され得る。組織の機能性は、これらの構成成分から起因し、それらの相対的な空間配置によって影響を受ける場合がある。天然の組織及び３Ｄ培養条件の細胞と比較すると、二次元（２Ｄ）単層で培養された細胞は、遺伝子発現プロファイルに著しい相違を呈する場合がある。そのため、２Ｄシステムは、複雑な３Ｄ組織環境を有効に表さない可能性がある。したがって、本開示は、細胞培養のための３Ｄ構造の磁性自己組織化に対するシステム及び方法を提供し得る。ある一つの実施形態では、安定ラジカルを含む磁気的に調節可能なマイクロコンポーネント（ｍａｇｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｔｕｎａｂｌｅ  ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）は、外部磁場の補助により自己組織化され得る。安定ラジカルの磁気感受性は、抗酸化剤であるビタミンＥへの暴露によりクエンチ（ｑｕｅｎｃｈｅｄ）（すなわち、減少又は排除）され得る。上記アプローチを使用して、３Ｄにおいて、多孔性、弾性率、及び質量密度等の特有の不均質な材料特性を有する複雑なコンストラクトの自己組織化を誘導してもよい。
【００３４】
ある実施形態では、本開示は、少なくとも約２週間の期間にわたって磁場に応答する（磁気的に活性）ヒドロゲル及び他の磁覚材料を提供する。材料の磁覚特性は、磁化が必要でなくなった場合、抗酸化剤処理の使用によって制御され得る。得られた材料又は組織化された構造物は、磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）が臨床用途のため物理的な放出機構（例えば、生体の腎臓による）によって排除される必要がある他のシステムと比較して、磁性粒子を含まない場合がある。さらに、磁気的に活性な安定ラジカルを使用して、磁覚材料を選択的に浮揚させ、マイクロスケールの対象物の３Ｄ自己組織化を誘導するため、微小環境の磁気的痕跡を変更してもよい。
【００３５】
磁覚材料の製造の基礎となり、これらの構成成分を様々な構造物への自己組織化を誘導する原理は、図面を参照することにより、またＴａｓｏｇｌｕ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．５：４７０２（２０１４）を参照することによってさらに理解され得る。
【００３６】
ここで、図１Ａ〜図１Ｄに説明される第１の実施形態によれば、様々な構造への組織化のためのビルディングブロックの作製に対するシステム１００は、組成物１０４を支持するためのステージ１０２を備えてもよい。組成物１０４は、メタクリル化ゼラチン（ＧｅｌＭＡ）、ポリエチレングリコールジメタクリレート（ＰＥＧＤＭＡ）等の１又は複数の架橋性ポリマーを含む液体溶液として最初に提供され得る。ポリマーの架橋は、光又は熱の適用、１又は複数の化学物質の添加等によって行われてもよい。さらに、組成物１０４は、細胞、磁性粒子、成長因子、培地成分等、又はそれらの組み合わせ等の１又は複数の追加の成分１０６を含んでもよい。紫外（ＵＶ）光源１０８、約１００μｍ〜約１００ｍｍのオーダーの寸法を有する複数のマイクロゲル又はビルディングブロック１１２を提供するための１又は複数のパターン化されたマスク１１０を使用して組成物１０４の少なくとも一部を架橋するため、システム１００を使用してもよい（図１Ｂ）。ビルディングブロック１１２は、マスク１１０の設計を変化させることによって多様な形状及びサイズで提供され得ることが理解される。達成され得るビルディングブロック１１２のプロファイルの例として、円形１１４、三角形１１６、スキューテトロミノ１１８、及びＬ−テトロミノ１２０が挙げられる。一般的に、図１Ｂに説明されるビルディングブロック１１２は、円筒形ビルディングブロック１１２に対応する円形１１４を有する三次元プリズム、三角形プリズム形のビルディングブロック１１２に対応する三角形１１６等であってもよい。
【００３７】
ある一つの態様では、ビルディングブロック１１２は、ビルディングブロック１１２を１又は複数の安定ラジカルを含む溶液に潜水、浸漬、又はインキュベートすることによって常磁性化又はラジカル化を経てもよい。ある一群の安定ラジカルの例として、４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシ（４−アミノ−ＴＥＭＰＯ）及びその誘導体が挙げられる。他の一群の安定ラジカルの例として、２−（３−カルボキシプロピル）−４，４−ジメチル−２−トリデシル−３−オキサゾリジニロキシ（５−ドキシル−ステアリン酸）等のドキシルラジカル、２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル等のピクリルヒドラジルラジカルが挙げられる。その後、ビルディングブロック１１２は、磁石１２２（図１Ｃ）のガイドにより自己組織化されてもよい。磁石のある一つの例は、永久ネオジム（ＮｄＦｅＢ）磁石である。しかしながら、他の種類の磁石を使用してビルディングブロック１１２を誘導してもよい。
【００３８】
図１Ｃを参照すると、ある実施形態では、構造物中のビルディングブロック１１２又はコンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）１２４への自己組織化は、貯蔵器１２６において行われてもよい。貯蔵器１２６は、水溶液又は他の液体培地１２８によって満たされてもよい。液体培地１２８の一例として、密度調整剤及び界面活性物質又は界面活性剤が挙げられる。密度調整剤の一例として、ノルウェー国オスローのＡＸＩＳ−ＳＨＩＥＬＤ製のＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭ密度勾配培地（ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｍｅｄｉｕｍ）等のイオジキサノール溶液が挙げられる。他の好適な密度調整剤として、溶液１２８の密度を増加して、ビルディングブロック１１２を貯蔵器１２６において溶液１２８の表面に浮かせる任意の材料又は組成物が挙げられる。例えば、液体培地１２８中に複数のビルディングブロック１１２を分散させる際に、複数のビルディングブロック１１２の各々が液体培地１２８の表面上又は表面で浮いてもよい。ある一つの態様では、該表面は、液体培地の空気、別の気体組成物、又は鉱物油等の別の液体組成物との界面であってもよい。別の態様では、ビルディングブロック１１２は、液体培地１２８の表面下に部分的又は完全に潜水されてもよい。
【００３９】
界面活性物質の例として、ポリソルベート８０等の非イオン界面活性剤が挙げられる。他の好適な界面活性物質として、溶液１２８の表面張力又は溶液１２８におけるビルディングブロック１１２に対する抵抗力を減少する任意のアニオン性、カチオン性、非イオン性及び双性イオン性の材料又は組成物が挙げられる。ある一つの態様では、界面活性物質を含む溶液１２８は、溶液１２８におけるビルディングブロック１１２のより速い動作を可能とし得る。ある一つの態様では、磁石１２２とビルディングブロック１１２の間の距離が減少すると、ビルディングブロック１１２の平均速度が増加し得る（図１Ｄ及び図１Ｅ）。
【００４０】
図１Ｃに説明される例では、コンストラクト１２４は、一群のビルディングブロック１１２ａ、一群のビルディングブロック１１２ｂ、一群のビルディングブロック１１２ｃ、一群のビルディングブロック１１２ｄ、及び一群のビルディングブロック１１２ｅを含むビルディングブロック１１２の組み合わせの各々１つを含む。コンストラクト１２４の全体的な形状を安定化するため、磁石１２２を使用してビルディングブロック１１２の誘導された自己組織化の後、二次架橋を行ってもよい。ある一つの態様では、組織化の後、コンストラクト１２４の磁化を「切る」（すなわち、消磁）すること、組織工学用途のための細胞増殖に対するフリーラジカルの可能性のある影響を最小化すること、又はそれらの組み合わせに有用な場合がある。したがって、組織化されたコンストラクトを二次架橋の後に抗酸化剤溶液に浸漬してもよい（図１Ｃ及び図１Ｆ）。
【００４１】
抗酸化剤は、不対状態を排除するため電子を受け取る又は供給することによってフリーラジカルを中和してもよい。一般的に、抗酸化剤はフリーラジカルを非フリーラジカル分子へと中和するプロセスにおいてフリーラジカルになる。フリーラジカル形態の抗酸化剤は、通常、中和されたフリーラジカルよりも反応性が乏しい。抗酸化剤分子は、不対電子の電荷を分配できるように非常に大きいか、別の抗酸化剤によって容易に中和されるか、フリーラジカル状態を終了する別の機構を有するか、又はそれらの組み合わせであってもよい。
【００４２】
フリーラジカルは、ミリボルト（ｍＶ）の一電子還元電位によって列挙されてもよい。各ラジカルの還元形態は、より高い電位を有するフリーラジカルを中和（還元）することができる。ヒドロキシルラジカル（ＯＨ）は、約２３００ｍＶの最も高い電位の一つを有し、最も破壊性（還元性）が高い場合がある。抗酸化剤の一例として、約４８０ｍＶのラジカル反応電位を有する（＋）−α−酢酸トコフェロール（すなわち、ビタミンＥ）が挙げられる。他の抗酸化剤の例として、それぞれ約２８２ｍＶ及び約９２０ｍＶの反応電位を有する、ビタミンＣ（アスコルビン酸塩）及びグルタチオンが挙げられる。ある一つの態様では、細胞膜における脂質過酸化の連鎖反応の終了に効果的な抗酸化剤であることから、ビタミンＥを使用することが有用な場合がある。他の実施形態では、種々の抗酸化剤が所与の反応性酸素種又は反応性窒素種を中和するのにより効果的な場合があるため、ビタミンＥ、ビタミンＣ、グルタチオン、ガンマ−トコフェロール、メラトニン、リコピン等の組み合わせ等の複数の抗酸化剤を使用して、抗酸化剤処理の有効性を高めてもよい。
【００４３】
ある一つの態様では、ビルディングブロック１１２が組織化されると、得られたコンストラクト１２４は毛管力、ヒドロゲルビルディングブロック等の場合であればビルディングブロック１１２の付着により組織化されたままである場合がある。さらに、組織化の後、二次架橋を行って、コンストラクト１２４の幾何学を安定化してもよい。二次架橋及び組織化ゲルの安定化の後、抗酸化剤処理を行ってもよい。したがって、抗酸化剤処理は、組織化されたコンストラクト１２４の幾何学に影響を与えなくてもよい。
【００４４】
別の例では、安定ラジカルを利用して、懸濁液の磁化率を改変し、ビーズ、ヒドロゲル、又は他の同様のビルディングブロックの浮揚自己組織化（ｌｅｖｉｔａｔｉｏｎａｌ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ）を誘導してもよい。図１Ｇ及び図１Ｈを参照すると、浮揚自己組織化に対するシステム１４０は、培地１４４で満たされた容器１４２を備えてもよい。複数のビルディングブロック１４６を容器１４２に添加してもよい。ある一つの態様では、培地１４４、ビルディングブロック１４６、又はそれらの組み合わせは、１又は複数の磁気応答性成分（ｍａｇｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）を含んでもよい。例えば、１又は複数の安定ラジカル、ガドリニウムイオン（Ｇｄ３＋）、マンガンイオン（Ｍｎ２＋）等、又はそれらの組み合わせを含む培地１４４を提供することが有用な場合がある。培地１４４が磁気応答性成分を含む場合、未処理の又は実質的に安定ラジカル若しくは他の磁気応答性材料を含まないビルディングブロック１４６を提供することが有用な場合がある。
【００４５】
図１Ｇによれば、ビルディングブロック１４６は、培地１４４よりも大きな密度を有してもよく、そのため最初は容器１４２の底で静止してもよい。システム１４０は、アンチヘルムホルツ配置に配置された一対の磁石１４８をさらに備えてもよい。磁石の適用又は活性化により、ビルディングブロック１４６が制御された方式で浮くことにより、結果的にビルディングブロック１４６のコンストラクト１５０への自己組織化をもたらす。
【００４６】
ヒドロゲルの磁化を特性評価するため、電子スピン共鳴（ＥＰＲ）測定を行ってもよい。図２Ａ〜図２Ｉに関して、２０％（重量／体積）ＰＥＧＤＭＡヒドロゲルを含む円筒形ビルディングブロックを作製した。その後、ビルディングブロックをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液、又は１０ｍｇ  ｍｌ−１、３０ｍｇ  ｍｌ−１、又は１５０ｍｇ  ｍｌ−１のいずれかの安定ラジカル溶液を含む安定ラジカル溶液のいずれかにおいてインキュベート（浸漬）した。ある一つの態様では、ＥＰＲ強度又はスピン密度は、ヒドロゲルビルディングブロック中のラジカル吸収量の指標を提供し得る。図２Ａ及び図２Ｂを参照すると、安定ラジカル溶液の濃度が増加するにつれて、ＥＰＲ強度又はスピン密度も同様に増加した。ヒドロゲルの常磁性化の多様性を示すため、５０％ＰＥＧＤＭＡ及び５％ＧｅｌＭＡに対してＥＰＲ測定を行った（図２Ｃ〜図２Ｆ）。検査した試料の結果は、５０％ＰＥＧＤＭＡゲルが最も大きなスピン密度を有し、最も高いラジカル吸収量を示した。図２Ｂ、図２Ｄ、及び図２Ｆに示されるように、浸漬したヒドロゲルは、安定ラジカルの濃度に対応する顕著な変色を示した。さらに、全てのビルディングブロックのＥＰＲスペクトルは、ラジカル濃度が増加するにつれてスピン密度の増加を示した。
【００４７】
ある一つの態様では、ラジカル溶液の濃度が１０ｍｇ−ｍＬ−１から１５０ｍｇ−ｍＬ−１へと増加するにつれて移行が観察され得る。ＥＰＲスペクトルは、１０ｍｇ−ｍＬ−１において３つのシングレットピークを示し、ラジカル濃度が増加すると、シングレットピークは３０ｍｇ  ｍｌ−１で左右のシングレットピークの間で融合し始め、１５０ｍｇ−ｍＬ−１で対称性のシングレットピークへと形成される。４−アミノ−ＴＥＭＰＯの濃度が高いと、単位体積当たりのスピン数は増加され、スピンはＰＥＧＤＭＡゲル中に局在化される。さらに、観察されるスペクトルは広がり、これはスピンプローブ（すなわち、４−アミノ−ＴＥＭＰＯ）の高局所濃度の指標の可能性があるパターンである。異なる環境（例えば、異なるポリマー種及び分子量を有する操作されたヒドロゲル）又は異なるラジカル濃度では、スピンプローブのアラインメント特性はスピンプローブの局在により異なる場合がある。例えば、スピンラベルされたシクロデキストリンを、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びシクロデキストリン（ｂ−ＣＤ）を含むヒドロゲルビルディングブロックの架橋点に組み込んだ。スピン標識ヒドロゲルビルディングブロックのＥＰＲスペクトルを、ｂ−ＣＤ、ＰＥＧ鎖の長さ、ゲル構造に捕捉された溶媒の性質、及び温度に対するＰＥＧの比の関数として調査した。ここで、２０％ＰＥＧＤＭＡ、５０％ＰＥＧＤＭＡ、及び５％ＧｅｌＭＡのヒドロゲルビルディングブロックについて、シングレットのパターン変化に関わらず、ＥＰＲスペクトル下の面積の増加が示され、捕捉されたラジカル量の増加及びヒドロゲルの磁気応答性の増加を示した。
【００４８】
図２Ｇを参照すると、安定ラジカルを含む溶液に一晩浸漬した後のスピン密度の比較は、５０％ＰＥＧＤＭＡが最も高いスピン密度を示したことを明らかにした。常磁性を切るため、ヒドロゲルビルディングブロックを、ビタミンＥを含む抗酸化剤溶液で処理した。図２Ｈに示されるように、抗酸化剤溶液で処理した試料のスピン密度は、元の試料と比較して著しく減少し（図２Ｉ）、フリーラジカルの量が抗酸化剤であるビタミンＥへの暴露によって著しく減少又は中和されることを示している。
【００４９】
異なるポリマーで作製されたビルディングブロックに対するアプローチの汎用性を示すため、ＰＥＧＤＭＡ及びＧｅｌＭＡで構成されるラジカル化ビルディング単位の磁気応答性を評価した。ある一つの態様では、ヒドロゲルを濃度範囲にわたって安定ラジカルを含む溶液中でインキュベート又は浸漬することが有用な場合がある。図３Ａ〜図３Ｉに示すように、ヒドロゲルビルディングブロックを１０ｍｇ  ｍｌ−１、３０ｍｇ  ｍｌ−１、又は１５０ｍｇ  ｍｌ−１の４−アミノ−ＴＥＭＰＯの溶液中でインキュベートした。製造及びインキュベーションに続いて、ラジカル化されたヒドロゲルビルディングブロックをＮｄＦｅＢ永久磁石の側に置いた。図３Ａに示すように、磁化時間の測定（すなわち、磁場に応答してヒドロゲルビルディングブロックが移動するのを観察するまでの経過時間）を行った。１５秒及び１分の期間、磁場に暴露した後、磁気応答性ヒドロゲルを計数した（図３Ｂ及び図３Ｃ）。結果は、９０％超のビルディングブロックが１分以内に磁気応答性になったことを示した。さらに、ヒドロゲルビルディングブロックの磁場応答性の寿命を判定した。０時間、２時間、５時間、８時間、及び２４時間を含むインキュベーション時間の範囲について、磁気応答性ヒドロゲルビルディングブロックの割合を計算した（図３Ｄ〜図３Ｆ）。結果は、５％のＧｅｌＭＡビルディングブロックは、２０％又は５０％のＰＥＧＤＭＡビルディングブロックのいずれかと比較してより長い時間磁気応答性を維持することを示す（図３Ｊ）。図３Ｇ〜図３Ｉに示すように、安定ラジカル溶液中のヒドロゲルビルディングブロックの浸漬時間を１又は複数の日まで増加した。磁化時間及び対応する偏差は、安定ラジカル溶液の濃度が増加するにつれて減少し、ビルディングブロックが浸漬時間、ラジカル溶液の濃度、又はそれらの組み合わせの増加によって磁場に対してより応答性になった可能性があることを示した。
【００５０】
常磁性の特性評価及び定量に続いて、ヒドロゲルを磁場の誘導によって液体培地と空気の界面で不均質なパターンへと自己組織化する。ここで、図４Ａを参照すると、様々なコンストラクトがＰＥＧＤＭＡ及びＧｅｌＭＡのヒドロゲルで構成されるビルディングブロックから作製され得る。ある一つの態様では、ビルディングブロックのポリマー濃度の変化は、懸濁する液体培地と個々のビルディングブロックの間の接触角を変化させ、それにより組織化されたコンストラクトの構成におけるビルディングブロック間にメニスカスを形成する場合がある。これは、同様に、液体表面の曲率及び毛管力の勾配に影響を及ぼす可能性がある（図４Ｇ）。ある一つの態様では、ビルディングブロックを組成物によってプログラム化して、異なるポリマーから製造されたビルディングブロックで構成される不均質なコンストラクトを提供してもよい（図４Ａのパネルｉ〜ｎ）。別の実施形態では、マクロ多孔性ヒドロゲルビルディングブロックをショ糖浸出（Ｐａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０６，１３８−１４８，（２０１０））によって作製し、ナノ多孔性ヒドロゲルと共に複雑な形状へと組織化してもよい（パネルｏ〜ｑ）。さらに別の態様では、ガラスバブル（密度＝０．４６ｇ  ｃｍ−３）をビルディングブロックにカプセル化して、通常のガラスバブルを含まないビルディングブロックよりも低い密度のゲルを製造してもよい。パネルｒ〜ｔに示されるように、様々な質量密度を有する不均質なアッセンブリ（ガラスバブルカプセル化軽ＰＥＧＤＭＡゲル及びより重いＰＥＧＤＭＡゲルを共に）もまた作製され得る。
【００５１】
多様なマイクロスケールのビルディングブロックの組織化の操作及び誘導に関する本開示の動的な方向の制御可能性を実証するため、テトロミノビルディングブロックから組織化されたｎコンストラクトを図１Ｃの貯蔵器１２６に類似する貯蔵器を使用して作製した。ジグザグ、棒状、正方形、Ｔ−ポリオミノを含む様々な形状のビルディングブロックは、図４Ｈに示される貯蔵器内の様々な開始場所又はウェル（ｗｅｌｌｓ）に分散され、図４Ｂに示されるように組織化を経時的にモニターした。
【００５２】
最終的な形状の制御は、浸漬溶液に含まれる安定ラジカルの量に依存し得る。理論的には、過剰量の安定ラジカルは、ビルディングブロックの磁化率を増幅することにより、各ビルディングブロックと永久磁石間の距離に関わらず、磁場の存在下でより大きな反応を提供し得る。これは、個々のビルディングブロックの動きに対する制御の減少（多数のブロックが同時に高磁場強度へと移動する）をもたらす場合がある。このアプローチは、（誘導されていない）自己組織化に有用な可能性がある。一方、安定ラジカルの限定された使用は、個々のビルディングブロックの制御を可能とする場合がある。さらに、抗酸化剤による処理に先立って、フリーラジカルが細胞又は他の生体材料に対して有し得るいかなる可能性のある悪影響も減少するため、フリーラジカルの濃度を減少することが有用な場合がある。別の態様では、組織化されたコンストラクトの最終の全体形状を安定化するため、貯蔵器の液体を排出した後、二次架橋を行って各ビルディングブロックを互いにコンストラクトへと付着させることが有用な場合がある。
【００５３】
複数の複雑な破損モードを有する３Ｄ軟材料（３Ｄ  ｓｏｆｔ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ）は、衝撃の間の軟組織代用物の動的応答を調べるためといった組織工学における、又は異なるヤング率を有する構成成分の駆動又は伝達をもたらすためのソフトロボティックにおけるいくつかの用途を有する場合がある。ある実施形態では、本開示は、３Ｄ構造物の製造を可能とし得る。例えば、ビルディングブロックは、最初に２Ｄコンストラクトへと組織化されてもよい。次に、液体培地を排出するか、あるいはコンストラクトを残して貯蔵器から回収してもよい。その後、二次架橋工程を行ってコンストラクトを安定化してもよい。さらに、ビタミンＥ又は別の抗酸化剤を使用してコンストラクトを処理し、少なくとも一部、上記コンストラクトに存在する安定ラジカルを中和してもよい。次の工程では、胚で検査した鉱物油及び新しい液体培地を、上記コンストラクトを含む貯蔵器に順次添加してもよい。この工程は、新しい液体培地が第１の液相の上部に第２の液相を形成しながら、貯蔵器の底部の第１の液相（すなわち、鉱物油）中にコンストラクトを浸漬したままにすることを可能とし得る。次に、別のセットのビルディングブロックを第２のコンストラクトに自己組織化することは、第１（先）のコンストラクトが組織化された位置で又はそのあたりで行われてもよい。すなわち、第２のコンストラクトは、第１のコンストラクトの相対的に上の第２の液相中で組織化されてもよい。その後、両方の液相を貯蔵器から排出して第１のコンストラクトの上に第２のコンストラクトを積層してもよい。このプロセスを１回又は複数回繰り返して、図４Ｃ及び図４Ｄのような３層以上の積層構造を提供してもよい。
【００５４】
ある一つの態様では、機械圧縮試験を行って、２０％ＰＥＧＤＭＡゲル（通常）、ショ糖浸出マクロ多孔性（ｓｕｃｒｏｓｅ−ｌｅａｃｈｅｄ  ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ）２０％ＰＥＧＤＭＡゲル及び複合ゲルのヤング率を判定してもよい（図４Ｅ）。圧縮応力対圧縮歪曲線図（図４Ｆ）は、複合ビルディングブロックは２つの明確な破損を示す場合があることを示し、これは、特に通常ゲル及びマクロ多孔性ゲルの終局歪と一致する。
【００５５】
【数１】
0006599348.tif 000002
【００５６】
さらに、破損歪における終局応力（τ）比、すなわち、上記数１に示す式は、図４Ｆに示される複合ビルディングブロックにおける通常ゲル及びマクロ多孔性ゲルの断面積の比のオーダーであり、これは、４つのカラム（通常の円筒形ゲル）が複合ゲル内で最初に破損した可能性があり、その後、残りのマクロ多孔性構造物が二次破損まで複合ゲルの完全性を保持することを示す。
【００５７】
細胞カプセル化ヒドロゲルの組織化及びコード化は、再生医学、細胞に基づく薬学研究及び組織工学を含むいくつかの分野で幅広い用途を有する場合がある。本開示の実施形態は、複雑な組織の微小環境に対する高レベルの制御を提供し得る。この目的のため、細胞生存率及び増殖に対する安定ラジカルの効果を評価した。図５Ａを参照すると、ＧｅｌＭＡヒドロゲルにカプセル化された３Ｔ３細胞の明視野及び蛍光画像を対照群（安定ラジカルなし）、及び３０ｍｇ  ｍｌ−１の４−アミノ−ＴＥＭＰＯの溶液に３０分間浸漬した安定ラジカル群について０日、３日、及び６日に画像化した。結果は、安定ラジカル含有群を含む全てのヒドロゲル群で３Ｔ３細胞が増殖したことを示した（図５Ｊ）。さらに、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）分析を行って、ラジカル及びビタミンＥの存在下での細胞の増殖を調べた（図５Ｂ〜図５Ｆ）。０日、１日、３日、５日及び７日の細胞懸濁液の体積に対する添加したラジカル懸濁液の体積の体積対体積比（体積／体積）の関数として細胞成長をプロットし、安定ラジカルの存在下での細胞の増殖を示した（図５Ｂ及び図５Ｋ）。
【００５８】
安定ラジカル（３０ｍｇ  ｍｌ−１の４−アミノ−ＴＥＭＰＯで３０分間）によるヒドロゲルビルディングブロックの常磁性化（浸漬）の後、細胞懸濁液の体積に対するビタミンＥ溶液の体積の比の範囲に亘るビタミンＥ溶液へのビルディングブロックの暴露は、５０％（体積／体積）超のビタミンＥ溶液について細胞増殖の増加をもたらした（図５Ｃ及び図５Ｄ）。別の態様では、細胞生存率及び増殖に対する安定ラジカル効果を、ビタミンＥ溶液を１００％（体積／体積）で一定に保ったまま、１０ｍｇ  ｍｌ−１、３０ｍｇ  ｍｌ−１、及び１５０ｍｇ  ｍｌ−１の４−アミノ−ＴＥＭＰＯを含む安定ラジカル濃度の範囲について細胞生存率を評価することによって測定した。結果は、より大きな濃度の安定ラジカルに対しては、ビタミンＥは細胞の回復を有意に補助し得ないことを示した。
【００５９】
ラジカル充填ヒドロゲルビルディングブロックのより速い駆動は、より高濃度のラジカルを必要とする場合があり、同様に、ビタミンＥによってクエンチ又は中和することがより困難な場合がある。細胞成長及び機能性は、高濃度のラジカル（１５０ｍｇ  ｍｌ−１の４−アミノ−ＴＥＭＰＯ）をヒドロゲルの磁化に利用する場合に顕著に減少される場合がある。ある一つの態様では、正方形、棒状、及びＬ形のコンストラクトへの組織化の後の３Ｔ３細胞の生存率を図５Ｇに示す。さらに、初代の心筋細胞を単離し、図５Ｈ及び図５Ｉに示されるＧｅｌＭａヒドロゲルビルディングブロックにカプセル化した。結果は、心筋細胞は、１０日におけるラジカル暴露及びビタミンＥ回復の後、表現型特性（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）及び機能性を保ち得ることを示す。
【００６０】
別の態様では、本開示は、安定ラジカルを使用するビルディングブロックの浮揚誘導型（ｌｅｖｉｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｇｕｉｄｅｄ）自己組織化に対するシステム及び方法を提供し得る。ガドリニウム（Ｇｄ３＋）及びマンガン（Ｍｎ＋２）のイオン塩の水溶液をビーズ及び粒子の浮揚に使用することができる。ある一つの態様では、軟質及び硬質の対象物の浮揚誘導型自己組織化におけるラジカルの使用を調べた。ビルディングブロックを浮揚させるため、アンチヘルムホルツ配置（同様の極が向かい合う）の２つの永久ＮｄＦｅＢ磁石を備える磁気セットアップを製造した。磁気セットアップによって作り出される磁場ノルム（輪郭）及び束密度（矢印）の模擬実験（図６Ａ）が、磁場は対照軸の中心で最小に達し得ることを示す（図６Ｋ及び図６Ｌ）。
【００６１】
適用される磁場Ｂの下、常磁性溶液に懸濁された比較的反磁性のヒドロゲルビルディングブロックに対して、等式（１）は、磁力Ｆｍを与え、等式（２）はヒドロゲルビルディングブロックに作用する重量Ｆｇの力を与える。
【００６２】
【数２】
0006599348.tif 000003
【００６３】
これらの等式では、Ｘｍは常磁性培地の無次元化磁化率（ｔｈｅ  ｎｏｎ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）であり、Ｘｇｅｌは懸濁されたヒドロゲルビルディングブロックの無次元化磁化率であり、μ０＝４π×１０−７＝４（Ｎ・Ａ−２）は自由空間の透磁率であり、Ｖ（ｍ３）はヒドロゲルビルディングブロックの体積であり、Ｐｇｅｌ（ｋｇ・ｍ−３）はヒドロゲルビルディングブロックの密度であり、Ｐｍ（ｋｇ・ｍ−３）は常磁性液体培地の密度であり、ｇは重力のベクターである。ヒドロゲルビルディングブロックはその体積を通して均一な密度分布及び磁化率を有すると仮定される。重力Ｆｇ（浮力の効果について較正される）は、常に、地球の中心に向くか、それから離れ、この力の大きさは常磁性培地及びヒドロゲルビルディングブロックの密度が浮揚実験の持続時間にわたって一定のままである限り、貯蔵器内でのヒドロゲルビルディングブロックの位置に依存しない。相対的に反磁性のヒドロゲルビルディングブロックに作用する磁力、Ｆｍは最小の磁場Ｂに向き、この力の大きさは磁場におけるヒドロゲルビルディングブロックの位置に依存する。一次的な場合（すなわち、ヒドロゲルビルディングブロックが磁力と重力とが釣り合う平衡点に達する前）では、慣性力（すなわち、等式（３）の左の項）、及びヒドロゲルビルディングブロックの移動速度と相関する抵抗力Ｆｄの等式５は、等式３に記載されるように有効となる。平衡では、抵抗力及び慣性力は消滅し、ヒドロゲルビルディングブロックに作用する磁力及び重力は互いに釣り合う（等式４）。
【００６４】
【数３】
0006599348.tif 000004
【００６５】
３Ｄにおけるアンチヘルムホルツ配置の２つの同一の長方形の永久磁石間の磁場を説明する正確な解析方程式は、かなり複雑である。ｚ軸が重力ｇ＝（０，０，−ｇ）のベクターの方向と一致する３Ｄデカルト座標系では、力の平衡は、これらの力の均衡が互いにｚ軸のみに沿うことから、等式８を得るため単純化する。
【００６６】
【数４】
0006599348.tif 000005
【００６７】
【数５】
0006599348.tif 000006
【００６８】
ある実施形態で使用される磁石（ＮｄＦｅＢ、５ｃｍ×５ｃｍ×２．５ｃｍ）により、Ｂｚは底部の磁石表面で最大＋Ｂ０（ｚ＝０）から磁石の上部表面で最小−Ｂ０（ｚ＝ｄ）までｚ（底部の磁石表面からの距離）と共に実質的に直線形に変化し、磁石間に分離がある場合、ｄはおよそ４５ｍｍ未満であるかそれに等しい。この直線性により、中心線に沿った磁場は、等式１０により近似され得る。
【００６９】
【数６】
0006599348.tif 000007
【００７０】
ヒドロゲル単位に対して作用する重力と磁力が互いに釣り合いをとる（等式１１）、２つの磁石間の平衡点Ｚｅｑ（ｍ）を見つけるため、磁場（等式１０）に対する陽関数表示（Ｔｈｅ  ｅｘｐｌｉｃｉｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を使用して等式８を解く。
【００７１】
【数７】
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【００７２】
対象物と周囲の培地の間の距離の関数としての釣り合い高度を図Ｓ１３にプロットする。
【００７３】
ある一つの例では、図６Ｂに示されるように１ｃｍ×１ｃｍ×１．５ｍｍの２０％ＰＥＧＤＭＡヒドロゲルをラジカル溶液に懸濁し、図６Ｃに示されるように貯蔵器を磁気セットアップに入れると、ラジカル溶液の常磁性によりヒドロゲルビルディングブロックの浮揚をもたらす。ラジカルと従来使用されるイオン塩の両方の存在下での競合効果を説明するため、非ラジカル化ヒドロゲルビルディングブロック（図６Ｄ、左のゲル）、及びラジカル化ヒドロゲルビルディングブロック（図６Ｄ、右のゲル）を含む２つの試料を作製し、ガドリニウム（Ｇｄ）溶液に入れた。著しい磁気的痕跡（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を有しない非ラジカル化ヒドロゲルビルディングブロックは、Ｇｄ溶液の常磁性により浮揚する。一方、ラジカル化ヒドロゲルビルディングブロックは、ラジカルの常磁性化とＧｄイオン塩の間の相殺効果により浮揚しない（図６Ｅ）。
【００７４】
別の態様では、より小さい、各種の複数のヒドロゲルビルディングブロック（ラジカル化及び非ラジカル化）を使用して、ゲルの選択的組織化を実証した。ラジカル化ヒドロゲルビルディングブロックは、ラジカルの常磁性化とＧｄイオン塩の間の相殺効果のため浮揚せず、一方、Ｇｄ溶液の常磁性により非ラジカル化ヒドロゲルビルディングブロックは浮揚され、組織化される（図６Ｆ及び図６Ｇ）。さらに、５００μｍのポリスチレンビーズを使用して、Ｇｄ及びラジカル溶液における組織化領域の時間的変化を定量した（図６Ｈ）。ラジカル溶液中での組織化の前（図６Ｉ）及び後（図６Ｊ）にスナップ写真を撮影した。２つの磁石間の距離の増加は、ラジカル溶液中でのビーズの浮揚高さの増加をもたらした（図６Ｍ及び図６Ｎ）。
【００７５】
ある一つの態様では、本開示は、形状、色、並びに質量密度、弾性率、及び多孔性等の材料の特性によって相互に識別可能な多成分構造物をパターン化するシステム及び方法を提供し得る。ある一つの態様では、構造物又はコンストラクトは、常磁性により気液界面で又は反磁性によりラジカル培地内で様々なビルディングブロックの自己組織化を誘導することにより作製され得る。
【００７６】
ある実施形態では、永久磁石に基づくアプローチは、幅広い適応性、並びに多方面にわたる自己組織化システム及び方法を提供し得る。ある一つの態様では、外部電源又は電力は省略されてもよい。別の態様では、永久磁石による磁場勾配パターンの作製及び貯蔵器に由来する成分の自己組織化の誘導は、比較的単純であり、安価な場合がある。さらに別の態様では、各構成成分の初期の浸漬ラジカル濃度に基づいて、磁化率及び磁場に対する応答が操作され得る。さらに、構成成分の大きさ及び組成を変化させてもよく、これは、浮遊する構成成分に及ぶ抵抗力に影響を与え、同様に構成成分の駆動速度に影響する。したがって、いくつかの構成成分を永久磁石によって並行して操作してもよい。さらなる態様では、提示される誘導型の磁気自己組織化戦略（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｓｔｒａｔｅｇｙ）は、接触しない方法で不均質な密度、弾性率、及び多孔性を有する機能性三次元（３Ｄ）構造への長さスケールが変化する材料の配列、配置及びパターン化を可能とし得る。
【００７７】
別の態様では、浮揚組織化のため、（例えば、ヒドロゲルのポリマー割合を変更することによって）密度を調整してもよく、これは、３Ｄ空間において異なる浮揚高さでビルディングブロックを平衡化するのに使用され得る。さらに、密度は、３Ｄでの平衡定位を変更するため、ビルディングブロック内で空間的に不均質な方式で操作されてもよい。さらに別の態様では、反磁性の浮揚及び常磁性の駆動に対し、組織化は、それぞれ液体中、並びに液体及び空気の界面で行われ得ることから、対象物は固体表面と接触する必要がない場合がある。さらに、流体培地は、スティクション（ｓｔｉｃｔｉｏｎ）、接触付着、乾燥摩擦、及び帯電を排除する。さらなる態様では、浮揚組織化は、完全に閉鎖されたチャンバー又はシステムの内部で行われてもよい。
【００７８】
ある実施形態では、永久磁石システムを使用して一定の磁力線が作られる。さらに、永久磁石システムは、空間的に一定であり、ヒドロゲル又はビーズの浮揚高さを規定する最小磁場強度位置（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｆｉｅｌｄ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｌｏｃａｔｉｏｎ）を提供し得る。交流を使用することにより、磁場は、方向及び強度、また最小磁場強度位置を変更し得る。磁場の変更は、経時的に浮揚高さを変更する等の新たな性能を付加し得る。ある一つの態様では、磁場の変更は、Ｎｅｅｌ緩和（Ｎｅｅｌ  ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ）により超常磁性粒子を加熱し、局在化された加熱スポットを作り出すため使用されてきた。ある実施形態では、磁場の変更は、ヒドロゲル又はビーズを浮揚させる同様の性能を提供し得る。追加的に（又は代替的に）、永久磁石は、一般的には持ち運びが可能であり、安価に製造でき、磁場セットアップの変更と比較して追加の外部機器を必要としない場合がある。
【００７９】
ある実施形態では、フリーラジカルによる微小成分の磁化は、染色、細胞カプセル化、マクロ多孔性の操作等の様々な技術と適合性があってもよい。ある一つの態様では、これらの技術は、磁化のためのゲルのラジカル暴露の前に行われてもよい。別の態様では、ＭＮＰカプセル化ヒドロゲルビルディングブロックは、架橋に先立ってＭＮＰをプレポリマー溶液及び細胞懸濁液と混合することによって製造されてもよい。しかしながら、後の加工工程の間、細胞又は他の材料をＭＮＰに暴露し得ることから、ビルディングブロックをラジカルで選択的に飽和させるのに有用な場合がある。別の態様では、安定ラジカルをしみ込ませたヒドロゲルは、ＵＶによる製造から得られたフリーラジカルによって磁化されたヒドロゲルと比較して、より安定で強固な駆動を可能とし得る。ある実施形態では、ラジカルは、シェル又はカプセルにカプセル化されてもよい。さらに、シェル又はカプセルを操作して、細胞とラジカルの間の相互作用を調節してもよい。
【００８０】
以下は、本発明を実施するための具体的な実施形態の例である。実施例は説明の目的で提供されるにすぎず、本発明の範囲を限定することを何ら意図するものではない。使用される数字（例えば、量、温度等）に関する精度を確実にするための努力が成されてきたが、いくつかの実験誤差及び偏差は当然許容されるべきである。
【実施例】
【００８１】
マイクロゲルビルディングブロックの製造のため、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ；１ｍｌ）にポリ（エチレングリコール）１０００ジメタクリレート（ＰＥＧＤＭＡ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、２０％、５０％（重量／体積））を溶解してＰＥＧＤＭＡマイクロゲルプレポリマー溶液を作製した。その後、光開始剤（ＰＩ）である２−ヒドロキシ−１−（４−（ヒドロキシエトキシ）フェニル）−２−メチル−１−プロパノン（１％、重量／体積、Ｉｒｇａｃｕｒｅ  ２９５９；ＣＩＢＡ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）をプレポリマー溶液に添加した。４０μｌのＰＥＧＤＭＡプレポリマー溶液を、９５×１５ｍｍ２  Ｐｙｒｅｘの再利用可能なペトリ皿（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の裏側のスペーサー（カバーガラス２５×２５ｍｍ２、厚さ：１５０μｍ）の間にピペットで移した。別のカバーガラスを液滴の上に置いた。フォトマスク（１×１ｍｍ２、正方形）をＵＶ光とプレポリマー液滴の間のカバーガラスに設置した。ＵＶ光（６．９Ｗ  ｃｍ−２、マイクロゲルの上５０ｍｍの高さ）を３０秒間適用することによってマイクロゲルを製造した。その後、フォトマスク及びカバーガラスを除き、正方形のＰＥＧＤＭＡマイクロゲルをカバーガラス上に形成した。かみそり（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｒａｚｏｒ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌｉｎｅ）を使用して、マイクロゲルをＰＢＳで満たしたアッセンブリチャンバーに移した。
【００８２】
ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、１ｍｌ）中にゼラチンメタクリレート凍結乾燥粉末（５％（重量／体積））を溶解することによって、ＧｅｌＭＡマイクロゲルプレポリマー溶液を作製した。その後、ＰＩである２−ヒドロキシ−１−（４−（ヒドロキシエトキシ）フェニル）−２−メチル−１−プロパノン（０．５％、重量／体積、Ｉｒｇａｃｕｒｅ  ２９５９；ＣＩＢＡ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）をプレポリマー溶液に添加した。４０μｌのＧｅｌＭＡプレポリマー溶液の液滴を、８０×１５ｍｍ２  Ｐｙｒｅｘの再利用可能なペトリ皿（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の裏側のスペーサー（カバーガラス２５×２５ｍｍ２、厚さ：１５０μｍ）の間にピペットで移した。別のカバーガラスをプレポリマー液滴に置いた後、フォトマスク（１×１ｍｍ２、正方形）をＵＶ光とプレポリマー液滴の間のカバーガラスに設置した。ＵＶ光（２．９Ｗ  ｃｍ−２、マイクロゲルの上５０ｍｍの高さ）を３０秒間適用することによってマイクロゲルを製造した。その後、フォトマスク及びカバーガラスを除き、正方形のＧｅｌＭＡマイクロゲルをカバーガラス上に形成した。かみそりを使用して、マイクロゲルをＰＢＳで満たしたアッセンブリチャンバーに移した。
【００８３】
ＥＰＲ測定用のラジカル化したＰＥＧＤＭＡヒドロゲルビルディングブロックの製造のため、中心に空洞（直径３ｍｍ、円形）を有するポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）成形型（ＰＭＭＡ、高さ１．５ｍｍ、３×３ｃｍ２、正方形）の下にカバーガラスを置いた。その後、ＰＥＧＤＭＡプレポリマー溶液（１％ＰＩを含むＰＥＧＤＭＡ１０００、２つの状況、すなわちＰＢＳに２０％及び５０％（重量／体積）溶解した）を成形型に満たすことによって円筒形のＰＥＧＤＭＡゲルを製造した。その後、別のカバーガラスをＰＭＭＡ成形型に置いた。ＵＶ光（６．９Ｗ  ｃｍ−２、成形型の上５０ｍｍの高さ）を３０秒間適用した。ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、１ｍｌ）に安定ラジカル粉末を溶解することによって、安定ラジカル４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（４−アミノ−Ｔｅｍｐｏ、Ｓｉｇｍａ、１０ｍｇ、３０ｍｇ  ｍｌ−１、１５０ｍｇ）溶液を作製した。その後、カバーガラスを除去した後、固体の円筒形ＰＥＧＤＭＡゲルを得た。安定ラジカル溶液（１ｍｌのＰＢＳに１０ｍｇ、３０ｍｇ、１５０ｍｇを溶解）。その後、４つの円筒型ＰＥＧＤＭＡヒドロゲルを以下の実験、（ｉ）対照：ＰＥＧＤＭＡヒドロゲルを１ｍｌのＰＢＳで満たした３５×１０ｍｍ２Ｐｙｒｅｘの再利用可能なペトリ皿（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に１０時間入れる、（ｉｉ）実験Ａ：ＰＥＧＤＭＡヒドロゲルを１０ｍｇ  ｍｌ−１の安定ラジカル溶液で満たしたペトリ皿に１０時間入れる、（ｉｉｉ）実験Ｂ：ＰＥＧＤＭＡヒドロゲルを３０ｍｇ  ｍｌ−１の安定ラジカル溶液で満たしたペトリ皿に１０時間入れる、（ｉｖ）実験Ｃ：ＰＥＧＤＭＡヒドロゲルを１５０ｍｇ  ｍｌ−１の安定ラジカル溶液で満たしたペトリ皿に１０時間入れる、により、対照群と実験群に分けた。その後、４つのＰＥＧＤＭＡヒドロゲルをＥＰＲ測定用のチューブに入れた。本項及び次項で１０時間は一晩のインキュベーションを指すことに留意されたい。
【００８４】
ＥＰＲ用のビタミンＥ処理ＰＥＧＤＭＡヒドロゲルビルディングブロックの製造のため、中心に空洞（直径３ｍｍ、円形）を有するＰＭＭＡ成形型（高さ１．５ｍｍ、３×３ｃｍ２、正方形）の下にカバーガラスを置いた。ＰＥＧＤＭＡプレポリマー溶液（１％ＰＩを含むＰＥＧＤＭＡ１０００、ＰＢＳに５０％（重量／体積）溶解した）を成形型に満たすことによって円筒形のＰＥＧＤＭＡゲルを製造した。その後、別のカバーガラスをＰＭＭＡ成形型に置いた。光架橋性ＰＥＧＤＭＡプレポリマー溶液内での架橋を達成するため、ＵＶ光（６．９Ｗ  ｃｍ−２、成形型の上５０ｍｍの高さ）を３０秒間適用した。カバーガラスを除去した後、固体の円筒形ＰＥＧＤＭＡゲルを得た。安定ラジカル（４−アミノ−Ｔｅｍｐｏ、Ｓｉｇｍａ）溶液（１ｍｌ  ＰＢＳ中に溶解した１０ｍｇ、３０ｍｇ、１５０ｍｇ）。ＰＥＧＤＭＡヒドロゲルを以下の対照群と実験群に分けた。すなわち、（ｉ）実験：１５０ｍｇ  ｍｌ−１の安定ラジカル溶液で満たした３５×１０ｍｍ２Ｐｙｒｅｘの再利用可能なペトリ皿（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に１０時間にわたってＰＥＧＤＭＡヒドロゲルを入れる。その後、ＰＥＧＤＭＡヒドロゲルを取り出し、１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）に溶解した０．０５％（重量／体積）水溶性ビタミンＥ（（＋）−α−酢酸トコフェロール、Ｓｉｇｍａ）にさらに１０時間浸漬した。（ｉｉ）対照Ａ：１５０ｍｇ  ｍｌ−１の安定ラジカル溶液で満たしたペトリ皿に１０時間にわたってＰＥＧＤＭＡヒドロゲルを入れる。（ｉｉｉ）対照Ｂ：ＰＢＳで満たした３５×１０ｍｍ２ペトリ皿に１０時間にわたってＰＥＧＤＭＡヒドロゲルを入れる。
【００８５】
ＰＥＧＤＭＡゲル組織化に対し、ヒドロゲルの常磁性浮動のための培地を２０％（体積／体積）ＯｐｔｉＰｒｅｐ（ＯｐｔｉＰｒｅｐ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｓｉｇｍａ、ＰＢＳとの混和）を使用して作製した。その後、０．００１％（体積／体積）Ｔｗｅｅｎ−８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０の粘稠液、Ｓｉｇｍａ）を上記溶液に添加した。ＧｅｌＭＡヒドロゲル組織化に対し、ヒドロゲルの常磁性浮動のための培地を３０％（体積／体積）ＯｐｔｉＰｒｅｐ（ＯｐｔｉＰｒｅｐ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＳＩＧＭＡ、ＰＢＳとの混和）を使用して作製した。その後、０．００１％（体積／体積）Ｔｗｅｅｎ−８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０の粘稠液、ＳＩＧＭＡ）を上記溶液に添加した。
【００８６】
細胞生存率及び増殖アッセイのため、加湿された３７℃の５％ＣＯ２を含有する雰囲気において、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）混合物で補足したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を培養した。
【００８７】
ＭＴＴ（Ｍｗ＝４１４）生存率アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のため、１ｍｌ当たり１０５細胞の密度（１ウェル当たり総容量１００μｌの細胞懸濁液）で細胞を９６ウェルプレートに蒔いた。安定ラジカル４−アミノ−ＴＥＭＰＯ溶液を１０ｍｇ  ｍｌ−１、３０ｍｇ  ｍｌ−１、９０ｍｇ  ｍｌ−１、及び１５０ｍｇ  ｍｌ−１の濃度で作製した。４時間後、細胞が付着すると、安定ラジカル溶液を種々の量（１％、２％、５％、１０％、及び２０％（体積／体積））でウェルに添加した。細胞を安定ラジカル溶液と共に３７℃で３０分インキュベートした。３０分後、全ての試料について、安定ラジカルを含有する細胞培養培地をウェルから吸引した。陽性対照試料は、安定ラジカルとインキュベートしなかった試料であった。その後、新しい培養培地及びＭＴＴ試薬（１０％（体積／体積））を全てのウェルに添加し、２時間インキュベートした。２時間の終わりに得られたホルマザンを１００μｌのＭＴＴ可溶化試薬ＳＤＳ（Ｍｗ＝２８８）に溶解した。次の日にＢＭＧ  ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｇａｌａｘｙ−Ｍｕｌｔｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒにより誘導されたホルマザン色素の吸光度を測定した。各試料について全ての判定を６回繰り返し行い、３つの独立した実験を実施した。細胞に対する４−アミノ−ＴＥＭＰＯ溶液の添加後０日、１日、３日、５日及び７日にＭＴＴ増殖アッセイを行った。
【００８８】
細胞に対する安定ラジカルの潜在的な悪影響を回復するため、ビタミンＥ処理を行った。滅菌ＰＢＳ中のビタミンＥ溶液を０．５ｍｇ  ｍｌ−１の最大溶解度で作製した。安定ラジカルのインキュベーションの後、１％、５％、１０％及び５０％（体積／体積）等の種々の体積比でビタミンＥ溶液をウェルに添加し、細胞を３０分間インキュベートした。３０分後、ビタミンＥ含有培養培地を吸引し、ＭＴＴアッセイを行った。
【００８９】
安定ラジカルのインキュベーションの３０分後にウェルに１００％（体積／体積）ビタミンＥ溶液を添加することによって、さらなるビタミンＥ処理を行った。３Ｔ３細胞の生存率に対するビタミンＥ処理の効果を０日、１日、３日、５日及び７日についてＭＴＴアッセイにより分析した。
【００９０】
３Ｔ３細胞のカプセル化及び生／死アッセイのため、マイクロゲルの製造に使用したカバースライドを、先に記載されるように３−（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレート（ＴＭＳＰＭＡ、Ｓｉｇｍａ）で被覆した。２０％（重量／体積）ＰＥＧＤＭＡ（２％（重量／体積）ＰＩ）によりカバースライド上に二次コーティングを塗布した。ＧｅｌＭＡ５％（重量／体積）プレポリマー溶液を最初にＰＢＳ中にＰＩ０．５％（重量／体積）を溶解することによって作製した。ＰＩが完全に溶解すると、凍結乾燥ゼラチンメタクリレート５％（重量／体積）を添加し、８０℃で溶解した。カプセル化工程の直前に、１ｍｌ当たり５×１０６細胞の細胞密度で室温（ＲＴ）にてプレポリマー溶液に３Ｔ３細胞を再懸濁した。４０μｌのプレポリマー溶液中の細胞懸濁液をＴＭＳＰＭＡ及びＰＥＧＤＭＡ被覆ガラススライドに置き、ＵＶ光２．６ｍＷ  ｃｍ−２（Ｏｍｎｉｃｕｒｅ  Ｓ２０００）のもと２５秒間にわたって光架橋を行った。１×１ｍｍ２細胞カプセル化ヒドロゲルを得た。細胞を搭載したヒドロゲルをＰＢＳで洗浄してあらゆる残留プレポリマー溶液を除去し、培養培地に浸漬し、インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）で４時間培養した。４時間のインキュベーション時間の後、細胞を３０ｍｇ  ｍｌ−１  ５％（体積／体積）の安定ラジカル溶液と共に３０分間インキュベートし、洗浄した。生／死生存率アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を０日目の試料に対して行った。細胞培地を除去し、１５０μｌの生／死アッセイ試薬をマイクロゲルの表面に添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。２０μｌの供給された２ｍＭエチジウムホモダイマー−１（ＥｔｈＤ−１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）ストック溶液を１０ｍｌの滅菌ＰＢＳに添加してボルテックスを行うことによって生／死色素を作製した。その後、５μｌの供給された４ｍＭカルセインＡＭストック溶液をＥｔｈＤ−１溶液と合わせ、再度ボルテックスを行った。生存しているカプセル化細胞をカルセインＡＭにより緑色に標識し、死細胞をＥｔｈＤ−１リンカーにより赤色に標識した。倒立型蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ−Ｚｅｉｓｓ  ＡＸＩＯ）を使用して蛍光画像を撮影した。カプセル化細胞の生存率をＩｍａｇｅ  Ｊ  ＩＴＣＮ（Ｉｍａｇｅ  ｂａｓｅｄ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉ：核計数のための画像によるツール）細胞計数プラグインにより定量した。
【００９１】
免疫細胞化学染色のため、３Ｔ３細胞カプセル化ゲルを４％パラホルムアルデヒドで室温にて２０分間固定し、洗浄した。室温で少なくとも２時間、１％仔ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ）中０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００（Ｓｉｇｍａ）によりゲルを透過処理した。ウサギ抗Ｋｉ６７（Ａｂ１６６６７、Ａｂｃａｍ）で４℃にて一晩ゲルを染色した。洗浄工程の後、室温で２時間に亘り二次抗体ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６４（Ａ１１０１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にゲルをインキュベートした。核対比染色としてＤＡＰＩを使用した。洗浄後、ヒドロゲルを蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ−Ｚｅｉｓｓ  ＡＸＩＯ）のもとで可視化した。
【００９２】
ラット心臓の解剖及び心筋細胞の単離のため、完全成長培地を、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ウマ血清（Ｇｉｂｃｏ）、２．５％仔ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ  ｍｌ−１ペニシリン及び１００ｍｇ  ｍｌ−１ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）で構成した。０．１％（重量／体積）ＩＩ型コラゲナーゼ酵素（２７０Ｕ  ｍｇ−１、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用して、心臓組織の小片を単一の細胞に分離した。新生仔心筋細胞の単離のため１日齢又は２日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。ハーバード大学医学大学院の動物実験委員会の承認されたプロトコル第０４８２１号に従ってマウスを解剖した。氷冷ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）緩衝液（Ｃａ２＋及びＭｇ２＋不含、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｅｌｌｇｒｏ）中で心臓を濯いで血液細胞成分を除去した。心臓をハサミで１ｍｍ３〜２ｍｍ３の小片に刻んで氷冷ＨＢＳＳ中に入れた。低速シェーカーで４℃にて１５時間〜１８時間、氷冷ＨＢＳＳ中０．１％（重量／体積）精製トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）に細かく刻んだ心室を入れた。完全成長培地を添加してトリプシン消化を阻害し、３７℃で５分間待った。消化のため、心臓組織片をコラゲナーゼ溶液と共に３７℃でインキュベートした。コラゲナーゼと共に５回（各１０分間）インキュベーションを行い、最初の細胞懸濁物を吸引して死細胞及び損傷した細胞、細胞片並びに血液細胞を除去した。収集した細胞懸濁物を７０μｍの細胞ストレーナーに通した。細胞を１，０００ｒ．ｐ．ｍ．で５分間遠心分離し、コラゲナーゼを除去した。温かい完全成長培地に再懸濁した後、心筋細胞を富化するため細胞を６０分間予備的に播種した。細胞を計数した後、細胞懸濁液を１ｍｌのＧＥＬＭＡプレポリマー溶液中１×１０６細胞の濃度に調整した。
【００９３】
心臓細胞のカプセル化のため、心筋細胞のカプセル化及びマイクロゲルの製造の前に、ＴＭＳＰＭＡ及び２０％（重量／体積）ＰＥＧＤＭＡ被覆ガラススライドを作製した。ＧｅｌＭＡ３％（重量／体積）プレポリマー溶液を最初にＰＢＳ中にＰＩ０．１％（重量／体積）を溶解することによって作製した。ＰＩが完全に溶解すると、凍結乾燥ゼラチンメタクリレート３％（重量／体積）を添加し、８０℃で溶解した。初代心筋細胞を計数した後、カプセル化工程の直前にＧｅｌＭＡ３％（重量／体積）プレポリマー溶液に１ｍｌ当たり１０×１０６細胞の細胞密度で再懸濁した。４０μｌのプレポリマー溶液中の細胞懸濁液をＴＭＳＰＭＡ及びＰＥＧＤＭＡ被覆ガラススライドに置き、ＵＶ光２．９ｍＷ  ｃｍ−２（Ｏｍｎｉｃｕｒｅ  Ｓ２０００）のもと２５秒間にわたって光架橋を行った。１×１ｍｍ２細胞カプセル化ヒドロゲルをＵＶフォトマスクによって得た。細胞積載ヒドロゲルをＰＢＳで洗浄してあらゆる残留プレポリマー溶液を除去し、培養培地に浸漬した後、インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）で４時間培養した。４時間のインキュベーション時間の後、細胞を１０ｍｇ  ｍｌ−１及び３０ｍｇ  ｍｌ−１の５％（体積／体積）の安定ラジカル４−アミノ−ＴＥＭＰＯ溶液と３０分間インキュベーションし、その後洗浄した。
【００９４】
ビタミンＥ処理のため、安定ラジカルのインキュベーションの後、培養培地中０．５ｍｇ  ｍｌ−１ビタミンＥ溶液を１００％（体積／体積）濃度でウェルに添加した後、３０分間インキュベートした。３０分後、ビタミンＥ含有培養培地を吸引し、カプセル化された細胞をさらに１０日間培養した。
【００９５】
免疫細胞化学染色のため、心筋細胞カプセル化ヒドロゲルを４％パラホルムアルデヒドにより室温で２０分間固定し、ＰＢＳで洗浄した。ゲルを１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）でブロックし、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００（Ｓｉｇｍａ）により室温で２時間透過処理した。細胞をマウス抗−α−アクチン（サルコメア、Ａ７８１１、Ｓｉｇｍａ）及びウサギ抗ＧＡＴＡ−４（ａｂ５２４５、Ａｂｃａｍ）により４℃で一晩染色した。試料を洗浄し、二次ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８抗体及びヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に対して室温で２時間洗浄及び染色した。アクチン細胞骨格をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７ファロイジン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で可視化し、ＤＡＰＩを核対比染色として使用した。洗浄後、Ｌｅｉｃａ  ＳＰ８  Ｘ倒立型共焦点顕微鏡（Ｘ  ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（Ｌｅｉｃａ）により、ヒドロゲルを可視化した。
【００９６】
浮揚実験に対するゲル製造のため、９０％（重量／体積）熱分解黒鉛粉末を２０％（重量／体積）ＰＥＧＤＭＡプレポリマー溶液に添加し、１分間ボルテックスを行うことにより熱分解黒鉛包埋ＰＥＧＤＭＡヒドロゲル（Ｐｙｒｏｌｙｔｉｃ  ｇｒａｐｈｉｔｅ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ＰＥＧＤＭＡ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ）を作製した。プレポリマー溶液をガラス製のカバーガラスに置いた１×１ｃｍ２形のＰＭＭＡ成形型にピペットで移した。その後、別のカバーガラスを成形型の上に置いた。上記セットアップを最適化したパラメーターで、すなわちセットアップと光源の間５ｃｍ、６．９Ｗ  ｃｍ−２のＵＶ強度で３０秒の架橋時間、ＵＶ光に暴露した。その後、ゲルをレーザーカッター（アリゾナ州スコッツデールのＶｅｒｓａＬａｓｅｒ）によって製造されたＰＭＭＡチャンバーに入れ、エポキシ（２  Ｔｏｎ、透明エポキシ、Ｉｎ  ＤｅｖＴｕｂｅ）により組織化した。ＯｐｔｉＰｒｅｐと混合したＰＢＳを常磁性培地のプレ溶液として作製した。その後、３００ｍｇ  ｍｌ−１の安定ラジカルをプレ溶液に添加し、１．８Ｍのラジカル溶液を形成してゲルに対して浮揚環境を提供した。
【００９７】
別の実施例では、２つの熱分解性黒鉛を包埋した正方形のＰＥＧＤＭＡゲルを製造した。２つの１×１ｃｍ２のゲルを０．６Ｍ（左のゲル）及び６Ｍのラジカル溶液（右のゲル）において別々に一晩インキュベートした。磁化後、ゲルを取り出し、浮揚のためＰＭＭＡチャンバーにおいて０．１６ＭのＧｄ溶液に入れた。ＰＢＳにガドリニウム塩を添加し、１分間ボルテックスした後、８０℃のオーブンで２０分間インキュベートすることによってＧｄ溶液を作製した。
【００９８】
さらに別の実施例では、９０％（重量／体積）熱分解性黒鉛粉末を２０％（重量／体積）ＰＥＧＤＭＡプレポリマー溶液に添加し、１分間ボルテックスを行うことによって熱分解性黒鉛包埋ＰＥＧＤＭＡヒドロゲルを作製した。その後、混合したプレポリマー溶液を６００μｍのスペーサーにピペットで移した後、カバーガラスで覆った。フォトマスク（１×１ｍｍ  正方形の形状）をカバーガラスに置いた。セットアップ全体を最適化したパラメーターで、すなわちセットアップと光源の間５ｃｍ、６．９Ｗ  ｃｍ−２のＵＶ強度で２５秒の架橋時間、ＵＶ光に暴露した。個々の塊の正方形のＰＥＧＤＭＡゲルを取り出した。１０個のゲルを青色で染色し、６Ｍのラジカル溶液中でインキュベートしたのに対し、別の１０個のゲルを黄色で染色し、０．６Ｍのラジカル溶液中でインキュベートした。いずれの場合も、上記ゲルを一晩インキュベートした。磁化後、浮揚のためＰＭＭＡチャンバーにおいて０．１９１ＭのＧｄ溶液にゲルを入れた。ＰＢＳにガドリニウム塩を添加し、１分間ボルテックスした後、８０℃のオーブンで２０分間インキュベートすることによってＧｄ溶液を作製した。
【００９９】
ヒドロゲル染色のため、ヒドロゲルの製造に続き、１％（重量／体積）色素（Ｐｒｏｃｉｏｎ、Ｍｘ  ｄｙｅ）溶液をヒドロゲルの上部にピペットで移した。３０分後、ヒドロゲルを含むカバーガラスをＰＢＳで２回穏やかに洗浄した。色素は小分子で構成され、ポリマーとのわずかな相互作用を有する。色素は、組織化プロセスの間ヒドロゲルにおいて十分な時間留まるように十分な相互作用を示した。
【０１００】
ＥＰＲ測定用のラジカル化ＧｅｌＭａヒドロゲル製造のため、カバーガラスを中心に空洞（直径３ｍｍ、円形）を有するＰＭＭＡ成形型（高さ１．５ｍｍ、３ｃｍ×３ｃｍの正方形）の下に置いた。ＧｅｌＭＡプレポリマー溶液を（５％重量／体積、ＰＢＳに溶解した）を成形型に充填することによって円筒形のＧｅｌＭＡゲルを製造した。その後、別のカバーガラスをＰＭＭＡ成形型に置いた。ＵＶ光（６．９Ｗ／ｃｍ２、成形型の上５０ｍｍの高さ）を３０分間適用して、光架橋性ＧｅｌＭＡプレポリマー溶液中の架橋を達成した。カバーガラスを除去した後、固体の円筒形ＰＥＧＤＭＡゲルを得た。安定ラジカル（４−アミノ−Ｔｅｍｐｏ、ＳＩＧＭＡ）溶液（１０ｍｇ、３０ｍｇ、１５０ｍｇを１ｍｌのＰＢＳに溶解）を作製した。その後、４つの円筒形ＧｅｌＭａヒドロゲルを対照群と実験群に分けた。すなわち、（ｉ）対照：ＧｅｌＭＡヒドロゲルを１ｍｌのＰＢＳで満たした３５ｍｍ×１０ｍｍのＰｙｒｅｘの再利用可能なペトリ皿（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に１０時間入れる、（ｉｉ）実験Ａ：ＧｅｌＭＡヒドロゲルを１０ｍｇ／ｍｌの安定ラジカル溶液で満たしたペトリ皿に１０時間入れる、（ｉｉｉ）実験Ｂ：ＧｅｌＭＡヒドロゲルを３０ｍｇ／ｍｌの安定ラジカル溶液で満たしたペトリ皿に１０時間入れる、（ｉｖ）実験Ｃ：ＧｅｌＭＡヒドロゲルを１５０ｍｇ／ｍｌの安定ラジカル溶液で満たしたペトリ皿に１０時間入れる。その後、４つのＧｅｌＭＡヒドロゲルを電子スピン共鳴（ＥＰＲ）測定用チューブに入れた。
【０１０１】
ＥＰＲ用のゲルの成形型製造のため、円筒形ゲル用成形型を設計し、レーザーカッター（アリゾナ州スコッツデールのＶｅｒｓａＬａｓｅｒＴＭ）により製造した。ＰＭＭＡ（高さ１．５ｍｍ、３ｃｍ×３ｃｍの正方形）をレーザーカッターによりカットし、中心に直径３ｍｍの円筒形の空洞を形成した。
【０１０２】
正方形ゲル用の成形型を設計し、レーザーカッター（アリゾナ州スコッツデールのＶｅｒｓａＬａｓｅｒＴＭ）により製造した。ＰＭＭＡ（高さ１．５ｍｍ、２ｃｍ×２ｃｍの正方形）をレーザーカッターによりカットし、中心に１ｃｍ２の正方形の空洞を形成した。
【０１０３】
常磁性組織化に対するチャンバーの製造のため、異なる形状を有する全てのチャンバー及びチャネルを２層の３ｍｍのＰＭＭＡと１層の１５０μｍの厚さの両面粘着剤（ＤＳＡ）で構築し、レーザーカッター（ＶｅｒｓａＬａｓｅｒＴＭ、アリゾナ州スコッツデール）によってカットした。チャンバー及びチャネルをＰＢＳ及び０．００１％体積／体積のＴｗｅｅｎ  ８０溶液に溶解した２０％体積／体積のＯｐｔｉＰｒｅｐで満たした。染色し、ラジカル化したヒドロゲルを１つずつ組織化して、ゲルの上に置いた異なるネオジム磁石（１．２×２．４ｃｍ、カリフォルニア州のＫ＆Ｊ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ）により異なる形状を形成した。セルティック形のチャンバーは、長方形のチャネルに接続された３つの円形貯蔵器で構成された。渦巻き状のチャンバーは、中央の正方形のチャネルに接続された４つの円形貯蔵器で構成された。爪状のチャンバーは、左の長方形のチャネルに収束する３つの円形貯蔵器で構成された。木の枝型のチャンバー（ｔｈｅ  ｔｒｅｅ  ｂｒａｎｃｈｅｓ−ｓｈａｐｅｄ  ｃｈａｍｂｅｒ）は、左の長方形のチャネルに収束する５つの円形貯蔵器で構成された。
【０１０４】
ガラスバブルをカプセル化するより軽いゲルの製造のため、５０％重量／体積のガラスバブル（３Ｍ（商標）、Ｇｌａｓｓ  Ｂｕｂｂｌｅｓ  Ｓ３８ＨＳ）を５０％重量／体積ＰＥＧＤＭＡプレポリマー溶液（１％重量／体積の光開始剤（ＰＩ）を含む、Ｉｒｇａｃｕｒｅ  ２９５９、ＣＩＢＡ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）に添加した。４０μｌのＰＥＧＤＭＡプレポリマー溶液を９５ｍｍ×１５ｍｍのＰｙｒｅｘの再利用可能なペトリ皿（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の裏側のスペーサー（カバーガラス２５×２５ｍｍ２、厚さ１５０μｍ）にピペットで移した。別のカバーガラスを液滴の上に置いた。フォトマスク（１ｍｍ×１ｍｍ、正方形）をＵＶ光とプレポリマー液滴の間のカバーガラス上にセットした。ＵＶ光（２．９Ｗ／ｃｍ２、マイクロゲルの上５０ｍｍの高さ）を２０秒適用することによってマイクロゲルを製造した。その後、フォトマスク及びカバーガラスを除去し、正方形の象牙色のＰＥＧＤＭＡミクロゲルを形成した。
【０１０５】
ヒドロゲルの機械的特性に対する不均質な多孔性の効果を評価するため、ＡＤＭＥＴ  ｅＸｐｅｒｔ  ２６００二重カラム検査機（米国マサチューセッツ州ノーウッド）を使用して圧縮検査を行った。下記の各条件の６つの試料を機械的検査に対して作製した。
【０１０６】
マクロ多孔性ＰＥＧＤＭＡの製造のため、２％（重量／体積）ＰＩを含む９０％（重量／体積）ショ糖包埋ＰＥＧＤＭＡプレポリマー溶液を２つのカバーガラスの間に置いた３００μｍの厚さのＤＳＡ成形型（空洞形）に注いだ。セットアップを、最適化されたパラメーター、すなわち光源とセットアップの間の高さ５ｃｍ、６．９Ｗ／ｃｍ２の強度、及び４０秒の架橋時間の下でＵＶ光（３６０ｎｍ〜４８０ｎｍ）に暴露した。その後、全てのゲルをＰＢＳに漬け、ＰＢＳを２時間の間、１０分毎に交換した。ショ糖が浸出し、マクロ多孔性ＰＥＧＤＭＡゲル（横断面領域の幅４．５ｍｍ）が形成された後、ゲルを食用色素で１時間染色した。
【０１０７】
ナノ多孔性ＰＥＧＤＭＡゲルの製造のため、１％（重量／体積）ＰＩを５０％（重量／体積）ＰＥＧＤＭＡプレポリマー溶液に添加した。その後、８０μｌのプレポリマー溶液を３００μｍの厚さのスペーサーにピペットで移し、カバーガラスで覆った。円形のフォトマスクをカバーガラス上に置いた。セットアップ全体を、最適化されたパラメーター、すなわち光源とセットアップの間の高さ５ｃｍ、６．９Ｗ／ｃｍ２の強度、及び３０秒の架橋時間の下でＵＶ光（３６０ｎｍ〜４８０ｎｍ）に暴露した。その後、円形ゲル（横断面領域の幅１ｍｍ）を食用色素で１時間染色した。
【０１０８】
複合ゲルの製造のため、マクロ多孔性及びナノ多孔性の両方のＰＥＧＤＭＡゲルを、染色後３０分間、３０ｍｇ／ｍｌの４−アミノ−ＴＥＭＰＯ溶液中に保持した。ネオジム磁石を使用して、Ｘ形状のマクロ多孔性ＰＥＧＤＭＡゲルを４つの円形５０％（重量／体積）ナノ多孔性ＰＥＧＤＭＡゲルと組織化した。組織化プロセスの後、組織化されたゲルが貯蔵器の底に落ち着くまで、スイミング溶液（ｓｗｉｍｍｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を非常にゆっくりとピペットで取り出した（１回に３００μｌ、ゲルの可能性のある分解を防止する）。４０μｌの５０％（重量／体積）ＰＥＧＤＭＡプレポリマー溶液を組織化されたゲル上にピペットで移し、二次架橋を行った。架橋ゲルを第１層として１０ｍｌのＰＢＳによって被覆した後、第２層としてさらに１０ｍｌの鉱物油（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で覆った。先の組織化の上の同じ領域で同じ組織化を繰り返した。その後、アッセンブリが結束するまで鉱物油及びＰＢＳの液層を注意深くピペットで取り出した。４０μｌ、５０％（重量／体積）ＰＥＧＤＭＡプレポリマー溶液を、６００μｍのスペーサーに置いた組織化ゲルに添加した。その後、別の架橋を行った。残留物を除去した後、複合ゲルを長方形（横断面領域の幅４．５ｍｍ）に切り取った。
【０１０９】
全てのヒドロゲル試料を０．２ｍｍ／分の速度で破損するまで圧縮した。最初の５％〜２０％の歪領域の圧縮応力−歪曲線の初期線形領域の傾きとしてヤング率を特定した。
【０１１０】
ゲルと磁石の間の距離の範囲に対する単一の磁化ヒドロゲルについての平均速度の測定のため、２０％（重量／体積）ＰＥＧＤＭＡプレポリマー溶液を作製した。その後、１％（重量／体積）ＰＩをプレポリマー溶液に添加した。混合した溶液を８０℃のオーブンで２０分間〜３０分間、ＰＥＧＤＭＡとＰＩがよく溶解するまでインキュベートした。２００μｌの作製したプレポリマー溶液を６００μｍの厚さのスペーサーにピペットで移し、プレポリマー溶液の上にカバーガラスを置き、サンドイッチ様のセットアップを形成した。セットアップ全体を２．６Ｗ／ｃｍ２  ＵＶに３０秒間暴露した。１ｍｍ×１ｍｍの正方形のフォトマスクをヒドロゲルの形状の調整に使用した。ゲル化の後、ヒドロゲルスライドを１．２Ｍ（２００ｍｇ／ｍｌ）の４−アミノ−ＴＥＭＰＯ溶液中で３０分間インキュベートした。その後、ＰＢＳで３回スライドを洗浄し、赤色食用色素（Ｐｒｏｃｉｏｎ（登録商標）  ＭＸ  Ｄｙｅ、０３０  Ｆｉｒｅ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｒｅｄ）で１時間スライドを染色した。磁化し、染色された小さなヒドロゲルビルディングブロックを選び、ＯｐｔｉＰｒｅｐ及びＰＢＳと混合した培地上に置いた。表面にゲルを保持するための培地の作製は、８０％（体積／体積）ＰＢＳに２０％（体積／体積）ＯｐｔｉＰｒｅｐを添加することによって達成された。永久磁石を固定するための実験に使用するセットアップを３ｍｍ厚さのＰＭＭＡによって製造した。磁石の底表面とペトリ皿の間の距離を１ｃｍに設定した。直径８．５ｃｍ、円形のペトリ皿を使用した。３つの異なる垂直距離、すなわち１ｍｍ、２ｍｍ、及び３ｍｍを磁石とヒドロゲルの間に設定した。１ｍｍの高さ（全培地の０．９ｃｍの高さ）は、５１．０４ｍｌの培地をペトリ皿に満たすことによって制御された。２ｍｍの高さ（全培地の０．８ｃｍの高さ）は、４５．３７ｍｌの培地をペトリ皿に満たすことによって制御された。３ｍｍの高さ（全培地の０．７ｃｍの高さ）は、３９．７ｍｌの培地をペトリ皿に満たすことによって制御された。各実験に対し、ヒドロゲルを１．５ｃｍの距離（磁石の中心から測定して）に置いた。磁石を挿入した（また固定した）後、その常磁性特性により磁化ヒドロゲルは磁石へと徐々に移動し始めた。その過程を記録することにより、平均速度を得た。６回繰り返した後、移動時間（磁石を固定した時ｔ＝０）を得て、平均速度及びその標準偏差を計算した後、チャートにプロットした。
【０１１１】
ビタミンＥ処理磁化ヒドロゲルの平均速速度を測定するため、２０％（重量／体積）ＰＥＧＤＭＡプレポリマー溶液を作製した。その後、１％（重量／体積）ＰＩをプレポリマー溶液に添加した。混合した溶液を８０℃のオーブンで２０分間〜３０分間、ＰＥＧＤＭＡとＰＩがよく溶解するまでインキュベートした。２００μｌの作製したプレポリマー溶液を６００μｍの厚さのスペーサーにピペットで移し、カバーガラスをプレポリマー溶液に置いて、サンドイッチ様のセットアップを形成した。セットアップ全体を２．６Ｗ／ｃｍ２  ＵＶに３０秒間暴露した。１ｍｍ×１ｍｍの正方形フォトマスクをヒドロゲルの形状を調整するため使用した。ゲル化の後、ヒドロゲルスライドを１．２Ｍ（２００ｍｇ／ｍｌ）の４−アミノ−ＴＥＭＰＯ溶液中、３０分間インキュベートした。その後、スライドをＰＢＳで３回洗浄し、赤色の食用色素（Ｐｒｏｃｉｏｎ  ＭＸ  Ｄｙｅ、０３０  Ｆｉｒｅ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｒｅｄ）で１時間スライドを染色した。先の実験の粘度分析と異なり、フリーラジカルに対するビタミンＥの効果を調査するため、３０分間、１時間、及び２時間（合計３つのスライド）に亘る染色の後、０．５ｍｇ／ｍｌのビタミンＥをゲルスライドにピペットで移した。ビタミンＥ処理の後、ヒドロゲルビルディングブロックをＯｐｔｉＰｒｅｐ及びＰＢＳと混合した培地の上に置いた。表面上にゲルを保持するための培地の作製は、８０％（体積／体積）ＰＢＳに２０％（体積／体積）ＯｐｔｉＰｒｅｐを添加することによって達成された。磁石と培地の表面の間の距離を１ｍｍに設定した。各実験に対し、ヒドロゲルを１．５ｃｍの距離（磁石の中心から測定して）に置いた。６回繰り返した後、移動時間（磁石を固定した時ｔ＝０）を得て、平均速度及びその標準偏差を計算した後、チャートにプロットした。ラジカル溶液中でのビーズの浮揚に対し、３ｍｍの厚さのＰＭＭＡを使用して１．５ｃｍ、２．６ｃｍ、及び３．６ｃｍの高さのチャンバーを製造した。４５個のポリスチレンビーズ（ＣｈｒｏｍｏＳｐｈｅｒｅｓＴＭ  Ｒｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）を最初にＯｐｔｉＰｒｅｐ溶液（ＯｐｔｉＰｒｅｐＴＭ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＳＩＧＭＡ）に入れた。その後、本発明者らは、全てのビーズがほぼ底に沈むまで、ＰＢＳをＯｐｔｉＰｒｅｐに添加し続けた。１．８Ｍ（３００ｍｇ／ｍｌ）の安定ラジカルを上記溶液に添加し、十分にボルテックスを行って、溶液中に４−アミノ−ＴＥＭＰＯが溶解するまで８０℃のオーブンに３０分間入れた。その後、ビーズ及び４−アミノ−ＴＥＭＰＯ溶液を種々の高さのＰＭＭＡチャンバー（各チャンバーにビーズ４５個）にピペットで移した。その後、貯蔵器を磁気デバイスに入れ、ビーズの動きを記録した。画像分析の後、ビーズの最も外側を通る線によって囲まれる長方形の領域として規定される組織化領域を計算した。１．５ｃｍの高さのチャンバーについて、組織化領域をｔ＝０秒、１５秒、３０秒、４５秒、６０秒、１０５秒、１３５秒、１６５秒、及び１８０秒において計算した。２．６ｃｍの高さのチャンバーについて、組織化領域を０秒、３０秒、７０秒、１００秒、１３０秒、１５０秒、１９０秒、２２０秒、２５０秒、及び３００秒において計算した。３．６ｃｍの高さのチャンバーについて、組織化領域をｔ＝０秒、３０秒、５５秒、７５秒、１００秒、１２０秒、１５０秒、１８０秒、２４０秒、２７０秒、３００秒、３３０秒、３６０秒（磁石の間にチャンバーが固定された時をｔ＝０）において計算した。
【０１１２】
本発明は、１又は複数の好ましい実施形態に関して記載されているが、明らかに述べられているものの他に、多くの等価物、代替物、変種、及び修飾が可能であり、本発明の範囲に含まれることが理解されるべきである。例えば、ある実施形態では、安定ラジカルは、ラジカル形態の分子が経時的に中性の非ラジカル形態へと壊変するように、既知の半減期を有する場合がある。したがって、組織化の間活性で、本来の壊変によりそのすぐ後に中和されるラジカル分子を選択することが可能な場合がある。かかる例では、抗酸化剤処理工程を使用しなくてもよい場合がある。
【０１１３】
本出願で特定される各参照は、その全体において参照により本明細書に援用される。
【０１１４】
本発明の概念が特定の実施形態を参照して説明されたが、当業者は、本発明の概念の趣旨から逸脱することなく上記実施形態に対して様々な置換及び／又は他の代替が行われ得ることを理解するであろう。したがって、上の記載は例であり、本発明の概念の範囲を限定するものではない。
【０１１５】
多数の実施例が本明細書に記載される。それにもかかわらず、様々な修飾が行われ得ることが理解されなければならない。例えば、記載される技術が異なる順番で行われる場合、及び／又は記載されるシステム、構造、デバイス、又は回路の構成成分が異なる方式で組み合わされる及び／又は他の構成成分若しくはそれらの等価物によって置換又は補足される場合、適した結果が達成される場合がある。したがって、他の実施は本発明の概念の範囲に含まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図５Ｋ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ−Ｃ】
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【図６Ｄ−Ｅ】
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【図６Ｆ−Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ−Ｊ】
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【図６Ｋ】
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【図６Ｌ】
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【図６Ｍ】
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【図６Ｎ】
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