(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
移行剤と複合体を形成する生物学的分子、および非複合体形成生物学的分子を含む混合物を提供するステップと；
混合物を、少なくとも１つのナノ細孔を含む膜と接触させるステップと；
ナノ細孔に電界を印加するステップと；
少なくとも１つのナノ細孔を通じて、移行剤と複合体を形成する生物学的分子を移行させるステップ
とを含む、生物学的分子組成物の分析方法であって、
複合体形成生物学的分子の移行が選択的に検出される、方法。
【請求項２】
複合体形成生物学的分子の１つまたは複数の移行事象の間に、ナノ細孔を通る電流の変化を測定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
複合体形成生物学的分子の移行事象の速度を測定するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
移行事象の速度から複合体形成生物学的分子の濃度を決定するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
複合体形成生物学的分子の濃度が移行事象の速度と実質的に直線関係を示す、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
移行された複合体形成生物学的分子を回収するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
移行剤が、印加電圧により設定された印加電界を用いた複合体形成生物学的分子の選択的な移行検出を可能にするのに十分な電荷を有する化学種である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
複合体形成生物学的分子および非複合体形成生物学的分子が、核酸およびタンパク質からなる群から独立して選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
移行剤が、複合体形成生物学的分子の移行前に、１つまたは複数の分子種と結合するためのアフィニティータグで修飾された一本鎖核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
アフィニティータグが、１つまたは複数のタンパク質と結合する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
アフィニティータグが、ビオチンまたはその誘導体を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
移行剤と複合体を形成する生物学的分子が、移行剤と相補的である配列を有する一本鎖核酸である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
一本鎖核酸が、１種または複数種のＲＮＡを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
複合体形成生物学的分子が核酸であり、移行事象の速度が核酸の長さに対して直線的に変化する、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つのナノ細孔が、５から３０ｎｍの直径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つのナノ細孔が、１０から２０ｎｍの直径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
印加電界の電圧が、１ｍＶから５Ｖである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願データ）
本出願は、２０１４年５月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／９９２，８１４号および２０１５年３月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／１３２，９８９号への米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張し、これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は生物学的分子組成物の分析に関し、特に、固体状態ナノ細孔を用いた生物学的分子組成物の選択的検出および定量に関する。
【背景技術】
【０００３】
免疫沈降およびプルダウンアッセイは生化学において主力である。異種混合物中の特定の物質を識別する能力によって、それらはプロテオミクス、エピジェノミクスおよびトランスクリプトミクスを含む、幅広い分野で重要な役割を果たす。しかしながら、幅広い有用性にもかかわらず、これらの確立された戦略には限界がある。大きな試料サイズが必要であることに加え、多くの人手を要し、本質的に定量的ではなく、それに続くＰＣＲまたは下流分析の充実が概ね必要である。これらの理由により、単一分子の感度がある定量技術は重要な利点を提供し得る。
【発明の概要】
【０００４】
一態様において、生物学的分子組成物の選択的検出および定量分析のための方法が本明細書に記載される。本明細書に記載の方法は、移行剤（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）と複合体を形成する生物学的分子、および非複合体形成生物学的分子を含む混合物を提供することを含む。混合物を少なくとも１つのナノ細孔を含む膜と接触させ、電界をナノ細孔に印加し、少なくとも１つのナノ細孔を通じて移行剤と複合体を形成する生物学的分子を移行し、複合体形成生物学的分子の移行が選択的に検出される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、複合体形成生物学的分子の１つまたは複数の移行事象の間に、ナノ細孔を通る電流の変化を測定することをさらに含む。さらに、該方法は、複合体形成生物学的分子の移行事象の速度を測定すること、および移行事象の速度から複合体形成生物学的分子の濃度を決定することをさらに含むことができる。重要なのは、移行された複合体形成生物学的分子を溶液から回収でき、よって最初の混合物の非複合体形成生物学的分子から分離されることである。本明細書に記載の方法による分析に適する生物学的分子は、核酸およびタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、例えば、生物学的分子は一本鎖および二本鎖デオキシリボ核酸（dexoxyribonucleic acid）（ＤＮＡ）、ならびにリボ核酸（ＲＮＡ）および鎖内二重らせんを有するＲＮＡを含む。
【０００５】
これらおよび他の実施形態は下記の詳細な説明においてより詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、本明細書に記載の一実施形態による生物学的分子組成物分析の方法を示す図である。
【図２】図２は、本明細書に記載のいくつかの実施形態による、共通の化学量論範囲での電気泳動移動度シフトアッセイと比較した、様々な電界での複合体形成生物学的分子の移行事象速度を示す図である。
【図３】図３は、本明細書に記載の一実施形態による、移行剤および複合体形成生物学的分子のモル比が１：１までの複合体形成生物学的分子の事象速度を示す図である。
【図４】図４は、本明細書に記載の一実施形態による、移行事象速度に対する複合体形成生物学的分子濃度の定量を示す図である。
【図５】図５は、本明細書に記載の一実施形態による、複合体形成移行剤および非複合体形成移行剤への印加電圧に対する移行事象速度を示す図である。
【図６】図６は、本明細書に記載の一実施形態による、複合体形成移行剤、非複合体形成移行および非複合体形成一本鎖核酸への印加電圧に対する移行事象速度を示す図である。
【図７】図７は、本明細書に記載の一実施形態による、複合体形成ｄｓ−ＤＮＡおよび非複合体形成ｄｓ−ＤＮＡへの印加電圧に対する移行事象速度を示す図である。
【図８】図８は、本明細書に記載の一実施形態による、複合体形成生物学的分子濃度に対する移行事象速度を示す図である。
【図９】図９は、本明細書に記載の一実施形態による、ｄｓ−ＤＮＡの長さに対する移行事象速度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
（詳細な説明）
本明細書に記載の実施形態は、下記の詳細な説明および実施例、ならびにそれらの前後の説明を参照することにより、より容易に理解することができる。しかしながら、本明細書で記載される要素、装置および方法は、詳細な説明および実施例に示される特定の実施形態に制限されない。これらの実施形態は、本発明の原理の例示にすぎないことが認識されるべきである。多くの改変および適合は本発明の精神および範囲から逸脱せず、当業者には容易に明らかであろう。
【０００８】
一態様において、生物学的分子組成物の選択的検出および定量分析のための方法が本明細書に記載される。本明細書に記載の方法は、移行剤と複合体を形成する生物学的分子、および非複合体形成生物学的分子を含む混合物を提供することを含む。混合物を少なくとも１つのナノ細孔を含む膜と接触させ、電界をナノ細孔に印加し、少なくとも１つのナノ細孔を通じて移行剤と複合体を形成する生物学的分子を移行し、複合体形成生物学的分子の移行が選択的に検出される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、複合体形成生物学的分子の１つまたは複数の移行事象の間に、ナノ細孔を通る電流の変化を測定することをさらに含む。さらに、該方法は、複合体形成生物学的分子の移行事象の速度を測定すること、および移行事象の速度から複合体形成生物学的分子の濃度を決定することをさらに含むことができる。重要なのは、移行された複合体形成生物学的分子を溶液から回収でき、よって最初の混合物の非複合体形成生物学的分子から分離されることである。
【０００９】
次に特定の工程を検討すると、本明細書に記載の方法は、移行剤と複合体を形成する生物学的分子、および非複合体形成生物学的分子を含む混合物を提供することを含む。本明細書に記載の方法によって、本発明の目的と矛盾しない任意の生物学的分子を選択的に検出および定量できる。本明細書に記載の方法による分析に適する生物学的分子は核酸を含む。いくつかの実施形態において、例えば、生物学的分子はｓｓ−ＤＮＡ、ｄｓ−ＤＮＡ、ならびにＲＮＡおよび鎖内二重らせんを有するＲＮＡを含む。ＲＮＡはｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ａＲＮＡまたはそれらの混合物を含むことができる。核酸は本発明の目的と矛盾しない、任意の所望の数のヌクレオチドを有することができる。いくつかの実施形態において、例えば、分析のための核酸は２５から１０００のヌクレオチドを有する。加えて、核酸は表Ｉから選択される数多くのヌクレオチドを有することができる。
【００１０】
【表１】
0006513705.tif 000002
【００１１】
混合物の核酸は真核生物、原核生物および／またはウイルス源に由来し得る。さらに、生物学的分子は核酸断片またはオリゴヌクレオチドを含むことができる。本明細書に記載の方法によって、本発明の目的と矛盾しない任意の長さのオリゴヌクレオチドを選択的に検出および定量できる。さらに、分析のための生物学的分子は単一ヌクレオチドおよび／またはその誘導体を含むことができる。
【００１２】
核酸に加えて、本明細書に記載の方法による分析に適する生物学的分子はタンパク質を含む。本発明の目的と矛盾しない任意のタンパク質を本明細書に記載の方法に用いることができる。
【００１３】
本明細書に記載のとおり、混合物の生物学的分子は移行剤と選択的に複合体を形成する。移行剤は、印加電圧により設定された印加電界を用いた複合体形成生物学的分子の移行の選択的検出を可能にする十分な電荷および／または構造がある化学種である。いくつかの実施形態において、例えば、移行剤はタンパク質、核酸または核酸断片を含む生物学的分子である。生物学的分子は天然に存在する状態であり得る。代替的に、複合体形成生物学的分子の移行の選択的検出を可能にする特定の結合、好適な電荷および／または構造を立証するために、生物学的分子を改変することができる。いくつかの実施形態において、移行剤は、複合体形成生物学的分子の移行前に１つまたは複数の分子種と結合するためのアフィニティータグで修飾された一本鎖核酸を含む。例えば、移行剤は、一本鎖核酸がタンパク質タグで修飾された、公知の特定の配列である一本鎖核酸を含むことができる。タンパク質タグは、移行剤と複合体を形成する生物学的分子の移行前に生物学的分子の混合物中の好適なタンパク質と結合することができる。一実施形態において、一本鎖核酸の移行剤は、相補（complimentary）配列の標的核酸の移行前にストレプトアビジンと結合するためにビオチニル化されている。
【００１４】
他の実施形態において、移行剤はナノ粒子のような非生物化学種である。本発明の目的と矛盾しない任意のナノ粒子を用いることができる。ナノ粒子は、例えば、カーボンナノ粒子（カーボンナノチューブ、グラフェン、フラーレン、等）を含む有機ナノ粒子を含むことができる。ナノ粒子は半導体ナノ粒子、セラミックナノ粒子および／または金属ナノ粒子のような無機ナノ粒子も含むことができる。
【００１５】
移行剤を生物学的分子混合物に加え、移行剤は生物学的分子と選択的に結合し、複合体形成生物学的分子を提供する。移行剤により選択的に結合しない生物学的分子は、混合物の非複合体形成生物学的分子を形成する。
【００１６】
選択的な移行検出のために生物学的分子に複合体を形成させるために、移行剤は部位特異的結合領域を含むことができる。複合体が形成される生物学的分子の同一性によって、部位特異的結合領域はＤＮＡまたはＲＮＡ結合ドメインであり得る。例えば、いくつかの実施形態において、移行剤は核酸結合ドメインの使用を必要とする核酸に直接結合することができる。
【００１７】
一本鎖核酸の移行剤は、生物学的分子の混合物中の相補配列の標的一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズすることができる。選択的ハイブリダイゼーションに続く移行は、混合物中の標的一本鎖核酸の定量を可能にし得る。いくつかの実施形態において、配列が異なる複数の一本鎖核酸の移行剤を、混合物中のいくつかの標的一本鎖核酸の存在の同定および／または定量に用いることができる。高度に保存された配列を、例えば、様々な細菌種のような、混合物中の特定種の同定が可能である移行剤に用いることができる。１つまたは複数の塩基対の不一致が分析結果に示される場合、相同性をモニターすることもできる。さらに、ＤＮＡの融解および／またはアニーリング特性は、一本鎖核酸の移行剤を用いることによって解明することができる。一本鎖型（移行剤と複合体を形成していない）および二本鎖型（移行剤と複合体を形成している）間の移行は、移行事象と一時的に相関があり得る。
【００１８】
代替的に、部位特異的結合領域はタンパク質結合ドメインであり得る。他の実施形態において、移行剤に結合するためのアフィニティータグを核酸に提供でき、それによって、タンパク質結合ドメインを必要とする。
【００１９】
移行剤は、複合体形成生物学的分子の同一性によって、いくつかのメカニズムによる複合体形成生物学的分子の移行の選択的検出を可能にし得る。いくつかの実施形態において、例えば、目的の生物学的分子は、印加電界の選択された条件および／または他の溶液条件でのナノ細孔を通じた移行に十分な電荷を持たない。そのような実施形態において、移行剤は目的の生物学的分子に十分な電荷を提供して、選択された印加電界および／または他の溶液条件での移行を起こす。したがって、混合物の非複合体形成生物学的分子が選択された条件下で移行しないので、複合体形成生物学的分子の移行を選択的に検出することができる。
【００２０】
代替的に、目的の生物学的分子は高電荷であり、ナノ細孔分析で用いられる従来の電子技術では検出できない速度で移行を起こす。タンパク質は、例えば、従来の電子技術では検出できない速度で度々移行し、それによって、ナノ細孔装置はタンパク質の検出および定量に適さない。そのような実施形態において、移行剤は十分な対立電荷および／またはサイズのものであり、従来のナノ細孔システムおよび電子技術での検出および定量のため、タンパク質移行速度を遅らせることができる。同様に、一本鎖核酸は、従来の電子技術では検出できない速度で度々移行し、それによってナノ細孔装置は核酸の検出および定量に適さない。そのような実施形態において、生物学的分子の混合物中の標的一本鎖核酸と相補的な配列を有する一本鎖核酸の移行剤が用いられる。一本鎖核酸の移行剤は、標的一本鎖核酸と形成する複合体の検出を可能にする構造を示す。本明細書に記載のとおり、一本鎖核酸の移行剤は、複合体形成標的一本鎖核酸の移行前に１つまたは複数の分子種と結合するためのタンパク質タグのようなアフィニティータグで修飾され得る。さらに、移行剤は、混合物中の他の種と十分に区別できる移行速度またはナノ細孔の滞留時間を提供し得る。
【００２１】
本明細書に記載のとおり、移行剤と複合体を形成する生物学的分子および非複合体形成生物学的分子を含む混合物は、少なくとも１つのナノ細孔を含む膜と接触する。いくつかの実施形態において、膜はナノ細孔の配列を含む。膜は任意の厚さを有し、本発明の目的と矛盾しない任意の材料から形成され得る。いくつかの実施形態において、膜は非金属性である。非金属性膜は、セラミック材料を含む１つまたは複数の電気絶縁材料を含むことができる。好適なセラミックは、金属酸化物、金属窒化物、金属炭化物もしくは金属炭窒化物またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態において、膜としての使用に適するセラミックは窒化ケイ素（ＳｉＮ、Ｓｉ３Ｎ４）である。加えて、膜セラミックは酸化ケイ素、炭化ケイ素、酸化アルミニウムまたは遷移金属酸化物を含むことができる。
【００２２】
いくつかの実施形態において、セラミック膜は本質的に多結晶である。いくつかの実施形態において、セラミック膜は本質的に単結晶である。さらに、セラミック膜は多層であり得る。多層膜の個別の層は、同じ材料または異なる材料を含むことができる。いくつかの実施形態において、セラミック膜の個別の層は遷移金属炭化物、遷移金属窒化物、遷移金属炭窒化物、遷移金属酸化物、アルミナ、シリカおよび窒化ケイ素からなる群から独立して選択される。
【００２３】
さらに、膜は１つまたは複数の半導体の材料を含むことができる。いくつかの実施形態において、好適な半導体の材料はＩＩ／ＶＩ半導体、ＩＶ族半導体またはＩＩＩ／Ｖ半導体を含む。いくつかの実施形態において、半導体材料は三元半導体または四元半導体を含む。好適な半導体材料は非晶構造、結晶構造またはそれらの混合物を有することができる。結晶半導体材料は多結晶または単結晶であり得る。
【００２４】
いくつかの実施形態において、膜は金属性である。そのような実施形態において、膜は金属または様々な金属合金であり得る。いくつかの実施形態において、例えば、好適な金属は、金のような貴金属を含む遷移金属である。代替的に、膜は、いくつかの実施形態においては金ではない。金属性膜を、本明細書に記載の方法で用いられる誘電または電気絶縁材料で覆うことができる。
【００２５】
いくつかの実施形態において、膜は有機材料を含む。例えば、膜は１つまたは複数の高分子材料を含むことができる。好適な高分子材料は、熱可塑性物質、熱硬化性物質またはエラストマーを含む。高分子材料は、いくつかの実施形態において、ポリエチレン、ポリプロピレンおよびポリカーボネートの１つまたは複数を含む。
【００２６】
本明細書に記載の方法の使用に適する膜は任意の所望の厚さを有することができる。いくつかの実施形態において、膜は、一本鎖核酸セグメントを含む１つまたは複数の核酸セグメントの検出および／または分析の実行に適する厚さを有する。いくつかの実施形態において、膜は約２００ｎｍ未満または約１００ｎｍ未満の平均厚さを有する。いくつかの実施形態において、膜は表ＩＩの平均厚さを有することができる。
【００２７】
【表２】
0006513705.tif 000003
【００２８】
さらに、膜は原子スケールの厚さを有することができる。いくつかの実施形態において、膜は、０．１ｎｍから０．９ｎｍのような、１ｎｍ未満の厚さを有する。いくつかの実施形態において、膜の厚さを、本明細書に記載の方法によるナノ細孔形成前に測定する。
【００２９】
加えて、本明細書に記載される膜のナノ細孔は、本発明の目的と矛盾しない任意のサイズおよび形を有することができる。いくつかの実施形態において、例えば、少なくとも１つのナノ細孔は約１ｎｍより大きいまたは約５ｎｍより大きい直径を有する。本明細書に記載される膜のナノ細孔は表ＩＩＩの直径を有する。
【００３０】
【表３】
0006513705.tif 000004
【００３１】
さらに、ナノ細孔は、膜の平均厚さと同じ厚さを有することができる。したがって、いくつかの実施形態において、ナノ細孔は本明細書の表ＩＩから選択される厚さを有することができる。代替的に、ナノ細孔は膜の平均厚さより薄い厚さを有する。
【００３２】
さらに、ナノ細孔の直径および／または厚さを、移行事象と関連がある電流測定のような、本明細書に記載される所望の信号対雑音比（ＳＮＲ）の測定に基づいて選択することができる。移行事象のＳＮＲは、いくつかの実施形態において、大きい直径のナノ細孔ほどより高く、小さい直径のナノ細孔ほどより低い。加えて、いくつかの実施形態において、ナノ細孔の直径および／または厚さは、ナノ細孔中の移行された種の所望の滞留時間または移行事象の所望の持続期間に基づいて選択される。いくつかの実施形態において、滞留時間および／または移行事象の持続期間は、薄いナノ細孔よりも厚いナノ細孔でより長い。滞留時間は、いくつかの実施形態において、ナノ細孔での最初のコンダクタンス低下から基礎値に戻るまでの経過時間である。
【００３３】
本明細書に記載される膜を本発明の目的と矛盾しない任意の方法で形成することができる。いくつかの実施形態において、例えば、膜を特許協力条約（ＰＣＴ）出願公開ＷＯ２０１２／１７０，４９９に記載される方法に従って形成し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３４】
本明細書に記載のとおり、電界をナノ細孔に印加させ、少なくとも１つのナノ細孔を通じて移行剤と複合体を形成する生物学的分子が移行し、移行事象が選択的に検出される。電界は、本発明の目的と矛盾しない任意の印加電圧に従って設定され得る。好適な印加電圧は、例えば、１ｍＶから５Ｖまでであり得る。いくつかの実施形態において、印加電圧は、１０ｍＶから１Ｖまたは５０ｍＶから５００ｍＶまでである。
【００３５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、複合体形成生物学的分子の１つまたは複数の移行事象の間に、ナノ細孔を通る電流の変化を測定することをさらに含む。さらに、該方法は、複合体形成生物学的分子の移行事象の速度を測定すること、および移行事象の速度から複合体形成生物学的分子の濃度を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、例えば、複合体形成生物学的分子の濃度。
【００３６】
重要なのは、移行された複合体形成生物学的分子は溶液から回収することができ、よって最初の混合物の非複合体形成生物学的分子から分離される。
【実施例】
【００３７】
これらおよび他の実施形態はさらに、下記の非限定的な実施例で示される。
【００３８】
（実施例１）
二本鎖ＤＮＡの選択的検出および定量
一価のストレプトアビジン（ＭＳ）の移行剤と結合するためのビオチンで修飾されたｄｓ−ＤＮＡの選択的検出および定量が本実施例に詳細に記載される。本実施例で用いられるモノビオチニル化されたｄｓ−ＤＮＡのＳＳ−ナノ細孔の識別を図１に示す。図１ａにおいて、電解質溶液に浸した単一のナノ細孔を有する薄膜に電気バイアスを印加する。これにより、孔を通じて分子（または分子複合体）の動電移行が容易になり、そのそれぞれがイオン電流事象を生じることができる。この技術はＭＳ（図１ｂ左）およびモノビオチニル化された９０ｂｐのｄｓＤＮＡ（ｂｉｏ９０、図１ｂ中央）測定に用い、それぞれ８μＭおよび１μＭの濃度で個々に測定した。５０〜２００ｍＶの範囲にわたって、どちらの分子についてもほとんど事象が同定されなかった。しかしながら、ＭＳとｂｉｏ９０を測定前にモル比８：１（ＭＳ：ｂｉｏ９０）で一緒にインキュベートすると、単位時間当たりの移行事象数の著しい増加（図１ｂ右）が観察された。混合物の事象速度は常に、どちらか一方の構成分子単独と比べて１桁より大きかった；２００ｍＶの印加電圧では、例えば、ＭＳ−ｂｉｏ９０複合体は２３．３±０．９ｓ−１の速度をもたらした一方、ＭＳおよびｂｉｏ９０個々の事象速度はそれぞれ０．０９±０．０４ｓ−１および１．１±０．２ｓ−１だった。複合体とナノ細孔との間の確率論的な相互作用よりも実際の移行にＭＳ−ｂｉｏ９０事象が対応することを立証するために、測定中に印加電圧の極性を逆にし、再捕獲事象を観察した。
【００３９】
さらにシステムを調査するため、一連のＳＳ−ナノ細孔測定を、ＭＳをｂｉｏ９０の一定量（１μＭ）に対して滴定して行った。全ての調査した電圧にわたって、測定された事象速度はモル比１：１まで著しく上昇した（図２ａ）。しかしながら、単一体からモル比８：１（ＭＳ：ｂｉｏ９０）まで、ＭＳの追加により事象速度はさらに上昇しなかった。これは、核タンパク質複合体の形成に必要なｄｓ−ＤＮＡの供給が限られた結果であり；タンパク質はかなり低い速度（約１０−５ｓ−１）であり、各オリゴヌクレオチドは単一のビオチン部分のみ含有するので、溶液中のほとんど全てのｂｉｏ９０が当モル濃度以上で結合したと予想された。同じ化学量論的範囲にわたってＭＳおよびｂｉｏ９０で行った電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）と移行結果を比較すると、非常に類似した傾向が観察された（図２ｂ）。これらのデータは、混合物に対して実質的に観察された全ての移行事象がＭＳ−ｂｉｏ９０複合体と対応したという結論を支持した。このアプローチの特異性が高いさらなる証拠は、ＭＳとインキュベートしたビオチニル化されていないｄｓＤＮＡが、ｂｉｏ９０単独と等しい、ごく小さい事象速度をもたらした対照測定によって提供された。
【００４０】
修飾オリゴヌクレオチドの選択的定量：図３において、モル比１：１までの事象速度を検証し、印加電圧の一次従属性を見出した。これは、ＭＳ−ｂｉｏ９０複合体の捕獲過程が孔との相互作用よりも拡散によって制御されていることを暗示し、以前の研究と一致した。重要なのは、事象頻度が分子濃度によって変化し得るので、観察された傾向が溶液中のＭＳ−ｂｉｏ９０複合体の定量への道を提供した。本システムで観察されたほとんど全ての事象は専ら複合体の移行によるものだったので、図３の直線フィットは、溶液中のＭＳ−ｂｉｏ９０の濃度を、所与の電圧で生じた特定の事象速度と関連付ける。よって、これまでに記載された測定は、タンパク質に限定されたレジーム（ＭＳ：ｂｉｏ９０＜１：１）で行い、その結果、測定された事象速度はコンジュゲートされていないｂｉｏ９０のバックグラウンドでＭＳ−ｂｉｏ９０複合体の定量を容易にした。しかしながら、同じアプローチは原則として、ビオチニル化されていないＤＮＡを有する異種溶液中でのビオチニル化されたオリゴヌクレオチドの定量にも用いることができる。
【００４１】
この可能性を調査するために、第三者によって調製された２つの試料で盲検試験を行った。これらのサンプルはそれぞれ、総濃度１μＭ（上述の測定濃度と等しい）に混合した、ビオチニル化されたおよびビオチニル化されていない９０ｂｐのｄｓ−ＤＮＡの異なる混合物を含有した。全てのｂｉｏ９０が複合体を形成したことを確認するために、両溶液をＭＳと共に４μＭの濃度でインキュベートする。以前のセクションに記載したように、ＭＳ単独では測定できる事象はごく少数しか生じなかったため、過剰のタンパク質は測定を不安定にしなかった。ＳＳ−ナノ細孔分析は、予想されたように、両試料で印加電圧と事象速度との間で直線関係を示した。２つの盲検試料から得られた事象速度と以前の測定との比較（図４）は、それぞれのｂｉｏ９０濃度の値を導いた：８５０±３５ｎＭ（試料１）および５２０±２０ｎＭ（試料２）。注目すべきことに、これらの実験で決定された濃度はそれぞれ調製された値である８００±２０および４８０±２０ｎＭに非常に一致していた。これらの結果は、我々のＳＳ−ナノ細孔アプローチは、混合試料中においても、単一ヌクレオチドビオチン修飾を選択的に有するＤＮＡを一意的に定量できることを立証する。
【００４２】
（方法）
ＳＳ−ナノ細孔デバイスの製造および電気的測定
ナノ細孔を、他にＷＯ２０１２／１７０，４９９に記載されているような技術を用いて製造した。簡単には、走査型ヘリウムイオン顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｏｒｉｏｎ  Ｐｌｕｓ）のビームの焦点を、シリコン支持チップの吊るされたシリコン窒化物薄膜（厚さ３０ｎｍ）に合わせた。較正された露出時間を用いて、７．３〜７．７ｎｍの直径のナノ細孔を摩砕した。そして、個別の孔を含有する支持チップを膜の両側への流体通路を有するカスタムフローセルに配置した。測定溶液（９００ｍＭのＮａＣｌおよび６ｍＭのＰＢＳ緩衝液）をフローセルの両側に導入し、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を溶液に浸した。デバイスが低いＲＭＳノイズ（一般的には、＜２０ｐＡ）および較正されたナノ細孔の直径と一致する直線電流−電圧特性を示すことを立証するために、電気的測定（Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ）を用いた。移行の測定は、生体分子を含有する測定溶液を有するデバイスの一方の側の溶液を交換することによって行った。コンダクタンスは２００ｋＨｚの帯域幅で記録し、四極ベッセルフィルターを用いて１００ｋＨｚでろ過した。分析は全ての測定に対して２５ｋＨｚの追加のローパスフィルターを適用したカスタムソフトウェアを用いて行った。分析の事象閾値について４つの標準偏差を設定し、１２〜２０００μｓの持続期間での事象のみについて検討した。
【００４３】
生体分子
Ｂｉｏ９０のオリゴヌクレオチド配列は購入した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）：ＴＧＴ  ＡＴＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＣＣＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＧＧ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＴＧＧ  ＴＡＴＢ  ＧＴＡ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＣＡ  ＴＴＣ  ＴＧＣ  ＡＧＧ  ＴＧＣ  ＡＣＡ  ＴＧＴ  ＴＡＡ  ＣＡＣ  ＴＡＧ  ＴＣＧ  ＴＧＡ。ＴＢは、内部がビオチニル化された単一のｄＴを表す。対立鎖（ｄｓＤＮＡを形成する）は修飾されていないヌクレオチドを含有していた。混合物（盲検測定）に用いたビオチニル化されていないオリゴヌクレオチドは同じ配列を有していたが、ビオチン部分は有していなかった。用いたストレプトアビジン変異体（ＳＡｅ１Ｄ３）は１つの活性ビオチン結合部位を含有し、Ｈｏｗａｒｔｈ  ｌａｂ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から供給された。この変異タンパク質（５４．５ｋＤａ）は野生型ストレプトアビジンと類似の結合アフィニティーおよび安定性を保持し、同等のｐＨ条件下で−１７．１ｅの負電荷を与える絶縁で用いられるヘキサグルタミン酸タグを含有する。
【００４４】
電気泳動移動度シフトアッセイ
ＭＳをｂｉｏ９０と０：１から８：１までのモル比（ＭＳ：ｂｉｏ９０）で、室温で２０分インキュベートした。そして混合物を可視化のためのエチジウムブロマイドを含む１．５％アガロースゲルにロードした。電気泳動ユニットの緩衝液槽を氷浴に浸し、タンパク質−ＤＮＡ複合体の解離を最小限にした。
【００４５】
（実施例２）
二本鎖ＤＮＡの選択的検出および定量
２種のＤＮＡ分子により与えられる牽引力の変動によって、ビオチニル化されたｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡを区別する能力を立証した。この効果はＭＳの存在下、ナノ細孔による一本鎖（ｓｓ）および二本鎖（ｄｓ）バーションの３４塩基対（ｂｐ）モノビオチニル化されたオリゴヌクレオチドの両方を分析することにより立証した。図５に示すように、事象速度の顕著な増加がｄｓＤＮＡ−ＭＳで観察され、ｓｓＤＮＡ−ＭＳでは増進が観察されなかった。この結果に基づいて、ビオチニル化されたｓｓＤＮＡは、生物学的分子の混合物中の相補標的配列と結合することができる配列特異的移行剤として用いることができる。３４ｂｐのビオチニル化されたｓｓＤＮＡの配列特異的移行能力を、相同性配列の一本鎖核酸および４つの非相同性ｓｓＤＮＡ配列のバックグラウンドを含む混合物で試験した。ＭＳを混合物中に導入し、熱サイクルを行い、アニーリングを促進した。図６は、ビオチニル化されたｄｓＤＮＡ−ＭＳのハイブリダイズされた複合体の移行が観察された結果を示す。重要なのは、非複合体形成ｓｓＤＮＡおよび非複合体形成ビオチニル化されたｓｓＤＮＡ−ＭＳ移行剤の移行が観察されなかったことである。
【００４６】
（実施例３）
ｄｓ−ＤＮＡの移行の特徴付け
一連のＳＳ−ナノ細孔の測定は、ビオチンで酵素的に標識され、続いてＭＳに結合した単一ヒドロキシメチルシトシンを有する１５０ｂｐのｄｓ−ＤＮＡ鎖の移行事象速度を、ナノ細孔の印加電圧および１５０ｂｐのｄｓ−ＤＮＡ鎖の濃度に対して測定して行った。ナノ細孔の構築および操作パラメーターは、５０〜６００ｍＶまでの印加電圧である実施例１で得たもの一致した。図７は、ｄｓ−ＤＮＡ−ビオチン−ＭＳの移行事象速度が電圧の上昇と共に増加した試験結果を示す。比較のために、ビオチン−ＭＳ移行剤構造を用いていない１５０ｂｐのｄｓ−ＤＮＡ鎖を試験し、移行反応は記録されなかった。ｄｓ−ＤＮＡ−ビオチン−ＭＳ濃度への移行事象速度の依存性もまた調査した。図８に示すように、移行事象速度は、２００ｍＶの一定の印加電圧でｄ−ｓＤＮＡ−ビオチン−ＭＳ濃度に対して概ね直線的に変化した。図８の影の部分はノイズフロアを表す。ｄｓ−ＤＮＡの長さへの移行事象速度の依存性もまた調査した。図９に示すように、移行率は、ｄｓ−ＤＮＡの長さへの実質的な一次従属性を示した。これらの立証された関係によって、本明細書に記載の方法は、核酸を含む生物学的分子の特徴付けおよび定量に対して強力なツールを提供する。
【００４７】
本発明の様々な実施形態は、本発明の様々な目的の履行として記載されている。これらの実施形態は、本発明の原理の単なる例示であることを理解されたい。発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者には多くの修正および適応が容易に明らかであろう。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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