(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカインパネルを分析するためのキットであって、
（ａ）
（ｉ）複数のウェルを含み、各ウェルは、以下のヒトでの分析対象：ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３およびＴＮＦαに対する捕捉抗体が結合している１０個の分離した結合ドメインを含む、マルチウェルアッセイプレート；
（ｉｉ）複数のウェルを含み、各ウェルは、ヒトでの以下の分析対象：ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７Ａ、ＴＮＦ−βおよびＶＥＧＦ−Ａに対する捕捉抗体が結合している１０個の分離した結合ドメインを含む、マルチウェルアッセイプレート；
（ｉｉｉ）複数のウェルを含み、各ウェルは、ヒトでの以下の分析対象：エオタキシン、ＭＩＰ−１α、エオタキシン−３、ＴＡＲＣ、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＭＤＣおよびＭＣＰ−４に対する捕捉抗体が結合している１０個の分離した結合ドメインを含む、マルチウェルアッセイプレート；
（ｉｖ）複数のウェルを含み、各ウェルは、ラットでの以下の分析対象：ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＫＣ／ＧＲＯ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびＴＮＦ−αに対する捕捉抗体が結合している１０個の分離した結合ドメインを含む、マルチウェルアッセイプレート；または
（ｖ）複数のウェルを含み、各ウェルは、マウスでの以下の分析対象：ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＫＣ／ＧＲＯ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０およびＴＮＦ−αに対する捕捉抗体が結合している１０個の分離した結合ドメインを含む、マルチウェルアッセイプレート
から選択されるマルチウェルアッセイプレート；
（ｂ）１つまたはそれ以上のバイアル、容器または区画中にあり、前記分析対象に対して特異的な、標識された検出抗体のセット；ならびに
（ｃ）１つまたはそれ以上のバイアル、容器または区画中にある、校正用タンパク質のセット
を含む、前記キット。
【請求項２】
１つまたはそれ以上の希釈用液をさらに含む、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記検出抗体は電気化学発光（ＥＣＬ）標識により標識されている、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
ＥＣＬ読取用緩衝液をさらに含む、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
前記分離した結合ドメインは前記ウェル内の電極上に位置する、請求項３に記載のキット。
【請求項６】
校正用タンパク質の前記セットはタンパク質の凍結乾燥混合物を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項７】
校正用タンパク質の前記セットは校正用タンパク質の液剤を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項８】
２つまたはそれ以上のサイトカインパネルを分析するためのキットであって、
（ａ）各々が複数のウェルを含み、各ウェルは、分析対象のセットに対する捕捉抗体が結合している１０個の分離した結合ドメインを含み、分析対象の前記セットは：
（ｉ）ヒトでの分析対象：ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３およびＴＮＦα；
（ｉｉ）ヒトでの分析対象：ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７Ａ、ＴＮＦ−βおよびＶＥＧＦ−Ａ；
（ｉｉｉ）ヒトでの分析対象：エオタキシン、ＭＩＰ−１α、エオタキシン−３、ＴＡＲＣ、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＭＤＣおよびＭＣＰ−４；
（ｉｖ）ラットでの分析対象：ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＫＣ／ＧＲＯ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびＴＮＦ−α；または
（ｖ）マウスでの分析対象：ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＫＣ／ＧＲＯ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０およびＴＮＦ−α
からなる群から選択される、２つまたはそれ以上のマルチウェルアッセイプレート；
（ｂ）１つまたはそれ以上のバイアル、容器または区画中にあり、前記分析対象に対して特異的な、標識された検出抗体のセット；ならびに
（ｃ）１つまたはそれ以上のバイアル、容器または区画中にある、校正用タンパク質のセット
を含む、前記キット。
【請求項９】
前記検出抗体は電気化学発光（ＥＣＬ）標識により標識されている、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記分離した結合ドメインは前記ウェル内の電極上に位置する、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記捕捉抗体および／または検出抗体は、ＣＩＥＦ、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ、ＤＬＳ、変性／非変性ゲルおよびＥｘｐｅｒｉｏｎからなる群から選択される分析試験法に供された、請求項９に記載のキット。
【請求項１２】
サイトカインパネルを分析するのに使用されるキットのロットを製造する方法であって、前記キットは、以下の分析対象のセット：
（ｉ）ヒトでの分析対象：ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３およびＴＮＦα；
（ｉｉ）ヒトでの分析対象：ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７Ａ、ＴＮＦ−βおよびＶＥＧＦ−Ａ；
（ｉｉｉ）ヒトでの分析対象：エオタキシン、ＭＩＰ−１α、エオタキシン−３、ＴＡＲＣ、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＭＤＣおよびＭＣＰ−４；
（ｉｖ）ラットでの分析対象：ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＫＣ／ＧＲＯ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびＴＮＦ−α；または
（ｖ）マウスでの分析対象：ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＫＣ／ＧＲＯ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０およびＴＮＦ−α
のうち１セットに対して特異的である、適格な検出抗体および捕捉抗体を含み；
前記ロット中の一部のキットをプレートコーティング均一性試験または機能試験に供する工程、および前記均一性試験または機能試験の結果に基づいて使用に足るロットを選別する工程を含む、前記方法。
【請求項１３】
前記使用に足るロットは：（ａ）プレート内変動係数（ＣＶ）、ここでＣＶは測定値のセットの標準偏差である、の平均は≦１０％；（ｂ）プレート内ＣＶの最大値は≦１３％；（ｃ）均一性測定値の平均は＜２５％；（ｄ）均一性測定値の最大値は＜３７％；および（ｅ）プレート内平均間のＣＶは≦１８％、からなる群から選択される均一性試験または機能試験の結果を満たす、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記使用に足るロットは、以下の均一性試験または機能試験の結果：（ａ）プレート内変動係数（ＣＶ)、ここでＣＶは測定値のセットの標準偏差である、の平均は≦１０％；（ｂ）プレート内ＣＶの最大値は≦１３％；（ｃ）均一性測定値の平均は＜２５％；（ｄ）均一性測定値の最大値は＜３７％；および（ｅ）プレート内平均間のＣＶは≦１８％、を満たす、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
サイトカインパネルを分析するのに使用されるキットを製造する方法であって、前記キットは、以下の分析対象のセット：
（ｉ）ヒトでの分析対象：ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３およびＴＮＦα；
（ｉｉ）ヒトでの分析対象：ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７Ａ、ＴＮＦ−βおよびＶＥＧＦ−Ａ；
（ｉｉｉ）ヒトでの分析対象：エオタキシン、ＭＩＰ−１α、エオタキシン−３、ＴＡＲＣ、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＭＤＣおよびＭＣＰ−４；
（ｉｖ）ラットでの分析対象：ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＫＣ／ＧＲＯ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびＴＮＦ−α；または
（ｖ）マウスでの分析対象：ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＫＣ／ＧＲＯ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０およびＴＮＦ−α
のうち１セットに対して特異的である、適格な検出抗体および捕捉抗体を含み；
（ａ）前記分析対象に対して特異的な検出抗体のセットのための原材料を、ＣＩＥＦ、ＤＬＳおよびＥｘｐｅｒｉｏｎに供する工程；
（ｂ）前記ＣＩＥＦ、ＤＬＳおよびＥｘｐｅｒｉｏｎ試験に基づいて、試験された前記（ａ）の原材料から適格な検出抗体を選択する工程；
（ｃ）前記分析対象に対して特異的な捕捉抗体のセットのための原材料を、ＣＩＥＦ、ＤＬＳおよびＥｘｐｅｒｉｏｎに供する工程；ならびに
（ｄ）前記ＣＩＥＦ、ＤＬＳおよびＥｘｐｅｒｉｏｎ試験に基づいて、捕捉抗体の前記（ｃ）の原材料から適格な捕捉抗体を選択する工程
を含む、前記方法。
【請求項１６】
前記検出抗体のセットのための前記原材料を、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、非変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびそれらの組合せからなる群から選択される追加の分析法に供する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出抗体のセットのための前記原材料を、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、非変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣ−ＭＡＬＳからなる追加の分析法に供する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記捕捉抗体のセットのための前記原材料を、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、非変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびそれらの組合せからなる群から選択される追加の分析法に供する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記捕捉抗体のセットのための前記原材料を、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、非変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣ−ＭＡＬＳからなる追加の分析法に供する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記検出抗体および捕捉抗体のセットのための前記原材料の各々を、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、非変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣ−ＭＡＬＳからなる追加の分析法に供する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１月３日に申請された米国仮特許出願第６１／７４８，６２６号の利益を主張するものであり、その全内容を参照によって本明細書に組み入れる。
【０００２】
本出願は、電気化学発光技術を用いてサイトカインを検出するために使用されるキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
サイトカインは急性および慢性炎症反応を媒介する可溶性因子であり、創傷治癒から自己免疫疾患までの多くの生理的事象に関与する。サイトカインは、細胞性および体液性免疫応答の重要な制御因子であり、その発現差異は広範な諸免疫疾患と関連付けられてきた。サイトカインは様々な細胞型に対して機能し、増殖、分化および成熟への刺激効果または阻害効果を有する。したがって、いずれかの生物システムにおいて単一のサイトカインのみのレベルを測定しても、全身レベルでの応答に関しては部分的な情報が得られるだけである。サイトカインのレベルについての包括的な試験は一般に、広範なセットのサイトカイン濃度を測定して、根底にある生理学をより良く理解することを目的とする。
【０００４】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は最も広く使用かつ報告されている、分泌されたサイトカインを定量するための方法である。しかしＥＬＩＳＡは、個々のアッセイウェル内で１反応あたり１個の分析対象しか検出できない。これにより試薬コストは高くなり、技術者の時間は過剰に費やされ、また各結果を得るためには大きなサンプル体積を用いる必要が生じる。強力なマルチプレックスアッセイにより、同一サンプル中の多くのサイトカインを同時に検出および定量できれば、コストは低減され、効率は改善することになる。従来のアッセイ法に対するマルチプレックス技術の利点としては、分析対象の同時検出、試薬取扱いの軽減、高いアッセイ処理能力、ならびにサンプルおよび試薬体積の減少が挙げられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、サイトカインパネルを分析するためのキットであって：
ｉ．（ａ）複数のウェルを含み、各ウェルは、ヒトでの以下の分析対象：ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３およびＴＮＦαに対する捕捉抗体が結合している１０個の分離した結合ドメインを含む、マルチウェルアッセイプレート；（ｂ）１つもしくはそれ以上のバイアル、容器もしくは区画中にあり、ヒトでの前記分析対象に対して特異的な、標識された検出抗体のセット；ならびに（ｃ）１つもしくはそれ以上のバイアル、容器もしくは区画中にある、校正用タンパク質のセット；
ｉｉ．（ａ）複数のウェルを含み、各ウェルは、ヒトでの以下の分析対象：ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７Ａ、ＴＮＦ−βおよびＶＥＧＦ−Ａに対する捕捉抗体が結合している１０個の分離した結合ドメインを含む、マルチウェルアッセイプレート；（ｂ）１つもしくはそれ以上のバイアル、容器もしくは区画中にあり、ヒトでの前記分析対象に対して特異的な、標識された検出抗体のセット；ならびに（ｃ）１つもしくはそれ以上のバイアル、容器もしくは区画中にある、校正用タンパク質のセット；
ｉｉｉ．（ａ）複数のウェルを含み、各ウェルは、ヒトでの以下の分析対象：エオタキシン、ＭＩＰ−１α、エオタキシン−３、ＴＡＲＣ、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＭＤＣおよびＭＣＰ−４に対する捕捉抗体が結合している１０個の分離した結合ドメインを含む、マルチウェルアッセイプレート；（ｂ）１つもしくはそれ以上のバイアル、容器もしくは区画中にあり、ヒトでの前記分析対象に対して特異的な、標識された検出抗体のセット；ならびに（ｃ）１つもしくはそれ以上のバイアル、容器もしくは区画中にある、校正用タンパク質のセット；
ｉｖ．（ａ）複数のウェルを含み、各ウェルは、ラットでの以下の分析対象：ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＫＣ／ＧＲＯ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびＴＮＦ−αに対する捕捉抗体が結合している１０個の分離した結合ドメインを含む、マルチウェルアッセイプレート；（ｂ）１つもしくはそれ以上のバイアル、容器もしくは区画中にあり、ヒトでの前記分析対象に対して特異的な、標識された検出抗体のセット；ならびに（ｃ）１つもしくはそれ以上のバイアル、容器もしくは区画中にある、校正用タンパク質のセット；または
ｖ．（ａ）複数のウェルを含み、各ウェルが、マウスでの以下の分析対象：ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＫＣ／ＧＲＯ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０およびＴＮＦ−αに対する捕捉抗体が結合している１０個の分離した結合ドメインを含む、マルチウェルアッセイプレート；（ｂ）１つもしくはそれ以上のバイアル、容器もしくは区画中にあり、ヒトでの前記分析対象に対して特異的な、標識された検出抗体のセット；ならびに（ｃ）１つもしくはそれ以上のバイアル、容器もしくは区画中にある、校正用タンパク質のセット
を含む、前記キットを提供する。
【０００６】
本明細書に記載するようなキット、またはキットのロットを製造する方法であって：（ａ）ヒトでの前記分析対象に対して特異的な検出抗体の予備的セットを、ＣＩＥＦ、ＤＬＳおよびＥｘｐｅｒｉｏｎに供する工程；（ｂ）前記ＣＩＥＦ、ＤＬＳおよびＥｘｐｅｒｉｏｎ試験に基づいて、検出抗体の前記予備的セットから適格な検出抗体を選択する工程；（ｃ）ヒトでの前記分析対象に対して特異的な捕捉抗体の予備的セットを、ＣＩＥＦ、ＤＬＳおよびＥｘｐｅｒｉｏｎに供する工程；ならびに（ｄ）前記ＣＩＥＦ、ＤＬＳおよびＥｘｐｅｒｉｏｎ試験に基づいて、捕捉抗体の前記予備的セットから適格な捕捉抗体を選択する工程を含む前記方法も提供する。好ましい実施形態では、キットのロットはこのプロトコールを使用して製造され、以下の規格のうち１つまたはそれ以上を満たす：（ａ）プレート内ＣＶの平均は≦１０％；（ｂ）プレート内ＣＶの最大値は≦１３％；（ｃ）均一性測定値の平均は＜２５％；（ｄ）均一性測定値の最大値は＜３７％；（ｅ）プレート内平均間のＣＶは≦１８％；（ｆ）シグナル下限は＞１５００；および（ｇ）シグナル上限は＜１０６。
【０００７】
好ましい実施形態では、本発明は、２つまたはそれ以上のサイトカインパネルを分析するためのキットであって、（ａ）各々が複数のウェルを含み、各ウェルは、分析対象のセットに対する捕捉抗体が結合している１０個の分離した結合ドメインを含み、分析対象の前記セットは：
（ｉ）ヒトでの分析対象：ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３およびＴＮＦα；
（ｉｉ）ヒトでの分析対象：ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７Ａ、ＴＮＦ−βおよびＶＥＧＦ−Ａ；
（ｉｉｉ）ヒトでの分析対象：エオタキシン、ＭＩＰ−１α、エオタキシン−３、ＴＡＲＣ、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＭＤＣおよびＭＣＰ−４；
（ｉｖ）ラットでの分析対象：ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＫＣ／ＧＲＯ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびＴＮＦ−α；または
（ｖ）マウスでの分析対象：ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＫＣ／ＧＲＯ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０およびＴＮＦ−α
からなる群から選択される、２つまたはそれ以上のマルチウェルアッセイプレート；
（ｂ）１つまたはそれ以上のバイアル、容器または区画中にあり、前記分析対象に対して特異的な、標識された検出抗体のセット；ならびに（ｃ）１つまたはそれ以上のバイアル、容器または区画中にある、校正用タンパク質のセット
を含む、前記キットを提供する。
【０００８】
本発明のさらなる実施形態は、各プレートが、プレート上面、プレート底面、ならびに該プレート上面および底面のｘ軸およびｙ軸を含み、各ウェルがスポットパターンを含み、該プレートが以下の規格：Δｘ≦０．２ｍｍ、Δｙ≦０．２ｍｍ、およびα≦０．１°を満たし、ここで、（ａ）Δｘは、該スポットパターンの中心とウェルの中心との間の、該プレートの該ｘ軸方向の差であり；（ｂ）Δｙは、スポットパターンの中心と該ウェルの中心との間の、該プレートの該ｙ軸方向の差であり；（ｃ）αは、該プレート底面の該ｘ軸と該プレート上面の該ｘ軸との間の、反時計回りの角度である、１０スポット９６ウェルのマルチウェルプレートである。
【０００９】
さらに本発明は、各プレートがプレート上面およびプレート底面を含み、各ウェルがあるスポットパターンを含み、該プレートが以下の規格を満たす、１０スポット９６ウェルのマルチウェルプレートを検討する：（ａ）長さの範囲は３．８９０４〜３．９００４インチ；（ｂ）幅の範囲は２．４７３６〜２．４８３６インチ；および（ｃ）ウェルからウェルまでの間隔は０．３５１３〜０．３５７３インチ。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】（ａ）−（ｃ）は、マルチウェルプレートのウェル内の１０スポットパターン（パネル（ａ））、９６ウェル１０スポットプレート内でのその配置（パネル（ｂ））、および本明細書に記載するようなマルチウェルアッセイプレートを使用して行うイムノアッセイの原理を図解した図である。
【図２】（ａ）−（ｅ）は、５個のサイトカインパネルの各々に対する標準曲線を示す図である。
【図３ａ】９６ウェルのマルチウェルアッセイプレートの構成を示す図である。
【図３ｂ】９６ウェルのマルチウェルアッセイプレートの構成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書で別段の規定がない限り、本発明との関連で使用される科学的および技術的用語は、通常の当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上別段の要求がない限り、単数形の用語は複数を包含し、複数形の用語は単数を包含するものとする。「１つの」という冠詞は、本明細書では、該冠詞の文法的対象に関する、１個または１個を超える個数（すなわち、少なくとも１個）を指すために使用される。例えば「ある要素」とは、１個の要素または１個を超える個数の要素を意味する。
【００１２】
本明細書で使用される「サンプル」という用語は、着目する疾患のバイオマーカーを含むまたは含む可能性のある、あらゆる体液、細胞、組織、器官またはそれらの組合せもしくはその一部を意味することを意図する。サンプルは例えば、生検により得られた検体の組織切片であっても、組織培養されているまたは組織培養に適合させた細胞であってもよい。サンプルはさらに細胞下画分または抽出物であっても、粗製のまたは実質的に純粋な核酸分子またはタンパク質調製物であってもよい。一実施形態では、本発明のアッセイで分析されるサンプルは血液、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、単離した血液細胞、血清および血漿である。他の適切なサンプルとしては、生検組織、腸管粘膜、唾液、大脳髄液および尿が挙げられる。
【００１３】
本発明は、サイトカインパネルを分析するためのキットに関する。少なくとも５個のアッセイパネルを検討し、各キットは、以下のパネルのうち１個を分析するために構成する：
【表１】
0006599237.tif 000002
【００１４】
このキットは、（ａ）電気化学発光アッセイで使用するために構成されたマルチウェルプレート上に配置した単一パネル、ならびに（ｂ）検出抗体、校正用試料、ならびに任意選択の希釈用液（ｄｉｌｕｅｎｔｓ）および／または緩衝液のような付随する消耗品を含んでいてよい。代わりに、マルチウェルプレートおよび付随する消耗品は別個に提供することもできる。またさらにキットは、パネルを上に配置したマルチウェルプレートを２つまたはそれ以上含んでいてよい、すなわち、パネル１〜５および付随する消耗品はキットとして、または別個に提供することができる。
【００１５】
パネル１、２、４および５は、炎症反応、免疫および多くの生物学的過程の制御にとって重要な、炎症関連のおよび／または成長因子のバイオマーカーを含む。これらの分泌されたバイオマーカーは様々な組織および体液中で検出することができ、過剰発現または過小発現していた場合、体の生物学的平衡が変化したことを示している可能性がある。これらのパネルはまた、多くの、Ｔｈ１／Ｔｈ２経路のバイオマーカーからなる。これらのパネル中のバイオマーカーは数多くの障害、中でも、例えば関節リウマチ、アルツハイマー病、喘息、アテローム硬化、アレルギー、全身性紅斑性狼瘡、肥満、がん、うつ病、多発性硬化症、糖尿病、乾癬およびクローン病などに関与する。
【００１６】
パネル３は、８つのＣＣケモカインアッセイ（ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｂ、エオタキシン、ＭＣＰ−４、ＴＡＲＣ、ＭＤＣおよびエオタキシン−３）および２つのＣＸＣケモカインアッセイ（ＩＬ−８およびＩＰ−１０）からなる。ケモカインは分子量が約８〜１０ｋＤａの、指向的な走化性を誘導することのできる低分子の走化性サイトカインである。保存された位置にある４個のシステイン残基のために、ケモカインの三次元構造はコンパクトなものとなる。ケモカインは最初の２個のシステイン残基間の間隔に基づいて、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、ＣケモカインおよびＣＸ３Ｃケモカインの４つのケモカインファミリーに分けられ、ここで、Ｃはシステインを、Ｘは他のいずれかのアミノ酸を表す。ケモカインは特定のＧタンパク質共役型受容体を活性化することにより機能し、その結果、炎症細胞および非炎症細胞が移動することになる。炎症促進性ケモカインは、免疫細胞が感染部位へと移動する原因であり、一方、恒常性ケモカインは、組織維持および発生を目的とする細胞移動の原因である。ケモカインはいくつかの疾患に関連する。
【００１７】
パネル１〜５は、複数のウェルを含み、各ウェルが１０個の「スポット」または分離した結合ドメインのあるアレイを有する、マルチウェルアッセイプレート内に構成される。１０スポットウェルの例を図１（ａ）に、そのウェルをマルチウェルプレートに組み込んだところを図１（ｂ）に示す。図１（ｃ）に示すように、各分析対象に対する捕捉抗体をウェル内の結合ドメインに固定し、この捕捉抗体を使用して、標的の分析対象の存在をイムノアッセイにて検出する。簡潔に言えば、その分析対象を含むことが疑われるサンプルをウェルに添加し、その分析対象はもし存在したなら、指定された結合ドメインの捕捉抗体に結合する。結合ドメイン上において結合した分析対象の存在は、標識された検出抗体を添加することにより検出する。検出抗体も分析対象に結合し、結合ドメイン上で「サンドイッチ」複合体（捕捉抗体−分析対象−検出抗体）を形成する。パネル１〜５中の各分析対象の、この１０スポットパターン内での位置を表２に定める。
【００１８】
【表２】
0006599237.tif 000003
【００１９】
【表３】
0006599237.tif 000004
【００２０】
本明細書に記載するマルチプレックスイムノアッセイキットにより、使用者が同時に複数のバイオマーカーを定量することが可能となる。パネルは、個々のアッセイが一緒によく機能するように選択および最適化する。サンプルは、アッセイする前に希釈が必要なことがある。着目する特定のサンプルマトリックスのサンプル希釈は、所与のパネルについて、サンプルマトリックス効果を最小にし、パネル中の全分析対象がアッセイのダイナミックレンジ内にある確立を最大にするように最適化する。好ましい実施形態では、パネル中の全分析対象は、少なくとも１つのサンプルタイプにおいてサンプル希釈が同一となるように分析する。好ましい別の実施形態では、ほとんどのサンプルタイプについて同一となる希釈を用い、パネル中の全分析対象を測定する。
【００２１】
所与のパネルにつき、全分析対象の予想レベルが、同一のサンプル希釈のもとで定量可能範囲に入るように、検出抗体濃度と、検出抗体に関してのタンパク質あたりの標識数（Ｌ／Ｐ比）とを調節する。所与の分析対象についての定量可能範囲上限を広げることを望むならば、Ｌ／Ｐを下げることができ、かつ／または検出抗体濃度を下げる。一方、定量可能範囲下限を広げることを望むならば、Ｌ／Ｐを上げることができ、検出抗体濃度が飽和レベルにない場合はそれを上げることができ、かつ／またはバックグラウンドシグナルを下げることができる。
【００２２】
アッセイパネルと共に使用するための校正用標準試料は、そのパネルに対し推奨されるサンプル希釈で、適切な定量可能範囲が得られるように選択する。校正用標準試料は、パネル中の分析対象の１つまたはそれ以上を、既知の濃度で有する。分析対象の未知サンプルでの濃度は、これらの標準試料と比較することにより決定する。一実施形態では、校正用標準試料は、アッセイパネルで測定される各種分析対象の混合物を含む。組み合わせた校正用試料中の分析対象のレベルは、各々の分析対象のアッセイシグナルが同等、例えば２倍、５倍または１０倍以内などになるように選択することが好ましい。別の実施形態では、校正用標準試料は、異なる複数のアッセイパネルからの分析対象の混合物を含む。
【００２３】
校正曲線は、例えば、直線当てはめ、４−パラメータロジスティック（４−ＰＬ）および５−パラメータ（５−ＰＬ）当てはめのような、当技術分野で知られている曲線当てはめなどを用いて、校正用標準試料で測定したアッセイシグナルに当てはめることができる。このような当てはめを用いると、分析対象の未知サンプルでの濃度は、測定したアッセイシグナルの、算出した当てはめに対する後退当てはめにより決定できる。校正用標準試料での測定値は、検出限界（ＬＯＤ）、定量限界（ＬＯＱ）、ダイナミックレンジおよび線形限界（ＬＯＬ）のような、アッセイの特徴を決定するためにも使用できる。
【００２４】
キットは以下のアッセイ成分を含む：本明細書に記載するパネルの１個に対し、イムノアッセイを行うために構成したマルチウェルアッセイプレート、パネル中の分析対象に対する検出抗体のセット（ここで該セットは、個々の検出抗体、および／または１つもしくはそれ以上の個々の検出抗体の混合物を含む組成物を含む）、およびパネル中の分析対象に対する校正用試料のセット（ここで該セットは、個々の校正用タンパク質組成物、および／または１つもしくはそれ以上の個々の校正用タンパク質の混合物を含む組成物を含む）。このキットは、１つまたはそれ以上の、以下の追加成分を含むこともできる：ブロッキング緩衝液（サンプル添加前にアッセイプレートをブロッキングするために使用する）、抗体希釈用液（検出抗体のストック濃度を使用濃度に希釈するために使用する）、アッセイ希釈用液（サンプルを希釈するために使用する）、校正用試料希釈用液（校正用標準試料を希釈または再構成するために使用する）および読取用緩衝液（ａ  ｒｅａｄ  ｂｕｆｆｅｒ）（例えばＥＣＬ測定などによる、アッセイ標識の検出に適切な環境を用意するために使用する）。抗体およびアッセイ希釈用液は、バックグラウンドを低減し、特異的シグナルを最適化し、アッセイ干渉およびマトリックス効果を低減するように選択する。校正用試料希釈用液は、保管期限、および校正用試料としての活性の維持期間が最長となるように最適化する。ブロッキング緩衝液は、バックグラウンドを低減するように最適化すべきである。読取用緩衝液は、感度および定量可能範囲が適切となり、解離速度が最も遅くなるように選択する。キット成分の試薬は、希釈してある、または希釈していない液体試薬、凍結乾燥物またはそれらの組合せとして提供することができ、キットは、使用前に試薬を適切に調製するための指示を含む。好ましい実施形態では、個々の検出抗体組成物を複数、液体の形態で含むキットに、検出抗体のセットを含める。さらに、キットで提供する校正用試料のセットは、校正用タンパク質の凍結乾燥混合物を含むのが好ましい。またさらにキットは、捕捉抗体で予めコーティングし、かつ安定化処理を施して、固定した該抗体が損なわれていない状態で安定なことを確実にしておいたマルチウェルアッセイプレートを含む。
【００２５】
マルチプレックスパネル開発の一環として、アッセイは、校正用試料および検出抗体の非特異的結合を低減するように最適化する。サンドイッチイムノアッセイでは、特異性は主に捕捉抗体の結合から生じる。マルチプレックスパネル評価のために考慮すべきいくつかの点として以下が挙げられる：（ａ）検出抗体の捕捉抗体への非特異的結合を低減して、パネル中のアッセイのバックグラウンドを低くする。これは、検出抗体の濃度およびＬ／Ｐを調節することにより実現できる；（ｂ）検出抗体の、パネル中の他の校正用試料への非特異的結合も望ましくなく、最小にすべきである；（ｃ）パネル中の他の校正用試料および他の関連する分析対象の非特異的結合を最小にすべきである；校正用試料の非特異的結合があるならそれは、パネル中のアッセイの全体的特異性を低下させることがあり、また校正用試料が補足抗体への結合をめぐって競合することになるために、信頼できない結果を生ずることもある。
【００２６】
パネル中の異なるアッセイは、異なるインキュベーション時間およびサンプルの取扱い条件を、最高性能のために必要とすることがある。したがって目的とするのは、そのパネル中のほとんどのアッセイに関して最適化されたプロトコールを選択することである。アッセイプロトコールの最適化としては、それだけに限らないが、以下のプロトコールパラメータのうち１つまたはそれ以上を調節することが挙げられる：タイミング（各工程のインキュベーション時間）、調製手順（校正用試料、サンプル、対照など）および洗浄工程の回数。
【００２７】
キットで使用する試薬、例えば検出抗体および捕捉抗体および校正用タンパク質などは、分析試験に供され、そしてその規格を満たすまたは上回ることが好ましい。キットの材料（ｋｉｔ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ）をキャラクタライズするために使用できる分析試験としては、これらに限らないが、ＣＩＥＦ、ＤＬＳ、還元および／または非還元ＥＸＰＥＲＩＯＮ、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、非変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣ−ＭＡＬＳならびにそれらの組合せが挙げられる。好ましい実施形態では、材料をＣＩＥＦ、ＤＬＳならびに還元および非還元ＥＸＰＥＲＩＯＮでキャラクタライズする。これらに限らないが、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、非変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびそれらの組合せを含めた、１つまたはそれ以上の追加の試験を使用して材料をキャラクタライズすることもできる。好ましい実施形態では材料を、上に列挙したようなキャラクタリゼーション試験の１つまたはそれ以上だけでなく、機能試験、すなわち標的の分析対象についての結合アッセイにも供する。材料が機能試験および／またはキャラクタリゼーション試験の規格を満たすことも上回ることもなかった場合、材料を追加の精製工程に供し、再試験を行うことができる。これら試験の各々、およびこれらの試験に供した原材料の分析に適用される測定値を、下に記載する：
キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ：Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ）は、ペプチドおよびタンパク質を分離するのに通常使用される手法で、凝集体の検出に有用である。ＣＩＥＦ分離では、溶液中のサンプルでキャピラリーを充填する。電圧を印加すると、イオンは自身が中性となる（ｐＨ＝ｐＩ）領域まで移動する。キャピラリーのアノード端は酸性溶液（低いｐＨ）中に位置し、一方、カソード端は塩基性溶液（高いｐＨ）中に位置する。等電点（ｐＩ）の等しい化合物は、くっきりとした区域に「集中し（ｆｏｃｕｓｅｄ）」、その特異的ゾーンに留まる。これにより、分子電荷および等電点に基づいて、明確にそれらの化合物を検出することが可能となる。各特異抗体溶液は、経時的に変化し得るフィンガープリントＣＩＥＦを有することになる。タンパク質溶液が変質した場合、タンパク質の性質および電荷分布が変化することがある。したがってＣＩＥＦは、タンパク質溶液の相対的純度を評価するための特に有用なツールであり、本明細書に記載するプレートおよびキット中の抗体および校正用試料をキャラクタライズする好ましい方法である。ＣＩＥＦで使用する測定値としては、主ピークのｐＩ、溶液のｐＩ範囲、およびプロファイル形状が挙げられ、これらの測定値の各々を、参照標準試料の測定値と比較する。
【００２８】
動的光散乱（ＤＬＳ）は、溶液中または懸濁液中のいずれかの粒子状物質の拡散を精査するために使用される。拡散速度（拡散係数）を決定することにより、校正を必要とすることなく、粒子サイズ、高分子鎖の構造、および溶液中または懸濁液中成分間の様々な相互作用に関する情報、さらには散乱体の動力学に関する情報をも得ることができる。ＤＬＳ実験では、媒質中の散乱体からの散乱光の変動（通常はμｓからｍｓの時間スケールでの時間的変異）を記録し、相関遅延時間ドメイン（ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｄｅｌａｙ  ｔｉｍｅ  ｄｏｍａｉｎ）内で解析する。ＣＩＥＦのように、各タンパク質溶液は、粒子サイズについてのフィンガープリントＤＬＳを生ずることになり、凝集の検出に申し分なく適している。結合特異性に関わりなく全てのＩｇＧは、同一のＤＬＳ粒子サイズを示すはずである。ＤＬＳを使用してタンパク質溶液を分析するために使用される測定値としては、多分散度の割合、強度の割合、質量の割合、およびタンパク質ピークの半径が挙げられる。好ましい実施形態では、抗体溶液は、以下のＤＬＳ規格のうち１つまたはそれ以上を満たすまたは上回る：（ａ）抗体ピークの半径：４〜８ｎｍ（抗体分子サイズ）；（ｂ）抗体ピークの多分散度：＜４０％（抗体分子のサイズ不均一性の測定）；（ｃ）抗体ピーク強度：＞５０％（他のピークが存在する場合、抗体ピークは主要ピークである）；および（ｄ）抗体ピークにおける質量：＞５０％。
【００２９】
還元および非還元ゲル電気泳動は当技術分野でよく知られた手法である。ＥＸＰＥＲＩＯＮ（商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ｗｗｗ．ｂｉｏ−ｒａｄ．ｃｏｍ）自動電気泳動ステーションは、電気泳動、染色、脱染、バンド検出およびイメージングを自動化し、かつ組み合わせて単一工程とすることによって、ゲルに基づく電気泳動の全工程を単一ユニット内で行う。これを使用して純度を測定できる。好ましくは、抗体調製物はＥｘｐｅｒｉｏｎで純度５０％超、より好ましくは純度７５％超、最も好ましくは純度８０％超である。非還元Ｅｘｐｅｒｉｏｎを使用したタンパク質分析に適用する測定値としてはタンパク質総質量の割合が挙げられ、還元Ｅｘｐｅｒｉｏｎの場合、測定値としては、抗体溶液中の重鎖および軽鎖総質量の割合、ならびに重鎖の軽鎖に対する比が挙げられる。
【００３０】
多角度光散乱（ＭＡＬＳ）検出は、特異的または非特異的タンパク質相互作用を測定するためにスタンドアロン（バッチ）モードで使用でき、さらにはフローフィールドフローフラクショネーション（ＦＦＦ）またはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）のような分離システムとの併用で使用することもできる。ＳＥＣ−ＭＡＬＳの組合せによる方法には、タンパク質の多量体化状態を確認する、タンパク質凝集を定量する、およびタンパク質複合体（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の化学量論を決定するなど、多くの応用がある。この方法は、サンプル成分の分子量を検出するために用いるのが好ましい。
【００３１】
好ましい実施形態では、アッセイは、アッセイプレートの単一のウェル、またはカートリッジのアッセイチャンバーであるアッセイチャンバーなどの、単一のアッセイチャンバー内で行う。好ましい実施形態では、本発明のキットは、各々の全体を参照によって本明細書に組み入れる例えばＵＳ２００４００２２６７７；ＵＳ２００５００５２６４６；ＵＳ２００５０１４２０３３；ＵＳ２００４０１８９３１１に記載されている電気化学発光測定を行うために構成したマルチウェルアッセイプレートを含む。アッセイプレートおよびプレートリーダーは現在は市販されている（ＭＵＬＴｌ−ＳＰＯＴ（登録商標）およびＭＵＬＴＩ−ＡＲＲＡＹ（登録商標）プレートおよびＳＥＣＴＯＲ（登録商標）装置、メソスケールディスカバリー（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ（ゲイザースバーグ、メリーランド）の一部門）。
【００３２】
本明細書で使用されるキットのロットは、１組のキット出荷規格を満たすキット成分を含むキット群を含む。ロットは少なくとも１０キット、少なくとも１００キット、少なくとも５００キット、少なくとも１，０００キット、少なくとも５，０００キット、または少なくとも１０，０００キットを含むことができる。そのロットのうちの一部のキットを分析試験に供して、そのロットが出荷規格を満たす、または上回ることを保証する。一実施形態では、出荷規格には、それだけに限らないが、キット操作、試薬安定性、およびキット成分の保存条件の規格が含まれる。キット操作の規格には、サンプルインキュベーションの最大の総時間と、キットを使用してアッセイを完了するのにかかる、最大の総時間とが含まれる。試薬安定性規格には、キット成分である各試薬の、指定保存温度での安定性の最低限度が含まれる。キット保存条件の規格には、キットの全成分についての保存温度範囲、キットの凍結成分についての保存温度の最高限度、およびキットの非凍結成分についての保存温度の最高限度が含まれる。ロット中の一部のキットを、これらの規格について点検する。この一部のキットの数量は、そのロットサイズによって決まる。好ましい実施形態では、３００キットまでのロットについては４〜７キットの抽出標本を試験し；３００〜９５０キットのロットについては８〜１０キットの抽出標本を試験し；９５０キット超のロットについては１０〜１２キットの抽出標本を試験する。代わりに、または追加で、１〜５％までの、好ましくは１〜３％までの、最も好ましくは２％までの抽出標本を試験する。
【００３３】
加えて、マルチウェルアッセイプレートの各ロットを均一性試験および機能試験に供するのが好ましい。ロット中の一部のプレートをこれらの試験法に供する。この一部のプレートの数量は、そのロットサイズによって決まる。好ましい実施形態では、３００プレートまでのロットについては４〜７プレートの抽出標本を試験し；３００〜９５０プレートのロットについては８〜１０プレートの抽出標本を試験し；９５０プレート超のロットについては１０〜１２プレートの抽出標本を試験する。代わりに、または追加で、１〜５％までの、好ましくは１〜３％までの、最も好ましくは２％までの抽出標本を試験する。均一性試験および機能試験の規格は、％ＣＶ（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  Ｖａｒｉａｖｉｌｉｔｙ；変動係数）によって表し、これは、測定値のセット（この場合はプレート全体にわたって結合ドメインから検出される相対シグナル）の標準偏差を、そのセットの平均で除したものとして規定される、無次元数である。
【００３４】
均一性試験の１タイプは、プロテインＡ／Ｇ試験である。プロテインＡ／Ｇの結合は、プレート内の全結合ドメインが捕捉抗体と連結していること確認するために用いられる。プロテインＡ／Ｇは、プロテインＡおよびのプロテインＧの両ＩｇＧ結合ドメインを組み合わせた組換え融合タンパク質であり、ヒトＩｇＧの全サブクラス、ならびにＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、およびそれ程にではないがＩｇＤに結合する。プロテインＡ／ＧはマウスＩｇＧの全サブクラスにも結合するが、マウスＩｇＡ、ＩｇＭまたは血清アルブミンには結合しない。このため、サンプルマトリックス中に存在する可能性のあるＩｇＡ、ＩｇＭおよび血清アルブミンからの干渉なしにマウスモノクローナルＩｇＧ抗体を検出するのに、プロテインＡ／Ｇは特によく適している。プロテインＡ／Ｇを、例えば蛍光、化学発光または電気化学発光標識、好ましくはＥＣＬ標識のような検出可能部分で標識して、検出を促進することができる。したがって、捕捉抗体がウェルの結合ドメインに付着している場合には、標識されたプロテインＡ／Ｇに結合することになり、プレート全体にわたって表面に結合している捕捉抗体の相対量を測定できる。
【００３５】
上記の均一性試験に加え、ロット中の一部のプレートについての均一性測定値を算出して、プレート内での傾向を評価することができる。均一性測定値は、プロテインＡ／Ｇ試験および／または他の均一性試験もしくは機能試験からのシグナルを規格化したマトリックスを用い、算出する。当技術分野で知られている手法でシグナルの生データを平滑化し、そうすることでノイズを生データから減ずる。均一性測定値は、この調整済みのデータセットでの最小シグナルを、最大シグナルから減ずることにより算出する。
【００３６】
好ましい実施形態では、ロット中の一部のプレートは、プロテインＡ／Ｇ試験および機能試験に供され、この一部のプレートは、以下の規格を満たすまたは上回る：
【００３７】
【表４】
0006599237.tif 000005
【００３８】
開示内容全体を参照によって本明細書に組み入れる、Ｗｏｈｌｓｔａｄｔｅｒらによる米国特許第７，８４２，２４６号に開示されているように、各プレートは、数個の要素、例えばプレート上面、プレート底面、ウェル、作用電極、対電極、参照電極、誘電体物質、電気的接合およびアッセイ試薬などからなる。プレートのウェルは、プレート上面の穴／開口部として規定する。プレート底面は、手作業または自動化された手段によりプレート上面に付着させ、ウェル底面とすることができる。プレートは、いかなるサイズまたは形状のウェルをいかなる個数、いかなる配置パターンまたは配置構成で有していてもよく、各種様々な物質により構成され得る。本発明の好ましい実施形態では、プレートおよびウェルの個数、サイズ、形状および構成については、業界標準フォーマットを用いる。標準フォーマットの例としては、ウェルが二次元アレイに構成された９６、３８４、１５３６および９６００ウェルプレートが挙げられる。他のフォーマットとしては、単一ウェルのプレート（各ウェル内に、スポットパターンを形成する複数のアッセイドメインを有するのが好ましい）、２ウェルプレート、６ウェルプレート、２４ウェルプレートおよび６１４４ウェルプレートを挙げることができる。プレートの各ウェルは、ウェル内に１個のスポットから２、４、７、９、１０、１６、２５個などの範囲の様々な密度のスポットパターンを含む。好ましい実施形態では、本発明のキットで使用されるプレートは１０スポット９６ウェルのプレートを含む。
【００３９】
各プレートは、１組の好ましい規格に従って組み立てる。好ましい実施形態では、プレート底面は、以下の規格を満たすまたは上回る：
【００４０】
【表５】
0006599237.tif 000006
【００４１】
さらに好ましい実施形態では、プレートは、プレートのウェル内のスポットパターンの並びに関し定めた規格も満たすまたは上回る。これらの規格は３つのパラメータ：（ａ）該スポットパターンの中心と該ウェルの中心との間の、該プレートのｘ軸方向（列の向き、長軸）の差であるΔｘ；（ｂ）該スポットパターンの中心と該ウェルの中心との間の、該プレートのｙ軸方向（行の向き、短軸）の差であるΔｙ；および（ｃ）９６ウェルプレートの、プレート底面の長軸とプレート上面の長軸との間の、反時計回りの角度であるαを含む。好ましい実施形態では、プレートは以下の規格：Δｘ≦０．２ｍｍ、Δｙ≦０．２ｍｍ、およびα≦０．１°を満たすまたは上回る。
【００４２】
以下の非限定的な実施例は、本発明を限定するのではなくむしろ例証するのに役立つ。
【実施例１】
【００４３】
試薬の調製
全試薬を室温にし、希釈用液を室温の水で解凍した。
【００４４】
（ｉ）標準試料の調製
各パネル用の多分析対象の校正用凍結乾燥試料混合物（Ｍｕｌｔｉ−ａｎａｌｙｔｅ  ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ  ｂｌｅｎｄｓ）および希釈用液は、メソスケールディスカバリー（ロックビル、メリーランド）から入手した。これは希釈用液１ｍＬで再構成すると、推奨される最高レベルの標準試料（ｈｉｇｈｅｓｔ  ｓｔａｎｄａｒｄ）を与える。凍結乾燥された校正用試料は再構成し、氷上で維持した。７個の標準溶液およびゼロ校正用ブランクを、４連までの複製試料として以下のように調製した：（ｘ）最高濃度の標準試料は、希釈用液１０００μＬを凍結乾燥された校正用試料バイアルに添加することにより調製した。この溶液をボルテックスして混合し、使用前に濡れた氷上で最低５分維持した。（ｙ）次の標準試料は、最高濃度の標準試料７５μＬを希釈用液２２５μＬに移すことにより調製した。この溶液をよく混合した。さらに５回、この手順により４倍希釈を連続で繰り返して、７個の標準試料を得た。（ｚ）希釈用液をブランクに使用した。推奨される最高濃度の標準試料へと希釈用液２で再構成した後、各キット用の多分析対象の校正用凍結乾燥試料は、２〜８℃で３０日間安定である。
【００４５】
（ｉｉ）サンプルの採取＆取扱い
血清を調製する際、サンプルは室温で２時間凝血させた。ヘパリンチューブ中で調製した血漿は通常、サンプル解凍後にさらなる凝血を示す。血清および血漿の双方を、分取前に２０００×ｇで２０分遠心した。無血清培地については、溶液中にキャリヤとなるタンパク質、例えば１％ＢＳＡなど、が存在することを利用して、分析対象が実験器具に付いて失われるのを防いだ。サイトカインのレベルが極端に高いサンプルは希釈した。組織培養上清サンプルは、希釈用液で少なくとも２倍に希釈した。採取後、サンプルを即座に試験するか、または分取物を≦２０℃で凍結した。サンプルは調製前に２０００ｇで３分遠心して、粒子を除去した。
【００４６】
（ｉｉｉ）サンプルの希釈
ヒト血清、血漿、ＣＳＦ、尿および細胞培養上清については、希釈用液で最低２倍に希釈した。
【００４７】
（ｉｖ）対照の調製
対照は、ヒトでの分析対象の組換え体をスパイクとして加えた、非ヒト動物のマトリックス中にて調製した。凍結乾燥対照は、希釈用液２５０μＬで再構成し、サンプルとして処理した。希釈用液２５０μＬで再構成した後、対照は２〜８℃で３０日間安定であった。
【００４８】
（ｖ）検出抗体溶液の調製
検出抗体はメソスケールディスカバリー（ロックビル、メリーランド）から、５０ｘストック溶液として入手し、使用時の検出抗体溶液は１Ｘとした。１Ｘ検出抗体溶液の光への曝露は避けて、アッセイのバックグラウンドが高くならないようにした。調製後、１Ｘ検出抗体溶液は暗所で保存した。
【００４９】
パネル１のプレート１個につき、以下を組み合わせた：
１．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）抗ヒトＩＦＮ−γ抗体を６０μＬ
２．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒトＩＬ−１β抗体を６０μＬ
３．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒトＩＬ−２抗体を６０μＬ
４．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒトＩＬ−４抗体を６０μＬ
５．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒトＩＬ−６抗体を６０μＬ
６．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒトＩＬ−８抗体を６０μＬ
７．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒトＩＬ−１０抗体を６０μＬ
８．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒトＩＬ−１２ｐ７０抗体を６０μＬ
９．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒトＩＬ−１３抗体を６０μＬ
１０．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒトＴＮＦα抗体を６０μＬ
１１．メソスケールディスカバリー（ロックビル、メリーランド）製の希釈用液３を２４００μＬ
【００５０】
パネル２のプレート１個につき、以下を組み合わせた：
１．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体を６０μＬ
２．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒトＩＬ−１α抗体を６０μＬ
３．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒトＩＬ−５抗体を６０μＬ
４．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒトＩＬ−７抗体を６０μＬ
５．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒトＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体を６０μＬ
６．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒトＩＬ−１５抗体を６０μＬ
７．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒトＩＬ−１６抗体を６０μＬ
８．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒトＩＬ−１７Ａ抗体を６０μＬ
９．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒトＴＮＦβ抗体を６０μＬ
１０．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒトＶＥＧＦ−Ａ抗体を６０μＬ
１１．メソスケールディスカバリー（ロックビル、メリーランド）製の希釈用液３を２４００μＬ
【００５１】
パネル３のプレート１個につき、以下を組み合わせた：
１．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒトエオタキシン抗体を６０μＬ
２．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒトＭＩＰ−１β抗体を６０μＬ
３．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒトＭＣＰ−４抗体を６０μＬ
４．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒトエオタキシン−３抗体を６０μＬ
５．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒトＴＡＲＣ抗体を６０μＬ
６．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒトＩＰ−１０抗体を６０μＬ
７．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒトＭＩＰ−１α抗体を６０μＬ
８．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒトＩＬ−８抗体を６０μＬ
９．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒトＭＣＰ−１抗体を６０μＬ
１０．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ヒトＭＤＣ抗体を６０μＬ
１１．メソスケールディスカバリー（ロックビル、メリーランド）製の希釈用液３を２４００μＬ
【００５２】
パネル４のプレート１個につき、以下を組み合わせた：
１．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ラットＩＦＮ−γ抗体を６０μＬ
２．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ラットＩＬ−２抗体を６０μＬ
３．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ラットＩＬ−４抗体を６０μＬ
４．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ラットＩＬ−１β抗体を６０μＬ
５．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ラットＩＬ−５抗体を６０μＬ
６．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ラットＩＰ−６抗体を６０μＬ
７．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ラットＫＣ／ＧＲＯ抗体を６０μＬ
８．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ラットＩＬ−１０抗体を６０μＬ
９．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ラットＩＬ−１３抗体を６０μＬ
１０．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ラットＴＮＦα抗体を６０μＬ
１１．メソスケールディスカバリー（ロックビル、メリーランド）製の希釈用液４０を２４００μＬ
【００５３】
パネル５のプレート１個につき、以下を組み合わせた：
１．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗マウスＩＦＮ−γ抗体を６０μＬ
２．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗マウスＩＬ−１β抗体を６０μＬ
３．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗マウスＩＬ−２抗体を６０μＬ
４．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗マウスＩＬ−４抗体を６０μＬ
５．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗マウスＩＬ−５抗体を６０μＬ
６．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗マウスＩＰ−６抗体を６０μＬ
７．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗マウスＫＣ／ＧＲＯ抗体を６０μＬ
８．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗マウスＩＬ−１０抗体を６０μＬ
９．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗マウスＩＬ−１２ｐ７０抗体を６０μＬ
１０．５０ＸのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗マウスＴＮＦα抗体を６０μＬ
１１．メソスケールディスカバリー（ロックビル、メリーランド）製の希釈用液４５を２４００μＬ
【００５４】
（ｖｉ）読取用緩衝液の調製
読取用緩衝液Ｔ（やはりメソスケールディスカバリーから得られる）は４Ｘストック溶液として入手し、使用溶液は２Ｘとした。プレート１個につき、同じ割合（１０ｍＬ）の読取用緩衝液Ｔ（４Ｘ）を、脱イオン水（１０ｍＬ）と合わせた。読取用緩衝液の使用溶液は予め調製し、堅く封止した容器中、室温で保存した（３年間まで安定）。
【００５５】
（ｖｉｉ）ＭＳＤプレートの調製
マルチウェルプレート（やはりメソスケールディスカバリーから得られる）は捕捉抗体で予めコーティングし（図１）、自社開発の安定化処理を施して、固定したその抗体が損なわれていない状態で安定なことを確実にした。プレートは配達されたままのものを使用した；さらに調製する（例えば、予め湿らせる）必要はなかった。
【実施例２】
【００５６】
アッセイプロトコール
（ｉ）１ウェルあたり希釈サンプル５０μＬ（標準試料、対照または未知試料）を添加した。プレートは粘着プレート封止剤で封止し、激しく振盪（３００〜１０００ｒｐｍ）しながら室温で２時間インキュベートした。
【００５７】
（ｉｉ）プレートを、１５０〜３００μＬ／ウェルのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。検出抗体溶液２５μＬを各ウェルに添加した。プレートは粘着プレート封止剤で封止し、激しく振盪（３００〜１０００ｒｐｍ）しながら室温で２時間インキュベートした。
【００５８】
（ｉｉｉ）プレートを、１５０〜３００μＬ／ウェルのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。２Ｘ読取用緩衝液Ｔ（メソスケールディスカバリー、ロックビル、メリーランド）１５０μＬを各ウェルに添加した。プレートは、ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）イメージャ（メソスケールディスカバリー、ロックビル、メリーランド）内で解析した。
【実施例３】
【００５９】
パネルの検証
アッセイの開発および性能評価は、業界指針および規制指針を用いて行った。製品開発の間、キット成分およびプロトコールは、製品の性能が最高となるように開発および最適化した。アッセイプロトコールの頑健性を評価して、特定のインキュベーション時間の境界を検討した。校正用試料、抗体および対照に対する安定性促進試験（Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ）をアッセイ開発中に行い、これを、完成品のキットに対する製造日から３６ヶ月までの安定性実時間試験（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ）により強化した。製品設計規格の検証は、各パネルに対する標準曲線および対照セット（やはりメソスケールディスカバリー、ロックビル、メリーランドから入手した）を３日間評価することにより、２人の独立した分析者がプレート計８個について行った。各プレートを１回の実験（ａ  ｒｕｎ）とみなした。標準曲線データの要約を図２（ａ）〜（ｅ）および表４〜８に示す。
【００６０】
各パネルに対する対照セットの、実験内および実験間の精度および確度を、９回の実験について評価した。精度および確度は、ロット検証および品質管理された出荷の一環として、各ロットについて検証した。精度に関する通常の規格は、日内および日間のいずれの諸実験でも、対照についての濃度ＣＶが２０％未満であることである。製品検証の一環として、各パネルの性能を、血清、ヘパリン血漿、ＥＤＴＡ血漿、クエン酸血漿、ＣＳＦ、尿および／または細胞培養上清中でのスパイクおよび回収率ならびに希釈直線性について評価した。ヒト天然分析対象のレベルは、血清、ヘパリン血漿、ＥＤＴＡ血漿、クエン酸血漿、ＣＳＦおよび尿中で測定した。ラットおよびマウス天然分析対象のレベルは、血清、ヘパリン血漿、ＥＤＴＡ血漿および尿中で測定した。
【００６１】
ヒト血液プールを、インビトロにおいて様々な刺激（ＬＰＳおよびザイモサンおよびペプチドグリカン）で刺激し、刺激時間の終わりに血漿を単離した。加えて、パネル１〜３用には、ＴＨＰ−１細胞株をＬＰＳで刺激し、刺激終了時に溶解液を調製した。単離したばかりのＰＢＭＣを各種の刺激剤で処理し、上清を単離した。次いで、血漿、細胞溶解液およびＰＢＭＣ上清は、ヒト天然分析対象のレベルについて、パネル１〜３を用いて評価した。パネル４用には、ラットマクロファージ細胞株ＮＲ８３８３をＬＰＳ、ＰＨＡおよびポークウィードマイトジェン（ＰＷＭ）で刺激し、細胞溶解液および細胞培養上清を単離した。血漿、細胞溶解液および細胞培養上清は、ラット天然分析対象のレベルについて、パネル４を用いて評価した。パネル５用には、ＲＡＷ細胞株をＬＰＳで刺激し、またＪ７７４Ａ．１細胞株をＬＰＳおよびＰＷＭで刺激し、刺激終了時に溶解液を調製した。次いで、血漿および細胞溶解液は、マウス天然分析対象のレベルについて、パネル５を用いて評価した。
【００６２】
図２（ａ）〜（ｅ）に、各パネル（それぞれ、パネル１〜５）のダイナミックレンジを図示している標準曲線のグラフを示す。
【００６３】
【表６】
0006599237.tif 000007
【００６４】
【表７】
0006599237.tif 000008
【００６５】
【表８】
0006599237.tif 000009
【００６６】
【表９】
0006599237.tif 000010
【００６７】
【表１０】
0006599237.tif 000011
【００６８】
【表１１】
0006599237.tif 000012
【００６９】
【表１２】
0006599237.tif 000013
【００７０】
検出下限（ＬＬＯＤ）は、バックグラウンド（ゼロ校正用ブランク）を２．５標準偏差上回るシグナルに基づいた算出濃度である。各パネルについて表９〜１３に示したＬＬＯＤは、８〜９回の実験に基づいて算出した。
【００７１】
【表１３】
0006599237.tif 000014
【００７２】
【表１４】
0006599237.tif 000015
【００７３】
【表１５】
0006599237.tif 000016
【００７４】
【表１６】
0006599237.tif 000017
【００７５】
【表１７】
0006599237.tif 000018
【００７６】
対照は、校正用試料を、アッセイ範囲全体にわたる諸レベルで、パネル１〜３についてはヒトでない動物のマトリックスに対し、パネル４についてはラット血清に対し、パネル５についてはマウス血清に対しスパイクとして加えることにより作製した。分析対象のレベルは、最低でも、３連の複製試料を用いた３回の実験を３日間行うことにより測定した。実験内％ＣＶの平均は、個々の実験内での、対照の複製試料における％ＣＶの平均である。実験間％ＣＶは、特定の回数の実験にわたる、対照の変動である。ロット間％ＣＶは、特定の数のキットロット全体にわたる、対照の変動である。
【００７７】
【表１８】
0006599237.tif 000019
【００７８】
【表１９】
0006599237.tif 000020
【００７９】
【表２０】
0006599237.tif 000021
【００８０】
【表２１】
0006599237.tif 000022
【００８１】
パネル１〜３の直線性を評価するために、市販品の正常個体（ｎｏｒｍａｌ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）ヒト血清、ＥＤＴＡ血漿、ヘパリン血漿、クエン酸血漿およびＣＳＦサンプルに対しては、校正用組換え体をスパイクとして加え、試験する前に２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍および６４倍に希釈した。正常個体ヒト尿に対しては、校正用組換え体をスパイクとして加え、２倍、４倍、８倍および１６倍に希釈した。各希釈での回収率（％）は、希釈度について調整した算出濃度を予測濃度で除する、すなわち、パネル１〜２においては２倍希釈、パネル３においては４倍希釈で、希釈度について調整し算出した濃度で除することにより算出した（下の式を参照されたい）。
【００８２】
パネル４の直線性を評価するために、市販品の正常ラット血清、ＥＤＴＡ血漿、ヘパリン血漿、クエン酸血漿および尿サンプルに対し、校正用組換え体をスパイクとして加え、試験する前に４倍、８倍、１６倍および３２倍に希釈した。各希釈での回収率（％）は、希釈度について調整した算出濃度を予測濃度で除する、すなわち、４倍希釈で希釈度について調整し算出した濃度で除することにより算出した。
【００８３】
パネル５の直線性を評価するために、市販品の正常マウス血清、ＥＤＴＡ血漿、ヘパリン血漿、クエン酸血漿および尿サンプルに対し、校正用組換え体をスパイクとして加え、試験する前に２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍および６４倍に希釈した。各希釈での回収率（％）は、希釈度について調整した算出濃度を予測濃度で除する、すなわち、２倍希釈で希釈度について調整し算出した濃度で除することにより算出した。
【００８４】
下に示した平均回収率（％）は、アッセイの定量範囲内にあるサンプルに基づく。
【数１】
0006599237.tif 000023
【００８５】
【表２２】
0006599237.tif 000024
【００８６】
【表２３】
0006599237.tif 000025
【００８７】
【表２４】
0006599237.tif 000026
【００８８】
【表２５】
0006599237.tif 000027
【００８９】
【表２６】
0006599237.tif 000028
【００９０】
【表２７】
0006599237.tif 000029
【００９１】
【表２８】
0006599237.tif 000030
【００９２】
【表２９】
0006599237.tif 000031
【００９３】
【表３０】
0006599237.tif 000032
【００９４】
【表３１】
0006599237.tif 000033
【００９５】
【表３２】
0006599237.tif 000034
【００９６】
アッセイの定量可能範囲全体にわたる、様々なサンプルタイプでのスパイクおよび回収率についての測定値を評価した。市販品のおよび細胞培養上清からの、複数個体のヒト血清、ＥＤＴＡ血漿、ヘパリン血漿、クエン酸血漿、尿および／またはＣＳＦサンプルに対し、異なる３つのレベル（高、中および低）で校正用試料をスパイクとして加え、次いで２倍に希釈した。
【００９７】
【表３３】
0006599237.tif 000035
【００９８】
【表３４】
0006599237.tif 000036
【００９９】
【表３５】
0006599237.tif 000037
【０１００】
【表３６】
0006599237.tif 000038
【０１０１】
【表３７】
0006599237.tif 000039
【０１０２】
【表３８】
0006599237.tif 000040
【０１０３】
【表３９】
0006599237.tif 000041
【０１０４】
【表４０】
0006599237.tif 000042
【０１０５】
【表４１】
0006599237.tif 000043
【０１０６】
【表４２】
0006599237.tif 000044
【０１０７】
【表４３】
0006599237.tif 000045
【０１０８】
【表４４】
0006599237.tif 000046
【０１０９】
【表４５】
0006599237.tif 000047
【０１１０】
【表４６】
0006599237.tif 000048
【０１１１】
個々のアッセイの特異性を評価するために、混合抗体を使用し、シグナルが約１００，０００個計測されることになる濃度で個々の校正用試料を用いて各パネルの実験を行った。
【数２】
0006599237.tif 000049
【０１１２】
【表４７】
0006599237.tif 000050
【０１１３】
【表４８】
0006599237.tif 000051
【０１１４】
【表４９】
0006599237.tif 000052
【０１１５】
【表５０】
0006599237.tif 000053
【０１１６】
【表５１】
0006599237.tif 000054
【０１１７】
各抗体の特異性を評価するために、上に列挙した諸濃度の混合校正用試料、および１Ｘ濃度の個々の抗体を使用して各パネルの実験を行った。
【０１１８】
【表５２】
0006599237.tif 000055
【０１１９】
【表５３】
0006599237.tif 000056
【０１２０】
【表５４】
0006599237.tif 000057
【０１２１】
【表５５】
0006599237.tif 000058
【０１２２】
【表５６】
0006599237.tif 000059
【０１２３】
他のバイオマーカーに対する、パネル１キットによるアッセイの特異性を評価するために、混合抗体を使用し、個々の組換えヒトタンパク質を用いて各キットの実験を行った。
【０１２４】
【表５７】
0006599237.tif 000060
【０１２５】
【表５８】
0006599237.tif 000061
【０１２６】
【表５９】
0006599237.tif 000062
【０１２７】
アッセイシグナルに対する、マルチプレックス方式の影響を評価するために、定量可能範囲内の標準試料を、各キットを使用して、個々のアッセイ（個々の校正用試料および個々の抗体）とマルチプレックスアッセイ（混合校正用試料および混合抗体）との間で比較した。個々のアッセイとマルチプレックスアッセイとの間の、算出された％シグナル差を、下に示す。
【０１２８】
【表６０】
0006599237.tif 000063
【０１２９】
【表６１】
0006599237.tif 000064
【０１３０】
【表６２】
0006599237.tif 000065
【０１３１】
【表６３】
0006599237.tif 000066
【０１３２】
【表６４】
0006599237.tif 000067
【０１３３】
キットは、受容体および他の関連タンパク質による干渉を最小にするように設計した。各パネルで、希釈用液および正常ヒト中の、多分析対象の校正用試料に対し、異なる３つの濃度の受容体および結合パートナーをスパイクとして加えた。回収した校正用試料の濃度を、スパイクを加えていない標準試料および正常血清と比較した。
【０１３４】
各パネル中の全アッセイは、メソスケールディスカバリー（ロックビル、メリーランド）から入手した校正用参照試料に対して校正した。ヒトでの以下の分析対象用のＮＩＢＳＣ／ＷＨＯ標準試料を、ＭＳＤ校正用参照試料に対して評価した。パネルを用いて得られたサンプル値を変換してＮＩＢＳＣ／ＷＨＯ濃度を概算するには、算出したサンプル値に濃度比を乗じた。
【０１３５】
【表６５】
0006599237.tif 000068
【０１３６】
【表６６】
0006599237.tif 000069
【０１３７】
【表６７】
0006599237.tif 000070
【０１３８】
【表６８】
0006599237.tif 000071
【０１３９】
（ａ）正常サンプルの試験
正常マウス血清（パネル４では、ラット血清）、市販品のＥＤＴＡ血漿、ヘパリン血漿、クエン酸血漿および尿サンプルを２倍から４倍に希釈し、各パネルを用いて試験した。サンプルの各セットでの濃度の中央値および範囲を下に示す。濃度は、サンプル希釈について補正してある。
【０１４０】
【表６９】
0006599237.tif 000072
【０１４１】
【表７０】
0006599237.tif 000073
【０１４２】
【表７１】
0006599237.tif 000074
【０１４３】
【表７２】
0006599237.tif 000075
【０１４４】
（ｂ）刺激したサンプル
パネル１：採取したばかりの正常ヒト全血をＬＰＳと共にインキュベートし、同時に、ペプチドグリカン（ＰＧ）およびザイモサン（ＺＹ）とも様々な時間枠でインキュベートした。次いで血漿を単離した。次いでこれらのサンプルはパネル１を用いて試験した。希釈度について調整した、各刺激モデルにおける濃度を下に示す。
【０１４５】
【表７３】
0006599237.tif 000076
【０１４６】
パネル２：採取したばかりの正常ヒト全血を、ＬＰＳおよびＰＨＡと共に、３７℃において様々な時間枠でインキュベートし、そして血漿を単離した。サンプルはパネル２を用いて試験した。
【０１４７】
【表７４】
0006599237.tif 000077
【０１４８】
パネル３：採取したばかりの正常ヒト全血を、ＬＰＳと共に、３７℃において異なる時間枠でインキュベートし、そして血漿を単離した。サンプルはパネル３を用いて試験した。
【０１４９】
【表７５】
0006599237.tif 000078
【０１５０】
パネル５：採取したばかりの正常マウス全血プールをＬＰＳと共にインキュベートし、同時に、ペプチドグリカン（ＰＧ）およびザイモサン（ＺＹ）とも様々な時間枠でインキュベートし、そして血漿を単離した。サンプルに対し、パネル５を用いて実験を行った。
【０１５１】
【表７６】
0006599237.tif 000079
【０１５２】
パネル１〜３用に、正常全血から単離したばかりのＰＢＭＣを、ＬＰＳ、ＰＨＡ、ＰＷＭ、Ｃｏｎ  Ａで刺激し、またＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体で同時刺激した。次いでサンプルはパネル１〜３を用いて試験した。希釈度について調整した、各刺激モデルにおけるｐｇ／ｍＬでの濃度を示す。
【０１５３】
【表７７】
0006599237.tif 000080
【０１５４】
【表７８】
0006599237.tif 000081
【０１５５】
【表７９】
0006599237.tif 000082
【０１５６】
パネル１〜３用に、ヒト急性単球性白血病細胞株（ＴＨＰ−１細胞株）をＬＰＳで６時間および１６時間刺激した。次いで上清を単離し、パネル１〜３を用いて試験した。希釈度について調整した、各サンプルにおけるｐｇ／ｍＬでの濃度を下に示す。
【０１５７】
【表８０】
0006599237.tif 000083
【０１５８】
【表８１】
0006599237.tif 000084
【０１５９】
【表８２】
0006599237.tif 000085
【０１６０】
パネル５用には、マウス単球マクロファージ細胞株（Ｊ７７４Ａ．１）およびマウス白血病性単球マクロファージ細胞株（ＲＡＷ２６４．７）を、様々な刺激物質で刺激した。Ｊ７７４Ａ．１細胞株の刺激は４時間、一方、ＲＡＷ細胞株の刺激は６時間であった。溶解液を回収し、パネル５を用いて実験を行った。濃度はｐｇ／ｍＬにて列挙し、これらは、１ウェルあたりの溶解液５０μｇに対して規格化してある。
【０１６１】
【表８３】
0006599237.tif 000086
【０１６２】
以下の校正用試料混合物を各パネルで以下のように使用した。
【０１６３】
【表８４】
0006599237.tif 000087
【０１６４】
【表８５】
0006599237.tif 000088
【０１６５】
【表８６】
0006599237.tif 000089
【０１６６】
【表８７】
0006599237.tif 000090
【０１６７】
【表８８】
0006599237.tif 000091
【０１６８】
以下の抗体、捕捉用および検出用を各パネルで以下のように使用した。
【０１６９】
【表８９】
0006599237.tif 000092
【０１７０】
【表９０】
0006599237.tif 000093
【０１７１】
【表９１】
0006599237.tif 000094
【０１７２】
【表９２】
0006599237.tif 000095
【０１７３】
【表９３】
0006599237.tif 000096
【０１７４】
本明細書では種々の刊行物および試験方法を引用しているが、その開示内容全体は参照によって本明細書に組み入れる。本明細書と、参照によって本明細書に組み入れるおよび／もしくは本明細書で参照している文献とが、矛盾する開示内容および／もしくは相反する用語使用を含んでいる場合、ならびに／または組み入れられる／参照する文献が、本明細書で使用もしくは規定しているのとは異なる形で、用語を使用もしくは規定している場合、本明細書を優先するものとする。
【０１７５】
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６．Ｓｕ  ＤＬ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏ−  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ＳＬＥ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１２；  ３４７１４１
７．Ｌｕｋｅｎｓ  ＪＲ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｏｂｅｓｉｔｙ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｍｅｄ．  ２０１１  Ｊｕｌ；  １２  （６２）：  ６５−７４．
８．Ｌａｏｕｉ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｓｕｂｓｅｔｓ，  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．  ２０１１；  ５５  （７−９）：  ８６１−７．
９．Ｈａｌｌｂｅｒｇ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｅｒｃｉｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍａｊｏｒ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ．  Ｊ．  Ａｆｆｅｃｔ．  Ｄｉｓｏｒｄ．  ２０１０；  １２６（１）：  ２６２−２６７．
１０．Ｏｒｅｊａ−Ｇｕｅｖａｒａ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  ＴＨ１／ＴＨ２  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｉｎ  ｒｅｌａｐｓｉｎｇ−ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｇｌａｔｉｒａｍｅｒ  ａｃｅｔａｔｅ  ｏｒ  Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ．  ＢＭＣ  Ｎｅｕｒｏｌ．  ２０１２  Ｓｅｐ．  １８；  １２（１）：  ９５．
１１．Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｅｗ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｎｅｗｌｙ  ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｓｉｂｌｉｎｇｓ．  Ｈｕｍ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１２  Ａｕｇ  １７；  Ｓ０１９８−８８５９  （１２）：  ００５０２−２．
１２．Ｙｅｈｕｄａ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｐｓｏｒｉａｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ．  Ｉｎｆｌａｍｍ．  Ｒｅｓ．  ２０１２  Ｊｕｌ．；  ６１  （７）：  ７３５−４２．
１３．Ｇｏｌｏｇａｎ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｉｎ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ：  Ａ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｂｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ．  Ｊ．  Ｃｒｏｈｎｓ  Ｃｏｌｉｔｉｓ．  ２０１２  Ｓｅｐ  ２４；  Ｓ１８７３−９９４６  （１２）００３９３−５．
１４．Ｋｗａｎ  Ｗ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｍｏｄｅｓｔ  ｂｅｎｅｆｉｔｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２０１２；  ３２  （１）：  １３３−  ４２．
１５．Ｃｒｏｔｔａ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｉｏｎｓ  ｓｕｂｖｅｒｔ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ａ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ  ｆｏｒ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｈｅｐａｔｏｌ．  ２０１０；  ５２（２）：  １８３−９０．
１６．Ｌｉｕ  Ｘ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  ｄｅｆｉｃｉｔｓ  ｉｎ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．
２０１２  Ａｕｇ  ２；  ２１６：  １３３−４２．
１７．Ｍｏｏｎ  ＭＨ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ｂ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ．
Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ２０１２  Ｓｅｐ  １９；  １１３５．
１８．Ｍｉｈａｉ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ
ａｓ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｆｅｖｅｒ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  ２０００；  ３１：  ｓ１７８−ｓ１８４．
１９．Ｌｉａｏ  Ｗ，  ｅｔ  ａｌ．  ＩＬ−２  ｆａｍｉｌｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：
ｎｅｗ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＩＬ−２  ａｓ  ａ  ｂｒｏａｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．
２０１１  Ｏｃｔ；  ２３（５）：  ５９８−６０４．
２０．Ａｂｅｒｇ  ＪＡ，  Ａｇｉｎｇ，  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ＨＩＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｔｏｐ  Ａｎｔｉｖｉｒ．  Ｍｅｄ．  ２０１２  Ａｕｇ；
２０（３）：  １０１−５．
２１．Ｓｈａｒｍａ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ／ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｂｙ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ：
ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．  ２００５  Ｄｅｃ；  １３１  （ｐｔ．  ６）：  ７８３−９６．
２２．Ｊａｃｙｓｙｎ  ＪＦ，  ｅｔ  ａｌ．  ＩＬ−４  ｆｒｏｍ  Ｔｈ２−ｔｙｐｅ  ｃｅｌｌｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｌａｙｅｄ−ｔｙｐｅ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｓｈｏｒｔｌｙ  ａｆｔｅｒ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００３  Ｄｅｃ；  ８１（６）：  ４２４−３０．
２３．Ｐｏｏｎ  ＡＨ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｓｔｈｍａ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ａｌｌｅｒｇｙ．  ２０１２  Ｍａｙ；  ４２（５）：  ６２５−３７．
２４．Ｄｅｎｇ  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒ  ｆｅｖｅｒ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｓ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２０１２；  ７（７）：  ｅ４１３６５．
２５．Ｚｕｐａｎ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｓｃｉ．  Ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｔｉｃ  ａｎｄ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｃ  ｂｏｎｅ  ｔｉｓｓｕｅｓ．  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｓｃｉ．  ２０１２  Ｍａｒ  １；  １９：  ２８．    
２６．Ｏ’Ｄｏｎｏｇｈｕｅ  ＲＪ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｓｔａｔ３  ｆｒｏｍ  Ｓｍａｄ３−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｕｎｇ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．  ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ２０１２  Ｓｅｐ；  ４（９）：  ９３９−５１．
２７．Ｇｏｒａｌ  Ｖ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ，  ｈｅｐａｔｉｃ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｌｅｖｅｌｓ：  ｗｈａｔ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａ？  Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．  ２０１１  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；  ５８（１０７−１０８）：  ９４３−８．
２８．Ｓｍｉｔｈ  ＰＤ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ａ  ｂｉｍｏｄａｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｉｓｃｈｅｍｉａ  ａｎｄ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．  ２０１２  Ｓｅｐ  １１；  １２６  （１１  Ｓｕｐｐｌ  １）：  Ｓ１１０−７．
２９．Ｔｉｎｋｌｅ  ＳＳ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｅｒｙｌｌｉｕｍ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ，  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６，  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｂｅｒｙｌｌｉｕｍ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｊ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．  １９９７  Ｄｅｃ；  １５６（６）：  １８８４−９１．
３０．Ａｏｕｎ  Ｅ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８  ｉｎ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ：  ａ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｐａｎｃｒｅａｔｏｌｏｄｙ．  ２００９  Ｊａｎ；  ９（６）：  ７７７−８５．
３１． Ｂｌｉｓｓ  ＳＫ，  ｅｔ  ａｌ．  ＩＬ−１０  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｌｉｖｅｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｕｒｉｎｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００３；  １７１：  ３１４２−３１４７．
３２．Ｗｅｉｊｅｒ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｉｎｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｈｏｓｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｐｅｒｉｔｏｎｉｔｉｓ．  Ｓｈｏｃｋ．  ２００５；  ２３：  ５４−８．
３３．Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ  ＭＫ，  ｅｔ  ａｌ．  １２／１５−ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．
２００９；  ７７：  ５６９０−７００．
３４．Ｙｉｎｇ  Ｘ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１３  ＳＮＰ  ｒｓ１８００９２５  ｗｉｔｈ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｒｈｉｎｉｔｉｓ  ｒｉｓｋ：  ａ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  １，４１１  ｃａｓｅｓ  ａｎｄ  ３１６９  ｃｏｎｔｒｏｌｓ．  Ｇｅｎｅ．  ２０１２  Ｓｅｐ；  ５０６（１）：  １７９−８３．
３５．Ｗａｌｃｚａｋ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ＩＬ−８  ａｎｄ  ＩＬ−１３  
ｇｅｎｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ
ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．  ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．  ２０１２  Ａｕｇ；  ３１（８）；  １４３１−８．  
３６．Ｈａｍｉｓｈｅｈｋａｒ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ  ｉｌｌ  ｓｅｐｔｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｌａｓｍａ  ｅｘｃｈａｎｇｅ．  Ｔｒａｎｓｆｓ．  Ａｐｈｅｒ．  Ｓｃｉ．  ２０１２  Ｓｅｐ  １１；  Ｓ１４７３−０５０２（１２）００２０５−４．
３７．ＭｃＣｌｅｌｌａｎ  ＪＬ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｕｒｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｐｃ（Ｍｉｎ／＋）  ｍｏｕｓｅ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ．  ２０１２；  ５７：  １１３−９．
３８．Ｌａｎｅ  ＢＲ，  ｅｔ  ａｌ．  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ＨＩＶ−１  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｂｙ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＡＮＴＥＳ  ａｎｄ  ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ  Ｃ−Ｃ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ５  （ＣＣＲ５）  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９９；  １６３：  ３６５３−６１．
３９．Ｂｏｗｅｎ  ＲＡ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅｓ  ｏｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｓｓａｙｓ．  Ｃｌｉｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２０１０  Ｊａｎ；  ４３（１−２）：  ４−２５．
４０．Ｚｈｏｕ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  ｓｔｏｒａｇｅ，  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．    Ｋｉｄｎｅｙ．  ２００６；  ６９：  １４７１−７６．
４１．Ｔｈｏｍａｓ  ＣＥ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｕｒｉｎｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ＆  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．  ２０１０；  １９：  ９５３−５９．
４２．Ｓｃｈｏｏｎｅｎｂｏｏｍ  ＮＳ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ  （１−４２）  ａｎｄ  ｔａｕ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．  ２００５；  ５１：  １８９−９５．
４３．Ｇｉｒｇｒａｈ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐ−８０  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ．    Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  １９８８；  ２５６：  ３５１−５６．
【図１】
0006599237.tif 000097
【図２】
0006599237.tif 000098
【図３ａ】
0006599237.tif 000099
【図３ｂ】
0006599237.tif 000100