(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の式Ｉの化学成分を含む組成物であって、前記化学成分の各々は、式Ｉ
【化１０１】
0006599373.tif 000093
の化合物、またはその医薬として許容され得る塩であり、
（１）前記組成物中の式Ｉの化学成分の総量の５０％超が、式Ｉ．ａ．ｉ
【化１０２】
0006599373.tif 000094
の化学成分であることを特徴とする、組成物。
【請求項２】
式Ｉ．ａ．ｉの前記化学成分の量が７０％超である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
式Ｉ．ａ．ｉの前記化学成分の量が８０％超である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
式Ｉ．ａ．ｉの前記化学成分の量が９０％超である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
式Ｉ．ａ．ｉの前記化学成分の量が９５％超である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
１つ以上の式Ｉの化学成分を含む組成物であって、前記組成物が請求項１〜５のいずれか一項に記載されている、組成物；および
ポリヌクレオチド
を含む脂質ナノ粒子。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項６に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項８】
１個以上のカチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール系脂質、ＰＥＧ修飾した脂質および／またはポリマーをさらに含む、請求項６に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項９】
１個以上の非カチオン性脂質、コレステロール系脂質および／またはＰＥＧ修飾した脂質をさらに含む、請求項８に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１０】
非カチオン性脂質、コレステロール系脂質およびＰＥＧ修飾した脂質をさらに含む、請求項９に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１１】
前記１個以上の非カチオン性脂質が、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン）、ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））から選択される、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１２】
前記１個以上のコレステロール系脂質は、コレステロールおよび／またはＰＥＧ化コレステロールである、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１３】
前記１個以上のＰＥＧ修飾した脂質は、１つ以上のＣ６〜Ｃ２０長のアルキル鎖を有する脂質へ共有結合した長さ最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１４】
前記脂質ナノ粒子は、約２５０ｎｍ未満の大きさを有する、請求項６〜１３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１５】
前記ｍＲＮＡは、約０．５ｋｂ以上の長さを有する、請求項７〜１４のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１６】
前記ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質は、細胞質ゾルタンパク質である、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１７】
前記ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質は、分泌タンパク質である、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１８】
前記ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質は、酵素である、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１９】
前記ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質は、細胞内酵素である、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項２０】
前記ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質は、尿素周期またはリソソーム貯蔵代謝障害と関係する酵素である、請求項１９に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項２１】
前記ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質は、膜貫通タンパク質である、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項２２】
前記ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質は、イオンチャネルタンパク質である、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項２３】
前記ｍＲＮＡが１個以上の修飾されたヌクレオチドを含む、請求項７〜２２のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項２４】
前記１個以上の修飾されたヌクレオチドは、プソイドウリジン、Ｎ−１−メチル−プソイドウリジン、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および／または２−チオシチジンを含む、請求項２３に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項２５】
前記ｍＲＮＡは非修飾である、請求項７〜２２のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項２６】
タンパク質コードｍＲＮＡを含む組成物の送達により疾患または障害を治療するための医薬の製造のためのリポソームの使用であって、前記リポソームはリポソーム内に封入されたタンパク質コードｍＲＮＡを含み、その結果、前記組成物の投与が、対象における前記ｍＲＮＡによってコードされる前記タンパク質の発現を生じさせ、前記リポソームが請求項１〜５のいずれか一項に記載のカチオン性脂質組成物を含む、使用。
【請求項２７】
タンパク質コードｍＲＮＡを含む組成物の送達により疾患または障害を治療するための医薬の製造のためのリポソームの使用であって、前記リポソームはリポソーム内に封入されたタンパク質コードｍＲＮＡを含み、その結果、前記組成物の投与が、対象における前記ｍＲＮＡによってコードされる前記タンパク質の発現を生じさせ、前記リポソームが請求項６〜２５のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子を含む、使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
脂質を用いた核酸の送達は、種々の疾患の治療に広範に探究されてきた。効率性の高くかつ毒性の低い、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及び伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のような核酸を送達することのできる脂質及び／または脂質組成物についての大きな需要がまだ存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
とりわけ、本発明は、ｍＲＮＡを送達するための立体化学的に濃縮した脂質を含む組成物を提供する。本発明は、以下の式Ｉの立体化学的に濃縮した脂質を含む組成物がｍＲＮＡを送達し及びコードされたタンパク質をインビボで生成する上で高度に有効でありかつ予期せぬ低い毒性を有するという驚くべき発見に一部基づいている。
【化１】
0006599373.tif 000002
本発明者らは、ｍＲＮＡ送達に使用した時、Ｉの立体化学的に濃縮した組成物が、立体的に濃縮していない、または立体的にほとんど濃縮していない、同じ脂質の組成物と比較して驚くべき低い毒性を有していることを、例えば劇的により低いアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の発現レベルによって発見した。表１を参照されたい。
【０００３】
いくつかの実施形態において、本発明は、式Ｉの１つ以上の化学成分を含む組成物を提供し、当該化学成分の各々は、式Ｉ
【化２】
0006599373.tif 000003
の化合物、その医薬として許容され得る塩、その溶媒和物、またはその医薬として許容され得る塩の溶媒和物であり、
当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量以上が、式Ｉ．ａ、式Ｉ．ｂ．１、式Ｉ．ｂ．２、式Ｉ．ｃ、式Ｉ．ｄ、式Ｉ．ｅ、式Ｉ．ｆ、式Ｉ．ｇ、または式Ｉ．ｈの化学成分であることを特徴とし、当該式の各々は独立して、以下に定義及び説明する。
【０００４】
いくつかの実施形態において、本発明は、式Ｉの１つ以上の化学成分を含む組成物を提供し、当該化学成分の各々は、式Ｉ
【化３】
0006599373.tif 000004
の化合物、その医薬として許容され得る塩、その溶媒和物、またはその医薬として許容され得る塩の溶媒和物であり、
当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量以上が、式Ｉ．ａ
【化４】
0006599373.tif 000005
の化学成分であり、この中で当該第一の閾値量は５０％であり、または
式Ｉ．ｂ．１
【化５】
0006599373.tif 000006
の化学成分であり、この中で当該第一の閾値量は２５％であり、または
式Ｉ．ｂ．２
【化６】
0006599373.tif 000007
の化学成分であり、この中で当該第一の閾値量は２５％であることを特徴とする。
【０００５】
いくつかの実施形態において、本発明は、式Ｉの１つ以上の化学成分を含む組成物を提供し、当該化学成分の各々は、式Ｉ
【化７】
0006599373.tif 000008
の化合物、その医薬として許容され得る塩、その溶媒和物、またはその医薬として許容され得る塩の溶媒和物であり、
当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量を超えるものが
式Ｉ．ｃ
【化８】
0006599373.tif 000009
の化学成分であり、この中で当該第一の閾値量は６．２５％であり、または
式Ｉ．ｄ
【化９】
0006599373.tif 000010
の化学成分であり、この中で当該第一の閾値量は６．２５％であり、または
式Ｉ．ｅ
【化１０】
0006599373.tif 000011
の化学成分であり、この中で当該第一の閾値量は２５％であり、または
式Ｉ．ｆ
【化１１】
0006599373.tif 000012
の化学成分であり、この中で当該第一の閾値量は２５％であり、または
式Ｉ．ｇ
【化１２】
0006599373.tif 000013
の化学成分であり、この中で当該第一の閾値量は１２．５％であり、または
式Ｉ．ｈ
【化１３】
0006599373.tif 000014
の化学成分であり、この中で当該第一の閾値量は２５％であることを特徴とする。
【０００６】
いくつかの実施形態において、当該第一の閾値量は、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。いくつかの実施形態において、当該第一の閾値量は、５０％である。いくつかの実施形態において、当該第一の閾値量は、７０％である。いくつかの実施形態において、当該第一の閾値量は、８０％である。いくつかの実施形態において、当該第一の閾値量は、９５％である。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本発明は、式Ｉの１つ以上の化学成分を含む組成物を提供し、当該組成物の各々は、式Ｉ
【化１４】
0006599373.tif 000015
の化合物、その医薬として許容され得る塩、その溶媒和物、またはその医薬として許容され得る塩の溶媒和物であり、
当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量以上が、式Ｉ．ａ、式Ｉ．ｂ．１、式Ｉ．ｂ．２、式Ｉ．ｃ、式Ｉ．ｄ、式Ｉ．ｅ、式Ｉ．ｆ、式Ｉ．ｇ、または式Ｉ．ｈから選択される第一の式の化学成分であり、かつ
当該組成物中の第一の式の化学成分の総量の第二の閾値量以上が、当該第一の式の同じ立体異性体の化学成分であることを特徴とする。
【０００８】
いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量以上は、式Ｉ．ａの化学成分である。
【０００９】
いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ａの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ａ．ｉ
【化１５】
0006599373.tif 000016
の化学成分である。
【００１０】
いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ａの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ａ．ｉｉ
【化１６】
0006599373.tif 000017
の化学成分である。
【００１１】
いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．１の化学成分である。
【００１２】
いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｂ．１の化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．１．ｉ
【化１７】
0006599373.tif 000018
の化学成分である。
【００１３】
いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｂ．１の化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．１．ｉｉ
【化１８】
0006599373.tif 000019
の化学成分である。
【００１４】
いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．２の化学成分である。
【００１５】
いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｂ．２の化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．２．ｉ
【化１９】
0006599373.tif 000020
の化学成分である。
【００１６】
いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｂ．２の化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．２．ｉｉ
【化２０】
0006599373.tif 000021
の化学成分である。
【００１７】
いくつかの実施形態において、当該第二の閾値量は、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。いくつかの実施形態において、当該第二の閾値量は、５０％である。いくつかの実施形態において、当該第二の閾値量は、７０％である。いくつかの実施形態において、当該第二の閾値量は、８０％である。いくつかの実施形態において、当該第二の閾値量は、９５％である。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本発明は、式Ｉの１つ以上の化学成分を含む組成物を提供し、当該化学成分の各々は、式Ｉ
【化２１】
0006599373.tif 000022
の化合物、その医薬として許容され得る塩、その溶媒和物、またはその医薬として許容され得る塩の溶媒和物であり、
当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第三の閾値量以上が、式Ｉの化学成分であることを特徴とする。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本発明は、式Ｉの１つ以上の化学成分を含む組成物を提供し、当該化学成分の各々は、式Ｉ
【化２２】
0006599373.tif 000023
の化合物、その医薬として許容され得る塩、その溶媒和物、またはその医薬として許容され得る塩の溶媒和物であり、
当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第三の閾値量以上が、式Ｉの同じ立体異性体の化学成分であることを特徴とする。
【００２０】
いくつかの実施形態において、式Ｉの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｉ、式Ｉ．ａ．ｉｉ、式Ｉ．ｂ．１．ｉ、式Ｉ．ｂ．１．ｉｉ、式Ｉ．ｂ．２．ｉ、または式Ｉ．ｂ．２．ｉｉの構造を有する。
【００２１】
いくつかの実施形態において、当該組成物の総量の第三の閾値量以上は、式Ｉ．ａ．ｉ、式Ｉ．ａ．ｉｉ、式Ｉ．ｂ．１．ｉ、式Ｉ．ｂ．１．ｉｉ、式Ｉ．ｂ．２．ｉ、または式Ｉ．ｂ．２．ｉｉの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物の総量の第三の閾値量以上は、式Ｉ．ａ．ｉの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物の総量の第三の閾値量以上は、式Ｉ．ａ．ｉｉの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物の総量の第三の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．１．ｉの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物の総量の第三の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．１．ｉｉの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物の総量の第三の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．２．ｉの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物の総量の第三の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．２．ｉｉの化学成分である。
【００２２】
いくつかの実施形態において、当該第三の閾値量は、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態において、当該第三の閾値量は、５０％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態において、当該第三の閾値量は、７０％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態において、当該第三の閾値量は、８０％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態において、当該第三の閾値量は、８５％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態において、当該第三の閾値量は、９５％（ｗ／ｗ）である。
【００２３】
いくつかの実施形態において、提供される組成物はさらに、コードしたタンパク質のインビボでのｍＲＮＡ送達及び発現のための１つ以上のｍＲＮＡを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本発明は、ｍＲＮＡ及びコードしたタンパク質のインビボでの高度に効率的な送達及び発現のための複数の方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、送達する必要のある対象へ、ｍＲＮＡを含む提供された組成物を投与することを含む、ｍＲＮＡのインビボでの送達方法を提供する。いくつかの実施形態において、当該方法の低い毒性により、提供される組成物は、より多量の送達されるｍＲＮＡ、より高いタンパク質発現レベル及び／またはより低い投与頻度を可能にし、それにより、より強力で、より安全で、かつより特許として都合の良いｍＲＮＡ療法を提供する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
式Ｉの１つ以上の化学成分を含む組成物であって、前記化学成分の各々は、式Ｉ
【化７２】
0006599373.tif 000024
の化合物、その医薬として許容され得る塩、その溶媒和物、またはその医薬として許容され得る塩の溶媒和物であり、前記組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量を超えるものが、式Ｉ．ａ
【化７３】
0006599373.tif 000025
の化学成分であり、この中で前記第一の閾値量は５０％であること、または
式Ｉ．ｂ．１
【化７４】
0006599373.tif 000026
の化学成分であり、この中で前記第一の閾値量は２５％であること、または
式Ｉ．ｂ．２
【化７５】
0006599373.tif 000027
の化学成分であり、この中で前記第一の閾値量は２５％であることを特徴とする、前記組成物。
（項目２）
前記第一の閾値量は７０％である、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記第一の閾値量は８０％である、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記第一の閾値量は９５％である、項目１に記載の組成物。
（項目５）
前記組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量を超えるものは、式Ｉ．ａの化学成分である、項目１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６）
前記組成物中の式Ｉ．ａの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ａ．ｉ
【化７６】
0006599373.tif 000028
の化学成分であり、この中で前記第二の閾値量は５０％であることを特徴とする、項目５に記載の組成物。
（項目７）
前記第二の閾値量は７０％である、項目６に記載の組成物。
（項目８）
前記第二の閾値量は８０％である、項目６に記載の組成物。
（項目９）
前記第二の閾値量は９０％である、項目６に記載の組成物。
（項目１０）
前記第二の閾値量は９５％である、項目６に記載の組成物。
（項目１１）
前記組成物中の式Ｉ．ａの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ａ．ｉｉ
【化７７】
0006599373.tif 000029
の化学成分であり、この中で前記第二の閾値量は５０％であることを特徴とする、項目５に記載の組成物。
（項目１２）
前記第二の閾値量は７０％である、項目１１に記載の組成物。
（項目１３）
前記第二の閾値量は８０％である、項目１１に記載の組成物。
（項目１４）
前記第二の閾値量は９０％である、項目１１に記載の組成物。
（項目１５）
前記第二の閾値量は９５％である、項目１１に記載の組成物。
（項目１６）
前記組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．１の化学成分である、項目１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１７）
前記組成物中の式Ｉ．ｂ．１の化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．１．ｉ
【化７８】
0006599373.tif 000030
の化学成分であり、この中で前記第二の閾値量は５０％であることを特徴とする、項目１６に記載の組成物。
（項目１８）
前記第二の閾値量は７０％である、項目１７に記載の組成物。
（項目１９）
前記第二の閾値量は８０％である、項目１７に記載の組成物。
（項目２０）
前記第二の閾値量は９０％である、項目１７に記載の組成物。
（項目２１）
前記第二の閾値量は９５％である、項目１７に記載の組成物。
（項目２２）
前記組成物中の式Ｉ．ｂ．１の化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．１．ｉｉ
【化７９】
0006599373.tif 000031
の化学成分であり、この中で前記第二の閾値量は５０％である、項目１６に記載の組成物。
（項目２３）
前記第二の閾値量は７０％である、項目２２に記載の組成物。
（項目２４）
前記第二の閾値量は８０％である、項目２２に記載の組成物。
（項目２５）
前記第二の閾値量は９０％である、項目２２に記載の組成物。
（項目２６）
前記第二の閾値量は９５％である、項目２２に記載の組成物。
（項目２７）
前記組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．２の化学成分である、項目１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２８）
前記組成物中の式Ｉ．ｂ．２の化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．２．ｉ
【化８０】
0006599373.tif 000032
の化学成分であり、この中で前記第二の閾値量は５０％であることを特徴とする、項目２７に記載の組成物。
（項目２９）
前記第二の閾値量は７０％である、項目２８に記載の組成物。
（項目３０）
前記第二の閾値量は８０％である、項目２８に記載の組成物。
（項目３１）
前記第二の閾値量は９０％である、項目２８に記載の組成物。
（項目３２）
前記第二の閾値量は９５％である、項目２８に記載の組成物。
（項目３３）
前記組成物中の式Ｉ．ｂ．２の化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．２．ｉｉ
【化８１】
0006599373.tif 000033
の化学成分であり、この中で前記第二の閾値量は５０％であることを特徴とする、項目２７に記載の組成物。
（項目３４）
前記第二の閾値量は７０％である、項目３３に記載の組成物。
（項目３５）
前記第二の閾値量は８０％である、項目３３に記載の組成物。
（項目３６）
前記第二の閾値量は９０％である、項目３３に記載の組成物。
（項目３７）
前記第二の閾値量は９５％である、項目３３に記載の組成物。
（項目３８）
前記組成物の総量の第三の閾値量以上は、式Ｉの化学成分であり、この中で前記第三の閾値量は８５％（ｗ／ｗ）であることを特徴とする、項目１〜４に記載の組成物。
（項目３９）
前記第三の閾値量は９０％である、項目３８に記載の組成物。
（項目４０）
前記第三の閾値量は９５％である、項目３８に記載の組成物。
（項目４１）
前記第三の閾値量は９８％である、項目３８に記載の組成物。
（項目４２）
前記組成物の総量の９０％（ｗ／ｗ）以上は、式Ｉ．ａ．ｉ
【化８２】
0006599373.tif 000034
の化学成分である、項目４１に記載の組成物。
（項目４３）
前記組成物の総量の９０％（ｗ／ｗ）以上は、式Ｉ．ａ．ｉｉ
【化８３】
0006599373.tif 000035
の化学成分である、項目４１に記載の組成物。
（項目４４）
前記組成物の総量の９０％（ｗ／ｗ）以上は、式Ｉ．ｂ．１．ｉ
【化８４】
0006599373.tif 000036
の化学成分である、項目４２に記載の組成物。
（項目４５）
前記組成物の総量の９０％（ｗ／ｗ）以上は、式Ｉ．ｂ．２．ｉ
【化８５】
0006599373.tif 000037
の化学成分である、項目４１に記載の組成物。
（項目４６）
前記組成物の総量の９０％（ｗ／ｗ）以上は、式Ｉ．ｂ．１．ｉ
【化８６】
0006599373.tif 000038
の化学成分である、項目４１に記載の組成物。
（項目４７）
前記組成物の総量の９０％（ｗ／ｗ）以上は、式Ｉ．ｂ．２．ｉ
【化８７】
0006599373.tif 000039
の化学成分である、項目４１に記載の組成物。
（項目４８）
組成物の投与が結果的に、インビボで伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）によってコードされるタンパク質の発現を生じるよう、リポソーム内に封入されたタンパク質コードｍＲＮＡを含む組成物を、送達を必要とする対象へ投与することを含む、インビボでのｍＲＮＡの送達方法であって、前記リポソームは、項目１〜４７のいずれか一項に記載のカチオン性脂質化合物を含む、前記方法。
（項目４９）
前記リポソームはさらに、１個以上の非カチオン性脂質、１個以上のコレステロール系脂質及び／または１個以上のＰＥＧ修飾脂質を含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記１個以上の非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ））ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））から選択される、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記１個以上のコレステロール系脂質は、コレステロール及び／またはＰＥＧ化コレステロールである、項目４９または５０に記載の方法。
（項目５２）
前記１個以上のＰＥＧ修飾脂質は、Ｃ６〜Ｃ２０長のアルキル鎖（複数可）を有する脂質へ共有結合した長さ最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む、項目４９〜５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記リポソームは、約２５０ｎｍ、２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、または５０ｎｍ未満の大きさを有する、項目４８〜５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記ｍＲＮＡは、約０．５ｋｂ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、または５ｋｂ以上の長さを有する、項目４８〜５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質は、細胞質ゾルタンパク質である、項目４８〜５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質は、分泌タンパク質であるである、項目４８〜５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質は、酵素である、項目４８〜５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記ｍＲＮＡは、１個以上の修飾されたヌクレオチドを含む、項目４８〜５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記１個以上の修飾されたヌクレオチドは、プソイドウリジン、Ｎ−１−メチル−プソイドウリジン、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、及び／または２−チオシチジンを含む、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記ｍＲＮＡは非修飾である、項目４８〜５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
項目４８〜６０のいずれか一項に記載の方法を用いて、治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡを送達する工程を含む、疾患または障害の治療方法。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】式Ｉの化合物を含む脂質ナノ粒子を用いた治療の際の野生型マウス肝臓におけるインビボでのヒトＡＳＳ１タンパク質産生の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（定義）
本発明がより容易に理解されるために、ある特定の用語をまず以下に定義する。以下の用語および他の用語についての追加の定義は、本明細書のいたるところで明らかにする。本発明の背景を説明するために及び本発明の実施に関する追加の詳細を提供するために本明細書で参照する公開物及び他の参照材料は、参照により本明細書により組み込まれる。
【００２７】
アミノ酸：本明細書で使用する場合、「アミノ酸」という用語はその最も広範な意味で、ポリペプチド鎖へ組み込むことのできる任意の化合物及び／または物質を指す。いくつかの実施形態において、アミノ酸は、一般的な構造ＨＥＮ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＨＯを有する。いくつかの実施形態において、アミノ酸は、天然アミノ酸である。いくつかの実施形態において、アミノ酸は合成アミノ酸であり、いくつかの実施形態において、アミノ酸はｄ型アミノ酸であり、いくつかの実施形態において、アミノ酸はｌ型アミノ酸である。「標準的なアミノ酸」は、天然ペプチドにおいて通常認められる２０個の標準的なｌ型アミノ酸のうちのいずれかを指す。「非標準的なアミノ酸」は、それが合成で調製されようと天然源から得られようとにかかわらず、標準的なアミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す。本明細書で使用する場合、「合成アミノ酸」は、塩、アミノ酸誘導体（アミドのような）、及び／または置換を含むがこれらに限定しない化学的に修飾されたアミノ酸を包含する。ペプチド中にカルボキシル末端アミノ酸及び／またはアミノ末端アミノ酸を含むアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化、保護基、及び／または化学基の活性に有害に影響することなくペプチドの循環半減期を変化させることのできる他の当該化学基との置換によって修飾することができる。アミノ酸は、ジスルフィド結合に関与し得る。アミノ酸は、１個以上の化学成分（例えば、メチル基、酢酸基、アセチル基、リン酸基、ホルミル部分、イソプレノイド基、硫酸基、ポリエチレングリコール部分、脂質部分、炭水化物部分、ビオチン部分など）との結合のような、１個の修飾または翻訳後修飾を含み得る。「アミノ酸」という用語は、「アミノ酸残基」と相互交換可能に使用され、遊離アミノ酸及び／またはペプチドのアミノ酸残基を指すことがある。当該用語を使用する脈絡から、アミノ酸が遊離アミノ酸かまたはペプチドの残基を指すかは明白であろう。
【００２８】
動物：本明細書で使用する場合、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態において、「動物」は、任意の発達段階にあるヒトを指す。いくつかの実施形態において、「動物」は、任意の発達段階の非ヒト動物を指す。ある実施形態において、当該非ヒト動物とは哺乳類である（例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／またはブタ）。いくつかの実施形態において、動物には、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫、及び／または蠕虫を含むが、これらに限定しない。いくつかの実施形態において、動物とは、トランスジェニック動物、遺伝的に操作した動物、及び／またはクローンであってもよい。
【００２９】
およそまたは約：本明細書で使用する場合、「およそ」または「約」という用語は、関心対象の１つ以上の値に適用する場合、記載の基準値と類似の値を指す。ある実施形態において、「およそ」または「約」という用語は、別段の記載がない限り、または脈絡から別段に明白な場合、記載の基準値のいずれかの方向で（より大きいまたはより小さい）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれより小さな数の内に収まる値の範囲を指す（このような数が可能な値の１００％を超えるであろう場合を除く）。
【００３０】
化学成分：本明細書で使用する場合、「化学成分」という用語には、化合物、塩、またはこれらの溶媒和物、あるいは化合物、塩、またはこれらの溶媒和物の任意の組み合わせを含む。
【００３１】
送達：本明細書で使用する場合、「送達」という用語は、局所送達及び全身送達の両方を包含する。例えば、ｍＲＮＡの送達は、ｍＲＮＡが標的組織へ送達され、かつコードしたタンパク質が発現して標的組織内に保有される状況、及び、ｍＲＮＡが標的組織内へ送達され、かつコードしたタンパク質が発現して患者の循環系（例えば、血清）へと分泌されて系統的に分配され、他の組織によって取り込まれる状況（「全身性分配」または「全身送達」とも呼ぶ）を包含する。
【００３２】
発現：本明細書で使用する場合、核酸配列の「発現」は、ｍＲＮＡからポリペプチドへの翻訳を指し、複数のポリペプチド（例えば、抗体の重鎖または軽鎖）からインタクトなタンパク質（例えば、抗体）へと及び／またはポリペプチド若しくは完全に集合したタンパク質（例えば、抗体）の翻訳後修飾を集合させる。この出願において、「発現」及び「生成」という用語ならびに文法上の等価物は、相互交換可能に使用する。
【００３３】
機能的な：本明細書で使用する場合、「機能的な」生体分子とは、特徴とする特性及び／または活性を呈する形態にある生体分子である。
【００３４】
半減期：本明細書で使用する場合、「半減期」という用語は、時間の開始時に測定した時間の値の半分に収まるための、核酸またはタンパク質の濃度または活性のような量に必要な時間である。
【００３５】
改善する、増大する、または減少する：本明細書で使用する場合、「改善する」、「増大する」または「減少する」という用語あるいは文法上の等価物は、本明細書に説明する治療の開始前の同じ個体における測定または本明細書に説明する治療の非存在下における対照対象（または複数の対照対象）における測定のような、基線測定に相対的な値を示す。「対照対象」とは、治療中の対象とほぼ同齢の治療中の当該対象と同じ形態の疾患に罹患している対象である。
【００３６】
インビトロ：本明細書で使用する場合、「インビトロ」という用語は、人工的な環境において、例えば、検査チューブまたは反応容器、例えば、多細胞生体内よりもむしろ細胞培養物において生じる事象を指す。
【００３７】
インビボ：本明細書で使用する場合、「インビボ」という用語は、ヒト及び非ヒト動物のような多細胞生体内で生じる事象を指す。細胞系系統の脈絡で当該用語は、生細胞内で生じる事象を指すために使用することがある（例えば、インビトロの系とは対照的）。
【００３８】
単離した：本明細書で使用する場合、「単離した」という用語は、（１）初期的に産生する場合（自然においてであろうと及び／もしくは実験の設定においてであろうと）、結合する構成要素のうちの少なくともいくつかから分離した、ならびに／または（２）人間の手によって生成、調製、及び／または製造された物質ならびに／あるいは実体を指す。単離した物質及び／または実体は、初期的に結合した他の構成要素の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超から分離してもよい。いくつかの実施形態において、単離した作用因子は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超純粋である。本明細書で使用する場合、物質は、他の構成要素が実質的にない場合「純粋」である。本明細書で使用する場合、単離した物質及び／または実体の％純度の計算には賦形剤（例えば、緩衝液、溶媒、水など）を含むべきではない。
【００３９】
局所分配または送達：本明細書で使用する場合、「局所分配」、「局所送達」という用語、または文法上の等価物は、組織特異的な送達または分配を指す。典型的には、局所的な分配または送達は、細胞内でまたは患者の循環系に入るのを回避する制限された分泌で翻訳及び発現するｍＲＮＡによってコードされるタンパク質（例えば、酵素）を必要とする。
【００４０】
伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：本明細書で使用する場合、「伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」という用語は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。本明細書で使用する場合のｍＲＮＡは、修飾されたＲＮＡ及び修飾されていないＲＮＡを両方包含する。ｍＲＮＡは、１つ以上のコード領域及び非コード領域を含有してもよい。ｍＲＮＡは、天然源から精製することができ、組換え発現系を用いて生成することができ、任意に精製、化学的に合成などすることができる。適宜、例えば、化学的に合成された分子の場合、ｍＲＮＡは、化学的に修飾された塩基若しくは糖、主鎖修飾などを有する類似体のようなヌクレオシド類似体を含むことができる。ｍＲＮＡ配列は、別段の記載がない限り、５’から３’の方向に呈する。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）、ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、及び２−チオシチジン）、化学的に修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化した塩基）、インターカレートした塩基、修飾した糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）、及び／または修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオアート及び５’−Ｎ−ホスホルアミダイト結合）であり、あるいはこれらを含む。
【００４１】
いくつかの実施形態において、当該ｍＲＮＡは、１個以上の非標準的なヌクレオチド残基を含む。非標準的なヌクレオチド残基には例えば、５−メチル−シチジン（「５ｍＣ」）、プソイドウリジン、及び／または２−チオ−ウリジン（「２ｓＵ」）を含むことがある。例えば、このような残基及び当該残基のｍＲＮＡへの組み込みに関する考察については、例えば、米国特許第８，２７８，０３６号またはＷＯ２０１１０１２３１６を参照されたい。当該ｍＲＮＡは、ＲＮＡであってもよく、これは、Ｕ残基の２５％が２−チオ−ウリジンであり、かつＣ残基の２５％が５−メチルシチジンであるＲＮＡとして定義される。ＲＮＡの使用についての教示については、米国特許公開ＵＳ２０１２０１９５９３６及び内部公開ＷＯ２０１１０１２３１６に開示されており、これらは両方とも、それらの内容が全体として参照により本明細書により組み込まれる。非標準的なヌクレオチド残基の存在は、同じ配列だが標準的な残基のみを含有する対照ｍＲＮＡよりもｍＲＮＡを安定で及び／またはあまり免疫原性のないものにし得る。さらなる実施形態において、当該ｍＲＮＡは、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン及び２−クロロ−６−アミノプリンシトシン、ならびにこれらの修飾物及び他の核酸塩基修飾物の組み合わせを含み得る。ある実施形態にはさらに、フラノース環または核酸塩基に対する追加の修飾を含み得る。追加の修飾には、例えば、糖修飾または糖置換（例えば、２’−Ｏ−アルキル修飾のうちの１個以上、ロックト核酸（ＬＮＡ））を含み得る。いくつかの実施形態において、当該ＲＮＡは、追加のポリヌクレオチド及び／またはペプチドポリヌクレオチド（ＰＮＡ）と複合体形成またはハイブリッド形成し得る。糖修飾が２’−Ｏ−アルキル修飾である実施形態において、このような修飾には、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾、２’−Ｏ−メチル修飾、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾及び２’−デオキシ修飾を含み得るが、これらに限定しない。ある実施形態において、これらの修飾のうちのいかなるものも、当該ヌクレオチドの０〜１００％で存在し得、例えば、ヌクレオチド成分の０％超、１％、１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、または１００％で個々にまたは組み合わせで存在し得る。
【００４２】
核酸：本明細書で使用する場合、「核酸」という用語はその最も広範な意味において、ポリヌクレオチド鎖へと組み込まれたもしくは組み込まれることのできる任意の化合物及び／または物質を指す。いくつかの実施形態において、核酸は、ホスホジエステル結合を介してポリヌクレオチドへと組み込まれたまたは組み込まれることのできる化合物及び／または物質である。いくつかの実施形態において、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチド及び／またはヌクレオシド）を指す。いくつかの実施形態において、「核酸」は、個々の核酸残基を含むポリヌクレオチド鎖を指す。いくつかの実施形態において、「核酸」は、ＲＮＡ、ならびに一本鎖及び／または二本鎖のＤＮＡ及び／またはｃＤＮＡを包含する。
【００４３】
患者：本明細書で使用する場合、「患者」または「対象」という用語は、提供される組成物が、例えば、実験、診断、予防、化粧、及び／または治療上の目的のために投与され得る任意の生体を指す。典型的な患者には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及び／またはヒトのような哺乳類）を含む。いくつかの実施形態において、患者はヒトである。ヒトには出生前形態及び出生後形態を含む。
【００４４】
医薬として許容され得る：「医薬として許容され得る」という用語は本明細書で使用する場合、完全な医学的判断の範囲内で、合理的な損益比と釣り合って、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題若しくは合併症なしでヒト及び動物の組織と接触して使用するのに適している。
【００４５】
ポリマー：本明細書で使用する場合、「ポリマー」は、少なくとも３（例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、など）の反復する共有結合構造単位から構成された化合物を指す。
【００４６】
塩：本明細書で使用する場合、「塩」または「医薬として許容され得る塩」という用語は、完全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答及びこれらに類する事象なしでヒト及び下等動物の組織と接触して使用するのに適しており、かつ合理的な損益比と釣り合っている塩を指す。医薬として許容され得る塩は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅらは、医薬として許容され得る塩をＪ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９７７）６６：１〜１９において詳細に説明している。本発明の化合物の医薬として許容され得る塩には、適切な無機及び有機の酸及び塩基に由来するものを含む。医薬として許容され得る非毒性の酸添加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸及び過塩素酸のような無機酸を用いて、または酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸若しくはマロン酸のような有機酸を用いて、あるいはイオン交換のような当該技術分野において使用される他の方法を用いることによって形成されるアミノ基の塩である。他の医薬として許容され得る塩には、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、  グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩（ｐｅｃｔｉｎａｔｅ）、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバルサン塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩、及びこれらに類するものを含む。適切な塩基由来の塩には、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩及びＮ＋（Ｃ１〜４アルキル）４塩を含む。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、及びこれらに類するものを含む。さらなる医薬として許容され得る塩には、適宜、非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、ならびにハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、スルホン酸塩及びアリールスルホン酸塩のような対イオンを用いて形成されるアミンカチオンを含む。さらなる医薬として許容され得る塩には、第四級アルキル化アミノ塩を形成するために適切な求電子試薬、例えば、ハロゲン化アルキルを用いてアミンの第四級化から形成された塩を含む。
【００４７】
全身分配または全身送達：本明細書で使用する場合、「全身分配」、「全身送達」という用語、または文法上の等価物は、身体全体または生体全体に影響する送達または分配の機序またはアプローチを指す。典型的には、全身分配または全身送達は、身体の循環系、例えば、血流を介して達成される。「局所分配または局所送達」に関する定義と比較されたい。
【００４８】
対象：本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊長類）を指す。ヒトには、出生前及び出生後の形態を含む。多くの実施形態において、対象はヒトである。対象は、疾患の診断または治療のために医療提供者に呈する人を指す患者であることができる。「対象」という用語は本明細書において、「個体」または「患者」と相互交換可能に使用する。対象は、疾患若しくは障害を罹患している可能性があり、または当該疾患若しくは障害の疑いがあるが、当該疾患または障害の症状を示していてもよくまたは示していなくてもよい。
【００４９】
実質的に：本明細書で使用する場合、「実質的に」という用語は、関心対象の特徴または特性の全体的なまたはほぼ全体的な程度または度合いを呈する定性的な条件を指す。生物学の当業者は、生物学的および化学的現象がまれに、極めてまれに、完全に至り及び／若しくは完全性へと進行し、または絶対的な結果を達成若しくは回避するであろうことを理解するであろう。「実質的に」という用語はそれゆえ本明細書において、多くの生物学的及び化学的現象において固有の完全性の潜在的な欠如を捉えるために使用する。
【００５０】
標的組織：本明細書で使用する場合、「標的組織」という用語は、治療されることになっている疾患によって影響される任意の組織を指す。いくつかの実施形態において、標的組織には、疾患関連性の病理、症状、または特徴を示す当該組織を含む。
【００５１】
治療有効量：本明細書で使用する場合、治療薬の「治療有効量」という用語は、疾患、障害、及び／または容態の発症を治療、診断、予防、及び／または遅延させるために、当該疾患、障害、及び／または容態に罹患しているまたは罹患している疑いのある対象へ投与するときに、十分である量を意味する。治療有効量が典型的には、少なくとも１つの単位用量を含む投与計画を介して投与されることは、当業者によって認識されるであろう。
【００５２】
治療すること：本明細書で使用する場合、「治療する」、「治療」、または「治療すること」という用語は、特定の疾患、障害、及び／若しくは容態の１つ以上の症状または特徴の発症を部分的に若しくは完全に緩和し、緩解させ、解放し、阻害し、予防し、遅延させ、重症度を低下させ、ならびに／または発生率を低下させるのに使用する任意の方法を指す。治療は、疾患の徴候を呈さない対象及び／または疾患の早期の徴候のみを呈する対象へ、当該疾患と関係する病状を発達させる危険性を低下させる目的のために投与され得る。
【００５３】
（詳細な説明）
本発明はとりわけ、立体化学的に濃縮した脂質組成物を用いてｍＲＮＡをインビボで送達するための脂質組成物及び方法を提供する。
【００５４】
（脂質組成物）
いくつかの実施形態において、本発明は、式Ｉの１個以上の化学成分を含む組成物を提供し、当該化学成分の各々は、式Ｉの化合物、その医薬として許容され得る塩、その溶媒和物、またはその医薬として許容され得る塩の溶媒和物であり、
当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量以上が、式Ｉ．ａ、式Ｉ．ｂ．１、式Ｉ．ｂ．２、式Ｉ．ｃ、式Ｉ．ｄ、式Ｉ．ｅ、式Ｉ．ｆ、式Ｉ．ｇ、または式Ｉ．ｈの化学成分であることを特徴とする。
【００５５】
いくつかの実施形態において、提供する組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量を超えるものが、式Ｉ．ａ、式Ｉ．ｂ．１、式Ｉ．ｂ．２、式Ｉ．ｃ、式Ｉ．ｄ、式Ｉ．ｅ、式Ｉ．ｆ、式Ｉ．ｇ、または式Ｉ．ｈの化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、提供する組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量が、式Ｉ．ａ、式Ｉ．ｂ．１、式Ｉ．ｂ．２、式Ｉ．ｃ、式Ｉ．ｄ、式Ｉ．ｅ、式Ｉ．ｆ、式Ｉ．ｇ、または式Ｉ．ｈの化学成分であることを特徴とする。
【００５６】
本明細書で使用する場合、式の「化学成分」とは、当該式の化合物、その医薬として許容され得る塩、その溶媒和物、またはその医薬として許容され得る塩の溶媒和物である。
【００５７】
いくつかの実施形態において、当該第一の閾値量は、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。いくつかの実施形態において、当該第一の閾値量は、５０％である。いくつかの実施形態において、当該第一の閾値量は、７０％である。いくつかの実施形態において、当該第一の閾値量は、８０％である。いくつかの実施形態において、当該第一の閾値量は、９５％である。
【００５８】
いくつかの実施形態において、当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量以上が、式Ｉ．ａの化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量を超えるものが、式Ｉ．ａの化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量が、式Ｉ．ａの化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は５０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は７０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は８０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は９０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は９５％である。
【００５９】
いくつかの実施形態において、当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量以上が、式Ｉ．ｂ．１の化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量を超えるものが、式Ｉ．ｂ．１の化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量が、式Ｉ．ｂ．１の化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は２５％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は５０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は７０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は８０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は９０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は９５％である。
【００６０】
いくつかの実施形態において、当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量以上が、式Ｉ．ｂ．２の化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量を超えるものが、式Ｉ．ｂ．２の化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量が、式Ｉ．ｂ．２の化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は２５％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は５０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は７０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は８０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は９０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は９５％である。
【００６１】
いくつかの実施形態において、当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量以上が、式Ｉ．ｃの化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量を超えるものが、式Ｉ．ｃの化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量が、式Ｉ．ｃの化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は６．２５％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は１２．５％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は２５％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は５０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は７０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は８０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は９０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は９５％である。
【００６２】
いくつかの実施形態において、当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量以上が、式Ｉ．ｄの化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量を超えるものが、式Ｉ．ｄの化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量が、式Ｉ．ｄの化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は６．２５％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は１２．５％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は２５％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は５０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は７０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は８０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は９０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は９５％である。
【００６３】
いくつかの実施形態において、当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量以上が、式Ｉ．ｅの化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量を超えるものが、式Ｉ．ｅの化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量が、式Ｉ．ｅの化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は２５％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は５０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は７０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は８０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は９０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は９５％である。
【００６４】
いくつかの実施形態において、当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量以上が、式Ｉ．ｆの化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量を超えるものが、式Ｉ．ｆの化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量が、式Ｉ．ｆの化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は２５％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は５０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は７０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は８０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は９０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は９５％である。
【００６５】
いくつかの実施形態において、当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量以上が、式Ｉ．ｇの化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量を超えるものが、式Ｉ．ｇの化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量が、式Ｉ．ｇの化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は１２．５％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は２５％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は５０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は７０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は８０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は９０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は９５％である。
【００６６】
いくつかの実施形態において、当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量以上が、式Ｉ．ｈの化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量を超えるものが、式Ｉ．ｈの化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量が、式Ｉ．ｈの化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は２５％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は５０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は７０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は８０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は９０％である。いくつかの実施形態において、第一の閾値量は９５％である。
【００６７】
いくつかの実施形態において、本発明は、式Ｉの１つ以上の化学成分を含む組成物を提供し、当該化学成分の各々は、式Ｉ
【化２３】
0006599373.tif 000040
の化合物、その医薬として許容され得る塩、その溶媒和物、またはその医薬として許容され得る塩の溶媒和物であり、
当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量以上が、式Ｉ．ａ、式Ｉ．ｂ．１、式Ｉ．ｂ．２、式Ｉ．ｃ、式Ｉ．ｄ、式Ｉ．ｅ、式Ｉ．ｆ、式Ｉ．ｇ、及び式Ｉ．ｈから選択される第一の式の化学成分であり、かつ
当該組成物中の第一の式の化学成分の総量の第二の閾値量以上が、第一の式の同じ立体異性体の化学成分であることを特徴とする。
【００６８】
いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量を超えるものは、式Ｉ．ａ、式Ｉ．ｂ．１、式Ｉ．ｂ．２、式Ｉ．ｃ、式Ｉ．ｄ、式Ｉ．ｅ、式Ｉ．ｆ、式Ｉ．ｇ、及び式Ｉ．ｈから選択される第一の式の化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量は、式Ｉ．ａ、式Ｉ．ｂ．１、式Ｉ．ｂ．２、式Ｉ．ｃ、式Ｉ．ｄ、式Ｉ．ｅ、式Ｉ．ｆ、式Ｉ．ｇ、及び式Ｉ．ｈから選択される第一の式の化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第二の閾値量を超えるものは、第一の式の同じ立体異性体の化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の第一の式の化学成分の総量の第二の閾値量は、第一の式の同じ立体異性体の化学成分である。
【００６９】
いくつかの実施形態において、第一の式は、式Ｉ．ａである。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量以上は、式Ｉ．ａの化学成分であり、かつ当該組成物中の式Ｉ．ａの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ａの同じ立体異性体の化学成分である。
【００７０】
いくつかの実施形態において、式Ｉ．ａの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｉ
【化２４】
0006599373.tif 000041
の構造を有する。
【００７１】
いくつかの実施形態において、式Ｉ．ａの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｉｉ
【化２５】
0006599373.tif 000042
の構造を有する。
【００７２】
いくつかの実施形態において、式Ｉ．ａの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｉｉｉ
【化２６】
0006599373.tif 000043
の構造を有する。
【００７３】
いくつかの実施形態において、式Ｉ．ａの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｉｖ
【化２７】
0006599373.tif 000044
の構造を有する。
【００７４】
いくつかの実施形態において、式Ｉ．ａの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｖ
【化２８】
0006599373.tif 000045
の構造を有する。
【００７５】
いくつかの実施形態において、式Ｉ．ａの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｖｉ
【化２９】
0006599373.tif 000046
の構造を有する。
【００７６】
いくつかの実施形態において、式Ｉ．ａの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｖｉｉ
【化３０】
0006599373.tif 000047
の構造を有する。
【００７７】
いくつかの実施形態において、式Ｉ．ａの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｖｉｉｉ
【化３１】
0006599373.tif 000048
の構造を有する。
【００７８】
いくつかの実施形態において、式Ｉ．ａの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｉｘ
【化３２】
0006599373.tif 000049
の構造を有する。
【００７９】
いくつかの実施形態において、式Ｉ．ａの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｘ
【化３３】
0006599373.tif 000050
の構造を有する。
【００８０】
いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ａの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ａ．ｉの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ａの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ａ．ｉｉの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ａの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ａ．ｉｉｉの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ａの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ａ．ｉｖの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ａの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ａ．ｖの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ａの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ａ．ｖｉの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ａの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ａ．ｖｉｉの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ａの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ａ．ｖｉｉｉの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ａの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ａ．ｉｘの化学成分である。
【００８１】
いくつかの実施形態において、第一の式は、式Ｉ．ｂ．１である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．１の化学成分であり、かつ当該組成物中の式Ｉ．ｂ．１の化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．１の同じ立体異性体の化学成分である。
【００８２】
いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｂ．１の立体異性体は、式Ｉ．ｂ．１．ｉ（すなわち、Ｒ４−ＳＳ−ｃＫＫ−Ｅ１２）の構造を有する。
【００８３】
いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｂ．１の立体異性体は、式Ｉ．ｂ．１．ｉｉ（すなわち、Ｓ４−ＳＳ−ｃＫＫ−Ｅ１２）の構造を有する。
【００８４】
いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｂ．１の立体異性体は、式Ｉ．ｂ．１．ｉｉｉ
【化３４】
0006599373.tif 000051
の構造を有する。
【００８５】
いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｂ．１の立体異性体は、式Ｉ．ｂ．１．ｉｖ
【化３５】
0006599373.tif 000052
の構造を有する。
【００８６】
いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｂ．１の立体異性体は、式Ｉ．ｂ．１．ｖ
【化３６】
0006599373.tif 000053
の構造を有する。
【００８７】
いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｂ．１の立体異性体は、式Ｉ．ｂ．１．ｖｉ
【化３７】
0006599373.tif 000054
の構造を有する。
【００８８】
いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｂ．１の化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．１．ｉの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｂ．１の化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．１．ｉｉの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｂ．１の化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．１．ｉｉｉの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｂ．１の化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．１．ｉｖの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｂ．１の化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．１．ｖの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｂ．１の化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．１．ｖｉの化学成分である。
【００８９】
いくつかの実施形態において、第一の式は、式Ｉ．ｂ．２である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．２の化学成分であり、かつ当該組成物中の式Ｉ．ｂ．２の化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．２の同じ立体異性体の化学成分である。
【００９０】
いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｂ．２の立体異性体は、式Ｉ．ｂ．２．ｉ（すなわち、Ｒ４−ＲＲ−ｃＫＫ−Ｅ１２）の構造を有する。
【００９１】
いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｂ．２の立体異性体は、式Ｉ．ｂ．２．ｉｉ（すなわち、Ｓ４−ＲＲ−ｃＫＫ−Ｅ１２）の構造を有する。
【００９２】
いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｂ．２の立体異性体は、式Ｉ．ｂ．２．ｉｉｉ
【化３８】
0006599373.tif 000055
の構造を有する。
【００９３】
いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｂ．２の立体異性体は、式Ｉ．ｂ．２．ｉｖ
【化３９】
0006599373.tif 000056
の構造を有する。
【００９４】
いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｂ．２の立体異性体は、式Ｉ．ｂ．２．ｖ
【化４０】
0006599373.tif 000057
の構造を有する。
【００９５】
いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｂ．２の立体異性体は、式Ｉ．ｂ．２．ｖｉ
【化４１】
0006599373.tif 000058
の構造を有する。
【００９６】
いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｂ．２の化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．２．ｉの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｂ．２の化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．２．ｉｉの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｂ．２の化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．２．ｉｉｉの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｂ．２の化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．２．ｉｖの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｂ．２の化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．２．ｖの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｂ．２の化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．２．ｖｉの化学成分である。
【００９７】
いくつかの実施形態において、第一の式は、式Ｉ．ｃである。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量以上は、式Ｉ．ｃの化学成分であり、かつ当該組成物中の式Ｉ．ｃの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｃの同じ立体異性体の化学成分である。いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｃの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｉの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｃの立体異性体は、式Ｉ．ｂ．１．ｉの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｃの立体異性体は、式Ｉ．ｂ．２．ｉの構造を有する。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｃの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ａ．ｉの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｃの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．１．ｉの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｃの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．２．ｉの化学成分である。
【００９８】
いくつかの実施形態において、第一の式は、式Ｉ．ｄである。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量以上は、式Ｉ．ｄの化学成分であり、かつ当該組成物中の式Ｉ．ｄの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｄの同じ立体異性体の化学成分である。いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｄの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｉｉの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｄの立体異性体は、式Ｉ．ｂ．１．ｉｉの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｄの立体異性体は、式Ｉ．ｂ．２．ｉｉの構造を有する。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｄの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ａ．ｉｉの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｄの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．１．ｉｉの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｄの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．２．ｉｉの化学成分である。
【００９９】
いくつかの実施形態において、第一の式は、式Ｉ．ｅである。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量以上は、式Ｉ．ｅの化学成分であり、かつ当該組成物中の式Ｉ．ｅの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｅの同じ立体異性体の化学成分である。いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｅの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｉｉｉの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｅの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｖの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｅの立体異性体は、式Ｉ．ｂ．１．ｉｉｉの構造を有する。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｅの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．２．ｉｉｉの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｅの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ａ．ｉｉｉの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｅの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ａ．ｖの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｅの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．１．ｉｉｉの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｅの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．２．ｉｉｉの化学成分である。
【０１００】
いくつかの実施形態において、第一の式は、式Ｉ．ｆである。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量以上は、式Ｉ．ｆの化学成分であり、かつ当該組成物中の式Ｉ．ｆの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｆの同じ立体異性体の化学成分である。いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｆの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｖｉｉの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｆの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｉｘの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｆの立体異性体は、式Ｉ．ｂ．１．ｖｉの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｆの立体異性体は、式Ｉ．ｂ．２．ｖｉの構造を有する。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｆの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ａ．ｉｉｉの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｆの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｉｘの構造である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｆの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．１．ｖｉの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｆの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．２．ｖｉの化学成分である。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、第一の式は、式Ｉ．ｇである。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量以上は、式Ｉ．ｇの化学成分であり、かつ当該組成物中の式Ｉ．ｇの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｇの同じ立体異性体の化学成分である。いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｇの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｉｖの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｇの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｖｉｉｉの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｇの立体異性体は、式Ｉ．ｂ．１．ｉｖの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｇの立体異性体は、式Ｉ．ｂ．２．ｉｖの構造を有する。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｇの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ａ．ｉｖの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｇの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｖｉｉｉの構造である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｇの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．１．ｉｖの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｇの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．２．ｉｖの化学成分である。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、第一の式は、式Ｉ．ｈである。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第一の閾値量以上は、式Ｉ．ｈの化学成分であり、かつ当該組成物中の式Ｉ．ｈの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｈの同じ立体異性体の化学成分である。いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｈの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｖｉの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｈの立体異性体は、式Ｉ．ｂ．１．ｖの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉ．ｈの立体異性体は、式Ｉ．ｂ．２．ｖの構造を有する。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｈの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ａ．ｖｉの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｈの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．１．ｖの化学成分である。いくつかの実施形態において、当該組成物中の式Ｉ．ｈの化学成分の総量の第二の閾値量以上は、式Ｉ．ｂ．２．ｖの化学成分である。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、当該第二の閾値量は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。いくつかの実施形態において、当該第二の閾値量は、５０％である。いくつかの実施形態において、当該第二の閾値量は、７０％である。いくつかの実施形態において、当該第二の閾値量は、８０％である。いくつかの実施形態において、当該第二の閾値量は、８５％である。いくつかの実施形態において、当該第二の閾値量は、９０％である。いくつかの実施形態において、当該第二の閾値量は、９５％である。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、本発明は、式Ｉの１つ以上の化学成分を含む組成物を提供し、当該化学成分の各々は式Ｉ
【化４２】
0006599373.tif 000059
の化合物、その医薬として許容され得る塩、その溶媒和物、またはその医薬として許容され得る塩の溶媒和物であり、
当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第三の閾値量以上が、式Ｉの化学成分であることを特徴とする。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、提供する組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第三の閾値量を超えるものが、式Ｉの化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、提供する組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第三の閾値量が式Ｉの化学成分であることを特徴とする。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、提供する組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第三の閾値量以上が、式Ｉ．ａ、式Ｉ．ｂ．１、式Ｉ．ｂ．２、式Ｉ．ｃ、式Ｉ．ｄ、式Ｉ．ｅ、式Ｉ．ｆ、式Ｉ．ｇ、または式Ｉ．ｈの化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、提供する組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第三の閾値量が、式Ｉ．ａの化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、提供する組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第三の閾値量以上が、式Ｉ．ｂ．１の化学成分であることを特徴とする。提供する組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第三の閾値量以上が、式Ｉ．ｂ．２の化学成分であることを特徴とする。提供する組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第三の閾値量以上が、式Ｉ．ｃの化学成分であることを特徴とする。提供する組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第三の閾値量以上が、式Ｉ．ｄの化学成分であることを特徴とする。提供する組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第三の閾値量以上が、式Ｉ．ｅの化学成分であることを特徴とする。提供する組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第三の閾値量以上が、式Ｉ．ｆの化学成分であることを特徴とする。提供する組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第三の閾値量以上が、式Ｉ．ｇの化学成分であることを特徴とする。提供する組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第三の閾値量以上が、式Ｉ．ｈの化学成分であることを特徴とする。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、提供する組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第三の閾値量以上が、式Ｉ．ａ．ｉ、式Ｉ．ａ．ｉｉ、式Ｉ．ａ．ｉｉｉ、式Ｉ．ａ．ｉｖ、式Ｉ．ａ．ｖ、式Ｉ．ａ．ｖｉ、式Ｉ．ａ．ｖｉｉ、式Ｉ．ａ．ｖｉｉｉ、式Ｉ．ａ．ｉｘ、式Ｉ．ｂ．１．ｉ、式Ｉ．ｂ．１．ｉｉ、式Ｉ．ｂ．１．ｉｉｉ、式Ｉ．ｂ．１．ｉｖ、式Ｉ．ｂ．１．ｖ、式Ｉ．ｂ．１．ｖｉ、式Ｉ．ｂ．２．ｉ、式Ｉ．ｂ．２．ｉｉ、式Ｉ．ｂ．２．ｉｉｉ、式Ｉ．ｂ．２．ｉｖ、式Ｉ．ｂ．２．ｖ、及び式Ｉ．ｂ．２．ｖｉの化学成分であることを特徴とする。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、本発明は、式Ｉの１つ以上の化学成分を含む組成物を提供し、当該化学成分の各々は、式Ｉ
【化４３】
0006599373.tif 000060
の化合物、その医薬として許容され得る塩、その溶媒和物、またはその医薬として許容され得る塩の溶媒和物であり、
当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第三の閾値量以上が、式Ｉの同じ立体異性体の化学成分である。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、提供する組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第三の閾値量を超えるものが、式Ｉの同じ立体異性体の化学成分であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、提供する組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第三の閾値量が、式Ｉの同じ立体異性体の化学成分である。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、式Ｉの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｉ、式Ｉ．ａ．ｉｉ、式Ｉ．ａ．ｉｉｉ、式Ｉ．ａ．ｉｖ、式Ｉ．ａ．ｖ、式Ｉ．ａ．ｖｉ、式Ｉ．ａ．ｖｉｉ、式Ｉ．ａ．ｖｉｉｉ、または式Ｉ．ａ．ｉｘの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｉの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｉｉの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｉｉｉの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｉｖの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｖの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｖｉの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｖｉｉの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｖｉｉｉの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉの立体異性体は、式Ｉ．ａ．ｉｘの構造を有する。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、式Ｉの立体異性体は、式Ｉ．ｂ．１．ｉ、式Ｉ．ｂ．１．ｉｉ、式Ｉ．ｂ．１．ｉｉｉ、式Ｉ．ｂ．１．ｉｖ、式Ｉ．ｂ．１．ｖ、または式Ｉ．ｂ．１．ｖｉの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉの立体異性体は、式Ｉ．ｂ．１．ｉの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉの立体異性体は、式Ｉ．ｂ．１．ｉｉの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉの立体異性体は、式Ｉ．ｂ．１．ｉｉｉの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉの立体異性体は、式Ｉ．ｂ．１．ｉｖの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉの立体異性体は、式Ｉ．ｂ．１．ｖの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉの立体異性体は、式Ｉ．ｂ．１．ｖｉの構造を有する。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、式Ｉの立体異性体は、式Ｉ．ｂ．２．ｉ、式Ｉ．ｂ．２．ｉｉ、式Ｉ．ｂ．２．ｉｉｉ、式Ｉ．ｂ．２．ｉｖ、式Ｉ．ｂ．２．ｖ、または式Ｉ．ｂ．２．ｖｉの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉの立体異性体は、式Ｉ．ｂ．２．ｉの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉの立体異性体は、式Ｉ．ｂ．２．ｉｉの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉの立体異性体は、式Ｉ．ｂ．２．ｉｉｉの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉの立体異性体は、式Ｉ．ｂ．２．ｉｖの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉの立体異性体は、式Ｉ．ｂ．２．ｖの構造を有する。いくつかの実施形態において、式Ｉの立体異性体は、式Ｉ．ｂ．２．ｖｉの構造を有する。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、当該第三の閾値量は、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態において、当該第三の閾値量は、５０％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態において、当該第三の閾値量は、７０％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態において、当該第三の閾値量は、８０％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態において、当該第三の閾値量は、８５％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態において、当該第三の閾値量は、９０％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態において、当該第三の閾値量は、９５％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態において、当該第三の閾値量は、９６％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態において、当該第三の閾値量は、９７％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態において、当該第三の閾値量は、９８％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態において、当該第三の閾値量は、９９％（ｗ／ｗ）である。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、本発明は、式Ｉの１つ以上の化学成分を含む組成物を提供し、当該化学成分の各々は、式Ｉ
【化４４】
0006599373.tif 000061
の化合物、その医薬として許容され得る塩、その溶媒和物、またはその医薬として許容され得る塩の溶媒和物であり、
当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第三の閾値量を超えるものが、式Ｉ．ａ．ｉ
【化４５】
0006599373.tif 000062
の化学成分であり、この中で、当該第三の閾値量は、５０％であることを特徴とする。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、本発明は、式Ｉの１つ上の化学成分を含む組成物を提供し、当該化学成分の各々は、式Ｉ
【化４６】
0006599373.tif 000063
の化合物、その医薬として許容され得る塩、その溶媒和物、またはその医薬として許容され得る塩の溶媒和であり、
当該組成物は、当該組成物中に式Ｉの化学成分の総量の第三の閾値量を超えるものが、式Ｉ．ａ．ｉｉ
【化４７】
0006599373.tif 000064
の化学成分であり、この中で、当該第三の閾値量は、５０％であることを特徴とする。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、本発明は、式Ｉの１つ以上の化学成分を含む組成物を提供し、当該化学成分の各々は、式Ｉ
【化４８】
0006599373.tif 000065
の化合物、その医薬として許容され得る塩、その溶媒和物、またはその医薬として許容され得る塩の溶媒和物であり、
当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第三の閾値量を超えるものが、式Ｉ．ｂ．１．ｉ
【化４９】
0006599373.tif 000066
の化学成分であり、この中で当該第三の閾値量は、５０％であることを特徴とする。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、本発明は、式Ｉの１つ以上の化学成分を含む組成物を提供し、当該化学成分の各々は、式Ｉ
【化５０】
0006599373.tif 000067
の化合物、その医薬として許容され得る塩、その溶媒和物、またはその医薬として許容され得る塩の溶媒和物であり、
当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第三の閾値量を超えるものが、式Ｉ．ｂ．１．ｉｉ
【化５１】
0006599373.tif 000068
の化学成分であり、この中で当該第三の閾値量は、５０％であることを特徴とする。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、本発明は、式Ｉの１つ以上の化学成分を含む組成物を提供し、当該化学成分の各々は、式Ｉ
【化５２】
0006599373.tif 000069
の化合物、その医薬として許容され得る塩、その溶媒和物、またはその医薬として許容され得る塩の溶媒和物であり、
当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第三の閾値量を超えるものが、式Ｉ．ｂ．２．ｉ
【化５３】
0006599373.tif 000070
の化学成分であり、この中で当該第三の閾値量、５０％である。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、本発明は、式Ｉの１つ以上の化学成分を含む組成物を提供し、当該化学成分の各々は、式Ｉ
【化５４】
0006599373.tif 000071
の化合物、その医薬として許容され得る塩、その溶媒和物、またはその医薬として許容され得る塩の溶媒和物であり、
当該組成物は、当該組成物中の式Ｉの化学成分の総量の第三の閾値量を超えるものが、式Ｉ．ｂ．２．ｉｉ
【化５５】
0006599373.tif 000072
の化学成分であり、この中で当該第三の閾値量は、５０％である。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、当該第二の閾値量は、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。いくつかの実施形態において、当該第二の閾値量は、５０％である。いくつかの実施形態において、当該第二の閾値量は、７０％である。いくつかの実施形態において、当該第二の閾値量は、８０％である。いくつかの実施形態において、当該第二の閾値量は、９５％である。
【０１２１】
（ｍＲＮＡのような作用因子の送達のためのリポソーム）
とりわけ、本発明は、治療薬の送達のための、本明細書に説明する脂質化合物を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、提供する組成物は、リポソームのような脂質系ナノ粒子である。本明細書で使用する場合、「リポソーム」という用語は、任意の層状、多層、または固体の脂質ナノ粒子ベシクルを指す。典型的には、本明細書で使用するリポソームは、１個以上の脂質を混合することによって、または１個以上の脂質及びポリマー（複数可）を混合することによって形成することができる。したがって、本明細書で使用する場合の「リポソーム」という用語は、脂質及びポリマー系ナノ粒子の両方を包含する。特に、本発明によるリポソームは、本明細書に説明する脂質化合物をカチオン性脂質構成要素として組み込む。非限定例として、本発明によるリポソームには、式Ｉの１つ以上の化学成分を含む組成物を含む。適切なリポソームは、第二の若しくは追加のカチオン性脂質、ヘルパー脂質（例えば、非カチオン性脂質及び／またはコレステロール系脂質）、ＰＥＧ修飾した脂質、及び／またはポリマーも含有することがある。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、カチオン性脂質（複数可）（例えば、式Ｉの１つ以上の化学成分を含む組成物）は、当該リポソームの約３０〜５０％（例えば、約３０〜４５％、約３０〜４０％、約３５〜５０％、約３５〜４５％、または約３５〜４０％）のモル比を構成する。いくつかの実施形態において、当該カチオン性脂質（例えば、式Ｉの１つ以上の化学成分を含む組成物）は、当該リポソームの約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％のモル比を構成する。いくつかの実施形態において、当該リポソームは、第二の脂質または追加のカチオン性脂質を含む。
【０１２３】
（第二のまたは追加のカチオン性脂質）
いくつかの実施形態において、リポソームは、第二のまたは追加のカチオン性脂質を含むことがある。本明細書で使用する場合、「カチオン性脂質」という句は、生理学的ｐＨのような選択したｐＨで正味の正の電荷を有するいくつかの脂質種のうちのいずれかを指す。いくつかのカチオン性脂質は、文献に説明されており、その多くは市販されている。本発明の組成物及び方法において使用するのに特に適したカチオン性脂質には、その各々が全体として参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開ＷＯ２０１０／０５３５７２（及び特に段落［００２２５］において説明されているＣ１２〜２００）、ＷＯ２０１２／１７０９３０及びＷＯ２０１３０６３４６８に説明されているものを含む。ある実施形態において、本発明の組成物及び方法は、例えば、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−１５，１８−ジエン−１−アミン（ＨＧＴ５０００）、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−４，１５，１８−トリエン−１−アミン（ＨＧＴ５００１）、及び（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−５，１５，１８−トリエン−１−アミン（ＨＧＴ５００２）のような、２０１３年３月２９日出願の国際特許公開第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３４６０２、公開番号ＷＯ２０１３／１４９１４０（参照により本明細書に組み込まれる）に説明されているイオン化可能なカチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子を採用する。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、第二のまたは追加のカチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリドまたは「ＤＯＴＭＡ」が使用される（Ｆｅｉｇｎｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，７４１３（１９８７）、米国特許第４，８９７，３５５号）。ＤＯＴＭＡは、単独で製剤することができ、あるいは、中性脂質であるジオレイルホスファチジル−エタノールアミン若しくは「ＤＯＰＥ」または他のカチオン性若しくは非カチオン性脂質とともにリポソーム転移ベシクルまたは脂質ナノ粒子へと組み込むことができ、このようなリポソームは、標的細胞への核酸の送達を亢進するために使用することができる。他の適切なカチオン性脂質には、例えば、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミンまたは「ＤＯＧＳ」、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムまたは「ＤＯＳＰＡ」（Ｂｅｈｒら．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，６９８２（１９８９）、米国特許第５，１７１，６７８号、米国特許第５，３３４，７６１号）、ｌ，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパンまたは「ＤＯＤＡＰ」、ｌ，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパンまたは「ＤＯＴＡＰ」を含む。追加の例示的なカチオン性脂質には、ｌ，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンまたは「ＤＳＤＭＡ」、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンまたは「ＤＯＤＭＡ」、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンまたは「ＤＬｉｎＤＭＡ」、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンまたは「ＤＬｅｎＤＭＡ」、Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリドまたは「ＤＯＤＡＣ」、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミドまたは「ＤＤＡＢ」、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミドまたは「ＤＭＲＩＥ」、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパンまたは「ＣＬｉｎＤＭＡ」、２−[５’−（コレスタ−５−エン−３−ベータ−オキシ）−３’−オキサペントキシ）−３−ジメチル−１−１−（シス，シス−９’，１−２’−オクタデカジエノキシ）プロパンまたは「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミンまたは「ＤＭＯＢＡ」、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンまたは「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」、２，３−ジリノレオイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピルアミンまたは「ＤＬｉｎＤＡＰ」、ｌ，２−Ｎ，Ｎ’−ジリノレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンまたは「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」、ｌ，２−ジリノレオイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンまたは「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］ジオ���ソランまたは「ＤＬｉｎ−−ＤＭＡ」、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［ｌ，３］−ジオキソランまたは「ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ」、及び２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）−ｌ，３−ジオキソラン−４−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）（ＷＯ２０１０／０４２８７７、Ｓｅｍｐｌｅら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２〜１７６（２０１０）を参照されたい）、あるいはこれらの混合物も含む（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．，ら，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７：２７６〜２８７（２００５）、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ＤＶ．，ら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３〜１００７（２００５）、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／１２１３４８Ａ１）。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、当該第二のまたは追加のカチオン性脂質は、ＸＴＣ（２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン）、ＭＣ３（（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノアート）、ＡＬＮＹ−１００（（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン））、ＮＣ９８−５（４，７，１３−トリス（３−オキソ−３−（ウンデシルアミノ）プロピル）−Ｎ１，Ｎ１６−ジウンデシル−４，７，１０，１３−テトラアザヘキサデカン−１，１６−ジアミド）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン）、ＨＧＴ４００３（その教示が全体として参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１２／１７０８８９）、ＩＣＥ（その教示が全体として参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１／０６８８１０）、ＨＧＴ５０００（その教示が全体として参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開ＷＯ／２０１３／１４９１４０）若しくはＨＧＴ５００１（シスまたはトランス）（ＷＯ／２０１３／１４９１４０）、ＷＯ２０１０／０５３５７２において開示されるもののようなアミノアルコールリピドイド、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．；Ｐａｌｍｅｒ，Ｌ．；Ｂｒｅｍｎｅｒ，Ｋ．；ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｉ．「Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ」Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．２００５，１０７，２７６〜２８７）、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（Ｓｅｍｐｌｅ，Ｓ．Ｃ．ら．「Ｒａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０，２８，１７２〜１７６）、Ｃ１２−２００（Ｌｏｖｅ，Ｋ．Ｔ．ら．「Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ」ＰＮＡＳ  ２０１０，１０７，１８６４〜１８６９）から選択することがある。
【０１２６】
（非カチオン性／ヘルパー脂質）
いくつかの実施形態において、提供するリポソームは、１個以上の非カチオン性（「ヘルパー」）脂質を含有している。本明細書で使用する場合、「非カチオン性脂質」という句は、任意の中性脂質、双性イオン性脂質またはアニオン性脂質を指す。本明細書で使用する場合、「アニオン性脂質」という句は、生理学的ｐＨのような選択したＨで正味の負の電荷を保有するいくつかの脂質種のうちのいずれかを指す。非カチオン性脂質には、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＤＯＰＥ−マル）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、またはこれらの混合物を含むが、それらに限定しない。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、このような非カチオン性脂質は単独で使用してもよいが、好ましくは、他の賦形剤、例えば、カチオン性脂質と併用する。いくつかの実施形態において、当該非カチオン性脂質は、リポソーム中に存在する総脂質の約５％〜約９０％、または約１０％〜約７０％のモル比を含むことがある。いくつかの実施形態において、非カチオン性脂質は、中性脂質、すなわち、当該組成物が製剤及び／または投与される条件下で正味の電荷を保有していない脂質である。いくつかの実施形態において、リポソーム中の非カチオン性脂質の百分率は、５％超、１０％超、２０％超、３０％超、または４０％超であることがある。
【０１２８】
（コレステロール系脂質）
いくつかの実施形態において、提供するリポソームは、１個以上のコレステロール系脂質を含む。例えば、適切なコレステロール系カチオン性脂質には、例えば、ＤＣ−Ｃｈｏｉ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−エチルカルボキサミドコレステロール）、１，４−ビス（３−Ｎ−オレイルアミノ−プロピル）ピペラジン（Ｇａｏら．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０（１９９１）、Ｗｏｌｆら．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３，１３９（１９９７）、米国特許第５，７４４，３３５号）、またはＩＣＥを含む。いくつかの実施形態において、コレステロール系脂質は、リポソーム中に存在する総脂質の約２％〜約３０％、または約５％〜約２０％のモル定量を含むことがある。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子中のコレステロール系脂質の百分率は、５％超、１０％超、２０％超、３０％超、または４０％超であることがある。
【０１２９】
（ＰＥＧ化脂質）
いくつかの実施形態において、提供するリポソームは、１個以上のＰＥＧ化脂質を含む。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾したリン脂質及び、Ｎ−オクタノイル−スフィンゴシン−１−［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）−２０００］（Ｃ８  ＰＥＧ−２０００セラミド）を含む誘導体化したセラミド（ＰＥＧ−ＣＥＲ）のような誘導体化脂質の使用も、カチオン性のうちの１個以上と組み合わせて、及びいくつかの実施形態においては、リポソームを含む他の脂質とともに、本発明によって熟慮される。熟慮したＰＥＧ修飾した脂質には、Ｃ６〜Ｃ２０の長さのアルキル鎖（複数可）を有する脂質へ共有結合した長さ最大５ｋＤａのポリエチレングリコール鎖を含むが、これに限定しない。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ修飾した脂質またはＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ化コレステロールまたはＰＥＧ−２Ｋである。このような構成要素の付加は、複合体凝集を防止することがあり、循環寿命を延長して標的細胞への脂質−核酸組成物の送達を高めるための手段も提供することがあり（Ｋｌｉｂａｎｏｖら．（１９９０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６８（１）：２３５〜２３７）、またはインビボでの処方から脱して迅速に交換するよう選択されることがある（米国特許第５，８８５，６１３号を参照されたい）。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、特に有用な交換可能な脂質は、より短いアシル鎖（例えば、Ｃ１４またはＣ１８）を有するＰＥＧ−セラミドである。本発明のＰＥＧ修飾したリン脂質及び誘導体化脂質は、リポソーム中に存在する総脂質の約０％〜約１５％、約０．５％〜約１５％、約１％〜約１５％、約４％〜約１０％、または約２％のモル比を含むことがある。
【０１３１】
種々の実施形態によると、第二のまたは追加のカチオン性脂質、非カチオン性脂質及び／または脂質ナノ粒子を含むＰＥＧ修飾した脂質の選択、ならびに互いに対するこのような脂質の相対的なモル比は、選択した脂質（複数可）の特徴、企図した標的細胞の性質、送達することになっているｍＲＮＡの特徴に基づいている。追加の考慮には、例えば、アルキル鎖の飽和、ならびに選択した脂質（複数可）の大きさ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、膜融合性及び毒性を含む。したがって、当該モル比は、適宜調整してもよい。いくつかの実施形態において、リポソーム中のＰＥＧ修飾した脂質の百分率は、１％超、２％超、５％超、１０％超、または１５％超であることがある。
【０１３２】
（ポリマー）
いくつかの実施形態において、本発明による適切なリポソームにはさらに、説明したような１個以上のカチオン性脂質及び、いくつかの実施形態において、本明細書に説明する種々の脂質を含む他の担体と組み合わせたポリマーを含む。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書で使用するようなリポソーム送達ビヒクルは、ナノ粒子を含有するポリマーも包含する。適切なポリマーには、例えば、ポリアクリラート、ポリアルキルシアノアクリラート、ポリラクチド、ポリラクチド−ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギナート、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、プロタミン、ＰＥＧ化プロタミン、ＰＬＬ、ＰＥＧ化ＰＬＬ及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含んでもよい。ＰＥＩが存在する場合、当該ＰＥＩは、１０〜４０ｋＤａに及ぶ分子量の分枝鎖ＰＥＩ、例えば、２５ｋＤａ分枝鎖ＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ  ＃４０８７２７）であってもよい。
【０１３３】
（治療薬）
本発明は、任意の治療薬を送達するために使用してもよい。具体的には、対象へ投与することになっている任意の治療薬は、本明細書に説明する複合体、ピコ粒子、ナノ粒子、マイクロ粒子、ミセル、またはリポソームを用いて送達してもよい。当該薬は、有機分子（例えば、治療薬、薬剤）、無機分子、核酸、タンパク質、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ターゲティング薬、同位体標識した有機分子若しくは無機分子、ワクチン、免疫学的作用因子などであってもよい。本発明のある実施形態において、送達することになっている作用因子は、作用因子の混合物であってもよい。
【０１３４】
ある実施形態において、治療薬は、医薬活性を有する有機分子、例えば、薬剤である。ある実施形態において、当該薬剤は、抗生物質、抗ウイルス薬、麻酔薬、ステロイド薬、抗炎症薬、抗新生物薬、抗癌薬、抗原、ワクチン、抗体、うっ血除去薬、降圧薬、鎮静薬、受胎調節薬、プロゲステロン作用薬、抗コリン作用薬、鎮痛薬、抗うつ薬、抗精神病薬、Ｉ３−アドレナリン受容体遮断薬、利尿薬、心血管系賦活薬、血管作動薬、非ステロイド性抗炎症薬、栄養剤などである。
【０１３５】
診断薬には、気体、金属、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、コンピュータ断層撮影法（ＣＡＴ）、単一光子放射コンピュータ断層撮影法、ｘ線、蛍光透視、及び磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）において使用する市販のイメージング剤、ならびに造影剤を含む。ＭＲＩにおける造影剤としての使用に適した材料の例としては、ガドリニウムキレート剤、ならびに鉄、マグネシウム、マンガン、銅、及びクロムが挙げられる。ＣＡＴ及びｘ線撮像に有用な材料の例としては、ヨウ素系材料が挙げられる。
【０１３６】
治療薬及び予防薬には、抗生物質、栄養補助剤、及びワクチンを含むが、これらに限定しない。ワクチンは、単離したタンパク質またはペプチド、失活した生体及びウイルス、死滅した生体及びウイルス、遺伝的に変化した生体またはウイルス、及び細胞抽出物を含むが、これらに限定しない。
【０１３７】
（ポリヌクレオチド）
本発明は、任意のポリヌクレオチドを送達するために使用することがある。ある実施形態において、当該ポリヌクレオチドは、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である。ＲＮＡｉの現象は、例えば次の参考文献、すなわち、Ｅｌｂａｓｈｉｒら，２００１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５：１８８、Ｆｉｒｅら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：８０６、Ｔａｂａｒａら，１９９９，Ｃｅｌｌ，９９：１２３、Ｈａｍｍｏｎｄら，Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０４：２９３、Ｚａｍｏｒｅら，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１：２５、Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ，２００７，Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，８：４６９、ならびにＭｏｒｒｉｓ及びＲｏｓｓｉ，２００６，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１３：５５３においてより詳細に考察されている。ある実施形態において、当該ポリヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）である。ある実施形態において、当該ポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ（短鎖干渉ＲＮＡ）である。ある実施形態において、当該ポリヌクレオチドは、ｓｈＲＮＡ（短鎖ヘアピンＲＮＡ）である。ある実施形態において、当該ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）である。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、特に発生中の遺伝子発現を調節するのを助ける、長さ約２１〜２３ヌクレオチドのゲノムでコードされた非コードＲＮＡである。例えば、Ｂａｒｔｅｌ，２００４，Ｃｅｌｌ，１１６：２８１、Ｎｏｖｉｎａ及びＳｈａｒｐ，２００４，Ｎａｔｕｒｅ，４３０：１６１、ならびに米国特許公開２００５／００５９００５を参照されたく、また、Ｗａｎｇ及びＬｉ，２００７，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．，１２：３９７５ならびにＺｈａｏ，２００７，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，３２：１８９においても総説されている。ある実施形態において、当該ポリヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡである。
【０１３８】
ある実施形態において、当該ポリヌクレオチドは、アンチセンス薬またはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として提供することがある。例えば、Ｆｉｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６〜８１１，１９９８を参照されたい。アンチセンス療法は、例えば、細胞条件下で細胞ｍＲＮＡ及び／若しくはゲノムＤＮＡ、またはこれらの突然変異体と特異的にハイブリッド形成し、例えば結合して、コードしたタンパク質の発現を、例えば、転写及び／または翻訳を阻害することによって阻害する、例えば一本鎖若しくは二本鎖のオリゴヌクレオチドまたはこれらの誘導体の投与またはインサイツ提供を含むよう意味する。例えば、Ｃｒｏｏｋｅ「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｄｒｕｇｓ」Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４８９（１）：３１〜４４，１９９９、Ｃｒｏｏｋｅ「Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｄｒｕｇｓ」Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１０（２）：１２３〜１２６，考察１２７，２０００、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅｓ  ３１３〜３１４，１９９９を参照されたい。当該結合は、従来の塩基対相補性によることがあり、または、例えば、二本鎖ヘリックスの主溝における特異的な相互作用を通じての、ＤＮＡ二重鎖への結合の場合におけることがある。例えば、Ｃｈａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７５（４）：２６７〜２８２，１９９７を参照されたい。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、及び／またはＲＮＡｉは、多数の入手可能なアルゴリズムのうちの１つ以上を用いて設計及び／または予測することができる。ほんの少数に過ぎない例を与えるために、次の資源、すなわち、Ａｌｎｙｌｕｍオンライン、Ｄｈａｒｍａｃｏｎオンライン、ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅオンライン、Ｍｏｌｅｃｕｌａオンライン、Ａｍｂｉｏｎオンライン、ＢｉｏＰｒｅｄｓｉオンライン、ＲＮＡｉウェブオンライン、Ｃｈａｎｇ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅオンライン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎオンライン、ＬｅｎｔｉＷｅｂオンラインＧｅｎＳｃｒｉｐｔオンライン、プロトコルオンライン、Ｒｅｙｎｏｌｄｓら，２００４，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２２：３２６、Ｎａｉｔｏら，２００６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３４：Ｗ４４８、Ｌｉら，  ２００７，ＲＮＡ，１３：１７６５、Ｙｉｕら，２００５，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ,  ２１：１４４、及びＪｉａら，２００６，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，７：２７１で認められるアルゴリズムを利用して、ポリヌクレオチドを設計及び／または予測することができる。
【０１４０】
当該ポリヌクレオチドは、任意の大きさまたは配列であってもよく、一本鎖または二本鎖であってもよい。ある実施形態において、当該ポリヌクレオチドは、長さ１００塩基対超である。ある実施形態において、当該ポリヌクレオチドは、長さ１０００塩基対超であり、長さ１０，０００塩基対超であることがある。当該ポリヌクレオチドは、当該技術分野において公知の任意の手段によって提供されてもよい。ある実施形態において、当該ポリヌクレオチドは、組換え技術を用いて操作されている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク，１９９９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，及びＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）を参照されたい。当該ポリヌクレオチドは、天然源から得て、天然に通常認められる混入している構成要素から精製することもある。当該ポリヌクレオチドは、実験室で化学的に合成することもある。ある実施形態において、当該ポリヌクレオチドは、標準的な固相化学を用いて合成する。
【０１４１】
当該ポリヌクレオチドは、化学的または生物学的な手段によって修飾されることがある。ある実施形態において、これらの修飾は、当該ポリヌクレオチドの安定性亢進をもたらす。修飾には、メチル化、リン酸化、末端キャッピングなどを含む。
【０１４２】
（ｍＲＮＡ）
本発明は、任意のｍＲＮＡを送達するために使用することができる。ｍＲＮＡは典型的には、ＤＮＡからリボソームへと情報を運搬するＲＮＡの種類と考えられている。ｍＲＮＡの存在は通常、非常に短時間であり、プロセシング及び翻訳に続く分解を含む。典型的には、真核生体において、ｍＲＮＡプロセシングは、Ｎ末（５’）端上にある「キャップ」及びＣ末（３’）端上にある「尾部」の付加を含む。典型的なキャップは、第一の転写されたヌクレオチドに対する５’−５’−三リン酸結合を通じて結合するグアノシンである、７−メチルグアノシンキャップである。当該キャップの存在は、たいていの真核細胞において認められるヌクレアーゼに対する耐性を提供するうえで重要である。当該尾部は典型的には、ポリアデニリル部分が当該ｍＲＮＡ分子の３’末端へ付加されるポリアデニル化事象である。この「尾部」の存在は、エキソヌクレアーゼ分解から当該ｍＲＮＡを防護するよう機能する。伝令ＲＮＡは典型的には、リボソームによって、タンパク質を構成する一連のアミノ酸へと翻訳される。
【０１４３】
１個以上のペプチド（例えば、タンパク質）またはペプチド断片へと翻訳することのできる任意のｍＲＮＡは、本発明の範囲内として熟慮される。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、１個以上の天然ペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、１個以上の修飾されたまたは非天然のペプチドをコードする。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、細胞内タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、細胞質ゾルタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、アクチン細胞骨格と会合するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、細胞膜と会合するタンパク質をコードする。いくつかの具体的な実施形態において、ｍＲＮＡは、膜貫通タンパク質をコードする。いくつかの具体的な実施形態において、ｍＲＮＡは、イオンチャネルタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、核周囲タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、核タンパク質をコードする。いくつかの具体的な実施形態において、ｍＲＮＡは、転写因子をコードする。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、シャペロンタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、細胞内酵素（例えば、尿素周期またはリソソーム貯蔵代謝障害と関係する酵素をコードするｍＲＮＡ）をコードする。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、細胞機序、ＤＮＡ修復、転写及び／または翻訳に関与するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、細胞外タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、細胞外マトリックスと関係するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、分泌タンパク質をコードする。具体的な実施形態において、本発明の組成物及び方法において使用するｍＲＮＡは、周辺の細胞外流体へと１個以上の標的細胞によって排出または分泌する機能的タンパク質または酵素を発現するために使用することがある（例えば、ホルモン及び／または神経伝達物質をコードするｍＲＮＡ）。
【０１４５】
（ｍＲＮＡの合成）
本発明によるｍＲＮＡは、種々の公知の方法のうちのいずれかにより合成してもよい。例えば、本発明によるｍＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）を介して合成してもよい。簡潔には、ＩＶＴは典型的には、プロモーター、リボヌクレオチド三リン酸のプール、ＤＴＴ及びマグネシウムイオンを含んでもよい緩衝系、ならびに適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ピロホスファターゼ、及び／またはＲＮアーゼ阻害薬を含有する直鎖または環状ＤＮＡテンプレートを用いて実施する。実際の条件は、具体的な応用により変化するであろう。
【０１４６】
いくつかの実施形態において本発明によるｍＲＮＡの調製のために、ＤＮＡテンプレートは、インビトロで転写される。適切なＤＮＡテンプレートは典型的には、プロモーター、例えば、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーターまたはＳＰ６プロモーターを、インビトロでの転写に続く所望のｍＲＮＡ及び末端シグナルに所望のヌクレオチド配列のために有する。
【０１４７】
本発明による所望のｍＲＮＡ配列（複数可）は、標準的な方法を用いて判定して、ＤＮＡテンプレートへと組み込んでもよい。例えば、所望のアミノ酸配列（例えば、酵素配列）から出発して、事実上の逆翻訳は、変性した遺伝暗号に基づいて実施する。次に、最適化アルゴリズムは、適切なコドンの選択に使用してもよい。典型的には、Ｇ／Ｃ含有量は、一方では最高の起こり得るＧ／Ｃ含有量を達成するために最適化することができ、もう一方ではコドンの使用によりｔＲＮＡの頻度を最良に可能に考慮する。最適化したＲＮＡ配列は、例えば、適切なディスプレイ装置の支援により、元の（野生型）配列と比較して、確立及び表示することができる。二次構造は、ＲＮＡの特性またはここに領域を安定化及び不安定化するのを算出するために分析することもできる。
【０１４８】
（修飾されたｍＲＮＡ）
いくつかの実施形態において、本発明によるｍＲＮＡは、非修飾のまたは修飾されたｍＲＮＡとして合成してもよい。典型的には、ｍＲＮＡは、安定性を高めるために修飾される。ｍＲＮＡの修飾には例えば、ＲＮＡのヌクレオチドの修飾を含むことができる。本発明による修飾されたｍＲＮＡにはしたがって、例えば、骨格修飾、糖修飾または塩基修飾を含むことができる。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、プリン類（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））またはピリミジン類（チミジン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））を含む天然のヌクレオチド及び／またはヌクレオチド類似体（修飾されたヌクレオチド）から、ならびに１−メチル−アデニン、２−メチル−アデニン、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテニル−アデニン、Ｎ６−メチル−アデニン、Ｎ６−イソペンテニル−アデニン、２−チオ−シトシン、３−メチル−シトシン、４−アセチル−シトシン、５−メチル−シトシン、２，６−ジアミノプリン、１−メチル−グアニン、２−メチル−グアニン、２，２−ジメチル−グアニン、７−メチル−グアニン、イノシン、１−メチル−イノシン、プソイドウラシル（５−ウラシル）、ジヒドロ−ウラシル、２−チオ−ウラシル、４−チオ−ウラシル、５−カルボキシメチルアミノ−メチル−２−チオ−ウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）−ウラシル、５−フルオロ−ウラシル、５−ブロモ−ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウラシル、５−メチル−２−チオ−ウラシル、５−メチル−ウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、５−メチルアミノメチル−ウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオ−ウラシル、５’−メトキシカルボニルメチル−ウラシル、５−メトキシ−ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、１−メチル−プソイドウラシル、ケウオシン、β−Ｄ−マンノシル−ケウオシン、ウイブトシン、ならびにホスホルアミダート、ホスホロチオアート、ペプチドヌクレオチド、メチルホスホン酸、７−デアザグアノシン、５−メチルシトシン及びイノシンのような、修飾されたヌクレオチド類似体またはプリン類及びピリミジン類の誘導体として合成してもよい。このような類似体の調製は、当業者に、例えば、米国特許第４，３７３，０７１号、米国特許第４，４０１，７９６号、米国特許第４，４１５，７３２号、米国特許第４，４５８，０６６号、米国特許第４，５００，７０７号、米国特許第４，６６８，７７７号、米国特許第４，９７３，６７９号、米国特許第５，０４７，５２４号、米国特許第５，１３２，４１８号、米国特許第５，１５３，３１９号、米国特許第５，２６２，５３０号及び米国特許第５，７００，６４２号から公知であり、それらの開示は、全体として参照により組み込まれる。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ（例えば、酵素をコードするｍＲＮＡ）は、ＲＮＡ骨格修飾を含有してもよい。典型的には、骨格修飾は、ＲＮＡ中に含有されるヌクレオチドの骨格のリン酸が化学的に修飾される修飾である。例示的な骨格修飾としては典型的には、メチルホスホン酸、メチルホスホルアミダート、ホスホルアミダート、ホスホロチオアート（例えば、シチジン５’−Ｏ−（１−チオリン酸））、ボラノリン酸、正に帯電したグアニジニウム基などが挙げられ、これは、他のアニオン基、カチオン基または中性基によってホスホジエステル結合を置き換えることによることを意味する。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ（例えば、酵素をコードするｍＲＮＡ）は、糖修飾を含有してもよい。典型的な糖修飾は、２’−デオキシ−２'−フルオロ−オリゴリボヌクレオチド（２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸、２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸）、２’−デオキシ−２’−デアミン−オリゴリボヌクレオチド（２’−アミノ−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸、２’−アミノ−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸）、２’−Ｏ−アルキルオリゴリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド（２’−Ｏ−メチルシチジン５’−三リン酸、２’−メチルウリジン５’−三リン酸）、２’−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド、及びこれらの異性体（２’−アラシチジン５’−三リン酸、２’−アラウリジン５’−三リン酸）、またはアジド三リン酸（２’−アジド−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸、２’−アジド−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸）からなる群から選択される糖修飾を含むがこれらに限定しない糖修飾を含有するヌクレオチドの糖の化学的修飾である。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ（例えば、酵素をコードするｍＲＮＡ）は、ヌクレオチドの塩基の修飾（塩基修飾）を含有することがある。塩基修飾を含有する修飾されたヌクレオチドは、塩基修飾されたヌクレオチドとも呼ぶ。このような塩基修飾されたヌクレオチドの例としては、２−アミノ−６−クロロプリンリボシド５’−三リン酸、２−アミノアデノシン５’−三リン酸、２−チオシチジン５’−三リン酸、２−チオウリジン５’−三リン酸、４−チオウリジン５’−三リン酸、５−アミノアリルシチジン５’−三リン酸、５−アミノアリル−ウリジン５’−三リン酸、５−ブロモシチジン５’−三リン酸、５−ブロモウリジン５’−三リン酸、５−ヨードシチジン５’−三リン酸、５−ヨードウリジン５’−三リン酸、５−メチルシチジン５’−三リン酸、５−メチルウリジン５’−三リン酸、６−アザシチジン５’−三リン酸、６−アザウリジン５’−三リン酸、６−クロロプリンリボシド５’−三リン酸、７−デアザアデノシン５’−三リン酸、７−デアザグアノシン５’−三リン酸、８−アザアデノシン５’−三リン酸、８−アジドアデノシン５’−三リン酸、ベンズイミダゾールリボシド５’−三リン酸、Ｎ１−メチルアデノシン５’−三リン酸、Ｎ１−メチルグアノシン５’−三リン酸、Ｎ６−メチルアデノシン−５’−三リン酸、Ｏ６−メチルグアノシン５’−三リン酸、プソイドウリジン５’−三リン酸、ピューロマイシン５’−三リン酸またはキサントシン５’−三リン酸が挙げられるが、これらに限定しない。
【０１５２】
（キャップ構造）
典型的には、ｍＲＮＡ合成には、Ｎ末（５’）端上にある「キャップ」及びＣ末（３’）端上にある「尾部」の付加を含む。当該キャップの存在は、たいていの真核細胞において認められるヌクレアーゼに対する耐性を提供するうえで重要である。「尾部」の存在は、エキソヌクレアーゼ分解から当該ｍＲＮＡを防護するよう機能する。
【０１５３】
したがって、いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ（例えば、酵素をコードするｍＲＮＡ）には、５’キャップ構造を含む。５’キャップは典型的には、次の通り付加する。まず、ＲＮＡ末端ホスファターゼは、５’ヌクレオチドから末端リン酸基のうちの１個を除去し、２個の末端リン酸を残し、次に、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）は、グアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸へ付加し、５’５’５三リン酸結合を生じ、次に、グアニンの７−窒素はメチルトランスフェラーゼによってメチル化される。キャップ構造の例としては、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ及びＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが挙げられるが、これらに限定しない。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、天然のキャップ構造は、第一の転写されたヌクレオチドの５’−末端へ三リン酸架橋を介して結合する７−メチルグアノシンを含み、結果的に、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎのジヌクレオチドキャップを生じ、式中、Ｎは任意のヌクレオシドである。インビボで、当該キャップは酵素で付加する。当該キャップは次に、核の中で付加し、酵素グアニリルトランスフェラーゼによって触媒される。ＲＮＡの５’末端への当該キャップの付加は、転写開始直後に生じる。当該末端ヌクレオシドは典型的には、グアノシンであり、その他のヌクレオチドすべてに対して逆方向であり、すなわち、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧｐＮｐＮｐである。
インビトロでの転写によって生じるｍＲＮＡについて共通のキャップは、５’末端でキャップ構造を有するＲＮＡを得るためにインビトロでＴ７またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写においてジヌクレオチドキャップとして使用されたｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇである。キャッピングされたｍＲＮＡのインビトロでの合成のための支配的な方法は、転写開始因子としてｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（「ｍ７ＧｐｐｐＧ」）の形態の事前に形成されたジヌクレオチドを採用する。
【０１５５】
今日まで、インビトロ翻訳実験において使用する通常の形態の合成ジヌクレオチドキャップは、逆転防止キャップ類似体（「ＡＲＣＡ」）または修飾されたＡＲＣＡであり、これは概して、２’または３’ＯＨ基が−ＯＣＨ３と置き換えられた修飾されたキャップ類似体である。
【０１５６】
追加のキャップ類似体には、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣ、非メチル化キャップ類似体（例えば、ＧｐｐｐＧ）、ジメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，７ＧｐｐｐＧ）、トリメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，２，７ＧｐｐｐＧ）、ジメチル化対称性キャップ類似体（例えば、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ）、または逆転防止キャップ類似体（例えば、ＡＲＣＡ、ｍ７、２’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７２’ｄＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ｄＧｐｐｐＧ及びこれらの四リン酸誘導体）を含むが、これらに限定しない（例えば、Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ら，「Ｎｏｖｅｌ  ‘ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ’ｃａｐ  ａｎａｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」，ＲＮＡ，９：１１０８〜１１２２（２００３）を参照されたい）。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、適切なキャップは、三リン酸架橋を介して第一の転写されたヌクレオチドの５’−末端へ結合した７−メチルグアニル酸（「ｍ７Ｇ」）であり、結果的にｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎを生じ、式中Ｎは、任意のヌクレオシドである。本発明の実施形態において利用するｍ７Ｇキャップの好ましい実施形態は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇである。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、当該キャップは、キャップ０構造である。キャップ０構造は、塩基１及び塩基２へ結合したリボースの２’−Ｏ−メチル残基を欠失している。いくつかの実施形態において、当該キャップは、キャップ１構造である。キャップ１構造は、塩基２における２’−Ｏ−メチル残基を有する。いくつかの実施形態において、当該キャップは、キャップ２構造である。キャップ２構造は、塩基２及び塩基３の両方へ結合した２’−Ｏ−メチル残基を有する。
【０１５９】
種々のｍ７Ｇキャップ類似体は、当該技術分野で公知であり、この多くは市販されている。当該ｍ７Ｇキャップ類似体には、先に説明したｍ７ＧｐｐｐＧ、ならびにＡＲＣＡ３’−ＯＣＨ３キャップ類似体及び２’−ＯＣＨ３キャップ類似体を含む（Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ら，ＲＮＡ，９：１１０８〜１１２２（２００３））。本発明の複数の実施形態における使用のための追加のキャップ類似体には、Ｎ７−ベンジル酸ジヌクレオシド四リン酸類似体（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ，Ｅ．ら，ＲＮＡ，１０：１４７９〜１４８７（２００４）において説明）、ホスホロチオアートキャップ類似体（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ−Ｎｏｇａｌｓｋａ，Ｅ．ら，ＲＮＡ，１３：１７４５〜１７５５（２００７）において説明)、ならびに参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，０９３，３６７号及び第８，３０４，５２９号に説明されているキャップ類似体（ビオチン化キャップ類似体を含む）を含む。
【０１６０】
（尾部構造）
典型的には、「尾部」の存在は、エキソヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを防護するよう機能する。ポリＡ尾部は、天然のメッセンジャー及び合成センスＲＮＡを安定化すると考えられている。それゆえ、ある実施形態において、長いポリＡ尾部は、ｍＲＮＡ分子へ付加することができ、したがって、当該ＲＮＡをより安定にすることができる。ポリＡ尾部は、種々の当該技術分野において認識されている技術を用いて付加することができる。例えば、長いポリＡ尾部は、ポリＡポリメラーゼを用いて合成のまたはインビトロで転写したＲＮＡへ付加することができる（Ｙｏｋｏｅら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９９６；１４：１２５２〜１２５６）。転写ベクターは、長いポリＡ尾部をコードすることもできる。加えて、ポリＡ尾部は、ＰＣＲ産物から直接転写によって付加することができる。ポリＡは、センスＲＮＡの３’末端へ、ＲＮＡリガーゼを用いて結合させてもよい（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９９１年版）を参照されたい）。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ（例えば、酵素をコードするｍＲＮＡ）には、３’ポリ（Ａ）尾部構造を含む。典型的には、ポリＡ尾部の長さは、少なくとも約１０、５０、１００、２００、３００、４００少なくとも５００ヌクレオチドであることができる。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡの３’末端上にあるポリＡ尾部には、約１０〜３００アデノシンヌクレオチド（例えば、約１０〜２００アデノシンヌクレオチド、約１０〜１５０アデノシンヌクレオチド、約１０〜１００アデノシンヌクレオチド、約２０〜７０アデノシンヌクレオチド、または約２０〜６０アデノシンヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡには、３’ポリ（Ｃ）尾部構造を含む。ｍＲＮＡの３’末端上にある適切なポリＣ尾部には典型的には、約１０〜２００シトシンヌクレオチド（例えば、約１０〜１５０シトシンヌクレオチド、約１０〜１００シトシンヌクレオチド、約２０〜７０シトシンヌクレオチド、約２０〜６０シトシンヌクレオチド、または約１０〜４０シトシンヌクレオチド）を含む。当該ポリＣ尾部は、当該ポリＡ尾部へ付加してもよく、または当該ポリＡ尾部を置換してもよい。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、ポリＡ尾部またはポリＣ尾部の長さは、本発明の修飾されたセンスｍＲＮＡ分子の安定性、したがってタンパク質の転写を制御するために調整される。例えば、ポリＡ尾部の長さは、センスｍＲＮＡ分子の半減期に影響することができるので、ポリＡ尾部の長さはヌクレアーゼに対するｍＲＮＡの耐性レベルを修飾して、それにより、標的細胞におけるポリヌクレオチド発現及び／またはポリペプチド精製の時間経過を制御することができるよう調整することができる。
【０１６３】
（５’及び３’非翻訳領域）
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡには、５’及び／または３’非翻訳領域を含む。いくつかの実施形態において、５’非翻訳領域には、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響する１個以上の配列、例えば、鉄応答配列を含む。いくつかの実施形態において、５’非翻訳領域は、長さ約５０ヌクレオチドと５００ヌクレオチドのあいだであってもよい。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、３’非翻訳領域には、ポリアデニル化シグナル、細胞中の位置に関するｍＲＮＡの安定性に影響するタンパク質についての結合部位、またはｍｉＲＮＡについての１個以上の結合部位のうちの１個以上を含む。いくつかの実施形態において、３’非翻訳領域は、長さ５０ヌクレオチドと５００ヌクレオチドの間またはそれより長くてもよい。
【０１６５】
例示的な３’及び／または５’ＵＴＲ配列は、センスｍＲＮＡ分子の安定性を高めるために安定であるｍＲＮＡ分子（例えば、グロビン、アクチン、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストン、またはクエン酸回路酵素）に由来することができる。例えば、５’ＵＴＲ配列には、ＣＭＶ最初期１（ＩＥ１）遺伝子の部分配列、または当該ヌクレアーゼ耐性を改善するための及び／または当該ポリヌクレオチドの半減期を改善するためのその断片を含んでもよい。ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードする配列、または当該ポ居りヌクレオチドをさらに安定化させるための当該ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’末端若しくは非翻訳領域に対するその断片の包含も熟慮される。概して、これらの修飾は、当該ポリヌクレオチドの修飾されていない対応物に対する当該ポ居りヌクレオチドの安定性及び／または薬物動態特性（例えば、半減期）を改善し、例えば、このようなポリヌクレオチドのインビボヌクレアーゼ消化に対する耐性を改善するためになされる修飾を含む。
【０１６６】
種々の実施形態によると、任意の大きさのｍＲＮＡは、提供するリポソームによって封入してもよい。いくつかの実施形態において、提供するリポソームは、長さ約０．５ｋｂ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、または５ｋｂよりも大きなｍＲＮＡを封入してもよい。
【０１６７】
（リポソーム）
提供する組成物における使用のためのリポソームは、当該技術分野において現に公知の種々の技術によって調製することができる。例えば、多層ベシクル（ＭＬＶ）は、適切な溶媒中に脂質を溶解した後、溶媒を蒸発させて、容器の内側に薄膜を残すことによって、または噴霧乾燥によって適切な入れ物または容器の内壁上に選択した脂質を沈着させることによってのような、従来技術により調製してもよい。次に、水相を当該容器へボルテックス動作をしながら添加して、結果的にＭＬＶの形成を生じてもよい。単層ベシクル（ＵＬＶ）は次に、多層ベシクルの均質化、超音波処理または押出成形によって形成することができる。加えて、単層ベシクルは、洗浄剤除去技術によって形成することができる。
【０１６８】
ある実施形態において、提供する組成物は、リポソームを含み、この中で、核酸、例えば、ｍＲＮＡのような作用因子は、リポソームの両表面上に会合しており、及び同じリポソーム内に封入されている。例えば、本発明の組成物の調製中に、カチオン性リポソームは、静電相互作用を通じて、ｍＲＮＡと会合してもよい。例えば、本発明の組成物の調製中に、カチオン性リポソームは、静電相互作用を通じてｍＲＮＡと会合してもよい。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物及び方法は、リポソーム中に封入したｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、当該１つ以上のｍＲＮＡ種は、同じリポソーム中に封入してもよい。いくつかの実施形態において、当該１つ以上のｍＲＮＡ種は、異なるリポソーム中に封入してもよい。いくつかの実施形態において、当該ｍＲＮＡは、１つ以上のリポソーム中に封入され、当該リポソームは、その脂質組成、脂質構成要素のモル比、大きさ、電荷（ゼータ電位）、ターゲティングリガンド及び／またはこれらの組み合わせにおいて異なっている。いくつかの実施形態において、当該１つ以上のリポソームは、異なる組成のカチオン性脂質、中性脂質、ＰＥＧ修飾した脂質及び／またはこれらの組み合わせを有してもよい。いくつかの実施形態において、当該１つ以上のリポソームは、当該リポソームを作製するのに使用する異なるモル比のカチオン性脂質、中性脂質、コレステロール及びＰＥＧ修飾した脂質を有してもよい。
【０１７０】
リポソーム中への核酸（例えば、ｍＲＮＡ）のような所望の治療薬の組み込みの過程はしばしば、「ローディング」と呼ぶ。例示的な方法は、参照により本明細書に組み込まれるＬａｓｉｃら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３１２：２５５〜２５８，１９９２において説明されている。リポソームに組み込まれた核酸は、リポソームの内部空間中に完全に若しくは部分的に位置し、リポソームの二重膜内でまたはリポソーム膜の外面と会合していてもよい。リポソームへの核酸の組み込みは、本明細書において「封入」とも呼び、この中で、当該核酸は、リポソームの内部空間内に完全に含有される。リポソームのような転移ベシクルへとｍＲＮＡを組み込む目的はしばしば、核酸及び／若しくは系を分解する酵素若しくは化学物質を含有することがある環境、または核酸の迅速な排出を引き起こす受容体から当該核酸を防護することである。したがって、いくつかの実施形態において、適切な送達ビヒクルは、当該送達ビヒクル中に含有されるｍＲＮＡの安定性を高めることができ、及び／または標的細胞若しくは組織へのｍＲＮＡの送達を容易にする。
【０１７１】
（リポソームの大きさ）
本発明に従った適切なリポソームは、種々の大きさで作製してもよい。いくつかの実施形態において、提供するリポソームは、既に公知のｍＲＮＡ封入リポソームよりも小さく作製してもよい。いくつかの実施形態において、大きさの減少したリポソームは、ｍＲＮＡのより効率的な送達と関係している。適切なリポソームの大きさの選択は、標的細胞または標的組織の部位及び幾分かはリポソームが作製中である応用を考慮に入れてもよい。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、適切な大きさのリポソームは、ｍＲＮＡによってコードされる抗体の全身分配を容易にするよう選択される。いくつかの実施形態において、ある細胞または組織へのｍＲＮＡのトランスフェクションを制限することは所望であることがある。例えば、肝細胞を標的にするために、リポソームは、その寸法が肝臓の肝類洞を裏打ちする内皮層の開窓よりも小さくなるような大きさであってもよく、このような場合、リポソームは、標的肝細胞に到達するためにこのような内皮開窓を容易に貫通し得る。
【０１７３】
あるいはまたは加えて、リポソームは、当該リポソームの寸法がある細胞または組織への分配を制限するまたは明らかに回避するのに十分な直径であるような大きさであってもよい。例えば、リポソームは、その寸法が、肝類洞を裏打ちする内皮層の開窓よりも大きくなり、それにより肝細胞へのリポソームの分配を制限するような大きさであってもよい。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、適切なリポソームは、約５００ｎｍ、４５０ｎｍ、４００ｎｍ、３５０ｎｍ、３００ｎｍ、２５０ｎｍ、２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１１０ｎｍ、１００ｎｍ、９５ｎｍ、９０ｎｍ、８５ｎｍ、８０ｎｍ、７５ｎｍ、７０ｎｍ、６５ｎｍ、６０ｎｍ、５５ｎｍ、若しくは５０ｎｍまたはそれより小さな大きさを有する。いくつかの実施形態において、適切なリポソームは、約２５０ｎｍ以下（例えば、約２２５ｎｍ、２００ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、または５０ｎｍ以下）の大きさを有する。いくつかの実施形態において、適切なリポソームは、約１０〜２５０ｎｍに及ぶ大きさを有する（例えば、約１０〜２２５ｎｍ、１０〜２００ｎｍ、１０〜１７５ｎｍ、１０〜１５０ｎｍ、１０〜１２５ｎｍ、１０〜１００ｎｍ、１０〜７５ｎｍ、または１０〜５０ｎｍに及ぶ）。いくつかの実施形態において、適切なリポソームは、約１００〜２５０ｎｍに及ぶ大きさを有する（例えば、約１００〜２２５ｎｍ、１００〜２００ｎｍ、１００〜１７５ｎｍ、１００〜１５０ｎｍに及ぶ）。いくつかの実施形態において、適切なリポソームは、約１０〜１００ｎｍに及ぶ大きさを有する（例えば、約１０〜９０ｎｍ、１０〜８０ｎｍ、１０〜７０ｎｍ、１０〜６０ｎｍ、または１０〜５０ｎｍに及ぶ）。
【０１７５】
当該技術分野で公知の種々の代替法は、リポソームの集団の分粒に利用可能である。１つのこのような分粒法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，７３７，３２３号において説明されている。浴またはプローブ超音波処理のいずれかによるリポソーム懸濁液の超音波処理は、直径約０．０５ミクロン未満の小さなＵＬＶまで漸次的な大きさの減少を生じる。均質化は、大きなリポソームを小さなリポソームへと断片化するために剪断エネルギーに頼る別法である。典型的な均質化手順において、ＭＬＶは、選択したリポソームの大きさ、典型的には約０．１ミクロンと０．５ミクロンの間が観察されるまで、標準的なエマルションホモジナイザーを通じて再循環する。リポソームの大きさは、参照により本明細書に組み込まれるＢｌｏｏｍｆｉｅｌｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０：４２１〜１５０（１９８１）において説明されるような準電光散乱（ｑｕａｓｉ−ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）（ＱＥＬＳ）によって測定してもよい。平均リポソーム径は、形成されたリポソームの超音波処理によって減少することがある。間欠的な超音波処理周期は、効率的なリポソーム合成を誘導するためにＱＥＬＳ評価を用いて変化させてもよい。
【０１７６】
（医薬組成物）
核酸、例えば、ｍＲＮＡのような作用因子の送達、及び／またはｍＲＮＡのインビボでの発現を容易にするために、リポソームのような送達ビヒクルは、１つ以上の追加の核酸、担体、ターゲティングリガンド若しくは安定化試薬と組み合わせて、または当該送達ビヒクルと混合する薬理学的組成物中で製剤することができる。薬剤の製剤及び投与のための技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，ペンシルバニア州イーストン市，最新版において認められ得る。
【０１７７】
核酸、例えば、ｍＲＮＡのような提供するリポソーム封入薬、及びこれを含有する組成物は、対象の臨床的容態、投与の部位及び方法、投与計画、対象の年齢、性別、体重及び陶業の臨床医と関連する他の因子を考慮に入れて、現行の医療実施に従って投与及び投薬してもよい。本明細書の目的のための「有効量」は、実験的臨床研究、薬理学的、臨床学的及び医学的分野における当業者に公知のような関連する考慮によって判断されてもよい。いくつかの実施形態において、投与する量は、症状の少なくともいくつかの安定化、改善または除去、及び当業者によって疾患の進行、退行または改善の適切な目安として選択される他の指標を達成するのに有効である。例えば、適切な量及び投薬計画は、少なくとも一過性タンパク質（例えば、酵素）産生を引き起こすものである。
【０１７８】
適切な投与経路には、例えば、経口投与、直腸投与、膣投与、経粘膜投与、気管内投与若しくは吸入投与を含む肺投与、または腸投与；皮内注射、経皮（局所）注射、筋肉内注射、皮下注射、髄内注射、ならびに髄腔内投与、直接的な心室内投与、静脈内投与、腹腔内投与及び／または鼻内投与を含む非経口送達を含む。
【０１７９】
あるいはまたは加えて、核酸、例えば、ｍＲＮＡ及び本発明の組成物のようなリポソーム封入薬は、全身様式よりも局所様式で、例えば、標的組織への好ましくは徐放製剤における医薬組成物の直接的な注射を介して投与してもよい。局所送達は、標的とされる組織に応じて種々の方法で作用することができる。例えば、本発明の組成物を含有するエアゾールは吸入することができ（鼻送達、気管送達、または気管支送達）、本発明の組成物は、例えば損傷、疾患徴候、または疼痛の部位へと注射することができ、組成物は、経口適用、気管適用、または食道適用のためのロゼンジ剤において提供することができ、胃または小腸への投与のための液剤、錠剤またはカプセル剤で供給することができ、直腸適用または膣適用のために坐剤形態供給することができ、あるいはクリーム、ドロップ、またはさらには注射の使用によって眼へ送達することさえできる。治療用の分子またはリガンドと複合体形成した提供する組成物を含有する製剤は、例えば、植え込み部位から周辺細胞へと当該組成物が拡散できるポリマーまたは他の構造若しくは物質とともに外科的に投与することさえできる。あるいは、当該製剤は、ポリマーまたは支持体の使用なしで外科的に適用することができる。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、提供するリポソーム及び／または組成物は、当該リポソーム及び／または組成物が、作用因子、例えば当該リポソーム及び／または組成物中に含有するｍＲＮＡの延長放出に適している。このような延長放出組成物は、対象へ延長した投与間隔で対象へ簡便に投与してもよい。例えば、一実施形態において、本発明の組成物は、対象へ、１日２回、毎日または隔日投与される。好ましい実施形態において、本発明の組成物は、対象へ、１週間に２回、１週間に１回、１０日間ごと、２週間ごと、３週間ごと、若しくはより好ましくは４週間ごと、１か月に１回、６週間ごと、８週間ごと、隔月、３か月ごと、４か月ごと、６か月ごと、８か月ごと、９か月ごとまたは毎年投与される。ｍＲＮＡを延長して経時的に送達または放出のいずれかをするためのデポー投与（例えば、筋肉内に、皮下的に、硝子体内に）のために製剤された組成物及びリポソームも熟慮される。好ましくは、採用する延長した放出手段は、安定性を高めるためにｍＲＮＡに対してなされる修飾と組み合わされる。
【０１８１】
本明細書に開示したリポソームのうちの１つ以上を含む凍結乾燥した医薬組成物、ならびに例えばその教示が全体として参照により本明細書に組み込まれる２０１２年６月８日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４１６６３号。公開番号ＷＯ２０１２／１７０８８９において開示されるような組成物の使用についての関連方法も本明細書において熟慮される。例えば、本発明による凍結乾燥した医薬組成物は、投与前に再構成してもよく、またはインビボで再構成することができる。例えば、凍結乾燥した医薬組成物は、適切な剤形（例えば、ディスク、ロッドまたは膜のような皮内剤形）で製剤することができ、剤形が個体の体液によってインビボで経時的に再水和するよう投与することができる。
【０１８２】
提供するリポソーム及び組成物は、任意の所望の組織へ投与してもよい。いくつかの実施形態において、作用因子、例えば、提供するリポソームまたは組成物によって送達されるｍＲＮＡは、当該リポソーム及び／または組成物が投与された組織において発現する。いくつかの実施形態において、送達されるｍＲＮＡは、当該リポソーム及び／または組成物が投与された組織とは異なる組織において発現する。送達されたｍＲＮＡが送達及び／または発現し得る例示的な組織としては、肝臓、腎臓、心臓、脾臓、血清、脳、骨格筋、リンパ節、皮膚、及び／または脳脊髄液が挙げられるが、これらに限定しない。
【０１８３】
種々の実施形態によると、送達される作用因子、例えば、ｍＲＮＡの発現のタイミングは、特定の医学的需要に適するよう調整することができる。いくつかの実施形態において、送達されるｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現は、提供するリポソームまたは組成物の単回投与後の血清または標的組織において、１、２、３、６、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、及び／または７２時間検出可能である。いくつかの実施形態において、当該ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現は、提供するリポソームまたは組成物の単回投与後に血清または標的組織において１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、及び／または７日間検出可能である。いくつかの実施形態において、当該ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現は、提供するリポソームまたは組成物の単回投与後に血清または標的組織において１週間、２週間、３週間、及び／または４週間検出可能である。いくつかの実施形態において、当該ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現は、提供するリポソームまたは組成物の単回投与後の１か月以上後に検出可能である。
【実施例】
【０１８４】
（実施例）
（実施例１−式Ｉのラセミ化合物の合成）
【化５６】
0006599373.tif 000073
ラセミ化合物１０は、トリフルオロ酢酸を用いたアルファ−アミノｔｅｒｔ−ブチルカルバマートの開裂及び結果として生じる遊離アミンを二量体化して３，６−ジオキソピペラジン２を形成することによって、保護されたリジン誘導体１であるＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＳｕから調製した。触媒パラジウム上での２の水素化は、第一級ジアミン３を生じ、これを４当量のエポキシド４及びトリエチルアミンで処理して、式Ｉのラセミ体である３，６−ジオキソピペラジン１０を形成する。
【０１８５】
（ジベンジル（（（２Ｓ，５Ｓ）−３，６−ジオキソピペラジン−２，５−ジイル）ビス（ブタン−４，１−ジイル））ジカルバマート２）
氷浴を用いて冷却したＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＳｕ１（５０ｇ）へ、ＴＦＡ（６０ｍＬ）を緩徐に添加した。結果として生じる混合物を２０分間撹拌した。氷浴をはずし、撹拌を１時間続行した。ＴＦＡは回転式蒸発によって除去した。油状残渣をＤＭＦ（８０ｍＬ）中に溶解し、撹拌したピリジン（無水物，２．５Ｌ）へ緩徐に添加した。質量分析は、１時間後に反応の完了を示した。ピリジンは回転式蒸発によって除去し、残渣はＥｔＯＡｃ（２Ｌ）で希釈した。２０分間の撹拌後にこの混合物を濾過して、２をオフホワイト色の固体として得た（一晩の真空乾燥後に２０ｇ。収率：７３％）。
【０１８６】
（（３Ｓ，６Ｓ）−３，６−ビス（４−アミノブチル）ピペラジン−２，５−ジオン−２ＨＯＡｃ３）
ＡｃＯＨ（５５０ｍＬ）及びＤＣＭ（５５０ｍＬ）からなる混合物中の化合物２へ、Ｐｄ／Ｃ（１０％、湿重量１０ｇ）を添加した。この混合物をＨ２バルーン下で４時間撹拌し、４時間後に質量分析は反応の完了を示した。この反応混合物を窒素で１０分間洗い流し、セライトで濾過した。このセライトをＭｅＯＨ（３×２５０ｍＬ）ですすいだ。組み合わせた濾液を蒸発させ、残渣をＥｔＯＡｃ（１．０Ｌ）で３０分間撹拌した。濾過で３を白色の固体として生じた（一晩の真空乾燥後に１６．３７ｇ。収率：１１４％。１Ｈ  ＮＭＲは、清浄な生成物を示すが、試料中に余分なＨＯＡｃがある）。
【０１８７】
（３，６−ビス（４−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン−２，５−ジオン１０）
室温で５００ｍＬの圧力フラスコ中で撹拌したＥｔＯＨ（７５ｍＬ）中の３（１５．８７ｇ、４２．２ｍｍｏｌ）及び４（５７ｍＬ、２６１ｍｍｏｌ）からなる混合物へ、Ｅｔ３Ｎ（２３ｍＬ、１６５ｍｍｏｌ）を添加した。このフラスコを窒素で５分間さっと流し、密封した。この混合物（固体及び液体のスラリー）を室温で３０分間撹拌した後、１５０〜１５５℃（油浴温）へと加熱し、５時間撹拌した。温度が１５０℃に到達した後、透明な溶液を得た。室温へ冷却した後、この反応溶液を蒸発させて、０〜３０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭを溶離剤として９回、及び０〜３０％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃを溶離剤として２回用いるフラッシュカラムクロマトグラフィーによって、残渣を精製した。ＤＣＭから５０％の７５：２２：３のＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ（水溶液）の溶離剤としての使用は、ほとんど極性のない副産物をともなう生成物の同時溶出をもたらした。副産物は、展開溶媒として３０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭを用いるＴＬＣ上で生成物と密接に流れた。これを３０％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃを展開溶媒として用いるＴＬＣ上で生成物から十分に分離した。カラム精製からの純粋な生成物画分をプール及び蒸発させた。子の油状残渣をＥｔ２Ｏ中に溶解して蒸発させた。真空下で一晩乾燥させて溶媒を全部除去し、ラセミ化合物１０を明黄色のゲル（９．８５ｇ、収率：２４％）として得た。ＥＬＳＤ検出を用いたＨＰＬＣは、同じ生成物塊を有する２つの類似の大きさのピークを示した。元素分析：（計算値）：Ｃ，７２．６３、Ｈ，１２．１７、Ｎ，５．６４、（実測値）：Ｃ，７２．２５、Ｈ，１２．３７、Ｎ，５．６８。質量スペクトル：９９３．８ｍ／ｚ。
【０１８８】
７．１５ｇの３及び２５．６ｍＬの４を用いた別の試行において、粗生成物は、０〜３０％のＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃを溶離剤として用いて２回精製して、２つのバッチの生成物、すなわち早期画分由来の１．５５ｇのバッチ及び後期画分由来の７．３８ｇのバッチを得た。両バッチは、１Ｈ  ＮＭＲによって純粋であった。ＥＬＳＤ検出を用いるＨＰＬＣは、７．３８ｇのバッチについては同じ生成物塊を有する２つの類似の大きさのピークを示したが、１．５５ｇバッチについては単一の生成物ピークしか示さなかった。
【０１８９】
（実施例２−式Ｉ．ｂ．１のキラル化合物（すなわち、化合物１０）の合成）
【化５７】
0006599373.tif 000074
２当量のエポキシド４を用いて保護したリジン誘導体５のＮ−アルキル化を介してキラル化合物１０を合成して、ジオール６を形成した。触媒パラジウム上でのジオール６の水素化は、アルファアミノ酸７を形成し、これを２つの部分に分ける。アルファアミノ酸７の第一の部分は、ｔｅｒｔ−ブチルカルバマートとして保護されたそのアルファアミノ基を有し、Ｂｏｃ無水物を用いた処理の際に、カルボン酸８を形成する。アルファアミノ酸７の第二の部分は、アミン９を形成するためにメチルエステルへ転換されたその遊離酸を有する。カルボン酸８及びアミン９は、ＤＭＦのような非プロトン性溶媒中でＨＡＴＵ及びジエタノールアミンのようなペプチドカップリング試薬を介して、アミド中間体へカップリングし、このアミド中間体のｔｅｒｔ−ブチルカルバマート基は、ジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸を用いて切断して、結果として生じるアミノエステル生成物をピペラジン−２，５−ジオン１０へと環化する。キラル中心全部における立体化学は、この経路を介して保存される。
【０１９０】
以下のキラル化合物１２〜１５は、個々のキラルエポキシド出発材料を用いて、説明した合成経路を介して調製する。
【化５８】
0006599373.tif 000075
【０１９１】
（実施例３−式Ｉ．ａ．ｉ（すなわち、Ｒ４−ＳＲ−ｃＫＫ−Ｅ１２）の化合物）
【化５９】
0006599373.tif 000076
【化６０】
0006599373.tif 000077
（化合物３．１の合成）
無水Ｅｔ２Ｏ（１０００ｍＬ）中のＭｇ（６０ｇ、２．５ｍｏｌ）の懸濁液に、ヨウ素１結晶を添加した後、１−ブロモノナン（２５ｍＬ）を添加した。この反応を開始させ、この溶液は水浴を備えた反応フラスコを加熱した後に還流し始めた。残余の１−ブロモノナン（３６０ｍＬ、合計２．０ｍｏｌ）を、１．５時間で追加の漏斗を通じて添加し、還流を維持した。添加後、この反応溶液を水浴でさらに３０分間加熱還流した後、これを室温へ冷却した。この３．１のエーテル溶液を次の反応において直接使用した。
【０１９２】
（化合物４．１の合成）
５Ｌの三つ首フラスコ中で機械的撹拌機で撹拌する−７８℃の無水ＴＨＦ（１０００ｍＬ）中のＣｕＩ（３９ｇ、０．２ｍｏｌ）の懸濁液に、Ｒ−エピクロロヒドリン（１８５ｇ、２．０ｍｏｌ）（追加の漏斗）を添加した。添加後、先の３．１のエーテル溶液を１時間でカニューレを介して添加した。この混合物を−７８℃で３．５時間撹拌した後、飽和ＮＨ４Ｃｌ（１５００ｍＬ）で急冷した。有機層を分離した。水層をＥｔ２Ｏ（２０００ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機相を鹹水で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４上）、真空下で蒸発させた。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（２．５ｋｇＳｉＯ２、ヘキサン中の０〜１０％ＥｔＯＡｃで溶出）によって精製して、２９２ｇの４．１（収率：６６％）を明黄色の油として得た。
【０１９３】
（化合物５．１の合成）
ＭｅＯＨ（６００ｍＬ）及びＴＨＦ（６００ｍＬ）中の４．１（２９２ｇ、１．３３ｍｏｌ）の溶液へ、追加の漏斗を通じて０℃でＮａＯＨ水溶液（１．５Ｍ、１０００ｍＬ）を添加した。添加後、この反応混合物を室温で２．５時間撹拌して、ＴＬＣは、主要な生成物、非常に微量の出発材料（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン＝１：９、Ｒｆ＝０．６）を示した。ＴＨＦ及びＭｅＯＨは、真空下で回転式蒸発によって除去した。水性残渣は、Ｅｔ２Ｏ（６００ｍＬ×３）で抽出した。組み合わせた有機相を鹹水で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させた。黄色の油状残渣をカラム（ＳｉＯ２、２．５ｋｇ、ヘキサン中の０〜１０％のＥｔＯＡｃで溶出）によって精製して、２０５ｇ（８４％）の純粋な５．１を得た。
【０１９４】
（化合物７．１の合成）
方法Ａ：室温で撹拌中のＤＣＭ（１０００ｍＬ）及びＭｅＯＨ（７１ｍＬ）からなる混合物中の６．１（７５ｇ、０．２５ｍｏｌ）の溶液へ、Ｎａ２ＣＯ３水溶液（２．０Ｍ、１３５ｍＬ）を添加した。有機層を分離し、水層をＤＣＭ（２５０ｍＬ×２）で抽出した。組み合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、真空下で蒸発させた。残渣をＭｅＯＨ（３７５ｍＬ）中に溶解した後、化合物５．１（１８５ｇ、１．０ｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で４日間撹拌すると、ＭＳ及びＴＬＣは大部分が所望の生成物を示した。濃縮後、粗生成物は、フラッシュカラムクロマトグラフィー（２．０ｋｇのＳｉＯ２、ヘキサン中の０〜６０％のＥｔＯＡｃで溶出）によって精製して、７．１（１３１ｇ、８２％）を淡黄色の粘性のある油として得た。
【０１９５】
方法Ｂ：ＭｅＯＨ（６００ｍＬ）中の８．１（５０ｇ、０．２ｍｏｌ）の懸濁液に、ＤＩＰＥＡ（４５ｍＬ）を添加した後、化合物５．１（１５０ｇ、０．８１３ｍｏｌ、４．０当量）を添加した。この反応混合物を室温で７日間撹拌した。溶媒を除去し、残渣をカラム（１．０ｋｇのＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ中の０〜３０％のＭｅＯＨで溶出）によって精製して、９．１を蝋状の固体（８３ｇ、６７％）として得た。０℃で撹拌したＤＭＦ（１０００ｍＬ）中の９，１（８１ｇ、０．１３ｍｏｌ）の溶液へ、ＨＡＴＵ（５０．１ｇ、０．１３ｍｏｌ）、次いでＤＩＰＥＡ（９２ｍＬ、０．５２ｍｏｌ）を添加した。この混合物を０℃で４０分間撹拌した後、ＭｅＯＨ（５３．２ｍＬ、１０．０当量）を添加した。結果として生じる混合物を室温で一晩撹拌した。これを次に、水（５０００ｍＬ）で希釈して、ＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ×４）で抽出した。組み合わせた有機相を鹹水（６００ｍＬ×３）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、真空下で蒸発させた。粗生成物をカラム（１．０ｋｇのＳｉＯ２、ヘキサン中の０〜８０％のＥｔＯＡｃで溶出）によって精製して、７．１（６９ｇ、２工程について５５％）を淡色の粘性のある油として得た。
【０１９６】
（化合物１０．１の合成）
ＤＣＭ（２００ｍＬ）中の７．１（６９ｇ、０．１１ｍｏｌ）の溶液へ、ＴＦＡ（２００ｍＬ）を添加し、この混合物を室温で２時間撹拌し、ＭＳ検出は所望の生成物のみを示した。溶媒はすべて真空下で蒸発させ、１１５ｇの褐色の油様生成物１０．１を得、これはさらなる精製なしで次の工程に使用した。
【０１９７】
（化合物１２．１の合成）
ＭｅＯＨ（９００ｍＬ）中の１１．１、Ｂｏｃ−Ｄ−リジン（７５ｇ、０．３０５ｍｏｌ）の懸濁液に、ＤＩＰＥＡ（６８ｍＬ）及び５．１（１９６ｇ、１．０６ｍｏｌ）を添加した。この混合物を室温で７日間撹拌した。揮発性物質を除去し、粗生成物をカラム（２．５ｋｇのＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ中の０〜４０％のＭｅＯＨで溶出）によって精製して、１１８ｇ（６３％）の純粋な化合物１２．１を得た。
【０１９８】
（化合物１３．１の合成）
氷浴で冷却したＤＭＦ（６００ｍＬ、均質な溶液を得るために５０℃へと３０分間加温）中の１２．１（６７．５ｇ、０．１１ｍｏｌ）の溶液に、ＨＡＴＵ（５０ｇ、０．１２ｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（９５ｍＬ、０．５５ｍｏｌ）を添加した。結果として生じる混合物を０℃で４５分間撹拌した後、ＤＭＦ（４００ｍＬ）中の化合物１０．１（１１５ｇ、先に得た）を追加の漏斗を用いて添加した。この混合物を室温で一晩撹拌した。エーテル（１０００ｍＬ）を添加した後、水（１０００ｍＬ）を添加した。有機相を分離し、水相をエーテル（２５０ｍＬ×２）で抽出した。組み合わせた有機相を水で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４上乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をカラム（１．０ｋｇのＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ中の０〜２０％のＭｅＯＨで溶出）によって精製して、９４．２ｇ（７６％）の化合物１３．１を得た。
【０１９９】
（式Ｉ．ａ．ｉ（すなわち、Ｒ４−ＳＲ−ｃＫＫ−Ｅ１２）の化合物の合成）
ＤＣＭ（３００ｍＬ）中の１３．１（９４ｇ、０．０８４ｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（３００ｍＬ）を添加した。この混合物を室温で２時間撹拌した。ＭＳ検出は、完全な反応を示した。溶媒を真空下で除去した。この残渣をＤＣＭ（５００ｍＬ）中に溶解し、Ｎａ２ＣＯ３水溶液（１．０Ｍ、５００ｍＬ）で洗浄した。水性洗浄物をＤＣＭ（１００ｍＬ）で逆抽出した。組み合わせた有機相を無水ＮａＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させた。この残渣をＭｅＯＨ（１５００ｍＬ）中に溶解し、氷浴で冷却した。ＮＨ４ＯＨ水溶液（２８％、８０ｍＬ）を追加の漏斗を通じて添加した。この反応混合物を室温へと緩徐に加温させておき、大気温で２日間撹拌した。揮発性物質は、真空下で蒸発させた。粗生成物は、カラム（１．０ｋｇのＳｉＯ２、溶媒：１％ＮＨ４ＯＨ、４〜９％ＭｅＯＨ、９５〜９０％ＥｔＯＡｃで溶出）によって精製して、３４ｇの純粋なＲ４−ＳＲ−ｃＫＫ−Ｅ１２及び２２ｇの不純なＲ４−ＳＲ−ｃＫＫ−Ｅ１２を得た。不純なＲ４−ＳＲ−ｃＫＫ−Ｅ１２は、カラムによって再精製して、１２ｇの純粋なＲ４−ＳＲ−ｃＫＫ−Ｅ１２を得た。したがって、合計４６ｇ（５５％）の純粋なＲ４−ＳＲ−ｃＫＫ−Ｅ１２（ゴム状固体）を得た。
【０２００】
（実施例４−式Ｉ．ａ．ｉｉ（すなわち、Ｓ４−ＳＲ−ｃＫＫ−Ｅ１２）の化合物）
【化６１】
0006599373.tif 000078
【化６２】
0006599373.tif 000079
（化合物３．１の合成）
無水Ｅｔ２Ｏ（６００ｍＬ）中のＭｇ（３０ｇ、１．２５ｍｏｌ）の懸濁液に、１結晶のヨウ素を添加した後、１−ブロモノナン（３０ｍＬ）を添加した。この反応を開始して、溶液は、水浴を有する反応フラスコを加熱した後に還流し始めた。残余の１−ブロモノナン（１６１ｍＬ、合計２．０ｍｏｌ）を追加の漏斗を通じて１．５時間添加して、還流を維持した。添加後、この反応溶液を水浴でさらに３０分間加熱還流した後、室温へ冷却した。この３．１のエーテル溶液を次の反応において直接使用した。
【０２０１】
（化合物４．２の合成）
５Ｌの三つ首フラスコ中で機械的撹拌機で撹拌中の−７８℃の無水ＴＨＦ（１０００ｍＬ）中のＣｕＩ（１９ｇ、０．１ｍｏｌ）の懸濁液に、追加の漏斗を用いてＳ−エピクロロヒドリン（９２ｇ、１．０ｍｏｌ）を添加した。添加後、先の３．２のエーテル溶液をカニューレを介して１時間で添加した。この混合物を−７８℃で３．５時間撹拌した後、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（４００ｍＬ）で急冷した。この有機層を分離した。水層をＥｔ２Ｏ（１０００ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機相を鹹水で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４上）、真空下で蒸発させた。粗生成物は、フラッシュカラムクロマトグラフィー（２．５ｋｇのＳｉＯ２、ヘキサン中の０〜１０％ＥｔＯＡｃで溶出）によって精製して、１１１．６ｇの４．２（収率：６６％）を明黄色の油として得た。
【０２０２】
（化合物５．２の合成）
ＭｅＯＨ（２３０ｍＬ）及びＴＨＦ（２３０ｍＬ）中の４．２（１１１．３ｇ、０．５０６ｍｏｌ）の溶液へ、ＮａＯＨ水溶液（１．５Ｍ、３９５ｍＬ）を、追加の漏斗を用いて０℃で添加した。添加後、この反応混合物を室温で２．５時間撹拌し、ＴＬＣは、主要な生成物及び非常に少量の出発材料（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン＝１：９、Ｒｆ＝０．６）を示した。ＴＨＦ及びＭｅＯＨは、真空下で回転式蒸発によって除去した。水性残渣は、Ｅｔ２Ｏ（２００ｍＬ×３）を用いて抽出した。組み合わせた有機相を鹹水で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させた。黄色の油状残渣をカラム（ＳｉＯ２、１．０ｋｇ、ヘキサン中の０〜１０％のＥｔＯＡｃで溶出）によって精製して、８１ｇ（８７％）の純粋な５．２を得た。
【０２０３】
（化合物７．２の合成）
室温で撹拌中のＤＣＭ（１００ｍＬ）及びＭｅＯＨ（１０ｍＬ）からなる混合物中の６．１（１３ｇ、０．０４４ｍｏｌ）の溶液に、Ｎａ２ＣＯ３水溶液（２．０Ｍ、２５ｍＬ）を添加した。有機層を分離し、水層をＤＣＭ（２５０ｍＬ×２）で抽出した。組み合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、真空下で蒸発させた。この残渣をＭｅＯＨ（６０ｍＬ）中に溶解した後、化合物５．２（３２ｇ、０．１７４ｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で４日間撹拌すると、ＭＳ及びＴＬＣは、大部分が所望の生成物を示した。濃縮後、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（６００ｇのＳｉＯ２、ヘキサン中の０〜６０％ＥｔＯＡｃで溶出）によって精製して、７．２（２３ｇ、８５％）を淡色の粘性のある油として得た。
【０２０４】
（化合物８．２の合成）
ＤＣＭ（６０ｍＬ）中の７．２（２３ｇ、０．０３６６ｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（６０ｍＬ）を添加し、この混合物を室温で２時間撹拌し、ＭＳ検出は所望の生成物のみを示した。溶媒はすべて真空下で蒸発させて、４０ｇの褐色の油様生成物８．２ｇを得、これをさらなる精製なしで次の工程において使用した。
【０２０５】
（化合物１０．２の合成）
ＭｅＯＨ（９００ｍＬ）中の１１．１、Ｂｏｃ−Ｄ−リジン（１４ｇ、０．０５７ｍｏｌ）の懸濁液に、ＴＥＡ（１１．６ｍＬ）及び５．２（４２ｇ、０．２２８ｍｏｌ）を添加した。この混合物を室温で７日間撹拌した。揮発性物質を除去し、粗生成物をカラム（１．０ｋｇのＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ中の０〜４０％のＭｅＯＨで溶出）によって精製して、２４ｇ（７０％）の純粋な化合物１０．２を得た。
【０２０６】
（化合物１１．２の合成）
氷浴で冷却中のＤＭＦ（１２０ｍＬ）中の１０．２（９．１ｇ、１４．８２ｍｍｏｌ）の溶液へ、ＨＡＴＵ（８．４ｇ、２２．２３ｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（２５ｍＬ、１４８．２ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を０℃で４５分間撹拌した後、ＤＭＦ（８０ｍＬ）中の化合物８．２は、追加の漏斗を用いて添加した。結果として生じる混合物を室温で一晩撹拌した。ＭＳ検出は、出発材料がないことを示した。エーテル（１０００ｍＬ）を添加した後、水（１０００ｍＬ）を添加した。有機相を分離し、水相をエーテル（２００ｍＬ×２）で抽出した。組み合わせた有機相を鹹水で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。この残渣をカラム（３３０ｇのＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ中の０〜２０％のＭｅＯＨで溶出）によって精製して、１０．６ｇの所望の化合物１１．２を得た。
【０２０７】
（式Ｉ．ａ．ｉｉ（すなわち、Ｓ４−ＳＲ−ｃＫＫ−Ｅ１２）の化合物の合成）
ＤＣＭ（３０ｍＬ）中の１１．２（１０．６ｇ、０．０８４ｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（３０ｍＬ）を添加した。この混合物を室温で２時間撹拌した。ＭＳ検出は、完全な反応を示した。溶媒を真空下で除去した。この残渣をＤＣＭ（１５０ｍＬ）中に溶解し、Ｎａ２ＣＯ３水溶液（１．０Ｍ、２００ｍＬ）で洗浄した。この水性洗浄物をＤＣＭ（１００ｍＬ）で逆抽出した。組み合わせた有機相を無水ＮａＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させた。この残渣をＭｅＯＨ（２００ｍＬ）中に溶解し、氷浴で冷却した。ＮＨ４ＯＨ水溶液（２８％、１０ｍＬ）を追加の漏斗を用いて添加した。この反応混合物を室温へ緩徐に加温させておき、大気温で２日間撹拌した。揮発性物質を真空下で蒸発させた。この粗生成物をカラム（６００ｇのＳｉＯ２、溶媒：１％ＮＨ４ＯＨ、４〜９％ＭｅＯＨ、９５〜９０％のＥｔＯＡｃで溶出）によって精製して、５．１ｇの純粋なＳ４−ＳＲ−ｃＫＫ−Ｅ１２を得た。
【０２０８】
（実施例５−式Ｉ．ｂ．１．ｉ（すなわち、Ｒ４−ＳＳ−ｃＫＫ−Ｅ１２）の化合物）
【化６３】
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【化６４】
0006599373.tif 000081
（化合物３．３（Ｎ２−（ｔｅｒｔ−ブチルカルボニル）−Ｎ６，Ｎ６−ビス（（Ｒ）−２−ヒドロキシドデシル）−Ｌ−リジンの合成）
メタノール（８０ｍＬ）中のＲ−エポキシド（５．１、４６ｇ、２５０ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−Ｌ−リジン８．１（１５ｇ、６１ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（１１ｍｌ）からなる混合物を室温で３日間撹拌した。揮発性物質を除去し、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ（１００／０〜７０/３０、２０分）で溶出するシリカゲル（３３０ｇ）上でのクロマトグラフィーによって、黄色の油状残渣を精製して、生成物３．３を白色の固体（９．７ｇ、２６％）として得た。
【０２０９】
（式Ｉ．ｂ．１．ｉ（すなわち、Ｒ４−ＳＳ−ｃＫＫ−Ｅ１２、（（３Ｓ，６Ｓ）−３，６−ビス（４−（ビス（（Ｓ）−２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン−２，５−ジオン））の化合物の合成）
ＤＣＭ（２８０ｍｌ）中の３．３（７．４ｇ、１２ｍｍｏｌ）及びＮＨＳ（１．３８ｇ、１２ｍｍｏｌ）の溶液にＤＣＣ（２．９７ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で１．５時間撹拌した。次に、この溶媒を除去し、この残渣（粗４．３）をＴＦＡ（３０ｍｌ）中に溶解した。結果として生じる混合物を室温で１時間撹拌した。次に、ＴＦＡを除去し、ＤＣＭ（３０ｍｌ）をこの残渣へ添加して、同時蒸発させ、残余のＴＦＡを除去した。粗５．３をＤＣＭ（３０ｍＬ）中に溶解し、Ｎ２下で０℃の無水ピリジン（４８０ｍＬ）へ添加した。結果として生じる混合物を室温で一晩撹拌した。次に、ピリジンを除去し、残渣をジエチルエーテル（３００ｍＬ）で希釈した。この形成した白色固体を濾過によって除去した。濾液をＮａ２ＣＯ３水溶液（１Ｍ、１５０ｍｌ）及び鹹水（１５０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。この残渣を、３％ＮＨ４ＯＨ／７％ＭｅＯＨ／９０％ＥｔＯＡｃで溶出するカラムクロマトグラフィーによって５回精製し（１回の３３０ｇカラムの後、４回の８０ｇカラム）、１．０５ｇの純粋なＲ４−ＳＳ−ｃＫＫ−Ｅ１２を淡色のゴムとして得た。１．０ｇのＲ４−ＳＳ−ｃＫＫ−Ｅ１２。
【０２１０】
（実施例６−式Ｉ．ｂ．１．ｉｉ（すなわち、Ｓ４−ＳＳ−ｃＫＫ−Ｅ１２）の化合物）
【化６５】
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【化６６】
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（化合物３（Ｎ２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ６，Ｎ６−ビス（（Ｓ）−２−ヒドロキシドデシル）−Ｌ−リジン）の合成）
メタノール（８０ｍｌ）中のＳ−エポキシド（５．２、４６ｇ、２５０ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−Ｌ−リジン８．１（１５ｇ、６１ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（１１ｍｌ）からなる混合物を室温で８日間撹拌した。揮発性物質を除去し、黄色の油状残渣を、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ（１００／０〜７０/３０、２０分）で溶出するシリカゲル（３３０ｇ）上でのクロマトグラフィーによって精製して、生成物３．４を白色の固体（２２ｇ、５９％）として得た。
【０２１１】
（式Ｉ．ｂ．１．ｉｉ（すなわち、Ｓ４−ＳＳ−ｃＫＫ−Ｅ１２、（（３Ｓ，６Ｓ）−３，６−ビス（４−（ビス（（Ｓ）−２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン−２，５−ジオン）の化合物の合成）
ＤＣＭ（２８０ｍｌ）中の３．４（２４．５ｇ、４０ｍｍｏｌ）及びＮＨＳ（４．６ｇ、４０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＣ（９．９ｇ、４８ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で３時間撹拌した。次に、この溶媒を除去し、残渣（粗４．４）を０℃のＴＦＡ（１００ｍｌ）中に溶解した。結果として生じる混合物を室温へと加温させておき、４５分間撹拌した。次に、ＴＦＡを除去し、ＤＣＭ（１２０ｍｌ）をこの残渣へ添加した後、同時蒸発させて、残余のＴＦＡを除去した。粗５．４を０℃の無水ピリジン（１．６Ｌ）中にＮ２下で溶解し、結果として生じる混合物を室温で一晩撹拌した。ピリジンを次に、回転式蒸発によって除去し、この残渣をジエチルエーテル（１Ｌ）で希釈した。形成した白色固体は濾過によって除去し、ジエチルエーテル（２００ｍｌ）で洗浄した。この濾液をＮａ２ＣＯ３水溶液（１Ｍ、５００ｍｌ）及び鹹水（５００ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。この残渣を、０〜５０％（３％ＮＨ４ＯＨ／７％ＭｅＯＨ／９０％ＥｔＯＡｃ）／ＥｔＯＡｃで溶出するシリカゲル（３３０ｇ）上でのカラムクロマトグラフィーによって精製して、６．８ｇのＴＬＣで純粋なＳ４−ＳＳ−ｃＫＫ−Ｅ１２及び７．１ｇのわずかに不純なＳ４−ＳＳ−ｃＫＫ−Ｅ１２を得た。この６．８ｇ（６．８ｍｍｏｌ）のＴＬＣで純粋なＳ４−ＳＳ−ｃＫＫ−Ｅ１２を１２０ｍｌの酢酸エチル中に溶解した。Ｂｏｃ２Ｏ（０．２２ｇ、１．０ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を室温で２時間撹拌した。この溶媒を除去し、この残渣を、０〜５０％（３％ＮＨ４ＯＨ／７％ＭｅＯＨ／９０％ＥｔＯＡｃ）／ＥｔＯＡｃで溶出するシリカゲル（１２０ｇ）上でのカラムクロマトグラフィーによって精製して、５．７ｇ（８４％）の純粋な生成物Ｓ４−ＳＳ−ｃＫＫ−Ｅ１２を得、これは、アミン副産物非含有であった。
【０２１２】
（実施例７−式Ｉ．ｂ．２．ｉ（すなわち、Ｒ４−ＲＲ−ｃＫＫ−Ｅ１２）の化合物）
【化６７】
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【化６８】
0006599373.tif 000085
（化合物３．１の合成）
無水Ｅｔ２Ｏ（０．９Ｌ）中に懸濁したマグネシウム（６０ｇ）に、１−ブロモノナン２．１（２０ｍＬ）を添加した後、触媒量のヨウ素（５０ｍｇ）を添加した。結果として生じる混合物を温水浴で、Ｍｇと２．１との反応が開始するまで加熱した。この浴を取り外し、残余の１−ブロモノナン（３７９．１ｍＬ）を添加して、緩徐な還流を維持した。２．１の添加後、還流をさらに３０分間温水浴によって維持した。結果として生じる３．１のグリニヤール溶液を冷却して、次の工程において直接使用した。
【０２１３】
（化合物４．１の合成）
−７８℃におけるＴＨＦ（１．５Ｌ）中に懸濁したＣｕＩ（３８．１ｇ）に、Ｒ−（−）−エピクロロヒドリン（１５６．８ｍＬ）を添加した。次に、先の３．１のグリニヤール溶液を、カニューレを介して添加し、その間、反応温度は−６５℃未満に維持した。結果として生じる反応混合物を−７８℃でさらに３時間撹拌した。次に、飽和塩化アンモニウム水溶液（０．８Ｌ）を注意深く添加した後、水（１．０Ｌ）を添加した。結果として生じる混合物を撹拌し、室温へ加温させておいた。有機層を分離し、水層をＥｔ２Ｏ（０．５Ｌ×２）で抽出した。有機層をＥｔ２Ｏ抽出物と組み合わせ、結果として生じる溶液を鹹水（０．５Ｌ×２）で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させ、結果として生じる残渣をシリカゲルカラム（ヘキサン〜２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）上で精製して、４．１（２４３．５ｇ、５５％）を黄色の油として提供した。
【０２１４】
（化合物５．１の合成）
０℃で撹拌した１：２．６のＭｅＯＨ−ＴＨＦ（３．６Ｌ）中の４．１（２４３．４９ｇ）の溶液に、ＮａＯＨ水溶液（１．５Ｍ、０．８９Ｌ、１．３３モル）を緩徐に添加した。結果として生じる混合物を加温させておき、室温で３時間撹拌した。ＴＬＣ分析は、４．１の完全な消失を示した。有機溶媒を蒸発させ、水層をＥｔ２Ｏ（１Ｌ＋５００ｍＬ×２）で抽出した。この有機抽出物を組み合わせ、鹹水（６００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させて、残渣を得、これをシリカゲルカラム（ヘキサン〜１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製して、エポキシド５．１（１９３．７ｇ、９５％）を明黄色の油として得た。
【０２１５】
（化合物１２．１の合成）
ＭｅＯＨ（１．０４Ｌ）中のＮ−Ｂｏｃ−Ｄ−リジン１１．１（４９．２ｇ、０．２モル）及びエポキシド５．１（１４７．２ｇ、０．８モル）からなる混合物を室温で撹拌した。ＤＩＰＥＡ（５１．９ｇ、０．４モル）を添加した。次に、結果として生じる混合物を８日間撹拌した後、濃縮乾固させた。この残渣をシリカゲルカラム（２ｋｇ、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ、０〜１０％）で精製して、大部分が純粋な４９．２ｇの１２．１（ＭＺ−５５０−１８０）及び５８．３ｇの不純な１２．１を得、後者を第二のカラム（１．５ｋｇ、ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ、１０〜４０％）によって精製して、大部分が純粋な４１．４ｇの１２．１を得た。この２つの大部分が純粋なバッチを組み合わせて、ＥｔＯＡｃ（０．５Ｌ）とともに３時間撹拌した。この混合物を濾過して、４１．４ｇの純粋な１２．１を白色の固体として得た。この濾液を濃縮乾固した。残渣をＥｔＯＡｃ（０．１Ｌ）とともに１時間撹拌して、濾過して、１０．６ｇの純粋な１２．１を得た。濾液を濃縮乾固し、残渣をシリカゲルカラム（３３０ｇ、ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ、１０〜４０％）上で精製し、２６．９ｇの純粋な１２．１の第三のバッチを得た。合計７８．９ｇの純粋な１２．１を得た。収率：６４％。
【０２１６】
（式Ｉ．ｂ．２．ｉ（すなわち、Ｒ４−ＲＲ−ｃＫＫ−Ｅ１２）の化合物の調製）
バッチ１：ＤＣＭ（７０ｍＬ）中の１２．１（６．１４ｇ、１０ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｍｉｄｅ）（１．１５ｇ、１０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＣ（２．４７ｇ、１２ｍｍｏｌ）を添加した。結果として生じる混合物を室温で３時間撹拌した。揮発性物質を真空下で蒸発させて残渣（ＮＨＳエステル６．５）を得、これをＴＦＡ（２５ｍＬ）中に溶解して、０．５時間撹拌した。ＴＦＡを真空下で除去し、残渣（化合物７．５）を０℃に冷却した。ピリジン（無水物、４００ｍＬ）を添加し、この反応混合物を室温で２時間撹拌した。ピリジンを真空下で除去し、残渣をＥｔ２Ｏ（３００ｍＬ）中に懸濁した。この固体を濾過により除去した。この濾液を１ＭのＮａ２ＣＯ３水溶液（１５０ｍＬ）及び鹹水（１５０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濃縮乾固した。この残渣をカラムクロマトグラフ（８０ｇ、７：３のＭｅＯＨ−ＮＨ３−Ｈ２Ｏ（ＥｔＯＡｃで４回）／ＥｔＯＡｃ、０〜５０％）によって分離して、Ｒ４−ＲＲ−ｃＫＫ−Ｅ１２をゴム状の固体（２．２２ｇ）として得た。ＥｔＯＡｃからの複数回の沈殿及び倍散で、純粋なＲ４−ＲＲ−ｃＫＫ−Ｅ１２（０．４６ｇ）をゴムとして得た。
【０２１７】
（実施例８−式Ｉ．ｂ．２．ｉｉ（すなわち、Ｓ４−ＲＲ−ｃＫＫ−Ｅ１２）の化合物）
【化６９】
0006599373.tif 000086
【化７０】
0006599373.tif 000087
（化合物３．１の合成）
無水Ｅｔ２Ｏ（０．９Ｌ）中に懸濁したマグネシウム（６０ｇ）に、１−ブロモノナン２．１（２０ｍＬ）を添加した後、触媒量のヨウ素（５０ｍｇ）を添加した。結果として生じる混合物を温水浴を用いて、Ｍｇと２．１との反応が開始するまで加熱した。この浴を外して、残余の１−ブロモノナン（３７９．１ｍＬ）を添加して、緩徐な還流を維持した。２．１の添加後、還流を温水浴によってさらに３０分間維持した。結果として生じる３．１のグリニヤール溶液を冷却して、次の工程において直接使用した。
【０２１８】
（化合物４．２の合成）
−７８℃のＴＨＦ（１．５Ｌ）中に懸濁したＣｕＩ（３８．１ｇ）に、Ｓ−（−）−エピクロロヒドリン（１５６．８ｍＬ）を添加した。次に、先の３．１のグリニヤール溶液をカニューレを介して添加し、その間、反応温度を−６５℃未満に維持した。結果として生じる反応混合物を−７８℃でさらに３時間撹拌した。次に、飽和塩化アンモニウム水溶液（０．８Ｌ）を注意深く添加した後、水（１．０Ｌ）を添加した。結果として生じる混合物を撹拌して室温へ加温させておいた。有機層を分離し、水層をＥｔ２Ｏ（０．５Ｌ×２）で抽出した。有機層をＥｔ２Ｏ抽出物と組み合わせ、結果として生じる溶液を鹹水（０．５Ｌ×２）で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させ、残渣をシリカゲルカラム（ヘキサン〜２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製して、４．２（２５０．８ｇ、５７％）を明黄色の油として得た。
【０２１９】
（化合物５．２の合成）
０℃で撹拌した１：２．６のＭｅＯＨ−ＴＨＦ（３．９Ｌ）中の４．２（２５０．８ｇ）の溶液に、ＮａＯＨ水溶液（１．５Ｍ、１．３６モル、０．９０Ｌ）を緩徐に添加した。結果として生じる混合物を加温させておき、室温で３時間撹拌した。ＴＬＣ分析は、４．２の完全な消失を示した。有機溶媒を蒸発させ、水層をＥｔ２Ｏ（１Ｌ＋５００ｍＬ×２）で抽出した。有機抽出物を組み合わせ、鹹水（６００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させ、残渣を得、これをシリカゲルカラム（ヘキサン〜１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製して、５．２（１９５．４ｇ、９３％）を明黄色の油として提供した。
【０２２０】
ＭｅＯＨ（１．０４Ｌ）中のＮ−Ｂｏｃ−Ｄ−リジン１１．１（４９．２ｇ、０．２モル）及びエポキシド５．２（１４７．２ｇ、０．８モル）からなる混合物を室温で撹拌した。ＤＩＰＥＡ（５１．９ｇ、０．４モル）を添加した。次に、結果として生じる混合物を８日間撹拌した後、濃縮乾固した。結果として生じる残渣を、シリカゲルカラム（２ｋｇ、ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ、１０〜３０％）で精製して、１０．２（７９．９ｇ、６５％）を白色の固体として得た。
【０２２１】
（式Ｉ．ｂ．２．ｉｉ（すなわち、Ｓ４−ＲＲ−ｃＫＫ−Ｅ１２）の化合物の調製）
ＤＣＭ（８００ｍＬ）中の１０．２（６１．４ｇ、１００ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｍｉｄｅ）（１１．５ｇ、１００ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＣ（２４．７ｇ、１２０ｍｍｏｌ）を添加した。結果として生じる混合物を室温で４時間撹拌した。揮発性物質を真空下で蒸発させて残渣（ＮＨＳエステル６．６）を得、これをＴＦＡ（２５ｍＬ）中に溶解して、４０分間撹拌した。ＴＦＡを真空下で除去し、残渣（化合物７．６）を０℃に冷却した。ピリジン（無水物、３．５Ｌ）を添加し、この反応混合物を室温で１９時間撹拌した。ピリジンを真空下で除去し、残渣をＥｔ２Ｏ（３．０Ｌ）中に懸濁した。この固体を濾過により除去した。この濾液を１ＭのＮａ２ＣＯ３水溶液（１．０Ｌ）及び鹹水（１．０Ｌ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濃縮乾固した。この残渣をカラムクロマトグラフ（（７％ＭｅＯＨ／３％ＮＨ３−Ｈ２Ｏ／９０％ＥｔＯＡｃ）／ＥｔＯＡｃ、０〜５０％）で溶出する４×３３０ｇシリカゲルカラム）によって精製して、Ｓ４−ＲＲ−ｃＫＫ−Ｅ１２をゴム状の固体（１５．９ｇ、１６％）として提供した。
【０２２２】
（実施例９−製剤）
本明細書に説明する製剤は、種々の核酸系材料を封入するよう設計した１つ以上のカチオン性脂質、ヘルパー脂質、及びペグ化脂質を採用する種々の比からなる多成分脂質混合物からなった。全体を通じて利用するカチオン性脂質は、式Ｉの化合物（３，６−ビス（４−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン−２，５−ジオン）である。ヘルパー脂質には、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ））ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））、コレステロールなどを含むことができる（が、排他的ではない）。ペグ化脂質には、Ｃ６〜Ｃ２０長のアルキル鎖（複数可）を有する脂質へ共有結合した長さ最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含むことができる（が、排他的ではない）。
【０２２３】
（伝令ＲＮＡ材料）
ヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、コドンの最適化されたホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）、及びコドンの最適化されたヒトアルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）伝令ＲＮＡを、当該遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡテンプレートからのインビトロ転写に続いて、ゲル電気泳動によって測定されるような長さおよそ２５０ヌクレオチドの５’キャップ構造（Ｃａｐ１）（Ｆｅｃｈｔｅｒ，Ｐ．、Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，Ｇ．Ｇ．“Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｃａｐ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｂｙ  ｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００５，８６，１２３９〜１２４９）及び３’ポリ（Ａ）尾部の付加によって合成した。各ｍＲＮＡ産物中に存在する５’及び３’非翻訳領域は、それぞれＸ及びＹと表し、記載の通り定義する（下記参照）。
コドンの最適化されたヒトアルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）ｍＲＮＡ：
【化７１】
0006599373.tif 000088
５’及び３’ＵＴＲ配列
X  =  
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG
Y  =  
CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUC
【０２２４】
（製剤プロトコル）
式Ｉの１つ以上の化合物、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋの５０ｍｇ／ｍＬエタノール溶液の一定分量を混合し、３ｍＬの終容積へとエタノールで希釈した。別途、ＡＳＳ１ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭクエン酸／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を１ｍｇ／ｍＬストックから調製した。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液へと迅速に注射して振盪して、２０％エタノール中の最終懸濁液を生じた。結果として生じるナノ粒子懸濁液を濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析濾過し、濃縮し、２〜８℃で保存した。終濃度＝０．６４ｍｇ／ｍＬ  ＡＳＳ１ｍＲＮＡ（封入済み）。Ｚ平均＝７８ｎｍ（Ｄｖ（５０）＝４６ｎｍ、Ｄｖ（９０）＝９６ｎｍ）。
【０２２５】
（実施例１０−静脈内送達されるＡＳＳ１ｍＲＮＡ搭載ナノ粒子を介して産生されるＡＳＳ１タンパク質の分析）
（注射プロトコル）
試験はすべて、核実験の開始時のおよそ６〜８週齢の雄ＣＤ−１マウスを用いて実施した。試料は、等価の合計用量１．０ｍｇ／ｋｇ（または他に指定）の封入したＡＳＳ１ｍＲＮＡの単回ボーラス尾静脈注射によって導入した。マウスは指定の時点で屠殺して、塩類溶液を還流した。
【０２２６】
（分析用器官組織の単離）
各マウスの肝臓、脾臓、腎臓及び心臓を収集し、個別の部分へと割り当て、１０％中性緩衝ホルマリンまたは瞬時凍結のいずれかで保存し、分析のために−８０℃で保存した。
【０２２７】
（分析用の血漿の単離）
動物はすべて、用量投与（±５％）後の指定した時点でＣＯ２窒息によって安楽死させた後、開胸して末端心血収集を行った。全血（最大入手可能容積）は、安楽死させた動物における心穿刺を介して、血清分離チューブ中へと収集し、室温で少なくとも３０分間凝血させておき、２２℃±５℃、９３００ｇで１０分間遠心分離し、血清を抽出するであろう。暫定的な血液収集のために、およそ４０〜５０μＬの全血を顔面静脈穿刺または尾部微量切断を介して収集するであろう。非処置動物から収集した試料は、試験動物との比較のために、基線ＡＳＳ１レベルとして使用した。
【０２２８】
（酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）分析）
ヒトＡＳＳ１  ＥＬＩＳＡ：捕捉抗体としてマウス抗ＡＳＳ１  ２Ｄ１〜２Ｅ１２ＩｇＧを、二次（検出）抗体としてウサギ抗ＡＳＳ１＃３２８５ＩｇＧ（Ｓｈｉｒｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）とともに採用する標準的なＥＬＩＳＡ手順に従った。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ウサギＩｇＧを、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液の活性化に使用した。この反応は、２０分後に２ＮのＨ２ＳＯ４を用いて消光した。検出は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ機器での吸光（４５０ｎｍ）を介してモニターした。観処置のマウス血清及び器官ならびにヒトＡＳＳ１タンパク質はそれぞれ、陰性対照及び陽性対照として使用した。
【０２２９】
（実施例１１−インビボでのヒトＡＳＳ１タンパク質産生）
式Ｉの化合物を含む、コドンの最適化されたｈＡＳＳ１ｍＲＮＡを搭載した脂質ナノ粒子を介したヒトＡＳＳ１タンパク質の産生は、先に説明した通り、単回ボーラス静脈内注射としてＣＤ−１マウスにおいて検査した。図１は、マウスヒトＡＳＳ１ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を式Ｉの種々のラセミ化合物及びキラル化合物を１．０ｍｇ／ｋｇ用量で処置する場合、ＥＬＩＳＡを介して検出されたヒトＡＳＳ１タンパク質の量を示す。マウスは注射２４時間後に屠殺し、肝臓のような器官を収集した。
【０２３０】
（実施例１２−毒性試験）
アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の発現レベルを、式Ｉの種々のラセミ化合物及びキラル化合物について測定した。ＡＳＴ及び／またはＡＬＴの発現レベルの亢進は概して、肝臓毒性を生じる作用因子によって生じた。式Ｉのキラル化合物は概して、同じ脂質の立体化学的に濃縮されていない、または立体化学的にほとんど濃縮されていない組成物と比較して、ＡＬＴ及び／またはＡＳＴの低い発現レベルを生じ、すなわち低い肝臓毒性問題と相関していた。以下の表１及び表２を参照されたい。
【表１−１】
0006599373.tif 000089
【表１−２】
0006599373.tif 000090
【表２−１】
0006599373.tif 000091
【表２−２】
0006599373.tif 000092
【０２３１】
本発明のいくつかの実施形態は、本明細書に説明及び示されてきたが、当業者は、当該機能を実行するための、ならびに／あるいは本明細書に説明する結果を及び／または利点のうちの１つ以上を得るために種々の他の手段ならびに／あるいは構造を容易に想定するであろうし、このような変法及び／または改変の各々は、本発明の範囲内であるとみなす。より一般的には、本明細書に説明するパラメータ、寸法、材料、及び形状がすべて、例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、ならびに／あるいは形状が、本発明の教示に使用する具体的な適用または複数の適用に依存するであろうことを容易に認識するであろう。当業者は、所定の実験法以下を用いて、本明細書に説明する本発明の具体的な実施形態と多くの等価物を認識するであろうし、または確認できるであろう。それゆえ、上述の実施形態は、例としてのみ呈されていること、ならびに添付の特許請求の範囲及びその等価物の範囲内で、本発明が具体的に説明及び請求される通り実施され得ないことは理解されることになっている。本発明は、本明細書に説明する各個々の特長、システム、物品、材料、キット、及び／または方法に向けられている。加えて、２つ以上のこのような特長、システム、物品、材料、キット、及び／または方法のうちの任意の組み合わせは、このような特長、システム、物品、材料、キット、及び／または方法が相互に一致している場合、本発明の範囲内に含まれる。
【図１】
0006599373.tif 000095
【配列表】
0006599373000001.app