(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞増殖システムにおいて複数の細胞を投入する方法であって、該方法は、
細胞増殖システムのバイオリアクター内の中空糸の内部及び前記バイオリアクターの中空糸の内部を流れる流体の循環路であるＩＣループ内において第１レートで循環する流体に、複数の細胞を付加するステップと、
前記流体の循環レートを、所定の期間、前記第１レートに維持して、前記流体において前記複数の細胞を均一に懸濁させるステップと、
前記複数の細胞を均一に懸濁させた後、前記流体の循環レートを、前記第１レートよりも低いレートに減らし、所定の期間で、前記複数の細胞のうちの第１のパーセンテージである８０％以下の量を前記バイオリアクター内に沈殿させ、前記複数の細胞のうちの第２のパーセンテージの量を前記バイオリアクターの外側に沈殿させるステップと、
前記バイオリアクター内において前記第１のパーセンテージの量の細胞を増殖するステップと、
前記第２のパーセンテージの量の細胞を廃棄するステップと、
を有する方法。
【請求項２】
細胞増殖システムにおいて複数の細胞を投入する方法であって、該方法は、
細胞増殖システムのバイオリアクター内の中空糸の内部及び前記バイオリアクターの中空糸の内部を流れる流体の循環路であるＩＣループ内において第１レートで循環する流体に、複数の細胞を付加するステップと、
付加した後、前記ＩＣループ及びバイオリアクター内を循環する前記流体の循環レートを、前記第１レートから、前記第１レートよりも高い第２レートに増やすステップと、
前記流体の循環レートを、所定の期間、前記第２レートに維持して、前記流体において前記複数の細胞を均一に懸濁させるステップと、
前記複数の細胞を均一に懸濁させた後、前記流体の循環レートを、前記第２レートよりも低いレートに減らし、所定の期間で、前記複数の細胞のうちの第１のパーセンテージである８０％以下の量を前記バイオリアクター内に沈殿させ、前記複数の細胞のうちの第２のパーセンテージの量を前記バイオリアクターの外側に沈殿させるステップと、
前記バイオリアクターにおいて前記第１のパーセンテージの量の細胞を増殖するステップと、
前記第２のパーセンテージの量の細胞を廃棄するステップと、
を有する方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法において、前記第１のパーセンテージは、前記複数の細胞の約５５％以上であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法において、前記第１のパーセンテージは、前記複数の細胞の約６０％以上であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法において、前記第１レートは、約７５ｍｌ／分以上であることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法において、前記第１レートは、約１００ｍｌ／分以上であることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法において、前記第１レートは、約２２５ｍｌ／分以下であることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法において、前記第１レートは、約２００ｍｌ／分以下であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法において、前記維持するステップにおいて、
前記バイオリアクターを、第１の姿勢である水平姿勢から、第１の姿勢から２７０°回転した第２の姿勢へ、回転軸を中心として回転させ、
前記バイオリアクターを、前記第２の姿勢で、第１の期間、休止させ、
前記バイオリアクターを、前記回転軸を中心として回転させて、前記第１の姿勢に戻し、
前記バイオリアクターを、前記第１の姿勢で、第２の期間、休止させる、
ことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９記載の方法において、前記第２の期間は、前記第１の期間と略等しいことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項９記載の方法において、前記バイオリアクターを回転させる際の前記バイオリアクターの角速度（ｒａｄ／秒）をωとした場合、前記第２の期間は、２ω-1に略等しいことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項９記載の方法において、前記バイオリアクターを、前記第１の姿勢と前記第２の姿勢との間で回転させる際は、第１角速度が維持されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法において、前記バイオリアクターを、前記回転軸を中心として回転させて、前記第１の姿勢に戻す際は、第２角速度が維持され、前記第２角速度は、前記第１角速度と略等しいことを特徴とする方法。
【請求項１４】
複数の細胞を増殖するためのシステムであって、該システムは、
少なくとも両端部を有する第１流体流路を備えるバイオリアクターと、
前記第１流体流路と流体的に関連付けられた流体入口路と、
前記バイオリアクターの前記第１流体流路において流体を循環させる第１ポンプと、
前記第１ポンプの動作を制御するコントローラと、
を備え、
前記第１流体流路の第１端部は、中空糸膜の第１ポートと流体的に関連付けられ、前記第１流体流路の第２端部は、前記中空糸膜の第２ポートと流体的に関連付けられ、前記第１流体流路は、前記中空糸膜の毛細管内側部分を有し、
前記流体入口路を介して、前記第１流体流路には、複数の細胞が導入され、
前記コントローラは、前記第１ポンプを制御することによって、
前記第１流体流路内において、流体を、第１レートにて循環させ、
前記流体の循環レートを、所定の期間、前記第１レートに維持して、前記流体において前記複数の細胞を均一に懸濁させ、
前記複数の細胞を均一に懸濁させた後、前記流体の循環レートを、前記第１レートよりも低いレートに減らし、前記複数の細胞のうちの第１のパーセンテージである８０％以下の量を前記バイオリアクター内に沈殿させ、前記複数の細胞のうちの第２のパーセンテージの量を前記バイオリアクターの外側に沈殿させ、
成長培地を有する流体を循環させて、前記バイオリアクターにおいて前記第１のパーセンテージの量の細胞を増殖させ且つ前記第１流体流路から前記第２のパーセンテージの量の細胞の大部分を廃棄することを特徴とするシステム。
【請求項１５】
請求項１４記載のシステムにおいて、前記第１のパーセンテージは、前記複数の細胞の約６５％以上であることを特徴とするシステム。
【請求項１６】
請求項１４又は１５に記載のシステムにおいて、前記第１レートは、約１４５ｍｌ／分以上であることを特徴とするシステム。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のシステムにおいて、前記第１レートは、約２５０ｍｌ／分以下であることを特徴とするシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１２年８月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／６９１，１９３号（タイトル：細胞増殖システムのバイオリアクターにおける細胞の投入・分配方法）の優先権を主張するものであり、該米国仮特許出願の全体は、ここでの開示により明確に本出願に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
ＣＥＳは、細胞を増殖させ、分化させるために使用される。いくつかの細胞増殖システムが当該分野において知られている。例えば、米国特許第５，１６２，２２５号明細書及び米国特許第６，００１，５８５号明細書において、細胞増殖のために設計された細胞増殖システムが一般的に記載されている。
【０００３】
種々の治療や療法における幹細胞の使用可能性に対して特に注目が集まっている。細胞増殖システムを使用することにより、幹細胞や、骨髄細胞のようなその他のタイプの細胞を増殖（例えば、成長）させることができる。ドナー細胞から増殖した幹細胞を使用することで、損傷を受けた又は欠陥のある組織を修復又は交換することができ、広範囲な疾病に対する幅広い臨床応用が存在する。再生医療分野における近年の前進により、幹細胞は、増殖能力、自己再生能力、未分化状態を維持する能力及び特定の条件下で特殊化した細胞に分化する能力といった特性を有することが示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
細胞増殖システムは、細胞を増殖させるための１以上の分室、例えば、細胞成長チャンバー（「バイオリアクター」とも称される）を有している。細胞を増殖させるため、通常、初期量の細胞を、バイオリアクターに投入し分配する。従って、細胞増殖システムに関連付けられたバイオリアクターにおける細胞の投入・分配方法の要求が存在する。本発明は、上記及び他の要求に対応するためになされた。
【０００５】
本発明の実施形態は、これら及びその他を考慮してなされた。しかしながら、上述の課題によって、本発明の実施形態の他の問題への適用が制限されるものではない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本節は、本発明のいくつかの実施形態の態様を簡単な形式で説明するためのものであり、主張される本発明の重要な又は必須の要素を特定することを意図していないし、また、請求項の範囲を制限することを意図しているものでもない。
【０００７】
本発明は、様々な異なる実施形態を含むと理解されるべきであり、また本節は、本発明を限定するものでないし、またそれら全ての実施形態を含むものでもない。本節では、実施形態に含まれる特徴が概略的に記載されるが、それ以外の実施形態に含まれる他の特徴のより具体的な記載を含む場合もある。
【０００８】
１以上の実施形態は一般には、細胞増殖システムのバイオリアクターにおける細胞の投入・分配のための方法及びシステムに関する。従って、実施形態には、細胞増殖システムのバイオリアクター内の中空糸の内部及び前記バイオリアクターの中空糸の内部を流れる流体の循環路であるＩＣループ内において第１レートで循環する流体に、複数の細胞を付加するステップを有する方法が含まれる。流体の循環レートは、所定の期間、第１レートに維持されることで、該流体において複数の細胞が均一に懸濁される。複数の細胞が均一に懸濁された後、流体の循環レートは、第１レートよりも低いレートに減らされる。複数の細胞のうちの第１のパーセンテージである８０％以下の量を、バイオリアクター内に沈殿させ、複数の細胞のうちの第２のパーセンテージの量を、バイオリアクターの外側に沈殿させる。第１のパーセンテージの量の細胞は、バイオリアクター内において増殖される。第２のパーセンテージの量の細胞は、廃棄される。実施形態において、循環レートを第１レートに維持している間、バイオリアクターを、第１の姿勢である水平姿勢から、第１の姿勢から２７０°回転した第２の姿勢へ、回転軸を中心として回転させ、バイオリアクターを、前記第２の姿勢で、第１の期間、休止させ、バイオリアクターを、前記回転軸を中心として回転させて、前記第１の姿勢に戻し、バイオリアクターを、前記第１の姿勢で、第２の期間、休止させる。
【０００９】
本発明の実施形態はまた、細胞を増殖させるためのシステムに関する。そのような実施形態は、少なくとも両端部を有する第１流体流路を備えるバイオリアクターを有し、前記第１流体流路の第１端部は、中空糸膜の第１ポートと流体的に関連付けられ、前記第１流体流路の第２端部は、前記中空糸膜の第２ポートと流体的に関連付けられ、前記第１流体流路は、前記中空糸膜の毛細管内側部分を有する。該実施形態はさらに、前記第１流体流路と流体的に関連付けられた流体入口路を有し、前記流体入口路を介して、前記第１流体流路には、複数の細胞が導入される。該実施形態には、前記バイオリアクターの前記第１流体流路において流体を循環させる第１ポンプも含まれる。該実施形態はさらに、前記第１ポンプの動作を制御するコントローラを有し、前記コントローラは、前記ポンプを制御して、前記第１流体流路内において、流体を、第１レートにて循環させ、前記流体の循環レートを、所定の期間、前記第１レートに維持して、前記流体において複数の細胞を均一に懸濁させ、前記複数の細胞を均一に懸濁させた後、前記流体の循環レートを、前記第１レートよりも低いレートに減らし、前記複数の細胞のうちの第１のパーセンテージである８０％以下の量を前記バイオリアクター内に沈殿させ、前記複数の細胞のうちの第２のパーセンテージの量を前記バイオリアクターの外側に沈殿させ、成長培地を有する流体を循環させて、前記バイオリアクターにおいて前記第１のパーセンテージの量の細胞を増殖させ且つ前記第１流体流路から前記第２のパーセンテージの量の細胞の大部分を除去する。
【００１０】
ここで使用される「少なくとも１つ」、「１以上の」、「及び／又は」は、接続的及び選言的の両方として機能する非限定的表現である。例えば、「Ａ、Ｂ及びＣのうち少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ又はＣのうち少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ及びＣのうち１以上」、「Ａ、Ｂ又はＣのうち１以上」、「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」のこれら各表現は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢ、ＡとＣ、ＢとＣ、又は、ＡとＢとＣ、のいずれかであることを意味する。
【００１１】
本発明の種々の実施形態は、ここで提供されるように、また請求項の範囲によって表現されるように、添付の図面及び詳細な説明に記載されている。しかしながら、この節が本発明の全ての態様、全ての実施形態を含むものではないこと、また、この節が本発明を限定あるいは制限するものではないことを理解すべきである。また、ここで開示される発明は、いかなる自明な変更、変形も含むことが当業者に理解されよう。
【００１２】
ここで提示される実施形態におけるさらなる効果は、以下の記載、添付図面から容易に理解されよう。
【００１３】
本発明の上記及びその他の効果及び特徴をさらに明確にするため、添付の図面における具体的な実施形態を参照して、本発明がより具体的に説明される。これら図面は、本発明の代表的な実施形態を示すだけであり、従って、本発明の範囲を制限するものではない。以下では、添付図面を用いて、本発明が詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１Ａは、細胞増殖システム（ＣＥＳ）の一実施形態の図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＣＥＳの他の実施形態の図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＣＥＳのさらに他の実施形態の図である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ＣＥＳ動作中に細胞成長チャンバーを回転方向又は横方向に動かす振動装置の図である。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ＣＥＳと共に使用するための、取り外し可能な流れ回路の図である。
【図２Ａ】図２Ａは、細胞成長チャンバーの中空糸型細胞成長チャンバーの実施形態の側面図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２Ａの中空糸型細胞成長チャンバーの一部切欠側面図である。
【図３】図３は、循環路を示したバイオリアクターの実施形態の正面図である。
【図４】図４は、脱着可能なバイオリアクターを有する細胞増殖システムの一部の斜視図である。
【図５】図５は、細胞増殖システムにおける細胞の投入・分配に関する方法のフローチャートである。
【図６】図６は、第１の姿勢におけるバイオリアクターの正面図である。
【図７】図７は、図６のバイオリアクターを９０°回転させた場合の正面図である。
【図８】図８は、図６のバイオリアクターを１８０°回転させた場合の正面図である。
【図９】図９は、図６のバイオリアクターを２７０°回転させて、第２位置にした場合の正面図である。
【図１０】図１０は、図６のバイオリアクターを回転させて初期位置へ戻した場合の正面図である。
【図１１】図１１は、ＣＥＳのシャフト組立体に接続されたバイオリアクターの斜視図である。
【図１２】図１２は、図１１の構造の側面図である。
【図１３】図１３は、バイオリアクターを長手方向軸中心に回転させるために使用される接続具の詳細斜視図である。
【図１４】図１４は、ロール回転を示すバイオリアクターの側面図である。
【図１５】図１５は、従来の方法を用いて投入・分配された後に収穫された増殖細胞を示すグラフである。
【図１６】図１６は、本発明の実施形態に係る方法を用いて投入・分配された後に収穫された増殖細胞を示すグラフである。
【図１７】図１７は、本発明の実施形態に係る方法を用いて投入・分配された細胞を増殖している際の乳酸塩の生成量を示すグラフである。
【図１８】図１８は、本発明の実施形態に係る方法を用いて投入・分配された細胞を増殖している際のグルコースの消費量を示すグラフである。
【図１９】図１９は、従来の方法を用いて投入・分配を行った後の細胞を増殖している際の乳酸塩の生成量を示すグラフである。
【図２０】図２０は、従来の方法を用いて投入・分配を行った後に増殖を行っている際の乳酸塩の平均生成量を示すグラフである。
【図２１】図２１は、本発明の実施形態を実施するために使用される基本的なコンピュータのブロック図である。
【図２２】図２２は、一実施形態に係る細胞増殖システムにおける細胞の投入・分配に関する方法のフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の原理は、以下の詳細な説明及び添付図面に示される実施形態を参照することで、さらに理解されよう。詳細な実施形態において具体的な特徴が示され説明されるが、本発明は、以下で説明される実施形態に限定されないと理解されるべきである。本開示は一般には、細胞増殖システムのバイオリアクターにおける複数の細胞の分配方法に関するものである。以下で記載されるように、バイオリアクター内での細胞の分配方法は、バイオリアクターへの細胞の投入、バイオリアクターの回転、及びバイオリアクターのある特定の姿勢における保持を含んでよい。
【００１６】
細胞増殖システム（ＣＥＳ）の一例が、図１Ａに概略的に示される。ＣＥＳ１０は、第１流体循環路１２と第２流体循環路１４とを有する。第１流体流路１６は、中空糸型細胞成長チャンバー２４（「バイオリアクター」とも呼ばれる）に流体的に関連付けられた少なくとも両端部１８、２０を有する。詳細には、端部１８は、細胞成長チャンバー２４の第１入口２２と流体的に関連付けられ、端部２０は、細胞成長チャンバー２４の第１出口２８と流体的に関連付けられる。第１循環路１２において、流体は、細胞成長チャンバー２４に配置された中空糸膜の中空糸の内部を通る（細胞成長チャンバー及び中空糸膜は以下でより詳細に説明される）。また、第１流量コントローラ３０が、第１流体流路１６に動作可能に接続され、第１循環路１２における流体の流れを制御する。
【００１７】
第２流体循環路１４は、第２流体流路３４と、細胞成長チャンバー２４と、第２流量コントローラ３２と、を有する。第２流体流路３４は、少なくとも両端部３６、３８を有する。第２流体流路３４の端部３６は、細胞成長チャンバー２４の入口ポート４０に、端部３８は、出口ポート４２にそれぞれ流体的に関連付けられる。細胞成長チャンバー２４を流れる流体は、細胞成長チャンバー２４の中空糸膜の外側と接触する。第２流体循環路１４は、第２流量コントローラ３２と動作可能に接続される。
【００１８】
このように、第１及び第２流体循環路１２、１４は、中空糸膜によって、細胞成長チャンバー２４において分離されている。第１流体循環路１２の流体は、細胞成長チャンバーにおいて中空糸の毛細管内側（ＩＣ）空間を流れる。従って、第１流体循環路１２を「ＩＣループ」と呼ぶ。第２流体循環路１４の流体は、細胞成長チャンバーにおいて中空糸の毛細管外側（ＥＣ）空間を流れる。従って、第２流体循環路１４を「ＥＣループ」と呼ぶ。第１流体循環路１２の流体は、第２流体循環路１４の流体の流れに対して、並流方向又は逆流方向のどちらを流れてもよい。
【００１９】
流体入口路４４は、第１流体循環路１２に流体的に関連付けられる。流体入口路４４によって、流体は第１流体循環路１２に導入され、流体出口路４６によって、流体は、ＣＥＳ１０から排出される。第３流量コントローラ４８が、流体入口路４４に動作可能に関連付けられる。あるいは、第３流量コントローラ４８は、流体出口路４６に関連付けられてもよい。
【００２０】
ここで使用される流量コントローラとしては、ポンプ、バルブ、クランプ、又はそれらの組み合わせが可能である。複数のポンプ、複数のバルブ、複数のクランプを、任意に組み合わせて配置してもよい。種々の実施形態において、流量コントローラは、蠕動ポンプであるか又は蠕動ポンプを含む。他の実施形態において、流体循環路、入口ポート、出口ポートは、任意の材料の配管で構成されてよい。
【００２１】
種々の部材に対して、「動作可能に関連付けられた」と記載されているが、ここで使用される「動作可能に関連付けられた」とは、動作可能な方式で互いに連結された部材を指し、部材が直接連結されている実施形態や、２つの連結された部材の間に別の部材が配置されている実施形態等も包含する。「動作可能に関連付けられた」部材は、「流体的に関連付けられる」ことができる。「流体的に関連付けられた」とは、流体が部材間を移動可能なように互いに連結された部材を指す。「流体的に関連付けられた」という用語は、２つの流体的に関連付けられた部材間に別の部材を配置する実施形態や、部材を直接接続する実施形態等を包含する。流体的に関連付けられた部材は、流体と接触しないが他の部材と接触することにより、システムを操作する部材を含んでもよい（例えば、可撓性の管の外側を圧縮することにより、該管を介して流体をポンピングする蠕動ポンプ等）。
【００２２】
一般に、緩衝液、タンパク質含有流体、細胞含有流体のように、如何なる種類の流体でも、循環路、入口路、出口路を流れることが可能である。本明細書で使用される用語「流体」「培地」「流体培地」は交換可能に使用される。
【００２３】
図１Ｂは、細胞増殖システム８００をより詳細に示している。ＣＥＳ８００は、第１流体循環路８０２（「毛細管内側ループ」又は「ＩＣループ」とも呼ぶ）と第２流体循環路８０４（「毛細管外側ループ」又は「ＥＣループ」とも呼ぶ）とを有する。第１流体流路８０６は、細胞成長チャンバー８０１に流体的に関連付けられて、第１流体循環路８０２を構成する。流体は、ＩＣ入口ポート８０１Ａを介して細胞成長チャンバー８０１に流入し、細胞成長チャンバー８０１内の中空糸を通って、ＩＣ出口ポート８０１Ｂを介して流出する。圧力センサ８１０は、細胞成長チャンバー８０１を離れる培地の圧力を測定する。圧力の他に、センサ８１０は、作動中において、培地圧力及び培地温度を検知する温度センサであってもよい。培地は、培地流量を制御するために用いられるＩＣ循環ポンプ８１２を介して、流れる。ＩＣ循環ポンプ８１２は、第１方向又は第１方向の反対の第２方向に、流体をポンピング可能である。出口ポート８０１Ｂは、逆方向では、入口として使用することができる。ＩＣループに流入する培地は、バルブ８１４を介して流入することができる。当業者であれば理解できるように、追加のバルブ及び／又は他の装置を種々の位置に配置して、流体経路のある部分において、培地を隔離し及び／又は該培地の特性を測定することもできる。従って、示される概略図は、ＣＥＳ８００の要素に対する１つの可能な構成であり、１以上の実施形態の範囲において、変形可能であると理解されるべきである。
【００２４】
ＩＣループに対して、培地のサンプルは、動作中に、サンプルコイル８１８から得られる。そして、培地は、ＩＣ入口ポート８０１Ａに戻って、流体循環路８０２を完了する。細胞成長チャンバー８０１で成長／増殖した細胞は、細胞成長チャンバー８０１から流し出され、バルブ８９８及びライン８９７を介して収穫バッグ８９９に入る。あるいは、バルブ８９８が閉じている場合、細胞は、チャンバー８０１に再分配され、さらに成長される。
【００２５】
第２流体循環路８０４において、流体は、ＥＣ入口ポート８０１Ｃを介して、細胞成長チャンバー８０１に入り、ＥＣ出口ポート８０１Ｄを介して細胞成長チャンバー８０１を離れる。ＥＣループでは、培地は、細胞成長チャンバー８０１の中空糸の外側と接触し、それによって、チャンバー８０１内における小分子の中空糸への及び中空糸からの拡散が可能となる。
【００２６】
培地が細胞成長チャンバー８０１のＥＣ空間に入る前に、第２流体循環路８０４に配置された圧力／温度センサ８２４によって、該培地の圧力及び温度が測定される。培地が細胞成長チャンバー８０１を離れた後、センサ８２６によって、第２流体循環路８０４の培地の圧力及び温度が測定される。ＥＣループに対して、培地のサンプルは、動作中に、サンプルポート８３０から又はサンプルコイルから得られる。
【００２７】
細胞成長チャンバー８０１のＥＣ出口ポート８０１Ｄを離れた後、第２流体循環路８０４の流体は、ＥＣ循環ポンプ８２８を通って、ガス輸送モジュール８３２に至る。ＥＣ循環ポンプ８２８は、両方向に流体をポンピング可能である。第２流体流路８２２は、ガス輸送モジュール８３２の入口ポート８３２Ａ及び出口ポート８３２Ｂを介してガス輸送モジュール８３２と流体的に関連付けられている。動作中は、流体培地は、入口ポート８３２Ａを介して、ガス輸送モジュール８３２に流入し、出口ポート８３２Ｂを介して、ガス輸送モジュール８３２から流出する。ガス輸送モジュール８３２は、ＣＥＳ８００における培地に対して、酸素を付加し、気泡を除去する。種々の実施形態において、第２流体循環路８０４における培地は、ガス輸送モジュール８３２に入るガスと平衡状態にある。ガス輸送モジュール８３２は、当分野で知られているような、酸素供給又はガス輸送に有用な、適当なサイズの任意の装置でよい。空気又はガスは、フィルタ８４０を介してガス輸送モジュール８３２に流入し、フィルタ８３８を介して、酸素供給器又はガス輸送装置８３２から流出する。フィルタ８３８、８４０は、酸素供給器８３２及び関連する培地の汚染を減少又は防止する。プライミング工程の一部を行っている際にＣＥＳ８００からパージされた空気又はガスは、ガス輸送モジュール８３２を介して大気にベント可能である。
【００２８】
ＣＥＳ８００として示された該構成において、第１流体循環路８０２及び第２流体循環路８０４における流体培地は、同じ方向で（並流構成で）細胞成長チャンバー８０１を流れる。ＣＥＳ８００は、対向流で流れるように構成してもよい。
【００２９】
少なくとも１つの実施形態において、（細胞容器、例えばバッグのようなソースからの）細胞を含む培地は、取り付け点８６２に取り付けられ、培地源からの流体培地は、取り付け点８４６に取り付けられる。細胞及び培地は、第１流体流路８０６を介して第１流体循環路８０２に導入される。取り付け点８６２は、バルブ８６４を介して、第１流体流路８０６と流体的に関連付けられる。取り付け点８４６は、バルブ８５０を介して、第１流体流路８０６と流体的に関連付けられる。試薬源を、点８４４に流体的に関連付けて、バルブ８４８を介して流体入口路８４２に関連付けてもよいし、又はバルブ８４８及び８７２を介して第２流体入口路８７４に関連付けてもよい。
【００３０】
空気除去チャンバー（ＡＲＣ）８５６が、第１循環路８０２に流体的に関連付けられる。空気除去チャンバー８５６は、１以上のセンサを有してもよい。該センサには、空気除去チャンバー８５６内における特定の測定点において、空気、流体の不足、及び／又はガス／流体境界、例えば、空気／流体境界、を検知するための上部センサ及び下部センサが含まれる。例えば、空気除去チャンバー８５６の底部近傍及び／又は頂部近傍で、超音波センサを用いて、それらの場所における空気、流体、及び／又は空気／流体境界を検知することができる。実施形態において、本開示の範囲を逸脱しない範囲で、他のタイプのセンサを使用することができる。例えば、本開示の実施形態に従って、光学センサを使用してもよい。プライミング工程の一部又はその他のプロトコルを行っている際にＣＥＳ８００からパージされる空気又はガスは、空気除去チャンバー８５６と流体的に関連付けられたライン８５８を通って、エアバルブ８６０から大気中へベント可能である。
【００３１】
ＥＣ培地源が、ＥＣ培地取り付け点８６８に取り付けられる。洗浄液源が、洗浄液取り付け点８６６に取り付けられる。これにより、ＥＣ培地及び／又は洗浄液が第１流体流路又は第２流体流路に付加される。取り付け点８６６は、バルブ８７０と流体的に関連付けられる。バルブ８７０は、バルブ８７２及び第１流体入口路８４２を介して第１流体循環路８０２と流体的に関連付けられる。また、バルブ８７０を開け、バルブ８７２を閉じることにより、取り付け点８６６は、第２流体入口路８７４及び第２流体流路８８４を介して第２流体循環路８０４と流体的に関連付けることができる。同様に、取り付け点８６８は、バルブ８７６と流体的に関連付けられる。バルブ８７６は、第１流体入口路８４２及びバルブ８７２を介して第１流体循環路８０２と流体的に関連付けられる。また、バルブ８７６を開け、バルブ８７２を閉じることにより、流体容器８６８は、第２流体入口路８７４と流体的に関連付けることができる。
【００３２】
ＩＣループにおいて、流体はまず、ＩＣ入口ポンプ８５４によって送られる。ＥＣループでは、流体はまず、ＥＣ入口ポンプ８７８によって送られる。超音波センサのようなエア検知器８８０がＥＣ入口路８８４と関連付けられてもよい。
【００３３】
少なくとも１つの実施形態において、第１及び第２流体循環路８０２、８０４は、廃棄ライン８８８と接続される。バルブ８９０を開けると、ＩＣ培地は、廃棄ライン８８８を流れ、廃棄バッグ８８６に至る。同様に、バルブ８９２を開けると、ＥＣ培地は、廃棄バッグ８８６に流れる。
【００３４】
細胞が細胞成長チャンバー８０１にて成長した後、該細胞は、細胞収穫路８９７を介して収穫される。細胞成長チャンバー８０１からの細胞は、バルブ８９８を開けた状態において、細胞を含むＩＣ培地をポンピングすることにより、細胞収穫路８９７を介して、細胞収穫バッグ８９９に収穫される。
【００３５】
ＣＥＳ８００の各部品は、細胞増殖機のような装置又はハウジング内に収容され、該装置は、細胞及び培地を所定温度に維持する。ある実施形態において、ＣＥＳ８００の部品は、ＣＥＳ１０（図１Ａ）又はＣＥＳ９００（図１Ｃ）のような他のＣＥＳと組み合わせてもよい。他の実施形態において、ＣＥＳは、本開示の範囲内において、図１Ａ〜図１Ｃに示されるよりも少ない部品を含んでもよい。
【００３６】
図１Ｃは、ＣＥＳの他の実施形態を示す。ＣＥＳ９００は、第１流体循環路９０２（「毛細管内側（ＩＣ）ループ」とも呼ぶ）と、第２流体循環路９０４（「毛細管外側ループ」又は「ＥＣループ」とも呼ぶ）とを有する。
【００３７】
第１流体流路９０６は、細胞成長チャンバー９０８と流体的に関連付けられて、第１流体循環路９０２を構成する。流体は、入口ポート９１０を通って、細胞成長チャンバー９０８に流入し、細胞成長チャンバー９０８内の中空糸を通り、出口ポート９０７を介して外に出る。圧力計９１７は、細胞成長チャンバー９０８を離れる培地の圧力を測定する。培地は、バルブ９１３及びポンプ９１１を介して流通する。バルブ９１３及びポンプ９１１は、培地の流量を制御するために使用される。培地のサンプルは、動作中に、サンプルポート９０５又はサンプルコイル９０９から得ることができる。第１流体循環路に配置された圧力／温度計９１５によって、動作中における培地圧力及び培地温度が検知できる。培地は、入口ポート９１０に戻って、流体循環路９０２を完了する。細胞成長チャンバー９０８で増殖した細胞は、細胞成長チャンバー９０８から流し出されるか又はさらなる成長のために中空糸内に再分配される。
【００３８】
第２流体循環路９０４は、細胞成長チャンバー９０８とループ状で流体的に関連付けられた第２流体流路９１２を有する。第２流体循環路９０４において、流体は、入口ポート９１４を介して細胞成長チャンバー９０８に入り、出口ポート９１６を介して細胞成長チャンバー９０８を離れる。培地は、細胞成長チャンバー９０８内の中空糸の外側と接触することにより、小分子が、中空糸へ及び中空糸から拡散可能となる。
【００３９】
培地が細胞成長チャンバー９０８のＥＣ空間に入る前に、第２循環路に配置された圧力／温度計９１９によって、該培地の圧力及び温度が測定可能である。培地が細胞成長チャンバーを離れた後、圧力計９２１によって、第２循環路において該培地の圧力が測定可能である。
【００４０】
第２流体循環路９０４において、流体は、細胞成長チャンバー９０８の出口ポート９１６を離れた後、ポンプ９２０及びバルブ９２２を通って、酸素供給器９１８へ至る。第２流体流路９１２は、酸素供給器入口ポート９２４及び酸素供給器出口ポート９２６を介して酸素供給器９１８と流体的に関連付けられる。動作において、流体培地は、酸素供給器入口ポート９２４を通って、酸素供給器９１８に流入し、酸素供給器出口ポート９２６を通って、酸素供給器９１８から流出する。
【００４１】
酸素供給器９１８は、ＣＥＳの培地に酸素を付加する。種々の実施形態において、第２流体循環路９０４の培地は、酸素供給器に入るガスと平衡状態にある。酸素供給器は、当分野で知られる如何なる酸素供給器でもよい。ガスは、フィルタ９２８を通って、酸素供給器９１８に入り、フィルタ９３０を通って、酸素供給器９１８から出る。フィルタ９２８、９３０は、酸素供給器９１８及び関連する培地の汚染を減少又は防止する。
【００４２】
ＣＥＳ９００として示された構成において、第１循環路９０２及び第２循環路９０４における流体培地は、細胞成長チャンバー９０８を同じ方向（並流構成）に流れる。ＣＥＳ９００は、対向流構成にしてもよいことは、当業者であれば理解できよう。また、入口ポート及び出口ポートは、細胞成長チャンバーにおいて如何なる箇所に配置してもよいことは、当業者であれば理解できよう。
【００４３】
細胞と流体培地は、第１流体入口路９３２を介して流体循環路９０２に導入される。流体容器９３４はバルブ９３８を介して、流体容器９３６はバルブ９４０を介して、それぞれ第１流体入口路９３２と流体的に関連付けられる。同様に、細胞容器９４２は、バルブ９４３を介して、第１流体循環路９０２と流体的に関連付けられる。細胞及び流体は、熱交換器９４４、ポンプ９４６を通って、ドリップチャンバー９４８に導入される。ドリップチャンバー９４８は、第１循環路９０２と流体的に関連付けられる。ドリップチャンバー９４８からのオーバーフローは、バルブ９５２を介してオーバーフローライン９５０から流れ出す。
【００４４】
流体容器９５４及び９５６から、流体が、第１及び第２流体循環路９０２、９０４に追加される。流体容器９５４は、バルブ９５８と流体的に関連付けられる。バルブ９５８は、第１流体入口路９６０を介して第１流体循環路９０２と流体的に関連付けられる。第１流体流路は、バルブ９６４を含む。また、流体容器９５４は、第２流体入口路９６２とも流体的に関連付けられる。同様に、流体容器９５６は、バルブ９６６と流体的に関連付けられ、バルブ９６６は、第１流体入口路９６０を介して第１流体循環路９０２と流体的に関連付けられる。また、流体容器９５６は、第２流体入口路９６２とも流体的に関連付けられる。
【００４５】
第２流体入口路９６２は、流体がドリップチャンバー９７０に入る前にポンプ９６８を流れるように構成される。第２流体入口路９６２は、第２流体循環路９０４へと続く。流体のオーバーフローは、バルブ９７４を通って、オーバーフローライン９７２を経由して、廃棄容器９７６へ向かう。
【００４６】
細胞は、細胞収穫路９７８を介して収穫される。細胞成長チャンバー９０８からの細胞は、該細胞を含む培地をポンピングすることにより、細胞収穫路９７８を通って、細胞収穫バッグ９８０へ収穫される。
【００４７】
第１及び第２流体循環路９０２、９０４は、接続路９８４によって、接続される。バルブ９８６を開けると、培地は、接続路９８４を介して、第１循環路９０２と第２循環路９０４との間を流れることができる。同様に、ポンプ９９０は、別の接続路９８８を介して、第１流体循環路９０２と第２流体循環路９０４との間において、培地をポンピングすることができる。
【００４８】
ＣＥＳの各部品は、インキュベーター９９９に収容される。インキュベーター９９９は、細胞及び培地を一定温度に保つ。
【００４９】
当業者であれば理解できるように、任意の数の流体容器（例えば、培地バッグ）を、任意の組み合わせで、ＣＥＳと流体的に関連付けることができる。さらに、ドリップチャンバーの位置又はドリップチャンバーとは独立のセンサの位置は、ＣＥＳにおいて、入口ポート９１０の前の任意の位置にしてよい。
【００５０】
ＣＥＳは、他の部品を含んでもよい。例えば、ＣＥＳにおける蠕動ポンプの位置に、１以上のポンプループ（図示せず）を付加することができる。ポンプループは、例えばポリウレタン（ＰＵ）（Ｔｙｇｏｔｈａｎｅ  Ｃ−２１０Ａとして市販）から形成することができる。また、蠕動ポンプ用の配管ループを含む、配管ラインを構成するためのカセットを、使い捨ての部分として、含んでもよい。
【００５１】
いくつかの実施形態において、着脱可能な流れ回路（「着脱式循環モジュール」とも呼ぶ）を設けてもよい。着脱可能な流れ回路は、ＣＥＳの永久固定された部分に取り付けるように構成された細胞増殖モジュールの一部であってもよい。通常、ＣＥＳの固定部分は、蠕動ポンプを含む。種々の実施形態において、ＣＥＳの固定部分は、バルブ及び／又はクランプを含むことができる。
【００５２】
着脱可能な流れ回路は、少なくとも２つの端部を有する第１流体流路を含むことができる。第１流体流路の第１端部は、細胞成長チャンバーの第１端部と流体的に関連付けられるように構成され、第１流体流路の第２端部は、細胞成長チャンバーの第２端部と流体的に関連付けられるように構成される。
【００５３】
同様に、着脱可能な流れ回路は、少なくとも２つの端部を有する第２流体流路を含むことができる。着脱可能な流れ回路の一部は、酸素供給器及び／又はバイオリアクターと流体的に関連付けられるように構成することができる。着脱可能な流れ回路は、酸素供給器及び細胞成長チャンバーと流体的に関連するように構成される第２流体流路を含むことができる。
【００５４】
種々の実施形態において、着脱可能な流れ回路は、取り外し可能に且つ使い捨て方式で、流量コントローラに取り付けてよい。着脱可能な流れ回路は、ＣＥＳのいくつかの部分に接続する着脱可能な流体管（例えば、可撓性チューブ）を含むことができる。図１Ｅを参照すると、着脱可能な流れ回路は、第１流体循環路１２６の配管を含むが、ポンプは含まない。着脱可能な流れ回路はさらに、バルブを含まずに、フラッシュライン（ｆｌｕｓｈ  ｌｉｎｅ）１３２の配管を含むことができる。着脱可能な流れ回路はさらに、第１循環路１２６をフラッシュライン１３２に接続する配管と、第１流体入口路１２４を含むことができる。その他の変形例では、着脱可能な流れ回路は、培地インレットバッグ１０６、１０８、ベントバッグ１１０、細胞入力バッグ１１２をドリップチャンバー１８６に接続する配管を含むことができる。着脱可能な流れ回路はまた、細胞収穫バッグ１４０を第１循環路１２６に接続する配管を含むことができる。
【００５５】
同様に、着脱可能な流れ回路は、第２循環路１６６を構成する配管を含むことができる。例えば、該配管は、酸素供給器１０４及びドリップチャンバー１８６を細胞成長チャンバー１０２に接続する配管を含むことができる。着脱可能な流れ回路はまた、流体入口路１１４を含むことができる。
【００５６】
他の実施形態において、着脱可能な流れ回路は、細胞成長チャンバーと、酸素供給器と、培地及び細胞を含むバッグとを含む。種々の実施形態において、各部品は、一体に接続されていてもよいし、別体でもよい。さらに、着脱可能な流れ回路は、バルブ、ポンプ及びそれらの組み合わせのような流体流量コントローラが取り付けられるように構成された１以上の部分を含むことができる。蠕動ポンプを使用する形態においては、着脱可能な流れモジュールは、配管の蠕動部分の周りに取り付けられるように構成された蠕動ループを含む。他の実施形態では、蠕動ループは、循環路、入口路、出口路と流体的に関連付けられるように構成される。着脱可能な流れ回路は、ポンプやバルブのような流体流量コントローラへの組み付けのための説明書に従って、キットの形式で組み立てられてもよい。
【００５７】
実施形態においては、細胞をＣＥＳのバイオリアクターに導入するために種々の方法が用いられる。以下で詳細に説明するように、実施形態は、細胞の着実な増殖を促進するために、バイオリアクター内において細胞を分配する方法及びシステムを含む。
【００５８】
実施形態によれば、細胞は、ＩＣループ又はＥＣループにおいて、成長（増殖）される。接着性懸濁細胞及び非接着性懸濁細胞が増殖される。一実施形態において、細胞成長チャンバーの中空糸の内腔は、フィブロネクチンがコーティングされる。二価陽イオンを含まない（例えば、カルシウム及びマグネシウムを含まない）ＰＢＳがＣＥＳシステムに付加される。接着性細胞が細胞成長チャンバー（例えば、チャンバー２４、９０８、８０１）に導入された後、それら細胞が中空糸に付着するように、十分な時間で培養される。ＩＣ及びＥＣ培地は、十分な栄養が細胞に確実に供給されるように、循環させられる。
【００５９】
ＩＣループ及びＥＣループの流量は、ある特定の値に調整される。種々の実施形態において、ＩＣループ及びＥＣループの流量はそれぞれ独立に、約２、約４、約６、約８、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約２００、約３００、約４００、又は約５００ｍＬ／分に設定される。種々の実施形態において、ＩＣ回路ループの流量は、１０〜２０ｍＬ／分に、ＥＣ回路ループの流量は、２０〜３０ｍＬ／分（培地が酸素供給器を流れて酸素レベルを回復可能な程度）に設定される。ガス交換／酸素供給器３０、９１８、８３２のようなガス交換モジュールを通じて蒸発する培地を補うため、追加の培地が、低い流量（例えば、いくつかの実施形態では０．１ｍＬ／分）で、ＣＥＳ内にポンピングされてよい。種々の実施形態において、ＥＣループは細胞廃棄物（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｗａｓｔｅ）を除去し、ＩＣループは培地内に成長因子を含む。
【００６０】
これらＣＥＳは、様々な成長条件及び成長基準において、大きな自由度を提供できる。培地を連続循環させることによって、細胞を、ＩＣループ内において、懸濁状態にしておくことができる。又は、培地循環を停止することで、細胞を沈殿（ｓｅｔｔｌｅ）させることもできる。限外濾過によって、新鮮な培地をＩＣループに付加して、細胞を取り去ることなく、余剰体積を調整することができる。ＥＣ培地循環によって、ガス、栄養、廃棄物の交換を可能とし、また、細胞を取り去ることなく、新しい培地の付加が可能となる。
【００６１】
当分野において、増殖される細胞としては、接着性細胞、非接着性細胞、又はそれら細胞を任意の組み合わせで共培養したものが挙げられる。
【００６２】
実施形態において、接着性細胞を収穫するため、ＩＣ培地及びＥＣ培地を、２価陽イオンを含まない培地（例えば、２価陽イオンを含まないＰＢＳ）に置換する。一実施形態において、トリプシンを第１循環路に投入し、ある時間の間（いくつかの実施形態では、約５分から約１０分）、接着性細胞を培養する。そして、該トリプシンをシステムから排出する。細胞成長チャンバーにおける流量を増やすことによって、細胞にせん断力を付加し、細胞成長チャンバーから放出される接着性細胞を、細胞収穫バッグへポンピングする。
【００６３】
非接着性細胞を増殖する場合、該細胞は、循環しているＩＣ回路から放出することができる。非接着性細胞を取り出しながら、接着性細胞は細胞成長チャンバー内に維持している。
【００６４】
前記ＣＥＳを用いて、様々な細胞増殖方法を実行することができる。
【００６５】
一実施形態において、播種した細胞集団を増殖させることができる。細胞は、ＣＥＳに、導入すなわち播種される。ある状況では、細胞接着が可能となるように、中空糸の内腔状態が調整される。そして、細胞は細胞成長チャンバーに付加され、接着性細胞が中空糸に接着し、非接着性細胞（例えば、造血幹細胞すなわちＨＳＣ）は接着しない。非接着性細胞は、システムから放出される。ある時間の間、培養した後、接着性細胞は、取り離され収穫される。
【００６６】
幹細胞、前駆細胞、及び完全に分化した細胞は全て増殖させることができる。
【００６７】
実施形態において、細胞増殖システムの細胞成長チャンバーは、中空糸膜を有する。該中空糸膜は、複数の半透過性中空糸から構成され、第１流体循環路と第２流体循環路とを分離している。
【００６８】
細胞成長チャンバーの一実施形態が、図２Ａ及び図２Ｂに示される。中空糸型細胞成長チャンバー２００が一部切欠側面図で示されている。細胞成長チャンバー２００は、細胞成長チャンバーハウジング２０２に収納されている。細胞成長チャンバーハウジング２０２は、４つの開口部すなわち４つのポート（入口ポート２０４、出口ポート２０６、入口ポート２０８、出口ポート２１０）を有する。
【００６９】
第１循環路の流体は、入口ポート２０４を通って細胞成長チャンバー２００に入り、複数の中空糸の毛細管内側（中空糸膜の毛細管内側（ＩＣ）又はＩＣ空間とも呼ぶ）を通って、出口ポート２０６を介して細胞成長チャンバー２００から出る。用語「中空糸」、「中空糸毛細管」、及び「毛細管」は、交換可能である。複数の中空糸は集合的に「膜」と呼ばれる。第２循環路の流体は、入口ポート２０８を通って細胞成長チャンバーに入り、中空糸の外側（膜のＥＣ側又はＥＣ空間とも呼ぶ）と接触し、出口ポート２１０を介して細胞成長チャンバー２００から出る。細胞は、第１循環路又は第２循環路に含ませることが可能であり、膜のＩＣ側又はＥＣ側のどちらにも存在させることができる。
【００７０】
細胞成長チャンバーハウジング２０２は、円筒状として図示されているが、当分野で知られるような任意の形状が可能である。細胞成長チャンバーハウジング２０２は、任意のタイプの生体適合性ポリマー材料から作製することができる。細胞成長チャンバーハウジングは、異なる形状、異なるサイズでもよい。
【００７１】
用語「細胞成長チャンバー」が用いられるが、ＣＥＳにおいて成長又は増殖される全ての細胞が細胞成長チャンバーで成長されるとは限らないことは、当業者であれば理解できよう。多くの実施形態において、接着性細胞は、成長チャンバーに配置された膜に接着するか、又は関連する配管内において成長する。非接着性細胞（「懸濁細胞」とも呼ぶ）も同様に成長される。細胞は、第１又は第２流体循環路内の他の領域で成長することもできる。
【００７２】
例えば、中空糸２１２の端部は、接続材（本明細書で「ポッティング」又は「ポッティング材」とも呼ぶ）によって細胞成長チャンバーの側部にポッティングされる。ポッティング材は、培地及び細胞の中空糸内への流れを妨害しないのであれば且つＩＣ入口ポートを介して細胞成長チャンバーに流入する液体を中空糸だけに流入させるようにできるのであれば、中空糸２１２を束ねるのに適する任意の材料でよい。ポッティング材の例として、ポリウレタン又は他の適切な結束材又は接着材が挙げられるが、これらに限定されない。種々の実施形態において、流体がＩＣ側に対して流入及び流出可能となるように、中空糸及びポッティングは、各端部において、中空糸の中心軸に対して垂直に切断されてよい。端部キャップ２１４及び２１６が、細胞成長チャンバーの端部に配置される。
【００７３】
入口ポート２０８を通って細胞成長チャンバー２００に入る流体は、中空糸の外側に接触する。中空糸型細胞成長チャンバーのこの部分は、「毛細管外側（ＥＣ）空間」と呼ばれる。小分子（例えば、水、酸素、乳酸塩等）は、中空糸を通じて中空糸の内部からＥＣ空間へ、又はＥＣ空間からＩＣ空間へ拡散することができる。成長因子のような高分子量の分子は、通常は、大きすぎるため中空糸を通過できず、中空糸のＩＣ空間内にとどまる。細胞をＩＣ空間で成長させる実施形態の場合、ＥＣ空間は、栄養を細胞に供給し細胞代謝の副生成物を取り去るための培地貯蔵部として使用される。培地は、必要であれば交換してもよい。また、必要であれば、培地を酸素供給装置を通じて循環させて、ガスを交換してもよい。
【００７４】
種々の実施形態において、細胞は、注射器を含む任意の方法で、中空糸に投入される。細胞は、細胞成長チャンバーと流体的に関連付けられるバッグのような流体容器から細胞成長チャンバーに導入されてもよい。
【００７５】
中空糸は、毛細管内側空間内で（すなわち、中空糸内腔内で）細胞を成長できるように構成される。中空糸は、培地の中空糸内腔における流れを妨げることなく、細胞が内腔に接着できる程度に十分な大きさである。種々の実施形態において、中空糸の内径は、約１００００、約９０００、約８０００、約７０００、約６０００、約５０００、約４０００、約３０００、約２０００、約１０００、約９００、約８００、約７００、約６５０、約６００、約５５０、約５００、約４５０、約４００、約３５０、約３００、約２５０、約２００、約１５０、又は約１００μｍ以上である。同様に、中空糸の外径は、約１００００、約９０００、約８０００、約７０００、約６０００、約５０００、約４０００、約３０００、約２０００、約１０００、約９００、約８００、約７００、約６５０、約７００、約６５０、約６００、約５５０、約５００、約４５０、約４００、約３５０、約３００、約２５０、約２００、約１５０、又は約１００μｍ以下である。中空糸の壁厚は、いくつかの実施形態において、小分子が拡散するのに十分であるべきである。
【００７６】
中空糸が細胞成長チャンバーの入口ポート及び出口ポートと流体的に関連付けられることができるのであれば、細胞成長チャンバーにおいて、任意の数の中空糸を使用することができる。種々の実施形態において、細胞成長チャンバーは、約１０００、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１００００、約１１０００、又は約１２０００以上の数の中空糸を有する。他の実施形態において、細胞成長チャンバーは、約１２０００、約１１０００、約１００００、約９０００、約８０００、約７０００、約６０００、約５０００、約４０００、約３０００、又は約２０００以下の数の中空糸を有する。他の実施形態において、中空糸の長さは、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、又は約９００ｍｍ以上である。実施形態において、細胞成長チャンバーは、平均長約２９５ｍｍ、平均内径２１５μｍ、平均外径３１５μｍの中空糸を約９０００本、有する。
【００７７】
中空糸は、細胞成長チャンバーの入口ポートから出口ポートへ液体が移動可能な糸（ｆｉｂｅｒ）を形成できる程度に十分なサイズを構成することが可能な任意の材料で構成することができる。種々の実施形態において、中空糸は、接着性幹細胞（例えば、ＭＳＣ）のような、ある特定のタイプの細胞を結合可能なプラスチックの接着性材料から構成可能である。種々の実施形態において、中空糸は、フィブロネクチンのような化合物で処理されて、接着性表面が形成される。
【００７８】
ある実施形態において、中空糸は、半透過性の生体適合性ポリマー材料から作製される。そのようなポリマー材料としては、ポリアミドとポリアリルエーテルスルホンとポリビニルピロリドンの混合物（ここでは、「ＰＡ／ＰＡＥＳ／ＰＶＰ」と呼ぶ）がある。半透過性膜によって、栄養、廃棄物、溶存ガスは該膜を通じてＥＣ空間とＩＣ空間との間で移動可能となる。種々の実施形態において、中空糸膜の分子移動特性は、代謝廃棄生成物が膜を通じて中空糸内腔側に拡散して取り出されるようにすると同時に、細胞成長に必要とされる高価な試薬（成長因子、サイトカイン等）の中空糸からの損失を最小限にするように選択される。
【００７９】
ある変形例では、ＰＡ／ＰＡＥＳ／ＰＶＰ中空糸の外側層は、規定の表面粗さを有する一様な開孔構造によって特徴付けられる。細孔の開口は、約０．５μｍから約３μｍの範囲のサイズであり、中空糸の外側表面の細孔数は、１平方ミリメートル当たり約１０，０００から約１５０，０００の範囲の数である。この外側層は、約１μｍから約１０μｍの厚さを有する。次の層は、スポンジ構造を有する第２層であり、ある実施形態では、約１μｍから約１５μｍの厚さを有する。この第２層は、前記外側層の支持体として機能する。第２層の隣の第３層は、指状構造を有する。この第３層によって機械的安定性が得られ、また、分子の膜移動抵抗が低くなるような高い空隙容量が提供される。使用中は、指状空隙は流体で満たされ、該流体によって、拡散及び対流における抵抗は、空隙容量が小さいスポンジ充填（ｓｐｏｎｇｅ−ｆｉｌｌｅｄ）構造を有するマトリックスの場合よりも、低くなる。この第３層は、約２０μｍから約６０μｍの厚さを有する。
【００８０】
他の実施形態において、中空糸膜は、約６５重量％から約９５重量％の少なくとも１つの疎水性ポリマーと、約５重量％から約３５重量％の少なくとも１つの親水性ポリマーと、を有する。疎水性ポリマーは、ポリアミド（ＰＡ）、ポリアラミド（ＰＡＡ）、ポリアリルエーテルスルホン（ＰＡＥＳ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリスルホン（ＰＳＵ）、ポリアリルスルホン（ＰＡＳＵ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエーテル、ポリウレタン（ＰＵＲ）、ポリエーテルイミド、及びポリエーテルスルホンのような任意の上記ポリマーの共重合体混合物、又はポリアリルエーテルスルホンとポリアミドの混合物からなる群から選択されることができる。親水性ポリマーは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリグリコールモノエステル（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｍｏｎｏｅｓｔｅｒ）、水溶性セルロース誘導体、ポリソルベート、ポリエチレン−ポリプロピレンオキサイド共重合体からなる群から選択されることができる。
【００８１】
細胞成長チャンバーで増殖させる細胞のタイプに応じて、高分子糸は、フィブロネクチンのような物質によって処理され、細胞成長及び／又は細胞の膜への接着が高められる。
【００８２】
ＣＥＳは、回転方向及び／又は横方向揺動装置に取り付けることによって、細胞増殖システムの他の部品に対して細胞成長チャンバーを動かす、すなわち「揺らす」ように構成された装置を有する。図１Ｄは、そのような装置の１つを示す。該装置において、バイオリアクター４００は、２つの回転方向揺動部品と１つの横方向揺動部品とに回転するように接続されている。
【００８３】
第１回転方向揺動装置部品４０２は、バイオリアクターを、バイオリアクターの中心軸４１０を中心に回転させる。バイオリアクターは、横方向揺動装置４０４に対して横方向に動くように接続されている。回転方向揺動装置部品４０２は、バイオリアクター４００に、回転するように関連付けられる。そして、回転方向揺動装置は、バイオリアクター４００を、バイオリアクターの中心軸４１０を中心に回転させる。回転は、時計回り又は反時計回りの方向に可能である。バイオリアクター４００は、中心軸４１０を中心に、単一の方向（時計回り方向又は反時計回り方向）に連続して回転させることができる。あるいは、バイオリアクター４００は、中心軸４１０を中心に、最初は時計回り、続いて反時計回りのように、交互に回転させることも可能である。
【００８４】
ＣＥＳはまた、バイオリアクター４００を回転軸４１２中心に回転させる第２回転方向揺動部品を有する。回転軸４１２は、バイオリアクター４００の中心点を通り、中心軸４１０に対して垂直である。バイオリアクター４００は、回転軸４１２を中心に、時計回り方向又は反時計回り方向のいずれかの単一方向に連続回転可能である。あるいは、バイオリアクター４００は、回転軸４１２を中心に、最初は時計回り、続いて反時計回りのように、交互に回転させることが可能である。種々の実施形態において、バイオリアクター４００を、回転軸４１２を中心に回転させることが可能であり、重力に対して水平方向姿勢に又は垂直方向姿勢に配置することができる。
【００８５】
横方向揺動部品４０４は、バイオリアクター４００と横方向に動くように関連付けられる。横方向揺動部品４０４の平面は、ｘ方向及びｙ方向に動く。これにより、バイオリアクターにおける細胞の沈殿は、中空糸内の細胞含有培地の動きによって、減らされる。
【００８６】
揺動装置の回転方向及び／又は横方向の動きによって、装置内における細胞の沈殿が減らされ、また、バイオリアクターのある部分に細胞が捕獲される可能性も抑えられる。細胞成長チャンバーにおける細胞の沈殿速度は、ストークスの式に従って、細胞と懸濁培地との密度差に比例する。ある実施形態において、上述のように、１８０°回転（速い）と休止（合計時間３０秒）を繰り返すことにより、非接着性の赤血球の懸濁状態を維持する。いくつかの実施形態では、約１８０°の最小回転が行われる。しかしながら、他の実施形態では、３６０°以上の回転を行うこともできる。異なる揺動部品を別個に又は組み合わせて使用してもよい。例えば、バイオリアクター４００を中心軸４１０中心に回転させる揺動部品を、バイオリアクター４００を軸４１２中心に回転させる揺動部品と組み合わせることができる。同様に、異なる軸を中心に時計回り及び反時計回りを独立に組み合わせて行うこともできる。
【００８７】
図３は、他の細胞成長チャンバー例、バイオリアクター３００、の正面図を示す。バイオリアクター３００は、長手方向軸ＬＡ−ＬＡを有し、バイオリアクターハウジング３０４を備える。少なくとも１つの実施形態において、バイオリアクターハウジング３０４は、４つの開口部又は４つのポート、すなわち、ＩＣ入口ポート３０８、ＩＣ出口ポート３２０、ＥＣ入口ポート３２８、ＥＣ出口ポート３３２を有する。
【００８８】
第１循環路内の流体は、バイオリアクター３００の第１の長手方向端３１２におけるＩＣ入口ポート３０８を通ってバイオリアクター３００に進入し、複数の中空糸３１６の毛細管内側（種々の実施形態において、中空糸膜の毛細管内（「ＩＣ」）側又は「ＩＣ空間」と呼ぶ）に進入して通過し、バイオリアクター３００の第２の長手方向端３２４に位置するＩＣ出口ポート３２０を通ってバイオリアクター３００の外に出る。第２循環路内の流体は、ＥＣ入口ポート３２８を通ってバイオリアクター３００に進入し、中空糸３１６の毛細管外側又は外側（該膜の「ＥＣ側」又は「ＥＣ空間」と呼ぶ）に接触して、ＥＣ出口ポート３３２を通ってバイオリアクター３００の外に出る。ＥＣ入口ポート３２８を通ってバイオリアクターに入った流体は、中空糸の外側に接触する。小分子（例えば、水、酸素、乳酸塩等）は、中空糸を通じて中空糸の内部からＥＣ空間へ、又はＥＣ空間からＩＣ空間へ拡散することができる。成長因子のような高分子量の分子は、通常は、大きすぎるため中空糸を通過できず、中空糸のＩＣ空間内にとどまる。培地は、必要であれば交換してもよい。また、必要であれば、培地を酸素供給装置を通じて循環させて、ガスを交換してもよい。細胞は、第１循環路及び／又は第２循環路内に含有させることができ、該膜のＩＣ側及び／又はＥＣ側に存在させることができる。一例として、一実施形態において、バイオリアクター３００は、約２１５×１０-6ｍの内径（ＩＤ）を有する約１１５２０本の糸を有してもよい。
【００８９】
バイオリアクターハウジング３０４は、円筒形状として示されているが、例えば、直方体のように、種々の形状を取ることができる。バイオリアクターハウジング３０４は、任意の種類の生体適合性高分子材料で作製されることができ、該材料は、複数の中空糸３１６のうちの１本以上の中空糸やバイオリアクターハウジング３０４内に存在する流体を観察できるように略透明な材料で作製されてもよい。その他種々のバイオリアクターハウジングは、様々な形状及びサイズを有してよい。
【００９０】
図４は、ＣＥＳ４３０の一部を示す斜視図である。ＣＥＳ４３０の一部は、ＣＥＳ４３０のボディ４０８の後部４３４を含む。明確にするため、ボディ４０８の前部は示さないが、前部は、例えば、蝶番４３８によって後部４３４に取り付けられる。これにより、前部は、ＣＥＳ４３０のバイオリアクター３００にアクセスするために開けることが可能なドア又はハッチを備えることが可能となる。バイオリアクター３００には、配管のためのスプール４１６とサンプリングポート４２０が取り付けられる。バイオリアクター３００の周りの環境は、細胞成長に適した条件となるように温度調整される。
【００９１】
図５は、ＣＥＳを用いた細胞増殖プロセス５００の一実施形態のフローチャートを示す。該プロセスは、以下で記載するように、バイオリアクター３００に細胞を投入・分配することに関する工程を含む。ＣＥＳ４３０の特徴が、プロセス５００のいくつかの工程を実行するように記載されるが、本発明はそれらに限定されない。本明細書では記載されないが、異なる特徴を有する他のＣＥＳが、プロセス５００の他の実施形態において、使用されてもよい。従って、バイオリアクター３００のようなＣＥＳ４３０の特徴に対する言及は、あくまで例示のためであって、プロセス５００が、ＣＥＳ４３０の使用に限定されるものではない。
【００９２】
細胞増殖プロセス５００を始めるため、ステップ５０４において、バイオリアクター３００及び関連する配管、関連する構造を本体４０８に取り付けて、ＣＥＳ４３０を操作可能とする。本体４０８に取り付けたら、ステップ５０８において、生理食塩水のような適当なプライミング流体を用いて、バイオリアクター３００、関連する配管、関連する構造に対して、プライミングを行う。ステップ５１２において、細胞を、バイオリアクター３００に投入・分配する。実施形態において、細胞の投入・分配は、いくつかのサブステップを含む。例えば、ある実施形態において、ステップ５１２は、バイオリアクター３００を開始位置に合わせて配置するサブステップ５１６と、バイオリアクター３００において細胞を投入・分配するサブステップ５２０と、を有する。細胞をバイオリアクター３００に投入・分配した後、ステップ５２８において、細胞増殖が行われる。すなわち、バイオリアクター３００内の細胞を成長及び／又は増殖させる。ステップ５３２において、細胞をバイオリアクター３００に追加する必要があるかどうか、及び／又は、バイオリアクター３００内で細胞を分配させるためにバイオリアクター３００を回転させる必要があるかどうか、について判断が行われる。細胞をバイオリアクター３００に投入する必要がある場合、及び／又は細胞をバイオリアクター３００において分配させる必要がある場合、細胞増殖プロセス５００は、ステップ５１２に戻る。細胞を追加する必要がない場合、及び／又は、バイオリアクター３００を回転させる必要がない場合、ステップ５３６において、細胞増殖ステップ５２８が完了したかどうかが、判断される。ここでは、十分な細胞数及び／又は細胞特徴の変化が達成された場合、細胞増殖プロセスは完了したと判断される。細胞増殖ステップ５２８が完了した場合、ステップ５４０において、細胞は収穫される。細胞増殖ステップ５２８が完了していない場合、細胞増殖ステップ５２８が続けられる。
【００９３】
図５のフローチャートをさらに参照して、ステップ５１２に示されるように、バイオリアクターにおける細胞の投入・分配に関して、さらに詳細に説明が行われる。詳細には、サブステップ５１６において、バイオリアクター３００が開始位置に合わせて配置される。図６に示されるように、少なくとも一実施形態において、バイオリアクター３００において細胞の投入・分配を開始するため、バイオリアクター３００が水平に配置される。すなわち、ステップ５０８において、バイオリアクター３００に対してプライミングが行われた後、サブステップ５１６において、バイオリアクター３００は、長手方向軸ＬＡ−ＬＡが開始位置（例えば、略水平位置）になるように配置される。その後、サブステップ５２０において、複数の細胞がバイオリアクター３００に投入され、バイオリアクター３００が、ある特定のシーケンスで回転させられて（以下で説明される）、バイオリアクター３００内での細胞の分配が促進される。
【００９４】
少なくとも一実施形態において、細胞を運ぶ培地がＩＣ入口３０８からＥＣ出口３３２に向かうような培地の流れを起こすことによって、細胞をバイオリアクター３００のＩＣ側へ（すなわちバイオリアクター３００の中空糸３１６内へ）投入する。また、細胞を運ぶ培地がＥＣ入口３２８からＩＣ出口３２０に向かうような培地の流れを起こすことによって、細胞をバイオリアクター３００のＥＣ側へ（すなわちバイオリアクター３００の中空糸３１６の外側へ）投入してもよい。
【００９５】
バイオリアクター３００内において細胞の分配をよりよくするために必要とされるバイオリアクター３００の動きを決定する際の補助を目的として、一実施形態において、バイオリアクター３００の位置決めの基準を計算するため、一連の計算が行われる。詳細には、バイオリアクター３００を回転させることによって、バイオリアクター３００内の特定の細胞（例えば、骨髄細胞）への重力加速度の影響は、バイオリアクター３００の配置に関連して、変わってくる。細胞に作用する力積を最終的な合計で０とするため、力積（「Ｉ」）の計算を行って、回転の変化を決定し、０°及び２７０°で適当な休止時間をもたせながら力積を相殺する。
【００９６】
まず、バイオリアクター３００内の細胞が受ける加速度に対して考察される。本発明の実施形態の前提として、バイオリアクター３００における細胞の分配と関連付けて、バイオリアクター３００内の特定の細胞に対する重力加速度（ｇ）を相殺させることが望ましい。従って、バイオリアクター３００における細胞の投入・分配に関連付けて、特定の細胞に対する重力の正味の影響が０となるように、バイオリアクター３００の回転シーケンスが探索される。以下の表１は、２つの軸、すなわち、図６に示される、バイオリアクター３００に関連付けられたＴ軸及びＬ´Ｌ´軸、に沿った重力加速度の影響がまとめられている。
【００９７】
【表１】
0006466841.tif 000002
【００９８】
表１において、プラス記号「＋」は、バイオリアクターが表の第１列に示される位置又は回転状態にある場合に、加速度が対応の軸においてプラス方向にあることを示す。マイナス記号「−」は、バイオリアクターが表の第１列に示される位置又は回転状態にある場合に、加速度が対応の軸においてマイナス方向にあることを示す。「０」は、バイオリアクターが表の第１列に示される位置にある場合に、加速度が対応の軸に対して略ゼロである状態を示す。０°は、ＥＣ入口３２８及びＥＣ出口３３２が上方を向いた状態で長手方向軸ＬＡ−ＬＡが水平方向を向いている場合におけるバイオリアクター３００の姿勢として定義される（図６参照）。９０°は、ＥＣ入口３２８及びＥＣ出口３３２が左側を向いた状態で、鉛直の場合として定義される（図７参照）。１８０°は、ＥＣ入口３２８及びＥＣ出口３３２が下方を向いた状態で、長手方向軸ＬＡ−ＬＡが水平方向を向いている場合として定義される（図８参照）。２７０°は、ＥＣ入口３２８及びＥＣ出口３３２が右側を向いた状態で、鉛直の場合として定義される（図９参照）。
【００９９】
バイオリアクター３００における細胞の分配方法は、バイオリアクター３００に投入した細胞に作用する重力による力積の最終的な合計が略０となるようにバイオリアクター３００の姿勢操作を行うステップを含む。少なくとも一実施形態において、バイオリアクターの操作は、バイオリアクター３００を回転して、その後、設定された時間の間、バイオリアクターを動かさずに保持することを含む。少なくとも一実施形態において、バイオリアクター３００を動かさずに保持する時間ｔpは、２ω-1に略等しい。ここで、ωは角速度（ｒａｄ／秒）であり、バイオリアクター３００が回転している間は、略一定である。異なる角速度及び休止時間を用いてもよいことは、当業者であれば理解できよう。
【０１００】
図６は、少なくとも一実施形態において、バイオリアクターを初期開始位置に位置付けた状態が示されている。ここで、バイオリアクターの長手方向軸は略水平である。バイオリアクター３００に細胞を投入する際、バイオリアクター３００に投入された細胞に対する重力の影響を軽減するため、一連の操作が始められる。詳細には、バイオリアクター３００は、第１角速度ωで、略２７０°回転させられる。図７は、９０°回転したバイオリアクター３００を示す。続いて、図８は、１８０°回転したバイオリアクター３００を示す。最後に、図９は、第２の姿勢に位置付けられたバイオリアクターを示す。この状態で、バイオリアクター３００は、ある時間の間、動かさずに保持され、Ｌ´Ｌ´軸のプラス方向に完全に沿った重力が作用する。バイオリアクター３００を適当な時間停止させた後、バイオリアクター３００を再び回転させて、図１０に示すように、原点位置すなわち初期開始位置に戻す。
【０１０１】
当業者であれば理解できるように、回転方向は、１より多くてもよい。さらに、バイオリアクター３００に投入された細胞に対する重力の影響をバランスさせることができるならば、初期開始位置は、１より多くてもよい。従って、ここでの計算、例示及び議論によって、細胞に対する重力の影響の減少、最小化又は除去及びバイオリアクター内における細胞分配の改良を行う目的で、バイオリアクター３００の操作を行うための１以上の構成が提供される。しかしながら、本開示によって内包される他の実施形態及び変形形態の範囲において、本明細書における計算、記載、図面は例示のためであり、本発明を限定するものではない。
【０１０２】
少なくとも一実施形態において、バイオリアクター３００における細胞分配に対する重力の影響は、バイオリアクター３００の角速度によって制御される。詳細には、回転速度又は角速度ω（ｒａｄ／秒）を用いて、バイオリアクター３００内の細胞が受ける重力による力積の最終的な合計をバランスさせる。
【０１０３】
少なくとも一実施形態において、長手方向軸ＬＡ−ＬＡを有するバイオリアクター３００において細胞を分配させる方法は、該長手方向軸ＬＡ−ＬＡを略水平にするか又は水平方向に対して約４５°に向けて、バイオリアクター３００内への細胞の投入・分配を開始するステップと、角度変位量が合計で略５４０°となるようにバイオリアクター３００を回転させるステップと、複数の姿勢において、バイオリアクター３００を動かさずに保持するステップと、を有する。少なくとも一実施形態において、回転の角速度は、バイオリアクターが回転している間は、略一定である。少なくとも一実施形態において、バイオリアクター３００の回転の角速度を、バイオリアクター３００が回転している時間のうちのある期間において、第１角速度ω1から第２角速度ω2に変化させる。
【０１０４】
図１１及び図１２では、チャンバーカップリング６０４によってシャフト組立体６００に接続されたバイオリアクター３００を異なる方向から見た状態が示されている。モータ６０８は、外側シャフト６１２を貫きバイオリアクター３００の長手方向軸に略垂直な回転軸を中心として外側シャフト６１２を回転させる。これにより、図７〜図１０に示すように、バイオリアクター３００は、ピッチモードで回転する。モータ６１６は、外側シャフト６１２内に配置された内側シャフト（図１３参照）を回転させ、チャンバーカップリング６０４内において回転嵌合させて、長手方向軸ＬＡ−ＬＡを中心としてバイオリアクター３００を回転させる。図１３に最もよく示されているように、内側シャフト７００は、チャンバーカップリング６０４内に設けられるロールカラー７０４に係合する構造を有する。内側シャフト部材７００は、内側シャフト部材７００の先端にベベルピニオン７０８を有する。該ベベルピニオン７０８は、内側シャフト部材７００が回転するとロールカラー７０４が回転して、細胞成長チャンバー３００を長手方向軸ＬＡ−ＬＡを中心として回転させるように、ロールカラー７０４の傾斜面７１２と接触する。
【０１０５】
図１４では、細胞成長チャンバーをロールモードで回転する例を示している。図１４では、細胞成長チャンバー３００の側面図が示されており、第１ロール位置（実線で示される）において、ＥＣ入口ポート３２８が鉛直上方を向いている。第２ロール位置（点線で示される）では、ＥＣ入口ポート３２８は下方を向いている。細胞成長チャンバー３００が長手方向軸を中心として任意の角度で回転するように、細胞成長チャンバー３００のロール回転は選択制御可能であることは理解できよう。細胞成長チャンバー３００のロール方向における周期的な回転は、図５のフローチャートに示されるステップ５１２の細胞投入・分配プロセスにおいて細胞コロニーが沈殿することを防止するのに役立つ。
【０１０６】
少なくとも一実施形態において、約２分よりも長い時間で行われる投入・分配ステップにおいて、細胞は、バイオリアクター３００の全体にわたって投入・分配される。少なくとも一実施形態において、投入・分配ステップは、数分にわたって、行われてもよい。投入・分配ステップの間、バイオリアクター３００に対して、複数回の回転シーケンスが行われる。このシーケンスは、細胞投入開始から略全ての細胞がバイオリアクター３００及びそれに関連の配管に投入完了するまで、連続的に行われる。
【０１０７】
少なくとも一実施形態において、バイオリアクター３００には、回転させながら、複数の細胞が投入される。この回転によって、バイオリアクター３００が回転していない場合に比べて、該細胞に作用する重力による力積の最終的な合計が小さくなる。すなわち、該方法は、バイオリアクターにおける複数の細胞に作用する重力による力積の実際の最終的な合計が、バイオリアクターを動かさずに保持した場合の細胞に作用する重力による避けるべき力積の最終的な合計に対して小さくなるように、バイオリアクターの姿勢操作を行うステップを有する。
【０１０８】
少なくとも一実施形態において、複数の細胞に作用する重力による力積の最終的な合計を減らすため、バイオリアクター３００を、少なくとも１８０°回転させる。
【０１０９】
少なくとも一実施形態において、複数の細胞に作用する重力による力積の最終的な合計を減らすため、バイオリアクター３００を、回転軸がバイオリアクター３００の長手方向軸ＬＡ−ＬＡに対して横断方向であるピッチモードで回転させる。少なくとも一実施形態において、複数の細胞に作用する重力による力積の最終的な合計を減らすため、バイオリアクター３００を、回転軸がバイオリアクター３００の長手方向軸ＬＡ−ＬＡに対して略平行であるロールモードで回転させる。ここで、長手方向軸ＬＡ−ＬＡに対して略平行である回転軸は、長手方向軸ＬＡ−ＬＡと一致させることができる。
【０１１０】
少なくとも一実施形態において、バイオリアクター３００からの細胞の収穫は、ここで記載されるように、バイオリアクター３００の姿勢を操作することによって行われる。すなわち、収穫工程の間、細胞に作用する重力による力積の最終的な合計を減らすため、バイオリアクター３００を回転させる。細胞収穫の間におけるバイオリアクターのそのような操作は、細胞の収集効率を改善する。さらに、細胞収穫の間におけるバイオリアクターの該操作は、重力の影響に打ち勝って、細胞がバイオリアクター３００から洗い流されるようになるので、細胞収集数が改善される。
【０１１１】
細胞がバイオリアクターの中空糸の壁に接着せずに懸濁状態で成長される少なくとも１つの実施形態において、バイオリアクター内の細胞に作用する重力の影響を減らすため、バイオリアクターは連続操作される。
【０１１２】
細胞は、複数の方法によって、ＣＥＳに付加される。上述のように、図５において、細胞の投入・分配は、複数のステップ又はサブステップを含む。図２２は、細胞を増殖／成長するためのプロセス１１００を示す。該プロセスは、細胞成長チャンバー又はバイオリアクターにおいて細胞を投入・分配するための複数のステップを有する。以下では、システムの特徴に対して、ステップが説明されるが、本発明は、それらに限定されるものではない。他の実施形態において、ステップはＣＥＳの他の部品によって行われてもよい。従って、プロセス１１００のステップは、ある特定の構造だけによって行われることに、限定されない。
【０１１３】
プロセス１１００は、１１０４から始まる。ステップ１１０８において、細胞が、細胞成長チャンバーを循環する流体に付加される。一実施形態において、細胞は、バイオリアクター（例えば、バイオリアクター３００）の毛細管内側（「ＩＣ」）空間ループに投入され、循環させることによって、均一に懸濁される。ＩＣループにおける流体は循環しながら、細胞がＩＣ空間ループへ付加される。ステップ１１１２において、細胞を、第１レートにて、細胞成長チャンバー内で循環させる。流体の循環は、循環ポンプによって行うことができる。
【０１１４】
ステップ１１１６において、所定の時間の間、該循環レートが維持される。いくつかの実施形態において、細胞を導入する場合（例えば、ステップ１１０８）、循環ポンプは、流体を、１つのレートで、ＩＣループ内を循環させ、細胞導入後は、より高い第２レートで、流体を循環させる。これら実施形態において、ステップ１１１６は、循環を、より高い第２レートに維持することを含む。
【０１１５】
細胞が一様に懸濁されたら、循環レートを下げるためのステップ１１２０が行われる。ステップ１１２０は、循環ポンプのレートを下げる又は循環ポンプを完全に停止することを含む。どんな場合でも、流体の循環レートは、ステップ１１２０において、下げられる。ステップ１１２４において、細胞を沈殿させる。上記から分かるように、細胞は、システム（例えば、ＣＥＳ１０、９００、８００）全体にわたって、略均一に分配される。ステップ１１２４において、バイオリアクター内にある細胞はバイオリアクター内に沈殿すると共に、バイオリアクター外にある細胞はバイオリアクター外に沈殿する。
【０１１６】
ステップ１１２８において、ステップ１１２４においてバイオリアクターに沈殿した細胞が、バイオリアクターにて増殖される。ステップ１１２８は、培地や他の栄養分のような流体をバイオリアクターへ循環させて、細胞成長を促進することを含む。バイオリアクターの外側で沈殿した細胞は、成長を促進する条件にはないので、廃棄状態である。従って、ステップ１１３２において、ステップ１１２４にてバイオリアクターの外側で沈殿した細胞が廃棄される。ここで、用語「廃棄状態」は、細胞が、バイオリアクター内に生じる、細胞成長促進のために最適化された条件にさらされていないことを意味する。従って、廃棄状態の細胞は、バイオリアクターにおいて増殖されず、いくつかの実施形態では、廃棄状態の細胞は、ＣＥＳを循環する流体において、死滅し、及び／又は洗い出される。場合によっては、廃棄状態の細胞は、ＣＥＳの別の部分において増殖又は成長され、さらには収穫されてもよいが、それら細胞は、バイオリアクター内の細胞と同一の、成長のために最適化された条件にはさらされていない。ステップ１１３６において、プロセスが終了する。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、プロセス１１００は、バイオリアクターの容積が、細胞を含む部分の容積（例えば、ＩＣループの容積）の約６５％から約７０％（例えば、６９％）であるシステムにおいて実行される。細胞がステップ１１２４において沈殿すると、細胞の約３０％から約３５％（例えば、３１％）（ＩＣループの外側の容積にある細胞）が廃棄されるであろう。
【０１１８】
プロセス１１００の実施形態によれば、バイオリアクターにおいて分配される細胞は、バイオリアクターにおいて通常は均一に分配されるので、細胞の分配状況にあまり影響されない。廃棄状態の細胞の損失は、従来の細胞投入方法に比べて、増殖した細胞の数を減らすことにはならない。
【０１１９】
バイオリアクターにおける従来の細胞投入方法では、バイオリアクター内ではないＩＣループの容積において沈殿した細胞を、バイオリアクター内の容積に押し入れようとするステップが行われていた。ＩＣループにおける液体の循環を変更することで、流体を入口ライン及び出口ラインからバイオリアクターの入口端及び出口端の両方に流すことによって、細胞を該ラインからバイオリアクター内に追い込んでいた。理論に束縛されるものではないが、これによって、バイオリアクター内の細胞の量は増加するが、細胞の均一な分配にはならないと考えられる。上記した方法（プロセス１１００）によって与えられる細胞の均一な分配であれば、これまでの方法と比べて、細胞増殖のためのよりよい環境が構築され、バイオリアクター内に分配された細胞の初期量の少ない分を補える。
【０１２０】
上記で説明してきた方法は、あくまで例示のためのものである。他の変形は、本発明の範囲内で行われる。例えば、ＩＣループは、バイオリアクター内に堆積（ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ）する細胞のパーセンテージが、ＣＥＳのＩＣループに導入される細胞の約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、又は約９５％以上であってよい。いくつかの実施形態において、ＣＥＳのＩＣループは、バイオリアクターに堆積する細胞の量が、ＣＥＳのＩＣループに導入される細胞の約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、又は約６０％以下であってよい。
【０１２１】
上述したように、いくつかの実施形態において、循環ポンプの循環レートは、プロセス１１００の種々のステップを通じて変更することができる。例えば、循環レートを、ステップ１１０８において細胞をＩＣループに導入する際は、第１レートとする。そして、細胞をＩＣループに導入した後は、循環レートを増やす。他の実施形態において、細胞をＩＣループに導入する際は、循環ポンプをＯＦＦにするか又は低い循環レートとして、細胞導入後は、ポンプをＯＮするか又は循環レートを増やす。本発明の方法のステップにおける、ＩＣループの循環レートは、約２５ｍｌ／分、約５０ｍｌ／分、約７５ｍｌ／分、約１００ｍｌ／分、約１２５ｍｌ／分、約１３０ｍｌ／分、約１３５ｍｌ／分、約１４０ｍｌ／分、約１４５ｍｌ／分、又は約１５０ｍｌ／分以上である。本発明の方法のステップにおける、ＩＣループの循環レートは、約４００ｍｌ／分、約３７５ｍｌ／分、約３５０ｍｌ／分、約３２５ｍｌ／分、約３００ｍｌ／分、約２７５ｍｌ／分、約２５０ｍｌ／分、約２２５ｍｌ／分、約２００ｍｌ／分、約１７５ｍｌ／分、約１７０ｍｌ／分、約１６５ｍｌ／分、約１６０ｍｌ／分、約１５５ｍｌ／分、約１５０ｍｌ／分、約１４５ｍｌ／分、又は約１４０ｍｌ／分以下である。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、ＩＣループの循環によってＩＣループ容積内の細胞を均一に分配することに加えて、循環ポンプをＯＦＦにする前に、又は低い循環レートに設定する前に、バイオリアクターを回転させて細胞をさらに均一に懸濁させてもよい。バイオリアクターの回転は、細胞をＩＣループ容積に導入する前に、導入している間に、及び／又は導入した後に、図３から図１４に関して記載したように実行してもよい。
【実施例】
【０１２３】
本実施例では、ｈＭＳＣ細胞が、上述した方法と同様の投入・分配方法を用いて、バイオリアクターにて増殖される。
【０１２４】
第０日目から第５日目の細胞増殖：１３．６Ｍから１７７Ｍ；ＣＶ＝１０％；ｄＴ＝３２．７時間
【０１２５】
第５日目から第６日目の増殖：１７７Ｍから２９６Ｍ；ＣＶ＝１０％；ｄＴ＝３２．４時間
【０１２６】
第６日目から第７日目の増殖：２９６Ｍから４０８Ｍ；ＣＶ＝１％；ｄＴ＝５１．７時間
【０１２７】
細胞フラスコ培養において、第７日目で約８０％のコンフルエンス、収穫は２０，１６０細胞数／ｃｍ2。ＣＥＳにおいて、第７日目で、収穫は１９，４２９細胞数／ｃｍ2。これは、バイオリアクターにおいてコンフルエンスが約８０％であることを表していると考えられる。
【０１２８】
コンフルエンスが約８０％を示していること、第６日目から第７日目までの細胞倍化時間の伸び（３２時間から５１時間）及びＣＶ％の減少は、細胞成長が細胞間相互作用によって減速され、バイオリアクターの能力が、この細胞集団に対する最大値に近づきつつあることを示している。
【０１２９】
図１５は、従来の方法を用いて投入・分配した細胞に対して、細胞収穫数を乳酸塩生成レートの関数として示している。図１６は、上述の方法と合致する方法（例えば、プロセス１１００の実施形態のような本発明の実施形態）を用いて投入・分配した細胞に対して、細胞収穫数を乳酸塩生成レートの関数として示している。図１５と図１６を比較すると、一様に増殖する（すなわち、播種の際、良く分配させた）細胞集団とレートとの関係において、収穫数が予測しやすくなっていることがわかる。
【０１３０】
図１７及び図１８は、上述の方法（すなわち、プロセス１１００のような本発明の実施形態）に従って投入・分配した細胞のデータを示す。図１７は、乳酸塩の生成、図１８は、グルコースの消費を、それぞれ示す。図１７及び図１８は、各プロセス間（ｒｕｎ−ｔｏ−ｒｕｎ）において高い一致性を示している。図１７及び図１８は、倍化時間：フラスコ培養ＣＶ％＝９．４、本発明の実施形態ＣＶ％＝２．４；及び収穫時の細胞数／ｃｍ2：フラスコ培養ＣＶ％＝２８．０、本発明の実施形態ＣＶ％＝１０．２を示す。細胞集団の指数関数的な成長は、均一な細胞分配を示している（特に７日間の増殖）。
【０１３１】
図１９及び図２０は、従来の方法を用いて投入・分配した細胞のデータを示す。図１９及び図２０は、比較のために示される。回帰分析による図１９及び図２０のデータの最適なフィッティングが「べき乗」の回帰線であるということは、乳酸塩濃度が「一定に」増加していることを示している。一方、本発明の実施形態に係る方法では、図１７及び図１８に示したように、指数関数的に増加している。
【０１３２】
図２１は、本発明の実施形態が実行される基本的なコンピュータシステム１２００の構成要素例を示す。コンピュータシステム１２００は、細胞を投入・分配する方法のいくつかのステップを実行する。システム１２００は、増殖のために細胞を投入・分配する上述のＣＥＳシステム１０、８００、９００の構成要素や特徴事項（例えば、流量制御装置、ポンプ、バルブ、バイオリアクターの回転等）を制御するためのコントローラである。
【０１３３】
コンピュータシステム１２００は、出力装置１２０４、及び／又は入力装置１２０８を有する。出力装置１２０４は、ＣＲＴ、ＬＣＤ、プラズマディスプレイのような、１以上のディスプレイを有してよい。出力装置１２０４は、プリンター、スピーカ等を有してもよい。入力装置１２０８は、キーボード、タッチ式入力装置、マウス、音声入力装置等を含んでよい。
【０１３４】
本発明の実施形態において、基本的なコンピュータシステム１２００は、処理装置１２１２、及び／又はメモリ１２１６を有してもよい。処理装置１２１２は、メモリ１２１６に記憶された命令を実行するために動作可能な汎用プロセッサであってよい。処理装置１２１２は、本発明の実施形態では、単一のプロセッサ又は複数のプロセッサを含んでよい。さらに、各プロセッサは、別個に命令を読み込んで実行するための１以上のコアを有するマルチコアプロセッサが可能である。プロセッサは、汎用プロセッサ、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ）、その他の集積回路を含んでよい。
【０１３５】
本発明の実施形態において、メモリ１２１６は、データ及び／又はプロセッサが実行可能な命令を短期に又は長期に記憶する任意の有形媒体を含んでよい。メモリ１２１６は、例えば、ランダム・アクセス・メモリ（ＲＡＭ）、リード・オンリ・メモリ（ＲＯＭ）、又は電気的消去・プログラム可能型リード・オンリ・メモリ（ＥＥＰＲＯＭ）を含む。他の記憶媒体としては、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、テープ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、又は、他の光学装置、テープ、磁気ディスク装置、磁気テープ、その他の磁気記憶装置等がある。実施形態において、システム１２００を使用して、バイオリアクター３００の回転、及び／又はＣＥＳシステムの種々の流量制御装置、ポンプ、バルブ等を制御する。メモリ１２１６は、循環ポンプ、バルブ、バイオリアクターの回転等の操作を制御する、バイオリアクターにおいて細胞を投入・分配するためのプロトコル及びプロシージャのような、プロトコル１２２０及びプロシージャ１２２４を記憶することができる。
【０１３６】
記憶装置１２２８は、任意の長期データ記憶装置又は部品である。本発明の実施形態において、記憶装置１２２０は、メモリ１２１６と関連して記載されたシステムのうちの１以上を含んでよい。記憶装置１２２８は、常設してもよいし、取り外し可能でもよい。システム１２００は、ＣＥＳシステムの一部分であり、記憶装置１２２８は、ＣＥＳシステムを利用するための種々のプロトコルを記憶できる。
【０１３７】
種々の構成要素は、ここにおいて、「動作可能に関連付けられている」と言及される場合がある。ここに使用される「動作可能に関連付けられている」とは、構成要素が動作可能な方式で相互に結合されていることを指し、これは、構成要素が直接結合された実施形態及び２つの結合された構成要素の間に付加的な構成要素が置かれる実施形態をも包含する。
【０１３８】
本発明は、その趣旨又は必須の特徴から逸脱することなく、他のいろいろな形態で実施することができる。そのため、前述した実施形態は、あらゆる点で単なる例示にすぎず、限定的に解釈してはならない。従って、本発明の範囲は、明細書本文ではなく、特許請求の範囲によって示すものである。さらに、特許請求の範囲の均等範囲に属する改変や変更は、全て本発明の範囲内のものである。
【０１３９】
種々の実施形態において、本発明は、ここで示され記載されたような構成要素、方法、処理、システム及び／又は装置を含み、また種々の実施形態、それら一部の結合、それら一部の組合せを含む。本開示を理解する当業者であれば、本発明がどのようになされ、どのように使用されるかは理解されよう。
【０１４０】
種々の実施形態において、本発明は、ここでは記載されていない要素を含まない場合の装置及びプロセスを提供することも含み、（例えば、性能向上、実施容易性の達成、実施コストの低減等のための）従来の装置又はプロセスに用いられてきたかもしれない要素を含まない場合の装置及びプロセスを提供することも含む。
【０１４１】
本発明の上述の記載は、本発明を例示する目的でなされたものであり、本発明を、ここに記載した形態に限定するものではない。上述の詳細な説明において、本発明の種々の特徴は、本発明の開示の理解容易性のために、一以上の実施形態にグループ化されている。しかしながら、このような開示の手法は、各請求項の範囲に明示される特徴より多くの特徴を本発明が必要とするという意図があると解釈されるべきではない。むしろ、本出願の請求項の範囲が記載するように、本発明の態様は、ここで開示した一実施形態の全ての特徴よりは少ない。従って、請求項の範囲は、詳細な説明に含まれるものであり、各請求項の範囲は、本発明の好ましい実施形態とは離れて、それ自身で成り立つものである。
【０１４２】
さらに、本発明の記載は、１以上の実施形態及びある変更形態、ある改変形態の記載を含むが、その他の変更形態、改変形態も本発明の範囲にある（例えば、本発明を理解した後の当業者の技能及び知識の範疇なので、当業者であれば理解できよう）。許容される範囲において、すなわち他の、交換可能な、及び／又は同等な、構造、機能、範囲、工程が、開示されているか否かにかかわらず、特許可能な主題を公にすることだけを意図しているのではなく、そのような構造、機能、範囲、工程を有する他の実施形態をも含む権利を取得することを意図する。
【図１Ａ】
0006466841.tif 000003
【図１Ｂ】
0006466841.tif 000004
【図１Ｃ】
0006466841.tif 000005
【図１Ｄ】
0006466841.tif 000006
【図１Ｅ】
0006466841.tif 000007
【図２Ａ】
0006466841.tif 000008
【図２Ｂ】
0006466841.tif 000009
【図３】
0006466841.tif 000010
【図４】
0006466841.tif 000011
【図５】
0006466841.tif 000012
【図６】
0006466841.tif 000013
【図７】
0006466841.tif 000014
【図８】
0006466841.tif 000015
【図９】
0006466841.tif 000016
【図１０】
0006466841.tif 000017
【図１１】
0006466841.tif 000018
【図１２】
0006466841.tif 000019
【図１３】
0006466841.tif 000020
【図１４】
0006466841.tif 000021
【図１５】
0006466841.tif 000022
【図１６】
0006466841.tif 000023
【図１７】
0006466841.tif 000024
【図１８】
0006466841.tif 000025
【図１９】
0006466841.tif 000026
【図２０】
0006466841.tif 000027
【図２１】
0006466841.tif 000028
【図２２】
0006466841.tif 000029