(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的の増幅および検出を集積したマイクロ流体装置であって、
マイクロチップを備え、
前記マイクロチップは、
少なくとも１つの試料リザーバと、
前記マイクロチップを少なくとも１つの増幅チャンバに接続するように構成された少なくとも１つの接続構造と、
少なくとも１つの試薬リザーバと、
少なくとも１つの混合リザーバと、
前記マイクロチップから取り外し可能である少なくとも１つの増幅チャンバと、
少なくとも１つの検出チャンバとを含み、前記少なくとも１つの検出チャンバは、前記マイクロチップから取り外し可能であり、
前記少なくとも１つの試薬リザーバは、前記少なくとも１つの混合リザーバに接続され、
前記少なくとも１つの混合リザーバは、前記少なくとも１つの検出チャンバに接続される、マイクロ流体装置。
【請求項２】
前記少なくとも１つの試料リザーバは、前記少なくとも１つの増幅チャンバに接続され、
前記少なくとも１つの増幅チャンバは、前記少なくとも１つの混合リザーバに接続される、請求項１に記載のマイクロ流体装置。
【請求項３】
前記少なくとも１つの増幅チャンバは、前記少なくとも１つの接続構造を介して、前記マイクロチップ上に組み立てられ、
前記少なくとも１つの接続構造は、１つ以上の接続部を含む、請求項１または２に記載のマイクロ流体装置。
【請求項４】
前記少なくとも１つの試料リザーバは、前記マイクロチップ上に設けられ、試料を収容するためのリザーバと、前記試料リザーバ上に設けられた取り外し可能な蓋とを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のマイクロ流体装置。
【請求項５】
前記取り外し可能な蓋は、空気入口と、前記蓋の内側に取り付けられ、内側から前記空気入口を覆うための疎水性通気膜とを含む、請求項４に記載のマイクロ流体装置。
【請求項６】
前記少なくとも１つの試料リザーバは、前記マイクロチップに設けられた第１流路、第１接続部、第１弾性チューブ、またはそれらの組み合わせを介して、前記少なくとも１つの増幅チャンバに接続され、
前記第１流路は、前記流路の開閉を制御するバルブを含み、
前記第１接続部は、ネジ付き接管、スリーブ接続部または鋳造接続部であり、
前記第１弾性チューブは、シリコーン、プラスチックまたはゴムを含み、
前記バルブは、弾性バルブ、相変化バルブまたはトルクバルブである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のマイクロ流体装置。
【請求項７】
前記少なくとも１つの増幅チャンバは、前記マイクロチップに設けられた第２流路、第２接続部、第２弾性チューブ、またはそれらの組み合わせを介して、前記少なくとも１つの混合リザーバに接続され、
前記第２流路は、前記流路の開閉を制御するバルブを含み、
前記第２接続部は、ネジ付き接管、スリーブ接続部または鋳造接続部であり、
前記第２弾性チューブは、シリコーン、プラスチックまたはゴムを含み、
前記バルブは、弾性バルブ、相変化バルブまたはトルクバルブである、請求項６に記載のマイクロ流体装置。
【請求項８】
前記少なくとも１つの試料リザーバは、前記マイクロチップに設けられた前記第１流路に接続され、
前記第１流路は、前記第１接続部に接続され、
前記第１接続部は、前記第１弾性チューブに接続され、
前記第１弾性チューブは、前記少なくとも１つの増幅チャンバに接続され、
前記少なくとも１つの増幅チャンバは、前記第２弾性チューブに接続され、
前記第２弾性チューブは、前記第２接続部に接続され、
前記第２接続部は、前記マイクロチップに設けられた前記第２流路に接続され、
前記第２流路は、前記少なくとも１つの混合リザーバに接続される、請求項７に記載のマイクロ流体装置。
【請求項９】
前記少なくとも１つの検出チャンバは、前記マイクロチップに設けられた第１導入流路を介して、導入流路開口に接続され、
前記少なくとも１つの検出チャンバは、前記マイクロチップに設けられた第２導入流路に接続され、
前記マイクロチップに設けられた前記第２導入流路は、前記マイクロチップに設けられた第３流路を介して、前記少なくとも１つの混合リザーバに接続される、請求項１〜８のいずれか１項に記載のマイクロ流体装置。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの試薬リザーバは、前記マイクロチップに設けられた第４流路を介して、前記少なくとも１つの混合リザーバに接続され、
前記第４流路は、前記流路の開閉を制御するバルブを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のマイクロ流体装置。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの試薬リザーバは、前記マイクロチップ上に設けられ、少なくとも１つの試薬を収容するためのリザーバと、前記試薬リザーバ上に設けられた取り外し可能な蓋とを含み、
前記取り外し可能な蓋は、空気入口と、前記蓋の内側に取り付けられ、内側から前記空気入口を覆う疎水性通気膜とを含み、
前記少なくとも１つの試薬は、核酸ハイブリッドを形成するための試薬である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のマイクロ流体装置。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの検出チャンバは、試料から少なくとも１つの標的分子を検出するためのアレイを含み、
前記アレイは、核酸マイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、組織マイクロアレイ、抗体マイクロアレイ、またはそれらの組み合わせである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のマイクロ流体装置。
【請求項１３】
前記マイクロ流体装置は、支持プラットフォームをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のマイクロ流体装置。
【請求項１４】
前記支持プラットフォームは、熱伝導性材料を含み、
前記支持プラットフォームは、前記少なくとも１つの増幅チャンバを封入するまたは埋入するための少なくとも１つの溝を備えた板を含む、請求項１３に記載のマイクロ流体装置。
【請求項１５】
前記支持プラットフォームは、前記マイクロチップに集積された一部であるまたは前記マイクロチップから取り外し可能である、請求項１３または１４に記載のマイクロ流体装置。
【請求項１６】
制御サブシステムをさらに含み、
前記制御サブシステムは、流体制御サブシステム、光学サブシステムおよび／または熱制御サブシステムを含み、
前記流体制御サブシステムは、前記導入流路開口、前記排出流路開口、および／または前記混合リザーバ開口に直接接続される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のマイクロ流体装置。
【請求項１７】
前記流体制御システムは、双方向バルブを介して、前記排出流路開口および前記混合リザーバ開口の両方に接続されたポンプを含む、請求項１６に記載のマイクロ流体装置。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの混合リザーバの容積は、前記少なくとも１つの試料リザーバおよび前記少なくとも１つの試薬リザーバの合計容積よりも大きい、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のマイクロ流体装置。
【請求項１９】
標的の増幅および検出を集積した方法であって、
（１）標的を含有するまたは標的を含有する疑いのある試料を請求項１〜１８のいずれか１項に記載の前記マイクロ流体装置の少なくとも１つの試料リザーバに添加し、前記少なくとも１つの試料リザーバを封止することと、
（２）少なくとも１つの試薬を少なくとも１つの試薬リザーバに添加し、前記少なくとも１つの試薬リザーバを封止することと、
（３）前記マイクロ流体装置を動作させ、前記試料を少なくとも１つの増幅チャンバに移送し、前記標的が前記試料中に存在する場合、前記標的の増幅反応を行うことと、
（４）前記マイクロ流体装置を動作させ、前記増幅反応の産物を前記少なくとも１つの混合リザーバに移送することと、
（５）前記マイクロ流体装置を動作させ、前記少なくとも１つの試薬を前記少なくとも１つの混合リザーバに移送し、前記増幅反応の前記産物と混合することによって、混合物を形成することと、
（６）前記マイクロ流体装置を動作させ、前記混合物を前記少なくとも１つの検出チャンバに移動することによって、ハイブリダイゼーション反応を行うことと、
（７）前記ハイブリダイゼーション反応の産物を検出することとを含み、前記ハイブリダイゼーション反応の産物の存在、不存在または量は、前記試料中に前記標的の存在、不存在または量を表し、
前記標的は、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは小分子である、方法。
【請求項２０】
前記試料は、結合組織、上皮組織、筋肉組織または神経組織、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、腺体および内部血管からなる群から選択される組織、または血液、尿、唾液、骨髄、精子、腹水、およびそれらの亜分画物からなる群から選択される体液から取得される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１４年３月３１日出願された中国特許出願第２０１４１０１２６５１５．６号の優先権利益を主張し、当該中国特許出願のすべての内容があらゆる目的のために参照により本明細書に援用される。
【０００２】
技術分野
いくつかの態様において、本開示は、生体分子を解析するための方法および装置に関する。特定の態様において、本開示は、（例えば、マイクロアレイを使用して）核酸の増幅および検出を行うための集積マイクロ流体装置、および当該集積マイクロ流体装置を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
分子診断の発展に伴い、核酸解析は、臨床検査、司法鑑識、食品検査および学術研究などの分野に広く応用されている。核酸解析に与えられた試料の量が通常少なく、試料中の標的分子の量も通常微量であるため、検出または定量する前に、しばしば、標的ヌクレオチド配列を増幅する必要がある。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、よく使用されているＤＮＡの特定の断片を増幅する技術のうち１つである。ＤＮＡは、増幅されると、さまざまな技術、例えばリアルタイム蛍光検出、ゲル電気泳動、毛細管電気泳動およびマイクロアレイ検出によって検出することができる。マイクロアレイ技術は、試料内の複数の特定の標的ＤＮＡ配列を高感度で且つ同時に測定することができるため、診断に広く使用される。従来のマイクロアレイ解析方法は、以下の処理工程、すなわち、核酸を増幅する工程、増幅産物をハイブリダイゼーション試薬と混合する工程、混合物をハイブリダイゼーションチャンバに移送する工程、ハイブリダイゼーション反応を保温する工程、洗浄工程および検出工程を必要とする。さまざまな市販装置、例えばマイクロアレイハイブリッド形成装置、清浄装置およびマイクロアレイスキャナを利用して、各々の処理工程を行うことができる。しかしながら、各処理工程を行うために、対応する装置が必要され、実験中に試料を添加および／または移送するために、並びに１つの装置から別の装置に試料を移送するために、手動操作が必要される。増幅された産物をマイクロアレイチャンバに移送する間に、増幅されたＰＣＲ産物は、空気に曝されるため、試料の交差汚染を引き起こす可能性が高い。したがって、ＰＣＲ産物の移送汚染を排除または低減することができるように、増幅機能および検出機能の両方を備える集積装置が望まれる。
【０００４】
一種類の装置は、ロボットアームを使用して、核酸の増幅、ハイブリダイゼーションの検出、増幅前に核酸の精製を含む異なる反応工程に、試薬および／または試料を移送する。この種類の装置の例として、Trusentry（商標）システム（Akonni Biosystems社）、およびProve-it（商標）StripArray（Mibidiag社）が挙げられる。しかしながら、これらの装置は、開放システムで溶液を移送するため、開放システムに交差汚染を引き起こす可能性がある。
【０００５】
閉鎖環境で核酸を解析するためのいくつかのカセットまたはマイクロ流体装置が知られている。これらの装置は、増幅およびマイクロアレイハイブリダイゼーションを行う機能を可能にするために、複数の素子および構造体を集積している。例えば、ＵＳ２０１０／０２９１６６８は、iCubateシステム（Icubate社）を開示している。このシステムは、試薬チャンバ、検出チャンバおよびカセット移液管を含むカセットを使用して、試料を移送する。この移液管は、外部ベースユニットの制御によって、カセット内で垂直方向および水平方向に沿って移動することができる。ＵＳ２０１３／０１３０２６７は、Unyvero（商標）溶液システム（Curetis AG社）を開示している。このシステムは、固定したマイクロアレイプローブを有する特殊多孔質膜を上面に設けた反応容器を用いて、ＰＣＲを行う。空気圧で液体を上下に移動するように制御することによって、ハイブリダイゼーションを行う。ＵＳ８８５２９１９は、Rheonix CARD（商標）システム（Rheonix社）を開示している。このシステムは、膜系バルブおよび気圧ポンプを用いて、マイクロ流体装置上に組み立てられた異なるチャンバの間に行われる試薬の移送を制御する。これらの装置は、小さい一方、複雑な形状を有することが多い。また、これらの装置の流体操作が複数あり、達成困難である。さらに、熱サイクル中、これらの装置の精細構造に歪みを生じさせることなく高圧力に耐えるように、複雑な製造技術を用いて、マイクロ流体装置を接続する必要がある。したがって、流体の処理および装置の製造が簡単で且つ安価であるマイクロ流体装置が必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概要
概要は、特許請求の範囲に記載の主題の範囲を限定するために用いられることを意図していない。特許請求の範囲に記載の主題の他の特徴、詳細、用途および利点が、添付の図面および添付の請求項に開示された態様を含む詳細な説明から明らかになるであろう。
【０００７】
一態様において、標的の増幅および検出を集積したマイクロ流体装置は、本明細書に開示される。この装置は、マイクロチップを備える。マイクロチップは、少なくとも１つの試料リザーバと、マイクロチップを少なくとも１つの増幅チャンバに接続するように構成された少なくとも１つの接続構造と、少なくとも１つの試薬リザーバと、少なくとも１つの混合リザーバと、少なくとも１つの検出チャンバとを含む。少なくとも１つの試薬リザーバは、少なくとも１つの混合リザーバに接続され、少なくとも１つの混合リザーバは、少なくとも１つの検出チャンバに接続される。一実施形態において、マイクロチップは、マイクロチップを少なくとも１つの増幅チャンバに接続するように構成された少なくとも１つの接続構造を含む。上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つの増幅チャンバは、取り外し可能であり、少なくとも１つの接続構造、例えばマイクロチップ上の１つ以上の接続部を介して、マイクロチップ上に組み立てることができる。上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つの試料リザーバは、少なくとも１つの接続構造を介して、少なくとも１つの取り外し可能な増幅チャンバに接続することができる。これによって、少なくとも１つの取り外し可能な増幅チャンバに、増幅反応を行うことができる。上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つの取り外し可能な増幅チャンバは、少なくとも１つの接続構造を介して、少なくとも１つの混合リザーバに接続することができる。これによって、増幅チャンバからの増幅反応産物は、少なくとも１つの混合リザーバに移送することができる。少なくとも１つの混合リザーバにおいて、増幅産物は、少なくとも１つの試薬、例えば、増幅産物と少なくとも１つの検出チャンバ内のプローブとの間のハイブリダイゼーションを検出するための試薬と混合することができる。
【０００８】
一実施形態において、マイクロ流体装置は、少なくとも１つの増幅チャンバをさらに備え、少なくとも１つの試料リザーバは、少なくとも１つの増幅チャンバに接続され、少なくとも１つの増幅チャンバは、少なくとも１つの混合リザーバに接続される。一実施形態において、少なくとも１つの増幅チャンバは、マイクロチップから取り外し可能である。上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つの増幅チャンバは、１つ以上の接続部を介して、マイクロチップ上に組み立てることができる。上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つの検出チャンバは、マイクロチップから取り外し可能である。
【０００９】
別の態様において、標的の増幅および検出を集積したマイクロ流体装置は、本明細書に開示される。この装置は、マイクロチップを備える。マイクロチップは、少なくとも１つの試料リザーバと、少なくとも１つの増幅チャンバと、少なくとも１つの試薬リザーバと、少なくとも１つの混合リザーバと、少なくとも１つの検出チャンバとを含む。少なくとも１つの試料リザーバは、少なくとも１つの増幅チャンバに接続され、少なくとも１つの増幅チャンバは、少なくとも１つの混合リザーバに接続される。少なくとも１つの試薬リザーバは、少なくとも１つの混合リザーバに接続され、少なくとも１つの混合リザーバは、少なくとも１つの検出チャンバに接続される。
【００１０】
上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つの試料リザーバは、マイクロチップ上に設けられ、試料を収容するためのリザーバを含むことができる。上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つの試料リザーバは、取り外し可能な蓋を含むことができる。上記実施形態のいずれかにおいて、取り外し可能な蓋は、空気入口と、蓋の内側に取り付けられ、内側から空気入口を覆うための疎水性通気膜とを含むことができる。上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つの試料リザーバは、マイクロチップに設けられた第１流路、第１接続部、第１弾性チューブ、またはそれらの組み合わせを介して、少なくとも１つの増幅チャンバに接続されることができる。上記実施形態のいずれかにおいて、第１流路は、流路の開閉を制御するバルブを含むことができる。上記実施形態のいずれかにおいて、第１接続部は、ネジ付き接管、スリーブ接続部または鋳造接続部とすることができる。上記実施形態のいずれかにおいて、第１弾性チューブは、シリコーン、プラスチックまたはゴムを含むことができる。上記実施形態のいずれかにおいて、第１弾性チューブは、シリコーン、プラスチック、およびゴムからなる群から選択される材料から作製することができる。上記実施形態のいずれかにおいて、バルブは、弾性バルブ、相変化バルブまたはトルクバルブとすることができる。
【００１１】
一実施形態において、少なくとも１つの試料リザーバは、マイクロチップに設けられた第１流路に接続され、第１流路は、第１接続部に接続され、第１接続部は、第１弾性チューブに接続され、第１弾性チューブは、少なくとも１つの増幅チャンバに接続される。
【００１２】
上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つの増幅チャンバは、マイクロチップに設けられた第２流路、第２接続部、第２弾性チューブ、またはそれらの組み合わせを介して、少なくとも１つの混合リザーバに接続されることができる。上記実施形態のいずれかにおいて、第２流路は、流路の開閉を制御するバルブを含むことができる。上記実施形態のいずれかにおいて、第２接続部は、ネジ付き接管、スリーブ接続部または鋳造接続部とすることができる。上記実施形態のいずれかにおいて、第２弾性チューブは、シリコーン、プラスチックまたはゴムを含むことができる。上記実施形態のいずれかにおいて、第２弾性チューブは、シリコーン、プラスチック、およびゴムからなる群から選択される材料から作製することができる。上記実施形態のいずれかにおいて、バルブは、弾性バルブ、相変化バルブまたはトルクバルブとすることができる。
【００１３】
一実施形態において、少なくとも１つの増幅チャンバは、第２弾性チューブに接続され、第２弾性チューブは、第２接続部に接続され、第２接続部は、マイクロチップに設けられた第２流路に接続され、第２流路は、少なくとも１つの混合リザーバに接続される。
【００１４】
上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つの検出チャンバは、マイクロチップに設けられた第１導入流路を介して、導入流路開口に接続することができる。一態様において、少なくとも１つの検出チャンバは、マイクロチップに設けられた第２導入流路に接続される。一実施形態において、マイクロチップに設けられた第２導入流路は、マイクロチップに設けられた第３流路を介して、少なくとも１つの混合リザーバに接続される。一態様において、第３流路は、流路の開閉を制御するバルブを含む。上記実施形態のいずれかにおいて、バルブは、弾性バルブ、相変化バルブまたはトルクバルブとすることができる。
【００１５】
上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つの検出チャンバは、マイクロチップに設けられた排出流路を介して、排出流路開口に接続することができる。
【００１６】
上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つの試薬リザーバは、マイクロチップに設けられた第４流路を介して、少なくとも１つの混合リザーバに接続することができる。一態様において、第４流路は、流路の開閉を制御するバルブを含む。上記実施形態のいずれかにおいて、バルブは、弾性バルブ、相変化バルブまたはトルクバルブとすることができる。
【００１７】
上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つの試薬リザーバは、マイクロチップ上に設けられ、少なくとも１つの試薬を収容するためのリザーバと、試薬リザーバ上に設けられた取り外し可能な蓋とを含むことができる。一態様において、取り外し可能な蓋は、空気入口と、蓋の内側に取り付けられ、内側から空気入口を覆うための疎水性通気膜とを含む。上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つの試薬は、核酸ハイブリッドを形成するための試薬であってもよい。
【００１８】
上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つの試料リザーバの数と少なくとも１つの増幅チャンバの数とは、同一であってもよく、異なってもよい。
【００１９】
上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つの検出チャンバは、試料から少なくとも１つの標的分子を検出するためのアレイを含むことができる。
【００２０】
上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つの検出チャンバは、試料から複数の標的分子を検出するためのアレイを含むことができる。上記実施形態のいずれかにおいて、アレイは、マイクロアレイであってもよい。一実施形態において、マイクロアレイは、核酸マイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、組織マイクロアレイ、抗体マイクロアレイ、またはそれらの組み合わせである。
【００２１】
上記実施形態のいずれかにおいて、増幅チャンバは、ガラス、石英、ゴムおよびプラスチック、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される材料を含むことができる。上記実施形態のいずれかにおいて、マイクロ流体装置は、支持プラットフォームをさらに含むことができる。一態様において、支持プラットフォームは、金属のような熱伝導性材料を含む。上記実施形態のいずれかにおいて、支持プラットフォームは、金属板のような板を含むことができる。一実施形態において、板は、少なくとも１つの増幅チャンバを封入するまたは埋入するための少なくとも１つの溝を含む。
【００２２】
上記実施形態のいずれかにおいて、支持プラットフォームは、一部としてマイクロチップに集積することができ、またはマイクロチップから取り外し可能である。
【００２３】
上記実施形態のいずれかにおいて、マイクロ流体装置は、制御サブシステムをさらに含むことができる。一態様において、制御サブシステムは、制御サブシステムは、流体制御サブシステム、光学サブシステムおよび／または熱制御サブシステムを含む。一実施形態において、流体制御サブシステムは、導入流路開口、排出流路開口および／または混合リザーバ開口に直接接続される。上記実施形態のいずれかにおいて、流体制御サブシステムは、少なくとも１つの流体容器、少なくとも１つのポンプ、および／または少なくとも１つのバルブを含むことができる。上記実施形態のいずれかにおいて、流体制御サブシステムは、少なくとも１つの流体容器、少なくとも１つのポンプおよび／または少なくとも１つのバルブを接続する流路をさらに含むことができる。上記実施形態のいずれかにおいて、バルブは、弾性バルブ、相変化バルブまたはトルクバルブとすることができる。一態様において、少なくとも１つの流体容器は、溶液容器、気体容器および／または廃棄物容器を含む。別の態様において、溶液容器は、溶液容器は、例えば、前記検出チャンバ内に配置されたマイクロアレイからの未結合の分子を洗浄するための溶液などの洗浄溶液を含む。上記実施形態のいずれかにおいて、溶液容器は、導入流路開口に接続することができる。
【００２４】
上記の実施形態のいずれにおいて、気体容器は、乾燥空気を含むことができる。上記実施形態のいずれかにおいて、気体容器は、導入流路開口に接続することができる。一態様において、廃棄物容器は、廃棄物を収集するために使用される。上記実施形態のいずれかにおいて、廃棄物容器は、排出流路開口に接続することができる。
【００２５】
上記実施形態のいずれかにおいて、流体制御システムは、必要に応じて、双方向バルブを介して、排出流路開口および混合リザーバ開口の両方に接続されたポンプを含むことができる。
【００２６】
上記実施形態のいずれかにおいて、熱制御サブシステムは、少なくとも１つの増幅チャンバ用の加熱および／または冷却素子を含むことができる。一態様において、熱制御サブシステムは、少なくとも１つの検出チャンバ用の加熱および／または冷却素子をさらに含む。
【００２７】
上記実施形態のいずれかにおいて、光学サブシステムは、検出チャンバ内の反応、例えば検出チャンバ内に配置されたアレイ上のハイブリダイゼーション反応を示す画像を撮影するためのカメラを含むことができる。
【００２８】
上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つの混合リザーバの容積は、少なくとも１つの試料リザーバおよび少なくとも１つの試薬リザーバの合計容積よりも大きくすることができる。
【００２９】
別の態様において、上記実施形態のいずれかに記載のマイクロ流体装置、および必要に応じて、マイクロ流体装置と共に使用するための１つ以上の試薬を含む、標的の増幅および検出を集積したキットは、本明細書に開示される。
【００３０】
さらに別の態様において、標的の増幅および検出を集積した方法は、本明細書に開示される。この方法は、標的を含有するまたは標的を含有する疑いのある試料を上記実施形態のいずれかに記載のマイクロ流体装置の少なくとも１つの試料リザーバに標的を添加し、少なくとも１つの試料リザーバを封止するステップと、少なくとも１つの試薬を少なくとも１つの試薬容器に添加し、少なくとも１つの試薬リザーバを封止するステップと、マイクロ流体装置を動作させ、試料を少なくとも１つの増幅チャンバに移送し、標的が試料中に存在する場合、標的の増幅反応を行うステップと、マイクロ流体装置を動作させ、増幅反応の産物を少なくとも１つの混合リザーバに移送するステップと、マイクロ流体装置を動作させ、少なくとも１つの試薬を少なくとも１つの混合リザーバに移送し、増幅反応の産物と混合することによって、混合物を形成するステップと、マイクロ流体装置を動作させ、混合物を少なくとも１つの検出チャンバに移送することによって、ハイブリダイゼーション反応を行うステップと、ハイブリダイゼーション反応の産物を検出するステップとを含み、ハイブリダイゼーション反応の産物の存在、不存在または量は、試料中に標的の存在、不存在または量を表す。
【００３１】
一態様において、方法は、洗浄溶液を用いて、少なくとも１つの検出チャンバを洗浄するステップをさらに含む。上記実施形態のいずれかにおいて、試料は、生体試料であってもよい。上記実施形態のいずれかにおいて、試料は、組織または体液から取得され、例えば結合組織、上皮組織、筋肉組織または神経組織、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、腺体および内部血管からなる群から選択される組織、または血液、尿、唾液、骨髄、精子、腹水、およびそれらの亜分画物、例えば血清または血漿からなる群から選択される体液から取得することができる。
【００３２】
前述の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、試料中に複数の標的のうち１つの存在、不存在、量および／または性質を解析することができる。
【００３３】
上記実施形態のいずれかにおいて、標的は、標的は、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは小分子であってもよい。上記実施形態のいずれかにおいて、ポリペプチドは、抗体であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本開示の一態様に係るマイクロ流体装置を示す概略図である。図中、１−マイクロ流体チップ、１１−試料リザーバ、１１１−蓋、１１２−空気入口、１１３−疎水性膜、１２−ハイブリダイゼーション試薬リザーバ、１３−接続部、１４−支持プラットフォーム、１５−混合リザーバ、２−核酸増幅プラットフォーム、２１−増幅チューブ、２２−弾性シリコンチューブ、２３−金属板、３−マイクロアレイプラットフォーム、３１−マイクロアレイチャンバ（ハイブリダイゼーション検出チャンバ）、３２−流体導入流路、３３−流体導入流路、３４−流体排出流路、４０−バルブ、５１−流体界面Ｉ（混合リザーバ開口）、５２−流体界面ＩＩ（導入流路開口）、５３−流体界面ＩＩＩ（排出流路開口）。
【図２】本開示の一態様に係るマイクロ流体装置に接続された制御サブシステムを示す概略図である。
【図３（ａ）】本開示の一態様に係るマイクロ流体装置を使用して検出された難聴遺伝子のＰＣＲ産物のマイクロアレイ結果を示す図である。図３（ａ）は、マイクロアレイのプローブ配置を示す図である。
【図３（ｂ）】図３（ａ）のように配置されたマイクロアレイの核酸分子を増幅し、ハイブリダイゼーションを行った後の蛍光画像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
詳細な説明
特許請求の範囲に記載の１つ以上の実施形態の詳細な説明は、特許請求の範囲に記載の主題の原理を示す添付の図面とともに、以下に提供される。特許請求の範囲に記載の主題は、これらの実施形態に関連して説明されるが、いずれの特定の実施形態には限定されない。理解すべきことは、特許請求の範囲に記載の主題は、さまざまな形態で具体化されることができ、多数の代替物、変形物および均等物を含むことである。したがって、本明細書に開示された具体的な詳細は、限定的であると解釈すべきではなく、請求項の基礎および当業者が事実上任意の適切な詳細なシステム、構造または態様で特許請求の範囲に記載の主題を採用するための代表的な基礎として解釈すべきである。本開示の完全な理解を提供するために、以下の説明では多数の具体的な詳細を記載する。これらの詳細は、例示のために提供され、特許請求の範囲に記載の主題は、これらの具体的な詳細の一部またはすべてを省いても、請求項に従って実施され得る。理解すべきことは、他の実施形態を使用することができ、特許請求の範囲に記載の主題の範囲から逸脱することなく、構造的な変更を行うことができることである。理解すべきことは、１つ以上の実施形態に別々記載されたさまざまな特徴および機能は、これらの特徴および機能を記載している特定の実施形態にしか適用できないと限定されないことである。その代わりに、これらの特徴および機能は、単独でまたは何らかの組合せで、本明細書に記載されていない他の実施形態またはこれらの特徴および機能を一部として記載していない他の実施形態の１つ以上に適用可能である。明確にするために、特許請求の範囲に記載の主題に関連する技術分野において公知の技術的事項は、特許請求の範囲に記載の主題を不必要に不明瞭にしないように、詳細に記載されていない。
【００３６】
特に定義しない限り、本明細書に使用されるすべての技術用語、表記、他の技術用語または専門用語、および科学用語または専門用語は、特許請求の範囲に記載の主題に関連する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同様の意味を有すると意図している。場合によって、明確にするためにおよび／または容易に参照するために、一般に理解される意味を有する用語は、本明細書において定義される。本明細書において、そのような定義は、当該技術分野において一般的に理解されている意味との実質的な相違点を表していると解釈すべきではない。本明細書に記載または参照される技術および手順の多くは、当業者によってよく理解されており、従来の技法を用いて一般に採用されている。
【００３７】
本願に参照された特許文献、科学論文およびデータベースを含むすべての出版物は、各々の独立した出版物が参照によって個別に援用されているのと同様の程度まで、その全内容があらゆる目的のために参照によって援用される。本明細書に記載の定義が、参照により本明細書に援用される特許、特許出願、公開出願または他の出版物に記載の定義に反するまたは矛盾する場合、本明細書に記載の定義は、参照により本明細書に援用される定義より優先する。出版物または文書の引用は、これらのいずれかが関連する先行技術であることを承認することを意図しておらず、これらの出版物または文書の内容または日付に関する如何なる承認を構成するものではない。
【００３８】
すべての見出しは、読者の利便性のために提供されたものであり、特に明記しない限り、見出しに続く本文の意味を限定するために使用すべきでない。
【００３９】
特に明記しない限り、記載された実施形態の実施は、当業者の実施技能の範囲内にある、有機化学技術、高分子技術、（組換え技術を含む）分子生物学技術、細胞生物学技術、生化学技術および配列決定技術の従来技術およびその説明を採用する。そのような従来技術は、ポリペプチドおよびタンパク質の合成および修飾、ポリヌクレオチドの合成および修飾、ポリマ配列の合成、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび連結、並びに標識を用いてハイブリダイゼーションの検出を含む。本明細書中の例を参照することによって、好適な技術の具体的な実例を提供することができる。しかしながら、他の同等する従来手順も、当然使用可能である。そのような従来技術および説明は、Green, et al.,Eds., Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV) (1999)；Weiner, Gabriel, Stephens, Eds., Genetic Variation: A Laboratory Manual (2007)；Dieffenbach, Dveksler, Eds., PCR Primer: A Laboratory Manual (2003)；Bowtell and Sambrook, DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual (2003)；Mount, Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis (2004)；Sambrook and Russell, Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2006)；およびSambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2002)（すべてCold Spring Harbor Laboratory Pressより）；Ausubel et al. eds., Current Protocols in Molecular Biology (1987)；T. Brown ed., Essential Molecular Biology (1991), IRL Press；Goeddel ed., Gene Expression Technology (1991), Academic Press；A. Bothwell et al.eds., Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes (1990), Bartlett Publ.；M. Kriegler, Gene Transfer and Expression (1990), Stockton Press；R. Wu et al. eds., Recombinant DNA Methodology (1989), Academic Press；M. McPherson et al., PCR: A Practical Approach (1991), IRL Press at Oxford University Press；Stryer, Biochemistry (4th Ed.) (1995), W. H. Freeman, New York N.Y.；Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (2002), IRL Press, London；Nelson and Cox, Lehninger, Principles of Biochemistry (2000) 3rd Ed., W. H. Freeman Pub., New York, N.Y.；Berg, et al., Biochemistry (2002) 5th Ed., W. H. Freeman Pub., New York, N.Y.；D. Weir& C. Blackwell, eds., Handbook of Experimental Immunology (1996), Wiley-Blackwellなどの標準的な実験室マニュアルに見つけることができ、上記マニュアルのすべては、その全内容があらゆる目的のために参照により本明細書に援用される。
【００４０】
本開示の全体にわたって、特許請求の範囲に記載の主題のさまざまな特徴は、範囲形式で示される。理解すべきことは、範囲形式の記載は、利便性および簡潔性を与えるのみであって、特許請求の範囲に記載の主題の範囲に対する剛性限定として見なすべきでないことである。したがって、範囲の記載は、すべての可能な部分範囲および各部分範囲に位置する各々の数値を具体的に開示していると見なすべきである。例えば、値の範囲を提供する場合、その範囲の上限値または下限値と記載された範囲内の任意の他の記載値または中間値との間に位置する各中間値は、特許請求の範囲に記載の主題に含まれると理解すべきである。これらのより小さい範囲の上限値および下限値は、独立してより小さい範囲に含まれてもよい。これらのより小さい範囲は、特許請求の範囲に記載の主題に含まれ、記載された範囲に与えた特定の除外限定を受ける。記載された範囲が上限値および下限値の一方または両方を含む場合、含まれた上限値および下限値の一方または両方を除外した範囲も、特許請求の範囲に記載の主題に含まれる。この規定は、範囲の幅に係わらず、任意の範囲に適用することができる。例えば、範囲１〜６の説明は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６および３〜６などの部分範囲、および各々の範囲に位置する１、２、３、４、５および６などの各々の数字を具体的に開示されていると考えるべきである。
【００４１】
Ａ．定義
本明細書および添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形「a」、「an」および「the」は、特に断りのない限り、複数の対象物を含む。例えば、「a」または「an」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。したがって、「試薬（a reagent）」を言及する場合、１つ以上の試薬を意味し、「当該方法（the method）」を言及する場合、本明細書に開示される同等の工程および方法、および／または当業者に公知の同等の工程および方法を意味する等である。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、「マイクロ流体装置」という用語は、一般に材料、特に流体で移送される材料、例えば液体を移送する装置、一部の実施形態においてマイクロ規模で液体を移送する装置、一部の実施形態においてナノ規模で液体を移送する装置を指す。したがって、本明細書に開示された主題によって記載されたマイクロ流体装置は、マイクロ規模の特徴、ナノ規模の特徴およびそれらの組合せを含むことができる。
【００４３】
したがって、典型的なマイクロ流体装置は、典型的には、デシメートル規模、センチメートル規模、ミリメートル規模またはそれ以下の寸法に形成された構造的または機能的特徴を含み、μＬ／分以下の流速で流体を扱うことができる。このような特徴は、典型的には、流路、流体リザーバ、反応チャンバ、混合チャンバおよび分離領域を含むがこれらに限定されない。一部の例において、流路は、約０．１μｍ〜約５００または５０００μｍの範囲に位置する少なくとも１つの断面寸法を含む。この程度の寸法を用いることによって、小さい面積により多くの流路を組み込むことができ、少量の流体を利用することができる。
【００４４】
マイクロ流体装置は、単独で存在してもよく、マイクロ流体システムの一部であってもよい。当該マイクロ流体システムは、例示として限定ではなく、試料、試薬および緩衝液などの流体をシステム内に導入するおよび／またはシステムを流通するためのポンプと、検出機器または検出システムと、データ記憶システムと、装置内の流体の輸送および／または方向を制御し、装置内の流体の環境条件、例えば温度および電流などを監視および制御するための制御システムとを含むことができる。
【００４５】
「流路」、「マイクロ流路」、「流体通路」および「マイクロ流体通路」という用語は、本明細書に使用される場合、交換可能に使用することができ、パターン化基板から材料にパターンを付与することよってまたは任意の好適な材料除去技術によって材料に形成された凹部または空洞を意味することができ、もしくは、例えば管、毛細管などの凹部または空洞と凹部または空洞に装着された任意の好適な流体伝導構造との組み合せを意味することができる。
【００４６】
「流路」、「マイクロ流路」および「流体通路」という用語は、本明細書に使用される場合、流体などの材料、例えば気体または液体が流れることができるマイクロ流体装置の流路を含むことができる。より具体的には、これらの用語は、例えば溶媒または化学試薬などの対象材料が流れることができる流路を含むことができる。いくつかの実施形態において、流体などの材料、例えば気体または液体は、バルブまたはポンプを作動させるように、流路を通って流れることができる。
【００４７】
「チップ」という用語は、本明細書に使用される場合、複数の一次元、二次元または三次元のマイクロ構造またはマイクロ規模構造を有し、その上で物理的プロセス、化学的プロセス、生物学的プロセス、生物物理学的プロセスまたは生化学的プロセスなどの特定のプロセスを実行可能な固体基板を指す。流路およびウェル、電極素子、電磁素子などのマイクロ構造またはマイクロ規模構造は、チップ上の物理的反応またはプロセス、生物物理学的反応またはプロセス、生物学的反応またはプロセス、生化学的反応またはプロセス、化学反応またはプロセスを容易にするために、基板に組み込まれ、基板上に製作され、またはそうでなければ基板に取付けられる。チップは、１つの次元で薄くてもよく、他の次元でさまざまな形状、例えば矩形、円形、楕円形または他の不規則形状を有してもよい。本発明のチップの主面のサイズは、例えば約１ｍｍ２〜約０．２５ｍ２まで大きく変化してもよい。好ましくは、チップのサイズは、約４ｍｍ２〜約２５ｃｍ２であり、その特性寸法が約１ｍｍ〜約５ｃｍである。チップの表面は、平坦面であってもよく、非平坦面であってもよい。非平坦面を有するチップは、表面上に製作された流路またはウェルを含んでもよい。
【００４８】
「マイクロアレイ」という用語は、本明細書に使用される場合、ポリヌクレオチドマイクロアレイ、ポリペプチドマイクロアレイまたは化学マイクロアレイを指す。特定のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、小分子化合物、ペプチドおよび炭水化物を固体表面上に固定化することによって、マイクロアレイを形成することができる。
【００４９】
一実施形態において、マイクロ流体装置のチャンバ、チューブ、バルブおよび／または流路間の接続は、実質的に気密性である。本明細書で使用される場合、「実質的に気密性」とは、気密性接続の場合に比べて、気体または空気が、解析結果に約１０％、約５％、約２％、約１％、約０．５％、約０．１％、約０．０１％、または約０．００１％を超える影響を与えるような漏れをしないことを意味する。
【００５０】
一実施形態において、増幅チューブは、剛性または実質的に剛性である。本明細書で使用される場合、「実質的に剛性」とは、力を加えないときの寸法に比べて、力を加えるときに、増幅チューブの寸法の変化が、約１０％未満、約５％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．１％未満、約０．０１％未満、または約０．００１％未満であることを意味する。
【００５１】
「試料」は、本明細書に使用される場合、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性またはそれらの任意の組み合せであってもよい。本開示の生体試料は、溶液試料、懸濁液試料、液体試料、粉末試料、ペースト試料、水性試料または非水性試料を含む。「生体試料」は、本明細書に使用される場合、生体源またはウイルス（もしくはプリオン）源もしくは他のマクロ分子源およびバイオ分子源から得られた任意の試料を含み、核酸、タンパク質および／または他の高分子を得ることができる対象物の任意種類の細胞または組織を含む。生体試料は、処理される生物源または試料から直接に得られた試料であってもよい。たとえば、増幅されている単離核酸は、生体試料を構成する。生体試料は、血液、血漿、血清、脳脊髄液、関節液、尿および汗などの体液、動物および植物からの組織試料および臓器試料、ならびに動物および植物に由来する処理済み試料を含むがこれらに限定されない。
【００５２】
本明細書に開示されたチップを用いて検出および／または解析可能な対象または標的分析物は、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、イオン、または上記のいずれかを含む多成分複合体を含むがこれらに限定されない任意の生体分子であってもよい。対象の細胞内分析物の例として、たとえば、糸粒体、Golgi体、小胞体、葉緑体、細胞内小胞、細胞外小胞、空胞、リソソームなどの細胞小器官が挙げられる。核酸および分析物の例として、さまざまな立体構造を有するゲノムＤＮＡ（たとえば、Ａ−ＤＮＡ、Ｂ−ＤＮＡ、Ｚ−ＤＮＡ）、糸粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｐｉＲＮＡが挙げられ得る。
【００５３】
「結合」という用語は、本明細書に使用される場合、２つの分子が互いに近接している安定な対合をもたらす当該分子同士間の引力相互作用を意味する。分子結合は、以下の種類、すなわち、非共有結合、可逆性共有結合および不可逆性共有結合に分類することができる。分子結合に関与し得る分子は、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、および医薬化合物などの小有機分子を含む。多くの場合、他の分子と安定な複合体を形成するポリペプチドは、レセプタと称され、結合相手の他の分子は、リガンドと称される。また、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド同士とまたは他の分子と安定な複合体、例えばＤＮＡ−タンパク質複合体、ＤＮＡ−ＤＮＡ複合体、ＤＮＡ−ＲＮＡ複合体などを形成することができる。
【００５４】
用語「ポリペプチド」は、本明細書に使用される場合、天然源から単離され、または組み換え技術によって産出され、または化学合成されたタンパク質、タンパク質の断片およびペプチドを指す。ポリペプチドに、１つ以上の修飾、例えば翻訳後修飾（例えば、グリコシル化など）または任意の他の修飾（例えば、ペグ化など）を行ってもよい。ポリペプチドは、１つ以上の非天然アミノ酸（例えば、修飾した側鎖を有するアミノ酸）を含んでもよい。本開示のポリペプチドは、典型的には、少なくとも約１０個のアミノ酸を含んでもよい。
【００５５】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」という用語は、本明細書において任意長さのヌクレオチド高分子を指すように互換的に使用され、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらの類似体、またはそれらの混合物を含むことができる。この用語は、分子の一次構造のみを指す。したがって、この用語は、三本鎖（triple-stranded）のデオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、二本鎖（double-stranded）のデオキシリボ核酸および一本鎖（single-stranded）のデオキシリボ核酸、ならびに三本鎖のリボ核酸（「ＲＮＡ」）、二本鎖のリボ核酸および一本鎖のリボ核酸を含む。さらに、当該用語は、アルキル化および／またはキャッピングによって修飾されたポリヌクレオチド、および修飾されていないポリヌクレオチドを含む。より具体的には、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する）、接合されているかいないかに関わらず、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈＲＮＡおよびｍＲＮＡを含むポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有する）、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドまたはＣ−グリコシドである他の種類のポリヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を含む他のポリマ、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸（「ＰＮＡ」））およびポリモルホリノポリマ（オレゴン州コーバリスのAnti-Virals, Inc.社が市販しているNeugene）、ならびに、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるような塩基対の形成および塩基のスタッキングを可能にする構成を有する核酸塩基を含有するような他の配列特異的な合成核酸ポリマを含む。したがって、これらの用語は、例えば、３′−デオキシ−２′，５′−ＤＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチドＮ３′−Ｐ５′ホスホルアミデート、２′−Ｏ−アルキル置換ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッド、またはＰＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリッドを含み、さらに、これらの用語は、公知種類の修飾、例えば、類似体、ヌクレオチド間修飾物および非修飾ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを用いて１つ以上のヌクレオチドの標識、アルキル化、キャッピング、および置換を含む。ヌクレオチド間修飾物の例として、例えば、非荷電結合を有するもの（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメート等）、負荷電結合を有するもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）、および正荷電結合を有するもの（例えば、アミノアルキルホスホルアミデート、アミノアルキルホスホトリエステル）、（酵素（例えば、ヌクレアーゼ）、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジン等を含む）タンパク質などのペンダント部分を有するもの、インターカレータを有するもの（例えば、アクリジン、ソラレン等）、（金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等の）キレートを有するもの、アルキル化剤を有するもの、修飾結合を有するもの（例えば、アルファアノマー核酸等）が挙げられる。
【００５６】
当然ながら、「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」という用語は、本明細書に使用される場合、既知のプリンおよびピリミジン塩基だけでなく、修飾された他のヘテロ環塩基も含有する部分を含むであろう。このような修飾物は、メチル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、もしくは他のヘテロ環物を含む。ヌクレオシドまたはヌクレオチドの修飾は、糖部分に対する修飾、例えばハロゲン基または脂肪族基を用いて、１つ以上のヒドロキシル基を置換する修飾、またはエーテル、アミンなどとしての官能化を含んでもよい。「ヌクレオチド単位」という用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドを包含するように意図している。
【００５７】
「核酸プローブ」および「プローブ」は、交換可能に使用され、上記で定義したように、対応する標的と結合することができる核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む構造体を指す。プローブのポリヌクレオチド領域は、ＤＮＡ、および／またはＲＮＡ、および／または合成ヌクレオチド類似体を含んでもよい。
【００５８】
本明細書において「相補的または一致した」を使用する場合、２つの核酸配列が少なくとも５０％の配列同一性を有することを意味する。好ましくは、２つの核酸配列は、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。また、「相補的または一致した」とは、２つの核酸配列が、低、中および／または高ストリンジェンシー条件の下で、ハイブリッドを形成することができることを意味する。配列同一性または相同性の割合は、参照配列の対応部分と整列された１つの配列および別の配列を比較することによって、計算される。
【００５９】
本明細書において「実質的に相補的または実質的に一致した」を使用する場合、２つの核酸配列が少なくとも９０％の配列同一性を有することを意味する。好ましくは、２つの核酸配列は、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。また、「実質的に相補的または実質的に一致した」とは、２つの核酸配列が、高ストリンジェンシー条件の下で、ハイブリッドを形成することができることを意味する。配列同一性または相同性の割合は、参照配列の対応部分と整列された１つの配列および別の配列を比較することによって、計算される。
【００６０】
一般に、ハイブリッドの安定性は、イオン濃度および温度に関連して変化する。典型的に、ハイブリダイゼーション反応は、低ストリンジェンシー条件の下で行われ、続いて、ストリンジェンシー条件を高いストリンジェンシー条件に変更して、洗浄を行う。中ストリンジェントハイブリダイゼーションは、プローブなどの核酸分子が相補的核酸分子に結合することを可能にする条件を指す。一般に、ハイブリッドされた核酸分子は、少なくとも６０％の同一性、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有する。中ストリンジェンシー条件は、４２℃で５０％ホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥおよび０．２％ＳＤＳにハイブリッドを形成し、その後、４２℃で０．２×ＳＳＰＥおよび０．２％ＳＤＳにハイブリッドを洗浄する条件と同等の条件である。高ストリンジェンシー条件は、たとえば、４２℃で５０％ホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥおよび０．２％ＳＤＳにハイブリッドを形成し、その後、６５℃で０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳにハイブリッドを洗浄する条件である。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、２２℃で１０％ホルムアミド、５×デンハート液、６×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳおよび０．２％ＳＤＳにハイブリッドを形成し、その後、３７℃で１×ＳＳＰＥおよび０．２％ＳＤＳに洗浄する条件と同等の条件を指す。デンハート液は、１％フィコール、１％ポリビニルピロリドン、および１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する。２０×ＳＳＰＥ（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ））は、３Ｍの塩化ナトリウム、０．２Ｍのリン酸ナトリウム、および０．０２５ＭのＥＤＴＡを含有する。他の好適な中ストリンジェンシーおよび高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション緩衝液および条件は、当業者に周知であり、たとえば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. (1989)；およびAusubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley & Sons (1999)に記載されている。
【００６１】
代替的に、ＲＮＡまたはＤＮＡ鎖が選択的なハイブリダイゼーション条件下で補体とハイブリッドを形成する時に、実質的な相補性が存在する。典型的に、少なくとも１４個から２５個のヌクレオチド鎖に対して、少なくとも約６５％の相補性、好ましくは少なくとも約７５％の相補性、より好ましくは少なくとも約９０％の相補性がある時に、選択的なハイブリダイゼーションが発生する。M. Kanehisa, Nucleic Acids Res. 12:203 (1984)を参照。
【００６２】
「相同」、「実質的に相同」および「実質的な相同性」という用語は、本明細書に使用される場合、参照アミノ酸配列に比べて、１つのアミノ酸配列が少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の同一性を有することを表す。配列同一性または相同性の割合は、参照配列の対応部分と整列された１つの配列および別の配列を比較することによって、計算される。
【００６３】
「プライマ」は、本明細書に使用される場合、天然または合成のオリゴヌクレオチドを指す。このようなオリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドテンプレートと二重鎖を形成する際に、核酸合成の開始点として機能することができ、伸長二重鎖を形成するようにテンプレートに沿って３′末端から伸長することができる。伸長プロセス時に追加されるヌクレオチドの配列は、テンプレートとしてのポリヌクレオチドの配列によって決定される。通常、たとえばＤＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼを用いて、プライマを伸長させる。
【００６４】
本明細書において、「多重化」または「多重アッセイ」は、複数の検出特性、例えば蛍光特性（例えば、励起波長、発光波長、発光強度、ＦＷＨＭ（半値全幅ピーク高さ）、または蛍光寿命）を用いて、複数の標的分子の存在を同時にアッセイすることができるアッセイまたは他の解析方法を指す。
【００６５】
本開示の態様および実施形態は、「からなる」および／または「から本質的になる」の態様および実施形態を含むと理解される。
【００６６】
本開示の他の目的、利点および特徴は、添付の図面と併せて、以下の明細書から明らかになるであろう。
【００６７】
Ｂ．集積マイクロ流体装置
一態様において、本発明の目的は、核酸の増幅および検出（例えば、マイクロアレイを用いた検出）を行うための組立式または集積式マイクロ流体装置およびその方法を提供することである。一態様において、本発明の目的は、バルブ、流路、リザーバおよび検出チャンバを含むさまざまなマイクロ流体特徴を備えるように、マイクロ流体装置を構成することによって達成される。いくつかの実施形態において、装置は、ＰＣＲを行うための１つ以上の増幅チャンバ、および／またはマイクロアレイを有するハイブリダイゼーション検出チャンバのような１つ以上の解析チャンバを含む。一態様において、マイクロ流体装置の一部またはすべての特徴は、特定の応用のために１つ以上の試薬の輸送を可能にするように、相互接続される。
【００６８】
一態様において、本発明の装置は、１つ以上のマイクロチップ基板を備える。別の態様において、装置は、１つ以上の増幅チャンバを含む。いくつかの態様において、装置は、１つ以上の検出チャンバ、例えば増幅された核酸とマイクロアレイ上のプローブとの間のハイブリダイゼーションを検出するための１つ以上のマイクロアレイチャンバを含む。いくつかの実施形態において、本発明の装置は、１つ以上のマイクロチップ基板、１つ以上の増幅チャンバおよび／または１つ以上の検出チャンバ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一態様において、マイクロチップは、１つ以上の試薬を用いて、１つ以上の試料を処理するように構成される。特定の実施形態において、マイクロチップは、１つ以上のリザーバ、１つ以上の流路、１つ以上のバルブ、および／または１つ以上の流体界面または開口を含む。一態様において、増幅チャンバは、１つ以上の接続部を介してマイクロチップ上に組み立てられた取り外し可能なチューブに形成される。一態様において、この取り外し可能な増幅チューブは、マイクロチップ上に直接形成された増幅チャンバに比べて、チップ製造の必要条件を低減する。一態様において、検出チャンバは、１つ以上の検出チャンバ内に位置する１つ以上のマイクロアレイを含む。一実施形態において、検出チャンバは、マイクロチップに集積された一部である。別の実施形態において、検出チャンバは、マイクロチップから取り外し可能である。別の実施形態において、検出チャンバは、例えば接着剤を介して、マイクロチップに接合される。
【００６９】
一態様において、マイクロチップ上に設けられた１つ以上のリザーバは、１つ以上の試料リザーバと、１つ以上の試薬リザーバ（例えば、ハイブリダイゼーション試薬リザーバ）と、１つ以上の混合リザーバとを含む。いくつかの実施形態において、試料リザーバおよび／または試薬リザーバは、取り外し可能な蓋によって封止される。この取り外し可能な蓋は、試料および／または試薬を添加するために開くことができ、アッセイ中に閉めることができる。いくつかの実施形態において、混合リザーバは、バルブおよび流路を経由して、増幅チャンバ、試薬リザーバおよび／または検出チャンバと別々に流体連通している。いくつかの態様において、バルブおよび流路は、マイクロチップ上に設置され、またはマイクロチップに埋入、封入または嵌入される。いくつかの態様において、空気界面または空気開口は、混合リザーバを流体制御サブシステム、例えば流体制御サブシステム内のポンプに接続するために、混合リザーバの上部に設けられる。いくつかの態様において、増幅されたＰＣＲ産物とハイブリダイゼーション緩衝液との混合は、空気を混合リザーバ内に圧送することによって、達成することができる。一態様において、混合物は、その後、検出チャンバに輸送され、例えば検出チャンバ内のマイクロアレイとハイブリッドを形成する。一態様において、マイクロチップは、流体をリザーバおよびチャンバの間に輸送するように構成された１つ以上の流路を含む。いくつかの実施形態において、流路は、各流路内の流体の流れを制御するバルブを含む。一態様において、マイクロチップ上に設けられた１つ以上の流体界面または開口は、流体制御サブシステムと連通するように構成される。
【００７０】
一態様において、増幅チャンバは、円筒形チャンバまたはチューブとして形成される。一態様において、増幅チャンバは、１つ以上の接続部を介して、マイクロチップ上に組み立てられる。一実施形態において、増幅チャンバまたはチューブは、約０．０１ｍｍ〜約１０ｍｍの内径、および約０．０２ｍｍ〜約２０ｍｍの外径を有する円筒である。特定の実施形態において、増幅チャンバまたはチューブの内径は、約０．０１ｍｍ未満、約０．０１ｍｍ〜約０．０２ｍｍ、約０．０２ｍｍ〜約０．０４ｍｍ、約０．０４ｍｍ〜約０．０６ｍｍ、約０．０６ｍｍ〜約０．０８ｍｍ、約０．０８ｍｍ〜約０．１０ｍｍ、約０．１０ｍｍ〜約０．１２ｍｍ、約０．１２ｍｍ〜約０．１４ｍｍ、約０．１４ｍｍ〜約０．１６ｍｍ、約０．１６ｍｍ〜約０．１８ｍｍ、約０．１８ｍｍ〜約０．２０ｍｍ、約０．２０ｍｍ〜約０．２２ｍｍ、約０．２２ｍｍ〜約０．２４ｍｍ、約０．２４ｍｍ〜約０．２６ｍｍ、約０．２６ｍｍ〜約０．２８ｍｍ、約０．２８ｍｍ〜約０．３０ｍｍ、約０．３０ｍｍ〜約０．３２ｍｍ、約０．３２ｍｍ〜約０．３４ｍｍ、約０．３４ｍｍ〜約０．３６ｍｍ、約０．３６ｍｍ〜約０．３８ｍｍ、約０．３８ｍｍ〜約０．４０ｍｍ、約０．４０ｍｍ〜約０．４２ｍｍ、約０．４２ｍｍ〜約０．４４ｍｍ、約０．４４ｍｍ〜約０．４６ｍｍ、約０．４６ｍｍ〜約０．４８ｍｍ、約０．４８ｍｍ〜約０．５０ｍｍ、約０．５０ｍｍ〜約０．５２ｍｍ、約０．５２ｍｍ〜約０．５４ｍｍ、約０．５４ｍｍ〜約０．５６ｍｍ、約０．５６ｍｍ〜約０．５８ｍｍ、約０．５８ｍｍ〜約０．６０ｍｍ、約０．６０ｍｍ〜約０．６２ｍｍ、約０．６２ｍｍ〜約０．６４ｍｍ、約０．６４ｍｍ〜約０．６６ｍｍ、約０．６６ｍｍ〜約０．６８ｍｍ、約０．６８ｍｍ〜約０．７０ｍｍ、約０．７０ｍｍ〜約０．７２ｍｍ、約０．７２ｍｍ〜約０．７４ｍｍ、約０．７４ｍｍ〜約０．７６ｍｍ、約０．７６ｍｍ〜約０．７８ｍｍ、約０．７８ｍｍ〜約０．８０ｍｍ、約０．８０ｍｍ〜約０．８２ｍｍ、約０．８２ｍｍ〜約０．８４ｍｍ、約０．８４ｍｍ〜約０．８６ｍｍ、約０．８６ｍｍ〜約０．８８ｍｍ、約０．８８ｍｍ〜約０．９０ｍｍ、約０．９０ｍｍ〜約０．９２ｍｍ、約０．９２ｍｍ〜約０．９４ｍｍ、約０．９４ｍｍ〜約０．９６ｍｍ、約０．９６ｍｍ〜約０．９８ｍｍ、約０．９８ｍｍ〜約１．００ｍｍ、約１．００ｍｍ〜約２．００ｍｍ、約２．００ｍｍ〜約３．００ｍｍ、約３．００ｍｍ〜約４．００ｍｍ、約４．００ｍｍ〜約５．００ｍｍ、約５．００ｍｍ〜約６．００ｍｍ、約６．００ｍｍ〜約７．００ｍｍ、約７．００ｍｍ〜約８．００ｍｍ、約８．００ｍｍ〜約９．００ｍｍ、約９．００ｍｍ〜約１０．００ｍｍ、または約１０．００ｍｍを超える。
【００７１】
特定の態様において、増幅チャンバまたはチューブの外径は、約０．０２ｍｍ未満、約０．０２ｍｍ〜約０．０４ｍｍ、約０．０４ｍｍ〜約０．０６ｍｍ、約０．０６ｍｍ〜約０．０８ｍｍ、約０．０８ｍｍ〜約０．１０ｍｍ、約０．１０ｍｍ〜約０．１２ｍｍ、約０．１２ｍｍ〜約０．１４ｍｍ、約０．１４ｍｍ〜約０．１６ｍｍ、約０．１６ｍｍ〜約０．１８ｍｍ、約０．１８ｍｍ〜約０．２０ｍｍ、約０．２０ｍｍ〜約０．２２ｍｍ、約０．２２ｍｍ〜約０．２４ｍｍ、約０．２４ｍｍ〜約０．２６ｍｍ、約０．２６ｍｍ〜約０．２８ｍｍ、約０．２８ｍｍ〜約０．３０ｍｍ、約０．３０ｍｍ〜約０．３２ｍｍ、約０．３２ｍｍ〜約０．３４ｍｍ、約０．３４ｍｍ〜約０．３６ｍｍ、約０．３６ｍｍ〜約０．３８ｍｍ、約０．３８ｍｍ〜約０．４０ｍｍ、約０．４０ｍｍ〜約０．４２ｍｍ、約０．４２ｍｍ〜約０．４４ｍｍ、約０．４４ｍｍ〜約０．４６ｍｍ、約０．４６ｍｍ〜約０．４８ｍｍ、約０．４８ｍｍ〜約０．５０ｍｍ、約０．５０ｍｍ〜約０．５２ｍｍ、約０．５２ｍｍ〜約０．５４ｍｍ、約０．５４ｍｍ〜約０．５６ｍｍ、約０．５６ｍｍ〜約０．５８ｍｍ、約０．５８ｍｍ〜約０．６０ｍｍ、約０．６０ｍｍ〜約０．６２ｍｍ、約０．６２ｍｍ〜約０．６４ｍｍ、約０．６４ｍｍ〜約０．６６ｍｍ、約０．６６ｍｍ〜約０．６８ｍｍ、約０．６８ｍｍ〜約０．７０ｍｍ、約０．７０ｍｍ〜約０．７２ｍｍ、約０．７２ｍｍ〜約０．７４ｍｍ、約０．７４ｍｍ〜約０．７６ｍｍ、約０．７６ｍｍ〜約０．７８ｍｍ、約０．７８ｍｍ〜約０．８０ｍｍ、約０．８０ｍｍ〜約０．８２ｍｍ、約０．８２ｍｍ〜約０．８４ｍｍ、約０．８４ｍｍ〜約０．８６ｍｍ、約０．８６ｍｍ〜約０．８８ｍｍ、約０．８８ｍｍ〜約０．９０ｍｍ、約０．９０ｍｍ〜約０．９２ｍｍ、約０．９２ｍｍ〜約０．９４ｍｍ、約０．９４ｍｍ〜約０．９６ｍｍ、約０．９６ｍｍ〜約０．９８ｍｍ、約０．９８ｍｍ〜約１．００ｍｍ、約１．００ｍｍ〜約２．００ｍｍ、約２．００ｍｍ〜約３．００ｍｍ、約３．００ｍｍ〜約４．００ｍｍ、約４．００ｍｍ〜約５．００ｍｍ、約５．００ｍｍ〜約６．００ｍｍ、約６．００ｍｍ〜約７．００ｍｍ、約７．００ｍｍ〜約８．００ｍｍ、約８．００ｍｍ〜約９．００ｍｍ、約９．００ｍｍ〜約１０．００ｍｍ、約１０．００ｍｍ〜約１１．００ｍｍ、約１１．００ｍｍ〜約１２．００ｍｍ、約１２．００ｍｍ〜約１３．００ｍｍ、約１３．００ｍｍ〜約１４．００ｍｍ、約１４．００ｍｍ〜約１５．００ｍｍ、約１５．００ｍｍ〜約１６．００ｍｍ、約１６．００ｍｍ〜約１７．００ｍｍ、約１７．００ｍｍ〜約１８．００ｍｍ、約１８．００ｍｍ〜約１９．００ｍｍ、約１９．００ｍｍ〜約２０．００ｍｍ、または約２０．００ｍｍを超える。
【００７２】
一態様において、増幅チューブの一端は、１つ以上の増幅される標的核酸分子（例えば、ＤＮＡ）を含む液体試料を供給するための試料リザーバと流体連通している。一実施形態において、増幅チューブの一端は、１つ以上の接続部および／または１つ以上の流路を介して、試料リザーバに接続される。別の態様において、増幅チューブの他端は、混合リザーバと流体連通している。一実施形態において、増幅チューブの他端は、１つ以上の接続部および／または１つ以上の流路を介して、混合リザーバに接続される。
【００７３】
上記の実施形態のいずれにおいて、検出チャンバ（例えば、マイクロアレイチャンバ）は、少なくとも２つの入口および／または１つの出口を含むことができる。一態様において、一方の入口は、１つ以上の流路を介して、混合リザーバに接続する。別の態様において、他方の入口は、１つ以上の流体界面または開口を介して、１つ以上の液体チャンバおよび／または流体制御サブシステムの１つ以上の乾燥空気チャンバと流体連通している。いくつかの態様において、出口は、１つ以上の流体界面または開口を介して、流体制御サブシステムの１つ以上の廃棄物チャンバと流体連通している。
【００７４】
上記実施形態のいずれかにおいて、リザーバを覆うための蓋は、上部の空気入口と、蓋の内側に取り付けられ、内側から空気入口を覆うための疎水性通気膜とを含むことができる。一態様において、空気入口は、マイクロ流体装置と環境大気との間の空気圧力のバランスを保つ。別の態様において、疎水性膜は、装置内の少なくとも１つの産物または試薬が大気に流失することを防止する。さらに別の態様において、疎水性膜は、環境からの汚染物が装置内に進入して、装置内の反応を干渉することを防止する。
【００７５】
上記実施形態のいずれかにおいて、混合リザーバは、混合操作中に混合物が溢れて、１つ以上のサブシステムに流出しないように、十分な容積を有するように構成されてもよい。
【００７６】
上記実施形態のいずれかにおいて、本明細書に記載の接続部は、ネジ付き接管、スリーブ接続部、または鋳造接続部であってもよい。
【００７７】
上記実施形態のいずれかにおいて、増幅チューブは、ガラス、石英、ゴム、プラスチック、またはそれらの組み合わせから作製されてもよい。
【００７８】
上記実施形態のいずれかにおいて、マイクロ流体装置は、支持プラットフォームを含むことができる。一態様において、支持プラットフォームは、装置のさまざまな素子の間の相互作用を容易にするように、チューブ、チャンバ、リザーバおよび／または流路を適所に保持する。一態様において、支持プラットフォームは、１つ以上の溝を有する金属板を備える。一態様において、増幅チューブは、溝に封入または埋入されている。一態様において、使用時に、金属板は、制御サブシステム内の加熱素子と密接する。一態様において、金属板の良好な熱伝導により、効率なＤＮＡ増幅反応を達成することができる。一実施形態において、支持プラットフォームは、マイクロ流体装置に集積された一部である。別の実施形態において、支持プラットフォームは、マイクロチップから取り外し可能である。
【００７９】
上記の実施形態のいずれにおいて、１以上のバルブは、弾性バルブ、相変化バルブまたはトルクバルブであってもよい。
【００８０】
一態様において、マイクロ流体装置が使用されているときに、マイクロ流体チップ上の流体界面または開口は、流体を装置内に輸送するために、流体制御サブシステムに連通する。一態様において、流体制御サブシステムは、１つ以上の流体容器と、ポンプと、バルブと、チューブとを含む。一態様において、ポンプは、ピストンポンプまたは蠕動ポンプである。別の態様において、ポンプは、流体の体積をマイクロリットル（μＬ）で精確に制御することができるステッピングモータに接続される。一態様において、バルブは、ピンチバルブであってもよい。いくつかの実施形態において、流体容器は、１つ以上の溶液容器および／または１つ以上の廃棄物容器を含む。一態様において、流体制御サブシステムは、効果的な密閉を与えるＯリングを備える流体マニホルドを介して、マイクロチップの１つ以上の流体界面または開口に接続される。一態様において、マイクロ流体装置が流体制御サブシステムに接続されると、閉鎖環境が形成され、解析中の汚染を回避する。
【００８１】
一態様において、マイクロ流体装置は、上記の流体制御サブシステムに加えて、増幅チャンバおよび／またはマイクロアレイ検出チャンバに加熱／冷却を提供するための１つ以上の熱制御サブシステムを含む１つ以上の他の制御サブシステム、および、マイクロアレイの画像を撮影するための１つ以上の光学システムと連携して動作する。一態様において、使用時、ユーザは、試料および１つ以上のハイブリダイゼーション試薬をリザーバに添加し、その後、装置を機器に挿入するだけである。一実施形態において、機器は、所定の作業工程に従って自動的に操作を行い、結果を提示する。
【００８２】
一態様において、マイクロ流体装置は、核酸の増幅およびハイブリダイゼーションの検出の自動操作を実現し、操作者の技術的専門知識の関与および／または必要を低減する。一態様において、すべての工程は、閉鎖システム内で行われるため、環境汚染の問題を回避する。別の態様において、核酸の増幅は、取り外し可能な増幅チューブ内で行われるため、チップ処理の困難性、並びにチップ製造および処理に関連するコストを低減する。また、一態様において、試料（例えば、少なくとも１つのハイブリダイゼーション試薬との混合物中の試料）を前後に往復して移動することによって、マイクロアレイ検出チャンバに動的ハイブリダイゼーションを適用することができ、マイクロアレイプローブと標的核酸配列との間の相互作用を促進し、試験時間を短縮することができる。
【００８３】
一実施形態において、ＰＣＲ増幅およびハイブリダイゼーション用の集積マイクロ流体装置は、記載される。一態様において、マイクロ流体装置は、マイクロチップ（例えば、マイクロ流体チップ）、例えば図１に示されたマイクロチップ１を含む。一態様において、マイクロチップは、マイクロ流体装置のベースの一部である。別の態様において、マイクロチップは、マイクロ流体装置のベースである。いくつかの実施形態において、マイクロチップは、増幅プラットフォームおよび／またはマイクロアレイプラットフォームを含む。特定の実施形態において、図１に示すように、マイクロチップは、増幅プラットフォーム２およびマイクロアレイプラットフォーム３を備える。
【００８４】
いくつかの実施形態において、マイクロチップは、試料リザーバおよび／またはハイブリダイゼーション試薬リザーバを備える。いくつかの実施形態において、マイクロチップは、複数の試料リザーバおよび／または少なくとも１つのハイブリダイゼーション試薬リザーバを備える。他の実施形態において、マイクロチップは、少なくとも１つの試料リザーバおよび／または複数のハイブリダイゼーション試薬リザーバを含む。さらに他の実施形態において、マイクロチップは、複数の試料リザーバおよび／または複数のハイブリダイゼーション試薬リザーバを備える。特定の実施形態において、図１に示すように、マイクロチップは、２つの試料リザーバ１１と、ハイブリダイゼーション試薬リザーバ１２とを備える。一態様において、試料リザーバは、取り外し可能な蓋によって覆われている。別の態様において、取り外し可能な蓋は、上部に入口（例えば、空気入口）を含む。さらに他の態様において、取り外し可能な蓋は、蓋の内側に固定された気体透過性疎水性膜を含む。特定の実施形態において、図１に示すように、試料リザーバ１１は、上部に空気入口１１２を有する取り外し可能な蓋１１１および蓋の内側に固定された気体透過性疎水性膜１１３によって、覆われている。一態様において、蓋は、試料（例えば、増幅試料）および／または１つ以上のハイブリダイゼーション試薬を添加するために開かれ、その後、解析のために固定される。
【００８５】
一態様において、試料リザーバは、例えば、マイクロチップに加工された流路またはチューブおよび／または接続部を介して、少なくとも１つの増幅反応チューブと流体連通している。特定の実施形態において、試料リザーバ１１は、マイクロチップ１に加工された流路２２および接続部１３を介して、増幅反応チューブ２１と流体連通している。一態様において、増幅チューブは、気密性または実質的に気密性である。別の態様において、増幅チューブは、剛性または実質的に剛性である。一態様において、増幅チューブは、シリコーンまたはプラスチックを含む。一態様において、増幅チューブは、シリコーンチューブまたはプラスチックチューブである。さらなる態様において、増幅チューブは、気密性硬質シリコーンチューブまたは気密性硬質プラスチックチューブである。一態様において、増幅チューブは、弾性チューブ、例えばシリコンチューブを介して、接続部に接続される。一実施形態において、伸び状態の弾性チューブの内径は、増幅チューブの外径および接続部の外径よりも小さくい。よって、弾性チューブを介して増幅チューブを接続部に接続するときに、弾性チューブは、増幅チューブおよび接続部に弾性力を与え、実質的な気密性接続を確保する。別の態様において、弾性チューブは、例えば、増幅チューブに流入するおよびそこから流出する流体の流量を制御するように、ピンチバルブとして機能する。いくつかの実施形態において、弾性チューブは、増幅チューブに流入するおよびそこから流出する流体の流量を制御するように、マイクロ流体装置の１つ以上のバルブと連携して動作する。いくつかの実施形態において、弾性チューブは、ピンチバルブとして機能し、増幅チューブに流入するおよびそこから流出する流体の流量を制御するためのマイクロ流体装置の１つ以上のバルブを置換する。
【００８６】
具体的な実施形態において、図１に示すように、増幅チューブ２１は、気密性硬質シリコーンパイプまたは気密性硬質プラスチックチューブであり、弾性シリコンチューブ２２を介して、接続部１３に接続される。伸び状態の弾性チューブ２２の内径は、増幅チューブ２１の外径および接続部１３の外径よりも僅かに小さくい。よって、弾性チューブ２２は、増幅チューブ２１および接続部１３に弾性力を与え、実質的な気密性接続を確保する。いくつかの実施形態において、弾性シリコーンチューブ２２は、ピンチバルブとして機能し、いくつかの態様においてオンボードバルブ４０を置換することができ、または増幅チューブ２１に流入するおよびそこから流出する流体の流量を制御するように、マイクロ流体装置の１つ以上のバルブと連動して動作することができる。
【００８７】
特定の実施形態において、マイクロ流体装置は、板、例えば金属板をさらに含む。一態様において、板は、例えば金属に匹敵する熱伝導率または金属よりも良好な熱伝導率を有する材料を含む。一態様において、板は、少なくとも１つの増幅チューブを封入または埋入するための１つ以上の溝を含む。別の態様において、マイクロ流体装置は、板および／または弾性チューブを支持する支持プラットフォームを含む。一態様において、マイクロ流体チップを機器内に挿入した後、板（例えば、金属板）は、冷却素子および／または加熱素子に密接する。一態様において、金属板の良好な熱伝導率によって、板と増幅チューブとの間の高速な熱交換を達成することができる。これを利用して、増幅チューブ内の溶液または反応混合物の温度を迅速に増加または減少することができる。特定の実施形態において、図１に示すように、マイクロチップは、金属板２３と弾性シリコーンチューブ２２とを支持するための支持プラットフォーム１４を含む。一態様において、増幅チューブ２１は、金属板２３の溝内に埋入される。マイクロ流体チップを機器内に挿入した後、金属板２３は、冷却素子および／または加熱素子に密接する。いくつかの実施形態において、ＰＣＲ反応中、対応するバルブを閉合すると、溶液は、増幅チャンバに十分に閉じ込められる。その後、図１に示すように、バルブを開放して、増幅産物は、１つ以上の混合リザーバ、例えば混合リザーバ１５に導入される。
【００８８】
一態様において、ハイブリダイゼーション試薬リザーバは、混合リザーバに接続される。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーション試薬リザーバは、１つ以上の流路および／または少なくとも１つのバルブを介して、混合リザーバに接続される。一態様において、少なくとも１つのバルブは、弾性バルブ、例えば圧力で作動する弾性バルブである。一態様において、バルブの弾性膜に外力を加えない場合、バルブは、開放しており、ハイブリダイゼーション試薬リザーバと混合リザーバとが流体連通になる。弾性膜に外力を加えるときに、膜は変形し、流体連通をブロックする。特定の実施形態において、図１に示すように、ハイブリダイゼーション試薬リザーバ１２は、流路およびバルブを介して、混合リザーバ１５に接続される。
【００８９】
いくつかの実施形態において、マイクロ流体装置は、ハイブリダイゼーション検出チャンバを備える。一態様において、ハイブリダイゼーション検出チャンバは、マイクロアレイプラットフォーム上に設けられる。一態様において、ハイブリダイゼーション検出チャンバは、少なくとも１つの流体導入流路と、少なくとも１つの流体排出流路とを備える。一態様において、ハイブリダイゼーション検出チャンバは、複数の流体導入流路と、１つの流体排出流路とを備える。一態様において、ハイブリダイゼーション検出チャンバは、複数の流体導入流路と、複数の流体排出流路とを備える。特定の実施形態において、ハイブリダイゼーション検出チャンバは、２つの流体導入流路と、１つの流体排出流路とを備える。一態様において、流体導入流路のうち少なくとも１つは、第１の流路を介して入口開口に接続される。別の態様において、流体導入流路のうち少なくとも１つは、第２流路を介して混合リザーバに接続される。一態様において、流体出口通路の少なくとも１つは、第３流路を介して排出開口に接続される。特定の実施形態において、マイクロアレイプラットフォーム３は、２つの導入流路３２および３３と１つの排出流路３４とを含むハイブリダイゼーション検出チャンバ３１を備える。導入流路３３は、マイクロチップに設けられた第１流路を介して、入口開口５２に接続し、導入流路３２は、マイクロチップに設けられた第２流路を介して、混合リザーバ１５に接続し、排出流路３４は、マイクロチップに設けられた第３流路を介して、排出開口５３に接続する。
【００９０】
一実施形態において、混合リザーバは、混合リザーバ開口を備える。一態様において、混合リザーバ開口は、流体制御サブシステムに設けられたポンプに接続される。一態様において、増幅産物および／またはハイブリダイゼーション試薬は、少なくとも１つのポンプおよび／または少なくとも１つのバルブを含む流体制御サブシステムの制御によって、任意の適切な順序で、混合リザーバに順次にポンプされる。一態様において、増幅産物および／またはハイブリダイゼーション試薬は、少なくとも１つのポンプの往復運動によって十分に混合される。一態様において、混合リザーバは、気泡が上部に上昇するのに十分な容積を有するように設計される。一実施形態において、混合リザーバは、溶液が流体制御サブシステムに進入することを防止するように、空気界面の下方に疎水性面を含む。特定の実施形態において、図１に示すように、混合リザーバ１５は、上部に混合リザーバ開口５１を有する。混合リザーバ１５は、この開口を介して、流体制御サブシステムに設けられたポンプと連通する。増幅産物およびハイブリダイゼーション試薬は、ポンプおよびバルブの制御によって、混合リザーバ１５に順次にポンプされる。
【００９１】
一実施形態において、混合液は、その後、ハイブリダイゼーション検出チャンバに移送される。いくつかの態様において、ハイブリダイゼーション検出チャンバは、制御サブシステム内の少なくとも１つの加熱素子、少なくとも１つの光学素子および／または少なくとも１つの流体マニホルドと連携して設けられる。いくつかの態様において、ハイブリダイゼーション検出チャンバの導入流路は、導入流路開口を介して、流体制御サブシステムに接続される。いくつかの態様において、ハイブリダイゼーション検出チャンバの排出流路は、排出流路開口を介して、流体制御サブシステムに接続される。特定の実施形態において、流体制御サブシステムは、少なくとも１つのポンプと、少なくとも１つのバルブと、少なくとも１つの洗浄緩衝液チャンバと、および／または少なくとも１つの廃棄物チャンバとを備える。一態様において、ハイブリダイゼーション保温期間中、標本または試料は、流体制御サブシステム内のポンプの往復運動によって、ハイブリダイゼーション検出チャンバ内で前後に循環される。一態様において、これによって、ハイブリダイゼーション効率が大きく改善される。別の態様において、ハイブリダイゼーション検出チャンバ内でハイブリッドを形成する間に、反応温度を制御するために、少なくとも１つの加熱素子を設ける。別の態様において、ハイブリダイゼーション反応後、ハイブリダイゼーション検出チャンバは、流体制御サブシステムの制御下で、洗浄および／または乾燥される。特定の実施形態において、図１に示すように、混合リザーバ１５からの混合液は、さらに、制御サブシステム内の少なくとも１つの加熱素子、少なくとも１つの光学素子および／または少なくとも１つの流体マニホールドと連携して設けられたハイブリダイゼーション検出チャンバ３１に輸送される。ハイブリダイゼーション検出チャンバの導入流路３３は、導入流路開口５２を介して、流体制御サブシステムに接続される。排出流路３４は、排出流路開口５３を介して、流体制御サブシステムに接続される。一態様において、ハイブリダイゼーション保温期間中、ハイブリダイゼーション効率を改善するために、標本または試料は、ポンプの往復運動によって、ハイブリダイゼーション検出チャンバ内で前後に循環される。
【００９２】
いくつかの実施形態において、マイクロチップは、中央素子、上部素子、下部素子、膜素子、および接続部のうち、１つ以上を含む。いくつかの態様において、本明細書に開示されたさまざまな構造は、中央素子の上面に形成される。いくつかの態様において、さまざまな構造は、射出成形技術によって、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリスチレンなどのプラスチック材料から製造される。いくつかの態様において、上部および下部部品は、容易に組み立てられる接着フィルムおよび／またはプラスチック板である。いくつかの態様において、上部または下部部品は、本明細書に開示されたさまざまな構造のうち、少なくとも１つを含んでもよく、含まなくてもよい。一態様において、膜素子は、バルブ構造の上面に配置される。一態様において、膜素子は、ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、およびナイロンなどから製造される。特定の態様において、本明細書に記載の接続部は、ねじ止め接管、スリーブ接続部、または鋳造接続部であるいくつかの実施形態において、これらの素子は、レーザ溶接、超音波溶接等の接着または溶接技術の手段によって、接合されることができる。
【００９３】
いくつかの実施形態において、マイクロ流体装置はさらに、制御サブシステムを備える。特定の実施形態において、マイクロ流体装置の制御サブシステムの概略図は、図２に示されている。特定の態様において、制御サブシステムは、流体制御サブシステム、光学サブシステム、および／または熱制御サブシステムを含む。一態様において、流体制御サブシステムは、直接流体マニホルドを介して、マイクロチップの流体界面（例えば、導入流路開口または排出流路開口）に接続される。いくつかの態様において、流体制御サブシステムは、少なくとも１つの流体容器、少なくとも１つのポンプ、少なくとも１つのバルブ、少なくとも１つの流体容器を少なくとも１つのポンプに接続するチューブ、および／または少なくとも１つのバルブを含む。特定の実施形態において、少なくとも１つの流体容器は、溶液／空気容器７１、溶液／空気容器７２、および廃棄物容器７３を含む。いくつかの態様において、容器７１は、未結合の分子を洗浄するための溶液を提供し、容器７２は、乾燥空気を提供する。いくつかの態様において、容器７１および容器７２の両方は、チューブおよび／または流路並びに流体界面５２（導入流路開口５２）を介して、ハイブリダイゼーション検出チャンバ３１と流体連通している。いくつかの態様において、廃棄物容器７３は、廃棄物を収集するために使用される。廃棄物容器７３は、チューブおよび／または流路並びに流体界面５３（排出流路開口５３）を介して、ハイブリダイゼーション検出チャンバ３１と流体連通している。いくつかの態様において、ポンプ８は、制御システムの端部に搭載され、チューブおよび双方向バルブ４９を介して、空気界面５１（混合リザーバ開口５１）および流体界面５３（排出流路開口５３）の両方に接続する。いくつかの態様において、チューブの開口／閉鎖を制御するように、ピンチバルブ４７、４８および４９は、組み立てられる。切替可能な圧力をバルブ４１、４２、４３、４４、４５および／または４６に適用することによって、弾性チューブ２２またはバルブ４０の膜を変形させる。いくつかの態様において、は、増幅およびハイブリダイゼーション中の各々の温度を制御するために、熱制御素子６１および６２をそれぞれ設ける。例えば、熱制御素子６１は、増幅プラットフォーム２の温度を制御し、熱制御素子６２は、ハイブリダイゼーションプラットフォーム３の温度を制御する。一実施形態において、光学システム９は、ハイブリダイゼーション検出チャンバに近接して（例えば、上方または下方）設けられ、ハイブリダイゼーション検出チャンバ内のハイブリダイゼーション反応、例えばマイクロアレイ結果を示す画像を撮影する。
【００９４】
Ｃ．標的ポリヌクレオチド
本明細書の装置を用いて検出される標的ポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖またはより高次鎖であってもよく、直鎖状または環状であってもよい。例示の一本鎖の標的ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｓＲＮＡまたはｓｓＤＮＡウイルスゲノムおよびウイロイドを含む。これらのポリヌクレオチドは、内部相補的な配列および有意な二次構造を含んでもよい。例示的な二本鎖の標的ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、糸粒体ＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＤＮＡウイルスゲノム、プラスミド、ファージ、ｓｈＲＮＡ（小ヘアピンＲＮＡまたは短ヘアピンＲＮＡ）、およびｓｉＲＮＡ（小／短鎖干渉ＲＮＡ）を含む。標的ポリヌクレオチドは、調製された生物学的供給源またはそれらの組み合わせから、組み換え的にまたは合成的に精製されることができる。標的ポリヌクレオチドは、試料の１つ以上の望ましくない成分を除去または減少することによって、または増幅前に標的ポリヌクレオチドを濃縮することによって、精製され得る。逆に、標的ポリヌクレオチドの濃度が特定のアッセイに高すぎる場合、標的ポリヌクレオチドを希釈することができる。
【００９５】
試料の収集、および必要に応じて核酸の抽出および精製の後、標的ポリヌクレオチドを含む試料の核酸部分に対し、１つ以上の予備処理を施すことができる。これらの予備処理は、インビトロ転写（ＩＶＴ）、標識化、断片化、増幅および他の反応を含む。これらの予備処理は、本明細書に開示された装置を用いて行うことができる。まず、逆転写酵素およびプライマ（標的の非相補領域を含む第１プライマであってもよい）を用いて、ｍＲＮＡを処理することによって、検出および／またはさらなる増幅の前にｃＤＮＡを作成することができる。この処置は、スライドに固定された細胞または組織から抽出または精製されたｍＲＮＡまたは切片上で抽出または精製されたｍＲＮＡを用いて、インビトロで行うことができる。核酸の増幅は、目的配列のコピー数を増加する。核酸の増幅を使用して、標識プライマまたは標識ヌクレオチドを用いて標的ポリヌクレオチドから産生された増幅産物に標識を組み込むことができる。使用に適する増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、自己持続配列複製（３ＳＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、Ｑベータレプリカーゼの使用、逆転写、ニック翻訳等を含むさまざまな増幅方法、特に標識された増幅産物を生成し且つ本明細書に教示された方法に利用することができる増幅方法を含む。
【００９６】
本発明の装置および方法を用いて、任意のヌクレオチドを検出することができる。このようなヌクレオチドの例は、ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ＡＤＰ、ＧＤＰ、ＣＤＰ、ＵＤＰ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＡＤＰ、ｄＧＤＰ、ｄＣＤＰ、ｄＴＤＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを含む。
【００９７】
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、配列に直接に組み込まれた標識を有しない。標的ポリヌクレオチドが直接に組み込まれた標識を有するように作られた場合または標識が標的ポリヌクレオチドに直接に結合する場合、この標識は、捕捉プローブ複合基質の検出および／または評価する部分の標識を妨害しないものである。
【００９８】
標的ポリヌクレオチドが一本鎖である場合、第１増幅サイクルは、標的ポリヌクレオチドに相補的なプライマ伸長産物を形成する。標的ポリヌクレオチドが一本鎖ＲＮＡである場合、第１増幅サイクルにおいて、逆転写酵素を用いてＲＮＡをＤＮＡに逆転写し、さらなる増幅サイクルを行い、プライマ伸長産物をコピーすることができる。当然ながら、ＰＣＲ用のプライマは、増幅可能な断片を生成する対応のテンプレート鎖の領域とハイブリッドを形成するように設計されなければならない。したがって、各プライマは、その３′ヌクレオチドが、相補テンプレート鎖の合成をプライミングするために使用されたプライマの３′ヌクレオチドの３′位に位置する対応のテンプレート鎖中のヌクレオチドと塩基対を形成するように、ハイブリッドを形成しなければならない。
【００９９】
標的ポリヌクレオチドの１つ以上の鎖をプライマと、プライマを伸長し且つ標的ポリヌクレオチドをコピーすることによって、完全長の相補的なポリヌクレオチドまたはより小さい一部を生成する適切な活性を有するポリメラーゼとを接触することによって、標的ポリヌクレオチドを増幅することができる。標的ポリヌクレオチドをコピーすることができるポリメラーゼ活性を有する任意の酵素、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、複数種類のポリメラーゼ活性を有する酵素は、使用されることができる。ポリメラーゼは、熱不安定性であってもよく、熱安定性であってもよい。酵素の混合物を使用することができる。例示的な酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、および逆転写酵素を含む。ＤＮＡポリメラーゼの例として、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩ（「ポリＩ」）、ポリＩのＫｌｅｎｏｗ断片、Ｔ４、Ｔ７、シークエナーゼ（商標）Ｔ７、シークエナーゼ（商標）バージョン２．０  Ｔ７、Ｔｕｂ、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、Ｐｆｘ、Ｐｆｕ、Ｔｓｐ、ＴＦＬ、Ｔｌｉ、およびパイロコッカス属ＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。ＲＮＡポリメラーゼの例として、例えば、大腸菌、ＳＰ６、Ｔ３およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。逆転写酵素の例として、例えば、ＡＭＶ、Ｍ−ＭｕＬＶ、ＭＭＬＶ、リボヌクレアーゼＨ−ＭＭＬＶ（SuperScript（商標））、SuperScript（商標））ＩＩ、ThermoScript（商標）、ＨＩＶ−１、およびＲＡＶ２逆転写酵素などが挙げられる。これらのすべての酵素は、市販されている。複数の特異性を有する例示的なポリメラーゼは、ＲＡＶ２ポリメラーゼおよびＴＬｉ（exo-）ポリメラーゼを含む。例示的な熱安定性ポリメラーゼは、Ｔｕｂ、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、Ｐｆｘ、Ｐｆｕ、Ｔｓｐ、ＴＦＬ、Ｔｌｉ、およびパイロコッカス属ＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼを含む。
【０１００】
標的ポリヌクレオチドの増幅を可能にするための適切な反応条件は、ｐＨ、緩衝液、イオン強度、１つ以上の塩の有無およびその濃度、ヌクレオチドおよびマグネシウムおよび／または他の金属イオンのような反応物質および補因子の有無およびその濃度、任意の共溶媒、温度、およびポリメラーゼ連鎖反応を含む増幅スキームを行うための熱循環プロファイルから選択され、使用されるポリメラーゼおよび試料の性質に部分的に依存する可能性がある。共溶媒は、ホルムアミド（一般的に約２〜約１０％）、グリセロール（一般的に約５〜約１０％）、およびＤＭＳＯ（一般的に約０．９〜約１０％）を含む。増幅中に偽陽性産物または人為産物の産出を最小限にするために、さまざまな技術を増幅スキームに使用することができる。これらの技術は、「タッチダウン」ＰＣＲ、ホットスタート法、ネステッドプライマの使用、またはプライマ二量体を形成する際に増幅せず、ステムループ構造を形成するように、ＰＣＲプライマの設計を含む。ＰＣＲを加速することができる技術、例えば、試料内の対流を大きくすることができる遠心ＰＣＲ、試料を急速加熱および急速冷却するための赤外線加熱工程を含む技術を使用することができる。増幅サイクルを１つ以上に行うことができる。ＰＣＲ中に、一方のプライマを過剰にすることによって、そのプライマの伸長産物を過剰に産出することができる。好ましくは、過剰に産出されたプライマ伸長産物は、検出される増幅産物である。複数の異なるプライマを用いて、試料中の特定のポリヌクレオチドの異なる領域を増幅することができる。増幅反応がＰＣＲのようにポリメラーゼを使用した複数の増幅サイクルを含む場合、所定のサイクルに形成されたプライマ伸長産物を対応するテンプレートから分離することは、望ましい。したがって、分離を有利にするように、サイクル間の反応条件を変更する。通常、反応条件の変更は、反応混合物の温度を上昇することによって行われる。分離を有利にするように、反応条件の他の変更、例えば、二本鎖ポリヌクレオチドを溶解した溶液の塩濃度の低下および／またはｐＨの上昇を行ってもよい。増幅反応混合物からの分離を行うことが好ましいが、まず、効果的な技術を用いてポリヌクレオチドを単離して、別の分離溶液に移し、追加の増幅サイクルを行うために、増幅反応混合物に再導入することもできる。
【０１０１】
いくつかの態様において、本明細書に開示されたアッセイは、多重化することができる。すなわち、無関係な異なる標的、または同一の遺伝子座からの異なる対立遺伝子または対立遺伝子のサブグループ、または同一の遺伝子座に位置する染色体の再配列に向けられた異なる対のプライマを使用することによって、複数の別個のアッセイを同時に実行することができる。これによって、試料中複数の標的ポリヌクレオチド（例えば、ｃＤＮＡライブラリー内の特定の遺伝子）の有無を定量化することができる。必要なものは、このようなアッセイにおいて、特異な捕獲配列または特異な標識を介して、異なる第２ポリヌクレオチドの伸長産物を一義に同定する能力である。
【０１０２】
増幅された標的ポリヌクレオチドは、例えば試薬リザーバからの１つ以上の試薬と相互作用することによって、増幅後処理を受けてもよい。いくつかの実施形態において、より容易にアクセス可能であり、ループおよび／またはハイブリッドを形成しない断片を複数の捕捉プローブに提供するために、ポリヌクレオチドアレイを用いてハイブリッドを形成する前に、増幅産物を断片化することが望ましい。ポリヌクレオチドの断片化は、実行されるアッセイに使用可能なサイズの断片を産出する任意の方法によって、行うことができる。適切な物理方法、化学方法および酵素方法は、当該分野に公知である。
【０１０３】
増幅された標的ポリヌクレオチドは、粒子に直接に結合することができ、または標的ポリヌクレオチドおよび／または粒子を修飾してから、粒子に結合することができる。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、例えばビオチン化によって修飾される。いくつかの他の実施形態において、粒子は、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンおよびアビジンなどの官能基を用いて、修飾される。標的ポリヌクレオチドは、これらの修飾および官能基を介して、粒子に結合することができる。二本鎖ポリヌクレオチドの場合、標的ポリヌクレオチドを粒子に結合した後、粒子に結合すると共に、化学反応、酵素または加熱、またはそれらの組み合わせによる変性方法によって、一本鎖の標的ポリヌクレオチドを作製することができる。いくつかの実施形態において、化学反応は、尿素、ホルムアミド、メタノール、エタノール、酵素、またはＮａＯＨを使用する。いくつかの実施形態において、酵素方法は、エキソヌクレアーゼおよびウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを使用する。いくつかの他の実施形態において、二本鎖の標的ポリヌクレオチドは、約３０℃〜約９５℃の間の適当な温度で熱変性する。
【０１０４】
本開示の方法は、試料中に存在する複数の標的ポリヌクレオチドの均質多重解析に適する。複数の標的ポリヌクレオチドは、複数の増幅オリゴヌクレオチドプライマまたはプライマセットによる試料の増幅によって生成される。使用された各プライマまたはプライマセットは、特定の標的ポリヌクレオチド配列の増幅に特異的である。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、パルボウイルスＢ１９、西ナイルウイルス、ハンタウイルス、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ）などを含む複数のポリヌクレオチド標的ウイルス配列の各々の増幅に特異的なプライマを用いて、試料を増幅することによって、複数の標的ウイル配列の有無を解析することができる。
【０１０５】
標的ポリヌクレオチドを含有するまたは標的ポリヌクレオチドを含有する疑いのある試料の一部は、細胞、組織または体液を含む活生物、およびウイルス、マイコプラズマおよび化石を含むその生物の沈着物から直接的にまたは間接的にから得ることができるポリヌクレオチドを含む任意生体材料の供給源であってもよい。また、試料は、合成手段によって全体的または部分的に作製された標的ポリヌクレオチドを含むことができる。一般的には、試料は、主に水性媒体として取得され、または主に水性媒体に分散される。試料の非限定的な例としては、血液、血漿、尿、精液、母乳、痰液、粘液、口腔スワブ、膣スワブ、直腸スワブ、吸引液、針生検、外科手術または剖検などによって得られた組織切片、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚、呼吸道、腸管および尿生殖路からの外部分泌物、涙、唾液、腫瘍、臓器、インビトロ細胞培養成分（細胞培養培地における細胞の増殖に起因する馴化培地、推定ウイルス感染細胞、組み換え細胞および細胞成分を含むがこれらに限定されない）からの標本、およびポリヌクレオチド配列を含むライブラリーなどの組み換え源からの標本が挙げられる。
【０１０６】
試料は、標的ポリヌクレオチドまたはその代用物を含むことが知られている陽性対照試料であってもよい。また、陰性対照試料を使用することもできる。これらの陰性対照試料は、標的ポリヌクレオチドを含有することが予想されていないが、標的ポリヌクレオチドを含有する疑いがある。所与のアッセイに使用された標的ポリヌクレオチド試薬によって汚染されないことを確認するために並びに所定セットのアッセイ条件が偽陽性結果（試料に標的ポリヌクレオチドが存在しなくても陽性シグナル）を生成するか否かを決定するために、これらの陰性対照試料は、検査される。
【０１０７】
存在する任意の標的ポリヌクレオチドを可溶化および／または精製するために、または増幅スキームに使用される試薬または検出試薬に接触されるように、試料を希釈、溶解、懸濁、抽出するまたは他の方法で処理することができる。試料が細胞を含む場合、細胞内のポリヌクレオチドを放出させるように、細胞を溶解または透過処理することができる。透過処理緩衝液を用いて細胞を溶解すると、溶解後に、さらなる工程、例えばポリメラーゼ連鎖反応を直接に行うことができる。
【０１０８】
標的ポリヌクレオチドは、二本鎖であってもよく、一本鎖であってもよい。いくつかの実施形態において、一本鎖の標的ポリヌクレオチドの少なくとも一部は、マイクロアレイ上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブの少なくとも一部と完全にまたは実質的に相補的である。他の実施形態において、一本鎖の標的ポリヌクレオチドは、マイクロアレイ上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブと完全に相補的である。
【０１０９】
標的ポリヌクレオチドにインビトロ操作を行うことによって、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドの断片を生成することできる。インビトロ操作の前、インビトロ操作中またはインビトロ操作の後に、発光団を用いて、標的ポリヌクレオチドを標識することができる。一実施形態において、レーザ、超音波、熱、マイクロ波、圧電、電気泳動、誘電泳動、固相付着、濾過および流動応力を含む物理処理を適用することができる。別の実施形態において、インビトロ操作は、酵素消化、等温増幅、ＰＣＲ増幅、逆転写、逆転写ＰＣＲ増幅、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ＡＳＰＣＲ）、単一塩基伸長（ＳＢＥ）、対立遺伝子特異的プライマ伸長（ＡＳＰＥ）、制限酵素消化、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、プライマ伸長、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、自己持続配列複製（３ＳＲ）、Ｑベータレプリカーゼの使用、ニック翻訳およびＬＡＭＰ法（ＬＡＭＰ）からなる群から選択される。
【０１１０】
二本鎖の標的ポリヌクレオチドの場合、任意の適切な方法で、例えば、化学反応、酵素反応、加熱等の物理処理、またはそれらの組み合わせによって、二本鎖の標的ポリヌクレオチドを変性することができる。いくつかの実施形態において、化学反応は、尿素、ホルムアミド、メタノール、エタノール、ＮａＯＨ、またはそれらの組み合わせを使用する。いくつかの実施形態において、酵素方法は、エキソヌクレアーゼおよびウラシル−Ｎ−グリコシラーゼによる処理が挙げられる。他の実施形態において、二本鎖の標的ポリヌクレオチドは、約３０℃〜約９５℃の間の適当な温度で熱変性する。
【０１１１】
Ｄ．マイクロアレイ
高処理量のマイクロアレイ技術は、数万個の分子相互作用を同時に評価することができる。マイクロアレイは、生物学、医学、薬物の発見に大きな影響を与えてきた。マイクロアレイに基づくＤＮＡアッセイは、遺伝子発現の解析、変異体、一塩基多型（ＳＮＰ）および短反復配列（ＳＴＲ）の遺伝子型決定などの応用に広く使用されてきた。ポリペプチドおよび化学マイクロアレイは、プロテオミクス分野における２つの重要なツールとして現れてきた。また、組み合わせライブラリーの一種である化学マイクロアレイは、リードの識別並びにこれらのリードの最適化のために使用することができる。バイオテロの時代において、法執行機関は、環境中の生物薬剤または化学薬剤の含量を検出することができるマイクロアレイの開発に大きな興味を持つでしょう。
【０１１２】
本開示のいくつかの実施形態によれば、分子相互作用を解析するためのアッセイ方法が提供される。本開示のいくつかの実施形態によれば、標的ポリヌクレオチドを多重解析するためのアッセイ方法が提供される。標的分子は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、小分子化合物、ペプチド、および炭水化物を含む。
【０１１３】
当業者なら認識するように、本開示は、特に医薬開発および診断のためのアッセイおよび技術において、非常に広く応用することができる。例えば、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア、ウイルスおよび原虫を含む多くの感染性病原体または病原性病原体のいずれかに関連するポリヌクレオチド分子を検出するように、または性病、肺疾患、胃腸疾患、心血管疾患などに関連するポリヌクレオチド断片を検出するように、アッセイを設計することができる。
【０１１４】
マイクロアレイは、分子生物学および医学に広く使用される多重化技術である。マイクロアレイは、微細ピンを使用する印刷、既製マスクを使用するフォトリソグラフィ、動的マイクロミラー装置を使用するフォトリソグラフィ、インクジェット印刷、マイクロコンタクト印刷、または微小電極アレイ上の電気化学を含むさまざまな技術を用いて、製造することができる。標準的なマイクロアレイにおいて、プローブ分子は、表面工学を介して、ガラス、シリコン、プラスチック、ヒドロゲル、アガロース、ニトロセルロースおよびナイロンを含む支持材料の固体表面に取り付けられる。
【０１１５】
蛍光標識された標的分子を検出するためのマイクロアレイ結果は、適切な方法で、例えば、明視野でＣＣＤによって（左パネル）、蛍光顕微鏡によって（中央パネル）、および擬似カラー処理を備える市販の蛍光マイクロアレイスキャナーによって（右パネル）、観察することができる。
【０１１６】
ＤＮＡマイクロアレイは、整列されたＤＮＡオリゴヌクレオチドの微小スポットを含む。これらの微小スポットは、プローブとして知られている。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で（標的と呼ばれる）相補的ポリヌクレオチド試料とハイブリッドを形成するために使用される遺伝子の短い部分であってもよく、または他のＤＮＡの短い部分であってもよい。溶液中の標的は、通常、マイクロアレイ上にハイブリドされた標的の螢光団標識、銀色標識または化学発光標識の検出によって、検出され、定量化される。マイクロアレイが数個から数万個のプローブを含むことができるため、マイクロアレイ実験は、多くの遺伝子検査を並行に達成することができる。
【０１１７】
本明細書に記載のシステムは、同一の標的ポリヌクレオチドを検出するために、２つ以上のプローブを含むことができる。例えば、いくつかの実施形態において、システムがマイクロアレイである場合、プローブは、複数のコピー（例えば、２、３、４、５、６、７またはそれ以上）でマイクロアレイ上に存在してもよい。いくつかの実施形態において、システムは、同一の標的ポリヌクレオチドを検出するために、異なるプローブを含む。例えば、これらのプローブは、標的ポリヌクレオチドの異なる（重畳または非重畳）領域に結合することができる。
【０１１８】
標的ポリヌクレオチドのレベルを決定することができる任意のプローブを使用することができる。いくつかの実施形態において、プローブは、オリゴヌクレオチドであってもよい。標的ポリヌクレオチドを検出するために、特定の配列変動が許容されると理解すべきである。したがって、オリゴヌクレオチドの配列（またはその相補配列）は、本明細書に記載の標的ポリヌクレオチドの配列と僅かに異なってもよい。当業者なら理解するように、このような配列変動は、標的ポリヌクレオチドのレベルを決定するオリゴヌクレオチドの能力に大きな影響を与えない配列の変動である。例えば、標準的な方法を用いて整列された場合、これらのオリゴヌクレオチド分子のホモログおよび変異体は、比較的高い配列同一性を有する。本開示に包含されるオリゴヌクレオチドの配列は、本明細書に記載の標的ポリヌクレオチドの配列と少なくとも４０％の配列同一性、例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドを検出するための部分と他の部分とを含む。他の部分は、例えば、オリゴヌクレオチドを基板上に付着させるために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、他の部分は、相補的な配列部分と基板の表面との間の距離を増加するための非特異的配列（例えば、ポリＴまたはポリｄＴ）を含む。
【０１１９】
本明細書に記載のシステム用のオリゴヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＺＮＡ、ＬＮＡおよびそれらの組み合わせ、および／またはそれらの修飾物を含む。また、これらのオリゴヌクレオチドは、修飾したオリゴヌクレオチド骨格を含むことができる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の標的ポリヌクレオチドの全体または一部と相補的または同様である連続オリゴヌクレオチドを少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれ以上を含む。単一のオリゴヌクレオチドは、このような相補的配列を２つ以上含むことができる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドを基板上に取り付けるために、オリゴヌクレオチドは、５′末端または３′末端に反応性基（例えばアミン）を有してもよい。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、プローブは、オリゴヌクレオチドである。アレイを形成するオリゴヌクレオチドは、（ｉ）フォトリソグラフィ技術を使用する（例えば、オリゴヌクレオチドの高密度アレイ）切片上合成、（ｉｉ）ガラス、シリコン、ナイロンまたはニトロセルロース上で中密度から低密度でスポッティング／印刷、（ｉｉｉ）マスキング、および（ｉｖ）ナイロンまたはニトロセルロースハイブリダイゼーション膜上でドットブロット含むがこれらに限定されない任意の数の方法で基板に取り付けることができる。また、オリゴヌクレオチドをマイクロタイターウェル、マイクロ流路または毛細管の液相アンカーと結合することによって、非共有結合でオリゴヌクレオチドを基板上に固定化することができる。
【０１２１】
当技術分野において、ポリヌクレオチドをガラススライドのような固体基板に取り付けるためのいくつかの技術が周知である。１つの方法では、修飾塩基またはアナログを増幅されたポリヌクレオチドに組み込む。修飾塩基またはアナログは、固体基板に付着することができる部分、例えばアミン基、アミン基の誘導体または正電荷を帯電する別のグループを含む。次いで、増幅産物をガラススライドなどの固体基板と接触させる。ガラススライドは、増幅産物上の反応性基と共有結合を形成し、増幅産物を共有結合的に付着することができるアルデヒドまたは別の反応性基で被覆されてもよい。増幅産物を含むマイクロアレイ装置は、Biodotスポッティング機器（BioDot社、Irvine、ＣＡ）およびアルデヒド被覆スライドガラス（CEL Associates, Houston, TX）を用いて製造することができる。増幅産物は、アルデヒド被覆スライド上にスポッティングされ、公開された手順に従って処理されることができる（Schena, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1995), 93:10614-10619）。アレイは、ロボットによって、ガラススライド、ナイロンスライド（Ramsay, G., Nature Biotechnol. (1998), 16:40-44）、ポリプロピレンスライド（Matson, et al., Anal Biochem. (1995), 224(1):110-6）、およびシリコーンスライド（Marshall and Hodgson, Nature Biotechnol. (1998), 16:27-31）上に印刷されることができる。組立体を整列する別の方法は、電場内でマイクロ移液管による精細移液（Marshall, and Hodgson, Nature Biotechnol. (1998), 16:27-31）、および正電荷被覆板上にポリヌクレオチドの直接スポッティングを含む。cmgm.stanford.edu/pbrown/に開示されているように、アミノプロピルシリコン表面化学を利用した方法も、当技術分野において公知である。
【０１２２】
本開示のアッセイは、多重で実施されてもよい。提供された多重化方法は、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、１０００またはそれ以上の異なる捕捉プローブを利用して、異なる標的ポリヌクレオチドから、対応する増幅産物を同時にアッセイすることができる。いくつかの実施形態において、多重方法を使用して、増幅されていないポリヌクレオチド標的配列をアッセイすることができる。本多重化に適した方法、例えば明細書に教示された多重化方法は、少ない標本から大量の情報を取得することができる。少ない標本の取得は、必要とされる技術侵襲性が低いため、研究者は、新たなアッセイを検証するためにまたは単にデータを取得するために、集団のより多くの個体から、試料を得る能力を高める。
【０１２３】
異なる基板が捕捉プローブ複合体の一部として多重アッセイに含まれる場合、異なる基板を区別できるように符号化することができる。任意の符号化方式を使用することができる。好都合に、符号化方式は、１つ以上の異なる蛍光体を使用することができる。使用された蛍光体は、蛍光半導体ナノ結晶であってもよい。高密度スペクトル符号化方式を使用することもできる。
【０１２４】
スペクトル符号化された捕捉プローブ複合体を含む１つ以上の異なる集団を作成することができる。各集団は、１つ以上の半導体ナノ結晶または蛍光ナノ粒子を含む既知のまたは決定できるスペクトルコードを有する基板に取り付けられた１つ以上の異なる捕捉プローブを含む。複合体の異なる集団、したがって異なるアッセイを混ぜることができ、混合集団の存在下でアッセイを行うことができる。個々の複合体のスペクトル特性をスキャンすることによって、それらのスペクトルコードをデコードすることができ、基板、したがって基板に取り付けられた捕捉プローブを同定することができる。多数の異なる半導体ナノ結晶、多数の異なる蛍光ナノ粒子およびそれらの組み合わせを区別することができるため、多数の異なる捕捉プローブおよび増幅産物を同時に調べることができる。
【０１２５】
一実施形態において、マイクロアレイは、少なくとも２つのプローブ分子を含む。別の実施形態において、マイクロアレイは、複数のオリゴヌクレオチドプローブを含む。さらに別の実施形態において、プローブ分子は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、小分子化合物、ペプチドおよび炭水化物からなる群から選択される。
【０１２６】
一実施形態において、得られた一本鎖の標的ポリヌクレオチドは、人工的に設計され、最適化されたポリヌクレオチド配列、例えばTag配列を含んでもよい。さらに別の実施形態において、マイクロアレイは、共通Tag配列を含む。さらに別の実施形態において、Tag配列は、共通Tag配列上のオリゴヌクレオチドプローブと相補的または実質的に相補的である。
【０１２７】
異なるTag配列間の差Ｔｍは、任意の適切な範囲に設定することができ、例えば約５℃以下である。いくつかの実施形態において、Tag配列は、それらの間に交差ハイブリッドを形成しない。いくつかの他の実施形態において、Tag配列は、種のゲノムＤＮＡに対して低い相同性を有する。好ましい実施形態において、Tag配列は、ヘアピン構造を有しない。一実施形態において、Tag配列は、一本鎖オリゴヌクレオチドまたは修飾アナログである。別の実施形態において、Tag配列は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）である。さらに別の実施形態において、Tag配列は、インビトロ操作時に、標的ポリヌクレオチドに導入される。
【０１２８】
Ｅ．マイクロ流体チップの使用
本発明のマイクロ流体チップを任意の適切なアッセイに使用して、アッセイの精度、再現性および／または感度、特に小さな反応容量を含むアッセイの精度、再現性および／または感度を改善することができる。例えば、マイクロ流体チップは、さまざまな部分、例えば核酸間の相互作用、タンパク質関与の免疫反応、タンパク質と核酸との間の相互作用、リガンド−収容体間の相互作用、および小分子とタンパク質または核酸との間の相互作用をアッセイするのに使用することができる。
【０１２９】
本発明のマイクロ流体チップを使用して、任意の解析物、例えば細胞、細胞小器官、ウイルス、分子、およびそれらの凝集体または複合体をアッセイすることができる。例示的な細胞は、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、組み換え細胞および培養細胞を含む。動物細胞、植物細胞、真菌細胞および細菌細胞は、動物界、植物界、真菌界および細菌界の任意の属または亜属から各々由来することができる。本方法を用いて、繊毛虫類、細胞性粘菌、鞭毛虫類および微胞子虫類の任意の属または亜属に由来する細胞をアッセイすることができる。また、本方法を用いて、ニワトリなどの鳥類、魚などの脊椎動物、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、雌ウシ、雄ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、サルおよび他の非ヒト霊長類などの哺乳動物、およびヒトに由来する細胞をアッセイすることができる。
【０１３０】
動物細胞の場合、特定の組織または器官に由来する細胞をアッセイすることができる。例えば、結合組織細胞、上皮組織細胞、筋肉組織細胞または神経組織細胞をアッセイすることができる。同様に、内部動物器官、例えば脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、腺、内部血管等に由来する細胞をアッセイすることができる。さらに、任意の植物、酵母などの真菌、真性細菌または古細菌などの細菌に由来する細胞をアッセイすることができる。また、動物、植物、真菌または細菌細胞などの任意の真核源または原核源に由来する組換え細胞をアッセイすることができる。さらに、体液、例えば血液、尿、唾液、骨髄、精液または他の腹水、および体液の亜分画、例えば血清または血漿をアッセイすることができる。
【０１３１】
例示的な細胞小器官は、核、糸粒体、葉緑体、リボソーム、ＥＲ、ゴルジ体、リソソーム、プロテアソーム、分泌小胞、空胞およびミクロソームを含む。例示的な分子は、無機分子、有機分子およびそれらの複合体を含む。例示的な有機分子は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ビタミン、単糖、オリゴ糖、炭水化物、脂質、およびそれらの複合体を含む。
【０１３２】
本発明のマイクロ流体チップを用いて、任意のヌクレオシドをアッセイすることができる。そのようなヌクレオシドの例は、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、およびウリジンを含む。本開示に従って、任意のヌクレオチドをアッセイすることができる。そのようなヌクレオチドの例は、ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ＡＤＰ、ＧＤＰ、ＣＤＰ、ＵＤＰ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＡＤＰ、ｄＧＤＰ、ｄＣＤＰ、ｄＴＤＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを含む。本発明のマイクロ流体チップを用いて、一本鎖核酸、二本鎖核酸および三本鎖核酸を含む任意の核酸をアッセイすることができる。そのような核酸の例は、Ａ−型ＤＮＡ、Ｂ−型ＤＮＡまたはＺ−型ＤＮＡなどのＤＮＡ、並びにｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡなどのＲＮＡを含む。
【０１３３】
本発明のマイクロ流体チップを用いて、任意の試料をアッセイすることができる。例えば、本方法を用いて、哺乳動物の試料をアッセイすることができる。例示的な哺乳動物は、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウサギ、モルモット、マウス、ヒト、ネコ、サル、イヌおよびブタを含む。本発明のマイクロ流体チップを用いて、臨床試料をアッセイするすることができる。例示的な臨床試料は、血清、血漿、全血、喀痰、脳脊髄液、羊水、尿、胃腸内容物、毛、唾液、汗、歯肉擦過物および生検からの組織を含む。好ましくは、本発明のマイクロ流体チップを用いて、ヒト臨床試料をアッセイする。
【０１３４】
任意の好適な試薬は、本開示に従ったアッセイに使用することができる。一局面において、本開示に使用された試薬は、試料中の分析物と特異的に結合するまたは相互作用する。例示的な試薬は、細胞、細胞小器官、ウイルス、分子、およびそれらの凝集体または複合体を含む。一局面において、試薬は、抗体または核酸である。
【０１３５】
本発明のマイクロ流体チップは、任意の好適なアッセイフォーマット、例えば直接アッセイフォーマット、サンドイッチアッセイフォーマット、または競合アッセイフォーマットに使用されることができる。一実施形態において、異なる複数の試薬を用いて、単一の分析物をアッセイする。別の実施形態において、異なる複数の試薬を用いて、異なる複数の分析物をアッセイする。さらに別の実施形態において、複数の試薬は、増幅チャンバまたはハイブリダイゼーションチャンバの内面に付着させられ、例えば１つ以上の試料中の１つ以上の分析物をアッセイするために使用される。
【０１３６】
本発明のマイクロ流体チップを用いて、細胞、細胞小器官、ウイルス、分子、およびそれらの凝集体または複合体からなる群から選択される部分同士間の相互作用を検出することができる。例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−タンパク質、ＲＮＡ−タンパク質およびタンパク質−タンパク質の間の相互作用などの高分子間の相互作用を分析することができる。他の実施形態において、本発明のマイクロ流体チップを用いて、高分子−小分子または小分子−小分子の間の相互作用を検出または分析することができる。本開示に従って、３つ以上の部分の間の相互作用を含むより複雑な相互作用を検出および／または分析することができる。ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡの間の相互作用を検出する場合、本開示に従って、試料または試薬を反応体積に移送した後、例えば低、中または高ストリンジェンシー下などの好適な条件下で、接触させる工程、すなわちハイブリドを形成する工程を行うことができる。
【０１３７】
試験部分と複数の標的部分との相互作用は、任意の好適な方法によって検出されることができ、本発明のマイクロ流体チップは、特定の検出方法に適するように作製されることができる。例えば、検出を容易にするように、試験部分および／または標的部分を標識することができる。任意の好適な標識を使用することができる。例示的な標識は、放射性標識、蛍光標識、化学標識、酵素標識、発光標識、およびＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）標識を含む。発光標識は、化学発光標識であってもよく、生物発光標識であってもよい。標識は、試験部分のみに、標的部分のみに、または両方に、直接的にまたは間接的に付着させられてもよく、結合させられてもよい。読み出しは、正のシグナルであってもよく、負のシグナルであってもよい。サンドイッチフォーマットまたは競合フォーマットを含む任意の好適なアッセイフォーマットを使用することができる。本発明のマイクロ流体チップを用いて、標識、ＰＣＲ反応のプライマまたはｄＮＴＰ、もしくは酵素を含む試料または試薬のいずれかを送達することができる。
【０１３８】
一実施形態において、本発明のマイクロ流体チップを用いて、試験部分と複数の遺伝子、遺伝子断片またはそれらの符号化製品との間の相互作用を検出する。例えば、複数の標的遺伝子、遺伝子断片またはそれらの符号化製品は、生物学的経路に関与し、同一または同様の生物学的機能を有するタンパク質のグループ、すなわち、細胞周期段階で発現されたタンパク質、細胞型で発現されたタンパク質、組織型で発現されたタンパク質、器官型で発現されたタンパク質、発達段階で発現されたタンパク質、その発現および／または活性が病気または疾患の種類もしくは段階で変更されたタンパク質、またはその発現および／または活性が薬または他の治療によって変更されたンパク質のグループに属する。
【０１３９】
本発明のマイクロ流体チップを用いて、単一の試験部分または物質と複数の標的部分との間の相互作用を検出することができる。好ましくは、本発明の方法は、例えば、高処理量モードで、複数の標的部分の検出、および／または複数の試験部分または物質の間の相互作用の検出に使用される。複数の試験部分または物質と複数の標的部分との相互作用は、同時にまたは連続的に検出することができる。
【０１４０】
本開示のマイクロ流体チップは、核酸増幅反応、生化学反応、免疫反応などを含むがこれらに限定されないさまざまな用途および反応に使用されることができる。
【０１４１】
本発明のマイクロ流体チップおよび方法を用いて、対象物の多数の感染症または感染状態を検出することができる。病原性ウイルスとして、レトロウイルス科（例えば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ，ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩとも称される）などのヒト免疫不全ウイルス）、およびＨＩＶ−ＬＰなどの他の単離菌、ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）、カリシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす株）、トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）、フラウイルス科（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）、コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）、ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）、フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）、パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）、オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）、ブンガウイルス科（例えば、ハンタンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス）、アレナウイルス科（出血熱ウイルス）、レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）、ビマウイルス科、ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）、パルボウイルス科（パルボウイルス）、パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）、アデノウイルス科（殆どのアデノウイルス）、ヘルペスウイルス科（ヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）、およびイリドウイルス科（例えば、アフリカブタ熱ウイルス）、Ｃ型肝炎ウイルス、並びに分類不能ウイルス（例えば、デルタ肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損末端であると考えられる）、ノーウォークおよび関連ウイルス、並びにアストロウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４２】
病原性細菌として、ヘリコバクターピロリ菌、ボレリア・ブルグドルフェリ、レジオネラ・ニューモフィリア、マイコバクテリア種（例えば、結核菌、Ｍ．アビウム、Ｍ．イントラセルラーレ、Ｍ．カンサイイ、Ｍ．ゴルドナエ）、黄色ブドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリア・モノサイトゲネス、化膿レンサ球菌（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｂ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス（ビリダンス群）、大便連鎖球菌、ストレプトコッカス・ボビス、ストレプトコッカス（嫌気性種）、肺炎連鎖球菌、病原性カンピロバクター種、エンテロコッカス種、インフルエンザ菌、炭疽菌、ジフテリア菌、コリネバクテリウム種、ブタ丹毒菌、ウェルシュ菌、破傷風菌、エンテロバクター・アエロゲネス、肺炎桿菌、パスツレラ・ムルトシダ、バクテロイデス種、フゾバクテリウム・ヌクレアタム、大腸菌の病原株、ストレプトバシルス・モニリフォルミス、トレポネーマ・パリジウム、トレポネーマ・ペルテヌエ、レプトスピラ、およびアクチノミセス・イスラエリイが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４３】
感染性真菌として、クリプトコックス・ネオフォルマンス、ヒストプラスマ・カプスラタム、コッキディオイデス・イムミティス、ブラストミケス・デルマティティディス、クラミディア・トラコマティス、カンディダ・アルビカンスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４４】
感染性原虫として、例えば熱帯熱マラリア原虫などのマラリア原虫種、例えばクルーズトリパノソーマなどのトリパノソーマ類、およびトキソプラズマ・ゴンディが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４５】
本発明のマイクロ流体チップは、上記の感染体の遺伝物質を検出することによって、例えば、感染体を示す特異的な核酸配列をＰＣＲすることによって、感染体を示すタンパク質、脂質、または多糖を検出することによって、および／または感染体に対する宿主応答（例えば、感染体に対する宿主抗体）を検出することによって、上記の感染体の検出に好適である。
【０１４６】
以下の実施形態は、本開示のさまざまな態様をさらに説明および例示することを意図しており、いずれかの方法、形状または形態で、本開示の範囲を明示的にまたは非明示的に限定することを意図していない。
【０１４７】
実施形態１
核酸の増幅およびマイクロアレイ検出を行うためのマイクロ流体装置組立体は、マイクロチップ（例えば、基板マイクロチップ）を備えることを特徴とする。
【０１４８】
マイクロチップは、少なくとも１つの試料リザーバと、少なくとも１つのハイブリダイゼーション試薬リザーバと、少なくとも１つの混合リザーバとを含み、少なくとも１つの試料リザーバおよび少なくとも１つのハイブリダイゼーション試薬リザーバの各々は、取り外し可能な蓋によって封止されている。
【０１４９】
マイクロ流体装置は、マイクロチップ上に設けられた少なくとも１つの増幅チャンバを含み、増幅チャンバの数は、試料リザーバの数と同様である。
【０１５０】
少なくとも１つの増幅チャンバは、第１接続部を介して、マイクロチップに設けられた第１流路と流体連通しており、第１流路は、少なくとも１つの試料リザーバと流体連通している。
【０１５１】
少なくとも１つの増幅チャンバは、第２接続部を介して、マイクロチップに設けられた第２流路と流体連通しており、第２流路は、少なくとも１つの混合リザーバと流体連通しており、少なくとも１つの混合リザーバは、混合リザーバ開口を含む。
【０１５２】
マイクロチップは、少なくとも２つの導入流路および少なくとも１つの排出流路を備える少なくとも１つのハイブリダイゼーション検出チャンバを含む。
【０１５３】
少なくとも２つの導入流路のうち一方は、マイクロチップ上の導入流路開口と流体連通しており、少なくとも２つの導入流路のうち他方は、マイクロチップに設けられた第３流路を介して、混合リザーバと流体連通しており、少なくとも１つの排出流路は、マイクロチップ上の排出流路開口と流体連通している。
【０１５４】
少なくとも１つのハイブリダイゼーション試薬リザーバは、マイクロチップに設けられた第４流路を介して、混合リザーバと流体連通している。
【０１５５】
第１、第２、第３および第４流路の各々は、少なくとも１つのバルブを有し、少なくとも１つのバルブは、対応する流路の開閉を制御する。
【０１５６】
実施形態２
実施形態１のマイクロ流体装置において、リザーバを覆うための蓋は、上部の空気入口と、蓋の内側に取り付けられ、内側から空気入口を覆うための疎水性通気膜とを含む。
【０１５７】
実施形態３
実施形態１または２に記載のマイクロ流体装置において、接続部は、ネジ付き接管、スリーブ接続部、または鋳造接続部である。
【０１５８】
実施形態４
実施形態１〜３のいずれかに記載のマイクロ流体装置において、増幅チャンバは、ガラス、石英、ゴムおよびプラスチックからなる群から選択される材料を含む。
【０１５９】
実施形態５
実施態様１〜４のいずれかに記載のマイクロ流体装置において、増幅チャンバは、弾性チューブを介して接続部に接続され、弾性チューブは、必要に応じて、シリコン、プラスチックおよびゴムからなる群から選択される材料を含む。
【０１６０】
実施形態６
実施形態１〜５のいずれかに記載のマイクロ流体装置において、マイクロ流体装置は、サブシステムのさまざまな素子の間の相互作用を容易にするように、チューブおよび流路を適所に保持する支持プラットフォームを備え、支持プラットフォームは、増幅チューブを封入または埋入するための１つ以上の溝を有する金属板を備え、支持プラットフォームは、マイクロ流体装置に集積された一部であってもよく、またはマイクロチップから取り外し可能であってもよい。
【０１６１】
実施形態７
実施形態１〜６のいずれかに記載のマイクロ流体装置において、なくとも１つの混合リザーバの容積は、少なくとも１つの試料リザーバおよび少なくとも１つの試薬リザーバの合計容積よりも大きい。
【０１６２】
実施形態８
実施態様１〜７のいずれかに記載のマイクロ流体装置において、弾性バルブ、相変化バルブまたはトルクバルブである。
【実施例１】
【０１６３】
マイクロ流体装置を用いて、難聴に関連する遺伝子変異の検出
この例において、本明細書に開示された例示的なマイクロ流体装置および制御サブシステムを用いて、難聴に関連する遺伝子変異を解析および検出した。
【０１６４】
遺伝性難聴変異検出キット（マイクロアレイ法）（CapitalBio社、北京、中国）を解析に使用した。濾紙上の乾燥血液を試験試料として回収した。血液試料の抽出は、キットの説明書に従って行われた。抽出されたＤＮＡをキット内のＰＣＲ試薬と混合した。移液管を用いて、ＰＣＲ混合物を試料リザーバに添加した。同様に、ハイブリダイゼーション試薬を試薬リザーバに添加した。アッセイ中、すべての試料リザーバおよびハイブリダイゼーションリザーバは、蓋で覆われた。装置を初期化して、機器に入れた。機器は、自動的に残りの操作を完了した。
【０１６５】
１．システムの初期化
１）洗浄溶液の調製
図２に示すように、溶液１（０．３×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ）を容器７１に充填し、溶液２（０．０６×ＳＳＣ）を容器７２に充填した。
【０１６６】
２）流体の予備充填
ピンチバルブ４７を開放し、「ａ」側を閉合し、「ｂ」側を開放するように、双方向バルブ４９を切換えた。溶液容器７１は、流体制御システムのチューブおよびサブシステムの内部流路（図示せず）を介して、廃棄物容器７３と流体連通した。蠕動ポンプを反時計回り方向に動かすことによって、流路のチューブに液体を充填した。その後、ピンチバルブ４７を閉合し、ピンチバルブ４８を開放した。次いで、ピンチバルブ４９を（「ａ」側を開放し、「ｂ」側を閉合する）他方側に切換え、流路の他の分岐チューブに液体を充填した。
【０１６７】
２．マイクロ流体装置の装入
その後、制御システムを含む機器に、充填された試料および試薬を有するマイクロ流体装置を装入した。いくつかの態様において、光学センサまたは磁気センサを用いて、装置の位置を確認した。同時に、バネまたはスロット設計を用いて、マイクロ流体装置と加熱素子との密着を保証した。また、マイクロチップ上の流体界面は、流体制御サブシステム内の流体マニホールドに密接に接続された。
【０１６８】
３．増幅
すべてのバルブを閉合した。「ａ」側を開放し、「ｂ」側を閉合するように、双方向バルブ４９を切換えた。その後、バルブ４１および４２を開放した。ＰＣＲ試料を増幅チューブにポンプした。その後、バルブ４１および４２を閉合した。同様に、バルブ４３および４４を制御することによって、別のＰＣＲ試料を対応する増幅チューブに導入した。予め設定された熱循環プログラムに従って、ＰＣＲを行った。
【０１６９】
４．混合
ピンチバルブ４１および４２を開放し、増幅産物を混合リザーバにポンプした。その後、バルブ４１および４２を閉合した。その後、バルブ４３および４４を制御することによって、他の増幅チューブに同様の操作を行った。続いて、バルブ４５を開放することによって、ハイブリダイゼーション試薬を混合リザーバに吸入した。蠕動ポンプを前後に移動するように操作することによって、混合リザーバ内の混合物に往復運動を加えた。徹底的に混合されたＰＣＲ産物は、ハイブリダイゼーションのために、準備された。
【０１７０】
５．ハイブリッドの形成
バルブ４６を開放し、「ｂ」側を開くように双方向バルブ４９を切換えた。ＰＣＲ産物およびハイブリダイゼーション試薬の混合物をマイクロアレイチャンバ３１内に導入した。温度制御素子を設定することによって、マイクロアレイチャンバを６０℃に加熱した。再び、蠕動ポンプを前後に移動するように操作することによって、マイクロアレイ内の混合物に往復運動を加えた。この動的ハイブリダイゼーション手順は、標的核酸配列がチャンバ上に固定化プローブに結合する効率を大幅に改善した。
【０１７１】
６．洗浄
ハイブリッド反応を保温した後、マイクロアレイチャンバの温度を２５℃に下げた。ピンチバルブ４７を開放した。容器７１からマイクロアレイチャンバに溶液を汲み上げ、プローブに結合していない核酸を洗い流す。結合していない核酸を含む液体は、廃棄物チャンバに導入された。同様に、容器７２内の溶液を用いて、ハイブリダイゼーション検出チャンバ（マイクロアレイチャンバ）を洗浄した。
【０１７２】
７．検出
ＬＥＤ光源およびＣＣＤカメラを用いて、マイクロアレイの画像または動画を撮影した。
【０１７３】
図３（ａ）は、マイクロアレイのプローブ配置を示している。図３（ｂ）は、上述の手順に従って、２時間のＰＣＲ反応および１５分のハイブリダイゼーションを行ったマイクロアレイの蛍光画像である。陽性対照スポットおよび試料スポットの両方は、効果的な検出を示す強い蛍光シグナルを示した。
【図１】
0006542797.tif 000002
【図２】
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【図３（ａ）】
0006542797.tif 000004
【図３（ｂ）】
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