(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に第１親和性分子を結合させた蛍光色素内包樹脂粒子を一定濃度で含む一定量の溶液を、該第１親和性分子と特異的に結合可能な第２親和性分子を一定密度で固定化したプレートと反応させた際に、計測される信号値（Ｓ）が下記式を満たすものを選択する工程を含む、蛍光色素内包樹脂粒子溶液の生産方法。
０．５×Ａ×Ｂ×（Ｃ／Ｄ）  ≦  Ｓ  ≦  １．２×Ａ×Ｂ×（Ｃ／Ｄ）
Ａ：第１親和性分子を結合させた、前記一定濃度の一定量の溶液中に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子に内包されている数と同数の蛍光色素単体を、前記プレートと反応させた際に計測される信号値
Ｂ：前記一定濃度の一定量の溶液に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子の全表面に結合している第１親和性分子の全数を蛍光色素内包樹脂粒子数で割った、蛍光色素内包樹脂粒子１つあたりに結合している第１親和性分子の数
Ｃ：前記蛍光色素内包樹脂粒子１粒子あたりの発光強度
Ｄ：前記蛍光色素内包樹脂粒子１粒子に内包されている数の蛍光色素単体の発光強度
【請求項２】
表面に第１親和性分子を結合させた蛍光色素内包樹脂粒子を一定濃度で含む一定量の溶液を、該第１親和性分子と特異的に結合可能な第２親和性分子を一定密度で固定化したプレートと反応させた際に、計測される信号値（Ｓ）が下記式を満たす蛍光色素内包樹脂粒子溶液について、当該蛍光色素内包樹脂粒子溶液に含まれる蛍光色素内包樹脂粒子の表面積の総和（Ｔ）に対する、前記第２親和性分子を一定密度で固定化したプレートに前記蛍光色素内包樹脂粒子溶液を散布した際に計測される信号値（Ｓ）の比の値（Ｓ／Ｔ）が所定の値となるように希釈し、前記蛍光色素内包樹脂粒子溶液の濃度を調整する工程を含む、蛍光色素内包樹脂粒子溶液の生産方法。
０．５×Ａ×Ｂ×（Ｃ／Ｄ）  ≦  Ｓ  ≦  １．２×Ａ×Ｂ×（Ｃ／Ｄ）
Ａ：第１親和性分子を結合させた、前記一定濃度の一定量の溶液中に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子に内包されている数と同数の蛍光色素単体を、前記プレートと反応させた際に計測される信号値
Ｂ：前記一定濃度の一定量の溶液に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子の全表面に結合している第１親和性分子の全数を蛍光色素内包樹脂粒子数で割った、蛍光色素内包樹脂粒子１つあたりに結合している第１親和性分子の数
Ｃ：前記蛍光色素内包樹脂粒子１粒子あたりの発光強度
Ｄ：前記蛍光色素内包樹脂粒子１粒子に内包されている数の蛍光色素単体の発光強度
【請求項３】
前記蛍光色素内包樹脂粒子を構成する母体である樹脂がメラミン樹脂およびスチレン樹脂からなる群から選択される樹脂である、請求項１または２に記載の生産方法。
【請求項４】
前記蛍光色素内包樹脂粒子を構成する蛍光色素が有機色素である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の生産方法。
【請求項５】
前記蛍光色素内包樹脂粒子を構成する蛍光色素がペリレンジイミドおよびフルオレセインイソチアネートからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の生産方法。
【請求項６】
前記蛍光色素内包樹脂粒子に結合している第１親和性分子がビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、抗ジニトロフェノール抗体および抗ジゴキシゲニン抗体からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の生産方法。
【請求項７】
前記第１親和性分子が、高分子由来のスペーサーを介して前記蛍光色素内包樹脂粒子に結合している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の生産方法。
【請求項８】
前記スペーサーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫染色等に用いられる蛍光色素内包樹脂粒子溶液の選択方法および濃度調整方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の抗体医薬を中心とした分子標的薬治療の広がりに伴い、分子標的薬をより効率的に使用するための正確な診断法への必要性が高まっている。従来から組織染色方法として、色素を用いるヘマトキシリン−エオジン〔ＨＥ〕染色、酵素を用いたＤＡＢ染色法が広くおこなわれてきたが、その染色濃度は温度、時間などの環境条件により大きく左右され、正確な定量測定は困難であるとされている。
【０００３】
そこで、検出目的の生体分子と結合可能な生体物質プローブを標識するための標識試薬として色素に代わり、蛍光色素が用いられるようになってきた。しかし、通常の蛍光色素を用いた場合では蛍光褪色による定量性低下の問題が生じることがある。そのため、酵素による蛍光・発光の増感などが行われているが、酵素の組織切片への非特異吸着などによる非特異の蛍光が問題となっている。そのような中で蛍光体を集積させたナノ粒子（蛍光色素内包樹脂粒子）は蛍光増感手段の一つの選択肢となっており、これを用いて染色を行うことで、従来の蛍光色素を用いた染色では得られない高い精度および定量性のある評価が可能となる。
【０００４】
例えば、特許文献１（国際公開ＷＯ２０１２／０２９３４２号パンフレット）には、蛍光色素内包樹脂粒子に生体物質プローブが結合されたものを染色試薬として用いる組織染色方法が開示されており、その実施例では、リンカー（ポリエチレングリコール鎖）を介して共有結合によって蛍光色素内包樹脂粒子が結合された抗体を用いて、検出対象を免疫染色する実施形態が開示されている。また、生体物質プローブと蛍光色素内包樹脂粒子とを、共有結合により直接結合させるのではなく、特異的に結合し合う親和性分子、たとえばストレプトアビジン（ＳＡ）とビオチンを介して間接的に結合させる手法も知られている。例えば、特許文献２（国際公開ＷＯ２０１４／２０３６１４号パンフレット）では、実施例において、１次抗体、ビオチンを結合させた２次抗体、およびストレプトアビジンを結合させた蛍光色素内包樹脂粒子を用いて、検出対象を免疫染色する実施形態が開示されている。
【０００５】
ここで、特許文献１に記載されているような従来技術では、表面を修飾した蛍光色素内包樹脂粒子溶液を染色液として免疫染色に用いる際、濃度、もしくは輝度を一定として染色液を調製していた。しかし、ロット（Ｌｏｔ）ごとに粒子の濃度、輝度、粒子の表面を修飾するものとの結合量が違うというこの方法では、ロット違いの表面修飾済み蛍光色素内包樹脂粒子を、粒子の輝度を一定にして染色を行うと±２０％程度の輝点数ばらつきが発生し、濃度を一定としても同様に±１５％程度のばらつきがあるという問題があった。また、粒子の表面状態を観察しても染色結果を予想することができず、表面修飾後の粒子の性能評価をおこなうためにはロット毎にそれぞれ病理染色を行う必要があった。
【０００６】
なお、特許文献３（特開２０１１−１４１２３２号公報）に記載されているような、ビオチン化プレートによる蛍光色素のビオチンに対するアビジンの親和性量測定は、蛍光色素一分子に対して、1つのアビジンが結合した蛍光色素に対する評価であって、本発明のように蛍光色素を集積させて、さらに表面に親和性分子を複数結合させた蛍光色素内包樹脂粒子の評価に使用した例はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１２／０２９３４２号パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１４／２０３６１４号パンフレット
【特許文献３】特開２０１１−１４１２３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上述したような課題を解決するために、ストレプトアビジン（ＳＡ）等の親和性分子による表面修飾済みの蛍光色素内包樹脂粒子を用いて染色液を調製する際に、従来品と比べて染色後の輝点数ばらつきが少ない蛍光色素内包樹脂粒子溶液の調整方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ビオチン化プレートとＳＡ表面修飾済み蛍光色素内包樹脂粒子を用いて反応させることで発光する蛍光を信号値とした場合、複数の異なったロットのＳＡ表面修飾済み蛍光色素内包樹脂粒子溶液の中から、所定の範囲に収まる信号値が得られるものを選択し、そのようなＳＡ表面修飾済み蛍光色素内包樹脂粒子溶液を染色液として用いると、染色のばらつきが抑えられること、その理由として、上記のような所定の信号値を発するＳＡ表面修飾済み蛍光色素内包樹脂粒子は、それぞれの蛍光色素内包樹脂粒子の表面積あたりにおけるストレプトアビジン結合量が同じになっていると考えられるため、この選択方法が表面修飾済み蛍光色素内包樹脂粒子溶液の調整法として非常に有力であることを見出した。
【００１０】
本発明は、上記課題を解決することのできる、例えば下記のような構成を有する、蛍光色素内包樹脂粒子溶液の選択方法およびその選択方法を利用した蛍光色素内包樹脂粒子溶液の濃度の調整方法、ならびにこれらの方法によって得られた蛍光色素内包樹脂粒子溶液を提供する。
【００１１】
［項１］
表面に第１親和性分子を結合させた蛍光色素内包樹脂粒子を一定濃度で含む一定量の溶液を、該第１親和性分子と特異的に結合可能な第２親和性分子を一定密度で固定化したプレートと反応させた際に、計測される信号値（Ｓ）が下記式を満たすものを選択する工程を含む、蛍光色素内包樹脂粒子溶液の生産方法。
０．５×Ａ×Ｂ×（Ｃ／Ｄ）  ≦  Ｓ  ≦  １．２×Ａ×Ｂ×（Ｃ／Ｄ）
Ａ：第１親和性分子を結合させた、前記一定濃度の一定量の溶液中に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子に内包されている数と同数の蛍光色素単体を、前記プレートと反応させた際に計測される信号値
Ｂ：前記一定濃度の一定量の溶液に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子の全表面に結合している第１親和性分子の全数を蛍光色素内包樹脂粒子数で割った、蛍光色素内包樹脂粒子１つあたりに結合される第１親和性分子の数
Ｃ：前記蛍光色素内包樹脂粒子１粒子あたりの発光強度
Ｄ：前記蛍光色素内包樹脂粒子１粒子に内包されている数の蛍光色素単体の発光強度
【００１２】
［項２］
表面に第１親和性分子を結合させた蛍光色素内包樹脂粒子を一定濃度で含む一定量の溶液を、該第１親和性分子と特異的に結合可能な第２親和性分子を一定密度で固定化したプレートと反応させた際に、計測される信号値（Ｓ）が下記式を満たす蛍光色素内包樹脂粒子溶液について、当該蛍光色素内包樹脂粒子溶液に含まれる蛍光色素内包樹脂粒子の表面積の総和（Ｔ）に対する、前記第２親和性分子を一定密度で固定化したプレートに前記蛍光色素内包樹脂粒子溶液を散布した際に計測される信号値（Ｓ）の比の値（Ｓ／Ｔ）が所定の値となるように希釈し、前記蛍光色素内包樹脂粒子溶液の濃度を調整する工程を含む、蛍光色素内包樹脂粒子溶液の生産方法。
０．５×Ａ×Ｂ×（Ｃ／Ｄ）  ≦  Ｓ  ≦  １．２×Ａ×Ｂ×（Ｃ／Ｄ）
Ａ：第１親和性分子を結合させた、前記一定濃度の一定量の溶液中に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子に内包されている数と同数の蛍光色素単体を、前記プレートと反応させた際に計測される信号値
Ｂ：前記一定濃度の一定量の溶液に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子の全表面に結合している第１親和性分子の全数を蛍光色素内包樹脂粒子数で割った、蛍光色素内包樹脂粒子１つあたりに結合される第１親和性分子の数
Ｃ：前記蛍光色素内包樹脂粒子１粒子あたりの発光強度
Ｄ：前記蛍光色素内包樹脂粒子１粒子に内包されている数の蛍光色素単体の発光強度
【００１３】
［項３］
前記蛍光色素内包樹脂粒子を構成する母体である樹脂がメラミン樹脂およびスチレン樹脂からなる群から選択される樹脂である、項１または２に記載の生産方法。
【００１４】
［項４］
前記蛍光色素内包樹脂粒子を構成する蛍光色素が有機色素である、項１〜３のいずれか一項に記載の生産方法。
【００１５】
［項５］
前記蛍光色素内包樹脂粒子を構成する蛍光色素がペリレンジイミドおよびフルオレセインイソチアネートからなる群から選択される、項１〜４のいずれか一項に記載の生産方法。
【００１６】
［項６］
前記蛍光色素内包樹脂粒子に結合している第１親和性分子がビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびニュートラアビジン、抗ジニトロフェノール抗体および抗ジゴキシゲニン抗体からなる群から選択される、項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【００１７】
［項７］
前記第１親和性分子が、高分子由来のスペーサーを介して前記蛍光色素内包樹脂粒子に結合している、項１〜６のいずれか一項に記載の生産方法。
【００１８】
［項８］
前記スペーサーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、項７に記載の生産方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の生産方法により、十分な染色性能を持った蛍光色素内包樹脂粒子溶液を選択し、さらに所定の方法で得られた信号値に基づいて蛍光色素内包樹脂粒子の濃度を調整することにより、一定の染色性能を持つ蛍光内包樹脂粒子溶液を得ることができる。例えばビオチン化プレートを用いて、ＳＡで修飾された表面修飾後の蛍光色素内包樹脂粒子を用いた場合、プレートから得られた信号値とその粒子を用いて実際に免疫染色を行なった輝度の強さとの相関関係が高いことから、実際に染色をおこなわずとも粒子の染色性能を判断することがでる。さらに、蛍光色素内包樹脂粒子の表面積の総和（Ｔ）に対する、ビオチン化プレートに蛍光色素内包樹脂粒子溶液を散布した際に計測される信号値（Ｓ）の比の値（Ｓ／Ｔ）が所定の値となるように溶液を希釈することによって、蛍光色素内包樹脂粒子溶液の濃度を同等の染色性能を持つように調整することが可能となる。従って、異なったロットの蛍光色素内包樹脂粒子溶液を用いて病理染色を行なった場合でも、ばらつきのない染色結果を得ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】左図は実施例１によって選択されたＳＡ結合蛍光色素内包樹脂粒子溶液を染色液として用いた場合、右図は比較例１によって選択されたＳＡ結合蛍光色素溶液を染色液として用いた場合、それぞれについて免疫染色画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
−蛍光色素内包樹脂粒子溶液の生産方法−
本発明の蛍光色素内包樹脂粒子溶液の生産方法は、以下に述べる所定の「選択工程」および／または「濃度調整工程」を含む。「濃度調整工程」に用いられる所定の蛍光色素内包樹脂粒子溶液は、典型的には「選択工程」において選択されたものであり、したがって本発明の蛍光色素内包樹脂粒子溶液の生産方法は「選択工程」に続いて「濃度調整工程」を含む実施形態であってもよい。一方で、「濃度調整工程」に用いられる所定の蛍光色素内包樹脂粒子溶液は、本発明における「選択工程」とは別の手段によって選択されたもの、または「濃度調整工程」を含む蛍光色素内包樹脂粒子溶液の生産方法の実施者とは異なる実施者による（つまり「濃度調整工程」とは不連続な）「選択工程」によって選択されたものであってもよい。
【００２２】
また、本発明の蛍光色素内包樹脂粒子溶液の生産方法に用いられる蛍光色素内包樹脂粒子は、当該生産方法の一部として含まれる蛍光色素内包樹脂粒子の作製工程によって得られたものであってもよいし、当該生産方法の実施者とは異なる実施者による（つまり「濃度調整工程」とは不連続な）作製工程によって得られたものであってもよい。表面修飾蛍光色素内包樹脂粒子の作製工程は、典型的には、蛍光色素内包樹脂粒子の合成工程、およびその表面修飾工程によって構成される。
【００２３】
以下、表面に第１親和性分子を結合させた蛍光色素内包樹脂粒子（本明細書において「表面修飾蛍光色素内包樹脂粒子」と称することがある。）に関する合成工程および表面修飾工程、ならびに表面修飾蛍光色素内包樹脂粒子の溶液に関する濃度調整工程および選択工程の順で、本発明の蛍光色素内包樹脂粒子溶液の生産方法に関係する工程を説明する。
【００２４】
［蛍光色素内包樹脂粒子の合成工程］
（蛍光色素内包樹脂粒子）
蛍光色素内包樹脂粒子とは、詳しくは、樹脂でできた粒子（母体）中に、比較的多量の蛍光色素が内包（集積化）された構造を有するナノサイズの粒子である。蛍光色素は、好ましくは樹脂の分子構造（たとえばメラミン樹脂のような熱硬化性樹脂が有する三次元的な網目構造）によって粒子内に閉じ込められている。あるいは、蛍光色素が有する官能基ないし部位と樹脂が有する官能基ないし部位との間に静電的相互作用（イオン結合）が働いているか、またはそれらの間で共有結合が形成されていることが好ましい。このようにして蛍光色素が強固に樹脂粒子に固定化されている蛍光色素内包樹脂粒子は、濃度消光を起こしにくく、また蛍光観察時に一定時間蛍光を当て続けても褪色しにくいため、ノイズであるエオジンの蛍光や細胞自家蛍光に対して著しく高い輝度を有する。その上、組織染色の透徹工程で用いられる有機溶媒（キシレン）によって蛍光色素が粒子外に溶出してしまうことも抑制されるため、蛍光標識体として優れている。
【００２５】
蛍光色素内包樹脂粒子を形成する樹脂としては、例えば、スチレン樹脂、アクリロニトリル樹脂、フラン樹脂、または、これに類する樹脂、キシレン樹脂、ポリ乳酸、ポリグリシジルメタクリレート、メラミン樹脂、尿素樹脂、ベンゾグアナミン樹脂、ポリアミド、フェノール樹脂、多糖類等、安定的に蛍光色素を内包できるものが挙げられる。蛍光色素をこのような粒子中に内包させることにより、蛍光色素単独よりも励起光の照射による劣化の起こりにくい（耐光性の強い）蛍光色素内包樹脂粒子を作製することができる。特に、スチレン樹脂およびメラミン樹脂は、耐光性の観点から蛍光色素内包樹脂粒子の母体として好ましい。
【００２６】
表面修飾蛍光色素内包樹脂粒子の作製に用いられる蛍光色素内包樹脂粒子の合成工程は、一般的な蛍光色素内包樹脂粒子と同様の、公知の重合方法を利用して行うことができる。
【００２７】
例えば、母体として熱硬化性樹脂を用いる場合、蛍光色素内包樹脂粒子は基本的に乳化重合法に従って、蛍光色素を用いることにより合成することができ、界面活性剤および重合反応促進剤を用いる重合方法により合成することが好ましい。母体として熱可塑性樹脂を用いる場合、蛍光色素内包樹脂粒子は、基本的にラジカル重合、イオン重合（アニオン重合、他）などに従って、蛍光色素を用いることにより合成することができ、例えばソープフリー乳化重合法に従った重合工程により合成することが好ましい。
【００２８】
このような合成方法により得られる内包型の蛍光標識用樹脂粒子において、大部分の蛍光色素は、望ましくは実質的に全ての蛍光色素は樹脂粒子に内包された状態で固定化されるが、一部の蛍光色素が樹脂粒子の表面に結合ないし付着した状態で固定化されることが排除されるものではない。また、蛍光色素が内包された状態において、どのような化学的または物理的な作用で蛍光色素が樹脂粒子に固定化されているかは限定されるものではない。上で例示した重合方法に従えば、合成工程に先立って、樹脂原料と蛍光色素とをあらかじめ共有結合させたり、樹脂原料に積極的に荷電した置換基を導入したりするための誘導体化工程を設けずとも、発光強度や耐光性に優れた蛍光色素内包樹脂粒子が得られるが、所望によりそのような工程を併用することも排除されるものではない。
【００２９】
（蛍光色素）
本明細書において「蛍光色素」とは、外部からのＸ線、紫外線または可視光線の照射を受けて励起し、励起状態から基底状態に到る過程において光を発光する物質一般を指す。したがって、本発明にいう「蛍光色素」は、励起状態から基底状態に戻るときの遷移態様の如何を問うものでなく、励起一重項からの失活に伴う発光である狭義の蛍光を発する物質であってもよいし、三重項からの失活に伴う発光である燐光を発する物質であってもよい。
【００３０】
また、本発明にいう「蛍光色素」は、励起光を遮断してからの発光寿命によって限定されるものでもない。したがって、硫化亜鉛やアルミン酸ストロンチウム等の蓄光物質として知られている物質であってもよい。本発明で用いる蛍光色素内包樹脂粒子に内包される蛍光色素としては有機蛍光色素または無機蛍光色素のどちらを選択してもよいが、粒径が小さく、母体である樹脂に効率よく内包させることが可能なことから、有機蛍光色素を用いるほうがより好ましい。
【００３１】
（有機蛍光色素）
蛍光色素としての使用可能な有機蛍光色素のとしては、ペリレン系色素分子、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、Ｃｙ（登録商標、ＧＥヘルスケア社製）系色素分子、クマリン系色素分子、ＮＢＤ（登録商標）系色素分子、エオジン系色素分子およびピレン系色素分子等を挙げることができる。
【００３２】
ペリレン系色素分子の具体例としては、ペリレンジイミドが挙げられ、フルオレセイン系色素分子の具体例としては、フルオレセインイソチアネート、５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−フルオレセイン、５，６−ジカルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン等が挙げられる。
【００３３】
ローダミン系色素分子の具体例としては、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン ６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン等が挙げられる。
【００３４】
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ系色素分子の具体例としては、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０等が挙げられる。
【００３５】
ＢＯＤＩＰＹ系色素分子の具体例としては、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５等が挙げられる。
【００３６】
Ｃｙ系色素分子の具体例としては、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７等が挙げられる。
クマリン系色素分子の具体例としては、メトキシクマリン、エオジン系色素分子の具体例としてはエオジン、ＮＢＤ（登録商標）系色素分子の具体例としては、ＮＢＤ、ピレン系色素分子の具体例としてはピレンが挙げられる。
【００３７】
これらの有機蛍光色素は、いずれかの種類を単独で用いても、複数種を併用してもよい。また、蛍光を発することができる範囲で、特に蛍光色素内包樹脂粒子の母体となる化合物との反応性を考慮して、誘導体化して用いてもよい。また特にペリレンジイミドおよびフルオレセインイソチアネートが好適に用いられる。
【００３８】
（無機蛍光色素）
蛍光色素としての使用可能な無機蛍光色素の例としては、量子ドットを挙げることができる。量子ドットとしては、ＩＩ−ＶＩ族化合物、ＩＩＩ−Ｖ族化合物、又はＩＶ族元素を成分として含有する量子ドット（それぞれ、「ＩＩ−ＶＩ族量子ドット」、「ＩＩＩ−Ｖ族量子ドット」、「ＩＶ族量子ドット」ともいう。）のいずれかを用いることができる。具体的には、国際公開ＷＯ２０１２／１３３０４７号公報に例示されたＣｄＳｅ等の粒子ドットを挙げることができる。これらの無機蛍光色素は、いずれかの種類を単独で用いても、複数種を併用してもよい。
【００３９】
蛍光色素内包樹脂粒子の平均粒径は特に限定されないが、通常１０〜５００ｎｍであり、好ましくは３０〜２００ｎｍである。また、粒径のばらつきを示す変動係数も特に限定されないが、通常は２０％以下であり、好ましくは５〜１５％である。
【００４０】
製造した蛍光色素内包樹脂粒子の平均粒子径の測定は、当該分野で知られた方法により行うことができ，例えば、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し、蛍光色素内包樹脂粒子の断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径（面積円相当径）として測定することができる。蛍光色素内包樹脂粒子の集団の粒子サイズの平均（平均粒径）および変動係数は、十分な数（たとえば１０００個）の蛍光色素内包樹脂粒子について上記のようにして粒子サイズ（粒径）を測定した後、平均粒径はその算術平均として算出され、変動係数は式：１００×粒径の標準偏差／平均粒径、により算出される。
【００４１】
［蛍光色素内包樹脂粒子の修飾工程］
蛍光色素内包樹脂粒子から表面修飾蛍光色素内包樹脂粒子を作製するための修飾工程は、一般的な表面修飾蛍光色素内包樹脂粒子と同様の、公知の修飾方法を利用して行うことができる。
【００４２】
（第１親和性分子）
本発明における第１親和性分子は、蛍光色素内包樹脂粒子の表面を修飾する分子であり、蛍光色素内包樹脂粒子を修飾でき、かつ後述する第２親和性分子に結合する分子であればとくに限定されるものではない。
【００４３】
第１親和性分子の第１グループとしては、ハプテン親和性分子、例えば、ビオチン、アビジンおよびその改変体（ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等）、ならびに抗ハプテン抗体（抗ジニトロフェノール抗体、抗ジゴキシゲニン抗体等）が挙げられる。このような第１グループの第１親和性分子は、免疫染色において、ハプテンを結合させた１次抗体または２次抗体と、ハプテン親和性分子を結合させた蛍光色素内包樹脂粒子とを含む免疫複合体を形成させる実施形態において用いられる。あるいは、ＦＩＳＨにおいて、ハプテンを結合させた核酸分子（プローブ）と、ハプテン親和性分子を結合させた蛍光色素内包樹脂粒子とを含む複合体を形成させる実施形態において用いられる。このような汎用性および染色効率の高さから、本発明の第１親和性分子としては上記第１グループから選ばれるものが好ましい。
【００４４】
第１親和性分子の第２グループとしては、抗ハプテン抗体を除く抗原親和性分子のうち、病理診断等の免疫染色の検出目的とする生体分子を抗原として特異的に認識する抗体、いわゆる１次抗体が挙げられる。このような第２グループの第１親和性分子は、免疫染色において、抗原と、１次抗体を結合させた蛍光色素内包樹脂粒子とを含む免疫複合体を形成させる実施形態において用いられる。この際の１次抗体は、検出目的とする生体分子に対応したものを用いることができ、例えばＨＥＲ２を検出目的とする免疫染色を行なう場合には、１次抗体として抗ＨＥＲ２抗体、好ましくは抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体を用いればよい。
【００４５】
第１親和性分子の第３グループとしては、抗ハプテン抗体を除く抗原親和性分子のうち、上述した１次抗体を抗原として特異的に認識する抗体、いわゆる２次抗体が挙げられる。このような第３グループの第１親和性分子は、免疫染色において、抗原と、１次抗体と、２次抗体を結合させた蛍光色素内包樹脂粒子とを含む免疫複合体を形成させる実施形態において用いられる。この際の２次抗体は、１次抗体（ＩｇＧ）を抗原として認識するものであればよく、１次抗体を産生した動物種に対応して、抗マウス、ラビット、牛、ヤギ、羊、犬、チキンＩｇＧ抗体を用いることができる。例えば、１次抗体として抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体を用いる場合には、２次抗体として抗ウサギＩｇＧ抗体を用いればよい。
【００４６】
蛍光色素内包樹脂粒子と第１親和性分子との結合は、直接的な結合であってもよいし、他の分子を介在させる間接的な結合であってもよい。一般的な作製方法を用いて、蛍光色素内包樹脂粒子が結合した第１親和性分子を作製することができる。
【００４７】
蛍光色素内包樹脂粒子に対して第１親和性分子を直接的に結合させる態様としては、特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着及び化学吸着等が挙げられ、公知の方法で行うことができる。結合の安定性からは、樹脂が有する（本来的に有するものであっても、所定の方法で樹脂の合成後に導入されたものであってもよい）官能基と第１親和性分子が有する官能基とを反応させることによって生じる共有結合のように、結合力の強い結合が好ましい。
【００４８】
蛍光色素内包樹脂粒子に対して第１親和性分子を間接的に結合する場合の態様としては、両末端に官能基を有する高分子を用いて、それらの官能基を樹脂が有する官能基と第１親和性分子が有する官能基のそれぞれと反応させることにより、蛍光色素内包樹脂粒子と第１親和性分子とをその高分子由来のスペーサー（リンカー）を介して結合させる態様が挙げられる。特にこのような実施形態において、蛍光色素内包樹脂粒子表面の単位面積当たりに結合する第１親和性分子の量が変動しやすいため、本発明を適用することの有効性が高い。
【００４９】
例えば、アミンとカルボン酸の反応によるアミド化、マレイミドとチオールの反応によるスルフィド化、アルデヒドとアミンの反応によるイミン化、エポキシとアミンの反応によるアミノ化等を利用して、第１親和性分子と（必要に応じてスペーサーと）蛍光色素内包樹脂粒子とを共有結合させることができる。第１親和性分子、必要に応じて用いられるスペーサーの両端、蛍光色素内包樹脂粒子の表面のそれぞれに、上述した反応に関与する官能基を導入しておき、所定の条件下で反応させることで、共有結合によって連結することができる。
【００５０】
蛍光色素内包樹脂粒子に対して第１親和性分子を間接的に結合させるスペーサーとして使用される（高）分子は特に限定されるものではなく、スペーサーとして一般的に用いられている、適切な長さを有する（高）分子の中から選択することができる。疎水性高分子のスペーサーの例としては、ポリアミド、飽和炭化水素、疎水性ポリアミノ酸、ポリスチレン、ポリメタクリル酸エステル等が挙げられ、親水性高分子のスペーサーの例としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸交互共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタアクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアスパルトアミド、合成ポリアミノ酸等が挙げられる。またスペーサーは１種類の物質から形成されていてもよいし、２種以上の物質から形成されていてもよい。
【００５１】
これらのスペーサーのなかでは、非特異的吸着を抑制できることなどの観点から親水性高分子が好ましく、特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、オキシエチレン単位の数により鎖長を設定しやすい観点から好ましい。ＰＥＧを用いる場合は、例えばサーモサイエンティフィック社等の市販のものを購入したり、化学構造の繰り返しの単位の数を設定して、試薬メーカー等に製造を依頼したりすることで任意の長さのものを入手することができる。
【００５２】
スペーサーの長さは、結合する蛍光色素内包樹脂粒子の粒径に応じて、適切な範囲で調整すればよい。単一の長さをもつスペーサーを用いてもよいし、それぞれ異なった２種類以上の長さをもつスペーサーを併用してもよい。単一のスペーサーを用いる場合、スペーサーの長さは１〜１００ｎｍが好ましい。２種類以上の長さを有するスペーサーを用いる場合、そのうちの少なくとも１種類のスペーサーの長さが１〜１００ｎｍであり、他のスペーサーの長さが０．１〜１０ｎｍであることが好ましい。
【００５３】
（第２親和性分子）
本発明において、第２親和性分子は、プレートに固定化され、第１親和分子と結合した蛍光色素内包樹脂粒子と反応することで発光する蛍光を信号値として計測するために用いられる分子であり、選択される第１親和性分子に対応した、それと特異的に結合する分子であればよい。このような第２親和性分子は、免疫染色を行なう際に、検出目的とする生体分子に対して直接的または間接的に結合させることで、第１親和性分子と結合した蛍光色素内包ナノ粒子と生体分子間の結合の仲立ちとなるために用いられる。
【００５４】
第１親和性分子の第１グループ（ハプテン親和性分子）に対応する、第２親和性分子の第１グループは、ハプテン親和性分子と特異的に結合する分子、すなわちハプテンであり、例えば、ビオチン、ジニトロフェノール、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。
【００５５】
第１親和性分子の第２グループ（１次抗体）に対応する、第２親和性分子の第２グループは、１次抗体と特異的に結合する分子であって、免疫染色の検出目的とする生体分子であってもよいし、１次抗体を抗原とする２次抗体であってもよい。ただし、１次抗体が結合した蛍光色素内包樹脂粒子は、免疫染色の際に検出目的とする生体分子に直接結合させるので、そのための結合能をなるべく正確に評価するため、検出目的とする生体分子を第２親和性分子の第２グループとすることがより適切である。
【００５６】
第１親和性分子の第３グループ（２次抗体）に対応する、第２親和性分子の第３グループは、２次抗体と特異的に結合する分子、すなわち２次抗体の抗原となっている１次抗体である。
【００５７】
第２親和性分子を固定化したプレートは、市販のものを用いてもよいし、プレートと第２親和性分子とを用いて作製してもよい。第２親和性分子としてビオチンを固定化したプレートは、ビオチン化プレート（例えばＧ−ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ社の製品）として市販されている。また、第２親和性分子として１次抗体または２次抗体を固定化したプレートは、市販のマイクロプレート（例えばマキシソープ社の製品、フルオロヌンクモジュール＆プレート）を利用して、所定のプロトコールに従って、所望の抗体を含む溶液をウェルに添加して反応させ、固定化することにより作製することができる。
【００５８】
［蛍光色素内包樹脂粒子溶液の選択工程］
本発明における選択工程は、表面に第１親和性分子を結合させた蛍光色素内包樹脂粒子を一定濃度で含む一定量の溶液を、該第１親和性分子と特異的に結合可能な第２親和性分子を一定密度で固定化したプレートと反応させた際に、計測される信号値（Ｓ）が下記式を満たすものを選択する工程である。
【００５９】
０．５×Ａ×Ｂ×（Ｃ／Ｄ）  ≦  Ｓ  ≦  １．２×Ａ×Ｂ×（Ｃ／Ｄ）
式中、Ａは第１親和性分子を結合させた、前記一定量の溶液中に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子に内包されている数と同数の蛍光色素単体を、前記プレートと反応させた際に計測される信号値を示し、
Ｂは前記一定濃度の一定量の溶液に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子の全表面に結合している第１親和性分子の全数を蛍光色素内包樹脂粒子数で割った、蛍光色素内包樹脂粒子１つあたりに結合している第１親和性分子の数を示し、
Ｃは前記蛍光色素内包樹脂粒子１粒子あたりの発光強度を示し、
Ｄは前記蛍光色素内包樹脂粒子１粒子に内包されている数の蛍光色素単体の発光強度を示す。
【００６０】
選択工程に先だって、第１親和性分子と結合させた蛍光色素内包樹脂粒子を任意のロット数用意し、それぞれについて適当な溶媒に懸濁して所定の濃度に調整した、蛍光色素内包樹脂粒子溶液を調製しておく。この際に用いる溶媒としては、例えばＰＢＳ、ＢＳＡ含有ＰＢＳおよびＨ2Ｏ等が挙げられ、特にプレートへのタンパク質の非特異的な吸着を抑制できるという観点から、１％程度のＢＳＡ含有ＰＢＳが好適である。
【００６１】
上記Ａの規定に含まれている、蛍光色素の「第１親和性分子を結合させた、前記一定濃度の一定量の溶液中に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子に内包されている数」（ａ）は、次のようにして計算することが可能である。すなわち、一定濃度（例えば０．０１ｎＭ、すなわち６．０２×１０9粒子／ｍＬ）の一定量の蛍光色素内包樹脂粒子溶液（蛍光色素内包樹脂粒子標準液）と、それと同じ一定濃度（例えば０．０１ｎＭ、すなわち６．０２×１０9分子／ｍＬ）の蛍光色素溶液（蛍光色素標準液）を調製し、それぞれの溶液の発光ピーク波長における蛍光強度を測定する。ここで、蛍光色素内包樹脂粒子内には蛍光色素同士が高濃度で集積しているので、濃度消光と呼ばれる現象により、蛍光色素内包樹脂粒子内が発する蛍光が弱められている可能性がある。そのため、「蛍光色素内包樹脂粒子標準液の蛍光強度」に「蛍光色素単体での量子収率／蛍光色素内包樹脂粒子の量子収率」を乗ずることにより、濃度消光の影響が補正された蛍光色素内包樹脂粒子標準液の蛍光強度を算出することができる。この「補正後の蛍光色素内包樹脂粒子標準液の蛍光強度」を「蛍光色素標準液の蛍光強度」で割れば、言い換えれば「蛍光色素内包樹脂粒子標準液の蛍光強度／蛍光色素標準液の蛍光強度」×「蛍光色素単体での量子収率／蛍光色素内包樹脂粒子の量子収率」を算出することにより、「第１親和性分子を結合させた、前記一定濃度の一定量の溶液中に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子に内包されている数」が求まる。なお、量子収率は公知の手段で、例えば「Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ−ＱＹ」（絶対ＰＬ量子収率測定装置、浜松ホトニクス株式会社）を用いて、計測することができる。
【００６２】
上記ａの値が算出できれば、その数の蛍光色素を含有する溶液を調製し、第２親和性分子が固定化されたプレートに塗布するなどして反応させることにより、その結果発せられる蛍光強度（信号値）（Ａ）を計測することができる。
【００６３】
上記Ｂの規定に含まれている「一定濃度の一定量の溶液に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子の全表面に結合している第１親和性分子の全数」（ｂ１）は、その全表面に結合している第１親和性分子の総重量を、第１親和性分子の分子量で除することにより算出することができる。ストレプトアビジンに代表される第１親和性分子がタンパク質であるのに対し、蛍光色素内包樹脂粒子の母体は樹脂であるので、ＢＣＡ法等のタンパク質の定量方法に基づいて、一定量の蛍光色素内包樹脂粒子溶液中のタンパク質（その全てが蛍光色素内包樹脂粒子の表面に結合しているものとする）の濃度を測定することができる。その測定された濃度に「一定量の溶液」の体積を掛ければ、前記タンパク質の総重量を算出することができ、その総重量を前記タンパク質の分子量（例えばストレプトアビジンの分子量は５２０００）で除すれば、Ｂの規定に用いられる前記タンパク質（前記第１親和性分子）の全数を算出することができる。
【００６４】
また、同じく上記Ｂの規定に含まれている、前記一定濃度の一定量の溶液に含まれる「蛍光色素内包樹脂粒子数」（ｂ２）は、粒子カウンター（例えばリオン社製「Liquid Particle Counter」）で計測することが可能である。前項にある第１親和性分子の全数を蛍光色素内包樹脂粒子数で除することにより、蛍光色素内包樹脂粒子一つに結合している第１親和性分子の数を計算することが可能である。
【００６５】
上記ｂ１およびｂ２の値が算出できれば、ｂ１／ｂ２により、蛍光色素内包樹脂粒子１つあたりに結合している第１親和性分子の数（平均値）（Ｂ）が求まる。
上記Ｃの「前記蛍光色素内包樹脂粒子１粒子あたりの発光強度」は、次のようにして計算することが可能である。すなわち、粒子カウンターを利用して、一定濃度（例えば０．０１ｎＭ、すなわち６．０２×１０9粒子／ｍＬ）の一定量の蛍光色素内包樹脂粒子溶液（蛍光色素内包樹脂粒子標準液）を調製し、発光ピーク波長における蛍光強度を測定する。蛍光色素内包樹脂粒子標準液の蛍光強度を、当該標準液中に含まれる蛍光色素内包樹脂粒子の数で除することにより、蛍光色素内包樹脂粒子１粒子あたりの発光強度が求まる。
【００６６】
上記Ｄの「前記蛍光色素内包樹脂粒子１粒子に内包されている数の蛍光色素単体の発光強度」は、次のようにして計算することが可能である。すなわち、一定濃度（例えば０．０１ｎＭ、すなわち６．０２×１０9分子／ｍＬ、蛍光色素の分子量をＷとすればＷ×１０-14ｇ／ｍＬ）の一定量の蛍光色素溶液（蛍光色素標準液）を調製し、その溶液の発光ピーク波長における蛍光強度を測定する。蛍光色素標準液の蛍光強度に、「蛍光色素内包樹脂粒子１粒子に内包されている蛍光色素の分子数（ないしその重量）／蛍光色素標準液中の蛍光色素の分子数（ないしその重量）」を乗じ、さらに、前述したような濃度消光の影響を補正するため、「蛍光色素単体での量子収率／蛍光色素内包樹脂粒子の量子収率」を乗ずることにより、蛍光色素内包樹脂粒子１粒子に内包されている数（ないし同等の重量）あたりの蛍光色素単体の蛍光強度が求まる。
【００６７】
なお、上記ＣおよびＤで規定する発光強度の測定方法は特に限定されるものではなく、一般的な蛍光光度計を用いて、適切な測定条件において測定すればよい。
信号値が上記式を満たす蛍光色素内包樹脂粒子溶液、換言すれば、相対値化された信号値：Ｓ／｛Ａ×Ｂ×（Ｃ／Ｄ）｝が０．５〜１．２の範囲にある蛍光色素内包樹脂粒子溶液は、染色液として十分な染色性能があると考えられる。
【００６８】
［蛍光色素内包樹脂粒子溶液の濃度調整工程］
上記の方法で選択された蛍光色素内包樹脂粒子溶液に含まれる蛍光色素内包樹脂粒子の表面積の総和（Ｔ）に対する、前記工程で計測された信号値（Ｓ）の比の値（Ｓ／Ｔ）が所定の値となるように適当な溶媒で希釈することで、複数のロット由来であるにも関わらず、一定の染色性能を持つ蛍光色素内包樹脂粒子溶液を得ることができる。ここで用いられる溶媒は、選択工程に先だって第１親和性分子と結合させた蛍光色素内包樹脂粒子の溶液を調製する際に用いた溶媒と同じものでよく、例えば１％程度のＢＳＡ含有ＰＢＳが特に好適である。
【００６９】
上記Ｔで規定する蛍光色素内包樹脂粒子の表面積の総和は、蛍光色素内包樹脂粒子の平均粒径を基に、粒子を球と仮定して求めた蛍光色素内包樹脂粒子一つ当たりの表面積に、上記一定量の溶液中に含まれる蛍光色素内包樹脂粒子数をかけることで算出することができる。ここで、平均粒子径の測定方法は前述した通りである。
【００７０】
上記により得られた蛍光色素内包樹脂粒子の染色液としての用途は、特に限定されない。ここでは発明の一実施形態として、蛍光色素内包樹脂粒子を用いて目的とする抗原（膜タンパク質等）を定量する蛍光免疫染色について説明するが、このほかにも例えば、蛍光色素内包樹脂粒子を用いて目的とする核酸やリボ核酸分子（遺伝子）を定量する、ＩＳＨ（Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）等に用いることができる。
【００７１】
−蛍光色素内包樹脂粒子溶液の用途−
本発明の生産方法により得られた蛍光色素内包樹脂粒子溶液は、一般的な蛍光色素内包樹脂粒子溶液と同様の用途を有し、例えば蛍光免疫染色またはＦＩＳＨのための染色液として用いることができる。具体的には、例えば、人体（患者）から採取した組織切片についてプレパラートを作製し、特定のタンパク質または遺伝子の発現状況を反映した染色像を観察することにより、そのタンパク質または遺伝子の発現量および発現部位等に基づいて病理診断のための情報を得ることのできる、組織免疫染色またはＦＩＳＨのための染色液としての用途が挙げられる。蛍光免疫染色は、組織染色に限定されるものではなく、細胞染色に適用することも可能である。検出対象とする生体分子は、それと特異的に結合する物質が存在するものであれば特に限定されるものではない。
【００７２】
組織免疫染色は、一般的に、標本作製工程、標本前処理工程、免疫染色工程、標本後処理工程、および観察工程を含む。以下、本明細書では免疫染色工程、標本後処理工程、および観察工程について記載するが、これらの工程に関するより詳細な実施形態や、その他の工程および蛍光免疫染色（組織免疫染色）全般に関する実施形態、さらにＦＩＳＨに関する実施形態については、たとえば、国際公開ＷＯ２０１３／０３５７０３号パンフレット、国際公開ＷＯ２０１３／１４７０８１号パンフレット、国際公開ＷＯ２０１４／１３６７７６号パンフレット等を参照することができる。
【００７３】
［免疫染色工程］
免疫染色工程において、第１親和性分子が結合した蛍光色素内包樹脂粒子を用いて特定の抗原に対する蛍光免疫染色を行うための手順は、第１親和性分子として前記第１〜第３のいずれのグループの分子を用いるかに応じて、適宜調整することができる。
【００７４】
第１親和性分子として第１グループの分子、例えばストレプトアビジンを用いる場合の手順を例に挙げて説明する。この場合に形成すべき免疫複合体は、（i）組織切片上の抗原／第２親和性分子としてビオチンが結合した１次抗体／第１親和性分子としてストレプトアビジンが結合した蛍光色素内包樹脂粒子、（ii）組織切片上の抗原／１次抗体／第２親和性分子としてビオチンが結合した２次抗体／第１親和性分子としてストレプトアビジンが結合した蛍光色素内包樹脂粒子、などとなる。（i）の場合は、第２親和性分子が結合した１次抗体を組織切片上の抗原と反応させ、続いて第１親和性分子が結合した蛍光色素内包樹脂粒子を反応させることにより、上記複合体を形成して抗原を蛍光標識することができる。（ii）の場合は、第２親和性分子を２次抗体に結合させる場合は、まず１次抗体を組織切片上の抗原と反応させ、続いて第２親和性分子が結合した２次抗体を反応させ、さらに第１親和性分子が結合した蛍光色素内包樹脂粒子を反応させるにより、上記複合体を形成して抗原を蛍光標識することができる。なお、第１親和性分子が結合した蛍光色素内包樹脂粒の作製方法は前述した通りであり、第２親和性分子が結合した１次抗体または２次抗体も、それと同様に一般的な方法に従って作製することができる。第１親和性分子として第２または第３グループの分子を用いる場合も、上記説明に準じた手順で行うことができる。
【００７５】
必要に応じて、免疫染色工程の前または後において、あるいは免疫染色工程と同時に、細胞ないし組織の形態観察用の染色液を用いた形態観察染色工程を行ってもよい。例えば、組織標本の形態を観察する場合、ヘマトキシリンを用いるヘマトキシリン染色（Ｈ染色）、またはヘマトキシリンおよびエオジンの２つの色素を用いるヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）が標準的に用いられる。形態観察染色はこれらの染色法に限定されるものではなく、他の形態観察染色としては、例えば細胞診に用いられるパパニコロウ染色（Ｐａｐ染色）等が挙げられる。
【００７６】
［標本後処理工程］
標本後処理工程には、固定処理、脱水・透徹処理、封入処理、その他必要に応じて洗浄処理等が含まれる。
【００７７】
固定処理は、上記蛍光免疫染色工程における染色に用いられた蛍光色素内包樹脂粒子を、生体物質もしくは生体物質に結合した抗体等に固定化する処理である。固定化処理液で処理する事で、タンパク質の架橋や変性を行ない、蛍光色素内包樹脂粒子と生体物質もしくは生体物質に結合した抗体等とを、化学的、物理的により強固に結合し、安定した状態とできる。本発明において固定処理は、固定処理溶液に免疫染色工程後の組織切片を浸漬することにより行うことができる。例えば、希パラホルムアルデヒド水溶液中に、免疫染色工程後の組織切片を数分から数時間程度浸漬することにより行うことができる。
【００７８】
固定処理溶液として、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、アセトン、エタノール、メタノール等の架橋剤、細胞膜透過物質等が挙げられる。この中では、強固に固定ができることから、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドが好ましく用いられる。
【００７９】
脱水・透徹処理は、染色した組織切片をＰＢＳ等の水系洗浄液で洗浄後、ＥｔＯＨ（エタノール）による脱水およびキシレン置換により行なわれる。ＥｔＯＨによる脱水は、ＥｔＯＨの水含有率を、例えば、５０％、３０％、１０％、０％というように水含有率を下げたＥｔＯＨに、組織切片を順次漬けていき、ＥｔＯＨに置換することで行なわれる。続いて、ＥｔＯＨ置換した切片をキシレンに漬ける事で、キシレン置換が行なわれ、切片が透徹される。
封入処理は、キシレン置換した切片に油系封入剤を載せ、カバーガラス等を載せる事で行なわれる。
【００８０】
［観察工程］
（ｉ：明視野観察工程）
明視野観察工程は、細胞または組織内の染色対象とする生体分子（抗原等）の位置を特定するために形態観察染色処理を行った場合に、染色された組織切片に照明光を当て、組織切片に沈着した発色剤の色素を観察し、細胞膜の形状等に係る画像を取得する工程である。
【００８１】
（ｉｉ：蛍光観察工程）
蛍光観察工程は、免疫染色処理された組織切片中の蛍光色素内包樹脂粒子に励起光を照射することにより、内包されている蛍光色素の発する蛍光を観察し、細胞または組織内の染色対象とする生体分子の量（輝点数または発光強度等）に係る画像を取得する工程である。
【００８２】
励起光の照射手段は特に限定されるものではない。例えば、蛍光顕微鏡が備えるレーザー光源から、必要に応じて所定の波長を選択的に透過させるフィルターを用いて、適切な波長および出力の励起光を染色された組織切片に照射すればよい。
【００８３】
前記励起光は、組織切片の自家蛍光との関係で蛍光色素が発する蛍光が識別可能である限り特に限定されないものの、組織切片からの自家蛍光強度が高くなりすぎないようにする観点から、４５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長を有する励起光が好ましい。また、前記蛍光色素を構成する蛍光物質としては当該励起光により４８０ｎｍ以上の範囲、好ましくは５８０〜６９０ｎｍの範囲にピークを有する蛍光を発するものを用いる（したがってこの領域の発光波長を有する蛍光を測定するようにする）。
【００８４】
また、本工程において生体分子の分布情報は、迅速な観察が行えるよう（蛍光）顕微鏡の鏡筒から取得するようにしてもよいし、（蛍光）顕微鏡に設置されたカメラが撮影した画像を別途表示手段（モニタ等）に表示し、それを観察することにより取得するようにしてもよい。標識体として用いる蛍光色素を構成する蛍光物質によるが、顕微鏡の鏡筒からの目視により十分に生体分子分布情報を取得することができなくても、カメラが撮影した画像から生体分子分布情報を取得することが可能な場合もある。
【００８５】
前記生体分子の分布情報を取得することとしては、例えば、蛍光の輝点数または発光輝度を基に、一細胞あたりの染色対象の生体分子の数もしくは密度を計測することが挙げられる。前記蛍光色素の励起には、吸収極大波長および蛍光波長に対応した励起光源および蛍光検出用光学フィルターを選択すればよい。輝点数または発光輝度の計測には、市販の画像解析ソフト（例えば、全輝点自動計測ソフト「Ｇ−Ｃｏｕｎｔ」（ジーオングストローム社製））を用いることが好適であるが、計測手段は特に限定されるものではない。
【実施例】
【００８６】
以下の手順に従って、蛍光標識体（表面に第１親和性分子を結合させた蛍光色素内包樹脂粒子、またはその対照物）を作製し、蛍光標識液（蛍光標識体の溶液）を調製した後、第２親和性分子を固定化したプレートを用いて蛍光標識液の試験を行い、免疫染色用の染色液としての性能を評価した。
【００８７】
各実施例において用いられた蛍光色素内包樹脂粒子はいずれも「ペリレンジイミド内包メラミン樹脂粒子」であり、その粒径は、蛍光色素内包樹脂粒子の合成工程における原料の樹脂量／色素量の比率を一定（０．０４）として、樹脂量を変化させることで制御されている。
【００８８】
実施例１〜４および比較例１〜２において、第１親和性分子に相当する分子はストレプトアビジン（ＳＡ）であり、第２親和性分子に相当する分子はビオチンである。免疫染色では、抗原／１次抗体／ビオチン結合２次抗体／ＳＡ結合蛍光標識体の複合体が形成されている。
【００８９】
実施例５〜８および比較例３〜４において、第１親和性分子に相当する分子は１次抗体（抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体）であり、第２親和性分子に相当する分子は２次抗体（抗ウサギＩｇＧ抗体）である。免疫染色では、抗原／１次抗体結合蛍光標識体の複合体が形成されている。
【００９０】
実施例９〜１２および比較例５〜６において、第１親和性分子に相当する分子は２次抗体（抗ウサギＩｇＧ抗体）であり、第２親和性分子に相当する分子は１次抗体（抗ＨＥＲ２ウサギ抗体）である。免疫染色では、抗原／１次抗体／２次抗体結合蛍光標識体の複合体が形成されている。
【００９１】
［１．蛍光標識体の作製］
［作製例１］ＳＡ結合蛍光色素内包樹脂粒子−１
（１−１）蛍光色素内包樹脂粒子の合成工程
Ｎ,Ｎ'−ビス（２,６−ジイソプロピルフェニル）−１,６,７,１２−テトラフェノキシペリレン−３,４：９,１０−テトラカルボキシジイミドを濃硫酸で処理し、ペリレンジイミドスルホン酸誘導体を作製した。これを酸クロリドに変換してペリレンジイミドスルホン酸クロリド誘導体とした。
【００９２】
ペリレンジイミドスルホン酸クロリド誘導体１７．３ｍｇを水２２．５ｍＬに加えた後、ホットスターラ―上で７０℃２０分間加熱し、メラミン樹脂「ニカラックＭＸ−０３５」（日本カーバイド工業社製）０．７８ｇ（粒径１５０ｎｍ）を加え、さらに５分間加熱撹拌した。ギ酸１００μＬを加え、６０℃２０分間で加熱攪拌した後、室温放冷した。冷却後、反応混合物を遠心用チューブに入れて遠心分離機に１２，０００ｒｐｍで２０分間かけ、上澄み除去した。回収された蛍光色素内包樹脂粒子（ペリレンジイミド内包メラミン樹脂粒子）の洗浄をエタノールと水で行なった。この蛍光色素内包樹脂粒子−１の平均粒子径（ＳＥＭ像でカウントした１００粒子についての粒子径の平均値）は２００ｎｍであった。
【００９３】
（１−２）第１親和性分子による修飾工程
上記合成工程（１）で得られた蛍光色素内包樹脂粒子−１、０．１ｍｇをＥｔＯＨ（エタノール）１．５ｍＬ中に分散し、アミノプロピルトリメトキシシランＬＳ−３１５０（信越化学工業社製）２μＬを加えて８時間反応させて表面アミノ化処理を行なった。
【００９４】
表面アミノ化処理された蛍光色素内包樹脂粒子−１を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭの濃度で含有するＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−ドデカエチレングリコール］エステル）を混合し、１時間反応させた。この混合液を１０，０００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭの濃度で含有するＰＢＳ溶液を加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで末端にマレイミド基が付加された蛍光色素内包樹脂粒子−１を得た。
【００９５】
一方、ストレプトアビジン（和光純薬社製）をスクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）を用いてチオール基付加処理を行ったのち、ゲルろ過カラムによるろ過を行い、蛍光色素内包樹脂粒子に結合可能なストレプトアビジン溶液を得た。
【００９６】
マレイミド基が付加された蛍光色素内包樹脂粒子−１を１３ｎＭの濃度で含有するＰＢＳ溶液１ｍＬと、チオール基が付加されたストレプトアビジンを２０ｍＭの濃度で含有するＰＢＳ溶液１ｍＬとを、ＥＤＴＡを２ｍＭの濃度で含有するＰＢＳ溶液中で混合し、１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去し、ＳＡ結合蛍光色素内包樹脂粒子−１を回収した。回収されたＳＡ結合蛍光色素内包樹脂粒子−１は１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中で保存した。
【００９７】
［作製例２］ＳＡ結合蛍光色素内包樹脂粒子−２
蛍光色素内包樹脂粒子の合成工程（１）において、原料の量を、ペリレンジイミドスルホン酸クロリド誘導体１４．４ｍｇ、メラミン樹脂「ニカラックＭＸ−０３５」０．６５ｇ、ギ酸１００μＬに変更し、それ以外は実施例１と同様にして、蛍光色素内包樹脂粒子−２を得た。蛍光色素内包樹脂粒子−２の平均粒子径は１５０ｎｍであった。続いて、実施例１の第１親和性分子による修飾工程（２）と同様にして、ＳＡ結合蛍光色素内包樹脂粒子−２を得て、保存した。
【００９８】
［作製例３］ＳＡ結合蛍光色素内包樹脂粒子−３
蛍光色素内包樹脂粒子の合成工程（１）において、原料の量を、ペリレンジイミドスルホン酸クロリド誘導体１２．８ｍｇ、メラミン樹脂「ニカラックＭＸ−０３５」０．５８ｇ、ギ酸１００μＬに変更し、それ以外は実施例１と同様にして、蛍光色素内包樹脂粒子−３を得た。蛍光色素内包樹脂粒子−３の平均粒子径は１００ｎｍであった。続いて、実施例１の第１親和性分子による修飾工程（２）と同様にして、ＳＡ結合蛍光色素内包樹脂粒子−３を得て、保存した。
【００９９】
［作製例４］ＳＡ結合蛍光色素内包樹脂粒子−４
蛍光色素内包樹脂粒子の合成工程（１）において、原料の量を、ペリレンジイミドスルホン酸クロリド誘導体９．３ｍｇ、メラミン樹脂「ニカラックＭＸ−０３５」０．４２ｇ、ギ酸１００μＬに変更し、それ以外は実施例１と同様にして、蛍光色素内包樹脂粒子−４を得た。蛍光色素内包樹脂粒子−４の平均粒子径は５０ｎｍであった。続いて、実施例１の第１親和性分子による修飾工程（２）と同様にして、ＳＡ結合蛍光色素内包樹脂粒子−４を得て、保存した。
【０１００】
［作製例５］１次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子−１＞
第１親和性分子による修飾工程（２）において、ストレプトアビジンの代わりに１次抗体として抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体（４Ｂ５、ベンタナ社製）を用い、チオール基が付加された当該１次抗体とマレイミド基が付加された蛍光色素内包樹脂粒子を反応させるようにし、それ以外は作製例１と同様にして、１次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子−１を得て、保存した。
【０１０１】
［作製例６］１次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子−２
第１親和性分子による修飾工程（２）において、ストレプトアビジンの代わりに１次抗体として抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体（４Ｂ５）を用い、チオール基が付加された当該１次抗体とマレイミド基が付加された蛍光色素内包樹脂粒子を反応させるよう変更し、それ以外は作製例２と同様にして、１次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子−２を得て、保存した。
【０１０２】
［作製例７］１次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子−３
第１親和性分子による修飾工程（２）において、ストレプトアビジンの代わりに１次抗体として抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体（４Ｂ５）を用い、チオール基が付加された当該１次抗体とマレイミド基が付加された蛍光色素内包樹脂粒子を反応させるよう変更し、それ以外は作製例３と同様にして、１次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子−３を得て、保存した。
【０１０３】
［作製例８］１次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子−４
第１親和性分子による修飾工程（２）において、ストレプトアビジンの代わりに１次抗体として抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体（４Ｂ５）を用い、チオール基が付加された当該１次抗体とマレイミド基が付加された蛍光色素内包樹脂粒子を反応させるよう変更し、それ以外は作製例４と同様にして、１次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子−４を得て、保存した。
【０１０４】
［作製例９］２次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子−１
第１親和性分子による修飾工程（２）において、ストレプトアビジンの代わりに２次抗体として抗ウサギＩｇＧ抗体（ＬＯ−ＲＧ−１、フナコシ社製）を用い、チオール基が付加された当該２次抗体とマレイミド基が付加された蛍光色素内包樹脂粒子を反応させるよう変更し、それ以外は作製例２と同様にして、２次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子−２を得て、保存した。
【０１０５】
［作製例１０］２次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子−２
第１親和性分子による修飾工程（２）において、ストレプトアビジンの代わりに２次抗体として抗ウサギＩｇＧ抗体（ＬＯ−ＲＧ−１）を用い、チオール基が付加された当該２次抗体とマレイミド基が付加された蛍光色素内包樹脂粒子を反応させるよう変更し、それ以外は作製例２と同様にして、２次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子−２を得て、保存した。
【０１０６】
［作製例１１］２次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子−３
第１親和性分子による修飾工程（２）において、ストレプトアビジンの代わりに２次抗体として抗ウサギＩｇＧ抗体（ＬＯ−ＲＧ−１）を用い、チオール基が付加された当該２次抗体とマレイミド基が付加された蛍光色素内包樹脂粒子を反応させるよう変更し、それ以外は作製例３と同様にして、２次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子−３を得て、保存した。
【０１０７】
［作製例１２］２次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子−４
第１親和性分子による修飾工程（２）において、ストレプトアビジンの代わりに２次抗体として抗ウサギＩｇＧ抗体（ＬＯ−ＲＧ−１）を用い、チオール基が付加された当該２次抗体とマレイミド基が付加された蛍光色素内包樹脂粒子を反応させるよう変更し、それ以外は作製例４と同様にして、２次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子−４を得て、保存した。
【０１０８】
［比較作製例１］ＳＡ結合蛍光色素
Ｎ,Ｎ'−ビス(２,６−ジイソプロピルフェニル)−１,６,７,１２−テトラフェノキシペリレン−３,４：９,１０−テトラカルボキシジイミドと等量のスルホニルクロリドを反応させ、ペリレンジイミドクロリド誘導体（反応性色素）とした。ストレプトアビジン（ＳＡ）を１ｍｇ／ｍＬとなるよう、１ｍＬの０．１Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ８．３）に溶かした。上記反応性色素をＤＭＳＯに１０ｍｇ／ｍＬとして溶かした。撹拌しているＳＡ溶液に、ゆっくりと１００μＬの反応性色素を加え、室温中で撹拌し、１時間反応した。Ｚｅｂａ  Ｓｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎｓを用い、溶媒にＰＢＳを用いて余剰の色素を除去することで、蛍光色素としてペリレンジイミドを有するＳＡ結合蛍光色素を得た。
【０１０９】
［比較作製例２］ＳＡ結合樹脂粒子
樹脂粒子としてポリスチレン粒子を用いる場合、ＳＡ結合樹脂粒子はポリスチレン粒子とＳＡとの物理吸着により作製可能である。市販のＣＯＯＨ末端のポリスチレン粒子（２００ｎｍ、Ｌｉｆe Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に、０．１Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ８．３）に溶かしたＳＡを１０００倍等量加え、撹拌することで、樹脂粒子としてポリスチレン粒子を有するＳＡ結合樹脂粒子を得た。
【０１１０】
［比較作製例３］１次抗体結合蛍光色素
ＳＡの代わりに１次抗体として抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体（４Ｂ５）を用い、反応性色素と当該１次抗体とを反応させるように変更し、それ以外は比較作成例１と同様にして、１次抗体結合蛍光色素を得た。
【０１１１】
［比較作製例４］１次抗体結合樹脂粒子
ＳＡの代わりに１次抗体として抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体（４Ｂ５）を用い、ポリスチレン粒子に当該１次抗体を吸着させるように変更し、それ以外は比較作製例２と同様にして、１次抗体結合樹脂粒子を得た。
【０１１２】
［比較作製例５］２次抗体結合蛍光色素
ＳＡの代わりに２次抗体として抗ウサギＩｇＧ抗体（ＬＯ−ＲＧ−１）を用い、反応性色素と当該２次抗体とを反応させるように変更し、それ以外は比較作成例１と同様にして、２次抗体結合蛍光色素を得た。
【０１１３】
［比較作製例６］２次抗体結合樹脂粒子
ＳＡの代わりに２次抗体として抗ウサギＩｇＧ抗体（ＬＯ−ＲＧ−１）を用い、ポリスチレン粒子に当該２次抗体を吸着させるように変更し、それ以外は比較作成例２と同様にして、２次抗体結合樹脂粒子を得た。
【０１１４】
[２．蛍光標識液の試験］
［実施例１〜４および比較例１〜２］ＳＡ結合蛍光標識液の試験
作製例１〜４のＳＡ結合蛍光色素内包樹脂粒子および比較作製例１〜２のＳＡ結合対照物（ＳＡ結合蛍光標識体）を用いて、次のような手順でそれらの溶液（ＳＡ結合蛍光標識液）を調製した後、ビオチンプレートを用いた試験を行った。実施例１〜４および比較例１〜２は、それぞれ作製例１〜４および比較例１〜２のＳＡ結合蛍光標識溶液についての試験に対応する。
【０１１５】
ＳＡ結合蛍光標識体の保存液を採取し、パーティクルカウンター「Ｌｉｑｕｉｄ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒ」（リオン社製）で粒子数を測定した後、濃度を０．０５ｎＭに調整した。市販のビオチン化プレート「Ｗｅｌｌ−Ｃｏａｔｅｄ  Ｂｉｏｔｉｎ，  ９６−ｗｅｌｌ，  Ｂｌａｃｋ」（Ｇ−ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ社製）をＰＢＳで５回洗浄した後、当該プレート上に、上記の濃度を調整した溶液を、１ウェルにつき１００μＬずつ添加し、４℃で一昼夜反応させた。反応後のプレートをＰＢＳで洗浄した後、マイクロプレートリーダー「プレートカメレオンＶ」（Ｈｉｄｅｘ社製）を用いて、蛍光強度の信号値（Ｓ）を測定した。
【０１１６】
［実施例５〜８および比較例３〜４］１次抗体結合蛍光標識液の試験
作製例１〜４および比較作製例１〜２のＳＡ結合蛍光標識体の代わりに、作製例５〜８の１次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子および比較作製例３〜４の１次抗体結合対照物（１次抗体結合蛍光標識体）を用いたこと、およびビオチンプレートの代わりに下記の手順で作製した２次抗体（抗ウサギＩｇＧ抗体）プレートを用いたこと以外は、実施例１〜４および比較例１〜２と同様の手順で、１次抗体結合蛍光標識液を調製し、２次抗体プレートを用いた試験を行い、蛍光強度の信号値（Ｓ）を測定した。実施例５〜８および比較例３〜４は、それぞれ作製例５〜８および比較作製例３〜４の１次抗体結合蛍光標識溶液についての試験に対応する。
【０１１７】
市販のプレート「フルオロヌンクモジュールプレートＦ１６」（マキシソープ社製）に、２０μｇ／ｍＬの濃度に調製した抗ウサギＩｇＧ抗体（ＬＯ−ＲＧ−１）溶液を、１ウェルにつき１００μＬずつ添加し、プレートシールをして４℃で一晩静置した。続いて、１ウェルにつき２００μＬのＰＢＳで洗浄し、１ウェルにつき２００μＬのブロッキング液（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）を添加し、プレートシールをして４℃で保存した。なお、このようにして作製された２次抗体プレートは、６か月程度安定して使用可能である。
【０１１８】
［実施例９〜１２および比較例５〜６］２次抗体結合蛍光標識液の試験
作製例１〜４および比較作製例１〜２のＳＡ結合蛍光標識体の代わりに、作製例９〜１２の２次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子および比較作製例５〜６の２次抗体結合対照物（２次抗体結合蛍光標識体）を用いたこと、およびビオチンプレートの代わりに下記の手順で作製した１次抗体（抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体）プレート）を用いたこと以外は、実施例１〜４および比較例１〜２と同様の手順で、２次抗体結合蛍光標識液を調製し、１次抗体プレートを用いた試験を行い、蛍光強度の信号値（Ｓ）を測定した。実施例９〜１２および比較例５〜６は、それぞれ作製例９〜１２および比較作製例５〜６の２次抗体結合蛍光標識溶液についての試験に対応する。
【０１１９】
市販のプレート「フルオロヌンクモジュールプレートＦ１６」（マキシソープ社製）に、２０μｇ／ｍＬの濃度に調製した抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体（４Ｂ５）溶液を、１ウェルにつき１００μＬずつ添加し、プレートシールをして４℃で一晩静置した。続いて、１ウェルにつき２００μＬのＰＢＳで洗浄し、１ウェルにつき２００μＬのブロッキング液（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）を添加し、プレートシールをして４℃で保存した。なお、このようにして作製された１次抗体プレートも、６か月程度安定して使用可能である。
【０１２０】
実施例１〜１２および比較例１〜６のそれぞれについて得られた信号値（Ｓ）を、蛍光色素単体での信号値（Ａ）×蛍光色素内包樹脂粒子１つあたりに結合している第１親和性分子の数（Ｂ）×｛蛍光色素内包樹脂粒子１粒子あたりの発光強度（Ｃ）／（蛍光色素内包樹脂粒子１粒子に内包されている数の蛍光色素単体での発光強度（Ｄ）｝で割り、相対値化したものを表１に示す。
【０１２１】
蛍光色素単体での信号値（Ａ）については、まず、各実施例および比較例に準じて、ペリレンジイミドに第１親和性分子を結合させた複合体を作製し、その複合体を０．０５ｎＭの濃度で含有する溶液を調製し、第２親和性分子を固定化したプレートと反応させた後に、同様の方法で蛍光強度の信号値を測定した。また、ペリレンジイミドの量子収率および蛍光色素内包樹脂粒子の量子収率を、Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ−ＱＹ」（浜松ホトニクス株式会社）で測定した。これらの測定値を用いて、前述したような算出方法により、蛍光色素単体での信号値（Ａ）を求めた。
【０１２２】
蛍光色素内包樹脂粒子１つあたりに結合している第１親和性分子の数（Ｂ）は、０．０５ｎＭ、１００μＬの溶液について、そこに含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子の総重量および粒子数、ならびに第１親和性分子の分子量を用いて求めた。
【０１２３】
蛍光色素内包樹脂粒子１粒子あたりの発光強度（Ｃ）は、各実施例および比較例で用いた蛍光色素内包樹脂粒子を０．０５ｎＭの濃度で含有する溶液について、同様の方法で蛍光強度の信号値を測定することで求めた。
【０１２４】
蛍光色素内包樹脂粒子１粒子に内包されている数の蛍光色素単体での発光強度（Ｄ）は、上記（Ａ）で用いた複合体を０．０５ｎＭの濃度で含有する溶液について測定された蛍光強度の信号値および当該溶液に含まれる蛍光色素の分子数の計算値、蛍光色素内包樹脂粒子１粒子に内包されている蛍光色素の分子数の計算値、さらに上記（Ａ）で測定された蛍光色素単体での量子収率および蛍光色素内包樹脂粒子の量子収率から算出した。
【０１２５】
[３．培養細胞の染色］
＜ＳＡ結合蛍光標識液を用いた場合＞
実施例１〜４のＳＡ結合蛍光色素内包樹脂粒子の溶液および比較例１〜２のＳＡ結合対照物の溶液（ＳＡ結合蛍光標識液）を用いて、次のような手順で培養細胞を染色し、染色画像を取得した。
【０１２６】
ＳＫ−ＢＲ−３細胞を用いた培養細胞スライド（ＨＥＲ２スコア３＋；パソロジー研究所）を脱パラフィン処理した後、水に浸漬する洗浄を行った。洗浄した培養細胞スライドを１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１２１℃、５分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活性化処理を行った。賦活化処理後の培養細胞スライドを、ＰＢＳを用いて洗浄した後、湿潤箱中で１時間１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いてブロッキング処理を行った。
【０１２７】
ブロッキング処理後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．０５ｎＭに希釈した抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体（ベンタナ社製：４Ｂ５）を組織切片と室温で２時間反応させた。これをＰＢＳ緩衝液で洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈したビオチン標識抗ウサギモノクローナル抗体と室温で３０分反応させた。
【０１２８】
ＳＡ結合蛍光標識液を遠心分離し、上澄み液を除去し、０．６％αカゼイン＋０．６％βカゼイン＋３％ＢＳＡ／ＴＢ  ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０１５Ｎ  ＮａＮ3に置換した後に、フィルター処理（孔径０．６５μｍ：ミリポア社製）を行った。さらに１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．２ｎＭに希釈し、前述の反応を行った培養細胞切片と、中性のｐＨ環境（ｐＨ６．９〜７．４）、室温で３時間反応させた後、培養細胞スライドを、ＰＢＳを用いて洗浄した。
【０１２９】
免疫染色後、形態観察染色を行った。免疫染色した培養細胞スライドをマイヤーヘマトキシリン液で１分間染色してヘマトキシリン染色を行った（Ｈ染色）。その後、該切片を４５℃の流水で３分間洗浄した。その後、純エタノールに５分間漬ける操作４回行い、洗浄・脱水を行った。続いてキシレンに５分間漬ける操作を４回行い、透徹を行った。最後に、封入剤（「エンテランニュー」、Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて組織切片を封入して観察用のサンプルスライドとした。
【０１３０】
上記免疫染色および形態観察染色した培養細胞スライドに対して所定の励起光を照射して蛍光を発光させ、蛍光顕微鏡（ＢＸ−５３，オリンパス社製）により観察および撮像を行った。上記励起光は、光学フィルターに通すことで５７５〜６００ｎｍに設定した。また、観察する蛍光の波長（ｎｍ）の範囲についても、光学フィルターに通すことで６１２〜６８２ｎｍに設定した。
【０１３１】
さらに、ジーオンオングストロング社製輝点計測ソフト、Ｇ−ｃｏｕｎｔを用いて輝点数および発光輝度を計測した。輝点についてはスライド中の８スポットについて各３０細胞の輝点を計測することにより、その平均値を求め、発光輝度は、８スポットそれぞれについて視野全体の蛍光強度を合算し、その平均値を求めた。
【０１３２】
顕微鏡観察、撮像時の励起波長条件は、５８０ｎｍの励起では視野中心部付近の照射エネルギーが９００Ｗ／ｃｍ2となるようにした。撮像時の露光時間は画像の輝度が飽和しないように任意（例えば４０００μ秒）に設定した。
なお、形態観察染色による像を観察する際には、免疫染色用の蛍光色素を励起させるための励起光を照射する必要はないので、光学顕微鏡と同様の観察条件下で観察した。
【０１３３】
＜１次抗体結合蛍光標識液を用いた場合＞
実施例５〜８の１次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子の溶液および比較例３〜４の１次抗体結合対照物の溶液（１次抗体結合蛍光標識液）を用いて、次のような手順で培養細胞を染色し、染色画像を取得した。
【０１３４】
ＳＫ−ＢＲ−３細胞を用いた培養細胞スライド（ＨＥＲ２スコア３＋；パソロジー研究所）を脱パラフィン処理した後、水に浸漬する洗浄を行った。洗浄した培養細胞スライドを１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１２１℃、５分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活性化処理を行った。賦活化処理後の培養細胞スライドを、ＰＢＳを用いて洗浄した後、湿潤箱中で１時間１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いてブロッキング処理を行った。
【０１３５】
１次抗体結合蛍光標識液を遠心分離し、上澄み液を除去し、０．６％αカゼイン＋０．６％βカゼイン＋３％ＢＳＡ／ＴＢ  ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０１５Ｎ  ＮａＮ3に置換した後に、フィルター処理（孔径０．６５μｍ：ミリポア社製）を行った。さらに１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．４ｎＭに希釈し、前述のブロッキング反応を行った培養細胞切片と、中性のｐＨ環境（ｐＨ６．９〜７．４）、室温で一昼夜反応させた後、培養細胞スライドを、ＰＢＳを用いて洗浄した。
【０１３６】
免疫染色後、形態観察染色を行った。免疫染色した培養細胞スライドをマイヤーヘマトキシリン液で１分間染色してヘマトキシリン染色を行った（Ｈ染色）。その後、該切片を４５℃の流水で３分間洗浄した。その後、純エタノールに５分間漬ける操作４回行い、洗浄・脱水を行った。続いてキシレンに５分間漬ける操作を４回行い、透徹を行った。最後に、封入剤（「エンテランニュー」、Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて組織切片を封入して観察用のサンプルスライドとした。
【０１３７】
＜２次抗体結合蛍光標識液を用いた場合＞
実施例９〜１２の２次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子および比較例５〜６の２次抗体結合対照物（２次抗体結合蛍光標識液）を用いて、次のような手順で培養細胞を染色し、染色画像を取得した。
【０１３８】
ＳＫ−ＢＲ−３細胞を用いた培養細胞スライド（ＨＥＲ２スコア３＋；パソロジー研究所）を脱パラフィン処理した後、水に浸漬する洗浄を行った。洗浄した培養細胞スライドを１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１２１℃、５分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活性化処理を行った。賦活化処理後の培養細胞スライドを、ＰＢＳを用いて洗浄した後、湿潤箱中で１時間１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いてブロッキング処理を行った。
【０１３９】
ブロッキング処理後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．０５ｎＭに希釈した抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体（ベンタナ社製：４Ｂ５）を組織切片と室温で２時間反応させた。これをＰＢＳ緩衝液で洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈した該抗体に結合するビオチン標識抗ウサギモノクローナル抗体と室温で３０分反応させた。
【０１４０】
２次抗体結合蛍光標識液を遠心分離し、上澄み液を除去し、０．６％αカゼイン＋０．６％βカゼイン＋３％ＢＳＡ／ＴＢ  ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０１５Ｎ  ＮａＮ3に置換した後に、フィルター処理（孔径０．６５μｍ：ミリポア社製）を行った。さらに１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．４ｎＭに希釈し、前述の反応を行った培養細胞切片と、中性のｐＨ環境（ｐＨ６．９〜７．４）、室温で一昼夜反応させた後、培養細胞スライドを、ＰＢＳを用いて洗浄した。
【０１４１】
免疫染色後、形態観察染色を行った。免疫染色した培養細胞スライドをマイヤーヘマトキシリン液で１分間染色してヘマトキシリン染色を行った（Ｈ染色）。その後、該切片を４５℃の流水で３分間洗浄した。その後、純エタノールに５分間漬ける操作４回行い、洗浄・脱水を行った。続いてキシレンに５分間漬ける操作を４回行い、透徹を行った。最後に、封入剤（「エンテランニュー」、Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて組織切片を封入して観察用のサンプルスライドとした。
【０１４２】
実施例１〜１２および比較例１〜６のそれぞれについての免疫染色の結果を表１に示す。ＳＫ−ＢＲ−３細胞一つあたりの輝点数が１０以上を○と評価する。
【０１４３】
【表１】
0006493085.tif 000002
【０１４４】
［４．染色液の濃度の調整］
［実施例１３〜１６］
実施例１〜４の蛍光色素内包樹脂粒子溶液に含まれる蛍光色素内包樹脂粒子（平均粒子径はそれぞれ２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１００ｎｍおよび５０ｎｍ）の表面積の総和（Ｔ）に対する、ビオチンを一定密度で固定化したプレートに蛍光色素内包樹脂粒子溶液を散布した際に計測される信号値（Ｓ）の比の値（Ｓ／Ｔ）が所定の値（２×１０12/ｎｍ2）となるように希釈することによって、濃度が調整された蛍光色素内包樹脂粒子溶液を得た。
【０１４５】
［比較例７〜１０］
実施例１〜４の蛍光色素内包樹脂粒子溶液を、蛍光色素内包樹脂粒子の濃度が０．０５ｎＭとなるように希釈することによって、濃度が調整された蛍光色素内包樹脂粒子溶液を得た。
【０１４６】
［比較例１１〜１４］
実施例１〜４の蛍光色素内包樹脂粒子溶液について、まず蛍光色素内包樹脂粒子の濃度が所定の値（０．０５ｎＭ）となるように希釈してその蛍光強度を測定し、その蛍光強度が等しくなるよう、それぞれの希釈液をさらに希釈することによって、輝度が調整された蛍光色素内包樹脂粒子溶液を得た。
【０１４７】
[５．濃度が調整された染色液を用いた培養細胞の染色］
実施例１３〜１６および比較例７〜１４それぞれの染色液を用いて、前記［３．培養細胞の染色］の手法と同様にして、細胞を染色し、染色画像を取得した。各実施例および比較例について、細胞の染色および染色画像の取得を９反復ずつ行い、染色後における輝点数のばらつきを計測した。
【０１４８】
結果を表２に示す。Ｓ／Ｔ値を一定にした溶液を染色液として用いた場合、蛍光色素内包樹脂粒子の平均粒子径に依らず、輝点数のばらつきが±7％以下に抑えられた（実施例１３〜１６）。一方で、蛍光色素内包樹脂粒子の輝度を一定にした溶液を染色液として用いて染色を行うと、±２０％程度の輝点数ばらつきが発生し、また蛍光色素内包樹脂粒子の濃度を一定にした溶液を染色液として用いても同様に±１５％程度のばらつきが生じることがわかる（比較例５〜１２）。
【０１４９】
【表２】
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【図１】
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