(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スコロダイトの製造方法であって、前記方法は、
単体硫黄が存在する環境下で鉄酸化細菌を培養する工程（Ｌ．ｆｅｒｒｉｐｈｉｌｕｍ  ＹＳＫとＡｔ．ｔｈｉｏｏｘｉｄａｎｓ  Ａ０１による共培養を除く）と、
前記鉄酸化細菌と、鉄と、砒素とを含む溶液中で、スコロダイトを生成する工程と、
を含む、該方法。
【請求項２】
前記鉄酸化細菌が好熱性鉄酸化細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記鉄酸化細菌を培養する工程が、一定濃度の単体硫黄の存在下で培養する工程である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
スコロダイトを製造するための組成物であって、鉄酸化細菌（Ｌ．ｆｅｒｒｉｐｈｉｌｕｍ  ＹＳＫとＡｔ．ｔｈｉｏｏｘｉｄａｎｓ  Ａ０１の組み合わせを除く）と単体硫黄とを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スコロダイトの製造に関する。より具体的には、耐砒素性に優れた鉄酸化細菌、該細菌の製造方法、該細菌用の培地、及び該細菌を用いたスコロダイトの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
銅鉱石などの非鉄製錬原料中には種々の不純物が混入しており、そのような不純物には砒素（Ａｓ）が含まれる。砒素は有毒元素であり周囲環境への影響を考えて、化学的に安定性の高い形態に変換した上で処分することが望まれる。この点、鉄砒素化合物であるスコロダイト（ＦｅＡｓＯ4・２Ｈ2Ｏ）の結晶は化学的に安定であることが知られており、長期保存にも適している。
【０００３】
特許文献１及び２では、スコロダイトを生成するために、好熱性鉄酸化細菌を用いる方法を開示している。より具体的には、二価の鉄イオンと、三価の砒素イオンとを、所定の比率で投入し、好熱性鉄酸化細菌の１種であるＡｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉが前記砒素イオンを固定化している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１３−１８００３４号公報
【特許文献２】特開２０１４−０４６２２１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように、鉄酸化細菌は、スコロダイトの製造に非常に有用である。しかし、一方で、スコロダイトを構成する砒素は、一般的に毒性を有する化合物である。そして、その毒性が、鉄酸化細菌の活動に悪影響を与えている。従って、スコロダイトの製造においては、鉄酸化細菌の能力が制限されている。
【０００６】
以上の点に鑑みて、本願発明は、砒素に対して耐性を有する鉄酸化細菌及びその製造方法を提供することを目的とする。さらに、本願発明は、前記鉄酸化細菌を用いて、スコロダイトを製造するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的に鑑みて、本発明者が鋭意検討した結果、硫黄源を有する環境下で予め鉄酸化細菌を培養すると、砒素の毒性に対する耐性が高まることを見出した。このような知見に基づき、本発明は、一側面において、以下の発明を包含する。
（発明１）
砒素に対する耐性を有する鉄酸化細菌を製造する方法であって、
硫黄源が存在する環境下で鉄酸化細菌を培養する工程を含む、該方法。
（発明２）
前記鉄酸化細菌が好熱性鉄酸化細菌である、発明１に記載の方法。
（発明３）
前記硫黄源中の硫黄の酸化状態が＋５以下である発明１に記載の方法。
（発明４）
前記鉄酸化細菌を培養する工程が、一定濃度の硫黄源の存在下で培養する工程である発明１〜３のいずれか１つに記載の方法。
（発明５）
スコロダイトの製造方法であって、
発明１〜４のいずれか１つに記載の方法に従って鉄酸化細菌を培養する工程と、
前記鉄酸化細菌と、鉄と、砒素とを含む溶液中で、スコロダイトを生成する工程と、
を含む、該方法。
（発明６）
砒素に対する耐性を有する鉄酸化細菌を製造するための培地であって、前記培地が硫黄源を含む、該培地。
（発明７）
発明１〜４のいずれか１つに記載の方法により製造される鉄酸化細菌。
（発明８）
スコロダイトを製造するための組成物であって、鉄酸化細菌と硫黄源とを含む組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明では、硫黄源の存在下で鉄酸化細菌を培養する。これにより、砒素の毒性に対して耐性を有する鉄酸化細菌を得ることができる。また、こうした鉄酸化細菌を、砒素が存在する環境下でのスコロダイトの生成に用いる場合、該環境下で鉄酸化細菌は良好に生育する。従って、鉄酸化細菌の作用によるスコロダイトの生成が良好に進行する。更には、こうした鉄酸化細菌は砒素に対する耐性が優れているため、スコロダイトの生成の際に投入する砒素の量を増やすことができる。従って、このような意味でも、スコロダイトの生成が良好に進行する。
【０００９】
ここで、上記のような砒素による悪影響を低減させる別の方法として、スコロダイトの生成を行う前に、鉄酸化細菌を、順化培養する方法が考えられる。より具体的には、順化培養中、培養液内の砒素濃度を段階的に上昇させる方法が考えられる。例えば、砒素濃度について初回５０ｍｇ／Ｌとし、以降５０ｍｇ／Ｌずつ濃度を上げて、最終濃度１ｇ／Ｌになるまで順化培養する。そして、培養中は菌数を確認し、対数増殖期を過ぎた段階で、更に砒素濃度を引き上げる。こうした方法より、砒素に対して耐性を有する鉄酸化細菌が優先的に増殖することになる。そして、このような鉄酸化細菌を用いれば、スコロダイトの製造中の砒素による悪影響を低減させることができる。しかし、このような方法では、砒素濃度を段階的に上昇させる分、時間と労力がかかることとなる。例えば、目的とする砒素濃度にするまでに順化させるのに時間がかかる（例えば数十日〜数百日かかる場合がある）。また、２回目以降の砒素濃度を高める培養を行う際に、どの程度の砒素濃度にするかについて具体的な設定方法は公知ではないため試行錯誤が必要である。
【００１０】
この点に関して、本発明の一側面では、一定濃度の硫黄源の存在下で鉄酸化細菌を培養する。即ち、砒素濃度を段階的に上げるといった上述の方法と比べると、より簡便な方法で、砒素に対する耐性を有する鉄酸化細菌を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】スコロダイトの製造環境下における鉄酸化細菌の増殖を表すグラフである。
【図２】スコロダイトの製造環境下における二価の鉄の変化を表すグラフである。
【図３】スコロダイトの製造環境下における鉄酸化細菌の増殖を表すグラフである。
【図４】生成したスコロダイトを走査型電子顕微鏡で観察したときの写真である。
【図５】スコロダイトの製造環境下における鉄酸化細菌の増殖を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を実施するための具体的な実施形態について説明する。
【００１３】
１．鉄酸化細菌
１−１．鉄酸化細菌の属種
一実施形態において、本発明は、鉄酸化細菌を用いる。鉄酸化細菌の属種は、特に限定されないが、以下の物が挙げられる：
Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｉｏｏｘｉｄａｎｓ等のＡｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ（アシディチオバチルス）属；
Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ等のＬｅｐｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ（レプトスピリウム）属；
Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ等のＦｅｒｒｏｐｌａｓｍａ（フェロプラズマ）属。
【００１４】
１−２．好熱性鉄酸化細菌
好適な一実施形態において、好熱性鉄酸化細菌を用いる。好熱性鉄酸化細菌は、高温環境下でも増殖することができる。従って、後述するスコロダイトの生成反応を高温化で実施することができる。好熱性鉄酸化細菌の属種は、特に限定されないが、以下の物が挙げられる：
Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｉｎｆｅｒｎｕｓ等のＡｃｉｄｉａｎｕｓ（アシディアヌス）属；
Ｓｕｌｆｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｉｄｏｏｘｉｄａｎｓ、Ｓｕｌｆｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ等のＳｕｌｆｏｂａｃｉｌｌｕｓ（スルフォバチルス）属；
Ａｃｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ等のＡｃｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ（アシジミクロビウム）属；
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ等のＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ（スルフォロブス）属；
Ａｃｉｄｉｐｌａｓｍａ  ｃｕｐｒｉｃｕｍｕｌａｎｓ等のＡｃｉｄｉｐｌａｓｍａ（アシディプラズマ）属；
Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｓｅｄｕｌａ等のＭｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ（メタロスファエラ）属。
【００１５】
２．前培養について
２−１．前培養の環境
鉄酸化細菌は、酸化しうる鉄源や硫黄源およびカリウム、リン、窒素成分等、生育に必須な成分が含まれる環境下であれば、増殖することができる。一実施形態において、前培養における環境は、培地であってもよい。前記培地は、固体培地であっても、液体培地であってもよいが、好ましくは、液体培地である。また、鉄酸化細菌の増殖を促すことができるものであれば、任意の培地を用いることができる。典型例として、当業者に公知の９Ｋ培地が挙げられるほか、公知文献（例えば、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９６）、１４２、７７５−７８３頁）に記載の培地や、分譲機関にて情報が公開されている先述の鉄酸化細菌を培養するための培地等が挙げられる。
【００１６】
一実施形態において、前培養環境に、硫黄源を添加することができる。これにより、砒素（例えば、三価の砒素、又は五価の砒素）の毒性に対して、耐性を有する鉄酸化細菌を得ることができる。また、一実施形態において、前培養に用いる環境（例えば、培地又は最小限の栄養を含む溶液）は砒素を含まなくてもよく、又は、前培養に用いる環境に砒素を積極的に添加しなくてもよい（例えば、砒素の原子量換算で、０．１ｇ／Ｌ以下、０．０１ｇ／Ｌ以下、０．００１ｇ／Ｌ以下、又は０ｇ／Ｌ）。
【００１７】
２−２．硫黄源
一実施形態において、硫黄源は、硫黄元素を含む任意の単体又は化合物であってもよい。硫黄原子は、６、５、４、３、２、１、０、−１、−２といった酸化数を有する状態に変化することができる。硫黄源となる物質中の硫黄は、上述した酸化数のいずれか１つ又はそれ以下若しくはそれ以上の酸化数を有する状態であってもよい（例えば、６以下、５以下、０以下、０以上等）。一実施形態において、硫黄の酸化数が５以下である状態が好ましく、言い換えれば更に酸化される余地がある状態であることが好ましい。以下の説明によって、本願発明の範囲を限定することは意図しないが、硫黄の酸化が細菌に対して特定の影響を及ぼし、細菌の性質（例えば、砒素の毒性に対する耐性）を改変させるものと考えられる。また、一実施形態において、硫黄源となる物質は、常温で固体である物質であってもよい。
【００１８】
限定されるものではないが、硫黄源としての具体的な物質の例として、以下の物が挙げられる：亜硫酸（Ｈ2ＳＯ3）あるいはその塩；チオ硫酸（Ｈ2Ｓ2Ｏ3）あるいはその塩；テトラチオン酸（Ｈ2Ｓ4Ｏ6）あるいはその塩；三酸化硫黄（ＳＯ3）；二酸化硫黄（ＳＯ2）；単体硫黄（Ｓ）；硫化水素（Ｈ2Ｓ）；有機硫黄化合物等。
【００１９】
硫黄源は多い方が菌の増殖に良いが、経済面で好ましくなく、また、固体硫黄源がスコロダイト製造工程に過剰に混在すると製造したスコロダイトとの分離が困難になるという問題が生じる。従って、前培養用の溶液（例えば、培地）が含む硫黄源の量は、特に限定されないが、一実施形態において、硫黄原子の重量に換算して、０．１〜５０ｇ／Ｌ、より好ましくは、０．５〜１０ｇ／Ｌである（例えば、Ｈ2ＳＯ4を９８．０８ｇ／Ｌ投入する場合、硫黄原子の重量に換算すると、３２．０６ｇ／Ｌとなる。特記しない限り、本明細書及び図面に記載した他の原子重量換算についても同様）。また、一実施形態において、硫黄源の濃度を、前培養の最中に変化させてもよい。例えば、前培養の最中に、硫黄源を定期的に添加させて段階的に硫黄源の濃度を上昇させてもよい。
【００２０】
しかし、工程を簡潔にする目的から、一実施形態において、鉄酸化細菌は、一定濃度の硫黄源の存在下で培養することができる。ここで、「一定濃度の硫黄源の存在下で培養する」とは、硫黄源の存在下で前培養を開始した後、積極的に硫黄源の添加及び／又は削除を行わず、上記の前培養を続行することをさす。この方法だと、砒素濃度を段階的に上げる上述の方法と比べると、工程が簡単となり、時間と労力の面で有利である。
【００２１】
２−３．前培養の培養条件
上述した培地の成分や鉄酸化細菌以外、他の培養条件は、状況に応じて当業者が適宜選択することができる。典型的な条件は以下の通りである。
温度：２０〜４５℃（好ましくは３０〜４５℃）
時間：２４〜１６８時間（好ましくは４８〜９６時間）
ｐＨ：０．５〜４．０（好ましくは１．５〜２．５）
好熱性鉄酸化細菌を用いる好適な実施形態においても、他の培養条件は、状況に応じて当業者が適宜選択することができる。典型的な条件は以下の通りである。
温度：４５〜８５℃（好ましくは６０〜８０℃）
時間：１２〜１６８時間（好ましくは４８〜９６時間）
ｐＨ：０．５〜４．０（好ましくは１．０〜２．５）
【００２２】
２−４．鉄酸化細菌の砒素に対する耐性
一実施形態において、本発明は、砒素に対する耐性が優れた鉄酸化細菌（例えば、好熱性鉄酸化細菌）又は該細菌を含む組成物を含む。鉄酸化細菌については、限定されないが、上述した属名（又は種名）の鉄酸化細菌が含まれる。そして、砒素に対する耐性が優れた鉄酸化細菌又は該細菌を含む組成物は、上記の前培養を行うことによって得ることができる。このようにして得られた鉄酸化細菌（又は該細菌を含む組成物）は、スコロダイトの製造に有用である。別の一実施形態においては、本発明は、鉄酸化細菌（例えば、好熱性鉄酸化細菌）と硫黄源とを含む組成物を含む。該実施形態においては、鉄酸化細菌は、前培養等の方法で、砒素に対する耐性を上昇させた状態であってもよく、逆に、砒素に対する耐性を上昇させた状態でなくてもよい。後者の場合には、組成物を保存しておき、使用する段階になってから、前培養等を行って、砒素に対する耐性を上昇させたうえで、使用すればよい。
【００２３】
３．スコロダイト
３−１．スコロダイトの反応
スコロダイトは、一例として、以下の化学反応によって形成される。
Ｆｅ3+＋Ｈ3ＡｓＯ4＋２Ｈ2Ｏ→ＦｅＡｓＯ4・２Ｈ2Ｏ＋３Ｈ+
鉄酸化細菌（例えば、好熱性鉄酸化細菌）は、鉄と砒素を引き寄せ、これらの物質を局在化させ、上記化学反応を起こす場を提供すると考えられる。
【００２４】
ここで、鉄が二価である場合には、鉄酸化細菌の作用により、三価の鉄に変換される。また、砒素が三価である場合には、前記三価の鉄が砒素を五価に酸化させると考えられる。そして、三価の鉄及び五価の砒素がそろったうえで上記のような反応が起こると考えられる。また、鉄酸化細菌が存在する別の実施形態では、鉄酸化細菌がＦｅ2+を酸化することができるため、下記のような化学反応も起こり、スコロダイトが製造されると考えられる。
４ＦｅＳＯ4＋４Ｈ3ＡｓＯ4＋Ｏ2＋６Ｈ2Ｏ  →  ４ＦｅＡｓＯ4・２Ｈ2Ｏ＋４Ｈ2ＳＯ4
【００２５】
３−２．スコロダイトの製造条件（鉄酸化細菌について）
一実施形態において、スコロダイトの製造は、溶液中で行われる。該溶液には、鉄酸化細菌が含まれ、そして、スコロダイトの生成が促進される。鉄酸化細菌は、硫黄源を含む環境で前培養された物を用いる。鉄酸化細菌の量は、特に限定されないが、典型的な量は、１×１０＾５〜１×１０＾８ｃｅｌｌ／ｍＬ、好ましくは、１×１０＾６〜１×１０＾７ｃｅｌｌ／ｍＬである。
【００２６】
３−３．スコロダイトの製造条件（培地）
スコロダイト製造時においても、鉄酸化細菌を良好に増殖させることが重要である。なぜなら、鉄酸化細菌が増殖すれば、それだけスコロダイト製造の速度も上がると考えられるからである。従って、スコロダイトに必要な鉄イオン源、砒素イオン源のみならず、鉄酸化細菌の増殖に適した培地を含めることが好ましい。培地は、前培養と同様、特に限定されず、固体培地又は液体培地であってもよいが、典型的には液体培地である。また、用いる液体培地としては、前培養と同様、典型的には９Ｋ培地、公知文献（例えば、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９６），１４２，７７５−７８３頁）に記載の培地や、分譲機関にて情報が公開されている先述の鉄酸化細菌を培養するための培地等が挙げられる。
【００２７】
一実施形態においては、スコロダイトの製造時の培地は、更に、酵母エキス（Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）を含むことができる。これにより、更にスコロダイトの生成を向上させることができる。酵母エキスの添加量は、特に限定されないが、典型的には、０．０１〜０．１重量％である（より好ましくは、０．０２〜０．１重量％）。
【００２８】
３−４．スコロダイトの製造条件（鉄イオンについて）
スコロダイトを構成する鉄イオン源については、二価の物でも三価の物でもよい。特に限定されないが、典型的には、硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ4）、水酸化鉄（ＩＩ、ＩＩＩ）、二硫化鉄（ＦｅＳ2）等の二価鉄化合物、黄鉄鉱、磁硫鉄鉱等の二価鉄を含む硫化鉄鉱物等が挙げられる。また、これらを１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。鉄イオン源の量は、特に限定されないが、後述する砒素イオンに対するモル比、即ち、Ｆｅ／Ａｓのモル比が、最終的に１〜２、好ましくは、１．２〜１．５であることが好ましい。
【００２９】
３−５．スコロダイトの製造条件（砒素イオンについて）
スコロダイトを構成する砒素イオン源については、三価の物でも五価の物でもよい。また、砒素イオン源については、典型的には、亜砒酸（Ｈ3ＡｓＯ3）や砒酸（Ｈ3ＡｓＯ4）、メタ亜砒酸等が挙げられる。砒素イオン源の量は、特に限定されないが、０．５〜３ｇ／Ｌである（砒素原子の重量に換算した量）。また、スコロダイトの製造効率を上げる意味から、砒素イオン源の量は、好ましくは１ｇ／Ｌ以上であり、更に好ましくは２ｇ／Ｌ以上である。一実施形態において、本発明で用いる鉄酸化細菌は、上述した濃度の砒素イオンが存在する環境下でも増殖可能である。また、スコロダイトの製造効率を上げる意味から、砒素イオン源の量を、２ｇ／Ｌ以上、あるいは５ｇ／Ｌ以上とすることも可能である。また、上限値については、特に規定されないが、これ以上濃度を上げても効果が出ないなどの経済的な観点等から適宜決定することができる。例えば、１０ｇ／Ｌ以下、９ｇ／Ｌ以下、８ｇ／Ｌ以下、７ｇ／Ｌ以下、６ｇ／Ｌ以下、５ｇ／Ｌ以下、４ｇ／Ｌ以下、又は３ｇ／Ｌ以下である。
【００３０】
また、上述した鉄イオン源と砒素イオン源との比率については、特に限定されないが、典型的には、Ｆｅ／Ａｓのモル比が、最終的に１〜２、好ましくは、１．２〜１．５である。
【００３１】
３−６．スコロダイトの製造条件（その他の条件について）
上述した培地の成分や鉄酸化細菌以外、他の培養条件は、状況に応じて当業者が適宜選択することができる。典型的な条件は以下の通りである。
温度：２０〜４５℃（好ましくは３０〜４５℃）
時間：１週間以上（好ましくは２週間以上）
ｐＨ：０．５〜３．０（好ましくは１．２〜２．５）
好熱性鉄酸化細菌を用いる好適な実施形態においても、他の培養条件は、状況に応じて当業者が適宜選択することができる。典型的な条件は以下の通りである。
温度：４５〜９０℃（好ましくは６０〜８５℃）
時間：１〜２８日間（好ましくは２日間以上）
ｐＨ：０．５〜３．０（好ましくは１．０〜２．０）
【００３２】
また、スコロダイトの製造を行う前に鉄酸化細菌の前培養を行っている場合には、スコロダイトの製造に必要な成分を前培養の環境に添加する形で行っても良い。あるいは、前培養した鉄酸化細菌のみを回収して、該細菌を新たなスコロダイトの製造環境に投入してもよい。前者の場合には、硫黄源が引き続き存在することとなり、製造工程の効率性や耐砒素性の観点から好ましい。
【００３３】
４．順化培養について
一側面において、本発明は、上述した前培養を行う前に、順化培養を行ってもよい。具体的な条件は特に限定されないが、例えば、砒素濃度について初回５０ｍｇ／Ｌとし、以降５０ｍｇ／Ｌずつ濃度を上げて、最終濃度１ｇ／Ｌになるまで順化培養することができる。また、他の条件についても特に限定されないが、典型的には以下のとおりである。
温度：４５〜９０℃（好ましくは６０〜８５℃）
時間：１０〜１００日間（好ましくは２０日間以上）
ｐＨ：０．５〜３．０（好ましくは１．０〜２．０）
順化培養と前培養を組み合わせることにより、順化培養のみの場合と比べて、鉄酸化細菌の増殖が良好に進行し、その結果、スコロダイトの製造効率が上がる。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明の実施例を示すが、これらの実施例は本発明及びその利点をより良く理解するために提示するものであり、本発明が限定されることを意図するものではない
【００３５】
実施例０〜３
９Ｋ無機塩培地２００ｍＬを培養フラスコに投入し、該培地のｐＨを希硫酸で１．５に調整した。これに好熱性鉄酸化菌の一種であるＡｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉを接種した（５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）。さらに、この培地に、単体硫黄を、最終濃度１０ｇ／Ｌになるように添加した。そして、７０℃で４日間、振盪培養した。
【００３６】
次に、この培地を５００ｍｌ振盪フラスコに移した。このときに細菌の濃度を１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調整した。そして、砒酸（Ｈ3ＡｓＯ4）と硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ4）を表１に記載の通り添加してＡｓ5+とＦｅ2+を所定の比率となるように調整した。更に、Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔを最終濃度として０．０２％となるように添加し、７０℃に保持しながら１２日間振盪した。振盪中の細菌濃度の変化は、Ｎｉｋｏｎ製ＬＡＢＯＰＨＯＴ−２で細菌を観察し、観察視野内の細菌数をカウントして、試料全体の細菌数に換算することにより測定した。また、培地中のＡｓやＦｅの濃度変化は、ＩＣＰ発光分光分析装置（ＩＣＰ−ＡＥＳ、セイコーインスツル株式会社製、ＳＰＳ７７００）で測定した。
【００３７】
【表１】
0006532781.tif 000002
【００３８】
細菌の増殖速度の変化を表２及び図１に示す。実施例０〜３を見ると、５日後までは対数増殖期であり、５日後以降は飽和状態となった。砒素の濃度が比較的高い実施例３と、比較的低い実施例１を比べると、細菌の増殖速度に遜色がなかった。いずれにしても、硫黄源存在下で培養することにより、その後の砒素存在下の環境でも良好に細菌が増殖することが示された。
【表２】
0006532781.tif 000003
【００３９】
また、二価の鉄イオンの濃度変化を表３及び図２に示す。実施例０〜３のいずれにおいても、鉄イオンの二価から三価への酸化が起こっていることが示された。
【表３】
0006532781.tif 000004
【００４０】
比較例１
実施例３と同様の方法で、前培養を行い、更に、Ａｓ5+（０．５ｇ／Ｌ）とＦｅ2+（２．０ｇ／Ｌ）存在下でスコロダイトの製造を行った。ただし、前培養においては、単体硫黄の代わりに、鉄源である硫酸第一鉄を鉄原子で２ｇ／Ｌになるように添加した。細菌の増殖速度の変化を表４及び図１に示す。細菌は全く増殖しておらず、これは砒素の毒性によるものと考えられる。また、二価の鉄イオンの濃度変化を表５及び図２に示す。実施例０〜３と比べると、鉄の酸化速度が低くなっていることが示された。従って、細菌の鉄酸化作用が阻害され、増殖が阻害されていることが示された。
【表４】
0006532781.tif 000005
【表５】
0006532781.tif 000006
【００４１】
実施例４
実施例１と同様の方法で、前培養及びスコロダイトの製造工程を実施した。ただし、Ａｓ5+の量を１ｇ／Ｌ、Ｆｅ2+の量を１ｇ／Ｌとした。細菌の増殖速度の変化を表６及び図３に示す。実施例１〜３よりもＡｓ5+が高いにもかかわらず、実施例１〜３と遜色ない増殖速度を示した。また、スコロダイトが生成しているのが確認された。回収したスコロダイト粒子をＳＥＭで観察した（図４）。
【００４２】
実施例５
実施例４と同様の方法で、前培養及びスコロダイトの製造工程を実施した。ただし、Ａｓ5+の量を２ｇ／Ｌ、Ｆｅ2+の量を２ｇ／Ｌとした。細菌の増殖速度の変化を表７及び図３に示す。実施例４よりもＡｓ5+が高いが、依然として細菌が増殖することが示された。また、実施例４と同様、スコロダイトが生成しているのが確認された。
【表６】
0006532781.tif 000007
【表７】
0006532781.tif 000008
【００４３】
比較例２
比較例１と同様の方法で、前培養及びスコロダイトの製造工程を実施した。前培養においては、単体硫黄の代わりに、鉄イオンを０．５ｇ／Ｌ添加した。鉄イオン源は、硫酸第一鉄を用いた。また、前培養においては、砒素イオンも０．５ｇ／Ｌになるように添加した。砒素イオンは、砒酸を用いた。細菌の増殖速度の変化を表８及び図３に示す。細菌は全く増殖していなかった。砒素を用いて前培養したとしても、硫黄源による前培養のように、砒素による耐性は向上しなかった。また、スコロダイトが生成されず、黄色の鉄沈殿物が生成されたのが確認された。
【表８】
0006532781.tif 000009
【００４４】
比較例３
９Ｋ無機塩培地２００ｍＬを５００ｍｌ振盪フラスコに投入し、該培地のｐＨを希硫酸で１．５に調整した。これに好熱性鉄酸化菌の一種であるＡｃｉｄｉａｎｕｓ  Ｂｒｉｅｒｌｅｙｉを接種した（２．１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）。なお、この菌は、事前に通常の順化培養を行った。すなわち、Ａｓ源としてメタ亜砒酸ナトリウムを用い、低濃度のＡｓ濃度から徐々に順化させて培養し、３価のＡｓ濃度として１ｇ／ＬまでＡｓ耐性をもたせた。次に、細菌濃度を２．１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調整し、砒酸（Ｈ3ＡｓＯ4）と硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ4）を添加してＡｓ3+とＦｅ2+をそれぞれ２ｇ／Ｌとなるように調整した。更に、ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔを最終濃度として０．０２％となるように添加し、７０℃に保持しながら１１日間振盪した。振盪中の細菌濃度の変化は、Ｎｉｋｏｎ製ＬＡＢＯＰＨＯＴ−２で細菌を観察し、観察視野内の細菌数をカウントして、試料全体の細菌数に換算することにより測定した。また、培地中のＡｓやＦｅの濃度変化は、ＩＣＰ発光分光分析装置（ＩＣＰ−ＡＥＳ、セイコーインスツル株式会社製、ＳＰＳ７７００）で測定した。
【００４５】
実施例６
９Ｋ無機塩培地２００ｍＬを培養フラスコに投入し、該培地のｐＨを希硫酸で１．５に調整した。これに好熱性鉄酸化菌の一種であるＡｃｉｄｉａｎｕｓ  Ｂｒｉｅｒｌｅｙｉを接種した（５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）。なお、この菌は、事前に通常の順化培養、すなわち、Ａｓ源としてメタ亜砒酸ナトリウムを用い、低濃度のＡｓ濃度から徐々に順化させて培養し、３価のＡｓ濃度１ｇ／ＬまでＡｓ耐性をもたせた。さらに、この培地に、単体硫黄を、最終濃度１０ｇ／Ｌになるように添加した。そして、７０℃で４日間、振盪培養した。次に、この培地を５００ｍｌ振盪フラスコに移した。このときに細菌の濃度を２．５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調整した。そして、砒酸（Ｈ3ＡｓＯ4）と硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ4）を添加して、Ａｓ3+とＦｅ2+をそれぞれ２ｇ／Ｌとなるように調整した。更に、ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔを最終濃度として０．０２％となるように添加し、７０℃に保持しながら９日間振盪した。振盪中の細菌濃度の変化は、Ｎｉｋｏｎ製ＬＡＢＯＰＨＯＴ−２で細菌を観察し、観察視野内の細菌数をカウントして、試料全体の細菌数に換算することにより測定した。また、培地中のＡｓやＦｅの濃度変化は、ＩＣＰ発光分光分析装置（ＩＣＰ−ＡＥＳ、セイコーインスツル株式会社製、ＳＰＳ７７００）で測定した。
【００４６】
比較例３及び実施例６における細菌の増殖速度の変化を表９及び図５に示す。硫黄による培養を行わなかった場合、細菌は試験開始後６日目までは増殖するものの、その後減少した。試験終了後、沈殿物が生成していたが、ＸＲＤで確認したところスコロダイトは検出されなかった。一方、硫黄による培養を行った場合、試験終了まで細菌が増殖し続けた。試験終了後、沈殿物が生成しており、ＸＲＤで確認したところスコロダイトが検出された。このことから、砒素イオンが３価であっても硫黄源存在下で培養すると砒素耐性を高める効果があることが確認できた。
【表９】
0006532781.tif 000010
【図１】
0006532781.tif 000011
【図２】
0006532781.tif 000012
【図３】
0006532781.tif 000013
【図４】
0006532781.tif 000014
【図５】
0006532781.tif 000015