(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト自己再生性内胚葉前駆細胞を作製する方法であって、
ａ）多能性ヒト幹細胞をアクチビンＡまたはノーダルを含む無血清培地中で培養するステップ；
ｂ）ステップａ）の細胞を、アクチビンＡ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、およびＦＧＦ２を含む無血清培地中で培養して胚体内胚葉細胞を作製するステップ；
ｃ）ステップｂ）の胚体内胚葉細胞を洗浄し、予め冷却した基底膜調製物を洗浄した細胞に添加するステップ；および
ｄ）ステップｃ）で得られた細胞を、無血清培地中にＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２、およびＥＧＦを含む浮遊培養物中で培養して、自己再生性内胚葉前駆細胞の増殖を選択的に促進するステップであって、ステップｄ）の前記浮遊培養物が基底膜調製物を含む、ステップ
を含む方法。
【請求項２】
単一ホルモン性膵島ベータ細胞を作製する方法であって、
ａ）多能性幹細胞をアクチビンＡまたはノーダルを含む無血清培地中で培養するステップ；
ｂ）ステップａ）の細胞を洗浄し、予め冷却した基底膜調製物を洗浄した細胞に添加するステップ；および
ｃ）ステップｂ）で得られた細胞を、無血清培地中にＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２、およびＥＧＦを含む浮遊培養物中で培養して、自己再生性内胚葉前駆細胞の増殖を選択的に促進するステップであって、ステップｃ）における前記浮遊培養物が基底膜調製物を含む、ステップ；ならびに
ｄ）前記内胚葉前駆細胞を島ベータ細胞促進性増殖因子と一緒に培養して、単一ホルモン性膵島ベータ細胞の形成をもたらすステップを含み、
ｉ）前記内胚葉前駆細胞を、ＢＭＰアンタゴニスト、Ｗｎｔ３Ａ、およびＦＧＦ１０と一緒に培養して、前腸内胚葉細胞の形成をもたらすステップ；
ｉｉ）前記前腸内胚葉細胞を、Ｂ２７、ＢＭＰアンタゴニスト、ヘッジホッグ阻害剤、レチノイン酸、およびＦＧＦ１０と一緒に培養して、膵臓内胚葉細胞の形成をもたらすステップ；
ｉｉｉ）前記膵臓内胚葉細胞を、Ｂ２７、ＢＭＰアンタゴニスト、ガンマ−セレクターゼ阻害剤、およびＡＬＫ５阻害剤と一緒に培養して、内分泌前駆細胞の形成をもたらすステップ；および
ｉｖ）前記内分泌前駆細胞を、ＢＭＰアンタゴニスト、ＡＬＫ５阻害剤、インスリン、グルコース、およびニコチンアミドと一緒に培養して、単一ホルモン性膵島ベータ細胞の形成をもたらすステップ
をさらに含む、方法。
【請求項３】
ステップａ）の前記無血清培地がアクチビンＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップａ）の前記培地がＷｎｔ３ＡまたはＧＳＫ３阻害剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップａ）の前記培地がＷｎｔ３ＡまたはＧＳＫ３阻害剤を含有しない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップａ）の前記培養を４〜１２日間行う、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ステップａ）の前記培養を４〜８日間行う、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップａ）の前記培養を接着培養として行う、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ステップａ）からの前記細胞が、胚体内胚葉細胞および内胚葉前駆細胞の集団を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ステップａ）で使用される前記無血清培地が、ＴＧＦ−β、潜在型ＴＧＦ−β結合タンパク質、ノーダル、ＧＳＫ３阻害剤、フォリスタチン関連タンパク質（ＦＳＲＰ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１、インドラクタムＶ、およびインスリン様増殖因子をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｄ）の前記浮遊培養物がアクチビンＡをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ステップｄ）の前記浮遊培養物がＴＧＦβをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップｄ）の前記培養を少なくとも７〜４０日間行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ステップｄ）の前記培養を少なくとも７〜２５日間行う、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップｄ）の前記培養をＲＯＣＫ阻害剤の存在下で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＲＯＣＫ阻害剤がＹ−２７６３２またはＨ１１５２である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＲＯＣＫ阻害剤を１２時間後に除去する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記基底膜調製物が０．０６〜０．６ｍｇ／ｍＬの最終濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記基底膜調製物が０．３ｍｇ／ｍＬから０．６ｍｇ／ｍＬの間の最終濃度で存在する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップｄ）の前記浮遊培養物を５日毎に解離させ、再集合させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ステップｄ）の前記浮遊培養物をスピナーフラスコ中で維持する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記スピナーフラスコを４０〜７０ｒｐｍで作動させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ステップｄ）の前記浮遊培養物を静置浮遊培養物として維持する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
ステップｄ）の前記内胚葉細胞を１ｍＬ当たり細胞２５０，０００〜２，０００，０００個の初期濃度の浮遊液で培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
ステップｄ）の前記内胚葉細胞を１ｍＬ当たり細胞２５０，０００〜５００，０００個の初期濃度の浮遊液で培養する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記内胚葉前駆細胞が、ＣＸＣＲ４、ＣＤ３４、およびＣＤ１１７（ｃ−ＫＩＴ）を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記内胚葉前駆細胞が、Ｓｏｘ１７、ＦｏｘＡ１、ＦｏｘＡ２、およびＣＤ３１のうちの少なくとも１つをさらに発現する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ヒト自己再生性内胚葉前駆細胞の形成は、ＭＥＦフィーダー層の存在もＭＥＦ馴化培地の存在も必要としない、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記多能性ヒト幹細胞が胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
ステップｂ）およびステップｄ）の何れか又は両方の培養を２０％酸素の下で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
ステップｂ）およびステップｄ）の何れか又は両方の培養を低酸素条件下で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記多能性幹細胞をステップａ）の前に低酸素条件下で維持する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記内胚葉前駆細胞をステップｄ）の前記培養の前に精製する、請求項２に記載の方法。
【請求項３４】
前記島ベータ細胞促進性増殖因子が、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）の強力な阻害剤、ＢＭＰアンタゴニスト、ヘッジホッグ阻害剤、ガンマ−セレクターゼ阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤、レチノイン酸、ＦＧＦ１０、Ｂ２７、およびＷｎｔ３ＡまたはＧＳＫ３阻害剤を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞が、Ｅｒｇ１をコードする誘導性発現カセットを含み、ステップｉｖ）が、Ｅ
ｒｇ１を発現するように前記細胞を誘導することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞が、Ｇｆｉ１をコードする誘導性発現カセットを含み、ステップｉｖ）が、Ｇ
ｆｉ１を発現するように前記細胞を誘導することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３７】
ステップｉ）で使用される前記ＢＭＰアンタゴニストがドルソモルフィンである、請求
項２に記載の方法。
【請求項３８】
ステップｉｉ）、ｉｉｉ）、およびｉｖ）で使用される前記ＢＭＰアンタゴニストがノギンである、請求項２に記載の方法。
【請求項３９】
ステップｉｉｉ）で使用される前記ガンマ−セレクターゼ阻害剤がＤＡＰＴである、請求項２に記載の方法。
【請求項４０】
ステップｉｉｉ）およびｉｖ）で使用される前記ＡＬＫ５阻害剤がＳＢ４３１５４２である、請求項２に記載の方法。
【請求項４１】
ステップｉｉ）で使用される前記ヘッジホッグ阻害剤がＫＡＡＤ−シクロパミンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４２】
ステップｉ）、ｉｉ）、およびｉｉｉ）の前記培養をそれぞれ３〜５日間行う、請求項２に記載の方法。
【請求項４３】
ステップｉｖ）の前記培養を４〜１０日間行う、請求項２に記載の方法。
【請求項４４】
前記単一ホルモン性膵島ベータ細胞を１〜４週間培養する、請求項２に記載の方法。
【請求項４５】
前記単一ホルモン性膵島ベータ細胞を浮遊培養物で培養する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記培養が接着培養を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４７】
前記培養を低酸素条件下で行う、請求項２に記載の方法。
【請求項４８】
前記培養物がＭＥＦフィーダー細胞およびＭＥＦ馴化培地を含まない、請求項２に記載の方法。
【請求項４９】
前記単一ホルモン性膵島ベータ細胞が、ＰＤＸ−１、インスリン、およびＣ−ペプチドを発現するが、グルカゴンは発現しない、請求項２に記載の方法。
【請求項５０】
前記単一ホルモン性膵島ベータ細胞がソマトスタチンを発現しない、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記単一ホルモン性膵島ベータ細胞が低レベルのソマトスタチンを発現する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記単一ホルモン性膵島ベータ細胞が少なくとも１２％純粋なものである、請求項２に記載の方法。
【請求項５３】
前記単一ホルモン性膵島ベータ細胞が少なくとも２０％純粋なものである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１である、請求項４に記載の方法。
【請求項５５】
ヒト自己再生性内胚葉前駆細胞集合体を作製する方法であって、
ａ）多能性ヒト幹細胞をアクチビンＡまたはノーダルを含む無血清培地中で培養するステップ；
ｂ）ステップａ）の細胞を、アクチビンＡ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、およびＦＧＦ２を含む無血清培地中で培養して胚体内胚葉細胞を作製するステップ；
ｃ）ステップｂ）の胚体内胚葉細胞を洗浄し、予め冷却した基底膜調製物を洗浄した細胞に添加するステップ；および
ｄ）前記胚体内胚葉細胞を、無血清培地中にＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２、およびＥＧＦを含む浮遊培養物で培養して、自己再生性内胚葉前駆細胞集合体の形成をもたらすステップであって、ステップｄ）の前記浮遊培養物が基底膜調製物を含む、ステップ
を含む方法。
【請求項５６】
ステップａ）の前記無血清培地がアクチビンＡを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ステップｄ）の前記浮遊培養物がアクチビンＡをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
ステップｄ）の前記浮遊培養物がＴＧＦβをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
ヒト自己再生性内胚葉前駆細胞を作製する方法であって、
ａ）多能性ヒト幹細胞を、アクチビンＡを含む無血清培地中で培養するステップ；
ｂ）ステップａ）の細胞を、アクチビンＡ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、およびＦＧＦ２を含む無血清培地中で培養して胚体内胚葉細胞を作製するステップ；
ｃ）ステップｂ）の胚体内胚葉細胞を洗浄し、予め冷却した基底膜調製物を洗浄した細胞に添加するステップ；および
ｄ）ステップｃ）で得られた細胞を、無血清培地中にアクチビンＡ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２、およびＥＧＦを含む浮遊培養物で培養して、自己再生性内胚葉前駆細胞の増殖を選択的に促進するステップであって、ステップｂ）の前記浮遊培養物が基底膜調製物を含む、ステップ
を含む方法。
【請求項６０】
ステップｄ）の前記浮遊培養物がＴＧＦβをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年４月３日に出願された米国仮出願第６１／８０８，００３号の優先権の利益を請求し、その全体の内容が参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明は、一般に、内分泌学、幹細胞、および分化細胞の分野に関する。より詳細には、本発明は、浮遊培養で未分化細胞から自己再生性内胚葉前駆細胞（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗｉｎｇ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）を作製することに関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓を含めた内胚葉由来組織は、細胞補充療法に潜在的に有用である。多能性幹細胞（ＰＳＣ）から、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、胚の形態形成を模倣するサイトカインに逐次的に曝露することによって、発生の間に初期の腸管を形成する胚体内胚葉（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ）およびその誘導系列を生成することが可能である。このようにして、胚性幹細胞（ＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から膵臓細胞を作製することができる（D'Amourら、２００６年；Gouon-Evansら、２００６年）。これらの試験により、移植療法に対するＰＳＣ由来の内胚葉組織の有望性が強調されるが、いくつかの障害が残っている。ＰＳＣから生成した内胚葉細胞は、未成熟表現型を示す傾向があり、多くの場合、十分に機能しない。例えば、現在ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてヒトＥＳＣから生成されている大多数の膵ベータ細胞は多ホルモン性であり、グルコース応答性ではない（D'Amourら、２００６年；Nostroら、２０１１年）。移植に使用するための内胚葉細胞を作製することにおけるさらなる障害は、必要な数の細胞を作製するために作製の規模を拡大する能力であり、これは、膵臓細胞に関しては、現在は固体表面で作製する必要性によって限定されている。これらの限定が回避される培養および単離方法を提供することが本発明の目的である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】D’Amour  et  al.,  Production  of  pancreatic  hormone  expressing  endocrine  cells  from  human  embryonic  stem  cells,  Nat.  Biotechnol.,  24:1392-1401,  2006.
【非特許文献２】Gouon-Evans  et  al.,  BMP-4  is  required  for  hepatic  specification  of  mouse  embryonic  stem  cell-derived  definitive  endoderm,  Nat.  Biotechnol.,  24:1402-1411,  2006.
【非特許文献３】Nostro  et  al.,  Stage-specific  signaling  through  TGFbeta  family  members  and  WNT  regulates  patterning  and  pancreatic  specification  of  human  pluripotent  stem  cells,  Development,  138:861-871,  2011.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明では、自己再生性内胚葉前駆細胞（以下、「ＥＰＣ」、「ＥＰ」、または「ＥＰ細胞」）を作製するための効率的な方法をもたらすことによって当技術分野における主要な欠如を克服する。第１の実施形態では、自己再生性内胚葉前駆細胞を作製するための方法であって、ａ）多能性幹細胞をアクチビンＡまたはノーダルを含む無血清培地中で培養して、内胚葉細胞の誘導をもたらすステップ、およびｂ）内胚葉細胞を、無血清培地中にＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２、およびＥＧＦ、またはそのホモログを含む浮遊培養物中で培養して、自己再生性内胚葉前駆細胞の増殖を選択的に促進するステップを含む方法が提供される。一実施形態では、自己再生性内胚葉前駆細胞を作製するための方法であって、ａ）多能性幹細胞を、アクチビンＡを含む無血清培地中で培養して内胚葉細胞の誘導をもたらすステップ、およびｂ）内胚葉細胞を、無血清培地中にアクチビンＡ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２、およびＥＧＦ、またはそのホモログを含む浮遊培養物中で培養して、自己再生性内胚葉前駆細胞の増殖を選択的に促進するステップを含む方法が提供される。一部の態様では、ステップｂ）の浮遊培養物はＴＧＦβをさらに含んでよい。ある特定の態様では、内胚葉細胞は、胚体内胚葉細胞および内胚葉前駆細胞の集団を含む。一部の態様では、ステップｂ）の内胚葉細胞を、浮遊液中、１ｍｌ当たり細胞約１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個の細胞の初期濃度、またはその中に導き出せる任意の範囲で培養する。内胚葉細胞を、浮遊液中、１ｍｌ当たり細胞約２５０，０００〜２，０００，０００個、より好ましくは１ｍｌ当たり細胞２５０，０００〜５００，０００個の初期濃度で培養することが好ましい。
【０００５】
一部の態様では、ステップａ）の無血清培地は、Ｗｎｔ３ＡまたはＧＳＫ３阻害剤をさらに含んでよい。他の態様では、ステップａ）の無血清培地は、Ｗｎｔ３ＡまたはＧＳＫ３阻害剤を含有しなくてよい。ＧＳＫ３阻害剤の好ましい例はＣＨＩＲ９９０２１である。一部の態様では、ステップａ）の培養を少なくともまたは約１日、２日、３日、４日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、またはその中に導き出せる任意の範囲で行うことができる。前記培養を約４〜１２日間、より好ましくは約５〜８日間行うことが好ましい。一部の態様では、ステップａ）の培養を接着培養として行うことができる。
【０００６】
一部の態様では、ステップｂ）において使用される内胚葉前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）促進性増殖因子は、ＴＧＦ−β、潜在型ＴＧＦ−β結合タンパク質、ノーダル、ＧＳＫ３阻害剤、フォリスタチン関連タンパク質（ＦＳＲＰ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１、インドラクタムＶ、および／またはインスリン様増殖因子をさらに含んでよい。ＧＳＫ３阻害剤の好ましい例はＣＨＩＲ９９０２１である。一部の態様では、ステップｂ）の培養を少なくともまたは約１日、２日、３日、４日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、またはその中に導き出せる任意の範囲で行うことができる。一部の態様では、ステップｂ）の培養を少なくとも１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、またはその中に導き出せる任意の範囲で行うことができる。前記培養を少なくとも約５〜約４０日間、より好ましくは約１０〜約１５日間行うことが好ましい。一部の態様では、ステップｂ）の培養をＲＯＣＫ阻害剤の存在下で行うことができる。ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ−２７６３２、Ｈ１１５２、またはＨＡ−１００であってよい。一部の態様では、ＲＯＣＫ阻害剤を培養の最初の約１２時間後に除去することができる。
【０００７】
一部の態様では、ステップｂ）の浮遊培養物は、細胞集団の培養を支持するために、基底膜調製物などのマトリックス成分をさらに含んでよい。マトリックス成分の非限定的な例としては、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、ビトロネクチン、ラミニン、ＰＬＯラミニン、フィブリン塊、フィブロネクチンならびにそれらの混合物、例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）および溶解させた細胞膜調製物が挙げられる。基底膜調製物は、約０．０６〜０．６ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．３〜０．６ｍｇ／ｍｌの最終濃度で存在してよい。
【０００８】
一部の態様では、ステップｂ）の浮遊培養物を約１日毎、２日毎、３日毎、４日毎、６日毎、７日毎、８日毎、９日毎、１０日毎、１１日毎、１２日毎、１３日毎、１４日毎、１５日毎、またはその中に導き出せる任意の範囲で解離させ、再集合させることができる。好ましくは、浮遊培養物を約４〜５日毎に解離させ、再集合させることができる。一部の態様では、ステップｂ）の浮遊培養物をスピナーフラスコ中で維持することができる。スピナーフラスコを約４０〜７０ｒｐｍで作動させることができる。一部の態様では、ステップｂ）の浮遊培養物を静置浮遊培養物として維持することができる。
【０００９】
一部の態様では、内胚葉前駆細胞は、ＣＸＣＲ４、ＣＤ１１７（ｃ−ＫＩＴ）、およびＣＤ３４を発現し得る。一部の態様では、内胚葉前駆細胞は、Ｓｏｘ１７、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、およびＣＤ３１をさらに発現し得る。前記発現は、タンパク質発現解析、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ解析、またはＲＮＡ発現解析、例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲによって検出することができる。一部の態様では、自己再生性内胚葉前駆細胞の形成のためにＭＥＦフィーダー層またはＭＥＦ馴化培地が存在する必要がない。一部の態様では、培養を正常酸素条件下で行う。一部の態様では、培養を低酸素条件下で行う。一部の態様では、ステップａ）の前に多能性幹細胞を低酸素条件下で維持することができる。
【００１０】
一部の態様では、多能性幹細胞は胚性幹細胞であっても人工多能性幹細胞であってもよい。幹細胞は、多分化能幹細胞、小能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、または単能性幹細胞も含み得る。幹細胞は、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、および皮膚幹細胞などの胎児幹細胞または成体幹細胞も含み得る。ある特定の態様では、幹細胞は、臍部、胎盤、羊水、絨毛膜絨毛、胚盤胞、骨髄、脂肪組織、脳、末梢血、臍帯血、月経血、血管、骨格筋、皮膚、および肝臓から単離することができる。
【００１１】
ある特定の態様では、方法は、内胚葉前駆細胞を島ベータ細胞促進性増殖因子（ｉｓｌｅｔ  ｂｅｔａ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）と一緒に培養して、単一ホルモン性（ｍｏｎｏ−ｈｏｒｍｏｎａｌ）膵島ベータ細胞の形成をもたらすステップをさらに含む。一部の態様では、内胚葉前駆細胞を、培養する前に精製することができる。前記精製は、ＣＤ３４、ＣＤ１１７、およびＣＸＣＲ４などのマーカーの発現に基づいてよい。ある特定の態様では、培養を浮遊培養として実施することができる。一部の態様では、培養を接着培養として実施することができる。島ベータ細胞促進性増殖因子は、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）の強力な阻害剤、ＢＭＰアンタゴニスト、ヘッジホッグ阻害剤、ガンマ−セレクターゼ阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤、レチノイン酸、ＦＧＦ１０、Ｂ２７、およびＷｎｔ３ＡまたはＧＳＫ３阻害剤を含んでよい。ＧＳＫ３阻害剤の好ましい例はＣＨＩＲ９９０２１である。一部の態様では、前記さらなる培養をＲＯＣＫ阻害剤の存在下で行うことができる。ＲＯＣＫ阻害剤はＹ−２７６３２、Ｈ１１５２、またはＨＡ−１００であってよい。
【００１２】
ある特定の態様では、単一ホルモン性膵島ベータ細胞の形成をもたらす方法は、ｉ）内胚葉前駆細胞をＢＭＰアンタゴニスト、Ｗｎｔ３Ａ、およびＦＧＦ１０と一緒に培養して、前腸内胚葉細胞の形成をもたらすステップ；ｉｉ）前腸内胚葉細胞を、Ｂ２７、ＢＭＰアンタゴニスト、ヘッジホッグ阻害剤、レチノイン酸、およびＦＧＦ１０と一緒に培養して、膵臓内胚葉細胞の形成をもたらすステップ；ｉｉｉ）膵臓内胚葉細胞を、Ｂ２７、ＢＭＰアンタゴニスト、ガンマ−セレクターゼ阻害剤、およびＡＬＫ５阻害剤と一緒に培養して、内分泌前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）の形成をもたらすステップ；およびｉｖ）前記内分泌前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）を、ＢＭＰアンタゴニスト、ＡＬＫ５阻害剤、インスリン、グルコース、およびニコチンアミドと一緒に培養して、単一ホルモン性膵島ベータ細胞の形成をもたらすステップをさらに含む。
【００１３】
ステップｉ）において使用されるＢＭＰアンタゴニストはドルソモルフィンまたはＬＤＮ−１９３１８９であってよい。ＢＭＰアンタゴニストはドルソモルフィンであることが好ましい。ステップｉｉ）、ｉｉｉ）、およびｉｖ）において使用されるＢＭＰアンタゴニストは、ノギン、グレムリン、ＵＳＡＧ−１、フォリスタチン、ＰＲＤＣ、ケルベロス、ココ、スクレロスチン、またはコーディンであってよい。ＢＭＰアンタゴニストはノギンであることが好ましい。ステップｉｉｉ）において使用されるガンマ−セレクターゼ阻害剤は、ＤＡＰＴ、ＲＯ４９２９０９７、ＢＭＳ−７０８１６３、セマガセスタット、ＭＫ−０７５２、ＹＯ−０１０２７、ＬＹ−４１１５７５、または（Ｒ）−フルルビプロフェンであってよい。ガンマ−セレクターゼ阻害剤はＤＡＰＴであることが好ましい。ステップｉｉｉ）およびｉｖ）において使用されるＡＬＫ５阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、ＡＬＸ−２７０−４４８、Ａ８３−０１、ＥＷ−７１９５、ＫＩ２６８９４、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ−３６４９４７、ＳＢ−５２５３３４、ＳＢ−５０５１２４、ＳＤ−２０８、ＩＮ−１２３３、またはＳＫＩ２１６２であってよい。ＡＬＫ５阻害剤はＳＢ４３１５４２であることが好ましい。ステップｉｉ）において使用されるヘッジホッグ阻害剤は、ＫＡＡＤ−シクロパミン、ビスモデギブ、ＬＹ２９４０６８０、ＭＲＴ−１０、ＭＲＴ−８３、またはＧＤＣ−０４４９であってよい。ヘッジホッグ阻害剤はＫＡＡＤ−シクロパミンであることが好ましい。
【００１４】
一部の態様では、細胞は、Ｅｒｇ１をコードする誘導性発現カセットを含んでよい。ある特定の態様では、単一ホルモン性膵島ベータ細胞の形成をもたらす方法のステップｉｖ）は、Ｅｒｇ１を発現するように細胞を誘導することをさらに含んでよい。一部の態様では、細胞は、Ｇｆｉ１をコードする誘導性発現カセットを含んでよい。ある特定の態様では、単一ホルモン性膵島ベータ細胞の形成をもたらす方法のステップｉｖ）は、Ｇｆｉ１を発現するように細胞を誘導することをさらに含んでよい。一部の態様では、細胞は、Ｅｒｇ１とＧｆｉ１の両方をコードする誘導性発現カセットを含んでよい。ある特定の態様では、単一ホルモン性膵島ベータ細胞の形成をもたらす方法のステップｉｖ）は、Ｅｒｇ１とＧｆｉ１の両方を発現するように細胞を誘導することをさらに含んでよい。種々の態様では、誘導性発現カセットを細胞のゲノムに組み込むことができる。種々の態様では、誘導性発現カセットをトランスポゾン（例えば、ｐｉｇｇｙＢａｃ）に含めることができる。種々の態様では、誘導性発現カセットをエピソームベクターに含めることができる。
【００１５】
一部の態様では、ステップｉ）、ｉｉ）、およびｉｉｉ）の培養を少なくともまたは約１日、２日、３日、４日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、またはその中に導き出せる任意の範囲で行うことができる。前記培養を約３〜５日間行うことが好ましい。一部の態様では、ステップｉｖ）の培養を少なくともまたは約１日、２日、３日、４日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、またはその中に導き出せる任意の範囲で行うことができる。前記培養を約３〜４０日間行うことが好ましい。
【００１６】
一部の態様では、培養物は、基底膜調製物を含んでよい。一部の態様では、培養を低酸素条件下で行うことができる。一部の態様では、培養物はＭＥＦフィーダー細胞およびＭＥＦ馴化培地を欠いてよい。
【００１７】
一部の態様では、単一ホルモン性膵島ベータ細胞は、ＰＤＸ、インスリン、Ｃ−ペプチド、およびＮｅｕｒｏＤ１、低レベルのソマトスタチンおよびＮｋｘ６．１を発現し、グルカゴンを発現しないものであってよい。前記発現は、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ解析などのタンパク質発現解析、またはｑＲＴ−ＰＣＲなどのＲＮＡ発現解析によって検出することができる。一部の態様では、単一ホルモン性膵島ベータ細胞は、細胞集団の少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％（または任意の中間の範囲）、またはその中に導き出せる任意の範囲である。単一ホルモン性膵島ベータ細胞は約１２％純粋なものまたは約２０％純粋なものであることが好ましい。単一ホルモン性膵島ベータ細胞のさらなる特性としては、これだけに限定されないが、グルコース応答性Ｃ−ペプチド放出および糖尿病の動物モデルにおいて膵臓生着によって糖尿病を元に戻す能力が挙げられる。
【００１８】
一部の態様では、単一ホルモン性膵島ベータ細胞を１〜４週間培養することができる。ある特定の態様では、前記培養は、浮遊培養を含んでよい。
【００１９】
別の実施形態では、本開示は、自己再生性内胚葉前駆細胞集合体を作製する方法であって、ａ）多能性幹細胞をアクチビンＡまたはノーダルを含む無血清培地中で培養して、内胚葉細胞の誘導をもたらすステップ、およびｂ）内胚葉細胞を、無血清培地中にＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２、およびＥＧＦまたはそのホモログを含む浮遊培養物中で培養して、自己再生性内胚葉前駆細胞集合体の形成をもたらすステップを含む方法を提供する。
【００２０】
さらに別の実施形態では、本開示は、自己再生性内胚葉前駆細胞集合体を作製する方法であって、ａ）多能性幹細胞を、アクチビンＡを含む無血清培地中で培養して内胚葉細胞の誘導をもたらすステップ、およびｂ）内胚葉細胞を、無血清培地中にアクチビンＡ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＥＧＦ、およびＴＧＦβまたはそのホモログを含む浮遊培養物中で培養して、自己再生性内胚葉前駆細胞集合体の形成をもたらすステップを含む方法を提供する。
【００２１】
種々の態様では、実施形態の細胞を、幹細胞から内胚葉前駆細胞への分化を引き起こすために十分な量の分化因子と接触させることができる。分化因子は、分化因子遺伝子の遺伝子産物を含んでよい。遺伝子産物は、ポリペプチドまたは分化因子遺伝子のＲＮＡ転写物であってよい。別の態様では、分化因子は、それらの細胞内への進入および／または核内への進入を容易にするための１つまたは複数のタンパク質形質導入ドメインを含んでよい。そのようなタンパク質形質導入ドメイン、例えば、ＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質形質導入ドメイン、ＨＳＶ  ＶＰ２２タンパク質形質導入ドメイン、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメイン、またはそのバリアントなどが当技術分野で周知である。
【００２２】
ある特定の態様では、本方法の出発細胞は、少なくともまたは約１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１０１０個、１０１１個、１０１２個、１０１３個またはその中に導き出せる任意の範囲の細胞を含んでよい。出発細胞集団の播種密度は、１ｍｌ当たり細胞少なくともまたは約１０個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、またはその中に導き出せる任意の範囲であってよい。
【００２３】
本発明の方法および／または組成物に関して考察されている実施形態は、本明細書に記載の任意の他の方法または組成物に対して使用することができる。したがって、１つの方法または組成物に関する実施形態を本発明の他の方法および組成物にも同様に適用することができる。
【００２４】
本明細書において使用される場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」とは、１つまたは複数を意味し得る。請求項（複数可）において使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語と同時に使用される場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という単語は、１つまたはそれ超を意味し得る。
【００２５】
特許請求の範囲における「または（ｏｒ）」は、代替物のみを指すことまたは代替物が相互排他的であることが明示されていない限り、「および／または」の意味を示すために使用されるが、本開示は代替物のみ、および「および／または」を指すという定義を支持する。本明細書で使用される場合、「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」とは、少なくとも第２またはそれ超を意味し得る。
【００２６】
本出願全体を通して、「約」という用語は、値を決定するために使用されるデバイス、方法に関する誤差の固有の変動、または試験対象の間に存在する変動を含む値を示すために使用される。
【００２７】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の発明の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、発明の詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態が示されているが、この発明の詳細な説明から本発明の主旨および範囲内の様々な変化および改変が当業者に明らかになるので、単に例示として示されていることが理解されるべきである。
【００２８】
以下の図は本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、これらの図の１つまたは複数を本明細書で提示されている特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによってよく理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１Ａ〜Ｄは、アクチビンＡまたはノーダルを含む培地中で培養したｉＰＳＣ由来細胞の特徴付けを示すグラフである。プロットは、ＣＸＣＲ−４発現およびＣＤ１１７発現に関する表面染色および関連するアイソタイプ対照染色を示す。図１Ａは、採取した細胞の前方散乱および側方散乱を示す。図１Ｂは、集団内に存在する生細胞を示す。図１Ｃは、アイソタイプ対照抗体の染色プロファイルを示す。図１Ｄは、ＣＸＣＲ−４発現およびＣＤ１１７発現に関する細胞表面染色を示す。
【００３０】
【図２−１】図２Ａ〜Ｇは、Ｅ８培地中で維持したｉＰＳＣに由来する内胚葉前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）集団を含む細胞の特徴付けを示す図である。プロットは、Ｓｏｘ１７発現、ＦｏｘＡ１発現、およびＦｏｘＡ２発現に関する細胞内染色ならびに関連するアイソタイプ対照染色を示す。図２Ａは、採取した細胞の前方散乱および側方散乱を示す。図２Ｂは、集団内に存在する生細胞を示す。図２Ｃおよび２Ｅは、アイソタイプ対照抗体の染色プロファイルを示す。図２Ｄは、ＦｏｘＡ１発現およびＳｏｘ１７発現の細胞内染色を示す。図２Ｆは、ＦｏｘＡ２発現の細胞内染色を示す。図２Ｇは、ｉＰＳＣに由来する内胚葉前駆細胞の免疫染色を示す。
【図２−２】図２Ａ〜Ｇは、Ｅ８培地中で維持したｉＰＳＣに由来する内胚葉前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）集団を含む細胞の特徴付けを示す図である。プロットは、Ｓｏｘ１７発現、ＦｏｘＡ１発現、およびＦｏｘＡ２発現に関する細胞内染色ならびに関連するアイソタイプ対照染色を示す。図２Ａは、採取した細胞の前方散乱および側方散乱を示す。図２Ｂは、集団内に存在する生細胞を示す。図２Ｃおよび２Ｅは、アイソタイプ対照抗体の染色プロファイルを示す。図２Ｄは、ＦｏｘＡ１発現およびＳｏｘ１７発現の細胞内染色を示す。図２Ｆは、ＦｏｘＡ２発現の細胞内染色を示す。図２Ｇは、ｉＰＳＣに由来する内胚葉前駆細胞の免疫染色を示す。
【００３１】
【図３】図３は、１５日にわたる浮遊液中ｉＰＳＣ由来のＥＰ培養物の細胞生存能力および生存を示すグラフである。ＥＰは４つの異なるｉＰＳＣ株に由来するものであった。グラフは、フローサイトメトリーによって数量化した、存在する生存細胞の数を示す。実験は正常酸素条件下で実施した。
【００３２】
【図４】図４は、１５日にわたる浮遊液中ｉＰＳＣ由来のＥＰ培養物の細胞生存能力および生存を示すグラフである。ＥＰは４つの異なるｉＰＳＣ株に由来するものであった。実験は正常酸素条件下で実施した。プロットは、フローサイトメトリーによって数量化した、ＣＸＣＲ−４／ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）／ＦｏｘＡ１／Ｓｏｘ１７発現のレベルを示す。
【００３３】
【図５】図５は、膵臓分化プロトコールに供した１５日ＥＰＣ培養物の細胞生存能力および生存を示すグラフである。実験は正常酸素条件下で実施した。ＥＰＣ集合体における新生集団を特徴付けるために、集合体を個別化し、分化のプロセスの種々の日数で生存細胞数を決定した。
【００３４】
【図６】図６は、膵臓分化培地に入れた１５日ＥＰＣ培養物からのＰＤＸ−１陽性細胞の出現を示すグラフである。実験は正常酸素条件下で実施した。ＥＰＣ集合体を特徴付けるために、個別化した細胞を、細胞内染色を実施し、陽性細胞の百分率をフローサイトメトリーによって評価することによってＰＤＸ−１の存在について染色した。
【００３５】
【図７】図７は、膵臓分化プロセスの種々の日数におけるＰＤＸ−１陽性細胞の代表的な染色プロファイルを示すグラフである。実験は正常酸素条件下で実施した。
【００３６】
【図８】図８は、膵臓分化培地に入れた３Ｄ  ＥＰＣ集合体の位相差画像である。写真は１０×および２０×の拡大率で取得した。
【００３７】
【図９】図９は、膵臓分化プロセスの１５日目の、１５日経過ＥＰＣ集合体におけるＰＤＸ−１発現についての免疫組織化学的染色を示す画像である。実験は正常酸素条件下で実施した。膵臓分化培地中に１５日間置いた浮遊培養物中のインタクトな１５日目のＥＰＣ集合体の、ｈｉｓｔｏｇｅｌに包埋し、免疫組織化学的染色によってＰＤＸ−１の存在について染色した代表的な画像である。写真は１０×および２０×の拡大率で取得した。
【００３８】
【図１０】図１０Ａ〜Ｉは、膵臓分化プロセスの１８日目の、インタクトな１５日経過ＥＰＣ集合体におけるソマトスタチン（somatostain）発現、グルカゴン発現、およびインスリン発現の免疫組織化学的染色を示す画像である。実験は正常酸素条件下で実施した。膵臓分化培地中に１８日間置いた浮遊培養物中のインタクトな１５日目のＥＰＣ集合体の、ｈｉｓｔｏｇｅｌに包埋し、免疫組織化学的染色によってソマトスタチン（図１０Ａ〜Ｃ）、グルカゴン（図１０Ｄ〜Ｆ）、およびインスリン（図１０Ｇ〜Ｉ）の存在について染色した代表的な画像である。写真は２０×の拡大率で取得した。
【００３９】
【図１１】図１１は、膵臓分化プロセスの１８日目の、集合体を解離させた後の、１５日経過ＥＰＣ集合体におけるＣ−ペプチド発現、グルカゴン発現、およびインスリン発現の細胞内染色を示す散布図である。実験は正常酸素条件下で実施した。散布図は、インスリン発現、グルカゴン発現、ソマトスタチン発現、およびＣ−ペプチド発現の細胞内染色を示す。左側のプロットは、細胞の前方散乱および側方散乱、その次に採取後の生細胞についての染色を示す。第３のプロットのセットは、ｉＰＳＣ−１１３１細胞におけるＣ−ペプチド対グルカゴン染色、Ｃ−ペプチド対ソマトスタチン染色、およびインスリン対グルカゴン染色の二重染色プロファイルを示す。第４のプロットおよび第５のプロットは、インスリン、グルカゴン、Ｃ−ペプチド、およびソマトスタチンの発現レベルの総百分率を示す。
【００４０】
【図１２】図１２は、膵臓分化の２０日目の、１５日経過ＥＰＣ集合体の予備ｑＰＣＲ分析を示すグラフである。実験は正常酸素条件下で実施した。
【００４１】
【図１３】図１３は、膵臓分化に２５日間供した１５日経過ＥＰＣ集合体のグルコース刺激によるＣ−ペプチド放出を示すグラフである。放出されたＣ−ペプチドを細胞１００，０００個に対して正規化した。陽性対照死体ヒト島：低グルコースで放出されたＣ−ペプチド１４６ｐｍｏｌおよび高グルコースで放出されたＣ−ペプチド２５７ｐｍｏｌ。
【００４２】
【図１４】図１４は、膵臓分化プロセスの略図である。
【００４３】
【図１５】図１５は、膵臓分化プロセスの異なる段階の一般的な概要である。列は、上から下に、段階、プロセスの間のその段階が起こる日数、その段階の間の分化プロセスに使用される因子、作製される細胞型、および作製される細胞型のマーカーを示す。
【００４４】
【図１６】図１６Ａ〜Ｄは、未分化ｉＰＳＣからの胚体内胚葉（ＤＥ）の生成に対する播種密度の影響を示すグラフである。ＤＥ生成をＣＨＩＲの不在下および２．５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４の存在下で実施した。図１６Ａ、各時点における総生存細胞収量。図１６Ｂ、各時点におけるＤＥ細胞の絶対数／総細胞数の比として決定したＤＥ生成の効率。図１６Ｃ、細胞内フローサイトメトリーによって数量化した、各時点におけるＦｏｘＡ１−Ｓｏｘ１７発現細胞の百分率。図１６Ｄ、表面染色によって数量化した、各時点におけるＣＸＣＲ４−ＣＤ１１７発現細胞の百分率。
【００４５】
【図１７】図１７は、低酸素条件によりＤＥ生成が改善されることを示すグラフである。ＣＸＣＲ４−ＣＤ１１７同時発現細胞の百分率を細胞表面染色によって、フローサイトメトリーによって決定した。ＦｏｘＡ１−ＦｏｘＡ２−Ｓｏｘ１７の百分率を、細胞内フローサイトメトリーを使用して数量化した。
【００４６】
【図１８−１】図１８Ａ〜Ｅは、ＭａｔｒｉｇｅｌによりＥＰＣが保存されるが、ＭＥＦは必須ではないことを示すグラフである。図１８Ａ、Ｍａｔｒｉｇｅｌを用いてまたは用いずに培養したＥＰＣ培養物由来の細胞上のＤＥマーカー（すなわち、ＣＸＣＲ４、ＣＤ１１７、ＦｏｘＡ２、およびＦｏｘＡ１）の百分率をフローサイトメトリーによって数量化した。効率を生存ＤＥ発現細胞の絶対数／総生存細胞数の比として決定した。図１８Ｂ、ＭＥＦを用いてまたは用いずに培養した２．０３８クローン８７７７についての生存細胞数。図１８Ｃ、ＭＥＦを用いてまたは用いずに培養した２．０３８クローン８７７７についてのＥＰＣの純度。図１８Ｄ、ＭＥＦを用いてまたは用いずに培養した２．０３８クローン８７７６についての生存細胞数。図１８Ｅ、ＭＥＦを用いてまたは用いずに培養した２．０３８クローン８７７６についてのＥＰＣの純度。
【図１８−２】図１８Ａ〜Ｅは、ＭａｔｒｉｇｅｌによりＥＰＣが保存されるが、ＭＥＦは必須ではないことを示すグラフである。図１８Ａ、Ｍａｔｒｉｇｅｌを用いてまたは用いずに培養したＥＰＣ培養物由来の細胞上のＤＥマーカー（すなわち、ＣＸＣＲ４、ＣＤ１１７、ＦｏｘＡ２、およびＦｏｘＡ１）の百分率をフローサイトメトリーによって数量化した。効率を生存ＤＥ発現細胞の絶対数／総生存細胞数の比として決定した。図１８Ｂ、ＭＥＦを用いてまたは用いずに培養した２．０３８クローン８７７７についての生存細胞数。図１８Ｃ、ＭＥＦを用いてまたは用いずに培養した２．０３８クローン８７７７についてのＥＰＣの純度。図１８Ｄ、ＭＥＦを用いてまたは用いずに培養した２．０３８クローン８７７６についての生存細胞数。図１８Ｅ、ＭＥＦを用いてまたは用いずに培養した２．０３８クローン８７７６についてのＥＰＣの純度。
【００４７】
【図１９Ａ】図１９Ａ〜Ｂは、定義済みのフィーダーフリー低酸素条件下での種々のｉＰＳＣクローンのＥＰＣサイクリングを示すグラフである。図１９Ａ、フィーダーフリーサイクリングの間のＥＰＣの増殖。図１９Ｂ、サイクリングの間の平均ＥＰＣ純度。各時点で、ＥＰＣ培養物の純度をフローサイトメトリーによって決定した。ＣＸＣＲ４／ＣＤ１１７／ＦｏｘＡ１／ＦｏｘＡ２／Ｓｏｘ１７の平均発現を数量化した。同じｉＰＳＣクローンの種々の実験の実行からのＥＰＣの純度を平均し、標準誤差を算出した。
【図１９Ｂ】図１９Ａ〜Ｂは、定義済みのフィーダーフリー低酸素条件下での種々のｉＰＳＣクローンのＥＰＣサイクリングを示すグラフである。図１９Ａ、フィーダーフリーサイクリングの間のＥＰＣの増殖。図１９Ｂ、サイクリングの間の平均ＥＰＣ純度。各時点で、ＥＰＣ培養物の純度をフローサイトメトリーによって決定した。ＣＸＣＲ４／ＣＤ１１７／ＦｏｘＡ１／ＦｏｘＡ２／Ｓｏｘ１７の平均発現を数量化した。同じｉＰＳＣクローンの種々の実験の実行からのＥＰＣの純度を平均し、標準誤差を算出した。
【００４８】
【図２０】図２０Ａ〜Ｅは、定義済みのフィーダーフリー低酸素条件下でのＥＰＣ培養物のｑＰＣＲ分析を示すグラフである。図２０Ａ、ＣＸＣＲ４遺伝子発現。図２０Ｂ、ＣＤ１１７遺伝子発現。図２０Ｃ、Ｓｏｘ１７遺伝子発現。図２０Ｄ、ＦｏｘＡ２遺伝子発現。図２０Ｅ、ＦｏｘＡ１遺伝子発現。
【００４９】
【図２１】図２１は、ＣＤ３４の発現を示すグラフである。ＣＤ３４はＥＰＣの後期マーカーである。ＣＤ３４の発現を、細胞表面染色を使用してフローサイトメトリーによって数量化した。
【００５０】
【図２２】図２２は、最終段階のＥＰＣ培養物の精製を示す図である。個別化した細胞を、ＣＤ３４、ＣＤ１１７、およびＣＸＣＲ４に対する、フィコエリトリン（ＰＥ）とコンジュゲートした抗体と一緒にインキュベートした後、ＭＡＣＳによって分離し、それにより、陽性画分が約８８％の純度で得られる。
【００５１】
【図２３】図２３は、ＭＥＦを用いずに３Ｄ集合体として繁殖させたＥＰＣからベータ細胞を生成するためのスキームである。
【００５２】
【図２４】図２４Ａ〜Ｂは、ベータ細胞を３Ｄ集合体として生成することについてのグラフである。２．０３８ＡＴ４細胞に由来する、２８日目の最終段階のベータ細胞のフローサイトメトリー分析。細胞を採取し、４％パラホルムアルデヒドを使用して固定し、０．１％サポニンを使用して透過処理し、ＰＤＸ、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｎｋｘ６．１、ソマトスタチン、グルカゴン、およびＣ−ペプチドの存在についてフローサイトメトリーによって染色した。陽性細胞の百分率が図２４Ａに示されている。ソマトスタチン／Ｃ−ペプチドおよびグルカゴン／Ｃ−ペプチドの染色後に生成したドットプロットが図２４Ｂに示されている。
【００５３】
【図２５】図２５は、２Ｄで繁殖させたＥＰＣからベータ細胞を生成するためのスキームである。
【００５４】
【図２６Ａ】図２６Ａ〜Ｂは、２．０３８細胞から生成した最終段階のベータ細胞のグルコース応答性を示すグラフである。図２６Ａ、分化の１５日目に採取したベータ細胞を、ＰＤＸ／ＮｅｕｒｏＤ１／Ｃ−ペプチド／グルカゴン／ソマトスタチンの発現について細胞内フローサイトメトリーによって数量化した。図２６Ｂ、非正規化Ｃ−ペプチド放出アッセイおよび正規化Ｃ−ペプチド放出アッセイ。データを総生存細胞数に対して正規化した。
【図２６Ｂ】図２６Ａ〜Ｂは、２．０３８細胞から生成した最終段階のベータ細胞のグルコース応答性を示すグラフである。図２６Ａ、分化の１５日目に採取したベータ細胞を、ＰＤＸ／ＮｅｕｒｏＤ１／Ｃ−ペプチド／グルカゴン／ソマトスタチンの発現について細胞内フローサイトメトリーによって数量化した。図２６Ｂ、非正規化Ｃ−ペプチド放出アッセイおよび正規化Ｃ−ペプチド放出アッセイ。データを総生存細胞数に対して正規化した。
【００５５】
【図２７】図２７Ａ〜Ｌは、２．０３８  ＡＴ４細胞から生成した最終段階のベータ細胞のグルコース応答性を示すグラフである。ベータ細胞分化プロセスの異なる段階においてＤｏｘを添加した。Ｄｏｘ（１．５μｇ／ｍｌ）誘導をベータ細胞分化の６日目から１５日目の間、ベータ細胞分化の８日目から１５日目の間、またはベータ細胞分化の１０日目から１５日目の間に実施した。ＰＤＸ／ＮｅｕｒｏＤ１／Ｃ−ペプチド／グルカゴン／ソマトスタチンを細胞内フローサイトメトリーによって数量化するために、ベータ細胞分化の１５日目に細胞を採取し、固定し、染色した。１５日目における新生ベータ細胞の分析により、ＰＤＸ（図２７Ａ〜Ｄ）、ＮｅｕｒｏＤ１（図２７Ｅ〜Ｈ）、およびソマトスタチン／グルカゴン（Glucagaon）／Ｃ−ペプチドの存在が明らかになった（図２７Ｉ〜Ｌ）。
【００５６】
【図２８】図２８は、２．０３８  ＡＴ４細胞から生成した最終段階のベータ細胞のグルコース応答性を示すグラフである。ベータ細胞分化プロセスの異なる段階においてＤｏｘを添加した。正規化Ｃ−ペプチド放出アッセイおよび非正規化Ｃ−ペプチド放出アッセイの結果が示されている。正規化は、各試料について取得した総生存細胞数に基づくものであった。
【００５７】
【図２９】図２９Ａ〜Ｄは、２．０３８  ＡＴ４細胞から生成した最終段階のベータ細胞のグルコース応答性を示すグラフである。ベータ細胞分化プロセスの異なる段階においてＤｏｘを添加した。ＰＤＸ／ＮｅｕｒｏＤ１／Ｃ−ペプチド／グルカゴン／ソマトスタチンを細胞内フローサイトメトリーによって数量化するために、ベータ細胞分化の１５日目に細胞を採取した。最終段階のベータ細胞の培養物を長期分析するために、ベータ細胞を最終段階の培地に入れた。最大４週間の培養で培養物に単一ホルモン性細胞が存在することが明らかになった。
【００５８】
【図３０】図３０Ａ〜Ｄは、２．０３８  ＡＴ４細胞から生成した最終段階のベータ細胞のグルコース応答性を示すグラフである。ベータ細胞分化プロセスの異なる段階においてＤｏｘを添加した。図３０Ａ、Ｄｏｘ誘導を伴わない非正規化Ｃ−ペプチド放出アッセイ。図３０Ｂ、Ｄｏｘ誘導を伴わない正規化Ｃ−ペプチド放出アッセイ。図３０Ｃ、Ｄｏｘ誘導を伴う非正規化Ｃ−ペプチド放出アッセイ。図３０Ｄ、Ｄｏｘ誘導を伴う正規化Ｃ−ペプチド放出アッセイ。正規化は、各試料について取得した総生存細胞数に基づくものであった。
【００５９】
【図３１】図３１Ａ〜Ｇは、２．０３８  ＡＴ４細胞から生成した最終段階のベータ細胞のｑＰＣＲ分析を示すグラフである。ベータ細胞分化プロセスの異なる段階においてＤｏｘを添加した。図３１Ａ、インスリン遺伝子発現。図３１Ｂ、グルカゴン遺伝子発現。図３１Ｃ、ソマトスタチン遺伝子発現。図３１Ｄ、ＰＤＸ１遺伝子発現。図３１Ｅ、ＮｅｕｒｏＤ１遺伝子発現。図３１Ｆ、Ｎｋｘ６．１遺伝子発現。図３１Ｇ、ニューロゲニン３遺伝子発現。
【００６０】
【図３２】図３２Ａ〜Ｂは、２．０３８親細胞および２．０３８ＡＴ４細胞由来のｉＰＳＣ／ＤＥ／ＥＰＣ／ベータ細胞のＥＲＧ発現およびＧＦＩ発現についてのｑＰＣＲ分析。図３２Ａ、ＥＲＧ遺伝子発現。図３２Ｂ、ＧＦＩ１遺伝子発現。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、体内のあらゆる細胞型に分化する潜在性と共に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて増大することが可能であるので、基礎生物学および多種多様な疾患に対する細胞に基づく療法のどちらに対しても極めて大きな潜在性をもたらすものである。ＥＳ／ｉＰＳ細胞の分化は、胚形成の間に起こる発生のプロセスを模倣すると思われる。これらの幹細胞集団は、成熟細胞型が生成されるまで、潜在性が連続的に制限されながら発生の中間体に降りていく。最初に、一次胚葉、中胚葉、内胚葉および外胚葉が形成され、次いで、それらがさらに成熟して派生細胞型になる。幹細胞補充療法のために特に魅力的な内胚葉由来の組織型の１つは、Ｉ型糖尿病を治療するための膵島のベータ細胞である。現在、移植の場に使用するための島が決定的に不足している。移植用の成熟した機能性組織型を生成する能力は、現在、多能性幹細胞を、発生の全ての段階を経て分化させる必要性があることによって限定されている。
【００６２】
本明細書では、フィーダーフリー条件下で維持した人工多能性幹細胞に由来する内胚葉前駆細胞（ＥＰＣ）を作製するための方法が提供される。この方法によって引き出されたＥＰ細胞は、単一ホルモン性ベータ細胞を生成することができるものである。プロセスの略図が図１４に示されている。プロセスの段階が図１５に示されている。
【００６３】
胚体内胚葉（ＤＥ）は、一過性の状態であり、直ちに分化し、増殖することができず、独特の形態を有さず、また、内胚葉の運命に十分に委ねられない場合がある。他方では、内胚葉前駆体（ＥＰ）細胞（またはＥＰＣ）は一過性のものではなく、独特の形態を有し、無制限に培養することができる（Chengら、２０１３年）。内胚葉前駆細胞は、ＣＸＣＲ４、ＣＤ１１７、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＣＤ３１、ＣＤ３４、およびＳＯＸ１７を発現するとも特徴付けられる。内胚葉前駆細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれにおいても、肝臓、膵臓、および腸などの内胚葉系列の細胞を生成することができるが、中胚葉または外胚葉を生成することはできない。同様に、免疫欠損マウスにおいてＥＰ細胞からは奇形腫が形成されない。したがって、ＤＥ細胞およびＥＰ細胞は、別個の発生の中間体を示し得、また、異なる発生潜在性を有し得る。
【００６４】
ｉＰＳＣ由来のＥＰ細胞は、ＣＸＣＲ−４、ＣＤ１１７、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＣＤ３４、ＣＤ３１、およびＨＮＦ４Ａを発現し、また、浮遊培養で５〜４０日間維持することができる。ＥＰは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ２、アクチビン、および任意選択でＴＧＦβの存在下、撹拌条件または静置条件で３Ｄ集合体として増大し、マーカーの表現型発現を維持する。ＥＰ培養物は、膵臓系列の細胞を生成するための培養条件に置くと、Ｄ−グルコースを用いた刺激に対して機能的に反応する単一ホルモン性（ｍｏｎｏ−ｈｏｒｍｏｎａｌ）ベータ細胞を生成する。
【００６５】
要約すると、無血清培地中で維持したヒトｉＰＳＣからＥＰ細胞を効率的に生成するための培養手順が提供される。ＥＰ細胞はそれらの表現型特性を保持し、少なくとも３０日にわたって３Ｄ培養物として増大する。膵臓分化培地に入れたＥＰ細胞は単一ホルモン性（ｍｏｎｏ−ｈｏｒｍｏｎａｌ）ベータ細胞を生成する。これらの細胞は、ハイスループットなスクリーニング適用のための理想的な細胞型としての機能を果たし、また、治療への適用における使用の潜在性を保持する。
【００６６】
定義
「分化」とは、培養物中またはｉｎ  ｖｉｖｏで、特殊化の程度がより低い細胞が特殊化の程度がより高い細胞になって、分化を伴わない同じ条件下で有するものと比べて少なくとも１つの新しい細胞型の後代を形成するプロセスである。「脱分化」とは、部分的に分化したまたは最終分化した細胞が、多能性または多分化能などの以前の発生段階に戻る細胞のプロセスである。「分化転換」とは、１つの分化細胞型が別の分化細胞型に変換されるプロセスである。ある特定の条件下では、新しい細胞型の特性を有する後代の割合は、優先度が増す順番に、少なくとも約１％、５％、２５％またはそれ超であり得る。
【００６７】
「多分化能」とは、細胞が、その後代まで、成体動物において見いだされるいくつかの異なる細胞型を生じさせることができることを意味する。
【００６８】
「多能性」とは、細胞が、その後代まで、生殖細胞を含めた、成体動物を構成する全ての細胞型を生じさせることができることを意味する。胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、および胚性生殖細胞は、この定義の下で多能性細胞である。
【００６９】
「自己細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、レシピエントと遺伝的に適合するドナー細胞を指す。
【００７０】
「全能性」という用語は、本明細書で使用される場合、生きて生まれた動物を生じる細胞を指し得る。「全能性の」という用語は、特定の動物の細胞の全てを生じる細胞も指し得る。全能性細胞は、１つまたは複数の核移植ステップで胚を発生させるための手順において利用した場合、動物の細胞の全てを生じさせることができる。
【００７１】
全能性細胞は、臓器摘出のために有用なもの、例えば、ホメオティック遺伝子を操作することによって臓器または付属器の成長が排除されるように遺伝子改変されたものなどの不完全な動物を生成するためにも使用することができる。さらに、ＥＳ細胞に由来するものなどの卵母細胞を子宮内で発達できなくする遺伝子改変により、ヒト由来のＥＳ細胞を生殖用のヒト卵母細胞を引き出すためには使用できず、治療的クローニングなどの適用のためにのみ使用できることが確実になる。
【００７２】
「胚性幹細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物中で維持されている胚から単離した多能性細胞を指し得る。そのような細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生殖細胞を含めた成体動物を構成する全ての細胞型を生じさせる能力を培養物中で保持する培養胚から単離された、急速に分裂している培養細胞である。胚性幹細胞は、フィーダー細胞を用いてまたは用いずに培養することができる。胚性幹細胞は、胚盤胞段階の胚および前駆胚盤胞段階の胚を含めた、任意の発生段階にある胚から単離された胚細胞から樹立することができる。胚性幹細胞は、円形細胞の形態を有し得、フィーダー層上で円形細胞集合塊に成長し得る。胚性幹細胞は当業者には周知である。例えば、ＷＯ９７／３７００９；Yang  &  Anderson（１９９２年）；Piedrahitaら（１９９８年）；Wiannyら（１９９７年）；Moore  &  Piedrahita（１９９７年）；Moore  &  Piedrahita（１９９６年）；Wheeler（１９９４年）；Hochereau-de  Reviers  &  Perreau（１９９３年）；Strojekら（１９９０年）；Piedrahitaら（１９９０年）；およびEvansら（１９９０年）を参照されたい。
【００７３】
「再プログラミング（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）」または「再プログラミングされた（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ）」という用語は、本明細書で使用される場合、特殊化の程度がより高い細胞を多能性細胞に変換することができる材料および方法を指し得る。
【００７４】
「単離された」という用語は、本明細書で使用される場合、別の細胞の群から機械的に分離された細胞を指し得る。細胞の群の例は、発達中の細胞塊、細胞培養物、細胞株、および動物である。
【００７５】
「分化細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、特殊化されていない表現型から特殊化された表現型に発達した前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）を指し得る。例えば、胚細胞は、腸の内側の上皮細胞に分化し得る。分化細胞は、例えば、胎児または生きて生まれた動物から単離することができる。
【００７６】
「未分化細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、特殊化されていない表現型を有し、分化することができる前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）を指し得る。未分化細胞の例は幹細胞である。
ＩＩ．内胚葉前駆細胞形成に関与する細胞
【００７７】
本発明のある特定の実施形態では、多能性細胞から内胚葉前駆細胞をもたらすための方法および組成物が開示されている。一部の実施形態では、細胞は、これだけに限定されないが、胚性幹細胞、胎児幹細胞、成体幹細胞、または人工多能性幹細胞を含めた幹細胞であってよい。
【００７８】
Ａ．幹細胞
幹細胞は、全てではないにしても大抵の多細胞生物体において見いだされる細胞である。幹細胞は、有糸細胞分裂によって自己再生する能力および多様な範囲の特殊化した細胞型に分化する能力を特徴とする。哺乳動物の幹細胞の２つの広範な型は、胚盤胞において見いだされる胚性幹細胞および成体組織において見いだされる成体幹細胞である。発生中の胚では、幹細胞は、特殊化された胚組織の全てに分化し得る。成体生物体では、幹細胞および前駆細胞は、特殊化した細胞を補充する体の修復系としての機能を果たし、また、血液、皮膚、または腸組織などの再生臓器の正常なターンオーバーを維持する。
【００７９】
ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける長期間増殖が可能であるが、内胚葉前駆細胞および膵島ベータ細胞を含めた、体の全ての細胞型に分化する潜在性を保持する。内胚葉前駆細胞により、薬物の開発および治療的使用の両方のための、患者に特異的な機能性膵島ベータ細胞の無制限の供給が潜在的にもたらされる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるヒトＥＳＣ／ｉＰＳＣから内胚葉前駆細胞を経た膵島ベータ細胞への分化により、正常なｉｎ  ｖｉｖｏ発生が再現される、すなわち、ヒトＥＳＣ／ｉＰＳＣは、内胚葉分化および内分泌特定化を含めた正常な逐次的な発生段階を経る。その逐次的な発生プロセスには、分化の異なる段階において異なる増殖因子を添加する必要がある。本発明のある特定の態様は、ヒトＥＳＣ／ｉＰＳＣを分化させることにより、十分に機能的な膵島ベータ細胞を提供する。この手法により、ヒト一次成体ベータ細胞と同一ではないとしても高度に類似した機能を有する膵島ベータ細胞が生成される。さらに、無制限の増殖能を有する本発明の内胚葉前駆細胞には、ベータ細胞分化のための出発細胞集団としての独特の利点がある。
【００８０】
１．胚性幹細胞
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、胚盤胞またはそれよりも前の桑実胚段階の胚の内部細胞塊の胚盤葉上層組織に由来する多能性幹細胞である。ＥＳ細胞は、２つの示差的な性質：多能性および無制限に自己再生する能力によって区別される。ＥＳ細胞は多能性である、すなわち、３つの一次胚葉：外胚葉、内胚葉、および中胚葉の全ての派生体に分化することができる。さらに、定義済みの条件下で、胚性幹細胞は、それら自体で無制限に繁殖することができる。これにより、継続的な研究または臨床使用のためにそれら自体を無限数産生することができるので、胚性幹細胞を研究および再生医療の両方のための有用なツールとして使用することが可能になる。ＥＳ細胞は、特定の細胞型のための十分かつ必要な刺激を与えられると、成体の２００超の細胞型のそれぞれに発達し得る。しかし、ＥＳ細胞は、胚体外膜または胎盤には寄与しない。
【００８１】
現在まで、ほぼ全ての研究はマウス胚性幹細胞（ｍＥＳ）またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）を使用して行われてきた。どちらも必須の幹細胞特性を有するが、未分化の状態を維持するために全く異なる環境を必要とする。マウスＥＳ細胞は、ゼラチンの層上で増殖させることができ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）の存在が必要である。ヒトＥＳ細胞は、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）のフィーダー層上で増殖させることができ、多くの場合、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２）の存在が必要である。最適な培養条件または遺伝子操作（Chambersら、２００３年）がないと、胚性幹細胞は急速に分化する。
【００８２】
ヒト胚性幹細胞は、いくつかの転写因子および細胞表面タンパク質が存在することによって定義することもできる。転写因子Ｏｃｔ−４、ナノグ、およびＳｏｘ−２は、分化および多能性の維持を導く遺伝子の抑制を確実にするコア調節ネットワークを形成する（Boyerら、２００５年）。ｈＥＳ細胞を同定するために最も一般的に使用される細胞表面抗原としては、糖脂質ＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４、ならびにケラタン硫酸抗原Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１が挙げられる。
【００８３】
マウスＥＳ細胞を得るための方法は周知である。１つの方法では、マウスの１２９系統由来の着床前胚盤胞をマウス抗血清で処理して栄養外胚葉を除去し、内部細胞塊を、ウシ胎仔血清を含有する培地中、化学的に不活性化したマウス胚線維芽細胞のフィーダー細胞層上で培養する。発達させる未分化ＥＳ細胞のコロニーをマウス胚線維芽細胞フィーダー層上、ウシ胎仔血清の存在下で継代培養してＥＳ細胞の集団を作製する。一部の方法では、血清を含有する培養培地にサイトカイン白血病抑制因子（ＬＩＦ）を添加することにより、マウスＥＳ細胞をフィーダー層の不在下で増殖させることができる（Smith、２０００年）。他の方法では、骨形成タンパク質およびＬＩＦの存在下で、マウスＥＳ細胞を無血清培地中で増殖させることができる（Yingら、２００３年）。
【００８４】
ヒトＥＳ細胞は、以前に記載された方法を使用して胚盤胞から得ることができる（Thomsonら、１９９５年；Thomsonら、１９９８年；ThomsonおよびMarshall、１９９８年；Reubinoffら、２０００年）。１つの方法では、５日目のヒト胚盤胞をウサギ抗ヒト脾臓細胞抗血清に曝露し、次いで、モルモット補体の１：５希釈物に曝露して、栄養外胚葉細胞を溶解させる。溶解した栄養外胚葉細胞をインタクトな内部細胞塊から除去した後、内部細胞塊を、ガンマ不活性化したマウス胚線維芽細胞のフィーダー層上、ウシ胎児血清の存在下で培養する。９〜１５日後、内部細胞塊に由来する細胞の集合塊を化学的に（すなわち、トリプシンに曝露する）または機械的に解離させ、ウシ胎児血清およびマウス胚線維芽細胞のフィーダー層を含有する新鮮な培地に再プレーティングする。さらに増殖させたら、未分化の形態を有するコロニーをマイクロピペットによって選択し、機械的に解離させて集合塊にし、再プレーティングする（米国特許第６，８３３，２６９号を参照されたい）。ＥＳ様形態は、見たところでは細胞質に対する核の比率が高い緻密なコロニーおよび顕著な核小体と特徴付けられる。生じたＥＳ細胞は、簡単なトリプシン処理によって、または個々のコロニーをマイクロピペットにより選択することによって常套的に継代することができる。一部の方法では、線維芽細胞のフィーダー層上、塩基性線維芽細胞増殖因子の存在下でＥＳ細胞を培養することによって、血清を用いずにヒトＥＳ細胞を増殖させることができる（Amitら、２０００年）。他の方法では、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）またはラミニンなどのタンパク質マトリックス上、塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する「馴化」培地の存在下で細胞を培養することによって、フィーダー細胞層を用いずにヒトＥＳ細胞を増殖させることができる（Xuら、２００１年）。培地を線維芽細胞と共培養することによって予め馴化する。
【００８５】
アカゲザルおよびコモンマーモセットのＥＳ細胞を単離するための方法も公知である（ThomsonおよびMarshall、１９９８年；Thomsonら、１９９５年；ThomsonおよびOdorico、２０００年）。
【００８６】
ＥＳ細胞の別の供給源は、樹立ＥＳ細胞株である。種々のマウス細胞株およびヒトＥＳ細胞株が公知であり、それらの増殖および繁殖の条件が定義されている。例えば、マウス１２９系統の胚の内部細胞塊からマウスＣＧＲ８細胞株が樹立されており、ＣＧＲ８細胞の培養物を、ＬＩＦの存在下で、フィーダー層を用いずに増殖させることができる。別の例として、ヒトＥＳ細胞株Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、およびＨ１４がThompsonら（１９９５年）によって樹立された。さらに、Ｈ９株のサブクローンＨ９．１およびＨ９．２が開発されてきた。事実上、例えば、参照により本明細書に組み込まれるYuおよびThompson（２００８年）に記載されているものなどの当技術分野で公知のあらゆるＥＳ細胞株または幹細胞株を本発明と共に使用することができることが予測される。
【００８７】
本発明と関連して使用するためのＥＳ細胞の供給源は、胚盤胞、胚盤胞の内部細胞塊の培養に由来する細胞、または樹立細胞系の培養物から得た細胞であってよい。したがって、本明細書で使用される場合、「ＥＳ細胞」という用語は、胚盤胞の内部細胞塊細胞、内部細胞塊から得たＥＳ細胞、およびＥＳ細胞株の培養物から得たＥＳ細胞を指し得る。
【００８８】
２．人工多能性幹細胞
人工多能性幹細胞は、一般にｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと省略され、非多能性細胞、一般には成体体細胞から人工的に引き出された多能性幹細胞の一種である。人工多能性幹細胞は、胚性幹細胞などの天然の多能性幹細胞と、同一ではないとしても、多くの点で、例えば、ある特定の幹細胞遺伝子およびタンパク質の発現、クロマチンメチル化パターン、倍加時間、胚葉体形成、奇形腫形成、生存可能なキメラの形成、ならびに潜在能および分化可能性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｂｉｌｉｔｙ）に関してなどで類似していると考えられているが、天然の多能性幹細胞とのそれらの完全な関連性はまだ評価中である。
【００８９】
ｉＰＳ細胞は、分化した体細胞の再プログラミングによって得られる。胚および胚組織の実験的使用に関する倫理的懸念を緩和するために、胚起源以外のヒト組織に由来する人工多能性細胞の生成が望まれる。人工多能性細胞の治療への適用の見込みが盛んに宣伝されている。医学的適用としては、２、３挙げると、アルツハイマー病、糖尿病および脊髄傷害の治療がある。他の適用としては、疾患モデリングおよび医薬品スクリーニングが挙げられる。
【００９０】
人工多能性幹細胞は種々の方法によって得られている。ヒト胎児または新生児線維芽細胞に、レンチウイルスによる形質導入を使用して４種の遺伝子、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ナノグおよびＬｉｎ２８をトランスフェクトする（Yuら、２００７年）。感染の１２〜２０日後に、ヒトＥＳ細胞の形態を有するコロニーが目に見えるようになる。コロニーを選び取り、増大させる。コロニーを構成する人工多能性幹細胞はヒトＥＳ細胞と形態学的に類似しており、種々のヒトＥＳ細胞マーカーを発現し、マウスに注射すると神経組織、軟骨、および腸上皮を有する奇形腫を形成する。
【００９１】
別の方法では、成体ヒト皮膚線維芽細胞に、レトロウイルスによる形質導入を使用して転写因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４をトランスフェクトする（Takahashiら、２００７年）。トランスフェクトされた細胞を、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を補充した培地中、ＳＮＬフィーダー細胞（ＬＩＦを産生するマウス細胞線維芽細胞株）上にプレーティングする。およそ２５日後に、ヒトＥＳ細胞コロニーに似ているコロニーが培養物中に出現する。ＥＳ細胞様コロニーを選び取り、ｂＦＧＦの存在下、フィーダー細胞上で増大させる。
【００９２】
ｉＰＳ細胞は、２００６年に最初にマウス細胞から作製され（Takahashiら、２００６年）、２００７年にヒト細胞から作製された（Takahashiら、２００７年；Yuら、２００７年）。これは、研究者が、研究において重要であり治療的使用を潜在的に有する多能性幹細胞を、議論の的になる胚の使用を伴わずに得ることが可能になり得るので、幹細胞研究における重要な前進として言及された。マウスまたはヒト組織から人工多能性細胞（ｉＰＳ細胞）を生成することの最初の上首尾の実証は、転写因子の特異的なセットを発現するレトロウイルスベクターの使用を伴うものであった。Ｊａｍｅｓ  ＴｈｏｍｓｏｎおよびＳｈｉｎｙａ  Ｙａｍａｎａｋａの研究室における研究により、レトロウイルスベクターによるマウスまたはヒト線維芽細胞への特異的な転写因子の導入が、それらの細胞を再プログラミングして未分化の多能性幹細胞にするために十分であることが実証された。Ｔｈｏｍｓｏｎにより使用された因子にはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ナノグおよびＬｉｎ２８が含まれる。Ｙａｍａｎａｋａにより使用された因子にはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃが含まれる。いずれの遺伝子セットによる再プログラミングも、後で再プログラミングされた細胞から消失させ、傷跡のないｉＰＳ細胞をもたらすことができる、宿主細胞のゲノムへの組み込みおよび転写因子の発現またはエピソームプラスミドからの発現によって実現される。
【００９３】
細胞特性に基づいて、ＥＳ細胞様コロニーの細胞は人工多能性幹細胞である。人工多能性幹細胞は、ヒトＥＳ細胞と形態学的に類似しており、種々のヒトＥＳ細胞マーカーを発現する。また、ヒトＥＳ細胞の分化がもたらされることが公知の条件下で増殖させると、人工多能性幹細胞は適宜分化する。例えば、人工多能性幹細胞は、内胚葉前駆細胞または膵島ベータ細胞の構造およびマーカーを有する細胞に分化し得る。事実上、例えばYuおよびThompson、２００８年に記載されているものを含めた、あらゆるｉＰＳ細胞または細胞株を本発明と共に使用することができることが予測される。
【００９４】
マウスから人工多能性幹細胞を調製する方法も公知である（TakahashiおよびYamanaka、２００６年）。ｉＰＳ細胞の誘導には、一般には、Ｓｏｘファミリーの少なくとも１種のメンバーおよびＯｃｔファミリーの少なくとも１種のメンバーの発現またはそれへの曝露が必要である。ＳｏｘおよびＯｃｔは、ＥＳ細胞の同一性を特定化する転写調節性階層の中核をなすと考えられている。例えば、Ｓｏｘは、Ｓｏｘ−１、Ｓｏｘ−２、Ｓｏｘ−３、Ｓｏｘ−１５、またはＳｏｘ−１８であってよく、ＯｃｔはＯｃｔ−４であってよい。ナノグ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４、またはｃ−Ｍｙｃのような追加的な因子により再プログラミング効率が増大し得、再プログラミング因子の特異的なセットは、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、ナノグ、および任意選択でＬｉｎ−２８を含むセットであってもよく、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ、および任意選択でｃ−Ｍｙｃを含むセットであってもよい。
【００９５】
ｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞と同様に、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４に対する抗体（Developmental  Studies  Hybridoma  Bank、National  Institute  of  Child  Health  and  Human  Development、Bethesda  Md）、およびＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１に対する抗体（Andrewsら、１９８７年）を使用した免疫組織化学的検査またはフローサイトメトリーによって同定または確認することができる特有の抗原を有する。ｉＰＳ細胞の多能性は、およそ０．５〜１０×１０６個の細胞を生後８〜１２週間の雄ＳＣＩＤマウスの後肢の筋肉に注射することによって確認することができる。３つの胚葉のそれぞれの少なくとも１つの細胞型が実証される奇形腫が発生する。
【００９６】
本発明のある特定の態様では、上記の通りおよびＷＯ２００９／１４９２３３に記載の通り、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２などのＯｃｔファミリーメンバーおよびＳｏｘファミリーメンバーを含む再プログラミング因子をＫｌｆおよび／またはナノグと組み合わせて使用して体細胞を再プログラミングすることよってｉＰＳ細胞を作製する。再プログラミング用の体細胞は、線維芽細胞、ケラチノサイト、造血細胞、間葉細胞、肝臓細胞、胃細胞、またはβ細胞などの、誘導して多能性にすることができる任意の体細胞であってよい。ある特定の態様では、Ｔ細胞も再プログラミング用の体細胞の供給源として使用することができる（参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１０／１４１８０１を参照されたい）。
【００９７】
再プログラミング因子は、組み込みベクターまたはエピソームベクター、例えば、ＥＢＶエレメントに基づく系などの１つまたは複数のベクターに含まれる発現カセットから発現させることができる（参照により本明細書に組み込まれるＵＷＯ２００９／１４９２３３；Yuら、２００９年を参照されたい）。別の態様では、再プログラミングタンパク質をタンパク質形質導入によって体細胞に直接導入することができる。
【００９８】
２．０３８  ＡＴ４細胞は、造血を誘導するように設計されたヒトｉＰＳＣである。２．０３８  ＡＴ４細胞は、誘導性遺伝子発現のためにｒｔＴＥＴタンパク質を構成的に発現するように工学的に操作されている。ｒｔＴＥＴの発現を可能にするために第３染色体上のヒトＲｏｓａ２６遺伝子座が選択された。ＬｏｘＰ組換え部位（ＬＯＸ７１およびＬＯＸ２２７２）をヒトＲＯＳＡ２６遺伝子の第１のイントロンに相同組換えによって導入した。ヒトＢＣＬ２遺伝子由来のスプライシングアクセプターシグナル（ＳＡ）をＬＯＸ７１部位の前に置いて、内在性ヒトＲＯＳＡ２６プロモーターからの選択マーカーの発現を可能にした。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｎｅｏ）を正の選択のために使用した。ＥＲＧ１およびＧＦＩ１のコード領域をＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンに基づく発現ベクターに、ｒｔＴＥＴ応答性誘導性プロモーターであるＴＥＴ誘導性プロモーター（Ｐｔｉｇｈｔ）の制御下でクローニングした。ＥＲＧ１およびＧＦＩ１は誘導性プロモーターＰｔｉｇｈｔの制御下にある。導入遺伝子の発現を誘導するために、細胞をドキシサイクリン（ＤＯＸ；０．２μｇ／ｍｌ）で処理する。正確に組み換えられた誘導性細胞はピューロマイシン（Ｐｕｒｏ＋）およびネオマイシン（Ｎｅｏ＋）に対して耐性である。
【００９９】
２．０３８  ＭＡＦＡ細胞は、転写因子ＭａＦＡを過剰発現するように設計されたヒトｉＰＳＣである。ネオマイシンと融合したＭａＦＡのコード領域を含有するプラスミドをｉＰＳＣに電気穿孔により導入した。ネオマイシン選択を使用して新生クローンを選択した。外因性ＭａＦＡは、ＭａＦａ＿Ｎｅｏｍｙｃｉｎベクターに存在するｒｔＴＥＴ応答性誘導性プロモーターであるＴＥＴ誘導性プロモーター（Ｐｔｉｇｈｔ）の制御下にある。導入遺伝子の発現を誘導するために、細胞をドキシサイクリン（ＤＯＸ；０．１〜１０μｇ／ｍｌ）で処理する。正確に組み換えられた誘導性細胞はネオマイシンに対して耐性である（Ｎｅｏ＋）。ポリクローナル集団をさらにサブクローニングして２．０３８Ｍａｆａ細胞を引き出した。
【０１００】
ＩＩＩ．内胚葉前駆体（ＥＰ）細胞特性
細胞は、いくつもの表現型の基準に従って特徴付けることができる。基準としては、これだけに限定されないが、発現した細胞マーカー、酵素活性の検出または定量化、および形態学的特徴および細胞間シグナル伝達の特徴付けが挙げられる。
【０１０１】
本発明のある特定の態様において具体化される内胚葉細胞は、天然の内胚葉細胞に特有の形態学的特徴を有する。この特徴はそのような物を評価する当業者により容易に理解され、２Ｄ培養物において増殖させた場合にはドーナツ様形態を含む。単一細胞に存在する１つまたは複数のそのような特徴は、内胚葉細胞系列のメンバーである細胞と一致する。細胞が内胚葉細胞に特有の形態的特徴を有するかどうかの偏りのない決定は、分化した後代細胞、成体または胎児内胚葉細胞、および線維芽細胞、またはＲＰＥ（網膜色素上皮）細胞などの１つまたは複数の陰性対照細胞の顕微鏡写真をコード化し、次いで、その顕微鏡写真を盲検式で評価し、コードを解読して、分化による内胚葉細胞が正確に同定されるかどうかを決定することによって行うことができる。
【０１０２】
胚体内胚葉は、一過性の状態であり、直ちに分化し、増殖することができず、独特の形態を有さず、また、内胚葉の運命に十分に委ねられない場合がある。他方では、内胚葉前駆体は一過性のものではなく、独特の形態を有し、無制限に培養することができる（Chengら、２０１３年）。内胚葉前駆細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれにおいても、肝臓、膵臓、および腸などの内胚葉系列の細胞を生成することができるが、中胚葉または外胚葉を生成することはできない。同様に、免疫欠損マウスにおいてＥＰ細胞からは奇形腫が形成されない。したがって、ＤＥ細胞およびＥＰ細胞は、独特の発生の中間体を示し得、また、異なる発生潜在性を有し得る。
【０１０３】
膵臓は、およそ手のサイズの臓器であり、胃の下部の後ろに位置する。膵臓は、形態学的かつ生理的に異なる２つの構造：消化に関与する酵素（アミラーゼ、リパーゼなど）および炭酸水素ナトリウムを産生する膵外分泌部、ならびに、血中グルコースの制御に関与するホルモン（インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、および膵臓ポリペプチド）を産生する膵内分泌部を含む。膵内分泌部の細胞は、島（ランゲルハンス島または膵島）の形態で膵臓内に分散する微小臓器として組織化されている。各膵島は、４種の細胞型：アルファ細胞、ベータ細胞、デルタ細胞およびＰＰ（ガンマ）細胞ならびにイプシロン細胞で構成される。ベータ細胞は、島の中央に見いだされ、グルコースに応答してインスリンを分泌することができる唯一の細胞である。
【０１０４】
本発明の細胞は、膵臓内胚葉の系列に特有の表現型マーカーを発現するかどうかに応じて特徴付けることもできる。内胚葉前駆細胞は、ＣＸＣＲ４、ＣＤ１１７、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＣＤ３１、ＣＤ３４、およびＳＯＸ１７を発現するとも特徴付けられる。膵島ベータ細胞の区別に有用な細胞マーカーの非限定的な例としては、ＰＤＸ−１、ニューロゲニン３、ｎｅｕｒｏＤ１、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、およびＣ−ペプチドが挙げられる。成熟膵島ベータ細胞マーカーとしては、これだけに限定されないが、ＰＤＸ１、Ｃ−ペプチド、およびインスリンが挙げられる。胎児膵臓の未成熟細胞と類似した未成熟膵島ベータ細胞は多ホルモン性であるが、成熟膵島ベータ細胞は単一ホルモン性であり、グルコース応答性である。
【０１０５】
本開示において列挙されている内胚葉前駆体タンパク質決定因子は、細胞表面マーカーについてのフロー免疫細胞化学、細胞内マーカーまたは細胞表面マーカーについての免疫組織化学的検査（例えば、固定した細胞または組織切片）、細胞抽出物のウエスタンブロット分析、および培地中に分泌される細胞抽出物または産物についての酵素結合イムノアッセイなどの任意の適切な免疫学的技法を使用して検出することができる。細胞による抗原の発現は、標準の免疫細胞化学またはフローサイトメトリーアッセイにおいて、任意選択で細胞を固定した後に、また、任意選択で、標識を増幅するために、標識された二次抗体または他のコンジュゲート（例えば、ビオチン−アビジンコンジュゲートなど）を使用して、有意に検出可能な量の抗体が抗原に結合する場合に、「抗体により検出可能」であると言える。
【０１０６】
特異的なマーカーの発現は、ノーザンブロット分析、ドットブロットハイブリダイゼーション分析によって、または標準の増幅方法において配列特異的なプライマーを使用するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってｍＲＮＡレベルで検出することもできる（米国特許第５，８４３，７８０号）。本開示において列挙されている特定のマーカーの配列データは、ＧｅｎＢａｎｋなどの公共のデータベースから入手することができる。ｍＲＮＡレベルでの発現は、細胞試料に対する、典型的な制御された実験における標準の手順に従ったアッセイの実行により、標準の時間ウィンドウ内で明白に識別可能なハイブリダイゼーションまたは増幅産物がもたらされる場合に、本開示に記載されているアッセイの１つに従って「検出可能」であると言える。別段の必要がなければ、対応するｍＲＮＡがＲＴ−ＰＣＲによって検出可能である場合に、特定のマーカーの発現が示される。タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルで検出される内胚葉前駆体またはベータ細胞特異的マーカーの発現は、そのレベルが未分化の多能性幹細胞、線維芽細胞、または他の無関係の細胞型などの対照細胞のレベルの少なくとも２倍、好ましくは１０倍超または５０倍超である場合に、陽性であるとみなされる。
【０１０７】
細胞は、膵島ベータ細胞系列の細胞に特有の酵素活性を示すかどうかに応じて特徴付けることもできる。例えば、グルコース刺激によるインスリン分泌（ＧＳＩＳ）アッセイにより、グルコース刺激への曝露に応答して放出されるＣ−ペプチドが測定される。このアッセイでは、各島バッチに対するグルコース刺激の指標がもたらされる。指標は、高グルコース濃度で放出されたインスリンと低グルコース濃度で放出されたインスリンの比である。
【０１０８】
別の態様では、分化によってもたらされるベータ細胞の生物学的機能を、例えば、グルコース刺激に応答して産生されるインスリンのレベル、および分化細胞を移植した際の糖尿病マウスモデルのｉｎ  ｖｉｖｏにおけるレスキューを決定することによって評価する。さらに別の態様では、ベータ細胞を、亜鉛含有量が高いことによって同定することができる（Shiroiら、２００２年）。
【０１０９】
内胚葉前駆細胞は、機能アッセイを使用して試験することができる。例えば、細胞をマウス胚の内胚葉区画内に移植して、当該細胞の、内在性内胚葉を同定し、それと相互作用する能力を試験することができる。
【０１１０】
細胞を同種の未分化細胞集団内で増殖させることができるのが内胚葉前駆細胞を培養することの利点であることは当業者には容易に理解されよう。そのように、下流の系列を生成するために内胚葉前駆細胞を使用することにより、より特殊化した細胞型の分化の効率が増大し得る。これにより、他の胚葉に由来するものなどの混入細胞型による望ましくない影響の潜在性も低下する。本発明のＥＰ細胞は、免疫染色および蛍光活性化定量化、または他の適切な技法によって決定して、０．１％未満（好ましくは１００ｐｐｍ未満または１０ｐｐｍ未満）が望ましくない細胞型のマーカーまたは他の特徴を担持する場合に、一部または全部の混入細胞型を基本的に含まないと特徴付けることができる。さらに、ＥＰ細胞は、間葉細胞または造血細胞を含まないまたは基本的に含まない可能性がある。
【０１１１】
本発明のある特定の態様に従って提供される細胞は、一次供給源から得た細胞のいくつもの特徴を有し得る。これらの特徴が特定の細胞に多く存在するほど、内胚葉前駆細胞系列の細胞であることをより強く特徴付けることができる。これらの特徴の少なくとも２つ、３つ、５つ、７つ、または９つを有する細胞がますます好ましい。培養容器または投与用の調製物中に存在し得る特定の細胞集団に関して、これらの特徴の発現が細胞間で均一であることが有利である場合が多い。この状況では、細胞の少なくとも約４０％、６０％、８０％、９０％、９５％、または９８％が所望の特徴を有する集団がますます好ましい。
【０１１２】
ＩＶ．内胚葉前駆体およびベータ細胞分化因子
本発明のある特定の態様は、内胚葉前駆体またはベータ細胞分化因子を提供する。本発明者らは、この節で列挙されている遺伝子のアイソフォームおよびバリアントの全てが本発明に含まれることも意図している。
【０１１３】
Ａ．細胞シグナル伝達阻害剤／アンタゴニスト
本発明のある特定の態様では、分化プロセスの少なくとも一部の間に、シグナル伝達カスケードに関与するシグナル伝達因子を阻害する１種または複数種のシグナル伝達阻害剤の存在下で細胞を維持することができる。これらの態様および実施形態では、所望の場合には同じシグナル伝達経路のシグナル伝達の構成成分を阻害する他のシグナル伝達阻害剤で置換してよいことが理解されよう。これは、上流刺激の阻害を含んでよい。同様に、所望の場合には、阻害剤を関連するシグナル伝達経路の他の阻害剤で置換することができる。
【０１１４】
そのようなシグナル伝達阻害剤、例えば、ＧＳＫ３阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤、ＢＭＰアンタゴニストは、少なくともまたは約０．０２μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、１５０μＭ、２００μＭ、５００〜約１０００μＭ、またはその中に導き出せる任意の範囲の有効濃度で使用することができる。
【０１１５】
キナーゼ阻害剤を同定するためのいくつものアッセイが公知である。例えば、Daviesら（２０００年）により、キナーゼをペプチド基質および放射標識したＡＴＰの存在下でインキュベートするキナーゼアッセイが記載されている。キナーゼによる基質のリン酸化により、標識が基質に組み入れられる。各反応の一定分量をホスホセルロース紙に固定化し、リン酸で洗浄して遊離のＡＴＰを除去する。次いで、インキュベート後の基質の活性を測定し、キナーゼ活性を示す。候補キナーゼ阻害剤の存在下、および不在下での相対的なキナーゼ活性を、そのようなアッセイを使用して容易に決定することができる。Downeyら（１９９６年）により、キナーゼ阻害剤を同定するために使用することができる、キナーゼ活性についてのアッセイも記載されている。
【０１１６】
１．グリコーゲンシンターゼキナーゼ３阻害剤
グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）は、特定の細胞基質内のある特定のセリンおよびトレオニンアミノ酸へのリン酸分子の付加を媒介するセリン／トレオニンプロテインキナーゼである。ＧＳＫ３によるこれらの他のタンパク質のリン酸化により、通常、標的タンパク質（「基質」とも称される）が阻害される。記載の通り、ＧＳＫ３は、グリコーゲンシンターゼをリン酸化し、したがって不活性化することが公知である。ＧＳＫ３は、損傷を受けたＤＮＡに対する細胞の応答およびＷｎｔシグナル伝達の制御にも関係づけられている。ＧＳＫ３により、ヘッジホッグ（Ｈｈ）経路内のＣｉもリン酸化され、それがタンパク質分解の標的になって不活性形態になる。グリコーゲンシンターゼに加えて、ＧＳＫ３は多くの他の基質を有する。しかし、ＧＳＫ３は、基質を最初にリン酸化する「プライミングキナーゼ」を通常必要とするという点で、キナーゼの中では普通でない。
【０１１７】
ＧＳＫ３によるリン酸化の結果は、通常、基質の阻害である。例えば、ＧＳＫ３により別のその基質である転写因子のＮＦＡＴファミリーがリン酸化されると、これらの転写因子は核に移行することができず、したがって、阻害される。発生の間に組織パターニングを確立するために必要である、Ｗｎｔシグナル伝達経路におけるその重要な役割に加えて、ＧＳＫ３は、骨格筋肥大などの状況において誘導されるタンパク質合成のためにも重大である。ＮＦＡＴキナーゼとしてのその役割によっても、分化と細胞増殖の両方の重要な調節因子として位置づけられる。
【０１１８】
ＧＳＫ３阻害とは、１種または複数種のＧＳＫ３酵素の阻害を指し得る。ＧＳＫ３酵素のファミリーは周知であり、いくつものバリアントが記載されている（例えば、Schafferら、２００３年を参照されたい）。特定の実施形態では、ＧＳＫ３−βを阻害する。ＧＳＫ３−α阻害剤も適切であり、ある特定の態様では、本発明において使用するための阻害剤により、ＧＳＫ３−αとＧＳＫ３−βの両方を阻害する。ＧＳＫ３阻害剤により、例えばＷｎｔ／β−カテニン経路を活性化することができる。
【０１１９】
ＧＳＫ３阻害剤の特定の実施例としては、これだけに限定されないが、ケンパウロン（Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、１−アザケンパウロン（Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＡＲ−Ａ０１４４１８（例えば、Gouldら、２００４年を参照されたい）、ＣＴ９９０２１（例えば、Wagman、２００４年を参照されたい）、ＣＴ２００２６（例えば、Wagman、２００４年を参照されたい）、ＳＢ４１５２８６、ＳＢ２１６７６３（例えば、Martinら、２００５年を参照されたい）、ＡＲ−Ａ０１４４１８（例えば、Nobleら、２００５年を参照されたい）、リチウム（例えば、Gouldら、２００３年を参照されたい）、ＳＢ４１５２８６（例えば、Frameら、２００１年を参照されたい）およびＴＤＺＤ−８（例えば、Chinら、２００５年を参照されたい）が挙げられる。Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手可能な別の例示的なＧＳＫ３阻害剤（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００８／０９４５９７を参照されたい）としては、これだけに限定されないが、ＢＩＯ（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン（Bromomdirubm）−３’−オキシム（ＧＳＫ３阻害剤ＩＸ）；ＢＩＯ−アセトキシム（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−アセトキシム（ＧＳＫ３阻害剤Ｘ）；（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−（２−フェニルキナゾリン−４−イル）アミン（ＧＳＫ３−阻害剤ＸＩＩＩ）；ピリドカルバゾール−シクロペンタジエニルルテニウム（cyclopenadienylruthenium）複合体（ＧＳＫ３阻害剤ＸＶ）；ＴＤＺＤ−８４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン（ＧＳＫ３ベータ阻害剤Ｉ）；２−チオ（３−ヨードベンジル）−５−（１−ピリジル）−［１，３，４］−オキサジアゾール（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＩＩ）；ＯＴＤＺＴ２，４−ジベンジル−５−オキソチアジアゾリジン−３−チオン（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＩＩＩ）；アルファ−４−ジブロモアセトフェノン（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＶＩＩ）；ＡＲ−ＡＯ１４４１８Ｎ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）尿素（ＧＳＫ−３ベータ阻害剤ＶＩＩＩ）；３−（１−（３−ヒドロキシプロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−４−ピラジン−２−イル−ピロール−２，５−ジオン（ＧＳＫ−３ベータ阻害剤ＸＩ）；ＴＷＳ１  １９ピロロピリミジン化合物（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＸＩＩ）；Ｌ８０３  Ｈ−ＫＥＡＰＰ  ＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ２またはそのミリストイル化された形態（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＸＩＩＩ）；２−クロロ−１−（４，５−ジブロモ−チオフェン−２−イル）−エタノン（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＶＩ）；ＡＲ−ＡＯ１４４〜１８；ＳＢ２１６７６３；およびＳＢ４１５２８６が挙げられる。
【０１２０】
本明細書で使用される阻害剤は、標的とするキナーゼに特異的であることが好ましい。ＧＳＫ３に対して特異的であるＣＨＩＲ９９０２１を用いて良好な結果が得られている。ＣＨＩＲ９９０２１の使用に適した濃度は０．０１〜１００マイクロモル、好ましくは０．１〜２０マイクロモル、より好ましくは０．３〜１０マイクロモルの範囲である。
【０１２１】
２．ＡＬＫ５阻害剤
ＴＧＦ−β受容体阻害剤は、一般にＴＧＦシグナル伝達の任意の阻害剤、または、ＴＧＦ−β受容体に対する抗体、ＴＧＦ−β受容体のドミナントネガティブバリアント、ならびにＴＧＦ−β受容体の発現を抑制するｓｉＲＮＡおよびアンチセンス核酸を含み得るＴＧＦ−β受容体（例えば、ＡＬＫ５）阻害剤に特異的な阻害剤を含み得る。例示的なＴＧＦ−β受容体／ＡＬＫ５阻害剤としては、これだけに限定されないが、ＳＢ４３１５４２（例えば、Inmanら、２００２年を参照されたい）、３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミドとしても公知のＡ−８３−０１（例えば、Tojoら、２００５年を参照されたい、また、例えばＴｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから市販されている）；２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１、５−ナフチリジン、Ｗｎｔ３ａ／ＢＩＯ（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００８／０９４５９７を参照されたい）、ＢＭＰ４（例えば、ＷＯ２００８／０９４５９７を参照されたい）、ＧＷ７８８３８８（−（４−［３−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］ピリジン（pyridm）−２−イル｝−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）ベンズアミド）（例えば、Gellibertら、２００６年を参照されたい）、ＳＭ１６（例えば、Suzukiら、２００７年を参照されたい）、ＩＮ−１１３０（３−（（５−（６−メチルピリジン−２−イル）−４−（キノキサリン−６−イル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）ベンズアミド）（例えば、Kimら、２００８年を参照されたい）、ＧＷ６６０４（２−フェニル−４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリジン）（例えば、de  Gouvilleら、２００６年を参照されたい）、ＳＢ−５０５１２４（２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン塩酸塩）（例えば、DaCostaら、２００４年を参照されたい）；ＳＵ５４１６；レルデリムマブ（ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍｂ）（ＣＡＴ−１５２）；メテリムマブ（ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ）（ＣＡＴ−１９２）；ＧＣ−１００８；ＩＤｌ  １；ＡＰ−１２００９；ＡＰ−１１０１４；ＬＹ５５０４１０；ＬＹ５８０２７６；ＬＹ３６４９４７；ＬＹ２１０９７６１；ＳＢ−４３１５４２；ＳＤ−２０８；ＳＭ１６；ＮＰＣ−３０３４５；Ｋｉ２６８９４；ＳＢ−２０３５８０；ＳＤ−０９３；ＡＬＸ−２７０−４４８；ＥＷ−７１９５；ＳＢ−５２５３３４；ＩＮ−１２３３；ＳＫＩ２１６２；グリベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）；３，５，７，２’，４’−ペンタヒドロキシフラボン（pentahydroxyfiavone）（Ｍｏｒｉｎ）；アクチビン−Ｍ１０８Ａ；Ｐ１４４；可溶性ＴＢＲ２−Ｆｃ；ピリミジン誘導体（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００８／００６５８３において列挙されているものを参照されたい）；およびRothら（２０１０年）に報告されたインドリノンが挙げられる。
【０１２２】
さらに、「ＡＬＫ５阻害剤」は非特異的なキナーゼ阻害剤を包含するものではないが、「ＡＬＫ５阻害剤」は、例えばＳＢ−４３１５４２などの、ＡＬＫ５に加えてＡＬＫ４および／またはＡＬＫ７を阻害する阻害剤を包含するものと理解されるべきである（例えば、Inmanら、２００２年を参照されたい）。
【０１２３】
ＴＧＦ−β／アクチビン経路を阻害することには同様の効果があると考えられている。したがって、ＴＧＦ−β／アクチビン経路の任意の阻害剤（例えば、上流または下流の）を、本明細書に記載のＴＧＦ−β／ＡＬＫ５阻害剤と組み合わせて、またはその代わりに使用することができる。例示的なＴＧＦ−β／アクチビン経路阻害剤としては、これだけに限定されないが、ＴＧＦ−β受容体阻害剤、ＳＭＡＤ２／３リン酸化の阻害剤、ＳＭＡＤ２／３とＳＭＡＤ４の相互作用の阻害剤、ならびにＳＭＡＤ６およびＳＭＡＤ７の活性化因子／アゴニストが挙げられる。さらに、本明細書に記載されているカテゴリー化は、ただ単に組織化するためのものであり、化合物は経路内の１つまたは複数の点で影響を及ぼす可能性があり、したがって、化合物は定義済みのカテゴリーの１つ超で機能し得ることは当業者には公知である。
【０１２４】
３．ＲＯＣＫ阻害剤
多能性幹細胞、特にヒトＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞は、クローンの単離または増大および分化誘導に重要である細胞の脱離および解離の際にアポトーシスを受けやすい。最近、ＲＯＣＫ関連シグナル伝達経路の阻害剤であるＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、例えばＲｈｏ特異的阻害剤、ＲＯＣＫ特異的阻害剤、またはミオシンＩＩ特異的阻害剤などの小数の分子のクラスにより、クローンの効率および解離させた多能性幹細胞の生存が増大することが見出された。本発明のある特定の態様では、多能性幹細胞を培養および継代するため、および／または幹細胞を分化させるためにＲＯＣＫ阻害剤を使用することができる。したがって、多能性幹細胞を増殖させる、解離させる、集合体を形成する、または分化させる任意の細胞培養培地、例えば接着培養物または浮遊培養物中にＲＯＣＫ阻害剤が存在してよい。別段の指定のない限り、本明細書では、ブレビスタチン（ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ）などのミオシンＩＩ阻害剤でＲＯＣＫ阻害剤の実験的使用を置換することができる。
【０１２５】
ＲＯＣＫシグナル伝達経路は、ＲｈｏファミリーＧＴＰアーゼ；Ｒｈｏの下流の主要なエフェクターキナーゼであるＲＯＣＫ；ＲＯＣＫの下流の優勢なエフェクターであるミオシンＩＩ（Harbら、２００８年）；および任意の中間、上流、または下流のシグナルプロセッサを含み得る。ＲＯＣＫにより、ミオシン調節性軽鎖（ＭＲＬＣ）の脱リン酸化によってミオシン機能を負に調節するＲＯＣＫの主要な下流の標的の１つであるミオシンホスファターゼ標的サブユニット１（ＭＹＰＴ１）がリン酸化され、不活性化され得る。
【０１２６】
ＲＯＣＫは、Ｒｈｏの標的タンパク質としての機能を果たすセリン／トレオニンキナーゼである（３つのアイソフォーム−−ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢおよびＲｈｏＣが存在する）。これらのキナーゼは、最初に、ＲｈｏＡに誘導されるストレスファイバーおよび接着斑の形成のメディエーターと特徴付けられた。２つのＲＯＣＫアイソフォーム−ＲＯＣＫ１（ｐ１６０ＲＯＣＫ、ＲＯＫβとも称される）およびＲＯＣＫ２（ＲＯＫα）−は、Ｎ末端キナーゼドメイン、その後に、Ｒｈｏ結合性ドメインを含有するコイルドコイルドメインおよびプレクストリン相同性ドメイン（ＰＨ）で構成される。どちらのＲＯＣＫも、ストレスファイバー形成、平滑筋収縮、細胞接着、膜ラフリングおよび細胞運動性に対するＲｈｏＡの作用を媒介する細胞骨格調節因子である。ＲＯＣＫは、ミオシンＩＩ、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）、ＭＬＣホスファターゼ（ＭＬＣＰ）ならびにホスファターゼ・テンシン・ホモログ（ＰＴＥＮ）などの下流の分子を標的とすることによってそれらの生物活性を発し得る。
【０１２７】
ＲＯＣＫ阻害剤の非限定的な例としては、ＨＡ−１００、Ｙ−２７６３２、Ｈ−１１５２、ファスジル（Ｆａｓｕｄｉｌ）（ＨＡ１０７７とも称される）、Ｙ−３０１４１（米国特許第５，４７８，８３８号に記載されている）、Ｗｆ−５３６、ＨＡ−１０７７、ヒドロキシル−ＨＡ−１０７７、ＧＳＫ２６９９６２Ａ、ＳＢ−７７２０７７−Ｂ、およびそれらの誘導体が挙げられる。さらに、他の低分子化合物もＲＯＣＫ阻害剤として公知であるので、そのような化合物またはその誘導体も実施形態に使用することができる（例えば、これによって参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２００５／０２０９２６１号、同第２００５／０１９２３０４号、同第２００４／００１４７５５号、同第２００４／０００２５０８号、同第２００４／０００２５０７号、同第２００３／０１２５３４４および２００３／００８７９１９号、ならびに国際特許公開第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６および２００４／０３９７９６号を参照されたい）。本発明のある特定の態様では、ＲＯＣＫ阻害剤の１つまたは２つまたはそれ超の組合せも使用することができる。本発明のある特定の態様では、Ｒｈｏ特異的阻害剤、例えばＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｃ３細胞外酵素など、および／またはミオシンＩＩ特異的阻害剤も、ＲＯＣＫ阻害剤として使用することができる。
【０１２８】
４．ＢＭＰ経路アンタゴニスト
一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路のアンタゴニスト（すなわち、ＢＭＰシグナル伝達アンタゴニストまたはＢＭＰアンタゴニスト）により、構成的に活性なＢＭＰシグナル伝達経路を阻害または下方制御する。一実施形態では、ＢＭＰシグナル経路は、ＢＭＰ２媒介性シグナル伝達経路またはＢＭＰ４媒介性シグナル伝達経路である。一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストにより、Ｉ型ＢＭＰ受容体シグナルトランスダクションを阻害する。一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路のアンタゴニストにより、Ｉ型ＢＭＰ受容体への結合によってＩ型ＢＭＰ受容体シグナルトランスダクションを阻害する。一実施形態では、Ｉ型ＢＭＰ受容体は、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３またはＡＬＫ６を含む。一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路のアンタゴニストにより、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５またはＳＭＡＤ８のリン酸化を阻害する。さらに別の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路のアンタゴニストにより、ＢＭＰ２またはＢＭＰ４のＢＭＰ受容体への結合またはＩＩ型ＢＭＰ受容体とＩ型ＢＭＰ受容体の相互作用を阻害する。ＢＭＰシグナル伝達経路のアンタゴニストは、化学薬剤である。化学薬剤としては、これだけに限定されないが、ドルソモルフィン、ＬＤＮ１  ９３１８９およびその類似体を挙げることができる。ポリペプチド由来のＢＭＰ経路アンタゴニストとしては、これだけに限定されないが、ノギン、グレムリン、コーディン、フォリスタチン、ケルベロス、ＰＲＤＣ、ＵＳＡＧ−１、ココ、およびスクレロスチンが挙げられる。
【０１２９】
５．ヘッジホッグ阻害剤
ヘッジホッグ阻害剤としては、これだけに限定されないが、ＫＡＡＤ−シクロパミン；ＧＤＣ−０４４９；アシルチオ尿素、アシル尿素、および報告アシルグアニジン誘導体（Solinasら、２０１２年）において報告された；フェニルキナゾリノン尿素（Bruntonら、２００８年）において報告された；シクロパミン類似体（Winklerら、２００９年）において報告された；ＡＹ９９４４、ＬＹ２９４０６８０、ＭＲＴ−１０、ＭＲＴ−８３、ＧＤＣ−０４４９、トリパラノール、ジェルビン、イトラコナゾール（itraconzaole）、スルフイソマジン（ｓｕｌｆｉｓｏｍａｄｉｎｅ）、ポドフィルム樹脂、コルヒチンが挙げられる。「ヘッジホッグ阻害剤」という用語は、スムーズンド（ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）の活性を低下させ、Ｈｈ経路の標的であるパッチド（ｐａｔｃｈｅｄ）およびＧＩｉ  １の活性を低下させる薬剤を指すものとする。「ヘッジホッグ阻害剤」という用語は、本明細書で使用される場合は、ヘッジホッグタンパク質の正常な機能を直接阻害することによって作用し得る任意の薬剤を指すだけでなく、ヘッジホッグ経路活性を阻害し、したがって、ｐｔｃの機能を再現する任意の薬剤も指す。
【０１３０】
６．ガンマセレクターゼ阻害剤
活性なγ−セレクターゼは４種のタンパク質の複合体であり、そのうちのプレセニリン（ＰＳ）により、タンパク質の膜貫通ドメイン内に位置する２つの高度に保存されたアスパラギン酸、Ｄ２５７およびＤ３８５を通じて活性部位がもたらされると考えられている。活性になるには、未成熟ＰＳがプロセシングされ、他のタンパク質との複合体に組み入れられて安定にならなければならない。これは、「プレセニリナーゼ（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎａｓｅ）」と称される酵素によるタンパク質分解性の切断を含み、これにより、成熟プロテアーゼにおいて互いに関連したままのＮ末端断片およびＣ末端断片が生じ、各断片は２つの必須のアスパラギン酸のうちの１つを含有する。しかし、この成熟ＰＳでさえ、複合体の他のメンバーの不在下ではＡＰＰを切断するのに不十分である。ニカストリン、Ａｐｈ−１、およびＰｅｎ−２と同定されたこれらのタンパク質は複合体の成熟化、安定化および輸送を調節するものである。例えば、Ｐｅｎ−２は、Ａｐｈ−１およびニカストリンとの複合体に組み入れられたら、未成熟ＰＳのプレセニリナーゼによる切断のために必要である。まとめると、４種のタンパク質の複合体によりγ−セレクターゼ活性が再構成され得、ＰＳ単独で、時にはそれ自体が、複合体の活性なコアとして提唱されたその役割に基づいて「γ−セレクターゼ」と称される。
【０１３１】
これまでに記載された最も特異的かつ有効なγ−セレクターゼ阻害剤としては、ＰＳ−１とＰＳ−２の両方を阻害するＮ−ｔＮ−ｆＳ．Ｓ−ジフルオロフェンアセチル−Ｌ−アラニルｌ−Ｓ−フェニルグリシン−ｆ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）が挙げられる。ＤＡＰＴは、置き換えアッセイにおいてγ−セレクターゼ活性部位について中程度に競合し得る細胞浸透性ジペプチド非遷移状態類似体であり、ＤＡＰＴの結合部位と活性部位の間にいくつかの重複が示唆される。
【０１３２】
ペプチド模倣阻害剤としては、Shearmenら（２０００年）に記載されているＬ−６８５，４５８（（５Ｓ）−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６−フェニル−（４Ｒ）ヒドロキシ−（２Ｒ）ベンジルヘキサノイル）−Ｌ−ｌｅｕ−Ｌ−ｐｈｅ−アミド）が挙げられる。ＡＬＸ−２６０−１２７は、Wolfeら（１９９８年）に記載されている、γ−セレクターゼの可逆的なジフルオロケトンペプチド模倣阻害剤である。光活性化ガンマ−セレクターゼ阻害剤はγ−セレクターゼの活性部位を対象とし、Liら（２０００年）に記載されている。スリンダク硫化物（ＳＳｉｄｅ）は、組換えアミロイドベータ前駆タンパク質Ｃ１００を基質として使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏガンマ−セレクターゼアッセイにおいてガンマ−セレクターゼに直接作用し、ガンマ−セレクターゼ活性を優先的に阻害する（Takahashiら（２００３年））。公知のガンマ−セレクターゼ阻害剤のさらなる例としては、これだけに限定されないが、ＲＯ４９２９０９７、ＢＭＳ−７０８１６３、セマガセスタット、ＭＫ−０７５２、ＹＯ−０１０２７、ＬＹ−４１１５７５、ＬＹ２８１１３７６、および（Ｒ）−フルルビプロフェンが挙げられる。
【０１３３】
γ−セレクターゼ阻害剤をスクリーニングするための様々なアッセイ、例えば、Takahashiら、（２００３年）によるもの、Pinnixら（２０００年）による、ＡＰＰの推定Ｃ末端断片−ガンマの検出に基づくアッセイ；McLendonら（２０００年）による、γ−セレクターゼ活性についての無細胞アッセイも記載されている。
【０１３４】
Ｂ．分化因子
本開示に例示されている内胚葉前駆体促進性増殖因子は、単一ホルモン性膵ベータ細胞にさらに分化し得る細胞の増殖を促進することができる可溶性増殖因子（ペプチドホルモン、サイトカイン、リガンド−受容体複合体、および他の化合物）を含み得る。そのような作用剤の非限定的な例としては、これだけに限定されないが、基本ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、ＢＭＰ−４、ＥＧＦ、アクチビンＡ、ＴＧＦベータ、およびＶＥＧＦなどの増殖因子、またはそのアイソフォームもしくはバリアントが挙げられる。
【０１３５】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の分化因子はＢＭＰ−４であり、これは、造血前駆細胞の増殖および分化潜在性の調節に重要である（Bhardwajら、２００１年；Bhatiaら、１９９９年；Chadwick  ２００３年）。ＢＭＰ−４は、内胚葉前駆細胞の自己再生の促進もし得る。
【０１３６】
さらなる実施形態では、１つまたは複数の分化因子は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）であり、これは、胚循環系の形成および血管新生に関与する重要なシグナル伝達タンパク質である。ＶＥＧＦは、血管内皮および他の細胞型（例えば、神経細胞、がん細胞、腎臓上皮細胞）を含めた種々の細胞型に影響を及ぼし得る。ＶＥＧＦの機能はがん、糖尿病、自己免疫疾患、および眼血管疾患を含めた種々の病態において重要であることも示されている。
【０１３７】
内胚葉前駆体および膵島ベータ細胞をもたらす分化は、細胞を、これだけに限定されないが、アクチビンＡ、ノーダル、Ｗｎｔ３Ａ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２／ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ１０、Ｂ２７、ＴＧＦベータ、ニコチンアミド、およびレチノイン酸を含めた、この節に記載されている因子の任意の１つまたは複数と接触させることによって実現することができる。また、Ｅｒｇ−１などのＥｔｓ転写因子、ならびにＧＦＩは、ベータ細胞分化に直接および／または間接的に関与することが公知である（Kobberupら、２００７年；Shroyerら、２００５年）。さらに、理論に束縛されることなく、発現が低酸素によって誘導されるＨＩＦ−１αは、調節されたベータ細胞機能であることが公知である（Chengら、２０１０年）。
【０１３８】
Ｖ．細胞培養
「培養した」という用語は、細胞に関して本明細書で使用される場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境において細胞分裂しているまたは細胞分裂していない１つまたは複数の細胞を指し得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境は、例えば適切な液体培地または寒天などの、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持するために適した当技術分野で公知の任意の培地であってよい。細胞培養のための適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境の特定の実施例は、Culture  of  Animal  Cells:  a  manual  of  basic  techniques（１９９４年）；Cells:  a  laboratory  manual（１９９８年）；およびAnimal  Cells:  culture  and  media（１９９４年）に記載されている。
【０１３９】
「細胞株」という用語は、本明細書で使用される場合、途絶えることなく少なくとも１回継代することができる培養細胞を指し得る。本発明は、無制限に継代することができる細胞株に関する。細胞継代は以下で定義されている。
【０１４０】
「浮遊液」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞が固体支持体に付着していない細胞培養条件を指し得る。浮遊液中で増殖している細胞を、増殖の間に当業者に周知の装置を使用して撹拌することができる。
【０１４１】
「単層」という用語は、本明細書で使用される場合、適切な培養条件で増殖している間、固体支持体に付着している細胞を指し得る。適切な増殖条件下で単層において増殖している細胞のごく一部が単層内の細胞に付着し得るが固体支持体には付着しない。
【０１４２】
「プレーティングした（ｐｌａｔｅｄ）」または「プレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ）」という用語は、細胞に関して本明細書で使用される場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて細胞培養物を樹立することを指し得る。例えば、細胞を細胞培養培地中に希釈し、次いで、細胞培養プレート、ディッシュ、またはフラスコに加えることができる。細胞培養プレートは、一般に当業者に公知である。細胞を種々の濃度および／または細胞密度でプレーティングすることができる。
【０１４３】
「細胞プレーティング」という用語は、「細胞継代」という用語に拡大することもできる。本発明の細胞は、当業者に周知の細胞培養技法を使用して継代することができる。「細胞継代」という用語は、（１）細胞を固体支持体または基質から放出させ、これらの細胞を解離するステップ、および（２）細胞を、さらなる細胞増殖のために適した培地中に希釈するステップを伴う技法を指し得る。細胞継代は、培養細胞を含有する液体培地の一部を取り出し、元の培養容器に液体培地を添加して細胞を希釈し、さらに細胞増殖させることも指し得る。さらに、さらなる細胞増殖のために適した培地を補充した新しい培養容器に細胞を添加することもできる。
【０１４４】
「低酸素」および「低酸素条件」という用語は、本明細書で使用される場合、周囲空気の酸素濃度（およそ１５％〜２０％酸素）と比較して低い酸素濃度を特徴とする条件を指し得る。一態様では、低酸素条件は、約１０％未満の酸素濃度を特徴とする。別の態様では、低酸素条件は、約１％〜１０％、１％〜９％、１％〜８％、１％〜７％、１％〜６％、１％〜５％、１％〜４％、１％〜３％、または１％〜２％、またはその中に導き出せる任意の範囲の酸素濃度を特徴とする。
【０１４５】
「増殖」という用語は、細胞に関して本明細書で使用される場合、ある期間にわたって数が増加し得る細胞の群を指し得る。
【０１４６】
「恒久的」または「不死化」という用語は、細胞に関して本明細書で使用される場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境において培養している間、細胞が途絶えるまで多数回細胞分裂し、細胞数が倍増し得る細胞を指し得る。永久細胞株は、培養物中のかなりの数の細胞が途絶えるまでに１０回超倍増し得る。永久細胞株は、培養物中のかなりの数の細胞が途絶えるまでに２０回超または３０回超倍増し得ることが好ましい。永久細胞株は、培養物中のかなりの数の細胞が途絶えるまでに４０回超または５０回超倍増し得ることがより好ましい。永久細胞株は、培養物中のかなりの数の細胞が死亡するまでに６０回超倍増し得ることが最も好ましい。
【０１４７】
出発細胞および分化細胞は、一般に、培養培地および条件に関して異なる要件を有する。通常は、少なくとも培養の最初の段階を、分化因子を導入した後に、培地の存在下、出発細胞を増殖させるために適することが公知の培養条件下で行う。この後に、分化培地の存在下、分化細胞に適することが公知の条件下でのその後の培養期間が続く。分化のために十分な時間の後、分化細胞を増大させるために、増大培地中で分化細胞をさらに培養することができる。そのような増大培地は、上記の１種または複数種のシグナル伝達阻害剤を含んでもよく、基本的にこれらの阻害剤を含まない培養培地を含んでもよい。
【０１４８】
培養の最初の段階は、最大６日間、より好ましくは最大４日間、および下記の特定の実施形態では、３日間以下、より詳細には最大または約１日の期間にわたることが好ましい。その後の１種または複数種のシグナル伝達阻害剤を含む分化培地中での培養の段階は、少なくともまたは約２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、３１日間、３２日間、３３日間、またはその中に導き出せる任意の範囲の期間にわたることが適切であり、最大１２０日間、好ましくは最大１０日間にわたってよい。内胚葉前駆体またはベータ細胞を生成するために使用される下記の特定の実施形態では、培養の最初の段階は約５日間の期間にわたり、その後の段階は種々の分化培地の存在下で培養毎に約２６〜４４日間にわたった。分化条件は、フィーダー細胞を基本的に含まないものであってよい。別の態様では、分化培地は既知組成のものであってよい。分化を改善するために、分化培地は、高濃度のＦＧＦをさらに含んでよく、ＴＧＦ−βを基本的に含まないものであってよい。いくつかの場合には、培地は、ＴＧＦ−βを含んでよい。
【０１４９】
Ａ．一般条件
本発明による培養条件は、使用される培地および幹細胞に応じて適切に定義される。本発明のある特定の態様による培地は、ＴｅＳＲ、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８  Ｍｅｄｉｕｍ、ＢＭＥ、ＢＧＪｂ、ＣＭＲＬ  １０６６、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ、ＩＭＤＭ、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ、ＲＰＭＩ  １６４０およびＦｉｓｃｈｅｒ培地のいずれかなどの動物細胞を培養するために基本培地として使用される培地、ならびにそれらの任意の組合せを使用して調製することができるが、培地は、動物細胞を培養するために使用することができる限りは、これらに特に限定されない。
【０１５０】
本発明による培地は、血清含有培地中であっても無血清培地中であってもよい。無血清培地とは、加工または精製されていない血清を伴わない培地を指し、したがって、それらとしては、精製された血液由来成分または動物組織由来成分（例えば、増殖因子など）を含む培地を挙げることができる。異種動物由来成分の混入を予防する観点から、血清は、幹細胞（複数可）の動物と同じ動物に由来するものであってよい。
【０１５１】
本発明による培地は、任意の血清の代替物を含有してもよく、それを含有しなくてもよい。血清の代替物としては、アルブミンを適切に含有する材料（例えば、脂質リッチアルブミン、アルブミン代用物、例えば組換えアルブミンなど、植物デンプン、デキストランおよびタンパク質加水分解産物など）、トランスフェリン（または他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆物質、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオグリセロール（thiolgiycerol）、またはそれに対する等価物を挙げることができる。血清の代替物は、例えば、国際公開第９８／３０６７９号に開示されている方法によって調製することができる。あるいは、より好都合なように、任意の市販の材料を使用することができる。市販の材料としては、ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｇｉｂｃｏ）、およびＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）が挙げられる。
【０１５２】
本発明の培地は、脂肪酸または脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸など）、ビタミン（複数可）、増殖因子、サイトカイン、抗酸化物質、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、および無機塩も含有してよい。２−メルカプトエタノールの濃度は、例えば、約０．０５〜１．０ｍＭ、特に約０．１〜０．５ｍＭであってよいが、濃度は、幹細胞（複数可）を培養するために適する限りは特にこれに限定されない。
【０１５３】
本発明の細胞（複数可）を培養するために使用される培養容器としては、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリ皿、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレー、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）Ｃｈａｍｂｅｒ、培養バッグ、およびローラービンを挙げることができるが、その中で細胞を培養することができる限りは特にこれだけに限定されない。幹細胞は、培養物の必要性に応じて、少なくともまたは約０．２ｍｌ、０．５ｍｌ、１ｍｌ、２ｍｌ、５ｍｌ、１０ｍｌ、２０ｍｌ、３０ｍｌ、４０ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌ、１５０ｍｌ、２００ｍｌ、２５０ｍｌ、３００ｍｌ、３５０ｍｌ、４００ｍｌ、４５０ｍｌ、５００ｍｌ、５５０ｍｌ、６００ｍｌ、８００ｍｌ、１０００ｍｌ、１５００ｍｌ、またはその中に導き出せる任意の範囲の体積で培養することができる。ある特定の実施形態では、培養容器はバイオリアクターであってよく、これは、生物活性のある環境を支持する任意のデバイスまたは系を指し得る。バイオリアクターの容積は少なくともまたは約２、４、５、６、８、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００リットル、１、２、４、６、８、１０、１５立方メートル、またはその中に導き出せる任意の範囲であってよい。
【０１５４】
培養容器は細胞接着性であっても非接着性であってもよく、目的に応じて選択することができる。細胞接着性培養容器は、容器表面の細胞に対する接着性を改善するために、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）などの細胞接着用の任意の基材でコーティングすることができる。細胞接着用の基材は、幹細胞またはフィーダー細胞（使用される場合）を付着させることが意図された任意の材料であってよい。細胞接着用の基材としては、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、ビトロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、ＰＬＯラミニン、フィブリン、トロンビン、およびＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎならびにそれらの混合物、例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、および溶解させた細胞膜調製物が挙げられる（Klimanskayaら、２００５年）。
【０１５５】
他の培養条件は、適切に定義されたものであってよい。例えば、培養温度は、約３０〜４０℃、例えば、少なくともまたは約３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃であってよいが、特にこれらに限定されない。ＣＯ２濃度は、約１〜１０％、例えば、約２〜５％、またはその中に導き出せる任意の範囲であってよい。酸素分圧は、少なくともまたは約１％、５％、８％、１０％、２０％、またはその中に導き出せる任意の範囲であってよい。酸素分圧は、正常酸素の培養物に関しては２０％であることが好ましい。正常酸素の培養条件および低酸素の培養条件は以下にさらに記載されている。
【０１５６】
ある特定の態様における本発明の方法は、例えば、細胞の接着培養に使用することができる。この場合、細胞をフィーダー細胞の存在下で培養することができる。本発明の方法においてフィーダー細胞を使用する場合では、胎児線維芽細胞などの間質細胞をフィーダー細胞として使用することができる（例えば、Hoganら、Manipulating  the  Mouse  Embryo、A  Laboratory  Manual（１９９４年）；Gene  Targeting、A  Practical  Approach（１９９３年）；Martin（１９８１年）；EvansおよびKaufman（１９８１年）；Jainchillら、（１９６９年）；Nakanoら（１９９６年）；Kodamaら（１９８２年）；および国際特許公開第０１／０８８１００号および同第２００５／０８０５５４号を参照されたい）。
【０１５７】
ある特定の態様における本発明の方法は、担体上での浮遊培養（Fernandesら、２００４年）またはゲル／バイオポリマー封入（米国特許出願公開第２００７／０１１６６８０号）を含めた、細胞の浮遊培養にも使用することができる。細胞の浮遊培養という用語は、細胞を培地中の培養容器またはフィーダー細胞（使用される場合）に対して非接着性条件で培養することを意味する。細胞の浮遊培養は、細胞の解離培養および集合細胞浮遊培養を含む。細胞の解離培養という用語は、浮遊した細胞を培養することを意味し、細胞の解離培養は、複数の細胞で構成される単一細胞の解離培養または小細胞集合体の解離培養である（例えば、細胞約２〜４００個）。上述の解離培養を継続すると、培養された解離させた細胞がより大きな細胞の集合体を形成し、その後、集合体浮遊培養を実施することができる。集合体浮遊培養は、胚様体培養法（Kellerら、１９９５年を参照されたい）、およびＳＦＥＢ法（Watanabeら、２００５年；国際公開第２００５／１２３９０２号）を含む。
【０１５８】
本発明の一部の実施形態の方法に従って浮遊液中で細胞を培養するために使用される培養容器は、内面が、その中で培養された細胞が接着または付着することができないように設計された（例えば、表面への付着または接着を予防するために非組織培養で処理した細胞）適切な純度グレードを有する任意の組織培養容器であってよい。スケーラブルな培養物を得るために、本発明の一部の実施形態に従った培養を、温度、かき混ぜ、ｐＨ、およびｐＯ２などの培養パラメータが適切なデバイスを使用して自動的に実施される制御された培養系（好ましくはコンピュータ制御された培養系）を使用して実施することが好ましい。培養パラメータが記録されたら、細胞増大を促進するために、必要に応じて系を培養パラメータの自動調整に設定する。細胞は、動的条件下（すなわち、細胞を浮遊培養で一定の動きに供する条件下）で培養することもでき、それらの増殖能力を保護しながら非動的条件下（すなわち、静置培養）で培養することもできる。細胞の非動的培養のためには、細胞をコーティングしていない５８ｍｍのペトリ皿（Greiner、Frickenhausen、Ｇｅｒｍａｎｙ）で培養することができる。細胞の動的培養のためには、細胞を、制御ユニットに接続することができ、したがって、制御された培養系をもたらすことができるスピナーフラスコ（例えば、２００ｍｌ〜１０００ｍｌ、例えば、２５０ｍｌのもの；１００ｍｌのもの；または１２５ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒ中）で培養することができる。培養容器（例えば、スピナーフラスコ、Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）を継続的に振とうする。本発明の一部の実施形態によると、振とう機を使用して培養容器を毎分９０回（ｒｐｍ）振とうする。本発明の一部の実施形態によると、培養培地を毎日交換する。
【０１５９】
Ｂ．多能性幹細胞の培養
多能性幹細胞の培養物は、集団内の実質的な割合の幹細胞およびそれらの誘導体が胚または成体起源の分化細胞とは区別される未分化細胞の形態学的特性を示す場合、「未分化」と記載される。未分化のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞は当業者には理解され、一般には、２次元の顕微鏡写真で核／細胞質比が高い細胞のコロニー中に現れ、核小体において顕著である。未分化細胞のコロニーには分化している細胞が近隣し得ることが理解される。
【０１６０】
ＥＳ細胞は、細胞を血清およびフィーダー層、一般にはマウス胚線維芽細胞の存在下で培養することによって未分化の状態で維持することができる。幹細胞を未分化の状態で維持するための他の方法も公知である。例えば、マウスＥＳ細胞は、フィーダー層を用いずにＬＩＦの存在下で培養することによって未分化の状態で維持することができる。しかし、マウスＥＳ細胞とは異なり、既存のヒトＥＳ細胞はＬＩＦには応答しない。ヒトＥＳ細胞は、線維芽細胞のフィーダー層上、塩基性線維芽細胞増殖因子の存在下でＥＳ細胞を培養することによって（Amitら、２０００年）、または、フィーダー層を用いずに、線維芽細胞馴化培地とそれに加えて塩基性線維芽細胞増殖因子の存在下、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）もしくはラミニンなどのタンパク質マトリックス上で培養することによって（Xuら、２００１年；米国特許第６，８３３，２６９号）、未分化の状態で維持することができる。
【０１６１】
ＥＳ細胞を調製し、培養するための方法は、奇形癌および胚性幹細胞を含めた細胞生物学、組織培養物、および発生学における標準の教本および総説において見いだすことができる：A  practical  approach（１９８７年）；Guide  to  Techniques  in  Mouse  Development（１９９３年）；Embryonic  Stem  Cell  Differentiation  in  vitro（１９９３年）；Properties  and  uses  of  Embryonic  Stem  Cells:  Prospects  for  Application  to  Human  Biology  and  Gene  Therapy（１９９８年）、全て参照により本明細書に組み込まれる。組織培養に使用される標準の方法は、一般には、Animal  Cell  Culture（１９８７年）；Gene  Transfer  Vectors  for  Mammalian  Cells（１９８７年）；およびCurrent  Protocols  in  Molecular  Biology  and  Short  Protocols  in  Molecular  Biology（１９８７年および１９９５年）に記載されている。
【０１６２】
体細胞に再プログラミング因子を導入するか、または体細胞を再プログラミング因子と接触させた後、これらの細胞を、多能性および未分化の状態を維持するために十分な培地中で培養することができる。本発明において生成された人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の培養には、これによって参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２００７／０２３８１７０号、同第２００３／０２１１６０３号、および同第２００８／０１７１３８５号に記載の通り、霊長類の多能性幹細胞、特に胚性幹細胞を培養するために開発された種々の培地および技法を使用することができる。当業者には公知である、幹細胞を培養し、多能性を維持するための追加的な方法を本発明と共に使用することができることが理解される。
【０１６３】
ある特定の実施形態では、未定義の条件を使用することができ、例えば、幹細胞を未分化の状態で維持するために、多能性細胞を線維芽細胞フィーダー細胞または線維芽細胞フィーダー細胞に曝露している培地中で培養することができる。
【０１６４】
あるいは、ＴｅＳＲ培地（Ludwigら、２００６年a；Ludwigら、２００６年b）またはＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地（Chenら、２０１１年）などの定義済みのフィーダーに依存しない培養系を使用して、多能性細胞を培養し、基本的に未分化の状態で維持することができる。フィーダーに依存しない培養系および培地を使用して多能性細胞を培養し、維持することができる。これらの手法により、マウス線維芽細胞「フィーダー層」を必要とせずに、引き出されたヒトｉＰＳ細胞ならびにヒト胚性幹細胞を基本的に未分化の状態のままにすることが可能になる。本明細書に記載の通り、所望の通り費用を低減するために、これらの方法に対して種々の改変を行うことができる。
【０１６５】
種々のマトリックス成分をヒト多能性幹細胞の培養および維持に使用することができる。例えば、それらの全体が参照により組み込まれるLudwigら（２００６年a；２００６年b）に記載の通り、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ＰＬＯラミニン、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブリン塊、およびビトロネクチンの組合せを、多能性細胞の増殖のための固体支持体をもたらす手段として培養表面をコーティングするために使用することができる。特に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を使用して、ヒト多能性幹細胞の細胞培養および維持のための基質をもたらすことができる。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）は、マウス腫瘍細胞から分泌されたゼラチン質のタンパク質混合物であり、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）により市販されている。この混合物は、多くの組織に見いだされる複雑な細胞外の環境に似ており、細胞生物学者により細胞培養のための基材として使用されている。
【０１６６】
Ｃ．細胞継代
本発明のある特定の態様は、細胞を解離するステップをさらに伴い得る。細胞解離は、任意の公知の手順を使用して実施することができる。これらの手順は、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡなど）、酵素（例えば、トリプシン、コラゲナーゼなど）などを用いた処理、および機械的解離（例えば、ピペッティングなど）などの操作を含む。解離の前および／またはその後に、ＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤を用いて細胞（複数可）を処理することができる。例えば、解離後にのみ細胞（複数可）を処理することができる。
【０１６７】
細胞培養の一部のさらなる実施形態では、培養容器がいっぱいになったら、解離に適した任意の方法によってコロニーを分割して、集合した細胞、またはさらには単一細胞にし、次いでその細胞を継代のために新しい培養容器に入れることができる。細胞継代は、培養した条件下で長期間にわたって細胞を生きたままに維持し、増殖させることを可能にする技法である。通常、細胞が約７０％〜１００％集密になったら継代する。
【０１６８】
細胞の単一細胞への解離、その後の単一細胞の継代は、本方法において、分化させるための細胞の増大、細胞選別、および定義済みの播種が容易になること、ならびに培養手順およびクローンの増大の自動化が可能になることなどのいくつかの有利な点を伴って使用することができる。例えば、単一細胞からクローン的に引き出せる後代細胞は遺伝子構造が同種であり得、かつ／または細胞周期が同時に起こり得、それにより標的化分化が増大し得る。単一細胞継代のための典型的な方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００８／０１７１３８５号に記載の通りであり得る。
【０１６９】
ある特定の実施形態では、細胞を単一の個々の細胞、または単一の個々の細胞と細胞を２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ超含む小細胞クラスターの組合せに解離させることができる。解離は、機械力によって、または、クエン酸ナトリウムなどの細胞解離剤、もしくは酵素、例えば、トリプシン、トリプシン−ＥＤＴＡ、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔなどによって実現することができる。
【０１７０】
細胞の供給源および増大の必要性に基づいて、解離させた細胞を個別にまたは小さなクラスターとして、少なくともまたは約１：２、１：４、１：５、１：６、１：８、１：１０、１：２０、１：４０、１：５０、１：１００、１：１５０、１：２００など、またはその中に導き出せる任意の範囲の分割比（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ  ｒａｔｉｏ）で新しい培養容器に移すことができる。浮遊細胞株分割比（ｓｐｌｉｔ  ｒａｔｉｏ）は、培養物細胞浮遊液の体積に対してなされたものであってよい。継代の間隔は、少なくともまたは約１日毎、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、７日毎、８日毎、９日毎、１０日毎、１１日毎、１２日毎、１３日毎、１４日毎、１５日毎、１６日毎、１７日毎、１８日毎、１９日毎、２０日毎、またはその中に導き出せる任意の範囲であってよい。例えば、異なる酵素的継代プロトコールについての実現可能な分割比（ｓｐｌｉｔ  ｒａｔｉｏ）は、３〜７日毎に１：２、４〜７日毎に１：３、および、およそ７日ごとに１：５〜１：１０、７日ごとに１：５０〜１：１００であってよい。高い分割比（ｓｐｌｉｔ  ｒａｔｉｏ）を使用する場合、継代の間隔を少なくとも１２〜１４日または過剰な自然発生的な分化または細胞死に起因する細胞の損失が伴わない任意の期間延長することができる。
【０１７１】
ある特定の態様では、単一細胞継代は、上記の通り、ＲＯＣＫ阻害剤などの、クローニング効率および細胞生存を増大させるために有効な小分子の存在下のものであってよい。そのようなＲＯＣＫ阻害剤、例えば、Ｙ−２７６３２、ＨＡ−１０７７、Ｈ−１１５２、ＨＡ−１００、またはブレビスタチン（ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ）を有効濃度で、例えば、少なくともまたは約０．０２μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、５０μＭ〜約１００μＭ、またはその中に導き出せる任意の範囲で使用することができる。
【０１７２】
Ｄ．酸素正常および低酸素
低酸素培養は、例えば、ＰｒｏＯｘＣ（ＢｉｏＳｐｈｅｒｉｘ、Ｌａｃｏｎａ、ＮＹ）；Ｈｙｐｏｘｉｃ  Ｇｌｏｖｅ  Ｂｏｘ（Ｃｏｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｇｒａｓｓ  Ｌａｋｅ、ＭＩ）；ＨｙｐＯｘｙｓｔａｔｉｏｎ（ＨｙｐＯｘｙｇｅｎ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ＭＤ）；またはＨｙｐｏｘｉａ  Ｃｈａｍｂｅｒ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）などの当技術分野で公知の種々の培養チャンバーのいずれかを用いて実現することができる。
【０１７３】
正常酸素条件は、一般に、細胞の培養に関して規範的な酸素レベルを含む。別段の定めがなければ、正常酸素条件下での細胞の培養には、当業者に公知の方法、装置および成分を利用することができる。そのような方法を直接利用することもでき、正常酸素の培養条件での使用に適応させることもできる。
【０１７４】
本教示の種々の態様では、細胞を増殖させるまたは維持する低酸素の雰囲気を正常酸素雰囲気で置き換えることができる。一部の実施形態では、細胞を低酸素条件下で増殖させることができ、正常酸素条件下で分化させることができる。培養物を低酸素条件下で維持する持続時間は、当業者が常套的な実験によって決定することができる。同様に、低酸素培養後に培養物を正常酸素条件下で維持する持続時間も、当業者が常套的な実験によって決定することができる。
【０１７５】
本明細書で使用される場合、低酸素条件は、外界空気の酸素濃度（およそ１５％〜２０％酸素）と比較して低い酸素濃度を特徴とする。参考として、ヒトの体内のＯ２濃度は、脳では０．５％〜７％にわたり、眼では１％〜５％にわたり、肝臓、心臓および腎臓では４％〜１２％にわたり、子宮では３％〜５％にわたる。一態様では、低酸素条件は、約１０％未満の酸素濃度を特徴とする。別の態様では、低酸素条件は、約１％〜１０％、１％〜９％、１％〜８％、１％〜７％、１％〜６％、１％〜５％、１％〜４％、１％〜３％、または１％〜２％の酸素濃度を特徴とする。ある特定の態様では、系では培養容器中約１〜３％酸素が維持される。低酸素条件は、周囲ガス濃度を制御することが可能な培養装置、例えば、嫌気性チャンバーを使用することによって創出し、維持することができる。
【０１７６】
一般には、増大および播種のために、１５％〜２０％酸素および５％ＣＯ２を伴う正常な雰囲気下で細胞培養物のインキュベーションを実施し、その時点で低酸素培養物を９５％窒素／５％ＣＯ２で満たした気密チャンバーに分割し、したがって、培養培地中で低酸素環境が創出される。
【０１７７】
本発明の培養ステップのいずれかで使用される増殖培地または培養培地は、正常酸素条件下であるか低酸素条件下であるかにかかわらず、血清を含んでもよく、血清を含まなくてもよい。さらに、低酸素培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）と有酸素培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）の両方に同じ培地を使用することができる。
【０１７８】
インキュベーション条件は、低酸素増殖条件を維持するためのｐＨ、温度、およびガス（例えば、Ｏ２、ＣＯ２など）の適切な条件である。
【０１７９】
ＶＩ．マーカーの発現
細胞培養物または細胞集団における特定の細胞型の量を決定するために、培養物中または集団内の特定の細胞型を他の細胞と区別する方法が望ましい。したがって、その存在、不在、および／または相対的な発現レベルが、本発明に従って作製される特定の細胞型に特異的であるマーカーが提供され、同様にそのようなマーカーの発現を検出し、決定するための方法が提供される。
【０１８０】
本明細書で使用される場合、「発現」とは、材料または物質の作製ならびに材料または物質の作製のレベルまたは量を指す。したがって、特異的なマーカーの発現を決定することとは、発現するマーカーの相対量もしくは絶対量のいずれかを検出すること、または単にマーカーの存在または不在を検出することを指す。
【０１８１】
本明細書で使用される場合、「マーカー」とは、観察または検出することができる任意の分子を指す。例えば、マーカーとしては、これだけに限定されないが、特定の遺伝子の転写物などの核酸、遺伝子のポリペプチド産物、遺伝子産物ではないポリペプチド、糖タンパク質、炭水化物、糖脂質、脂質、リポタンパク質、または小分子を挙げることができる。
【０１８２】
マーカーの存在、不在、および／または発現レベルは、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって決定することができる。例えば、ＣＸＣＲ−４、ＣＤ１１７、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ１、ＣＤ３１、ＣＤ３４、およびＨＮＦ４Ａなどのある特定の遺伝子マーカーによって産生される転写物の量を定量的ｑＰＣＲによって決定する。さらに、免疫組織化学的検査またはフローサイトメトリーを使用して、上記の遺伝子によって発現されるタンパク質を検出することができる。ｑＰＣＲ、フローサイトメトリー、および免疫組織化学的検査を使用して、そのようなマーカーの量または相対的な割合を同定および決定することができる。
【０１８３】
ＶＩＩ．内胚葉前駆体およびベータ細胞の使用
本発明のある特定の態様の方法および組成物によって提供される内胚葉前駆体およびベータ細胞は、種々の適用において使用することができる。これらとしては、これだけに限定されないが、いくつか挙げると、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるベータ細胞の移植または埋め込み；細胞傷害性の化合物、発がん物質、突然変異原増殖／制御因子、医薬化合物などのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるスクリーニング；糖尿病の機構の解明；薬物および／または増殖因子が作動する機構の試験；患者における糖尿病の診断およびモニタリング；遺伝子療法；ならびに生物活性のある産物の産生がある。
【０１８４】
Ａ．試験化合物のスクリーニング
本発明の、分化により引き出された内胚葉前駆細胞またはベータ細胞を使用して、本明細書において提供されるベータ細胞の特性に影響を及ぼす因子（例えば、溶媒、小分子薬物、ペプチド、およびポリヌクレオチドなど）または環境条件（例えば、培養条件または操作など）についてスクリーニングすることができる。
【０１８５】
いくつかの適用では、幹細胞（分化したものまたは未分化のもの）を使用して、細胞の膵島ベータ細胞系列に沿った成熟化を促進する、またはそのような細胞の培養物中での長期間の増殖および維持を促進する因子をスクリーニングする。例えば、候補ベータ細胞成熟化因子または増殖因子を異なるウェル中の内胚葉前駆細胞に添加し、次いで、それにより生じたあらゆる表現型の変化をさらなる培養および細胞の使用に関して望ましい基準に従って決定することによってそれらを試験する。
【０１８６】
本発明の特定のスクリーニングへの適用は、薬物研究における医薬化合物の試験に関する。読者は一般に標準の教本であるIn  vitro  Methods  in  Pharmaceutical  Research、Academic  Press、１９９７年、および米国特許第５，０３０，０１５号を参照する）。本発明のある特定の態様では、内胚葉前駆細胞またはベータ細胞系列に分化する細胞は、短期培養において内胚葉細胞株または一次内胚葉細胞に対して予め実施した標準の薬物スクリーニングおよび毒性アッセイのための試験細胞としての役割を果たす。候補医薬化合物の活性の評価は、一般に、本発明のある特定の態様で提供される内胚葉前駆体またはベータ細胞を候補化合物と混ぜ、化合物に起因する細胞の形態、マーカー表現型、または代謝活性のあらゆる変化を決定し（処理していない細胞または不活性な化合物で処理した細胞と比較して）、次いで、化合物の効果と観察された変化との相互関係を明らかにすることを伴う。化合物が内胚葉前駆細胞またはベータ細胞に対する薬理学的効果を有するように設計されていることを理由に、または、他の箇所に対する影響を有するように設計した化合物がベータ細胞に対する意図されたものではない副作用を有し得ることを理由に、スクリーニングを行うことができる。２種またはそれ超の薬物を組み合わせて（細胞と同時にまたは逐次的に混ぜることによって）試験して、可能性のある薬物間相互作用効果を検出することができる。いくつかの適用では、化合物を、ベータ細胞に対する毒性についてスクリーニングする。例えば、Kuzuyaら、２００１年を参照されたい。
【０１８７】
Ｂ．ベータ細胞療法および移植
本発明は、おそらく糖尿病に起因してそのような療法を必要とする対象に対する、ある程度の膵臓機能を修復するための、本明細書において提供されるベータ細胞の使用も提供する。例えば、本明細書に開示されている方法によって引き出された膵島ベータ細胞および内胚葉前駆細胞を使用して、糖尿病を治療することができる（例えば、移植片を工学的に作製することによってなど）。
【０１８８】
本明細書において提供されるベータ細胞の治療への適用に対する適合性を決定するために、細胞をまず適切な動物モデルにおいて試験することができる。１つのレベルでは、細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生存し、表現型を維持する能力について評価する。本発明で提供されるベータ細胞を免疫不全動物（例えば、ＳＣＩＤマウス、または化学的にまたは放射線照射によって免疫不全にした動物など）の、腎臓被膜の下、脾臓内、または肝小葉内などのさらに観察しやすい部位に投与する。数日から数週間またはそれ超までの期間後に組織を採取し、多能性幹細胞などの出発細胞型が依然として存在するかどうかに関して評価する。これは、投与される細胞に検出可能な標識（例えば、緑色蛍光タンパク質、またはβ−ガラクトシダーゼなど）をもたらすことによって、または、投与される細胞に特異的な構成的マーカーを測定することによって実施することができる。本発明で提供されるベータ細胞をげっ歯類モデルにおいて試験する場合、投与される細胞の存在および表現型は、ヒト特異的抗体を使用した免疫組織化学的検査もしくはＥＬＩＳＡによって、またはヒトポリヌクレオチド配列に特異的な増幅を引き起こすプライマーおよびハイブリダイゼーション条件を使用したＲＴ−ＰＣＲ分析によって評価することができる。遺伝子発現をｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで評価するための適切なマーカーは本開示の他の箇所において提供される。
【０１８９】
本発明の方法によって提供されるベータ細胞および内胚葉前駆細胞を、糖尿病を治療するそれらの能力について種々の動物モデルにおいて試験することができる。本発明のある特定の態様において使用することができる種々のそのような動物モデルは、例えば、SrinivasanおよびRamarao（２００７年）およびKing（２０１２年）において考察されている。好ましい動物モデルは、実験的な糖尿病が誘導されるようにストレプトゾトシンを用いて処理した免疫無防備状態のマウスである。分化させたベータ細胞を腎臓被膜内に埋め込むことができ、細胞が機能性であれば、糖尿病は逆転する。このアッセイは、一般に、死体島の機能を試験するために使用される。
【０１９０】
その酵素のプロファイル、または動物モデルにおける有効性に従って望ましい機能特性が実証される、本発明のある特定の態様で提供されるベータ細胞および内胚葉前駆細胞は、それを必要とするヒト対象への直接投与にも適し得る。ベータ細胞を直接膵臓に送達することができる。
【０１９１】
本発明のある特定の態様で提供されるベータ細胞または内胚葉前駆体は、任意のそれを必要とする対象の療法のために使用することができる。そのような療法に適し得る好ましいヒトの状態は糖尿病である。ヒト療法に関して、用量は、一般に、細胞約１０９個から１０１２個の間、一般には、細胞約５×１０９から５×１０１０個の間であり、対象の体重、苦痛の性質および重症度、ならびに投与される細胞の複製に関わる能力に関して調整される。治療の様式および適切な用量を決定することの最終責任は管理する臨床医にある。
【０１９２】
本発明のある特定の態様は、バイオエンジニアリングによって作製された組織移植片の一部を形成する、本明細書において提供されるベータ細胞または内胚葉前駆細胞を含む。そのような組織移植片は、膵組織移植片であってよい。
【０１９３】
Ｃ．商業目的、治療目的、および研究目的のための配布
製造、配布、および使用のために、本発明の内胚葉前駆体を含めたベータ細胞系列細胞は、一般には、等張性賦形剤または培養培地中の細胞培養物または浮遊物の形態で、任意選択で輸送または保管を容易にするために凍結して供給される。
【０１９４】
本発明は、製造、分布、または使用の間のいつでも存在する細胞のセットまたは組合せを含む異なる試薬系も包含する。細胞セットは、本開示に記載され、例示されているが、分化由来細胞（ベータ細胞系列細胞、それらの前駆物質および亜型）に限定されない細胞集団の２つのまたはそれ超の任意の組合せを、未分化の幹細胞または他の分化細胞型と組み合わせて含む。セット内の細胞集団は、時には同じゲノムまたはその遺伝子改変された形態を共有する。セット内の各細胞型は一緒に、または、同じ設備内もしくは異なる場所で、同じ時間もしくは違う時間に、同じ実体または取引関係を有する異なる実体の制御下で包装されてよい。
【実施例】
【０１９５】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示されている技法は、本発明者により、本発明の実施においてよく機能することが発見された技法であり、したがって、それを実施するための好ましい方式を構成するとみなせることが当業者には理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、それでもなお、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを理解するべきである。
【０１９６】
（実施例１）
胚体内胚葉（ＤＥ）細胞の生成
ＴｅＳＲまたはＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地の存在下、フィーダーフリー条件下でヒトｉＰＳＣを維持した。ｉＰＳＣの単層内胚葉前駆体分化のために、ＰＳＣをＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングしたディッシュに８０％集密度でプレーティングした。未分化のｉＰＳＣを、１０％ＳＦＤ、１×グルタミン、ＭＴＧ（４．５×１０−４Ｍ）を補充したＲＰＭＩ培地中、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはノーダル（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下、無血清条件下でゼロ日目に培養し、その後、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ４（０．５ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）をさらに補充したＲＰＭＩ／１０％ＳＦＤ培地中、無血清条件下で２日間培養した。この後、ＭＴＧ（４．５×１０−４Ｍ）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（０．５ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＳＦＤ培地中で、２日後に培地を交換して４日間培養した。ＳＦＤ培地はChengら（２０１２年b）の通り作製した。試料採取のために、細胞の一部を採取し、個別化し、ＣＸＣＲ４およびＣＤ１１７の表面発現ならびにＦｏｘＡ１、Ｓｏｘ１７、およびＦｏｘＡ２の細胞内発現について特異的抗体を使用して染色し、フローサイトメトリーを使用して可視化した（図１および図２Ａ〜Ｆ）。ＣＸＣＲ４、ＣＤ１１７、ＦｏｘＡ２、およびＦｏｘＡ１の同時発現によって定義されるこの細胞集団は５日目と７日目の間に生成した。ＤＥ生成のさらなる最適化およびさらなる実施形態が以下に提供される。
【０１９７】
（実施例２）
ＤＥの生成に対する播種密度の影響
Ｍａｔｒｉｇｅｌ上Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８を使用して維持した未分化のｉＰＳＣを異なる１ｃｍ２当たりの播種密度（例えば、５０００、１５，０００、および２０，０００）で、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上にプレーティングした。プレーティングの４日後、１ｃｍ２当たり細胞１５，０００個および１ｃｍ２当たり細胞２０，０００個で播種した細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含有する９０％ＲＰＭＩ／１０％ＳＦＤ培地中に２４時間置いた（Ｔ０）。次の日に、培養物を、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、２．５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、および１０ｎｇ／ｍＬのゼブラフィッシュＦＧＦ２を含有する培地中に４８時間置いた（Ｔ１／Ｔ２）。最後に、培養物を、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、２．５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、および１０ｎｇ／ｍＬのゼブラフィッシュＦＧＦ２を補充したＳＦＤ培地中に次の４〜５日間置いた（Ｔ３〜Ｔ６）。このステップ時に、任意選択で、細胞を最大１２日間インキュベートすることができる。３日目から６日目まで、ＴｒｙｐＬＥを使用して細胞を採取した。各時点で消化後の総生存細胞数を決定した（図１６Ａ）。ＣＸＣＲ４、ＣＤ１１７同時発現細胞の百分率を表面染色によって決定し（図１６Ｄ）、ＦｏｘＡ２発現およびＦｏｘＡ１発現の百分率（図１６Ｃ）を細胞内フローサイトメトリーによって数量化した。各時点でプロセスの効率をＤＥ発現細胞の絶対数／総細胞数の比として決定した。
【０１９８】
（実施例３）
ＣＨＩＲの補充はＤＥの生成に必須ではない
Ｍａｔｒｉｇｅｌ上Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８を使用して維持した未分化のｉＰＳＣをＭａｔｒｉｇｅｌ上に１ｃｍ２当たり細胞１３，０００個の播種密度でプレーティングした。プレーティングの４日後、細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含有する９０％ＲＰＭＩ／１０％ＳＦＤ培地中に１日置き、その後、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、２．５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、および１０ｎｇ／ｍＬのゼブラフィッシュＦＧＦ２を補充した９０％ＲＰＭＩ／１０％ＳＦＤと一緒に次の２日間インキュベートした。４日目から１２日目まで、細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、２．５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、および１０ｎｇ／ｍＬのゼブラフィッシュＦＧＦ２を補充したＳＦＤ培地中に置いた。分化の１日目に２μＭのＣＨＩＲの補充を１つのセットには含めたが、別のセットには含めなかった。７日目にＴｒｙｐＬＥを使用して細胞を採取した。各時点で消化後の総生存細胞数を決定した。ＣＸＣＲ４、ＣＤ１１７同時発現細胞の百分率を細胞表面染色によって、フローサイトメトリーによって決定した（表１）。ＣＸＣＲ４／ＣＤ１１７２重陽性細胞の絶対数を算出した。インプットｉＰＳＣとアウトプットＤＥの比も数量化した（表１）。内胚葉誘導のゼロ日目にＣＨＩＲを添加することにより、ＤＥ形成の効率の上昇はもたらされなかった。
【表１】
0006602288.tif 000002
【０１９９】
（実施例４）
ＤＥ誘導に対する低酸素の影響
幹細胞ニッチにおける酸素濃度（通常２％〜９％Ｏ２）は、恒常性を維持すること、胚発生を容易にすること、多数のシグナル伝達カスケードを調節すること、および分化を誘導するために幹細胞多能性を維持することにおいて極めて重大な役割を果たす（Langnerら、２０１０年）。未分化のｉＰＳＣ（２．０３８  ＡＴ４ＥＧＮ）をＭａｔｒｉｇｅｌ上Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８を使用して、低酸素条件下（５％Ｏ２）、ネオマイシン（１００μｇ／ｍＬ）およびピューロマイシン（６００ｎｇ／ｍＬ）の存在下で少なくとも５回の継代にわたって維持した。０．５ｍＭのＥＤＴＡおよびＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地を使用して細胞を繁殖させた。細胞の播種密度は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上１ｃｍ２当たり細胞１５，０００〜３０，０００個で変動させた。
【０２００】
ｉＰＳＣを少なくとも５回の継代にわたって低酸素条件に最適に順応させた後、細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ上に１ｃｍ２当たり細胞１５，０００個の密度でプレーティングした。プレーティングの４日後、細胞を１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、２．５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、および１０ｎｇ／ｍＬのゼブラフィッシュＦＧＦ２を含有するＳＦＤ培地中に次の８日間置いた。Ｍａｔｒｉｇｅｌ上で維持したｉＰＳＣを使用して、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８を正常酸素条件下で使用した並行分化をセットアップした。８日目にＴｒｙｐＬＥを使用して両方のセットを採取した。消化後の総生存細胞数を決定し、ＣＸＣＲ４、ＣＤ１１７同時発現細胞の百分率を細胞表面染色によって、フローサイトメトリーによって決定した。ＦｏｘＡ１／ＦｏｘＡ２／Ｓｏｘ１７の百分率を、細胞内フローサイトメトリーを使用して数量化した（図１７）。
【０２０１】
低酸素条件下で維持したｉＰＳＣは正常酸素条件下で維持したｉＰＳＣと比較して高い純度でＤＥを生成する。正常酸素の細胞では約５０％のＤＥ陽性染色が実証されたが、低酸素の細胞では、８０％〜９０％のＤＥ陽性染色が発現した。以下に考察されている通り、低酸素条件により、ＤＥを生成するためのプロセスの改善、ならびにＥＰＣのサイクリングの持続時間の増加がもたらされる。プロセスの効率はおよそ１：２０（ｉＰＳＣ：ＤＥ）であった。
【０２０２】
（実施例５）
内胚葉前駆体（ＥＰ）細胞の生成
ＴｒｙｐＬＥを使用してＤＥ細胞を採取し、個別化した細胞をクエンチ培地中で洗浄した。培養物の総生存細胞数を決定した。細胞を再度洗浄し、生じた細胞ペレットを氷上に置いた。低温の、予め冷却したニートＭａｔｒｉｇｅｌ溶液を細胞ペレットに０．３ｍｇ／ｍｌから０．６ｍｇ／ｍｌの間の濃度で添加した。予め冷却した、グルタミン（１×）、ＭＴＧ（４．５×１０−４Ｍ）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）、１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２、および２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを含有し、１μＭのＨ１１５２または１０μＭのＹ−２７６３２のいずれかのＲｏｃｋ阻害剤を含有する無血清ＳＦＤ培地を、予め冷却したピペットチップを使用して氷上で細胞とＭａｔｒｉｇｅｌの混合物に添加し、気泡の形成を防ぐために穏やかに混合した。最終的な細胞密度は１ｍｌ当たり細胞０．２５個から１００万個の間であった。生じたＭａｔｒｉｇｅｌ細胞浮遊液を１２５スピナーフラスコに移した。スピナーを通常の酸素（２０％）および５％ＣＯ２下に置き、スピナーの速度を４０ＲＰＭから７０ＲＰＭの間で変動させた。１２〜１８時間以内に集合体が形成された。次の日に、細胞の集合体を静置し、スピナーから上清培地を廃棄した。細胞の集合体を、グルタミン（１×）、ＭＴＧ（４．５×１０−４Ｍ）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）、１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、ならびに、それぞれ２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、ＥＧＦおよびＦＧＦ２を含有する無血清ＳＦＤ培地中に置いた。スピナーに毎日半供給するか４８時間毎に完全培地交換を実施した。他の関連する実験では、浮遊集合体を約５日毎に解離、再集合させた。プロセス全体を通して様々な時点でＥＰ集合体を試料採取した。
【０２０３】
試料採取のために、所望の体積の集合体をスピナーから取り出し、集合体を遠心分離によって（１２００ｒｐｍ、５分）遠心沈澱させた。集合体をトリプシン消化によって個別化し、クエンチし、洗浄し、細胞計数およびＦＡＣ染色のために細胞を適切な培地に再浮遊させた。図２Ｇには、ｈｉｓｔｏｇｅｌに包埋し、ＨＮＦ３アルファ、ＨＮＦ４アルファ、およびＳｏｘ１７発現の存在について染色した、浮遊培養物中のインタクトな１５日目のＥＰＣ集合体の代表的な画像が示されている。生存細胞の存在を図３に示されている通り数量化した。ＣＸＣＲ４／ＣＤ１１７／ＦｏｘＡ１／Ｓｏｘ１７発現のレベルをフローサイトメトリーによって数量化した（図４）。
【０２０４】
（実施例６）
ＭａｔｒｉｇｅｌによりＤＥが保存されるがＭＥＦはＥＰＣサイクリングに必須ではない
ＭａｔｒｉｇｅｌおよびＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地を使用して維持した未分化のｉＰＳＣから生成した胚体内胚葉細胞を、ＴｒｙｐＬＥを使用して採取した。採取後、個別化した細胞をクエンチ培地中で洗浄した。培養物の総生存細胞数を決定した。細胞を再度洗浄し、生じた細胞ペレットを氷上に置いた。低温の、予め冷却したニートＭａｔｒｉｇｅｌ溶液を細胞ペレットに０．３ｍｇ／ｍｌの濃度で添加した。予め冷却した、１μＭのＨ１１５２または１０μＭのＹ−２７６３２のいずれかのＲｏｃｋ阻害剤を補充した無血清ＥＰＣサイクリング培地（ＩＭＤＭ：Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（３：１）、０．５％Ｂ２７、０．５％Ｎ２、０．１％ＢＳＡ、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、０．４５μＭのＭＴＧ、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸、５０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ（ゼブラフィッシュＦＧＦ２または熱安定性ＦＧＦ１のいずれか）、２．５ｎｇ／ｍＬのアクチビン（Activin）、および０．１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ）を氷上で細胞とＭａｔｒｉｇｅｌの混合物に１ｍＬ当たり細胞０．２５百万個から０．５百万個の間の最終密度で添加した。生じた細胞浮遊液を１２５スピナーフラスコに移した、または静置条件下で超低付着容器に入れた。培養物を遠心沈澱させ、１２時間後に、Ｒｏｃｋ阻害剤を欠く新鮮なＥＰＣサイクリング培地に入れた。
【０２０５】
ＥＰＣ集合体を遠心沈澱させ、１日おきに新鮮なＥＰＣサイクリング培地を供給した。４日目、８日目、および１２日目に培養物を再集合させた。集合体を、ＴｒｙｐＬＥを使用して５〜１０分にわたって個別化し、クエンチし、洗浄した。新鮮なＭａｔｒｉｇｅｌおよびＲｏｃｋ阻害剤の存在下で培養物を再集合させた。１２〜１８時間後に培地を交換し、その時点で、培養物を、Ｒｏｃｋ阻害剤を欠くＥＰＣサイクリング培地に入れた。
【０２０６】
ＥＰＣ培養物を、０．３ｍｇ／ｍＬのＭａｔｒｉｇｅｌを用いてまたは用いずに、およびＥＰＣ１００個当たり１個のＭＥＦを用いてまたは用いずに１５日間維持した。１５日間の最後に、ＴｒｙｐＬＥまたは０．５％トリプシンまたはディスパーゼ（２ｍｇ／ｍｌ）とトリプシンの組合せを使用してＥＰＣ培養物を採取した。個別化した細胞浮遊液をクエンチし、洗浄し、消化後の総生存細胞数を決定した。ＤＥマーカーであるＣＸＣＲ４、ＣＤ１１７、ＦｏｘＡ２、およびＦｏｘＡ１の百分率をフローサイトメトリーによって数量化した。プロセスの効率を、実験の最後に得られた生存ＤＥ細胞の絶対数／総生存細胞数の比として決定した。
【０２０７】
Ｍａｔｒｉｇｅｌにより保護されたＤＥ発現細胞の表現型発現の存在（図１８Ａ）。ＥＰＣ培養物の純度はＭａｔｒｉｇｅｌの不在下で低下した（図１８Ａ）。Ｍａｔｒｉｇｅｌの存在下ではＤＥ生成の効率も増強された。ＥＰＣサイクリングの間のＭＥＦの存在は必須ではなかった。３Ｄ培養物のＥＰＣ純度（図１８Ｃおよび図１８Ｅ）および収率（図１８Ｂおよび図１８Ｄ）はＭＥＦの不在下で保持された。
【０２０８】
（実施例７）
定義済みのフィーダーフリー低酸素条件下でのＥＰＣサイクリング
ＭａｔｒｉｇｅｌおよびＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地を使用して維持した種々の未分化ｉＰＳＣＳから生成した胚体内胚葉細胞を、ＴｒｙｐＬＥを使用して５〜１０分にわたって採取した。個別化したＤＥをクエンチし、洗浄した。培養物の総生存細胞数を決定した。細胞を再度洗浄し、生じた細胞ペレットを氷上に置いた。低温の、予め冷却したニートＭａｔｒｉｇｅｌ溶液を細胞ペレットに０．３ｍｇ／ｍｌの濃度で添加した。予め冷却した、Ｒｏｃｋ阻害剤（１μＭのＨ１１５２）を補充したＴ３／Ｔ６培地（１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、２．５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、および１０ｎｇ／ｍＬのゼブラフィッシュＦＧＦ２を補充したＳＦＤ培地）を氷上で細胞とＭａｔｒｉｇｅｌの混合物に１ｍＬ当たり細胞０．２５百万個から０．５百万個の間の最終密度で添加した。生じた細胞浮遊液を１２５スピナーフラスコに移した。低酸素条件下、スピナーの速度を７０ｒｐｍにセットした。培養物を遠心沈澱させ、１２〜１８時間後に、５０％Ｔ３／Ｔ６培地およびＲｏｃｋ阻害剤を欠く５０％無血清ＥＰＣサイクリング培地を含む新鮮な培地に入れた。ＥＰＣ集合体を遠心沈澱させ、１日おきに新鮮なＥＰＣサイクリング培地を供給し、その後、無血清ＥＰＣサイクリング培地を供給した。上記の通りＴｒｙｐＬＥ消化した後、４日目、８日目、および１２日目に、０．３ｍｇ／ｍｌのＭａｔｒｉｇｅｌを用いて培養物を再集合させた。２．０３８  ＡＴ４以外の全ての細胞株がＲｏｃｋ阻害剤（Ｈ１１５２）の存在下で再集合した。ＥＰＣの継代毎に総生存細胞数を推定した。スピナー培養物を低酸素条件下に置いたままにした。結果により、フィーダーフリーＥＰＣサイクリング相の間のＥＰＣの増殖が示されている（図１９Ａ）。２．０３８ＡＴ４（１００μｇ／ｍＬのネオマイシンおよび６００ｎｇ／ｍＬのピューロマイシンの存在下で維持したもの）は親ｉＰＳＣと比較して最も増殖性であった。この細胞株は、Ｅｒｇ発現カセットおよびＧＦＩ１発現カセットを含み、これらの発現はドキシサイクリン誘導によって制御される。２．０３８ＭＡＦＡ細胞（ＥＰＣサイクリングの間以外はＧ４１８の存在下で維持したもの）はＭＡＦＡ発現カセットを含み、この発現は、ドキシサイクリン誘導によって制御される。ＥＰＣサイクリングの間の各時点でＥＰＣ培養物の純度をフローサイトメトリーによって決定した。ＣＸＣＲ４／ＣＤ１１７／ＦｏｘＡ１／ＦｏｘＡ２／Ｓｏｘ１７の平均発現を数量化した。同じｉＰＳＣクローンの種々の実験の実行からのＥＰＣの純度を平均し、標準誤差を算出した（図１９Ｂ）。結果により、フィーダーフリー低酸素条件下でサイクリングした種々のｉＰＳＣクローンについての平均純度が約５０％であったことが示される。
【０２０９】
（実施例８）
定義済みのフィーダーフリー低酸素条件下でのＥＰＣ培養物のｑＰＣＲ分析
胚体内胚葉およびＥＰＣ集合体サイクリングに関連する遺伝子の発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって数量化した（図２０）。４〜５日間毎に、０．５％トリプシン−ＥＤＴＡを使用して、３７℃、１０〜２０分にわたってＥＰＣを採取した。細胞を勢いよくピペッティングして、単一細胞浮遊液を創出した。ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅを用いてＲＮＡを処理し、ＱｉａｇｅｎからのＲｎｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（カタログ番号７４１３６）を製造者の指示に従って使用して単離した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００を使用してＲＮＡ数量化を実施した。
【０２１０】
ＰｒｏｍｅｇａからのＩｍＰｒｏｍ−ＩＩ  ＲＴ  Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号Ａ３８００）を製造者の指示に従って用いてＲＮＡを逆転写した。ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（カタログ番号４３６９０１６）およびＴａｑＭａｎプローブ（カタログ番号４３３１１８２；ＣＸＣＲ４：Ｈｓ００２３７０５２＿ｍ１；Ｃｋｉｔ：Ｈｓ００１７４０２９＿ｍ１；Ｓｏｘ１７：Ｈｓ００７５１７５２＿ｓ１；ＦｏｘＡ１：Ｈｓ００２７０１２９＿ｍ１；ＦｏｘＡ２：Ｈｓ００２３２７６４＿ｍ１；ＧＡＰＤＨ：Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１）を使用して、技術的３連で、Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒで４０サイクル行ってｒｔ−ｑＰＣＲを実施した。誘導倍率をＤｅｌｔａＣｐによって算出し、ＧＡＰＤＨに対して正規化した。遺伝的背景が同じである未分化ｉＰＳＣ（陰性対照）では遺伝子発現は見られなかった。陽性対照であるＷ２  Ｐ１６および２．０３８  Ｐ２では未知のものと同様のプロファイルが実証された。
【０２１１】
ＣＤ３４は、後期ＥＰＣ培養物のマーカーであることが見いだされた。２．０３８ＡＴ４、２．０３８  ＭＡＦＡ親細胞、および２．０３８親細胞から生成した３Ｄ  ＥＰＣ培養物をＥＰＣサイクリングの間の種々の継代時に採取し、ＣＤ３４の存在について染色した。トリプシンを使用してＥＰＣ集合体を個別化し、クエンチし、洗浄し、ＣＸＣＲ４およびＣＤ１１７と一緒にＣＤ３４の存在について染色した。ＥＰＣサイクリングの異なる段階におけるＣＤ３４陽性細胞の百分率を、フローサイトメトリーを使用して数量化した。ＣＤ３４発現の程度は異なるｉＰＳＣクローンについて変動した。２．０３８に由来するＥＰＣは２％〜１５％のＣＤ３４を発現し、２．０３８（ＭＡＦＡ）に由来するＥＰＣは２％〜２５％のＣＤ３４陽性細胞を発現し、２．０３８ＡＴ４は４％〜３５％のＣＤ３４を発現する（図２１）。新生ＣＤ３４細胞はＣＤ１１７／ＣＸＣＲ４陽性である。
【０２１２】
（実施例９）
最終段階のＥＰＣ培養物の精製
最終段階のＥＰＣ培養物を採取し、０．５％トリプシン溶液を使用して個別化した。細胞浮遊液をクエンチし、洗浄し、ＰＥとコンジュゲートしたＣＸＣＲ−４／ＣＤ１１７／ＣＤ３４と一緒に４℃で２０分インキュベートした。細胞を洗浄し、磁気抗ＰＥ抗体と一緒に４℃で２０分インキュベートした。細胞を洗浄し、ＭＡＣＳカラムを製造者の説明書に従って使用して精製した。陽性画分の純度および細胞数を決定した（図２２）。細胞を、Ｒｏｃｋ阻害剤を補充したＥＰＣ改変培地中のニートＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングしたプレート上に置いた。プレーティングの１２〜１８時間後、細胞を、Ｒｏｃｋ阻害剤を伴わない新鮮なＥＰＣ改変培地に入れた。プレーティングの５日後、ベータ細胞分化を開始した。
【０２１３】
（実施例１０）
ＥＰＣ集合体の膵臓分化
浮遊培養で生成したＥＰＣを、膵臓細胞型を生成するために分化培地に入れた（図８）。ＥＰ細胞の膵臓分化のために、Nostroら（２０１１年）に記載されており、Chengら（２０１２年a）によってさらに改変されたプロトコールを利用した。プロセス全体を３Ｄ培養物として継続した。
【０２１４】
ＥＰＣ培養物を１５日間増大させ、Ｗｎｔ３Ａ（３ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ−１０（５０ｎｇ／ｍｌ）およびドルソモルフィン（０．７５μＭ）を含有するＳＦＤ培地中で３日間培養して、前腸／中腸内胚葉細胞を生成した。細胞をＧｌｕｔａＭＡＸ（１％）、レチノイン酸を伴わないＢ２７（１％）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（１％）、ＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ）、トランス−レチノイン酸（２μＭ）、ノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＦＧＦ−１０（５０ｎｇ／ｍｌ）を含有する高グルコースＤＭＥＭ培地中で３日間培養して、膵臓内胚葉細胞を生成した。このステップの後、細胞をＧｌｕｔａＭＡＸ（１％）、レチノイン酸を伴わないＢ２７（１％）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（１％）、ＳＢ４３１５４２（６μＭ）、およびノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）を含有する高グルコースＤＭＥＭ培地中で３日間培養した。次に、細胞を以前の、γＳｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤（ＤＡＰＴ、２μＭ）を補充した高グルコースＤＭＥＭ培地中で１〜２日間培養した。この段階から、細胞をグルコース（４０ｍＭ）、ニコチンアミド（１０ｍＭ）、ＳＢ４３１５４２（６μＭ）、およびノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）を含有するＳＦＤ培地中で１〜２日間培養した。最後に、細胞をＳＢ４３１５４２（５．４μＭ）、ノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（８００ｐＭ、０．４７μｌ／ｍｌ）、およびニコチンアミド（１０ｍＭ）を含有するＳＦＤ培地であって、追加的なグルコース（４０ｍＭ）を添加した培地と追加的なグルコース添加していない培地を毎日交互に用いて次の１０日間培養した。
【０２１５】
試料採取のために、所望の体積の集合体をスピナーから取り出し、集合体を遠心分離によって（１２００ｒｐｍ、５分間）遠心沈澱させた。集合体をトリプシン消化によって個別化し、クエンチし、洗浄し、プロセスの種々の日数における生存細胞数を決定した（図５）。個別化した細胞を、細胞内染色を実施し、陽性細胞の百分率をフローサイトメトリーによって評価することによってＰＤＸ−１の存在について染色した（図６および図７）。インタクトな、１５日経過ＥＰＣ集合体を膵臓分化プロセスの１５日目にｈｉｓｔｏｇｅｌに包埋し、ＰＤＸ−１の存在について免疫組織化学的検査によって染色した（図８）。
【０２１６】
集合体の分化の状態を評価するために、インタクトな、１５日経過ＥＰＣ集合体を膵臓分化プロセスの１８日目にｈｉｓｔｏｇｅｌに包埋し、ソマトスタチン（図１０Ａ〜Ｃ）、グルカゴン（図１０Ｄ〜Ｆ）、およびインスリン（図１０Ｇ〜Ｉ）の存在について免疫組織化学的検査によって染色した。集合体は、ソマトスタチンおよびグルカゴンの発現については陰性であるがインスリンの発現については陽性であることが見いだされた。膵臓分化の１８日目の、１５日経過ＥＰＣ集合体におけるＣ−ペプチド発現、グルカゴン発現、およびインスリン発現についての細胞内染色を、集合体を解離させた後に実施した（図１１）。マーカー発現に関するデータが表２に要約されている。ＥＰＣからベータ細胞を生成するためのプロセスの効率は０．３％である。
【表２】
0006602288.tif 000003
【０２１７】
集合体の分化の状態をさらに評価するために、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して膵臓全体、島、および２０日経過した集合体から全ＲＮＡを単離し、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて処理した。ランダムな六量体およびオリゴ（ｄＴ）をＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に使用してＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。以前に記載されている通りＴａｑｍａｎプローブおよびプライマーを使用してＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）でｑＰＣＲを実施した（Nostroら、２００８年）（図１２）。発現レベルをハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨに対して正規化した。
【０２１８】
Ｃ−ペプチド放出アッセイを、Ｍｅｒｃｏｄｉａ  Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｍｅｒｃｏｄｉａ）を使用して以前に記載されている通り実施した（D'Amourら、２００６年）。簡単に述べると、各ｉＰＳＣクローンに由来する、ベータ細胞分化プロトコールにおいて２５日目を過ぎた集合体を２４ウェルプレート中のｍｉｌｌｉｃｅｌｌ  ＰＣＦインサートに置いた。集合体をＫＲＢＨ培地１ｍｌ中、３７℃および５％ＣＯ２、２０％Ｏ２で１時間平衡化した。次に集合体を２．８ｍＭのグルコースを補充したＫＲＢＨ培地１ｍｌを含有する第２のウェルに入れ、インキュベーションを３７℃および５％ＣＯ２、２０％Ｏ２で１時間継続した。最後に、集合体を２８ｍＭのグルコースを補充したＫＲＢＨ培地１ｍｌに入れ、インキュベーションを３７℃および５％ＣＯ２、２０％Ｏ２で１時間継続した。非常に注意してウェルの移動間に残留した流体全ての集合体を流出させた。残った上清を収集し、−２０℃で保管した。約３０のヒト成体島もこのアッセイの陽性対照として使用した。ｉＰＳＣ由来のβ細胞および死体成体島を２．８ｍＭ（基底（Ｂａｓａｌ））または２８ｍＭ（グルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ））のＤ−グルコースで刺激した後、ＴｒｙＰＬＥを用いて集合体を消化し、試料当たりの総生存細胞数を決定した。Ｃ−ペプチド分泌を各試料について取得した総生存細胞数に基づいて正規化した（図１３）。初代ヒト島はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｍａｄｉｓｏｎ  ｉｓｌｅｔ  ｃｏｒｅ  ｄｉｖｉｓｉｏｎから購入した。
【０２１９】
（実施例１１）
ＭＥＦを用いずに３Ｄ集合体として繁殖させたＥＰＣからのベータ細胞の生成
２．０３８  ＡＴ４  ＥＰＣ培養物を採取し、０．５％トリプシン溶液を使用して個別化した。生じた細胞浮遊液をクエンチし、洗浄し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（０．３ｍｇ／ｍｌ）と混合した。集合体を低酸素条件下、１ｍｌ当たり細胞０．３百万個の細胞密度でＥＰＣサイクリング培地に入れた。最初の５日間、細胞に新鮮なＥＰＣサイクリング培地を供給し、再集合の６日後に、Nostroら（２０１１年）に記載されており、Chengら（２０１２年a）によってさらに改変されたプロトコールを使用して３Ｄ形式でベータ細胞分化を開始した。３Ｄ手法のスキームは図２３に提示されている。このスキームでは、ＥＰＣをＭＡＣ分離後、ベータ細胞分化の開始前に精製することができる。
【０２２０】
２．０３８  ＡＴ４細胞に由来する２８日目の最終段階のベータ細胞をフローサイトメトリー分析によって分析した。細胞を採取し、４％パラホルムアルデヒドを使用して固定し、０．１％サポニンを使用して透過処理し、ＰＤＸ、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｎｋｘ６．１、ソマトスタチン、グルカゴン、およびＣ−ペプチドの存在についてフローサイトメトリーによって染色した。陽性細胞の百分率が図２４Ａに示されている。ソマトスタチン／Ｃ−ペプチドおよびグルカゴン／Ｃ−ペプチドについて染色した後に生成したドットプロットが図２４Ｂに示されている。
【０２２１】
（実施例１２）
ＭＥＦを用いずに３Ｄ集合体として繁殖させたＥＰＣからのベータ細胞の生成
２．０３８細胞から浮遊培養で生成したＥＰＣを上記の通りＭＡＣＳ分離によって精製し、膵臓細胞型を生成するために分化培地に入れた。ＥＰ細胞の膵臓分化のために、Nostroら（２０１１年）に記載されており、Chengら（２０１２年a）によってさらに改変されたプロトコールを２Ｄ形式で利用した。２Ｄ手法のスキームは図２５に提示されている。
【０２２２】
ＥＰＣ培養物を精製し、ＥＰＣサイクリング培地の存在下、ニートＭａｔｒｉｇｅｌ上で５日間プレーティングした。前腸／中腸内胚葉細胞を生成するために、細胞をＷｎｔ３Ａ（３ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ−１０（５０ｎｇ／ｍｌ）およびドルソモルフィン（０．７５μＭ）を含有するＳＦＤ培地中に３日間置くことによってベータ細胞分化を開始した。膵臓内胚葉細胞を生成するために、細胞をＧｌｕｔａＭＡＸ（１％）、レチノイン酸を伴わないＢ２７（１％）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（１％）、ＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ）、トランス−レチノイン酸（２μＭ）、ノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＦＧＦ−１０（５０ｎｇ／ｍｌ）を含有する高グルコースＤＭＥＭ培地中で３日間培養した。このステップの後、細胞をＧｌｕｔａＭＡＸ（１％）、レチノイン酸を伴わないＢ２７（１％）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（１％）、ＳＢ４３１５４２（６μＭ）、およびノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）を含有する高グルコースＤＭＥＭ培地中で３日間培養した。次に、細胞を以前の、γＳｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤（ＤＡＰＴ、２μＭ）を補充した高グルコースＤＭＥＭ培地中で１〜２日間培養した。この段階から、細胞をグルコース（４０ｍＭ）、ニコチンアミド（１０ｍＭ）、ＳＢ４３１５４２（６μＭ）、およびノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）を含有するＳＦＤ培地中で１〜２日間培養した。最後に、細胞をＳＢ４３１５４２（５．４μＭ）、ノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（８００ｐＭ、０．４７μｌ／ｍｌ）、およびニコチンアミド（１０ｍＭ）を含有するＳＦＤ培地であって、追加的なグルコース（４０ｍＭ）を添加した培地と追加的なグルコース添加していない培地を毎日交互に用いて次の１０日間培養した。単一ホルモン性ベータ細胞の存在が２Ｄ形式での分化の１０日目から１５日目の間に検出された。
【０２２３】
ＰＤＸ／ＮｅｕｒｏＤ１／Ｃ−ペプチド／グルカゴン／ソマトスタチンを細胞内フローサイトメトリーによって定量化するために、分化の１５日目にベータ細胞の培養物を採取し、固定し、染色した（図２６Ａ）。最終段階の培養物では、１２％単一ホルモン性細胞の存在が明らかになった。最終段階の培養物はＰＤＸおよびＮｅｕｒｏＤ１について陽性であった。最終段階の集合体では、グルコースに対する反応性が明らかになった（図２６Ｂ）。グルコース応答アッセイを記載の通り実施し、データを細胞数に対して正規化した。
【０２２４】
Ｃ−ペプチド放出アッセイをＭｅｒｃｏｄｉａ  Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｍｅｒｃｏｄｉａ）を使用して以前に記載されている通り実施した（D'Amourら、２００６年）。簡単に述べると、各ｉＰＳＣクローンに由来する、ベータ細胞分化プロトコールにおいて２５日目を過ぎた集合体を２４ウェルプレート中のｍｉｌｌｉｃｅｌｌ  ＰＣＦインサートに置いた。集合体をＫＲＢＨ培地１ｍｌ中、３７℃および５％ＣＯ２、２０％Ｏ２で１時間平衡化した。次に集合体を、レベルを１ｍＭから２０ｍＭまで段階的に上昇させたグルコースを補充したＫＲＢＨ培地０．５ｍｌを含有する第２のウェルに入れた。各インキュベーションを３７℃および５％ＣＯ２、２０％Ｏ２で２０分間続けた。非常に注意してウェルの移動間に残留した流体全ての集合体を流出させた。残った上清を収集し、−２０℃で保管した。実験の最後に、データを正規化するために、ＴｒｙＰＬＥを用いて集合体を消化し、試料当たりの総生存細胞数を決定した。Ｃ−ペプチド分泌を各試料について取得した総生存細胞数に基づいて正規化した。
【０２２５】
（実施例１３）
ＭＥＦを用いずに３Ｄ集合体として繁殖させた２．０３８ＡＴ４  ＥＰＣからのベータ細胞の生成
２．０３８ＡＴ４．１４ＥＧＮ（２．０３８ＡＴ４とも称される）細胞を、ＣＨＩＲを用いず、２．５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４を使用したＤＥ誘導の間、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８中、低酸素条件下で維持した。ＤＥを、ＭＥＦを伴わないＥＰＣサイクリング培地中、低酸素条件下で維持した。培地は、ｉＰＳＣ培養、ＤＥ培養、およびＥＰＣサイクリングのためにネオマイシン（１００μｇ／ｍｌ）およびピューロマイシン（６００ｎｇ／ｍｌ）を補充したものであった。７日後に、ＥＰＣを採取し、ＣＤ３４／ＣＸＣＲ４／ＣＤ１１７を使用してＭＡＣＳ精製を実施した。精製された細胞をニートＭａｔｒｉｇｅｌ上、Ｒｏｃｋ阻害剤の存在下でプレーティングした。
【０２２６】
再集合の５日後に、Nostroら（２０１１年）に記載されており、Chengら（２０１２年a）によってさらに改変されたプロトコールに従って２Ｄ形式でベータ細胞分化を開始した。ベータ細胞分化プロセスの異なる段階においてＤｏｘを添加した。ベータ細胞分化の６日目から１５日目の間、ベータ細胞分化の８日目から１５日目の間、またはベータ細胞分化の１０日目から１５日目の間にＤｏｘ（１．５μｇ／ｍｌ）誘導を実施した。ＰＤＸ／ＮｅｕｒｏＤ１／Ｃ−ペプチド／グルカゴン／ソマトスタチンを細胞内フローサイトメトリーによって数量化するために、ベータ細胞分化の１５日目に細胞を採取し、固定し、染色した。１５日目における新生ベータ細胞の分析により、ＰＤＸ（図２７Ａ〜Ｄ）、ＮｅｕｒｏＤ１（図２７Ｅ〜Ｈ）、およびソマトスタチン／グルカゴン／Ｃ−ペプチドの存在が明らかになった（図２７Ｉ〜Ｌ）。分化の１５日目のベータ細胞では、低ソマトスタチン陽性細胞およびグルカゴン陽性細胞の欠如と一緒に、ＰＤＸ陽性細胞、ＮｅｕｒｏＤ１陽性細胞、およびＣ−ペプチド陽性細胞の存在が明らかになった。分化プロセスの１０日目から１５日目の間にＤｏｘを添加することにより、最高レベルの単一ホルモン性Ｃ−ペプチド陽性細胞が明らかになった。
【０２２７】
（実施例１４）
２．０３８ＡＴ４細胞に由来する、グルコース応答性の最終段階のベータ細胞
Ｃ−ペプチド放出アッセイを実施例１２に記載の通り実施した。１０日目から１５日目の間にＤｏｘ誘導を用いて誘導したベータ細胞の培養物では、１〜５ｍＭのグルコースに対する応答が生じた（図２８）。細胞数はＤｏｘ誘導された培養物において非誘導条件と比較して多かった。
【０２２８】
ＰＤＸ／ＮｅｕｒｏＤ１／Ｃ−ペプチド／グルカゴン／ソマトスタチンを細胞内フローサイトメトリーによって数量化するために、ベータ細胞分化の１５日目に細胞を採取し、固定し、染色した。最終段階のベータ細胞の培養物を長期分析するために、ベータ細胞を最終段階の培地に入れた。最大４週間の培養について培養物に単一ホルモン性細胞が存在することが明らかになった（図２９）。
【０２２９】
ベータ細胞分化の１０日目から１５日目の間にＤｏｘ（１．５μｇ／ｍｌ）を添加して再度実験を実施した。ベータ細胞分化の１５日目に細胞を採取し、ＰＤＸ／ＮｅｕｒｏＤ１／Ｃ−ペプチド／グルカゴン／ソマトスタチン発現レベルについて細胞内フローサイトメトリーによってアッセイした。細胞で２５％〜３０％ＰＤＸ／ＮｅｕｒｏＤ１発現が明らかになった。総Ｃ−ペプチドレベルはおよそ１０％でありそのうちの５％の細胞が単一ホルモン性だと思われた。グルカゴン発現は記録されなかった。Ｃ−ペプチド放出アッセイを上記の通り実施した。結果により、１〜１５ｍＭのグルコースに対する用量依存的な応答が明らかになった。Ｄｏｘ誘導したベータ細胞の培養物と誘導していないベータ細胞の培養物のどちらもグルコースに対する用量依存的な応答を引き出すことができた（図３０）。
【０２３０】
（実施例１５）
最終段階の培養物のｑＰＣＲ分析
４〜５日間毎に、０．５％トリプシン−ＥＤＴＡを使用して、３７℃、１０〜２０分にわたってＥＰＣを採取した。細胞を勢いよくピペッティングして、単一細胞浮遊液を創出した。ＱｉａｇｅｎからのＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（カタログ番号７４１３６）を製造者の指示に従って使用してＲＮＡを単離した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００を使用してＲＮＡ数量化を実施した。ＰｒｏｍｅｇａからのＩｍＰｒｏｍ−ＩＩ  ＲＴ  Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号Ａ３８００）を製造者の指示に従って用いてＲＮＡを逆転写した。ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（カタログ番号４３６９０１６）およびＴａｑＭａｎプローブ（カタログ番号４３３１１８２；ＩＮＳ：Ｈｓ０２７４１９０８＿ｍ１；ＧＣＧ：Ｈｓ０１０３１５３６＿ｍ１；ＳＳＴ：Ｈｓ００３５６１４４＿ｍ１；ニューロゲニン３：Ｈｓ０１８７５２０４＿ｓ１；ＮＫＸ６．１：Ｈｓ００２３２３５５＿ｍ１；ＰＤＸ１：Ｈｓ００２３６８３０＿ｍ１；ＮｅｕｒｏＤ１：Ｈｓ０１９２２９９５＿ｓ１；ＧＡＰＤＨ；Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１）を使用して技術的３連で、Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒで４５サイクルを行い、ｒｔ−ｑＰＣＲを実施した（図３１）。遺伝的背景が同じである未分化のｉＰＳＣを陰性対照として使用した。膵臓全体のＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎカタログ番号ＡＭ７９５４）およびＵＷ  Ｉｓｌｅｔ  Ｃｏｒｅから提供されたヒト島を陽性対照として使用した。遺伝的背景が同じである未分化のｉＰＳＣを陰性対照として使用した。誘導倍率をＤｅｌｔａＣｐによって算出し、ＧＡＰＤＨに対して正規化した。
【０２３１】
（実施例１６）
ＥＲＧ発現およびＧＦＩ発現についてのｉＰＳＣ／ＤＥ／ＥＰＣ／ベータ細胞のｑＰＣＲ分析
２．０３８細胞および２．０３８ＡＴ４細胞からの異なるプロセスの段階におけるＥＲＧ転写物のレベル（図３２Ａ）およびＧＦＩ転写物のレベル（図３２Ｂ）を数量化した。２．０３８ＡＴ４細胞のＤｏｘ誘導はベータ細胞分化段階においてのみ適用した。２．０３８ＡＴ４由来の細胞は、分化の段階にかかわらず常にネオマイシン（１００μｇ／ｍＬ）およびピューロマイシン（６００ｎｇ／ｍＬ）を含有する培地中で培養した。ＱｉａｇｅｎからのＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（カタログ番号７４１３６）を製造者の指示に従って使用して、２．０３８細胞および２．０３８ＡＴ４細胞に由来する未分化ｉＰＳＣ、ＤＥ、ＥＰＣ、およびベータ細胞の培養物からＲＮＡを単離した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００を使用してＲＮＡ数量化を実施した。ＰｒｏｍｅｇａからのＩｍＰｒｏｍ−ＩＩ  ＲＴ  Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号Ａ３８００）を製造者の指示に従って用いてＲＮＡを逆転写した。ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（カタログ番号４３６９０１６）およびＴａｑＭａｎプローブ（ＥＲＧ：Ｈｓ０１５５４６２９＿ｍ１；ＧＦＩ１：Ｈｓ００３８２２０７＿ｍ１；ＧＡＰＤＨ：Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１）を使用し、技術的３連で、Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒで４５サイクルを行い、ｒｔ−ｑＰＣＲを実施した。誘導倍率をＤｅｌｔａＣｐによって算出し、ＧＡＰＤＨに対して正規化した。遺伝的背景が同じである未分化のｉＰＳＣを陰性対照として使用した。膵臓全体のＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎカタログ番号ＡＭ７９５４）およびＵＷ  Ｉｓｌｅｔ  Ｃｏｒｅから提供されたヒト島を陽性対照として使用した。
【０２３２】
２．０３８ＡＴ４  ｉＰＳＣでは、Ｄｏｘ非誘導選択条件下でＥＲＧ／ＧＦＩ転写物の存在が明らかになり、ＥＰＣサイクリング全体を通してレベルが維持された。ベータ細胞分化の間のＤｏｘ誘導により、転写物のレベルのわずかな上昇があった。親２．０３８ＥＰＣ培養物では、ＥＰＣサイクリングおよびベータ細胞分化の間にＥＲＧのレベルが上方制御されることが明らかになった。理論に束縛されることなく、これらのデータにより、サイクリングの間の生存の促進およびＥＰＣ培養物の維持におけるＥＲＧおよびＧＦＩの役割が示される。Ｄｏｘ誘導した培養物では、非誘導条件よりも細胞数が多く、したがって、これらの転写因子は、ＥＰＣに由来するベータ細胞を保存するために役立ち得る。
【０２３３】
本明細書において開示され、特許請求されている方法は全て、本開示に照らして、過度な実験を伴わずに行い、達成することができる。本発明の組成物および方法は好ましい実施形態に関して記載されているが、本発明の概念、主旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法および方法のステップまたは一連のステップに変形を適用することができることが当業者には明らかになろう。より詳細には、化学的かつ生理的に関連するある特定の薬剤で本明細書に記載の薬剤を置換することができ、同時に、同じまたは同様の結果が実現されることが明らかになろう。当業者に対して明らかであるそのような同様の置換および修飾は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の主旨、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載のものを補足する例示的な手続き上のまたは他の詳細をもたらすものである限りでは、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ−Ｉ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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