(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質。
（ａ）  配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）  配列番号１に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列からなるタンパク質、および、
（ｃ）  上記（ａ）または（ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、かつ、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
糖鎖が付加された、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性のＫｍ値が２ｍＭ以下である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項６】
以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子。
（Ａ）  配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｂ）  配列番号４に記載の塩基配列からシグナルペプチドをコードする塩基配列を除いた塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｃ）  上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、
配列番号４に記載の塩基配列の９２０番目と９２１番目の間に挿入されたＧＴＡＡＧＴＣＴＣＣＣＧＡＴＧＧＡＧＡＡＴＣＣＴＡＡＡＡＴＧＡＣＡＧＡＴＡＧＧＴＡＡＴＧＡＴＧＣＴＡＴＣＡＣＡＧの塩基配列からなるイントロン、および、配列番号４に記載の塩基配列の１５４０番目と１５４１番目の間に挿入されたＧＴＡＡＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＡＡＡＴＴＡＴＡＴＧＡＡＡＴＴＡＴＧＴＡＣＴＡＡＴＡＡＧＡＴＡＣＴＴＡＧの塩基配列からなるイントロンの少なくとも１つと
を含むＤＮＡ、および、
（Ｄ）  上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのＤＮＡと９０％以上の同一性を有し、かつフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項５または６に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項８】
請求項５または６に記載の遺伝子を含む形質転換体。
【請求項９】
請求項５または６に記載の遺伝子を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質を含むグルコース濃度測定試薬。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質を用いたグルコースセンサ。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質を用いたグルコース濃度測定方法。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質を含む２−デオキシ−Ｄ−グルコース濃度測定試薬。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質を用いた２−デオキシ−Ｄ−グルコースセンサ。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質を用いた２−デオキシ−Ｄ−グルコース濃度測定方法。
【請求項１７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質を用いたバイオ燃料電池。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該遺伝子を含む形質転換体、上記遺伝子または上記形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法、ならびに、上記タンパク質を用いたグルコースセンサ、グルコース濃度測定方法、２−デオキシ−Ｄ−グルコースセンサ、２−デオキシ−Ｄ−グルコース濃度測定方法、およびバイオ燃料電池に関する。
【背景技術】
【０００２】
血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすために重要である。血糖自己測定に用いられるセンサには、グルコースを基質とする酵素が利用されている。
【０００３】
グルコースオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．４）は、血糖センサ用の酵素として古くから利用されており、グルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有している。しかし、グルコースオキシダーゼを用いた測定では、血液中の溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。
【０００４】
一方、溶存酸素の影響を受けない酵素として、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）依存性またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）依存性のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）（ＮＡＤ（Ｐ）ＧＤＨ：ＥＣ１．１．１．４７）や、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）依存性のＧＤＨ（ＰＱＱＧＤＨ：ＥＣ１．１．５．２）が、血糖センサ用の酵素として知られている。しかし、ＮＡＤ（Ｐ）ＧＤＨは、安定性に乏しく、補酵素の添加が必要であるといった欠点があり、また、ＰＱＱＧＤＨは、基質特異性に乏しく、グルコース以外の糖類にも作用するという欠点がある。
【０００５】
このため、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要なく、基質特異性にも優れた酵素として、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素（ＦＡＤＧＤＨ：ＥＣ１．１．９９．１０）が注目されている。ＦＡＤＧＤＨは、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素としてグルコースからＤ−グルコノ−１，５−ラクトンへの酸化反応を触媒する酵素であり、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅやＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓといった常温性糸状菌から発見されている。
【０００６】
ただし、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、または、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓの野生株から培養・精製して得られたＦＡＤＧＤＨは、ある程度の熱安定性を有している。しかし、グルコースセンサ用試薬の作製工程において、酵素に加熱乾燥処理を施す場合や、保管時の環境温度が高温になる場合が考えられるため、グルコースセンサに用いる酵素は高い熱安定性を有していることが望ましい。
【０００７】
このため、特許文献１では、ＦＡＤＧＤＨの熱安定性を向上させるために、特定の変異を加えたＦＡＤＧＤＨの構造遺伝子を用いて大腸菌で組換えＦＡＤＧＤＨを発現させることにより、野生株で産生されたＦＡＤＧＤＨと同等程度の熱安定性を有するＦＡＤＧＤＨが得られることが開示されている。また、特許文献２では、さらに熱安定性に優れたＦＡＤＧＤＨとして、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓなどの好熱性糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨを用いることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００９／１１９７２８号
【特許文献２】国際公開第２０１４／０４５９１２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、ＦＡＤＧＤＨには、耐熱性だけでなく、グルコース濃度が特に低濃度である場合にも高感度な測定を可能とすることが求められる場合がある。
【００１０】
本発明は、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要ないというＦＡＤＧＤＨの優れた特性を保ちつつ、熱安定性に優れ、かつ、グルコース濃度が特に低濃度である場合にも高感度な測定を可能とする、ＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
〔１〕
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質。
【００１２】
（ａ）  配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）  配列番号１に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｃ）  上記（ａ）または（ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質、および、
（ｄ）  上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【００１３】
〔２〕
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ（Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｍａｌｉｇｎｕｓ（Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ）、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃａｒｎｅｕｓ（Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ）由来である、〔１〕に記載のタンパク質。
【００１４】
〔３〕
糖鎖が付加された、〔１〕または〔２〕に記載のタンパク質。
【００１５】
〔４〕
前記フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性のＫｍ値が２ｍＭ以下である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【００１６】
〔５〕
〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【００１７】
〔６〕
以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子。
【００１８】
（Ａ）  配列番号４〜６のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｂ）  配列番号４〜６のいずれかに記載の塩基配列からシグナルペプチドをコードする塩基配列を除いた塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｃ）  上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、イントロンとを含むＤＮＡ、および、
（Ｄ）  上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１９】
〔７〕
〔５〕または〔６〕に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【００２０】
〔８〕
〔５〕または〔６〕に記載の遺伝子を含む形質転換体。
【００２１】
〔９〕
〔５〕または〔６〕に記載の遺伝子を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。
【００２２】
〔１０〕
〔８〕に記載の形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。
【００２３】
〔１１〕
〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のタンパク質を含むグルコース濃度測定試薬。
【００２４】
〔１２〕
〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のタンパク質を用いたグルコースセンサ。
【００２５】
〔１３〕
〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のタンパク質を用いたグルコース濃度測定方法。
【００２６】
〔１４〕
〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のタンパク質を含む２−デオキシ−Ｄ−グルコース濃度測定試薬。
【００２７】
〔１５〕
〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のタンパク質を用いた２−デオキシ−Ｄ−グルコースセンサ。
【００２８】
〔１６〕
〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のタンパク質を用いた２−デオキシ−Ｄ−グルコース濃度測定方法。
【００２９】
〔１７〕
〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のタンパク質を用いたバイオ燃料電池。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要ないというＦＡＤＧＤＨの優れた特性を保ちつつ、熱安定性に優れ、かつ、グルコース濃度が特に低濃度である場合にも高感度な測定を可能とする、ＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】実施例１での縮重ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。（ａ）はＡ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓの場合、（ｂ）はＡ．ｍａｌｉｇｎｕｓの場合、（ｃ）Ａ．ｃａｒｎｅｕｓの場合を示す。
【図２】Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列を示す図である。
【図３】図２に示す塩基配列におけるエキソンの構成を示す模式図である。
【図４】Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のＯＲＦの塩基配列と、その塩基配列から類推されるアミノ酸配列を示す図である。
【図５】Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列を示す図である。
【図６】図５に示す塩基配列におけるエキソンの構成を示す模式図である。
【図７】Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のＯＲＦの塩基配列と、その塩基配列から類推されるアミノ酸配列を示す図である。
【図８】Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列を示す図である。
【図９】図８に示す塩基配列におけるエキソンの構成を示す模式図である。
【図１０】Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のＯＲＦの塩基配列と、その塩基配列から類推されるアミノ酸配列を示す図である。
【図１１】実施例５のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。（ａ）はＣＢＢ染色した場合、（ｂ）はＰＡＳ染色した場合を示す。
【図１２】実施例６のＡ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨについての吸収スペクトルを示す図である。
【図１３】実施例６のＡ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨについての吸収スペクトルを示す図である。
【図１４】実施例６のＡ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨについての吸収スペクトルを示す図である。
【図１５】実施例７の温度安定性評価におけるＡ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの残活性率を示すグラフである。
【図１６】実施例７の温度安定性評価におけるＡ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの残活性率を示すグラフである。
【図１７】実施例７の温度安定性評価におけるＡ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの残活性率を示すグラフである。
【図１８】実施例７の温度依存性評価におけるＡ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの相対活性を示すグラフである。
【図１９】実施例７の温度依存性評価におけるＡ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの相対活性を示すグラフである。
【図２０】実施例７の温度依存性評価におけるＡ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの相対活性を示すグラフである。
【図２１】実施例７の活性とグルコース濃度との関係の検討において、Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨについてのグルコース濃度と活性との関係を示すグラフである。
【図２２】実施例７の活性とグルコース濃度との関係の検討において、Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨについてのグルコース濃度と活性との関係を示すグラフである。
【図２３】実施例７の活性とグルコース濃度との関係の検討において、Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨについてのグルコース濃度と活性との関係を示すグラフである。
【図２４】図２１〜図２３の結果と、比較のためのＴｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨについての同様の結果とをまとめたグラフである。
【図２５】図２４のグルコース濃度０〜１０ｍＭの範囲の部分を拡大したグラフである。
【図２６】比較のために図２５のグラフを補正したグラフである。
【図２７】実施例７の活性とグルコース濃度との関係の検討において、Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨについてのラインウィーバーバークプロットを示す図である。
【図２８】実施例７の活性とグルコース濃度との関係の検討において、Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨについてのラインウィーバーバークプロットを示す図である。
【図２９】実施例７の活性とグルコース濃度との関係の検討において、Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨについてのラインウィーバーバークプロットを示す図である。
【図３０】実施例７の活性とグルコース濃度との関係の検討において、比較のためのＴｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨについてのラインウィーバーバークプロットを示す図である。
【図３１】実施例７の基質特異性評価における相対活性を示す図である。
【図３２】実施例７のｐＨ安定性評価におけるＡ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの残活性率を示すグラフである。
【図３３】実施例７のｐＨ安定性評価におけるＡ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの残活性率を示すグラフである。
【図３４】実施例７のｐＨ安定性評価におけるＡ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの残活性率を示すグラフである。
【図３５】実施例７のｐＨ依存性評価におけるＡ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの相対活性を示すグラフである。
【図３６】実施例７のｐＨ依存性評価におけるＡ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの相対活性を示すグラフである。
【図３７】実施例７のｐＨ依存性評価におけるＡ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの相対活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
（実施形態１）
本実施形態の発明は、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質である。
（ａ）  配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）  配列番号１に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｃ）  上記（ａ）または（ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質、および、
（ｄ）  上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質のアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上）の相同性を有し、かつ、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【００３３】
なお、配列番号１は、「野生型のＡ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列」であって、シグナルペプチドも含んでいる。
【００３４】
シグナルペプチドは、糸状菌等によるタンパク質分子の生合成の過程において、細胞内で生合成されたタンパク質を、適切な場所に輸送するために不可欠な構造である。シグナルペプチド部分は、例えば配列番号１のような「シグナルペプチドを含むアミノ酸配列」をコードする遺伝子の情報に基づいて、いったんは合成されるが、最終的にはその役割を終えたのち切除される。
【００３５】
本実施形態のタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）は、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要ないというＦＡＤＧＤＨの優れた特性を保ちつつ、熱安定性に優れ、かつ、グルコース濃度が特に低濃度である場合にも高い活性（反応速度）を有し、高感度な測定を可能とする。一方、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有さないタンパク質では、グルコース濃度が特に低濃度である場合の活性（反応速度）が低下する傾向がある。
【００３６】
本実施形態のタンパク質は、好ましくは、Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ、Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓまたはＡ．ｃａｒｎｅｕｓ由来のタンパク質である。これらのタンパク質については、上述の本発明の効果を奏することが実際に確認されている。
【００３７】
上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質である、上記（ｄ）のタンパク質の一例としては、
（ａ２）  配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ２）  配列番号２に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列からなるタンパク質、および、
（ｃ２）  上記（ａ２）または（ｂ２）のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質
が挙げられる。
【００３８】
なお、配列番号２は、「野生型のＡ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列」であって、シグナルペプチドも含んでいる。
【００３９】
また、上記（ｄ）のタンパク質の別の例としては、
（ａ３）  配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ３）  配列番号３に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列からなるタンパク質、および、
（ｃ３）  上記（ａ３）または（ｂ３）のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質
が挙げられる。
【００４０】
なお、配列番号３は、「野生型のＡ．ｃａｒｎｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列」であって、シグナルペプチドも含んでいる。
【００４１】
本発明のタンパク質（酵素）は、糖鎖が付加されたものであることが好ましい。一般に糖鎖が付加されたタンパク質は糖鎖が付加されたタンパク質よりも熱安定性等に優れる場合が多いからである。なお、熱安定性は、所定の温度および時間の熱処理後に、酵素のＦＡＤＧＤＨ活性を測定し、その熱処理前のＦＡＤＧＤＨ活性値に対する比率を求めることにより判断される。ＦＡＤＧＤＨ活性は、種々公知の方法で測定することができる。
【００４２】
また、本実施形態のタンパク質は、グルコースだけでなく、他の糖類も基質とする傾向があるため、グルコースだけでなく、他の糖類も基質とすることが求められる場合に有利である。例えば、本実施形態のＦＡＤＧＤＨを燃料電池に用いた場合、糖類の混合物であることが多いバイオ燃料から効率よく電力を回収することが可能となる。
【００４３】
（実施形態２）
本実施形態の発明は、上記実施形態１のタンパク質をコードする遺伝子である。具体的には、以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
【００４４】
（Ａ）  配列番号４〜６のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｂ）  配列番号４〜６のいずれかに記載の塩基配列からシグナルペプチドをコードする塩基配列を除いた塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｃ）  上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、イントロンとを含むＤＮＡ、および、
（Ｄ）  上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００４５】
配列番号４は、「野生型のＡ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子の塩基配列」であって、シグナルペプチドをコードする塩基配列を含んでいるが、終止コドンは含んでいない。配列番号５は、「野生型のＡ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子の塩基配列」であって、シグナルペプチドをコードする塩基配列を含んでいるが、終止コドンは含んでいない。配列番号６は、「野生型のＡ．ｃａｒｎｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子の塩基配列」であって、シグナルペプチドをコードする塩基配列を含んでいるが、終止コドンは含んでいない。
【００４６】
「上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、イントロンとを含むＤＮＡ」とは、上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列をエキソンとし、そのエキソン配列の途中にイントロン配列が介在しているＤＮＡである。
【００４７】
また、本実施形態の遺伝子には、上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子も含まれる。
【００４８】
ここで、ストリンジェントな条件とは、用いられるプローブ・標識方法によっても異なるが、例えば、ハイブリダイズの条件としては、「０．０２％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣ中で４０〜７０℃」の条件が挙げられる。なお、ストリンジェントな条件は、結合する核酸の融解温度（Ｔｍ）に基づいて決定することができる。ハイブリダイズ後の洗浄条件としては、例えば、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、室温（２５℃）」の条件が挙げられる。ストリンジェントな条件では、配列番号４〜６のいずれかに示す塩基配列と９０％以上の相同性、好ましくは９５％以上の相同性、より好ましくは９７％以上の相同性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることが好ましい。
【００４９】
本実施形態の遺伝子の塩基配列は、これらの具体例に限定されず、実施形態１のタンパク質をコードするものであればよく、ＦＡＤＧＤＨの発現を向上させるように、コドン出現頻度（Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）を変えた塩基配列なども含まれる。
【００５０】
（実施形態３）
本実施形態の発明は、実施形態２の遺伝子を含む組換えベクターである。実施形態３の遺伝子は、例えば、プラスミドベクターと連結された状態にて宿主微生物に導入され、該宿主はＦＡＤＧＤＨを生産する形質転換体となる。
【００５１】
（実施形態４）
本実施形態の発明は、実施形態２の遺伝子を含む形質転換体である。形質転換体の宿主としては、酵母、糸状菌、大腸菌、動物細胞、昆虫細胞など目的に応じて様々な宿主を用いることができるが、糖鎖が付加されたタンパク質を生産するためには、宿主として酵母、糸状菌等の微生物由来の真核生物を用いることが好ましい。真核生物の中でも酵母は産業上多くの利用実績があり、例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅが使用できる。
【００５２】
本実施形態の具体例としては、例えば、実施形態３の組換えベクターで形質転換された酵母が挙げられる。
【００５３】
（実施形態５）
本実施形態の発明は、実施形態２の遺伝子を用いたＦＡＤＧＤＨの製造方法である。本実施形態では、例えば、実施形態４の形質転換体を用いることにより、ＦＡＤＧＤＨを製造することができる。具体的には、例えば、以下に示すような手順で製造することが可能である。
【００５４】
所望のＦＡＤＧＤＨの遺伝情報を有するＤＮＡ（実施形態２の遺伝子）は、プラスミドベクターと連結された状態にて宿主に導入される。宿主については、上記実施形態４で説明した宿主と同様である。
【００５５】
宿主に組換えベクターを導入する方法としては、例えば宿主が酵母の場合には、スフェロプラスト法や酢酸リチウム法などが用いられる。また、エレクトロポレーション法などを用いても良い。宿主が糸状菌の場合には、プロトプラスト化された細胞等が用いられる。宿主が大腸菌に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの導入を行う方法などを採用することができる。また、エレクトロポレーション法を用いても良い。さらに、市販のコンピテントセル（例えば、ＴａＫａＲａ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  ＢＬ２１；タカラバイオ株式会社）を用いても良い。
【００５６】
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＦＡＤＧＤＨを安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００５７】
培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ分解物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００５８】
培地温度は菌が発育し、ＦＡＤＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、酵母の場合、好ましくは２０〜３５℃程度であり、大腸菌の場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は培養条件によって異なるが、ＦＡＤＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、通常は６〜７２時間程度である。培地ｐＨは菌が発育しＦＡＤＧＤＨを生産する範囲で適宜変更しうるが、特に好ましくはｐＨ５．０〜９．０程度である。
【００５９】
培養物中のＦＡＤＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般にはＦＡＤＧＤＨが培養液中に存在する場合は、濾過、遠心分離などにより、タンパク質の含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。一方、ＦＡＤＧＤＨが菌体内に存在する場合は、得られた培養物から濾過または遠心分離などの手法により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加してＦＡＤＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００６０】
このようにして得られたＦＡＤＧＤＨ含有溶液からＦＡＤＧＤＨを回収する方法としては、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、硫酸アンモニムや硫酸ナトリウムなどを用いた塩析処理、または、親水性有機溶媒（例えばメタノール、エタノール、アセトン）による分別沈殿法が挙げられる。また、加温処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤或やゲル濾過剤などを用いたゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーにより、ＦＡＤＧＤＨを精製することもできる。
【００６１】
ＦＡＤＧＤＨの製造はこのような方法に限定されず、例えば、実施形態２の遺伝子を用いて無細胞タンパク質翻訳系によってＦＡＤＧＤＨを製造することも可能である。
【００６２】
（実施形態６）
本実施形態の発明は、実施形態１のタンパク質を含むグルコース濃度測定試薬を用いたグルコースセンサである。
【００６３】
グルコース濃度測定試薬は、実施形態５の方法により製造されたＦＡＤＧＤＨを少なくとも１回の測定に十分な量で含む。また、グルコース濃度測定試薬は、該ＦＡＤＧＤＨ以外に、例えば、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液を含み得る。グルコース濃度測定試薬の形態は特に限定されないが、グルコースセンサ用に適した種々の形態（例えば、凍結乾燥された試薬や、適切な保存容器中の溶液）で提供され得る。
【００６４】
グルコースセンサに用いられる電極は、特に限定されないが、カーボン電極、金電極、白金電極などを用いることができる。例えば、この電極上には、本発明のタンパク質（酵素：ＦＡＤＧＤＨ）が固定化される。
【００６５】
固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて、本発明のタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）をカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドを架橋する方法が用いられる。
【００６６】
本実施形態では、実施形態１のタンパク質を含むグルコース濃度測定試薬を用いたグルコースセンサについて説明したが、実施形態１のタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）はグルコース以外の糖類（例えば、癌の診断に使われる２−デオキシ−Ｄ−グルコース）も基質とするため、同様にして、実施形態１のタンパク質を含む２−デオキシ−Ｄ−グルコース濃度測定試薬を用いた２−デオキシ−Ｄ−グルコースセンサを提供することも可能である。
【００６７】
（実施形態７）
本実施形態の発明は、実施形態１のタンパク質を用いたグルコース濃度測定方法である。グルコース濃度の測定は、例えば、以下のようにして行うことができる。
【００６８】
恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として実施形態１のタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）を固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００６９】
本実施形態では、実施形態１のタンパク質を用いたグルコース濃度測定方法について説明したが、実施形態１のタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）はグルコース以外の糖類（例えば、２−デオキシ−Ｄ−グルコース）も基質とするため、同様にして、実施形態１のタンパク質を用いた２−デオキシ−Ｄ−グルコース濃度の測定を行うことも可能である。
【００７０】
（実施形態８）
本実施形態の発明は、実施形態１のタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）を用いたバイオ燃料電池である。実施形態１のＦＡＤＧＤＨは、グルコースだけでなく２−デオキシ−Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ラフィノース、スクロースなどの脱水素反応を触媒し、この反応により生じた電子が電力として供給される。このため、本実施形態によれば、糖類の混合物であることが多いバイオ燃料から効率よく電力を回収することが可能となる。
【実施例】
【００７１】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７２】
（実施例１）
独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物資源部門（ＮＢＲＣ）より購入した表１に示す糸状菌３種を対象として、糸状菌からのＦＡＤＧＤＨ遺伝子のスクリーニングを行った。
【００７３】
【表１】
0006460513.tif 000002
【００７４】
購入した糸状菌は、ポテトデキストロース培地（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）または麦芽エキス培地（２％麦芽エキス、２％グルコース、０．１％ペプトン）を用いて好気的に培養した。培養後の糸状菌からＷｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
【００７５】
なお、糸状菌の産生するタンパク質を分析することにより、ＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質を探索するのは、ＦＡＤＧＤＨの産生量がごく微量であるため、現実的には困難である。このため、本発明者らは、ＦＡＤＧＤＨを産生することが知られている常温性糸状菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌）に由来するＦＡＤＧＤＨの一次構造（アミノ酸配列）の共通部分に着目し、該共通部分のうちの特定のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相当するプライマーを用いて、糸状菌ゲノムＤＮＡを鋳型とする縮重ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行ない、そのＰＣＲ産物を分析することにより、糸状菌がＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質を産生しているかどうかを判別することができた。
【００７６】
常温性糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列の共通部分のうちの特定のアミノ酸配列は、好ましくは、ＹＤＹＩＶＶＧＧＧＴＳＧＬ、ＱＶＬＲＡＧＫＡＬＧＧＴＳＴＩＮＧＭＡＹＴＲＡＥＤＶＱＩＤ、ＲＳＮＦＨＰＶＧＴＡＡＭＭ、または、ＮＶＲＶＶＤＡＳＶＬＰＦＱＶＣＧＨＬＶＳＴＬＹＡＶＡＥＲＡである。
【００７７】
本実施例では、縮重ＰＣＲ用のプライマーとして、これらのアミノ酸配列の少なくとも一部をコードする塩基配列またはこれと相補的な塩基配列を含むプライマーである以下のプライマーを用いて、糸状菌ゲノムＤＮＡを鋳型とする縮重ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行なった。
【００７８】
縮重ＰＣＲ用のセンスプライマーとしては、
プライマーＡ（５’−ＴＡＹＧＡＹＴＡＹＡＴＣＧＴＴＹＴＹＧＧＡＧＧＣＧＧ−３’：配列番号７）、
プライマーＢ（５’−ＣＡＡＧＴＫＣＴＮＣＧＴＧＣＲＧＧＲＡＡＧＧＣＣＣＴＴＧＧ−３’：配列番号８）、または、
プライマーＣ（５’−ＡＣＳＣＧＣＧＣＭＧＡＧＧＡＴＧＴＣＣＡＧＡＴ−３’：配列番号９）
を用いた。
【００７９】
アンチセンスプライマーとしては、
プライマーＤ（５’−ＣＡＴＣＡＴＧＧＣＡＧＣＭＧＴＫＣＣＧＡＣＧＧＧＲＴＧＧＡＡＧＴＴ−３’：配列番号１０）、または、
プライマーＥ（５’−ＧＴＧＣＴＭＡＣＣＡＡＲＴＧＧＣＣＧＣＡＲＡＣＣＴＧＧＡＡ−３’：配列番号１１）
を用いた。
【００８０】
なお、上記プライマーＡ〜Ｅは配列中にミックス塩基（Ｋ、Ｎ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｙ）を含んでいるが、プライマーＡ〜Ｅの各々は、ミックス塩基の箇所において塩基配列が異なる複数種のプライマーの混合物を意味する。
【００８１】
上記３種の糸状菌から得たゲノムＤＮＡを鋳型として、上記３種のセンスプライマーのいずれかと上記２種のアンチセンスプライマーのいずれかとの組み合わせを用いた６通りの縮重ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動（１．２％アガロースゲル）に供し、泳動後のゲルについて臭化エチジウム染色を施すことによりＰＣＲ産物の存在を確認した。
【００８２】
その結果、Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ（ＮＢＲＣ６９９３）、Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ（ＮＢＲＣ８１３２）およびＡ．ｃａｒｎｅｕｓ（ＮＢＲＣ５８６１）の３種の糸状菌のゲノムを鋳型として得られたＰＣＲ産物について、複数のＤＮＡバンドが検出された（図１（ａ）〜図１（ｃ）中の＊印）。Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓでは左のレーンから順に約１．７、１．９、１．５、１．６ｋｂｐ、Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓでは左のレーンから順に約１．５、１．７ｋｂｐ、Ａ．ｃａｒｎｅｕｓでは左のレーンから順に約１．６、１．８、１．６、１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片が得られた。なお、図１において、レーンＭはマーカーであり、レーン１はプライマーＡとＤの組合せを用いた場合、レーン２はプライマーＡとＥの組合せを用いた場合、レーン３はプライマーＢとＤの組合せを用いた場合、レーン４はプライマーＢとＥの組合せを用いた場合、レーン５はプライマーＣとＤの組合せを用いた場合、レーン６はプライマーＣとＥの組合せを用いた場合を示している。
【００８３】
縮重ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ−ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に連結した後に、大腸菌ＤＨ５α（宝酒造）にサブクローニングした。挿入ＤＮＡ断片の塩基配列解析を行った結果、既報のアスペルギルス属糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子と高い相同性を有する遺伝子断片の増幅が確認された。このことから、Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ、Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓおよびＡ．ｃａｒｎｅｕｓのゲノムにＦＡＤＧＤＨ遺伝子が存在することが示唆された。
【００８４】
（実施例２）
本実施例では、Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨをＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母を用いて製造した。以下、詳細について説明する。
【００８５】
（１）Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ（ＮＢＲＣ６９９３）からのＦＡＤＧＤＨ遺伝子のクローニング
クローニングに先立ち、Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子部分断片をプローブとするゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション解析を行なった。Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓゲノムＤＮＡを各種制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）で切断し、アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、ゲルに含まれているＤＮＡ断片を２０×ＳＳＣ（３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  クエン酸三ナトリウム、ｐＨ７．０）を用いたキャピラリー法によりナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋；  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に転写した。転写後のナイロンメンブレンとジゴキシゲニン標識プローブＤＮＡ（ＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；  Ｒｏｃｈｅ）を混合し、６５℃でハイブリダーゼーションを行なった。プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片はアルカリホスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体（ＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；  Ｒｏｃｈｅ）を用いて検出した。
【００８６】
その結果、ＢａｍＨＩのレーンから約３．５ｋｂの位置にプローブとハイブリダイズするＤＮＡバンドが検出された。既報のアスペルギルス属糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が約１．８ｋｂであることから、プローブとハイブリダイズするこの約３．５ｋＢのＢａｍＨＩ断片が、Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の全領域を包括しているものと考えられた。
【００８７】
次に、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲにより、Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の開始コドン近傍領域を含む５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域と、終始コドン近傍領域を含む３’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域のクローニングを試みた。ＢａｍＨＩで切断したＡ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓのゲノムＤＮＡを調製用アガロースゲルに供し、約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をＴ４リガーゼ（宝酒造）により環状化し、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲの鋳型とした。
【００８８】
Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子内部配列に基づいて設計したプライマー６９９３ＧＳＰ３（５’−ＧＣＴＧＣＴＡＴＴＣＴＧＣＡＴＧＴＴＧＴＡＧＧＴＣＣＡＧＣＣ−３’）、および、プライマー６９９３ＧＳＰ５（５’−ＣＣＴＡＧＴＧＣＡＴＣＣＧＡＣＡＴＣＴＴＣＧＧＡＡＧＣ−３’）を用いてＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲを行なった結果、約２．５ｋｂの位置に単一のＤＮＡ断片が検出された。
【００８９】
このＤＮＡ断片をサブクローニングし塩基配列解析を行なったところ、Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域と３’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域の増幅に成功したことがわかった。
【００９０】
次に、５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域および３’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域の配列に基づいて設計したプライマー６９９３ＧＳＰ９（５’−ＧＴＡＧＡＣＴＡＧＡＣＡＣＡＴＴＧＡＧＡＴＧＣＴＴＧＧＴＧＡ−３’）と６９９３ＧＳＰ１０（５’−ＡＡＧＣＴＴＴＡＡＡＴＴＡＧＡＣＡＡＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＴＡ−３’）を用いてＡ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行なった。その結果、単一の約２．８ｋｂのＤＮＡ断片の増幅が確認され、このＤＮＡ断片がＡ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含んでいることがわかった。
【００９１】
（２）Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の塩基配列解析
Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列はプライマーウォーキング法により決定した。Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列を図２に示す。
【００９２】
スプライシング部位をＧＴ−ＡＧ則に基づいて予測することにより、この塩基配列中のエキソンとイントロンを特定した。Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子は、３つのエキソン（エキソン１；９２０ｂｐ、エキソン２；６２０ｂｐ、エキソン３；２０９ｂｐ）から構成される１７４９ｂｐのＯＲＦ（５８３アミノ酸をコード）を含んでいた(図２の下線部および図３参照）。
【００９３】
図４に、このようにして特定されたＡ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のＯＲＦ（ＦＡＤＧＤＨコーディング領域）の塩基配列と、その塩基配列から類推されるアミノ酸配列を示す。
【００９４】
図４に示すアミノ酸配列について、シグナルペプチドの存在の有無およびシグナルペプチド切断部位を、シグナルペプチド予測サーバーＳｉｇｎａｌＰ４．０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）により推測した。その結果、開始コドンに由来するメチオニン（Ｍｅｔ１）から１７番目のセリン（Ｓｅｒ１７）までの配列がシグナルペプチドとして同定された。また、図４に示すアミノ酸配列において、ＦＡＤ結合に重要なＦＡＤ結合モチーフ（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）は完全に保存されていた。
【００９５】
（３）Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子発現型プラスミドの作製
Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域をＯｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲにより合成した。
【００９６】
まず、各エキソンをＰＣＲ増幅した。エキソン１のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、６９９３ＧＳＰ１１（５’−ＡＴＣＡＴＧＴＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＴＧＴＴＣＴＣＴＣＣＣＴＣ−３’）と６９９３Ｅ１Ａ（５’−ＧＡＧＧＡＴＡＧＣＴＧＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡＣＣＣＧＡＡＣＧ−３’）を用いた。エキソン２のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、６９９３Ｅ２Ｓ（５’−ＡＡＴＴＣＡＧＣＴＡＴＣＣＴＣＴＣＣＣＡＡＴＴＣＧＡＣＡＴＡ−３’）と６９９３Ｅ２Ａ（５’−ＧＧＡＧＣＧＧＡＡＡＧＣＡＧＡＧＴＴＧＧＴＣＣＡＡＧＡＡＧＣ−３’）を用いた。エキソン３のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、６９９３Ｅ３Ｓ（５’−ＴＣＴＧＣＴＴＴＣＣＧＣＴＣＣＡＡＣＴＴＣＣＡＣＧＣＣＧＴＴ−３’）と６９９３ＧＳＰ１２（５’−ＴＡＣＣＴＡＴＴＴＧＣＴＡＣＣＣＧＣＣＴＴＡＡＴＡＡＧＧＴＣ−３’）を用いた。
【００９７】
増幅したエキソン１とエキソン２とをＯｖｅｒｌａｐ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲにより連結した。さらに、連結したＤＮＡ断片とエキソン３とをＯｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲにより連結し、Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域を合成した。
【００９８】
次に、Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子コーディング領域を鋳型として、分泌発現型プラスミド作製用プライマー６９９３Ｐｉｃ１（５’−ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＴＡＣＧＡＣＴＡＣＡＴＣＧＴＣＧＴＧＧＧＡ−３’）および６９９３Ｐｉｃ２（５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＴＧＣＴＡＣＣＣＧＣＣＴＴＡＡＴＡＡＧ−３’）を用いたＰＣＲを行ない、成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子を増幅した。なお、増幅したＡ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子のＣ末端側にはヒスチジンタグを融合するためのヒスチジンのコドン（ＣＡＣ）が付加されている。
【００９９】
増幅したＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで切断した後に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ用分泌発現ベクターｐＰＩＣ９（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の同一制限酵素サイトに連結することにより、Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子分泌発現型プラスミドを作製した。成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子をｐＰＩＣ９に連結することにより、成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子の上流には酵母用シグナル配列が融合されている。
【０１００】
（４）Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の酵母における発現と組換え酵素の精製
Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子分泌発現型プラスミドをＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＳ１１５株（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に導入した。分泌発現型プラスミドを導入したＧＳ１１５株をＢＭＧ培地（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液：ｐＨ６．０、１．３４％酵母ニトロゲンベース、４×１０−５％ビオチン、１％グリセロール）で２日間培養した（前培養）。前培養により取得した菌体をＢＭＭ培地（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液：ｐＨ６．０、１．３４％酵母ニトロゲンベース、４×１０−５％ビオチン、０．５％メタノール）に植菌し、５日間ほど３０℃で好気的に培養した。
【０１０１】
培養後の培養上清を回収し、ＰＢＳ緩衝液に対して透析を行なった。透析後の培養上清をＰＢＳ緩衝液で平衡化したＮｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ）カラム（直径２．０ｃｍ、高さ２．０ｃｍ）に供した。カラムをＰＢＳ緩衝液で洗浄した後に、吸着したタンパク質を２００ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。溶出画分をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  ＭＷＣＯ１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて脱塩処理を施し、Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ精製標品とした。
【０１０２】
（実施例３）
本実施例では、Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨをＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母を用いて製造した。以下、詳細について説明する。
【０１０３】
（１）Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ（ＮＢＲＣ８１３２）からのＦＡＤＧＤＨ遺伝子のクローニング
クローニングに先立ち、Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子部分断片をプローブとするゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション解析を行なった。Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓゲノムＤＮＡを各種制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）で切断し、アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、ゲルに含まれているＤＮＡ断片を２０×ＳＳＣ（３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  クエン酸三ナトリウム、ｐＨ７．０）を用いたキャピラリー法によりナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋；  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に転写した。転写後のナイロンメンブレンとジゴキシゲニン標識プローブＤＮＡ（ＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；  Ｒｏｃｈｅ）を混合し、６５℃でハイブリダーゼーションを行なった。プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片はアルカリホスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体（ＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；  Ｒｏｃｈｅ）を用いて検出した。
【０１０４】
その結果、ＸｂａＩのレーンから約３．５ｋｂの位置にプローブとハイブリダイズするＤＮＡバンドが検出された。既報のアスペルギルス属糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が約１．８ｋｂであることから、プローブとハイブリダイズするこの約３．５ｋＢのＸｂａＩ断片が、Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の全領域を包括しているものと考えられた。
【０１０５】
次に、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲにより、Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の開始コドン近傍領域を含む５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域と、終始コドン近傍領域を含む３’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域のクローニングを試みた。ＸｂａＩで切断したＡ．ｍａｌｉｇｎｕｓのゲノムＤＮＡを調製用アガロースゲルに供し、約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をＴ４リガーゼ（宝酒造）により環状化し、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲの鋳型とした。
【０１０６】
Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子内部配列に基づいて設計したプライマー８１３２ＧＳＰ３（５’−ＧＣＴＧＣＴＧＴＴＣＴＧＣＡＴＡＴＣＡＴＡＧＧＴＣＣＡＧＣＣ−３’）、および、プライマー８１３２ＧＳＰ５（５’−ＡＣＣＴＡＴＣＴＣＧＧＴＣＡＣＣＣＡＡＣＣＧＣＣＴＣＴＧＡＣ−３’）を用いてＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲを行なった結果、約２．５ｋｂの位置に単一のＤＮＡ断片が検出された。
【０１０７】
このＤＮＡ断片をサブクローニングし塩基配列解析を行なったところ、Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域と３’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域の増幅に成功したことがわかった。
【０１０８】
次に、５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域および３’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域の配列に基づいて設計したプライマー８１３２ＧＳＰ９（５’−ＣＣＣＧＧＧＧＧＣＡＴＣＡＧＴＴＣＧＡＴＴＣＴＣＡＡＡＣＡＣ−３’）と８１３２ＧＳＰ１０（５’−  ＣＣＡＴＧＧＣＧＡＧＡＧＣＣＣＴＧＴＡＧＧＧＧＴＣＡＡＴＴＣ−３’）を用いてＡ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行なった。その結果、単一の約２．８ｋｂのＤＮＡ断片の増幅が確認され、このＤＮＡ断片がＡ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含んでいることがわかった。
【０１０９】
（２）Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の塩基配列解析
Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列はプライマーウォーキング法により決定した。Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列を図５に示す。
【０１１０】
スプライシング部位をＧＴ−ＡＧ則に基づいて予測することにより、この塩基配列中のエキソンとイントロンを特定した。Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子は、３つのエキソン（エキソン１；９３２ｂｐ、エキソン２；６２０ｂｐ、エキソン３；２０９ｂｐ）から構成される１７６１ｂｐのＯＲＦ（５８７アミノ酸をコード）を含んでいた(図５の下線部および図６参照）。
【０１１１】
図７に、このようにして特定されたＡ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のＯＲＦ（ＦＡＤＧＤＨコーディング領域）の塩基配列と、その塩基配列から類推されるアミノ酸配列を示す。
【０１１２】
図７に示すアミノ酸配列について、シグナルペプチドの存在の有無およびシグナルペプチド切断部位を、シグナルペプチド予測サーバーＳｉｇｎａｌＰ４．０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）により推測した。その結果、開始コドンに由来するメチオニン（Ｍｅｔ１）から１９番目のアラニン（Ａｌａ１９）までの配列がシグナルペプチドとして同定された。また、図７に示すアミノ酸配列において、ＦＡＤ結合に重要なＦＡＤ結合モチーフ（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）は完全に保存されていた。
【０１１３】
（３）Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子発現型プラスミドの作製
Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域をＯｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲにより合成した。
【０１１４】
まず、各エキソンをＰＣＲ増幅した。エキソン１のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、８１３２ＧＳＰ１１（５’−ＴＣＣＡＴＧＣＴＡＧＣＣＡＴＧＣＴＧＧＣＣＡＡＡＡＴＣＴＣＴ−３’）と８１３２Ｅ１Ａ（５’−ＧＴＧＴＴＧＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＴＧＧＧＴＴＡＣＣＡＡＣ−３’）を用いた。エキソン２のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、８１３２Ｅ２Ｓ（５’−ＧＴＴＧＧＴＡＡＣＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＴＧＣＴＣＡＡＣＡＣ−３’）と８１３２Ｅ２Ａ（５’−ＧＴＧＧＡＡＧＴＴＧＧＡＧＣＧＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＴＴＧＡＴ−３’）を用いた。エキソン３のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、８１３２Ｅ３Ｓ（５’−ＡＴＣＡＡＣＴＣＣＧＴＣＴＣＴＣＧＣＴＣＣＡＡＣＴＴＣＣＡＣ−３’）と８１３２ＧＳＰ１２（５’−ＡＴＣＣＴＡＡＡＣＡＴＣＣＣＣＡＧＣＣＴＴＧＡＴＴＡＧＧＴＣ−３’）を用いた。
【０１１５】
増幅したエキソン１とエキソン２とをＯｖｅｒｌａｐ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲにより連結した。さらに、連結したＤＮＡ断片とエキソン３とをＯｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲにより連結し、Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域を合成した。
【０１１６】
次に、Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子コーディング領域を鋳型として、分泌発現型プラスミド作製用プライマー８１３２Ｐｉｃ１（５’−ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＣＣＴＣＧＴＡＣＧＡＣＴＡＣＡＴＴＧＴＣ−３’）および８１３２Ｐｉｃ２（５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＣＡＴＣＣＣＣＡＧＣＣＴＴＧＡＴＴＡＧ−３’）を用いたＰＣＲを行ない、成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子を増幅した。なお、増幅したＡ．ｍａｌｉｇｎｕｓ成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子のＣ末端側にはヒスチジンタグを融合するためのヒスチジンのコドン（ＣＡＣ）が付加されている。
【０１１７】
増幅したＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで切断した後に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ用分泌発現ベクターｐＰＩＣ９（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の同一制限酵素サイトに連結することにより、Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子分泌発現型プラスミドを作製した。成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子をｐＰＩＣ９に連結することにより、成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子の上流には酵母用シグナル配列が融合されている。
【０１１８】
（４）Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の酵母における発現と組換え酵素の精製
上記のようにして得られたＡ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子分泌発現型プラスミドを用いた以外は、実施例２と同様にして、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓでの発現を行い、Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ精製標品を得た。
【０１１９】
（実施例４）
本実施例では、Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨをＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母を用いて製造した。以下、詳細について説明する。
【０１２０】
（１）Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ（ＮＢＲＣ５８６１）からのＦＡＤＧＤＨ遺伝子のクローニング
クローニングに先立ち、Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子部分断片をプローブとするゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション解析を行なった。Ａ．ｃａｒｎｅｕｓゲノムＤＮＡを各種制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）で切断し、アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、ゲルに含まれているＤＮＡ断片を２０×ＳＳＣ（３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  クエン酸三ナトリウム、ｐＨ７．０）を用いたキャピラリー法によりナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋；  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に転写した。転写後のナイロンメンブレンとジゴキシゲニン標識プローブＤＮＡ（ＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；  Ｒｏｃｈｅ）を混合し、６５℃でハイブリダーゼーションを行なった。プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片はアルカリホスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体（ＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；  Ｒｏｃｈｅ）を用いて検出した。
【０１２１】
その結果、ＡｐａＩのレーンから約６．０ｋｂの位置にプローブとハイブリダイズするＤＮＡバンドが検出された。既報のアスペルギルス属糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が約１．８ｋｂであることから、プローブとハイブリダイズするこの約６．０ｋＢのＡｐａＩ断片が、Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の全領域を包括しているものと考えられた。
【０１２２】
次に、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲにより、Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の開始コドン近傍領域を含む５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域と、終始コドン近傍領域を含む３’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域のクローニングを試みた。ＡｐａＩで切断したＡ．ｃａｒｎｅｕｓのゲノムＤＮＡを調製用アガロースゲルに供し、約６．０ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をＴ４リガーゼ（宝酒造）により環状化し、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲの鋳型とした。
【０１２３】
Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子内部配列に基づいて設計したプライマー５８６１ＧＳＰ３（５’−ＧＣＴＧＣＴＡＴＴＣＴＧＣＡＴＡＴＴＧＴＡＧＧＴＣＣＡＧＣＣ−３’）、および、プライマー５８６１ＧＳＰ５（５’−ＧＡＣＡＴＣＴＴＣＧＧＴＡＧＣＡＡＴＡＣＴＡＣＣＡＡＣＧＴＴ−３’）を用いてＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲを行なった結果、約５．０ｋｂの位置に単一のＤＮＡ断片が検出された。
【０１２４】
このＤＮＡ断片をサブクローニングし塩基配列解析を行なったところ、Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域と３’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域の増幅に成功したことがわかった。
【０１２５】
次に、５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域および３’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域の配列に基づいて設計したプライマー５８６１ＧＳＰ９（５’−ＧＡＡＴＴＣＣＴＴＣＡＡＧＧＡＡＡＣＴＡＧＧＣＣＧＣＣＣＴＴ−３’）と５８６１ＧＳＰ１０（５’−ＧＴＣＧＡＣＡＣＡＡＧＧＣＣＡＴＴＴＧＧＴＣＴＡＴＣＧＡＣＣ−３’）を用いてＡ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行なった。その結果、単一の約２．８ｋｂのＤＮＡ断片の増幅が確認され、このＤＮＡ断片がＡ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含んでいることがわかった。
【０１２６】
（２）Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の塩基配列解析
Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列はプライマーウォーキング法により決定した。Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列を図８に示す。
【０１２７】
スプライシング部位をＧＴ−ＡＧ則に基づいて予測することにより、この塩基配列中のエキソンとイントロンを特定した。Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子は、３つのエキソン（エキソン１；９２６ｂｐ、エキソン２；６２０ｂｐ、エキソン３；２０９ｂｐ）から構成される１７５５ｂｐのＯＲＦ（５８５アミノ酸をコード）を含んでいた(図８の下線部および図９参照）。
【０１２８】
図１０に、このようにして特定されたＡ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のＯＲＦ（ＦＡＤＧＤＨコーディング領域）の塩基配列と、その塩基配列から類推されるアミノ酸配列を示す。
【０１２９】
図１０に示すアミノ酸配列について、シグナルペプチドの存在の有無およびシグナルペプチド切断部位を、シグナルペプチド予測サーバーＳｉｇｎａｌＰ４．０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）により推測した。その結果、開始コドンに由来するメチオニン（Ｍｅｔ１）から１８番目のアラニン（Ａｌａ１８）までの配列がシグナルペプチドとして同定された。また、図１０に示すアミノ酸配列において、ＦＡＤ結合に重要なＦＡＤ結合モチーフ（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）は完全に保存されていた。
【０１３０】
（３）Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子発現型プラスミドの作製
Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域をＯｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲにより合成した。
【０１３１】
まず、各エキソンをＰＣＲ増幅した。エキソン１のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、５８６１ＧＳＰ１１（５’−ＡＣＣＡＴＧＴＴＣＧＴＴＣＣＣＡＡＧＡＣＴＣＴＣＴＣＣＴＣＣ−３’）と５８６１Ｅ１Ａ（５’−ＧＡＧＡＡＴＧＴＣＧＧＧＧＴＴＴＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＡＧＣＧ−３’）を用いた。エキソン２のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、５８６１Ｅ２Ｓ（５’−ＡＡＣＣＣＣＧＡＣＡＴＴＣＴＣＴＣＴＡＡＧＣＡＴＡＡＣＡＴＣ−３’）と５８６１Ｅ２Ａ（５’−ＣＧＡＧＣＧＡＧＡＧＧＣＣＴＴＧＴＴＡＡＴＣＣＡＧＧＣＡＧＣ−３’）を用いた。エキソン３のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、５８６１Ｅ３Ｓ（５’−ＡＡＧＧＣＣＴＣＴＣＧＣＴＣＧＡＡＣＴＴＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴ−３’）と５８６１ＧＳＰ１２（５’−ＧＧＴＣＴＡＧＡＧＣＴＴＧＴＣＡＣＣＣＴＴＧＡＴＣＡＧＧＴＣ−３’）を用いた。
【０１３２】
増幅したエキソン１とエキソン２とをＯｖｅｒｌａｐ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲにより連結した。さらに、連結したＤＮＡ断片とエキソン３とをＯｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲにより連結し、Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域を合成した。
【０１３３】
次に、Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子コーディング領域を鋳型として、分泌発現型プラスミド作製用プライマー５８６１Ｐｉｃ１（５’−ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣＴＣＣＴＡＣＧＡＣＴＡＣＡＴＣＧＴＣ−３’）および５８６１Ｐｉｃ２（５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴＣＡＣＣＣＴＴＧＡＴＣＡＧ−３’）を用いたＰＣＲを行ない、成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子を増幅した。なお、増幅したＡ．ｃａｒｎｅｕｓ成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子のＣ末端側にはヒスチジンタグを融合するためのヒスチジンのコドン（ＣＡＣ）が付加されている。
【０１３４】
増幅したＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで切断した後に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ用分泌発現ベクターｐＰＩＣ９（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の同一制限酵素サイトに連結することにより、Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子分泌発現型プラスミドを作製した。成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子をｐＰＩＣ９に連結することにより、成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子の上流には酵母用シグナル配列が融合されている。
【０１３５】
（４）Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の酵母における発現と組換え酵素の精製
上記のようにして得られたＡ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子分泌発現型プラスミドを用いた以外は、実施例２と同様にして、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓでの発現を行い、Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ精製標品を得た。
【０１３６】
（実施例５）
＜ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＞
実施例２〜４で得られた３種のＦＡＤＧＤＨ精製標品（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓで発現し、精製されたＡ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ、Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨまたはＡ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨを含む溶液）中のタンパク質濃度を測定した。タンパク質濃度は、市販のタンパク質定量キット（Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ；  サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いたＢＣＡ法により測定した。なお、該キットでは、標準タンパク質としては牛血清アルブミンを使用している。得られた濃度測定値に基づいて、ＦＡＤＧＤＨ５μｇを含む精製標品を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。
【０１３７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＬａｅｍｍｌｉの方法に準じて行なった。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルとしては、「ｅ−ＰＡＧＥＬ  １０−２０％」（アトー株式会社）を使用した。泳動後のゲルはＣＢＢ（Coomassie  Brilliant  Blue）ベースの染色液「ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ」（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）により染色した。タンパク質マーカーには、「Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ  Ｂｒｏａｄ  Ｒａｎｇｅ（１０−２３０ｋＤａ）」（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を使用した。
【０１３８】
また、別途、染色液として、ＰＡＳ（Periodic  acid−Schiff  stain）染色液を用いる以外は、同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。なお、ＰＡＳ染色液は、糖を選択的に酸化してアルデヒドを生成し、シッフ試薬によって赤紫色に変色する。
【０１３９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１１に示す。レーン１がタンパク質マーカーであり、レーン２がＡ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ（実施例２）であり、レーン３がＡ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ（実施例４）であり、レーン４がＡ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ（実施例３）である。なお、（ａ）がＣＢＢベースの染色液を用いた場合、（ｂ）がＰＡＳ染色液を用いた場合の結果である。図１１（ａ）に示されるように、Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ、Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨおよびＡ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨのいずれも、電気泳動的に単一な精製標品の取得に成功したことがわかった。また、図１１（ｂ）に示されるように、これらの精製標品は、いずれも糖鎖付加されたタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）であることが分かった。
【０１４０】
（実施例６）
＜吸収スペクトル計測＞
実施例２〜４で得られた３種のＦＡＤＧＤＨ精製標品（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓで発現し、精製されたＡ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ、Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨまたはＡ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨを含む溶液）を実施例５での濃度測定値に基づいて希釈し、２ｍｇ／ｍＬの酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。該ＦＡＤＧＤＨ溶液の吸収スペクトルを、ＵＶ／可視分光光度計ＤＵ−８００（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）用いて計測した。また、上記ＦＡＤＧＤＨ溶液にグルコースを終濃度１５０ｍＭとなるように添加した溶液についても同様に吸収スペクトルを計測した。得られた吸収スペクトルを図１２（Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）、図１３（Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）および図１４（Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）に示す。
【０１４１】
図１２〜図１４に示されるように、ＦＡＤＧＤＨ溶液の吸収スペクトルでは、典型的なＦＡＤ由来のピークが観察された（図１２〜図１４の「ＦＡＤＧＤＨ」）。一方、グルコース添加後のＦＡＤＧＤＨ溶液の吸収スペクトルでは、ＦＡＤに由来するピーク（３５０〜５００ｎｍの吸収ピーク）が消失した（図１２〜図１４の「ＦＡＤＧＤＨ＋グルコース」）。
【０１４２】
これらの結果から、酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）にて発現し、精製されたＦＡＤＧＤＨ（Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ、Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨおよびＡ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）は、いずれも補酵素として酸化型ＦＡＤを含んだホロ型酵素として精製されたことが分かる。したがって、酵母によって生産された本発明のＦＡＤＧＤＨは、補酵素の添加を必要とせずにグルコース濃度測定試薬などとして使用できるというＦＡＤＧＤＨの利点を有している。
【０１４３】
（実施例７）
本実施例では、実施例２〜４で得られた３種のＦＡＤＧＤＨ精製標品（酵母で発現し、精製されたＡ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ、Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨまたはＡ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨを含む溶液）について、ＦＡＤＧＤＨの酵素活性に関する以下の各種特性（温度安定性、温度依存性、活性（反応速度）とグルコース濃度との関係、基質特異性、ｐＨ安定性およびｐＨ依存性）に関する評価試験を行った。なお、本実施例における酵素活性測定原理、酵素活性の定義、活性測定方法は次のとおりである。
【０１４４】
［酵素活性測定原理］
Ｄ−グルコース  ＋  １−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ  ＋  ＦＡＤＧＤＨ
→  Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン  ＋  １−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ（還元型）
＋  ＦＡＤＧＤＨ（酸化型）
１−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ（還元型）  ＋  ＤＣＰＩＰ
→  １−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ  ＋  ＤＣＰＩＰ（還元型）
還元型１−メトキシフェナジンメトサルフェート（１−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ）による２，６−ジクロロフェノリンドフェノール（ＤＣＰＩＰ）の還元により生じた還元型ＤＣＰＩＰ量は、分光光度計を用いて６００ｎｍの吸光度を測定することにより計測した。また、基質特異性の検討においては、Ｄ−グルコースを他の糖類に変更し、それぞれの糖類（基質）に対する酵素活性を測定した。
【０１４５】
［酵素活性の定義］
酵素の活性（ＦＡＤＧＤＨ活性）は、３７℃、ｐＨ７．０の条件下において還元型ＤＣＰＩＰを１分あたりに１マイクロモル形成させるＦＡＤＧＤＨ量を１ユニットとして定義する。
【０１４６】
具体的に、ＦＡＤＧＤＨ活性は、後述の吸光度変化（ΔＯＤTEST、ΔＯＤBLANK）から以下の式により求められる。
【０１４７】
ＦＡＤＧＤＨ活性（Ｕ／ｍＬ）
＝［（ΔＯＤTEST−ΔＯＤBLANK）×３．１］／（１６．３×０．１×希釈率）
なお、式中の各定数は、
３．１  ：  ＦＡＤＧＤＨ溶液混和後の反応液の容量（ｍＬ）
１６．３  ：  ＤＣＰＩＰのミリモル分子吸光係数（ｍＭ−１・ｃｍ−１）
０．１  ：  ＦＡＤＧＤＨ溶液の容量（ｍＬ）
である。
【０１４８】
［活性測定方法］
（１）  キュベット内で以下の組成で反応液を混合する。
０．１Ｍ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）                １．５ｍＬ
１Ｍ  グルコース溶液                                            ０．９ｍＬ
１．７５ｍＭ  2,6-Dichlorophenolindophenol（ＤＣＰＩＰ）        ０．１２ｍＬ
２０ｍＭ  1-Methoxy-5-methylphenazium  methylsulfate（1-mPMS）  ０．０２１ｍＬ
１０％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００                                  ０．０６ｍＬ
Ｈ２Ｏ                                                  ０．３９９ｍＬ
（２）  ３７℃で１０分間プレインキュベートする。
（３）  ＦＡＤＧＤＨ溶液を０．１ｍＬ加えて転倒混和し、３７℃で反応させる。この間、吸光光度計を用いて６００ｎｍでの吸光度を記録し、１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤTEST）を算出する。
（４）  対照として、酵素液（上述の反応液にＦＡＤＧＤＨ溶液を加えた液）の代わりに等量の酵素希釈用液（５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に０．０１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加した液）について、（３）と同様に吸光度変化を記録し、１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤBLANK）を算出する。
【０１４９】
＜温度安定性＞
ここでは、酵素活性の温度安定性の評価を行った。まず、終濃度５０ｍＭクエン酸バッファーを含有し、ｐＨ５．０であり、１×１０−３重量％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有し、酵素活性が１０Ｕ／ｍＬとなるように、酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。これらのＦＡＤＧＤＨ溶液をマイクロチューブに分注し、ＰＣＲマシーンを用いて５℃〜８０℃の範囲内の数種の温度で１５分間加熱した。加熱前後の酵素活性を測定し、加熱前の酵素活性に対する加熱後の酵素活性の比率（残活性率）を求めた。結果を図１５（Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）、図１６（Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）および図１７（Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）に示す。
【０１５０】
図１５において、Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨは４５℃でも約９０％の活性を保持しており、熱安定性が極めて高いことが示された。また、図１６において、Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨは５５℃でも１００％近くの活性を保持しており、熱安定性が極めて高いことが示された。また、図１７において、Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨは５０℃でも１００％近くの活性を保持しており、熱安定性が極めて高いことが示された。なお、天然のＡ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ、Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓおよびＡ．ｃａｒｎｅｕｓは糖鎖付加をする真核生物であるため、天然の酵素も高い熱安定性を示すことが推測される。
【０１５１】
これらの結果から、本発明のＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質は、熱安定性に優れていることが分かる。なお、特許文献１におけるＦＡＤＧＤＨについての５０℃１５分間の熱安定性試験の結果と、本発明の５０℃での結果とを比べても、本発明のＦＡＤＧＤＨは特許文献１と同等以上の高い熱安定性を有していることが分かる。
【０１５２】
＜温度依存性＞
ここでは、酵素活性の温度依存性の評価を行った。まず、上記ｐＨ安定性の評価試験と同様にして、酵素活性が０．０５〜０．２Ｕ／ｍＬとなるように酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。これらのＦＡＤＧＤＨ溶液について、４℃〜６０℃（または７０℃）の範囲で酵素活性を測定し、３７℃での活性を１００（％）としたときの相対活性を求めた。結果を図１８（Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）、図１９（Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）および図２０（Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）に示す。
【０１５３】
図１８に示されるように、Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの場合、５０℃〜５５℃で活性がピークとなっていた。また、図１９に示されるように、Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの場合、５０℃〜６０℃で活性がピークとなっていた。また、図２０に示されるように、Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの場合、５０℃〜５５℃で活性がピークとなっていた。
【０１５４】
＜活性（反応速度）とグルコース濃度との関係＞
ここでは、活性（反応速度）とグルコース濃度との関係について検討した。具体的には、実施例２〜４で得られた３種のＦＡＤＧＤＨ精製標品について、上記活性測定方法のグルコース溶液の濃度を０、０．３、１．０、２．９、９．７、２９．０および９６．８ｍＭに変化させた以外は、同様にして酵素活性［Ｖ（ｕｎｉｔ／ＦＡＤ１μｍｏｌ）］を測定した。なお、酵素活性を比較するために、濃縮、希釈によって値が変動する体積当たりの活性値（ｕｎｉｔ／ｍＬ）ではなく、酵素自身が含有しているＦＡＤの濃度を４５０ｎｍの吸光スペクトルにより測定し、ＦＡＤ当たりの活性値として酵素活性［Ｖ（ｕｎｉｔ／ＦＡＤ１μｍｏｌ）］を算出した。酵素活性とグルコース濃度との関係を図２１（Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）、図２２（Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）および図２３（Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）に示す。
【０１５５】
図２４は、図２１〜図２３のグルコース濃度が０〜３０ｍＭの範囲結果と、比較として好熱性糸状菌であるＴｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨについて同様に測定した酵素活性の結果と、をまとめたグラフである。ただし、図２４では、全てのＦＡＤＧＤＨについてグルース濃度が０ｍＭである場合の活性値をグラフに追加している。
【０１５６】
なお、比較のために用いたＴｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ（Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ）由来ＦＡＤＧＤＨは、特許文献２の実施例７と同様にしてＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓを用いて製造した精製標品である。
【０１５７】
また、図２５は、図２４のグルコース濃度０〜１０ｍＭの範囲の部分を拡大したグラフである。さらに、図２５では、それぞれの酵素活性の最大値［Ｖｍａｘ］が異なるため、縦軸を最大値に対する酵素活性の比率［Ｖ／Ｖｍａｘ（％）］に補正したグラフを図２６に示す。
【０１５８】
主に図２５および図２６から、本発明のタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）は、グルコース濃度が特に低濃度である場合にも高い活性（反応速度）を有することが分かる。
【０１５９】
さらに、図２７〜図３０に、Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ、Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ、Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ、および、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨのそれぞれについて得られたラインウィーバーバークプロット（Lineweaver-Burke  plot）を示す。なお、Ｓはグルコース濃度を意味する。ラインウィーバーバークプロットにおいて、直線のＸ切片が−１／Ｋｍ、Ｙ切片が１／Ｖｍａｘとなるため、グラフからＫｍ、Ｖｍａｘを求めることができる。これらのラインウィーバーバークプロットから求めた各ＦＡＤＧＤＨのＫｍ値（ｍＭ）を表２に示す。
【０１６０】
また、実施例１のＡ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列に対する各ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列の相同性を求めた結果を併せて表２に示す。
【０１６１】
【表２】
0006460513.tif 000003
【０１６２】
表２に示されるように、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ（Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨに対するアミノ酸の相同性が７０％未満）に対して、実施例２〜４のＦＡＤＧＤＨ（Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨに対するアミノ酸の相同性が７０％以上）のＫｍ値は、半分以下となっている。言い換えれば、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨのＫｍ値が２ｍＭより大きいのに対して、実施例２〜４のＦＡＤＧＤＨのＫｍ値は２ｍＭ以下である。この結果からも、本発明のタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）は、Ｋｍが極めて低く、グルコース濃度が特に低濃度である場合にも高い活性（反応速度）を有することが分かる。なお、一般にＫｍ値が小さい程、酵素−基質複合体の解離が起きにくい、つまり、酵素と基質が結合し易いと考えられている。特に、完全分解法によってグルコース濃度を測定する場合において、Ｋｍ値が小さい程、高感度な測定が可能となる。
【０１６３】
＜基質特異性＞
ここでは、ＦＡＤＧＤＨがグルコースおよびグルコース以外の糖類を基質とするかどうかを確認した。まず、グルコース濃度が４０ｍＭの場合に十分な酵素活性が得られる酵素濃度に、それぞれの酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。これらのＦＡＤＧＤＨ溶液について、上記活性測定方法を上記反応液中の糖類の濃度が４０ｍＭとなるように変更し、酵素活性を測定した。測定は、図３１に示す１５種類の糖類について行った。なお、酵素が含まれない場合を対照とし、それぞれの糖に対して対照をとった。グルコースについて酵素活性の測定値を１００（％）としたときの他の各糖類の相対活性を算出し、図３１にまとめた。なお、ＤＣＰＩＰ吸光度の変化量が対照と比較して有意差がないものに関しては活性がないと判断し、０．０と表記した。
【０１６４】
図３１に示す結果において、調べた１５種類の糖類のうちＤ−グルコース以外については、実施例２〜４のＦＡＤＧＤＨの全てが２−デオキシ−Ｄ−グルコースを基質として認識することが分かった。また、実施例２〜４のＦＡＤＧＤＨは、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ラフィノース、スクロースおよびＤ−キシロースに対しても反応することが分かる。なお、Ｄ−フルクトースに対してもわずかに反応している。
【０１６５】
したがって、本発明のタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）はグルコース以外の糖類（例えば、癌のマーカーとなる２−デオキシ−Ｄ−グルコース）も基質とするため、グルコース以外の糖類の濃度測定試薬として使用することができ、それをグルコース以外の糖類の濃度を測定するためのセンサを提供することが可能である。
【０１６６】
また、本発明のＦＡＤＧＤＨは、グルコースに加えて２−デオキシ−Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ラフィノース、スクロースなどの脱水素反応も触媒するため、燃料の脱水素反応により生じた電子を電力として供給するバイオ燃料電池に適用した場合、糖類の混合物であることが多いバイオ燃料から効率よく電力を回収できることが分かる。
【０１６７】
＜ｐＨ安定性＞
ここでは、酵素活性のｐＨ安定性の評価を行った。まず、実施例２〜４で得られた３種のＦＡＤＧＤＨ精製標品（酵母で発現し、精製されたＡ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ、Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨまたはＡ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨを含む溶液）について、上記活性測定方法により酵素活性を測定した。それらの測定値に基づいて各精製標品を水で希釈することで、酵素活性が１４Ｕ／ｍＬとなるような酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。
【０１６８】
これらのＦＡＤＧＤＨ溶液に対して、所定のｐＨに調整された０．１ＭのＢｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ広域緩衝液を等量混合し、ｐＨを２．０〜１１．０の範囲で変化させた複数の酵素溶液を調製し、各酵素溶液の調製直後の酵素活性を測定した。次に、各試料溶液を２５℃で２０時間インキュベートした後に酵素活性を測定して、インキュベート前の酵素活性に対するインキュベート後の酵素活性の割合（残活性率）を求めた。結果を図３２（Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）、図３３（Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）および図３４（Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）に示す。
【０１６９】
図３２〜図３４において、Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ、Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨおよびＡ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの活性は、ｐＨ２．０〜８．０の広範囲にわたって安定であった。
【０１７０】
＜ｐＨ依存性＞
ここでは、酵素活性のｐＨ依存性の評価を行った。上記ｐＨ安定性の評価試験と同様にして、酵素活性が０．２Ｕ／ｍＬとなるような酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。ｐＨを４．０〜９．０の範囲で変化させた複数の酵素活性測定溶液を調製し、それぞれのｐＨ条件における酵素活性を測定した。最も活性が高かったｐＨ条件における酵素活性を１００（％）とし、他の各ｐＨ条件における酵素活性の比率を相対活性として求めた。結果を図３５（Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）、図３６（Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）および図３７（Ａ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）に示す。
【０１７１】
図３５〜図３７において、Ａ．ｂｒｕｎｎｅｏ−ｕｎｉｓｅｒｉａｔｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ、Ａ．ｍａｌｉｇｎｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨおよびＡ．ｃａｒｎｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの至適ｐＨはｐＨ４．０〜６．０であることが示された。
【図１】
0006460513.tif 000004
【図２】
0006460513.tif 000005
【図３】
0006460513.tif 000006
【図４】
0006460513.tif 000007
【図５】
0006460513.tif 000008
【図６】
0006460513.tif 000009
【図７】
0006460513.tif 000010
【図８】
0006460513.tif 000011
【図９】
0006460513.tif 000012
【図１０】
0006460513.tif 000013
【図１１】
0006460513.tif 000014
【図１２】
0006460513.tif 000015
【図１３】
0006460513.tif 000016
【図１４】
0006460513.tif 000017
【図１５】
0006460513.tif 000018
【図１６】
0006460513.tif 000019
【図１７】
0006460513.tif 000020
【図１８】
0006460513.tif 000021
【図１９】
0006460513.tif 000022
【図２０】
0006460513.tif 000023
【図２１】
0006460513.tif 000024
【図２２】
0006460513.tif 000025
【図２３】
0006460513.tif 000026
【図２４】
0006460513.tif 000027
【図２５】
0006460513.tif 000028
【図２６】
0006460513.tif 000029
【図２７】
0006460513.tif 000030
【図２８】
0006460513.tif 000031
【図２９】
0006460513.tif 000032
【図３０】
0006460513.tif 000033
【図３１】
0006460513.tif 000034
【図３２】
0006460513.tif 000035
【図３３】
0006460513.tif 000036
【図３４】
0006460513.tif 000037
【図３５】
0006460513.tif 000038
【図３６】
0006460513.tif 000039
【図３７】
0006460513.tif 000040
【配列表】
0006460513000001.app