(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
0006542808.tif 000019
［式中、
Ｒ1及びＲ2は独立して、Ｈ、Ａ及びＢから選択され、かつＲ1及びＲ2は同時にＨではなく；
【化２】
0006542808.tif 000020
であり、
ここで、式Ａ又は式Ｂにおいて、
矢印はＡ又はＢが式Ｉの母環と連結する部位であり；
ｎは独立して、１、２、３、４、５、６又は７であり；
Ｒ4は独立して、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、ニトロ及びシアノから選択され；
であり、
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3、Ｙ4、及びＹ5は独立して、Ｃ、Ｓ、Ｏ、Ｎ及びＳｅ原子から選択され；
Ｘ1〜Ｘ2、Ｘ2〜Ｘ3、Ｘ3〜Ｘ4、Ｙ1〜Ｙ2、Ｙ2〜Ｙ3、Ｙ3〜Ｙ4、及びＹ4〜Ｙ5は独立して、単結合又は二重結合であり；
Ｚ1、Ｚ2、Ｚ3、Ｚ4、Ｚ5、Ｚ6、Ｚ7、Ｚ8、及びＺ9は独立して、水素原子、ヒドロキシ、アルデヒド基、カルボキシル、アミノ、シアノ、ハロゲン，Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ3−Ｃ10シクロアルキル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、Ｃ1−Ｃ6アルキルチオール、Ｃ3−Ｃ10シクロアルコキシ、Ｃ1−Ｃ6アルケニル、エネイニルヘテロ環（ｅｎｅｙｎｙｌｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ｒｉｎｇ）、ヘテロシクロアルキル、置換されたヘテロシクロアルキル、芳香環、芳香族ヘテロ環、又はベンゾ−芳香族ヘテロ環（ｂｅｎｚｏ−ａｒｏｍａｔｉｃ  ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ｒｉｎｇ）であり、
ここで、Ｃ1−Ｃ6アルキル、芳香環、芳香族ヘテロ環、ベンゾ−芳香族ヘテロ環は、置換されていないか、あるいは以下の基：
−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、ニトロ、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、Ｃ1−Ｃ6アルキルチオール、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ1−Ｃ6アルケニル、Ｃ1−Ｃ6アルキニル及びＣ1−Ｃ6アルコキシ
から独立して選択される１、２、３、４又は５個の置換基で置換されており；
ここで、式Ａにおいて、Ｎ原子はＸ1、Ｘ2、Ｘ3、及びＸ4と一緒になってチアゾール環を形成し；そして、
式Ｂにおいて、Ｎ原子はＹ1、Ｙ2、Ｙ3、Ｙ4、及びＹ5と一緒になってピリジン環を形成する］
の化合物、あるいは薬学的に許容されるその塩又は水和物。
【請求項２】
Ｚ1、Ｚ2、Ｚ3、Ｚ4、Ｚ5、Ｚ6、Ｚ7、Ｚ8、及びＺ9は独立して、ヒドロキシ、アルデヒド基、カルボキシル、アミノ、シアノ、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ3アルキル、Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル、Ｃ1−Ｃ3アルコキシ、Ｃ1−Ｃ3アルキルチオール、Ｃ3−Ｃ6シクロアルコキシ及びＣ1−Ｃ3アルキル−エニルから選択される、請求項１に記載の式Ｉの化合物、あるいは薬学的に許容されるその塩又は水和物。
【請求項３】
Ｚ1、Ｚ2、Ｚ3、Ｚ4、Ｚ5、Ｚ6、Ｚ7、Ｚ8、及びＺ9は独立して、水素原子、ヒドロキシ、及びメチルから選択される、請求項１又は２に記載の式Ｉの化合物、あるいは薬学的に許容されるその塩又は水和物。
【請求項４】
Ｒ1及びＲ2は独立して、Ｈ、カルボニルメチル−（４−メチル−チアゾールＲ4塩−３−イル）、カルボニルメチル−（４，５−ジメチルチアゾールＲ4塩−３−イル）、カルボニルメチル−（ピリジンＲ4塩−１−イル）、カルボニルメチル−（３−ヒドロキシ−ピリジンＲ4塩−１−イル）、カルボニルメチル−（３−メチル−ピリジンＲ4塩−１−イル）及びカルボニルメチル−（４−メチル−ピリジンＲ4塩−１−イル）から選択され；
Ｒ4は独立して、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、ニトロ及びシアノから選択され；かつ
Ｒ1、Ｒ2は同時にＨであることはできない、請求項１に記載の式Ｉの化合物、あるいは薬学的に許容されるその塩又は水和物。
【請求項５】
Ｒ1及びＲ2は独立して、Ｈ、カルボニルメチル−（４−メチル−チアゾールブロミド塩−３−イル）、カルボニルメチル−（４，５−ジメチルチアゾールブロミド塩−３−イル）、カルボニルメチル−（ピリジンブロミド塩−１−イル）、カルボニルメチル−（３−ヒドロキシ−ピリジンブロミド塩−１−イル）、カルボニルメチル−（３−メチル−ピリジンブロミド塩−１−イル）及びカルボニルメチル−（４−メチル−ピリジンブロミド塩−１−イル）から選択され、かつ
Ｒ1、Ｒ2は同時にＨではない、請求項１に記載の式Ｉの化合物、あるいは薬学的に許容されるその塩又は水和物。
【請求項６】
以下の化合物：
３１，４２−ビス−Ｏ−カルボニルメチル−（４−メチル−チアゾールブロミド塩−３−イル）−ラパマイシン、
４２−Ｏ−カルボニルメチル−（４−メチル−チアゾールブロミド塩−３−イル）−ラパマイシン、
３１−Ｏ−カルボニルメチル−（４−メチル−チアゾールブロミド塩−３−イル）−ラパマイシン、
３１，４２−ビス−Ｏ−カルボニルメチル−（４，５−ジメチルチアゾールブロミド塩−３−イル）−ラパマイシン、
４２−Ｏ−カルボニルメチル−（４，５−ジメチルチアゾールブロミド塩−３−イル）−ラパマイシン、
３１−Ｏ−カルボニルメチル−（４，５−ジメチルチアゾールブロミド塩−３−イル）−ラパマイシン、
３１，４２−ビス−Ｏ−カルボニルメチル−（ピリジンブロミド塩−１−イル）−ラパマイシン、
３１，４２−ビス−Ｏ−カルボニルメチル−（３−ヒドロキシ−ピリジンブロミド塩−１−イル）−ラパマイシン、
３１，４２−ビス−Ｏ−カルボニルメチル−（３−メチル−ピリジンブロミド塩−１−イル）−ラパマイシン、
４２−Ｏ−カルボニルメチル−（ピリジンブロミド塩−１−イル）−ラパマイシン、
４２−Ｏ−カルボニルメチル−（３−メチル−ピリジンブロミド塩−１−イル）−ラパマイシン、
４２−Ｏ−カルボニルメチル−（３−ヒドロキシ−ピリジンブロミド塩−１−イル）−ラパマイシン、
４２−Ｏ−カルボニルメチル−（４−メチル−ピリジンブロミド塩−１−イル）−ラパマイシン、
３１，４２−ビス−Ｏ−カルボニルメチル−（４−メチル−ピリジンブロミド塩−１−イル）−ラパマイシン、
３１−Ｏ−カルボニルメチル−（３−メチル−ピリジンブロミド塩−１−イル）−ラパマイシン、
３１−Ｏ−カルボニルメチル−（ピリジンブロミド塩−１−イル）−ラパマイシン、及び
３１−Ｏ−カルボニルメチル−（４−メチル−ピリジンブロミド塩−１−イル）−ラパマイシン
から選択される、請求項１に記載の式Ｉの化合物、あるいは薬学的に許容されるその塩又は水和物。
【請求項７】
以下の方法（１）〜（３）：
【化３】
0006542808.tif 000021
【化４】
0006542808.tif 000022
【化５】
0006542808.tif 000023
［上記の方法（１）〜（３）において、
Ｒ3は独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩから選択され；
他の記号は独立して、請求項１〜８のいずれか１項において定義された通りである］
のいずれか１つに記載の工程を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物の調製方法。
【請求項８】
方法（１）、方法（２）又は方法（３）の最終反応工程において、試薬が添加され、そして前記試薬が独立して、５員ヘテロ環化合物及び６員ヘテロ環化合物から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記試薬が、チアゾール、ピリジン、又は１又は２以上のＣ1−Ｃ6アルキルで置換されたチアゾール、１又は２以上のＣ1−Ｃ6アルキルで置換されたピリジン、１又は２以上のハロゲン原子で置換されたチアゾール、及び１又は２以上のハロゲン原子で置換されたピリジンから選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記試薬が、４−メチルチアゾール、４，５−ジメチルチアゾール、ピリジン、３−ヒドロキシピリジン、３−メチルピリジン及び４−メチルピリジンから選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物、あるいは薬学的に許容されるその塩又は水和物と、場合により薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物、あるいは薬学的に許容されるその塩又は水和物、あるいは請求項１１に記載の医薬組成物を含む薬剤コーティングを含む、冠動脈ステント。
【請求項１３】
医薬としての使用のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物、あるいは薬学的に許容されるその塩又は水和物。
【請求項１４】
医薬としての使用のための、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
免疫の抑制、ｍＴＯＲの阻害、ｍＴＯＲＣ１の阻害、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲシグナル経路の阻害、Ｔリンパ球増殖の阻害、抗腫瘍、腫瘍細胞のアポトーシスの促進、細胞周期のＧ１期での停止，動脈塞栓症の緩和、抗老化、抗アルツハイマー病、臓器拒絶の防止，抗炎症、又は抗菌における使用のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物、あるいは薬学的に許容されるその塩又は水和物。
【請求項１６】
免疫の抑制、ｍＴＯＲの阻害、ｍＴＯＲＣ１の阻害、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲシグナル経路の阻害、Ｔリンパ球増殖の阻害、抗腫瘍、腫瘍細胞のアポトーシスの促進、細胞周期のＧ１期での停止，動脈塞栓症の緩和、抗老化、抗アルツハイマー病、臓器拒絶の防止，抗炎症、又は抗菌における使用のための、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
腎臓癌、リンパ腫、肺癌、肝臓癌、乳癌、神経内分泌癌、子宮肉腫又は胃癌の処置、及び／又は予防、及び／又は補助療法における使用のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物、あるいは薬学的に許容されるその塩又は水和物。
【請求項１８】
腎臓癌、リンパ腫、肺癌、肝臓癌、乳癌、神経内分泌癌、子宮肉腫又は胃癌の処置、及び／又は予防、及び／又は補助療法における使用のための、請求項１１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬化学物質の分野に関し、そしてラパマイシン誘導体、及びその調製方法、医薬組成物及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラパマイシンはシロリムスとも呼ばれ、Ｖｅｎｉｚａらにより１９７５年にStreptomyces hygroscopicus菌から単離された。ラパマイシンは新しい免疫抑制薬として１９８９年に臨床段階に入り、１９９９年に市販された。その後、Ｔリンパ球増殖に対するラパマイシンの阻害効果から、腫瘍細胞の阻害に用いることが教示され、良好な抗腫瘍活性を示すことが見いだされた。この化合物はＵＳＡのワイス社(Wyeth Company)によって、抗腫瘍剤として開発されており、臨床段階にさしかかっている。
【０００３】
人体でのラパマイシンの作用標的は、ｍＴＯＲ（哺乳類ラパマイシン標的タンパク）である。ｍＴＯＲはＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲシグナル経路における重要な構成要素である。ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲシグナル経路は腫瘍細胞の増殖及びアポトーシスに関連したシグナル伝達経路を調節するので、一方で、腫瘍細胞の増殖活性が促進されて、腫瘍細胞の浸潤や転移能力をさらに増強し、他方で、腫瘍のアポトーシスに関連したタンパク質への作用は、内因性アポトーシス阻害物質の活性化、及び／又はアポトーシス阻害関連プロテインキナーゼの発現及び活性化を促進し、その結果、腫瘍細胞のアポトーシスを阻害する。このように、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲシグナル経路は腫瘍の発生及び成長の調節の中核部であり、したがって、ｍＴＯＲは、腫瘍の遺伝子治療の鍵となる標的である。
【０００４】
動物の体内では、ｍＴＯＲは主に二つの錯体、すなわちｍＴＯＲＣ１とｍＴＯＲＣ２の形で存在する。ここで、ｍＴＯＲＣ１（ｍＴＯＲ錯体１）は４つの部分：ｍＴＯＲ、ラプター（Raptor：regulatory associated protein of mTOR）、ｍＬＳＴ８、ＰＲＡＳ４０（プロリンリッチＡＫＴ基質４０ｋＤａ）からなり、ｍＴＯＲＣ２（ｍＴＯＲ錯体２）は、５つの部分：ｍＴＯＲ、リクター（ラプター非依存）、ｍＬＳＴ８、ｍＳＩＮ１（哺乳類ストレス活性化プロテインキナーゼ相互作用プロテイン１、プロター１（リクター１とともに観察されるタンパク質）からなる。ｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２は、ほとんどすべてが異なる上流活性化因子と下流エフェクター（影響因子）を含み、それらは互いに協調して、共に細胞周期の進行を調節する。ｍＴＯＲＣ１の下流エフェクターはリボソームｐ７０Ｓ６キナーゼプロテイン（Ｓ６キナーゼ１、Ｓ６Ｋ１）及び真核生物翻訳開始因子４Ｅ結合プロテイン（４ＥＢＰ１）を主に含む。４ＥＢＰ１とＳ６Ｋ１リン酸化を調節することによって、ｍＴＯＲＣ１は特定のｍＲＮＡの翻訳開始に影響を与え、それによって、タンパク質の合成を調節し、細胞の成長や増殖を調節する。その主たる生物学的機能はタンパク質合成を調節することである。ｍＴＯＲＣ１が成長因子などで刺激されると、下流のＳ６Ｋ１（Ｔｈｒ３８９部位）が活性化されることにより細胞の成長や増殖が促進される。インビボでは、ひとたび、ｍＴＯＲＣ１が過剰に活性化されると、下流の４ＥＢＰ１やＳ６Ｋ１が過剰発現し、その後、細胞の増殖をコントロールできなくなり、過剰の免疫や腫瘍が生じる。ｍＴＯＲＣ２は主に細胞骨格タンパク質の形成に関与する。ｍＴＯＲＣ２はＡｋｔのＳｅｒ４７３部位で作用してＡｋｔレベルを上方に調節する。(TANG Yan, Research summary of mTOR inhibitors [J]. Organic Chemistry, 2011, 31(7): 1144-1154)。ラパマイシンの免疫抑制や抗腫瘍メカニズムは主に細胞受容体ＦＫＢＰ１２に結合してｍＴＯＲＣ１を阻害することであるが、ラパマイシンは、ｍＴＯＲＣ２に対してもごくわずかであるが阻害効果を有している。
【化１】
0006542808.tif 000002
【０００５】
ラパマイシンは、有力な抗腫瘍活性を有しているが、安定性に乏しいことと水への溶解性が乏しいという二つの著しい欠陥がある。ラパマイシンの水に対する溶解度は、わずか２．６μｇ／ｍＬであり、水にはほとんど不溶である。長年の研究により、ラパマイシンの４２位の水酸基を変性すると、ラパマイシンの物理的、化学的性質を確実に改良できることが見いだされ、市場にでているいくつかの医薬はこの方式に基づいている。
【０００６】
市場にある４２位を置換したいくつかのラパマイシン誘導体を以下に挙げる。
【０００７】
テムシロリムス（Ｔｅｍｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）（商品名トーリセル（Ｔｏｒｉｓｅｌ））は、Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔにより開発された４２−アクリラートを有するラパマイシン誘導体で、ラパマイシンのプロドラッグである。ラパマイシン誘導体の中では、ＦＤＡによって２００７年に認可された最も初期の抗癌薬である。テムシロリムスは進行した腎細胞癌（ＲＣＣ：renal cell carcinoma）患者の治療での第一選択薬で、初期の腎細胞癌患者では、生存期間中央値を３から６か月延長することが可能である。テムシロリムスは、Ｔ細胞の増殖を著しく阻害し、その半抑制濃度（ＩＣ50）は０．８ｎｍｏｌ／Ｌであり、スニチニブやソラフェニブなどのキナーゼ阻害剤と組み合わせて用いられる。
【０００８】
エベロリムス（Ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）（商品名Ｚｏｒｔｒｅｓｓ）は、Ｎｏｖａｒｔｉｓ社により開発され、最初の経口ｍＴＯＲ阻害剤であり、その化学構造は４２−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシンである。水への溶解性はラパマイシンより優れており、人体に入ったあと速やかに加水分解される。実験ではエベロリムスの経口生体利用効率は１５％から３０％であり、人体での半減期は１６から１９時間である。２００３年にスウェーデンで最初に市場に出され、初期には免疫抑制剤としてのみ用いられていたが、現在ではＲＣＣ、膵臓神経内分泌腫瘍（ＰＮＥＴ：pancreatic neuroendocrine tumor）、及び上衣下巨細胞性星細胞腫（ＳＥＧＡ：subependymal giant cell astrocytoma）に処方することが認められている。ＦＤＡはエベロリムスの経口錠剤を、免疫リスクが低いか中程度の成人の腎臓移植患者の臓器拒絶反応の防止に用いることができることを承認している。エベロリムスは、同時に、減量したシクロスポリンＡ、バシリキシマブ、及びコルチコステロイドと組み合わせて用いることができる。認可されたフェーズIII 試験ではエベロリムスは急性臓器拒絶を防ぎ、腎臓の機能を維持することが示されている。
【０００９】
リダホロリムス（Ａｒｉａｄ／Ｍｅｒｃｋ社）は、ラパマイシンのＣ４３位を変性したもので、溶解性とＰＫ値が改善されている。研究段階では、転移性の軟部組織肉腫又は骨肉腫の治療のフェーズIII 臨床試験が完了している。プラセボ群と比較して、投薬群は死亡リスクが２８％低減された（ＮＣＴ００５３８２３９）。２０１２年にＡｒｉａｄ／Ｍｅｒｃｋ社は、リダホロリムスをＦＤＡに新薬申請したが、ＦＤＡの専門家委員会は、治療効果に疑義があるとしており、申請にはいくつか障壁がある。
【００１０】
ゾタロリムス（Ｚｏｔａｒｏｌｉｍｕｓ）（Ｍｅｄｔｒｏｎｉ社）は、ゾタロリムスでコートした冠動脈ステント（エンデバー、Ｅｎｄｅａｖｏｒ）としてＦＤＡに認可された。裸の（コートしていない）金属の冠動脈ステントの群と比較して、２００６年に該医薬コート群では動脈塞栓症、心臓疾患及び心筋梗塞のステント使用者の死亡率が明らかに減少した。
【００１１】
ウミロリウムス（Ｕｍｉｒｏｌｉｕｍｓ）（バイオリムス：Ｂｉｏｌｉｍｕｓ、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ社）は２００７年にバイオリムスで被覆した冠動脈ステント、バイオリムスＡ９としてヨーロッパで認可された。免疫抑制や抗炎症活性の点でラパマイシンよりも効果があり、細胞周期をＧ１期で停止することにより、細胞遊走や増殖を妨害し、それにより血管再狭窄の発生を防止する。
【００１２】
現時点でも新たなラパマイシン誘導体の開発は必要とされている。
【発明の概要】
【００１３】
発明の内容
研究を深め、独創性ある研究を通して、本発明者らは、一連の新規なラパマイシンのアンモニウム塩構造を有するカルボキシルエステル誘導体（式Ｉの化合物）を得た。それらは、水への溶解性と代謝の点で、ラパマイシンの欠陥を大いに克服している（実施例１４の化合物は、ラパマイシンと比較して水への溶解性を４０，０００倍改善した）。さらに、いくつかの化合物はインビトロで抗腫瘍性がラパマイシンより優れており、正常細胞に対する毒性はラパマイシンより低く、極めて良いドラッガビリティ (druggability)を有している。従って、以下の発明が提供される。
【００１４】
本発明の一実施態様は、式Ｉの化合物、薬学的に許容されるその塩又は水和物に関する。
【化２】
0006542808.tif 000003
式中、
Ｒ1及びＲ2は独立して、Ｈ、Ａ及びＢから選択され、Ｒ1及びＲ2は同時にＨではなく、
【化３】
0006542808.tif 000004
であり、
ここで、式Ａ又は式Ｂにおいて、
矢印はＡ又はＢが式Ｉの母環と連結する部位であり；
ｎは独立して、１、２、３、４、５、６又は７であり；
Ｒ4は独立して、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、ニトロ及びシアノから選択され；
であり、
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3、Ｙ4、及びＹ5は独立して、Ｃ、Ｓ、Ｏ、Ｎ及びＳｅ原子から選択され；
Ｘ1〜Ｘ2、Ｘ2〜Ｘ3、Ｘ3〜Ｘ4、Ｙ1〜Ｙ2、Ｙ2〜Ｙ3、Ｙ3〜Ｙ4、及びＹ4〜Ｙ5は独立して、単結合又は二重結合であり（当業者には自明であるが、Ｘ1〜Ｘ2及びＹ1〜Ｙ2は二重結合を形成しない）；
Ｚ1、Ｚ2、Ｚ3、Ｚ4、Ｚ5、Ｚ6、Ｚ7、Ｚ8、及びＺ9は独立して、水素原子、ヒドロキシ、アルデヒド基、カルボキシル、アミノ、シアノ、ハロゲン，Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ3−Ｃ10シクロアルキル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、Ｃ1−Ｃ6アルキルチオール、Ｃ3−Ｃ10シクロアルコキシ、Ｃ1−Ｃ6アルケニル、エネイニルヘテロ環(eneynylheterocyclic ring)、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、芳香環、芳香族ヘテロ環、及びベンゾ−芳香族ヘテロ環(benzo-aromatic heterocyclic ring)から、選択され、ここで、Ｃ1−Ｃ6アルキル、芳香環、芳香族ヘテロ環、ベンゾ−芳香族ヘテロ環は、置換されていないか、あるいは以下の基：−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、ニトロ、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、Ｃ1−Ｃ6アルキルチオール、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ1−Ｃ6アルケニル、Ｃ1−Ｃ6アルキニル及びＣ1−Ｃ6アルコキシから独立して選択される１、２、３、４又は５個の置換基で置換されている。
【００１５】
好ましくは、Ｎ原子はＸ1、Ｘ2、Ｘ3、及びＸ4と、あるいはＹ1、Ｙ2、Ｙ3、Ｙ4、及びＹ5と一緒になってヘテロ環構造、好ましくは、安定なヘテロ環構造を形成する。
【００１６】
本発明の項目のうちのいずれか１項に記載の式Ｉの化合物、薬学的に許容されるその塩又は水和物において、好ましくは；
【００１７】
Ｚ1、Ｚ2、Ｚ3、Ｚ4、Ｚ5、Ｚ6、Ｚ7、Ｚ8、及びＺ9は独立して、水素原子、ヒドロキシ、アルデヒド基、カルボキシル、アミノ、シアノ、ハロゲン，Ｃ1−Ｃ3アルキル、Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル、Ｃ1−Ｃ3アルコキシ、Ｃ1−Ｃ3アルキルチオール、Ｃ3−Ｃ6シクロアルコキシ、及びＣ1−Ｃ3アルケニルから選択される。
【００１８】
本発明の項目のうちのいずれか１項に記載の式Ｉの化合物、薬学的に許容されるその塩又は水和物において、好ましくは：
式Ａにおいて、Ｎ原子はＸ1、Ｘ2、Ｘ3、及びＸ4と一緒になってチアゾール環を形成し、
及び／又は
式Ｂにおいて、Ｎ原子はＹ1、Ｙ2、Ｙ3、Ｙ4、及びＹ5と一緒になってピリジン環を形成する。
【００１９】
本発明の項目のうちのいずれか１項に記載の式Ｉの化合物、薬学的に許容されるその塩又は水和物において、好ましくは：
Ｚ1、Ｚ2、Ｚ3、Ｚ4、Ｚ5、Ｚ6、Ｚ7、Ｚ8、及びＺ9は独立して、水素原子、ヒドロキシ、及びメチルから選択される。
【００２０】
本発明の項目のうちのいずれか１項に記載の式Ｉの化合物、薬学的に許容されるその塩又は水和物において、好ましくは、
Ｒ1及びＲ2は独立して、Ｈ、カルボニルメチル−（４−メチル−チアゾールＲ4塩−３−イル）、カルボニルメチル−（４，５−ジメチルチアゾールＲ4塩−３−イル）、カルボニルメチル−（ピリジンＲ4塩−１−イル）、カルボニルメチル−（３−ヒドロキシ−ピリジンＲ4塩−１−イル）、カルボニルメチル−（３−メチル−ピリジンＲ4塩−１−イル）及びカルボニルメチル−（４−メチル−ピリジンＲ4塩−１−イル）から選択され、ここで、Ｒ4は独立して、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、ニトロ及びシアノから選択され；
かつＲ1、Ｒ2は同時にＨであることはできない。
【００２１】
本発明の項目のうちのいずれか１項に記載の式Ｉの化合物、薬学的に許容されるその塩又は水和物において、好ましくは、
Ｒ1及びＲ2は独立して、Ｈ、カルボニルメチル−（４−メチル−チアゾールブロミド塩−３−イル）、カルボニルメチル−（４，５−ジメチルチアゾールブロミド塩−３−イル）、カルボニルメチル−（ピリジンブロミド塩−１−イル）、カルボニルメチル−（３−ヒドロキシ−ピリジンブロミド塩−１−イル）、カルボニルメチル−（３−メチル−ピリジンブロミド塩−１−イル）及びカルボニルメチル−（４−メチル−ピリジンブロミド塩−１−イル）から選択され；
かつＲ1、Ｒ2は同時にＨであることはできない。
【００２２】
一実施態様では、本発明の化合物、薬学的に許容されるその塩又は水和物は表１から選択される。
【表１】
0006542808.tif 000005
【表２】
0006542808.tif 000006
【表３】
0006542808.tif 000007
【表４】
0006542808.tif 000008
【表５】
0006542808.tif 000009
【表６】
0006542808.tif 000010
【００２３】
本発明の別の態様は、本発明の項目のうちのいずれか１項に記載の式Ｉの化合物の調製方法に関し、次の（１）から（３）のいずれか一つの方法の工程を含む。
【化４】
0006542808.tif 000011
【化５】
0006542808.tif 000012
【化６】
0006542808.tif 000013
上記方法（１）から（３）において、
Ｒ3は独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩから選択され；
他の記号の意味は独立して、上記項目のいずれか１項において言及されたものと同じ意味である。
【００２４】
方法（１）では、最初にラパマイシンをアシルハリドと反応させて、３１−及び４２−ビスエステル化生成物（中間体１）を生成する。次に、この生成物をヘテロ環と反応させて、４級アンモニウム塩型の３１，４２ビス置換ラパマイシン誘導体を生成する。
【００２５】
方法（２）では、ラパマイシンを最初に十分な量のトリメチルクロロシランと反応させて、中間体２を生成する。次に、３１位のエーテル結合を酸の存在下で加水分解し、中間体３を生成する。次に、この中間体の４２位をハロゲン化アシルハリドで置換し、中間体４を得て、次に３１位のトリメチルシリルエーテルを酸で加水分解し、４２位モノエステル化物（中間体５）を得る；最後に、中間体５をアザ環状化合物と反応させて、４級アンモニウム塩型の４２位モノ置換ラパマイシン誘導体を生成する。
【００２６】
方法（３）では、中間体３の４２位をｔｅｒｔ−ブチルジメチルシクロシランで置換して中間体６を得る。続いて、３１位のトリメチルシリルエーテルを酸で加水分解し、中間体７を得る；中間体７をハロゲン化アシルハリドと反応させて中間体８を得、次に、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテルを酸性条件下で加水分解し、中間体９を得、最後に、中間体９をアザ環状化合物させて、４級アンモニウム塩型の３１位モノ置換ラパマイシン誘導体を生成する。
【００２７】
方法（１）の最終工程、すなわち、中間体１から方法（１）の最終生成物への反応では、反応試薬（以後、Ｒ５と記す）を加えることができる。
【００２８】
方法（２）の最終工程、すなわち、中間体５から方法（２）の最終生成物への反応では、反応試薬（以後、Ｒ５と記す）を加えることができる。
【００２９】
方法（３）の最終工程、すなわち、中間体９から方法（３）の最終生成物への反応では、反応試薬（以後、Ｒ５と記す）を加えることができる。
【００３０】
試薬Ｒ５は、独立して、５員ヘテロ環化合物及び６員ヘテロ環化合物から選択され；
好ましくは、チアゾール、ピリジン、１又は２以上のＣ1−Ｃ6アルキルで置換されたチアゾール、１又は２以上のＣ1−Ｃ6アルキルで置換されたピリジン、１又は２以上のハロゲン原子で置換されたチアゾール、及び１又は２以上のハロゲン原子で置換されたピリジンから選択され；
より好ましくは４−メチルチアゾール、４，５−ジメチルチアゾール、ピリジン、３−ヒドロキシピリジン、３−メチルピリジン及び４−メチルピリジンから選択される。
【００３１】
本発明の別の態様は、本発明の項目のうちのいずれか１項に記載の化合物、薬学的に許容されるその塩又は水和物、及び場合により薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００３２】
本発明のすべての化合物は極めてよい水溶性を有し、様々な剤形を調製するのに好都合である。経口投与に用いる場合は、本発明の化合物を、経口投与にふさわしい剤形（錠剤、カプセル、水溶液、水懸濁液を含むがこれに限定されない）に、いかなる調製法でも加工することができる。ここで、錠剤の担体には、通常、ラクトース及びコーンスターチが含まれ、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤を添加してもよい。カプセルの希釈剤としては、通常、ラクトース乾燥コーンスターチが含まれる。水懸濁液では、有効成分は、通常、適切な乳化剤や懸濁剤とともに用いられる。必要ならば、上記経口投与の剤形では、甘味剤、香料又は着色剤をさらに添加してもよい。
【００３３】
本発明の化合物は、無菌注射水又は油懸濁液、又は無菌注射溶液を含む無菌注射薬の形でも投与される。ここで有用な担体又は溶媒には、水、リンゲル液及び生理食塩水が含まれる。
【００３４】
本発明項目のうちのに記載のいずれか１項に記載の化合物、薬学的に許容されるその塩又は水和物、あるいは本発明記載の医薬組成物は薬剤としても用いることができる。
【００３５】
本発明の項目のうちのいずれか１項に記載の化合物、薬学的に許容されるその塩又は水和物、あるいは本発明記載の医薬組成物は、免疫の抑制、ｍＴＯＲの阻害、ｍＴＯＲＣ１の阻害、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲシグナル経路の阻害、Ｔ−リンパ球増殖の阻害、抗腫瘍、腫瘍細胞のアポトーシス促進、細胞周期のＧ１期での停止、動脈塞栓症の緩和、抗老化、抗アルツハイマー病、臓器拒絶の防止、又は及び抗炎症に用いることができる。好ましくは、前記抗腫瘍とは、腎臓癌、リンパ腫、肺癌、肝臓癌、乳癌、神経内分泌癌、子宮肉腫又は胃癌の処置、及び／又は予防、及び／又は補助療法をいう。
【００３６】
本発明は、さらに、有効量の本発明の項目のうちのいずれか１項に記載の化合物、薬学的に許容されるその塩又は水和物、あるいは本発明記載の医薬組成物を用いる工程を含む、腎臓癌、リンパ腫、肺癌、肝臓癌、乳癌、神経内分泌癌、子宮肉腫又は胃癌の処置、及び／又は予防、及び又は補助療法のため方法に関する。
【００３７】
本発明の化合物、薬学的に許容されるその塩又は水和物、あるいは本発明記載の医薬組成物の投与量は、多くの因子、例えば、処置又は補助療法を行う疾患の特性や重症度、性別、年齢、体重、及び患者又は動物の個別の反応、用いられる具体的な化合物、投与の方法及び回数等に依存する。投与は１回又は２、３、４回の投与形態で行われる。
【００３８】
さらに本発明の別の態様は、本発明の項目のうちのいずれか１項に記載の化合物、薬学的に許容されるその塩又は水和物、あるいは本発明記載の医薬組成物の、免疫抑制剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ｍＴＯＲＣ１阻害剤、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲシグナル経路の阻害剤、Ｔ−リンパ球増殖の阻害剤、抗腫瘍剤、腫瘍細胞のアポトーシスの促進剤、細胞周期のＧ１期での停止剤、動脈塞栓症の緩和剤、抗老化剤、抗アルツハイマー病剤、臓器拒絶の防止剤、抗炎症薬又は抗菌薬の製造のための使用に関する。好ましくは、前記抗腫瘍薬は腎臓癌、リンパ腫、肺癌、肝臓癌、乳癌、神経内分泌癌、子宮肉腫又は胃癌の処置、及び／又は予防、及び又は補助療法のための医薬である。
【００３９】
さらに本発明の別の態様は、有効量の本発明の項目のうちのいずれか１項に記載の化合物、薬学的に許容されるその塩又は水和物、あるいは本発明記載の医薬組成物を用いる工程を含む、免疫の抑制、ｍＴＯＲの阻害、ｍＴＯＲＣ１の阻害、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲシグナル経路の阻害、Ｔリンパ球増殖の阻害、腫瘍細胞のアポトーシス促進、細胞周期のＧ１期での停止、臓器拒絶の防止、動脈塞栓症の緩和、抗老化、抗アルツハイマー病、抗腫瘍、抗炎症、又は、インビボもしくはインビトロでの抗菌方法に関する。
【００４０】
本発明の一つの態様において、「インビトロ」法は非治療目的に使用される。
【００４１】
本発明の別の態様は、本発明の項目のうちのいずれか１項に記載の化合物、薬学的に許容されるその塩又は水和物、あるいは本発明の項目のうちの医薬組成物を含む薬剤コーティングを含む、冠動脈ステントに関する。
【００４２】
本発明はさらに、冠動脈ステントの製造における、本発明の項目のうちのいずれか１項に記載の化合物、薬学的に許容されるその塩又は水和物、あるいは本発明記載の医薬組成物の使用に関する。
【００４３】
本発明はさらに、有効量の本発明の項目のうちのいずれか一つの項目の化合物、薬学的に許容されるその塩又は水和物、あるいは本発明記載の医薬組成物を用いる工程を含む冠動脈ステント調製方法に関する。
【００４４】
本発明において、
用語「Ｃ1−Ｃ6アルキル」は、１から４個の炭素原子を有する直鎖又は分岐のアルキル、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、２−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、２−ヘキシル、３−ヘキシル等を表し；Ｃ1−Ｃ4アルキル、Ｃ1−Ｃ3アルキル、又はＣ1−Ｃ2アルキルも同様に解釈される。具体的なアルキルは、Ｃ1−Ｃ4アルキル、Ｃ1−Ｃ3アルキル、又はＣ1−Ｃ2アルキルである。
【００４５】
用語「Ｃ1−Ｃ6アルコキシ」は、１から６個の炭素原子を有する直鎖又は分岐のアルコキシ、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、２−ペントキシ、イソペントキシ、ネオペントキシ、ヘキシロキシ、２−ヘキシロキシ、３−ヘキシロキシ等を表し；Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、Ｃ1−Ｃ3アルコキシ、又はＣ1−Ｃ2アルコキシも同様に解釈される。具体的なアルコキシは、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、Ｃ1−Ｃ3アルコキシ、又はＣ1−Ｃ2アルコキシである。
【００４６】
用語「Ｃ1−Ｃ6アルキルチオ」は、「Ｃ1−Ｃ6アルコキシ」と同様に解釈され、違いは、酸素原子が硫黄原子に置き換わったことである。
【００４７】
用語「Ｃ3−Ｃ10シクロアルキル」は、３から１０個の炭素原子を有する飽和炭素環基を表す。このシクロアルキルは単環、又は縮合多環でもよく、芳香環に縮合してもよい。これらの基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシルが挙げられる。本文中で、シクロアルキルは置換されていなくても、一つ以上の置換可能な位置で種々の基で置換されてもよい。例えば、これらのシクロアルキルは、以下の基：Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、モノ（Ｃ1−Ｃ6）アルキルアミノ、ジ（Ｃ1−Ｃ6）アルキルアミノ、Ｃ2−Ｃ6アルケニル、Ｃ2−Ｃ6アルキニル、Ｃ1−Ｃ6ハロゲン化アルキル、又はＣ1−Ｃ6ハロゲン化アルコキシ、で置換されてもよい。Ｃ3−Ｃ6シクロアルキルも同様に解釈される。
【００４８】
用語「Ｃ3−Ｃ10シクロアルコキシ」は、３から１０個の炭素原子を有する飽和シクロアルコキシ基を表す。このシクロアルコキシは単環でも、縮合多環でもよく、芳香環に縮合してもよい。これらの基の例としては、シクロプロポキシ、シクロブトキシ、シクロペントキシ及びシクロヘキロキシが挙げられる。本文中で、シクロアルコキシは置換されていなくても、一つ以上の置換可能な位置で種々の基で置換されてもよい。例えば、これらのシクロアルコキシは、以下の基：Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、モノ（Ｃ1−Ｃ6）アルキルアミノ、ジ（Ｃ1−Ｃ6）アルキルアミノ、Ｃ2−Ｃ6アルケニル、Ｃ2−Ｃ6アルキニル、Ｃ1−Ｃ6ハロゲン化アルキル、又はＣ1−Ｃ6ハロゲン化アルコキシ、で置換されてもよい。Ｃ3−Ｃ6シクロアルコキシも同様に解釈される。
【００４９】
用語「Ｃ2−Ｃ6アルケニル」は２から６個の炭素原子及び少なくとも１個の二重結合を有し、エテニル、プロペニル、１−ブテン−３−イル、１−ペンテン−３−イル、及び１−ヘキセン−５−イルを含む；Ｃ3−Ｃ5アルケニルも同様に解釈される。Ｃ3−Ｃ5アルケニルが好ましい。
【００５０】
用語「Ｃ2−Ｃ6アルキニル」は２から６個の炭素原子及び少なくとも１個の三重結合を有し、エチニル、プロピニル、ブチニル、及びペンチン−２−イルを含む；Ｃ3−Ｃ5アルキニルも同様に解釈される。Ｃ3−Ｃ5アルキニルが好ましい。
【００５１】
用語「ハロゲン」又は「ハロゲン原子」は、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素原子を表す。
【００５２】
用語「芳香環」は又は「「アリール」は、単環（例えばフェニル）、多環（例えばビフェニル）又は少なくとも１個の芳香環と縮合した多環（例えば、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、ナフチル）を表し、場合によって、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、トリフルオロメチル、アリール、ヘテロアリール及びヒドロキシで、モノービス−、又はトリ−置換されてもよい。
【００５３】
用語「アリールアルキル」は、１又は２個以上のアリール基（上に定義した）で置換されたアルキル（上で定義した）を表す。好ましくは、アリールアルキルは、アリールＣ1−Ｃ3アルキルである。例として、ベンジル、フェニルエチルが挙げられる。
【００５４】
用語「芳香族ヘテロ環」は又は「ヘテロアリール」は、５−、６−又は７−員の単環又は多環系で５から１０個の原子を含む縮合環系（うち少なくとも１個は芳香環である）を含み、かつ、環系は窒素、酸素又は硫黄原子から選ばれる少なくとも１個、多くても４個のヘテロ原子を含む。ヘテロアリールの例としては、ピリジニル、イミダゾリル、ピリミジル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、キノリン環、イソキノリン環、インドール環、ベンゾイミダゾール環、ベンゾフラン環、ベンゾチオフェン、ベンゾチアゾール環、ピリダジン環、等が挙げられる。それらは場合によって、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、トリフルオロメチル、アリール、ヘテロアリール及びヒドロキシで、モノ−、ビス−、又はトリ−置換されてもよい。
【００５５】
用語「ヘテロ（複素）環」又は「ヘテロ環基」は、５−、６−又は７−員の単環又は多環系を表し、４から１０個の原子を含む縮合環系を含み、窒素、酸素又は硫黄原子から選ばれる少なくとも１個、多くても４個のヘテロ原子を含む。ただし、環は二つの隣接したＯまたはＳを含まない。縮合環系は芳香基と縮合したヘテロ環であってもよい。好ましくは、ヘテロ環は、ピロリルアルキル、テトラヒトロフリル、ジヒドロフリル、テトラヒドロチオフェニル、ピペリジル、モルホリン環、ヘキサメチレン環、ピペラジニルを含むが、これに限定されない。さらに、それらは以下の基：Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、モノ（Ｃ1−Ｃ6）アルキルアミノ、ジ（Ｃ1−Ｃ6）アルキルアミノ、Ｃ2−Ｃ6アルケニル、Ｃ2−Ｃ6アルキニル、Ｃ1−Ｃ6ハロゲン化アルキル、及びＣ1−Ｃ6ハロゲン化アルコキシ、で置換されてもよい。
【００５６】
「生体（インビボ）」に投与される場合、用語「有効量」は、本発明において、疾患又は障害の治療、予防、緩和、及び／又は鎮静が認められる投与量を表す。
【００５７】
用語「対象」は、本発明において、疾患又は障害の治療、予防、緩和、及び／又は鎮静のために本発明の組成物を受ける、患者又は動物、特に、ヒト、犬、サル、ウシ、ウマ等の哺乳動物を表す。
【００５８】
用語「疾患又は障害」は、身体的状態が本発明における疾患又は障害に関係する対象の身体的状態を表す。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１Ａ】腫瘍細胞Ａ５４９における、Ｓ６Ｋ１のＴｈｒ３８９及びＡｋｔのＳｅｒ４７３のリン酸化に対する化合物の阻害効果；実施例Ｎｏ．１−８の化合物；Ｂ。
【図１Ｂ】腫瘍細胞Ａ５４９における、Ｓ６Ｋ１のＴｈｒ３８９及びＡｋｔのＳｅｒ４７３のリン酸化に対する化合物の阻害効果；実施例Ｎｏ．９−１７の化合物。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
具体的実施方式
本発明の実施態様を実施例と共に詳細に述べる。ただし、以下に述べる実施例が単に本発明を述べているだけであり、本発明の範囲を制限するものではないことは、当業者にとって自明である。実施例において具体的な条件が述べられていない場合は、従来の条件又は製造業者が推薦している条件を用いている。製造業者が示されていない試薬又は装置は、すべて市販の従来製品である。
【００６１】
化合物の融点は、ＳＲＹ−１型の融点測定装置で測定した。温度は較正していない。1Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、VARIAN INOVA 600型ＮＭＲ分光計で測定した。質量スペクトルはAPI-150EX LC/MS高分解能磁場型質量分析計で測定した。
【００６２】
実施例１：３１，４２−Ｏ−カルボニルメチル−（４−メチル−チアゾールブロミド塩−３−イル）−ラパマイシン（化合物１）の調製
工程１：１ｇ（１．０９ｍｍｏｌ）のラパマイシンを１０ｍＬの乾燥ジクロロメタンに溶解し、−１０℃まで冷却し、次に０．８７ｇ（１１ｍｍｏｌ）の乾燥ピリジンを加えた。反応溶液に、２．２ｇ（１０ｍｍｏｌ）のブロモアセチルブロミドの５ｍＬジクロロメタン溶液をゆっくりと滴下し、３０分以内に添加を終え、反応を１０分間継続したのち停止した。反応溶液を１ｍｏｌ／Ｌの塩酸で中和し、蒸留水で２０ｍＬ×３回洗浄し、次にカラムクロマトグラフィーで精製し、０．７３ｇの白色泡状中間体１（ｎ＝１、Ｒ3＝Ｂｒ、Ｒ4＝Ｂｒ）を得た。
【００６３】
工程２：０．７３ｇ（０．６３ｍｍｏｌ）の中間体１（ｎ＝１、Ｒ3＝Ｂｒ、Ｒ4＝Ｂｒ）を２０ｍＬのアセトンに溶解し、０．９４ｇ（９．４５ｍｍｏｌ）の４−メチルチアゾールを加え、６０℃で５時間反応させ、生成物をカラムで精製し、０．７ｇの淡黄色顆粒状化合物１を得た。
【００６４】
融点.142-145℃;MS:1193 [M-2Br-H]+,597[(M-2Br)/2]+; 1H-NMR (600MHz,DMSO-d6 δ ppm), 10.18 (d,2H), 8.07 (s,2H), 6.46 (s,1H), 6.38 (m, 1H), 6.24 (m, 1H), 6.22 (m, 1H), 5.71 (s, 1H), 5.59(s, 2H), 5.46 (m, 1H), 5.33 (s, 1H), 4.91 (m, 3H), 4.53 (s, 2H)。
【００６５】
実施例２：４２−Ｏ−カルボニルメチル−（４−メチル−チアゾールブロミド塩−３−イル）−ラパマイシン（化合物２）の調製
工程１：２ｇ（２．１９ｍｍｏｌ）のラパマイシンを２５ｍＬの乾燥酢酸エチルに溶解し、０℃から５℃まで冷却した。反応溶液に、１．５０ｇ（２２ｍｍｏｌ）のイミダゾールを加え、１．２ｇ（１１ｍｍｏｌ）のトリメチルクロロシランの５ｍＬ酢酸エチル溶液を、中間体２への転換が完全になるまで、３０分以内でゆっくりと滴下した。反応溶液に、１０ｍＬの０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸溶液を、中間体２の転換が完全になるまで、３時間以内でゆっくりと滴下し、次に生成物をカラムクロマトグラフィーで精製し、１．３ｇの白色泡状の中間体３を得た。
【００６６】
工程２：１．３ｇ（１．３ｍｍｏｌ）の中間体３をジクロロメタン１５ｍＬに溶解し、−１０℃まで冷却し、次に１．０３ｇ（１３ｍｍｏｌ）の乾燥ピリジンを加えた。反応溶液に、１．３１ｇ（６．５ｍｍｏｌ）のブロモアセチルブロミドの５ｍＬジクロロメタン溶液をゆっくりと滴下し、３０分以内に添加を終え、反応を１０分間継続したのち停止した。反応溶液を１ｍｏｌ／Ｌの塩酸で中和し、蒸留水で２０ｍＬ×３回洗浄し、次にカラムクロマトグラフィーで精製し、１．２ｇの白色泡状中間体４（ｎ＝１、Ｒ3＝Ｂｒ、Ｒ4＝Ｂｒ）を得た。
【００６７】
工程３：１．２ｇ（１．１ｍｍｏｌ）の中間体４（ｎ＝１、Ｒ3＝Ｂｒ、Ｒ4＝Ｂｒ）を１５ｍＬのアセトンに溶解し、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸水溶液０．７ｍＬを滴下し、添加を１時間以内に終え、反応を３０分継続し、反応物を完全に転換した。カラム分離により精製し、１．０５ｇの白色泡状中間体５（ｎ＝１、Ｒ3＝Ｂｒ、Ｒ4＝Ｂｒ）を得た。
【００６８】
工程４：１．０５ｇ（０．９５ｍｍｏｌ）の中間体５（ｎ＝１、Ｒ3＝Ｂｒ、Ｒ4＝Ｂｒ）を２０ｍＬのアセトンに溶解し、０．９４ｇ（９．５ｍｍｏｌ）の４−メチルチアゾールを加え、６０℃で５時間反応させた。生成物をカラムで精製し、１．０２ｇの淡黄色粒状化合物２を得た。
【００６９】
融点130-133℃;MS:1053.8 [M-Br]+; 1H-NMR (600MHz, DMSO-d6 δ ppm), 10.16 (d,1H), 8.06 (s, 1H), 6.45 (s,1H), 6.38 (m, 1H), 6.22 (m, 1H), 6.15 (m, 1H), 5.62 (s, 2H), 5.46(M, 1H), 5.24 (s, 1H), 5.08 (d, 1H), 4.97 (s, 1H), 4.93 (s, 1H), 4.68 (m, 1H), 4.00 (s, 2H), 3.97 (s, 1H)。
【００７０】
実施例３：３１−Ｏ−カルボニルメチル−（４−メチル−チアゾールブロミド塩−３−イル）−ラパマイシン（化合物３）の調製
工程１：１．２ｇ（２ｍｍｏｌ）の中間体３を酢酸エチル２０ｍＬに溶解し、０℃から５℃まで冷却した。反応溶液に、１．３６ｇ（２０ｍｍｏｌ）のイミダゾールを加え、１．５ｇ（１０ｍｍｏｌ）のｔｅｒｔ−ブチルジメチルクロロシランの５ｍＬ酢酸エチル溶液を、３０分以内でゆっくりと滴下し、反応を３０分継続した；カラム分離により１．３ｇの中間体６を得た。反応溶液に、０．５ｍＬの０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸溶液を３０分以内で加え、反応物の転換が完全になるまで、１時間以内で添加を終えた。カラム分離及び精製により、１．０５ｇの白色泡状の中間体７を得た。
【００７１】
工程２：１．０５ｇ（１．０２ｍｍｏｌ）の中間体７を１０ｍＬの乾燥ジクロロメタンに溶解し、−１０℃まで冷却し、次に０．８１ｇ（１０．２ｍｍｏｌ）の乾燥ピリジンを加えた。反応溶液に、１．０３ｇ（５．１ｍｍｏｌ）のブロモアセチルブロミドの５ｍＬジクロロメタン溶液をゆっくりと滴下し、３０分以内に添加を終えた。反応を１０分間継続したのち停止した。反応溶液を１ｍｏｌ／Ｌの塩酸で中和し、蒸留水で２０ｍＬ×３回洗浄し、次にカラムクロマトグラフィー法を用いて精製を行い、０．７３ｇの白色泡状中間体８（ｎ＝１、Ｒ3＝Ｂｒ、Ｒ4＝Ｂｒ）を得た。
【００７２】
工程３：０．７３ｇ（０．６４ｍｍｏｌ）の中間体８（ｎ＝１、Ｒ3＝Ｂｒ、Ｒ4＝Ｂｒ）を１０ｍＬのアセトンに溶解し、２ｍｏｌ／Ｌ硫酸溶液０．５ｍＬを滴下し、添加を３０分以内に終え、反応物が完全に転換するまで、反応を３０分継続した。カラム分離及び精製により、０．４ｇの白色泡状中間体９（ｎ＝１、Ｒ3＝Ｂｒ、Ｒ4＝Ｂｒ）を得た。
【００７３】
工程４：０．４ｇ（０．３９ｍｍｏｌ）の中間体９（ｎ＝１、Ｒ3＝Ｂｒ、Ｒ4＝Ｂｒ）を２０ｍＬのアセトンに溶解し、０．３８ｇ（３．９０ｍｍｏｌ）の４−メチルチアゾールを加え、６０℃で５時間反応させた；カラム分離により、０．２７ｇ（０．２４ｍｍｏｌ）の淡黄色粒状化合物３を得た。
【００７４】
融点130-132℃; MS:1054 [M-Br]+; 1H-NMR (600MHz, DMSO-d6 δ ppm), 10.16 (d,1H), 8.05 (s, 1H), 6.45 (s,1H), 6.37 (m, 1H), 6.25 (m, 1H), 6.18 (m, 2H), 5.70 (s, 2H), 5.46(m, 1H), 5.35 (s, 1H), 4.55 (d 2H), 4.04 (s, 1H)。
【００７５】
実施例４：３１，４２−Ｏ−カルボニルメチル−（４，５−ジメチル−チアゾールブロミド塩−３−イル）−ラパマイシン（化合物４）の調製
調製方法は実施例１を参照した（ｎ＝１、Ｒ3＝Ｂｒ、Ｒ4＝Ｂｒ、Ｒ5＝４、５−ジメチルチアゾール）。
【００７６】
融点135-139℃;MS:1220.9 [M-2Br-H]+; 1H-NMR (600MHz, DMSO-d6 δ ppm), 10.03 (d,2H), 6.46 (s,1H), 6.37 (m, 1H), 6.24 (m, 1H), 6.18 (m, 1H), 6.12 (m, 1H), 5.76 (m, 3H), 5.62(s, 2H), 5.46 (m, 1H), 5.32 (s, 1H), 5.32 (s, 1H), 4.93 (s, 1H), 4.83 (m, 2H), 4.61 (s, 1H), 4.55 (s, 1H), 4.52 (s, 1H)
【００７７】
実施例５：４２−Ｏ−カルボニルメチル−（４，５−ジメチル−チアゾールブロミド塩−３−イル）−ラパマイシン（化合物５）の調製
調製方法は実施例２を参照した（ｎ＝１、Ｒ3＝Ｂｒ、Ｒ4＝Ｂｒ、Ｒ5＝４，５−ジメチルチアゾール）。
【００７８】
融点135-138℃; MS:1067.9 [M-Br]+; 1H-NMR (600MHz, DMSO-d6 δ ppm), 10.03 (d,1H), 6.49 (s,1H), 6.37 (m, 1H), 6.21 (m, 1H), 6.14 (m, 2H), 5.62 (m, 2H), 5.46 (m, 1H), 5.23 (s, 1H), 5.08 (s, 1H), 4.97 (s, 1H), 4.93 (s, 1H), 4.68 (s, 1H), 4.06 (s, 2H), 4.01 (s, 1H)。
【００７９】
実施例６：３１−Ｏ−カルボニルメチル−（４，５−ジメチル−チアゾールブロミド塩−３−イル）−ラパマイシン（化合物６）の調製
調製方法は実施例３を参照した（ｎ＝１、Ｒ3＝Ｂｒ、Ｒ4＝Ｂｒ、Ｒ5＝４，５−ジメチルチアゾール）。
【００８０】
融点125-127℃; MS:1067.7 [M-Br]+; 1H-NMR (600MHz, DMSO-d6 δ ppm), 10.02 (d,1H), 6.45 (s,1H), 6.37 (m, 1H), 6.25 (m, 1H), 6.20 (m, H), 6.15 (m, H), 5.70 (m, 2H), 5.45 (m, 1H), 5.33 (s, 1H), 5.08 (s, 1H), 4.93 (s, 1H), 4.81 (m, 1H), 4.56 (m, 3H), 4.03 (m, 1H)。
【００８１】
実施例７：３１，４２−Ｏ−カルボニルメチル−（ピリジンブロミド塩−１−イル）−ラパマイシン（化合物７）の調製
調製方法は実施例１を参照した（ｎ＝１、Ｒ3＝Ｂｒ、Ｒ4＝Ｂｒ、Ｒ5＝ピリジン）。
【００８２】
融点140-142℃; MS:1153 [M-Br]+; 1H-NMR (600MHz, DMSO-d6 δ ppm), 8.96 (d, 4H), 8.72 (m, 2H), 8.22 (m, 4H), 6.44 (s, 1H), 6.40 (m, 1H), 6.24 (m, 1H), 6.17 (m, 2H), 5.87 (m, 1H), 5.79 (m, 1H), 5.48 (m, 1H), 5.29 (s, 1H), 4.95 (m, 2H), 4.81 (s, 1H), 4.52 (m, 3H)。
【００８３】
実施例８：３１，４２−Ｏ−カルボニルメチル−（３−ヒドロキシ−ピリジンブロミド塩−１−イル）−ラパマイシン（化合物８）の調製
合成方法は実施例１を参照した（ｎ＝１、Ｒ3＝Ｂｒ、Ｒ4＝Ｂｒ、Ｒ5＝３−ヒドロキシピリジン）。
【００８４】
融点120-124℃; MS:1185.4 [M-2Br-H]+; 1H-NMR (600MHz, DMSO-d6 δ ppm), 12.04 (s, 2H), 8.60 (m, 4H), 8.00 (m, 4H), 6.43 (m, 2H), 6.12 (m, 3H), 5.61 (m, 3H), 5.56 (m, 1H)。
【００８５】
実施例９：３１，４２−Ｏ−カルボニルメチル−（３−メチル−ピリジンブロミド塩−１−イル）−ラパマイシン（化合物９）の調製
調製方法は実施例１を参照した（ｎ＝１、Ｒ3＝Ｂｒ、Ｒ4＝Ｂｒ、Ｒ5＝３−メチルピリジン）。
【００８６】
融点159-162℃; MS:1181.2 [M-2Br-H]+; 1H-NMR (600MHz, DMSO-d6 δ ppm), 9.00 (s, 1H), 8.89 (m, 2H), 8.81 (m, 1H), 8.57 (s, 2H), 8.14 (m, 2H), 6.46 (s, 1H), 6.38 (m, 1H), 6.23 (m, 1H), 6.14 (m, 2H), 5.80 (m, 5H), 5.46 (m, 1H), 5.29 (m, 1H)。
【００８７】
実施例１０：４２−Ｏ−カルボニルメチル−（ピリジンブロミド塩−１−イル）−ラパマイシン（化合物１０）の調製
調製方法は実施例２を参照した（ｎ＝１、Ｒ3＝Ｂｒ、Ｒ4＝Ｂｒ、Ｒ5＝ピリジン）。
【００８８】
融点135-137℃; MS:1034.1 [M-Br]+; 1H-NMR (600MHz, DMSO-d6 δ ppm), 9.07 (d, 1H), 9.02 (m, 1H), 8.71 (m, 1H), 8.24 (m, 2H), 8.14 (m, 2H), 6.45 (s, 1H), 6.41 (m, 1H), 6.22 (m, 1H), 6.14 (m, 1H), 5.80 (m, 5H), 5.67 (m, 2H), 5.44 (m, 1H), 5.25 (s, 1H), 5.08 (m, 1H)。
【００８９】
実施例１１：４２−Ｏ−カルボニルメチル−（３−メチル−ピリジンブロミド塩−１−イル）−ラパマイシン（化合物１１）の調製
調製方法は実施例２を参照した（ｎ＝１、Ｒ3＝Ｂｒ、Ｒ4＝Ｂｒ、Ｒ5＝３−メチルピリジン）。
【００９０】
融点138-140℃; MS:1048 [M-Br]+; 1H-NMR (600MHz, DMSO-d6 δ ppm), 9.07 (d, 1H), 9.02 (m, 1H), 8.71 (m, 1H), 8.24 (m, 2H), 8.14 (m, 2H), 6.45 (s, 1H), 6.41 (m, 1H), 6.22 (m, 1H), 6.14 (m, 1H), 5.80 (m, 5H), 5.67 (m, 2H), 5.44 (m, 1H), 5.25 (s, 1H), 5.08 (m, 1H)。
【００９１】
実施例１２：４２−Ｏ−カルボニルメチル−（３−ヒドロキシ−ピリジンブロミド塩−１−イル）−ラパマイシン（化合物１２）の調製
調製方法は実施例２を参照した（ｎ＝１、Ｒ3＝Ｂｒ、Ｒ4＝Ｂｒ、Ｒ5＝３−ヒドロキシピリジン）。
【００９２】
融点146-148℃; MS:1050 [M-Br]+; 1H-NMR (600MHz, DMSO-d6 δ ppm), 12.08 (s, 1H), 8.60 (m, 1H), 8.53 (m, 1H), 8.02 (m, 2H), 6.45 (m, 2H), 6.38 (s, 1H), 6.22 (m, 1H), 6.12 (m, 2H), 5.60 (m, 2H), 5.48 (m, 1H), 5.25 (m, 1H), 5.08 (m, 1H)。
【００９３】
実施例１３：４２−Ｏ−カルボニルメチル−（４−メチル−ピリジンブロミド塩−１−イル）−ラパマイシン（化合物１３）の調製
調製方法は実施例２を参照した（ｎ＝１、Ｒ3＝Ｂｒ、Ｒ4＝Ｂｒ、Ｒ5＝４−メチルピリジン）。
【００９４】
融点157-160℃; MS:1048.1 [M-Br]+; 1H-NMR (600MHz, DMSO-d6 δ ppm), 8.89 (d, 1H), 8.05 (m, 2H), 6.45 (s, 1H), 6.41 (m, 1H), 6.22 (m, 1H), 6.12 (m, 2H), 5.61 (m, 3H), 5.46 (m, 1H), 5.25 (m, 1H), 5.08 (d, 1H), 4.93 (m, 2H)。
【００９５】
実施例１４：３１，４２−Ｏ−カルボニルメチル−（４−メチル−ピリジンブロミド塩−１−イル）−ラパマイシン（化合物１４）の調製
調製方法は実施例１を参照した（ｎ＝１、Ｒ3＝Ｂｒ、Ｒ4＝Ｂｒ、Ｒ5＝４−メチルピリジン）。
【００９６】
融点181-183℃; MS:1181.2 [M-2Br-H]+; 1H-NMR (600MHz, DMSO-d6 δ ppm), 8.90 (d, 2H), 8.78 (d, 2H), 8.06 (m, 4H), 6.46 (d, 1H), 6.38 (m, 1H), 6.20 (m, 1H), 6.14 (m, 2H), 5.80 (d, 1H), 5.62 (m, 4H), 5.47 (m, 1H), 5.29 (s, 1H)。
【００９７】
実施例１５：３１−Ｏ−カルボニルメチル−（３−メチル−ピリジンブロミド塩−１−イル）−ラパマイシン（化合物１５）の調製
調製方法は実施例３を参照した（ｎ＝１、Ｒ3＝Ｂｒ、Ｒ4＝Ｂｒ、Ｒ5＝３−メチルピリジン）。
【００９８】
融点138-140℃; MS:1048.1 [M-Br]+; 1H-NMR (600MHz, DMSO-d6 δ ppm), 8.88 (d, 1H), 8.80 (d, 1H), 8.57 (m, 1H), 8.12 (m, 1H), 6.45 (m, 1H), 6.40 (m, 1H), 6.23 (m, 1H), 6.17 (m, 2H), 5.81 (d, 1H), 5.74(m, 2H), 5.47 (m, 1H) 5.28 (s, 1H)。
【００９９】
実施例１６：３１−Ｏ−カルボニルメチル−（ピリジンブロミド塩−１−イル）−ラパマイシン（化合物１６）の調製
調製方法は実施例３を参照した（ｎ＝１、Ｒ3＝Ｂｒ、Ｒ4＝Ｂｒ、Ｒ5＝ピリジン）。
【０１００】
融点140-142℃; MS:1034 [M-Br]+; 1H-NMR (600MHz, DMSO-d6 δ ppm), 8.96 (d, 2H), 8.72 (m, 1H), 8.22 (m, 2H), 6.44 (s, 1H), 6.40 (m, 1H), 6.24 (m, 1H), 6.17 (m, 2H), 5.87 (m, 1H), 5.79 (m, 1H), 5.48 (m, 1H), 5.29 (s, 1H), 4.95 (m, 2H), 4.81 (s, 1H), 4.52 (m, 3H)。
【０１０１】
実施例１７：３１−Ｏ−カルボニルメチル−（４−メチル−ピリジンブロミド塩−１−イル）−ラパマイシン（化合物１７）の調製
調製方法は実施例３を参照した（ｎ＝１、Ｒ3＝Ｂｒ、Ｒ4＝Ｂｒ、Ｒ5＝４−メチルピリジン）。
【０１０２】
融点145-148  ℃; MS:1048.1 [M-Br]+; 1H-NMR (600MHz, DMSO-d6 δ ppm), 8.77 (d, 2H), 8.03 (d, 2H), 6.44 (s, 1H), 6.40 (m, 1H), 6.23 (m, 1H), 6.16 (m, 2H), 5.80 (d, 1H), 5.70 (d, 1H), 5.44 (m, 1H), 5.29 (m, 1H), 5.29 (s, 1H)。
【０１０３】
実施例１８：溶解度試験
本発明の化合物１−１７を取り、中国薬局方（Chinese Pharmacopoeia）第２部２０１０年版の溶解度試験法に従って、別々に試験した。結果を表２に示す：
【表７】
0006542808.tif 000014
【表８】
0006542808.tif 000015
【０１０４】
表２のデータから、本発明の化合物は、ラパマイシンより明らかに高い水溶解度を有しており、いくつかの化合物では実に３から４桁大きいことが分かる。
【０１０５】
実施例１９：ラットの初代培養肝細胞における毒性の実験評価
実験方法：ＳＤラットの肝葉を、殺菌した平皿に入れ、適量の肝細胞洗浄液（あらかじめ４℃に冷却）を加え、肝臓を細断し、線維性結合組織を除去して肝細胞懸濁液を作製し、２００メッシュのふるいで分別し、５０ｍＬの遠心分離管に入れ、５００ｒｐｍで１から２分間、遠心分離した；上澄み液を除去し、沈殿物に２０から３０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０（あらかじめ４℃に冷却）を加えて３回洗浄した；等積の肝細胞懸濁液をとり、Ｐｅｒｃｏｌｌ分離溶液Ｉに懸濁させ、上下に回転して混合し、４℃、８００ｒｐｍで１０分間、遠心分離し、上澄み液を除去し、肝細胞をＰＢＳで１回洗浄した（８００ｒｐｍ、５分）。肝細胞沈殿物を肝細胞培養液に加え、再懸濁化し、１０ｍＬに希釈し、その適量を計数用にとり、０．４％トリパンブルーを用いて生存率を決定した。９０％以上の生存率の肝細胞を９６ウエルプレートに２×１０3の密度で植え付け、１００μＬのＲＰＭＩ１６４０培養液をそれぞれのウエルに加えた。培養は３７℃、５％ＣＯ2で２４時間行った。化合物をＤＭＳＯで望ましい濃度に希釈し、それぞれのウエルに、１μＬ（最終的な化合物濃度は通常１０００μＭから開始し、１０倍勾配希釈を６勾配とした）を加えた。ブランクの対照には、１μＬのＤＭＳＯを加えた。
【０１０６】
細胞を３７℃、５％ＣＯ2で２４時間培養した後、ウエルに１００μＬのＡＴＰ検出試薬を加え、１５分間振とう培養し、ウエルの蛍光値をＥＬＩＡＳＡで読み取った。それぞれの実施例化合物の細胞生存率を計算し、次に、ＧＩ50値（５０％の細胞が阻害される添加化合物の濃度）を計算した。結果を表４に示す。明らかに、該化合物の毒性はラパマイシンのそれよりも著しく低かった。
【表９】
0006542808.tif 000016
【０１０７】
表４のデータは、本発明の化合物の毒性がラパマイシンよりも著しく低いことを示している。
【０１０８】
実施例２０：化合物のｍＴＯＲＣ１及びＴＯＲＣ２に対する阻害活性の実験
腫瘍細胞Ａ５４９における実施例化合物の分子作用機構
【０１０９】
実験材料：ＤＭＥＭ高グルコース細胞培養液（Hyclone社）、ウシ胎仔血清(ＦＢＳ)(Gibco社)、ペニシリン及びストレプトマイシンはNorth China Pharmaceutical Co. Ltdから、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）はGibco社から購入した。膵酵素及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）はSigma社の製品である。Ａ５４９細胞系（ヒト肺線癌細胞系）はＡＴＣＣから購入した。マウス抗ヒトｐ−ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔ３８９）モノクローナル抗体、マウス抗ヒトｐ７０Ｓ６Ｋモノクローナル抗体、マウス抗ヒトｐ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）モノクローナル抗体、及びマウス抗ヒトＡＫＴモノクローナル抗体はCell Signaling Technology社から購入した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス、及びヤギ抗マウスモノクローナル抗体はCell Signaling Technology社から購入した。細胞溶解溶液はBeijing Solarbio Science and Technology Co., Ltd.から購入し、ローディングバッファー、ＳＤＳ電気泳動緩衝液、Ｔｏｗｂｉｎ転写緩衝液、ＴＢＳ、及びＴＢＳＴはBiyuntian社から購入した。ＥＣＬ化学発光（ケミルミネッセンス）溶液はBeijing Pulilai Genetic Technology Co., Ltd.から、展開液及び固定液はthe Tenth Chemical Plant of Shijiazhuang社から、ＮＣ膜はWhatman社から、写真用フィルムはCarestream (Xiamen) Medical Equipment Co., Ltd.から、脱脂粉乳はBeijing Xikai Creative Technology Co., Ltdから購入した。
【０１１０】
実験方法：
Ａ５４９細胞を９６−ウエルプレートに広げ、細胞を８０％から９０％の密度まで成長させ、次に、血清枯渇条件下で一晩培養し、２日目に１６７ｎＭのインシュリン及び化合物と２時間、共培養し、次に細胞を溶解し、Ｓ６Ｋ１のＴｈｒ３８９部位（ｍＴＯＲＣ１に相当）とＡｋｔのＳｅｒ４７３部位（ｍＴＯＲＣ２に相当）における実施例化合物のリン酸化レベルをウエスタンブロット法で検出した。これらはｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２に対する該化合物の阻害レベルを半定量的に反映するものとして用いた（結果に現れるバンド中、ブロットの不在は該当するタンパク質の発現が阻害されていることを示し、ブロットの存在は発現が阻害されていないことを示す）。陽性対照化合物はラパマイシンである。評価の結果を図１（図１Ａ及び図１Ｂ）に示す。具体的な工程は以下の通りである。
【０１１１】
１．細胞の処理
１）細胞を６−ウエルプレートに植え付けた。２４時間後に細胞は８０％−９０％に広がった；
２）細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次に２ｍＬの無血清培地で置換し、血清枯渇条件下で一晩培養を行った；
３）処理した細胞に、試験に供する化合物（２０μＭ）及びインシュリン（１６７ｎＭ）を含む２μＬの細胞培養液を加え、２時間、共培養を行った。
【０１１２】
２．細胞の溶解
１）６−ウエルプレート上の細胞を１０ｍＬのＰＢＳで洗い出し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した；
２）上澄み液を除去し、次に６０μＬの細胞溶解緩衝液（プロテアーゼ阻害剤を含む）を加え、細胞を氷上で２０から３０分間溶解し、１０分後、２から３秒間振とう器で振とうし、氷上に戻した。
３）遠心分離の前に再度、３秒間、振とうを行い、次に４℃、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
４）ローディングバッファー６０μＬを２回加え、沸騰したウオーターバスに５分間浸漬し、使用に供するまで−２０℃又は−８０℃で冷凍保存した。
【０１１３】
３．ウエスタンブロット分析
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；最初、スペーサーゲルの泳動には８０Ｖを用い、次に分離ゲルの泳動には１２０Ｖを用いた。
２）転写；湿式転写、氷浴中、２５０ｍＡ、１５０分
３）５％ミルクを用い、室温で１から２時間（又は４℃で一晩）封止を行った。
４）一次抗体（ＴＢＳで希釈）を加え、４℃で一晩放置した。
５）ＴＢＳＴ洗浄  ３×１０分。
６）二次抗体（３％脱脂粉乳ＴＢＳ溶液で１：２０００希釈）を加え、封止フィルム上、室温で２時間、培養した。
７）ＴＢＳＴ洗浄  ３×１０分
８）ＥＣＬ  化学発光展開液Ａ及びＢのそれぞれ５００μＬを平皿で混合し、５分間洗浄した。
９）フィルムを露光用締め具に取り付け、暗室で一定時間露光し、次に展開液中に２分間、固定液中に５分間置き、次にフィルムを水道水で洗浄し、焼き付けて乾燥した。
１０）写真を撮影し、保存した。
【０１１４】
この結果は、本発明の化合物が、ｍＴＯＲＣ１を効果的に阻害し、それらの阻害効果はラパマイシンに劣るものではない（ラパマイシンはｍＴＯＲＣ１のみを阻害する。したがって、我々の化合物はラパマイシンに劣らない活性を有している）ことを示している。
【０１１５】
実施例２１：腫瘍細胞阻害実験
実施例化合物の腫瘍細胞Ａ５４９に対する活性を評価した。
【０１１６】
実験材料：ＤＭＥＭ高グルコース細胞培養液（Hyclone社）、ウシ胎仔血清(ＦＢＳ)(Gibco社)、ペニシリン及びストレプトマイシンはNorth China Pharmaceutical Co. Ltdから、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）はGibco社から、Cell Titer-Glo（登録商標）細胞生存検出試薬はPromega社から購入した。パンクレアチン及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）はSigma社の製品である。Ａ５４９細胞系（ヒト肺線癌細胞系）はＡＴＣＣから購入した。
【０１１７】
実験方法：
白壁及び浸透性底付き９６−ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に、ウエル当たり５０００個の細胞を植え付け、３７℃、５％ＣＯ2で２４時間培養した。試験に供する化合物をＤＭＳＯに溶解し、１００ｍＭに希釈し、該化合物の母液を得た。
【０１１８】
２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液を化合物の希釈に用いた。ここで、濃度勾配は３勾配、濃度範囲は１００μＭから３ｎＭである。９６−ウエルプレートの培養細胞に、種々の希釈度の化合物をウエル当たり１００μＬ加えた。３７℃、ＣＯ2で７２時間培養し、上澄み液を除去し、細胞生存検出試験を実施した。
【０１１９】
Cell Titer-Glo（登録商標） 反応緩衝液を等量の基質と混合した後、混合物を９６−ウエルプレートにウエル当たり１００μＬ加えた。４分間水平振とうして細胞溶解を誘導した。室温で１５分間、平衡状態にし、反応信号を安定化した。９６−ウエルプレートのそれぞれのウエルの化学発光単位を、化学発光検出器を用いて検出した。
【０１２０】
それぞれの化合物の異なる希釈度での阻害率をそれぞれのウエルの化学発光値から計算し、Origin 8.0ソフトウェアを用いてそれぞれの化合物のＳ型曲線近似を行い、ＥＣ50を計算した。結果を表５に示す。
【表１０】
0006542808.tif 000017
【０１２１】
この結果は、本発明の化合物が腫瘍細胞を効果的に阻害し、いくつかの化合物はラパマイシンよりさらに優れた効果を有し、したがって、抗腫瘍医薬の製品化が期待できることを示している。
【０１２２】
実施例２２：薬剤耐性腫瘍細胞系に対する阻害実験
実施例化合物の多薬剤耐性腫瘍細胞系ＭＥＳ−ＳＡに対する活性を評価した。
【０１２３】
実験材料：ＤＭＥＭ高グルコース細胞培養液（Hyclone社）、ウシ胎仔血清(ＦＢＳ)(Gibco社)、ペニシリン及びストレプトマイシンはNorth China Pharmaceutical Co. Ltdから、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）はGibco社から、Cell Titer-Glo（登録商標）細胞生存検出試薬はPromega社から購入した。パンクレアチン及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）はSigma社の製品である。ＭＥＳ−ＳＡ細胞系（ヒト子宮肉腫細胞系）はＡＴＣＣから購入した。ＭＲＣ５細胞（ヒト胎児肺線維芽細胞）はＡＴＣＣから購入した。
【０１２４】
実験方法：
白壁及び浸透性底付き９６−ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に、ウエル当たり５０００個の細胞を植え付け、３７℃、５％ＣＯ2で２４時間培養した。試験に供する化合物をＤＭＳＯに溶解し、１００ｍＭに希釈し、該化合物の母液を得た。
【０１２５】
２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液を化合物の希釈に用いた。ここで、濃度勾配は３勾配、濃度範囲は１００μＭから０．０４６μＭである。種々の希釈度の化合物を９６−ウエルプレートの培養細胞に、ウエル当たり１００μＬ加えた。３７℃、ＣＯ2で７２時間培養し、上澄み液を除去し、細胞生存検出試験を実施した。
【０１２６】
Cell Titer-Glo（登録商標） 反応緩衝液を等量の基質と混合し、混合物を９６−ウエルプレートにウエル当たり１００μＬ加えた。４分間水平振とうして細胞溶解を誘導した。室温で１５分間、平衡状態にし、反応信号を安定化した。９６−ウエルプレートのそれぞれのウエルの化学発光量を、化学発光検出器を用いてで検出した。
【０１２７】
それぞれの化合物の異なる希釈度での阻害率をそれぞれのウエルの化学発光値から計算し、Origin 8.0ソフトウェアを用いてそれぞれの化合物のＳ型曲線近似を行い、ＥＣ50を計算した。ＭＲＣ５細胞に対する化合物のＥＣ50値の、ＭＥＳ−ＳＡ細胞に対する化合物のＥＣ50値の比を、その化合物の治療指数として用いた。結果を表６に示す。
【表１１】
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【０１２８】
この結果は、本発明の化合物が、多薬剤耐性腫瘍細胞系ＭＥＳ−ＳＡの増殖を効果的にに阻害し、正常細胞に対するそれらの阻害活性は、一般にＭＥＳ−ＳＡに対する阻害活性より低く、したがって、良好な治療指数と良好な安全性を有していることを示している。いくつかの化合物は、ラパマイシンより優れた効果を示し、抗腫瘍医薬を作ることが期待され、又は抗腫瘍医薬として作用することが期待される。
【０１２９】
本発明を実施する具体的な形態を詳細に述べたが、これらの詳細を、本発明が開示している教示に基づいて、修正し、変更できることは当業者にとっては自明であり、それらの変更は本発明の範囲に含まれる。本発明の全保護範囲は、添付の請求項とそのすべての等価物である。
【図１Ａ】
0006542808.tif 000024
【図１Ｂ】
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