(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは動物対象の免疫プロファイルを、正常と同定および特徴づける、または、特定の疾患と関連付けられた細胞のタイプおよび数の存在を特徴とすると同定および特徴づけるために、半定量的配列情報を解析する方法であって、以下の工程を含む方法：
(a)対象の免疫プロファイルとデータベース中に保存された疾患ライブラリー由来の累積的な免疫プロファイルとの間で共有される1つまたは複数の別個の相補性決定領域3（CDR3）配列を同定する工程；
(b)該共有される別個のCDR3配列に対応する、対象の検出された配列の総数を合計する工程；
(c)対象の免疫プロファイルと疾患ライブラリーとの間で共有されるそれらの別個のCDR3を表す、検出された配列の総数の対象の免疫プロファイルにおけるパーセンテージを計算して、1つまたは複数のオリジナル・シェアリング・インデックス（original sharing indice）を作成する工程；
(d)データベース中に保存されたパブリックライブラリーから配列を無作為に選択してサブライブラリーを形成する工程であって、該サブライブラリーが、疾患ライブラリー中の別個のCDR3配列の数にほぼ等しい複数の別個のCDR3配列を含む、工程；
(e)対象の免疫プロファイルとサブライブラリーとの間で共有される1つまたは複数の別個のCDR3配列を同定する工程；
(f)該共有されるCDR3配列に対応する検出された配列の総数を合計し、かつ対象の免疫プロファイルとサブライブラリーとの間で共有される検出された配列の総数の対象の免疫プロファイルにおけるパーセンテージを計算して、サンプリング・シェアリング・インデックス（sampling sharing index）を作成する工程；
(g)工程(d)〜(f)を、対象の免疫プロファイルを、正常と同定および特徴づける、または、特定の疾患と関連付けられた細胞のタイプおよび数の存在を特徴とすると同定および特徴づけるための、統計的に有意な結果をもたらすのに十分な回数繰り返す工程；および
(h)サンプリング・シェアリング・インデックスが、対象の免疫プロファイルと疾患ライブラリーとの間のオリジナル・シェアリング・インデックスに等しいかまたはそれを超える回数の割合としてP値を推定する工程。
【請求項２】
工程(g)が、工程(d)〜(f)を少なくとも1000回またはそれ以上繰り返すことを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
該対象からの別個のCDR3の半定量的増幅および配列決定が工程(a)に先行し、該半定量的増幅および配列決定が以下の工程を含む、請求項1または請求項2記載の方法：
(i)対象から単離された白血球の亜集団から、RNAを単離する工程；
(ii)ネステッドプライマーを用いてアンプリコンを生成するために第1増幅反応においてRT-PCRを用いてRNAを増幅する工程であって、ネステッドプライマーの少なくとも一部分が、結果として生じるアンプリコン中に共用プライマーに対する結合部位を組み込むための追加のヌクレオチドを含む、工程；
(iii)第1増幅反応由来のアンプリコンと第1増幅反応由来の1つまたは複数の未使用プライマーとを分離する工程；
(iv)第2増幅反応において共用プライマーを添加することによって、共用プライマーに対する少なくとも1つの結合部位を有する第1増幅反応のアンプリコンを増幅する工程であって、第2増幅反応の産物が別個のCDR3を含むポリヌクレオチドである工程；ならびに
(v)細胞の亜集団における抗体および／または受容体の再構成を同定するために、第2増幅反応のアンプリコンを配列決定する工程；
ここで、工程(iv)および(v)の増幅および配列決定が、該対象からの別個のCDR3についての半定量的配列情報をもたらす、方法。
【請求項４】
白血球の亜集団の単離が、フローサイトメトリーによって行われる、請求項3記載の方法。
【請求項５】
白血球の亜集団がT細胞を含む、請求項3記載の方法。
【請求項６】
T細胞が、ナイーブT細胞、成熟T細胞および記憶T細胞からなる群より選択される、請求項5記載の方法。
【請求項７】
白血球の亜集団がB細胞を含む、請求項3記載の方法。
【請求項８】
B細胞が、ナイーブB細胞、成熟B細胞および記憶B細胞からなる群より選択される、請求項7記載の方法。
【請求項９】
細胞の亜集団における再構成が、B細胞免疫グロブリン重鎖（IgH）、B細胞κ、B細胞λ軽鎖、T細胞受容体β、T細胞γおよびT細胞δの再構成からなる群より選択される、請求項3記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。2014年2月5日に作成された、該ASCIIコピーは、15892-0005_SL.txtという名称であり、サイズは93,776バイトである。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、「Method for Evaluating an Immunorepertoire」と題される、2013年2月11日に出願された、米国仮出願第61/763,341号の継続出願であり、その優先権を主張し、これは参照により本明細書に組み入れられる。
【０００３】
発明の分野
本発明は、細胞の集団中のT細胞受容体抗体を同定するための方法、およびその情報を用いて患者の免疫状態を測定し、患者がどの疾患を有し得る可能性があるかを予測するための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
科学者は、ある疾患が特定の遺伝子または遺伝子突然変異と関連付けられることを長年にわたって知っている。しかし、遺伝的因果関係は、ヒトにおいて診断される疾患の一部のみを占める。多くの疾患が、感染および環境要因に対する免疫系の反応と何らかの関係があるようであるが、免疫系が、癌、アルツハイマー病、肋軟骨炎、線維筋痛症、狼瘡、および他の疾患などの疾患においてどのような役割を果たすかは、依然として不明のままである。
【０００５】
ヒトゲノムは、7つの主要座に局在する、一倍体ゲノム当たり総数567〜588個のIG（免疫グロブリン）ならびにTR（T細胞受容体）遺伝子（339〜354個のIGおよび228〜234個のTR）を含む。それらは405〜418個のV、32個のD、105〜109個のJおよび25〜29個のC遺伝子を含む。機能的IGおよびTR遺伝子の数は一倍体ゲノム当たり321〜353個である。それらは187〜216個のV、28個のD、86〜88個のJおよび20〜21個のC遺伝子を含む（http://imgt.cines.fr）。これらの遺伝子の再構成によって、推定2.5x107個の可能性のある抗体またはT細胞受容体が作製され得る。
【０００６】
現在まで、わずかな疾患しか、共通抗原（Prinz, J. et al., Eur. J. Immunol. (1999) 29(10): 3360-3368,「Selection of Conserved TCR VDJ Rearrangements in Chronic Psoriatic Plaques Indicates a Common Antigen in Psoriasis Vulgaris」（非特許文献1））および／または特定のVDJ再構成（Tamaru, J. et al., Blood (1994) 84(3): 708-715, 「Hodgkin's Disease with a B-cell Phenotype Often Shows a VDJ Rearrangement and Somatic Mutations in the VH Genes」（非特許文献2））に対する身体の反応と関連付けられていない。必要とされるのは、ヒト免疫反応細胞における変化を評価し、それらの変化と特定の疾患とを関連付けるためのよりよい方法である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Prinz, J. et al., Eur. J. Immunol. (1999) 29(10): 3360-3368,「Selection of Conserved TCR VDJ Rearrangements in Chronic Psoriatic Plaques Indicates a Common Antigen in Psoriasis Vulgaris」
【非特許文献２】Tamaru, J. et al., Blood (1994) 84(3): 708-715, 「Hodgkin's Disease with a B-cell Phenotype Often Shows a VDJ Rearrangement and Somatic Mutations in the VH Genes」
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、免疫反応細胞集団における変化を評価し、それらの変化と特定の疾患とを関連付けるための方法に関する。本発明の一局面において、方法は、(a)少なくとも1つのヒトまたは動物対象から白血球の亜集団を単離する工程、(b)細胞の亜集団からRNAを単離する工程、(c)ネステッドプライマーを用いてアンプリコンを生成するために第1増幅反応においてRT-PCRを用いてRNAを増幅する工程であって、ネステッドプライマーの少なくとも一部分が、結果として生じるアンプリコン中に共用プライマーに対する結合部位を組み込むための追加のヌクレオチドを含む、工程、(d)第1増幅反応由来のアンプリコンと第1増幅反応由来の1つまたは複数の未使用プライマーとを分離する工程、(e)第2増幅反応において共用プライマーを添加することによって、共用プライマーに対する少なくとも1つの結合部位を有する第1増幅反応のアンプリコンを増幅する工程、ならびに(f)細胞の亜集団における抗体および／または受容体の再構成を同定するために、第2増幅反応のアンプリコンを配列決定する工程を含む。一態様において、亜集団は、全血集団または別の混合集団のサンプルを含み得る。
【０００９】
一態様において、白血球の亜集団を単離する工程を、ナイーブB細胞、成熟B細胞、記憶B細胞、ナイーブT細胞、成熟T細胞、および記憶T細胞を分離するために、フローサイトメトリーによって行ってもよい。方法の様々な態様において、細胞の亜集団における組換えは、B細胞免疫グロブリン重鎖（IgH）、κおよび／またはλ軽鎖（IgK、IgL）、T細胞受容体α、β、γ、δの再構成である。
【００１０】
本発明の別の局面において、方法は、以下を含む追加の工程を任意で含み得る：(g)ワクチンが投与された個体の集団について同定された再構成と、ワクチンが投与されなかった個体の集団について同定された再構成とを比較し、免疫反応を生じさせることにおけるワクチンの有効性を評価する工程。
【００１１】
方法はまた、以下の追加の工程を任意で含み得る：(g)正常な個体の集団について同定された再構成と、疾患を有すると診断された個体の集団について同定された再構成とを比較して、特定の再構成または再構成のセットと疾患との間に相関関係があるかどうかを決定する工程。
【００１２】
様々な局面において、方法は、T細胞またはB細胞内の遺伝子再構成から生じ、特定の抗原についての抗体および／またはT細胞受容体の親和性および特異性の原因である相補性決定領域3（CDR3）を含むポリヌクレオチドの半定量的増幅をもたらすことができる。半定量的増幅は、特定のCDR3配列の存在を検出するだけでなく、それらのCDR3配列を生成するために必要な組換え事象をもたらした細胞の相対存在量を決定するための方法を提供する。
【００１３】
本発明の一局面は、従って、半定量的配列情報を解析してヒトまたは動物についての1つまたは複数の免疫状態レポートを提供するための方法に関する。免疫状態レポートを与えるための方法は、以下の工程を含む：(a)対象の免疫プロファイルとデータベース中に保存された疾患ライブラリー由来の累積的な免疫プロファイルとの間で共有される1つまたは複数の別個のCDR3配列を同定し、該共有される別個のCDR3配列に対応する、対象の検出された配列の総数を合計し、そして対象の免疫プロファイルと疾患ライブラリーとの間で共有されるそれらの別個のCDR3を表す、検出された配列の総数の対象の免疫プロファイルにおけるパーセンテージを計算して、1つまたは複数のオリジナル・シェアリング・インデックス（original sharing indice）を作成する工程；(b)データベース中に保存されたパブリックライブラリーから配列を無作為に選択して、疾患ライブラリー中の別個のCDR3配列の数にほぼ等しい複数の配列を含むサブライブラリーを形成し、対象の免疫プロファイルとサブライブラリーとの間で共有される1つまたは複数の別個のCDR3配列を同定し、該共有されるCDR3配列に対応する検出された配列の総数を合計し、そして対象の免疫プロファイルとサブライブラリーとの間で共有される検出された配列の総数の対象の免疫プロファイルにおけるパーセンテージを計算して、サンプリング・シェアリング・インデックス（sampling sharing index）を作成する工程；(c)工程(b)を少なくとも1000回またはそれ以上繰り返す工程；および(d)サンプリング・シェアリング・インデックスが、患者の免疫プロファイルと疾患ライブラリーとの間のオリジナル・シェアリング・インデックスに等しいかまたはそれを超える回数の割合としてP値を推定する工程。
【００１４】
[本発明1001]
免疫反応細胞集団における変化を評価し、それらの変化と特定の疾患とを関連付けるための方法であって、以下の工程を含む方法：
(a)少なくとも1つのヒトまたは動物対象から白血球の亜集団を単離する工程；
(b)細胞の該亜集団からRNAを単離する工程；
(c)ネステッドプライマーを用いてアンプリコンを生成するために第1増幅反応においてRT-PCRを用いてRNAを増幅する工程であって、ネステッドプライマーの少なくとも一部分が、結果として生じるアンプリコン中に共用プライマーに対する結合部位を組み込むための追加のヌクレオチドを含む、工程；
(d)第1増幅反応由来のアンプリコンと第1増幅反応由来の1つまたは複数の未使用プライマーとを分離する工程；
(e)第2増幅反応において共用プライマーを添加することによって、共用プライマーに対する少なくとも1つの結合部位を有する第1増幅反応のアンプリコンを増幅する工程；ならびに
(f)細胞の亜集団における抗体および／または受容体の再構成を同定するために、第2増幅反応のアンプリコンを配列決定する工程。
[本発明1002]
第2増幅反応の産物が、相補性決定領域3（CDR3）を含むポリヌクレオチドである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
白血球の亜集団を単離する工程が、フローサイトメトリーによって行われる、本発明1001の方法。
[本発明1004]
白血球の亜集団がT細胞を含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
T細胞が、ナイーブT細胞、成熟T細胞および記憶T細胞からなる群より選択される、本発明1004の方法。
[本発明1006]
白血球の亜集団がB細胞を含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
B細胞が、ナイーブB細胞、成熟B細胞および記憶B細胞からなる群より選択される、本発明1006の方法。
[本発明1008]
細胞の亜集団における再構成が、B細胞免疫グロブリン重鎖（IgH）、B細胞κ、B細胞λ軽鎖、T細胞受容体β、T細胞γおよびT細胞δの再構成からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1009]
(g)ワクチンが投与された個体の集団について同定された再構成と、ワクチンが投与されなかった個体の集団について同定された再構成とを比較する工程；および
(h)免疫反応を生じさせることにおけるワクチンの有効性を評価する工程
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
(g)正常な個体の集団について同定された再構成と、疾患を有すると診断された個体の集団について同定された再構成とを比較する工程；
(h)特定の再構成または再構成のセットと疾患との間に相関関係があるかどうかを決定する工程
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1011]
ヒトまたは動物についての1つまたは複数の免疫状態レポートを提供するために、半定量的配列情報を解析する方法であって、以下の工程を含む方法：
(a)対象の免疫プロファイルとデータベース中に保存された疾患ライブラリー由来の累積的な免疫プロファイルとの間で共有される1つまたは複数の別個のCDR3配列を同定する工程；
(b)該共有される別個のCDR3配列に対応する、対象の検出された配列の総数を合計する工程；
(c)対象の免疫プロファイルと疾患ライブラリーとの間で共有されるそれらの別個のCDR3を表す、検出された配列の総数の対象の免疫プロファイルにおけるパーセンテージを計算して、1つまたは複数のオリジナル・シェアリング・インデックス（original sharing indice）を作成する工程；
(d)データベース中に保存されたパブリックライブラリーから配列を無作為に選択してサブライブラリーを形成する工程であって、該サブライブラリーが、疾患ライブラリー中の別個のCDR3配列の数にほぼ等しい複数の別個のCDR3配列を含む、工程；
(e)対象の免疫プロファイルとサブライブラリーとの間で共有される1つまたは複数の別個のCDR3配列を同定する工程；
(f)該共有されるCDR3配列に対応する検出された配列の総数を合計し、かつ対象の免疫プロファイルとサブライブラリーとの間で共有される検出された配列の総数の対象の免疫プロファイルにおけるパーセンテージを計算して、サンプリング・シェアリング・インデックス（sampling sharing index）を作成する工程；
(g)工程(d)〜(f)を少なくとも1000回またはそれ以上繰り返す工程；および
(h)サンプリング・シェアリング・インデックスが、患者の免疫プロファイルと疾患ライブラリーとの間のオリジナル・シェアリング・インデックスに等しいかまたはそれを超える回数の割合としてP値を推定する工程。
[本発明1012]
個人の免疫レパートリーのデータベースを開発するための方法であって、以下の工程を含む方法：
(a)1つまたは複数の個体に由来する白血球の亜集団由来の1つまたは複数のRNAを増幅および配列決定する工程；
(b)配列をデータベースへ入力して、コンピューター、サーバー、または他の電子記憶装置上に保存され得るデータを提供する工程；
(c)1つまたは複数のRNAの配列に対応する個体についての識別情報および特徴を、コンピューター、サーバー、または他の電子記憶装置上に保存され得るデータとして入力する工程、ならびに
(d)1つまたは複数の個体について工程(b)および工程(e)のデータを評価して、1つまたは複数のRNA配列と配列に対応する個体の1つまたは複数の特徴との間に相関関係が存在するかどうかを決定する工程。
[本発明1013]
識別情報が、患者識別番号、患者のHLA型を含むコード、下されている場合がある1つまたは複数の臨床診断を含む疾患コード、サンプルの日付を含む「ステージング・コード」、RNAが増幅および配列決定された細胞亜集団の型を含む細胞型コード、ならびにサンプルについて同定された配列を含む1つまたは複数の配列コードからなる群より選択される、本発明1012の方法。
[本発明1014]
白血球の亜集団がT細胞を含む、本発明1012の方法。
[本発明1015]
T細胞が、ナイーブT細胞、成熟T細胞および記憶T細胞からなる群より選択される、本発明1014の方法。
[本発明1016]
白血球の亜集団がB細胞を含む、本発明1012の方法。
[本発明1017]
B細胞が、ナイーブB細胞、成熟B細胞および記憶B細胞からなる群より選択される、本発明1016の方法。
本開示は、下記の図面を参照してよりよく理解することができる。図面の要素は、必ずしも互いに一定の縮尺ではなく、代わりに、本開示の原理を明確に説明することを目的として強調されている。さらに、同様の参照番号は、いくつかの図にわたって対応する部分を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図1aおよび1bは、本明細書に開示されるプライマーを用いて本発明の方法によって得られた増幅産物の存在を示すゲルの写真である。
【図２】図2aおよび2bは、疾患を有する個体および全般的に健康である個体における免疫プロファイル間の観察された多様性の差異を示す図であり、各黒丸は別個のCDR3配列を示し、丸のサイズは、別個のCDR3配列が免疫プロファイルにおいて見出される回数を示す。
【図３】パブリックライブラリーを作成するための方法を示す図である。
【図４】疾患ライブラリーを作成するための方法を示す図である。
【図５】患者免疫プロファイルと疾患ライブラリーとを比較し、これら2つに共有される患者免疫プロファイル中の各別個のCDR3についてのパーセンテージを計算し、そしてそれらのパーセンテージを合算して合計またはシェアリング・インデックスを作ることによって得られた結果を示す。
【図６】患者免疫プロファイルとパブリックライブラリーのサブセットとを比較し、これら2つに共有される各別個のCDR3についてのパーセンテージを計算し、そして患者免疫プロファイル中のそれらのパーセンテージを合算して合計またはシェアリング・インデックスを作ることによって得られた結果を示す。
【図７】本発明の方法を示すグラフであり、ここで、曲線下面積は、パブリックライブラリーのサブセット（サブライブラリー）について得られたトータル・シェアリング・インデックス（total sharing indice）を示し、P値が推定され、個体の免疫プロファイルおよび1つまたは複数の疾患ライブラリーの比較についてのシェアリング・インデックスは、垂線（DL1、DL2など）によって示される。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
詳細な説明
本発明者らは、多数の細胞からの抗体およびT細胞受容体の再構成を評価するための方法を開発し、この方法は、個体の集団において同定された再構成を比較して、特定の再構成または再構成のセットと疾患または疾患のある症状との間に相関関係があるかどうかを決定することについて有用である。この方法はまた、感染および／または環境要因に応答しての個体（単数または複数）の免疫反応の履歴を確立することについて、ならびにワクチンの有効性を評価することについて有用である。
【００１７】
本発明は、免疫反応細胞集団における変化を評価し、それらの変化と特定の疾患とを関連付けるための方法に関する。本発明の一局面において、方法は、(a)少なくとも1つのヒトまたは動物対象から白血球の亜集団を単離する工程、(b)細胞の亜集団からRNAを単離する工程、(c)ネステッドプライマーを用いてアンプリコンを生成するために第1増幅反応においてRT-PCRを用いてRNAを増幅する工程であって、ネステッドプライマーの少なくとも一部分が、結果として生じるアンプリコン中に共用プライマーに対する結合部位を組み込むための追加のヌクレオチドを含む、工程、(d)第1増幅反応由来のアンプリコンと第1増幅反応由来の1つまたは複数の未使用プライマーとを分離する工程、(e)第2増幅反応において共用プライマーを添加することによって、共用プライマーに対する少なくとも1つの結合部位を有する第1増幅反応のアンプリコンを増幅する工程、ならびに(f)細胞の亜集団における抗体および／または受容体の再構成を同定するために、第2増幅反応のアンプリコンを配列決定する工程を含む。一態様において、亜集団は、全血集団または別の混合集団サンプルを含み得る。
【００１８】
一態様において、末梢血サンプルを患者から採取し、白血球の亜集団を単離する工程を、ナイーブB細胞、成熟B細胞、記憶B細胞、ナイーブT細胞、成熟T細胞、および記憶T細胞を分離するために、フローサイトメトリーによって行ってもよい。細胞の亜集団における組換えは、B細胞免疫グロブリン重鎖（IgH）、κおよび／またはλ軽鎖（IgK、IgL）、T細胞受容体β、γ、またはδの再構成である。
【００１９】
本発明の第2局面において、方法は、以下の追加の工程を含み得る：(g)正常な個体の集団について同定された再構成と、疾患を有すると診断された個体の集団について同定された再構成とを比較して、特定の再構成または再構成のセットと疾患との間に相関関係があるかどうかを決定する工程。
【００２０】
本発明の別の局面において、方法は、以下を含む追加の工程を含み得る：(g)ワクチンが投与された個体の集団について同定された再構成と、ワクチンが投与されなかった個体の集団について同定された再構成とを比較し、免疫反応を生じさせることにおけるワクチンの有効性を評価する工程。
【００２１】
ある態様において、第1増幅反応由来のアンプリコンと第1増幅反応由来の1つまたは複数の未使用プライマーとを分離する工程を省略してもよく、2つの増幅反応を同じ反応チューブにおいて行ってもよい。
【００２２】
本発明者は、公開番号WO2005/038039（この開示は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）に記載した、tem-PCRとして公知のPCR法を以前開発した。より最近になって、本発明者は、米国仮特許出願第61/042,259号（この開示は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）に記載した、arm-PCRと呼ばれる方法を開発した。さらに、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出するための装置を記載し、この装置は以下を含む：ネステッドプライマーを用いてアンプリコンを生成するために1つまたは複数の標的ポリヌクレオチドを増幅するためのサーモサイクリング用の第1増幅チャンバであって、ネステッドプライマーの少なくとも一部分が、結果として生じるアンプリコン中に共用プライマーに対する結合部位を組み込むための追加のヌクレオチドを含む、第1増幅チャンバ；第1増幅反応由来のアンプリコンと第1増幅反応由来の1つまたは複数の未使用プライマーとを分離するための手段；および、第2増幅反応において共用プライマーを添加することによって、第1増幅反応の間に生成された1つまたは複数のアンプリコンを増幅するためのサーモサイクリング用の第2増幅チャンバであって、第1増幅反応のアンプリコンが、少なくとも1つの共用プライマーに対する少なくとも1つの結合部位を有する、第2増幅チャンバ。
【００２３】
廃棄物リザーバおよび第2 PCRチャンバの両方に流体接続された第1 PCRチャンバを含むPCRチップも記載し、廃棄物リザーバおよび第2 PCRチャンバは各々、さらに少なくとも1つの電極を含み、電極は、第1 PCRチャンバから生成されたアンプリコンを分離するための手段を含む。第2 PCRチャンバは、ハイブリダイゼーションおよび検出チャンバに流体接続されており、ハイブリダイゼーションおよび検出チャンバは、ビーズの物理的な位置が、チップによって分析されるサンプル中の特定の標的ポリヌクレオチドの存在の指標となるように配置された、マイクロスフィアまたはビーズを含む。
【００２４】
tem-PCR法、および特にarm-PCR法は、1つの反応で多数のポリヌクレオチドの半定量的増幅を提供する。さらに、arm-PCRは上乗せされた感度を提供する。両方とも、1つの反応で多数のポリヌクレオチドを増幅する能力を提供し、これは、例えば、様々なT細胞およびB細胞のレパートリーが非常に大きいために、本発明の方法において有利である。増幅反応における共用プライマー結合部位の添加、および共用プライマーを用いた標的分子のその後の増幅は、定量的、または半定量的結果を提供する − 患者血液サンプル中の様々な再構成を含む細胞の相対量を決定することを可能にする。抗原の認識に起因するクローン増殖は、その抗原を認識する、より大きな集団の細胞をもたらし、それらの相対数によって細胞を評価することは、抗原曝露が抗体産生B細胞または受容体保有T細胞の増殖に影響を与えたかどうかを決定するための方法を提供する。これは、例えば、特定の疾患を有すると診断された個体において、優勢である特定の細胞の集団が存在し得るかどうかを評価するために有用であり、また、ワクチンが与えられた個体においてワクチンが所望の免疫反応を達成したか否かを評価するために特に有用であり得る。
【００２５】
いくつかの市販のハイスループットシークエンシング技術、例えば、Roche Life Sciencesの454シークエンシングがある。454シークエンシング法において、454Aおよび454Bプライマーが、PCR中にPCR産物上へ連結されるかまたはPCR反応後にライゲーションされる。tem-PCRまたはarm-PCRと協力して行われる場合、454Aおよび454Bプライマーは増幅反応において共用プライマーとして使用され得る。PCR産物、通常、異なる配列の混合物は、1μl当たり約200コピーへ希釈される。「エマルジョンPCR」反応において（半固体ゲル様環境）、希釈されたPCR産物は、マイクロビーズの表面上においてプライマー（454Aまたは454B）によって増幅される。PCRテンプレートは非常に希薄であるので、通常、たった1つのビーズが1つのテンプレートに隣接しており、半固体環境中に閉じ込められ、増幅はビーズ上および周囲においてのみ生じる。次いで、ビーズが溶出され、特別に設計されたウェルを有するプレート上へ置かれる。各ウェルは1つのビーズのみを保持することができる。次いで、試薬がウェルへ添加され、パイロシークエンシングが行われる。光ファイバー検出器が、各ウェルからのシークエンシング反応を読み取るために使用され得、データがコンピューターによって並行して収集される。1つのそのようなハイスループット反応が、6000万個までの読み取り（6000万個のビーズ）を生じさせることができ、各読み取りは、約300bp配列を生じさせることができる。
【００２６】
本発明の一局面は、「個人の免疫レパートリー」または免疫プロファイルのデータベースの開発を含み、その結果、各個体は、ベースラインを確立し、長年にわたって、既知および未知の両方の抗原に対する免疫反応の発達を追跡できる。この情報は、情報が多数の個体から集められる場合、特に、癌および心臓疾患などの疾患の発症に関して、価値ある情報をもたらすであろう疫学的データベースを提供する可能性があり、これらの疾患は、形質転換細胞またはウイルスもしくは他の感染要因への曝露から生じることが多いと考えられており、それらの多くはまだ確認されていない。本発明の方法についての1つの特に重要な使用は、感染症、環境要因、またはワクチンが自閉症の原因であり得るかどうかを決定するための小児の評価を含む。例えば、ワクチン投与は自閉症の発症を誘発し得ると多くの人が仮定している。しかし、多くの人はまた、その可能性のある相関関係を、ワクチン中のチメロサールなどの薬剤の使用によるものとし、研究は、チメロサールはその疾患の原因因子ではないようであることを実証した。カクテルワクチンの開発が、自閉症の症例数の増加と相関関係があるという推測が依然として存在するが、データを集めて多数の抗原についての潜在的な因果関係を評価することは、極めて困難である。本発明の方法は、そのプロセスを簡略化し、自閉症および他の疾患のよりよい理解のための重要な情報を提供し得、ここで、異なる個体の免疫反応は、因子または因子の群に曝露された一部の個体における疾患のディファレンシャルな発症についての説明を提供し得、一方、同様に曝露された他の人はその疾患を発症しない。
【００２７】
感染によって誘発される、免疫プロファイルの不均衡は、癌、白血病、神経疾患（アルツハイマー病、多発性硬化症、パーキンソン病、自閉症など）、自己免疫疾患、および代謝疾患を含む、多くの疾患に至り得る。これらの疾患は、免疫プロファイル疾患と呼ばれ得る。次の2つの免疫プロファイル疾患形態が存在し得る：(1)「機能喪失」形態、および(2)「機能獲得」形態。「機能喪失」形態において、人は疾患にかかりやすく、何故ならば、制限されたおよび／または限定された免疫プロファイルは、最も効果的かつ必要なIGおよびTRを産生する細胞を欠いているためである。「機能獲得」形態において、人は疾患にかかりやすく、何故ならば、免疫プロファイルは、通常はそこに存在するべきでないIGおよびTRを産生する細胞を獲得したためである。「機能喪失」（LOF）免疫プロファイル疾患において、個体は、疾患と戦うために適切な機能性B細胞またはT細胞を有しない。HLAタイピングは、それらの細胞が、免疫細胞成熟プロセスの初期段階の間に排除されることを明らかにしており、それらの細胞は、自己タンパク質に対して強く反応するために、一般に排除される。
【００２８】
本発明の一局面はまた、以下を含む方法を提供する：(a)1つまたは複数の個体由来のT細胞および／またはB細胞由来の1つまたは複数のRNAを増幅および配列決定する工程、(b)配列をデータベースへ入力して、コンピューター、サーバー、または他の電子記憶装置上に保存され得るデータを提供する工程、(c)1つまたは複数のRNAの配列に対応する個体についての識別情報および特徴を、コンピューター、サーバー、または他の電子記憶装置上に保存されてもよいデータとして入力する工程、ならびに(d)1つまたは複数の個体について工程(b)および工程(e)のデータを評価して、1つまたは複数のRNA配列と配列に対応する個体の1つまたは複数の特徴との間に相関関係が存在するかどうかを決定する工程。識別情報は、例えば、患者識別番号、患者のHLA型を含むコード、下されている場合がある1つまたは複数の臨床診断を含む疾患コード、サンプルの日付を含む「ステージング・コード」、RNAが増幅および配列決定された細胞亜集団の型を含む細胞型コード、ならびにサンプルについて同定された配列を含む1つまたは複数の配列コードを含み得る。
【００２９】
記載の方法は、免疫レパートリー全体の増幅を可能にするだけでなく、高度に多重化された様式でかつ半定量的に増幅を可能にする、新規のプライマー設計を含む。多重増幅は、ごく少数のPCRまたはRT-PCR反応が必要とされることを要求する。例えば、全てのIGが1つの反応で増幅され得、または、それをIgH、IgLまたはIgKについて2つまたは3つの反応に分割することができる。同様に、TRA、TRB、TRD、およびTRGを含む、T細胞受容体（TR）は、たった1つの反応で増幅され得るか、または少数の反応で増幅され得る。半定量的増幅は、多重反応における全ての標的が独立して増幅され、その結果、増幅産物のエンド・ポイント分析は、それらの標的における元の内部比率を反映することを意味する。
【００３０】
様々な局面において、方法は、T細胞またはB細胞内の遺伝子再構成から生じ、特定の抗原についての抗体および／またはT細胞受容体の親和性および特異性の原因である相補性決定領域（CDR）を含むポリヌクレオチドの半定量的増幅をもたらすことができる。半定量的増幅は、特定のCDR3配列の存在を検出するだけでなく、それらのCDR3配列を生成するために必要な組換え事象をもたらした細胞の相対数を決定するための方法を提供する。
【００３１】
本発明の一局面は、従って、半定量的配列情報を解析してヒトまたは動物についての1つまたは複数の免疫状態レポートを提供するための方法に関する。免疫状態レポートを作成するための方法は、以下の工程を含む：(a)対象の免疫プロファイルとデータベース中に保存された疾患ライブラリーとの間で共有される1つまたは複数の別個のCDR3配列を同定し、該共有されるCDR3配列の総数を合計し、そして対象の免疫プロファイルと疾患ライブラリーとの間で共有される、対象の免疫プロファイル中の配列の総数のパーセンテージを計算して、1つまたは複数のオリジナル・シェアリング・インデックスを作成する工程；(b)データベース中に保存されたパブリックライブラリーから配列を無作為に選択して、疾患ライブラリー中の別個のCDR3配列の数にほぼ等しい複数の配列を含むサブライブラリーを形成し、対象の免疫プロファイルとサブライブラリーとの間で共有される1つまたは複数の別個のCDR3配列を同定し、該共有されるCDR3配列の総数を合計し、そして対象の免疫プロファイルとサブライブラリーとの間で共有される、対象の免疫プロファイル中の配列の総数のパーセンテージを計算して、サンプリング・シェアリング・インデックスを作成する工程；(c)工程(b)を少なくとも1000回またはそれ以上繰り返す工程；および(d)サンプリング・シェアリング・インデックスが、患者の免疫プロファイルと疾患ライブラリーとの間のオリジナル・シェアリング・インデックスに等しいかまたはそれを超える回数の割合としてP値を推定する工程。
【００３２】
本発明者らは、例えば、癌、自己免疫疾患などといった、ある疾患を有する個体の免疫プロファイルは、1つまたは複数の免疫細胞集団における多様性の欠如を特徴とし得ることを発見した。図1は、例えば、癌患者（図1a）由来の血液サンプル中に存在するT細胞の別個のタイプおよび数と、健康な患者（図1b）由来のものとの間で観察され得る差異を示す図であり、ここで、各円は、T細胞受容体の相補性決定領域（例えば、CDR3）の、増幅および配列決定された組換えcDNAによって示されるT細胞の別個のタイプと、同じCDR3配列を共有するとPCR増幅および配列決定によって決定された細胞の相対数とを示す。図1aが示すように、CDR3配列によって示されるように、異なる特異性の別個の細胞はより少ないが、ある特定の特異性の細胞の数はより多い場合がある。図1bは、異なる細胞がより多いが、同じCDR3配列を共有する各タイプの細胞の数がより少ない正常プロファイルを示している。
【００３３】
各別個のCDR3を発現する細胞のリスト、およびヒトまたは動物由来の血液または組織サンプル中に示されるそのような細胞の数は、そのヒトまたは動物についての免疫プロファイルを構成し得る。ヒトのある群、例えば、健康な個体と様々な異なる疾患を有する個体との両方を含む群からの免疫プロファイルをコンパイルすることは、正常な集団において見られる多様性のタイプを表す「パブリックライブラリー」を提供し得る（図2）。同様に、特定の疾患を有すると臨床的に診断された個体の群の免疫プロファイルをコンパイルすることは、拡大された細胞集団の特定のCDR3など、多様性の欠如を表す「疾患ライブラリー」を提供し得る（図3）。これらの免疫プロファイルは、例えば、インターネットへのコンピューターアクセスによってアクセス可能なデータベース中に保存され得、それにより、情報は、患者の免疫状態を分析するために本発明の方法において使用され得る。
【００３４】
別個のCDR3を発現する細胞（「別個のCDR3」、これらの細胞は特有のCDR3配列を共有する）のリスト、および個体由来の血液または組織サンプル中に存在する各別個のCDR3の数を含む、免疫プロファイルを、個々の患者について作成してもよい。患者の免疫プロファイルを、特定の疾患を有すると診断された患者の群の、組み合わせられた免疫プロファイル（データベース中に保存された、疾患ライブラリー）と比較する。これは、一連の疾患ライブラリーについて行われ得、図4に示す。
【００３５】
何百万もの可能性のある組み合わせが、パブリックライブラリーについて可能であり、それらの個体の大部分の免疫系は、一般に、特定の疾患を有すると診断された個体の群のそれよりも増加した多様性を示す。従って、本発明者らは、本発明の方法についての正確な評価および比較が、パブリックライブラリー中の別個のCDR3のリストおよびそれらの数から無作為にサンプリング／選択することによってサブライブラリーを作成する工程によって促進されると判断した。CDR3断片の特有のペプチド配列によって示される、別個のCDR3の数は、疾患ライブラリーにおいて同定された別個のCDR3の数、または2つ以上の疾患ライブラリーから計算された平均値とほぼ同じであるべきである。パブリックライブラリーから無作為にサンプリングすることによって作成された、有意な数のサブライブラリー、例えば、1000またはそれ以上のサブライブラリーを作成することは、様々な別個のCDR3の存在を増加させ、個々の患者の免疫プロファイルを、正常（「健康」）と同定および特徴づける、または、特定の疾患と関連付けられた細胞のタイプおよび数の存在を特徴とすると同定および特徴づけるために、統計的に有意に有効である結果をもたらす。
【００３６】
本発明の方法において、患者は、そこから別個のCDR3が半定量的に増幅および配列決定される、例えば血液または組織を含む臨床サンプルを供給する。これは、別個のCDR3の全てについての各CDR3の識別および相対存在量を提供する。この情報は、少なくとも1つのパブリックライブラリーおよび1つまたは複数の疾患ライブラリーを含有するデータベースにアクセスするプログラムへ入力され得る。データ入力および／または解析のために使用されるソフトウェアは、データベースへのインターネットアクセスを介してアクセスされ得るか、またはデータベース中の配列情報へのインターネットアクセスを伴って、個々のパーソナル・コンピューター上に置かれ得る。個体の免疫プロファイルと様々なライブラリーおよびサブライブラリーとの間で比較を得、図4および図5に一般に示されるように結果を作成し、ここで、特定のCDR3配列が検出され、検出されたそれらの別個のCDR3配列の数がカウントされ、そしてその特定の別個のCDR3が個体の免疫プロファイルおよび特定のライブラリーの両方に存在する（即ち、その特定の別個のCDR3が個体と該ライブラリーとの間で「共有される」）か否かについて判定がなされる。共有されると判定されたCDR3の数を示すパーセンテージを一緒に合算して、個体の免疫プロファイルと特定のライブラリーとの間で共有される個体の免疫プロファイル中のCDR3から構成される総数の割合から構成される合計を作成する（即ち、「シェアリング・インデックス」）。サブライブラリーについて得られた結果から、P値を、ランダムパーセンテージが特定の疾患ライブラリーについて示されるパーセンテージに等しいかまたはそれを超える確率として計算し、サンプリング・シェアリング・インデックスが特定のライブラリーについてのオリジナル・シェアリング・インデックスを超える回数の割合が例えば0.01未満である場合、有意な結果が示される。そのシェアリング・インデックスが個体の免疫プロファイルと疾患ライブラリーとの関係を示す場合、個体は、個体／患者が、特定の疾患ライブラリーによって示される疾患を有する可能性について知らされ得る。全ての疾患ライブラリーに対して算出されたP値が0.01を超える場合、個体のレポートは、免疫プロファイルが正常そうであり、疾患状態は検出されなかったことを示し得る。
【００３７】
配列データはコンパイルされ、個体の複数の集団についての1つまたは複数のデータベース中に保存されるので、さらに、あるシェアリング・インデックスを、ある疾患の前提条件または素因を有する集団を示すライブラリーと関連付けることが可能であり得る。免疫系は事前対応（proactive）および事後対応（reactive）の両方であり、免疫プロファイルに反映される免疫系の変化は、素因、前提条件、またはさらには確立された疾患が存在するという、最初の、場合によっては唯一のシグナルを提供し得る。本発明者らは本方法を利用して、あるタイプの癌、炎症性腸疾患、およびあるウイルス感染症が、存在するCDR3を示す免疫レパートリーのサブセットを作成するためにARM-PCR法を使用してCDR3を配列決定することによって得られた患者および確立された疾患ライブラリー間のシェアリング・インデックスを決定することによって検出され得ることを実証した。
【００３８】
フィルターが配列データへ適用される場合、結果は信頼性がさらにより高くなる。例えば、本発明者らは、信頼性が有意にさらに高い結果の作成を助ける、配列データについての「SMART」フィルターを開発した。これを実施例においてさらに説明する。
【００３９】
さらなる説明のために、下記の例は本発明の方法を説明し得る。血液サンプルを任意のワクチンの投与前に小児から採取してもよく、各小児についてのそれらの血液サンプルは「ベースライン」を確立し、それから将来のサンプルが評価され得る。各小児について、将来のサンプルは、疾患と相関することが公知の細胞の集団を拡大させた作用因子への曝露が存在したかどうかを決定するために利用され得、これは、将来的にその疾患を発症するリスクについての「マーカー」として役立ち得る。そのように同定された個体は、次いで、より厳密にモニターされ得、その結果、早期発見が可能となり、任意の利用可能な治療選択肢が、疾患過程のより早い段階で提供され得る。
【００４０】
別の例によると、血液サンプルを任意のワクチンの投与前に小児から採取してもよく、各小児由来のそれらの血液サンプルは「ベースライン」を確立し、それから将来のサンプルが評価され得る。各小児についておよび研究における小児の集団全体について、それらのベースラインは、ワクチン投与後、抗体およびT細胞受容体を増幅させるために標的特異的プライマーを使用したT細胞およびB細胞のRNAシークエンシングの結果と比較され得る。比較は、症状、診断された疾患、ならびに各個体について対応する抗体およびT細胞受容体配列と関連付けられる他の情報に関するデータの評価をさらに含み得る。ワクチンの投与と特定の疾患の発症との間に関係が存在する場合、その疾患の症状を示す個体はまた、例えば、対応する抗体もしくはT細胞受容体、または対応する抗体もしくはT細胞受容体のセットを共有し得る。
【００４１】
本発明の方法は、例えば、自己免疫疾患を有する個体間の共通点を同定するために特に有用であり得、感染および環境因子と、心臓疾患、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、および癌などの疾患との相関関係をよりよく説明する疫学的データを提供し得る − 疾患の存在、または疾患を発症する傾向のいずれかを示す「バイオマーカー」を提供する。
【００４２】
本方法はまた、受動免疫療法の開発のために有用であり得る。例えば、感染要因への曝露後、ある抗体産生B細胞および／またはT細胞が増殖される。本発明の方法は、例えば、防御抗体の同定を可能にし、それらの抗体は、そのような療法が必要とされる状況において受動免疫療法を提供するために利用され得る。
【００４３】
本発明の方法はまた、望ましくない再構成を有する細胞の標的化除去を達成する能力を提供し得、この方法は、そのような細胞再構成が同定され得る手段を提供する。
【００４４】
本発明者は、本発明の方法における使用のための標的特異的プライマーを同定および開発した。T細胞特異的プライマーを表1に示し、抗体特異的プライマーを表2に示す。本発明のさらなる態様は、表1または表2のプライマーのいずれか1つまたは組み合わせを使用して、血液サンプル由来のRNAを増幅する、より具体的には、細胞の集団中の抗体、T細胞受容体、およびHLA分子を同定する方法である。
【００４５】
arm-PCRまたはtem-PCRは、本発明者によって以前記載された増幅方法において免疫グロブリンスーパーファミリー分子をコードする遺伝子を増幅するために使用され得る（Han et al., 2006. Simultaneous Amplification and Identification of 25 Human Papillomavirus Types with Templex Technology. J. Clin. Micro. 44(11). 4157-4162）。tem-PCR反応において、ネステッド遺伝子特異的プライマーは、最初のPCRサイクリングの間、標的を濃縮するように設計されている。その後、ユニバーサルな「スーパー」プライマーを、全ての標的を増幅するために使用する。プライマーをFo（フォワード・アウト）、Fi（フォワード・イン）、Ri（リバース・イン）、Ro（リバース・アウト）、FS（フォワード・スーパー・プライマー）およびRS（リバース・スーパー・プライマー）と呼び、スーパープライマーは、標的特異的プライマーの末端でのそれらのプライマーに対する結合部位の付加に起因して様々な分子に共通である。遺伝子特異的プライマー（Fo、Fi、Ri、およびRo）を極めて低い濃度で使用する。異なるプライマーは、3つの主な段階の各々でtem-PCRプロセスに関与する。先ず、「濃縮」段階で、低濃度遺伝子特異的プライマーに、テンプレートを見つけるために十分な時間を与える。各々の意図される標的について、どのプライマーが使用されるかに依存して、4つの可能性のある産物が生じ得る：Fo/Ro、Fi/Ro、Fi/Ri、およびFo/Ri。濃縮段階は典型的に10サイクル行われる。第二または「タグ化」段階において、アニーリング温度を72℃へ上昇させ、長い40ヌクレオチドのインサイド・プライマー（FiおよびRi）のみが作用する。このタグ化段階の10サイクル後、全てのPCR産物がユニバーサル・スーパー・プライマー配列で「タグ化」される。次いで、第三「増幅」段階で、高濃度スーパープライマーは、全ての標的を増幅し、プロセス中にビオチンでPCR産物を標識するように、効率的に作用する。共有結合によって特定のプローブをLuminexカラー被覆ビーズと連結させてもよい。
【００４６】
免疫グロブリンスーパーファミリー分子をコードする遺伝子を増幅するために、本発明者は、パブリック・ドメイン中の配列情報に基づいてネステッドプライマーを設計した。B細胞およびT細胞でのVDJ再構成を研究するために、本発明者は、再構成されそして発現されたRNAを増幅するためのプライマーを設計した。一般に、一対のネステッド・フォワード・プライマーはV遺伝子から設計され、リバース・ネステッド・プライマーのセットはJまたはC遺伝子から設計される。平均アンプリコンサイズは250〜350bpである。例えば、IgHV遺伝子について、7個の異なるファミリーに分類され得る123個の遺伝子が存在し、本発明のプライマーをファミリー特異的となるように設計する。しかし、増幅されたcDNA配列を配列決定する場合は、同じファミリー内の遺伝子間のさらなる区別を可能にするために十分な配列多様性が存在する。MHC遺伝子座について、意図はゲノムDNAを増幅することである。
【実施例】
【００４７】
シェアリング・インデックスの計算
Sは対象の免疫プロファイル（IP）であり、これは、N個の特有のCDR3配列であるCDR31、CDR32、... CDR3nによって示され、各CDR3はそれ自体の頻度、s1、s2、... snを有すると仮定する。
【００４８】
Dは疾患ライブラリーであり、これは、M個の特有のCDR3を有するある数の患者の免疫プロファイルの合計である。疾患ライブラリー中の全ての患者は、同じ疾患を有すると診断された。
【００４９】
Pはパブリックライブラリーであり、これは、多数の対照の免疫プロファイルの合計である。
【００５０】
シェアリング・インデックス（SharingIndex）は、sx、sy、... szの合計と定義され、ここで、CDR3x、CDR3y、... CDR3Zは、対象の免疫プロファイルとライブラリーとにおいて共有される。sx、sy、... szは対象の免疫プロファイルにおけるCDR3の頻度であって、ライブラリーにおけるものではないことに注意のこと。
【００５１】
疾患ライブラリー（D）中よりもパブリックライブラリー（P）中により多くの特有のCDR3が常に存在すると仮定して、パブリックライブラリー中のM個の特有のCDR3を無作為に選択し、使用して、サブライブラリーP1を作成し、対象とサブライブラリーとの間のシェアリング・インデックス（SIp1）を、上記の式に従って算出する。サンプリング手順を1000回またはそれ以上繰り返し、1000個またはそれ以上のSIpxを算出する。
【００５２】
対象と疾患ライブラリーとの間のシェアリング・インデックスSIdを同じ様式で算出する。P値を、全てのSI（SIp1、SIp2、... SIpx、SId（SIdが含まれることに注意のこと））の分率と定義し、これは、SIdに等しいかまたはそれを超える。パブリックライブラリー中のCDR3をサンプリングする場合、x個の対照の免疫プロファイル中に見られるCDR3は、x回のサンプリングされる機会が与えられることに注意のこと。
【００５３】
T細胞またはB細胞再構成部位の増幅
全てのオリゴ（oligo）を、1x TEを用いて再懸濁した。454Aおよび454Bを除く全てのオリゴを100 pmol/μLの濃度へ再懸濁した。454Aおよび454Bを1000 pmol/μLの濃度へ再懸濁した。454Aおよび454Bは、以前に記載された共用プライマーと機能的に同じであり、ハイスループット配列決定手順をフォローアップするために、異なる配列を使用した。
【００５４】
3つの異なるプライマーミックスを作製した。アルファ・デルタ・プライマーミックスは82個のプライマー（TRAV-C + TRDV-Cの全て）を含み、ベータ・ガンマ・プライマーミックスは79個のプライマー（TRBVCおよびTRGV-Cの全て）を含み、B細胞プライマーミックスは合計70個のプライマーを含んだ。Fo、FiおよびRiプライマーを1 pmol/μLの濃度で使用した。Roプライマーを5 pmol/μLの濃度で使用した。454Aおよび454Bを30 pmol/μLの濃度で使用した。
【００５５】
3つの異なるRNAサンプルをALLCELLS(www.allcells.com)に注文した。全てのサンプルを最終濃度4 ng/uLまで希釈した。注文したサンプルは以下であった。
0006460343.tif 000002
【００５６】
Qiagen One-Step RT-PCRキットを用いてRT-PCRを行った。各サンプルは以下を含有した：
10μLのQiagenバッファー
2μLのDNTP
2μLの酵素
23.5μLのdH2O
10μLの適切なプライマーミックス
2.5μLの適切なテンプレート（10ngのRNAトータル）
【００５７】
下記のサイクリング条件を使用して、サンプルを実行した：
50℃で30分間
95℃で15分間
94℃で30秒間
以下を15サイクル
55℃で1分間
72℃で1分間
94℃で15秒間
以下を6サイクル
70℃で1分30秒間
94℃で15秒間
以下を30サイクル
55℃で15秒間
72℃で15秒間
72℃で3分間
4℃で維持。
【００５８】
図1aに示されるゲル中に配置されたサンプルの順序は以下であった：(1)ラダー（500bpが最大のワーキング（working）であり、20bpずつ低下し、図1aの中央の鮮明なバンドは200bpである）；(2)α+δプライマーミックスおよび10ng Pan T細胞テンプレート；(3)β+γプライマーミックスおよび10ng Pan T細胞テンプレート；(4)B細胞プライマーミックスおよび10ng B細胞テンプレート；(5)B細胞プライマーミックスおよび10ng ALL細胞テンプレート；(6)α+δプライマーミックスおよび10ng ALL細胞テンプレート；(7)β+γプライマーミックスおよび10ng ALL細胞テンプレート；8．α+δプライマーミックスブランク；(9)β+γプライマーミックスブランク；(10)B細胞プライマーミックスブランク；(11)ランニングバッファーブランク。これらのサンプルを、1X ClearPAGE（登録商標）DNAネイティブランニングバッファーを用いて、プレキャストClearPAGE（登録商標）SDS 10%ゲル上において実行した。
【００５９】
最初の実験は、テンプレートが含まれたPCR反応からスミアが生じることを示した。スミアは、異なるサイズのPCR産物が生じたことを示しており、これは、異なるVDJ再構成の混合物を示した。B細胞反応からいくらかのバックグラウンド増幅が存在する。そのプライマーミックスに対するさらなる改善が、反応をクリーンアップするために必要とされた。
【００６０】
PCR産物が異なるVDJ再構成を実際に含むかどうかを決定するために、単一クローンを単離して配列決定することが必要であった。ルーチンなクローニング手順を使用する代わりに、本発明者は異なる戦略を用いた。アルファ・デルタ・ミックスおよびベータ・ガンマ・ミックスから生成されたPCR産物（図1a中のレーン2および3）を1:1000に希釈し、2μlアリコートを以下の反応においてPCRテンプレートとして使用した。次いで、レパートリー全体を標的化するプライマーの混合物を使用する代わりに、一対の特定のFiおよびRiプライマーを使用して（各々5 pmol）、たった1つの特定のPCR産物を増幅した。下記のサイクリング条件を使用して、サンプルを増幅した：
95℃で5分間
以下を30サイクル
94℃で30秒間
72℃で1分間
72℃で3分間
4℃で維持。
【００６１】
Qiagen PCRキットを使用して産物を増幅した。PCRのために使用したマスターミックスは以下を含有した。
0006460343.tif 000003
【００６２】
図1bにおけるゲルの写真は以下の反応のPCR産物を示す：(1)ラダー；(2)TRAV1Fi+TRACRiおよびアルファ・デルタPan T PCR産物；(3)TRAV2Fi+TRACRiおよびアルファ・デルタPan T PCR産物；(4)TRAV3Fi+TRACRiおよびアルファ・デルタPan T PCR産物；(5)TRAV4Fi+TRACRiおよびアルファ・デルタPan T PCR産物；(6)TRAV5Fi+TRACRiおよびアルファ・デルタPan T PCR産物；(7)TRAV1Fi+TRACRiおよびアルファ・デルタPan T PCR産物；(8)TRAV2Fi+TRACRiおよびアルファ・デルタPan T PCR産物；(9)TRAV3Fi+TRACRiおよびアルファ・デルタPan T PCR産物；(10)TRAV4Fi+TRACRiおよびアルファ・デルタPan T PCR産物；(11)TRAV5Fi+TRACRiおよびアルファ・デルタPan T PCR産物；(12)PCRブランク。F1として列挙されるプライマーは「フォワード・インナー」プライマーであり、Foとして列挙されるプライマーは「フォワード・アウター」プライマーであり、RiおよびRoは、それぞれ、「リバース・インナー」および「リバース・アウター」プライマーを示す。
【００６３】
図1bによって示されるように、単一のPCR産物が各反応から生成された。異なるサイズバンドが異なる反応から生じた。このPCRクローニングアプローチは、次の2つの主な理由のために成功している−(1)この反応において使用したPCRテンプレートは、全ての可能性のあるVDJ再構成を増幅するためのプライマーミックスを使用した（例えば、T細胞受容体αおよびδ遺伝子を増幅するために合計82個のプライマーを含んだプライマーミックスを使用した）以前の反応の、希釈したPCR産物(1:1000)であった、および(2)特定のV遺伝子を標的化する、たった1対のプライマーを、この「クローニング」実験の間、各反応において使用する。これらの産物の一部をゲル精製し、配列決定した。以下は、上述のプロトコルから得られる例示的配列である。各ケースにおいて、単一クローンが得られ、Fiプライマーにマッチした特定のT細胞受容体V遺伝子が同定された。
【００６４】
TRAV1テンプレート＋シークエンシングプライマーとしての454A：
0006460343.tif 000004
【００６５】
TRAV1テンプレート＋シークエンシングプライマーとしての454A：
0006460343.tif 000005
【００６６】
TRAV2テンプレート＋シークエンシングプライマーとしての454A：
0006460343.tif 000006
【００６７】
TRAV3テンプレート＋シークエンシングプライマーとしての454A：
0006460343.tif 000007
【００６８】
TRAV4テンプレート＋シークエンシングプライマーとしての454A：
0006460343.tif 000008
【００６９】
TRAV5テンプレート＋シークエンシングプライマーとしての454A：
0006460343.tif 000009
【００７０】
TRBV19Fiテンプレート＋シークエンシングプライマーとしての454A：
0006460343.tif 000010
【００７１】
TRBV20Fiテンプレート＋シークエンシングプライマーとしての454A：
0006460343.tif 000011
【００７２】
TRBV21Fiテンプレート＋シークエンシングプライマーとしての454A：
0006460343.tif 000012
【００７３】
TRBV23Fiテンプレート＋シークエンシングプライマーとしての454A：
0006460343.tif 000013
【００７４】
TRBV24Fiテンプレート＋シークエンシングプライマーとしての454A：
0006460343.tif 000014
【００７５】
TCRβトランスクリプトームの全体的レパートリー分析に対する人工産物の影響を調べるために、本発明者らは、化学合成したTCRβ CDR3テンプレートを用いて対照実験を行った。このために、本発明者らは、4つの別個のクローンを化学合成し、各クローンをクローン的に精製し、アンプリコン・レスキュー・マルチプレックス（amplicon rescue multiplex）(ARM)-PCR用のテンプレートとして4つの構築物の異なるミックスを調製した。2つの異なる反応混合物を、2つの独立したARM-PCR反応へ供し、プールされたPCR産物を、Illimuna HiSeq2000（登録商標）を使用して両末端から100bpの長さで配列決定した。本発明者らは、先ず、改変Needleman-Wunschアルゴリズムを用いてオーバーラッピング・アライメントによってペアド-エンド読み取り（paired-end read）を共に連結し、次いで、この結合配列を生殖細胞系V、DおよびJリファレンス配列へマッピングした。
【００７６】
クリーニング無しで、本発明者らは、テンプレートミックスIから合計5,729,613個の配列を得、これらをTCRβ V、DおよびJセグメントへマッピングすることができた。驚いたことに、配列読み取りは、その称するところでは、合計36,439個の特有のCDR3変異体を示した。従って、たった4つの別個のCDR3変異体がテンプレート混合物中に存在していたことを考えると、同定されたCDR3変異体のうちの事実上全てが、非真正（non-authentic）であるはずである。同様の結果が第2テンプレートミックスについて得られ、ここでは、合計9,131,681個のVDJマッピングされた配列が同定され、これらは、50,354個の特有のTCRβ CDR3変異体の存在を模倣した。本発明者らの独立した配列決定実験は、ごく僅かな別個のCDR3テンプレート変異体が人工的なレパートリー多様性を作ることができ、これは実際のテンプレート多様性を遥かに上回ることを示しており、従って、本発明者らは、これらの人工産物を排除しようと試みた。
【００７７】
3'末端Illumina配列決定読み取りの質は一般に低いと考えられている。レパートリー配列決定の文脈において、これは厄介であり、何故ならば、PCRプライマーは、プライマー-テンプレートミスマッチングに起因する悪影響を回避するために超可変V(D)J結合部から十分に遠位に配置される必要があるためである。結果として、関心対象のCDR3セグメントは、増加した配列決定エラー率を有する領域である、配列決定読み取りの3'末端のより近くへ一般に「シフトされる」。注目に値する別の技術的な問題は、配列決定エラーがコンテキスト特異的（context-specific）であり、従ってストランド特異的（strand-specific）であるという観察である。従って、順方向読取りにおける配列決定エラーが対応する逆方向読取りにおける配列決定エラーと同時に起こる確率は稀であると想定することが現実的である。
【００７８】
このことを考慮して、本発明者らは、Illumina（登録商標）技術に基づいて完全TCR CDR3セグメントの二本鎖配列決定を与えるペアド-エンド戦略を発明した。このアプローチにおいて、フォワードおよびリバースシークエンシングプライマーを、それぞれ、フレームワーク領域3におよびTCR J領域またはC領域の5'末端に配置する。Illumina配列読取りの平均の長さ（現在100〜150 bp）を考慮して、この設計は、CDR3セグメントを規定する両方の鎖の完全な配列決定を可能にする。第2の工程において、順方向および逆方向読取りは、次いで、配列ミスマッチについて分析され、両方の鎖の非同一性を示すCDR3配列は、新しく開発されたペアド-エンド・フィルタリング・アルゴリズムを使用して排除される。
【００７９】
テンプレートミックスIについて得られた5,729,613個のCDR3配列へこの配列決定エラーフィルターを適用することによって、本発明者らは、逆鎖において矛盾する配列情報を含有した合計2,751,131個（48%）のCDR3配列を同定した。これらの配列を捨てることによって、35,455個（97.2%）の別個の人工的なCDR3変異体が排除された。これと一致して、ペアド-エンドフィルターは、テンプレートミックスIIから4,308,020個（47%）のCDR3配列を除去し、49,063個（97.4%）の人工的なCDR3変異体が排除された。それぞれ、合計973および1271の特有のCDR3変異体が、フィルターを通過した。これらの結果は、ペアド-エンド配列決定およびフィルタリングが、非真正の特有のCDR3配列の総数をほぼ2桁減らすことを示している。
【００８０】
配列決定エラーフィルター後の非真正CDR3変異体の頻度分布の詳細な解析によって、両方の混合物中に、全ての人工産物のうちのおよそ50%がシングルコピー配列であったことが明らかとなった。これらの人工的なCDR3のうちの約10%が、100を超えるコピー数を示し、全ての人工的なCDR3変異体の80%超を占めた。可変TCR遺伝子は体細胞超突然変異を受けないことを考慮して、本発明者らは、マッピングされた生殖細胞系V、DおよびJリファレンス配列に対してヌクレオチドミスマッチを示すCDR3配列読み取りを同定および除去するリファレンスアルゴリズムを開発した。何故ならば、これらは、PCR増幅または配列決定のレベルで生じた人工産物であるに違いないためである。
【００８１】
このフィルタリングアルゴリズムをテンプレートミックスIの「ペアド-エンドフィルタリングされた」配列へ適用することによって、合計29,804個の配列（これは609個の特有のCDR3変異体に対応する）が除去された。テンプレートミックスIIについて、54,516個の人工的な配列（831個の特有のCDR3変異体）が同定された。従って、リファレンス配列フィルターの使用は非真正の別個のCDR3配列の60%の減少をもたらす。リファレンスフィルターは、V-JおよびD-J結合部で無効である。何故ならば、体細胞組換えの間にこれらの領域中に無作為に付加されたヌクレオチドはマッピングすることができないためである。従って、本発明者らは、次の4つの変数をよりよく理解するために、コンピュータシミュレーション実験後にPCRフィルターを実行した：総エンド-ポイントエラー率に対する、最初のテンプレート数、各サイクルの複製効率、サイクル数(n)、およびDNAポリメラーゼエラー率(μ)の影響。対照的に、本発明者らは、PCRポリメラーゼエラー率が、累積誤差数に対して顕著な影響を有することを見出した。
【００８２】
本発明者らの対照配列決定実験において、PCR増幅を、Taqポリメラーゼを使用して、第1および第2反応において15サイクルおよび45サイクルで行った。より現実的にARM-PCR反応中の誤差累積をシミュレートするために、PCR効率を最初の25サイクルについて1サイクル当たり5%および残りのサイクルについて1サイクル当たり10%減少するように設定した。それぞれの新たなPCRについてPCR効率を1.0へリセットした。さらに、本発明者らは、第2の位置での突然変異を可能にした。1 bp当たり1サイクル当たりのエラーとして表される、Taq酵素についての公表された置換エラー率は、0.023 x 10-4〜2.1 x 10-4の範囲である。シミュレーション実験において、置換エラー率を2.7 x 10-5に設定し、挿入-欠失（insertion-deletion）（indel）エラー率を1.0 x10-6に設定した。Taqポリメラーゼは、テンプレートのホモポリマー領域において遥かにより高い挿入-および-欠失（indel）突然変異率を有することが公知である。ホモポリマー領域について、この領域の任意の位置におけるindel突然変異は同一のパターンを生じさせる。従って、ホモポリマー領域におけるindelエラー率をn x μに設定し、ここで、nはホモポリマー領域の長さであり、μは1.0 x 10-6である。
【００８３】
エンドポイントエラー率に対する最初のテンプレート数およびPCR効率の影響は小さいため、多重PCR反応において異なる最初の数および異なる複製効率を有する分子に対してシミュレーション実験から推定される同じエンド-ポイントエラー率を適用することが安全であるはずである。カットオフエラー率（μ）を、各カテゴリーについて9999番目の10000分位点でエラー率として経験的に設定した。3つ未満の位置が異なる、頻度NAおよびNB（NA>>NB）の、2つの同様のCDR3配列AおよびBについて、NA* μ≧ NBの場合（ここで、μは対応するカットオフエラー率である）、CDR3配列Bが除外される。テンプレートミックスIの「リファレンスフィルタリングされた」配列に対してこのフィルタリングアルゴリズムを適用することによって、合計22,369個の配列（これは281個の特有のCDR3変異体に対応した）が除去された。テンプレートミックスIIについて、39,920個の人工的な配列（348個の特有のCDR3変異体）が同定された（表1）。従って、PCR増幅エラーフィルターの使用は、約80%の非真正の別個のCDR3配列のさらなる減少をもたらす。
【００８４】
上記のフィルターを通過した配列のプールにおいて、本発明者らは、いくつかの高存在量CDR3変異体を同定し、これらは、多数の位置で、それらの最も類似するインプットテンプレート配列とは異なっていた。CDR3断片の多数の位置でのPCR置換および／またはindel突然変異の発生はシミュレーション実験によれば極めて稀であるため、それらのCDR3変異体は、人工産物の他の供給源から生じるはずである。興味深いことに、本発明者らは、これらの配列の一部は2つの別個のインプットテンプレートの断片から構成され、明確なブレークポイントを示したことを見出し、それらをキメラと同定した。キメラ配列は、PCRの間の不完全なプライマー伸長またはテンプレートスイッチングから生じるPCR人工産物であり、モザイク様構造を形成する。この予想外のPCR人工産物を踏まえて、本発明者らは、コンピューター「モザイクフィルター」を開発した。このフィルタリングアルゴリズムを使用して、本発明者らは、テンプレート混合物IおよびIIにおいて、それぞれ、合計17および15個のキメラ配列を同定した。注目すべきことに、これらのCDR3キメラの一部は1000を超える配列コピー数を示し、このことは、フィルターについての本発明者らのアルゴリズムが、高存在量キメラCDR3配列を同定することができることを示している。
【００８５】
フィルタリングアルゴリズムの適用は、たった4つの規定のTCR CDR3テンプレートのハイスループット配列決定によって生じた非真正の特有のCDR3配列の99.8%を排除した。それぞれ、たった62個および73個の人工的なCDR3配列が、全てのフィルターを通過した。これらの中で、2つの最も豊富なCDR3配列は、混合実験の両方において同一であった。最も考えられることとして、それらは、正確にブレークポイントに配置された単一ヌクレオチド置換のためにフィルタリングを逃れたキメラ人工産物を示す。残っている間違いのCDR3の中で、それぞれ、85% (n=53)および75% (n=55)が単一読み取りであった。人工産物のこの小さな分率を排除するために、本発明者らは、TCR免疫レパートリーのハイストリンジェンシーデータ解析は、シングルコピーCDR3読み取りを除去する追加のフィルター（頻度閾値フィルター）を含むべきであることを提唱する。
【００８６】
（表１）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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