(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＲＢＢチロシンキナーゼドメイン（ＥＲＢＢ−ＴＫＤ）に結合する非天然ポリペプチドまたはその生物学的に活性な変異体であって、配列番号１であるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、非天然ポリペプチドまたはその生物学的に活性な変異体。
【請求項２】
前記ＥＲＢＢが、ＥＲＢＢ１、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、またはＥＲＢＢ４である、請求項１に記載の非天然ポリペプチド。
【請求項３】
前記ＥＲＢＢ−ＴＫＤが、ＥＧＦＲ−ＴＫＤである、請求項１に記載の非天然ポリペプチド。
【請求項４】
１つ以上の付加アミノ酸配列をさらに含む、請求項１に記載の非天然ポリペプチド。
【請求項５】
前記付加アミノ酸配列が、標的配列、細胞透過性配列、タグ配列、および連結配列から選択される、請求項４に記載の非天然ポリペプチド。
【請求項６】
治療有効量の請求項１に記載の非天然ポリペプチド、およびその薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項７】
追加の抗癌剤をさらに含む、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記追加の抗癌剤が、ＥＲＢＢ阻害剤またはＥＧＦＲ阻害剤である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ＥＧＦＲ阻害剤が、ゲフィチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ、アファチニブ、ネチツムマブ、ニモツズマブ、ＰＦ２９９８０４、ＲＯ５０８３９４５、ＡＢＴ−８０６、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
癌の阻害剤、予防剤および／または治療剤である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ＥＧＦＲの活性化を阻害する、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記癌が、ＥＲＢＢ発現癌である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記ＥＲＢＢ発現癌が、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、食道癌、喉頭癌、胃癌、結腸癌、肺癌、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記ＥＲＢＢ発現癌が、肺癌である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記肺癌が、肺腺癌、肺小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、または非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
少なくとも１つの追加の癌療法と組み合わせて使用される、請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記追加の癌療法が、放射線療法、化学療法、免疫療法、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記化学療法が、追加の抗癌剤を使用するものである、請求項１７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は米国特許出願第６２／１５５，５２０号（２０１５年５月１日出願）に基づく優先権の利益を主張し、それを本明細書に参考として援用する。
【０００２】
本開示は、癌治療に使用されるポリペプチドおよび癌を治療するために当該ポリペプチドを使用する方法に関する。具体的に、本開示は、ＥＲＢＢ発現癌の治療におけるＰＩＮＫ１のＣ末端ドメイン（ＰＩＮＫ１−ＣＴＤ）に関する。
【背景技術】
【０００３】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼドメイン（ＴＫＤ）活性化変異の同定は、２００４年に肺癌治療の新しい時代を迎えた。変異型ＥＧＦＲは、５０％のアジア人肺腺癌および１０％の白人肺腺癌における肺発癌の駆動遺伝子として機能する。ＥＧＦＲ変異体は、野生型ＥＧＦＲの従来のリガンド依存性活性化とは異なり、構成的に活性化される。活性化されたＥＧＦＲ変異体は、最も一般的にはエクソン２１  Ｌ８５８Ｒ置換（Ｌ８５８Ｒ）またはエクソン１９欠失（Ｅｘｌ９Ｄｅｌ）を有する患者にとって、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ−ＴＫＩ）に対する良好な初期応答を通常有するが、最終的には１２の中位数の後に疾患の進行が見られてしまう。後天性Ｔ７９０Ｍ変異は、これらの耐性症例の半分以上を占める。さらに、ｄｅ  ｎｏｖｏ  Ｔ７９０Ｍは、ＥＧＦＲ−ＴＫＩナイーブ肺腺癌症例の約２５％に存在し、ＥＧＦＲ−ＴＫＩに対する短い初期応答時間が予測される。ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍの変異はＡＴＰ結合ポケットに立体配座変化を引き起こす。これにより、その天然基質ＡＴＰに対する受容体親和性が増加する。これは、肺腺癌管理において未解決の問題として残っている（非特許文献１を参照）。
【０００４】
ＰＴＥＮ誘発推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）は、癌細胞におけるＰＴＥＮによるそのアップレギュレーションのために潜在的な腫瘍抑制因子として２００１年に同定された（非特許文献２を参照）。ＰＩＮＫ１の遺伝性早期発症パーキンソン病における役割が報告されてから広く研究されるようになった。ＰＩＮＫ１は、ミトコンドリア標的配列、保存されたセリン／スレオニンキナーゼドメイン、およびＣ末端ドメインを有する、アミノ酸タンパク質５８１個をコードする。これはミトコンドリアの品質管理の主要な調節因子であり、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲ軸（シグナル伝達チェーン）またはオートファジー経路を介して細胞保護作用および抗アポトーシス機能を有する（非特許文献３および４を参照）。
【０００５】
癌生物学におけるＰＩＮＫ１の役割に関する報告は、多少矛盾している。ＰＩＮＫ１の腫瘍抑制的役割を支持する直接の証拠が欠けている。ＰＩＮＫ１遺伝子は、腫瘍抑制活性を有すると推定される領域であり、腫瘍抑制因子であるＰＴＥＮ、ＦＯＸ０３ａ、Ｂｅｃｌｉｎ−１およびＰａｒｋｉｎと関連している領域である染色体ｌｐ３６上に位置するが、その抗増殖効果は証明できない（非特許文献５および６を参照）。一方、かなり多くの研究が、ＰＩＮＫ１の発癌性の役割を示唆している。ハイスループットＲＮＡ干渉スクリーニングは、ＰＩＮＫ１ノックダウンとタキソール感受性との間の関係を示し、ＤＮＡミスマッチ修復欠損を伴う悪性腫瘍の治療標的としてＰＩＮＫ１を同定する（非特許文献７を参照）。また、ＰＩＮＫ１は、ＩＧＦ−１依存性ＡＫＴシグナル伝達の最適活性化、ｍＴＯＲＣ２を介したＡＫＴ−Ｓ４７３リン酸化の増強、および癌細胞における細胞周期進行の調節に必要であることが判明している（非特許文献８〜１０を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】C. H. Yun et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 2070-2075 (2008)
【非特許文献２】M. Unoki, Y. Nakamura. Oncogene. 22, 2172-2185 (2003)
【非特許文献３】H. Murata et al. J. Biol. Chem. 286, 7182-7189 (2011)
【非特許文献４】G. Arena et al. Cell. Death. Differ. 20, 920-930 (2013)
【非特許文献５】Y. Mei et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 5153-5158 (2009)
【非特許文献６】Y. Gong et al. Nat. Genet. 46, 588-594 (2014)
【非特許文献７】S. A. Martin, M. Hewish, D. Sims, C. J. Lord, A. Ashworth. Cancer. Res. 71, 1836-1848 (2011)
【非特許文献８】H. Murata et al. J. Biol. Chem. 286, 7182-7189 (2011)
【非特許文献９】R. S. Akundi, L. Zhi, H. Bueler. Neurobiol. Dis. 45, 469-478 (2012)
【非特許文献１０】C. H. O'Flanagan, V. A. Morais, W. Wurst, B. De Strooper, C. O'Neill. Oncogene. (2014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
蓄積された証拠は、癌生物学におけるＰＩＮＫ１の関与を支持するが、その正確な役割は謎である。ＥＧＦＲは、過去１０年間で最も研究された受容体チロシンキナーゼであったが、その活性化メカニズムはまだ完全には理解されていない。ＥＧＦＲ変異の同定およびＥＧＦＲ−ＴＫＩの開発は、肺癌治療における最先端の突破であるが、薬物耐性が依然として未解決の問題となっている。ＰＩＮＫ１とＥＧＦＲとの相互作用を探ることによって、ＥＧＦＲ発現癌を治療するための新しい薬剤を開発することに価値がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一局面では、本開示は、ＥＲＢＢチロシンキナーゼドメイン（ＥＲＢＢ−ＴＫＤ）に結合する非天然ポリペプチドを提供し。一実施形態において、本開示は、配列番号１と少なくとも１０％の同一性を有するアミノ酸配列またはその生物学的に活性な変異体を含むが、配列番号２と同一のアミノ酸配列が除外されるＥＲＢＢチロシンキナーゼドメイン（ＥＲＢＢ−ＴＫＤ）に結合する非天然ポリペプチドを提供する。別の実施形態において、本開示は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の約３〜約７２個の連続するアミノ酸残基断片を含む、ＥＲＢＢチロシンキナーゼドメイン（ＥＲＢＢ−ＴＫＤ）に結合する非天然ポリペプチド、またはその生物学的に活性な変異体を提供する。
【０００９】
別の局面において、本開示は、治療有効量の本開示のポリペプチドおよびその薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。一実施形態において、前記薬学的に許容される担体は、ミセル、リポソームなどである。
【００１０】
一局面では、本開示は、治療有効量の本開示のＰＩＮＫｌ−ＣＴＤポリペプチドをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、ＥＧＦＲの二量体化および活性化を阻害する方法を提供する。一実施形態において、本開示は、治療有効量の本開示の非天然ポリペプチドをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、癌（好ましくはＥＲＢＢ発現癌）を阻害、予防および／または治療するためのＥＧＦＲの活性化を阻害する方法を提供する。好ましくは、前記癌は、肺癌であり、より好ましくは、前記肺癌は、肺腺癌である。
【発明の効果】
【００１１】
ＥＧＦＲ変異の同定およびＥＧＦＲ−ＴＫＩの開発は、肺癌治療における最先端の突破であるが、薬物耐性は依然として未解決の問題である。本開示は、少なくともＥＲＢＢとＰＩＮＫ１との相互作用に基づいて、ＥＲＢＢ発現癌におけるＰＩＮＫ１の役割を解明している。本開示は、ＥＲＢＢ発現癌治療の新しい方向を提供し得る、ＰＩＮＫ１のＣ末端ドメイン（ＰＩＮＫ１  −ＣＴＤ）の抗腫瘍機能を実証する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、肺腺癌細胞におけるＰＩＮＫ１とＥＧＦＲとの相互作用を示す。図１Ａは、ＣＬ１−５、ＰＣ９、Ｈ１９７５およびＨ３２５５細胞における内因性ＥＧＦＲ−ｐＹ１０６８、ＥＧＦＲおよびＰＩＮＫ１の免疫ブロット法である。図１Ｂは、免疫沈降による内因性ＰＩＮＫ１とＥＧＦＲとの相互作用を示す。図１Ｃは、ＣＬ１−５細胞において、野生型ＥＧＦＲ−ＧＦＰ（緑色）およびＰＩＮＫ１−ｍｙｃ（赤色）を同時に過剰発現させた。共焦点画像は、ＥＧＦＲおよびＰＩＮＫ１（帯黄色）（ＩおよびＩＩ）の共局在を実証した。３Ｄ構造の照明顕微鏡画像は、細胞質膜下の相互作用を具体的に開示した（ＩＩＩおよびＩＶ）。
【００１３】
【図２】図２Ａ〜２Ｅは、ＰＩＮＫｌによりＥＧＦＲの二量体化および活性化を阻害することを示す。図２Ａにおいて、免疫ブロット法は、ＣＬ１−５、ＰＣ９、Ｈ１９７５およびＨ３２５５細胞におけるＰＩＮＫ１のノックダウンに伴う総ＥＧＦＲの減少を実証した。図２Ｂおよび２Ｃにおいて、ＲＴ−ｑＰＣＲは、ＰＩＮＫ１のｍＲＮＡが十分に減少されたにもかかわらず、ＥＧＦＲのｍＲＮＡが減少されないことを示した。図２Ｄにおいて、ＥＧＦＲの二量体化アッセイには、ＥＧＦＲの単量体を各対照群およびノックダウン群で同等になるように標準化された場合、ＰＩＮＫ１のノックダウンによるＥＧＦＲの二量体に対する単量体の比の増加を実証した。図２Ｅにおいて、ＰＩＮＫ１ノックダウン下で、ＥＧＦＲタンパク質の膜画分が減少され、ＥＧＦＲタンパク質の細胞質画分が増加されたことから、受容体内在化の増加を示した。
【００１４】
【図３】図３Ａ〜３Ｅは、ＰＩＮＫ１−ＣＴＤとＥＧＦＲ−ＴＫＤとの直接的相互作用を示す。図３Ａは、アミノ酸１−１２１０、１−３７８、１−６２１、１−６４４、１−６９０、１−９５４、６４５−１２１０、６４５〜９５４および９５５〜１２１０を含む９つのＦｌａｇ融合型ＥＧＦＲ構築物の模式図である。図３Ｂにおいて、免疫沈降の結果から、構築物Ｅ、Ｆ、ＧおよびＩ（Ａにおける星）のみが、ＰＩＮＫ１と相互作用したチロシンキナーゼドメインを含だことを示す。図３Ｃは、アミノ酸１−５８１、１−５０９、１−１５５、１５６−５０９、１５６−３０９、３１０−４２８、４２９−５８１および７８−５８１を含む８つのｍｙｃ融合型ＰＩＮＫ１構築物の模式図である。図３Ｄにおいて、免疫沈降の結果から、構築物Ａ、ＧおよびＨ（Ｃにおける星）のみが、ＥＧＦＲと相互作用したＣの末端ドメインを含だことを示す。図３Ｅにおいて、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＧＳＴプルダウンアッセイには、ＰＩＮＫ１−ＣＴＤとＥＧＦＲ−ＴＫＤとの直接的相互作用を実証した。ＭＴＳはミトコンドリア標的配列である。ＴＭは膜貫通ドメインである。
【００１５】
【図４】図４は、ＥＧＦＲ経路に対するＰＩＮＫ１ノックダウンの影響を示す。免疫ブロット法は、全ての試験細胞において、ＰＩＮＫ１ノックダウン下でＥＧＦＲ−Ｙ１０６８リン酸化の増強を表した。  ＰＩＮＫ１ノックダウンは、ＥＧＦＲ依存性（ａｄｄｉｃｔｅｄ）ＰＣ９、Ｈ１９７５およびＨ３２５５細胞においてＥＧＦＲ経路活性化を強化したが、ＣＬ１−５細胞におけるＡＫＴ−Ｓ４７３リン酸化およびＡ５４９細胞におけるＳＴＡＴ３−Ｙ７０５リン酸化を減弱した。
【００１６】
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、ＰＩＮＫ１−ＣＴＤが肺癌細胞におけるＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）およびＨＥＲ２のリン酸化を阻害することを示す。図５Ａにおいて、２μＭのＣＴＤポリペプチドは、ＣＬ１−５、ＨＯＰ６２、ＰＣ９およびＨ１９７５におけるＥＧＦＲリン酸化を効率的に阻害した。図５Ｂにおいて、ＣＴＤ処理は、ＣＬ１−５細胞におけるＨＥＲ２リン酸化の用量依存的阻害を示した。図５Ｃにおいて、ＥＲＢＢ１〜ＥＲＢＢ４（ＨＥＲ１からＨＥＲ４）のチロシンキナーゼドメインのアミノ酸配列アライメントは、高い配列同一性を示した。Ｒ９は９個のアルギニン残基からなるペプチドである。
【００１７】
【図６】図６Ａ〜６Ｌは、ｓｈＰＩＮＫ１、ＰＩＮＫ１およびＰＩＮＫ１−ＣＴＤが安定に発現する肺癌細胞の腫瘍異種移植片（ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）を示す。図６Ａ、Ｄ、ＧおよびＪにおいて、ＰＩＮＫ１の過剰発現は、ＣＬ１−５細胞において腫瘍生長を悪化したが、ＰＣ９、Ｈ１９７５およびＨ３２５５細胞において腫瘍生長を抑制した。図６Ｂ、Ｅ、ＨおよびＫにおいて、ＰＩＮＫ１−ＣＴＤ過剰発現は、全ての試験細胞において腫瘍生長を阻害した。図６Ｃ、Ｆ、ＩおよびＬにおいて、ＰＩＮＫ１ノックダウンは、ＣＬ１−５細胞において腫瘍生長を阻害したが、ＰＣ９、Ｈ１９７５およびＨ３２５５細胞において腫瘍生長を促進した。各群におて、Ｎは７である。
【００１８】
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、ＰＩＮＫ１によるＥＧＦＲの二量体化が阻害されたことを示す。図７Ａにおいて、免疫ブロット法は、ＣＬ１−５、ＰＣ９、Ｈ１９７５およびＨ３２５５細胞におけるＰＩＮＫ１の過剰発現に伴う総ＥＧＦＲの増加を実証した。図７Ｂにおいて、ＥＧＦＲのｍＲＮＡのＲＴ−ｑＰＣＲ分析は、ＰＩＮＫ１が過剰発現された場合に、明らかな変化を示さなかった。また、図７Ｃにおいて、ＣＬ１−５、ＰＣ９、Ｈ１９７５およびＨ３２５５細胞のＥＧＦＲの二量体化アッセイには、ＥＧＦＲの単量体を各対照群および過剰発現群で同等になるように標準化された場合、ＰＩＮＫ１の過剰発現でＥＧＦＲの単量体に対する二量体の比の減少を実証した。
【００１９】
【図８】図８は、ＥＧＦＲ経路に対するＰＩＮＫ１過剰発現の影響を示す。免疫ブロット法は、全ての試験細胞において、ＰＩＮＫ１過剰発現でＥＧＦＲ−Ｙ１０６８の減弱を実証した。ＰＩＮＫ１過剰発現は、ＥＧＦＲ依存性のＰＣ９およびＨ１９７５細胞にけるＳＴＡＴ３−Ｙ７０５、ＡＫＴ−Ｓ４７３、またはＥＲＫ−Ｔ２０２／Ｙ２０４のリン酸化を同時に減少させた。Ｈ３２５５細胞において、ＰＩＮＫ１過剰発現はＳＴＡＴ３−Ｙ７０５およびＡＫＴ−Ｓ４７３のリン酸化を弱めるが、ＥＲＫ−Ｔ２０２／Ｙ２０４のリン酸化を増強した。ＥＧＦＲ非依存性のＣＬ１−５およびＡ５４９細胞において、ＥＧＦＲ−Ｙ１０６８のリン酸化が抑制されても、ＰＩＮＫ１の過剰発現はＳＴＡＴ３−Ｙ７０５、ＡＫＴ−Ｓ４７３、またはＥＲＫ−Ｔ２０２／Ｙ２０４のリン酸化を増加させた。
【００２０】
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、ＥＧＦＲの二量体化および活性化に対するＰＩＮＫ１−ＣＴＤの障害を示す。図９Ａにおいて、ＣＬ１−５、ＰＣ９、Ｈ１９７５およびＨ３２５５細胞のＥＧＦＲ二量体化アッセイには、ＥＧＦＲの単量体を各対照群および過剰発現群で同等になるように標準化された場合、ＰＩＮＫ１−ＣＴＤ過剰発現下でＥＧＦＲ単量体に対する二量体の比の減少を実証した。また、図９Ｂにおいて、免疫ブロット法の結果は、全ての分析した細胞における総ＥＧＦＲ比に対するリン酸化ＥＧＦＲ−Ｙ１０６８の減少を示した。ＥＧＦＲ依存性のＰＣ９、Ｈ１９７５およびＨ３２５５細胞において、ＥＧＦＲ下流シグナル伝達は、ＰＩＮＫ１−ＣＴＤの過剰発現で同時に下方制御された。野生型ＥＧＦＲ  ＣＬ１−５細胞におけるＥＧＦＲ−Ｙ１０６８のリン酸化がＰＩＮＫ１−ＣＴＤによって減弱された場合、ＳＴＡＴ３−Ｙ７０５のリン酸化の減少のみがあった。
【００２１】
【図１０】図１０は、腫瘍異種移植片のグロス画像を示す。ＰＩＮＫ１の過剰発現は、ＣＬ１−５細胞において腫瘍生長を悪化したが、ＰＣ９、Ｈ１９７５および２５Ｈ３２５５細胞において腫瘍生長を抑制した。ＰＩＮＫ１−ＣＴＤの過剰発現は、全ての試験細胞において腫瘍生長を阻害した。ＰＩＮＫ１ノックダウンは、ＣＬ１−５細胞の腫瘍生長を阻害したが、ＰＣ９およびＨ１９７５細胞の腫瘍生長を促進した。各群において、Ｎは７である。
【００２２】
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｃは、ＣＴＤ処理が腫瘍生長を阻害させることを示す。図１１Ａおよび１１Ｂにおいて、ＣＴＤ処理は、ＣＬ１−５およびＨ１９７５肺癌鼠の異種移植モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍生長を阻害した。図１１Ｃにおいて、ＣＴＤ処理は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＭＴＴアッセイにより実証されるように、癌細胞生存率を低下させた。Ｒ９は、９個のアルギニン残基からなるペプチドである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
定義
本発明のヌクレオチド、ポリペプチド、組成物、物品、装置および／または方法が開示および記載される前に、本開示は、特定の合成方法、特定の治療計画、または特定の精製手順に限定されないことが理解されるべきである。当然のことながら、変化する可能性がある。本明細書に使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【００２４】
本明細書において、単数形「一」、「一つ」および「前記」は、文脈が明確に指示しないかぎり、複数の指示対象の場合を含む。したがって、例えば、「ポリペプチド」について、ポリペプチドの混合物を含み、「薬学的担体」について、２つ以上のそのような担体の混合物などを含む。
【００２５】
本明細書において、「ポリペプチド」という用語は、天然に生成された、または合成されたアミノ酸残基のポリマーであり、好ましくはペプチド結合により排他的に結合されたものである。非宿主ＤＮＡ分子の発現により製造されたポリペプチドは、「異種」ペプチドまたはポリペプチドである。用語「アミノ酸残基」は、ペプチド結合またはペプチド結合とは異なる結合により連結された天然または非天然のアミノ酸残基であり得る。アミノ酸残基は、Ｄ−配置またはＬ−配置であり得る。
【００２６】
本明細書において、「単離されたポリペプチド」または「精製されたポリペプチド」という用語は、炭水化物、脂質、またはポリペプチドの本質に関する他のポリペプチド様不純物のような、細胞成分に実質的に含まないポリペプチドである。典型的には、単離されたポリペプチドの調製物は、高度に精製された形態のポリペプチドを含む。特定のポリペプチド調製物が単離されたポリペプチドを含有することを示す１つの方法は、ポリペプチド調製物をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルのクーマシーブリリアントブルー染色により単一バンドが出現される。しかしながら、用語「単離された」は、二量体のような別の物理的形態、あるいはグリコシル化または誘導体化形態の同じポリペプチドの存在を除外しない。
【００２７】
本明細書において、「アミノ末端」および「カルボキシル末端」という用語は、ポリペプチド内の位置を示すために用いられる。文脈が許容する場合、これらの用語は、ポリペプチドの特定の配列または部分を指して、近接または相対位置を示すために用いられる。例えば、ポリペプチド内の参照配列のカルボキシル末端に位置する特定の配列は、参照配列のカルボキシル末端に近接して位置するが、必ずしも完全なポリペプチドのカルボキシル末端になくてもよい。
【００２８】
本明細書において、「配列同一性」という用語または例えば本明細書に使用される「配列と１０％同一」を含む用語は、配列がヌクレオチド毎の単位またはアミノ酸毎の単位で比較ウィンドウに関して同一であることを意味する。したがって、「配列同一性の割合」は、比較ウインドウの２つの最適にアライメントをとった配列を比較すること、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えばＡｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が両方の配列中に存在する位置の数を決定して、整合した位置の数を得ること、その整合した位置の数を比較ウインドウ中の位置の全体数（すなわちウインドウの大きさ）で割ること、その結果に１００を掛けて配列同一性の割合を得ることによってを乗算する。本明細書に記載の参照配列（例えば、配列表を参照）のいずれかと少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の配列同一性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれる。典型的には、ポリペプチド変異体が参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を維持する。
【００２９】
本明細書において、「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成を指す。例えば、構造遺伝子の場合には、発現は、構造遺伝子からｍＲＮＡへの転写およびｍＲＮＡから１つまたは２つ以上のポリペプチドへの翻訳を含む。
【００３０】
本明細書において、「核酸」という用語は、ヌクレオチド類似体を使用して生成されたＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）およびＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含むことが意図される。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。
【００３１】
本明細書において、「対象」または「患者」という用語は、動物を指すために互換的に使用される。特定の実施形態では、対象は哺乳動物である。別の実施形態では、対象はヒトである。
【００３２】
本明細書において、「療法」という用語は、癌またはそれに関連する疾患もしくは症状の予防または治療に用いることができる任意のプロトコル（複数可）、方法（複数可）、組成物（複数可）、製剤（複数可）および／または薬剤（複数可）を指すことができる。ある実施形態において、用語「療法」は、当業者に公知である癌またはそれに関連する疾患もしくは症状の予防または治療に用いることができる、生物学的療法、支持療法及び／または他の療法を指す。
【００３３】
本明細書において、「治療有効量」という用語は、癌の発達、再発、または発症の予防およびその１つまたは２つ以上の症状の予防をもたらすための、十分な療法の量を指し、それは、別の療法の予防効果（複数可）を増強または改善し、重症度や癌の持続期間を短縮し、癌の１つまたは２つ以上の症状を改善し、癌の進行を予防し、癌の退行を引き起こし、および／または別の療法の治療効果（複数可）を増強または改善する。
【００３４】
本明細書において、「組み合わせ」という用語は、対象への療法の投与の文脈において、複数の療法（例えば、予防的および／または治療的）の使用を指す。「組み合わせ」という用語の使用は、癌を有したか、癌を有しているか、または癌に罹患しやすい対象への第２の療法の投与と同時に、またはそれに続く療法の順序を制限しない。いくつかの実施形態において、療法は、療法が一緒に作用することができるように、時間間隔内で対象に投与される。一実施形態では、複数の療法は、それらが別途に投与された場合よりも有益な利益を提供するように、ある時間間隔内で対象者に投与される。任意の追加療法は、他の追加療法と共に任意の順序で投与することができる。
【００３５】
本明細書において、「予防する」、「予防すること」、「予防」という用語は、対象への療法の投与の文脈において、療法（例えば、予防剤または治療剤）の投与、または療法の組み合わせ（例えば、予防剤または治療剤の組み合わせ）の結果としての、対象における脳腫瘍またはその症状の再発、発症および／または発達の予防または阻害を指す。
【００３６】
本明細書において、ＰＴＥＮ誘導性推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）は、ＰＩＮＫ１遺伝子によってコードされているミトコンドリアセリン／スレオニン−タンパク質キナーゼである。ＰＩＮＫ１の活性は、パーキンタンパク質を脱分極したミトコンドリアに結合させて、それらのミトコンドリアのオートファジーを誘導する。
【００３７】
本明細書において、赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＥＲＲＢ、ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒａｌ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ）は、ＥＧＦＲ（ＥＧＦ受容体）／ＥｒｂＢ１／Ｈｅｒ１（ヘレグリン−１）、ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２（ヘレグリン−２）、ＥｒｂＢ３／Ｈｅｒ３（ヘレグリン−３）およびＥｒｂＢ４／Ｈｅｒ４（ヘレグリン−４）の４つのメンバーを含む。ＥｒｂＢの過剰発現は、乳房、前立腺、卵巣、肝臓、膀胱、食道、喉頭、胃、結腸および肺の腫瘍形成に関連する。
【００３８】
本明細書において、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ；ヒトにおいてＥｒｂＢ−１およびＨＥＲ１としても知られている）は、細胞外タンパク質リガンドの表皮成長因子ファミリー（ＥＧＦ−ファミリー）メンバーの細胞表面受容体である。
【００３９】
本明細書において、「変異体」または「変異」という用語は、野生型分子とは異なる構造を有する分子（例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）を指す。野生型分子との構造の違いには、異なる配列（例えば、異なるアミノ酸またはヌクレオチド配列）、追加の配列、欠損配列（すなわち、配列の一部分が欠けている）、修飾で変化（メチル化、リン酸化など）、および／または野生型分子の全部または一部分と他の分子との融合を含む。「野生型」という用語は、天然に存在する供給源から単離された場合に、その遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）を指す。野生型遺伝子または遺伝子産物は、ある集団で最も頻繁に観察されるものであり、したがって、遺伝子の「正常」または「野生型」形態で任意に設計される。
【００４０】
ＰＩＮＫ１のＣ末端ドメイン（ＰＩＮＫ１−ＣＴＤ）ポリペプチド
本開示は、ＥＲＢＢチロシンキナーゼドメイン（ＥＲＢＢ−ＴＫＤ）に結合することにより、ＥＧＦＲを活性化から妨げるＰＩＮＫ１−ＣＴＤポリペプチドを含む。ＰＩＮＫ１−ＣＴＤポリペプチドは、ＥＲＢＢ発現癌を阻害、予防および／または治療するように機能する。特に、ＰＩＮＫ１−ＣＴＤポリペプチドだけでは、野生型および変異型ＥＧＦＲ細胞の両方においてＥＧＦＲの活性化を直接阻害し、腫瘍生長を抑制することができる。本開示は、ＰＩＮＫ１がＨＥＲ１と物理的に結合し、そのシグナル伝達を抑制し、ＥＲＢＢ発現癌治療におけるＰＩＮＫ１−ＣＴＤの治療可能性を示唆していることを開示する。
【００４１】
一態様において、本開示は、ＥＲＢＢチロシンキナーゼドメイン（ＥＲＢＢ−ＴＫＤ）に結合するポリペプチドを提供する。
【００４２】
一実施形態において、本開示は、配列番号１のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な変異体と少なくとも１０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＥＧＦＲ−ＴＫＤに結合するポリペプチドを提供する。更なる実施形態において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な変異体と少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するポリペプチドを提供する。
【００４３】
一実施形態において、本開示は、１つまたは２つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入を有する配列番号１の改変アミノ酸配列を含む、ＥＲＢＢ−ＴＫＤに結合するポリペプチドを提供する。
【００４４】
一実施形態において、本開示は、配列番号１の約３〜約７２個の連続するアミノ酸残基またはその生物学的に活性な変異体を有する断片を含む、ＥＲＢＢ−ＴＫＤに結合するポリペプチドを提供する。一実施形態において、ＥＲＢＢ−ＴＫＤはＥＧＦＲ−ＴＫＤである。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、共有結合により結合した３〜１０、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１０〜４０、１０〜５０、１０〜６０、または１０〜７０個のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、約３〜約７０、約３〜約６０、約３〜約５０、約３〜約４０、約３〜約３０、約３〜ら約２０、約１０〜約７０、約１０〜約６０個、約１０〜約５０個、約１０〜約４０個、約１０〜約３０個、約１０〜約２０個、または約１０〜約１５個のアミノ酸残基を含む。ポリペプチドは、共有結合により結合した８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７１、７２、またはそれ以上のアミノ酸のポリマーであってもよい。
【００４５】
一実施形態において、本開示は、１つまたは２つ以上の付加アミノ酸配列をさらに含むポリペプチドを提供する。一実施形態では、付加アミノ酸配列は、ペプチドやタンパク質タグ配列、標的配列、透過性ペプチド配列（例えば、細胞透過性配列）、または連結配列（例えば、エンドプロテイナーゼとしてのタンパク質分解酵素により分解可能な配列）である。更なる実施形態において、ペプチドやタンパク質タグは、ポリヒスチジンタグであってもよい。いくつかの実施形態において、透過性ペプチド配列は、膜付着および内在化のための９つのアルギニン残基を含み得る。
【００４６】
配列番号1のアミノ酸配列は以下の通りである。
SLWGEHILALK NLKLDKMVGW LLQQSAATLL ANRLTEKCCV ETKMKMLFLA 
NLECETLCQA ALLLCSWRAA L （配列番号１） 
【００４７】
本開示のＰＩＮＫ−ＣＴＤポリペプチドは、ＰＩＮＫ１のＣ末端ドメインからＰＩＮＫ１の５１０〜５８１アミノ酸に位置する。ＰＩＮＫ１の配列は以下の通りである。
0006542468.tif 000002
【００４８】
本開示のポリペプチドを調製するために、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用することができる。一実施形態において、ＰＩＮＫ１−ＣＴＤ断片をコードするＤＮＡは、ＰＩＮＫ１断片の配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって得ることができる（ＰＣＲ技術：ＤＮＡ増幅用の原理および応用、Ｅｒｌｉｃｈ（編）、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照）。次いで、増幅されたＰＩＮＫ１−ＣＴＤ断片ＤＮＡを発現ベクターに容易に挿入することができる。ベクターは、異なる遺伝子環境間での輸送または宿主細胞における発現のために制限およびライゲーションによって所望の配列が挿入されていてよい任意の数の核酸であってよい。ベクターは典型的にはＤＮＡから成るが、ＲＮＡベクターも利用可能である。ベクターはプラスミドおよびファージミドを含むが、これらに限定されない。クローニングベクターは、宿主細胞で複製でき、決定可能なようにベクターを切断できて、新たな組換えベクターが宿主細胞で複製できる能力を保持するように所望のＤＮＡ配列をライゲーションできる１つまたは２つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位によってさらに特徴付けられるものである。本開示のＰＩＮＫ１−ＣＴＤ単離されたポリペプチドは、宿主細胞中でコード核酸を発現させることにより産生され得る。核酸は、宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトされることができる。したがって、本開示のいくつかの局面は、ＰＩＮＫ１−ＣＴＤ単離されたポリペプチドをコードする核酸の形質転換および／またはトランスフェクションを含む。形質転換は、原核細胞の内部への外因性または異種核酸の導入である。トランスフェクションは、真核細胞の内部への外因性または異種性核酸の導入である。形質転換またはトランスフェクトする核酸は、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込まれ（共有結合）ても組み込まれなくてもよい。原核生物において、例えば、形質転換する核酸は、プラスミドまたはウイルス性ベクターのようなエピソームエレメントで維持されてよい。真核細胞について、安定的にトランスフェクトされた細胞は、染色体複製を介して娘細胞によって受け継がれるように染色体にトランスフェクトする核酸が組み込まれているものである。この安定性は、トランスフェクトする核酸を含む娘細胞の集団からなる細胞系またはクローンを確立する真核細胞の能力によって実証される。
【００４９】
ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を調製する別の手段は、Ｅｎｇｅｌｓら、１９８９、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔｌ．  Ｅｄ．  ２８：７１６−３４によって記載れたもののような、当業者に周知の方法を用いた化学的合成である。これらの方法は、とりわけ、核酸合成用のホスホトリエステル、ホスホロアミダイト、およびＨ-ホスホン酸塩方法を含む。そのような化学的合成の好ましい方法は、標準的なホスホロアミダイト化学を用いた、ポリマー支持合成である。当業者に公知の他の方法も使用し得る。
【００５０】
本開示によれば、本開示のＰＩＮＫ１−ＣＴＤポリペプチドだけで、野生型および変異型ＥＧＦＲ細胞の両方におけるＥＧＦＲの活性化を直接阻害し、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍生長を抑制することができ、癌治療におけるＰＩＮＫ１−ＣＴＤの治療可能性を示唆する。
【００５１】
ＥＧＦＲの活性化変異は、ＥＧＦＲをＥＧＦＲ発現癌のドライバー癌遺伝子に変換する。「ＥＧＦＲ変異体」は、野生型ＥＧＦＲとは異なるＥＧＦＲ変異体を与えるＥＧＦＲ分子において、任意の種類の変異（すなわち、変化）を含む。いくつかの実施形態において、変異は、ＥＧＦＲ分子のキナーゼ活性化を増加させ、および／または腫瘍細胞を１つまたは２つ以上のＥＧＦＲ阻害剤に感受性を与える。いくつかの実施形態において、変異は、ＥＧＦＲのキナーゼドメインにある。いくつかの実施形態では、変異は、ヒトＥＧＦＲ遺伝子のエキソン１８〜２１の１つにある。最も一般的なＥＧＦＲ変異は、エクソン１９内の欠失（例えば、エキソン１９（Ｄｅｌ  Ｅ７４６−Ａ７５０）における１５ｂｐのヌクレオチド内インフレーム欠失）およびエクソン２１（Ｌ８５８Ｒ）におけるコドン８５８でのロイシンをアルギニンで置換する点突然変異である。癌細胞における変異遺伝子産物を検出する能力は、そのような療法から得られる可能性が最も高い患者を同定し、臨床試験をより効率的かつ有益なものにすることができる。
【００５２】
ＥＧＦＲ変異体は、当該分野で公知の標準的な手段によって検出することができる。例えば、配列決定、野生型または変異体配列に特異的なプライマーおよび／またはプローブを用いる核酸増幅、および欠失変異体を検出するための増幅および長さ分析によって、ヌクレオチドレベルで変異体を検出することができる。ＥＧＦＲ変異状態を決定する例示的な方法は、Ｒｏｓｅｌｌら，２００９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３６１：９５８−９６７およびＬｉら，２０１１，ＰＬｏＳＯＮＥ，６：ｅ２８２０４に開示される。核酸分析用のキットは、市販されており、例えば、ＥＧＦＲＰｙｒｏＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）、ＥＧＦＲＰＣＲＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）、およびＥＧＦＲＲＧＱＰＣＲＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）である。ＥＧＦＲＲＧＱＰＣＲキットは、エクソン１９、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ、Ｌ８６１Ａ、Ｓ７６８Ｉ、およびＧ７１９Ｘ（Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ａ、またはＧ７１９Ｃの存在を検出しますが、それらを区別しない）における１９個の欠失を含む、ＥＧＦＲ遺伝子の２９種の変異を検出することができる。
【００５３】
特定のＥＧＦＲ変異体は、例えば、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｄａｎｖｅｒｓ，Ｍａｓｓ．）または変異特異的ＡＱＵＡペプチド（Ｓｔｅｍｍａｎｎら，２００１，Ｃｅｌｌ，１０７：７１５−７２６）由来の、ＥＧＦ受容体（Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌＳｐｅｃｉｆｉｃ）（６Ｂ６）ＸＰ．ＲＴＭ．ウサギｍＡｂおよびＥＧＦ受容体（Ｌ８５８Ｒ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ）（４３Ｂ２）ウサギｍＡｂような、変異特異的抗体を使用して、ポリペプチドレベルで検出することができる。他の同定された変異型ＥＧＦＲポリペプチドに特異的に結合するように、変異特異的抗体を調製することができる。
【００５４】
投与および医薬組成物
別の態様において、本開示は、治療有効量の本開示のＰＩＮＫ１−ＣＴＤ単離されたポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、本開示の医薬組成物は、ＨＥＲが物理的な結合を介して活性化を抑制するサプレッサーである。一実施形態において、本開示の医薬組成物は、追加の抗癌剤をさらに含む。好ましくは、追加の抗癌剤は、ＥＧＦＲ阻害剤である。様々なＥＧＦＲ阻害剤が知られており、本明細書に開示された方法で使用することができ、例えば、ゲフィチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ、アファチニブ、ネチツムマブ、ニモツズマブ、ＰＦ２９９８０４（Ｊａｎｎｅら，２０１１，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，１７：１１３１−３９）、ＲＯ５０８３９４５（グリコエンジニアリング抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅ；Ｍａｒｋｍａｎら，２０１０，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ，２８：１５ｓ，ａｂｓｔｒ２５２２）、ＡＢＴ−８０６（ヒト化抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体；Ａｂｂｏｔｔ）、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４（Ｋａｔａｙａｍａら，２０１１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０８：７５３５−４０）、およびＡＰ２６１１３を挙げることができる。
【００５５】
一態様において、本開示は、治療有効量の本開示のＰＩＮＫ１−ＣＴＤ単離されたポリペプチドを対象に投与することを含む、ＥＧＦＲの二量体化および活性化を妨げる方法を提供する。一実施形態において、本開示は、治療有効量の本開示のＰＩＮＫ１−ＣＴＤ単離されたポリペプチドを対象に投与することを含む、癌の阻害、予防および／または治療のための方法を提供する。一実施形態において、癌は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、食道癌、喉頭癌、胃癌、結腸癌、および肺癌などのＥＲＢＢ発現癌であり、より好ましくは、肺癌であり、さらに好ましくは、肺癌は肺腺癌である。いくつかの実施形態にいおて、肺癌は、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）または非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。
【００５６】
医薬組成物は、当該分野で公知の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤をさらに含むことができる（一般的にＲｅｍｉｎｇｔｏｎ（２００５）、薬学の科学と実践、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓを参照）。製剤は、投与様式に適合するように作製される。一般に、タンパク質を投与する方法は、当業者に公知であり、本開示のポリペプチドの投与に適用することができる。
【００５７】
投与は、血液又は組織細胞と究極的に接触して分子を導入するために通常使用される経路のいづれかによるものである。このようなポリペプチドを対象に投与するための適切な方法は利用可能であり、特定の組成物を投与するために複数の経路を使用することができるが、特定の経路はしばしば、他の経路よりもより早く且つより効果的な作用または反応を提供することができる。
【００５８】
薬学的に許容可能な担体は、部分的には、投与される特定の組成物、ならびに組成物を投与するのに用いられる特定の方法によって決定される。したがって、本開示の医薬組成物の様々な適切な製剤が存在する。
【００５９】
本開示のＰＩＮＫ１−ＣＴＤ単離ポリペプチドは、タンパク質またはペプチドに適する任意の従来経路により投与することができるが、これに限定されるものではない。適切な経路には、経口、直腸内、局所的、吸入（これに限定されないが、エアロゾルを介することを含む）、口腔（これに限定されないが、舌下を含む）、膣内、非経口（これらに限定されないが、皮下、筋肉内、皮内、関節内、胸腔内、腹腔内、脳内、くも膜下腔内、動脈内、または静脈内を含む）、局所的（すなわち、気道表面を含む皮膚および粘膜表面の両方）、肺、眼内、鼻腔内および経皮投与が挙げられるが、いずれの場合においても最も適切な経路は、治療される状態の性質および重症度に依存する。投与は、局所または全身のいずれかであり得る。本開示のＰＩＮＫ１−ＣＴＤの単離ポリペプチドは、他の薬剤または治療剤と組み合わせて使用されることができる。
【００６０】
関節内（関節における）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、および皮下経路などの非経口投与に適した製剤は、例えば、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及びその製剤を目的の治療対象の血液と等張にする溶質を含有していてもよい水性および非水性の等張滅菌注射溶液、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および防腐剤を含むしていてもよい水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられる。本開示のＰＩＮＫ１−ＣＴＤ単離されたポリペプチドの製剤は、単位用量または複数用量の密封容器、例えば、アンプルおよびバイアルとして提供されることができる。
【００６１】
対象に投与される用量は、本開示の文脈において、適用に応じて、ある期間または他の適切な活性にわたって患者において有益な治療反応を有するために十分である。用量は、本開示の特定のＰＩＮＫ１−ＣＴＤ単離されたポリペプチドまたは製剤の有効性、ならびに使用されるポリペプチドの活性および対象の状態、ならびに治療される対象の体重または表面積によって決定される。その用量のサイズは、特定の対象において、特定のベクター、製剤などの投与に伴う任意の有害な副作用の存在、本質、および程度によって決定される。
【００６２】
投与される用量は、典型的には、現在使用されている治療用タンパク質の用量に相当する範囲にあり、関連組成物の変化した活性または血清中半減期に合わせて調整される。本開示のＰＩＮＫ１−ＣＴＤ単離されたポリペプチドまたは医薬製剤は、放射線療法、化学療法、免疫療法、抗体投与、ワクチン投与、細胞毒性剤の投与などを含む任意の公知の従来の療法によって、治療条件を補うことができる。例えば、化学療法は、追加の抗癌剤を対象に投与することを含む。
【実施例】
【００６３】
実施例１−肺腺癌におけるＰＩＮＫ１とＥＧＦＲの相互作用
肺腺癌におけるＰＩＮＫ１とＥＧＦＲが相互作用するかどうかを判定するために、異なるタイプのＥＧＦＲを有する４つの肺腺癌細胞株において、免疫ブロット法により内因性ＰＩＮＫ１およびＥＧＦＲを最初に調べた。前記４つの肺腺癌細胞株は、ＣＬ１−５（野生型）、ＰＣ９（Ｅｘｌ９Ｄｅｌ）、Ｈ１９７５（Ｌ８５８Ｒ＋Ｔ７９０Ｍ）およびＨ３２５５（Ｌ８５８Ｒ）である（図１Ａ）。続いて、全ての細胞溶解物をＥＧＦＲモノクローナル抗体で免疫沈降させ、ＰＩＮＫ１抗体で免疫ブロットした。この結果、４つの免疫沈降物において、ＰＩＮＫ１の検出を示し、内因性タンパク質複合体の形成を示した（図１Ｂ）。ＰＩＮＫ１およびＥＧＦＲタンパク質の相互作用を視覚化するために、ＣＬ１−５細胞において、野生型ＥＧＦＲ−ＧＦＰおよびＰＩＮＫ１−ｍｙｃを同時に過剰発現させた。これらの２つのタンパク質はＣＬ１−５細胞に共局在し、共局在化の多くは細胞質膜の真下で生じたことが示した（図１Ｃ）。これらのデータは、ＥＧＦＲ変異状態にかかわらず、これら２つのタンパク質キナーゼ間の相互作用の可能性を示唆している。
【００６４】
実施例２−ＰＩＮＫ１によるＥＧＦＲの二量体化の阻害および内在化
ＰＩＮＫ１とＥＧＦＲとの間において相互作用が存在する可能性があるので、次にＥＧＦＲにおけるＰＩＮＫ１の潜在的役割を調べた。ＣＬ１−５、ＰＣ９、Ｈ１９７５およびＨ３２５５細胞において、ＰＩＮＫ１がノックダウンされ、同時にＥＧＦＲのｍＲＮＡ発現の下方制御を伴わずに総ＥＧＦＲタンパク質の減少を見出した（図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ）。ｍＲＮＡ発現の低下がないタンパク質レベルの減少は、タンパク質の代謝回転が増大されることを示唆している。現在の知識に基づいて、ＥＧＦＲの代謝回転は、受容体の二量体化および内在化によって媒介される（Ａ．Ｖ．Ｖｉｅｉｒａ，Ｃ．Ｌａｍａｚｅ，Ｓ．Ｌ．Ｓｃｈｍｉｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７４，２０８６−２０８９（１９９６）；Ｒ．Ｈｅｕｋｅｒｓｅｔａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｅｔ１２６，４９００−４９１２（２０１３）；ａｎｄＡ．Ｔｏｍａｓ，Ｃ．Ｅ．Ｆｕｔｔｅｒ，Ｅ．Ｒ．Ｔｒｅｎｄｓ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２４，２６−３４（２０１４））。したがって、ＰＩＮＫ１は、これらのプロセスにおいて役割を果たすかどうかが研究された。ＰＩＮＫ１の操作下でＥＧＦＲの二量体化の変化を評価するために、ＰＩＮＫ１ノックダウン細胞および実験対照細胞を、リソソーム阻害剤（２０ｍＭのＮＨ4Ｃ１）およびプロテアソーム阻害剤（１０μＭのＭＧ１３２）で６時間処理した後、ＢＳ３を用いて細胞ベースのタンパク質二量体化を行った。ＣＬ１−５細胞については、細胞採取の２０分前にＥＧＦ（５０ｎｇ  ／  ｍＬ）を投与した。勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット法による分析は、ＰＩＮＫ１ノックダウンに伴うＥＧＦＲの単量体に対する二量体の比の増加を明らかにした。パターンは、異なるタイプのＥＧＦＲを有するＣＬ１−５、ＰＣ９、Ｈ１９７５およびＨ３２５５細胞の間で観察された（図２Ｄ）。ＥＧＦＲ内在化は、単量体に対する二量体の増加した比と共に増強されるかどうかを決定するために、全ての細胞溶解物を細胞膜および細胞質画分に分画して、ＥＧＦＲの亜細胞分布を調べた。ＣＬ１−５およびＨ１９７５細胞によって実証されるように、ＥＧＦＲの膜画分は減少し、ＥＧＦＲの細胞質画分はＰＩＮＫ１ノックダウン下で増加し、受容体内在化の増加を示した（図２Ｅ）。このデータは、ＰＩＮＫ１ノックダウンがＥＧＦＲの二量体化および内在化を容易にし、総ＥＧＦＲタンパク質レベルの低下をもたらすことを示す。
【００６５】
次に、過剰なＰＩＮＫ１タンパク質が逆の現象を引き起こすかどうかを明らかにするために、ＣＬ１−５、ＰＣ９、Ｈ１９７５およびＨ３２５５細胞においてＰＩＮＫ１を過剰発現させた。結果、総ＥＧＦＲタンパク質は、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡ発現の有意な変化を伴わずに増加したことを示した（図７Ａおよび７Ｂ）。一致して、ＰＩＮＫ１過剰発現を伴うＥＧＦＲの単量体に対する二量体の比の減少があった（図７Ｃ）。まとめると、これらのデータは、ＰＩＮＫ１が、ＥＧＦＲタンパク質の二量体化、内在化および代謝回転におけるその役割を通して、総ＥＧＦＲタンパク質レベルに影響を及ぼすことを示唆する。
【００６６】
実施例３−ＰＩＮＫ１−ＣＴＤとＥＧＦＲ−ＴＫＤとの直接相互作用
ＰＩＮＫ１とＥＧＦＲとの相互作用を解明するために、次に、これら２つのプロテインキナーゼが直接的に相互作用するかどうか、どのドメインを介して相互作用するかを調べた。それは、ＥＧＦＲ−ｆｌａｇ（アミノ酸１〜１２１０）としてｆｌａｇ融合全長ＥＧＦＲ構築物である、および、異なるＥＧＦＲ機能的ドメイン（アミノ酸１〜３７８、１〜６２１、１〜６４４、１〜６９０、１〜９５４、６４５〜１２１０、６４５〜９５４、９５５〜１２１０）に基づく８つの連続切断ＥＧＦＲ−ｆｌａｇ構築物を確立した（図３Ａ）。これらの９つの構築物の各々を、ＨＥＫ２９３細胞中の全長ＰＩＮＫ１と同時に過剰発現させた。細胞溶解物を抗ｆｌａｇ抗体で免疫沈降させ、免疫沈降物をＰＩＮＫ１抗体で免疫ブロットした。このデータは、全長ＥＧＦＲ−ｆｌａｇ構築物ならびにアミノ酸１〜９５４、６４５〜１２１０、および６５５〜９５４を含む構築物のみがＰＩＮＫ１と相互作用し、ＥＧＦＲ−ＴＫＤがＰＩＮＫ１結合の重要な領域であることを示した（図３Ｂ）。同時に、ｍｙｃ融合全長ＰＩＮＫ１構築物およびアミノ酸１〜５０９、１〜１５５、１５６〜５０９、１５６〜３０９、３１０〜４２８、４２９〜５８１および７８〜５８１を含む別の７つの切断されたＰＩＮＫ１−ｍｙｃ構築物を確立した（図３Ｃ）。これらの８つの構築物の各々を、ＨＥＫ２９３細胞中の全長ＥＧＦＲ−ｆｌａｇと同時トランスフェクトした。細胞溶解物を抗ｍｙｃ抗体によって免疫沈降させ、抗ｆｌａｇ抗体で免疫ブロットした。このデータは、ＰＩＮＫ１タンパク質のアミノ酸５１０〜５８１がＥＧＦＲ−ＴＫＤと相互作用する潜在領域であることを実証した（図３Ｄ）。直接相互作用がＥＧＦＲ−ＴＫＤとＰＩＮＫ１−ＣＴＤとの間に存在することをさらに確認するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＧＳＴプルダウンアッセイを実施した。組換えＧＳＴ融合ＰＩＮＫ１−ＣＴＤ（アミノ酸５１０〜５８１）および陰性対照構築物であるＧＳＴ融合ＰＩＮＫ１３１０−４２８（アミノ酸３１０〜４２８）は、個別に精製ＨｉｓタグＥＧＦＲ−ＴＫＤ（アミノ酸６４５〜９５４）とインキュベートし、抗Ｈｉｓ抗体による免疫ブロット法により分析した（図３Ｅ）。結果は、ＰＩＮＫ１−ＣＴＤがＥＧＦＲ−ＴＫＤに直接結合することを示した。これらのデータは、ＰＩＮＫ１がＰＩＮＫ１−ＣＴＤおよびＥＧＦＲ−ＴＫＤを介してＥＧＦＲと直接相互作用することを示している。この相互作用は、ＥＧＦＲ受容体の二量化、内在化および代謝回転において役割を果たす。
【００６７】
実施例４−ＰＩＮＫ１−ＣＴＤによるＨＥＲ１およびＨＥＲ２のリン酸化の阻害
ＰＩＮＫ１−ＣＴＤとＨＥＲ１またはＨＥＲ２との相互作用を決定するために、ＰＩＮＫ１−ＣＴＤポリペプチドをＣＬ１−５、ＨＯＰ６２、ＰＣ９またはＨ１９７５細胞と共培養した。この実施例において、使用したＰＩＮＫ１−ＣＴＤは、Ｇｅｎｍｅｄｋｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ株式会社から合成され、９つのアルギニン残基とコンジュゲートさせて膜結合および内在化を行った。９つのアルギニン残基（Ｒ９）のみを有するペプチドと共培養した群を対照群として使用した。この結果、ＣＴＤポリペプチドは、細胞内のＣＬ１−５、ＨＯＰ６２、ＰＣ９およびＨ１９７５におけるＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）のリン酸化を効果的に阻害することを示した（図５Ａ）。また、ＣＴＤポリペプチドは、ＣＬ１−５細胞におけるＨＥＲ２のリン酸化を用量依存的に阻害した（図５Ｂ）。ＥＲＢＢ１〜ＥＲＢＢ４（ＨＥＲ１〜ＨＥＲ４）のチロシンキナーゼドメインのアミノ酸配列アライメントを行った、その結果、ＥＲＢＢ１〜ＥＲＢＢ４は高い配列同一性を示した（図５Ｃ）。
【００６８】
実施例５−ＥＧＦＲ非依存性細胞におけるＰＩＮＫ１によるｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍生長の悪化
代表的なｉｎ  ｖｉｖｏ表現型変化は、分子シグナル伝達の研究において特に重要である。ＰＩＮＫ１ノックダウンは、いくつかの野生型ＥＧＦＲ細胞モデルにおいて細胞増殖を減少させることが報告されている（Ｃ．Ｈ．Ｏ’Ｆｌａｎａｇａｎ，Ｖ．Ａ．Ｍｏｒａｉｓ，Ｗ．Ｗｕｒｓｔ，Ｂ．ＤｅＳｔｒｏｏｐｅｒ，Ｃ．Ｏ’Ｎｅｉｌｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．（２０１４））。このような現象が野生型ＥＧＦＲ肺腺癌細胞に存在するかどうかを調べるために、ｓｈＰＩＮＫ１およびＰＩＮＫ１を安定に発現するＥＧＦＲ野生型ＣＬ１−５細胞を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍生長を評価した。この結果、ＰＩＮＫ１ノックダウンは腫瘍生長を遅らせ、ＰＩＮＫ１過剰発現は腫瘍生長を悪化させることを示した（図６Ａおよび６Ｃ、および図１０）。この観察は、免疫ブロット法の結果と両立し、ＰＩＮＫ１が腫瘍形成において癌遺伝子として機能するという一般的な理解と一致する（図４および図８）（Ｈ．Ｍｕｒａｔａｅｔａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６，１５７１８２−７１８９（２０１１）；Ｊ．Ｐ．ＭａｃＫｅｉｇａｎ，Ｌ．Ｏ．Ｍｕｒｐｈｙ，Ｊ．Ｂｌｅｎｉｓ．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，５９１−６００（２００５）；Ｓ．Ａ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍ．Ｈｅｗｉｓｈ，Ｄ．Ｓｉｍｓ，Ｃ．Ｊ．Ｌｏｒｄ，Ａ．Ａｓｈｗｏｒｔｈ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．７１，１８３６−１８４８（２０１１）；Ｒ．Ｓ．Ａｋｕｎｄｉ，Ｌ．Ｚｈｉ，Ｈ．Ｂｕｅｌｅｒ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．４５，４６９−４７８（２０１２）；ａｎｄＣ．Ｈ．Ｏ’Ｆｌａｎａｇａｎ，Ｖ．Ａ．Ｍｏｒａｉｓ，Ｗ．Ｗｕｒｓｔ，Ｂ．ＤｅＳｔｒｏｏｐｅｒ，Ｃ．Ｏ’Ｎｅｉｌｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．（２０１４））。
【００６９】
実施例６−ＥＧＦＲ依存性細胞におけるＰＩＮＫ１によるインビボ腫瘍生長の阻害
ＰＩＮＫ１は、ＣＬ１−５細胞における腫瘍生長を促進するが、ＥＧＦＲ依存性変異細胞であるＰＣ９、Ｈ１９７５およびＨ３２５５において、状況は反対である。ＳｈＰＩＮＫ１およびＰＩＮＫ１を安定に発現する細胞は、腫瘍異種移植実験に使用した。この結果、ＰＩＮＫ１ノックダウンが腫瘍生長を加速させることを示し、免疫ブロット法により示されるＥＧＦＲ経路活性化の増強と一致した（図６Ｆ、６Ｉ、６Ｌ、図４および図１０）。一方、ＰＩＮＫ１過剰発現は、Ｈ１９７５異種移植片を発現するＥＧＦＲＴ７９０Ｍ変異体を含む腫瘍生長を、遅延させるようであった（図６Ｄ、６Ｇおよび６Ｊ、図８および図１０）。この文脈において、ＰＩＮＫ１は腫瘍サプレッサーとして働き、これは最初に特定されたが確認されなかったときに元々示唆された役割である（Ｍ．Ｕｎｏｋｉ，Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２２，２１７２−２１８５（２００３））。まとめに、これらのデータは、異なる細胞型の間で観察された相違が、ＥＧＦＲ依存性または非依存に起因し得ることを示唆する。
【００７０】
実施例７−ＥＧＦＲ依存性およびＥＧＦＲ非依存性細胞の両方に対するＰＩＮＫ１−ＣＴＤの抗腫瘍効果
次に、ＰＩＮＫ１−ＣＴＤを安定に発現するＣＬ１−５、ＰＣ９、Ｈ１９７５およびＨ３２５５細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍生長を調べた。ＰＩＮＫ１−ＣＴＤは、ＥＧＦＲの活性化を阻害することが示されている。それは、ＥＧＦＲ依存のＰＣ９、Ｈ１９７５およびＨ３２５５細胞におけるＥＧＦＲ下流シグナル伝達を下方制御するだけでなく、ＥＧＦＲ非依存性ＣＬ１−５細胞におけるＳＴＡＴ３−Ｙ７０５のリン酸化も減弱する（図９Ａおよび９Ｂ）。免疫ブロット法での結果と一致して、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍異種移植は、試験した全ての細胞においてＰＩＮＫ１−ＣＴＤが阻害効果を発揮することを証明した（図６Ｂ、６Ｅ、６Ｈ、および６Ｋ）。さらに、合成ポリペプチドＰＩＮＫ１−ＣＴＤ（Ｇｅｎｍｅｄｋｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ株式会社）は、マウス異種移植モデルに用いた。２μＭのＣＴＤポリペプチドまたはＲ９ペプチド（対照群として）は、毎日または２日ごとにマウスに注射した（図１１Ａおよび１１Ｂに矢印で示す）。この結果、ＰＩＮＫ１−ＣＴＤ処理は、ＣＬ１−５およびＨ１９７５肺癌マウス異種移植モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍生長を阻害することを示した（図１１Ａおよび１１Ｂ）。この観察は、ＣＬ１−５、Ｈ１９７５、ＰＣ９およびＨｏｐ６２の生存性が２μＭのＣＴＤポリペプチドによって減少したことを示した、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＭＴＴアッセイの結果と適合する（図１１Ｃ）。
【００７１】
これらの結果より、ＰＩＮＫ１の発癌機能がＣ末端ドメインの外側の領域に存在し、ＰＩＮＫ１−ＣＴＤの腫瘍阻害効果が細胞のＥＧＦＲシグナル伝達依存性に依存しているという仮定を強める。ＣＬ１−５はＥＧＦＲ非依存性であるが、ＰＩＮＫ１−ＣＴＤの観察された腫瘍遅延効果は、ＣＬ１−５細胞における異常なＥＧＦＲ−ＳＴＡＴ３シグナル伝達の重要性を示唆している。したがって、結果は肺腺癌におけるＰＩＮＫ１−ＣＴＤの治療可能性を示している。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕ＥＲＢＢチロシンキナーゼドメイン（ＥＲＢＢ−ＴＫＤ）に結合する非天然ポリペプチドまたはその生物学的に活性な変異体であって、配列番号１と少なくとも１０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むが、配列番号２と同一のアミノ酸配列は除外されることを特徴とする、非天然ポリペプチドまたはその生物学的に活性な変異体。
〔２〕前記ＥＲＢＢが、ＥＲＢＢ１、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、またはＥＲＢＢ４である、前記〔１〕に記載の非天然ポリペプチド。
〔３〕前記ＥＲＢＢ−ＴＫＤが、ＥＧＦＲ−ＴＫＤである、前記〔１〕に記載の非天然ポリペプチド。
〔４〕前記アミノ酸配列が、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、付加、および／または挿入を有する配列番号１の改変配列である、前記〔１〕に記載の非天然ポリペプチド。
〔５〕前記アミノ酸配列が、配列番号１の約３〜約７２個の連続するアミノ酸残基を有する断片を含む、前記〔１〕に記載の非天然ポリペプチド。
〔６〕前記アミノ酸配列が、配列番号１である、前記〔１〕に記載の非天然ポリペプチド。
〔７〕１つ以上の付加アミノ酸配列をさらに含む、前記〔１〕に記載の非天然ポリペプチド。
〔８〕前記付加アミノ酸配列が、標的配列、細胞透過性配列、タグ配列、および連結配列から選択される、前記〔７〕に記載の非天然ポリペプチド。
〔９〕治療有効量の前記〔１〕に記載の非天然ポリペプチド、およびその薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
〔１０〕追加の抗癌剤をさらに含む、前記〔９〕に記載の医薬組成物。
〔１１〕前記追加の抗癌剤が、ＥＲＢＢ阻害剤またはＥＧＦＲ阻害剤である、前記〔１０〕に記載の医薬組成物。
〔１２〕前記ＥＧＦＲ阻害剤が、ゲフィチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ、アファチニブ、ネチツムマブ、ニモツズマブ、ＰＦ２９９８０４、ＲＯ５０８３９４５、ＡＢＴ−８０６、ＮＶＰ−ＴＡＥ６８４、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、前記〔１１〕に記載の医薬組成物。
〔１３〕癌を阻害、予防および／または治療するための、ＥＧＦＲの活性化を阻害する方法であって、治療有効量の前記〔１〕に記載の非天然ポリペプチドを、それを必要とする対象に投与する工程を含むことを特徴とする、方法。
〔１４〕前記癌が、ＥＲＢＢ発現癌である、前記〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕前記ＥＲＢＢ発現癌が、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、食道癌、喉頭癌、胃癌、結腸癌、肺癌、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、前記〔１４〕に記載の方法。
〔１６〕前記ＥＲＢＢ発現癌が、肺癌である、前記〔１５〕に記載の方法。
〔１７〕前記肺癌が、肺腺癌、肺小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、または非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、前記〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕少なくとも１つの追加の癌療法を前記対象に投与する工程をさらに含む、前記〔１３〕に記載の方法。
〔１９〕前記追加の癌療法が、放射線療法、化学療法、免疫療法、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、前記〔１８〕に記載の方法。
〔２０〕前記化学療法が、追加の抗癌剤を前記対象に投与する工程を含む、前記〔１９〕に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ＡＢ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ−Ｆ】
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【図６Ｇ−Ｌ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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