(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ω−アミノ酸生合成代謝経路が内在しているか、ω−アミノ酸生合成代謝経路が導入されている微生物にベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子が導入されている、ω−アミノ酸からラクタム生成能を有する組換え微生物をω−アミノ酸の存在下に培養してラクタムを生成する段階；および
（ｂ）前記生成されたラクタムを回収する段階
を含む、ω−アミノ酸からラクタムを製造する方法であって、
前記ラクタムは、２−ピロリドン（２−ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、バレロラクタム（ｖａｌｅｒｏｌａｃｔａｍ）、カプロラクタム（ｃａｐｒｏｌａｃｔａｍ）、ヘプタノラクタム（ｈｅｐｔａｎｏｌａｃｔａｍ）、オクタノラクタム（ｏｃｔａｎｏｌａｃｔａｍ）、ノナノラクタム（ｎｏｎａｎｏｌａｃｔａｍ）、デカノラクタム（ｄｅｃａｎｏｌａｃｔａｍ）、ウンデカノラクタム（ｕｎｄｅｃａｎｏｌａｃｔａｍ）及びドデカノラクタム（ｄｏｄｅｃａｎｏｌａｃｔａｍ）で構成された群から選択され、
前記ω−アミノ酸は、γ−アミノ酪酸（ｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ、ＧＡＢＡ）、５−アミノ吉草酸（５−ａｍｉｎｏｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄ、５ＡＶＡ）、６−アミノカプロン酸（６−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ、６ＡＣＡ）、７−アミノヘプタン酸（７−ａｍｉｎｏｈｅｐｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、７ＡＨＡ）、８−アミノオクタン酸（８−ａｍｉｎｏｏｃｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、９−アミノノナン酸（９−ａｍｉｎｏｎａｎｏｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、１０−アミノデカン酸（１０−ａｍｉｎｏｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、１１−アミノウンデカン酸（１１−ａｍｉｎｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）及び１２−アミノドデカン酸（１２−ａｍｉｎｏｄｏｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）で構成された群から選択されることを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
前記ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、クロストリジウム属プロピオニクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）由来のａｃｔ遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
導入されたω−アミノ酸生合成代謝経路が５−アミノ吉草酸（５ＡＶＡ）生合成代謝経路であり、前記５−アミノ吉草酸（５ＡＶＡ）生合成代謝経路は、ｄｅｌｔａ−ａｍｉｎｏｖａｌｅｒａｍｉｄａｓｅをコードする遺伝子及びｌｙｓｉｎｅ  ２−ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅをコードする遺伝子を導入することにより導入されたことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｄｅｌｔａ−ａｍｉｎｏｖａｌｅｒａｍｉｄａｓｅをコードする遺伝子は、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）由来のｄａｖＡ遺伝子であり、前記ｌｙｓｉｎｅ  ２−ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅをコードする遺伝子は、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）由来のｄａｖＢ遺伝子であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ω−アミノ酸は、グルコース、スクロース、ガラクトース、マルトース、キシロース、グリセロール、フルクトース及びサトウキビを含む単糖類、二糖類及び多糖類で構成される群から選択される炭素源から生合成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記組換え微生物は、バクテリア、酵母およびカビで構成された群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）ω−アミノ酸を含む反応溶液にベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼを混合した後、反応させてω−アミノアシル−ＣｏＡを製造する段階；及び
（ｂ）前記製造されたω−アミノアシル−ＣｏＡの環構造形成を介してラクタムを製造する段階
を含む、ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼを利用してω−アミノ酸からラクタムを製造する方法であって、
前記ラクタムは、２−ピロリドン（２−ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、バレロラクタム（ｖａｌｅｒｏｌａｃｔａｍ）、カプロラクタム（ｃａｐｒｏｌａｃｔａｍ）、ヘプタノラクタム（ｈｅｐｔａｎｏｌａｃｔａｍ）、オクタノラクタム（ｏｃｔａｎｏｌａｃｔａｍ）、ノナノラクタム（ｎｏｎａｎｏｌａｃｔａｍ）、デカノラクタム（ｄｅｃａｎｏｌａｃｔａｍ）、ウンデカノラクタム（ｕｎｄｅｃａｎｏｌａｃｔａｍ）及びドデカノラクタム（ｄｏｄｅｃａｎｏｌａｃｔａｍ）で構成された群から選択され、
前記ω−アミノ酸は、γ−アミノ酪酸（ｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ、ＧＡＢＡ）、５−アミノ吉草酸（５−ａｍｉｎｏｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄ、５ＡＶＡ）、６−アミノカプロン酸（６−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ、６ＡＣＡ）、７−アミノヘプタン酸（７−ａｍｉｎｏｈｅｐｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、７ＡＨＡ）、８−アミノオクタン酸（８−ａｍｉｎｏｏｃｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、９−アミノノナン酸（９−ａｍｉｎｏｎａｎｏｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、１０−アミノデカン酸（１０−ａｍｉｎｏｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、１１−アミノウンデカン酸（１１−ａｍｉｎｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）及び１２−アミノドデカン酸（１２−ａｍｉｎｏｄｏｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）で構成された群から選択されることを特徴とする、前記方法。
【請求項８】
前記ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼは、クロストリジウム属プロピオニクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）由来のａｃｔ遺伝子によってコードされる酵素であることを特徴とする請求項７に記載のラクタムの製造方法。
【請求項９】
（ａ）ω−アミノ酸生合成代謝経路が内在しているか、ω−アミノ酸生合成代謝経路が導入されている微生物にベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子が導入されている、ω−アミノ酸からラクタム生成能を有する組換え微生物をω−アミノ酸の存在下に培養してω−アミノアシル−ＣｏＡを生成する段階；及び
（ｂ）前記生成されたω−アミノアシル−ＣｏＡを回収する段階
を含む、ω−アミノ酸からω−アミノアシル−ＣｏＡを製造する方法であって、
前記ω−アミノ酸は、γ−アミノ酪酸（ｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ、ＧＡＢＡ）、５−アミノ吉草酸（５−ａｍｉｎｏｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄ、５ＡＶＡ）、６−アミノカプロン酸（６−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ、６ＡＣＡ）、７−アミノヘプタン酸（７−ａｍｉｎｏｈｅｐｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、７ＡＨＡ）、８−アミノオクタン酸（８−ａｍｉｎｏｏｃｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、９−アミノノナン酸（９−ａｍｉｎｏｎａｎｏｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、１０−アミノデカン酸（１０−ａｍｉｎｏｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、１１−アミノウンデカン酸（１１−ａｍｉｎｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）及び１２−アミノドデカン酸（１２−ａｍｉｎｏｄｏｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）で構成された群から選択されることを特徴とする、前記方法。
【請求項１０】
ω−アミノ酸を含む反応溶液にベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼを混合した後、反応させて、ω−アミノアシル−ＣｏＡを製造する段階を含む、ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼを利用してω−アミノ酸からω−アミノアシル−ＣｏＡを製造する方法であって、
前記ω−アミノ酸は、γ−アミノ酪酸（ｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ、ＧＡＢＡ）、５−アミノ吉草酸（５−ａｍｉｎｏｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄ、５ＡＶＡ）、６−アミノカプロン酸（６−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ、６ＡＣＡ）、７−アミノヘプタン酸（７−ａｍｉｎｏｈｅｐｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、７ＡＨＡ）、８−アミノオクタン酸（８−ａｍｉｎｏｏｃｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、９−アミノノナン酸（９−ａｍｉｎｏｎａｎｏｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、１０−アミノデカン酸（１０−ａｍｉｎｏｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、１１−アミノウンデカン酸（１１−ａｍｉｎｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）及び１２−アミノドデカン酸（１２−ａｍｉｎｏｄｏｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）で構成された群から選択されることを特徴とする、前記方法。
【請求項１１】
前記ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼは、クロストリジウム属プロピオニクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）由来のａｃｔ遺伝子によってコードされる酵素であることを特徴とする請求項１０に記載のω−アミノアシル−ＣｏＡの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素を利用したラクタムの製造方法に関し、より詳細にはω−アミノ酸をω−アミノアシル−ＣｏＡに転換する酵素または前記酵素をコードする遺伝子が導入されている組換え微生物を利用したラクタムの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年石油枯渇問題と環境問題によって微生物を利用した持続可能な様々な付加価値化学製品産生に大きい注目が集まっている。様々な付加価値化合物の中でもナイロンの前駆体である様々なラクタムの産生のために多くの研究が行われているが、現在まで組換え微生物を利用した様々なラクタムの産生成功事例はない。
【０００３】
しかし、既存代謝工学的方法を利用してラクタムの前駆体であるω−アミノ酸を産生する組換え微生物については多く報告されている。代表的な例としてラクタムである２−ピロリドン、バレロラクタム、カプロラクタムの前駆体であるω−アミノ酸であるｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ（ＧＡＢＡ）、５−ａｍｉｎｏｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄ（５ＡＶＡ）、６−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ（６ＡＣＡ）を産生した事例が公知された。まずＧＡＢＡの場合、大きくコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（Shi et al., Biotechol. Lett. 33:2469-2474 2011; Shi et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 40:1285-1296, 2013; Takahashi et al., Enzyme Microb. Tech. 51:171-176, 2012）と乳酸バクテリア（Ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ）（Li et al., Microb. Cell. Fact. 9:85, 2010）基盤の組換え微生物を利用して産生研究が進行されている。そして、５ＡＶＡの場合、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を利用して産生された例がある（Park et al., Metab. Eng. 16:42-47, 2013; Adkins et al., Biotechnol. Bioeng. 110:1726-1734, 2013）。最後に６ＡＣＡの場合、メタン菌（ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｓ）の代謝回路を基盤として５−ｆｏｒｍｙｌｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄ（ＵＳ２０１２／００２８３２０Ａ１）を介して６ＡＣＡ産生（ＵＳ２０１４／０１３４６８１）を成功して特許出願している。
【０００４】
組換え微生物を利用した直接的なラクタム産生は報告されていないが、最も多い需要を有しているラクタム中一つのカプロラクタムを微生物で産生できる代謝回路をデザインした特許がある（ＵＳ２０１３／０３０３７２３Ａ１）。しかし、この特許ではこのような代謝回路を実際に起きるようにすることができる酵素および実際のカプロラクタムが産生されたデータは全くない。
【０００５】
そこで、本発明者等は、微生物を利用して様々なラクタムを効率よく産生する方法を開発しようと努力した結果、ω−アミノ酸（ｏｍｅｇａ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）を基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）に受け入れて、ω−アミノアシル−ＣｏＡに転換する酵素を新しく探し出して、前記酵素自体またはその遺伝子が導入された組換え微生物を利用してラクタムを製造できることを確認して本発明の完成に至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ω−アミノ酸をω−アミノアシル−ＣｏＡに転換する酵素をコードする遺伝子が導入されている組換え微生物を提供するところにある。
【０００７】
本発明の他の目的は、前記組換え微生物を利用してω−アミノ酸から様々なラクタムを製造する方法を提供するところにある。
【０００８】
本発明のさらに他の目的は、ω−アミノ酸をω−アミノアシル−ＣｏＡに転換する酵素を利用してω−アミノ酸から様々なラクタムを製造する方法を提供するところにある。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、ω−アミノ酸をω−アミノアシル−ＣｏＡに転換する酵素をコードする遺伝子が導入されている組換え微生物を利用してω−アミノ酸から様々なω−アミノアシル−ＣｏＡを製造する方法を提供するところにある。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、ω−アミノ酸をω−アミノアシル−ＣｏＡに転換する酵素を利用してω−アミノ酸から様々なω−アミノアシル−ＣｏＡを製造する方法を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を達成するために、本発明は、ω−アミノ酸生合成代謝経路が内在しているか、ω−アミノ酸生合成代謝経路を有する微生物にベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼ（ｂｅｔａ−ａｌａｎｉｎｅ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）をコードする遺伝子が導入されている、ω−アミノ酸からラクタム生成能を有する組換え微生物を提供する。
【００１２】
本発明はまた、（ａ）前記組換え微生物を培養してラクタムを生成する段階；及び（ｂ）前記生成されたラクタムを回収する段階を含む、ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼ遺伝子が導入された組換え微生物を利用してω−アミノ酸からラクタムを製造する方法を提供する。
【００１３】
本発明はまた、（ａ）ω−アミノ酸を含む反応溶液にベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼを混合した後、反応させてω−アミノアシル−ＣｏＡを製造する段階；及び（ｂ）前記製造されたω−アミノアシル−ＣｏＡの環構造形成を介してラクタムを製造する段階を含む、ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼを利用してω−アミノ酸からラクタムを製造する方法を提供する。
【００１４】
本発明はまた、（ａ）前記組換え微生物を培養してω−アミノアシル−ＣｏＡを生成する段階；及び（ｂ）前記生成されたω−アミノアシル−ＣｏＡを回収する段階を含む、ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼ遺伝子が導入された組換え微生物を利用してω−アミノ酸からω−アミノアシル−ＣｏＡを製造する方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、ω−アミノ酸を含む反応溶液にベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼを混合した後、反応させて、ω−アミノアシル−ＣｏＡを製造する段階を含む、ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼを利用してω−アミノ酸からω−アミノアシル−ＣｏＡを製造する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ω−アミノ酸からｏｍｅｇａ−ａｍｉｎｏ  ａｃｙｌ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａにかけて様々なラクタムを産生する経路を示したものである。
【図２】ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼを精製するために、ｈｉｓ−ｔａｇｇｉｎｇされたａｃｔ遺伝子が挿入されたｐＥＴ３０αｈｉｓ−ａｃｔと発現プラスミドを示したものである。
【図３】精製されたｂｅｔａ−ａｌａｎｉｎｅ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  ＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真である。
【図４】ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼの酵素を利用してｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件で製造したＧＡＢＡ−ＣｏＡの分析結果である。
【図５】ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼの酵素を利用してｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件で製造した６ＡＣＡ−ＣｏＡの分析結果である。
【図６】ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼの酵素を利用してｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件で製造した２−ピロリドンの分析結果である。
【図７】ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼの酵素を利用してｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件で製造したカプロラクタムの分析結果である。
【図８】ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼを微生物内で発現するために作製したａｃｔ遺伝子が挿入されたｐＴａｃ１５ｋ＿ａｃｔプラスミドを示したものである。
【図９】前記ベクターが導入された組換え微生物を培養して製造した２−ピロリドンの分析結果である。
【図１０】ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼの酵素を利用してｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件で製造した７ＡＨＡ−ＣｏＡの分析結果である。
【図１１】ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼの酵素を利用してｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件で製造したバレロラクタムの分析結果である。
【図１２】本発明の一実施例で行ったリジンからバレロラクタムを産生する代謝経路を示したものである。
【図１３】ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼを微生物内で発現するために作製したａｃｔ遺伝子が挿入されたｐＥＫＥｘ１＿ａｃｔプラスミドを示したものである。
【図１４】グルタミン酸デカルボキシラーゼを微生物内で発現するために作製したｇａｄＢ遺伝子が挿入されたｐＥＫＥｘ１＿ｇａｄＢプラスミドを示したものである。
【図１５】ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼとグルタミン酸デカルボキシラーゼを微生物内で発現するために作製したａｃｔとｇａｄＢ遺伝子が挿入されたｐＥＫＥｘ１＿ａｃｔ＿ｇａｄＢプラスミドを示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００１８】
本発明では、酵素ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼが自然的なω−アミノ酸基質であるｂｅｔａ−ａｌａｎｉｎｅの他にも様々なω−アミノ酸を基質に受け入れて該当するｏｍｅｇａ−ａｍｉｎｏ  ａｃｙｌ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａを作ることを確認して、このようなｏｍｅｇａ−ａｍｉｎｏ  ａｃｙｌ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａが酵素の助けなく該当ラクタムで転換されることを確認して、これにより酵素を利用してω−アミノ酸から様々なラクタムを産生できるシステムの確立が可能であることを確認しようと試みた（図１）。
【００１９】
本発明では、ω−アミノ酸をω−アミノアシル−ＣｏＡに変換する酵素中一つであるベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子が導入されている微生物を利用してラクタムの製造の可能性を調べる実験を行った。その結果、前記酵素をコードする遺伝子が導入された微生物を利用する場合、ラクタムが産生されることを確認した。
【００２０】
すなわち、本発明の一実施例では、微生物内で代表的なω−アミノ酸であるＧＡＢＡがＧＡＢＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａを経て２−ピロリドンが生成されるか否かを確認するために、ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子ａｃｔがクローニングされたｐＴａｃ１５ｋ＿ａｃｔベクターを作製した後（図８）、これを野生型の大腸菌に導入した。また、微生物内にＧＡＢＡを供給するためにＧＡＢＡの前駆体であるグルタミン酸をブドウ糖と共に炭素源として提供した。前記組換え微生物を前記培養条件で培養した結果、微生物培養液でラクタムの一種である２−ピロリドンが生成されることを確認することができた（図９）。
【００２１】
従って、一観点において、本発明は、ω−アミノ酸生合成代謝経路が内在しているか、ω−アミノ酸生合成代謝経路が導入されている微生物にベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子が導入されている、ω−アミノ酸からラクタム生成能を有する組換え微生物に関する。
【００２２】
本発明で用語「内在」とは、微生物に遺伝子組換えで追加せず、微生物が自主的に保有している代謝経路を意味する。例えば、本発明の一実施例で行ったグルタミン酸からＧＡＢＡを産生する大腸菌の代謝経路は、ブドウ糖から該当過程を経てグルタミン酸を生合成した後、内在したグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧａｄＡ或いはＧａｄＢ）によりＧＡＢＡを産生する経路である。
【００２３】
本発明において、前記ω−アミノ酸生合成経路が導入されることは、該当する遺伝子を導入するものであり得る。例えば、大腸菌でリジンから５−アミノ吉草酸（５ＡＶＡ）を生合成する代謝経路を導入するものであってもよい。
【００２４】
本発明において、前記リジンから５−アミノ吉草酸を生合成する代謝経路は、ｄｅｌｔａ−ａｍｉｎｏｖａｌｅｒａｍｉｄａｓｅをコードする遺伝子及びｌｙｓｉｎｅ  ２−ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅをコードする遺伝子を導入することを特徴とし、前記ｄｅｌｔａ−ａｍｉｎｏｖａｌｅｒａｍｉｄａｓｅをコードする遺伝子は、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）由来のｄａｖＡ遺伝子であり、前記ｌｙｓｉｎｅ  ２−ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅをコードする遺伝子は、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）由来のｄａｖＢ遺伝子であることを特徴とするが、これに限定されない。
【００２５】
本発明において、前記ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、クロストリジウム属プロピオニクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）由来のａｃｔ遺伝子であることを特徴とするが、これに限定されない。
【００２６】
本発明において、前記クロストリジウム属プロピオニクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）由来のａｃｔ遺伝子は、配列番号１で表されることを特徴とするが、これに限定されない。
【００２７】
本発明において、前記ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼは、配列番号２で表されることを特徴とするが、これに限定されない。
【００２８】
本発明において、前記酵素は、相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）、すなわちアミノ酸配列類似性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）が５０％以上であることを特徴とし、好ましくは６０％以上であることを特徴とし、より好ましくは７０％以上であることを特徴とする。
【００２９】
本発明において、前記ラクタムは、異種原子環状輪構造であり、輪内アミド結合（ａｍｉｄｅ  ｂｏｎｄ）を有することを特徴とする化学物質である限り、いずれも使用されるが、これに制限されず、好ましくは、プロピオラクタム（ｐｒｏｐｉｏｌａｃｔａｍ）、２−ピロリドン（２−ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、バレロラクタム（ｖａｌｅｒｏｌａｃｔａｍ）、カプロラクタム（ｃａｐｒｏｌａｃｔａｍ）、ヘプタノラクタム（ｈｅｐｔａｎｏｌａｃｔａｍ）、オクタノラクタム（ｏｃｔａｎｏｌａｃｔａｍ）、ノナノラクタム（ｎｏｎａｎｏｌａｃｔａｍ）、デカノラクタム（ｄｅｃａｎｏｌａｃｔａｍ）、ウンデカノラクタム（ｕｎｄｅｃａｎｏｌａｃｔａｍ）及びドデカノラクタム（ｄｏｄｅｃａｎｏｌａｃｔａｍ）で構成された群から選択されることを特徴とする。
【００３０】
本発明において、前記ω−アミノ酸は、アミンとカルボキシル酸官能基を同時に有することを特徴とする化学物質である限り、いずれも使用されるが、これに制限されず、好ましくは、β−アラニン（ｂｅｔａ−ａｌａｎｉｎｅ）、γ−アミノ酪酸（ｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ、ＧＡＢＡ）、５−アミノ吉草酸（５−ａｍｉｎｏｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄ、５ＡＶＡ）、６−アミノカプロン酸（６−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ  、６ＡＣＡ）、７−アミノヘプタン酸（７−ａｍｉｎｏｈｅｐｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、７ＡＨＡ）、８−アミノオクタン酸（８−ａｍｉｎｏｏｃｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、９−アミノノナン酸（９−ａｍｉｎｏｎａｎｏｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、１０−アミノデカン酸（１０−ａｍｉｎｏｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、１１−アミノウンデカン酸（１１−ａｍｉｎｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）及び１２−アミノドデカン酸（１２−ａｍｉｎｏｄｏｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）で構成された群から選択されることを特徴とする。
【００３１】
本発明において、前記β-アラニンはアスパラギン酸からＬ−ａｓｐａｒｔａｔｅ−α−ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅによって生合成される経路を有することを特徴とするが、前記ＧＡＢＡはグルタミン酸からグルタミン酸カルボキシラーゼ（ＧａｄＡあるいはＧａｄＢ）によって生合成される経路を有することを特徴とするが、前記５ＡＶＡはリジンからデルタ−アミノバレルアミダーゼ（ＤａｖＡ）及びリジン−２−モノオキシゲナーゼ（ＤａｖＢ）によって生合成される経路を有することを特徴とするが、前記６ＡＣＡ及び７ＡＨＡはアルファ−ケトグルタル酸からｈｏｍｏｃｉｔｒａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、３−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ／ｉｓｏｈｏｍｏｃｉｔｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ｂｒａｎｃｈｅｄ−ｃｈａｉｎ  α−ｋｅｔｏａｃｉｄ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ及びｐｙｒｕｖａｔｅ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅによって生合成される経路を有することを特徴とするが、これに限定されない。
【００３２】
本発明において、前記ω−アミノ酸は、グルコース、スクロース、ガラクトース、マルトース、キシロース、グリセロール、フルクトース及びサトウキビを含む単糖類、二糖類及び多糖類で構成される群から選択される炭素源から生合成されることを特徴とするが、これに限定されない。
【００３３】
本発明において、前記組換え微生物は、前駆体であるω−アミノ酸を自主的に産生あるいは炭素源として使用できる微生物ならいずれも該当するか、好ましくはバクテリア、酵母およびカビで構成された群から選択されることを特徴とする。
【００３４】
本発明において、前記バクテリアは、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）および大腸菌で構成された群から選択されることを特徴とするが、これに限定されない。
【００３５】
他の観点において、本発明は、（ａ）前記組換え微生物を培養してラクタムを生成する段階；および（ｂ）前記生成されたラクタムを回収する段階を含むω−アミノ酸からラクタムを製造する方法に関する。
【００３６】
本発明において、組換え微生物の培養過程は、通常知られている培養方法を使用して実行できて、本発明の実施例で使用された特定培地および特定培養方法以外にも乳清（ｗｈｅｙ）、ＣＳＬ（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｏｒ）等の糖化液と、他の培地が使用できて、流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続培養など様々な方法を使用することができる（Lee et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 26: 63, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 58: 663, 2002; Lee et al., Biotechnol. Lett., 25: 111, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 54: 23, 2000; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 72: 41, 2001）。
【００３７】
一方、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件で前記酵素を利用する場合、ω−アミノ酸から様々なラクタムを製造できると予想した。
【００３８】
本発明の他の実施例では、ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼが自然的基質であるｂｅｔａ−ａｌａｎｉｎｅの他にω−アミノ酸であるＧＡＢＡ、６ＡＣＡ、７ＡＨＡにも作用することを確認するために、ｅｎｚｙｍｅ  ａｓｓａｙを行った。先ず精製された酵素を得るために、ｈｉｓ  ｔａｇが付いたベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼを暗号化するｈｉｓ−ａｃｔ遺伝子をクローニングしてｐＥＴ３０ａ＿ｈｉｓ＿ａｃｔベクターを作製して（図２）、ｈｉｓ  ｔａｇがあるベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼを精製した（図３）。精製されたタンパク質とａｃｅｔｙｌ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  ＡとＧＡＢＡ、６ＡＣＡ或いは７ＡＨＡを入れてｅｎｚｙｍｅ  ａｓｓａｙを行った。その後各ω−アミノ酸のｏｍｅｇａ−ａｍｉｎｏ  ａｃｙｌ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ形態であるＧＡＢＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ、６ＡＣＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａと７ＡＨＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａが生成されたことをＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ或いはＨＰＬＣ−ＭＳを利用して確認した（図４、図５、図１０）。
【００３９】
本発明のさらに他の実施例では、代表的なω−アミノアシル−ＣｏＡ中一つであるＧＡＢＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ、５ＡＶＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａと６ＡＣＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａが酵素の助けなく該当するラクタムに転換されることを確認するために、実験を行った。Ｅｎｚｙｍｅ  ａｓｓａｙによってＧＡＢＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ、５ＡＶＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａと６ＡＣＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａを作って何の酵素の添加なしに置いた結果、それぞれ２−ピロリドン、バレロラクタムとカプロラクタムが生成されることを確認した（図６、図７、図１１）。
【００４０】
従って、さらに他の観点において、本発明は、（ａ）ω−アミノ酸を含む反応溶液にベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼを混合した後、反応させてω−アミノアシル−ＣｏＡを製造する段階；及び（ｂ）前記製造されたω−アミノアシル−ＣｏＡの環構造形成を介してラクタムを製造する段階を含む、ω−アミノ酸からラクタムを製造する方法に関する。
【００４１】
本発明において、前記ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、クロストリジウム属プロピオニクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）由来のａｃｔ遺伝子であることを特徴とするが、これに限定されない。
【００４２】
本発明において、前記ラクタムは、異種原子環状輪構造であり、輪内アミド結合（ａｍｉｄｅ  ｂｏｎｄ）を有することを特徴とする化学物質である限り、いずれも使用されるが、これに制限されず、好ましくは、プロピオラクタム、２−ピロリドン、バレロラクタム、カプロラクタム、ヘプタノラクタム、オクタノラクタム、ノナノラクタム、デカノラクタム、ウンデカノラクタム及びドデカノラクタムで構成された群から選択されることを特徴とする。
【００４３】
さらに他の観点において、本発明は、（ａ）前記組換え微生物を培養してω−アミノアシル−ＣｏＡを生成する段階；及び（ｂ）前記生成されたω−アミノアシル−ＣｏＡを回収する段階を含む、ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼ遺伝子が導入された組換え微生物を利用してω−アミノ酸からω−アミノアシル−ＣｏＡを製造する方法に関する。
【００４４】
本発明において、前記生成されたω−アミノアシル−ＣｏＡを回収する段階は、細胞を破砕してω−アミノアシル−ＣｏＡを含む混合物を収得する段階；及び精製過程を経てω−アミノアシル−ＣｏＡを回収する段階で構成されることを特徴とするが、これに限定されない。
【００４５】
本発明での細胞破砕は、当業者に公示された様々な方法で行われることができ、好ましくは音波処理方法で行われることを特徴とするが、これに限定されない。前記精製過程は、クロマトグラムを利用する方法が好ましいが、これに限定されない。
【００４６】
本発明において、前記生成されたω−アミノアシル−ＣｏＡを回収する段階は、細胞を破砕する前、細胞を固定させる段階または化合物を処理してω−アミノアシル−ＣｏＡの環構造形成を防止する段階をさらに含んでもよい。
【００４７】
さらに他の観点において、本発明は、ω−アミノ酸を含む反応溶液にベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼを混合した後、反応させて、ω−アミノアシル−ＣｏＡを製造する段階を含む、ω−アミノ酸からω−アミノアシル−ＣｏＡを製造する方法に関する。
【００４８】
本発明において、前記ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、クロストリジウム属プロピオニクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）由来のａｃｔ遺伝子であることを特徴とするが、これに限定されない。
【００４９】
本発明において、前記ラクタムは、異種原子環状輪構造であり、輪内アミド結合（ａｍｉｄｅ  ｂｏｎｄ）を有することを特徴とする化学物質である限り、いずれも使用されるが、これに制限されず、好ましくは、プロピオラクタム、２−ピロリドン、バレロラクタム、カプロラクタム、ヘプタノラクタム、オクタノラクタム、ノナノラクタム、デカノラクタム、ウンデカノラクタム及びドデカノラクタムで構成された群から選択されること）を特徴とする。
【００５０】
本願において、「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」とは、適切な宿主内でＤＮＡを発現させることができる適切な調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子または単に潜在的ゲノム挿入物であってもよい。適当な宿主で形質転換されると、ベクターは、宿主ゲノムと関係がなく複製して機能できるか、または、一部の場合にはゲノムそれ自体に統合され得る。プラスミドが現在のベクターの最も通常的に用いられる形態であるため、本発明の明細書で「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」及び「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、時には互いに交換的に用いられる。しかし、本発明は、当業界に知られているまたは知られるようになるものと同等な機能を有するベクターの異なる形態を含む。哺乳動物細胞培養物発現のための典型的な発現ベクターは、例えばｐＲＫ５（ＥＰ３０７，２４７号）、ｐＳＶ１６Ｂ（ＷＯ９１／０８２９１号）およびｐＶＬ１３９２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に基づいている。
【００５１】
「現調節配列（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という表現は、特定の宿主生物で作動可能に連結されたコード配列の現に必須的なＤＮＡ配列を意味する。そのような調節配列は、転写を施するためのプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解の終結を調節する配列を含む。例えば、原核生物に適した調節配列は、プロモーター、任意にオペレーター配列及びリボソーム結合部位を含む。核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーがこれに含まれる。プラスミドで遺子の現量に最も影響をえる因子はプロモーターである。高現用のプロモーターとしてＳＲαプロモーターとサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）由プロモーター等が好ましく使用される。
【００５２】
本発明のＤＮＡ配列を発現させるために、非常に様々な発現調節配列中いずれもベクターに使用できる。有用な発現調節配列としては、例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルスの初期および後期プロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣまたはＴＲＣシステム、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ファージラムダの主なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコードタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは、他のグリコール分解酵素に対するプロモーター、前記ホスファターゼのプロモーター、例えばＰｈｏ５、酵母α−交配システムのプロモーターおよび原核細胞または真核細胞またはこれらのウイルスの遺伝子の発現を調節すると知られている構成と誘導のその他の配列およびこれらの種々の組合せが含まれる。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターΦ１０はＥ．ｃｏｌｉでタンパク質ＮＳＰを発現させるのに有用に使用できる。
【００５３】
核酸は、他の核酸配列と機能的関係で配置される時、「作動可能に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」される。これは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が調節配列（等）に結合する時遺伝子発現を可能にする方式で連結された遺伝子および調節配列（等）であってもよい。例えば、プレ配列（ｐｒｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）または分泌リーダー（ｌｅａｄｅｒ）に対するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結されて；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されたり；またはリボソーム結合部位は、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されたり；またはリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合、コード配列に作動可能に連結される。一般に、「作動可能に連結された」とは、連結されたＤＮＡ配列が接触して、また、分泌リーダーの場合、接触してリーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）は、接触する必要がない。これらの配列の連結は、便利な制限酵素部位でライゲーション（連結）により行われる。そのような部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｄａｐｔｏｒ）またはリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を使用する。
【００５４】
本願明細書に使用される用語「発現ベクター」とは、通常異種のＤＮＡの断片が挿入された組換えキャリア（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃａｒｒｉｅｒ）であり一般に二本鎖のＤＮＡの断片を意味する。ここで、異種ＤＮＡは、宿主細胞で天然では発見されないＤＮＡである異形ＤＮＡを意味する。発現ベクターは、一度宿主細胞内に存在すると、宿主染色体ＤＮＡと関係なく複製することができ、ベクターの数個のコピーおよびそれの挿入された（異種）ＤＮＡが生成され得る。
【００５５】
当業界に周知された通り、宿主細胞で形質感染遺伝子の発現水準を高めるためには、該当遺伝子が、選択された発現宿主内で機能を発揮する転写および解読発現調節配列に作動可能に連結されなければならない。好ましくは発現調節配列および該当遺伝子は、細菌選択マーカーおよび複製開始点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ）を一緒に含んでいる一つの発現ベクター内に含まれるようになる。発現宿主細胞が真核細胞である場合には、発現ベクターは、真核発現宿主内で有用な発現マーカーをさらに含まなければならない。
【００５６】
上述した発現ベクターによって形質転換または形質感染された宿主細胞は、本発明のさらに他の側面を構成する。本願明細書に使用される用語「形質転換」とは、ＤＮＡを宿主に導入してＤＮＡが染色体外因子としてまたは染色体統合完成によって複製可能になることを意味する。本願明細書に使用される用語「形質感染」とは、任意のコード配列が実際に発現してもしなくても発現ベクターが宿主細胞によって受容されることを意味する。
【００５７】
発明の宿主細胞は、原核または真核生物細胞であり得る。また、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率が高い宿主が通常使用される。大腸菌、シュードモナス、バシラス、ストレプトマイセス、真菌、酵母のような周知の真核および原核宿主、スポドプテラ・フルギペルダ（ＳＦ９）のような昆虫細胞、ＣＨＯおよびマウス細胞のような動物細胞、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０およびＢＭＴ１０のようなアフリカミドリ猿細胞、および組織培養されたヒト細胞は使用できる宿主細胞の例である。本発明のＮＳＰタンパク質をコードするｃＤＮＡをクローニングする時には、動物細胞を宿主とすることが好ましい。ＣＯＳ細胞を利用する場合には、ＣＯＳ細胞でＳＶ４０ラージＴ抗原（ｌａｒｇｅ  Ｔ  ａｎｔｉｇｅｎ）が発現しているので、ＳＶ４０の複製開始点を有するプラスミドは細胞中多数コピー（ｃｏｐｙ）のエピソーム（ｅｐｉｓｏｍｅ）として存在するようになり、通常より高発現が期待される。導入されたＤＮＡ配列は、宿主細胞と同じ種から得られるか、宿主細胞と異なる種のものであるか、またはそれはいかなる異種または相同性ＤＮＡを含むハイブリッドＤＮＡ配列であってもよい。
【００５８】
もちろん、すべてのベクターと発現調節配列が、本発明のＤＮＡ配列を発現するが、すべてが同等に機能を発揮するとは限らないことを理解しなければならない。同様にすべての宿主が同じ発現システムに対して同じ機能を発揮することはない。しかし、当業者なら、過度な実験的負担なしに本発明の範囲を逸脱しないまま種々のベクター、発現調節配列および宿主の中から適切な選択を行うことができる。例えば、ベクターを選択するには宿主を考慮しなければならないが、これはベクターがその中で複製されなければならないためである。ベクターの複製数、複製数を調節できる能力および当該ベクターによってコードされる他のタンパク質、例えば抗生剤マーカーの発現もさらに考慮されなければならない。発現調節配列を選定するに当たっても、種々の因子を考慮しなければならない。例えば、配列の相対的強度、調節可能性および本発明のＤＮＡ配列との相溶性等、特に可能性がある二次構造と関連して考慮しなければならない。単細胞宿主は、選定されたベクター、本発明のＤＮＡ配列によってコードされる産物の毒性、分泌特性、タンパク質を正確にフォールディングさせることができる能力、培養および発酵要件、本発明ＤＮＡ配列によってコードされる産物を宿主から精製することの容易性などの因子を考慮して選定されなければならない。これらの変数の範囲内で、当業者は、本発明のＤＮＡ配列を発酵または大規模動物培養で発現させることができる種々のベクター／発現調節配列／宿主の組合せを選定することができる。発現クローニングによってＮＳＰタンパク質のｃＤＮＡをクローニングしようとする時のスクリーニング法として、バインディング法（ｂｉｎｄｉｎｇ法）、パニング法（ｐａｎｎｉｎｇ法）、フィルムエマルジョン法（ｆｉｌｍ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ法）などが適用され得る。
【００５９】
本発明の定義上「実質的に純粋な」とは、本発明に係るポリペプチドおよびポリペプチドをコードするＤＡＮ配列がバクテリアから由来した他のタンパク質を実質的に含まないことを意味する。
【００６０】
組換えタンパク質を発現するための宿主細胞は、短い時間内高濃度菌体培養が可能で遺伝子操作が容易で遺伝学的、生理的特徴が明らかになっている大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）等のような原核細胞が広く利用されてきた。しかし、タンパク質の翻訳後修飾（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、分泌過程および活性型の３次元構造、タンパク質の活性状態の問題点を解決するために、最近単細胞真核細胞である酵母系列（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ等）、糸状の真菌類（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ）、昆虫細胞（ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌｓ）、植物細胞、ほ乳動物細胞（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ）等高等生物に至るまで組換えタンパク質生産の宿主細胞として活用しているので、実施例で例示された大腸菌だけでなく他の宿主細胞を利用することは当業界の通常の知識を有する者にとって容易に適用可能である。
【実施例】
【００６１】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００６２】
実施例１．ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性確認
１−１：ｐＥＴ３０ａ＿ｈｉｓ＿ａｃｔベクターの作製
クロストリジウム・プロピオニクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）菌株由来ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼのアミノ酸配列およびこれをコードするａｃｔ遺伝子の塩基配列は、それぞれ配列番号２および１のようになる。
【００６３】
クロストリジウム・プロピオニクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）菌株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号３と４のプライマーでＰＣＲを行って、Ｎ末端（Ｎ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ）にｈｉｓ−ｔａｇが付いたｂｅｔａ−ａｌａｎｉｎｅ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａをコードするｈｉｓ＿ａｃｔ遺伝子切片を作製した。
［配列番号３］ｃｋｐｈｉｓａｃｔ（ＮｄｅＩ，Ｆ）：
５’−ＡＧＡＣＡＧＣＡＴＡＴＧＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＡＡＡＧＡＣＣＣＴＴＧＧＡＡＧＧＴＡＴＴＣＧ−３’
［配列番号４］ｃｋｐａｃｔ（ＳａｌＩ，Ｒ）：
５’−ＡＧＡＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＡＴＧＡＣＡＴＴＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣＡＧＴＧＡ−３’
【００６４】
次に、前記ｈｉｓ＿ａｃｔ切片とｐＥＴ３０ａプラスミドに制限酵素（ＮｄｅＩおよびＳａｌＩ）を処理した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを処理して、制限酵素で切断されたｈｉｓ＿ａｃｔ切片およびｐＥＴ３０ａプラスミドを接合させることによって、組換えプラスミドであるｐＥＴ３０ａ＿ｈｉｓ＿ａｃｔを作製した（図２）。
【００６５】
１−２：ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼの精製
ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼの精製のために実施例１−１で収得したプラスミドｐＥＴａ＿ｈｉｓ＿ａｃｔを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｆ−ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−  ｍＢ−）ｇａｌ  ｄｃｍ（ＤＥ３）  ａ  ｐｒｏｐｈａｇｅ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，米国）に導入した。
【００６６】
前記形質転換菌株を２５ｍｇ／Ｌカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）が含まれた１０ｍＬ  ＬＢ液体培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ，ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ５ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ）に接種して３７℃で２００ｒｐｍで持続的に振盪して初期培養した後、前記のような培地２００ｍＬに１％接種して３７℃で２００ｒｐｍで持続的に振盪して培養した後、分光光度計で６００ｎｍ波長で測定した光学密度（Ｏ．Ｄ．）が０．４の時、１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加してｈｉｓ＿ａｃｔ発現を誘導した。
【００６７】
発現誘導してから４時間後に培養液を遠心分離機（Ｈａｎｉｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ，韓国）で３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間処理して微生物を分離して、上澄み液は除去して、分離した微生物をｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｎａ３ＰＯ４，３００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）４０ｍＬに再び入れた後、ｃｅｌｌ  ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（Ｓｏｎｉｃｓ  ＆  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ．，米国）を利用して３０％の強度で５秒間パルスを与えて５秒間休む方式で２時間微生物を溶解させた後、１３２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して細胞残骸を除去した後、細胞溶解液を得た。
【００６８】
このような細胞溶解液を０．４５μｍフィルターで精製して、Ｔａｌｏｎ  ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，米国）を利用してｈｉｓ−ｔａｇが付いたベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼを分離した。Ｔａｌｏｎ  ｒｅｓｉｎに付いたベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼの分離は、それぞれ７．５、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０ｍＭのｉｍｉｄａｚｏｌｅが混ざったｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｂｕｆｆｅｒを利用して行った。その後、全細胞溶解液、ｔａｌｏｎ  ｒｅｓｉｎｓを通過したタンパク質溶液、各濃度のｉｍｉｄａｚｏｌｅで得たタンパク質溶液を全て５ｘＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝溶液（ＬＰＳ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、韓国）と混ぜたサンプルを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを利用して分離して、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ  Ｒ２５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，米国）溶液で染色した（図３）。その結果、最も純度が高い１２０ｍＭで精製したベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼを利用した。
【００６９】
１−３：ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼのｅｎｚｙｍｅ  ａｓｓａｙ
Ｅｎｚｙｍｅ  ａｓｓａｙは５０ｍＭ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）で行った。Ｅｎｚｙｍｅ  ａｓｓａｙに必要な基質および酵素は下記の量で入れた。１０ｍＭのＧＡＢＡ、６ＡＣＡ或いは７ＡＨＡ、１ｍＭのａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ、そして２．５μｇの精製されたベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼを添加して２時間３０℃で反応を行って、ｅｎｚｙｍｅ  ａｓｓａｙ混合物からｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ誘導体だけ分離するために、ＯＡＳＩＳ  ＨＬＢ  ＳＰＥカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ，米国）を利用して下記のプロトコルを使用した。
【００７０】
最初にカートリッジに１ｍＬのメタノールを流した後、２ｍＬの０．１５％ＴＣＡ溶液を流した。その後ｅｎｚｙｍｅ  ａｓｓａｙしたｍｉｘｔｕｒｅを流した後、再び１ｍＬの０．１５％ＴＣＡ溶液を流した。最後に、メタノールとＮＨ４ＯＨが９９：１体積比で混ざった溶液を１ｍＬ流して精製されたｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ誘導体を収得して、真空遠心分離機を利用して溶媒を飛ばして−２４℃にサンプルを保管した。
【００７１】
このサンプルをＨＰＬＣ−ＭＳ（Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒｓ：ＬＣ／ＭＳＤ  ＶＬ，Ａｇｉｌｅｎｔ，米国，ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ，米国）またはＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒｓ：ＡＰＩ３２００ＱＴＲＡＰ，ＳＣＩＥＸ，米国，ＨＰＬＣ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ，日本）で分析する直前に蒸溜水に溶かしてｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ誘導体分析を行った。ＧＡＢＡと６ＡＣＡを基質として利用して行ったｅｎｚｙｍｅ  ａｓｓａｙ  ｍｉｘｔｕｒｅの場合、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳを利用してｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅで分析して、７ＡＨＡを基質として利用したｅｓｓａｙ  ｍｉｘｔｕｒｅの場合、ＨＰＬＣ−ＭＳを利用してｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｏｄｅで分析した。
【００７２】
その結果、ＧＡＢＡを基質として利用して行ったｅｎｚｙｍｅ  ａｓｓａｙ  ｍｉｘｔｕｒｅの１次ＭＳ分析結果、ＧＡＢＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａの予想されるｍ／ｚ値である８５３と似た値である８５２．２でピークが出て、このピークを２次ＭＳで断片化（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）して分析した結果、予想されるピークであるｍ／ｚ＝２４４、３４６、４２８と似た値である２４３．１、３４５．５、４２８．１でピークを確認した（図４）。また、６ＡＣＡを基質として利用して行ったｅｎｚｙｍｅ  ａｓｓａｙ  ｍｉｘｔｕｒｅの１次ＭＳ分析結果、６ＡＣＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａの予想されるｍ／ｚ値である８８１と似た値である８８１．３でピークが出て、このピークを２次ＭＳで断片化して分析した結果予想されるピークであるｍ／ｚ＝２７２、３７４、４２８と似た２７２．２、３７４．３、４２８．２でピークを確認した（図５）。また、７ＡＨＡを基質として利用して行ったｅｎｚｙｍｅ  ａｓｓａｙ  ｍｉｘｔｕｒｅの場合、ｔ＝９．８４４分に新しいＣｏＡ誘導体ピークが見えることを確認して７ＡＨＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａの予想されるｍ／ｚ値である８９３．２と同じ値を有していた（図１０）。
【００７３】
この結果から、本発明によりベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼが成功的にＧＡＢＡ、６ＡＣＡと７ＡＨＡをそれぞれＧＡＢＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ、６ＡＣＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ、そして７ＡＨＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａに転換させることを確認した。
【００７４】
実施例２．ｉｎ  ｖｉｔｒｏで２−ピロリドン、バレロラクタムおよびカプロラクタム産生確認
実施例１−３に記述された方法でｅｎｚｙｍｅ  ａｓｓａｙを行ってＧＡＢＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ、５ＡＶＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａおよび６ＡＣＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａを製造した。製造したＧＡＢＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ、５ＡＶＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａおよび６ＡＣＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａを３７℃で４８時間何の処理なしに放置した後、２−ピロリドン、バレロラクタムおよびカプロラクタムが生成されるか否かＨＰＬＣ−ＭＳで分析した。
【００７５】
その結果、先ず標準２−ピロリドン試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）をＨＰＬＣ−ＭＳで分析した結果、２−ピロリドンのピークを６．３５２分に検出して、このピークをＭＳ分析した結果、ｍ／ｚ＝８６．１，１０８．１でピークが現れることを確認した。対照群でベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼを入れなかった、すなわちＧＡＢＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａが作られなかったａｓｓａｙ  ｍｉｘｔｕｒｅを分析した結果、６分帯に何のピークも現れないことを確認した。
【００７６】
ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼを入れてＧＡＢＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａが作られたａｓｓａｙ  ｍｉｘｔｕｒｅサンプルでは、標準２−ピロリドン試薬と似た６．３４８分でピークを検出して、このピークをＭＳ分析した結果、標準２−ピロリドン試薬と似たｍ／ｚ＝８６．０、１０８．０でピークを検出した（図６）。また、標準バレロラクタム試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）をＨＰＬＣ−ＭＳで分析した結果、バレロラクタムのピークを８．０９８分に検出して、このピークをＭＳ分析した結果、ｍ／ｚ＝１００．１でピークが現れることを確認した。
【００７７】
ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼを入れて５ＡＶＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａが作られたａｓｓａｙ  ｍｉｘｔｕｒｅサンプルでは、標準バレロラクタム試薬と似た８．０９２分でピークを検出して、このピークをＭＳ分析した結果、標準バレロラクタム試薬と似たｍ／ｚ＝１００．１でピークを検出した（図１１）。標準カプロラクタム試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）をＨＰＬＣ−ＭＳで分析した結果、カプロラクタムのピークを９．３９５分に検出して、このピークをＭＳ分析した結果、ｍ／ｚ＝１１４．１、１３６．０でピークが現れることを確認した。
【００７８】
前記のような論理でベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼが入らなくて６ＡＣＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａが作られなかったａｓｓａｙ  ｍｉｘｔｕｒｅの場合、９分帯でピークが検出されず、ベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼを入れて６ＡＣＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａが作られたａｓｓａｙ  ｍｉｘｔｕｒｅサンプルでは標準カプロラクタム試薬と似た９．４６９分でピークが検出されて、このピークをＭＳ分析した結果、標準カプロラクタム試薬と似たｍ／ｚ＝１１４．１、１３６．０でピークが検出されることを確認した（図７）。
【００７９】
この結果から、本発明によりベータアラニンコエンザイムＡトランスフェラーゼを利用して作ったＧＡＢＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ、５ＡＶＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａおよび６ＡＣＡ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａが酵素の助けなくそれぞれ２−ピロリドン、バレロラクタムおよびカプロラクタムに転換されることを確認した。
【００８０】
実施例３．組換え微生物を利用したω−アミノ酸からラクタム産生
３−１：ｐＴａｃ１５ｋ＿ａｃｔベクターの作製
クロストリジウム・プロピオニクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）菌株の染色体ＤＮＡを鋳型にして、配列番号５と６のプライマーでＰＣＲを行って、ｂｅｔａ−ａｌａｎｉｎｅ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａをコードするａｃｔ遺伝子切片を作製した。
［配列番号５］ｃｋｐａｃｔ（ＥｃｏＲＩ，Ｆ）：
５’−ＡＧＡＣＡＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＧＡＣＣＣＴＴＧＧＡＡＧＧＴＡＴＴ−３’
［配列番号６］ｃｋｐａｃｔ（ＳａｃＩ，Ｒ）：
５’−ＡＧＡＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＡＴＧＡＣＡＴＴＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣＡＧＴＧ−３’
【００８１】
次に、前記ａｃｔ切片とｔａｃプロモーターの強い遺伝子発現を行うｐＴａｃ１５ｋ（Hiszczyn’ ska-Sawicka and Kur, 1997）プラスミドに制限酵素（ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩ）を処理した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを処理して、制限酵素で切断されたａｃｔ切片およびｐＴａｃ１５ｋプラスミドを接合させることによって、組換えプラスミドであるｐＴａｃ１５ｋ＿ａｃｔを作製した（図８）。
【００８２】
３−２：ｐＥＫＥｘ１＿ａｃｔベクターの作製
実施例３−１で作製したａｃｔ切片とｔａｃプロモーターの強い遺伝子発現を行うｐＥＫＥｘ１（Eikmanns et al., Gene. 102, 93-98,1991）プラスミドに制限酵素（ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ）を処理した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを処理して、制限酵素で切断されたａｃｔ切片およびｐＥＫＥｘ１プラスミドを接合させることによって、組換えプラスミドであるｐＥＫＥｘ＿ａｃｔを作製した（図１３）。
【００８３】
３−３：ｐＥＫＥｘ１＿ｇａｄＢベクターの作製
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）菌株の染色体ＤＮＡを鋳型にして、配列番号８と９のプライマーでＰＣＲを行って、グルタミン酸デカルボキシラーゼをコードするｇａｄＢ遺伝子切片を作製した。
［配列番号７］ｅｃｊｇａｄＢ（ＢａｍＨＩ，ＲＢＳ，Ｆ）：
５’−ＡＧＡＣＡＧＧＧＡＴＣＣＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＡＴＧＧＡＴＡＡＧＡＡＧＣＡＡＧＴＡＡＣＧＧＡＴＴ−３’
［配列番号８］ｅｃｊｇａｄＢ（ＳａｌＩ，Ｒ）：
５’−ＡＧＡＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＧＴＡＴＧＴＴＴＡＡＡＧＣＴＧＴＴＣＴＧＴＴ−３’
【００８４】
次に、前記ｇａｄＢ切片とｔａｃプロモーターの強い遺伝子発現を行うｐＥＫＥｘ１（Eikmanns et al., Gene. 102, 93-98, 1991）プラスミドに制限酵素（ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ）を処理した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを処理して、制限酵素で切断されたｇａｄＢ切片およびｐＥＫＥｘ１プラスミドを接合させることによって、組換えプラスミドであるｐＥＫＥｘ＿ｇａｄＢを作製した（図１４）。
【００８５】
３−４：ｐＥＫＥｘ１＿ａｃｔ＿ｇａｄＢベクターの作製
実施例３−２で作製したｐＥＫＥｘ１−ａｃｔプラスミドおよび実施例３−２で作製したｇａｄＢ切片に制限酵素（ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ）を処理した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを処理して、制限酵素で切断されたｇａｄＢ切片およびｐＥＫＥｘ１＿ａｃｔプラスミドを接合させることによって、組換えプラスミドであるｐＥＫＥｘ＿ａｃｔ＿ｇａｄＢを作製した（図１５）。
【００８６】
３−５：組換え微生物作製
微生物内でｂｅｔａ−ａｌａｎｉｎｅ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ遺伝子をコードするａｃｔ遺伝子が発現できるよう実施例３−１で作製したｐＴａｃ１５ｋ＿ａｃｔプラスミドを大腸菌ＷＬ３１１０（Lee et al., Mol. Syst. Biol. 3:149 2007）に導入して組換え微生物を製造して（ＷＬ３１１０／ｐＴａｃ１５ｋ−ａｃｔ）、空ベクターであるｐＴａｃ１５ｋが導入された大腸菌（ＷＬ３１１０／ｐＴａｃ１５ｋ）を対照群菌株として使用した。
【００８７】
また、様々な炭素源での産生可能性を検出するために、微生物内でｂｅｔａ−ａｌａｎｉｎｅ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ遺伝子をコードするａｃｔ遺伝子が発現されるよう、実施例３−１で作製されたｐＴａｃ１５ｋ＿ａｃｔプラスミドを大腸菌ＸＱ５６／ｐＫＥ１１２−ｄａｖＡＢ（Park et al., Metab. Eng. 16:42-47 2013）に導入して組換え微生物を製造して（ＸＱ５６／ｐＫＥ１１２−ｄａｖＡＢ／ｐＴａｃ１５ｋ−ａｃｔ）、空ベクターであるｐＴａｃ１５ｋが導入された大腸菌（ＸＱ５６／ｐＫＥ１１２−ｄａｖＡＢ／ｐＴａｃ１５ｋ）を対照群菌株として使用した。
【００８８】
また、様々な炭素源で産生可能性を検出するために、微生物内でＧＡＢＡを生合成するためのグルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子をコードするｇａｄＢ遺伝子とｂｅｔａ−ａｌａｎｉｎｅ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ遺伝子をコードするａｃｔ遺伝子が発現されるよう、実施例３−４で作製されたｐＥＫＥｘ１＿ａｃｔ＿ｇａｄＢプラスミドを野生型コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２）に導入して組換え微生物を製造して（ＡＴＣＣ  １３０３２／ｐＥＫＥｘ１＿ａｃｔ＿ｇａｄＢ）、ｇａｄＢ遺伝子だけを発現する実施例３−３で作製されたｐＥＫＥｘ１＿ｇａｄＢプラスミドが導入されたコリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ  １３０３２／ｐＥＫＥｘ１＿ｇａｄＢ）を対照群菌株として使用した。
【００８９】
３−６：組換え微生物を利用したＧＡＢＡからの２−ピロリドン産生確認
実施例３−５で製造した組換え微生物（ＷＬ３１１０／ｐＴａｃ１５ｋ−ａｃｔ）を１０ｍＬ  ＬＢ培地に接種して３７℃で８時間前培養を行って、前培養した培養液１．５ｍＬを３５０ｍＬフラスコに５０ｍＬの変形ＭＲ−１培地に接種して培養した。
【００９０】
変形ＭＲ−１培地（ｐＨ７．０）の組成は、蒸溜水１リットル当り１０ｇブドウ糖、５ｇ  ＧＡＢＡ、９ｇ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、６．６７ｇ  ＫＨ２ＰＯ４，４．０ｇ  （ＮＨ４）２ＨＰＯ４、０．８ｇ  ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ、０．８ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５ｍＬ  ｔｒａｃｅ  ｍｅｔａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（蒸溜水１リットル当り１０ｇ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．２ｇ  ＺｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、０．５８ｇ  ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、１ｇ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．１ｇ  （ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、０．０２ｇ  Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ）の成分で構成された培地である。前記組成でＧＡＢＡを炭素源として供給した。培養は４８時間３７℃と２００ｒｐｍで作動するｓｈａｋｉｎｇ  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（ｊＳＲ、韓国）で行った。培養が終わった、培養液は１３，２００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上澄み液だけを採取してＨＰＬＣ−ＭＳ分析を行うことによって、２−ピロリドンの産生を確認した。
【００９１】
その結果、表１に開示された通り、空ベクターが形質転換された組換え微生物では全く２−ピロリドンが産生されないのに対して、本発明に係る組換え微生物は１９３．７８ｍｇ／Ｌの２−ピロリドンが産生されることを確認した。
この結果から、本発明に係る組換え微生物がＧＡＢＡを炭素源として利用して２−ピロリドンを成功的に生成することを確認した。
【００９２】
【表１】
0006602872.tif 000002
【００９３】
３−７：組換え微生物を利用した５ＡＶＡからバレロラクタム産生確認
実施例３−５で製造した組換え微生物（ＷＬ３１１０／ｐＴａｃ１５ｋ−ａｃｔ）を１０ｍＬ  ＬＢ培地に接種して３７℃で８時間前培養を行って、前培養した培養液１．５ｍＬを３５０ｍＬフラスコに５０ｍＬの変形ＭＲ−２培地に接種して培養した。
【００９４】
変形ＭＲ−２培地（ｐＨ７．０）の組成は、蒸溜水１リットル当り１０ｇブドウ糖、５ｇ  ５ＡＶＡ、９ｇ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、６．６７ｇ  ＫＨ２ＰＯ４，４．０ｇ  （ＮＨ４）２ＨＰＯ４、０．８ｇ  ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ、０．８ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５ｍＬ  ｔｒａｃｅ  ｍｅｔａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（蒸溜水１リットル当り１０ｇ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．２ｇ  ＺｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、０．５８ｇ  ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、１ｇ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．１ｇ  （ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、０．０２ｇ  Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ）の成分で構成された培地である。前記組成でＧＡＢＡを炭素源として供給した。培養は４８時間３７℃と２００ｒｐｍで作動するｓｈａｋｉｎｇ  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（ｊＳＲ、韓国）で行った。培養が終わった、培養液は１３，２００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上澄み液だけを採取してＨＰＬＣ−ＭＳ分析を行うことによって、バレロラクタムの産生を確認した。
【００９５】
その結果、表２に開示された通り、本発明に係る組換え微生物は５９２．６８ｍｇ／Ｌのバレロラクタムが産生されることを確認した。
この結果から、本発明に係る組換え微生物が５ＡＶＡを炭素源として利用してバレロラクタムを成功的に生成することを確認した。
【００９６】
【表２】
0006602872.tif 000003
【００９７】
実施例４．組換え微生物を利用した他の炭素源からラクタム産生
４−１：組換え微生物を利用したグルタミン酸からの２−ピロリドン生成確認
実施例３−５で製造した組換え微生物（ＷＬ３１１０／ｐＴａｃ１５ｋ−ａｃｔ）を１０ｍＬ  ＬＢ培地に接種して３７℃で８時間前培養を行って、前培養した培養液１．５ｍＬを３５０ｍＬフラスコに５０ｍＬの変形Ｍ９培地に接種して培養した。
【００９８】
変形Ｍ９培地の組成は、蒸溜水１リットル当り１０ｇブドウ糖、５ｇグルタミン酸、６．７８ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３．０ｇ  ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ  ＮａＣｌ、１．０ｇ  ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍｇ  ｔｈｉａｍｉｎｅの成分で構成された培地である。前記組成でグルタミン酸は、微生物内でＧＡＢＡを供給するために炭素源として供給した。培養は４８時間３７℃と２００ｒｐｍで作動するｓｈａｋｉｎｇ  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（ｊＳＲ、韓国）で行った。培養が終わった、培養液は１３，２００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上澄み液だけを採取してＨＰＬＣ−ＭＳ分析を行うことによって、２−ピロリドンの産生を確認した。
【００９９】
その結果、図９に開示された通り、空ベクターが形質転換された組換え微生物では全く２−ピロリドンが産生されないのに対して、本発明に係る組換え微生物は、２−ピロリドン標準物質と似た６．４４５分にピークを示し、このピークを分析した結果、標準２−ピロリドンと同様にｍ／ｚ＝８６．１、１０８．０でピークを有することを確認した。
この結果から、本発明に係る組換え微生物がグルタミン酸を炭素源として利用して２−ピロリドンを成功的に生成することを確認した。
【０１００】
４−２：組換え微生物を利用したブドウ糖からバレロラクタム生成確認
実施例３−５で製造した組換え微生物（ＸＱ５６／ｐＫＥ１１２−ｄａｖＡＢ／ｐＴａｃ１５ｋ−ａｃｔ）を１０ｍＬ  ＬＢ培地に接種して３７℃で８時間前培養を行って、前培養した培養液１．５ｍＬを３５０ｍＬフラスコに５０ｍＬの変形ＭＲ−３培地に接種して培養した。
【０１０１】
変形ＭＲ−３培地（ｐＨ７．０）の組成は、蒸溜水１リットル当り１０ｇブドウ糖、９ｇ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、６．６７ｇ  ＫＨ２ＰＯ４，４．０ｇ  （ＮＨ４）２ＨＰＯ４、０．８ｇ  ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ、０．８ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５ｍＬ  ｔｒａｃｅ  ｍｅｔａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（蒸溜水１リットル当り１０ｇ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．２ｇ  ＺｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、０．５８ｇ  ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、１ｇ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．１ｇ  （ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、０．０２ｇ  Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ）の成分で構成された培地である。前記組成でブドウ糖を炭素源として供給した。培養は３６時間３７℃と２００ｒｐｍで作動するｓｈａｋｉｎｇ  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（ｊＳＲ、韓国）で行った。培養が終わった、培養液は１３，２００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上澄み液だけを採取してＨＰＬＣ−ＭＳ分析を行うことによって、バレロラクタムの産生を確認した。
【０１０２】
その結果、表３に開示された通り、空ベクターが形質転換された組換え微生物では全くバレロラクタムが産生されないのに対して、本発明に係る組換え微生物は２８．３６ｍｇ／Ｌのバレロラクタムが産生されることを確認した。
この結果から、本発明に係る組換え微生物がブドウ糖を炭素源として利用してバレロラクタムを成功的に生成することを確認した。
【０１０３】
【表３】
0006602872.tif 000004
【０１０４】
４−３：組換え微生物を利用したブドウ糖から２−ピロリドン生成確認
実施例３−５で製造した組換え微生物（ＡＴＣＣ  １３０３２／ｐＥＫＥｘ１＿ａｃｔ＿ｇａｄＢ）を５ｍＬ  ＲＧ培地（ｂｒａｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ４０ｇ／Ｌ，ブドウ糖１０ｇ／Ｌ，ｂｅｅｆ  ｅｘｔｒａｃｔ  １０ｇ／Ｌ，ｓｏｒｂｉｔｏｌ  ３０ｇ／Ｌ）に接種して３０℃で１２時間前培養を行って、前培養した培養液１．５ｍＬを３５０ｍＬフラスコに５０ｍＬの変形ＧＰ１培地に接種して培養した。
【０１０５】
ＧＰ１培地（ｐＨ７．０）の組成は、蒸溜水１リットル当り５ｇブドウ糖、５０ｇ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１．０ｇ  ＫＨ２ＰＯ４，３．０ｇ  ｕｒｅａ、０．４ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５０ｇ  ｐｅｐｔｏｎｅ、０．０１ｇ  ＦｅＳＯ４、０．０１ｇ  ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、２００μｇ  ｔｈｉａｍｉｎｅ、０．１ｍＭ  ｐｙｒｉｄｏｘａｌ  ５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｈｙｄｒａｔｅ、５０μｇ  ｂｉｏｔｉｎの成分で構成された培地である。前記組成でブドウ糖を炭素源として供給した。培養は９６時間３０℃と２００ｒｐｍで作動するｓｈａｋｉｎｇ  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（ｊＳＲ、韓国）で行った。培養が終わった、培養液は１３，２００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上澄み液だけを採取してＨＰＬＣ−ＭＳ分析を行うことによって、バレロラクタムの産生を確認した。
【０１０６】
【表４】
0006602872.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明の組換え微生物はω−アミノ酸からプロピオラクタム、２−ピロリドン、バレロラクタム、カプロラクタムおよびヘプタノラクタムなどの様々なラクタム化合物が製造でき、ラクタムの産業的生産に有用である。
【０１０８】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
0006602872.tif 000006
【図２】
0006602872.tif 000007
【図３】
0006602872.tif 000008
【図４】
0006602872.tif 000009
【図５】
0006602872.tif 000010
【図６】
0006602872.tif 000011
【図７】
0006602872.tif 000012
【図８】
0006602872.tif 000013
【図９】
0006602872.tif 000014
【図１０】
0006602872.tif 000015
【図１１】
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【図１２】
0006602872.tif 000017
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
0006602872.tif 000020
【配列表】
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