(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）試料を使用する信号発生反応のそれぞれのサイクルにおける信号値を収得し、サイクルにおける信号値を提供する段階と、
（ｂ）それぞれのサイクルに一つの閾値を適用し、複数の閾値をサイクルに適用する段階であって、前記サイクルの少なくとも二つのサイクルの閾値は、互いに異なっている段階と、
（ｃ）閾値のそれぞれにより定められる閾値基準を満足する一つ以上のサイクルを確認する段階と、
（ｄ）前記段階（ｃ）で確認されたサイクルを使用して試料を分析する段階と、
を含み、
前記閾値は、閾値変化サイクル（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅｄ  ｃｙｃｌｅ，  ＴＣＣ）を基準に、前記ＴＣＣ以前のサイクル及びこれに対応する閾値の集合により形成された関数と、前記ＴＣＣ以後のサイクル及びこれに対応する閾値の集合により形成された関数とが互いに異なっているように設定される試料の分析方法。
【請求項２】
前記試料の分析は、試料内分析物質の存在または不存在を定量的または定性的に決定するものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記信号発生反応は、増幅曲線を提供する反応であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記信号値は、信号発生反応から発生した信号値であるか、あるいは信号発生反応から発生した信号の数学的に変形された値であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記閾値基準は、閾値と同一であるか、閾値より大きい信号値を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記試料の分析は、試料内標的核酸分子の存在を決定するものであり、前記閾値基準を満足する一つ以上のサイクルの確認は、増幅曲線のＣｔ値を決定するものであることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記試料の分析は、試料内標的核酸分子の存在を決定するものであり、前記閾値基準を満足する一つ以上のサイクルの確認は、増幅曲線のベースライン領域のエンドポイントサイクルを決定するものであることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）（ｉ）増幅反応における増幅サイクル及び（ｉｉ）信号発生手段から得た前記増幅サイクルにおける信号値を含む生データセットを収得する段階と、
（ｂ）前記生データセットからベースラインスタートポイントサイクルとエンドポイントサイクルを決定して、ベースライン領域を決定する段階と、
（ｃ）前記決定されたベースライン領域内生データセットの二つ以上のデータポイントからベースライン領域の最適ライン関数を算出する段階と、
（ｄ）前記生データセットの信号値から前記ベースライン領域の最適ライン関数により計算された関数値を差し引き、補正されたデータセットを収得する段階であって、前記補正されたデータセットは、（ｉ）増幅反応の増幅サイクル及び（ｉｉ）前記差し引いた結果を含む段階と、
を含む、信号発生手段の存在下で行われた増幅反応から収得した生データセットを補正する方法であって、
前記段階（ｂ）において、ベースライン領域のエンドポイントサイクルは、
（ｂ１）それぞれの増幅サイクルに一つのベースライン閾値を適用し、複数の閾値をサイクルに適用する段階であって、前記サイクルの少なくとも二つのサイクルのベースライン閾値は、互いに異なっている段階と、
（ｂ２）ベースライン閾値のそれぞれにより決定される閾値基準を満足する一つ以上のサイクルを確認する段階と、
（ｂ３）前記段階（ｂ２）で確認されたサイクルを使用してベースライン領域のエンドポイントサイクルを決定する段階と、
を含む方法により決定され、
増幅サイクルに対するベースライン閾値は、ベースライン閾値変化サイクル（ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅｄ  ｃｙｃｌｅ，  ＢＴＣＣ）を基準に、前記ＢＴＣＣ以前のサイクル及びこれに対応するベースライン閾値の集合により形成された第１関数と、前記ＢＴＣＣ以後のサイクル及びこれに対応するベースライン閾値の集合により形成された第２関数とが互いに異なっているように設定される、方法。
【請求項９】
前記段階（ａ）は、前記生データセットをプロットして増幅曲線を収得する段階をさらに含み、前記段階（ｄ）は、前記補正されたデータセットをプロットして補正された増幅曲線を収得する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記増幅サイクルは、ベースライン閾値変化サイクルを境界に２以上のグループに分類されて、同一なグループに属するサイクルは、連続的であり、同一なグループに属するサイクルは、互いに同一なベースライン閾値を有して、互いに隣接したグループに属するサイクルは、互いに異なるベースライン閾値を有することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記段階（ｂ２）における確認は、生データセットを使用して、それぞれの増幅サイクルに対して計算された傾きと、それぞれの増幅サイクルに対するベースライン閾値を比較して行われることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記傾きは、特定サイクルにおけるデータポイント及び前記特定サイクルの以前及び／または以後のサイクルの少なくとも一つのデータポイントを利用した最小二乗法により計算されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記段階（ｂ）において、ベースラインのエンドポイントサイクルは、最小ベースラインエンドポイントサイクル（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ  ｃｙｃｌｅ，  ＭＢＥＣ）以上のサイクルで決定されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記ベースラインエンドポイントサイクルは、
（ｉ）それぞれの増幅サイクルに対して計算された傾きを収得する段階と、
（ｉｉ）前記傾きをそれぞれの増幅サイクルに対するベースライン閾値と比較し、ベースライン領域の候補エンドポイントサイクルを収得する段階と、
（ｉｉｉ）前記候補エンドポイントサイクルをＭＢＥＣと比較する段階であって、前記候補エンドポイントサイクルがＭＢＥＣより大きい場合、前記候補エンドポイントサイクルをエンドポイントサイクルに決定する段階と、
を含む方法により決定することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ベースライン領域の最適ライン関数を算出する段階は、ベースライン領域内の少なくとも二つのデータポイントを使用した線形回帰分析により行うことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
試料を分析する方法を実行するためのプロセッサを具現する指示を含む、コンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、前記試料を分析する方法は、
（ａ）前記試料を使用する信号発生反応のそれぞれのサイクルにおける信号値を収得し、サイクルにおける信号値を提供する段階と、
（ｂ）それぞれのサイクルに一つの閾値を適用し、複数の閾値をサイクルに適用する段階であって、前記サイクルの少なくとも二つのサイクルの閾値は、互いに異なっている段階と、
（ｃ）閾値のそれぞれにより定められる閾値基準を満足する一つ以上のサイクルを確認する段階と、
（ｄ）前記段階（ｃ）で確認されたサイクルを使用して試料を分析する段階と、
を含み、
前記閾値は、閾値変化サイクル（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅｄ  ｃｙｃｌｅ，  ＴＣＣ）を基準に、前記ＴＣＣ以前のサイクル及びこれに対応する閾値の集合により形成された関数と、前記ＴＣＣ以後のサイクル及びこれに対応する閾値の集合により形成された関数とが互いに異なっているように設定されることを特徴とする、記録媒体。
【請求項１７】
信号発生手段の存在下で行われた増幅反応から収得した生データセットを補正する方法を実行するためのプロセッサを具現する指示を含む、コンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、前記生データセットを補正する方法は、
（ａ）（ｉ）前記増幅反応における増幅サイクル及び（ｉｉ）前記信号発生手段から得た前記増幅サイクルにおける信号値を含む生データセットを収得する段階と、
（ｂ）前記生データセットからベースラインスタートポイントサイクルとエンドポイントサイクルを決定して、ベースライン領域を決定する段階と、
（ｃ）前記決定されたベースライン領域内生データセットの二つ以上のデータポイントからベースライン領域の最適ライン関数を算出する段階と、
（ｄ）前記生データセットの信号値から前記ベースライン領域の最適ライン関数により計算された関数値を差し引き、補正されたデータセットを収得する段階であって、前記補正されたデータセットは、（ｉ）増幅反応の増幅サイクル及び（ｉｉ）前記差し引いた結果を含む段階と、
を含み、
前記段階（ｂ）において、ベースライン領域のエンドポイントサイクルは、
（ｂ１）それぞれの増幅サイクルに一つのベースライン閾値を適用し、複数の閾値をサイクルに適用する段階であって、前記サイクルの少なくとも二つのサイクルのベースライン閾値は、互いに異なっている段階と、
（ｂ２）ベースライン閾値のそれぞれにより決定される閾値基準を満足する一つ以上のサイクルを確認する段階と、
（ｂ３）前記段階（ｂ２）で確認されたサイクルを使用してベースライン領域のエンドポイントサイクルを決定する段階と、
を含む方法により決定され、
増幅サイクルに対するベースライン閾値は、ベースライン閾値変化サイクル（ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅｄ  ｃｙｃｌｅ，  ＢＴＣＣ）を基準に、前記ＢＴＣＣ以前のサイクル及びこれに対応するベースライン閾値の集合により形成された第１関数と、前記ＢＴＣＣ以後のサイクル及びこれに対応するベースライン閾値の集合により形成された第２関数とが互いに異なっているように設定されることを特徴とする、記録媒体。
【請求項１８】
（ａ）コンピュータプロセッサと、（ｂ）前記コンピュータープロセッサと連結された、請求項１６に記載のコンピュータ読み取り可能な記録媒体とを含む、試料の分析のための装置。
【請求項１９】
（ａ）コンピュータプロセッサと、（ｂ）前記コンピュータープロセッサと連結された、請求項１７に記載のコンピュータ読み取り可能な記録媒体とを含む、信号発生手段の存在下で行われた増幅反応から得た生データセットを補正する方法のための装置。
【請求項２０】
試料を分析する方法を実行するためのプロセッサを具現する、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に格納されたコンピュータプログラムであって、前記試料を分析する方法は、
（ａ）前記試料を使用する信号発生反応のそれぞれのサイクルにおける信号値を収得し、サイクルにおける信号値を提供する段階と、
（ｂ）それぞれのサイクルに一つの閾値を適用し、複数の閾値をサイクルに適用する段階であって、前記サイクルの少なくとも二つのサイクルの閾値は、互いに異なっている段階と、
（ｃ）閾値のそれぞれにより定められる閾値基準を満足する一つ以上のサイクルを確認する段階と、
（ｄ）前記段階（ｃ）で確認されたサイクルを使用して試料を分析する段階と、
を含み、
前記閾値は、閾値変化サイクル（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅｄ  ｃｙｃｌｅ，  ＴＣＣ）を基準に、前記ＴＣＣ以前のサイクル及びこれに対応する閾値の集合により形成された関数と、前記ＴＣＣ以後のサイクル及びこれに対応する閾値の集合により形成された関数とが互いに異なっているように設定されることを特徴とする、コンピュータプログラム。
【請求項２１】
信号発生手段の存在下で行われた増幅反応から収得した生データセットを補正する方法を実行するためのプロセッサを具現する、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に格納されたコンピュータプログラムであって、前記生データセットを補正する方法は、
（ａ）（ｉ）前記増幅反応における増幅サイクル及び（ｉｉ）前記信号発生手段から得た前記増幅サイクルにおける信号値を含む生データセットを収得する段階と、
（ｂ）前記生データセットからベースラインスタートポイントサイクルとエンドポイントサイクルを決定して、ベースライン領域を決定する段階と、
（ｃ）前記決定されたベースライン領域内生データセットの二つ以上のデータポイントからベースライン領域の最適ライン関数を算出する段階と、
（ｄ）前記生データセットの信号値から前記ベースライン領域の最適ライン関数により計算された関数値を差し引き、補正されたデータセットを収得する段階であって、前記補正されたデータセットは、（ｉ）増幅反応の増幅サイクル及び（ｉｉ）前記差し引いた結果を含む段階と、
を含み、
前記段階（ｂ）において、ベースライン領域のエンドポイントサイクルは、
（ｂ１）それぞれの増幅サイクルに一つのベースライン閾値を適用し、複数の閾値をサイクルに適用する段階であって、前記サイクルの少なくとも二つのサイクルのベースライン閾値は、互いに異なっている段階と、
（ｂ２）ベースライン閾値のそれぞれにより決定される閾値基準を満足する一つ以上のサイクルを確認する段階と、
（ｂ３）前記段階（ｂ２）で確認されたサイクルを使用してベースライン領域のエンドポイントサイクルを決定する段階と、
を含む方法により決定され、
増幅サイクルに対するベースライン閾値は、ベースライン閾値変化サイクル（ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅｄ  ｃｙｃｌｅ，  ＢＴＣＣ）を基準に、前記ＢＴＣＣ以前のサイクル及びこれに対応するベースライン閾値の集合により形成された第１関数と、前記ＢＴＣＣ以後のサイクル及びこれに対応するベースライン閾値の集合により形成された第２関数とが互いに異なっているように設定されることを特徴とする、コンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料の分析方法に関する。特に、本発明は、試料を分析する方法及び増幅反応の生データセットを補正する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料の分析は、多様な技術分野で非常に重要な技術である。試料の分析は、特定の特性の観点で試料を詳細に説明するか、描写するか、あるいは特徴を確認するために行う。
【０００３】
試料の分析は、生命工学分野でさらに重要な意味を有する。特に、試料の分析は、一般に分析物質（ａｎａｌｙｔｅ）の存在または不存在、結合親和度、酵素活性、遺伝子発現水準及びアミノ酸やヌクレオチド配列のような特定特性に対する情報を提供するために行う。代表的に、試料の分析のために免疫分析法（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）及び遺伝子分析法（ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ）が広く使用されてきて、生体試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅ）を分析する技術に係る米国特許第６，５１６，２７６号、第６，２２８，５９３号、第７，３４９，８０９号、第７，１１５，２２９号及び第６，８１６，７９０号に公開されている。
【０００４】
標的核酸増幅反応は、標的核酸分子を検出する大部分の技術に広く関連している。核酸増幅は、多様な増幅技術が提案されているほど、分子生物学分野の多様な方法のうち、最も核心的な技術である。核酸増幅技術として最も広く使用される技術は、重合酵素連鎖反応（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ：  ＰＣＲ）であって、この技術は、二本鎖ＤＮＡの変性、ＤＮＡ鋳型へのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング及びＤＮＡ重合酵素によるプライマー伸長の繰り返されたサイクル過程に基づいている（Ｍｕｌｌｉｓら，  米国特許第４，６８３，１９５号，  第４，６８３，２０２号及び第４，８００，１５９号；  Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０，  １３５０−１３５４）。
【０００５】
リアルタイムＰＣＲは、試料から標的核酸分子を実時間で検出するためのＰＣＲベースの技術である［Ｌｏｇａｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００９）．  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ］。特定標的核酸分子を検出するために、標的核酸の量に比例して検出可能な蛍光信号を放出する信号発生手段を利用する。検出可能な蛍光信号の放出は、例えば、二本鎖ＤＮＡ間に結合したら信号を放出するインターカレーター（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）を使用するか、蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子を有するオリゴヌクレオチドを使用する方法がある。標的核酸の量に比例する蛍光信号が各増幅サイクル毎に検出されて、これを増幅サイクルに対してプロットし、増幅曲線（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ）または増幅プロファイル曲線（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｃｕｒｖｅ）を得るようになる。
【０００６】
一般に、リアルタイムＰＣＲによる増幅曲線は、ベースライン領域（ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｒｅｇｉｏｎ）、指数領域（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｐｈａｓｅ）、直線領域（ｌｉｎｅａｒ  ｐｈａｓｅ）及び渋滞領域（ｐｌａｔｅａｕ  ｐｈａｓｅ）に分かれる。指数領域は、ＰＣＲ増幅産物の増加に比例し、放出される蛍光信号が増加する領域である。直線領域では、蛍光信号増加が実質的に減少し、実質的に線形方式で行動するようになり、渋滞領域は、ＰＣＲ増幅産物の増加及び蛍光信号の放出が飽和状態に至り、それ以上蛍光信号の増加が現れない領域を意味する。
【０００７】
ベースライン領域は、ＰＣＲ反応初期サイクルの間に、蛍光信号がほとんど変化せず一定に維持される領域を意味する。この領域では、ＰＣＲ産物の水準が、検出できるほど十分ではないため、この領域の蛍光信号の大部分は、反応試料自体の蛍光信号及び測定システム自体の蛍光信号を含む背景信号（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｓｉｇｎａｌ）に起因する。
【０００８】
リアルタイムＰＣＲデータの正確且つ再現性のある分析のために、得られた増幅曲線の補正（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）または正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）を行わなければならない。増幅曲線の補正は、ベースライン領域を決定し、決定されたベースライン領域における背景信号（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｓｉｇｎａｌ）を除去することにより行うことができる。
【０００９】
背景信号は、ＰＣＲ反応時、反応条件及び環境の変化を反映するため、反応毎に変わって、これにより、試料内の核酸分子の量とは無関係なベースライン移動（ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｄｒｉｆｔ）が頻繁に起こる。このようなベースライン移動は、反応間の増幅曲線の比較を難しくして、標的核酸検出において、偽陽性または偽陰性結果を招来しやすい。したがって、ＰＣＲデータ分析において、このようなベースライン領域の適切な設定及び設定されたベースラインに基づいたＰＣＲ実験データの修正が必要である。
【００１０】
増幅曲線を補正するための従来の一つの方法では、ＰＣＲ初期サイクルの任意のサイクル領域（例えば、３〜１５サイクル）をベースラインと決定して、他の方法では、実験により増幅曲線が決定された後、増幅信号が十分増加する前にサイクルを決定して、ベースラインを設定する。米国特許第８，２１９，３２４号は、増幅曲線の２次導関数（ｓｅｃｏｎｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）を求めて、一定な特徴を有するデータポイントをベースラインのエンドポイントサイクルとし、ベースライン領域を設定する方法を開示する。
【００１１】
このような従来の方法は、幾つかの重要な短所を有する。
【００１２】
前述の従来の一つの方法において、ベースラインを一つの初期任意サイクル領域に決定する場合、反応毎に相異なる背景信号の変化を補正することはできるが、この方法は、ベースライン移動（ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｄｒｉｆｔ）を補正するものではない。また、増幅領域の始まりは、初期試料に存在する標的核酸の量によって変わるため、ベースライン領域が予め決定されている場合、これを多様なサンプルに一律的に適用することは困難である。また、ベースライン領域を実験者が任意で決定する場合、同一増幅曲線といっても、分析する実験者によってベースライン領域設定が相異なる場合があり、これにより、実際増幅産物の量が変わってしまうため、信頼できる結果を導出することが困難である。
【００１３】
または、米国特許第８，２１９，３２４号に開示された方法によると、ベースラインは、複雑なアルゴリズムにより決定されるが、この場合、前記アルゴリズムには、明確に定義されていない多くのパラメータが必要になり、最適化が難しくなる。
【００１４】
閾値を使用する多様な試料分析方法において、ノイズ信号または非典型的なパターンの信号（例えば、陰の傾きパターン）の発生により、偽陽性または偽陰性結果が引き起こされる。このような分析誤りは、従来の閾値を使用する方法によっては除去することが難しい。
【００１５】
したがって、当業界では、各試料（またはＰＣＲ反応）に対し、新しい方式で閾値を設定するか、正確なベースライン領域を設定することにより、試料分析方法を改善するための新しい接近法（例えば、増幅曲線の補正）の開発が切実に必要であり、これは、より正確で且つ信頼性のある分析結果に寄与する。
【００１６】
本明細書全体にかけて多数の引用文献及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された文献及び特許の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の発明者は、信号発生反応を通じて収得したデータセットの加工を通じて、さらに正確で且つ信頼性のある信号発生反応の結果を得て、これにより、さらに正確で且つ信頼性のある試料の分析結果を提供するために鋭意研究した。その結果、信号発生反応による信号の有意性を決定するに邪魔になる要素、または信号発生反応による実際信号の増加を示すものではない不正確な信号を効果的に除去するために、サイクルの少なくとも二つのサイクルの閾値が互いに異なっている可変閾値が、信号発生反応のサイクルに適用できることを見出した。また、本発明が増幅反応の生データセットの補正に適用できることを見出した。
【００１８】
したがって、本発明の目的は、可変閾値を使用した試料分析方法を提供することである。
【００１９】
本発明の他の目的は、信号発生手段を利用した増幅反応の生データセットを補正する方法を提供することである。
【００２０】
本発明のまた他の目的は、試料分析方法を実行させるためのプロセッサを具現する指示を含む、コンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供することである。
【００２１】
本発明のまた他の目的は、信号発生手段を利用した増幅反応の生データセットを補正する方法を実行するためのプロセッサを具現する指示を含む、コンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供することである。
【００２２】
本発明のまた他の目的は、試料分析のための装置を提供することである。
【００２３】
本発明のまた他の目的は、信号発生手段を利用した増幅反応の生データセットを補正する装置を提供することである。
【００２４】
本発明のまた他の目的は、試料分析方法を実行させるためのプロセッサを具現する、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に格納されたコンピュータプログラムを提供することである。
【００２５】
本発明のまた他の目的は、信号発生手段を利用した増幅反応の生データセットを補正する方法を実行するためのプロセッサを具現する、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に格納されたコンピュータプログラムを提供することである。
【００２６】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本明細書の発明の詳細な説明において、本発明と直接的な関連がなく、技術分野によく知られた一般技術及び知識に関する説明は、詳細な説明が本発明をさらによく説明するために省かれる。また、以下説明されたセクション間共通する内容は、明細書の複雑性を避けるために省かれる。
【００２８】
Ｉ．可変閾値を利用した試料の分析
本発明の一様態によると、本発明は、（ａ）サイクルにおける信号値を提供するために、前記試料を使用する信号発生反応のそれぞれのサイクルにおける信号値を収得する段階と、
（ｂ）それぞれのサイクルに閾値を適用し、複数の閾値をサイクルに適用する段階（前記サイクルの少なくとも二つのサイクルの閾値は、互いに異なっている）と、
（ｃ）閾値のそれぞれにより定められる閾値基準を満足する一つ以上のサイクルを確認する段階と、
（ｄ）前記段階（ｃ）で確認されたサイクルを使用して試料を分析する段階と、
を含む、試料の分析方法を提供する。
【００２９】
本発明は、信号発生反応で得たデータセット（例えば、信号値とサイクル）を使用して、これを加工して試料を分析する方法に関する。
【００３０】
本発明の一具現例によると、試料の分析は、試料内分析物質の存在または不存在を決定することである。用語‘試料内分析物質の存在または不存在の決定’は、試料内分析物質の存在または不存在を定量的、定性的に決定することを意味する。
【００３１】
本発明の発明者は、信号発生反応を通じて収得したデータセットの加工を通じて、さらに正確で且つ信頼性のある信号発生反応の結果を得て、これにより、さらに正確で且つ信頼性のある試料の分析結果を提供するために鋭意研究した。その結果、信号発生反応による信号の有意性を決定するに邪魔になる要素、または信号発生反応による実際信号の増加を示すものではない不正確な信号を効果的に除去するために、サイクルの少なくとも二つのサイクルの閾値が互いに異なっている可変閾値が、信号発生反応のサイクルに適用できることを見出した。また、本発明が増幅反応の生データセットの補正に適用できることを見出した。
【００３２】
サイクルのうち、少なくとも二つのサイクルの閾値が互いに異なる値を有する閾値が信号発生反応のサイクルに適用される本方法は、知られていない。
【発明の効果】
【００３３】
本発明の特徴と利点を要約すると以下の通りである。
（ａ）試料分析のための本発明は、多重反応及び工程でよく現れる、誤り信号に基づいたサイクルの決定を防止し、これにより、試料分析のための情報をより正確に得ることができる。
（ｂ）試料分析のための本発明において、閾値は、各サイクルに適用され、複数の閾値がサイクルに独立して適用され、これにより、試料の分析において、非正常的な信号の影響を除去する。従来の方法は、試料分析において、信号そのものを分析して、非正常的な信号を除去する。したがって、本発明の方法は、従来の方法とは異なるアルゴリズムで行われるものであり、したがって、従来の方法と共に使用することができ、これにより、試料分析の正確性を大幅に向上させることができる。
（ｃ）本発明は、各試料のより正確なベースライン領域の設定を通じて増幅曲線を補正するため、増幅反応の結果は、より正確で、信頼性高く分析される。
（ｄ）本発明は、簡潔な過程（アルゴリズム）によって増幅曲線を補正するため、分析対象および測定装備による最適化が非常に容易である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の試料分析方法の一具現例に対する流れ図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明の増幅曲線補正方法の一具現例に対する流れ図である。
【図２】図２は、信号発生手段としてＴａｑＭａｎプローブを使用して行った５０サイクル以上リアルタイムＰＣＲの結果を示す補正前増幅曲線を示す。リアルタイムＰＣＲは、信号発生手段の存在下で行われて、増幅サイクル番号と測定された信号を含む生データセットを収得する。生データセットは、プロットされる。ＲＦＵは、相対的蛍光単位を表示する。
【図３】図３は、  図２の補正前増幅曲線の傾き曲線を示す。Ｙ軸は、生データセットを利用して計算された各増幅サイクルにおける傾きを示す。傾きは、最小二乗法により計算された。Ｓは、ベースライン領域のスタートポイントサイクルであり、Ｅは、ベースライン領域のエンドポイントサイクルである。初期サイクルの一つがスタートポイントサイクル（Ｓ）と決定されて、ベースライン閾値と傾き曲線の一番目のクロスポイントサイクルがエンドポイントサイクル（Ｅ）と決定された。
【図４Ａ】図４Ａは、図２の補正前増幅曲線（生データセット）のベースライン領域と、最小二乗法により収得した最適ライン関数により書かれた最適ライン（線形回帰線）のベースライン領域の拡大図である（Ｓは、ベースライン領域のスタートポイントサイクルであり、Ｅは、ベースライン領域のエンドポイントである）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、生データセットの測定された信号値から最適ライン関数の値を差し引いて収得した、補正された増幅曲線のベースライン領域の拡大図である（Ｓは、ベースライン領域のスタートポイントサイクルであり、Ｅは、ベースライン領域のエンドポイントである）。
【図５】図５は、図２の補正された増幅曲線を収得する過程を示している。図２の生データセットの蛍光信号強度から最適ライン（線形回帰線）関数値が差し引かれ、補正されたデータセットが収得されて、補正されたデータセットをプロットし、補正された増幅曲線を収得した。
【図６】図６は、本発明の試料分析用プログラムを備えたリアルタイムＰＣＲシステムの一具現例を図式的に示している。
【図７】図７は、ベースライン領域のエンドポイントを決定するために、固定ベースライン閾値（‘３００’または‘３０’）を全体増幅サイクルに使用する場合、ベースライン領域決定に誤りが発生することを示す。
【図８Ａ】図８Ａは、高濃度試料においてベースライン領域を決定する具現例を示す。エンドポイントサイクルは、傾き曲線とベースライン閾値とのクロスポイントサイクルのうち、最小ベースラインエンドポイントサイクル（ＭＢＥＣ）以後サイクルに決定された。
【図８Ｂ】図８Ｂは、低濃度試料においてベースライン領域を決定する具現例を示す。エンドポイントサイクルは、傾き曲線とベースライン閾値とのクロスポイントサイクルのうち、最小ベースラインエンドポイントサイクル（ＭＢＥＣ）以後サイクルに決定された。
【図８Ｃ】図８Ｃは、エンドポイントサイクルの決定に、ＭＢＥＣを使用するか、使用せずに決定されたベースライン領域を使用して、増幅曲線を補正した結果を示す。
【図９】図９は、サイクルによって変われるベースライン閾値が増幅曲線（または傾き曲線）に適用された多数の具現例を図式的に示している。太線は、ベースライン閾値を示す。ＢＴＣＣは、ベースライン閾値変化サイクルを示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、高濃度試料の傾き曲線にＶＢＴ（可変ベースライン閾値、Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｂａｓｅｌｉｎｅ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を適用した結果を示している。エンドポイントサイクルは、傾き曲線とＢＴＣＣ（ベースライン閾値変化サイクル）によって相異して適用されるベースライン閾値と傾き曲線間のクロスポイントサイクルに決定される。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、低濃度試料の傾き曲線にＶＢＴ（可変ベースライン閾値、Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｂａｓｅｌｉｎｅ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を適用した結果を示している。エンドポイントサイクルは、傾き曲線とＢＴＣＣ（ベースライン閾値変化サイクル）によって相異して適用されるベースライン閾値と傾き曲線間のクロスポイントサイクルに決定される。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、エンドポイントサイクル決定にＶＢＴ（可変ベースライン閾値）を使用するか、使用せずに求められたベースライン領域を使用して増幅曲線を補正した結果を示している。
【図１１Ａ】図１１Ａは、Ｃｔ値を決定するために、増幅曲線にＶＳＴ（可変信号閾値）を適用した結果を示している。ＦＳＴ（固定信号閾値）方法は、公知技術を意味する。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、Ｃｔ値を決定するために、順に希釈されたＦｌｕ  Ａのｇｅｎｏｍｉｃ  ＲＮＡ（１０−３、１０−４、１０−５、１０−６及び１０−７希釈）の増幅曲線にＶＳＴ（可変信号閾値）を適用した結果を示している。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、Ｃｔ値を決定するために、順に希釈されたＦｌｕ  Ａのｇｅｎｏｍｉｃ  ＲＮＡ（１０−３、１０−４、１０−５、１０−６及び１０−７希釈）の増幅曲線にＶＳＴ（可変信号閾値）を適用した結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
図１Ａは、本発明の試料分析方法の一具現例に対する流れ図である。本発明をより詳細に説明すると、以下のようである。
【００３６】
段階（ａ）：信号値収得段階（Ｓ１０）
第一、サイクルにおける信号値を提供するために、前記試料を使用する信号発生反応のそれぞれのサイクルにおける信号値を収得する。
【００３７】
本発明は、信号発生反応で得たデータセット（例えば、信号値とサイクル）を使用して試料を分析する方法に関する。段階（ａ）は、（ｉ）試料を利用した信号発生反応のサイクル及び（ｉｉ）サイクルにおける信号発生反応の信号値を含むデータセットを収得する段階とも説明でできる。
【００３８】
本発明で用語‘信号発生反応’は、試料内分析物質の存在に依存的に信号を発生できる反応を意味する。
【００３９】
信号発生反応は、信号の変化を伴う。
【００４０】
本発明の一具現例によると、信号発生反応は、信号増幅反応である。
【００４１】
本発明で用語‘信号’は、測定可能な産出物を意味する。
【００４２】
信号変化は、分析物質の存在または不存在を定量的または定性的に示す指標役割をすることができる。
【００４３】
有用な指標の例としては、蛍光強度、発光強度、化学発光強度、生発光強度、燐光強度、電化伝達、電圧、電流、電力、エネルギー、温度、粘度、光散乱、放射線強度、反射力、透過度、吸光度がある。最も広く使われる指標としては、蛍光強度がある。
【００４４】
本発明の一具現例によると、信号発生反応は、増幅曲線を提供する反応である。特に、増幅曲線は、信号増幅曲線である。
【００４５】
このような信号発生反応は、生物学的または化学的反応を含む。生物学的反応は、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、マイクロアレイ、インベーダーアッセイ、免疫アッセイ反応及び細菌培養分析のような遺伝的分析反応を含む。特に、信号発生反応を遺伝的分析反応を含む。化学的反応は、化学物質の生産、変化または分解を含む化学的分析方法を含む。
【００４６】
分析物質（ａｎａｌｙｔｅ）は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、アミノ酸、生物学的化学物、ホルモン、抗体、抗原、代謝産物、細胞などである。択一的に、分析物質は、化学物質のような非生物学的物質である。
【００４７】
本発明の一具現例によると、分析物質は、標的核酸分子である。用語‘標的核酸分子’は、分析または検出対象核酸分子を意味する。
【００４８】
本発明の一具現例によると、信号発生反応は、分析物質の増幅を伴うかあるいは伴わない反応である。
【００４９】
特に、信号発生反応は、分析物質、具体的に標的核酸分子の増幅を伴う反応である。さらに具体的には、信号発生反応は、標的核酸分子の増幅を伴い、標的核酸分子の増幅によって信号が増加または減少（好ましくは、増加）できる反応である。
【００５０】
本発明で用語‘信号発生’は、信号の発生または消滅及び信号の増加または減少を全部含む。特に、用語‘信号発生’は、信号の増加を意味する。
【００５１】
本発明の一具現例によると、前記信号発生反応は、信号発生手段の存在下で行われる。
【００５２】
本発明で用語‘信号発生手段’は、分析物質（例えば、標的核酸分子）の存在を示す信号の発生に使用される物質を意味する。例えば、オリゴヌクレオチド、標識及び酵素である。択一的に、本発明で用語‘信号発生手段’は、信号発生のための物質を使用する方法を意味するものとして使用できる。
【００５３】
多様な種類の信号発生手段が当業者に知られている。信号発生手段は、標識そのもの及び標識の付いたオリゴヌクレオチドを全て含む。標識は、蛍光標識、発光標識、化学発光標識、電気化学的標識及び金属標識を含む。標識は、インターカレーティング染料（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ｄｙｅ）のように、標識そのものが信号発生手段として使用できる。択一的に、単一標識または供与分子（ｄｏｎｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）及び受容分子（ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を含む相互作用的二重標識が、一つ以上のオリゴヌクレオチドに結合された状態で使用できる。
【００５４】
信号発生手段は、核酸分解酵素（例えば、５’−ヌクレアーゼまたは／及び３’−ヌクレアーゼ）のような信号を発生させるための要素を追加的に含むことができる。
【００５５】
本発明の方法は、標的核酸分子の存在または不存在を決定するために使用されるため、信号発生反応は、当業界に知られた多様な方法によって行うことができる。代表的な例としては、ＴａｑＭａｎＴＭ  ｐｒｏｂｅ方法（米国第５，２１０，０１５号）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ方法（Ｔｙａｇｉら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １４  （３）：３０３（１９９６）），スコルピオン（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ）方法（Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：８０４−８０７（１９９９）），サンライズ（Ｓｕｎｒｉｓｅ  ｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ）方法（Ｎａｚａｒｅｎｋｏら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２５（１２）：２５１６−２５２１（１９９７），及び米国特許第６，１１７，６３５号），Ｌｕｘ方法（米国特許第７，５３７，８８６号），ＣＰＴ（Ｄｕｃｋ  Ｐら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ９：１４２−１４８（１９９０）），ＬＮＡ方法（米国特許第６，９７７，２９５号），Ｐｌｅｘｏｒ方法（Ｓｈｅｒｒｉｌｌ  ＣＢら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  １２６：４５５０−４５５６（２００４）），ＨｙｂｅａｃｏｎｓＴＭ（Ｄ．  Ｊ．  Ｆｒｅｎｃｈら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（２００１）  １３，  ３６３−３７４及び米国特許第７，３４８，１４１号），Ｄｕａｌ−ｌａｂｅｌｅｄ，  ｓｅｌｆ−ｑｕｅｎｃｈｅｄ  ｐｒｏｂｅ（米国特許第５，８７６，９３０号），Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅ（Ｂｅｒｎａｒｄ  ＰＳら，  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２０００，  ４６，  １４７−１４８），ＰＴＯＣＥ（ＰＴＯ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）方法（ＷＯ  ２０１２／０９６５２３），ＰＣＥ−ＳＨ（ＰＴＯ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）方法（ＷＯ  ２０１３／１１５４４２），ＰＣＥ−ＮＨ（ＰＴＯ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｎｏｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）方法（ＰＣＴ／ＫＲ２０１３／０１２３１２）、ＣＥＲ方法（ＷＯ  ２０１１／０３７３０６）がある。
【００５６】
本発明で用語‘増幅’または‘増幅反応’は、信号を増加または減少させるための反応を意味する。前記信号の増加または減少は、信号発生手段により起こる。
【００５７】
本発明の一具現例によると、信号発生手段による信号は、分析物質（例えば、標的核酸分子）の存在に依存的に発生して、前記信号の強度は、増幅反応によって増加または減少する。
【００５８】
本発明の一具現例によると、増幅反応は、分析物質（例えば、標的核酸分子）の存在に依存的に信号発生手段による信号を増幅するための反応を意味する。
【００５９】
本発明の一具現例によると、増幅曲線は増幅反応によって得られる。
【００６０】
本発明において、用語‘サイクル’は、状態の変化を伴う複数の測定において状態の変化の単位を意味する。状態の変化は、例えば温度の変化、反応時間の変化、反応回数の変化、濃度の変化、ｐＨの変化および／または測定対象（例えば、標的核酸分子）の複製回数の変化を含む。したがって、サイクルは、時間またはプロセスサイクル、単位運営サイクル及び複製サイクルでありえる。
【００６１】
例えば、酵素の基質分解能が基質の濃度によって分析される場合、酵素の分解能に対する複数の測定が様々な基質濃度で行われる。この場合、基質濃度の増加が状態の変化に該当し、その増加の単位がサイクルに該当する。
【００６２】
他の例として、等温増幅反応は、反応時間に応じて、同一温度条件で複数の測定が行われ、この場合、反応時間が状態の変化に該当し、反応時間単位がサイクルに該当する。
【００６３】
特に、一連の反応の繰り返しまたは一定時間間隔を有する反応の繰り返しの場合、用語‘サイクル’は、前記繰り返しの単位を意味する。
【００６４】
例えば、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）において、サイクルは、標的分子の変性、標的分子とプライマーのアニーリング（混成化）及びプライマーの伸長を含む反応単位を意味する。この場合、反応の繰り返しの増加が状態の変化に該当し、前記繰り返し単位がサイクルに該当する。
【００６５】
本発明の一具現例によると、標的核酸分子が試料に存在する場合、測定される信号値（例えば、信号強度）は、増幅反応のサイクルの増加によって増加または減少する。
【００６６】
本発明の一具現例によると、標的核酸分子の存在を示す信号の増幅のための増幅反応は、信号が標的核酸分子の増幅と同時に増幅される方法（例えば、リアルタイムＰＣＲ）で行われる。択一的に、前記増幅反応は、信号が標的核酸分子の増幅を伴わずに増幅される方法［例えば、ＣＰＴ方法（Ｄｕｃｋ  Ｐ、ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、９：１４２−１４８（１９９０））、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ（米国特許第６，３５８，６９１号及び第６，１９４，１４９号）］で行うことができる。
【００６７】
標的核酸分子を増幅する様々な方法が知られている。これらに限定されないが、例えば、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ、ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、リガーアゼ連鎖反応（ＬＣＲ、ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｗｉｅｄｍａｎｎ  Ｍら、’Ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＣＲ）−ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  ‘ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９４  Ｆｅｂ；  ３（４）：Ｓ５１−６４）、ＧＬＣＲ（ｇａｐ  ｆｉｌｌｉｎｇ  ＬＣＲ、ＷＯ  ９０／０１０６９、ＥＰ  ４３９１８２、およびＷＯ  ９３／００４４７）、Ｑ−ｂｅｔａ（Ｑ−ｂｅｔａ  ｒｅｐｌｉｃａｓｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｃａｈｉｌｌ  Ｐ  、ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ。、３７（９）：１４８２−５（１９９１）、米国特許第５，５５６，７５１号）、鎖置換増幅（ＳＤＡ、ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＧＴ  Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０（７）  ：１６９１１６９６（１９９２）、ＥＰ  ４９７２７２）、ＮＡＳＢＡ（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｃｏｍｐｔｏｎ、Ｊ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３５０（６３１３）：９１２（１９９１））、転写媒介増幅（ＴＭＡ、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｈｏｆｍａｎｎ  ＷＰなど、  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｖｉｒｏｌ．３２（４）：２８９−９３（２００５）；米国特許第５，８８８，７７９号）またはローリングサークル増幅（ＲＣＡ、Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ  ＣＡなど、Ｐｒｏｃ。Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ。Ｓｃｉ。ＵＳＡ。１０２：１７３３２１７３３６（２００５））である。
【００６８】
本発明の一具現例によると、本発明で使用する標識は、蛍光標識であり、より具体的に、単一蛍光標識または蛍光レポーター分子とクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識である。本発明の一具現例によると、本発明で使用する増幅反応は、標的核酸分子の増幅を伴って信号を増幅させる。本発明の一具現例によると、本発明の増幅反応は、ＰＣＲ方法によって行われる。
【００６９】
信号発生反応は、試料分析のためのデータセット（信号値及びサイクル値）を提供する。
【００７０】
本発明において、用語‘信号値’は、信号発生反応のサイクルで実際に測定された信号値（例えば、増幅反応による実際蛍光強度）またはその変形を意味する。前記変形は、測定された信号値（信号強度）の数学的に加工された値でする。測定された信号値の数学的に加工された値は、例えば、測定された信号値の対数値（ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ  ｖａｌｕｅｓ）または微分値（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）である。前記測定された信号値の微分値は、多重微分を含む。
【００７１】
本発明において、用語‘データポイント’は、サイクルと、前記サイクルにおける信号値を含む座標値を意味する。信号発生手段を用いた増幅反応によって得られたデータポイントは、直交座標系の座標値で表示することができる。前記直交座標系において、Ｘ軸は、増幅反応のサイクルを示し、Ｙ軸は、該サイクルで前記信号発生手段からの信号値を示す（図２参照）。
【００７２】
本発明において、用語‘データセット’は、データポイントの集合を意味する。前記データセットは、生データセットと変形されたデータセットとを含む。
【００７３】
生データセットは、本発明の分析のための最初のデータセットである。前記生データセットは、試料分析のための信号発生反応（例えば、増幅反応）を介して直接収得したデータポイントのセットである。
【００７４】
例えば、本発明は、増幅反応の生データセットを補正するために使用される場合、生データセットは、増幅反応から直接収得したデータポイントの集合を含む（図２参照）。
【００７５】
変形されたデータセットは、生データセットが数学的に加工されたデータセットを含む。前記変形されたデータセットは、補正されたデータセット及び傾きデータセットを含む。補正されたデータセットは、生データセットの補正を介して収得したデータポイントのセットである。
【００７６】
本明細書では、生データセットと変形されたデータセットは、相対的な意味を有する。たとえば、生データセットは、あるデータの変形になる前のデータセットを意味し、変形されたデータセットは、データの変形後に収得したデータセットである。
【００７７】
本発明で使用されたデータセットは、信号発生反応で得られたデータポイントの部分または全部または補正されたデータポイントの全部又は一部を含むことができる。
【００７８】
本発明の一具現例によると、前記信号発生反応は、標的核酸分子の増幅を伴う反応である。より具体的に、前記標的核酸分子の増幅を伴う反応は、リアルタイム重合酵素連鎖反応である（リアルタイムＰＣＲ）。
【００７９】
本発明の一具現例によると、前記信号値は、信号発生反応から発生した信号値であるか、または信号発生反応から発生した信号の数学的に変形された値である。
【００８０】
本発明の一具現例によると、前記信号発生反応は、リアルタイムＰＣＲであり、前記信号値は、リアルタイムＰＣＲから発生された信号の数学的に変形された値であって、前記数学的に変形された値は、信号値をサイクルに対して微分した値である（図３参照）。前記サイクルに対して微分された信号値は、生データセットの導関数を含む。
【００８１】
図２は、信号発生反応として、リアルタイムＰＣＲを通じて収得したデータセットの具体的な例を示しており、リアルタイムＰＣＲの増幅曲線に該当する。図２に示されたデータセットは、信号発生反応から直接的に収得した生データセットである。生データセットは、リアルタイムＰＣＲの増幅サイクル及び前記増幅サイクルで測定された信号強度（例えば、ＲＦＵ）を含む。
【００８２】
図３は、生データセットの変形の一つを示しているが、これは、増幅サイクルで計算された傾きに対するデータポイントを含む。図３の曲線は、図２の生データセットのに導関数に該当する。
【００８３】
増幅反応を示す増幅曲線は、信号値を増幅サイクルに対してプロットして得ることができる。本明細書の増幅曲線は、データセットをプロットして得た曲線をいう。
【００８４】
補正前増幅曲線は、測定された信号値またはその変形に基づいた、各増幅サイクルで測定された信号値またはその変形された値を示す補正前増幅曲線を意味する。前記補正前増幅曲線は、増幅サイクルに対して測定された信号強度をプロットして得られる。特に、補正前増幅曲線は、生データセットをプロットして得ることができる。
【００８５】
補正後増幅曲線は、補正前増幅曲線をもとに補正された増幅曲線を意味する。前記補正された増幅曲線は、補正されたデータセットをプロットして得ることができる。
【００８６】
本発明において、用語‘標的核酸’または‘標的核酸分子’は、検出または定量する関心核酸分子を意味する。前記標的核酸分子は、二本鎖だけでなく、一本鎖の配列をすべて含む。前記標的核酸分子は、反応で新たに生成された配列だけでなく、初期から核酸試料中に存在する配列を含む。
【００８７】
前記標的核酸分子は、あらゆるＤＮＡ（ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ分子またはこれらの交雑体（ｃｈｉｍｅｒａ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を全て含む。前記核酸分子は、二本鎖形態または一本鎖形態である。出発物質として核酸が二本鎖である場合、二本の鎖を、一本鎖または一部一本鎖形態に変形することが好ましい。鎖を分離する既知の方法は、、これに限定されず、例えば、熱処理、アルカリ、ホルムアミド（ｆｏｒｍａｍｉｄｅ）、尿素（ｕｒｅａ）及びグリオキサール（ｇｌｙｏｘａｌ）処理、酵素的処理（例えば、ヘリカーゼ活性）、および結合タンパク質がある。例えば、鎖分離は８０℃乃至１０５℃の熱処理を通じて行うことができる。このような処理を実現する一般的な方法は、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２００１）で提供される。
【００８８】
前記標的核酸分子は、自然に発生した原核、真核（例えば、原生動物（ｐｒｏｔｏｚｏａｎｓ）と寄生動物（ｐａｒａｓｉｔｅｓ）、カビ（ｆｕｎｇｉ）、酵母（ｙｅａｓｔ）、高等植物、下等動物、哺乳類や人間を含む高等動物）、ウイルス（例えば、ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ）、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）、エプスタイン−バールウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）、肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ポリオウイルス（ｐｏｌｉｏ  ｖｉｒｕｓ）など）またはウイロイド（ｖｉｒｏｉｄ）の核酸を含む。また、核酸分子は、組換え的に生産または化学的に合成された、あるいは合成できる核酸分子も含む。したがって、前記核酸配列は、自然から発見されるか、発見されないものである。標的核酸分子は、知られているか知られていない配列をすべて含む。
【００８９】
本発明の用語’試料’は、細胞、組織、生物由来の流体（ｆｌｕｉｄ）または本発明によって評価できるその他の中間物質を意味し、前記試料は、例えば、ウイルス、バクテリア、組織、細胞、血液、血清、血漿、リンパ、喀痰、スワップ（ｓｗａｐ）、吸引液（ａｓｐｉｒａｔｅ）、気管支肺胞洗浄液（ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ  ｆｌｕｉｄ）、乳、尿、糞便、眼球液、唾液、精液、脳抽出物、脊髄液、盲腸、脾臓および扁桃腺抽出液、羊膜液、腹水液および非生物学的試料（例えば、食品または水）である。また、前記試料は、化学反応の液相、固相の物質である。さらに、前記試料は、生物学的原料から抽出した天然核酸と合成された核酸分子の両方を含む。
【００９０】
段階（ｂ）：各サイクルに閾値適用段階（Ｓ２０）
閾値がそれぞれのサイクルに適用され、複数の閾値がサイクルに適用される。前記サイクルの少なくとも二つのサイクルの閾値は、互いに異なっている。つまり、複数の閾値は、全体がまたは一部が異なる値を有する。
【００９１】
本発明の最も目立つ特徴は、複数の閾値を信号発生反応のサイクルに適用し、この際、前記サイクルの少なくとも二つのサイクルの閾値は、互いに異なっていることである。
【００９２】
各サイクルには、一つの個別閾値が割り当てられる。例えば、信号発生反応のサイクルが３０個である場合、３０個の閾値が個別に割り当てられる。前記割り当てられた閾値は、同一か、相異なっている。本発明の最も顕著な特徴は、前記割り当てられた閾値の少なくとも二つは、互いに異なっていることである。
【００９３】
閾値の適用は、閾値によって決定される閾値基準を満足するデータポイントを選択するために行われる。伝統的に、信号発生反応における信号値を評価するために、一つの閾値が採択される。つまり、従来の技術は、信号発生反応の信号値を評価するために、すべてのサイクルに渡って同一な閾値を使用する固定閾値方法を導入した。
【００９４】
これとは異なって、本発明は、サイクルの少なくとも二つのサイクルの閾値は、互いに異なる可変閾値を使用して、これにより、試料を分析する。
【００９５】
サイクルの少なくとも二つのサイクルの閾値は、互いに異なっている。いわば、複数の閾値は、全体が異なっているか、あるいは、一部が互いに異なる値を有する。
【００９６】
サイクルに対する閾値をプロットして得られたグラフをＴＣグラフ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ  ｇｒａｐｈ）という。このＴＣグラフは、閾値セットをプロットして得られる。前記閾値セットは、閾値ポイントの集合である。閾値ポイントとは、サイクルと前記サイクルにおける閾値を含む座標値をいう。
【００９７】
ベースラインを求めるために、データセットに適用される閾値は、ベースライン閾値と命名され、サイクルに対してベースライン閾値をプロットして得られたグラフをＢＴグラフという。
【００９８】
本発明の方法が増幅反応の生データセットを補正するために使用される場合（ｅｇ、ｂａｓｅｌｉｎｉｎｇ）、ＴＣグラフの一種のＢＴグラフは、ベースライン閾値をサイクルに対してプロットして得られる（図９参照）。
【００９９】
本発明の一具現例によると、サイクルの少なくとも二つ以上のサイクルは、互いに異なる閾値を有し、したがって、試料分析のための情報をとびきり正確に得ることができる。本発明ではこれを‘可変閾値（ＶＴ）’方法と命名する。前記ＶＴ方法は、可変ベースライン閾値方法と可変信号閾値方法とを両方とも含む。
【０１００】
本発明の一具現例によると、前記閾値は、閾値−変化サイクル（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅｄ  ｃｙｃｌｅ、ＴＣＣ）を基準に、前記ＴＣＣ以前のサイクル及びこれらに適用される閾値の集合によって形成された関数と、前記ＴＣＣ以後のサイクル及びこれらに適用される閾値の集合によって形成された関数とが互いに異なっているように決定される。
【０１０１】
本発明の一具現例によると、ＴＣＣには、ＴＣＣ以前のサイクルの関数またはＴＣＣ以後のサイクルの関数のいずれも適用することができる。
【０１０２】
本発明において、用語‘閾値−変化サイクル’（ＴＣＣ）は、閾値変化のパターンがサイクルを超えながら変更される基準サイクルを意味する。特に、本発明において、用語‘閾値−変化サイクル’（ＴＣＣ）は、閾値が変わる基準サイクルを意味する。前記ＴＣＣは、一つであるか、または複数である。本発明において、用語‘ＴＣＣ以前のサイクル’とは、閾値−変化サイクルより前のサイクルを意味し、‘ＴＣＣ以後のサイクル’とは、閾値−変化サイクルより後のサイクルを意味する。
【０１０３】
ＴＣＣ以前のサイクルとこれらのＴＣＣ以前のサイクルに適用される閾値によって形成された関数と、ＴＣＣ以後のサイクルとこれらのＴＣＣ以後のサイクルに適用される閾値によって形成された関数とが互いに異なっていることは、ＴＣＣ以前のサイクルとＴＣＣ以後のサイクルのＴＣグラフが互いに異なるパターンを示すことを意味する。この例示は、図９に示されており、セクションＩＩで後述する。
【０１０４】
前記ＴＣＣは、一つの反応に一つまたはそれ以上設定することができる。
【０１０５】
本発明の一具現例によると、前記ＴＣＣの数は１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，２０，２０，４０または５０個である。前記ＴＣＣの数は、７０，６０，５０，４０または３０以下である。具体的に、前記ＴＣＣの数は、１〜２または１〜３個である。
【０１０６】
本発明の一具現例によると、サイクルは、少なくとも一つのＴＣＣ（閾値−変化サイクル）を基準に、少なくとも二つの異なるグループに分類される。同一なグループに分類されたサイクルは連続的であり、同一な閾値を有する。互いに隣接したグループに属するサイクルは、互いに異なる閾値を有する。したがって、互いに離れたグループに属するサイクルは、相異なる、あるいは同一な閾値を有する。ＴＣＣはＴＣＣ前のサイクルまたはＴＣＣ後のサイクルと同一な閾値を有することができる。ＴＣＣは、一つのデータセットにおいて、一つが設定可能であり、この場合、データセットのサイクルは、二つのグループに分類される。択一的に、ＴＣＣは、一つのデータセットにおいて、二つ以上設定可能であり、この場合、データセットのサイクルは、３つ以上のグループに分類される。
【０１０７】
表現‘互いに隣接したグループに属するサイクル’の例は、以下の通りである。信号発生反応は、合計４０個のサイクルを含み、グループ１は、１〜１０サイクル、グループ２は、１１〜２０サイクル、グループ３は、２１〜３０サイクルであって、グループ４は、３１〜４０サイクルである。この場合、互いに隣接したグループは、グループ１とグループ２、グループ２とグループ３またはグループ３とグループ４である。互いに離れたグループは、グループ１とグループ４、グループ１とグループ３またはグループ２とグループ４である。
【０１０８】
本発明の一具現例によると、前記互いに隣接したグループの関数は、互いに異なっており、前記互いに離れたグループの関数は、互いに同一であるか、異なっている。
【０１０９】
本発明の一具現例によると、前記の段階（ｂ）は、サイクルの少なくとも一つのサイクルに追加閾値を適用する段階をさらに含む。
【０１１０】
本発明の一具現例によると、付加的な閾値セットがデータセットに適用される。
【０１１１】
本発明の一具現例によると、閾値セットは、サイクルの少なくとも二つのサイクルに適用される閾値が互いに異なっている、可変閾値セットである。
【０１１２】
本発明の一具現例によると、閾値セットは、サイクルに適用された閾値が同一な、固定閾値セットである。
【０１１３】
本発明の一具現例によると、多重閾値セットは、可変閾値セット及び固定閾値セットで構成された群から選択される少なくとも二つの閾値セットを含む。
【０１１４】
本発明の一具現例によると、多重閾値セットは、少なくとも一つの固定閾値セットを含む。
【０１１５】
本発明の一具現例によると、多重閾値セットは、少なくとも一つの可変閾値セットを含む。
【０１１６】
本発明の一具現例によると、多重閾値セットは、少なくとも一つの固定閾値セットと、少なくとも一つの可変閾値セットを含む。
【０１１７】
本発明の一具現例によると、多重閾値セットのそれぞれは、対応する閾値基準を有する。
【０１１８】
本発明の一具現例によると、多重閾値セットは、データセットの分析に同時に適用される。複数のサイクルが閾値基準を満たしていることが観察されると、これらのすべてが分析に使用されるか、またはその一部が分析に使用できる。
【０１１９】
本発明の一具現例によると、多重閾値セットは、データセットの分析に順次適用される。最初に適用された閾値セットの閾値基準を満たしているサイクルがない場合、別の閾値セットが適用される。
【０１２０】
本発明の一具現例によると、閾値セットは、データセットに適用され、追加閾値は、サイクルの少なくとも一つのサイクルに適用できる。
【０１２１】
追加閾値の適用については、後述するセクションＩＩの（３）多重閾値セット方法の記載を参照して説明することができる。
【０１２２】
段階（ｃ）：閾値基準を満足するサイクルの確認（Ｓ３０）
各サイクルに閾値を適用した後、各閾値によって決定された閾値基準（ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ）を満足する１つ以上のサイクルが確認される。
【０１２３】
本発明において、用語‘閾値基準’は、一定の特徴を有するサイクルを確認するための基準をいい、前記一定の基準は、各閾値によって決定される。
【０１２４】
本発明の一具現例によると、閾値基準は、閾値と関心サイクルにおける信号値を含む、ある参照（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）または基準（ｂｅｎｃｈｍａｒｋ）である。
【０１２５】
本発明の一具現例によると、前記閾値基準は、サイクルの信号値と該サイクルに適用された閾値間の大きさ関係である。
【０１２６】
本発明の一具現例によると、前記閾値基準は、各サイクルの信号値と、各増幅サイクルの閾値との比較である。
【０１２７】
特に、前記閾値基準は、信号値が閾値以上であるか、以下であるかによって定義される。
【０１２８】
本発明の一具現例によると、前記閾値基準は、閾値と同一であるか、閾値より大きい信号値を有するものである。
【０１２９】
たとえば、閾値が１〜１０サイクルでは、５に設定されて、１１〜２０サイクルでは、２に設定される場合、閾値基準は、信号値が１〜１０サイクルでは、５以上、１１〜２０サイクルでは、２以上と定義される。
【０１３０】
段階（ｄ）：確認されたサイクルを使用して試料を分析する段階（Ｓ４０）
試料は、段階（ｃ）で確認されたサイクルを使用して分析される。
【０１３１】
本発明の一具現例によると、前記試料の分析は、試料内の標的核酸分子の存在を決定することであり、前記閾値基準を満足する１つ以上のサイクルの確認は、増幅曲線のＣｔ値を決定することである。この場合、閾値基準は、閾値と同一な信号値を有することができる。確認されるサイクルの数は、一つでありえる。
【０１３２】
本発明の方法が、標的核酸分子の存在を決定するために、リアルタイムＰＣＲでＣｔ値を決定するに適用される場合、本発明の方法は、以下のような段階を含む；
（ａ）サイクルにおける信号値を提供するために、前記試料を使用するリアルタイムＰＣＲのそれぞれのサイクルにおける信号値を収得する段階と、
（ｂ）それぞれのサイクルに信号閾値を適用して、複数の信号閾値をサイクルに適用する段階（前記サイクルの少なくとも二つのサイクルの閾値は、互いに異なっている）と、
（ｃ）信号閾値のそれぞれによって決定される閾値基準を満足する一つ以上のサイクルを確認する段階と、
（ｄ）前記段階（ｃ）で確認されたサイクルを使用して、リアルタイムＰＣＲにおけるＣｔ値を決定する段階。
【０１３３】
リアルタイムＰＣＲにおけるＣｔ値決定に適用する例は、実施例３及び図１１Ａ乃至１１Ｃに例示されている。前記閾値は、Ｃｔ値決定においては、信号閾値と命名される。Ｃｔ値を決定する本方法は、ＶＳＴ（可変信号閾値）方法と命名される。
【０１３４】
実施例３及び図１１Ａ乃至１１Ｃに記載されているように、可変信号閾値を使用する本方法は、初期ノイズ信号が発生される初期増幅サイクルのデータポイントが、標的核酸分子が存在すると決定される誤りを除去するすることができる。さらに、本方法は、後期増幅サイクルにおいて、信号値が増加するスタートポイントをより正確に決定することができ、これによって、Ｃｔ値の決定において、誤りを除去することができる。
【０１３５】
本発明の一具現例によると、試料の分析は、試料から標的核酸分子の存在を決定することであり、閾値基準を満足する一つ以上のサイクルを確認することは、リアルタイムＰＣＲの増幅曲線のベースライン領域のエンドポイントサイクルを決定することができる。この場合、閾値基準は、ベースライン閾値と同一な信号値を有するものである。確認されるサイクルの数は、一つでありえる。
【０１３６】
本方法が、標的核酸分子の存在を決定するための増幅曲線のベースライン領域のエンドポイントサイクルを決定するために適用される場合、本方法は、以下の段階を含む；
（ａ）サイクルにおける信号値を提供するために、試料を使用するリアルタイムＰＣＲのそれぞれのサイクルにおける信号値を収得し、（ｉ）リアルタイムＰＣＲの増幅サイクル、および（ｉｉ）前記増幅サイクルにおける信号値を含む生データセットを収得する段階と、
（ｂ）前記生データセットを使用してベースライン領域のスタートポイントサイクルとエンドポイントサイクルを決定して、ベースライン領域を決定する段階（前記エンドポイントサイクルは、下記段階によって決定される）と、
（ｂ１）ベースライン閾値を各増幅サイクルに適用し、複数のベースライン閾値を増幅サイクルに適用する段階（サイクルの少なくとも二つのサイクルのベースラインの閾値は、互いに異なっている）と、
（ｂ２）それぞれのベースライン閾値によって決定されるベースライン閾値基準を満足する１つ以上のサイクルを確認する段階と、
（ｂ３）前記段階（ｂ２）で確認されたサイクを使用してベースライン領域のエンドポイントサイクルを決定する段階、
（ｃ）前記決定されたベースライン領域内生データセットの二つ以上のデータポイントからベースライン領域の最適ライン関数を算出する段階と、
（ｄ）前記生データセットの信号値から前記ベースライン領域の最適ライン関数によって計算された関数値を差し引き、補正されたデータセットを収得する段階（前記補正されたデータセットは、（ｉ）前記リアルタイムＰＣＲの増幅サイクル及び（ｉｉ）前記差し引いた結果を含む）。
【０１３７】
さらに具体的に、前記段階（ｂ２）における確認は、生データセットを使用し、それぞれの増幅サイクルに対して計算された傾きと、それぞれの増幅サイクルに対するベースライン閾値とを比較して行われる。
【０１３８】
セクションＩＩに説明された方法がセクションＩの代表的な実施例であるため、その共通する内容は、明細書の複雑性を避けるために省く。
【０１３９】
本方法は、増加パターン（例えば、増幅反応による信号変化）及び減少パターンの信号変化を含む如何なるパターンの信号変化にも適用することができる。
【０１４０】
ＩＩ．増幅反応の生データセットの補正
本発明の他の様態によると、本発明は、以下の段階を含む信号発生手段の存在下で行われた増幅反応の生データセットを補正する方法を提供する；
（ａ）（ｉ）前記増幅反応における増幅サイクル及び（ｉｉ）前記信号発生手段から得た前記増幅サイクルにおける信号値を含む生データセットを収得する段階と、
（ｂ）前記生データセットからベースラインスタートポイントサイクルとエンドポイントサイクルを決定して、ベースライン領域を決定する段階と、
（ｃ）前記決定されたベースライン領域内生データセットの二つ以上のデータポイントからベースライン領域の最適ライン関数を算出する段階と、
（ｄ）前記生データセットの信号値から前記ベースライン領域の最適ライン関数により計算された関数値を差し引き、補正されたデータセットを収得する段階（前記補正されたデータセットは、（ｉ）前記増幅反応の増幅サイクル及び（ｉｉ）前記差し引いた結果を含む）。
【０１４１】
増幅反応の生データセットを補正する方法である本方法は、試料を分析する方法の特定具現例であるため、これらの間に共通する記載は、明細書の複雑性を避けるために省く。
【０１４２】
本発明の発明者は、増幅反応を通じて収得した生データセットを補正して、これにより、増幅反応に対する、より正確で信頼性の高い分析結果を定性的、定量的に提供する新しい方法について鋭意研究した。その結果、増幅反応の生データセットを補正するための新しい方法を発見した。特に、本発明の新しい方法によって、ベースライン領域のエンドポイントサイクルが決定でき、本発明は、増幅反応のより正確で信頼性の高い分析結果を収得するに寄与することを発見した。
【０１４３】
図１Ｂは、本発明の増幅曲線補正方法の一具現例に対する流れ図を示す。本発明をより詳細に説明すると、以下のようである。
【０１４４】
段階（ａ）：生データセットの収得（Ｓ１１０）
最初に、生データセットが収得される。前記生データセットは、（ｉ）増幅反応の増幅サイクル及び（ｉｉ）信号発生手段から得られた増幅サイクルにおける信号値を含む。
【０１４５】
生データセットは、信号発生手段の存在下で増幅反応を行って得られる。段階（ａ）は、択一的に、信号発生手段の存在下で増幅反応を行って、生データセットを収得する段階と表現することができる。
【０１４６】
本発明の一具現例によると、信号発生手段による信号は、標的核酸分子の存在に依存的に発生し、その強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）は、増幅反応の進行によって増加または減少する。
【０１４７】
本発明の一具現例によると、増幅反応は、標的核酸分子の存在に依存的に、信号発生手段の存在下で信号を増幅する反応を意味する。
【０１４８】
特に、一連の反応の繰り返しまたは一定時間間隔を有する反応の繰り返しの場合、用語‘サイクル’は、前記の繰り返しの単位を意味する。
【０１４９】
例えば、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）において、サイクルは、標的分子の変性、標的分子とプライマーのアニーリング（混成化）とプライマーの伸長を含む反応単位を意味する。この場合、反応の繰り返しの増加が状態変化に該当し、前記繰り返し単位がサイクルに当たる。他の例として、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及びＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のような等温核酸増幅反応の場合、サイクルは、時間間隔を意味する。
【０１５０】
本発明の一具現例によると、標的核酸分子が試料内に存在する場合、測定された信号値（例えば、信号強度）は、増幅サイクル数の増加によって増加するか、減少する。
【０１５１】
前記生データセットは、（ｉ）増幅サイクル及び（ｉｉ）信号発生手段から得られた増幅サイクルにおける信号値を含む。
【０１５２】
本発明の用語‘信号値’は、増幅サイクルで実際測定された信号値またはその変形を意味する。前記変形は、測定された信号値（信号強度）の数学的に加工された値を含むことができる。数学的に加工された値は、例えば、測定された信号値の対数値（ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ  ｖａｌｕｅｓ）または微分値（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）を含む。前記測定された信号値の微分値は、多重微分を含むことができる。
【０１５３】
上述のように、生データセットを収得する段階（Ｓ１１０）において、増幅サイクル及び前記増幅サイクルにおける信号発生手段からの信号値を含むデータセットは、増幅反応の実行によって得られ、補正前の増幅曲線（最初の増幅曲線）を提供するためにプロットされる。
【０１５４】
（ｉ）増幅サイクル及び（ｉｉ）前記増幅サイクルにおける信号値を含む生データセットは、増幅反応によって得られ、図２に示したような補正前の増幅曲線を提供するためにプロットされる。図２においてＲＦＵは、相対的蛍光単位（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｕｎｉｔ）である。
【０１５５】
上述のように、増幅曲線は、ベースライン領域（ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｒｅｇｉｏｎ）、指数領域（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｐｈａｓｅ）、直線領域（ｌｉｎｅａｒ  ｐｈａｓｅ）と渋滞領域（ｐｌａｔｅａｕ  ｐｈａｓｅ）に区分される。
【０１５６】
ベースライン領域では、初期増幅サイクルの間に蛍光信号の変化がほとんどない。指数領域は、増幅産物の増加に比例して、蛍光信号が増加することを示す。直線領域では、蛍光信号の増加が実質的に減少し、実質的に線形に現れる。渋滞領域では、増幅産物と蛍光信号の飽和により、蛍光信号の増加はほとんどない。
【０１５７】
ベースライン領域の信号の大部分を占める背景信号が、試料内標的核酸分子の量と無関係なベースライン移動（ｄｒｉｆｔ）の原因となるため、ベースライン領域の決定及び増幅曲線の補正がなされる必要がある。
【０１５８】
段階（ｂ）：ベースライン領域の決定（Ｓ１２０）
次に、生データセットを用いたベースライン領域のスタートポイントサイクル及びエンドポイントサイクルの決定によって、ベースライン領域が決定される。
【０１５９】
ベースライン領域決定に関する‘生データセットの利用’は、前記生データセットの直接的、間接的使用をすべて含む。生データセットの間接的利用は、生データセットの変形されたデータセットの利用を含む。
【０１６０】
本発明の一具現例によると、スタートポイントサイクル及びエンドポイントサイクルは、生データセットから直接決定されるか、あるいは生データセットが数学的に加工されたデータセットから決定される。
【０１６１】
例えば、スタートポイントサイクルは、一定の値以上の信号値を有する最初のサイクルに決定する方法で、生データセットから直接的に決定することができる。択一的に、エンドポイントサイクルは、一定の値以上の傾き値を有する最初のサイクルに決定する方法で、数学的に加工されたデータセットから決定することができる。
【０１６２】
本発明において、用語‘スタートポイントサイクル’は、ベースライン領域の開始に当たるサイクルを意味する。
【０１６３】
ベースラインスタートポイントサイクル（Ｓ）は、ユーザーによって任意に決定することができる。一般には、スタートポイントサイクルは、増幅反応の初期の典型的な変動形態が現れた後のサイクルに決定する。例えば、スタートポイントサイクルは、１〜１０サイクルから決定でき、例えば２〜１０、２〜８、２〜６または２〜４サイクルから決定できる。
【０１６４】
択一的に、ベースライン領域のスタートポイントサイクル（Ｓ）は、一定条件を満足するサイクルを考慮して決定することができる。
【０１６５】
例えば、スタートポイントサイクルは、以前サイクルと異なる傾き傾向を示す一番目のサイクルに決定することができる。前記以前サイクルと異なる傾き傾向を示すサイクルは、例えば、以前サイクルより大きい傾きを有するが、初期サイクルの傾きより１０％以下の傾きを有するサイクル、以前サイクルの傾きが負のとき正の傾きを示すサイクルまたは以前サイクルの傾きが正のとき、負の傾きを有するサイクルである。
【０１６６】
本発明の一具現例によると、各サイクルにおける信号値の変化率が計算され、これをベースラインのスタートポイントサイクルまたはエンドポイントサイクルの決定に利用することができる。本明細書で特に言及しない限り、用語‘傾き’は、選択されたサイクルで信号値の変化率を意味する。本発明の一具現例によると、傾きは、サイクルに対してプロットされ、傾き曲線を提供する。
【０１６７】
本発明において、用語‘エンドポイントサイクル’は、ベースライン領域の終了に当たるサイクルを意味する。ベースラインエンドポイントサイクル（Ｅ）がベースライン領域の終わりを決定するため、ベースラインエンドポイントサイクルは、信号増幅が発生する前のサイクルで決定される。
【０１６８】
前記ベースライン領域のエンドポイントサイクルは、生データセットまたはその変形されたデータセットから決定することができる。
【０１６９】
ベースライン領域のエンドポイントサイクルは、さまざまな方法で決定できる。
【０１７０】
たとえば、エンドポイントサイクルは、２次微分値が最大となるサイクルに決定することができる。または、データセットの傾き曲線の特徴（位置及び大きさ）がエンドポイントサイクルの決定のために分析される。例えば、傾き曲線は、指数領域のピークが最も大きいはずなので、ベースライン領域のエンドポイントサイクルは、指数領域のピークが始まるサイクルに決定できる。
【０１７１】
また、エンドポイントサイクルは、以前サイクルと比較し、変動係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）が急激に増加することを示す一番目のサイクルで決定することができる。または、エンドポイントサイクルは、予め指定した値以上の変動係数を有するサイクルで決定することができる。前記変動係数は、標準偏差を算術平均で割ったものとして定義される。前記変動係数は、変動係数が算出されるサイクルとその一定数前、後のサイクルを選択して、これらの選択されたサイクルの標準偏差と算術平均を計算して変動係数を求めることができる。前記選択されたサイクルの一定数は、１，２，３，４または５であり、好ましくは、１または２である。
【０１７２】
本発明の一具現例によると、前記エンドポイントサイクルは、前記スタートポイントサイクルと、データセットで最大の傾きを有するデータポイントのサイクルとの間で決定される。
【０１７３】
本発明の一具現例によると、前記エンドポイントサイクルは、超過サイクル（ｎｏｔ−ｌｅｓｓ−ｔｈａｎ  ｃｙｃｌｅ）の中から選択することができる。または、前記エンドポイントサイクルは、超過サイクルの中で選択されたサイクルを、エンドポイントサイクルを決定するための基準サイクルとして決定することができる。
【０１７４】
本発明において、用語‘超過サイクル’（ｎｏｔ−ｌｅｓｓ−ｔｈａｎ  ｃｙｃｌｅ（ｓ））は、ベースライン閾値と同一またはそれ以上の値を有するデータポイントのサイクルを意味する。つまり、超過サイクルは、ベースライン閾値以上の傾きを有するサイクルである。
【０１７５】
増幅曲線が減少するパターンの場合、エンドポイントサイクルは、未満サイクル（ｎｏｔ−ｍｏｒｅ−ｔｈａｎ  ｃｙｃｌｅ）の中から選択されたサイクルによって決定できる。
【０１７６】
本発明の一具現例によると、前記エンドポイントサイクルは、クロスポイントサイクルの中で選択されたサイクルによって決定することができる。または前記エンドポイントサイクルは、クロスポイントサイクルの中で選択されたサイクルをエンドポイントサイクルの決定のための基準サイクルとして決定することができる。
【０１７７】
本発明の用語‘クロスポイントサイクル’（ｃｒｏｓｓ−ｐｏｉｎｔ  ｃｙｃｌｅ）は、ベースライン閾値と同一な値を有するデータポイントのサイクルを意味する。
【０１７８】
前記クロスポイントサイクルは、データポイントのサイクルの中で決定できる。
【０１７９】
前記クロスポイントサイクルは、ベースライン閾値とデータポイントを使用して数学的に計算されたサイクルによって決定することができる。
【０１８０】
本発明の一具現例によると、エンドポイントサイクルは、ベースライン閾値と同一な傾きを有するデータポイントのサイクル、ベースライン閾値を超過する傾きを有する一番目のデータポイントのサイクルまたはベースライン閾値未満の一次傾きを有する一番目のデータポイントのサイクルによって決定される。または、特定値の傾きを有するデータポイントのサイクルまたは特定値を超過する一番目のデータポイントのサイクルを基準サイクルとして使用し、エンドポイントサイクルを決定するための数学的方程式に代入する方法でエンドポイントサイクルを決定することができる。前記数学的方程式の例は、‘エンドポイントサイクル＝基準サイクル−（１，２，３または４サイクル）’；‘エンドポイントサイクル＝基準サイクル＋（１，２，３または４サイクル）’；‘エンドポイントサイクル＝［基準サイクル×０．９］’；及び‘エンドポイントサイクル＝［基準サイクル−（ベースライン閾値×０．１）］’を含む。［Ｘ］は、Ｘ値と同一か小さい最大の整数を表示する。
【０１８１】
前記傾きと共に記載された特定値は、ベースライン閾値（ＢＴ）である。ベースライン閾値は、一般にベースラインを決定するために使用され、本発明では、ベースライン領域のエンドポイントサイクルを決定するために使用される。前記ベースライン閾値は、測定対象および／または測定機器に応じて予め決定（または入力）でき、またはユーザーによって任意に決定することができる。
【０１８２】
本発明の一具現例によると、エンドポイントサイクルは、ベースライン閾値と傾き曲線の一番目のクロスポイントのサイクルまたは（前記）一番目のクロスポイントのデータポイントのサイクルに最も近いサイクルによって決定できる。
【０１８３】
クロスポイントのサイクルまたはクロスポイントのデータポイントのサイクルをクロスポイントサイクルという。前記クロスポイントサイクルは、各サイクルに対してベースライン閾値をプロットして得られたグラフ（以下、ベースライン閾値グラフまたはＢＴグラフという）と傾き曲線が交互するポイントのサイクルである。
【０１８４】
クロスポイントサイクルの数は、傾き曲線および／またはＢＴグラフの形に応じて、一つまたはそれ以上である。エンドポイントサイクルを決定するためのクロスポイントサイクルは、例えば、最初のクロスポイントサイクルまたは最後のクロスポイントサイクルのように、予め決定された特定クロスポイントサイクルによって決定できる。またはクロスポイントサイクルの数が二つ以上である場合、最も少ないサイクル数を有するクロスポイントサイクルがエンドポイントサイクルとして決定される。
【０１８５】
クロスポイントのサイクルの値は、整数ではないことがある。実際の実験で、サイクルは整数で表示されるため、エンドポイントサイクルは、整数であることが望ましい。したがって、前記クロスポイントサイクルを超過する一番目の整数サイクル（ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｃｙｃｌｅ）または前記一番目の整数サイクルの１，２，３または４番目前または後のサイクルがエンドポイントサイクルとして決定できる。またはエンドポイントサイクルは、クロスポイントサイクル未満の最も大きい整数サイクルまたは前記最も大きい整数サイクルの１，２，３または４番目前または後のサイクルがエンドポイントサイクルとして決定される。
【０１８６】
本発明の一具現例によると、ベースライン領域のエンドポイントサイクルは、ベースライン閾値と傾き曲線の一番目のクロスポイントのサイクル又は前記一番目のクロスポイントのデータポイントのサイクルの１，２，３または４サイクル前または後のサイクルによって決定される。
【０１８７】
本発明の一具現例によると、ベースライン閾値は、増幅領域が現れる前の初期サイクルの間、背景信号によって干渉されないように設定できる。
【０１８８】
本発明の一具現例によると、ベースライン閾値は、様々な試料の分析結果によって選択された適切な値に設定することができる。
【０１８９】
図３は、２〜４サイクルのいずれかのサイクルがスタートポイントサイクルに決定されて、ベースライン閾値と傾き曲線間の一番目のクロスポイントサイクルがエンドポイントサイクルに決定されたベースライン領域を示す。
【０１９０】
本発明では、前記決定されたスタートポイントサイクルとエンドポイントサイクル間の相対的距離が一定値以下である場合、前記相対的距離は、適切なベースライン領域を確保するために、追加に調整することができる。
【０１９１】
前記相対的距離は、エンドポイントサイクルからスタートポイントサイクルを差し引いて計算することができる。前記追加調整が必要な相対的距離の一定値は、０，１，２，３，４，５，６，７，８，９または１０サイクルであり、好ましくは、０，１，２，３または４サイクルである。
【０１９２】
前記追加調整の方法は、スタートポイントサイクルまたはエンドポイントサイクル、またはその両方のサイクルを、前記相対的距離が一定値以上になるように任意に設定する方法である。または、前記追加調整方法は、スタートポイントサイクルまたはエンドポイントサイクルのいずれかを、上述のスタートポイントサイクルまたはエンドポイントサイクル決定方法によって決定し、前記決定されたスタートまたはエンドサイクルから前記相対的距離が一定値以上になるサイクルの範囲で、他の一つを、上述のスタートポイントサイクルまたはエンドポイントサイクル決定方法によって決定する方法で決定することができる。
【０１９３】
本発明の一具現例によると、データポイントの傾きは、前記データポイントのサイクルにおける信号値の変化を示す。
【０１９４】
上述のように、本発明の増幅反応は、サイクルに応じて信号減少を示す反応を含む。
【０１９５】
前記傾きは、微分法など、様々な方法で計算することができる。
【０１９６】
前記傾きは、特定サイクルのデータポイント及び前記特定サイクルの前および／または後のサイクルの少なくとも一つのデータポイントを使用して、最小二乗法またはＬＭＳ（ｌｅａｓｔ  ｍｅａｎ  ｓｑｕａｒｅ）アルゴリズムなどにより計算することができる。
【０１９７】
以下、線形回帰分析の代表的な例として、最小二乗法（ｌｅａｓｔ  ｓｑｕａｒｅ  ｍｅｔｈｏｄ）を挙げて説明するが、本発明はこれに限定されない。
【０１９８】
最小二乗法で傾きを計算するのに使用されるデータポイントの数は、二つ以上でありえる。例えば、最小二乗法で傾きを計算するために使用されるデータの数は、２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４または１５個以下である。特に、前記データポイントの数は、２〜３、２〜１５、３〜１１、３〜９、３〜７、３〜５または５〜７個である。
【０１９９】
最小二乗法で傾きを計算するのに使用されるデータポイントは、隣接したサイクルであるか、離れているサイクルである。
【０２００】
たとえば、傾きは、特定サイクルのデータポイント及び特定サイクル以前および／または以後のサイクルに対応する少なくとも一つのデータポイントを使用して、最小二乗法によって計算することができる。
【０２０１】
他の例としては、前記傾きは、前記データセットのうち、特定サイクルに対応するデータポイント、特定サイクル以前のサイクルのデータポイント及び特定サイクル以後のサイクルのデータポイントを使用して、最小二乗法によって計算することができる。
【０２０２】
最小二乗法によって傾き計算に使用されるデータポイントの数は、サイクルに応じて変わる。たとえば、データポイントの傾きは、互いに隣接した二つまたは三つのデータポイントを使用して、最小二乗法によって計算することができる。たとえば、一番目のサイクル以前にはサイクルが存在しないため、一番目のサイクルの傾きは、一番目のサイクルとその次のサイクルのデータポイントを使用して、最小二乗法によって計算することができる。最後のサイクル以後には、サイクルがないため、最後のサイクルの傾きは、最後のサイクルと隣接した直前のサイクルを使用して、最小二乗法によって計算することができる。他のサイクルに対しては、前記傾きは、該サイクルのデータポイント、前記該サイクルの直前のサイクルのデータポイント及び前記該サイクルの直後のサイクルのデータポイントを使用して、最小二乗法によって計算することができる。
【０２０３】
本発明の一具現例によると、前記最小二乗法は、下記数学式１で表すことができる。
【数１】
0006602374.tif 000002
（前記数学式１において、
【数２】
0006602374.tif 000003
であり、
Ｉは、傾きを求めようとするデータポイントのサイクルであり、ｍは、Ｉ番目サイクルのデータポイントの傾きであって、ｘｉは、ｉ番目サイクルのサイクル番号であり、ｙｉは、ｉ番目サイクルで測定された信号値であって、ｎは、ａ＋ｂ＋１であり、ａ及びｂは、独立的に０以上１０以下の整数（但し、ａは、Ｉ未満であり、ａ＋ｂ＋１は、２以上、生データセットのデータポイントの数以下、Ｉ＋ｂは、生データセットのデータポイントの数以下）である。）
【０２０４】
‘ａ＋ｂ＋１’は、Ｉ番目のサイクルの傾きを計算するために使用されるデータポイントの数であり、ＬＳＭＲ（最小二乗法範囲；  Ｌｅａｓｔ  Ｓｑｕａｒｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｒａｎｇｅ）と称する。‘ａ’は、Ｉ番目のサイクルの傾きを計算するために使用されるデータポイントのうち、最小サイクルを計算するための値である。‘ｂ’は、最大サイクルを計算するための値である。データポイントの数は、全体反応で収得したデータポイントの数を意味し、増幅曲線の最大サイクル値に当たる。
【０２０５】
‘ａ’及び‘ｂ’は、独立して、０乃至１０の整数であり、好ましくは、１乃至５の整数、さらに好ましくは、１乃至３の整数である。
【０２０６】
前記‘ａ’及び‘ｂ’は、同一な値であることが有利であるが、これらは、測定対象、測定環境及びサイクルによって変わる。
【０２０７】
前記‘ａ’及び‘ｂ’は、Ｉ−ａが１未満であるか、Ｉ＋ｂが全体データポイントの数を超過する場合を除いて、反応の全体データポイントに同一に適用されることが有利である。しかし、信号値の変化側面で特別な属性または区間特性を示す特定データポイントまたは特定範囲のデータポイントの傾きは、他の前記‘ａ’及び‘ｂ’を適用して計算することができる。
【０２０８】
たとえある反応のすべてのデータポイントに一定な‘ａ’及び‘ｂ’が適用される場合でも、Ｉ−ａが１未満であるか、Ｉ＋ｂが全体データポイントの数を超過するデータポイントの傾きを計算するためには、‘ａ’と‘ｂ’の値は、他のデータポイントに適用されたものとは異なる値を有することができる。たとえば、Ｉ−ａが１未満であるデータポイントでは、‘ａ’は‘Ｉ−ａ’が１になるように調整することができる。この場合、‘ｂ’は、一定に維持されるか、‘ａ’の調整によって変わる。
【０２０９】
Ｉ＋ｂが全体データポイントの数を超過するデータポイントの場合、‘ｂ’は、‘Ｉ＋ｂ’が全体データポイントの数と同一になるように調整される。この場合、‘ａ’は、一定に維持されるか、‘ｂ’の調整によって変わる。
【０２１０】
ＬＳＭＲの値、‘ａ’及び‘ｂ’は、測定対象および／または測定装備に応じて、あらかじめ決定（入力）することができ、またはユーザーによって任意に決定することができる。
【０２１１】
図３は、数学式１で表現される最小二乗法によって計算された傾き曲線を示す。Ｙ軸は、最小二乗法により各増幅サイクルで計算された蛍光信号強度（または相対的蛍光単位）の傾きを示す。
【０２１２】
ベースライン領域決定のエンドポイントサイクル
上述のように、初期サイクルにおいて、背景信号による干渉を避けながら、ベースライン領域のエンドポイントサイクルは、生データセットから各増幅サイクルで計算された傾きと各増幅サイクルに対するベースライン閾値とを比較して決定することができる。
【０２１３】
ベースラインの閾値は、ベースライン領域のエンドポイントサイクルを決定するために設定される。前記ベースライン閾値は、測定対象および／または測定装備に応じて、あらかじめ決定（入力）することができ、またはユーザーによって任意に決定することができる。
【０２１４】
背景信号またはノイズによる増幅分析の誤りは、エンドポイントサイクルの誤った決定によるものでありえる。核酸増幅反応のような増幅反応において、非正常的な蛍光信号は、初期サイクルで頻繁に現れて、記録される。非正常的な蛍光信号の検出は、標的核酸分子の量を反映しない蛍光信号を検出することをいう。
【０２１５】
ベースライン閾値が過度に低く設定される場合、非正常的な蛍光信号の傾き値がエンドポイントサイクルの決定に影響を与えるようになる。もしそう決定されたエンドポイントサイクルを使用してベースライン領域が決定され、増幅曲線が補正されると、補正された増幅曲線は、偽陽性結果を示すか、増幅産物の量を反映しない。もしエンドポイントサイクルの決定に非正常的な蛍光信号の傾き値が関与することを避けるために、ベースライン閾値が過度に高く設定される場合、ベースライン閾値と傾き曲線間の交差が、初期サイクルではなく、後のサイクルで起こるか、傾き曲線のピークが低い場合は、ベースライン閾値と傾き曲線間の交差が起こらないことがある。
【０２１６】
本発明の一具現例によると、上述の問題を解決するために、特定サイクル以前のサイクルは、エンドポイントサイクルの決定のプロセスから除く。または初期背景信号がエンドポイントサイクルの決定に関与しないよう、ベースライン閾値が調整される。
【０２１７】
本発明の一具現例によると、ベースライン閾値は、増幅領域が観察される前の初期のサイクルにおいて、背景信号によって干渉されないように設定することができる。
【０２１８】
（１）特定サイクル以前のサイクルを除外する方法
本発明の一具現例によると、エンドポイントサイクルを決定するために、特定サイクル以前のサイクルを除外する方法において、前記特定サイクルは、最小ベースラインエンドポイントサイクル（ＭＢＥＣ、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｂａｓｅｌｉｎｅ  Ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ  Ｃｙｃｌｅ）である。この方法において、エンドポイントサイクルは、ＭＢＥＣ以上のサイクルの中から決定される。ＭＢＥＣ適用によって、増幅反応初期サイクルの間の背景信号またはノイズ信号によって、エンドポイントサイクルが増幅領域の始まりより過度に離れて最初に決定されることを防止することができる。このようにエンドポイントサイクルの決定にＭＢＥＣを設定する方法を‘ＭＢＥＣ方法’という。
【０２１９】
前記ＭＢＥＣは、測定機器、個々の装備の特性、分析試料、試薬の影響による背景信号またはノイズ信号のパターンに応じて多様に設定することができる。ＭＢＥＣは、背景信号またはノイズ信号による誤りが防止される限り、設定サイクル範囲に制限がない。例えば、ＭＢＥＣは、１〜５０サイクルの範囲で決定することができ、好ましくは、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０サイクル、より好ましくは、５〜１５サイクルの範囲で決定することができる。
【０２２０】
図８Ａ及び図８Ｂに示すように、傾き曲線の二つのクロスポイントサイクル（Ｅ１、Ｅ２）のうち、ＭＢＥＣが適用されると、ＭＢＥＣを超過するＥ２がエンドポイントサイクルとして決定される。
【０２２１】
また、ＭＢＥＣを超過するクロスポイントサイクルが二つ以上である場合、より小さいクロスポイントサイクルがエンドポイントサイクルに決定される。上述のように、ＭＢＥＣを超過する最も小さいクロスポイントサイクルの値が整数ではない場合、前記最も小さいクロスポイントサイクルを超過する一番目の整数サイクル値または前記一番目の整数サイクル値の１，２，３または４サイクル前または後のサイクルがエンドポイントサイクルとして決定される。または、前記最も小さいクロスポイントサイクル値未満の最も大きい整数サイクルまたは前記最も大きい整数サイクルの１，２，３または４サイクル前または後のサイクルがエンドポイントサイクルとして決定される。
【０２２２】
本発明の一具現例によると、前記の段階（ｂ）において、ベースライン領域のエンドポイントサイクルは、最小ベースラインエンドポイントサイクル（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ  ｃｙｃｌｅ、ＭＢＥＣ）以上のサイクルで決定され、前記ＭＢＥＣは、増幅反応の前または後に決定される。
【０２２３】
ＭＢＥＣが決定された後は、ベースライン領域のエンドポイントサイクルは、さまざまな方法で容易に決定することができる。例えば、クロスポイントサイクルまたは超過サイクルが先に確認され、これらがエンドポイントサイクルに決定できるかどうかを評価するために、ＭＢＥＣと比較する。または前記エンドポイントサイクルを単純にＭＢＥＣ以後のサイクルの中から決定することができる。
【０２２４】
もしＭＢＥＣ以上のクロスポイントサイクルが存在しない場合は、傾き曲線の最後のサイクルがエンドポイントサイクルに決定される。
【０２２５】
本発明の一具現例によると、前記ベースライン領域のエンドポイントサイクルは、以下の段階を含む方法によって決定することができる；
（ｉ）それぞれの増幅サイクルに対して計算された傾きを収得する段階と、
（ｉｉ）前記傾きをそれぞれの増幅サイクルに対するベースライン閾値と比較し、ベースライン領域の候補エンドポイントサイクルを収得する段階と、
（ｉｉｉ）前記候補エンドポイントサイクルをＭＢＥＣと比較する段階（前記候補エンドポイントサイクルがＭＢＥＣより大きい場合、前記候補エンドポイントサイクルをエンドポイントサイクルに決定する）。
【０２２６】
候補エンドポイントがＭＢＥＣ未満の場合、前記候補は除去され、前記段階（ｉ）および（ｉｉ）が、新しい候補エンドポイントを検索するために繰り返される。もしＭＢＥＣ以上で候補エンドポイントがない場合、傾き曲線の最後のサイクルがエンドポイントサイクルに決定される。
【０２２７】
本発明のＭＢＥＣ方法は、好ましくない増幅反応の初期サイクルでエンドポイントサイクルが決定されることを防止し、結果的に、より正確に増幅曲線を補正することができる。
【０２２８】
（２）可変ベースライン閾値方法
本発明の一具現例によると、ベースライン閾値（ＢＴ）は、初期背景信号がエンドポイントサイクルの決定に関与しないように調整される。
【０２２９】
上述のように、生データセットを利用して、各増幅サイクルで計算された傾きと各増幅サイクルに対するベースライン閾値とを比較して、エンドポイントサイクルを決定するために、固定ベースライン閾値（ＦＢＴ）は、すべての増幅反応のサイクルに適用されることが一般的である。
【０２３０】
本発明によると、ベースライン閾値は、各サイクルに対して同一であるか、または相異に適用（割り当て）される。またはベースライン閾値は、すべてのサイクルにおいて相異に適用される。
【０２３１】
本発明の一具現例によると、サイクルの少なくとも二つのサイクルは、互いに異なるベースライン閾値を有する。したがって、複数のベースライン閾値は、全体が又は一部が互いに異なっている。複数のベースライン閾値全部または一部が互いに異なる値を有するように、サイクルに適用されるベースライン閾値を調整するこの方法は、‘可変ベースライン閾値’（ＶＢＴ、ｖａｒｉａｂｌｅ  ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）方法と命名する。
【０２３２】
本発明の一具現例によると、前記ベースライン領域のエンドポイントサイクルは、以下の段階を含む方法によって決定することができる；
（ｂ１）それぞれの増幅サイクルにベースライン閾値を適用して、複数のベースライン閾値をサイクルに適用する段階（前記サイクルの少なくとも二つのサイクルのベースライン閾値は、互いに異なっている）、
（ｂ２）ベースライン閾値のそれぞれによって決定される閾値基準を満足する一つ以上のサイクルを確認する段階と、
（ｂ３）前記段階（ｂ２）で確認されたサイクルを使用してベースライン領域のエンドポイントサイクルを決定する段階。
【０２３３】
ベースラインの閾値をサイクルに対してプロットして得られたグラフをＢＴグラフという。
【０２３４】
単一ベースライン閾値がすべてのサイクルに割り当てられる場合、前記ＢＴグラフは、ｘ軸と平行な直線を有する。
【０２３５】
ＶＢＴ方法によると、図９に示されたように、互いに異なるベースライン閾値による多様なＢＴグラフを収得することができる。
【０２３６】
本発明の一具現例によると、増幅反応のサイクルは、少なくとも二つの相異なるグループに分類されて、同一なグループに属するサイクルは、互いに同一なベースライン閾値を有し、互いに異なるグループに属するサイクルは、相異なるベースライン閾値を有する。この場合、ＢＴグラフは、ｘ軸と平行な直線を有する（図９の（ａ）と（ｂ）を参照）。
【０２３７】
本発明の一具現例によると、全体または一部サイクルのベースライン閾値は、サイクル数の増加によって一定比率で増加するか、減少する。この場合、ＢＴグラフは、１次関数の形態で表れる（図９の（ｃ）、（ｄ）、（ｇ）及び（ｈ）参照）。
【０２３８】
本発明の一具現例によると、全体または一部サイクルのベースライン閾値は、サイクル数の増加によって変化する比率で増加するか、減少する。この場合、ＢＴグラフは、曲線関数（例えば、２次関数）形態で表れる（図９の（ｆ）参照）。
【０２３９】
本発明の一具現例によると、増幅サイクルは、少なくとも二つのグループに分類されて、同一グループに分類されたサイクルは、同一なベースライン閾値を有して、異なるグループに分類されたサイクルは、異なるベースライン閾値を有する。このような場合、ＢＴグラフは、少なくとも二つの関数によって表現することができる。前記ＢＴグラフは、連続的または不連続的にプロットできる。
【０２４０】
本発明の一具現例によると、ベースライン閾値変化サイクル（ＢＴＣＣ）が設定され、前記設定されたＢＴＣＣの前、後のサイクルには、相異なるベースライン閾値がそれぞれ適用される。
【０２４１】
本発明において、用語‘ベースライン閾値変化サイクル’（ＢＴＣＣ；  ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅｄ  ｃｙｃｌｅ）は、ベースライン閾値の変化パターンがサイクルを超えながら変更される基準サイクルをいう。特に用語‘ベースライン閾値変化サイクル  ’（ＢＴＣＣ）は、ベースライン閾値が変化する基準サイクルを意味する。前記ＢＴＣＣは、一つの増幅反応に対して一つまたはそれ以上設定できる。前記ＢＴＣＣは、増幅反応前、増幅反応中または増幅反応後に設定できる。
【０２４２】
本発明の一具現例によると、増幅サイクルに対するベースライン閾値は、ベースライン閾値変化サイクル（ＢＴＣＣ）を基準に、前記ＢＴＣＣ以前のサイクルとこれらに適用されるベースライン閾値の集合によって形成された第１関数と、前記ＢＴＣＣ以後のサイクルとこれらに適用されるベースライン閾値の集合によって形成された第２関数とが互いに異なっているように設定される。
【０２４３】
本発明の一具現例によると、ＢＴＣＣには、ＢＴＣＣ以前のサイクルに対する関数またはＢＴＣＣ以後のサイクルに対する関数が適用される。
【０２４４】
一つのサイクルに一つのベースライン閾値が適用されるため、サイクルに対するベースライン閾値の関数が形成できる。前記関数は、全体サイクルに対する閾値の集合から形成することができ、一部サイクルに対する閾値の集合から形成することができる。
【０２４５】
ＢＴＣＣ以前のサイクルとこれらに適用されるベースライン閾値の集合によって形成された第１関数と、前記ＢＴＣＣ以後のサイクルとこれらに適用されるベースライン閾値の集合によって形成された第２関数とが互いに異なるように設定されるということは、ＢＴＣＣ以前のサイクルの第１関数のＢＴグラフとＢＴＣＣ以後のサイクルの第２関数のＢＴグラフとが互いに異なるパターンを示すことを意味する。
【０２４６】
たとえば、ＢＴＣＣ以前のサイクルに適用されたベースライン閾値は、１次関数で表すことができ、ＢＴＣＣ以後のサイクルに適用されたベースライン閾値は、定数関数で表すことができる（図９の（ｃ）参照）。図９の（ｃ）において、ＢＴＣＣ以前のサイクルに適用されたベースライン閾値は一定に減少し、ＢＴＣＣ以後のサイクルに適用されたベースライン閾値は、固定された値を有する。
【０２４７】
他の例として、二つのベースライン閾値を有する場合、一番目のＢＴＣＣ（ＢＴＣＣ１）以前のサイクルに対するベースライン閾値と二番目のＢＴＣＣ（ＢＴＣＣ２）以後のサイクルに対するベースライン閾値は、定数関数で表し、ＢＴＣＣ１とＢＴＣＣ１間のベースライン閾値は、前記二つの定数関数を連結する１次関数（図９の（ｄ）参照）、または２次関数または他の関数（図９の（ｆ）参照）で表すことができる。
【０２４８】
ＢＴＣＣ前のＢＴグラフとＢＴＣＣ後のＢＴグラフは、ＢＴＣＣを起点に不連続的な形態でありえる（図９の（ｅ）と（ｈ）参照）。このような場合、ＢＴＣＣを、ＢＴＣＣ前の関数とＢＴＣＣ後の関数にそれぞれ適用すると、互いに異なる関数値を算出する。
【０２４９】
本発明の一具現例によると、前記増幅サイクルは、ベースライン閾値変化サイクル（ＢＴＣＣ）を境に、２以上の異なるグループに分類される。この場合、同一なグループに属するサイクルは、連続的で、同一なグループに属するサイクルは、互いに同一なベースライン閾値を有し、互いに隣接した別のグループに属するサイクルは、相異なるベースライン閾値を有する。したがって、離隔された別のグループに分類されたサイクルは、互いに異なるか、同一な閾値を有する。ＢＴＣＣのベースライン閾値は、ＢＴＣＣ以前のサイクルまたは以後のサイクルのベースライン閾値と同一でありえる。ＢＴＣＣは、一つのデータセットに一つ設定でき、この場合、データセットのサイクルは、二つのグループに分類される。または前記ＢＴＣＣは、一つのデータセットに二つ以上設定することができて、この場合、データセットのサイクルは、３つ以上のグループに分類される。
【０２５０】
本発明の一具現例によると、増幅サイクルは、少なくとも１つ以上のＢＴＣＣを基準に、少なくとも二つの相異なるグループに分類され、同一なグループに属するサイクルは、同一なベースライン閾値を有することができる。非特異的信号またはノイズ信号が激しく表れるサイクル区間には、高いまたは低いベースライン閾値が適用されて、非特異的またはノイズ信号が正常信号として検出されないようにすることができる。また、その他のサイクル区間には、一般的なベースライン閾値が適用され、正常信号を検出および分析する。
【０２５１】
好ましくは、増幅サイクルは、ＢＴＣＣを基準に、互いに異なる二つのグループに分類され、同一なグループは、同一なベースライン閾値を有して、異なるグループに分類されたグループは、異なるベースライン閾値を有する。ＢＴＣＣは、ＢＴＣＣの前または後のサイクルと同一なベースライン閾値を有することができる。
【０２５２】
本発明の一実施例では、前記ＶＢＴ方法を、初期サイクルが非正常的に高い傾き値を有する増幅結果に使用した。ＢＴＣＣを設定した後、増幅曲線の補正のために、高いベースライン閾値をＢＴＣＣ以前のサイクルに適用して、低ベースライン閾値をＢＴＣＣ以後のサイクルに適用した。ＶＢＴを適用した場合が、さらに正確に増幅曲線を補正できることを確認した。
【０２５３】
前記ＢＴＣＣは、測定機器、試料、試薬の特性に影響を受ける背景信号またはノイズ信号のパターンによって変わる。ＢＴＣＣは、背景信号またはノイズ信号による誤りが防止される限り、その決定範囲に制限がない。たとえば、ＢＴＣＣは、７０，６０，５０，４０，３０，２９，２８，２７，２６，２５，２４，２３，２２，２１，１０または１５サイクル以下でありえる。前記ＢＴＣＣサイクルは、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２５，３０，３５または４０サイクル以上でありえる。ＢＴＣＣは、１乃至７０サイクル範囲内で決定することができ、好ましいサイクル範囲は、１〜６０、１〜５０、１〜４０、１〜３０、５〜６０、５〜５０、５〜４０、１０〜４０、１０〜３５、１５〜３５、１５〜３０、１５〜２５であり、さらに好ましくは、１５〜２５サイクルである。
【０２５４】
図１０Ａ及び図１０Ｂに示されたように、ＢＴＣＣを基準に、第１ＢＴグラフ（１ｓｔ  ＢＴ）と第２ＢＴグラフ（２ｎｄ  ＢＴ）で表示される二つの関数が定数関数であると、傾き曲線との一番目のクロスポイントサイクルがベースライン領域のエンドポイントサイクル（Ｅ２）に決定される。
【０２５５】
ＭＢＥＣ方法とＶＢＴ方法は、選択的に適用することができる。また、前記二つの方法を両方とも増幅曲線の補正に適用することができる。
【０２５６】
実施例２では、インフルエンザＡウイルス（Ｆｌｕ  Ａ）の核酸を収得して、増幅し、第１増幅曲線を確保した。ベースライン領域のエンドポイントサイクルをＭＢＥＣ方法またはＶＢＴ方法をそれぞれ適用するか、両方とも適用せずに、それぞれ収得した。以後、得られたエンドポイントサイクルに決定されたベースライン領域を使用し、第１増幅曲線を補正した。その結果、ＭＢＥＣ方法またはＶＢＴ方法を適用した補正は、前記方法を適用していない補正に比べて、増幅産物の量をより正確に反映する、補正された増幅曲線を提供することができることを確認した。
【０２５７】
（３）多重ベースライン閾値セット方法
本発明の一具現例によると、追加的なベースライン閾値が、サイクルの少なくとも一つのサイクルに適用できる。
【０２５８】
本発明の一具現例によると、追加的なベースライン閾値セットが、データセットに適用できる。
【０２５９】
一般的な核酸増幅では、標的核酸分子がない場合、増幅曲線は、平らな形状（ｆｌａｔ  ｓｈａｐｅ）であるか、非特異的結合及び増幅によって少し増加するパターンである。可能性が低いが、非正常的な陰性増幅反応は、サイクルの増加に応じて、信号値の減少を示す（すなわち、陰性傾きパターン）。
【０２６０】
このような場合、ベースライン領域の決定および生データセットの補正において、誤りが発生しやすいが、これは、ベースライン閾値セットと増幅曲線（または傾き曲線）との間のクロスポイントが発生せず、したがって、ベースライン領域のエンドポイントサイクルが設定されないからである。本発明の追加ベースライン閾値のセットの適用は、このような誤りのある分析を防止することができる。例えば、追加ベースライン閾値セットのベースライン閾値が負に適用され、したがって、負の傾き値を有するベースライン領域のエンドポイントサイクルを決定することができる。
【０２６１】
本発明の一具現例によると、少なくとも二つの閾値セットがデータセットに適用される。増幅曲線の分析において誤り防止のために、少なくとも二つの閾値セットをデータセットに適用する方法は、‘多重ベースライン閾値セット’方法と命名される。ベースライン閾値セットは、ベースライン閾値ポイントの集合である。前記ベースライン閾値ポイントは、サイクルと、前記サイクルにおけるベースライン閾値を含む座標値をいう。
【０２６２】
本発明の一具現例によると、ベースライン閾値セットは、サイクルの少なくとも二つのサイクルに適用されたベースライン閾値が互いに異なる、可変ベースライン閾値セットである。
【０２６３】
本発明の一具現例によると、ベースライン閾値セットは、すべてのサイクルに適用されるベースライン閾値が同一な、固定ベースライン閾値セットである。
【０２６４】
本発明の一具現例によると、多重ベースライン閾値セットは、可変ベースライン閾値セットと固定ベースライン閾値セットとを含むグループから選択された少なくとも二つのベースライン閾値セットを含む。
【０２６５】
本発明の一具現例によると、多重ベースライン閾値セットは、少なくとも一つの固定ベースライン閾値セットを含む。
【０２６６】
本発明の一具現例によると、多重ベースライン閾値セットは、少なくとも一つの可変ベースライン閾値セットを含む。
【０２６７】
本発明の一具現例によると、多重ベースライン閾値セットは、少なくとも一つの固定ベースライン閾値セット及び少なくとも一つの可変ベースライン閾値セットを含む。
【０２６８】
本発明の一具現例によると、多重ベースライン閾値セットは、少なくとも二つのベースライン閾値セットを含み、前記少なくとも二つのベースライン閾値セットは、すべて固定ベースライン閾値セットである。
【０２６９】
本発明の一具現例によると、多重ベースライン閾値セットの各ベースライン閾値セットは、対応する閾値基準を有する。
【０２７０】
本発明の一具現例によると、多重ベースライン閾値セットは、同時に分析対象データセットに適用することができる。閾値基準を満足する複数のサイクルが観察される場合、すべてがまたはその一部が分析に使用できる。
【０２７１】
本発明の一具現例によると、多重ベースライン閾値セットは、順次に分析対象データセットに適用することができる。最初に適用されたベースライン閾値セットの閾値基準を満足するサイクルがない場合、また他のベースライン閾値セットが適用される。
【０２７２】
本発明の一具現例によると、ベースライン閾値セットがデータセットに適用されて、追加的なベースライン閾値セットがサイクルの少なくとも一つのサイクルに適用できる。
【０２７３】
本発明の一具現例によると、ベースライン領域のエンドポイントサイクルは、以下の段階を含む方法によって決定できる；
（ａ）各サイクルにベースライン閾値を適用する段階と、
（ｂ）少なくとも一つのサイクルに追加ベースライン閾値を適用する段階と、
（ｃ）各ベースライン閾値によって決定されたベースライン閾値基準を満足する１つ以上のサイクルを確認する段階と、
（ｄ）前記段階（ｃ）で確認されたサイクルを使用してベースライン領域のエンドポイントサイクルを決定する段階。
【０２７４】
段階（ａ）のベースラインの閾値は、正常的な増幅結果のエンドポイント決定のために適用される。
【０２７５】
段階（ｂ）の追加的なベースライン閾値は、段階（ａ）のベースライン閾値によって決定された主閾値基準（ｍａｉｎ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ）を満足するサイクルがない、非正常的な増幅結果に適用される。
【０２７６】
さらに具体的に、閾値基準を満足するサイクルは、以下の方法で確認される；ｎ番目サイクルの差引結果の符号が（ｎ−１）番目サイクルの差引結果の符号と相異なる場合、ｎ番目サイクルは、閾値基準を満足するものである。前記差引結果は、信号値から閾値を差し引いた結果である。
【０２７７】
エンドポイントサイクルを決定するために、さまざまなデータセットが使用できる。適切な閾値及び決定方法は、データセットの種類に応じて選択できる。当業者は、本発明の方法を、上述の傾きデータセットの具現例及び実施例の指示および方向に基づいて、多様なデータセットの分析に利用することができる。
【０２７８】
段階（ｃ）：最適ライン関数の算出（Ｓ１３０）
ベースライン領域の決定に続いて、ベースライン領域の最適ライン関数が、ベースライン領域内生データセットの二つ以上のデータポイントから計算される。
【０２７９】
最適ライン関数は、データにあらわれた傾向を最もよく表す関数を意味する。最適ラインは、前記最適ライン関数をプロットして得られたグラフを意味する。
【０２８０】
最適ライン関数は、ベースライン領域内の少なくとも二つのデータポイントを使用して求めることができる。例えば、ベースライン領域の一部またはすべての地域のデータポイントを使用して求めることができる。
【０２８１】
最適ライン関数は、様々な方法で求めることができる。例えば、ベースライン領域内のデータポイントを使用した線形回帰分析（ｌｉｎｅａｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）またはＬＭＳ（ｌｅａｓｔ  ｍｅａｎ  ｓｑｕａｒｅ）アルゴリズムによって求めることができる。
【０２８２】
特に、線形回帰の１次方程式、‘ｙ＝ｍｘ＋ｂ’で表示される最適ライン関数は、スタートポイントサイクルからエンドポイントサイクルまでのデータポイントを使用して求めることができる。
【０２８３】
図４Ａに示されたように、最適ライン傾きの‘ｍ’及び最適ラインのｙ軸切片の‘ｂ’は、下記数学式２及び３によって計算することができる。
【０２８４】
【数３】
0006602374.tif 000004
【数４】
0006602374.tif 000005
（前記数学式２及び３において、
【数５】
0006602374.tif 000006
であり、ｍは、最適ラインの傾きであって、ｂは、ｙ軸切片であり、Ｘｉは、ｉ番目サイクルのサイクル番号であって、ｙｉは、ｉ番目サイクルで測定された信号値であり、Ｓは、ベースライン領域のスタートポイントサイクルであって、Ｅは、ベースライン領域のエンドポイントサイクルであり、ｎは、Ｅ−Ｓ＋１である。）
【０２８５】
段階（ｄ）：補正されたデータセットの収得（Ｓ１４０）
補正されたデータセットは、生データセットの信号値から最適信号関数の値を差し引いて得られる。前記得られたデータセットは、（ｉ）増幅反応の増幅信号値及び（ｉｉ）減算された結果を含む。
【０２８６】
本発明の一具現例によると、前記段階（ａ）は、第１増幅曲線を得るために、生データセットをプロットする段階をさらに含み、前記段階（ｄ）は、補正された増幅曲線を得るために、補正されたデータセットをプロットする段階をさらに含む。
【０２８７】
補正された増幅曲線（第２増幅曲線）は、補正前の増幅曲線（第１増幅曲線）から最適ラインを差し引いて得ることができる。図５に示したように、生データセットの信号値から、最適ライン関数から計算された値を差し引いて、補正されたデータセット及び補正された増幅曲線を収得する。
【０２８８】
本発明の一具現例によると、生データセットの補正は、最適ライン関数で算出された値を、ベースライン領域だけでなく、ベースライン領域ではないその他の領域でも差し引くことを含む。例えば、すべてのサイクルに対して生データセットを得て、生データセットの信号値から最適ライン関数の値を差し引いて補正されたデータセットを求め、続いて前記補正されたデータセットをプロットし、補正された増幅曲線を得ることができる。または、ベースライン領域に属するサイクルの生データセットを得て、最適ライン関数及び補正されたデータセットを得て、他のサイクルに対しては、サイクルから信号発生の度に生データセットを得て、前記生データセットから最適ライン関数による該サイクルに対応する値を差し引いて、補正されたデータセットを得て、これをプロットし、補正された増幅曲線を得ることができる。
【０２８９】
ＩＩＩ．記録媒体、装置及びコンピュータプログラム
以下、記載された本発明の記録媒体、装置およびコンピュータプログラムは、本発明の方法をコンピュータで実行するためのものであるため、その共通する内容は、明細書の複雑性を避けるために省く。
【０２９０】
本発明の一様態によると、本発明は、以下の段階を含む、試料を分析する方法を実行させるためのプロセッサを具現する指示を含む、コンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供する；
（ａ）サイクルにおける信号値を提供するために、前記試料を使用する信号発生反応のそれぞれのサイクルにおける信号値を収得する段階と、
（ｂ）それぞれのサイクルに閾値を適用し、複数の閾値をサイクルに適用する段階（前記サイクルの少なくとも二つのサイクルの閾値は、互いに異なっている）と、
（ｃ）閾値のそれぞれにより定められる閾値基準を満足する一つ以上のサイクルを確認する段階と、
（ｄ）前記段階（ｃ）で確認されたサイクルを使用して試料を分析する段階。
【０２９１】
本発明の一具現例によると、前記信号発生反応は、試料内の分析物質の存在に依存的に信号を発生する。この際、前記分析物質は、標的核酸分子であり、前記信号発生反応は、標的核酸分子の増幅を伴うか、あるいは伴わない反応であって、前記標的核酸分子の増幅を伴う反応は、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。
【０２９２】
本発明の一具現例によると、前記信号発生反応は、リアルタイムＰＣＲであって、信号値は、前記リアルタイムＰＣＲにより発生された信号値が数学的に変形された値であり、前記数学的に変形された値は、サイクルに対して信号値を微分した値である。
【０２９３】
本発明の一具現例によると、前記閾値は、閾値変化サイクル（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅｄ  ｃｙｃｌｅ、ＴＣＣ）を基準に、前記ＴＣＣ以前のサイクル及びこれらに適用される閾値の集合によって形成された関数と、前記ＴＣＣ以後のサイクル及びこれらに適用される閾値の集合によって形成された関数とが互いに異なるように決定される。
【０２９４】
本発明の他の一様態によると、本発明は、以下の段階を含む、信号発生手段の存在下で行われた増幅反応から得た生データセット（ｒａｗ  ｄａｔａ  ｓｅｔ）を補正する方法を実行させるためのプロセッサを具現する指示を含む、コンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供する；
（ａ）（ｉ）前記増幅反応における増幅サイクル及び（ｉｉ）前記信号発生手段から得た前記増幅サイクルにおける信号値を含む生データセットを収得する段階と、
（ｂ）前記生データセットからベースラインスタートポイントサイクルとエンドポイントサイクルを決定して、ベースライン領域を決定する段階と、
（ｃ）前記決定されたベースライン領域内生データセットの二つ以上のデータポイントからベースライン領域の最適ライン関数を算出する段階と、
（ｄ）前記生データセットの信号値から前記ベースライン領域の最適ライン関数により計算された関数値を差し引き、補正されたデータセットを収得する段階（前記補正されたデータセットは、（ｉ）増幅反応の増幅サイクル及び（ｉｉ）前記差し引いた結果を含む）。
【０２９５】
本発明の一具現例によると、前記段階（ｂ）においてベースライン領域のエンドポイントサイクルは、以下の段階を含む方法により決定される；
（ｂ１）それぞれの増幅サイクルにベースライン閾値を適用して、複数の閾値をサイクルに適用する段階（前記サイクルの少なくとも二つのサイクルのベースライン閾値は、互いに異なっている）、（ｂ２）ベースライン閾値のそれぞれによって決定される閾値基準を満足する一つ以上のサイクルを確認する段階と、（ｂ３）前記段階（ｂ２）で確認されたサイクルを使用してベースライン領域のエンドポイントサイクルを決定する段階。
【０２９６】
本発明の一具現例によると、前記段階（ｂ１）の傾きは、特定サイクルにおけるデータポイント及び前記特定サイクルの以前および／または以後のサイクルの少なくとも一つのデータポイントを利用した最小二乗法によって計算することができる。
【０２９７】
本発明の一具現例によると、本発明は、以下の段階を含む、試料を分析する方法を実行するためのプロセッサを具現する、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に格納されたコンピュータプログラムを提供する；
（ａ）サイクルにおける信号値を提供するために、前記試料を使用する信号発生反応のそれぞれのサイクルにおける信号値を収得する段階と、
（ｂ）それぞれのサイクルに閾値を適用し、複数の閾値をサイクルに適用する段階（前記サイクルの少なくとも二つのサイクルの閾値は、互いに異なっている）と、
（ｃ）閾値のそれぞれによって定められる閾値基準を満足する一つ以上のサイクルを確認する段階と、
（ｄ）前記段階（ｃ）で確認されたサイクルを使用して試料を分析する段階。
【０２９８】
本発明の一具現例によると、前記信号発生反応は、試料内の分析物質の存在に依存的に信号を発生させ、前記の分析物質は、標的核酸分子であり、前記信号発生反応は、標的核酸分子の増幅を伴うかあるいは伴わない反応であって、前記標的核酸分子の増幅を伴う反応は、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。
【０２９９】
本発明の一具現例によると、前記信号発生反応は、リアルタイムＰＣＲであり、信号値は、前記リアルタイムＰＣＲにより発生された信号値が数学的に変形された値であって、前記数学的に変形された値は、サイクルに対して信号値を微分した値である。
【０３００】
本発明の一具現例によると、前記閾値は、閾値変化サイクル（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅｄ  ｃｙｃｌｅ、ＴＣＣ）を基準に、前記ＴＣＣ以前のサイクル及びこれらに適用される閾値の集合によって形成された関数と、前記ＴＣＣ以後のサイクル及びこれらに適用される閾値の集合によって形成された関数とが互いに異なるように決定される。
【０３０１】
本発明の他の一様態によると、本発明は、以下の段階を含む、信号発生手段の存在下で行われた増幅反応から得た生データセットを補正する方法を実行するためのプロセッサを具現する、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に格納されたコンピュータプログラムを提供する；
（ａ）（ｉ）前記増幅反応における増幅サイクル及び（ｉｉ）前記信号発生手段から得た前記増幅サイクルにおける信号値を含む生データセットを収得する段階と、
（ｂ）前記生データセットからベースラインスタートポイントサイクルとエンドポイントサイクルを決定して、ベースライン領域を決定する段階と、
（ｃ）前記決定されたベースライン領域内生データセットの二つ以上のデータポイントからベースライン領域の最適ライン関数を算出する段階と、
（ｄ）前記生データセットの信号値から前記ベースライン領域の最適ライン関数により計算された関数値を差し引き、補正されたデータセットを収得する段階（前記補正されたデータセットは、（ｉ）増幅反応の増幅サイクル及び（ｉｉ）前記差し引いた結果を含む）。
【０３０２】
本発明の一具現例によると、前記信号発生手段の存在下で行われた増幅反応から得た生データセットを補正する方法を実行するためのプロセッサを具現する、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に格納されたコンピュータプログラムを提供する。
【０３０３】
本発明の一具現例によると、前記段階（ｂ）においてベースライン領域のエンドポイントサイクルは、以下の段階を含む方法により決定される；
（ｂ１）それぞれの増幅サイクルにベースライン閾値を適用して、複数の閾値をサイクルに適用する段階（前記サイクルの少なくとも二つのサイクルのベースライン閾値は、互いに異なっている）、（ｂ２）ベースライン閾値のそれぞれによって決定される閾値基準を満足する一つ以上のサイクルを確認する段階と、（ｂ３）前記段階（ｂ２）で確認されたサイクルを使用してベースライン領域のエンドポイントサイクルを決定する段階。
【０３０４】
本発明の一具現例によると、前記段階（ｂ１）の傾きは、特定サイクルにおけるデータポイント及び前記特定サイクルの以前および／または以後のサイクルの少なくとも一つのデータポイントを利用した最小二乗法によって計算することができる。
【０３０５】
前記プログラム指示は、プロセッサによって実行される場合、プロセッサが上述の本発明の方法を実行するように運営できる。試料分析方法を実行するためのプログラム指示は、サイクルにおける信号値を提供するために、前記試料を使用する信号発生反応のそれぞれのサイクルにおける信号値を収得する指示と、それぞれのサイクルに閾値を適用して、閾値のそれぞれによって決定される閾値基準を満足する一つ以上のサイクルを確認する指示と、前記確認されたサイクルを使用して試料を分析する指示とを含む。増幅反応から得られた生データセットを補正する方法を実行するためのプログラム指示は、生データセットを収得する指示と、前記生データセットから、ベースラインスタートポイントサイクルとエンドポイントサイクルを決定してベースライン領域を決定し、前記ベースライン領域の最適ライン関数を算出する指示と、前記生データセットの信号値から、前記ベースライン領域の最適ライン関数によって計算された関数値を差し引いて、補正されたデータセットを収得する指示とを含む。
【０３０６】
本発明の方法は、プロセッサで実行され、前記プロセッサは、スタンドアロンコンピュータ、ネットワーク付きコンピュータまたはリアルタイムＰＣＲ装置のようなデータ収得装置のプロセッサである。
【０３０７】
コンピュータ読み取り可能な記録媒体は、当業界に公知された様々な記憶媒体、例えば、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、フラッシュメモリ、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスクドライブ、ポータブルＨＤＤ、ＵＳＢ、磁気テープ、ＭＩＮＩＤＩＳＣ、不揮発性のメモリカード、ＥＥＰＲＯＭ、光学ディスク、光学記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、システムメモリ、およびウェブサーバーを含むが、これらに限定されるものではない。
【０３０８】
データポイント（例えば、信号強度及び増幅サイクル）は、多様な方式でで収集することができる。たとえば、データポイントは、ＰＣＲデータ収集装置にあるプロセッサによって収集できる。データポイントは、収得され次第実時間でプロセッサに提供できて、または、メモリユニットまたはバッファに格納され、実験終了後、プロセッサに提供することができる。同様に、データセットは、前記収集装置とのネットワーク接続（例えば、ＬＡＮ、ＶＰＮ、インターネットおよびイントラネット）または直接接続（例えば、ＵＳＢまたは他の直接有線接続または無線接続）によってデスクトップコンピュータシステムなどの別のシステムに提供でき、またはＣＤ、ＤＶＤ、フロッピー（登録商標）ディスクおよびポータブルＨＤＤのようなポータブルメディア上に提供することができる。同様に、データセットは、ノートブックまたはデスクトップコンピュータシステムなどのクライアントにネットワーク接続（例えば、ＬＡＮ、ＶＰＮ、インターネット、イントラネットおよび無線通信ネットワーク）を介してサーバシステムに提供することができる。
【０３０９】
データポイントが受信されるか得られた後、試料を分析するか、増幅反応の補正されたデータセットを得るためのデータ分析プロセスが進行される。例えば、試料分析のためのプロセッサは、各閾値によって決定された閾値基準を満足する一つまたはそれ以上のサイクルを確認するために、受信されたデータポイントを分析する。増幅反応の補正されたデータセットを得るためのプロセッサは、ベースライン領域を決定し、ベースライン領域の最適ライン関数を算出して、生データセットの信号値から、最適ライン関数によって計算された関数値を差し引き、補正されたデータセットを収得するために、受信されたデータポイントを分析する。
【０３１０】
本発明を実行するためのプロセッサを具現する指示は、ロジックシステムに含まれる。前記指示は、たとえポータブルＨＤＤ、ＵＳＢ、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ及びＤＶＤのようなソフトウェア記録媒体に提供できるが、メモリモジュール（例えば、ハードドライブ、またはローカルまたは付着ＲＡＭまたはＲＯＭのような他のメモリ）にダウンロード及び格納できる。本発明を実行するコンピュータコードは、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ、ＶＢＳｃｒｉｐｔ、ＪａｖａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）、Ｐｅｒｌ及びＸＭＬのような多様なコーディング言語で実行できる。また、多様な言語及びプロトコルは、本発明によるデータと命令の外部及び内部記憶と伝達に利用できる。
【０３１１】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、（ａ）コンピュータプロセッサ、および（ｂ）前記コンピュータプロセッサにカップリングされた前記本発明のコンピュータ読み取り可能な記録媒体を含む、試料を分析する装置を提供する。
【０３１２】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、（ａ）コンピュータプロセッサ、および（ｂ）前記コンピュータプロセッサにカップリングされた前記本発明のコンピュータ読み取り可能な記録媒体を含む、信号発生手段の存在下で行われた増幅反応の生データセットを補正する装置を提供する。
【０３１３】
本発明の一具現例によると、前記装置は、試料及び信号発生手段を収容できる反応容器、前記反応容器の温度を調節する温度調節手段及び／または増幅サイクルにおける信号を検出する検出器をさらに含むことができる。
【０３１４】
本発明の一具現例によると、前記コンピュータのプロセッサは、サイクルにおける信号値を受信するだけでなく、試料を分析するか、増幅反応の補正されたデータセットを得る。
【０３１５】
前記プロセッサは、一つのプロセッサが下記二つのパフォーマンスを実行するように構築することができる：データポイントの受信及び試料の分析や補正されたデータセットを収得。
【０３１６】
または、プロセッサユニットは、二つのプロセッサが前記二つのパフォーマンスをそれぞれ実行するように構築することができる。
【０３１７】
本発明の一具現例によると、プロセッサは、標的分析物質（例えば、標的核酸分子）の検出に用いられる従来の装置（例えば、リアルタイムＰＣＲ装置）にソフトウェアをインストールして具現することができる。
【０３１８】
図６は、増幅反応の生データセットを補正するための本発明の一実施例に最適化されたリアルタイムＰＣＲシステムを示している。前記システムは、リアルタイムＰＣＲ増幅を実行するためのリアルタイムＰＣＲ装置１１０、生データセットを補正し、補正された結果をディスプレイするために、ケーブル１３０を介して前記リアルタイムＰＣＲ装置１１０に連結されたロジックシステムのコンピュータシステム１２０を含む。前記コンピュータシステム１２０は、補正結果をユーザーのニーズに応じてグラフ、テーブル（表）及びワードなど、様々な形でディスプレイすることができる。前記コンピュータシステムは、増幅反応の増幅曲線を補正するための本発明の方法を実行するための、コンピュータ読み取り可能な記録媒体を含む。前記リアルタイムＰＣＲ装置１１０及び前記コンピュータシステム１２０は、システムに統合することができる。
【０３１９】
増幅曲線に関するデータポイント（例えば、信号強度及び増幅サイクル）は、多様な方法で収集できる。たとえば、データポイントは、リアルタイムＰＣＲ装置１１０のデータ収集装置内のプロセッサによって受信し収集することができる。データセットは、実時間でプロセッサに提供されるか、またはメモリユニットまたはバッファに格納されて、実験終了後、プロセッサに提供される。
【０３２０】
同様に、データセットは、ネットワーク接続（例えば、ＬＡＮ、ＶＰＮ、インターネット及びイントラネット）または直接接続（例えば、ＵＳＢまたは他の直接有線接続または無線接続）によって、またはＣＤ、ＤＶＤ、フロッピー（登録商標）ディスクおよびポータブルＨＤＤのようなポータブルメディアを介して、リアルタイムＰＣＲ装置１１０からデスクトップコンピュータシステムのようなコンピュータシステム１２０に提供できる。同様に、データセットは、ノートブックまたはデスクトップコンピュータシステムのようなクライアントにネットワーク接続（例えば、ＬＡＮ、ＶＰＮ、インターネット、イントラネット、および無線通信ネットワーク）を介してサーバシステムに提供できる。
【０３２１】
データセットが受信されて得られた後、データ分析プロセッサは、補正された増幅曲線を反映するデータセットを準備する。
【０３２２】
増幅曲線の補正は、コンピュータシステム１２０にインストールされているアプリケーション（つまり、プログラム）によって実行できる。択一的に、増幅曲線の補正は、コンピュータシステム１２０の運営システムにおいて、前記アプリケーションが運営できるコンピュータシステム１２０にアプリケーションストアサーバーまたはアプリケーションプロバイダサーバを介して直接インストールされたアプリケーションによって作られる。前記運営システムは、Ｗｉｎｄｏｗ、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈおよびスマートフォンや、タブレットＰＣのようなモバイル端末にインストールされるｉＯＳ及びアンドロイドのようなモバイル運営システムを含む。
【０３２３】
上述のように、本発明の増幅曲線補正方法は、供給者がインストールした、またはユーザーが直接インストールしたアプリケーション（即ち、プログラム）によってコンピュータシステム１２０に具現でき、コンピュータ読み取り可能な記録媒体１２２に記録されえる。
【０３２４】
本発明の増幅曲線を補正するための方法が具現されたコンピュータプログラム１２４は、前記補正のためのすべての機能を具現することができる。前記コンピュータプログラム１２４は、本発明の方法を実行するように具現されたコンピュータ読み取り可能な記録媒体に格納されたプログラム指示を含めたプログラムである。
【０３２５】
コンピュータプログラム１２４は、Ｃ、Ｃ＋＋、ＪＡＶＡ（登録商標）、Ｖｉｓｕａｌ  ｂａｓｉｃ、ＶＢＳｃｒｉｐｔ、ＪａｖａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）、Ｐｅｒｌ、ＸＭＬ及び機械語などの適切なコンピュータ言語を使用してコードすることができる。前記プログラムコードは、前記言及された数学的関数に対する関数コード及びコンピュータシステム１２０のプロセッサによって順番にプロセスを移行するための制御コードを含む。
【０３２６】
前記コードは、プロセッサによって、上述した機能の移行に必要な追加情報またはメディアが、コンピュータシステム１２０の内蔵または外付けメモリのどの位置（アドレス）で参照されるかに対するメモリ参照コードをさらに含む。
【０３２７】
コンピュータシステム１２０がプロセッサの機能の実行のために、他のコンピュータまたはサーバーとリモートで通信が必要な場合、前記コードは、プロセッサがどのように通信モジュール（例えば、有線および／または無線通信モジュール）を使用して他のコンピュータまたはサーバーとリモートで通信するか、または通信時、どのような情報またはメディアを伝達するかに対する通信関連コードをさらに含むことができる。
【０３２８】
本発明の具現のための機能的プログラム及びコード（コードセグメント）は、コンピュータが読み取るストレージメディア及び実行プログラムなど、システム環境を考慮して、当業界のプログラマによって容易に推論または修正できる。
【０３２９】
記録媒体１２２が配布されて、コンピュータで読み取り可能なコードが記憶されて、配布形式で実行される。このような場合、複数の配布されたコンピュータのうち、少なくとも一つのコンピュータに、前記記録媒体１２２は、ネットワークで接続されたコンピュータシステムに分散でき、噴射方式で、コンピュータ読み取り可能なコードが保存されて、実行できる。このような場合、複数の分散されたコンピュータのうち、少なくとも一つのコンピュータは、前記機能の一部を実行して、その実行結果を少なくとも一つのコンピュータに伝達し、結果が伝達されたコンピュータも前記機能の一部を実行して、その結果を少なくとも一つの他のコンピュータに提供する。
【０３３０】
本発明の実行のためのアプリケーション（つまり、プログラム）の記録された記録媒体１２２は、アプリケーションストアサーバーまたはアプリケーションプロバイダサーバーに含まれた記録媒体（例えば、ハードディスク）、またはアプリケーションプロバイダサーバそのものであるか、プログラムを記録した別のコンピュータ及びその記録媒体でありえる。
【０３３１】
記録媒体１２２を読み取り可能なコンピュータシステム１２０は、一般的なデスクトップやノート型パソコンなどの一般ＰＣだけではなく、スマートフォン、タブレットＰＣ、ＰＣＡ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ａｓｓｉｓｔａｎｔｓ）及び移動通信端末などのモバイル端末を含み、コンピューティング可能なあらゆるデバイスを含む。
【０３３２】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【実施例】
【０３３３】
実施例１：増幅曲線の補正
図６に示されたリアルタイムＰＣＲシステムを使用して、増幅曲線の傾き曲線及びベースライン閾値から得たベースライン領域の最適ラインによって増幅曲線を補正することができるかを確認した。
【０３３４】
生データセット（補正前の増幅曲線）の収得（Ｓ１１０）
アップストリームプライマーとダウンストリームプライマーの伸長およびＴａｑＭａｎプローブの切断のために、５’ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素を使用した。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）のゲノムＤＮＡを標的核酸配列として使用した。
【０３３５】
ＮＧの検出のために、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲを使用した。標的核酸が存在すると、ＴａｑＭａｎプローブが切断されて、標識された断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）が放出される。増幅曲線は、標識された断片からの信号を測定して得られる。
【０３３６】
ＮＧに対するＴａｑＭａｎプローブは、５’末端に蛍光レポーター分子（Ｃａｌ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０）を標識して、３’末端にクエンチャー分子（ＢＨＱ−２）を標識した（配列番号：３）。
【０３３７】
本実施例で使用されてアップストリームプライマー、ダウンストリームプライマー、およびプローブの配列は、以下の通りである：
ＮＧ−Ｆ  ５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴＩＩＩＩＩＧＴＡＡＴＣＡＧＡＴＧ−３’（配列番号：１）
ＮＧ−Ｒ  ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣＩＩＩＩＩＣＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣ−３’（配列番号：２）
ＮＧ−Ｐ  ５’−［Ｃａｌ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０］ＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［ＢＨＱ−２］−３’（配列番号：３）
（Ｉ：Ｄｅｏｘｙｉｎｏｓｉｎｅ、ＢＨＱ−２：Ｂｌａｃｋ  ｈｏｌｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ−２）
【０３３８】
リアルタイムＰＣＲは、標的核酸（１０ｐｇ、１ｐｇ、１００ｆｇ、１０ｆｇ、または１ｆｇのＮＧゲノムＤＮＡ）、ＮＧ標的増幅のための５ｐｍｏｌｅのアップストリームプライマー（配列番号：１）と５ｐｍｏｌｅのダウンストリームプライマー（配列番号：２）、３ｐｍｏｌｅのＴａｑＭａｎプローブ（配列番号：３）、および５μｌの４×マスターミックス（Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）［最終、２００μＭ  ｄＮＴＰｓ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ＵのＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素］を含む最終的な容量２０μｌの反応混合液で行った。前記反応混合液を含むチューブをリアルタイムＰＣＲ装置（ＣＦＸ９６ＴＭ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、５０℃で５分間放置して、次いで９５℃で１５分間変性させた後、９５℃で３０秒間、６０℃で６０秒間および７２℃で３０秒間行われるサイクルを５０回繰り返した。信号検出は、各サイクルごとに６０℃で行った。
【０３３９】
生データセットは、リアルタイムＰＣＲ増幅によって得て、補正前の増幅曲線は、生データセットを使用してプロットした（図２参照）。
【０３４０】
補正前の増幅曲線は、以下のように補正した。
【０３４１】
ベースライン領域の決定（Ｓ１２０）
増幅反応の３番目のサイクルをベースライン領域のスタートポイントサイクル（５）に設定した。
【０３４２】
ベースライン領域のエンドポイントサイクル（Ｅ）を決定するために、数学式１で表される最小二乗法（Ｌｅａｓｔ  Ｓｑｕａｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄ）を使用した線形回帰分析（Ｌｉｎｅａｒ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、ＬＲＡ）を生データに対して行い、傾き曲線を得た。この際、ｉ番目のサイクルにおける傾き値を算出するために、ｉ−１、ｉ、ｉ＋１の３つのサイクルに対応するデータを使用した（つまり、ａ＝１及びｂ＝１）。
【０３４３】
傾き曲線でピークが生成される前の初期サイクルにおける背景信号（Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｓｉｇｎａｌ）と交差しないように、ベースライン閾値（Ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を‘２０’に設定した。ベースライン閾値と傾き曲線との最初のクロスポイント（ｃｒｏｓｓ−ｐｏｉｎｔ、ＣＰ）のサイクルをエンドポイントサイクル（Ｅ）に決定して、最終的にベースライン領域を決定した（図３参照）。
【０３４４】
ベースライン領域の最適ライン関数の算出（Ｓ１３０）
前記決定されたベースライン領域のスタートポイントサイクル（Ｓ）からエンドポイントサイクル（Ｅ）まで各サイクルのデータを利用し、最小二乗法により回帰直線の１次線形方程式形態の最適ライン関数を算出した（図４Ａ参照）。
【０３４５】
算出される線形回帰線１次線形方程式の一般式は、‘ｙ＝ｍｘ＋ｂ’であり、ここで傾きを示す‘ｍ’は、上述の数学式２によって算出し、ｙ軸切片を示す‘ｂ’は、上述の数学式３によって算出した。その結果、算出された線形回帰線の１次線形方程式形態の最適ライン関数は、‘ｙ＝２．５１２ｘ＋２３９６．４’である。
【０３４６】
補正されたデータセット（補正された増幅曲線）の収得（Ｓ１４０）
補正前の増幅曲線全体１〜５０サイクルから前記算出した最適ライン関数値を差し引いて、補正されたデータセットを収得し、補正された増幅曲線を得するために、前記補正されたデータセットをプロット（ｐｌｏｔｔｉｎｇ）した。
【０３４７】
図４Ｂは、図２のベースライン領域の生データセットの各サイクルのデータ（測定された信号値）からベースライン領域の最適ライン関数によるデータ（関数値）を差し引いて得られた、補正されたデータセットを示す。
【０３４８】
図５は、前記補正されたデータセットをプロットして得られた、補正された増幅曲線を示す。
【０３４９】
本発明の方法は、単純なアルゴリズムを使用して増幅曲線の補正を行うことができるため、本発明は、測定された試料及び測定機器に対する特定条件をさらに簡単な方法で最適化することが可能である。
【０３５０】
実施例：増幅曲線の補正（ＩＩ）
リアルタイム重合酵素連鎖反応を行って得られた増幅曲線を補正するためのベースライン領域決定における誤りを除去することができるかどうか確認した。
【０３５１】
アップストリームプライマーとダウンストリームプライマーの伸長およびＴａｑＭａｎプローブの切断のために、５’ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素を使用した。インフルエンザＡウイルス（Ｆｌｕ  Ａ）のゲノムＤＮＡを標的核酸配列として使用した。
【０３５２】
ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲを使用してＦｌｕ  Ａを検出した。標的核酸が存在すると、ＴａｑＭａｎプローブが切断されて、標識された断片が放出される。増幅曲線は、標識された断片からの信号を測定して得ることができる。
【０３５３】
Ｆｌｕ  Ａに対するＴａｑＭａｎプローブは、５’末端に蛍光レポーター分子（ＦＡＭ）を標識して、３’末端にクエンチャー分子（ＢＨＱ−１）を標識した（配列番号：６）。
【０３５４】
本実施例で使用されたアップストリームプライマー、ダウンストリームプライマー、およびプローブの配列は、以下の通りである：
Ｆｌｕ  Ａ−Ｆ５’−ＴＧＧＡＡＴＧＧＣＴＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＣＣＩＩＩＩＩＴＧＴＣＡＣＣＴＣＴ−３’（配列番号：４）
Ｆｌｕ  Ａ−Ｒ５’−ＣＡＴＣＣＴＧＴＴＧＴＡＴＡＴＧＡＧＧＣＣＣＡＴＩＩＩＩＣＴＧＧＣＡＡＧ−３’（配列番号：５）
Ｆｌｕ  Ａ−Ｐ５’−［ＦＡＭ］ＣＴＣＡＣＴＧＧＧＣＡＣＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡ［ＢＨＱ−１］−３’（配列番号：６）
（Ｉ：Ｄｅｏｘｙｉｎｏｓｉｎｅ、ＢＨＱ−１：Ｂｌａｃｋ  ｈｏｌｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ−１）
【０３５５】
リアルタイムＰＣＲは、標的核酸（抽出したＦｌｕ  ＡゲノムＲＮＡの１０−３、１０−４、１０−５、または１０−６希釈）、Ｆｌｕ  Ａ標的増幅のための５ｐｍｏｌｅのアップストリームプライマー（配列番号：４）及び５ｐｍｏｌｅのダウンストリームプライマー（配列番号：５）、３ｐｍｏｌｅのＴａｑＭａｎプローブ（配列番号：６）、及び５μｌの５×ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液［７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ］及び２μｌの酵素混合物［最終、３．５ＵのＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素、２５ＵのＭＭＬＶ逆転写酵素、５ＵのＲＮａｓｅ抑制剤］を含む最終容量２５μｌの反応混合液で行った。前記反応混合液を含むチューブをリアルタイムＰＣＲ装置（ＣＦＸ９６ＴＭ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、５０℃で２０分間放置し、次いで９５℃で１５分間変性させた後、９５℃で１０秒間、６０℃で６０秒間および７２℃で１０秒間行われるサイクルを４５回繰り返した。信号検出は、各サイクルごとに６０℃で行った。
【０３５６】
ベースライン領域の決定段階（Ｓ１２０）での誤りの確認
ベースライン領域のエンドポイントサイクル（Ｅ）は、増幅反応で、実際標的信号強度の増加が始まるサイクルまたはこのサイクルに近接したサイクルに決定することができる。
【０３５７】
ベースライン領域のエンドポイントサイクルは、各サイクルで計算される傾き及び各サイクルにおける閾値を全部考慮して決定することができる。この場合、ベースライン閾値は、実施例１のように、すべての増幅サイクルに対して適用することができる。しかし、このような接近法は、ベースライン領域を決定する際、誤りを発生させるおそれがある（図７参照）。
【０３５８】
例えば、ベースライン閾値を‘３０’のように低く設定する場合、実際標的信号強度が増加し始めるポイントではなく、初期ノイズ信号が発生したポイントがベースライン領域のエンドポイントサイクルに決定されることがあって、ベースライン領域決定誤りが発生する可能性がある。一方、このような誤りを回避するために、ベースライン閾値を‘３００’のように高く設定すると、低濃度の標的配列を含む試料（すなわち、傾き値が低い試料）からは、実際標的信号強度が増加し始めるポイントが検出されず、これも同様にベースライン領域決定に誤りが発生するおそれがある。
【０３５９】
このように、ベースライン領域決定誤りにより、正確な実際増幅産物の量が反映されていない、補正された増幅曲線が得られる可能性がある。
【０３６０】
ＭＢＥＣ方法によるエンドポイントのサイクルの決定
増幅反応の３番目のサイクルをベースライン領域のスタートポイントサイクル（Ｓ）に設定した。
【０３６１】
図８Ａ及び図８Ｂに示すように、傾き曲線でエンドポイントサイクルは、最小ベースラインエンドポイントサイクル（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ  ｃｙｃｌｅ、ＭＢＥＣ）以後のサイクルに決定できる。実施例２において、１０番目のサイクルがＭＢＥＣに決定された。
【０３６２】
図８Ａ（高濃度試料）及び図８Ｂ（低濃度試料）で示されたように、ＭＢＥＣを適用しないと、エンドポイントサイクルがベースライン閾値と傾き曲線間の最初のクロスポイント（ＣＰ１）のサイクルに指定されて、ベースライン領域（Ｂ１）は、３〜７サイクル領域（高濃度試料）または３〜４サイクル領域（低濃度試料）に決定される。一方、ＭＢＥＣを適用すると、ＭＢＥＣを超える領域における最初のクロスポイント（ＣＰ２）のサイクルがエンドポイントサイクルに指定されて、ベースライン領域（Ｂ２）は、３〜２９サイクル領域（高濃度試料）または３〜３８サイクル領域（低濃度試料）に決定される。
【０３６３】
図８Ｃに示されたように、ベースライン閾値を‘３０’に決定して、ＭＢＥＣを適用しないと、補正された増幅曲線から増幅産物の量を不正確に反映するか、偽陰性結果と解釈される。しかし、ベースライン閾値を‘３０’に決定して、ＭＢＥＣを適用すると、補正された増幅曲線は、増幅産物の量を正確に反映するようになる。
【０３６４】
このように、増幅反応の初期サイクルで頻繁に発見されるノイズ信号により、このような初期ノイズ信号が発生するポイントがベースライン領域のエンドポイントサイクルに誤って決定されることがあり、ベースライン決定誤りが発生する。
【０３６５】
前記結果によって、ベースライン領域の決定（Ｓ１２０）誤りは、本発明の方法により成功的に除去できることを確認した。
【０３６６】
ＶＢＴ（Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｂａｓｅｌｉｎｅ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）方法によるエンドポイントサイクルの決定
実施例２で使用したＶＢＴ（可変ベースライン閾値）方法は、ベースライン閾値−変化サイクル（ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅｄ  ｃｙｃｌｅ、ＢＴＣＣ）を決定し、互いに異なるベースライン閾値を前記ＢＴＣＣ前と後のサイクルにそれぞれ適用する方式で行う。
【０３６７】
ＢＴＣＣを２０サイクルに決定し、第１のＢＴ（ベースライン閾値）を１〜２０サイクルに適用し、第２のＢＴを２１〜４５サイクルにそれぞれ相異に適用した。第１のＢＴは‘３００’に決定し、第２のＢＴは‘３０’に決定した。
【０３６８】
図１０Ａ（高濃度試料）及び図１０Ｂ（低濃度試料）に示されたように、ＶＢＴを適用せずに、固定ベースライン閾値を‘３０’にして、全てのサイクルに適用したとき、高濃度試料の場合、エンドポイントサイクル（Ｅ１）は、７サイクルに決定されるか、または低濃度試料の場合、エンドポイントサイクル（Ｅ１）は、４サイクルに決定された。
【０３６９】
増幅反応の３番目のサイクルをベースライン領域のスタートポイントサイクル（Ｓ）に決定すると、ベースライン領域（Ｂ１）は、３〜７サイクル領域（高濃度試料）または３〜４サイクル領域（低濃度試料）に決定された。一方、ＶＢＴを適用すると、エンドポイントサイクル（Ｅ１）は、高濃度試料の場合、２９サイクルに決定されるか、または低濃度試料の場合、３８サイクルに決定された。したがって、ベースライン領域（Ｂ２）は、３〜２９サイクル（高濃度試料）または３〜３８サイクル（低濃度試料）に決定された。
【０３７０】
図１０Ｃに示されたように、ＶＢＴを適用しなかった場合、補正された増幅曲線は、増幅産物の量を不正確に反映するか、偽陰性結果を示した。しかし、ＶＢＴを適用したとき、補正された増幅曲線は、増幅産物の量を正確に反映し、偽陰性結果は表れなかった。
【０３７１】
したがって、前記結果によると、可変的なベースライン閾値を異なって設定するＶＢＴ方法を通じて、初期増幅サイクルで初期ノイズ信号を発生させるポイントをベースライン領域のエンドポイントサイクル（Ｅ）に誤って設定する誤りを除去することができることを確認した。また、ＶＢＴ方法は、増幅サイクルの後半部において、信号増加が始まるポイントをより正確に決定することができ、ベースライン領域の決定（Ｓ１２０）誤りを除去することができた。
【０３７２】
実施例２の結果によると、ベースライン領域は、初期サイクルにおける背景信号の干渉無しに決定できることを確認した。
【０３７３】
上述のように、本発明は、ベースライン領域決定誤りを除去して増幅曲線を補正することにより、より信頼性の高い正確な方式で増幅曲線を分析することができる。
【０３７４】
実施例３：正確なＣｔ値決定による標的核酸の検出及び定量
増幅曲線からＣｔ値を決定する段階における誤りを除去することができるかどうかを確認した。
【０３７５】
アップストリームプライマーとダウンストリームプライマーの伸長およびＴａｑＭａｎプローブの切断のために、５’ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素を使用した。インフルエンザＡウイルス（Ｆｌｕ  Ａ）のゲノムＤＮＡを標的核酸配列として使用した。
【０３７６】
Ｆｌｕ  Ａ検出のために、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲを使用した。標的核酸が存在すると、ＴａｑＭａｎプローブが切断されて、標識された断片が放出される。増幅曲線は、標識された断片からの信号を測定して得ることができる。
【０３７７】
Ｆｌｕ  Ａに対するＴａｑＭａｎプローブは、５’末端に蛍光レポーター分子（ＦＡＭ）を標識して、３’末端にクエンチャー分子（ＢＨＱ−１）を標識した（配列番号：６）。
【０３７８】
本実施例で使用されてアップストリームプライマー、ダウンストリームプライマー、およびプローブの配列は、以下の通りである：
Ｆｌｕ  Ａ−Ｆ５’−ＴＧＧＡＡＴＧＧＣＴＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＣＣＩＩＩＩＩＴＧＴＣＡＣＣＴＣＴ−３’（配列番号：４）
Ｆｌｕ  Ａ−Ｒ５’−ＣＡＴＣＣＴＧＴＴＧＴＡＴＡＴＧＡＧＧＣＣＣＡＴＩＩＩＩＣＴＧＧＣＡＡＧ−３’（配列番号：５）
Ｆｌｕ  Ａ−Ｐ５’−［ＦＡＭ］ＣＴＣＡＣＴＧＧＧＣＡＣＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡ［ＢＨＱ−１］−３’（配列番号：６）
（Ｉ：Ｄｅｏｘｙｉｎｏｓｉｎｅ、ＢＨＱ−１：Ｂｌａｃｋ  ｈｏｌｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ−１）
【０３７９】
リアルタイムＰＣＲは、標的核酸（抽出したＦｌｕ  ＡゲノムＲＮＡの１０−３、１０−４、１０−５、１０−６、または１０−７希釈）、Ｆｌｕ  Ａ標的増幅のための５ｐｍｏｌｅのアップストリームプライマー（配列番号：４）及び５ｐｍｏｌｅのダウンストリームプライマー（配列番号：５）、３ｐｍｏｌｅのＴａｑＭａｎプローブ（配列番号：６）、及び５μｌの５×ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液［７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ］及び２μｌの酵素混合物［最終、３．５ＵのＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素、２５ＵのＭＭＬＶ逆転写酵素、５ＵのＲＮａｓｅ抑制剤］を含む最終容量２５μｌの反応混合液で行った。前記反応混合液を含むチューブをリアルタイムＰＣＲ装置（ＣＦＸ９６ＴＭ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、５０℃で２０分間放置し、次いで９５℃で１５分間変性させた後、９５℃で１０秒間、６０℃で６０秒間および７２℃で１０秒間行われるサイクルを４５回繰り返した。信号検出は、各サイクルごとに６０℃で行った。
【０３８０】
Ｃｔ値決定誤りの確認
増幅曲線から標的核酸の正確な量を得るための伝統的なサイクル閾値（Ｃｔ）方法は、信号閾値を使用する。Ｃｔ値は、蛍光反応が背景信号水準以上に増加して、あらかじめ決定された信号閾値と交差する、増幅曲線の指数期内のポイントに基づいて決定される。このような場合、固定信号閾値（ｆｉｘｅｄ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ、ＦＳＴ）の使用は、Ｃｔ値の決定に誤りを発生させるおそれがある。
【０３８１】
図１１Ａは、抽出したＦｌｕ  ＡゲノムＲＮＡの希釈（１０−３）から得た、補正された増幅曲線を示す。
【０３８２】
図１１Ａに示されたように、ＦＳＴ値が‘２００’ＲＦＵのように低い値に決定されると、実際標的信号が指数的に増加するポイントではなく、初期ノイズ信号を発生させるポイントがＣｔ値に決定されることがあり、これにによって、標的核酸濃度の決定における誤りが発生するようになる。
【０３８３】
図１１Ｂは、抽出されたＦｌｕ  ＡゲノムＲＮＡの希釈（１０−７〜１０−３）から得た、補正された増幅曲線を示す。図１１Ｂに示されたように、ＦＳＴ値が‘５００’ＲＦＵのように高い値に決定されると、低い濃度の標的配列を含む試料は、実際標的核酸の量より少ない量に決定されることがある。
【０３８４】
このように、固定信号閾値を設定する伝統的なＣｔ方法は、標的核酸の濃度決定における誤りを除去することができないことを確認した。
【０３８５】
ＶＳＴ（Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）方法によるＣｔ値の決定
実施例３で使用したＶＳＴ（可変信号閾値）方法は、信号閾値  −  変化サイクル（ｓｉｇｎａｌ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅｄ  ｃｙｃｌｅ、ＳＴＣＣ）を決定し、互いに異なる信号ベースライン閾値を、前記ＳＴＣＣ前及び後のサイクルにそれぞれ適用する方式で行う。
【０３８６】
図１１Ａにおいて、ＳＴＣＣを１０サイクルに決定し、第１のＳＴ（信号閾値）を１〜１０サイクルに、第２のＳＴを１１〜４５サイクルにそれぞれ相異に適用した。図１１Ｂ及び図１１Ｃにおいて、ＳＴＣＣを３８サイクルに決定し、第１のＳＴ（信号閾値）を１〜３８サイクルに適用して、第２のＳＴを３９〜４５サイクルにそれぞれ相異に適用した。前記第１のＳＴは、‘５００’ＲＦＵに決定し、第２のＳＴは、‘２００’ＲＦＵにそれぞれ決定した。
【０３８７】
図１１Ａに示されたように、ＦＳＴを‘２００’ＲＦＵで適用したとき、ＦＳＴと増幅曲線間の最初のクロスポイント（ＣＰ１）におけるＣｔ値は、１．２４に決定された。一方、ＶＳＴを適用したとき、ＶＳＴに対する最初のクロスポイント（ＣＰ２）におけるＣｔ値は、３２．０２に決定された。
【０３８８】
図１１Ｂ及び図１１Ｃに示されたように、標的核酸の存在または不存在を区分するカット  −  オフ値は、Ｃｔ＜４０に設定した。ＦＳＴを‘５００’ＲＦＵに設定して適用したとき、１０−６希釈されたＲＮＡの結果は、Ｃｔ  ４３．４１を示したが、この値は、標的核酸の量を不正確に反映したものである。
【０３８９】
また、標的核酸の存在または不存在を区分するカット−オフ値がＣｔ＜４０に設定されたため、Ｃｔ  ４３．４１は、標的核酸の不存在を示すが、これは、偽陰性結果に当たる。ＶＳＴを適用する場合、１０−６希釈されたＲＮＡの結果は、Ｃｔ  ３９．８２を示すが、これは、標的核酸の量を正確に反映したものであって、陽性の結果を示す。
【０３９０】
したがって、可変的な信号閾値を互いに異なるように設定するＶＳＴ方法は、初期増幅曲線における初期ノイズ信号を発生させるポイントをＣｔ値として誤って解釈する誤りを除去することができる。また、ＶＳＴ方法は、Ｃｔ値をより正確に決定することができ、標的核酸の濃度決定誤りを除去することができる。
【０３９１】
上述のように、本発明は、適切な信号閾値の設定を通じて、正確なＣｔ値を決定することにより、さらに信頼性の高い正確な方式で標的核酸を検出して、定量することができる。
【０３９２】
以上、本発明の特定な部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
【図１Ａ】
0006602374.tif 000007
【図１Ｂ】
0006602374.tif 000008
【図２】
0006602374.tif 000009
【図３】
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【図４Ａ】
0006602374.tif 000011
【図４Ｂ】
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【図５】
0006602374.tif 000013
【図６】
0006602374.tif 000014
【図７】
0006602374.tif 000015
【図８Ａ】
0006602374.tif 000016
【図８Ｂ】
0006602374.tif 000017
【図８Ｃ】
0006602374.tif 000018
【図９】
0006602374.tif 000019
【図１０Ａ】
0006602374.tif 000020
【図１０Ｂ】
0006602374.tif 000021
【図１０Ｃ】
0006602374.tif 000022
【図１１Ａ】
0006602374.tif 000023
【図１１Ｂ】
0006602374.tif 000024
【図１１Ｃ】
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【配列表】
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