(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸ライブラリーを予備的に分離するデバイスであって、
移動相が流通可能な複数のウェルを含む固相ブロックと、
前記ブロックの各ウェルにそれぞれ形成されたモノリスと、
を備えており、
ここで、前記各ウェルのモノリスのそれぞれは、化学反応サイトまたはリガンドに動作的に結合している相補的オリゴヌクレオチドに選択的に結合する付着オリゴヌクレオチドを有しており、溶媒に対して透過性を有するモノリスカラムとして形成されている、デバイス。
【請求項２】
前記各ウェルのモノリスのそれぞれは、アミド結合、エステル結合、ウレア結合、ウレタン結合、炭素−ケイ素結合、炭素−窒素結合、炭素−炭素結合、エーテル結合、チオエーテル結合、もしくはジスルフィド結合を形成することにより、または環状付加により、該ウェルの表面に共有結合的に結合されている、請求項１に記載の分離デバイス。
【請求項３】
前記ブロックは、チタン、アルミニウム、ステンレス鋼、ドープドメタル、ガラス、石英、ポリカーボネート、溶融シリカ、ポリ（メチルメタクリレート）、プラスチック、ポリエーテルエーテルケトン、ドープドポリエーテルエーテルケトン、ドープドポリスチレン、環状オレフィンコポリマー、ポリエーテルイミド、ドープドポリプロピレン、またはこれらの組合せから構成されている、請求項１に記載の分離デバイス。
【請求項４】
前記ブロックは、アルミニウムから構成されている、請求項３に記載の分離デバイス。
【請求項５】
前記アルミニウムの表面は、シラン処理されている、請求項４に記載の分離デバイス。
【請求項６】
前記モノリスは、ポリマーからなるモノリスであり、該モノリスと前記表面がシラン処理されたアルミニウムとの共有結合は、炭素−炭素結合である、請求項５に記載の分離デバイス。
【請求項７】
前記モノリスは、ポリマーからなるモノリスである、請求項１に記載の分離デバイス。
【請求項８】
前記モノリスは、ポリ（ＧＭＡ−ｃｏ−ＥＤＭＡ）から構成されている、請求項７に記載の分離デバイス。
【請求項９】
前記各ウェルのモノリスのそれぞれは、約０．５ｆｍｏｌ／μＬ〜約０．４ｎｍｏｌ／μＬの一本鎖核酸を結合し得る、請求項１に記載の分離デバイス。
【請求項１０】
前記モノリス上の前記付着オリゴヌクレオチドの密度は、約１ｐｍｏｌ／１０μＬ〜約１μｍｏｌ／μＬである、請求項１に記載の分離デバイス。
【請求項１１】
前記各ウェルのモノリスのそれぞれは、約０．５ｆｍｏｌ／μＬ〜約０．４ｎｍｏｌ／μＬの一本鎖核酸を結合し得る、請求項１０に記載の分離デバイス。
【請求項１２】
前記付着オリゴヌクレオチドの前記相補的オリゴヌクレオチドに結合する速度定数は、約１×１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１×１０６Ｍ−１ｓ−１である、請求項１に記載の分離デバイス。
【請求項１３】
核酸プログラム型化合物ライブラリーを調製する方法であって：
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のデバイスの前記ウェルに形成された前記モノリスに、核酸分子の混合物を接触させ、それによって該核酸分子を複数の亜集団にスプリットすること；
前記核酸分子の亜集団を分離容器に移すこと；
および、
前記分離された核酸分子の亜集団を、異なる化学サブユニットと反応させること、ここで、前記デバイスの各ウェルは前記分離容器とアドレス可能に配列される；
を包含する、核酸プログラム型化合物ライブラリーの調製方法。
【請求項１４】
核酸プログラム型化合物ライブラリーを調製する方法であって：
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のデバイスの前記ウェルに形成された前記モノリスに、核酸分子の混合物を接触させ、それによって該核酸分子を複数の亜集団にスプリットすること；
前記核酸分子の亜集団を、アニオン交換材を含む２つ以上のアドレス可能なウェルを具備するブロックを含むアレイに移すことにより、該核酸分子の亜集団を該ウェルに固定すること；
および、
前記固定された核酸分子の亜集団を、異なる化学サブユニットと反応させること、ここで、前記デバイスの各ウェルは、前記アニオン交換材を含む前記アレイのアドレス可能なウェルとアドレス可能に配列される；
を包含する、核酸プログラム型化合物ライブラリーの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下に、２０１４年１月２８日および２０１４年６月２日にそれぞれ出願された米国仮特許出願第６１／９３２，７４７号および同第６２／００６，８４５号に基づく優先権を主張し、これらの仮特許出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本明細書において、リガンドに選択的に結合する認識化合物が付着したモノリス、そのようなモノリスの調製方法、そのアレイ、およびその使用が提供される。例えば、本明細書で提供されるモノリスは、そのカラムおよびアレイにおいて使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
架橋ポリマー担体は、触媒反応、分離および固相合成において有用である。初期の架橋ポリマー担体は、均質な多孔質粒子として提供され、それらは、一般に連続流プロセス（特にクロマトグラフィ）に使用された。しかしながら、粒子状の吸着剤の使用には、対流と固相担体への結合との間の置換が遅いため分解能が低くなる、充填粒子間の間隙容量が大きい、背圧が高い、および動的結合能力が特に高分子では低い、という多くの重大な問題がある。これらの欠点により、各種リガンドに結合可能な認識分子を付着した官能化担体として均質な多孔質粒子を用いることは制限されていた。
【０００４】
最近になって多孔質のモノリス材料が開発された（Arrua, et al., Materials (2009) 2 2429-2466; Svec et al., Monolith Materials, J. of Chromatography Library, Vol. 67, Svec et al., (Eds.); Wu et al., J. Chromatography A (2008) 369-392）。これらの不均一なマクロ多孔質ポリマーは、剛性の高い多孔質構造を有する。この構造は、調製の過程で形成され、通常は任意の溶媒中や乾燥した状態においても維持され、モノリスにスポンジ様の性質を与える。重要なことに、流体がモノリスの孔を通過するモノリス材料では、間隙容量が大きい（すなわち、透過性が高い）、高分子の置換が遅い（すなわち、物質移動速度が遅い）、分解能が低い、および背圧が高いといった問題は軽減する。今日、モノリスは、クロマトグラフィによる分離において主に使用されているが、リガンド結合用の認識分子（特にＤＮＡ）の付着により官能化されたモノリスの調製やその利用（例えばアレイでの利用）にはあまり注意が向けられていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、付着した認識化合物を含むモノリス、およびこれらのモノリスのアレイが要望されている。そのようなモノリスおよびそのアレイは、リガンドの結合にとりわけ有用となる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、認識化合物で官能化されたモノリス、そのアレイ、およびその使用を提供する。一態様において、認識化合物を付着したモノリスが提供される。認識化合物はリガンドに選択的に結合する。いくつかの実施形態では、認識化合物は、オリゴヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、ペプチド核酸、ペプチド、デプシペプチド、ポリペプチド、抗体、ペプトイド、ポリマー、ポリシロキサン、５０ダルトン超の分子量の無機化合物、約３０００ダルトン〜約５０ダルトンの分子量の有機化合物、またはこれらの組合せである。他のいくつかの実施形態では、リガンドは、オリゴヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、ペプチド核酸、ペプチド、デプシペプチド、ポリペプチド、抗体、ペプトイド、ポリマー、ポリシロキサン、５０ダルトン超の分子量の無機化合物、約３０００ダルトン〜約５０ダルトンの分子量の有機化合物、またはこれらの組合せである。
【０００７】
いくつかの実施形態では、リガンドに選択的に結合する付着認識化合物を包含するモノリスを含むハウジングが提供される。他のいくつかの実施形態では、ハウジングは、ファージディスプレイ、ＲＮＡディスプレイまたは核酸プログラム型のコンビナトリアルケミストリーにより提示され得る化合物ライブラリーのメンバーに選択的に結合する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、アレイが提供される。アレイは、リガンドに選択的に結合する付着認識化合物を包含するモノリスを含むハウジングを２つ以上包含する。他のいくつかの実施形態では、アレイは、ハウジングを含む２つ以上のウェルを包含するブロックを含む。ハウジングは、リガンドに選択的に結合する付着認識化合物を包含するモノリスを含む。
【０００９】
さらに他の態様においては、モノリスメディアが提供される。モノリスメディアは、リガンドに選択的に結合する付着認識化合物を有する凝集粒子を含む。
【００１０】
さらに他の態様においては、２つ以上のイオン交換ハウジングを含むアレイが提供される。イオン交換ハウジングはイオン性基を有するモノリスを含む。いくつかの実施形態では、アレイは、移動相を流通可能なフィルタプレートもしくは他の任意の型のマイクロプレートまたは装置と、イオン交換材を含む２つ以上のウェルを包含するブロックとを含む。イオン交換材は、イオン性基を含むモノリスを包含する。
【００１１】
さらに他の態様においては、核酸プログラム型化合物ライブラリーを調製する方法が提供される。その方法は、核酸分子の混合物を、２つ以上のアドレス可能なウェルを有するブロックを含むアレイと接触させる工程を含む。各ウェルは、一本鎖核酸に選択的に結合することにより核酸分子を亜集団にスプリットする１つ以上の付着認識化合物を有するモノリスを含む。上記核酸分子の亜集団は、所望により、例えば昇温、イオン強度の変化またはｐＨの変化を利用して認識化合物から分離することができ、分離された核酸分子は分離容器（separate containers）に移される。次いで、上記分離された核酸分子の亜集団を異なる化学サブユニットと反応させる。ここで、上記核酸分子は少なくとも１つの結合配列と１つの化学反応サイトとを含む。核酸分子の亜集団が所望により分離容器に移されるときには、核酸に選択的に結合する認識化合物が付着したモノリスを含むウェルは、上記分離容器とアドレス可能に配列される。
【００１２】
さらに他の態様においては、核酸プログラム型化合物ライブラリーを調製する方法が提供される。その方法は、核酸分子の混合物を、２つ以上のアドレス可能なウェルを有するブロックを含むアレイと接触させる工程を含む。各ウェルは、一本鎖核酸に選択的に結合することにより核酸分子を亜集団にスプリットする１つ以上の付着認識化合物を有するモノリスを含む。上記核酸分子の亜集団は、移動相を流通可能なフィルタプレートもしくは他の任意の型のマイクロプレートまたは装置と、２つ以上のアドレス可能なウェルを含むブロックと、を含む第２のアレイに移される。上記核酸分子の亜集団は、例えば昇温、イオン強度の変化またはｐＨの変化を利用して、認識化合物から分離することができる。第２のアレイのウェルは、核酸分子の亜集団を非特異的に固定するアニオン交換材を含む。上記固定された核酸分子の亜集団を、異なる化学サブユニットと反応させる。核酸に選択的に結合する１つ以上の認識化合物が付着したモノリスを含むウェルは、上記アニオン交換材を含むウェルとアドレス可能に配列される。上記核酸分子は、少なくとも１つの結合配列と１つの化学反応サイトとを含む。いくつかの実施形態では、上記アニオン交換材は、アニオン交換基を有するモノリスを含む。
【００１３】
さらに他の態様においては、装置が提供される。その装置は、異なるブロックを含む２つのアレイを含む。第１のアレイのブロックは、リガンドに選択的に結合する認識化合物が付着したモノリスを含む、２つ以上のアドレス可能なウェルを含む。第２のアレイのブロックは、移動相を流通可能なフィルタプレートもしくは他の任意の型のマイクロプレートまたは装置と、イオン交換材を含む２つ以上のアドレス可能なウェルとを含む。リガンドに選択的に結合する認識化合物が付着したモノリスを含むウェルは、イオン交換材を含むウェルと配列されている。いくつかの実施形態では、上記イオン交換材は、イオン交換基を有するモノリスを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、フラグメントライブラリーのＤＮＡ誘導性スプリットの例を示す。この例の核酸タグの縮重ファミリーは、２０塩基対のヌクレオチド配列が連結してなり、それらは一定（Ｃ１〜Ｃ５）であるかまたは可変（ａ１〜ｊ４）である。ＤＮＡフラグメントの可変領域のａ１〜ｊ４の文字は、直交ハイブリダイゼーション特性を有する２０の別個のヌクレオチド配列を示す。第１のスプリットを行うために、フラグメントの縮重ファミリーを配列ａ１ｃ〜ｊ１ｃ（これらは第１の可変領域の配列ａ１〜ｊ１と相補的である）で表わされる１０の異なるアフィニティ樹脂のセットに通す（アフィニティ樹脂の例が円で示されている）。フラグメントの原ファミリーの１０のサブプールが得られる。その後、核酸タグの各サブプールを別個の化学モノマーと反応させて、各核酸タグの化学反応サイトに上記別個の化学モノマーをカップリング（結合）させる。その後、サブプールは再び一緒にされ、そのライブラリーは配列ａ２〜ｊ２などに基づいて新しいサブプールのセットにスプリットされる。
【図２】図２は、核酸タグの化学反応サイトにおけるケミカルカップリング反応の例を示す。化学反応サイトを含む核酸タグが、ＤＭＦ中、ＦＭＯＣ−アラニンのＮＨＳエステルで処理される。ＦＭＯＣ保護基がピペリジンで除去され、核酸タグの化学反応サイトに結合したアラニンが得られる。このプロセスは、別個のポリペプチドのライブラリーを作成するために、多数回にわたり多様なアミノ酸で連続的に繰り返すことができる。
【図３Ａ】図３Ａ−３Ｄは、一連のカラムを用いて異なる化合物のライブラリーを作成する分割ベース化学合成法を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ−３Ｄは、一連のカラムを用いて異なる化合物のライブラリーを作成する分割ベース化学合成法を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ−３Ｄは、一連のカラムを用いて異なる化合物のライブラリーを作成する分割ベース化学合成法を示す。
【図３Ｄ】図３Ａ−３Ｄは、一連のカラムを用いて異なる化合物のライブラリーを作成する分割ベース化学合成法を示す。
【図４】図４は、左から右に、Ａ１２、Ｄ１１、Ｔ１、Ｄ１２およびＡ１１を有するハイブリダイゼーションアレイの例を示す。前面は上であり、装置の上面は左である。
【図５】図５は、左から右に、Ｄ０１、Ｔ１およびＤ０２を有するトランスファーアレイの例を示す。前面は上であり、装置の上面は左である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
＜定義＞
他に定義されていない限り、本明細書中の科学技術用語は全て、本発明が属する技術分野における当業者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。１つの用語に複数の定義が存在する場合には、特に明記されていない限り、本項に記載のものが優先する。
【００１６】
本明細書および添付の請求の範囲で使用されるとき、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈上他の明記がない限り、複数の指示物を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「タグ」という言及は、複数のそのようなタグを含み、「化合物」という言及は、１つ以上の化合物および当業者に知られたその均等物を含むなどである。
【００１７】
請求項は、オプションの構成要素を除くように記載されてもよいことがさらに留意される。この記述は、請求項の構成要素の記載に関連して、「のみ（solely）」、「のみ（only）」などの排他的な用語の使用、または「否定的（negative）」な限定のための先行基礎となることを意図している。
【００１８】
「アルキル」は、本明細書で使用されるとき、任意の飽和もしくは不飽和のもの、分岐もしくは非分岐のもの、環状のもの、またはそれらの組合せを意味し、典型的には１〜１０の炭素原子を有し、それにはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシルなどが含まれ、これらは所望によりメチルで置換されていてもよい。
【００１９】
「アルキレン」は、本明細書で使用されるとき、任意の分岐もしくは非分岐もの、環状のもの、またはそれらの組合せを意味し、典型的には１〜１０の炭素原子を有し、それにはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシルなどが含まれ、これらは所望によりメチルで置換されていてもよい。
【００２０】
「化合物の集団を増幅する」とは、本明細書で使用されるとき、核酸タグの連鎖ハイブリダイゼーション配列にしたがって合成され本明細書に記載の反復法によって得られた化合物の集団を増加させることを指す。
【００２１】
「抗体」は、本明細書で使用されるとき、免疫グロブリン遺伝子、または免疫グロブリン遺伝子のフラグメント（例えば、１種以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むフラグメント）により実質的にまたは部分的にコードされた１種以上のポリペプチドを含むタンパク質を指す。認識される免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミューの定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖（Ｌ鎖）は、通常、例えば、カッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖（Ｈ鎖）は、通常、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンとして分類され、これにより、免疫グロブリンのクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥがそれぞれ規定される。通常の免疫グロブリン（抗体）の構造単位はテトラマーを含む。本来、各テトラマーは、２つの同じ対のポリペプチド鎖からなり、各対は１本の「軽」鎖（約２５ｋＤ）と１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）とを有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原の認識に関与する、約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸からなる可変領域を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれこれらの軽鎖および重鎖を指す。抗体は、完全な免疫グロブリンとして、または、各種ペプチダーゼによる消化によって生成される多くのよく特徴付けられたフラグメントとして存在する。例えば、ペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合の下で抗体を消化して、Ｆ（ａｂ’）２（抗原結合性フラグメント）およびＦｃ（結晶性フラグメントまたは補体結合性フラグメント）を生成する。Ｆ（ａｂ’）２は、Ｆａｂのダイマーであり、それ自体、ジスルフィド結合によりＶＨ−ＣＨ１に結合している軽鎖である。Ｆ（ａｂ’）２は、温和な条件下で還元してヒンジ領域のジスルフィド結合を切断し、それにより（Ｆａｂ’）２ダイマーをＦａｂ’モノマーにすることができる。Ｆａｂ’モノマーは、本質的に、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂである。抗体分子のＦｃ部分は、免疫グロブリン重鎖の定常領域にほぼ相当し、抗体のエフェクター機能を担う（抗体フラグメントのより詳細な説明については、Fundamental Immunology, 4th edition. W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1998)を参照）。種々の抗体フラグメントは、インタクトな抗体の消化の点から定義されるが、当業者であれば、そのようなＦａｂ’フラグメントやＦｃフラグメントは、化学的に、または組換えＤＮＡ法、ペプチドディスプレイ法などによってデノボ合成し得ることが理解される。したがって、この明細書において抗体という用語には、抗体全体の改変によって生成された抗体フラグメントや、組換えＤＮＡ法によりデノボ合成された抗体フラグメントが包含される。抗体はまた、単一アームの複合モノクローナル抗体、可変重鎖および可変軽鎖が（直接またはペプチドリンカーを介して）結合して連続するポリペプチドを形成している単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）抗体などの単鎖抗体、ならびに二重特異性抗体、三重特異性抗体および四重特異性抗体を包含する（Pack et al.(1995)J Mol Biol 246: 28; Biotechnol 11:1271；およびBiochemistry 31:1579）。抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって得られるフラグメントなどである。
【００２２】
「塩基特異的二重鎖形成」または「特異的ハイブリダイゼーション」は、本明細書で使用されるとき、所与の長さのオリゴヌクレオチドについて、一本鎖オリゴヌクレオチドとその相補配列の核酸鎖とで配列特異的な対合を生成するために有効な温度、イオン強度および／または溶媒条件を指す。そのような条件は、ほとんど相補的だが内部塩基に１か所以上のミスマッチを有する２本の鎖のハイブリダイゼーションを妨げる（または、ほぼ妨げる）に足るだけの厳しいものであることが好ましい。いくつかの実施形態では、塩基特異的二重鎖を形成する２つの配列の同一領域は、約５ｂｐ超である。他のいくつかの実施形態では、同一領域は１０ｂｐ超である。
【００２３】
「キャプチャー核酸」、「キャプチャーオリゴヌクレオチド」および「固定化キャプチャー核酸」は、本明細書で使用されるとき、モノリスに付着した核酸配列を指す。一般に、キャプチャー核酸の配列は、核酸タグの異なるハイブリダイゼーション配列（例えば、ａ１、ｂ１、ｃ１など）の１つに相補的であり、したがって、核酸タグ化分子の集団を、別異の核酸タグ化分子の複数の亜集団として分離容器へと配列特異的にスプリット（分別）することができる。
【００２４】
「化学反応サイト」は、本明細書で使用されるとき、核酸タグの化学成分であって様々な化学結合を形成可能なものを指す。そのような化学結合には、アミド結合、エステル結合、ウレア結合、ウレタン結合、炭素−カルボニル結合、炭素−窒素結合、炭素−炭素単結合、オレフィン結合、チオエーテル結合、およびジスルフィド結合が含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
「コンビナトリアルライブラリー」は、本明細書で使用されるとき、多数の（通常、１０３〜１０１５以上の）異なる化合物を包含する分子ライブラリーを指す。これらの化合物は、典型的には、サブユニットの配列が異なることにより、または側鎖官能基および結合の組合せの違いによって一般に特徴付けられる。
【００２６】
「ＤＡＥＭ」は、本明細書で使用されるとき、２（ジメチルアミノ）エチルメタクリレートを指す。
【００２７】
「ＤＥＧＤＭＡ」は、本明細書で使用されるとき、ジエチレングリコールジメタクリレートを指す。
【００２８】
「デプシペプチド」は、本明細書で使用されるとき、本明細書に定義されたペプチドであって、１つ以上のアミド結合がエステル結合で置換されているものを指す。
【００２９】
「異なる配列小分子化合物」は、小有機分子であって、必須ではないが典型的には、環構造などの共通の親構造（parent structure）と、複数の異なるＲ置換基または改変環構造（それぞれ、様々な形態、例えば、異なるＲ基などを取る）とを有する。そのような化合物は、通常、オリゴマー的ではなく（すなわち、類似のサブユニットの繰返し配列により構成されたものではなく）、基本骨格および官能基の点では類似であり得るが、鎖長、環のサイズもしくは数、または置換パターンなどの点では変わり得る。
【００３０】
「ＥＤＭＡ」は、本明細書で使用されるとき、エチレングリコールジメタクリレートを指す。
【００３１】
「核酸タグの遺伝子組換え」は、本明細書で使用されるとき、１つ以上の所望の活性を有する化合物から誘導された核酸タグのキメラを形成することを指す。キメラは、濃縮および段階的合成、ＰＣＲ増幅および段階的合成、部分的消化、再構築および段階的合成を繰り返して、１つ以上の所望の活性を有する化合物に結合した濃縮度の高い核酸タグの亜集団を得た後、遺伝子組換えを行うことによって形成することができる。
【００３２】
「ＧＭＡ」は、本明細書で使用されるとき、グリシジルメタクリレートを指す。
【００３３】
「ＨＥＭＡ」は、本明細書で使用されるとき、２−ヒドロキシルエチルメタクリレートを指す。
【００３４】
「水和物」は、本明細書に記載の化合物の結晶格子への化学量論比での水の導入を指し、その導入によって付加物が形成される。水和物の生成方法としては、水蒸気を含む雰囲気中での貯蔵、水を含む剤形化、または通常の薬学的処理工程、例えば、結晶化（すなわち、水または水性混合溶媒からの結晶化）、凍結乾燥、湿式造粒、水性フィルムコーティング、または噴霧乾燥などが挙げられるが、これらに限定されない。水和物はまた、ある特定の環境下で、結晶性溶媒和物を水蒸気に曝露することにより、または無水物を水へ懸濁させることにより、生成することができる。水和物はまた、水和物多型をもたらす２つ以上の形態で結晶化させることができる。例えば、（Guillory, K., Chapter 5, pp. 202-205, Polymorphism in Pharmaceutical Solids, (Brittain, H. ed.), Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1999）を参照されたい。上記の水和物調製方法は、十分に当業者の技術の範囲内であり、完全に従来技術であり、当該技術分野で一般に行われている実験を超える実験が要求されることはない。水和物は、当業者によく知られた方法、例えば、単結晶Ｘ線回折法、粉末Ｘ線回折法、偏光光学顕微鏡法、熱顕微鏡法、熱重量分析法、示差熱分析法、示差走査熱量分析法、赤外分光分析法、ラマン分光法、ＮＭＲ分光法などの方法で、特徴付けおよび／または分析がなされ得る。（Brittain, H., Chapter 6, pp. 205-208, Polymorphism in Pharmaceutical Solids,(Brittain, H. ed.),Marcel Dekker, Inc., New York, 1999）。さらに、HOLODIAG, Pharmaparc II, Voie de l'Innovation, 27 100 Val de Reuil, France（http://www.holodiag.com）などの多くの企業が、水和物の調製および／または特徴付けなどのサービスを定型業務として提供している。
【００３５】
「リガンド」は、本明細書で使用されるとき、オリゴヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、ペプチド核酸、ペプチド、デプシペプチド、ポリペプチド、抗体、ペプトイド、ポリマー、ポリシロキサン、５０ダルトン超の分子量の無機化合物、約５０ダルトン〜約１０００ダルトンの分子量の有機化合物、またはこれらの組合せを指す。
【００３６】
「リンカー」は、本明細書で使用されるとき、モノリスを認識化合物と結合させる機能を果たす任意の分子または物質である。リンカーは、構造および長さが異なり得る。リンカーは、疎水性または親水性、長いまたは短い、硬質、半硬質または軟質、などであり得る。結合基は、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−鎖などのポリメチレン鎖、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ鎖などのポリ（エチレングリコール）鎖（いずれの例においても、ｎは１〜約２０の整数である）、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−１’，２’−ジデオキシリボース−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト；９−Ｏ−ジメトキシトリチル−トリエチレングリコール、１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト；３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロピル−１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト；および１８−Ｏ−ジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール、１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、アミノ−カルボン酸リンカー（例えば、ペプチド（例えば、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯｓｕまたはＺ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｏｓｕ）、ＰＥＧ（例えば、Ｆｍｏｃ−アミノＰＥＧ２０００−ＮＨＳまたはアミノ−ＰＥＧ（１２−２４）−ＮＨＳ）、またはアルカン酸鎖（例えば、Ｂｏｃ−ε−アミノカプロン酸−Ｏｓｕ））、クリックケミストリーリンカー（例えば、ペプチド（例えば、アジドホモアラニン−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｏｓｕまたはプロパルギルグリシン−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｏｓｕ）、ＰＥＧ（例えば、アジド−ＰＥＧ−ＮＨＳ）、またはアルカン酸鎖（例えば、５−アジドペンタン酸、（Ｓ）−２−（アジドメチル）−１−Ｂｏｃ−ピロリジン、または４−アジド−ブタン−１−オイック酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル））、チオール反応性リンカー（例えば、ＰＥＧ（例えば、ＳＭ（ＰＥＧ）ｎＮＨＳ−ＰＥＧ−マレイミド）、アルカン鎖（例えば、３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）−プロピオン酸−Ｏｓｕまたはスルホスクシンイミジル６−（３’−［２−ピリジルジチオ］プロピオンアミド）ヘキサノエート）））、オリゴヌクレオチド合成用アミダイト（例えば、アミノ修飾剤（例えば、６−（トリフルオロアセチルアミノ）−ヘキシル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホラミダイト）、チオール修飾剤（例えば、Ｓ−トリチル−６−メルカプトヘキシル−１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト）、またはクリックケミストリー修飾剤（例えば、５−ヘキシニル−ＴＴＴ（Ｔ）０−７、６−ヘキシニル−ＴＴＴ（Ｔ）０−７、５−ヘキシン−１−イル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホラミダイト、６−ヘキシン−１−イル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホラミダイト、３−ジメトキシトリチルオキシ−２−（３−（３−プロパルギルオキシプロパンアミド）プロパンアミド）プロピル−１−Ｏ−スクシノイル、長鎖アルキルアミノＣＰＧ、または���−アジド−ブタン−１−オイック酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル））を含み得る。
【００３７】
「開始剤」は、本明細書で使用されるとき、熱、光またはレドックスによる開始によってモノビニルモノマーまたはポリビニルモノマーの重合を開始可能な任意のフリーラジカル発生剤を指す。「ＭＡＡ」は、本明細書で使用されるとき、メタクリル酸を指す。
【００３８】
「ＭＡＥＴＡ」は、本明細書で使用されるとき、［２−（メタクリルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロリドを指す。
【００３９】
「γ−ＭＡＰＳ」は、本明細書で使用されるとき、３−（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレートを指す。
【００４０】
「モノリス」は、本明細書で使用されるとき、温和な圧力で移動相の高流量を可能にする大きな連通孔または流路を含む連続的固定相（すなわち、単一の連続材料（例えば、ポリマー系またはシリカ系のマトリックス）を指す。
【００４１】
「モノリスメディア」は、本明細書で使用されるとき、凝集粒子の充填物であって、粒子径に基づいて予想されるより著しく低いカラム圧を有するものを指す。
【００４２】
「ＮＢＥ」は、本明細書で使用されるとき、ノルボルン−２−エンを指す。
【００４３】
「非特異的結合」は、「非特異的モノリス」に関して本明細書で使用されるとき、モノリスに適用された核酸の配列に依存しない核酸の結合を指す。非特異的結合材料の例としては、あるイオン強度で核酸タグ化分子を非特異的に捕捉し、分子反応後、より高いイオン強度で核酸タグ化分子を放出する効果があるイオン交換材料が挙げられる。
【００４４】
「核酸」は、本明細書で使用されるとき、下記に定義されるオリゴヌクレオチドアナログ、ならびに二重鎖のＤＮＡおよびＲＮＡの分子を指す。ＤＮＡおよびＲＮＡ分子は、下記に定義する各種アナログを含み得る。
【００４５】
「核酸タグ誘導合成」もしくは「タグ誘導合成」または「化学翻訳」は、本明細書で使用されるとき、核酸タグに連結されたハイブリダイゼーション配列に基づく、本明細書に記載の方法にしたがった複数の化合物の合成を指す。
【００４６】
「核酸タグ」、「核酸担体」、「合成誘導核酸タグ」および「ＤＮＡタグ」は、本明細書で使用されるとき、それぞれ、少なくとも（ｉ）異なる第１のハイブリダイゼーション配列、（ｉｉ）異なる第２のハイブリダイゼーション配列、および（ｉｉｉ）化学反応サイト、を含む核酸配列を意味する。「ハイブリダイゼーション配列」は、約３〜５０の（典型的には約５〜約３０の）核酸サブユニットを含むオリゴヌクレオチドを指す。そのような「核酸タグ」は、連鎖ハイブリダイゼーション配列に基づきコンビナトリアルライブラリーを合成することができる。
【００４７】
「オリゴヌクレオチド」または「オリゴ」は、本明細書で使用されるとき、約３〜約５０の（典型的には約５〜約３０の）核酸サブユニットを含む核酸オリゴマーを指す。ライブラリー化合物の合成を誘導するオリゴ（例えば、ハイブリダイゼーション配列）との関連では、オリゴは、天然に存在するヌクレオチド残基、ヌクレオチドアナログ残基、または配列特異的塩基対合を形成することができる他のサブユニット（直鎖ポリマー内に形成される場合、ポリメラーゼおよび１つ以上のヌクレオチド三リン酸（例えば一般的なデオキシリボヌクレオチド）の存在下における鎖誘導重合のために、このポリマーが適切な基質を提供できることを条件とする）を含み得るか、またはそれらから構成され得る。「既知の配列のオリゴ」とは、その核酸配列が知られているオリゴである。
【００４８】
「オリゴヌクレオチドアナログ」は、本明細書で使用されるとき、修飾（modified）された核酸であって、それが誘導されたオリゴヌクレオチドの化学活性または生物活性のいくつかまたは全てが可能である核酸を指す。オリゴヌクレオチドアナログは、一般に、リン酸ジエステル結合を含むが、ある場合には、別の骨格を有し得るオリゴヌクレオチドアナログが含まれる。リボース−ホスフェート骨格の修飾は、ラベルなどの追加部分を付加しやすくし、あるいはそのような分子の安定性および半減期を増すためになされ得る。さらに、天然に存在する核酸とアナログとの混合物が作られ得る。あるいは、異なる核酸アナログの混合物や天然に存在する核酸とアナログとの混合物が作られ得る。オリゴヌクレオチドは、規定通り一本鎖または二本鎖であり得、あるいは二本鎖または一本鎖の配列の両方の部分を含み得る。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであり得、ここで核酸はデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの任意の組合せを含み、また任意の塩基（ウラシル、ウリジン、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む）の組合せであり得る。
【００４９】
「ペプチド」は、本明細書で使用されるとき、約２〜５０アミノ酸残基、約２〜２０アミノ酸残基、または約２〜１０残基のアミノ酸残基のポリマーを指す。ペプチドは、例えば、糖ペプチド、ＰＥＧ化ペプチド、リポペプチド、有機または無機リガンドと結合したペプチド、ペプチド結合アイソスター（isostere）（例えば、Ψ［ＣＨ２Ｓ］、Ψ［ＣＨ２ＮＨ２］、Ψ［ＮＨＣＯ］、Ψ［ＣＯＣＨ２］、Ψ［（Ｅ）もしくは（Ｚ）ＣＨ＝ＣＨ］など）を含むペプチドなどの修飾ペプチドを含み、また、環状ペプチドなども含む。いくつかの実施形態においては、アミノ酸残基は、任意のＬ−α−アミノ酸、Ｄ−α−アミノ残基、それらのＮ−アルキル変異体、またはそれらの組合せであり得る。他のいくつかの実施形態においては、アミノ酸残基は、任意のＬ−α−アミノ酸、Ｄ−α−アミノ残基、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、それらのＮ−アルキル変異体、またはそれらの組合せであり得る。
【００５０】
「動作的に連結（operatively linked）」は、本明細書で使用されるとき、一緒に結合している少なくとも２つの化学基または構造を指す。例えば、オリゴヌクレオチドは、リガンドまたは化学反応サイトにリンカーを介して共有結合的に結合し得る。いくつかの実施形態では、上記基または構造は、様々な操作、例えば、プロセスの工程などを経ても、結合状態を維持し得る。
【００５１】
「ペプチド核酸」は、本明細書で使用されるとき、核酸の糖−リン酸主鎖が擬ペプチド骨格により置換されているオリゴヌクレオチドアナログ（例えば、Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン）（Nielsen et al., 米国特許第５，５３９，０８２号明細書；Nielsen et al., 米国特許第５，７７３，５７１号明細書；Burchardt et al.,米国特許第６，３９５，４７４号明細書）を指す。
【００５２】
「ペプトイド」は、本明細書で使用されるとき、ポリＮ−置換グリシン（Simon et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(1992) 89 (20) 9367-9371）のポリマーを指し、その環状変異体を含む。
【００５３】
「ポリペプチド」は、本明細書で使用されるとき、アミノ酸残基（典型的には、５０超のアミノ酸残基を含む）のポリマーを指し、その環状変異体を含む。ポリペプチドは、タンパク質（糖タンパク質、ＰＥＧ化タンパク質、リポタンパク質、有機または無機リガンドと結合したポリペプチドなどの修飾タンパク質を含む）レセプター、レセプターフラグメント、酵素、構造タンパク質（例えば、コラーゲン）などを含む。いくつかの実施形態においては、アミノ酸残基は、任意のＬ−α−アミノ酸、Ｄ−α−アミノ残基、またはそれらの組合せであり得る。他のいくつかの実施形態においては、アミノ酸残基は、任意のＬ−α−アミノ酸、Ｄ−α−アミノ残基、それらのＮ−アルキル変異体、またはそれらの組合せであり得る。
【００５４】
「ポリマー」は、コポリマーを含み、用語「モノマー」は、コモノマーを含む。ポリマーは、例えば、ポリアミド、リン脂質、ポリカーボネート、多糖類、ポリウレタン、ポリエステル、ポリ尿素、ポリアセテート、ポリアリーレンスルフィド、ポリエチレンイミン、ポリイミドなどを含む。
【００５５】
「ポロゲン」または「ポロゲン溶媒」は、本明細書で使用されるとき、重合過程においてポリマーマトリックスに孔（ポア）を形成することができる溶媒を指し、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、エステル、アミド、アルコール、ケトン、エーテル、可溶性ポリマーの溶液、およびこれらの組合せを含むが、これらに限定されない。
【００５６】
「認識化合物」は、本明細書で使用されるとき、オリゴヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、ペプチド核酸、ペプチド、デプシペプチド、ポリペプチド、抗体、ペプトイド、ポリマー、ポリシロキサン、分子量５０ダルトン超の無機化合物、分子量約５０ダルトン〜約１０００ダルトンの有機化合物、またはこれらの組合せを指す。
【００５７】
「塩」は、親化合物の所望の薬理活性を有する化合物の塩を指す。そのような塩には、（１）塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸によって、または酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタン−ジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、４−メチルビシクロ［２．２．２］−オクト−２−エン−１−カルボン酸、グルコへプトン酸、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、ターシャリーブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸などの有機酸によって生成される酸付加塩；あるいは（２）親化合物に存在する酸性プロトンが金属イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオンもしくはアルミニウムイオンに置き換えられることにより；またはエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミンなどの有機塩基に配位することにより生成される塩が含まれる。いくつかの実施形態においては、塩は、存在する酸性プロトンが無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アルミニウム、水酸化カルシウムなど）および有機塩基（例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミンなど）と反応し得るときに生成され得る。いくつかの実施形態においては、塩は薬学的に許容可能である。
【００５８】
「溶媒和物」は、本明細書に記載の化合物の結晶格子への化学量論比での溶媒の導入を指し、その導入によって付加物が形成される。溶媒和物の形成方法には、溶媒を含む雰囲気での貯蔵、溶媒を含む剤形化、または通常の薬学的処理工程、例えば、結晶化（すなわち、溶媒または混合溶媒からの結晶化）、蒸気拡散などが含まれるが、これらに限定されない。溶媒和物はまた、ある特定の環境下で溶媒にさらすか、または溶媒中に物質を懸濁させることにより、他の結晶性の溶媒または水和物から形成され得る。溶媒和物は、溶媒和物多型をもたらす２つ以上の形態で結晶化させることができる。例えば、（Guillory, K., Chapter 5, pp. 205-208, Polymorphism in Pharmaceutical Solids, (Brittain, H. ed.), Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1999）を参照されたい。上記の溶媒和物の調製方法は、十分に当業者の技術の範囲内であり、完全に従来技術であり、当該技術分野で一般に行われている実験を超える実験が要求されることはない。溶媒和物は、当業者によく知られた方法、例えば、単結晶Ｘ線回折法、粉末Ｘ線回折法、偏光顕微鏡法、熱顕微鏡法、熱重量分析法、示差走査熱量測定法、赤外分光分析法、ラマン分光法、ＮＭＲ分光測定などの方法で、特徴付けおよび／または分析され得る。（Brittain, H., Chapter 6, pp. 205-208, Polymorphism in Pharmaceutical Solids, (Brittain, H. ed.), Marcel Dekker, Inc., New York, 1999）。さらに、HOLODIAG, Pharmaparc II, Voie de l'Innovation, 27 100 Val de Reuil, France（http://www.holodiag.com）などの多くの企業が溶媒和物の調製および／または特徴付けなどのサービスを定型業務として提供している。
【００５９】
「所望の活性のための選択」は、本明細書で使用されるとき、分子の物性に基づいて、より所望度の高い分子をより所望度の低い分子から分離する任意の生化学的手順である。したがって、分子の不均質な混合物から所望の特性を示す化合物を物理的に分離することが含まれる。例としては、固定化標的タンパク質への結合による混合物からのリガンドのアフィニティ精製や、酵素を介してのアフィニティハンドルの結合による混合物からの酵素基質の単離などが挙げられる。
【００６０】
「ＳＰＭＡ」は、本明細書で使用されるとき、３−スルホプロピルメタクリレートを指す。
【００６１】
「ＴＲＩＭ」は、本明細書で使用されるとき、トリメチロールプロパントリメタクリレートを指す。
【００６２】
「タグ化化合物」、「ＤＮＡタグ化化合物」または「核酸タグ化化合物」は、本明細書で使用されるとき、（ａ）固有の核酸タグであって、各化合物の各固有核酸タグは少なくとも１つの、好ましくは２つ以上の連結された異なるハイブリダイゼーション配列を有し、そのハイブリダイゼーション配列は相補的な固定化キャプチャー核酸配列に特異的に結合することができるもの、および、（ｂ）化学的に反応する部分であって、化合物前駆体、部分的に合成された化合物または完全な化合物を含み得る部分、を指す。上記化学的に反応する部分が完全に合成物である核酸タグ化化合物もまた、核酸タグ化化合物と呼ぶ。
【００６３】
＜認識化合物付着モノリス、およびそのアレイ＞
モノリスは、粒子間空隙のない、一体に連続した多孔質媒体であって、クロマトグラフィ担体として一般に使用されている（例えば、Ueki et al., Anal. Chem. (2004) 76, 7007-7012; Ueki et al., J. Chromatography A (2006) 1106, 106-111; Saburadin et al., Analytica Chimica Acta (2012) 736 108-114; Shu et al., J. Chromatography A (2011) 1218 5288-5234; Lubbad et al., J. Chromatography A (2011) 1218 8897-8902; Lubbad et al., J. Chromatography A (2011) 1218 2362-2367）。概略的には、モノリスは、相互接続されたセルまたはチャネルの繰返しを含む任意の単体の構造体であり、所定の空隙率によって特徴付けられ、固相とそれを囲む移動相との間の相互作用をサポートする。移動相が多孔質のモノリスメディアを通過させられることにより、対流が生じ、物質移動が促進される。モノリスは、ポリマー（すなわち有機物）、シリカ、有機物−シリカハイブリッド、無機物、クライオゲルおよびアガロースをベースとすることができ、最初の２つのタイプが最も一般的である。
【００６４】
本明細書においては、最も広い意味で、認識化合物付着モノリス、およびそのアレイが提供される。一側面において、リガンドに選択的に結合する認識化合物が付着したモノリスが提供される。いくつかの実施形態においては、モノリスは多孔質である。他のいくつかの実施形態においては、モノリスは、イオン性基を含む。これらの実施形態のいくつかにおいては、認識化合物はモノリスにイオン的に結合している。これらの実施形態の他のものにおいては、認識化合物はモノリスに共有結合的に結合している。
【００６５】
いくつかの実施形態においては、認識化合物が、オリゴヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、ペプチド核酸、ペプチド、デプシペプチド、ポリペプチド、抗体、ペプトイド、ポリマー、ポリシロキサン、分子量５０ダルトン超の無機化合物、分子量約５０ダルトン〜約３０００ダルトンの有機化合物、またはこれらの組合せである。他のいくつかの実施形態においては、リガンドが、オリゴヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、ペプチド核酸、ペプチド、デプシペプチド、ポリペプチド、抗体、ペプトイド、ポリマー、ポリシロキサン、分子量５０ダルトン超の無機化合物、分子量約５０ダルトン〜約３０００ダルトンの有機化合物、またはこれらの組合せである。さらに他のいくつかの実施形態においては、認識化合物が、オリゴヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、ペプチド核酸、ペプチド、デプシペプチド、ポリペプチド、抗体、ペプトイド、分子量約５０ダルトン〜約３０００ダルトンの有機化合物、またはこれらの組合せであり、リガンドが、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、ペプチド、デプシペプチド、ポリペプチド、抗体、ペプトイド、分子量約５０ダルトン〜約３０００ダルトンの有機化合物、またはこれらの組合せである。
【００６６】
いくつかの実施形態においては、認識化合物が、オリゴヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、ペプチド核酸、またはこれらの組合せである。他のいくつかの実施形態においては、リガンドが、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、またはこれらの組合せである。さらに他のいくつかの実施形態においては、認識化合物が、オリゴヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、ペプチド核酸、またはこれらの組合せであり、リガンドが、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、またはこれらの組合せである。
【００６７】
いくつかの実施形態においては、認識化合物が、ｌａｃリプレッサー、ｔｒｐリプレッサー、ラムダリプレッサー、ａｒｃリプレッサーなどのタンパク質性ＤＮＡ結合タンパク質であるか、またはこれらのリプレッサーの改変変異体であって新規なＤＮＡ結合特異性を有するものであり、リガンドが二本鎖ＤＮＡである。さらに他のいくつかの実施形態においては、認識化合物は、ＣｒｅＩファミリーメガヌクレアーゼなどのサイト特異的ヌクレアーゼであるか、またはヌクレアーゼ活性は欠損しているが配列特異的ＤＮＡ認識特性は残存しているＴＡＬＥＮヌクレアーゼである。
【００６８】
いくつかの実施形態では、モノリスは、シリカコポリマーにより形成されている。他のいくつかの実施形態では、シリカコポリマーは、
【化１】
0006602772.tif 000002
またはこれらの組合せからなる群から選択されるモノマーを含む。
【００６９】
シリカ系モノリスは、ポロゲンの存在下、酸を触媒としたアルコキシシランの加水分解および重縮合により調製し得る。加熱および乾燥の後、シリル化によって、ゾル−ゲルネットワークが誘導され得る。認識化合物の付着に適した官能基は、製造過程で官能性モノマーを直接導入することによって、またはシリカモノリスを修飾することによって、シリカモノリスに導入することができる。例えば、
【化２】
0006602772.tif 000003
は、ＧＭＡ−ｃｏ−ＥＤＭＡポリマーモノリス用に、下記のように官能化し得る。本明細書に記載された方法の実施に利用し得る他のシリカモノリスは、ポリ（ｐ−メチルスチレン−ｃｏ−ビス（ｐ−ビニルベンジル）ジメチルシランである（Wieder et al., J. Chromatography A (2008) 1191 252-263）。
【００７０】
化学的官能性の変化は新たなモノリスの物理的特性の最適化を必要としないため、通常はシリカモノリスを修飾することが好ましい。ここで、ゾル−ゲルモノリスは、上述したいくつかのモノマーなどのオルガノクロロシランやオルガノアルコキシシラン試薬によるシリル化によって化学的に修飾される。シリカモノリスの官能基は、認識化合物が相補的官能基を含む場合、認識化合物により、例えばエーテル結合、エステル結合またはアミド結合を形成することによって、直接官能化される。いくつかの実施形態では、相補的官能基（例えば、アジドとアセチレン；ジエンと電子不足オレフィン）の環状付加またはクリックケミストリー（Evans, R. A., Australian J. of Chemistry, 60 (6): 384-395 (2007)）が、認識化合物のモノリスへの付着に使用され得る。
【００７１】
あるいは、シリカモノリスの官能基に二官能性のリンカーを付着させ、認識化合物を、上記二官能性リンカーの相補的官能基とアミド結合、カルバメート結合、エステル結合、ウレア結合、ウレタン結合、炭素−窒素結合、炭素−炭素結合、エーテル結合、チオエーテル結合、またはジスルフィド結合を形成することによって、上記モノリスに共有結合的に結合させることができる。いくつかの実施形態では、相補的官能基（例えば、アジドとアセチレン；ジエンと電子不足オレフィン）の環状付加またはクリックケミストリーを、モノリスに共有結合的に結合したリンカーを認識化合物に付着させるために使用し得る。
【００７２】
さらに、認識化合物を、シリカモノリスの官能基と反応可能な官能基を含むリンカーによって官能化し得る。前述したように、リンカーに結合した認識化合物は、該リンカーの相補的官能基とアミド結合、カルバメート結合、エステル結合、ウレア結合、ウレタン結合、炭素−窒素結合、炭素−炭素結合、エーテル結合、チオエーテル結合、またはジスルフィド結合を形成することによって、上記モノリスに共有結合的に結合させることができる。いくつかの実施形態では、相補的官能基（例えば、アジドとアセチレン；ジエンと電子不足オレフィン）の環状付加またはクリックケミストリーを、認識化合物に共有結合的に結合したリンカーにモノリスを付着させるために使用し得る。
【００７３】
いくつかの実施形態では、モノリスは、無機モノリスおよび有機モノリスの両方の利点（すなわち、有機溶媒中での機械的および構造的な安定性と、官能化の容易性）を併せ持つ有機−無機シリカハイブリッドである。そのようなモノリスは、その構造の一部に有機官能基を有するように修飾されたシランから製造することができる。
【００７４】
いくつかの実施形態では、モノリスは、例えば、ジルコニア、ハフニアまたはチタニアモノリスなどの無機モノリスであり得る（Hoth et al., J. Chromatogr. A, (2005) 392; Randon et al., J. Chromatogr. A (2006) 19; Rivera et al., Analyst. (2009), 31; Kubo et al., Mater. Let., (2010) 177; Konishi et al., J. Chromatogr. A, (2009) 7375）。上記無機モノリスは、シリカモノリスでは問題となり得るような極端なｐＨや温度に対する耐性があり、かつ独特で特有の選択性を有することが多い。いくつかの実施形態では、無機モノリスは、シリカモノリスについて上述したような方法で、認識化合物により官能化され得る。
【００７５】
ポリマー系モノリスは、通常、高度に架橋した構造を有し、微小球体が融合したアレイが空隙によって分離された内部構造を含む。多孔質のポリマーモノリスの構造的剛性は、このような構造において一般的に見出される高架橋による。
【００７６】
いくつかの実施形態では、モノリスは、有機コポリマーを含む。他のいくつかの実施形態では、有機コポリマーは、１種のモノビニルポリマーと１種のポリビニルポリマーとの組合せである。さらに他のいくつかの実施形態においては、有機コポリマーは、複数種のモノビニルポリマーと複数種のポリビニルポリマーの組合せである。さらに他のいくつかの実施形態においては、有機コポリマーは、１種のポリビニルポリマーであるか、または複数種のポリビニルポリマーの組合せである。
【００７７】
上述のような実施形態のいくつかにおいては、コポリマーは、ビニルスチレン、ビニルナフタレン、ビニルアントラセン、およびそれらの環置換誘導体（ここで、上記置換基の例には、クロロメチル基、炭素原子数１０以下のアルキル基、ヒドロキシル基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、ハロゲン原子、窒素原子、保護されたヒドロキシル基、もしくはアミノ基が含まれる。）、アクリルアミドおよびメタクリルアミド、ならびに窒素原子上において１個または２個の、Ｃ１〜５アルキル基、Ｃ１〜４アルキルアミノアルキル基もしくはジアルキルアミノアルキル基、Ｃ１〜４メトキシアミノアルキル基、Ｃ１〜４ジメトキシアミノアルキル基もしくはジエトキシアミノアルキル基、Ｃ１〜４メトキシアルキル基、テトラヒドロピラニル基、およびテトラヒドロフルフリル基で置換されたそれらの誘導体、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルピロリドン、およびこれらの混合物、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、アルキルアクリーレート、アルキルメタクリーレート、ペルフルオロアルキルアクリレート、ペルフルオロアルキルメタクリーレート、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、ヒドロキシアルキルアクリレート、ヒドロキシアルキルメタクリレート（ここで、上記の各アルキル基におけるアルキル基は、１〜１０の炭素原子からなる。）、スルホアルキルアクリレート、スルホアルキルメタクリレート、オリゴエチレンオキシドアクリレート、オリゴエチレンオキシドメタクリレート、アクリレート誘導体およびメタクリレート誘導体（例えば、第一級、第二級、第三級および第四級アミン、エポキシドおよび両性イオンなどの官能性を有する誘導体）、ビニルピリジン、ビニルアセテート、ビニルピロリドン、ビニルアズラクトン、またはこれらの組合せからなる群から選択されるモノビニルモノマーを含む。他のいくつかの実施形態においては、モノビニルモノマーは、スチレン、ビニルナフタレン、ビニルアントラセン、およびそれらの環置換誘導体（ここで、上記置換基の例には、クロロメチル基、炭素原子数１８以下のアルキル基、ヒドロキシル基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、ハロゲン原子、窒素原子、保護されたヒドロキシル基、アミノ基またはこれらの組合せが含まれる。）を含むが、これらに限定されない。さらに他のいくつかの実施形態においては、モノビニルモノマーは、アクリルアミドおよびメタクリルアミド、ならびに窒素原子上において１個または２個の、Ｃ１〜５アルキル基、Ｃ１〜４アルキルアミノアルキル基もしくはジアルキルアミノアルキル基、Ｃ１〜４メトキシアミノアルキル基、Ｃ１〜４ジメトキシアミノアルキル基もしくはジエトキシアミノアルキル基、Ｃ１〜４メトキシアルキル基、テトラヒドロピラニル基、およびテトラヒドロフルフリル基で置換されたそれらの誘導体、Ｎ−アクリロイルピペリジン、およびＮ−アクリロイルピロリドン、またはこれらの組合せを含むが、これらに限定されない。さらに他のいくつかの実施形態においては、モノビニルモノマーはまた、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、アルキルアクリーレート、アルキルメタクリーレート、ペルフルオロアルキルアクリレート、ペルフルオロアルキルメタクリーレート、ヒドロキシアルキルアクリレート、ヒドロキシアルキルメタクリレート（ここで、上記の各アルキル基におけるアルキル基は、１〜１０の炭素原子からなる。）、スルホアルキルアクリレート、スルホアルキルメタクリレート、オリゴエチレンオキシドアクリレート、オリゴエチレンオキシドメタクリレート、アクリレート誘導体およびメタクリレート誘導体（例えば、第一級、第二級、第三級および第四級アミン、エポキシドおよび両性イオンなどの官能性を有する誘導体）、ビニルアセテート、ビニルピロリドン、ビニルアズラクトン、およびこれらの組合せからなる群から選択され得る。
【００７８】
いくつかの実施形態では、コポリマーは、
【化３】
0006602772.tif 000004
およびこれらの組合せからなる群から選択されるモノビニルモノマーを含む。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ポリビニルモノマーは、アルキレンジアクリレート、アルキレンジアクリルアミド、アルキレンジメタクリレート、アルキレンジアクリルアミド、アルキレンジメタクリルアミド、ヒドロキシアルキレンジアクリレート、ヒドロキシアルキレンジメタクリレート（ここで、上記の各アルキレンモノマーにおけるアルキレン基は、１〜１０の炭素原子からなる。）、オリゴエチレングリコールジアクリレート、オリゴエチレングリコールジメタクリレート、ポリカルボン酸のビニルエステル、ジビニルベンゼン、ジビニルナフタレン、ペンタエリスリトールジメタクリレート、ペンタエリスリトールトリメタクリレート、ペンタエリスリトールテトラメタクリレート、ペンタエリスリトールジアクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ペンタエリスリトールテトラアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、トリメチロールプロパンアクリレート、またはこれらの組合せである。他のいくつかの実施形態においては、ポリビニルモノマーは、
【化４】
0006602772.tif 000005
およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【００８０】
ポリマーモノリスは、通常、少なくとも１種のポロゲンに溶解された、フリーラジカル開始剤およびモノマー（少なくとも１種のポリビニルモノマーを含む）を含む混合物から製造される。代表的なポロゲン溶媒の例には、一般的な有機溶媒、例えば、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、トルエン、クロロベンゼン、ヘキサン、メタノール、ジメチルホルムアミド、シクロヘキサノール、ドデカノール、超臨界ＣＯ２、エーテルなどが含まれる。モノリスの形成は、外部ソース（例えば、光開始、熱など）による開始剤（例えば、ＡＩＢＮ、ＴＥＭＰＯ、ＡＰＳ、ＴＭＥＤなど）のフリーラジカルへの分解、または開始剤（例えばベンゾフェノン）の光励起によって引き起こされる。これによりポリマー鎖の形成が誘発され、該ポリマー鎖は反応混合物から沈澱し、最終的に凝集して連続した固体構造を形成する。モノリスのモルフォロジーは、例えば、ポリビニルモノマー、モノビニルモノマー、温度、ポロゲン溶媒（ポロゲン）の組成および割合、フリーラジカル開始剤の濃度、および重合を開始させる方法などの、多くの変数に依存する。
【００８１】
いくつかの実施形態においては、ポリマーモノリスは、１種以上のポリビニルモノマーを含む混合物を、開始剤およびポロゲンの存在下で重合することにより製造される。他のいくつかの実施形態においては、ポリマーモノリスは、１種以上のポリビニルモノマーを含む混合物を、開始剤、ポロゲンおよび１種以上のモノビニルモノマーの存在下で重合することにより製造される。混合物は、通常、適切な溶媒によって洗浄され、ポロゲンおよび他の不純物が除かれる。
【００８２】
いくつかの実施形態においては、混合物は、約１０〜約６０体積％の量の１種以上のポリビニルモノマー、約４５〜約９０体積％のポロゲン、および約０．１〜約１体積％の開始剤である。他のいくつかの実施形態においては、混合物は、約１０〜約５０体積％の量の１種以上のポリビニルモノマー、約４５〜約８５体積％のポロゲン、および約０．１〜約１体積％の開始剤である。さらに他のいくつかの実施形態においては、混合物は、約２０〜４０体積％の量の１種以上のポリビニルモノマー、約４５〜約８０体積％のポロゲン、および約０．１〜約１体積％の開始剤である。さらに他のいくつかの実施形態においては、混合物は、約１５〜４０体積％の量の１種以上のポリビニルモノマー、約４５〜約８５体積％のポロゲン、および約０．１〜約１体積％の開始剤である。さらに他のいくつかの実施形態においては、混合物は、約１０〜４０％の１種以上のモノビニルモノマー、１０〜４０体積％の１種以上のポリビニルモノマー、約２０〜約８０体積％のポロゲン、および約０．１〜約１体積％の開始剤である。さらに他のいくつかの実施形態においては、混合物は、約２０〜３０％の１種以上のモノビニルモノマー、２０〜３０体積％の１種以上のポリビニルモノマー、約２０〜約６０体積％のポロゲン、および約０．１〜約１体積％の開始剤である。さらに他のいくつかの実施形態においては、混合物は、約２５〜３５体積％の量の１種以上のポリビニルモノマー、約２０〜約７５体積％のポロゲン、および約０．１〜約１体積％の開始剤である。
【００８３】
いくつかの実施形態においては、モノリスは、ポリ（ＧＭＡ−ｃｏ−ＥＤＭＡ）、ポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＥＤＭＡ）、ポリ（ＥＤＭＡ−ｃｏ−ＭＡＡ）、ポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＥＤＭＡ−ｃｏ−ＳＰＭＡ）、ポリ（ＧＭＡ−ｃｏ−ＤＥＧＤＭＡ）、ポリ（ＤＥＭＡ−ｃｏ−ＰＥＧＤＡ）、ポリ（ＭＡＥＴＡ−ｃｏ−ＰＧＤＡ）、ポリ（ＨＭＡ−ｃｏ−ＥＤＭＡ）、ポリ（ＬＭＡ−ｃｏ−ＥＤＭＡ）、ポリ（ＢＭＡ−ｃｏ−ＥＤＭＡ）、ポリ（ＯＤＭＡ−ｃｏ−ＥＤＭＡ）、ポリ（ＣＭＳ−ｃｏ−ＤＶＢ）、ポリ（ＧＭＡ−ｃｏ−ＤＶＢ）、ポリ（ＧＭＡ−ｃｏ−ＴＲＩＭ）、ポリ（スチレン−ｃｏ−ＤＶＢ）、ポリ（ＮＢＥ−ｃｏ−（ＮＢＥ−ＣＨ２Ｏ）３ＳｉＣＨ３）である。これらの実施形態において、上記ポリマーは、ＧＭＡをＥＤＭＡと、ＨＥＭＡをＥＤＭＡと、ＥＤＭＡをＭＡＡと、ＨＥＭＡをＥＤＭＡおよびＳＰＭＡと、ＧＭＡをＤＥＧＤＭＡと、ＤＡＥＭをＰＥＧＤＡと、ＭＡＥＴＡをＰＧＤＡと）、ＨＭＡをＥＤＭＡと）、ＬＭＡをＥＤＭＡと、ＢＭＡをＥＤＭＡと、ＯＤＭＡをＥＤＭＡと）、ＣＭＳをＤＶＢと、ＧＭＡをＤＶＢと、ＧＭＡをＴＲＩＭと、およびスチレンをＤＶＢと、それぞれ重合させることにより製造される。
【００８４】
認識化合物の付着に適した官能基は、製造過程で官能性モノマーを直接組み込むことにより、あるいはポリマーモノリスを修飾することにより、ポリマーモノリスに導入され得る。官能性モノマーのいくつかの例として、下記に示すものが挙げられる。
【化５】
0006602772.tif 000006
【００８５】
化学的官能性の変化は新たなモノリスの物理的特性の最適化を必要としないため、通常はポリマーモノリスを修飾が一般に好ましい。ここで、ポリマーモノリスは、例えば、官能性モノマーの重合によりモノリス表面に配置されたエポキシ基、クロロメチル基、フェノール性ヒドロキシル基およびアザラクトン基と反応させることによって（Luo et al., J. Chromatogr. A (2001) 926 255; Gusev et al., J. Chromatogr. A (1999) 855 273; Xie et al., Biotechnol Bioeng. (1999) 62 30）、、化学的に修飾され得る。認識化合物が相補的官能基を含む場合、ポリマーモノリス上の官能基は、認識化合物と、例えば、エーテル結合、エステル結合またはアミド結合を形成することによって、直接反応し得る。
【００８６】
あるいは、ポリマーモノリスの官能基に二官能性のリンカーを付着させ、認識化合物を、上記二官能性リンカーの相補的官能基とアミド結合、カルバメート結合、エステル結合、ウレア結合、ウレタン結合、炭素−窒素結合、炭素−炭素結合、エーテル結合、チオエーテル結合、およびジスルフィド結合を形成することによって、上記モノリスに共有結合的に結合させることができる。いくつかの実施形態では、相補的官能基（例えば、アジドとアセチレン；ジエンと電子不足オレフィン）の環状付加またはクリックケミストリーを、モノリスに共有結合的に結合したリンカーを認識化合物に付着させるために使用し得る。
【００８７】
さらに、認識化合物を、ポリマーモノリスの官能基と反応可能な官能基を含むリンカーによって官能化し得る。前述したように、リンカーに結合した認識化合物は、該リンカーの相補的官能基とアミド結合、カルバメート結合、エステル結合、ウレア結合、ウレタン結合、炭素−窒素結合、炭素−炭素結合、エーテル結合、チオエーテル結合、またはジスルフィド結合を形成することによって、上記モノリスに共有結合的に結合させることができる。いくつかの実施形態では、相補的官能基（例えば、アジドとアセチレン；ジエンと電子不足オレフィン）の環状付加またはクリックケミストリーを、認識化合物に共有結合的に結合したリンカーにモノリスを付着させるために使用し得る。
【００８８】
ポリマーモノリスへの認識基の付着には、例えばＧＭＡまたはその誘導体などのような、オキシラン基を含むモノマーが有用である。そのようなモノマーを含むコポリマーは、各種の求核試薬（例えば、アジド、スルフィドイオン、アミンなど）によって開環させることができ、その後、二官能性リンカー、認識化合物に付着したリンカー、または認識化合物の相補的官能基との反応に使用されて、後ろの２つの例ではモノリスに付着した認識化合物を提供することができる。例えば、ポリ（ＧＭＡ−ｃｏ−ＥＤＭＡ）またはポリ（ＧＭＡ−ｃｏ−ＤＶＢ）は、活性化エステル、アジド、スルフィドイオンまたはアミンとの反応後、ジエン、アセチレン、チオールおよび活性化エステルを含む認識化合物と反応して、それぞれ、ディールス・アルダー付加物、１，３−双極子環化付加物、ジスルフィドおよびアミドを提供することができる。同様に、ポリ（ＣＭＳ−ｃｏ−ＤＶＢ）は、アジド、スルフィドイオンまたはアミンとの反応後、アセチレン、チオールおよび活性化エステルを含む認識化合物と反応して、それぞれ、１，３−双極子環化付加物、ジスルフィドおよびアミドを提供することができる。ポリ（ＧＭＡ−ｃｏ−ＥＤＭＡ）またはポリ（ＧＭＡ−ｃｏ−ＤＶＢ）はまた、ジオールに加水分解され、その後、アルデヒドに酸化することができる。上記の官能基はいずれも、リンカー、認識化合物に付着したリンカー、または認識化合物の相補的官能基と反応して、後ろの２つの例ではモノリスに付着した認識化合物を提供することができる。
【００８９】
上記実施形態のいくつかにおいては、認識化合物は核酸である。他のいくつかの実施形態では、認識化合物はオリゴヌクレオチドである。いくつかの例示的な実施形態では、ポリ（ＧＭＡ−ｃｏ−ＥＤＭＡ）、ポリ（ＧＭＡ−ｃｏ−ＤＶＢ）またはポリ（ＣＭＳ−ｃｏ−ＤＶＢ）モノリスをアジドと反応させて、アジド官能基を含むモノリスを提供する。これらの実施形態のいくつかでは、オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドの５’末端にリンカー（例えば、ＰＥＧまたはポリＴ）により結合している５’アルキニル基（例えば、Ｃ３〜Ｃ２０）を含む。上記実施形態のいくつかにおいては、オリゴヌクレオチドは、Ｃｕ（Ｉ）を利用したクリックケミストリーによってモノリスに結合される。
【００９０】
他のいくつかの例示的実施形態においては、ポリ（ＧＭＡ−ｃｏ−ＥＤＭＡ）、ポリ（ＧＭＡ−ｃｏ−ＤＶＢ）またはポリ（ＣＭＳ−ｃｏ−ＤＶＢ）モノリスをアジドと反応させて、アジド基を含むモノリスを提供する。これらの実施形態のいくつかでは、オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドの５’末端にリンカー（例えば、ＰＥＧまたはポリＴ）により結合している末端アルキン、ジベンゾシクロオクチン、またはビシクロ［６．１．０］ノニンを含む。上記実施形態のいくつかにおいては、オリゴヌクレオチドは、Ｃｕフリーのクリックケミストリーによってモノリスに結合される。
【００９１】
フリーラジカル付加、グラフトおよび光グラフトの手法もまた、モノリスの表面にポリマーリガンドを付加することによって該モノリスを反応性官能基で官能化するために使用され得る（Myer et al., Macromolecules (2000) 3, 7769-7775; Rohr et al., Macromolecules (2003) 36, 1677-1684; Wang et al., J. Chromatography A (2007) 1147, 24-29）。そのようなポリマーを含有するリガンドは、モノリス表面の官能基密度を大幅に高め、それによりモノリス表面の結合能を増大させ得る。他の多くの方法をポリマーモノリスの官能化およびモノリスへの認識成分の付着に使用し得ることが当業者には認識される。
【００９２】
いくつかの実施形態においては、ポリ（ＧＭＡ−ｃｏ−ＥＤＭＡ）またはポリ（ＧＭＡ−ｃｏ−ＤＶＢ）は、活性化エステル、アジド、スルフィドイオンまたはアミンとの反応後、イオン交換樹脂に変換される。他のいくつかの実施形態においては、ポリ（ＣＭＳ−ｃｏ−ＤＶＢ）は、アジド、スルフィドイオンまたはアミンとの反応後、イオン交換樹脂に変換される。ポリ（ＧＭＡ−ｃｏ−ＥＤＭＡ）またはポリ（ＧＭＡ−ｃｏ−ＤＶＢ）はまた、ジオールに加水分解され、その後、アルデヒドに酸化され、さらに官能基の操作によってイオン交換樹脂に変換される。
【００９３】
いくつかの実施形態においては、多孔質モノリスは、約４５％〜約８５％の空隙率を有する。他のいくつかの実施形態においては、多孔質モノリスは、約６０％〜約７５％の空隙率を有する。さらに他のいくつかの実施形態において、メソ細孔（５ｎｍ〜５０ｎｍ）の体積分率は、約３０％〜約８０％である。さらに他のいくつかの実施形態において、ミクロ細孔（２ｎｍ）の体積分率は、約０％〜約１０％である。さらに他のいくつかの実施形態において、細孔（５０ｎｍ〜３００ｎｍ）の体積分率は、約１％〜約２０％である。さらに他のいくつかの実施形態において、フロースルー孔（＞３００ｎｍ）の体積分率は、約４０％未満である。
【００９４】
いくつかの実施形態において、多孔質ポリマーモノリスの細孔径は、約５ｎｍ〜約１０，０００ｎｍの範囲である。他のいくつかの実施形態において、多孔質ポリマーモノリスの細孔径は、約５０ｎｍ〜約５，０００ｎｍの範囲である。さらに他のいくつかの実施形態において、多孔質ポリマーモノリスの細孔径は、約１００ｎｍ〜約１０，０００ｎｍの範囲である。さらに他のいくつかの実施形態において、多孔質ポリマーモノリスの細孔径は、約５０ｎｍ〜約７００ｎｍの範囲である。
【００９５】
さらに他のいくつかの実施形態において、モノリスの平均ミクロ細孔径は、約２ｎｍ未満である。さらに他のいくつかの実施形態において、モノリスの平均メソ細孔径は、約２ｎｍ〜約５０ｎｍである。さらに他のいくつかの実施形態においては、モノリスの平均ミクロ細孔径は約２ｎｍ未満であり、該モノリスの平均メソ細孔径は約２ｎｍ〜約５０ｎｍであり、かつ該モノリスの平均細孔径は約５０ｎｍ〜約７００ｎｍである。
【００９６】
いくつかの実施形態において、ポリマーマトリックスの比表面積は、約０．５ｍ２／ｇ〜約１０００ｍ２／ｇの範囲である。他のいくつかの実施形態において、ポリマーマトリックスの比表面積は、約１ｍ２／ｇ〜約５００ｍ２／ｇの範囲である。さらに他のいくつかの実施形態において、ポリマーマトリックスの比表面積は、約５ｍ２／ｇ〜約２００ｍ２／ｇの範囲である。さらに他のいくつかの実施形態において、ポリマーマトリックスの比表面積は、約１０ｍ２／ｇ〜約１００ｍ２／ｇの範囲である。さらに他のいくつかの実施形態において、ポリマーマトリックスの比表面積は、約２０ｍ２／ｇ〜約６０ｍ２／ｇの範囲である。さらに他のいくつかの実施形態において、ポリマーマトリックスの比表面積は、約３０ｍ２／ｇ〜約５０ｍ２／ｇの範囲である。
【００９７】
いくつかの実施形態において、モノリスの透過率は、約１ミリダルシー〜約１×１０４ダルシーである。他のいくつかの実施形態において、モノリスの透過率は、約８．９×１０２ダルシー〜約８．９×１０４ダルシーである。さらに他のいくつかの実施形態において、モノリスの透過率は、約１ミリダルシー〜約１×１０３ダルシーである。さらに他のいくつかの実施形態において、モノリスの透過率は、約８．９×１０３ダルシーである。
【００９８】
理論に縛られることを望むものではないが、リガンドの経路の決定または結合に重要であり得るモノリスの特性には、モノリスに固定された認識要素に対する溶液中の大きなリガンドマクロ分子の急速なハイブリダイゼーション速度、低い背圧、およびリガンド認識要素が付着したモノリスの高い結合能が含まれる。
【００９９】
いくつかの実施形態においては、認識化合物の密度は、約１ｐｍｏｌ／１０μｌ〜約１μｍｏｌ／１０μｌである。さらに他のいくつかの実施形態において、認識化合物の密度は、約１ｎｍｏｌ／１０μｌである。
【０１００】
いくつかの実施形態においては、認識化合物はオリゴヌクレオチドであり、リガンドは、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ配列またはそれらの組合せである。上記実施形態のいくつかにおいては、オリゴヌクレオチドは、約１０の核酸サブユニット〜約５０の核酸サブユニットを有する。上記実施形態の他のいくつかにおいては、オリゴヌクレオチドは、約１５の核酸サブユニット〜約４０の核酸サブユニットを有する。上記実施形態のさらに他のいくつかにおいては、認識化合物の相補的核酸配列に結合する速度定数は、約１×１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１×１０６Ｍ−１ｓ−１である。上記実施形態のさらに他のいくつかにおいては、認識化合物の相補的核酸配列に結合する速度定数は、約１×１０３Ｍ−１ｓ−１〜約１×１０６Ｍ−１ｓ−１である。上記実施形態のさらに他のいくつかにおいては、認識化合物の相補的核酸配列に結合する速度定数は、約１×１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１×１０５Ｍ−１ｓ−１である。一般に、上述のようなフロースルーモノリスは、急速かつ特異的なＤＮＡ／ＲＮＡ／核酸ハイブリダイゼーションに有用であり得る。いくつかの実施形態においては、核酸はホモポリマーではない。
【０１０１】
いくつかの実施形態においては、モノリスはクライオゲルモノリスである（Malik et al., J. Sep Sci. (2006) 1686; Galaer et al., J. Sep Sci. (2012) 1173; Arvidsson et al., J. Chromatography A (2002) 27; Daniak et al., J. Chromatography B (2006) 145）。クライオゲルは、適度に凍ったモノマー前駆体またはポリマー前駆体溶液の存在下で形成される、良好な化学的および物理的安定性を有するゲルマトリックスである。一般にポリアクリアミドをベースするクライオゲルモノリスは、通常、他のゲルより大きな空孔を有しており、そのためタンパク質凝集物、膜フラグメント、ウイルスなどのように大きな実体物用のマトリックスとして特に有用である。いくつかの実施形態においては、認識化合物は、上記で提示された方法によってクライオゲルモノリスに付着され得る。
【０１０２】
いくつかの実施形態においては、モノリスはアガロース系モノリスである。他のいくつかの実施形態においては、モノリスは、スーパーポーラスなアガロース系モノリスである。これらの実施形態のいくつかにおいては、スーパー細孔（superpore）の直径は、約２０μｍ〜約２００μｍである。これらの実施形態の他のいくつかにおいては、スーパー細孔（superpore）の体積は、約２０％〜５０％変化する。アガロースモノリスは、アガロースエマルションをキャストすることにより製造され得る（Gustavsson et al., J. Chromatography A, (1999), 832 29-39; Gustavsson et al., J. Chromatography A, (2000), 925 69-78）。
【０１０３】
一般に、アガロースから生成されたモノリスは、多糖のＤ−ガラクトースおよびＬ−ガラクトピラノースの交互サブユニットの遊離ヒドロキシル基との反応によって、認識化合物で官能化することができる。認識化合物が相補的官能基を含む場合、ヒドロキシル基は、認識化合物によって直接、例えばエーテル結合、エステル結合またはカルバメート結合を形成することにより官能化され得る。あるいは、多糖のヒドロキシル基に二官能性のリンカーを付着させ、そして認識化合物を、アミド結合、カルバメート結合、エステル結合、ウレア結合、ウレタン結合、炭素−窒素結合、炭素−炭素結合、エーテル結合、チオエーテル結合、もしくはジスルフィド結合の形成により、または付着させたリンカー上の適当な官能基（例えば、アジド、ジエンまたは電子不足オレフィン）との環状付加あるいはクリックケミストリーにより、付着させ得る。さらに、認識化合物は、ヒドロキシル化合物と反応可能な基を含む二官能性リンカーによって官能化され得る。
【０１０４】
他の側面において、モノリスメディアが提供される。モノリスメディアは、リガンドに選択的に結合する認識化合物が付着した凝集粒子を含む。特に限定するものではないが、一例として、負に帯電した樹脂粒子がグラフトされて、正に帯電したグラフト樹脂粒子が提供され得る。正に帯電したグラフト樹脂粒子は、その後、コートされていない樹脂粒子と混合されて、イオン結合により凝集した粒子を形成する。当業者に知られた様々な方法で凝集粒子に認識化合物を付着させることができ、該凝集粒子をカラムの形成に使用することができる。このような手法の利点は、凝集粒子の充填が壁面とモノリスとの間の間隙を防止するため、壁にモノリスを共結合的または非共有結合的に接着させる必要がないことである。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、ハウジング（例えば、カラムまたはウェル）が提供される。ハウジングは、１つ以上の、リガンドに選択的に結合する付着認識化合物を含むモノリスを包含する。いくつかの実施形態においては、モノリスはハウジングに結合している。いくつかの実施形態においては、ハウジングは、化合物ライブラリーのメンバーに選択的に結合する。これらの実施形態のいくつかにおいては、ライブラリーは、ファージディスプレイ法、ＲＮＡディスプレイ法、または核酸プログラム型コンビナトリアルケミストリーにより提供される。これらの実施形態の他のいくつかにおいては、ライブラリーは、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ配列、ペプチド、デプシペプチド、ポリペプチド、抗体、ペプトイド、分子量約５０ダルトン〜約３０００ダルトンの有機化合物、またはこれらの組合せを含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態においては、ハウジング（例えば、カラムまたはウェル）が提供され、該ハウジングは、認識化合物がオリゴヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、ペプチド核酸、ペプチド、デプシペプチド、ポリペプチド、抗体、ペプトイド、分子量約５０ダルトン〜約３０００ダルトンの有機化合物、またはこれらの組合せであり、リガンドが一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、ペプチド、デプシペプチド、ポリペプチド、抗体、ペプトイド、分子量約５０ダルトン〜約３０００ダルトンの有機化合物、またはこれらの組合せである。他のいくつかの実施形態においては、認識化合物がオリゴヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、ペプチド核酸、またはこれらの組合せであり、リガンドが一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、またはこれらの組合せである。
【０１０７】
いくつかの実施形態においては、ハウジング（例えば、カラムまたはウェル）が提供され、該ハウジングは、認識化合物がオリゴヌクレオチドであり、リガンドが一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ配列、またはこれらの組合せである。これらの実施形態のいくつかにおいては、ハウジングは、約０．５ｆｍｏｌ／μｌ〜約０．４ｎｍｏｌ／μｌの一本鎖核酸を結合することができる。これらの実施形態の他のものにおいては、オリゴヌクレオチドは、一本鎖核酸に特異的な配列である。これらの実施形態のいくつかにおいては、カラムは、例えば、ペプチド、環状ペプチド、トリアゼン、および有機小分子などの付着リガンドを含むＤＮＡライブラリーをルートする。
【０１０８】
いくつかの実施形態においては、ハウジング（例えば、カラムまたはウェル）が提供され、該ハウジングは、化学反応サイトまたはリガンドに動作的に結合している相補的オリゴヌクレオチドに選択的に結合する付着オリゴヌクレオチドを有するモノリスを含む。他のいくつかの実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、約１０の核酸サブユニット〜約５０の核酸サブユニットである。さらに他のいくつかの実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、約１５の核酸サブユニット〜約４０の核酸サブユニットである。さらに他のいくつかの実施形態においては、相補的オリゴヌクレオチドに結合する速度定数は、約１×１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１×１０６Ｍ−１ｓ−１である。さらに他のいくつかの実施形態においては、相補的オリゴヌクレオチドに結合する速度定数は、約１×１０３Ｍ−１ｓ−１〜約１×１０６Ｍ−１ｓ−１である。さらに他のいくつかの実施形態においては、相補的オリゴヌクレオチドに結合する速度定数は、約１×１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１×１０５Ｍ−１ｓ−１である。さらに他のいくつかの実施形態においては、相補的オリゴヌクレオチドは、化学反応サイトを含むリガンドに動作的に結合し、そのリガンドは、ペプチド、ペプトイド、分子量２０００ダルトン未満の有機化合物である。
【０１０９】
いくつかの実施形態においては、モノリスの透過率は、約１ミリダルシー〜約１×１０４ダルシーである。他のいくつかの実施形態においては、モノリスの透過率は、約１ミリダルシー〜約１×１０３ダルシーである。さらに他のいくつかの実施形態においては、モノリスの透過率は、約８．９×１０２ダルシー〜約８．９×１０４ダルシーである。さらに他のいくつかの実施形態においては、モノリスの透過率は、約８．９×１０３ダルシーである。さらに他のいくつかの実施形態においては、カラムが相補的オリゴヌクレオチドに予備的に結合する。さらに他いくつかのの実施形態においては、カラムは、約０．５ｆｍｏｌ／μｌ〜約０．４ｎｍｏｌ／μｌの相補的オリゴヌクレオチドに結合する。さらに他のいくつかの実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに動作的に結合しているアルキン基にモノリスのアジド基が環状付加して１，２，３トリアゾールを形成することにより、モノリスに付着する。
【０１１０】
いくつかの実施形態においては、化学反応サイトまたはリガンドに動作的に結合している相補的オリゴヌクレオチドに選択的に結合する付着オリゴヌクレオチドを有するモノリスを含む２つ以上のカラムを備え、上記相補的オリゴヌクレオチドが混合物の成分であるアレイが提供される。他のいくつかの実施形態においては、上記アレイは２つ以上のウェルを含むブロックであり、ここで各ウェルは異なるカラムを含む。他のいくつかの実施形態においては、カラムはウェルの表面に取り付けられている。さらに他のいくつかの実施形態においては、カラムは、アミド結合、エステル結合、ウレア結合、ウレタン結合、炭素−ケイ素結合、炭素−窒素結合、炭素−炭素結合、エーテル結合、チオエーテル結合、もしくはジスルフィド結合を形成することにより、または環状付加により、ウェルの表面に共有結合的に結合されている。さらに他のいくつかの実施形態においては、ブロックは、チタン、アルミニウム、ステンレス鋼、ドープドメタル、ガラス、石英、ポリカーボネート、溶融シリカ、ポリ（メチルメタクリレート）、プラスチック、ポリエーテルエーテルケトン、ドープドポリエーテルエーテルケトン、ドープドポリスチレン、環状オレフィンコポリマー、ウルテム（ultem）ポリエーテルイミド、ドープドポリプロピレン、またはこれらの組合せから構成される。さらに他のいくつかの実施形態においては、ブロックの内壁は、壁の表面積を増大させるように改変されている。さらに他のいくつかの実施形態においては、ウェルは研磨されている。さらに他のいくつかの実施形態においては、ウェルに筋が付けられている。さらに他のいくつかの実施形態においては、ウェルの寸法は、内径が約３．５〜４ｍｍ、および高さが約１〜４ｍｍである。さらに他のいくつかの実施形態においては、ウェルはアドレス可能である。
【０１１１】
いくつかの実施形態においては、２つ以上のウェルを有するブロックを含むアレイが提供される。いくつかの実施形態においては、ウェルは、リガンドに選択的に結合する付着認識化合物を含むハウジングを含む。他のいくつかの実施形態においては、モノリスは、ウェルの表面に付着される。モノリスは、ウェルの表面とアミド結合、エステル結合、ウレア結合、ウレタン結合、炭素−ケイ素結合、炭素−窒素結合、炭素−炭素単結合、エーテル結合、チオエーテル結合、またはジスルフィド結合を形成することにより、ウェルの表面に共有結合的に付着され得る。あるいは、クリックケミストリーまたは環状付加によって、ウェル表面の適当な官能基とモノリス上の基との間の環状付加物が提供され得る。官能基は、例えば、ウェル表面を官能性シラン化合物（例えば、３−（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレート）でシリル化することにより、またはメタクリロイルオキシデシルジハイドロジェンホスフェートのイオン結合により、ウェル表面に結合され得る。あるいは、ウェル表面はポリマー（例えば、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリジメチルシロキサン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ−２−ノルボルネン−ｃｏ−エチレン）で被覆され、ベンゾフェノンへの照射などにより開始されるフリーラジカル付加によってモノリスに付着され得る。他のいくつかの実施形態においては、モノリス形成過程において、ポリマーで被覆されたウェル表面にポリビニルモノマーが結合され、さらにモノリス表面のペンダントオレフィンと反応して、モノリスをウェル表面に共有結合的に結合させ得る。さらに他のいくつかの実施形態においては、モノリスはウェルに直接付着され得る。
【０１１２】
いくつかの実施形態においては、ブロックは、チタン、アルミニウム、ステンレス鋼、ドープドメタル、ガラス、石英、ポリカーボネート、溶融シリカ、ポリ（メチルメタクリレート）、プラスチック、ポリエーテルエーテルケトン、ドープドポリエーテルエーテルケトン、ドープドポリスチレン、ウルテムポリエーテルイミド、環状オレフィンコポリマー、ドープドポリプロピレン、またはこれらの組合せを含む。ブロックのウェルは、研磨、筋付け、または当業者に知られたその他の方法で、壁の表面積が増大するように改変され得る。いくつかの実施形態においては、ウェルの寸法は、直径が約０．１ｍｍ〜約５０ｍｍ、および高さが約０．１ｍｍ〜約１０ｍｍである。他のいくつかの実施形態においては、ウェルの寸法は、直径が約１０ｍｍ、および高さが約１０ｍｍである。さらに他のいくつかの実施形態においては、ウェルの寸法は、内径が約３．５〜約４ｍｍ、および高さが約１〜約４ｍｍである。いくつかの実施形態においては、ウェルはアドレス可能である。
【０１１３】
いくつかの実施形態においては、２つ以上のイオン交換ハウジング（例えば、カラムまたはウェル）を含むアレイが提供され、該アレイは、移動相のフロースルーが可能なフィルタプレートまたは他の任意の型のマイクロプレートもしくは装置を含む。これらの実施形態のいくつかにおいては、イオン交換ハウジングは、イオン性基を有するモノリスを含む。これらの実施形態のいくつかにおいては、上記イオン性基は、アミン、カルボン酸またはスルホン酸である。これらの実施形態のいくつかにおいては、モノリスは、グリシジルメタクリレートを含むコポリマーと、アミンまたはスルホン酸等価物との反応生成物である。これらの実施形態の他のいくつかにおいては、モノリスは、ポリ（ＧＭＡ−ｃｏ−ＥＤＭＡ）、ポリ（ＧＭＡ−ｃｏ−ＤＥＧＤＭＡ）またはポリ（ＧＭＡ−ｃｏ−ＤＶＢ）と、アミンまたはスルホン酸等価物との反応生成物である。これらの実施形態のさらに他のものにおいては、モノリスは、ポリ（ＣＭＳ−ｃｏ−ＤＶＢ）と、アミンまたはスルホン酸等価物との反応生成物である。いくつかの実施形態においては、イオン交換カラムは、従来のイオン交換材を含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態においては、移動相のフロースルーが可能なフィルタプレートまたは他の任意の型のマイクロプレートもしくは装置を含むアレイが提供される。上記アレイはまた、２つ以上のウェルを含むブロックを含む。各ウェルはイオン交換材を含む。いくつかの実施形態においては、イオン交換材は、イオン性基を有するモノリスを含む。これらの実施形態のいくつかにおいては、イオン性基は、アミン、カルボン酸またはスルホン酸である。これらの実施形態のいくつかにおいては、モノリスは、グリシジルメタクリレートを含むコポリマーと、アミンまたはスルホン酸等価物との反応生成物である。これらの実施形態の他のものにおいては、モノリスは、ポリ（ＧＭＡ−ｃｏ−ＥＤＭＡ）、ポリ（ＧＭＡ−ｃｏ−ＤＥＧＤＭＡ）またはポリ（ＧＭＡ−ｃｏ−ＤＶＢ）と、アミンまたはスルホン酸等価物との反応生成物である。これらの実施形態のさらに他のものにおいては、モノリスは、ポリ（ＣＭＳ−ｃｏ−ＤＶＢ）と、アミンまたはスルホン酸等価物との反応生成物である。いくつかの実施形態においては、イオン交換材は、従来のイオン交換材である。
【０１１５】
いくつかの実施形態においては、カラムは、ウェルの表面に付着される。他のいくつかの実施形態においては、カラムは、アミド結合、エステル結合、ウレア結合、ウレタン結合、炭素−ケイ素結合、炭素−窒素結合、炭素−炭素結合、エーテル結合、チオエーテル結合、もしくはジスルフィド結合を形成することにより、または環状付加により、ウェルの表面に共有結合的に結合されている。
【０１１６】
いくつかの実施形態においては、ブロックは、チタン、アルミニウム、ステンレス鋼、ドープドメタル、ガラス、石英、ポリカーボネート、溶融シリカ、ポリ（メチルメタクリレート）、プラスチック、ポリエーテルエーテルケトン、ドープドポリエーテルエーテルケトン、ドープドポリスチレン、環状オレフィンコポリマー、ウルテムポリエーテルイミド、ガラス繊維フィルタプレート、ドープドポリプロピレン、またはこれらの組合せを含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態においては、ウェルの寸法は、直径が約０．１ｍｍ〜約５０ｍｍ、および高さが約０．１ｍｍ〜約１０ｍｍである。他のいくつかの実施形態においては、ウェルの寸法は、直径が約１０ｍｍ、および高さが約１０ｍｍである。さらに他のいくつかの実施形態においては、ウェルの寸法は、内径が約３．５〜４ｍｍ、および高さが約１〜４ｍｍである。いくつかの実施形態においては、ウェルはアドレス可能である。
【０１１８】
＜付着認識化合物を有するモノリスおよびそのアレイの使用方法＞
核酸プログラム型化合物ライブラリーの調製方法が提供される。その方法は、核酸分子の混合物を、２つ以上のアドレス可能なウェルを有するブロックを含むアレイと接触させる工程を含む。各ウェルは、一本鎖核酸と選択的に結合することで核酸分子を亜集団にスプリットする１つ以上の付着認識化合物を有するモノリスを含む。いくつかの実施形態においては、アレイは２つ以上のオリゴヌクレオチドを含み、各カラムの付着オリゴヌクレオチドは化学反応サイトまたはリガンドに動作的に結合している相補的オリゴヌクレオチドに選択的に結合する。ここで、上記相補的ヌクレオチドは混合物の成分である。
【０１１９】
核酸分子の亜集団は、所望により、例えば昇温、イオン強度の変化またはｐＨの変化などによって認識化合物から分離され得、分離された核酸分子は分離容器に移される。分離された核酸分子の亜集団を、その後、異なる化学サブユニットと反応させる。その核酸分子は、動作的に結合している少なくとも１つの結合配列と少なくとも１つの化学反応サイトとを含む。核酸分子の亜集団が所望により分離容器に移されると、核酸に選択的に結合する付着認識化合物を有するモノリスを含むウェルが上記分離容器とアドレス可能に配列される。いくつかの実施形態においては、分離された核酸分子の亜集団は、異なる化学サブユニットと反応させる前に固定される。他のいくつかの実施形態においては、分離された核酸分子の亜集団は、異なる化学サブユニットと反応させる前にアニオン交換カラムに固定される。さらに他のいくつかの実施形態においては、アニオン交換カラムは、イオン交換基を有するモノリスを含む。
【０１２０】
核酸プログラム型化合物ライブラリーを調製する他の方法が提供される。その方法は、核酸分子の混合物を、２つ以上のアドレス可能なウェルを有するブロックを含むアレイと接触させる工程を含む。各ウェルは、一本鎖核酸と選択的に結合することで核酸分子を亜集団にスプリットする１つ以上の付着認識化合物を有するモノリスを含む。いくつかの実施形態においては、アレイは２つ以上のオリゴヌクレオチドを含み、各カラムの付着オリゴヌクレオチドは化学反応サイトまたはリガンドに動作的に結合する相補的オリゴヌクレオチドに選択的に結合する。ここで、上記相補的オリゴヌクレオチドは混合物の成分である。
【０１２１】
核酸分子の亜集団は第２のアレイに移される。上記第２のアレイは、移動相のフロースルーを可能にするフィルタプレートまたは他の任意の型のマイクロプレートもしくは装置と、２つ以上のアドレス可能なウェルを含むブロックとを含む。核酸分子の亜集団は、例えば昇温、イオン強度の変化またはｐＨの変化などにより認識化合物から分離され得る。第２のアレイのウェルは、核酸分子の亜集団を非特異的に固定するアニオン交換材を含む。固定された核酸分子の亜集団を、異なる化学サブユニットと反応させる。核酸に選択的に結合する１つ以上の付着認識化合物を有するモノリスを含むウェルは、上記アニオン交換材を含むウェルとアドレス可能に配列される。核酸分子は、動作的に結合している少なくとも１つの結合配列と少なくとも１つの化学反応サイトとを含む。いくつかの実施形態では、アニオン交換材はアニオン交換基を有するモノリスを含む。いくつかの実施形態においては、アレイは２つ以上のオリゴヌクレオチドを含み、各カラムの付着オリゴヌクレオチドは化学反応サイトまたはリガンドに動作的に結合する相補的オリゴヌクレオチドに選択的に結合する。ここで、上記相補的ヌクレオチドは混合物の成分である。他のいくつかの実施形態では、アニオン交換材はイオン交換基を有するモノリスカラムを含む。他のいくつかの実施形態においては、分離された核酸分子の亜集団は、異なる化学サブユニットと反応する前に固定される。さらに他のいくつかの実施形態においては、分離された核酸分子の亜集団は、異なる化学サブユニットと反応させる前にアニオン交換材に固定される。
【０１２２】
したがって、上記開示は、下記に記述するように、ＤＮＡプログラム型コンビナトリアルケミストリー（「ＤＰＣＣ」）（例えば、Wrenn et al., J. Am. Chem. Soc. (2007) 129 (43) 13137-13143; Wrenn et al., Annu. Rev. Biochem. (2007) 76, 331-349; Hurbury et al.,米国特許第７，４７９，４７２号明細書；Hurbury et al.,米国特許出願公開第２００６／００９９６２６号明細書を参照）を実施する新規な方法を説明している。
【０１２３】
ＤＰＣＣは、核酸テンプレート型コンビナトリアルケミカルライブラリーの合成、スクリーニングおよび増幅の方法を提供する。コンビナトリアルケミカルライブラリーは、それぞれ異なる化合物部分と固有識別子核酸配列部分（すなわち核酸タグ）とを有する複数種の二官能性分子（すなわち、核酸タグ化分子）を含み、上記核酸配列によって対応する化合物部分が特定され、その合成が導かれる。使用される核酸タグ化分子と、コンビナトリアル核酸タグ化化合物の従来の合成方法およびスクリーニング方法との詳細は、上記の参考文献に記載されている。
【０１２４】
以下において、小分子のコンビナトリアルライブラリーの製造に用いられる核酸タグ化分子をより詳細に記述する。核酸タグ化分子は、少なくとも１つの、通常は２つ以上の異なる連鎖ハイブリダイゼーション配列を含む核酸タグと、付着した（通常は共有結合的に付着した）化学反応サイトとを有するタグ化化合物である（図１）。所与の任意の核酸タグのハイブリダイゼーション配列は、一般に、他のいかなる核酸タグの配列とも相異している。異なる核酸タグが共通のコドンを共有し得ることに留意されたい。各核酸タグのハイブリダイゼーション配列は、各々後続する合成ステップにおいて化学反応サイトに結合した固有の化合物を合成するために用いられる特定の化学モノマーを識別する。したがって、各核酸タグのハイブリダイゼーション配列はまた、特定の化学モノマーの化学反応サイトへの結合順を特定する。
【０１２５】
一般に、核酸タグの各ハイブリダイゼーション配列は、モノリスに付着した相補的キャプチャー核酸配列とのハイブリダイゼーションのための個別の配列を提供する。核酸タグの異なるハイブリダイゼーション配列によって、核酸タグ化分子の集団を、複数の別個の核酸タグ化分子の亜集団へと配列特異的にスプリットすることが可能となる。その後、核酸タグ化分子の各亜集団を別個の化学モノマーと反応させ、各核酸タグの化学反応サイトにおいて上記別個の化学モノマーのカップリングを可能にする。
【０１２６】
いくつかの実施形態においては、ＢｓａＩサイトを含みＴｍが５７〜６０℃の範囲にある直交性の２０量体（下記直交性の規則を参照）のセットが選択される。これは定常領域であり、そのようなオリゴは２２存在する。上記セットは、コドンとして使用するための、Ｔｍが４９〜５３の範囲にある直交性２０量体のセットを生成するためのシードとして使用される。クエリーとサブジェクト（シードの配列）との間の直交性は、次の基準で定義される：（ａ）インレジスターアライメント（クエリーヌクレオチド１がサブジェクトヌクレオチド１とマッチ）は、１２を超えるヌクレオチドとマッチするべきではない；（ｂ）９以下のヌクレオチドの連続するランは、クエリーとサブジェクト（任意のレジスター）の間で一致するべきである；（ｃ）６以下のヌクレオチドの連続するランは、３’末端または５’末端のいずれかにおいて、クエリーとサブジェクトとの間で一致する；および（４）上記条件の全ては、クエリーの逆相補鎖によって満たされなければならない。
【０１２７】
２０量体のセットは次の規則により作成される：（ａ）最近隣法を用いてＴｍを計算し；（ｂ）範囲内（コドンでは４９〜５３、定常領域では５７〜６１）になければ廃棄し；（ｃ）パリンドロームなし＞４ｂｐであり；かつ（ｄ）単一塩基のランなし＞４ｎｔである。
【０１２８】
第１の反応工程を行うために、核酸タグの集団を、核酸タグの異なる複数の亜集団に「スプリット」する。例えば、各タグの「第１」位置（Ｖ１）における１０の異なるハイブリダイゼーション配列（例えば、ａ１、ｂ１またはｃ１）に対応する１０の異なる亜集団にスプリットする（図３Ａ、上部および中央部）。これは、核酸タグ含有分子を、上記核酸タグにおける異なる「第１位置」ハイブリダイゼーション配列のうちの１つに相補的な配列（例えば、ａ１’、ｂ１’またはｃ１’）を有するキャプチャー核酸が付着した第１グループのモノリスと接触させることによって行われる。本明細書において、これらの固定された核酸を「キャプチャー核酸」または「キャプチャーオリゴヌクレオチド」と称し、核酸タグ配列に相補的な配列を「キャプチャー配列」と称することがある。この接触工程は、異なる核酸タグを有する分子の集団をＸ１の亜集団（ここで、Ｘは、プールされた化合物を分離するために使用される、異なるキャプチャー配列の数である）に分けるために提供される。各亜集団の分子は、核酸タグ内に少なくとも１つの共通するハイブリダイゼーション配列を有している。
【０１２９】
第１のスプリット工程の後、Ｘ１の異なる核酸タグ亜集団（例えば、図３Ａに示すような、１０の異なる核酸タグ亜集団）を、Ｘ１の異なる化学モノマーと反応させる（図３Ａ、中央部）。反応は、このカップリング工程に用いられる各化学モノマーのアイデンティティが上記亜集団における上記核酸タグの特定の「第１」位置のハイブリダイゼーション配列によって誘導されるように行われる。図３Ａに例示されるように、化学モノマーＡ１、Ｂ１、またはＣ１は、「第１」位置の特定の核酸タグハイブリダイゼーション配列（例えば、ａ１、ｂ１またはｃ１）に対応する。第１のケミカルカップリング工程により、特定の化学モノマーを各核酸タグ亜集団の化学反応サイトに接合させることによって、各タグの化学反応サイトを、試薬特異性化合物中間体に変換する（例えば、図２に示すＡ１、Ｂ１、またはＣ１）。その結果、各核酸タグ亜集団の化学反応サイトに異なる化学モノマーが接合した、Ｘ１種の異なる核酸タグ含有化合物の亜集団が得られる（図３Ａ、下部）。例えば、３つの異なる核酸タグの集団（上記「スプリット」工程において、ハイブリダイゼーションによってａ１、ｂ１またはｃ１に分離される）が図３Ａの下部に示されており、配列によって分離された第１の亜集団の分子は化学モノマーＡ１を含むように改変され、ｂ１配列によって分離された第２の亜集団の分子は化学モノマーＢ１を含むように改変され、および配列によって分離された第３の亜集団の分子は化学モノマーＣ１を含むように改変されている。それぞれの場合において、化学モノマーは、核酸タグ含有化合物の化学反応サイトに結合されており、添加された化学モノマーは、必要に応じて次の工程で追加のモノマーを結合するための反応サイトを提供する。
【０１３０】
第１のスプリットおよびケミカルカップリング工程に続いて、Ｘ１の異なる核酸タグ含有化合物亜集団をプールし、核酸タグの異なるＸ２の「第２位置」ハイブリダイゼーション配列（例えば、ａ２、ｂ２またはｃ２）のうちの１つと相補的な配列をそれぞれ有する第２グループの固相試薬（固定されたキャプチャー核酸配列、例えば、ａ２’、ｂ２’またはｃ２’）と接触させる（図３Ｂ、上部および中央部）。その結果、プールされた核酸タグ化合物の母集団が、複数の、Ｘ２の異なる核酸タグの亜集団にスプリットされる。第２の工程における亜集団の数（Ｘ２）は、第１段階のスプリットで得られる亜集団の数（Ｘ１）と同一であってもよく異なってもよい。上述のように、核酸タグ化分子の各亜集団は、核酸タグの「第２位置」のハイブリダイゼーション配列（例えば、ａ２、ｂ２またはｃ２）により決まる（図３Ｂ、中央部）。
【０１３１】
その後、核酸タグ化化合物の異なる「第２位置」亜集団を、それぞれ、第２の複数の化学モノマーの１つ、各サブセットの異なる化学モノマー（例えば、Ａ２、Ｂ２、またはＣ２）と反応させる（図３Ｂ、中央部）。その結果、各核酸タグ含有亜集団の分子における前の化学モノマーに異なる化学モノマーが接合した、Ｘ２の異なる核酸タグの亜集団が得られる（図３Ｂ、下部）。例えば、図３Ｂの下部に示すように、核酸タグ含有化合物の、９つの異なる亜集団が生成され得る。ここで、第１の集団は化学モノマーＡ１およびＡ２を含み、第２の集団は化学モノマーＡ１およびＢ２を含み、第３の集団は化学モノマーＡ１およびＣ２を含み、第４の集団は化学モノマーＢ１およびＡ２を含み、第５の集団は化学モノマーＢ１およびＢ２を含み、第６の集団は化学モノマーＢ１およびＣ２を含み、第７の集団は化学モノマーＣ１およびＡ２を含み、第８の集団は化学モノマーＣ１およびＢ２を含み、第９の集団は化学モノマーＣ１およびＣ２を含む。
【０１３２】
前に反応させた核酸タグをＸｎの異なる亜集団（ここで、Ｘは、プールされた化合物を分離するために使用される異なるキャプチャー配列の数であり、ｎは、合成スキームの工程数である）にスプリットするこのプロセスは、所望により繰り返すことができる。例えば、図３Ｃおよび図３Ｄに示すように、核酸タグ含有化合物を新しい１組の固定キャプチャーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせ、その後、Ｘｎの分離したタグの亜集団を、Ｘｎの異なる選択された化学モノマーと反応させることができる。これらの工程は、所望の反応工程の全てが核酸タグ含有化合物の反応サイトで連続的に行われ、完了するまで繰り返すことができる（図３Ｃおよび図３Ｄ）。その結果、Ｘ１×Ｘ２×．．．×ＸＮの異なる核酸タグ化化合物のコンビナトリアルライブラリーが得られる。ここでは、各化合物の核酸タグのＮの位置における特定のハイブリダイゼーション配列（例えば、Ｖ１、Ｖ２およびＶ３。図１を参照）が、特定の化合物の化学モノマーの配列を決定する。
【０１３３】
図３Ｄの上部に例示されるように、図３Ａ〜３Ｃに例示される工程によって、２７の異なる核酸タグ化化合物の集団を生成することができる。例示する化合物のコンビナトリアルライブラリーは、例えば、化学モノマーＡ１、Ａ２およびＡ３を含む第１の集団、化学モノマーＡ１、Ｂ２およびＡ３を含む第２の集団、化学モノマーＡ１、Ｃ２およびＡ３を含む第３の集団、化学モノマーＢ１、Ａ２およびＡ３を含む第４の集団、化学モノマーＢ１、Ｂ２およびＡ３を含む第５の集団、化学モノマーＢ１、Ｃ２およびＡ３を含む第６の集団、化学モノマーＣ１、Ａ２およびＡ３を含む第７の集団、化学モノマーＣ１、Ｂ２およびＡ３を含む第８の集団、化学モノマーＣ１、Ｃ２およびＡ３を含む第９の集団などを含む。
【０１３４】
図１に例示されるように、核酸タグは、連結された異なる核酸配列からなるＺｎ（例えば、ｎ＝９）領域と、化学反応サイトとから構成される。これらの領域のうちの５つが、Ｃ１〜Ｃ５で示されており、核酸タグに共通の「定常」または「スペーサ」配列を指す。残りの４つのＺ領域はＶ１〜Ｖ４で示され、第１位置〜第４位置における「可変」ハイブリダイゼーション配列を指す。いくつかの代表的な実施形態では、核酸タグの３’末端から５’末端に向かってＶ領域とＣ領域とが交互に配置される。いくつかの実施形態では、最初のＺ領域はＣ領域である。他のいくつかの実施形態では、最初のＺ領域はＶ領域である。いくつかの実施形態では、最後のＺ領域はＣ領域である。他のいくつかの実施形態では、最後のＺ領域はＶ領域である。
【０１３５】
可変ハイブリダイゼーション配列は、一般に、各位置の核酸タグの亜集団の各グループで相違している。本実施形態では、全てのＶ領域が２つの異なるＣ領域と接している。下記から理解されるように、Ｖ領域配列は全て直交性であり、２つのＶ領域配列が互いにクロスハイブリダイズすることはない。例えば、４つの可変領域を有し、該４つの可変領域のそれぞれについて４００の異なる核酸タグ配列を有する核酸タグを含む一実施形態においては、合計で１６００の直交性の核酸ハイブリダイゼーション配列がある。そのようなハイブリダイゼーション配列は、公知の方法で設計することができる。例えば、各可変ハイブリダイゼーション配列が２０のヌクレオチドを含む場合、各位置で４つのヌクレオチドのうちの１つの可能性があり、４２０の異なる配列が可能である。各配列が他の配列と、内部に少なくとも２〜３またはそれ以上の異なるヌクレオチドがあることで異なるようにすることにより、可能性のある異なる候補のうち特定の配列を選択することができる。
【０１３６】
一般に、適切なＣおよびＶ領域は、約１０ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、もしくはそれを超える長さを有する。いくつかの実施形態では、ＣおよびＶ領域は、約１１ヌクレオチド〜約２９ヌクレオチドの長さであり、例えば、約１２ヌクレオチド〜約２８ヌクレオチド、約１３ヌクレオチド〜約２７ヌクレオチド、約１４ヌクレオチド〜約２６ヌクレオチド、約１４ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド〜約２４ヌクレオチド、約１６ヌクレオチド〜約２３ヌクレオチド、約１７ヌクレオチド〜約２２ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド〜約２１ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチドの長さを有する。
【０１３７】
核酸タグは、約１〜約１００、またはそれを超える数の異なるＶ領域（ハイブリダイゼーション配列）を含むことができ、例えば約２００超、約３００超、約５００超の異なるＶ領域を含み得る。いくつかの代表的な実施形態においては、核酸タグは、約１〜約５０の異なるＶ領域を含み、例えば、約２〜約４８、約３〜約４６、約４〜約４４、約５〜約４２、約６〜約４０、約７〜約３８、約８〜約３６、約９〜約３４、約１０〜約３２、約１１〜約３０、約１２〜約２９、約１３〜約２８、約１３〜約２８、約１４〜約２７、約１５〜約２６、約１６〜約２５、約１７〜約２４、約１８〜約２３、約１９〜約２２、約２０〜約２１の異なるＶ領域を含む。
【０１３８】
核酸タグは、約１〜約１００、またはそれを超える数の異なるＣ領域（定常配列）を含むことができ、例えば、約２００超、約３００超、約５００超の異なるＣ領域を含み得る。いくつかの代表的な実施形態においては、核酸タグは、約１〜約５０の異なるＣ領域を含み、例えば、約２〜約４８、約３〜約４６、約４〜約４４、約５〜約４２、約６〜約４０、約７〜約３８、約８〜約３６、約９〜約３４、約１０〜約３２、約１１〜約３０、約１２〜約２９、約１３〜約２８、約１３〜約２８、約１４〜約２７、約１５〜約２６、約１６〜約２５、約１７〜約２４、約１８〜約２３、約１９〜約２２、約２０〜約２１の異なるＣ領域を含む。
【０１３９】
核酸タグは、領域Ｚ１〜Ｚｎ（例えば、ｎ＝９）が、３’のＺ１で始まり、Ｚｎに続く５’末端の化学反応サイトまで互いに結合するように合成される。例えば、核酸タグの３’末端から始まってＺ１がＺ２に結合し、Ｚ２がＺ３に結合し、Ｚ３がＺ４に結合するなどであり、そして、化学反応サイトは、核酸タグの任意のサイトで（例えば、核酸タグの３’末端や５’末端、または他の任意の位置で）Ｚｎに結合される。
【０１４０】
上述のように、核酸タグの集団は縮重（degenerate）している。すなわち、核酸タグのほぼ全てにおいて、ヌクレオチド配列が互いに異なっている。異なる核酸タグ間のヌクレオチドの違いは、全て、ハイブリダイゼーション配列（Ｖ領域）に存在する。例えば、核酸タグの初期集団は、各亜集団のＶ１の特定の配列に基づいて、４００の第１の核酸タグ亜集団を含み得る。したがって、各亜集団のＶ１領域は、４００の異なる２０塩基対からなるハイブリダイゼーション配列の任意の１つを含む。このようなＶ１に基づく核酸タグ集団の分離により、４００の異なる核酸タグの亜集団が生成される。同様に、上記と同じ核酸タグの初期集団はまた、各亜集団のＶ２の特定の配列に基づいて、４００の、第１の亜集団とは異なる第２の核酸タグ亜集団を含み得る。
【０１４１】
図１に示す核酸タグ集団の一例では、異なる核酸タグのＶ１領域における第１のハイブリダイゼーション配列の最初のいくつかを、ａ１、ｂ１、ｃ１．．．ｊ１で示している。同様に、異なる核酸タグのＶ２領域における第２のハイブリダイゼーション配列の最初のいくつかを、ａ２、ｂ２、ｃ２．．．ｊ２で示している。Ｖ３における第３のハイブリダイゼーション配列の最初のいくつかを、ａ３、ｂ３、ｃ３．．．ｊ３で示すなどである。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、核酸タグは、所定のスペーサ領域に、同じ２０塩基対からなる配列を共有する一方、異なるスペーサ領域間に、異なる２０塩基対からなる配列を有する。例えば、核酸タグは、同じＣ１スペーサ領域、同じＣ２スペーサ領域および同じＣ３スペーサ領域を含む（ここで、Ｃ１、Ｃ２およびＣ３は、互いに異なる）。
【０１４３】
したがって、１８０ヌクレオチドの長さの核酸タグの各々は、９つの異なる２０塩基対領域に４つの可変領域（ａ１、ｂ１、ｃ１．．．ｄ５、ｅ５、ｆ５．．．ｈ１０、ｉ１０、ｊ１０）と５つのスペーサ領域（ｚ１．．．ｚ１１）とが交互に含まれる順序だったアセンブリからなる。２０の塩基対領域は次の特性を有する：（ｉ）指定された特定の温度Ｔｍにおいて、マイクロモル濃度の領域配列の全てが溶媒中で相補的ＤＮＡ配列に有効にハイブリダイズし、かつ（ｉｉ）上記領域配列が、ハイブリダイゼーションに関して互いに直交性を有する（これは、上記配列のいずれも、他の領域配列または他のいかなる領域配列の相補体とも、温度Ｔｍにおいて、有効にクロスハイブリダイズしないことを意味する。）。
【０１４４】
縮重した核酸タグは、それらの構成ブロックから、Stemmer et al., Gene (1995) 164 (1) 49-53に記載のプライマーレスＰＣＲアセンブリ法により、またはライゲーション法により、構築することができる。
【０１４５】
上記のように、核酸タグは、さらに化学反応サイトを含む。化学反応サイトの例には、該核酸タグの３’末端、５’末端、または他の任意の位置が含まれる。いくつかの実施形態においては、化学反応サイトは、核酸タグの５’塩基の５’アルコールを、鎖状スペーサ（例えば、末端に第１級アミン基を有する１２−炭素鎖）に結合されたリン酸基を導入する市販の試薬（例えば、Glen Researchから入手可能なもの、またはチオールもしくは他の化学反応サイトを合成ＤＮＡに導入するために用いられる他の多くの試薬）で修飾することによって付加することができる。
【０１４６】
化学反応サイトは、核酸タグのＶ領域配列の順序によって決まる特定の化合物が合成されるサイトである。例示される化学反応サイトは、第１級アミンである。第１級アミンのほか、多くの様々なタイプの化学反応サイトを、任意のサイト、例えば、核酸タグの３’末端、５’末端、または他の任意の位置に導入することができる。化学反応サイトの例としては、アミド結合、エステル結合、ウレア結合、ウレタン結合、炭素−カルボニル結合、炭素−窒素結合、炭素−炭素一重結合、オレフィン結合、チオエーテル結合、およびジスルフィド結合を形成することができる化学成分が挙げられるが、これらに限定されない。酵素により合成する場合、触媒の有効性のため必要に応じて補酵素を使用してもよい。そのような補酵素は、当業者には公知である。補酵素の例には、ポリケチド合成に有用なホスフォパントテニル基がある。
【０１４７】
化合物ライブラリーの全体は、ＤＮＡテンプレート型ライブラリーのスプリットと、核酸タグの各サブセットに対するケミカルおよび／またはバイオケミカルカップリングとを交互に行うことにより合成される。
【０１４８】
製造された複数の化合物は、化学構造の同定を促進する核酸配列タグに結合される。従来のＤＮＡ塩基配列決定法は、合成を誘導する核酸タグの配列決定に容易に用いることができ、かつ有用である（例えば、Maniatis et al., eds., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)を参照）。
【０１４９】
化合物ライブラリーは、所望の活性について、例えば特定の反応を触媒する能力または固定されたレセプターに高い親和性で結合する能力などについて、スクリーニングすることができる。ほとんどの場合、所望の活性を有する分子の亜集団、およびそれらの核酸タグは、選択の過程で、シブリング（sibling）から物理的に分割することができる。選択後、その選択された分子の付着核酸タグを、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）（Saiki et al., Science (1988) 239 (4839) 487-491）によって合成する。コード鎖の合成に使用される５’末端プライマーの５’ヒドロキシル基を、新たな第１級アミンの化学反応サイトに結合したリン酸基で修飾する。合成後、コード鎖を非コード鎖から分離する。核酸タグは、単に個々の化合物の合成履歴をレポートするのではなく、ライブラリーの合成を誘導するので、最初のライブラリーから増幅したコード鎖を、第２世代の化合物ライブラリーの構築を誘導するために使用することができる。この手順（選択、ＤＮＡタグ増幅、およびライブラリーの再合成）を複数回繰り返して行うことにより、非常に複雑なライブラリーから個々の所望の化合物を増幅させることができる。
【０１５０】
上記によって製造された化合物ライブラリーの全体または個々のライブラリーメンバーは、活性を調節するかあるいは所望の構造特性または機能特性を有する化合物を区別することができるスクリーニングアッセイにおいて、１つ以上の所望の活性について評価することができる。アッセイおよび機能解析の例としては、酵素アッセイ、非酵素触媒アッセイ、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、レセプター／リガンド結合アッセイ、および細胞ベースのアッセイなどが挙げられるが、これらに限定されない。より具体的には、細胞ベースの方法は、例えば、（１）ライブラリー化合物の細胞表面への特異的結合（すなわち、癌細胞に結合し、非癌細胞に結合しない）、（２）ライブラリー化合物の細胞抽出物の化合物への結合（例えば、全細胞抽出物をショ糖勾配で分離することによって生成された細胞フラクションへの結合）、（３）細胞によるエンドサイトーシスが可能なライブラリー化合物、および（４）ライブラリーの動物への注入によるライブラリー化合物のインビボ局在および結合特性、に基づいている。（例えば、腫瘍の血管に特異的に向かうペプチドを単離するためのファージディスプレイライブラリーのインビボ選択を記載するArap et al., Science (1998) 279 (5349) 377-80)を参照）。当業者は理解されるように、そのようなアッセイは、本明細書に記載の方法により合成された化合物ライブラリー全体で、またはそれから誘導された亜集団で行うことができる。
【０１５１】
リガンドの合成およびＤＰＣＣによる同定が可能な認識化合物の数は、事実上、無限である。認識化合物としては、オリゴヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、ペプチド核酸、ペプチド、デプシペプチド、ポリペプチド、抗体、ペプトイド、ポリマー、ポリシロキサン、５０ダルトン超の分子量の無機化合物、約３０００ダルトン〜約５０ダルトンの分子量の有機化合物、またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５２】
核酸タグ誘導コンビナトリアルライブラリー法により製造される所望のリガンドとしては、オリゴヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、ペプチド核酸、ペプチド、デプシペプチド、ポリペプチド、抗体、ペプトイド、ポリマー、ポリシロキサン、５０ダルトン超の分子量の無機化合物、約３０００ダルトン〜約５０ダルトンの分子量の有機化合物、またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５３】
選択されたライブラリーメンバーの増幅を可能とすることに加えて、この方法によると、コードされた化合物ライブラリーを生成することができる。より具体的には、選択された化合物の亜集団をコードする核酸タグ間の遺伝子組換えが、インビトロで、核酸タグ配列の突然変異またはランダムな切断によって行われ、その後、関連する核酸配列が生成され（「遺伝子シャッフリング」、Stemmer, Nature, (1994) 370 389-391; Stemmer et al.，米国特許第５，８１１，２３８号明細書）、次いで追加の化合物が段階的に合成される。この手順（選択、ＤＮＡタグ増幅、遺伝子組換え、およびライブラリーの再合成）を複数回繰り返して行うことにより、非常に複雑なライブラリーから個々の所望の化合物を生成することができる。
【０１５４】
いくつかの実施形態においては、特定のハイブリダイゼーション配列の各々に、固有の制限サイトが導入される。一例として、１１の特定のハイブリダイゼーション配列を有するライブラリーの部分消化が、１１の対応する制限酵素による部分消化によりなされ、その後、プライマーレスＰＣＲ再構築反応が起こり、ライブラリーから選択された化合物に対する核酸タグの相互の再構築を可能にし、さらなる合成工程を可能にする。タンパク質合成の遺伝子シャッフリング（Crameri et al., Nature (1998) 391 288-291）と類似して、化合物ライブラリーの遺伝子組換えを行う能力によって、化合物ライブラリーにおいて多様性を調査および最適化し得る効率が大幅に増大する。いくつかの実施形態においては、遺伝子は環状化されている。
【０１５５】
したがって、ポリヌクレオチドシャッフリングによって、１つ以上の所望の活性を有するリガンドを生成する変異核酸配列の集団を得る。それらは、構造の点で関連する分子および／または機能の点で関連する分子、および／またはそれらの変異体の合成を誘導することができる。例えば、ｍＲＮＡの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）に結合することができる分子が、この方法で特定され得る。合成を誘導する核酸タグの選択された亜集団のインビトロでのＰＣＲによる増幅もまた、「遺伝子シャッフリング」の前または後において、上記方法により可能である。
【０１５６】
さらに他の側面において、装置が提供される。その装置は、分離ブロックを含む２つのアレイを包含する。第１のアレイのブロックは、リガンドに選択的に結合する認識化合物が付着したモノリスを含む、２つ以上のアドレス可能なウェルを含む。第２のアレイのブロックは、イオン交換材を含む、２つ以上のアドレス可能なウェルを含む。リガンドに選択的に結合する認識化合物が付着したモノリスを含むウェルは、イオン交換材を含むウェルと配列される。いくつかの実施形態においては、イオン交換材は、イオン交換基を有するモノリスを含む。他のいくつかの実施形態では、イオン交換材は、アニオン交換基を有するモノリスを含む。上述した任意のアレイの特定の実施形態を、本明細書に記載する装置に使用することができる。
【０１５７】
そうしたものとして、上記開示はＤＰＣＣ（前述の実施例については、例えば、Hurbury et al.,米国特許出願公開第２００６／００９９６２６号明細書；Weisenger et al., PLos ONE 7, e32299を参照）を行うための新規な装置を示す。上記のように、ＤＮＡライブラリーは、ハイブリダイゼーションおよび化学サイクルの繰返しによって小分子に翻訳される。サイクルの数は、ライブラリーの製造に必要なコンビナトリアルケミストリーの工程数に依存する。特定の工程における各シントンは、固有のコドンに対応することとなる。上記実施形態において、ハイブリダイゼーションアレイは、同じコドンを含むＤＮＡライブラリーのメンバー（すなわち、リガンド）が、１つ以上の、同種のアンチコドン認識化合物が付着したモノリスに固定されるように、ＤＮＡライブラリーを、アドレス可能なウェルに分ける（すなわち、ルートする）。ハイブリダイゼーションアレイは、Hurbury et al.,米国特許出願公開第２００６／００９９６２６号明細書に記載されたスプリットフィルタ、またはWeissenger et al., PLos ONE 7, e32299に記載のセファロースカラムに代えて使用され得る。
【０１５８】
他の側面において、ハイブリダイゼーションアレイは、同じコドンを含むＤＮＡライブラリーのメンバー（すなわち、リガンド）が、１つ以上の、同種のアンチコドン認識化合物が付着したモノリスに固定されるように、ＤＮＡライブラリーを、アドレス可能なウェルに分ける（すなわち、ルートする）。トランスファーアレイは、さらなるケミストリー工程のために、ＤＮＡライブラリーに特異的にハイブリダイズしたメンバーを、別々のアドレス可能なウェルに溶出する。そのような装置の使用はＤＮＡライブラリーに限定されないことが当業者には認識される。各種の多様な化合物ライブラリーを、同様にして、適切に選択された認識化合物でルートし、以下に記載するようにさらに処理することができる。
【０１５９】
例示的なハイブリダイゼーションアレイを図４に示す。それは、上から下に組み立てられた５枚のプレート：Ａ１２、Ｄ１１、Ｔ１、Ｄ１１およびＡ１１を含む。プレートＴ１はアレイであり、各アドレス可能なウェルは、特定のアンチコドン認識化合物が付着したモノリスを含む。プレートＤ１１およびＤ１２は、例えばプラスチックにより形成され、プレートＴ１上の特定のアンチコドン認識化合物が付着したモノリスをプレートＡ１１およびＡ１２の内面の溝と接続するコンタクトホールを含む。これらの溝は、空気圧および真空を適用し得るチャネルに接続されている。ＡおよびＤプレート間にはダイヤフラムが配置され、Ａプレートの溝と、Ｄプレートの孔と、Ｔプレート内のモノリスからなる封止された連続的サーペンタイン（蛇行）流路を形成している。Ｄプレートの１つ（Ｄ１１）は、この流路への液体の流出入を可能とするポートを有する。上下のＡプレートの溝は、該Ａプレートのチャネルに空気圧および真空を適切に周期的に適用することによって、サーペンタイン流路内において液体の方向性のある流れが、例えばハイブリダイゼーションポンプにより形成されるように設計されている（例えば、Weissenger et al., PLos ONE 7, e32299を参照）。メソ流体装置の正味の効果は、head-to-tail型に連結した、特定のアンチコドン認識化合物が付着したモノリスカラムのアレイ（すなわちハイブリダイゼーションアレイ）を通してＤＮＡリガンドのライブラリーを流すことに例えられ得る。当業者には、Ｎ個のそのような装置を、ライブラリーが原則的には無数のハイブリダイゼーションアレイ間で分けられ得るように、順に接続し得ることが理解される。
【０１６０】
ＤＮＡライブラリーがハイブリダイゼーションアレイを流れると、適当なコドンを含むＤＮＡライブラリーのメンバーは、ハイブリダイゼーションアレイ内の、同種のアンチコドン認識化合物が付着したモノリスにハイブリダイズする。いくつかの実施形態においては、ＤＮＡライブラリーを装置に５回循環させると、各コドンの＞９０％の分離が保証される（すなわち、各コドンを有するＤＮＡライブラリーの９０％が、アンチコドン認識化合物が付着した正しいモノリスに固定される；これには、アンチコドン認識化合物が付着したモノリスカラムへのＤＮＡライブラリーの各パスが、同種のコドンの＞４０％を分離することが必要とされる）。したがって、この工程の終了時において、いくつかの実施形態では、ライブラリーの＞９０％がハイブリダイゼーションアレイに固定される。他のいくつかの実施形態では、ＤＮＡライブラリーを装置に５回循環させると、各コドンの約８０％〜約９０％の分離が保証される。したがって、この工程の終了時において、いくつかの実施形態では、ライブラリーの約８０％〜約９０％がハイブリダイゼーションアレイに固定される。いくつかの実施形態においては、装置は分解され、ＤＮＡライブラリーの特定のメンバーに結合した同種のアンチコドン認識化合物に付着したモノリスを含むハイブリダイゼーションアレイ（すなわち、プレートＴ１）は、次に、トランスファーアレイを形成するために使用される。
【０１６１】
トランスファーアレイは、アンチコドン認識化合物が付着したモノリスがＤＮＡライブラリーの特定のメンバーにハイブリダイズしているアレイにおける個々のモノリスカラムの並行処理を可能にする。いくつかの実施形態においては、トランスファーアレイは、図５に示すように、プレートＤ０１、Ｔ１およびＤ０２を含む。これらの実施形態のいくつかにおいては、アドレス可能なトランスファーアレイのウェルのクロスコンタミネーションを防止するため、プレートＤ０１およびＤ０２の内面（Ｔ１に隣接する面）のストリートパターン溝にシリコーンガスケットが配置されている。Ｄ０１プレートの上部に供給された液体は、例えば遠心分離によって、アセンブリを通過する。トランスファーアレイは、アンチコドン認識化合物が付着したモノリスを有するアレイの洗浄、溶出および再生を行うことができる。いくつかの実施形態においては、トランスファーアレイのウェルは、アンチコドン認識化合物が付着したモノリスにハイブリダイズしたＤＮＡライブラリーの特定のメンバーを固定するために使用し得るイオン交換材を含む。いくつかの実施形態においては、トランスファーアレイウェルのアドレスは、ハイブリダイゼーションアレイウェルのアドレスに直接対応する。
【０１６２】
さらに、図は、３’末端についての第１のルートされたコドンを示しているが、当業者であれば、第１のルートされたコドンにより５’末端についてもルートし得ることを認識できる。また、当業者であれば、各ルーティング工程の後に１つ以上の化学工程が続き得ることを認識できる。
【０１６３】
最後に、本発明を実施する代替の方法があることに留意すべきである。したがって、本実施形態は例示であって限定されるものではないと考えるべきであり、本発明は、本明細書に示した詳細に限定されるべきものではなく、添付の特許請求の範囲の範囲およびその均等物内で変更することができる。
【０１６４】
刊行物において引用されている方法および／または材料を開示および記述するために、本明細書で引用した刊行物および特許は全て、その全体が参照により組み込まれる。本開示は、矛盾が生じない限り、組み込まれた刊行物の全ての開示に優先することが理解される。本明細書で論じられている刊行物は、本出願の出願日前の開示のためにのみ示される。本明細書における一切のものは、従来の発明によるそのような刊行物に先行する権利が本発明に与えられないことを許容するとみなされるべきではない。さらに、提示された公開日は実際の刊行日と異なっている可能性があり、独立して確認する必要があり得る。
【０１６５】
以下の実施例は、単に説明のためであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１６６】
＜実施例１：チタンのシラン処理＞
２個の＃４チタン製グレード５のワッシャー（United Titanium、外径＝０．３１２５インチ、内径＝０．１２５インチ、厚さ＝０．０３２インチ）に、＃６−３２タップ（外形＝０．１３６インチ、３２ネジ山／インチ）でネジを切り、水で洗浄し、アセトンで洗浄した後、５分間乾燥させた。その後、各ワッシャーをエッペンドルフチューブに入れ、１１５μｌのＭＰＳ（Gelestから入手した［３−（メタクリロイルオキシ）プロピル］トリメトキシシラン）の溶液約２５０μｌ、および３４５μｌのヘプタンに溶解した４０μｌのチタンｎ−ブトキシド（Gelest）を加え、チューブを振盪し、上下を反転させた。約１５分後、上記ワッシャーを１５〜３０分間空気乾燥させ、９９℃で４５分間硬化させ、アセトンで濯いで過剰の未反応試薬を除去し、さらに５分間の空気乾燥を行った。
【０１６７】
＜実施例２：モノリスの生成およびシラン処理したチタンへの結合＞
上記シラン処理したチタンワッシャーをフォイルバッグ（Sigma #183385）に入れ、そのバッグをＮ２で５回フラッシュした後に閉じた。３ｍＬのＧＭＡ、１ｍＬのＥＤＭＡ、３ｍＬの１−プロパノール、２．４ｍＬの１，４−ブタンジオールおよび０．６ｍＬの水を含む混合物をＮ２で約２分間スパージし、約１０分間超音波処理し、この時点で１０ｍｇのＡＩＢＮ（２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）を加え、この混合物を撹拌して開始剤を溶解させた。さらに１分間この混合物を超音波処理し、上部の空間をＮ２で約３０秒間パージし、上記シラン処理したワッシャーが入っているフォイルバッグに注ぎ、残留する空気／Ｎ２を除去した後、封をした。上記ワッシャーは２枚の外側のアルミニウム板でサンドイッチ状に挟まれており、これによりポリマーはワッシャーのネジ穴（「ウェル」）内にのみ生成した。このアセンブリを６０℃のオーブン内に水平に置き、終夜インキュベーションした。上記プレート／クランプアセンブリをオーブンから取り出し、室温と平衡化させ、中身を取り出してモノリスワッシャーを得た。過剰のモノリスは上記ワッシャーのエッジから除去した。
【０１６８】
上記モノリスワッシャーを、シリンジと結合しているフィルターハウジングに収容し、５ｍＬのエタノールおよび５ｍＬの水で洗浄した。
【０１６９】
＜実施例３：アルミニウム６０６１アレイのシラン処理＞
機械加工により３８４ウェルのプレートに形成された厚さ３．１２５ｍｍの６０６１グレードアルミニウム板を水道水で洗浄し、蒸留水で５分間濯ぎ、アセトン中で１５分間洗浄し、５分間空気乾燥した。上記プレートを、約４５℃で約１０分間、１０％ＮａＯＨで処理し、過剰のＮａＯＨを拭取り除去し、該プレートの表面全体が銀色になるまで３０％ＨＮＯ３溶液に浸漬した（１〜３分間）。その後、上記プレートを蒸留水で濯ぎ、１０〜６０分間空気乾燥させ、６０℃で１５分間、３０％のＭＰＳアセトン溶液で処理し、アセトン中で３回洗浄し、空気乾燥させ、８０℃で終夜硬化させた。その後、上記プレートをアセトンで洗浄し、約１０〜１５分間空気乾燥させた。
【０１７０】
＜実施例４：モノリスの生成とシラン処理したアルミニウム６０６１アレイへの結合＞
実施例３で調製した、シラン処理したアルミニウムプレートをフォイルバッグ（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｚ１８３３９３）に入れ、そのバッグをＮ２で５回フラッシュした後に閉じた。１５ｍＬのＧＭＡ、５ｍＬのＥＤＭＡ、１５ｍＬの１−プロパノール、１２ｍＬの１，４−ブタンジオールおよび３ｍＬの水を含む混合物をＮ２で約５分間スパージし、約１０分間超音波処理し、この時点で２５〜５０ｍｇのＡＩＢＮを加え、この混合物を撹拌して開始剤を溶解させた。さらに１分間、混合物を超音波処理し、上部の空間をＮ２で約１分間パージし、上記シラン処理したアルミニウムプレートが入っているフォイルバッグに注ぎ、残留する空気／Ｎ２を除去した後、封をした。その後、封入された上記シラン処理アルミニウムプレートを２個の外側アルミニウムブロックの間に挟み、該アルミニウムブロックをＣ型クランプで締め付けた。これにより、ポリマーが確実にプレートの機械加工された穴（「ウェル」）の内部でのみ生成するようにした。このアセンブリを６０℃のオーブン内に水平に置き、終夜インキュベーションした。上記プレート／クランプアセンブリをオーブンから取り出し、室温と平衡化させ、中身を取り出してモノリスアレイプレートを得た。過剰のモノリスは上記プレートのエッジから除去した。
【０１７１】
上記モノリスアレイを約３０ｍＬ〜約４０ｍＬのエタノールで３回洗浄した。アルミニウムプレートに付着した上記モノリスを通してエタノールを抜き出すために真空を使用した（２０ｐｓｉで１０〜６０秒間）。その後、各ウェルに約３０μｌ〜約４０μｌのエタノールを加え、真空を適用することにより上記モノリスを通して抜き出した（１５〜２０ｐｓｉで約１５〜約２０秒間）。最後に、各ウェルに約３０μｌ〜約４０μｌのエタノールを加え、１０００ｒｐｍで約３分間の回転により上記モノリスから抜き出した。その後、同様にして上記モノリスアレイを水で洗浄した。理想的には、各ウェルの各モノリスが溶媒に対して透過性を有する。１つでも不透過性のウェルがあれば、その後の使用に対してアレイを不適格とみなすのに十分である。
【０１７２】
＜実施例５：アルミニウム６０６１アレイに取り付けたグリシジルエポキシドモノリスのアジドによる開環＞
簡潔に言えば、実施例４で調製したモノリスアレイの各ウェルに、２０μｌのアジ化ナトリウムの水溶液（８ｍＬの水および４．６ｍＬの氷酢酸に２５ｍｍｏｌ）を加え、真空を使用してモノリスを通して抜き出した。上記手順を１回繰り返し、上記アジド溶液を入れたバスに上記アレイを移し、約５分間脱ガスを行い、上記アジド溶液を満たしたリザーバに移し、３０℃で終夜インキュベーションを行い、蒸留水で十分に洗浄し、水中に保管してアジドアルコール官能化モノリスアレイを得た。
【０１７３】
＜実施例６：アルミニウム６０６１アレイに付着したアジド官能化モノリスへのオリゴヌクレオチドの付着＞
０．１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、６２５μＭのＣｕＳＯ４、３．１２５ｍＭのＴＨＰＴＡ（トリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン、Ｓｉｇｍａ−Aldrich）、１２．５ｍＭのアミノグアニジン−ＨＣｌ、０．３ＭのＮａＣｌ、１２．５ｍＭのアスコルビン酸塩および１ｎｍｏｌの固定化されるべきオリゴヌクレオチド（一般構造は５’ヘキシニル−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−アンチコドン、Eurofins MWG Operon Inc., 2211 Seminole Drive Huntsville, AL 35805より購入）を含有する３０μｌの「クリック」溶液を、アレイの各アジド−アルコール官能化モノリスに加え、合計１時間のインキュベーションを行った。上記「クリック」溶液を一定間隔（約１５分毎）でモノリスから遠心分離し、新しいアスコルビン酸塩を補充（１００ｍＭのアスコルビン酸塩３μｌ以下を添加）して同じモノリスに戻した。１時間のインキュベーションの後、上記「クリック」溶液をモノリスから遠心分離し、３０μｌのトリス−ＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）でアレイを３回洗浄して銅をキレート化し、反応を停止させた。得られた官能化アレイは、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のアジド中、４℃で保管した。
【０１７４】
上記アジド修飾モノリスへの５’−ヘキシニル−オリゴの付着におけるクリックケミストリーの効率を、上記「クリック」溶液からのオリゴの除去により評価した。典型的には、等濃度の２つのオリゴ、すなわち５’−ＯＨオリゴ（対照オリゴ）と５’−ヘキシニルオリゴ（試験オリゴ）からなる試験反応物を、室温で合計１時間、「クリック」緩衝液中でモノリスと共にインキュベーションし、その後、モノリスから遠心分離した。排出された「クリック」溶液を、２つのオリゴを分離するアセトニトリル勾配（移動相Ａ：１３５ｍＭトリエチルアミン、１５０ｍＭ氷酢酸、５％アセトニトリル；移動相Ｂ：２５％移動相Ａ、７５％アセトニトリル）を有するＣ１８カラム上のＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。モノリスと共に行ったインキュベーションの前後における試料中の対照および試験オリゴの相対ピーク面積を用いて、モノリスに「クリックされた」５’ヘキシニル−オリゴの割合を見積もった。
【０１７５】
＜実施例７：アルミニウム６０６１アレイに付着したオリゴヌクレオチド官能化モノリスのプロピオール酸によるブロック＞
実施例６で処理したモノリスアレイ中の任意の未反応アジ化物群は、次のようにしてプロピオール酸と反応させることによりブロックした。０．１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、６２５μＭのＣｕＳＯ４、３．１２５ｍＭのＴＨＰＴＡ（トリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン、Sigma−Aldrich）、１２．５ｍＭのアミノグアニジン−ＨＣｌ、０．３ＭのＮａＣｌ、１２．５ｍＭのアスコルビン酸塩および８ｍＭのプロピオール酸を含有する３０μｌの「クリック」溶液を、アレイの各官能化モノリスに加え、合計３０分間のインキュベーションを行った。上記「クリック」溶液を一定間隔（約１５分毎）でモノリスから遠心分離し、新しいアスコルビン酸塩を補充（１００ｍＭのアスコルビン酸塩３μｌ以下を添加）して同じモノリスに戻した。３０分のインキュベーション後、上記「クリック」溶液をモノリスから遠心分離し、３０μｌのトリス−ＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）でアレイを３回洗浄して銅をキレート化し、反応を停止させた。処理したアレイを、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のアジ化物中、４℃で保管した。
【０１７６】
＜実施例８：アルミニウム５０３８アレイのシラン処理＞
上記プレートを、約４５℃で約１５分間、約１０％のＮａＯＨで処理したこと以外は、実施例３と同様にしてシラン処理を行った。
【０１７７】
＜実施例９：モノリスの生成とシラン処理したアルミニウム５０３８アレイへの結合＞
実施例５の手順を使用して上記モノリスアレイを得た。
【０１７８】
＜実施例１０：ＰＥＥＫワッシャーのＵＶ処理＞
＃１０−３２タップ（外径＝０．１９インチ、ネジ山数／インチ＝３２）を用いてワッシャーにネジを切り、シンチレーションバイアル中、１：１０のＥＤＭＡ：メタノール溶液に浸した。入射ＵＶ光を分散させるために、各ワッシャーの中央部にステンレス製のコーンを配置した。また、外径面を結合強度の試験に使用するために、ワッシャーの側面周囲にもコーンを配置した。次いで、バイアルを約１ｃｍの高さまでＥＤＭＡ：メタノール溶液に浸漬させた。その後、約３ｃｍの距離から１５分間、３０２ｎｍのＵＶ光をワッシャーに照射し、ワッシャーを反転させて、約３ｃｍの距離から１５分間、３０２ｎｍのＵＶ光を再度照射し、メタノールで３回濯ぎ、空気乾燥させ、窒素下でフォイルバッグ中に保管した。このワッシャーを使用して実施例２に記載の手順によりモノリスを成型した。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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