(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
増殖速度の低下、ＳＡ−β−ｇａｌ活性の増加、ＳＩＲＴ１遺伝子の発現量減少、テロメラーゼ活性の低下等の老化現象を既に呈した老化幹細胞に対し、幹細胞における活性を回復または向上させる処理に用いられ、
（１）ｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒド（ＴＣ）及び溶剤を含み、幹細胞活性を回復または向上させるための活性回復処理液と、
（２）少なくとも、ウシ胎児血清、上皮細胞成長因子、Ｌ−アスコルビン酸を含む幹細胞培養液と、
を備える老化幹細胞における活性の回復／活化処理に用いられるキットにおいて、
前記溶剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、又は、０．５％メチル化セルロースを含有するリン酸緩衝液であり、
前記活性回復処理液は、４℃以下の光を避けた環境で保存され、
前記幹細胞培養液は、−２０℃の環境で保存され、
前記キットを使用する際に、先に、前記活性回復処理液と前記幹細胞培養液とを充分に混合して、そのＴＣの最終濃度が２μＭ〜６μＭになるようにした混合液を得てから、引き続いて、処理対象である老化幹細胞を前記混合液に投入して前記老化幹細胞に対し活性の回復処理を行う、
ことを特徴とする老化幹細胞における活性の回復／活化処理に用いられるキット。
【請求項２】
前記老化幹細胞が脂肪幹細胞である場合、前記幹細胞培養液は、ヒト組換え上皮細胞成長因子、牛脳下垂体抽出物、１０％のウシ胎児血清、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、濃度０．２ｍＭのＬ−アスコルビン酸及び濃度２ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システインを含む無血清角化細胞培地（Ｋ−ＳＦＭ）である、
ことを特徴とする請求項１に記載の老化幹細胞における活性の回復／活化処理に用いられるキット。
【請求項３】
前記老化幹細胞がウォートンズ・ゼリー幹細胞、又は、ヒト骨髄間葉系幹細胞である場合、前記幹細胞培養液は、１０％のウシ胎児血清、１０μｇ／ｍＬのアルカリ性線維芽細胞増殖因子、濃度２ｍＭのＬ−グルタミン、及び１００単位／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを含むＩＭＤＭ培養液である、
ことを特徴とする請求項１に記載の老化幹細胞における活性の回復／活化処理に用いられるキット。
【請求項４】
前記幹細胞培養液は、Ｋ−ＳＦＭ培養液、ＤＭＥＭ培養液、ＩＭＤＭ培養液、ＭＥＭ培養液、α−ＭＥＭ培養液、ＢＭＥ培養液、ＭＥＭ／Ｆ１２培養液、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０培養液、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培養液、及びＲＰＭＩ培養液からなる群から選択した少なくとも一種である、
ことを特徴とする請求項１に記載の老化幹細胞における活性の回復／活化処理に用いられるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、trans-シンナムアルデヒド（trans-cinnamaldehyde、ＴＣ）の使用に関し、更に詳しくは、幹細胞の抗老化及び／又は幹細胞の若返り並びに幹細胞による治療を含む幹細胞へのtrans-シンナムアルデヒドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、その自己再生（self-renew）及び分化能力により、全能性（totipotent）幹細胞、多能性（pluripotent）幹細胞、多分化能（multipotent）幹細胞及び単能性（unipotent）幹細胞に分けられる。また、幹細胞は、幹細胞の発育過程で出現する前後の順序及び分布状況により、胚性幹細胞（embryonic stem cell、ＥＳ細胞）及び成体幹細胞（adult stem cell）の２種類に大きく分けられる。研究から明らかなように、細胞の分化は可逆的であり、完全に分化した成熟体細胞（somatic cells）に特定の遺伝子を導入すると、成熟体細胞がリプログラム（reprogram）されて多能細胞になることが可能である。このようなリプログラムされた多能細胞のうち、胚性幹細胞の特性及び機能を持つものは、誘導多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells、ｉＰＳ細胞）と称される。この誘導多能性幹細胞は、あらゆる身体の組織に分化し、疾病の研究及び治療に用いられている。
【０００３】
また、現在の医学研究分野において有効な治療法が未だ確立されていない疾病は多く、例えば、糖尿病、自己免疫拒絶反応、脳梗塞、心筋梗塞、腎不全、白血病、筋萎縮症、重度の貧血、アルツハイマー病、パーキンソン病、癌等の疾病がある。多能性（pluripotency）を有する幹細胞を再生医学に応用することで、長年直面してきた治療困難を解決し、難治性疾病を治療することが可能になってきている。そして、幹細胞による治療法は、ある難治性疾病の患者にとって、その病気を治療する希望の一つとなっている。
【０００４】
なお、幹細胞を体内に移植して疾病を治療するという幹細胞治療の成否は、幹細胞の品質によって決まる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、幹細胞の品質を低下させる原因がいくつかあり、例えば、様々なストレスを受けることにより、細胞周期の停滞及び増殖速度の低下等の起こる細胞老化（cellular senescence）が主要原因の１つとして挙げられる。一旦、細胞が老化すると、組織の修復、組織の再生及びターンオーバー（turnover）に必須な幹細胞又は始原細胞の欠乏を招き、幹細胞による治療効果を向上させることができなくなる。このため、幹細胞の抗老化を有効に達成することができれば、幹細胞による治療の成功率を高めることが可能となる。
【０００６】
本発明は、このような従来の問題を鑑みてなされたものである。上記課題を解決するため、本発明は前述した治療上の需要のために研究開発を行った成果であり、本案の発明者は、研究によりtrans-シンナムアルデヒドが幹細胞の抗老化及び幹細胞の若返り等に有効である上、幹細胞による治療に適用できると共に細胞による治療効果を高めることができることを発見した。
【０００７】
従って、本発明は、幹細胞の老化防止及び／又は幹細胞の若返り方法を提供することを目的とする。すなわち、幹細胞に対してtrans-シンナムアルデヒドでの処理を行い、例えば、幹細胞培養液中に約０．１から約５０μｇ／ｍＬのtrans-シンナムアルデヒドを注入して幹細胞の処理を行う。
【０００８】
また、本発明の他の目的は、幹細胞の老化防止及び／又は幹細胞の若返りに用いられる組成物を提供することにある。この組成物は、例えば、trans-シンナムアルデヒドを一例として含む。
【０００９】
なお、本発明の更なる他の目的は、trans-シンナムアルデヒドを用いた製剤を提供することにある。この製剤は、幹細胞の老化防止及び／又は幹細胞の若返りに用いられ、好ましくは保健食品又は薬剤である。
【００１０】
更に、本発明の更なる他の目的は、幹細胞による治療に用いられ、且つ、
（１）幹細胞を有する第一部分と、
（２）trans-シンナムアルデヒドを有する第二部分と、
（３）第三部分及び／又は前記第一部分及び／又は第二部分に存在する幹細胞培養液と、を含むキットを提供することにある。
このキットを使用する際は、まず、幹細胞培養液中でtrans-シンナムアルデヒドにより幹細胞の処理を行い、その後、処理した幹細胞を幹細胞による治療に使用する。
【００１１】
本発明の更なる他の目的は、治療必要な個体に対し、有効量の幹細胞を投与する幹細胞による治療方法を提供することにある。この幹細胞は、trans-シンナムアルデヒドによる処理を事前に行った幹細胞である。
【００１２】
以下、本発明が属する技術分野において通常知識を有する者が本発明の特徴を明確に理解することができるように、本発明の詳細な技術内容及び具体的な実施態様を記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】種々の処理を行った脂肪由来幹細胞の表面抗原発現状況を示すフローサイトメトリー解析図。
【図１Ｂ】種々の処理を行った脂肪由来幹細胞の表面抗原発現状況を示すフローサイトメトリー解析図。
【図２Ａ】骨形成性（osteogenic）分化試験において、種々の処理を行った脂肪由来幹細胞の骨形成性分化能力を示す図。
【図２Ｂ】骨形成性分化試験において、種々の処理を行った脂肪由来幹細胞の骨形成性分化能力を示す図。
【図２Ｃ】骨形成性分化試験において、種々の処理を行った脂肪由来幹細胞の骨形成性分化能力を示す図。
【図２Ｄ】脂肪生成性（adipogenic）分化試験において、種々の処理を行った脂肪由来幹細胞の脂肪生成性分化能力を示す図。
【図２Ｅ】脂肪生成性分化試験において、種々の処理を行った脂肪由来幹細胞の脂肪生成性分化能力を示す図。
【図２Ｆ】脂肪生成性分化試験において、種々の処理を行った脂肪由来幹細胞の脂肪生成性分化能力を示す図。
【図２Ｇ】種々の処理を行った脂肪由来幹細胞のうち骨形成性分化した細胞の相対数を示す図。ここで、縦軸は波長４５０ｎｍでの吸光度値を示し、横軸は種々の処理を行った脂肪由来幹細胞（***：Ｐ値が０．０１未満で、有意差があることを表す）を示す。
【図２Ｈ】種々の処理を行った脂肪由来幹細胞のうち脂肪生成性分化した細胞の相対数を示す図。ここで、縦軸は波長５１０ｎｍでの吸光度値を示し、横軸は種々の処理を行った脂肪由来幹細胞（***：Ｐ値が０．０１未満で、有意差があることを表す）を示す。
【図３Ａ】種々の処理を行った脂肪由来幹細胞の増殖速度を示すＫｉ６７染色写真。
【図３Ｂ】種々の処理を行った脂肪由来幹細胞の増殖速度を示すＫｉ６７染色写真。
【図３Ｃ】種々の処理を行った脂肪由来幹細胞の増殖速度を示すＫｉ６７染色写真。
【図４Ａ】異なる濃度でtrans-シンナムアルデヒド処理した脂肪由来幹細胞におけるＳＡ−β−ｇａｌ活性を示す図。ここで、縦軸はＳＡ−β−ｇａｌ活性パーセントを示し、横軸は種々の処理を行った脂肪由来幹細胞（***：Ｐ値が0.01未満で、有意差があることを表す）を示す。
【図４Ｂ】先にＨ２Ｏ２で老化を誘導してから種々の処理を行った脂肪由来幹細胞におけるＳＡ−β−ｇａｌ活性を示す図。ここで、縦軸はＳＡ−β−ｇａｌ活性パーセントを示し、横軸は種々の処理を行った各組の脂肪由来幹細胞（***：Ｐ値が０．０１未満で、有意差があることを表す）を示す。
【図４Ｃ】種々の処理を行った脂肪由来幹細胞におけるＳＡ−β−ｇａｌの活性を示す写真。
【図４Ｄ】種々の処理を行った脂肪由来幹細胞におけるＳＡ−β−ｇａｌの活性を示す写真。
【図４Ｅ】種々の処理を行った脂肪由来幹細胞におけるＳＡ−β−ｇａｌの活性を示す写真。
【図５Ａ】定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（quantitative reverse transcription  Polymerase chain reaction（quantitative ＲＴ−ＰＣＲ））により、異なる濃度でtrans-シンナムアルデヒド処理を行った脂肪由来幹細胞におけるＳＩＲＴ１遺伝子の発現量を解析した図。ここで、縦軸はＳＩＲＴ１遺伝子の発現量を示し、横軸は種々の処理を行った脂肪由来幹細胞（***：Ｐ値が０．０１未満で、有意差があることを表す）を示す。
【図５Ｂ】定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により、先にＨ２Ｏ２で老化を誘導してから異なる濃度でtrans-シンナムアルデヒド処理を行った脂肪由来幹細胞におけるＳＩＲＴ１遺伝子の発現量を解析した図。ここで、縦軸はＳＩＲＴ１遺伝子の発現量を示し、横軸は種々の処理を行った脂肪由来幹細胞（***：Ｐ値が０．０１未満で、有意差があることを表す）を示す。
【図５Ｃ】定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により、種々の処理を行った脂肪由来幹細胞におけるＳＩＲＴ１遺伝子の発現量を解析した図。ここで、縦軸はＳＩＲＴ１遺伝子の発現量を示し、横軸は種々の処理を行った脂肪由来幹細胞（ｎｓ：Ｐ値が０．４１７で、有意差がないことを表す）を示す。
【図６Ａ】種々の処理を行った脂肪由来幹細胞における老化関連遺伝子、細胞周期調節関連遺伝子及び多能性関連遺伝子の発現量を示す半定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（semiquantitative ＲＴ−ＰＣＲ）の結果を示す写真。
【図６Ｂ】種々の処理を行った脂肪由来幹細胞における老化関連遺伝子、細胞周期調節関連遺伝子及び多能性関連遺伝子の発現量を示す半定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応の結果を示す統計的棒グラフ。
【図７】種々の処理を行った脂肪由来幹細胞におけるテロメラーゼ（telomerase）活性を示す統計的棒グラフ。ここで、縦軸はテロメラーゼ活性を示し、横軸は種々の処理を行った細胞（***：Ｐ値が０．０１未満で、有意差があることを表す）を示す。
【図８Ａ】種々の処理を行ったヒト骨髄間葉系幹細胞におけるＳＡ−β−ｇａｌの活性を示す写真。
【図８Ｂ】種々の処理を行ったヒト骨髄間葉系幹細胞におけるＳＡ−β−ｇａｌの活性を示す写真。
【図８Ｃ】種々の処理を行ったヒト骨髄間葉系幹細胞におけるＳＡ−β−ｇａｌの活性を示す写真。
【図８Ｄ】種々の処理を行ったヒト骨髄間葉系幹細胞におけるＳＡ−β−ｇａｌ活性を示す図。ここで、縦軸はＳＡ−β−ｇａｌ活性パーセントを示し、横軸は種々の処理を行ったヒト骨髄間葉系幹細胞（***：Ｐ値が０．０５未満で、有意差があることを表す）を示す。
【図９Ａ】種々の処理を行ったウォートンズ・ゼリー幹細胞におけるＳＡ−β−ｇａｌ活性を示す写真。
【図９Ｂ】種々の処理を行ったウォートンズ・ゼリー幹細胞におけるＳＡ−β−ｇａｌ活性を示す写真。
【図９Ｃ】種々の処理を行ったウォートンズ・ゼリー幹細胞におけるＳＡ−β−ｇａｌ活性を示す写真。
【図９Ｄ】種々の処理を行ったウォートンズ・ゼリー幹細胞におけるＳＡ−β−ｇａｌ活性を示す図。ここで、縦軸はＳＡ−β−ｇａｌ活性パーセントを示し、横軸は種々の処理を行ったウォートンズ・ゼリー幹細胞（***：Ｐ値が０．０５未満で、有意差があることを表す）を示す。
【図１０Ａ】定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により、種々の処理を行ったヒト骨髄間葉系幹細胞におけるＳＩＲＴ１遺伝子の発現量を解析した図。ここで、縦軸はＳＩＲＴ１遺伝子の発現量を示し、横軸は種々の処理を行ったヒト骨髄間葉系幹細胞（***：Ｐ値が０．０５未満で、有意差があることを表す）を示す。
【図１０Ｂ】定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により、種々の処理を行ったウォートンズ・ゼリー幹細胞におけるＳＩＲＴ１遺伝子の発現量を解析した図。ここで、縦軸はＳＩＲＴ１遺伝子の発現量を示し、横軸は種々の処理を行ったウォートンズ・ゼリー幹細胞（***：Ｐ値が０．０５未満で、有意差があることを表す）を示す。
【図１１Ａ】「ＴＡＡ組」ラット（肝臓線維化したラット）の肝臓における線維化の進展状況を示すマッソントリクローム染色（Masson’s trichrome staining）写真。
【図１１Ｂ】「ＴＡＡ組」ラット（肝臓線維化したラット）の肝臓における肝炎症状の進展状況を示すヘマトキシリン及びエオシン染色（Ｈ＆Ｅ染色）写真。
【図１２Ａ】種々の処理を行った７日目のラット肝組織切片におけるα-フェトタンパク質（α-fetoprotein、ＡＦＰ）の免疫組織化学染色写真。
【図１２Ｂ】種々の処理を行った７日目のラット肝組織切片におけるα-フェトタンパク質の免疫組織化学染色写真。
【図１２Ｃ】種々の処理を行った７日目のラット肝組織切片におけるα-フェトタンパク質の免疫組織化学染色写真。
【図１２Ｄ】種々の処理を行った７日目のラット肝組織切片におけるα-フェトタンパク質の免疫組織化学染色写真。
【図１２Ｅ】種々の処理を行った７日目のラット肝組織切片におけるα-フェトタンパク質の免疫組織化学染色写真。
【図１２Ｆ】種々の処理を行った１４日目のラット肝組織切片におけるα-フェトタンパク質の免疫組織化学染色写真。
【図１２Ｇ】種々の処理を行った１４日目のラット肝組織切片におけるα-フェトタンパク質の免疫組織化学染色写真。
【図１２Ｈ】種々の処理を行った１４日目のラット肝組織切片におけるα-フェトタンパク質の免疫組織化学染色写真。
【図１２Ｉ】種々の処理を行った１４日目のラット肝組織切片におけるα-フェトタンパク質の免疫組織化学染色写真。
【図１２Ｊ】種々の処理を行った１４日目のラット肝組織切片におけるα-フェトタンパク質の免疫組織化学染色写真。
【図１３Ａ】種々の処理を行ったラットの肝臓において、線維化の程度が時間経過により異なることを示すマッソントリクローム染色（Masson’s trichrome staining）写真。
【図１３Ｂ】種々の処理を行ったラットの肝臓において、線維化の程度が時間経過により異なることを示すマッソントリクローム染色（Masson’s trichrome staining）写真。
【図１３Ｃ】種々の処理を行ったラットの肝臓において、肝炎の症状が時間経過により異なることを示すヘマトキシリン及びエオシン染色（Hematoxylin and Eosin Staining、Ｈ＆Ｅ染色）写真。
【図１３Ｄ】種々の処理を行ったラットの肝臓において、肝炎の症状が時間経過により異なることを示すヘマトキシリン及びエオシン染色（Ｈ＆Ｅ染色）写真。
【図１４Ａ】種々の処理を行ったラットの肝臓線維化点数を示す統計的棒グラフ（***：Ｐ値が０．０１未満で、有意差があることを表す）。
【図１４Ｂ】ラット肝臓の活性化点数を示す統計的棒グラフ（***：Ｐ値が０．０１未満で、有意差があることを表す）。
【図１５Ａ】ラット肝臓のＧＰＴ発現量を示す統計的棒グラフ（***：Ｐ値が０．０１未満で、有意差があることを表す）。
【図１５Ｂ】ラット肝臓のＧＯＴ発現量を示す統計的棒グラフ（**：Ｐ値が０．０５未満で、有意差があることを表す）。
【図１５Ｃ】ラット肝臓のアルブミン発現量を示す統計的棒グラフ（***：Ｐ値が０．０１未満で、有意差があることを表す）。
【図１５Ｄ】ラット肝臓のプロトロンビン時間を示す統計的棒グラフ（***：Ｐ値が０．０１未満で、有意差があることを表す）。
【図１５Ｅ】ラット肝臓の総ビリルビン発現量を示す統計的棒グラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下では本発明の具体的な実施態様について記載する。但し、本発明は、本発明の精神を逸脱しない範囲で多くの異なる形式の態様により実施可能であり、本発明の保護範囲を明細書に記載の範囲に限定して解釈するべきではない。また、文中で特に説明のない限り、本明細書（及び特許請求の範囲）において使用される「一」、「前記」及びそれらに類似する言葉が付された用語は、その単数型及び複数型を共に含むと理解すべきである。「有効量」又は「治療有効量」とは、個体の病状を少なくとも部分的に改善させるために、その個体に投予される有効な化合物の量を指す。「個体」とは哺乳動物を指し、哺乳動物は人間又は人間以外の動物である。
【００１５】
幹細胞は、現代医学において広く使用されており、その応用例として、例えば、自己免疫疾患（例えば、糖尿病、自己免疫拒絶反応）の治療、消化器疾患（例えば、肛門／胃腸管瘻）の治療、肝臓疾患（例えば、肝硬変、肝臓線維）の治療、腎臓疾患（例えば、腎不全）の治療、心血管疾患（例えば、脳梗塞、心筋梗塞）の治療、神経系疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病）の治療、血液疾患（例えば、白血病）の治療、骨形成異常症（例えば、変形性関節炎、変形性膝関節症）の治療、歯周病の治療、腱炎の治療、脊椎損傷の治療、頭部創傷の治療、整形手術（例えば、片側萎縮、 小陥凹瘢痕）、脱毛症、皮膚の美白及び／又は皺の除去に使用されている。これは、例えば、Stem cells: innovations in clinical applications. Stem Cells int. Volume 2014、 Article ID 516278、 9 pagesに記載されており、この文献の全文をここでは参照する。
【００１６】
しかしながら、幹細胞が数世代の継代培養及び／又は体内への移植により各種ストレスを受けて細胞老化すると、幹細胞による治療効果に影響が出ることがある。これは、例えば、Replicative senescence-associated gene expression changes in mesenchymal stromal cells are similar under different culture conditions. Haematologica. 95(6):867-74 (2010)に記載されており、この文献の全文をここでは参照する。研究から明らかなように、幹細胞の老化に伴って、例えば、幹細胞の増殖速度の低下、幹細胞における老化関連β-ガラクトシダーゼ（senescence associated-β-galactosidase、ＳＡ−β−ｇａｌ）活性の増加、幹細胞におけるＳＩＲＴ１遺伝子の発現減少及び幹細胞におけるテロメラーゼ活性の低下といった現象が発生する。これらの現象を逆転及び／又は回復させることが可能になると、既に報告されているように幹細胞の老化防止に有効となり、幹細胞の疾病治療への応用に益する。これらのことは、例えば、Four faces of cellular senescence. J Cell Biol. 192(4):547-556 (2011)、A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92(20):9363-9367 (1995)、SIRT1 overexpression antagonizes cellular senescence with activated ERK/S6k1 signaling in human diploid fibroblasts. PLoS One. 5;3(3):e1710 (2008)、Aging、 tumor suppression and cancer: high wire-act! Mech Ageing Dev. 126(1):51-8 (2005)及びTelomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345(6274):458-460 (1990)に記載されており、これら文献の全文をここでは参照する。
【００１７】
本案の発明者は、研究を行うことにより増殖速度の低下、ＳＡ−β−ｇａｌ活性の増加、ＳＩＲＴ１遺伝子の発現量減少、テロメラーゼ活性の低下等の老化現象を呈する老化幹細胞に対してtrans-シンナムアルデヒドでの処理を行うことで、これら幹細胞における老化現象を有効的に逆転及び／又は回復できることを発見した。更に研究した結果、trans-シンナムアルデヒドは、一般的な幹細胞（すなわち、未老化の幹細胞）におけるＳＡ−β−ｇａｌ活性を有効的に低下させると共に、一般的な幹細胞におけるＳＩＲＴ１の遺伝子の発現を増加させることも見出した。
【００１８】
このため、本発明は、幹細胞の抗老化及び幹細胞の若返り並びにその応用に関わるものであり、幹細胞の抗老化及び／又は幹細胞の若返りに用いられる組成物、その製剤及び方法の提供を含む。製剤の製造にはtrans-シンナムアルデヒドが用いられ、組成物はtrans-シンナムアルデヒドを含み、方法はtrans-シンナムアルデヒドにより幹細胞を処理することを含んでいる。
【００１９】
また、本発明の組成物、製剤及び方法は、任意の幹細胞、例えば、胚性幹細胞、成体幹細胞及び誘導多能性幹細胞に適用することができる。成体幹細胞は、例えば、造血幹細胞及び間葉系幹細胞（脂肪由来幹細胞、骨髄間葉系幹細胞、ウォートンズ・ゼリー（Wharton’s jelly）幹細胞等を含む）を含んでおり、その由来により臍帯血幹細胞、末梢血幹細胞、神経幹細胞、表皮幹細胞、筋肉幹細胞、脂肪由来幹細胞、膵幹細胞、角膜幹細胞、肝臓幹細胞及び腸上皮幹細胞等に分類される。
【００２０】
本発明の方法に基づいて、幹細胞による治療に先立って幹細胞をtrans-シンナムアルデヒドで事前処理すると、以下の少なくとも１つの効果を得ることができる。すなわち、幹細胞の増殖速度の上昇、幹細胞におけるＳＡ−β−ｇａｌ活性の低下、幹細胞におけるＳＩＲＴ１遺伝子発現の増加及び幹細胞におけるテロメラーゼ活性の向上の効果が得られ、これにより、幹細胞の抗老化及び／又は幹細胞の若返りを実現することができる。これにより、幹細胞による治療効果が高まる。trans-シンナムアルデヒドは、組成物又は製剤の形式で使用される。
【００２１】
本発明に係る幹細胞の抗老化及び／又は幹細胞の若返り方法では、幹細胞の生存に無害であれば、任意の条件の下でtrans-シンナムアルデヒドによる幹細胞の処理を行うことができる。本発明の一実施態様では、この処理を幹細胞培養液中で行う。trans-シンナムアルデヒド並びに／若しくはtrans-シンナムアルデヒドの組成物及び／又は製剤は、処理する幹細胞を含む幹細胞培養液中に添加される又は、例えば、凍結保存された幹細胞を含む幹細胞培養液中に添加される。
【００２２】
培養液は、処理する幹細胞に対応しているものであれば、いずれのものでも本発明で使用することが可能である。幹細胞培養液は、通常、幹細胞の成長や分化に必要な養分及び条件（例えば、水素イオン指数）等を与えるための必須成分を含む。一般的には、幹細胞培養液は、基礎培養液、動物血清（例えば、ウシ胎児血清）、成長因子（例えば、ヒト組換え上皮細胞成長因子、線維芽細胞増殖因子）、栄養物質（例えば、牛の脳下垂体抽出物）、非必須アミノ酸（例えば、L-グルタミン、N-アセチル-Ｌ-システイン）、酸化還元剤（例えば、L-アスコルビン酸）、抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン）等を含む。本発明の方法に使用される基礎培養液は、例えば、K-SFM培地（keratinocyte-serum free medium）、DMEM培養液（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）、IMDM培養液（Iscove's modified Dulbecco's medium、IMDM、Invitrogen）、MEM培養液（Minimum Essential Medium）、α-MEM培養液、BME培養液（Basal Media Eagle）、MEM/F12培養液、Ham's F10培養液、Ham's F12培養液及びRPMI培養液（Rosewell Park Memorial Institute）を含むが、これらに限定されない。例えば、本発明の方法が脂肪由来幹細胞の抗老化及び／又は脂肪由来幹細胞の若返りに使用される場合には、K-SFM培地を基礎培養液として用いてtrans-シンナムアルデヒドによる処理を行うことができる。
【００２３】
好ましくは、幹細胞培養液中に約０．１μｇ／ｍＬから約５０μｇ／ｍＬのtrans-シンナムアルデヒドを添加して幹細胞の処理を行う。より好ましくは、幹細胞培養液中に約２μｇ／ｍＬから約２０μｇ／ｍＬのtrans-シンナムアルデヒドを添加して幹細胞の処理を行い、これにより、幹細胞の抗老化効果を与える。または、幹細胞培養液中に約４μｇ／ｍＬから約２０μｇ／ｍＬのtrans-シンナムアルデヒドを添加して幹細胞の処理を行い、これにより、幹細胞の若返り効果を与える。
【００２４】
本発明は、幹細胞の抗老化及び／又は幹細胞の若返りの組成物及びtrans-シンナムアルデヒドを用いた製剤を提供する。これら組成物及び製剤は、すなわち、前述の本発明に係る方法のtrans-シンナムアルデヒドを含む組成物及び製剤であり、生体外の幹細胞の処理に用いられ、これにより、幹細胞の使用効果を高めることができ、また、例えば、人体に使用され、これにより、生体内の幹細胞の若返り又は抗老化効果を提供する。
【００２５】
本発明に係る幹細胞の抗老化及び／又は幹細胞の若返りに用いられる組成物又は製剤は、生体外で使用される場合には媒体を含む。この媒体は、処理する幹細胞に対して悪影響を及ぼさず、且つtrans-シンナムアルデヒドの処理効果に影響を及ぼさないものであればよく、例えば、ジメチルスルホキシド、エタノール又は０．５％のメチルセルロースを含有するリン酸緩衝溶液により構成される。
【００２６】
本発明に係る幹細胞の抗老化及び／又は幹細胞の若返りに用いられる組成物又は製剤が人体の個体に使用される場合、これら組成物又は製剤は、あらゆる適当な形態のうちのいずれかに形成されるものであればよく、特殊な制限を受けない。例として、組成物又は製剤は、飲み薬又は飲用の食品、例えば、食品添加剤、飲料添加剤、栄養補助食品、食品組成分、飲料組成分、保健食品、栄養製品、医薬食品、栄養品の形態で提供されてもよく、また、薬剤の形式で提供してもよいが、これらに限定されるものではない。好ましくは、組成物又は製剤は、保健食品又は薬剤の形態で提供される。
【００２７】
薬剤として本発明に係る組成物及び／又は製剤が提供される場合、この薬剤は、要求される投薬方式に対応する適当な薬剤形態で提供する。例えば、薬剤は、経口又は非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉、腹腔又は鼻腔）等の投薬方式で必要な個体に使用されてもよいが、これに限定されるものではない。また、使用形式及び用途に応じて、適当な媒体を選択使用してから薬剤を提供することができる。
【００２８】
薬剤が経口投薬に適用される形態の場合を例として、本発明が提供する薬剤は、trans-シンナムアルデヒドの効果に悪影響を与えないあらゆる医薬上許容可能な媒体を含み、例えば、溶剤（水、食塩水、ブドウ糖（dextrose）、グリセリン、エタノール又はそれに類似するもの及びこれらの組み合わせ）、油性溶剤、希釈剤、安定剤、吸収遅延剤、崩壊剤、乳化剤、抗酸化剤、粘着剤、潤滑剤、吸湿材、固体担体（例えば、澱粉、ベントナイト（bentonite））等を含む。この薬剤は、あらゆる方法を利用して経口投薬に適用可能な薬剤形態で提供され、例えば、錠剤（糖衣錠を含む）、丸薬、カプセル剤、顆粒剤、粉末剤、流エキス剤、溶液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤及びチンキ剤等の形式で提供されてもよい。
【００２９】
薬剤が皮下、静脈内、筋肉又は腹腔注射に適用される注射薬剤形態又は点滴薬剤形態とされる場合、本発明が提供する薬剤に１種又は複数の溶剤、例えば、等張液、塩基緩衝液（例えば、リン酸塩緩衝液又はクエン酸塩緩衝液）、可溶化剤、乳化剤、５％の糖溶液及び他の媒体等の成分を添加して、静脈注入液、乳剤静脈注入液、粉末注射剤、懸濁性注射剤又は粉末懸濁性注射剤等の薬剤形態として提供してもよい。また、薬剤は、他の溶液又は懸濁液中に溶解されて固体状の注射前薬剤とした薬剤形態に作製されてもよく、更に、この固体状の注射前薬剤を乳化可能な薬剤形態にして提供してもよい。そして、この固体状の注射前薬剤を個体に投与する前に、まず、固体状の注射前薬剤を他の溶液又は懸濁液中に溶解又は乳化して注射剤にすれば、所望の注射剤を提供することが可能になる。なお、鼻腔又は皮膚を経由して投予可能な外用薬剤の形態は、例えば、乳液、クリーム、ジェル（例えば、ジェルウォーター）、膏薬（例えば、分散軟膏や軟膏）、噴霧剤又は溶液（例えば、洗浄液や懸濁液）等を含む。
【００３０】
必要に応じて、本発明で提供される薬剤には更に適当な量の添加剤を含むことができ、例えば、薬剤の服用時の口当たり及び視覚効果を高める調味剤、調色剤、着色剤等と、薬剤の安定性及び保存性を改善させる媒体、結合剤、緩衝剤、増粘剤、潤滑剤、崩壊剤、安定剤、乳化剤、粉末剤、懸濁剤、保存剤、防腐剤、抗菌剤又は抗真菌剤等と、を更に含んでもいてもよい。また、状況需要に応じて薬剤は、更に１つ又は複数の他の活性成分を含んでもいてもよいし、１つ又は複数の他の活性成分を含む薬物と併用してもよい。このようにして薬剤による効果を更に増強させることが可能になり、また、製剤や配合物に関する運用の柔軟性及び対応性を増加させることも可能になる。なお、他の活性成分は、trans-シンナムアルデヒドの効果に対して悪影響を引き起こさないものであればよい。
【００３１】
本発明で提供される薬剤は、１日１回、１日複数回又は数日に１回等の異なる頻度で使用することができるが、このような頻度は、投予する個体の年齢、体重及び健康状態によって異なる。例えば、幹細胞の抗老化及び／又は幹細胞の若返りのために薬剤を経口方式で個体に投予する場合、trans-シンナムアルデヒドで計算した日投薬量は約１０ｍｇ／体重１ｋｇ―ｄａｙから約５００ｍｇ／体重１ｋｇ―ｄａｙとすればよいが、好ましくは約６０ｍｇ／体重１ｋｇ―ｄａｙから約２４０ｍｇ／体重１ｋｇ―ｄａｙとし、更に好ましくは約１００ｍｇ／体重１ｋｇ―ｄａｙから約1６０ｍｇ／体重１ｋｇ―ｄａｙとする。ここで、単位としての『ｍｇ／体重１ｋｇ』とは、個体の体重１ｋｇ当たりに必要な投薬量を指す。但し、幹細胞の老化状況が重度である個体に対する投薬量は、実際の需要に応じて増加させることができ、例えば、数倍又は数十倍に増加させてもよい。
【００３２】
本発明の組成物及び／又は製剤が保健食品の形態で提供される場合、この形態は、例えば、乳製品類、肉類、パン類、野菜類、飼料、ジュース類、お茶類、スポーツドリンク、栄養ドリンク等を含んでいるが、これらに制限されない。trans-シンナムアルデヒドの添加工程は、保健食品の種類により異なるが、添加工程における環境がtrans-シンナムアルデヒドの処理効果に影響を与えないものであればよい。例えば、trans-シンナムアルデヒドは、製造過程における原料段階で添加されてもよいし（すなわち、保健食品の一部分とする）、製造が完成した後の完成品段階で添加されてもよい（すなわち、保健食品の添加物とする）。添加工程におけるtrans-シンナムアルデヒドの形態は、trans-シンナムアルデヒド自体のままでもよいし、trans-シンナムアルデヒドを他の各種成分（例えば、蛋白質、糖類、脂肪、微量元素又はビタミン等でもよいが、これらに限定されない）と混合して製造した錠剤状、カプセル状、顆粒状、粉末状、懸濁液状又は乳化液状の製剤として添加及び混合してもよい。
【００３３】
本発明で提供される保健食品は、需要に応じて更に適当な量の賦形剤（例えば、乳糖、白糖、澱粉又はマンニトール）、崩壊剤（例えば、炭酸カルシウムや線維素グリコール酸カルシウム）、結合剤（例えばα化澱粉、アラビアガム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリジン又はヒドロキシプロピルセルロース ）、増粘剤（天然ゴム）、潤滑剤（例えば、滑石粉、ステアリン酸マグネシウム又はポリエチレングリコール6000）及び／又は他の添加剤（例えば、保健食品の服用時の口当たり及び視覚効果を高める調味剤、調色剤、着色剤等及び保健食品の安定性及び保存性を改善させる媒体、緩衝剤、安定剤、乳化剤、粉末剤、懸濁剤、保存剤、防腐剤、抗菌剤又は抗真菌剤等）を含むことができる。また、保健食品は、需要に応じて更に１つ又は複数の他の活性成分を含んでいてもよいし、１つ又は複数の他の活性成分を含む保健食品と併用してもよい。これにより、保健食品の効果を更に強化させることが可能になり、製剤運用の柔軟性及び対応性を高めることが可能になる。なお、他の活性成分は、trans-シンナムアルデヒドの効果に対して不利な影響を引き起こさないものであればよい。
【００３４】
本発明で提供される保健食品は、１日１回、１日複数回又は数日に１回等の異なる頻度で食用することができ、この頻度は、保健食品を食用する個体の年齢、体重及び健康状態に応じて変更される。本発明で提供される保健食品におけるtrans-シンナムアルデヒドの含量は、所定の族群に応じて調整され、好ましくは、所定の服用量になるように調整する。例えば、１日分の服用量は個体につき約５００ｍｇ／ｄａｙであり、１食の保健食品当たり２５０ｍｇのtrans-シンナムアルデヒドを含有する場合は、個体は保健食品を毎日約２食食用することが推奨される。本発明の保健食品に係わる推奨食用量、特定の族群（例えば、妊婦、患者）の食用基準及び条件若しくは他の食品又は医薬と一緒に服用する場合の推奨事項は、その外装に標示される。そして、その標示される内容に基づいて使用者は、医師、薬剤師又は他の専門家による指導がなくとも、家でも自分でも安全に保健食品を服用することが可能になる。
【００３５】
本発明によれば、幹細胞による治療の前に幹細胞がtrans-シンナムアルデヒドで処理されることによって幹細胞の抗老化及び若返りが誘導されるので、幹細胞による治療効果が高まる。本発明は、trans-シンナムアルデヒドを幹細胞による治療に使用することが可能であるという発見及び応用に関し、幹細胞による治療に用いられるキット及び方法の提供を含む。
【００３６】
本発明に係る幹細胞による治療に使用されるキットは、（１）幹細胞を有する第一部分と、（２）trans-シンナムアルデヒドを有する第二部分と、（３）第三部分及び／又は第一部分及び／又は第二部分に存在する幹細胞培養液と、を含む。このキットを使用する場合、まず、幹細胞培養液中でtrans-シンナムアルデヒドによる幹細胞の処理を行い、その後、処理した幹細胞を幹細胞による治療に使用する。幹細胞の選定、培養液の選定及びtrans-シンナムアルデヒドの使用条件及び方法に関しては、いずれも上述のように行う。trans-シンナムアルデヒドは、好ましくは培養液１ｍＬ当たり約０．１μｇから約５０μｇの濃度で使用される。
【００３７】
本発明のキットでは、通常、各成分は別々に包装又は保存されてから各自単独に運送又は販売されるが、各成分を一緒に組み合わせてキットとした後に配送又は販売されてもよい。また、キットの使用方法は、使用説明書に記載されており、キットを使用する際にはその使用説明書に記載の順序及びプロセスに従って、使用者が現場で各成分を混合してから幹細胞を培養、処理及び適用することができる。
【００３８】
例えば、本発明のキットにおける各成分が別々に包装又は保存されると共に各自単独に運送又は販売される場合、幹細胞は、-８０℃の環境で凍結保存液に保存されるのが望ましい。trans-シンナムアルデヒドは、好ましくは４℃以下の光を避けた環境で、例えば、ジメチルスルホキシド、エタノール及び０．５％のメチルセルロースを含有するリン酸緩衝生理食塩水等の溶剤中に保存され、また、幹細胞培養液は-２０℃の環境で保存される。
なお、例えば、本発明のキットにおける各成分が組み合わせられて配送及び販売される場合、内部が-８０℃の容器（例えば、液体窒素容器）、内部が４℃より低い容器及び内部が-２０℃の容器（例えば、アイスボックス）の各々に、それぞれ幹細胞、trans-シンナムアルデヒド及び幹細胞培養液を入れるのが望ましい。
各容器の形状及び大きさは特に限定されないが、各容器は、外部の温度と隔絶させる機能を有すると共に、各成分を一緒に配送及び販売する際に保存温度が互いに影響し合わないように構成されている。幹細胞の保存に適切な凍結保存液が使用される場合、凍結保存液は、幹細胞の生存率を有効的に維持すると共に、幹細胞の染色体組成、増殖及び分化能力に影響を与えない。
通常、幹細胞に合わせて凍結保存液の組成は調整される。凍結保存液は、ジメチルスルホキシド、ブドウ糖等の細胞の栄養成分及びpH調整剤等を含むのが一般的であるが、血清及び動物性蛋白は含まない。
【００３９】
本発明に係わる幹細胞を使用する治療方法は、治療が必要な個体に有効量の幹細胞を投与することを特徴とし、幹細胞は、trans-シンナムアルデヒドにより事前に処理したものである。例えば、本発明の方法に係わる具体的な実施態様において幹細胞は、線維化した肝臓への治療に使用される前にtrans-シンナムアルデヒドを用いて事前に処理されることで抗老化機能を発揮し、幹細胞による線維化した肝臓への治療効果を高める。幹細胞の処理及び関連物質の選定、trans-シンナムアルデヒドの用量範囲及び治療の応用に関しては、上述のように行う。
【００４０】
以下の実施例では、更に例を示して本発明を説明する。これら実施例は、説明のために提供されるものであり、本発明の保護範囲を制限するものではない。本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲に示す。
【実施例】
【００４１】
Ａ．細胞実験
実例１：幹細胞の準備
（１）脂肪由来幹細胞（adipose derived stem cell、ＡＤＳＣ）
３７℃、５％二酸化炭素の下で、脂肪由来幹細胞を無血清角化細胞培地（keratinocyte-serum free medium、Ｋ−ＳＦＭ、Invitrogen-Gibco社等から購入）中で５回から７回継代培養した。このＫ−ＳＦＭ培地は、ヒト組換え上皮細胞成長因子（human recombinant epidermal growth factor、Gibco社から購入）、牛脳下垂体抽出物（bovine pituitary extract、Invitrogen-Gibco社等から購入）、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Hyclone社から購入）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ、Biowest社から購入）、濃度０．２ｍＭのＬ−アスコルビン酸（L-ascorbic acid、Sigma社から購入）及び濃度２ｍＭのＮ−アセチル-Ｌ-システイン（N-acetyl-L-cysteine、Sigma社から購入）を含む。
【００４２】
上述のように継代培養された脂肪由来幹細胞を含む培養液を４等分し、それぞれに最終濃度１００μＭのＨ２Ｏ２（Sigma-Aldrich社から購入）を添加して２時間処理し、幹細胞の老化を誘導した。その後、古い培養液を除去すると共に新鮮な培養液を加え、最終濃度０、２、４又は６μＭのtrans-シンナムアルデヒド（trans-cinnamaldehyde、ＴＣ、Sigma-Aldrich社から購入）をそれぞれ添加して６時間処理し、「Ｈ２Ｏ２組（Ｈ２Ｏ２による処理を２時間行い、ＴＣによる処理は行わない）」、「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ２組（Ｈ２Ｏ２による処理を２時間行い、濃度２μＭのＴＣによる処理を６時間行った）」、「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ４組（Ｈ２Ｏ２による処理を２時間行い、濃度４μＭのＴＣによる処理を６時間行った）」及び「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組（Ｈ２Ｏ２による処理を２時間行い、濃度６μＭのＴＣによる処理を６時間行った）」と呼ぶ脂肪由来幹細胞を取得した。
【００４３】
上述のように継代培養された脂肪由来幹細胞を含む培養液を５等分し、それぞれに最終濃度１００μＭのＨ２Ｏ２を添加して２時間処理し、幹細胞の老化を誘導した。その後、古い培養液を除去すると共に新鮮な培養液を加え、第１等分には最終濃度６μＭのＴＣを添加して６時間処理し、「ＴＣ６Ｈ組」と呼ぶ脂肪由来幹細胞を取得した。第２等分から第５等分には最終濃度６μＭのＴＣを各々添加して６時間処理し、その後、細胞をＤＭＥＭ（Dulbecco's modified essential medium）培養液中に移して、それぞれ１２、２４、４８及び７２時間培養を継続し、「ＴＣ１２Ｈ組」、「ＴＣ２４Ｈ組」、「ＴＣ４８Ｈ組」及び「ＴＣ７２Ｈ組」と呼ぶ脂肪由来幹細胞を取得した。
【００４４】
上述のように継代培養された脂肪由来幹細胞を含む培養液を４等分し、それぞれに最終濃度０、２、４及び６μＭのＴＣを添加して６時間処理し、「未処理組（いかなる処理も行っていない）」、「ＴＣ２組（濃度２μＭのＴＣによる処理を６時間行った）」、「ＴＣ４組（濃度４μＭのＴＣによる処理を６時間行った）」及び「ＴＣ６組（濃度６μＭのＴＣによる処理を６時間行った）」と呼ぶ脂肪由来幹細胞を取得した。
【００４５】
（２）ウォートンズ・ゼリー幹細胞（Wharton’s jelly stem cell、ＷＪＳＣ）
３７℃、５％二酸化炭素の下で、ウォートンズ・ゼリー幹細胞をＩＭＤＭ培養液（Iscove's modified Dulbecco's medium、Invitrogen社から購入）中で５回から７回継代培養した。ＩＭＤＭ培養液は、１０％のウシ胎児血清（Hyclone社から購入）、１０μｇ／ｍＬのアルカリ性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor、bFGF、R&D system社から購入）、濃度２ｍＭのL-グルタミン（Invitrogen-Gibco社等から購入）及び１００単位／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Invitrogen社から購入）を含む。
【００４６】
上述のように継代培養されたウォートンズ・ゼリー幹細胞を含む培養液を３等分し、第１等分及び第２等分に最終濃度１００μＭのＨ２Ｏ２をそれぞれ添加して２時間処理し、幹細胞の老化を誘導した。その後、古い培養液を除去すると共に新鮮な培養液を加え、最終濃度０又は６μＭのＴＣをそれぞれ添加して６時間処理し、「Ｈ２Ｏ２組（Ｈ２Ｏ２による処理を２時間行ったが、ＴＣによる処理は行っていない）」及び「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組（Ｈ２Ｏ２による処理を２時間行い、濃度６μＭのＴＣによる処理を６時間行った）」と呼ぶウォートンズ・ゼリー幹細胞を取得した。第３等分にはいかなる処理も行わず、「未処理組」と呼ぶウォートンズ・ゼリー幹細胞を取得した。
【００４７】
（３）ヒト骨髄間葉系幹細胞（human bone marrow mesenchymal stem cell、ｈＢＭＭＳＣ）
３７℃、５％二酸化炭素の下で、ヒト骨髄間葉系幹細胞（ｈＢＭＭＳＣ）をＩＭＤＭ培養液（Invitrogen-Gibco社等から購入）中で５回から７回継代培養した。ＩＭＤＭ培養液は、１０％のウシ胎児血清（Hyclone社から購入）、１０μｇ／ｍＬのアルカリ性線維芽細胞増殖因子（Ｒ＆Ｄ system社から購入）、濃度２ｍＭのL-グルタミン（Invitrogen-Gibco社等から購入）及び１００単位／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Invitrogen-Gibco社等から購入）を含む。
【００４８】
上述のように継代培養されたヒト骨髄間葉系幹細胞を含む培養液を３等分し、第１等分及び第２等分に最終濃度１００μＭのＨ２Ｏ２をそれぞれ添加して２時間処理し、幹細胞の老化を誘導した。その後、古い培養液を除去すると共に新鮮な培養液を加え、最終濃度０又は６μＭのＴＣをそれぞれ添加して６時間処理し、「Ｈ２Ｏ２組（Ｈ２Ｏ２による処理を２時間行ったが、ＴＣによる処理は行っていない）」及び「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組（Ｈ２Ｏ２による処理を２時間行い、濃度６μＭのＴＣによる処理を６時間行った）」と呼ぶヒト骨髄間葉系幹細胞を取得した。第３等分にはいかなる処理も行わず、「未処理組」と呼ぶヒト骨髄間葉系幹細胞を取得した。
【００４９】
実例２：幹細胞の表面抗原発現に対するＨ２Ｏ２及びtrans-シンナムアルデヒドの影響
実例１の（１）の「未処理組」、「Ｈ２Ｏ２組」及び「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組」の脂肪由来幹細胞に、それぞれ異なる抗体を作用させた。抗体は、Dako社から購入したヒト白血球分化抗原１４（human cluster of differentiation 14、ＣＤ１４）の抗体と、ヒト白血球分化抗原２９（ＣＤ２９）の抗体と、ヒト白血球分化抗原４４（ＣＤ４４）の抗体と、ヒト白血球分化抗原４５（ＣＤ４５）の抗体と、ヒト白血球型抗原-ＡＢＣ（human leukocyte antigen-ABC、ＨＬＡ−ＡＢＣ）の抗体と、Becton Dickinson社から購入したヒト白血球分化抗原３４（ＣＤ３４）の抗体と、ヒト白血球分化抗原４９ｂ（ＣＤ４９ｂ）の抗体と、ヒト白血球分化抗原７３（ＣＤ７３）の抗体と、ヒト白血球分化抗原９０（ＣＤ９０）の抗体と、ヒト白血球型抗原-ＤＲ（ＨＬＡ−ＤＲ）の抗体と、を含む。その後、フローサイトメトリー（Beckman Coulter社、モデルナンバー：ＦＣ５００）により各組の細胞表面抗原の発現を分析した。結果を図１Ａ及び図１Ｂに示す。
【００５０】
図１Ａ及び図１Ｂから分かるように、「未処理組」と比較して「Ｈ２Ｏ２組」及び「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組」の表面抗原の発現パターンに明確な変化はなく、この３組の脂肪由来幹細胞は、全て間葉系幹細胞のマーカー（例えば、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＨＬＡ−ＡＢＣ）を発現しているが、造血幹細胞のマーカー（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ−ＤＲ）を発現していなかった。この結果が示すように、Ｈ２Ｏ２による処理又はＴＣによる処理は、共に幹細胞の表面抗原の発現に影響を与えない。
【００５１】
実例３：幹細胞の分化能力に対するtrans-シンナムアルデヒドの影響
（１）骨形成性分化試験
ＤＭＥＭ培養液中で、実例１の（１）の「未処理組」、「Ｈ２Ｏ２組」及び「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組」の脂肪由来幹細胞を培養し、脂肪由来幹細胞が骨形成性分化に向かうように誘導した。この培養液は、１０％のウシ胎児血清、濃度２０ｎＭのデキサメタゾン（dexamethasone）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２．５μｇ／ｍＬのアムホテリシン（amphotericin）、濃度１０ｍＭのｂ-グリセリンリン酸塩（b-glycerophosphate）及び０．０５ｍＭ濃度のL-アスコルビン酸-2-リン酸塩（L-ascorbicacid 2-phosphate）を含む。培養から７日目にアルカリフォスファターゼ（alkaline phosphatase）検知キット（EMD Millipore社から購入、モデルナンバー：ＣＳＣＲ００４）を用いて染色を行い、その後、顕微鏡で撮影した結果を図２Ａ乃至図２Ｃに示す。骨形成性分化後の細胞は、顕微鏡下で見ると紫色を呈する。撮影後、各組の波長４５０ｎｍの吸光度値（ＯＤ４５０ｎｍ）（この吸光度値は、紫色の細胞の数に対応する）を測定し、脂肪由来幹細胞の骨形成性分化能力に対するＨ２Ｏ２及び／又はＴＣの影響を検討した。結果を図２Ｇに示す。
【００５２】
図２Ａ乃至図２Ｃ及び図２Ｇから分かるように、「未処理組」と比較すると「Ｈ２Ｏ２組」の骨形成性分化後の細胞数は明らかに減少し、「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組」の骨形成性分化後の細胞数は「未処理組」と同程度であった。この結果が示すように、幹細胞の骨形成性分化能力はＨ２Ｏ２による処理で低下し、このＨ２Ｏ２の悪影響はＴＣによる処理により打ち消されて幹細胞の骨形成性分化能力が正常に回復した。
【００５３】
（２）脂肪生成性分化試験
ＤＭＥＭ培養液中で、実例１の（１）の「未処理組」、「Ｈ２Ｏ２組」及び「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組」の脂肪由来幹細胞を培養し、脂肪由来幹細胞を脂肪生成性分化に向かうように誘導した。この培養液は、１０％のウシ胎児血清、１０μｇ／ｍＬのインスリン、濃度１μＭのデキサメタゾン、濃度０．５ｍＭの３-イソブチル-メチルキサンチン（3-isobutyl-1-methylxanthine、ＩＢＭＸ）及び濃度１００μＭのインドメタシン（indomethacin）を含む。培養から７日目にオイルレッドＯ染色（Oil Red O staining）を行い、顕微鏡で撮影した結果を図２Ｄ乃至図２Ｆに示す。幹細胞は、脂肪生成性分化に際して細胞中に油滴を生じ、オイルレッドＯ染色の後、細胞中の油滴は顕微鏡下で見ると橙赤色を呈する。オイルレッドＯ染色の工程はCoptis chinensis alkaloids exert anti-adipogenic activity on 3T3-L1 adipocytes by downregulating C/EBP-α and PPAR-γ. Fitoterapia. 98:199-208 (2014)に記載されており、この文献の全文をここでは参照する。
【００５４】
撮影後にイソプロパノール（４％のNonidet P-40洗浄剤）により各組の細胞油滴を抽出し、各組の波長５１０ｎｍの吸光度値（ＯＤ５１０ｎｍ）（この吸光度値は、橙赤色細胞に対応する。すなわち、脂肪生成性分化後の細胞の数に対応する）を検知した。結果を図２Ｈに示す。
【００５５】
図２Ｄ乃至図２Ｆ及び図２Ｈから分かるように、「未処理組」と比較すると「Ｈ２Ｏ２組」の脂肪生成性分化後の細胞数は明らかに減少しており、「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組」の脂肪生成性分化後の細胞数は「未処理組」と同程度であった。この結果が示すように、幹細胞の脂肪生成性分化能力はＨ２Ｏ２による処理で低下し、このＨ２Ｏ２の悪影響はＴＣによる処理により打ち消されて幹細胞の脂肪生成性分化能力が正常に回復した。
【００５６】
実例４：trans-シンナムアルデヒドによる幹細胞の若返り及び幹細胞の抗老化の効果
（１）増殖速度分析
実例１の（１）の「未処理組」、「Ｈ２Ｏ２組」及び「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組」の脂肪由来幹細胞を、それぞれリン酸緩衝生理食塩水（Phosphate buffered saline、PBS）で繰り返し２回洗浄した。その後、３．７％のホルムアルデヒドにより固定し、１０％のウシ胎児血清（ＰＢＳ中に希釈される）によりブロッキング反応を行った。そして、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、４℃でＫｉ６７抗体（Novus biological社から購入）を細胞に反応させ、１日後に更に細胞をＰＢＳで１回洗浄し、室温で二次抗体（goat anti rabbit IgG、Merk Millipore社から購入）を細胞に２時間反応させた。最後にＤＡＰＩ染色剤（Invitrogen社から購入）により遮光染色を行った後、蛍光顕微鏡で観察した。結果を図３Ａ乃至図３Ｃに示す。増殖中の細胞のＧ１、Ｓ、Ｇ２及びＭ期における核蛋白はＫｉ６７抗体により染色されるが、静止Ｇ０期の細胞は染色されない。このため、Ｋｉ６７により染色される細胞が多いほど、増殖中の細胞が多いことが分かる（すなわち、増殖速度がより速い）。
【００５７】
図３Ａ乃至図３Ｃから分かるように、「未処理組」と比較すると「Ｈ２Ｏ２組」でＫｉ６７が染色される細胞は明らかに減少している一方、「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組」でＫｉ６７が染色される細胞は明らかに増加し、「未処理組」に相当するほどに増加していた（矢印が指す箇所は増殖中の細胞）。この結果が示すように、幹細胞はＨ２Ｏ２による処理により老化され、Ｈ２Ｏ２の悪影響はＴＣによる処理により打ち消されて、老化した幹細胞の増殖速度が正常に回復した（すなわち、幹細胞の抗老化）。
【００５８】
（２）老化関連β-ガラクトシダーゼ（senescence associated-β-galactosidase、SA-β-gal）の活性測定試験
老化細胞は、酸性条件（例えば、ｐＨ６．０）でのＳＡ−β−ｇａｌ染色により染色されることが知られており、このため、細胞内のＳＡ−β−ｇａｌ発現量を検知して細胞の老化程度を知ることができる。
【００５９】
実例１の（１）の脂肪由来幹細胞を、それぞれＰＢＳで２回洗浄した。その後、３％のホルムアルデヒドにより固定し、ＰＢＳで１回洗浄した。次いで、３７℃でＣＯ２のない環境で、調合された新鮮な染色溶液中で各組の細胞染色を1２時間行った。この染色溶液は、１μｇ／ｍＬの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシダーゼ（5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactosidase、X-gal）と、濃度４０ｍＭのクエン酸／リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）と、濃度５ｍＭのフェロシアン化カリウムと、濃度５ｍＭのフェリシアン化カリウムと、濃度１５０ｍＭの塩化ナトリウムと、濃度２ｍＭの塩化マグネシウムと、を含む。
【００６０】
染色溶液を除去し、各組の細胞をＰＢＳで洗浄した。最後に、顕微鏡で１０倍の倍率で拡大して観察及び撮影を行い、ＳＡ−β−ｇａｌ活性を示す細胞のパーセンテージを計算した。結果を図４Ａ乃至図４Ｅに示す。
【００６１】
図４Ａに示すように、「未処理組」と比較して「ＴＣ２組」、「ＴＣ４組」及び「ＴＣ６組」の全てで、ＳＡ−β−ｇａｌ活性を示す細胞数がＴＣ濃度の増加に連れて減少した。これは、ＴＣが幹細胞の若返り能力を有していることを示している。
【００６２】
図４Ｂ乃至図４Ｅから分かるように、「未処理組」と比較し、「Ｈ２Ｏ２組」でＳＡ−β−ｇａｌ活性を示す細胞数が明らかに増加しており、これはＨ２Ｏ２が幹細胞を老化させたことを示す。また、「Ｈ２Ｏ２組」と比較し、「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ２組」、「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ４組」及び「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組」の全てでＳＡ−β−ｇａｌ活性を示す細胞数は明らかに減少しており、これはＨ２Ｏ２が引き起こした幹細胞の老化の悪影響がＴＣにより打ち消されたことを示す。
【００６３】
（３）遺伝子発現分析
（３-１）ｃＤＮＡの調製
ＲＮＡ精製キット（RNeasy Mini kit、Qiagen社から購入）により、実例１の各組の脂肪由来幹細胞、骨髄間葉系幹細胞及びウォートンズ・ゼリー幹細胞から全ＲＮＡを抽出し、その後、逆転写キット（ＲＴ Pre Mix、iNtRON Biotechnology社から購入）を用いて取得した全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。
【００６４】
【表１】
0006466484.tif 000002
【００６５】
（３-２）定量的ＲＴ−ＰＣＲ
上述の（３-１）で取得した各組の脂肪由来幹細胞のｃＤＮＡを１μＬ取り、０．６μＬの表１に示すＳＩＲＴ１遺伝子の対応プライマー（５ｐＭ／μＬ）、３．４μＬの脱イオン水及び１０μＬのＳＹＢＲ Green ＰＣＲ master mix（Thermo Scientific社から購入）を各々加え、その後、同期定量的ポリメラーゼ連鎖反応器（ABI prism 7700 sequence detection system）中に入れて反応を行い、遺伝子発現量を定量した。反応条件は、以下の通りである。ｉ）５０℃、２分間、１サイクル。ｉｉ）９５℃、１０分間、１サイクル。  ｉｉｉ）９５℃、１５秒、６０℃、３０秒、７２℃、３０秒、以上の工程を４０サイクル。ｉｖ）７２℃、１０分間、１サイクル。ｖ）最後に４℃で反応を終了させる。結果を図５Ａ乃至図５Ｃに示す。
【００６６】
図５Ａから分かるように、「Ｈ２Ｏ２組」と比較し、「ＴＣ２組」、ＴＣ４組」及び「ＴＣ６組」のＳＩＲＴ１（沈黙交配型情報調節２ホモログ１、silent mating type information regulation 2 homolog 1）遺伝子の発現は、ＴＣ濃度の増加に連れて明らかに増加していた。これは、ＴＣが幹細胞の若返り能力を有することを示す。
【００６７】
図５Ｂから分かるように、「Ｈ２Ｏ２組」と比較し、「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ２組」、「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ４組」及び「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組」のＳＩＲＴ１遺伝子の発現は、ＴＣ濃度の増加に連れて明らかに増加していた。これは、ＴＣが幹細胞の抗老化能力を有することを示す。
【００６８】
図５Ｃから分かるように、「ＴＣ６Ｈ組」と比較し、「ＴＣ１２Ｈ組」、「ＴＣ２４Ｈ組」、「ＴＣ４８Ｈ組」、「ＴＣ７２Ｈ組」のＳＩＲＴ１遺伝子の発現には明確な差異がなかった。これは、ＴＣによる幹細胞のＳＩＲＴ１遺伝子発現を増加させる効果が、少なくとも７２時間維持されることを示す。
【００６９】
（３-３）半定量的ＲＴ−ＰＣＲ
上述の（３-１）で取得した「未処理組」、「Ｈ２Ｏ２組」及び「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組」の脂肪由来幹細胞ｃＤＮＡを２．５マイクロリットル取り、２．５μＬの表１に示す各遺伝子の対応プライマー（濃度１０μＭ）、７．５μＬの脱イオン水及び１２．５μＬのEconoTaq（登録商標） PLUS GREEN 2X Master Mix（Lucigen、Middleton、Wisconsin、USA）を加え、これらサンプルをポリメラーゼ連鎖反応器中に入れて反応させた。反応条件は、以下のように設定した。ｉ）９４°Ｃ、３０秒、５５°Ｃ、３０秒、９４°Ｃ、６０秒、以上の工程で３０サイクルの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Revers transcription polymerase chain reaction、RT-PCR）を行った。ｉｉ）７２°Ｃ、１０分間。ｉｉｉ）最後に４°Ｃまで冷却させて反応を終了させた。取得したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物を２％のアガロペクチンで３０分間電気泳動（電圧：１００Ｖ）し、アガロペクチンを臭化エチジウム（ethidium bromide、ＥｔＢｒ）中に入れて１０分間染色を行った後、ゲル画像化システム（DOC PRINT DP-001FDC、VilberLourmat France）を用いて画像を撮影した。結果を図６Ａに示す。最後に、ソフトウェア（Image J）により各遺伝子の発現量を定量した。結果を図６Ｂに示す。
【００７０】
図６Ａ及び図６Ｂから分かるように、「未処理組」と比較し、「Ｈ２Ｏ２組」のＳＩＲＴ１遺伝子の発現は明らかに減少しており、「Ｈ２Ｏ２組」と比較し、「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組」のＳＩＲＴ１遺伝子の発現は明らかに増加していた。「未処理組」と比較し、「Ｈ２Ｏ２組」のｐ２１及びｐ５３遺伝子の発現は明らかに増加しており、「Ｈ２Ｏ２組」と比較し、「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組」のｐ２１及びｐ５３遺伝子の発現は明らかに減少していた。「Ｈ２Ｏ２組」と比較し、「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組」のＯＣＴ４（octamer-binding transcription factor 4）及びＮＡＮＯＧ遺伝子の発現には明確な差異がない。
【００７１】
ＳＩＲＴ１遺伝子の発現が老化に関係し、ｐ２１及びｐ５３遺伝子の発現は細胞周期の調節に関係し、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧ遺伝子の発現は幹細胞の多能性（pluripotency）に関係していることが知られている。このため、上述の結果は、ＴＣが幹細胞の抗老化及び細胞周期の調節能力を有する一方、幹細胞の多能性には影響を与えないことを示している。
【００７２】
（３-４）マイクロアレイ分析（Microarray Analysis）
逆転写キット（RT Pre Mix、iNtRON Biotechnology社から購入）及び表２に示す各遺伝子の対応プライマー及び表１に示すＳＩＲＴ１遺伝子、ｐ５３遺伝子の対応プライマーにより、上述の（３-１）で得られた「Ｈ２Ｏ２組」、「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組」の脂肪由来幹細胞の全ＲＮＡに対して約２０又は３０サイクルの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を行い、各遺伝子の一本鎖ｃＤＮＡを得た。
【００７３】
上述のｃＤＮＡを遺伝子チップ（affymetrixGeneChip Human Genome U133 plus 2.0 Array、Affymetrix）とハイブリさせ、その後、マイクロアレイスキャナーシステム（Gene Chip（登録商標） Scanner 3000）によりマイクロアレイのスキャンを行ってデータを分析した。表３に示すように、「Ｈ２Ｏ２組」の遺伝子発現（「Ｈ２Ｏ２組」における遺伝子発現を１倍と設定）との比較により、「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組」の遺伝子発現を倍数で示した。
【００７４】
【表２】
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【００７５】
【表３】
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【００７６】
表３から分かるように、「Ｈ２Ｏ２組」と比較し、「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組」の脂肪由来幹細胞における細胞増殖関連遺伝子（すなわち、ＮＹＦＡ、ＣＣＮＤ１、ＥＩＦ５、ＳＩＲＴ１、Ｅ２Ｆ６、ＰＯＬＲ３Ｈ、ｈＴＥＲＴ及びＰＣＮＡ）の発現が全て明らかに増加しており、細胞のアポトーシス（apoptosis）関連遺伝子（すなわち、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＰＩＭ１、ｐ５３及びｐ１６）の発現が全て明らかに減少していた。この結果が示すように、ＴＣは、細胞における転写、翻訳関連遺伝子の発現及びＳＩＲＴ１遺伝子の発現を増加させることで細胞の増殖速度を速める。
【００７７】
（４）テロメラーゼ活性測定試験
テロメラーゼ活性は、細胞老化の鍵となる制御因子である。そこで、テロメラーゼ反復配列増幅法（Telomeric Repeat Amplification Protocol、ＴＲＡＰ）により実例１の（１）の「未処理組」、「Ｈ２Ｏ２組」及び「ＴＣ６Ｈ組」の脂肪由来幹細胞におけるテロメラーゼ活性の分析を行った。まず、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりテロメア３′末端のプライマー（すなわち、Ｔｅｌｏ  ＴＡＧＧＧ）がテロメラーゼの触媒作用により伸長され、且つＴＴＡＧＧＧ反復配列が増幅され、その後に酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により各組の生成物シグナルを検知した。結果を図７に示す。なお、ＨＥＫ２９３細胞（いかなる処理も行っていない）におけるテロメラーゼ活性を、陽性コントロールとした。
【００７８】
図７から分かるように、「未処理組」と比較し、「Ｈ２Ｏ２組」のテロメラーゼ活性は明らかに低下しており、「Ｈ２Ｏ２組」と比較し、「ＴＣ６Ｈ組」のテロメラーゼ活性は明らかに向上していた。この結果は、Ｈ２Ｏ２による処理で幹細胞が老化し、ＴＣによる処理で老化した幹細胞のテロメラーゼ活性が向上したことを示し、これは、ＴＣが幹細胞の抗老化能力を有することを示している。
【００７９】
（５）骨髄間葉系幹細胞及びウォートンズ・ゼリー幹細胞の試験
（５-１）ＳＡ−β−ｇａｌの活性測定試験
実例１の各組の骨髄間葉系幹細胞及びウォートンズ・ゼリー幹細胞を使用し、上述の（２）の工程を重複して行った。結果を図８Ａ乃至図８Ｄ及び図９Ａ乃至図９Ｄにそれぞれ示す。
【００８０】
図８Ａ乃至図８Ｄから分かるように、「未処理組」のヒト骨髄間葉系幹細胞と比較し、「Ｈ２Ｏ２組」のヒト骨髄間葉系幹細胞でＳＡ−β−ｇａｌ活性を示す細胞数は明らかに増加しており、「Ｈ２Ｏ２組」のヒト骨髄間葉系幹細胞と比較し、「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組」のヒト骨髄間葉系幹細胞でＳＡ−β−ｇａｌ活性を示す細胞数は明らかに減少していた。この結果は、脂肪由来幹細胞の結果と一致する。
【００８１】
図９Ａ乃至図９Ｄから分かるように、「未処理組」のウォートンズ・ゼリー幹細胞と比較し、「Ｈ２Ｏ２組」のウォートンズ・ゼリー幹細胞でＳＡ−β−ｇａｌ活性を示すウォートンズ・ゼリー幹細胞数は明らかに増加しており、「Ｈ２Ｏ２組」のウォートンズ・ゼリー幹細胞と比較し、「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組」のウォートンズ・ゼリー幹細胞でＳＡ−β−ｇａｌ活性を示す細胞は明らかに減少していた。この結果も、脂肪由来幹細胞の結果と一致する。
【００８２】
（５-２）ＳＩＲＴ１遺伝子発現分析
（３-１）で取得した各組のヒト骨髄間葉系幹細胞及びウォートンズ・ゼリー幹細胞のｃＤＮＡを使用して、上述の（３-２）の工程と同様にして定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。結果を図１０Ａ及び図１０Ｂに示す。
【００８３】
図１０Ａから分かるように、「未処理組」のヒト骨髄間葉系幹細胞と比較し、「Ｈ２Ｏ２組」のヒト骨髄間葉系幹細胞のＳＩＲＴ１遺伝子の発現は明らかに減少しており、これはＨ２Ｏ２処理により細胞が老化したことを示す。一方、「Ｈ２Ｏ２組」のヒト骨髄間葉系幹細胞と比較し、「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組」のヒト骨髄間葉系幹細胞におけるＳＩＲＴ１遺伝子の発現は明らかに増加しており、これは、ＴＣが幹細胞の抗老化能力を有することを示す。この結果は、脂肪由来幹細胞の結果と一致する。
【００８４】
図１０Ｂから分かるように、「未処理組」のウォートンズ・ゼリー幹細胞と比較し、「Ｈ２Ｏ２組」のウォートンズ・ゼリー幹細胞におけるＳＩＲＴ１遺伝子の発現は明らかに減少しており、これはＨ２Ｏ２処理により細胞が老化したことを示す。一方、「Ｈ２Ｏ２組」のウォートンズ・ゼリー幹細胞と比較し、「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組」のウォートンズ・ゼリー幹細胞におけるＳＩＲＴ１遺伝子の発現は明らかに増加しており、これは、ＴＣが幹細胞の抗老化能力を有することを示す。この結果も、脂肪由来幹細胞の結果と一致する。
【００８５】
Ｂ．動物実験
実例５：肝臓線維化ラットモデルの構築
８週目の雄のWisterラット（計３５匹）に対して、腹膜内注射方式により２００ｍｇ／体重１ｋｇのチオアセトアミド（thioacetamide、ＴＡＡ）を３日毎に１回で計６０日（すなわち、合計２０回）注射し、「ＴＡＡ組」ラットと称する肝臓線維化ラットモデルを獲得した。これとは別に、チオアセトアミド未注射で、同じ体積の普通の食塩水が注射された正常な「比較群」ラット（計１２匹）も用意した。最後の注射が完了してから４日後に、４匹の「比較群」ラット及び３匹の「ＴＡＡ組」ラットをエーテルによりサクリファイスし、以下の分析を行った。
【００８６】
（１）組織病理学点数評価
「比較群」及び「ＴＡＡ組」のラットの肝臓組織サンプルを取り、その後、組織サンプルを切片に切断及び染色し、組織病理学的な点数評価を行った。結果を図１１Ａ及び図１１Ｂに示す。染色方法は、ヘマトキシリン及びエオシン染色（Hematoxylin and Eosin Staining、H&E Staining）並びにマッソントリクローム染色（Masson’s trichrome staining）であり、これらはAdipose-derived stem cells can abrogate chemical-induced liver fibrosis and facilitate recovery of liver function. Cell Transplant. 21(12):2753-2764 (2012)に基づいており、この文献の全文をここでは参照する。ヘマトキシリン及びエオシン染色並びにマッソントリクローム染色の結果をMetavirステージングシステムにより分析し、以下の表５に示すように、それぞれステージングを行って活性点数（activity score）及び繊維化点数（fibrosis score）を獲得した。活性点数は、高いほど肝炎の程度が重いことを意味し、繊維化点数は、高いほど繊維化程度が重いことを意味する。
【００８７】
【表５】
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【００８８】
図１１Ａ（マッソントリクローム染色結果）から分かるように、「ＴＡＡ組」ラットの肝臓組織中では、肝臓線維化の特徴であるコラーゲンの蓄積及び２本の血管の繋がりが見られた。また、Metavirステージングシステムにより図１１Ａに示した結果を分析すると、「比較群」ラットの繊維化点数が０であるのに対し、「ＴＡＡ組」ラットの繊維化点数は４であった。この結果から、ラットの肝臓は、ＴＡＡを長期間注射することにより重度に繊維化することが分かった（ひいては肝硬変を発症する）。
【００８９】
図１１Ｂ（ヘマトキシリン及びエオシン染色結果）から分かるように、「ＴＡＡ組」ラットの肝臓組織は、明らかにマクロファージの浸潤を受けている。また、Metavirステージングシステムにより図１１Ｂに示した結果を分析すると、「比較群」ラットの活性点数が０であるのに対し、「ＴＡＡ」ラットの活性点数は３であった。この結果から、ラットの肝臓は、ＴＡＡを長期間注射することにより重度の炎症症状を呈することが分かった。
【００９０】
（２）生化学機能指数分析
「比較群」及び「ＴＡＡ組」ラットの心臓血液を回収し、生化学モジュール（Roche社から購入、モデルナンバー：Integra 800）を用いて肝臓の生化学機能指数を分析し、これにより、肝臓の傷害程度の評価を行った。生化学機能指数は、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（glutamate oxaloacetate transaminase、ＧＯＴ）発現量と、グルタミン酸ピルビン酸転移酵素（glutamate pyruvate transaminase、ＧＰＴ）発現量と、アルブミン（albumin）発現量と、総ビリルビン（total bilirubin）発現量と、プロトロンビン時間（prothrombin time）と、を含む。結果を表４に示す。
【００９１】
【表４】
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【００９２】
表４から分かるように、「比較群」と比較し、「ＴＡＡ組」ラットのＧＯＴ、ＧＰＴ及び総ビリルビンの血液中における発現量及びプロトロンビン時間はすべて明らかに増加しており、逆に、アルブミンの血液中における発現量は明らかに低下していた。この結果からラットの肝臓は、ＴＡＡを長期間注射することにより障害されることが再確認できた。
【００９３】
実例６：幹細胞による治療効果のtrans-シンナムアルデヒドによる強化効果
実例５で余った３２匹の「ＴＡＡ組」ラットを「仮性注射組」、「幹細胞組」、「Ｈ２Ｏ２組」及び「ＴＣ組」（各組８匹ずつ）に分け、それぞれ異なる処理（処理当日を処理後『第０日目』と呼ぶ）を行った。「仮性注射組」は、３００マイクロリットルの普通食塩水のみをラットの線維化した肝臓に注射した。「幹細胞組」は、３００マイクロリットル（１×１０６個の細胞を含む）の実例１で得られる「未処理組」の脂肪由来幹細胞をラットの線維化した肝臓に注射した（陽性コントロール組）。「Ｈ２Ｏ２組」は、３００マイクロリットル（１×１０６個の細胞を含む）の実例１で得られる「Ｈ２Ｏ２組」の脂肪由来幹細胞をラットの線維化した肝臓に注射した（陰性コントロール組）。「ＴＣ組」は、３００マイクロリットル（１×１０６個の細胞を含む）の実例１で得られる「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組」の脂肪由来幹細胞をラットの線維化した肝臓に注射した。
【００９４】
各組のラットに異なる処理を行った『第７日目』に各組４匹のラットをエーテルによりサクリファイスし、処理後『第１４日目』に各組の残りの４匹のラットをサクリファイスした。各組のラットの心臓血液及び肝臓組織のサンプルを回収し、以下の分析を行った。
【００９５】
（６-１）α-フェトタンパク質（α-fetoprotein、ＡＦＰ）免疫組織染色
「比較群（未処理組）」、「仮性注射組」、「幹細胞組」、「Ｈ２Ｏ２組」及び「ＴＣ組」ラットの肝組織の切片に対して、ヒトα-フェトタンパク質抗体（Calbiochem社、ＳＴ１６７３）によりα-フェトタンパク質免疫組織染色分析を行った。幹細胞移植後『第７日目』の結果を図１２Ａ乃至図１２Ｅに示し、幹細胞移植後『第１４日目』の結果を図１２Ｆ乃至図１２Ｊに示す。α-フェトタンパク質抗体はヒトのα-フェトタンパク質に対するものであり、このため、α-フェトタンパク質シグナルを有する細胞（矢印で指す褐色の細胞）は、移植後に分化して肝細胞様細胞（hepatocyte-like cell）となった脂肪由来幹細胞を表している。
【００９６】
図１２Ａ乃至図１２Ｊから分かるように、幹細胞移植後『第７日目』及び『第１４日目』の「幹細胞組」、「Ｈ２Ｏ２組」及び「ＴＣ組」の肝臓組織中にはα−フェトタンパク質のシグナルを有する多くの細胞が存在する（矢印が指す箇所）。この結果は、各組の幹細胞がラットの肝臓に移植された後に、生存及び分化していることを示す。以下では、各組の幹細胞が肝臓繊維化ラットに与える治療効果について更に詳述する。
【００９７】
（６-２）組織病理学点数評価
「比較群」、「仮性注射組」、「幹細胞組」、「Ｈ２Ｏ２組」及び「ＴＣ組」ラットの心臓血液に対して、実例５の（１）の組織病理学点数評価を行った。結果を図１３Ａ乃至図１３Ｄ、図１４Ａ及び図１４Ｂに示す。マッソントリクローム染色の結果を図１３Ａ及び図１３Ｂに示し、ヘマトキシリン及びエオシン染色の結果を図１３Ｃ及び図１３Ｄに示す。また、図１４Ａ及び図１４Ｂの結果をデータ化し、以下の表６に示す。
【００９８】
【表６】
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【００９９】
図１３Ａ乃至図１３Ｄ、図１４Ａ、図１４Ｂ及び表６から分かるように、ＴＡＡを長期間注射したラットの肝臓には重度の炎症反応が起こり、肝臓組織にはマクロファージの浸潤による重度の繊維化（更には、肝硬変を患う）が発生していた。しかしながら、「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組」の脂肪由来幹細胞で治療したラットの肝臓では、炎症反応の程度が低下し、且つ肝臓の繊維化が改善されている。
【０１００】
（６-２）生化学機能指数分析
「比較群」、「仮性注射組」、「幹細胞組」、「Ｈ２Ｏ２組」及び「ＴＣ組」ラットの心臓血液に対して、実例５の（２）の生化学機能指数分析を行った。結果を図１５Ａ乃至図１５Ｅに示す。
【０１０１】
図１５Ａから分かるように、治療後『第１４日目』における「Ｈ２Ｏ２組」のＧＰＴ発現量（９３±１３単位／Ｌ）と比較し、「幹細胞組」のＧＰＴ発現量が明らかに低下していた（７２±１４単位／Ｌ）。また、「幹細胞組」と比較し、「ＴＣ組」のＧＰＴ発現量も明らかに低下していた（６６±１４単位／Ｌ）。この結果は、「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組」の脂肪由来幹細胞により治療を行うと、肝臓線維化ラットの血液中のＧＰＴ発現量が有効的に低下することを示している。
【０１０２】
図１５Ｂから分かるように、治療後『第１４日目』における「仮性注射組」のＧＯＴ発現量（２０８±１２単位／Ｌ）と比較し、「幹細胞組」のＧＯＴ発現量が明らかに低下していた（１６２±６０単位／Ｌ）。また、「幹細胞組」と比較し、「ＴＣ組」のＧＯＴ発現量も明らかに低下していた（１３７±１８単位／Ｌ）。この結果は、「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組」の脂肪由来幹細胞により治療を行うと、肝臓線維化ラットの血液中のＧＯＴ発現量が有効的に低下することを示している。
【０１０３】
図１５Ｃから分かるように、治療後『第１４日目』における「幹細胞組」のアルブミン発現量（３．５２±０．２８ｇ／ｄＬ）と比較し、「仮性注射組」のアルブミン発現量（３．２３±０．０１ｇ／ｄＬ）は明らかに低かった。また、「仮性注射組」と比較し、「ＴＣ組」のアルブミン発現量が明らかに増加していた（３．４８±０．０３ｇ／ｄＬ）。この結果は、「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組」の脂肪由来幹細胞により治療を行うと、肝臓線維化ラットの血液中のアルブミン発現量が有効的に増加することを示している。
【０１０４】
図１５Ｄから分かるように、治療後『第１４日目』における「仮性注射組」のプロトロンビン時間（２３．１０±２．５秒）と比較し、「ＴＣ組」のプロトロンビン時間（１０．８８±０．６７秒）が明らかに減少していた。この結果は、「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組」の脂肪由来幹細胞により治療を行うと、肝臓線維化ラットのプロトロンビン時間が有効的に減少することを示している。
【０１０５】
図１５Ｅから分かるように、治療後『第１４日目』における「幹細胞組」の総ビリルビン発現量（０．０５±０．０２ｍｇ／ｄＬ）と比較し、「ＴＣ組」の総ビリルビン発現量（０．０３４±０．０３ｍｇ／ｄＬ）は明らかに低下し、且つ「比較群」の総ビリルビン発現量（０．０２±０．０２ｍｇ／ｄＬ）に近づいている。この結果は、「Ｈ２Ｏ２＋ＴＣ６組」の脂肪由来幹細胞により治療を行うと、肝臓線維化ラットの血液中の総ビリルビン発現量が有効的に低下することを示している。
【０１０６】
上述の結果は、trans-シンナムアルデヒド（ＴＣ）により幹細胞を処理すると幹細胞の抗老化に有効であり、これにより、幹細胞による治療効果が高まることを示している。
【０１０７】
本明細書に開示された実施例は、本発明を限定するものではなく説明するためのものであり、このような実施例によって本発明の思想と範囲が限定されるものではない。本発明の保護範囲は特許請求の範囲により解釈すべきであり、それと同等の範囲内にある全ての技術は、本発明の権利範囲に含まれるものと解釈すべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ−Ｂ】
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【図１５Ｃ−Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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