(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体と、前記支持体の一方の表面上に固定された、アナライトに特異的に結合しうる第１リガンドとを含む検出デバイスを用いて、検体中のアナライトを検出する方法であって、
検体を前記検出デバイスの前記支持体上に提供して、前記検体に含まれる前記アナライトを前記第１リガンドに結合させる第１工程と、
前記第１工程の前または後に、標識物質で標識された、前記アナライトに特異的に結合しうる第２リガンドを前記アナライトに結合させる第２工程と、
前記第１工程および前記第２工程の後に、アルデヒド基を有する有機化合物である架橋剤を前記支持体上に提供して、前記第１リガンドと前記アナライトとの間、前記第２リガンドと前記アナライトとの間、前記第１リガンドと前記第２リガンドとの間、２つの前記第１リガンドの間、２つの前記第２リガンドの間、および２つの前記アナライトの間を架橋する第３工程と、
を有する、検出方法。
【請求項２】
前記架橋剤は、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドまたはこれらの組み合わせである、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記第３工程の後に、前記標識物質に由来するシグナルを検出する工程をさらに有する、請求項１または請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記検出デバイスは、誘電体からなるプリズムと、前記プリズム上に配置された前記支持体としての金属膜とを含み、
前記標識物質は、蛍光物質であり、
前記シグナルを検出する工程では、前記第１リガンドが固定された領域に対応する前記金属膜の裏面に前記プリズムを介して励起光を照射したときに、前記蛍光物質から放出される蛍光を検出する、
請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】
前記支持体は、前記第１リガンドが固定された領域に回折格子を含む金属膜であり、
前記標識物質は、蛍光物質であり、
前記シグナルを検出する工程では、前記回折格子に励起光を照射したときに、前記蛍光物質から放出される蛍光を検出する、
請求項３に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出方法および検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査などにおいて、検体中のタンパク質やＤＮＡなどの微量のアナライト（被検出物質）を高感度かつ高精度に検出することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。このため、微量のアナライトを高感度かつ高精度に検出するための方法が求められている。
【０００３】
アナライトの検出方法として、イムノアッセイが知られている。一般的に、イムノアッセイでは、まずアナライトに特異的に結合しうる１次抗体（第１リガンド）が固定された支持体上に検体を提供する。これにより、アナライトおよび１次抗体が互いに結合する。次いで、１次抗体に結合しているアナライトを標識物質（例えば、蛍光物質や酵素、放射性同位元素など）で標識する。たとえば、１次抗体に結合しているアナライトに標識物質で標識された２次抗体（第２リガンド）を結合させる。最後に、アナライトを標識している標識物質に由来するシグナルを検出することで、アナライトを検出することができる。
【０００４】
また、標識物質として蛍光物質を用いるイムノアッセイにおいて、検出感度および検出精度を向上させる方法として、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）が知られている。ＳＰＦＳでは、所定の条件で光を金属膜に照射すると、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：以下「ＳＰＲ」と略記する）が生じることを利用する。アナライトに特異的に結合できる第１リガンド（例えば１次抗体）を金属膜上に固定化して、アナライトを特異的に固定するための反応場を形成する。この反応場にアナライトを含む検体を提供すると、アナライトは反応場の第１リガンドに結合する。次いで、蛍光物質で標識された第２リガンド（例えば２次抗体）を反応場に提供すると、反応場の第１リガンドに結合したアナライトは蛍光物質で標識される。この状態で金属膜に励起光を照射すると、アナライトを標識する蛍光物質は、ＳＰＲにより増強された電場により励起され、蛍光を放出する。したがって、蛍光を検出することで、アナライトの存在またはその量を検出することができる。ＳＰＦＳでは、ＳＰＲにより増強された電場により蛍光物質を励起するため、高感度でアナライトを検出することができる。ＳＰＦＳは、励起光と表面プラズモンとを結合（カップリング）させる手段により、プリズムカップリング（ＰＣ）−ＳＰＦＳと、格子カップリング（ＧＣ）−ＳＰＦＳとに大別される。ＰＣ−ＳＰＦＳでは、１つの面に金属膜を形成されたプリズムを使用する。この方法では、プリズムと金属膜の界面において励起光を全反射させることで、励起光と表面プラズモンとを結合させる。一方、ＧＣ−ＳＰＦＳでは、回折格子を形成された金属膜を使用する。この方法では、回折格子に励起光を照射することで、励起光と表面プラズモンとを結合させる。
【０００５】
このように、イムノアッセイでは、抗体およびアナライトが特異的に結合することを利用する。しかしながら、抗体とアナライトとの結合は可逆的であるため、アナライトが抗体から解離してしまうことがある。このため、アナライトおよび／または標識物質が支持体（金属膜）から遊離してしまい、アナライトを正確に検出できないという問題が生じる。特に、ＳＰＦＳでは、アナライトは、蛍光物質で標識された２次抗体を介して蛍光標識されている。このように、アナライトが、１次抗体および２次抗体によりサンドイッチされている場合、１次抗体からアナライトおよび／または２次抗体が解離することで蛍光物質が分散してしまい、正確な検出を行うことができなくなる可能性がより高くなる。
【０００６】
このような問題を解決する手段として、ＳＰＦＳにおいて、１次抗体（第１リガンド）、アナライトおよび２次抗体（第２リガンド）からなるサンドイッチ構造体の解離を抑制する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。特許文献１に記載の方法では、ナノ構造粒子と、当該ナノ構造粒子上に固定された、１次抗体（第１リガンド）および２次抗体（第２リガンド）に特異的に結合する第３リガンドとを有するナノ構造体を使用する。１次反応および２次反応を行ってサンドイッチ構造体を形成した後に、このナノ構造体を反応場に提供することで、ナノ構造体により、第２リガンド−第２リガンド間および第２リガンド−第１リガンド間を架橋させる。これにより、サンドイッチ構造体の解離を抑制することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１３−５３９０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１に記載の方法では、ナノ構造体の準備が煩雑であるという課題がある。すなわち、特許文献１に記載の方法では、第１リガンドおよび第２リガンドの種類に応じてこれらに特異的に結合しうる第３リガンドを準備しなければならない。また、この第３リガンドをナノ構造粒子に固定しなければならない。
【０００９】
本発明の目的は、リガンドおよびアナライトの解離をより容易に抑制し、高感度かつ高精度にアナライトを検出することができる検出方法および検出キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る検出方法は、支持体と、前記支持体の一方の表面上に固定された、アナライトに特異的に結合しうる第１リガンドとを含む検出デバイスを用いて、検体中のアナライトを検出する方法であって、検体を前記検出デバイスの前記支持体上に提供して、前記検体に含まれる前記アナライトを前記第１リガンドに結合させる工程と、アルデヒド基を有する有機化合物である架橋剤を前記支持体上に提供して、前記第１リガンドと前記アナライトとを架橋する工程と、を有する。
【００１１】
また、上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る検出キットは、検体中のアナライトを検出するための検出キットであって、支持体と、前記支持体の一方の表面上に固定された、アナライトに特異的に結合しうる第１リガンドとを含む検出デバイスと、アルデヒド基を有する有機化合物である架橋剤と、を有する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、リガンドとアナライトとの結合力が弱くても、リガンドとアナライトとが解離することを従来技術よりも容易に抑制し、高感度かつ高精度にアナライトを検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＳＰＦＳ装置の構成を示す模式図である。
【図２】図２は、ＳＰＦＳ装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。
【図３】図３は、本実施の形態に係る検出方法を説明するための模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の一実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。ここでは、本発明に係る検出方法を、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）に適用した例について説明する。
【００１５】
（ＳＰＦＳ装置および検出デバイスの構成）
図１は、ＳＰＦＳ装置２００の構成を示す模式図である。ＳＰＦＳ装置２００は、光照射部２１０、反射光検出部２２０、蛍光検出部２３０、送液部２４０、搬送部２５０および制御部２６０を有する。ＳＰＦＳ装置２００は、搬送部２５０のチップホルダー２５２に検出チップ（検出デバイス）１００を装着した状態で使用される。そこで、検出デバイス１００について先に説明し、その後にＳＰＦＳ装置２００の各構成要素について説明する。
【００１６】
検出デバイス（検出チップ）１００は、入射面１１１、成膜面１１２および出射面１１３を有するプリズム１１０と、成膜面１１２上に形成された金属膜（支持体）１２０と、金属膜１２０の一方の表面上に固定されている第１リガンド１３０（後述する図３参照）と、金属膜１２０上に配置された流路蓋１４０とを含む。第１リガンド１３０は、アナライト１０に特異的に結合しうる。なお、詳細については後述するが、検出デバイス１００は、蛍光物質２０で標識された第２リガンド１５０と、架橋剤１６０とともに使用される。
【００１７】
プリズム１１０は、蛍光物質２０を励起するための励起光αに対して透明な誘電体からなる。前述のとおり、プリズム１１０は、入射面１１１、成膜面１１２および出射面１１３を有する。入射面１１１は、励起光αをプリズム１１０の内部に入射させる。成膜面１１２上には、金属膜１２０が配置されている。プリズム１１０の内部に入射した励起光αは、金属膜１２０の裏面で反射されて反射光βとなる。より具体的には、励起光αは、プリズム１１０と金属膜１２０との界面（成膜面１１２）で反射されて反射光βとなる。出射面１１３は、反射光βをプリズム１１０の外部に出射させる。
【００１８】
プリズム１１０の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム１１０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面１１２であり、一方の脚に対応する面が入射面１１１であり、他方の脚に対応する面が出射面１１３である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面１１１と出射面１１３とが対称になり、励起光αのＳ波成分がプリズム１１０内に滞留しにくくなる。
【００１９】
入射面１１１は、励起光αが光源に戻らないように形成される。励起光αの光源がレーザーダイオードである場合、励起光αがレーザーダイオードに戻ると、レーザーダイオードの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまう。そこで、理想的な増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面１１１に垂直に入射しないように、入射面１１１の角度が設定される。本実施の形態では、入射面１１１と成膜面１１２との角度および成膜面１１２と出射面１１３との角度は、いずれも約８０°である。ここで、「共鳴角」とは、金属膜１２０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、出射面１１３から出射される反射光βの光量が最小となるときの、入射角を意味する。また、「増強角」とは、金属膜１２０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、検出デバイス１００の上方に放出される励起光αと同一波長の散乱光（以下「プラズモン散乱光」という）δの光量が最大となるときの、入射角を意味する。
【００２０】
なお、検出デバイス１００の設計により、共鳴角（およびその極近傍にある増強角）が概ね決まる。設計要素は、プリズム１１０の屈折率や、金属膜１２０の屈折率、金属膜１２０の膜厚、金属膜１２０の消衰係数、励起光αの波長などである。金属膜１２０上に固定されたアナライト１０によって共鳴角および増強角がシフトするが、その量は数度未満である。
【００２１】
プリズム１１０は、複屈折特性を少なからず有する。プリズム１１０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム１１０の材料は、好ましくは、屈折率が１.４〜１.６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。プリズム１１０の製造方法の例には、射出成形法が含まれる。
【００２２】
金属膜（支持体）１２０は、プリズム１１０の成膜面１１２上に配置されている。これにより、成膜面１１２に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜１２０中の自由電子との間で表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：以下「ＳＰＲ」と略記する）が生じ、金属膜１２０の表面上に局在場光（一般に「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる）を生じさせることができる。本実施の形態では、金属膜１２０は、成膜面１１２の全面に形成されている。
【００２３】
金属膜１２０の材料は、表面プラズモン共鳴を生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜１２０の材料の例には、金、銀、銅、アルミニウム、これらの合金が含まれる。本実施の形態では、金属膜１２０は、金薄膜である。金属膜１２０の形成方法は、特に限定されない。金属膜１２０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜１２０の厚みは、特に限定されないが、３０〜７０ｎｍの範囲内が好ましい。
【００２４】
第１リガンド１３０は、アナライト１０に特異的に結合することができる分子であり、金属膜１２０の一方の表面上に固定されている。これにより、アナライト１０と第１リガンド１３０とが互いに接触したときに、アナライト１０が第１リガンド１３０に固定される。第１リガンド１３０の種類は、アナライト１０に特異的に結合することができ、かつ架橋剤１６０により架橋されうるものであれば特に限定されない。第１リガンド１３０の例には、アナライト１０と相互作用を持つ親和性分子として、抗体や酵素、アビジン、ストレプトアビジンなどのタンパク質、アミノ酸、脂質、これらの修飾分子、およびこれらの複合体が含まれる。なお、乾燥による変性を防止する観点から、第１リガンド１３０は、検出デバイス１００の未使用時において保護層により保存されていてもよい。
【００２５】
第１リガンド１３０を金属膜１２０上に固定化する方法は、特に限定されない。たとえば、金属膜１２０の上に、第１リガンド１３０を結合させた自己組織化単分子膜（以下「ＳＡＭ」という）または高分子膜を形成すればよい。ＳＡＭの例には、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１１−ＳＨなどの置換脂肪族チオールで形成された膜が含まれる。高分子膜を構成する材料の例には、ポリエチレングリコールおよびＭＰＣポリマーが含まれる。また、第１リガンド１３０に結合可能な反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を有する高分子を金属膜１２０に固定化し、この高分子に第１リガンド１３０を結合させてもよい。
【００２６】
流路蓋１４０は、金属膜１２０上に配置されている。金属膜１２０がプリズム１１０の成膜面１１２の一部にのみ形成されている場合、流路蓋１４０は、成膜面１１２上に配置されていてもよい。本実施の形態では、流路蓋１４０は、金属膜１２０の上に配置されている。流路蓋１４０の裏面には、流路溝が形成されており、流路蓋１４０は、金属膜１２０（およびプリズム１１０）と共に、液体を収容し、かつ液体が流れる流路１４１を形成する。また、反応場は、流路１４１に露出するように配置されている。すなわち、金属膜１２０に固定化されている第１リガンド１３０も、流路１４１内に露出している。流路１４１の両端は、流路蓋１４０の上面に形成された不図示の注入口および排出口とそれぞれ接続されている。流路１４１内へ液体が提供されると、液体は第１リガンド１３０に接触する。
【００２７】
流路蓋１４０は、金属膜１２０上から放出される蛍光γおよびプラズモン散乱光δに対して透明な材料からなることが好ましい。流路蓋１４０の材料の例には、樹脂が含まれる。蛍光γおよびプラズモン散乱光δを外部に取り出す部分が蛍光γおよびプラズモン散乱光δに対して透明であれば、流路蓋１４０の他の部分は、不透明な材料で形成されていてもよい。流路蓋１４０は、例えば、両面テープや接着剤などによる接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜１２０またはプリズム１１０に接合されている。
【００２８】
なお、検出デバイス１００は、流路蓋１４０の代わりに、貫通孔を有する枠体と、枠体に積層される天板とを有していてもよい。この場合、流路１４１は、金属膜１２０が形成されたプリズム１１０に対して、枠体および天板をこの順で積層することで形成される。金属膜１２０の表面は、流路１４１の底面となる。枠体の貫通孔の内面は、流路１４１の側面となる。天板の一方の面（内側の面）は、流路１４１の天面となる。
【００２９】
なお、金属膜１２０の表面において、第１リガンド１３０が固定されている領域を反応場という。反応場では、後述のとおり、第１リガンド１３０およびアナライト１０の結合（１次反応）や、アナライト１０および第２リガンド１５０の結合（２次反応）、架橋剤１６０による第１リガンド１３０およびアナライト１０の架橋（架橋反応）などが行われる。
【００３０】
次に、アナライト１０を検出するためのＳＰＦＳ装置２００について説明する。前述のとおり、ＳＰＦＳ装置２００は、励起光照射部２１０、反射光検出部２２０、蛍光検出部２３０、送液部２４０、搬送部２５０および制御部２６０を有する。
【００３１】
励起光照射部２１０は、チップホルダー２５２に保持された検出デバイス１００のプリズム１１０の入射面１１１に向けて励起光αを照射する。より具体的には、励起光照射部２１０は、検出デバイス１００のプリズム１１０側から第１リガンド１３０が固定されている領域（反応場）に対応する金属膜１２０の裏面に、励起光αを全反射角度となるように出射する。ここで「励起光」とは、蛍光物質を直接または間接的に励起させる光である。たとえば、励起光αは、プリズム１１０を介して金属膜１２０にＳＰＲが生じる角度で照射されたときに、蛍光物質を励起させる局在場光を金属膜１２０の表面上に生じさせる光である。
【００３２】
励起光照射部２１０は、光源２１１、第１角度調整部２１２および光源制御部２１３を有する。励起光照射部２１０は、さらにコリメートレンズや励起光フィルターなどを有していてもよい。
【００３３】
光源２１１は、検出デバイス１００の金属膜１２０に向けて励起光αを出射する。光源２１１の種類は、特に限定されない。光源２１１の種類の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。本実施の形態では、光源２１１は、レーザーダイオードである。また、照射スポットのサイズとしては、例えば１ｍｍφ程度であることが好ましい。
【００３４】
第１角度調整部２１２は、プリズム１１０と金属膜１２０との界面（成膜面１１２）に対する励起光αの入射角を調整する。第１角度調整部２１２は、励起光αを金属膜１２０の所定の位置（第１リガンド１３０が配置されている領域に対応する金属膜１２０の裏側）に所定の入射角で照射させるために、励起光αの光軸とチップホルダーとを相対的に回転させる。本実施の形態では、第１角度調整部２１２は、光源２１１を励起光αの光軸と直交する軸を中心として回転させる。このとき、入射角を走査しても金属膜１２０（成膜面１１２）上での照射位置がほとんど移動しないように、回転軸の位置を設定する。たとえば、回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における２つの励起光αの光軸の交点近傍（成膜面１１２上の照射位置とプリズム１１０の入射面１１１との間）に設定することで、照射位置のズレを極小化することができる。
【００３５】
光源制御部２１３は、光源２１１を動作させる各種機器を制御して、光源２１１からの励起光αの出射を制御する。光源制御部２１３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００３６】
反射光検出部２２０は、共鳴角の測定などを行うために、検出デバイス１００への励起光αの照射によって生じた反射光βの光量を測定する。反射光検出部２２０は、第１受光センサー２２１、第２角度調整部２２２および第１センサー制御部２２３を含む。
【００３７】
第１受光センサー２２１は、反射光βが入射する位置に配置され、反射光βの光量を測定する。第１受光センサー２２１の種類は、特に限定されない。たとえば、第１受光センサー２２１は、フォトダイオード（ＰＤ）である。
【００３８】
第２角度調整部２２２は、金属膜１２０に対する励起光αの入射角に応じて、第２受光センサー２２１の位置（角度）を調整する。第２角度調整部２２２は、反射光βが第１受光センサー２２１に入射するように、第１受光センサー２２１とチップホルダー２５２とを相対的に回転させる。
【００３９】
第１センサー制御部２２３は、第１受光センサー２２１の出力値の検出や、検出した出力値による第１受光センサー２２１の感度の管理、適切な出力値を得るための第１受光センサー２２１の感度の変更、などを制御する。第１センサー制御部２２３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００４０】
蛍光検出部２３０は、励起光照射部２１０が金属膜１２０へ励起光αを照射したときに、アナライト１０を標識する蛍光物質２０から放出される蛍光γを検出する。蛍光検出部２３０は第１レンズ２３１、光学フィルター２３２、第２レンズ２３３、第２受光センサー２３４、第２センサー制御部２３５および位置切替機構２３６を有する。蛍光検出部２３０は、さらに集光レンズ群や開口絞り、蛍光フィルターなどを有していてもよい。
【００４１】
第１レンズ２３１は、例えば、集光レンズであり、金属膜１２０上から出射される光を集光する。第２レンズ２３３は、例えば、結像レンズであり、第１レンズ２３１で集光された光を第２受光センサー２３４の受光面に結像させる。両レンズの間の光路は、略平行な光路になっている。光学フィルター２３２は、両レンズの間に配置されている。
【００４２】
光学フィルター２３２は、蛍光成分のみを第２受光センサー２３４に導き、高いＳＮ比で蛍光γを検出するために、励起光成分（プラズモン散乱光δ）を除去する。光学フィルター２３２の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。光学フィルター２３２は、例えば、所定の光成分を反射する多層膜を含むフィルター、または所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターである。
【００４３】
第２受光センサー２３４は、金属膜１２０上に存在する蛍光物質２０から放出される蛍光γを検出して、金属膜１２０上の蛍光像を検出する。第２受光センサー２３４の種類は、特に限定されず、例えば、感度およびＳＮ比が高い光電子増倍管であり、アバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ）やフォトダイオード（ＰＤ）、ＣＣＤイメージセンサーなどであってもよい。
【００４４】
第２センサー制御部２３５は、第２受光センサー２３４の出力値の検出や、検出した出力値による第２受光センサー２３４の感度の管理、適切な出力値を得るための第２受光センサー２３４の感度の変更などを制御する。第２センサー制御部２３５は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００４５】
位置切替機構２３６は、光学フィルター２３２の位置を、蛍光検出部２３０における光路上または光路外に切り替える。具体的には、第２受光センサー２３４が蛍光γを検出するときには、光学フィルター２３２を蛍光検出部２３０における光路上に配置し、第２受光センサー２３４がプラズモン散乱光δを検出するときには、光学フィルター２３２を蛍光検出部２３０における光路外に配置する。
【００４６】
送液部２４０は、チップホルダー２５２に保持された検出デバイス１００の金属膜１２０上に、検体や第２リガンド１５０を含む溶液、架橋剤１６０を含む溶液、洗浄液などを供給する。また、送液部２４０は、検出デバイス１００の金属膜１２０上の液体を除去する。送液部２４０は、液体チップ２４１、シリンジポンプ２４２および送液ポンプ駆動機構２４３を含む。
【００４７】
液体チップ２４１は、検体や標識液、洗浄液などの液体を収容する容器である。液体チップ２４１としては、通常、複数の容器が液体の種類に応じて配置されるか、または複数の容器が一体化したチップが配置される。本実施の形態では、液体チップ２４１は、検体、第２リガンド１５０を含む溶液、架橋剤１６０を含む溶液および洗浄液（緩衝液）をそれぞれ収容する。
【００４８】
検体の例には、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液およびその希釈液が含まれる。アナライト１０の種類の例には、タンパク質（ポリペプチドやオリゴペプチドなど）、アミノ酸、脂質およびこれらの修飾分子が含まれる。たとえば、第１リガンド１３０が抗体の場合は、アナライト１０はその抗体に対する抗原である。第１リガンド１３０が特定のタンパク質の場合は、アナライト１０はそのタンパク質に対する抗体である。第１リガンド１３０が特定の基質に結合する酵素の場合は、アナライト１０はその基質である。第１リガンド１３０が特定の酵素により結合される基質である場合は、アナライト１０はその酵素である。第１リガンド１３０がアビジンまたはストレプトアビジンの場合は、アナライト１０はビオチンである。第１リガンド１３０がビオチンの場合は、アナライト１０はアビジンまたはストレプトアビジンである。
【００４９】
第２リガンド１５０は、蛍光物質２０で標識されており、アナライト１０に特異的に結合することができる。これにより、アナライト１０および第２リガンド１５０が互いに接触したときに、アナライト１０が第２リガンド１５０を介して蛍光物質２０により標識される。第２リガンド１５０の種類は、アナライト１０に特異的に結合することができるものであれば特に限定されないが、後述するように第２リガンド１５０のように、架橋剤１６０により架橋されうるものであることが好ましい。第２リガンド１５０の例には、抗体や酵素、レクチン、アビジン、ストレプトアビジンなどのタンパク質、アミノ酸、糖鎖、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸、脂質、これらの修飾分子、およびこれらの複合体が含まれる。第２リガンド１５０は、蛍光物質２０で標識されている点を除いては第１リガンド１３０と同じであってもよいし、異なっていてもよい。本実施の形態では第２リガンド１５０は、蛍光物質２０で標識されている点を除いては第１リガンド１３０と同じである。
【００５０】
第２リガンド１５０を蛍光標識する方法は、特に限定されない。第２リガンド１５０を蛍光標識するには、例えば、カルボキシル基を有する蛍光物質２０と、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドとを縮合剤（例えば、水溶性カルボジイミド）を用いて縮合反応させて、カルボキシル基を活性エステル化した後、当該蛍光物質２０と、アミノ基を有する第２リガンド１５０とを縮合剤を用いて縮合反応させればよい。または、イソチオシアネート基およびアミノ基をそれぞれ有する第２リガンド１５０および蛍光物質２０を反応させればよく、スルホニルハライド基およびアミノ基をそれぞれ有する第２リガンド１５０および蛍光物質２０を反応させてもよく、ヨードアセトアミド基およびチオール基をそれぞれ有する第２リガンド１５０および蛍光物質２０を反応させてもよく、ビオチン化された蛍光物質２０と、ストレプトアビジン化された第２リガンド１５０とを反応させてもよい。
【００５１】
架橋剤１６０は、少なくとも第１リガンド１３０およびアナライト１０を架橋する。架橋剤１６０は、アルデヒド基を有する有機化合物である。アナライト１０がタンパク質である場合、架橋剤１６０のアルデヒド基と、タンパク質の側鎖のアミノ基とが反応し、結合することで、第１リガンド１３０と、アナライト１０とを架橋することができる。また、架橋剤１６０は、第１リガンド１３０またはアナライト１０と、第２リガンド１５０とも架橋できることが好ましい。これにより、第１リガンド１３０からアナライト１０および／または第２リガンド１５０が解離して、蛍光物質２０が分散することを防ぐこともできる。架橋剤１６０の種類は、上記架橋反応を起こすことができれば特に限定されず、アナライト１０、第１リガンド１３０および第２リガンド１５０の種類に応じて適宜選択されうる。架橋剤１６０の種類の例には、ホルムアルデヒドやパラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなどが含まれる。また、架橋剤１６０が有するアルデヒド基の数も、上記架橋反応を起こすことができれば特に限定されない。上記の架橋剤１６０は、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００５２】
シリンジポンプ２４２は、シリンジ２４４と、シリンジ２４４内を往復動作可能なプランジャー２４５とによって構成される。プランジャー２４５の往復運動によって、液体の吸引および吐出が定量的に行われる。シリンジ２４４が交換可能であると、シリンジ２４４の洗浄が不要となる。このため、不純物の混入などを防止する観点から好ましい。シリンジ２４４が交換可能に構成されていない場合は、シリンジ２４４内を洗浄する構成をさらに付加することにより、シリンジ２４４を交換せずに使用することが可能となる。
【００５３】
送液ポンプ駆動機構２４３は、プランジャー２４５の駆動装置、およびシリンジポンプ２４２の移動装置を含む。シリンジポンプ２４２の駆動装置は、プランジャー２４５を往復運動させるための装置であり、例えば、ステッピングモーターを含む。ステッピングモーターを含む駆動装置は、シリンジポンプ２４２の送液量や送液速度を管理できるため、検出デバイス１００の残液量を管理する観点から好ましい。シリンジポンプ２４２の移動装置は、例えば、シリンジポンプ２４２を、シリンジ２４４の軸方向（例えば垂直方向）と、軸方向を横断する方向（例えば水平方向）との二方向に自在に動かす。シリンジポンプ２４２の移動装置は、例えば、ロボットアーム、２軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルによって構成される。
【００５４】
送液部２４０は、液体チップ１４１より各種液体を吸引し、検出デバイス１００の流路１４１内に供給する。このとき、プランジャー２４５を動かすことで、検出デバイス１００中の流路１４１内を液体が往復し、流路１４１内の液体が撹拌される。これにより、液体の濃度分布の均一化や、流路１４１内における反応（例えば、後述する１次反応、２次反応および架橋反応）の促進などを実現することができる。このような操作を行う観点から、検出デバイス１００の注入口は多層フィルムで保護されており、かつシリンジ２４４がこの多層フィルムを貫通した時に注入口を密閉できるように、検出デバイス１００およびシリンジ２４４が構成されていることが好ましい。
【００５５】
搬送部２５０は、検出デバイス１００を設置位置、検出位置または送液位置に搬送し、固定する。ここで「設置位置」とは、検出デバイス１００をＳＰＦＳ装置２００に設置するための位置である。また、「検出位置」とは、励起光照射部２１０が検出デバイス１００に励起光αを照射し、それに伴い発生する反射光β、蛍光γまたはプラズモン散乱光δを反射光検出部２２０または蛍光検出部２３０が検出する位置である。さらに、「送液位置」とは、送液部２４０が検出デバイス１００の流路１４１内に液体を供給するか、または検出デバイス１００の流路１４１内の液体を除去する位置である。搬送部２５０は、搬送ステージ２５１およびチップホルダー２５２を含む。チップホルダー２５２は、搬送ステージ２５１に固定されており、検出デバイス１００を着脱可能に保持する。チップホルダー２５２の形状は、検出デバイス１００を保持することができ、かつ励起光α、反射光β、蛍光γおよびプラズモン散乱光δの光路を妨げない形状である。たとえば、チップホルダー２５２には、励起光α、反射光β、蛍光γおよびプラズモン散乱光δが通過するための開口が設けられている。搬送ステージ２５１は、チップホルダー２５２を一方向およびその逆方向に移動させる。搬送ステージ２５１も、励起光α、反射光β、蛍光γおよびプラズモン散乱光δの光路を妨げない形状である。搬送ステージ２５１は、例えば、ステッピングモーターなどで駆動される。
【００５６】
制御部２６０は、第１角度調整部２１２、光源制御部２１３、第２角度調整部２２２、第１センサー制御部２２３、第２センサー制御部２３５、位置切替機構２３６および送液ポンプ駆動機構２４３の動作を制御する。また、制御部２６０は、蛍光検出部２３０からの出力信号（検出結果）を処理する処理部としても機能する。具体的には、処理部は、蛍光検出部２３０（第２受光センサー２３４）が検出した検出値に基づいて、アナライト１０の存在または量を示すシグナル値を算出する。制御部２６０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含み、ソフトウェアを実行するコンピュータである。
【００５７】
（アナライトの検出方法）
次に、ＳＰＦＳ装置２００の検出動作（本実施の形態に係る検出方法）について説明する。図２は、ＳＰＦＳ装置２００の動作手順の一例を示すフローチャートである。図３は、本実施の形態に係る検出方法を説明するための模式図である。
【００５８】
まず、検出の準備をする（工程Ｓ１０）。具体的には、検出デバイス１００を準備して、ＳＰＦＳ装置２００のチップホルダー２５２に設置する。また、検出デバイス１００の金属膜１２０上に保湿剤が存在する場合は、アナライト１０が適切に第１リガンド１３０に結合できるように、金属膜１２０上を洗浄して保湿剤を除去する。
【００５９】
次いで、検体を金属膜１２０上に提供してアナライト１０を第１リガンド１３０に結合させる（工程Ｓ２０）。具体的には、制御部２６０は、搬送ステージ２５１を操作して、検出デバイス１００を設置位置から送液位置に移動させる。この後、制御部２６０は、送液ポンプ駆動機構２４３を操作して、液体チップ２４１内の検体を金属膜１２０（流路１４１内の反応場）上に提供する。これにより、検体中のアナライト１０を第１リガンド１３０に接触させ、結合させることができる（１次反応）。
【００６０】
次いで、第２リガンド１５０をアナライト１０に結合させる（工程Ｓ３０）。具体的には、制御部２６０は、送液ポンプ駆動機構２４３を操作して、流路１４１内から検体を除去した後、液体チップ２４１内の第２リガンド１５０を含む溶液を金属膜１２０（流路１４１内の反応場）上に提供する。第２リガンド１５０は、蛍光物質２０で標識されており、アナライト１０に特異的に結合しうる。したがって、第２リガンド１５０を第１リガンドに結合しているアナライト１０に接触させ、結合させることができる。これにより、第２リガンド１５０を介してアナライト１０を蛍光物質２０で標識することができる（２次反応）。
【００６１】
なお、１次反応と２次反応の順番は、後述する架橋剤１６０を提供する工程（工程Ｓ４０）の前であれば、これに限定されない。たとえば、第２リガンド１５０をアナライト１０に結合させた後に、これらの複合体を含む液体を金属膜１２０上に提供してもよい。また、金属膜１２０上に検体と第２リガンド１５０を含有する溶液を同時に提供してもよい。
【００６２】
次いで、第１リガンド１３０、アナライト１０および第２リガンド１５０を架橋する（工程Ｓ４０）。具体的には、制御部２６０は、送液ポンプ駆動機構２４３を操作して、流路１４１内から第２リガンド１５０を含む溶液を除去した後、液体チップ２４１内の架橋剤１６０を含む溶液を金属膜１２０（流路１４１内の反応場）上に提供する。図３に示されるように、架橋剤１６０は、第１リガンド１３０、アナライト１０および第２リガンド１５０に非特異的に結合する。これにより、第１リガンド１３０およびアナライト１０を架橋することができる（架橋Ａ）。本実施の形態では、これと同時に、アナライト１０および第２リガンド１５０も架橋することができる（架橋Ｂ）。また、本実施の形態のように１次反応と２次反応とを行った後に架橋剤１６０を提供した場合には、さらに近隣の第１リガンド１３０相互（架橋Ｃ）、近隣のアナライト相互（架橋Ｄ）、あるいは近隣の第２リガンド１５０相互（架橋Ｅ）、ならびに第１リガンド１３０および第２リガンド１５０（架橋Ｆ）の一部も架橋することができ、好ましい。結果として、架橋剤１６０は、第１リガンド１３０とアナライト１０との解離およびアナライト１０と第２リガンド１５０との解離を抑制することができる。
【００６３】
次いで、アナライト１０を標識する蛍光物質２０から放出される蛍光γを検出する（工程Ｓ５０）。具体的には、制御部２６０は、送液ポンプ駆動機構２４３を操作して、流路１４１内から架橋剤１６０を含む溶液を除去する。この後、制御部２６０は、励起光照射部２１０を操作して第１リガンド１３０が固定された領域（反応場）に対応する金属膜１２０の裏面にＳＰＲが生じるように励起光αを照射するとともに、第２受光センサー２３４の検出値を記録する。このとき、制御部２６０は、第１角度調整部２１２を操作して、励起光αの入射角を増強角に設定する。また、制御部２６０は、位置切替機構２３６を制御して、光学フィルター２３２を蛍光検出部２３０における光路内に配置する。これにより、制御部（処理部）２６０は、検体中のアナライト１０の量を示す蛍光γの光量を得る。
【００６４】
最後に、アナライト１０の存在または量を示すシグナル値を算出する（工程Ｓ６０）。具体的には、制御部（処理部）２６０は、第２受光センサー２３４の検出値と、あらかじめ作成しておいた検量線とを比較してアナライト１０の存在または量を示すシグナル値を算出する。
【００６５】
以上の手順により、第１リガンド１３０とアナライト１０との解離およびアナライト１０と第２リガンド１５０との解離を抑制しつつ、検体に含まれるアナライト１０の存在または量を高感度かつ高精度で検出することができる。
【００６６】
なお、本実施の形態に係る検出方法では、第２リガンド１５０をアナライト１０に結合させる工程（工程Ｓ３０）の前に、必要に応じて増強角の測定を行ってもよい。具体的には、制御部２６０は、励起光照射部２１０および第１角度調整部２１２を操作して励起光αを第１リガンド１３０が固定された領域（反応場）に対応する金属膜１２０の裏面に照射しながら、金属膜１２０に対する励起光αの入射角（例えば７１°±３°）を走査する。また、制御部２６０は、蛍光検出部２３０を操作して第２受光センサー２３４が金属膜１２０の近傍から放出されるプラズモン散乱光δを検出する。これにより、制御部２６０は、励起光αの入射角と、プラズモン散乱光δの強度との関係を含むデータを得る。そして、制御部２６０は、データを解析して、プラズモン散乱光δの強度が最大となる入射角（増強角；本実施の形態では７１°）を決定する。
【００６７】
また、本実施の形態に係る検出方法では、第２リガンド１５０をアナライト１０に結合させる工程（工程Ｓ３０）の前に、必要に応じて光学ブランク値の測定を行ってもよい。ここで「光学ブランク値」とは、蛍光γの測定（工程Ｓ５０）において検出デバイス１００の上方に放出される背景光の光量を意味する。具体的には、制御部２６０は、蛍光検出部２３０を操作して、金属膜１２０に励起光αを照射するとともに、第２受光センサー２３４の出力値（光学ブランク値）を記録する。このとき、制御部２６０は、第１角度調整部２１２を操作して、励起光αの入射角を増強角に設定する。また、制御部２６０は、位置切替機構２３６を制御して、光学フィルター２３２を蛍光検出部２３０における光路内に配置する。
【００６８】
（効果）
以上のとおり、本実施の形態に係る検出方法では、架橋剤１６０として、アルデヒド基を有する有機化合物を準備しておけばよく、従来の検出方法のように、第１リガンド１３０および第２リガンド１５０の種類に応じたナノ構造体をあらかじめ準備しておく必要がない。したがって、本実施の形態に係る検出方法では、より容易に第１リガンド１３０とアナライト１０との解離およびアナライト１０と第２リガンド１５０との解離を抑制することができ、アナライト１０を高感度かつ高精度に検出することができる。
【００６９】
また、本実施の形態に係る検出方法では、架橋によって第１リガンド１３０とアナライト１０との解離を抑制するため、第１リガンド１３０とアナライト１０との結合力が弱くても、適切に第１リガンド１３０とアナライト１０との解離を抑制することができる。
【００７０】
なお、上記の検出デバイス１００および架橋剤１６０は、アナライト１０を検出するための検出キットとして使用されうる。このとき、第２リガンド１５０および架橋剤１６０は、溶液として別々の容器に収容された状態で検出キットを構成する。なお、検出キットは、さらに検量線作成用の標準物質や取扱説明書などのアナライト１０の検出に必要な器材を有していてもよい。これにより、ユーザーは、当該検出キットを使用してアナライト１０の検出を容易に、好感度かつ高精度に行うことができる。
【００７１】
また、本実施の形態では、ＰＣ−ＳＰＦＳを利用した検出方法について説明したが、本発明に係る検出方法は、これに限定されず、ＧＣ−ＳＰＦＳを利用してもよい。この場合、プリズム１１０は不要であり、金属膜１２０は回折格子を含む。第１リガンド１３０は、回折格子上に配置される。また、励起光照射部２１０および蛍光検出部２３０は、検出デバイス１００の金属膜１２０側において、励起光αの光軸と金属膜１２０との交点を通り、かつ金属膜１２０の表面に対する法線を挟むように互いに配置される。蛍光γの検出（工程Ｓ５０）では、回折格子に向けて励起光αを照射する。
【００７２】
また、本実施の形態では、ＳＰＦＳを利用した検出方法について説明したが、本発明に係る検出方法は、これに限定されない。たとえば、本発明に係る検出方法では、ＳＰＲ法を利用してもよい。この場合、蛍光γの検出の代わりに反射光βを検出する。したがって、２次反応（工程Ｓ３０）は、不要である。また、検出装置は、蛍光検出部を有さず、反射光検出部２２０（第１受光センサー２２１）が反射光βを検出する。この場合は、アナライト１０と第２リガンド１５０とを結合させないため、架橋剤は、第１リガンド１３０とアナライト１０とを架橋する。このように第２リガンド１５０を使用しない場合も、架橋剤により第１リガンド１３０とアナライト１０とを架橋することで、第１リガンド１３０とアナライト１０との解離を抑制することができ、アナライト１０を高感度かつ高精度で検出することができる。
【００７３】
また、本実施の形態では、第２リガンド１５０の標識物質として蛍光物質２０を使用したが、本発明に係る検出方法および検出キットは、これに限定されない。例えば、第２リガンドの標識物質として、酵素を使用してもよい（例えばＥＬＩＳＡ）。この場合、蛍光γの検出の代わりに、酵素および酵素基質による呈色を確認すればよい。したがって、蛍光γの検出（工程Ｓ５０）およびシグナル値の算出（工程Ｓ６０）は、不要である。また、プリズム１１０および金属膜１２０は、不要である。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明に係る検出方法および検出キットは、アナライトを高い信頼性で検出することができるため、例えば疾患の検査などに有用である。
【符号の説明】
【００７５】
１０  アナライト
２０  蛍光物質
１００  検出デバイス
１１０  プリズム
１１１  入射面
１１２  成膜面
１１３  出射面
１２０  金属膜
１３０  第１リガンド
１４０  流路蓋
１４１  流路
１５０  第２リガンド
１６０  架橋剤
２００  表面プラズモン増強蛍光測定装置（ＳＰＦＳ装置）
２１０  励起光照射部
２１１  光源
２１２  第１角度調整部
２１３  光源制御部
２２０  反射光検出部
２２１  第１受光センサー
２２２  第２角度調整部
２２３  第１センサー制御部
２３０  蛍光検出部
２３１  第１レンズ
２３２  光学フィルター
２３３  第２レンズ
２３４  第２受光センサー
２３５  第２センサー制御部
２３６  位置切替機構
２４０  送液部
２４１  液体チップ
２４２  シリンジポンプ
２４３  送液ポンプ駆動機構
２４４  シリンジ
２４５  プランジャー
２５０  搬送部
２５１  搬送ステージ
２５２  チップホルダー
２６０  制御部（処理部）
α  励起光
β  反射光
γ  蛍光
δ  プラズモン散乱光
Ａ〜Ｆ  架橋
【図１】
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【図２】
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【図３】
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