(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料核酸を受容するように、かつ終止を利用した合成時配列決定法（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｐｒｏｃｅｓｓ）で前記試料核酸を処理するように構成される配列決定機器から、観察または測定された核酸配列決定データを受信する段階と、
Ｎ番目のヌクレオチドフロー中にＫ番目の塩基に存在する活性分子及び不活性分子の可能な分子状態及び状態遷移を模擬するための模擬フレームワークを用いて候補塩基配列のセットの各候補配列の予測シグナルを決定することにより前記観察または測定された核酸配列決定データに関して前記候補塩基配列のセットを生成する段階であって、ここで、Ｋ及びＮはそれぞれ、塩基及びヌクレオチドフローに関連する指標を示し、前記可能な状態遷移を模擬するための前記模擬フレームワークが、推定繰越率（ＣＦＲ）、推定不完全伸長率（ＩＥＲ）、推定垂下率（ＤＲ）、推定再活性化分子率（ＲＭＲ）、及び推定終止失敗率（ＴＦＲ）を組み込み、前記ＲＭＲが０以上であり、前記ＴＦＲが１未満である、段階と、
どの配列が前記観察または測定された核酸配列決定データともっとも一致するかを決定することにより、前記候補塩基配列のセットから、ソルバー関数の最適化をもたらす１つの候補配列を、前記試料核酸の配列に対応するものであると特定する段階と
を含む、核酸配列決定のための方法。
【請求項２】
前記模擬フレームワークが、
（ｉ）第１のセットの状態遷移係数を用いて、活性状態のままであるかまたは活性になり、かつフローＮにおいて塩基Ｋを組み込まない、活性状態にある分子の割合、
（ｉｉ）第２のセットの状態遷移係数を用いて、活性状態のままであり、かつフローＮにおいて塩基Ｋを組み込む、活性状態にある分子の割合
をモデル化することによって、前記Ｋ番目の塩基が前記Ｎ番目のヌクレオチドフローと適合する状況に関して可能な状態遷移を模擬する段階を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のセットの状態遷移係数が、状態遷移係数［１−ＴＦＲ］、状態遷移係数［ＴＦＲ］、状態遷移係数［ＲＭＲ］、及び状態遷移係数［（ＩＥＲ×（１−ＤＲ））］を含み、フローＮにおいて塩基Ｋを組み込まなかった活性分子を示す出力Ｑ３が、式
Ｑ３＝Ｑ１×［１−ＴＦＲ］＋（Ｑ１×［ＴＦＲ］＋Ｑ２＋Ｑ６×［ＲＭＲ］）×［ＩＥＲ×（１−ＤＲ）］
に基づいて決定され、式中、Ｑ１、Ｑ２、及びＱ６が入力であり、
Ｑ１が、フローＮにおいて塩基Ｋ−１を組み込んだ活性分子を示し、
Ｑ２が、フローＮ−１において塩基Ｋを組み込まなかった活性分子を示し、かつ
Ｑ６が、Ｎ−１回のフローにおいてＫ−１個の塩基を組み込んでいる不活性分子を示し、
前記第２のセットの状態遷移係数が、状態遷移係数［ＴＦＲ］、状態遷移係数［ＲＭＲ］、及び状態遷移係数［（１−ＩＥＲ）×（１−ＤＲ）］を含み、フローＮにおいて塩基Ｋを組み込んだ分子を示す出力Ｑ４が、式
Ｑ４＝（Ｑ１×［ＴＦＲ］＋Ｑ２＋Ｑ６×［ＲＭＲ］）×［（１−ＩＥＲ）×（１−ＤＲ）］
に基づいて決定され、式中、Ｑ１、Ｑ２、及びＱ６が入力であり、
Ｑ１が、フローＮにおいて塩基Ｋ−１を組み込んだ活性分子を示し、
Ｑ２が、フローＮ−１において塩基Ｋを組み込まなかった活性分子を示し、かつ
Ｑ６が、Ｎ−１回のフローにおいてＫ−１個の塩基を組み込んでいる不活性分子を示す、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記模擬フレームワークが、
（ｉ）第１のセットの状態遷移係数を用いて、活性状態のままであるかまたは活性になり、かつフローＮにおいて塩基Ｋを組み込まない、活性状態にある分子の割合、
（ｉｉ）第２のセットの状態遷移係数を用いて、活性状態のままであり、かつフローＮにおいて塩基Ｋを組み込む、活性状態にある分子の割合
をモデル化することによって、前記Ｋ番目の塩基が前記Ｎ番目のヌクレオチドフローと適合しない状況に関して可能な状態遷移を模擬する段階を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のセットの状態遷移係数が、状態遷移係数［１−ＴＦＲ］、状態遷移係数［ＴＦＲ］、状態遷移係数［ＲＭＲ］、及び状態遷移係数［（１−ＣＦＲＭ）＋（ＣＦＲＭ×ＩＥＲ×（１−ＤＲ））］を含み、フローＮにおいて塩基Ｋを組み込まなかった活性分子を示す出力Ｑ３が、式
Ｑ３＝Ｑ１×［１−ＴＦＲ］＋（Ｑ１×［ＴＦＲ］＋Ｑ２＋Ｑ６×［ＲＭＲ］）×［（１−ＣＦＲＭ）＋（ＣＦＲＭ×ＩＥＲ×（１−ＤＲ））］
に基づいて決定され、式中、Ｑ１、Ｑ２、及びＱ６が入力であり、
Ｑ１が、フローＮにおいて塩基Ｋ−１を組み込んだ活性分子を示し、
Ｑ２が、フローＮ−１において塩基Ｋを組み込まなかった活性分子を示し、かつ
Ｑ６が、Ｎ−１回のフローにおいてＫ−１個の塩基を組み込んでいる不活性分子を示し、
前記第２のセットの状態遷移係数が、状態遷移係数［ＴＦＲ］、状態遷移係数［ＲＭＲ］、及び状態遷移係数［ＣＦＲＭ×（１−ＩＥＲ）×（１−ＤＲ）］を含み、フローＮにおいて塩基Ｋを組み込んだ分子を示す出力Ｑ４が、式
Ｑ４＝（Ｑ１×［ＴＦＲ］＋Ｑ２＋Ｑ６×［ＲＭＲ］）×［ＣＦＲＭ×（１−ＩＥＲ）×（１−ＤＲ）］
に基づいて決定され、式中、Ｑ１、Ｑ２、及びＱ６が入力であり、
Ｑ１が、フローＮにおいて塩基Ｋ−１を組み込んだ活性分子を示し、
Ｑ２が、フローＮ−１において塩基Ｋを組み込まなかった活性分子を示し、かつ
Ｑ６が、Ｎ−１回のフローにおいてＫ−１個の塩基を組み込んでいる不活性分子を示し、
Ｍが、（Ｎ−Ｍ）番目のフローがＫ番目の塩基と適合するような最小数である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記終止を利用した合成時配列決定法が、前記試料核酸に沿ったプライマー伸長を可逆的に終止させるために可逆的ターミネーターを利用した可逆的終止配列決定を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記可逆的ターミネーターが、前記可逆的ターミネーターのペントースの３'−ヒドロキシル基の酸素原子に結合した保護基を有する３'−Ｏ−保護化可逆的ターミネーターを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記可逆的ターミネーターが、保護されていない３'−ヒドロキシル基を有する３'−非保護化可逆的ターミネーター及び塩基に結合した可逆的終止基を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記終止を利用した合成時配列決定法が、前記試料核酸に沿ったプライマー伸長を不可逆的に終止させるために不可逆的ターミネーターを利用した不可逆的終止配列決定を含み、前記可能な状態遷移を模擬するための前記模擬フレームワークが、推定不活性化分子率（ＩＭＲ）をさらに組み込む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
試料核酸、終止基を有する少なくとも１つのヌクレオチド、プライマー、及びポリメラーゼを受容するように、かつ終止を利用した合成時配列決定法で前記試料核酸を処理して核酸配列決定生データを生成するように構成される配列決定機器と、
前記核酸配列決定生データを受信するように、かつＮ番目のヌクレオチドフロー中にＫ番目の塩基に存在する活性分子及び不活性分子の可能な分子状態及び状態遷移を模擬するための模擬フレームワークを用いて候補塩基配列のセットの各候補配列のための予測シグナルを決定することにより試料核酸の前記候補塩基配列のセットを生成するように構成される処理装置と
を備え、ここで、Ｋ及びＮはそれぞれ、塩基及びヌクレオチドフローと関連する指標を示し、前記可能な状態遷移を模擬するための前記模擬フレームワークが、推定繰越率（ＣＦＲ）、推定不完全伸長率（ＩＥＲ）、推定垂下率（ＤＲ）、推定再活性化分子率（ＲＭＲ）、及び推定終止失敗率（ＴＦＲ）を組み込み、前記ＲＭＲが０以上の値であり、前記ＴＦＲが１未満の値であり、前記処理装置が、どの配列が前記観察または測定された核酸配列決定データともっとも一致するかを決定することにより、前記候補塩基配列のセットから、ソルバー関数の最適化をもたらす１つの候補配列を、前記試料核酸の配列に対応するものであると特定するようにさらに構成される、核酸配列決定システム。
【請求項１１】
前記ＲＭＲの値が０であり、前記ＴＦＲの値が０である、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
前記配列決定機器への、前記試料核酸、終止基を有する前記少なくとも１つのヌクレオチド、前記プライマー、及び前記ポリメラーゼのフローのタイミング及び量を制御するように構成されるフロー制御装置をさらに備える、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのヌクレオチドが、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、及びｄｄＴＴＰの形態の２'，３'ジデオキシヌクレオチドを含み、前記フロー制御装置が、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、及びｄｄＴＴＰの混合物を、同時に前記配列決定機器内に流すように構成される、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのヌクレオチドが、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、及びｄｄＴＴＰの形態の２'，３'ジデオキシヌクレオチドを含み、前記フロー制御装置が、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、及びｄｄＴＴＰの各々を、一度に１つずつ前記配列決定機器内に流すように構成される、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１５】
前記配列決定機器が、前記試料核酸に相補的な核酸鎖の合成の間の重合中に放出される水素イオンを検出するように構成されるイオン半導体配列決定装置を備える、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１６】
機械可読メモリと、
機械可読命令を実行するように構成される処理装置と
を備える装置であって、前記命令が実行されると、前記装置に、
試料核酸を受容するように、かつ終止を利用した合成時配列決定法で前記試料核酸を処理するように構成される配列決定機器から、観察または測定された核酸配列決定データを受信させることと、
Ｎ番目のヌクレオチドフロー中にＫ番目の塩基に存在する活性分子及び不活性分子の可能な分子状態及び状態遷移を模擬するための模擬フレームワークを用いて候補塩基配列のセットの各候補配列の予測シグナルを決定することにより前記観察または測定された核酸配列決定データに関して前記候補塩基配列のセットを生成させることであって、ここで、Ｋ及びＮはそれぞれ、塩基及びヌクレオチドフローに関連する指標を示し、前記可能な状態遷移を模擬するための前記模擬フレームワークが、推定繰越率（ＣＦＲ）、推定不完全伸長率（ＩＥＲ）、推定垂下率（ＤＲ）、推定再活性化分子率（ＲＭＲ）、及び推定終止失敗率（ＴＦＲ）を組み込み、前記ＲＭＲが０以上であり、前記ＴＦＲが１未満である、ことと、
どの配列が前記観察または測定された核酸配列決定データともっとも一致するかを決定することにより、前記候補塩基配列のセットから、ソルバー関数の最適化をもたらす１つの候補配列を、前記試料核酸の配列に対応するものであると特定させることと
を行わせる、装置。
【請求項１７】
前記ＴＦＲが０である、請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
前記可能な状態遷移を模擬するための前記模擬フレームワークが、推定不活性化分子率（ＩＭＲ）をさらに組み込む、請求項１６に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１３年１０月４日出願の米国仮出願第６１／８８６，８７８号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本出願は、概して、核酸配列決定のための方法、システム、及びコンピュータ可読媒体に関し、より具体的には、核酸配列決定における整相効果をモデル化するための方法、システム、及びコンピュータ可読媒体に関する。
【背景技術】
【０００３】
核酸分子内のヌクレオチドの順序が決定される核酸配列決定は、生物学的研究、遺伝子検査等の多岐にわたる医療用途において、広く普及している。そのような用途に利用される配列決定法の一つの種類は、核酸鎖中のヌクレオチドの順序が、対応する鎖を合成することによって決定される、合成時配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）である。合成時配列決定が、多くの現在のプラットフォームにおいて使用される高処理量方法である一方で、その使用に関連するいくつかの欠点がある。例えば、合成時配列決定プラットフォームは、所与の核酸鎖中のヌクレオチドの順序を決定するために、後で処理されなければならない多量の配列決定データを生成する。さらに、これらの方法によって得られる配列決定データは、正確な塩基呼び出しを行うための能力を妨害する位相同期の喪失（すなわち、同一鋳型の同期合成の喪失）等の様々な誤差を含み得る。したがって、これらの問題に対処し、合成時配列決定プラットフォームを介して得られる多量の配列決定データのさらに正確かつ効率的な処理を可能にするシステム及び方法に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００４】
本開示の例示的実施形態は、上述の問題のうちの１つ以上を解決し得、かつ／または上述の望ましい特徴のうちの１つ以上を示し得る。他の特徴及び／または利点は、以下の説明から明らかになり得る。
【０００５】
少なくとも１つの例示的実施形態に従って、核酸配列決定のための方法は、試料核酸を受容するように、かつ終止を利用した合成時配列決定法（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｐｒｏｃｅｓｓ）で試料核酸を処理するように構成される配列決定機器から、観察または測定された核酸配列決定データを受信することを含む。本方法は、Ｎ番目のヌクレオチドフロー中にＫ番目の塩基に存在する活性分子及び不活性分子の可能な状態遷移を模擬するための模擬フレームワークを用いて候補配列の予測シグナルを決定することにより観察または測定された核酸配列決定データに関して候補塩基配列のセットを生成することも含み、ここで、Ｋ及びＮはそれぞれ、塩基及びヌクレオチドフローに関連する指標を示す。可能な状態遷移を模擬するための模擬フレームワークは、推定繰越率（ＣＦＲ）、推定不完全伸長率（ＩＥＲ）、推定垂下率（ＤＲ）、推定再活性化分子率（ＲＭＲ）、及び推定終止失敗率（ＴＦＲ）を組み込み、ＲＭＲは、０以上であり、ＴＦＲは、１未満である。本方法は、該候補塩基配列のセットから、ソルバー関数の最適化をもたらす１つの候補配列を、試料核酸の配列に対応するものであると特定することをさらに含む。
【０００６】
少なくとも１つの例示的実施形態に従って、核酸配列決定システムは、試料核酸、終止基を有する少なくとも１つのヌクレオチド、プライマー、及びポリメラーゼを受容するように、かつ終止を利用した合成時配列決定法で試料核酸を処理して核酸配列決定生データを生成するように構成される配列決定機器を含む。処理装置は、核酸配列決定生データを受信するように、かつＮ番目のヌクレオチドフロー中にＫ番目の塩基に存在する活性分子及び不活性分子の可能な状態遷移を模擬するための模擬フレームワークを用いて候補配列のための予測シグナルを決定することにより試料核酸の候補塩基配列のセットを生成するように構成され、ここで、Ｋ及びＮはそれぞれ、塩基及びヌクレオチドフローと関連する指標を示す。可能な状態遷移を模擬するための模擬フレームワークは、推定繰越率（ＣＦＲ）、推定不完全伸長率（ＩＥＲ）、推定垂下率（ＤＲ）、推定再活性化分子率（ＲＭＲ）、及び推定終止失敗率（ＴＦＲ）を組み込み、ＲＭＲは、０以上の値であり、ＴＦＲは、１未満の値である。
【０００７】
少なくとも１つの例示的実施形態に従って、本装置は、機械可読メモリと、機械可読命令を実行するように構成される処理装置とを備え、命令が実行されると、装置に、試料核酸を受容するように、かつ終止を利用した合成時配列決定法で試料核酸を処理するように構成される配列決定機器から、観察または測定された核酸配列決定データを受信させることと、Ｎ番目のヌクレオチドフロー中にＫ番目の塩基に存在する活性分子及び不活性分子の可能な状態遷移を模擬するための模擬フレームワークを用いて候補配列の予測シグナルを決定することにより観察または測定された核酸配列決定データに関して候補塩基配列のセットを生成させることと、を行わせ、ここで、Ｋ及びＮはそれぞれ、塩基及びヌクレオチドフローに関連する指標を示す。可能な状態遷移を模擬するための模擬フレームワークは、推定繰越率（ＣＦＲ）、推定不完全伸長率（ＩＥＲ）、推定垂下率（ＤＲ）、推定再活性化分子率（ＲＭＲ）、及び推定終止失敗率（ＴＦＲ）を組み込み、ＲＭＲは、０以上であり、ＴＦＲは、１未満である。
【０００８】
[本発明1001]
試料核酸を受容するように、かつ終止を利用した合成時配列決定法（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｐｒｏｃｅｓｓ）で前記試料核酸を処理するように構成される配列決定機器から、観察または測定された核酸配列決定データを受信する段階と、
Ｎ番目のヌクレオチドフロー中にＫ番目の塩基に存在する活性分子及び不活性分子の可能な状態遷移を模擬するための模擬フレームワークを用いて候補配列の予測シグナルを決定することにより前記観察または測定された核酸配列決定データに関して候補塩基配列のセットを生成する段階であって、ここで、Ｋ及びＮはそれぞれ、塩基及びヌクレオチドフローに関連する指標を示し、前記可能な状態遷移を模擬するための前記模擬フレームワークが、推定繰越率（ＣＦＲ）、推定不完全伸長率（ＩＥＲ）、推定垂下率（ＤＲ）、推定再活性化分子率（ＲＭＲ）、及び推定終止失敗率（ＴＦＲ）を組み込み、前記ＲＭＲが0以上であり、前記ＴＦＲが1未満である、段階と、
前記候補塩基配列のセットから、ソルバー関数の最適化をもたらす1つの候補配列を、前記試料核酸の配列に対応するものであると特定する段階と
を含む、核酸配列決定のための方法。
[本発明1002]
前記模擬フレームワークが、
（ｉ）第1のセットの状態遷移係数を用いて、活性のままであるかまたは活性になり、かつフローＮにおいて塩基Ｋを組み込まない分子の割合、
（ｉｉ）第2のセットの状態遷移係数を用いて、活性のままであり、かつフローＮにおいて塩基Ｋを組み込む分子の割合
をモデル化することによって、前記Ｋ番目の塩基が前記Ｎ番目のヌクレオチドフローと適合する状況に関して可能な状態遷移を模擬する段階を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記第1のセットの状態遷移係数が、状態遷移係数［1−ＴＦＲ］、状態遷移係数［ＴＦＲ］、状態遷移係数［ＲＭＲ］、及び状態遷移係数［（ＩＥＲ×（1−ＤＲ））］を含み、
前記第2のセットの状態遷移係数が、状態遷移係数［ＴＦＲ］、状態遷移係数［ＲＭＲ］、及び状態遷移係数［（1−ＩＥＲ）×（1−ＤＲ）］を含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記模擬フレームワークが、
（ｉ）第1のセットの状態遷移係数を用いて、活性のままであるかまたは活性になり、かつフローＮにおいて塩基Ｋを組み込まない分子の割合、
（ｉｉ）第2のセットの状態遷移係数を用いて、活性のままであり、かつフローＮにおいて塩基Ｋを組み込む分子の割合
をモデル化することによって、前記Ｋ番目の塩基が前記Ｎ番目のヌクレオチドフローと適合しない状況に関して可能な状態遷移を模擬する段階を含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記第1のセットの状態遷移係数が、状態遷移係数［1−ＴＦＲ］、状態遷移係数［ＴＦＲ］、状態遷移係数［ＲＭＲ］、及び状態遷移係数［（1−ＣＦＲＭ）＋（ＣＦＲＭｘＩＥＲ×（1−ＤＲ））］を含み、
前記第2のセットの状態遷移係数が、状態遷移係数［ＴＦＲ］、状態遷移係数［ＲＭＲ］、及び状態遷移係数［ＣＦＲＭ×（1−ＩＥＲ）×（1−ＤＲ）］を含み、
Ｍが、（Ｎ−Ｍ）番目のフローがＫ番目の塩基と適合するような最小数である、本発明1004の方法。
[本発明1006]
前記終止を利用した合成時配列決定法が、前記試料核酸に沿ったプライマー伸長を可逆的に終止させるために可逆的ターミネーターを利用した可逆的終止配列決定を含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記可逆的ターミネーターが、前記可逆的ターミネーターのペントースの3'−ヒドロキシル基の酸素原子に結合した保護基を有する3'−Ｏ−保護化可逆的ターミネーターを含む、本発明1006の方法。
[本発明1008]
前記可逆的ターミネーターが、保護されていない3'−ヒドロキシル基を有する3'−非保護化可逆的ターミネーター及び塩基に結合した可逆的終止基を含む、本発明1006の方法。
[本発明1009]
前記終止を利用した合成時配列決定法が、前記試料核酸に沿ったプライマー伸長を可逆的に終止させるために不可逆的ターミネーターを利用した不可逆的終止配列決定を含み、前記可能な状態遷移を模擬するための前記模擬フレームワークが、推定不活性化分子率（ＩＭＲ）をさらに組み込む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
試料核酸、終止基を有する少なくとも1つのヌクレオチド、プライマー、及びポリメラーゼを受容するように、かつ終止を利用した合成時配列決定法で前記試料核酸を処理して核酸配列決定生データを生成するように構成される配列決定機器と、
前記核酸配列決定生データを受信するように、かつＮ番目のヌクレオチドフロー中にＫ番目の塩基に存在する活性分子及び不活性分子の可能な状態遷移を模擬するための模擬フレームワークを用いて候補配列のための予測シグナルを決定することにより試料核酸の候補塩基配列のセットを生成するように構成される処理装置と
を備え、ここで、Ｋ及びＮはそれぞれ、塩基及びヌクレオチドフローと関連する指標を示し、前記可能な状態遷移を模擬するための前記模擬フレームワークが、推定繰越率（ＣＦＲ）、推定不完全伸長率（ＩＥＲ）、推定垂下率（ＤＲ）、推定再活性化分子率（ＲＭＲ）、及び推定終止失敗率（ＴＦＲ）を組み込み、前記ＲＭＲが0以上の値であり、前記ＴＦＲが1未満の値である、核酸配列決定システム。
[本発明1011]
前記ＲＭＲの値が0であり、前記ＴＦＲの値が0である、本発明1010のシステム。
[本発明1012]
前記処理装置が、前記候補塩基配列のセットから、ソルバー関数の最適化をもたらす1つの候補配列を、前記試料核酸の正しい配列に対応するものであると特定するようにさらに構成される、本発明1010のシステム。
[本発明1013]
前記配列決定機器への、前記試料核酸、終止基を有する前記少なくとも1つのヌクレオチド、前記プライマー、及び前記ポリメラーゼのフローのタイミング及び量を制御するように構成されるフロー制御装置をさらに備える、本発明1010のシステム。
[本発明1014]
前記少なくとも1つのヌクレオチドが、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、及びｄｄＴＴＰの形態の2'，3'ジデオキシヌクレオチドを含み、前記フロー制御装置が、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、及びｄｄＴＴＰの混合物を、同時に前記配列決定機器内に流すように構成される、本発明1013のシステム。
[本発明1015]
前記少なくとも1つのヌクレオチドが、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、及びｄｄＴＴＰの形態の2'，3'ジデオキシヌクレオチドを含み、前記フロー制御装置が、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、及びｄｄＴＴＰの各々を、一度に1つずつ前記配列決定機器内に流すように構成される、本発明1013のシステム。
[本発明1016]
前記配列決定機器が、前記試料核酸に相補的な核酸鎖の合成の間の重合中に放出される水素イオンを検出するように構成されるイオン半導体配列決定装置を備える、本発明1013のシステム。
[本発明1017]
機械可読メモリと、
機械可読命令を実行するように構成される処理装置と
を備える装置であって、前記命令が実行されると、前記装置に、
試料核酸を受容するように、かつ終止を利用した合成時配列決定法で前記試料核酸を処理するように構成される配列決定機器から、観察または測定された核酸配列決定データを受信させることと、
Ｎ番目のヌクレオチドフロー中にＫ番目の塩基に存在する活性分子及び不活性分子の可能な状態遷移を模擬するための模擬フレームワークを用いて候補配列の予測シグナルを決定することにより前記観察または測定された核酸配列決定データに関して候補塩基配列のセットを生成させることと
を行わせ、ここで、Ｋ及びＮはそれぞれ、塩基及びヌクレオチドフローに関連する指標を示し、前記可能な状態遷移を模擬するための前記模擬フレームワークが、推定繰越率（ＣＦＲ）、推定不完全伸長率（ＩＥＲ）、推定垂下率（ＤＲ）、推定再活性化分子率（ＲＭＲ）、及び推定終止失敗率（ＴＦＲ）を組み込み、前記ＲＭＲが0以上であり、前記ＴＦＲが1未満である、装置。
[本発明1018]
前記処理装置が、機械可読命令を実行するようにさらに構成され、前記命令が実行されると、前記装置に、前記候補塩基配列のセットから、ソルバー関数の最適化をもたらす1つの候補配列を、前記試料核酸の正しい配列決定と対応するものであると特定させる、本発明1017の装置。
[本発明1019]
前記ＴＦＲが0である、本発明1017の装置。
[本発明1020]
前記可能な状態遷移を模擬するための前記模擬フレームワークが、推定不活性化分子率（ＩＭＲ）をさらに組み込む、本発明1017の装置。
追加の目的、特徴、及び／または利点は、続く説明の部分及び説明から明白になるであろう部分に記載されるか、または本開示及び／または特許請求の実施によって理解され得る。これらの目的及び利点の内の少なくともいくつかは、添付の特許請求において具体的に指摘される要素及び組み合わせによって、理解及び実現され得る。
【０００９】
前述の概説及び以下の詳述の両方は、例示的かつ説明的なものにすぎず、特許請求を限定するものではなく、むしろ、特許請求が、等価物を含む範囲のこれら全容の権利を有すべきであることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
本開示は、以下の詳述から、単独でまたは添付の図面と併せて理解され得る。これらの図面は、本開示のさらなる理解を提供するために含まれ、本明細書に組み込まれ、かつその一部を構成する。これらの図面は、本教示の１つ以上の例示的実施形態を例示し、説明と一緒になって特定の原理及び操作を説明する役目を果たす。
【００１１】
【図１】本開示の実施形態に従う、合成時配列決定システムを例示する概略図である。
【図２】本開示の実施形態に従う、核酸配列の特定方法を例示する流れ図である。
【図３】本開示の実施形態に従う、予測イオノグラムを算出するための模擬フレームワークの概略図である。
【図４】本開示の実施形態に従う、可能な状態及び状態遷移と併せて、図３の模擬フレームワーク内のセルの例を例示する。
【図５】本開示の他の実施形態に従う、可能な状態及び状態遷移と併せて、図３の模擬フレームワーク内のセルの例を例示する。
【図６】本開示の実施形態に従う、予測イオノグラムを算出するための模擬フレームワークの簡略化した概略図を例示する。
【図７】本開示の実施形態に従う、可能な状態及び状態遷移と併せて、図６の模擬フレームワーク内のセルの例を例示する。
【図８】本開示の実施形態に従う、予測イオノグラムを算出するための模擬フレームワークの簡略化した概略図を例示する。
【図９】本開示の実施形態に従う、可能な状態及び状態遷移と併せて、図８の模擬フレームワーク内のセルの例を例示する。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｄは、本開示の実施形態に従う、低ノイズレベルのための標準的整相及びターミネーター整相の模擬比較を例示する。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｄは、本開示の実施形態に従う、中ノイズレベルのための標準的整相及びターミネーター整相の模擬比較を例示する。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｄは、本開示の実施形態に従う、高ノイズレベルのための標準的整相及びターミネーター整相の模擬比較を例示する。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｈは、本開示の実施形態に従う、終止化学を利用した合成時配列決定法での０．５％の不完全伸長率の模擬結果を例示する。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｈは、本開示の実施形態に従う、終止化学を利用した合成時配列決定法での１．５％の不完全伸長率の模擬結果を例示する。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｈは、本開示の実施形態に従う、終止化学を利用した合成時配列決定法での２．５％の不完全伸長率の模擬結果を例示する。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｈは、本開示の実施形態に従う、終止化学を利用した合成時配列決定法での３．５％の不完全伸長率の模擬結果を例示する。
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｈは、本開示の実施形態に従う、終止化学を利用した合成時配列決定法での４．５％の不完全伸長率の模擬結果を例示する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
詳細な説明
例示的実施形態を例示する本説明及び属する図面は、限定するものとして解釈されるべきではない。等価物を含む本説明及び特許請求の範囲から逸脱することなく、種々の機械的、組成的、構造的、電気的、及び操作的変更が行われ得る。そのような場合において、周知の構造及び技法は、本開示を不明瞭にしないように、示されていないか、または詳述されていない。２つ以上の図中の類似番号は、同じまたは類似の要素を表す。さらに、一実施形態に関連して詳述される要素及びこれらの関連する特徴は、実用的である場合は常に、これらが具体的に示されないか記載されていない他の実施形態に含まれてもよい。例えば、要素が一実施形態に関連して詳述され、第２の実施形態に関連して記載されていない場合、その要素は、それでもなお第２の実施形態に含まれると主張され得る。
【００１３】
本明細書及び添付の特許請求の目的上、別段の表示がない限り、量、パーセント、または比率を表すすべての数字、及び明細書及び特許請求で使用される他の数値は、すべての事例において、「約」という用語によって、これらがまだあまり改良されていない程度において、改良されているとして理解される。したがって、特に反対の指示の無い限り、以下の本明細書及び添付される特許請求の範囲において示される数値的なパラメータは、得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、特許請求の範囲への均等論の適用を制限する試みとしてではなく、各数値的なパラメータは、少なくとも、報告される有意の桁数の観点から、かつ通常の端数処理方法を適用することによって解釈されるべきである。
【００１４】
本明細書及び添付の特許請求において使用する場合、単数形の「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」ならびに任意の単語の任意の単数使用は、明示的かつ明白に一指示対象に限定されない限り、複数の参照を含むことに留意する。本明細書において使用する場合、用語「含む」及びその文法的異形は、リスト内の項目の列挙が、列挙される項目と置換または項目に追加され得る他の類似した項目を除外しないような、非限定的であることが意図される。
【００１５】
種々の例示的実施形態に従って、本開示は、終止化学を利用する合成時配列決定法で配列決定誤差を生じ得る整相効果の存在によって損なわれ得る核酸配列決定データを、処理及び／または分析することにより、塩基呼び出しをすることを含む試料核酸配列の評価のためのシステム、方法、及びコンピュータ可読媒体を企図する。例えば、いくつかの実施形態において、試料核酸中の塩基の配列決定を特定する配列決定問題への解決法は、整相モデル下で算出した予測した一組の値と、例えば、配列決定機器を用いた実験を介して得た測定した一組の値との間の距離を、（例えば、最小二乗フィットフレームワークを介して）最小化することにより見出すことができる。いくつかの実施形態において、最小化問題への解決策は、ツリー型解法で可能な配列を検索または詳しく考察することによって特定され得る。このように、本開示の種々の例示的実施形態は、そのような整相効果を取り除くか訂正する必要性なしに、１つ以上の整相効果を考慮にいれることにより、塩基呼び出しが行われることを可能にすることができる。
【００１６】
種々の例示的実施形態において、終止を利用した合成時配列決定法に生じる１つ以上の整相効果は、整相モデルへの入力として推定及び提供されるパラメータとして捕捉される。パラメータは、配列決定される核酸分子の同一鋳型間の同期合成に起因して起こる様々な整相誤差を説明するために、選択されてもよい。例えば、整相モデルは、不完全伸長、繰越、垂下、再活性化分子、終止失敗、及び／または不活性化分子のためのパラメータを組み込んでもよい。このように、種々の例示的実施形態は、終止化学を利用した合成時配列決定法に存在する１つ以上の整相効果に起因して不正確な塩基が呼び出される可能性を、低減または排除することができる。種々の例示的実施形態のこれらの特徴及び他の特徴は、図面に関連して以下に詳述される。
【００１７】
図１は、試料核酸中に存在するヌクレオチドの順序を決定し得る、核酸配列決定システム１０を例示する。ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって結合される天然デオキシリボヌクレオチド（例えば、ＤＮＡのデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、及びデオキシチミジン、またはＲＮＡのこれらのリボース対応物）を含んでもよい。しかしながら、それらは、例えば、修飾された塩基、糖、またはヌクレオチド間結合を含む非天然ヌクレオチド類似体も含んでもよい。例示的な実施例において、ポリヌクレオチドは、「ＡＴＧＣＣＴＧ」等の文字列（大文字または小文字）によって表すことができ、別段の表示がないか、文脈から明らかでない限り、ヌクレオチドは、左から右の５′→３′の順番であり、「Ａ」は、デオキシアデノシンを示し、「Ｃ」は、デオキシシチジンを示し、「Ｇ」は、デオキシグアノシンを示し、「Ｔ」は、デオキシチミジンを示し、「Ｉ」は、デオキシイノシンを示し、「Ｕ」は、デオキシウリジンを示すことが理解されるであろう。
【００１８】
核酸配列決定システム１０は、分析及び／または処理のための配列決定機器１４からの核酸配列決定データを受信する制御及び処理システム１２を含む。配列決定機器１４は、終止化学を用いて合成時配列決定法を実施するように構成される（「終止を利用した合成時配列決定」）。本明細書において使用する場合、用語「終止を利用した合成時配列決定」は、任意の種類の終止化学を使用するすべての合成時配列決定法を包含する。例えば、終止を利用した合成時配列決定には、核酸複製が、２'，３'ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）（例えば、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ）を含む化学変化したｄＮＴＰ（例えば、化学変化したｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及び／またはｄＴＴＰ）等の１つ以上のターミネーターの反応混合物内への組み込みを介して、可逆的または不可逆的に段階的に終止する合成時配列決定法が挙げられるが、これに限定されない。
【００１９】
１つ以上の物質１６は、フロー制御装置１８の制御の下で種々の濃度で提供される。例示される実施形態において、物質には、核酸ポリメラーゼ２０、核酸プライマー２２、核酸鋳型２４、デオキシロボヌクレオチド（ｄｅｏｘｙｒｏｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（ｄＮＴＰ（複数可））（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）２６、及び２'，３'ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）（例えば、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ）２８が挙げられるが、以下に詳述されるとおり、例えば、所与の用途のために提供される物質１６は、実装例特有の考慮すべき事項に応じて変化してもよい。
【００２０】
制御及び処理システム１２の例示される実施形態は、様々な他のシステムの構成要素との通信を可能にするための、処理装置３２が接続される内部バス３０を含む。制御及び処理システム１２は、処理装置３２によって実行される命令を格納するためのバス３０と接合される、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、または他の動的メモリも含む。ＲＡＭ３４は、処理装置３２によって実行される命令の実行中に、一時変数または他の中間情報を格納するのにも使用されてもよい。さらに、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）３６、または他の静的記憶装置が、処理装置３２のための静的情報及び命令を格納するために提供される。制御及び処理システム１２は、情報または命令を格納するための磁気ディスク、光ディスク、または半導体ドライブ（ＳＳＤ）等の記憶装置３８も含んでもよい。記憶装置３８は、メディアドライブ及び取り外し可能な記憶インターフェースを含んでもよい。メディアドライブは、ハードディスクドライブ、フロッピーディスクドライブ、磁気テープドライブ、光ディスクドライブ、ＣＤもしくはＤＶＤドライブ（ＲもしくはＲＷ）、フラッシュドライブ、または他の取り外し可能なメディアドライブもしくは固定メディアドライブ等の、固定記憶媒体または取り外し可能な記憶媒体を支援するための、ドライブまたは他の機構を含んでもよい。記憶装置３８は、特定のコンピュータソフトウェア、命令、またはデータをコンピュータ可読記憶媒体に記憶したコンピュータ可読記憶媒体をさらに含んでもよい。
【００２１】
制御及び処理システム１２は、ソフトウェア及び／またはデータが、計算システム制御及び処理システム１２と１つ以上の外部デバイスとの間を転送されることを可能にする、通信インターフェース４０も含んでもよい。通信インターフェース４０の例には、モデム、（イーサネットまたは他のＮＩＣカード等の）ネットワークインターフェース、（例えば、ＵＳＢポート、ＲＳ−２３２Ｃシリアルポート等の）通信ポート、ＰＣＭＣＩＡスロット及びＰＣＭＣＩＡカード、ブルートゥース等が挙げられる。ソフトウェア及び通信インターフェース４０を介して転送されるデータは、通信インターフェース４０によって受信され得る、電子信号、電磁信号、光信号または他のシグナルであり得るシグナルの形態でもよい。これらのシグナルは、無線媒体、ワイヤもしくはケーブル、光ファイバー、または他の通信媒体等のチャネルを介して、通信インターフェース４０によって、送信及び受信されてもよい。
【００２２】
１つ以上の制御入力４２は、通信インターフェース４０を介して処理装置３２と通信されてもよい。制御入力４２は、キーボード、タッチスクリーン入力能力とともに構成されるＬＣＤディスプレイ等の対話型ディスプレイ、マウス等のカーソル制御等の、１つ以上の入力デバイスを介して、提供されてもよい。さらに、処理装置３２は、バス３０を介して、利用者に情報を表示するためのブラウン管（ＣＲＴ）または液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）等のディスプレイ４４にも接合されてもよい。
【００２３】
核酸配列決定システムの操作中、配列決定機器１４は、終止を利用した合成時配列決定法を実行し、それにより配列決定操作で合成されている核酸鎖内への１つ以上のヌクレオチド組み込みを示す組み込みシグナルに対応する生データを生成する。さらに、上述のとおり、例示される核酸配列決定システム１０において、核酸ポリメラーゼ２０、核酸プライマー２２、配列決定される核酸鋳型２４、ｄＮＴＰ（複数可）２６、及びｄｄＮＴＰ（複数可）２８が、終止を利用した合成時配列決定法での使用のための配列決定機器１４への入力として提供される。しかしながら、当業者によって理解されるとおり、配列決定機器１４に提供される反応物の特定の種類、混合物、及びタイミングは、使用される合成時配列決定方法の種類、使用される終止化学の種類、利用可能な撮像プラットフォームまたは感知プラットフォーム等の様々な実装例特有の考慮すべき事項に応じて変化するであろう。したがって、図１に示される物質１６は、配列決定機器へ提供され得た反応物の種類の非限定的例である。
【００２４】
種々の例示的な実施形態において、配列決定機器１４に提供されるターミネーターは、プライマー伸長を終止させるのに好適な様々なクラスのターミネーターのいずれかを含んでもよい。例えば、好適なターミネーターには、３'ヒドロキシルが欠如し、それ故に、３'位のヒドロキシルの代わりの水素が理由で核の複製を中断する、ｄｄＮＴＰ等の不可逆的ターミネーターが挙げられる。追加の例として、可逆的ターミネーターもまた、利用されてもよい。そのようなターミネーターは、３'−Ｏ−保護化可逆的ターミネーター及び３'−非保護化可逆的ターミネーターを含んでもよい。好適な３'−Ｏ−保護化可逆的ターミネーターは、ペントースの３'ヒドロキシルの酸素原子に結合した終止基を含んでもよい。３'−ＯＮＨ２可逆的ターミネーター、３'−Ｏ−アリル可逆的ターミネーター、及び３'−Ｏ−アジドメチ（ａｚｉｄｏｍｅｔｈｙ）可逆的ターミネーターを含むが、これらに限定されない、この種類のいくつかの市販されているターミネーターが、異なる実装例で利用されてもよい。好適な３'−非保護化可逆的ターミネーターには、無傷の３'ヒドロキシル基及びプライマー伸長の終止のために塩基に結合した終止基が挙げられる。「バーチャルターミネーター」という名の３'−ＯＨ非保護化可逆的ターミネーター、及びヒドロキシメチル化核酸塩基に結合した終止用２−ニトロベンジル部分を有する「Ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ（商標）」と呼ばれる３'−ＯＨ非保護化ヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されないこの種類のいくつかの市販されているターミネーターが、異なる実装例において利用されてもよい。
【００２５】
選択されるターミネーターの種類に応じて、配列決定機器１４によって実施されるプロセスにおける使用のために選択される特定のポリメラーゼ２０は、変化してもよい。すなわち、核酸配列決定のために選択されるヌクレオチド類似体の種類は、最適な効率を生じるであろうＤＮＡポリメラーゼ２０の種類に影響を与え得る。例えば、一実施形態において、Ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ（商標）が、ターミネーターとしての使用のために選択されてもよく、Ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ（商標）と一緒に使用するために開発されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＤＮＡポリメラーゼが、効率を最適化するために利用されてもよい。
【００２６】
さらに、選択される合成時配列決定法の種類及び用いられる終止化学の種類に応じて、ｄＮＴＰ２６及び／またはｄｄＮＴＰ２８の順序及び混合物は、フロー制御装置１８によって変更されてもよい。例えば、サンガー配列決定法が配列決定機器１４によって行われることが選択された場合、４つの独立した配列決定反応が行われ得、各々が、４つの種類のｄｄＮＴＰのうちの１つ及び他の３つのｄＮＴＰを含む（例えば、１つの反応は、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰの他に、ｄｄＡＴＰを含むであろう）。さらなる例として、ダイ終止配列決定法が、配列決定機器１４によって使用されることが選択された場合、フロー制御装置１８が、ｄｄＮＴＰ２８（すなわち、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ）の４つすべてを含む反応を制御してもよく、各々が、異なる色蛍光マーカーと結合され、例えば、蛍光系撮像システムを介する特定を可能にする。
【００２７】
一例示的実施例に従って、配列決定機器１４は、電子または電荷系核酸終止を利用した合成時配列決定を、実施するように構成されてもよい。終止化学を使用する電子または電荷系配列決定（例えば、ｐＨ系配列決定）を利用するような実施形態において、ヌクレオチド組み込み事象から生成された組み込みシグナルは、ポリメラーゼ触媒によるヌクレオチド伸長反応の天然副生成物として生成されるイオン（例えば、水素イオン）を検出することにより、決定され得る。これは、例えば、目的の核酸配列の断片であり得、かつ、粒子、微小粒子、ビーズ等の固体支持体にクローン集団として直接または間接的に結合し得る、試料核酸または鋳型核酸を配列決定するのに使用されてもよい。試料または鋳型核酸２４は、プライマー２２及びポリメラーゼ２０と機能的に関連されてもよい。鋳型核酸２４は、ターミネーター及び洗浄の、反復周期または（ヌクレオチド組み込みが、組み込みシグナルの対応する生成で生じ得ることから、本明細書で「ヌクレオチドフロー」と称され得る）「フロー」に供されてもよい。一実施形態において、利用されるターミネーターは、Ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ（商標）のうちの１つでもよく、ポリメラーゼは、ＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒＩＩＩ等のＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＤＮＡポリメラーゼのうちの１つでもよい。
【００２８】
プライマー２２は、例えば、鋳型内の次の塩基に相補的なｄｄＮＴＰ２８が添加されるたびに、プライマーの３′末端が、ポリメラーゼによって伸長され得るように、試料または鋳型２４にアニールされてもよい。次いで、ヌクレオチドフローの既知の配列及び各ヌクレオチドフロー中に測定された組み込みシグナルに基づき、反応チャンバ内に存在する試料核酸２４と関連するヌクレオチド（複数可）の種類、配列及び数の固有性が決定され得る。
【００２９】
ヌクレオチドフローの配列は、ヌクレオチドフローの短い規定の周期の連続した反復からなる周期的反復様式（例えば、例えば「ＡＣＴＧ  ＡＣＴＧ．．．」等の、４つのヌクレオチドフローの規定の配列の連続した反復）に基づいてもよいか、ヌクレオチドフローのいくつかの他の様式（２０１２年１０月１８日に公開されたＨｕｂｂｅｌｌらの米国特許出願公開第２０１２／０２６４６２１号に論じられるか、企図される種々のヌクレオチドフロー順序のいずれか等）に全体的または部分的に基づいてもよいか、または、これらのいくつかの組み合わせにも基づいてよい。
【００３０】
一実施形態において、各反応が４つの異なるｄｄＮＴＰに対して一度に１つずつ曝露されるように、４つの異なる種類のｄｄＮＴＰが、反応チャンバに連続して添加される。例示的な実施例において、４つの異なる種類のｄｄＮＴＰは、以下の順番：ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ等で添加され、各曝露後には、洗浄ステップが続く。ｄｄＮＴＰへの各曝露と、続く洗浄ステップは、「ヌクレオチドフロー」と見なされ得る。４つの連続したヌクレオチドフローは、「周期」と見なされ得る。例えば、２周期ヌクレオチドフローの順序は、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰによって表されることができ、各曝露後には、洗浄ステップが続く。上述のターミネーターのうちの１つ以上を利用する終止化学を使用するある特定の実施形態において、各ヌクレオチドフローは、プライマー伸長が終止する前に単一のヌクレオチド組み込みをもたらし得る。
【００３１】
図２は、ＤＮＡ鋳型の核酸配列を特定するための方法５０の実施形態を例示する。方法５０は、配列決定操作を介して得られた測定または観察されたデータの形態の生データを受信する（ブロック５２）ことを含む。例えば、生データは、終止を利用した合成時配列決定法を行った後に、配列決定機器１４から制御及び処理システム１２の処理装置３２によって受信され得る。処理装置３２は、ブロック５２で受信された生データを塩基呼び出しへと変換し、試料核酸鋳型と関連する連続した塩基呼び出しを読み取りへとコンパイルするように構成されるソルバーを含んでもよく、各塩基呼び出しは、特定のヌクレオチド特定（例えば、ｄＡＴＰ（「Ａ」）、ｄＣＴＰ（「Ｃ」）、ｄＧＴＰ（「Ｇ」）、ｄＴＴＰ（「Ｔ」））を指す。
【００３２】
この生データを塩基呼び出しに変換するために、終止を利用した合成時配列決定法で起こり得る整相効果をモデル化し、生データを処理または分析し塩基呼び出しを決定する際に、そのような整相効果が考慮に入れられることを可能にするために、整相モデルが生成されてもよい。そのためには、例示される実施形態において、６つのパラメータのうちの１つ以上の推定値が、ブロック５４、５６、５８、６０、６２、及び６４で推定されてもよい。具体的には、方法５０が繰越率（ＣＦＲ）の推定値を得ることを含むことができる（ブロック５４）。ＣＦＲは、プラスのフレームシフトを包含し、核酸コピーが所与のフロー周期でフローするものとは異なるヌクレオチドを組み込む率に対応するパラメータであり得る。
【００３３】
方法５０は、不完全伸長率（ＩＥＲ）の推定値を得ることも含むことができる（ブロック５６）。ＩＥＲは、マイナスのフレームシフトを包含し、核酸コピーがフロー周期中に伸長することに失敗した率に対応するパラメータであり得る。方法５０は、活性化核酸コピーが周期中に不活性になる率に対応する垂下率（ＤＲ）の推定値を得ることをさらに含むことができる（ブロック５８）。活性から不活性への遷移は、例えば、終止基の不完全な除去またはポリメラーゼ不活性化に起因して起こり得る。
【００３４】
さらに、方法５０は、再活性化分子率（ＲＭＲ）の推定値を得ることを含むことができる（ブロック６０）。ＲＭＲは、不活性核酸コピーが、意図されるよりも後の時点で再活性化する率に対応する。このパラメータは、終止基が前に無傷のままで残され、後ほど除去される事例を包含してもよい。さらに、方法５０は、終止失敗率（ＴＦＲ）の推定値を得ることを含むことができる（ブロック６２）。ＴＦＲは、プライマー伸長の終止が無効であったことに起因して整相誤差が起こる率に対応する。例えば、３'−非保護化可逆的ターミネーターを使用する実施形態において、ポリメラーゼが３'ヒドロキシル基を認識することを終止基が妨害できず、それ故に追加のヌクレオチドが組み込まれる率を、ＴＦＲは含んでもよい。ＴＦＲは、上に詳述される他の種類のターミネーターが、プライマー伸長を終止させることに失敗した率、及び所与のポリメラーゼが、３'位の終止基を判別することに失敗し、それ故に、追加のヌクレオチドを組み込む率も含んでもよい。
【００３５】
さらに、方法５０は、不活性化分子率（ＩＭＲ）の推定値を得ることを含むことができる（ブロック６４）。ＩＭＲは、核酸コピーが塩基を組み込んだ後、及び対応する組み込みシグナルが検出された後に不活性になる率に対応する。そのような不活性化は、例えば、不可逆的ターミネーターの使用に起因して、または、可逆的ターミネーターが使用された際の、転換後の終止の全体的な失敗に起因して起こり得る。
【００３６】
これらの推定値が６つの特定されたパラメータまたは実装例に応じて用いられる６つのパラメータのうちの１つ以上のサブセットに対して得られると、方法５０は、活性分子及び不活性分子の可能な分子状態遷移を各フロー及び塩基で模擬すること（ブロック６６）と、生成された配列セットのどの配列が、ソルバー関数を最適化するかを特定すること（ブロック６８）により、候補配列のセットを生成することを含む。
【００３７】
例えば、一実施形態において、ソルバーは、いくつかの観察または測定された生データといくつかの意味でもっとも一致する配列の、可能な塩基配列のセットまたは候補塩基配列のセットから、効率的に解決するか、または決定する機能を備えた、ソフトウェアツールまたはアプリケーションとして構成されてもよい。可能な配列または候補配列は、推定パラメータを組み込む１つ以上の予測モデル下でそのような配列に対して予期されるデータを予測し、予測データが、いくつかの距離基準下で、観察されたデータからどれだけ「近いか」を決定することにより、評価されてもよい。
【００３８】
これを例示するために、Ｙが、観察または測定されたデータ（例えば、例えば観察または測定されたイオノグラムもしくはフローグラム等の値または他の配列決定値のベクトル）であるとし、Ｘが、予測したデータ（例えば、予測イオノグラムまたはフローグラム等の値のベクトル）であるとし、Ａが、可能な核酸もしくは塩基配列のセットまたは候補核酸もしくは塩基配列のセット（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴの可能な配列を含むセット、もっとも明らかな長さを有するＡ、Ｃ、Ｇ、及びＴの可能な配列を含むセット、または任意の他のサブセットの候補）であるとし、Ｐが、１つ以上の予測モデルによって使用されるパラメータのセット（例えば、不完全伸長、繰越、垂下、再活性化分子、終止失敗率、不活性化率のパラメータのうちの１つ以上）であるとする。この場合、ある実施形態において、ソルバーは、以下のように、Ａセットから１つ以上の試料核酸、「最良の」候補配列Ａ＊を含むいくつかの規定の空間または反応閉じ込め領域を決定する関数ｆであると考えられてもよく、
Ａ＊＝ｆ（Y，X（Ａ，Ｐ））＝ａｒｇＡ，Ｐ  ｍｉｎ  Ｄ（Ｙ−Ｘ（Ａ，Ｐ））
式中
ａｒｇｘ，ｙ  ｍｉｎ  ｆ（ｘ，ｙ）
は、関数ｆ（ｘ、ｙ）を一般に最小化するであろうｘ及びｙの値（または値（複数））を概して示し、式中、Ｄ（ｙ−ｘ）は、ｙとｘとの間の「距離」のいくつかの関数を示す（例えば、例えば二乗距離またはベクトル間の距離の任意の他の測定したものの合計）。
【００３９】
そのようなソルバーは、原則としてＡセット中の配列の可能な組み合わせ及びＰセット中のパラメータの値を原則として考慮し、配列の最適な組み合わせ及びパラメータ値を特定し得る。もちろん、そのような徹底的な調査は、計算コストが高く、潜在的に非常に時間がかかり得る。実際問題として、調査は、有利にサブセットの配列及びサブセットのパラメータの候補値に限定され得る。ある実施形態において、調査は、最適化とは別にパラメータ推定を実施し、（例えば、図２のブロック５４、５６、５８、６０、６２、及び６４に見られるように）、プロセスを２段階に分けることにより、促進され得る。例えば、第１のステップにおいて、パラメータが推定されてもよく、第２のステップにおいて、パラメータ推定が、ソルバー問題への入力として確定されかつ供給される場合に処理されてもよく、これは次いで以下のとおり再び公式化され、
Ａ＊＝ｆ（Y，X，Ａ，Ｐ）＝ａｒｇＡ  ｍｉｎ  Ｄ（Ｙ−Ｘ（Ａ｜Ｐ））
式中、Ｘ（Ａ｜Ｐ）は、いくつかの確定されたパラメータＰがある場合のＡの関数としてＸを示す。
【００４０】
一実施形態において、例えば、Ｐが最初の５つのパラメータ（例えば、それぞれ、ＩＥＲ、ＣＦＲ、ＤＲ、ＲＭＲ、及びＴＦＲとして表される、不完全伸長率、繰越率、垂下率、再活性化分子率、及び終止失敗率）を含む場合、最適な配列Ａ＊は、以下のとおり見出され得る：まず、ＩＥＲ、ＣＦＲ、ＤＲ、ＲＭＲ、及びＴＦＲの推定値は、任意の好適な方法を用いて得ることができる。参照は、２０１１年１０月２７日出願のＤａｖｅｙらの米国特許第８，６６６，６７８号へ、かつ２０１３年８月１５日出願のＤａｖｅｙらの米国公開第２０１４／００５１５８４号に照会され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、ＩＥＲ、ＣＦＲ、及びＤＲの推定のための例示的技法を開示し、当業者は、例えば、開示の技法を使用して、ＲＭＲ、ＴＦＲ、及び／またはＩＭＲも推定することにより、追加のパラメータ推定を提供するために、そのような技法がどのようにして適用され得るかを理解する。さらに、いくつかの実施形態において、パラメータのうちの１つ以上が、動的プログラミングマトリックス内の各セル（例えば、後述のマトリックス７０、１２０、及び／または１３０内の各セル）について別個に推定されてもよく、それにより所与のマトリックスのセル全体に推定パラメータの変動をもたらす。別の実施形態において、パラメータのうちの１つ以上が、動的プログラミングマトリックス内の所与の行の固定された推定値で設定されてもよい一方で、マトリックスの異なる列内の残りのパラメータのうちの１つ以上が、セル間で異なる。実際には、マトリックスのセルの各々のパラメータ推定は、所与の実装例に応じて様々な好適な様式で変化してもよい。
【００４１】
次に、Ａ＊は、以下を解くことにより見出すことができ、
Ａ＊＝ａｒｇＡ  ｍｉｎ  Ｄ（Ｙ−Ｘ（Ａ｜ＩＥＲ，ＣＦＲ，ＤＲ，ＲＭＲ，ＴＦＲ））
式中、Ｘ（Ａ｜Ｐ）は、いくつかの確定されたパラメータＰ（例えば、この例においてＩＥＲ、ＣＦＲ、ＤＲ、ＲＭＲ、及びＴＦＲ）がある場合のＡの関数としてＸを示す。任意の好適な最適化方法は、ツリー型解法等を用いて、この問題を解決するのに使用されてもよい。また、前述の方法は、上述の６つのパラメータの異なる数または組み合わせを用いて適用され得、上記の５つは、一つの非限定的な例示的実例であると理解されるべきであることに留意されたい。
【００４２】
実際には、いくつかの実施形態において、６つの開示されるパラメータのサブセットが利用されてもよい。例えば、一実施形態において、ＩＥＲ、ＣＦＲ、及びＤＲの３つのパラメータが、終止を利用した合成時配列決定法で利用されてもよい。別の実施形態において、４つのパラメータが、例えば、ＩＥＲ、ＣＦＲ、ＤＲ、及びＲＭＲを０に設定したＴＦＲと組み合わせて、あるいはＩＥＲ、ＣＦＲ、ＤＲ、またはＴＦＲを、０に設定したＲＭＲと組み合わせて利用されてもよい。しかしながら、他の実施形態において、先の５つのパラメータは、ＲＭＲ及びＴＦＲが両方ともに０より大きい値に設定されているが、ＴＦＲが１未満であるモデルに組み込まれてもよい。不可逆的ターミネーターが利用されるさらに別の実施形態では、ＩＥＲ、ＣＦＲ、ＤＲ、ＴＦＲ、ＲＭＲ、及びＩＭＲを含む６つすべての開示のパラメータを組み込んでもよい。実際には、本明細書に提供されるパラメータモデルの可能な置換は、種々の例示的実施形態に従う整相モデルが、終止化学を利用しないプラットフォームを含む様々な配列決定プラットフォームにわたって、適用可能になることを可能にする。例えば、終止化学が使用されない一実施形態において、上述の５つのパラメータモデルは、さらに以下に詳述されるとおり、ＲＭＲを０に、かつＴＦＲを１に設定することにより、３つのパラメータモデルに納めてもよい。
【００４３】
図３〜９は、予測イオノグラムを算出するのに利用され得る、模擬フレームワーク及びマトリックスの例示的実施形態を例示する。所与の用途に選択される特定の模擬フレームワーク及びマトリックスは、合成時配列決定法に利用される終止化学の種類等の様々な実装例特有の考慮すべき事項及び要因に依存し得る。例えば、図３及び４はそれぞれ、模擬フレームワーク及びマトリックスを例示し、これらは、例えば上述の可逆的ターミネーターを利用する、終止を利用した合成時配列決定法において、予測イオノグラムを算出するのに利用され得る。さらなる例として、図３及び５はそれぞれ、模擬フレームワーク及びマトリックスを例示し、これらは、例えば上述の不可逆的ターミネーターを利用する、終止を利用した合成時配列決定法において、予測イオノグラムを算出するのに利用され得る。
【００４４】
さらに具体的には、図３は、本発明の実施形態に従う予測イオノグラムを算出するための模擬フレームワーク７０を概略的に例示する。描写は、種々のステップを含み、ヌクレオチドフロー（例えば、フロー１、２、３などを表す列）及びヌクレオチド塩基（例えば、塩基１、２、３などを表す行）のマトリックスであると考えられ得る。塩基は、以下にさらに詳述されるとおり、特定の意図されるフロー中に組み込まれることもあれば、組み込まれないこともあり、さらには意図されないフロー中に組み込まれることもある。意図される組み込み、組み込み失敗、及び／または意図されない組み込みの模擬は、そのようなマトリックスのセルに沿った経路を生成する。
【００４５】
５つのパラメータ整相モデル
図４は、可能な分子状態及び状態遷移が、一開示実施形態に従って標識が付けられた、図３に例示されるマトリックス内の例示的セル８０を例示する。そのようなセルは、ＩＥＲ、ＣＦＲ、ＤＲ、ＲＭＲ、ＴＦＲの５つのパラメータを組み込んだパラメータの整相モデルのＮ番目のヌクレオチドフロー中のＫ番目の塩基に存在する活性分子（例えば、フロー中に活性ポリメラーゼで活発に合成される分子）及び不活性分子に起こり得ることを例示する。そのような整相モデルは、例えば、可逆的ターミネーターを使用する、終止を利用した合成時配列決定プラットフォームで有用であり得る。この点に到着するために、活性分子は、フローＮにおいて塩基Ｋ−１を組み込むか、またはフローＮ−１において塩基Ｋを組み込まないかのいずれかを含む。不活性分子は、Ｎ−１フローにおいてＫ−１塩基を組み込む分子を含む。
【００４６】
フローＮにおいて塩基Ｋ−１を組み込んだ活性分子（図４のＱ１と標識が付けられている）に関して、その時には接合点８２に２つの可能性がある。終止基が、プライマー伸長の終止に失敗したか（例えば、Ｑ１×［ＴＦＲ］と等しいＱ１'）、または終止から転換されたか（例えば、Ｑ１−Ｑ１'もしくはＱ１×［１−ＴＦＲ］と等しいＱ１''）のいずれか。さらに以下に論じられるとおり、Ｑ１'サブセットは、接合点８６に渡され、そこで、次いでこれらには、３つの可能性のうちの１つがセル８０で（すなわち、フローＮのＫ番目の塩基で）起き得、またＱ１"サブセットは接合点８９に渡される。Ｎ−１フローにおいて塩基Ｋを組み込むことに失敗したことに起因してセル８０に入った活性分子は、図４のＱ２によって表され、このサブセットの活性分子もまた、図４の接合点８６に渡される。
【００４７】
セル８０に入るＮ−１フローにおいてＫ−１塩基を組み込んでいる不活性分子（Ｑ６と標識が付けられている）に関しては、これらの不活性分子は、接合点８４で再活性化するか（Ｑ６'）、不活性のまま（Ｑ６''）のいずれかであり得る。他の活性分子と同様に、サブセットＱ６'は、接合点８６に渡される。
【００４８】
故に、接合点８６に到着することは、セル８０の活性分子（Ｑ１'、Ｑ２、及びＱ６'）の合計である。接合点８６では、３つの可能性のうちの１つが起こり得る。活性分子は、伸長することに失敗するか、不完全伸長が起き得、サブセットＱ８が接合点８９に渡されるか；活性化分子が、不活性になり、垂下が起き得、サブセットＱ５が接合点９０に渡されるか；または、活性分子が、正常な伸長もしくは繰越事象を起こし、フローＮにおいて塩基Ｋを組み込み得、サブセットの分子Ｑ４が、フローＮにおいて塩基Ｋを組み込みフローの列Ｎに沿って次のセルに移動する活性分子になる。
【００４９】
５つのパラメータの整相モデル−Ｋ番目の塩基がＮ番目のフローと適合する
図４に例示されるマトリックス内の例示的セル８０を参照すると、Ｋ番目の塩基がＮ番目のフローと適合する状況において、種々の接合点の種々の遷移は、以下のとおりであってもよい：接合点８２が１つの入力（Ｑ１）ならびに２つの出力（Ｑ１'＝Ｑ１×［ＴＦＲ］及びＱ１''＝Ｑ１×［１−ＴＦＲ］）を有し；接合点８４が、１つの入力（Ｑ６）ならびに２つの出力（Ｑ６'＝Ｑ６×［ＲＭＲ］及びＱ６''＝Ｑ６×［１−ＲＭＲ］）を有し；接合点８６が３つの入力（Ｑ１'、Ｑ２、及びＱ６'）ならびに３つの出力（Ｑ８＝（Ｑ１'＋Ｑ２＋Ｑ６'）×［ＩＥＲ×（１−ＤＲ）］、Ｑ５＝（Ｑ１'＋Ｑ２＋Ｑ６'）×［ＤＲ］、及びＱ４＝（Ｑ１'＋Ｑ２＋Ｑ６'）×（［１−ＩＥＲ］×［１−ＤＲ］））を有し；接合点８９が、２つの入力（Ｑ１''及びＱ８）ならびに１つの出力（Ｑ３＝Ｑ１''＋Ｑ８）を有し；ならびに接合点９０が２つの入力（Ｑ５及びＱ６''）及び１つの出力（Ｑ７＝Ｑ５＋Ｑ６''）を有する。それ故、例示的セル８０からの出力（Ｑ３、Ｑ４、及びＱ７）に関して、Ｑ３は、５つのパラメータのうちの４つに基づく４つの遷移係数に基づいて、前の状態から直接的または間接的に決定されてもよい。これらの遷移係数は、それぞれ、［ＴＦＲ］、［１−ＴＦＲ］、［ＲＭＲ］、及び［ＩＥＲ×（１−ＤＲ）］である。Ｑ４は、３つの遷移係数（［ＴＦＲ］、［ＲＭＲ］、及び（［１−ＩＥＲ］×［１−ＤＲ］））に基づいて、前の状態から直接的または間接的に決定されてもよい。Ｑ７は、４つの遷移係数（［ＴＦＲ］、［ＲＭＲ］、（１−［ＲＭＲ］）、及び［ＤＲ］）に基づいて、前の状態から直接的または間接的に決定されてもよい。
【００５０】
活性のままで、かつフローＮ（Ｑ３）において塩基Ｋを組み込まない分子の割合は、前の活性状態における分子の量の測定値（例えば、数、濃度など）に、対応する遷移係数を掛け、得られた量を足すことにより決定され得る（例えば、（Ｑ１'＋Ｑ２＋Ｑ６'）に、遷移係数［ＩＥＲ×（１−ＤＲ）］を掛けてＱ８を得、Ｑ１に遷移係数［１−ＴＦＲ］を掛けてＱ１''を得、Ｑ８とＱ１''とを足して、Ｑ３を得る）。反対に、活性のまま、かつフローＮ（Ｑ４）において塩基Ｋを組み込む分子の割合は、前の活性状態における分子の量の測定値（例えば、数、濃度など）に、対応する遷移係数を掛けることにより、決定され得る（例えば、（Ｑ１'＋Ｑ２＋Ｑ６'）に遷移係数［（１−ＩＥＲ）×（１−ＤＲ）］を掛けて、Ｑ４を得る）。
【００５１】
さらに、Ｎフロー（Ｑ７）においてＫ−１塩基を組み込んでいる不活性になる分子の割合は、遷移に達する前の活性状態または前の不活性状態における分子の量のいくつかの測定値（例えば、数、濃度など）に、対応する遷移係数を掛け、得られた量を足すことにより、決定され得る（例えば、（Ｑ１'＋Ｑ２＋Ｑ６'）に遷移係数［ＤＲ］を掛けてＱ５を得、Ｑ６に遷移係数［１−ＲＭＲ］を掛けて、Ｑ６''を得、Ｑ５とＱ６''とを足して、Ｑ７を得る）。
【００５２】
５つのパラメータの整相モデル−Ｋ番目の塩基がＮ番目のフローと適合しない
Ｋ番目の塩基がＮ番目のフローと適合しない状況において、図４の接合点の種々の遷移は、以下のとおりでもよい：接合点８２が１つの入力（Ｑ１）ならびに２つの出力（Ｑ１'＝Ｑ１×［ＴＦＲ］及びＱ１''＝Ｑ１×［１−ＴＦＲ］）を有し；接合点８６が、３つの入力（Ｑ１'、Ｑ２、及びＱ６'）ならびに３つの出力（Ｑ８＝（Ｑ１'＋Ｑ２＋Ｑ６'）×［（１−ＣＦＲＭ）＋ＣＦＲＭ×ＩＥＲ×（１−ＤＲ）］、Ｑ５＝（Ｑ１'＋Ｑ２＋Ｑ６'）×［ＣＦＲＭ×ＤＲ］、及びＱ４＝（Ｑ１'＋Ｑ２＋Ｑ６'）×（ＣＦＲＭ×［１−ＩＥＲ］×［１−ＤＲ］））を有し；接合点８９が、２つの入力（Ｑ１''及びＱ８）ならびに１つの出力（Ｑ３＝Ｑ１''＋Ｑ８）を有し；接合点８４が、１つの入力（Ｑ６）ならびに２つの出力（Ｑ６'＝Ｑ６×［ＲＭＲ］及びＱ６''＝Ｑ６×［１−ＲＭＲ］を有し；ならびに接合点９０が、２つの入力（Ｑ５及びＱ６''）ならびに１つの出力（Ｑ７＝Ｑ５＋Ｑ６''）を有し、Ｍは、（Ｎ−Ｍ）番目のフローがＫ番目の塩基と適合するような最小数である。それ故、Ｋ番目の塩基がＮ番目のフローと適合しないとき、例示的セル８０からの出力に関して、５つのパラメータに基づく４つの遷移係数に基づいて、前の状態から直接的または間接的に決定され得る。これらの係数は、［ＴＦＲ］、［１−ＴＦＲ］、［ＲＭＲ］、及び［（１−ＣＦＲＭ）＋ＣＦＲＭ×ＩＥＲ×（１−ＤＲ）］）］である。Ｑ４は、３つの遷移係数（［ＴＦＲ］、［ＲＭＲ］及び（ＣＦＲＭ×［１−ＩＥＲ］×［１−ＤＲ］））に基づいて前の状態から直接的または間接的に決定され得、Ｑ７は、４つの遷移係数（［ＴＦＲ］、［ＲＭＲ］、（１−［ＲＭＲ］）、及び［ＣＦＲＭ×ＤＲ］）に基づいて、前の状態から直接的または間接的に決定され得る。
【００５３】
Ｋ番目の塩基がＮ番目のフローと適合しない場合、活性のまま、かつ及びフローＮにおいて塩基Ｋを組み込まない分子の割合（例えば、Ｑ３）は、活性状態前の分子の量のいくつかの測定値（例えば、数、濃度など）に、対応する遷移係数を掛け、得られた量を足すことにより、決定され得る（例えば、（Ｑ１'＋Ｑ２＋Ｑ６'）に［（１−ＣＦＲＭ）＋（ＣＦＲＭ×ＩＥＲ×（１−ＤＲ））］の項を含む遷移係数を掛けてＱ８を得、Ｍは、（Ｎ−Ｍ）番目のフローがＫ番目の塩基と適合するような最小数であり、Ｑ１に遷移係数［１−ＴＦＲ］を掛け、Ｑ１''を得、Ｑ８とＱ１''とを足してＱ３を得る）。反対に、活性のまま、かつフローＮ（Ｑ４）において塩基Ｋを組み込む分子の割合は、前の活性状態における分子の量のいくつかの測定値（例えば、数、濃度など）に、対応する遷移係数を掛けることにより、決定され得る（例えば、（Ｑ１'＋Ｑ２＋Ｑ６'）に、［ＣＦＲＭ×（１−ＩＥＲ）×（１−ＤＲ）］の項を含む遷移係数を掛けて、Ｑ４を得る）。さらに、不活性で、Ｎフロー（Ｑ７）においてＫ−１塩基を組み込んでいる分子の割合は、前の状態の分子の量（例えば、数、濃度、など）を対応する遷移係数によって合わせ、得られた量を足すことにより、決定され得る（例えば、（Ｑ１'＋Ｑ２＋Ｑ６'）に遷移係数［ＣＦＲＭ×ＤＲ］を掛けてＱ５を得、Ｑ６に遷移係数［１−ＲＭＲ］を掛けてＱ６''を得、Ｑ５とＱ６''とを足して、Ｑ７を得る）。
【００５４】
６つのパラメータの整相モデル
図５は、６つ目のパラメータが上に詳述される整相モデル内へ組み込まれた他の例示的に従う、可能な分子状態及び状態遷移に標識が付けられた、図３に例示されるマトリックス内の例示的セル１１０を例示する。この追加のパラメータは、不活性化分子率（ＩＭＲ）であり、分子が不活性化される率に対応し、これは、不可逆的ターミネーターを用いる実施例または可逆的ターミネーターの転換処理が不完全である場合に有用であり得る。
【００５５】
例示的セル１１０は、ＩＭＲを組み込む６つのパラメータモデルのＮ番目のヌクレオチドフロー中にＫ番目の塩基に存在する活性分子（例えば、フロー中に活性ポリメラーゼで活発に合成される分子）及び不活性分子に起こり得ることを例示する。この点に到着するために、活性分子は、フローＮにおいて塩基Ｋ−１を組み込むか、またはフローＮ−１において塩基Ｋを組み込まないかのいずれかを含む。不活性分子は、Ｎ−１フローにおいてＫ−１塩基を組み込む分子を含む。
【００５６】
フローＮにおいて塩基Ｋ−１を組み込んだ活性分子（図５のＱ１と標識が付けられている）に関し、その時には接合点８２に３つの可能性がある。終止基が、プライマー伸長を終止させることに失敗した（例えば、Ｑ１に終止失敗率を掛けたもの、もしくはＱ１×［ＴＦＲ］と等しいＱ１'）か、分子が不活性化された（例えば、Ｑ１×［ＩＭＲ］に等しいＱ１'''）か、または終止から転換される（例えば、Ｑ１−Ｑ１'−Ｑ１'''もしくはＱ１×［１−ＴＦＲ−ＩＭＲ］と等しいＱ１''）かのいずれか。さらに以下に論じられるとおり、Ｑ１'サブセットは、接合点８６に渡され、そこで、次いでこれらには、３つの可能性のうちの１つがセル８０内で（すなわち、フローＮのＫ番目の塩基で）起き得、またＱ１"サブセットは接合点８９に渡され、Ｑ１'''サブセットは接合点８４に渡される。Ｎ−１フローにおいて塩基Ｋを組み込むことに失敗したことに起因してセル８０に入った活性分子は、図５のＱ２によって表され、このサブセットの活性分子もまた、図５の接合点８６に渡される。
【００５７】
セル８０に入るＮ−１フローにおいてＫ−１塩基を組み込んでいる不活性分子（Ｑ６）に関しては、これらの不活性分子は、接合点８４で不活性化分子（Ｑ１'''）と結合され、次いで、接合点８４の分子は、再活性化するか（Ｑ６'）、不活性のまま（Ｑ６''）のいずれかであり得る。他の活性分子と同様に、サブセットＱ６'は、接合点８６に渡される。
【００５８】
故に、接合点８６に到着することは、セル８０の活性分子（Ｑ１'、Ｑ２、及びＱ６'）の合計である。接合点８６では、３つの可能性のうちの１つが起こり得る。活性分子は、伸長することに失敗するか、不完全伸長が起き得、サブセットＱ８が接合点８９に渡されるか；活性化分子が、不活性になり、垂下が起き得、サブセットＱ５が接合点９０に渡されるか；または、活性分子が、正常な伸長もしくは繰越事象を起こし、フローＮにおいて塩基Ｋを組み込み得、サブセットの分子Ｑ４が、フローＮにおいて塩基Ｋを組み込みフローの列Ｎに沿って次のセルに移動する活性分子になる。
【００５９】
６つのパラメータの整相モデル−Ｋ番目の塩基がＮ番目のフローと適合する
図５に例示されるマトリックス内の例示的セル１１０を参照すると、Ｋ番目の塩基がＮ番目のフローと適合する状況において、種々の接合点の種々の遷移は、以下のとおりであってもよい：接合点８２が、１つの入力（Ｑ１）ならびに３つの出力（Ｑ１'＝Ｑ１×［ＴＦＲ］；Ｑ１''＝Ｑ１×［１−ＴＦＲ−ＩＭＲ］、及びＱ'''＝Ｑ１×［ＩＭＲ］）を有し；接合点８４が、２つの入力（Ｑ１'''及びＱ６）ならびに２つの出力（Ｑ６'＝（Ｑ６＋Ｑ１'''）×［ＲＭＲ］及びＱ６''＝（Ｑ６＋Ｑ１'''）×［１−ＲＭＲ］）を有し；接合点８６が、３つの入力（Ｑ１'、Ｑ２、及びＱ６'）ならびに３つの出力（Ｑ８＝（Ｑ１'＋Ｑ２＋Ｑ６'）×［ＩＥＲ×（１−ＤＲ）］、Ｑ５＝（Ｑ１'＋Ｑ２＋Ｑ６'）×［ＤＲ］、及びＱ４＝（Ｑ１'＋Ｑ２＋Ｑ６'）×（［１−ＩＥＲ］×［１−ＤＲ］））を有し；接合点８９が、２つの入力（Ｑ１''及びＱ８）ならびに１つの出力（Ｑ３＝Ｑ１''＋Ｑ８）を有し；ならびに接合点９０が、２つの入力（Ｑ５及びＱ６''）ならびに１つの出力（Ｑ７＝Ｑ５＋Ｑ６''）を有する。
【００６０】
それ故、例示的セル１１０（Ｑ３、Ｑ４、及びＱ７）からの出力に関してＱ３は、６つのパラメータのうちの５つに基づいて、５つの遷移係数を用いて前の状態から直接的または間接的に決定され得、５つの遷移係数は、［ＩＭＲ］、［ＴＦＲ］、［１−ＴＦＲ−ＩＭＲ］、［ＲＭＲ］、及び［ＩＥＲ×（１−ＤＲ）］である。Ｑ４は、遷移係数［ＩＭＲ］、［ＴＦＲ］、［ＲＭＲ］、及び（［１−ＩＥＲ］×［１−ＤＲ］）に基づいて、前の状態から直接的または間接的に決定されてもよい。Ｑ７は、４つの遷移係数［ＩＭＲ］、［ＴＦＲ］、［ＲＭＲ］、（１−［ＲＭＲ］）、及び［ＤＲ］に基づいて、前の状態から直接的または間接的に決定されてもよい。
【００６１】
活性のままで、かつフローＮ（Ｑ３）において塩基Ｋを組み込まない分子の割合は、前の活性状態における分子の量の測定値（例えば、数、濃度など）に、対応する遷移係数を掛け、得られた量を足すことにより決定され得る（例えば、（Ｑ１'＋Ｑ２＋Ｑ６'）に、遷移係数［ＩＥＲ×（１−ＤＲ）］を掛けてＱ８を得、Ｑ１に遷移係数［１−ＴＦＲ−ＩＭＲ］を掛けてＱ１''を得、Ｑ８とＱ１''とを足して、Ｑ３を得る）。反対に、活性のまま、かつフローＮ（Ｑ４）において塩基Ｋを組み込む分子の割合は、前の活性状態における分子の量の測定値（例えば、数、濃度など）に、対応する遷移係数を掛けることにより、決定され得る（例えば、（Ｑ１'＋Ｑ２＋Ｑ６'）に遷移係数［（１−ＩＥＲ）×（１−ＤＲ）］を掛けて、Ｑ４を得る）。さらに、Ｎフロー（Ｑ７）においてＫ−１塩基を組み込んでいる不活性になる分子の割合は、遷移に達する前の活性状態または前の不活性状態における分子の量のいくつかの測定値（例えば、数、濃度など）に、対応する遷移係数を掛け、得られた量を足すことにより、決定され得る（例えば、（Ｑ１'＋Ｑ２＋Ｑ６'）に遷移係数［ＤＲ］を掛けてＱ５を得、Ｑ６＋Ｑ１'''に遷移係数［１−ＲＭＲ］を掛けて、Ｑ６''を得、Ｑ５とＱ６''とを足して、Ｑ７を得る）。
【００６２】
６つのパラメータの整相モデル−Ｋ番目の塩基が、Ｎ番目のフローと適合しない
図５に例示されるマトリックス内の例示的セル１１０を参照すると、Ｋ番目の塩基がＮ番目のフローと適合しない状況において、種々の接合点の種々の遷移は、以下のとおりであってもよい：接合点８２が、１つの入力（Ｑ１）ならびに３つの出力（Ｑ１'＝Ｑ１×［ＴＦＲ］、Ｑ１'''＝Ｑ１×［ＩＭＲ］及びＱ１''＝Ｑ１×［１−ＴＦＲ−ＩＭＲ］）を有し；接合点８４が、２つの入力（Ｑ１'''及びＱ６）ならびに２つの出力（Ｑ６'＝（Ｑ６＋Ｑ１'''）×［ＲＭＲ］及びＱ６''＝（Ｑ６＋Ｑ１'''）×［１−ＲＭＲ］）を有し；接合点８６が、３つの入力（Ｑ１'、Ｑ２、及びＱ６'）ならびに３つの出力（Ｑ８＝（Ｑ１'＋Ｑ２＋Ｑ６'）×［（１−ＣＦＲＭ）＋ＣＦＲＭ×ＩＥＲ×（１−ＤＲ）］、Ｑ５＝（Ｑ１'＋Ｑ２＋Ｑ６'）×［ＣＦＲＭ×ＤＲ］、及びＱ４＝（Ｑ１'＋Ｑ２＋Ｑ６'）×（［ＣＦＲＭ］×［１−ＩＥＲ］×［１−ＤＲ］）を有し；接合点８９が、２つの入力（Ｑ１''及びＱ８）ならびに１つの出力（Ｑ３＝Ｑ１''＋Ｑ８）を有し；接合点９０が、２つの入力（Ｑ５及びＱ６''）ならびに１つの出力（Ｑ７＝Ｑ５＋Ｑ６''）を有する。
【００６３】
それ故、例示的セル１１０（Ｑ３、Ｑ４、及びＱ７）からの出力に関して、Ｑ３は、６つのパラメータに基づいて、５つの遷移係数を用いて、前の状態から直接的または間接的に決定され得、５つの遷移係数は、［ＩＭＲ］、［ＴＦＲ］、［１−ＴＦＲ−ＩＭＲ］、［ＲＭＲ］、及び［（１−ＣＦＲＭ）＋（ＣＦＲＭ×ＩＥＲ×（１−ＤＲ）］）であり、Ｑ４は、遷移係数［ＩＲＲ］、［ＴＦＲ］、［ＲＭＲ］、及び［ＣＦＲＭ×（１−ＩＥＲ）×（１−ＤＲ）］に基づいて、前の状態から直接的または間接的に決定され得、Ｑ７は、遷移率［ＩＲＲ］、［ＴＦＲ］、［ＲＭＲ］、［１−ＲＭＲ］、及び［ＣＦＲＭ×ＤＲ］に基づいて、前の状態から直接的または間接的に決定され得る。
【００６４】
活性のままで、かつフローＮ（Ｑ３）において塩基Ｋを組み込まない分子の割合は、前の活性状態における分子の量の測定値（例えば、数、濃度など）に、対応する遷移係数を掛け、得られた量を足すことにより決定され得る（例えば、（Ｑ１'＋Ｑ２＋Ｑ６'）に、遷移係数［（１−ＣＦＲＭ）＋（ＣＦＲＭ×ＩＥＲ×（１−ＤＲ）］を掛けてＱ８を得、Ｑ１に遷移係数［１−ＴＦＲ−ＩＭＲ］を掛けてＱ１''を得、Ｑ８とＱ１''とを足して、Ｑ３を得る）。反対に、活性のまま、かつフローＮ（Ｑ４）において塩基Ｋを組み込む分子の割合は、活性化前の状態の分子の量の測定値（例えば、数、濃度など）に、対応する遷移係数を掛けることにより、決定され得る（例えば、（Ｑ１'＋Ｑ２＋Ｑ６'）に遷移係数［（ＣＦＲＭ）×（１−ＩＥＲ）×（１−ＤＲ）］を掛けて、Ｑ４を得る）。さらに、Ｎフロー（Ｑ７）においてＫ−１塩基を組み込んでいる不活性になる分子の割合は、遷移に達する前の活性状態または前の不活性状態における分子の量のいくつかの測定値（例えば、数、濃度など）に、対応する遷移係数を掛け、得られた量を足すことにより、決定され得る（例えば、（Ｑ１'＋Ｑ２＋Ｑ６'）に遷移係数［ＣＦＲＭ×ＤＲ］）を掛けてＱ５を得、Ｑ６＋Ｑ１'''に遷移係数［１−ＲＭＲ］を掛けて、Ｑ６''を得、Ｑ５とＱ６''とを足して、Ｑ７を得る）。
【００６５】
終止化学が使用されない場合の整相モデル
図６は、終止化学が利用されない場合の実施形態に従って予測イオノグラムを算出するための、模擬フレームワーク１２０を、概略的に例示する。そのような実施形態において、上述の５つか６つのパラメータのいずれかついて、ＲＭＲは、０に設定されてもよく、ＴＦＲは、１に設定されてもよく、（使用される場合）ＩＭＲもまた、０に設定されてもよい。ＲＭＲが０に設定されるとき、不活性化分子は、もはやあらゆる反応に関与しないため、追跡される必要はない。したがって、前述同様に、描写は、種々のステップを含み、フロー（フロー１、２、３などを表す列）及び塩基（塩基１、２、３などを表す行）のマトリックスであると考えられ得る。再度、塩基は、フローに反応して組み込まれてもよく、または組み込まれなくてもよく、組み込みの模擬（またはその欠如）は、マトリックスのセルに沿った経路を生成する。
【００６６】
図７は、図６に例示されるように、マトリックス内の例示的セル１２２を実施例に従う可能な状態及び状態遷移とともに例示する。そのようなセル１２２は、Ｎ番目のフロー中に、Ｋ番目の塩基に存在する活性分子（例えば、ポリメラーゼ）に起こり得ることを例示する。この点に到着するために、分子は、フローＮにおいて塩基Ｋ−１を組み込んだか、フローＮ−１において塩基Ｋを組み込まなかったかのいずれかである。この時、いくつかの可能性がある。分子は、正常な伸長または繰越事象を起こし、フローＮにおいて塩基Ｋを組み込み得る。分子は、伸長に失敗するか、または不完全伸長事象を起こし、フローＮにおいて塩基Ｋを組み込み得ない。最後に、分子は、不活性になり、それ故に垂下を起こし得る。分子の集団について、可能な後続の状態の分子の割合は、入ってくる集団及び状態遷移パラメータに依存するであろう。
【００６７】
図７に例示されるとおりのマトリックス内の例示的セル１２を参照すると、Ｋ番目の塩基が、Ｎ番目のフローと適合する状況において、活性のまま、かつフローＮにおいて塩基Ｋを組み込まない分子の割合（例えば、Ｑ３）は、２つ前の状態（例えば、Ｑ１＋Ｑ２）の分子の量のいくつかの測定値（例えば、数、濃度など）に、［ＩＥＲ×（１−ＤＲ）］の項を含む遷移係数を掛けることにより、決定され得、ＩＥＲは、不完全伸長率であり、ＤＲは、垂下率である。反対に、活性のまま、かつフローＮ（例えば、Ｑ４）において塩基Ｋを組み込む分子の割合は、２つ前の状態の分子（例えば、Ｑ１＋Ｑ２）の量のいくつかの測定値（例えば、数、濃度など）に、［（１−ＩＥＲ）×（１−ＤＲ）］の項を含む遷移係数を掛けることにより、決定され得る。
【００６８】
図７に例示されるとおりのマトリックス内の例示的セル１２を参照すると、Ｋ番目の塩基が、Ｎ番目のフローと適合しない状況において、活性のまま、かつフローＮにおいて塩基Ｋを組み込まない分子の割合（例えば、Ｑ３）は、２つ前の状態（例えば、Ｑ１＋Ｑ２）の分子の量のいくつかの測定値（例えば、数、濃度など）に、［（１−ＣＦＲＭ）＋（ＣＦＲＭ×ＩＥＲ×（１−ＤＲ））］の項を含む遷移係数を掛けることにより、決定され得、ＣＦＲは繰越率であり、Ｍは、（Ｎ−Ｍ）番目のフローがＫ番目の塩基と適合するような最小数である。反対に、活性のまま、かつフローＮ（例えば、Ｑ４）において塩基Ｋを組み込む分子の割合は、２つ前の状態の分子（例えば、Ｑ１＋Ｑ２）の量のいくつかの測定値（例えば、数、濃度など）に、［ＣＦＲＭ×（１−ＩＥＲ）×（１−ＤＲ）］の項を含む遷移係数を掛けることにより、決定され得る。
【００６９】
図８は、ＲＭＲ率、ＴＦＲ率、及び（モデル化される場合）ＩＭＲ率が、０に設定される実施例に従う、予測イオノグラムを算出するための模擬フレームワーク１３０を、概略的に例示する。これらのパラメータを０に設定することにより、図８に示すとおり、動的プログラミングマトリックスは、上三角マトリックスに変換する。図６及び７の実施形態と同様に、ＲＭＲが０に設定されるとき、不活性化分子は、いずれの反応にも関与しないため、追跡される必要はない。したがって、前述同様に、描写は、種々のステップを含み、フロー（フロー１、２、３などを表す列）及び塩基（塩基１、２、３などを表す行）のマトリックスであると考えられ得る。再度、塩基は、フローに反応して組み込まれてもよく、または組み込まれなくてもよく、組み込みの模擬（またはその欠損）は、マトリックスのセルに沿った経路を生成する。
【００７０】
図９は、可能な分子状態及び状態遷移が、一開示実施形態に従って標識が付けられた図８に例示されるマトリックス内の例示的セル１３２を例示する。そのようなセルは、Ｎ番目のヌクレオチドフロー中にＫ番目の塩基に存在する活性分子（例えば、フロー中に活性ポリメラーゼで活発に合成される分子）に起こり得ることを例示する。この点に到着するために、活性分子は、フローＮにおいて塩基Ｋ−１を組み込むか、またはフローＮ−１において塩基Ｋを組み込まないかのいずれかを含む。このモデルにおいて、フローＮにおいて塩基Ｋ−１を組み込んだ活性分子（図９のＱ１）は、接合点８９に渡される。Ｎ−１フローにおいて塩基Ｋを組み込むことに失敗したことに起因してセル１３２に入った活性分子は、図９のＱ２によって表され、このサブセットの活性分子もまた、図９の接合点８６に渡される。
【００７１】
接合点８６では、３つの可能性のうちの１つが起こり得る。活性分子は、図９のＱ８によって表される、伸長に失敗するか、不完全伸長が起き、接合点８９に渡されるか；図９のサブセットＱ５によって表される、不活性になり、垂下が起こるか；または、図９のＱ４によって表される、正常な伸長もしくは繰越事象が起こり、フローＮにおいて塩基Ｋを取り込み、これは、フローＮにおいて塩基Ｋを取り込んだ活性分子になり、フローの列Ｎに沿って次のセルに移動する。
【００７２】
図９に例示されるマトリックス内の例示的セル８０を参照すると、Ｋ番目の塩基がＮ番目のフローと適合する状況において、種々の接合点の種々の遷移は、以下のとおりであってもよい：接合点８６が、１つの入力（Ｑ２）ならびに３つの出力（Ｑ８＝（Ｑ２）×［ＩＥＲ×（１−ＤＲ）］、Ｑ５＝（Ｑ２）×［ＤＲ］、及びＱ４＝（Ｑ２）×（［１−ＩＥＲ］×［１−ＤＲ］））を有し；接合点８９が、２つの入力（Ｑ１及びＱ８）ならびに１つの出力（Ｑ３＝Ｑ１＋Ｑ８）を有する。
【００７３】
それ故、例示的セル８０（Ｑ３及びＱ４）からの出力に関して、Ｑ３は、遷移率［ＩＥＲ×（１−ＤＲ）］に基づいて、前の状態から直接的または間接的に決定され得、Ｑ４は、遷移率（［１−ＩＥＲ］×［１−ＤＲ］）に基づいて、前の状態から直接的または間接的に決定され得る。活性のままで、かつフローＮ（Ｑ３）において塩基Ｋを組み込まない分子の割合は、前の活性状態における分子の量の測定値（例えば、数、濃度など）に、対応する遷移係数を掛け、得られた量を足すことにより決定され得る（例えば、（Ｑ２）に、遷移係数［ＩＥＲ×（１−ＤＲ）］を掛けてＱ８を得、Ｑ８とＱ１とを足して、Ｑ３を得る）。反対に、活性のまま、かつフローＮ（Ｑ４）において塩基Ｋを組み込む分子の割合は、前の活性状態における分子の量の測定値（例えば、数、濃度など）に、対応する遷移係数を掛けることにより、決定され得る（例えば、（Ｑ２）に遷移係数［（１−ＩＥＲ）×（１−ＤＲ）］を掛けて、Ｑ４を得る）。
【００７４】
Ｋ番目の塩基がＮ番目のフローと適合しない状況において、種々の接合点の種々の遷移は、以下のとおりであってもよい：接合点８６が、１つの入力（Ｑ２）ならびに３つの出力（Ｑ８＝（Ｑ２）×［（１−ＣＦＲＭ）＋ＣＦＲＭ×ＩＥＲ×（１−ＤＲ）］、Ｑ５＝（Ｑ２）×［ＤＲ］、及びＱ４＝（Ｑ２）×（［ＣＦＲＭ］×［１−ＩＥＲ］×［１−ＤＲ］）を有し；接合点８９が、２つの入力（Ｑ１及びＱ８）ならびに１つの出力（Ｑ３＝Ｑ１＋Ｑ８）を有する。それ故、例示的セル８０（Ｑ３及びＱ４）からの出力に関して、Ｑ３は、遷移係数［（１−ＣＦＲＭ）＋ＣＦＲＭ×ＩＥＲ×（１−ＤＲ）］に基づいて、前の状態から直接的または間接的に決定され得、Ｑ４は、遷移係数（［ＣＦＲＭ］×［１−ＩＥＲ］×［１−ＤＲ］）に基づいて、前の状態から直接的または間接的に決定され得る。活性のままで、かつフローＮ（Ｑ３）において塩基Ｋを組み込まない分子の割合は、前の活性状態における分子の量の測定値（例えば、数、濃度など）に、対応する遷移係数を掛け、得られた量を足すことにより決定され得る（例えば、（Ｑ２）に、遷移係数［（１−ＣＦＲＭ）＋ＣＦＲＭ×ＩＥＲ×（１−ＤＲ）］を掛けてＱ８を得、Ｑ８とＱ１とを足して、Ｑ３を得る）。反対に、活性のまま、かつフローＮ（Ｑ４）において塩基Ｋを組み込む分子の割合は、前の活性状態における分子の量の測定値（例えば、数、濃度など）に、対応する遷移係数を掛けることにより、決定され得る（例えば、（Ｑ２）に遷移係数［ＣＦＲＭ×（１−ＩＥＲ）×（１−ＤＲ）］を掛けて、Ｑ４を得る）。
【００７５】
模擬研究
図１０Ａ〜１０Ｄ、１１Ａ〜１１Ｄ、及び１２Ａ〜１２Ｄは、本明細書に開示されるＩＥＲ、ＣＦＲ、ＤＲ、ＲＭＲ、及びＴＦＲの５つパラメータを用いる終止化学整相モデル（図中、三角及び省略形「終止」で示される）と、終止化学を使用しない配列決定システムのために利用される標準的整相モデル（図中、丸及び省略形「フロー」によって示される）との間の比較を示す模擬プロットを例示し、これらの両方が、同じ模擬整相誤差を有する。図６及び７に詳述される実施形態を、標準的整相を模擬するのに使用した一方で、図８及び９に詳述される実施形態を、終止化学整相を模擬するのに使用した。提示される模擬において、ＲＭＲを、０に設定し、ＴＦＲを、１未満に設定した。図１０Ａ〜１０Ｄは、（ノイズ標準偏差を、０．０３加法性、０．０３乗法性に設定した）低ノイズレベルの模擬結果を示すプロットを例示し、図１１Ａ〜１１Ｄは、（ノイズ標準偏差を、０．１加法性、０．０５乗法性に設定した）中ノイズレベルの模擬結果を示すプロットを例示し、図１２Ａ〜１２Ｄは、（ノイズ標準偏差を、０．２加法性、０．０５乗法性に設定した）高ノイズレベルの模擬結果を示すプロットを例示する。以下の図に示すとおり、同じ整相パラメータを経験するとき、終止化学モデルは、標準モデルと比較して、１フロー当たりの誤差率の低減を呈する。さらに、提示される模擬に基づいて、本明細書に提供される終止化学のモデルは、より長いホモポリマーに対して、結果において、予期しない、かつ著しくより高い精度を可能にする。
【００７６】
特に、図１０Ａ、１１Ａ、及び１２Ａは、低、中、及び高ノイズレベルそれぞれに対して、誤差率対ホモポリマーの長さを例示する。これらのプロットに示すとおり、終止化学誤差率は、標準誤差率と比較して、ノイズレベルの各々で著しく小さくなる。図１０Ｂ、１１Ｂ、及び１２Ｂは、低、中、及び高ノイズレベルそれぞれのフローによる誤差率を例示する。これらのプロットに示すとおり、本明細書に提供される終止化学のモデルは、１フロー当たりの誤差率の低減を可能にする。図１０Ｃ、１１Ｃ、及び１２Ｃは、低、中、及び高ノイズレベル、それぞれに対し、鋳型を介して配列決定するのに掛かるフロー数を例示する。図１０Ｄ、１１Ｄ、及び１２Ｄは、再度、終止化学モデルで小さくなった誤差率を示す、低、中、及び高ノイズレベル、それぞれに対する１塩基当たりの平均誤差率を例示する。
【００７７】
図１３Ａ〜１３Ｈ、図１４Ａ〜１４Ｈ、図１５Ａ〜１５Ｈ、図１６Ａ〜１６Ｈ、及び図１７Ａ〜１７Ｈは、０．５、１．５、２．５、３．５、及び４．５、それぞれの不完全伸長レベルに対する、終止化学モデル化と標準モデル化とを比較した模擬を例示する。Ａ〜Ｄ及びＥ〜Ｆのセットは、異なるヌクレオチドフローの順序に対して、同じセットの塩基配列及び整相パラメータを模擬する。ノイズ標準偏差は、０．０５加法性、０．０５乗法性に設定した。例示される模擬に示すとおり、終止化学モデルは、図１３Ａ、１３Ｅ、１４Ａ、１４Ｅ、１５Ａ、１５Ｅ、１６Ａ、１６Ｅに見ることができるように、より長いホモポリマー長に対して、改善した誤差率を提供する。整相効果は、後のフローが、一般的に前のフローよりも大きい誤差率を経験するように、時間とともに累積する。所与の長さの鋳型配列を介して配列決定するために、より多くの総フロー数を必要とするが（図Ｃを参照のこと）、（鋳型の末端部に向かって、後のフローで常に起こる）１フロー当たりの模擬ピーク誤差率は、ターミネーター配列決定ではないものの模擬ピーク誤差率を上回らず、かつ概してそれよりも、著しく低いままである。観察された模擬誤差率は、ヌクレオチドフローの順序によって変化する。例えば、図１６Ｂにおいて、終止化学モデルの誤差ピークは、標準モデルの誤差ピークよりも後の点で起こり、かつ高さが低い。同様の効果が、標準モデルよりもより多くのフローの終止モデルに関して誤差率が低いままである図１７Ｂ及び１７Ｆで認められる。（１７Ｄを除く）図１３Ｄ、Ｈ〜１７Ｄ、Ｈにおいて、終止化学モデル模擬の結果は、より低い１つの塩基当たりの誤差率、したがって、より高い全体の塩基精度を示す。
【００７８】
さらに、修正及び代替実施形態が、本明細書の開示を考慮して当業者に明らかになるであろう。例えば、システム及び方法は、操作の明瞭さのために、図表及び説明から省略された追加の要素またはステップを含んでもよい。したがって、この説明は、ほんの一例として解釈され、本開示の実行の一般的な様式を、当業者に教示する目的のためである。本明細書に示され、記載される種々の実施形態は、例示的として見なされることが理解されたい。これらの要素及び物質の要素及び物質、ならびに構成は、本明細書に例示され、記載されるものと置換することができ、部品及びプロセスは転換することができ、本教示の特定の特徴は、本明細書の説明の利益を有した後に、当業者に明らかになるように、すべて独立して利用することができる。本教示及び以下の特許請求の精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される要素に、変更が加えられてもよい。
【００７９】
本明細書に記載される特定の実施例及び実施形態は、非限定的であり、本教示の範囲から逸脱することなく、構造、寸法、材料、及び手法に対して、修正が加えられてもよいことが、理解されたい。
【００８０】
本開示に従う他の実施形態は、本明細書及び本明細書に開示される本発明の実施を考慮して、当業者に明らかになるであろう。本明細書及び実施例が例示的なものにすぎないと見なされ、特許請求の範囲が等価物を含むこれらの全容及び範囲の権利を有することが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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