(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水酸基を有する親水性部と、カルボキシル基を有し、炭素数が８〜１６である脂肪酸である疎水性部とをエステル結合させた脂肪酸エステルに、蛍光標識を共有結合させた蛍光標識脂肪酸エステルを有し、
当該蛍光標識脂肪酸エステルおよび芽胞形成細菌を結合させて前記蛍光標識のシグナル強度を検出することにより、前記芽胞形成細菌の有無を判断できる芽胞形成細菌の検出剤。
【請求項２】
前記親水性部がトレハロースであり、前記脂肪酸エステルがトレハロース脂肪酸エステルであり、前記蛍光標識がＤＭＥＱである請求項１に記載の芽胞形成細菌の検出剤。
【請求項３】
前記トレハロース脂肪酸エステルがトレハロースパルミチン酸エステルである請求項２に記載の芽胞形成細菌の検出剤。
【請求項４】
前記芽胞形成細菌が高温偏性嫌気性菌である請求項１〜３の何れか一項に記載の芽胞形成細菌の検出剤。
【請求項５】
前記高温偏性嫌気性菌がモーレラ属の細菌である請求項４に記載の芽胞形成細菌の検出剤。
【請求項６】
前記モーレラ属の細菌がモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）である請求項５に記載の芽胞形成細菌の検出剤。
【請求項７】
水酸基を有する親水性部と、カルボキシル基を有し、炭素数が８〜１６である脂肪酸である疎水性部とをエステル結合させた脂肪酸エステルに蛍光標識を共有結合させた蛍光標識脂肪酸エステル、および、芽胞形成細菌を結合させる結合工程と、
前記蛍光標識のシグナル強度を検出するシグナル検出工程と、を有する芽胞形成細菌の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、芽胞形成細菌を検出する検出剤および検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の中には、芽胞を形成する細菌が存在する。芽胞形成細菌は、生存に良好な環境では活発に分裂し増殖するが、環境の栄養分が減少したり、乾燥するなど、増殖に不利な環境になると芽胞を形成する。芽胞は極めて高い耐久性を持っており、さらに環境が悪化して通常の細菌が死滅する状況に陥っても生き残ることが可能である。しかし、芽胞の状態では細菌は新たに分裂することはできず、その代謝も限られている。
【０００３】
芽胞は栄養細胞の中に形成される耐久型細胞であり、水分が非常に低く、殆ど代謝せず、いわば休眠状態にある。この状態のときは種々のストレスに強い耐性を示し、加熱に対する抵抗性も強く、殺滅には１００℃以上で所定時間以上の加熱が必要である。休眠状態にある芽胞は、生き残った芽胞が再びその細菌の増殖に適した環境に置かれると、当該芽胞が発芽して、通常の増殖・代謝能を有する菌体が作られる。
【０００４】
芽胞は耐熱性が強いために、加熱殺菌によって微生物の制御をしている容器詰め食品では、その存在が問題となる。芽胞は、容器詰め食品にとって最も重要な生物学的危害要因で、加熱殺菌の指標となっている。
【０００５】
芽胞を作る代表的な細菌としては、好気性または通性嫌気性の有芽胞グラム陽性桿菌であるバチルス属の細菌や、偏性嫌気性の有芽胞グラム陽性桿菌であるクロストリジウム属やモーレラ属等の細菌が知られている。
【０００６】
モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）は高温偏性嫌気性菌であり、増殖適温は５５〜６０℃であって３５℃では増殖しない。多くの芽胞形成細菌と同様に土壌菌であり、食品材料の汚染源は主に砂糖や増粘多糖類であるといわれている。食品材料の炭水化物や脂肪等が分解されて風味が悪くなり食用に適さなくなることを変敗というが、モーレラ・サーモアセティカを原因とする変敗はフラットサワー様で、ガス発生せず酸を生成するタイプである。モーレラ・サーモアセティカを原因とする変敗事例を有する食品として、これまでにミルクコーヒー、ミルクティー、ココア飲料、ドリンクスープ、しるこドリンク等が知られている。モーレラ・サーモアセティカの芽胞の耐熱性は極めて高く、１２０℃でのＤ値（Decimal reduction value）が４０分以上であり、加熱殺菌処理のみでの変敗防止は極めて困難である。
【０００７】
容器詰め食品のうち飲料製造において、例えば乳成分含有飲料は通常レトルト加熱殺菌処理が行なわれるが、この加熱殺菌処理の通常の条件では耐熱性芽胞形成細菌の芽胞が残存する虞がある。乳成分含有飲料が自動販売機などにおいて低温保存状態で販売ないし貯蔵される場合には、残存した耐熱性芽胞形成細菌の芽胞は発芽・増殖し難く、品質上の問題が生じることは殆どない。しかし、例えば５５℃の加温状態に置かれた場合には、残存した高温耐熱性芽胞形成菌の芽胞が発芽・増殖して、飲料内容物に変敗を生じさせる結果、飲食適性（商品性）が失われる虞がある。
【０００８】
そのため、例えば特許文献１には、乳成分含有飲料においてレトルト殺菌処理を行なった後に高温状態で保存した場合に耐熱性芽胞形成細菌の芽胞が発芽・増殖することを抑制するため、ショ糖脂肪酸エステル等の乳化剤を添加することが開示してある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平１０−１６５１５１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
容器詰め食品において行われるレトルト加熱等の加熱処理は、その温度や時間が過剰となれば、食品材料の風味などの品質に対して悪影響を及ぼし、さらにエネルギー消費の面で負担が大きい。また、特許文献１にて使用されるショ脂肪酸エステルは、添加量によっては食品材料の風味に悪影響を与える虞があるため、使用量は少ない方がよい。
【００１１】
そのため、食品材料に対する芽胞形成細菌の混入をできるだけ早い段階で検出し、食品材料から芽胞形成細菌が検出された場合には、例えば容器詰め食品の製造において当該食品材料を使用しない等して、当該芽胞形成細菌の食品への混入を避けることが望ましい。
【００１２】
従って、本発明の目的は、食品材料中における芽胞形成細菌の検出を迅速かつ容易に行うことができる芽胞形成細菌の検出剤、および、芽胞形成細菌の検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
即ち、上記目的を達成するため、以下の［１］〜［７］に示す発明を提供する。
［１］水酸基を有する親水性部と、カルボキシル基を有し、炭素数が８〜１６である脂肪酸である疎水性部とをエステル結合させた脂肪酸エステルに、蛍光標識を共有結合させた蛍光標識脂肪酸エステルを有し、当該蛍光標識脂肪酸エステルおよび芽胞形成細菌を結合させて前記蛍光標識のシグナル強度を検出することにより、前記芽胞形成細菌の有無を判断できる芽胞形成細菌の検出剤。
［２］前記親水性部がトレハロースであり、前記脂肪酸エステルがトレハロース脂肪酸エステルであり、前記蛍光標識がＤＭＥＱである［１］に記載の芽胞形成細菌の検出剤。
［３］前記トレハロース脂肪酸エステルがトレハロースパルミチン酸エステルである［２］に記載の芽胞形成細菌の検出剤。
［４］前記芽胞形成細菌が高温偏性嫌気性菌である［１］〜［３］の何れか一項に記載の芽胞形成細菌の検出剤。
［５］前記高温偏性嫌気性菌がモーレラ属の細菌である［４］に記載の芽胞形成細菌の検出剤。
［６］前記モーレラ属の細菌がモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）である［５］に記載の芽胞形成細菌の検出剤。
［７］水酸基を有する親水性部と、カルボキシル基を有し、炭素数が８〜１６である脂肪酸である疎水性部とをエステル結合させた脂肪酸エステルに蛍光標識を共有結合させた蛍光標識脂肪酸エステル、および、芽胞形成細菌を結合させる結合工程と、前記蛍光標識のシグナル強度を検出するシグナル検出工程と、を有する芽胞形成細菌の検出方法。
【００１４】
蛍光標識脂肪酸エステルは休眠芽胞に殆ど作用せず、発芽した後の芽胞に作用すると考えられる。休眠芽胞が発芽した後、コートやコルテックスが分解され、水がコアに侵入するようになり、蛍光標識脂肪酸エステルも芽胞内膜に到達する。蛍光標識脂肪酸エステルが膜に結合するときには、膜のリン脂質二重膜に蛍光標識脂肪酸エステルの脂肪酸部分が入り込むと考えられる。
【００１５】
従って、本構成によれば、芽胞形成細菌を有する可能性のある食品材料に、蛍光標識脂肪酸エステルを含有する検出剤を添加し、蛍光標識脂肪酸エステルおよび芽胞形成細菌を結合させて蛍光標識のシグナル強度を検出することにより、前記芽胞形成細菌の有無を迅速かつ容易に判断できる。脂肪酸エステルの疎水性部は、炭素数が８〜１６である脂肪酸とする。
【００１６】
容器詰め食品のうち飲料製造において、例えば乳成分含有飲料は通常レトルト加熱殺菌処理が行なわれるが、この加熱殺菌処理の通常の条件では耐熱性芽胞形成細菌の芽胞が残存する虞がある。特に、芽胞形成細菌が高温偏性嫌気性菌であれば、芽胞の耐熱性は極めて高いため、当該高温偏性嫌気性菌の混入をできるだけ早い段階で検出することができれば好ましい。また、当該高温偏性嫌気性菌のうち、モーレラ属の細菌に分類されるモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）を原因とする変敗事例が広く公知であるため、モーレラ・サーモアセティカを検出できる検出剤であれば、汎用性が非常に高くなる。
【００１７】
本発明の芽胞形成細菌の検出方法は、未発芽芽胞には蛍光標識脂肪酸エステルは結合せず、発芽後に蛍光標識脂肪酸エステルが芽胞に結合すると考えられるため、増殖可能な芽胞形成細菌（芽胞）を迅速かつ容易に検出することができる検出方法となる。
さらに本発明の芽胞形成細菌の検出方法は、芽胞形成細菌を有する可能性のある食品材料に、蛍光標識脂肪酸エステルを含有する検出剤を添加して混合する結合工程を行い、シグナル検出工程では、フローサイトメーターといった公知の装置を使用してシグナル強度の検出を行うことができるため、食品材料中における芽胞形成細菌の検出を迅速かつ容易に行うことができる。
【００１８】
このように芽胞形成細菌の混入を検出することができれば、例えば容器詰め食品の製造において当該食品材料を使用しない等して、当該芽胞形成細菌の食品への混入を避けることができ、さらに加熱殺菌条件の緩和や乳化剤添加量の低減を図ることが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】蛍光標識脂肪酸エステル（ＤＭＥＱ−トレハロースパルミチン酸エステル）の構造式を示す図である。
【図２】芽胞発育に対する脂肪酸エステルの影響を調べたグラフである。
【図３】脂肪酸エステル作用による芽胞の形態変化の観察結果を示した写真図である。
【図４】脂肪酸エステルが膜に結合する場合の模式図を示した図である。
【図５】ＤＭＥＱ−トレハロースパルミチン酸エステルがモーレラ・サーモアセティカの芽胞に結合しているかどうかを顕微鏡によって観察した結果を示した写真図である。
【図６】芽胞への蛍光標識脂肪酸エステルの結合量をフローサイトメーターで測定し、横軸に蛍光強度、縦軸にそれぞれの蛍光強度をもつ細胞数をプロットした蛍光ヒストグラムを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の実施形態を図面に基づいて説明する。
本発明の芽胞形成細菌の検出剤は、水酸基を有する親水性部と、カルボキシル基を有し、炭素数が８〜１６である脂肪酸である疎水性部とをエステル結合させた脂肪酸エステルに、蛍光標識を共有結合させた蛍光標識脂肪酸エステルを有し、当該蛍光標識脂肪酸エステルおよび芽胞形成細菌を結合させて蛍光標識のシグナル強度を検出することにより、芽胞形成細菌の有無を判断できる。
【００２１】
芽胞形成細菌は、栄養細胞の分裂・増殖（対数増殖期）、芽胞形成、芽胞（休眠）、発芽、発芽後生育、及び栄養細胞の対数増殖という一連の生物学的変化を伴う生活環を有しているものであればよい。栄養細胞は、栄養源の枯渇など環境条件の変化によって不等分裂を起こし、母細胞とプレスポア（Prespore）の２つの細胞に分化する。プレスポアは、母細胞内に取り込まれてフォアスポア（Forespore、前芽胞）となる。フォアスポアが成熟し、芽胞（Spore）になると母細胞は自己溶解する。
【００２２】
芽胞は高い耐久性（耐熱性、耐圧性、耐薬品性）と長期休眠能を持つことから、食品や飲料、医薬品などの分野において芽胞の混入を想定した厳しい殺菌操作が必要となる。また、芽胞の耐久性の強さは種類（菌種や菌株）により異なるため、食品材料や製品などに混入した場合、迅速かつ正確に種類を同定し種類に応じた対応をしなければならない。
【００２３】
本発明に適用できる芽胞形成細菌としては限定されるものではないが、例えば、
モーレラ属に属する細菌、例えばモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）、モーレラ・グリセリニ（Moorella glycerini）、モーレラ・ムルデリ（Moorella mulderi）、モーレラ・サーモオートトロフィカ（Moorella thermoautotrophica）；
クロストリジウム属に属する細菌、例えば破傷風菌（Clostridium tetani）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）；
バチルス属に属する細菌、例えばバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、バチルス・アンスラシス（Bacillus anthracis）、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）；
ゲオバチルス属に属する細菌、例えばゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）；
アリシクロバチルス属に属する細菌、例えばアリシクロバチルス・アシドテレストリス（Alicyclobacillus acidoterrestris）;
スポロラクトバチルス属に属する細菌、例えばスポロラクトバチルス・イヌリナス（Sporolactobacillus inulinus；
リシニバチルス属に属する細菌、例えばリシニバチルス・スフェリカス（Lysinibacillus sphaericus）；
サーモアネロバクター属に属する細菌、例えばサーモアネロバクター・マスラニイ（Thermoanaerobacter mathranii）、サーモアネロバクター・アセトエチリカス（Thermoanaerobacter acetoethylicus）；
サーモアネロバクテリウム属に属する細菌、例えばサーモアネロバクテリウム・サーモサッカロリティカム（Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum）、サーモアネロバクテリウム・アシジトレランス（Thermoanaerobacterium aciditolerans）；
デスルフォトマキュラム属に属する細菌、例えばデスルフォトマキュラム・ニグリフィカンス（Desulfotomaculum nigrificans）、デスルファトマキュラム・サーモアセトキシダンス（Desulfotomaculum thermoacetoxidans）；
が挙げられる。
尚、当業者には周知であるとおり、上記例示した細菌名及び分類は将来的に変更される可能性がある。
【００２４】
本発明においては、上述した芽胞形成細菌であれば、任意の種及び株のものを用いることができる。
【００２５】
上述した細菌のうち、モーレラ属は高温耐熱性菌であり、バチルス属、クロストリジウム属およびアリシクロバチルス属は中温耐熱性菌である。
【００２６】
本発明の芽胞形成細菌の検出剤における脂肪酸エステルは、水酸基を有する親水性部と、カルボキシル基を有する脂肪酸である疎水性部とをエステル結合させたものである。
【００２７】
親水性部は、水酸基を有する糖類、アルコール、アスコルビン酸等を使用することができるが、これらに限定されるものではない。糖類としてはショ糖やトレハロース等、アルコールとしては、三価のアルコールであるグリセリン等を使用することができるが、これらに限定されるものではない。
疎水性部は、炭素数が８〜１６である脂肪酸を使用する。当該脂肪酸は、飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸の何れであってもよい。
【００２８】
本実施形態では、脂肪酸エステルとして、トレハロースとパルミチン酸とがエステル結合したトレハロースパルミチン酸エステルを使用した場合について説明する。パルミチン酸は、炭素数が１６の飽和脂肪酸である。
【００２９】
蛍光標識脂肪酸エステルは、上述した脂肪酸エステルに蛍光標識を共有結合させたものである。
蛍光標識は、トレハロースの水酸基に蛍光物質を共有結合させてある。当該蛍光標識は、上述した親水性部（糖類等）に共有結合して標識できるものであれば公知の蛍光物質を使用することができる。蛍光物質を共有結合させる手法は、公知の手法により行えばよい。本実施形態では、ＤＭＥＱ（6,7-dimethoxy-1-methyl-2(1H)-quinoxalinone：７−ジメトキシ−１−メチル−２（１Ｈ）−キノキサリノン）を使用した場合について説明する。図１に、ＤＭＥＱ−トレハロースパルミチン酸エステルの構造式を示す。
【００３０】
本発明の芽胞形成細菌の検出剤は、このような蛍光標識脂肪酸エステルおよび芽胞形成細菌を結合させて蛍光標識のシグナル強度を検出することにより、芽胞形成細菌の有無を判断できるものである。
【００３１】
缶や袋状の収容容器に食品を収容した容器詰め食品のうち飲料製造において、例えば乳成分含有飲料は通常レトルト加熱殺菌処理が行なわれるが、この加熱殺菌処理の通常の条件では耐熱性芽胞形成細菌の芽胞が残存する虞がある。特に、芽胞形成細菌が高温偏性嫌気性菌であれば、芽胞の耐熱性は極めて高いため、当該高温偏性嫌気性菌の混入をできるだけ早い段階で検出することができれば好ましい。また、当該高温偏性嫌気性菌のうち、モーレラ属の細菌に分類されるモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）を原因とする変敗事例が広く公知であるため、モーレラ・サーモアセティカを検出できる検出剤であれば、汎用性が非常に高くなる。
【００３２】
本発明の芽胞形成細菌の検出剤は、上述した蛍光標識脂肪酸エステルを含む態様であれば、緩衝剤、賦形剤、保存剤等を含んだ組成物の態様で供することが可能である。当該組成物に含まれる緩衝剤等は、蛍光標識脂肪酸エステルおよび芽胞形成細菌との結合や、蛍光標識のシグナル強度の検出に影響を与えない成分であれば、何れの成分を使用してもよい。
【００３３】
本発明の芽胞形成細菌の検出方法は、水酸基を有する親水性部とカルボキシル基を有する脂肪酸である疎水性部とをエステル結合させた脂肪酸エステルに蛍光標識を共有結合させた蛍光標識脂肪酸エステル、および、芽胞形成細菌を結合させる結合工程と、当該蛍光標識のシグナル強度を検出するシグナル検出工程と、を有する。
【００３４】
結合工程は、芽胞形成細菌を有する可能性のある食品材料に、蛍光標識脂肪酸エステルを含有する検出剤を添加して混合し、必要に応じて所定時間の撹拌を行うとよい。当該食品材料は、例えば容器詰め食品における飲料製造に使用されるものであり、液体状、ゲル状、粉末状、粒状、固形状等を呈するものを使用することができる。芽胞形成細菌を有する可能性のある食品材料と、蛍光標識脂肪酸エステルを含有する検出剤とは、そのまま直接混合してもよいし、当該検出剤を含む培地を調製した後に食品材料を添加してもよい。当該培地は、例えば変法チオグリコレート培地等を使用できるが、これに限定されるものではない。
【００３５】
この食品材料に芽胞形成細菌が混入している場合、当該芽胞形成細菌および蛍光標識脂肪酸エステルは以下の態様により結合すると考えられる。
【００３６】
即ち、蛍光標識脂肪酸エステルは休眠芽胞に殆ど作用せず、発芽した後の芽胞に作用すると考えられる。休眠芽胞が発芽した後、コートやコルテックスが分解され、水がコアに侵入するようになり、蛍光標識脂肪酸エステルも芽胞内膜に到達する。蛍光標識脂肪酸エステルが膜に結合するときには、膜のリン脂質二重膜に蛍光標識脂肪酸エステルの脂肪酸部分が入り込むと考えられる。
【００３７】
シグナル検出工程では、芽胞形成細菌に結合した蛍光標識脂肪酸エステルにおける蛍光標識のシグナル強度を検出する。蛍光標識を検出するための手段は、当業者に周知である。即ち、適切な波長の光で蛍光色素を励起すること、および、得られた蛍光を検出することによってこの標識は検出され得る（例えばフローサイトメトリー、または当該分野で公知の他の方法）。蛍光は、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子増倍管などのような電子感知器の使用によって視覚的に検出できる。即ち、シグナル検出工程では、フローサイトメーターといった公知の装置を使用して迅速かつ容易にシグナル強度の検出を行うことができる。
【００３８】
以上より、本発明の芽胞形成細菌の検出方法は、未発芽芽胞には蛍光標識脂肪酸エステルは結合せず、発芽後に蛍光標識脂肪酸エステルが芽胞に結合すると考えられるため、増殖可能な芽胞形成細菌（芽胞）を迅速かつ容易に検出することができる。
【実施例】
【００３９】
〔実施例１〕
モーレラ・サーモアセティカの芽胞の調製を行った。
菌株は変敗ミルクコーヒー缶詰から分離した２４−１株とした。培養は変法チオグリコレート寒天培地（ｐＨ７．０、日水製薬株式会社製）の混釈培養法で、５５℃、１０〜１４日間の条件で嫌気培養した。コロニーを採取し、滅菌希釈水に懸濁して菌懸濁液を調製して、１００℃、５分の加熱処理およびリゾチーム処理を行って栄養細胞を選択的に溶解させた。その後、ＳＤＳ処理により純度９５％以上の精製芽胞液を得た。芽胞は直径約１μｍの球形であった。
【００４０】
得られた発芽の挙動を観察した。
発芽の評価は、一般的に濁度低下や耐熱性消失を経時的に測定することで行われている。モーレラ・サーモアセティカの芽胞の発芽を変法チオグリコレート培地中、５５℃で調べた。濁度（ＯＤ650）は１２０分で７０％低下した（結果は示さない）。
耐熱性消失は、経時的にサンプリングし、芽胞を１００℃、５分で加熱処理し、生残したものを耐熱性芽胞数とし、混釈法で５５℃、７日間の条件で嫌気培養した後、形成されたコロニー数で調べた。耐熱性芽胞数は１２０分で９１％低下した（結果は示さない）。
位相差顕微鏡（オリンパス株式会社製）による観察を行った（休眠芽胞は白くキラキラ光って見え、発芽芽胞は暗色化し黒く見える）。０分では大部分の芽胞が休眠状態で２０分、６０分、１２０分と時間経過につれて、暗色化した芽胞数が増加し、発芽しているものと認められた（結果は示さない）。
このように濁度低下、耐熱性消失、位相差顕微鏡観察の３つの方法で、発芽の時間経過はほぼ同じで、２０分で発芽し始め、１２０分で発芽はほぼ完了しているものと認められた。
【００４１】
〔実施例２〕
芽胞の発育に対する脂肪酸エステルの影響を調べた。
（１）培地の脂肪酸エステル濃度と芽胞の発育との関係
芽胞発育に対する脂肪酸エステルの影響を調べた。実施例１で得た精製芽胞を１００℃、５分の条件で加熱活性化した後、脂肪酸エステルを０〜１００ｐｐｍ含有した変法チオグリコレート培地に接種し、５５℃の嫌気条件のもと、経時でサンプリングし、波長６５０ｎｍにおける濁度を分光光度計（株式会社日立製作所製）で測定した。
【００４２】
脂肪酸エステルの濃度が０，１，１０，１００ｐｐｍである場合の濁度変化を図２に示した。脂肪酸エステルの濃度が０，１ｐｐｍでは最初の数時間で濁度低下があるが、これは発芽段階に相当すると考えられた。２４時間以降の濁度増加は栄養増殖に相当すると考えられた。
【００４３】
一方、脂肪酸エステルの濃度が１０，１００ｐｐｍでは、最初の数時間での濁度低下は脂肪酸エステルの濃度が０，１ｐｐｍの場合と同様で、発芽は起こっていると考えられた。しかし２４時間以降の濁度増加は認められず、発芽後の増殖は確認されなかった。よって、脂肪酸エステルの濃度が１０ｐｐｍ以上では発芽段階には影響しないが、増殖はできなくなると考えられた。
【００４４】
（２）脂肪酸エステル作用による芽胞の形態変化
上述したように、脂肪酸エステル１０ｐｐｍでは完全に増殖が抑制されていると認められた。そこで脂肪酸エステル１０ｐｐｍを含有する変法チオグリコレート培地において一定時間インキュベートした芽胞を、透過電子顕微鏡（日本電子株式会社製）で観察した。電子顕微鏡のサンプル作製は凍結置換法で行い、ミクロトームで７０−８０ｎｍの超薄切片を作製した。観察結果を図３に示した。
【００４５】
休眠状態の芽胞では、中心部がコアで、その周りに厚いコルテックスやコートの層が観察される（図３（ａ））。変法チオグリコレート培地に脂肪酸エステルを添加しない場合場合（０ｐｐｍ）、６時間後ではコアは膨潤し、コルテックスやコートは消失し、発芽が完了した。発芽後生育を経て、２４時間後では分裂が始まっており、分裂中の栄養細胞が観察された（図３（ｂ）〜（ｄ））。
【００４６】
変法チオグリコレート培地に脂肪酸エステルを１０ｐｐｍ添加した場合では、６時間後でコルテックスやコートはほぼ消失し、コアが膨潤している点は０ｐｐｍの場合（図３（ｃ））と類似しているが、芽胞の膜の一部に欠損を生じていると認められた（図３（ｅ））。１２時間後では、内部が淡くなっていると認められた（図３（ｆ））。２４時間後では、膜欠損部が大きくなり、内部がさらに淡くなり、コア内容物が漏出していると認められた（図３（ｇ））。
【００４７】
（３）脂肪酸エステルの作用機構（考察）
これまでに得られた実験結果から脂肪酸エステルの作用機構について考察すると、脂肪酸エステルは休眠芽胞に殆ど作用せず、発芽した後の芽胞に作用すると考えられる。休眠芽胞が発芽した後、コートやコルテックスが分解され、水がコアに侵入するようになり、脂肪酸エステルも芽胞内膜に到達する。脂肪酸エステルが膜に結合し、膜に欠損を生じ、コア内容物が漏出する。その結果、増殖できなくなり、死滅すると考えられる。休眠芽胞と発芽芽胞では膜の物理的状態が異なることが知られている。休眠状態での膜は凝縮状態にあるが、発芽しコアが膨潤すると容積も大きくなり、膜が緩んだ状態になる。この状態が細胞膜の通常の状態で、栄養細胞の膜も類似した状態である。本来の細胞膜機能を発揮するには、緩んだ状態でなければならないと考えられる。
【００４８】
従って、脂肪酸エステルが芽胞に作用する段階は発芽以降であり、発芽後生育が起こるまでの間と推測される。また脂肪酸エステルは膜に結合していると考えられる。図４に膜脂肪酸エステルが膜に結合する場合の模式図を示す。膜のリン脂質二重膜に脂肪酸エステルの脂肪酸部分が入り込むと考えられる。比較的少量の脂肪酸エステルの結合では、修復できると思われるが、その修復に長時間を要し、増殖開始が遅れると推測される。脂肪酸エステルの結合量が、ある一定以上になると欠損を生じ、コア内容物も漏出し、増殖できなくなると考えられる。
【００４９】
〔実施例３〕
蛍光標識脂肪酸エステルを用いて芽胞の膜に結合するかどうかを調べた。
（１）蛍光標識脂肪酸エステル
脂肪酸エステルとして、トレハロースとパルミチン酸とがエステル結合したトレハロースパルミチン酸エステルを用いた。トレハロースの水産基に蛍光試薬であるＤＭＥＱ（株式会社同仁化学研究所製）を常法により共有結合させ、蛍光標識したＤＭＥＱ−トレハロースパルミチン酸エステルを合成した（図１）。
【００５０】
蛍光標識したＤＭＥＱ−トレハロースパルミチン酸エステルが脂肪酸エステルの生育阻害効果に影響するかどうかを調べるため、トレハロースパルミチン酸エステルおよびＤＭＥＱ−トレハロースパルミチン酸エステルの最小発育濃度を比較した。
トレハロースパルミチン酸エステル或いはＤＭＥＱ−トレハロースパルミチン酸エステルの何れか一方を含む変法チオグリコレート培地において休眠芽胞を一定時間インキュベートした後、芽胞を蛍光顕微鏡（ＢＺ−Ｘ７００：キーエンス社製）で観察した。結果を表１に示した。
【００５１】
【表１】
0006460811.tif 000002
【００５２】
この結果、ＤＭＥＱ−トレハロースパルミチン酸エステルの最小発育濃度はトレハロースパルミチン酸エステルと同程度であり、トレハロースパルミチン酸エステルの蛍光標識の有無に関わらず、生育阻害作用効果に差は無く、蛍光標識が生育阻害作用に影響することは無いものと認められた。
【００５３】
尚、トレハロース脂肪酸エステルで、脂肪酸が炭素数８のミリスチン酸から１６のパルミチン酸までの５種類のエステル（炭素数８，１０，１２，１４，１６）についてモーレラ・サーモアセティカの芽胞に対する生育阻害作用を調べた結果、パルミチン酸タイプが最も効果が強いことが分かった（結果は示さない）。
【００５４】
また、親水基としてショ糖、グリセリン、アスコルビン酸、トレハロースとさまざまなものについて生育阻害作用を比較したところ、いずれの親水基の場合も同等の効果であり（結果は示さない）、これらの作用機構は同一と推測された。
【００５５】
〔実施例４〕
ＤＭＥＱ−トレハロースパルミチン酸エステルがモーレラ・サーモアセティカの芽胞に結合しているかどうかを位相差顕微鏡（オリンパス株式会社製）或いは蛍光顕微鏡（ＢＺ−Ｘ７００：キーエンス社製）によって観察した。
【００５６】
ＤＭＥＱ−トレハロースパルミチン酸エステルを１０ｐｐｍ含有する変法チオグリコレート培地で５分間インキュベート（５５℃）した休眠芽胞、および、同様の変法チオグリコレート培地で６時間インキュベート（５５℃）した芽胞について比較観察した。結果を図５に示した。
【００５７】
ＤＭＥＱ−トレハロースパルミチン酸エステル含有培地に５分間インキュベートさせた休眠芽胞は休眠状態のままで、未だ発芽していないことは位相差顕微鏡画像（図５（ａ））から判断でき、蛍光顕微鏡観察（図５（ｂ））では蛍光染色されていなかった。従って、休眠状態の芽胞には蛍光脂肪酸エステル（ＤＭＥＱ−トレハロースパルミチン酸エステル）が結合していないと認められた。
【００５８】
一方、ＤＭＥＱ−トレハロースパルミチン酸エステル含有培地に６時間インキュベートさせた芽胞は、ほぼすべて発芽していることは位相差顕微鏡画像（図５（ｃ））から判断でき、蛍光顕微鏡観察（図５（ｄ））では蛍光染色されていた。従って、発芽した芽胞には蛍光脂肪酸エステル（ＤＭＥＱ−トレハロースパルミチン酸エステル）が結合すると認められた。
【００５９】
従って、蛍光標識脂肪酸エステルは休眠芽胞に殆ど作用せず、発芽した後の芽胞に作用すると考えられる。休眠芽胞が発芽した後、コートやコルテックスが分解され、水がコアに侵入するようになり、蛍光標識脂肪酸エステルも芽胞内膜に到達する。蛍光標識脂肪酸エステルが膜に結合するときには、膜のリン脂質二重膜に蛍光標識脂肪酸エステルの脂肪酸部分が入り込むと考えられる。
【００６０】
〔実施例５〕
芽胞への蛍光標識脂肪酸エステル（ＤＭＥＱ−トレハロースパルミチン酸エステル）の結合量をフローサイトメーター（ベイバイオサイエンス株式会社製）で測定した。
【００６１】
フローサイトメーターは、細い流路の中を一つずつ分離した細胞を流し、その細胞にレーザ光を照射し、発せられた蛍光を捕捉し蛍光強度を測定する装置である。蛍光強度は蛍光標識分子の結合量と相関している。
【００６２】
ＤＭＥＱ−トレハロースパルミチン酸エステルを含む変法チオグリコレート培地で６時間インキュベートした芽胞をサンプルとして、横軸に蛍光強度、縦軸にそれぞれの蛍光強度をもつ細胞数をプロットした蛍光ヒストグラムを得た（図６）。培地中の脂肪酸エステル濃度の増加につれて、蛍光ヒストグラムは強度の大きい方にシフトした。蛍光強度の代表値として蛍光ヒストグラムの中央値を用い、培地中の脂肪酸エステル濃度と蛍光強度の関係をプロットしたところ、良好な直線性を示した。すなわち培地中の脂肪酸エステル濃度に比例して蛍光標識脂肪酸エステルは芽胞に結合しているものと認められた。
【００６３】
そのため、本発明の芽胞形成細菌の検出剤を使用することにより、芽胞の量に応じて蛍光標識脂肪酸エステルを結合させることができ、さらに、結合した蛍光標識脂肪酸エステルの量に応じたシグナルを検出することができるため、良好に芽胞を検出することができる。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明は、芽胞形成細菌を検出する検出剤および検出方法に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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