(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンベロープを有するウイルス粒子に由来するウイルス様粒子を含有するワクチンであって、
前記ウイルス様粒子は、粒子構造が固定化されており、
前記ウイルス様粒子の脂質成分の含有量が、前記ウイルス粒子の脂質成分の含有量に対して低減している、ワクチン。
【請求項２】
前記ウイルス様粒子の脂質成分の含有量が、前記ウイルス粒子の脂質成分の含有量を基準として、５０質量％未満である、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記ウイルス様粒子の脂質成分の含有量が、前記ウイルス粒子の脂質成分の含有量を基準として、２０質量％未満である、請求項１又は２に記載のワクチン。
【請求項４】
前記脂質成分がコレステロールである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項５】
前記ウイルス様粒子が、
前記ウイルス粒子の表面抗原、
前記ウイルス粒子のマトリックス蛋白質又は膜蛋白質、及び、
前記ウイルス粒子の核蛋白質、
を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項６】
前記ウイルス様粒子が、前記ウイルス粒子に由来するゲノム核酸を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項７】
前記ウイルス粒子が、オルソミクソウイルス粒子、フラビウイルス粒子、又はＢ型肝炎ウイルス粒子である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項８】
前記ウイルス粒子が、インフルエンザウイルス粒子、日本脳炎ウイルス粒子、又はＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ）粒子である、請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】
前記ウイルス粒子が、インフルエンザウイルス粒子である、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記インフルエンザウイルス粒子が、Ａ型インフルエンザウイルス粒子、又はＢ型インフルエンザウイルス粒子である、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記インフルエンザウイルス粒子が、Ｈ１Ｎ１亜型株、Ｈ２Ｎ２亜型株、Ｈ３Ｎ２亜型株、Ｈ３Ｎ８亜型株、Ｈ５Ｎ１亜型株、Ｈ５Ｎ２亜型株、Ｈ５Ｎ６亜型株、Ｈ６Ｎ１亜型株、Ｈ７Ｎ３亜型株、Ｈ７Ｎ７亜型株、Ｈ７Ｎ９亜型株、Ｈ９Ｎ２亜型株、又はＨ１０Ｎ８亜型株に分類されるインフルエンザウイルス粒子である、請求項９又は１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記表面抗原が、ヘマグルチニン（ＨＡ）又はノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含む、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記マトリックス蛋白質又は膜蛋白質が、Ｍ１蛋白質又はＭ２蛋白質を含む、請求項８〜１２のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記ウイルス様粒子が、前記ウイルス粒子の粒子径の７０〜１３０％の平均粒子径を有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記ウイルス様粒子が、ショ糖密度勾配遠心で測定した場合に、ショ糖濃度３５％以上にピークが検出されるウイルス様粒子である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１６】
ウイルス様粒子を含有するワクチンの製造方法であって、
エンベロープを有するウイルス粒子に対して粒子構造を固定化する工程と、
固定化された前記ウイルス粒子に対して脱脂処理を行う工程と、
を含む、製造方法。
【請求項１７】
前記固定化する工程が、前記ウイルス粒子を含む懸濁液Ａに固定化剤を加える工程を含む、請求項１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記固定化剤がアルデヒド類を含む、請求項１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
前記固定化剤が１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記アルデヒド類が、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２１】
前記アルデヒド類が、ホルムアルデヒドを含む、請求項２０に記載の製造方法。
【請求項２２】
前記ホルムアルデヒドの濃度が、前記懸濁液Ａ及び前記固定化剤の全量を基準として、０．００７〜０．０７６ｗ／ｖ％である、請求項２１に記載の製造方法。
【請求項２３】
前記アルデヒド類が、グルタルアルデヒドを含む、請求項２０に記載の製造方法。
【請求項２４】
前記グルタルアルデヒドの濃度が、前記懸濁液Ａ及び前記固定化剤の全量を基準として、０．００２〜０．０５ｗ／ｖ％である、請求項２３に記載の製造方法。
【請求項２５】
前記脱脂処理を行う工程が、固定化された前記ウイルス粒子を含む懸濁液Ｂに脱脂剤を加える工程を含む、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２６】
前記脱脂剤が、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、酢酸メチル、酢酸エチル、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２５に記載の製造方法。
【請求項２７】
前記脱脂剤が、ジエチルエーテルを含む、請求項２６に記載の製造方法。
【請求項２８】
前記ジエチルエーテルの濃度が、前記懸濁液Ｂ及び前記脱脂剤の全量を基準として、１０ｖｏｌ％以上である、請求項２７に記載の製造方法。
【請求項２９】
前記脱脂剤が界面活性剤を更に含む、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項３０】
前記ウイルス粒子が、培養細胞又は鶏卵に感染させて、回収されたウイルス粒子である、請求項１６〜２９のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項３１】
前記培養細胞が、Ｖｅｒｏ細胞、又はＭＤＣＫ細胞である、請求項３０に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス様粒子を含むワクチンに関する。本発明は、全粒子ウイルスに対して脂質成分の含有量が低減しているウイルス様粒子を含むワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルス及び日本脳炎ウイルス等のウイルスによる感染症は、ウイルスの種類、感染した対象によって、重症化する場合がある。このようなウイルスによる感染症に対する防御の方法として、ワクチンの接種等が知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２００９  ２００（６）８４１−８４８
【非特許文献２】Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００９  ２７（５）７８６−７９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
インフルエンザウイルス及び日本脳炎ウイルス等のウイルスに対するワクチンは不活化ワクチンと生ワクチンとの二種類が製造、市販されている。このうち、不活化ワクチンは、精製したウイルス粒子をホルマリン等の不活化剤で処理して調製する全粒子ワクチンと、精製したウイルス粒子を有機溶媒又は界面活性剤で破壊して調製するスプリットワクチンとに大別される。全粒子ワクチンは免疫原性が高く、感染予防の効果の面では優れている。しかし、全粒子ワクチンは局所反応及び発熱等の副反応が強く出る傾向がある。一方スプリットワクチンは、この副反応の問題を解決するため、ウイルスを有機溶媒又は界面活性剤で破壊（スプリット化）したものを含むワクチンである。スプリットワクチンは、局所反応が低減され、発熱反応もほとんどないため安全性に優れている。しかし、基礎免疫が成立していない小児又は免疫反応が衰えた高齢者において、スプリットワクチンの免疫原性は低い傾向がある。したがって、スプリットワクチンより優れた有効性（免疫原性）、さらに好ましくは全粒子ワクチンに匹敵する有効性が示され、かつ安全性の高いワクチンの開発が望まれている。【０００５】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、免疫原性が高く、かつ副反応が抑えられたワクチンの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究した結果、驚くべきことにウイルスの粒子構造を破壊（スプリット化）せずに、ウイルスエンベロープの脂質成分のみを低減し、それ以外は本来のウイルスと同等の成分及び構造を有するウイルス様粒子が、免疫原性試験及び発熱試験の成績において優れることを見出し、本発明を完成させるに到った。【０００７】
すなわち、本発明は以下の［１］〜［１５］を提供する。
［１］エンベロープを有するウイルス粒子に由来するウイルス様粒子を含有するワクチンであって、
上記ウイルス様粒子の脂質成分の含有量が、上記ウイルス粒子の脂質成分の含有量に対して低減している、ワクチン。
［２］上記ウイルス様粒子の脂質成分の含有量が、上記ウイルス粒子の脂質成分の含有量を基準として、５０質量％未満である、［１］に記載のワクチン。
［３］上記ウイルス様粒子の脂質成分の含有量が、上記ウイルス粒子の脂質成分の含有量を基準として、２０質量％未満である、［１］又は［２］に記載のワクチン。
［４］上記脂質成分がコレステロールである、［１］〜［３］のいずれかに記載のワクチン。
［５］上記ウイルス様粒子が、
上記ウイルス粒子の表面抗原、
上記ウイルス粒子のマトリックス蛋白質又は膜蛋白質、及び、
上記ウイルス粒子の核蛋白質、
を含む、［１］〜［４］のいずれかに記載のワクチン。
［６］上記ウイルス様粒子が、上記ウイルス粒子に由来するゲノム核酸を含む、［１］〜［５］のいずれかに記載のワクチン。
［７］上記ウイルス粒子が、オルソミクソウイルス粒子、フラビウイルス粒子、又はＢ型肝炎ウイルス粒子である、［１］〜［６］のいずれかに記載のワクチン。
［８］上記ウイルス粒子が、インフルエンザウイルス粒子、日本脳炎ウイルス粒子、又はＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ）粒子である、［７］に記載のワクチン。
［９］上記ウイルス粒子が、インフルエンザウイルス粒子である、［８］に記載のワクチン。
［１０］上記インフルエンザウイルス粒子が、Ａ型インフルエンザウイルス粒子、又はＢ型インフルエンザウイルス粒子である、［９］に記載のワクチン。
［１１］上記インフルエンザウイルス粒子が、Ｈ１Ｎ１亜型株、Ｈ２Ｎ２亜型株、Ｈ３Ｎ２亜型株、Ｈ３Ｎ８亜型株、Ｈ５Ｎ１亜型株、Ｈ５Ｎ２亜型株、Ｈ５Ｎ６亜型株、Ｈ６Ｎ１亜型株、Ｈ７Ｎ３亜型株、Ｈ７Ｎ７亜型株、Ｈ７Ｎ９亜型株、Ｈ９Ｎ２亜型株、又はＨ１０Ｎ８亜型株に分類されるインフルエンザウイルス粒子である、［９］又は［１０］に記載のワクチン。
［１２］上記表面抗原が、ヘマグルチニン（ＨＡ）又はノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含む、［８］〜［１１］のいずれかに記載のワクチン。
［１３］上記マトリックス蛋白質又は膜蛋白質が、Ｍ１蛋白質又はＭ２蛋白質を含む、［８］〜［１２］のいずれかに記載のワクチン。
［１４］上記ウイルス様粒子が、上記ウイルス粒子の粒子径の７０〜１３０％の平均粒子径を有する、［１］〜［１３］のいずれかに記載のワクチン。
［１５］上記ウイルス様粒子が、ショ糖密度勾配遠心で測定した場合に、ショ糖濃度３５％以上にピークが検出されるウイルス様粒子である、［１］〜［１４］のいずれかに記載のワクチン。【０００８】
さらに本発明は以下の［１６］〜［５０］を提供する。
［１６］ウイルス様粒子を含有するワクチンの製造方法であって、
エンベロープを有するウイルス粒子に対して粒子構造を固定化する工程と、
固定化された上記ウイルス粒子に対して脱脂処理を行う工程と、
を含む、製造方法。
［１７］上記固定化する工程が、上記ウイルス粒子を含む懸濁液Ａに固定化剤を加える工程を含む、［１６］に記載の製造方法。
［１８］上記固定化剤がアルデヒド類を含む、［１７］に記載の製造方法。
［１９］上記固定化剤が１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）を含む、［１７］に記載の製造方法。
［２０］上記アルデヒド類が、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、及びそれらの組合せからなる群から選択される、［１８］に記載の製造方法。
［２１］上記アルデヒド類が、ホルムアルデヒドを含む、［２０］に記載の製造方法。
［２２］上記ホルムアルデヒドの濃度が、上記懸濁液Ａ及び上記固定化剤の全量を基準として、０．００７〜０．０７６ｗ／ｖ％である、［２１］に記載の製造方法。
［２３］上記アルデヒド類が、グルタルアルデヒドを含む、［２０］に記載の製造方法。
［２４］上記グルタルアルデヒドの濃度が、上記懸濁液Ａ及び上記固定化剤の全量を基準として、０．００２〜０．０５ｗ／ｖ％である、［２３］に記載の製造方法。
［２５］上記脱脂処理を行う工程が、固定化された上記ウイルス粒子を含む懸濁液Ｂに脱脂剤を加える工程を含む、［１６］〜［２４］のいずれかに記載の製造方法。
［２６］上記脱脂剤が、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、酢酸メチル、酢酸エチル、及びそれらの組合せからなる群から選択される、［２５］に記載の製造方法。
［２７］上記脱脂剤が、ジエチルエーテルを含む、［２６］に記載の製造方法。
［２８］上記ジエチルエーテルの濃度が、上記懸濁液Ｂ及び上記脱脂剤の全量を基準として、１０ｖｏｌ％以上である、［２７］に記載の製造方法。
［２９］上記脱脂剤が界面活性剤を更に含む、［２５］〜［２８］のいずれかに記載の製造方法。
［３０］上記ウイルス粒子が、培養細胞又は鶏卵に感染させて、回収されたウイルス粒子である、［１６］〜［２９］のいずれかに記載の製造方法。
［３１］上記培養細胞が、Ｖｅｒｏ細胞、又はＭＤＣＫ細胞である、［３０］に記載の製造方法。
［３２］ウイルスによる感染症を予防する方法であって、
エンベロープを有するウイルス粒子に由来するウイルス様粒子を含有するワクチンを対象に投与する工程を含み、
上記ウイルス様粒子の脂質成分の含有量が、上記ウイルス粒子の脂質成分の含有量に対して低減している、方法。
［３３］上記対象が哺乳動物である、［３２］に記載の方法。
［３４］上記対象がヒトである、［３２］に記載の方法。
［３５］上記ウイルス様粒子の脂質成分の含有量が、上記ウイルス粒子の脂質成分の含有量を基準として、５０質量％未満である、［３２］〜［３４］のいずれかに記載の方法。
［３６］上記ウイルス様粒子の脂質成分の含有量が、上記ウイルス粒子の脂質成分の含有量を基準として、２０質量％未満である、［３２］〜［３５］のいずれかに記載の方法。
［３７］上記脂質成分がコレステロールである、［３２］〜［３６］のいずれかに記載の方法。
［３８］上記ウイルス様粒子が、
上記ウイルス粒子の表面抗原、
上記ウイルス粒子のマトリックス蛋白質又は膜蛋白質、及び、
上記ウイルス粒子の核蛋白質、
を含む、［３２］〜［３７］のいずれかに記載の方法。
［３９］上記ウイルス様粒子が、上記ウイルス粒子に由来するゲノム核酸を含む、［３２］〜［３８］のいずれかに記載の方法。
［４０］上記ウイルス粒子が、オルソミクソウイルス粒子、フラビウイルス粒子、又はＢ型肝炎ウイルス粒子である、［３２］〜［３９］のいずれかに記載の方法。
［４１］上記ウイルス粒子が、インフルエンザウイルス粒子、日本脳炎ウイルス粒子、又はＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ）粒子である、［４０］に記載の方法。
［４２］上記ウイルス粒子が、インフルエンザウイルス粒子である、［４１］に記載の方法。
［４３］上記インフルエンザウイルス粒子が、Ａ型インフルエンザウイルス粒子、又はＢ型インフルエンザウイルス粒子である、［４２］に記載の方法。
［４４］上記インフルエンザウイルス粒子が、Ｈ１Ｎ１亜型株、Ｈ２Ｎ２亜型株、Ｈ３Ｎ２亜型株、Ｈ３Ｎ８亜型株、Ｈ５Ｎ１亜型株、Ｈ５Ｎ２亜型株、Ｈ５Ｎ６亜型株、Ｈ６Ｎ１亜型株、Ｈ７Ｎ３亜型株、Ｈ７Ｎ７亜型株、Ｈ７Ｎ９亜型株、Ｈ９Ｎ２亜型株、又はＨ１０Ｎ８亜型株に分類されるインフルエンザウイルス粒子である、［４２］又は［４３］に記載の方法。
［４５］上記表面抗原が、ヘマグルチニン（ＨＡ）又はノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含む、［４１］〜［４４］のいずれかに記載の方法。
［４６］上記マトリックス蛋白質又は膜蛋白質が、Ｍ１蛋白質又はＭ２蛋白質を含む、［４１］〜［４５］のいずれかに記載の方法。
［４７］上記ウイルス様粒子が、上記ウイルス粒子の粒子径の７０〜１３０％の平均粒子径を有する、［３２］〜［４６］のいずれかに記載の方法。
［４８］上記ウイルス様粒子が、ショ糖密度勾配遠心で測定した場合に、ショ糖濃度３５％以上にピークが検出されるウイルス様粒子である、［３２］〜［４７］のいずれかに記載の方法。
［４９］ウイルスに対するワクチンの製造における、エンベロープを有するウイルス粒子に由来するウイルス様粒子の使用であって、
上記ウイルス様粒子の脂質成分の含有量が、上記ウイルス粒子の脂質成分の含有量に対して低減している、使用。
［５０］ウイルスによる感染症を予防するための、エンベロープを有するウイルス粒子に由来するウイルス様粒子であって、
上記ウイルス様粒子の脂質成分の含有量が、上記ウイルス粒子の脂質成分の含有量に対して低減している、ウイルス様粒子。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、免疫原性が高く、かつ副反応が抑えられたワクチンの提供が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】インフルエンザウイルス粒子及びこれに由来するウイルス様粒子を電子顕微鏡で撮影した写真である（ホルマリン処理）。
【図２】インフルエンザウイルス粒子由来のウイルス様粒子における、マトリックス蛋白質（Ｍ１）と核蛋白質（ＮＰ）の有無を示すＳｌｏｔ−ｂｌｏｔ法の結果を示す写真である。
【図３】インフルエンザウイルス粒子由来のウイルス様粒子における、ヘマグルチニン（ＨＡ）、マトリックス蛋白質（Ｍ１）と核蛋白質（ＮＰ）の有無を示すＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔ法の結果を示す写真である。
【図４】インフルエンザウイルス粒子由来のウイルス様粒子におけるゲノムＲＮＡの有無を確認したアガロースゲル電気泳動の写真である。
【図５】インフルエンザウイルス粒子及びこれに由来するウイルス様粒子を電子顕微鏡で撮影した写真である（グルタルアルデヒド処理）。
【図６】インフルエンザウイルス粒子及びこれに由来するウイルス様粒子を電子顕微鏡で撮影した写真である（ＥＤＣ処理）。
【図７】日本脳炎ウイルス粒子及びこれに由来するウイルス様粒子を電子顕微鏡で撮影した写真である（グルタルアルデヒド処理）。
【図８】組換え沈降Ｂ型肝炎ウイルス様粒子及びこれに由来するウイルス様粒子を電子顕微鏡で撮影した写真である（ホルマリン処理）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１２】
（ウイルス様粒子を含有するワクチン）
本実施形態に係るワクチンは、エンベロープを有するウイルス粒子（以下、「エンベロープウイルス粒子」という場合がある。）に由来するウイルス様粒子を含有するワクチンであって、上記ウイルス様粒子の脂質成分の含有量が、上記ウイルス粒子の脂質成分の含有量に対して低減している。上記ワクチンの免疫原性は、スプリットワクチンの免疫原性以上であり、全粒子ワクチンの免疫原性と同等以上であってもよい。上記ワクチンは、局所反応及び発熱等の副反応がスプリットワクチンと同等以上に抑えられる。
【００１３】
「エンベロープを有するウイルス粒子に由来するウイルス様粒子」（以下、単に「ウイルス様粒子」という場合がある。）とは、エンベロープを有するウイルス粒子を改変することで得られ、上記ウイルス粒子に類似の外部構造及び内部構造を有する構造体を意味する。本実施形態に係るウイルス様粒子は、その由来となっている元のウイルス粒子と同等の粒子性を維持するよう粒子構造が固定化されていてもよい。
【００１４】
エンベロープウイルス粒子に含まれる脂質成分としては、例えば、コレステロール、フォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン、スフィンゴミエリン等が挙げられる。上記脂質成分はコレステロールであってもよい。
【００１５】
上記脂質成分の含有量は、公知の方法によって測定が可能である。例えば、コレステロールオキシダーゼ・ＤＡＯＳ法、蛍光色素法、質量分析法等が挙げられる。
【００１６】
例えば蛍光色素法で測定した場合、上記ウイルス様粒子の脂質成分の含有量は、上記ウイルス粒子の脂質成分の含有量を基準として、８０質量％以下であってもよく、７５質量％以下であってもよく、７０質量％以下であってもよく、６０質量％以下であってもよく、５０質量％以下であってもよく、５０質量％未満であってもよく、４０質量％以下であってもよく、３０質量％以下であってもよく、２０質量％以下であってもよく、２０質量％未満であってもよい。上記ウイルス様粒子の脂質成分の含有量が上記ウイルス粒子の脂質成分の含有量を基準として、上述した範囲内であると、ワクチンとしてウイルス様粒子を接種した場合、発熱反応等の副反応が更に抑制しやすい傾向がある。上記ウイルス様粒子の脂質成分の含有量の下限は特に制限はないが、例えば、上記ウイルス粒子の脂質成分の含有量を基準として、１質量％以上であってもよく、５質量％以上であってもよく、１０質量％以上であってもよく、１５質量％以上であってもよい。
【００１７】
エンベロープを有するウイルス粒子としては、例えば、ポックスウイルス粒子、ヘルペスウイルス粒子、オルソミクソウイルス粒子、パラミクソウイルス粒子、ラブドウイルス粒子、コロナウイルス粒子、アレナウイルス粒子、トガウイルス粒子、フラビウイルス粒子、ブニヤウイルス粒子、レトロウイルス粒子、ヘパドナウイルス粒子及びＢ型肝炎ウイルス粒子が挙げられる。上記ウイルス粒子は、粒子構造を固定化させる上で、表面抗原と、マトリックス蛋白質又は膜蛋白質と、を有するウイルス粒子であってもよい。このようなウイルス粒子としては、例えば、オルソミクソウイルス粒子、パラミクソウイルス粒子、ラブドウイルス粒子及びフラビウイルス粒子が挙げられる。上記オルソミクソウイルス粒子は、インフルエンザウイルス粒子であってもよい。上記フラビウイルス粒子は、日本脳炎ウイルス粒子であってもよい。上記Ｂ型肝炎ウイルス粒子は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ）粒子であってもよい。
【００１８】
インフルエンザウイルス粒子としては、例えば、Ａ型インフルエンザウイルス粒子及びＢ型インフルエンザウイルス粒子が挙げられる。Ａ型インフルエンザウイルス粒子の場合には、例えば、Ｈ１Ｎ１亜型株、Ｈ２Ｎ２亜型株、Ｈ３Ｎ２亜型株、Ｈ３Ｎ８亜型株、Ｈ５Ｎ１亜型株、Ｈ５Ｎ２亜型株、Ｈ５Ｎ６亜型株、Ｈ６Ｎ１亜型株、Ｈ７Ｎ３亜型株、Ｈ７Ｎ７亜型株、Ｈ７Ｎ９亜型株、Ｈ９Ｎ２亜型株、又はＨ１０Ｎ８亜型株に分類されるインフルエンザ粒子が挙げられる。
【００１９】
ウイルス様粒子は、ウイルス粒子の表面抗原、ウイルス粒子のマトリックス蛋白質又は膜蛋白質、及び、ウイルス粒子の核蛋白質、を含んでいてもよい。このような構成を取ることによって、免疫原性が更に向上する傾向がある。
【００２０】
ウイルス粒子がインフルエンザウイルス粒子である場合、上記表面抗原としては、例えば、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）が挙げられる。
【００２１】
ウイルス粒子がインフルエンザウイルス粒子である場合、上記マトリックス蛋白質としては、例えば、Ｍ１蛋白質が挙げられる。上記膜蛋白質としては、例えば、Ｍ２蛋白質が挙げられる。
【００２２】
ウイルス様粒子は、ウイルス粒子に由来するゲノム核酸を含んでいてもよい。上記ウイルス様粒子の上記ゲノム核酸の含有量は、上記ウイルス粒子（又は不活化全粒子ウイルス）の上記ゲノム核酸の含有量を基準として、５０質量％以上であってもよく、８０質量％以上であってもよく、８５質量％以上であってもよく、９０質量％以上であってもよく、９５質量％以上であってもよく、１００質量％であってもよい。上記ウイルス様粒子の上記ゲノム核酸の含有量の上限は、特に制限はないが、上記ウイルス粒子の上記ゲノム核酸の含有量を基準として、１００質量％以下であってもよく、９９質量％以下であってもよく、９５質量％以下であってもよい。
【００２３】
上記ゲノム核酸の含有量は、公知の方法によって測定が可能である。例えば、蛍光法、吸光度法、ＰＣＲ法等が挙げられる。
【００２４】
従来、ウイルス粒子を構成する表面抗原、マトリックス蛋白質、又は膜蛋白質をコードする遺伝子を宿主内（例えば、酵母細胞、昆虫細胞等）へ導入して、それらの蛋白質を宿主内で発現させた後にウイルス粒子を形成させる、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の作製方法が知られている。このような遺伝子組換え技術で得られたＶＬＰには、ウイルス由来のゲノム核酸及び核蛋白質は含まれていない。一方、本実施形態に係るウイルス様粒子は、後述するように、ウイルス粒子自体を宿主へ感染、増殖させた後、得られたウイルス粒子に対して後述する固定化処理及び脱脂処理を施して作製する。そのため、本実施形態に係るウイルス様粒子は、遺伝子組換え技術で作製したＶＬＰとは異なり、ウイルス粒子由来のゲノム核酸及び核蛋白質を含むことが可能である。
【００２５】
ウイルス粒子由来のゲノム核酸はアジュバントとして作用し得る。例えば、不活化ポリオウイルスワクチンにはウイルスゲノムＲＮＡを含むＤ抗原と、ウイルスゲノムＲＮＡを含まないＣ抗原がある。Ｃ抗原は免疫原性が弱くワクチン抗原としての効果を示さない。ワクチン抗原として効果を有する分子種はＤ抗原のみである。このことはワクチンに内包されたウイルスゲノムＲＮＡがその効果の発現に重要であることを示唆している。そのため、本実施形態に係るウイルス様粒子は、ワクチンの免疫原性を更に向上させる観点からウイルス粒子由来のゲノム核酸を含有してもよい。核蛋白質は、ウイルスに対する細胞障害性Ｔ細胞等の細胞性免疫を誘導し、ウイルス排除に効果を示すことから、本実施形態に係るウイルス様粒子は核蛋白質を含んでいてもよい。
【００２６】
本実施形態に係るウイルス様粒子は、Ｔｈ１型応答を誘導し得る。スプリットインフルエンザワクチンがＴｈ２型応答を誘導することとは対照的である。マウスにおいてＴｈ１型応答によって誘導されるＩｇＧ２ａサブクラスの抗体は、Ｔｈ２型応答によって誘導されるＩｇＧ１サブクラスの抗体よりもインフルエンザウイルスに対する感染防御能が優れている。このことから、上記ウイルス様粒子による有効性のさらなる向上が期待できる。すなわち、上記ウイルス様粒子は、マウスにおいて抗原特異的ＩｇＧ１よりも抗原特異的ＩｇＧ２ａを誘導してもよい。
【００２７】
ウイルス様粒子は、ショ糖密度勾配遠心、高速液体クロマトグラフィー、及び／又は動的光散乱法によって測定した場合、由来となる元のウイルス粒子と実質的に同一のパラメーター（例えば、分子量、平均粒子径、密度、ヘマグルチニン（ＨＡ）含量等）であってもよい。
【００２８】
例えば、ウイルス様粒子が、由来となっている元のウイルス粒子の粒子径の７０〜１３０％の平均粒子径を有するウイルス様粒子であってもよく、８０〜１２０％の平均粒子径を有するウイルス様粒子であってもよい。
【００２９】
ウイルス様粒子が、インフルエンザウイルス粒子に由来する場合、ウイルス様粒子の平均粒子径は、動的光散乱法で測定した場合に１２０ｎｍ前後であってもよく、１１０ｎｍ〜１３０ｎｍであってもよく、１２０ｎｍ〜１３０ｎｍであってもよい。他の側面において、ウイルス様粒子が、インフルエンザウイルス粒子に由来する場合、ウイルス様粒子の平均粒子径は、動的光散乱法で測定した場合に９５ｎｍ以上であってもよく、１００ｎｍ以上であってもよく、１１０ｎｍ以上であってもよく、１２０ｎｍ以上であってもよく、１３０ｎｍ以上であってもよい。上記平均粒子径は、１４５ｎｍ以下であってもよく、１４０ｎｍ以下であってもよく、１３０ｎｍ以下であってもよい。ウイルス様粒子が、日本脳炎ウイルス粒子に由来する場合、ウイルス様粒子の平均粒子径は、動的光散乱法で測定した場合に９５ｎｍ前後であってもよく、８０ｎｍ〜１２０ｎｍであってもよい。ウイルス様粒子が、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ）粒子に由来する場合、ウイルス様粒子の平均粒子径は、動的光散乱法で測定した場合に１００ｎｍ前後であってもよく、９０ｎｍ〜１６０ｎｍであってもよい。
【００３０】
ウイルス様粒子は、ショ糖密度勾配遠心で測定した場合に、ショ糖濃度３５％以上にピークが検出されるウイルス様粒子であってもよく、ショ糖濃度４５％以上５５％以下にピークが検出されるウイルス様粒子であってもよく、ショ糖濃度４９％以上５２％以下にピークが検出されるウイルス様粒子であってもよい。上記ショ糖濃度は、公知の方法によって求めることが可能である。例えば、ウイルス様粒子を含む検体を１５〜６０％のショ糖密度勾配に重層し、４℃、１８０００ｒｐｍで１６時間、遠心分離を行うことで上記ショ糖濃度を求めることができる。
【００３１】
ワクチンに含まれるウイルス様粒子の量は、ウイルスの種類又は投与対象に応じて適宜選択してもよい。例えば、ワクチンに含まれるウイルス様粒子の量（濃度）は、ヘマグルチニン濃度として、ウイルス株あたり１〜４０μｇ／ｍｌであってもよい。
【００３２】
ワクチンは、同じ種類のウイルス又は細菌に由来する抗原を含む、単味ワクチンであってもよい。ワクチンは、複数の種類のウイルス又は細菌に由来する抗原を含む、混合ワクチンであってもよい。ワクチンは、同じ属のウイルス又は細菌であって、複数の種類の型に由来する抗原を含む、多価ワクチンであってもよい。例えば、ワクチンがインフルエンザウイルスワクチンである場合、Ａ型インフルエンザウイルス様粒子又はＢ型インフルエンザウイルス様粒子のいずれかを含んでいてもよく、それらを両者とも含んでいてもよい。上記インフルエンザウイルスワクチン又は日本脳炎ウイルスワクチンは、他のウイルス又は細菌に由来する抗原を含んでいてもよい。例えば、ジフテリア・百日せき・破傷風・不活化ポリオウイルス混合ワクチン（ＤＰＴ−ＩＰＶワクチン）に混合されていてもよい。
【００３３】
ワクチンの剤形は、例えば、液状、粉末状（凍結乾燥粉末、乾燥粉末）、カプセル状、錠剤、凍結状態であってもよい。
【００３４】
ワクチンは、医薬として許容されうる担体を含んでいてもよい。上記担体としては、ワクチン製造に通常用いられる担体を制限なく使用することができる。具体的には、上記担体は、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、等張水性緩衝液及びそれらの組み合わせが挙げられる。ワクチンは、乳化剤、保存剤（例えば、チメロサール）、等張化剤、ｐＨ調整剤、不活化剤（例えば、ホルマリン）等が、更に適宜配合されてもよい。
【００３５】
ワクチンの投与経路は、例えば、経皮投与、舌下投与、点眼投与、皮内投与、筋肉内投与、経口投与、経腸投与、経鼻投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、口から肺への吸入投与であってもよい。
【００３６】
ワクチンの投与方法は、例えば、シリンジ、経皮的パッチ、マイクロニードル、移植可能な徐放性デバイス、マイクロニードルを付けたシリンジ、無針装置、又はスプレーによって投与する方法であってもよい。
【００３７】
ワクチンの免疫原性をさらに高めるために、ワクチンがウイルス様粒子と共にアジュバントを含むことも可能である。アジュバントとしては、例えば、アルミニウムアジュバント又はスクアレンを含む水中油型乳濁アジュバント（ＡＳ０３、ＭＦ５９等）、ＣｐＧ及び３−Ｏ−脱アシル化−４’−モノホスホリル  ｌｉｐｉｄ  Ａ（ＭＰＬ）等のＴｏｌｌ様受容体のリガンド、サポニン系アジュバント、ポリγ−グルタミン酸等のポリマー系アジュバント、キトサン及びイヌリン等の多糖類が挙げられる。
【００３８】
対象となる哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒト等が挙げられる。本実施形態に係るワクチンは、ヒトに対して用いられてもよく、５歳未満の小児、６５歳以上の高齢者に対して用いられてもよい。
【００３９】
ワクチンは、投与の目的、投与方法、投与対象の状況（性別、年齢、体重、病状等）によって異なるが、ヒトに対して投与される場合、１回当り、３．８μｇＨＡ〜３０μｇＨＡの有効成分（ウイルス様粒子）が、投与されるように用いられてもよい。
【００４０】
（ワクチンの製造方法）
本実施形態に係るウイルス様粒子を含有するワクチンの製造方法は、エンベロープを有するウイルス粒子に対して粒子構造を固定化する工程と、固定化された上記ウイルス粒子に対して脱脂処理を行う工程を含む。
【００４１】
ワクチンの安全性を高める技術として、従来から、界面活性剤又は有機溶媒を使ってエンベロープを有するウイルス粒子を破壊（スプリット化）する方法が知られている。しかしながら、これらの方法では粒子の崩壊に伴いワクチンの有効性（免疫原性）が低下する傾向がある。上記製造法では、脱脂処理を行う前に、ウイルス粒子を固定化しているため、脱脂処理によってもウイルス粒子構造が維持され、結果的に、ワクチンの有効性を維持しつつ、安全性を高めることが可能になる。
【００４２】
上記製造方法には、宿主を培養する工程、ウイルスを宿主へ感染させる工程、宿主内でウイルスを増殖させる工程、又は宿主からウイルス粒子を回収する工程を更に含んでいてもよい。
【００４３】
ウイルス粒子は、宿主にウイルス粒子を感染、増殖させた後に、宿主から回収されたウイルス粒子であってもよい。宿主はウイルス粒子の種類に応じて適宜選択してもよい。ウイルス粒子がインフルエンザウイルス粒子である場合には、宿主としては例えば、培養細胞、鶏卵が挙げられる。培養細胞としては、例えば、Ｖｅｒｏ細胞及びＭＤＣＫ細胞が挙げられる。
【００４４】
インフルエンザウイルスの感染、増殖方法としては、鶏卵又はＶｅｒｏ細胞を宿主として用いる方法（Ｖａｃｃｉｎｅ．  １９９８  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；１６（９−１０）：９６０−８．）、Ｖｅｒｏ細胞を宿主として用いる方法（Ｖａｃｃｉｎｅ．  ２００７  Ａｕｇｕｓｔ  １０；  ２５（３２）：  ６０２８−６０３６．）、ＭＤＣＫ細胞を宿主として用いる方法（Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ２０１２  Ｎｏｖ；８６（２２）：１２３４１−５０）が、当業者にとって公知の方法である。
【００４５】
エンベロープを有するウイルス粒子に対して粒子構造を固定化する工程
本実施形態において「固定化」とは、表面抗原同士、表面抗原とマトリックス蛋白質（若しくは膜蛋白質）、又はマトリックス蛋白質同士（若しくは膜蛋白質同士）を化学的に結合させ、ウイルス粒子の粒子構造を保持することを意味する。ウイルス様粒子は、ウイルス本来の粒子構造を保持することによって、ウイルス様粒子の免疫原性がスプリットワクチンの免疫原性以上であり、作製条件によっては不活化全粒子ウイルスの免疫原性と同等以上となると本発明者らは考えている。粒子構造の保持は、電子顕微鏡解析、ショ糖密度勾配遠心、又は動的光散乱法、ＨＡ、ＮＰ若しくはＭ１に対する抗体を用いた検出法（Ｓｌｏｔ  ｂｌｏｔ、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ等）によって、確認することが可能である。
【００４６】
上記固定化する工程は、ウイルス粒子を固定化剤で処理する方法が例示され、例えば、ウイルス粒子を含む懸濁液Ａに固定化剤を加える工程が挙げられる。固定化剤の種類は、ウイルスの種類に応じて適宜変更できる。例えば、上記固定化剤は、有機溶媒、アルデヒド類、ジイミドエステル、ビス（３，５−ジブロモサリチル）フマレート（ＤＢＢＦ）、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）、及びそれらの組合せが挙げられる。有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、アセトン、及びそれらの組合せが挙げられる。アルデヒド類としては、例えば、ホルムアルデヒド（例えば、ホルマリン）、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、及びそれらの組合せが挙げられる。
【００４７】
固定化剤の濃度は、ウイルスの種類、固定化剤の種類に応じて適宜変更してもよい。固定化剤が、ホルムアルデヒドを含む場合、ホルムアルデヒドの濃度は、懸濁液Ａ及び固定化剤の全量を基準として、０．００７〜０．０７６ｗ／ｖ％であってもよい。上記ホルムアルデヒドの濃度が０．００７ｗ／ｖ％未満である場合、固定化が弱くなり、粒子構造が保持されにくい傾向がある。上記ホルムアルデヒドの濃度が０．０７６ｗ／ｖ％を超える場合、固定化が強く、架橋による化学修飾が進み過ぎる傾向がある。ＨＡ活性を更に向上させる観点から、ホルムアルデヒドの濃度は、懸濁液Ａ及び固定化剤の全量を基準として、０．０１７５〜０．０７６ｗ／ｖ％であってもよく、０．０２８〜０．０７６ｗ／ｖ％であってもよい。ホルムアルデヒドを含む固定化剤を用いる方法は、ウイルス粒子がインフルエンザ粒子である場合に用いてもよい。
【００４８】
固定化剤がホルマリン（３５〜３８%ホルムアルデヒド水溶液）である場合、ホルマリン濃度は、懸濁液Ａ及び固定化剤の全量を基準として、０．０２〜０．２ｖｏｌ％であってもよく、０．０５〜０．２ｖｏｌ％であってもよく、０．０８〜０．２ｖｏｌ％であってもよい。
【００４９】
固定化剤が、グルタルアルデヒドを含む場合、グルタルアルデヒドの濃度が、懸濁液Ａ及び固定化剤の全量を基準として、０．００２〜０．０５ｗ／ｖ％であってもよく、０．００５〜０．０１ｗ／ｖ％であってもよい。上記濃度が０．００２ｗ／ｖ％未満である場合、ウイルス粒子として日本脳炎ウイルス粒子を用いたとき粒子が凝集する傾向がある。上記濃度が０．０５ｗ／ｖ％を超える場合、ウイルス粒子として日本脳炎ウイルス粒子を用いたとき、主要構造タンパク質であるＥタンパク質のエピトープが失活する傾向がある。固定化剤としてグルタルアルデヒドを用いる方法は、ウイルス粒子がインフルエンザ粒子、日本脳炎ウイルス粒子である場合に用いてもよい。
【００５０】
固定化剤が、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）を含む場合、ＥＤＣの濃度が、懸濁液Ａの全量を基準として、０．００５〜０．５Ｍであってもよく、０．００５〜０．０５Ｍであってもよい。ＥＤＣを含む固定化剤を用いる方法は、ウイルス粒子がインフルエンザ粒子である場合に用いてもよい。
【００５１】
固定化剤で処理するときの温度は、ウイルスの種類、固定化剤の種類、固定化剤の濃度等に応じて適宜変更してもよい。上記温度は４℃から３７℃であってもよく、２５℃〜３７℃であってもよい。
【００５２】
固定化剤で処理するときの期間（処理時間）は、ウイルスの種類、固定化剤の種類、固定剤の濃度、固定化処理の温度等に応じて適宜変更してもよい。上記期間は、１日から６週間であってもよく、１週間から４週間であってもよい。固定化剤としてＥＤＣを用いる場合、上記期間は、０．５時間〜４時間であってもよく、１．５時間〜２．５時間であってもよい。
【００５３】
固定化されたウイルス粒子に対して脱脂処理を行う工程
脱脂処理を行う工程は、固定化されたウイルス粒子を脱脂剤で処理する方法が例示され、例えば、固定化されたウイルス粒子を含む懸濁液Ｂに脱脂剤を加える工程が挙げられる。脱脂剤の種類は、ウイルスの種類に応じて適宜変更してもよい。例えば、上記脱脂剤はジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、酢酸メチル、酢酸エチル、及びそれらの組合せが挙げられる。脱脂剤で処理する際の濃度は、ウイルスの種類又は脱脂剤の種類に応じて適宜変更してもよい。脱脂剤の濃度は、懸濁液Ｂ及び脱脂剤の全量を基準として、１０ｖｏｌ％以上４００ｖｏｌ％以下であってもよい。上記脱脂剤の濃度が１０ｖｏｌ％未満である場合、脱脂が不完全となる傾向がある。上記脱脂剤の濃度が４００ｖｏｌ％を超える場合、ウイルス粒子の構造が保持されなくなる傾向がある。脱脂剤がジエチルエーテルを含む場合、ジエチルエーテルの濃度は、懸濁液Ｂ及び脱脂剤の全量を基準として、１０ｖｏｌ％以上であってもよく、１２．５ｖｏｌ％〜５０ｖｏｌ％であってもよく、３３ｖｏｌ％〜５０ｖｏｌ％であってもよい。
【００５４】
脱脂剤は界面活性剤を含んでいてもよい。ウイルス様粒子同士の凝集が抑えられ、収率が向上する傾向がある。界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリソルベート８０、及びそれらの組合せが挙げられる。脱脂剤に含まれる界面活性剤の濃度は、０．００２ｖｏｌ％〜０．３ｖｏｌ％であってもよく、０．００５ｖｏｌ％〜０．１ｖｏｌ％であってもよい。
【００５５】
脱脂剤で処理するときの温度は、ウイルスの種類、脱脂剤の種類、脱脂剤の濃度等に応じて適宜変更してもよい。上記温度は、４℃から常温（２５℃）であってもよい。
【００５６】
脱脂剤で処理するときの期間（処理時間）は、ウイルスの種類、脱脂剤の種類、脱脂剤の濃度、脱脂処理の温度等に応じて適宜変更してもよい。上記期間は１時間から２時間であってもよい。
【００５７】
上記製造方法において、脱脂処理後に脱脂剤を除去する工程を更に含んでいてもよい。脱脂剤がジエチルエーテルである場合には、例えば、懸濁液Ｂ及び脱脂剤との混合液を、４℃、３０００ｒｐｍにて、５分間遠心した後、水相を回収する方法が挙げられる。
【００５８】
必要に応じて、回収したウイルス様粒子を精製する工程を更に含んでいてもよい。ウイルス様粒子を精製する方法としては、公知の方法によって適宜行うことが可能であるが、例えば、限外ろ過膜を用いてろ過する方法が挙げられる。
【００５９】
ワクチン接種では、実際の感染時と同様の免疫の質と量を対象に賦与できることが好ましく、実際の感染によって起こる免疫に対するワクチンによって誘導される免疫の模倣性がその効果を決定する。ワクチン中には感染防御のための抗原としてのウイルス蛋白質が全て含まれていてもよい。ウイルス蛋白質の免疫原性を高めるためのウイルス由来のゲノム核酸の存在、ウイルス粒子の大きさ、形等が、それぞれで免疫応答に働いていることを踏まえれば、最良のワクチンとは実際のウイルスにより近い成分及び構造を有するものであると本発明者らは考えている。本実施形態に係るウイルス様粒子は、ウイルスエンベロープの脂質成分のみを低減し、それ以外は本来のウイルス粒子と同等の成分及び構造を有するため、免疫原性が高く、かつ副反応が抑えられたワクチンの提供が可能になる。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例によって本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。【００６１】
［実施例１］
インフルエンザウイルス様粒子の調製
１．ホルマリン処理（ウイルス粒子に対して粒子構造を固定化する工程）
Ｂ型インフルエンザウイルス（Ｂ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１１株、以下、「Ｂ／ＷＣ株」と記載することがある。）を１１日齢の発育鶏卵の漿尿膜腔内に接種し、３４℃で２日間培養した。得られた漿尿液を清澄化した後、遠心分離によってインフルエンザウイルス粒子を沈殿させた。上記インフルエンザウイルス粒子をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で再浮遊させ、ショ糖密度勾配遠心で、ショ糖濃度が３３％〜５０％である画分を回収することによって精製した。精製したインフルエンザウイルス粒子の蛋白質の濃度が終濃度５００μｇ／ｍＬとなるように、得られた画分を希釈し、懸濁液Ａを得た。その後、最終濃度が０．０２〜０．２ｖｏｌ％（ホルムアルデヒド換算で、０．００７〜０．０７６ｗ／ｖ％）となるようにホルマリン（３５〜３８ｗ／ｖ％ホルムアルデヒド水溶液、固定化剤）を懸濁液Ａに添加し、４℃で４週間若しくは６週間、又は、２５℃で１週間反応させた。反応終了後、ＰＢＳで反応液を透析し、ホルマリンを除くことで、固定化されたインフルエンザウイルス粒子を含む懸濁液Ｂを得た。【００６２】
２．エーテル処理（固定化されたウイルス粒子に対して脱脂処理を行う工程）
ホルマリン処理を行った上記インフルエンザウイルス粒子を含む懸濁液Ｂに、最終濃度が０．１ｖｏｌ％になるようにポリソルベート８０を添加した。その後最終濃度が５０ｖｏｌ％となるように、上記懸濁液Ｂと等容のジエチルエーテル（脱脂剤）を添加し、４℃で２時間撹拌した。その後、得られた混合液を４℃、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行って、水相を回収することによってエーテル相を除いた。以上の工程によって、検体であるインフルエンザウイルス様粒子を調製した。
予備実験として、得られたインフルエンザウイルス様粒子の脂質成分の含有量をコレステロールオキシダーゼ・３，５−ジメトキシ−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ハイドロキシ−３−スルホプロピル）−アニリンナトリウム（ＤＡＯＳ）法で測定した。その結果、得られたインフルエンザウイルス様粒子の脂質成分の含有量は、インフルエンザウイルス粒子の脂質成分の含有量に対して多くても８０質量％以下であることが示唆された。以下、蛍光色素法によって、インフルエンザウイルス様粒子の脂質成分の含有量を詳細に検討した。
インフルエンザウイルスのエンベロープは、コレステロールを多く含むことが報告されていることから、コレステロールを脂質成分の代表として定量した。【００６３】
３．脂質成分の含有量
Ａ型インフルエンザウイルスにおいても、Ｈ１Ｎ１亜型株（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｘ−１７９Ａ）株、以下、「Ａ／ＣＡ株」と記載することがある。）及びＨ３Ｎ２亜型株（Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／３９／２０１２（Ｘ−２３３Ａ）株、以下、「Ａ／ＮＹ株」と記載することがある。）について、上記に準じた方法でウイルス様粒子を作製した。他のＢ型インフルエンザウイルスについてもＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８株（以下、「Ｂ／ＢＲ株」と記載することがある。）及びＢ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２（ＢＸ−５１Ｂ）株（以下、「Ｂ／ＭＡ株」と記載することがある。）について、上記に準じた方法でウイルス様粒子を作製した。代表として、０．０８％のホルマリン濃度で２５℃、１週間反応後、エーテル処理したインフルエンザウイルス様粒子の脂質成分の含有量を、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、商品名）を用いて測定した。まず、インフルエンザウイルス様粒子を含む検体を超遠心分離（２４０００ｒｐｍ、２ｈｒｓ、４℃）にかけて上清とペレット成分とに分離した。得られたペレット成分をＰＢＳで再懸濁した。再懸濁したペレット成分に蛍光物質レゾルフィンを加えて反応させた。反応後の蛍光物質レゾルフィンの蛍光強度を測定することによって、インフルエンザウイルス様粒子の脂質成分の含有量を定量した。その結果、インフルエンザウイルス様粒子の脂質成分の含有量は、インフルエンザウイルス全粒子（以下、「全粒子抗原」と記載することがある。）の脂質成分の含有量に対して、多くても４０質量％以下であることが示唆された（表１）。【００６４】
【表１】
0006602762.tif 000002
【００６５】
４．脂質成分の含有量（エーテル容量比検討）
Ｈ１Ｎ１亜型株（Ａ／ＣＡ株）由来のウイルス様粒子を代表として、エーテル容量比を変化させることによる脱脂処理に対する影響について検討した。まず、蛋白質濃度が終濃度２５００μｇ／ｍＬとなるように、ＰＢＳでウイルス様粒子を希釈し、０．０８％のホルマリン濃度で２５℃、１週間反応させた。反応終了後、ＰＢＳで反応液を透析し、ホルマリンを除くことで、固定化されたインフルエンザウイルス粒子を含む懸濁液Ｂを得た。その後、エーテルの容量を変えたこと以外は、上記「２．エーテル処理」と同様の方法によって、エーテル処理（脱脂処理）を行い、インフルエンザウイルス様粒子を得た。得られたインフルエンザウイルス様粒子を使用し、脂質成分の含有量をＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、商品名）を用いて測定した。インフルエンザウイルス様粒子を含む検体を超遠心分離（２４０００ｒｐｍ、２ｈｒｓ、４℃）にかけて上清とペレット成分とに分離した。得られたペレット成分をＰＢＳで再懸濁した。再懸濁したペレット成分に蛍光物質レゾルフィンを加えて反応させた。反応後の蛍光物質レゾルフィンの蛍光強度を測定することによって、インフルエンザウイルス様粒子の脂質成分の含有量を定量した。比較対照は、ホルマリン濃度０．０２％で４℃、６週間反応させた不活化全粒子ウイルス（以下、「全粒子抗原」と記載することがある。）を用いた。その結果、エーテル：懸濁液Ｂ（ｖｏｌ比）を１：１としてエーテル処理を行った場合、インフルエンザウイルス様粒子の脂質成分の含有量は、インフルエンザウイルス全粒子の脂質成分の含有量に対して、約７０質量％であった。エーテル：懸濁液Ｂ（ｖｏｌ比）を１：２又は１：６としてエーテル処理を行った場合、インフルエンザウイルス様粒子の脂質成分の含有量は、インフルエンザウイルス全粒子の脂質成分の含有量に対して、約３０質量％であった。一方、エーテル：懸濁液Ｂ（ｖｏｌ比）を１：１２としてエーテル処理を行った場合、インフルエンザウイルス様粒子の脂質成分の含有量は、全粒子抗原と同様に脂質成分はほとんど除去されず、約１００％残存していることが示唆された（表２）。上記結果から、脱脂の効果は、エーテルの量だけではなく、ポリソルベート８０の濃度にも依存していると本発明者らは考えている。すなわち、「エーテル：懸濁液Ｂ」が、１：１から１：６に変化するにつれて、相対的にポリソルベート８０の濃度が高くなるため、脱脂が進むと本発明者らは考えている。しかし、「エーテル：懸濁液Ｂ」が１：１２になると、相対的にポリソルベート８０の濃度が高かったとしても、エーテルの濃度が低すぎることが影響し、脱脂の効果が減少すると本発明者らは考えている。【００６６】
【表２】
0006602762.tif 000003
【００６７】
インフルエンザウイルス粒子に由来するスプリット抗原
比較対照とするスプリットインフルエンザウイルス（以下、「スプリット抗原」と記載することがある。）は、インフルエンザＨＡワクチン（化学及血清療法研究所製、商品名「インフルエンザＨＡワクチン“化血研”」）を使用した。【００６８】
［実施例２］
物性評価
上記実施例１で得られたウイルス様粒子（検体）の物性を以下の方法で評価した。なお、以下の実験において、特にことわりがない限り、比較対照として用いた全粒子抗原はホルマリン濃度０．０２％で４℃、６週間反応させたものである。
１．ショ糖密度勾配遠心法による分析
実施例１によって調製したウイルス様粒子をショ糖密度勾配遠心法によって分析した。検体を１５〜６０％のショ糖密度勾配に重層し、４℃、１８０００ｒｐｍで１６時間、遠心分離を行った。遠心後、１フラクションあたり０．６ｍＬずつ分画し、各フラクションのショ糖濃度、ＨＡ価及び蛋白質濃度を測定した。Ｈ１Ｎ１亜型株の結果を表３に示す。スプリット抗原では、蛋白質がショ糖濃度２５〜５０％に幅広く分布し、ウイルス粒子が分解していることが示された。これに対し、ウイルス様粒子では高いショ糖濃度（４９〜５１．４％）に単一ピークとして分画されていることから、不活化全粒子と同様の形状（粒子性）を有することが示された。ＨＡ活性についてはホルマリン処理時のホルマリン濃度が０．０２％以上で２５６０倍であった。Ｂ型株（Ｂ／ＷＣ株）の結果を表４に示す。スプリット抗原では、蛋白質が同様にショ糖濃度２５〜５０％に幅広く分布し、ウイルス粒子が分解していることが示された。これに対し、ウイルス様粒子では高いショ糖濃度（５０．６〜５２．２％）に単一ピークとして分画されていることから、不活化全粒子と同様の形状（粒子性）を有することが示された。ＨＡ活性についてはホルマリン処理時のホルマリン濃度が高い程、ＨＡ価が高く、０．０５％で２５６０倍、０．０８％以上では５１２０倍であった。【００６９】
【表３】
0006602762.tif 000004
【００７０】
【表４】
0006602762.tif 000005
【００７１】
２．電子顕微鏡による解析
ウイルス様粒子（Ｂ型株であるＢ／ＷＣ株由来）の形状をさらに詳細に調べるために、電子顕微鏡による観察を実施した。約５００μｇ／ｍＬの上記検体を、グルタルアルデヒドを用いて室温で２０分間固定した。その後、観察用のイオンコートしたシートメッシュ（日新ＥＭ社製）に、固定した検体を載せて約６０秒間静置し、２％リンタングステン酸水溶液でネガティブ染色した。染色した検体を、透過型電子顕微鏡（ＦＥＩカンパニー社製テクナイＧ２：加速電圧１２０ｋＶ）を用いて観察、撮影した。【００７２】
代表として、０．０５％のホルマリン濃度で２５℃、１週間反応後、エーテル処理したウイルス様粒子の観察結果を示す（図１の（Ｂ））。比較対照として、０．０２％のホルマリン濃度で４℃、６週間反応させた全粒子抗原の観察結果を示す（図１の（Ａ））。さらに、Ｈ１Ｎ１亜型株（Ａ／ＣＡ株）及びＨ３Ｎ２亜型株（Ａ／ＮＹ株）について上記に準じた方法でウイルス様粒子を作製した。他のＢ型インフルエンザウイルスであるＢ／ＢＲ株及びＢ／ＭＡ株について上記に準じた方法でウイルス様粒子を作製した。代表として０．０８％のホルマリン濃度で２５℃、１週間反応後、エーテル処理したウイルス様粒子の観察結果を示す（図１の（Ｃ）〜（Ｆ））。ウイルス様粒子は全粒子抗原と同様に粒子構造が保たれていた。エンベロープがエーテル処理によって脱脂された観察像では、ウイルス様粒子同士が結合しあった凝集体は認められなかった。【００７３】
３．動的光散乱
ウイルス様粒子（Ｂ型株であるＢ／ＷＣ株由来）の平均粒子径をＰａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ：ＮＩＣＯＭＰ  ３８０  ＺＬＳ−Ｓを用いて解析した。動的光散乱法による液体中の平均粒子径を表５に示す。スプリット抗原は二峰性であり、１１０ｎｍ付近と４００ｎｍ付近とにピークが認められた。一方、それ以外の全ての検体は平均粒子径が１２０ｎｍ前後で単峰性であった。このことから、エーテル処理後の平均粒径は、ウイルス粒子と同等の粒子サイズであることがわかった。すなわち、エーテル処理によって脱脂されてもウイルス様粒子の平均粒子径は単一で変わらないことがわかった。動的光散乱実験から、ウイルス様粒子の粒子構造は保たれており、凝集体のような不純物は認められなかった。【００７４】
【表５】
0006602762.tif 000006
【００７５】
４．高速液体クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ））
代表として、Ｈ１Ｎ１亜型株（Ａ／ＣＡ株）に由来するウイルス様粒子、全粒子抗原及びスプリット抗原の分子量分布を測定した。上記測定は、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ６０００ＰＷＸＬ（ＴＯＳＯＨ）を用いて行った。溶離液にＰＢＳを用いた。溶出パターンを表６に示す。スプリット抗原は溶出時間１９〜２９分付近に三峰性のピークが認められた。一方、ウイルス様粒子及び全粒子抗原は溶出時間１７分付近に単峰性のピークが認められた。このことから、エーテル処理を行っているウイルス様粒子の分子量分布は、エーテル処理を行っていないウイルス粒子（全粒子抗原）と同等の分子量分布であることが分かった。この結果から、エーテル処理によって脱脂されても分子量分布は単一で変わらないことが示唆された。【００７６】
【表６】
0006602762.tif 000007
【００７７】
５．ウイルス蛋白質の分析
ウイルス様粒子（Ｂ型株であるＢ／ＷＣ株由来）の構成蛋白質について調べるために、Ｓｌｏｔ−ｂｌｏｔ法によって抗体染色を行った。スプリット抗原、ホルマリン処理のみ行った検体、又はホルマリン処理後にエーテル処理した検体について、それぞれの検体に対してＳＤＳ処理及び加熱処理を行っていない群（Ａ群）、並びに、ＳＤＳ処理及び加熱処理を行った群（Ｂ群）を用意した。検体の種類を表７に示す。【００７８】
【表７】
0006602762.tif 000008
【００７９】
（Ｓｌｏｔ−ｂｌｏｔ法）
上記の群のそれぞれの検体をＰＶＤＦ膜（ポリフッ化ビニリデン膜）へアプライし、乾燥させた。染色、脱色後、ＰＶＤＦ膜をブロッキングし、一次抗体（マウスモノクローナル抗体：抗ＮＰ抗体又は抗Ｍ１抗体）、二次抗体（抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート）と反応させ、ＬＡＳ−３０００（富士フイルム株式会社製、商品名）で撮影した。図２にＭ１、ＮＰのＳｌｏｔ  ｂｌｏｔの結果を示す。ＳＤＳ処理及び加熱処理を共に行っていない群（Ａ群）では、粒子構造が壊れているスプリット抗原（第１レーン）、及びホルマリン固定が弱い検体（０．０２％ホルマリン濃度反応後、エーテル処理した検体：第３、第４レーン）において、ＮＰ及びＭ１が検出された。これに対し、全粒子抗原（第２レーン）、及び０．０２％より高いホルマリン濃度の検体（第５、第６、第７レーン）において、ＮＰ及びＭ１はほとんど検出されなかった。一方、ＳＤＳ処理及び加熱処理を共に行った群（Ｂ群）では、ウイルス様粒子が破壊され、いずれの検体でもＭ１及びＮＰが検出された。このことから、Ｍ１及びＮＰはウイルス様粒子の内部に存在することが示された。【００８０】
（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法）
Ｈ１Ｎ１亜型株（Ａ／ＣＡ株）について上記に準じた方法でウイルス様粒子を作製した。異なるホルマリン濃度（０．０２％〜０．１４％）でウイルス粒子を固定化後、エーテル処理を行いウイルス様粒子を得た。得られたウイルス様粒子は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ―ＰＡＧＥ）を行った後、ＰＶＤＦ膜へ転写した。上記ＰＶＤＦ膜を、一次抗体（マウスモノクローナル抗体：抗ＨＡ抗体、抗ＮＰ抗体又は抗Ｍ１抗体）、及び二次抗体（抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート）と反応させ、ＬＡＳ−３０００（富士フイルム株式会社製、商品名）で撮影した。このとき、発色基質としてＲＰＮ２２０９  ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、商品名）を用いた。ＨＡ（図３のＡ）、Ｍ１（図３のＢ）、ＮＰ（図３のＣ）のＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔの結果を示す。ホルマリン未処理に対し、ホルマリン処理された各ウイルス構成タンパク質は高分子化し、高分子側に泳動されていることが示された。すなわちホルマリン未処理に対し、ホルマリン処理された各ウイルス構成タンパク質は、０．０５％以上の濃度で２５０ｋＤａ以上の高分子重合体を生じ、ゲルトップに詰まっていることが示された。０．０５％未満の弱い架橋ではエーテル処理時に粒子を保つことが出来ず、図２に示すようにＮＰ及びＭ１が検出されている。【００８１】
６．ウイルス粒子に由来するゲノム核酸の分析（定性分析）
ウイルス様粒子（Ｂ型株であるＢ／ＷＣ株由来）におけるウイルス粒子に由来するゲノム核酸（「ウイルス由来ゲノム核酸」という場合がある。）について検討した。ホルマリン処理のみを行った検体、又はホルマリン処理後にエーテル処理した検体について、それぞれの検体に対して超遠心した群又は超遠心していない群を用意した。上記の群の上清からＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製、商品名）を用いて、ＲＮＡを抽出した。抽出後、Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＡＭＶ）（タカラバイオ株式会社製、商品名）、ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧｅｎｅＡｍｐＲ９７００）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行い、ＨＡをコードするＤＮＡ領域を増幅した。アガロースゲル電気泳動を行い、ＤＮＡ産物のバンドパターンを確認した。【００８２】
図４にＲＴ−ＰＣＲ後のＤＮＡ産物のバンドパターンの結果を示す。表８に図４の結果をまとめた。超遠心していない場合には、全ての条件でＲＴ−ＰＣＲによってウイルス由来のＲＮＡが検出された。一方、超遠心した場合には、スプリット抗原及びホルマリンによる固定化が最も弱い検体（０．０２％のホルマリン濃度で４℃、４週間反応後、エーテル処理した検体）では、超遠心後の上清からもＲＮＡが検出された。その条件以外の検体では、ＲＮＡが検出されなかった。このことから０．０２％以上のホルマリン濃度で２５℃、１週間ホルマリン処理し、エーテル処理された抗原では、ＲＮＡは粒子内に包含されていることが示された。【００８３】
【表８】
0006602762.tif 000009
【００８４】
７．ウイルス粒子に由来するゲノム核酸の分析（定量分析）
ウイルス様粒子における、ウイルス粒子に由来するゲノム核酸（「ウイルス由来ゲノム核酸」という場合がある。）の定量について検討した。ウイルス様粒子、全粒子抗原、スプリット抗原をＰＢＳで希釈し、ＳＤＳとＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを加えて５５℃、２４時間で反応させた。その後、ＴＲＩｚｏｌ  ＬＳ  ＲｅａｇｅｎｔとＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＤＮａｓｅ  （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、商品名）とを用いてＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡの含有量は、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ  ＲＮＡ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ａｎｄ  Ｋｉｔ  （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、商品名）で測定した。【００８５】
表９に全粒子抗原に対するウイルス様粒子とスプリット抗原のＲＮＡ含有量の割合を示す。ウイルス様粒子は全粒子抗原に対して、ＲＮＡが約９０％残存したが、スプリット抗原は１０〜４０％であった。この結果から、ウイルス様粒子にはＲＮＡがほぼ残存していることが示唆された。【００８６】
【表９】
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【００８７】
８．免疫原性１
Ａ型インフルエンザウイルスにおいて、Ｈ３Ｎ２亜型株（Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｘ−２２３）株、以下、「Ａ／ＴＸ株」と記載することがある。）についても実施例１に準じた方法でウイルス様粒子を作製した。ウイルス様粒子における免疫原性を、マウスを用いて評価した。ｄｄＹマウス（雌性、８週齢）に、スプリット抗原、全粒子抗原、又はウイルス様粒子を、蛋白質量として０．８μｇの接種量で筋肉内接種した（一群当たり１６匹）。免疫３週後にマウスを安楽死させ、全採血した。遠心分離によって血清を得て、ＨＩ抗体価を測定した。代表として０．０８％のホルマリンで２５℃、１週間反応後、エーテル処理した検体の免疫原性（ＨＩ抗体価（ＧＭＴ））の結果を表１０に示す。Ｈ１Ｎ１亜型株、Ｈ３Ｎ２亜型株の場合、ウイルス様粒子はスプリット抗原と比較して有意に高い免疫原性（Ｈ１Ｎ１亜型株：Ｐ＜０．０５、Ｈ３Ｎ３亜型株：Ｐ＜０．０１）であり、全粒子抗原と同等の免疫原性であった。Ｂ型株（Ｂ／ＭＡ株）の場合、ウイルス様粒子はスプリット抗原と比較して高い免疫原性であり、全粒子抗原と同等の免疫原性であった。【００８８】
【表１０】
0006602762.tif 000011
【００８９】
９．免疫原性２
Ｈ１Ｎ１亜型株（Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９、以下、「Ａ／ＮＣ株」と記載することがある。）、Ｈ３Ｎ２亜型株（Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ／３／２００３、以下、「Ａ／ＷＹ株」と記載することがある。）及びＢ株（Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／２００２、以下、「Ｂ／ＳＧ株」と記載することがある。）について実施例１に準じた方法でウイルス様粒子を作製した。得られたインフルエンザウイルス様粒子における免疫原性を、マウスを用いて評価した。ｄｄＹマウス（雌性、８週齢）を用いて、スプリット抗原、又はウイルス様粒子を１群当たり８匹に１μｇＨＡの接種量で、３週間の間隔で２回皮下接種した。１次免疫を行って３週後に部分採血、２次免疫を行って２週後に全採血した。遠心分離によって血清を得て、ＨＩ抗体価を測定した。代表として０．２％のホルマリンで５℃、３日間反応後、エーテル処理した検体の免疫原性（ＨＩ抗体価（ＧＭＴ））の結果を表１１（１次免疫後）、表１２（２次免疫後）に示す。1次免疫後のＡ／ＮＣ株、Ａ／ＷＹ株の場合、ウイルス様粒子はスプリット抗原と比較して有意に免疫原性が高かった。【００９０】
【表１１】
0006602762.tif 000012
【００９１】
【表１２】
0006602762.tif 000013
【００９２】
１０．免疫原性３
スプリット抗原、全粒子抗原、及びウイルス様粒子の免疫原性を、カニクイザル（雌性、２１〜２９箇月齢）を用いて評価した。スプリット抗原、全粒子抗原、又はウイルス様粒子を１群当たり５匹に７．５μｇＨＡ相当（スプリット抗原のＨＡ量に相当するタンパク質量）の接種量で、２８日間の間隔で２回皮下接種した。２次免疫前、及び２次免疫後２８日後に部分採血した。遠心分離によって血清を得て、ＨＩ抗体価及び中和抗体価を測定した。代表として０．０８％のホルマリンで２５℃、７日間反応後、エーテル処理した検体（ウイルス様粒子）の免疫原性の結果を、表１３（２次免疫後のＨＩ抗体価（ＧＭＴ））、表１４（２次免疫後の中和抗体価（ＧＭＴ））に示す。ＨＩ抗体価では、ウイルス様粒子はスプリット抗原と比較して高い免疫原性を有することが分かった。特に、Ｈ１Ｎ１亜型株では有意に免疫原性が高かった。中和抗体価においても、ウイルス様粒子はスプリット抗原と比較して高い免疫原性を有することが分かった。特に、Ｈ１Ｎ１亜型株及びＢ型株では有意に免疫原性が高かった。【００９３】
【表１３】
0006602762.tif 000014
【００９４】
【表１４】
0006602762.tif 000015
【００９５】
１１．抗体サブクラス解析１
抗体サブクラス解析として、上記「８．免疫原性１」で得られたマウスの血清中に含まれる、ウイルス抗原に特異的なＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体価を測定した。比較対照として、０．０２％のホルマリンで２５℃、１週間反応後、エーテル処理した検体を同様にマウスに免疫した。得られたマウスの血清中に含まれる、ウイルス抗原特異的なＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの抗体価を測定した。その結果、スプリット抗原とは対照的に、ウイルス様粒子（ホルマリン濃度：０．０８％）は、全粒子抗原と同様に抗原特異的ＩｇＧ１よりも抗原特異的ＩｇＧ２ａを誘導することが示された。一方、同じウイルス様粒子であっても、０．０２％のホルマリンで固定化を行った検体は、スプリット抗原と同様に抗原特異的ＩｇＧ２ａよりも抗原特異的ＩｇＧ１を誘導することが示された（［表１５］〜［表１７］）。Ｔｈ１型応答によって誘導されるＩｇＧ２ａサブクラスの抗体は、Ｔｈ２型応答によって誘導されるＩｇＧ１サブクラスの抗体よりもインフルエンザウイルスに対する感染防御能が優れていることから、ウイルス様粒子（ホルマリン濃度：０．０８％）による有効性のさらなる向上が期待できる。【００９６】
【表１５】
0006602762.tif 000016
【００９７】
【表１６】
0006602762.tif 000017
【００９８】
【表１７】
0006602762.tif 000018
【００９９】
１２．免疫原性４
ウイルス様粒子抗原の免疫原性機序を解析するために、Ｔｏｌｌ  ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ７  ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ（ＴＬＲ７ＫＯ）マウス（Ｂａｃｋｂｏｒｎｅ：ＢＡＬＢ／ｃ）を用いて解析を行った。使用したマウスはオリエンタルバイオサービス社から購入した。雌性、５週齢のマウスを用いて、全粒子抗原、ウイルス様粒子抗原、スプリット抗原を１群当たり５〜６匹に蛋白質量２μｇ／各株の接種量で、３週間の間隔で２回筋肉内接種した。１次免疫を行って３週後に部分採血、２次免疫を行って２週後に全採血した。遠心分離によって血清を得て、ＨＩ抗体価を測定した。ワクチン株は、Ｈ１Ｎ１亜型株（Ａ／ＣＡ株）、Ｈ３Ｎ２亜型株（Ａ／ＮＹ株）、Ｂ型株（Ｂ／ＢＲ株及びＢ／ＭＡ株）を使用した。全粒子抗原、ウイルス様粒子抗原、及びスプリット抗原の調製方法に関しては、実施例１に準じた。１次免疫を行って３週間後の血清中のＨＩ抗体価の幾何平均値（ＧＭＴ）を表１８に示す。野生型マウス（＋／＋）では、ウイルス様粒子はスプリット抗原と比較して高いＨＩ抗体価を示した。一方、ノックアウトマウス（−／−）では、スプリット抗原と同等まで、ウイルス様粒子に対するＨＩ抗体価が低下していた。この結果は、ウイルス様粒子に内包されているウイルス一本鎖ＲＮＡがウイルス様粒子の免疫原性に大きく寄与していることを示唆している。【０１００】
【表１８】
0006602762.tif 000019
【０１０１】
１３．抗体サブクラス解析２
抗体サブクラス解析として、上記「１２．免疫原性４」で得られたマウスの血清中に含まれる、ウイルス抗原に特異的なＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体価を測定した。その結果を［表１９］〜［表２１］に示す。Ｔｈ２優位な免疫応答が誘導されやすいＢＡＬＢ／ｃ野生型マウス（＋／＋）においても、スプリット抗原とは対照的に、ウイルス様粒子は、抗原特異的ＩｇＧ１よりも抗原特異的ＩｇＧ２ａを誘導することが示された。それに対してノックアウトマウス（−／−）では、ＩｇＧ２ａの抗体価が顕著に低下していた。この結果は、ウイルス一本鎖ＲＮＡがＴｈ１優位な免疫誘導に必須であることを示唆している。【０１０２】
【表１９】
0006602762.tif 000020
【０１０３】
【表２０】
0006602762.tif 000021
【０１０４】
【表２１】
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【０１０５】
１４．ＩＦＮ−γ産生細胞数解析
上記「１２．免疫原性４」で得られたマウスの脾臓中に含まれる、抗原特異的なＩＦＮ−γ産生細胞数を計測するためにＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。解析にはＭｏｕｓｅ  ＩＦＮ  ｇａｍｍａ  ＥＬＩＳＰＯＴ  Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏ！（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、商品名）を用い、添付概要書に記載されている方法に準じて行った。その結果を［表２２］〜［表２５］に示す。樹状細胞、Ｔｈ１細胞、及びＮＫ細胞等の細胞性免疫に関わる細胞から産生されるＩＦＮ−γは、スプリット抗原よりも全粒子抗原又はウイルス様粒子を接種されたマウスにおいて強く誘導されることが確認された。ノックアウトマウス（−／−）では、ウイルス様粒子抗原によって誘導されたＩＦＮ−γ産生細胞数が顕著に低下していた。このことから、ウイルス一本鎖ＲＮＡによってＩＦＮ−γ産生細胞が誘導され、Ｔｈ１優位な免疫応答が惹起されることが示唆された。【０１０６】
【表２２】
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【０１０７】
【表２３】
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【０１０８】
【表２４】
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【０１０９】
【表２５】
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【０１１０】
１５．メモリーＢ細胞数解析
上記「１２．免疫原性４」で得られたマウスの脾臓中に含まれる、抗原特異的なメモリーＢ細胞数を計測するためにＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。ＥＬＩＳＰＯＴを行う前に、メモリーＢ細胞から抗体産生細胞に分化させるために、マイトジェン（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ由来のレクチン、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｓｏｌｕｂｌｅ、ＣｐＧ  ＯＤＮ、及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のＬＰＳ）による刺激を行った。その結果を［表２６］〜［表２９］に示す。脾臓細胞中のメモリーＢ細胞は、スプリット抗原よりも全粒子抗原又はウイルス様粒子抗原を接種されたマウスにおいて強く誘導されることが確認された。ウイルス様粒子抗原を接種されたノックアウトマウス（−／−）では、脾臓中のメモリーＢ細胞数が低下していた。このことから、ウイルス様粒子抗原のメモリーＢ細胞誘導能にウイルス一本鎖ＲＮＡが大きく関与していることが示唆された。【０１１１】
【表２６】
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【０１１２】
【表２７】
0006602762.tif 000028
【０１１３】
【表２８】
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【０１１４】
【表２９】
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【０１１５】
１６．発熱試験１
スプリット抗原、全粒子抗原又はウイルス様粒子をＰＢＳで希釈し、１ｍＬ中の蛋白質含量を２４０μｇとしたものを試料とした。ウイルス様粒子は代表として０．０８％のホルマリンで２５℃、１週間反応後、エーテル処理した検体を用いた。上記試料を、体重１ｋｇ当たりにつき１ｍＬをウサギに接種して、発熱の上昇を観察した。ウサギ３羽の発熱反応の和（℃）を表３０に示す。【０１１６】
エーテル処理を行わなかった全粒子抗原のみ１．３℃以上の発熱和が認められた。エーテル処理を行ったスプリット抗原、ウイルス様粒子はいずれも１．３℃以上の発熱和は認められなかった。【０１１７】
【表３０】
0006602762.tif 000031
【０１１８】
１７．発熱試験２
Ｈ１Ｎ１亜型株（Ａ／ＣＡ株）のウイルス粒子を、蛋白質濃度が終濃度２５００μｇ／ｍＬとなるように希釈し、０．０８％のホルマリン濃度で２５℃、１週間反応させた。反応終了後、ＰＢＳで反応液を透析し、ホルマリンを除くことで、固定化されたインフルエンザウイルス粒子を含む懸濁液Ｂを得た。その後、エーテル容量及びポリソルベート８０濃度を０．０５ｖｏｌ％に変えたこと以外は、上記「２．エーテル処理」と同様の方法によって、エーテル処理を行い、コレステロールの含有量がそれぞれ異なるインフルエンザウイルス様粒子を得た。得られたインフルエンザウイルス様粒子をＰＢＳで希釈し、１ｍＬ中の蛋白質含量を２４０μｇとしたものを試料とした。体重１ｋｇ当たりにつき１ｍＬの上記試料を、ウサギに接種して、発熱の上昇を観察した。ウサギ３羽の発熱反応の和（℃）を表３１に示す。【０１１９】
コレステロールの含有量が全粒子抗原に対して約７０％残存したウイルス様粒子（エーテル：懸濁液Ｂ（ｖｏｌ比）が１：１の検体）を含め、すべての検体において、１．３℃以上の発熱和は認められなかった。【０１２０】
【表３１】
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【０１２１】
１８．サイトカイン定量１
発熱試験の代替法として、ヒトＰＢＭＣを用いた炎症性サイトカイン測定系によって、サイトカインの量を評価した。炎症性サイトカインとして代表的な、ＩＬ−１β、ＩＬ−６に関して測定を行った。ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をＦＣＳ  ＭＥＭに懸濁し、４ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈した。１００μＬずつ９６穴プレートに添加し、スプリット抗原、全粒子抗原又はウイルス様粒子を同量添加した（終濃度５０μｇ／ｍＬ）。その後、３７℃で２４時間ＣＯ２雰囲気下で培養し、上清中のＩＬ−１βとＩＬ−６とをＥＬＩＳＡ法で定量した。代表として０．０８％のホルマリンで２５℃、１週間反応後、エーテル処理した検体のサイトカイン定量（ＩＬ−１β）の結果を表３２に示し、サイトカイン定量（ＩＬ−６）の結果を表３３に示す。ウイルス様粒子を用いた場合、全粒子抗原を用いた場合よりも、炎症性サイトカインの量が少ないことがわかった。このことから、ウイルス様粒子は、全粒子抗原に比べて、副反応を抑制しやすいことが示唆された。【０１２２】
【表３２】
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【０１２３】
【表３３】
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【０１２４】
［実施例３］
インフルエンザウイルス様粒子の調製
１．グルタルアルデヒド（ＧＡ）処理（ホルマリンのようにメチレン架橋を形成せず、ウイルス粒子に対して不可逆的な架橋反応によって固定化する工程）
Ａ型インフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２亜型株（Ａ／ＮＹ株））及びＢ型インフルエンザウイルス（Ｂ／ＢＲ株）を実施例１と同様に精製した。精製したインフルエンザウイルス粒子をβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）不活化後、蛋白質濃度が終濃度１０００μｇ／ｍＬとなるように希釈し、懸濁液Ａ１（Ａ／ＮＹ株）及び懸濁液Ａ２（Ｂ／ＢＲ株）を得た。次に、１ｗ／ｖ％ＧＡ溶液を用いて、ＧＡ濃度が０．０１６ｗ／ｖ％又は０．００８ｗ／ｖ％となるように希釈した。
懸濁液Ａ１又は懸濁液Ａ２と、希釈したＧＡ溶液（０．０１６ｗ／ｖ％又は０．００８ｗ／ｖ％）とを等量混合し、４℃で３日間反応させた。反応終了後、ＰＢＳで反応液を透析し、ＧＡを除くことで、固定化されたインフルエンザウイルス粒子を含む懸濁液Ｂ１（Ａ／ＮＹ株）及び懸濁液Ｂ２（Ｂ／ＢＲ株）を得た（全粒子抗原（ＧＡ固定））。【０１２５】
２．エーテル処理（固定化されたウイルス粒子に対して脱脂処理を行う工程）
ＧＡ処理を行った上記インフルエンザウイルス粒子を含む懸濁液Ｂ１及び懸濁液Ｂ２に、最終濃度が０．０５ｖｏｌ％になるようにポリソルベート８０を添加した。その後上記懸濁液Ｂ１又は懸濁液Ｂ２に、最終濃度が３３ｖｏｌ％となるようにジエチルエーテル（脱脂剤）を添加し、２５℃で１時間撹拌した。その後、得られた混合液を４℃、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行って、水相を回収することによってエーテル相を除いた。以上の工程によって、検体であるインフルエンザウイルス様粒子を調製した。【０１２６】
得られたインフルエンザウイルス様粒子の脂質成分の含有量をＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、商品名）を用いて測定した。インフルエンザウイルス様粒子を含む検体を超遠心分離（２４０００ｒｐｍ、２ｈｒｓ、４℃）にかけて上清とペレット成分とに分離した。得られたペレット成分をＰＢＳで再懸濁した。再懸濁したペレット成分に蛍光物質レゾルフィンを加えて反応させた。反応後の蛍光物質レゾルフィンの蛍光強度を測定することによって、全粒子抗原（ＧＡ固定）に対するインフルエンザウイルス様粒子の脂質成分の含有量を定量した。その結果、インフルエンザウイルス様粒子の脂質成分の含有量は、インフルエンザウイルス粒子の脂質成分の含有量に対して多くても５０質量％以下であることが示唆された（表３４）。【０１２７】
【表３４】
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【０１２８】
［実施例４］
物性評価
上記実施例３で得られたウイルス様粒子（検体）の物性を以下の方法で評価した。
１．電子顕微鏡による解析
ウイルス様粒子（Ａ／ＮＹ株由来）の形状をさらに詳細に調べるために、電子顕微鏡による観察を実施した。約５００μｇ／ｍＬの上記検体を、グルタルアルデヒドを用いて室温で２０分間固定した。その後、観察用のイオンコートしたシートメッシュ（日新ＥＭ社製）に、固定した検体を載せて約６０秒間静置し、２％リンタングステン酸水溶液でネガティブ染色した。染色した検体を、透過型電子顕微鏡（ＦＥＩカンパニー社製テクナイＧ２：加速電圧１２０ｋＶ）を用いて観察、撮影した。【０１２９】
代表として、０．００８ｗ／ｖ％のＧＡ濃度で４℃、３日間反応後、エーテル処理したウイルス様粒子の観察結果を示す（図５の（Ｂ））。比較対照として、０．００８ｗ／ｖ％のＧＡ濃度で４℃、３日間反応させた全粒子抗原の観察結果を示す（図５の（Ａ））。ウイルス様粒子は全粒子抗原と同様に粒子構造が保たれていた。エンベロープがエーテル処理によって壊れ、染色液が侵入した観察像では、ウイルス様粒子同士が結合しあった凝集体は認められなかった。【０１３０】
２．動的光散乱
ウイルス様粒子の平均粒子径をウイルス様粒子の平均粒子径をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ社製）を用いて解析した。動的光散乱法による液体中の平均粒子径を表３５に示す。ウイルス様粒子は平均粒子径が１３０ｎｍ前後で単峰性であった。このことから、エーテル処理後の平均粒径は、ウイルス粒子と同等の粒子サイズであることがわかった。すなわち、エーテル処理により脱脂されてもウイルス様粒子の平均粒子径は単一で変わらないことがわかった。動的光散乱実験から、ウイルス様粒子の粒子構造は保たれており、凝集体のような不純物は認められなかった。【０１３１】
【表３５】
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【０１３２】
３．ウイルス粒子に由来するゲノム核酸の分析（定量分析）
ウイルス様粒子におけるウイルス粒子に由来するゲノム核酸（「ウイルス由来ゲノム核酸」という場合がある。）の定量について検討した。ウイルス様粒子、全粒子抗原をＰＢＳで希釈し、ＳＤＳとＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを加えて５５℃、１８〜５７時間で反応させた。その後、ＴＲＩｚｏｌ  ＬＳ  ＲｅａｇｅｎｔとＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＤＮａｓｅ  (ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、商品名)を用いてＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡの含有量は、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ  ＲＮＡ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ａｎｄ  Ｋｉｔ  （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、商品名）で測定した。【０１３３】
表３６に全粒子抗原に対するウイルス様粒子のＲＮＡ含有量の割合を示す。ウイルス様粒子は全粒子抗原に対してＲＮＡが約８０％残存していた。ＧＡ処理の場合においても、ホルマリン処理の場合と同様にウイルス様粒子にはＲＮＡがほぼ残存していることが示唆された。【０１３４】
【表３６】
0006602762.tif 000037
【０１３５】
４．免疫原性１
ウイルス様粒子における免疫原性を、マウスを用いて評価した。ｄｄＹマウス（雌性、８週齢）に、スプリット抗原（ホルマリン不活化）、又はウイルス様粒子を蛋白質量として０．８μｇの接種量で筋肉内接種した（一群当たり１６匹）。免疫３週後にマウスを安楽死させ、全採血した。遠心分離によって血清を得て、中和抗体価を測定した。代表として０．００４ｗ／ｖ％のＧＡで４℃、３日間反応後、エーテル処理した検体の免疫原性（中和抗体価（ＧＭＴ））の結果を表３７に示す。Ｂ型株の場合、ウイルス様粒子はスプリット抗原と比較して高い免疫原性であった。【０１３６】
【表３７】
0006602762.tif 000038
【０１３７】
５．免疫原性２
Ｂ型株であるＢ／ＷＣ株について実施例１に準じた方法でウイルス様粒子を作製した。得られたインフルエンザウイルス様粒子における免疫原性を、マウスを用いて評価した。ｄｄＹマウス（雌性、８週齢）に、スプリット抗原（ホルマリン不活化）、ウイルス様粒子を蛋白質量として０．８μｇの接種量で筋肉内接種した（一群当たり１６匹）。免疫３週後にマウスを安楽死させ、全採血した。遠心分離によって血清を得て、ＨＩ抗体価を測定した。代表として０．０１０ｗ／ｖ％のＧＡで４℃、３日間反応後、エーテル処理したウイルス様粒子の免疫原性（ＨＩ抗体価（ＧＭＴ））の結果を表３８に示す。ウイルス様粒子はスプリット抗原と比較して高い免疫原性であった。【０１３８】
【表３８】
0006602762.tif 000039
【０１３９】
６．発熱試験
ウイルス様粒子をＰＢＳで希釈し、１ｍＬ中の蛋白質含量を２４０μｇとしたものを試料とした。上記試料を、体重１ｋｇ当たりにつき１ｍＬをウサギに接種して、発熱の上昇を観察した。ウサギ３羽の発熱反応の和（℃）を表３９に示す。【０１４０】
エーテル処理を行ったウイルス様粒子はいずれも１．３℃以上の発熱和は認められなかった。【０１４１】
【表３９】
0006602762.tif 000040
【０１４２】
７．サイトカイン定量
実施例２の「１８．サイトカイン定量１」に準じて、サイトカインを定量した。ウイルス様粒子Ａ／ＮＹ株のサイトカイン定量（ＩＬ−１β及びＩＦＮ−α）の結果を表４０に、Ｂ／ＢＲ株のサイトカイン定量の結果を表４１に示す。ウイルス様粒子を用いた場合、全粒子抗原（ホルマリン固定）を用いた場合よりも、炎症性サイトカインの量が少ないことがわかった。このことから、ウイルス様粒子は、全粒子抗原に比べて、副反応を抑制しやすいことが示唆された。【０１４３】
【表４０】
0006602762.tif 000041
【０１４４】
【表４１】
0006602762.tif 000042
【０１４５】
［実施例５］
インフルエンザウイルス様粒子の調製
１．  １−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）処理（ウイルス粒子のカルボキシル基にアミノ基を反応させてアミド結合を生成させ固定化する工程）
ＥＤＣを、濃度が４〜０．１ＭとなるようにＰＢＳで希釈した。Ａ型インフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２亜型株（Ａ／ＮＹ株））及びＢ型インフルエンザウイルス（Ｂ／ＢＲ株）を実施例１と同様に精製した。精製したインフルエンザウイルス粒子をＢＰＬ不活化後、ＥＤＣ濃度が０．５〜０．００５Ｍとなるように希釈したＥＤＣ溶液を添加し、４℃で２時間反応させた。このとき、反応液中の蛋白質濃度が２５００μｇ／ｍＬとなるようにした。反応終了後、ＰＢＳで反応液を透析し、ＥＤＣを除くことで、固定化されたインフルエンザウイルス粒子を含む懸濁液Ｂ１（Ａ／ＮＹ株）及び懸濁液Ｂ２（Ｂ／ＢＲ株）を得た。【０１４６】
２．エーテル処理（固定化されたウイルス粒子に対して脱脂処理を行う工程）
ＥＤＣ処理を行った上記インフルエンザウイルス粒子を含む懸濁液Ｂ１及び懸濁液Ｂ２に、最終濃度が０．０５ｖｏｌ％になるようにポリソルベート８０を添加した。その後上記懸濁液Ｂ１又は懸濁液Ｂ２に、最終濃度が３３ｖｏｌ％となるようにジエチルエーテル（脱脂剤）を添加し、２５℃で１時間撹拌した。その後、得られた混合液を４℃、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行って、水相を回収することによってエーテル相を除いた。以上の工程によって、検体であるインフルエンザウイルス様粒子を調製した。【０１４７】
得られたインフルエンザウイルス様粒子の脂質成分の含有量をＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、商品名）を用いて測定した。インフルエンザウイルス様粒子を含む検体を、超遠心分離（２４０００ｒｐｍ、２ｈｒｓ、４℃）にかけて上清とペレット成分とに分離した。得られたペレット成分をＰＢＳで再懸濁した。再懸濁したペレット成分に蛍光物質レゾルフィンを加えて反応させた。反応後の蛍光物質レゾルフィンの蛍光強度を測定することによって、インフルエンザウイルス様粒子の脂質成分の含有量を定量した。その結果、インフルエンザウイルス様粒子の脂質成分の含有量は、インフルエンザウイルス粒子の脂質成分の含有量に対して多くても５０質量％以下であることが示唆された（表４２）。【０１４８】
【表４２】
0006602762.tif 000043
【０１４９】
［実施例６］
物性評価
上記実施例５で得られたウイルス様粒子（検体）の物性を以下の方法で評価した。
１．ショ糖密度勾配遠心法による分析
Ｈ３Ｎ２亜型株（Ａ／ＮＹ株）由来のウイルス様粒子について、ショ糖密度勾配遠心法によって分析した。代表として、０．０５ＭのＥＤＣ濃度でＥＤＣ処理を行った検体（全粒子抗原及びウイルス様粒子）を１５〜６０％のショ糖密度勾配に重層し、４℃、１８０００ｒｐｍで１６時間、遠心分離を行った。遠心後、１フラクションあたり０．６ｍＬずつ分画し、各フラクションのショ糖濃度、ＨＡ価及び蛋白質濃度を測定した。結果を表４３に示す。ウイルス様粒子では高いショ糖濃度（約５０％）に単一ピークとして分画されていることから、不活化全粒子と同様の形状（粒子性）を有することが示された。ＨＡ活性については１２８０倍であった。【０１５０】
【表４３】
0006602762.tif 000044
【０１５１】
２．電子顕微鏡による解析
ウイルス様粒子（Ａ／ＮＹ株由来）の形状をさらに詳細に調べるために、電子顕微鏡による観察を実施した。約５００μｇ／ｍＬの上記検体を、グルタルアルデヒドを用いて室温で２０分間固定した。その後、観察用のイオンコートしたシートメッシュ（日新ＥＭ社製）に、固定した検体を載せて約６０秒間静置し、２％リンタングステン酸水溶液でネガティブ染色した。染色した検体を、透過型電子顕微鏡（ＦＥＩカンパニー社製テクナイＧ２：加速電圧１２０ｋＶ）を用いて観察、撮影した。【０１５２】
代表として、０．５ＭのＥＤＣ濃度で４℃、２時間反応後、エーテル処理したウイルス様粒子の観察結果を示す（図６の（Ｂ））。比較対照として、０．５ＭのＥＤＣ濃度で４℃、２時間反応させた全粒子抗原の観察結果を示す（図６の（Ａ））。ウイルス様粒子は全粒子抗原と同様に粒子構造が保たれていた。エンベロープがエーテル処理によって壊れ、染色液が侵入した観察像では、ウイルス様粒子同士が結合しあった凝集体は認められなかった。【０１５３】
３．ウイルス粒子に由来するゲノム核酸の分析（定量分析）
ウイルス様粒子におけるウイルス粒子に由来するゲノム核酸（「ウイルス由来ゲノム核酸」という場合がある。）の定量について検討した。ウイルス様粒子、又は全粒子抗原をＰＢＳで希釈し、ＳＤＳとＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを加えて５５℃、６時間で反応させた。その後、ＴＲＩｚｏｌ  ＬＳ  ＲｅａｇｅｎｔとＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＤＮａｓｅ  (ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、商品名)を用いてＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡの含有量は、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ  ＲＮＡ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ａｎｄ  Ｋｉｔ  （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、商品名）で測定した。【０１５４】
表４４に全粒子抗原に対するウイルス様粒子のＲＮＡ含有量の割合を示す。ウイルス様粒子は全粒子抗原に対してＲＮＡが約９０％残存し、ＥＤＣ処理の場合においても、ホルマリン処理の場合と同様にウイルス様粒子にはＲＮＡがほぼ残存していることが示唆された。【０１５５】
【表４４】
0006602762.tif 000045
【０１５６】
４．免疫原性１
ウイルス様粒子における免疫原性を、マウスを用いて評価した。ｄｄＹマウス（雌性、８週齢）に、スプリット抗原（ホルマリン不活化）、又はウイルス様粒子を蛋白質量として０．８μｇの接種量で筋肉内接種した（一群当たり１６匹）。免疫３週後にマウスを安楽死させ、全採血した。遠心分離によって血清を得て、中和抗体価を測定した。代表として０．０５ＭのＥＤＣで４℃、２時間反応後、エーテル処理したウイルス様粒子の免疫原性（中和抗体価（ＧＭＴ））の結果を表４５に示す。Ｈ３Ｎ２亜型株の場合、ウイルス様粒子はスプリット抗原と比較して高い免疫原性であった。Ｂ型株の場合、ウイルス様粒子はスプリット抗原と比較して有意に高い免疫原性（Ｐ＜０．０５）であった。【０１５７】
【表４５】
0006602762.tif 000046
【０１５８】
５．発熱試験
ウイルス様粒子をＰＢＳで希釈し、１ｍＬ中の蛋白質含量を２４０μｇとしたものを試料とした。上記試料を、体重１ｋｇ当たりにつき１ｍＬをウサギに接種して、発熱の上昇を観察した。ウサギ３羽の発熱反応の和（℃）を表４６に示す。【０１５９】
エーテル処理を行ったウイルス様粒子はいずれも１．３℃以上の発熱和は認められなかった。【０１６０】
【表４６】
0006602762.tif 000047
【０１６１】
６．サイトカイン定量
実施例２の「１８．サイトカイン定量１」に準じて、サイトカインを定量した。ウイルス様粒子Ａ／ＮＹ株のサイトカイン定量（ＩＬ−１β及びＩＦＮ−α）の結果を表４７に、Ｂ／ＢＲ株のサイトカイン定量の結果を表４８に示す。ウイルス様粒子を用いた場合、全粒子抗原（ホルマリン固定）を用いた場合よりも、炎症性サイトカインの量が少ないことがわかった。このことから、ウイルス様粒子は、全粒子抗原に比べて、副反応を抑制しやすいことが示唆された。【０１６２】
【表４７】
0006602762.tif 000048
【０１６３】
【表４８】
0006602762.tif 000049
【０１６４】
［実施例７］
日本脳炎ウイルス様粒子の調製
１．グルタルアルデヒド処理（ウイルス粒子に対して粒子構造を固定化する工程）
Ｖｅｒｏ細胞培養日本脳炎ワクチン原薬（化学及血清療法研究所製、商品名「エンセバック」（０．０８％ホルマリンで不活化済）、懸濁液Ａ）に対して、最終濃度が０．００２〜０．０５ｖｏｌ％となるようにグルタルアルデヒドを添加し、４℃で３日間反応させた。反応終了後、賦活剤である乳糖（終濃度５ｗ／ｖ％）を添加したＰＢＳで、得られた反応液を透析した。透析によって、グルタルアルデヒドを除くことで、固定化された日本脳炎ウイルス粒子を含む懸濁液Ｂを得た。【０１６５】
２．エーテル処理（固定化されたウイルス粒子に対して脱脂処理を行う工程）
上記懸濁液Ｂに対して、等容のジエチルエーテル及び最終濃度が０．０１ｖｏｌ％になるようにポリソルベート８０を添加し、常温で１時間撹拌した。４℃、３０００ｒｐｍで５分間遠心した後、水相を回収し、エーテル相を除いた。以上の工程によって、検体である日本脳炎ウイルス様粒子を調製した。【０１６６】
［実施例８］
物性評価
上記実施例７で得られたウイルス様粒子（検体）の物性を以下の方法で評価した。
１．電子顕微鏡による解析
ウイルス様粒子の形状を詳細に調べるために、電子顕微鏡による観察を実施した。観察用のイオンコートしたシートメッシュ（日新ＥＭ社製）に、約７０μｇ／ｍＬの上記検体を載せて約６０秒間静置し、２％リンタングステン酸水溶液でネガティブ染色した。染色した検体を、透過型電子顕微鏡（ＦＥＩカンパニー社製テクナイＧ２：加速電圧１２０ｋＶ）を用いて観察、撮影した。【０１６７】
代表として、０．０１ｗ／ｖ％のグルタルアルデヒド濃度で４℃、３日間反応後、エーテル処理したウイルス様粒子の観察結果を示す（図７の（Ｃ））。比較対象として、グルタルアルデヒド未固定後、エーテル処理したウイルス様粒子（図７の（Ｂ））、Ｖｅｒｏ細胞培養日本脳炎ワクチン原薬（図７の（Ａ））の観察結果をそれぞれ示す。ウイルス様粒子はグルタルアルデヒドで固定することでＶｅｒｏ細胞培養日本脳炎ワクチン原薬と同様に粒子構造が保たれていた。一方、グルタルアルデヒド未固定のウイルス様粒子は凝集している様子が観察された。【０１６８】
２．動的光散乱
ウイルス様粒子の平均粒子径をＰａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ：ＮＩＣＯＭＰ  ３８０  ＺＬＳ−Ｓを用いて解析した。動的光散乱法による液体中の平均粒子径を表４９に示す。ウイルス様粒子は平均粒子径が約９０ｎｍでほぼ単峰性であった。一方、Ｖｅｒｏ細胞培養日本脳炎ワクチン原薬は約８０ｎｍでほぼ単峰性であった。このことから、エーテル処理後の平均粒径は、エーテル処理を行っていないウイルス粒子よりわずかに大きく、エーテル処理によって脱脂されても平均粒子径はほぼ変わらないことがわかった。動的光散乱実験から、ウイルス様粒子の粒子構造は保たれており、凝集体のような不純物は認められなかった。【０１６９】
【表４９】
0006602762.tif 000050
【０１７０】
３．抗原の含有量
抗日本脳炎ウイルス抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によって、抗原の含有量（抗原含量）を測定した。検体中に含まれるＥ抗原は、抗日本脳炎ウイルスウサギＩｇＧ（一次抗体；ポリクローナル抗体）が結合したマイクロプレートに捕捉される。その後、西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合した抗日本脳炎ウイルスＢ蛋白質モノクローナル抗体（二次抗体；モノクローナル抗体）を反応させることで、プレートに結合した抗Ｅ抗原抗体／Ｅ抗原／二次抗体の複合体が形成される。反応せず残った試薬及び検体を洗浄によって除去し、酵素基質液（ｏ−フェニレンジアミン溶液：ＯＰＤ溶液）と反応させるとＥ抗原複合体上のＨＲＰが反応し、発色が起きる。ＯＰＤの発色の強度は、複合体の量（Ｅ抗原量を反映）に比例することを利用し、Ｅ抗原含量を測定した。【０１７１】
代表として０．０１ｗ／ｖ％のグルタルアルデヒド濃度で４℃、３日間反応後、エーテル処理したウイルス様粒子（ポリソルベート８０を０．００５％添加してエーテル処理したものと、ポリソルベート８０を添加しないでエーテル処理したもの）、グルタルアルデヒド未固定後エーテル処理したウイルス様粒子、及び、Ｖｅｒｏ細胞培養日本脳炎ワクチン原薬それぞれの抗原含有量を表５０に示す。ポリソルベート８０を添加していない検体及びグルタルアルデヒド未固定の検体では抗原含有量が６．２５μｇ／ｍＬ未満であったのに対し、ポリソルベート８０を０．００５％添加したウイルス様粒子はＶｅｒｏ細胞培養日本脳炎ワクチン原薬と同等の抗原が含まれていた。【０１７２】
【表５０】
0006602762.tif 000051
【０１７３】
日本脳炎ウイルスの膜を構成する脂質として、コレステロールが最も多いことが示されている。そこで、ウイルス様粒子の脂質成分の含有量はコレステロールを代表として定量することとした。得られた日本脳炎ウイルス様粒子の脂質成分の含有量をＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、商品名）を用いて測定した。日本脳炎ウイルス様粒子を含む検体を、超遠心分離（２８０００ｒｐｍ、６ｈｒｓ、４℃）にかけて上清とペレット成分とに分離した。得られたペレット成分をＰＢＳで再懸濁した。再懸濁したペレット成分に蛍光物質レゾルフィンを加えて反応させた。反応後の蛍光物質レゾルフィンの蛍光強度を測定することによって、日本脳炎ウイルス様粒子の脂質成分の含有量を定量した。その結果、日本脳炎ウイルス様粒子の脂質成分の含有量は、日本脳炎ウイルス粒子の脂質成分の含有量に対して多くても２０質量％以下であることが示唆された（表５１）。【０１７４】
【表５１】
0006602762.tif 000052
【０１７５】
４．ウイルス粒子に由来するゲノム核酸の分析（定量分析）
ウイルス様粒子におけるウイルス粒子に由来するゲノム核酸（「ウイルス由来ゲノム核酸」という場合がある。）の定量について検討した。ウイルス様粒子、又は全粒子抗原をＰＢＳで希釈し、ＳＤＳとＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを加えて５５℃、５４時間で反応させた。その後、ＴＲＩｚｏｌ  ＬＳ  ＲｅａｇｅｎｔとＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＤＮａｓｅ  (ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、商品名)を用いてＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡの含有量は、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ  ＲＮＡ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ａｎｄ  Ｋｉｔ  （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、商品名）で測定した。【０１７６】
表５２に全粒子抗原に対するウイルス様粒子のＲＮＡ含有量の割合を示す。ウイルス様粒子は全粒子抗原に対してＲＮＡが約７０％残存していることが示唆された（表５２）。【０１７７】
【表５２】
0006602762.tif 000053
【０１７８】
５．サイトカイン定量
発熱試験の代替法として、ヒトＰＢＭＣを用いた炎症性サイトカイン測定系によって、サイトカインの量を評価した。炎症性サイトカインとして代表的な、ＩＬ−１β、ＩＬ−６に関して測定を行った。ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をＦＣＳ  ＭＥＭに懸濁し、４ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈した。１００μＬずつ９６穴プレートに添加し、ウイルス様粒子又はＶｅｒｏ細胞培養日本脳炎ワクチン原薬を同量添加した（終濃度２５μｇ／ｍＬ）。その後、３７℃で２４時間ＣＯ２雰囲気下で培養し、上清中のＩＬ−１βとＩＬ−６とをＥＬＩＳＡ法で定量した。代表として０．０１ｗ／ｖ％のグルタルアルデヒド濃度で４℃、３日間反応後、エーテル処理した検体のサイトカイン定量（ＩＬ−１β及びＩＬ−６）の結果を表５３に示す。ＩＬ−１β、ＩＬ−６共にウイルス様粒子はＶｅｒｏ細胞培養日本脳炎ワクチン原薬よりも低かった。このことから、ウイルス様粒子は、Ｖｅｒｏ細胞培養日本脳炎ワクチン原薬に比べて、副反応を抑制しやすいことが示唆された。【０１７９】
【表５３】
0006602762.tif 000054
【０１８０】
６．免疫原性（マウス）
ｄｄＹマウス（雌性、４週齢）に、代表として０．０１ｗ／ｖ％のグルタルアルデヒド濃度で４℃、３日間反応後、エーテル処理したウイルス様粒子（ポリソルベート８０を０．００５％添加してエーテル処理したもの）又はＶｅｒｏ細胞培養日本脳炎ワクチン原薬を４μｇ又は１μｇの接種量で腹腔内接種した（一群当たり１０匹）。免疫１週間後に再度免疫し、その１週間後にマウスを安楽死させ、全採血した。遠心分離によって血清を得て、群毎に等量ずつプールし、中和抗体価を測定した。５０％プラック減少率から算出した結果を表５４に示す。エーテル処理したウイルス様粒子はＶｅｒｏ細胞培養日本脳炎ワクチン原薬と比較して同等又はそれ以上の中和抗体価であった。【０１８１】
【表５４】
0006602762.tif 000055
【０１８２】
７．免疫原性（カニクイザル）
カニクイザル（雌性、約８歳齢）に、代表として０．０１ｗ／ｖ％のグルタルアルデヒド濃度で４℃、３日間反応後、エーテル処理したウイルス様粒子（ポリソルベート８０を０．０１％添加してエーテル処理したもの）又はＶｅｒｏ細胞培養日本脳炎ワクチン原薬を４μｇの接種量で腹腔内接種した（一群当たり３匹）。免疫３週間後に再度免疫し、その４週間後に部分採血した。遠心分離によって血清を得て、群毎に等量ずつプールし、中和抗体価を測定した。５０％プラック減少率から算出した結果を表５５に示す。エーテル処理したウイルス様粒子はＶｅｒｏ細胞培養日本脳炎ワクチン原薬と比較し、同様に十分な中和抗体を誘導した。【０１８３】
【表５５】
0006602762.tif 000056
【０１８４】
［実施例９］
ＨＢｓウイルス様粒子の調製
１．ホルムアルデヒド処理（ウイルス粒子に対して粒子構造を固定化する工程）
ＨＢｓ抗原液（懸濁液Ａ）を撹拌しながら、最終濃度が０．０１８〜０．１６２ｗ／ｖ％となるようにホルムアルデヒドを添加し、反応させた。反応終了後、ＰＢＳで反応液を透析し、ホルムアルデヒドを除くことで、固定化されたＨＢｓ粒子を含む懸濁液Ｂを得た。【０１８５】
２．エーテル処理（固定化されたウイルス粒子に対して脱脂処理を行う工程）
上記懸濁液Ｂに対して、最終濃度が０．０５ｖｏｌ％になるようにポリソルベート８０を添加した。その後最終濃度が５０ｖｏｌ％となるように、上記懸濁液Ｂと等容のジエチルエーテル（脱脂剤）を添加し、２５℃で１時間撹拌した。その後、得られた混合液を４℃、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行って、水相（懸濁液Ｃ）を回収することによってエーテル相を除いた。【０１８６】
３．アルミニウム塩の添加
上記懸濁液Ｃにアルミニウム塩を混合した。以上の工程によって、検体であるＨＢｓウイルス様粒子を調製した。【０１８７】
［実施例１０］
物性評価
上記実施例９で得られたウイルス様粒子（検体）の物性を以下の方法で評価した。
１．電子顕微鏡による解析
ウイルス様粒子の形状を詳細に調べるために、電子顕微鏡による観察を実施した。観察用のイオンコートしたシートメッシュ（日新ＥＭ社製）に、約２５μｇ／ｍＬの上記検体を載せて約６０秒間静置し、２％リンタングステン酸水溶液でネガティブ染色した。染色した検体を、透過型電子顕微鏡（ＦＥＩカンパニー社製テクナイＧ２：加速電圧１２０ｋＶ）を用いて観察、撮影した。【０１８８】
代表として、０．０５ｗ／ｖ％のホルムアルデヒド濃度で３７℃、９６時間反応後、エーテル処理したウイルス様粒子の観察結果を示す（図８の（Ｂ））。比較対照として、ホルマリン固定後、エーテル未処理の全粒子（図８の（Ａ））の観察結果を示す。ウイルス様粒子はホルマリンで固定することでＨＢｓ全粒子と同様に粒子構造が保たれていた。【０１８９】
２．抗原の含有量
高親和性抗ＨＢｓマウスモノクローナル抗体を用いた１ステップサンドイッチＥＩＡ法によって、抗原の含有量（抗原含量）を測定した。上記測定は、全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ（東ソー株式会社製、商品名）を用いて行った。測定に用いる試薬カップには、磁性ビーズに固定化された抗体とアルカリ性ホスファターゼ標識抗体とが、凍結乾燥体として封入されている。上記試薬カップに検体を添加することで抗原抗体反応を、一定時間、一定温度で行った。反応後、洗浄水で上記磁性ビーズを洗浄することによって遊離の酵素標識抗体及び検体成分を除去した。その後、磁性ビーズに結合したアルカリ性ホスファターゼ標識抗体の酵素活性を測定するため、酵素基質として４−メチルウンベリフェリルリン酸を添加した。酵素反応の結果として得られる蛍光物質（４−メチルウンベリフェロン）の生成速度を測定することによって、検体中のＨＢｓ抗原濃度を測定した。【０１９０】
代表として、０．０５ｗ／ｖ％のホルムアルデヒド濃度で３７℃、９６時間反応後、エーテル処理したウイルス様粒子、及び、比較対照として組換え沈降Ｂ型肝炎ワクチン（化学及血清療法研究所製、商品名「ビームゲン」）を使用した。それぞれの抗原含量（ｎｇ／ｍＬ）を蛋白濃度（ｎｇ／ｍＬ）で除した比活性の値を表５６に示す。ポリソルベート８０を０．００５％添加したウイルス様粒子は組換え沈降Ｂ型肝炎ワクチンと同等の抗原が含まれていた。【０１９１】
【表５６】
0006602762.tif 000057
【０１９２】
３．動的光散乱
ウイルス様粒子の平均粒子径をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ社製）を用いて解析した。代表として、０．０５ｗ／ｖ％のホルムアルデヒド濃度で３７℃、９６時間反応後、エーテル処理したウイルス様粒子、及び、比較対照として組換え沈降Ｂ型肝炎ワクチンを測定した結果を表５７に示す。どちらの検体も平均粒子径が１００ｎｍ前後で単峰性であった。このことから、エーテル処理後のウイルス様粒子の平均粒径は、ウイルス粒子と同等の粒子サイズであり、単一で変わらないことがわかった。動的光散乱実験から、ウイルス様粒子の粒子構造は保たれており、凝集体のような不純物は認められなかった。【０１９３】
【表５７】
0006602762.tif 000058
【０１９４】
４．ホスファチジルコリンの含有量試験
ＨＢｓ抗原に含まれる脂質成分のうち、８０％以上はホスファチジルコリンである。そこで、ＨＢｓ抗原の脂質成分の含有量はホスファチジルコリンの含有量を代表として定量することとした。Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＡＢＳ社製、商品名）を用いて測定した。西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の触媒下で、反応過程で生じる過酸化水素を高感度蛍光プローブで検出し、その蛍光強度を測定することによってホスファチジルコリンの含有量を測定した。代表として、０．０５ｗ／ｖ％のホルムアルデヒド濃度で３７℃、９６時間反応後、エーテル処理したウイルス様粒子、及び、比較対照として組換え沈降Ｂ型肝炎ワクチンを測定した結果を表５８に示す。ウイルス様粒子のホスファチジルコリンの含有量は、比較対照に対して、多くても５９質量％以下であることが示唆された。【０１９５】
【表５８】
0006602762.tif 000059
【０１９６】
５．免疫原性（マウス）
ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウス（雌性、５週齢）に、０．０５ｗ／ｖ％のホルムアルデヒド濃度で３７℃、９６時間反応後、エーテル処理したウイルス様粒子（ポリソルベート８０を０．００５％添加してエーテル処理したもの）又は組換え沈降Ｂ型肝炎ワクチンを、２μｇ又は０．５μｇの接種量で筋肉内接種した（一群当たり８匹）。免疫４週間後に再度免疫し、その４週間後にマウスを安楽死させ、全採血した。遠心分離によって血清を得て、全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ（東ソー株式会社製、商品名）を用いて、血清中の抗体価を測定した。固層及び酵素標識抗原にＨＢｓ抗原を用いた１ステップサンドイッチＥＩＡ法によって測定した。測定に用いる試薬カップには、磁性ビーズに固定化された抗原とアルカリ性ホスファターゼ標識抗原とが、凍結乾燥体として封入されている。上記試薬カップに検体を添加することで抗原抗体反応を一定時間、一定温度で行った。反応後、洗浄水で上記磁性ビーズを洗浄することによって未反応の酵素標識抗原を除去した。その後、磁性ビーズに結合したアルカリ性ホスファターゼ標識抗原の酵素活性を測定するため、酵素基質として４−メチルウンベリフェリルリン酸を添加した。酵素反応の結果として得られる蛍光物質（４−メチルウンベリフェロン）の生成速度を測定することによって、検体中の抗ＨＢｓ抗体濃度を測定した。結果を表５９に示す。エーテル処理したウイルス様粒子は組換え沈降Ｂ型肝炎ワクチンと比較して同等又はそれ以上の免疫原性であった。【０１９７】
【表５９】
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【産業上の利用可能性】
【０１９８】
本発明は医薬品の分野、特にワクチンの分野において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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