(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アラントインを有効成分として含有する、植物の高温ストレス耐性を向上させるための、高温ストレス耐性向上剤。
【請求項２】
高温ストレスにより植物が白化すること、高温ストレスにより植物が萎れること、及び、高温ストレスにより植物の葉が巻くことのうち１つ以上を抑制するための、請求項１に記載の高温ストレス耐性向上剤。
【請求項３】
植物においてＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現を促進する、請求項１又は２に記載の高温ストレス耐性向上剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の高温ストレス耐性向上剤を植物に施用する工程を含む、植物の高温ストレス耐性を向上させる方法。
【請求項５】
前記工程において、前記高温ストレス耐性向上剤を、ストレスを受ける前の植物に施用する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
アラントインを有効成分として含有する、植物の白化を抑制するための、白化抑制剤。
【請求項７】
アラントインを有効成分として含有する、植物においてＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現を促進するための、ＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物における高温ストレス耐性向上剤、高温ストレス耐性を向上させる方法、白化抑制剤、及びＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物は高温、乾燥等の様々な環境ストレスに曝されて生息している。植物は動物のように移動することが難しいことから、環境ストレスから身を守るための機構が植物では発達している。
【０００３】
乾燥ストレス応答性エレメント（ＤＲＥ；  ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）は、シロイヌナズナのゲノムにおいて、水ストレス誘導性遺伝子の１つであるＲＤ２９Ａのプロモーター解析により存在が確認された配列である。ＤＲＥＢ（ＤＲＥ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）はＤＲＥに結合するタンパク質として単離された転写因子である。ＤＲＥＢのうちＤＲＥＢ２Ａは、ＡＰＥＴＡＬＡ２／エチレン応答性エレメント結合因子型（ＡＰ２／ＥＲＦ−ｔｙｐｅ）の転写因子であり、ＤＲＥを認識するタンパク質として単離された（非特許文献３）。ＤＲＥＢ２Ａは乾燥及び高塩濃度条件により強く誘導されることから、乾燥ストレス及び高塩ストレス条件において働く転写因子であると考えられる（非特許文献１）。ＤＲＥＢ２Ａの活性は翻訳後に制御されており、ＡＰ２／ＥＲＦ  ＤＮＡ結合ドメインに隣接する３０アミノ酸の領域がタンパク質の翻訳後の制御に重要な役割を果たしていると考えられる。ＤＲＥＢ２Ａにおいてこの領域を欠損させたＤＲＥＢ２Ａ  ＣＡは活性を有し、ＤＲＥＢ２Ａ  ＣＡを過剰発現させたシロイヌナズナは矮性の表現型を示し、乾燥ストレス耐性が顕著に向上することが確認されている（非特許文献２）。
【０００４】
非特許文献３、特許文献１では、植物が高温ストレスを受けた際にＤＲＥＢ２Ａがターゲット遺伝子を誘導する機構について報告されている。非特許文献３、特許文献１によれば、ＤＰＢ３−１（又はＮＦ−ＹＣ１０）というタンパク質がＤＲＥＢ２Ａと相互作用することにより、ＤＲＥＢ２Ａによる高温ストレス耐性遺伝子の誘導が促進されるという機構が提唱されている。また非特許文献３ではＤＰＢ３−１とＤＲＥＢ２Ａとの前記相互作用は、乾燥ストレス誘導遺伝子の発現に影響しないことが示されている。
【０００５】
特許文献２では、ＤＲＥＢ２Ａ遺伝子を導入した形質転換植物では、発根率が向上すること、及び、切花の花持ちが延長することが記載されている。
【０００６】
一方、アラントイン（５−ウレイドヒダントイン）は、核酸塩基（プリン塩基）の分解過程で生じる中間産物である。植物体内では、アラントインは、５−ヒドロキシイソ尿酸からアラントインシンターゼ（ＡＳ）により生成され、アラントイナーゼ（ＡＬＮ）によりアラントイン酸へと分解される。非特許文献４では、シロイヌナズナにおいてＡＬＮ遺伝子を破壊しアラントインを植物体内に蓄積するように変異させたａｌｎ−１変異株が、野生株と比較して高い乾燥ストレス耐性を有することを報告している。
【０００７】
非特許文献５では、シロイヌナズナにアラントインを付与すると生長が促進されることが報告されている。
【０００８】
特許文献３では、アラントイン等のウレイドを植物に与えることでストレスから植物を保護する方法が開示されている。特許文献３では干ばつ、寒冷等の環境の乱れの際に植物は酸化ストレスによりダメージを受けること、ウレイドの濃度が高いとスカベンジャー経路が促進され植物がダメージから保護されることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ２０１３／１１１７５５
【特許文献２】特許第４２１９７１１号
【特許文献３】ＵＳ２０１０／０３３３２３７
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓａｋｕｍａ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １０３：  １８８２２−１８８２７（２００６）
【非特許文献２】Ｓａｋｕｍａ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １８：  １２９２−１３０９（２００６）
【非特許文献３】Ｓａｔｏ，  Ｈ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２６：  ４９５４−４９７３（２０１４）
【非特許文献４】Ｗａｔａｎａｂｅ，  Ｓ．  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  ３７：  １０２２−１０３６（２０１４）
【非特許文献５】渡辺ら，第５５回日本植物生理学会年会要旨集ＰＦ０４４（０４６１）（２０１４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
植物が高温ストレスを受けると、植物が白化する、萎れる、葉が縮れる等の問題が生じ、高温ストレスが過度であると植物生存できなくなる場合がある。このため農作物等の植物における高温ストレス耐性の向上が求められている。
【００１２】
上記の通りアラントインは、植物において乾燥ストレス耐性、低温ストレス耐性等のストレス耐性を向上させる作用を有することが知られている。しかしながら高温ストレス耐性とアラントインとの関係はこれまで調査されていない。
【００１３】
アラントインについては、植物において特に乾燥ストレス耐性を向上させる作用がこれまでに研究されている。
【００１４】
しかし植物において、乾燥ストレス耐性と高温ストレス耐性とは異質な性質であり、ストレス耐性発現の機構が異なることから、乾燥ストレス耐性と高温ストレス耐性とに相関性はない。例えば非特許文献３では、上記の通り、ＤＲＥＢ２Ａによる高温ストレス耐性誘導のためにはＤＰＢ３−１とＤＲＥＢ２Ａとの相互作用が必要であるのに対して、該相互作用は、乾燥ストレス耐性誘導には無関係であると記載されている。このことからも明らかな通り、ある成分が、乾燥ストレス等の、高温ストレス以外のストレスに対する耐性を向上させることができたとしても、それが高温ストレス耐性を向上させる作用を有するとは限らない。従って、アラントインが植物に高温ストレス以外の幾つかのストレスへの耐性の向上作用を有するという従来の知見からは、高温ストレス耐性に関するアラントインの作用を予測することはできない。
【００１５】
一方、植物におけるＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現は、上記の通り、高温ストレス耐性、乾燥ストレス耐性等の各種ストレス耐性の向上に寄与する。また、ＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現は、発根率の向上、切花の花持ちの延長等の有利な効果を奏することも知られている。ＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現を促進させることできる物質は、植物に施用することでこれらの有利な作用を奏することが可能である。しかしそのような物質は従来提供されていない。特許文献１に記載されているようにＤＲＥＢ２Ａ遺伝子を導入した形質転換植物ではＤＲＥＢ２Ａによる有利な作用を奏することができるが、形質転換植物は天然に存在しない植物であるため産業的な利用が難しいという問題がある。天然に存在する物質を植物に施用することにより該植物でのＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現を向上させる技術の有用性は大きいと考えられる。
【００１６】
そこで本発明は、植物において高温ストレス耐性を向上させるための手段を提供することを目的の１つとする。本発明はまた、植物の白化を抑制するための手段を提供することを目的の１つとする。本発明は更にまた、植物においてＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現を促進するための手段を提供することを目的の１つとする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは植物にアラントインを作用させると、植物の高温ストレス耐性が向上する、植物の白化が抑制される、植物においてＤＲＥＢ２Ａ遺伝子が促進されるという予想外の効果が生じることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、本発明は以下の発明を包含する。
（１）アラントインを有効成分として含有する、植物の高温ストレス耐性を向上させるための、高温ストレス耐性向上剤。
（２）高温ストレスにより植物が白化すること、高温ストレスにより植物が萎れること、及び、高温ストレスにより植物の葉が巻くことのうち１つ以上を抑制するための、（１）に記載の高温ストレス耐性向上剤。
（３）植物においてＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現を促進する、（１）又は（２）に記載の高温ストレス耐性向上剤。
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載の高温ストレス耐性向上剤を植物に施用する工程を含む、植物の高温ストレス耐性を向上させる方法。
（５）前記工程において、前記高温ストレス耐性向上剤を、ストレスを受ける前の植物に施用する、（４）に記載の方法。
（６）アラントインを有効成分として含有する、植物の白化を抑制するための、白化抑制剤。
（７）アラントインを有効成分として含有する、植物においてＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現を促進するための、ＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤。
（８）（６）に記載の白化抑制剤を植物に施用する工程を含む、植物の白化を抑制する方法。
（９）（７）に記載のＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤を植物に施用する工程を含む、植物においてＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現を促進する方法。
（１０）植物の高温ストレス耐性を向上させるためのアラントインの使用。
（１１）植物の白化を抑制するためのアラントインの使用。
（１２）植物においてＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現を促進するためのアラントインの使用。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】実験１における１シャーレ内の区画の説明図である。
【図１Ｂ】実験１において、シロイヌナズナを各熱ショック条件で処理し１週間生育させた後の各シャーレの写真を示す。
【図２】実験１において、シロイヌナズナを各熱ショック条件で処理し１週間生育させたときの生存率を示す。
【図３】実験２において、４５℃で１．５時間処理したヒートショック後３日目のタマネギの写真を示す。図３上段がアラントイン区（生存率３３．３％）のタマネギの写真であり、図３下段が水区（生存率０％）のタマネギの写真である。
【図４】実験３において、４５℃で１時間処理したヒートショック後７日目のコマツナの写真を示す。図４上段がアラントイン区（生存率１００％）のコマツナの写真であり、図４下段が水区（生存率３３．３％）のコマツナの写真である。
【図５Ａ】実験６における１シャーレ内の区画の説明図である。
【図５Ｂ】実験６において、各アラントイン濃度の培地で栽培したシロイヌナズナを熱ショック条件及び対照条件で処理し１週間生育させた後の各シャーレの写真を示す。
【図６】実験６において、各アラントイン濃度の培地で栽培したシロイヌナズナを熱ショック条件及び対照条件で処理し１週間生育させたときの生存率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
＜１．アラントイン＞
アラントインは５−ウレイドヒダントインとも呼ばれ、フリー体が次式で表される構造を有する。
【００２０】
【化１】
0006532026.tif 000002
【００２１】
アラントインは１つの不斉炭素（式中＊で示す）を有し、（Ｒ）−アラントインと（Ｓ）−アラントインの形態がある。本発明に用いるアラントインとしては（Ｒ）−アラントインであってもよいし、（Ｓ）−アラントインであってもよいし、それらの混合物であってもよい。
【００２２】
アラントインは植物が利用可能な形態であればよく、フリー体の形態や、水和物等の溶媒和物の形態の適当な形態であることができる。また、フリー体、水和物等の形態のうち２種以上の混合物であってもよい。
【００２３】
＜２．植物＞
本発明の徐放性肥料を施用する対象植物は特に限定されず双子葉植物、単子葉植物等の種々の植物である。
【００２４】
双子葉植物としては例えばアサガオ属植物、アブラナ属植物、ヒルガオ属植物、サツマイモ属植物、シロイヌナズナ属植物、ネナシカズラ属植物、ナデシコ属植物、ハコベ属植物、タカネツメクサ属植物、ミミナグサ属植物、ツメクサ属植物、ノミノツヅリ属植物、オオヤマフスマ属植物、ワチガイソウ属植物、ハマハコベ属植物、オオツメクサ属植物、シオツメクサ属植物、マンテマ属植物、センノウ属植物、フシグロ属植物、ナデシコ科植物、モクマモウ科植物、ドクダミ科植物、コショウ科植物、センリョウ科植物、ヤナギ科植物、ヤマモモ科植物、クルミ科植物、カバノキ科植物、ブナ科植物、ニレ科植物、クワ科植物、イラクサ科植物、カワゴケソウ科植物、ヤマモガシ科植物、ボロボロノキ科植物、ビャクダン科植物、ヤドリギ科植物、ウマノスズクサ科植物、ヤッコソウ科植物、ツチトリモチ科植物、タデ科植物、アカザ科植物、ヒユ科植物、オシロイバナ科植物、ヤマトグサ科植物、ヤマゴボウ科植物、ツルナ科植物、スベリヒユ科植物、モクレン科植物、ヤマグルマ科植物、カツラ科植物、スイレン科植物、マツモ科植物、キンポウゲ科植物、アケビ科植物、メギ科植物、ツヅラフジ科植物、ロウバイ科植物、クスノキ科植物、ケシ科植物、フウチョウソウ科植物、アブラナ科植物、モウセンゴケ科植物、ウツボカズラ科植物、ベンケイソウ科植物、ユキノシタ科植物、トベラ科植物、マンサク科植物、スズカケノキ科植物、バラ科植物、マメ科植物、カタバミ科植物、フウロソウ科植物、アマ科植物、ハマビシ科植物、ミカン科植物、ニガキ科植物、センダン科植物、ヒメハギ科植物、トウダイグサ科植物、アワゴケ科植物、ツゲ科植物、ガンコウラン科植物、ドクウツギ科植物、ウルシ科植物、モチノキ科植物、ニシキギ科植物、ミツバウツギ科植物、クロタキカズラ科植物、カエデ科植物、トチノキ科植物、ムクロジ科植物、アワブキ科植物、ツリフネソウ科植物、クロウメモドキ科植物、ブドウ科植物、ホルトノキ科植物、シナノキ科植物、アオイ科植物、アオギリ科植物、サルナシ科植物、ツバキ科植物、オトギリソウ科植物、ミゾハコベ科植物、ギョリュウ科植物、スミレ科植物、イイギリ科植物、キブシ科植物、トケイソウ科植物、シュウカイドウ科植物、サボテン科植物、ジンチョウゲ科植物、グミ科植物、ミソハギ科植物、ザクロ科植物、ヒルギ科植物、ウリノキ科植物、ノボタン科植物、ヒシ科植物、アカバナ科植物、アリノトウグサ科植物、スギナモ科植物、ウコギ科植物、セリ科植物、ミズキ科植物、イワウメ科植物、リョウブ科植物、イチヤクソウ科植物、ツツジ科植物、ヤブコウジ科植物、サクラソウ科植物、イソマツ科植物、カキノキ科植、ハイノキ科植物、エゴノキ科植物、モクセイ科植物、フジウツギ科植物、リンドウ科植物、キョウチクトウ科植物、ガガイモ科植物、ハナシノブ科植物、ムラサキ科植物、クマツヅラ科植物、シソ科植物、ナス科植物、ゴマノハグサ科植物、ノウゼンカズラ科植物、ゴマ科植物、ハマウツボ科植物、イワタバコ科植物、タヌキモ科植物、キツネノマゴ科植物、ハマジンチョウ科植物、ハエドクソウ科植物、オオバコ科植物、アカネ科植物、スイカズラ科植物、レンプクソウ科植物、オミナエシ科植物、マツムシソウ科植物、ウリ科植物、キキョウ科植物、キク科植物等に施用することができる。
【００２５】
単子葉植物としては例えばウキクサ属植物、アオウキクサ属植物、カトレア属植物、シンビジウム属植物，デンドロビューム属植物、ネギ属植物、ファレノプシス属植物，バンダ属植物，パフィオペディラム属植物，ラン科植物、ガマ科植物、ミクリ科植物、ヒルムシロ科植物、イバラモ科植物、ホロムイソウ科植物、オモダカ科植物、トチカガミ科植物、ホンゴウソウ科植物、カヤツリグサ科植物、ヤシ科植物、サトイモ科植物、ホシグサ科植物、ツユクサ科植物、ミズアオイ科植物、イグサ科植物、ビャクブ科植物、ユリ科植物、ヒガンバナ科植物、ヤマノイモ科植物、アヤメ科植物、バショウ科植物、ショウガ科植物、カンナ科植物、ヒナノシャクジョウ科植物等に施用することができる。
対象となる植物は野生型の植物には限定されず、変異体や形質転換体等であってもよい。
【００２６】
＜３．高温ストレス耐性向上剤、高温ストレス耐性を向上する方法＞
本発明の一実施形態は、アラントインを有効成分として含有する、植物の高温ストレス耐性を向上させるための、高温ストレス耐性向上剤である。
【００２７】
本発明の一実施形態は、前記の高温ストレス耐性向上剤を植物に施用する工程を含む、植物の高温ストレス耐性を向上させる方法である。
【００２８】
ここで高温ストレスとは、通常の生育温度よりも高い温度、例えば２５℃以上、より具体的には３０℃以上の温度に植物体が曝されることによるストレスであり、より具体的には５０℃以下の温度に植物体が曝されることによるストレスである。前記高温に植物体が曝される１日当たりの時間としては特に限定されないが、例えば６０分間以上、より具体的には９０分間以上が挙げられ、より具体的には６００分間以下が挙げられる。
【００２９】
本発明の高温ストレス耐性向上剤及びの高温ストレス耐性向上方法は、高温ストレスのなかでも特に、十分な湿度を保ち且つ高温の環境に曝された植物が受けるストレスに対する耐性を向上させるために効果的である。
【００３０】
一般に植物は、高温ストレス環境に曝されると、植物が白化する（クロロシス）、植物が萎れる、葉が巻く等の生理障害が生じる。本発明の高温ストレス耐性向上剤及びの高温ストレス耐性向上方法によれば、これらの生理障害のうち１つ以上を抑制することができると期待される。本明細書に記載の実験では、本発明の高温ストレス耐性向上剤及び高温ストレス耐性向上方法は、高温ストレスによる上記生理障害のなかでも少なくとも、高温ストレスにより植物が白化すること（クロロシス）、高温ストレスにより植物が萎れること、及び、高温ストレスにより植物の葉が巻くことのうち１つ以上を抑制したことが確認されている。
【００３１】
本発明の高温ストレス耐性向上剤及びの高温ストレス耐性向上方法において、アラントインによる高温ストレス耐性向上作用の機構は特に限定されないが、可能性の１つとして、植物においてＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現を促進することにより高温ストレス耐性が向上するという機構が推定される。ＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現の促進については、下記の＜５．ＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤、ＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現を促進する方法＞に詳述する。
【００３２】
本発明の高温ストレス耐性向上剤及び高温ストレス耐性向上方法において、アラントインによる高温ストレス耐性向上作用の機構の他の可能性として、植物においてＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現を促進し、且つ、熱ショック転写因子３（ＨＳＦ３）遺伝子の発現を抑制することにより高温ストレス耐性が向上するという機構が推定される。非特許文献１によれば、ＤＲＥＢ２Ａ  ＣＡを過剰発現させたシロイヌナズナにおいては、ＨＳＦ３遺伝子の発現量が向上し、それに伴い高温ストレス耐性が向上する。本発明では、植物にアラントインを与えることにより、ＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現量が向上する一方で、ＨＳＦ３遺伝子の発現量が抑制され、高温ストレス耐性が向上することから、アラントインは、これまで知られていた機構とは異質な機構により植物での高温ストレス耐性を向上させると推定される。ＨＳＦ３遺伝子の発現の抑制については、下記の＜５．ＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤、ＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現を促進する方法＞に詳述する。
【００３３】
本発明の高温ストレス耐性向上剤は、アラントインを含有し、且つ植物の高温ストレス耐性を向上させる作用を有するものであればよく、アラントイン自体であってもよいし、アラントインと他の成分とが組み合わされたアラントイン含有組成物であってもよい。
【００３４】
本発明の高温ストレス耐性向上剤は固形状、液状等の任意の形状であることができる。
本発明の高温ストレス耐性向上剤がアラントイン含有組成物である場合、アラントインに加えて、植物に有益な他の成分や、製剤化に必要な成分を更に含んでいてもよい。他の成分としては公知の肥料成分等が挙げられる。製剤化に必要な成分としては、担体、液体媒体等が挙げられる。
【００３５】
本発明の高温ストレス耐性向上剤がアラントイン含有組成物である場合、その製造方法は特に限定されず、各成分を混合したり、固形状組成物であれば必要に応じて粉砕、造粒、乾燥等の操作をして、液体状組成物であれば必要に応じて撹拌、分散等の操作をして製造することができる。
【００３６】
本発明の、植物の高温ストレス耐性を向上させる方法は、上記の高温ストレス耐性向上剤を植物に施用する工程を含む。このとき対象となる植物としては、高温ストレス耐性の向上を必要とする植物であり、例えば、上記の温度条件のような高温ストレスを受ける可能性のある環境で栽培される植物である。具体的な植物の種類は既述の通りである。
【００３７】
本発明の高温ストレス耐性向上剤を植物に施用する方法としては、本発明の高温ストレス耐性向上剤又は本発明の高温ストレス耐性向上剤から放出されたアラントインが植物の根、茎、葉などの植物体に接触することができる方法であれば特に限定されず、前記植物体に本発明の高温ストレス耐性向上剤が直接接するように施用してもよいし、前記植物体が定着した土壌等の栽培担体に本発明の高温ストレス耐性向上剤を施用してもよい。
【００３８】
本発明の高温ストレス耐性向上剤を植物に施用する時期は特に限定されないが、好ましくは、本発明の高温ストレス耐性向上剤を、高温ストレスを受ける前の植物に施用する。本発明の高温ストレス耐性向上剤は、ＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現を促進する。既述の通りＤＲＥＢ２Ａ遺伝子が発現すると各種ストレス耐性遺伝子の発現が誘導されると推定される。このため、高温ストレスを受ける前に予め本発明の高温ストレス耐性向上剤を施用した植物は、高温ストレス耐性が予め向上した状態となり、その後に高温ストレスを受けたときの生存率が高いと推定される。
【００３９】
本発明の高温ストレス耐性向上剤を高温ストレスを受ける前の植物に施用する場合、本発明の高温ストレス耐性向上剤を前記植物に施用する時点をＴ１とし、前記植物が高温ストレスに曝され始める時点をＴ２としたとき、Ｔ１からＴ２までの時間が好ましくは０．５〜１０日、好ましくは０．５〜９日、好ましくは０．５〜８日、好ましくは０．５〜７日、好ましくは０．５〜６日、好ましくは０．５〜５日、好ましくは０．５〜４日、好ましくは０．５〜３日、好ましくは０．５〜２日、好ましくは０．５〜１．５日である。この実施形態によれば、前記植物は本発明の高温ストレス耐性向上剤により高温ストレス耐性が向上した状態で高温ストレスに曝されるため、高温ストレスに曝された後の生存率が高い。本発明の高温ストレス耐性向上剤を高温ストレスを受ける前の植物にＮ回（Ｎは２以上）施用してもよく、その場合は、高温ストレス耐性向上剤を施用する各時点Ｔ１ｎ（ｎは１〜Ｎの整数）からＴ２までの時間がそれぞれ上記範囲を満たすことが好ましい。本発明の高温ストレス耐性向上剤を複数回施用することにより、植物の高温ストレス耐性を更に向上させることができる。
【００４０】
＜４．白化抑制剤、植物の白化を抑制する方法＞
本発明の一実施形態は、アラントインを有効成分として含有する、植物の白化を抑制するための、白化抑制剤である。
【００４１】
本発明の一実施形態は、前記白化抑制剤を植物に施用する工程を含む植物の白化を抑制する方法である。
植物の白化はクロロシスとも呼ばれ、主に高温ストレスにより生じる。
【００４２】
本発明による白化抑制の対象となる植物は、白化の抑制を必要とする植物であり、例えば、上記の温度条件のような高温ストレスを受ける可能性のある環境で栽培される植物である。具体的な植物の種類は既述の通りである。
【００４３】
本発明の白化抑制剤は、アラントインを含有し、且つ植物の白化を抑制する作用を有するものであればよく、アラントイン自体であってもよいし、アラントインと他の成分とが組み合わされたアラントイン含有組成物であってもよい。
【００４４】
本発明の白化抑制剤は固形状、液状等の任意の形状であることができる。
本発明の白化抑制剤がアラントイン含有組成物である場合、該組成物は高温ストレス耐性向上剤について説明したのと同様のアラントイン含有組成物を使用できる。
【００４５】
本発明の白化抑制剤を植物に施用する方法としては、本発明の白化抑制剤又は本発明の白化抑制剤から放出されたアラントインが植物の根、茎、葉などの植物体に接触することができる方法であれば特に限定されず、前記植物体に本発明の白化抑制剤が直接接するように施用してもよいし、前記植物体が定着した土壌等の栽培担体に本発明の白化抑制剤を施用してもよい。
【００４６】
本発明の白化抑制剤を植物に施用する時期は特に限定されないが、好ましくは、本発明の白化抑制剤を、白化の原因となるストレス（例えば高温ストレス）を受ける前の植物に施用する。本発明の白化抑制剤は、ＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現を促進する。既述の通りＤＲＥＢ２Ａ遺伝子が発現すると各種ストレス耐性遺伝子の発現が誘導されると推定される。このため、ストレスを受ける前に予め本発明の白化抑制剤を施用した植物は、ストレス耐性が予め向上した状態となり、その後にストレスを受けたときの白化が効果的に抑制されると予測される。
【００４７】
本発明の白化抑制剤を、白化の原因となるストレスを受ける前の植物に施用する場合、本発明の白化抑制剤を前記植物に施用する時点をＴ１とし、前記植物が前記ストレスに曝され始める時点をＴ２としたとき、Ｔ１からＴ２までの時間が好ましくは０．５〜１０日、好ましくは０．５〜９日、好ましくは０．５〜８日、好ましくは０．５〜７日、好ましくは０．５〜６日、好ましくは０．５〜５日、好ましくは０．５〜４日、好ましくは０．５〜３日、好ましくは０．５〜２日、好ましくは０．５〜１．５日である。この実施形態によれば、前記植物は本発明の白化抑制剤によりストレス耐性が向上した状態で前記ストレスに曝されるため、前記ストレスに曝された後の白化がより効果的に抑制される。本発明の白化抑制剤を、前記ストレスを受ける前の植物にＮ回（Ｎは２以上）施用してもよく、その場合は、白化抑制剤を施用する各時点Ｔ１ｎ（ｎは１〜Ｎの整数）からＴ２までの時間がそれぞれ上記範囲を満たすことが好ましい。本発明の白化抑制剤を複数回施用することにより、植物の白化を更に抑制することができる。
【００４８】
＜５．ＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤、ＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現を促進する方法＞
本発明の一実施形態は、アラントインを有効成分として含有する、植物においてＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現を促進するための、ＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤である。
【００４９】
本発明の一実施形態はまた、前記ＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤を植物に施用する工程を含む、植物においてＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現を促進する方法である。
【００５０】
本発明のこれらの実施形態は、植物でのＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現を促進することにより、高温ストレス耐性、乾燥ストレス耐性等の各種ストレス耐性の向上に寄与する。また、対象植物における発根率の向上、切花の花持ちの延長等の有利な効果を奏する。
【００５１】
本発明の、植物においてＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現を促進する方法では、好ましくは、ＨＳＦ３遺伝子の発現が抑制される。
【００５２】
本発明において遺伝子の発現とはゲノムＤＮＡを鋳型としてｍＲＮＡを発現する過程（転写）、及び／又は、前記ｍＲＮＡを鋳型としてタンパク質を合成する過程（翻訳）を含む。本発明において遺伝子とは、所定のポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸であり、典型的には、植物が有するゲノムＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを鋳型として生成されるｍＲＮＡを指す。
【００５３】
本発明におけるＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現の促進とは、アラントインを施用していない植物と比較して、ＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現量が有意に増大することを意味する。植物においてＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現が促進されることは、植物体内でのＤＲＥＢ２ＡのポリペプチドをコードするｍＲＮＡの量、及び／又は、ＤＲＥＢ２Ａのポリペプチドの量の増大を検出することにより確認することができる。本発明におけるＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現の促進の程度は特に限定されないが、本発明のＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤を施用していない植物でのＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現量を１００としたとき、本発明のＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤を施用した植物でのＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現量が例えば１２０以上、好ましくは１５０以上、好ましくは２００以上となる。
【００５４】
本発明におけるＨＳＦ３遺伝子の発現の抑制とは、アラントインを施用していない植物と比較して、ＨＳＦ３遺伝子の発現量が有意に減少することを意味する。植物においてＨＳＦ３遺伝子の発現が抑制されることは、植物体内でのＨＳＦ３のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの量、及び／又は、ＨＳＦ３のポリペプチドの量の減少を検出することにより確認することができる。本発明におけるＨＳＦ３遺伝子の発現の抑制の程度は特に限定されないが、本発明のＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤を施用していない植物でのＨＳＦ３遺伝子の発現量を１００としたとき、本発明のＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤を施用した植物でのＨＳＦ３遺伝子の発現量が例えば９０以下、好ましくは８０以下、好ましくは７５以下となる。
【００５５】
本発明によるＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現の促進の対象となる植物は、前記遺伝子の発現の促進を必要とする植物であり、例えば、上記の温度条件のような高温ストレスや、他のストレスを受ける可能性のある環境で栽培される植物である。具体的な植物の種類は既述の通りである。
【００５６】
本発明のＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤は、アラントインを含有し、且つ植物のＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現を促進する作用を有するものであればよく、アラントイン自体であってもよいし、アラントインと他の成分とが組み合わされたアラントイン含有組成物であってもよい。
【００５７】
本発明のＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤は固形状、液状等の任意の形状であることができる。
本発明のＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤がアラントイン含有組成物である場合、該組成物は高温ストレス耐性向上剤について説明したのと同様のアラントイン含有組成物を使用できる。
【００５８】
本発明のＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤を植物に施用する方法としては、本発明のＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤又は本発明のＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤から放出されたアラントインが植物の根、茎、葉などの植物体に接触することができる方法であれば特に限定されず、前記植物体に本発明のＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤が直接接するように施用してもよいし、前記植物体が定着した土壌等の栽培担体に本発明のＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤を施用してもよい。
【００５９】
本発明のＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤を植物に施用する時期は特に限定されないが、好ましくは、本発明のＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤を、ストレス（例えば高温ストレス）を受ける前の植物に施用する。本発明のＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤は、ＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現を促進する。既述の通りＤＲＥＢ２Ａ遺伝子が発現すると各種ストレス耐性遺伝子の発現が誘導されると推定される。このため、ストレスを受ける前に予め本発明のＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤を施用した植物は、ストレス耐性が予め向上した状態となり、その後にストレスを受けたときの生存率が高いと推定される。
【００６０】
本発明のＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤を、ストレスを受ける前の植物に施用する場合、本発明のＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤を前記植物に施用する時点をＴ１とし、前記植物が前記ストレスに曝され始める時点をＴ２としたとき、Ｔ１からＴ２までの時間が好ましくは０．５〜１０日、好ましくは０．５〜９日、好ましくは０．５〜８日、好ましくは０．５〜７日、好ましくは０．５〜６日、好ましくは０．５〜５日、好ましくは０．５〜４日、好ましくは０．５〜３日、好ましくは０．５〜２日、好ましくは０．５〜１．５日である。この実施形態によれば、前記植物は本発明のＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤によりストレス耐性が向上した状態で前記ストレスに曝されるため、前記ストレスに曝された後の生存率が高い。本発明のＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤を、前記ストレスを受ける前の植物にＮ回（Ｎは２以上）施用してもよく、その場合は、ＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤を施用する各時点Ｔ１ｎ（ｎは１〜Ｎの整数）からＴ２までの時間がそれぞれ上記範囲を満たすことが好ましい。本発明のＤＲＥＢ２Ａ遺伝子発現促進剤を複数回施用することにより、植物のストレス耐性を更に向上させることができる。
【００６１】
本発明においてＤＲＥＢ２Ａ遺伝子とは、ＮＣＢＩ（米国立生物工学情報センター、National Center for Biotechnology）が提供するデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）やその他のデータベースにおいて、dehydration-responsive element-binding protein 2A又はdehydration-responsive element-binding protein 2A-likeとアノテーションされているポリペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子、並びに、前記ポリペプチドと相同な機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子を指す。
【００６２】
ＮＣＢＩが提供するデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）においてdehydration-responsive element-binding protein 2A又はdehydration-responsive element-binding protein 2A-likeとアノテーションされているポリペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子は、下記ＵＲＬのウェブサイトに示される検索結果により確認することができる：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=dehydration-responsive+element-binding+protein+2A
例えばシロイヌナズナのＤＲＥＢ２Ａ遺伝子（ＡＧＩコード＝ＡＴ５Ｇ０５４１０）は、ｃＤＮＡの塩基配列としては、配列番号１に示す通りである。配列番号１に示す塩基配列のうち第１８９塩基から第１１９６塩基までの部分塩基配列が、ＤＲＥＢ２Ａのポリペプチドをコードする領域である。
【００６３】
また、対象とする植物によっては、dehydration-responsive element-binding protein 2A又はdehydration-responsive element-binding protein 2A-likeとアノテーションされているポリペプチドと相同な機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子の発現が促進されてもよい。
【００６４】
前記の、dehydration-responsive element-binding protein 2A又はdehydration-responsive element-binding protein 2A-likeとアノテーションされているポリペプチドと相同な機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子としては、例えば、
（１）配列番号１に示す塩基配列のうち第１８９塩基から第１１９６塩基までの部分塩基配列がコードするシロイヌナズナＤＲＥＢ２Ａポリペプチドのアミノ酸配列において、１又は数個、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、好ましくは１〜１０個、好ましくは１〜５個、好ましくは１〜３個、好ましくは１又は２個、のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列を含み、且つ、前記シロイヌナズナＤＲＥＢ２Ａポリペプチドと相同な機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子、又は
（２）前記シロイヌナズナＤＲＥＢ２Ａポリペプチドのアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、好ましくは９０％以上、好ましくは９５％以上、好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、前記シロイヌナズナＤＲＥＢ２Ａポリペプチドと相同な機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子
が挙げられるがこれらには限定されない。
【００６５】
本発明においてアミノ酸配列の配列同一性は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等を使用して求めることができる。例えば、前記シロイヌナズナＤＲＥＢ２Ａポリペプチドのアミノ酸配列と、他のアミノ酸配列との一致度が最大となるように、必要に応じてギャップを挿入して、この２つのアミノ酸配列のアラインメントを行ったとき、総アミノ酸残基数（ギャップを挿入する場合、ギャップ数を含む）に対する一致したアミノ酸残基数の割合（％）を指し、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡによるタンパク質の検索システムを用いて決定することができる（Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら、１９９３年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、第９０巻、ｐ.５８７３-５８７７；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２１５巻、ｐ．４０３−４１０；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．ら、１９８８年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８５巻、ｐ.２４４４-２４４８）。
【００６６】
本発明においてＨＳＦ３遺伝子とは、ＮＣＢＩ（米国立生物工学情報センター、National Center for Biotechnology）が提供するデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）やその他のデータベースにおいて、heat stress transcription factor A-1b又はheat stress transcription factor A-1b-likeとアノテーションされているポリペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子、並びに、前記ポリペプチドと相同な機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子を指す。
【００６７】
ＮＣＢＩが提供するデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）においてheat stress transcription factor A-1b又はheat stress transcription factor A-1b-likeとアノテーションされているポリペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子は、下記ＵＲＬのウェブサイトに示される検索結果により確認することができる：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=heat+stress+transcription+factor+A-1b
【００６８】
例えばシロイヌナズナのＨＳＦ３遺伝子（ＡＧＩコード＝ＡＴ５Ｇ１６８２０）は、ｃＤＮＡの塩基配列としては、配列番号２に示す通りである。配列番号２に示す塩基配列のうち第１７４塩基から第１６１９塩基までの部分塩基配列が、ＨＳＦ３のポリペプチドをコードする領域である。
【００６９】
また、対象とする植物によっては、heat stress transcription factor A-1b又はheat stress transcription factor A-1b-likeとアノテーションされているポリペプチドと相同な機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子の発現が抑制されてもよい。
【００７０】
前記の、heat stress transcription factor A-1b又はheat stress transcription factor A-1b-likeとアノテーションされているポリペプチドと相同な機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子としては、例えば、
（１）配列番号２に示す塩基配列のうち第１７４塩基から第１６１９塩基までの部分塩基配列がコードするシロイヌナズナＨＳＦ３ポリペプチドのアミノ酸配列において、１又は数個、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、好ましくは１〜１０個、好ましくは１〜５個、好ましくは１〜３個、好ましくは１又は２個、のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列を含み、且つ、前記シロイヌナズナＨＳＦ３ポリペプチドと相同な機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子、又は
（２）前記シロイヌナズナＨＳＦ３ポリペプチドのアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、好ましくは９０％以上、好ましくは９５％以上、好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、前記シロイヌナズナＨＳＦ３ポリペプチドと相同な機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子
が挙げられるがこれらには限定されない。
【実施例】
【００７１】
以下、本発明を、具体例を参照して説明する。しかしながら以下の具体例は本発明の特範囲を限定するものではない。
【００７２】
＜実験１．アラントイン蓄積シロイヌナズナの高温ストレス耐性の評価＞
１．植物材料
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  （Ｌ．）  Ｈｅｙｎｈ．，  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ−０）について、遺伝的背景が異なる以下の３種のラインを用いた。
（１）野生株（ＷＴ）
（２）アラントイナーゼ遺伝子破壊株（ａｌｎ−１）
（３）アラントイナーゼ遺伝子破壊株の相補株（ａｌｎ−１  ３５Ｓ：ＡＬＮ）
これらの植物は、非特許文献４において用いられているものと同じである。なお、アラントイナーゼ遺伝子破壊株の相補株（ａｌｎ−１  ３５Ｓ：ＡＬＮ）は、前記文献において「３５Ｓｐｒｏ：ＡＬＮ／ａｌｎ−１」と表示されているものと同一である。
【００７３】
上記（２）アラントイナーゼ遺伝子破壊株（ＳＡＬＫ＿０００３２５，  Ｙａｎｇ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｈａｎ  Ｋ．−Ｈ，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  １３４：  １０３９−１０４９）は、ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から入手したものである。
【００７４】
上記（３）アラントイナーゼ遺伝子破壊株の相補株（ａｌｎ−１  ３５Ｓ：ＡＬＮ）は、野生型シロイヌナズナ由来のアラントイナーゼの全長をコードするＤＮＡを、ベクターを利用して上記のａｌｎ−１に導入して得られたものである。具体的な調製方法は非特許文献４に記載の通りである。
【００７５】
２．生育培地
規定の半分の濃度のムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類（Murashige T., F. Skoog F. 1962, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures, Physiologia Plantarum 15: 473-497）及びスクロース、ビタミン類、ゲランガム（固化剤）をＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］緩衝液に溶解した。得られた溶液をオートクレーブ後、２５ｍＬずつ深型滅菌シャーレＦＸ（サンセイ医療器材；９０×２０ｍｍ）に分注してクリーンベンチ内で固化させ、１／２ＭＳ固形培地とした。得られた１／２ＭＳ固形培地は各成分を表１に示す濃度で含む。
【００７６】
【表１】
0006532026.tif 000003
【００７７】
３．生育条件および高温ストレス処理
（１）上記植物の完熟種子を数百粒とり１．５ｍＬチューブに入れた。以下の操作（２）〜（６）はクリーンベンチ内で行った。
（２）２．５％（ｖ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウム１ｍＬを、種子の入ったチューブに入れ、小型旋回ミキサー（１８回転／分）にセットして１０分間滅菌した。
（３）スピンダウン後、次亜塩素酸ナトリウム溶液を捨てて滅菌水を１ｍＬ加え、（２）の操作を行った。
（４）滅菌水を用いて（３）の操作を３回繰り返し、種子を十分に洗浄した。
（５）１／２ＭＳ固形培地の１シャーレを放射状に３つの区画に分け、各ラインについてそれぞれ１つの区画に９粒の種子（１シャーレ合計２７粒）を播種した（図１Ａ参照）。（６）蓋をあけた状態でシャーレをクリーンベンチ内に置き、種子周りの水を蒸発させた後（約２０〜３０分間）、サージカルテープでシャーレをシールした。
（７）シャーレを１枚ずつアルミホイルで包み、低温処理（４℃）を２日間行い休眠打破した。
（８）培養室に移し、２２℃・長日条件（蛍光灯下で１６時間光照射；０．０７ｍｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ−１  ｓ−１）で７日間培養した。
（９）上記（８）により無菌生育させた７日齢植物を、予め４５℃に設定しておいたインキュベータの庫内に置き、暗黒下で熱ショックを７５分間、９０分間又は１０５分間与えた。対照試験では、熱ショックを与えず２２℃での生育を継続した。
（１０）熱ショック処理後、シャーレを２２℃インキュベータ内で１０〜１５分間冷却し、上記（８）の条件で再び１週間生育させた。ダメージがシリアスな場合は３日目頃から葉のクロロシス（白化現象）が観察されるようになる。この現象を利用して生存率を評価した。
上記試験を２回行った。
【００７８】
４．結果
各熱ショック条件で処理し１週間生育させた後の各シャーレの写真を図１Ｂに示す。図１Ｂに示す個々のシャーレ内の植物のラインの配置は図１Ａに示す通りである。シャーレ内の数値は各区画での（生存した実生の数）／（発芽した実生の数）を示す。
【００７９】
図２には、各熱ショック条件での生存率を示す。図２に示す生存率は、図１Ｂに数値を示した生存数の結果を元に各条件での生存率（％）を求め、２つの試験での平均値を算出した結果である。
【００８０】
図１Ｂ及び図２に示す試験結果から、アラントイナーゼ遺伝子破壊株（ａｌｎ−１）は高温ストレスに耐性を有することが分かる。アラントイナーゼ遺伝子破壊株（ａｌｎ−１）では植物体内でアラントインの代謝が進まず蓄積されることから、本実験で観察された高温ストレス耐性はアラントインが植物体内で高濃度に存在することにより生じるものと結論づけた。
高温ストレスによりダメージを受けた植物では、葉のクロロシス（白化現象）が観察された。
【００８１】
＜実験２．アラントイン施用による単子葉植物への高温ストレス耐性付与＞
一辺５ｃｍのポリポットをバランスディッシュＢＤ−２（アズワン社）に載せ、７０ｍｌのバーミキュライト（プロトリーフ社）を入れ、その上に８０ｍｌ培養土（タキイ種苗）を入れ、タマネギ（品種：ネオアース、タキイ種苗）の種を３粒×３箇所播種し、更にその上に２０ｍｌのバーミキュライトを覆土した。その後に、水道水５０ｍｌ×２回の給水をバランスディッシュに行った。ポリポット（バランスディッシュと一体で）をバットに載せ、２２℃、１００００Ｌｕｘ、１２時間明期、１２時間暗期のインキュベータに置き、栽培を開始した。栽培開始日を播種０日目とする。播種５日目、発芽が確認された。播種６日目、各ポットの３個体（１箇所につき１個体）を残し、残りの個体を間引いた。
【００８２】
播種６日目、実験区ごとに水道水（以下、水区）、或いは、１ｍＭアラントイン水溶液（アラントイン区）４０ｍｌ／ポットをそれぞれに施用した。播種１１日目、全ポットに４０ｍｌ／ポットの水道水を給水した。播種１３日目（タマネギは本葉第２葉期）、バットごと恒温器に入れて４５℃コントロール下で１時間、１．５時間、２時間さらし、高温ストレスを与えた。高温ストレス前後でポット中の土は十分な湿気を保った状態であった。高温ストレス処理終了後、２２℃のインキュベータに戻し、栽培を継続した。ヒートショック後２日目に、４０ｍｌ／ポットの給水を行った。さらに、その後中２日の間隔で４０ｍｌ／ポットの給水を行った。
【００８３】
ヒートショック後３日目の生存率は、１時間処理で、水区２２．２％、アラントイン区６６．７％、１．５時間処理で、水区０％、アラントイン区３３．３％、２時間処理で、水区０％、アラントイン区１１．１％であった。ヒートショック後８日目の生存率も同じ結果であった。以上の結果から、アラントインの施用による高温ストレス耐性付与効果が確認できた。
【００８４】
ここで「生存率」とは、ヒートショック処理を施した植物体の数に対する、生存した植物体の割合を示す。生存率の算出に際しては、最新葉に生理障害（白化、萎れ、葉の巻）があり、これ以上生育しない個体を生存していない個体として扱った。
【００８５】
図３には、４５℃で１．５時間処理したヒートショック後３日目の植物体の写真を示す。図３上段がアラントイン区（生存率３３．３％）の植物体の写真であり、図３下段が水区（生存率０％）の植物体の写真である。
【００８６】
＜実験３．アラントイン施用による双子葉植物への高温ストレス耐性付与＞
一辺５ｃｍのポリポットをバランスディッシュＢＤ−２（アズワン社）に載せ、７０ｍｌのバーミキュライト（プロトリーフ社）を入れ、その上に８０ｍｌ培養土（タキイ種苗）を入れ、コマツナ（品種：楽天、タキイ種苗）の種をポット中央に３粒播種し、更にその上に２０ｍｌのバーミキュライトを覆土した。その後に、水道水５０ｍｌ×２回の給水をバランスディッシュに行った。ポリポット（バランスディッシュと一体で）をバットに載せ、２２℃、１００００Ｌｕｘ、１２時間明期、１２時間暗期のインキュベータに置き、栽培を開始した。栽培開始日を播種０日目とする。
【００８７】
播種３日目、発芽が確認された。播種６日目、各ポットの１個体を残し、残りの個体を間引いた。播種６日目、実験区ごとに水道水又は１ｍＭアラントイン水溶液４０ｍｌ／ポットをそれぞれに施用した。播種１１日目、全ポットに４０ｍｌ／ポットの水道水を給水した。播種１３日目、実験区ごとに水道水又は１ｍＭアラントイン水溶液４０ｍｌ／ポットをそれぞれに施用した。播種１４日目（コマツナは本葉第２葉期）、バットごと恒温器に入れて４５℃コントロール下で１時間さらし、高温ストレスを与えた。高温ストレス前後でポット中の土は十分な湿気を保った状態であった。高温ストレス処理終了後、２２℃のインキュベータに戻し、栽培を継続した。ヒートショック後２日目に、４０ｍｌ／ポットの給水を行った。さらに、その後中２日の間隔で４０ｍｌ／ポットの給水を行った。
【００８８】
ヒートショック後７日目の生存率は、１時間処理で、水区３３．３％、アラントイン区１００％であった。以上の結果から、アラントインの施用による高温ストレス耐性付与効果が確認できた。
【００８９】
ここで「生存率」とは、ヒートショック処理を施した植物体の数に対する、生存した植物体の割合を示す。生存率の算出に際しては、最新葉に生理障害（白化、萎れ、葉の巻）があり、これ以上生育しない個体を生存していない個体として扱った。
【００９０】
図４には、４５℃で１時間処理したヒートショック後７日目の植物体の写真を示す。図４上段がアラントイン区（生存率１００％）の植物体の写真であり、図４下段が水区（生存率３３．３％）の植物体の写真である。
【００９１】
＜実験４．アラントイン蓄積植物におけるＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現促進＞
１．概要
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  （Ｌ．）  Ｈｅｙｎｈ．）の遺伝子発現に与えるアラントインの影響を精査するために、アラントイナーゼの遺伝子破壊によりアラントインを蓄積するａｌｎ−１変異株のマイクロアレイ未加工データ（NCBI Gene Expression Omnibus accession number GSE44922）に対して、Konishi, T. (2004) Three-parameter longnormal distribution ubiquitously found in cDNA microarray data and its application to parametric data treatment. BMC Bioinformatics 5: 5に記載の手法に従って標準化処理を施した。得られた標準化データに対して二次元配置分散分析を適用し、厳格な検定条件（Ｐ＜０．００１）のもと、野生株と比較して転写産物レベルが３倍以上変動した遺伝子を選抜した（Konishi, T. (2011) Microarray test results should not be compensated for multiplicity of gene contents. BMC Syst. Biol. 5(Suppl 2): S6）。これらの遺伝子に対してVirtualPlant (version 1.3; http://virtualplant.bio.nyu.edu/cgi-bin/vpweb/)を使用して、生物プロセスに関する遺伝子オントロジー(GO)解析を行った。
【００９２】
２．手順の詳細
シロイヌナズナの２週齢の野生株及びａｌｎ−１変異株の苗から全ＲＮＡを抽出した。各遺伝子型について２つの独立した生物試料を用いた。ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写とラベリング及びAffymetrics ATH1 Gene Chipsへのハイブリダイゼーションを、製造元の指示書に従って行った。ハイブリダイゼーションを行ったマイクロアレイを洗浄後、Affymetrics GeneChip Scanner 3000 7Gを用いてハイブリダイゼーションに由来するシグナルを収集した。この手順により、野生株及びａｌｎ−１変異株のそれぞれについて２枚ずつ計４枚のマイクロアレイ未加工データを取得した。この手順はWatanabe, S. et. al., (2014) Plant Cell Environ. 37: 1022-1036に記載されている通りである。
【００９３】
これらのマイクロアレイ未加工データは、NCBI Gene Expression Omnibus（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）のアクセッション番号で登録・公開されている。これらのマイクロアレイデータについて、スカイライト・バオテック（株）のSuperNORMサービスを利用して、３パラメータ対数正規分布モデルを使ったパラメトリック法により標準化し、各遺伝子の発現量をｚスコアに変換した（前記Konishi, T. (2004)）。この標準化作業により、異なるマイクロアレイ間での遺伝子発現量の比較が可能となる。標準化したデータはGSE73841のアクセッション番号で登録されている。
【００９４】
個々の遺伝子の発現量を野生株とａｌｎ−１変異株の間で比較した。ａｌｎ−１変異株の発現量が３倍以上増大あるいは低下した遺伝子を、前記Ｋｏｎｉｓｈｉ，２０１１の方法に従い厳格な検定条件（Ｐ＜０．００１）のもと二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により選抜した。VirtualPlant (version 1.3; http://virtualplant.bio.nyu.edu/cgi-bin/vpweb/)のBioMapsツールをデフォルトの設定で使用し（偽発見率補正したFisherの正確確率検定, P<0.01）、Arabidopsisゲノムアノテーション (TAIR release 10; http://arabidopsis.org/) に従い、生物プロセスに関する遺伝子オントロジー(GO)解析を行った。
【００９５】
３．結果
上記の解析の結果、ａｌｎ−１変異株において、ＤＲＥＢ２Ａ遺伝子（ＡＧＩコード＝ＡＴ５Ｇ０５４１０、配列番号１）の発現量は野生株の３．１７倍であった。
【００９６】
一方で、ａｌｎ−１変異株において、熱ショック転写因子３遺伝子（ＨＳＦ３）（ＡＧＩコード＝ＡＴ５Ｇ１６８２０、配列番号２）の発現量は野生株の０．５７７倍であった。
【００９７】
＜実験５．アラントイン含有培地中での栽培によるＤＲＥＢ２Ａ遺伝子の発現促進＞
シロイヌナズナ野生株種子（Ｃｏｌｕｍｂｉａ−０）を２．５％（ｖ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウムで滅菌後、実験１、表１記載の１／２ＭＳ固形培地（１ｍＭアラントインを含む、コントロール区はアラントインなし、直径９０ｍｍ、高さは２０ｍｍの深型シャーレ）に播種し、長日条件（５０００Ｌｕｘ、１６時間明期、８時間暗期のインキュベータ、２２℃）で１４日間成長させた。市販キットを用いてシロイヌナズナ葉、茎からＲＮＡの抽出（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡＩＩ、ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）、逆転写（ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、ＴＯＹＯＢＯ）および定量ＰＣＲ（ＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ  ＦＡＳＴ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、ＫＡＰＡＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）を行った。レファレンス遺伝子にはＡＣＴ２（ＡＧＩコード＝ＡＴ３Ｇ１８７８０）を用いた。その結果、コントロール区と比較してＤＲＥＢ２Ａ（ＡＧＩコード＝ＡＴ５Ｇ０５４１０、配列番号１）の相対発現量は２．２倍、ＨＳＦ３（ＡＧＩコード＝ＡＴ５Ｇ１６８２０、配列番号２）の相対発現量は０．７倍であった。
【００９８】
＜実験６．アラントイン含有培地中での栽培したシロイヌナズナの高温ストレス耐性の評価＞
１．植物材料
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  （Ｌ．）  Ｈｅｙｎｈ．，  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ−０）については、実験１．に記載の野生株（ＷＴ）を用いた。
【００９９】
２．生育培地
実験１、表１記載の１／２ＭＳ固形培地（アラントイン添加区は１０μＭ、１００μＭ、１０００μＭアラントインを更に添加し、アラントイン無添加区はアラントインの添加なし、深型シャーレNo. 903 VALMARK 滅菌シャーレ；イナ・オプティカ社）。
【０１００】
３．生育条件および高温ストレス処理
（１）上記植物の完熟種子を数百粒とり１．５ｍＬチューブに入れた。以下の操作（２）〜（６）はクリーンベンチ内で行った。
（２）２．５％（ｖ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウム１ｍＬを、種子の入ったチューブに入れ、小型旋回ミキサー（１８回転／分）にセットして１０分間滅菌した。
（３）スピンダウン後、次亜塩素酸ナトリウム溶液を捨てて滅菌水を１ｍＬ加え、（２）の操作を行った。
（４）滅菌水を用いて（３）の操作を３回繰り返し、種子を十分に洗浄した。
（５）前記シャーレでは、平面視で円形の収容部が、直径方向に延びる１つの隔壁によって半円形の２つの区画に区切られている。前記シャーレの一方の区画にアラントイン無添加１／２ＭＳ固形培地を収容し、他方の区画にアラントイン添加１／２ＭＳ固形培地を収容し、それぞれ１つの区画に１５粒の種子（１シャーレ合計３０粒）を播種した（図５Ａ参照）。
（６）蓋をあけた状態でシャーレをクリーンベンチ内に置き、種子周りの水を蒸発させた後（約２０〜３０分間）、サージカルテープでシャーレをシールした。
（７）シャーレを１枚ずつアルミホイルで包み、低温処理（４℃）を２日間行い休眠打破した。
（８）培養室に移し、２２℃・長日条件（蛍光灯下で１６時間光照射；０．０７ｍｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ−１  ｓ−１）で７日間培養した。
（９）上記（８）により無菌生育させた７日齢植物を、予め４５℃に設定しておいたインキュベータの庫内に置き、暗黒下で熱ショックを１０５分間与えた。対照試験では、熱ショックを与えず２３℃での生育を継続した。
（１０）熱ショック処理後、シャーレを２３℃インキュベータ内で１０〜１５分間冷却し、上記（８）の条件で再び１週間生育させた。ダメージがシリアスな場合は３日目頃から葉のクロロシス（白化現象）が観察されるようになる。この現象を利用して生存率を評価した。
上記試験を２回行った。
【０１０１】
４．結果
各熱ショック条件で処理し１週間生育させた後の各シャーレの写真を図５Ｂに示す。図５Ｂに示す個々のシャーレ内の植物のラインの配置は図５Ａに示す通りである。シャーレ内の数値は各区画での（生存した実生の数）／（発芽した実生の数）を示す。
【０１０２】
図６には、各熱ショック条件での生存率を示す。図６に示す生存率は、図５Ｂに数値を示した生存数の結果を元に各条件での生存率（％）を求め、写真を示していない別の１回の試験についても同様に生存率（％）を求め、２つの試験での平均値を算出した結果である。
【０１０３】
図５Ｂ及び図６に示す試験結果から、アラントイン含有培地中での栽培したシロイヌナズナは高温ストレスに耐性を有することが分かる。アラントイン含有培地中で栽培したシロイヌナズナでは植物体内でアラントインが蓄積されることから、本実験で観察された高温ストレス耐性はアラントインが植物体内で高濃度に存在することにより生じるものと結論づけた。
【０１０４】
高温ストレスによりダメージを受けた植物では、葉のクロロシス（白化現象）が観察された。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【配列表】
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