(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）配列番号１又は配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１又は配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１又は配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１又は配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボン４’−グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボン４’−グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボン４’−グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項９】
さらに、以下の（ｆ）〜（ｉ）：
（ｆ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチドを含有する、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載のベクターが導入された非ヒト宿主。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを用いてフラボンの７位の水酸基に糖を付加する方法。
【請求項１２】
前記フラボンがフラボン４’−グルコシドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドが導入された、植物若しくはその子孫又はそれらの部分若しくは組織。
【請求項１４】
さらに、以下の（ｆ）〜（ｊ）：
（ｆ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｊ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチドが導入された、請求項１３に記載の植物若しくはその子孫又はそれらの部分若しくは組織。
【請求項１５】
切花である、請求項１３又は１４に記載の植物の部分。
【請求項１６】
請求項１５に記載の切花を用いた切花加工品。
【請求項１７】
以下の工程：
請求項１０に記載の非ヒト宿主を培養し又は生育させ、そして
該非ヒト宿主からフラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を採取する、
を含む、フラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質の製造方法。
【請求項１８】
前記フラボンがフラボン４’−グルコシドである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
以下の工程：
請求項１０に記載の非ヒト宿主を培養し又は生育させ、そして
該非ヒト宿主から、７位の水酸基に糖が付加されたフラボンを採取する、
を含む、７位の水酸基に糖が付加されたフラボンの製造方法。
【請求項２０】
前記フラボンが４’位の水酸基にも糖が付加されている、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラボン、特にフラボン４’−グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
花産業において、新しい形質を持つ花は常に珍重される。特に、花の最も重要な形質である「色」を変化させた植物の開発は産業上重要視され、これまで、古典的な方法である交配による品種改良によってさまざまな色の花が開発されてきた。交配は有効な品種改良方法であるものの、植物に固有の遺伝的制限があるため、交配可能な近縁種が持つ遺伝子資源しか利用することができないという欠点がある。例えば、長年の交配育種にもかかわらず、バラ、カーネーション、キク、ユリには紫色〜青色、リンドウ、アイリスには鮮やかな赤色、ゼラニウム、アサガオには黄色の品種は、これまで作出されていない。【０００３】
花の色は、フラボノイド、カロテノイド、クロロフィル、ベタレインの４種類の色素に起因する。この中で、フラボノイドは黄、赤、紫、青といった多様な色を呈する。赤、紫、青色を呈する１グループはアントシアニンと総称され、アントシアニンの構造の多彩さが花の色が多彩である原因の１つである。アントシアニンはその生合成経路を考慮するとアグリコンの構造に依り、大きく３つのグループに分類することができる。カーネーションやゼラニウムのような鮮やかな赤色の花にはペラルゴニジン型アントシアニンが、青色や紫色の花にはデルフィニジン型アントシアニンが含まれることが多い。バラ、カーネーション、キク、ユリに青や紫色の品種が存在しないのは、これらの植物がデルフィニジン型アントシアニンを合成する能力がないことが原因である。【０００４】
花色が青くなるためにはデルフィニジンが蓄積することに加え、（ｉ）アントシアニンが１つ又は複数の芳香族アシル基により修飾されること、（ｉｉ）アントシアニンがフラボンやフラボノールなどのコピグメントと共存すること、（ｉｉｉ）鉄イオンやアルミニウムイオンがアントシアニンと共存すること、（ｉｖ）アントシアニンが局在する液胞のｐＨが中性から弱アルカリ性に上昇すること、又は（ｖ）アントシアニン、コピグメント、金属イオンが錯体を形成すること（このようなアントシアニンはメタロアントシアニンと呼ばれる）のいずれかが必要であると考えられている（以下、非特許文献１）。【０００５】
フラボノイドやアントシアニン生合成はよく研究され、関連する生合成酵素やそれをコードする遺伝子が同定されている（以下、非特許文献２参照）。例えば、デルフィニジンの生合成に必要なフラボノイドのＢ環を水酸化するフラボノイド３’，５’−水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）の遺伝子は多くの植物から得られている。また、これらのＦ３’５’Ｈ遺伝子をカーネーション（以下、特許文献１参照）、バラ（以下、非特許文献３、特許文献２、３参照）、キク（以下、特許文献４参照）に導入することにより、花弁でデルフィニジンを蓄積し、花の色が青く変化した遺伝子組換え植物も作出されている（以下、非特許文献４参照）。このようなカーネーションとバラは市販されている。【０００６】
フラボン（flavone）は、有機化合物の一種で、フラバン誘導体の環状ケトンであり、狭義には化学式Ｃ15Ｈ10Ｏ2、分子量２２２．２４の化合物、２，３−ジデヒドロフラバン−４−オン（2,3-didehydroflavan-4-one）を指す。広義にはフラボン類に属する誘導体を「フラボン」と称する。広義のフラボン（フラボン類）はフラボノイドのカテゴリーの１つであり、フラボノイドの中でフラボン構造を基本骨格とし、さらに３位に水酸基を持たないものが「フラボン」に分類される。代表的な「フラボン」としてはアピゲニン（apigenin; 4',5,7-trihydroxyflavone）やルテオリン（luteolin; 3',4',5,7-tetrahydroxyflavone）が挙げられる。本願明細書中、用語「フラボン」とは、広義のフラボン、すなわち、フラボン類に属する誘導体を意味する。【０００７】
フラボンの生合成に必要なフラボン合成酵素（ＦＮＳ）の遺伝子も多くの植物から得られている。フラボンは、アントシアニンと共存するとアントシアニンの色を青く濃くする効果があることが知られており、これらのＦＮＳ遺伝子は花色改変において注目されていた。Ｆ３’５’Ｈと共にＦＮＳ遺伝子を、フラボンを合成する能力がないバラへ導入することにより、花弁でデルフィニジンを蓄積すると同時に、フラボンも蓄積し、花の色がより一層青く変化した（以下、特許文献５参照）。また、フラボンは、花色青色化以外に、紫外線を吸収することから、植物を紫外線から守ったり、虫媒花では昆虫の視覚へのシグナルとして機能する。また、フラボンは植物と土壌微生物との相互作用にも関係している。さらに、フラボンは健康によい成分として食品や化粧品の素材としても用いられている。例えば、フラボンは抗癌作用を有するといわれており、フラボンを多く含む食材を摂取することによって、ガンの治療や予防になることも実証されている。【０００８】
また、アントシアニンやフラボンを修飾する遺伝子も多くの植物から得られている。糖転移酵素、アシル基転移酵素、メチル基転移酵素などがあるが、ここでは配糖化反応を触媒する糖転移酵素（ＧＴ）について記載する。例えば、アントシアニンの３位の水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、リンドウ、シソ、ペチュニア、バラ、キンギョソウなどから単離されている（以下、非特許文献４〜６、特許文献６参照）。アントシアニンの５位の水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、シソ、ペチュニア、リンドウ、バーベナ、トレニアなどから単離されている（以下、非特許文献５〜７、特許文献７参照）。フラボンの７位の水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、シロイヌナズナから単離されている（以下、非特許文献８参照）。バイカレンの７位の水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がコガネバナから単離されており、この遺伝子を大腸菌で発現させたタンパク質がフラボノイドの７位の水酸基にグルコースを転移する活性を示す反応を触媒することも報告されている（以下、非特許文献９参照）。アントシアニンの３’位の水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、リンドウ、チョウマメ、サイネリアから単離されている（以下、特許文献８参照）。また、アントシアニンのＡ環とＣ環の異なる２箇所の水酸基に逐次的にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がバラで単離されている（以下、特許文献９参照）。アントシアニンのＢ環の異なる２箇所の水酸基に逐次的にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がチョウマメで単離されている（以下、特許文献１０参照）。【０００９】
前記した糖転移酵素は、ＵＤＰ−グルコースを糖供与体としているが、最近、アシルグルコースを糖供与体とする糖転移酵素も同定されている。アントシアニジン３-グルコシドの５位の水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がカーネーションから、７位の水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がデルフィニウムから単離されている（以下、非特許文献１０・１３参照）。さらに、リビングストンデージー由来の糖転移酵素遺伝子を大腸菌で発現させたタンパク質が、in vitro においてフラボノイドの４’位又は７位のいずれか一方の水酸基にグルコースを転移する活性を示すことが報告されている（以下、非特許文献１１参照）。また、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドがネモフィラから単離されている（以下、特許文献１１参照）。【００１０】
このように糖転移酵素としては様々な水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質が多数存在しているが、その機能が同定されていない糖転移酵素も未だ多数残っていると考えられている。したがって、植物内で機能し、花色の改変に有用な糖転移酵素の取得が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００６／１０５５９８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２０１０／１２２８４９号パンフレット
【特許文献３】国際公開第ＷＯ２００５／０１７１４７号パンフレット
【特許文献４】国際公開第ＷＯ２００９／０６２２５３号パンフレット
【特許文献５】国際公開第ＷＯ２００８／１５６２１１号パンフレット
【特許文献６】国際公開第ＷＯ２００７／０９４５２１号パンフレット
【特許文献７】国際公開第ＷＯ９９／０５２８７号パンフレット
【特許文献８】国際公開第ＷＯ０１／０９２５０９号パンフレット
【特許文献９】特開２００６−１４９２９３号公報
【特許文献１０】特開２００５−９５００５号公報
【特許文献１１】国際公開第ＷＯ２０１３／１０８７９４号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第ＷＯ２０１２／０９６３０７号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Natural Product Reports (2009), 26, 884-915
【非特許文献２】Biosci. Biotechnol. Biochem (2010), 74(9), 1760-1769
【非特許文献３】Plant Cell Physiol (2007), 48(11), 1589-1600
【非特許文献４】Plant Cell Physiol (1996), 37(5), 711-716
【非特許文献５】J. Biol. Chem (1999), 274(11), 7405-7411
【非特許文献６】Plant Molecular Biology (2002), 48, 401-411
【非特許文献７】Journal of Experimental Botany (2008), 59(6), 1241-1252
【非特許文献８】Biosci. Biotechnol. Biochem (2006), 70(6), 1471-1477
【非特許文献９】Planta (2000), 210, 1006-1013
【非特許文献１０】Plant Cell (2010), 22(10), 3374-89
【非特許文献１１】The Plant Journal (1999), 19(5), 509-519
【非特許文献１２】Threes (2007), 21, 521-529
【非特許文献１３】Plant Cell（2013），25(10)，4150-65
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
フラボンの物性を変えることは、花の色を変えることや、食品、医薬品、化粧品の素材の開発に必要である。例えば、デルフィニジンを蓄積しているカーネーション、バラ、キクの色は青紫色であるが、この色をさらに青くする研究が行われている。【００１４】
ツユクサ、ヤグルマギク、サルビア、ネモフィラの色素に代表されるメタロアントシアニンは、アントシアニン６分子、フラボン６分子、及び金属イオン２原子からなり、各成分が集合して安定な青色色素を形成している。例えば、ネモフィラのメタロアントシアニンは、ネモフィリン、マロニルアピゲニン４’，７−ジグルコシド、Ｍｇ2+、及びＦｅ3+から形成されている。サルビアのメタロアントシアニンは、シアノサルビアニン、アピゲニン４’，７−ジグルコシド、及びＭｇ2+から形成されている。これまでの研究によって、メタロアントシアニンを形成する青い花はすべて、４’位と７位の両方の水酸基に糖が付加されているフラボンを生合成しており、そのフラボンに付加されている糖が、メタロアントシアニン形成における分子認識において、重要な役割を担っていることが分かっている。フラボンの４’位に配位されている糖が形成時の分子認識に重要であり、７位の糖はその安定性に寄与することが示されている（非特許文献１）。これら２つの糖がフラボンに付加されてはじめて、メタロアントシアニンが形成され、美しい青色が発現する。
かかる状況の下、本発明が解決しようとする課題は、フラボン、特にフラボン４’−グルコシドの７位の水酸基に糖を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとその使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題を解決すべく、本願発明者は鋭意検討し、実験を重ねた結果、フラボン、特にフラボン４’−グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを単離し、これを使用することができることを確認し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りのものである。【００１６】
［１］以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）配列番号１又は配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１又は配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチド。【００１７】
［２］配列番号１又は配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、前記［１］に記載のポリヌクレオチド。【００１８】
［３］配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、前記［１］に記載のポリヌクレオチド。【００１９】
［４］配列番号１又は配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボン４’−グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、前記［１］に記載のポリヌクレオチド。【００２０】
［５］配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボン４’−グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、前記［１］に記載のポリヌクレオチド。【００２１】
［６］前記［１］〜［５］のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質。【００２２】
［７］前記［１］〜［５］のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。【００２３】
［８］さらに、以下の（ｆ）〜（ｉ）：
（ｆ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチドを含有する、前記［７］に記載のベクター。【００２４】
［９］前記［７］又は［８］に記載のベクターが導入された非ヒト宿主。【００２５】
［１０］前記［１］〜［５］のいずれかに記載のポリヌクレオチドを用いてフラボンの７位の水酸基に糖を付加する方法。【００２６】
［１１］前記フラボンがフラボン４’−グルコシドである、前記［１０］に記載の方法。【００２７】
［１２］前記［１］〜［５］のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入された、植物若しくはその子孫又はそれらの部分若しくは組織。【００２８】
［１３］さらに、以下の（ｆ）〜（ｉ）：
（ｆ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチドが導入された、前記［１２］に記載の植物若しくはその子孫又はそれらの部分若しくは組織。【００２９】
［１４］切花である、前記［１２］又は［１３］に記載の植物の部分。【００３０】
［１５］前記［１４］に記載の切花を用いた切花加工品。【００３１】
［１６］以下の工程：
前記［９］に記載の非ヒト宿主を培養し又は生育させ、そして
該非ヒト宿主からフラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を採取する、
を含む、フラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質の製造方法。【００３２】
［１７］前記フラボンがフラボン４’−グルコシドである、前記［１６］に記載の方法。【００３３】
［１８］以下の工程：
前記［９］に記載の非ヒト宿主を培養し又は生育させ、そして
該非ヒト宿主から、７位の水酸基に糖が付加されたフラボンを採取する、
を含む、７位の水酸基に糖が付加されたフラボンの製造方法。【００３４】
［１９］前記フラボンの４’位の水酸基にも糖が付加されている、前記［１８］に記載の方法。【００３５】
［２０］前記［１９］に記載の製造方法により製造された４’位及び７位の水酸基に糖が付加されフラボンを含有する組成物。
【発明の効果】
【００３６】
本発明のポリヌクレオチドを適切な宿主細胞内で発現させることにより、フラボン、特にフラボン４’−グルコシドの７位の水酸基に特異的に糖を転移する活性を有するタンパク質を製造することが可能となる。本発明により、フラボン、特にフラボン４’−グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を、植物内で、構成的又は組織特異的に発現させることで、花色の改変に利用することができる。【００３７】
フラボン、特にフラボン４’−グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を植物へ導入することにより、４’位と７位の両方の水酸基に糖が付加したフラボンを容易に生成することができる。好ましくは、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を、７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質と共に植物内で発現させることにより、４’位と７位の両方の水酸基に糖が付加したフラボンが生成する。
また、本発明により、７位の水酸基に糖が付加したフラボン、特に４’位及び７位の両方の水酸基に糖が付加したフラボンの製法、及び該製法によって得られたフラボンを含む組成物も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】花弁抽出液とアピゲニンを酵素反応させた液の高速液体クロマトグラムである。
【図２】アピゲニン４’，７−ジグルコシドの生合成経路を説明する図である。
【図３】ＮｍＧＴ２２タンパク質溶液とアピゲニンを酵素反応させた液の高速液体クロマトグラムである。
【図４】ＮｍＧＴ２２タンパク質溶液とアピゲニン４‘−グルコシドを酵素反応させた液の高速液体クロマトグラムである。
【図５】ＮｍＧＴ２２タンパク質溶液とアピゲニン７−グルコシドを酵素反応させた液の高速液体クロマトグラムである。
【図６】ＮｍＧＴ２２タンパク質の各種フラボノイド基質に対する反応性をまとめた図である。
【図７】ＮｍＧＴ２２とブドウのヒドロキシ安息香酸やケイ皮酸に糖を付加する酵素（ＶｖｇＧＴ２）のアミノ酸配列を比較するアライメント図である。
【図８】本発明のＮｍＧＴ２２及びそのホモログ（ＮｍＧＴ２２−II）と前記述した諸酵素との関係を指標する系統樹である。
【図９】ＮｍＧＴ２２を導入した組換えＢＹ２の抽出液の高速液体クロマトグラムである。
【図１０】ＮｍＧＴ２２を導入した組換えバラの花弁抽出液の高速液体クロマトグラムである。
【図１１】ＮｍＧＴ２２とＮｍＧＴ２２−IIのアミノ酸配列を比較するアライメントである。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明は、（ａ）配列番号１又は配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１又は配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチドに関する。
【００４０】
本明細書中、用語「ポリヌクレオチド」はＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。
本明細書中、用語「ストリジェント条件」とは、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドと、ゲノムDNAとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、及びその他公知の条件の適当な組み合わせによって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、又はハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（stringency）は増加する。さらに、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。したがって、用語「ストリンジェント条件」とは、各塩基配列間の「同一性」の程度が、例えば、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上であるような、高い同一性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリダイズするような条件を意味する。「ストリンジェント条件」としては、例えば、温度６０℃〜６８℃において、ナトリウム濃度１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭ、ｐＨ６〜８であるような条件を挙げることができ、具体例としては、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、１％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液５０％ホルムアルデヒド、及び４２℃の条件でハイブリダイゼーションを行い、０．１×ＳＳＣ（１５ｍＭＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ、及び５５℃の条件で洗浄を行うものを挙げることができる。
【００４１】
ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。このようなハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子としては、天然由来のもの、例えば、植物由来のもの、植物由来以外のものであってもよい。また、ハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子はｃＤＮＡであってもよく、ゲノムＤＮＡであっても化学合成したＤＮＡでもよい。
【００４２】
上記「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を意味する。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
また、本発明に係るＤＮＡは、当業者に公知の方法、例えば、ホスホアミダイド法等により化学的に合成する方法、植物の核酸試料を鋳型とし、目的とする遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計したプライマーを用いる核酸増幅法などによって得ることができる。
【００４３】
本明細書中、用語「同一性」とは、ポリペプチド配列（又はアミノ酸配列）あるいはポリヌクレオチド配列（又は塩基配列）における２本の鎖の間で該鎖を構成している各アミノ酸残基同志又は各塩基同志の互いの適合関係において同一であると決定できるようなものの量（数）を意味し、二つのポリペプチド配列又は二つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものであり、「同一性」は容易に算出できる。二つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の同一性を測定する方法は数多く知られており、用語「同一性」は、当業者には周知である（例えば、Lesk, A. M. (Ed.), Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988); Smith, D. W. (Ed.), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Grifin, A. M. & Grifin, H. G. (Ed.), Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human Press, New Jersey, (1994); von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, New York, (1987); Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New York, (1991)等参照）。
【００４４】
また、本明細書に記載される「同一性」の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の同一性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、好ましくは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒアプリケーション（バージョン９．５、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）のＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて算出される数値である。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチド（核酸、遺伝子）は、着目のタンパク質を「コードする」ものである。ここで、「コードする」とは、着目のタンパク質をその活性を備えた状態で発現させるということを意味している。また、「コードする」とは、着目のタンパク質を連続する構造配列（エクソン）としてコードすること、又は介在配列（イントロン）を介してコードすることの両者の意味を含んでいる。
【００４６】
生来の塩基配列を有する遺伝子は、以下の実施例に記載するように、例えば、ＤＮＡシークエンサーによる解析によって得られる。また、修飾されたアミノ酸配列を有する酵素をコードするＤＮＡは生来の塩基配列を有するＤＮＡを基礎として、常用の部位特定変異誘発やＰＣＲ法を用いて合成することができる。例えば、修飾したいＤＮＡ断片を生来のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの制限酵素処理によって得て、これを鋳型にして、所望の変異を導入したプライマーを用いて部位特定変異誘発やＰＣＲ法を実施し、所望の修飾したＤＮＡ断片を得る。その後、この変異を導入したＤＮＡ断片を目的とする酵素の他の部分をコードするＤＮＡ断片と連結すればよい。
あるいは短縮されたアミノ酸配列からなる酵素をコードするＤＮＡを得るには、例えば、目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば、全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを所望の制限酵素により切断し、その結果得られたＤＮＡ断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコードしていない場合は、不足部分の配列からなるＤＮＡ断片を合成し、連結すればよい。
【００４７】
また、得られたポリヌクレオチドを大腸菌及び酵母での遺伝子発現系を用いて発現させ、酵素活性を測定することにより、得られたポリヌクレオチドがフラボン、特にフラボン４’−グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードすることを確認することができる。さらに、当該ポリヌクレオチドを発現させることにより、ポリヌクレオチド産物であるフラボン、特にフラボン４’−グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を得ることができる。あるいは配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに対する抗体を用いてもフラボン、特にフラボン４’−グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を取得することができ、かかる抗体を用いて他の生物由来のフラボン、特にフラボン４’−グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローン化することもできる。
【００４８】
本発明は、前記したポリヌクレオチドを含む（組換え）ベクター、特に発現ベクター、さらに該ベクターによって形質転換された宿主にも関する。
宿主としては、原核生物又は真核生物を用いることがきる。原核生物としては細菌、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する細菌、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物、例えば、バシルス・スブシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など常用の宿主を用いることができる。真核生物としては、下等真核生物、例えば、真核微生物、例えば、真菌である酵母又は糸状菌が使用できる。
【００４９】
酵母としては、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などが挙げられ、また糸状菌としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物、例えば、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物が挙げられる。宿主としては、さらに動物細胞又は植物細胞が使用でき、動物細胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒトなどの細胞系が使用され、さらに、昆虫細胞、例えば、カイコ細胞、カイコの成虫それ自体も宿主として使用される。
【００５０】
本発明の発現ベクターは、さらに、以下の（ｆ）〜（ｊ）：
（ｆ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｊ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチドを含有してもよい。これらのポリヌクレオチドは、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするものであり、国際公開第ＷＯ２０１３／１０８７９４（特許文献１１）に詳しく記載されている。
【００５１】
また、本発明の発現ベクターは、それらを導入する宿主の種類に依存して発現制御領域、例えば、プロモーター、ターミネーター、複製起点などを含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、常用のプロモーター、例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーターなどが使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーターなどが使用され、そして糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼプロモーター、ｔｒｐＣプロモーターなどが使用される。また、動物細胞宿主用のプロモーターとしては、ウイルス性プロモーター、例えば、ＳＶ４０アーリープロモーター、ＳＶ４０レートプロモーターなどが使用される。
植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの35S RNAプロモーター、rd29A遺伝子プロモーター、rbcSプロモーター、mac-1プロモーター等が挙げられる。また、組織特異的な遺伝子発現のためには、その組織で特異的に発現する遺伝子のプロモーターを用いることができる。
発現ベクターの作製は、制限酵素、リガーゼなどを用いて常法に従って行うことができる。また、発現ベクターによる宿主の形質転換も常法に従って行うことができる。
【００５２】
前記発現ベクターによって形質転換された宿主を培養、栽培又は生育させ、培養物又は培地から常法に従って、例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどにより回収・精製して、目的とするタンパク質を得ることができる。
本明細書では、ネモフィラ由来のフラボン、特にフラボン４’−グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子について述べているが、本発明に係るポリヌクレオチドは、ネモフィラ由来の遺伝子に限定されるものではなく、フラボン、特にフラボン４’−グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の起源としては植物でも動物でも微生物であってもよく、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有している限り、起源を問わず、植物における花色の変更に利用可能である。
【００５３】
本発明は、フラボン、特にフラボン４’−グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを植物に導入し、これを該植物内に含有させることにより得られる、植物若しくはその子孫又はこれらの部分若しくは組織にも関する。該部分若しくは組織の形態としては切花であることができる。本発明に係るフラボン、特にフラボン４’−グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、フラボン、特にフラボン４’−グルコシドの７位を配糖化したり、そのような配糖化を抑制することができ、その結果として植物における花色を変更することができる。
さらに、本発明のポリヌクレオチドに加え、上述のフラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを植物に導入してもよい。これにより、４’位と７位の両方の水酸基に糖が付加されているフラボンを植物内で効率的に生合成させることが可能となる。
【００５４】
現在の技術水準の下では、植物にポリヌクレオチドを導入し、そのポリヌクレオチドを構成的又は組織特異的に発現させる技術を利用することができる。植物へのＤＮＡの導入は、当業者に公知の方法、例えば、アグロバクテリウム法、バイナリーベクター法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、パーティクルガン法等によって行なうことができる。
【００５５】
形質転換可能な植物の例としては、バラ、カーネーション、キク、キンギョソウ、シクラメン、ラン、トルコキキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリプ、アンセリウム、コチョウラン、イネ、オオムギ、コムギ、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、ダイズ、アルファルサ、ルービン、トウモロコシ、カリフラワー、ダリアなどが挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００５６】
本発明は、上記切花を用いた加工品（切花加工品）にも関する。ここで、切花加工品としては、当該切花を用いた押し花、プリザードフラワー、ドライフラワー、樹脂密封品などを含むが、これに限定されるものではない。
また、本発明の製造方法により製造された７位の水酸基に糖が付加されたフラボン、特に４’位と７位の両方の水酸基に糖が付加されたフラボンは、食品、医薬品、化粧品の製造方法などの用途に使用することができる。
【００５７】
本発明においては、アンチセンス法、コサプレッション法、ＲＮＡｉ法などによって、植物内で目的の遺伝子の発現を抑制することも可能である。目的の遺伝子の発現を抑制する方法は、当業者に公知の方法に従って行なうことができるが、例えば、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術［バイオサイエンスとインダストリー, 50, 322 (1992)、化学, 46, 681 (1991)、Biotechnology,9, 358 (1992)、Trends in Biotechnology,10, 87 (1992) 、Trends in Biotechnology,10, 152 (1992)、細胞工学, 16, 1463 (1997)］、トリプル・ヘリックス技術［Trends in Biotechnology,10, 132 (1992)］等が挙げられる。例えば、遺伝子の発現の抑制は、本発明による遺伝子のアンチセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の全部又は一部を含んでなる一本鎖核酸分子を用いて行なわれる。このような方法はアンチセンス法として知られている。アンチセンス法では、発現を抑制したい遺伝子に相補的な配列をもつＲＮＡを高レベルで発現させることにより、標的遺伝子の発現が抑制される。この方法では、本発明に係るポリヌクレオチド（遺伝子）のアンチセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の全部を含んでなる一本鎖ＲＮＡを用いることができる。また、上記の方法では、本発明による遺伝子のアンチセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の一部を含んでなる一本鎖ＲＮＡを用いることもできる。このような部分的な一本鎖ＲＮＡは本発明による遺伝子の発現を抑制しうるものであればよく、当業者であれば適宜設計することができるが、好ましくは本発明による遺伝子に特異的なものとされ、その鎖長は、好ましくは５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは５〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは１０〜２０ヌクレオチドとされる。
【００５８】
遺伝子の発現の抑制は、本発明に係る遺伝子のセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の全部又は一部を含んでなる一本鎖核酸分子を用いて行なわれる。すなわち、このセンス一本鎖核酸は、上記のアンチセンス一本鎖核酸と同様に、本発明による遺伝子の発現の抑制に用いることが可能である。この方法では、本発明による遺伝子のセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の全部を含んでなる一本鎖ＲＮＡを用いることができる。また、上記の方法では、遺伝子のセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の一部を含んでなる一本鎖ＲＮＡを用いることもできる。このような部分的な一本鎖ＲＮＡは本発明による遺伝子の発現を抑制しうるものであればよく、当業者であれば適宜設計することができるが、好ましくは本発明による遺伝子に特異的なものとされ、その鎖長は、好ましくは５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは５〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは１０〜２０ヌクレオチドとされる。
【００５９】
さらに、遺伝子の発現の抑制は、本発明による遺伝子と同一のヌクレオチド配列の全部又は一部を含んでなる二本鎖核酸分子を用いて行なわれる。例えば、この二本鎖核酸分子を用いることにより、被子植物において本発明による遺伝子のアンチセンス又はセンス一本鎖核酸を発現させることができる。本発明による二本鎖核酸分子は、好ましくはＤＮＡとされ、その鎖長及び具体的なヌクレオチド配列は、目的とする一本鎖核酸分子の鎖長およびヌクレオチド配列に対応するものとされる。例えば、上記アンチセンス一本鎖核酸を発現させる場合には、本発明による二本鎖核酸分子は、本発明による遺伝子のアンチセンス鎖をコード鎖として含むものとされる。また、上記センス一本鎖核酸を発現させる場合には、本発明による二本鎖核酸分子は、本発明による遺伝子のセンス鎖をコード鎖として含むものとされる。
【００６０】
二本鎖核酸分子は、当業者に公知の方法を用いて植物中で発現させることができる。例えば、プロモーター、本発明による二本鎖核酸分子、及び転写ターミネーター等を含む発現ベクター、目的とする植物中に導入し、得られた植物体を栽培することにより、二本鎖核酸分子を発現させることができる。植物への発現ベクターの導入は、当業者に公知の方法、例えば、アグロバクテリウム法、バイナリーベクター法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、パーティクルガン法等によって行なうことができる。
【００６１】
本発明による核酸分子を用いた遺伝子発現の抑制法の他の例としては、コサプレッション法が挙げられる。この方法では、本発明による遺伝子の全ヌクレオチド配列を有するセンス二本鎖ＤＮＡが目的の植物中に導入される。これにより、本発明によるセンス一本鎖ＲＮＡが発現され、このＲＮＡにより該遺伝子の発現が極端に抑制される（Plant Cell 9: 1357-1368, 1997）。
【００６２】
本発明により、フラボン（特にフラボン４’−グルコシド）の７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする新規なポリヌクレオチドが提供される。本発明のポリヌクレオチドを適切な宿主細胞内で発現させることにより、フラボン（特にフラボン４’−グルコシド）の７位の水酸基に特異的に糖を転移する活性を有するタンパク質を製造することが可能となる。本発明により、フラボン（特にフラボン４’−グルコシド）の７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を、植物内で、構成的又は組織特異的に発現させることで、花色の改変に利用することができる。また、本発明により、７位の水酸基に糖が付加したフラボン、特に４’位及び７位の両方の水酸基に糖が付加したフラボンの製法、及び該製法によって得られたフラボンを含む組成物が提供される。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例に従って発明を具体的に説明する。
［実施例１：ネモフィラ花弁におけるフラボンの４’位と７位の水酸基に糖を転移する活性の検出］
ネモフィラ（Nemophila menziesii)の花弁を、以下のように定義した発達段階に分けて採取し、液体窒素で凍らせ、−８０℃冷凍庫で保存した：
ステージ１：色が付いていない堅く閉じたつぼみ（約２−５ｍｍ）；
ステージ２：有色の堅く閉じたつぼみ（約２−５ｍｍ）；
ステージ３：有色の閉じたつぼみ、がく片がちょうど開こうとしているつぼみ（約５−１０ｍｍ）；
ステージ４：花弁が開こうとしているつぼみ（約１０−１５ｍｍ）
ステージ５：完全にひらいた花【００６４】
＜ネモフィラ花弁抽出液の調製＞
アントシアニンが生合成される前の花弁のステージ１と２で、フラボン糖転移酵素活性が検出されることが期待される。そこで、ステージ１と２の花弁を用いて、花弁抽出液を調製した。２５０ｍｇの花弁サンプル（−８０℃で保存していたステージ１と２のサンプル１２５ｍｇずつ)を液体窒素中で乳鉢ですりつぶし、２．０ｍｌの抽出バッファー（組成；リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）：１００ｍＭ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）：１ｍＭ、ポリビニルピロリドン４０：５０ｍｇ／ｍｌ、スクロース：１００ｍｇ／ｍｌ）を加えて、縣濁した。得られた縣濁物を遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、１０分間）し、回収した上清に３０％の飽和濃度となるように硫酸アンモニウムを加えた。４℃で１時間撹拌した後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して上清を回収した。得られた上清に硫酸アンモニウムを飽和濃度７０％となるように添加し、４℃で１時間撹拌した後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して沈澱を得た。この沈澱を５００μｌの溶出バッファー（組成；ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）：２．５ｍＭ、ＤＴＴ：１ｍＭ、アミジノファニルメタンスルフォニルフルオライド塩酸（ＡＰＭＳＦ）：１０μＭ）に溶かし、ＮＡＰ−５Ｃｏｌｕｍｓ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  ＤＮＡ  Ｇｒａｄｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて脱塩することにより、硫酸アンモニウムを取り除いた。この液を「花弁抽出液」とした。遠心分離には、Ａｖａｎｔｉ ＨＰ−２６ＸＰ（ローター：ＪＡ−２）を使用した（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）。【００６５】
＜ネモフィラ花弁抽出液を用いた酵素活性測定＞
４０μｌの花弁抽出液、２μｌの５０ｍＭ  ＵＤＰ−グルコース、２０μｌの１Ｍ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５μｌの１ｍＭ アピゲニン（０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解）を混合し、水で反応体積２００μｌになるように氷上で調整した反応液を、３０℃で２０分間保持した。その後、２００μｌの停止バッファー（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を加えて反応を停止させ、反応液を高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所））にて分析した。検出器は島津ＰＤＡ  ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰを用い３３０ｎｍでフラボンを検出した。カラムはＳｈｉｍ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ  １５０ｍｍ＊４．６ｍｍ（島津製作所）を用いた。溶出には、Ａ液（０．１％ＴＦＡ水溶液）とＢ液（０．１％ＴＦＡを含む９０％メタノール水溶液）を用いた。両者の８：２の混合液から３：７の混合液までの１０分間の直線濃度勾配とそれにつづく６分間３：７の混合液による溶出を行なった。流速は０．６ｍｌ／分とした。コントロールとして、花弁抽出液を１００℃２０分で熱処理した花弁抽出液を用いて同じ条件下で酵素反応させた反応液を用いた。
その結果、アピゲニン４’，７−ジグルコシド精製品やアピゲニン７−グルコシド標品と同じ保持時間・吸収極大を示すフラボンに加え、アピゲニン７−グルコシドと近い保持時間を示すフラボンが生合成された（図１参照）。ＵＤＰ−グルコースを加えずに酵素反応させたときには、アピゲニン以外のピークは検出されなかった。【００６６】
［実施例２：アピゲニン４’−グルコシドの保持時間・吸収極大の決定］
ネモフィラ花弁におけるアピゲニン４’，７−ジグルコシドの生合成経路を考慮すると、アピゲニン４’，７−ジグルコシドが生合成される過程で、アピゲニン４’−グルコシドとアピゲニン７−グルコシドが中間成生物として生合成されることが期待される（図２参照）。このことから、実施例１において検出されたアピゲニン７−グルコシドと近い保持時間を示すフラボンは、アピゲニン４’−グルコシドであると判断された（図１参照）。アピゲニン４’−グルコシドの保持時間・吸収極大を決定することができた。
これらの結果より、ネモフィラ花弁には、ＵＤＰ−グルコースに依存したフラボンの４’位と７位の水酸基にそれぞれ糖を転移する活性を有するタンパク質が存在することが明らかとなった。フラボン４’，７−ジグルコシド生合成経路として、１つの酵素によってフラボンの４’位及び７位の水酸基の配糖化が行われる経路、フラボンの４’位の水酸基の配糖化が行われた後に７位の水酸基の配糖化が行われる経路、そしてフラボンの７位の水酸基の配糖化が行われた後に４’位の水酸基の配糖化が行われる経路が存在する可能性が考えられる（図２参照）。これまでに、フラボンの４’位及び／又は７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子としてＮｍＧＴ３及びＮｍＧＴ４（特許文献１２）が、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子としてＮｍＧＴ８（特許文献１１、配列番号３）が取得されている。【００６７】
［実施例３：フラボン４’−グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の候補遺伝子の取得］
＜ｔｏｔａｌＲＮＡの単離＞
Ｐｌａｎｔ  ＲＮＡｅａｓｙ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、製造者に推奨されているプロトコールに従い、ネモフィラのステージ１と２の花弁からｔｏｔａｌＲＮＡを単離した。
＜ネモフィラの花弁由来のｃＤＮＡの発現解析＞
３０μｇのネモフィラの花弁由来ｔｏｔａｌＲＮＡの逆転写反応を行った後、均一化ｃＤＮＡライブラリーを作製した。作製したライブラリーをエマルジョンＰＣＲによって、クローンごと増幅した後、ゲノムシークエンサーＦＬＸ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｊａｐａｎ株式会社）により塩基配列の決定を行った。その得られた配列データの中からリンドウのアントシアニン３’−糖転移酵素の遺伝子配列と同一性を示す配列を抽出した。これらの配列をアミノ酸配列に翻訳してアセンブルすることによって、糖転移酵素をコードする候補遺伝子を得た。【００６８】
［実施例４：フラボン４’−グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の候補遺伝子の完全長ｃＤＮＡ配列の取得］
実施例３では糖転移酵素候補遺伝子の配列が３０種得られた。その内２０個の遺伝子（ＮｍＧＴ１０〜２９）について完全長ｃＤＮＡ配列を取得するための実験を行った。
完全長ｃＤＮＡ配列の取得は、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ  Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従って行った。実施例３で得られたｃＤＮＡ部分配列の中からそのクローンに特異的な領域を選び、この領域の配列をもとにしてＲＡＣＥ用プライマーを設計し、ＲＡＣＥ  ＰＣＲによって５’，３’末端配列を得た。この配列をもとに、完全長ｃＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーを設計し、ネモフィラｃＤＮＡを鋳型にして、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社） を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、反応体積５０μｌでＰＣＲ反応を行った（９４℃で２分間保持し、９４℃１５秒間、５５℃３０秒間、６８℃で２分間のサイクルを３０サイクル繰り返した後、４℃で保持した）。ネモフィラのｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、実施例２で単離したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型にして、製造者に推奨されているプロトコールに従って合成した。このＰＣＲ生成物を用いて、ｐＥＴ  ＳＵＭＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従って、ＮｍＧＴ遺伝子の完全長を含むプラスミド（ｐＥＴ  ＳＵＭＯ−ＮｍＧＴ１０〜２９）を取得した。プラスミドに挿入された塩基配列を解析し、フラボン４’−グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の候補遺伝子（ＮｍＧＴ１０〜２９）の中から完全長ｃＤＮＡ配列を取得した。ｐＥＴ  ＳＵＭＯ−ＮｍＧＴ１０〜２９は、実施例５以下で大腸菌発現コンストラクトとして活用する。【００６９】
［実施例５：フラボン４’−グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質候補の酵素活性測定実験（粗酵素を用いた場合）］
＜糖転移酵素の大腸菌での発現＞
ｐＥＴ  ＳＵＭＯ−ＮｍＧＴ１０〜２９を、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、大腸菌株ＢＬ２へ導入し、形質転換大腸菌を取得した。この大腸菌をＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ１（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、培養した。調製した培養液２ｍｌで、形質転換大腸菌をＯＤ６００値が０．５になるまで３７℃で培養した（約４時間）。この大腸菌液を前培養液として、５０ｍｌの培養液に加え、２５℃で一晩本培養した。
一晩本培養した大腸菌液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）し、集菌した菌体を５ｍｌのソニックバッファー（組成；ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．０）：２．５ｍＭ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）：１ｍＭ、アミジノファニルメタンスルフォニルフルオライド塩酸（ＡＰＭＳＦ）：１０μＭ）に懸濁し、超音波処理により大腸菌を粉砕した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して、上清を回収した。その上清を粗酵素液とした。遠心分離には、Ａｖａｎｔｉ ＨＰ−２６ＸＰ（ローター：ＪＡ−２）を使用した（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）。【００７０】
＜酵素活性測定＞
８０μｌの粗酵素液、２μｌの５０ｍＭ  ＵＤＰ−グルコース、２０μｌの１Ｍ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１μｌの２ｍＭのアピゲニン４’−グルコシド（０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解）を混合し、水で反応体積２００μｌになるように氷上で調整した反応液を３０℃で３０分間保持した。その後、２００μｌの停止バッファー（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を加えて反応を停止させ、反応液を高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所））にて分析した。検出器は島津ＰＤＡ  ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰを用い３３０ｎｍでフラボンを検出した。カラムはＳｈｉｍ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ  １５０ｍｍ＊４．６ｍｍ（島津製作所）を用いた。溶出には、Ａ液（０．１％ＴＦＡ水溶液）とＢ液（０．１％ＴＦＡを含む９０％メタノール水溶液）を用いた。両者の８：２の混合液から３：７の混合液までの１０分間の直線濃度勾配とそれにつづく６分間３：７の混合液による溶出を行なった。流速は０．６ｍｌ／分とした。コントロールとして、インサートを挿入しないｐＥＴ  ＳＵＭＯベクターを導入した大腸菌の粗酵素液を用いて同じ条件化で酵素反応させた反応液を用いた。
その結果、ＮｍＧＴ２２について、基質以外のピークがみられた。
実施例６以降は、ＮｍＧＴ２２（配列番号１）又はそのホモログであるＮｍＧＴ２２−II（配列番号５）について記載する。【００７１】
［実施例６：フラボン４’−グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質の酵素活性測定実験（Ｈｉｓ−Ｔａｇを付加したタンパク質を精製した場合）］
＜糖転移酵素の大腸菌での発現とタンパク質精製＞
実施例５で記載したｐＥＴ  ＳＵＭＯ−ＮｍＧＴ２２を導入した大腸菌株ＢＬ２をＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ１（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、培養した。調製した培養液８ｍｌで、形質転換大腸菌をＯＤ６００値が０．５になるまで３７℃で培養した（約４時間）。この大腸菌液を前培養液として、２００ｍｌの培養液に加え、２５℃で一晩本培養した。
一晩本培養した大腸菌液を遠心分離（１０００×ｇ、４℃、１０分間）し、集菌した菌体を２０ｍｌの抽出液（組成；緩衝液（ＫＣl：３００ｍＭ、ＫＨ2ＰＯ4：５０ｍＭ、イミダゾール：５ｍＭ）（ｐＨ８．０）、アミジノファニルメタンスルフォニルフルオライド塩酸（ＡＰＭＳＦ）：１０μＭ）に懸濁し、超音波処理により大腸菌を粉砕した後、遠心分離（１４００×ｇ、４℃、２０分）して、上清を回収した。その上清を０．４５μｍフィルターに通し、Ｐｒｏｆｉｎｉａ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従って、Ｈｉｓ−Ｔａｇ精製した。得られた精製タンパク質溶液を、ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓ（Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０Ｋ）（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ社）を用いて、遠心分離（７５００×ｇ、４℃、１５分間）し、その濃縮されたタンパク質溶液を「ＮｍＧＴ２２タンパク質溶液」とした。遠心分離には、Ａｖａｎｔｉ ＨＰ−２６ＸＰ（ローター：ＪＡ−２）を使用した（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）。【００７２】
＜酵素活性測定＞
１０μｌのタンパク質溶液、２μｌの５０ｍＭ  ＵＤＰ−グルコース、１０μｌの１ＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１μｌの２ｍＭアピゲニン４’−グルコシド（０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解）を混合し、水で反応体積１００μｌになるように氷上で調整した反応液を３０℃で２０分間保持した。その後、１００μｌの停止バッファー（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を加えて反応を停止させ、反応液を高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所））にて分析した。検出器は島津ＰＤＡ  ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰを用い３３０ｎｍでフラボンを検出した。カラムはＳｈｉｍ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ  １５０ｍｍ＊４．６ｍｍ（島津製作所）を用いた。溶出には、Ａ液（０．１％ＴＦＡ水溶液）とＢ液（０．１％ＴＦＡを含む９０％メタノール水溶液）を用いた。両者の８：２の混合液から３：７の混合液までの１０分間の直線濃度勾配とそれにつづく６分間３：７の混合液による溶出を行なった。流速は０．６ｍｌ／分とした。【００７３】
その結果、アピゲニン４’，７−ジグルコシドと同じ保持時間・吸収極大を示すフラボンが合成されていた。反応率（基質が変換された割合）は１００％であった（図４、図６参照）。同じ反応条件下で基質を２ｍＭのルテオリン４’−グルコシド（０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解）として酵素反応を行った場合には、ルテオリン４’，７−ジグルコシドが合成された。反応率は９９．６８％であった（図６）。一方、同じ反応条件下で基質を２ｍＭのアピゲニン（０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解）にした場合にはアピゲニン４’，７−ジグルコシドは合成されず、アピゲニン７−グルコシドが合成された。反応率は７７．１６％であった（図３、図６参照）。同様に、同じ反応条件下で基質を２ｍＭのルテオリン（０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解）とした場合も、ルテオリン４’，７−ジグルコシドは合成されず、ルテオリン７−グルコシドが合成された。反応率は９９．０７％であった（図６）。さらに、同じ反応条件下で基質を２ｍＭのアピゲニン７−グルコシド（０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解）とした場合は、アピゲニン４’，７−ジグルコシドは微量しか合成されず、反応率は２．６９％にとどまった（図５、図６参照）。同様に、同じ反応条件下で基質を２ｍＭのルテオリン７−グルコシド（０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解）とした場合も、ルテオリン４’，７−ジグルコシドは微量しか合成されず、反応率は１６．１０％であった（図６）。さらに、図６に記載の各種フラボノイド化合物（ペラルゴニジン、ペラルゴニジン３−グルコシド、シアニジン、シアニジン３−グルコシド、デルフィニジン、デルフィニジン３−グルコシド、ペオニジン、ペチュニジン、マルビジン、トリセチン、ケンフェロール、ケンフェロール３−グルコシド、ケルセチン、ケルセチン３−グルコシド、ミリセチン、イソビテキシン）、及びベタニジンに対する反応性を調べたところ、ＮｍＧＴ２２タンパク質は、アピゲニン４’−グルコシド、ルテオリン４’−グルコシド、アピゲニン、ルテオリンのようなフラボンの７位を選択的に配糖化し、基質特異性が高いことが明らかとなった。そして、４’位の水酸基に糖が転移されたフラボンを基質としたときの活性がもっとも強いことも明らかとなった（図６参照）。【００７４】
また、ＮｍＧＴ２２と既知の糖転移酵素における塩基配列及びアミノ酸配列の同一性を解析した。ＮｍＧＴ２２と同じネモフィラ由来の糖転移酵素と比較すると、ＮｍＧＴ２２とＮｍＧＴ３の間の、及びＮｍＧＴ２２とＮｍＧＴ４の間の、及びＮｍＧＴ２２とＮｍＧＴ８の間のアミノ酸配列の同一性は、それぞれ、２４％、及び２５％、及び２４％であった。また、ＮｍＧＴ２２と洋ナシ由来の糖転移酵素であるＰｃＦ７ＧＴの間のアミノ酸配列の同一性は３２％であった（表１参照）。既に同定されている糖転移酵素の中で、ＮｍＧＴ２２と最も同一性が高いアミノ酸配列は、ＶｖｇＧＴ２（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＪＮ１６４６８０）であったが、アミノ酸配列の同一性は僅かに６２％であった（表１、図７参照）。この解析には、ＭａｃＶｅｃｔｏｒアプリケーション（バージョン９．５、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）のＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いた。
【表１】
0006602291.tif 000002
かかる結果からも、ＮｍＧＴ２２は植物内において既知の糖転移酵素とは異なる機能を示すものと推定される。実際に、ＮｍＧＴ３及びＮｍＧＴ４は、フラボンの４’位及び／又は７位の水酸基に糖を転移する活性を植物では有していない。ＮｍＧＴ８は、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移するものの、７位の水酸基に糖を転移する活性を有していない。ＶｖｇＧＴ２は、ブドウのヒドロキシ安息香酸やケイ皮酸に糖を付加する機能を有するが、ＮｍＧＴ２２のように、フラボンの７位の水酸基に糖を特異的に転移する活性を有してはいない。ＰｃＦ７ＧＴは、フラボノイドの一種であるエリオジクチオールの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するが、洋ナシにはフラボンは含まれておらず、また、フラボン４’−グルコシドへの糖転移活性についても知られていない。よって、フラボン４’−グルコシドに対して特に選択的な活性を示すＮｍＧＴ２２とは明確に異なる基質特異性を有するものと考えられる。さらに、ＮｍＧＴ２２は、アントシアニン３−グルコシドの５位の水酸基に糖を特異的に転移する活性も有するが（図６参照）、ＰｃＦ７ＧＴはフラボノイドの５位の水酸基に糖を転移する機能を有さないことが報告されている（非特許文献１２）。【００７５】
また、図８に、本発明のＮｍＧＴ２２と前記した諸酵素との関係を指標する系統樹を示す。【００７６】
［実施例７：ＮｍＧＴ２２遺伝子のタバコ培養細胞ＢＹ―２における発現］
本発明のＮｍＧＴ２２遺伝子が、植物内でフラボン４’−グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードすることを確かめるため、ＮｍＧＴ２２とＮｍＧＴ８を共発現させたタバコ培養細胞（ＢＹ―２）におけるフラボンの４’位及び７位の水酸基の配糖化の有無を評価する。
ＮｍＧＴ２２とＮｍＧＴ８を植物で共発現させるためのバイナリーベクターｐＳＰＢ６２６１を構築し、ＢＹ−２へ導入した。
導入したコンストラクトｐＳＰＢ６２６１では、基本骨格としてｐＢＩＮＰＬＵＳ（ｖａｎＥｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  ４，ｐ２８８）を、ＮｍＧＴ２２遺伝子とＮｍＧＴ８遺伝子を発現させるプロモーターとしてＥｌ２３５Ｓプロモーター（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，ｐ４９）を、ターミネーターとしてＨＳＰターミネーター（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ（２０１０）５１，３２８−３３２）を使用した。
ＢＹ−２の形質転換は下記の方法で行った。まず、ＢＹ−２を、１００ｍｌのＢＹ−２培養液体培地（組成；無機十種（ＮＨ4ＮＯ3：１．６５ｇ／Ｌ、ＫＮＯ3：１．９ｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4：１７０ｍｇ／Ｌ、Ｈ3ＢＯ3：６．２ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ4・４Ｈ2０：２２．３ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：８．６ｍｇ／Ｌ、Ｋｌ：０．８３ｍｇ／Ｌ、Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2０：、０．２５ｍｇ／ＬＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ：０．０２５ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ：０．０２５ｍｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ2・Ｈ2Ｏ：４４０ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：３７０ｍｇ／Ｌ、Ｆｅ−ＥＤＴＡ：４２．１ｍｇ／Ｌ、Ｓｕｃｒｏｓｅ：３０ｇ／Ｌ、Ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ：１００ｍｇ／Ｌ、Ｔｈｉａｍｉｎ−ＨＣｌ：１ｍｇ／Ｌ、２，４−シクロロフェノキシン酢酸：０．２ｍｇ／Ｌ）（ｐＨ５．７）で培養し、ＯＤ５５０値が１．３になるまで２７℃で培養した（約３日間）。このＢＹ−２培養液３ｍｌに５ｍｌのＹＥＰ培地（組成；BactoTM  Yeast Extract：１０ｇ/L、BactoTM Peptone：１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：５ｇ／Ｌ）（ｐＨ７．０）で、ＯＤ５５０値が１．７になるまで２８℃で培養したｐＳＰＢ６２６１を導入したアグロバクテリウム溶液５０μｌと１．５μｌの２０ｍＭアセトシリンゴンを加えて、さらに２日半２７℃で培養した。２日半培養したＢＹ−２とアグロバクテリウムの共培養液を遠心分離（８００ｒｐｍ、１５℃、１分）し、上澄み液を除去した細胞層に１０ｍｌの洗浄培地（組成；無機十種（ＮＨ4ＮＯ3：１．６５ｇ／Ｌ、ＫＮＯ3：１．９ｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4：１７０ｍｇ／Ｌ、Ｈ3ＢＯ3：６．２ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ4・４Ｈ2０：２２．３ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：８．６ｍｇ／Ｌ、Ｋｌ：０．８３ｍｇ／Ｌ、Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2０：、０．２５ｍｇ／ＬＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ：０．０２５ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ：０．０２５ｍｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ2・Ｈ2Ｏ：４４０ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：３７０ｍｇ／Ｌ、Ｆｅ−ＥＤＴＡ：４２．１ｍｇ／Ｌ、Ｓｕｃｒｏｓｅ：３０ｇ／Ｌ、Ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ：１００ｍｇ／Ｌ、Ｔｈｉａｍｉｎ−ＨＣｌ：１ｍｇ／Ｌ、２，４−シクロロフェノキシン酢酸：０．２ｍｇ／Ｌ、カルベニシリンニナトリウム）（ｐＨ５．７）を加えて懸濁した。この懸濁作業を５回繰り返し、ＢＹ−２とアグロバクテリウムの共培養液からアグロバクテリウムを除去した。遠心分離には、ｈｉｍａｃＣＦ１６ＲＸ（ローター：Ｔ４ＳＳ３１）を使用した（ＨＩＴＡＣＨＩ社）。このＢＹ−２培養液１ｍｌを、カナマイシンを含んだ選択培地（組成；無機十種（ＮＨ4ＮＯ3：１．６５ｇ／Ｌ、ＫＮＯ3：１．９ｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4：１７０ｍｇ／Ｌ、Ｈ3ＢＯ3：６．２ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ4・４Ｈ2０：２２．３ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：８．６ｍｇ／Ｌ、Ｋｌ：０．８３ｍｇ／Ｌ、Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2０：、０．２５ｍｇ／ＬＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ：０．０２５ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ：０．０２５ｍｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ2・Ｈ2Ｏ：４４０ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：３７０ｍｇ／Ｌ、Ｆｅ−ＥＤＴＡ：４２．１ｍｇ／Ｌ、Ｓｕｃｒｏｓｅ：３０ｇ／Ｌ、Ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ：１００ｍｇ／Ｌ、Ｔｈｉａｍｉｎ−ＨＣｌ：１ｍｇ／Ｌ、２，４−シクロロフェノキシン酢酸：０．２ｍｇ／��、カルベニシリンニナトリウム、カナマイシン：１００ｍｇ/L）（ｐＨ５．７）にまき、ＮｍＧＴ２２及びＮｍＧＴ８が導入された組換えＢＹ−２を選抜した。【００７７】
＜ＮｍＧＴ２２遺伝子のＢＹ−２における発現解析＞
選抜されたＢＹ−２の細胞塊を用いて、ＮｍＧＴ２２遺伝子の発現解析を行った。ｔｏｔａｌＲＮＡ単離は実施例３に記載した方法で取得し、ｃＤＮＡ合成は実施例４に記載した方法で行った。逆転写ＰＣＲ反応は、ｃＤＮＡを鋳型として、ＥｘＴａｑ  ｐｏｌｙｍａｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、反応体積３０μｌで行った（９４℃で２分間保持し、９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で２分間保持のサイクルを２５サイクル繰り返した後、４℃で保持した）。ＮｍＧＴ２２の完全長ｃＤＮＡが特異的に増幅するようなプライマー（フォワードプライマー：ATGGAATGCAAAAATCCAGATTC、リバースプライマー：CTAGGTAATAAATCTGAAATTATTG）を設計した。反応産物をアガロースゲル電気泳動で解析したところ、完全長ｃＤＮＡに相当する１４３２ｂのバンドが検出されたことから、ＢＹ−２においてＮｍＧＴ２２遺伝子が転写されていることが確認された。【００７８】
＜ＢＹ−２におけるＮｍＧＴ２２の機能解析＞
完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ８と完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ２２について転写産物が合成されたＢＹ―２系統を選抜するため、さらにＮｍＧＴ８についても同様の発現解析を行った（フォワードプライマー：ATGGAGAAAAAAACTATT、リバースプライマー：CTATTTCCAACCATCCAG、完全長ｃＤＮＡ：１４２５ｂ）。こうして得られた完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ８と完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ２２について転写産物が確認されたＢＹ―２系統について、ＮｍＧＴ８及びＮｍＧＴ２２の基質であるアピゲニンを付与する実験を行った。【００７９】
組換えＢＹ−２を、１００ｍｌのＢＹ−２培養液体培地で培養し、ＯＤ５５０値が１．１になるまで２７℃で培養した（約３日間）。このＢＹ−２培養液に、３ｍＭのアピゲニン（０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液で溶解）を１３０μｌ加えて、さらに２日半２７℃で培養した。
対照として、遺伝子を導入していないＢＹ−２、フラボンの水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子としてＮｍＧＴ８遺伝子のみを導入したＢＹ―２についても同様にしてアピゲニン付与実験を行った。そのＢＹ−２培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５℃、１５分）して取り出した細胞層を液体窒素中で乳鉢ですりつぶし、２ｍｌの抽出バッファー（組成；１％ＨＣｌを含むメタノール）を加えて、１晩常温で放置した。その細胞抽出液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５℃、１５分）して回収した上清を、デシケーターを用いて２００μｌまで濃縮した。遠心分離には、ｈｉｍａｃＣＦ１６ＲＸ（ローター：Ｔ４ＳＳ３１）を使用した（ＨＩＴＡＣＨＩ社）。その細胞抽出液を、さらに遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１５℃、１５分）して、回収した上清を０．２２μｌフィルターに通して、高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所））にて分析した。遠心分離には、ＭＸ−２０５（ローター：ＡＲ０１５−２４）を使用した（TOMY社）。高速液体クロマトグラフィーの検出器は島津ＰＤＡ  ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰを用い３３０ｎｍでフラボンを検出した。カラムはＳｈｉｍ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ  １５０ｍｍ＊４．６ｍｍ（島津製作所）を用いた。溶出には、Ａ液（０．１％ＴＦＡ水溶液）とＢ液（０．１％ＴＦＡを含む９０％メタノール水溶液）を用いた。両者の８：２の混合液から３：７の混合液までの１０分間の直線濃度勾配とそれにつづく６分間３：７の混合液による溶出を行なった。流速は０．６ｍｌ／分とした。対照として、遺伝子を導入していないＢＹ−２、フラボンの水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子としてＮｍＧＴ８のみを導入した組換えＢＹ−２についても同様にして、アピゲニン付与実験を行い、細胞抽出液の分析を行った（図９）。【００８０】
非組換えＢＹ−２から得た細胞抽出液においては、生合成されたフラボン化合物のうちアピゲニン４’,７−ジグルコシドが０．１０％を占めており、アピゲニン４’−グルコシドは検出されなかった。ＮｍＧＴ８のみを導入した組換えＢＹ―２から得た細胞抽出液においては、生合成されたフラボン化合物のうちアピゲニン４’,７−ジグルコシド、及びアピゲニン４’−グルコシドが１０．９９％、及び３１．６５％を占めていることが分かった。ＮｍＧＴ８とＮｍＧ２２を導入した組換えＢＹ−２から得た細胞抽出液においては、生合成されたフラボン化合物のうちアピゲニン４’,７−ジグルコシドが２６．３５％を占めており、アピゲニン４’−グルコシドは検出されなかった。残りの７３．６５％は、対照のＢＹ−２から得た細胞抽出液にも含まれるフラボン化合物であることから、ＢＹ−２内在活性によって生合成された、アピゲニンージグルコシドやフラボン７―グルコシドなどであることが示唆された（図９）。
ＮｍＧＴ８とＮｍＧＴ２２を導入した組換えＢＹ−２から得た細胞抽出液において、ＮｍＧＴ８のみを導入したＢＹ−２から得た細胞抽出液において検出されたアピゲニン４’−グルコシドが検出されなかった。このことから、ＮｍＧＴ２２は、ＮｍＧＴ８によってＢＹ−２内で生合成されたアピゲニン４’−グルコシドを基質にして、アピゲニン４’−グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質として機能していることが示唆された。ＮｍＧＴ２２とＮｍＧＴ８を共発現させることによって、植物内にフラボン４’,７−ジグルコシドを生合成させることが可能となる。【００８１】
［実施例８：ＮｍＧＴ２２遺伝子のバラにおける発現］
＜ＮｍＧＴ２２遺伝子のバラにおける発現用コンストラクトの作製＞
本発明のＮｍＧＴ２２遺伝子が、植物内でフラボン４’−グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードすることを確かめるため、ＮｍＧＴ２２とＮｍＧＴ８を共発現させたバラにおけるフラボンの４’位及び７位の水酸基の配糖化の有無を評価する。バラは元来フラボンを生合成しないため、トレニアフラボン合成酵素も共に発現させた。
ＮｍＧＴ２２とＮｍＧＴ８とトレニアフラボン合成酵素を植物で共発現させるためのバイナリーベクターｐＳＰＢ６２６９を構築し、バラ（品種リタパヒューメラ）へ導入した。導入したコンストラクトｐＳＰＢ６２６９は、バイナリーベクターｐＢＩＮＰＬＵＳ（ｖａｎＥｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  ４，ｐ２８８）を基本骨格とし、トレニアフラボン合成酵素遺伝子、ＮｍＧＴ２２遺伝子、及びＮｍＧＴ８遺伝子それぞれの発現カセットを有する。各遺伝子を発現させるプロモーターとして、Ｅｌ２３５Ｓプロモーター（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，ｐ４９）を用いた。【００８２】
＜ＮｍＧＴ２２遺伝子のバラにおける発現解析＞
カナマイシンを含む選択培地でシュートを形成し、発根が見られた個体を馴化し、組換えバラの葉を用いて、実施例７に記載した方法と同様にして、遺伝子発現解析を行った。その結果、バラにおいてＮｍＧＴ２２遺伝子が転写されていることが確認された。【００８３】
＜バラにおけるＮｍＧＴ２２の機能解析＞
完全長ｃＤＮＡトレニアフラボン合成酵素と完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ８と完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ２２について転写産物が合成されたバラ系統を選抜するため、さらにトレニアフラボン合成酵素とＮｍＧＴ８についても同様の発現解析を行った（トレニアフラボン合成酵素：フォワードプライマー：ATGGACACAGTCTTAATCAC、リバースプライマー：TCAAGCACCCGATATTGTG、完全長ｃＤＮＡ：１５３９ｂ。ＮｍＧＴ８フォワードプライマー：ATGGAGAAAAAAACTATT、リバースプライマー：CTATTTCCAACCATCCAG、完全長ｃＤＮＡ：１４２５ｂ）。こうして得られた完全長ｃＤＮＡトレニアフラボン合成酵素と完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ８と完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ２２について転写産物が確認されたバラ系統について、花弁の色素分析を行った。０．２ｇの完全にひらいた花の花弁を２４時間以上凍結乾燥させ、スパチュラで細かく砕き、４ｍｌの抽出バッファー（組成；０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液）を加えて、２０分間超音波下で処理した。その花弁抽出液を、さらに遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１５℃、１５分）して、回収した上清を０．２２μｌフィルターに通して、高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所））にて分析した。遠心分離には、ＭＸ−２０５（ローター：ＡＲ０１５−２４）を使用した（TOMY社）。高速液体クロマトグラフィーの検出器は島津ＰＤＡ  ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰを用い３３０ｎｍでフラボンを検出した。カラムはＳｈｉｍ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ  １５０ｍｍ＊４．６ｍｍ（島津製作所）を用いた。溶出には、Ａ液（０．１％ＴＦＡ水溶液）とＢ液（０．１％ＴＦＡを含む９０％メタノール水溶液）を用いた。両者の８：２の混合液から０：１０の混合液までの９０分間の直線濃度勾配とそれにつづく５分間０：１０の混合液による溶出を行なった。流速は０．６ｍｌ／分とした。対照として、遺伝子を導入していないバラ、トレニアフラボン合成酵素とＮｍＧＴ８のみを導入した組換えバラについても同様にして、花弁の色素分析を行った（図１０）。
トレニアフラボン合成酵素とＮｍＧＴ８のみを導入した組換えバラにおいては、フラボン４’−グルコシド（アピゲニン４’−グルコシド、トリセチン４’−グルコシド）が検出されたが、フラボン４’,７−ジグルコシドは検出されなかった（図１０）。一方で、トレニアフラボン合成酵素とＮｍＧＴ８とＮｍＧＴ２２を導入した組換えバラでは、アピゲニン４’,７−ジグルコシドとトリセチン４’,７−ジグルコシドが検出された（図１０）。フラボン４’,７−ジグルコシドは、生合成されたフラボン・フラボノール化合物のうち６．２０％を占めていることが分かった。残りの９３．８０％は、対照のバラからも得られたフラボン・フラボノール化合物であることから、バラ内在活性、導入したトレニアフラボン合成酵素とＮｍＧＴ８によって生合成された、フラボン７−グルコシドやフラボン４’―グルコシドなどであることが示唆された（図１０）。
トレニアフラボン合成酵素とＮｍＧＴ８とＮｍＧＴ２２を導入した組換えバラにおいて、トレニアフラボン合成酵素とＮｍＧＴ８のみを導入した組換えバラから検出されなかったフラボン４’,７−ジグルコシドが検出されたことから、ＮｍＧＴ２２は、ＮｍＧＴ８によってバラ花弁内で生合成されたフラボン４’−グルコシドを基質にして、フラボン４’−グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質として機能していることが示唆された。ＮｍＧＴ２２とＮｍＧＴ８を共発現させることによって、植物内にフラボン４’,７−ジグルコシドを生合成させることが可能となる。【００８４】
［実施例９：ＮｍＧＴ２２−IIの取得および酵素活性測定実験］
実施例３、実施例４と同様にして、ＮｍＧＴ２２と塩基配列において９８％の同一性を示す配列（ＮｍＧＴ２２−II（配列番号５））を取得した。
実施例４に記載した方法で、ｐＥＴ  ＳＵＭＯ−ＮｍＧＴ２２−IIを作製し、実施例６に記載した方法で酵素活性測定を行った。その結果、ＮｍＧＴ２２−IIは、ＮｍＧＴ２２と同様、フラボン４’−グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質であることが明らかとなった。また、フラボンに対する基質特異性についても、ＮｍＧＴ２２−IIは、ＮｍＧＴ２２と同じ傾向を示した。ＮｍＧＴ２２−IIは系統樹においてもＮｍＧＴ２２と非常に近い位置にあり、ＮｍＧＴ２２−IIとＮｍＧＴ２２の間のアミノ酸配列の同一性は９９％であった（図８、図１１）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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