(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
順番に、ＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲおよびスタッファーフラグメントを含む発現エンハンサーであって、ＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲが配列番号：１のヌクレオチド１−１６０からなり、ここでヌクレオチド１１５−１１７がＡＴＧまたは非ＡＴＧコドンであり、スタッファーフラグメントが不完全なＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列および１つ以上のコザック配列を含み、不完全なＭタンパク質が配列番号：１のヌクレオチド１６１−５０９を含み、ここでヌクレオチド１６１−１６３がＡＴＧまたは非ＡＴＧコドンであり、１つ以上のコザック配列がヌクレオチド配列ＡＧＡＡＡ、ＡＧＡＣＡ、ＡＧＧＡＡまたはＡＡＧＣＡを含む、発現エンハンサー。
【請求項２】
スタッファーフラグメントが３４９から約５００のヌクレオチド長、またはそれらの間の任意の長さを含む、請求項１に記載の発現エンハンサー。
【請求項３】
スタッファーフラグメントが、マルチプルクローニングサイトをさらに含む、請求項２に記載の発現エンハンサー。
【請求項４】
不完全なＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、３４９または３５１ヌクレオチド長のいずれかである、請求項１に記載の発現エンハンサー。
【請求項５】
ＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲのヌクレオチド１１５がアデニンまたはグアニンである、請求項１に記載の発現エンハンサー。
【請求項６】
請求項１に記載の発現エンハンサーおよび目的のヌクレオチド配列と作動可能に連結される制御領域を含む核酸配列を含む、植物発現系。
【請求項７】
コモウイルス３’ＵＴＲをさらに含む、請求項６に記載の植物発現系。
【請求項８】
サイレンシングのサプレッサーをコードする第二の核酸配列をさらに含む、請求項７に記載の植物発現系。
【請求項９】
サイレンシングのサプレッサーが、ＨｃＰｒｏおよびｐ１９からなる群から選択される、請求項８に記載の植物発現系。
【請求項１０】
制御領域が、プラストシアニンプロモーター、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター、２ｘ  ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＣＡＳプロモーター、ＲｂｃＳプロモーター、Ｕｂｉプロモーター、またはアクチンプロモーターからなる群から選択される、請求項６に記載の植物発現系。
【請求項１１】
目的のヌクレオチド配列が、ウイルスタンパク質または抗体をコードする、請求項６に記載の植物発現系。
【請求項１２】
ウイルスタンパク質が、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、およびインフルエンザＢ型ヘマグルチニンからなる群から選択されるインフルエンザヘマグルチニンである、請求項１１に記載の植物発現系。
【請求項１３】
ウイルスタンパク質または抗体をコードするヌクレオチド配列が、天然シグナルペプチド配列、または非天然シグナルペプチドを含む、請求項１２に記載の植物発現系。
【請求項１４】
非天然シグナルペプチドが、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）由来である、請求項１３に記載の植物発現系。
【請求項１５】
請求項６に記載の植物発現系を植物または植物の部分に導入すること、および目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で、植物もしくは植物の部分をインキュベートすることを含む、植物または植物の部分において目的のタンパク質を生産する方法。
【請求項１６】
請求項６に記載の植物発現系を用いて一過性に遺伝子導入されている、または安定的に形質転換されている、植物または植物の部分。
【請求項１７】
目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結される、請求項１に記載の発現エンハンサーを含む核酸。
【請求項１８】
目的のヌクレオチド配列が、Ｂ  ＨＡ、Ｃ、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６から選択されるインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）である、請求項１７に記載の核酸。
【請求項１９】
ＨＡが、ＨＡの天然膜貫通ドメインが、異種の膜貫通ドメインと置き換わっているキメラＨＡである、請求項１８に記載の核酸。
【請求項２０】
異種の膜貫通ドメインが、Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから得られる、請求項１９に記載の核酸。
【請求項２１】
不完全なＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号：１−４のいずれかのヌクレオチド１６１から５０９、配列番号：５５のヌクレオチド１６１−５１１、または配列番号：５６のヌクレオチド１６１−５１１を含む、請求項１に記載の発現エンハンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物における目的のタンパク質の発現に関する。本発明はまた、植物における目的のタンパク質の生産のための方法および組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
植物は、組換えタンパク質のための生産系として大きな可能性を提供する。植物において外来タンパク質を生産することへの１つのやり方は、安定なトランスジェニック植物系統を生成することである。しかしながら、これは時間がかかり、および労働集約的な工程である。トランスジェニック植物の代替は、植物ウイルスベースの発現ベクターの使用である。植物ウイルスベースのベクターは、植物における急速で、高レベルな一過性のタンパク質の発現を可能にする。
【０００３】
植物における、高レベルで、一過性の外来タンパク質の発現を達成する１つの方法は、ササゲモザイクウイルス（Ｃｏｗｐｅａ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＣＰＭＶ；例えば、ＷＯ２００７／１３５４８０；ＷＯ２００９／０８７３９１；ＵＳ  ２０１０／０２８７６７０，Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ；１４８：１２１−１２１８；Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ；６：８２−９２；Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ；７：６８２−６９３；Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．２００９，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｆｒｏｍ  Ｐｌａｎｔｓ，ｖｏｌ．４８３：２５−３９を参照されたい）などのコモウイルスを含む、ＲＮＡ植物ウイルスに基づくベクターの使用を伴う。
【０００４】
コモウイルスは、二分節ゲノムを有するＲＮＡウイルスである。コモウイルスのＲＮＡゲノムのセグメントは、ＲＮＡ−１およびＲＮＡ−２と称される。ＲＮＡ−１は、ＶＰｇ、複製酵素（ｒｅｐｌｉｃａｓｅ）およびプロテアーゼタンパク質をコードする。ウイルスは、ウイルスのゲノムの複製のために当該複製酵素を必要とする。コモウイルス、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）のＲＮＡ−２は、４つの機能性ペプチドにプロセシングされる１０５ｋＤａまたは９５ｋＤａのポリプロテインを生産する。
【０００５】
ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２の５’領域は、１１５、１６１、５１２および５２４位に開始コドン（ＡＵＧ）を含む。１６１および５１２位の開始コドンは、同一のトリプレットリーディングフレームにある。１６１位の開始コドンでの開始は、１０５Ｋポリプロテインの合成を生じる一方で、５１２位の開始コドンでの開始は、９５Ｋポリプロテインの合成を指示する。ＣＰＭＶにおける５１２位の開始コドンでの翻訳の開始は、１６１位の開始より、より効率的であり、その結果、１０５Ｋポリプロテインより多くの９５Ｋポリプロテインの生産がもたらされる。１１５位の開始コドンは、ウイルス複製にとって必須ではない（Ｗｅｌｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．７５（８）：７４１−７）。
【０００６】
ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２における１６１および５１２位の開始部位間のフレームの維持は、ＲＮＡ−１にコードされる複製酵素によるＲＮＡ−２の効率的な複製に必要とされる（Ｈｏｌｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７２，３１１−  ３２０；ｖａｎ  Ｂｏｋｈｏｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９５，３７７−３８６；Ｒｏｈｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９３，６７２−６７９；Ｗｅｌｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．７５（８）：７４１−７）。この要件は、ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２発現ベクターの複製型における５１２開始コドンの上流に挿入されうる配列の長さに影響する。さらに、ポリリンカーの使用は、それらがこれらの開始部位間のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をずらしうるので、慎重に使用されるべきである。
【０００７】
ＣＰＭＶは、植物における異種ポリペプチドの生産に適切なベクター系の開発のための基礎として役立っている（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３，１７８８−１７９２；Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７  Ｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  （Ｈｅｆｆｅｒｏｎ，Ｋ．ｅｄ），ｐｐ．３３９−５５５）。これらの系は、ＲＮＡ−２の改変に基づくが、完全長型または欠失型が用いられるかどうかという点で異なる。改変ＲＮＡ−２の複製は、ＲＮＡ−１との共接種により達成される。外来タンパク質は、ＲＮＡ−２由来のポリプロテインのＣ−末端に融合される。Ｎ−末端ポリペプチドの解放は、口蹄疫ウイルス由来の２Ａ触媒ペプチド配列の作用により媒介される（Ｇｏｐｉｎａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６７：１５９−１７３）。得られるＲＮＡ−２分子は、植物内および植物間の両方に拡散することができる。この戦略は、ササゲ（ｃｏｗｐｅａ）植物において、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）および小免疫タンパク質（ＳＩＰｓ）などの多くの組換えタンパク質を発現するために使用されてきた（Ｍｅｃｈｔｃｈｅｒｉａｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３１，１０−１５；２００６；Ｍｏｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．４，６２３−６３１；Ａｌａｍｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．１，１１０３−１１１１）。成功にもかかわらず、完全長のウイルスベクターの使用は挿入される配列のサイズを制限し、かつ植物間の移動はウイルスの生物学的封じ込めについて懸念される。
【０００８】
生物学的封じ込め、および挿入サイズの問題に対処するために、Ｃａｎｉｚａｒｅｓらは、ＲＮＡ−２のコーディング領域の大部分を目的の配列に置換し、ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２の無効なバージョン（ｄｅＩＲＮＡ−２）を生産した（２００６  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｊ  ４：１８３−１９３）。ＲＮＡ−２の５１２位のＡＵＧ、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）のすぐ上流に、発現される配列を融合し、ＲＮＡ−２を模倣する分子を作製した。かかる構築物は、ＲＮＡ−１およびサイレンシングサプレッサーの存在下で植物へ導入された際に複製でき、かつ実質的なレベルの異種タンパク質の合成を指示した（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ  ６：８２−９２）。
【０００９】
ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ベクターにおける１６１位の開始コドンの変異（Ｕ１６２Ｃ；ＨＴ）は、５１２位の開始コドンの後に挿入される配列によりコードされるタンパク質の発現レベルを増加させる。これはウイルス複製を必要としない外来タンパク質の高レベルの生産を可能にし、かつＣＰＭＶ−ＨＴ系と命名された（ＷＯ２００９／０８７３９１；Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ  ａｎｄ  Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，２００８，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４８，１２１２−１２１８）。ｐＥＡＱ発現プラスミドにおいて（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，７，ｐｐ  ６８２−６９３；ＵＳ  ２０１０／０２８７６７０）、発現される配列は、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ間に位置している。ｐＥＡＱシリーズにおける５’ＵＴＲは、Ｕ１６２Ｃ（ＨＴ）変異を保有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、植物における目的のタンパク質の発現に関する。本発明はまた、植物における目的のタンパク質の生産のための方法および組成物を提供する。
【００１１】
本明細書に記載されるように、順番に、配列番号：１のヌクレオチド１−１６０を含む、または配列番号：１と約８０％から１００％の配列類似性を含むヌクレオチド配列を含むＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲヌクレオチド配列、ならびに不完全なＭタンパク質、植物において活性な１つ以上のコザック配列、もしくは両方をコードするヌクレオチド配列を含むスタッファーフラグメントを含む、発現エンハンサーが提供される。スタッファーフラグメントは、１０から約５００のヌクレオチド長、またはそれらの間の任意の長さを含んでもよい。スタッファーフラグメントの不完全なＭタンパク質は、約１０から約３５１のヌクレオチド長、またはそれらの間の任意の長さを含んでもよい。スタッファーフラグメントは、マルチプルクローニングサイトをさらに含んでもよい。マルチプルクローニングサイトは、約０から約１００のヌクレオチド長、またはそれらの間の任意の長さを含む。
【００１２】
コザック配列が、配列番号：５−１７に示される配列の群から選択される、上記に記載される発現エンハンサーもまた提供される。
【００１３】
順番に、配列番号：１のヌクレオチド１−１６０を含む、または配列番号：１と約８０％から１００％の配列類似性を含むヌクレオチド配列を含むＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲヌクレオチド配列、ならびに不完全なＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列および１つ以上の植物コザック配列をコードするヌクレオチド配列を含むスタッファーフラグメントを含む発現エンハンサーと作動可能に連結された制御領域を含む核酸配列を含む植物発現系であって、当該発現エンハンサーは目的のヌクレオチド配列と作動可能に連結されたものである、植物発現系もまた提供される。植物発現系はコモウイルス３’ＵＴＲをさらに含んでもよい。植物発現系は、サイレンシングのサプレッサー、例えばＨｃＰｒｏまたはｐ１９をコードする第二の核酸配列をさらに含んでもよい。
【００１４】
上記で定義される植物発現系の目的のヌクレオチド配列は、ウイルスタンパク質または抗体をコードしてもよい。例えば、ウイルスタンパク質は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、インフルエンザＢ型ヘマグルチニンの群から選択されてもよい。ウイルスタンパク質または抗体をコードするヌクレオチド配列は、天然シグナルペプチド配列、または非天然シグナルペプチドを含んでもよく、例えば非天然シグナルペプチドは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）から得られてもよい。
【００１５】
本明細書に記載されるように、植物または植物の部分に上記で定義される植物発現系を導入すること、および目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で、植物もしくは植物の部分をインキュベートすることを含む、植物または植物の部分において目的のタンパク質を生産する方法が提供される。
【００１６】
本発明はまた、上記に記載される植物発現系を用いて一過性に遺伝子導入されている、または安定的に形質転換されている、植物または植物の部分を提供する。
【００１７】
植物ベースの発現系は、好ましくは、例えば、目的の遺伝子にとって便利なクローニング部位を含有するなどの多くの特性を有し、費用対効果のある方法で植物に容易に感染してもよく、播種される植物の効率的な局所または全身感染を引き起こしてもよい。さらに、当該感染は、有用なタンパク質物質の良好な収率を提供するだろう。
【００１８】
この発明の概要は、必ずしも発明の全ての特徴を記載するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
本発明のこれらの、および他の特徴は、添付した図面による参照における以下の記載からより明らかとなるだろう：
【図１】図１Ａは、目的のヌクレオチド配列に融合された、従来技術（ＣＰＭＶ  ＨＴ）の、および本明細書に記載される（ＣＰＭＶ  ＨＴ＋）、エンハンサー配列の例の一般的な概略図を示す。この図に示されるエレメントの全てがエンハンサー配列内で必要とされなくてもよい。さらなるエレメントは、コモウイルス３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、プラストシアニン３’ＵＴＲ、またはコモウイルス３’ＵＴＲおよびプラストシアニン３’ＵＴＲの組み合わせをコードする配列を含む、目的のヌクレオチド配列の３’末端（図示せず）で含まれてもよい。図１Ｂは、それらの５’末端で植物制御領域（これらの非限定例２Ｘ３５Ｓにおける）、およびそれらの３’末端で、スタッファーフラグメント、ＡＴＧ開始部位を含む、目的のヌクレオチド配列、「ＧＯＩ」に作動可能に連結された、従来技術（ＣＰＭＶ  ＨＴ）に記載されるエンハンサー配列を含む構築物、および本発明（ＣＰＭＶ  ＨＴ＋）に記載されるエンハンサー配列を含む構築物を示す。これらの例において、ＣＰＭＶ  ＨＴのためのスタッファーフラグメントは、不完全なＭタンパク質およびマルチプルクローニングサイトを含み、かつＣＰＭＶ  ＨＴ＋についての例では、スタッファーフラグメントは、不完全なＭタンパク質、マルチプルクローニングサイトおよび植物コザック配列を含む。
【図２】図２は、目的のヌクレオチド配列と作動可能に連結されるＣＰＭＶ−ＨＴ（従来技術）発現構築物、およびＣＰＭＶ  ＨＴ＋ベースの発現構築物を含む植物において生産されるタンパク質の粗タンパク質の抽出物における相対血液凝集力価（ＨＭＧ）を示す。ＰＤＩシグナルペプチドを有するＨ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（構築物番号４８４：ＣＰＭＶ  ＨＴ；および構築物番号１８０５：ＣＰＭＶ  ＨＴ＋；実施例４を参照されたい）、ＰＤＩシグナルペプチドを有するＨ３  Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（構築物番号１３９１：ＣＰＭＶ  ＨＴ；および構築物番号１８１９：ＣＰＭＶ  ＨＴ＋；それぞれ実施例１および２を参照されたい）、欠失タンパク質分解ループを有し、かつＰＤＩシグナルペプチドを有するＢ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８（構築物番号１０３９：ＣＰＭＶ  ＨＴ；および構築物番号１８２９：ＣＰＭＶ  ＨＴ＋；実施例８を参照されたい）、欠失タンパク質分解ループを有し、Ｈ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９のものによって置換された膜貫通ドメインおよび細胞質側末端を有し、かつＰＤＩシグナルペプチドを有するＢ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８＋Ｈ１ＴＭ（構築物番号１０６７：ＣＰＭＶ  ＨＴ；および構築物番号１８７５：ＣＰＭＶ  ＨＴ＋；実施例９を参照されたい）、欠失タンパク質分解ループを有し、かつＰＤＩシグナルペプチドを有するＢ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２（構築物番号２０７２：ＣＰＭＶ  ＨＴ；および構築物番号２０５２：ＣＰＭＶ  ＨＴ＋；実施例１０を参照されたい）、欠失タンパク質分解ループを有し、Ｈ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９のものによって置換された膜貫通ドメインおよび細胞質側末端を有し、かつＰＤＩシグナルペプチドを有するＢ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２＋Ｈ１Ｔｍ（構築物番号２０７４：ＣＰＭＶ  ＨＴ；および構築物番号２０６２：ＣＰＭＶ  ＨＴ＋；実施例１１を参照されたい）、欠失タンパク質分解ループを有し、かつ天然シグナルペプチドを有するＢ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０（構築物番号１４４５：ＣＰＭＶ  ＨＴ；および構築物番号１８３９：ＣＰＭＶ  ＨＴ＋；実施例１２を参照されたい）、および欠失タンパク質分解ループを有し、Ｈ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９のものによって置換された膜貫通ドメインおよび細胞質側末端を有し、かつ天然シグナルペプチドを有するＢ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０＋Ｈ１Ｔｍ（構築物番号１４５４：ＣＰＭＶ  ＨＴ；および構築物番号１８６０：ＣＰＭＶ  ＨＴ＋；実施例１３を参照されたい）由来の、ＨＡの発現データが示される。
【図３】図３は、ＣＰＭＶ−ＨＴ（従来技術）発現構築物、およびＣＰＭＶ  ＨＴ＋ベースの発現構築物を含む植物において生産されるタンパク質の粗タンパク質の抽出物における相対血液凝集力価（ＨＭＧ）を示す。ＰＤＩシグナルペプチドを有するインフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５（Ｈ５  Ｉｎｄｏ；構築物番号４０９：ＣＰＭＶ  ＨＴ；および構築物番号２３１９：ＣＰＭＶ  ＨＴ＋；実施例５を参照されたい）、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを有するインフルエンザＡ／Ｈａｎｇｚｈｏｕ／１／２０１３由来のＨ７（Ｈ７  Ｈａｎ；構築物番号２１４０：ＣＰＭＶ  ＨＴ；および構築物番号２１４２：ＣＰＭＶ  ＨＴ＋；実施例６を参照されたい）、インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５の膜貫通ドメインおよび細胞質側末端（ＴＭＣＴ）に融合され、かつアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのシグナルペプチドを有する、インフルエンザＡ／Ｈａｎｇｚｈｏｕ／１／２０１３由来のＨ７（Ｈ７Ｈａｎ＋Ｈ５Ｔｍ；構築物番号２１３０：ＣＰＭＶ  ＨＴ；構築物番号２１４６：ＣＰＭＶ  ＨＴ＋；実施例７を参照されたい）についての発現データが示される。
【図４】図４Ａは、試験された植物コザック配列のバリアントの例を示す。ＣＰＭＶ  ＨＴ＋、植物制御領域、５’ＵＴＲ、スタッファーフラグメント、および目的のヌクレオチド配列（ＧＯＩ）の部分的な配列を示す構築物。この非限定例において、構築物は、２Ｘ３５Ｓ制御領域、不完全なＭタンパク質およびマルチプルクローニングサイト（制限酵素部位）、植物コザック配列を含むスタッファーフラグメントを含むＣＰＭＶ  ＨＴ＋を含む（目的のヌクレオチド配列の５’末端は、また：「ＡＴＧ・・・ＧＯＩ」と示され；ここでＧＯＩはＨ３  Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１である）。植物コザック配列のバリアントはまた、配列の下に示される（図７も参照されたい）。それぞれのバリアント植物コザック配列は、スタッファーフラグメントの３’末端と目的のヌクレオチド配列（これらの非限定例において、Ｈ３  Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１）の５’−ＡＴＧ部位の間に配置された。構築物の他のエレメント同一のままである。図４Ｂは、示されるＣＰＭＶ  ＨＴ＋発現構築物およびバリアント植物コザック配列を含む植物において生産される目的のヌクレオチド配列のＨＡ力価を示す。
【図５】図５は、構築物番号１３９１（Ａ−２Ｘ３５Ｓ  ＣＰＭＶ−ＨＴ  ＰＤＩＳＰ  Ｈ３  Ｖｉｃｔｏｒｉａ  ＮＯＳ；実施例１を参照されたい）を調製するために使用される配列構成要素を示す。構築物番号１３９１は、従来技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全なＭタンパク質をコードする配列に融合される１６１位の変異開始コドンを有するＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲ）を組み込み、かつ５’ＵＴＲと目的のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／Ｈ３  Ｖｉｃｔｏｒｉａ）との間に異種のコザック配列を含まない。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図５Ａは、プライマー配列ＩＦ−ＰＤＩ．Ｓ１＝３ｃ（配列番号：１８）を示す。図５Ｂは、プライマー配列ＩＦ−Ｈ３Ｖ３６１１１．ｓ１−４ｒ（配列番号：１９）を示す。図５Ｃは、ＰＤＩＳＰ／Ｈ３  Ｖｉｃｔｏｒｉａの配列（配列番号：２０）を示す。図５Ｄは、構築物１１９１の概略図を示す。図５Ｅは、構築物１１９１を示し；左から右に、ｔ−ＤＮＡボーダー（下線）、プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットを有する２Ｘ３５Ｓ  ＣＰＭＶ−ＨＴ  ＮＯＳ（配列番号：２１）。図５Ｆは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１３９１を示す。ＰＤＩＳＰ／Ｈ３  Ｖｉｃｔｏｒｉａヌクレオチド配列に下線が引かれ；ＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲは太字で示され；不完全なＭタンパク質（配列番号：２２）はイタリックである。図５Ｇは、ＰＤＩＳＰ／Ｈ３  Ｖｉｃｔｏｒｉａのアミノ酸配列（配列番号：２３）を示す。図５Ｈは、構築物番号１３９１の（参照構築物）概略図を示す。
【図６】図６は、構築物番号１８１９（２Ｘ３５Ｓ  ＣＰＭＶ−ＨＴ＋  ＰＤＩＳＰ  Ｈ３  Ｖｉｃｔｏｒｉａ  ＮＯＳ；実施例１を参照されたい）を調製するために使用される配列構成要素を示す。構築物番号１８１９は、ＣＰＭＶ−ＨＴ＋配列（不完全なＭタンパク質をコードするスタッファーフラグメントに融合される１６１位の変異開始コドン、マルチプルクローニングサイトを有するＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲ）を組み込み、かつマルチプルクローニングサイトと目的のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／Ｈ３  Ｖｉｃｔｏｒｉａ）間に植物コザック配列を含む）。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図６Ａは、プライマー配列ＩＦ（ＳａｃＩＩ）−Ｋｏｚａｃ＿ＰＤＩ．ｃ（配列番号：２４）を示す。図６Ｂは、構築物２１８１の概略図を示す。図６Ｃは、構築物２１８１についての配列を示す（左から右に、ｔ−ＤＮＡボーダーに下線が引かれ；プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシング阻害剤発現カセットを有する２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ＋／ＮＯＳ；配列番号：２５）。図６Ｄは、２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１８１９を示す。ＰＤＩＳＰ／Ｈ３  Ｖｉｃｔｏｒｉａヌクレオチド配列に下線が引かれる（配列番号：２６）。図６Ｅは、構築物１８１９の概略図を示す。  図７は、「ＣＰＭＶ  ＨＴ＋」ベースの構築物（構築物番号１９５２から１９５９）の選択を調製するために使用される植物コザック配列におけるバリエーションを含む配列を示す。植物コザック配列におけるバリエーションを含む、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ＋／ＮＯＳ発現系におけるＳａｃＩＩ制限酵素部位およびＰＤＩＳＰ／Ｈ３  ＶｉｃｔｏｒｉａのＡＴＧ間の配列のバリエーションが示される（構築物１８１９由来の対応する配列からのバリエーションとして当該配列が示される；実施例２を参照されたい）。バリアント植物コザック配列に下線が引かれる。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド。図７Ａは、ＩＦ−ＨＴ１＊−ＰＤＩ．ｃのヌクレオチド配列（配列番号：２７；構築物番号１９５２を調製するために使用される）を示す。図７Ｂは、ＩＦ−ＨＴ２＊−ＰＤＩ．ｃのヌクレオチド配列を示す（配列番号：２８；構築物番号１９５３を調製するために使用される）。図７Ｃは、ＩＦ−ＨＴ３＊−ＰＤＩ．ｃのヌクレオチド配列を示す（配列番号：２９；構築物番号１９５４を調製するために使用される）。図７Ｄは、ＩＦ−ＨＴ４＊−ＰＤＩ．ｃのヌクレオチド配列を示す（配列番号：３０；構築物番号１９５５を調製するために使用される）。図７Ｅは、ＩＦ−ＨＴ５＊−ＰＤＩ．ｃのヌクレオチド配列を示す（配列番号：３１；構築物番号１９５６を調製するために使用される）。図７Ｆは、ＩＦ−ＨＴ６＊−ＰＤＩ．ｃのヌクレオチド配列を示す（配列番号：３２  構築物番号１９５７を調製するために使用される）。図７Ｇは、ＩＦ−ＨＴ７＊−ＰＤＩ．ｃのヌクレオチド配列を示す（配列番号：３３；構築物番号１９５８を調製するために使用される）。図７Ｈは、ＩＦ−ＨＴ８＊−ＰＤＩ．ｃのヌクレオチド配列を示す（配列番号：３４���構築物番号１９５９を調製するために使用される）。図７Ｉは、配列番号：２７（図７Ａ）を用いる植物コザック配列（コザック１）を含む構築物番号１９５２の概略図を示す。それぞれの構築物（１９５３−１９５９）がそれぞれ図７Ｂから７Ｈ（配列番号：２８から３４）に示される改変植物コザック配列（コザック１）を含むことを除き、構築物１９５３−１９５９は、構築物１９５２と同一の特徴を含む。
【図８】図８は、構築物番号４８４および１８０５（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ  ＰＤＩＳＰ／Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ＋  ＰＤＩＳＰ／Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＮＯＳ；実施例４を参照されたい）を調製するために使用される配列構成要素を示す。構築物番号４８４は、従来技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全なＭタンパク質をコードする配列に融合される１６１位の変異開始コドンを有するＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲ）を組み込み、かつ５’ＵＴＲと目的のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の間に異種のコザック配列を含まない。構築物番号１８０５は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲ、不完全なＭタンパク質を含むスタッファーフラグメント、マルチプルクローニングサイト、および植物コザック配列を含み、かつＣＰＭＶ  ＨＴ＋ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図８Ａは、ＰＤＩＳＰ／Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａのヌクレオチド配列（配列番号：３５）を示す。図８Ｂは、ＰＤＩＳＰ／Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａのアミノ酸配列（配列番号：３６）を示す。図８Ｃは、構築物番号４８４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ；参照構築物）の概略図を示す。図８Ｄは、構築物番号１８０５（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ＋）の概略図を示す。
【図９】図９は、構築物番号４０９および２３１９（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ  ＰＤＩＳＰ／Ｈ５  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ  ＮＯＳ；ＣＰＭＶ  ＨＴ＋  ＰＤＩＳＰ／Ｈ５  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ  ＮＯＳ；実施例５を参照されたい）を調製するために使用される配列構成要素を示す。構築物番号４０９は、従来技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全なＭタンパク質をコードする配列に融合される１６１位の変異開始コドンを有するＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲ）を組み込み、かつ５’ＵＴＲと目的のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／Ｈ５  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ）の間に異種のコザック配列を含まない。構築物番号２３１９は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲ、不完全なＭタンパク質を含むスタッファーフラグメント、マルチプルクローニングサイト、および植物コザック配列を含み、かつＣＰＭＶ  ＨＴ＋ベースの構築物の一例である。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図９Ａは、ＰＤＩＳＰ／Ｈ５  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａのヌクレオチド配列（配列番号：３７）を示す。図９Ｂは、ＰＤＩＳＰ／Ｈ５  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａのアミノ酸配列（配列番号：３８）を示す。図９Ｃは、構築物番号４０９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ；参照構築物）の概略図を示す。図９Ｄは、構築物番号２３１９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ＋）の概略図を示す。
【図１０】図１０は、構築物番号２１４０および２１４２（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ  Ｈ７  Ｈａｎｇｚｈｏｕ  ＮＯＳ；ＣＰＭＶ  ＨＴ＋  Ｈ７  Ｈａｎｇｚｈｏｕ  ＮＯＳ；実施例６を参照されたい）を調製するために使用される配列構成要素を示す。構築物番号２１４０は、従来技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全なＭタンパク質をコードする配列に融合される１６１位の変異開始コドンを有するＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲ）を組み込み、かつ５’ＵＴＲと目的のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／Ｈ７  Ｈａｎｇｚｈｏｕ）の間に異種のコザック配列を含まない。構築物番号２１４２は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲ、不完全なＭタンパク質を含むスタッファーフラグメント、マルチプルクローニングサイト、および植物コザック配列を含み、かつＣＰＭＶ  ＨＴ＋ベースの構築物の一例である。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図１０Ａは、天然のＨ７  Ｈａｎｇｚｈｏｕのヌクレオチド配列（配列番号：３９）を示す。図１０Ｂは、天然のＨ７  Ｈａｎｇｚｈｏｕのアミノ酸配列（配列番号：４０）を示す。図１０Ｃは、構築物番号２１４０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ；参照構築物）の概略図を示す。図１０Ｄは、構築物番号２１４２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ＋）の概略図を示す。
【図１１】図１１は、構築物番号２１３０および２１４６（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ  Ｈ７  Ｈａｎｇｚｈｏｕ＋Ｈ５  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ  ＴＭＣＴ  ＮＯＳ；ＣＰＭＶ  ＨＴ＋  Ｈ７  Ｈａｎｇｚｈｏｕ＋Ｈ５  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ  ＴＭＣＴ  ＮＯＳ；実施例７を参照されたい）を調製するために使用される配列構成要素を示す。構築物番号２１３０は、従来技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全なＭタンパク質をコードする配列に融合される１６１位の変異開始コドンを有するＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲ）を組み込み、かつ５’ＵＴＲと目的のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／Ｈ７  Ｈａｎｇｚｈｏｕ＋Ｈ５  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ  ＴＭＣＴ）の間に異種のコザック配列を含まない。構築物番号２１４６は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲ、不完全なＭタンパク質を含むスタッファーフラグメント、マルチプルクローニングサイト、および植物コザック配列を含み、かつＣＰＭＶ  ＨＴ＋ベースの構築物の一例である。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図１１Ａは、Ｈ７  Ｈａｎｇｚｈｏｕ＋Ｈ５  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ  ＴＭＣＴのヌクレオチド配列（配列番号：４１）を示す。図１１Ｂは、Ｈ７  Ｈａｎｇｚｈｏｕ＋Ｈ５  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ  ＴＭＣＴのアミノ酸配列（配列番号：４２）を示す。図１１Ｃは、構築物番号２１３０（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ；参照構築物）の概略図を示す。図１１Ｄは、構築物番号２１４６（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ＋）の概略図を示す。
【図１２】図１２は、構築物番号１０３９および１８２９（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ  ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）  ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ＋  ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）  ＮＯＳ；実施例８を参照されたい）を調製するために使用される配列構成要素を示す。構築物番号１０３９は、従来技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全なＭタンパク質をコードする配列に融合される１６１位の変異開始コドンを有するＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲ）を組み込み、かつ５’ＵＴＲと目的のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−））の間に異種のコザック配列を含まない。構築物番号１８２９は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲ、不完全なＭタンパク質を含むスタッファーフラグメント、マルチプルクローニングサイト、および植物コザック配列を含み、かつＣＰＭＶ  ＨＴ＋ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失タンパク質分解ループ。図１２Ａは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）のヌクレオチド配列（配列番号：４３）を示す。図１２Ｂは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）のアミノ酸配列を示す；配列番号：４４）。図１２Ｃは、構築物番号１０３９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ；参照構築物）の概略図を示す。図１２Ｄは、構築物番号１８２９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ＋）の概略図を示す。
【図１３】図１３は、構築物番号１０６７および１８７５（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ  ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＴＭＣＴ  ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ＋  ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＴＭＣＴ  ＮＯＳ；実施例９を参照されたい）を調製するために使用される配列構成要素を示す。構築物番号１０６７は、従来技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全なＭタンパク質をコードする配列に融合される１６１位の変異開始コドンを有するＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲ）を組み込み、かつ５’ＵＴＲと目的のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＴＭＣＴ）の間に異種のコザック配列を含まない。構築物番号１８７５は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲ、不完全なＭタンパク質を含むスタッファーフラグメント、マルチプルクローニングサイト、および植物コザック配列を含み、かつＣＰＭＶ  ＨＴ＋ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失タンパク質分解ループ；ＴＭＣＴ：膜貫通ドメイン細胞質側末端。図１３Ａは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＴＭＣＴのヌクレオチド配列（配列番号：４５）を示す。図１３Ｂは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＴＭＣＴのアミノ酸配列（配列番号：４６）を示す。図１３Ｃは、構築物番号１０６７（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ；参照構築物）の概略図を示す。図１３Ｄは、構築物番号１８７５（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ１６０＋）の概略図を示す。
【図１４】図１４は、構築物番号２０７２および２０５２（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ  ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）  ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ＋  ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）  ＮＯＳ；実施例１０を参照されたい）を調製するために使用される配列構成要素を示す。構築物番号２０７２は、従来技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全なＭタンパク質をコードする配列に融合される１６１位の変異開始コドンを有するＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲ）を組み込み、かつ５’ＵＴＲと目的のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−））の間に異種のコザック配列を含まない。構築物番号２０５２は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲ、不完全なＭタンパク質を含むスタッファーフラグメント、マルチプルクローニングサイト、および植物コザック配列を含み、かつＣＰＭＶ  ＨＴ＋ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失タンパク質分解ループ。図１４Ａは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）のヌクレオチド配列（配列番号：４７）を示す。図１４Ｂは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）のアミノ酸配列（配列番号：４８）を示す。図１４Ｃは、構築物番号２０７２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ；参照構築物）の概略図を示す。図１４Ｄは、構築物番号２０５２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ＋）の概略図を示す。
【図１５】図１５は、構築物番号２０７４および２０６２（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ  ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＴＭＣＴ  ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ＋  ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＴＭＣＴ  ＮＯＳ；実施例１１を参照されたい）を調製するために使用される配列構成要素を示す。構築物番号２０７４は、従来技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全なＭタンパク質をコードする配列に融合される１６１位の変異開始コドンを有するＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲ）を組み込み、かつ５’ＵＴＲと目的のヌクレオチド配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＴＭＣＴ）の間に異種のコザック配列を含まない。構築物番号２０６２は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲ、不完全なＭタンパク質を含むスタッファーフラグメント、マルチプルクローニングサイト、および植物コザック配列を含み、かつＣＰＭＶ  ＨＴ＋ベースの構築物の一例である。ＰＤＩＳＰ：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失タンパク質分解ループ；ＴＭＣＴ：膜貫通ドメイン細胞質側末端。図１５Ａは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＴＭＣＴのヌクレオチド配列（配列番号：４９）を示す。図１５Ｂは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＴＭＣＴのアミノ酸配列（配列番号：５０）を示す。図１５Ｃは、構築物番号２０７４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ；参照構築物）の概略図を示す。図１５Ｄは、構築物番号２０６２（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ＋）の概略図を示す。
【図１６】図１６は、構築物番号１４４５および１８３９（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ  ＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）  ＮＯＳ、および２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ＋  ＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）  ＮＯＳ；実施例１２を参照されたい）を調製するために使用される配列構成要素を示す。構築物番号１４４５は、従来技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全なＭタンパク質をコードする配列に融合される１６１位の変異開始コドンを有するＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲ）を組み込み、かつ５’ＵＴＲと目的のヌクレオチド配列（ＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−））の間に異種のコザック配列を含まない。構築物番号１８３９は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲ、不完全なＭタンパク質を含むスタッファーフラグメント、マルチプルクローニングサイト、および植物コザック配列を含み、かつＣＰＭＶ  ＨＴ＋ベースの構築物の一例である。ＰｒＬ−：欠失タンパク質分解ループ；ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター。図１６Ａは、ＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）のヌクレオチド配列（配列番号：５１）を示す。図１６Ｂは、ＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）のアミノ酸配列（配列番号：５２）を示す。図１６Ｃは、構築物番号１４４５（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ；参照構築物）の概略図を示す。図１６Ｄは、構築物番号１８３９（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ＋）の概略図を示す。
【図１７】図１７は、構築物番号１４５４および１８６０（それぞれ、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ  ＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＴＭＣＴ  ＮＯＳおよび２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ＋  ＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＴＭＣＴ  ＮＯＳ；実施例１３を参照されたい）を調製するために使用される配列構成要素を示す。構築物番号１４５４は、従来技術のＣＰＭＶ−ＨＴ配列（不完全なＭタンパク質をコードする配列に融合される１６１位の変異開始コドンを有するＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲ）を組み込み、かつ５’ＵＴＲと目的のヌクレオチド配列（ＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＴＭＣＴ）の間に異種のコザック配列を含まない。構築物番号１８６０は、１６０ヌクレオチドを含むＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲ、不完全なＭタンパク質を含むスタッファーフラグメント、マルチプルクローニングサイト、および植物コザック配列を含み、かつＣＰＭＶ  ＨＴ＋ベースの構築物の一例である。ＮＯＳ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＰｒＬ−：欠失タンパク質分解ループ；ＴＭＣＴ：膜貫通ドメイン細胞質側末端。図１７Ａは、ＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＴＭＣＴのヌクレオチド配列（配列番号：５３）を示す。図１７Ｂは、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＴＭＣＴのアミノ酸配列（配列番号：５４）を示す。図１７Ｃは、構築物番号１４５４（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ；参照構築物）の概略図を示す。図１７Ｄは、構築物番号１８９３（２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ＋）の概略図を示す。
【００２０】
詳細な説明
本発明は、植物における目的のタンパク質の発現に関する。本発明はまた、植物における目的のタンパク質の生産のための方法および組成物を提供する。
【００２１】
以下の記載において、多くの用語は広く使用され、以下の定義は発明の種々の態様の理解を容易にするために提供される。用語の例を含む、本明細書における例の使用は、例示的な目的のみのためであり、かつ本明細書の発明の実施形態の範囲および意味を限定することを企図するものではない。
【００２２】
本明細書で使用されるように、用語「を含む」と併せて本明細書で使用される際に、単語「ａ」または「ａｎ」の使用は、「１つの」を意味してもよいが、それらはまた、「１つ以上の」、「少なくとも１つの」および「１より大きい」の意味と一致する。用語「約」は、指定される値からおよそ＋／−１０％のバリエーションを指す。用語「複数（ｐｌｕｒａｌｉｔｙ）」は、１より大きいこと、例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上等を意味する。
【００２３】
本発明は、コモウイルス５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、および改変された、延長された、またはトランケートされたスタッファー配列を含む、植物において目的のタンパク質を生産するための核酸、発現エンハンサーおよび発現系を提供する。目的の配列を含む植物細胞、植物組織、植物全体、接種源、核酸、構築物、ならびに植物において目的のタンパク質を発現する方法も提供される。
【００２４】
本発明の発現エンハンサーの一例は、図１Ａに示されるＣＰＭＶ  ＨＴ＋を含むが、これに限定されない。ＣＰＭＶ  ＨＴ＋のヌクレオチド配列の非限定例は、配列番号：１、３および４を参照して提供される。
【００２５】
植物宿主内の目的のヌクレオチド配列の発現を駆動するために、発現エンハンサーＣＰＭＶ  ＨＴ＋を、植物において活性な制御領域とエンハンサー配列の５’末端で作動可能に連結してもよく、かつ発現エンハンサーの３’末端で目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結してもよい（図１Ａ）。
【００２６】
いずれかのＣＰＭＶ  ＨＴ＋を用いる、植物において１つ以上の目的のタンパク質を生産するための発現系もまた提供される。本明細書に記載の発現系は、ＣＰＭＶ  ＨＴ＋、またはＣＰＭＶ  ＨＴ＋と８０％から１００％まで、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を含む配列を含む、発現カセットを含む。ＣＰＭＶ  ＨＴ＋を含む発現カセットは、発現エンハンサーの５’末端に作動可能に連結された、植物において活性な制御領域をさらに含んでもよい。目的のヌクレオチド配列は、発現カセットの３’末端に作動可能に連結してもよく、その結果、植物内に導入される時に、植物宿主内の目的のヌクレオチド配列の発現を達成する。
【００２７】
図１Ａおよび１Ｂを参照すると、改変されたＭタンパク質と共に、コモウイルスゲノム由来の５’ＵＴＲ配列（コモウイルス５’ＵＴＲ）を含む発現エンハンサーが示される。図１Ａおよび１Ｂでは、不完全なＭタンパク質を含む、従来技術のＣＰＭＶ  ＨＴエンハンサー（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ  ａｎｄ  Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，  ２００８，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ；１４８：１２１２−１２１８；ＷＯ  ２００９／０８７３９１；出典明示により本明細書に組み込まれる）が、本発明のＣＰＭＶ  ＨＴ＋と共に示される。
【００２８】
従来技術のＣＰＭＶ  ＨＴ発現エンハンサー（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ  ａｎｄ  Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，  ２００８，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ；１４８：１２１２−１２１８；ＷＯ  ２００９／０８７３９１；出典明示により本明細書に組み込まれる）は、配列番号：２のヌクレオチド１６１−５０９を含む不完全なＭタンパク質であって、１６２位の改変ＡＴＧ（ＡＴＧが、ＡＣＧに改変されている）からなる不完全なＭタンパク質およびリンカー配列に融合された、１１５位の改変ＡＴＧ（ＡＴＧがＣＧＴに改変されている）を有するＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲのヌクレオチド１−１６０を含む（配列番号：２を参照されたい）。目的のヌクレオチド配列は、リンカー配列の３’末端に融合される（図１Ａおよび１Ｂを参照されたい）。従来技術のＣＰＭＶ  ＨＴは、目的のヌクレオチド配列が発現エンハンサーに融合される位置からすぐ上流の植物コザック配列を欠く。
【００２９】
本発明のＣＰＭＶ  ＨＴ＋は、改変され、かつ改変ＡＴＧ（１６１−１６３位でＡＴＧがＡＣＧに改変されており；１６２位で「Ｔ」が「Ｃ」に改変されている）、不完全なＭタンパク質、リンカー配列および植物コザック配列を含む、スタッファー配列に融合されている、１１５−１１７位の改変ＡＴＧ（ここでＡＴＧはＧＴＧに改変されており；１１５位のＡがＧに改変されている）を有するＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲのヌクレオチド１−１６０を含んでもよい。ＣＰＭＶ  ＨＴ＋ヌクレオチド配列の非限定例は配列番号：１および４に示される。目的のヌクレオチドは、コザック配列、例えばＣＰＭＶ  ＨＴ＋の植物コザック配列の３’末端に融合されてもよい（図１Ａおよび１Ｂを参照されたい）。
【００３０】
また、本発明の発現エンハンサーの５’ＵＴＲは、１１５位で「Ａ」を含んでもよく、かつ、改変され、かつＡＣＧへのヌクレオチド１６１−１６３の改変ＡＴＧ（ここで１６２位の「Ｔ」が、「Ｃ」に改変されている）、不完全なＭタンパク質、リンカー配列および植物コザック配列を含む、スタッファー配列に融合されている、配列番号：４に示されるヌクレオチド１１５−１１７での天然のＡＴＧ配列を含んでもよい。１１５位の天然型または野生型「Ａ」を含む発現エンハンサーは、ＣＰＭＶ  ＨＴ＋［ＷＴ１１５］と称されてもよい。ＣＰＭＶ  ＨＴ＋［ＷＴ１１５］ヌクレオチド配列の非限定例は、配列番号：３に示される。目的のヌクレオチドは、ＣＰＭＶ  ＨＴ＋［ＷＴ１１５］の植物コザック配列の３’末端に融合されてもよい（図１Ａおよび１Ｂを参照されたい）。ＣＰＭＶ  ＨＴ＋は、１１５位でヌクレオチド「Ｇ」を含む（配列番号：１）ので、ＣＰＭＶ  ＨＴ＋［ＷＴ１１５］は、ＣＰＭＶ  ＨＴ＋のバリアントと考えてもよい。また、ＣＰＭＶ  ＨＴ＋［５１１］は、ヌクレオチド１６１−５１１の不完全なＭタンパク質を含む（配列番号：５６を参照されたい）ので、ＣＰＭＶ  ＨＴ＋［５１１］は、ＣＰＭＶ  ＨＴ＋のバリアントと考えてもよい。このように、「ＣＰＭＶ  ＨＴ＋」という用語は、ＣＰＭＶ  ＨＴ＋［ＷＴ１１５］およびＣＰＭＶ  ＨＴ＋［５１１］などのバリアントを含む、総称である。
【００３１】
ＣＰＭＶ  ＨＴ＋発現エンハンサーの非限定例は配列番号：１、３および４に示されるが、しかしながら、スタッファーフラグメントが不完全なＭタンパク質を含み、かつ目的のヌクレオチド配列に融合される場合は、植物において活性なコザック配列、例えば植物コザック配列が目的のヌクレオチド配列の５’末端に位置することを条件に、本発明から逸脱することなく、ＣＰＭＶ  ＨＴ＋およびＣＰＭＶ  ＨＴ＋［ＷＴ１１５］のスタッファー配列中に変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）または改変がなされてもてもよい、と理解されるべきである。ＣＰＭＶ  ＨＴ＋発現エンハンサーの別の例（Ｍタンパク質−天然コザック配列を含む）は、配列番号：５６に提供される（ＣＰＭＶ  ＨＴ＋［５１１］）。
【００３２】
スタッファー配列は、挿入、トランケーションまたは欠失により改変されてもよく、その結果、従来技術エンハンサーＣＰＭＶ  ＨＴ（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ  ａｎｄ  Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，  ２００８，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ；１４８：１２１２−１２１８；ＷＯ  ２００９／０８７３９１；出典明示により本明細書に組み込まれる）の最初の（未改変）不完全なＭタンパク質配列と比較する場合、不完全なＭタンパク質配列はより長くなり、トランケートされ、または短縮されている。不完全なＭタンパク質に加えて、本発明のＣＰＭＶ  ＨＴ＋発現エンハンサーのスタッファー配列は、１つ以上の制限酵素部位（ポリリンカー、マルチプルクローニングサイト、１つ以上のクローニング部位）、１つ以上の植物コザック配列もしくはＭタンパク質−天然コザック配列、１つ以上のリンカー配列、１つ以上の組換え部位、またはそれらの組み合わせをさらに含んでもよい。例えば、限定と考えられるべきではないが、スタッファー配列は、順番に、不完全なＭタンパク質（配列番号：１もしくは２のヌクレオチド１６１−５０９、または配列番号：５６のヌクレオチド１６１−５１１）、植物において活性なコザック配列、例えば植物コザック配列に融合された望ましい長さのマルチプルクローニングサイトを含んでもよい。
【００３３】
目的のヌクレオチド配列は、様々なアプローチを用いて本発明のＣＰＭＶ  ＨＴ＋（またはＣＰＭＶ  ＨＴ＋［ＷＴ１１５］、またはＣＰＭＶ  ＨＴ＋［５１１］）エンハンサー配列に融合（作動可能に連結）されてもよい。例えば、限定と考えられるべきではないが：
１）目的のヌクレオチド配列、例えば目的のタンパク質をコードする核酸は、不完全なＭタンパク質配列からなるスタッファーフラグメント（マルチプルクローニングサイトを有する、または有しない）のすぐ後のＣＰＭＶ  ＨＴ＋発現エンハンサーに融合されてもよい。この場合、目的のヌクレオチド配列は、不完全なＭタンパク質配列（または、もしあればマルチプルクローニングサイト）の３’末端に融合されており、かつ目的のヌクレオチド配列は、その５’末端で、目的のヌクレオチド配列のＡＴＧ開始部位からすぐ上流に植物コザック配列を含む。
２）目的のヌクレオチド配列は、スタッファーフラグメントの３’末端に位置される植物コザック配列のすぐ後で、スタッファーフラグメント（不完全なＭタンパク質、任意のマルチプルクローニングサイト、および植物コザック配列を含む）を含む発現エンハンサーに融合されてもよい。この場合、目的のヌクレオチド配列は、対応するマルチプルクローニングサイトまたは植物コザック配列を含まないだろう。
３）目的のヌクレオチド配列は、マルチプルクローニングサイトを用いてＣＰＭＶ  ＨＴ＋発現エンハンサーに融合されてもよい。この場合、目的のヌクレオチド配列は、発現エンハンサーおよび目的のヌクレオチド配列のＡＴＧ開始部位からすぐ上流の植物コザック配列との融合を可能にするために、その５’末端で対応するクローニング部位を含んでもよい。
【００３４】
上記方法のいずれかを用いる全体的な結果は、５’ＵＴＲ配列と作動可能に関連する（作動可能に連結される）植物制御領域を含む、構築物もしくは発現カセットであり、当該５’ＵＴＲ配列は、植物コザック配列に融合された不完全なＭタンパク質を含むスタッファーフラグメントの５’末端に融合され、ここで、植物コザック配列の３’末端は目的のヌクレオチド配列の５’末端に融合されている。構築物は、目的のヌクレオチド配列の３’末端に作動可能に連結されるコモウイルス３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、例えばプラストシアニン３’ＵＴＲもしくは植物内で活性な他の３’ＵＴＲ、ならびにターミネーター配列、例えばＮＯＳターミネーターを含む配列をさらに含んでもよい（図１Ａを参照されたい）。
【００３５】
本明細書に記載される、１つまたは１より多くの発現エンハンサー（例えばＣＰＭＶ  ＨＴ＋、ＣＰＭＶ  ＨＴ＋［ＷＴ１１５］、ＣＰＭＶ  ＨＴ＋［５１１］）と作動可能に連結される制御領域および目的のヌクレオチド配列を含む、第一の核酸配列を含む植物発現系もまた提供される。さらに、プロモーター（制御領域）配列、コモウイルス５’ＵＴＲを含む発現エンハンサー（例えばＣＰＭＶ  ＨＴ＋、ＣＰＭＶ  ＨＴ＋［ＷＴ１１５］、またはＣＰＭＶ  ＨＴ＋［５１１］）および１つ以上の目的のタンパク質をコードする１つ以上の核酸配列に融合された、植物コザック配列を有するスタッファー配列を含む核酸が記載される。当該核酸は、目的のヌクレオチド配列の３’末端に作動可能に連結される、コモウイルス３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、例えばプラストシアニン３’ＵＴＲ、もしくは植物において活性な他の３’ＵＴＲ、ならびにターミネーター配列、例えばＮＯＳターミネーターを含む配列をさらに含んでもよく（図１Ａを参照されたい）、その結果、目的のヌクレオチド配列は、コモウイルス３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、プラストシアニン３’ＵＴＲ、または他の３’ＵＴＲ配列より上流に挿入される。
【００３６】
「作動可能に連結される」により、核酸配列の発現の媒介または調節などの意図される機能を実施するために、直接的または間接的のいずれかで、特定の配列が相互作用することが意味される。作動可能に連結された配列の相互作用は、例えば、作動可能に連結された配列と相互作用するタンパク質により媒介されてもよい。
【００３７】
本明細書で参照される「発現エンハンサー」、「エンハンサー配列」または「エンハンサーエレメント」は、配列番号：１のヌクレオチド１−１６０に由来する、または約８０％から１００％、もしくはそれらの間の任意の量の配列類似性を共有する、配列を含む。エンハンサー配列は、それが取り付けられた下流の異種のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の発現を増強できる。
【００３８】
「５’ＵＴＲ」または「５’非翻訳領域」または「５’リーダー配列」という用語は、翻訳されないｍＲＮＡの領域を指す。５’ＵＴＲは、典型的に転写開始部位で始まり、かつコーディング領域の翻訳開始部位または開始コドン（通常ｍＲＮＡ中ではＡＵＧ、ＤＮＡ配列中ではＡＴＧ）の直前で終結する。５’ＵＴＲは、長さにおいて、またはコドンが開始コドンとしてもはや機能せず、翻訳が代替開始部位で開始しうるように、自然に存在する開始コドンまたは翻訳開始部位に変異を導入することによって、改変されてもよい。例えば天然型ＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲの１１５、１６１、５１２、５２４位またはそれらの組み合わせで開始するＡＴＧは、ＡＴＧ配列を除去するように、例えばＡＣＧ、ＧＴＧ、またはＣＧＴまたは他の非ＡＴＧ配列に改変されてもよい。
【００３９】
「不完全なＭタンパク質」により、配列番号：１のヌクレオチド１６１−５０９、または配列番号：５６のヌクレオチド１６１−５１１の、約１０から約３５１ヌクレオチド、またはそれらの間の任意の量を含むＭタンパク質コーディング配列が意味される。配列番号：１のヌクレオチド１６１−５０９、または配列番号：５６のヌクレオチド１６１−５１１は、天然型ＣＰＭＶ  ＲＮＡ２ゲノム配列（本明細書中の配列番号：５５を参照されたい；ＷＯ２００９／０８７３９１の表１も参照されたい；出典明示により本明細書に組み込まれる）に示されるＭタンパク質の配列に対応しており、「ａｔｇ」開始部位を除去するように１６１−１６３位の１つ以上のヌクレオチドに改変（置換）を有する。不完全なＭタンパク質配列の非限定例は、配列番号：１−４のヌクレオチド１６１から５０９、配列番号：５５のヌクレオチド１６１−５１１、または配列番号：５６のヌクレオチド１６１−５１１に規定される配列と、約８０％から１００％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を含むヌクレオチド配列を含む。当該配列は、開始コドンまたは開始部位を除去するように改変されてもよく、その結果、当該配列は、「ａｔｇ」コドンを含まない。さらに、不完全なＭタンパク質の非限定例は、配列番号：１−４のヌクレオチド１６１から５０９、配列番号：５５のヌクレオチド１６１−５１１、または配列番号：５６のヌクレオチド１６１−５１１を含む。本明細書に記載される使用のための天然型ＣＰＭＶ  ＲＮＡ２配列（配列番号：５５）への改変を含む配列の非限定例は、ＣＰＭＶ  ＨＴ＋、（配列番号：１）、およびＣＰＭＶ  ＨＴ＋［５１１］（配列番号：５６）を含む。
【００４０】
配列番号：５５は、ヌクレオチド１−５１４のＣＰＭＶ  ＲＮＡ２ゲノムの天然型（野生型）配列のセグメント（ＷＯ２００９／０８７３９１の表１に示される天然型ＣＭＰＶ  ＲＮＡ−２ゲノムセグメントの全長配列；出典明示により本明細書に組み込まれる）を含む。配列番号：５５のヌクレオチド１−５１１由来の５’ＵＴＲ配列は、１１５および１６１位で開始する野生型「ａｔｇ」配列（イタリック太字）、およびヌクレオチド１６１−５１１由来の下線が引かれた不完全なＭタンパク質（５１２位の「ａｔｇ」はまた、文脈について示され；ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２の天然型５’領域の５１２位の「ａｔｇ」での開始は、９５Ｋのポリプロテインの合成を生じる）：
【化１】
0006599354.tif 000002
配列番号：５５
を含む。
【００４１】
ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２配列（配列番号：１を参照されたい）のヌクレオチド１−１６０由来の５’ＵＴＲは、第一のインフレーム開始開始コドン（１６１位の）まで、転写開始部位で開始し、これは野生型コモウイルスゲノムセグメントによりコードされる２つのカルボキシ共末端タンパク質の長い方の生産についての開始部位として機能する（２つのコードされるタンパク質のうち短い方は１５５位で開始する）。さらにＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ゲノム配列中の１１５位での（または対応する）“第三の”開始部位はまた、変異、欠失またはそうでなければ変更されてもよい。不完全なＭタンパク質と組み合わさると、１６１位のＡＵＧの除去に加えて、ＡＵＧ１１５の除去は、目的のヌクレオチド配列の発現を高めることが示されている（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ  ａｎｄ  Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，  ２００８，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ；１４８：１２１２−１２１８；ＷＯ  ２００９／０８７３９１；出典明示により本明細書に組み込まれる）。
【００４２】
発現エンハンサーは、配列番号：１、３もしくは４のヌクレオチド１−５０９、配列番号：５５のヌクレオチド１−５１１、または配列番号：５６のヌクレオチド１−５１１を含んでもよく、かつ不完全なＭタンパク質、ならびにスタッファーフラグメント、および任意にマルチプルクローニングサイトの３’末端の植物コザック配列を含むスタッファーフラグメントに融合されたＣＰＭＶ  ５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、または配列番号：１のヌクレオチド１−１６０、配列番号：１のヌクレオチド１６１−５０９、配列番号：１のヌクレオチド１−５０９、配列番号：５５のヌクレオチド１−５１１、または配列番号：５６のヌクレオチド１−５１１と、８０％から１００％まで、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を含み、かつ不完全なＭタンパク質を含むスタッファーフラグメント含み、かつスタッファーフラグメントおよび任意のマルチ−クローニング部位の３’末端で、植物コザック配列またはＭタンパク質−天然コザック配列のいずれかの、植物において活性なコザック配列をさらに含み、かつ従来技術「ＣＰＭＶ  ＨＴ」エンハンサー配列に作動可能に連結される異種のオープンリーディングフレームをコードする同一のヌクレオチド配列の発現と比較する場合、発現エンハンサーに作動可能に連結される異種のオープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列の発現を高める特性を示す、配列を含む（配列番号：２；Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ  Ｆ．，ａｎｄ  Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ  Ｇ．Ｐ．，２００８，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４８：ｐｐ．１２１２−１２１８；出典明示により本明細書に組み込まれる）。
【００４３】
スタッファー配列は、不完全なＭタンパク質の約５０から３５１ヌクレオチド、またはそれらの間の任意の量、例えば配列番号：１のヌクレオチド１６１−５０９または配列番号：５５または５６のヌクレオチド１６１−５１１であるがこれらに限定されない、スタッファーフラグメントの３’末端に位置する植物コザック配列もしくはＭタンパク質−天然コザック配列、ならびに不完全なＭタンパク質をコードする配列とコザック配列、例えば植物コザック配列の間に位置する、長さが約０から１００ヌクレオチド、もしくはそれらの間の任意の量のマルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）を含んでもよい。従ってスタッファー配列は、ＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲ配列の３’末端に融合された、約５０から約５００、またはそれらの間の任意の量のヌクレオチド長のものであってもよく、例えばスタッファー配列は、ＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲ配列の３’末端に融合された、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００，３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００ヌクレオチド、またはそれらの間の任意の量の長さのものであってもよい。
【００４４】
発現エンハンサーは、植物発現系に目的のヌクレオチドの挿入を促進するために、１つ以上の「制限酵素部位」もしくは「制限酵素認識部位」、「マルチプルクローニングサイト」、「ＭＣＳ」、「クローニング部位」「ポリリンカー配列」または「ポリリンカー」をさらに含んでもよい。制限酵素部位は、当該技術分野でよく知られる制限酵素により認識される特異的な配列モチーフである。発現エンハンサーは、不完全なＭタンパク質の下流（３’）に位置する１つ以上の制限酵素部位またはクローニング部位を含んでもよい。１つ以上の制限酵素部位またはクローニング部位は、１つ以上のコザック配列の上流（５’）に位置してもよく、かつ不完全なＭタンパク質とコザック配列の間に位置する。ポリリンカー配列（マルチプルクローニングサイト）は、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸配列を５’ＵＴＲの３’末端に付加おおび除去するために有用な核酸の任意の配列を含んでもよい。ポリリンカー配列は、４から約１００の核酸、またはそれらの間の任意の量を含んでもよい。
【００４５】
配列番号：１、３、４または５６の配列に規定されるＣＰＭＶ  ＨＴ＋発現エンハンサー（ＣＰＭＶ  ＨＴ＋［ＷＴ１１５］；ＣＰＭＶ  ＨＴ＋［５１１］を含む）は、本発明の発現エンハンサーの、限定と考えられるべきではない例である。配列番号：１、３、４または５６に規定されるＣＰＭＶ  ＨＴ＋、ＣＰＭＶ  ＨＴ＋［ＷＴ１１５］、またはＣＰＭＶ  ＨＴ＋［５１１］を含み、かつ発現エンハンサー配列と作動可能に関連する植物制御領域、ならびに発現エンハンサーの３’末端に融合された目的のヌクレオチド配列（ＧＯＩ；３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を有する）をさらに含む発現カセットもしくはベクターもまた、本発明に含まれる。配列番号：１、３、４または５６に規定されるＣＰＭＶ  ＨＴ＋発現エンハンサーのバリアントもまた、本発明に含まれる。
【００４６】
もしエンハンサー配列が、エンハンサー配列の３’末端で、ＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲ配列、不完全なＭタンパク質、および植物において活性なコザック配列、例えば植物コザック配列を含むならば、エンハンサー配列は、「ＣＰＭＶ  ＨＴ＋エンハンサー配列」と呼ばれてもよく、ただし、従来技術「ＣＰＭＶ  ＨＴ」エンハンサー配列（配列番号：２；Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ  Ｆ．，ａｎｄ  Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ  Ｇ．Ｐ．，２００８，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４８：ｐｐ．１２１２−１２１８；出典明示により本明細書に組み込まれる）に作動可能に連結される異種のオープンリーディングフレームをコードする同一のヌクレオチド配列の発現と比較する場合、ＣＰＭＶ  ＨＴ＋エンハンサー配列が発現エンハンサーに作動可能に連結される異種のオープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列の発現を高める特性を示すことを条件とする。
【００４７】
ＣＰＭＶ  ＨＴ＋中に存在してもよいバリエーションは、以下を含んでもよい：
１）約５０から約３５１ヌクレオチドまたはそれらの間の任意の量の不完全なＭタンパク質の長さの改変；
２）マルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）における改変、含まれる配列と、長さ約０から約１００のヌクレオチドまたはそれらの間の任意の長さのＭＣＳの長さの両方；および
３）コザック配列は、植物において活性な任意のコザック配列であってもよく、かつ植物コザック配列またはＭタンパク質−天然コザック配列を含んでもよい。
例えば、ＣＰＭＶ  ５’ＵＴＲは、配列番号：１または３のヌクレオチド１から１６０、または配列番号：１または３のヌクレオチド１−１６０と約８０％から約１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を含む。
【００４８】
配列番号：１は、ＣＰＭＶ  ＨＴ＋を含む発現エンハンサーの例である（小文字、太字およびイタリックで示される１１５位の改変ＡＴＧ（ＧＴＧ）を含む、ヌクレオチド１−１６０、５’ＵＴＲ；以下を含むスタッファーフラグメント：下線が引かれた不完全なＭタンパク質、ヌクレオチド１６１−５０９、１６２位の改変ヌクレオチド（ＡＣＧ）を有する；イタリックで示されるマルチプルクローニングサイト、ヌクレオチド５１０−５２８；ならびに大文字および太字で示される植物コザック配列、ヌクレオチド５２９−５３４）：
【化２】
0006599354.tif 000003
（配列番号：１）。
【００４９】
構築物１８１９、１８０５、２３１９、２１４２、２１４６、１８２９、１８７５、２０５２、２０６２、１８３９および１８６０（実施例１、および４−１３を参照されたい）は、配列番号：１を含むＣＰＭＶ  ＨＴ＋発現エンハンサーを含む構築物の代表例である。これらの構築物を用いた結果は、図２および３に見出されうる。
【００５０】
配列番号：２は、従来技術で知られる「ＣＰＭＶ  ＨＴ」発現エンハンサー（例えばＳａｉｎｓｂｕｒｙ  ａｎｄ  Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ  ２００８，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４８：ｐｐ．１２１２−１２１８の図１；出典明示により本明細書に組み込まれる）を含む。ＣＰＭＶ  ＨＴは、１１５位の改変ヌクレオチド（ｃｇｔ）を有する配列番号：２のヌクレオチド１−１６０由来の５’ＵＴＲ配列、および１６２位の改変ヌクレオチド（ａｃｇ）を有する不完全なＭタンパク質を含み、かつ、植物コザック配列を欠く（５’ＵＴＲ：ヌクレオチド１−１６０；不完全なＭタンパク質は下線が引かれ、ヌクレオチド１６１−５０９）。配列番号：２はまた、Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ  ａｎｄ  Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ  ２００８により記載される従来技術のＣＰＭＶ  ＨＴ配列中に存在しないマルチプルクローニングサイト（イタリック、ヌクレオチド５１０−５１７）を含む：
【化３】
0006599354.tif 000004
配列番号：２。
【００５１】
ＣＰＭＶ  ＨＴを含む構築物は、参照構築物として明細書中で示され、その結果、目的のヌクレオチド配列の発現レベル、またはＣＰＭＶ  ＨＴ＋、ＣＰＭＶ  ＨＴ＋［ＷＴ１１５］もしくはＣＰＭＶ  ＨＴ＋［５１１］を含む構築物を用いて生産された目的のヌクレオチド配列によりコードされる産物が比較されてもよい。構築物１３９１、４８４、４０９、２１４０、２１３０、１０３９、１０６７、２０７２、２０７４、１４４５および１４５４（実施例１、および４−１３を参照されたい）は、参照構築物ＣＰＭＶ  ＨＴの代表例であり、かつ配列番号：２を含む。これらの構築物を用いる結果は、図２および３に見出されうる。
【００５２】
本明細書に記載されるＣＰＭＶ  ＨＴ＋の植物コザック配列は、任意の植物コザック配列であってもよく、配列番号：５−１７の配列の１つを含むが、これらに限定されない（図４も参照されたい、植物コザックを有するＣＰＭＶ  ＨＴ＋；図４の構築物は配列番号：１のヌクレオチド１−５２８、植物コザック配列のいくつかの例の１つを含み、かつ植物制御領域および目的のヌクレオチド配列：ＧＯＩの転写開始部位ＡＴＧを含む）。
【００５３】
発現エンハンサーは、１つ以上の「コザックコンセンサス配列」または「コザック配列」をさらに含んでもよい。コザック配列は、植物において活性な任意のコザック配列、例えば、植物コザック配列（例えばＣＰＭＶ  ＨＴ＋；ＣＰＭＶ  ＨＴ  ＷＴ１１５）、または天然のＭタンパク質内に存在するコザック配列（例えばＣＰＭＶ  ＨＴ＋  ５１１）を含んでもよい。コザック配列は、翻訳の開始において重要な役割を果たす。任意のｍＲＮＡ不安定配列が、導入遺伝子構築物から排除されること、および、必要に応じ、翻訳開始部位（ｓｔａｒｔ  ｓｉｔｅ）または開始部位（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）が、植物のためのコザックコンセンサスと一致することを確保することによって、翻訳の割合は最適化されうる（Ｇｕｔｉｅｒｒｒｅｚ，Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．４，  ４２９−４３８；Ｋａｗａｇｕｃｈｉ，Ｒ．ａｎｄ  Ｂａｉｌｅｙ−Ｓｅｒｒｅｓ，Ｊ．，  ２００２，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．５，  ４６０−４６５）。このモチーフにおいて最も高度に保存される位置は、ＡＴＧコドンの３ヌクレオチド上流のプリン（最も頻繁にはＡ）であり、翻訳の開始を示す（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，  １９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：９４７−９５０、出典明示により本明細書に組み込まれる）。コザック配列は、不完全なＭタンパク質内に存在する天然の配列を含んでもよい。例えば、配列番号：５５または５６に示される不完全なＭタンパク質のヌクレオチド５１２からすぐ上流の配列、例えば配列番号：５５のヌクレオチド５０８−５１１。
【００５４】
植物コザックコンセンサス配列は、当技術分野で知られている（例えばＲａｎｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２００８，Ｊｕｌｙ  ３９（３），  ｐｐ．２０７−２１３を参照されたい）。本明細書に記載されるように、自然に存在するコザック配列および合成コザック配列の両方は発現エンハンサーにおいて使用されてもよく、または目的のヌクレオチド配列に融合されてもよい。
【００５５】
植物コザック配列は、以下の植物コンセンサス配列を含むがこれらに限定されない、任意の知られた植物コザック配列であってもよい（例えばＬ．Ｒａｎｇａｎ  ｅｔ．ａｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８を参照されたい）：
ｃａＡ（Ａ／Ｃ）ａ          （配列番号：５；植物界）
ａａＡ（Ａ／Ｃ）ａ          （配列番号：６；双子葉植物）
ａａ（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｃ）ａ    （配列番号：７；シロイヌナズナ）
植物コザック配列はまた：
ＡＧＡＡＡ      （配列番号：８）
ＡＧＡＣＡ      （配列番号：９）
ＡＧＧＡＡ      （配列番号：１０）
ＡＡＡＡＡ      （配列番号：１１）
ＡＡＡＣＡ      （配列番号：１２）
ＡＡＧＣＡ      （配列番号：１３）
ＡＡＧＡＡ      （配列番号：１４）
ＡＡＡＧＡＡ      （配列番号：１５）
ＡＡＡＧＡＡ      （配列番号：１６）
（Ａ／−）Ａ（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｃ）Ａ．（配列番号：１７；コンセンサス配列）
の群から選択されてもよい（図４を参照されたい）。
【００５６】
植物コザックコンセンサス配列を有するＣＰＭＶ  ＨＴ＋は、配列番号：４に提供される（小文字、太字およびイタリックで示される１１５位の改変ＡＴＧ（ＧＴＧ）を含む、ヌクレオチド１−１６０、５’ＵＴＲ；以下を含むスタッファーフラグメント：下線が引かれた不完全なＭタンパク質、ヌクレオチド１６１−５０９、１６２位の改変ヌクレオチド（ＡＣＧ）を有する；イタリックで示されるマルチプルクローニングサイト、ヌクレオチド５１０−５２８；ならびに大文字および太字で示されるコンセンサス植物コザック配列、ヌクレオチド５２９−５３４）。
【化４】
0006599354.tif 000005
（配列番号：４）
【００５７】
配列番号：５６（「ＣＰＭＶ  ＨＴ＋［５１１］」）は、ヌクレオチド１−１５４由来のＣＰＭＶ  ＲＮＡ２ゲノムの天然の配列のセグメントを含む。配列番号：５６のヌクレオチド１−５１１由来の５’ＵＴＲ配列は、１１５位（「ａ」の代わりに「ｇ」；イタリック太字で示される）および１６２位で（「ｔ」の代わりに「ｃ」；イタリック太字で示される）改変「ａｔｇ」配列を、ならびにヌクレオチド１６１−５１１由来の不完全なＭタンパク質（下線が引かれる）を含む。ＣＰＭＶ  ＨＴ＋［５１１］は、天然のＭタンパク質コザックコンセンサス配列（ヌクレオチド５０８−５１１；太字）を含む：
【化５】
0006599354.tif 000006
配列番号：５６
【００５８】
構築物１９５２−１９５９は、バリアント植物コザック配列を有する、配列番号：１を含むＣＰＭＶ  ＨＴ＋発現エンハンサーの例である（実施例３、ならびに図４および７を参照されたい）。
【００５９】
ＣＰＭＶ  ＨＴ＋エンハンサー配列の別の非限定例は、配列番号：３の配列により提供される（ＣＰＭＶ  ＨＴ＋［ＷＴ１１５］）。ＣＰＭＶ  ＨＴ＋を含み、かつ配列番号：３の発現エンハンサー配列と作動可能に関連する植物制御領域、および３’末端で目的のヌクレオチド配列（ＧＯＩ）に融合された転写開始部位（ＡＴＧ）を含む、発現カセットもしくはベクターもまた、本発明の一部分である。
【００６０】
配列番号：３（ＣＰＭＶ  ＨＴ＋［ＷＴ１１５］）は、小文字、太字で示される、１１５−１１７位のＡＴＧを有する、ヌクレオチド１−１６０、５’ＵＴＲ、以下を含むスタッファーフラグメント：下線が引かれた不完全なＭタンパク質、ヌクレオチド１６１−５０９、小文字、太字、および下線が引かれた１６１−１６３位の改変ＡＴＧ（ａｃｇ）を有する、イタリックで示されるマルチプルクローニングサイト、ヌクレオチド５１０−５２８；ならびに大文字および太字で示される植物コザック配列、ヌクレオチド５２９−５３４を含む。
【化６】
0006599354.tif 000007
（配列番号：３）
【００６１】
配列番号：３の植物コザック配列は、配列番号：５−１７の配列の１つを含むが、これらに限定されない、任意の植物コザック配列であってもよい（図４、植物コザックを有するＣＰＭＶ  ＨＴ＋も参照されたい；図４の構築物は、配列番号：１のヌクレオチド１−５２８、植物コザック配列のいくつかの例の１つを含み、かつ植物制御領域および目的のヌクレオチド配列：ＧＯＩの転写開始部位ＡＴＧを含む）。
【００６２】
ＣＰＭＶ  ＨＴ＋発現エンハンサーは、配列番号：１、３もしくは４のヌクレオチド１−１６０、配列番号：１、３もしくは４のヌクレオチド１６１−５０９、または配列番号：１、３もしくは４のヌクレオチド１−５０９に規定される配列と少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、および８０％の同一性を有してもよい。例えばエンハンサー配列は、配列番号：１、３もしくは４のヌクレオチド１−１６０、配列番号：１、３もしくは４のヌクレオチド１６１−５０９、または配列番号：１、３もしくは４のヌクレオチド１−５０９に規定される配列と約８０％から約１００％まで、またはそれらの間の任意の量の同一性を有してもよく、または配列番号：１、３もしくは４のヌクレオチド１−１６０、配列番号：１、３もしくは４のヌクレオチド１６１−５０９、または配列番号：１、３もしくは４のヌクレオチド１−５０９に規定される配列と約９０％から約１００％まで、またはそれらの間の任意の量の同一性を有してもよく、または配列番号：１、３もしくは４のヌクレオチド１−１６０、配列番号：１、３もしくは４のヌクレオチド１６１−５０９、または配列番号：１、３もしくは４のヌクレオチド１−５０９に規定される配列と約９５％から約１００％まで、またはそれらの間の任意の量の同一性を有してもよく、ここで、発現エンハンサーは、本明細書に記載される植物制御領域および植物コザック配列に作動可能に連結される場合に、同一の植物制御領域を用いてＣＰＭＶ  ＨＴ（配列番号：２）に融合された目的のヌクレオチド配列の発現レベルと比較される場合、発現エンハンサーに作動可能に連結された目的のヌクレオチド配列の発現レベルを増加させる。
【００６３】
特定の配列に言及する場合の用語「パーセントの類似性」、または「パーセントの同一性」は、例えばウィスコンシン大学ＧＣＧソフトウェアプログラムに記載されるように、またはマニュアルアラインメントおよび外観検査によって、使用される（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．１９９５補足を参照されたい）。比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野でよく知られている。比較のための配列の最適なアラインメントは例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２）を用いて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈのアラインメントアルゴリズムによって（１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３）、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎの類似性方法のための研究によって（１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ”ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４）、これらのアルゴリズムのコンピューター化される実装によって（例えば：Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）  ｉｎ  ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）実行できる。
【００６４】
パーセントの配列同一性および配列類似性を決定するために適切なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それはＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７７、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０  ）にそれぞれ記載される。本発明の核酸およびタンパク質に対するパーセントの配列同一性を決定するために、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は本明細書に記載されるパラメーターを用いて使用される。例えばＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較をデフォルトとして使用してもよい。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長、および１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照されたい）５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較をデフォルトとして使用してもよい。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センターを通じて利用可能である（ＵＲＬ：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を参照されたい）。
【００６５】
図２−４に示されるように、本明細書に記載される発現エンハンサーの使用は、同一のプロモーター、３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を用いて、かつ従来技術の発現エンハンサーに作動可能に連結された、同一の目的のヌクレオチド配列の発現と比較する場合、一般に目的のヌクレオチド配列の発現の増加をもたらした。例えば、図２および３を参照すると：
Ｈ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（「ＰＤＩ−Ｈ１  Ｃａｌ」、または「Ｈ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９」）：ＣＰＭＶ  ＨＴ＋ベースの構築物番号１８０５、ＣＰＭＶ  ＨＴベースの構築物番号４８４（実施例４を参照されたい）；
Ｈ３  Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（「ＰＤＩ−Ｈ３  Ｖｉｃ」、または「Ｈ３  Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１」）：ＣＰＭＶ  ＨＴ＋ベースの構築物番号１８１９；ＣＰＭＶ  ＨＴベースの構築物番号１３９１（それぞれ実施例１および２を参照されたい）；
欠失タンパク質分解ループを有し、かつ天然シグナルペプチドを有するＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０（「ＷｔＳｐ−Ｂ  Ｗｉｓ−ＰｒＬ」、または「Ｂ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０」）：ＣＰＭＶ  ＨＴ＋ベースの構築物番号１８３９；ＣＰＭＶ  ＨＴベースの構築物番号１４４５（実施例１２を参照されたい）；
欠失タンパク質分解ループを有し、かつＰＤＩシグナルペプチドを有するＢ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８（「Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８」）：ＣＰＭＶ  ＨＴ＋ベースの構築物番号１８２９；ＣＰＭＶ  ＨＴベースの構築物番号１０３９（実施例８を参照されたい）；
Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８＋Ｈ１Ｔｍ、膜貫通ドメインおよび細胞質側末端に融合された欠失タンパク質分解ループを有し、かつＰＤＩシグナルペプチドを有する（「Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８＋Ｈ１Ｔｍ」）：ＣＰＭＶ  ＨＴ＋ベースの構築物番号１８７５；ＣＰＭＶ  ＨＴベースの構築物１０６７（実施例９を参照されたい）、
欠失タンパク質分解ループを有し、かつＰＤＩシグナルペプチドを有するＢ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２  ２０１２（「Ｂ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２  ２０１２」）：ＣＰＭＶ  ＨＴ＋ベースの構築物番号２０５２；ＣＰＭＶ  ＨＴベースの構築物番号２０７２（実施例１０を参照されたい）、
膜貫通ドメインおよび細胞質側末端に融合された欠失タンパク質分解ループを有し、かつＰＤＩシグナルペプチドを有するＢ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２＋Ｈ１Ｔｍ（「Ｂ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２＋Ｈ１Ｔｍ」）：ＣＰＭＶ  ＨＴ＋ベースの構築物番号２０６２；ＣＰＭＶ  ＨＴベースの構築物２０７４（実施例１１を参照されたい）、
膜貫通ドメインおよび細胞質側末端に融合された欠失タンパク質分解ループを有し、かつ天然シグナルペプチドを有するＢ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０＋Ｈ１Ｔｍ（「Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０＋Ｈ１Ｔｍ」）：ＣＰＭＶ  ＨＴ＋ベースの構築物番号１８６０；ＣＰＭＶ  ＨＴベースの構築物１４５４（実施例１３を参照されたい）；
ＰＤＩシグナルペプチドを有するインフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５（ＰＤＩ  Ｈ５  Ｉｎｄｏ）：ＣＰＭＶ  ＨＴ＋ベースの構築物番号２３１９；ＣＰＭＶ  ＨＴベースの構築物番号４０９（実施例５を参照されたい）；
天然シグナルペプチドが、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのものにより置換されているインフルエンザＡ／Ｈａｎｇｚｈｏｕ／１／２０１３由来のＨ７（Ｈ７  Ｈａｎ）：ＣＰＭＶ  ＨＴ＋ベースの構築物番号２１４２；ＣＰＭＶ  ＨＴベースの構築物番号２１４０（実施例６を参照されたい）
インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５の膜貫通ドメインおよび細胞質側末端（ＴＭＣＴ）に融合され、かつアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのシグナルペプチドを有する、インフルエンザＡ／Ｈａｎｇｚｈｏｕ／１／２０１３由来のＨ７（Ｈ７  Ｈａｎ＋Ｈ５Ｔｍ）：ＣＰＭＶ  ＨＴ＋ベースの構築物番号２１４６；ＣＰＭＶ  ＨＴベースの構築物番号２１３０（実施例７を参照されたい）
と作動可能に連結される、ＣＰＭＶ−ＨＴ（従来技術）発現構築物およびＣＰＭＶ  ＨＴ＋ベースの発現構築物を含む植物において生産されるタンパク質の発現の比較が示される。
【００６６】
一般に、発現（血液凝集活性として決定される）は、従来技術のＣＰＭＶ  ＨＴベースの構築物に関するものと比較する場合、ＣＰＭＶ  ＨＴ＋ベースの構築物において増加する。
【００６７】
さらに、目的のヌクレオチド配列のいくつかは、例えば異種のシグナルペプチド（例えばＰＤＩ）、異種の膜貫通ドメイン細胞質側末端配列（ＴＤＣＴ）、および／または欠失タンパク質分解ループ（ＰｒＬ−）を含む改変配列を含む、キメラタンパク質または改変タンパク質をコードし、かつ活性における増加をさらに観察した。
【００６８】
もし、上述のＣＰＭＶ  ＨＴ＋ベースの構築物において使用される植物コザック配列が、他の植物コザック配列、例えば、配列番号：８−１６において定義されるそれらの植物コザック配列の１つと置き換わっていれば、ＣＰＭＶ  ＨＴ＋ベースの構築物を用いて観察される発現の増加もまた、観察される。例えば、図４を参照すると、種々の植物コザック配列にそれぞれ融合される目的のヌクレオチド配列（Ｈ３  Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１）と作動可能に連結されるＣＰＭＶ  ＨＴ＋ベースの発現構築物を含む植物において生産されるタンパク質の発現の比較が示されている。それぞれの場合において、ＣＰＭＶ  ＨＴ＋ベースの構築物による発現（血液凝集力価として決定される）は、顕著な発現レベル、かつ従来技術のＣＰＭＶ  ＨＴベースの構築物より大きいことを実証する。
【００６９】
タンパク質をコードする目的のヌクレオチド配列は、発現される遺伝子の上流に位置する「翻訳開始部位（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）」もしくは「開始部位（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）」または「翻訳開始部位（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｔａｒｔ  ｓｉｔｅ）」もしくは「開始部位（ｓｔａｒｔ  ｓｉｔｅ）」または「開始コドン」の存在を必要とする。かかる開始部位が、エンハンサー配列の一部、または目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部のいずれかとして提供されてもよい。
【００７０】
「発現カセット」は、宿主細胞における目的の核酸の転写のための適切なプロモーターまたは他の制御エレメントの制御下で、およびそれらと作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）（もしくは作動可能に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ））連結される目的の核酸を含むヌクレオチド配列を指す。
【００７１】
「タンパク質分解ループ」または「開裂部位」は、前駆体ＨＡ０開裂に伴うタンパク質分解部位のコンセンサス配列を意味する。本明細書に使用される「コンセンサス」または「コンセンサス配列」は、複数の配列のアラインメントの解析に基づく関連配列の配列可変性、例えば、特定のインフルエンザＨＡ０配列のサブタイプを含む配列（アミノ酸またはヌクレオチド配列のいずれか）を意味する。インフルエンザＨＡ０開裂部位のコンセンサス配列は、例えばコンセンサスＨ１、コンセンサスＨ３、コンセンサスＨ５を含むインフルエンザＡコンセンサスヘマグルチニンアミノ酸配列、または例えば、Ｂ  Ｆｌｏｒｉｄａ、Ｂ  Ｍａｌａｙｓｉａ、Ｂ  ＷｉｓｃｏｎｓｉｎおよびＢ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓに限定されないインフルエンザＢコンセンサスヘマグルチニンアミノ酸配列を含んでもよい。タンパク質分解のループ領域の配列の非限定例は、米国仮出願番号６１／８０６，２２７（２０１３年、３月２８出願、出典明示により本明細書に組み込まれる；またＢｉａｎｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７９：７３８０−７３８８を参照されたい；出典明示により本明細書に組み込まれる）の図１５および１８Ｂにおいて示される。
【００７２】
例えば点変異、置換、挿入、または欠失に限定されないが、タンパク質分解ループまたは開裂部位における残基はいずれかが変異されてもよい。本明細書で使用される用語「アミノ酸変異」または「アミノ酸改変」は、アミノ酸置換、欠失、挿入、および改変を包含することを意味する。最終的な構築物が、所望の特徴、例えば、減少されるもしくは消滅されるタンパク質分解ループの開裂またはプロテアーゼによる開裂部位を所有する限り、置換、欠失、挿入、および改変の任意の組み合わせは、米国仮出願番号６１／８０６，２２７（２０１３年、３月２８出願、出典明示により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、最終的な構築物に到達するよう作製されうる。
【００７３】
本明細書に記載されるように、目的のタンパク質をコードする目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結される発現エンハンサー配列を含む核酸構築物（発現系）が提供される。本明細書に記載されるエンハンサー配列を含む植物発現系もまた、提供される。また、目的のタンパク質をコードする、目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結されるエンハンサー配列と作動可能に関連する植物制御領域を含む植物発現系が提供される。エンハンサー配列は、配列番号：１もしくは３、または配列番号：１、３もしくは４のヌクレオチド１−１６０、配列番号：１、３もしくは４のヌクレオチド１６１−５０９、または配列番号：１、３もしくは４のヌクレオチド１−５０９と１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％の同一性を示すヌクレオチド配列から選択されてもよく、ここで、発現エンハンサーが本明細書に記載される植物制御領域および植物コザック配列に作動可能に連結される場合に、同一の植物制御領域を用いてＣＰＭＶ  ＨＴ（配列番号：２；Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ  Ｆ．，ａｎｄ  Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ  Ｇ．Ｐ．，２００８，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４８：ｐｐ．１２１２−１２１８に記載される不完全なＭタンパク質を含む従来先行技術のエンハンサー配列；出典明示により本明細書に組み込まれる）に融合された目的のヌクレオチド配列の発現レベルと比較される場合、発現エンハンサーに作動可能に連結される目的のヌクレオチド配列の発現レベルを増加させる。
【００７４】
本発明のエンハンサー配列が、宿主生物、例えば植物における目的のタンパク質を発現するために使用されてもよい。この場合では、目的のタンパク質はまた、問題となっている宿主生物に異種であってもよく、かつ当技術分野で知られた形質転換技術を用いて植物細胞に導入されてもよい。生物における異種の遺伝子は、内在性等価遺伝子（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｇｅｎｅ）、すなわち同一のもしくは類似の機能を正常に実行するもの、と置き換わってもよく、または挿入される配列は、内在性遺伝子もしくは他の配列に付加されてもよい。
【００７５】
本発明はさらに、順番に、目的のヌクレオチド配列ならびに３’ＵＴＲ配列およびターミネーター配列と融合される、本明細書に記載される発現エンハンサー配列に作動可能に連結される、プロモーターまたは植物制御領域を含む発現カセットを提供する。エンハンサー配列は、例えば、配列番号：１、３および４、または配列番号：１、３もしくは４のヌクレオチド１−１６０、配列番号：１、３もしくは４のヌクレオチド１６１−５０９、または配列番号：１、３もしくは４のヌクレオチド１−５０９と１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％の同一性を示すヌクレオチド配列のいずれか１つに定義されてもよいが、これらに限定されない。発現エンハンサーまたは目的のヌクレオチド配列のいずれかは、植物コザック配列を含んでもよい。
【００７６】
当業者が理解するように、ターミネーション（ターミネーター）配列は、植物宿主で活性な任意の配列であってもよく、例えばターミネーション配列は、二分節ＲＮＡウイルス、例えばコモウイルスのＲＮＡ−２ゲノムセグメント由来であってもよく、またはターミネーション配列は、ＮＯＳターミネーターであってもよい。
【００７７】
本発明の構築物は、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含みうる。３’非翻訳領域は、ポリアデニレーションシグナルおよびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を与えることができる任意の他の制御シグナルを含有する。ポリアデニレーションシグナルは通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラック（ｔｒａｃｋｓ）の付加に影響を与えることによって特徴付けられる。バリエーションは共通ではないが、ポリアデニレーションシグナルは、一般に標準型５’ＡＡＴＡＡＡ−３’への相同性の存在により認識される。適切な３’領域の非限定例は、ノパリンシンターゼ（Ｎｏｓ遺伝子）などのアグロバクテリウム腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド遺伝子、およびダイズ貯蔵タンパク質遺伝子などの植物遺伝子、リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ遺伝子の小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ；米国４，９６２，０２８；出典明示により本明細書に組み込まれる）、プラストシアニン発現を制御する際に使用されるプロモーター（Ｐｗｅｅ  ａｎｄ  Ｇｒａｙ  １９９３；出典明示により本明細書に組み込まれる）のポリアデニレーションシグナルを含有する、３’転写非翻訳領域である。ターミネーション（ターミネーター）配列は、アルファルファプラストシアニン遺伝子の３’ＵＴＲから得られてもよい。
【００７８】
「目的のヌクレオチド（もしくは核酸）配列」、または「目的のコーディング領域」によって、目的のタンパク質を生産するための、宿主生物、例えば植物内で発現される任意のヌクレオチド配列、またはコーディング領域（これらの用語は、互換的に使用されてもよい）が意味される。かかる目的のヌクレオチド配列は、限定されないが、天然もしくは改変タンパク質、工業用酵素もしくは改変工業用酵素、農業用タンパク質もしくは改変農業用タンパク質、ヘルパータンパク質、タンパク質サプリメント、医薬活性タンパク質、栄養補助食品、付加価値のある生産物、または飼料、食品もしくは飼料および食品用途の両方のためのそれらのフラグメントをコードしてもよい。
【００７９】
目的のタンパク質は、天然、または非天然シグナルペプチドを含んでもよく；非天然シグナルペプチドは、植物由来であってもよく、または動物性または細菌性のポリペプチドから得られてもよい。天然シグナルペプチドは、発現されている目的のタンパク質のシグナルペプチドに対応してもよく、さらに、シグナルペプチドは、インフルエンザ以外のウイルスの構造タンパク質またはヘマグルチニン由来であってもよい。使用されてもよいシグナルペプチドの非限定例は、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ  ＳＰ；アクセッション番号．Ｚ１１４９９のヌクレオチド３２−１０３）のもの、またはパタチンシグナルペプチド（ＰａｔＡ  ＳＰ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ａ０８２１５のヌクレオチド１７３８−１８０６に位置する）である。このアクセッション番号についてのＰａｔＡ  ＳＰのヌクレオチド配列は：
ＡＴＧＧＣＡＡＣＴＡＣＴＡＡＡＡＣＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴＧＡＴＡＴＴＡＧＣＡＡＣＴＡＣＴＡＧＴＴＣＡＡＣＡＴＧＴＧＣＴ  （配列番号：５７）；であり
パタチン  Ａシグナルペプチドのアミノ酸配列は：
ＭＡＴＴＫＴＦＬＩＬＦＦＭＩＬＡＴＴＳＳＴＣＡ（配列番号：５８）である。
【００８０】
目的のヌクレオチド配列、または目的のコーディング領域はまた、医薬活性タンパク質、例えば、予防接種もしくはワクチン接種等のため有用な、成長因子、成長調節因子、抗体、抗原、およびそれらのフラグメント、またはそれらの誘導体をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。かかるタンパク質は、ヒト病原体であるタンパク質、ウイルスタンパク質、例えば限定されないが呼吸器合胞体ウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、狂犬病ウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）由来の１つ以上のタンパク質、またはインターロイキン、例えば１つまたは１より多くのＩＬ−１からＩＬ−２４、ＩＬ−２６およびＩＬ−２７、サイトカイン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｈＰＧ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦもしくはそれらの組み合わせ、インターフェロン、例えば、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、血液凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、またはｔＰＡ  ｈＧＨ、受容体、受容体アゴニスト、例えばＲｉｔｕｘａｎを含むがこれに限定されない抗体、神経ポリペプチド、インスリン、ワクチン、例えば表皮成長因子、ケラチノサイト成長因子、形質転換成長因子に限定されない成長因子、成長調節因子、抗原、自己抗原、それらのフラグメント、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００８１】
目的のタンパク質はまた、インフルエンザヘマグルチニンを含んでもよい（ＨＡ；出典明示により本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／００９８７６を参照されたい）。ＨＡは、シグナルペプチド、ＨＡ１ドメイン、および一般的にＣ−末端および小細胞質側末端で膜貫通アンカー部位を含むＨＡ２ドメインを含むホモ三量体膜Ｉ型糖タンパク質である。ＨＡをコードするヌクレオチド配列はよく知られており、かつ利用可能である（例えば、ＢｉｏＤｅｆｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄａｔａｂａｓｅ；Ｓｑｕｉｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３６：Ｄ４９７−Ｄ５０３）ＵＲＬ：ｂｉｏｈｅａｌｔｈｂａｓｅ．ｏｒｇ／ＧＳｅａｒｃｈ／ｈｏｍｅ．ｄｏ？ｄｅｃｏｒａｔｏｒ＝Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ；または国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＵＲＬ：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい）によって維持されるデータベースを参照されたい。両方が出典明示により本明細書に組み込まれる）。
【００８２】
ＨＡタンパク質が、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザのものであってもよく、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６の群から選択されるＡ型インフルエンザＨＡのサブタイプであってもよい。発明のいくつかの態様において、ＨＡが、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７およびＨ９群から選択されるＡ型インフルエンザ由来であってもよい。上に列挙されたＨＡのフラグメントもまた、目的のタンパク質であると考えられてもよい。さらに、ＨＡタイプまたは上に列挙されたサブタイプ由来のドメインが、キメラＨＡを生産するために組み合わせられてもよい（例えば出典明示により本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／０７６７７８を参照されたい）。
【００８３】
ＨＡタンパク質を含むサブタイプの例は、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／１９９５、Ａ／ｈｅｒｒｉｎｇ  ｇｕｌｌ／ＤＥ／６７７／８８（Ｈ２Ｎ８）、Ａ／Ｔｅｘａｓ／３２／２００３、Ａ／ｍａｌｌａｒｄ／ＭＮ／３３／００、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／１／２０００、Ａ／ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｐｉｎｔａｉｌ／ＴＸ／８２８１８９／０２、Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｏｎｔａｒｉｏ／６１１８／６８（Ｈ８Ｎ４）、Ａ／ｓｈｏｖｅｌｅｒ／Ｉｒａｎ／Ｇ５４／０３、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｇｅｒｍａｎｙ／Ｎ／１９４９（Ｈ１０Ｎ７）、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｅｎｇｌａｎｄ／５６（Ｈ１１Ｎ６）、Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｌｂｅｒｔａ／６０／７６（Ｈ１２Ｎ５）、Ａ／Ｇｕｌｌ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／７０４／７７（Ｈ１３Ｎ６）、Ａ／Ｍａｌｌａｒｄ／Ｇｕｒｊｅｖ／２６３／８２、Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｕｓｔｒａｌｉａ／３４１／８３（Ｈ１５Ｎ８）、Ａ／ｂｌａｃｋ−ｈｅａｄｅｄ  ｇｕｌｌ／Ｓｗｅｄｅｎ／５／９９（Ｈ１６Ｎ３）、Ｂ／Ｌｅｅ／４０、Ｃ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／６６、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｉｓｌａｎｄｓ  ３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ  １０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｔｅａｌ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２））を含む。
【００８４】
ＨＡタンパク質が、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７またはＨ９サブタイプであってもよい。例えば、Ｈ１タンパク質が、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｉｓｌａｎｄｓ  ３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）またはＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）株由来であってもよい。Ｈ３タンパク質はまた、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ  １０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｈａｗａｉｉ／２２／２０１２（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／３９／２０１２（Ｈ３Ｎ２）、またはＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）株由来であってもよい。本発明のさらなる態様において、Ｈ２タンパク質が、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）株由来であってもよい。Ｈ５タンパク質が、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、またはＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５株由来であってもよい。本発明の態様において、Ｈ６タンパク質が、Ａ／Ｔｅａｌ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）株由来であってもよい。Ｈ７タンパク質が、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）株、またはＨ７Ａ／Ｈａｎｇｚｈｏｕ／１／２０１３、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）、もしくはＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）株由来であってもよい。本発明の態様において、Ｈ９タンパク質は、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）株由来である。本発明のさらなる態様において、ＨＡタンパク質が、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８、Ｂ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２−様ウイルス（山形系統）、またはＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０（山形系統）を含むＢ型ウイルスであってもよいインフルエンザウイルス由来であってもよい。Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９またはＢサブタイプ由来のＨＡタンパク質のアミノ酸配列の非限定例は、ＷＯ２００９／００９８７６、ＷＯ２００９／０７６７７８、ＷＯ２０１０／００３２２５（出典明示により本明細書に組み込まれる）に記載される配列を含む。インフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、Ｈ５  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａであってもよい。
【００８５】
ＨＡはまた、ＨＡの天然膜貫通ドメインが異種の膜貫通ドメインと置き換わっている、キメラＨＡであってもよい。ＨＡタンパク質の膜貫通ドメインは、高度に保存されている（例えばＷＯ２０１０／１４８５１１の図１Ｃを参照されたい；出典明示により本明細書に組み込まれる）。異種の膜貫通ドメインは、任意のＨＡ膜貫通ドメイン、例えば、限定されないが、Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号．ＡＣＡ３３４９３．１）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号．ＡＢＵ９９１９４．１）、Ｈ１／Ｂｒｉ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号．ＡＤＥ２８７５０．１）、Ｈ１  Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号．ＡＢＵ９９１０９．１）、Ｈ１／ＮＣ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号．ＡＡＰ３４３２４．１）、Ｈ２Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／１９５７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号．ＡＡＡ６４３６６．１）、Ｈ３  Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号．ＡＣＩ２６３１８．１）、Ｈ３  Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号．ＡＢＯ３７５９９．１）、Ｈ５Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号．ＡＢＤ２８１８０．１）、Ｈ５Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号．ＡＣＲ４８８７４．１）、Ｈ５−Ｉｎｄｏ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号．ＡＢＷ０６１０８．１）由来の膜貫通ドメインから得られてもよい。膜貫通ドメインはまた、以下のコンセンサスアミノ酸配列：
ｉＬＸｉＹｙｓｔｖＡｉＳｓｌＸｌＸＸｍｌａｇＸｓＸｗｍｃｓ（配列番号：５９）
によって定義されてもよい。
【００８６】
異種の膜貫通ドメインを有するキメラＨＡを含む構築物の例は、以下を含む：構築物番号１８７５（Ｈ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９により置換されている膜貫通ドメインおよび細胞質側末端を有するＢ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８＋Ｈ１ＴＭ；実施例９を参照されたい）、構築物番号２０７４（Ｈ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９のものによって置換された膜貫通ドメインおよび細胞質側末端を有するＢ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２＋Ｈ１Ｔｍ；実施例１１を参照されたい）、および構築物番号１８６０（Ｈ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９のものによって置換された膜貫通ドメインおよび細胞質側末端を有するＢ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０＋Ｈ１Ｔｍ；実施例１３を参照されたい）。これらのキメラＨＡの活性は、図２に示される。
【００８７】
本明細書で規定される発現エンハンサーはまた、１つまたは１より多くの目的のタンパク質をコードする、任意の目的のヌクレオチド配列の発現を駆動するために使用してもよい。タンパク質の例は、例えば、限定されないが、工業用酵素、例えばセルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、スブチリシン、タンパク質サプリメント、栄養補助食品、付加価値のある生産物、または飼料、食品もしくは飼料および食品用途の両方のためのそれらのフラグメント、医薬活性タンパク質、例えば、限定されないが、成長因子、成長調節因子、抗体、抗原、および予防接種もしくはワクチン接種等のため有用なそれらのフラグメントまたはそれらの誘導体、を含む。さらなる目的のタンパク質は、インターロイキン、例えばＩＬ−１からＩＬ−２４、ＩＬ−２６およびＩＬ−２７の１つまたは１より多く、サイトカイン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｈＰＧ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦまたはそれらの組み合わせ、インターフェロン、例えば、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、血液凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、またはｔＰＡ  ｈＧＨ、受容体、受容体アゴニスト、抗体、神経ポリペプチド、インスリン、ワクチン、成長因子、例えば、限定されないが、上皮成長因子、ケラチノサイト成長因子、形質転換成長因子、成長調節物質、抗原、自己抗原、それらのフラグメント、抗体、モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、一本鎖モノクローナル抗体、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、またはそれらの組み合わせを含んでもよいが、これらに限定されない。
【００８８】
目的のタンパク質がＶＬＰであるならば、ＶＬＰは、ＨＡ０前駆体型、またはジスルフィド架橋形態により共に保持されるＨＡ１もしくはＨＡ２ドメインを含んでもよい。ＶＬＰは、約２０ｎｍから１μｍ、またはそれらの間の任意の量、例えば６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０もしくは２００ｎｍ、またはそれらの間の任意の量、例えば１００ｎｍの平均サイズを有してもよく、かつ、脂質膜を含んでもよい。ＶＬＰは、エンベロープまたは非エンベロープ、例えば、ウイルス外被タンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルス性カプシドタンパク質、またはウイルスコートタンパク質であってもよい。ＶＬＰは、１つ以上の脂質、リン脂質、核酸、膜等をさらに含んでもよい。
【００８９】
ＨＡは、天然または非天然シグナルペプチドを含んでもよく；非天然シグナルペプチドは、植物由来であってもよい。例えば、シグナルペプチドは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド（ＰＤＩ）であってもよい。天然シグナルペプチドは、発現されたヘマグルチニンのものに対応してもよく、または第二のヘマグルチニンに対応してもよい。
【００９０】
本発明はまた、ＨＡタンパク質をコードする配列を含む核酸分子を提供する。核酸分子はＨＡタンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つ以上の制御領域をさらに含んでもよい。核酸分子が、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６またはＢ型インフルエンザ由来のＨＡをコードする配列を含んでもよい。例えば、当該核酸分子によりコードされるＨＡタンパク質が、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９サブタイプ、Ｂ型由来のＨＡであってもよい。当該核酸によりコードされるＨ１タンパク質が、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｉｓｌａｎｄｓ  ３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）またはＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）株由来であってもよい。当該核酸分子によりコードされるＨ３タンパク質が、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ  １０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｈａｗａｉｉ／２２／２０１２（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／３９／２０１２（Ｈ３Ｎ２）、またはＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）株由来であってもよい。当該核酸分子によりコードされるＨ２タンパク質が、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）株由来であってもよい。当該核酸分子によりコードされるＨ５タンパク質が、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、またはＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５株由来であってもよい。当該核酸分子によりコードされるＨ６タンパク質が、Ａ／Ｔｅａｌ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）株由来であってもよい。当該核酸分子によりコードされるＨ７タンパク質が、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）株、またはＨ７Ａ／Ｈａｎｇｚｈｏｕ／１／２０１３、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）、もしくはＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）株由来であってもよい。さらに、当該核酸分子によりコードされるＨ９タンパク質が、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）株由来であってもよい。当該核酸分子によりコードされるＨＡタンパク質が、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８、Ｂ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２−様ウイルス（山形系統）、またはＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０（山形系統）を含むＢ型ウイルスインフルエンザウイルス由来であってもよい。Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９またはＢサブタイプ由来のＨＡタンパク質のアミノ酸配列の非限定例は、ＷＯ２００９／００９８７６、ＷＯ２００９／０７６７７８、ＷＯ２０１０／００３２２５（出典明示により本明細書に組み込まれる）に記載される配列を含む。��ンフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、Ｈ５  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａであってもよい。
【００９１】
表１：本明細書に記載される調製された構築物の例：
【表１−１】
0006599354.tif 000008
【表１−２】
0006599354.tif 000009
１：ＳＰ−シグナルペプチド
２：ＰＤＩ−アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ
３：ＷＴ−野生型または天然
４：ＴＭＣＴ−膜貫通ドメインおよび細胞質側末端
【００９２】
もし目的の核酸配列が、直接的にまたは間接的に植物に毒性な生産物をコードするならば、かかる毒性が、所望の組織内または所望の植物発達の段階で、目的のヌクレオチド配列を選択的に発現させることによって減少されてもよい。
【００９３】
本発明のヌクレオチド配列、または核酸分子、または遺伝的構築物、またはベクターで形質転換されている、またはこれらを含んでいる、任意の適切な植物宿主において、目的のコーディング領域または目的のヌクレオチド配列が発現されてもよい。適切な宿主の例は、シロイヌナズナ、例えばキャノーラ、アブラナ属、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、タバコ属（タバコ）、例えば、ニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、アルファルファ、ジャガイモ、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔｕｓ）、ニンジン（ｇｉｎｓｅｎｇ）、エンドウ、オートムギ、コメ、ダイズ、コムギ、オオムギ、ヒマワリ、ワタ、コーン（ｃｏｒｎ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）を含む農作物を含むが、これらに限定されない。
【００９４】
本明細書に使用される用語「バイオマス」および「植物物質」は、植物由来の任意の物質を指す。バイオマスまたは植物物質は、植物全体、または葉、根、茎、花、種子を含む植物の部分を含んでもよく、それはまた、植物の任意の組織、植物の任意の細胞、または植物の任意の画分、植物、組織もしくは細胞の部分を含んでもよい。さらに、バイオマスまたは植物物質は、細胞内の植物構成要素、細胞外の植物構成要素、植物の液体もしくは固体抽出物、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。さらに、バイオマスまたは植物物質は、植物の葉、茎、果実、根またはそれらの組み合わせ由来の、植物、植物細胞、組織、液体抽出物、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。植物の一部分が、植物物質またはバイオマスを含んでもよい。
【００９５】
「制御領域」「制御エレメント」または「プロモーター」によって、典型的に、常にではないが、遺伝子のタンパク質コーディング領域の上流の核酸の部分が意味され、それはＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれか、またはＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含んでもよい。制御領域が活性であり、かつ目的の遺伝子と作動可能に関連する、もしくは目的の遺伝子と作動可能に連結される場合、これは、目的の遺伝子の発現という結果をもたらしうる。制御エレメントが、器官特異性を媒介することができ、または発達もしくは一時的な遺伝子活性化を制御することができてもよい。「制御領域」は、プロモーターエレメント、基本的なプロモーター活性を示すコアプロモーターエレメント、外部刺激に反応して誘導性であるエレメント、負の制御エレメントなどのプロモーター活性を媒介するエレメントまたは転写エンハンサーを含む。本明細書で使用されるように「制御領域」はまた、転写後に活性なエレメント、例えば、翻訳および転写エンハンサー、翻訳および転写リプレッサーなどの遺伝子発現を調節する制御エレメント、上流活性化配列、ならびにｍＲＮＡ不安定性決定因子、を含む。これらの後者のエレメントのいくつかが、コーディング領域の近位に位置してもよい。
【００９６】
この開示の文脈において、用語「制御エレメント」または「制御領域」は、常にではないが、通常、構造的な遺伝子のコーディング配列の上流（５’）のＤＮＡの配列を典型的に指し、それは、特定の部位で開始する転写のために必要とされるＲＮＡポリメラーゼおよび／または他の因子のための認識を提供することによってコーディング領域の発現を制御する。しかしながら、イントロン内に位置する、または配列の３’の他のヌクレオチド配列もまた、目的のコーディング領域の発現の制御に貢献しうることが理解されるだろう。特定の部位での開始を保証する、ＲＮＡポリメラーゼまたは他の転写因子のための認識を提供する制御エレメントの例は、プロモーターエレメントである。全てではないが、ほとんどの真核生物のプロモーターエレメントは、ＴＡＴＡボックス、転写開始部位のおよそ２５塩基対上流に通常位置するアデノシンおよびチミジンヌクレオチド塩基対を含む保存された核酸配列を含有する。プロモーターエレメントは、転写の開始を担う基本的なプロモーターエレメント、並びに遺伝子発現を改変する他の制御エレメント（上に列挙されたような）を含んでもよい。
【００９７】
発生制御される、誘導性の、または構成的なものを含む、いくつかのタイプの制御領域が存在する。発生制御される、またはその制御下で遺伝子の差次的発現を制御する制御領域は、特定の器官もしくは器官の組織内で、その器官もしくは組織の発達の間の特定の時点で活性化される。しかしながら、発生制御されるいくつかの制御領域が、特定の発達段階で特定の器官または組織内で優先的に活性であってもよく、それらはまた、発生制御される方法で活性であってもよく、または同様に植物内の他の器官もしくは組織において基本的なレベルであってもよい。組織特異的な制御領域の例、例えば、種子特異的制御領域は、ナピンプロモーターおよびクルシフェリンプロモーターを含む（Ｒａｓｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５２：５９５−５９９；Ｂｉｌｏｄｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １４：１２５−１３０）。葉特異的なプロモーターの例は、プラストシアニンプロモーターを含む（米国７，１２５，９７８を参照されたい、出典明示により本明細書に組み込まれる）。
【００９８】
誘導性制御領域は、誘導物質に反応して１つ以上のＤＮＡ配列または遺伝子の転写を、直接的にまたは間接的に活性化することが可能なものである。誘導物質の不在下では、ＤＮＡ配列または遺伝子は、転写されないだろう。典型的に、転写を活性化するための誘導性制御領域に特異的に結合するタンパク質因子は、不活性型で存在してもよく、それは次いで直接的にまたは間接的に誘導物質により活性型に変換される。しかしながら、タンパク質因子もまた、不在であってもよい。誘導物質は、タンパク質、代謝産物、成長調節剤、除草剤もしくはフェノール化合物などの化学的薬剤、または熱、低温、塩、もしくは毒性エレメントにより直接的に課される生理的ストレス、もしくは間接的にウイルスなどの病原体もしくは病因物質の作用を介す生理的ストレスでありうる。噴霧、散水、加熱、もしくは同様の方法によってなど、外部から誘導物質を細胞もしくは植物に加えることによって、誘導性制御領域を含有する植物細胞が誘導物質にさらされてもよい。誘導性制御エレメントは、植物または非植物遺伝子のいずれか由来であってもよい（例えばＧａｔｚ、Ｃ．ａｎｄ  Ｌｅｎｋ、Ｉ．Ｒ．Ｐ．，１９９８，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．３、３５２−３５８；出典明示により組み込まれる）。潜在的な誘導性プロモーターの例は、テトラサイクリン−誘導性プロモーター（Ｇａｔｚ、Ｃ．，１９９７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，８９−１０８；出典明示により組み込まれる）、ステロイド誘導性プロモーター（Ａｏｙａｍａ、Ｔ．ａｎｄ  Ｃｈｕａ、Ｎ．Ｈ．，１９９７，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２，３９７−４０４；出典明示により組み込まれる）およびエタノール−誘導性プロモーター（Ｓａｌｔｅｒ，Ｍ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ，１９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １６，１２７−１３２；Ｃａｄｄｉｃｋ、Ｍ．Ｘ．，ｅｔ  ａｌ，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６、１７７−１８０、出典明示により組み込まれる）、サイトカイニン誘導性ＩＢ６およびＣＫＩ１遺伝子（Ｂｒａｎｄｓｔａｔｔｅｒ，Ｉ．ａｎｄ  Ｋｉｅｂｅｒ，Ｊ．Ｊ．，１９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １０，１００９−１０１９；Ｋａｋｉｍｏｔｏ，Ｔ．，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４、９８２−９８５；出典明示により組み込まれる）およびオーキシン誘導性エレメント、ＤＲ５（Ｕｌｍａｓｏｖ、Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ９，１９６３−１９７１；出典明示により組み込まれる）を含むが、これらに限定されない。
【００９９】
植物の様々な部分にわたって、および継続的に植物発達にわたって、構成的な制御領域は、遺伝子の発現を指示する。既知の構成的な制御エレメントの例は、ＣａＭＶ  ３５Ｓ転写産物に関連するプロモーター（ｐ３５Ｓ；Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８１０−８１２）、ライスアクチン１（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，１９９１，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，３：１１５５−１１６５）、アクチン２（Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１０：１０７−１２１）、またはｔｍｓ２（米国５，４２８，１４７、出典明示により本明細書に組み込まれる）、およびトリオースリン酸イソメラーゼ１（Ｘｕ  ｅｔ．ａｌ．，１９９４，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６：４５９−４６７）遺伝子、トウモロコシユビキチン１遺伝子（Ｃｏｒｎｅｊｏ  ｅｔ  ａｌ，１９９３，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：６３７−６４６）、シロイヌナズナユビキチン１および６遺伝子（Ｈｏｌｔｏｒｆ  ｅｔ  ａｌ，１９９５，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：６３７−６４６）、タバコ翻訳開始因子４Ａ遺伝子（Ｍａｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９５  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：９９５−１００４）。キャッサバ葉脈モザイクウイルス（Ｃａｓｓａｖａ  Ｖｅｉｎ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ｐＣＡＳ、（Ｖｅｒｄａｇｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）；リブロースニリン酸カルボキシラーゼの小サブユニットのプロモーター、ｐＲｂｃＳ：（Ｏｕｔｃｈｋｏｕｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、ｐＵｂｉ（単子葉植物および双子葉植物のための）を含む。
【０１００】
本明細書に記載されるように、葉発現における実証される効率を有するエンハンサー配列を含む制御領域が、一過性発現において効果的であるとわかった。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、核マトリックスへの付着による光合成遺伝子の上流制御エレメントの付着が、強い発現を媒介しうる。例えばエンドウプラストシアニンの翻訳開始部位から−７８４まで（米国７，１２５，９７８、出典明示により本明細書に組み込まれる）が、強いレポーター遺伝子発現を媒介するために使用されてもよい。
【０１０１】
本明細書に使用される用語「構成的な」は、構成的な制御領域の制御下のヌクレオチド配列が、全ての細胞タイプにおいて同一のレベルで発現されるが、存在量のバリエーションがよく観察されるとしても当該配列が広い範囲の細胞タイプにおいて発現されることを、必ずしも示すものではない。
【０１０２】
上記に記載されるような発現構築物が、ベクター中に存在してもよい。ベクターは、生物または宿主のゲノムへの発現カセットの導入およびインテグレーションを可能にするボーダー配列を含んでもよい。当該構築物は、植物バイナリーベクター、例えばｐＰＺＰ（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ、ｅｔ  ａｌ．１９９４）に基づくバイナリー形質転換ベクターであってもよい。当該構築物の他の例は、ｐＢｉｎ１９（Ｆｒｉｓｃｈ、Ｄ．Ａ．，Ｌ．Ｗ．Ｈａｒｒｉｓ−Ｈａｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２７：４０５−４０９を参照されたい）を含む。
【０１０３】
所望であれば、この発明の構築物は、選択可能なマーカーを含むようにさらに操作されてもよい。しかしながら、これは、必要とされなくてもよい。有用な選択可能なマーカーは、抗生物質、例えば、ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）、ハイグロマイシン、カナマイシン、などの化学物質、またはホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｙｃｉｎ）、グリホサート、クロルスルフロン（ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｕｒｏｎ）などの除草剤への抵抗性を提供する酵素を含む。同様に、ＧＵＳ（ベータ−グルクロニダーゼ）などの色変化、またはルシフェラーゼもしくはＧＦＰなどの発光により同定可能な化合物の生産のために提供する酵素が使用されてもよい。
【０１０４】
ベクターはまた、本明細書に記載される発現エンハンサーを含んでもよい。発現エンハンサーは、遺伝子サイレンシングのサプレッサーおよびＮＰＴＩＩも含有するＴ−ＤＮＡに位置されてもよい。ポリリンカーはまた、タンパク質精製を容易にするために、目的のタンパク質へのＮ−またはＣ−末端Ｈｉｓ−タグの包含を可能にする、１つまたは２つの６ｘヒスチジン残基のセットをコードしてもよい。
【０１０５】
転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）が、植物における導入遺伝子の発現を制限することを伴ってもよく、およびジャガイモウイルスＹ（ＨｃＰｒｏ）由来のサイレンシングサプレッサーの共発現が、導入遺伝子ｍＲＮＡの特異的な分解に対抗するために使用されてもよい（Ｂｒｉｇｎｅｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＥＭＢＯ  Ｊ．１７、６７３９−６７４６、出典明示により本明細書に組み込まれる）。代替サイレンシングサプレッサーが、当技術分野でよく知られており、かつ本明細書に記載されるように使用されてもよい（Ｃｈｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３４６：７−１４；出典明示により本明細書に組み込まれる）、例えば、限定されないが、ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ（タバコ・エッチ・ウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ  ｅｔｃｈ  ｖｉｒｕｓ）−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ）、トマト・ブッシー・スタント・ウイルス（Ｔｏｍａｔｏ  ｂｕｓｈｙ  ｓｔｕｎｔ  ｖｉｒｕｓ）のＢＹＶ−ｐ２１、ｐ１９（ＴＢＳＶ  ｐ１９；ｐ１９の構築は、ＷＯ２０１０／０００３２２５に記載される、出典明示により本明細書に組み込まれる）、トマト・クリンクル・ウイルス（Ｔｏｍａｔｏ  ｃｒｉｎｋｌｅ  ｖｉｒｕｓ）のカプシドタンパク質（ＴＣＶ  −ＣＰ）、キュウリモザイクウイルスの２ｂ；ＣＭＶ−２ｂ）、ジャガイモウイルスＸのｐ２５（ＰＶＸ−ｐ２５）、ジャガイモウイルスＭのｐ１１（ＰＶＭ−ｐ１１）、ジャガイモウイルスＳのｐ１１（ＰＶＳ−ｐ１１）、ブルーベリー・スコーチ・ウイルス（Ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ  ｓｃｏｒｃｈ  ｖｉｒｕｓ）のｐ１６、（ＢＳｃＶ−ｐ１６）、シトラス・トリステザ・ウイルス（Ｃｉｔｒｕｓ  ｔｒｉｓｔｅｚａ  ｖｉｒｕｓ）のｐ２３（ＣＴＶ−ｐ２３）、ブドウ葉巻随伴病ウイルス（Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ  ｌｅａｆｒｏｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）−２のｐ２４、（ＧＬＲａＶ−２  ｐ２４）、ブドウ葉巻ウイルスＡ（Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ  ｖｉｒｕｓ  Ａ）のｐ１０、（ＧＶＡ−ｐ１０）、ブドウ葉巻ウイルスＢ（Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ  ｖｉｒｕｓ  Ｂ）のｐ１４（ＧＶＢ−ｐ１４）、ハナウド潜在ウイルス（Ｈｅｒａｃｌｅｕｍ  ｌａｔｅｎｔ  ｖｉｒｕｓ）のｐ１０（ＨＬＶ−ｐ１０）、またはニンニク共通潜在ウイルス（Ｇａｒｌｉｃ  ｃｏｍｍｏｎ  ｌａｔｅｎｔ  ｖｉｒｕｓ）のｐ１６（ＧＣＬＶ−ｐ１６）。
【０１０６】
従って、１つ以上のサイレンシングのサプレッサー、例えば、限定されないが、ＨｃＰｒｏ、ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ、ＢＹＶ−ｐ２１、ＴＢＳＶ  ｐ１９、ＴＣＶ−ＣＰ、ＣＭＶ−２ｂ、ＰＶＸ−ｐ２５、ｒｇｓｃａｍ、ＦＨＶ由来のＢ２タンパク質、ＣＰＭＶの小コートタンパク質、およびＴＣＶ由来のコートタンパク質、ＰＶＭ−ｐ１１、ＰＶＳ−ｐ１１、ＢＳｃＶ−ｐ１６、ＣＴＶ−ｐ２３、ＧＬＲａＶ−２  ｐ２４、ＧＢＶ−ｐ１４、ＨＬＶ−ｐ１０、ＧＣＬＶ−ｐ１６、またはＧＶＡ−ｐ１０が、さらに植物内で高レベルのタンパク質生産を保証するためにコモウイルス−ベースの発現カセット、ジェミニウイルス由来増幅エレメント、および目的のタンパク質をコードする核酸配列とともに共発現されてもよい。
【０１０７】
本発明の構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接的なＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポーレーション、等を用いて植物細胞に導入されうる。かかる技術の評価のためには、例えばＷｅｉｓｓｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＶＩＩＩ、ｐｐ．４２１−４６３（１９８８）；Ｇｅｉｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｒｅｙ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ  Ｅｄ．（１９８８）；ならびにＭｉｋｉ  ａｎｄ  Ｉｙｅｒ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ、Ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，  ２ｄ  Ｅｄ．ＤＴ．Ｄｅｎｎｉｓ，ＤＨ  Ｔｕｒｐｉｎ，ＤＤ  Ｌｅｆｅｂｒｖｅ，ＤＢ  Ｌａｙｚｅｌｌ（ｅｄｓ），Ａｄｄｉｓｏｎ  Ｗｅｓｌｙ，Ｌａｎｇｍａｎｓ  Ｌｔｄ．Ｌｏｎｄｏｎ，  ｐｐ．５６１−５７９（１９９７）を参照されたい。他の方法は、直接的なＤＮＡ取り込み、リポソームの使用、エレクトロポーレーション、例えばプロトプラストを用いるもの、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）またはウィスカー（ｗｈｉｓｋｅｒ）、および減圧インフィルトレーション（ｖａｃｕｕｍ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を含む。例えば、Ｂｉｌａｎｇ、ｅｔ  ａｌ．（１９９１、Ｇｅｎｅ  １００：２４７−２５０）、Ｓｃｈｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２８：１０４−１１２）、Ｇｕｅｒｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５２：１１１−１１６）、Ｎｅｕｈａｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ．７５：３０−３６）、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２９８７、Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０−７３）；Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９：１３５３）、Ｈｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０８：１２６５）、Ｈｏｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：１２２９−１２３１）、ＤｅＢｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ９１：６９４−７０１）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ、ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，１９８８）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｐｌｎａｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｃｈｕｌｅｒ  ａｎｄ  Ｚｉｅｌｉｎｓｋｉ、ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，１９８９）、ＷＯ９２／０９６９６、ＷＯ９４／００５８３、ＥＰ３３１０８３、ＥＰ１７５９６６、Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ（２００２、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈ、１０５：３４３−３４８）、ＥＰ  ２９０３９５；ＷＯ  ８７０６６１４；米国特許番号４，９４５，０５０；５，０３６，００６；および５，１００，７９２、１９９５年５月１０日出願の米国特許出願番号０８／４３８，６６６、および１９９２年９月２５日出願の���７／９５１，７１５を参照されたい（これらの全ては出典明示により本明細書に組み込まれる）。
【０１０８】
一過性発現方法を使用して、本発明の構築物を発現させもよい（  Ｄ’Ａｏｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  ４８３、ｐａｇｅｓ４１−５０；Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ、２００２、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１０５：３４３−３４８を参照されたい；出典明示により本明細書に組み込まれる）。あるいは、Ｋａｐｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１２２、１０１−１０８；出典明示により本明細書に組み込まれる）、またはＷＯ００／０６３４００、ＷＯ００／０３７６６３（これらは出典明示により本明細書に組み込まれる）により記載されるような減圧−ベースの一過性発現方法が使用されてもよい。これらの方法は、例えば、限定されないがアグロイノキュレーション（Ａｇｒｏ−ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）またはアグロインフィルトレーション（Ａｇｒｏ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、シリンジインフィルトレーション（ｓｙｒｉｎｇｅ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）の方法を含んでもよいが、他の一過性方法もまた、上述のように使用されてもよい。アグロイノキュレーション、アグロインフィルトレーション、またはシリンジインフィルトレーションにより、所望の核酸を含むアグロバクテリアの混合物は、組織、例えば葉、植物の地上部分（茎、葉および花を含む）、他の植物の部分（茎、根、花）、または植物全体の細胞間隙に侵入する。表皮を横切った後、アグロバクテリアは感染し、かつｔ−ＤＮＡコピーを細胞に導入する。ｔ−ＤＮＡはエピソームとして転写され、およびｍＲＮＡが翻訳され、感染される細胞における目的のタンパク質の生産をもたらすが、しかしながら、核内へのｔ−ＤＮＡの通過は一過性である。
【０１０９】
本明細書に記載される一過性タンパク質発現のための適切なプラットフォーム植物として使用されてもよい本発明の遺伝子構築物を含有するトランスジェニック植物、植物細胞または種子も、本発明の一部と見なされる。植物細胞から植物全体を再生する方法もまた、当技術分野で知られている（例えばＧｕｅｒｉｎｅａｕ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ（１９９３、Ｐｌａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｆａｘ（Ｃｒｏｙ  ＲＲＤ  ｅｄ）  Ｏｘｆｏｒｄ，ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  ｐｐ  １２１−１４８を参照されたい）。一般的に、形質転換されている植物細胞は適切な培地において培養され、それは抗生物質などの選択的な薬剤を含有してもよく、ここで選択可能なマーカーは、形質転換されている植物細胞の同定を容易にするために使用される。カルスが形成されると、既知の方法に従い適切な植物ホルモンを用いることにより、シュート形成を促し、かつ当該シュートは、植物の再生のための発根培地に導入される。次に、種子から、または栄養繁殖技術を用いるいずれかで反復的発生（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）を樹立するために、当該植物が使用されてもよい。トランスジェニック植物は、組織培養を用いずに生成されうる。安定な形質転換、およびこれらの生物の再生のための方法は、当技術分野で樹立され、かつ当業者に知られている。利用可能な技術は、Ｖａｓｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，ＶｏＩ  Ｉ，Ｉｌ  ａｎｄ  ＩＩＩ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８４）、および  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ、（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）において検討される。形質転換されている植物、および再生される植物を獲得する方法は、本発明に重要ではない。
【０１１０】
もし植物、植物の部分もしくは植物細胞が形質転換、または２つ以上の核酸構築物により共形質転換される場合、核酸構築物が、核酸がプールされる単一の遺伝子導入事象においてアグロバクテリウムに導入されてもよく、またバクテリア細胞は記載されるように遺伝子導入されてもよい。あるいは、構築物は連続的に導入されてもよい。この場合では、第一の構築物は、記載されるようアグロバクテリウムに導入され、唯一単独で形質転換されているバクテリアだけが、増殖することができる選択的な条件下（例えば抗生物質の存在下）で当該細胞を増殖させる。この第一の選択工程の後、第二の核酸構築物を、記載されるようアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｕｍ）に導入し、かつ二重−形質転換されているバクテリアだけが増殖することができる二重−選択的条件で細胞を増殖させる。その後、本明細書に記載されるように、二重−形質転換されているバクテリアが植物、植物の部分もしくは植物細胞を形質転換するために使用されてもよく、または第三の核酸構築物に適応するさらなる形質転換工程に供されてもよい。
【０１１１】
あるいは、もし植物、植物の部分、もしくは植物細胞が形質転換されている、または２つ以上の核酸構築物により共形質転換されているならば、アグロバクテリウム細胞と植物、植物の部分、または植物細胞の共インフィルトレーション性の（ｃｏ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ）混合物によって、核酸構築物が、植物に導入されてもよく、それぞれアグロバクテリウム細胞が、植物内導入される１つ以上の構築物を含んでもよい。当該インフィルトレーションの工程の間に、構築物内の目的のヌクレオチド配列の植物、植物の部分または植物細胞内の相対発現レベルを変化させるために、所望の構築物を含む種々のアグロバクテリア集団の濃度は、変化されてもよい。
【０１１２】
本開示はさらに、本明細書で定義される発現系を含むトランスジェニック植物を提供し、ここで、本明細書に記載されるような発現系、例えばＣＰＭＶ  ＨＴ（配列番号：２）の１つ以上の構成要素を欠く他の類似する発現系と比較して強化されるレベルで、カセットにおける目的の異種核酸は発現される。
【０１１３】
本開示はさらに、本明細書に記載される発現系を発現する植物、または植物の部分を提供する工程、少なくとも目的のタンパク質が発現されている組織を採取する工程、および任意に、組織から目的のタンパク質を単離する工程を含む、目的のタンパク質を生成するための方法を含む。
【０１１４】
従って、種々の態様において、限定無しに、本発明は：
−配列番号：１もしくは３、または配列番号：１もしくは３のいずれか１つに記載の配列に１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を示すヌクレオチド配列から選択されるコモウイルス  ５’ＵＴＲを含む発現エンハンサーであって、ここで、当該発現エンハンサーは、本明細書に記載される植物制御領域および植物において活性なコザック配列、例えば植物コザック配列に作動可能に連結される場合に、同一の植物制御領域を用いてＣＰＭＶ  ＨＴ（配列番号：２；不完全なＭタンパク質を含む従来技術のエンハンサー配列、Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ  Ｆ．，ａｎｄ  Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ  Ｇ．Ｐ．，２００８，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４８：ｐｐ．１２１２−１２１８に記載される；出典明示により本明細書に組み込まれる）に融合された目的のヌクレオチド配列の発現レベルと比較される場合、発現エンハンサーに作動可能に連結される目的のヌクレオチド配列の発現レベルを増加させるものである、発現エンハンサーを提供する。
−上記で定義されるようなコモウイルス−ベースの発現エンハンサーもしくは発現カセット、プロモーター（制御領域）、任意にポリリンカー、コザック配列、目的のタンパク質をコードする核酸、ならびにターミネーターを含む１つ以上の発現系を提供する。
−本明細書に記載される１つ以上の発現系またはベクターを用いて、植物などの宿主生物において目的のタンパク質を発現する方法を提供する。
−本発明の１つ以上の発現系またはベクターから目的のタンパク質を発現する宿主細胞および生物、ならびに当該宿主および生物を生産する方法を提供する。
【０１１５】
表２：配列のリスト
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【０１１６】
実施例１：２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／Ｈ３  Ｖｉｃｔｏｒｉａ／ＮＯＳ（構築物番号１３９１）
【０１１７】
天然シグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのものにより置換されているインフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１由来のＨ３（ＰＤＩＳＰ／Ｈ３  Ｖｉｃｔｏｒｉａ）をコードする配列を以下のＰＣＲ−ベースの方法を用いて、２Ｘ３５Ｓ−ＣＰＭＶ−ＨＴ−ＮＯＳ発現へクローニングした。ＰＤＩＳＰ／Ｈ３  Ｖｉｃｔｏｒｉａコーディング配列を含有するフラグメントを、ＰＤＩＳＰ／Ｈ３  Ｖｉｃｔｏｒｉａ配列（図５Ｃ、配列番号：２０）をテンプレートとして用いて、プライマーＩＦ−ＰＤＩ．Ｓ１＋３ｃ（図５Ａ、配列番号：１８）およびＩＦ−Ｈ３Ｖ３６１１１．ｓ１−４ｒ（図５Ｂ、配列番号：１９）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系にクローニングした。構築物番号１１９１（図５Ｄおよび５Ｅ、配列番号：２１）をＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、かつ線状化プラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリー反応のために使用した。構築物番号１１９１は、ＣＰＭＶ−ＨＴ−ベースの発現カセットにおける目的の遺伝子の「Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングを企図するアクセプタープラスミドである。それはまた、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーター下のＴＢＳＶ  Ｐ１９サイレンシングサプレッサーの共発現のための遺伝子構築物を組み込む。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、かつ左から右に配列ｔ−ＤＮＡボーダーが図５Ｅに示されている（配列番号：２１）。得られた構築物は、番号１３９１が与えられた（図５Ｆ、配列番号：２２）。ＰＤＩＳＰに融合されたインフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１由来の成熟Ｈ３のアミノ酸配列は、図５Ｇに示されている（配列番号：２３）。プラスミド１３９１の表示は、図５Ｈに示されている。
【０１１８】
実施例２：２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ＋／ＰＤＩＳＰ／Ｈ３  Ｖｉｃｔｏｒｉａ／ＮＯＳ（構築物番号１８１９）
【０１１９】
天然シグナルペプチドがアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのものにより置換されている、インフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１由来のＨ３（ＰＤＩＳＰ／Ｈ３  Ｖｉｃｔｏｒｉａ）をコードする配列を以下のＰＣＲ−ベースの方法を用いて２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ＋／ＮＯＳ発現へクローニングした。ＰＤＩＳＰ／Ｈ３  Ｖｉｃｔｏｒｉａコーディング配列を含有するフラグメントをＰＤＩＳＰ／Ｈ３  Ｖｉｃｔｏｒｉａ配列（図８Ｃ、配列番号：２０）をテンプレートとして用いて、プライマーＩＦ（ＳａｃＩＩ）−コザック  ＰＤＩ．ｃ（図６Ａ、配列番号：２４）およびＩＦ−Ｈ３Ｖ３６１１１．ｓ１−４ｒ（図５Ｂ、配列番号：１９）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ＋／ＮＯＳ発現系にクローニングした。構築物番号２１８１（図６Ｂ）をＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、かつ線状化プラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎアセンブリー反応のために使用した。構築物番号２１８１は、ＣＰＭＶ−ＨＴ＋ベースの発現カセットにおける目的の遺伝子の「Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングを企図するアクセプタープラスミドである。それはまた、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーター下のＴＢＳＶ  Ｐ１９サイレンシングサプレッサーの共発現のための遺伝子構築物を組み込む。骨格はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、かつ左から右に配列ｔ−ＤＮＡボーダーが図６Ｃに示されている（配列番号：２５）。得られた構築物は、番号１８１９が与えられた（図６Ｄ、配列番号：２６）。ＰＤＩＳＰに融合されたインフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１由来の成熟Ｈ３のアミノ酸配列は、図５Ｇに示されている（配列番号：２３）。プラスミド１８１９の表示は、図６Ｅに示されている。
【０１２０】
実施例３  ２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ＋／ＮＯＳ発現系におけるＳａｃＩＩ制限酵素部位とＰＤＩＳＰ／Ｈ３  ＶｉｃｔｏｒｉａのＡＴＧとの間の配列のバリエーション（構築物番号１９５２から１９５９）
【０１２１】
改変フォワードプライマーを用いて、および全ての他の段階を同一に保って、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶＨＴ＋／ＮＯＳ発現系におけるＳａｃＩＩ制限酵素部位とＰＤＩＳＰ／Ｈ３  ＶｉｃｔｏｒｉａのＡＴＧとの間の配列バリエーションを含む８構築物を、構築物番号１８１９（実施例２を参照されたい）における同一のＰＣＲ−ベースの方法を用いて作製した。バリアントＨＴ１＊からＨＴ８＊を図７Ａ−７Ｈにおいて記載されるプライマーで増幅した：
ＩＦ−ＨＴ１＊（−Ｍｐｒｏｔ）−ＰＤＩ．ｃ（図７Ａ、配列番号：２７）、
ＩＦ−ＨＴ２＊（−Ｍｐｒｏｔ）−ＰＤＩ．ｃ（図７Ｂ、配列番号：２８）、
ＩＦ−ＨＴ３＊（−Ｍｐｒｏｔ）−ＰＤＩ．ｃ（図７Ｃ、配列番号：２９）
ＩＦ−ＨＴ４＊（−Ｍｐｒｏｔ）−ＰＤＩ．ｃ（図７Ｄ、配列番号：３０）
ＩＦ−ＨＴ５＊（−Ｍｐｒｏｔ）−ＰＤＩ．ｃ（図７Ｅ、配列番号：３１）
ＩＦ−ＨＴ６＊（−Ｍｐｒｏｔ）−ＰＤＩ．ｃ（図７Ｆ、配列番号：３２）
ＩＦ−ＨＴ７＊（−Ｍｐｒｏｔ）−ＰＤＩ．ｃ（図７Ｇ、配列番号：３３）および
ＩＦ−ＨＴ８＊（−Ｍｐｒｏｔ）−ＰＤＩ．ｃ（図７Ｈ、配列番号：３４）、
構築物番号１９５２から１９５９をそれぞれ作製するためのプライマー。プラスミド１９５２の表示は図７Ｉに示されている。類似する特徴を用いて構築物１９５３−１９５９を調製した。
【０１２２】
実施例４：ＰＤＩＳＰ／Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａのための２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ（構築物番号４８４）およびＨＴ＋（構築物番号１８０５）
【０１２３】
天然シグナルペプチドが、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのものにより置換されている、インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９由来のＨ１（ＰＤＩＳＰ／Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に対応するコーディング配列（図８Ａ、配列番号：３５）を、元のＨＴおよび改変ＨＴ＋へ、それぞれ構築物１３９１および１８１９（実施例１および２を参照されたい）として、ＰＤＩＳＰ／Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａに対して特異的に設計される改変ＰＣＲプライマーを用いて、同一のＰＣＲベースの方法を用いてクローニングした。ＰＤＩＳＰに融合されたインフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９由来の成熟Ｈ１のアミノ酸配列（配列番号：３６）は、図８Ｂに示される。プラスミド４８４および１８０５の表示は、図８Ｃおよび図８Ｄに示される。
【０１２４】
実施例５：Ｈ５  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａのための２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ（構築物番号４０９）およびＨＴ＋（構築物番号２３１９）
【０１２５】
天然シグナルペプチドが、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのものにより置換されている、インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５（ＰＤＩＳＰ／Ｈ５  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ）に対応するコーディング配列（図９Ａ、配列番号：３７）を、元のＨＴおよび改変ＨＴ＋へ、それぞれ構築物１３９１および１８１９（実施例１および２を参照されたい）として、ＰＤＩ／Ｈ５  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａに対して特異的に設計される改変ＰＣＲプライマーを用いて同一のＰＣＲベースの方法を用いてクローニングした。ＰＤＩＳＰを有するインフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来の成熟Ｈ５のアミノ酸配列は、図９Ｂに示される（配列番号：３８）。プラスミド４０９および２３１９の表示は、図９Ｃおよび図９Ｄに示される。
【０１２６】
実施例６：ＰＤＩＳＰ−Ｈ７  Ｈａｎｇｚｈｏｕのための２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ（構築物番号２１４０）およびＨＴ＋（構築物番号２１４２）
【０１２７】
天然シグナルペプチドが、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのものにより置換されている、インフルエンザＡ／Ｈａｎｇｚｈｏｕ／１／２０１３由来のＨ７（ＰＤＩＳＰ／Ｈ７  Ｈａｎｇｚｈｏｕ）に対応するコーディング配列（図１０Ａ、配列番号：３９）を、元のＨＴおよび改変ＨＴ＋へ、それぞれ構築物１３９１および１８１９（実施例１および２を参照されたい）として、ＰＤＩＳＰ／Ｈ７  Ｈａｎｇｚｈｏｕに対して特異的に設計される改変ＰＣＲプライマーを用いて、同一のＰＣＲベースの方法を用いてクローニングした。ＰＤＩＳＰに融合されたインフルエンザＡ／Ｈａｎｇｚｈｏｕ／１／２０１３由来の成熟Ｈ７のアミノ酸配列は、図１０Ｂに示される（配列番号：４０）。プラスミド２１４０、２１４２および２１６８の表示は、図１０Ｃおよび図１０Ｄに示される。
【０１２８】
実施例７：ＰＤＩＳＰ／Ｈ７  Ｈａｎｇｚｈｏｕ＋Ｈ５  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ  ＴＭＣＴのための２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ（構築物番号２１３０）およびＨＴ＋（構築物番号２１４６）
【０１２９】
インフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５の膜貫通ドメインおよび細胞質側末端（ＴＭＣＴ）に融合され、かつアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのシグナルペプチドを有する、インフルエンザＡ／Ｈａｎｇｚｈｏｕ／１／２０１３由来のＨ７（ＰＤＩＳＰ／Ｈ７  Ｈａｎｇｚｈｏｕ＋Ｈ５  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ  ＴＭＣＴ）の外部ドメインに対応するキメラヘマグルチニンコーディング配列（図１１Ａ、配列番号：４１）を、元のＨＴおよび改変ＨＴ＋へ、それぞれ構築物１３９１および１８１９（実施例１および２を参照されたい）として、ＰＤＩＳＰ／Ｈ７  Ｈａｎｇｚｈｏｕ＋Ｈ５  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ  ＴＭＣＴに対して特異的に設計される改変ＰＣＲプライマーを用いて、同一のＰＣＲベースの方法を用いてクローニングした。ＰＤＩＳＰに融合されたＨ７  Ｈａｎｇｚｈｏｕ＋Ｈ５  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ  ＴＭＣＴのアミノ酸配列は図１１Ｂに示される（配列番号：４２）。プラスミド２１３０および２１４６の表示は、図１１Ｃおよび１１Ｄに示される。
【０１３０】
実施例８：ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）のための２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ（構築物番号１０３９）およびＨＴ＋（構築物番号１８２９）
【０１３１】
天然シグナルペプチドが、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのものにより置換されている、欠失タンパク質分解ループ（ＰｒＬ−）を有するインフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８由来のＨＡに対応するコーディング配列（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）；図１２Ａ、配列番号：４３）を、元のＨＴおよび改変ＨＴ＋へ、それぞれ構築物１３９１および１８１９（実施例１および２を参照されたい）として、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）に対して特異的に設計される改変ＰＣＲプライマーを用いて、同一のＰＣＲベースの方法を用いてクローニングした。ＰＤＩＳＰに融合された成熟ＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）のアミノ酸配列は、図１２Ｂに示される（配列番号：４４）。プラスミド１０３９および１８２９の表示は、図１２Ｃおよび１２Ｄに示される。
【０１３２】
実施例９：ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＴＭＣＴのための２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ（構築物番号１０６７）およびＨＴ＋（構築物番号１８７５）
【０１３３】
インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９由来のＨ１の膜貫通ドメインおよび細胞質側末端（ＴＭＣＴ）に融合され、かつアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのシグナルペプチドを有する、欠失タンパク質分解ループ（ＰｒＬ−）を有するインフルエンザＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８由来のＨＡ（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＴＭＣＴ）の外部ドメインに対応するキメラヘマグルチニンコーディング配列（図１３Ａ、配列番号：４５）を、元のＨＴおよび改変ＨＴ＋へ、それぞれ構築物１３９１および１８１９（実施例１および２を参照されたい）として、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＴＭＣＴに対して特異的に設計される改変ＰＣＲプライマーを用いて、同一のＰＣＲベースの方法を用いてクローニングした。ＰＤＩＳＰに融合された成熟ＨＡ  Ｂ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＴＭＣＴのアミノ酸配列は、図１３Ｂに示される（配列番号：４６）。プラスミド１０６７および１８７５の表示は、図１３Ｃおよび１３Ｄに示される。
【０１３４】
実施例１０：ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）のための２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ（構築物番号２０７２）およびＨＴ＋（構築物番号２０５２）
【０１３５】
天然シグナルペプチドが、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのものにより置換されている、欠失タンパク質分解ループ（ＰｒＬ−）を有するインフルエンザＢ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２由来のＨＡ（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−））に対応するコーディング配列（図１４Ａ、配列番号：４７）を、元のＨＴおよび改変ＨＴ＋へ、それぞれ構築物１３９１および１８１９（実施例１および２を参照されたい）として、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）に対して特異的に設計される改変ＰＣＲプライマーを用いて、同一のＰＣＲベースの方法を用いてクローニングした。ＰＤＩＳＰに融合された成熟ＨＡ  Ｂ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）のアミノ酸配列は、図１４Ｂに示される（配列番号：４８）。プラスミド２０７２および２０５２の表示は、図１４Ｃおよび図１４Ｄに示される。
【０１３６】
実施例１１：ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＴＭＣＴのための２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ（構築物番号２０７４）およびＨＴ＋（構築物番号２０６２）
【０１３７】
インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９由来のＨ１の膜貫通ドメインおよび細胞質側末端（ＴＭＣＴ）に融合され、かつアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのシグナルペプチドを有する、欠失タンパク質分解ループ（ＰｒＬ−）を有するインフルエンザＢ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２由来のＨＡ（ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＴＭＣＴ）の外部ドメインに対応するキメラヘマグルチニンコーディング配列（図１５Ａ、配列番号：４９）を、元のＨＴおよび改変ＨＴ＋へ、それぞれ構築物１３９１および１８１９（実施例１および２を参照されたい）として、ＰＤＩＳＰ／ＨＡ  Ｂ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＴＭＣＴに対して特異的に設計される改変ＰＣＲプライマーを用いて、同一のＰＣＲベースの方法を用いてクローニングした。ＰＤＩＳＰに融合された成熟ＨＡ  Ｂ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＴＭＣＴのアミノ酸配列は、図１５Ｂに示される（配列番号：５０）。プラスミド２０７４および２０６２の表示は、図１５Ｃおよび図１５Ｄに示される。
【０１３８】
実施例１２：ＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）のための２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ（構築物番号１４４５）およびＨＴ＋（構築物番号１８３９）
【０１３９】
天然シグナルペプチドを有し、欠失タンパク質分解ループ（ＰｒＬ−）を有するインフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０由来のＨＡ（ＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−））に対応するコーディング配列（図１６Ａ、配列番号：５１）を、元のＨＴおよび改変ＨＴ＋へ、それぞれ構築物１３９１および１８１９（実施例１および２を参照されたい）として、ＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）に対して特異的に設計される改変ＰＣＲプライマーを用いて、同一のＰＣＲベースの方法を用いてクローニングした。天然シグナルペプチドを有するＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）のアミノ酸配列は、図１６Ｂに示される（配列番号：５２）。プラスミド１４４５および１８３９の表示は、図１６Ｃおよび１６Ｄに示される。
【０１４０】
実施例１３：ＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＴＭＣＴのための２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ  ＨＴ（構築物番号１４５４）およびＨＴ＋（構築物番号１８６０）
【０１４１】
インフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９由来のＨ１の膜貫通ドメインおよび細胞質側末端（ＴＭＣＴ）に融合され、ＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎの天然シグナルペプチドを有し、欠失タンパク質分解ループ（ＰｒＬ−）を有するインフルエンザＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／２／２０１２由来のＨＡ（ＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＴＭＣＴ）の外部ドメインに対応するキメラヘマグルチニンコーディング配列（図１７Ａ、配列番号：５３）を、元のＨＴおよび改変ＨＴ＋へ、それぞれ構築物１３９１および１８１９として、ＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＴＭＣＴに対して特異的に設計される改変ＰＣＲプライマーを用いて、同一のＰＣＲベースの方法を用いてクローニングした。ＨＡ  Ｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＰｒＬ−）＋Ｈ１  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＴＭＣＴのアミノ酸配列は、図１７Ｂに示される（配列番号：５４）。プラスミド１４５４および１８６０の表示は、図１７Ｃおよび１７Ｄに示される。
【０１４２】
実施例１４：アグロバクテリウム遺伝子導入
【０１４３】
Ｄ’Ａｏｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ  ２００８（Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：９３０−９４０）により記載される方法を用いて、ＤＮＡ構築物をエレクトロポーレーションによりアグロバクテリウム株ＡＧＬ１に遺伝子導入した。１０ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０μＭアセトシリンゴン、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補充したｐＨ５．６のＹＥＢ培地において、遺伝子導入されているアグロバクテリウムを０．６および１．６間のＯＤ６００まで増殖させた。浸潤培地（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．６）において使用および再懸濁される前に、アグロバクテリウム懸濁液を遠心分離した。
【０１４４】
植物バイオマス、接種源およびアグロインフィルトレーションの調製
本明細書に使用される用語「バイオマス」および「植物物質」は、植物由来の任意の物質を反映するよう意図される。バイオマスまたは植物物質は、植物全体、組織、細胞、またはそれらの任意の画分を含んでもよい。さらに、バイオマスまたは植物物質は、細胞内の植物構成要素、細胞外の植物構成要素、植物の液体もしくは固体抽出物、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。さらに、バイオマスまたは植物物質は、植物の葉、茎、果実、根またはそれらの組み合わせ由来の、植物、植物細胞、組織、液体抽出物、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。植物の一部分が、植物物質またはバイオマスを含んでもよい。
【０１４５】
市販の基材ピートモスで満たされる平地で、種子からニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物を生長させた。当該植物を１６／８光周期および、日中２５℃／夜２０℃の温度管理体制下で温室において生長するようにした。播種から３週間後、個々の苗木を取り出し、鉢に移植し、かつ同じ環境条件下でさらに３週間温室で生長させた。
【０１４６】
１０ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０μＭアセトシリンゴン、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補充したｐＨ５．６ＹＥＢ培地において、それぞれ構築物が遺伝子導入されているアグロバクテリアを０．６および１．６間のＯＤ６００に達するまで増殖させた。浸潤培地（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．６）において使用および再懸濁される前にアグロバクテリウム懸濁液を遠心分離し、かつ一晩４°Ｃで貯蔵した。浸潤の日に、培養バッチを２．５培養容積で希釈し、かつ使用前にあたためた。Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの植物全体を２分間２０−４０トルの真空下で気密ステンレススチールタンクにバクテリア懸濁液に逆さまに置いた。採取までの２−６日インキュベーション期間のために、植物を温室に戻した。
【０１４７】
葉の採取および総タンパク質抽出
【０１４８】
インキュベーション後、植物の地上の一部を採取し、−８０℃で凍結し、かつ破砕した。３倍容積の、冷５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１ｍＭ  フッ化フェニルメチルスルホニル（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）において、凍結−破砕の植物物質のそれぞれのサンプルをホモジナイズ（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）することで総可溶性タンパク質を抽出した。ホモジナイゼーション後、スラリーを４℃で１０分間、１０，０００ｇで遠心分離し、かつこれらの清澄粗抽出物（上清）を解析のために保存した。
【０１４９】
実施例１５：血液凝集アッセイ
【０１５０】
清澄粗抽出物の総タンパク質含量は、参照標準としてウシ血清アルブミンを用いるブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）により決定した。
【０１５１】
血液凝集アッセイは、Ｎａｙａｋ  ａｎｄ  Ｒｅｉｃｈｌ（２００４）により記載される方法に基づいた。簡潔には、ウェル当たりに希釈されるサンプルの１００μＬを残して試験サンプル（１００μＬ）の二倍段階希釈を、１００μＬ  ＰＢＳを含有するＶ−底９６−穴マイクロタイタープレートにおいて作製した。０．２５％ターキー赤血球懸濁液（Ｂｉｏ  Ｌｉｎｋ  Ｉｎｃ．，Ｓｙｒａｃｕｓｅ，ＮＹ；全てのＢ株、Ｈ１、Ｈ５およびＨ７のため）または０．５％モルモット赤血球懸濁液（Ｈ３のため）の１００マイクロリッターをそれぞれのウェルに加え、および室温で２時間プレートをインキュベートした。ＨＡ活性として、完全な血液凝集を示す最大希釈の逆数を記録した。
【０１５２】
全ての引用文献は、出典明示により本明細書に組み込まれる。
【０１５３】
１つ以上の実施形態に関して、本発明は記載されている。しかしながら、請求項に明らかにされるような本発明の範囲から逸脱することなく多くの変形および改変を行えることは当業者には自明であろう。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【配列表】
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