(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アジュバント添加ビロソームを調製する方法であって、
（ｉ）膜融合タンパク質を含むアジュバント非添加ビロソームの水性組成物を提供する工程と、
（ｉｉ）両親媒性アジュバントを、水との均質な混合物を形成することができる製薬上許容可能な非水性の水混和性溶媒に溶解させる工程と、
（ｉｉｉ）前記ビロソームの膜融合活性を保持しながら、ビロソーム膜の外側リーフレットへのアジュバントの挿入を誘導するために、前記アジュバント溶液を前記水性ビロソーム組成物中に希釈する工程と、を含む方法。
【請求項２】
前記非水性アジュバント水混和性溶媒が、２０℃で少なくとも５ｇ／１００ｍＬ、好ましくは少なくとも１０ｇ／１００ｍＬ、より好ましくは少なくとも２０ｇ／１００ｍＬの水に対する溶解度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アジュバント溶媒が、アセトニトリル、２−ブタノール、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸、ギ酸、メタノール、エタノール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、２−メチル−１−プロパノールおよびＴＨＦ、またはそれらの任意の混合物からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記アジュバント溶媒がＤＭＳＯまたはＤＭＦである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記膜融合タンパク質が、好ましくは、ＨＩＶ  ｇｐ１２０／ｇｐ４１タンパク質、パラミクソウイルスＦタンパク質およびインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質、バキュロウイルスのｇｐ６４タンパク質、並びにセムリキ森林ウイルスのＥタンパク質からなる群から選択されるウイルス融合タンパク質である、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記膜融合タンパク質が、ＲＳＶ  Ｆタンパク質または融合活性変異体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
エンベロープウイルス、好ましくは、レトロウイルス科、風疹ウイルス、パラミクソウイルス科、フラビウイルス科、ヘルペスウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、ハンタウイルス科、バキュロウイルス科、コロナウイルス科、パポバウイルス科、ラブドウイルス科、アルファウイルス科、アルテリウイルス科、フィロウイルス科およびポックスウイルス科からなる群から選択されるウイルスの機能的再構成によってビロソームを調製する工程を含む、請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記機能的再構成が、前記ウイルスのウイルスエンベロープの可溶化を可能にする短鎖リン脂質または界面活性剤を含有し、該短鎖リン脂質が０．１ｍＭより大きい臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）を有する、溶液とエンベロープウイルスを接触させる工程を含み、前記溶液から短鎖リン脂質または界面活性剤を除去して、機能的に再構成されたウイルスエンベロープの形成を可能にし、好ましくは前記リン脂質または界面活性剤が透析、濾過、または疎水性ビーズへの吸収によって除去される工程を更に含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記短鎖リン脂質が、０．３ｍＭより大きい、好ましくは１ｍＭより大きい臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記リン脂質がホスファチジルコリン、好ましくは、１，２−ジヘプタノイル−ｓｎ−ホスファチジルコリンまたは１，２−ジカプロイル−ｓｎ−ホスファチジルコリンである、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記界面活性剤が、オクタ‐エチレン‐グリコールモノＮドデシルエーテルである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記疎水性ビーズが、ポリスチレンジビニルベンゼンからなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記両親媒性アジュバントが、好ましくはモノ−ホスホリル脂質Ａおよびその誘導体並びにリポペプチドからなる群から選択されるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）によって認識される化合物である、請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記両親媒性アジュバントが、好ましくはα−ガラクトシルセラミド、ホスファチジルイノシトールマンノシド、内毒素性リポ多糖類の誘導体およびそれらの誘導体からなる群から選択される糖脂質である、請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記両親媒性アジュバントが、好ましくはアジュバント活性を有するＪａｇｇｅｄ−１または黄色ブドウ球菌Ａタンパク質に由来するアミノ酸配列を含む両親媒性ペプチドである、請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ビロソームが、少なくとも１つの更なる抗原、好ましくは、腫瘍抗原若しくはウイルス、寄生虫、真菌または細菌に由来する抗原を含む、請求項１〜１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗原が、好ましくはインフルエンザウイルスまたはＲＳＶに由来するウイルス抗原である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗原が、内在性膜タンパク質または膜アンカー部分に結合した抗原である、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記膜アンカー部分が、膜貫通ドメインまたは膜アンカーアミノ酸配列である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記膜アンカー部分が、脂質部分、好ましくはリン脂質またはアシル鎖である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
膜融合タンパク質を含むビロソームとアジュバントとを含むアジュバント添加ビロソームであって、前記アジュバントが、前記ビロソーム膜の外側リーフレットに本質的に閉じ込められた両親媒性アジュバントであることを特徴とするアジュバント添加ビロソーム。
【請求項２２】
前記両親媒性アジュバントが、請求項１４〜１６の何れかに記載の化合物である、請求項２１に記載のアジュバント添加ビロソーム。
【請求項２３】
少なくとも１つの更なる抗原、好ましくは、腫瘍抗原またはウイルス、寄生虫、真菌または細菌に由来する抗原を含む、請求項２１または２２に記載のアジュバント添加ビロソ
ーム。
【請求項２４】
前記抗原が、好ましくはインフルエンザウイルスまたはＲＳＶに由来するウイルス抗原である、請求項２３に記載のアジュバント添加ビロソーム。
【請求項２５】
前記抗原が、内在性膜タンパク質または膜アンカー部分に結合した抗原であり、好ましくは、前記膜アンカー部分が膜貫通ドメイン、膜アンカーアミノ酸配列または脂質部分である、請求項２３または２４に記載のアジュバント添加ビロソーム。
【請求項２６】
請求項２１〜２５の何れか１項に記載のアジュバント添加ビロソームと、製薬上許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項２７】
請求項２１〜２５の何れか１項に記載のアジュバント添加ビロソームを含む免疫原性組成物。
【請求項２８】
鼻腔内送達、非経口送達または経口投与のために処方される、請求項２６または２７に記載の組成物。
【請求項２９】
医薬品としての使用のための、請求項２１〜２５の何れか１項に記載のアジュバント添加ビロソーム。
【請求項３０】
癌または感染性疾患の予防または治療の方法における使用のための、請求項２１〜２５の何れか１項に記載のアジュバント添加ビロソーム。
【請求項３１】
ビロソームに基づくワクチンのアジュバント／抗原比を最適化する方法であって、請求項２１〜２５の何れか１項に記載のアジュバント添加ビロソームを含む少なくとも第１および第２の試験調製物を、任意には請求項１〜２０の何れか１項に記載の方法を用いて、調製する工程であって、それぞれの試験調製物が別個のアジュバント／抗原比を有するようにする工程と、試験対象内のそれぞれの試験調製物を免疫応答を誘導する効力について評価する工程と、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学およびワクチン学の分野に関する。具体的には、本発明は、ビロソームを提供するための改良された方法、ビロソームを含む組成物およびその使用に関する。膜を含む（エンベロープを有する）ウイルスに対するワクチンは、ほとんどが死滅または弱毒化生ウイルス、またはそれらのタンパク質の調製物（例えば、スプリットウイルスワクチンまたはサブユニット調製物）からなる。死滅ウイルスおよびタンパク質調製物によるワクチン接種は、複製弱毒化生または組換えウイルスによるワクチン接種よりも安全である。なぜなら、後者は野生型ウイルスに突然変異または復帰する可能性があるからである。サブユニットワクチンは局所的および全身的な副作用がより少なく、また、ウイルスよりもむしろ細胞によって発現される組換えウイルスタンパク質から調製することができ、産生をより安全にし、ワクチン調製物を生ウイルスで汚染する危険性を排除するという明らかな利点を有する。しかしながら、生ウイルスの注射が一般に、ウイルスによる将来の感染に対して保護する強力な細胞性および抗体免疫応答を誘導する一方、タンパク質調製物、特に膜タンパク質調製物のような非複製ワクチンはそれを誘導せず、主に抗体応答を誘導する可能性がある。感染細胞はＭＨＣ−１分子上の感染性病原体由来の物質を表面に提示し、細胞傷害性Ｔ細胞応答のような細胞性免疫応答を開始する。細胞内で産生されない多くのタンパク質調製物は、このようにして免疫系には提示されない。生または死滅したウイルスも、樹状細胞のような免疫系の特殊な食細胞によって優先的に取り込まれ、免疫系の他の細胞に提示され、免疫応答を誘発する。これらの食細胞は、ウイルスサイズの粒子を摂取して身体を巡回するが、スプリットウイルスまたはサブユニットワクチンに由来するもののような精製タンパク質を効率的に取り込まない。膜タンパク質に特有の問題は、これらが水に溶解しないことである。従って、抗原提示細胞への提示に成功するためには、これらのタンパク質は何らかの形態の可溶化によって、ワクチンにおけるその使用を可能にする必要がある。
【０００２】
物理的または化学的手段によってサブユニットまたはタンパク質調製物に対する免疫応答を強化する多数の試みが行われてきた。これらの実験から浮上する最も重要な原理は、ウイルスタンパク質の多数のコピーを、食細胞によって効率的に取り込まれる粒子に組み込ませる必要があることである。これらの粒子は、ビロソーム様粒子、ビロソーム、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、混合ミセル、プロテオソーム調製物または微粒子担体上のタンパク質であり得る。しばしば、これらの粒子はまた、食細胞または免疫系のエフェクター細胞上の特異的な受容体に対処する免疫系を刺激することを意図した化学物質（アジュバントと呼ばれる）も含有する。
【背景技術】
【０００３】
ビロソームは特に有用な種類のワクチン組成物である。ビロソームは、エンベロープウイルスの再構成された膜である。それらは一般に、界面活性剤または短鎖リン脂質でエンベロープウイルスから膜タンパク質および脂質を抽出し、次いで、抽出された脂質およびウイルス膜タンパク質からこの界面活性剤または短鎖リン脂質を除去することによって産生され、実際には、これによってウイルスコアまたはヌクレオカプシドを取り囲む特徴的な脂質二重層（エンベロープ）が再構成または改質される（ＷＯ２００４／０７１４９２，  Ｓｔｅｇｍａｎｎ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ６，  ２６５１−２６５９）。しかしながら、ビロソームは、基本的に、あらゆる内在性膜タンパク質または末梢膜タンパク質、または脂質アンカーと共役したタンパク質から組み立てることができる。ビロソームの本質的な特徴は、それらが免疫系の食細胞によって効率的に取り込まれるサイズの粒子であり、それらが天然のウイルスエンベロープの組成、表面構造および機能的活性、特に、膜融合活性を密接に模倣することである  。脂質、アジュバントまたはタンパク質のような他の分子を、可溶化された膜物質に添加することができる。次いで、膜を界面活性剤または短鎖リン脂質を除去することによって改質してビロソームを産生する。膜の改質中、添加された分子はビロソーム内に含まれるか、またはビロソーム膜に一体化される。ビロソームは、ワクチンとして、または分子を細胞に送達するために用いることができる。
【０００４】
インフルエンザウイルスおよびセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）は、エンベロープウイルスの２つの古典的な例である。エンベロープウイルスは一般に、細胞への結合および細胞の侵入に必要な特異的な膜タンパク質（「スパイク」）を運ぶ。これらのタンパク質は、「融合前形態」として知られている準安定構造の成熟ビリオンの表面上に存在する。ウイルスが細胞に結合した後、これらのウイルスによる細胞の感染の第一段階は、受容体媒介エンドサイトーシスによるインタクトなウイルス粒子の取り込みである。その後、エンドソーム区画が、エンドソームの膜に存在するＡＴＰ依存性プロトンポンプの活性のために弱酸性になる。これらの酸性条件（ｐＨ  ５〜６）によって誘発されたウイルススパイクタンパク質は、ウイルス膜とエンドソームの膜との融合を促進する構造変化（「融合前」から「融合後」構造）を経る  。そのような融合の結果として、ウイルスヌクレオカプシドおよび遺伝物質（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が細胞質に入り、ゲノムの複製が子孫ウイルスを産生する。
【０００５】
免疫応答を誘導するのに特に活性であるビロソームは、膜融合、受容体結合および他の活性のような天然ウイルスのエンベロープタンパク質の正常な機能を維持していることが分かった。ビロソーム膜上のウイルススパイクタンパク質が融合前形態であることを示す受容体結合および膜融合活性の保存は、当該ビロソームの完全な免疫原性特性の発現に不可欠である。ビロソームの膜融合活性に起因する細胞質送達の結果として、ビロソームタンパク質からのエピトープのＭＨＣ−１提示が証明され、防御細胞傷害性Ｔ細胞活性の誘導をもたらした（Ｂｕｎｇｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３  （２００５）  １２３２−１２４１，  Ｂｕｎｇｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  １１１（６）：７１７−７２７）。従って、膜融合活性を有するビロソームは、ワクチンとして有用であり、死滅ワクチンの安全性プロファイルを有する一方、生ワクチンを代表する刺激を有する免疫系を提供する。
【０００６】
ビロソームワクチン製剤がビロソームの注射または鼻腔内適用後に免疫応答を刺激する能力を更に改善するために、ビロソームの膜に両親媒性アジュバントを組み込むことは、当該技術分野において公知である。例えば、ウイルスが界面活性剤または短鎖リン脂質で可溶化され、次いで、ウイルスヌクレオカプシドが除去されるＷＯ２００４／１１０４８６を参照されたい。その後、同じ界面活性剤または短鎖リン脂質に溶解したアジュバントを可溶化ウイルス膜に加えて、ビロソームにアジュバントを組み込む。次いで、界面活性剤または短鎖リン脂質を除去すると、少なくともウイルス膜タンパク質および脂質並びにアジュバントを含むビロソームが形成される。このような方法でビロソーム膜に組み込まれた両親媒性アジュバントは、膜中に安定に一体化され（Ｓｔｅｇｍａｎｎ、Ｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１０；  ２８（３４）：５５４３−５０；  ＷＯ２００４／１１０４８６）、  前臨床試験において、これらのビロソームによるワクチン接種後の免疫応答を増強または改変する（Ｋａｍｐｈｕｉｓ，  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ  ２０１２；  ７（５）：ｅ３６８１２）ことが示されている。
【０００７】
しかしながら、膜中のタンパク質とアジュバントとの濃度の比は、それらが両方とも同じ膜中に存在するため、ビロソーム膜の形成時に固定される。また、アジュバントは膜二重層の両方のリーフレットに組み込まれるが、外側リーフレットに存在するアジュバントのみが、免疫系の細胞上に存在する受容体との相互作用に利用可能である。
【０００８】
抗原／アジュバント比は、ワクチン接種後の免疫応答に深刻な影響を及ぼす。例えば、モノホスホリル脂質Ａアジュバントを含有する呼吸器系合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ビロソームについては、アジュバントの閾値濃度が、よりバランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２応答に対する主要なＴｈ２応答からの免疫応答を歪めることができることが分かった（Ｋａｍｐｈｕｉｓ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ  ２０１２；  ７（５）：ｅ３６８１２）。
【０００９】
アジュバントを含有するワクチンの販売許可を得るためには（「ヒト使用のためのワクチンにおけるアジュバントに関するＥＭＡガイドライン」参照：ＥＭＥＡ／ＣＨＭＰ／ＶＥＧ／１３４７１６／２００４）、抗原のアジュバントとの適切で安定した会合を証明し、次いで、前臨床試験およびその後の臨床試験におけるワクチン候補の安全性評価が必要である。動物実験の結果は、しばしば、ヒトにおけるワクチンの効果を完全に予測するものではない。特に、最適な抗原／アジュバント比を推定することは困難である。副作用を最小限に抑えるためには低いアジュバント濃度が望ましいが、アジュバントは、所望の方法で、そして高いアジュバント濃度で免疫応答を増強または改変する必要がある。寛容化または増加した反応原性（すなわち、ワクチンの  一般的な「期待される」有害応答、特に過剰な免疫学的応答並びに関連する徴候および症状をもたらし得る特性）のような他の影響が生じ得る。従って、最適な抗原／アジュバント比は、試行錯誤によってのみ決定することができる。更に、高齢者または幼児のような様々に異なるグループの患者について、様々に異なる比率が最適である可能性がある。ミョウバンに吸収された抗原のような古典的なアジュバントを用いて処方されたワクチンについては、抗原はＧＭＰ（原薬Ａ）のもとで産生され、臨床試験のために放出され、その後、ＧＭＰグレードのミョウバン（原薬Ｂ）と混合されて臨床薬剤製品を形成することができ、様々なアジュバント／抗原比での容易な試験を可能にする。しかしながら、このアプローチは、抗原とアジュバントとの間の比が既に膜の再構成時に固定されているため、組み込まれた両親媒性アジュバントを有するビロソームについては不可能である。
【００１０】
従って、アジュバント添加ビロソームを調製するための現在利用可能な方法を用いて種々のアジュバント／抗原比を試験する唯一の方法は、様々に異なる抗原／アジュバントの組み合わせ（各調製物は原薬を構成する）を用いて多種多様なビロソームを産生し、各調製物について必要な前臨床安全性および免疫原性試験を行い、臨床試験のために各調製物を放出し、様々に異なる調製物それぞれについて試験を個別に行うことである。この方法では、そのような試験のコストがかなり大幅に増倍することは明らかである。
【発明の概要】
【００１１】
これらの問題を克服するために、本発明者らはアジュバント添加ビロソームの臨床試験を容易にすることを追求した。特に、前臨床安全性、免疫原性、放出、臨床試験等のために別個の試験を必要とする調製物の数を最小限にすることを目的とした。更なる目的は、免疫原性を保持しながら、用いられるアジュバントの量を最小限に抑えることであった。
【００１２】
これらの目標の少なくともいくつかは、アジュバント添加されたビロソームを調製するための従来の方法を適合させることによって達成し得ることが観察された。より詳細には、この新規な方法は、アジュバントを含まない抗原を含有するビロソームを予備形成すること、および好適な溶媒に溶解した両親媒性アジュバントを添加することを含む。溶解したアジュバントは予備形成されたビロソームを含有する水性組成物と混合され、その結果、アジュバント溶媒が水と混合し、アジュバントがビロソーム膜に一体化される。従って、両親媒性アジュバントは、ビロソーム形成時ではなく、ビロソーム形成後にビロソーム膜に含まれる。本発明のこの「２段階」法は、様々に異なるアジュバント／抗原比を有するビロソームベースのワクチンの製剤化および膜の外側リーフレットにのみ組み込まれたアジュバントを有するビロソームの形成を容易にする。驚くべきことに、（ウイルス性）タンパク質をアジュバント溶媒に曝露したにも拘わらず、この新規の後挿入プロトコルに従って得られたビロソームは、これまでの組み込み法と同様の融合活性を示した。
【００１３】
従って、一実施形態において、本発明は、アジュバント添加ビロソームを調製する方法を提供し、前記方法は、
（ｉ）膜融合タンパク質を含むアジュバント非添加ビロソームの水性組成物を提供する工程と、
（ｉｉ）両親媒性アジュバントを、水との均質な混合物を形成することができる製薬上許容可能な非水性溶媒に溶解させる工程と、
（ｉｉｉ）ビロソームの膜融合活性を保持しながら、ビロソーム膜の外側リーフレットへのアジュバントの挿入を誘導するために、当該アジュバント溶液を当該水性ビロソーム組成物中に希釈する工程と、を含む。
【００１４】
本発明は、アジュバント添加ビロソームを含むワクチンの前臨床および臨床試験に関して重要な利点を有する。予備形成されたビロソーム組成物は故に「原薬Ａ」を形成し、一方、溶媒中のアジュバントは「原薬Ｂ」である。必要なのは、原薬ＡおよびＢについての安全性および臨床試験のみである。原薬ＡおよびＢの様々なアジュバント／抗原比を有する薬剤製品への組み込みを、臨床で行うことができる。
【００１５】
更に、アジュバントは様々な副作用を生じることが知られており、その範囲は注入部位における疼痛から炎症、ベル麻痺（Ｌｅｗｉｓ，  Ｄ．ＪＨ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳＯｎｅ  ２００９  ４（９）：ｅ６９９９）およびナルコレプシー（Ｏ  Ｆｌａｎａｇａｎ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳＯｎｅ  ２０１４，１９（１７）ｐｉｉ２０７８９に及ぶ。従って、最低有効濃度のアジュバントを組み込むことが重要である。ビロソーム膜を形成する従来の１段階プロセスを行っている時に、アジュバントをビロソーム膜に組み込むことによって、アジュバントは二重層の両方のリーフレットに組み込まれる。ただし、膜の外側リーフレットに存在するアジュバントの半分のみが免疫系の細胞と接触することができ、そのため、望ましくない副作用に寄与し得る濃度は有効濃度の２倍である。対照的に、予備形成されたビロソーム膜を用いる本発明の方法においては、アジュバントは、膜の外側リーフレットにのみ挿入され、その全てが免疫系との相互作用に利用可能となる。これにより、両方のリーフレットにアジュバントを含む従来のビロソームと比較して、有効なアジュバント濃度を半減させることができ、よって副作用を潜在的に制限することができる。
【００１６】
ビロソーム二重層の外側リーフレットに特異的に両親媒性アジュバントを後挿入することは、当該技術分野において開示も示唆もされていない。例えば、ＷＯ２００７／０９９３８７は、ビロソーム様ベシクルの免疫賦活効果を、ベシクルを少なくとも１つのアジュバントと会合させることによって、更に増大させてもよいことを教示しているが、アジュバントが当該ベシクルの脂質二重層内に封入および／または組み込まれ、および／または当該ベシクルと自由に組み合わせてもよいことが一般的に教示されているに過ぎない。二重層の外側のリーフレットにおける後挿入アジュバントについては何ら言及も示唆もされていない。
【００１７】
第１の態様において、本発明は、予備形成されたビロソームの膜内に両親媒性アジュバントを導入する方法を提供する。第２の態様において、本発明は、ビロソーム膜の外側リーフレットにのみ存在するアジュバントを有するビロソームを提供する。
【００１８】
用語「ビロソーム」は、脂質膜に埋め込まれたウイルスエンベロープタンパク質を含有するリポソームを指す。ビロソームはインビトロで形成され、ウイルスコアタンパク質を含有しない。一般に、ビロソームは、約１５０ｎｍの平均直径を有する球状の単層ベシクルである。リポソームとは対照的に、ビロソームは一般に、リン脂質二重層膜にインターカレートされたインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）またはマトリックスタンパク質２（Ｍ２）のような機能性ウイルスエンベロープ糖タンパク質を含有する。これらのビロソームを産生するために、アジュバントを含まない通常のビロソームの水性懸濁液を、当該技術分野で公知の方法に従って最初に製造することができる。調製のプロトコルは、当業者に周知である。本発明に好適なプロトコルは、例えば、ＷＯ２００４／０４５５８２またはＥＰ  ０  ５３８  ４３７に記載されている。ある実施形態によれば、ビロソームは、ビロソームベシクルそれ自体、またはビロソームベシクルとリポソームベシクルの融合から生じるベシクルの何れかから得られてもよい。
【００１９】
ビロソームベシクルの調製は、当業者に公知の任意の方法、例えば、Ｂｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２０：３１３−３３１（１９９３）に記載されているような方法で行われてもよい。一実施形態において、ビロソームを調製する工程は、エンベロープウイルス、好ましくは、レトロウイルス科、風疹ウイルス、パラミクソウイルス科、フラビウイルス科、ヘルペスウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、ハンタウイルス科、バキュロウイルス科、コロナウイルス科、パポバウイルス科、ラブドウイルス科、アルファウイルス科、アルテリウイルス科、フィロウイルス科およびポックスウイルス科からなる群から選択されるウイルスの機能的再構成を含む。典型的には、ビロソームへのエンベロープウイルスの機能的再構成は、当該ウイルスのウイルスエンベロープの可溶化を可能にする短鎖リン脂質または界面活性剤を含有する溶液とエンベロープウイルスを接触させることを含み、当該溶液から短鎖リン脂質または界面活性剤を除去して、機能的に再構成されたウイルスエンベロープの形成を可能にすることを更に含む。好ましくは、リン脂質または界面活性剤は、透析、濾過、または疎水性ビーズへの吸収によって除去される。好ましい疎水性ビーズとしては、ポリスチレンジビニルベンゼンからなるビーズが挙げられる。ビロソームを調製するのに有用な脂質は、０．１  ｍＭより大きい、好ましくは０．３  ｍＭより大きい、より好ましくは１  ｍＭより大きい臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）を有する短鎖リン脂質である。例えば、リン脂質がホスファチジルコリン、好ましくは、１，２−ジヘプタノイル−ｓｎ−ホスファチジルコリンまたは１，２−ジカプロイル−ｓｎ−ホスファチジルコリンである場合、非常に良好な結果が得られる。ＷＯ２００４／０７１４９２も参照のこと。好適な界面活性剤も当該技術分野で公知である。好ましくは、界面活性剤は、オクタ−エチレン−グリコールモノ（ｎ−ドデシル）エーテルのような非イオン界面活性剤である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＲＳＶビロソームに後挿入されたアジュバント３−Ｄ−ＰＨＡＤの平衡密度勾配分析。パネルＡは、タンパク質、リン酸塩（リン脂質および３−Ｄ−ＰＨＡＤの両方に由来する）、および１．１、１．２と１．１１まで数値が連続的に増加するように示した画分の密度。パネルＢは、ＤＭＳＯに溶解した３−Ｄ−ＰＨＡＤのみの同様の勾配を示す。
【００２１】
【図２】図１Ａの勾配からの試料のＴＬＣプレート分析。レーン１：ＲＳＶウイルス脂質抽出物、レーン２：使用されたＰＣおよびＰＥ、レーン３：３Ｄ−ＰＨＡＤアジュバント、レーン４〜８：勾配の画分１．５〜１．９。エタノール染色後、スポットを丸で囲み、プレートをリンモリブデン酸塩試薬で顕色させた。
【００２２】
【図３】ＤＭＦ中の溶液由来のＲＳＶビロソーム中のアジュバント３−Ｄ−ＰＨＡＤの後挿入の平衡密度勾配分析。画分は数値が増加するように示されている。図１と同様の分析。
【００２３】
【図４】ＤＭＳＯ中の溶液由来のＲＳＶビロソーム中のアジュバントＭＰＬＡの後挿入の平衡密度勾配分析。画分は数値が増加するように示されている。図１と同様の分析。
【００２４】
【図５】ＤＭＳＯ中の溶液由来のＲＳＶビロソーム中のリポペプチドアジュバントの後挿入の平衡密度勾配分析。画分は数値が増加するように示されている。図１と同様の分析。
【００２５】
【図６】図５の勾配の画分からの試料の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。ウイルス膜タンパク質Ｆ（Ｆ１サブユニット）およびＧが示されている。リポペプチドには矢印が付されている。
【００２６】
【図７】ＥＬＩＳＡによって決定された抗ＲＳＶＩｇＧ。幾何平均力価の対数（ベース１０）表現であり、線は平均を示す。
【００２７】
【図８】Ｅｘ−ｖｉｖｏ中和抗体。力価の対数（ベース２）表現であり。線は平均を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
特異的な実施形態において、ビロソームは、例えば、インタクトなインフルエンザウイルスをオクタエチレングリコールモノ（ｎ−ドデシル）エーテル（Ｃ１２Ｅ８）で可溶化し、ヌクレオカプシドを沈殿させ（ウイルス性糖タンパク質および脂質が上清中に残存する）、上清中の界面活性剤を疎水性樹脂（Ｂｉｏ−Ｂｅａｄｓ  ＳＭ２）で除去した後、元のウイルス膜脂質およびスパイク糖タンパク質から再構成されてもよい（Ｓｔｅｇｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｆｆｉｃ  １：５９８−６０４，  １９８７）。様々に異なるウイルス株由来のＨＡを含有するビロソームの調製は、非イオン界面活性剤であるオクタエチレングリコールモノドデシルエーテルで可溶化されたウイルスの等量のタンパク質で行ってもよい。
【００２９】
Ｂｉｏ−Ｂｅａｄｓ  ＳＭ２を用いて界面活性剤を除去した後、ビロソームを含有する様々に異なるタイプの融合タンパク質が形成されてもよい。一実施形態によれば、本発明によるビロソーム様ベシクルは、ビロソームベシクルとリポソームベシクルとの融合体から得られても
【００３０】
従って、一実施形態によれば、本発明のビロソーム様ベシクルは、ビロソーム脂質およびリポソーム脂質を含んでもよい。
【００３１】
ビロソーム膜は、好ましくは、（ａ）脂質二重層、（ｂ）膜タンパク質、および（ｃ）場合により、更なる抗原を含む。好ましくは、膜タンパク質はウイルス膜融合タンパク質である。好ましくは、脂質二重層は、ウイルス膜の、融合タンパク質によって誘導される、ウイルスの天然宿主の宿主細胞との融合に適合し得る脂質組成物を有する。好ましくは、脂質組成物は、最適な融合ｐＨでの融合に適合し得る。ビロソームの産生のために、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のようなレトロウイルス科、風疹ウイルス、パラインフルエンザウイルス、はしか、流行性耳下腺炎、呼吸器系合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルスのようなパラミクソウイルス科、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、ダニ媒介性脳炎、セントルイス脳炎または西ナイルウイルスのようなフラビウイルス科、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルスのようなヘルペスウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、ハンターンのようなハンタウイルス科、コロナウイルス科、ヒト乳頭腫ウイルスのようなパポバウイルス科、狂犬病ウイルスのようなラブドウイルス科、ヒトコロナウイルスのようなコロナウイルス科、アルファウイルス科、アルテリウイルス科、エボラウイルスのようなフィロウイルス科、アレナウイルス科、天然痘ウイルスのようなポックスウイルス科、またはアフリカ豚コレラウイルス、といった種々のエンベロープウイルスのうち任意のものを、本明細書において提供されている方法において用いることができる。
【００３２】
ウイルスの融合タンパク質は、本明細書において、通常はエンベロープウイルスであるウイルスの内在性膜タンパク質を意味するものと理解され、このウイルスは、好適な細胞の表面上で発現される場合、適切なｐＨで細胞のこのウイルスの天然宿主である細胞との融合を誘導することができる。再構成ウイルス膜に組み込むためのウイルス融合タンパク質の例としては、セムリキ森林ウイルスＥ１タンパク質、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質、ＨＩＶ  ｇｐ１２０／ｇｐ４１タンパク質、パラミクソウイルスのＦタンパク質が挙げられる。また、標的細胞との融合を媒介することができる融合タンパク質の（遺伝子改変）変異体も包含される。ウイルス融合タンパク質によって誘導される２つのタイプの融合を区別することができる。第１のタイプの融合、例えば、ＨＩＶ  ｇｐ１２０／ｇｐ４１タンパク質またはパラミクソウイルスＦタンパク質によって誘発されるような融合は、通常は標的宿主細胞の表面において中性ｐＨで生じる。第２のタイプの融合、例えば、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質によって誘発されるような融合は、宿主細胞のエンドソーム区画内から、より低いｐＨ（５．０〜６．５）で内在化する際に生じる。両方のタイプの融合が本発明に特異的に含まれる。
【００３３】
宿主細胞と融合する本発明のビロソームの能力は故に、適切なウイルス融合タンパク質の存在に依存する。ただし、この能力は、融合が不可能である特定の合成脂質およびウイルス融合タンパク質からなるビロソームが当該技術分野において説明されているように、再構成ウイルス膜の二重層の脂質組成に更に依存する。ビロソームの脂質組成は、そのため、好ましくは、膜が適切なｐＨで適切な宿主細胞と融合することができるように選択される。ビロソームに融合活性を提供する１つの好ましい脂質組成物は、ウイルスの天然脂質を含む脂質組成物である。「ウイルスの天然脂質」という用語は、本明細書において、細胞、好ましくは、哺乳動物、昆虫または植物の細胞上で増殖したウイルス、または孵化卵上で増殖したウイルスの膜に存在する脂質を意味すると理解される。ウイルスの天然脂質は故に、好ましくは、合成脂質とは対照的に、このようにして増殖したウイルス粒子から得られるか単離される。
【００３４】
一方、本発明の機能的に再構成されたウイルス膜は、他の供給源由来の精製脂質、例えば、ウイルス脂質に加えて、精製脂質または合成脂質を含んでもよい。これら他の脂質は、調製中にビロソーム膜に添加することができる。ビロソームの融合活性は、一般に、ウイルス起源の脂質に似た脂質またはウイルスエンベロープの脂質組成に酷似した脂質混合物が添加された場合に最適に維持される。従って、本発明によれば、広範囲の脂質を当該ビロソーム膜に含めることができる。この群の脂質には、中性および荷電リン脂質、ステロイド由来脂質、中性および荷電合成脂質が含まれる。融合活性を有するビロソームの提供のための脂質組成物は故に、好ましくは、天然のウイルス膜から得られるか得ることができる組成物である。従って、本発明において用いられる脂質組成物は、ウイルスの天然脂質のみからなる組成物、他の供給源由来の脂質を補充したウイルスの天然脂質からなる組成物、並びに天然ウイルス膜の脂質組成物を模倣する、様々な供給源由来の脂質からなる組成物を含む。
【００３５】
これらの脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、スフィンゴミエリン（ＳＰＭ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、およびホスファチジルセリン（ＰＳ）のようなコレステロールおよびリン脂質を含んでもよい。ただし、他のリン脂質を添加してもよい。これらには、様々な脂肪アシル組成を有し、天然および／または（半）合成起源であるホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、カルジオリピン（ＣＬ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、並びにリン酸ジセチルが、それらに限定されることなく含まれる。また、セラミドおよび種々の糖脂質、例えば、セレブロシドまたはガングリオシドを添加してもよい。
【００３６】
本発明のビロソームは、好ましくは、カチオン性脂質、合成脂質、糖脂質、リン脂質、ステロールおよびそれらの誘導体からなる群から選択される脂質を含む。リン脂質は、好ましくは、様々な脂肪アシル組成を有するホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、カルジオリピンおよびホスファチジルイノシトールを含む。カチオン性脂質は、好ましくは、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、ＤＯＤＡＣ（Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ，−ジメチルアンモニウムクロリド）、ＤＤＡＢ（ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド）、ＴＣ−Ｃｈｏｌ（コレステリルＮ−（トリメチルアンモニオエチル）カルバメートクロリド）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（コレステリルＮ−（ジメチルアンモニオエチル）カルバメートクロリド）、または他のカチオン性コルステロール誘導体、およびステアリルアミンまたは他の脂肪酸アミン、ＤＰＰＥ（ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＯＧＳ（ジオレオイル−グリセロ−スクシネート）、ＤＯＳＰＡ（２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート）、ＤＯＳＰＥＲ（１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）プロピルアミド）、ＴＨＤＯＢ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２，３−ジオレオイルオキシ−１，４−（ブタンジアンモニウムヨージド）、ＤＯＰＡ（ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−ホスフェート）、ＤＯＴＰ（ジオクチルテレフタレート）、ＤＯＳＣ（ジオレオイル−スクシニル−グリセロール）、ＤＯＴＢ（ジオレオイル−ｅ−（４’−トリメチルアンモニオ）−ブタノイル−ｓｎ−グリセロール）、ＤＯＰＣ（ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−ホスファチジルコリン）、ＤＯＰＥ（ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−ホスファチジルエタノールアミン）などからなる群から選択される。特に好ましくは、カチオン性脂質は、ＴＣ−Ｃｈｏｌ（コレステリルＮ−（トリメチルアンモニオエチル）カルバメート）またはＤＣ−Ｃｈｏｌ（コレステリルＮ−（ジメチルアンモニオエチル）カルバメート）のようなカチオン性コレステロール誘導体から選択される。それらは、ＰＣ（ホスファチジルコリン）との混合物中の小さな単層リポソームとして処方されてもよい。本発明のビロソームは、好ましくは卵由来のＰＣおよび、より好ましくはＤＯＰＣ（ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホチジルコリン）、ＤＯＰＥ（ジオレオイル−Ｓｎ−グリセロ−ホスファチジルエタノールアミン）を含む。本発明のビロソームに組み込むことができるコレステロールまたはステロール誘導体の例として、コレステロールヘミスクシネート、ラノステロール、エルゴステロールのようなフィトステロール、並びにビタミンＤおよびビタミンＤ関連化合物が挙げられる。
【００３７】
アジュバントを含まない予備形成されたビロソームの外側リーフレットにアジュバントを導入するために、アジュバントを水と混合できる非水性溶媒に溶解する。その後、この溶液をアジュバントを含まないビロソームの水性懸濁液に添加する。溶媒の希釈は、アジュバントを不溶性にし、ビロソーム膜への自発的な一体化が達成される。
【００３８】
当業者は、水との均質な混合物を形成することができ、１相のみの溶液として説明可能な、製薬上許容可能な非水性溶媒を選択することができるであろう。例えば、それは当該技術分野において公知の溶媒の群から「医薬品における残留溶媒」として選択される。これらは、原薬または賦形剤の製造において、または薬剤製品の調製において使用または産生される有機揮発性化学物質として定義される。「水との均質な混合物を形成することができる」という表現は、用いられる特異的な条件下で、アジュバント溶媒が、ビロソーム組成物の水相と、そこに溶解されているアジュバントをビロソームに接触させることを可能にし、ビロソーム膜の外側リーフレットへのアジュバントの挿入を誘導するのに十分な程度まで混合することが意図されている。好適な溶媒は、アジュバントを効率的に溶解し、水と混合可能である。好ましくは、それらはビロソーム、特にこれらビロソームに存在する膜融合タンパク質を損傷しない。より好ましくは、これらの溶媒は製薬上許容可能であり、非毒性である。好ましい溶媒は、共沸溶媒、アルコールおよびエステルである。
【００３９】
溶解されたアジュバントの容量は、典型的には、それが希釈される水性ビロソーム組成物の容量と比べて小さい。例えば、アジュバント溶液は、少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも２０倍希釈される。
【００４０】
従って、アジュバント溶媒の水溶性は比較的低くてもよい。一実施形態において、非水性アジュバント溶媒は２０℃で少なくとも５  ｇ／１００  ｍＬの水への溶解度を有する。好ましくは、２０℃における水への溶解度は、少なくとも１０  ｇ／１００  ｍＬ、より好ましくは少なくとも２０  ｇ／１００  ｍＬである。好ましい実施形態において、アジュバント溶媒は水混和性溶媒、すなわち全ての割合で水と混合して均質な溶液を形成する溶媒である。
【００４１】
一実施形態において、アジュバント溶媒は、アセトニトリル、２−ブタノール、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸、ギ酸、メタノール、エタノール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、２−メチル−１−プロパノールおよびＴＨＦ、またはそれらの任意の混合物からなる群から選択される。ビロソームの融合活性が確実に維持されるように、選択されたアジュバント溶媒は膜融合タンパク質の機能を少なくとも部分的に保存すべきである。融合タンパク質の溶媒の悪影響に対する感受性は、融合タンパク質の特異的なタイプに依存する。一般に、低ｐＨでの融合を誘導する融合タンパク質は、ＤＭＳＯまたはＤＭＦのような溶媒に対する感受性はあまり高くないものの、酸性溶媒に対する感受性が非常に高いのに対し、パラミクソウイルスＦタンパク質のような中性ｐＨで機能する融合タンパク質は、溶媒のｐＨに対する感受性がずっと低い。当業者は、当該技術分野において公知の方法を用いて、融合タンパク質に対する所定の非水性溶媒の効果を試験し、評価することができるであろう。例えば、候補溶媒のパネルを、リポソーム標的を用いる無細胞融合アッセイにおいて、所定のビロソーム調製物の融合活性に対するその影響についてスクリーニングすることができる。融合は、インビトロ融合測定、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）（Ｓｔｒｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０：４０９３）によってモニターすることができる。アジュバント溶媒がＤＭＳＯ、エタノールまたはＤＭＦである場合、良好な結果が得られる。
【００４２】
本明細書において用いられる「アジュバント」という用語は、１つまたは複数の抗原と共に注射された場合、その抗原に対する免疫応答を非特異的に増強する任意の物質を指す。アジュバントは、その性質に応じて、細胞媒介性免疫応答、体液性免疫応答またはその２つの組合せを促進することができる。免疫応答の増強は非特異的であるので、同じアジュバントを様々に異なる抗原と併用して様々に異なる標的に対する応答を促進することができ、例えば、Ｍ．結核由来の抗原と併用してＭ．結核に対する免疫を促進でき、または腫瘍由来の抗原と併用してその特異的な種類の腫瘍に対する免疫を促進できることが十分理解される。本明細書において、アジュバントは、ヒトまたは動物を免疫化するために抗原と組み合わせて用いられる場合、免疫系を刺激し、それによって、好ましくは、アジュバントそのものに対して特異的な免疫応答を生じることなく、抗原に対する免疫応答に影響を及ぼすか、それを誘発するか、増強するか、または促進する任意の物質または化合物を含むことが意図されている。「両親媒性アジュバント」という用語は、疎水性膜が埋め込まれ、環境を意識した極性（頭部基）部分を有し、水中の脂質二重層ベシクルまたはミセルと会合し得る、より好ましくは一体化し得る、リポペプチド、モノ−ホスホリル脂質Ａ並びにその誘導体および類似体のような化合物および糖脂質を含む任意のアジュバントを含むことが意図されている。好ましくは、融合タンパク質、両親媒性アジュバントおよび、好ましくは随意の更なる抗原もまた、脂質二重層の疎水性内部と相互作用する、すなわち、二重層の脂質との、および／または互いの疎水性相互作用を通じて、ウイルス膜の二重層に会合、一体化、および／または埋め込まれる。
【００４３】
本発明のビロソーム膜は、好ましくは機能的に、脂質、両親媒性アジュバント、ウイルス融合タンパク質および１つまたは複数の抗原を含むビロソームであって、両親媒性アジュバント、脂質、ウイルス融合タンパク質および抗原は、主に疎水性相互作用を通じて相互作用し、両親媒性アジュバントの疎水性部分は、好ましくは、脂質二重層膜の一体部分を形成し、当該二重層は融合タンパク質、抗原および脂質を更に含有する。機能的再構成とは、再構成された膜が膜融合活性を有することを意味する。好ましい再構成ウイルス膜はベシクルの形態である。
【００４４】
この用語にはまた、二重層膜の内部、疎水性領域、および外部に向かって配向されたその極性頭部基部分、膜の極性表面と接触するその疎水性部分を有する脂質二重層（ウイルスの天然脂質を含む）に安定に組み込まれた任意の両親媒性アジュバントも含まれる。しかしながら、より顕著でない両親媒性を有する、すなわち極性を持たないか弱い極性しか持たない極性頭部基部分を有するが、脂質二重層ベシクルに会合または一体化することができる、より疎水性の高いアジュバントは特異的に本発明から排除されない。
【００４５】
本明細書において、アジュバントは、ヒトまたは動物に免疫性を与えるために抗原と組み合わせて用いられる場合、免疫系を刺激し、それによって、好ましくは、アジュバントそのものに対して特異的な免疫応答を生じることなく、抗原に対する免疫応答を誘発するか、増強するか、または促進する任意の物質または化合物を含むことが意図されている。好ましいアジュバントは、Ｔｈ２型応答からＴｈ１型応答への免疫応答を歪める。他の好ましいアジュバントは、アジュバントが存在しないこと以外は同じ条件下で抗原に対して生成された免疫応答と比較して、所定の抗原に対する免疫応答を少なくとも１．５、２、２．５、５、１０または２０倍増加させる。他の好ましいアジュバントは、免疫応答の持続時間を向上させる。対応する対照群にわたって動物またはヒトの群におけるアジュバントによって産生される所定の抗原に対する免疫応答の統計的平均増強を決定するための試験が、当該技術分野において利用可能である。アジュバントは、好ましくは、少なくとも２つの異なる抗原に対する免疫応答に影響を及ぼすか、増強することができる。本発明の機能的ビロソームに組み込まれるアジュバントは、好ましくは、両親媒性アジュバントである。
【００４６】
好ましい実施形態において、ビロソーム中に存在する両親媒性アジュバントは、ヒトにおける使用について製薬上許容可能である。本発明の両親媒性アジュバントは、好ましくは、抗原に共有結合せず、再構成膜の脂質二重層中に共に存在する。抗原とアジュバントとが共有結合していないという事実は、抗原の処理およびそのエピトープの免疫系への提示が、天然のタンパク質単独のものと本質的に同一であり、天然の病原体上に存在するタンパク質の良好な認識を確実なものにすることを保証する。一方、抗原およびアジュバントの脂質二重層（および互い）との疎水性相互作用は、調製物中のビロソーム上にわたるアジュバントおよび抗原の分布を可能にし、それによって調製物中の膜ベシクルの大部分が、単一ベシクル中に抗原およびアジュバントの両方を含有し、より好ましくはベシクルの少なくとも６０、７０、８０、９０または９５％が、抗原およびアジュバントの両方を含有する。単一の膜またはベシクルにおける抗原とアジュバントとの組み合わせは、アジュバントによって活性化される抗原提示細胞への抗原の送達を可能にし、それによってビロソームの治療および／または予防有効性が増加する。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態において、当該両親媒性アジュバントは、抗原提示細胞上に存在するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）によって認識される。代替的に、両親媒性アジュバントは、他の受容体を標的としてもよい。ＴＬＲによって認識される種々の化合物は当該技術分野において公知であり、例えば、リポペプチド、モノ−ホスホリル脂質Ａおよびモノ−ホスホリル脂質Ａの誘導体または合成もしくは半合成類似体、リポ多糖類、ペプチドグリカン、リポタイコ酸、リポタンパク質（マイコプラズマ、マイコバクテリアまたはスピロヘータ由来）、二本鎖ＲＮＡ（ポリＩ：Ｃ）、非メチル化ＤＮＡ、リポアラビノマンナン、フラジェリン、ＣｐＧ含有ＤＮＡ、およびイミダゾキノリンが挙げられる。そのようなＴＬＲ認識アジュバントは、それ自体で両親媒性アジュバントであってもよく、または代替的に、それらは、例えば、疎水性化合物（下記参照）の極性ＴＬＲリガンドへの接合によって、両親媒性アジュバントに改変されてもよい。好ましい両親媒性アジュバントには、モノ−ホスホリル脂質Ａおよびその誘導体並びにリポペプチドが含まれる。
【００４８】
一実施形態において、本発明のビロソームは、ＰＨＡＤ（リン酸化ヘキサアシルジサッカライド）およびその３−Ｏ−デスアシル誘導体である３−Ｄ−ＰＨＡＤから選択される合成アジュバントの存在によって特徴付けられる。両者とも、合成ＴＬＲ−４アゴニストとして当該技術分野において公知である。ＰＨＡＤは、当該技術分野においてグリコピラノシド脂質ＡまたはＧＬＡとも呼ばれる。Ｌｏｕｓａｄａ−Ｄｉｅｔｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅを参照。２０１１  Ａｐｒ  １２；２９（１７）：３２８４−９２．一実施形態において、ビロソームは、以下の構造を有するＰＨＡＤを含有する（記号１４は各アシル鎖中の炭素原子の総数を示す）。
【化１】
0006466571.tif 000002
【００４９】
別の好ましい実施形態において、ビロソームは、以下の構造を有する３−Ｄ−ＰＨＡＤを含有する。
【化２】
0006466571.tif 000003
【００５０】
本発明の別の実施形態において、当該両親媒性アジュバントは糖脂質である。両親媒性アジュバントとして用いるのに好ましい糖脂質は、アジュバント活性を有し、ヒトにおける使用について製薬上許容可能である。糖脂質は、１つまたは複数の糖に共有結合した脂質（または他の疎水性化合物）である。例示的な糖脂質アジュバントには、α−ガラクトシルセラミド、ホスファチジルイノシトールマンノシド、内毒素性リポ多糖類の誘導体およびその誘導体が含まれる。非常に好ましい実施形態において、本発明は、糖脂質がα−ガラクトシルセラミドまたはホスファチジルイノシトールマンノシドである、本発明によるビロソームを提供する。「α−ガラクトシルセラミド」および「ホスファチジルイノシトールマンノシド」という各用語は、何れかの任意の誘導体を含むことが意図されている。アジュバント活性を有し、本発明の文脈において有用であるこれらの分子の誘導体は、例えば、それぞれ米国特許第５，９３６，０７６号および米国特許第４，５４２，２１２号に記載されている。本発明における使用のための他の好適な糖脂質アジュバントには、例えば、遺伝的に改変されたグラム陰性病原体から得られてもよく、かつＷＯ０２／０９７４６に概説されているように、ＬＰＳの脂質Ａ部分の毒性が低減しているがアジュバント活性（の一部）を保持しているグラム陰性細菌の内毒素性リポ多糖類（ＬＰＳ）の改変形態が含まれる。
【００５１】
本発明において両親媒性アジュバントとして用いるための改変ＬＰＳは、好ましくは、毒性が低減された改変脂質Ａ部分を有する。改変ＬＰＳの毒性は、好ましくは対応する野生型ＬＰＳの毒性未満であり、より好ましくは、改変ＬＰＳの毒性は、野生型ＬＰＳの毒性の９０、８０、６０、４０、２０、１０、５、２、１、０．５または０．２％未満である。低減した毒性を有する野生型および種々の改変ＬＰＳの毒性は、当該技術分野で公知の任意の好適なアッセイにおいて決定されてもよい。一方、毒性が低減された改変ＬＰＳは、十分な免疫刺激活性、すなわちアジュバント活性を依然として有していなければならない。低下した毒性を有する改変ＬＰＳは、好ましくは、対応する野生型ＬＰＳの免疫刺激活性の少なくとも１０、２０、４０、８０、９０または１００％を有する。免疫刺激活性は、上記のように実験動物においてインビボで、またはインビトロで決定されてもよい。インビトロの場合、例えば、ＬＰＳ刺激樹状細胞による少なくとも１つのサイトカイン（例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−６およびＩＬ−１−ベータのうちの１つ）の産生を測定すること、またはＬＰＳ刺激樹状細胞上の少なくとも１つの共刺激分子（例えば、ＣＤ４０またはＣＤ８６）の発現を測定することによって試験されるＬＰＳとのインキュベーションによって刺激された樹状細胞の成熟を決定することによって行われてもよい。
【００５２】
本発明の別の態様において、本発明によるビロソーム中に存在する両親媒性アジュバントはペプチド、好ましくは、両親媒性ペプチドである。両親媒性アジュバントとして用いるのに好ましいペプチドは、アジュバント活性を有し、ヒトにおける使用について製薬上許容可能である。アジュバント活性を有するペプチド、特に極性ペプチドは、それらを好適な疎水性化合物（上記参照）に（共有結合的に）連結することによって両親媒性アジュバントにされてもよい。代替的に、両親媒性ペプチドは、以下に記載される膜貫通配列のようなアミノ酸の疎水性ストレッチを含んでもよい。好ましいペプチドは、ＮｏｔｃｈリガンドＪａｇｇｅｄ−１（Ｗｅｉｊｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２；  Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＣ  ５２０２０参照）由来の配列またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓタンパク質Ａ由来の配列を含む。Ｊａｇｇｅｄ−１またはタンパク質Ａ由来の配列を有するペプチドは、好ましくは、好適な疎水性化合物（上記参照）に共有結合され、および／または膜貫通配列（下記参照）を含む。脂質二重層から突出するＪａｇｇｅｄ−１またはタンパク質Ａ由来のペプチドの（極性）部分は、好ましくは、３、４、５、６、７または８以下のアミノ酸を含む。
【００５３】
本発明のビロソームは、融合タンパク質および、随意に更なる抗原を含む。従って、ウイルス融合タンパク質のみを含み、更なる抗原を含まないビロソームは、本発明の一部であり、この場合、ウイルス融合タンパク質は、融合タンパク質としてのその機能に加え、抗原としての機能も有することが理解されるべきである。一方、ビロソームは故に、ウイルス融合タンパク質に加えて１つまたは複数の更なる抗原を含んでもよい。従って、一実施形態において、ビロソームは、少なくとも１つの更なる抗原、好ましくは、腫瘍抗原またはウイルス、寄生虫、真菌または細菌に由来する抗原を含む。
【００５４】
本発明による再構成ウイルス膜の一部である抗原は、好ましくは、再構成ウイルス膜ベシクルの脂質二重層膜に挿入することができる疎水性部分を有する。ウイルス、細菌、酵母および寄生虫のような多くの病原性実体は、そのキャプシド、細胞壁または膜内に、宿主において免疫応答を誘発するタンパク質を担持する。例えば、膜貫通セグメントのような疎水性要素を有し、本発明による再構成ウイルス膜の一部として好適な抗体の例として、病原体の膜（ウイルスの場合はエンベロープとも呼ばれる）に存在するタンパク質が挙げられる。従って、好ましくは、本発明の再構成ウイルス膜中に存在する抗原は、内在性膜タンパク質である。本発明のビロソーム中の抗原タンパク質は、それらがウイルス膜または細胞膜に現れるのと同じ様式で配向されるが、膜脂質二重層中に存在する場合、通常は部分的または少なくとも一時的に隠されたエピトープを提示してもよい。これらの抗原提示ビロソームによる免疫系の刺激は、免疫系の細胞によるそれらの特異的認識、それらの特定の性質、タンパク質の提示、および隠されたエピトープの暴露の組み合わせによるものであってもよい。好ましくは、本発明のビロソームに用いられる抗原タンパク質は、１つまたは複数の防御エピトープ、すなわち、抗原が由来する病原体による感染を防御する、または抗原を発現する腫瘍に対して防御する免疫応答を哺乳動物において誘発することができるエピトープを含む。
【００５５】
好ましい実施形態において、当該抗原は、ウイルス、寄生虫、真菌または細菌に由来する。本発明によるビロソームの形成に適用および使用することができる抗原は、あらゆる種類のウイルスに由来し得るが、そのようなウイルスの非限定的な例として、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のようなレトロウイルス科、風疹ウイルス、パラインフルエンザウイルス、はしか、流行性耳下腺炎、呼吸器系合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒトメタニューモウイルスのようなパラミクソウイルス科、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、ダニ媒介性脳炎、セントルイス脳炎または西ナイルウイルスのようなフラビウイルス科、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルスのようなヘルペスウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、ハンターンのようなハンタウイルス科、コロナウイルス科、ヒト乳頭腫ウイルスのようなパポバウイルス科、狂犬病ウイルスのようなラブドウイルス科、ヒトコロナウイルスのようなコロナウイルス科、アルファウイルス科、アルテリウイルス科、エボラウイルスのようなフィロウイルス科、アレナウイルス科、天然痘ウイルスのようなポックスウイルス科、およびアフリカ豚コレラウイルス、が含まれる。特に好ましいのは、当該抗原がインフルエンザウイルスまたはＲＳＶ由来であるビロソームである。本発明のビロソームに用いることができるインフルエンザウイルス由来のタンパク質は、好ましくは、赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質および／またはＭ２タンパク質の単独または組み合わせである。本発明のビロソームに用いることができるＲＳＶ由来のタンパク質は、融合（Ｆ）、糖タンパク質（Ｇ）および／またはマトリックス（Ｍ）タンパク質である。
【００５６】
同様に、そのような抗原は、病原性細菌、真菌（酵母を含む）、または寄生虫に由来してもよい。そのような抗原としては、例えば、Ｈ．ピロリのようなヘリコバクター属、Ｎ．髄膜炎菌のようなナイセリア属、Ｈ．インフルエンザのようなヘモフィルス属、Ｂ．百日咳のようなボルデテラ属、クラミジア属、連鎖球菌ｓｐ．血清型Ａのような連鎖球菌属、Ｖ．コレラのようなビブリオ属、例えば、サルモネラ、シゲラ、カンピロバクターおよびエシェリキア属を含むグラム陰性腸内病原菌、の細菌性抗原、並びに炭疽、ハンセン病、結核、ジフテリア、ライム病、梅毒、腸チフスおよび淋病を引き起こす細菌由来の抗原が挙げられる。寄生虫由来の抗原には、例えば、バベオシスボビス、プラスモディウム、リーシュマニアｓｐｐ．  トキソプラスマ、およびＴ．クルージのようなトリパノソーマ属といった原生動物由来の抗原が含まれる。真菌抗原は、アスペルギルス属ｓｐ．、カンジダアルビカンス、例えば、Ｃ．ネオフォルマンスおよびヒストプラスマカプスラーツムのようなクリプトコックスといった真菌由来の抗原を含んでもよい。
【００５７】
ワクチン接種は、一般に、病原体に対する予防的防御または病原体感染後の疾患の治療について適用されるが、当業者は、腫瘍治療のためのワクチンの適用について認識している。更に、益々多くの腫瘍特異的タンパク質が、ヒトまたはヒト化抗体によって標的化され得る適切な実体であると見出されている。そのような腫瘍特異的タンパク質もまた、本発明の範囲内である。多くの腫瘍特異的抗原が当該技術分野で公知である。従って、１つの好ましい実施形態において、本発明は、腫瘍特異的抗原を含むビロソームを提供する。好適な腫瘍抗原には、例えば、癌胎児抗原、前立腺特異的膜抗原、短縮型上皮成長因子受容体（ＥＧＲＦ）、トムセン−フリーデンライヒ（Ｔ）抗原、ＧＭ−２およびＧＤ−２ガングリオシド、Ｅｐ−ＣＡＭ、ムチン−１、上皮糖タンパク質−２、および結腸特異的抗原が含まれる。
【００５８】
これらの病原体に由来する好ましい抗原は、内在性膜タンパク質である。しかしながら、非膜タンパク質抗原またはそれらの防御エピトープを含む部分もまた、それらを膜貫通配列に融合させる本発明における使用のために改変されてもよい。従って、一実施形態において、抗原は、内在性膜タンパク質または膜アンカー部分に結合した抗原である。例えば、抗原は、膜貫通ドメインまたは膜アンカー型アミノ酸配列に結合することができる。膜貫通配列または膜アンカー配列は当該技術分野において周知であり、哺乳類の膜貫通分子の遺伝的ジオメトリに基づく。膜貫通配列は、通常、約１０〜３０個、通常およそ２０個のアミノ酸のストレッチからなり、その大部分は疎水性側鎖を有する。膜貫通配列は、広範囲のタンパク質について公知であり、これらのうちの何れを用いてもよい。本発明における使用のための膜アンカー配列の例としては、例えば、ＣＤ８、ＩＣＡＭ−２、ＩＬ−８Ｒ、ＣＤ４およびＬＦＡ−１に由来するものが挙げられる。好ましくは、膜貫通配列は、ウイルス膜に天然に存在するウイルス内在性膜タンパク質に由来する。その例としては、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）糖タンパク質Ｇの膜貫通領域（例えば、アミノ酸３８〜６３）またはインフルエンザウイルスノイラミニダーゼの膜貫通領域（例えば、アミノ酸７〜２７）が挙げられる。疎水性相互作用は、水性環境中に存在する疎水性物質間の非共有、非静電的引力によって生じる。一実施形態において、膜アンカー部分は脂質部分、好ましくは、リン脂質またはアシル鎖である。従って、更に好ましい抗原は、リン脂質またはアシル鎖などの疎水性物質に共有結合する可溶性タンパク質またはペプチドであり、これによってビロソーム膜へそれらの組み込みが可能になる。
【００５９】
本発明はまた、本発明による新規な「後挿入」の方法によって得られるアジュバント添加ビロソームを提供する。そのようなアジュバント添加ビロソームは、とりわけ、アジュバントが、本質的にビロソーム膜の外側リーフレットに閉じ込められた両親媒性アジュバントであることを特徴とする。好ましくは、アジュバント添加ビロソームは、本明細書において上記した１つまたは複数の両親媒性アジュバントを含む。特に好ましいビロソームは、エンベロープウイルス、好ましくは、レトロウイルス科、風疹ウイルス、パラミクソウイルス科、フラビウイルス科、ヘルペスウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、ハンタウイルス科、バキュロウイルス科、コロナウイルス科、パポバウイルス科、ラブドウイルス科、アルファウイルス科、アルテリウイルス科、フィロウイルス科およびポックスウイルス科からなる群から選択されるウイルスに由来するものである。
【００６０】
アジュバント添加ビロソームは、少なくとも１つの更なる抗原、好ましくは、腫瘍抗原またはウイルス、寄生虫、真菌または細菌に由来する抗原を含んでもよい。特異的な実施形態において、抗原はウイルス抗原であり、好ましくは、インフルエンザウイルスまたはＲＳＶに由来する。本明細書において上記したように、抗原は、好ましくは、膜アンカー部分が膜貫通ドメイン、膜アンカーアミノ酸配列または脂質部分である、内在性膜タンパク質または膜アンカー部分に結合した抗原であり得る。
【００６１】
他の特異的に好ましいビロソームは、ヒトメタニューモウイルス、パラミクソウイルスＦタンパク質、単純ヘルペスウイルスｇＤおよびｇＢタンパク質、ＨＩＶ  ｇｐ４１タンパク質由来のタンパク質またはペプチドを追加的に含有するインフルエンザビロソーム、ＣＳおよびＡＭＡのようなマラリアタンパク質由来のタンパク質およびペプチドを含有するインフルエンザビロソーム、または乳癌ワクチンに有用な抗原を追加的に含有するインフルエンザビロソームに由来する抗原を含むものである。
【００６２】
本発明によるビロソームは、物質（例えば、免疫原性分子、薬剤および／または遺伝子）を標的細胞に送達するために用いられてもよい。リポソームとは異なり、ビロソームは、ウイルスエンベロープタンパク質によって誘発される細胞への効率的な侵入の利点を提供し、次いで、ビロソームの内容物の細胞内放出をもたらす。更に、ビロソームは、特定の活性ウイルスエンベロープタンパク質がそれらの膜に組み込まれる場合、細胞膜との融合の直後に、その内容物を細胞質に放出してもよく、例えば、これにより、エンドソームの酸性環境における治療物質の分解が防止される。本発明によるビロソームは、特定の疾患または障害に関連する抗原に対する免疫応答を刺激することが望ましいワクチン接種の分野において特に有用である。そのような場合、抗原は、典型的には、ビロソーム中に封入されているか、ビロソームに結合しており、その後、ビロソームはこの抗原をワクチン接種される宿主免疫系に送達する。送達される特定の抗原のために、結果として生じる予防薬および／または治療薬は、必然的に抗原が会合する疾患または障害に対して特異的である。
【００６３】
従って、更なる態様において、本発明は、活性成分として本発明によるビロソームおよび製薬上許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬調製物を提供する。製薬上許容可能な安定剤、浸透圧剤、緩衝剤、分散剤なども医薬組成物に組み込んでもよい。好ましい形態は、意図された投与の形式および治療的適用に依存する。医薬担体は、患者にビロソームを送達するのに好適な任意の適合する非毒性物質であり得る。
【００６４】
鼻腔内送達のための製薬上許容可能な担体は、水、緩衝食塩水、グリセリン、ポリソルベート２０、クレモホールＥＬおよびカプリル酸／カプリン酸グリセリドの水性混合物によって例示され、中性ｐＨ環境を提供するために緩衝化されてもよい。非経口送達のための製薬上許容可能な担体は、随意的に２０％アルブミンを補充した滅菌緩衝化０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌまたは５％（ｗ／ｖ）グルコースによって例示される。非経口投与用の調製物は無菌でなければならない。ポリペプチドまたは抗体の投与のための非経口経路は公知の方法に従っており、それらの方法には、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内または病巣内経路による注射または注入が含まれる。
【００６５】
筋肉内注射のための典型的な医薬組成物は、例えば、１〜１０  ｍｌのリン酸緩衝食塩水および１〜１００μｇ、好ましくは１５〜５０μｇ（の抗原タンパク質）の本発明のビロソームを含有するように構成されるであろう。
【００６６】
経口投与の場合、活性成分は、エリキシル剤、シロップ剤、および懸濁剤のような液体剤形で投与することができる。経口投与のための液体剤形は、患者の受容度を高めるために着色剤および香味料を含有することができる。非経口的に、経口的にまたは鼻腔内に投与可能な組成物を調製する方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１５ｔｈ  ｅｄ．，
Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ，  １９８０）（あらゆる目的のためにその全体が参照によって組み込まれる）を含む様々なソースにおいてより詳細に説明されている。
【００６７】
一実施形態において、本発明のビロソームは、免疫原性組成物またはワクチンに含まれる。「ワクチン」という用語は、細胞および／または抗体免疫応答を誘導するために宿主に投与されてもよい調製物を指す。ワクチンは、追加的なアジュバント、製薬上許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含有してもよい。例示的な更なるアジュバントは、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、ゲルブアジュバント（ＧＭＤＰ；  Ｃ．Ｃ．Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ．）、ＲＩＢＩトリアジュバント（ＭＰＬ；  ＲＩＢＩ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｉｎｃ．）、カリウムミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＱＳ２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、タイターマックスアジュバント（ＣｙｔＲｘ）、およびクイルＡアジュバントを含む。アジュバント特性を有してもよい他の化合物には、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、またはゼラチンのような結合剤、デンプン、ラクトースまたはデキストリンのような賦形剤、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、プリモゲル、コーンスターチなどのような崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムまたはステロテックスのような潤滑剤、コロイド状二酸化ケイ素のような流動促進剤、スクロースまたはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジフレーバーのような香味剤、および着色剤が含まれる。
【００６８】
一実施形態において、本発明のビロソームは、凍結乾燥後に凍結乾燥または再水和されてもよい。凍結乾燥ビロソームは、乾燥粉末としてのワクチン、または再水和後のワクチンとして用いられてもよい。
【００６９】
医薬品として使用するための本発明によるアジュバント添加ビロソームもまた提供される。例えば、本明細書において、癌または感染性疾患の予防または治療の方法における使用のためのアジュバント添加ビロソームが提供される。一実施形態において、アジュバント添加ビロソームは免疫原性である。「免疫原性」という用語は、抗体応答および／または細胞媒介性免疫応答（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含む）を産生することを含む、宿主動物における免疫応答の誘発が可能な分子を指す。
【００７０】
アジュバント添加ビロソームまたはワクチンの投与量は、例えば、予防的および／または治療的免疫応答を誘発するのに有効な最初に同定される用量によって決定することができる。これは、ウイルス特異的免疫グロブリンの血清力価を測定することによって、および／または血清試料、尿試料および／または粘膜分泌物中の抗体の阻害率を測定することによって達成されてもよい。投与量は、ＲＳＶに対する天然宿主ではない動物を含む動物研究から決定することができる。例えば、動物にワクチン候補を投与し、誘発された免疫応答を部分的に特徴づけ、および／または中和抗体が産生されたかどうかを決定することができる。更に、ヒトのための有効用量を決定するために、定常的なヒト臨床研究を行うことができる。有効な用量は、インビトロおよび／またはインビボ動物モデルに由来する用量反応曲線から外挿されてもよい。
【００７１】
一実施形態において、本発明に従って調製された医薬品の１日用量は、１日当たり成人１人あたりビロソーム１０  ｎｇ／ｋｇから約１０  ｇ／ｋｇの範囲で変動する。経口投与の場合、医薬品は、好ましくは、治療過程における患者の徴候および症状に応じた投薬量の症候的調整のために０．００１〜１，０００  ｍｇ、好ましくは０．０１〜１００  ｍｇ、より好ましくは０．０５〜５０  ｍｇ、最も好ましくは０．１〜２０  ｍｇのビロソームを含有する錠剤の形態で提供される。錠剤は、例えば、０．００１、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２．５、１０、２０、５０または１００ミリグラムのビロソームを含有してもよい。実施形態に従って調製された医薬品中の有効量のビロソームは、通常、投与単位当たり、体重に対して約０．０００１  ｍｇ／ｋｇ〜約５０  ｍｇ／ｋｇの投与量レベルで供給される。より詳細には、その範囲は１日当たり体重に対して約０．０００１  ｍｇ／ｋｇ〜７  ｍｇ／ｋｇである。小児に投与される場合、投与量は適切に低減されてもよい。
【００７２】
ワクチンは、一実施形態において、希釈剤を用いて処方されてもよい。例示的な「希釈剤」には、水、生理食塩水、ヒト血清アルブミン、油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒、ベンジルアルコールのような抗菌剤、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムのような酸化防止剤、エチレンジアミン−テトラ−酢酸のようなキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝剤、および浸透圧を調整するための塩化ナトリウムまたはデキストロースのような助剤が含まれる。例示的な「担体」には、液体担体（例えば、水、生理食塩水、培地、生理食塩水、水性デキストロースおよびグリコール）および固体担体（デンプン、グルコース、ラクトース、スクロースおよびデキストランによって例示される炭水化物、アスコルビン酸およびグルタチオンによって例示される酸化防止剤、ならびに加水分解されたタンパク質が含まれる。
【００７３】
ワクチンは、一実施形態において、賦形剤を含有してもよい。「賦形剤」という用語は、本明細書において、抗原の送達のためのビヒクルを形成する任意の不活性物質（例えば、アラビアゴム、シロップ、ラノリン、デンプン、など）を指す。賦形剤という用語は、十分な液体の存在下で、丸薬または錠剤の調製に必要な接着品質を組成物に付与する物質を含む。
【００７４】
一実施形態において、免疫応答は、ビロソームに含まれる目的とするタンパク質に特異的に結合する抗体の産生を含む。抗体または細胞（リンパ球細胞など）と別の分子（タンパク質またはペプチドなど）との相互作用に関して用いられる場合の「特異的な結合」または「特異的に結合」という用語は、相互作用が分子上の特定の構造（すなわち、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味する。
【００７５】
別の実施形態において、免疫応答は、目的とするタンパク質に特異的に結合するＴリンパ球の数を増加させることを含む。「Ｔリンパ球」という用語は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、ヘルパーＴ細胞、およびサプレッサーＴ細胞のうちの１つ以上を含むが、これに限定されない。Ｔリンパ球は、ＭＨＣ分子と合成されたペプチドフラグメントの形態で抗原を認識する受容体を発現する。
【００７６】
従って、本発明のビロソームは、一実施形態において、ワクチンに組み込まれてもよく、免疫学的に有効な量のワクチンを動物に投与して免疫応答を生じさせてもよい。本明細書において用いられる場合、「免疫原性的に有効な量」および「免疫学的に有効な量」という各用語は、ワクチン接種時の宿主において免疫応答（特異的抗体の産生および／またはＴＣＬ応答の誘導を含む）を誘発および／またはその産生を増加させる分子の量を指す。必須ではないが、免疫学的に有効な（すなわち免疫原性的に有効な）量は「防御的」量であることが好ましい。組成物の「防御的」および「治療的」量という各用語は、疾患の１つまたは複数の症状を遅延、軽減、緩和、改善、安定化および／または逆転させる組成物の量を指す。
【００７７】
本発明のビロソームまたはワクチンは、一実施形態において、予防的に（すなわち、感染因子による感染および／または疾患症状の観察の前に）および／または治療的に（すなわち、感染因子による感染および／または疾患症状の観察後に）投与されてもよい。投与はまた、１つまたは複数の疾患症状の発現に付随して（すなわち、それと同時に、またはその間に）行われてもよい。また、本発明のビロソームまたはワクチンは、別の種類の薬剤または治療手順（例えば、外科手術、化学療法、放射線療法など）の投与の前、同時、および／または後に投与してもよい。本発明の化合物を投与する方法には、非経口、経口、腹腔内、鼻腔内、局所（例えば、直腸および膣）および舌下形態での投与が含まれるが、これらに限定されない。非経口投与経路には、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内注射および注入経路が含まれる。更なる態様において、本発明は、治療上または予防上有効な量の本発明のビロソーム（を含む医薬組成物）を、予防または治療を必要とする被験体に投与することによって行われる、感染症もしくは腫瘍に対するワクチン接種、またはその予防もしくは治療のための方法に関する。本発明はまた、医薬品、好ましくは感染症もしくは腫瘍に対するワクチン接種、またはその予防もしくは治療のための医薬品として使用される本発明のビロソームにも関する。本発明は更に、感染症もしくは腫瘍に対するワクチン接種、またはその予防もしくは治療のための医薬品の製造における本発明のビロソームの使用に関する。一実施形態において、本発明は、免疫学的に有効な量の本発明の免疫原性組成物を被験体に投与して免疫応答を生じることを含む、癌またはウイルス性疾患に対して被験体を免疫化する方法を提供する。例えば、ウイルス性疾患は、ＲＳＶ、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、またはサイトメガロウイルスによって引き起こされる。
【００７８】
より更なる態様は、薬剤開発の領域、特にワクチンの最適化に関する。ビロソームに基づくワクチンのアジュバント／抗原比を最適化する方法が提供される。この方法は、本発明によるアジュバント添加ビロソームを含む、それぞれが別個のアジュバント・抗原比を有する少なくとも２つの調製物を調製すること、および／または本発明による「後挿入」法を用いること、および試験対象内のそれぞれの調製物を免疫応答を誘導する効力について評価することを含む。本明細書において上記に説明したように、この方法は、アジュバント添加ビロソームを含むワクチンの前臨床および臨床試験に関して重要な利点を有する。予備形成されたビロソーム組成物は「原薬Ａ」を形成し、一方、溶媒中のアジュバントは「原薬Ｂ」であるので、必要なのは、原薬ＡおよびＢの安全性および臨床試験のみである。別個のアジュバント／抗原比を有する少なくとも２つの薬剤製品調製物への原薬ＡおよびＢの組み込みを臨床で行うことができ、そのため、前臨床試験およびその後の臨床試験において、コストがかかる個々のアジュバント／抗原比についての安全性評価をしなくても済むようになる。更に、この方法は、任意のビロソームを用いて様々に異なるアジュバントを試験することを可能にし、または様々に異なるビロソームを用いて任意のアジュバントを経済的に試験することを可能にする。
【実施例】
【００７９】
実施例１：ＲＳＶビロソームへの後挿入によるアジュバントＭＰＬの組み込み
ビロソームは、当該技術分野において説明されているように、精製された呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、Ａ２株から調製された。簡潔に言うと、ウイルスを５０  ｍＭジ−カプロイルホスファチジルコリン（ＤＣＰＣ）中で氷上で３０分間可溶化し、ウイルスヌクレオカプシドを１２０，０００ｇで３０分間遠心分離することによって除去した。上清を回収し、０．１μｍフィルターで濾過した。ホスファチジルコリン（ＰＣ）とホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）（ソース：鶏卵、それぞれ、鶏卵からリン酸基転移された）の混合物から、溶媒蒸発により、２：１のモル比で薄い脂質フィルムを調製した（クロロホルム／メタノール２：１ｖ／ｖ）。ウイルス膜上清（２．３５  ｍｌ）を、８５０  ｎｍｏｌのリン脂質当たり１  ｍｇのタンパク質の比で薄い脂質フィルムに添加した。混合物を０．２μｍのフィルターでろ過し、ガンマ線照射（１０  ｋＤａ分子量カットオフ）により、２リットルのＨＮＥ緩衝液を７回取り替えて４８時間、４℃で滅菌したスライド−ａ−ライザー透析カセット中で透析した。ビロソームを収穫し、ビロソーム中のリン脂質濃度を測定した。
【００８０】
ＤＭＳＯ中の、両親媒性アジュバントである、合成モノ−ホスホリル脂質Ａ類似体３−Ｄ−ＰＨＡＤ（ＷＯ２０１３／１５５４４８に開示）のストック溶液を調製した。８５０ｎｍｏｌのリン脂質を含有するビロソーム９７５μｌに、１５３ｎｍｏｌの３−Ｄ−ＰＨＡＤを含有する２５μｌのＤＭＳＯ溶液を、ボルテックスミキサーで試料を攪拌しながら急速に添加した。４℃で一晩保存した後、ビロソームの密度を、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＡＨ  ６５０ローターにおいて５０ｋｒｐｍで６６時間回転させた１０〜６０％スクロース勾配上に負荷された平衡密度勾配遠心分離によって分析した。対照として、１５３ｎｍｏｌの３Ｄ−Ｐ−ＨＡＤのみを同様の勾配で流した。勾配からの試料を、密度、リン酸塩（脂質および３−Ｄ−ＰＨＡＤの両方）、およびタンパク質の尺度を与える屈折率測定法によってスクロース濃度について分析した。図１に示すように、ビロソームはおよそ１．０５４〜１．０７５９  ｇ／ｍｌの単一バンドを形成し、全てのリン酸塩を含み、一方、遊離３−Ｄ−ＰＨＡＤはおよそ１．１２  ｇ／ｍｌのバンドを形成した。従って、ＤＭＳＯ溶液からビロソームに添加された３Ｄ  ＰＨＡＤのほとんどがビロソームに組み込まれた。
【００８１】
勾配の画分を、Ｆｏｌｃｈ法に従ってクロロホルム／メタノールで抽出し、薄層クロマトグラフィーによってＭｅｒｃｋ  ＨＰ  ＴＬＣ  ６０プレート上で分析した。プレートを１００：７５：１５（ｖ／ｖ）の割合のクロロホルム：メタノール：水に流した。連続したエタノール、ヨウ素、ニンヒドリンおよびリンモリブデン酸塩染色により、脂質および３ＤＰＨＡＤを可視化した。対照として、ＲＳＶウイルス脂質のＦｏｌｃｈ抽出物、ビロソームを調製するために用いられたたＰＣおよびＰＥ、および遊離３ＤＰＨＡＤも同じプレート上に流した。図２に示すように、３−Ｄ−ＰＨＡＤはビロソーム含有画分に存在することが判明した。
【００８２】
実施例２：ＲＳＶビロソームへの数種の溶媒を用いた数種のアジュバントの後挿入
ビオソームは、実施例１において説明したように、精製されたＲＳＶウイルス、Ａ２株から調製した。ビロソームを収穫し、ビロソーム中のリン脂質濃度を測定した。
【００８３】
数種の溶媒中の数種のアジュバントのストック溶液を調製した：
１）５０μｌのＤＭＦ中の１００ｎｍｏｌの３−Ｄ−ＰＨＡＤ
２）５０μｌのＤＭＳＯ中の１００ｎｍｏｌのモノ−ホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）
３）５０μｌのＤＭＳＯ中の０．３  ｍｇのＮ−パルミトイル−Ｓ−２，３（ビスパルミトイルオキシ）−プロピル−システイニル−セリル−（リシル）３−リジン（リポペプチド）
【００８４】
上記のアジュバント溶液を、それぞれ８５０ｎｍｏｌのリン脂質を含有する９５０μｌのビロソームを有する４本のチューブに添加し、ボルテックスで急速混合した。４℃で一晩保存した後、ビロソームの密度を、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＡＨ  ６５０ローターにおいて１２０，０００ｇで６６時間回転させた１０〜６０％スクロース勾配上で平衡密度勾配遠心分離によって分析した。勾配からの資料を密度、リン酸塩（脂質および３  ＤＰＨＡＤの両方）、およびタンパク質について分析した。図３〜５に示すように、全ての勾配において、リン酸塩（リン脂質、３−Ｄ−ＰＨＡＤまたはＭＰＬＡ由来）の単一のピークのみが存在し、タンパク質も含有しているのに対し、リポペプチドは画分４〜７に存在し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により画分６（ビロソームの最高濃度を含む）でピークに達することが判明した（図７）。これは、アジュバントが全ての場合においてビロソームに組み込まれたことを実証する。リポペプチド含有ビロソームはおよそ１．１  ｇ／ｍｌのピーク密度を有するが、他のビロソームはおよそ１．０４〜１．０６  ｇ／ｍｌでバンドを形成した。従って、ビロソームに添加される様々に異なるアジュバントは、ビロソームの密度に様々に影響し、それらが組み込まれたことの更なる証拠となる。
【００８５】
実施例３：ビロソーム形成中またはビロソーム形成後の何れかに組み込まれた３−Ｄ−ＰＨＡＤを含有するＲＳＶビロソームによるマウスの免疫化
２種の異なるビロソーム調製物を、精製された呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、Ａ２株から調製した。簡潔に言うと、ウイルスを５０  ｍＭジ−カプロイルホスファチジルコリン（ＤＣＰＣ）中で氷上で３０分間可溶化し、ウイルスヌクレオカプシドを１２０，０００  ｇで３０分間遠心分離することによって除去した。上清を回収し、０．１μｍフィルターで濾過した。２つの薄い脂質フィルムを調製した。１つ（試験試料）は、溶媒（クロロホルム／メタノール２：１（ｖ／ｖ））の蒸発によるＰＣとＰＥの割合が２：１である混合物、もう１つ（比較例）は追加的に３−Ｄ−ＰＨＡＤを含有するものであった。
【００８６】
ウイルス膜上清を、８５０  ｎｍｏｌのリン脂質（試験試料）当たり１  ｍｇのタンパク質の割合で、または８５０のリン脂質＋２００  ｎｍｏｌの３−Ｄ−ＤＰＨＡＤ（比較例）当たり１  ｍｇのタンパク質の割合で、薄い脂質フィルムに添加した。混合物を０．２μｍのフィルターでろ過し、ガンマ線照射（１０  ｋＤａ分子量カットオフ）により、２リットルのＨＮＥ緩衝液を７回取り替えて４８時間、４℃で滅菌したスライド−ａ−ライザー透析カセット中で透析した。ビロソームを収穫し、ビロソーム中のリン脂質濃度を測定した。８５０ｎｍｏｌのリン脂質を含有し、３−Ｄ−ＰＨＡＤを含有しない水性ビロソーム組成物９７５μｌに、１５３ｎｍｏｌの３−Ｄ−ＰＨＡＤを含有する２５μｌのＤＭＳＯ溶液を、ボルテックスミキサーで試料を攪拌しながら急速に添加した。従って、比較ビロソーム調製物は、ビロソーム形成中に組み込まれた２００  ｎｍｏｌの３−Ｄ−ＰＨＡＤを含有し（「組み込み」）、一方、試験ビロソーム調製物は、ビロソーム形成後に溶媒から添加された１００  ｎｍｏｌの３−Ｄ−ＰＨＡＤを含有した（「後挿入」）。
【００８７】
１０匹のＢａｌｂ／Ｃマウスからなる３つの群をそれぞれ、ビヒクル対照（ＨＮＥ緩衝液、１４５  ｍＭ  ＮａＣｌ、５  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．４）、  マウス１匹につき注射毎に５μｇのウイルスタンパク質および１μｇの３−Ｄ−ＰＨＡＤである「組み込み」ビロソーム調製物  、マウス１匹につき注射毎に５μｇのウイルスタンパク質および０．５μｇの３−Ｄ−ＰＨＡＤである「後挿入」ビロソーム調製物、の何れかを用いて第１日目と第１５日目に免疫化を行った。
【００８８】
ウイルスタンパク質に対するＩｇＧ力価を、第２８日目に、先に説明したように決定した（（Ｋａｍｐｈｕｉｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ  ２０１２；  ７（５）：ｅ３６８１２）。図７に示すように、３−Ｄ−ＰＨＡＤ後挿入ビロソームによって誘導されたＩｇＧ力価は、組み込み３−Ｄ−ＰＨＡＤビロソームによって誘導されたものと同価であったが、後者のビロソームは２倍の量のアジュバントを含有していた。
【００８９】
生ウイルスに対する中和抗体力価を、第２８日目に、先に説明したようにｅｘ  ｖｉｖｏで決定した（Ｋａｍｐｈｕｉｓ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ  ２０１２；  ７（５）：ｅ３６８１２）。図８に示すように、３−Ｄ−ＰＨＡＤ後挿入ビロソームによって誘導されたＩｇＧ力価は、組み込み３−Ｄ−ＰＨＡＤビロソームによって誘導されたものと少なくとも同価であったが、後者のビロソームは２倍の量の３−Ｄ−ＰＨＡＤを含有していた。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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