(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
不特定アシルトランスフェラーゼ（ワックスエステルシンターゼ／アシル補酵素Ａ：ジアシルグリセロール  アシルトランスフェラーゼ）をコードする外因性核酸を含む、遺伝子改変した酸化炭素資化性酢酸産生細菌であって、クロストリジウム  オートエタノゲナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）由来である細菌。
【請求項２】
前記不特定アシルトランスフェラーゼが、アシネトバクター  バイリイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｙｉ）由来のものである、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
前記核酸がプラスミドである、請求項１または２に記載の細菌。
【請求項４】
前記不特定アシルトランスフェラーゼをコードする核酸が、クロストリジウム  オートエタノゲナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）に最適化されたコドンである、請求項３に記載の細菌。
【請求項５】
ＣＯおよび／またはＣＯ２をバイオディーゼルに変換する工程であって、前記工程が、
気体のＣＯ含有物質および／またはＣＯ２含有物質を、培養媒体中の請求項１〜４のいずれか一項に記載の酸化炭素資化性酢酸産生細菌の培養物を含むバイオリアクターに通し、これにより、前記細菌が前記ＣＯおよび／またはＣＯ２を前記バイオディーゼルに変換することと、
前記バイオリアクターから前記バイオディーゼルを回収することと
を含む、工程。
【請求項６】
前記物質が、工業廃ガスを含む、請求項５に記載の工程。
【請求項７】
前記物質が合成ガスを含む、請求項５に記載の工程。
【請求項８】
前記培養物が嫌気性である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の工程。
【請求項９】
前記バイオディーゼルが、脂肪酸エチルエステルを含む、請求項５〜８のいずれか一項に記載の工程。
【請求項１０】
前記バイオディーゼルが、脂肪酸ブチルエステルを含む、請求項５〜９のいずれか一項に記載の工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＯを含む物質の微生物発酵によるバイオディーゼル産生のための組み換え微生物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸酸化炭素資化性アセトゲンＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍまたはＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉを含む細菌は、脂質および細胞膜の生合成における脂肪酸を産生する。
【０００３】
野生型のクロストリジウム株では、脂肪酸経路の流れの調節は、乾燥細胞の質量の通常５〜６％（ｗ／ｗ）を占める脂質（湿潤細胞の質量では１〜１．５（ｗ／ｗ）％）に重要である（Ｌｅｐａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １３３：１０３−１１０）。概して、脂質の９５％超は、存在する脂肪酸と、１２：０、１４：０、１４：１、１６：０、１６：１、１７Δ、１８：０、１８：１、１９Δの比率にて、厳密に定義されたＣ１６〜Ｃ１８の長さの鎖の範囲内に存在する（Ｌｅｐａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １３３：  １０３−１１０）。
【０００４】
脂肪酸（ＦＡ）およびその誘導体は、多くエネルギーを含んでおり、「ドロップイン」輸送として使用されるバイオ燃料／ジェット燃料、および／他の工業用化学化合物の精製物としての可能性を有する。脂肪酸誘導体の例として、バイオディーゼル、遊離脂肪酸、アルケン類、およびアルカン類が挙げられる。
【０００５】
バイオディーゼルは、モノアルキルエステルであり、標準的なディーゼルエンジンとして単独で使用することができ、または石油のディーゼルと混合することができる。また、灯油の代わりとなる低炭素代替物として使用することもできる。２００９年、世界中で３５億ガロン超のバイオディーゼルが使用されている。バイオディーゼルは、通常、アルコールの存在下での脂質のエステル交換反応による植物性または動物性の脂肪に化学的に由来し、グリセリンおよびモノアルキルエステルを得る。この工程により生成されるバイオディーゼルは、しかしながら、様々な範囲の長さの炭素鎖で明確化されていない多様な動物および植物供給源由来の油の変動により、ディーゼルエンジンに損傷を引き起こす可能性がある。（Ｆｕｋｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｅｎｇ  ９２：  ４０５−４１６）。問題となる重要な点は、生産工程および燃料の経年化からもたらされるモーターオイルの薄弱化、ピストンリングのコークス化、油圧部品の腐食、および注入システムでの析出であり、動物または植物由来のバイオディーゼルの使用をいくつかの型において拒絶する自動車の製造業者がいくらか現れるということである（Ｋoｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１，  Ｔｈｅ  Ｐａｓｔ，  Ｐｒｅｓｅｎｔ，  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ  -  Ｂｉｏｂｕｔａｎｏｌ  ａｓ  Ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ，  Ｉｎ：  ｄｏｓ  Ｓａｎｔｏｓ  Ｂｅｒｎａｄｅｓ  （Ｅｄ．）  Ｂｉｏｆｕｅｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ−Ｒｅｃｅｎｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，  ＩｎＴｅｃｈ，  ４５１−４８６）。
【０００６】
糖またはセルロース系供給原料を生成する食物または非食物である作物のいずれかを使用するバイオ燃料の現在の生成は、土地利用、食物の安全性、供給および環境問題の不安定性に関する欠点を有し得る。
【０００７】
本発明の目的は、これらの問題を克服し、バイオディーゼルの生成方法を提供し、または、少なくとも公共に有益な選択肢を提供することである。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、概して、特に、ＣＯを含む物質の微生物発酵によりバイオディーゼルを生成する方法、およびこのような方法に使用する組み換え微生物を提供する。
【０００９】
第１の態様では、本発明は、バイオディーゼルおよび任意にＣＯを含む物質の発酵による１つ以上の他の産物を産生できる酸化炭素資化性アセトゲン組み換え微生物を提供する。
【００１０】
１つの特定の実施形態では、本微生物は、組み換え微生物をもたらす親微生物中に存在しないバイオディーゼル生合成経路における１つ以上の外因性酵素（本明細書中で外因性酵素を指す）が発現するよう適合される。別の実施形態では、本微生物は、組み換え微生物をもたらす親微生物中に存在するバイオディーゼル生合成経路中の１つ以上の内因性酵素を過剰発現するよう適合される（本明細書中で内因性酵素を指す）。
【００１１】
１つの実施形態では、この組み換え微生物は、組み換え微生物をもたらす親微生物よりも産生するバイオディーゼル量が多いよう適合される。
【００１２】
１つの実施形態では、微生物が発現または過剰発現するよう適合される１つ以上の酵素は、アシルトランスフェラーゼである。
【００１３】
１つの実施形態では、この酵素は、配列番号１に定義されるアシルトランスフェラーゼ、またはその機能的に等価な変異体である。
【００１４】
１つの実施形態では、親微生物は、アルコールを産生するためにＣＯを含む物質を発酵できるが、アルコールをバイオディーゼルに変換できず、組み換え微生物が、エタノールのバイオディーゼルへの変換に関与する１つ以上の酵素を発現するよう適合される。
【００１５】
１つの実施形態では、微生物は、１つ以上の外因性核酸の発現を増大するように適合され、この１つ以上の外因性核酸が、本明細書中に前述される酵素のうちの１つ以上をコードする、１つ以上の外因性核酸を含む。
【００１６】
１つの実施形態では、発現を増大するよう適合した１つ以上の外因性核酸は、調節エレメントである。１つの実施形態では、この調節エレメントはプロモーターである。１つの実施形態では、このプロモーターは、構成的プロモーターである。１つの実施形態では、このプロモーターは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ遺伝子クラスター、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼプロモーター、Ｒｎｆ複合体オペロンプロモーター、ＡＴＰシンターゼオペロンプロモーター、およびホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーターを含む群から選択される。
【００１７】
１つの実施形態では、この酢酸産生酸化炭素資化性組み換え微生物は、脂肪酸生合成経路における１つ以上の外因性酵素を発現するようさらに適合される。さらなる態様では、この微生物は、脂肪酸生合成経路中の１つ以上の内因性酵素を過剰発現するよう適合される。
【００１８】
１つの実施形態では、本微生物は、本明細書に前述する１つ以上の酵素をコードし、かつ１つ以上の酵素を発現するよう適合した１つ以上の外因性核酸を含む。１つの実施形態では、本微生物は、少なくとも２つの酵素をコードし、かつ、この少なくとも２つの酵素を発現するよう適合した１つ以上の外因性核酸を含む。他の実施形態では、本微生物は、５つ以上の酵素をコードし、かつ、この５つ以上の酵素を発現するよう適合した１つ以上の外因性核酸を含む。
【００１９】
１つの実施形態では、この１つ以上の外因性核酸は、核酸構築物またはベクターであり、１つの特定の実施形態では、本明細書に前述されるいずれかの組み合わせを指す酵素のうちの１つ以上をコードするプラスミドである。
【００２０】
１つの実施形態では、外因性核酸は、発現プラスミドである。
【００２１】
１つの特定の実施形態では、親微生物はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｍａｇｎｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ，  Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ  ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｕｖｉを含む酸化炭素資化性酢酸産生細菌の群から選択される。
【００２２】
１つの実施形態では、親微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉである。１つの特定の実施形態では、微生物は、株ＤＳＭ１００６１の誘導体である、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ２３６９３である。別の特定の実施形態では、微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  ＤＳＭ１３５２８（またはＡＴＣＣ５５３８３）である。
【００２３】
第２の態様では、本発明は、微生物中で発現する際に、微生物にＣＯを含む物質の発酵によりバイオディーゼルを産生する１つ以上の酵素をコードする核酸を提供する。
【００２４】
１つの実施形態では、この核酸は、微生物中で発現する際に、ＣＯを含む物質の発酵によりバイオディーゼルを微生物に産生させる２つ以上の酵素をコードする。
【００２５】
１つの実施形態では、本発明の核酸は、このような酵素を５つ以上コードする。
【００２６】
１つの実施形態では、この酵素は、アシルトランスフェラーゼおよびその機能的に等価な変異体からなる群から選択される。
【００２７】
１つの実施形態では、アシルトランスフェラーゼをコードする核酸は配列番号１であり、またはその機能的に等価な変異体である。
【００２８】
１つの実施形態では、本発明の核酸はプロモーターをさらに含む。１つの実施形態では、このプロモーターは、制御下で遺伝子の構成的発現を可能にする。１つの特定の実施形態では、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌクラスタープロモーターを使用する。他の特定の実施形態では、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼプロモーター、Ｒｎｆ複合体オペロンプロモーター、ＡＴＰシンターゼオペロンプロモーター、またはホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーターを使用する。１つの特定の実施形態では、このプロモーターは、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来である。
【００２９】
第３の態様では、本発明は、第２の態様の１つ以上の核酸を含む核酸構築物またはベクターを提供する。
【００３０】
１つの特定の実施形態では、核酸構築物またはベクターは、発現構築物またはベクターである。１つの特定の実施形態では、発現構築物またはベクターはプラスミドである。
【００３１】
第４の態様では、本発明は、第２の態様の１つ以上の核酸または第３の態様のベクターもしくは構築物のいずれかを含む宿主生物を提供する。
【００３２】
第５の態様では、本発明は、本発明の第３の態様に記載される発現構築物またはベクターおよびメチル化構築物またはベクターを含む組成物を提供する。
【００３３】
好ましくは、本組成物は、本発明の第１の態様に係る組み換え微生物を生成できる。
【００３４】
１つの特定の実施形態では、発現構築物／ベクターおよび／またはメチル化構築物／ベクターはプラスミドである。
【００３５】
第６の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の組み換え微生物を使用して、ＣＯを含む物質を発酵することを含む微生物発酵により、バイオディーゼルおよび任意の１つ以上の他の産物を産生する方法を提供する。
【００３６】
１つの実施形態では、本方法は、
ａ．本発明の第１の態様の１つ以上の微生物の培養物を含むバイオリアクターに、ＣＯを含む物質を提供するステップと、
ｂ．バイオリアクター中でこの培養物を嫌気的に発酵し、バイオディーゼルを産生するステップと
を含む。
【００３７】
１つの実施形態では、本方法は、
ａ．工業用工程の結果として生成されたＣＯ含有ガスを捕獲するステップと、
ｂ．本発明の第１の態様の１つ以上の微生物を含む培養物により、ＣＯ含有ガスを嫌気的に発酵してバイオディーゼルを産生するステップと
を含む。
【００３８】
本方法の態様の特定の実施形態では、発酵は、水培養物媒体中で起こる。
【００３９】
本方法の態様の特定の実施形態では、物質の発酵は、バイオリアクター中で起こる。
【００４０】
好ましくは、ＣＯを含む物質は、ＣＯを含む気体性の物質である。１つの実施形態では、この物質は、工業排ガスを含む。特定の実施形態では、このガスは製鋼廃ガスまたは合成ガスである。
【００４１】
１つの実施形態では、この物質は、概して、少なくとも２０〜１００容量％のＣＯ、２０〜７０容量％のＣＯ、３０〜６０容量％のＣＯ、および４０〜５５容量％のＣＯなどの主要な比率のＣＯを含む。特定の実施形態では、この物質は、約２５容量％、約３０容量％、約３５容量％、約４０容量％、約４５容量％、約５０容量％、約５５容量％、または約６０容量％のＣＯを含む。
【００４２】
特定の実施形態では、この方法は、発酵ブロスからバイオディーゼルおよび任意に１つ以上の他の産物を回収するステップをさらに含む。
【００４３】
第７の態様では、本発明は、第６の態様の方法により産生されるバイオディーゼルを提供する。
【００４４】
別の態様では、本発明は、微生物がバイオディーゼルを産生でき、または親微生物を比較して多くの量のバイオディーゼル、および任意にＣＯを含む物質の発酵による１つ以上の他の産物を産生できるような１つ以上の核酸の導入により酸化炭素資化性酢酸産生親微生物を変換することを含む、本発明の第１の態様による微生物の産生方法であって、この親微生物は、ＣＯを含む物質の発酵により、バイオディーゼルを産生できず、またはこの組み換え微生物よりも低レベルのバイオディーゼルを産生する、方法を提供する。
【００４５】
１つの特定の実施形態では、親微生物は、バイオディーゼル生合成経路の１つ以上の酵素を発現するよう適合した１つ以上の外因性酵素を導入することにより形質転換される。さらなる実施形態では、親微生物は、脂肪酸生合成経路の１つ以上の酵素を発現するよう適合した１つ以上の外因性核酸を導入することによりさらに形質転換される。さらなる実施形態では、親微生物は、脂肪酸生合成経路の１つ以上の酵素を発現するよう適合した１つ以上の内因性核酸を発現または過剰発現することによりさらに形質転換される。１つの実施形態では、親微生物は、親微生物中に天然に存在するバイオディーゼル経路の１つ以上の内因性酵素を過剰発現するよう適合した１つ以上の核酸で形質転換される。
【００４６】
ある実施形態では、１つ以上の酵素は本明細書中に前述されている。
【００４７】
１つの実施形態では、遺伝子改変される酸化炭素資化性酢酸産生細菌は、非特異的アセチルトランスフェラーゼ（ワックスエステルシンターゼ／アシル補酵素Ａ：ジアシルグリセロール  アシルトランスフェラーゼ）をコードする外因性核酸を含む。この細菌は、限定するものではないが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｍａｇｎｕｍを含むクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｉｄｉｕｍ）である。他の使用され得るクロストリジウム種は、酢酸産生性ではないが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃ．  ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ、およびＣ．ｐａｓｔｅｒｉａｎｕｍを含む。
【００４８】
また、この細菌は、たとえば、ｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ  ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、またはＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｕｖｉであってもよい。外因性非特異的アセチルトランスフェラーゼは、非特異的なアセチルトランスフェラーゼである、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｙｉであってもよい。この核酸はプラスミド上にあってもよい。非特異的アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍまたは他の宿主細菌に最適化されたコドンであってもよい。
【００４９】
別の実施形態では、ＣＯおよび／またはＣＯ２をバイオディーゼルに変換する工程が提供される。気体のＣＯ含有物質および／またはＣＯ２含有物質を酸化炭素資化性の酢酸産生細菌を含む培養媒体の培養物を含むバイオリアクターを通過させる。この細菌は、非特的アセチルトラスフェラーゼ（ワックスエステルシンターゼ／アシル補酵素Ａ：ジアシルグリセロール  アシルトランスフェラーゼ）をコードする外因性核酸を含む。この細菌は、ＣＯおよび／またはＣＯ２を直接バイオディーゼルに変換し、この際にアルコール（たとえばエタノールもしくはブタノール）または脂肪酸を供給する必要がない。この物質は工業用廃ガスを含んでも良い。この培養物は、嫌気的に増殖かつ厳密に維持されてもよい。バイオディーゼルは、脂肪酸エチルエステルおよび／または脂肪酸ブチルエステルを含んでも良い。
【００５０】
別の実施形態では、酸化炭素資化性酢酸産生細菌中で複製するプラスミドが提供される。このプラスミドは、非特異的アセチルトランスフェラーゼ（ワックスエステルシンターゼ／アシル補酵素Ａ：ジアシルグリセロール  アシルトランスフェラーゼ）をコードする外因性核酸を含む。この非特異的アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍに最適化されたコドンであってもよい。任意に、プラスミドは、例えば、所望のメチラーゼを含む細菌を介して通過することによりメチル化されてもよい。
【００５１】
本発明はまた、本願の明細書に記載または示される一部、要素、および特徴を広く含むものであってもよく、個別または集合的であってもよく、これらの一部、要素および特徴のうちの２つ以上のいずれかの組み合わせであってもよい。特定の整数が、本明細書中に記載されているが、特定の整数が、本発明に関連する技術で知られている均等物を有すると本明細書に記載されており、このような均等物は、以下に個別に記載されていない限り、本明細書に組み込まれるものである。
【００５２】
本発明のこれらの態様および他の態様は、すべて新規態様と考えられるものであり、このことは、以下の記載により明らかとなる。このような理解は、添付図面を参照しながら実施例のみにより得られるものである。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】は、一酸化炭素および／または水素のエタノールまたはブタノールなどのアルコールへの変換、それに続く、不特定アシルトランスフェラーゼ（unspecificacyltransferase）によるアルコールおよび脂肪酸ＣｏＡエステルの脂肪酸アシルエステル（バイオディーゼル）への変換を示す。
【００５４】
【図２】は、発現プラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ａｔｆの遺伝子マップである。
【００５５】
【図３】ＣＯ由来のバイオディーゼル産物を確認するＧＣ−ＭＳ結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
以下は、一般的な用語を用いた好ましい実施形態を含む本発明の説明である。本発明アは、以下の「実施例」と見出しの下に得られる開示からさらに明瞭となる。この実施例は、本発明を指示する実験データ、本発明の多様な態様の特定の例、および本発明を実施する手段を提供する。
【００５７】
本発明に記載されるように、「発酵ブロス」は、少なくとも栄養培地および細菌細胞を含む培養媒体である。
【００５８】
本発明に記載されるように、「シャトル微生物」は、メチルトランスフェラーゼ酵素が、目的微生物から発現され、かつ目的微生物と異なる微生物である。
【００５９】
本発明に記載されるように、「目的微生物」は、発現構築物／ベクターに含まれる遺伝子が、シャトル微生物から発現され、かつシャトル微生物と異なる微生物である。
【００６０】
「主要な発酵産物」という用語は、最も高い濃度および／または収率で産生される１つの発酵産物を意味することを意図するものである。
【００６１】
「効率が増大する」、「増大効率」などの用語は、発酵工程に関連して使用される際には、限定するものではないが、
発酵を触媒する微生物の増殖の速度、上昇した産物濃度での増殖速度および／または産物の産生速度、消費した物質容量あたり産生された所望の産物の容量、所望の産物の産生速度または産生レベル、および、他の発酵産物と比較して産生される所望の産物の相対比率のうち、１つ以上を増加させることが含まれる。
【００６２】
「一酸化炭素を含む物質」などの文言は、一酸化炭素が、たとえば、増殖および／または発酵用の１つ以上の細菌の株を利用できるいずれかの物質を含むと理解されるべきである。
【００６３】
「一酸化炭素を含む気体物質」などの文言および用語は、あるレベルの一酸化炭素を含むいずれかの気体を含む。ある実施形態では、この物質は、約２０容量％〜約１００容量％のＣＯ、２０〜７０容量％のＣＯ、３０〜６０容量％のＣＯ、および４０〜５５容量％のＣＯを含む。特定の実施形態では、この物質は、約２５容量％、約３０容量％、約３５容量％、約４０容量％、約４５容量％、約５０容量％、約５５容量％、または約６０容量％のＣＯを含む。
【００６４】
水素を含む物質は必ずしも必要ではないが、Ｈ２の存在は、本発明の方法にしたがって産物を生成するために有害なものではない。特定の実施形態では、水素の存在は、アルコール産生の総合的な効率を改善する。たとえば、特定の実施形態では、本物質は、約２：１、または１：１、または１：２の比率のＨ２：ＣＯを含んでもよい。１つの実施形態では、本物質は、約３０容量％以下のＨ２、約２０容量％以下のＨ２２、約１５容量％以下のＨ２、または約１０容量％以下のＨ２を含む。他の実施形態では、本物質流は、たとえば、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、もしくは１％未満といった低濃度のＨ２を含み、または水素を実質的に含まない。また、本物質は、たとえば、約１〜８０容量％、または１〜約３０容量％のＣＯ２などのＣＯ２を含んでもよい。１つの実施形態では、本物質は、約２０容量％以下のＣＯ２を含む。特定の実施形態では、約１５容量％以下、約１０容量％以下、約５容量％以下のＣＯ２を含み、または実質的にＣＯ２を含まない。
【００６５】
以下の説明では、本発明の実施形態を「ＣＯを含む気体物質」を送達かつ発酵する点に関して記載する。しかしながら、気体物質は、代替的な形態にて提供されてもよいことが理解される。たとえば、ＣＯを含む気体物質は、液体中に溶解された状態で提供されてもよい。本質的に、液体は、一酸化炭素含有ガスで飽和されており、この液体をバイオリアクターに追加する。これは、標準的な方法を使用して達成される。たとえば、微小気泡分散ジェネレーター（Ｈｅｎｓｉｒｉｓａｋ  ｅｔ．  ａｌ．  Ｓｃａｌｅ−ｕｐ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  ｆｏｒ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  １０１，  Ｎｕｍｂｅｒ  ３  ／  Ｏｃｔｏｂｅｒ，  ２００２）を使用できる。さらなる例として、ＣＯを含有する気体物質を、固体支持体上に吸着させてもよい。このような代替方法は、「ＣＯを含有する物質」などの文言の使用に包有される。
【００６６】
本発明の特定の実施形態では、ＣＯ含有気体物質は、工業でのオフガスまたは廃ガスである。「工業での廃ガスまたはオフガス」は、工業用工程により精製されるＣＯを含むいずれかのガスを含み、かつ、鉄金属製品の製造、非鉄金属製品の製造、石油精製工程、石炭の気化、電力生成、カーボンブラックの生成、およびコークの製造の結果として生成されるガスを含むよう広く解釈されるべきである。さらなる例として、本明細書で他に記載されるものを含んでも良い。
【００６７】
特段の記載がない限り、本明細書に使用される「発酵する」、「発酵工程」、または「発酵反応」などの文言は、この工程の増殖期および産物生合成期を含むよう意図される。本明細書にさらに記載されるように、いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、第１の増殖リアクターおよび第２の発酵リアクターを含んでも良い。このように、金属または組成物を発酵反応に添加することは、これらのリアクターのいずれかまたは両方へ添加することを含むと理解される。
【００６８】
用語「バイオリアクター」は、１つ以上の容器、および／またはタワー、もしくはパイプ配置からなる発酵装置を含み、連続撹拌槽リアクター（ＣＳＴＲ）、固定化細胞リアクター（ＩＣＲ）、トリクルベッド反応器（ＴＢＲ）、気泡塔、ガスリフト発酵槽、スタティックミキサー、または気液接触に適した他の装置を含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは第１の増殖リアクターおよび第２の発酵リアクターを含む。このように、物質をバイオリアクターまたは発酵反応に添加することを指す際には、適切なこれらのリアクターのいずれかまたは両方に添加することを含むことが理解される。
【００６９】
「外因性核酸」は、導入される微生物外に起源を有する核酸である。外因性核酸は、限定するものではないが、導入される微生物（たとえば、組み換え微生物由来の親微生物）、導入された生物と異なる微生物の株または種類、人工的にまたは組み換えにて作成した微生物の株または種類を含むいずれかの適切な供給源に由来してもよい。１つの実施形態では、外因性核酸は導入され、かつ特定の遺伝子の発現または過剰発現を増大させる（たとえば、配列（たとえば遺伝子）の複製数を増大させ、または強力または構成的なプロモーターを導入して発現を増大させることにより）ために導入される微生物内に天然に存在する核酸配列を表す。別の実施形態では、外因性核酸は、導入され、かつ、微生物内に天然に存在しない産物の発現、または微生物に対して未変性な遺伝子の発現の増大を可能にする微生物内に天然に存在しない核酸配列を示す（たとえば、プロモーターなどの調節エレメントを導入する場合）。外因性核酸は、導入される微生物のゲノムに統合される、または、染色体外の状態を保持するよう適合されてもよい。
【００７０】
「外因性」は、タンパク質を指す際に使用してもよい。このことは、組み換え微生物由来の親微生物中に存在しないタンパク質を指す。
【００７１】
組み換え微生物、および核酸またはタンパク質に関して本明細書で使用される「内因性」の用語は、組み換え微生物由来の親微生物に存在する核酸またはタンパク質のいずれかを指す。
【００７２】
本明細書に記載される「バイオディーゼル」は、たとえば、脂肪酸エチルエステル（ＦＡＥＥ）および／または脂肪酸ブチルエステル（ＦＡＢＥ）を含む脂肪酸アルキルエステルを指す。この産生されるバイオディーゼルは、脂肪酸アルキルエステルの混合物であってもよい。
【００７３】
本明細書に記載される「バイオディーゼル生合成」経路は、脂肪アシルＣｏＡからバイオディーゼルまでの経路を指す。この経路の例示的な酵素は、限定するものではないが、アシルトランスフェラーゼ［ＥＣ：２．３．−．−］およびアシルＣｏＡシンテターゼ／長鎖脂肪酸―ＣｏＡリガーゼ［ＥＣ：６．２．３．１］を含む。
【００７４】
「脂肪酸生合成」経路は、アセチルＣｏＡから脂肪酸ＣｏＡの産生までの経路を指す。この経路の例示的な酵素は、限定するものではないが、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ／ビオチンカルボキシラーゼ［ＥＣ：６．３．４．１４／ＥＣ：６．４．１．２／ＥＣ：６．４．１．３］、マロニルトランスフェラーゼ／マロン酸デカルボキシラーゼ［ＥＣ：２．３．１．３９］、脂肪酸シンターゼ［ＥＣ：２．３．１．８５／ＥＣ：２．３．１．８６／ＥＣ：２．３．１．−］、３−オキソアシル−［アシル−キャリアー−タンパク質］シンターゼ［ＥＣ：２．３．１．４１／ＥＣ：２．３．１．１７９／ＥＣ：２．３．１．１８０］、３−オキソアシル−［アシル−キャリアータンパク質］レダクターゼ［ＥＣ：１．１．１．１００］、３−ヒドロキシミリストイル  ＡＣＰ  デヒドラーゼ［ＥＣ：４．２．１．−］、３−ヒドロキシデカノイル−［アシル−キャリアータンパク質］  デヒドラターゼ  ［ＥＣ：４．２．１．６０］、エノイル−［アシル−キャリアータンパク質］レダクターゼ  ［ＥＣ：１．３．１．９、ＥＣ：１．３．１．−，  ＥＣ：１．３．１．−］、脂肪アシル−ＡＣＰ  チオエステラーゼ  ［ＥＣ：３．１．２．−  ３．１．２．１４］、オレオイル−［アシル−キャリアータンパク質］ヒドロラーゼ［ＥＣ：３．１．２．１４］、アシル−［アシル−キャリアータンパク質］デサチュラーゼ［ＥＣ：１．１４．１９．２］、アセチルＣｏＡアシルトランスフェラーゼ［ＥＣ：２．３．１．１６］、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ  デヒドロゲナーゼ［ＥＣ：１．１．１．３５］、エノイル−ＣｏＡ  ヒドラターゼ／長鎖  ３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ  デヒドロゲナーゼ［ＥＣ：１．１．１．２１１，  ＥＣ：４．２．１．１７］、エノイル−ＣｏＡ  ヒドラターゼ［ＥＣ：４．２．１．１７］、トランス−２−エノイル−ＣｏＡ  レダクターゼ［ＥＣ：１．３．１．３８］、パルミトイル−タンパク質チオエステラーゼ［ＥＣ：３．１．２．２２］、脂肪酸伸長タンパク質［ＥＣ：２．３．１．−］、３−ケトアシル−ＣｏＡ  シンターゼ［ＥＣ：２．３．１．−］、β−ケトレダクターゼ  ［ＥＣ：１．１．１．−］、３−ヒドロキシ  アシル−ＣｏＡ  デヒドラターゼ［ＥＣ：４．２．１．−］、エノイル  レダクターゼ［ＥＣ：１．３．１．−］、パルミトイル−ＣｏＡ  ヒドロラーゼ［ＥＣ：３．１．２．２］を含む。
【００７５】
本発明は、実質的に同一の機能を実施される場合、本明細書に特に例示される配列と異なる核酸を使用して実施されてもよいことが理解される。タンパク質またはペプチドをコードする核酸配列では、このことは、コードしたタンパク質またはペプチドが、実質的に同一の機能を有することを意味する。プロモーター配列を示す核酸配列では、変異型配列は、１つ以上の遺伝子の発現を促進する性質を有する。このような核酸は、本明細書で「機能的に等価な変異体」であってもよい。たとえば、核酸の機能的に等価な変異体は、対立変異体、遺伝子のフラグメント、変異（欠損、挿入、ヌクレオチドの置換など）を含む遺伝子、および／または遺伝子多型などが挙げられる。他の微生物由来のホモログ遺伝子もまた、本明細書に特に例示される配列の機能的に等価な変異体の例として考慮されてもよい。これらの遺伝子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｙｉなどの種のホモログ遺伝子を含み、これらの詳細は、ＧｅｎｅｂａｎｋまたはＮＣＢＩなどのウェブサイトで公開されているため入手可能である。「機能的に等価な変異体」との文言は、特定の生物に最適化されたコドンの結果として配列が変動する核酸を含むとされてもよい。本明細書の核酸の「機能的に等価な変異体」は、同定した核酸と、好ましくは少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、好ましくは約９０％、好ましくは約９５％以上の核酸配列同一性を有する。
【００７６】
また、本発明は、本明細書に特に例示されるアミノ酸配列と配列が異なるポリペプチドを使用して実施してもよいことが理解される。これらの変異体は、本明細書中で「機能的に等価な変異体」を指してもよい。タンパク質またはペプチドの機能的に等価な変異体は、同定したタンパク質またはペプチドと、少なくとも４０％、好ましくは５０％、好ましくは６０％、好ましくは７０％、好ましくは７５％、好ましくは８０％、好ましくは８５％、好ましくは９０％、好ましくは９５％以上のアミノ酸同一性を共有するタンパク質またはペプチドを含み、かつ、対象となるペプチドまたはタンパク質と実質的に同一の機能を有する。このような変異体は、タンパク質またはペプチドのフラグメントの範囲内を含み、このフラグメントは、ポリペプチドの切断型を含み、欠損が１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５のアミノ酸であってもよく、ポリペプチドの各末端の１〜２５の残基が伸長してもよく、欠損が、領域内のいずれかの長さであってもよく、または内部に位置してもよい。本明細書の特定のポリペプチドの機能的に等価な変異体は、たとえば、前述の段落に例示されるように、他種の細菌のホモログ遺伝子により発現されるポリペプチドを含むとされるものである。
【００７７】
本明細書で使用される「実質的に同一の機能」は、核酸またはポリペプチドが、変異体である場合でも機能を実施することができることを意味する。たとえば、本発明の酵素の変異体は、元の酵素と同一の反応を触媒できる。しかしながら、この変異体は、元のポリペプチドまたは核酸と同一のレベルの活性を有することを意味するものではないと解釈される。
【００７８】
機能的に等価な変異体が、当業者に知られている方法を使用した変異体である核酸またはポリペプチドと実質的に同一の機能を有するかどうかを評価してもよい。しかしながら、たとえば、アシルトランスフェラーゼ活性を試験するアッセイは、Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ７０：  ７１１９−２５；  Ｓｔoｖｅｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １８７：  １３６９−７６に記載される。
【００７９】
本明細書で使用される際の「過剰に発現」、「過剰発現」などの用語および文言は、同一条件下の親微生物のタンパク質（核酸を含む）の発現レベルと比較した１つ以上のタンパク質の発現（同一のタンパク質をコードする１つ以上の核酸の発現を含む）のいずれかの増大を広く含むものである。タンパク質（または核酸）は、いずれかの特定のレベルに発現する意味に解釈されるべきものではない。
【００８０】
「親微生物」は、本発明の組換え微生物を産生するために使用される微生物である。親微生物は、天然に存在する（すなわち野生型微生物である）または前もって改変されているが、本発明の対象である１つ以上の酵素を発現または過剰発現しない微生物である。したがって、本発明の組換え微生物を、親微生物中に発現または過剰発現しなかった１つ以上の酵素を発現または過剰発現するように改変してもよい。
【００８１】
核酸「構築物」または「ベクター」などの用語は、細胞に遺伝子物質を伝達するビヒクルとしての使用に適したいずれかの核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡを含む）として広く解釈される。この用語は、プラスミド、ウイルス（バクテリオファージを含む）、コスミド、および人口染色体を含むものとする。構築物またはベクターは、１つ以上の調節エレメント、複製起源、マルチクローニング部位、および／または選択可能マーカーを含んでもよい。１つの実施形態では、構築物またはベクターは、構築物またはベクターによりコードされた１つ以上の遺伝子発現を可能にするよう適合されている。核酸構築物またはベクターは、細胞への送達を促進する１以上の薬剤で製剤化した核酸（たとえば、リポソーム結合型核酸、核酸が含まれている生物）と同様に、裸の核酸を含む。
【００８２】
驚くべきことに、本発明者らは、ＣＯ含有物質からバイオディーゼルを産生するよう組み換え微生物を改変したことを示した。本発明者らは、組み換え生物を改変し、脂肪酸誘導体バイオディーゼルの産生ためにそれを使用する方法を発明した。また、本発明者らは、遊離脂肪酸、アルカン類およびアルケン類を含む他の脂肪酸誘導体も、本発明の一部としてこのバイオディーゼルを産生可能であると考える。これら全ての産物は、脂肪酸の鍵となる中間物質である脂肪酸アシルＣｏＡ（ＣｏＡとのチオエステル）または脂肪酸ＡＣＰ（アシルキャリアータンパク質）由来とすることができる。
【００８３】
本発明により産生されるバイオディーゼルは、長鎖の、エネルギーの密集した化合物であり、かつ、この合成は、ＡＴＰなどのヌクレオシド三リン酸の形態でエネルギーを費やすことを細胞に要求する。好気性工程および／または物質として糖を使用する際には、いくつかのＡＴＰ分子を得るために、解糖から十分なエネルギーが供給される必要がある。好気性工程および／または物質として糖を使用する際の脂肪酸生合成経路を介したバイオディーゼルの産生は、多くの反応が必要とされるが高いＡＴＰ供給力により推進されて、Ｃ５ペントースおよびＣ６ヘキソース分子がより長鎖の脂肪酸に変換されることにより、比較的直接的な方法で行われる。本発明は、糖系物質からバイオ燃料を生産することより利点を持ち得、工業用工程からの一酸化炭素を含む排ガスを利用するバイオディーゼルを生産する代替手段を提供する。
【００８４】
ＣＯまたはＣＯ２のようなＣ１物質を使用した嫌気的アセトゲンでは、解糖系のように脂肪酸などの長い分子を形成することは難しく、正味エネルギーは、炭素を固定化するＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路での十分なレベルのリン酸化を取得し、分子のＡＴＰを取得するためにＣＯ２をギ酸塩に活性化し、膜勾配を取得する。アセトゲン（未処置の生物および組み換え生物）で記録される大部分の炭素原子を含む最終産物は、Ｃ４化合物ブタノールおよび２，３ブタンジオールである。
【００８５】
本発明者らは、アセチルＣｏＡ中間物質を介してＣ１供給原料ＣＯを使用して、バイオディーゼルなどの長鎖脂肪酸分子を産生することが可能であることを示した。物質ＣＯおよびＣＯ２は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路中で直接アセチルＣｏＡにチャネル化され（脂肪酸生合成の開始時点）、解糖系を介して糖以降で、より少ない反応および酵素が必要とされ、ＡＴＰが少ないにも関わらず、より早く有効な工程を利用することができる。この量の少ないＡＴＰは、酸化炭素資化性アセトゲンで利用できるが、本発明者らは、（中間物質の反応のより高い化学的運動量により）この直接的な経路が、より高い代謝の流れを持続し得ることを考慮した。
【００８６】
本発明の特定の実施形態では、本発明者らは、本発明の組み換え微生物によるバイオディーゼルの産生（脂肪酸アルキルエステル）が、外因性アシルトランスフェラーゼの微生物に誘導することにより可能となることを見出した。バイオディーゼルの従来の産生方法は、アルコールの存在下での脂質（トリグリセリド）のエステル交換反応により、グリセリンおよびバイオディーゼル得ることを含む。しかしながら、本発明は、アルコール（エタノールおよび／またはブタノール）ならびに脂肪酸の両方を共産生できる組み換え微生物を提供する。本発明者らは、この共産生が、ＦＡＥＥ（脂肪酸エチルエステル）および／またはＦＡＢＥ（脂肪酸ブチルエステル）のいずれかを含むバイオディーゼルのｉｎｖｉｖｏの産生のための推進力を提供するために必要な物質を提供すると考えている。
【００８７】
本発明の実施形態を達成するために、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｙｉ由来の不特定アシルトランスフェラーゼ（ワックスエステルシンターゼ／アシル補酵素Ａ：ジアシルグリセロール  アシルトランスフェラーゼ）を酢酸産生微生物に導入した。この微生物は、脂肪酸アルキルエステル（すなわちバイオディーゼル）に変換されるアルコール（たとえばエタノールまたはブタノール）および脂肪酸アシルＣｏＡを産生する（図１）（Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ７０：  ７１１９−２５；  Ｓｔoｖｅｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １８７：  １３６９−７６）。脂肪酸アシルＣｏＡは、脂肪酸の直接産物であり、たとえば、酸化炭素資化性アセトゲン中に存在し得る、例えば、アシルＣｏＡシンテターゼ（長鎖脂肪酸ＣｏＡリガーゼ）の作用により産生される。この酵素を使用したＦＡＥＥのＩｎｖｉｖｏ産生は、外部から反応に供給される補足的な脂肪酸またはアルコールを除いて、示されていない（Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １５２，  ２５２９−３６）。すべての生物が脂肪酸前駆物質を産生するが、Ｅ．  ｃｏｌｉのようなアルコールを（大量に）産生しない生物では、追加的な遺伝子改変が必要である。ＦＡＢＥの細菌産生は、以前に例示されていない。本発明は、そのような外部からのアルコールの供給を必要とせず、したがって、多くの利点を提供し得る。これらの利点は、供給原料の費用、器具およびパラメーター制御の複雑性の大幅な低減、ならびにこの工程により必要とされる操作および分離ステップの限定の低減などを含む。
【００８８】
本発明者らは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ中で、本発明の有効性を例示したが、本発明は、酸化炭素資化性酢酸産生微生物および本明細書にさらに論述される広い群に提供可能であることが考慮される。
【００８９】
微生物
本明細書に前述されるように、本発明は、ＣＯを含む物質の発酵により、バイオディーゼルおよび任意に１つ以上の他の産物を産生できる組み換え微生物を提供する。
【００９０】
１つの特定の実施形態では、本微生物は、バイオディーゼル生合成経路の１つ以上の外因性酵素を発現するよう適合される。別の実施形態では、本微生物は、バイオディーゼル生合成経路の１つ以上の内因性酵素を過剰発現するよう適合される。
【００９１】
１つの実施形態では、組み換え微生物は、組み換え微生物をもたらす親微生物により大量のバイオディーゼルを産生するよう適合される。
【００９２】
１つの実施形態では組み換え微生物をもたらす親微生物が、ＣＯを含む物質を発酵して、アルコールを産生できるが、アルコールをバイオディーゼルに変換できず、かつ、組み換え微生物が、エタノールをバイオディーゼルに変換する際に関与する１つ以上の酵素を発現するよう適合される。
【００９３】
１つの実施形態では、酸化炭素資化性組み換え微生物は、脂肪酸生合成経路の１つ以上の外因性酵素を発現するようさらに適合可能である。さらなる態様では、本微生物は、脂肪酸生合成経路の１つ以上の内因性酵素を過剰発現するようさらに適合される。
【００９４】
本微生物は、たとえば、内因性遺伝子の発現の増大（たとえば、ある遺伝子の発現を推進するために、強力なまたは構成的なプロモーターを導入することによる）、酵素をコードし、かつこの酵素を発現するよう適合した外因性核酸、誘導することによる特定のコードをコードする遺伝子のコード数の増大、または親微生物内に天然に存在しない酵素をコードし、かつこの酵素を発現するよう適合した外因性核酸の誘導のいずれかを含む組み換え方法のいずれかによる１つ以上の酵素を発現または過剰発現するよう適合されてもよい。
【００９５】
ある実施形態では、親微生物は、ａ）１つ以上の内因性遺伝子の増大または過剰発現、およびｂ）１つ以上の外因性遺伝子の導入、これらの組み合わせを提供するために形質転換されてもよい。たとえば、バイオディーゼル生合成経路および任意の脂肪酸生合成経路の１つ以上の酵素をコードする１つ以上の遺伝子は親微生物に対して未変性であってもよいが、経路中の１つ以上の他の酵素をコードする１つ以上の他の遺伝子を含まなくてもよい。
【００９６】
１つの実施形態では、バイオディーゼル生合成経路の１つ以上の酵素は、アシルトランスフェラーゼおよびその機能的に等価な変異体からなる群から選択される。例として、アシルトランスフェラーゼの配列情報が提供される。
【００９７】
本発明に使用される酵素および機能的な変異体は、細菌または他の生物の異なる属および種を含む、いずれかの適切な供給源由来であってもよい。しかしながら、１つの実施形態では、アシルトランスフェラーゼは、配列番号１に記載されるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｙｉ由来の酵素、またはその機能的に等価な変異体である。特定の実施形態では、アシルトランスフェラーゼは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｙｉの不特定アシルトランスフェラーゼＹＰ＿０４５５５５．１；  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：  ２８７９２１８の特徴と同一の特徴を有する。アシルＣｏＡシンテターゼ／長鎖脂肪酸ＣｏＡリガーゼは、たとえば、受入番号Ｐ６９４５１またはＧｅｎｅＩＤ：  ９４６３２７の下で得られる。
【００９８】
１つの実施形態では、本微生物は、親微生物に存在する１つ以上の核酸の発現を増大させるよう適合され、かつ１つ以上の核酸が本明細書に前述される酵素の１つ以上をコードする１つ以上の外因性核酸を含む。１つの実施形態では、発現を増大するよう適合した１つ以上の外因性核酸は調節エレメントである。１つの実施形態では、調節エレメントはプロモーターである。１つの実施形態では、このプロモーターは、適切な発酵条件下で好ましくは高活性の構成的プロモーターである。誘導可能なプロモーターも使用できる。好ましい実施形態では、プロモーターは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ遺伝子クラスター、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼプロモーター、Ｒｎｆ複合体オペロンプロモーター、ＡＴＰシンターゼオペロンプロモーター、およびホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーターから選択される。適切な発酵条件下で発現、好ましくは高レベルの発現を行うことができる他のプロモーターも、例示的な実施形態の代替物として有効であることは当業者に明らかである。
【００９９】
１つの実施形態では、本微生物は、本明細書に前述の酵素の１つ以上をコードし、かつこの酵素を発現するよう適合した１つ以上の外因性核酸を含む。１つの実施形態では、本微生物は、少なくとも２つの酵素をコードし、かつこの酵素を発現するよう適合した１つ以上の外因性核酸を含む。他の実施形態では、本微生物は、３つの酵素をコードし、かつこの酵素を発現するよう適合した１つ以上の外因性核酸を含む。他の実施形態では、本微生物は、５つの酵素をコードし、かつこの酵素を発現するよう適合した１つ以上の外因性核酸を含む。
【０１００】
１つの特定の実施形態では、本微生物は、アシルトランスフェラーゼまたはその機能的に等価な変異体をコードする１つ以上の外因性核酸を含む。
【０１０１】
１つの特定の実施形態では、アシルトランスフェラーゼは、配列番号１に例示される核酸によりコードされ、またはその機能的に等価な変異体である。
【０１０２】
本微生物は、１つ以上の外因性核酸を含んでもよい。（遺伝子または調節エレメント（たとえばプロモーター）などの）２つ以上の遺伝子エレメントで親微生物を形質転換することが望ましく、これらのエレメントは、１つ以上の外因性核酸上に含まれていてもよい。
【０１０３】
１つの実施形態では、１つ以上の外因性核酸は、核酸構築物またはベクターであり、１つの特定の実施形態では、本明細書に前述されるいずれかの酵素の組み合わせの内の１つ以上をコードするプラスミドである。
【０１０４】
外因性核酸は、親微生物の形質転換上の染色体外に維持されていてもよく、または親微生物のゲノム内に統合されていてもよい。したがって、これらは、染色体下構築物の統合（たとえば、宿主ゲノム上でホモログ組み換えおよび標的化統合を可能にする領域）、発現、かつ複製（たとえば、複製起源、プロモーター、および他の調節エレメントまたは配列）を支援するよう適合した追加的なヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０１０５】
１つの実施形態では、本明細書に前述される１つ以上の酵素をコードする外因性核酸は、外因性核酸によりコードされる１つ以上の酵素の発現を促進するよう適合したプロモーターをさらに含む。１つの実施形態では、このプロモーターは、適切な発酵条件下で好ましくは高活性の構成的プロモーターである。誘導可能なプロモーターも使用できる。好ましい実施形態では、このプロモーターは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ遺伝子クラスター、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼプロモーター、Ｒｎｆ複合体オペロンプロモーター、ＡＴＰシンターゼオペロンプロモーター、およびホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーターから選択される。発現、好ましくは適切な発酵条件下での高レベルの発現を行うことのできる他のプロモーターが、例示的な実施形態の代替物として有効であることは当業者に明らかである。
【０１０６】
１つの実施形態では、外因性核酸は発現プラスミドである。
【０１０７】
１つの実施形態では、親酸化炭素資化性酢酸産生微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ  ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｕｖｉから成る群から選択される。
【０１０８】
第１または第２の態様の特定の実施形態では、親微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｍａｇｎｕｍを含む酸化炭素資化性クロストリジウムの群から選択される。
【０１０９】
１つの実施形態では、微生物は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ，  Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、および「Ｃ．  ｒａｇｓｄａｌｅｉ」ならびに関連する単離物を含む酸化炭素資化性クロストリジウムのクラスターから選択される。これらは、限定するものではないが、株Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＪＡＩ−１Ｔ（ＤＳＭ１００６１）  （Ａｂｒｉｎｉ，  Ｎａｖｅａｕ，  ＆  Ｎｙｎｓ，  １９９４）、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＬＢＳ１５６０  （ＤＳＭ１９６３０）（ＷＯ／２００９／０６４２００）、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＬＢＳ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  ＰＥＴＣＴ  （ＤＳＭ１３５２８  ＝  ＡＴＣＣ  ５５３８３）  （Ｔａｎｎｅｒ、Ｍｉｌｌｅｒ，  ＆  Ｙａｎｇ，  １９９３）、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  ＥＲＩ−２  （ＡＴＣＣ  ５５３８０）  （米国特許第５，５９３，８８６号）、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  Ｃ−０１  （ＡＴＣＣ  ５５９８８）  （米国特許第６，３６８，８１９号）、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  Ｏ−５２  （ＡＴＣＣ  ５５９８９）  （米国特許第６，３６８，８１９号）、または“Ｃ．  ｒａｇｓｄａｌｅｉ  Ｐ１１Ｔ“  （ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６２２）  （ＷＯ  ２００８／０２８０５５）ならびに“Ｃ．  ｃｏｓｋａｔｉｉ”（米国特許第２０１１／０２２９９４７号）、“Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＭＴ３５１”（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｔｙｕｒｉｎ  ＆  Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ、２０１２）などの関連する単離物ならびにＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  ＯＴＡ−１  （Ｔｉｒａｄｏ−Ａｃｅｖｅｄｏ  Ｏ．  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ  ｆｒｏｍ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｇａｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ．  ＰｈＤ  ｔｈｅｓｉｓ，  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  ２０１０）などのそれらの変異株を含む酸化炭素資化性クロストリジウムのクラスターから選択される。
【０１１０】
これらの株は、クロストリジウムのリボソームｒＲＮＡクラスターI（Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）内にサブクラスターを形成し、これはＤＮＡ‐ＤＮＡ再会合およびＤＮＡフィンガープリントの実験（ＷＯ  ２００８／０２８０５５米国特許第２０１１／０２２９９４７号）により判定された個々の種であるにも関わらず、１６Ｓ  リボソームｒＲＮＡ遺伝子レベルで少なくとも９９％の同一性を有する。
【０１１１】
このクラスターの株は、同様の遺伝子型および表現型を有する、共通した特徴により規定され、かつ、エネルギー変換および発酵代謝の同一の形態を共有する。このクラスターの株はシトクロムを欠いており、Ｒｎｆ複合体を介してエネルギーを保存する。
【０１１２】
このクラスターのすべての株は、４．２ＭＢｐのゲノムサイズを有し（Ｋoｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）、３２モル％前後のＧＣ組成物（Ａｂｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４；  Ｋoｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０；  Ｔａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）  （ＷＯ  ２００８／０２８０５５；  米国特許第２０１１／０２２９９４７号）を有し、かつ、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路（一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、および一酸化炭素デヒドロゲナーゼ／アセチルＣｏＡシンターゼ）、ヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、Ｒｎｆ複合体（ｒｎｆＣＤＧＥＡＢ）、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（Ｋoｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，  ２０１１）の酵素をコードする保存された本質的な鍵遺伝子オペロンを有する。ガス摂取を担う、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路遺伝子の組織および数は、核酸およびアミノ酸配列の相違にも関わらず、すべての種で同一であると分かった（Ｋoｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０１１３】
すべての株は、同様の形態およびサイズ（対数増殖細胞は、０．５〜０．７×３〜５μｍ）を有し、中温性（３０〜３７℃の最適増殖温度）であり、厳密に嫌気性である（Ａｂｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４；  Ｔａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）（ＷＯ  ２００８／０２８０５５）。さらに、全ての株は、同一のＰＨ範囲（ｐＨ４〜７．５、最適初期ｐＨ５．５〜６）、同様の増殖速度を有するＣＯ含有ガス上での強力な独立栄養性増殖、ならびに特定の条件下で形成した２，３−ブタノールおよび乳酸を含む主要な発酵最終産物としてのエタノールおよび酢酸での代謝プロファイルなどの主要な系統的性質を共有する（Ａｂｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４；  Ｋoｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１；  Ｔａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）。しかしながら、種によって多様な糖（たとえばラムノース、アラビノース）、酸（たとえばグルコン酸、クエン酸）、アミノ酸（たとえばアルギニン、ヒスチジン）、または他の物質（たとえばベタイン、ブタノール）の物質の利用に差異が生じる。このような種の一部は、特定のビタミン類（たとえばチアミン、ビオチン）に対して栄養要求性であることが見出されるものもあり、見出されないものもある。カルボン酸の対応するアルコールへの還元は、これらの生物の範囲内で示される（Ｐｅｒｅｚ，  Ｒｉｃｈｔｅｒ，  Ｌｏｆｔｕｓ，  ＆  Ａｎｇｅｎｅｎｔ，  ２０１２）。
【０１１４】
したがって、記載されるこれらの性質は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍまたはＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉに特異的ではないが、酸化炭素資化性、エタノール合成クロストリジウムの一般的な性質を示す。本発明は、生産性に差異がある可能性があるが、これらすべての株に作用することが予想される。
【０１１５】
本発明の組み換え酸化炭素資化性酢酸産生微生物は、組み換え親微生物を産生する先行技術のいずれかを使用して、親酸化炭素資化性酢酸産生微生物および１つ以上の外因性核酸から調製されてもよい。例示的な意味のみとして、形質転換（形質誘導またはトランスフェクションを含む）は、エレクトロポレーション、電気融合、超音波処理、ポリエチレングリコール媒介形質転換、接合、または化学的かつ天然のコンピテンスにより達成されてもよい。適切な形質転換技術は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＥＦ，  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｒｏｔａｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ，  １９８９に記載される。
【０１１６】
エレクトロポレーションは、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  （Ｋoｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０；  Ｌｅａｎｇ，  Ｕｅｋｉ，  Ｎｅｖｉｎ，  ＆  Ｌｏｖｌｅｙ，  ２０１２）  （ＰＣＴ／ＮＺ２０１１／０００２０３；  ＷＯ２０１２／０５３９０５）、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（ＰＣＴ／ＮＺ２０１１／０００２０３；  ＷＯ２０１２／０５３９０５），  Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ（Ｓｔｒaｔｚ，  Ｓａｕｅｒ，  Ｋｕｈｎ，  ＆  Ｄuｒｒｅ，  １９９４）、またはＭｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ  （Ｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）などのいくつかの酸化炭素資化性アセトゲンに記載されており、Ｃ．  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  （Ｍｅｒｍｅｌｓｔｅｉｎ，  Ｗｅｌｋｅｒ，  Ｂｅｎｎｅｔｔ，  ＆  Ｐａｐｏｕｔｓａｋｉｓ，  １９９２），  Ｃ．  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ  （Ｊｅｎｎｅｒｔ，  Ｔａｒｄｉｆ，  Ｙｏｕｎｇ，  ＆  Ｙｏｕｎｇ，  ２０００）またはＣ．  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  （ＭＶ  Ｔｙｕｒｉｎ，  Ｄｅｓａｉ，  ＆  Ｌｙｎｄ，  ２００４）などの多くのクロストリジウム中で使用される標準的な方法である。
【０１１７】
電気融合は、酢酸産生Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＭＴ３５１（Ｔｙｕｒｉｎ  ａｎｄ  Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ，  ２０１２）に記載される。
【０１１８】
プロファージ誘発は、Ｃ．  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ（Ｐｒａｓａｎｎａ  Ｔａｍａｒａｐｕ  Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ，  ２０１０，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ  ２５７７５  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ        Ｍｕｔａｎｔｓ，  Ｍａｓｔｅｒｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｋｅｎｔｕｃｋｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の場合と同様に酸化炭素資化性アセトゲンに記載されている。
【０１１９】
アセトゲンＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  （Ｈｅｒｂｅｒｔ，  Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅ，  Ｐｕｒｄｙ，  Ｅｌｍｏｒｅ，  ＆  Ｍｉｎｔｏｎ，  ２００３）およびＣ．  ａｃｅｔｏｂｕｙｌｉｃｕｍ  （Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｙｏｕｎｇ，  ＆  Ｙｏｕｎｇ，  １９９０）を含む多くの他のクロストリジウムの選択方法として接合が記載されている。
【０１２０】
１つの実施形態では、親株は、単一の炭素およびエネルギー供給源としてＣＯを使用する。
【０１２１】
１つの実施形態では、親微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉである。１つの特定の実施形態では、微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ２３６９３である。別の特定の実施形態では、この微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  ＤＳＭ１３５２８  （またはＡＴＣＣ５５３８３）である。
【０１２２】
核酸
本発明はまた、本発明の組み換え微生物を産生する際に使用する１つ以上の核酸または核酸構築物を提供する。
【０１２３】
１つの実施形態では、この核酸は、微生物中で発現する際に、微生物がＣＯを含む物質の発酵によりバイオディーゼルを産生できるようにするバイオディーゼル生合成経路の１つ以上の酵素をコードする配列を含む。１つの特定の実施形態では、本発明は、微生物中で発現する際に、微生物に、ＣＯを含む物質の発酵によりバイオディーゼルを産生できるようにする２つ以上の酵素をコードする核酸を提供する。１つの実施形態では、本発明の核酸は、このような３つの酵素、または５つの酵素をコードする。
【０１２４】
１つの特定の実施形態では、酵素は、アシルトランスフェラーゼおよびその機能的に等価な変異体からなる群から選択される。
【０１２５】
本明細書中に記載される酵素をコードする例示的なアミノ酸配列および核酸配列は、本明細書に前述したＧｅｎｅｂａｎｋから取得できる。しかしながら、当業者は、本明細書に含まれる情報を有し、本発明の酵素をコードする適切な代替核酸またはその機能的に等価な変異体を、Ｇｅｎｅｂａｎｋおよび他のデータベースまたは遺伝子コードを容易に理解する。
【０１２６】
１つの実施形態では、アシルトランスフェラーゼは、配列番号１の配列によりコードされ、またはその機能的に等価な変異体である。
【０１２７】
１つの実施形態では、核酸は、脂肪酸生合成経路の１つ以上の外因性酵素をさらにコードする。さらなる態様では、核酸は、脂肪酸生合成経路の１つ以上の内因性酵素をさらにコードする。
【０１２８】
１つの実施形態では、本発明の核酸は、プロモーターをさらに含む。１つの実施形態では、このプロモーターは、制御下で遺伝子の構成的発現を可能にする。しかしながら、誘導可能なプロモーターを使用してもよい。当業者は、本発明のプロモーターを容易に理解する。好ましくは、このプロモーターは、適切な発酵条件下で高レベルの発現を行う。特定の実施形態では、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌクラスタープロモーターを使用する。別の実施形態では、ホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーターを使用する。別の実施形態では、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼプロモーター、Ｒｎｆ複合体オペロンプロモーターまたはＡＴＰシンターゼオペロンプロモーターを使用する。１つの特定の実施形態では、プロモーターは、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来である。
【０１２９】
本発明の核酸は、親微生物の形質転換上で染色体の外にある状態を保持してもよく、または微生物のゲノム内に統合するよう適合されてもよい。したがって、本発明の核酸は、統合（たとえば、ホモログ組み換えおよび宿主ゲノム内への標的化した統合を可能にする領域）または安定した外染色体構築物の発現および複製（たとえば、複製起源、プロモーターおよび他の調節配列）を支援するよう適合した追加的な核酸配列を含んでもよい。
【０１３０】
１つの実施形態では、核酸は、核酸構築物またはベクターである。１つの特定の実施形態では、核酸構築物またはベクターは、発現構築物またはベクターであるが、他のクローニングに使用されるような他の構築物またはベクターも、本発明に含まれる。１つの特定の実施形態では、発現構築物またはベクターはプラスミドである。
【０１３１】
本発明の発現構築物／ベクターは、プロモーターおよびもし望ましい場合、さらなるタンパク質の発現に適した追加的な遺伝子に加えて、任意の数の調節エレメントを含んでもよい。１つの実施形態では、発現構築物／ベクターは１つのプロモーターを含む。別の実施形態では、発現構築物／ベクターは、２つ以上のプロモーターを含む。１つの特定の実施形態では、発現構築物／ベクターは、発現される各遺伝子の１つのプロモーターを含む。１つの実施形態では、発現構築物／ベクターは、１つ以上のリボソーム結合部位、好ましくは、発現される各遺伝子のリボソーム結合部位を含む。
【０１３２】
本明細書に記載される核酸配列および構築物／ベクター配列は、リボソーム結合部位および／または制限部位に必要とされるような標準的なリンカーヌクレオチドを含んでもよいことは当業者に理解される。このようなリンカー配列は必須であると解釈されるべきではなく、定義される配列上に限定を提供するものではない。
【０１３３】
本発明の発現構築物／ベクターを含む核酸および核酸構築物は、当業者にとって標準であるいずれかの技術を使用して構築されてもよい。たとえば、化学的合成または組み換え技術を使用してもよい。このような技術は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８９）に記載される。さらなる例示的な技術は、以下の実施例に記載される。本質的に、個々の遺伝子および調節エレメントは、遺伝子が所望のタンパク質を形成して発現できるように互いに作動可能に連結される。本発明の使用に適したベクターは、当業者に理解されるであろう。しかしながら、例として、以下のベクターｐＭＴＬ８００００  ｖｅｃｔｏｒｓ、ｐＩＭＰ１、ｐＪＩＲ７５０および以下の本明細書の実施例に例示されるプラスミドが適切であってもよい。
【０１３４】
本発明の核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｃＤＮＡを含むいずれかの適切な形態であってもよい。
【０１３５】
また、本発明は、本明細書に記載されるいずれか１つ以上の核酸を含むウイルス、細菌、および酵母微生物を含む、宿主生物、特には微生物である。
【０１３６】
微生物産生方法
１つ以上の外因性核酸は、裸の核酸として親微生物に送達されてもよく、または形質転換工程を促進するため、１つ以上の薬剤で製剤化されてもよい（たとえば、リポソーム結合核酸、この核酸が含まれる生物）。この１つ以上の核酸は、適宜、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその組み合わせであってもよく、ある実施形態では、制限阻害剤を使用してもよい（たとえば、Ｎ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ６４，  ４１２．）参照）。
【０１３７】
本発明の微生物は、組み換え微生物を産生する当業者に知られているいずれかの技術を使用した親微生物および１つ以上の外因性核酸から調製されてもよい。例として、形質転換（形質誘導またはトランスフェクション）を、エレクトロポレーション、電気融合、超音波処理、ポリエチレングリコール媒介形質転換、化学的かつ天然のコンピテンス、または接合により達成されてもよい。適切な形質転換技術は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＥＦ，  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｒｏｔａｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ，  １９８９に記載される。
【０１３８】
エレクトロポレーションは、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  （Ｋoｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０、Ｐｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １０７：  １３０８７−９２；  ＰＣＴ／ＮＺ２０１１／０００２０３；  ＷＯ２０１２／０５３９０５），  Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  （ＰＣＴ／ＮＺ２０１１／０００２０３；  ＷＯ２０１２／０５３９０５）、またはＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ  （Ｓｔｒａｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６０：１０３３−３７）などのいくつかの酸化炭素資化性アセトゲンに記載されており、Ｃ．  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  （Ｍｅｒｍｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １０，  １９０−１９５）、Ｃ．  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ  （Ｊｅｎｎｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １４６：  ３０７１−３０８０）、またはＣ．  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  （Ｔｙｕｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ７０：  ８８３−８９０）などの多くのクロストリジウムに使用される標準的な方法である。プロファージ誘導は、Ｃ．  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ  （Ｐｒａｓａｎｎａ  Ｔａｍａｒａｐｕ  Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ，  ２０１０，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ  ２５７７５  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｔａｎｔｓ，  Ｍａｓｔｅｒｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｋｅｎｔｕｃｋｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の場合と同様に酸化炭素資化性アセトゲンに例示されており、接合は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  （Ｈｅｒｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  ２２９：  １０３−１１０）、またはＣ．  ａｃｅｔｏｂｕｙｌｉｃｕｍ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １３６：  ８１９−８２６）を含む多くのクロストリジウムの選択方法として記載されており、クロストリジウム酸化炭素資化性アセトゲンと同様の形式で使用できる。
【０１３９】
ある実施形態では、形質転換される微生物中で活性である制限系のため、微生物中に誘導される核酸をメチル化することが必要である。このことは、以下に記載の方法を含む多様な技術を使用して実施でき、以下の実施例にさらに例示される。
【０１４０】
例として、１つの実施形態では、本発明の組み換え微生物は、以下のステップ：
（ｉ）本明細書に記載される発現構築物／ベクターおよび（ｉｉ）メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むメチル化構築物／ベクターのシャトル微生物への導入；
メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現；
シャトル微生物から１つ以上の構築物／ベクターの単離；および
目的微生物への１つ以上の構築物／ベクターの導入
を含む、方法により産生される。
【０１４１】
１つの実施形態では、メチルトランスフェラーゼ遺伝子は構成的に発現される。別の実施形態では、メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現が誘導される。
【０１４２】
シャトル微生物は、微生物であり、好ましくは、陰性微生物であり、この微生物は発現構築物／ベクターを作製する核酸配列のメチル化を促進する。特定の実施形態では、シャトル微生物は、制限陰性Ｅ．  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ、またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓである。
【０１４３】
メチル化構築物／ベクターは、メチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列である。
【０１４４】
発現構築物／ベクターおよびメチル化構築物／ベクターをシャトル微生物に導入すると、メチル化構築物／ベクター上に存在するメチルトランスフェラーゼが誘導される。本発明の１つの特定の実施形態では、メチル化構築物／ベクターは、誘導可能なｌａｃプロモーターを含み、ラクトースまたはその類似体、より好ましくはイソプロピルβ−Ｄ‐チオ−がラクトース（ＩＰＴＧ）の添加により誘導されるが、この誘導は、いずれかの適切なプロモーター系によるものであってもよい。他の適切なプロモーターは、ａｒａ、ｔｅｔ、またはＴ７系を含む。本発明のさらなる実施形態では、メチル化構築物／ベクターのプロモーターは、構成的プロモーターである。
【０１４５】
特定の実施形態では、メチル化構築物／ベクターは、メチル化構築物／ベクターに存在するいずれかの遺伝子が、シャトル微生物に発現するようシャトル微生物の同一性に特異的な複製起源を有する。好ましくは、発現構築物／ベクターは、発現構築物／ベクター上のいずれかの遺伝子が、目的微生物に発現されるように、目的微生物の同一性に特異的である複製起源を有する。
【０１４６】
メチルトランスフェラーゼ酵素の発現は、発現構築物／ベクター上に存在する遺伝子のメチル化をもたらす。その後、発現構築物／ベクターは、既知のいずれかの方法によってシャトル微生物から単離されてもよい。例示的な意味として、以下の本明細書に記載される実施例に記載される方法を使用して、発現構築物／ベクターを単離してもよい。
【０１４７】
特定の実施形態では、構築物／ベクターの両方が単離される。
【０１４８】
発現構築物／ベクターは、既知のいずれかの方法を使用して目的微生物に導入されてもよい。しかしながら、例として、以下の実施例に記載される方法を使用してもよい。発現構築物／ベクターがメチル化されているため、発現構築物／ベクター上に存在する核酸配列は、目的微生物に組み込むことができ、かつ、成功裡に発現できる。
【０１４９】
メチルトランスフェラーゼ遺伝子は、シャトル微生物に導入され、かつ過剰発現されてもよい。したがって、１つの実施形態では、結果として得られるメチルトランスフェラーゼ酵素を、既知の方法を使用して収集してもよく、発現プラスミドをメチル化するためにｉｎｖｉｔｒｏで使用してもよい。その後、発現構築物／ベクターを発現のために目的微生物に導入してもよい。別の実施形態では、メチルトランスフェラーゼ遺伝子を、シャトル微生物のゲノムに導入し、発現構築物／ベクターを、シャトル微生物の導入し、シャトル微生物から１つ以上の構築物／ベクターを単離し、発現構築物／ベクターを目的微生物に導入する。
【０１５０】
上述の発現構築物／ベクターおよびメチル化構築物／ベクターを組み合わせて物質としての組成物を提供してもよいことが予想される。このような組成物は、本発明の組み換え微生物を産生するために制限障壁機構を回避する際の特定の用途を有する。
【０１５１】
１つの特定の実施形態では、本発現構築物／ベクターおよび／またはメチル化構築物／ベクターはプラスミドである。
【０１５２】
当業者は、本発明の微生物を産生する際に使用する適切なメチルトランスフェラーゼの数を理解するものである。しかしながら、例として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉのファージΦＴ１メチルトランスフェラーゼおよび以下の実施例に記載されるメチルトランスフェラーゼを使用してもよい。１つの実施形態では、メチルトランスフェラーゼは、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、またはその機能的に等価な変異体である。適切なメチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、適切なメチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、所望のメチルトランスフェラーゼおよび遺伝子コードを考慮して含まれることが容易に理解される。１つの実施形態では、メチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、以下の実施例に記載される（たとえば、配列番号１７の核酸またはその機能的に等価な変異体）。
【０１５３】
メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を可能にするよう適合した任意の数の構築物／ベクターを使用して、メチル化構築物／ベクターを産生してもよい。しかしながら、例として、以下の実施例に記載したプラスミドを使用してもよい（たとえば、配列番号１４）。
【０１５４】
産生方法
本発明は、本発明の組み換え微生物を使用して、ＣＯを含む物質を発酵することを含む微生物発酵により、バイオディーゼルおよび任意の１つ以上の他の産物の産生方法を提供する。本発明の方法を使用して、工業工程からの合計大気炭素排出を低減してもよい。
【０１５５】
好ましくは、この発酵は、本発明の組み換え微生物を使用して、バイオリアクター中の物質を嫌気的に発酵して少なくともバイオディーゼルを産生するステップを含む。
【０１５６】
１つの実施形態では、本方法は、
ａ．本発明の１つ以上の培養物を含むバイオリアクターにＣＯを含む物質を提供するステップと、
ｂ．バイオリアクター中の培養物を嫌気的に発酵して少なくともバイオディーゼルを産生するステップと
を含む。
【０１５７】
１つの実施形態では、本方法は、
ａ．工業工程の結果として生成されたＣＯ含有ガスを捕獲するステップと、
ｂ．本発明の１つ以上の微生物を含む培養物により、ＣＯ含有ガスを嫌気的に発酵してバイオディーゼルを産生するステップと
を含む。
【０１５８】
本発明の実施形態では、微生物により発酵した気体物質は、ＣＯを含む気体物質である。気体物質は、工業工程の副産物として得られるＣＯ含有廃ガスであってもよく、または自動車から排煙などの他のいくつかの供給源由来であってもよい。ある実施形態では、工業用工程は、製鋼などの鉄製品の製造、非製鋼製品の製造、石油精製工程、石炭の気化、電力生産、カーボンブラックの生成、アンモニアの生成、メタノールの生成、およびコークからなる群から選択される。これらの実施形態では、ＣＯ含有ガスは従来のいずれかの方法を使用して大気に放出される前に工業用工程から捕獲してもよい。ＣＯは、合成ガス（一酸化炭素および水素を含むガス）の成分であってもよい。工業用工程から生成したＣＯは、通常、燃焼してＣＯ２を生成し、したがって、本発明は、ＣＯ２温室ガスの排出を低減し、バイオ燃料として使用するためのバイオディーゼルを産生する際の特定の用途を有する。気体のＣＯ含有物質の組成に応じて、この物質を発酵に導入する前に、ダスト粒子などの望ましくない不純物のいずれかを除去するために処置することが望ましい。例えば、既知の方法を使用して気体物質を濾過し、または洗浄してもよい。
【０１５９】
発生する細菌の増殖およびバイオディーゼルの産生では、ＣＯ含有物質の気体に加えて、適切な栄養媒体をバイオリアクターに供給する必要がある。
【０１６０】
本方法の態様の特定の実施形態では、発酵は、水培養媒体中で起こる。本方法の態様の特定の実施形態では、物質の発酵は、バイオリアクター中で起こる。
【０１６１】
物質および媒体は、連続形態、バッチ、またはバッチ供給形態でバイオリアクターに供給されてもよい。栄養培地は、使用される微生物の増殖を可能にするために十分なビタミン類および無機類を含む。ＣＯを使用した発酵に適した嫌気的媒体は当業者に知られている。たとえば、適切な培地は、Ｂｉｅｂｅｌ（２００１）に記載される。本発明の１つの実施形態では培地は、以下の実施例に記載される。
【０１６２】
発酵は、発生する産生に対する適切な発酵条件下で実施されることが望ましい。考慮すべき反応条件は、圧力、温度、気体の流量、液体の流量、培地のｐＨ、培地の酸化還元電位、撹拌速度（連続して撹拌タンクリアクターを使用する場合）、接種レベル、液相中のＣＯが制限されないことを保証する最大気体物質濃度、および阻害産物を回避するための最大産物濃度が挙げられる。
【０１６３】
さらに、大抵の場合、物質流のＣＯ濃度（または気体物質のＣＯ分圧）を増大し、かつ、ＣＯが基質である場合の発酵効率を増大させることが望ましい。圧力を増大して作動させることにより、気相から液相へのＣＯの伝達速度が顕著に増大して、発酵の産生用の炭素供給源として微生物により行うことができる。このことは、同様に、保持時間（導入される気体流量により分けられるバイオリアクターの液体容量として定義される）を、バイオリアクターが、大気圧より大きい圧力で維持される際に短縮できることを意味する。最適反応条件は、使用される本発明の特定の微生物に部分的に依存する。しかしながら、一般的に、発酵は、大気圧より高い圧力で実施することが好ましい。また、得られるＣＯからバイオディーゼルへの変換速度は、部分的に、物質の保持時間の関数であり、所望の保持時間を達成することは、必要とするバイオリアクターの容量を示し、加圧系の使用は、必要とされるバイオリアクターの容量を顕著に低減でき、結果として発酵器具の主要な費用を顕著に低減できる。米国特許第５，５９３，８８６号により得られる実施形態では、反応作動圧の増大に応じて低減できる。すなわち、１０大気圧で作動するバイオリアクターは、１大気圧での作動の１／１０の容量のみ必要である。
【０１６４】
例として、上昇した圧力での気体からエタノールへの発酵の利点が記載される。例えば、国際公開特許公報０２/０８４３８は、３０ｐｓｉｇから７５ｐｓｉｇの圧力下で実施した気体からエタノールへの発酵を記載しており、この文献では、１５０ｇ／ｌ／日および３６９ｇ／ｌ／日のエタノール生産性が得られる。しかしながら、たとえば、大気圧での同様の媒体および導入気体組成を使用して実施した発酵は、１日あたりリットルあたり１０〜２０倍少ないエタノールを産生することが見いだされた。
【０１６５】
また、ＣＯ含有気体物質の導入の比率は、液相中のＣＯの濃度が、限定されないよう保証されることが望ましい。このことは、１つ以上の産物が、培養物により消費され得るＣＯ限定条件の結果によるものである。
【０１６６】
発酵反応を供給するために使用される気体流の組成は、この反応の効率および／または費用に顕著に影響を与えることができる。たとえば、Ｏ２は、嫌気的発酵工程の効率を低減し得る。発酵の前後の発酵工程段階の望ましくないまたは不必要な気体の処理は、このような場合の負担を増大し得る（例えば、気体流は、バイオリアクターに入る前に加圧され、不必要なエネルギーを使用して、発酵に必要ではない気体を加圧し得る）。したがって、望ましくない成分を除去し、かつ、望ましい成分の濃度を増大させるために、物質流、特に、工業供給源由来の物質流を処理することが望ましい。
【０１６７】
ある実施形態では、本発明の細菌の培養物を、水培養媒体で維持する。好ましくは、この水培養媒体は、最小嫌気的微生物増殖媒体である。適切な媒体は当業者により知られており、たとえば、米国特許第５，１７３，４２９号、同第５，５９３，８８６号、および国際公開特許公報第０２／０８４３８号および以下の実施例に記載される文献に記載される。
【０１６８】
バイオディーゼルまたはバイオディーゼルおよび／もしくは１つ以上の他の生成物を含む混合流は、分別蒸留、蒸発、浸透気化法、気体のストリッピング、および液体―液体抽出などを含む抽出発酵などの当業者に知られている方法により発酵ブロスから回収されてもよい。また、産物は、相の分離により抽出できる媒体に拡散または分泌されてもよい。
【０１６９】
本発明の好ましい実施形態では、バイオディーゼルおよび１つ以上の産物を、バイオリアクターからブロスの一部を連続的に除去し、ブロスから微生物細胞（濾過により簡便に）分離し、かつ、ブロスから１つ以上の産物を回収することにより、発酵ブロスから回収する。アルコールを、たとえば蒸留により簡便に回収してもよい。アセトンは、たとえば、蒸留により回収されてもよい。生成された酸はいずれも、たとえば活性炭に吸着させて回収してもよい。分離した微生物細胞を、好ましくは、発酵バイオリアクターに戻す。アルコールおよび酸を除去した後に残る、細胞を含まない透過物は、好ましくは発酵バイオリアクターに戻される。バイオリアクターに戻す前に、栄養媒体を補充するために、さらなる栄養物（ビタミンＢなど）を、細胞を含まない透過物に添加してもよい。
【０１７０】
また、バイオリアクターに戻す前に、活性炭に対する酢酸の吸着を高めるために上述のようにブロスのｐＨを調整する場合、ｐＨは、発酵バイオリアクターのブロスのｐＨと同様のｐＨに再調整されるべきである。
【実施例】
【０１７１】
本発明を、以下の非限定的な実施例を参照して説明する。
【０１７２】
実施例１：ＣＯ由来のバイオディーゼルの産生
酢酸産生酸化炭素資化性（acetogenic carboxydotroph）のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍを、バイオディーゼル脂肪酸アシルエステル、ブタン酸ブチルエステル（ＦＡＢＥ）の産生のために、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｙｉの不特定アシルトランスフェラーゼで改変した。ブタノール産生を、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの遺伝子改変株を使用して以前に例証した（ＷＯ  ２０１２／０５３９０５）。
【０１７３】
株および増殖条件
すべてのサブクローニングステップを、以前に記載される標準的な株および増殖条件を使用してＥ．  ｃｏｌｉ中で実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｒｏｔａｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ，  １９８９；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｌｔｄ．，  Ｈｏｂｏｋｅｎ，  １９８７）。
【０１７４】
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ１００６１およびＤＳＭ２３６９３（ＤＳＭ１００６１の誘導体）を、ＤＳＭＺ（ドイツ収集の微生物および細胞培養物、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａsｅ  ７  Ｂ，  ３８１２４、ドイツブラウンシュヴァイク市）から取得した。増殖を、厳密な嫌気条件および技術を使用して３７℃で実行した（Ｈｕｎｇａｔｅ，  １９６９，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．  ３Ｂ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  １１７−１３２；  Ｗｏｌｆｅ，  １９７１，  Ａｄｖ．  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ６：  １０７−１４６）。酵母抽出物を含まない化学的に規定されたＰＥＴＣ培地（表１）および唯一の炭素およびエネルギー供給源としての３０ｐｓｉの一酸化炭素含有製鋼廃ガス（ニュージーランドのＧｌｅｎｂｒｏｏｋの工場地帯で収集、組成：４４％  ＣＯ、３２％  Ｎ２、２２％  ＣＯ２、２％  Ｈ２）を使用した。
【表１−１】
0006466836.tif 000002
【表１−２】
0006466836.tif 000003
【表１−３】
0006466836.tif 000004
【表１−４】
0006466836.tif 000005
【０１７５】
発現プラスミドの構築
標準的な組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術を本発明に使用し、これらの技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，  １９８９およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，  １９８７により記載される。Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｙｉの不特定アシルトランスフェラーゼ（ＹＰ＿０４５５５５．１；  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：  ２８７９２１８）は最適化コドンであり、合成されていた（配列番号１）。
【０１７６】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ  １００６１由来のゲノムＤＮＡを、ＢｅｒｔｒａｍおよびＤuｒｒｅ  （１９８９）による改変方法を使用して単離した。１晩置いた１００ｍｌの培養物を回収し（６，０００×ｇ、１５分、４℃）、リン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）で洗浄し、１．９ｍｌのＳＴＥ緩衝液（５０ｍＭのトリスＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのスクロース；ｐＨ８．０）で懸濁した。３００μｌのリゾチーム（〜１００，０００Ｕ）を添加して、この混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、その後、１０％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ溶液を２８０μｌ添加し、さらに１０分間インキュベートした。２４０μｌのＥＤＴＡ溶液（０．５Ｍ、ｐＨ８）、２０μｌのトリス−ＨＣｌ（１Ｍ、ｐＨ７．５）、および１０μｌのＲＮａｓｅ  Ａ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を添加することにより室温でＲＮＡを溶解した。そのあと、１００μｌのプロテイナーゼＫ（０．５Ｕ）を添加し、タンパク質分解を、１〜３時間、３７℃で行った。最後に、６００μｌの過塩素酸ナトリウム（５Ｍ）を添加した後、フェノール−クロロホルム抽出およびイソプロパノール沈殿を行った。ＤＮＡの定量および定性を、分光光度的に検査した。
【０１７７】
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来のホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼプロモーター領域（配列番号４）を、オリゴヌクレオチドＰｐｔａ−ａｃｋ−ＮｏｔＩ−Ｆ（配列番号：２：ＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＡＴＧＡＴＡＴＴＴＡＴＧＴＣＣ）および  Ｐｐｔａ−ａｃｋ−ＮｄｅＩ−Ｒ（配列番号：３：ＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＴＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴＴＴＣＣＴＣＣ）を含むゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅し、ｉＰｒｏｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｒａｔｏｒｉｅｓ）を適用して以下の、初期変性（９８℃、３０分間）、３５サイクルの変性（９８℃、１０秒）、アニーリング（５５℃、３０秒）、および伸長（７２℃、３０秒間）のプログラムを最終的な伸長（７２℃、１０分間）の前に行った。
【０１７８】
増幅したホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロン（Ｐｐｔａ−ａｃｋ）の４９８ｂｐのプロモーター領域を、ＮｏｔＩ  および  ＮｄｅＩ制限部位および株ＤＨ５α−Ｔ１Ｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＥ．  ｃｏｌｉ−ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍシャトルベクターｐＭＴＬ  ８５２４１  （ＦＪ７９７６５１．１；Ｎｉｇｅｌ  Ｍｉｎｔｏｎ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ；Ｈｅａｐ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）に内にクローニングした。その後、合成したアシルトランスフェラーゼ遺伝子（配列番号１）を、ＮｄｅＩ  および  ＥｃｏＲＩを使用してクローニングし、プラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ａｔｆ（配列番号：５；Ｆｉｇ．２）を形成した。この挿入断片を、表２に得られるオリゴヌクレオチドを使用して相補的に配列決定し、この結果を、ａｔｆ遺伝子が変異のないことを確認した。
【表２】
0006466836.tif 000006
【０１７９】
ＤＮＡのメチル化
ＦＡＥＥ発現プラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ａｔｆのメチル化を、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ，  Ｃ．  ｒａｇｓｄａｌｅｉ  および  Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ由来のメチルトランスフェラーゼから設計し、合成したハイブリッドタイプＩＩメチルトランスフェラーゼ（配列番号１２）を使用してＥ．ｃｏｌｉでｉｎ  ｖｉｖｏで実施した。このメチルトランスフェラーゼを、ベクターｐＧＳ２０  （配列番号：１４）中の誘導型のｌａｃプロモーター（配列番号１３）に融合した。
【０１８０】
発現プラスミドおよびメチル化プラスミドを、制限陰性Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’  Ｋａｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の同一の細胞に形質転換し、適合性のグラム−（−）の複製起源（発現プラスミドにおける高コピーのＣｏｌＥ１およびメチル化プラスミドにおける低コピーのｐ１５Ａ）により可能である。Ｉｎ  ｖｉｖｏでのメチル化は、１ｍＭのＩＰＴＧの添加により誘導され、メチル化プラスミドは、ＱＩＡＧＥＮプラスミドミディキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して単離した。得た混合物をＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ２３６９３での形質転換の実験に使用したが、大量（高コピー）の発現プラスミドのみが、クロストリジウム中で複製が可能なグラム−（＋）複製起源（ｒｅｐＬ）を有する。
【０１８１】
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍへの形質転換
完全な形質転換の実験の間、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ２３６９３を、１ｇ／Ｌの酵母抽出物および１０ｇ／ｌのフルクトース、ならびに炭素供給源としての３０ｐｓｉ製鋼廃ガス（ニュージーランドのＧｌｅｎｂｒｏｏｋの工場地帯で収集、組成：４４％  ＣＯ、３２％  Ｎ２、２２％  ＣＯ２、２％  Ｈ２）を補充したＰＥＴＣ培地（表１）で増殖した。
【０１８２】
完全な細胞を作製するために、５０ｍｌのＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ２３６９３培養物を、新鮮な培地に３日間連続して継代培養した。これらの細胞を使用して、ＯＤ６００ｎｍが０．０５のＤＬ−スレオニン４０ｍｌを含む５０ｍｌのＰＥＴＣ培地に接種した。この培養物のＯＤ６００ｎｍが０．４に達した際に、この細胞を、嫌気的チャンバーに移し、４，７００×ｇおよび４℃で回収した。この培養物を２回氷冷したエレクトロポレーションバッファー（２７０ｍＭのスクロース、１ｍＭのＭｇＣｌ２、７ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で洗浄し、最終的に６００μｌの新鮮なエレクトロポレーションバッファーで懸濁した。この混合物を、１μｇのメチル化プラスミド混合物を含む０．４ｃｍの電極ギャップを有するあらかじめ氷冷したエレクトロポレーションキュベットに移し、すぐに以下の設定（２．５ｋＶ，６００Ω，および２５μＦ）でＧｅｎｅ  ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用し電気を通した。３．７〜４．０ｍｓの時定数を得た。この培養物を、５ｍｌの新鮮な培地に移した。細胞の再産生を、チューブホルダーに取り付けられたＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｈｅｌｉｏｓ  Ｅｐｓｉｌｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して６００ｎｍの波長でモニタリングした。バイオマスを最初に液滴した後、細胞は再び増殖を開始した。バイオマスがこの時点から２倍となると、細胞を集め、２００μｌの新鮮な培地で懸濁し、４μｇ／ｍｌのクラリスロマイシンを含む選択的ＰＥＴＣプレート（１．２％  ＢａｃｔｏTM  Ａｇａｒ  （ＢＤ）を含む）上にプレーティングした。３７℃、３０ｐｓｉの製鋼ガスでの接種の４〜５日後、コロニーが視認可能となった。
【０１８３】
このコロニーを使用して、４μｇ／μｌのクラリスロマイシンを含む２ｍｌのＰＥＴＣ培地を接種した。増殖が起こった際、この培養液を、４μｇ／μｌのクラリスロマイシンおよび唯一の炭素源として３０ｐｓｉの製鋼ガスを含むＰＥＴＣ培地で、５ｍｌ、次に５０ｍｌにスケールアップした。
【０１８４】
成功した形質転換の確認
ＤＮＡの転換を確認するために、プラスミドミニプレップを、Ｚｙｐｐｙ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ）を使用して１０ｍｌの培養物容量から実施した。単離プラスミドの質が、クロストリジウムのエキソヌクレアーゼの活性により制限溶解に対して十分ではないため［Ｂｕｒｃｈｈａｒｄｔ  および  Ｄuｒｒｅ，  １９９０］、ＰＣＲを、表２に得られる単離プラスミドおよびオリゴヌクレオチドを用いて実施し、プラスミドの存在を確認した。ＰＣＲを、ｉＮｔＲＯＮ  Ｍａｘｉｍｉｓｅ  Ｐｒｅｍｉｘ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｉｎｔｒｏｎ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、以下の、最初の変性（９４℃、２分間）、３５サイクルの変性（９４℃、２０秒間）、アニーリング（５５℃、２０秒間）、および伸長（７２℃、６０秒間）、条件で、最終伸長ステップ（７２℃、５分間）の前に実施した。
【０１８５】
クローンの同一性を確認するため、５０ｍｌのＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ２３６９３培養物からゲノムＤＮＡを単離した（上述参照）。オリゴヌクレオチドｆＤ１（配列番号：１５：ｃｃｇａａｔｔｃｇｔｃｇａｃａａｃＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ）およびｒＰ２（配列番号：１６：ｃｃｃｇｇｇａｔｃｃａａｇｃｔｔＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ）［Ｗｅｉｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１］を使用して１６ｓリボソームＲＮＡ遺伝子に対してＰＣＲを実施し、この際、ｉＮｔＲＯＮ  Ｍａｘｉｍｉｓｅ  Ｐｒｅｍｉｘ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｉｎｔｒｏｎ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、以下の、最初の変性（９４℃、２分）、３５サイクルの変性（９４℃、２０秒）、アニーリング（５５℃、２０秒間）、伸長（７２℃、６０秒）といった条件を、最終伸長ステップ（７２℃、５分間）の前に行った。シークエンシングの結果は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（Ｙ１８１７８，  ＧＩ：７２７１１０９）の１６ｓリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒｒｓＡ）と少なくとも９９．９％同一であった。
【０１８６】
ＣＯ由来のバイオディーゼル産物を確認するための増殖実験
ＦＡＥＥ産生を例証するために、ＰＥＴＣ培地を調製し、発現プラスミドｐＭＴＬ８５２４５−ａｔｆを有するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ株を用いて接種した。５０ｍＬＰＥＴＣ培地（表１）の入った血清ビンを、製鋼廃ガス（ニュージーランドのＧｌｅｎｂｒｏｏｋの工場地帯で収集、組成：４４％  ＣＯ、３２％  Ｎ２、２２％  ＣＯ２、２％  Ｈ２）由来の３０ｐｓｉのＣＯ含有ガス流で加圧し、５日間培養した。同一の実験を、プラスミドを有さない野生型Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ株を用いて実行した。
【０１８７】
培養物を、ヘッドスペースのサンプリングを使用してＧＣ−ＭＳにより分析した。２ｍＬの試料を含む２０ｍＬのバイアルを、繊維（Ｓｕｐｅｌｃｏ  ＰＤＭＳ  １００  繊維）に１０分間４０℃に暴露し、その後、３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍのＺｂＷａｘカラムを備えつけた５９７３ＭＳＤを含むアジレント社の６８９０  ＧＣを使用して、以下の条件（インジェクターの温度：２５０℃、スプリットレス注入：２５０℃で１０分間脱着；１ｍＬ／分の一定流量；オーブンに４０℃で５分間保持、１０℃／分で１９０℃まで上昇、５分間保持、３℃／分で２０８℃まで上昇、１０℃／分で２２０℃まで上昇、１０分間保持、６０℃／分で４０℃まで戻す；ＭＳＤ：スキャンモード、１．４７スキャン／秒で質量範囲３８〜６５０ＡＭＵ）で分析した。アメリカ国立標準技術研究所（ＮＩＳＴ）標準参照データベースに対するバイオディーゼル物質のブタン酸ブチルエステルと一致する２つのピークが、発現プラスミドを輸送する株に見いだされたが、プラスミドのない野生型株中には存在せず、１−オクタデカノール（Ｃ１８）またはテトラデカナール（Ｃ１４）、ヘプタデカン（Ｃ１７）、９−オクタデカナール（Ｃ１８）および１１−ヘキサデカナール（Ｃ１６）のようなＣ１４〜Ｃ１８の範囲のいくつかの脂肪酸産物も同様である（表３、図３）。エタノールおよびブタノールのようなアルコールは、３５°Ｃで作動するＲＩＤ（Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＨＰＬＣシステムおよび３５℃を維持したＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラム（３００×７．８分、粒径９μｍ）を使用して実施した。ＲＩＤ（Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ），は３５°Ｃで作動され、Ａｌｌｔｅｃ  ＩＯＡ−２００有機物酸コールム（１５０ｘ６・５ｍｍ、粒径８μｍ）を60°で維持した。わずかに酸性化した水（０．００５  Ｍ  Ｈ２ＳＯ４）を、０．２５ｍｌ／分の流量での稼働相として使用した。タンパク質および他の細胞残物を除去するために、４００μｌの試料を１００μｌの２％（ｗ／ｖ）の５−スルホサリチル酸と混合し、１４，０００×ｇで３分間遠心機にかけ、沈殿残物を分離した。１０μｌの上清を、分析のためＨＰＬＣに注入した。
【表３】
0006466836.tif 000007
【０１８８】
本発明は本明細書に記載されている通りであり、これは、過度の実験を行うことなく本明細書を読むことにより本発明の実施を可能とすることを目的とする。しかしながら、本発明の範囲を逸脱することなく、多くの成分およびパラメーターを、特定の内容に変動または修正してもよく、知られている均等物に変えてもよいことは、当業者に明らかである。また、このような修正および均等物は、個々に設定されるように本明細書に組み込まれていることは明らかである。発明の名称、表題などは、本文書の読み手の理解を高めるために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するように読み取られるものではない。
【０１８９】
もし存在する場合には、上記かつ以下に引用されるすべての特許出願、特許、および公開公報のすべての開示は、本明細書に参照として援用される。しかしながら、いずれの特許出願、特許、および公開公報に対する参照は、世界のいずれかの国の一般的に共通な知識の有効な先行技術または形態部分を構成するものではなく、認識されるものではなく、示唆されるものではない。
【０１９０】
特段の記載がない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語は、排他的な意味と反対の包括的な意味として理解され、すなわち「限定するものではないが、〜を含む」と理解される。
また、本発明は以下を提供する。
［１］  非特異的なアセチルトランスフェラーゼ（ワックスエステルシンターゼ／アシル補酵素Ａ：ジアシルグリセロール  アシルトランスフェラーゼ）をコードする外因性核酸を含む、遺伝子改変した酸化炭素資化性細菌。
［２］  クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｉｄｉｕｍ）である、［１］に記載の細菌。
［３］  前記外因性非特異的アセチルトランスフェラーゼが、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｙｉの非特異的アセチルトランスフェラーゼである、［１］に記載の細菌。
［４］  前記核酸はプラスミドである、［１］に記載の細菌。
［５］  Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍである、［１］に記載の細菌。
［６］  Ｃ．ｌｊｕｎｄａｈｌｉｉである、［１］に記載の細菌。
［７］  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｍａｇｎｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ  ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｕｖｉからなる群から選択される、［１］に記載の細菌。
［８］  前記非特異的アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸が、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍに最適化されるコドンである、［５］に記載の細菌。
［９］  ＣＯおよび／またはＣＯ２をバイオディーゼルに変換する工程であって、前記工程が、
気体のＣＯ含有物質および／またはＣＯ２含有物質を、培養媒体中の［１］に記載の酸化炭素資化性酢酸産生細菌の培養物を含むバイオリアクターに通し、これにより、前記細菌が前記ＣＯおよび／またはＣＯ２を前記バイオディーゼルに変換することと、
前記バイオリアクターから前記バイオディーゼルを回収することと
を含む、工程。
［１０］  前記物質が、工業廃ガスを含む、［９］に記載の工程。
［１１］  前記培養物が厳密に嫌気性である、［９］に記載の工程。
［１２］  前記バイオディーゼルが、脂肪酸エチルエステルを含む、［９］に記載の工程。
［１３］  前記バイオディーゼルが、脂肪酸ブチルエステルを含む、［９］に記載の工程。
［１４］  酸化炭素資化性酢酸産生細菌を複製するプラスミドであって、前記プラスミドが、非特異的アセチルトランスフェラーゼ（ワックスエステルシンターゼ／アシル補酵素Ａ：ジアシルグリセロール  アシルトランスフェラーゼ）をコードする外因性核酸を含む、プラスミド。
［１５］  前記非特異的アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸が、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍに最適化されたコドンである、［１４］に記載のプラスミド。
［１６］  メチル化されている、［１４］に記載のプラスミド。
【０１９１】
参考文献
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Ｋoｐｋｅ，  Ｍ．，  Ｈｅｌｄ，  Ｃ．，  Ｈｕｊｅｒ，  Ｓ．，  Ｌｉｅｓｅｇａｎｇ，  Ｈ．，  Ｗｉｅｚｅｒ，  Ａ．，  Ｗｏｌｌｈｅｒｒ，  Ａ．，  Ｅｈｒｅｎｒｅｉｃｈ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）．  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ  ａ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｙｎｇａｓ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，  １０７（２９）．  
Ｋoｐｋｅ，  Ｍ．，  Ｍｉｈａｌｃｅａ，  Ｃ．，  Ｌｉｅｗ，  Ｆ．，  Ｔｉｚａｒｄ，  Ｊ．  Ｈ．，  Ａｌｉ，  Ｍ．  Ｓ．，  Ｃｏｎｏｌｌｙ，  Ｊ．  Ｊ．，  Ａｌ−Ｓｉｎａｗｉ，  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）．  ２，３−Ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｂｙ  Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，  ａｎ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｒｏｕｔｅ  Ｔｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｕｓｉｎｇ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｗａｓｔｅ  Ｇａｓ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ７７（１５），  ５４６７-７５．
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【図１】
0006466836.tif 000008
【図２】
0006466836.tif 000009
【図３】
0006466836.tif 000010
【配列表】
0006466836000001.app