(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号７及び１３のアミノ酸配列よりなる群から選ばれた少なくとも一つ以上の分泌タンパク質が不活性化された、Ｌ−リシンを産生するコリネバクテリウム・グルタミクム。
【請求項２】
微生物を培養して培養物又は細胞中にＬ−リシンを産生するステップと、培養物からＬ−リシンを回収するステップと、を含む、Ｌ−リシンを産生する方法であって、
該微生物が、  配列番号１、７及び１３のアミノ酸配列よりなる群から選ばれた少なくとも一つ以上の分泌タンパク質が不活性化された、Ｌ−リシン産生能を有するコリネバクテリウム属である、方法。
【請求項３】
Ｌ−リシンを産生するための、Ｌ−リシンを産生するコリネバクテリウム属微生物の使用であって、ここで微生物は、配列番号１、７及び１３のアミノ酸配列よりなる群から選ばれた少なくとも一つ以上の不活性化された分泌タンパク質を含む、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−リシンの産生能が向上した微生物及びこれを用いたＬ−リシンの産生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−リシンは、動物の飼料、ヒトの医薬品及び化粧品産業に用いられており、コリネバクテリウム属菌株やエシェリキア属菌株を用いた発酵により産生されている。最近、高効率の産生菌株及び発酵工程技術の開発のための様々な研究が行われている。
【０００３】
ビールやワインの生産に用いられる酵母において、発酵過程中の気泡の発生を調節するための研究が盛んに行われてきている中で、最近の研究において、気泡の発生に影響を及ぼす遺伝子（ＡＷＡ１、ＦＰＧ１、ＣＦＧ１）が判明された（Ｓｈｉｍｏｉ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６８：２０１８−２５；  Ｂｌａｓｃｏ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｙｅａｓｔ．  ２０１１，  ２８：４３７−５１；  Ｂｌａｓｃｏ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  ２０１２，  ６０：１０７９６−０７）。ここで、これらの遺伝子が不活性化された菌株においては、気泡の発生が母菌株に比べて大幅に減少されたのに対し、これらの遺伝子が過発現された菌株においては、気泡の発生が増加することが究明された。
【０００４】
酵母の培養に際して、気泡は、次のような一連の過程に経て発生する。まず、発酵中に発生する微細ガスバブルにマンノタンパク質が混ざる。このとき、ガスバブルの内部は疎水性部位が、ガスバブルの外部は親水性部位が占める。その結果、培養液の粘性が増加して様々なタンパク質だけではなく、細胞まで混ざることにより、気泡が発生する（Ｓｗａｒｔ  ＣＷ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．  ２０１２，  １２：８６７−６９）。
【０００５】
酵母を用いた ビールの生産に当たっては適切なレベルの気泡の発生が求められているが、アミノ酸など有用産物の量産に用いられる微生物の発酵に当たっては気泡の発生を抑える必要がある。培養中に過量の気泡が発生する場合、培養液の粘性が増加して培養液内の酸素ガスの伝達効率（Ｏｘｙｇｅｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｒａｔｅ；ＯＴＲ）が低下され、酷い場合には菌体の溶解を引き起こすこともある。なお、気泡の発生を抑えるための過量の消泡剤の使用は、産業的な側面からみて、製造コストを高騰させる負担要因として働くおそれがあり、菌体の生長を阻害する否定的な影響を及ぼすおそれがある。
この理由から、本発明者らは、コリネバクテリウム属菌株を対象として過量の気泡の発生に影響を及ぼす遺伝子を選別して、遺伝的な側面からみて気泡の発生を有効に抑えることにより、Ｌ−リシンの産生能が増加することを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、Ｌ−リシンの産生能が向上したコリネバクテリウム属微生物を提供することである。
本発明の他の目的は、前記コリネバクテリウム属微生物を用いてＬ−リシンを産生する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述した目的を達成するために、本発明の一態様は、配列番号１、７、及び１３のアミノ酸配列よりなる群から選ばれた少なくとも一つ以上の分泌タンパク質が不活性化されたコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明の他の態様は、前記コリネバクテリウム属微生物を培養してＬ−リシンを産生する方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明による微生物は、気泡の発生に与る分泌タンパク質が不活性化されてＬ−リシンの産生能が向上した菌株である。この菌株を用いると、気泡の発生が抑えられ、その結果、工程設備の増設又はさらなる多量の消泡剤の投入なしに培養可能な産生量が増える。なお、産業的な側面からみて、産生し易さ及び製造コストの節減などの効果が期待され、Ｌ−リシンが効率よく産生される。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を詳述する。
一つの態様によれば、本発明においては、配列番号１、７、及び１３のアミノ酸配列よりなる群から選ばれた少なくとも一つ以上の分泌タンパク質が不活性化されたコリネバクテリウム属微生物を提供する。
【００１０】
Ｌ−リシンを産生するための大量の培養中に過量の気泡が発生する場合、培養液の粘性が増加して培養液内の酸素ガスの伝達効率（Ｏｘｙｇｅｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｒａｔｅ；ＯＴＲ）が低下され、酷い場合には菌体の溶解を引き起こすこともある。すなわち、気泡の発生を抑えるという側面からみて、気泡の発生の原因となる分泌タンパク質を不活性化させることは、リシンの産生に有利に働くものと考えられた。
【００１１】
このため、本発明の一実施形態においては、Ｌ−リシンの産生及び発酵工程を改善すべく、リシンの産生に不要な気泡の発生の原因となる主たる分泌タンパク質を選別するために、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（前記微生物は、ＫＦＣＣ１０８８１として公開されていて、ブダペスト条約下である国際寄託機関に再寄託されてＫＣＣＭ１１０１６Ｐという寄託番号が与えられた、韓国登録特許第１０−０１５９８１２号）を培養した後、発酵過程中に生成された気泡のみを分離してペプチドを確保した。このようにして確保したペプチドを分析して、相対的に検出量が最も多いタンパク質３種を選んでコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２に対するＮＣＢＩ許可番号ＮＣｇｌ０３３６、ＮＣｇｌ０７１７及びＮＣｇｌ２９１２遺伝子により暗号化されるペプチドを選り抜いた。
【００１２】
本発明において、前記ＮＣｇｌ０３３６遺伝子により暗号化されるペプチドは、コリネバクテリウム属微生物に内在的に存在するエステラーゼである。具体的には、前記ペプチドは配列番号１のアミノ酸を含んでいてもよく、本発明において提示した分泌タンパク質であって、エステラーゼ活性を有するタンパク質である限り、前記配列番号１のアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは、９０％以上、より好ましくは、９５％以上、特に好ましくは、９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列もまた本発明に含まれる。なお、微生物の種又は菌株に応じて前記活性を示すタンパク質のアミノ酸配列に違いが存在する場合があるため、これに限定されない。前記配列と相同性を有する配列であって、実質的に配列番号１のアミノ酸配列と同一であるか、又はそれに対応する生物学的な活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換又は付加されたアミノ酸配列を有する場合もまた本発明の範囲に含まれるということはいうまでもない。
【００１３】
本発明において、前記ＮＣｇｌ０３３６遺伝子は配列番号２のヌクレオチド配列を有し、前記配列番号２のヌクレオチド配列に対して８０％以上、好ましくは、９０％以上、より好ましくは、９５％以上、特に好ましくは、９７％以上の相同性を有するヌクレオチド配列もまた本発明に含まれる。また、遺伝暗号の縮退性（ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）に起因して同じアミノ酸配列をコーディングする前記配列の変異体もまた本発明に含まれる。更に、本発明のＮＣｇｌ０３３６をコーディングするポリヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列に由来するプローブと厳しい条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下で混成化されてもよく、正常的に機能するＮＣｇｌ０３３６をコーディングする変異型であってもよい。
【００１４】
本発明において、前記ＮＣｇｌ０７１７遺伝子により暗号化されるペプチドは、コリネバクテリウム属微生物に内在的に存在するエステラーゼである。具体的には、前記ペプチドは配列番号７のアミノ酸を含んでいてもよく、本発明において提示した分泌タンパク質であって、エステラーゼ活性を有するタンパク質である限り、前記配列番号７のアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは、９０％以上、より好ましくは、９５％以上、特に好ましくは、９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列もまた本発明に含まれる。また、微生物の種又は菌株に応じて前記活性を示すタンパク質のアミノ酸配列に違いが存在する場合があるため、これに限定されない。前記配列と相同性を有する配列であって、実質的に配列番号７のアミノ酸配列と同じであるか、又はそれに対応する生物学的な活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換又は付加されたアミノ酸配列を有する場合もまた本発明の範囲に含まれるということはいうまでもない。
【００１５】
本発明において、前記ＮＣｇｌ０７１７遺伝子は、配列番号８のヌクレオチド配列を有し、前記配列番号８のヌクレオチド配列に対して８０％以上、好ましくは、９０％以上、より好ましくは、９５％以上、特に好ましくは、９７％以上の相同性を有するヌクレオチド配列もまた本発明に含まれる。また、遺伝暗号の縮退性に起因して同じアミノ酸配列をコーディングする前記配列の変異体もまた本発明に含まれる。更に、本発明のＮＣｇｌ０７１７をコーディングするポリヌクレオチドは、配列番号８のヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列に由来するプローブと厳しい条件下で混成化されてもよく、正常的に機能するＮＣｇｌ０７１７をコーディングする変異型であってもよい。
【００１６】
本発明において、前記ＮＣｇｌ２９１２遺伝子により暗号化されるペプチドは、コリネバクテリウム属微生物に内在的に存在するエステラーゼである。具体的には、前記ペプチドは配列番号１３のアミノ酸を含んでいてもよく、本発明において提示した分泌タンパク質であって、エステラーゼ活性を有するタンパク質である限り、前記配列番号１３のアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは、９０％以上、より好ましくは、９５％以上、特に好ましくは、９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列もまた本発明に含まれる。また、微生物の種又は菌株に応じて前記活性を示すタンパク質のアミノ酸配列に違いが存在する場合があるため、これに限定されない。前記配列と相同性を有する配列であって、実質的に配列番号１３のアミノ酸配列と同じであるか、又はそれに対応する生物学的な活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換又は付加されたアミノ酸配列を有する場合もまた本発明の範囲に含まれるということはいうまでもない。
【００１７】
本発明において、前記ＮＣｇｌ２９１２遺伝子は、配列番号１４のヌクレオチド配列を有し、前記配列番号１４のヌクレオチド配列に対して８０％以上、好ましくは、９０％以上、より好ましくは、９５％以上、特に好ましくは、９７％以上の相同性を有するヌクレオチド配列もまた本発明に含まれる。また、遺伝暗号の縮退性に起因して同じアミノ酸配列をコーディングする前記配列の変異体もまた本発明に含まれる。更に、本発明のＮＣｇｌ０７１７をコーディングするポリヌクレオチドは、配列番号１４のヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列に由来するプローブと厳しい条件下で混成化されてもよく、正常的に機能するＮＣｇｌ２９１２をコーディングする変異型であってもよい。
【００１８】
本発明において、「相同性」という用語は、与えられたアミノ酸配列又は塩基配列と一致する度合いを意味し、百分率にて表示されてもよい。本明細書において、与えられたアミノ酸配列又は塩基配列と同一又は類似の活性を有するその相同性配列が「％相同性」と表示される。前記アミノ酸配列に対する相同性は、例えば、文献によるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［参照：Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｐｒｏ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０，  ５８７３（１９９３）］やＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ［参照：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １８３，  ６３（１９９０）］を用いて決定してもよい。このようなアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている［参照：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ］．
【００１９】
本発明における用語「厳しい条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的な混成化を可能にする条件を意味する。例えば、このような厳しい条件は、文献（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９；  Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に具体的に記載されている。
【００２０】
本発明における用語「不活性化」は、当業界における周知の任意の不活性化方法により行われてもよい。本発明において、不活性化とは、前記内在的な遺伝子の発現が野生菌株に比べて低いレベルに減るか、或いは全く発現されない遺伝子及びたとえ発現されてもその活性がないか、或いは減っている遺伝子が生成されることを意味するものであり、遺伝子の塩基配列の全体、一部、又はその発現調節配列の全体又は一部を欠失、置換、挿入により変異させるか、又はこれらの組み合わせによるものであってもよい。
【００２１】
具体例としては、前記内在的な遺伝子のオープンリーディングフレームが内部的に失われた遺伝子断片を含む組換えベクターにコリネバクテリウム属微生物を形質転換して内在的な遺伝子を欠損又は突然変異させることにより、前記内在的な遺伝子の活性が不活性化された微生物を製造してもよい。前記遺伝子の染色体内への挿入は、当業界における周知の任意の方法により行われてもよい。
【００２２】
本明細書における用語「内在的な」酵素及び活性とは、微生物又は細胞にそもそも存在する天然状態の酵素及びその活性を意味する。すなわち、当該酵素及び活性が変異される前の酵素及びその活性を意味するものである。
【００２３】
本発明における用語「組換えベクター」とは、好適な宿主内において目的タンパク質を発現させるように好適な調節配列に作動可能なように連結された前記目的タンパク質を暗号化させるポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始可能なプロモータ、そのような転写を調節するための任意のオペレータ配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコーディングする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含む。ベクターは、適当な宿主内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製されたり機能したりでき、ゲノムそれ自体に取り込まれてもよい。本発明において用いられるベクターは、宿主中において複製可能なものであれば、特に限定されるものではなく、当業界における周知の任意のベクターが使用可能である。
【００２４】
前記組換えベクターの製作に用いられたベクターは、天然状態若しくは組換え状態のプラスミド、コスミド、ウィルス及びバクテリオファージであってもよい。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＭＢＬ３、λＭＢＬ４、λＩＸＩＩ、λＡＳＨＩＩ、λＡＰＩＩ、λｔ１０、λｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどが使用可能であり、プラスミドベクターとして、ｐＤＺベクター、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などが使用可能である。使用可能なベクターは特に限定されるものではなく、公知の発現ベクターが使用可能である。
【００２５】
本発明における用語「形質転換」とは、目的タンパク質を暗号化させるポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に取り込んで宿主細胞内において前記ポリヌクレオチドが暗号化させるタンパク質を発現させることを意味する。取り込まれたポリヌクレオチドは、宿主細胞内において発現可能である限り、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置してもよく、染色体外に位置してもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質を暗号化させるＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に取り込まれて発現可能なものである限り、いかなる形態で取り込まれても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自体的に発現されるのに必要なあらゆる要素を含むポリヌクレオチド構造体である発現カセットの形で宿主細胞に取り込まれてもよい。前記発現カセットは、通常、前記遺伝子のオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ、以下、「ＯＲＦ」と略称する。）に作動可能なように連結されているプロモータ、転写終結信号、リボソーム結合部位及び翻訳終結信号を含む。前記発現カセットは、自体的に複製可能な発現ベクターの形であってもよい。なお、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形で宿主細胞に取り込まれて、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能なように連結されているものであってもよい。
【００２６】
前記組換えベクターを取り込む母菌株としては、Ｌ−リシンを産生する微生物であれば、制限なしに使用可能であるが、具体的には、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属微生物が使用可能であり、更に具体的には、コリネバクテリウム・グルタミクム微生物が使用可能である。
【００２７】
本発明における用語「Ｌ−リシンを産生する微生物」とは、Ｌ−リシンを産生するように通常の公知の遺伝子を操作して得た微生物であってもよく、例えば、Ｌ−アミノ酸の産生に与るコリネバクテリウム属微生物に内在するａｓｐＢ（アスパルテートアミノトランスフェラーゼを暗号化させる遺伝子）、ｌｙｓＣ（アスパルテートキナーゼを暗号化させる遺伝子）、ａｓｄ（アスパルテートセミアルデヒドジヒドロゲナーゼを暗号化させる遺伝子）、ｄａｐＡ（ジヒドロジピコリネートシンターゼを暗号化させる遺伝子）、ｄａｐＢ（ジヒドロジピコリネートリダクターゼを暗号化させる遺伝子）及びｌｙｓＡ（ジアミノジピメレートジカルボキシラーゼを暗号化させる遺伝子）よりなる群から選ばれた遺伝子のうちの一つ又はそれ以上を挿入して得るか、又はＬ−ロイシン栄養要求性を取り込んだ変異菌株にＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を処理して得た微生物であってもよい。
【００２８】
より具体的に、本発明においては、コリネバクテリウム属微生物として、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（前記微生物は、ＫＦＣＣ１０８８１で公開されていて、ブタペスト条約下である国際寄託機関に再寄託されてＫＣＣＭ１１０１６Ｐという寄託番号が与えられた。大韓民国登録特許第１０−０１５９８１２号）、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ（大韓民国登録特許第１０−０９２４０６５号）、コリネバクテリウム・グルタミクムＬ−リシンの産生菌株ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ（前記微生物は、ＫＦＣＣ１０７５０で公開されていて、ブタペスト条約下の国際寄託機関に再寄託されて、ＫＣＣＭ１１３４７Ｐが与えられた。大韓民国登録特許第１０−００７３６１０号）及びコリネバクテリウム・グルタミクムＣＪ３Ｐ菌株（Ｂｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１２，  １３：Ｒ４０）を用いたが、これに限定されない。
【００２９】
本発明の好適な実施形態において、本発明により形質転換された微生物は、コリネバクテリウム・グルタミクム（ＫＣＣＭ１１５０２Ｐ、ＫＣＣＭ１１４８１Ｐ、ＫＣＣＭ１１４８２Ｐ）であってもよい。
【００３０】
他態様によれば、また、本発明においては、前記形質転換された微生物を用いてＬ−リシンを産生する方法を提供する。より具体的には、本発明の微生物を培養して培養物又は細胞中にＬ−リシンを産生するステップ及び前記培養物からＬ−リシンを回収するステップを含んでなる、Ｌ−リシンを産生する方法を提供する。
【００３１】
本発明の方法において、コリネバクテリウム属微生物の培養は、当業界における周知の任意の培養条件及び培養方法が使用可能である。
コリネバクテリウム属微生物の培養のために使用可能な培地としては、例えば、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  （Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，  ＵＳＡ，  １９８１）に開示されている培地が挙げられる。
培地中において使用可能な糖源としては、葡萄糖、サッカロース、乳糖、果糖、マルトース、澱粉、セルロースなどの糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツオイルなどの油及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸などの脂肪酸、グリセロール、エタノールなどのアルコール、酢酸などの有機酸が挙げられる。これらの物質は、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。
使用可能な窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆・麦及びよう素又は無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが挙げられる。窒素源もまた、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。
使用可能なリン源としては、リン酸二水素カリウム又はリン酸水素二カリウム又はこれに対応するナトリウムを含有する塩が挙げられる。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウム又は硫酸鉄などの金属塩を含有しなければならない。最後に、前記物質に加えて、 アミノ酸及びビタミンなどの必須性物質が使用可能である。なお、培養培地に適した前駆体が使用可能である。前記原料は、培養過程において培養物に適切な方式により回分式又は連続式により添加可能である。
前記微生物の培養中に、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどの基礎化合物又はリン酸又は硫酸などの酸化合物を適切な方式を用いて培養物のｐＨを調節してもよい。また、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡の生成を抑えてもよい。好気状態を保つために、培養物内に酸素又は酸素含有ガス（例えば、空気）を注入する。培養物の温度は、通常、２０℃〜４５℃、好ましくは、２５℃〜４０℃である。培養時間は、所望のＬ−アミノ酸の生成量が得られるまで持続可能であるが、好ましくは、１０〜１６０時間である。
本発明の方法において、培養は、バッチ工程、注入バッチ及び繰り返し注入バッチ工程などの連続式又は回分式により行われてもよい。このような培養方法は、当業界において周知であり、任意の方法が使用可能である。
【００３２】
以下、本発明について実施例を挙げてより詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】
実施例１：培養中の気泡の発生に関わる分泌タンパク質の選別
本実施例においては、気泡の発生原因となる分泌タンパク質を選別するために、下記の方法を用いて実験を行った。
まず、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（前記微生物は、ＫＦＣＣ１０８８１で公開されていて、ブタペスト条約下である国際寄託機関に再寄託されてＫＣＣＭ１１０１６Ｐという寄託番号が与えられた。大韓民国登録特許第１０−０１５９８１２号）菌株を１Ｌの発酵槽を用いて培養した後、発酵過程において生成された気泡のみを分離して１５ｍｌの試験管に移して濃縮させた。
気泡濃縮試料中に含まれているタンパク質の同定のために、界面活性剤入り適量の染色剤を試料に混合した後、８％のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行い、電気泳動の終わったドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルは、クマシーブルー染色法を用いて染色した。次いで、染色されたタンパク質バンド部位を切開し、トリプシンを処理してペプチドを確保し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ方法を用いて確保されたペプチドのアミノ酸配列を分析した。
分析されたペプチドを米国国立生物情報センター（ＮＣＢＩ）が提供するブラスト検索を通じてコリネバクテリウム属微生物にある遺伝子として同定した。同定されたペプチドの内から相対的に検出量が最も多い３種を選んで当該タンパク質の遺伝子を最終的に選り抜き、選り抜かれた遺伝子は、ＮＣＢＩ許可番号ＮＣｇｌ０３３６、ＮＣｇｌ０７１７及びＮＣｇｌ２９１２である。
【００３４】
実施例２：分泌タンパク質ＮＣｇｌ０３３６遺伝子の不活性化のための組換えプラスミドの製作
コリネバクテリウム染色体上においてＮＣｇｌ０３３６遺伝子を不活性化させる組換えプラスミドの製作のために、米国国立保健院の遺伝子銀行（ＮＩＨ Ｇｅｎｂａｎｋ）に報告された塩基配列に基づいて、ＮＣｇｌ０３３６の配列番号１のアミノ酸及び配列番号２のヌクレオチドの配列を確保した。ＮＣｇｌ０３３６のオープンリーディングフレームが内部的に失われた遺伝子断片を製造するために、前記配列番号２に基づいてそれぞれ配列番号３〜６のプライマーを製作した。
【００３５】
配列番号３：５'−ａｔｃｃｔｃｔａｇａｇｔｃｇａｃＧＡＡＧＣＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＣＧＣＴＧ−３'
配列番号４：５'−ＴＡＴＡＧＴＴＣＧＧＴＴＣＣＧＣＧＴＣＴＣＣＡＡＣＧＣＡＴＣＣＧＧＣＣ−３'
配列番号５：５'−ＣＧＧＡＡＣＣＧＡＡＣＴＡＴＡＣＣＡＣＣＧＡＧＧＧＡＣＧＣＡＴＴＣＴＣ−３'
配列番号６：５'−ａｔｇｃｃｔｇｃａｇｇｔｃｇａｃＧＣＴＣＡＡＡＣＧＣＡＣＧＡＧＣＧＡＡＧ−３'
【００３６】
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号３及び配列番号４、配列番号５及び配列番号６をプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）［Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ］を行った。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）条件は、９５℃における３０秒間の変性、５０℃における３０秒間のアニーリング及び７２℃における１分間の重合反応を３０回繰り返し行った。
その結果、３４２ｂｐ及び３１５ｂｐのＮＣｇｌ０３３６遺伝子部位が含まれている２対のＤＮＡ断片である、ＮＣｇｌ０３３６−Ａ及びＮＣｇｌ０３３６−Ｂを得た。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅された前記ＤＮＡ断片は、インフュージョンクローニングキット（インビトロジェン社製）を用いてｐＤＺプラスミド（大韓民国登録特許第１０−０９２４０６５号）に接合した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンが含まれているＬＢ固体培地に塗抹した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて目的とする遺伝子が挿入されたプラスミドに形質転換されたコロニーを選別した後、通常的に知られているプラスミド抽出法を用いてプラスミドを得、このプラスミドをｐＤＺ−ΔＮＣｇｌ０３３６と命名した。ｐＤＺ−ΔＮＣｇｌ０３３６は、ＮＣｇｌ０３３６の遺伝子５０３ｂｐが失われていた。
【００３７】
実施例３：分泌タンパク質ＮＣｇｌ０７１７遺伝子の不活性化のための組換えプラスミドの製作
コリネバクテリウム染色体上においてＮＣｇｌ０７１７遺伝子を不活性化させる組換えプラスミドの製作のために、米国国立保健院の遺伝子銀行（ＮＩＨ Ｇｅｎｂａｎｋ）に報告された塩基配列に基づいて、ＮＣｇｌ０７１７の配列番号７のアミノ酸及び配列番号８のヌクレオチドの配列を確保し、ＮＣｇｌ０７１７のオープンリーディングフレームが内部的に失われた遺伝子断片を製造するために、前記配列番号８に基づいてそれぞれ配列番号９〜１２のプライマーを製作した。
【００３８】
配列番号９：５'−ＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＴＣＧＣＧＧＡＴＡＡＡＴＧＧＧ−３'
配列番号１０：５'−ＣＡＣＧＴＧＡＡＡＴＴＣＡＧＧＴＣＧＣＧＴＧＧＴＴＣＡＣＣＴＣＣＧＡＡＧ−３'
配列番号１１：５'−ＣＴＴＣＧＧＡＧＧＴＧＡＡＣＣＡＣＧＣＧＡＣＣＴＧＡＡＴＴＴＣＡＣＧＴＧ−３'
配列番号１２：５'−ＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＴＣＣＣＡＴＧＡＴＴＧＴＴＣＴＧ−３'
【００３９】
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号９及び配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２をプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）条件は、９５℃における３０秒間の変性 、５０℃における３０秒間アニーリング及び７２℃における１分間の重合反応を３０回繰り返し行った。
その結果、４９３ｂｐ及び４９１ｂｐのＮＣｇｌ０７１７遺伝子部位が含まれている２対のＤＮＡ断片である、ＮＣｇｌ０７１７−Ａ及びＮＣｇｌ０７１７−Ｂを得た。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅された前記ＤＮＡ断片は、インフュージョンクローニングキット（インビトロジェン社製）を用いてｐＤＺプラスミドに接合した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンが含まれているＬＢ固体培地に塗抹した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて目的とする遺伝子が挿入されたプラスミドに形質転換されたコロニーを選別した後、通常的に知られているプラスミド抽出法を用いてプラスミドを得、このプラスミドをｐＤＺ−ΔＮＣｇｌ０７１７と命名した。ｐＤＺ−ΔＮＣｇｌ０７１７は、ＮＣｇｌ０７１７の遺伝子７８６ｂｐが失われていた。
【００４０】
実施例４：分泌タンパク質ＮＣｇｌ２９１２遺伝子の不活性化のための組換えプラスミドの製作
コリネバクテリウム染色体上においてＮＣｇｌ２９１２遺伝子を不活性化させる組換えプラスミドの製作のために、米国国立保健院の遺伝子銀行（ＮＩＨ Ｇｅｎｂａｎｋ）に報告された塩基配列に基づいて、ＮＣｇｌ２９１２の配列番号１３のアミノ酸及び配列番号１４のヌクレオチドの配列を確保し、ＮＣｇｌ２９１２のオープンリーディングフレームが内部的に失われた遺伝子断片を製造するために、前記配列番号１４に基づいてそれぞれ配列番号１５〜１８のプライマーを製作した。
【００４１】
配列番号１５：５'−ＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＴＧＣＧＡＣ−３'
配列番号１６：５'−ＣＴＣＧＴＡＧＴＣＧＣＴＡＧＣＡＣＣＴＡＴＴＡＣＧＧＧＡＧＧＴＣ−３'
配列番号１７：５'−ＧＡＣＣＴＣＣＣＧＴＡＡＴＡＧＧＴＧＣＴＡＧＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧ−３'
配列番号１８：５'−ＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＣＣＣＧＡＧＣＴＡＴＣＴＡＡＣＡＣ−３'
【００４２】
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号１５及び配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８をプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）条件は、９５℃における３０秒間の変性 、５０℃における３０秒間アニーリング及び７２℃における１分間の重合反応を３０回繰り返し行った。
その結果、４４４ｂｐ及び６３６ｂｐのＮＣｇｌ２９１２遺伝子部位が含まれている２対のＤＮＡ断片である、ＮＣｇｌ２９１２−Ａ及びＮＣｇｌ２９１２−Ｂを得た。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅された前記ＤＮＡ断片は、インフュージョンクローニングキット（インビトロジェン社製）を用いてｐＤＺプラスミドに接合した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンが含まれているＬＢ固体培地に塗抹した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて目的とする遺伝子が挿入されたプラスミドに形質転換されたコロニーを選別した後、通常的に知られているプラスミド抽出法を用いてプラスミドを得、このプラスミドをｐＤＺ−ΔＮＣｇｌ２９１２と命名した。ｐＤＺ−ΔＮＣｇｌ２９１２は、ＮＣｇｌ２９１２の遺伝子１２８ｂｐが失われていた。
【００４３】
実施例５：リシンの産生菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ由来の分泌タンパク質遺伝子の不活性化菌株の製作及び評価
前記実施例２、３及び４において製作した３種の組換えプラスミド（ｐＤＺ−ΔＮＣｇｌ０３３６、ｐＤＺ−ΔＮＣｇｌ０７１７及びｐＤＺ−ΔＮＣｇｌ２９１２）を電気パルス法を用いてコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐにそれぞれ形質転換し、相同組換えにより染色体上において目的遺伝子が不活性化された菌株をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法を用いて製造し、それぞれＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ΔＮＣｇｌ０３３６、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ΔＮＣｇｌ０７１７、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ΔＮＣｇｌ２９１２と命名した。
前記３種の菌株及び対照群を下記の種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに接種し、３０℃において２０時間かけて２００ｒｐｍにて振とう培養した。次いで、１ｍｌの種培養液を下記の産生培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに接種し、３７℃において９６時間かけて２００ｒｐｍにて振とう培養した。前記種培地及び産生培地の組成は、それぞれ下記の通りである。
【００４４】
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
葡萄糖２０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４１０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、ヨウ素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ１０００μｇ、カリシウム−パントテン酸２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１ｌを基準とする）
＜産生培地（ｐＨ７．０）＞
葡萄糖１００ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、コーンスティープ固形分５ｇ、ヨウ素３ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、カリシウム−パントテン酸２０００μｇ、ニコチンアミド３０００μｇ、ＣａＣＯ３３０ｇ（蒸留水１ｌを基準とする）
培養を終えた後、培養液をマスシリンダに移して生成された気泡の高さを測定し、ＨＰＬＣを用いて分析したＬ−リシンの濃度を下記表１に示す。表１の結果は、３回繰り返し実験した結果値であり、平均値をもって産生能を評価した。
【表１】
0006493926.tif 000002
【００４５】
表１に示すように、母菌株ＫＣＣＭ１１０１６ＰからＮＣｇｌ０３３６、ＮＣｇｌ０７１７及びＮＣｇｌ２９１２遺伝子が不活性化された菌株においてリシンの産生能が約６％増加した。これとともに、気泡の発生は、母菌株に比べてＮＣｇｌ０３３６、ＮＣｇｌ０７１７及びＮＣｇｌ２９１２遺伝子がそれぞれ不活性化された菌株において約６〜１５％低減されることが分かる。
したがって、コリネバクテリウム属微生物においてリシンの産生に不要な主たる分泌タンパク質を不活性化させることにより、培養中に発生する気泡が有効に制御することができ、これにより、Ｌ−リシンの産生能を向上させることができるということを確認した。
【００４６】
実施例６：Ｌ−リシンの産生菌株ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ由来の分泌タンパク質不活性化菌株の製作及び評価
リシン生合成経路が強化されたＬ−リシンの産生菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ（大韓民国登録特許第１０−０９２４０６５号）において分泌タンパク質の不活性化効果が前記実施例５の実験結果と略同じであるか否かを比較するために、３種の分泌タンパク質が不活性化された菌株を前記実施例５の方法と同様にして製造して、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ−ΔＮＣｇｌ０３３６、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ−ΔＮＣｇｌ０７１７、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ−ΔＮＣｇｌ２９１２と命名し、Ｌ−リシンの産生能とともに気泡の発生量を比較した。
前記菌株のリシンの産生能を比較するために、各対照群とともに実施例６の方法と同様にして培養し、培養を終えた後、気泡の発生量は実施例６の方法と同様にして測定し、ＨＰＬＣを用いて分析したＬ−リシンの濃度は、下記表２に示す。表２の結果は、３回繰り返し実験結果値であり、平均値をもって産生能を評価した。     
【表２】
0006493926.tif 000003
【００４７】
表２に示すように、母菌株ＫＣＣＭ１０７７０ＰからＮＣｇｌ０３３６、ＮＣｇｌ０７１７、ＮＣｇｌ２０８５、ＮＣｇｌ２９１２遺伝子がそれぞれ不活性化された菌株においてリシンの産生能が約４％増加した。これとともに、気泡の発生は、母菌株に比べてＮＣｇｌ０３３６、ＮＣｇｌ０７１７、ＮＣｇｌ２０８５、ＮＣｇｌ２９１２遺伝子がそれぞれ不活性化された菌株において約４〜１８％低減されることが分かる。
したがって、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ（大韓民国登録特許第１０−０９２４０６５号）においても、前記実施例６と同様に、リシンの産生に不要な主たる分泌タンパク質を不活性化させることにより、培養中に発生する気泡を有効に制御することができ、これにより、Ｌ−リシンの産生能を向上させることができるということを確認した。
【００４８】
実施例７：Ｌ−リシンの産生菌株ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ由来の分泌タンパク質不活性化菌株の製作及び評価
人工変異法により製作されたコリネバクテリウム・グルタミクムＬ−リシンの産生菌株ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ（前記微生物は、ＫＦＣＣ１０７５０で公開されていて、ブタペスト条約下の国際寄託機関に再寄託されて、ＫＣＣＭ１１３４７Ｐが与えられた。大韓民国登録特許第１０−００７３６１０号）においても分泌タンパク質の不活性化の効果を確認するために、３種の分泌タンパク質が不活性化された菌株を前記実施例５、６の方法と同様にして製造してＫＣＣＭ１１３４７Ｐ−ΔＮＣｇｌ０３３６、ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ−ΔＮＣｇｌ０７１７、ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ−ΔＮＣｇｌ２９１２と命名し、Ｌ−リシンの産生能とともに気泡の発生量を比較した。
前記菌株のリシンの産生能を比較するために、各対照群とともに実施例５、６の方法と同様にして培養し、培養を終えた後、気泡の発生量は実施例５、６の方法と同様にして測定し、ＨＰＬＣを用いて分析したＬ−リシンの濃度は、下記表３に示す。表３の結果は、３回繰り返し実験結果値であり、平均値をもって産生能を評価した。     
【表３】
0006493926.tif 000004
【００４９】
表３に示すように、母菌株ＫＣＣＭ１１３４７ＰからＮＣｇｌ０３３６、ＮＣｇｌ０７１７及びＮＣｇｌ２９１２遺伝子が不活性化された菌株においてリシンの産生能が約５％増加した。これとともに、気泡の発生は、母菌株に比べてＮＣｇｌ０３３６、ＮＣｇｌ０７１７及びＮＣｇｌ２９１２遺伝子がそれぞれ不活性化された菌株において約４〜１５％低減されることが分かる。
したがって、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１３４７Ｐ（大韓民国登録特許第９４−０００１３０７号）においても前記実施例５、６と同様にリシンの産生に不要な主たる分泌タンパク質を不活性化させることにより、培養中に発生する気泡を有効に制御することができ、これにより、Ｌ−リシンの産生能を向上させることができるということを確認した。
【００５０】
実施例８：Ｌ−リシンの産生菌株ＣＪ３Ｐ由来の分泌タンパク質不活性化菌株の製作及び評価
野生株に３種の変異［ｐｙｃ（Ｐ４５８Ｓ）、ｈｏｍ（Ｖ５９Ａ）、ｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）］を組み込んでＬ−リシンの産生能を有するコリネバクテリウム・グルタミクムＣＪ３Ｐ（Ｂｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，１３：Ｒ４０）においても前記実施例５、６、７と同様に分泌タンパク質の不活性化の効果を調べるために、３種の分泌タンパク質が不活性化された菌株を前記実施例５、６、７の方法と同様にして製造してＣＪ３Ｐ−ΔＮＣｇｌ０３３６、ＣＪ３Ｐ−ΔＮＣｇｌ０７１７、ＣＪ３Ｐ−ΔＮＣｇｌ２９１２と命名し、Ｌ−リシンの産生能とともに気泡の発生量を比較した。
前記菌株のリシンの産生能を比較するために、各対照群とともに実施例５、６、７の方法と同様にして培養し、培養を終えた後、気泡の発生量は実施例５、６、７の方法と同様にして測定し、ＨＰＬＣを用いて分析したＬ−リシンの濃度は、下記表４に示す。表４の結果は、３回繰り返し実験結果値であり、平均値をもって産生能を評価した。     
【表４】
0006493926.tif 000005
【００５１】
表４に示すように、母菌株ＣＪ３ＰからＮＣｇｌ０３３６、ＮＣｇｌ０７１７、ＮＣｇｌ２９１２遺伝子が不活性化された菌株においてリシンの産生能が約８％増加した。これとともに、気泡の発生は、母菌株に比べてＮＣｇｌ０３３６、ＮＣｇｌ０７１７、ＮＣｇｌ２９１２遺伝子がそれぞれ不活性化された菌株において約５〜１７％低減されることが分かる。
したがって、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＪ３Ｐにおいても、前記実施例５、６、７の実験結果と同様に、リシンの産生に不要な主たる分泌タンパク質を不活性化させることにより、培養中に発生する気泡を有効に制御することができ、これにより、Ｌ−リシンの産生能を向上させることができるということを確認した。
【００５２】
実施例９：Ｌ−リシンの産生菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ由来の分泌タンパク質同時不活性化菌株の製作及び評価
Ｌ−リシンの産生菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐにおける分泌タンパク質の同時不活性化による効果を確認するために、分泌タンパク質遺伝子が同時に不活性化された３種の菌株を前記実施例５、６、７、８の方法と同様にして製造して、各遺伝子を組み合わせて不活性化させた菌株をＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ΔＮＣｇｌ０３３６／ΔＮＣｇｌ０７１７、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ΔＮＣｇｌ０３３６／ΔＮＣｇｌ２９１２、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ΔＮＣｇｌ０７１７／ΔＮＣｇｌ２９１２と命名し、Ｌ−リシンの産生能とともに気泡の発生量を比較した。
前記菌株のリシンの産生能を比較するために、対照群とともに実施例５、６、７、８の方法と同様にして培養し、培養を終えた後、気泡の発生量は、実施例５、６、７、８の方法と同様にして測定し、ＨＰＬＣを用いて分析したＬ−リシンの濃度は、下記表５に示す。表５の結果は、３回繰り返し実験結果値であり、平均値をもって産生能を評価した。  
【表５】
0006493926.tif 000006
【００５３】
表５に示すように、母菌株ＫＣＣＭ１１０１６ＰからＮＣｇｌ０３３６／ＮＣｇｌ０７１７、ＮＣｇｌ０３３６／ＮＣｇｌ２９１２、ＮＣｇｌ０７１７／ＮＣｇｌ２９１２遺伝子が同時に不活性化された菌株においてリシンの産生能が約５％増加した。これとともに、気泡の発生は、母菌株に比べてＮＣｇｌ０３３６／ＮＣｇｌ０７１７、ＮＣｇｌ０３３６／ＮＣｇｌ２９１２、ＮＣｇｌ０７１７／ＮＣｇｌ２９１２遺伝子が同時に不活性化された菌株において約１０〜１４％低減されることが分かる。
したがって、コリネバクテリウム属微生物においてリシンの産生に不要な主たる分泌タンパク質を同時に不活性化させることにより、培養中に発生する気泡を有効に制御することができ、これにより、Ｌ−リシンの産生能を向上させることができるということを確認した。
【００５４】
実施例１０：Ｌ−リシンの産生菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ由来の分泌タンパク質不活性化統合菌株の製作及び評価
Ｌ−リシンの産生菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐにおける分泌タンパク質の不活性化による統合効果を確認するために、３種の分泌タンパク質がいずれも不活性化された菌株を前記実施例５、６、７、８、９の方法と同様にして選別してＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ΔＮＣｇｌ０３３６／ΔＮＣｇｌ０７１７／ΔＮＣｇｌ２９１２と命名し、Ｌ−リシンの産生能とともに気泡の発生量を比較した。
前記菌株のリシンの産生能を比較するために、対照群とともに実施例５、６、７、８、９の方法と同様にして培養し、培養を終えた後、気泡の発生量は、実施例５、６、７、８、９の方法と同様にして測定し、ＨＰＬＣを用いて分析したＬ−リシンの濃度は、下記表６に示す。表６の結果は、３回繰り返し実験結果値であり、平均値をもって産生能を評価した。     
【表６】
0006493926.tif 000007
【００５５】
表６に示すように、母菌株ＫＣＣＭ１１０１６ＰからＮＣｇｌ０３３６、ＮＣｇｌ０７１７及びＮＣｇｌ２９１２遺伝子がいずれも不活性化された菌株においてリシンの産生能が約７％増加し、気泡の発生は、母菌株に比べてＮＣｇｌ０３３６、ＮＣｇｌ０７１７及びＮＣｇｌ２９１２遺伝子がいずれも不活性化された菌株において約１７％低減されることが分かる。
したがって、コリネバクテリウム属微生物においてリシンの産生に不要な主たる分泌タンパク質をいずれも不活性化させることにより、培養中に発生する気泡を有効に制御することができ、これにより、Ｌ−リシンの産生能を向上させることができるということを確認した。
上記の結果から、Ｌ−リシンの産生菌株における主たる分泌タンパク質の不活性化は、発酵中に過剰に生成される気泡を制御することにより、菌体の生長とともにＬ−リシンの産生能を増加させるのに効果があるということを確認し、前記菌株、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ΔＮＣｇｌ０３３６、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ΔＮＣｇｌ０７１７、及びＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ΔＮＣｇｌ２９１２をそれぞれＣＡ０１−２２８１、ＣＡ０１−２２７９、及びＣＡ０１−２２８０と命名し、ＣＡ０１−２２７９及びＣＡ０１−２２８０は２０１３年１１月２２日付けで、ＣＡ０１−２２８１は２０１３年１２月１３日付けで韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に国際寄託してそれぞれＫＣＣＭ１１４８１Ｐ（ＣＡ０１−２２７９）、ＫＣＣＭ１１４８２Ｐ（ＣＡ０１−２２８０）、及びＫＣＣＭ１１５０２Ｐ（ＣＡ０１−２２８１）という寄託番号が与えられた。
【表７】
0006493926.tif 000008
【表８】
0006493926.tif 000009
【表９】
0006493926.tif 000010
【配列表】
0006493926000001.app