(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の残基Ｆ２７、Ｌ３０、及びＲ３３の１つ以上でヒトインターフェロンオメガ（ＩＦＮω）と結合する、単離されたモノクローナル抗体であって、
該抗体は、ＩＦＮω、ＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＣ、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ及びＩＦＮαＪ１の活性を中和し、かつ、配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列と配列番号２４の軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列とを含むか、又は配列番号２７のＶＨアミノ酸配列と配列番号２８のＶＬアミノ酸配列とを含む、
前記抗体。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体と、製薬上許容された担体とを含む、医薬組成物。
【請求項３】
前記抗体がヒトＩＦＮαＤと結合せず、中和しない、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、ＩＦＮαＡ、ＩＦＮαＨ２、ＩＦＮαＫ、ＩＦＮαＷＡ及びＩＦＮα４ａの活性を中和する、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記活性が、転写因子２（ＳＴＡＴ２）、インターフェロン調節因子９（ＩＲＦ９）、並びに分泌胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）のシグナル伝達因子及び活性化因子を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞における、インターフェロン誘導性ＩＳＧ５４プロモーター下でのＳＥＡＰの阻害である、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が、０．９×１０−９Ｍ〜１．８５×１０−８ＭのＩＣ５０値でＩＦＮωの活性を中和する、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体が、０．３×１０−９Ｍ〜４．５×１０−９Ｍの解離定数（ＫＤ）のＩＦＮωと結合するものであり、該ＫＤは、ＰｒｏｔｅＯｎ（商標；Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州）でＳＰＲ技術を用いて測定され、該測定は、前記抗体を、抗ヒトＦｃ抗体とカップリングしたチップに３０μＬ／分の流量で２分間負荷し、５０μＬ／ｍＬの流量で２分間、ランニング緩衝液（緩衝液の組成）で洗浄した後、１：３希釈で１００ｎＭ〜１．２３ｎＭまでの範囲の５つの異なる濃度で、組換えＩＦＮタンパク質を３分間会合させ、１０分間解離させる（該会合及び解離はどちらも５０μＬ／ｍＬの流量で）ことにより行われる、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が、ウイルス誘導性白血球インターフェロンの活性を阻害し、該ウイルス誘導性白血球インターフェロンの活性が、１００Ｕ／ｍＬのインターフェロンによって誘導された全血中のＩＰ−１０の放出である、請求項４に記載の抗体。
【請求項９】
前記活性が、５０μｇ／ｍＬの抗体の存在下で５０％超阻害される、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体がヒトインターフェロン−β（ＩＦＮβ）と結合せず、中和しない、請求項４に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体が、ヒト、ヒト化、又はヒト適応型である、請求項４に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体が、ＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ３型、又はＩｇＧ４型アイソタイプである、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体が二重特異性である、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体が、ＢＬｙｓ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−６、ＣＤ２７、ＢＤＣＡ２、又はＩＬ−１２若しくはＩＬ−２３のｐ４０サブユニットと結合する、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
請求項１４に記載の抗体と、製薬上許容された担体とを含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広域中和インターフェロンα抗体アンタゴニスト及びインターフェロンω抗体アンタゴニスト、並びにそれらの抗体又はフラグメントをコードしたポリヌクレオチド、及び上記を製造及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｉ型ＩＦＮは、遍在的に発現するヘテロ二量体受容体（ＩＦＮＡＲ）を介して全てのシグナルが抗ウイルス、抗増殖、及び免疫調節作用に至るサイトカインのファミリーである。ヒトにおいては、Ｉ型ＩＦＮは、少なくとも１２のＩＦＮαタンパク質サブタイプと、ＩＦＮβ、ＩＦＮε、ＩＦＮκ、及びＩＦＮωのそれぞれの１つのサブタイプとで構成されている。Ｉ型ＩＦＮの誘導は、無菌リガンド及び微生物リガンドの両方に応答して生じる。Ｉ型ＩＦＮの抗ウイルス及び抗増殖作用は、感染症及び腫瘍学的適応症のために診療所で利用されてきたが、Ｉ型ＩＦＮのアンタゴニストが、免疫媒介炎症性適応症のために開発されている。
【０００３】
ＳＬＥ、Ｉ型糖尿病、乾癬、原発性シェーグレン病、全身性硬化症及び慢性関節リウマチなどの複数の免疫媒介性炎症性疾患は、全血及び／又は組織中に存在する一般にＩＦＮシグネチャと呼ばれるＩＦＮ誘導性の遺伝子転写物の過剰によって決定される様々な程度の上昇型ＩＦＮの証拠を呈する。
【０００４】
ループスのために現在臨床開発中のＩ型ＩＦＮアンタゴニストのアプローチとしては、ＩＦＮαサブタイプを中和する複数のアプローチが含まれ、抗ＩＦＮα抗体が用いられるその他のＩ型ＩＦＮ（β、ε、κ、ω）は含まれない（例えば、米国特許第７，０８７，７２６号、同第８，０２５，８８２号、及び米国特許出願公開第ＵＳ２００８／０１６００３０号に記載されているものなど）。臨床試験のデータは、抗ＩＦＮα抗体で治療した患者におけるＩ型ＩＦＮシグネチャの部分的低減（Ｍｅｒｒｉｌｌら、Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ７０：１９０５〜１９１３，２０１１；Ｙａｏら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ６０：１７８５〜１７９６，２００９）及び、インターフェロンシグネチャメトリック（ＩＳＭ）の軽度及び中程度から重度の活性なループスの被験者の予め特定したバイオマーカー定義群において２４週にＳＬＥ、フレア率、並びにステロイド負担の兆候及び症状の改善を示している。高ＩＳＭとして予め定義された患者には効能は認められなかった（Ｋａｌｕｎｉａｎら、２０１２  ＡＣＲ／ＡＲＨＰ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ；Ａｂｓｔｒａｃｔ  ＃  ２６２２，２０１２）。
【０００５】
抗ＩＦＮＡＲ１抗体は、ループスの治療の代替手段である（Ｗａｎｇら、２０１３；Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ａｃｃｅｐｔｅｄ  ａｒｔｉｃｌｅ  ｐｒｅｖｉｅｗ  １４  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１３；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｌｐｔ．２０１３．３５）。ＩＦＮβを含む全てのＩ型ＩＦＮによって誘導されるＩＦＮシグナル伝達を中止するために、ＩＦＮＡＲ１の遮断が予測される。遺伝子をコードするＩＦＮβの特異的欠失は、機能的ＩＦＮβを有する同様に曝露されたマウスと比較すると、ウイルス宿主の実質的な感受性を被るので、ＩＦＮβは、抗ウイルス防衛においてより重要な役割を果たすことができる（Ｌａｚｅａｒら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８５：７１８６〜７１９４，２０１１；Ｄｅｏｎａｒａｉｎら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７４：３４０４〜３４０，２０００；Ｄｅｏｎａｒａｉｎら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１０：３５４０〜３５４３，２００４；Ｇｅｒｌａｃｈら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８０：３４３８〜３４４４、２００６）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、ルーパス及び他の免疫媒介炎症性疾患の治療のための追加的な抗体が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様は、ヒトインターフェロンオメガ（ＩＦＮω）及び少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又は１０のヒトインターフェロンアルファ（ＩＦＮα）サブタイプと結合し、それらの活性を中和する、単離されたモノクローナル抗体である。
【０００８】
本発明の他の態様において、単離された抗体は、ヒトＩＦＮω及びヒトＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ及び／又はＩＦＮαＪ１との結合のために、
重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列（配列番号２３）、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列（配列番号２４）、又は、
ＶＨアミノ酸配列（配列番号２７）、及びＶＬアミノ酸配列（配列番号２８）を含む単離抗体と競合する。
【０００９】
本発明の更なる態様において、単離された抗体は、配列番号１の残基Ｆ２７、Ｌ３０、及びＲ３３の１つ以上でＩＦＮωと結合し、単離された抗体は、配列番号１９の残基Ｆ２７、Ｌ３０、及びＲ３３の１つ以上でＩＦＮα４ａと結合し、単離された抗体は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）免疫複合体で誘導されたＩＦＮの活性を阻害する。
【００１０】
本発明の追加の態様は、本発明の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド、及び本発明の抗体と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物である。
【００１１】
本発明の更なる態様は、治療上の有効量の本発明の単離された抗体を、それらを必要とする患者に、その疾病の治療又は予防のために充分な時間にわたって投与することを含む、ＩＦＮα及びＩＦＮωの産生の増加に関連する疾病の治療方法又は予防方法である。本発明の追加の態様において、ＩＦＮα及びＩＦＮωの産生の増加に関連する疾病は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である。
【００１２】
本発明の別の態様は、ＩＦＮω及びＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ及び／又はＩＦＮαＪ１とＩＦＮＡＲの相互作用を阻害する方法を、それを必要とする患者において行う方法であって、ＩＦＮω及びＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＣ、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ及び／又はＩＦＮαＪ１とＩＦＮＡＲとの相互作用を防ぐために十分な時間にかけて、本発明の単離された抗体を患者に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１Ａ）１００Ｕ／ｍｌの内因性白血球ＩＦＮ（ウイルス誘発した）又は図１Ｂ）特定濃度の２５０Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＦＮωによって誘導した全血中に放出されたＩＰ−１０の阻害を示す。
【図２】示されているように、様々な抗体による全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者由来の免疫複合体により誘導されたＩ型ＩＦＮの阻害を示す。抗ＩＦＮα１と抗ＩＦＮω、抗ＩＦＮα２と抗ＩＦＮω、又は抗ＩＦＮα３と抗ＩＦＮωの組み合わせは、抗ＩＦＮα抗体単独と比較してより顕著な阻害をもたらす。広域中和抗ＩＦＮα／ＩＦＮω抗体（Ｍ４３）は、総活性の更なる抑制を示した。
【図３】抗ＩＦＮω、抗ＩＦＮα抗体、又はそれら２つの組み合わせによる、上昇ＳＬＥ遺伝子シグネチャの阻害率（％）を示す。抗体治療の非存在下でのベースライン上昇ＩＦＮ誘導性遺伝子発現は１００％に正規化した。
【図４】ＩＦＮω／ＦａｂＭ４３複合体の全体分子構造を示す。Ｈの標識はＶＨ、Ｌの標識はＶＬ、左上はＩＦＮωである。
【図５】図５Ａ）ＩＦＮα４Ａ／Ｆａｂ３５７複合体及び図５Ｂ）ＩＦＮω／Ｆａｂ３５７複合体の全体分子構造を示す。Ｆａｂについては、Ｆｖ部分だけが示されている。Ｆａｂ５３７はＣ２５９５のＦａｂである。
【図６】６Ａ）ＩＦＮα４Ａ／ＦａｂＭ８８複合体の全体分子構造を示す。図６Ｂ）抗原結合部位中のエピトープ領域の部分の周りの代表的な電子密度（１．５σで２ｍＦｏ−ＤＦＣ）。Ｈの標識はＶＨ、Ｌの標識はＶＬ、左上はＩＦＮα４Ａである。
【図７】ＩＦＮα４Ａの構造及びＩＦＮω並びにＩＦＮαとの比較を示す。図７Ａ）ＩＦＮα４Ａ。５つの主要なヘリックスが標識されている。長い接続ループＡＢもまた、短いヘリカルセグメントの隣で標識されている。図７Ｂ）ＩＦＮω（ｐｄｂコード３ｓｅ４）及び図７Ｃ）ＩＦＮβ（ｐｄｂ  ｉｄ  １ａｕ１）。図７Ｄ）ＩＦＮβとの構造比較。ＡＢヘリカルセグメントの周りの主な違いを楕円により示す。
【図８】Ｍ８８による中和モード。ＩＦＮω／ＩＦＮＡＲ１／ＩＦＮＡＲ２構造（ｐｄｂ  ｉｄ  ３ｓｅ４）及びＭ８８／ＩＦＮα４をＩＦＮの上に重ね合わせた。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書に引用される特許及び特許出願を含む（ただしそれらに限定されない）全ての刊行物は、参照により恰もそれらの全体が記載されているものと同様にして、本明細書に援用するものである。
【００１５】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的でのみ使用され、限定を意図するものではないと理解すべきである。特に断らないかぎり、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
【００１６】
本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本発明の試験を実施するために使用できるが、例示となる材料及び方法を本明細書に記載する。本発明を説明及び特許請求するうえで以下の用語が用いられる。
【００１７】
用語「特異的結合」又は「特異的結合する」又は「結合する」とは、本明細書で使用されるとき、抗体が所定の抗原と、他の抗原とよりも高い親和性で結合することを指す。典型的には、抗体は、１×１０-7Ｍ未満、例えば１×１０-8Ｍ未満、１×１０-9Ｍ未満、１×１０-10Ｍ未満、１×１０-11Ｍ未満、又は１×１０-12Ｍ未満の解離定数（ＫD）で既定の抗原に結合し、非特異的抗原又はエピトープ（例えばＢＳＡカゼイン）への結合に関しては、典型的には、そのＫDより少なくとも１０倍小さいＫDで結合する。解離定数は標準的手法を用いて測定することができる。しかし、所定の抗原と特異的結合する抗体は、他の関連抗原、例えばヒト又はサル、例えばカニクイザル（cynomolgus）又はＰａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー）などの他の種から得た同様の所定の抗原（ホモログ）と交差反応性を示す可能性もある。既定の抗原と特異的結合する抗体は、更に、例えばインターフェロンアルファ（ＩＦＮα）及びインターフェロンオメガ（ＩＦＮω）のような２つ以上の異なる抗原間で共有されるエピトープに結合することができる、すなわち、抗体はＩＦＮα及びＩＦＮωと交差反応する。
【００１８】
本明細書で使用する用語「中和」又は「中和する」又は「中和抗体」又は「抗体アンタゴニスト」とは、任意の機構によって、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）及び／又はインターフェロンオメガ（ＩＦＮω）の生物活性を部分的に又は完全に阻害する抗体又は抗体フラグメントを指す。中和抗体は、以下のようにＩＦＮα及び／又はＩＦＮωの生物活性のアッセイを用いて同定することができる。ＩＦＮα及び／又はＩＦＮω中和抗体は、測定されるＩＦＮα及び／又はＩＦＮωの生物活性を２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％阻害することが可能である。
【００１９】
本明細書で使用する用語「インターフェロンα」（ＩＦＮα）は、ヒトアルファインターフェロンの全てのネイティブのサブタイプを指す。ネイティブのＩＦＮαは、構造的相同性の高い別個の遺伝子によってコードされた２３以上の密接に関連するタンパク質のサブタイプで構成されている（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ及びＷｅｂｅｒ、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３３：２５１、１９８６；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．１８：８０５〜８１６、１９９８）。ヒトＩＦＮαサブタイプは、少なくとも、ＩＦＮαＡ（ＩＦＮα２）（配列番号５）、ＩＦＮαＢ２（ＩＦＮα８）（配列番号６）、ＩＦＮαＣ（ＩＦＮα１０）（配列番号７）、ＩＦＮαＤ（ＩＦＮα１）（配列番号８）、ＩＦＮαＦ（ＩＦＮα２１）（配列番号９）、ＩＦＮαＧ（ＩＦＮα５）（配列番号１０）、及びＩＦＮαＨ（ＩＦＮα１４）（配列番号１１）、Ｐ３４Ｈ置換基を伴うＩＦＮαＩ（ＩＦＮα１７）（配列番号１２）、ＩＦＮαＪ１（ＩＦＮα７）（配列番号１３）、ＩＦＮαＫ（ＩＦＮα６）（配列番号１４）、ＩＦＮα４ｂ（ＩＦＮα４）（配列番号１５）、及びＩＦＮαＷＡ（ＩＦＮα６）（配列番号１６）である。ヒトインターフェロンの命名法は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｇｅｎｅｎａｍｅｓ＿ｏｒｇ／ｇｅｎｅｆａｍｉｌｉｅｓ／＿ＩＦＮに見出される。
【００２０】
本明細書で使用する用語ＩＦＮωは、ヒトＩＦＮωであって、配列番号１に示されるアミノ酸配列及びＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０５０００を有するものを指す。
【００２１】
用語「Ｉ型インターフェロン」は、ヒトインターフェロンαの全てのサブタイプ及びインターフェロンβ、インターフェロンε、インターフェロンω、及びインターフェロンκの１つのサブタイプを指し、共通インターフェロン受容体ＩＦＮＡＲに結合する。
【００２２】
本明細書で使用する用語「ＩＮＦＡＲ」は、ヘテロダイマーまたはＩＦＮＡＲ１及びＩＦＮＡＲ２である周知のインターフェロン受容体を指す。ＩＦＮＡＲ１及びＩＦＮＡＲ２のタンパク質配列は、配列番号３１及び３２にそれぞれ示される。ＩＮＦＡＲ１の成熟細胞外ドメインは、配列番号３１の残基２８〜４３６の範囲であり、ＩＮＦＡＲ２の成熟細胞外ドメインは、配列番号３２の残基２７〜２４３の範囲である。
【００２３】
本明細書で使用されるとき、「抗体」という用語は、広義で意図され、ポリクローナル抗体、マウス、ヒト、ヒト適合性、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、抗体フラグメント、少なくとも２つの無傷の抗体若しくは抗体フラグメント又は二量体の、四量体の若しくは多量体の抗体から形成される二重特異性抗体又は多重特異性抗体、並びに一本鎖抗体を含む、免疫グロブリン分子を含む。
【００２４】
免疫グロブリンは、重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じてＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つの大きなクラスに分類することができる。ＩｇＡ及びＩｇＧは、更に、アイソタイプＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3及びＩｇＧ4に下位分類される。あらゆる脊椎動物種の抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて２つの明確に異なるタイプ、すなわちカッパ（κ）及びラムダ（λ）のうちの１つに分類することができる。
【００２５】
用語「抗体フラグメント」とは、重鎖及び／又は軽鎖抗原結合部位、例えば、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、２及び３、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、２及び３、重鎖可変領域（ＶＨ）、又は軽鎖可変領域（ＶＬ）を保有する免疫グロブリン分子の一部を指す。抗体フラグメントとしては、周知のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ及びＦｖのフラグメント、並びに１つのＶＨドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）が挙げられる。ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、互いに合成リンカーを介して結合することで様々なタイプの一本鎖抗体設計を形成する可能性があり、ＶＨドメイン及びＶＬドメインが別々の一本鎖抗体構築物で発現される場合は、ＶＨ／ＶＬドメインが分子内又は分子間で対を成して、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）又はダイアボディなどの一価の抗原結合部位を形成する（これらは、例えば国際特許出願公開第ＷＯ１９９８／４４００１号、国際特許出願公開第ＷＯ１９８８／０１６４９号、国際特許出願公開第ＷＯ１９９４／１３８０４号、国際特許出願公開第ＷＯ１９９２／０１０４７号に記載されている）。
【００２６】
抗体可変領域は、３つの「抗原結合部位」で遮られた「フレームワーク」領域からなる。抗原結合部位は、様々な用語を使用して定義される：（ｉ）配列可変性に基づく相補性決定領域（ＣＤＲ）が、ＶＨ内に３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）及びＶＬ内に３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）存在する（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｋａｂａｔ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２：２１１〜５０，１９７０；Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）。（ｉｉ）「高頻度可変領域」すなわち「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」が、ＶＨ内に３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ内に３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）存在する。この領域は、抗体可変ドメインであり、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜１７，１９８７）により定義される構造中で、高頻度可変性を示す。他の用語には、「ＩＭＧＴ−ＣＤＲ」（Ｌｅｆｒａｎｃら著、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２７巻、５５〜７７頁、２００３年）及び「特異性決定残基使用」（ＳＤＲＵ）（Ａｌｍａｇｒｏ著、Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．、第１７巻、１３２〜１４３頁、２００４年）が含まれる。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）は、抗原結合部位の標準化ナンバリング及び定義を規定する。各ＣＤＲ、ＨＶ及びＩＭＧＴの表記の間の対応についてはＬｅｆｒａｎｃら著、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２７巻、５５〜７７頁、２００３年に述べられている。
【００２７】
本明細書で使用されるとき、「Ｃｈｏｔｈｉａ残基」は、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２７３巻、９２７〜９４８頁、１９９７年）に従ってナンバリングされた抗体ＶＬ残基及びＶＨ残基である。
【００２８】
「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」は、抗原結合部位として定義されたものを除く、可変領域の残りの配列である。抗原結合部位は上記に述べたような様々な用語によって定義され得るため、フレームワークの正確なアミノ酸配列は抗原結合部位がどのように定義されるかによって決まる。
【００２９】
「ヒト抗体」又は「完全ヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリン配列に由来する可変領域の配列と定常領域の配列とを含む抗体を指す。本発明のヒト抗体は置換を包含する可能性があるので、当該ヒト抗体は、発現した免疫グロブリン又は生殖細胞系列遺伝子配列の正確な複製物でない場合がある。ただし、抗原結合部位がヒト以外の種から得られる抗体は、「ヒト抗体」の定義には包含されない。
【００３０】
「ヒト適応」抗体又は「ヒトフレームワーク適応（ＨＦＡ）」抗体は、米国特許公開第ＵＳ２００９／０１１８１２７号に記載されている方法に従って適応された抗体を指し、また、ヒト以外の種に由来する抗原結合部位配列がヒトフレームワークにグラフトされた抗体も指す。
【００３１】
「ヒト化抗体」とは、抗原結合部位がヒト以外の種に由来しかつ可変領域フレームワークがヒト免疫グロブリン配列に由来する、抗体を指す。ヒト化抗体はフレームワーク領域内に置換を含む可能性があることから、当該フレームワークは、発現したヒト免疫グロブリン又は生殖細胞系列遺伝子配列の完全な複製物でなくてもよい。
【００３２】
本明細書で使用するとき、「モノクローナル抗体」という用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープの単一の結合特異性及び親和性を示す。
【００３３】
「実質的に同一の」という表現は、本明細書で使用されるとき、比較される２つの抗体可変領域のアミノ酸配列が同一であるか又は「ごく僅かな差異」があるということを意味する。ごく僅かな差異とは、抗体特性に悪影響を及ぼさない、抗体又は抗体可変領域の配列における１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又は１１個のアミノ酸の置換である。本明細書に開示される可変領域の配列と実質上同一のアミノ酸配列は、本出願の範囲に属する。一部の実施形態では、配列の同一性は、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い可能性がある。同一性（％）は、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ｖ．９．０．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のＡｌｉｇｎＸモジュールの初期設定を使用するペアワイズアライメントによって決定することができる。本発明のタンパク質配列を問い合わせ配列として使用することで、例えば、近縁配列を確認するために公開データベース又は特許データベースでの検索を実行することができる。かかる検索を実行するために使用されるプログラム例は、初期設定を使用する、ＸＢＬＡＳＴ若しくはＢＬＡＳＴＰプログラム（ｈｔｔｐ＿／／ｗｗｗ＿ｎｃｂｉ＿ｎｌｍ／ｎｉｈ＿ｇｏｖ）、又はＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔ（商標）（ＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔ、Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）スイートである。
【００３４】
用語「エピトープ」とは、本明細書で使用されるとき、抗体が特異的結合する抗原の一部を意味する。エピトープは通常、アミノ酸又は多糖類側鎖のような部位の化学的に活性な（極性、非極性又は疎水性など）表面基からなり、特定の３次元構造特性及び特定の電荷特性を有しうる。エピトープは、立体配座空間単位を形成する連続した及び／又は連続していないアミノ酸から成り得る。連続していないエピトープについて、抗原の直鎖配列の異なる部分からのアミノ酸は、タンパク質分子の折り畳みを通じて、３次元空間において近接する。
【００３５】
本明細書で使用されるとき、「パラトープ」という用語は、抗原が特異的結合する抗体の一部分を意味する。パラトープは元来線状であっても又は不連続であってもよく、一つながりの線状のアミノ酸よりも、抗体の隣接していないアミノ酸同士の空間関係によって形成されてよい。「軽鎖パラトープ」及び「重鎖パラトープ」又は「軽鎖パラトープのアミノ酸残基」及び「重鎖パラトープのアミノ酸残基」はそれぞれ、抗原と接触する抗体の軽鎖残基及び重鎖残基を指す。
【００３６】
本明細書で使用されるとき、「二重特異性」とは、２種の異なる抗原と結合する抗体、又は抗原内の２種の異なるエピトープと結合する抗体を指す。二重特異性抗体は、二重特異性抗体がＩＦＮα及びＩＦＮωと交差反応する場合に、２つ以上の異なる抗原に結合することができる。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、「単一特異性」とは、１つの抗原又は１つのエピトープと結合する抗体を指す。単一特異性抗体は、単一特異性抗体がＩＦＮα及びＩＦＮωと交差反応する場合に、２つ以上の異なる抗原に結合することができる。
【００３８】
用語「〜と組み合わせて」は、本明細書で使用されるとき、記述の対象である薬剤が、混合物として一緒に、又はそれぞれ単独薬剤として同時に、又はそれぞれ単独薬剤として順次に任意の順序で、動物に投与され得ることを意味する。
【００３９】
本明細書で使用するとき、用語「ＩＦＮαの生物活性及び「ＩＦＮωの生物活性」は、ＩＦＮα及びＩＦＮωが、それぞれに対応する受容体ＩＦＮＡＲと結合した結果として生じる任意の活性を指す。１つのＩＦＮα及びＩＦＮωの生物活性は、標準的な方法を用いて、ＩＦＮα及びＩＦＮωが、ＨＥＫ２９３細胞においてＩＳＧ５４などのインターフェロン誘導性プロモーター下で分泌胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の発現を誘導して、安定的に、転写因子２（ＳＴＡＴ２）のシグナル伝達因子及び活性化因子、インターフェロン調節因子９（ＩＲＦ９）、並びにＳＥＡＰを発現する能力である。別のＩＦＮα及びＩＦＮωの生物活性は、本明細書に記載のような、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）又は全血からのケモカインＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）の産生の誘導である。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
「ベクター」なる用語は、生物系内で複製されうる、又はこうした系間を移動しうるポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは一般的に、生物系内でこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持を促進するように機能する複製起点、ポリアデニル化シグナル又は選択マーカーなどの要素を含んでいる。このような生物系の例としては、細胞、ウイルス、動物、植物、及びベクターを複製することができる生物学的成分を利用して再構成された生物系を挙げることができる。ベクターを構成するポリヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッド分子であってもよい。
【００４２】
用語「発現ベクター」は、生体系又は再構成された生体系において、その発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの翻訳を指示するために使用することができるベクターを意味する。
【００４３】
「ポリヌクレオチド」なる用語は、糖−リン酸骨格又は他の同等の共有結合化学により共有結合を介して連結されたヌクレオチド鎖からなる分子を意味する。二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡが、ポリヌクレオチドの典型例である。
【００４４】
「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語は、ペプチド結合により連結されてポリペプチドを生成する少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を意味する。５０個未満のアミノ酸からなる小さいポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれる場合もある。
【００４５】
本明細書では表１に示すような従来の１文字及び３文字のアミノ酸コードを用いる。
【００４６】
発明の構成
本発明は、ヒトインターフェロンオメガ（ＩＦＮω）及び複数のヒトインターフェロンα（ＩＦＮα）のサブタイプ（ＩＦＮα／ω抗体）と結合し、その活性を中和するモノクローナル抗体を提供する。本発明は、少なくとも部分的に、本発明のＩＦＮα／ω抗体が結合する、ＩＦＮωと、ＩＦＮαサブタイプと、が共有する最小限の中和性のエピトープの同定に基づく。本発明のＩＦＮα／ω抗体は、ＩＦＮαサブタイプを中和するがＩＦＮωを中和しない抗体よりも、Ｉ型ＩＦＮ及びＩＦＮシグネチャのＳＬＥ関連の調製物の中和においてより強力であり、したがって、ＩＦＮα及びＩＦＮωの産生の増加に関連する例えば免疫媒介炎症性疾患のような任意の疾患の治療において、より効能が優れている可能性がある。本発明のＩＦＮα／ω抗体はＩＦＮβを中和しないので、全てのＩ型ＩＦＮを遮断することが予測される抗ＩＦＮＡＲ療法と比較して、より好ましい安全性及びＰＫ特性を有する可能性がある。本明細書で使用するとき、「ＩＦＮα／ω抗体は、本明細書に例示するＩＮＦω及び複数のＩＦＮαサブタイプと結合し、中和する抗体を指す。
【００４７】
本発明の一実施形態は、ヒトインターフェロンω（ＩＦＮω）及び少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又は１０のヒトインターフェロンα（ＩＦＮα）サブタイプと結合し、それらの活性を中和する、モノクローナル抗体である。
【００４８】
本発明の抗体は、ＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ及びＩＦＮαＪ１を中和し得る。本発明の抗体は、ＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＣ、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ及びＩＦＮαＪ１を中和し得る。本発明の抗体は、ＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＣ、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ、ＩＦＮαＪ１及びＩＦＮαＡを中和し得る。本発明の抗体は、ＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＣ、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ、ＩＦＮαＪ１、ＩＦＮαＡ及びＩＦＮαＨ２を中和し得る。本発明の抗体は、ＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＣ、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ、ＩＦＮαＪ１、ＩＦＮαＡ、ＩＦＮαＨ２及びＩＦＮαＫを中和し得る。本発明の抗体は、ＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＣ、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ、ＩＦＮαＪ１、ＩＦＮαＡ、ＩＦＮαＨ２、ＩＦＮαＫ及びＩＦＮαＷＡを中和し得る。本発明の抗体は、ＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＣ、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ、ＩＦＮαＪ１、ＩＦＮαＡ、ＩＦＮαＨ２、ＩＦＮαＫ、ＩＦＮαＷＡ及びＩＦＮα４ａを中和し得る。
【００４９】
本発明の抗体がＩＦＮα及びＩＦＮωを中和する能力は、インターフェロン応答性プロモーター下でレポーター遺伝子を発現する細胞株を使用して種々のＩＦＮαサブタイプ及び／又はＩＦＮωで細胞を刺激するレポーター遺伝子アッセイにおいて、試験することができる。例えば、完全に活性なＩ型ＩＦＮシグナル伝達経路を発現する（ＳＴＡＴ２及びＩＲＦ９を安定に発現する）ように設計され、ＩＦＮα／β誘導性ＩＳＧ５４プロモーターの制御下でＳＥＡＰレポーター遺伝子でトランスフェクトされたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＦＮ−α／β細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を、本明細書に記載したように使用することができる。周知の試薬を用いてアルカリホスファターゼからのシグナルを検出することが可能であり、そのシグナルを分光光度計で読み取ることが可能であり、標準的な方法を用いて阻害に関するＩＣ50を計算することが可能である。
【００５０】
一実施形態において、本発明の抗体は、それらのヒトＩＦＮω及びヒトＩＦＮαサブタイプの活性が、転写因子２（ＳＴＡＴ２）、インターフェロン調節因子９（ＩＲＦ９）、及びＳＥＡＰのシグナル伝達因子及び活性化因子を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞におけるインターフェロン誘導性ＩＳＧ５４プロモーター下で分泌された胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の発現の阻害であるときに、約５×１０-8Ｍ未満、約１×１０-8Ｍ未満、約１×１０-9Ｍ未満、約１×１０-10Ｍ未満、約１×１０-11Ｍ未満、又は約１×１０-12Ｍ未満のＩＣ50値でＩＦＮωの活性を阻害し、且つ、約５×１０-8Ｍ未満、約１×１０-8Ｍ未満、約１×１０-9Ｍ未満、約１×１０-10Ｍ未満、約１×１０-11Ｍ未満、又は約１×１０-12Ｍ未満のＩＣ50値でＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ又はＩＦＮαＪ１を阻害する。本発明の抗体は、本明細書で実施例３に記載したような「ＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイ」においてＩＣ50値が約５×１０-8未満、例えば１×１０-8Ｍ未満、約１ｘ１０-9Ｍ未満、約１×１０-10Ｍ未満、約１×１０-11Ｍ未満又は約１×１０-12Ｍ未満であるときに、ＩＦＮω及び／又は任意のＩＦＮαサブタイプを「中和する」。
【００５１】
本発明の抗体はまた、ＩＦＮで誘導性末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）又は全血からのＩＰ−１０の放出のようなＩＦＮ誘導性のサイトカインの放出を阻害するそれらの能力を評価することによって、それらのＩＦＮα及びＩＦＮω中和能力について試験することができる。例えば、ＰＢＭＣは、試験されるＩＦＮ及び抗体の予め形成された複合体で処置した標準的なプロトコルを使用して健康なボランティアからのヘパリン化全血から単離され、ＩＰ−１０の放出は、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘサイトカイン／ケモカインキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｐｒｅｍｉｘｅｄ  ３９  ｐｌｅｘ）のような標準的な方法を使用して測定される。ＩＦＮα及びＩＦＮωを中和する抗体は、抗体の非存在下でのＩＦＮ誘導性のＩＰ−１０の放出と比較したとき、ＩＰ−１０の放出を少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、又は１００％阻害することができる。
【００５２】
本発明の抗体は、ＩＦＮωを中和することに加えて、少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又は１０のＩＦＮαサブタイプと結合し、中和することができる。これらのＩＦＮαサブタイプ及びＩＦＮωは、標準的な方法を使用して組換え発現によって産生することができる。分泌を指示するために使用できる例示的なシグナル配列は、配列番号１７〜２１に示される。
【００５３】
本発明の抗体は、約５×１０-9Ｍ未満、約１×１０-9Ｍ未満、約５×１０-10Ｍ未満、約１×１０-10Ｍ未満、約５×１０-11Ｍ未満、約１×１０-11Ｍ未満、約５×１０-12Ｍ未満、又は約１×１０-12Ｍ未満の解離定数（ＫD）のヒトＩＦＮωと結合し、約５×１０-9Ｍ未満、約１×１０-9Ｍ未満、約５×１０-10Ｍ未満、約１×１０-10Ｍ未満、約５×１０-11Ｍ未満、約１×１０-11Ｍ未満、約５×１０-12Ｍ未満、又は約１×１０-12Ｍ未満のＫDのヒトＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ又はＩＦＮαＪ１と結合する。
【００５４】
ＩＦＮω又はＩＦＮαに対する抗体の親和性は、任意の好適な方法を使用して実験により測定することができる。こうした方法では、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００又はＫｉｎＥｘＡ装置、ＥＬＩＳＡ、若しくは当業者には周知である競合的結合アッセイを使用することができる。特定の抗原／ＩＦＮω又はＩＦＮαサブタイプの相互作用の測定された親和力は、異なる条件（例えば、容量オスモル濃度、ｐＨ）下で測定したときに様々であり得る。したがって、親和性及びその他の結合パラメータ（例えば、ＫD、Ｋon、Ｋoff）の測定は、好ましくは標準的な条件及び例えば本明細書に記載の緩衝液などの標準化緩衝液を用いて行われる。例えばＢｉａｃｏｒｅ  ３０００又はＰｒｏｔｅＯｎを用いた親和性測定での内部エラー（標準偏差（ＳＤ）として測定されるもの）は典型的に、典型的な検出範囲内で測定した場合、５〜３３％の範囲内であり得ることが当業者には分かるであろう。したがって、用語「約」は、アッセイにおける典型的な標準偏差を表す。例えば、ＫDが１×１０-9Ｍの場合の典型的なＳＤは、＋０．３３×１０-9Ｍ以下である。
【００５５】
ヒトＩＦＮω及びＩＦＮαと所望の親和性及び中和特性で結合する抗体は、ヒトＩＦＮω及びＩＦＮαサブタイプでパニングすることによって、及び所望により更なる抗体親和性成熟によって、変異体又はフラグメントのライブラリから選択され得る。例示のパニングキャンペーンにおいて、ファージライブラリを順にパニングしてもよく、あるいは、チンパンジーＩＦＮωと、ヒトＩＦＮαサブタイプＩＦＮα２、ＩＦＮα１、ＩＦＮαＨ２、ＩＦＮαＧ及びＩＦＮαＦとの混合物を用いてパニングしてもよい。あるいは、本発明の抗体は、チンパンジー及びカニクイザル（cynomolgus）ＩＦＮω、ヒトＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＤ、ＩＦＮαＪ１、ＩＦＮαＣ、ＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＨ２、ＩＦＮαＡ、ＩＦＮα４ａ、ＩＦＮαＧ、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＷＡ及びＩＦＮαＩでマウスを免疫し、標準的な方法を用いてそのハイブリオーマをスクリーニングすることによって作ることができる。
【００５６】
抗体は、任意の適当な方法及び本発明に記載の方法を用い、ＩＦＮω及びＩＦＮαの生物活性の阻害に基づいて同定することができる。
【００５７】
本発明の一実施形態は、ヒトインターフェロンオメガ（ＩＦＮω）及び少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又は１０のヒトインターフェロンアルファ（ＩＦＮα）サブタイプと結合しそれらの活性を中和する単離されたモノクローナル抗体であり、その抗体は、ヒトＩＦＮω及びヒトＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ又はＩＦＮαＪ１との結合のために、単離された抗体と競合するものであって、以下を含む。
【００５８】
重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列（配列番号２３）、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列（配列番号２４）、又は、
ＶＨアミノ酸配列（配列番号２７）、及びＶＬアミノ酸配列（配列番号２８）。
【００５９】
ヒトＩＦＮω及びヒトＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ及び／又はＩＦＮαＪ１への特異的結合と、特定のＶＨ及びＶＬを含む本発明の抗体との間の競合は、周知の方法を用いてインビトロでアッセイすることができる。例えば、非標識抗体の存在下におけるＭＳＤ  Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇ（商標）ＮＨＳエステル標識抗体とヒトＩＦＮω及びヒトＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ又はＩＦＮαＪ１との結合を、ＥＬＩＳＡ又はＢｉｏａｃｏｒｅ解析によって評価してもよく、あるいは、フローサイトメトリーを用いて、本発明の抗体との競合を実証してもよい。あるいは、Ｏｃｔｅｔ（カリフォルニア州Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ）を用いてリアルタイム無標識競合結合アッセイを、本明細書に記載したように使用してもよい。配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４のＶＬ、又は配列番号２７のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含む抗体が、ヒトＩＦＮω及びヒトＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ及び／又はＩＦＮαＪ１と結合するのを阻害する試験抗体の能力は、試験抗体がこれらの抗体と競合してヒトＩＦＮω及びヒトＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ及び／又はＩＦＮαＪ１と結合することを実証している。
【００６０】
別の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１の残基Ｆ２７、Ｌ３０、及びＲ３３の１つ以上でＩＦＮωと結合する。
【００６１】
別の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１９の残基Ｆ２７、Ｌ３０、及びＲ３３の１つ以上でＩＦＮα４ａと結合する。
【００６２】
ＩＦＮω及びＩＦＮα４ａの両方の残基Ｆ２７、Ｌ３０、及びＲ３３は、本発明のＩＦＮα／ω抗体の広域中和活性に必要とされる最小のエピトープを画定する。いくつかの抗体／ＩＦＮα複合体又は抗体／ＩＦＮω複合体の結晶構造は、それら３つの残基が抗体結合に主に寄与することを明らかに示している。ヒトＩＦＮα４ａは、他のヒトＩＦＮαと少なくとも８３％アイデンティティを共有し、ヒトＩＦＮωと５９％アイデンティティを共有している。Ｆ２７残基はＩＦＮαＤ（α１）を除く全てのヒトＩＦＮαに保存される。Ｆ２７は、ヒトＩＦＮωにも保存される。Ｌ３０及びＲ３３はどちらも全てのヒトＩＦＮα及びヒトＩＦＮωに保存される。
【００６３】
本発明の別の実施形態において、ヒトインターフェロンω（ＩＦＮω）及び少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又は１０のヒトインターフェロンアルファ（ＩＦＮα）サブタイプと結合し、それらの活性を中和する本発明のモノクローナル抗体は、ＩＦＮαＤと結合せず、中和しない。
【００６４】
特異的にＩＦＮω及びＩＦＮα残基と結合する本発明の抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を発現するマウスを免疫することによって（Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６〜９、１９９４；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５〜５１、１９９６；Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６〜５６、１９９７、米国特許第５，７７０，４２９号、同第７，０４１，８７０号、及び同第５，９３９，５９８号）、又はエピトープ接触残基を含むペプチド、例えばＩＦＮωのＡＢループ（配列番号１のＦＮωのアミノ酸残基２２〜３４）又はＩＦＮα４ａのＡＢループ（配列番号１９のＩＦＮα４ａのアミノ酸残基２２〜３４）のアミノ酸配列を有するペプチド、若しくは本明細書に記載のようなＩＦＮωとＩＦＮαサブタイプの混合物でＢａｌｂ／ｃマウスを免疫し、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫し、Ｋｏｈｌｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜９７、１９７５）のハイブリドーマ法を用いることによって、作ることができる。得られた抗体が、配列番号２３のＶＨ及び配列番号２４のＶＬを有する抗体のような本発明の抗体と競合する能力を試験し、標準の方法を使用して、そのエピトープへのそれらの結合を試験する。例えば、両方の個別の構成成分の構造が知られている場合、インシリコでタンパク質−タンパク質ドッキングを行って、適合性のある相互作用部位を特定することができる。抗原抗体複合体を用いて水素−重水素（Ｈ／Ｄ）交換を行うことによって、抗体が結合し得る抗原の領域をマッピングすることができる。抗原のセグメント及び点変異誘導を用いることにより、抗体の結合に重要なアミノ酸の位置を特定することができる。抗体−抗原複合体の共結晶構造を使用して、エピトープ及びパラトープに寄与する残基を同定することができる。特定されたｍＡｂは更に、Ｑｕｅｅｎら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、第８６巻、１００２９〜３２頁、１９８９年及びＨｏｄｇｓｏｎら著、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：４２１、１９９１で開示されている技術等の技術によって、変化したフレームワーク支持残基を組み込むことによって結合親和性を保存するように修飾することができる。
【００６５】
別の実施形態において、本発明の抗体は、残基Ｆ２７、Ｌ３０、及びＲ３３の１つ以上でＩＦＮωと結合し、更に、配列番号１の残基Ｐ２６、Ｋ３１、及びＲ３４からなる群から選択される少なくとも１つのＩＦＮω残基と結合する。
【００６６】
別の実施形態において、本発明の抗体は、残基Ｆ２７、Ｌ３０、及びＲ３３の１つ以上でＩＦＮωと結合し、更に、配列番号１の残基Ｒ２２、Ｒ２３、Ｉ２４、Ｓ２５、Ｐ２６、Ｋ３１、Ｄ３２、Ｒ３４、Ｄ３５、Ｑ４０、Ｋ１３４、Ｍ１４６、Ｅ１４７、Ｍ１４９、Ｋ１５０、Ｆ１５３及びＬ１５４からなる群から選択される少なくとも１つのＩＦＮω残基と結合する。
【００６７】
別の実施形態において、本発明の抗体は、１つ以上の残基Ｒ２２、Ｐ２６、Ｆ２７、Ｌ３０、Ｋ３１、Ｄ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、Ｄ３５、Ｑ４０、Ｋ１３４、Ｍ１４６，Ｅ１４７、Ｍ１４９、Ｋ１５０、Ｆ１５３及びＬ１５４で配列番号１のＩＦＮωと結合する。
【００６８】
別の実施形態において、本発明の抗体は、１つ以上の残基Ｒ２３、Ｉ２４、Ｓ２５、Ｐ２６、Ｆ２７、Ｌ３０、Ｋ３１、Ｒ３３、Ｒ３４、Ｍ１４６、Ｅ１４７、Ｍ１４９及びＫ１５０で配列番号１のＩＦＮωと結合する。
【００６９】
別の実施形態において、本発明の抗体は、残基Ｆ２７、Ｌ３０、及びＲ３３の１つ以上でＩＦＮα４ａと結合し、更に、配列番号１９の残基Ｐ２６、Ｋ３１、及びＲ３４からなる群から選択される少なくとも１つのＩＦＮα４ａ残基と結合する。
【００７０】
別の実施形態において、本発明の抗体は、残基Ｆ２７、Ｌ３０、及びＲ３３の１つ以上でＩＦＮα４ａと結合し、更に、配列番号１９の残基Ａ１９、Ｈ２６、Ｆ２７、Ｌ３０、Ｋ３１、Ｄ３２、Ｒ３３、Ｈ３４、Ｄ３５、Ｖ１４３、Ａ１４６、Ｅ１４７、Ｍ１４９、Ｒ１５０及びＳ１５３からなる群から選択される少なくとも１つのＩＦＮα４ａの残基と結合する。
【００７１】
別の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１９の１つ以上の残基Ａ１９、Ｈ２６、Ｆ２７、Ｌ３０、Ｋ３１、Ｄ３２、Ｒ３３、Ｈ３４、Ｄ３５、Ｖ１４３、Ａ１４６、Ｅ１４７、Ｍ１４９、Ｒ１５０及びＳ１５３でＩＦＮα４ａと結合する。
【００７２】
別の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１９の１つ以上の残基Ｇ２２、Ｒ２３、Ｉ２４、Ｓ２５、Ｈ２６、Ｆ２７、Ｃ２９、Ｌ３０、Ｋ３１、Ｒ３３、Ｈ３４  Ｖ１４３、Ａ１４６、Ｅ１４７及びＲ１５０及びＳ１５３でＩＦＮα４ａと結合する。
【００７３】
別の実施形態において、本発明の抗体は、ウイルス誘導性白血球インターフェロンの活性を阻害する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、ウイルス誘導性白血球インターフェロンの活性は、１００Ｕ／ｍＬのインターフェロンによって誘導された全血中のＩＰ−１０の放出である。
【００７５】
本発明の抗体は、本明細書に記載したように、１００Ｕ／ｍＬのインターフェロンによって誘導された全血中のＩＰ−１０の放出を阻害するそれらの能力によって評価されるように、活性化された白血球によって生成されたインターフェロンを中和することが可能である。本発明の抗体は、活性化された白血球により生成されたインターフェロンの作用を、５０μｇ／ｍＬの抗体の存在下において、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％中和することが可能である。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、５０μｇ／ｍＬの抗体の存在において、全血中のＩＰ−１０の放出を５０％超阻害する。
【００７７】
別の実施形態において、本発明の抗体は、ＳＬＥ免疫複合体誘導性のＩＦＮ産生を阻害する。ＳＬＥ免疫複合体は、ＳＬＥに存在するＩ型ＩＦＮ環境を代表する。ＩＦＮ産生は、本明細書に記載のようにレポーター遺伝子アッセイを用いて測定することができる。
【００７８】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ＳＬＥ免疫複合体誘導性のインターフェロンの産生を少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％阻害することができる。
【００７９】
本発明の抗体は、ヒト、ヒト化、又はヒト適応型であり得る。
【００８０】
本発明の抗体は、ＩｇＡ型、ＩｇＤ型、ＩｇＥ型、ＩｇＧ型又はＩｇＭ型であってもよい。本発明の抗体は、ＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ３型、ＩｇＧ４型であってもよい。
【００８１】
本発明の別の実施形態は、
重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列（配列番号２３）、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列（配列番号２４）、
ＶＨアミノ酸配列（配列番号２５）、及びＶＬアミノ酸配列（配列番号２６）、又は、
ＶＨアミノ酸配列（配列番号２７）、及びＶＬアミノ酸配列（配列番号２８）を含む単離された抗体である。
【００８２】
いかなる非ヒト配列も欠くヒトｍＡｂは、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７〜８６，２０００、及びＫｒｅｂｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５４：６７〜８４  ２００１に参照される技術によって、ファージディスプレイライブラリから調製及び最適化することができる。例示の方法では、本発明の抗体は、バクテリオファージｐＩＸコートタンパク質を有する融合タンパク質として、抗体重鎖及び軽鎖可変領域を発現するライブラリから単離される。抗体ライブラリをヒトＩＦＮω及びＩＦＮαの結合についてスクリーニングして、得られた陽性クローンの特性評価を更に行い、Ｆａｂはクローンライセートから単離して、全長ＩｇＧとして発現する。例示の抗体ライブラリ及びスクリーニング法は、Ｓｈｉら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９７：３８５〜９６、２０１０；国際特許公開第ＷＯ２００９／０８５４６２号、及び米国特許第１２／５４６８５０号、米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，９６９，１０８号、及び同第５，８８５，７９３号に記載されている。
【００８３】
結果として得られたｍＡｂは、それらのフレームワーク領域において、特定のフレームワーク残基をマッチングするヒト生殖細胞系列に存在する残基へと変更するように更に改変することができる。
【００８４】
本発明の抗体の免疫エフェクター特性は、当業者には周知の技術により、Ｆｃ改変によって強化又はサイレンシングすることも可能である。例えば、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、貧食、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ））のダウンレギュレーション等のＦｃエフェクター機能は、これら活性に関与するＦｃの残基を改変することによって提供及び／又は制御することができる。また、薬物動態特性は、抗体の半減期を延長するＦｃドメインの残基を変異させることによって強化することができる（Ｓｔｒｏｈｌ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、第２０巻、６８５〜９１頁、２００９年）。
【００８５】
更に、本発明の抗体は、グリコシル化、異性化、又は脱グリコシル化等の反応によって、あるいはポリエチレングリコール部分の付加（ペグ化）及び脂質化等の自然界では生じない共有結合修飾等の反応によって翻訳後修飾してもよい。こうした修飾はインビボあるいはインビトロで行われ得る。例えば、本発明の抗体はポリエチレングリコールと接合する（ペギレート）することによって薬物動態的なプロファイルを向上させることができる。結合は、当業者に既知の方法によって行うことができる。治療用抗体とＰＥＧとの結合は、機能に干渉することなく薬力学を強化することが示されている（Ｋｎｉｇｈｔら著、Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ、第１５巻、４０９〜１８頁、２００４年、Ｌｅｏｎｇら著、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、第１６巻、１０６〜１９頁、２００１年、Ｙａｎｇら著、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ、第１６巻、７６１〜７０頁、２００３年）。
【００８６】
安定性、選択性、交差反応性、親和性、免疫原性、又は他の望ましい生物学的若しくは生物物理学的特性を改善するように修飾される、本発明の抗体又はそのフラグメントは発明の範囲内である。抗体の安定性は、分子内力及び分子間力の中でも特に（１）固有の安定性に影響を及ぼす個々のドメインのコアパッキング、（２）ＨＣとＬＣとのペアリングに影響するタンパク質／タンパク質の界面相互作用、（３）極性及び荷電残基の埋め込み、（４）極性及び荷電残基の水素（Ｈ）結合ネットワーク、及び（５）表面電荷及び極性残基の分布、などの多くの因子によって影響される（Ｗｏｒｎら著、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、第３０５巻、９８９〜１０１０頁、２００１年）。構造を不安定化させる可能性のある残基は、抗体の結晶構造に基づいて、あるいは場合によっては分子モデリングによって特定することが可能であり、また、抗体の安定性に対するこれらの残基の影響は、特定された残基に変異を含む変異体を生成及び評価することにより試験することができる。抗体の安定性を高める方法の１つは、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）で測定する場合、熱転移中点温度（Ｔｍ）を高くすることである。一般に、タンパク質のＴｍは、その安定性と相関性を示すが、溶液中でのそのアンフォールディングし易さ及び変性し易さ、並びにそのタンパク質のアンフォールディングし易さに応じた分解プロセスとは負の相関性を示す（Ｒｅｍｍｅｌｅら、Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，１３：３６〜４６，２０００）。幾つかの研究からは、ＤＳＣにより熱安定性として測定される製剤の物理的安定性の順位と他の方法によって測定される物理的安定性との間に相関性が見つかった（Ｇｕｐｔａら著、ＡＡＰＳ  ＰｈａｒｍＳｃｉ．５Ｅ８、２００３年、Ｚｈａｎｇら著、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、第９３巻、３０７６〜３０８９頁、２００４年、Ｍａａら著、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．、第１４０巻、１５５〜１６８頁、１９９６年、Ｂｅｄｕ−Ａｄｄｏら著、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、第２１巻、１３５３〜１３６１頁、２００４年、Ｒｅｍｍｅｌｅら著、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．、第１５巻、２００〜２０８頁、１９９７年）。これらの配合物の研究は、ＦａｂのＴｍが対応するｍＡｂの長期の物理的安定性と密接な関係があることを示唆している。フレームワーク又はＣＤＲ内のアミノ酸の差異は、Ｆａｂドメインの熱安定性に有意な影響を及ぼし得る（Ｙａｓｕｉら著、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、第３５３巻、１４３〜１４６頁、１９９４年）。
【００８７】
本発明のＩＦＮα／ω抗体は、二重特異性抗体へと操作することが可能であり、これらもまた本発明の範囲に包含される。本発明の抗体のＶＬ及び／又はＶＨ領域は、公開されている方法を用いて、ＴａｎｄＡｂ（登録商標）設計のような構造として一本鎖二重特異性抗体（国際特許公開第ＷＯ１９９９／５７１５０号、米国特許公開第２０１１／０２０６６７２号）へと、あるいは、二重特異性ｓｃＦＶ（例えば、米国特許第５，８６９，６２０号、国際特許公開第ＷＯ１９９５／１５３８８Ａ号、国際特許公開第ＷＯ１９９７／１４７１９号、又は国際特許公開第ＷＯ２０１１／０３６４６０号に記載されているような構造として）へと操作することができる。
【００８８】
本発明の抗体のＶＬ領域及び／又はＶＨ領域は、二重特異性全長抗体へと改変することも可能であり、当該抗体の結合手はそれぞれ特徴的な抗原又はエピトープに結合する。そのような二重特異性抗体は、典型的には、２つの抗体重鎖間のＣＨ３相互作用を調節して、次に列挙する特許に記載されているような技術を用いて二重特異性抗体を形成することによって作られる（米国特許第７，６９５，９３６号、国際特許公開第ＷＯ０４／１１１２３３号、米国特許公開第ＵＳ２０１０／００１５１３３号、米国特許公開第ＵＳ２００７／０２８７１７０号、国際特許公開第ＷＯ２００８／１１９３５３号、米国特許公開第ＵＳ２００９／０１８２１２７号、米国特許公開第ＵＳ２０１０／０２８６３７４号、米国特許公開第ＵＳ２０１１／０１２３５３２号、国際特許公開第ＷＯ２０１１／１３１７４６号、国際特許公開第ＷＯ２０１１／１４３５４５号、又は米国特許公開第ＵＳ２０１２／０１４９８７６号）。本発明の抗体のＶＬ及び／又はＶＨ領域が組み込まれる追加の二重特異性構造は、例えば、デュアル可変ドメイン免疫グロブリン（国際特許公開第ＷＯ２００９／１３４７７６号）、又は２つの結合手を異なる特異性と接続する、ロイシンジッパー又はコラーゲン二量体化ドメインのような様々な二量体化ドメインを含む構造（国際特許公開第ＷＯ２０１２／０２２８１１号、米国特許第５，９３２，４４８号、米国特許第６，８３３，４４１号）である。
【００８９】
本発明の別の態様は、本発明の抗体重鎖可変領域若しくは抗体軽鎖可変領域又はそれらのフラグメントあるいはそれらの相補体のいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドである。遺伝コードの縮重又は所与の発現系におけるコドンの選好性を考慮すると、本発明の抗体アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドもまた本発明の範囲内に含まれる。
【００９０】
本発明の別の実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。かかるベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現ベクター、トランスポゾンに基づいたベクター、又は任意の手段によって特定の生物又は遺伝子的バックグラウンドに本発明のポリヌクレオチドを導入するのに適した他の任意のベクターであってよい。
【００９１】
本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。かかるホスト細胞は、真核細胞、細菌細胞、植物細胞又は古細菌細胞であってよい。例示的な真核細胞は、哺乳動物、昆虫、鳥類又は他の動物由来のものでよい。哺乳動物の真核細胞としては、ハイブリドーマ細胞株又は骨髄腫細胞株などの不死化細胞株、例えばＳＰ２／０（ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｍａｎａｓｓａ、ＶＡ、ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳ０（ＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＵＫ、ＥＣＡＣＣ番号８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６４６）及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８０）マウス細胞株が挙げられる。ヒト骨髄腫細胞株の一例は、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ  ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）である。他の有用な細胞株としては、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣＣＲＬ−６１）、又はＤＧ４４などの、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来するものが挙げられる。
【００９２】
本発明の別の実施形態は、本発明のホスト細胞を培養することと、前記ホスト細胞によって産生された抗体を回収することとを含む、本発明の抗体の製造方法である。抗体を製造して精製する方法は当該技術分野では周知のものである。
【００９３】
本発明の別の実施形態は、ＩＦＮω及びＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ及び／又はＩＦＮαＪ１と、ＩＦＮＡＲとの相互作用を、それを必要とする患者において阻害する方法であり、この方法は、ヒトＩＦＮωとヒトＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ及び／又はＩＦＮαＪ１と結合するために、配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）並びに配列番号２４の軽鎖可変領域（ＶＬ）、又は配列番号２７のＶＨ並びに配列番号２８のＶＬを含む単離された抗体と競合する単離された抗体を、ＩＦＮω及びＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ及び／又はＩＦＮαＪ１とＩＦＮＡＲとの相互作用を防ぐために十分な時間にかけて、患者に投与することを含む。抗体とＩＦＮＡＲとの競合は、標準的な方法及び例えば、ＩＦＮＡＲ１（配列番号３１）及びＩＦＮＡＲ２（配列番号３２）又はそれらのＦｃ融合タンパク質の細胞外部分を用いる本明細書に記載の方法を用いてアッセイすることが可能である。
【００９４】
治療方法
本発明のα／ω抗体を使用して、ＩＦＮα及びＩＦＮωの産生の増加に関連する任意の疾病を治療又は予防することが可能である。本発明の方法において、本発明の任意のＩＦＮα／ω抗体を使用することが可能である。あるいは、ヒトＩＦＮω及びヒトＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ及び／又はＩＦＮαＪ１と結合するために、配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列並びに配列番号２４の軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列、又は配列番号２７のＶＨアミノ酸配列並びに配列番号２８のアミノ酸配列を含む単離された抗体と競合する任意の抗体を使用してもよい。更に、配列番号１の残基Ｆ２７、Ｌ３０、及びＲ３３の１つ以上でＩＦＮ  ＩＦＮωと結合し、配列番号１９の残基Ｆ２７、Ｌ３０、及びＲ３３の１つ以上でＩＦＮα４ａと結合する任意の抗体を使用してもよい。
【００９５】
本発明の方法を用いて任意の分類に属する動物患者を治療することができる。このような動物の例としては、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜などの哺乳動物が挙げられる。例えば、本発明の抗体は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、Ｉ型糖尿病、乾癬、原発性シェーグレン病、全身性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患（ＩＢＤ：クローン病、潰瘍性大腸炎、及びセリアック病を含む）、免疫媒介炎症性甲状腺炎、及び糸球体腎炎などの免疫媒介炎症性疾患の予防及び治療に有用である。更に、本発明の抗体組成物は、移植拒絶を阻害又は予防するため、又は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の治療のために使用することができる。
【００９６】
本発明の抗体はまた、かかる治療のための薬剤の調製においても有用であり、薬剤は、本明細書に定められる投薬量で投与するために調製される。
【００９７】
いかなる特定の理論による束縛も意図しないが、免疫複合体ＳＬＥトリガが、ＩＦＮα及びＩＦＮωを含むがＩＦＮβを含まないＩ型ＩＦＮを引き起こすことが示唆されている。したがって、本発明のＩＦＮα／ωβ抗体は、抗ウイルス防御においてより重要な役割を果たし得るＩＦＮの機能を温存する一方でこれらの病原性のＩ型ＩＦＮを広域に阻害する、より有効なＳＬＥ治療を提供し得る。本発明において、広域中和性ＩＦＮα／ω抗体が生成され、ＩＦＮα及びＩＦＮωが抗原的に特異であるという示唆からの課題（Ａｄｏｌｆ、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ６８：１６６９〜１６７６、１９８７）にもかかわらず、ＩＦＮα及びＩＦＮωに存在する特異な中和性エピトープが同定された。
【００９８】
ＩＦＮαとＳＬＥとの関係は、このサイトカインがＳＬＥ患者の血清中で上昇することが実証された１９７９年に最初に説明された（Ｈｏｏｋｓら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３０１：５〜８、１９７９；Ｐｒｅｂｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１６：４２９〜４３１、１９８２）。より最近では、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子シグネチャがＳＬＥ患者のサブセットにおいて広範に説明されており、ＩＦＮシグネチャの発現範囲が疾患の臨床的及び血清学的特徴の両方と正相関することが報告されている（Ｋａｒａｇｅｏｒｇａｓら、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２７３９０７、２０１１；Ｂａｅｃｈｌｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：２６１０〜２６１５、２００３；Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９７：７１１〜７２３、２００３；Ｄａｌｌ’ｅｒａら、Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ６４：１６９２〜１６９７，２００５；Ｎｉｅｗｏｌｄら，Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎ  ８：４９２〜５０２，２００７）。いくつかの遺伝学関連の研究は、一部のルーパス患者の疾患を媒介するＩ型ＩＦＮの潜在的な役割を示している（Ｄｅｌｇａｄｏ−Ｖｅｇａら、（Ｄｅｌｇａｄｏ−Ｖｅｇａら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  １２  Ｓｕｐｐｌ  １  Ｓ２；Ｅｌｋｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｏｎｅ；Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ  １１：８０３〜８１２、２０１１）。更なる研究は、ＳＬＥの病原性機序に関わる一連の遺伝子産物の発現をＩＦＮαが調節することを明らかにしている。例えば、ＩＦＮαは、ＢＬｙＳの重要なＢ細胞の生存因子の発現だけでなくＢｅｎｌｙｓｔａ（登録商標）（ベリムマブ）の標的もまた誘導することができる。ＳＬＥ患者におけるＩ型ＩＦＮの活性と可溶性ＢＬｙｓのレベルには正相関が存在し（Ｒｉｔｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ６３：３９３１〜３９４１、２０１１）、ＳＬＥ患者におけるＩＦＮαの遮断は、組織を採取したＳＬＥ患者の少数の皮膚病変の生検でＢＬｙＳの遺伝子発現の減少をもたらした（Ｙａｏら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ６０：１７８５〜１７９６、２００９）。ＩＬ−６と同様に、ＩＦＮαもまた、Ｉｇ分泌形質細胞の生成のために重要であることが示された（Ｊｅｇｏら、Ｃｕｒｒ  Ｄｉｒ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ８：１２４−１３９、２００５）。Ｂ細胞コンパートメントへの直接の影響のほかに、ＩＦＮαはループス病因の他の重要なメディエータへの影響を呈する。Ｂｌａｎｃｏらは、ＩＦＮαが抗原提示ＤＣへの単球の分化を誘導し得ることを実証した（Ｂｌａｎｃｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：１５４０〜１５４３、２００１）。ＳＬＥ血清検体中のＩＦＮαの中和は、ＤＣへの単球の分化を誘導するＳＬＥ血清の能力を大幅に減少させ、一部のＳＬＥ患者における自己抗原に対する寛容性を減少させるこのサイトカインの重要な役割を実証した。感染性又は腫瘍学的適応症のためのＩＦＮα療法は、一部の患者において、治療中止後に治まるＳＬＥ様疾患を誘導することを示した（Ｂｕｒｄｉｃｋら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｓａｆ  ８：４５９〜４７２、２００９；Ｂｉｇｇｉｏｇｇｅｒｏら、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４３：２４８〜２５４、２０１���）。
【００９９】
ＩＦＮは、感染の制御を助けるために、ウイルスなどの感染性因子に応答して急速に生成される。核酸リガンドに結合した自己抗体は、ＳＬＥにおけるＩ型ＩＦＮの主な誘導物質であると考えられている。自己抗原のクリアランス障害と関連した自己抗体の圧倒的多数は、ＩＦＮの生産のフィードバックサイクルに至り、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）への免疫複合体のＦｃ受容体依存性の内在が、ＩＦＮの増量、及びしたがってＩＦＮシグネチャの確立につながる。トール様受容体（ＴＬＲ）７及びＴＬＲ９などの核酸受容体は、ｐＤＣのエンドソームコンパートメントにおいて濃縮され、Ｉ型ＩＦＮ放出につながるカスケードを開始するこれらの核酸含有免疫複合体の主要なセンチネルであると考えられる。これに関して、ＴＬＲ７及び９の複数の阻害剤が、ＳＬＥのために臨床開発中である。
【０１００】
ＩＦＮα及びＩＦＮωのどちらもＳＬＥにおいて上昇し、同様の免疫調節作用を誘導し得る。合成リガンドを使用したＴＬＲ７及びＴＬＲ９のアゴニズム（Ｇｉｂｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１８：７４〜８６、２００２）又はＳＬＥ患者由来の免疫複合体（本明細書に記載した）はＩＦＮα及びＩＦＮωタンパク質のＩＦＮω転写物の両方を誘導し（Ｈａｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎ  ４：１７７〜１８６、２００３）、タンパク質（データは表示せず）はＳＬＥ患者において上方調節される。
【０１０１】
Ｉ型ＩＦＮに対する自己抗体はまた、ＳＬＥ患者にも見出され、これはおそらく、過度の体液性免疫応答と組み合わされてこれらのＳＬＥ患者におけるＩＦＮの上昇の結果である。ＩＦＮωに対する自己抗体は、検査したＳＬＥコホートにおいて、ＩＦＮαに対する自己抗体よりも高頻度で見出されたが、一方、ＩＦＮβに対する自己抗体はごくわずかな量で検出された（Ｓｌａｖｉｋｏｖａら、Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ  ２３：１４３〜１４７、２００３）。ＩＦＮωによって付与される一般的な活性はＩＦＮαの作用に似ており、ＳＬＥ患者におけるＩＦＮωの上昇が疾患の病因に寄与し得ることを示唆している（Ａｄｏｌｆら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６５：９２９０〜９２９５、１９９０；Ａｄｏｌｆ、Ｍｕｌｔ  Ｓｃｌｅｒ  １  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ４４〜４７、１９９５；Ｋｕｂｅｓら、Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｓ  １４：５７〜５９、１９９４；Ｔｉｅｆｅｎｔｈａｌｅｒら、Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ  １７：３２７〜３２９、１９９７）。ＳＬＥにおけるＩＦＮβの存在及び役割の確実性はより低い。ＳＬＥ患者の血清を刺激として用いたＩＦＮαの特異的中和はＩ型ＩＦＮの活性を実質的に低下させたが、一方、試験した患者の血清検体を用いたＩＦＮβの中和はごくわずかな作用しかもたらさず、疾患の病因へのＩＦＮβの関与がごくわずかであることを示唆している（Ｈｕａら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ５４：１９０６〜１９１６、２００６）。
【０１０２】
臨床開発におけるＩ型ＩＦＮアンタゴニストの現在のアプローチは、インターフェロン受容体のＩＦＮＡＲ１鎖の中和に関して、ＩＦＮαサブタイプのスペクトルの中和には注目しているが、他のＩ型ＩＦＮ（β、ε、κ、ω）、したがって、全てのＩ型ＩＦＮのシグナル伝達の遮断には注目していないか、又は、ＩＦＮαに特異のワクチン接種アプローチの利用に注目している（Ｍｅｒｒｉｌｌら、Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ７０：１９０５〜１９１３、２０１１；Ｚａｇｕｒｙら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０６：５２９４〜５２９９、２００９）。臨床試験において、ＳＬＥ患者における抗ＩＦＮα抗体は、ＩＦＮシグネチャを呈する患者におけるＩ型ＩＦＮの部分的低下、及び探索的分析でのわずかな作用を示した（Ｍｅｒｒｉｌｌら、Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ７０：１９０５〜１９１３、２０１１）。第２相試験において、免疫抑制剤の欠如下での抗ＩＮＦα治療に伴い、インターフェロンシグネチャメトリック（ＩＳＭ）で低中程度から重度の活性なルーパス被験者の予め特定されたバイオマーカー定義群において、２４週に、ＳＬＥの兆候及び症状、フレア率、及びステロイド負担が改善した。興味深いことに、高ＩＳＭとして予め定義された患者には効能は認められなかった（Ｋａｌｕｎｉａｎら、２０１２  ＡＣＲ／ＡＲＨＰ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ；Ａｂｓｔｒａｃｔ  ＃  ２６２２、２０１２）。
【０１０３】
ＩＦＮβを含む全てのＩ型ＩＦＮによって誘導されるＩＦＮシグナル伝達を中止するために、ＩＦＮＡＲ１に対するモノクローナル抗体が予測される。ＳＬＥの病因におけるＩＦＮβの重要な役割を支持するデータの欠如にもかかわらず、ＩＦＮβは抗ウイルス防御においてより重要な役割を果たす可能性がある。ＩＦＮβをコードする遺伝子の特異的欠失は、機能性ＩＦＮβを有する同じように曝露されたマウスと比較して、ウイルスの宿主への実質的な感受性を被る（Ｌａｚｅａｒら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８５：７１８６〜９４；Ｄｅｏｎａｒａｉｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７４：３４０３〜０９、２０００；Ｄｅｏｎａｒａｉｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１０：３５４０〜３５４３、２００４；Ｇｅｒｌａｃｈら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８０：３４３８〜３４４４、２００６；Ｋｏｅｒｎｅｒら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８１：２０２５〜２０３０、２００７）。
【０１０４】
本発明の一実施形態は、ＩＦＮα及びＩＦＮωの産生の増加に関連する疾患の治療又は予防の方法であり、この方法は、治療的有効量の、ヒトインターフェロンオメガ（ＩＦＮω）及び少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又は１０のヒトインターフェロンアルファ（ＩＦＮα）サブタイプと結合しその活性を中和する単離された抗体、若しくは、ヒトＩＦＮω及びヒトＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ又はＩＦＮαＪ１と結合するために、配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列及び配列番号２４の軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列、又は配列番号２７のＶＨアミノ酸配列、及び配列番号２８のＶＬアミノ酸配列を含む単離された抗体と競合する抗体を、その疾患の治療又は予防のために十分な時間にかけて、それを必要とする患者に投与することを含む。
【０１０５】
本発明の別の実施形態は、ＩＦＮω及びＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ又はＩＦＮαＪ１とＩＦＮＡＲとの相互作用を、この方法を必要とする患者において防ぐ方法であって、ヒトインターフェロンオメガ（ＩＦＮω及び少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又は１０のヒトインターフェロンアルファ（ＩＦＮα）サブタイプと結合しその活性を中和する単離された抗体、若しくは、ヒトＩＦＮω及びヒトＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ及び／又はＩＦＮαＪ１と結合するために、配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列及び配列番号２４の軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列、又は配列番号２７のＶＨアミノ酸配列及び配列番号２８のＶＬアミノ酸配列を含む単離された抗体と競合する抗体を、ＩＦＮω及びＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ及び／又はＩＦＮαＪ１とＩＦＮＡＲとの相互作用を防ぐために十分な時間にかけて患者に投与することを含む。
【０１０６】
他の実施形態において、本発明の方法に使用可能な抗体としては、配列番号１の残基Ｆ２７、Ｌ３０、及びＲ３３の１つ以上でＩＦＮωと結合し、配列番号１９の残基Ｆ２７、Ｌ３０、及びＲ３３の１つ以上でＩＦＮα４ａと結合する抗体が挙げられる。
【０１０７】
本発明の抗体は、ルーパス傾向マウス及び、種々の薬剤を用いてルーパス様の表現型を誘導又は加速したマウスの系統を含む、ルーパスの動物モデルにおけるその有効性について試験することができる（Ｐｅｒｒｙら、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０１１：２７１６９４、２０１１）。例えば、ＮＺＢ／ＮＺＷ  Ｆ１マウスは、糸球体腎炎を含むヒトルーパスのいくつかの特徴を有する時間依存型且つ雌バイアスの疾患を示す。ヒトと比較すると、複数の別個のＩＦＮαサブタイプがマウスで生産されており（ｖａｎ  Ｐｅｓｃｈら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７８：８２１９〜２８、２００４）、マウスにおけるＩＦＮω発現が欠如しているため、疾患関連細胞におけるインビトロ試験を疾患関連ＩＦＮ製剤を用いて行い、本発明の抗体の有効性及び疾患改善能を評価することができる。そのようなインビトロアッセイは、例えば、全血中のＳＬＥ免疫複合体によって誘導されるＩＦＮ産生の阻害の評価、又は、本明細書に記載のような、ＩＦＮシグネチャを低下する抗体の能力の評価である。
【０１０８】
本発明のＩＦＮα／ω抗体のＶＨ及びＶＬドメインは、本明細書に記載した二重特異性抗体及び分子に組み込むことができ、その二重特異性抗体は、ＩＦＮω及び少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又は１０のヒトインターフェロンアルファ（ＩＦＮα）サブタイプ、例えば、ＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ及びＩＦＮαＪ１、並びに、ＢＬｙｓ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−６、ＣＤ２７、ＢＤＣＡ２（ＣＬＥＣ４Ｃ、Ｃ型レクチンドメインファミリー４、メンバーＣ）、又はＩＬ−１２及びＩＬ−２３のｐ４０サブユニットと、特異的に結合し、中和する。あるいは、ヒトＩＦＮω及びヒトＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ及び／又はＩＦＮαＪ１と結合するために、配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、及び配列番号２４の軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列、若しくは配列番号２７のＶＨアミノ酸配列及び配列番号２８のＶＬアミノ酸配列を含む単離された抗体と競合する抗体を使用してもよい。更に、配列番号１の残基Ｆ２７、Ｌ３０、及びＲ３３の１つ以上でＩＦＮωと結合し、配列番号１９の残基Ｆ２７、Ｌ３０、及びＲ３３の１つ以上でＩＦＮα４ａと結合する任意の抗体のＶＨ及びＶＬドメインを使用してもよい。
【０１０９】
ＢＬｙｓ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−６、ＣＤ２７、ＢＤＣＡ２（ＣＬＥＣ４Ｃ、Ｃ型レクチンドメインファミリー４、メンバーＣ）、又はＩＬ−１２及びＩＬ−２３のｐ４０サブユニットは、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を発現するマウス（Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６〜９、１９９４；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５〜５１、１９９６；Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６〜５６、１９９７、米国特許第５，７７０，４２９号、同第７，０４１，８７０号、及び同第５，９３９，５９８号）、又は対応するタンパク質若しくはタンパク質の細胞外ドメイン、あるいは本明細書に記載されるファージディスプレイライブラリを用いて、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫することによってなど、本明細書に記載した方法を用いて生成することができる。あるいは、ＢＬｙｓ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−６、ＣＤ２７、ＢＤＣＡ２（ＣＬＥＣ４Ｃ、Ｃ型レクチンドメインファミリー４、メンバーＣ）、又はＩＬ−１２及びＩＬ−２３のｐ４０サブユニットを用いて、二重特異性分子を生成してもよい。
【０１１０】
投与／製薬学的組成物
ＩＦＮα及びＩＦＮωの産生の増加に関連する状態の処置に有効な本発明のＩＦＮα／ω抗体の「治療的有効量」は、標準的な研究手法によって決定することができる。例えば、ＳＬＥのような免疫媒介炎症性疾患の処置において有効であろう本発明のＩＦＮα／ω抗体は、当該技術分野で周知の関連する動物モデルにＩＦＮα／ω抗体を投与することによって決定することができる。
【０１１１】
所望によりインビトロアッセイを用いて最適な用量範囲を特定することができる。特定の有効用量の選択は、当業者であれば幾つかの因子の考慮に基づいて（例えば臨床試験によって）決定することができる。こうした要因には、治療又は予防しようとする疾患、疾患症状、患者の体重、患者の免疫状態、及び当業者には既知の他の要因が含まれる。製剤に用いられる正確な用量は、投与経路、及び疾患の重篤度にも依存し、医師の判断及び各患者の状況に基づいて決定されなければならない。有効量は、インビトロ又は動物モデル試験系から導出される用量反応曲線から推定することができる。本発明の抗体の有効性及び有効量について、本明細書に記載したモデルのいずれかを用いて試験することができる。
【０１１２】
本発明の抗体の治療上の使用のための投与方法は、薬剤を宿主に送達する任意の好適な経路であってよい。これらの抗体の医薬組成物は、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、又は鼻腔内等の非経口投与に特に有用である。
【０１１３】
本発明の抗体は、有効量の薬剤を製薬上許容される担体中の有効成分として含有する医薬組成物として調製することができる。「担体」という用語は、活性化合物と共に投与する希釈剤、補助剤、賦形剤又は溶媒のことを指す。こうした医薬用溶媒は、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などの、石油、動物、植物又は合成物由来の水及び油などの液体であってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを用いることができる。これらの溶液は滅菌され、一般には粒子状物質を含まないものである。これらは、従来周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。この組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる製薬上許容される補助物質、例えばｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤等を含むことができる。かかる医薬製剤中の本発明の抗体の濃度は幅広く変化してよく、すなわち約０．５重量％未満、通常は約１重量％又は少なくとも約１重量％か、最大で１５又は２０重量％までであってよく、また、選択される特定の投与方法に従って、主として必要とされる用量、液体の体積、粘度等に基づいて選択される。
【０１１４】
したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌済み緩衝水、及び約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、例えば約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、又はより好ましくは約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明の抗体を含むように調製することができる。同様に、静脈内注射用の本発明の医薬組成物は、２５０ｍＬの滅菌リンゲル溶液、及び約１ｍｇ〜約３０ｍｇ、好ましくは５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明の拮抗物質を含むように調製することができる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法は周知のものであり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」，１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにより詳細に述べられている。
【０１１５】
本発明の抗体は、保存のために凍結乾燥させ、使用前に好適な担体に溶解させることができる。この手法は、これまでに、従来の免疫グロブリン及びタンパク製剤に有効であることが分かっており、当該技術分野において既知の凍結乾燥法及び再構成法を用いることができる。
【０１１６】
（詳細な説明）
以下に、本明細書の他の箇所に記載した開示にしたがった本発明の番号付けした更なる特定の実施形態を列挙する。上記の本発明の実施形態の特徴は、これらの番号付けされた更なる実施形態の各々及び全てにもまた関係する。
１）（ａ）ヒトインターフェロンオメガ（ＩＦＮω）及び少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又は１０のヒトインターフェロンアルファ（ＩＦＮα）サブタイプと結合し、それらの活性を中和する、単離されたモノクローナル抗体。
２）抗体が、ヒトＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ及びＩＦＮαＪ１と結合し、活性を中和する、実施形態１に記載の抗体。
３）抗体が、ヒトＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＣ、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ及びＩＦＮαＪ１と結合し、活性を中和する、実施形態１又は２のいずれかに記載の抗体。
４）抗体が、ヒトＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＣ、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ、ＩＦＮαＪ１及びＩＦＮαＡと結合し、活性を中和する、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の抗体。
５）抗体が、ヒトＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＣ、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ、ＩＦＮαＪ１、ＩＦＮαＡ及びＩＦＮαＨ２と結合し、活性を中和する、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の抗体。
６）抗体が、ヒトＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＣ、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ、ＩＦＮαＪ１、ＩＦＮαＡ、ＩＦＮαＨ２及びＩＦＮαＫと結合し、活性を中和する、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の抗体。
７）抗体が、ヒトＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＣ、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ、ＩＦＮαＪ１、ＩＦＮαＡ、ＩＦＮαＨ２、ＩＦＮαＫ及びＩＦＮαＷＡと結合し、活性を中和する、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の抗体。
８）抗体が、ヒトＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＣ、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ、ＩＦＮαＪ１、ＩＦＮαＡ  ＩＦＮαＨ２、ＩＦＮαＫ、ＩＦＮαＷＡ及びＩＦＮα４ａと結合し、活性を中和する、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の抗体。
９）前記ヒトＩＦＮω及びヒトＩＦＮαサブタイプの活性が、転写因子２（ＳＴＡＴ２）、インターフェロン調節因子９（ＩＲＦ９）、並びに分泌胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）のシグナル伝達因子及び活性化因子を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞におけるインターフェロン誘導性ＩＳＧ５４プロモーター下でのＳＥＡＰの阻害である、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の抗体。
１０）前記抗体が、実施例３における「親和性の測定」の項で定義した条件下で、約５×１０-8Ｍ未満、約１×１０-8Ｍ未満、約１×１０-9Ｍ未満、約１×１０-10Ｍ未満、約１×１０-11Ｍ未満、又は約１×１０-12Ｍ未満のＩＣ50値でヒトＩＦＮωの活性を阻害し、且つ、５×１０-8Ｍ未満、約１×１０-8Ｍ未満、約１×１０-9Ｍ未満、約１×１０-10Ｍ未満、約１×１０-11Ｍ未満、又は約１×１０-12Ｍ未満のＩＣ50値でＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ又はＩＦＮαＪ１の活性を阻害する、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の抗体。
１１）前記抗体が、約５×１０-9Ｍ未満、約１×１０-9Ｍ未満、約５×１０-10Ｍ未満、約１×１０-10Ｍ未満、約５×１０-11Ｍ未満、約１×１０-11Ｍ未満、約５×１０-12Ｍ未満又は約５×１０-12Ｍ未満の解離定数（ＫD）のヒトＩＦＮωと結合し、約５×１０-9Ｍ未満、約１×１０-9Ｍ未満、約５×１０-10Ｍ未満、約１×１０-10Ｍ未満、約５×１０-11Ｍ未満、約１×１０-11Ｍ未満、約５×１０-12Ｍ未満、又は約５×１０-12Ｍ未満のＫDのヒトＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ又はＩＦＮαＪ１と結合する、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の抗体。
１２）前記抗体が、ヒトＩＦＮω、並びにヒトＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ及び／又はＩＦＮαＪ１との結合のために、以下を含む単離抗体と競合する、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の抗体。
ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列（配列番号２３）、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列（配列番号２４）、又は、
ｂ）ＶＨアミノ酸配列（配列番号２７）、及びＶＬアミノ酸配列（配列番号２８）を含む単離された抗体である。
１３）前記抗体が、配列番号１の残基Ｆ２７、Ｌ３０、及びＲ３３の１つ以上でＩＦＮωと結合する、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載の抗体。
１４）前記抗体が、配列番号１の残基Ｆ２７、Ｌ３０、及びＲ３３でＩＦＮωと結合する、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の抗体。
１５）前記抗体が、配列番号１の残基Ｐ２６、Ｋ３１、及びＲ３４からなる群から選択される少なくとも１つのＩＦＮω残基と更に結合する、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載の抗体。
１６）前記抗体が、配列番号１の残基Ｒ２２、Ｒ２３、Ｉ２４、Ｓ２５、Ｐ２６、Ｋ３１、Ｄ３２、Ｒ３４、Ｄ３５、Ｑ４０、Ｋ１３４、Ｍ１４６、Ｅ１４７、Ｍ１４９、Ｋ１５０、Ｆ１５３及びＬ１５４からなる群から選択される少なくとも１つのＩＦＮω残基と更に結合する、実施形態１４又は１５のいずれか１つに記載の抗体。
１７）前記抗体が、配列番号１９の残基Ｆ２７、Ｌ３０、及びＲ３３の１つ以上でＩＦＮα４ａと結合する、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の抗体。
１８）前記抗体が、配列番号１９の残基Ｆ２７、Ｌ３０、及びＲ３３でＩＦＮα４ａと結合する、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の抗体。
１９）前記抗体が、配列番号１９の残基Ｈ２６、Ｋ３１及びＲ３４からなる群から選択される少なくとも１つのＩＦＮα４ａ残基と更に結合する、実施形態１７又は１８のいずれか１つに記載の抗体。
２０）前記抗体が、配列番号１９の残基Ａ１９、Ｇ２２、Ｒ２３、Ｉ２４、Ｓ２５、Ｈ２６、Ｃ２９、Ｋ３１、Ｄ３２、Ｈ３４、Ｄ３５、Ｖ１４３、Ａ１４６、Ｅ１４７、Ｍ１４９、Ｒ１５０及びＳ１５３からなる群から選択される少なくとも１つのＩＦＮα４ａ残基と更に結合する、実施形態１７〜１９のいずれか１つに記載の抗体。
２１）前記抗体がウイルス誘導性白血球インターフェロンの活性を阻害する、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の抗体。
２２）前記ウイルス誘導性白血球インターフェロンの活性が、１００Ｕ／ｍＬのインターフェロンによって誘導された全血中におけるＩＰ−１０の放出である、請求項２１に記載の抗体。
２３）前記活性が、５０μｇ／ｍＬの抗体の存在下で５０％超阻害される、請求項２２に記載の抗体。
２４）前記抗体が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）免疫複合体によって誘導されるＩＦＮの活性を阻害する、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載の抗体。
２５）前記活性が、約５０％超阻害される、請求項２４に記載の抗体。
２６）抗体であって、
ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列（配列番号２３）、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列（配列番号２４）、又は、
ｂ）重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列（配列番号２７）、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列（配列番号２８）を含む、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載の抗体。
２７）前記抗体がヒトインターフェロンβ（ＩＦＮβ）と結合せず、中和しない、実施形態１〜２６のいずれか１つに記載の抗体。
２８）前記抗体がＩＦＮαＤと結合せず、中和しない、実施形態１〜２７のいずれか１つに記載の抗体。
２９）前記抗体が、ヒト、ヒト化、又はヒト適応型である、実施形態１〜２８のいずれか１つに記載の抗体。
３０）前記抗体が、ＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ３型、又はＩｇＧ４型アイソタイプである、実施形態１〜２９のいずれか１つに記載の抗体。
３１）前記抗体がヒ二重特異性である、実施形態１〜３０のいずれか１つに記載の抗体。
３２）前記抗体が、ＢＬｙｓ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−６、ＣＤ２７、ＢＤＣＡ２、又はＩＬ−１２若しくはＩＬ−２３のｐ４０サブユニットと結合する、実施形態３１に記載の抗体。
３３）実施形態１〜３２のいずれか１つに記載の抗体と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
３４）ＩＦＮα及び／又はＩＦＮωの産生の増加に関連する疾患の治療又は予防に使用するための、実施形態１〜３２のいずれか１つに記載の抗体、又は実施形態３３に記載の医薬組成物。
３５）ＩＦＮα及び／又はＩＦＮωの産生の増加に関連する疾患が、免疫媒介炎症性疾患であり、所望により、前記免疫媒介炎症性疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、Ｉ型糖尿病、原発性シェーグレン病、全身性硬化症、又は関節リウマチである、実施形態３４にしたがった使用のための、実施形態１〜３２のいずれか１つに記載の抗体、又は実施形態３３に記載の医薬組成物。
３６）患者がＩ型インターフェロンシグネチャを呈する、実施形態３４又は３５にしたがった使用のための、実施形態３４又は３５のいずれか１つに記載の抗体、又は実施形態３３に記載の医薬組成物。
３７）前記抗体が二重特異性抗体であり、前記二重特異性抗体が、ＢＬｙｓ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−６、ＣＤ２７、ＢＤＣＡ２、又はＩＬ−１２及びＩＬ−２３のｐ４０サブユニットと結合する、実施形態３４〜３６にしたがった使用のための、実施形態１〜３２のいずれか１つに記載の抗体、又は実施形態３３に記載の医薬組成物。
３８）患者におけるＩＦＮω及びＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＣ、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ及び／又はＩＦＮαＪ１とＩＦＮＡＲとの相互作用の阻害における使用のための、実施形態１〜３２又は３７のいずれか１つに記載の抗体、又は実施形態３３に記載の医薬組成物。
３９）前記患者が免疫媒介炎症性疾患を有し、所望により、前記免疫媒介炎症性疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、Ｉ型糖尿病、乾癬、原発性シェーグレン病、全身性硬化症、又は関節リウマチである、実施形態３８にしたがった使用のための抗体又は医薬組成物。
４０）患者がＩ型インターフェロンシグネチャを呈する、実施形態３８又は３９にしたがった使用のための抗体又は医薬組成物。
４１）前記抗体が二重特異性抗体であり、前記二重特異性抗体が、ＢＬｙｓ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−６、ＣＤ２７、ＢＤＣＡ２、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３のｐ４０サブユニット、又はＢＤＣＡ２と結合する、実施形態３８〜４０のいずれか１つにしたがった使用のための抗体又は医薬組成物。
【０１１７】
次に本発明を以下の具体的かつ非限定的な実施例を参照して説明する。
【実施例】
【０１１８】
実施例１．免疫付与、ファージパニング、抗体の特徴付け、及び結晶学研究に使用されるヒトＩ型ＩＦＮ抗原の生成：
以下を含む、１２の個別の組換えヒトＩ型ＩＦＮα（αＡ（α２ａ）（配列番号５）、αＢ２（α８）（配列番号６）、αＣ（α１０）（配列番号７）、αＤ（α１）（配列番号８）、αＦ（α２１）（配列番号９）、αＧ（α５）（配列番号１０）、αＨ２（α１４）（配列番号１１）、αＩ（α１７）（配列番号１２）、αＪ１（α７）（配列番号１３）、αＫ（α６）（配列番号１４）、α４ｂ（α４）（配列番号１５）、αＷＡ（α１６）（配列番号１６））、及びチンパンジーＩＦＮω（ｃｈｉｍｐ  ＩＦＮω）（配列番号３）を、配列番号１７〜２１のようなシグナル配列を用い、標準的な方法を用いて、ＨＥＫ  ２９３細胞において発現した。発現レベル及び可溶性を改善するために、ヒトＩＦＮωの８０位のＩＦＮ−ω（Ｔ８０Ｅ）で単一のアミノ酸変異体を生成し、ＨＥＫ  ２９３細胞において発現した。Ｔ８０Ｅ  ＩＦＮω変異体（配列番号２）は、野生型タンパク質と同等の活性を有していた。
【０１１９】
実施例２．ＩＦＮα及びＩＦＮωと結合し中和する抗体の生成
マウスの接種
Ｃ２５９５の生成
ヒトＩＦＮ−α、チンパンジーＩＦＮ−ω、及びカニクイザルＩＦＮ−ωの混合物をＢＡＬＢ／ｃマウスに複数回腹腔内接種した。０日目にマウスにチンパンジーＩＦＮ−ωを接種した。１４日目に、同じマウスにチンパンジー及びカニクイザルのＩＦＮω、ＩＦＮαＤ、ＩＦＮαＪ１、ＩＦＮαＣ、ＩＦＮαＢ２、ＩＦＮαＨ２、ＩＦＮαＡ、ＩＦＮα４ａ、ＩＦＮαＧ、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＷＡ及びＩＦＮαＩの混合物を接種した。２０８日目に、同じマウスにカニクイザルＩＦＮ−ω、ヒトＩＦＮα４ｂ、ＩＦＮαＡ、ＩＦＮαＤ、及びＩＦＮαＫの混合物を接種した。２２１日目に、同じマウスにカニクイザルＩＦＮ−ω、ヒトＩＦＮαＪ、ＩＦＮαＩ、ＩＦＮα４ａ、ＩＦＮαＡ及びＩＦＮαＦ．の混合物を接種した。接種後、特異的ＩｇＧ力価を評価した。十分な力価が得られた直後に、膵細胞を単離してＦＯ細胞と融合した。得られたハイブリドーマを９６ウェルプレートに播種して１０日間培養した。まず、チンパンジーＩＦＮ−ωの結合及びヒトＩＦＮαＡ、ＩＦＮαＨ２、ＩＦＮαＤ、及びＩＦＮα４ａの混合物の結合に関して、ＥＬＩＳＡを用いて一次スクリーンによって抗原特異性クローンを同定した。ＩＦＮ−α及び／又はＩＦＮ−ωへのハイブリドーマの結合は、Ｌｕｍｉｎｅｘ多重アッセイによって更にスクリーニングした。更なる研究のために、ＩＦＮα及びヒト並びにカニクイザルのＩＦＮωのほとんどに広域結合するクローンを選定した。
【０１２０】
ファージディスプレイライブラリ
ヒトＩ型ＩＦＮ結合性Ｆａｂは、ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｐＩＸファージディスプレイライブラリから選択した（Ｂｉｏｌ．３９７：３８５〜３９６、２０１０；国際特許出願公開第ＷＯ２００９／０８５４６２号、米国特許公開第ＵＳ２０１０／００２１４７７号、米国特許公開第ＵＳ２０１２／０１０８７９５号）。
【０１２１】
ＩＦＷＭ４３の選定
ｐＩＸファージディスプレイライブラリは、ヒト野生型ＩＦＮ−α配列Ｃ末端ポリヒスチジンタグの発現から生成され、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにより精製した、精製されたＩ型ＩＦＮαＡ（ＩＦＮα２）に対してパニングした。３ラウンドのパニングを用いた。第１、第２、及び第３ラウンドのパニングに、それぞれ、１００ｎＭ、１０ｎＭ及び１ｎＭのビオチン化抗原を使用した。３ラウンドのパニング後に採取したファージミドクローン由来のモノクローナルＦａｂについて、標準のＥＬＩＳＡを用いて、それらが結合するチンパンジーＩＦＮω、ヒトＩＦＮα２、ＩＦＮα１、ＩＦＮαＨ２、ＩＦＮαＧ、ＩＦＮα  Ｆ及びアビジンに関して一次スクリーニングした。ＥＬＩＳＡにおいて、ＩＦＮα及びＩＦＮ−ωに特異的に結合したＦａｂフラグメント（Ｆａｂ）を配列決定し、それらが異なるＶ領域配列を有している場合には、一意のＩＦＮバインダーとして同定した。それらのＦａｂを、ヒトＩｇＧ１  ｍＡｂに変換し、抗炎症活性の同定と関係する細胞ベースの一連のアッセイにおいてそれらの中和活性を更に試験した後、ＩＦＮバインダーとして同定した。
【０１２２】
ＩＦＷＭ８８の同定
ｐＩＸファージディスプレイライブラリは、ヒト野生型ＩＦＮ−α配列Ｃ末端ポリヒスチジンタグの発現から生成され、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにより精製した、精製されたＩ型ＩＦＮαＧ（ａ５）に対してパニングした。３ラウンドのパニングを用いた。第１、第２、及び第３ラウンドのパニングに、それぞれ、１００ｎＭ、１０ｎＭ及び１ｎＭのビオチン化抗原を使用した。３ラウンドのパニング後に採取したファージミドクローン由来のモノクローナルＦａｂについて、標準のＥＬＩＳＡを用いて、それらが結合するチンパンジーＩＦＮω、ヒトＩＦＮα２、ＩＦＮα１、ＩＦＮαＨ２、ＩＦＮαＧ、ＩＦＮα  Ｆ及びアビジンに関して一次スクリーニングした。ＥＬＩＳＡにおいて、ＩＦＮα及びＩＦＮ−ωに特異的に結合したＦａｂフラグメント（Ｆａｂ）を配列決定し、それらが異なるＶ領域配列を有している場合には、一意のＩＦＮバインダーとして同定した。それらのＦａｂを、ヒトＩｇＧ１  ｍＡｂに変換し、抗炎症活性の同定と関係する細胞ベースの一連のアッセイにおいてそれらの中和活性を更に試験した後、ＩＦＮバインダーとして同定した。
【０１２３】
生成した抗体の可変領域のアミノ酸配列は以下の通り：ＩＦＷＭ４３  ＶＨ：配列番号２３；ＩＦＷＭ４３  ＶＬ：配列番号２４；ＩＦＷＭ８８  ＶＨ：配列番号２５；ＩＦＷＭ８８  ＶＬ：配列番号２６；Ｃ２５９５  ＶＨ：配列番号２７；Ｃ２５９５  ＶＬ：配列番号２８。Ｃ２５９５可変領域はヒトＩｇＧ１定常領域に移され、得られた抗体はＭ３２３９と命名した。ＩＦＷＭ４３はＭ４３とも呼ばれ、ＩＦＷＭ８８はＭ８８と呼ばれる。
【０１２４】
実施例３．ＩＦＮα及びＩＦＮωと結合し中和する抗体の特徴付け
方法
親和性の測定
抗体の結合親和性は、ＰｒｏｔｅＯｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州）でＳＰＲ技術を用いて行われた。製造業者の推奨した標準ＮＨＳ／ＥＤＣ化学を用いて、ヤギの抗ヒトＦｃ抗体（製造）をＧＬＣチップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州）にアミンカップリングした。次に、抗ＩＦＮ  ｍＡｂを、抗体とカップリングしたチップに３０μＬ／分の流量で２分間負荷した。５０μＬ／ｍＬの流量で２分間、ランニング緩衝液（緩衝液の組成）で洗浄した後、１：３希釈で１００ｎＭ〜１．２３ｎＭまでの範囲の５つの異なる濃度で、組換えＩＦＮ抗原を３分間会合させ、１０分間解離させた（どちらも５０μＬ／ｍＬの流量で）。チップは、異なる抗原の実行の間に各方向において１００ｍＭのリン酸を用いて生成した。ＰｒｏｔｅＯｎマネージャ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州）を用いて、データ解析を行った。センサーグラムは、ｍＡｂによって分類した。（インタースポット又はブランクチャネル基準のいずれかを使用して）整列及び基準補正を適用した後、ＳＰＲデータを運動速度定数のラングミュアモデルにグローバルに適合させた（ＫD＝ｋoff／ｋon、式中、ＫD＝平衡解離定数、ｋon＝会合速度定数、ｋoff＝解離速度定数）。
【０１２５】
ＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイ（「ＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイ」）
完全に活性なＩ型ＩＦＮシグナル伝達経路を発現する（ＳＴＡＴ２及びＩＲＦ９を安定に発現する）ように操作され、ＩＦＮα／β誘導性ＩＳＧ５４プロモーターの制御下でＳＥＡＰレポーター遺伝子でトランスフェクトされた、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＦＮ−α／β細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を使用した。細胞は、１０％ウシ胎児血清、１００ｕｇ／ｍＬのブラストサイジン、及び３０ｕｇ／ｍＬのゼオシンでＤｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地中のコラーゲンＩ型コーティングされたＴ１５０フラスコにて、３７℃、５％ＣＯ2で増殖した。細胞を採取し、３８４ウェルプレートに、１ｍＬにつき５０，０００個の細胞で、各ウェルに５０μＬを播種した。播種した細胞を３７℃、５％ＣＯ2で２４時間インキュベートした。試験したインターフェロン試料は、調製し、使用済みのＨＥＫ  ＩＳＲＥ無血清培地中で希釈し、ＩＦＮ試料５０μＬを各ウェルに加えた。播種した細胞を３７℃、５％ＣＯ2で２０時間インキュベートした。室温で２０分間インキュベートした後、６０μＬ／ウェルのＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）を濾過水中に再縣濁した２０μＬの播種した細胞上清から、アルカリホスファターゼが検出された。Ｂｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙプレートリーダーで６５０ｎｍで光密度を読み取った。
【０１２６】
いくつかのＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイは、以下のように９６ウェルプレートで行った。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＦＮ−α／β細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を、無選別培地（ＤＭＥＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ／１０％  ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）１００μＬに各ウェルに５０，０００個の細胞で播種し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、Ｉ型ＩＦＮ刺激因子を、別の９６ウェルＵ底トランスファープレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）において、Ｉ型ＩＦＮ阻害剤あり又はなしで調製し（すなわち、組換えインターフェロン、白血球ＩＦＮ、ＩＣ誘導したＩＦＮプレップ、血清等）、１０分間３７℃で予め温めた。インキュベータから細胞プレートを取り出し、培地を取り除き、９６ウェルＵ底トランスファープレートにおいて調製した１００μＬの適切処置物と交換した。細胞を再び３７℃に２４時間置いた。翌日、４０μＬの上清を、１６０μＬのＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）ＳＥＡＰ基材（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を含む９６ウェル平底プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に移した。プレートを約１５分間発色させ、６５０ｎｍの吸光度で分光計を使用して読み取った。
【０１２７】
ＩＰ−１０放出アッセイ
健康なボランティアからのヘパリン化全血を、アイソタイプ対照と共に、いくつかの異なるＩ型ＩＦＮ阻害剤を含有する９６ウェルＵ底プレートに播種した。阻害剤及び適切なアイソタイプ対照を、１０％  ＦＢＳを用いたＲＰＭＩ培地にて希釈した。ＩＦＮ及び阻害剤又はアイソタイプ対照を、１０％  ＦＢＳを含有する体積３０μＬのＲＰＭＩ培地中に希釈した。それらの試料を１５〜２０分間予めインキュベートした後、その希釈液を含有するプレートにヘパリン化した全血２４０μＬを加えて、２７０μＬの最終体積を得た。試料を混合し、３７℃で２０〜２２時間インキュベートさせた。インキュベーション後、試料を４００Ｘｇで５分間遠心分離し、血漿を回収し、後の分析のために凍結した。ＩＰ−１０プロファイリングは、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘサイトカイン／ケモカインキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｐｒｅｍｉｘｅｄ  ３９プレックスで行った。試料の調製及びアッセイは、ＢｉｏＲａｄモデル（Ｂｉｏｐｌｅｘ（商標）２００）システム及びＢｉｏｐｌｅｘマネージャ（商標）ソフトウェア４．１を用いてデータを収集し、製造業者の推奨に従って行った。統計解析はＧｒａｐｈパッドＰｒｉｓｍ  Ｖ．５ソフトウェアにより行った。場合によっては、ＩＰ−１０の定量化を、Ｑｉａｇｅｎの単一検体ＥＬＩＳＡキットを用いて行った。
【０１２８】
ＳＬＥ全血遺伝子シグネチャアッセイ
ＳＬＥドナーの全血をＡｓｔｅｒａｎｄから市販により入手した。全血遺伝子発現解析は、ＩＦＮ刺激遺伝子（ＩＳＧ）が濃縮されたプライマー及びプローブを含有するカスタムＴａｑＭａｎ低密度アレイカードを用いて行った。アレイに含まれていた遺伝子は以下の通り。ＡＣＴＢ、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１３、ＦＡＳ、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ１７Ａ、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＯＡＳＬ、１８Ｓ、ＳＴＡＴ１、ＬＹ６Ｅ、ＰＬＳＣＲ１、ＭＸ１、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩ４４、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＦＩ２７、ＩＳＧ１５、ＲＳＡＤ２、ＣＸＣＬ１０、ＬＡＧ３、及びＴＮＦＳＦ１０。製造業者の使用説明書に従って、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００  ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州）でＲＴ−ＰＣＲ増幅を行った。相対的発現値を、比較閾値サイクル（Ｃt）法を用いて算出した。端的に述べると、この手法は、２-ΔΔCｔを用いて、較正群（健常な未処置の全血）に対して正規化した標的遺伝子の発現を算出する。ベータアクチン（ＡＣＴＢ）を内在性対照として選択した。閾値サイクル（Ｃt）は、その量の増幅した標的が一定の閾に達するサイクル数を示す。全てのインターフェロン誘導標的遺伝子及びＡＣＴＢのＣｔデータを用いて、ΔＣt値［ΔＣt＝Ｃt（標的遺伝子）−Ｃt（ＡＣＴＢ）］を得た。ΔΔＣt値は、対照群（５人の健常な未処置の全血ドナー）の平均を各標的のΔＣt値から減算して算出した。相対発現値は、等式２-ΔΔCを用いて算出した。本実験の３人のＳＬＥドナーは、低密度アレイの９つのＩＳＧに関して少なくとも対照群の２倍の高さの遺伝子発現を有していた。３人の全てのドナーに対するＩ型ＩＦＮ阻害剤の作用を比較するために、最初に、あらゆる治療／阻害剤について以下の式を用いて阻害率（％）を決定した。
（２-ΔΔCｔ  ＳＬＥ未処置血液−２-ΔΔCｔ阻害剤/-ΔΔCｔ  ＳＬＥ未処置血液）×１００＝阻害率（％）。次に、３人の全てのドナーに対する各処置についてのベースライン（％）を以下の等式によって算出した。１００−阻害率（％）＝ベースライン（％）。
【０１２９】
次に、処置群による３人の全てのドナーの平均ベースライン（％）を、９つの遺伝子のそれぞれについて決定した。この群がベースラインから１００％であることを示すために、未処置ＳＬＥ群（「ＳＬＥ血液のみ」）を１００に設定した。ベースラインは、ＩＦＮ誘導遺伝子発現が０％であることを示す。最後に、９つの全ての遺伝子に対する各治療群の平均及び標準偏差を決定し、プロットした。スチューデントのｔ検定を行うことによって、統計的有意性を決定した。
【０１３０】
ＳＬＥ免疫複合体の調製
ＳＬＥ患者の血漿をＳＣＩＰＡＣ（Ｋｅｎｔ、イギリス）から入手した。ＩＳＲＥに基づくレポーター遺伝子アッセイによって、Ｉ型ＩＦＮ活性を有する血漿試料を更にＩｇＧ精製に使用した。ＩｇＧは、製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）の推奨するＮＡＢ（商標）タンパク質Ａ／Ｇスピンカラムを用いて精製し、濃度を決定するためにタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ）を実行した。１Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に５×１０7細胞／ｍＬで懸濁したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて、自己抗原溶解物を調製した。Ｈｅｋ２９３−Ｔ細胞を破壊するために、−８０℃で少なくとも１０分間（ただし最初の凍結は少なくとも３０分間）凍結させてから３７℃で融解する凍結融解サイクルを４回行い、この凍結融解後、細胞の破片を遠心分離により除去し（５分間４００ｇ）、可溶性抗原の量をタンパク質アッセイによって定量した。１：１の比率で、精製したＩｇＧと壊死細胞の溶解物とをいっしょに３０分間ＲＴでインキュベートして、免疫複合体を形成した。次いで、各ウェルにつき合計４ｍＬのＰＢＭＣ培地において、４００μｇ／ｍＬの最終濃度の免疫複合体を６ウェルプレートの３つのウェルに加えた。上述のように健康ドナーのＩｇＧを精製及び「複合化」し、対照として使うためにＰＢＭＣを刺激するために用いた。これらの研究からの馴化培地をアリコートし、阻害実験のための内因性ＩＦＮのためのソースとして使用した。健康ボランティアから単離されたＩｇＧから調製した製剤では、ＩＦＮ活性は認められなかった。
【０１３１】
結果
組換えＩ型ＩＦＮの親和性及び中和
表２は、個々の組換えヒトＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）に対する抗体Ｍ４３、Ｍ８８、及びＭ３２３９の解離定数（ＫD）を示す。Ｍ４３、Ｍ８８、及びＣ２５９５は、少なくとも４つのＩＦＮα分子（アルファＢ２、アルファＦ、アルファＧ及びアルファＪ１）を中和した。アルファＤについては、結合は認められなかった。
【０１３２】
表３は、レポーター遺伝子アッセイで測定された個々の組換えヒトＩ型ＩＦＮに対する抗体Ｍ４３、Ｍ８８、及びＭ３２３９（Ｃ２５９５）のＩＣ50値を示す。Ｍ４３は、少なくとも１０のＩＦＮα分子を阻害しており、広域中和性であった。Ｍ３２３９はサブｐＭ  ＩＣ50でＩＦＮωを中和し、Ｍ４３はｎＭ範囲内のＩＣ50でＩＦＮωを中和した。Ｍ８８は、その非常に弱い結合のために、この特定のアッセイではＩＦＮωに対する中和活性を示さなかった。しかしながら、親和性成熟後、Ｍ８８由来の抗体は強いＩＦＮω中和活性を示す一方で、それらの広域のＩＦＮα中和活性を維持した（データは示されていない）。これらの抗体はいずれもＩＦＮβと結合せず、中和しなかった。
【０１３３】
【表２】
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【０１３４】
【表３】
0006466904.tif 000004
【０１３５】
内因性Ｉ型ＩＦＮの中和
内因性Ｉ型ＩＦＮを中和する抗体の能力は、内因性白血球ＩＦＮ（ウイルス誘導した）又は組換えＩＦＮωで刺激したヒト全血からのケモカインＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）の放出を評価するアッセイで評価した。白血球ＩＦＮ（図１Ａ）及び組換えＩＦＮω（図１Ｂ）の両方の用量依存性阻害が、Ｍ４３及びＣ２５９５に認められ、ウイルス誘導された白血球によって精製されるような広範なスペクトルのＩ型の活性を中和する抗体の能力が示された。内因性白血球ＩＦＮはＳｉｇｍａ（カタログ番号Ｉ４７８４−１ＭＵ）から購入した。
【０１３６】
疾患関連ＩＦＮミリューの中和
ＳＬＥに存在するＩ型ＩＦＮミリューをより正しく代表するために、刺激としてのＳＬＥ免疫複合体誘導したＩＦＮを減少する抗体の能力について、抗体を試験した。ＳＬＥ免疫複合体誘導したＩＦＮは、ＳＬＥ患者由来の免疫複合体でヒトＰＢＭＣを刺激することによって調製し、阻害剤ｍＡｂ及び対照ｍＡｂの存在下でＩ型ＩＦＮ誘導性のレポーター遺伝子のアッセイ（上記のＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイ）に、この条件付けした培地を使用した。選択的ＩＦＮω中和性のｍＡｂを３つの異なるＩＦＮαアンタゴニストとの組み合わせにおいて添加したところ、等量のアイソタイプ対照ｍＡｂの存在下での抗ＩＦＮα  ｍＡｂと比べて、免疫複合体誘導したＩＦＮの総活性は更に低下した（図２）。更に、抗ＩＦＮα／ω  ｍＡｂ  Ｍ４３は、ＩＦＮα阻害剤ｍＡｂと比べて、更なる活性の抑制を示し、ＩＦＮα及びＩＦＮωの両方の遮断が、ＩＦＮαの中和のみの場合よりも総ＩＦＮ活性を低下し得ることを示した（図２）。
【０１３７】
ＳＬＥ関連ＩＦＮミリューへのＩＦＮωの寄与
上述のように、９つのＩＦＮ誘導した遺伝子の組み合わせを用いて、ＳＬＥ遺伝子シグネチャのアッセイを開発した。遺伝子シグネチャを阻害する多様な抗体の能力を試験した。ＩＦＮω特異性アンタゴニストｍＡｂ（抗−ω）は同等の濃度のアイソタイプ対照ｍＡｂと比べてＩＦＮシグネチャを下方調節し、ＩＦＮ−ωがＳＬＥにおいてＩＦＮシグネチャを誘導する活性のＩ型ＩＦＮミリューの一部であることを示した。ＩＦＮω抗体とＩＦＮα抗体との組み合わせは、ＩＦＮα又はＩＦＮω阻害剤単独よりも、これらの患者の血液中で永続するＩＦＮシグネチャのより顕著な抑制をもたらした（図３）。
【０１３８】
実施例４競合的エピトープマッピング
エピトープ結合実験は、Ｏｃｔｅｄ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、カリフォルニア州Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ）を用いてリアルタイム無標識競合結合アッセイを使用して行った。イン・タンデムアッセイ形式及び古典的サンドイッチアッセイ形式の２つのアッセイ形式を使用した。
【０１３９】
イン・タンデムアッセイ形式では、リアルタイム運動シグナルを測定しながら、ストレプトアビジンバイオセンサーチップ（ｆｏｒｔｅＢｉｏ、カリフォルニア州Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ）を５分間０．５μｇ／ｍＬのビオチン化した組換えインターフェロンに浸漬した。次いで、それらのチップをｍＡｂの第１セット（１０μｇ／ｍＬ）に１５分間浸漬した。その後、それらのチップをｍＡｂの第２セット（１０μｇ／ｍＬ）に更に１０分又は１５分間浸漬した。第２セットのｍＡｂに浸漬したチップからの正の結合シグナルは、第１のｍＡｂセットと異なるエピトープへのそれらの結合を示し、負のシグナルは、同じエピトープへのそれらの結合を示す。それらの２つのｍＡｂセットの親和性の差による誤った結果を排除するために、その実験を逆順で、すなわち第２のｍＡｂセットを最初に浸漬してから第１のｍＡｂセットに浸漬して、反復した。全ての抗体及び抗原は、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ及び０．０２％のＴｗｅｅｎ  ２０を用いてＰＢＳ中に希釈した。
【０１４０】
古典的サンドイッチアッセイ形式では、製造業者（ｆｏｒｔｅＢｉｏ、カリフォルニア州Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ）のプロトコルに従って、第１のｍＡｂセットを、標準的なＮＨＳ／ＥＤＣ媒介化学を用いたアミン反応性バイオセンサーチップに結合した。エタノールアミンにて５分間急冷した後、チップを組換えインターフェロン（２μｇ／ｍＬ）に１０分間浸漬し、次いで、第２のｍＡｂセット（１５μｇ／ｍＬ）に１０又は１５分間浸漬した。カップリングｍＡｂはＭＥＳ緩衝液６．０中に希釈し、一方、ビニングｍＡｂ及び抗原は１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ及び０．０２％のＴｗｅｅｎ  ２０を用いてＰＢＳ中に希釈した。
【０１４１】
３つのエピトープビニング実験を、以下の抗体を用いて両方のアッセイ形式を使用して行った。Ｍ４３、Ｍ８８、及びＣ２５９５（複数のＩＦＮαサブタイプ及びＩＦＮωの結合）、Ｃ２６０１及びＭ４２（ＩＦＮωと結合するが、ＩＦＮαサブタイプとは弱く結合する）、並びにＣ２６０５（複数のＩＦＮαサブタイプと結合するがＩＦＮωとは結合せず）。様々なＩＦＮ−α分子を競合アッセイ（ヒトＩＦＮαサブタイプＩＦＮαＡ、ＩＦＮαＢ、ＩＦＮαＣ、ＩＦＮαＦ、ＩＦＮαＧ、ＩＦＮαＨ、ＩＦＮαＪ、ＩＦＮα２、ＩＦＮα４ａ、及びチンパンジーＩＦＮω並びにヒトＩＦＮＡＲ２−Ｆｃ分子）で試験した。
【０１４２】
表４は、Ｍ４３の存在下での競合の結果を示し、表５はＩＦＮＡＲ２−Ｒｃの存在下での競合を示す。Ｍ４３とＭ８８は試験した全てのＩＦＮα分子及びチンパンジーＩＦＮωへの結合に関して互いに競合した。ＩＦＮωに結合しないＭ４２は、試験したＭ４３を有するＩＦＮ−分子との結合に関して競合しなかった。Ｍ４３は、ＩＦＮω及び多様なＩＦＮα分子との結合に関してＣ２５９５及びＩＦＮＡＲ−Ｆｃと競合した。Ｃ２６０５は、ほとんどのＩＦＮαに対して、Ｍ４３と結合を競合せず、これら２つの抗体が異なるエピトープに結合することを示した。強いＩＦＮωバインダーだが弱いＩＦＮαバインダーであるＣ２６０１はＭ４３を有するＩＦＮωとの結合に関してＭ４３と結合せず、これら２つの抗体が別個のエピトープと結合することを示した。Ｃ２６０１又はＣ２６０５ではなく、Ｃ２５９５は、チンパンジーＩＦＮω及び／又はＩＦＮαとの結合に関してＩＦＮＡＲ２−Ｆｃと競合しなかった。ＩＦＮω及び複数のＩＦＮαサブタイプと結合する抗体、したがって別個のエピトープビンを画定する抗体は、以下の通り。ＢｉｎＡ：ｍａｂ  Ｍ４３、Ｍ８８、Ｃ２５９５。ＩＦＮα又はＩＦＮωのみと結合する抗体は別個のエピトープビンを形成する。
【０１４３】
【表４】
0006466904.tif 000005
【０１４４】
【表５】
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【０１４５】
実施例５．ＩＦＮω  Ｔ８０Ｅ変異体との複合体における抗ＩＦＮα／ω抗体Ｍ４３の結晶構造由来のＭ４３のエピトープ
ＩＦＷＭ４３（以下、ｍＡｂについてはＭ４３、ＦａｂについてはＦａｂＭ４３）は、ヒトＩＦＮα分子及びＩＦＮωを広域に中和し、多くのＩＦＮαサブタイプ及びヒトＩＦＮωとの結合を示す。ＩＦＮαサブタイプ及びＩＦＮωに対するその特異性に関する構造的ベースを明らかにするために、ＦａｂＭ４３との複合体におけるＩＦＮ−ωの結晶構造を決定した。
【０１４６】
材料と方法
タンパク質
Ｈｉｓタグ付けしたＦａｂＭ４３（ＩｇＧ１／κアイソタイプ）及びＴ８０Ｅ変異（本例においてＩＦＮω及びＩＦＮωＴ８０Ｅは同義）をＨＥＫ２９３Ｆ細胞にて発現し、アフィニティ及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。タンパク質は、２０ｍＭのトリス、ｐＨ  ７．４、５０ｍＭのＮａＣｌにおける量である。
【０１４７】
ＩＦＮω／ＦａｂＭ４３複合体の結晶化
この複合体は、１．０５：１．０（過剰のＩＦＮω）のモル比でＩＦＮωをＦａｂＭ４３と混合することによって調製し、２０ｍＭの酢酸Ｎａ（ｐＨ  ５．５）、０．１Ｍ  ＮａＣＬ、及び１０％グリコールで平衡したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムで精製した。精製した複合体を、Ａｍｉｃｏｎ−Ｕｌｔｒａ  １０ｋＤａカットオフを用いて１０．２４ｍｇ／ｍＬに濃縮した。Ｘ回折に適した結晶は、記載されているように（Ｏｂｍｏｌｏｖａら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ６６：９２７〜３３、２０１０）、ＭＭＳ播種した２６％のＰＥＧ  ３３５０、１ＭのＬｉＣＬ、０．７％の１−ブタノールからのシッティングドロップにて得た。
【０１４８】
Ｘ線データ収集及び構造決定
Ｘ線データ収集については、結晶を、２０％グリセロールを補充した合成母液（０．１ＭＥＳ（ｐＨ  ６．５）、２０％  ＰＥＧ  ３３５０、１Ｍ  ＬｉＣＬ）に数秒間浸し、液体窒素中でフラッシュ凍結させた。Ｘ線回折データはＳｗｉｓｓ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅで収集した。Ｘ線データはプログラムＸＤＳ（Ｋａｂｓｃｈ、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  ６６：１２５〜１３２、２０１０）で処理した。Ｘ線データ統計を表６に示す。
【０１４９】
構造は、Ｐｈａｓｅｒ（Ｒｅａｄ、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５７：１３７３〜８２、２００１）を用いて分子置換（ＭＲ）で解析した。ＭＲの検索モデルはＦａｂ１５（ＰＤＢ  ＩＤ  ３ＮＣＪ；Ｌｕｏら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４０２：７０８〜７１９、２０１０）及びＩＦＮ−α２（ＰＤＢ  ＩＤ  １ＲＨ２；Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：１４５３〜１４６３、１９９６））の結晶構造であり、ＣαモデルはＰＤＢにおいて入手可能である。ＭＲに使用するために、Ｃα座標及びＰＤＢでの反射データを用いてＰｈａｓｅｒを使用してＭＲによってＩＦＮ−α２の完全な分子モデルを取得し、ＰＨＥＮＩＸで精密化した（Ａｄａｍｓら、Ｊ  Ｓｙｎｃｒｈｒｏｔｒｏｎ  Ｒａｄｉａｔ  １１：５３〜５５、２００４）。ＩＦＮ−ω／ＦａｂＭ４３構造はＰＨＥＮＩＸを用いて精密化し、モデルの調製はＣＯＯＴを用いて実行した（ＥｍＳＬＥｙ  ａｎｄ  Ｃｏｗｔａｎ、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ６０：２１２６〜２１３２、２００４）。他の全ての結晶学的計算は、ＣＣＰ４のプログラムスイートを用いて行った（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｊｅｃｔ、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５３：２４０〜２５５、１９９４）。可変ドメインと定常ドメインとの間のエルボー角度は、ＲＢＯＷプログラムを用いて計算した（Ｓｔａｎｆｉｅｌｄら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３５７：１５６６〜１５７４、２００６）。分子グラフィックはＰｙＭｏｌを用いて生成した（ＤｅＬａｎｏ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ、Ｄｅｌａｎｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。構造精密化統計を表６に提供する。
【０１５０】
【表６】
0006466904.tif 000007
aＲmerge＝Σ｜Ｉ−＜Ｉ＞｜／ΣＩ、式中、Ｉは測定された反射の強度であり、＜Ｉ＞はこの反射の全ての測定値の平均強度である。
bＲcryst＝Σ｜｜Ｆobs｜−｜Ｆcalc｜｜／Σ｜Ｆobs｜、式中、Ｆobs及びＦcalcは、観察され、算出された構造因子、Ｒfreeは精密化の前にランダムに選択された反射の５％のセットについて算出される。
cラマチャンドランプロットはＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙを用いて算出した。
dａ*、ｂ*及びｃ*における異方性の解像限界は、回折異方性スケールサーバによれば、３．０、２．５、及び２．５Åである（ｈｔｔｐ：／／＿ｓｅｒｖｉｃｅｓ＿ｍｂｉ＿ｕｃｌａ．ｅｄｕ／＿ａｎｉｓｏｓｃａｌｅ／）。回折データ統計は、これらの限界を用いた、異方性の切り捨て及びスケーリング後のデータセットに関する。
【０１５１】
結果
全体構造
非対称単位に６つのＩＦＮω／ＦａｂＭ４３複合体が存在する。これらの複合体の全てが非常に類似している。ＩＦＮω／ＦａｂＭ４３複合体の全体的な分子構造を図４に示す。図面の説明Ｈの標識はＶＨ、Ｌの標識はＶＬ、左上はＩＦＮωである。
【０１５２】
ＩＦＮω分子は本質的に同一の立体配座を有し、平均Ｃα  ｒｍｓｄは０．３５Å未満である。ＩＦＮωの分子構造は、平均Ｃα  ｒｍｓｄが０．５３ÅであるＩＦＮ−α２と非常に類似したへリックス束であり、Ｃα  ｒｍｓｄが０．４７Åである公開されているＩＦＮ−ω（ｐｄｂｉｄ  ３ｓｅ４）及びＩＦＮβ（９４の残基に関してＣα  ｒｍｓｄ  ０．８５Å）とほぼ同一である。しかしながら、ＩＦＮ−βのＡＢループは残基１つ分短いので、ＩＦＮα／ωとＩＦＮ−βとの間にはいくつかの有意な違いが存在する。Ｆａｂ分子はまた、ＣＤＲ−Ｈ１（Ｇ26ＧＴＦ29）（配列番号３３）における短い部分を除いて同一の構造を有し、わずかに異なるバックボーン立体配座を採用する。
【０１５３】
エピトープ、パラトープ、及びＡｂ／Ａｇの相互作用
Ｍ４３は、ＡＢループ（Ｒ２２とＱ４０の間）の残基及び残基Ｋ１３４、Ｍ１４６、Ｍ１４９、Ｋ１５０、Ｆ１５３並びにへリックスＥのＬ１５４で構成された立体配座エピトープを認識する（表７）。パラトープは６つのＣＤＲのうち５つからの残基で構成されている。パラトープ残基は主に疎水性であり、一連のポケットを形成し、そこに、短いＡＢへリックスの残基Ｆ２７、Ｌ３０、Ｋ３１及びＲ３３の側鎖がドッキングする。抗体と抗原の相互作用は、ほとんどがｖｄｗ及び疎水性パッキングのように思われる。抗体と抗原の間には少数のＨ結合しかなく、それらのほとんどにバックボーン−バックボーン又は側鎖−バックボーンの相互作用が関与している。Ａｂ／Ａｇ相互作用の大部分は、ＡＢへリックスのいくつかの残基Ｆ２７、Ｌ３０、Ｋ３１及びＲ３３によるものである。したがって、ＩＦＮωのこの領域がエピトープの主な部分を構成しているように見える。
【０１５４】
【表７】
0006466904.tif 000008
【０１５５】
結合パートナーの３．９Å以内の全ての残基は接触残基とみなす。抗体ＶＬ及びＶＨの残基は順に番号付けされる。
【０１５６】
抗体の中和形態
ＩＦＮＡＲ１及び／又はＩＦＮＡＲ２との複合体中のＩＦＮα／ωの結晶構造は最近報告されている（Ｔｈｏｍａｓら、Ｃｅｌｌ  １４６：６２１〜６３２、２０１１）。Ｍ４３／ＩＦＮα４の構造とＩＦＮω／ＩＦＮＡＲ１／ＩＦＮＡＲ２複合体との比較は、Ｍ４３重鎖とＩＦＮＡＲ２の明らかなオーバーラップを示している。したがって、Ｍ４３はＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮ相互作用を遮断することによって中和する。
【０１５７】
実施例６．ＩＦＮωＴ８０Ｅ又はＩＦＮα４Ａとの複合体中のＦａｂ３５７（Ｃ２５９５のＦａｂ）の結晶構造からのＣ２５９５のエピトープ
Ｃ２５９５（以下、ｍＡｂに関してはＣ２５９５、Ｆａｂに関してはＦａｂ３５７）は、複数のヒトＩＦＮ−α分子及びマウスハイブリドーマから得たＩＦＮωを中和する抗体である。Ｖ領域をクローンし、ヒト重鎖及び軽鎖（ＩｇＧ１κアイソタイプ）にキメラ化して、組換えＦａｂ３５７を生成した。ＩＦＮ−ω／Ｆａｂ３５７及びＩＦＮ−α４Ａ／Ｆａｂ３５７の結晶構造を決定した。
【０１５８】
材料及び方法
タンパク質
Ｈｉｓタグ付けしたＦａｂ３５７（ＩｇＧ１／κアイソタイプ）及びＴ８０Ｅ変異ヒトＩＦＮω（以下、ＩＦＮωＴ８０Ｅ。ＩＦＮωと、Ｔ８０Ｅを有するＩＦＮωとは、本実施例では同義）をＨＥＫ２９３Ｆ細胞において発現させ、アフィニティ及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。タンパク質は、２０ｍＭトリス（ｐＨ  ７．４）、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおける量である。）。ＩＦＮα４Ａは、２０ｍＭトリス（ｐＨ  ７．４）、５０ｍＭ  ＮａＣｌにおいて、Ｃｒｏｗｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．から入手した。
【０１５９】
ＩＦＮ−α４Ａ／Ｆａｂ３５７複合体及びＩＦＮ−ω／Ｆａｂ３５７複合体の結晶化
ＩＦＮα４Ａ／Ｆａｂ３５７複合体は、１．０５：１．０のモル比でＩＦＮα４ＡとＦａｂ３５７とを混合することによって調製し、０．１Ｍ  ＮａＣＬを用いて、２０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ  ６．５）にて、ＳｕｐｅｒＤｅｘ  ２００カラムで精製した。精製した複合体を５．５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。回折に適した結晶は、タンパク質溶液及び２０％  ＰＥＧ  ３３５０及び播種した０．２Ｍのクエン酸アンモニウムの等量の混合物を含むシッティングドロップ中で増殖した。
【０１６０】
ＩＦＮω／Ｆａｂ３５７複合体は、１．１７：１．０（過剰のＩＦＮω）のモル比で、４℃で２時間インキュベートしたＩＦＮωとＦａｂ３５７とを混合することによって調製し、このＩＦＮω／Ｆａｂ３５７複合体を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．５）、０．１Ｍ  ＮａＣＬで平衡したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製し、６．８ｍｇ／ｍＬに濃縮した。Ｘ回折に適した結晶は、タンパク質複合体と、播種した１００ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ  ６．５）、１８％  ＰＥＧ  ３Ｋ、０．２Ｍ  ＬｉＣｌとの混合物を含むシッティングドロップから得た。
【０１６１】
Ｘ線データ収集及び構造決定
Ｘ線データ収集については、ＩＦＮ−α４Ａ／Ｆａｂ３５７及びＩＦＮω／Ｆａｂ３５７の結晶を、２０％グリセロールを補充した合成母液（それぞれに対応して、２０％  ＰＥＧ  ３３５０、０．２Ｍクエン酸アンモニウム、プレート１０／２０／１１−ＭＭＳ−Ａ１０；及び０．１ＭＥＳ（ｐＨ  ６．５）、１８％  ＰＥＧ  ３３５０、０．２Ｍ  ＬｉＣＬ、プレート１２／２１／２０１１−Ｂ１１（Ｒ））中に数秒間浸漬し、液体窒素でフラッシュ凍結した。Ｘ線回折データは、それぞれ、Ａｄｖａｎｃｅ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂ及びＳｗｉｓｓ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅで収集した。Ｘ線データはＸＤＳプログラムにより処理した。Ｘ線データ統計を表８に示す。
【０１６２】
構造は、Ｐｈａｓｅｒを用いた分子置換（ＭＲ）で解析した。ＭＲの検索モデルは、Ｆａｂ１５（ＰＤＢ  ＩＤ  ３ＮＣＪ）、及びＭ４３との複合体としてのＩＦＮωの結晶構造であった。ＰＨＥＮＩＸ5を用いてそれらの構造を精密化し、ＣＯＯＴを用いてモデルの調整を実行した。他の全ての結晶学的計算は、ＣＣＰ４の一連のプログラムを用いて行った。分子グラフィックはＰｙＭｏｌを用いて生成した。構造精密化統計を表８に提供する。
【０１６３】
【表８】
0006466904.tif 000009
a  Ｒmerge＝Σ｜Ｉ−＜Ｉ＞｜／ΣＩ、式中、Ｉは測定された反射の強度であり、＜Ｉ＞はこの反射の全ての測定値の平均強度である。
b  Ｒcryst＝Σ｜｜Ｆobs｜−｜Ｆcalc｜｜／Σ｜Ｆobs｜、式中、Ｆobs及びＦcalcは、観察され、算出された構造因子、Ｒfreeは精密化の前にランダムに選択された反射の５％のセットについて算出される。
【０１６４】
ラマチャンドランプロットはＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙを用いて算出した。
【０１６５】
結果
全体構造
両方の結晶構造中に、非対称単位に１つの抗原／抗体複合体が存在している。代表的な分子構造の全体を図５に示す。Ｆａｂ分子は両方の結晶において非常に類似している。ＩＦＮα４Ａの立体配座はＩＦＮα４Ａ／ＦａｂＭ８８のそれと非常に類似している。ＩＦＮω／Ｆａｂ３５７の構造については、ＩＦＮωのモデルは残基Ｒ２２〜Ｐ３９及びＬ１１８〜Ｌ１５４のみを含む。ＩＦＮωの不足している残基は、結晶パッキングがそれらの存在を排除するため、結晶の無秩序の結果ではない。明らかに、ＩＦＮωのタンパク質分解切断は、結晶化中に発生した。コールドボックス内でシッティングしている同じ複合体のその部分がいくらかのプロテアーゼ分解を受けていた証拠があるが、そのパターンは、結晶中で確認されたものと同一ではなかった（データは示されていない）。にもかかわらず、ＩＦＮωの結合領域はよく秩序だっている。
【０１６６】
エピトープ、パラトープ、及びＡｂ／Ａｇの相互作用
Ｃ２５９５は、ＩＦＮα４ＡとＩＦＮωの両方で、（Ｒ／Ｇ２２とＲ／Ｈ３４の間の）ＡＢループの残基及び残基Ｖ１４３、Ｍ／Ａ１４６、Ｅ１４７並びにヘリックスＥのＲ／Ｋ１５０を含んで成るほぼ同一の立体配座エピトープを認識する（表９）。パラトープは、６つのＣＤＲのうちの４つ（ＣＤＲ−Ｌ１、Ｌ３、Ｈ２、及びＨ３）からの残基を含んで成る。パラトープ残基は主に疎水性であり、一連のポケットを形成し、そこに、短いＡＢへリックスの残基Ｆ２７、Ｌ３０、Ｋ３１及びＲ３３の側鎖がドッキングする。抗体と抗原の相互作用は、ほとんどがｖｄｗ及び疎水性パッキングのように思われる。抗体と抗原の間には少数のＨ結合しかなく、それらのほとんどにバックボーン−バックボーン又は側鎖−バックボーンの相互作用が関与している。Ａｂ／Ａｇ相互作用の大部分は、ＡＢへリックスのいくつかの残基Ｆ２７、Ｌ３０、Ｋ３１及びＲ３３によるものである。したがって、ＩＦＮωのこの領域がエピトープの主な部分を構成しているように見える。
【０１６７】
【表９】
0006466904.tif 000010
【０１６８】
結合パートナーの３．９Å以内の全ての残基は接触残基とみなす。抗体ＶＬ及びＶＨの残基は順に番号付けされる。
【０１６９】
抗体の中和形態
Ｃ２５９５はＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮ相互作用を遮断することによって中和する。
【０１７０】
実施例７．ＩＦＮα４Ａとの複合体における抗−ＩＦＮα抗体Ｍ８８の結晶構造由来のＭ８８のエピトープ
ＩＦＮα４Ａとの複合体における抗−ＩＦＮ抗体Ｍ８８の結晶構造は２．５Åに対して決定した。主エピトープはＩＦＮのＡＢループのヘリカル要素Ａ１９〜Ｄ３５である。Ｍ８８の結合はＩＦＮＡＲ２の相互作用を防ぐであろう。したがって、Ｍ８８はＩＦＮＡＲ２ブロッカーである。その構造はＭ８８の結合の交差反応性を明らかにする。
【０１７１】
ＩＦＷＭ８８（以下、ｍＡｂ及びＦａｂに関してそれぞれＭ８８及びＦａｂＭ８８）は、ヒトＩＦＮαを中和する抗体である。Ｍ８８  ｍＡｂは、ＩＦＮαの多くのサブタイプとの結合を示すが、ヒトＩＦＮωとの結合はほとんど示さない。
【０１７２】
材料及び方法
タンパク質
Ｈｉｓタグ付けしたＦａｂＭ８８（ＩｇＧ１／カッパアイソタイプ）をクローンし、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞において発現し、アフィニティ及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。Ｆａｂは、２０ｍＭのトリス（ｐＨ  ７．４）、５０ｍＭのＮａＣｌに受け取られた。ＩＦＮα４ａは、（２０ｍＭのトリス（ｐＨ  ７．４）、５０ｍＭのＮａＣｌにおいて）Ｃｒｏｗｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．から入手した。
【０１７３】
ＩＦＮα４Ａ／ＦａｂＭ８８複合体の結晶化
この複合体は、ＩＦＮα４ＡとＦａｂＭ８８とを、１．０５：１．０（過剰のＩＦＮα４Ａ）のモル比で混合し、４℃で１時間インキュベートし、２０ｍＭのトリス（ｐＨ  ８．０）、１０％グリセロール、０．１ＭのＮａＣｌで２０倍希釈してから、Ａｍｉｃｏｎ−Ｕｌｔｒａ  １０ｋＤａカットオフを用いて９．２５ｍｇ／ｍＬに濃縮することによって調製した。最初の結晶化は、ＩＨ１、ＩＨ２及びＰＥＧスイート（Ｑｉａｇｅｎ）で設定した。複合体の結晶化は、Ｏｒｙｘ４ロボット（Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、２０℃で蒸気拡散法により行った。ＩＨ２＃Ｅ１２〜２５％  ＰＥＧ  ３Ｋ、０．２Ｍのクエン酸アンモニウムから結晶が現れた。これらの最初の結晶を用いて、結晶化シードを調製した。結晶の質を改善するために、ＩＦＮα４Ａ／ＦａｂＭ８８複合体を、２０ｍｍのＭＥＳ（ｐＨ  ６．５）、０．１ＭのＮａＣｌ、１０％グリセロールで平衡したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製し、８．１６ｍｇ／ｍＬに濃縮した。Ｘ回折に適した結晶は、記載されているように（Ｏｂｍｏｌｏｖａら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ６６：９２７〜９３５、２０１０）ＭＭＳ播種した２８％のＰＥＧ  ３Ｋ、０．２Ｍのクエン酸アンモニウムから得た。
【０１７４】
Ｘ線データ収集及び構造決定
Ｘ線データ収集のために、１つの結晶を数秒間、２０％グリコールを補充した母液に浸し、９５Ｋで窒素のストリームにおいてフラッシュ凍結した。Ｘ線回折データは、Ｏｓｍｉｃ（商標）ＶａｒｉＭａｘ（商標）共焦点光学系、Ｓａｔｕｒｎ  ９４４  ＣＣＤ検出器、及びＸ−ｓｔｒｅａｍ（商標）２０００極低温冷却システム（Ｒｉｇａｋｕ、テキサス州）を備えたＲＩｇＡｋｕ  ＭｉｃｒｏＭａｘ（商標）−００７ＨＦマイクロフォーカスＸ線ジェネレータを用いて収集した。回折強度は半分度画像で２３５度の結晶回転にわたって検出された。Ｘ線データをＸＤＳプログラムにより処理した。Ｘ線データ統計を表１０に示す。
【０１７５】
構造は、Ｐｈａｓｅｒを用いた分子置換（ＭＲ）で解析した。ＭＲの検索モデルは、Ｆａｂ１５（ＰＤＢ  ＩＤ  ３ＮＣＪ）及びＩＦＮα２（ＰＤＢ  ＩＤ  １ＲＨ２（このＣαモデルはＰＤＢにおいて入手可能であった）の結晶構造であった。ＭＲに使用するために、Ｃα座標及びＰＤＢでの反射データを用いてＰｈａｓｅｒを使用してＭＲによってＩＦＮα２の完全な分子モデルを取得し、ＰＨＥＮＩＸで精密化した。ＰＨＥＮＩＸを用いてＩＦＮα４Ａ／ＦａｂＭ８８の構造を精密化し、ＣＯＯＴを用いてモデルの調整を実行した。他の全ての結晶学的計算は、ＣＣＰ４のプログラムスイートを用いて行った。可変ドメインと定常ドメインとの間のエルボー角度は、ＲＢＯＷプログラムを用いて計算した。全ての分子グラフィックはＰｙＭｏｌを用いて生成した。構造精密化統計を表１０に提供する。
【０１７６】
【表１０】
0006466904.tif 000011
a  高分解能シェル値はカッコ内に示す。
b  完成度が低いのは、高分解能シェルは検出器の角にのみ反射を包含するため。
【０１７７】
結果
全体構造
ＩＦＮα４Ａ／ＦａｂＭ８８複合体の全体的な分子構造を図６に示す。非対称単位にこれらの複合体は２つ存在する。２つの独立したＩＦＮα４Ａ分子の分子モデルは、一方に残基７〜１０２及び１１３〜１６０を、もう一方に１２〜１０２及び１１３〜１６０を含む。両方の分子中の残基１０３と１１２との間の接続ループは無秩序である。２つのＦａｂ分子は軽鎖に関しては１〜２１２の残基、重鎖に関しては１〜２２１の残基を含む。Ｃ末端６ｘＨｉｓタグ及び鎖間ジスルフィド結合は無秩序である。
【０１７８】
２つのＩＦＮα４Ａ分子は、１２２のＣα原子に対して０．１３２Åの平均ＲＭＳＤを有する本質的に同一の立体配座を有する。それら２つのＦａｂ分子は、Ｆａｂ全体に対して０．５Å未満の平均ＲＭＳＤを有する同一の構造もまた有する。興味深いことに、それら２つのＦａｂはＲＢＯＷに従ってほぼ同一のエルボー角度（１７２度及び１７４度）を有する。
【０１７９】
ＩＦＮαの構造
ＩＦＮα４Ａ（図７Ａ）の分子構造は、０．５〜０．７Åの平均Ｃα  ｒｍｓｄを有するＩＦＮα２と非常に類似している。それはまた、ＩＦＮω（図７Ｂ、１１２の残基に関して０．６１ÅのＣα  ｒｍｓｄ）及びＩＦＮβ（図７Ｃ、９４の残基に関して０．８５ÅのＣα  ｒｍｓｄ）とも非常に類似している。ＩＦＮβのＡＢループにより短い残基が１つあるために、ＩＦＮα／ωとＩＦＮβの間にはいくつかの有意な違いがある。
【０１８０】
エピトープ、パラトープ、及びＡｂ／Ａｇの相互作用
Ｍ８８は、ＡＢループ（Ａ１９とＤ３５の間）の残基及びへリックスＥの残基Ｖ１４３、Ａ１４６、Ｅ１４７及びＲ１５０で構成された立体配座エピトープを認識する（表１１）。パラトープは６つの全てのＣＤＲからの残基で構成されている。パラトープ残基は主に疎水性であり、一連のポケットを形成し、そこに、短いＡＢへリックスの残基Ｆ２７、Ｌ３０、Ｋ３１及びＲ３３の側鎖がドッキングする。抗体と抗原の相互作用は、ほとんどがｖｄｗ及び疎水性パッキングのように思われる。抗体と抗原の間には少数のＨ結合しかなく、それらのほとんどにバックボーン−バックボーン又は側鎖−バックボーンの相互作用が関与している。Ａｂ／Ａｇ相互作用の大部分は、ＡＢへリックスのいくつかの残基Ｆ２７、Ｌ３０、Ｋ３１及びＲ３３によるものである。したがって、ＩＦＮα４Ａのこの領域がエピトープの主な部分を構成している。ＶＬのＦ５０は、構造の抗原と直接接していない。しかしながら、その側鎖は、結合に関与するＹ３２（ＶＬ）及びＰ１０５（ＶＨ）の近くにある。この残基はおそらく、結合を有利にするために、ＣＤＲ−Ｈ３の局所構造をそれが支持することから選択された。
【０１８１】
【表１１】
0006466904.tif 000012
【０１８２】
結合パートナーの３．９Å以内の全ての残基は接触残基とみなす。抗体ＶＬ及びＶＨの残基は順に番号付けされる。ＬＨＩ及びＡＢＪは２つの複合体を代表する。
【０１８３】
交差反応性及び親和性の改善のための、構造に基づくライブラリの設計
Ｍ８８はＩＦＮαサブタイプの多くと強く結合するが、ＩＦＮωとの結合は弱い。現在の複合体の構造及びＩＦＮωの構造を用いた分子モデリングに基づく、２つの戦略が可能である。１つの戦略は、ＩＦＮα４Ａ／Ｍ８８構造内の現在の接触の全てを維持する一方で追加のＡｂ／Ａｇ相互作用を生成することによりＣＤＲ−Ｌ１（ｅｘｔＬ１ライブラリ）を延長することである。構造及び配列の比較は、全てのＩＦＮαサブタイプで５つの残基表面パッチ（Ｄ３２、Ｈ３４、Ｄ３５、Ｙ１３０及びＫ１３４）が１００％保存されたことを示している（表１２）。
【０１８４】
【表１２】
0006466904.tif 000013
【０１８５】
これらの５つの残基のうちＩＦＮωにおけるＨ３４の代わりにＲ３４を除く４つの残基もまた保存された。ＣＤＲ−Ｌ１は、この良好に保存された表面パッチから離れている。したがって、より長いＣＤＲ−Ｌ１、例えば３−１−１正準構造に追加の６つの残基を有する生殖細胞系列ＩＧＫＶ４−１（Ｂ３）のものなどは、このパッチと接触するために十分に長くなるであろうと仮定される。より長いＣＤＲ−Ｌ１は全てのＩＦＮαサブタイプ及びＩＦＮωに追加の相互作用をもたらし、それにより、親和性及び特異性広域化の両方を改善するであろう。延長されたＣＤＲ−Ｌ１の配列は、ライブラリからのファージディスプレイによって最適化することができる。ファージディスプレイライブラリの設計は表１３に示されている。その抗原と反対側を向いているｅｘｔＬ１の位置はランダム化されていない。ＶＬのＦ５０位のみが、非ヒト生殖細胞系列の残基である。構造上、それはＣＤＲ−Ｌ３に支持を提供するように見える。したがって、それによる延長ＣＤＲ−Ｌ１の支持を最適化するために、この位置もまたランダム化される。
【０１８６】
【表１３】
0006466904.tif 000014
Ｘは任意のアミノ酸
【０１８７】
抗体の中和形態
ＩＦＮＡＲ１及び／又はＩＦＮＡＲ２との複合体中のＩＦＮα／ωの結晶構造は最近報告されている（Ｔｈｏｍａｓら、Ｃｅｌｌ  １４６：６２１〜６３２、２０１１）。図８は、ＩＦＮω／ＩＦＮＡＲ１／ＩＦＮΑ２複合体の上にＭ８８／ＩＦＮα４を重ねたものである。ＨＣとＩＦＮＡＲ２が重なり合うことは明らかである。したがって、Ｍ８８はＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮ相互作用を遮断することによって中和する。
【０１８８】
実施例８．ＩＦＮα及びＩＦＮωの最小限のエピトープは広域のＩＦＮα／ＩＦＮω中和活性を提供する
ＩＦＮωＴ８０Ｅ／ＦａｂＭ４３、ＩＦＮα４Ａ／ＦａｂＭ８８、ＩＦＮα４Ａ／Ｆａｂ３５７（Ｃ２５９５）及びＩＦＮω／Ｆａｂ３５７の結晶構造は、ＩＦＮω及び複数のＩＦＮαサブタイプの広域中和に必要とされる最小限の共通エピトープを画定する（表１４）。４つの結晶構造の抗体／抗原相互作用の解析は、ＩＦＮα４ａ（配列番号１９）及びＩＦＮω（配列番号１）のＡＢループの３つの残基、Ｆ２７、Ｌ３０、及びＲ３３がそれらの抗体と広範な接触を形成することを示している。これらの残基が抗体の結合に主に寄与する可能性が高い。したがって、Ｆ２７、Ｌ３０、及びＲ３３は、ＩＦＮω／ＩＦＮαの交差中和エピトープの主要な要素である。
【０１８９】
立体配座エピトープは、ＡＢループ（配列番号１のＩＦＮω及び配列番号１９のＩＦＮα４ａの残基２２〜３４）からの、短いヘリカル部分（２７〜２９）を有する残基と、ヘリカルＥの残基（１３４〜１５４はＩＦＮω及びＩＦＮα２を除く全てのＩＦＮαサブタイプ（すなわち１３３〜１５３）のヘリカルＥの同じ残基である）とで構成されている。具体的には、配列番号１のＩＦＮωの位置Ｐ２６、Ｆ２７、Ｌ３０、Ｋ３１、Ｒ３３及びＨ３４、並びに配列番号１９のＩＦＮα４ａの残基Ｈ２６、Ｆ２７、Ｌ３０、Ｋ３１、Ｒ３３及びＨ３４が、中和抗体によって認識される。これらの残基は、多様なＩＦＮαサブタイプ及びＩＦＮω間で主に保存され、したがって、これらの抗体の交差反応性及び示差特異性を担うものであるが、異なるソースに由来する。追加的なエピトープ残基は、ＩＦＮωのＲ２２、Ｒ２３、Ｉ２４、Ｓ２５、Ｄ３２、Ｄ３５、Ｍ１４９、Ｋ１５０、又はＬ１５４及びＩＦＮα４ａの残基Ａ１９、Ｇ２２、Ｒ２３、Ｉ２４、Ｓ２５、Ｈ２６、Ｆ２７、Ｃ２９、Ｌ３０、Ｋ３１、Ｄ３２、Ｒ３３、Ｈ３４、Ｄ３５、Ｖ１４３、Ａ１４６、Ｅ１４７、Ｍ１４９、Ｒ１５０、又はＳ１５３である。
【０１９０】
【表１４】
0006466904.tif 000015
【図１】
0006466904.tif 000016
【図２】
0006466904.tif 000017
【図３】
0006466904.tif 000018
【図４】
0006466904.tif 000019
【図５】
0006466904.tif 000020
【図６】
0006466904.tif 000021
【図７】
0006466904.tif 000022
【図８】
0006466904.tif 000023
【配列表】
0006466904000001.app