(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんを阻害するための医薬組成物であって、
（ａ）配列番号２、配列番号１２、配列番号２０及びその組み合わせからなる群から選択される、それぞれがゾウｐ５３タンパク質をコードする１つ以上の核酸、又は
（ｂ）配列番号３、配列場号１３、配列番号２１及びその組み合わせからなる群から選択される、１つ以上のゾウｐ５３タンパク質
を含む医薬組成物であって、前記核酸又は前記タンパク質は、がん細胞内に導入され、前記がん細胞のＤＮＡは、前記核酸若しくは前記タンパク質を導入する前、又は、前記核酸若しくは前記タンパク質を導入した後に損傷される、医薬組成物。
【請求項２】
それぞれがゾウｐ５３タンパク質をコードする１つ以上の核酸を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ゾウｐ５３タンパク質をコードする核酸が、レトロ遺伝子である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ゾウｐ５３タンパク質をコードする核酸が、祖先遺伝子である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
それぞれがゾウｐ５３タンパク質をコードする複数の核酸を含む、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
複数の核酸が、複数の異なるレトロ遺伝子を含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
複数の核酸のうちの少なくとも１つが、祖先遺伝子を含む、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
１つ以上の核酸が、ＲＮＡ又はＤＮＡを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
１つ以上のゾウｐ５３タンパク質を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
１つのゾウｐ５３タンパク質を含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ゾウｐ５３タンパク質が、レトロ遺伝子によりコードされる、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ゾウｐ５３タンパク質が、祖先遺伝子によりコードされる、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
複数の異なるゾウｐ５３タンパク質を含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
複数の異なるゾウｐ５３タンパク質が、複数の異なるレトロ遺伝子によりコードされる、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
複数の異なるゾウｐ５３タンパク質のうちの少なくとも１つが、祖先ｐ５３タンパク質である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
１つ以上の核酸又は１つ以上のゾウｐ５３タンパク質が、医薬として許容される担体を含む組成物の形態にある、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
リポソームを含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
１つ以上の核酸又は１つ以上のｐ５３タンパク質が、リポソーム内にカプセル化されている、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
組成物が、ナノ粒子を含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
ナノ粒子が、リポソーム内にカプセル化されたゾウｐ５３タンパク質又はゾウＴＰ５３核酸を含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
ナノ粒子が、細網内皮系との相互作用を低減する部分で装飾された外部表面を含む、請求項１９又は２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記部分が、ポリエチレングリコールを含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記部分が、標的部分を含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
標的部分が、がん細胞に対するナノ粒子の親和性を増加させる、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
小分子化学療法薬、モノクロナール抗体及びイメージング剤からなる群から選択される１つ以上の添加剤をさらに含む、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
イメージング剤が、造影剤、糖、鉄錯体又はガドリニウム（Ｇｄ）を含む、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
がん細胞が、インビトロ又はインビボにある、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
がん細胞が、哺乳動物に由来する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
哺乳動物が、ヒトである、請求項２８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２０１５年１０月８日の米国仮特許出願の第６２／２３９，１０３号、及び２０１６年８月２４日出願の米国仮特許出願第６２／３７９，１７９号の優先権を主張し、そのすべての内容を、完全に参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
電子的に提出された資料の参照による組み込み
本明細書と同時に提出され、２０１６年１０月６日に作成された、１８４，７７４バイトＡＳＣＩＩ（テキスト）のファイルネーム「０２６３８９−９１７３＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」として識別される、コンピューター読み取り可能ヌクレオチド／アミノ酸配列表を、参照により本明細書にその全体を組み込む。
【背景技術】
【０００３】
多細胞生物は、突然変異及びがんの発症に対して保護するための内因性の防御法を有する。そのような防御機構の１つとして、がんの重要なサプレッサーである腫瘍タンパク質ｐ５３（遺伝子ＴＰ５３によりコードされる）により制御されるシグナリング経路が挙げられる。ｐ５３は「ゲノムの守護者」と呼ばれ、ＤＮＡ損傷が検出されたときに細胞分裂を停止させ、突然変異の修復を開始するか、又は損傷が回復不能な場合にはアポトーシスを引き起こすことができる（Ｂｌａｇｏｓｋｌｏｎｎｙ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、９８巻：１６１−１６６頁（２００２年））。ヒトは、１コピーのＴＰ５３（２つの対立遺伝子）を含み、この機能性対立遺伝子の両方が、がん発症を防止するのに重要である。機能的対立遺伝子の１つでも存在しないと、患者がその生涯においてがんを発症する確率が９０％に及ぶがん素質である、リー・フラウメニ症候群（ＬＦＳ）を引き起こす（ＭｃＢｒｉｄｅら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ；１１巻（５号）：２６０−２７１頁（２０１４年））。ｐ５３の不活性化もがんを引き起こす可能性があり（Ｌａｎｅ、ＤＰ．、Ｎａｔｕｒｅ；３５８巻（６３８１号）：１５−１６頁（２０１４年）；Ｈａｎａｈａｎら、Ｃｅｌｌ；１４４巻（５号）：６４６−６７４頁（２０１１年））、またヒトではｐ５３機能は年齢と共に自然退化し（Ｆｅｎｇら、ＰＮＡＳ；１０４巻（４２号）：１６６３３−１６６３８頁（２００７年））、全男性の１／２、及び全女性の１／３が、その生涯においてがんを発症しやすくなる（米国癌学会；Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ＆  Ｆｉｇｕｒｅｓ（２０１５年））。ｐ５３の突然変異が、非常に多くのヒトのがんにおいて同定されている（Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ；２５３巻（５０１５号）：４９−５３（１９９１年））。
【０００４】
研究者らは、当然ながら、ｐ５３の保護特性を利用することにより、がんを根絶することに注力した。例えば、レトロウイルス及びアデノウイルス媒介型のＴＰ５３遺伝子療法が、ヒトｐ５３をがん細胞に送達するために開発されており（Ｃａｉら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ：４巻：６１７−６２４頁（１９９３年）；Ｂｒａｎｄｔら、Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ；９０巻：４８４−５００頁（１９６９年））、また、マウス二重微小染色体２（ＭＤＭ２）によるｐ５３の負の調節を破壊することにより、ｐ５３の蓄積が誘発可能である（Ｖａｓｓｉｌｅｖら、Ｓｃｉｅｎｃｅ；３ｉ０３巻：８４４−８４８頁（２００４年））。しかしこれらの療法は、主に、ヒトにおける野生型ｐ５３の活性を復元させること、又は突然変異体ｐ５３を含むがん細胞を除去することに重点が置かれていた。
【０００５】
細胞分裂する毎に、新たな遺伝子突然変異が導入されるおそれがあることを前提とすれば、より大きな生物（当然ながら、より多数の細胞分裂を必要とする）では、突然変異した細胞の数が増加するであろうことは、当初より疑われていた（Ｔｏｍａｓｅｔｔｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ；３４７巻（６２１７号）：７８−８１頁（２０１５年））。すべての哺乳動物細胞が、発癌性の突然変異を同程度に起こしやすいとすれば、がんのリスクは、身体サイズ（細胞の数）、及び種の寿命（細胞分裂の数）と共に増加するはずである。しかし、身体サイズが大型化しても、また寿命が延びても、動物全体を通じてがん罹病率は増加しないと考えられるので、この理論は３５年ほど前には反証された（Ｃａｕｌｉｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｃｏｌ  Ｅｖｏｌｕｔ；２６巻（４号）：１７５−１８２頁（２０１１年）；Ｐｅｔｏら、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ；３２巻（４号）：４１１−４２６頁（１９７５年））。より大型の動物におけるこのようながんに対する耐性の細胞機構及び分子的機構は、明確に理解されていないが、しかし最近の研究は、ゾウはがん発症に対して特に耐性があることを示した（Ａｂｅｇｇｌｅｎら、ＪＡＭＡ；３１４巻（１７号）：１８５０−６０頁（２０１５年））。また、ゾウは余分なコピー数のＴＰ５３遺伝子を担持することも発見された。フォローアップ試験は、ゾウのｐ５３（ＥＰ５３）が、がん細胞がヒトｐ５３をすでに含む場合であっても、がん細胞の殺傷に特に有効であることを示した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｌａｇｏｓｋｌｏｎｎｙ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｓｅｒ、９８巻：１６１−１６６頁（２００２年）
【非特許文献２】ＭｃＢｒｉｄｅら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ；１１巻（５号）：２６０−２７１頁（２０１４年）
【非特許文献３】Ｌａｎｅ、ＤＰ．、Ｎａｔｕｒｅ；３５８巻（６３８１号）：１５−１６頁（２０１４年）
【非特許文献４】Ｈａｎａｈａｎら、Ｃｅｌｌ；１４４巻（５号）：６４６−６７４頁（２０１１年）
【非特許文献５】Ｆｅｎｇら、ＰＮＡＳ；１０４巻（４２号）：１６６３３−１６６３８頁（２００７年）
【非特許文献６】米国癌学会；Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ＆  Ｆｉｇｕｒｅｓ（２０１５年）
【非特許文献７】Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ；２５３巻（５０１５号）：４９−５３（１９９１年）
【非特許文献８】Ｃａｉら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ：４巻：６１７−６２４頁（１９９３年）
【非特許文献９】Ｂｒａｎｄｔら、Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ；９０巻：４８４−５００頁（１９６９年）
【非特許文献１０】Ｖａｓｓｉｌｅｖら、Ｓｃｉｅｎｃｅ；３ｉ０３巻：８４４−８４８頁（２００４年）
【非特許文献１１】Ｔｏｍａｓｅｔｔｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ；３４７巻（６２１７号）：７８−８１頁（２０１５年）
【非特許文献１２】Ｃａｕｌｉｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｃｏｌ  Ｅｖｏｌｕｔ；２６巻（４号）：１７５−１８２頁（２０１１年）
【非特許文献１３】Ｐｅｔｏら、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ；３２巻（４号）：４１１−４２６頁（１９７５年）
【非特許文献１４】Ａｂｅｇｇｌｅｎら、ＪＡＭＡ；３１４巻（１７号）：１８５０−６０頁（２０１５年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
がん性細胞に対するｐ５３機能をより有効に復元する組成物及び方法に対する必要性が、存続する。本発明は、そのような組成物及び方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本開示は、がん細胞を、（ａ）それぞれがゾウｐ５３タンパク質をコードする１つ以上の核酸配列又は（ｂ）１つ以上のゾウｐ５３タンパク質と接触させることを含み、これによりがんが阻害される、がんを阻害する方法を提供する。
【０００９】
本開示は、医薬として許容される担体及び（ａ）それぞれがゾウｐ５３タンパク質をコードする１つ以上の核酸配列又は（ｂ）１つ以上のゾウｐ５３タンパク質を含む組成物も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】３３種類の異なる哺乳動物種のｌｏｇ（質量×寿命）を、それぞれの種において剖検を実施したときに腫瘍を示した割合（％）に対してプロットした図である。
【図２】アフリカゾウにおけるＡ群及びＢ群ＴＰ５３レトロ遺伝子を示す系統樹を示す図である。
【図３】図３Ａは、アフリカゾウ及びアジアゾウに由来するＰＢＭＣ及びアフリカゾウ線維芽細胞で実施したＴＰ５３特異的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す電気泳動ゲルの画像を示す図である。Ａ群及びＢ群のゾウｐ５３レトロ遺伝子に対応する２０１ｂｐ及び１８５ｂｐの２つのバンドを示す。図３Ｂは、図３Ａに示すＰＣＲ結果の、より高解像度の画像を示す図である。
【図４】図４Ａは、ＥＰ５３レトロ遺伝子でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞が、ＭＧ１３２又はドキソルビシンにより誘発されたＤＮＡ損傷に応答して、タンパク質の発現を増加させることを表わすウェスタンブロット画像の図である。図４Ｂは、ＥＰ５３レトロ遺伝子でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞が、ＭＧ１３２又はドキソルビシンにより誘発されたＤＮＡ損傷に応答して、タンパク質の発現を増加させることを表わすウェスタンブロット画像の図である。図４Ｃは、ＥＰ５３ｒ９でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞が、電離照射に起因するＤＮＡ損傷に応答して、このタンパク質を上方制御し、リン酸化したタンパク質の発現を増加させることができることを表わすウェスタンブロット画像の図である。
【図５Ａ】２Ｇｙ及び６Ｇｙの電離照射に応答して遅発性アポトーシス（ｌａｔｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）が生じたゾウ末梢血リンパ球の割合（％）を、ヒト末梢血リンパ球と比較して表わす棒グラフの図である。
【図５Ｂ】２Ｇｙ及び６Ｇｙの電離照射に応答して早期アポトーシス（ｅａｒｌｙ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）が生じたゾウ末梢血リンパ球の割合（％）を、ヒト末梢血リンパ球と比較して表す棒グラフの図である。
【図６Ａ】アフリカゾウに由来するリンパ球は、ドキソルビシンへの曝露後、より高レベルの遅発性アポトーシスを示すことを表わす棒グラフの図である。
【図６Ｂ】アフリカゾウに由来するリンパ球は、ドキソルビシンへの曝露後、より高レベルの早期アポトーシスを示すことを表わす棒グラフの図である。
【図７】リー・フラウメニ症候群の患者、健常対照者１０例、及びアフリカゾウ１頭に由来する末梢血リンパ球が、２Ｇｙ電離照射への曝露後に、遅発性アポトーシスを生じた割合（％）を表わす散布図である。
【図８】ドキソルビシンへの曝露後に、ゾウ線維芽細胞は、ヒト線維芽細胞よりも多くのカスパーゼ３／７切断を示すことを表わす折れ線グラフの図である。
【図９】２Ｇｙ及び６Ｇｙ電離照射から５時間及び２４時間後における、ｐ５３及びｐ２１タンパク質の発現の増加を表わすウェスタンブロット画像の図である。
【図１０Ａ】２Ｇｙ電離照射処理から１８時間後の、ヒト及びアジアゾウに由来するリンパ球におけるアポトーシス細胞の割合（％）を表わす棒グラフの図である。
【図１０Ｂ】２Ｇｙ電離照射から５時間後の、アジアゾウリンパ球におけるｐ２１タンパク質の発現を表わすウェスタンブロット画像の図である。
【図１０Ｃ】電離照射処理から１８時間後の、年齢群別にソートしたアジアゾウのアポトーシスリンパ球の割合（％）を表わす棒グラフの図である。
【図１１Ａ】ドキソルビシンによる処理後に、ＥＰ５３ｒ５でトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるカスパーゼ活性の増加を表わす折れ線グラフの図である。
【図１１Ｂ】ドキソルビシンによる処理後に、ＥＰ５３ｒ９でトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるカスパーゼ活性の増加を表わす折れ線グラフの図である。
【図１２Ａ】ドキソルビシンによる処理後に、ＥＰ５３ｒ６でトランスフェクトしたＵ−２ＯＳ細胞におけるカスパーゼ活性の増加を表わす折れ線グラフの図である。
【図１２Ｂ】ドキソルビシンによる処理後に、ＥＰ５３ａｎｃで誘発されたＵ−２ＯＳ細胞におけるカスパーゼ活性の増加を表わす折れ線グラフの図である。
【図１２Ｃ】ＥＰ５３ａｎｃで誘発し、ドキソルビシンで処理してＤＮＡ損傷を誘発したＵ−２ＯＳ細胞は、ｐ５３標的遺伝子、ｐ２１及びＭＤＭ２の増加を示すことを表わすウェスタンブロット画像の図である。
【図１３】ＧＦＰ標識ＥＰ５３ｒ９でトランスフェクトしたＵ−２ＯＳ細胞は、リン酸化ＥＰ５３ｒ９の増加と同時にリン酸化ヒトｐ５３の減少を示すことを表わすウェスタンブロットの図である。
【図１４Ａ】ＥＰ５３ｒ９でトランスフェクトしたＨＣＴ１１６細胞は、ドキソルビシンによる処理後に、カスパーゼ活性の増加を示すことを表わすドットプロットの図である。
【図１４Ｂ】ＥＰ５３ｒ９でトランスフェクトしたＨＣＴ１１６細胞は、ドキシサイクリンの用量増加と相関関係を有するＥＰ５３ｒ９発現の増加を示すことを表わすウェスタンブロットの図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本開示は、アフリカゾウは、がんに対してヒトよりも耐性が高いという発見に少なくともある程度基づく。がんによる死亡率は、ヒトの場合、約１１％〜２５％である一方、ゾウでは、約３％〜６％にがんが生ずる。このがんに対する耐性向上は、ゾウではｐ５３タンパク質をコードするＴＰ５３遺伝子の遺伝的コピーが増加していることにより部分的に説明され得る。ヒトは、１コピーのＴＰ５３の（２つの対立遺伝子）しか有さないが、ゾウは、少なくとも２０コピーのゾウｐ５３（ＥＰ５３）遺伝子（４０の対立遺伝子）を有する。細胞培養試験では、ゾウリンパ球は、電離照射曝露に起因するＤＮＡ損傷に応答してアポトーシスを生じさせる可能性がより高いことが判明したが、それは、ゾウｐ５３媒介型のアポトーシスが引き起こされる前のＤＮＡ損傷に対する閾値がより低いことを示唆する。ゾウｐ５３は、ＤＮＡ損傷を検出すること、及び突然変異した細胞を生物から除去することにおいて、ヒトｐ５３よりも有効であるように思われる。ゾウｐ５３の使用は、ヒトがんを標的とする機構としてこれまでに探索されてこなかった。
【００１２】
ゾウｐ５３配列
本開示は、がん細胞を、それぞれが１つのゾウｐ５３タンパク質、又は１つ以上のゾウｐ５３タンパク質をコードする１つ以上の核酸配列と接触させることを含む、がんを阻害する方法を提供する。
【００１３】
核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であってもよく、又は二本鎖配列及び一本鎖配列の両方の部分を含んでもよい。核酸は、ＤＮＡであってもよく及びデオキシリボヌクレオチドを含んでもよく、又はＲＮＡであってもよく及びリボヌクレオチドを含んでもよい。核酸は、化学合成法により、又は組換え方法により取得可能である。特定の核酸配列は、保存的に修飾されたその変異体（例えば、コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、一塩基多型（ＳＮＰ）、及び相補的配列、ならびに明示された配列を含み得る。
【００１４】
がん細胞は、任意の適する組合せでゾウｐ５３タンパク質をコードする任意の適する核酸配列と接触し得る。例えば、いくつかの実施形態では、がん細胞は、ゾウｐ５３タンパク質をコードする１つの核酸配列と接触し得る。その他の実施形態では、がん細胞は、それぞれがゾウｐ５３タンパク質をコードする複数の核酸配列と接触する。ゾウは、少なくとも２０コピーのＴＰ５３遺伝子を含むので、がん細胞は、それぞれがゾウｐ５３タンパク質をコードする２〜２５個の核酸配列（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個の核酸配列）と接触し得る。１つの実施形態では、ゾウｐ５３タンパク質をコードする１つ以上の核酸配列は、レトロ遺伝子である。本明細書で用いる場合、用語「レトロ遺伝子」とは、逆転写によりゲノムの中に再度コピーされたＤＮＡ遺伝子から転写されたＲＮＡを意味する。レトロ遺伝子は、イントロンを欠く場合がある。がん細胞は、同一のレトロ遺伝子、複数の異なるレトロ遺伝子、又はその組み合わせをそれぞれ含む、複数の核酸配列と接触してもよい。これに加えて、又はこれに代えて、ゾウｐ５３タンパク質をコードする核酸配列は、祖先遺伝子であり得る。本明細書で用いる場合、用語「祖先遺伝子」とは、遺伝子のファミリーがその由来とする共通遺伝子を意味する。祖先遺伝子は、祖先遺伝子の復活又は祖先遺伝子の修復に由来し得るが、その場合、祖先タンパク質は、系統発生的方法によって推測され、当該タンパク質をコードするＤＮＡ分子が合成される（Ｃｈａｎｇら、Ｉｎｔｅｇｒ  Ｃｏｍｐ  Ｂｉｏｌ；４３巻（４号）：５００−５０７頁（２００３年））。がん細胞は、それぞれが同一の祖先遺伝子、複数の異なる祖先遺伝子、又はその組み合わせを含む複数の核酸配列と接触し得る。その他の実施形態では、がん細胞は、１つ以上のｐ５３をコードするレトロ遺伝子と１つ以上のｐ５３をコードする祖先遺伝子との組合せと接触し得る。
【００１５】
ゾウｐ５３タンパク質をコードするレトロ遺伝子の核酸配列の例として、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、及び配列番号７６が挙げられるが、これらに限定されない。ゾウｐ５３タンパク質をコードする祖先遺伝子の核酸配列の例として配列番号２が挙げられるが、これに限定されない。
【００１６】
細胞（例えば、がん細胞）に送達する場合、１つ以上の核酸配列が、遺伝子導入ベクターに組み込まれ得る。「遺伝子導入ベクター」又は「ベクター」は、適する宿主細胞に遺伝物質（例えば、核酸配列）を運ぶ能力を有する任意の分子又は組成物であり、この宿主細胞において、コードされたタンパク質の合成が行われる。適するベクターとして、プラスミド、ウイルスベクター、リポソーム、脂質、ポリマー、無機ナノ粒子、又は任意の上記組み合わせを含むキメラベクター（例えばプラスミド−脂質複合体又はプラスミド−ポリマー複合体）が挙げられるが、これらに限定されない。適するウイルスベクターとして、例えばレトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に基づくベクター、パルボウイルスに基づくベクター、センダイウイルス（ＳｅＶ）に基づくベクター、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）に基づくベクター、ＡＡＶ−アデノウイルスのキメラベクター、及びアデノウイルスに基づくベクターが挙げられ、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第４版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０１２年）、及びＡｕｓｕｂｅｌらの、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（２０１６年）に記載されている標準的組換えＤＮＡ技術を使用して調製され得る。適するポリマー、脂質、及び無機ナノ粒子は、例えばＰｅｅｒらの、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２巻：７５１−７６０頁（２００７年）、及びＢｏｕｓｓｉｆらの、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、９２巻：７２９７−７３０１頁（１９９５年））に記載されている。
【００１７】
その他の実施形態では、がん細胞は、１つ以上のゾウｐ５３タンパク質と接触し得る。がん細胞は、任意の適する組み合わせで、任意の適するゾウｐ５３タンパク質と接触し得る。上記で議論したように、ゾウは、少なくとも２０コピーのＴＰ５３遺伝子を含むので、がん細胞は、２〜２５個のｐ５３タンパク質（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個のタンパク質）と接触し得る。１つ以上のゾウｐ５３タンパク質は、本明細書に記載するレトロ遺伝子のような１つ以上のレトロ遺伝子によりコードされ得る。例えば、がん細胞は、それぞれが同一のレトロ遺伝子、複数の異なるレトロ遺伝子、又はその組み合わせによりコードされる複数のタンパク質と接触し得る。これに加えて又はこれに代えて、１つ以上のゾウｐ５３タンパク質は、本明細書に記載する祖先遺伝子のような祖先遺伝子によりコードされ得る。がん細胞は、それぞれが同一の祖先遺伝子、複数の異なる祖先遺伝子、又はその組み合わせによりコードされる複数のｐ５３タンパク質と接触し得る。その他の実施形態では、がん細胞は、１つ以上のレトロ遺伝子によりコードされたｐ５３タンパク質と１つ以上の祖先遺伝子によりコードされたｐ５３タンパク質との組合せと接触し得る。
【００１８】
レトロ遺伝子によりコードされたゾウｐ５３のアミノ酸配列の例として、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、及び配列番号７７が挙げられるが、これらに限定されない。祖先遺伝子によりコードされるゾウｐ５３のアミノ酸配列の例として配列番号３が挙げられるが、これに限定されない。
【００１９】
組成物
特定の実施形態では、１つ以上のゾウｐ５３タンパク質をコードする１つ以上のゾウＴＰ５３核酸配列は、組成物の形態にある。したがって、本開示は、医薬として許容される担体、及び（ａ）それぞれがゾウｐ５３タンパク質をコードする１つ以上の核酸配列、又は（ｂ）１つ以上のゾウｐ５３タンパク質を含む組成物も提供する。任意の適する医薬として許容される担体は、本開示の文脈において利用可能であり、またそのような担体は、当技術分野において周知されている。担体の選択は、組成物が投与される特定の部位、及び組成物の投与に使用される特定の方法により、一部決定される。組成物のための代表的な処方物として、経口処方物、注入用処方物、及びエアゾール処方物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
経口投与に適する処方物として、（ａ）水、生理食塩水、又は飲料のような希釈剤に溶解した、有効量の１つ以上の核酸配列又はタンパク質のような液体溶液、（ｂ）それぞれが、事前に決定された量の１つ以上の核酸配列又はタンパク質を、固体又は顆粒として含有するカプセル、サシェ剤、又は錠剤、（ｃ）適する液体中の懸濁物、及び（ｄ）好適なエマルジョンが該当し得る。錠剤の形態は、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ、ポテトスターチ、微結晶セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、及びその他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤化剤、防腐剤、着香料、及び薬理学的に適合する賦形剤のうちの１つ以上を含み得る。ロゼンジ形態は、香料、通常スクロース及びアカシアもしくはトラガント中に１つ以上の核酸配列もしくはタンパク質を含む他、１つ以上の核酸配列もしくはタンパク質に加えて、ゼラチン及びグリセリンのような不活性な基剤中に有効成分を含む香錠、又は当技術分野において公知である賦形剤を含有するスクロース及びアカシア、エマルジョン、ゲル等を含み得る。
【００２１】
非経口投与に適する処方物として、抗酸化剤、バッファー、静菌薬、及びこの処方物を意図したレシピエントの血液と等張にせしめる溶質を含み得る水性及び非水性、等張、無菌の注射溶液、ならびに懸濁化剤（ｓｕｓｐｅｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び防腐剤を含み得る水性及び非水性の無菌懸濁物が挙げられる。処方物は、単位用量又は複数回投与用の、アンプル及びバイアルのような密閉された容器内に供されてもよく、また、駐車のためには使用直前に無菌液体の賦形剤、例えば水の添加のみを必要とする、凍結乾燥された（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）（凍結乾燥された（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ））状態で保管されてもよい。即時注射溶液及び懸濁物は、無菌の粉末、顆粒、及びこれまでに記載されている種類の錠剤から調製され得る。
【００２２】
エアゾール投与に適する処方物は、１つ以上の核酸配列もしくはタンパク質を、単独で、又は吸入により投与するためのエアゾール処方物に製造可能なその他の適する成分と組み合わせて、含む。これらのエアゾール処方物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等のような加圧式の受け入れ可能な噴霧剤中に入れられ得る。この処方物は、ネブライザー又はアトマイザーなどにおいて、非加圧式調製物用の医薬品としても処方化され得る。
【００２３】
局所的投与に適する処方物として、クリーム、ローション、ゲル、軟膏等を挙げることができる。その他の適する処方物が利用可能であり、例えば坐剤は、乳化性の基剤又は水溶性の基剤のような様々な基剤の使用により調製され得る。膣腔投与に適する処方物は、１つ以上の核酸配列又はタンパク質に加えて、適するものとして当技術分野において公知である担体を含有する、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム又はスプレー処方物として供され得る。
【００２４】
一実施形態では、組成物の適する処方物は、タンパク質の熱安定性に等しいか又はそれ未満の相転移温度を含み得る。例えば、２５℃の熱安定性を有するタンパク質は、２３℃の融解温度に該当するリン脂質（例えば、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ））を用いて処方化され得る。適するリン脂質は、当技術分野において周知である。
【００２５】
上記方法の１つの態様では、組成物はリポソームを含む。用語「リポソーム」とは、本明細書で使用する場合、脂質二重層から構成される人工的に調製された小胞を意味する。用語「脂質二重層」とは、本明細書で使用する場合、脂質分子の２層からなる膜を意味する。脂質二重層は、細胞膜、核膜及びウイルス体膜のような自然に存在する二重層と類似した厚さを有し得る。例えば、脂質二重層は、約１０ｎｍ以下の厚さ、例えば約１ｎｍ〜約９ｎｍ、約２ｎｍ〜約８ｎｍ、約２ｎｍ〜約６ｎｍ、約２ｎｍ〜約４ｎｍ又は約２．５ｎｍ〜約３．５ｎｍの範囲の厚さを有し得る。脂質二重層は、核酸、タンパク質、イオン、及びその他の分子が望ましくない領域に拡散するのを阻止しつつ、それらを保持するバリアである。
【００２６】
脂質二重層を形成する「脂質分子」は、親水性の頭部及び疎水性の尾部を備える分子を含み得る。脂質分子は、約１４〜約５０個の炭素原子を含み得る。脂質二重層を形成し得る脂質分子の例として、リン脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートした脂質、コレステロール又は任意のこれらの組み合わせが挙げられる。リポソームは、ユニラメラ小胞又はマルチラメラ小胞として分類され得る。ユニラメラ小胞は、本明細書で定義するように、両親媒性脂質の単一の二重層、又はそのような脂質の混合物であり、チャンバー内部に水溶液を含有する。マルチラメラ小胞は、多くの同心円状の両親媒性脂質二重層から構成される。
【００２７】
上記方法の別の態様では、リポソームは、ミセル、バイセル又は脂質ナノディスクであり得る。本明細書で用いる場合、「ミセル」とは、疎水的内部を備える界面活性剤分子の凝集物を意味する。いくつかの実施形態では、ミセルは、リポソームの親水性内部空間内に含まれ得る。「バイセル」とは、ディスク型のミセルである。ミセル又はバイセルは、疎水性の核酸、タンパク質、イオン又はその他の分子を含み得る。用語「ナノディスク」とは、本明細書で用いる場合、少なくとも１つのリン脂質二重層を意味し、疎水性の端部が少なくとも１つの両親媒性タンパク質により安定化している。
【００２８】
いくつかの実施形態では、１つ以上の核酸配列又は１つ以上のゾウｐ５３アミノ酸配列が、リポソーム内にカプセル化される。
【００２９】
別の実施形態では、１つ以上の核酸配列又は１つ以上のゾウｐ５３タンパク質は、ナノ粒子内にカプセル化され得る。「ナノ粒子」とは、本明細書で定義するように、少なくとも１つの１００ｎｍ未満の寸法を有する三次元粒子である。本開示の文脈において、ナノ粒子は、疎水性のコア及びコアを取り巻く親水性の層を含み得る。ナノ粒子は、１つ以上の部分で装飾された外部表面も含み得る。本明細書で用いる場合、「部分（ｍｏｉｅｔｙ）」とは、分子の一部分又は官能基である。１つ以上の部分は、ナノ粒子コア内に埋め込まれても、コアに含まれても、少なくともコアの一部分を形成する分子に連結しても、コアに連結した分子に連結しても、又は直接コアに連結してもよい。部分は、ナノ粒子と細網内皮系との相互作用を低下させるように選択されてもよい。そのような部分として、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【００３０】
一実施形態では、１つ以上の部分は、標的部分を含み得る。本明細書で用いる場合、「標的部分」は、特定の細胞型、例えばがん細胞にナノ粒子を誘導する。標的部分は、標的部分が細胞成分との相互作用に利用可能であるように、又はナノ粒子の表面特性に影響を及ぼすように、コアから外に向かって伸展するのが好ましい。一実施形態では、標的部分は、コア又はコアと相互作用する成分に繋留され得る。標的部分は、ナノ粒子の代謝的取り込みを促進するために、コレステロール、糖又はインスリンのような小分子担体を含み得る。標的部分は、分子（例えば標的対象細胞の外部にある受容体）に対して特異的な抗体又はリガンドをさらに含み得る。１つ以上の標的部分は、ナノ粒子が、その他のオルガネラ又は細胞質と比較して、実質的に類似した非標的ナノ粒子よりもより高い濃度で特異的細胞のオルガネラに蓄積するように、ナノ粒子を標的として、これを特異的細胞のオルガネラを標的とすることができる。実質的に類似した非標的ナノ粒子は、標的対象のナノ粒子と実質的に同一の相対的濃度（例えば、約５％以内）で同一の成分を含むが、標的部分を欠く。ナノ粒子による標的の対象となり得る細胞のオルガネラとして、例えば細胞膜、核、核小体、ミトコンドリア、ゴルジ装置、ゴルジ小胞、粗面小胞体、滑面小胞体、リソゾーム、ペルオキシソーム、細胞質、細胞基質、液胞及び分泌小胞が挙げられる。
【００３１】
別の実施形態では、特定の細胞型の標的化を促進するため、及び／又はタンパク質の半減期を延ばすために、標的部分、例えばターゲティングペプチド、コレステロール、糖、又はポリエチレングリコールは、ゾウｐ５３タンパク質の変異体にコンジュゲートし得る。
【００３２】
ナノ粒子は、１つ以上の治療剤（例えば、本明細書に記載する、ゾウＴＰ５３をコードする核酸又はｐ５３タンパク質）も含み得る。一実施形態では、治療剤は、ゾウｐ５３タンパク質の短いペプチドセグメント、例えば長さが１３ｍｅｒであるペプチドを含み得る。治療剤は、ナノ粒子の細胞取り込み後、例えばナノ粒子と特定の細胞型との融合後に、特定の細胞型内に放出され得る。別の実施形態では、治療剤は、特定の細胞型の外部に放出され、マクロピノサイトーシスのような細胞機構により取り込まれ得る。治療剤は、ナノ粒子コアに収納され、所望の速度でコアから放出され得る。いくつかの実施形態では、コアは生分解性であってもよく、コアが分解又は浸食されると１つ以上の治療剤を放出する。
【００３３】
組成物は、がんを阻害するか、又は本明細書に記載するゾウｐ５３核酸及びタンパク質の活性を増強する、１つ以上の追加の薬剤又は添加剤をさらに含み得る。薬剤は、治療剤の有効性を任意選択的に改善し、及び／又は治療剤の不活性化、変性、もしくは分解を防止し得る。例えば、組成物は、小分子化学療法薬、モノクロナール抗体又はイメージング剤（例えば、造影剤、糖、鉄錯体、又はガドリニウム（Ｇｄ））をさらに含み得る。
【００３４】
上記組成物、１つ以上のゾウｐ５３をコードする核酸配列、又は１つ以上のゾウｐ５３タンパク質は、キット、すなわち事前に決定された量の試薬と、診断的アッセイ又は治療法を実施するための説明書との包装された組合せで提供可能である。キットは、安定剤、バッファー等のような添加剤、ならびにキットの使用説明書を含み得る。様々な試薬の相対的な量は、試薬の溶液において、アッセイ感度を実質的に最適化する濃度を提供するように変化し得る。
【００３５】
がんを阻害する方法
本開示は、それぞれが本明細書に記載するゾウｐ５３タンパク質をコードする１つ以上の核酸配列、本明細書に記載する１つ以上のゾウｐ５３タンパク質又は１つ以上の本明細書に記載するゾウ核酸配列タンパク質を含む組成物を使用して、がんを阻害する方法を提供する。用語「がんを阻害すること」とは、本明細書で用いる場合、１つ以上のがん細胞の成長、増殖及び／又は転移を予防、抑制、ブロックし、又は低速化させることを意味する。いくつかの実施形態では、例えば本明細書に記載する方法は、がん細胞の増殖阻害、がん細胞の血管新生阻害、がん細胞の根絶及び／又は少なくとも１つのがん性腫瘍のサイズの縮小を促進し得、それにより、ヒトががんについて治療される。
【００３６】
本明細書に記載する方法は、例えば膀胱がん、骨がん、脳がん、乳がん、子宮頚がん、結腸がん、食道がん、胆嚢がん、頭部及び頸部のがん（例えば、口腔、咽頭、喉頭、唾液腺ならびに副鼻腔及び鼻腔のがん）、白血病、肝がん、肺がん、リンパ腫、メラノーマ、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、直腸がん、腎細胞癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（ｇａｓｔｒｉｃ））がん、小腸がん及び甲状腺がんのような当技術分野において公知のあらゆるがん細胞型の成長、増殖及び／又は転移を阻害するために利用可能である。がん細胞は、望ましくは、哺乳動物であり、好ましくはヒト（例えば、がんを含むヒト）である、本明細書で定義する対象に由来し得る。がん細胞は、ヒト以外の動物、例えばすべての哺乳動物及び非哺乳動物の脊椎動物（例えば、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、齧歯類、家禽、両生類、及び爬虫類であるが、これらに限定されない）にも由来し得る。
【００３７】
いくつかの実施形態では、がん細胞は、例えば原発性のがんもしくは腫瘍、転移性のがんもしくは腫瘍又はがん腫瘍の再成長のようながん細胞の集団であり得る。１つの実施形態では、がん細胞又はがん細胞の集団は、ＴＰ５３の発現変化（例えば、過剰又は過少発現）、異常な機能を有するｐ５３タンパク質の発現又はｐ５３タンパク質発現の完全停止を引き起こす、ＴＰ５３遺伝子の欠損、点突然変異、挿入、置換、又は遺伝子再配列を含むＴＰ５３遺伝子のような欠陥のあるＴＰ５３遺伝子（例えば、突然変異体）又はタンパク質を含む。欠陥遺伝子又は欠損遺伝子は、一方の対立遺伝子内に存在しても（異型接合性の変化）、又は２つの対立遺伝子内に存在しても（ホモ接合性の変化）よい。がん細胞又はがん細胞の集団は、がん細胞ゲノム全体を通じて、その他のゲノム異常と共に、正常なＴＰ５３遺伝子又はタンパク質を含み得る。
【００３８】
本明細書に記載する方法に基づき、がん細胞は、エキソビボ、インビボ、又はインビトロであり得る。「エキソビボ」とは、天然の条件に対する変更が最低限に抑えられた生物外の人工的な環境に置かれた細胞又は組織の内部又は上部で実施される方法を意味する。対照的に、用語「インビボ」は、その正常でそのままの状態の生体内で実施される方法を意味する一方、「インビトロ」法は、その通常の生物学的状況から単離された生物の構成成分を使用して実施される。
【００３９】
方法がインビトロ又はエキソビボで実施されるいくつかの実施形態では、がん細胞は、腫瘍又はがん細胞株であり得る。腫瘍及びがん細胞株は、商業的に取得可能であるか、又は公的供給源から取得可能である。腫瘍又はがん細胞株が購入可能な、商業的又は公的に利用可能な供給源の例として、アメリカ合衆国培養細胞株保存機関（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓｕｓ、Ｖａ．；Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ及びＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ；Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＣＬＳ）、ドイツ；及び欧州細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
その他の実施形態では、本明細書に記載する方法は、インビボで実施される、すなわち、１つ以上のゾウＴＰ５３をコードする核酸配列、１つ以上のゾウｐ５３タンパク質、又はその組成物は、それを必要としている動物、望ましくは哺乳動物（本明細書に記載する哺乳動物のような）、及び好ましくはがんに罹患しているヒトに直接投与される。本明細書に記載する方法は、哺乳動物、例えばヒト、イヌ等にインビボ投与するのに十分適する。１つ以上のゾウ核酸配列、タンパク質又は組成物は、経口、静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮的、筋肉内、鼻腔内、バッカル、舌下又は坐剤投与を含む標準的な投与技術を使用して、哺乳動物（例えば、ヒト、イヌ等）に投与され得る。組成物は、好ましくは非経口投与に適する。用語「非経口」は、本明細書で用いる場合、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、膣腔及び腹腔内投与を含む。より好ましくは、組成物は、静脈内、腹腔内、又は皮下注射による末梢全身性送達法を使用して哺乳動物に投与される。特定の実施形態では、本明細書に記載する１つ以上のゾウ核酸配列、タンパク質又は組成物をがん細胞に送達したときの効果は、治療的である。すなわち、この効果は、疾患及び／又は疾患（例えば、がん）に起因する有害な症状の部分的又は完全な治癒をもたらす。この目的を達成するために、本明細書に記載する方法は、「治療上有効な量」の本明細書に記載する１つ以上のゾウ核酸配列、タンパク質又は組成物を投与するステップを含む。「治療上有効な量」とは、必要とされる投与及び期間において、所望の治療結果を実現するのに有効な量を意味する。治療上有効な量は、個体の疾患状態、年齢、性別及び体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する１つ以上のゾウ核酸配列、タンパク質又は組成物の能力のような要因に基づき変化し得る。例えば、治療上有効な量のゾウＴＰ５３核酸又はタンパク質は、ヒトにおいてｐ５３タンパク質の生物活性を増加させる量、及び／又はがんに対するｐ５３シグナリング経路を増強させる量であり得る。望ましくは、治療効果は、がん細胞の死を引き起こす。
【００４１】
あるいは、薬理学的及び／又は生理的な効果は、予防的であり得る。すなわちこの効果は、疾患（例えば、がん）又はその症状の完全又は部分的な予防をもたらす。この点で、本明細書に記載する方法は、「予防上有効な量」の本明細書に記載する１つ以上のゾウ核酸配列、タンパク質又は組成物を投与するステップを含む。「予防上有効な量」とは、必要とされる投与及び期間において、所望の予防的結果（例えば、疾患発症の予防）を実現するのに有効な量を意味する。好ましくは、予防的結果は、がんの予防である。
【実施例】
【００４２】
下記の実施例は、本発明についてさらに説明するが、もちろん、本発明の範囲を多少なりとも制限するものと解釈すべきでない。
【００４３】
［実施例１］
この実施例は、体重ががんの罹病率と相関関係を有するか、その真否を確認するために、異なる哺乳動物種（ゾウを含む）のがん発生率について記載する。
【００４４】
がん罹病率が身体のサイズ又は寿命と共に増加するか、その真否を確認するために、動物園の動物からの剖検データを調べた。Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｚｏｏにより収集された１４年間の剖検データ（Ｆｅｎｇら、ＰＮＡＳ；１０４巻（４２号）：１６６３３−１６６３８頁（２００７年））をまとめ、サイズ及び寿命が最大６桁にまたがる哺乳動物３６種について腫瘍罹病率を計算した（米国癌学会；Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ＆  Ｆｉｇｕｒｅｓ（２０１５年））。ゾウ百科事典からのデータ（Ｇｒｉｎｅｒら、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｚｏｏ  Ａｎｉｍａｌｓ；Ｚｏｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９８３年））を、捕獲されたアフリカゾウ（（ロキソドンタ・アフリカーナ（Ｌｏｘｏｄｏｎｔａ  ａｆｒｉｃａｎａ））及びアジアゾウ（エレファス・マキシムス（Ｅｌｅｐｈａｓ  ｍａｘｉｍｕｓ））について死因分析し、ならびに年齢別罹病率及び全体的な生涯がんリスクを見積もるのに用いた。これまでに確立されたがん変換モデル（ｄｅ  Ｍａｇａｌｈａｅｓら、Ｊ  Ｅｖｏｌ  Ｂｉｏｌ；２２巻（８号）：１７７０−１７７４頁（２００９年））を使用して、がん発症を伴わずに細胞質量が１００×増加（ゾウとヒトの間の相違）したときに相当する細胞突然変異率の減少割合（％）を計算した。
【００４５】
【表１】
0006599566.tif 000002
【００４６】
分析した哺乳動物３６種は、シマクサマウス（体重５１ｇ、最長寿命４．５年）からゾウ（体重４８００ｋｇ、最長寿命６５年）に及んだ。分析した３６種において、がんリスクは、哺乳動物の身体サイズ及び最長寿命と共に増加しなかった（例えば、ロックハイラックス、１％［９５％ＣＩ、０％〜５％］；リカオン、８％［９５％ＣＩ、０％〜１６％］；及びライオン、２％［９５％ＣＩ、０％〜７％］）（図１）。質量、寿命及び基礎代謝量及びがん罹病率をどのように組み合わせても、有意な関連性が認められないことが判明した。ゾウ百科事典データベースから得られた注釈付きのゾウの死亡６４４例において、生涯がん罹病率は、３．１１％（９５％ＣＩ、１．７４％〜４．４７％）であることが判明している（表１）。より控えめな推定値を得るために、死因について適切な詳細情報が欠けた症例について推定がん罹病率を計算し、推定ゾウがん死亡率４．８１％（９５％ＣＩ、３．１４％〜６．４９％）を得た。発癌性の代数モデルに基づき（ｄｅ  Ｍａｇａｌｈａｅｓら、Ｊ  Ｅｖｏｌ  Ｂｉｏｌ；２２巻（８号）：１７７０−１７７４頁（２００９年））、突然変異率を計算すると、１／２．１７の低下となり、細胞質量がヒトと比較して１００×増加していることを前提としても、ゾウをがん発症から保護するのに十分であった。全体として、ヒトのがん死亡率１１％〜２５％と比較して、ゾウのがん死亡率は５％未満であると判明した（２５）。
【００４７】
この実施例の結果は、ゾウを含む、より長い寿命のより大きな動物は、より小型の動物と比較してがんを発症しにくい可能性があることを実証する。
【００４８】
［実施例２］
この実施例は、ゾウにおけるがん関連遺伝子のゲノム分析について記載する。
【００４９】
ゲノム配列分析を、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベース（リリース７２）及びＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋデータベース内のアフリカゾウゲノムの公的に利用可能なスキャフォールドで実施した；特に、がん関連遺伝子（発癌遺伝子及び腫瘍抑制因子を含む）について調べた。ＴＰ５３の配列アラインメントを関連する種において探索し、アフリカゾウ及びアジアゾウのＴＰ５３レトロ遺伝子をクローニングし、再配列決定した。ゾウ間の一塩基多型（ＳＮＰ）問題を回避するために、単一のゾウにおいてキャピラリーシークエンシングを実施した。全ゲノム配列決定（ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）ＨＩＳＥＱ  ２５００（登録商標）配列決定システム；Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、ＴＰ５３遺伝子エリア内の包括度１００×超、平均配列包括度４０×で、アフリカゾウから新たに抽出したＤＮＡについて実施した。
【００５０】
系統発生最大尤度を、配列決定されたＴＰ５３レトロ遺伝子クローンのクラスター化、及びアフリカゾウゲノムにおいて明らかとなった固有遺伝子の数の確認に用いた。系統発生学は、ゾウ及びハイラックスにおけるＴＰ５３レトロ遺伝子の互いの類似性ならびに祖先ＴＰ５３配列とのその関連性を可視化できるようにした。この試験から得られたキャピラリーシークエンシング後のクローンを丸で示し、ＧｅｎＢａｎｋからの公開された配列を四角で示す。アフリカゾウ（Ｌ．アフリカーナ）のドラフトゲノムＬｏｘＡｆｒ３は、１９個のＴＰ５３のコピーを含有する（図２）。系統発生分析は、処理後のＴＰ５３のコピーからなる少なくとも１８個の異なるクラスターを明らかにする。これらのクラスターは、Ａ群及びＢ群と表示される２群のいずれかに該当する。ヒトハプロイドゲノムは、ＴＰ５３のコピー１個を含有する一方、Ｅｎｓｅｍｂｌ及びＧｅｎＢａｎｋは、アフリカゾウゲノムでは多数のＴＰ５３パラログについて注釈する（それぞれ１２個及び２０個のハプロイドコピー）。ゾウ配列アラインメントは、ＴＰ５３に匹敵する遺伝子構造を有する１個のＴＰ５３コピーが、その他の哺乳動物の種において見つかったことを明らかにした（祖先のコピー）。
【００５１】
その他の１９コピーは、真正なイントロンを欠いており、それらのコピーがレトロトランスポジション（レトロ遺伝子）に由来することを示唆している。包括度を深めた全ゲノム配列決定は、ＴＰ５３に関し、ＧｅｎＢａｎｋで注釈された総２０コピーと類似して、祖先コピー１個及び総レトロ遺伝子１９コピーを確認した。キャピラリーシークエンシングから得られたレトロ遺伝子１８個のうち１１個はこれまでのＧｅｎ−Ｂａｎｋの注釈、及びローカルな全ゲノム配列データと同一ではなかったが、類似していた。参照ＴＰ５３コピー全体にわたり認められた包括度の高い変動は、まだそのアセンブリに成功していないと考えられるさらなるＴＰ５３ゾウコピーを示唆した。
【００５２】
８個の公開されたレトロ遺伝子コピーについて証拠は存在しなかった。これは、おそらくは、クローンの過少サンプリング、公開されたゲノム内のミスアセンブリ又は個々のゾウの間の相違に起因するであろう。追加の７個のクローニングされた配列は、複数のクローンから支持されたが、いずれのデータベースにも見出されなかった。ゲノム内のＴＰ５３コピーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーにより検出されなかった可能性もある。アジアゾウＤＮＡは、Ａ群及びＢ群のＴＰ５３レトロ遺伝子の１５〜２０個のコピーを含むことも判明した。
【００５３】
ゾウはＴＰ５３レトロ遺伝子（ＥＰ５３ｒ）を発現するのか立証するために、ＴＰ５３及びそのレトロ遺伝子の機能的分子解析を、アフリカゾウ及びアジアゾウ由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、及びアフリカゾウ由来の線維芽細胞で実施した。２Ｇｙ電離照射に曝露したＰＢＭＣ及び線維芽細胞からＲＮＡを単離し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施した。祖先配列（ＥＰ５３ａｎｃ）及びスプライスバリアントからＴＰ５３レトロ遺伝子を区別するように、ＰＣＲプライマーを設計した。ゲル上の２０１ｂｐ及び１８５ｂｐは、それぞれＡ群及びＢ群のＥＰ５３レトロ遺伝子に対する予想されるサイズであるが、そのサイズでＲＴ−ＰＣＲ産物が認められ（図３Ａ）、Ｓａｎｇｅｒ配列決定法は、そのレトロ遺伝子としての同一性を確認した。より高解像度の画像を図３Ｂに示す。
【００５４】
この実施例の結果は、ゾウは、２群（Ａ群及びＢ群）に分割され得る１９個のＴＰ５３レトロ遺伝子（ＥＰ５３ｒ）及び１個の祖先ＴＰ５３遺伝子（ＥＰ５３ａｎｃ）を有することを示唆する。
【００５５】
［実施例３］
この実施例は、ヒト細胞株内にトランスフェクトされたゾウＥＰ５３レトロ遺伝子が、タンパク質に翻訳され得たことを実証する。
【００５６】
哺乳動物発現ベクターをクローニングして、ｍｙｃタンパク質由来のエピトープに融合したゾウｐ５３レトロ遺伝子（ＥＰ５３ｒ）タンパク質を生成した。ｍｙｃタグを、細胞ライセートから翻訳されたタンパク質を免疫沈降させるため、及び／又はウェスタンブロットでタンパク質をプローブするために用いた。５つの異なるＥＰ５３ｒ：レトロ遺伝子１、レトロ遺伝子５、レトロ遺伝子７、レトロ遺伝子９、及びレトロ遺伝子１７について、構築物を開発した。これらのレトロ遺伝子は、異なるＥＰ５３遺伝子の範囲（ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を代表するので選択した。５つすべてのＥＰ５３ｒをトランケーションされたタンパク質として発現させ、約５３ｋＤａ（ヒトｐ５３と類似）の長さのＥＰ５３タンパク質の全サイズと比較した。
【００５７】
ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３）、マウス線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）、及びヒト骨肉腫細胞（Ｕ−２ＯＳ）を、ｍｙｃタグ化ＥＰ５３ｒプラスミド（ｍｙｃ−ＥＰ５３ｒ）のうちの１つでトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３細胞に由来するデータを示すが、それらは、その他の細胞型において実施された実験を代表する。脂質に基づくトランスフェクションを実施し、陰性対照として、細胞を空ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、抗生物質を含有する培地内に細胞を配置して、目的遺伝子を発現しなかった細胞を、選択的に殺傷した。選択を完了したら、ドキシサイクリンを添加して遺伝子発現を誘発し、それをウェスタンブロットにより確認した。
【００５８】
がん細胞株Ｕ−２ＯＳ（骨肉腫）及びＨＣＴ１１６（結腸がん）も、レンチウイルスベクターに感染させて、ゾウＥＰ５３ｒタンパク質を発現する安定な細胞株を生成した。レンチウイルスを作製するのに使用されるプラスミドは、細胞がドキシサイクリンで処理されたときに限り目的遺伝子が発現される、テトラサイクリン誘導可能遺伝子発現プラスミドであった。ウイルス形質導入から２４時間後、抗生物質を含有する培地内に細胞を配置して、目的遺伝子を発現しなかった細胞を取り除いた。選択を完了したら、目的遺伝子の発現を、ウェスタンブロットにより確認した。
【００５９】
Ｐ５３は、ＤＮＡ損傷に応答して上方制御されるので、トランスフェクト又は形質導入された細胞が目的とする遺伝子を発現することができることを確認するために、細胞をＭＧ１３２（プロテアーゼ阻害剤）又はドキソルビシン（ＤＮＡとインターカレートして高分子生合成を阻止する）で処理してＤＮＡ損傷を誘発した。テトラサイクリン誘導可能細胞の場合、ＭＧ１３２又はドキソルビシンによる処理前に、ドキシサイクリンで２４〜４８時間、細胞を処理した。ＤＮＡ損傷の誘発後、細胞を採取し、ペレット化した。細胞ペレットを凍結し、次にホスファターゼ及びプロテアーゼ阻害剤を含有する細胞溶解バッファー中で溶解した。細胞ライセートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥプロテインゲルで泳動し、次にＰＶＤＦメンブレンに転写した（ウェスタンブロット）。メンブレンをブロックし、次に一次抗体でプローブしてｐ５３タンパク質レベルを決定した。ブロットを、二次ＨＲＰコンジュゲート抗体でプローブし、基質及びケミルミノメーターを使用して、タンパク質レベルを検出した。各ウェスタンブロットについて、ＧＡＰＤＨをローディング対照として使用した。セリン１５残基におけるリン酸化ＥＰ５３ｒ（ホスホ−ＥＰ５３ｒ）についても、ブロットをプローブした。ＤＮＡ損傷はｐ５３のリン酸化を誘発するが、このリン酸化は、このタンパク質とその負の制御因子であるマウス二重微小染色体２（ＭＤＭ２）との相互作用を低下させる、（Ｍｉｌｃｚａｒｅｋら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ；６０巻：１−１１頁（１９９７年））。
【００６０】
１０μＭのＭＧ１３２又は１μＭのドキソルビシンでトランスフェクト後の細胞を処理した後、ＨＥＫ２９３細胞中の５つのＥＰ５３ｒすべてにおいて、タンパク質のラベリング増加、ならびにホスホ−ＥＰ５３ｒのラベリング増加が認められた（図４Ａ及び図４Ｂ）。これは、遺伝子の細胞への移行が成功したこと、及びＥＰ５３ｒ遺伝子がタンパク質に翻訳可能であったことを示唆した。ホスホ−ＥＰ５３ｒの増加により、ＭＧ１３２がゾウタンパク質のプロテアソーム分解を防止することを確認した。次に、ＥＰ５３ｒは負の制御因子であるＭＤＭ２と相互作用することができるかを明確にした。ＥＰ５３ｒがＭＤＭ２と結合することができるか確認するために、ＨＥＫ２９３細胞をＥＰ５３ｒ９でトランスフェクトし、６Ｇｙ電離照射で処理してＤＮＡ損傷を誘発した。発現したＥＰ５３ｒ９タンパク質を、次に、ｍｙｃタグに対する抗体を用いて免疫沈降させ、ウェスタンブロットを行った。免疫ブロットは、６Ｇｙ電離照射が、ＥＰ５３ｒ９発現及びリン酸化を増加させることを示した。これは、ＤＮＡ損傷に対してタンパク質が安定化したこと、及びそれに加えて、ＭＤＭ２がｍｙｃ−ＥＰ５３ｒ９と共免疫沈降したことの指標であり、２つのタンパク質は確かに相互作用することを示唆した（図４Ｃ）。
【００６１】
この実施例の結果は、ｍｙｃ−ＥＰ５３ｒが、細胞にトランスフェクト可能であること、ＤＮＡ損傷に応答してタンパク質を生成し得ること、及びＭＤＭ２と相互作用し得ることを実証する。
【００６２】
［実施例４］
この実施例は、ゾウ及びヒトの末梢血リンパ球中における細胞のＤＮＡ損傷に対する応答について記載する。
【００６３】
実験を、３群の対象：アフリカゾウ及びアジアゾウ、ユタ大学でがん遺伝学試験に登録したリー・フラウメニ症候群（ＬＦＳ）を有する患者の代表的な臨床コホート、及び年齢が一致しかつ重大ながんの家族歴を有さないヒト対照（がん遺伝学試験にも登録した）から得た末梢血リンパ球（ＰＢＬ）で実施した。ＬＦＳの患者を、代表的なサンプルとして組み入れるために、そのＴＰ５３突然変異の状態、異なるがんの病歴、及び採血の可否に基づき選択した。アフリカゾウ線維芽細胞、ヒト線維芽細胞、及びＨＥＫ２９３細胞について、実験室でのフォローアップ実験をも実施して、結果を確認した。
【００６４】
電離照射（０．５、２、５、６、１０及び２０Ｇｙ）、又はドキソルビシン（０．００５〜３０μＭ）を使用して、培養された一次ＰＢＬ内でＤＮＡ損傷を誘発し、次にアポトーシスの兆候、ＤＮＡ修復効率、及び細胞周期停止についてＰＢＬを評価した。アポトーシスを、アネキシンＶ（ＡＶ）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）について染色された細胞の数を測定することにより評価した；ＡＶ＋ＰＩ＋の場合、遅発性アポトーシス、及びＡＶ＋ＰＩ−の場合には初期アポトーシスとして細胞を分類した。アポトーシスを、ＡＰＯ−ＴＯＸ  ＧＬＯ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）又はＣＡＳＰＡＳＥ−ＧＬＯ（登録商標）３／７アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）及びＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ社）をも使用して測定した。ＡＰＯ−ＴＯＸ  ＧＬＯ（商標）と共に含まれるＭＵＬＴＩ−ＴＯＸ−ＦＬＵＯＲ（商標）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）から得られたカウントを使用して、又はカスパーゼ活性を測定した場合、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）を使用して、結果を細胞生存率に対して標準化した。アポトーシスの統計的に有意な差異を、ＧＲＡＰＨＰＡＤ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）で計算した。
【００６５】
２Ｇｙ及び６Ｇｙ電離照射してから１８時間後、アフリカゾウＰＢＬは、ヒトＰＢＬと比較して、有意に上昇したアポトーシス率を示した（遅発性アポトーシス：それぞれ１４．０７％に対して３３．２０％、；Ｐ＜０．００１（図５Ａ）；早期アポトーシス：それぞれ１１．７３％に対して２１．０７％、；Ｐ＜０．００１（図５Ｂ））。アフリカゾウリンパ球は、５μＭのドキソルビシンに曝露した場合、１８及び２４時間において、遅発性（図６Ａ）及び初期（図６Ｂ）アポトーシスの有意な増加をも示した。
【００６６】
２Ｇｙの電離照射で処理したＬＦＳの個人（ｎ＝１０）、健常対照者（ｎ＝１０）、及びアフリカゾウ１頭に由来する末梢血リンパ球は、異なるレベルのアポトーシスを明らかにした（アポトーシスは、処理を施さないで培養したＡＶ＋ＰＩ＋細胞の割合（％）から、２Ｇｙ電離照射で処理したＡＶ＋ＰＩ＋細胞の割合（％）を減じることにより計算した）。ＬＦＳ患者の細胞では、アポトーシスは、健康なヒトＰＢＬと比較して有意に少なかった（７．１７％と比較して２．７１％；Ｐ＜０．００１）、及びゾウＰＢＬ（１４．６４％；Ｐ＜０．００１）（図７）。
【００６７】
リンパ球と同様に、（カスパーゼ３／７切断増加の測定基準として）より高いアポトーシス率が、１０μＭ及び３０μＭのドキソルビシンによりＤＮＡ損傷を受けたゾウ線維芽細胞においても、認められた（図８）（ゾウ：９．１倍の増加；ヒト：２．２４倍の増加；Ｐ＜０．００１）。ゾウ線維芽細胞は、さらに、０．５Ｇｙの電離照射後、細胞周期停止と同時に生存率低下を示した（ヒト：９５．８７％と比較してゾウ：８０．８１％；Ｐ＝０．０１）。
【００６８】
Ｐ５３は、ＤＮＡ損傷後のｐ２１及びＭＤＭ２タンパク質の誘導において重要な役割を演じている（Ｍａｃｌｅｏｄら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ；９巻（８号）：９３５−９４４頁（１９９５年）；Ｙｏｏｎら、ＰＮＡＳ；９９巻（２４号）：１５６３２−１５６３７頁（２００２年））ので、免疫ブロットでｐ２１発現を評価して、放射線に対するゾウ細胞内ＤＮＡ損傷応答がＰ５３に依存するか検証した。ゾウＰＢＬ及びヒトＰＢＬの両方は、電離照射曝露後にｐ５３及びｐ２１タンパク質の発現の増加を示した（図９）。０．５Ｇｙの電離照射で処理したゾウＰＢＬでは、ヒトＰＢＬと比較して、５時間の時点でより多くのｐ２１タンパク質発現が認められた（３．５倍の増加と比較して２０．１倍の増加；Ｐ＝０．００４）。ゾウ線維芽細胞も、２Ｇｙの電離照射後、ヒト線維芽細胞では増加しなかったのと比較して、５時間の時点でｐ２１タンパク質の発現増加を示した（１．９倍の増加）。
【００６９】
事後解析として、同じ実験を、異なる年齢（２、１２、１７、３８、５７及び６９歳）の複数のアジアゾウ（ｎ＝６）に由来するＰＢＬにおいて繰り返した。アジアゾウリンパ球では、２Ｇｙの電離照射（図１０Ａ）に曝露したときに、アポトーシス率の増加（ヒト細胞の２３．６７％と比較して５０．６３％；Ｐ＜０．００１）、及びｐ２１発現の増加（図１０Ｂ）が実証された。さらに、直線回帰及び非線形関係について利用可能なヨンクヒール・タプストラ検定の両方で検定したとき、アジアゾウの年齢と共に、ＰＢＬにおけるアポトーシス応答が減少した（図１０Ｃ）（２Ｇｙ放射線に曝露してから１８時間経過時点において、２歳のゾウの場合、５２．５３％［９５％ＣＩ、３５．８６％〜６９．２％］及び６９歳のゾウの場合、４０．０３％［９５％ＣＩ、３０．６４％〜４９．４３％］；直線回帰によりＰ＝０．００２；ヨンクヒール・タプストラ検定によりＰ＜０．００１）。
【００７０】
ＨＥＫ２９３細胞は、ｐ５３の機能を本質的に阻害するアデノウイルスタンパク質を発現する；しかし、マウス線維芽細胞株であるＮＩＨ３Ｔ３は、機能的ＴＰ５３遺伝子を発現する。したがってＮＩＨ３Ｔ３細胞において追加の試験を実施して、やはり機能的野生型ＴＰ５３を発現する細胞内で、ＥＰ５３ｒ５及びＥＰ５３ｒ９の発現が細胞生存率に及ぼす効果を試験した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＥＰ５３ｒ５又はＥＰ５３ｒ９でトランスフェクトし、次にドキソルビシンで処理してＤＮＡ損傷を誘発した。図１１に示す通り、ＥＰ５３ｒ５（図１１Ａ）及びＥＰ５３ｒ９（図１１Ｂ）でトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞において、対照細胞と比較してカスパーゼ活性の有意な増加が認められ、ＥＰ５３ｒ５及びＥＰ５３ｒ９発現は、機能的ＴＰ５３をすでに発現している細胞内でアポトーシスを増加させることを示唆する。
【００７１】
【表２】
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【００７２】
ＤＮＡ修復の有効性を、次にＤＮＡ内の二本鎖切断の指標であるホスホ−ヒストンＨ２ＡＸ（ｐＨ２ＡＸ）標識した病巣の数を決定することにより評価した。２Ｇｙ電離照射によりＤＮＡ損傷を誘発した後、細胞を１、５、１０、１８、２４及び７２時間培養し、次に評価した。リンパ球では、ＤＮＡ損傷に反応してｐ５３依存性アポトーシスが生じ（Ｈｅｉｎｒｉｃｈｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ；２２巻（４号）：５５５−５７１頁（２００３年）；Ｌｏｗｅら、Ｃｅｌｌ；７４巻（６号）：９５７−９６７頁（１９９３年））、一方線維芽細胞では、ｐ５３依存性のアポトーシス及び細胞周期停止の両方が生じる（Ａｎｔｏｃｃｉａら、Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｒｅｓ；５０巻（５号）：４５７−４６８頁（２００９年）；Ｋａｓｔａｎら、Ｃｅｌｌ；７１巻（４号）：５８７−５９７頁（１９９２年）；Ａｔｔａｒｄｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ；２３巻（４号）：９７３−９８０頁（２００４年））。したがって両方のゾウ細胞型について試験した。
【００７３】
電離照射しても、ヒトＰＢＬ及びゾウＰＢＬにおいて、標識したｐＨ２ＡＸ病巣を有する細胞の割合（％）に有意差は認められず、このことは、ゾウにおけるアポトーシス増加は、ＤＮＡ損傷起因とみなすことはできないことを示唆している（表２）。細胞を、ｐＨ２ＡＸ病巣の数（０〜５、６〜１０、１１〜１５、１６〜２０＋）別にビンニング（ｂｉｎｎｅｄ）し、ヒトとゾウの間でＤＮＡ損傷修復率に有意差はないことを実証した。
【００７４】
【表３】
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【００７５】
ＤＮＡ損傷に応答して、ゾウ細胞内での遺伝子発現の変化を同定するために、ゾウ末梢血リンパ球を２Ｇｙ電離照射により処理した。照射処理細胞及び未処理細胞を３７℃で５時間培養した。ＲＮＡを細胞から抽出し、ＤＮａｓｅで処理してゲノムＤＮＡを取り除いた。ＲＮＡ配列決定を実施し、放射線への曝露後、ゾウ細胞内で最も上方制御された遺伝子トップ２０をまとめた。表３では、グレーで強調された遺伝子は、ヒト細胞内ｐ５３に関する既知の標的又は制御因子である。この結果は、ヒト細胞内ＤＮＡ損傷により誘発されるｐ５３シグナリング経路と同様に、ＤＮＡ損傷は、ゾウ細胞内でｐ５３依存性シグナリング経路を誘発することを示唆する。
【００７６】
この実施例の結果は、ゾウ細胞が、ＤＮＡ損傷に応答してより高レベルのアポトーシスを引き起こすこと、及びＥＰ５３タンパク質が、ヒト細胞内に形質導入されると、これらの細胞は、ＤＮＡ損傷に応答してより高レベルのアポトーシスを引き起こすことができることを実証する。
【００７７】
［実施例５］
この実施例は、ＥＰ５３発現が、様々なＥＰ５３遺伝子でトランスフェクトしたヒトがん細胞株Ｕ−２ＯＳ（骨肉腫）のアポトーシスを増加させることができるかどうかについて評価する。
【００７８】
Ｕ−２ＯＳ細胞を、ＥＰ５３ｒ５又は祖先ＥＰ５３（ＥＰ５３ａｎｃ）でトランスフェクトし、次にドキシサイクリンで処理してＥＰ５３ｒ発現を誘発した。次に、細胞を、ドキソルビシン（ｄｏｘｙ）で処理して、ＤＮＡに損傷を与えた。図１２Ａに示す通り、空ベクターを含む対照細胞と比較して、ＥＰ５３ｒ５形質導入細胞株において、カスパーゼ活性の有意な増加が認められ、ＥＰ５３ｒ５の発現は、機能的ＴＰ５３をも発現するがん細胞のアポトーシスを増加させることを示唆する。
【００７９】
Ｕ−２ＯＳ細胞に、ＥＰ５３ａｎｃをも形質導入した。次に、これらの細胞を、ＥＰ５３ａｎｃを発現するように誘発し、ドキソルビシンで処理して、ＤＮＡ損傷を引き起こした。図１２Ｂに示す通り、ＥＰ５３ａｎｃを発現するように誘発された細胞では、空ベクターが形質導入された細胞と比較して、カスパーゼ活性が２０倍増加した。ｐ５３標的遺伝子、ｐ２１及びＭＤＭ２の増加と同様に、これらの細胞はより多くの蛍光体（ｐｈｏｓｐｈｏｒ）−ＥＰ５３ａｎｃを示した（図１２Ｃ）。ＥＰ５３ａｎｃを発現した細胞は、より少量の内因性ヒトｐ５３をも発現した。ドキソルビシン処理を行わなくても（ｎｏ  ｄｏｘｙ）、ＥＰ５３ａｎｃを発現するＵ−２ＯＳ細胞では、空ベクターが形質導入された細胞と比較して有意なアポトーシスが生じた。
【００８０】
Ｕ−２ＯＳ細胞を、ＧＦＰでタグ化されたＥＰ５３ｒ９でトランスフェクトして（ＧＦＰ−ＥＰ５３ｒ９）追加の実験を実施した。トランスフェクション後、２４、４８又は７２時間後に、細胞を採取し、全細胞ライセートをウェスタンブロッティング用に処理した。ブロットを、ホスホ−ＥＰ５３ｒ９、ならびに内因性のヒト蛍光体−ｐ５３についてプローブした。ＥＰ５３Ｒ９の発現増加に加えて、Ｕ−２ＯＳ細胞は野生型ｐ５３の応答修復を示し、これらの細胞のアポトーシスを誘発したことが判明した（図１３）。
【００８１】
Ｕ−２ＯＳ細胞を、ＥＰ５３ａｎｃ及びヒトＴＰ５３でもトランスフェクトし、ドキシサイクリンによる誘発後の細胞生存率を７２時間後に観察した。ゾウｐ５３でトランスフェクトした細胞では、細胞生存率が３５．６％（ＳＥＭ１．８５）まで低下したが、一方ヒトｐ５３が形質導入された細胞では、細胞生存率の低下は４６．１％（ＳＥＭ１．１２）に過ぎないことが判明し、ゾウｐ５３は、ヒトｐ５３単独よりも多くのヒトがん細胞を殺傷することができることを示唆する。ＥＰ５３ａｎｃでトランスフェクトしたＵ−２ＯＳ細胞では、ゾウｐ５３タンパク質の誘発後のアポトーシス活性の増加と整合してカスパーゼ活性の増加（１４．２２％、ＳＥＭ０．２３）も、ヒトｐ５３でトランスフェクトした細胞と比較して（１０．８９％、ＳＥＭ０．１２）認められた。
【００８２】
ＥＰ５３ｒ９発現のヒト結腸がん細胞の細胞性老化に対する効果を調べるために、ＨＣＴ１１６がん細胞に、ＥＰ５３ｒ９をコードするテトラサイクリン誘導可能ベクターを形質導入した。タンパク質の発現を、次にドキシサイクリンにより誘発し、次に細胞をドキソルビシンで処理してＤＮＡに損傷を与えた。ＨＣＴ１１６−ＥＰ５３ｒ９細胞は、対照細胞と比較して有意により多くのカスパーゼ活性を示した（図１４Ａ）。ウェスタンブロットを実施して、これらの細胞におけるＥＰ５３ｒ９の発現を確認した（図１４Ｂ）。より高い濃度のドキシサイクリンで処理した細胞ほど、ＥＰ５３ｒ９を発現しない細胞と比較して、より多くの内因性ヒトリン酸化ｐ５３（Ｓｅｒ１５）を発現することが判明した。細胞にフラッグタグ化ＥＰ５３ｒ９を形質導入し、フラッグに対する抗体を、ＥＰ５３ｒ９の発現を検証するのに使用した。細胞を５−ＦＵで処理してｐ５３経路を活性化させた。これらの結果は、ＥＰ５３ｒ９が、これらの細胞内で活性化した内因性のｐ５３の量を増加させることによりアポトーシスを増加させたことを示唆する。
【００８３】
この実施例の結果は、がん細胞株内でＥＰ５３を誘発すると、アポトーシスの有意な増加を引き起こすことを実証する。
【００８４】
公開資料、特許出願、及び特許を含め、本明細書で引用されたすべての参考資料を、各参考資料が、参照により組み込まれることを個別及び特別に示唆され、ならびに本明細書においてそのまま記載された場合と同程度まで、参照により本明細書に組み込む。
【００８５】
本発明を記載する文脈における用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくとも１つ」及び類義語の使用（特に下記の特許請求の範囲の文脈において）は、本明細書で別途明示しない限り、又は文脈から明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方が該当するものと解釈される。用語「少なくとも１つ」を使用した後に１つ以上の項目が列挙される場合（例えば、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」）、それは、本明細書で別途明示しない限り、又は文脈から明らかに矛盾しない限り、列挙された項目（Ａ又はＢ）から選択される１つの項目、又は列挙されている項目（Ａ及びＢ）の２つ以上の任意の組み合わせを意味するものと解釈される。用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有すること」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含有すること」は、別途明記しない限り、非制限的用語（すなわち、「〜を含むが、これらに限定されない」を意味する）として解釈される。本明細書における数値の範囲の列挙は、本明細書で別途明示しない限り、範囲内に収まる異なる数値それぞれを個々に参照する簡便な方法として役に立つように意図されているに過ぎず、異なる数値それぞれは、本明細書で個別に列挙されたかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載するすべての方法は、本明細書で別途明示しない限り、さもなければ文脈から明らかに矛盾しない限り、任意の適する順序で実施可能である。本明細書に提示するあらゆるすべての例、又は代表的な言語（例えば、「のような」）の使用は、本発明をより良く明示するように意図されているに過ぎず、別途主張されない限り、本発明の範囲に対して制限を提起しない。本明細書内のいずれの言語についても、本発明の実践に不可欠な何らかの請求外の要素を示すものと解釈すべきでない。
【００８６】
本発明の好ましい実施形態が、本発明を実施するのに本発明者らにとって公知の最良の形態を含め、本明細書に記載されている。好ましい実施形態の変形形態は、上記説明を閲読すれば当業者にとって明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がそのような変形形態を適宜採用するよう期待し、また本発明者らは、本発明が本明細書に特に記載する以外の方式でも実践されるように意図する。したがって、本発明は、該当する法令の許可にしたがって、本明細書に添付の特許請求の範囲に列挙した主題を修正したもの及びその均等物のすべてを含む。さらに、上記要素のすべての可能な変形形態におけるその任意の組み合わせは、本明細書で別途明示しない限り、さもなければ文脈から明らかに矛盾しない限り本発明に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【配列表】
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