(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列  ＡＣＤＴＡＴＣＶＬＧＲＬＳＱＥＬＨＲＬＱＴＹＰＲＴＮＶＧＳＫＡＦ−ＮＨ２（（配列番号１）−ＮＨ２）またはその薬学的に許容され得る塩を有する、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）アゴニスト。
【請求項２】
以下を含有している薬学的組成物：
薬学的に許容され得る賦形剤；および
請求項１に記載のカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）アゴニスト。
【請求項３】
代謝障害を処置するための、請求項１に記載のカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）アゴニスト。
【請求項４】
前記代謝障害が、糖尿病および肥満からなる群より選択される、請求項３に記載のカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）アゴニスト。
【請求項５】
代謝障害を処置するための、有効量の請求項１に記載のカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）アゴニスト。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年７月３０日に提出された、「ＣＧＲＰ  ＡＧＯＮＩＳＴ  ＰＥＰＴＩＤＥＳ」の表題の米国仮特許出願番号第６１／８６０，２４４号の優先権を主張する。上記出願の全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、電子形式の配列表とともに提出されている。配列表は、２０１４年７月２５日に作製されたおよそ８ｋｂのサイズの、「ＣＳＯＡＲ．００２ＷＯ．ＴＸＴ」のタイトルのファイルとして提出される。電子形式の配列表中の情報は、参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる。
【０００３】
技術分野
本発明は、ペプチドホルモンのカルシトニン／カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＴ／ＣＧＲＰ）ファミリーのペプチドアゴニスト、およびそれらの治療的使用に関する。
【０００４】
関連技術の記述
ＣＴ／ＣＧＲＰペプチドファミリーには、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、アドレノメジュリン（ＡＤＭ）、インテルメジン（ＩＭ）、カルシトニン（ＣＴ）およびアミリンが含まれる。これらのペプチドの生物学的作用は、２つの密接に関係しているＩＩ型Ｇタンパク質共役受容体である、カルシトニン受容体（ＣＴＲ）およびカルシトニン受容体様受容体（ＣＲＬＲ）に対する結合により媒介される（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ，ｅｔ  ａｌ．１９９９，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５６：２３５−２４２；Ｐｏｙｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５４：２３３−２４６）。カルシトニン受容体はカルシトニン作用の主要な媒介因子であるが、受容体が受容体活性修飾タンパク質（ＲＡＭＰ）と会合している場合には、これはアミリンに優先的に結合する（例えば、Ｔｉｌｉｋａｒａｔｎｅ，ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９４（ｌ）：６１−７２を参照のこと）。クローニングおよび機能の研究により、ＣＧＲＰ、ＡＤＭ、ＩＭが、およびより程度は低いがアミリンも同様に、ＣＲＬＲと３種の受容体活性修飾タンパク質（ＲＡＭＰ−１、ＲＡＭＰ−２、およびＲＡＭＰ−３）の様々な組み合わせと相互作用することが示されている（例えば、ＭｃＬａｔｃｈｉｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：３３３−３３９およびＲｏｈ  ｅｔ  ａｌ．２００４，ＪＢＣ  ２７９（８）：７２６４−７２７４を参照のこと）。実際、カルシトニン受容体様受容体（ＣＲＬＲ）および受容体活性修飾タンパク質（ＲＡＭＰ）の同時発現が、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、アドレノメジュリン（ＡＤＭ）、およびインテルメジン（ＩＭ）の機能性受容体を作製するために必要である。ＲＡＭＰとＣＲＬＲとの間でのヘテロ二量体の形成が、ＣＧＲＰ、ＡＤＭ、およびＩＭ受容体の適切な細胞表面標的化および薬理学的特性に不可欠である。ＲＡＭＰ−１のＣＲＬＲとの同時発現はＣＧＲＰ受容体の形成につながるが、ＲＡＭＰ−２およびＲＡＭＰ−３のＣＲＬＲとの同時発現により、それぞれ、ＡＤＭおよびＩＭ受容体を形成する（Ｍｉｒｅｔ，ｅｔ  ａｌ．２００２，ＪＢＣ  ２７７（９）：６８８１−６８８７）。ＩＭは、３種類のＲＡＭＰ／ＣＲＬＲ共受容体の全てについての非選択的アゴニストであることが示されている。
【０００５】
ＣＴ／ＣＧＲＰファミリーのホルモンペプチドの生理学的機能は、受容体結合特異性、ならびに個々のリガンドおよびそれらのそれぞれの受容体の組織発現プロフィールにより決定され、心臓血管の形態形成、感覚神経伝達（ｓｅｎｓｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）、炎症反応、侵害行動、およびグルコース恒常性に関与していることが示されている （例えば、Ｈａｙ, ｅｔ ａｌ. ２００１, Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ. Ｓｃｉ. ２２：５７−５９； Ｓｈｉｎｄｏ, ｅｔ ａｌ. ２００１, Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０４：１９６４−１９７１； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ. ２００１, Pａｉｎ ８９：２６５−２７３； Ｓａｌｍｏｎ ｅｔ ａｌ. （１９９９） Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ １０：８４９−８５４； Ｓａｌｍｏｎ, ｅｔ ａｌ. ２００１, Ｎａｔ. Ｎｅｕｒｏｓｃｉ. ４： ３５７−３５８； ａｎｄ Ｍｕｌｄｅｒ, ｅｔ ａｌ. ２０００, Ａｍ. Ｊ. Ｐｈｙｓｉｏｌ. ２７８：Ｅ６８４−Ｅ６９１を参照のこと）
【０００６】
カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）は、いくつかの種の中では、ＣＧＲＰ−αおよびＣＧＲＰ−β（またはそれぞれ、ＣＧＲＰ−ＩおよびＣＧＲＰ−ＩＩ）と命名された２つの形態で存在するペプチドである。ＣＧＲＰペプチドは種間で高度に保存されており、例えば、ヒトのα−ＣＧＲＰとβ−ＣＧＲＰとの間での９２％のアミノ酸相同性（３個のアミノ酸が異なる）と比較して、ヒトのＣＧＲＰ−αペプチドとラットのＣＧＲＰ−αペプチドは、８９％のアミノ酸相同性を共有する（これらの成熟ペプチドは４個のアミノ酸が異なる）（例えば、Ｍａ，Ｈ．２００４，Ｎａｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２（３）：４１−４７を参照のこと）。ペプチドホルモンのＣＴ／ＣＧＲＰファミリーの中の十分に研究されているペプチドであるＣＧＲＰは、残基８〜２５の間のアミノ酸配列に両親媒性α−ヘリックス二次構造を含有している、感覚神経、運動神経、および腸神経から放出される３７アミノ酸の血管作用性神経ペプチドである。ＣＧＲＰは、例えば、Ｅｖａｎｓ，ｅｔ  ａｌの米国特許第４，５３０，８３８号に記載されているように、強力な血管拡張性作用および強心性作用を有する。ＣＧＲＰは、中枢神経系および末梢神経系のいずれにも存在し、自律神経の入力（ａｕｔｏｎｏｍｉｃ  ｉｎｐｕｔ）に関連する限られた量の後角からの感覚入力を受領している体のそのような領域に濃縮される。脳内では、ペプチドは、感覚神経核および運動能神経（ｍｏｔｏｒ  ｃｒａｎｉａｌ  ｎｅｒｖｅｓ）の核中、ならびに、視床下部、視索前野、視床腹外側、海馬などの細胞体中に存在する （Ｐｏｙｎｅｒ, Ｄ. １９９２, Ｐｈａｒｍａｃ. Ｔｈｅｒ. ５６：２３−５１）。
【０００７】
ＣＧＲＰは、以下のような様々な薬理学的作用に関与していることが知られている：１）血管拡張、２）筋肉および肝臓ＡＭＰキナーゼ（ｍｕｓｃｌｅ  ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ  ＡＭＰ  ｋｉｎａｓｅ）（ＡＭＰＫ）の活性化、ならびに脂肪分解および／または脂質の酸化、３）食物摂取量の減少、４）胃内容物排出の阻害および腸機能の改変、ならびに５）解糖作用の増大およびグリコーゲン合成の阻害。これらの作用についてのきちんとした生理学的意義は完全には理解されていない。しかし、脂肪酸の酸化ならびに脂質利用可能性および脂質利用の調節におけるＣＧＲＰの役割の証拠は明らかにされている（Ｄａｎａｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ，２００８  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４９（１）：１５４−１６０）。複数の研究が、その作用が視床下部の傍室核（ＰＶＮ）によるという証拠を含む、食物摂取の阻害におけるＣＧＲＰの役割を明らかにしている (例えば、 Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ａｌｖａｒｅｚ, ＲＭ, ｅｔ ａｌ. ２００９ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ３０（４）：８０３−８０７ ａｎｄ Ｄｈｉｌｌｏ, ＷＳ, ｅｔ ａｌ. ２００２, Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ３ＯＣ４３； ＩＳＳＮ１４７０−３９４７ を参照のこと) 。さらに、ＣＧＲＰが、糖尿病の改善において重要な役割を担っていることが知られているタンパク質であるＧＬＰ−１の分泌を刺激することが示されている。
【０００８】
メタボリック症候群は、肥満、インスリン耐性、脂質異常症および高血圧症により現れる疾患状態である。今日、これらの４つの兆候は、選択的な処置方法論により処置される。天然のＣＧＲＰは３０分未満の半減期を有しており、ＣＧＲＰの注入後の薬理学的作用が短時間であることは明白である。投与されたＣＧＲＰの血管拡張作用が原因で、天然のＣＧＲＰのｉｎ  ｖｉｖｏでの薬理学的研究は、血管拡張および代償性の血管収縮作用の二次的作用の理由から困難であり得る。したがって、ＣＧＲＰの薬理学的有用性には、特に、ＣＧＲＰの長期使用または慢性使用に関して、ＣＧＲＰアナログの作製が必要であり、長期作用およびいくつかの作用は長期作用性のアナログを用いた場合にのみ得られ得る。同様に、特に、慢性使用について治療薬として存続可能であるためには、長期作用を有しているアナログが望ましい。
【０００９】
発明の概要
１つの態様では、本発明は、式Ｉの構造を含有しているカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）アゴニスト、あるいはその薬学的に許容され得る塩を提供する：
Ｘ１−Ｙ１−Ｚ１
（Ｉ）
式中：
Ｘ１は、以下の一般式を有している、少なくとも約５〜約７個のアミノ酸残基を含有しているＮ末端断片であり：
Ｘ１  Ｘ２  Ｘ３  Ｔｈｒ  Ｘ４  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ（配列番号６）
式中、Ｘ１は、ＡｌａもしくはＣｙｓであるか、または存在せず、Ｘ２は、Ｃｙｓ、ＳｅｒまたはＧｌｙであり、しかしただし、Ｘ１とＸ２の少なくとも１つがＣｙｓであり、Ｘ１またはＸ２の１つだけがＣｙｓであり、Ｘ３は、ＡｓｐまたはＡｓｎであり、そしてＸ４は、ＡｌａまたはＳｅｒであり、式中、Ｘ１の末端Ｃｙｓは、Ｘ１またはＸ２中のＣｙｓ残基とジスルフィド架橋を形成することができ；
Ｙ１は、少なくとも約１２〜約２４個、および好ましくは約１５個のアミノ酸残基を含有している中心のコアであり、ここでは、中心のコアの残基の少なくともいくつかは、生理学的条件下でα−ヘリックスを形成することができ、上記中心のコアは以下の一般式を有しており：
Ｘ５ Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｘ６  Ｘ７  Ｇｌｎ  Ｘ８  Ｘ９  Ｘ１０  Ａｒｇ  Ｘ１１  Ｘ１２  Ｔｈｒ  Ｘ１３（配列番号７）
式中、Ｘ５は、ＶａｌまたはＭｅｔであり、Ｘ６は、ＬｅｕまたはＴｙｒであり、Ｘ７は、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、Ｘ８は、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘ９は、ＰｈｅまたはＬｅｕであり、Ｘ１０は、ＨｉｓまたはＡｓｎであり、Ｘ１１は、ＰｈｅまたはＬｙｓであり、Ｘ１２は、ＨｉｓまたはＧｌｎであり、Ｘ１３は、ＰｈｅまたはＴｙｒであり；
そして
Ｚ１は、少なくとも約６〜約１２個のアミノ酸残基、好ましくは、約１０個のアミノ酸残基を含有しているＣ末端断片であり、上記Ｃ末端断片はＣ末端アミドを含有しており、上記断片は以下の一般式を有している：
Ｐｒｏ  Ｘ１４  Ｔｈｒ  Ｘ１５  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ（配列番号８）
式中、Ｘ１４は、ＡｒｇまたはＧｌｎであり、Ｘ１５は、ＡｓｎまたはＡｌａであり；
ここでは、上記ＣＧＲＰアゴニストは、ヒトＣＧＲＰ受容体に対してヒトＣＧＲＰよりも高い結合親和性を有する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、Ｘ１は、６または７個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｙ１は、１５個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｚ１は、１０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｘ１は、６または７個のアミノ酸を含み、Ｙ１は１５個のアミノ酸を含み、そしてＺ１は、１０個のアミノ酸を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、Ｘ１はＣｙｓであり、そしてＸ２は、ＳｅｒまたはＧｌｙである。いくつかの実施形態では、Ｘ２はＣｙｓであり、そしてＸ１は、Ａｌａである。いくつかの実施形態では、Ｘ１は、配列番号９を含む。いくつかの実施形態では、Ｚ１は、配列番号１０を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）アゴニストが提供される。いくつかの実施形態では、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）アゴニストは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５、あるいはそれらの薬学的に許容され得る塩を含む群より選択される。いくつかの実施形態では、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）アゴニストは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５のアミノ酸配列、またはそれらの薬学的に許容され得る塩に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）アゴニストは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５のアミノ酸配列、またはそれらの薬学的に許容され得る塩に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）アゴニストは、ＸＴＥＮＳポリペプチドのＮ末端付加を含む。いくつかの実施形態では、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）アゴニストは、誘導基（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｇｒｏｕｐ）で修飾されたアミノ末端を含む。いくつかの実施形態では、誘導基は、アセチル、アリール、アラルキル、アシル、エポキシスクシニル、およびコレステリル基より選択される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）アゴニストは、誘導基で修飾されたカルボキシ末端を含む。いくつかの実施形態では、誘導基は、アルコール、アルデヒド、エポキシコハク酸塩、酸ハロゲン化物、カルボニル、ハロメタン、ジアゾメタン基、およびカルボキサミドより選択される。いくつかの実施形態では、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）アゴニストは、アミド基で置き換えられたＣ末端カルボキシ基を含む。いくつかの実施形態では、アミド基は構造−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本発明のカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）アゴニストを含有している薬学的組成物が提供される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、許容され得る賦形剤および上記実施形態のいずれかを含有する。
【００１６】
【００１７】
【００１８】
【００１９】
【００２０】
【００２１】
いくつかの実施形態では、代謝障害を処置する方法が提供される。いくつかの実施形態では、上記方法には、有効量の本発明のカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）アゴニストをそれが必要な被験体に投与する工程が含まれる。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。
【００２２】
いくつかの実施形態では、メタボリック症候群、糖尿病、および肥満を含む群より選択される代謝障害を処置する方法が提供される。いくつかの実施形態では、上記方法には、有効量のカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）アゴニストをそれが必要な被験体に投与する工程が含まれる。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。
【００２３】
いくつかの実施形態では、被験体において解糖作用を増大させる方法が提供される。いくつかの実施形態では、上記方法には、有効量の本発明のカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）アゴニストを投与する工程が含まれる。いくつかの実施形態では、被験体においてＡＭＰＫ活性化を増大させる方法が提供される。いくつかの実施形態では、上記方法には、有効量の本発明のカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）アゴニストを投与する工程が含まれる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、被験体はインスリン耐性に罹患している。いくつかの実施形態では、被験体は２型真性糖尿病に罹患している。いくつかの実施形態では、被験体は高血圧症に罹患している。いくつかの実施形態では、被験体は脂質異常症に罹患している。いくつかの実施形態では、被験体はアテローム性動脈硬化症に罹患している。いくつかの実施形態では、被験体は血栓症に罹患している。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】以下の実施例１に記載するＣＡＬＣＲＬ：ＲＡＭＰ１−ＣＲＥ−ｂｌａ  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆアゴニストスクリーニングの結果を提供する。ＣＧＲＰ受容体の活性化率（％）に対するＡＣＸ０１７（（配列番号１）−ＮＨ２）の濃度のグラフは、本発明のＣＧＲＰアゴニストが、ＣＧＲＰ受容体を、約１０５ｎＭのＥＣ５０濃度で活性化させたことを明らかにしている。
【００２６】
【図２】以下の実施例１に記載するＣＡＬＣＲＬ：ＲＡＭＰ３−ＣＲＥ−ｂｌａ  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆアゴニストスクリーニングの結果を提供する。アドレノメジュリン２（ＡＭ２）受容体の活性化率（％）に対するＡＣＸ０１７（（配列番号１）−ＮＨ２）の濃度のグラフは、本発明のＣＧＲＰアゴニストが、アドレノメジュリン２（ＡＭ２）受容体を活性化しなかったことを示している。
【００２７】
【図３−６】本明細書中の実施例２に記載する、４日の食物摂取の研究の結果を提供する。１日目〜４日目のそれぞれについての累積食物摂取量に対する効果を、それぞれ図３〜６に示す。８時間の経過全体にわたる試験群（単回用量のＡＣＸ０１７（（配列番号１）−ＮＨ２）およびプラセボ群のそれぞれの累積食物摂取量をグラフにする。
【００２８】
好ましい実施形態の詳細な説明
１つの態様では、本発明は、式Ｉの構造を有しているカルシトニン遺伝子関連ペプチドアゴニスト、あるいはその薬学的に許容され得る塩を提供する：
Ｘ１−Ｙ１−Ｚ１
（Ｉ）
式中：
Ｘ１は、以下の一般式を有している、少なくとも約５〜約７個のアミノ酸残基を含有しているＮ末端断片であり：
Ｘ１  Ｘ２  Ｘ３  Ｔｈｒ  Ｘ４  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ（配列番号６）
式中、Ｘ１は、ＡｌａもしくはＣｙｓであるか、または存在せず、Ｘ２は、Ｃｙｓ、ＳｅｒまたはＧｌｙであり、しかしただし、Ｘ１とＸ２の少なくとも１つがＣｙｓであり、Ｘ１またはＸ２の１つだけがＣｙｓであり、Ｘ３は、ＡｓｐまたはＡｓｎであり、そしてＸ４は、ＡｌａまたはＳｅｒであり、式中、Ｘ１の末端Ｃｙｓは、Ｘ１またはＸ２中のＣｙｓ残基とジスルフィド架橋を形成することができ；
Ｙ１は、少なくとも約１２〜約２４個、および好ましくは約１５個のアミノ酸残基を含有している中心のコアであり、ここでは、中心のコアの残基の少なくともいくつかは、生理学的条件下でα−ヘリックスを形成することができ、上記中心のコアは以下の一般式を有しており：
Ｘ５ Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｘ６  Ｘ７  Ｇｌｎ  Ｘ８  Ｘ９  Ｘ１０  Ａｒｇ  Ｘ１１  Ｘ１２  Ｔｈｒ  Ｘ１３（配列番号７）
式中、Ｘ５は、ＶａｌまたはＭｅｔであり、Ｘ６は、ＬｅｕまたはＴｙｒであり、Ｘ７は、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、Ｘ８は、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘ９は、ＰｈｅまたはＬｅｕであり、Ｘ１０は、ＨｉｓまたはＡｓｎであり、Ｘ１１は、ＰｈｅまたはＬｅｕであり、Ｘ１２は、ＨｉｓまたはＧｌｎであり、Ｘ１３は、ＰｈｅまたはＴｙｒであり；
そして
Ｚ１は、少なくとも約６〜約１２個のアミノ酸残基、好ましくは、約１０個のアミノ酸残基を含有しているＣ末端断片であり、上記Ｃ末端断片はＣ末端アミドを含有しており、上記断片は以下の一般式を有している：
Ｐｒｏ  Ｘ１４  Ｔｈｒ  Ｘ１５  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ（配列番号８）
式中、Ｘ１４は、ＡｒｇまたはＧｌｎであり、Ｘ１５は、ＡｓｎまたはＡｌａであり；
ここでは、上記ＣＧＲＰアゴニストは、ヒトＣＧＲＰ受容体に対してヒトＣＧＲＰよりも高い結合親和性を有する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、Ｘ１は、配列番号９の配列（ＡＣＤＴＡＴＣ）を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、Ｚ１は、配列番号１０の配列（ＰＲＴＮＶＧＳＫＡＦ）を含む。
【００３１】
いくつかのＣＧＲＰアゴニストは、本発明にしたがうと、配列番号１、２、３、４、または５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％の配列同一性を有しているアミノ酸配列を含み、ここでは、上記ペプチドはアゴニスト活性を保持している。
【００３２】
いくつかの実施形態は、薬学的に許容され得る賦形剤と、本明細書中で開示され、記載されるようなカルシトニン遺伝子関連ペプチドアゴニストを含有している薬学的組成物を提供する。
【００３３】
いくつかの実施形態は、不十分なＣＧＲＰレベルと関係があるか、またはＣＧＲＰの増加により改善する症状を処置する方法を提供する。上記方法は、本明細書中で開示され、記載されるようなカルシトニン遺伝子関連ペプチドアゴニストを個体に投与する工程を含み、上記方法は、有効量の本明細書中で開示され、記載されるようなカルシトニン遺伝子関連ペプチドアゴニストを個体に投与する工程を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態は、表１に列挙した以下のペプチド配列より選択される構造を有しているカルシトニン遺伝子関連ペプチドアゴニストを提供する。
【表１】
0006538682.tif 000002
【００３５】
いくつかの実施形態では、カルシトニン遺伝子関連ペプチドアゴニストのアミノ酸配列が、修飾により、酵素によるタンパク質加水分解に対するカルシトニン遺伝子関連ペプチドアゴニストの感受性を低下させるように、配列番号１、２、３、４、または５の配列に関して修飾され得る。いくつかの実施形態では、この修飾には、８６４残基のＸＴＥＮＳポリペプチド（被験体への投与後にタンパク質の安定性を高めることが示されているポリペプチド）全体またはその一部を含有している配列のＮ末端付加が含まれ得る。例えば、Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７（１２）：１１８６−１１９２（その全体が引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと。
【００３６】
定義
本明細書中で使用される場合は、「アゴニスト」は、その相補性の生物学的活性がある受容体に結合し、その後に、受容体において生物学的応答を引き起こすか、または受容体の既存の生物学的活性を増強するかのいずれかを行うように活性化する、生物学的活性があるリガンドをいう。
【００３７】
本明細書中で使用される場合は、「Ｃ末端アミド」は、ポリペプチドがＣ末端カルボキシ（すなわち、Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨ）部分ではなくカルボキサミド（すなわち、Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ２）で終わるように、ポリペプチドのカルボキシ末端に通常存在するＣ末端ヒドロキシル部分に取って代わるアミド部分をいう。プロドラッグとしての薬学的に許容され得るアミドの記述については、Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｈ．ｅｄ．１９８５  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍを参照のこと。これらのアミドは、典型的には、対応するカルボン酸とアミンから形成される。一般的には、アミドの形成は、従来の合成技術により達成され得る。例えば、 Ｍａｒｃｈ, １９９２ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, ４ｔｈ Ｅｄ., Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ, ｐ. ３９３ ａｎｄ Ｍａｒｋ, ｅｔ ａｌ. １９８０ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆ Ｓｏｎｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ を参照のこと。
【００３８】
本明細書中で使用される場合は、用語「α−ヘリックス」は、α−ヘリックスタンパク質構造、または受容体上に同様のＸ１およびＺ１ドメインの配置を生じる任意の他の構造アナログを形成する構造成分を意味する。
【００３９】
本明細書中で使用される場合は、「薬学的に許容され得る担体」は、有効成分の生物学的活性の有効性を妨害しない、かつ宿主または患者に対して毒性のない分散媒をいう。
【００４０】
本明細書中で使用される場合は、「薬学的に許容され得る塩」は、製薬産業で通常使用されている非毒性のアルカリ金属、アルカリ土類金属、およびアンモニウムの塩をいい、これには、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウム、およびプロタミンの亜鉛塩が含まれる。これらは当該技術分野で周知の方法により調製される。また、この用語は、非毒性の酸付加塩を含み、これは一般的には、本明細書中で開示される修飾されたカルシトニン遺伝子関連ペプチドアゴニストを適切な有機酸または無機酸と反応させることにより調製される。代表的な塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナプシル酸塩などが挙げられる。したがって、この用語は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などのような無機酸と、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などのような有機酸とで形成された、遊離の塩基の生物学的有効性および特性を保持しており、かつ生物学的にもまた別の意味での望ましくないものではない、そのような塩をいう。プロドラッグとしての薬学的に許容され得る塩の記述については、Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｈ．ｅｄ．，１９８５  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍを参照のこと。
【００４１】
本明細書中で使用される場合は、本明細書中で開示される組成物に適用される「治療有効量または薬学的有効量」は、所望される生物学的結果を誘導するために十分な組成物の量をいう。その結果は、疾患の兆候、症候、または原因の軽減、あるいは、生物学的システムの任意の他の所望される変更であり得る。
【００４２】
本明細書中で開示されるペプチド化合物のアミノ末端および／またはカルボキシ末端は、修飾されていない水素であり得る。あるいは、ペプチド化合物のアミノ末端および／またはカルボキシ末端は、誘導基で修飾され得る。ペプチド化合物のＮ末端に存在し得るアミノ誘導基としては、アセチル、アリール、アラルキル、アシル、エポキシスクシニル、およびコレステリル基が挙げられる。ペプチド化合物のＣ末端に存在し得るカルボキシ誘導基としては、アルコール、アルデヒド、エポキシコハク酸塩、酸ハロゲン化物、カルボニル、ハロメタン、ジアゾメタン基、およびカルボキサミドが挙げられる。好ましい実施形態では、アミノ末端は修飾されていない水素であり、カルボキシ末端はカルボキサミド誘導基で修飾される。
【００４３】
標準的なアミノ酸についての一文字の略記および三文字の略記（括弧内）が表２に提供される。
【表２】
0006538682.tif 000003
【００４４】
生化学命名に関するＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会（ＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）（ＪＣＢＮ）によるアミノ酸およびペプチドについての学名と記号体系は、以下の文献の中で公開されている。Ｂｉｏｃｈｅｍ. Ｊ., １９８４, ２１９, ３４５−３７３； Ｅｕｒ. Ｊ. Ｂｉｏｃｈｅｍ., １９８４, １３８, ９−５ ３７； １９８５, １５２, Ｉ； １９９３, ２１３, ２； Ｉｎｔｅｒｎａｔ. Ｊ. Ｐｅｐｔ. Ｐｒｏｔ. Ｒｅｓ., １９８４, ２４,  ｐ ８４以降；Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ., １９８５, ２６０, １４−４２； Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ. Ｃｈｅｍ., １９８４, ５６, ５９５−６２４； Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ, １９８５, １６, ３８７−４１０； Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ, ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ, Ｐｏｒｔｌａｎｄ Ｐｒｅｓｓ, １９９２, ｐａｇｅｓ ３９−６９。
【００４５】
アミノ酸は、本明細書中では多くの場合、通常の三文字のコードおよび／または一文字のコードにより記載される。タイプミスが原因で一般的に使用されるコードから逸脱している場合は、一般的に使用されるコードを適用する。
【００４６】
本明細書中で同定されたポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列をアラインし、必要であれば、最大のパーセント配列同一性を達成するためのギャップを導入した後の、そしていずれの保存的置換も配列同一性の一部とはみなさない、特異的なポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補の配列中のアミノ酸残基の百分率と定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＣｌｕｓｔａｌＷ２、Ｋａｌｉｇｎ、ＭＡＦＦＴ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような一般的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当業者の能力の範囲内である様々な方法で達成され得る。当業者は、比較する配列の全長にわたり最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。
【００４７】
ペプチドの調製
固相合成
本明細書中で記載されるカルシトニン遺伝子関連ペプチドアゴニストは、例えば、標準的な固相技術を使用することにより、当該分野で公知の従来法により調製され得る。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６３  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（その全体が参照により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと。
【００４８】
これらの固相ペプチド合成手順は当該分野で周知であり、Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，１９８４  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ  ２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙにより、およびＭ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，１９９３，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  Ｅｄ，，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによりさらに記載されている。
【００４９】
Ｃ末端の修飾
本発明のＣＧＲＰアゴニストは、好ましくは、Ｃ末端アミドを含む。ここでは、Ｃ末端カルボキシル基がアミド−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４によって置き換えられ、式中、Ｒ３およびＲ４は、好ましくは水素（Ｈ）であるが、いずれかが、または両方が、例えば、Ｃ末端アミドを酵素分解から保護するため、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏでペプチド化合物の半減期を延長するために選択される官能基であり得る。しかしただし、そのような官能基は、ペプチド化合物のＣＧＲＰ受容体に対する結合を妨害しない、あるいは、そのような結合を可能にするようにｉｎ  ｖｉｖｏで修飾または除去される。そのような官能基は、当業者に周知である。例えば、Ｋａｈｎｓ，Ａ．ａｎｄ  Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｈ．１９９１  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８（１２）：１５３３−１５３８を参照のこと。そのようなＣ末端アミドの合成のための技術もまた当業者に周知である。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本明細書中で開示され、記載されるようなカルシトニン遺伝子関連ペプチドアゴニストもまた、当該分野で周知である組換えＤＮＡ技術により調製され得る。そのような組換えにより生産されたＣＧＲＰペプチドアゴニストは、例えば、酸からアミドへの酵素による変換を含む、当該分野で周知の技術を使用した組換え生産後に、例えば、Ｃ末端カルボキシル基をアミドで置き換えるためにさらに修飾され得る。
【００５１】
薬理学的処方物
本発明のＣＧＲＰペプチドアゴニストを含有している組成物は、予防的処置および／または治療的処置のために投与され得る。治療的用途においては、組成物は、上記のような疾患にすでに罹患している患者に対して、疾患の症候および／またはその合併症を治癒させるまたは少なくとも部分的に停止させるもしくは軽減するために十分な量で投与される。これを達成するために適している量は、「治療有効量」または「治療有効用量」と定義される。この使用に有効な量は、例えば、患者の疾患の重篤度、ならびに患者の体重および全身状態に依存し、当業者により容易に決定され得る。
【００５２】
予防的用途においては、本明細書中で開示される化合物を含有している組成物が、特定の疾患に罹患しやすいかまたは別の点で特定の疾患のリスクがある患者に投与され、組成物は疾患を防ぐ、遅らせる、または疾患の重篤度を下げるために十分である。そのような量は、「予防有効量」または「予防有効用量」と定義される。この使用でもまた、正確な量は、例えば、患者の健康状態および体重に依存し、当業者により容易に決定され得る。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本発明の化合物の治療有効量が、インスリン耐性、２型真性糖尿病、高血圧症、肥満、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症および／または血栓症に罹患している被験体（例えば、患者または動物）に投与される。本発明の化合物の投与のための投与量範囲は、治療効果を生じるために十分に大きい投与量範囲である。
【００５４】
いくつかの実施形態には、有効成分として、少なくとも１種の本明細書中で開示されるペプチドを、薬学的担体または希釈剤と組み合わせて含有している薬学的組成物が含まれる。これらの薬学的組成物は、当業者に公知であるような任意の手段により投与され得、これには、経口、肺、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内、もしくは皮下注入）、吸入（微細粉末製剤を介して、もしくはエアロゾル）、経皮、鼻内、または舌下の投与経路が含まれるが、これらに限定されるわけではなく、そして、各投与経路に適切な投薬形態に処方され得る。例えば、１９９３年１２月２３日に公開されたＢｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ特許公開番号第ＷＯ９３／２５２２１号；１９９４年８月１８日に公開されたＰｉｔｔ，ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ特許公開番号第ＷＯ９４／１７７８４号；および１９９４年９月７日に公開されたＰｉｔｔ，ｅｔ  ａｌ．欧州特許出願番号６１３，６８３号（これらのそれぞれが、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと。
【００５５】
同様に、適切な投与経路は当業者に公知であり、これには例えば、経口、経粘膜、または局所；非経口送達（筋肉内、皮下、静脈内、脊髄内注射、髄腔内、腹腔内、鼻内、または眼内注射、ならびに針を用いない皮下送達を含む）が含まれ得るが、これらに限定されるわけではない。化合物はまた、予め決定された速度での長期投与、および／または時限式拍動性投与（ｔｉｍｅｄ，ｐｕｌｓｅｄ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）のための、持続性放出型投薬形態または徐放型投薬形態（デポー注射、浸透圧ポンプ、経皮（電気移送式を含む）パッチなどを含むがこれらに限定されるわけではない）でも投与され得る。
【００５６】
本発明の実施形態の薬学的組成物は、それ自体が公知である様式で、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠を作ること（ｄｒａｇｅｅ−ｍａｋｉｎｇ）、湿式粉砕、乳化、カプセル化、封入、または錠剤成形のプロセスにより、製造され得る。
【００５７】
したがって、本発明の実施形態にしたがって使用される薬学的組成物は、薬学的に使用され得る、意図される投与経路に適している調製物への活性化合物の処理を容易にする賦形剤および助剤を含有している１種類以上の生理学的に許容され得る担体を使用して、従来の様式で処方され得る。任意の周知の技術、担体、および賦形剤が、適切に、かつ当該分野で理解されているように、例えば、上記Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ中のように使用され得る。
【００５８】
正確な投与量は、薬物ごと、および疾患ごとの基準で決定されるが、ほとんどの場合、投与量に関していくらかの一般化が行われ得、薬学分野の当業者は、本明細書中の開示から、適切な容量を日常的に行われている技術を使用して決定できることを理解するであろう。通常は、本発明の化合物についての用量は、約１０−１５Ｍ〜１０−５Ｍ（例えば、筋肉、血液、血清または血漿の１つ以上において測定した場合）の濃度に入るであろう。
【００５９】
所望される本発明の化合物のレベルまたは濃度に達するように動物に投与される本発明の化合物の量は、化合物の半減期（例えば、血清半減期）、ならびに投与の頻度および態様のような、開業医に周知の多数の要因に依存するであろう。説明のためであって、限定のためではないが、本発明の化合物の用量は、１用量あたり２０ピコグラム〜１グラムまでの範囲、より多くの場合は、３ナノグラム〜５００マイクログラムの間の範囲で投与され得る。様々な実施形態では、単位投与量（いくつかの場合は、１日量）は、約１００マイクログラム未満、約１０マイクログラム未満、約１マイクログラム未満、約１００ナノグラム未満、約１０ナノグラム未満、約１ナノグラム未満、約１００ピコグラム未満、または約１０ピコグラム未満である。
【００６０】
本発明の化合物の他の範囲は、最初の用量応答曲線によるデータおよび日常的に行われる方法により得ることができる他のデータに基づいて熟練した開業医に明らかであろう。薬学的に許容され得る塩の投与の場合は、投与量は遊離の塩基として計算され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、１日あたり１〜４回投与されるか、または１回の急性投与として投与される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、例えば、１週間以上、または数か月間もしくは数年間にわたる持続的治療の期間にわたり投与されるであろう。
【００６１】
投薬量および間隔は、調節作用または最小有効濃度（ＭＥＣ）を維持するために十分な活性部分の血漿レベルを提供するように個別に調整され得る。ＭＥＣは化合物それぞれについて変わるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのデータから概算することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投与量は、個体の特性および投与経路に応じて様々であろう。しかし、ＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを使用して、血漿濃度を決定することができる。
【００６２】
投与間隔もまた、ＭＥＣ値を使用して決定することができる。組成物は、１０〜９０％の時間について、好ましくは、３０〜９０％の間、および最も好ましくは５０〜９０％の間の時間について、ＭＥＣを上回る血漿レベルを維持するレジメンを使用して投与されるべきである。
【００６３】
本発明の化合物は、例えば、代謝性または心臓血管疾患／障害もまた処置する他の活性物質とともに処方され得るか、あるいはそれと同時に投与され得る。
【００６４】
本明細書全体を通じて、特定の化合物についての任意の詳述に、その化合物およびその任意の（他の）薬学的に許容され得る塩が含まれると理解されるものとする。
【００６５】
他の有用性
本明細書中で記載される化合物は、ＣＧＲＰの生物学的役割を理解するための固有のツールとしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで有用である。本発明の化合物がそのような開発を容易にするための構造と活性との間の関係についての重要な情報を提供するので、本発明の化合物はまた、ＣＧＲＰ受容体に結合し、ＣＧＲＰ受容体を活性化させる他の化合物の開発においても有用である。
【００６６】
実施例
以下の実施例を本発明の実施形態をさらに説明するために提供する。これらは、実施形態の範囲の限定を意味するものではない。
【００６７】
実施例１
細胞をベースとするＧＰＣＲプロファイリングアッセイ。本発明の代表的なＣＧＲＰアゴニストペプチドＡＣＸ０１７（（配列番号１）−ＮＨ２）を、細胞をベースとするアッセイにおいてＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に対してプロファイルして、そのアゴニスト活性と用量応答を決定した。ＣＧＲＰおよびアドレノメジュリン受容体のスクリーニングの結果を以下に提供する。アッセイは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡによるＳｅｌｅｃｔＳｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ＧＰＣＲ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓを使用して行った。
【００６８】
ＣＡＬＣＲＬ：ＲＡＭＰ１−ＣＲＥ−ｂｌａ  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ−アゴニストのスクリーニング（ＣＧＲＰ受容体）
ＣＡＬＣＲＬ：ＲＡＭＰ１−ＣＲＥ−ｂｌａ  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞を解凍し、アッセイ培地（ＤＭＥＭ、１０％の透析したＦＢＳ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）、０．１ｍＭのＮＥＡＡ、１００Ｕ／ｍＬ／１００μｇ／ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中に、３１２，５００細胞／ｍＬの濃度になるように再懸濁した。３２μＬの細胞懸濁液（１０，０００細胞）を、３８４ウェルのＰｏｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓｉｎｅアッセイプレートの各ウェルに添加した。アッセイ培地中の細胞を、加湿インキュベーター中で３７℃／５％のＣＯ２で、プレート中で１６〜２４時間インキュベートした。ＣＧＲＰまたはＡＣＸ０１７の４μＬの１０×段階希釈物をプレートの適切なウェルに添加した。４μＬのアッセイ培地を全てのウェルに添加して、アッセイの最終容量を４０μＬとした。プレートを加湿インキュベーター中で、３７℃／５％のＣＯ２で５時間インキュベートした。８μＬの１μΜのＳｕｂｓｔｒａｔｅ＋Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｄ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを各ウェルに添加し、プレートを室温で２時間インキュベートした。プレートを蛍光プレートリーダーで読み取った。
【００６９】
ＣＡＬＣＲＬ：ＲＡＭＰ３−ＣＲＥ−ｂｌａ  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ−アゴニストのスクリーニング（アドレノメジュリン２受容体）
ＣＡＬＣＲＬ：ＲＡＭＰ３−ＣＲＥ−ｂｌａ  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞を解凍し、アッセイ培地（ＤＭＥＭ、１０％の透析したＦＢＳ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）、０．１ｍＭのＮＥＡＡ、１００Ｕ／ｍＬ／１００μｇ／ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中に、３１２，５００細胞／ｍＬの濃度になるように再懸濁した。３２μＬの細胞懸濁液（１０，０００細胞）を３８４ウェルのＰｏｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓｉｎｅアッセイプレートの各ウェルに添加した。アッセイ培地中の細胞を、加湿インキュベーター中で３７℃／５％のＣＯ２で、プレート中で１６〜２４時間インキュベートした。アドレノメジュリンまたはＡＣＸ０１７の４μＬの１０×段階希釈物をプレートの適切なウェルに添加した。４μＬのアッセイ培地を全てのウェルに添加して、アッセイの最終容量を４０μＬとした。プレートを加湿インキュベーター中で、３７℃／５％のＣＯ２で５時間インキュベートした。８μＬの１μＭのＳｕｂｓｔｒａｔｅ  ＋  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｄ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを各ウェルに添加し、プレートを室温で２時間インキュベートした。プレートを蛍光プレートリーダーで読み取った。
【００７０】
以下の対照を、それぞれの個々の細胞株について各プレート上で行った。
【００７１】
全長のアゴニストの対照。全長のアゴニストの対照には、０．１％のＤＭＳＯ、細胞、および最大濃度の既知のアゴニストを含めた。全長のアゴニストの対照は、アッセイの上端、すなわち、１００％の活性化を決定するために使用した。
【００７２】
アゴニストを含まない対照。アゴニストを含まない対照には、０．１％のＤＭＳＯ、細胞、およびアゴニストの代わりのアッセイ培地を含めた。アゴニストを含まない対照は、アッセイの下端、すなわち、０％の活性化を決定するために使用した。
【００７３】
細胞を含まない対照。細胞を含まない対照には、０．１％のＤＭＳＯおよびアッセイ培地を含めた。これは、クマリンおよびフルオレセインの両方の波長についてバックグラウンドの蛍光を決定するために使用した。この値をバックグラウンドの減算に使用した。
【００７４】
既知のアゴニスト。既知のアゴニストの滴定を各細胞株についてそれぞれのプレート上で行い、細胞株が確実に、予め決定した予想されるＥＣ５０／ＩＣ５０範囲内で活性化されるようにした。
【００７５】
結果。図１に示すように、ＡＣＸ０１７は、ＣＧＲＰ受容体に対してアゴニスト活性を示し、１０５ｎＭのおおよそのＥＣ５０濃度を有していた。対照的に、図２は、ＡＣＸ０１７がアドレノモジュリン２（ＡＭ２）受容体を活性化しなかったことを示している。このように、ＡＣＸ０１７が、用量依存性の応答において、ＣＧＲＰ受容体に対する結合および機能的特異性を示すことが明らかにされた。
【００７６】
実施例２
食物摂取の実験。数日間の処置の間および処置を超えての両方で、食物摂取に対する本発明のＣＧＲＰアゴニストの効果を経時的に評価した。研究は、Ｅｘｐｌｏｒａ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡにより行い、動物をそのＩＡＣＵＣ基準にしたがって処置した。
【００７７】
Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（雄、４００ｇの体重（約１２〜１４週齢））を、少なくとも７日間、飼育環境および１２時間の明／暗の逆周期（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃｙｃｌｅ）（一晩中明るい／日中は暗い）に順応させた。動物は、目的を持って飼育した（ｐｕｒｐｏｓｅ−ｂｒｅｄ）、特定の病原体を含まない、研究の開始時には実験が行われたことがない動物であった。動物には、研究の最初から終わりまでを通じて、６０％ｋｃａｌ％ｆａｔの特別なＲｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ（Ｄ１２４９２，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ，Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）と酸性水（ｐＨ２．５〜３．０）に自由に接近できるようにした。研究の開始時の体重は少なくとも４５０ｇであった。１）顕著な低体重、２）重篤な脱水症状、または３）喧嘩による創傷があった動物は研究から除外した。
【００７８】
０日目に、１２匹の動物を、群の間で同等の平均体重となるように無作為に２つの群（試験群および対照群）に分けた。動物に、ＡＣＸ０１７（（配列番号１）−ＮＨ２）（試験群）または媒体（対照群）のいずれかを用いて、４日間にわたり毎日１回の腹腔内注射を投与した。毎日、投与は、明期が終わる前に行った。ＡＣＸ０１７は、１０％のＤＭＳＯ水溶液中で１５０μｇ／ｋｇで投与した。ＡＣＸ０１７および媒体の両方を１ｍＬ／ｋｇの用量として送達した。
【００７９】
食物摂取を、投与前、および投与後２時間、４時間、６時間、および８時間で測定した。食物摂取は、１日目、２日目、３日目、および４日目に明期が終わる前に、ならびに投与後２時間、４時間、６時間、および８時間で食物用ホッパーの重量を測定することにより測定した。
【００８０】
投与後のそれぞれの時点での試験群および対照群のそれぞれについての食物摂取の平均を決定した。試験期間（８時間）全体にわたる各群についての累積食物摂取を、１日〜４日のそれぞれについて、それぞれ図１〜４にグラフの形態で提供する。
【００８１】
４時間での対照群と比較して、その期間に摂取した食物が少なかったことにより明らかであるように、一貫して、ＡＣＸ０１７は、投与後少なくとも約４時間の間、試験群において食欲を抑制した。このように、ＡＣＸ０１７（（配列番号１）−ＮＨ２）は、示したように被験体において食欲の抑制を生じることができる。
【００８２】
本明細書中で引用した全ての文献はそれらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
【００８３】
本明細書中での実質的に全ての複数形および／または単数形の用語の使用に関して、当業者は、内容および／または用途に適切である場合は、複数形から単数形に、ならびに／あるいは単数形から複数形に変換できる。様々な単数形／複数形の交換は、明確化の目的のために本明細書中で明白に示され得る。
【００８４】
一般的には、本明細書中で、特に添付の特許請求の範囲（例えば、添付の特許請求の範囲の主要部）において使用される用語が、「オープンな（ｏｐｅｎ）」用語（例えば、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は「含むがこれに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」と解釈されるべきであり、用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は「少なくとも有する（ｈａｖｉｎｇ  ａｔ  ｌｅａｓｔ）」と解釈されるべきであり、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は「含むがそれらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｅｓ  ｂｕｔ  ｉｓ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」と解釈されるべきであるなど）として一般的に意図されることが当業者に理解されるであろう。挿入される請求項の記述の明確な数が意図される場合は、そのような意図がその請求項の中で明白に記載され、そのような記述が存在しなければそのような意図が存在しないことが当業者によりさらに理解されるであろう。例えば、理解の助けとして、以下の添付の特許請求の範囲に、前置きとしての表現「少なくとも１」および「１以上」の使用が、請求項の記述を挿入するために含まれ得る。しかし、そのような表現の使用は、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による請求項の記述の挿入が、そのように挿入された請求項の記述を含む任意の特定の請求項を、同じ請求項が前置きとしての表現「１以上」または「少なくとも１」と、「ａ」または「ａｎ」のような不定冠詞（例えば、「ａ」および／または「ａｎ」は、「少なくとも１」または「１以上」を意味すると解釈されるものとする）を含む場合でもなお、１つのそのような記述のみを含む実施形態に限定することを暗に意味するとは解釈されるべきでない。同じことが、請求項の記述を挿入するために使用される定冠詞の使用についても当てはまる。加えて、挿入された請求項の記述の具体的な数が明白に記載されている場合もなお、当業者は、そのような記述が少なくとも記載される数を意味すると解釈されるべきであることを理解するであろう（例えば、他の修飾を伴わない「２つの記述」というありのままの記述は、少なくとも２つの記述、または２つ以上の記述を意味する）。さらに、「Ａ、Ｂ、およびＣなどの少なくとも１つ」と同様の慣習が使用される場合は、一般的には、そのような構成は、当業者がその慣習を理解している意味で意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、およびＣの少なくとも１つを有しているシステム」は、Ａだけ、Ｂだけ、Ｃだけ、ＡとＢを一緒に、ＡとＣを一緒に、ＢとＣを一緒に、ならびに／あるいはＡ、Ｂ、およびＣを一緒に有しているシステムなどを含むが、これらに限定されるわけではない）。「Ａ、Ｂ、またはＣなどの少なくとも１つ」と同様の慣習が使用される場合は、一般的には、そのような構成は、当業者がその慣習を理解している意味で意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、またはＣの少なくとも１つを有しているシステム」は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢを一緒に、ＡとＣを一緒に、ＢとＣを一緒に、ならびに／あるいはＡ、Ｂ、およびＣを一緒に有しているなどのシステムを含むが、これらに限定されるわけではない）。２つ以上の代替えの用語を示している事実上全ての離接語および／または表現は、明細書、特許請求��範囲、または図面のいずれの中であってとしても、これらの用語のうちの１つ、これらの用語のいずれか、またはこれらの用語の両方を含む可能性を意図すると理解されるべきであることが、当業者にさらに理解されるであろう。例えば、表現「ＡまたはＢ」は、「Ａ」または「Ｂ」、あるいは「ＡおよびＢ」の可能性を含むと理解されるであろう。
【００８５】
加えて、本開示の特徴または態様がマーカッシュ形式の請求項のグループに関して記載されている場合は、当業者は、それにより本開示がまたマーカッシュ形式の請求項のグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーの部分集団に関しても記載されていることを理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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