(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）分離された細胞を下記化学式（１）で表されるジペノサイド７５で処理した対照群と、分離された細胞をミトコンドリア活性の促進が予想される候補物質で処理した実験群をそれぞれ得るステップと、
（ｂ）前記対照群及び前記実験群において細胞内ＡＴＰ生成量又は細胞内ミトコンドリア膜電位をそれぞれ測定するステップと、
（ｃ）前記実験群において測定された細胞内ＡＴＰ生成量又は細胞内ミトコンドリア膜電位が前記対照群において測定された細胞内ＡＴＰ生成量又は細胞内ミトコンドリア膜電位と同等又はより高いレベルである候補物質を選択するステップとを含む、ミトコンドリア活性促進剤のスクリーニング方法。
【化１】
0006556837.tif 000003
【請求項２】
前記分離された細胞はインスリン分泌細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法の実施において使用され、下記化学式（１）で表されるジペノサイド７５を含むミトコンドリア活性促進剤スクリーニング用組成物。
【化２】
0006556837.tif 000004
【請求項４】
請求項１に記載の方法の実施において使用され、請求項３に記載の組成物を含むミトコンドリア活性促進剤スクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミトコンドリア活性促進剤のスクリーニング方法（Method for screening activator of mitochondria activity）に関し、より具体的にはジペノサイドで処理された細胞を用いてミトコンドリア活性促進剤をスクリーニングする方法、前記ジペノサイドを含むミトコンドリア活性促進剤スクリーニング用組成物、及び前記組成物を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアはほとんどの真核細胞に存在する細胞小器官である。ミトコンドリアの主機能の１つは酸化的リン酸化であり、上記過程によりブドウ糖や脂肪酸などの燃料物質由来のエネルギーがＡＴＰに変換され、それが様々なエネルギー要求生合成及び他の代謝活性を推進させる上で用いられる。ミトコンドリアは核のゲノムＤＮＡとは区別される独自のＤＮＡを含み、前記ミトコンドリアのＤＮＡは約１６，０００塩基対を有する環状のＤＮＡであることが知られている。また、前記ミトコンドリアのＤＮＡは核のＤＮＡとは異なり、独自の修復機序（repair mechanism）がなく、ＤＮＡを保護する役割を果たすヒストンタンパク質がないので、細胞の外部環境又は内部環境により変異しやすい。前記変異は、多くの場合ミトコンドリア活性を抑制する効果をもたらすが、部分的にはミトコンドリア活性を促進させる効果をもたらすこともある。
【０００３】
前記ミトコンドリアのＤＮＡが変異してミトコンドリア活性が抑制されると、ミトコンドリア膜電位異常による膨潤、活性酸素種やフリーラジカルなどによる酸化的ストレスによる機能異常、遺伝的要因による機能異常、及びミトコンドリアのエネルギー生成のための酸化的リン酸化機能の欠陥による機能異常が発生し、代謝性疾患、退行性脳疾患、肝機能異常、筋疾患、免疫疾患などが誘発され得ることが知られている。よって、ミトコンドリア活性抑制により誘発される疾患を治療するための様々な製剤が開発されている（特許文献１、２、３、４など）。
【０００４】
一方、前記ミトコンドリアのＤＮＡが変異してミトコンドリア活性が促進されると、細胞内で過剰にＡＴＰが生成されて細胞機能異常が誘発され得る。これにより誘発され得る疾患としては、関節リウマチをはじめとする様々な自己免疫疾患、各種癌疾患などが挙げられる。ミトコンドリア活性抑制による疾患についてはミトコンドリア活性を促進させる観点から様々な研究が行われているが、未だミトコンドリア活性抑制を改善するのに適した促進剤は開発されていない現状である。これは、ミトコンドリア機能促進活性を示す様々な候補物質が見出されたが、実質的にミトコンドリア機能を促進させることができなかったからである。よって、実質的にミトコンドリア機能を促進させることのできる促進剤を見出す方法の開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】韓国登録特許第１０４８７６６号公報
【特許文献２】韓国公開特許第２００５−０１１７３１３号公報
【特許文献３】韓国公開特許第２０１３−００６４７６１号公報
【特許文献４】韓国公開特許第２０１４−００１２４５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
こうした背景の下、本発明者らは、実質的にミトコンドリア機能を促進させることのできる促進剤を見出す方法を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、分離された細胞においてミトコンドリア活性を促進させることのできるジペノサイド７５を基準物質として用いて、前記ジペノサイド７５と同等又はより高いレベルにミトコンドリア活性を促進させる候補物質をミトコンドリア機能促進剤として用いる方法を開発し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ジペノサイドで処理された細胞を対照群として用いて、ミトコンドリア活性促進剤をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記ジペノサイドを含むミトコンドリア活性促進剤スクリーニング用組成物を提供することを目的とする。
【０００８】
さらに、本発明は、前記組成物を含むミトコンドリア活性促進剤スクリーニング用キットを提供することを目的とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のミトコンドリア活性促進剤をスクリーニングする方法を用いると、実質的にミトコンドリア活性を促進させることのできる製剤を効果的に見出すことができるので、ミトコンドリア活性抑制による疾患の治療剤の開発に広く活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ジペノサイド７５、ジンセノサイドＦ１、ジンセノサイドＲｇ３、ジンセノサイドＲｂ２又はジンセノサイドＲｂ３での処理による細胞内のＡＴＰ量の変化を示すグラフである。
【図２】ジペノサイド７５、ジンセノサイドＦ１、ジンセノサイドＲｇ３、ジンセノサイドＲｂ２又はジンセノサイドＲｂ３での処理による細胞内のミトコンドリア膜電位の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明者らは、実質的にミトコンドリア機能を促進させることのできる促進剤を見出す方法を開発すべく様々な研究を行っていたところ、ジペノサイドに着目するようになった。サポニン系化合物の一種であるジペノサイドは、高麗人参だけでなく、アマチャヅル、ツルアマチャなどの植物に含まれることが知られている。また、細胞内で様々な活性を示すジンセノサイドとは異なり、ジペノサイドは細胞内で抗酸化活性を示すだけであり、その他の細胞内活性は知られていない。
【００１２】
本発明者らは、分離された細胞をジペノサイドの一種であるジペノサイド７５で処理し、ミトコンドリアから産生されるＡＴＰ生成量の変化を測定した結果、ジペノサイド７５での処理によるＡＴＰ生成量の増加が確認されたので、前記ジペノサイド７５が実質的にミトコンドリア機能を促進させることのできる促進剤であることが分かった。
【００１３】
よって、ジペノサイドで処理した細胞を対照群として用いて、ミトコンドリア機能を促進させることが期待される候補物質をスクリーニングすると、実質的にミトコンドリア機能を促進させることのできる促進剤をスクリーニングできることが確認された。このようにジペノサイドを用いてミトコンドリア活性促進剤をスクリーニングする方法は、従来から公知のものではなく、本発明者によって最初に開発されたものである。
【００１４】
上記目的を達成するために、本発明の一態様は、（ａ）分離された細胞をジペノサイドで処理した対照群と、分離された細胞をミトコンドリア活性の促進が予想される候補物質で処理した実験群をそれぞれ得るステップと、（ｂ）前記対照群及び前記実験群においてミトコンドリア活性をそれぞれ測定するステップと、（ｃ）前記実験群において測定されたミトコンドリア活性が前記対照群において測定されたミトコンドリア活性と同等又はより高いレベルである候補物質を選択するステップとを含む、ミトコンドリア活性促進剤のスクリーニング方法を提供する。
【００１５】
ここで、前記分離された細胞は、ジペノサイドによってミトコンドリア活性が促進されるものであれば特にこれに限定されるものではないが、一例としてインスリン分泌細胞が挙げられる。前記ミトコンドリア活性は、ミトコンドリアから生成されるＡＴＰの生成量、ミトコンドリアＤＮＡレベルなどを用いて測定することができる。例えば、分離された細胞においてジペノサイドで処理してミトコンドリア活性が向上すると、それに応じて前記細胞において測定されるＡＴＰの生成量が増加するので、前記対照群及び前記実験群の細胞において生成されるＡＴＰの生成量を測定することにより、ミトコンドリア活性を測定することができる。
【００１６】
前記ミトコンドリア活性を測定する方法には前述した方法以外にも当業界で公知のあらゆる方法を用いることができ、当業者が必要に応じて前記公知の方法を選択的に用いることができることは言うまでもない。
【００１７】
本発明における「ジペノサイド（gypenoside）」とは、「ギノサポニン（gynosaponin）」ともいい、アマチャヅル（Gynostemma pentaphyllum）及びツルアマチャに含まれるサポニン化合物の一種であるダンマラン系（dammarane type）サポニンを意味する。前記ジペノサイドは、脂質代謝改善作用、心血管系疾患予防作用、血糖降下作用、中枢神経系作用、抗癌作用、血小板凝集阻害作用、強壮作用などの効能を示すことが知られており、細胞内では抗酸化効果を示すことが知られている。
【００１８】
本発明において、前記ジペノサイドはミトコンドリア活性を向上させる促進剤として用いることができ、前記ジペノサイドはミトコンドリア活性を向上させる効果を発揮するものであれば特にこれらに限定されるものではないが、一例としてジペノサイド１、ジペノサイド３、ジペノサイド４、ジペノサイド５、ジペノサイド８、ジペノサイド１７、ジペノサイド４８、ジペノサイド７５などを単独で又は組み合わせて用いることができ、他の例として化学式（１）のジペノサイド７５を用いることができる。
【００１９】
【化１】
0006556837.tif 000002
本発明の一実施例によれば、インスリン分泌細胞であるＩＮＳ−１細胞をジペノサイド７５で処理して２時間培養し、次いで前記細胞において生成されたＡＴＰ量を測定した結果、ジペノサイド７５で処理していない対照群細胞に比べて、ＡＴＰ生成量が増加することが確認された（図１）。
【００２０】
本発明の他の態様は、ジペノサイドを含むミトコンドリア活性促進剤スクリーニング用組成物及び前記組成物を含むミトコンドリア活性促進剤スクリーニング用キットを提供する。
【００２１】
前記組成物及び前記キットに含まれるジペノサイド７５は細胞内のミトコンドリア活性を向上させることができるので、前記組成物及び前記キットはミトコンドリア活性促進剤をスクリーニングするための対照群を作製するために用いられる。
【００２２】
特に、前記キットは、ジペノサイド７５だけでなく、候補物質がミトコンドリア活性を抑制するか否か確認する方法に適した１種類又はそれ以上の他の構成成分組成物、溶液又は装置を含んでもよい。例えば、ジペノサイド７５によりミトコンドリア活性が向上する細胞、前記細胞の培養に用いられる容器、前記細胞の培養に用いられる培地、ＡＴＰ生成量測定に用いられる適切な緩衝液、ＡＴＰ生成量測定に用いられる蛍光物質（ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣなど）などをさらに含んでもよい。
【００２３】
具体的な一例として、本発明のミトコンドリア活性促進剤スクリーニング用キットは、ミトコンドリアで生成されるＡＴＰ量を測定するルシフェラーゼ測定法を行うために必要な必須要素を含むキットであってもよい。すなわち、前記キットは、細胞破砕用緩衝液、ルシフェラーゼ、前記ルシフェラーゼの蛍光発色を誘導する基質、前記ルシフェラーゼの蛍光発色に必要な緩衝液、テストチューブ又は他の適切なコンテナなどを含んでもよい。
【００２４】
他の例として、本発明のミトコンドリア活性促進剤スクリーニング用キットは、ＰＣＲを行ってミトコンドリアＤＮＡを増幅するために必要な必須要素を含むキットであってもよい。すなわち、前記キットは、前記ミトコンドリアＤＮＡに対して特異的なそれぞれのプライマー対、テストチューブ又は他の適切なコンテナ、反応緩衝液（ｐＨ及びマグネシウム濃度は様々である）、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、Ｔａｑポリメラーゼや逆転写酵素などの酵素、ＤＮａｓｅ、ＲＮＡｓｅ抑制剤、ＤＥＰＣ水（DEPC-water）、滅菌水などを含んでもよい。また、定量対照区として用いられる遺伝子に特異的なプライマー対を含んでもよい。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２６】
実施例１：  ジペノサイド７５のミトコンドリア活性化促進効果
ミトコンドリアの機能が低下した場合、インスリンシグナル伝達の阻害により糖尿病の原因となることがある。よって、ジペノサイド７５のミトコンドリア機能活性化効果を確認するために、ジペノサイド７５で処理し、その後増加したＡＴＰ量とミトコンドリア膜電位を測定した。
【００２７】
まず、インスリン分泌細胞であるＩＮＳ−１細胞を細胞培養器で培養（３７℃，５％ＣＯ２，ＲＰＭＩ培地，１０％ＦＢＳ）し、その後１０μＭのジペノサイド７５、ジンセノサイドＦ１、ジンセノサイドＲｇ３、ジンセノサイドＲｂ２又はジンセノサイドＲｂ３で２時間処理し、細胞内のＡＴＰ量とミトコンドリア膜電位を測定した。ここで、対照群としてはＤＭＳＯで処理した細胞を用いた。
【００２８】
次に、細胞内のＡＴＰ量をルシフェラーゼにより測定した。ルシフェラーゼの活性化による蛍光発色はＡＴＰ量に依存するので、前記蛍光発色のレベルを測定することにより、細胞内のＡＴＰ量を測定することができる。
【００２９】
具体的には、上記各物質で処理されたＩＮＳ−１細胞を凍結・解凍及び超音波処理により破砕して細胞破砕液を得て、得られた前記細胞破砕液にルシフェラーゼ及びルシフェリンを加えて蛍光発色を誘導し、次いで蛍光発色レベルを定量し、比較した（図１）。
【００３０】
図１はジペノサイド７５、ジンセノサイドＦ１、ジンセノサイドＲｇ３、ジンセノサイドＲｂ２又はジンセノサイドＲｂ３での処理による細胞内のＡＴＰ量の変化を示すグラフである。図１から分かるように、対照群に比べて、ジペノサイド７５で処理すると細胞内のＡＴＰ量が５０％増加することが確認された。
【００３１】
最後に、ミトコンドリア膜電位をＴＭＲＭ染色により測定した。ミトコンドリア膜電位に比例してＴＭＲＭ染色レベルが増加するので、前記ＴＭＲＭ染色レベルを測定することにより、細胞内のミトコンドリア膜電位を測定することができる。
【００３２】
具体的には、上記各物質で処理されたＩＮＳ−１細胞をＴＭＲＭで染色し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）にかけ、前記染色レベルを定量分析し、比較した（図２）。
図２はジペノサイド７５、ジンセノサイドＦ１、ジンセノサイドＲｇ３、ジンセノサイドＲｂ２又はジンセノサイドＲｂ３での処理による細胞内のミトコンドリア膜電位の変化を示すグラフである。図２から分かるように、対照群に比べて、ジペノサイド７５で処理すると細胞内のミトコンドリア膜電位が約４０％増加することが確認された。
【００３３】
図１及び図２の結果から、ジペノサイド７５は細胞内のミトコンドリアの機能を活性化し、細胞内のＡＴＰレベルとミトコンドリア膜電位レベルを増加させることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明のミトコンドリア活性促進剤をスクリーニングする方法を用いると、実質的にミトコンドリア活性を促進させることのできる製剤を効果的に見出すことができるので、ミトコンドリア活性抑制による疾患の治療剤の開発に広く活用することができる。
【図１】
0006556837.tif 000005
【図２】
0006556837.tif 000006