(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の精製方法であって、
（ａ）生体外合成したｍＲＮＡ、未成熟中断ＲＮＡ配列及びＤＮＡ鋳型を含む不純調製物を提供することと、
（ｂ）前記ｍＲＮＡ及びＤＮＡ鋳型からの前記未成熟中断ＲＮＡ配列の分離を促進する条件下で前記不純調製物をカオトロピック剤で処理することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）により処理された不純調製物をタンジェント流濾過に付すことによってｍＲＮＡを精製することとを含み、
ステップ（ｃ）により精製した前記精製ｍＲＮＡには、未成熟中断ＲＮＡが実質的になく、前記精製ｍＲＮＡが９５％より大きい完全性を有する、
前記方法。
【請求項２】
ステップ（ｂ）が、前記カオトロピック剤の添加された前記不純調製物を室温で約５分間インキュベートすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カオトロピック剤が、尿素、チオシアン酸グアニジン、ドデシル硫酸ナトリウム、及びその組合せからなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）が、前記不純調製物に尿素を添加して約１Ｍ以上の結果的尿素濃度を達成することを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記結果的尿素濃度が、約２Ｍ以上、３Ｍ以上、４Ｍ以上、５Ｍ以上、６Ｍ以上、７Ｍ以上、８Ｍ以上、９Ｍ以上、または１０Ｍ以上である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）が、前記不純調製物にチオシアン酸グアニジンを添加して約４Ｍ以上の結果的チオシアン酸グアニジン濃度を達成することを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記結果的チオシアン酸グアニジン濃度が、約４Ｍ以上、５Ｍ以上、６Ｍ以上、７Ｍ以上、８Ｍ以上、９Ｍ以上、または１０Ｍ以上である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記タンジェント流濾過が、水性溶媒のみを用いて行われる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記タンジェント流濾過が、溶媒として水を用いて行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｃ）により精製した前記ｍＲＮＡが、未成熟中断したＲＮＡ配列及び／または生体外合成で用いた酵素試薬を１％未満含有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｃ）により精製した前記ｍＲＮＡが、未成熟中断したＲＮＡ配列及び／または生体外合成で用いた酵素試薬を０．５％未満含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｃ）により精製した前記ｍＲＮＡが、未成熟中断したＲＮＡ配列及び／または生体外合成で用いた酵素試薬を０．１％未満含有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｃ）により精製した前記ｍＲＮＡが、生体外合成で用いた未成熟中断したＲＮＡ配列及び／または酵素試薬を、アガロースゲル電気泳動法またはクロマトグラフィー法によって決定して検知できない程度に含有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記未成熟中断したＲＮＡ配列が、１５未満の塩基を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記未成熟中断したＲＮＡ配列が、約８〜１２の塩基を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
生体外合成で用いた前記酵素試薬が、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼＩ、ピロホスファターゼ、及び／またはリボヌクレアーゼ阻害薬を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
生体外合成で用いた前記酵素試薬が、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記タンジェント流濾過が、前記生体外合成したｍＲＮＡにキャップとポリＡ尾部が付加される前に行われる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記タンジェント流濾過が、前記生体外合成したｍＲＮＡにキャップとポリＡ尾部が付加された後に行われる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記タンジェント流濾過が、前記生体外合成したｍＲＮＡにキャップとポリＡ尾部が付加される前後の両方に行われる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記生体外合成したｍＲＮＡが、長さが約１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、または５ｋｂより大きい、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記生体外合成したｍＲＮＡが、安定性を向上させるように１つまたは複数の修飾を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つまたは複数の修飾が、修飾されたヌクレオチド、修飾された糖リン酸塩主鎖、５’及び／または３’非翻訳領域から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記生体外合成したｍＲＮＡが無修飾である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ｃ）により精製した前記ｍＲＮＡが、９８％より大きい完全性を有する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ｃ）により精製した前記ｍＲＮＡが、９９％より大きい完全性を有する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の製造方法であって、
ｍＲＮＡを生体外で合成することと、
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法を用いて前記生体外合成したｍＲＮＡを精製することと、
を含む前記方法。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法を用いて精製したメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）混合物であって、前記メッセンジャーＲＮＡには、未成熟中断配列が実質的になく、前記メッセンジャーＲＮＡが９５％より大きい完全性を有する、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２０１３年３月１４日出願の米国仮特許出願第６１／７８４，９９６号の利益を主張し、その文献の全体が参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
メッセンジャーＲＮＡ療法が、様々な疾患の治療に対する益々重要な方法となっている。メッセンジャーＲＮＡ療法では、その療法の必要な患者にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与することと、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を患者体内で産生させることとが必要となる。そのため、高純度で安全なｍＲＮＡ産生物を確実に産生させることが重要である。従来、ＲＮＡ精製は、典型的にスピンカラムを使用し、治療的投与及び大規模産生にとって望ましくないエタノールのような苛性溶媒または可燃性溶媒の使用を必要とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、医薬品として投与に適したｍＲＮＡをタンジェント流濾過（ＴＦＦ）に基づいて精製する改善された方法を提供する。本発明以前には、ＲＮＡ精製は、典型的にスピンカラムを使用し、治療的投与及び大規模産生にとって望ましくないエタノールのような苛性溶媒または可燃性溶媒の使用を必要とした。さらに、先行技術の方法では通常、未成熟中断物（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ａｂｏｒｔ）または「ショートマー（ｓｈｏｒｔｍｅｒ）」として知られる不完全転写物の分離ができず、それは、免疫賦活性が高いと報告されているものであり、その存在は、ｍＲＮＡの医薬品有効成分（ＡＰＩ）としての毒性及び耐用性プロファイルを大きく変更することがある。本発明は、ｍＲＮＡ産生混合物から反応物、酵素、副生物、特に、ショートマーを除去するのにタンジェント流濾過が驚くほど効果的であるという発見に部分的に基づく。本明細書に記載の通り、タンジェント流濾過を、特に、変性剤を用いた前処理と組み合わせると、未成熟に中断したＲＮＡ配列（即ち、ショートマー）も含めて、反応物、酵素、及び副生物を効果的に除去することができ、同時にｍＲＮＡの完全性も維持する。さらに驚くべきことに、本発明者らは、いずれの苛性溶媒または可燃性溶媒をも用いることなく水性緩衝液のみを溶媒として用いて、タンジェント流濾過が良好に実行できることを実証した。このようにして、本発明は、治療分野への大規模製造工程の応用から、より効果的で信頼性がありより安全なｍＲＮＡ精製方法を提供する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の精製方法であって、
（ａ）生体外合成したｍＲＮＡを含む不純調製物を変性条件に付すことと、
（ｂ）ステップ（ａ）による不純調製物から前記ｍＲＮＡをタンジェント流濾過によって精製することとを含み、
ステップ（ｂ）により精製した前記ｍＲＮＡには、生体外合成で用いた未成熟中断ＲＮＡ配列及び／または酵素試薬が実質的にない、
前記方法。
（項目２）
ステップ（ａ）が、前記不純調製物にタンパク質変性剤を添加することを含む、項目１に記載の方法。
［項目２ａ］
ステップ（ａ）が、前記タンパク質変性剤の添加された前記不純調製物を室温で約５分間インキュベートすることを含む、項目２に記載の方法。
（項目３）
前記タンパク質変性剤が、尿素、チオシアン酸グアニジン、ＫＣｌ、ドデシル硫酸ナトリウム、サルコシル、及びその組合せからなる群より選択される、項目２または２ａに記載の方法。
（項目４）
ステップ（ａ）が、前記不純調製物に尿素を添加して約１Ｍ以上の結果的尿素濃度を達成することを含む、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記結果的尿素濃度が、約２Ｍ以上、３Ｍ以上、４Ｍ以上、５Ｍ以上、６Ｍ以上、７Ｍ以上、８Ｍ以上、９Ｍ以上、または１０Ｍ以上である、項目４に記載の方法。
（項目６）
ステップ（ａ）が、前記不純調製物にチオシアン酸グアニジンを添加して約４Ｍ以上の結果的チオシアン酸グアニジン濃度を達成することを含む、項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記結果的チオシアン酸グアニジン濃度が、約４Ｍ以上、５Ｍ以上、６Ｍ以上、７Ｍ以上、８Ｍ以上、９Ｍ以上、または１０Ｍ以上である、項目６に記載の方法。
（項目８）
ステップ（ａ）が、前記不純調製物にＫＣｌを添加して約１Ｍ以上の結果的ＫＣｌ濃度を達成することを含む、項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記結果的ＫＣｌ濃度が、約２Ｍ以上、３Ｍ以上、４Ｍ以上、または５Ｍ以上である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記タンジェント流濾過が、水性溶媒のみを用いて行われる、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記タンジェント流濾過が、溶媒として水を用いて行われる、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
ステップ（ｂ）により精製した前記ｍＲＮＡが、未成熟中断したＲＮＡ配列及び／または生体外合成で用いた酵素試薬を１％未満含有する、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
ステップ（ｂ）により精製した前記ｍＲＮＡが、未成熟中断したＲＮＡ配列及び／または生体外合成で用いた酵素試薬を０．５％未満含有する、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
ステップ（ｂ）により精製した前記ｍＲＮＡが、未成熟中断したＲＮＡ配列及び／または生体外合成で用いた酵素試薬を０．１％未満含有する、項目１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
ステップ（ｂ）により精製した前記ｍＲＮＡが、生体外合成で用いた未成熟中断したＲＮＡ配列及び／または酵素試薬を、アガロースゲル電気泳動法またはクロマトグラフィー法によって決定して検知できない程度に含有する、項目１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記未成熟中断したＲＮＡ配列が、１５未満の塩基を含む、項目１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記未成熟中断したＲＮＡ配列が、約８〜１２の塩基を含む、項目１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
生体外合成で用いた前記酵素試薬が、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼＩ、ピロホスファターゼ、及び／またはリボヌクレアーゼ阻害薬を含む、項目１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
生体外合成で用いた前記酵素試薬が、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを含む、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記タンジェント流濾過が、前記生体外合成したｍＲＮＡにキャップとポリＡ尾部が付加される前に行われる、項目１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記タンジェント流濾過が、前記生体外合成したｍＲＮＡにキャップとポリＡ尾部が付加された後に行われる、項目１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記タンジェント流濾過が、前記生体外合成したｍＲＮＡにキャップとポリＡ尾部が付加される前後の両方に行われる、項目１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記生体外合成したｍＲＮＡが、長さが約１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、または５ｋｂより大きい、項目１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記生体外合成したｍＲＮＡが、安定性を向上させるように１つまたは複数の修飾を含む、項目１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記１つまたは複数の修飾が、修飾されたヌクレオチド、修飾された糖リン酸塩主鎖、５’及び／または３’非翻訳領域からなる群より選択される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記生体外合成したｍＲＮＡが無修飾である、項目１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
ステップ（ｂ）により精製した前記ｍＲＮＡが、９５％より大きい完全性を有する、項目１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
ステップ（ｂ）により精製した前記ｍＲＮＡが、９８％より大きい完全性を有する、項目１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
ステップ（ｂ）により精製した前記ｍＲＮＡが、９９％より大きい完全性を有する、項目１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の製造方法であって、
ｍＲＮＡを生体外で合成することと、
項目１〜２９のいずれか一項に記載の方法を用いて前記生体外合成したｍＲＮＡを精製することと、
を含む前記方法。
（項目３１）
項目１〜３０のいずれか一項に記載の方法を用いて精製したメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）。
【０００４】
一態様では、本発明は、（ａ）生体外合成したｍＲＮＡを含む不純調製物を変性条件に付すことと、（ｂ）ステップ（ａ）から得た不純調製物からｍＲＮＡをタンジェント流濾過によって精製することとによるステップを含み、ステップ（ｂ）により精製したｍＲＮＡには、生体外合成で用いた未成熟中断ＲＮＡ配列及び／または酵素試薬が実質的にない、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の精製方法をとりわけ提供する。
【０００５】
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）は、不純調製物にタンパク質変性剤を添加することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）は、タンパク質変性剤を添加した不純調製物を室温で約１〜１０分（例えば、約２〜９、２〜８、２〜７、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６分）間インキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）は、タンパク質変性剤を添加した不純調製物を室温で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０分間インキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）は、タンパク質変性剤を添加した不純調製物を室温で約５分間インキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、適切なタンパク質変性剤は、尿素、チオシアン酸グアニジン、ＫＣｌ、ドデシル硫酸ナトリウム、サルコシル、他の洗浄剤、及びその組合せからなる群より選択される。
【０００６】
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）は、尿素を不純調製物に添加して約１Ｍ以上の結果的尿素濃度を達成することを含む。いくつかの実施形態では、結果的尿素濃度は、約２Ｍ以上、３Ｍ以上、４Ｍ以上、５Ｍ以上、６Ｍ以上、７Ｍ以上、８Ｍ以上、９Ｍ以上、または１０Ｍ以上である。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）は、チオシアン酸グアニジンを不純調製物に添加して、約１Ｍ以上の結果的チオシアン酸グアニジン濃度を達成することを含む。いくつかの実施形態では、結果的チオシアン酸グアニジン濃度は、約２Ｍ以上、３Ｍ以上、４Ｍ以上、５Ｍ以上、６Ｍ以上、７Ｍ以上、８Ｍ以上、９Ｍ以上、または１０Ｍ以上である。
【０００８】
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）は、ＫＣｌを不純調製物に添加して、約１Ｍ以上の結果的ＫＣｌ濃度を達成することを含む。いくつかの実施形態では、結果的ＫＣｌ濃度は、約２Ｍ以上、３Ｍ以上、４Ｍ以上、または５Ｍ以上である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、タンジェント流濾過は、水性溶媒のみを用いて行われる。いくつかの実施形態では、タンジェント流濾過は、水を溶媒として用いて行われる。いくつかの実施形態では、タンジェント流濾過は、約１００〜２００ｍＬ／分（例えば、約１００〜１８０ｍＬ／分、１００〜１６０ｍＬ／分、１００〜１４０ｍＬ／分、１１０〜１９０ｍＬ／分、１１０〜１７０ｍＬ／分、または１１０〜１５０ｍＬ／分）の供給速度及び／または約１０〜５０ｍＬ／分（例えば、約１０〜４０ｍＬ／分、１０〜３０ｍＬ／分、２０〜５０ｍＬ／分、または２０〜４０ｍＬ／分）の流量で行われる。いくつかの実施形態では、タンジェント流濾過は、約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、もしくは２００ｍＬ／分の供給速度及び／または約１０、２０、３０、４０、もしくは５０ｍＬ／分の流量で行われる。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）により精製したｍＲＮＡは、生体外合成で用いた未成熟中断したＲＮＡ配列及び／または酵素試薬を約５％未満（例えば、約４％、３％、２％、または１％未満）含有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）により精製したｍＲＮＡは、生体外合成で用いた未成熟中断したＲＮＡ配列及び／または酵素試薬を約１％未満（例えば、約０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、または０．１％未満）含有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）により精製したｍＲＮＡは、生体外合成で用いた未成熟中断したＲＮＡ配列及び／または酵素試薬を約０．５％未満含有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）により精製したｍＲＮＡは、生体外合成で用いた未成熟中断したＲＮＡ配列及び／または酵素試薬を約０．１％未満含有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）により精製したｍＲＮＡは、生体外合成で用いた未成熟中断したＲＮＡ配列及び／または酵素試薬を、臭化エイチジウム染色法及び／またはクーマシー染色法によって決定して検知できない程度に含有する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、未成熟中断したＲＮＡ配列は、１５未満の塩基（例えば、１４、１３、１２、１１、１０、９、または８未満の塩基）を含む。いくつかの実施形態では、未成熟中断したＲＮＡ配列は、約８〜１２の塩基を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、生体外合成で用いる酵素試薬は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼＩ、ピロホスファターゼ、及び／またはリボヌクレアーゼ阻害薬を含む。いくつかの実施形態では、生体外合成で用いる酵素試薬は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、タンジェント流濾過は、生体外合成したｍＲＮＡにキャップ及びポリＡ尾部を添加する前に行われる。いくつかの実施形態では、タンジェント流濾過は、生体外合成したｍＲＮＡにキャップ及びポリＡ尾部を添加した後に行われる。いくつかの実施形態では、タンジェント流濾過は、生体外合成したｍＲＮＡにキャップ及びポリＡ尾部を添加する前及び添加した後の両方に行われる。
【００１４】
いくつかの実施形態では、生体外合成したｍＲＮＡは、長さが約１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、または５ｋｂより大きい。いくつかの実施形態では、生体外合成したｍＲＮＡは、１つまたは複数の修飾を含んで安定性を向上させる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の修飾は、修飾されたヌクレオチド、修飾された糖リン酸塩主鎖、５’及び／または３’非翻訳領域より選択される。いくつかの実施形態では、生体外合成したｍＲＮＡは無修飾である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）により精製したｍＲＮＡは、約９５％より大きい（例えば、約９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上より大きい）完全性を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）により精製したｍＲＮＡは、９８％より大きい完全性を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）により精製したｍＲＮＡは、９９％より大きい完全性を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）により精製したｍＲＮＡは、約１００％の完全性を有する。
【００１６】
本発明はまた、ｍＲＮＡを生体外で合成することと、生体外合成したｍＲＮＡを本明細書に記載の方法に従って精製することとによるステップを含む、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の製造方法を提供する。
【００１７】
本発明はまた、本明細書に記載の方法に従って精製したメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を提供する。
【００１８】
本願で使用される場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」及び「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は同等語句として使用される。本願で約（ａｂｏｕｔ）／約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）の付いた数字または付いていない数字は、当業者に理解されるどのような通常の変動をも包含するものとする。
【００１９】
本発明の他の特徴、目的、及び利点は、この後に続く詳細な説明で明らかである。しかしながら、本詳細な説明は本発明の実施形態を示す一方で、制限するものとしてではなく例示するものとしてのみ与えられていることを理解されたい。本発明の範囲内での種々の変更及び修正が、本詳細な説明から当業者に明らかとなる。
【００２０】
以下の図は例示を目的としているに過ぎず、制限をするものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】尿素への曝露も含めて、提供される方法に従って精製したＦＦＬ  ｍＲＮＡ試料の生体外転写における例示的なタンパク質レベルを、種々の対照のものとともに、ゲル電気泳動及びクーマシー染色法が示したによって表して示す。
【図２】提供される方法に従って精製した生体外転写試料における例示的なホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ｍＲＮＡレベルを、従来方法に従って精製したｍＲＮＡの場合と比較したものを、アガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色法によって表して示す。
【図３】５Ｍ尿素への曝露がある場合とない場合のＴＦＦも含めた、提供される方法に従って精製したＦＦＬ  ｍＲＮＡの生体外転写試料における例示的なタンパク質レベルを、従来方法ゲル電気泳動及びクーマシー染色法に従って精製したｍＲＮＡと比較して示す。
【図４】提供される方法によって提供された翻訳された精製ＦＦＬ  ｍＲＮＡから収集した例示的な蛍光データを、従来方法によって提供された精製ｍＲＮＡと比較して示す。
【図５】プロテイナーゼＫ及び／または５Ｍ尿素への曝露も含めて、提供される方法に従って精製した因子ＩＸ（ＦＩＸ）ｍＲＮＡの生体外転写試料の例示的なタンパク質レベルを、従来方法ゲル電気泳動及びクーマシー染色法に従って精製したｍＲＮＡと比較して示す。
【図６】提供される方法に従って精製した生体外転写試料における例示的なＦＩＸ  ｍＲＮＡレベルを、アガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色法によって表して示す。
【図７】２Ｍ  ＫＣｌへの曝露も含めて、提供される方法に従って精製した嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）ｍＲＮＡの生体外転写試料における例示的なタンパク質レベルを、従来方法ゲル電気泳動及びクーマシー染色法に従って精製したｍＲＮＡと比較して示す。
【図８】２Ｍ  ＫＣｌへの曝露も含めて、提供される方法に従って精製した生体外転写試料における例示的なＣＦＴＲ  ｍＲＮＡレベルを、アガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色法によって表して示す。
【図９】２Ｍ  ＫＣｌへの曝露も含めて、提供される方法に従って精製した生体外転写試料における例示的なＣＦＴＲ  ｍＲＮＡレベルを、従来方法に従って精製したｍＲＮＡの場合と比較したものを、アガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色法によって表して示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
定義
本発明がより容易に理解されるように、まず所定の用語を下に定義する。次の用語及び他の用語に対する追加的定義も本明細書全体を通じて明記する。
【００２３】
動物：本明細書で使用される場合、用語「動物」とは動物界のいずれの動物をも指す。いくつかの実施形態では、「動物」とは、発達のいずれの段階かにあるヒトを指す。いくつかの実施形態では、「動物」とは、発達のいずれの段階かにある非ヒト動物を指す。所定の実施形態では、非ヒト動物は哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／またはブタ）である。いくつかの実施形態では、動物としては、以下に限定されないが、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類、及び／または蠕虫類が挙げられる。いくつかの実施形態では、動物は、遺伝子導入動物、遺伝子操作動物、及び／またはクローンであってもよい。
【００２４】
約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）または約（ａｂｏｕｔ）：本明細書で使用される場合、用語「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」とは、関心の１つまたは複数の値に適用されるとき、述べられている参照値に類似した値のことを指す。所定の実施形態では、用語「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」は、他に記載がないか他に文脈から明らかでなければ、述べられた参考値から、いずれかのほう（大きいほうか小さいほう）に２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下以内に入る値の範囲を指す（但し、かかる数字が、あり得る値の１００％を超えると考えられる場合は除く）。
【００２５】
生物活性のある：本明細書で使用される場合、語句「生物活性のある」とは、生物学的系、特に生体に活性を有する剤の特性を指す。例えば、生体に投与されたときにその生体に生物学的効果を有する剤は生物活性があると考えられる。
【００２６】
発現：本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」とは、ｍＲＮＡをポリペプチド（例えば、抗体の重鎖または軽鎖）に翻訳すること、多重ポリペプチド（例えば、抗体の重鎖または軽鎖）を無傷タンパク質（例えば、抗体）へと構築すること、及び／または、翻訳後にポリペプチドまたは完全に構築されたタンパク質（例えば、抗体）を修飾することを指す。この適用において、用語「発現」及び「産生」、並びに文法的相当語句は互換的に使用される。
【００２７】
官能的：本明細書で使用される場合、「官能的」生物分子とは、生物分子を特徴づける特性及び／または活性を示す形式における生物分子である。
【００２８】
改善、増加、または低減：本明細書で使用される場合、用語「改善」、「増加」、もしくは「低減」、または文法的相当語句は、ベースライン測定値、例えば、本明細書に記載の処理を開始する前の同じ個体における測定値、または本明細書に記載の処理をしていない１つの対照対象（または複数の対照対象）における測定値等と比較した場合の値を指す。「対照対象」とは、治療されている対象と同じ形式の疾患を罹患しており、治療されている対象とほぼ同じ年齢である対象である。
【００２９】
不純物：本明細書で使用される場合、用語「不純物」は、限局された量の液体、気体、または固体の中の物質で、標的材料または化合物の化学的組成とは異なるものを指す。不純物はまた夾雑物とも呼ばれる。
【００３０】
生体外：本明細書で使用される場合、用語「生体外」とは、例えば、多細胞生体内ではなく、試験管内または反応槽内、細胞培養液内等、人工的な環境内で起こる事象を指す。
【００３１】
生体内：本明細書で使用される場合、用語「生体内」とは、ヒト及び非ヒト動物等、多細胞性生体内で起こる事象を指す。細胞に基づく系に関する文脈においては、この用語は、（例えば、生体外系とは対照的なものとして）生細胞内で起こる事象を指すのに使用される場合がある。
【００３２】
単離した：本明細書で使用される場合、用語「単離した」とは、（１）（自然及び／または実験的設定において）最初に産生されたときにつながっていた成分の少なくともいくつかから分離され、かつ／または、（２）人の手によって産生、調製、及び／または製造された、物質及び／または実在物を指す。単離した物質及び／または実在物は、それが最初につながっていた他の成分の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％より多くから分離されていてもよい。いくつかの実施形態では、単離した剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％より多くの純度であってもよい。物質は、実質的に他の成分がない場合に「純」であると、この語は本明細書で使用される。本明細書で使用される場合、単離した物質及び／または実在物のパーセント純度の計算は賦形剤（例えば、緩衝液、溶媒、水等）を含むものではない。
【００３３】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：本明細書で使用される場合、用語「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。ｍＲＮＡは、本明細書で使用される場合、修飾ＲＮＡと無修飾ＲＮＡの両方を包含する。ｍＲＮＡは１つまたは複数のコード領域及び非コード領域を含有していてもよい。
【００３４】
ｍＲＮＡ完全性：本明細書で使用される場合、用語「ｍＲＮＡ完全性」とは、概ね、ｍＲＮＡの質を指す。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ完全性は、精製工程（例えば、タンジェント流濾過）の後に分解しないｍＲＮＡのパーセンテージを指す。ｍＲＮＡ完全性は、当分野で周知の方法を用いて、例えば、ＲＮＡアガロースゲル電気泳動によって決定してもよい（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｅｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）。
【００３５】
核酸：本明細書で使用される場合、用語「核酸」とは、その最も広い意味において、ポリヌクレオチド鎖に組み込まれているか組み込むことが可能ないずれの化合物及び／または物質をも指す。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合によってポリヌクレオチド鎖に組み込まれているかまたは組み込むことが可能な化合物及び／または物質である。いくつかの実施形態では、「核酸」とは、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチド及び／またはヌクレオシド）を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」とは、個々の核酸残基を含むポリヌクレオチド鎖を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡ、並びに一本鎖及び／または二本鎖ＤＮＡ、及び／またはｃＤＮＡを包含する。さらに、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、及び／または類似の用語は、核酸類似体、即ち、ホスホジエステル主鎖とは別のものを有する類似体を含む。例えば、いわゆる「ペプチド核酸」は、当分野で既知であり、主鎖内にホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有し、本発明の範囲内であると考えられる。用語「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、お互いの縮重版であり、かつ／または同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を包含する。タンパク質をコードするヌクレオチド配列及び／またはＲＮＡはイントロンを含んでもよい。核酸は、天然源から精製したり、組換え発現系を用いて産生させて任意で精製したり、化学的に合成したり等、できる。適切である場合には、例えば、化学的に合成した分子の場合、核酸は、化学的に修飾された塩基または糖、主鎖修飾等を有する類似体等のヌクレオシド類似体を含むことができる。核酸配列は、他に断りがなければ、５’から３’への方向で表される。いくつかの実施形態では、核酸は、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、及び２−チオシチジン）；化学的に修飾された塩基；生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）；介在塩基；修飾された糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、及び六炭糖）；及び／もしくは修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエート及び５’−Ｎ−ホスホラミダイト結合）であるかまたはそれを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、送達を促進または達成するために化学的に修飾されなかった核酸（例えば、ヌクレオチド及び／またはヌクレオシド等も含めた、ポリヌクレオチド及び残基等）を意味する「無修飾核酸」を特に対象とする。
【００３６】
患者：本明細書で使用される場合、用語「患者」または「対象」とは、提供される組成物が、例えば、実験上、診断上、予防上、美容上、及び／または治療上の目的のために投与されてもよいいずれの生体をも指す。典型的な患者としては、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及び／またはヒト等の哺乳動物）が挙げられる。いくつかの実施形態では、患者はヒトである。ヒトは、出生前及び出生後の形式を含む。
【００３７】
薬剤的に許容できる：用語「薬剤的に許容できる」とは、本明細書で使用される場合、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー応答、もしくは他の問題または合併症無しに、ヒト及び動物の組織と接触させて、妥当なリスク・ベネフィット比と釣り合う使用をするのに適切な物質を指す。
【００３８】
未成熟中断したＲＮＡ配列：用語「未成熟中断したＲＮＡ配列」とは、本明細書で使用される場合、ｍＲＮＡ合成反応（例えば、生体外合成反応）の不完全産生物を指す。様々な理由で、ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型の転写を完成させるとは限らない、即ち、ＲＮＡ合成が未成熟に終了する。ＲＮＡ合成の未成熟終了の考えられる原因としては、ＤＮＡ鋳型の質、特定のポリメラーゼを対象とするポリメラーゼ転写終結配列の鋳型における存在、緩衝液の劣化、温度、リボヌクレオチドの欠乏、及びｍＲＮＡ二次構造が挙げられる。未成熟中断したＲＮＡ配列は、所望の転写産生物の意図した長さよりも短いどのような長さでもよい。例えば、未成熟中断したｍＲＮＡ配列は、１０００塩基未満、５００塩基未満、１００塩基未満、５０塩基未満、４０塩基未満、３０塩基未満、２０塩基未満、１５塩基未満、１０塩基未満、またはそれ以下であってもよい。
【００３９】
塩：本明細書で使用される場合、用語「塩」とは、酸と塩基の中和反応から生じるか生じ得るイオン化合物を指す。
【００４０】
対象：本明細書で使用される場合、用語「対象」とは、ヒトまたはいずれの非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、もしくは霊長類）をも指す。ヒトには、出生前及び出生後の形式を含む。多くの実施形態では、対象はヒトである。対象は患者である場合があり、これは、疾患の診断または治療を行う医療提供者にかかるヒトを指す。用語「対象」は、本明細書において「個体」または「患者」と互換的に用いられる。対象は、疾患または障害を罹患する可能性があるか罹患しやすいが、その疾患または障害の症状を顕している場合もあればない場合もある。
【００４１】
実質的に：本明細書で使用される場合、用語「実質的に」とは、関心対象の特徴または特性の全体的またはほぼ全体的な範囲もしくは程度を表す質的状態を指す。生物学分野の当業者であれば、生物学的及び化学的現象は、完了に至ること、及び／もしくは完全状態に進むこと、または、絶対的な結果を達成したり回避したりすることが、仮にあったとしてもまれにしかないことを理解するものである。したがって、用語「実質的に」は、本明細書では、多くの生物学的及び化学的現象に特有の、完全性の潜在的欠如を捉えるために使用される。
【００４２】
実質的にない：本明細書で使用される場合、「実質的にない」とは、除去すべき物質（例えば、未成熟中断したＲＮＡ配列）の量が比較的にわずかしか存在しないか全く存在しない状態を指す。例えば、「未成熟中断したＲＮＡ配列が実質的にない」とは、未成熟中断したＲＮＡ配列が、約５％、４％、３％、２％、１．０％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、またはそれ以下（重量）より少ない不純物レベルで存在することを意味する。あるいは、「未成熟中断したＲＮＡ配列が実質的にない」とは、未成熟中断したＲＮＡ配列が、約１００ｎｇ、９０ｎｇ、８０ｎｇ、７０ｎｇ、６０ｎｇ、５０ｎｇ、４０ｎｇ、３０ｎｇ、２０ｎｇ、１０ηｇ、１ηｇ、５００ρｇ、１００ρｇ、５０ρｇ、１０ρｇ、またはそれ以下未満のレベルで存在することを意味する。
【００４３】
（詳細な説明）
本発明は、タンジェント流濾過に基づいて不純調製物（例えば、生体外合成反応混合物）からｍＲＮＡを精製する改善された方法をとりわけ提供する。いくつかの実施形態では、本発明による発明的方法は、（ａ）生体外合成したｍＲＮＡを含む不純調製物を変性条件に付すことと、（ｂ）ステップ（ａ）から得た不純調製物からｍＲＮＡをタンジェント流濾過によって精製することとによるステップを含み、ステップ（ｂ）により精製したｍＲＮＡには、生体外合成で用いた未成熟中断ＲＮＡ配列及び／または酵素試薬が実質的にない。
【００４４】
本発明の種々の態様が以下の項で詳細に説明される。項分けの使用は本発明を限定することを意図しない。各項は本発明のいずれの態様にも適用することができる。この出願においては、「または（ｏｒ）」の使用は、他に記載がなければ、「及び／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。
ｍＲＮＡの合成
【００４５】
ｍＲＮＡは、典型的には、ＤＮＡからリボソームへ情報を運ぶ種類のＲＮＡと考えられている。ｍＲＮＡの生存期間は典型的には、非常に短く、プロセシング及び翻訳を含み、それに分解が続く。典型的には、真核生物においては、ｍＲＮＡプロセシングは、Ｎ末端の（５’）末端への「キャップ」の付加及びＣ末端の（３’）末端への「尾部」の付加を含む。典型的なキャップは７−メチルグアノシンキャップであり、これは、第１の転写されたヌクレオチドに５’−５’−三リン酸結合を通じて結合するグアノシンである。キャップの存在は、殆どの真核生物細胞に見られるヌクレアーゼに抵抗性を提供する上で重要である。尾部は、典型的にはポリアデニル化現象であり、これによりポリアデニリル成分がｍＲＮＡ分子の３’末端に付加されるのである。この「尾部」の存在は、エキソヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを保護する働きをする。メッセンジャーＲＮＡは、タンパク質を構成する一連のアミノ酸へ、リボソームによって翻訳される。
【００４６】
本発明によるｍＲＮＡは、種々の既知の方法のいずれによって合成してもよい。例えば、本発明によるｍＲＮＡは、生体外転写（ＩＶＴ）によって合成してもよい。手短に言えば、ＩＶＴは典型的に、プロモーターを含有する線状または環状のＤＮＡ鋳型、リボヌクレオチド三リン酸のプール、ＤＴＴ及びマグネシウムイオンを含んでいてもよい緩衝系と、適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ）、デオキシリボヌクレアーゼＩ、ピロホスファターゼ、及び／またはリボヌクレアーゼ阻害薬とで実行する。正確な条件は具体的な用途によって異なる。これらの試薬の存在は、いくつかの実施形態では、最終産生物において望ましくなく、したがって、不純物と呼ばれることがあり、これらの不純物の１つまたは複数を含有する調製物は不純調製物と呼ばれることがある。
【００４７】
本発明によるｍＲＮＡは、商業規模で精製してもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、バッチあたり０．１グラム、０．５グラム、１グラム、２グラム、３グラム、４グラム、５グラム、６グラム、７グラム、８グラム、９グラム、１０グラム、２０グラム、３０グラム、４０グラム、５０グラム、６０グラム、７０グラム、８０グラム、９０グラム、１００グラム、２００グラム、３００グラム、４００グラム、５００グラム、６００グラム、７００グラム、８００グラム、９００グラム、または１０００グラム以上の規模で精製される。
【００４８】
種々の実施形態では、本発明を用いて、生体外合成した種々の長さのｍＲＮＡを精製してもよい。いくつかの実施形態では、本発明を用いて、長さが約１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、または１５ｋｂを超える生体外合成したｍＲＮＡを精製してもよい。いくつかの実施形態では、本発明を用いて、典型的には、安定性を向上させる１つまたは複数の修飾を含有するｍＲＮＡを精製してもよい。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の修飾は、修飾されたヌクレオチド、修飾された糖リン酸塩主鎖、５’及び／または３’非翻訳領域より選択される。いくつかの実施形態では、本発明を用いて、生体外合成した無修飾のｍＲＮＡを精製してもよい。
【００４９】
典型的に、ｍＲＮＡは、安定性を向上させるように修飾される。ｍＲＮＡの修飾といった場合、例えば、ＲＮＡのヌクレオチドの修飾を含むことができる。こうして、本発明の修飾ｍＲＮＡは、例えば、主鎖修飾、糖修飾、または塩基修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、抗体をコードするｍＲＮＡ（例えば、重鎖及び軽鎖をコードするｍＲＮＡ）は、例えば、以下に限定されないが、プリン（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））またはピリミジン（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））、並びに、修飾ヌクレオチド類似体またはプリン及びピリミジンの誘導体としては、例えば、１−メチル−アデニン、２−メチル−アデニン、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテニル−アデニン、Ｎ６−メチル−アデニン、Ｎ６−イソペンテニル−アデニン、２−チオ−シトシン、３−メチル−シトシン、４−アセチル−シトシン、５−メチル−シトシン、２，６−ジアミノプリン、１−メチル−グアニン、２−メチル−グアニン、２，２−ジメチル−グアニン、７−メチル−グアニン、イノシン、１−メチル−イノシン、プソイドウラシル（５−ウラシル）、ジヒドロ−ウラシル、２−チオ−ウラシル、４−チオ−ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）−ウラシル、５−フルオロ−ウラシル、５−ブロモ−ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウラシル、５−メチル−２−チオ−ウラシル、５−メチル−ウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、５−メチルアミノメチル−ウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオ−ウラシル、５’−メトキシカルボニルメチル−ウラシル、５−メトキシ−ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、１−メチル−プソイドウラシル、ケウオシン、β−Ｄ−マンノシル−ケウオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、ウィブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、及びホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ホスホロチオエート、ペプチドヌクレオチド、メチルホスホネート、７−デアザグアノシン、５−メチルシトシン、及びイノシン等、天然のヌクレオチド及び／またはヌクレオチド類似体（修飾ヌクレオチド）から合成してもよい。かかる類似体の調製は、例えば、米国特許第４，３７３，０７１号、米国特許第４，４０１，７９６号、米国特許第４，４１５，７３２号、米国特許第４，４５８，０６６号、米国特許第４，５００，７０７号、米国特許第４，６６８，７７７号、米国特許第４，９７３，６７９号、米国特許第５，０４７，５２４号、米国特許第５，１３２，４１８号、米国特許第５，１５３，３１９号、米国特許第５，２６２，５３０号、及び第５，７００，６４２号から、当業者に既知であり、これらの開示は参照によりその全範囲が本明細書に援用される。
【００５０】
典型的には、ｍＲＮＡ合成は、Ｎ末端（５’）末端への「キャップ」の付加及びＣ末端（３’）末端への「尾部」の付加を含む。キャップの存在は、殆どの真核生物細胞に見られるヌクレアーゼに抵抗性を得させる上で重要である。「尾部」の存在は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護するように働く。
【００５１】
このようにして、いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは５’キャップ構造を含む。５’キャップは、典型的には、次の通り付加される：まず、ＲＮＡ末端ホスファターゼが末端リン酸基の１つを５’ヌクレオチドから取り除き、末端リン酸を２つ残し；次いで、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）がグアニリルトランスフェラーゼによって末端リン酸に付加され、５’５’５三リン酸結合を生じさせ：次いで、グアニンの７−窒素がメチルトランスフェラーゼによってメチル化される。キャップ構造の例としては、以下に限定されないが、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ及びＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが挙げられる。
【００５２】
生体外転写反応から提供されるｍＲＮＡはいくつかの実施形態では望ましいことがあるが、細菌、真菌、植物、及び／または動物から産生される野生型ｍＲＮＡも含めた、ｍＲＮＡの他の源も、本発明の範囲内にあるとして企図される。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは５’及び／または３’非翻訳領域を含む。いくつかの実施形態では、５’非翻訳領域は、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を与える１つまたは複数の要素、例えば、鉄応答配列を含む。いくつかの実施形態では、５’非翻訳領域は、約５０〜５００ヌクレオチドの長さであってもよい。
【００５４】
いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、細胞内におけるｍＲＮＡの位置の安定性に影響するタンパク質に対する結合部位、または、ｍｉＲＮＡに対する１つまたは複数の結合部位のうち、１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、長さが５０〜５００ヌクレオチドまたはそれ以上であってもよい。
【００５５】
本発明を用いて、種々のタンパク質をコードするｍＲＮＡを精製してもよい。ホタルルシフェラーゼ、因子ＩＸ、及びＣＦＴＲをコードするｍＲＮＡの精製の非限定的な例は、実施例の項で詳細に記載される。
変性条件及び変性剤
【００５６】
典型的には、分子間力を分断することによって、タンパク質または核酸の高次構造を一次的または恒久的に変化させることが、変性と呼ばれている。変性は、構造的変化を生じさせ、しばしば活性の消失へ至る。分子の未変性高次構造は通例最も水溶性があるため、分子の二次及び三次構造を分断することは可溶性に変化を引き起こすことがあり、溶液からのタンパク質または核酸の沈殿を生じさせることがある。驚くべきことに、本明細書に記載される通り、変性条件をタンジェント流濾過（ＴＦＦ）と組み合わせて用いると、ｍＲＮＡ精製を促進することができ、同時にｍＲＮＡの完全性をなお維持する。
【００５７】
本明細書で使用される場合、用語「変性条件」とは、変性を引き起こし得るいずれの化学的または物理的条件をも指す。例示的な変性条件としては、以下に限定されないが、化学的試薬、高温、極端なｐＨなどが挙げられる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、変性条件は、精製されるｍＲＮＡを含有する不純調製物に１つまたは複数の変性剤を添加することにより達成される。いくつかの実施形態では、本発明に適切な変性剤は、タンパク質及び／またはＤＮＡ変性剤である。いくつかの実施形態では、変性剤は、１）酵素（セリンプロテイナーゼまたはデオキシリボヌクレアーゼなど）、２）酸、３）溶媒、４）架橋剤、５）カオトロピック剤、６）還元剤、及び／または７）高い塩濃度による高イオン強度であってもよい。いくつかの実施形態では、個々の剤は、これらのカテゴリーの２つ以上に入るものでもよい。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ合成に用いたタンパク質とＤＮＡ鋳型を分解するために１つまたは複数の酵素を変性剤として用いてもよい。いくつかの実施形態では、適切な酵素としては、以下に限定されないが、キモトリプシン及びキモトリプシン様セリンプロテアーゼなどのセリンプロテアーゼ、トリプシン及びトリプシン様セリンプロテアーゼ、エラスターゼ及びエラスターゼ様セリンプロテアーゼ、サブチリシン及びサブチリシン様セリンプロテアーゼ、並びにその組合せ、デオキシリボヌクレアーゼＩ、ＩＩ、及び／またはＩＶなどのデオキシリボヌクレアーゼ（デオキシリボヌクレアーゼ）、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＳｔｕＩ、ＸｂａＩなどの制限酵素、並びにその組合せが挙げられる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、酸を変性剤として用いてもよい。いくつかの実施形態では、適切な酸は、酢酸、ギ酸、シュウ酸、クエン酸、安息香酸、クロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、アスコルビン酸、スルホサリチル酸、及びその組合せであってもよい。
【００６１】
いくつかの実施形態では、溶媒を変性剤として用いてもよい。いくつかの実施形態では、溶媒は、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、エタノール、メタノール、デナトニウム、及びその組合せであってもよい。
【００６２】
いくつかの実施形態では、カオトロピック剤を変性剤として用いてもよい。カオトロピック剤は、水素結合及びファンデルワールス力など非共有結合力に干渉することによって、タンパク質及び核酸など巨大分子の構造を分断する物質である。いくつかの実施形態では、カオトロピック剤は、尿素、チオ尿素、塩化グアニジウム、チオシアン酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、ドデシル硫酸ナトリウム、過塩素酸リチウム、及びその組合せであってもよい。
【００６３】
いくつかの実施形態では、精製されるｍＲＮＡを含有する不純調製物は尿素で処理される。いくつかの実施形態では、結果的尿素濃度が約１Ｍ以上となるような量の尿素が添加される。いくつかの実施形態では、尿素は、結果的尿素濃度が約２Ｍ以上、３Ｍ以上、４Ｍ以上、５Ｍ以上、６Ｍ以上、７Ｍ以上、８Ｍ以上、９Ｍ以上、または１０Ｍ以上となるように添加される。いくつかの実施形態では、精製されるｍＲＮＡを含有する不純調製物は、チオシアン酸グアニジンで処理される。いくつかの実施形態では、結果的チオシアン酸グアニジン濃度が約１Ｍ以上となるような量のチオシアン酸グアニジンが添加される。いくつかの実施形態では、チオシアン酸グアニジンは、結果的チオシアン酸グアニジン濃度が約２Ｍ以上、３Ｍ以上、４Ｍ以上、５Ｍ以上、６Ｍ以上、７Ｍ以上、８Ｍ以上、９Ｍ以上、または１０Ｍ以上となるように添加される。
【００６４】
いくつかの実施形態では、還元剤を変性剤として用いてもよい。還元剤は、他の種に電子を与え、そうして還元剤自体は酸化される化合物である。いくつかの実施形態では、還元剤は、水素化アルミニウムリチウム、ナトリウムアマルガム、ジボラン、水素化ホウ素ナトリウム、亜硫酸、水素化ジイソブチルアルミニウム、亜リン酸エステル、一酸化炭素、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、及びその組合せであってもよい。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ｐＨ、熱、及び／または重金属（鉛、水銀、またはカドミウムなど）の１つまたは複数もまた、変性剤として用いてもよい。極端なｐＨはタンパク質を変性させることが知られている。タンパク鎖の主鎖は中性であるが、タンパク質を構成するアミノ酸残基はしばしば酸性基及び塩基性基を含有する。これらの基は通常帯電しており、反対の電荷の基で塩橋を形成することがある。そのために、極端なｐＨは、これらの酸性基及び塩基性基上の電荷を変化させ、塩橋を分断することがある。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ｐＨの変化の激しさがより小さくてもまた、タンパク質の活性と可溶性に影響することがある。個々のアミノ酸のように、タンパク質は、負電荷の数が正電荷の数と等しくなる等電点を有する。これはしばしば、水溶性の最小点である。等電点のｐＨでは、分子上に正味荷電はない。個々の分子は、お互いに近づき、凝固し、溶液から沈殿する傾向がある。等電点のｐＨより上または下のｐＨでは、それぞれ正味負電荷または正電荷を分子は有する。そのために、タンパク質分子はお互いに近づくとき、同種の全体的電荷を有し、お互いに反発し合う。
【００６７】
いくつかの実施形態では、熱を変性剤として用いてもよい。熱は、タンパク質分子に動力学的エネルギーを供給し、その原子をより急速に振動させる。いくつかの実施形態では、これにより、水素結合及び疎水性相互作用などの比較的弱い力が分断される。熱はまた、殺菌で用いられ、細菌中の酵素を変性させ、そうして破壊する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、水銀（ＩＩ）、鉛（ＩＩ）、及び銀などの金属イオンの塩は、ジスルフィド基や、酸性アミノ酸のカルボン酸イオンと強い結合を形成する能力を有するので、変性剤として用いてもよい。このようにして、それらは、ジスルフィド架橋及び塩結合の両方を分断し、タンパク質が不溶性金属−タンパク質塩として溶液から沈殿するようにする。
【００６９】
いくつかの実施形態では、高濃度の塩（高塩分）もまた、変性剤として用いてもよい。高濃度の塩は、水溶液からタンパク質と核酸の両方を沈殿させることが知られている。いくつかの実施形態では、高濃度の塩は、１Ｍと１０Ｍを含めてその間であってもよい。いくつかの実施形態では、高濃度の塩は、２Ｍと９Ｍを含めてその間であってもよい。いくつかの実施形態では、高濃度の塩は、２Ｍと８Ｍを含めてその間であってもよい。いくつかの実施形態では、高濃度の塩は、２Ｍと５Ｍを含めてその間であってもよい。いくつかの実施形態では、高濃度の塩は、１Ｍより大きい濃度であってもよい。いくつかの実施形態では、高濃度の塩は、２Ｍより大きい濃度であってもよい。いくつかの実施形態では、高濃度の塩は、３Ｍより大きい濃度であってもよい。いくつかの実施形態では、高濃度の塩は、４Ｍより大きい濃度であってもよい。いくつかの実施形態では、高濃度の塩は、５Ｍより大きい濃度であってもよい。いくつかの実施形態では、高濃度の塩は、６Ｍより大きい濃度であってもよい。いくつかの実施形態では、高濃度の塩は、７Ｍより大きい濃度であってもよい。いくつかの実施形態では、高濃度の塩は、８Ｍより大きい濃度であってもよい。いくつかの実施形態では、単一の塩を変性剤として用いてもよい。いくつかの実施形態では、２つ以上の塩を変性剤として用いてもよい。
【００７０】
いくつかの実施形態では、変性剤として用いられる塩は、カルシウム塩、鉄塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、またはその組合せであってもよい。いくつかの実施形態では、変性剤として使用に適切な例示的で具体的な塩としては、以下に限定されないが、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、臭化カリウム（ＫＢｒ）、臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）、臭化リチウム（ＬｉＢｒ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、不純調製物が付される変性剤は塩化カリウム（ＫＣｌ）である。いくつかの実施形態では、ＫＣｌは、結果的ＫＣｌ濃度が約１Ｍ以上となるように添加される。いくつかの実施形態では、ＫＣｌは、結果的ＫＣｌ濃度が約２Ｍ以上、３Ｍ以上、４Ｍ以上、または５Ｍ以上となるように添加される。
【００７１】
いくつかの実施形態では、不純調製物を１つまたは複数の変性剤で或る時間インキュベートすることが望ましい場合がある。いくつかの実施形態では、不純調製物を変性剤で１分未満インキュベートする。いくつかの実施形態では、不純調製物を変性剤で１分間インキュベートする。いくつかの実施形態では、不純調製物を変性剤で２分間インキュベートする。いくつかの実施形態では、不純調製物を変性剤で３分間インキュベートする。いくつかの実施形態では、不純調製物を変性剤で４分間インキュベートする。いくつかの実施形態では、不純調製物を変性剤で５分間インキュベートする。いくつかの実施形態では、不純調製物を変性剤で１０分間インキュベートする。いくつかの実施形態では、不純調製物を変性剤で１時間インキュベートする。いくつかの実施形態では、不純調製物を変性剤で２時間インキュベートする。
【００７２】
いくつかの実施形態では、不純調製物を１つまたは複数の変性剤で室温（例えば、約２０〜２５℃）でインキュベートする。いくつかの実施形態では、不純調製物を１つまたは複数の変性剤で室温より低い温度でインキュベートする。いくつかの実施形態では、不純調製物を１つまたは複数の変性剤で室温より高い温度でインキュベートする。
精製
【００７３】
いくつかの実施形態では、変性条件への曝露の前及び／または後に、タンジェント流濾過を用いてｍＲＮＡを不純調製物から精製する。いくつかの実施形態では、タンジェント流濾過は、生体外合成したｍＲＮＡにキャップ及びポリＡ尾部を添加する前に行われる。いくつかの実施形態では、タンジェント流濾過は、生体外合成したｍＲＮＡにキャップ及びポリＡ尾部を添加した後に行われる。いくつかの実施形態では、タンジェント流濾過は、生体外合成したｍＲＮＡにキャップ及びポリＡ尾部を添加する前及び添加した後の両方に行われる。
従来式膜濾過
【００７４】
概して、膜濾過には、１つまたは複数の挿入された透過性膜を用いて固体を流体から分離することが含まれる。膜濾過はまた、粒子を気体試料から濾過するのに用いてもよい。２つの主な形式の膜濾過があり、溶解−拡散のみにより進行する受動濾過と、正圧または負圧（即ち、真空）を用いて力で液体または気体に膜面上を進ませる能動濾過とである。
【００７５】
従来式膜濾過はまた、「全量」濾過としても知られる。この形式では、供給物を膜に負荷し、正圧または負圧によって押し通す。全量濾過は費用が高くなく簡単であるが、主な欠点は、透過しないかまたは透過が緩慢な溶質（濃縮水とも呼ばれる）で膜を汚してしまうか詰まらせてしまうことと、濃度分極とである。概して、膜は、押し込む力が高いほど、より早く詰まるか汚損する傾向がある。膜が汚損したり詰まったりするに従い、濾過速度は落ち、ついには、フィルターを交換するかまたは浄化するまでは透過物が通過できなくなる。濃度分極は、非透過性溶質がフィルターの表面上に集まって、ついには一種の二次膜を形成する現象で、これは、膜上の透過性溶質の移動をさらに妨げる。結果として、典型的に、全量濾過がバッチ式工程では用いられる。
タンジェント流濾過
【００７６】
クロスフロー濾過とも呼ばれるタンジェント流濾過（ＴＦＦ）は、濾過する材料が、フィルターを通り抜けるというよりはそれに沿った接線方向に通過する、一種の濾過である。ＴＦＦでは、望ましくない透過物は、フィルターを通り抜け、所望の濃縮水は、フィルターに沿って通過し、下流で集められる。所望の材料はＴＦＦでは典型的に濃縮水に含有され、このことは、従来式の全量濾過で通常遭遇することの反対である、ということに留意することが重要である。
【００７７】
濾過する材料によって、ＴＦＦは通常、精密濾過か限外濾過のいずれかに用いられる。精密濾過は典型的には、フィルターが０．０５μｍと１．０μｍを含めてその間にある孔径を有する場合として定義され、一方、限外濾過は０．０５μｍ未満の孔径をもったフィルターを典型的に含む。孔径はまた、個々のフィルターに対して、分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔ  ｏｆｆ）（ＭＷＣＯ）とも呼ばれる公称分画分子量（ｎｏｍｉｎａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｌｉｍｉｔ）（ＮＭＷＬ）を決定し、精密濾過膜では典型的に１０００キロダルトン（ｋＤａ）より大きいＮＭＷＬを有し、限外濾過フィルターでは１ｋＤａ〜１０００ｋＤａのＮＭＷＬを有する。
【００７８】
タンジェント流濾過の主な利点は、従来式の「全量」濾過中であればフィルターの中に凝集してそれを塞ぐ可能性のある非透過性粒子（時に「濾過ケーク」とも呼ばれる）が、そうはならずにフィルターの表面に沿って運ばれるということである。この利点により、タンジェント流濾過は、概ねフィルターを除去したり浄化したりする必要がないために作業中止時間が大幅に低減されるので、連続稼動を必要とする工業工程で広く用いることができる。
【００７９】
タンジェント流濾過は、とりわけ、濃縮及びダイアフィルトレーションも含めたいくつかの目的のために用いることができる。濃縮は、溶液から溶媒を除去し、同時に溶質分子を保持する工程である。試料を効果的に濃縮するために、保持される溶質分子の分子量よりも実質的に小さいＮＭＷＬまたはＭＷＣＯを有する膜が用いられる。概して、当業者は、標的分子の分子量よりも３〜６倍小さいＮＭＷＬまたはＭＷＣＯを有するフィルターを選択してもよい。
【００８０】
ダイアフィルトレーションは、望ましくない小さい粒子をフィルターに通し、同時に、所望の大きい分子を、溶液中のそれらの分子の濃度を変えることなく濃縮水中に保持する分画工程である。ダイアフィルトレーションはしばしば、溶液から塩または反応緩衝液を除去するために用いられる。ダイアフィルトレーションは、連続的または非連続的のいずれかであり得る。連続的ダイアフィルトレーションでは、ダイアフィルトレーション溶液を、濾液が生成されるのと同じ速度で試料供給物に添加する。非連続的ダイアフィルトレーションでは、溶液をまず希釈し、次いで、出発濃度に濃縮し戻す。非連続的ダイアフィルトレーションは、溶質分子が所望の濃度に達するまで繰り返してもよい。
【００８１】
典型的なＴＦＦ工程で重要な少なくとも３つの工程変数：膜貫通圧力、供給速度、及び透過物の流量。膜貫通圧力は、流体をフィルターに通して推進し、それとともに透過性分子を運ぶ力である。いくつかの実施形態では、膜貫通圧力は、１平方インチあたり１ポンド（ｐｓｉ）と３０ポンド（ｐｓｉ）を含めてその間である。
【００８２】
供給速度（クロスフロー速度とも言われる）は、供給路を通ってフィルターに沿って流れる溶液フローの速度である。供給速度は、流し去らなければフィルターを詰まらせたり汚損させたりして、そうして濾液フローを制限する可能性のある分子を流し去る力を決定する。いくつかの実施形態では、供給速度は、５０〜５００ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、供給速度は、５０〜４００ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、供給速度は、５０〜３００ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、供給速度は、５０〜２００ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、供給速度は、７５〜２００ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、供給速度は、１００〜２００ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、供給速度は、１２５〜１７５ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、供給速度は、１３０ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、供給速度は、６０〜２２０ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、供給速度は、６０ｍＬ／分以上である。いくつかの実施形態では、供給速度は、１００ｍＬ／分以上である。いくつかの実施形態では、供給速度は、１５０ｍＬ／分以上である。いくつかの実施形態では、供給速度は、２００ｍＬ／分以上である。いくつかの実施形態では、供給速度は、２２０ｍＬ／分以上である。
【００８３】
透過物の流量は、系から透過物を除去する速度である。供給速度が一定の場合、透過物流量を上げると、フィルターと平行方向に圧力を上げることができ、濾過速度の向上につながるが、同時にまた、フィルターの詰まりや汚損のリスクを上げる可能性も出てくる。ＴＦＦに用いられる原理、理論、及び装置が、Ｍｉｃｈａｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ”ｉｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （Ｗ．Ｐ．Ｏｌｓｏｎ，ｅｄ．，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ，Ｉｌｌ．１９９５）に記載される。また、ＴＦＦに改善のなされたものである高速タンジェント流濾過（ＨＰ−ＴＦＦ）に関する記載については、米国特許第５，２５６，２９４号及び第５，４９０，９３７号を参照されたい。いくつかの実施形態では、流量は、１０〜１００ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、流量は、１０〜９０ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、流量は、１０〜８０ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、流量は、１０〜７０ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、流量は、１０〜６０ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、流量は、１０〜５０ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、流量は、１０〜４０ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、流量は、２０〜４０ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、流量は、３０ｍＬ／分である。
【００８４】
本明細書に記載の種々の工程変数のいずれの組合せを用いてもよい。いくつかの実施形態では、タンジェント流濾過は、約１００〜２００ｍＬ／分（例えば、約１００〜１８０ｍＬ／分、１００〜１６０ｍＬ／分、１００〜１４０ｍＬ／分、１１０〜１９０ｍＬ／分、１１０〜１７０ｍＬ／分、もしくは１１０〜１５０ｍＬ／分）の供給速度、及び／または約１０〜５０ｍＬ／分（例えば、約１０〜４０ｍＬ／分、１０〜３０ｍＬ／分、２０〜５０ｍＬ／分、もしくは２０〜４０ｍＬ／分）の流量で行われる。いくつかの実施形態では、タンジェント流濾過は、約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、もしくは２００ｍＬ／分の供給速度、及び／または約１０、２０、３０、４０、もしくは５０ｍＬ／分の流量で行われる。
【００８５】
流量を上げて大（商業）規模精製に対応するには、タンジェント流濾過を約１０Ｌ〜２００Ｌ／分の供給速度で行うことが必要となる。（例えば、約１０〜１８０Ｌ／分、１００〜１６０Ｌ／分、１００〜１４０Ｌ／分、１１０〜１９０Ｌ／分、１１０〜１７０Ｌ／分、もしくは１１０〜１５０Ｌ／分）及び／または約１０〜５０Ｌ／分（例えば、約１０〜４０Ｌ／分、１０〜３０Ｌ／分、２０〜５０Ｌ／分、もしくは２０〜４０Ｌ／分の流量）。いくつかの実施形態では、タンジェント流濾過は、約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、もしくは２００Ｌ／分の供給速度、及び／または約１０、２０、３０、４０、もしくは５０Ｌ／分の流量で行われる。
【００８６】
上に記載の通り、ＴＦＦで用いられるフィルターは、種々の孔径、従ってＮＭＷＬ、のいずれを有してもよい。いくつかの実施形態では、フィルターは、１００ｋＤａ〜１０００ｋＤａのＮＭＷＬを有するものである。いくつかの実施形態では、フィルターは、２００ｋＤａ〜７００ｋＤａのＮＭＷＬを有するものである。いくつかの実施形態では、フィルターは、２００ｋＤａ〜５００ｋＤａのＮＭＷＬを有するものである。いくつかの実施形態では、フィルターは、３００ｋＤａのＮＭＷＬを有する。いくつかの実施形態では、フィルターは、５００ｋＤａのＮＭＷＬを有する。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本発明のタンジェント流濾過は、水性溶媒のみを用いて行われる。いくつかの実施形態では、本発明のタンジェント流濾過は、水を溶媒として用いて行われる。
精製ｍＲＮＡの特徴づけ
【００８８】
種々の実施形態では、本発明に従って精製したｍＲＮＡには、未成熟中断したＲＮＡ配列、ＤＮＡ鋳型、及び／または、生体外合成で用いられた酵素試薬を含め、但しこれに限定されない、ｍＲＮＡ合成工程由来の不純物が、実質的にない。
【００８９】
本発明によって提供される具体的な利点は、未成熟中断したＲＮＡ配列（「ショートマー」とも言われる）を高度に除去または排除する能力である。いくつかの実施形態では、本発明による方法は、未成熟中断したＲＮＡ配列の約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％よりも多くかまたは実質的に全てを除去する。いくつかの実施形態では、本発明に従って精製したｍＲＮＡには、未成熟中断したＲＮＡ配列が実質的にない。いくつかの実施形態では、本発明に従って精製したｍＲＮＡは、約５％未満（例えば、約４％、３％、２％、または１％未満）の未成熟中断したＲＮＡ配列を含有する。いくつかの実施形態では、本発明に従って精製したｍＲＮＡは、約１％未満（例えば、約０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、または０．１％未満）の未成熟中断したＲＮＡ配列を含有する。いくつかの実施形態では、本発明に従って精製したｍＲＮＡは、例えば、臭化エイチジウム及び／またはクーマシー染色法で測定して検出できない程度に、未成熟中断したＲＮＡ配列を含有する。いくつかの実施形態では、未成熟中断したＲＮＡ配列は、１５未満の塩基（例えば、１４、１３、１２、１１、１０、９、または８未満の塩基）含む。いくつかの実施形態では、未成熟中断したＲＮＡ配列は約８〜１２の塩基を含む。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本発明による方法は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼＩ、ピロホスファターゼ、及び／またはリボヌクレアーゼ阻害薬を含め、但しそれに限定されない、生体外合成で用いられた酵素試薬を、高度に除去または排除する。いくつかの実施形態では、本発明は、具体的には、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを除去するのに効果的である。いくつかの実施形態では、本発明による方法は、生体外合成で用いられた酵素試薬の約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％よりも多くかまたは実質的に全てを除去する。いくつかの実施形態では、本発明に従って精製したｍＲＮＡには、生体外合成で用いられた酵素試薬が実質的にない。いくつかの実施形態では、本発明に従って精製したｍＲＮＡは、約５％未満（例えば、約４％、３％、２％、または１％未満）の生体外合成で用いられた酵素試薬を含有する。いくつかの実施形態では、本発明に従って精製したｍＲＮＡは、約１％未満（例えば、約０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、または０．１％未満）の生体外合成で用いられた酵素試薬を含有する。いくつかの実施形態では、本発明に従って精製したｍＲＮＡは、例えば、臭化エチジウム及び／またはクーマシー染色法で測定して検出できない程度に、生体外合成で用いられた酵素試薬を含有する。
【００９１】
種々の実施形態では、本明細書に記載の方法を用いて精製したｍＲＮＡは、高度の完全性を維持する。本明細書で使用される場合、用語「ｍＲＮＡ完全性」とは、概して、精製後のｍＲＮＡの質を指す。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ完全性は、タンジェント流濾過の後に分解していないｍＲＮＡのパーセンテージを指す。ｍＲＮＡ完全性は、当分野で周知の方法を用いて、例えば、ＲＮＡアガロースゲル電気泳動によって決定してもよい（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｅｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）。いくつかの実施形態では、本発明に従って精製したｍＲＮＡは、約９５％より大きい（例えば、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上より大きい）完全性を有する。いくつかの実施形態では、本発明に従って精製したｍＲＮＡは、９８％より大きい完全性を有する。いくつかの実施形態では、本発明に従って精製したｍＲＮＡは、９９％より大きい完全性を有する。いくつかの実施形態では、本発明に従って精製したｍＲＮＡは、約１００％の完全性を有する。
【実施例】
【００９２】
実施例１．メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の生成と精製
ｍＲＮＡの合成
以下の実施例のそれぞれでは、ｍＲＮＡの合成を完全なリボヌクレアーゼ非含有条件下で実施した。全てのチューブ、バイアル、ピペットチップ、ピペット、緩衝液等は、他に明示的に断りがなければ、ヌクレアーゼ非含有である必要があった。
【００９３】
以下の実施例では、他に断りがなければ、ｍＲＮＡを線状ＤＮＡ鋳型から生体外転写によって合成した。所望のｍＲＮＡ前駆体（ＩＶＴ）構築物を産生させるために、線状ＤＮＡ約１００ｕｇ、ｒＮＴＰ（３．３３ｍＭ）、ＤＴＴ（１０ｍＭ）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼ阻害薬、ピロホスファターゼ、及び反応緩衝液（１０×、８００ｍＭヘペス（ｐＨ８．０）、２０ｍＭスペルミジン、２５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．７）の混合物をリボヌクレアーゼ非含有水と調製して、２．２４ｍＬの最終体積にした。反応混合物を３７℃で２０分〜１２０分の間インキュベートする。完了時、混合物をデオキシリボヌクレアーゼＩでさらに１５分間処理し、以上により、クエンチする。
５’キャップ及び３’尾部の付加
【００９４】
上述のＩＶＴステップ（及び、場合によりその上に初期ＴＦＦ濾過）から得た精製したｍＲＮＡ産生物を６５℃で１０分間変性させた。別途、ＧＴＰ（２０ｍＭ）、Ｓ−アデノシルメチオニン、リボヌクレアーゼ阻害薬、２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、及びグアニリルトランスフェラーゼを一定分量ずつ、反応緩衝液（１０×、５００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭ  ＫＣｌ、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）とともに混合し、８．３ｍＬの最終濃度にした。変性後、ｍＲＮＡを氷上で冷却し、次いで反応混合物に添加する。合わせた溶液を３７℃で２０〜９０分の間インキュベートする。完了時、ＡＴＰ（２０ｍＭ）、ポリＡポリメラーゼ及びテーリング反応緩衝液（１０×、５００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５Ｍ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を一定分量ずつ添加し、合計反応混合物を３７℃で２０〜４５分の間さらにインキュベートする。完了時、最終反応混合物をクエンチし、以上により、精製する。
タンジェント流濾過による精製
【００９５】
以下の実施例では、他に断りがなければ、タンジェント流濾過（ＴＦＦ）系は、濾過膜と蠕動ポンプ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｌａｂｓｃａｌｅ  ＴＦＦ  ｓｙｓｔｅｍ）からなり、膜に沿った流体の接線方向循環は約１３０ｍＬ／分の供給速度であり、透過物に対する流量は３０ｍＬ／分であった。使用したＴＦＦ膜は、ＭｉｄｉＫｒｏｓ  ５００ｋＤａ  ｍＰＥＳ  １１５ｃｍ２（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ）であった。使用前にフィルターカートリッジをヌクレアーゼ非含有水で洗浄し、０．２Ｎ  ＮａＯＨでさらに浄化した。最後に、透過物と濃縮水のｐＨがｐＨ約６に達するまで、系をヌクレアーゼ非含有水で浄化した。
実施例２．精製ｍＲＮＡの分析
精製したｍＲＮＡにおける酵素の存在の試験
【００９６】
他に断りがなければ、精製の前後に存在したいずれの残留試薬酵素の存在をも決定するために、標準クーマシー染色タンパク質ゲル法を実施した。いくつかの場合には、加えてＢＣＡアッセイを実施した。
アガロースゲル電気泳動アッセイによるｍＲＮＡ完全性の評価
【００９７】
他に断りがなければ、メッセンジャーＲＮＡのサイズ及び完全性をゲル電気泳動によって評価した。自己注入式（ｓｅｌｆ−ｐｏｕｒｅｄ）１．０％アガロースゲルまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｅ−Ｇｅｌプレキャスト１．２％アガロースゲルのいずれかを使用した。メッセンジャーＲＮＡをウェルあたり１．０〜１．５ｕｇの量ずつ入れた。完了時、メッセンジャーＲＮＡのバンドを臭化エチジウムを用いて視覚化した。
生体外ｍＲＮＡ完全性アッセイ
【００９８】
他に断りがなければ、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡの生体外トランスフェクションを実施した。１マイクログラムの各ｍＲＮＡ構築物のトランスフェクションを、リポフェクタミンを用いて、別々のウェルで実施した。選んだ時点（例えば、４時間、８時間等）で細胞を採集し、それぞれのタンパク質産生を分析した。ＦＦＬ  ｍＲＮＡについては、バイオルミネセンスアッセイにより、細胞可溶化液を分析して、ルシフェラーゼ産生の有無を調べた。
バイオルミネセンス分析
【００９９】
提供されるＲＮＡの蛍光評価を含む実施例では、他に断りがなければ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（品目番号Ｅ１５００）を用いて、バイオルミネセンスアッセイを実施した。ルシフェラーゼアッセイ緩衝液１０ｍＬをルシフェラーゼアッセイ基質に添加し、ボルテックスによって混合することによって、ルシフェラーゼアッセイ試薬を調製した。ホモジェネート試料約２０ｕＬを９６ウェルプレートに入れ、続いて各試料にプレート対照２０ｕＬを入れた。別途、ルシフェラーゼアッセイ試薬１２０ｕＬを（上に記載の通りに調製して）９６ウェル平底プレートの各ウェルに加えた。次いで、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｆｌｅｘ  Ｓｔａｔｉｏｎ計測器を用い、適切なチャンバーに各プレートを挿入し、（相対的光単位（ＲＬＵ）での測定で）発光を測定した。
実施例３．ホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の生成と精製
【０１００】
この実施例は、種々の実施形態で、タンジェント流濾過（ＴＦＦ）及び変性剤の組合せを提供される方法に従って用いて、高純度に精製したｍＲＮＡ産生物を産生させ得ることを例証する。この実施例では、尿素をタンパク質変性剤として用いる。
【０１０１】
この実施例では、ホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ＲＮＡ（下の配列番号１）の５ミリグラムバッチを、上に記載の生体外方法によって転写して、上述の中間構築物をキャップもポリＡ尾部もない状態で産生させた。この反応は、２．２４ｍＬの合計体積を維持し、完了時に等体積の１０Ｍ尿素によってクエンチし、採集尿素濃度を５Ｍにした。得られた溶液を室温で５分間インキュベートし、タンジェント流濾過（ＴＦＦ）系貯留部に移した。試料をヌクレアーゼ非含有水で希釈して２００ｍＬにし、ヌクレアーゼ非含有水１２００ｍＬで、一度に２００ｍＬの限外濾過によって洗浄した。これに続いて、試料を１０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．４）２００ｍＬで処理し、続いて、ヌクレアーゼ非含有水で６００ｍｌの洗浄を行った。最後に、試料を約２ｍＬに濃縮し、最終濃度を２６０ｎｍ（λｍａｘ）での吸収により決定した。
コドン最適化ホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ｍＲＮＡ（配列番号１）
X2AUGGAAGAUGCCAAAAACAUUAAGAAGGGCCCAGCGCCAUUCUACCCACUCGAAGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCUGCACAAAGCCAUGAAGCGCUACGCCCUGGUGCCCGGCACCAUCGCCUUUACCGACGCACAUAUCGAGGUGGACAUUACCUACGCCGAGUACUUCGAGAUGAGCGUUCGGCUGGCAGAAGCUAUGAAGCGCUAUGGGCUGAAUACAAACCAUCGGAUCGUGGUGUGCAGCGAGAAUAGCUUGCAGUUCUUCAUGCCCGUGUUGGGUGCCCUGUUCAUCGGUGUGGCUGUGGCCCCAGCUAACGACAUCUACAACGAGCGCGAGCUGCUGAACAGCAUGGGCAUCAGCCAGCCCACCGUCGUAUUCGUGAGCAAGAAAGGGCUGCAAAAGAUCCUCAACGUGCAAAAGAAGCUACCGAUCAUACAAAAGAUCAUCAUCAUGGAUAGCAAGACCGACUACCAGGGCUUCCAAAGCAUGUACACCUUCGUGACUUCCCAUUUGCCACCCGGCUUCAACGAGUACGACUUCGUGCCCGAGAGCUUCGACCGGGACAAAACCAUCGCCCUGAUCAUGAACAGUAGUGGCAGUACCGGAUUGCCCAAGGGCGUAGCCCUACCGCACCGCACCGCUUGUGUCCGAUUCAGUCAUGCCCGCGACCCCAUCUUCGGCAACCAGAUCAUCCCCGACACCGCUAUCCUCAGCGUGGUGCCAUUUCACCACGGCUUCGGCAUGUUCACCACGCUGGGCUACUUGAUCUGCGGCUUUCGGGUCGUGCUCAUGUACCGCUUCGAGGAGGAGCUAUUCUUGCGCAGCUUGCAAGACUAUAAGAUUCAAUCUGCCCUGCUGGUGCCCACACUAUUUAGCUUCUUCGCUAAGAGCACUCUCAUCGACAAGUACGACCUAAGCAACUUGCACGAGAUCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCUCAGCAAGGAGGUAGGUGAGGCCGUGGCCAAACGCUUCCACCUACCAGGCAUCCGCCAGGGCUACGGCCUGACAGAAACAACCAGCGCCAUUCUGAUCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCUGGCGCAGUAGGCAAGGUGGUGCCCUUCUUCGAGGCUAAGGUGGUGGACUUGGACACCGGUAAGACACUGGGUGUGAACCAGCGCGGCGAGCUGUGCGUCCGUGGCCCCAUGAUCAUGAGCGGCUACGUUAACAACCCCGAGGCUACAAACGCUCUCAUCGACAAGGACGGCUGGCUGCACAGCGGCGACAUCGCCUACUGGGACGAGGACGAGCACUUCUUCAUCGUGGACCGGCUGAAGAGCCUGAUCAAAUACAAGGGCUACCAGGUAGCCCCAGCCGAACUGGAGAGCAUCCUGCUGCAACACCCCAACAUCUUCGACGCCGGGGUCGCCGGCCUGCCCGACGACGAUGCCGGCGAGCUGCCCGCCGCAGUCGUCGUGCUGGAACACGGUAAAACCAUGACCGAGAAGGAGAUCGUGGACUAUGUGGCCAGCCAGGUUACAACCGCCAAGAAGCUGCGCGGUGGUGUUGUGUUCGUGGACGAGGUGCCUAAAGGACUGACCGGCAAGUUGGACGCCCGCAAGAUCCGCGAGAUUCUCAUUAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGAUCGCCGUGUAY2
５’及び３’ＵＴＲ配列：
Ｘ２＝
GGGAUCCUACC（配列番号２）
Ｙ２＝
UUUGAAUU（配列番号３）
【０１０２】
最終反応体積９ｍＬ中、上に記載の通り、約５ｍｇのＴＦＦ精製したホタルルシフェラーゼＲＮＡにキャップと尾部を形成した。この反応混合物（６．７ｍｌ）の一部を５Ｍ尿素で室温（ＲＴ）で５分間処理し、ＴＦＦを用いて精製した。キャップ／尾部反応混合物約１．５ｍｇを、水のみを用いてＴＦＦによって精製し、単離した。別途、キャップ／尾部反応混合物の別の一部少量を、ＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙ精製キットを用い、公開されているプロトコールに従って精製した。単離した最終ＦＦＬ  ｍＲＮＡのバッチ３つに等分し、下に記載の通り、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へとトランスフェクトした。蛍光検出（ＦＦＬ活性）によって細胞可溶化液を分析し、ＦＦＬタンパク質の有無を調べた。
【０１０３】
この実施例では、この実施例の反応酵素を除去するために、ＦＦＬ  ｍＲＮＡ  ＩＶＴ反応混合物の一部を１０Ｍ尿素に付し、５Ｍ尿素の結果的最終濃度を得た。この溶液を室温で５分間インキュベートし、次いで、上に記載の通り、ＴＦＦによって精製した。図１は、上述の尿素条件を用いたＴＦＦの後に結果的に得られた単離したｍＲＮＡを明らかにするクーマシー染色タンパク質ゲルを示す。完了時に存在している検出可能酵素はない。
【０１０４】
キャップと尾部の形成されたＦＦＬ  ｍＲＮＡ産生物を産生させた後、ＴＦＦの方法を用いてさらに、最終標的ｍＲＮＡを精製した。同じキャップ／尾部反応混合物の一部を別々に等分し、比較のために、尿素無しのＴＦＦか、またはスピンカラム方法（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキット）によって精製した。ＴＦＦまたはスピンカラムによって単離した最終ｍＲＮＡの比較を、ゲル電気泳動を用いて行い、図２に示す。さらに、残留酵素レベルをタンパク質ゲルによって監視した（図３）。図２で、約１９００ｎｔで移動するそれぞれの「ＩＶＴ」ＦＦＬ  ｍＲＮＡバンドを、キャップと尾部（Ｃ／Ｔ）が形成された長さ約２１００ｎｔの最終ｍＲＮＡとともに、はっきりと見ることができる。キャップ／尾部ステップの後にスピンカラム単離を用いて典型的に観察される「ショートマー」のバンドが、レーン４に実際に観察される。
【０１０５】
ＴＦＦ精製ｍＲＮＡを用いると、キャップ／尾部ステップの後にショートマーバンドが存在しないことが明らかである。いずれかの精製方法を用いて相当量の酵素試薬を除去することは可能であるが、ショートマー不純物は除去できない。このことは、本明細書に記載のタンジェント流濾過方法が、ｍＲＮＡ転写中における、未成熟中断した配列の良好で効率的な精製方法であることを実証した。
【０１０６】
提供されるｍＲＮＡが所望のタンパク質に翻訳され得るか否かを決定するために、単離したＦＦＬ  ｍＲＮＡ構築物（ＴＦＦ対スピンカラム）のそれぞれの比較を行った。下に列記する３つの構築物のそれぞれをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、対応するＦＦＬタンパク質産生を、ルシフェリン（上述）へ曝露したときのＦＦＬ発光の形式でＦＦＬタンパク質活性によって評価した。
ＦＦＬ構築物：
１．ＴＦＦ（尿素有り）によって精製したＦＦＬ  ＩＶＴ及びＴＦＦ（尿素無し）によるＣ／Ｔステップ
２．ＴＦＦ（尿素有り）によって精製したＦＦＬ  ＩＶＴ及びＴＦＦ（尿素無し）によるＣ／Ｔステップ
３．スピンカラムによって精製したＦＦＬ  ＩＶＴ及びスピンカラムによるＣ／Ｔステップ
【０１０７】
それぞれから産生されるＦＦＬタンパク質の発光出力の比較を図４に表す。ＴＦＦ精製したＦＦＬ  ｍＲＮＡの完全性を、記載した条件（５Ｍ尿素への曝露）の下、タンジェント流濾過工程の間中維持する。
実施例４．因子ＩＸ（ＦＩＸ）ｍＲＮＡの生成と精製
【０１０８】
この実施例は、種々の実施形態で、タンジェント流濾過（ＴＦＦ）及び変性剤の組合せを提供される方法に従って用いて、高純度度に精製したｍＲＮＡ産生物を産生させてもよいことをさらに例証する。この実施例では、チオシアン酸グアニジンをタンパク質変性剤として用いる。
【０１０９】
この実施例では、今回は因子ＩＸ（下記配列番号４）をコードする第２の種のｍＲＮＡを産生させ、精製した。最初に、因子ＩＸ（ＦＩＸ）ＲＮＡの５ミリグラムバッチを、上に記載の生体外方法によって転写して、そのＲＮＡをキャップもポリＡ尾部もない状態で産生させた。この反応は、２．２４ｍＬの合計体積を維持し、完了時にプロテイナーゼＫ（４ｍｇ／ＩＶＴ反応１ｍｌ）の添加によってクエンチし、これを反応混合物中３７℃で５分間インキュベートした。完了時、６Ｍチオシアン酸グアニジン（４．３ｍＬ、最終約４Ｍ）を添加し、得られた溶液を室温で５分間インキュベートし、ＴＦＦ系貯留部に移した。試料をヌクレアーゼ非含有水で希釈して２００ｍＬにし、ヌクレアーゼ非含有水１６００ｍＬで、一度に２００ｍＬの限外濾過によって洗浄した。完了時、試料を約２ｍＬに濃縮し、最終濃度を２６０ｎｍ（λｍａｘ）での吸収により決定した。
ヒト因子ＩＸ（ＦＩＸ）ｍＲＮＡ（配列番号４）
X1AUGCAGCGCGUGAACAUGAUCAUGGCAGAAUCACCAGGCCUCAUCACCAUCUGCCUUUUAGGAUAUCUACUCAGUGCUGAAUGUACAGUUUUUCUUGAUCAUGAAAACGCCAACAAAAUUCUGAGGCGGAGAAGGAGGUAUAAUUCAGGUAAAUUGGAAGAGUUUGUUCAAGGGAACCUUGAGAGAGAAUGUAUGGAAGAAAAGUGUAGUUUUGAAGAAGCACGAGAAGUUUUUGAAAACACUGAAAGAACAACUGAAUUUUGGAAGCAGUAUGUUGAUGGAGAUCAGUGUGAGUCCAAUCCAUGUUUAAAUGGCGGCAGUUGCAAGGAUGACAUUAAUUCCUAUGAAUGUUGGUGUCCCUUUGGAUUUGAAGGAAAGAACUGUGAAUUAGAUGUAACAUGUAACAUUAAGAAUGGCAGAUGCGAGCAGUUUUGUAAAAAUAGUGCUGAUAACAAGGUGGUUUGCUCCUGUACUGAGGGAUAUCGACUUGCAGAAAACCAGAAGUCCUGUGAACCAGCAGUGCCAUUUCCAUGUGGAAGAGUUUCUGUUUCACAAACUUCUAAGCUCACCCGUGCUGAGGCUGUUUUUCCUGAUGUGGACUAUGUAAAUUCUACUGAAGCUGAAACCAUUUUGGAUAACAUCACUCAAAGCACCCAAUCAUUUAAUGACUUCACUCGGGUUGUUGGUGGAGAAGAUGCCAAACCAGGUCAAUUCCCUUGGCAGGUUGUUUUGAAUGGUAAAGUUGAUGCAUUCUGUGGAGGCUCUAUCGUUAAUGAAAAAUGGAUUGUAACUGCUGCCCACUGUGUUGAAACUGGUGUUAAAAUUACAGUUGUCGCAGGUGAACAUAAUAUUGAGGAGACAGAACAUACAGAGCAAAAGCGAAAUGUGAUUCGAAUUAUUCCUCACCACAACUACAAUGCAGCUAUUAAUAAGUACAACCAUGACAUUGCCCUUCUGGAACUGGACGAACCCUUAGUGCUAAACAGCUACGUUACACCUAUUUGCAUUGCUGACAAGGAAUACACGAACAUCUUCCUCAAAUUUGGAUCUGGCUAUGUAAGUGGCUGGGGAAGAGUCUUCCACAAAGGGAGAUCAGCUUUAGUUCUUCAGUACCUUAGAGUUCCACUUGUUGACCGAGCCACAUGUCUUCGAUCUACAAAGUUCACCAUCUAUAACAACAUGUUCUGUGCUGGCUUCCAUGAAGGAGGUAGAGAUUCAUGUCAAGGAGAUAGUGGGGGACCCCAUGUUACUGAAGUGGAAGGGACCAGUUUCUUAACUGGAAUUAUUAGCUGGGGUGAAGAGUGUGCAAUGAAAGGCAAAUAUGGAAUAUAUACCAAGGUAUCCCGGUAUGUCAACUGGAUUAAGGAAAAAACAAAGCUCACUUAAY1
５’及び３’ＵＴＲ配列：
Ｘ1＝
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG（配列番号５）
Ｙ1＝
CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUC（配列番号６）
【０１１０】
上記の方法をまた、上に記載の通り、但し、プロテイナーゼＫのステップの間アクチノマイシンＤ（１０μｇ／ＩＶＴ反応１ｍｌ）を添加して、実施した。プロテイナーゼＫ（アクチノマイシンＤ有りまたは無し）でＩＶＴ反応をクエンチすることによって、全ての酵素の除去をやはり良好に達成することができる（図５）。プロテイナーゼＫは、除去を促進することができるが、ｍＲＮＡ薬物原料を大規模に製造するには、この酵素を大規模に作製することが必要で、不必要な追加的コストを負うことになり、したがって、いくつかの実施形態では、望ましい方法ではないことがある。図６に示す通り、上に記載される通り（アクチノマイシンＤ有り及び無し）に産生したＦＩＸ  ｍＲＮＡ、並びに５Ｍ尿素を用いて精製したＦＩＸ  ｍＲＮＡは、実施例３に記載のＦＦＬ  ｍＲＮＡに関する結果同様、検出できるレベルのショートマーを含有しない。
実施例５．嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）ｍＲＮＡの生成及び生成
【０１１１】
この実施例は、種々の実施形態で、タンジェント流濾過（ＴＦＦ）及び変性剤の組合せを提供される方法に従って用いて、高純度に精製したｍＲＮＡ産生物を産生させてもよいことをさらに例証する。この実施例では、塩化カリウムをタンパク質変性剤として用いる。
【０１１２】
この実施例では、今回は嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ、下記配列番号７）をコードする第３の種のｍＲＮＡを産生させ、精製した。最初に、ＣＦＴＲ  ＲＮＡの５ミリグラムバッチを、上に記載の生体外方法によって転写して、上述のＲＮＡをキャップもポリＡ尾部もない状態で産生させた。この反応は、２．２４ｍＬの合計体積を維持し、完了時に２Ｍ  ＫＣｌ（約２００ｍＬ）の添加によってクエンチした。得られた溶液を室温で５分間インキュベートし、ＴＦＦ系の貯留部に移した。試料を、２００ｍＬの一定体積にて、ヌクレアーゼ非含有水中２Ｍ  ＫＣＬで、３〜４ダイアボリューム（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）に対してダイアフィルトレート（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｅ）した。この後、得られた溶液を、ヌクレアーゼ非含有水４００ｍＬで、一回２００ｍＬの限外濾過によって洗浄した。これに続いて、試料を１ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．４）２００ｍＬで処理し、ヌクレアーゼ非含有水で６００ｍｌの洗浄を行った。最後に、試料を約２ｍＬに濃縮し、最終濃度を２６０ｎｍ（λｍａｘ）での吸収により決定した。
コドン最適化嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）ｍＲＮＡ（配列番号７）
X1AUGCAGCGGUCCCCGCUCGAAAAGGCCAGUGUCGUGUCCAAACUCUUCUUCUCAUGGACUCGGCCUAUCCUUAGAAAGGGGUAUCGGCAGAGGCUUGAGUUGUCUGACAUCUACCAGAUCCCCUCGGUAGAUUCGGCGGAUAACCUCUCGGAGAAGCUCGAACGGGAAUGGGACCGCGAACUCGCGUCUAAGAAAAACCCGAAGCUCAUCAACGCACUGAGAAGGUGCUUCUUCUGGCGGUUCAUGUUCUACGGUAUCUUCUUGUAUCUCGGGGAGGUCACAAAAGCAGUCCAACCCCUGUUGUUGGGUCGCAUUAUCGCCUCGUACGACCCCGAUAACAAAGAAGAACGGAGCAUCGCGAUCUACCUCGGGAUCGGACUGUGUUUGCUUUUCAUCGUCAGAACACUUUUGUUGCAUCCAGCAAUCUUCGGCCUCCAUCACAUCGGUAUGCAGAUGCGAAUCGCUAUGUUUAGCUUGAUCUACAAAAAGACACUGAAACUCUCGUCGCGGGUGUUGGAUAAGAUUUCCAUCGGUCAGUUGGUGUCCCUGCUUAGUAAUAACCUCAACAAAUUCGAUGAGGGACUGGCGCUGGCACAUUUCGUGUGGAUUGCCCCGUUGCAAGUCGCCCUUUUGAUGGGCCUUAUUUGGGAGCUGUUGCAGGCAUCUGCCUUUUGUGGCCUGGGAUUUCUGAUUGUGUUGGCAUUGUUUCAGGCUGGGCUUGGGCGGAUGAUGAUGAAGUAUCGCGACCAGAGAGCGGGUAAAAUCUCGGAAAGACUCGUCAUCACUUCGGAAAUGAUCGAAAACAUCCAGUCGGUCAAAGCCUAUUGCUGGGAAGAAGCUAUGGAGAAGAUGAUUGAAAACCUCCGCCAAACUGAGCUGAAACUGACCCGCAAGGCGGCGUAUGUCCGGUAUUUCAAUUCGUCAGCGUUCUUCUUUUCCGGGUUCUUCGUUGUCUUUCUCUCGGUUUUGCCUUAUGCCUUGAUUAAGGGGAUUAUCCUCCGCAAGAUUUUCACCACGAUUUCGUUCUGCAUUGUAUUGCGCAUGGCAGUGACACGGCAAUUUCCGUGGGCCGUGCAGACAUGGUAUGACUCGCUUGGAGCGAUCAACAAAAUCCAAGACUUCUUGCAAAAGCAAGAGUACAAGACCCUGGAGUACAAUCUUACUACUACGGAGGUAGUAAUGGAGAAUGUGACGGCUUUUUGGGAAGAGGGUUUUGGAGAACUGUUUGAGAAAGCAAAGCAGAAUAACAACAACCGCAAGACCUCAAAUGGGGACGAUUCCCUGUUUUUCUCGAACUUCUCCCUGCUCGGAACACCCGUGUUGAAGGACAUCAAUUUCAAGAUUGAGAGGGGACAGCUUCUCGCGGUAGCGGGAAGCACUGGUGCGGGAAAAACUAGCCUCUUGAUGGUGAUUAUGGGGGAGCUUGAGCCCAGCGAGGGGAAGAUUAAACACUCCGGGCGUAUCUCAUUCUGUAGCCAGUUUUCAUGGAUCAUGCCCGGAACCAUUAAAGAGAACAUCAUUUUCGGAGUAUCCUAUGAUGAGUACCGAUACAGAUCGGUCAUUAAGGCGUGCCAGUUGGAAGAGGACAUUUCUAAGUUCGCCGAGAAGGAUAACAUCGUCUUGGGAGAAGGGGGUAUUACAUUGUCGGGAGGGCAGCGAGCGCGGAUCAGCCUCGCGAGAGCGGUAUACAAAGAUGCAGAUUUGUAUCUGCUUGAUUCACCGUUUGGAUACCUCGACGUAUUGACAGAAAAAGAAAUCUUCGAGUCGUGCGUGUGUAAACUUAUGGCUAAUAAGACGAGAAUCCUGGUGACAUCAAAAAUGGAACACCUUAAGAAGGCGGACAAGAUCCUGAUCCUCCACGAAGGAUCGUCCUACUUUUACGGCACUUUCUCAGAGUUGCAAAACUUGCAGCCGGACUUCUCAAGCAAACUCAUGGGGUGUGACUCAUUCGACCAGUUCAGCGCGGAACGGCGGAACUCGAUCUUGACGGAAACGCUGCACCGAUUCUCGCUUGAGGGUGAUGCCCCGGUAUCGUGGACCGAGACAAAGAAGCAGUCGUUUAAGCAGACAGGAGAAUUUGGUGAGAAAAGAAAGAACAGUAUCUUGAAUCCUAUUAACUCAAUUCGCAAGUUCUCAAUCGUCCAGAAAACUCCACUGCAGAUGAAUGGAAUUGAAGAGGAUUCGGACGAACCCCUGGAGCGCAGGCUUAGCCUCGUGCCGGAUUCAGAGCAAGGGGAGGCCAUUCUUCCCCGGAUUUCGGUGAUUUCAACCGGACCUACACUUCAGGCGAGGCGAAGGCAAUCCGUGCUCAACCUCAUGACGCAUUCGGUAAACCAGGGGCAAAACAUUCACCGCAAAACGACGGCCUCAACGAGAAAAGUGUCACUUGCACCCCAGGCGAAUUUGACUGAACUCGACAUCUACAGCCGUAGGCUUUCGCAAGAAACCGGACUUGAGAUCAGCGAAGAAAUCAAUGAAGAAGAUUUGAAAGAGUGUUUCUUUGAUGACAUGGAAUCAAUCCCAGCGGUGACAACGUGGAACACAUACUUGCGUUACAUCACGGUGCACAAGUCCUUGAUUUUCGUCCUCAUCUGGUGUCUCGUGAUCUUUCUCGCUGAGGUCGCAGCGUCACUUGUGGUCCUCUGGCUGCUUGGUAAUACGCCCUUGCAAGACAAAGGCAAUUCUACACACUCAAGAAACAAUUCCUAUGCCGUGAUUAUCACUUCUACAAGCUCGUAUUACGUGUUUUACAUCUACGUAGGAGUGGCCGACACUCUGCUCGCGAUGGGUUUCUUCCGAGGACUCCCACUCGUUCACACGCUUAUCACUGUCUCCAAGAUUCUCCACCAUAAGAUGCUUCAUAGCGUACUGCAGGCUCCCAUGUCCACCUUGAAUACGCUCAAGGCGGGAGGUAUUUUGAAUCGCUUCUCAAAAGAUAUUGCAAUUUUGGAUGACCUUCUGCCCCUGACGAUCUUCGACUUCAUCCAGUUGUUGCUGAUCGUGAUUGGGGCUAUUGCAGUAGUCGCUGUCCUCCAGCCUUACAUUUUUGUCGCGACCGUUCCGGUGAUCGUGGCGUUUAUCAUGCUGCGGGCCUAUUUCUUGCAGACGUCACAGCAGCUUAAGCAACUGGAGUCUGAAGGGAGGUCGCCUAUCUUUACGCAUCUUGUGACCAGUUUGAAGGGAUUGUGGACGUUGCGCGCCUUUGGCAGGCAGCCCUACUUUGAAACACUGUUCCACAAAGCGCUGAAUCUCCAUACGGCAAAUUGGUUUUUGUAUUUGAGUACCCUCCGAUGGUUUCAGAUGCGCAUUGAGAUGAUUUUUGUGAUCUUCUUUAUCGCGGUGACUUUUAUCUCCAUCUUGACCACGGGAGAGGGCGAGGGACGGGUCGGUAUUAUCCUGACACUCGCCAUGAACAUUAUGAGCACUUUGCAGUGGGCAGUGAACAGCUCGAUUGAUGUGGAUAGCCUGAUGAGGUCCGUUUCGAGGGUCUUUAAGUUCAUCGACAUGCCGACGGAGGGAAAGCCCACAAAAAGUACGAAACCCUAUAAGAAUGGGCAAUUGAGUAAGGUAAUGAUCAUCGAGAACAGUCACGUGAAGAAGGAUGACAUCUGGCCUAGCGGGGGUCAGAUGACCGUGAAGGACCUGACGGCAAAAUACACCGAGGGAGGGAACGCAAUCCUUGAAAACAUCUCGUUCAGCAUUAGCCCCGGUCAGCGUGUGGGGUUGCUCGGGAGGACCGGGUCAGGAAAAUCGACGUUGCUGUCGGCCUUCUUGAGACUUCUGAAUACAGAGGGUGAGAUCCAGAUCGACGGCGUUUCGUGGGAUAGCAUCACCUUGCAGCAGUGGCGGAAAGCGUUUGGAGUAAUCCCCCAAAAGGUCUUUAUCUUUAGCGGAACCUUCCGAAAGAAUCUCGAUCCUUAUGAACAGUGGUCAGAUCAAGAGAUUUGGAAAGUCGCGGACGAGGUUGGCCUUCGGAGUGUAAUCGAGCAGUUUCCGGGAAAACUCGACUUUGUCCUUGUAGAUGGGGGAUGCGUCCUGUCGCAUGGGCACAAGCAGCUCAUGUGCCUGGCGCGAUCCGUCCUCUCUAAAGCGAAAAUUCUUCUCUUGGAUGAACCUUCGGCCCAUCUGGACCCGGUAACGUAUCAGAUCAUCAGAAGGACACUUAAGCAGGCGUUUGCCGACUGCACGGUGAUUCUCUGUGAGCAUCGUAUCGAGGCCAUGCUCGAAUGCCAGCAAUUUCUUGUCAUCGAAGAGAAUAAGGUCCGCCAGUACGACUCCAUCCAGAAGCUGCUUAAUGAGAGAUCAUUGUUCCGGCAGGCGAUUUCACCAUCCGAUAGGGUGAAACUUUUUCCACACAGAAAUUCGUCGAAGUGCAAGUCCAAACCGCAGAUCGCGGCCUUGAAAGAAGAGACUGAAGAAGAAGUUCAAGACACGCGUCUUUAAY1
５’及び３’ＵＴＲ配列：
Ｘ1＝
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG（配列番号５）
Ｙ1＝
CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUC（配列番号６）
【０１１３】
この実施例では、反応酵素を除去するために、２Ｍ  ＫＣｌダイアフィルトレーションを用いた。大量の２Ｍ  ＫＣｌに曝露すると、反応混合物に存在する全ての酵素（Ｔ７ポリメラーゼを含む）の除去が良好であるとの結果が、タンパク質ゲル電気泳動によって決定した場合に、得られた（図７）。アガロースゲル電気泳動によって明らかとなったように、標的メッセンジャーＲＮＡは、かかる条件への曝露の後でも無傷のままである（図８）。
【０１１４】
さらに、ＣＦＴＲ  ＩＶＴ構築物のキャップ形成と尾部形成の後、２Ｍ  ＫＣｌを用いたＴＦＦによって最終ＣＦＴＲ転写物（キャップ有りかつ尾部有り）を良好に精製することができる。この最終単離産生物を、スピンカラム方法によって精製した同じ産生物と比較すると、ゲル電気泳動によって決定した場合に、「ショートマー」バンドが大きく減少していることを観察する（図９）。
同等事項及び範囲
【０１１５】
当業者は、本明細書に記載する発明の具体的な実施形態の多くの同等事物を認識し、単に日常的実験を用いてそれを確認することができるものである。本発明の範囲は、上記明細書に限定されることを意図されておらず、より正確には次の特許請求の範囲に明記する通りである。
【図１】
0006586075.tif 000002
【図２】
0006586075.tif 000003
【図３】
0006586075.tif 000004
【図４】
0006586075.tif 000005
【図５】
0006586075.tif 000006
【図６】
0006586075.tif 000007
【図７】
0006586075.tif 000008
【図８】
0006586075.tif 000009
【図９】
0006586075.tif 000010
【配列表】
0006586075000001.app