(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の標的核酸内の一塩基多型（ＳＮＰ）を検出する方法であって、該方法は： サンプルと、任意の標的核酸がサンプル中に存在する場合に増幅産物を生成する第１の核酸配列を含むプライマー対と、を接触させることを含む増幅工程の実施；
増幅産物と、５’末端及び３’末端を有するＳＮＰ特異的加水分解プローブとを接触させることを含むハイブリダイズ工程の実施であって、
前記ＳＮＰ特異的加水分解プローブは、前記プローブの３’末端に位置するヘアピン構造と、前記増幅産物の領域を含むＳＮＰに相補的な第２の核酸配列からなる核酸配列を有し；
前記ＳＮＰ特異的加水分解プローブはさらに、第１及び第２の相互作用性ラベルを含み、ここで前記第１の相互作用性ラベルは、５’末端においてドナー蛍光成分を含み、前記第２の相互作用性ラベルは、前記加水分解プローブの前記ドナー蛍光成分の５ヌクレオチド以内に、対応するアクセプター蛍光成分を含み、ここで前記増幅産物の前記ＳＮＰにハイブリダイズする前記加水分解プローブの第２の核酸配列内のヌクレオチドは、前記第１および第２の相互作用性ラベルの間に位置し；そして
前記ヘアピン構造は、１以上の非天然ヌクレオチドを含む非天然の核酸配列の領域を含み、前記３’末端でヘアピン構造を生成するものであり、ここで前記１以上の非天然ヌクレオチドは、前記増幅産物の天然型または野生型配列と比較して、前記加水分解プローブの前記３’末端で付加または変更されたヌクレオチドである；及び、
前記増幅産物の存在又は非存在の検出であって、ここで、前記増幅産物の存在が、前記標的核酸におけるＳＮＰの存在の指標であって、ここで、前記増幅産物の非存在が、前記標的核酸におけるＳＮＰが非存在の指標である、
を含む方法。
【請求項２】
アクセプター蛍光成分はクエンチャーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増幅工程は、５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を使用する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
プライマーの第１の核酸配列及び／又は加水分解プローブの第２の核酸配列が、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
プライマーの第１の核酸配列及び／又は加水分解プローブの第２の核酸配列が、４０以下のヌクレオチドを有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
サンプル中の標的核酸内のＳＮＰを検出するキットであって、以下：
標的核酸の増幅産物を生成する特異的な第１の核酸配列を含む少なくとも１つのプライマー対；及び
５’末端及び３’末端を有するＳＮＰ特異的加水分解プローブであって、
前記ＳＮＰ特異的加水分解プローブは、前記プローブの３’末端に位置するヘアピン構造と、前記増幅産物の領域を含むＳＮＰに相補的な第２の核酸配列からなる核酸配列を有し；
前記ＳＮＰ特異的加水分解プローブはさらに、第１及び第２の相互作用性ラベルを含み、ここで前記第１の相互作用性ラベルは、５’末端においてドナー蛍光成分を含み、前記第２の相互作用性ラベルは、前記加水分解プローブの前記ドナー蛍光成分の５ヌクレオチド以内に、対応するアクセプター蛍光成分を含み、ここで前記増幅産物の前記ＳＮＰにハイブリダイズする前記加水分解プローブの第２の核酸配列内のヌクレオチドは、前記第１および第２の相互作用性ラベルの間に位置し；そして
前記ヘアピン構造が、１以上の非天然ヌクレオチドを含む非天然核酸配列の領域を含み、前記３’末端でヘアピン構造を生成するものであり、ここで前記１以上の非天然ヌクレオチドは、前記増幅産物の天然型または野生型配列と比較して、前記加水分解プローブの前記３’末端で付加または変更されたヌクレオチドである、
を含むキット。
【請求項７】
アクセプター蛍光成分はクエンチャーである、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
さらに、５’から３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を含む、請求項６又は７に記載のキット。
【請求項９】
プライマーの第１の核酸配列及び／又は加水分解プローブの第２の核酸配列が、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１０】
プライマーの第１の核酸配列及び／又は加水分解プローブの第２の核酸配列が、４０以下のヌクレオチドを有する、請求項６〜９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１】
増幅産物のＳＮＰを含む領域に相補的な核酸配列を含む５’末端及び３’末端を有するＳＮＰ特異的加水分解プローブであって、
前記ＳＮＰ特異的加水分解プローブは、前記プローブの３’末端に位置するヘアピン構造と、前記増幅産物の領域を含むＳＮＰに相補的な第２の核酸配列からなる核酸配列を有し；
前記ＳＮＰ特異的加水分解プローブはさらに、第１及び第２の相互作用性ラベルを含み、ここで前記第１の相互作用性ラベルは、５’末端においてドナー蛍光成分を含み、前記第２の相互作用性ラベルは、前記加水分解プローブの前記ドナー蛍光成分の５ヌクレオチド以内に、対応するアクセプター蛍光成分を含み、ここで前記増幅産物の前記ＳＮＰにハイブリダイズする前記加水分解プローブの第２の核酸配列内のヌクレオチドは、前記第１および第２の相互作用性ラベルの間に位置し；そして
前記ヘアピン構造が、１以上の非天然ヌクレオチドを含む非天然核酸配列の領域を含み、前記３’末端でヘアピン構造を生成するものであり、ここで前記１以上の非天然ヌクレオチドは、前記増幅産物の天然型または野生型配列と比較して、前記加水分解プローブの前記３’末端で付加または変更されたヌクレオチドである、
ＳＮＰ特異的加水分解プローブ。
【請求項１２】
アクセプター蛍光成分がクエンチャーである、請求項１１に記載のＳＮＰ特異的加水分解プローブ。
【請求項１３】
加水分解プローブの核酸配列が、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１１又は１２に記載のＳＮＰ特異的加水分解プローブ。
【請求項１４】
加水分解プローブが、４０以下のヌクレオチドを有する、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のＳＮＰ特異的加水分解プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく診断分野に関するものであって、より具体的には、加水分解プローブを用いたＰＣＲ検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ＰＣＲは、ＤＮＡ又はＲＮＡの小さなセグメンをコピー又は「増幅」するための効率的かつコスト効果の高い方法である。ＰＣＲを用いることで、数百万のＤＮＡ断片のコピーがわずか数時間で作製され、分析に必要十分なＤＮＡが得られる。この方法は、臨床医が、血液や組織などの最小源の量のサンプルを使用して病気を診断し、監視することを可能とする。リアルタイムＰＣＲは、増幅及び検出を同時に可能とする。検出の一方法としては、例えば、オリゴヌクレオチドプローブの５’末端に共有結合したフルオロフォアを有し、例えば、内部的に又は３’末端に結合したクエンチャーを有するオリゴヌクレオチド加水分解プローブ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとしても知られる）を利用して実施される。加水分解プローブは、Ｔａｑポリメラーゼの５’から３’エキソヌクレアーゼ活性に依存する二重標識オリゴヌクレオチドプローブであって、相補的標的配列へのハイブリダイズする際に加水分解プローブを切断し、その結果、蛍光ベースの検出をもたらす。
【０００３】
リアルタイムＰＣＲ法は、一塩基多型（ＳＮＰ）を有する標的核酸中の配列変異を増幅し、検出するために使用することができる。しかし、利用可能なＳＮＰ検出／ジェノタイピングアッセイの多くは、ＳＮＰが対立遺伝子であるという仮定に基づいている（例えば、Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，２００７，２１，１７１−１７６を参照）。現在、既存のリアルタイムＰＣＲ法を用いたＳＮＰの検出は、十分な感度と特異性を欠いている。標準的なＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブなどの加水分解プローブは、典型的には、プライマーと比較して８〜１０℃高い融解温度（Ｔｍ）を有するように長さが約１８〜２２塩基に設計されている。標準的なＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、一般的には、ＳＮＰ検出の特異性及び感度が低いことが証明されており、ＷＴ（野生型）とＭＴ（ミュータント）標的の完全には区別することができない。現在のＴａｑＭａｎ（登録商標）を基礎とするＳＮＰジェノタイピングアッセイは、対立遺伝子を識別するためのプローブ−鋳型結合安定性を増加させ、長さがより短いＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢ（マイナーグルーブバインダー）プローブの使用を含んでいる。塩基を安定するような追加の塩基修飾（プロピニルｄＵ、プロピニルｄＣ）は、ＳＮＰの検出及び識別を改善するための標準的なＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ設計に含めることもできる。このように、当該技術分野おいて、感度の高い様式でＳＮＰを特異的に検出する迅速かつ信頼性の高い方法が希求されている。
【発明の概要】
【０００４】
本開示の主題は、３’末端を向くヘアピン構造を含むように設計されたＳＮＰ特異的加水分解プローブを含む。このような加水分解プローブは、必ずしも、プロピニルｄＵ、プロピニルｄＣ等の追加的な塩基修飾、又は、ＭＧＢｓなどの特殊な分子の使用は含まない。プローブの３’末端の近くのヘアピン構造は、鋳型へのプローブの３’部分がハイブリダイズすることを遅延させ、従って、レポーターと５’末端付近のクエンチャーとの間の単一のミスマッチに基づく、ＷＴとＭＴ標的の識別に役立つ。ＳＮＰ特異的プローブの５’部分は、ＷＴの鋳型と比較して、ＭＴ鋳型により効率的にハイブリダイズすることが可能である。ＳＮＰ特異的プローブがＷＴ標的を発見すると、ＷＴ標的への単一ミスマッチがハイブリダイズ及びプローブ切断を防止し、従って、蛍光が検出されない。
【０００５】
一態様では、サンプル中の標的核酸のＳＮＰを検出する方法が提供されるものであって、該方法が、サンプルと、サンプル中に標的核酸酸が存在する場合に増幅産物を生成する第１の核酸配列を含むプライマーと、を接触させることを含む増幅工程の実行；増幅産物と、増幅産物のＳＮＰを含む領域に相補的な第２の核酸配列を含むＳＮＰ特異的加水分解プローブと、を接触させることを含むハイブリダイズ工程の実施であって、ＳＮＰ特異的加水分解プローブが、第１及び第２の相互作用性ラベル、５’末端及び３’末端、並びに、３’末端を向くヘアピン構造を含むものであって、ヘアピン構造が、ヘアピン構造を形成するための１以上の非天然（例えば、変異した又は追加の）ヌクレオチドを含む、非天然ヌクレオチドの領域を含むものである；並びに、増幅産物の存在又は非存在の検出、を含む方法であって、ここで、増幅産物が存在することは、標的核酸の標的におけるＳＮＰの存在を示すものであって、ここで、増幅産物が存在しないことは、標的核酸の標的中にＳＮＰが存在しないことの指標である。一実施形態において、第１の相互作用性ラベルは、５’末端にドナー蛍光成分を含み、第２の相互作用性ラベルは、加水分解プローブのドナー蛍光成分の５ヌクレオチド以内に対応するアクセプター蛍光成分を含んでいる。特定の実施形態において、アクセプター蛍光成分はクエンチャーである。別の実施形態において、増幅は、５’から３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を使用する。別の実施形態において、プライマーの第１の核酸配列及び／又は加水分解プローブの第２の核酸配列は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態において、プライマーの第１の核酸配列及び／又は加水分解プローブの第２の核酸配列は、４０以下のヌクレオチドを有する。
【０００６】
別の態様では、サンプル中の標的核酸内のＳＮＰを検出するキットを提供するものであって、標的核酸の増幅産物を生成するための特異的な第１の核酸配列を含む少なくとも一つのプライマー；及び、増幅産物の領域を含むＳＮＰに相補的な第２の核酸配列を含むＳＮＰ特異的加水分解プローブ、を含むキットであって、ＳＮＰ特異的加水分解プローブが、第１及び第２の相互作用性ラベル、５’末端及び３’末端、並びに、３’末端を向くヘアピン構造を含むものであって、ヘアピン構造が、ヘアピン構造を形成するための１以上の非天然（例えば、変異した又は追加の）ヌクレオチドを含んでいる。一実施形態では、第１相互作用性ラベルは、５’末端にドナー蛍光成分を含み、第２の相互作用性ラベルは、加水分解プローブのドナー蛍光成分の５ヌクレオチド以内の対応するアクセプター蛍光成分を含む。特定の実施形態では、アクセプター蛍光成分はクエンチャーである。別の実施形態において、キットはさらに、５’から３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を含む。別の実施形態では、プライマーの第１の核酸配列及び／又は加水分解プローブの第２の核酸配列は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態では、プライマーの第１の核酸配列及び／又は加水分解プローブの第２の核酸配列は、４０以下のヌクレオチドを有する。
【０００７】
一態様では、ＳＮＰ特異的加水分解プローブは、増幅産物の領域を含むＳＮＰに相補的な核酸配列を含むものが提供され、ＳＮＰ特異的加水分解プローブが、第１及び第２の相互作用性ラベル、５’末端及び３’末端、並びに、３’末端を向くヘアピン構造を含むものであって、ヘアピン構造が、ヘアピン構造を形成するための１以上の非天然（例えば、変異した又は追加の）ヌクレオチドを含んでいる。一実施形態では、第１相互作用性ラベルは、５’末端を向く、５’末端近傍、又は５’末端における、ドナー蛍光成分であってもよく、第２の相互作用性ラベルは、加水分解プローブのドナー蛍光成分の５ヌクレオチド以内において、対応するアクセプター蛍光成分であってもよい。特定の実施形態では、アクセプター蛍光成分はクエンチャーである。別の実施形態では、加水分解プローブの核酸配列は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態では、加水分解プローブは、４０以下のヌクレオチドを有する。
【０００８】
別段の定義がない限り、本明細書中で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は同等の方法及び材料を、本発明の実践又は試験において用いることができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。さらに、材料、方法、及び実施例は単なる例示であり、限定することを意図するものではない。
【０００９】
本発明の１以上の実施形態の詳細は、添付の図面及び以下の説明に記載されている。発明の他の特徴、目的及び利点は、図面及び詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、３’末端を向くヘアピン構造を有する加水分解プローブを用いた５２６Ｎ  ＳＮＰを検出するためのリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す。
【図２】図２は、ＭＴプラスミド（配列番号：５）及びＷＴプラスミド（配列番号：６）の一部、並びに、分子間相互作用を防止するために置換された末端塩基を有するヘアピンを有しないプローブ（長い矢印）上の５２６Ｎ  ＳＮＰ（ＣＡＣ／ＡＡＣ）の位置を示す。
【図３】図３は、ヘアピンを形成するために置換した３塩基を有する３’末端にヘアピン構造を有するように設計された５２６Ｎ  ＳＮＰ位置用の加水分解プローブの配列（配列番号：１）を示す。
【図４】図４は、ヘアピン構造を有さない加水分解プローブを用いた５２６Ｎ  ＳＮＰ検出のリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す。
【図５】図５は、３’末端を向くヘアピン構造を有する加水分解プローブを用いた５３１Ｌ    ＳＮＰ検出のリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す。
【図６】図６は、ＭＴプラスミド（配列番号：７）及びＷＴプラスミド（配列番号：８）の一部並びにヘアピンなしプローブ（長い矢印）上の５３１Ｌ  ＳＮＰ（ＴＣＧ／ＴＴＧ）の位置を示す。
【図７】図７は、ヘアピンを形成するように置換された１塩基を有する３’末端にヘアピン構造を有するように設計された５３１Ｌ  ＳＮＰ位置用加水分解プローブの配列（配列番号：３）を示す。
【図８】図８は、ヘアピン構造有さない加水分解プローブを用いた５３１Ｌ  ＳＮＰ検出のリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本明細書は、サンプル中の標的核酸内の一塩基多型（ＳＮＰ）を検出する方法、キット、及び加水分解プローブを記載している。他の方法と比較して、標的核酸中のＳＮＰを検出するリアルタイムＰＣＲの感受性を増大すること、並びに、サンプルの封じ込め及び増幅産物のリアルタイム検出を含むリアルタイムＰＣＲの特徴を改善することは、臨床検査室における標的核酸中のＳＮＰの日常的な診断及び検出に関するこの技術の実装を実現可能とする。
【００１２】
方法は、１以上のプライマー又は１以上のプライマー対を使用して、サンプル中における、標的核酸分子、例えば、検出される対象のＳＮＰを含む遺伝子標的の１以上の部分を増幅することを含む、少なくとも１つのサイクル工程の実施を含んでも良い。本明細書で使用されるように、「プライマー」、「プライマー（複数）」、及び「プライマー対」は、特異的に核酸配列標的にアニーリングし、適切な条件下において、そこから合成を開始するオリゴヌクレオチドプライマー（単数又は複数）を指す。各プライマーは、標的及びＳＮＰが存在する場合、各増幅産物の少なくとも一部が標的及びＳＮＰのそれぞれ対応する核酸配列を含むように、それぞれの標的内又は隣接する領域にアニーリングする。対象のＳＮＰが標的核酸分子中に存在するか否かを問わず、増幅産物は、標的核酸がサンプル中に提供されるならば、生成される。
【００１３】
方法は、増幅産物と、増幅産物の領域を含むＳＮＰに相補的な核酸配列を含むＳＮＰ特異的加水分解プローブとを接触させることを含むハイブリダイズ工程を含むことも可能である。ＳＮＰ特異的加水分解プローブは、第１及び第２の相互作用性ラベル、５’末端及び３’末端、並びに、３’末端を向くヘアピン構造を含むことができる。ヘアピン構造は、天然配列の一部ではない１以上の変異させたヌクレオチドを含み得る、又は、追加の非天然核酸ヌクレオチドを含み得る、非天然核酸領域を含むように設計することができるものであって、ヘアピン構造を形成するための天然配列に追加したヌクレオチドである。このように、通常、３’末端にヘアピン構造を形成しない核酸配列は、例えば、核酸配列を改変すること、例えば、３’末端を向く配列において１以上のヌクレオチドを変化させることによって、又は、３’末端に核酸配列に１以上のヌクレオチドを追加することによって、ヘアピンを形成するように設計することができる。
【００１４】
対象のＳＮＰが、サンプル中の核酸標的中に存在する又は存在しないか否かを検出するために、増幅産物は、ＳＮＰ特異的加水分解プローブから放出される検出可能な標識を介して検出される。増幅産物がＳＮＰ特異的加水分解プローブにより検出される場合、ＳＮＰの存在が示される。あるいは、増幅産物がＳＮＰ特異的加水分解プローブにより検出されない場合、ＳＮＰの存在が示されない。従って、増幅産物の存在は、標的核酸の標的においてＳＮＰが存在する指標であり、増幅産物が存在しないことは、標的核酸の標的においてＳＮＰが存在しない指標である。
【００１５】
本明細書で使用される、用語「増幅する」は、鋳型核酸分子（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）又は結核菌（ＭＴＢ）、又は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ））の片方又は両方の鎖に相補的な核酸分子を合成するプロセスを指す。核酸分子の増幅は、典型的には、鋳型核酸を変性すること（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、プライマーの融解温度より低い温度で鋳型核酸にプライマーをアニーリングすること（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、及び、増幅産物を生成するためにプライマーから酵素的に伸長すること（ｅｌｏｎｇａｔｉｎｇ）、を含む。増幅は、典型的には、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ酵素（例えば、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ）及び、ポリメラーゼ酵素の最適活性に必要な適切な緩衝液及び／又はコファクター（例えば、ＭｇＣｌ２及び／又はＫＣｌ）の存在を必要とする。
【００１６】
用語「プライマー」は本明細書中において、当業者に知られているものとして使用されるものであって、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡ合成を「プライム」することが可能なオリゴマー化合物、主にオリゴヌクレオチド並びに修飾されたオリゴヌクレオチドを意味し、すなわち、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端は、デオキシヌクレオシド三リン酸を使用してピロリン酸を放出することにより、３’から５’へホスホジエステル結合を形成し、さらに「ヌクレオチド」が、鋳型依存ＤＮＡポリメラーゼが結合する場所に遊離３’−ＯＨ基を提供する。一般に、プライマーは、既知の鋳型配列に基づいて設計される。一方のプライマーはセンス鎖をプライミングし、他方は標的ＤＮＡ又はｃＤＮＡの相補鎖をプライミングする。ＰＣＲは、一様な標的ＤＮＡ若しくはＲＮＡに対して（すなわち、同一の配列を有する標的）、又は、混合した標的ＤＮＡ若しくはＲＮＡに対して（すなわち、保存配列に隣接する異なる介在配列を有する標的）実施可能である。混合したＤＮＡ／ＲＮＡ（例えば、配列不均一性を含む）に対し、標的配列がミスマッチプライマー（すなわち、寛容プライマー）が十分な相補性を有している場合、ミスマッチプライマーは、ＰＣＲ反応で機能することが可能である。
【００１７】
用語「ハイブリダイズする」とは、１以上のプローブが増幅産物へアニーリングすることを意味する。ハイブリダイズの条件は、典型的には、プローブの融解温度よりも低いが、プローブの非特異的なハイブリダイズを回避する温度を含んでいる。
【００１８】
用語「５’から３’エキソヌクレアーゼ活性」とは、典型的には、ヌクレオチドが核酸鎖の５’末端から除去されることによる、核酸鎖の合成に関連した、核酸ポリメラーゼの活性を意味する。
【００１９】
用語「熱安定性ポリメラーゼ」とは、熱安定性を有するポリメラーゼ酵素を意味し、すなわち、酵素は、鋳型に対して相補的なプライマー伸長産物を形成することを触媒し、二本鎖鋳型核酸が変性するのに必要な時間、高温にさらしても不可逆的に変性しない。一般的に、合成は、各プライマーの３’末端で開始され、鋳型鎖に沿って５’から３’方向に進行する。熱安定性ポリメラーゼは、サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉａｖｕｓ）、Ｔ．ルバー（Ｔ．ｒｕｂｅｒ）、Ｔ．サーモフィスル（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｔ．アクアティクス（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、Ｔ．ラクテウス（Ｔ．ｌａｃｔｅｕｓ）、Ｔ．ルベウス（Ｔ．ｒｕｂｅｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）及びメタノサーマス・フェルウィドゥス（Ｍｅｔｈａｕｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｅｒｖｉｄｕｓ）から単離される。それにもかかわらず、熱安定性でないポリメラーゼも、酵素が補充されることで提供されるＰＣＲアッセイにおいて使用することができる。
【００２０】
用語「その相補体」は、所定の核酸と同じ長さであり、かつ、所定の核酸と正確に相補的である核酸を意味する。
【００２１】
核酸に関して使用される用語「伸長（ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ）」又は「エロンゲーション（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）」は、核酸に追加ヌクレオチド（又は他の類似分子）が取り込まれる場合を意味する。例えば、核酸は、典型的には、核酸の３’末端にヌクレオチドを付加するポリメラーゼ等の、ヌクレオチド組み込み生体触媒によって任意に伸長される。
【００２２】
２以上の核酸配列の文脈において、用語「同一の（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」又はパーセント「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、最も一致するように整列して比較した時、例えば、当業者が入試可能な配列比較アルゴリズムの一つを使用することによって、又は、目視検査によって測定する場合、同一の、又は、同一のヌクレオチドの特定のパーセントを有する、２以上の配列又はサブ配列を意味する。パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに適した例示的なアルゴリズムとしては、ＢＬＡＳＴプログラムであって、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）の「Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ」（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）、Ｇｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）の「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｂｙ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｓｅａｒｃｈ」（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２）、Ｍａｄｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）の「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ＢＬＡＳＴ  ｓｅｒｖｅｒ」（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１）、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）の「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ」（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）及び、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）「ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ：  Ａ  ｎｅｗ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ＢＬＡＳＴ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｏｒ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ」（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６）に記載されている。
【００２３】
オリゴヌクレオチドの文脈において「修飾ヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの所望の特性を提供する別のヌクレオチドに置換されている変更をいう。本明細書に記載のオリゴヌクレオチドにおいて、置換することができる例示的な修飾されたヌクレオチドは、例えば、Ｃ５−メチル−ｄＣ、Ｃ５−エチル−ｄＣ、Ｃ５−メチル−ｄＵ、Ｃ５−エチル−ｄＵ、２，６−ジアミノプリン、Ｃ５−プロピニル−ｄＣ、Ｃ５−プロピニル−ｄＵ、Ｃ７−プロピニル−ｄＡ、Ｃ７−プロピニル−ｄＧ、Ｃ５−プロパルギルアミノ−ｄＣ、Ｃ５−プロパルギルアミノ−ｄＵ、Ｃ７−プロパルギルアミノ−ｄＡ、Ｃ７−プロパルギルアミノ−ｄＧ、７−デアザ−２−デオキシキサントシン、ピラゾロピリミジン類似体、シュード−ｄＵ、ニトロピロール、ニトロインドール、２’−０−メチルリボ−Ｕ、２’−０−メチルリボ−Ｃ、Ｎ４−エチル−ｄＣ、Ｎ６−メチル−ｄＡ、等を含む。本発明のオリゴヌクレオチドで置換することができる多くの他の修飾ヌクレオチドは、本明細書中で言及される、又は、そうでなければ当技術分野で知られている。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドの置換は、非修飾オリゴヌクレオチドの対応する融解温度と比較して、オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）を変化させる。さらに説明するために、特定の修飾ヌクレオチド置換が、非特異的核酸増幅を減少させる（例えば、プライマーダイマーの形成などを最小限にする）、意図する標的アンプリコンの収率を増加させる、及び／又は、本発明のいくつかの実施形態等である。核酸修飾のこれらの種類の例としては、例えば、米国特許第６，００１，６１１号明細書に記載されている。
【００２４】
本明細書で使用されるように、本明細書に記載のプローブの３’末端を向くヘアピン構造の文脈における、用語「非天然ヌクレオチド」とは、天然配列、例えば、野生型配列において、天然に生じるヌクレオチドではないヌクレオチドをいう。このような非天然ヌクレオチドは、例えば、ＡからＧへと変更されたヌクレオチドであってもよく、又は、非天然ヌクレオチドが追加されてもよく、例えば、Ｇが配列に挿入されてもよい。非天然ヌクレオチド（単数又は複数）を含むことは、ヘアピン構造を生成するために、天然の配列内へと設計することが可能であり、換言すれば、天然の配列は、ヘアピン構造が自然に発生しない場所のヘアピン構造を強制的に操作することが可能である。天然の配列は、天然の配列中に少なくとも１つの非天然ヌクレオチドを変更又は追加することによって、３’末端を向くヘアピン構造を含むように設計することが可能であって、例えば、ヘアピン構造を形成するために、１、２、３、４、５、６、又は７の非天然ヌクレオチドが天然の配列に含まれてもよい。特定の実施形態において、非天然ヌクレオチド（単数又は複数）は、修飾ヌクレオチドを含んでもよい。
【００２５】
標的核酸及びオリゴヌクレオチド
本明細書は、例えば、標的核酸配列の一部を増幅することによって標的核酸中のＳＮＰを検出する方法を提供するものであって、標的核酸配列が１以上のＳＮＰを含むことが既知又は疑われている任意の標的核酸配列であってもよく、例えば、標的核酸配列が、例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、又はリファンピシン耐性ＭＴＢである。標的核酸配列中のＳＮＰを検出するために、標的核酸配列を増幅するためのプライマー及びプローブを調製することが可能である。また、機能的変異体は、通常の方法を用いて当業者によって特異性及び／又は感受性について評価することができる。代表的な機能的変異体は、例えば、本明細書に開示されたプローブ及び／又はプライマーは、１以上の欠失、挿入、及び／又は置換を含むことができる。例えば、プライマー又はプローブの実質的に同一の変異体は、例えば、元のプライマー若しくはプローブ又はその相補体に対して少なくとも８０％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する変異体が提供される。
【００２６】
プライマー及び／又はプローブの任意の機能的に活性を有する変異体は、それぞれの元の配列と比較して、本明細書に記載の方法、キット、又は加水分解プローブにおいて同等又はより高い特異性及び感度を提供するものと同一であるとみなしてもよい。
【００２７】
上記に詳述したように、プライマー（及び／又はプローブ）は、化学的に修飾され得る、すなわち、プライマー及び／又はプローブは修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチド化合物を含むことができる。プローブ（又はプライマー）は修飾オリゴヌクレオチドである。「修飾ヌクレオチド」（又は「ヌクレオチド類似体」）は、いくつかの修飾により天然の「ヌクレオチド」とは異なるが、それでも塩基若しくは塩基様化合物、ペントフラノシル糖若しくはペントフラノシル糖様化合物、リン酸部分若しくはリン酸、又はそれらの組み合わせより構成される。例えば、「標識」は、「ヌクレオチド」の塩基部分に取り付けることができ、それによって「修飾ヌクレオチド」が得られる。「ヌクレオチド」の天然塩基も、例えば、７−ベサザプリン（ｄｅｓａｚａｐｕｒｉｎｅ）と置換してもよく、それによって、同様に「修飾ヌクレオチド」が得られる。用語「修飾ヌクレオチド」又は「ヌクレオチド類似体」は、本出願において互換的に使用される。「修飾ヌクレオチド」（又は「ヌクレオチド類似体」）は、「修飾ヌクレオシド」（又は「ヌクレオシド類似体」）として上記で概説した方法によるいくつかの修飾により、天然のヌクレオシドとは異なっている。
【００２８】
標的核酸配列を増幅する修飾オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体を含むオリゴヌクレオチドは、例えば、オリゴ（モレキュラバイオロジーインサイツ社、カスケード、コロラド州）のようなコンピュータプログラムを用いて設計することができる。増幅プライマーとして使用するオリゴヌクレオチドを設計する場合の重要な特徴は、これらに限定されないが、検出を容易にするための適切なサイズの増幅産物（例えば、電気泳動による）、プライマー対メンバーの同様な融解温度、及び、各プライマーの長さ（すなわち、プライマーは、配列特異的にアニーリングし、合成を開始するのに十分な長さであるが、オリゴヌクレオチド合成の間に忠実度が減少するように長くしないことが必要である）を含む。一般的に、オリゴヌクレオチドプライマーは、８〜５０ヌクレオチド長であり、特に、１０〜４０ヌクレオチド長、又は１２〜４０オリゴヌクレオチド長である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、又は５０ヌクレオチド長）。
【００２９】
プライマーセットに加えて、本方法は、標的核酸配列中のＳＮＰの存在又は非存在を検出するために、１以上のプローブを使用してもよい。用語「プローブ」とは、合成又は生物学的に作製された核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）であって、設計又は選択により、特に定められた所定のストリンジェンシーの下、特異的に（すなわち、優先的に）「標的核酸」へハイブリダイズすることが可能な特異的ヌクレオチド配列を含んでいる。「プローブ」は、標的核酸を検出することを意味する「検出プローブ」と呼ぶことができる。本発明のいくつかの実施形態では、説明したプローブは、少なくとも一つの蛍光標識で標識することができる。一実施形態では、プローブは、ドナー蛍光成分、例えば、蛍光色素、及び、対応するアクセプター蛍光成分、例えば、クエンチャーで標識することができる。
【００３０】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）加水分解プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドの設計は、プライマーの設計と同様に行うことができる。本発明の実施形態は、増幅産物の検出のための単一のプローブを使用することができる。実施形態に応じて、プローブは、少なくとも一つの標識及び／又は少なくとも１のクエンチャー成分を含んでもよい。プライマーと同様、プローブは通常、同様の融解温度を有しており、各プローブの長さは、配列特異的ハイブリダイズが起こるために十分であるが、合成中の忠実度（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）が低減する程の長さであってはならない。オリゴヌクレオチドプローブは、長さが一般に４０以下のヌクレオチドを有し、特に１２〜４０、１５〜４０及び１５〜３０の間のヌクレオチド長である（例えば、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４又は２５）。
【００３１】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
米国特許第４，６８３，２０２号明細書、米国特許第４，６８３，１９５号明細書、米国特許第４，８００，１５９号明細書、及び米国特許第４，９６５，１８８号明細書は、従来のＰＣＲ技術を開示している。米国特許第５，２１０，０１５号明細書、米国特許第５，４８７，９７２号明細書、米国特許第５，８０４，３７５号明細書、米国特許第５，８０４，３７５号明細書、米国特許第６，２１４，９７９号明細書及び米国特許第７，１４１，３７７号明細書は、リアルタイムＰＣＲ及びＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を開示する。ＰＣＲは、典型的には、選択された核酸鋳型（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）に結合する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。実施形態において記載されている有用なプライマーは、標的核酸配列内で核酸合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを含む。プライマーは、従来の方法による制限消化で精製される、又は、合成して製造することができる。プライマーは、最大効率で増幅するためには、好ましくは一本鎖であるが、プライマーは二本鎖であってもよい。二本鎖プライマーは、最初に変性し、すなわち、鎖を分離するために処理する。二本鎖核酸を変性する一つの方法としては、加熱によるものである。
【００３２】
鋳型核酸が二本鎖の場合、ＰＣＲにおいて鋳型として使用する前に、二本鎖を分離する必要がある。鎖分離は、物理的、化学的又は酵素的手段を含む任意の適当な変性法によって達成することができる。核酸鎖を分離する一つの方法は、優位に変性されるまで（例えば、５０％以上変性、６０％以上変性、７０％以上変性、８０％以上変性、９０％以上変性又は９５％以上変性）、核酸を加熱することを含む。鋳型核酸を変性させるために必要な条件は、例えば、緩衝液塩濃度及び変性する核酸の長さ若しくはヌクレオチド組成に依存するが、典型的には、約９０℃〜約１０５℃の範囲で、温度及び核酸の長さなどの反応の特徴に応じた時間である。変性は、典型的には約３０秒〜４分間行われる（例えば、１分〜２分３０秒、又は１．５分）。二本鎖鋳型核酸が熱により変性される場合、反応混合物は、標的核酸分子上のその標的配列に対し各プライマーのアニーリングを促進する温度まで冷却することを妨げない。アニーリングの温度は、通常、約３５℃から約６５℃である（例えば、約４０℃〜約６０℃、約４５℃〜約５０℃）。アニーリング時間は、約１０秒〜約１分（例えば、約２０秒〜約５０秒、約３０秒〜約４０秒）にすることができる。次いで、反応混合物を、ポリメラーゼの活性が促進され又は最適化された温度、すなわち、鋳型核酸に相補的な産物を生成するためにアニールしたプライマーから伸長するのに十分な温度に調整する。温度は、核酸鋳型にアニールされた各プライマーから伸長産物を合成するのに十分であるべきであり、その相補的な鋳型から伸長産物を変性させるほど高くあってはならない（例えば、伸長のための温度は一般に約４０℃〜約８０℃の範囲（例えば、約５０℃〜約７０℃、約６０℃））。伸長時間は、約１０秒〜約５分（例えば、約３０秒〜約４分、約１分〜約３分、約１分３０秒〜約２分）であってもよい。
【００３３】
ＰＣＲアッセイは、ＲＮＡ又はＤＮＡ（ｃＤＮＡ）等の標的核酸を使用することができる。鋳型核酸は精製される必要はない。それは、ヒト細胞中に含まれる標的核酸のような複雑な混合物の微量画分であってもよい。標的核酸分子は、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｅｒｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），１９９３，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．）に記載されているような通常の技術によって、生物学的サンプルから抽出することができる。核酸は、プラスミド、又は、細菌、酵母、ウイルス、細胞小器官、若しくは植物や動物などの高等生物を含む天然資源のような任意の数の供給源から得ることができる。
【００３４】
オリゴヌクレオチドプライマーは、プライマー伸長を誘導する反応条件下でＰＣＲ試薬と組み合わせられる。例えば、鎖伸長反応は、一般に、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．３）、１５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．００１％（ｗ／ｖ）のゼラチン、０．５〜１．０μｇの変性鋳型ＤＮＡ、５０ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドプライマー、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ及び１０％ＤＭＳＯを含む。反応は、通常、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ又はその１以上の類似体をそれぞれ１５０〜３２０μＭを含有する。
【００３５】
新規に合成された鎖は、反応後の工程で使用することができる二本鎖分子を形成する。鎖分離、アニーリング、及び伸長工程は、多くの場合、標的核酸分子に対応する増幅産物の所望の量を生成するために必要に応じて繰り返すことができる。反応における制限因子は、反応液中に存在するプライマー、耐熱性酵素、及びヌクレオシド三リン酸の量である。サイクル工程（すなわち、変性、アニーリング、及び伸長）は、好ましくは、少なくとも１回繰り返される。検出に使用するために、サイクルの工程数は、例えば、サンプルの性質に依存するであろう。サンプルが核酸の複合混合物である場合、検出に十分な標的配列を増幅するためには、より多くのサイクル工程が必要とされる。一般的に、サイクル工程は、少なくとも約２０回繰り返されるが、４０、６０又は１００回繰り返してもよい。
【００３６】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）
ＦＲＥＴ技術（例えば、米国特許第４，９９６，１４３号明細書、米国特許第５，５６５，３２２号明細書、米国特許第５，８４９，４８９号明細書、及び米国特許第６，１６２，６０３号明細書を参照）は、ドナー蛍光成分及び対応するアクセプター蛍光成分が互いにある一定の距離内に配置される場合、２つの蛍光成分の間にエネルギー移転が起こり、可視化される、又は、他の方法で検出及び／又は定量化される、という概念に基づいている。ドナーは、適切な波長の光照射によって励起された場合、一般的にアクセプターにエネルギーを移転する。アクセプターは、典型的には、異なる波長の光放射の形として、移転されたエネルギーを再放出する。
【００３７】
一例において、オリゴヌクレオチドプローブは、ドナー蛍光成分と、光以外の形で移転されたエネルギーを消費する対応するクエンチャーとを含有することができる。プローブが無傷である場合、ドナー蛍光成分からの蛍光発光が消光されるように、エネルギー移動が典型的には２つの蛍光成分の間で起こる。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長工程の間に、増幅産物に結合したプローブは、ドナー蛍光成分の蛍光発光が消光されるように、例えば、Ｔａｑポリメラーゼの５’から３’エキソヌクレアーゼ活性によって切断される。この目的のための例示的なプローブとしては、例えば、米国特許第５，２１０，０１５号明細書、米国特許第５，９９４，０５６号明細書及び米国特許第６，１７１，７８５号明細書、に記載されている。一般的に使用されるドナー−アクセプター対は、ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡのペアが含まれる。一般的に使用されるクエンチャーは、ＤＡＢＣＹＬ及びＴＡＭＲＡである。一般的に使用されるダーククエンチャーは、ブラックホールクエンチャーTM（ＢＨＱ）（バイオサーチ・テクノロジーズ社、ノバト、カル）、アイオワブラックTM（インテグレーテッドＤＮＡテック社、コーラルビル、アイオワ州）、ブラックベリーTMクエンチャー６５０（ＢＢＱ−６５０）（ベリー＆アソシエート、デクスター、ミシガン州）を含む。
【００３８】
蛍光分析は、例えば、光子計数落射蛍光顕微鏡システム（特定の範囲で蛍光発光を監視するための適切なダイクロイックミラー及びフィルターを含む）、光子計数光電子増倍管システム、又は蛍光光度計を用いて実施することができる。エネルギー転移を開始するための励起は、アルゴンイオンレーザーを用いて行うことができ、高輝度（Ｈｇ）アークランプ、光ファイバー光源、又は所望の範囲に励起するために適宜フィルターをかけた他の高輝度光源を用いて、実施することができる。
【００３９】
ドナー及び対応するアクセプター蛍光成分に関して本明細書中で使用される「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）」とは、ドナー蛍光成分の励起スペクトルと重複する発光スペクトルを有するアクセプター蛍光成分を指す。アクセプター蛍光成分の発光スペクトルの最大波長は、ドナー蛍光成分の励起スペクトルの最大波長よりも少なくとも１００ｎｍ大きくあるべきである。従って、効率的な非放射性エネルギーの移転を介してそれらの間で産生されうる。
【００４０】
蛍光ドナー及び対応するアクセプター成分は、一般に、（ａ）高効率フェルスターエネルギー移動、（ｂ）大規模最終ストークスシフト（＞１００ｎｍ）（ａ  ｌａｒｇｅ  ｆｉｎａｌ  Ｓｔｏｋｅｓ  ｓｈｉｆｔ）、（ｃ）可視スペクトルの赤色部分への可能な範囲での発光をシフト（＞６００ｎｍ）、及び（ｄ）ドナー励起波長での励起によって生成されるラマン水蛍光放出よりも高い波長への発光のシフト、より選択される。例えば、ドナー蛍光成分は、レーザーライン（例えば、ヘリウム−カドミウム４４２ｎｍ又は、アルゴン４８８ｎｍ）の近くのその励起最大値、高消光係数、高量子収率、及び、対応するアクセプター蛍光成分の励起スペクトルと蛍光発光の良好な重複を有するように選択することができる。対応するアクセプター蛍光成分は、高消光係数、高量子収率、ドナー蛍光成分の発光とのその励起の良好な重複、及び、可視スペクトルの赤色部分の発光（＞６００ｎｍ）を有するように選択することができる。
【００４１】
ＦＲＥＴ技術における種々のアクセプター蛍光成分と共に使用することができる代表的なドナー蛍光成分は、フルオレセイン、ルシファーイエロー、Ｂ−フィコエリトリン、９−アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローＶＳ、４−アセトアミド−４’−イソチオ−シアネートスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアネートフェニル）−４−メチルクマリン、スクシンイミジル１−ピレネブチレート、及び４−アセトアミド−４’−イソチオシアネートスチルベン−２，２’−ジスルホン酸誘導体、を含む。代表的なアクセプター蛍光成分は、使用されるドナー蛍光成分に依存するが、ＬＣレッド６４０、ＬＣレッド７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンＸイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミンペンタアセテート、又はランタニドイオンの他のキレート（例えば、ユーロピウム、又はテルビウム）を含む。ドナー及びアクセプター蛍光成分は、例えば、モレキュラープローブ社（ジャンクションシティ、オレゴン州）又はシグマケミカル社（セントルイス、ミズーリ州）から、取得することができる。
【００４２】
ドナー及びアクセプター蛍光成分は、リンカーアームを介して適切なプローブオリゴヌクレオチドに結合させることができる。リンカーアームはドナー及びアクセプター蛍光成分との間の距離に影響を与えるので、各リンカーアームの長さは重要である。本開示の目的のためのリンカーアームの長さは、ヌクレオチド塩基から蛍光成分までのオングストローム（Å）の距離である。一般に、リンカーアームは、約１０Å〜約２５Åである。リンカーアームは、国際公開第８４／０３２８５号に記載された種類であってもよい。国際公開第８４／０３２８５号はまた、特定のヌクレオチド塩基にリンカーアームを取り付けるための、及び、リンカーアームに蛍光成分を取り付けるための方法を開示する。
【００４３】
ＬＣレッド６４０−ＮＨＳエステルなどのアクセプター蛍光成分は、例えば、ＬＣレッド６４０−ホスホラミダイトを作製するために、Ｃ６−ホスホラミダイト（ＡＢＩ社（フォスターシティ、カリフォルニア州）又は、グレンリサーチ（スターリング、バージニア州）から入手可能）と組み合わせることが出来る。オリゴヌクレオチドへ、フルオレセイン等のドナー蛍光成分を結合するために頻繁に使用されるは、チオ尿素リンカー（ＦＩＴＣ由来、例えば、グレンリサーチ社又はＣｈｅｍＧｅｎｅ社（アッシュランド、ＭＡ）のフルオレセイン−ＣＰＧ’ｓ）、アミドリンカー（フルオレセイン−ＮＨＳ−エステル由来、バイオジェネックス社（サンラモン、カリフォルニア州）のフルオレセイン−ＣＰＧ等）、又はオリゴヌクレオチド合成後のフルオレセイン−ＮＨＳエステルの結合を必要とする３’−アミノ−ＣＰＧ、を含む。
【００４４】
標的核酸中のＳＮＰの検出
本開示は、生体内の標的核酸中のＳＮＰの存在又は非存在を検出するための方法を提供する。提供される方法は、サンプル汚染、偽陰性、及び偽陽性の問題を避ける。方法は、プライマー対を使用して、サンプルから標的核酸分子の一部を増幅する少なくとも１つのサイクル工程に実施、及び、３’末端を向くヘアピン構造を有する加水分解プローブを利用する蛍光検出工程を含む。複数サイクルの工程は、好ましくは、サーモサイクラー中で実施されてもよい。記載された方法は、サンプル中の標的核酸中にＳＮＰが存在することを検出するためのプライマー及びプローブを用いて実施することができる。
【００４５】
本明細書で説明するように、増幅産物は、ＦＲＥＴ技術を利用する標識加水分解プローブを用いて検出することができる。一ＦＲＥＴの形式は、増幅産物の有無を検出するＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を利用し、結果として、標的核酸中のＳＮＰの存在又は非存在を検出する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術は、二つの蛍光成分で標識された１つの一本鎖ハイブリダイズ加水分解プローブを利用する。第１の蛍光成分が適当な波長の光で励起されると、吸収されたエネルギーはＦＲＥＴの原理に従って第２の蛍光成分に移動する。第２の蛍光成分は一般的にクエンチャー分子である。ＰＣＲ反応のアニーリング工程の間に、標識されたハイブリダイズプローブは標的ＤＮＡ（すなわち、増幅産物）に結合し、続く伸長フェーズ中に、Ｔａｑポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性によって分解される。結果として、励起された蛍光成分とクエンチャー成分は空間的に互いに分離される。その結果、クエンチャーの非存在下で第１の蛍光成分が励起すると、第１の蛍光成分からの蛍光発光を検出することが可能となる。一例として、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００配列検出システム（アプライド  バイオシステム社）はＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を使用し、サンプル中の標的核酸内のＳＮＰの存在又は非存在を検出する本明細書に記載の方法を実施するのに適している。
【００４６】
一般に、ＦＲＥＴの存在がサンプル中の標的核酸中のＳＮＰの存在を示し、ＦＲＥＴの非存在が、サンプル中にＨＳＶ−１及び／又はＨＳＶ−２が存在しないことを示す。不十分なサンプル収集、輸送の遅延、不適切な輸送条件、又は特定の収集した拭き取り検体（ｓｗａｂ）（アルギン酸カルシウム又はアルミニウムシャフト）の使用は、しかしながら、試験結果の成功及び／又は正確さに影響を与えるすべての条件である。本明細書に開示される方法を使用して、例えば、４５サイクル工程内でのＦＲＥＴの検出は、サンプル中の標的核酸中のＳＮＰの存在の指標である。
【００４７】
本発明の方法を実施するのに使用することができる代表的な生物学的サンプルとしては、限定されないが、皮膚の拭き取り検体、鼻の拭き取り検体、創傷拭き取り検体、血液培養、皮膚及び軟組織感染を含む。生物学的サンプルの収集及び保管方法は、当業者に知られている。生物学的サンプルは、標的核酸を放出するために処理することができ（例えば、当技術分野で公知の核酸抽出方法及び／又はキットによって）、場合によっては、生物学的サンプルは、ＰＣＲ反応成分及び適切なオリゴヌクレオチドと直接接触させることができる。
【００４８】
各サーモサイクラーランにおいて、コントロールサンプルも同様にサイクルすることができる。ポジティブコントロールサンプルは、例えば、コントロールプライマー及びコントロールプローブを用いて、（標的遺伝子の上記増幅産物以外の）標的核酸対照鋳型を増幅することができる。ポジティブコントロールサンプルは、例えば、標的核酸分子を含むプラスミド構築物を増幅することもできる。このようなプラスミドコントロールは、患者のサンプルと並んで、内部（例えば、サンプル内）又は別々のサンプルランで増幅することができる。各サーモサイクラーランは、例えば、標的鋳型ＤＮＡを欠くネガティブコントロールを含むこともできる。このようなコントロールは、増幅、ハイブリダイズ及び／又はＦＲＥＴ反応の成功又は失敗の指標である。従って、コントロール反応は、例えば、配列特異的にアニーリングし、伸長を開始するプライマーの能力、並びに、配列特異的にハイブリダイズし、ＦＲＥＴを起こすプローブの能力を容易に決定することができる。
【００４９】
実施形態において、本発明の方法は、汚染を回避する工程を含む。例えば、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼを利用する酵素的方法は、あるサーモサイクラーランとその次のランとの間の汚染を低減又は排除することが、米国特許第５，０３５，９９６号明細書、米国特許第５，６８３，８９６号明細書及び米国特許第５，９４５，３１３号明細書に記載されている。
【００５０】
ＦＲＥＴ技術と組み合わせた従来のＰＣＲ法は、本発明の方法を実施するために使用することができる。一実施形態では、ライトサイクラー（登録商標）の機器を使用する。以下の特許出願は、ライトサイクラー（登録商標）技術を使用したリアルタイムＰＣＲについて記載する：国際公開第９７／４６７０７号、国際公開第９７／４６７１４及び国際公開第９７／４６７１２。
【００５１】
ライトサイクラー（登録商標）は、ＰＣワークステーションを用いて操作することができ、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ＮＴオペレーティングシステムを利用することができる。サンプルからの信号は、光ユニット上に機械が順次キャピラリーに位置したときに得られる。ソフトウェアは、各測定後すぐにリアルタイムで蛍光シグナルを表示することができる。蛍光取得時間は１０〜１００ミリ秒（ｍ秒）である。各サイクル工程後、蛍光の定量的表示対サイクル数が、継続的にすべてのサンプルに対して更新される。生成されたデータは、さらなる分析のために保存することができる。
【００５２】
本発明の実施形態は、１以上の市販の機器の構成に限定されないものと理解される。
【００５３】
製造品／キット
本開示はさらに、標的核酸中のＳＮＰを検出するための製造品又はキットを提供する。製造品は、適切な包装材料と共に、ＳＮＰを検出するために使用されるプライマー及びプローブを含むことができる。ＳＮＰを検出するための代表的なプライマー及びプローブは、標的核酸分子にハイブリダイズすることができる。また、キットは、ＤＮＡの固定、ハイブリダイズ、及び検出に必要な、適切に包装された試薬及び材料を含むこともでき、例えば、固体支持体、緩衝剤、酵素、及びＤＮＡスタンダードが含まれる。プライマー及びプローブを設計する方法は本明細書中に開示され、標的核酸の標的核酸分子のＳＮＰを増幅する及びハイブリダイズするプライマー及びプローブの代表的な例を提供する。
【００５４】
本発明の製造品は、プローブを標識するための１以上の蛍光成分、あるいは、キットに付属の標識することができるプローブを含むことができる。例えば、製造品は、ＳＮＰ特異的プローブを標識するためのドナー及び／又はアクセプター蛍光成分を含むことができる。適切なＦＲＥＴドナー蛍光成分及び対応するアクセプター蛍光成分の例としては、上記に提供されている。
【００５５】
製造品はまた、サンプル中の標的核酸内のＳＮＰを検出するプライマー及びプローブを使用するための説明を有する添付文書又はパッケージのラベルを含むことができる。製造品はさらに、本明細書に開示された方法を行うための試薬（例えば、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、補因子、又は汚染を防止する薬剤）を含むことができる。このような試薬は、本明細書に記載の市販の機器の１つに特異的であってもよい。
【００５６】
本発明の実施形態は、以下の実施例において説明するが、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００５７】
以下の実施例及び図面は、本発明、添付の特許請求の範囲に記載された真の範囲の理解を助けるために提供される。なお、本発明の精神から逸脱することなく、示される手順においてなされ得ることが理解される。
【００５８】
実施例１
ＭＴＢ−ＲＩＦ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＳＮＰ検出
結核（ＴＢ）は、一般的に結核菌（ＭＴＢ）又はＭＴＢ−複合体の他のメンバーによって引き起こされる重篤な肺障害である。ＭＴＢの薬剤耐性株が上昇し、薬剤耐性結核の特に危険な形態は多剤耐性結核（ＭＤＲ−ＴＢ）である。ＭＤＲ−ＴＢとは、最も一般的に使用される抗結核薬、リファンピシン及びイソニアジドの少なくとも２つに耐性となったＭＴＢと定義される。リファンピシン耐性の約８３〜８７％は、ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットをコードするｒｐｏＢ遺伝子の８１塩基対のリファンピシリン耐性決定領域（ＲＲＤＲ）内の一塩基多型によって引き起こされる。変異体特異的ＴａｑＭａｎ（登録商標）加水分解プローブは、５’末端にフルオロフォア及び内部クエンチャーを有するように設計された。それに加えて、付加的な塩基／塩基（複数）がプローブの３’末端に導入され、その結果、３’末端に向くヘアピン構造をもたらす。プローブは、ＷＴとＭＴとの間のミスマッチがレポーターと５’末端近傍のクエンチャーとの間に位置するように設計した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが無傷の場合、レポーター及びクエンチャーはお互いに近傍に位置し、それにより、任意の蛍光の放出を防止する。
【００５９】
プライマーとＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、ＰＣＲ中、変性後に相補的なＤＮＡ鎖にアニールする。ハイブリダイズ後及びＰＣＲの伸長フェーズの期間、ＤＮＡポリメラーゼの５’から３’エキソヌクレアーゼ活性がプローブを切断し、それにより、レポーター及びクエンチャー色素を分離し、蛍光が検出される。プローブの３’末端付近のヘアピン構造は、鋳型へのプローブの３’側半分のハイブリダイズを遅らせ、従って、単一塩基対の違いやミスマッチに基づいてＷＴとＭＴ標的の識別に役立つ。ＭＴヘアピンＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの５’側半分は、ＷＴ鋳型と比較して、ＭＴプラスミドＤＮＡの鋳型により効率的にハイブリダイズする。ＭＴ特異的プローブがＷＴ標的を見つけると、ＷＴ標的への単一のミスマッチがハイブリダイズ及びプローブ切断を防止し、蛍光が検出されない。
【００６０】
材料及び方法
ＤＮＡ標的−野生型（ＷＴ）及び変異（ＭＴ）プラスミド
【００６１】
ＭＴとＷＴプラスミドＤＮＡ：１ｅ６ｃｐ／ＰＣＲから１０ｃｐ／ＰＣＲまでの範囲の試験されたインプットは、結核菌のｒｐｏＢ遺伝子のリファンピシン耐性決定領域（ＲＲＤＲ）の一部を示す表１に示されている。
【００６２】
【表１】
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【００６３】
ＭＴＢ特異的オリゴヌクレオチド：野生型及び変異体プラスミドの両方のフォワード及びリバースプライマー一式
【００６４】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは表ＩＩに示される。
【表２】
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【００６５】
命名：Ｆはトレオ−ＦＡＭを表す。Ｐはリン酸を表す。ＱはＢＨＱ−２クエンチャーを表す。太字の下線はヘアピンを形成するために変更又は追加された塩基である。
【００６６】
プラットフォーム：ライトサイクラー（登録商標）４８０システム
リアルタイムＰＣＲ増幅は、フォワード及びリバースプライマー並びに３’末端にヘアピン構造を有するＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブのセットを使用して実施した。野生型又は変異型プラスミドＤＮＡは１ｅ６、１ｅ２、１ｅ３及び１ｅ１  ｃｐ／ＰＣＲで試験した。ＰＣＲ反応容量は５０μＬのであり、マスターミックスの成分及び温度条件を以下に列挙する。増幅はＬＣ４８０プラットフォーム上で実施し、ＰＣＲ成長曲線は、ＡＴＦデータ分析ソフトウェアを用いて分析した。結果は、図１〜８に記載する。前述の発明は、明確さと理解のためにある程度詳細に説明してきたが、当業者にとって、この開示を読むことによって、本発明の真の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細の様々な変更を行うことができることは明らかである。例えば、上述したすべての技術及び装置は、様々な組み合わせで使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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