(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列が以下のアミノ酸配列：
ＨＸ２ＱＧＴＦＴＳＤＸ１０ＳＸｌ２Ｘ１３ＬＸ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８ＡＸ２０Ｘ２１ＦＸ２３Ｘ２４ＷＬＸ２７Ｘ２８ＧＸ３０（配列番号４）である単離ペプチド；
ここで、
（１）  Ｘ２はＳであり、Ｘ１０はＹであり、Ｘ１２はＫであり、Ｘ１３はＫであり、Ｘ１５はＤであり、Ｘ１６はＳであり、Ｘ１７はＥであり、Ｘ１８はＲであり、Ｘ２０はＲであり、Ｘ２１はＤであり、Ｘ２３はＶであり、Ｘ２４はＡであり、Ｘ２７はＶであり、Ｘ２８はＡであり、かつＸ３０はＧである（配列番号１６）、
（２）  Ｘ２はＳであり、Ｘ１０はＫであり、Ｘ１２はＥであり、Ｘ１３はＹであり、Ｘ１５はＤであり、Ｘ１６はＳであり、Ｘ１７はＥであり、Ｘ１８はＲであり、Ｘ２０はＲであり、Ｘ２１はＤであり、Ｘ２３はＶであり、Ｘ２４はＡであり、Ｘ２７はＥであり、Ｘ２８はＡであり、かつＸ３０はＧである（配列番号１７）、
（３）  Ｘ２はＳであり、Ｘ１０はＫであり、Ｘ１２はＫであり、Ｘ１３はＹであり、Ｘ１５はＥであり、Ｘ１６はＧであり、Ｘ１７はＱであり、Ｘ１８はＡであり、Ｘ２０はＫであり、Ｘ２１はＥであり、Ｘ２３はＩであり、Ｘ２４はＡであり、Ｘ２７はＥであり、Ｘ２８はＫであり、かつＸ３０はＲである（配列番号２２）；
（４）  Ｘ２はＳであり、Ｘ１０はＫであり、Ｘ１２はＳであり、Ｘ１３はＹであり、Ｘ１５はＤであり、Ｘ１６はＳであり、Ｘ１７はＲであり、Ｘ１８はＳであり、Ｘ２０はＲであり、Ｘ２１はＤであり、Ｘ２３はＶであり、Ｘ２４はＡであり、Ｘ２７はＥであり、Ｘ２８はＡであり、かつＸ３０はＧである（配列番号２０）；
（５）  Ｘ２はＳであり、Ｘ１０はＫであり、Ｘ１２はＥであり、Ｘ１３はＹであり、Ｘ１５はＤであり、Ｘ１６はＳであり、Ｘ１７はＥであり、Ｘ１８はＲであり、Ｘ２０はＲであり、Ｘ２１はＤであり、Ｘ２３はＶであり、Ｘ２４はＡであり、Ｘ２７はＥであり、Ｘ２８はＡであり、かつＸ３０はＧである（配列番号１２）；あるいは
（６）  Ｘ２はＳであり、Ｘ１０はＫであり、Ｘ１２はＳであり、Ｘ１３はＹであり、Ｘ１５はＤであり、Ｘ１６はＳであり、Ｘ１７はＲであり、Ｘ１８はＲであり、Ｘ２０はＲであり、Ｘ２１はＤであり、Ｘ２３はＶであり、Ｘ２４はＡであり、Ｘ２７はＥであり、Ｘ２８はＡであり、かつＸ３０はＧである（配列番号２１）。
【請求項２】
前記ペプチドに結合した異種構造部分をさらに含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドおよび担体を含む、医薬組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の組成物を含む、キット。
【請求項５】
アミノ酸に対する修飾をさらに含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
前記修飾がアシル部分の付加である、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
前記修飾が、リジン残基のＮ（イプシロン）基上のパルミトイル部分である、請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
前記パルミトイル基がリンカーを介してリジンに連結されている、請求項７に記載のペプチド。
【請求項９】
前記リンカーがガンマグルタミン酸である、請求項８に記載のペプチド。
【請求項１０】
アミノ酸配列がＨＳＱＧＴＦＴＳＤＫＳＥＹＬＤＳＥＲＡＲＤＦＶＡＷＬＥＡＧＧ（配列番号１２）である単離ポリペプチド。
【請求項１１】
末端グリシンのカルボキシル基が無修飾の酸である、請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１２】
アミノ酸に対する修飾をさらに含む、請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１３】
前記修飾がアシル部分の付加である、請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１４】
前記修飾が、リジン残基のＮ（イプシロン）基上のパルミトイル部分である、請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１５】
前記パルミトイル基がリンカーを介してリジンに連結されている、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項１６】
前記リンカーがガンマグルタミン酸である、請求項１５に記載のペプチド。
【請求項１７】
ペプチドが、ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＫ（ガンマＥ−パルミトイル）ＳＥＹＬＤＳＥＲＡＲＤＦＶＡＷＬＥＡＧＧ−酸である、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項１８】
請求項１０に記載のペプチドおよび担体を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の組成物を含む、キット。
【請求項２０】
請求項１７に記載のペプチドおよび担体を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
電子的に提出された配列表の参照
本出願と共に提出のＡＳＣＩＩテキストファイル（名称：ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ＿ａｓｃｉｉ．ｔｘｔ；サイズ：１２．３キロバイト；および作成日：２０１３年１２月１０日）中の電子的に提出された配列表の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、世界中で増大する主要な健康問題であり、心血管疾患、腎疾患、高血圧症、脳卒中、不妊症、呼吸機能不全、およびＩＩ型糖尿病など、多くの生死にかかわる疾患と関連している。
【０００３】
グルカゴンおよびグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は、グルコースホメオスタシス、インスリン分泌、胃内容排出、および腸管増殖、ならびに食物摂取の調節を含む、多種多様な生理機能に関与する、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、およびオキシントモジュリン（ＯＸＭ）を含む、幾つかの異なるプログルカゴン由来ペプチドを形成するように種々の組織でプロセシングされる、１５８アミノ酸の前駆体ポリペプチドであるプレプログルカゴンに由来する。グルカゴンは、プログルカゴンのアミノ酸３３〜６１（プレプログルカゴンの５３〜８１）に対応する２９アミノ酸のペプチドであり、一方、ＧＬＰ−１は、プログルカゴンのアミノ酸７２〜１０８に対応する３７アミノ酸のペプチド（プレプログルカゴンの９２〜１２８）として生成される。ＧＬＰ−ｌ（７〜３６）アミドまたはＧＬＰ−ｌ（７〜３７）酸は、ＧＬＰ−１受容体において基本的に等価な活性を示すＧＬＰ−１の生物学的に活性な形態である。
【０００４】
グルカゴンは膵臓により産生され、グルカゴン受容体（「ｇｌｕｃＲ」）と相互作用する。グルカゴンは肝臓で作用して、糖新生およびグリコーゲン分解を介して血中グルコースを上昇させる。血中グルコースが低下し始めると、グルカゴンは、グリコーゲンを分解してグルコースを放出するように肝臓にシグナルを送るため、血中グルコースレベルが正常値に向かって上昇する。
【０００５】
ＧＬＰ−１は、グルカゴンと比較すると異なる生物活性を有する。ＧＬＰ−１は、腸のＬ細胞から分泌され、ＧＬＰ−１受容体に結合する。その活性には、インスリンの合成および分泌の刺激、グルカゴン分泌の阻害、および食物摂取の抑制が含まれる。
【０００６】
それぞれの受容体においてアゴニストとして作用するグルカゴンとＧＬＰ−１は両方とも、体重減少に有効であることが示されている。特定のＧＬＰ−１アナログが販売されているか、または肥満治療のために開発中であり、これらには、例えば、リラグルチド（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ製のＶＩＣＴＯＺＡ（登録商標））およびエキセナチド（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ／Ａｍｙｌｉｎ製のＢｙｅｔｔａ（登録商標））が挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
肥満を有効に治療するためのさらに多くの薬剤、例えば、溶解性、製剤化能、安定性、および効力が改善されたＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドなどの必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、以下のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる単離ペプチドを提供する：
ＨＸ２ＱＧＴＦＴＳＤＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３ＬＸ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８ＡＸ２０Ｘ２１ＦＸ２３Ｘ２４ＷＬＸ２７Ｘ２８ＧＸ３０；
ここで、Ｘ２はＧまたはＳであり、Ｘ１０はＹまたはＫであり、Ｘ１２はＫ、Ｅ、Ｒ、またはＳであり、Ｘ１３はＫまたはＹであり、Ｘ１５はＤまたはＥであり、Ｘ１６はＳまたはＧであり、Ｘ１７はＥ、Ｒ、Ｑ、またはＫであり、Ｘ１８はＲ、Ｓ、またはＡであり、Ｘ２０はＲ、Ｋ、またはＱであり、Ｘ２１はＤまたはＥであり、Ｘ２３はＶまたはＩであり、Ｘ２４はＡまたはＱであり、Ｘ２７はＥまたはＶであり、Ｘ２８はＡまたはＫであり、かつＸ３０はＧまたはＲである（配列番号４）。特定の態様では、Ｘ２はＳであり、Ｘ１５はＤであり、Ｘ１６はＳであり、Ｘ２０はＲであり、Ｘ２１はＤであり、Ｘ２３はＶであり、Ｘ２４はＡであり、Ｘ２８はＡであり、かつＸ３０はＧである（配列番号５）。特定の態様では、Ｘ１７がＥである場合、Ｘ１８はＲであり、Ｘ１７がＲである場合、Ｘ１８はＳである（配列番号６および７）。特定の態様では、Ｘ１０はＹであり、Ｘ１２はＫであり、Ｘ１３はＫであり、かつＸ２７はＶである（配列番号８および９）。特定の態様では、Ｘ１０はＫであり、Ｘ１３はＹであり、かつＸ２７はＥである（配列番号１０および１１）。特定の態様では、Ｘ１２はＥであり（配列番号１２および１３）、あるいはＸ１２はＲである（配列番号１４および１５）。特定の態様では、単離ペプチドは、配列番号１６を含むか、またはそれからなる。特定の態様では、単離ペプチドは、アミノ酸配列の配列番号１７もしくはアミノ酸配列の配列番号１９を含むか、またはそれからなる。特定の態様では、単離ペプチドは、配列番号１８を含むか、またはそれからなる。
【０００９】
上記のペプチドの特定の実施形態では、Ｘ３０のカルボキシル基はアミド化されている。他の実施形態では、カルボキシル基は無修飾の酸である。
【００１０】
本明細書に提供されるペプチドはいずれも、１つまたは複数の修飾されたアミノ酸、例えばアシル部分の付加などをさらに含むことができ、例えば、その修飾は、リシン残基のＮ（イプシロン）基上へのパルミトイル部分の付加であり得る。特定の実施形態では、パルミトイル基はガンマグルタメートリンカーによってリシン残基に連結される。ベータアラニンおよびアミノヘキサン酸を含む、別のリンカーも使用されている。さらに、例えば２または４個のＰＥＧ単位を含有する短いＰＥＧ部分を含有するリンカーを含む、別のリンカーも可能である。
【００１１】
種々の実施形態では、本明細書に提供される単離ポリペプチドは、グルカゴン受容体、ＧＬＰ−１受容体、またはグルカゴン受容体とＧＬＰ−１受容体の両方に結合することができる。特定の態様では、グルカゴン受容体はヒトグルカゴン受容体であり、かつ／またはＧＬＰ−１受容体はヒトＧＬＰ−１受容体である。特定の態様では、本明細書に提供される単離ポリペプチドは、ｃＡＭＰアッセイ１（本明細書に記載される）において、１０，０００ｐＭ未満、５０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、または２ｐＭ未満のＥＣ５０で、ヒトグルカゴン受容体に結合する。特定の態様では、本明細書に提供される単離ポリペプチドは、ｃＡＭＰアッセイ１において、１０，０００ｐＭ未満、５０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、または２ｐＭ未満のＥＣ５０で、ヒトＧＬＰ−１受容体に結合する。
【００１２】
特定の態様では、本明細書に提供される単離ポリペプチドは、ＧＬＰ−１活性のアゴニスト、グルカゴン活性のアゴニスト、またはＧＬＰ−１活性とグルカゴン活性の両方のアゴニストである。一部の実施形態では、本明細書に提供される単離ポリペプチドは、グルカゴン受容体とＧＬＰ−１受容体の両方に結合し、グルカゴン受容体におけるよりも、ＧＬＰ−１受容体において、天然リガンドと比較して、少なくとも約２倍高い活性を示す。一実施形態では、このペプチドは、グルカゴン受容体においてグルカゴンと比較した場合よりも、ＧＬＰ１ＲにおいてＧＬＰ１と比較した場合に５〜１０倍高い相対効力を示す。
【００１３】
特定の態様では、本明細書に提供される単離ポリペプチドは、このペプチドに結合した異種構造部分をさらに含むことができる。一部の態様では、異種構造部分は、タンパク質、ペプチド、タンパク質ドメイン、リンカー、有機ポリマー、無機ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ビオチン、アルブミン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＨＳＡ  ＦｃＲｎ結合部分、抗体、抗体のドメイン、抗体フラグメント、一本鎖抗体、ドメイン抗体、アルブミン結合ドメイン、酵素、リガンド、受容体、結合ペプチド、非ＦｎＩＩＩスキャフォールド、エピトープタグ、組換えポリペプチドポリマー、サイトカイン、またはこのような部分の２つ以上の任意の組合せである。
【００１４】
また、本明細書に記載される単離ポリペプチドおよび担体を含む医薬組成物も提供される。さらに、そのような医薬組成物を含むキットも提供される。
【００１５】
また、過剰体重を原因または特徴とする疾患または病態を治療または予防するための方法であって、本明細書に提供される単離ペプチドまたはそのようなペプチドを含む組成物の有効量を、治療を必要とする被験体に投与することを含む方法も提供される。特定の態様では、疾患または病態は、肥満、インスリン抵抗性、耐糖能障害、糖尿病前症、空腹時血糖の増加、ＩＩ型糖尿病、高血圧症、脂質異常症（またはこれらの代謝リスクファクターの組合せ）、グルカゴン産生腫瘍、心血管疾患、例えば、うっ血性心不全、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、冠動脈心疾患、または末梢動脈疾患；脳卒中、呼吸機能不全、腎疾患、およびそれらの任意の組合せであり得る。この方法によれば、本明細書に記載される単離ポリペプチドは、注射（例えば、皮下注射）により投与することができる。この方法によれば、このペプチドは、１日１回投与することができる。特定の実施形態では、被験体はヒトである。
【００１６】
また、過剰体重を原因または特徴とする疾患または病態を治療または予防するための方法であって、本明細書に提供される単離ペプチドまたはそのようなペプチドを含む組成物の有効量を、治療を必要とする被験体に投与することを含む方法も提供される。この方法によれば、本明細書に記載される単離ポリペプチドは、注射（例えば、皮下注射）により投与することができる。この方法によれば、このペプチドは、１日１回投与することができる。特定の実施形態では、被験体はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】グルカゴン／ＧＬＰ−１共アゴニストペプチドＧ７３０を異なる３用量で投与した後の、ＤＩＯマウスにおける０日目からの体重変化の平均パーセントを、ビヒクル処置およびリラグルチド治療と比較して示す。異なる群の開始時の体重はそれぞれ、ビヒクル：４７．４±３．７ｇ、Ｇ７３０  １０ｎｍｏｌ／ｋｇ：４４．５±２．２ｇ、Ｇ７３０  ２０ｎｍｏｌ／ｋｇ：４５．９±３．６ｇ、およびＧ７３０  ５０ｎｍｏｌ／ｋｇ：４６．１±２．４ｇであった。
【図２】グルカゴン／ＧＬＰ−１共アゴニストペプチドＧ７９７を異なる３用量で投与した後の、ＤＩＯマウスにおける０日目からの体重変化の平均パーセントを、ビヒクル処置およびリラグルチド治療と比較して示す。異なる群の開始時の体重はそれぞれ、ビヒクル：４７．４±３．７ｇ、Ｇ７９７  ５ｎｍｏｌ／ｋｇ：４７．５±１．２ｇ、Ｇ７９７  ２０ｎｍｏｌ／ｋｇ：４７．４±２．２ｇ、およびＧ７９７  ５０ｎｍｏｌ／ｋｇ：４７．２±１．８ｇであった。
【図３】グルカゴン／ＧＬＰ−１共アゴニストペプチドＧ８１２を２０ｎｍｏｌ／ｋｇで投与した後の、ＤＩＯマウスにおける０日目からの体重変化の平均パーセントを、ビヒクル処置およびリラグルチド治療と比較して示す。異なる群の開始時の体重はそれぞれ、ビヒクル：４７．４±３．７ｇ、およびＧ８１２  ２０ｎｍｏｌ／ｋｇ：４９．２±３．４ｇであった。
【図４】図１、２、および３に提示する、３種のグルカゴン／ＧＬＰ−１共アゴニストペプチドについての体重変化の結果を比較するグラフである。
【図５】グルカゴン／ＧＬＰ−１共アゴニストペプチドＧ７９６を異なる２用量で投与した後の、ＤＩＯマウスにおける０日目からの体重変化の平均パーセントを、ビヒクル処置およびリラグルチド治療と比較して示す。
【図６】グルカゴン／ＧＬＰ−１共アゴニストペプチドＧ６８５を異なる２用量で投与した後の、ＤＩＯマウスにおける０日目からの体重変化の平均パーセントを、ビヒクル処置およびリラグルチド治療と比較して示す。
【図７】グルカゴン／ＧＬＰ−１共アゴニストペプチドＧ９３３を異なる２用量で投与した後の、ＤＩＯマウスにおける０日目からの体重変化の平均パーセントを、ビヒクル処置およびリラグルチド治療と比較して示す。
【図８】図５、６、および７に提示する、３種のグルカゴン／ＧＬＰ−１共アゴニストペプチドについての体重変化の結果を比較するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義
本開示の全体にわたって、「ａ」または「ａｎ」という用語は、その実体の１つまたは複数を指し、例えば、「ポリヌクレオチド（ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」は、１つまたは複数のポリヌクレオチドを表わすと理解される。そのため、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数の」、および「少なくとも１つの」という用語は、本明細書で互換的に使用することができる。
【００１９】
さらに、「および／または」は、本明細書で使用される場合、他方を伴ってまたは伴わずに、２つの指定の特徴または構成要素のそれぞれを、明確に開示していると解釈されるべきである。したがって、本明細書において「Ａおよび／またはＢ」などの語句で使用される「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むことを意図するものである。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句で使用される「および／または」という用語は、以下の局面のそれぞれを包含することを意図するものである：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
【００２０】
本明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉で態様が記載される場合は常に、他の場合には、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および／または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という観点から記載される類似の態様も提供されていると理解される。
【００２１】
他に定義されていない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本開示が関係する技術分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；およびＯｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓは、本開示で使用される用語の多くについての一般的辞書を当業者に提供する。
【００２２】
単位、接頭辞、および記号は、国際単位系（Ｓｙｓｔｅｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  Ｕｎｉｔｅｓ）（ＳＩ）で承認された形式で表示される。数値範囲は、その範囲を定義する数を包含する。別に指示がない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向で、左から右に記載される。本明細書に提供される標題は、本開示の種々の態様を限定するものではなく、本明細書を全体として参照することにより理解され得るものである。したがって、この直後に定義される用語は、本明細書を全体として参照することにより、さらに完全に定義される。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、単数形の「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」も複数形の「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）」も包含することを意図するものであり、２個以上のアミノ酸の任意の１つの鎖または複数の鎖を含む。したがって、本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ペプチドサブユニット」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、「アミノ酸配列」、または２個以上のアミノ酸の１つまたは複数の鎖を指す任意の他の用語は、これらの用語のそれぞれがより具体的な意味を有することがあるとしても、「ポリペプチド」の定義に包含される。「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれについてもその代わりに、またはそれと互換的に使用することができる。この用語はさらに、翻訳後修飾または合成後修飾、例えば、糖鎖付加、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解、または非天然アミノ酸による修飾、を受けたポリペプチドを含む。
【００２４】
より具体的には、本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、完全長のペプチドおよびそのフラグメント、変異体、または誘導体、例えば、ＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチド（例えば、長さが２９、３０、または３１アミノ酸）を包含する。本明細書に開示される「ペプチド」、例えばＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドは、半減期を延長するために、例えばＦｃドメインまたはアルブミンドメインなどの追加の成分を含む融合ポリペプチドの一部になることもある。本明細書に記載されるペプチドはまた、いくつかの異なる方法で誘導体化することができる。
【００２５】
「フラグメント」、「アナログ」、「誘導体」、または「変異体」という用語は、ＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドを指す場合、少なくとも一部の所望の活性（例えば、グルカゴンおよび／またはＧＬＰ−１受容体への結合）を保持する任意のペプチドを含む。本明細書に提供されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドのフラグメントには、発現、精製、および／または被験体への投与の間に、所望の性質を示すタンパク質分解フラグメント、欠失フラグメントが含まれる。
【００２６】
本明細書で使用される「変異体」という用語は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または修飾により、言及するペプチドとは異なるペプチドを指す。変異体は、当技術分野で公知の突然変異誘発技術を用いて生成することができる。変異体はさらに、または代替的に、他の修飾を含有することができ、例えば、ペプチドは、例えば半減期、溶解性、または安定性を向上させるために、異種構造のアミノ酸配列または他の部分にコンジュゲートまたはカップリング、例えば融合させることができる。本明細書に提供されるペプチドにコンジュゲートまたはカップリングさせる部分の例としては、以下に限定されるものではないが、アルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等が挙げられる。ペプチドはまた、ペプチドの合成、精製、または同定を容易にするために（例えば、６−Ｈｉｓ）、あるいは固体支持体へのポリペプチドの結合を増強するために、リンカーまたは他の配列にコンジュゲートさせるまたは生成させるカップリングさせることができる。
【００２７】
本明細書で使用される「配列同一性」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列間、または２つ以上のポリペプチド配列間の関係を指す。一方の配列のある位置が、比較対象の配列の対応する位置にあるものと同じ核酸塩基またはアミノ酸によって占められている場合に、これらの配列は、その位置において「同一」であると言われる。パーセント「配列同一性」は、両方の配列において、同一の核酸塩基またはアミノ酸が存在する位置の数を決定して、「同一」位置の数を得ることにより計算される。次いで、「同一」位置の数を、比較ウィンドウ中の位置の総数で割って１００を掛けて、「配列同一性」のパーセントを得る。「配列同一性」のパーセントは、比較ウィンドウ上の２つの最適にアライメントされた配列を比較することにより決定される。比較用に配列を最適にアライメントするために、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列部分は、参照配列を一定に保ちながら、ギャップと称される付加または欠失を含むことができる。最適なアライメントとは、ギャップがあるにしても、参照配列および比較対象配列の間の「同一」位置が可能な限り最大となる数をもたらすアライメントである。２つの配列間のパーセント「配列同一性」は、２００４年９月１日の時点で国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から入手可能であった「ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」というプログラムバージョンを用いて決定することができる。このプログラムには、プログラムＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列比較用）およびＢＬＡＳＴＰ（ポリペプチド配列比較用）が組み込まれており、これらのプログラムは、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（１２）：５８７３−５８７７，１９９３）のアルゴリズムに基づいている。「ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」を利用する場合、語長（３）、オープンギャップペナルティ（１１）、伸長ギャップペナルティ（１）、ギャップ減少（５０）、期待値（１０）、およびこれに限定されるものではないが、マトリックスオプションを含む他の任意の要求パラメーターについて、２００４年９月１日の時点でデフォルトパラメーターであったパラメーターを使用することができる。
【００２８】
「組成物」または「医薬組成物」という用語は、例えば薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤と一緒に、本明細書に提供されるＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドを含有する、治療を必要とする被験体（例えば、肥満について治療されているヒト被験体）に投与するための組成物を指す。
【００２９】
「薬学的に許容される」という用語は、健全な医療判断の範囲内で、妥当なベネフィット／リスク比に釣り合って、過度の毒性または他の合併症を伴わずに、ヒトおよび動物の組織との接触に適している組成物を指す。
【００３０】
「有効量」とは、単回投与でまたは連続投与の一部として被験体に投与すると、治療（例えば、肥満の治療）に有効である、本明細書に提供されるＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドの量である。例えば、その投与が体重減少または体重維持（例えば、体重増加の予防）、体脂肪の減少、低血糖の予防または調節、高血糖の予防または調節、インスリン合成の亢進、または食物摂取の低下の１つまたは複数をもたらす場合に、量は有効である。この量は、治療されるすべての被験体に対して固定した用量であることも、または治療される被験体の体重、健康状態、および体調、所望の体重減少もしくは体重維持の程度、ペプチドの製剤、医学的状態の専門的評価、ならびに他の関連因子に応じて異なることもある。
【００３１】
「被験体」という用語は、本明細書に提供されるＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドによる治療を必要とする、任意の被験体、特に哺乳動物被験体を意味する。哺乳動物被験体としては、以下に限定されるものではないが、ヒト、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、クマ、雌ウシ、類人猿、サル、オランウータン、およびチンパンジーが挙げられる。一実施形態では、被験体はヒト被験体である。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「それを必要とする被験体」とは、治療することが望ましい個体、例えば、体重または体脂肪の減少、体重または体脂肪の維持を進めることが望ましい、あるいは所定期間にわたって体重増加を防止するか最小限に抑えることが望ましい肥満した被験体または肥満する傾向のある被験体を指す。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「ＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチド」は、アッセイ１の条件下において、天然グルカゴンと比較して、少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上のグルカゴン受容体における活性を示し、かつ天然ＧＬＰ−１と比較して、少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上のＧＬＰ−１受容体における活性を示すキメラペプチドである。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「天然グルカゴン」という用語は、配列番号１の配列を含む天然に存在するグルカゴン（例えば、ヒトグルカゴン）を指す。「天然ＧＬＰ−１」という用語は、天然に存在するＧＬＰ−１、例えばヒトＧＬＰ−１を指し、例えば、ＧＬＰ−ｌ（７〜３６）アミド（配列番号２）、ＧＬＰ−ｌ（７〜３７）酸（配列番号３）、またはそれら２つの化合物の混合物を包含する総称である。本明細書で使用される場合、何らさらに詳細な名称がない場合における「グルカゴン」または「ＧＬＰ−１」への一般的な言及はそれぞれ、天然ヒトグルカゴンまたは天然ヒトＧＬＰ−１を意味することを意図する。別に指示がない限り、「グルカゴン」はヒトグルカゴンを指し、「ＧＬＰ−１」はヒトＧＬＰ−１を指す。
【００３５】
ＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチド
グルカゴン受容体とＧＬＰ−１受容体の両方に結合するペプチドが本明細書に提供される。特定の実施形態では、本明細書に提供されるペプチドは、グルカゴン活性とＧＬＰ−１活性の共アゴニストである。このようなペプチドは、本明細書ではＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドと呼ばれる。本明細書に提供されるＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドは、体重減少の促進、体重増加の防止、または所望体重の維持のために、ＧＬＰ−１活性とグルカゴン活性を好ましい比で保有し、かつ最適化された溶解性、製剤化能、および安定性を保有する。特定の実施形態では、本明細書に提供されるＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドは、ヒトＧＬＰ１およびヒトグルカゴンの受容体において活性であり、特定の実施形態では、ＧＬＰ−１受容体における天然リガンドと比較した相対活性は、グルカゴン受容体におけるよりも、少なくとも約１倍、２倍、５倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、または２５倍高い。
【００３６】
特定の実施形態では、開示されるＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドは、グルカゴンおよびＧＬＰ−１の受容体において所望の効力を有し、体重減少の促進のための所望の相対効力を有する。特定の実施形態では、開示されるＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドは、ｃＡＭＰアッセイ１（実施例２を参照のこと）において、１０，０００ｐＭ未満、５０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、または２ｐＭ未満のＥＣ５０によって示される、ＧＬＰ−１受容体でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力を示す。特定の実施形態では、開示されるＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドは、４．４％ヒト血清アルブミンでのｃＡＭＰアッセイ（アッセイ２、実施例２を参照のこと）において、１０，０００ｐＭ未満、５０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、または２ｐＭ未満のＥＣ５０によって示される、ＧＬＰ−１受容体でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力を示す。特定の実施形態では、開示されるＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドは、ｃＡＭＰアッセイ１（実施例２を参照のこと）において、１０，０００ｐＭ未満、５０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、または２ｐＭ未満のＥＣ５０によって示される、グルカゴン受容体でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力を示す。特定の実施形態では、開示されるＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドは、４．４％ヒト血清アルブミンでのｃＡＭＰアッセイ（アッセイ２、実施例２を参照のこと）において、１０，０００ｐＭ未満、５０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、または２ｐＭ未満のＥＣ５０によって示される、グルカゴン受容体でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力を示す。特定の実施形態では、開示されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、天然リガンドと比較した場合に、アッセイ２を用いると、約０．０１〜０．５０の範囲、例えば約０．０２〜０．３０の範囲、例えば、約０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１���０、１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、または０．３０の相対ＧＬＰ１−Ｒ／ｇｌｕｃＲ効力比を有する。
【００３７】
特定の実施形態では、開示されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、ｃＡＭＰアッセイ１（実施例２を参照のこと）において、１０，０００ｐＭ未満、５０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、または２ｐＭ未満のＥＣ５０によって示される、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（胃抑制ペプチド）（ＧＩＰＲ）でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力を示す。特定の実施形態では、開示されるＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドは、４．４％ヒト血清アルブミンでのｃＡＭＰアッセイ（アッセイ２、実施例２を参照のこと）において、１０，０００ｐＭ未満、５０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、または２ｐＭ未満のＥＣ５０によって示される、ＧＩＰＲでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力を示す。
【００３８】
特定の実施形態では、本明細書に提供されるＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドは、許容される溶解性、製剤化の容易さ、血漿安定性、および改善された薬物動態特性の１つまたは複数の基準を備えている。特定の実施形態では、開示されるＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドは、幅広いｐＨ範囲にわたって標準緩衝液に可溶である。
【００３９】
特定の実施形態では、ＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドは、以下に限定されるものではないが、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、またはヒスチジン緩衝液を含む緩衝系および一連のイオン強度、例えば０．２５〜１５０ｍＭにて、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、またはそれ以上の濃度まで共通緩衝液に可溶である。代表的な緩衝液としては、１００ｍＭグルタミン酸ｐＨ４．５緩衝液、１００ｍＭ酢酸ｐＨ５緩衝液、１００ｍＭコハク酸ｐＨ５緩衝液、１００ｍＭリン酸ｐＨ６緩衝液、１００ｍＭヒスチジンｐＨ６緩衝液、１００ｍＭリン酸ｐＨ６．５緩衝液、１００ｍＭリン酸ｐＨ７．０緩衝液、１００ｍＭヒスチジンｐＨ７．０緩衝液、１００ｍＭリン酸ｐＨ７．５緩衝液、１００ｍＭトリスｐＨ７．５緩衝液、および１００ｍＭトリスｐＨ８．０緩衝液が挙げられる。特定の実施形態では、開示されるＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドは、一連のｐＨにわたって、例えば、ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０、例えば、ｐＨ４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、または８．５で、０．８ｍｇ／ｍｌにて標準緩衝液に可溶である。特定の実施形態では、開示されるＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドは、ｐＨ４．５〜８．０、５．０〜８．０、５．５〜８．０、６．０〜８．０、６．５〜８．０、７．０〜８．０、４．５〜８．５、５．５〜８．５、５．５〜８．５、６．０〜８．５、６．５〜８．５、または７．０〜８．５の標準緩衝液に可溶である。
【００４０】
特定の実施形態では、開示されるＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドは、標準医薬製剤で製剤化することができる。代表的な製剤としては、以下に限定されるものではないが、０．１ＭトリスｐＨ７．５、１５０ｍＭマンニトール、最終製剤ｐＨ＝７．２；０．０５Ｍトリス、５０ｍＭアルギニン／プロリン、最終製剤ｐＨ＝８．０；またはリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）／１．８５％Ｗ／Ｖプロピレングリコール、最終製剤ｐＨ＝７．０が挙げられる。特定の実施形態では、開示されるＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドは、これらのまたは他の製剤において、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、またはそれ以上の濃度まで可溶である。
【００４１】
特定の実施形態では、開示されるＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドは、血清または血漿中でのプロテアーゼに対する安定性が許容可能なものである。グルカゴンまたはＧＬＰ−１の共通の分解産物には、＋１生成物（酸）およびＤＰＰ  ＩＶ切断生成物が含まれる。＋１質量の生成物は、グルタミンのアミド基またはＣ末端における脱アミドから生じ得る。切断生成物は、血漿中のプロテアーゼＤＰＰ  ＩＶの作用により生じる。特定の実施形態では、開示されるＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドは、血漿中にて３７℃で２４時間後に、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のレベルまで、血漿中に安定に残存する。
【００４２】
以下のアミノ酸配列を含むＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドが本明細書に提供される：
ＨＸ２ＱＧＴＦＴＳＤＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３ＬＸ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８ＡＸ２０Ｘ２１ＦＸ２３Ｘ２４ＷＬＸ２７Ｘ２８ＧＸ３０；
ここで、Ｘ２はＧまたはＳであり、Ｘ１０はＹまたはＫであり、Ｘ１２はＫ、Ｅ、Ｒ、またはＳであり、Ｘ１３はＫまたはＹであり、Ｘ１５はＤまたはＥであり、Ｘ１６はＳまたはＧであり、Ｘ１７はＥ、Ｒ、Ｑ、またはＫであり、Ｘ１８はＲ、Ｓ、またはＡであり、Ｘ２０はＲ、Ｋ、またはＱであり、Ｘ２１はＤまたはＥであり、Ｘ２３はＶまたはＩであり、Ｘ２４はＡまたはＱであり、Ｘ２７はＥまたはＶであり、Ｘ２８はＡまたはＫであり、かつＸ３０はＧまたはＲである（配列番号４）。特定の実施形態では、上記に示された単離ポリペプチドが提供され、ここで、Ｘ２はＳであり、Ｘ１０はＹまたはＫであり、Ｘ１２はＫ、Ｅ、Ｒ、またはＳであり、Ｘ１３はＫまたはＹであり、Ｘ１５はＤであり、Ｘ１６はＳであり、Ｘ１７はＥ、Ｒ、Ｑ、またはＫであり、Ｘ１８はＲ、Ｓ、またはＡであり、Ｘ２０はＲであり、Ｘ２１はＤであり、Ｘ２３はＶであり、Ｘ２４はＡであり、Ｘ２７はＥまたはＶであり、Ｘ２８はＡであり、かつＸ３０はＧである（配列番号５）。特定の実施形態では、上記に示される単離ポリペプチドが提供され、ここで、Ｘ２はＳであり、Ｘ１０はＹまたはＫであり、Ｘ１２はＫ、Ｅ、Ｒ、またはＳであり、Ｘ１３はＫまたはＹであり、Ｘ１５はＤであり、Ｘ１６はＳであり、Ｘ１７がＥである場合、Ｘ１８はＲであり、またはＸ１７がＲである場合、Ｘ１８はＳであり、Ｘ２０はＲであり、Ｘ２１はＤであり、Ｘ２３はＶであり、Ｘ２４はＡであり、Ｘ２７はＥまたはＶであり、Ｘ２８はＡであり、かつＸ３０はＧである（それぞれ、配列番号６および配列番号７）。特定の実施形態では、上記に示される単離ポリペプチドが提供され、ここで、Ｘ２はＳであり、Ｘ１０はＹであり、Ｘ１２はＫであり、Ｘ１３はＫであり、Ｘ１５はＤであり、Ｘ１６はＳであり、Ｘ１７がＥである場合、Ｘ１８はＲであり、またはＸ１７がＲである場合、Ｘ１８はＳであり、Ｘ２０はＲであり、Ｘ２１はＤであり、Ｘ２３はＶであり、Ｘ２４はＡであり、Ｘ２７はＶであり、Ｘ２８はＡであり、かつＸ３０はＧである（それぞれ、配列番号８および配列番号９）。特定の実施形態では、上記に示される単離ポリペプチドが提供され、ここで、Ｘ２はＳであり、Ｘ１０はＫであり、Ｘ１２はＫ、Ｅ、Ｒ、またはＳであり、Ｘ１３はＹであり、Ｘ１５はＤであり、Ｘ１６はＳであり、Ｘ１７がＥである場合、Ｘ１８はＲであり、Ｘ１７がＲである場合、Ｘ１８はＳであり、Ｘ２０はＲであり、Ｘ２１はＤであり、Ｘ２３はＶであり、Ｘ２４はＡであり、Ｘ２７はＥであり、Ｘ２８はＡであり、かつＸ３０はＧである（それぞれ、配列番号１０および配列番号１１）。特定の実施形態では、上記に示される単離ポリペプチドが提供され、ここで、Ｘ２はＳであり、Ｘ１０はＫであり、Ｘ１２はＥであり、Ｘ１３はＹであり、Ｘ１５はＤであり、Ｘ１６はＳであり、Ｘ１７がＥである場合、Ｘ１８はＲであり、またはＸ１７がＲである場合、Ｘ１８はＳであり、Ｘ２０はＲであり、Ｘ２１はＤであり、Ｘ２３はＶであり、Ｘ２４はＡであり、Ｘ２７はＥであり、Ｘ２８はＡであり、かつＸ３０はＧである（それぞれ、配列番号１２および配列番号１３）。特定の実施形態では、上記に示される単離ポリペプチドが提供され、ここで、Ｘ２はＳであり、Ｘ１０はＫであり、Ｘ１２はＲであり、Ｘ１３はＹであり、Ｘ１５はＤであり、Ｘ１６はＳであり、Ｘ１７がＥである場合、Ｘ１８はＲであり、またはＸ１７がＲである場合、Ｘ１８はＳであり、Ｘ２０はＲであり、Ｘ２１はＤであり、Ｘ２３はＶであり、Ｘ２４はＡであり、Ｘ２７はＥであり、Ｘ２８はＡであり、かつＸ３０はＧである（それぞれ、配列番号１４および配列番号１５）。
【００４３】
本明細書に提供されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドには、以下に限定されるものではないが、Ｇ７３０（配列番号１６）、Ｇ７９７（配列番号１７）、Ｇ８４９（配列番号１８）、Ｇ９３３（配列番号１９）、Ｇ８６５（配列番号２０）、Ｇ７９６（配列番号２１）、Ｇ８１２（配列番号２２）、およびＧ３８０（配列番号２３）が含まれる。これらのＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドを、表１に列挙する：
【００４４】
【表１】
0006490011.tif 000002
【００４５】
ペプチドＧ７９７とＧ９３３は両方とも、位置１２にグルタミン酸残基を有し、実施例２で示されるように、グルカゴン受容体とＧＬＰ−１受容体の両方において強固な活性を保持している。対応する残基は、エキセンディン−４およびグルカゴンではリジンであり、ＧＬＰ−１ではセリンである。この残基は受容体に接触するとは考えられていないが、正から負への電荷の変化は、隣接する環境に変化を及ぼす可能性がある。さらに、Ｇ７９７、Ｇ８４９、およびＧ９３３は位置２７にグルタミン酸残基を有する。残基２７は、エキセンディン−４ではリジンであり、ＧＬＰ１（バリン）およびグルカゴン（メチオニン）では無電荷の疎水性残基である。エキセナチドのリジンは、残基Ｇｌｕｌ２７およびＧｌｕ２４でＧＬＰ１受容体と静電的相互作用を形成する（Ｃ．Ｒ．Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８５  ７２３−７３０（２０１０）；Ｓ．Ｒｕｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８３  １１３４０−１１３４７（２００８））。位置２７の電荷が負に変化するとＧＬＰ１Ｒ効力の喪失が予想されるが、その変化はＧ７９７、Ｇ８４９、およびＧ９３３のＧＬＰ１Ｒ活性と矛盾しない。
【００４６】
作製方法。本開示は、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドを作製する方法を提供する。本明細書に提供されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、任意の適切な方法により作製することができる。例えば、特定の実施形態では、本明細書に提供されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、当業者に周知の方法により、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）により記載される固相合成により、化学的に合成される。固相ペプチド合成は、例えば実施例１に説明するように、例えば、標準試薬を使用して自動合成装置を用いることにより、行うことができる。
【００４７】
あるいは、本明細書に提供されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、当業者に周知である好都合なベクター／宿主細胞の組合せを用いて組換えにより生成させることができる。ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドを組換えにより生成させるために、種々の方法が利用可能である。一般に、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、適切な発現ビヒクル（例えば、挿入されたコード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含有するベクター）に挿入される。ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドをコードする核酸は、適切な読み枠でベクターに挿入される。次いで、発現ベクターは、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドを発現する適切な宿主細胞にトランスフェクトされる。適切な宿主細胞としては、限定されるものではないが、細菌、酵母、または哺乳動物細胞が挙げられる。種々の市販宿主発現ベクター系を、本明細書に記載されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドを発現するために利用することができる。
【００４８】
修飾、コンジュゲート、融合、および誘導体化。特定の実施形態では、本明細書に提供されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、アミノ酸の修飾により安定化される。特定の実施形態では、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基はアミド化される。特定の実施形態では、Ｃ末端アミノ酸は、例えば、Ｇ７３０、Ｇ７９７、Ｇ８４９、Ｇ８６５、Ｇ７９６、Ｇ８１２、およびＧ３８０のように、アミド化されたグリシンである。特定の実施形態、例えばＧ９３３では、Ｃ末端グリシンは無修飾の酸である。特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸残基がアシル化されたＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドが提供される。例えば、特定の実施形態では、本明細書に提供されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、パルミトイル基がＮ（イプシロン）基に結合している、１つまたは複数のリジン残基を含有する。特定の実施形態では、リンカーがリジンとパルミトイル基との間に組み込まれている。このリンカーは、ガンマグルタミン酸基であっても、または以下に限定されるものではないが、ベータアラニンおよびアミノヘキサン酸などの別のリンカーであってもよい。コレステロールまたはミリストイル基の付加など種々のアシル化方法を用いることができる。特定の実施形態では、パルミトイル部分は位置１３に付加される（例えば、Ｇ７３０）。特定の実施形態では、パルミトイル部分は、位置１０に付加される（例えば、Ｇ７９７、Ｇ８４９、Ｇ９３３、Ｇ８６５、Ｇ７９６、およびＧ８１２）。特定の実施形態では、パルミトイル部分は位置１７に付加される（例えば、Ｇ３８０）。
【００４９】
本明細書に提供されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチド（例えば、Ｇ７３０、Ｇ７９７、Ｇ８４９、およびＧ９３３）は、パルミトイル化されて、血清アルブミンと結合することにより半減期が延長され得ることになり得、そのため、実施例１に記載するように、腎臓でクリアランスされる傾向が低下する。
【００５０】
代替的または追加的に、本明細書に開示されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドを、例えば半減期を延長するために、異種構造部分と結合させることができる。異種構造部分は、タンパク質、ペプチド、タンパク質ドメイン、リンカー、有機ポリマー、無機ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ビオチン、アルブミン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＨＳＡ  ＦｃＲｎ結合部分、抗体、抗体のドメイン、抗体フラグメント、一本鎖抗体、ドメイン抗体、アルブミン結合ドメイン、酵素、リガンド、受容体、結合ペプチド、非ＦｎＩＩＩスキャフォールド、エピトープタグ、組換えポリペプチドポリマー、サイトカイン、およびこのような部分の２つ以上の組合せとすることができる。
【００５１】
例えば、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、異種構造ポリペプチドと融合させることができる。ペプチドは、組換え遺伝子融合および発現を介して、または化学結合によりタンパク質に融合させることができる。融合の相手として適切なタンパク質としては、限定されるものではないが、ヒト血清アルブミン、抗体、および抗体のＦｃ部分への融合を含む抗体フラグメントが挙げられる。ＧＬＰ−１は、効力を保持しながらこれらのタンパク質に融合されている（Ｌ．Ｂａｇｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３  ２４９２−２５００（２００４）；Ｐ．Ｂａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，Ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  １３  ４２６−４３３（２０１１）；Ｐ．Ｐａｕｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ２０１２，Ｐｏｓｔｅｒ  １９４６）。ペプチドに高分子量を与えるために伸張された組換えペプチド配列についても記載されている（Ｖ．Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２７  １１８６−１１９０（２００９）；ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（欧州特許第２１７３８９０号明細書））。特定の実施形態では、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、融合相手（例えば、アルブミンまたはＦｃ部分）に対して、Ｃ末端で融合タンパク質のＮ末端部分として組み込まれる。本明細書に記載されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドはまた、ヒト血清アルブミンに親和性を有する「Ａｌｂｕｄａｂｓ」などのペプチドまたはタンパク質ドメインに融合させることができる（Ｍ．Ｓ．Ｄｅｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７  ３５０３５−３５０４３（２００２）；Ａ．Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ２３  ２７１−２７８（２０１０））。本明細書に開示されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドを異種構造ポリペプチド（例えば、アルブミンまたはＦｃ部分）と融合させるための方法は、当業者に周知である。
【００５２】
さらに安定化させ半減期を延長させるために、他の異種構造部分をＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドにコンジュゲートさせることができる。化学的な融合の場合、特定の実施形態では、遊離Ｎ末端の維持を特徴とするが、誘導体化ための別のポイントを作製することができる。さらに別の方法では、高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの大きな化学部分を用いてペプチドを誘導体化する。「ＰＥＧ化されたＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチド」は、ペプチドに共有結合したＰＥＧ鎖を有する。ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドの誘導体化（例えば、ＰＥＧ化）は、パルミトイル化されているリジン、あるいは誘導体化を可能にするように置換されているか伸張によって組み込まれている、システインなどの残基で行うことができる。上記のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチド形式は、相対効力ならびにＧＬＰ−１受容体活性化とグルカゴン受容体活性化の間のバランスについてｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで特徴づけることができる。
【００５３】
「ポリエチレングリコール鎖」または「ＰＥＧ鎖」という一般用語は、一般式Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ（式中、ｎは３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の整数である）で表される、分枝鎖または直鎖となる、エチレンオキシドと水との縮合ポリマーの混合物を指す。ＰＥＧ鎖には、約５００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される平均合計分子量を有するエチレングリコールのポリマーが含まれる。ＰＥＧ鎖の平均分子量は数字により示され、例えば、ＰＥＧ−５，０００は、約５，０００の合計分子量平均を有するポリエチレングリコール鎖を指す。
【００５４】
ＰＥＧ化は、当技術分野で公知のＰＥＧ化反応のいずれによっても実行することができる。例えば、Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，３：４−１０，１９９２、ならびに欧州特許出願第０１５４３１６号明細書および同第０４０１３８４号明細書を参照されたい。ＰＥＧ化は、反応性のあるポリエチレングリコール分子（または類似の反応性のある水溶性ポリマー）によるアシル化反応またはアルキル化反応を用いて行うことができる。
【００５５】
ＰＥＧ化されたＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドを調製するための方法は、一般に、（ａ）ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドを、この分子が１つまたは複数のＰＥＧ基に結合するようになる条件下でポリエチレングリコール（ＰＥＧの反応性のあるエステルまたはアルデヒド誘導体など）と反応させるステップと、（ｂ）反応生成物を得るステップとを含む。
【００５６】
医薬組成物
さらに、本明細書に提供されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドの有効量を含有し、代謝疾患、例えば肥満、の治療用に製剤化された組成物、例えば医薬組成物、が提供される。
【００５７】
本開示の組成物は、公知の方法に従って製剤化することができる。適切な調製方法は、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９５）に記載されている。組成物は、以下に限定されるものではないが、水溶液、エマルジョン、ゲル、懸濁液、凍結乾燥形態、または当技術分野で公知の他の形態を含む、種々の形態をとることができる。加えて、組成物は、例えば希釈剤、結合剤、安定剤、および防腐剤を含む、薬学的に許容される添加剤を含有することができる。ひとたび製剤化されたならば、本発明の組成物は、被験体に直接投与することができる。
【００５８】
本発明の組成物と共に用いることができる担体は、当技術分野で周知であり、これらには、限定されるものではないが、例えばチログロブリン、ヒト血清アルブミンなどのアルブミン、破傷風トキソイド、およびポリＬ‐リジン、ポリＬ−グルタミン酸などのポリアミノ酸、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質等が含まれる。種々の水性担体、例えば、水、緩衝化された水、０．８％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等を使用することができる。組成物は、従来の周知の滅菌技術により滅菌することも、または滅菌濾過することもできる。得られた組成物は、そのまま使用するためにパッケージングすることも、または凍結乾燥することもでき、凍結乾燥調製物は投与前に滅菌溶液と混合される。組成物は、例えばｐＨ調整剤および緩衝剤、等張化剤、湿潤剤等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミンオレート等、生理的条件に近づけるために必要とされる、薬学的に許容される補助物質を含有することができる。
【００５９】
肥満を治療する方法、モデル系。
ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、グルカゴンの効果（例えば、食物摂取の抑制またはグルコースレベルの調節）を、ＧＬＰ−１の効果（例えば、胃運動性の抑制またはインスリン放出の促進）と合わせることができる。したがって、これらのペプチドは、過剰な脂肪組織の除去を加速し、持続可能な体重減少を誘導し、また血糖制御を改善するように作用することができる。ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドはまた、高コレステロール、高ＬＤＬコレステロール、または異常なＨＤＬ／ＬＤＬ比などの心血管リスクファクターを低減するように作用することができる。
【００６０】
本開示は、肥満または肥満関連疾患または障害を治療する方法であって、治療を必要とする被験体に、本明細書に開示されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドを投与することを含む方法を提供する。さらに、肥満または肥満関連疾患または障害を治療するためのＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドが提供される。さらに、肥満または肥満関連疾患または障害を治療するための薬剤の製造における、本明細書に提供されるＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドの使用が提供される。
【００６１】
本明細書に提供されるＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドは、（例えば、食欲、摂食、食物摂取、カロリー摂取、および／またはエネルギー消費の制御により）体重増加の防止、体重減少の促進、過剰体重の低減、または病的肥満を含む肥満の治療を行うために投与することができる。加えて、本明細書に提供されるＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドは、他の肥満関連代謝障害の治療に用いることができる。他の肥満関連障害の例としては、限定されるものではないが、インスリン抵抗性、耐糖能障害、糖尿病前症、空腹時血糖の増加、ＩＩ型糖尿病、高血圧症、脂質異常症（またはこれらの代謝リスクファクターの組合せ）、グルカゴン産生腫瘍、うっ血性心不全などの心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、冠動脈心疾患、または末梢動脈疾患、脳卒中、呼吸機能不全、または腎疾患が挙げられる。
【００６２】
「治療」とは、有益なまたは所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本明細書に提供される場合、開示されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドによる有益なまたは所望の臨床結果としては、限定されるものではないが、体重減少、体重増加の低減、食欲低下、血清グルコースレベルおよび血清インスリンレベルの低減もしくは安定化、肥満関連疾患の寛解、軽減、安定化、程度の減弱、または肥満関連疾患の進行の遅延もしくは減速が挙げられる。「治療」とは、特定の実施形態では、治療的処置と予防または防止処置の両方を指す。治療を必要とする対象には、すでに障害を有する対象、および障害が防止されるべきである対象が含まれる。治療とは、治療しない場合と比較して、肥満関連症状（例えば、体重増加）の亢進を抑制または低減することを意味し、必ずしも関連病態の完全な停止を示唆することを意味するものではない。
【００６３】
本明細書に提供されるＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドの投与経路は、例えば、経口、吸入または局所による非経口とすることができる。本明細書で使用される「非経口」という用語には、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸内、膣内の投与が含まれる。投与形態の他の例には、注射用溶液、特に静脈内もしくは動脈内の注射用または点滴用溶液がある。本明細書に提供されるＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドは、単回用量としてまたは複数回用量として投与することができる。特定の実施形態では、ＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドは皮下注射により投与される。
【００６４】
非経口製剤は、単回ボーラス用量、点滴または負荷ボーラス用量、その後の維持用量とすることができる。これらの組成物は、特定の固定した間隔または変動する間隔で、例えば、１日１回または「必要に応じて」を基本にして投与することができる。投与レジメンはまた、最適な所望の応答（例えば、治療的または予防的な応答）が得られるように調整することができる。
【００６５】
投与されるＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドの量は、本明細書の開示に示される過度な実験をすることなく、当業者によって容易に決定することができる。ＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドの投与方法およびそれぞれの量に影響を及ぼす要因としては、以下に限定されるものではないが、疾患の重症度（例えば、肥満の程度）、被験体の病歴、および治療を受ける被験体の年齢、身長、体重、健康状態、および体調が挙げられる。同様に、投与されるＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドの量は、投与方法および被験体がこの薬剤の単回用量を投与されるか、複数回用量を投与されるかに依存することになる。特定の実施形態では、本明細書に提供されるＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドは、注射により１日１回投与することができる。
【００６６】
キット
さらに他の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される方法を実施するために使用することができる、ＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドを含むキットを提供する。特定の実施形態では、キットは、１つまたは複数の容器中に、本明細書に開示されるＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドを含む。当業者ならば、開示されるＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドが当技術分野で周知の確立されたキット形式の１つに容易に組み込むことができることを容易に認識するであろう。
【実施例】
【００６７】
[実施例１]
ＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドの合成、修飾、および特徴づけ
略語表：
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
ｔｅｒｔ−Ｂｕ；ｔｅｒｔ−ブチル
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＩＣ：ジイソプロピルカルボジイミド
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
Ｍｔｔ：４−メチルトリチル
ＮＭＰ：Ｎ−メチルピロリドン
Ｐｂｆ：２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＩＳ：トリイソプロピルシラン
Ｔｒｔ：トリフェニルメチル、トリチル
【００６８】
ＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドは、以下のように合成した。ＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧＲまたは前負荷Ｆｍｏｃ−Ｗａｎｇ樹脂（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ）上でのペプチド鎖の伸長を、ＰＲＥＬＵＤＥ（商標）固相ペプチド合成機（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ，ＵＳＡ）を用いて行なった。Ｎ−メチルピロリドン（ΝΜΡ）中における、アミノ酸のヒドロキシベンゾトリアゾールエステルのカップリングについては、製造業者により提供されたプロトコールを適用した。アミノ酸のアルファアミノ基の半永久的な保護については、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基を用いたが、側鎖は、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシンついてはｔｅｒｔ−ブチル（ｔｅｒｔ−Ｂｕ）、アルギニンについては２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）、またヒスチジンについてはトリチル（Ｔｒｔ）を用いて保護した。位置１のヒスチジンのＮ末端アミノ基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ）で保護した。その後に側鎖の化学修飾を必要とする場合は、Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）をペプチド鎖に組み込んだ。
【００６９】
ペプチド鎖伸長の完了と同時に、Ｍｔｔ基を、２％ＴＦＡおよび５％ＴＩＳ（１０×７ｍｌ、それぞれ０．５分）を含有するＤＣＭでペプチド樹脂を洗浄することにより除去した。Ｌｙｓの側鎖への脂質部分のカップリングは、ＨＯＢｔの存在下で、カップリング試薬としてＤＩＣを用いて、ＰＲＥＬＵＤＥ（商標）ペピチド合成機で行なった。
【００７０】
ＴＦＡ：ＴＩＳ：水（９５：２．５：２．５）の混合物を用いて、ペプチドを樹脂から切断した。室温で２時間後、ペプチジル樹脂を濾過し、ＴＦＡで洗浄し、濾液を合わせて真空蒸発乾固した。残渣をエーテルで粉砕し、形成された沈殿を濾過し、エーテルで洗浄し、乾燥した。粗ペプチドを５％酢酸水溶液中に溶解し、Ｖａｒｉａｎ  ９２０−ＬＣシステムに装着されたＰｏｌａｒｉｓ  ３  Ｃ８−Ａカラム上で逆相高圧液体クロマトグラフィーにより分析した。１５分間にわたる１０〜９０％の緩衝液Ｂの標準勾配システムを用いて分析した。緩衝液Ａは０．１％ＴＦＡ水溶液とし、緩衝液Ｂは０．１％ＴＦＡアセトニトリル溶液とした。ＨＰＬＣプロファイルを２１０ｎｍで記録した。調製用の分離は、半調製用Ｃ１８  ＲＰ  ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｗａｔｅｒｓカラムを用いてＶａｒｉａｎ  ＰｒｏＳｔａｒシステム上で行なった。３０分間にわたる３０〜７０％の緩衝液Ｂの勾配からなる、水およびアセトニトリルの上記溶媒系を用いて分離した。クロマトグラフィー的に均質な生成物（＞９７％純粋）をエレクトロスプレイ質量分析法（ＭａｓｓＬｙｎｘ，Ｗａｔｅｒｓ）により分析した。
【００７１】
[実施例２]
ｉｎ  ｖｉｔｉｒｏ試験
グルカゴン受容体およびＧＬＰ−１受容体の媒介によるｃＡＭＰ生成
細胞ベースのｃＡＭＰ活性アッセイにおけるペプチドの生物活性（アッセイ１）
実施例１の方法により合成したＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドについて、以下の方法により生物活性、例えば１つまたは複数の細胞受容体応答の刺激、を試験した。ヒト、マウス、ラット、またはイヌのＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）、グルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）、またはグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（胃抑制ポリペプチド）受容体（ＧＩＰＲ）を発現する安定な細胞株を、標準的な方法により、ＨＥＫ２９３ｓ細胞またはＣＨＯ細胞で作製した。これらの種々の受容体のペプチド活性化により、機能的活性アッセイで測定することができるｃＡＭＰ二次メッセンジャーが下流で生成される。
【００７２】
ｃＡＭＰアッセイは、以下の「アッセイ培地」を用いて行なった：
アッセイ培地：０．５ｍＭ  ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ  ＃１７０１８）を含有するＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＃４１９６６）中に１０％ＦＢＳ。
低タンパク質吸着３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＃７８１２８０）を用いて、アッセイ培地で作製した試験試料について連続的に１／５希釈を１１回行った。試料稀釈液はすべて二つ組で作製した。
【００７３】
目的の受容体を発現する、凍結保存用バイアルの細胞を、水浴中で迅速に解凍し、予め加温したアッセイ培地に移し、２４０×ｇで５分間遠心した。最適濃度でアッセイ培地に細胞を再懸濁した（例えば、ｈＧＣＧＲ細胞を１×１０５細胞／ｍｌ、ｈＧＬＰ−ｌＲ細胞およびｈＧＩＰＲ細胞を０．５×ｌ０５細胞／ｍｌ）。
【００７４】
稀釈プレートから、５μＬのレプリカを黒色低容量丸底３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＃３６７６）上にスタンプした。これに、５μＬの細胞懸濁液を加え、プレートを室温で３０分間インキュベートした。
【００７５】
市販のｃＡＭＰ  ｄｙｎａｍｉｃ  ２  ＨＴＲＦキット（Ｃｉｓｂｉｏ、カタログ＃  ６２ＡＭ４ＰＥＪ）を用い、製造業者が推奨する２段階プロトコールに従って、ｃＡＭＰレベルを測定した。手短に言えば；抗ｃＡＭＰクリプテート（ドナーフルオロフォア）およびｃＡＭＰ−ｄ２（アクセプターフルオロフォア）を、キット中に提供されるコンジュゲートおよび溶解用緩衝液でそれぞれ１／２０に希釈することにより、別々に作製した。５μＬの抗ｃＡＭＰクリプテートをアッセイプレートのすべてのウェルに加え、また５μＬのｃＡＭＰ−ｄ２を、非特異的結合（ＮＳＢ）ウェルを除くすべてのウェルに加え、コンジュゲートおよび溶解用緩衝液をそれらのウェルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートし、次いで、３２０ｎｍの励起波長ならびに６２０ｎｍおよび６６５ｎｍの発光波長を用いて、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上で読み取った。
【００７６】
合成したＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドの配列、および「アッセイ培地」で実施のｃＡＭＰアッセイで測定したＥＣ５０値を表２に示す。表２のペプチドはすべて、Ｃ末端アミドにして合成した。さらなるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、Ｃ末端酸にして合成し、「アッセイ培地」で実施のｃＡＭＰアッセイで測定したＥＣ５０値を表３に示す。「アッセイ培地」で実施した、さらなるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドについてのＥＣ５０値を表４に示す。表４のペプチドはすべて、Ｃ末端酸を有する場合の「酸」という表示がない限り、Ｃ末端アミドを有する。
【００７７】
【表２】
0006490011.tif 000003
【００７８】
【表３】
0006490011.tif 000004
【００７９】
【表４−１】
0006490011.tif 000005
【００８０】
【表４−２】
0006490011.tif 000006
【００８１】
【表４−３】
0006490011.tif 000007
【００８２】
【表４−４】
0006490011.tif 000008
【００８３】
血漿濃度の血清アルブミンの存在下における、グルカゴン受容体およびＧＬＰ−１受容体を媒介としたｃＡＭＰ生成のアッセイ（アッセイ２）
ｃＡＭＰ生成を誘導するペプチドについてのアゴニスト効力測定を、以下のように、ヒト、ラット、またはマウスの血清アルブミンのそれぞれ４．４、３．２、および３．２％の存在下で、ヒト、ラット、もしくはマウスのグルカゴン受容体（ＧｌｕｃＲまたはＧＣＧＲと略す）またはＧＬＰ−１受容体を発現するＣＨＯ細胞で行った。
【００８４】
ヒト、マウス、またはラットのＧｌｕｃＲ受容体またはＧＬＰ−１受容体を安定に組換え発現するＣＨＯ細胞を、１０％ＦＢＳおよびジェネテシン（１００μｇ／ｍｌ）含有ＤＭＥＭ中で培養した。凍結保存する細胞ストックは、２×ｌ０７／バイアルで無血清１×細胞凍結用培地−ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）にて調製し、−８０℃で保存した。細胞を３７℃で迅速に解凍した後、ヒト、ラット、およびマウスの血清アルブミンについて、それぞれ４．４、３．２、および３．２％で血清アルブミンを含有するアッセイ緩衝液（ＤＭＥＭ）中に希釈した。ペプチドをＤＭＳＯで連続的に希釈した後、規定の最終濃度で血清アルブミンを含有するＤＭＥＭ中に１００倍希釈した。次いで、希釈したペプチドを、黒色低容量３８４ウェルマイクロタイターアッセイプレートに移した。細胞をアッセイプレートに加え、室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、アッセイを停止し、ＣｉｓＢｉｏ  Ｂｉｏａｓｓａｙｓから入手可能なＨＴＲＦ（登録商標）ｄｙｎａｍｉｃ  ｄ２  ｃＡＭＰアッセイキットを用い、製造業者のガイドラインに従ってｃＡＭＰを測定した。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＥＮＶＩＳＩＯＮ（登録商標）蛍光プレートリーダー上で、プレートを読み取った。ヒトおよびラットの血清アルブミンはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから、マウスの血清アルブミンはＥｑｕｉｔｅｃｈ  Ｂｉｏ  Ｌｔｄ．から購入した。
【００８５】
製造業者のガイドラインに記載のように、データを％デルタＦに変換し、４パラメーターロジスティックスフィットにより分析してＥＣ５０を決定した。選択したペプチドに対するアッセイ２のＥＣ５０値を表５に示す。決定されるアッセイ２のＥＣ５０値は、組換え細胞株においてＧＬＰ１受容体およびグルカゴン受容体で試験されるペプチドの固有の効力と、遊離ペプチドの量を決定する、血清アルブミンに対するペプチドの親和性との両方に依存する。血清アルブミンとの結合があると、得られるＥＣ５０値は増大する。血漿濃度のアルブミンでの遊離ペプチドの割合および０％ＨＳＡでのＥＣ５０は、ＨＳＡ濃度に伴うｃＡＭＰ生成の変動に基づいて計算することができる。例えば、Ｇ７３０およびＧ９３３はそれぞれ、４．４％ＨＳＡでの遊離ペプチドについて、０．８５％および０．２９％の値を示し、０％ＨＳＡでのＧＬＰ１Ｒについて、７ｐＭおよび６ｐＭの値を示した。Ｇ７９７およびＧ８４９はそれぞれ、４．４％ＨＳＡでの遊離ペプチドについて、０．８２％および０．４８％の値を示し、０％ＨＳＡでのＧＬＰ１Ｒについて、７ｐＭおよび２ｐＭの値を示した。種々のペプチド間における、ＧＬＰＩＲおよびＧｌｕｃＲでの活性のバランスを比較するために、これらのＥＣ５０を天然リガンドのＥＣ５０に関連づける以下の計算を用いて、これらの相互関係を得ることができる。
【００８６】
【表５】
0006490011.tif 000009
【００８７】
血漿中のペプチドの安定性試験
ペプチドＧ７３０、Ｇ７９７、Ｇ８４９、およびＧ９３３の血漿中安定性を、以下のように測定した。
【００８８】
固体ペプチドを秤量してエッペンドルフ低吸着チューブに入れ、ＤＭＳＯに溶解することにより、約２００μｍｏｌ／Ｌのペプチド原液を調製した。ｌ０μＬの原液を、エッペンドルフ低吸着チューブ中の９９０μＬの血漿に加え、初期濃度が約２μｍｏｌ／Ｌの血漿中ペプチドを得た。ヒト、ラット、およびマウス由来の凍結ブランク血漿を解凍し、３７℃の温度に加熱した後、原液を添加した。添加された血漿試料を穏やかに混合し、約５分間平衡化させた後、実験を開始した。血漿試料をＧａｌａｘｙＲ  ＣＯ２インキュベーター中にて、３７℃で４８時間インキュベートした。０、１、２、６．５、１７、４８時間にサンプリング（３０μＬ）を行った。試料は、分析まで−７０℃に保存した。
【００８９】
血漿試料は以下のようにアッセイした。３０μＬの血漿試料を、９６ウェル低吸着プレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄ）中で、１８０ｍｌの冷エタノールでタンパク質沈殿させた。混合および遠心分離後、ｌ００μｌの上清を新しいプレートに移し、１μｌを分析カラムに注入した。
【００９０】
分析は、ポジティブエレクトロスプレイイオン化法の中高分解能質量分析計（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＰｅｎＴＯＦ）に連結されたμＬＣ−システム（ＬＣ  Ｅｘｉｇｅｎｔ  μＬＣ）を用いて行なった。分析カラムは、２．７μｍの粒径を有する、５ｃｍ、１ｍｍのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ（注文仕様）Ｃ１８カラムとした。流量：０．１ｍｌ／分で、ゆっくりした逆相勾配を用いた。用いた移動相は、アセトニトリルおよび０．１％ギ酸を含有する水とした。
【００９１】
得られたデータを、以下の分解生成物について手作業で評価した：＋１生成物（酸）およびＤＰＰ  ＩＶ切断生成物。＋１質量の生成物は、グルタミンのアミド基またはＣ末端における脱アミドから生じ得る。切断生成物は、血漿中のプロテアーゼＤＰＰ  ＩＶの作用により生じる。ペプチドの分解とペプチド生成物の形成の両方を、初期ペプチド濃度のパーセントで報告する。ピークを積分し、残存ペプチドの％を以下のように計算した：（ピーク面積／０時間でのピーク面積）×１００。２４時間の時点でのデータを表６に示す。脱アミドおよびＤＰＰ  ＩＶ切断のレベルは、Ｇ７９７およびＧ９３３については低いものであった。
【００９２】
【表６】
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【００９３】
溶解度
ペプチド溶解度は、以下のように、４．５〜８．０のｐＨ範囲内の種々の緩衝化学種で評価した。ＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドの乾燥粉末形態を、室温にて種々の緩衝液中で再構成した。ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００分光光度計を用いて、２８０ｎｍでの吸光度を測定し、ペプチド濃度を以下の式を用いて計算した：
ｃ＝（Ａ２８０＊Ｍｗ）／ε
式中、ｃ−濃度、ε−吸光係数、Ｍｗ−分子量、Ａ２８０−２８０ｎｍでの吸光度、
ε＝（１×Ｔｒｐ＝５５６０）＋（１×Ｔｙｒ＝１２００）
【００９４】
結果を表７に示す。ペプチドのそれぞれは、一連のｐＨ（６．５〜８．５）にわたり０．８ｍｇ／ｍｌで可溶であった。Ｇ７３０は４．５〜８．０のｐＨ範囲で可溶であり、Ｇ７９７は６〜８．０のｐＨ範囲で可溶であり、Ｇ９３３は６〜８．０のｐＨ範囲で可溶であった。また、Ｇ９３３の溶解度を、表７に示すいくつかの異なる緩衝系で試験した。Ｇ９３３は、少なくとも以下の緩衝系にてｌｍｇ／ｍｌで可溶であった：ヒスチジン（ｐＨ６および７；イオン強度：０．２５〜１００ｍＭ）、リン酸ナトリウム（ｐＨ６〜７．５；イオン強度：０．２５〜１００ｍＭ）、およびトリス／ヒドロキシメチルアミノメタン（ｐＨ７〜９；イオン強度：０．２５〜１００ｍＭ）。
【００９５】
【表７】
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【００９６】
製剤
ペプチド溶解度を３つの異なる等張製剤で評価した：
１．デフォルト製剤（ＤＦ）＝０．１ＭトリスｐＨ７．５、１５０ｍＭマンニトール。最終製剤ｐＨ＝７．２。
２．バックアップ製剤１（ＢＦ１）＝０．０５Ｍトリス、５０ｍＭアルギニン／プロリン。最終製剤ｐＨ＝８．０。
３．バックアップ製剤２（ＢＦ２）＝リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）／１．８５％Ｗ／Ｖプロピレングリコール。最終製剤ｐＨ＝７．０。
【００９７】
上記に詳述のように溶解度を測定し、結果を表８に示す。Ｇ７３０、Ｇ７９７、およびｇ９３３は、ＤＦにおいて少なくとも５ｍｇ／ｍｌまで可溶であり、ＤＦにおけるＧ８４９の最大溶解度は３．７ｍｇ／ｍｌであり、Ｇ７９７はＢＦｌにおいて少なくとも１０ｍｇ／ｍｌまで可溶であり、Ｇ９３３はＢＦ２において少なくとも１０ｍｇ／ｍｌまで可溶であった。
【００９８】
【表８】
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【００９９】
ＤＦの安定性は、逆相超高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ  ＵＰＬＣ）により、１ヶ月以内の純度を測定することにより評価した。保存条件は、５℃、２５℃、４０℃、および−８０℃とした。結果を表９および１０に示す。
【０１００】
【表９】
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【０１０１】
【表１０】
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【０１０２】
ペプチドはすべて、溶解性、製剤化能、および安定性に関して、許容される特性を示した。
【０１０３】
[実施例３]
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験
Ｇ７３０、Ｇ７９７、およびＧ８１２（試験Ａ）
本明細書に開示の選択されたＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドを、以下のように、食餌誘導肥満（ＤＩＯ）マウスモデルで試験した。雌性Ｃ５７／Ｂ１６ＪＨｓｄ０１ａ（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＫから入手）において、９〜１１週齢で、高脂肪食のＤ１２４９２（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）およびチョコレート菓子のデリカトボール（ｄｅｌｉｃａｔｏ  ｂａｌｌ）（Ｄｅｌｉｃａｔａ  Ｂａｋｖｅｒｋ，Ｓｗｅｄｅｎ）で開始し、動物施設に到着する前の１６週間、３週間の順化期間、および薬物治療期間、その食餌を維持した。食餌の２つの成分のカロリー量を表１１に示す。マウスを９群（ｎ＝５〜６）に分け、治療を２９週齢で開始した。治療群および投与量を表１２に示す。
【０１０４】
【表１１】
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【０１０５】
【表１２】
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【０１０６】
ＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドＧ７３０、Ｇ７９７、およびＧ８１２、ならびにリラグルチドを、ビヒクル、１００ｍＭトリス／１５０ｍＭマンニトール、ｐＨ７．４で製剤化した。治療では、１４日間、１日２回皮下投与し、その間、動物を高脂肪食で維持した。動物の体重を、投与期間中毎日モニターした。１４日目に、意識のあるマウスから、血漿グルコースおよびインスリン測定用の血液試料を、４時間の絶食期間後に採取した。次いで、イソフルランを用いてマウスを麻酔し、末端血を眼の背後にある毛細管床から採取した。以下のパラメーターを測定した：トリグリセリド、総コレステロール、非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）、ベータヒドロキシブチレート、および繊維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）の血液化学測定（以下の表１４および１５）。
【０１０７】
体重に対する、リラグルチドおよびＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドＧ７３０、Ｇ７９７、およびＧ８１２による治療効果を、リラグルチドおよびビヒクルと比較して、表１〜４に示す。Ｇ７３０またはＧ７９７のいずれかで治療された動物は、１４日間の投与期間にわたり、用量依存的および継続的な体重減少を示した。５０ｎｍｏｌ／ｋｇでは、Ｇ７３０およびＧ７９７で治療された動物は、ビヒクル処置の動物と比較して、１４日目で約２４％の体重変化があった。
【０１０８】
Ｇ７３０またはＧ７９７で治療されたマウスは、１４日目において、グルコースレベルの用量依存的な低下を示した（表１３）。インスリンレベルの低下も、特に高用量において、これらの２つの治療により観察された（表１３）。インスリン感受性指数ホメオスタシスモデル評価（ＨＯＭＡ）は、２０ｎｍｏｌ／ｋｇのＧ７３０ならびに２０および５０ｎｍｏｌ／ｋｇのＧ７９７において顕著に改善した。ＨＯＭＡは、β細胞機能およびインスリン抵抗性を評価するために、血漿インスリンおよびグルコースレベルの合計を用いるモデリング方法である（表１４）。総血漿コレステロールは、リラグルチド、Ｇ７３０、およびＧ７９７のいずれによっても、すべての用量で低下したが、血漿非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）レベルならびに血漿および肝臓のトリグリセリド（ＴＧ）の変化はそれよりも顕著ではなかった。ベータヒドロキシブチレート（ＢｅＨｙ）は、体重減少と一致して、レベルが増大する傾向があった。繊維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）は、概ね、デュアルＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチド治療と共に増加した。
【０１０９】
【表１３】
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【０１１０】
【表１４】
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【０１１１】
Ｇ８６５、Ｇ９３３、およびＧ７９６（試験Ｂ）
さらなるＧＬＰ−１／グルカゴンペプチドセットを、上記と同じプロトコールであるが、表１５に示す治療群および用量を用いて、食餌誘導肥満モデルで試験した。
【０１１２】
【表１５】
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【０１１３】
ＧＬＰ−ｌ／グルカゴンアゴニストペプチドＧ８６５、Ｇ９３３、およびＧ７９６、ならびにリラグルチドを、ビヒクル、１００ｍＭトリス／１５０ｍＭマンニトール、ｐＨ７．４で製剤化した。治療では、１４日間、１日２回皮下投与し、その間、動物を高脂肪食で維持した。動物の体重を、投与期間中毎日モニターした。１４日目に、意識のあるマウスから、血漿グルコースおよびインスリン測定用の血液試料を、４時間の絶食期間後に採取した。次いで、イソフルランを用いてマウスを麻酔し、末端血を眼の背後にある毛細管床から採取した。以下のパラメーターを測定した：トリグリセリド、総コレステロール、非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）、ベータヒドロキシブチレート、および繊維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）の血液化学測定（以下の表１６および１７）。
【０１１４】
体重に対する、リラグルチドおよびＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドＧ９３３、Ｇ８６５、Ｇ７９６による治療効果を、リラグルチドおよびビヒクルと比較して、表５〜８に示す。Ｇ９３３、Ｇ８６５、またはＧ７９６のいずれかで治療された動物は、１４日間の投与期間にわたり、用量依存的および継続的な体重減少を示した。
【０１１５】
治療後１４日目のグルコースレベル、インスリンレベル、およびＨＯＭＡを、表１６に示す。治療後１４日目の総血漿コレステロールレベル、血漿非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）レベル、血漿および肝臓のトリグリセリド（ＴＧ）レベル、ベータヒドロキシブチレート（ＢｅＨｙ）レベル、および繊維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）レベルを表１７に示す。
【０１１６】
【表１６】
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【０１１７】
【表１７】
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【０１１８】
本開示は、記載される特定の実施形態により範囲が限定されるべきではなく、これらの実施形態は本開示の個々の態様の個別の説明を意図するものであり、機能的に均等ないかなる組成物または方法も本開示の範囲内に入る。実際に、本明細書に示され、記載されているものに追加した本開示の種々の変更形態が、前述の記載および添付図面から当業者には明らかとなるであろう。そのような変更形態は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。
【０１１９】
本明細書に記述されるすべての刊行物および特許出願は、あたかも個々の刊行物または特許出願がそれぞれ具体的かつ個々に参照により組み込まれるように指示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は以下の実施形態を包含する。   
[１]  単離ペプチドであって、以下のアミノ酸配列：
ＨＸ２ＱＧＴＦＴＳＤＸ１０ＳＸｌ２Ｘ１３ＬＸ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８ＡＸ２０Ｘ２１ＦＸ２３Ｘ２４ＷＬＸ２７Ｘ２８ＧＸ３０；
（ここで、Ｘ２はＧまたはＳであり、Ｘ１０はＹまたはＫであり、Ｘ１２はＫ、Ｅ、Ｒ、またはＳであり、Ｘ１３はＫまたはＹであり、Ｘ１５はＤまたはＥであり、Ｘ１６はＳまたはＧであり、Ｘ１７はＥ、Ｒ、Ｑ、またはＫであり、Ｘ１８はＲ、Ｓ、またはＡであり、Ｘ２０はＲ、Ｋ、またはＱであり、Ｘ２１はＤまたはＥであり、Ｘ２３はＶまたはＩであり、Ｘ２４はＡまたはＱであり、Ｘ２７はＥまたはＶであり、Ｘ２８はＡまたはＫであり、かつＸ３０はＧまたはＲである（配列番号４））を含む単離ペプチド。   
[２]  Ｘ２がＳであり、Ｘ１５がＤであり、Ｘ１６がＳであり、Ｘ２０がＲであり、Ｘ２１がＤであり、Ｘ２３がＶであり、Ｘ２４がＡであり、Ｘ２８がＡであり、かつＸ３０がＧである（配列番号５）、１に記載のペプチド。   
[３]  Ｘ１７がＥである場合、Ｘ１８はＲであり、Ｘ１７がＲである場合、Ｘ１８はＳである（配列番号６および７）、２に記載のペプチド。   
[４]  Ｘ１０がＹであり、Ｘ１２がＫであり、Ｘ１３がＫであり、かつＸ２７がＶである（配列番号８および９）、２または３に記載のペプチド。   
[５]  Ｘ１０がＫであり、Ｘ１３がＹであり、かつＸ２７がＥである（配列番号１０および１１）、２または３に記載のペプチド。   
[６]  Ｘ１２がＥである（配列番号１２および１３）、５に記載のペプチド。   
[７]  Ｘ１２がＲである（配列番号１４および１５）、５に記載のペプチド。   
[８]  アミノ酸配列の配列番号１６を含む、４に記載のペプチド。   
[９]  アミノ酸配列の配列番号１７または配列番号１９を含む、６に記載のペプチド。   
[１０]  アミノ酸配列の配列番号１８を含む、７に記載のペプチド。   
[１１]  Ｘ３０のカルボキシル基がアミド化されている、１〜１０のいずれか一項に記載のペプチド。   
[１２]  Ｘ３０のカルボキシル基が無修飾の酸である、１〜１０のいずれか一項に記載のペプチド。   
[１３]  アミノ酸に対する修飾をさらに含む、１〜１２のいずれか一項に記載のペプチド。   
[１４]  前記修飾がアシル部分の付加である、１３に記載のペプチド。   
[１５]  前記修飾が、リジン残基のＮ（イプシロン）基上のパルミトイル部分である、１３または１４に記載のペプチド。   
[１６]  前記パルミトイル基がリンカーを介してリジンに連結されている、１５に記載のペプチド。   
[１７]  前記リンカーがガンマグルタメートである、１６に記載のペプチド。   
[１８]  前記ペプチドが、グルカゴン受容体に結合するか、ＧＬＰ−１受容体に結合するか、またはグルカゴン受容体とＧＬＰ−１受容体の両方に結合する、１〜１７のいずれか一項に記載のペプチド。   
[１９]  グルカゴン受容体に結合する、１８に記載のペプチド。   
[２０]  前記グルカゴン受容体が、マウスグルカゴン受容体またはヒトグルカゴン受容体である、１８または１９に記載のペプチド。   
[２１]  ｃＡＭＰアッセイ１において、１０，０００ｐＭ未満、５０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、または２ｐＭ未満のＥＣ５０で、ヒトグルカゴン受容体に結合する、１８〜２０のいずれか一項に記載のペプチド。   
[２２]  ＧＬＰ−１受容体に結合する、１８〜２１のいずれか一項に記載のペプチド。   
[２３]  前記ＧＬＰ−１受容体が、マウスＧＬＰ−１受容体またはヒトＧＬＰ−１受容体である、１８または２２に記載のペプチド。   
[２４]  ｃＡＭＰアッセイ１において、１０，０００ｐＭ未満、５０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、または２ｐＭ未満のＥＣ５０で、ヒトＧＬＰ−１受容体に結合する、２２または２３に記載のペプチド。   
[２５]  ＧＬＰ−１活性のアゴニスト、グルカゴン活性のアゴニスト、またはＧＬＰ−１活性とグルカゴン活性の両方のアゴニストである、１〜２４のいずれか一項に記載のペプチド。   
[２６]  グルカゴン受容体とＧＬＰ−１受容体の両方に結合する、１８〜２５のいずれか一項に記載のペプチドであって、前記ペプチドが、前記グルカゴン受容体におけるよりも、前記ＧＬＰ−１受容体において、天然リガンドと比較して、少なくとも約２倍、５倍、または１０倍高い活性を示す、ペプチド。   
[２７]  前記ペプチドに結合した異種構造部分をさらに含む、１〜２６のいずれか一項に記載のペプチド。   
[２８]  前記異種構造部分が、タンパク質、ペプチド、タンパク質ドメイン、リンカー、有機ポリマー、無機ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ビオチン、アルブミン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＨＳＡ  ＦｃＲｎ結合部分、抗体、抗体のドメイン、抗体フラグメント、一本鎖抗体、ドメイン抗体、アルブミン結合ドメイン、酵素、リガンド、受容体、結合ペプチド、非ＦｎＩＩＩスキャフォールド、エピトープタグ、組換えポリペプチドポリマー、サイトカイン、または前記列挙された部分の２つ以上の組合せである、２７に記載のペプチド。   
[２９]  １〜２８のいずれか一項に記載のペプチドおよび担体を含む医薬組成物。   
[３０]  ２９に記載の組成物を含むキット。   
[３１]  １〜２８のいずれか一項に記載のペプチドまたは２９に記載の組成物の有効量を、治療を必要とする被験体に投与することを含む、過剰体重を原因または特徴とする疾患または病態を治療または予防する方法。   
[３２]  前記疾患または病態が肥満である、３１に記載の方法。   
[３３]  前記疾患または病態がＩＩ型糖尿病である、３１に記載の方法。   
[３４]  前記ペプチドが注射によって投与される、３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。   
[３５]  前記注射が皮下に投与される、３４に記載の方法。   
[３６]  前記ペプチドが１日１回投与される、３４または３５に記載の方法。   
[３７]  前記被験体がヒトである、２９〜３６のいずれか一項に記載の方法。  
[３８]  １〜２８のいずれか一項に記載のペプチドまたは２９に記載の組成物の有効量を、治療を必要とする被験体に投与することを含む、被験体の体重を減少させる方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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