(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において腫瘍を処置するための医薬の製造における第１組成物の使用であって、前記第１組成物が複数の細菌由来無傷ミニ細胞または無傷死滅細菌細胞を含んでなり、それぞれのミニ細胞又は死滅細菌細胞が
(a) 抗新生物薬を包含し、該抗新生物薬が放射性核種、化学療法薬、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、及びリボザイムからなる群より選択される機能性核酸、並びに、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、及びリボザイムからなる群より選択される機能性核酸が転写されるポリヌクレオチドからなる群より選択され、かつ
(b) 前記ミニ細胞又は死滅細菌細胞の表面にリガンドを保持し、該リガンドが非食作用哺乳動物細胞表面受容体に特異性を有するものであり、該非食作用哺乳動物細胞表面受容体が腫瘍の表面に発現され、
ここで対象における腫瘍の処置が、該第１組成物と、同時に又は逐次的に、第２組成物を投与することを含み、該第２組成物がインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）または対象においてＩＦＮ−γの発現を増強する薬剤を含んでなり、該ＩＦＮ−γの発現を増強する薬剤がＩＦＮ−γの発現を誘導するウイルスワクチン又はＩＦＮ−γをコードする核酸である、前記使用。
【請求項２】
第２の組成物が精製されたＩＦＮ−γタンパク質を含んでなる、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
第２の組成物がＩＦＮ−γの発現を誘導するウイルスワクチンを含んでなる、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
第２の組成物がＩＦＮ−γをコードする核酸を含んでなる、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
第１の組成物が約１０９〜約１０１０のミニ細胞または死滅細菌細胞を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
抗新生物薬が放射性核種である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
抗新生物薬が化学療法薬である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
化学療法薬が約９００ダルトン未満の分子量を有する小分子薬である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
小分子薬が細胞傷害性である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
小分子薬がモルホリニルアントラサイクリン誘導体である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
小分子薬がＰＮＵ−１５９６８２である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記抗新生物薬が機能性核酸または機能性核酸をコードするポリヌクレオチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
前記機能性核酸が、腫瘍細胞増殖、血管新生もしくは化学療法耐性を促進し、かつ／またはアポトーシスまたは細胞周期の停止を阻害する遺伝子を阻害する、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記機能性核酸がｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、及びリボザイムから選択される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
以下の(a)第１組成物並びに(b)第２組成物、
(a)複数の細菌由来無傷ミニ細胞または無傷死滅細菌細胞を含んでなる第１組成物、ここでそれぞれのミニ細胞又は死滅細菌細胞が
(1) 抗新生物薬を包含し、該抗新生物薬が、放射性核種、化学療法薬、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、及びリボザイムからなる群より選択される機能性核酸、並びに、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、及びリボザイムからなる群より選択される機能性核酸が転写されるポリヌクレオチドからなる群より選択され、かつ
(2) リガンドを前記ミニ細胞又は死滅細菌細胞の表面に保持し、該リガンドが非食作用哺乳動物細胞表面受容体に特異性を有するものであり、該非食作用哺乳動物細胞表面受容体が腫瘍の表面に発現され、並びに
(b)インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）または対象においてＩＦＮ−γの発現を増強する薬剤を含んでなる第２の組成物、ここで、該ＩＦＮ−γの発現を増強する薬剤がＩＦＮ−γの発現を誘導するウイルスワクチン又はＩＦＮ−γをコードする核酸である、
を含んでなる、対象における腫瘍を処置するためのパッケージ、製品、またはキット、
ここで該対象における腫瘍の処置は、該第１組成物と該第２組成物とを、同時に又は逐次的に投与することを含む、前記パッケージ、製品、またはキット。
【請求項１６】
以下の(a)並びに(b)、
（ａ）複数の細菌由来無傷ミニ細胞または無傷死滅細菌細胞、ここでそれぞれのミニ細胞または死滅細菌細胞は、
(1) 抗新生物薬を包含し、該抗新生物薬が、放射性核種、化学療法薬、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、及びリボザイムからなる群より選択される機能性核酸、並びに、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、及びリボザイムからなる群より選択される機能性核酸が転写されるポリヌクレオチドからなる群より選択されるものであり、かつ、
(2) その表面にリガンドを保持し、該リガンドは非食作用哺乳動物細胞表面受容体に特異性を有するものであり、該非食作用哺乳動物細胞表面受容体が腫瘍の表面に発現され、並びに
（ｂ）インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）または対象においてＩＦＮ−γの発現を増強する薬剤、ここで該ＩＦＮ−γの発現を増強する薬剤がＩＦＮ−γの発現を誘導するウイルスワクチン又はＩＦＮ−γをコードする核酸である、
を含んでなる対象における腫瘍を処置するための組成物、ここで該対象における腫瘍の処置は、該複数の細菌由来無傷ミニ細胞または無傷死滅細菌細胞と該インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）または対象においてＩＦＮ−γの発現を増強する薬剤とを、同時に又は逐次的に投与することを含む、前記組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物を負荷した二重特異性リガンド標的化ミニ細胞およびインターフェロン−γを用いた併用腫瘍治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
現在、癌治療に使用されるほとんどの薬物が全身投与されている。細胞傷害性抗癌薬の全身送達は、癌治療に決定的な役割を果たすが、それはまた重大な問題を産む。例えば、投与される薬剤への正常な組織／器官の全身暴露は重篤な毒性を引き起こすおそれがある。これは、全身送達される癌化学療法薬が多くの場合、薬物のバイオアベイラビリティの低さを克服するために極めて高用量で、患者内に大きな分布体積で送達されなければならないという事実によって悪化する。また、全身薬物投与は、主要血管に留置カテーテルを必要とする場合が多いので侵襲的と言える。全身薬物投与は多くの場合、末梢または中枢いずれかの静脈の使用を必要とすることから、静脈炎などの局部的合併症を引き起こし得る。また、薬物の管外遊出も、ビンカアルカロイドおよびアントラサイクリンの投与時に一般に見られるものなど、投与局部に水疱／組織損傷を招くことがある。
【０００３】
癌療法におけるもう１つの難題は、腫瘍細胞の免疫監視からの回避である。免疫系細胞と悪性細胞の間の相互作用は、腫瘍形成に重要な役割を果たす。免疫系の悪性転換細胞の検知および拒絶の失敗は癌発生をもたらし得る。腫瘍は、免疫介在性拒絶から逃れるために複数の機構を用いている。これらの機構の多くが現在、細胞レベルおよび分子レベルで知られている。この知見にもかかわらず、癌免疫療法は臨床において依然として確立された治療とは言えない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
概要
本発明者らは、抗新生物薬を負荷した二重特異性抗体標的化ミニ細胞による癌療法を受けている動物は、その動物が並行ウイルス感染を受けている場合に、薬物に対してより大きな抗腫瘍応答を示すことを発見した。さらなる検討により、この文脈で抗癌薬の治療効力に見られる増強は、投与された薬物負荷二重特異性抗体標的化ミニ細胞の腫瘍死滅能と、それ自体、ウイルス感染が誘発したインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γまたはＩＦＮγ）の発現の増強による、腫瘍細胞に対して活性化された宿主免疫応答との間の共力作用から生じることが明らかになった。
【０００５】
ＩＦＮ−γはそれ自体、単剤療法および他の抗新生物薬との併用の両方で、その潜在的抗新生物用途が検討されてきた。しかしながら、このような検討は臨床的成功に至っていない。例えば、ＩＦＮ−αとＩＦＮ−γの併用治療では、ＩＦＮ−α単独による治療を超える改善を示すことはできなかった。例えば、Kloke et al., Eur. J. Haematol. 48: 93-8 (1992)、およびWandl et al., Semin. Oncol. 19: 88-94 (1992)参照。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認された唯一のＩＦＮ−γ適応は、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）および重症悪性大理石骨（骨疾患）の治療に関するものである。
【０００６】
よって、その態様の１つにおいて、本開示は対象において腫瘍を処置するための方法を提供する。本方法は、（Ａ）複数の細菌由来無傷ミニ細胞および／または無傷死滅細菌細胞を含んでなり、前記ミニ細胞および死滅細胞のそれぞれが抗新生物薬を包含しかつ前記ミニ細胞の表面に結合したリガンドを介して腫瘍細胞表面受容体へ標的化される第１の組成物と、（Ｂ）ＩＦＮ−γまたは対象においてＩＦＮ−γの発現を増強する薬剤を含んでなる第２の組成物とを前記対象に投与することを必要とする。
【０００７】
いくつかの態様では、第２の組成物は、ＩＦＮ−γタンパク質、特に、薬学上適切に精製されたＩＦＮ−γタンパク質を含んでなる。いくつかの態様では、第２の組成物は、ウイルスワクチンを含んでなる。いくつかの態様では、第２の組成物は、ＩＦＮ−γをコードする核酸を含んでなる。
【０００８】
いくつかの態様では、第１の組成物は、約１０９〜約１０１０個のミニ細胞または死滅細菌細胞を含んでなる。
【０００９】
いくつかの態様では、抗新生物薬は放射性核種である。いくつかの態様では、抗新生物薬は化学療法薬である。いくつかの態様では、抗新生物薬は、機能性核酸または機能性核酸をコードするポリヌクレオチドである。いくつかの態様では、機能性核酸は、腫瘍細胞増殖、血管新生または化学療法耐性を促進し、かつ／またはアポトーシスまたは細胞周期の停止を阻害する遺伝子を阻害する。いくつかの態様では、機能性核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、またはリボザイムから選択される。
【００１０】
また、複数の細菌由来無傷ミニ細胞または無傷死滅細菌細胞を含んでなり、そのそれぞれが抗新生物薬を包含しかつその表面に非食作用哺乳動物細胞表面受容体に特異性を有するリガンドを保持するものを含む第１の組成物と、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）または対象においてＩＦＮ−γの発現を増強する薬剤を含んでなる第２の組成物とを含んでなるパッケージ、製品、またはキットも提供される。
【００１１】
別の実施形態では、（ａ）それぞれ抗新生物薬を包含しかつその表面に非食作用哺乳動物細胞表面受容体に特異性を有するリガンドを保持する複数の細菌由来無傷ミニ細胞または無傷死滅細菌細胞と、（ｂ）ＩＦＮ−γまたは対象においてＩＦＮ−γの発現を増強する薬剤とを含んでなる組成物が提供される。
【００１２】
他の目的、特徴、および利点は以下の記載から明らかとなる。特定の実施形態の趣旨および範囲内の種々の変化および改変は本明細書から明らかであるので、詳細な説明および具体例は単に例示のために示されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｃは、３個体のイヌＡ、Ｂ、およびＣそれぞれに関して種々の時点（用量数で示されるｘ軸）で測定された腫瘍体積（左のｙ軸）および血清ＩＦＮ−γ濃度（右のｙ軸）のチャートを表す。これらのチャートは、薬物に対する腫瘍の応答が、ＩＦＮ−γの血清濃度が上昇した際に極めて大きくなったことを示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｃは、３個体のイヌＡ、Ｂ、およびＣそれぞれに関して種々の時点（用量数で示されるｘ軸）で測定された腫瘍体積（左のｙ軸）および血清ＩＦＮ−γ濃度（右のｙ軸）のチャートを表す。これらのチャートは、薬物に対する腫瘍の応答が、ＩＦＮ−γの血清濃度が上昇した際に極めて大きくなったことを示す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｃは、３個体のイヌＡ、Ｂ、およびＣそれぞれに関して種々の時点（用量数で示されるｘ軸）で測定された腫瘍体積（左のｙ軸）および血清ＩＦＮ−γ濃度（右のｙ軸）のチャートを表す。これらのチャートは、薬物に対する腫瘍の応答が、ＩＦＮ−γの血清濃度が上昇した際に極めて大きくなったことを示す。
【図２】図２は、６週齢雌無胸腺ヌードマウスに確立された、腫瘍サイズ約２８５ｍｍ３のヒト肺胞腺癌腫瘍異種移植片の、ＩＦＮ−γと二重特異性リガンド標的化・ドキソルビシン封入無傷ミニ細胞を用いた併用処置の効果を示す。群１のマウスは生理食塩水を受け、群２のマウスはＩＦＮ−γ単独を受け、群３のマウスはＥＧＦＲミニ細胞Ｄｏｘを受け、群４のマウスはＥＧＦＲミニ細胞ＤｏｘとＩＦＮ−γを受けた。この例および後続の例では、ｘ軸の下の三角は投与時機を示す。
【図３】図３は、６週齢雌無胸腺ヌードマウスに確立された、中等度の腫瘍サイズ、すなわち約１４５ｍｍ３のヒト乳房腫瘍異種移植片の、ＩＦＮ−γと二重特異性リガンド標的化・ドキソルビシン封入無傷ミニ細胞を用いた併用処置の効果を示す。群１のマウスは生理食塩水を受け、群２のマウスはＩＦＮ−γ単独を受け、群３のマウスはＥＧＦＲミニ細胞Ｄｏｘを受け、群４のマウスはＥＧＦＲミニ細胞ＤｏｘとＩＦＮ−γを受けた。
【図４】図４は、６週齢雌無胸腺ヌードマウスに確立された、大腫瘍サイズ、すなわち、約２５０ｍｍ３のヒト乳房腫瘍異種移植片の、ＩＦＮ−γと二重特異性リガンド標的化・ドキソルビシン封入無傷ミニ細胞を用いた併用処置の効果を示す。群１のマウスは生理食塩水を受け、群２のマウスはＩＦＮ−γ単独を受け、群３のマウスはＥＧＦＲミニ細胞Ｄｏｘを受け、群４のマウスはＥＧＦＲミニ細胞ＤｏｘとＩＦＮ−γを受けた。
【図５】図５は、６週齢雌無胸腺ヌードマウスに確立された、極めて大きな腫瘍サイズ、すなわち、約２６５〜約６００ｍｍ３のヒト乳房腫瘍異種移植片の、ＩＦＮ−γと二重特異性リガンド標的化・ドキソルビシン封入無傷ミニ細胞を用いた併用処置の効果を示す。４個体総てのマウスがＥＧＦＲミニ細胞ＤｏｘとＩＦＮ−γを受けた。
【図６】図６は、６週齢雌無胸腺ヌードマウスに確立された、約１００ｍｍ３の腫瘍サイズのヒト肺胞腺癌腫瘍異種移植片の、ＩＦＮ−γ（２種類の異なる用量）と二重特異性リガンド標的化・ドキソルビシン封入無傷ミニ細胞を用いた併用処置の効果を示す。群１のマウスは生理食塩水を受け、群２のマウスはＥＧＦＲミニ細胞Ｄｏｘを受け、群３のマウスはＥＧＦＲミニ細胞Ｄｏｘと０．７５×１０４ＩＵのＩＦＮ−γを週に２回受け、群４のマウスはＥＧＦＲミニ細胞Ｄｏｘと０．５×１０４ＩＵのＩＦＮ−γを週に３回受けた。
【図７−１】図７−１は、ヒト受容体チロシンキナーゼの２０のサブファミリーと５８のメンバーを示す（Lemmon and Schlessinger, Cell 141: 1117-134 (2010)から抜粋）。
【図７−２】（図７−１の続き）
【発明を実施するための形態】
【００１４】
上述のように、本発明者らは、腫瘍を有する患者に、患者が高レベルのＩＮＦ−γに曝された状況で抗新生物薬を負荷した二重特異性抗体標的化ミニ細胞を投与すると、ＩＦＮ−γが活性化されない場合、例えば、そのレベルが検出限界に満たない場合に比べて大幅に改善された抗腫瘍応答が得られることを決定付けた。このミニ細胞媒介抗腫瘍活性と高ＩＦＮ−γの間の共力作用は、腫瘍応答の増強規模から明らかである。いずれの特定の機構に委ねるものではないが、本発明者らは、本明細書に記載のアプローチが宿主抗腫瘍応答に重要な免疫刺激における極めて重要な経路を利用することを企図する。細菌由来ミニ細胞とＩＦＮ−γは、本開示に従って二重特異性抗体標的化ミニ細胞を介して腫瘍細胞に細胞内送達された際に抗新生物薬が誘導する抗腫瘍応答の増強に共同して免疫刺激における異なる重要な経路を惹起する。
【００１５】
本発明者らはまた、腫瘍細胞の周囲の血管が健全性の欠如を示すこと；すなわち、血管が、血液脳関門（ＢＢＢ）環境であっても、大きな窓を持ち、「漏出しやすい」ことを発見した。従って、従来の理解とは相対して、ミニ細胞といった大きさの、すなわち、上述のＢＢＢの共通孔径限界よりもはるかに大きい粒子でも、漏出性血管の壁の窓よりも小さいので、それらの粒子はこれらの窓から腫瘍の微小環境中へ受動的に管外遊出し得る。
【００１６】
腫瘍の微小環境に入ると、ミニ細胞は受容体により媒介される宿主腫瘍細胞による内部移行を誘導することができ、宿主腫瘍細胞により取り込まれ得る。よって、抗新生物薬を封入したミニ細胞は、腫瘍細胞の細胞質中に薬剤を放出してそれを死滅させる。
【００１７】
ＩＦＮ−γは腫瘍療法における使用のために示唆されてきたが、その臨床適用は、少なからずその高い毒性のために現在のところ限定されている。腫瘍細胞に対する免疫応答を刺激するＩＦＮ−γの能力もそれほど成功を見ていない。よって、本発明の文脈では、ＩＦＮ−γによって果たされる役割は有利なだけでなく、全く驚くべきことである。
【００１８】
よって、その態様の１つにおいて、本開示は、抗新生物薬を保持する複数の無傷細菌由来ミニ細胞から構成される組成物を、腫瘍を有する患者に投与するとともに、その患者に患者のＩＦＮ−γレベルを増強する薬剤を投与することも必要とする、腫瘍の処置を提供する。別の態様によれば、死滅細菌細胞も同様に標的腫瘍細胞に取り込まれた際に放出するための抗癌薬を負荷することができるので、このような細胞もミニ細胞とともにまたはミニ細胞の代わりに使用することができる。例えば、その内容が引用ことにより本明細書の一部とされる公開国際出願ＷＯ／２００８／０１２６９５を参照。
【００１９】
薬物を負荷したミニ細胞および／または死滅細菌細胞を含有する組成物の投与は、好ましくは、例えば、静脈内投与または動脈内投与などの全身投与である。さらに、ＩＦＮ−γまたはＩＦＮ−γの発現を誘導する薬剤は、異なる経路、すなわち、皮下または筋肉内によって投与することができるが、そうする必要はない。ミニ細胞および／または死滅細菌細胞治療薬は、ＩＦＮ−γと並行してまたは異なる時点で投与することができる。
【００２０】
（Ａ）定義
そうではないことが定義されない限り、本明細書で使用される総ての技術用語および科学用語は、関連分野の熟練者に一般に理解されているものと同様の意味を有する。
【００２１】
便宜のため、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語および句の意味を以下に示す。他の用語および句は本明細書中に定義される。
【００２２】
単数形「１つの(a)」、「１つの(an)」および「その(the)」は、文脈がそうではないことを明示しない限り、複数の指示語を含む。
【００２３】
本明細書で互換的に使用される「癌」、「新生物」、「腫瘍」、「悪性腫瘍」および「癌腫」は、細胞増殖の制御の著しい欠如を特徴とする異常な増殖表現型を呈する細胞または組織を意味する。本開示の方法および組成物は、悪性細胞、前転移性細胞、転移性細胞、および非転移性細胞に特に適用される。
【００２４】
「薬物」とは、動物、特に哺乳動物およびヒトにおいて局所効果または全身効果をもたらす生理学的または薬理学的に活性ないずれの物質も意味する。
【００２５】
本明細書で互換的に使用される「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」の用語は、診断、処置、または療法が望まれるいずれの哺乳動物対象も意味する。個体、対象、宿主、または患者はヒトまたは非ヒト動物であり得る。よって、好適な対象としては、限定されるものではないが、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、およびマウスを含み得る。
【００２６】
用語「処置("treatment," "treating," "treat")」などは、腫瘍患者において所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味する。この効果は、完全にもしくは部分的に腫瘍もしくはその症状を予防するという点で予防的であってもよく、かつ／または腫瘍および／もしくは腫瘍に帰属する有害作用の部分的もしくは完全な安定化もしくは治癒という点で治療的であってもよい。処置は、哺乳動物、特にヒトにおける腫瘍のいずれの処置も包含する。所望の効果は、特に、腫瘍応答であり、これは腫瘍量の減少または腫瘍量増加の阻害として測定することができる。腫瘍応答に加え、全生存期間、無増悪生存期間、または腫瘍再発までの時間または有害作用の減少も所望の治療効果として臨床上使用できる。
【００２７】
（Ｂ）処置
本開示は、発明者らの発見と一致して、細菌由来および無傷ミニ細胞または無傷死滅細菌細胞は、ＩＦＮ−γのレベルを増強する薬剤とともに腫瘍患者に投与した場合、ミニ細胞または死滅細菌細胞が単独で投与される場合よりも驚くほど大きい治療効力を達成し得るという実験的証拠に反映され、それにより具現化される。
【００２８】
（Ｃ）抗新生物薬
「抗新生物薬」という句は、新生細胞の増殖、発生、成熟、または拡散を防ぐまたは阻害する、化学的薬物であれ生物学的薬物であれ、薬物を表す。
【００２９】
本開示の文脈で、ある種の腫瘍患者を処置するための抗新生物薬の選択は、従来の医療行為と一致していくつかの因子によって決まる。これらの因子には、限定されるものではないが、患者の齢、腫瘍のステージ、および何であれ患者が受けた可能性がある過去の療法が含まれる。
【００３０】
本開示によれば、薬物は、無傷細菌由来ミニ細胞に封入され、その後、腫瘍を処置するために投与される、以下に詳説されるクラスのうちの１つから選択することができる。これらの薬物はまた、ドラッグデザインおよび創薬努力から設計された合成類似体でもあり得る。
【００３１】
シクロホスファミド（サイトキサン）、メクロレタミン、メルファラン（アルケラン）、クロラムブシル（ロイケラン）、チオテパ(Thiopeta)（チオプレックス）、ブスルファン（ミレラン）により例示される多官能性アルキル化剤。
【００３２】
プロカルバジン（マツラン）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、アルトレタミン（ヘキサレン）、クロラムブシル、シスプラチン（プラチノール）、カルボプラチン、イフォスファミド、オキサリプラチンにより例示されるアルキル化薬。
【００３３】
メトトレキサート（ＭＴＸ）、６−チオプリン（メルカプトプリン［６−ＭＰ］、チオグアニン［６−ＴＧ］）、メルカプトプリン（プリントール）、チオグアニン、リン酸フルダラビン、クラドリビン：（ロイスタチン）、ペントスタチン、フルオロウラシル(Flurouracil)（５−ＦＵ）、シタラビン（ａｒａ−Ｃ）、アザシチジンにより例示される代謝拮抗物質。
【００３４】
ビンブラスチン（ベルバン）、ビンクリスチン（オンコビン）、ビンデシン、ビノレルビン、ポドフィロトキシン（エトポシド｛ＶＰ−１６｝およびテニポシド｛ＶＭ−２６｝）、カンプトテシン（トポテカンおよびイリノテカン）、パクリタキセル（タキソール）およびドセタキセル（タキソテール）などのタキサンにより例示される植物アルカロイド、テルペノイドおよびトポイソメラーゼ阻害剤。
【００３５】
ドキソルビシン（アドリアマイシン、ルベックス、ドキシル）、ダウノルビシン、デュオカルマイシン、イダルビシン、ダクチノマイシン（コスメゲン）、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシン：（ムタマイシン）、ブレオマイシン（ブレノキサン）により例示される抗生物質。
【００３６】
エストロゲンおよびアンドロゲン阻害剤（タモキシフェンおよびフルタミド）、ゴナドトロピン放出ホルモン作用薬（ロイプロリドおよびゴセレリン（ゾラデックス））、アロマターゼ阻害剤（アミノグルテチミドおよびアナストロゾール（アリミデックス））により例示されるホルモン剤。
【００３７】
アムサクリン、アスパラギナーゼ（Ｅｌ−ｓｐａｒ）、ヒドロキシ尿素、ミトキサントロン（ノバントロン）、ミトタン（リソドレン）、メイタンシノイド、レチノイン酸誘導体、骨髄増殖因子（サルグラモスチムおよびフィルグラスチム）、アミフォスチンにより例示される様々な抗癌薬。
【００３８】
葉酸代謝拮抗薬、例えば、ペメトレキセド。
【００３９】
ＤＮＡ低メチル化薬、例えば、アザシチジン、デシタビン。
【００４０】
ポリ（アデノシン二リン酸［ＡＤＰ］−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）経路阻害剤、例えば、イニパリブ、オラパリブ、ベリパリブ。
【００４１】
ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路阻害剤、例えば、エベロリムス。
【００４２】
ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、例えば、ボリノスタット、エンチノスタット（ＳＮＤＸ−２７５）、モセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）、パノビスタット（ＬＢＨ５８９）、ロミデプシン、バルプロ酸。
【００４３】
サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤、例えば、フラボピリドール、オロモウシン、ロスコビチン、ケンパウロン、ＡＧ−０２４３２２（ファイザー）、ファスカプリシン、リュビジン、プルバラノールＡ、ＮＵ２０５８、ＢＭＬ−２５９、ＳＵ  ９５１６、ＰＤ−０３３２９９１、Ｐ２７６−００。
【００４４】
熱ショックタンパク質（ＨＳＰ９０）阻害剤、例えば、ゲルダナマイシン、タネスピマイシン、アルベスピマイシン、ラディシコール、デグエリン、ＢＩＩＢ０２１。
【００４５】
Murine double minute 2（ＭＤＭ２）阻害剤、例えば、シス−イミダゾリン、ベンゾジアゼピンジオン、スピロ−オキシインドール、イソキノリノン、チオフェン、５−デアザフラビン、トリプタミン。
【００４６】
未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤、例えば、アミノピリジン、ジアミノピリミジン、ピリドイソキノリン、ピロロピラゾール、インドロカルバゾール、ピロロピリミジン、ジアニリノピリミジン。
【００４７】
ベンズアミド、フタラジノン、三環式インドール、ベンズイミダゾール、インダゾール、ピロロカルバゾール、フタラジノン、イソインドリノンにより例示されるポリ［ＡＤＰリボース］ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤。
【００４８】
本開示に使用可能な活性剤は、上記に列挙された薬物種または特定の薬剤に限定されない。種々の創薬プラットフォームが、癌細胞のユニークな分子シグネチャーに向けられる新薬を生み出し続け、実際に何千というこのような化学的および生物学的薬物が発見されており、そのうちの一部だけが本明細書に挙げられている。さらに、親水性または疎水性の多様な活性剤の封入に適合する無傷細菌由来ミニ細胞および死滅細菌細胞の驚くべき能力は、本質的に、ミニ細胞に封入された場合、このような薬物はいずれも、本開示の発見に従って癌を治療する能力を有することを意味する。
【００４９】
同様に、抗新生物薬種の例は、放射性核種、化学療法薬、および限定されるものではないが調節ＲＮＡを含む機能性核酸である。
【００５０】
１．放射性核種
「放射性核種」は、不安定な核、すなわち、核内で新たに作り出された放射性粒子または原子の電子に付与されるべく利用可能な余剰エネルギーを特徴とするものを有する原子である。従って、放射性核種は放射減衰を受け、γ線および／または原子以下の粒子を放出する。多くの放射性核種が当技術分野で公知であり、イットリウム−９０、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２４、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、ルビジウム−８２、タリウム−２０１、ガリウム−６７、フッ素−１８、キセノン−１３３、およびインジウム−１１１などのそのうちいくつかは、医学的使用に好適であることが知られている。
【００５１】
放射性核種は、核医学において、特に、腫瘍細胞を傷害するためのβ線放射体として広範囲の使用を見出している。従って、放射性核種は、本開示における抗新生物薬として好適に使用される。
【００５２】
放射性核種は、いずれの既知技術によって無傷、細菌由来ミニ細胞と会合させてもよい。よって、タンパク質またはその他のミニ細胞表面部分（下記参照）を、Rice et al., Semin. Nucl. Med. 41, 265-282 (2011)に詳説されているＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（ロックフォード、ＩＬ）の製品であるＰｉｅｒｃｅヨウ素化試薬を使用するなど、市販の標識手段を用いて放射性核種で標識することができる。あるいは、放射性核種は、ミニ細胞の内部のタンパク質に組み込むこともできる。
【００５３】
後者の場合、ミニ細胞産生細菌株を、外来タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡで形質転換させる。非対称細胞分裂中にミニ細胞が形成される場合、数コピーのプラスミドＤＮＡがミニ細胞の細胞質に分離する。得られた組換えミニ細胞を、放射性標識アミノ酸の存在下、ミニ細胞内部でプラスミドＤＮＡから発現される外来タンパク質が放射性核種を保持するアミノ酸を組み込むような条件下でインキュベートする。例えば、Clark-Curtiss and Curtiss, Methods Enzymol. 101: 347-362 (1983)のプロトコールに従い、組換えミニ細胞を、３５Ｓ−メチオニンを含む最小増殖培地でインキュベートし、それにより、新たに発現されるプラスミドコードタンパク質が３５Ｓ−メチオニンを組み込む。所望により、組換えミニ細胞に他の放射性標識が封入されるようにするために同様のアプローチを使用することができる。
【００５４】
また、ミニ細胞表面のオリゴ糖を、例えば、Fukuda, Curr. Protocols Molec. Biol. (Suppl. 26), 17.5.1-17.5.8 (1994)に記載の十分に確立されたプロトコールを用いて放射性標識することもできる。ミニ細胞に固有のこのようなオリゴ糖の例は、グラム陰性菌に由来するミニ細胞の表面に見られるリポ多糖（ＬＰＳ）のＯ−多糖成分である（下記参照）。
【００５５】
これに関して好ましい方法は、ミニ細胞を特定の腫瘍に標的化するために使用される二重特異性抗体を放射性標識することである。以下のＧ節および特許公報ＵＳ２００７／０２３７７４４（その内容は引用することにより本明細書の一部とされる）を参照。すなわち、ミニ細胞に「コーティング」された二重特異性抗体は、放射性標識のために有意な量の付加的表面タンパク質を露出する。よって、抗体コーティングミニ細胞と会合した放射性標識のより高い比活性を達成することができる。対照的に、非コーティングミニ細胞の放射性標識、すなわち、放射性核種が固有の部分のみを標識する場合には、より弱い標識（より低い比活性）となり得る。一実施形態では、このより弱い標識は、グラム陰性菌由来ミニ細胞の外膜結合性タンパク質がＬＰＳによりマスクされ、このＬＰＳは、以下にさらに述べるように、ミニ細胞表面を覆うＯ−多糖の長鎖を含んでなるために生じると思われる。
【００５６】
腫瘍を処置するために、本開示の組成物は一用量で、または腫瘍全体が排除されなければ、少なくとも腫瘍量を減少させるのに十分な腫瘍内放射線のレベルを全体として与える複数用量で送達される。処置の進行は、この線に沿って、個々の事例に従って監視することができる。しかしながら、一般論として、組成物中に封入される放射能の量は一般に約３０〜５０Ｇｙ程度であるが、本発明はまたより高線量の放射能、すなわち、約３０Ｇｙ〜約２００Ｇｙの間の全域を与える約５０〜２００Ｇｙも企図する。
【００５７】
場合によっては、本組成物中に封入される放射能の量は上述のものよりも低くてさえよく、ミニ細胞により保持される放射性核種の腫瘍への極めて効率的かつ特異的送達を与え得る。よって、一態様において、本組成物は、約２０〜４０Ｇｙ、または約１０〜３０Ｇｙ、または約１〜約２０Ｇｙ、または１０Ｇｙ未満を含む。
【００５８】
２．化学療法薬
本開示に使用される抗新生物薬はまた、化学療法薬であり得る。本明細書では、「化学療法薬」、「化学療法剤」、および「化学療法」は、新生細胞を死滅または破壊する能力を有する薬物を意味して互換的に使用される。化学療法薬は、以下にさらに詳説されるように、小分子薬または生物薬であり得る。
【００５９】
下位区分「小分子薬」は、（ｉ）生体プロセスに対しての効果、および（ｉｉ）タンパク質またはポリマー高分子に比べて低分子量を有することを特徴とする化合物を包含する。小分子薬は一般に約８００ダルトン以下であり、下限はテモダール（登録商標）（テモゾロミド）により例示されるように約１５０ダルトンであり、多形性膠芽腫および他のタイプの脳癌の治療に使用される約１９４ダルトンである。この文脈で「約」は、適格分子量値は測定精度の変動および実験誤差を数ダルトンまたは数十ダルトン程度で受けることを示す。よって、小分子薬は、約９００ダルトン以下、約８００以下、約７００以下、約６００以下、約５００以下、または約４００ダルトン以下、例えば、約１５０〜約４００ダルトンの範囲の分子量を持ち得る。より具体的には、小分子薬は、約４００ダルトン以上、約４５０ダルトン以上、約５００ダルトン以上、約５５０ダルトン以上、約６００ダルトン以上、約６５０ダルトン以上、約７００ダルトン以上、または約７５０ダルトン以上の分子量を持ち得る。別の実施形態では、ミニ細胞中に封入される小分子薬は、約４００〜約９００ダルトンの間、約４５０〜約９００ダルトンの間、約４５０〜約８５０ダルトンの間、約４５０〜約８００ダルトンの間、約５００〜約８００ダルトンの間、または約５５０〜約７５０ダルトンの間の分子量を持つ。
【００６０】
具体的には、好適な小分子薬としては、限定されるものではないが、とりわけナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素(nitrosorueas)、エチレンイミン、スルホン酸アルカン、テトラジン、白金化合物、ピリミジン類似体、プリン類似体、代謝拮抗物質、葉酸類似体、アントラサイクリン、タキサン、ビンカアルカロイド、およびトポイソメラーゼ阻害剤が挙げられる。よって、本発明で使用するための小分子薬は、以下のもののいずれか、とりわけ、ダイネマイシンＡ、ウニカラマイシン(unicalamycin）、カリケアマイシンγ１およびカリケアマイシンθ１などのエンジイン；ＦＲ９０１４６４の合成類似体であるメアヤマイシン；例えば、Tanpure et al., Bioorg. Med. Chem. 21: 8019-32 (2013)に記載のベンゾスベレン誘導体；ドラスタチンの合成類似体であるオーリスタチンＥ、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、およびオーリスタチンＦなどのオーリスタチン；デュオカルマイシンＳＡおよびＣＣ−１０６５などのデュオカルマイシン；メイタンシンおよびその誘導体（メイタンシノイド）、例えば、ＤＭ１およびＤＭ４；イリノテカン（カンプトサール（登録商標））およびその他のトポイソメラーゼ阻害剤、例えば、トポテカン、エトポシド、ミトキサントロンおよびテニポシド；ならびにその合成がOkano et al., J. Am. Chem. Soc. 128: 7136-37 (2006)により詳説されているヤタケマイシンの中から選択され得る。
【００６１】
より詳しくは、本段落で詳説される特定の小分子薬のいずれか１以上または総てが本発明で使用するために好適なものの例である：アクチノマイシン−Ｄ、アルケラン、ａｒａ−Ｃ、アナストロゾール、ＢｉＣＮＵ、ビカルタミド、ビサントレン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン（ゼローダ（登録商標））、カルボプラチン、カルボプラチナン、カルムスチン、ＣＣＮＵ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、ＣＰＴ−１１、シクロホスファミド、シタラビン、シトシンアラビノシド、サイトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ＤＴＩＣ、エピルビシン、エチレンイミン、エトポシド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、フォテムスチン、ゲムシタビン、ヘキサメチルアミン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロン酸、ペントスタチン、プリカマイシン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、ＳＴＩ−５７１、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テトラジン、チオグアニン、チオテパ、トムデックス、トポテカン、トレオスルファン、トリメトレキサート、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、およびＶＰ−１６。
【００６２】
本明細書の目的では、「生物薬」は、対照的に、下記に述べる生体プロセス（「機能性核酸」を除く）により作出できる任意の生物学的に活性な高分子、および上記で定義されるように大きさによって小分子薬と限定されたポリペプチドを表して定義される。よって、下位区分「生物薬」は小分子薬および機能性核酸の下位区分を入れず、それらの下位区分と重複しない。生物薬の例は、天然物であれ組換え体であれまたは例えば医薬品化学および薬物設計のツールを用いて合成により作製されたものであれ、治療用タンパク質および抗体である。
【００６３】
しかしながらやはり、化学療法薬の目的で設計されたある種の分子は、前臨床または臨床試験中に許容できない毒性またはその他の安全性の問題のために脱落する。本発明者らは、ミニ細胞内に化学療法薬を封入した後に腫瘍患者に全身送達すると、その薬物が腫瘍細胞に送達されることを示した。さらに、腫瘍細胞が破壊され、薬物を含有する細胞質が正常組織の近傍へ放出された後であっても、その結果は正常組織に無毒である。これは薬物がすでにＤＮＡなどの腫瘍細胞の構造に結合され、正常細胞をもはや攻撃できないからである。よって、本発明は、高毒性の化学療法薬の腫瘍患者への送達に特に有用である。
【００６４】
本明細書で「高毒性化学療法薬」および「超毒性化学療法薬」という句は、癌細胞に対する有効用量に比べて正常細胞に対する致死容量が相対的に低い化学療法薬を意味する。よって、一態様において、高毒性化学療法薬は、（１）薬物が設計される癌のタイプ、（２）その薬物に関する前臨床または臨床試験が実施される第１の癌タイプ、または（３）処置された総ての癌の中で最も高い有効性を示す癌タイプなどの標的癌に対するその中央有効用量（ＥＤ５０）よりも低い半致死量（ＬＤ５０）を有する。例えば、高毒性化学療法薬は、標的癌に対する薬物のＥＤ５０の約５００％、４００％、３００％、２５０％、２００％、１５０％、１２０％、または１００％より低いＬＤ５０を持ち得る。別の態様では、高毒性化学療法薬は、標的癌に対するその最小有効用量より低い最大亜致死用量（すなわち、重大なまたは不可逆的な毒性を生じない最高用量）、例えば、最小有効用量の約５００％、４００％、３００％、２５０％、２００％、１５０％、１２０％、１００％、９０％、８０％、７０％、６０％または５０％を有する。
【００６５】
よって、本明細書の一実施形態によれば、対象における腫瘍は、それぞれ高毒性化学療法薬を包含する複数の無傷細菌由来ミニ細胞から構成される治療上有効な量の組成物を全身投与することを含んでなる方法により処置される。下記に述べるメイタンシノイドおよびデュオカルマイシンは、このようにして使用される超毒性化学療法薬のクラスの代表例である。
【００６６】
この文脈で好適な癌化学療法薬としては、とりわけ、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素（nitrosorueas）、エチレンイミン、スルホン酸アルカン、テトラジン、白金化合物、ピリミジン類似体、プリン類似体、代謝拮抗物質、葉酸類似体、アントラサイクリン、タキサン、ビンカアルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、およびホルモン剤が挙げられる。
【００６７】
小分子薬の下位区分の例である化学療法薬は、アクチノマイシン−Ｄ、アルケラン、ａｒａ−Ｃ、アナストロゾール、ＢｉＣＮＵ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン（ゼローダ（登録商標））、カルボプラチン、カルボプラチナン、カルムスチン、ＣＣＮＵ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、ＣＰＴ−１１、シクロホスファミド、シタラビン、シトシンアラビノシド、サイトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ＤＴＩＣ、エピルビシン、エチレンイミン、エトポシド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、フォテムスチン、ゲムシタビン、ヘキサメチルアミン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロン酸、ペントスタチン、プリカマイシン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、ＳＴＩ−５７１、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テトラジン、チオグアニン、チオテパ、トムデックス、トポテカン、トレオスルファン、トリメトレキサート、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、およびＶＰ−１６である。
【００６８】
メイタンシノイド（分子量：約７３８ダルトン）は、強力な細胞傷害性を有するメイタンシンの化学誘導体の群である。毒性問題のためにヒト患者への使用には危険性が懸念されるが、メイタンシノイドは、本発明に従うミニ細胞を介した腫瘍患者への送達に好適である。
【００６９】
デュオカルマイシン（分子量：約５８８ダルトン）は、最初に放線菌(Streptomyces)から単離された一連の関連天然物である。それらはまた強力な細胞傷害性を有するが、ヒトへの使用には危険と考えられる。メイタンシノイドと同様に、デュオカルマイシンは、本発明での使用に好適な化学療法薬である。
【００７０】
同様の例として、国際特許出願ＷＯ１９９８／００２４４６に記載のモルホリニルアントラサイクリン誘導体クラスの化合物がある。このような誘導体の中に、ネモルビシン（３’−デアミノ−３’−［２（Ｓ）−メトキシ−４−モルホリニル］ドキソルビシン）、ａ／ｋ／ａ  ＭＭＤＸ、およびその主要代謝産物ＰＮＵ−１５９６８２（３’−ｄｅアミノ−３”−４’−アンヒドロ−［２”（Ｓ）−メトキシ−３”（Ｒ）−ヒドロキシ−４”−モルホリニル］ドキソルビシン）（その構造式を以下に示す）、ならびに米国特許第８，４７０，９８４（その内容は引用することにより本明細書の一部とされる）に記載のこれら４つの他のこのような誘導体：３’−デアミノ−３”−４’−アンヒドロ−［２”（Ｓ）−メトキシ−３”（Ｒ）−ヒドロキシ−４”−モルホリニル］イダルビシン；３’−デアミノ−３”−４’−アンヒドロ−［２”（Ｓ）−メトキシ−３”（Ｒ）−ヒドロキシ−４”−モルホリニル］ダウノルビシン；３’−デアミノ−３”−４’−アンヒドロ−［２”（Ｓ）−メトキシ−３”（Ｒ）−ヒドロキシ−４”−モルホリニル］−カミノマイシン；および３’−デアミノ−３”−４’−アンヒドロ−［２”（Ｓ）−エトキシ−３”（Ｒ）−ヒドロキシ−４”−モルホリニル］ｄ−オキソルビシンがある。
【００７１】
【化１】
0006538031.tif 000002
【００７２】
上述のいずれの誘導体の薬学上許容される酸付加塩も、この群の自家蛍光モルホリニルアントラサイクリン誘導体の、本発明に従うメンバーである。
【００７３】
生物化学療法薬の下位区分には、限定されるものではないが、アスパラギナーゼ、ＡＩＮ−４５７、バピネオズマブ、ベリムマブ、ブレンツキシマブ、ブリアキヌマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、ダロツズマブ、デノスマブ、エピラツズマブ、エスタフェナトクス、ファーレツズマブ、フィギツムマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ（ＷＸ−Ｇ２５０）、イブリツモマブ、イノツズマブ、イピリムマブ、メポリズマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、ナプツモマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オテリキシズマブ、オゾガマイシン、パギバキシマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、レスリズマブ、リツキシマブ、ＲＥＧＮ８８、ソラネズマブ、タネズマブ、テプリズマブ、チウキセタン、トシツモマブ、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、トレメリムマブ、ベドリズマブ、ザルツムマブ、およびザノリムマブが含まれる。
【００７４】
本組成物は、多くて約１ｍｇの化学療法薬を含み得る。あるいは、化学療法薬の量は多くて約７５０μｇ、５００μｇ、２５０μｇ、１００μｇ、５０μｇ、１０μｇ、５μｇ、１μｇ、０．５μｇ、または０．１μｇであり得る。別の態様では、本組成物は、ミニ細胞に封入されずに使用される場合の薬物の治療上有効量の約１／１，０００未満、あるいはまた約１／２，０００、１／５，０００、１／１０，０００、１／２０，０００、１／５０，０００、１／１００，０００、１／２００，０００または１／５００，０００未満の量の化学療法薬を含有する。本開示のさらに別の態様によれば、本組成物は、少なくとも約１ｎｍｏｌの化学療法薬を含有し得る。よって、本開示はまた、化学療法薬の量がそれぞれ少なくとも約２ｎｍｏｌ、約３ｎｍｏｌ、約４ｎｍｏｌ、約５ｎｍｏｌ、約１０ｎｍｏｌ、約２０ｎｍｏｌ、約５０ｎｍｏｌ、約１００ｎｍｏｌ、および約８００ｎｍｏｌである実施形態を包含する。
【００７５】
３．機能性核酸
「機能性核酸」は、宿主細胞に導入した際に、あるタンパク質の発現を特異的に妨げる核酸分子を意味する。腫瘍の処置に関して、本開示によれば、無傷細菌由来ミニ細胞を介して腫瘍細胞に送達される機能性核酸積載物は、腫瘍細胞増殖、血管新生もしくは化学療法耐性を促進する、かつ／またはアポトーシスもしくは細胞周期の停止を阻害する遺伝子；すなわち、「腫瘍増進遺伝子」を阻害することが好ましい。
【００７６】
一般的にはそれは、本開示で使用される機能性核酸分子は、タンパク質に関する転写産物と相互作用することによってタンパク質の発現を低減する能力を有する場合である。本開示のミニ細胞積載物のこの区分には、とりわけ、調節ＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、短鎖ＲＮＡ（一般に、４００塩基長未満）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイムおよびデコイＲＮＡ、アンチセンス核酸、およびＬｉｎｃＲＮＡが含まれる。これに関して「リボザイム」は、他のＲＮＡ分子をヌクレオチド塩基配列特異的様式で繰り返し切断することができる酵素活性を有するＲＮＡ分子を意味する。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、分子が転写産物とハイブリダイズしてその翻訳を遮断することができるように、特定の遺伝子転写産物の一部と相補的である核酸分子を表す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡを含んでなり得る。「ＬｉｎｃＲＮＡ」または「長い遺伝子間非コードＲＮＡ」の見出しは、２００ヌクレオチドより長い非タンパク質コード転写産物を包含する。ＬｉｎｃＲＮＡは、例えば、Khalil et al., Proc Nat’l Acad. USA 106: 11667-72 (2009)により述べられているように、遺伝子の転写、スプライシング、および／または翻訳を調節することができる。
【００７７】
調節ＲＮＡのタイプのそれぞれは、上記のように腫瘍増進遺伝子を阻害する機能性核酸分子の供給源となり得、従って、本開示に従った使用に好適である。よって、本開示の好ましい一実施形態では、無傷ミニ細胞は、腫瘍増進遺伝子を標的化するために利用可能な転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）機構を媒介するｓｉＲＮＡ分子を保持する。例えば、MacDiarmid et al., Nature Biotech. 27: 645-51 (2009)（抗体提示ミニ細胞は、化学療法薬とともに、薬剤耐性の発達に対抗するｓｉＲＮＡを送達する）およびOh and Park, Advanced Drug Delivery Rev. 61: 850-62 (2009)（乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、肝臓癌、肺癌および前立腺癌をそれぞれ治療するための治療用ｓｉＲＮＡの送達）を参照。
【００７８】
記載のように、「ｓｉＲＮＡ」は一般に、タンパク質発現に特異的に干渉するそれらの能力に対して命名された約１０〜約３０ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ分子を意味する。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は、１２〜２８ヌクレオチド長、より好ましくは１５〜２５ヌクレオチド長、さらにより好ましくは１９〜２３ヌクレオチド長、最も好ましくは２１〜２３ヌクレオチド長である。従って、ｓｉＲＮＡ分子は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９ヌクレオチド長であり得る。
【００７９】
１つのストランドの長さは、ｓｉＲＮＡ分子の長さを表す。例えば、２１リボヌクレオチド長（２１マー）と記載されるｓｉＲＮＡは、１９の連続する塩基対に対してアニーリングするＲＮＡの２本の逆ストランドを含んでなり得る。各ストランドの残りの２つのリボヌクレオチドは、「オーバーハング」を形成すると考えられる。ｓｉＲＮＡが長さの異なる２本のストランドを含む場合には、長い方のストランドがｓｉＲＮＡの長さを表す。例えば、２１ヌクレオチド長の１本のストランドと２０ヌクレオチド長の第２のストランドを含むｄｓＲＮＡは、２１マーを構成する。
【００８０】
特異な場合ではｓｉＲＮＡ、一般には調節ＲＮＡの設計を助けるツールは容易に利用可能である。例えば、コンピューターに基づくｓｉＲＮＡ設計ツールがインターネットのwww.dharmacon.comで利用可能である。
【００８１】
別の好ましい実施形態では、本開示の無傷ミニ細胞は、ｓｉＲＮＡと同様に転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）機構を媒介し得るｍｉＲＮＡを保持する。また、ｓｉＲＮＡと同様に、ｍｉＲＮＡにより媒介される遺伝子サイレンシング効果が、腫瘍増進遺伝子を標的化するために利用可能である。例えば、Kota et al., Cell 137: 1005-17 (2009)（トランスフェクションによるｍｉＲＮＡの送達は、マウス肝臓癌モデルにおいて毒性なく、癌細胞増殖の阻害、腫瘍特異的アポトーシスおよび疾病進行からの劇的な保護をもたらした）、およびTakeshita, et al., Molec. Ther. 18: 181-87 (2010)（一時的トランスフェクションによる合成ｍｉＲＮＡの送達は、骨組織において転移性前立腺腫瘍細胞の増殖を阻害した）を参照。
【００８２】
ｍｉＲＮＡとｓｉＲＮＡはどちらもＲＮＡ干渉を媒介するが、違いを示している。これに関して、「ｍｉＲＮＡ」は一般に１７〜２７ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡ分子のクラスを意味する（ｓｉＲＮＡの場合にように二本鎖ではない）。従って、ｍｉＲＮＡ分子は、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７ヌクレオチド長であり得る。好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子は２１〜２５ヌクレオチド長である。
【００８３】
ｍｉＲＮＡとｓｉＲＮＡの間のもう１つの違いは、前者は一般にｍＲＮＡ標的と完全に相補的ではないことである。他方、ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ標的と完全に相補的でなければならない。結果として、ｓｉＲＮＡは一般に単一の特定の標的のサイレンシングをもたらし、一方、ｍｉＲＮＡは無差別である。
【００８４】
加えて、ｓｉＲＮＡとｍｉＲＮＡはどちらもＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）に集合するが、ＲＩＳＣ集合前のそれぞれの初期プロセシングが異なる。これらの違いは、Chu et al., PLoS Biology 4: 1122-36 (2006)、およびGregory et al., Methods in Molecular Biology 342: 33-47 (2006)に詳細に記載されている。
【００８５】
いくつかのデータベースがｍｉＲＮＡデポジトリーとして役立つ。例えば、ｍｉＲＢａｓｅ(www.mirbase.org)およびｔａｒｂａｓｅ(http://diana.cslab.ece.ntua.gr/DianaToolsNew/ index.php?r=tarbase/index)参照。従来の用途では、ｍｉＲＮＡは一般に、接頭辞「−ｍｉｒ」を連番と組み合わせて命名される。例えば、マウスｍｉｒ−３５２の後に発見された新たなｍｉＲＮＡはマウス「ｍｉｒ−３５３」と命名される。
【００８６】
この場合にもまた、ｍｉＲＮＡを含む調節ＲＮＡの設計を助けるためのツールが容易に利用可能である。これに関して、コンピューターに基づくｍｉＲＮＡ設計ツールがインターネットのwmd2.weigelworld.org/cgi-bin/mirnatools.plで利用可能である。
【００８７】
上述のように、本開示で使用される機能性核酸は、腫瘍細胞増殖、血管新生または化学療法耐性を促進する遺伝子を阻害することができる。阻害される遺伝子はまた、それ自体、アポトーシスまたは細胞周期の停止を阻害することができる。機能性核酸により標的化可能な遺伝子の例を以下に示す。
【００８８】
本開示の機能性核酸は好ましくは、薬剤耐性を促進するか、アポトーシスを阻害するか、または新生物表現型を促進するタンパク質の遺伝子または転写産物を標的化する。これらに関して機能性核酸の適用の成功は当技術分野で達成されているが、ミニ細胞ベクターの利益は無い。例えば、Sioud, Trends Pharmacol. Sci. 25 : 22-8 (2004), Caplen, Expert Opin. Biol. Ther. 3: 575-86 (2003)、Nieth et al., FEBS Lett. 545: 144-50 (2003)、Caplen and Mousses, Ann. NY Acad. Sci. 1002: 56-62 (2003)、Duxbury et al., Ann. Surg. 240: 667-74 (2004)、Yague et al., Gene Ther. 11: 1170-74 (2004)、およびDuan et al., Mol. Cancer Ther. 3: 833-8 (2004)参照。
【００８９】
薬物耐性に寄与するタンパク質は、機能性核酸の好ましい標的を構成する。これらのタンパク質は獲得された薬物耐性または固有の薬物耐性に寄与し得る。腫瘍細胞などの罹患細胞が最初は薬物に応答するが、その後の処置サイクルに不応となる場合、耐性表現型が獲得される。獲得薬物耐性に関与する有用な標的としては、ＡＴＰ結合カセット輸送体、例えば、Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ、Ｐ−１７０、ＰＧＹ１、ＭＤＲ１、ＡＢＣＢ１、ＭＤＲ関連タンパク質、多剤耐性タンパク質１）、ＭＤＲ−２およびＭＤＲ−３が含まれる。ＭＲＰ２（多剤耐性関連タンパク質）、ＢＣＲ−ＡＢＬ（切断点クラスター領域−エイブルソン原癌遺伝子）、ＳＴＩ−５７１耐性関連タンパク質、肺耐性関連タンパク質、シクロオキシゲナーゼ−２、核因子κ、ＸＲＣＣ１（Ｘ線交差相補グループ１(X-ray cross-complementing group 1)）、ＥＲＣＣ１（除去修復交差相補遺伝子(excision cross-complementing gene)）、ＧＳＴＰ１（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）、変異型β−チューブリン、およびＩＬ−６などの増殖因子は、獲得薬物耐性に関与するさらなる標的である。
【００９０】
薬物耐性に寄与する特に有用な標的としては、ＡＴＰ結合カセット輸送体、例えば、Ｐ−糖タンパク質、ＭＤＲ−２、ＭＤＲ−３、ＢＣＲＰ、ＡＰＴ１１ａ、およびＬＲＰが含まれる。
【００９１】
有用な標的としてまた、アポトーシス耐性を増進するタンパク質も含まれる。これらにはＢｃｌ−２（Ｂ細胞白血病／リンパ腫）、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ａ１／Ｂｆｌ  １、接着斑キナーゼ、ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ、およびｐ５３変異型タンパク質が含まれる。
【００９２】
有用な標的としてはさらに、発癌性および変異型腫瘍抑制タンパク質が含まれる。これらの例は、β−カテニン、ＰＫＣ−α（タンパク質キナーゼＣ）、Ｃ−ＲＡＦ、Ｋ−Ｒａｓ（Ｖ１２）、ＤＰ９７デッドボックスＲＮＡヘリカーゼ、ＤＮＭＴ１（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１）、ＦＬＩＰ（Ｆｌｉｃｅ様阻害タンパク質）、Ｃ−Ｓｆｃ、５３ＢＰＩ、ポリコーム群タンパク質ＥＺＨ２（ｚｅｓｔｅホモログのエンハンサー）、ＥｒｂＢ１、ＨＰＶ−１６  Ｅ５およびＥ７（ヒト乳頭腫ウイルス初期５および初期７）、Ｆｏｒｔｉｌｉｎ  ＆  ＭＣＩ１Ｐ（骨髄細胞白血病１タンパク質）、ＤＩＰ１３α（ＤＤＣ相互作用タンパク質１３ａ）、ＭＢＤ２（メチルＣｐＧ結合ドメイン）、ｐ２１、ＫＬＦ４（Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子４）、ｔｐｔ／ＴＣＴＰ（翻訳制御腫瘍タンパク質）、ＳＰＫ１およびＳＰＫ２（スフィンゴシンキナーゼ）、Ｐ３００、ＰＬＫ１（Ｐｏｌｏ様キナーゼ−１）、Ｔｒｐ５３、Ｒａｓ、ＥｒｂＢ１、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＢＡＧ−１（ＢＣＬ２関連ａｔｈａｎｏｇｅｎｅ１）、ＭＲＰ２、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＳＴＩ−５７１耐性関連タンパク質、肺耐性関連タンパク質、シクロオキシゲナーゼ−２、核因子κ、ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ１、ＧＳＴＰ１、変異型β−チューブリン、および増殖因子が含まれる。
【００９３】
また、細胞質ポリアデニル化要素結合タンパク質（ＣＥＰＢ）により例示されるグローバル調節要素も標的として有用である。例えば、ＣＥＰＢ４は膠芽腫および膵臓癌で過剰発現され、この場合、このタンパク質は腫瘍増殖に関連する何百という遺伝子を活性化し、健康な細胞では検出されない(Oritz-Zapater et al., Nature Medicine, doi: 10.1038/nm.2540 (published on-line December 4, 2011))。従って、本明細書によれば、膠芽腫の処置は、ＣＥＰＢ４の過剰発現に対抗する薬剤、例えば、ｓｉＲＮＡまたは腫瘍細胞のよるＣＥＰＢ４の発現を混乱させるその他の機能性核酸分子を包含する無傷細菌由来ミニ細胞を含有する組成物に投与によって果たすことができる。
【００９４】
さらなる有用な機能性核酸は、ＤＮＡ複製および修復に関与するものである。例としてリボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ）が挙げられ、これはリボヌクレオシド５’−二リン酸の、ＤＮＡの複製および修復に必要なそれらの対応する２’−デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸への変換を触媒することから、癌の潜在的治療標的である。D'Angiolella et al., Cell: 149:1023-34 (2012)参照。ヒトＲＲは、ＲＲＭ１とＲＲＭ２の２つのサブユニットを含んでなり、両サブユニットを標的とする機能性核酸が本明細書において有用である。有用な機能性核酸のさらなる例としては、総ての生物においてＤＮＡ複製に必須である、７０ｋＤａ（ＲＰＡ１）、３２ｋＤａ（ＲＰＡ２）、および１４ｋＤａ（ＲＰＡ３）サブユニットから構成されるトリマー複合体である複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）が挙げられる。Iftode et al., Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 34: 141-80 (1999)参照。
【００９５】
（Ｄ）腫瘍
本開示の組成物および方法は、特定の種類に限定されず、多様な腫瘍タイプの処置に有用である。これは、ミニ細胞または死滅細菌細胞が種々の抗新生物薬を封入することができ、特に、異なる腫瘍細胞に特異的な二重特異性リガンドと結合させた場合に異なる腫瘍タイプの細胞を標的とすることができるからである。加えて、ＩＦＮ−γと組み合わせたミニ細胞または死滅細菌細胞の能力は、いずれの腫瘍細胞に対する免疫応答も刺激することができると思われる。
【００９６】
本開示の一実施形態によれば、本組成物および方法は、副腎癌、肛門癌、再生不良性貧血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、成人の脳／ＣＮＳ腫瘍、小児の脳／ＣＮＳ腫瘍、乳癌、男性乳癌、小児癌、原発不明癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸／直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、眼癌、膀胱癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌および下咽頭癌、白血病、成人急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ｃｍｌ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、小児白血病、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、リンパ腫、皮膚リンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、小児非ホジキンリンパ腫、口腔および口咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫−成人軟組織癌、皮膚癌、基底細胞および扁平上皮細胞皮膚癌、皮膚癌−黒色腫、小腸癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、陰門癌、ワルデンストロームマクログロブリン血症、およびビルムス腫瘍から選択される１以上の癌の処置に使用される。
【００９７】
一実施形態では、本組成物および方法は、脳腫瘍の処置に好適である。脳腫瘍には１２０を超えるタイプがある。ほとんどの医療施設は脳腫瘍を識別するために世界保健機関（ＷＨＯ）の分類体系を用いている。ＷＨＯは、脳腫瘍を細胞の起源および最低悪性度（良性）から最高悪性度（悪性）まで細胞の挙動の仕方によって分類する。腫瘍タイプは、増殖の速度を表すグレードＩ（最低悪性）からグレードＩＶ（最高悪性）の範囲のグレードに割り付けられる場合もある。腫瘍タイプによってグレード分類体系の変形も存在する。個々の腫瘍の分類およびグレードはその採り得る挙動を予測する助けとなる。最も頻繁に診断されるタイプとしては、聴神経腫、星状細胞腫（グレードＩ−毛様細胞性星状細胞腫、グレードＩＩ−低悪性度星状細胞腫、グレードＩＩＩ−退形成性星状細胞腫、およびグレードＩＶ−膠芽腫（ＧＢＭ））、脊索腫、ＣＮＳリンパ腫、頭蓋咽頭腫、その他の神経膠腫（脳幹膠腫、脳室上衣細胞腫、混合型神経膠腫、視神経膠腫および上衣下細胞腫）、髄芽細胞腫、髄膜腫、転移性脳腫瘍、乏突起膠腫、下垂体腫瘍、原始神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）、その他の脳関連症状、および神経鞘腫が挙げられる。
【００９８】
小児の間では、これらの脳腫瘍タイプがより多い：脳幹膠腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、若年毛様細胞性星状細胞腫（ＪＰＡ）、髄芽細胞腫、視神経膠腫、松果体腫瘍、原始神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）、および横紋筋様腫瘍。
【００９９】
（Ｅ）ミニ細胞および死滅細菌細胞
「ミニ細胞」は、染色体を欠き（「染色体不含」）、かつ、二分裂の際にＤＮＡ分離に伴い細胞分裂の協調が乱されることによって生じる細菌細胞の誘導体を意味する。ミニ細胞は、特定の状況で自発的に生成および放出されるが特定の遺伝子再配列またはエピソーム遺伝子発現によるものではない、いわゆる「膜ブレブ」（約０．２μｍ以下の大きさ）などの他の小型の小胞とは異なる。同様に、無傷ミニ細胞は、特定の遺伝子再配列またはエピソーム遺伝子発現によって生じるものではない、細菌ゴーストとは異なる。本開示で使用される細菌由来ミニ細胞は完全に無傷であり、従って、外膜または画定膜が破壊または分解され、さらには除去されることを特徴とする細菌細胞誘導体の他の染色体不含形態とは区別される。米国特許第７，１８３，１０５号  第１１１段落の第５４行以下を参照。本開示のミニ細胞を特徴付ける無傷膜は、積載物が放出されて腫瘍細胞内に事後取り込みされるまで、ミニ細胞内への治療用積載物の保持を可能とする。
【０１００】
本開示で使用されるミニ細胞は、大腸菌(E. coli)およびネズミチフス菌(S. typhymurium）などの細菌細胞から作製することができる。原核生物染色体複製は正常な二分裂に関連し、細胞中央の隔壁の形成に関与している。大腸菌では、例えば、ｍｉｎＣＤなどのｍｉｎ遺伝子の突然変異は、細胞分裂中に細胞極において隔壁形成の阻害を除去することができ、その結果、正常な娘細胞と染色体を欠くミニ細胞が産生される。de Boer et al., J. Bacteriol. 174(1): 63-70 (1992); Raskin & de Boer, J. Bacteriol. 181:  6419-6424 (1999); Hu & Lutkenhaus, Mol. Microbio. 34(1): 82-90 (1999); Harry, Mol. Microbiol. 40(4): 795-803 (2001)参照。
【０１０１】
ｍｉｎオペロン突然変異に加え、染色体を欠くミニ細胞はまた、例えば、枯草菌(B. subtilis)のｄｉｖＩＶＢ１における、隔壁形成に影響を及ぼす一定範囲の他の遺伝子再配列または突然変異の後にも生じる。Reeve and Cornett, J. Virol. 15: 1308-16 (1975)参照。ミニ細胞はまた、細胞分裂／染色体分離に関与するタンパク質の遺伝子発現レベルにおける摂動の後にも形成され得る。例えば、ｍｉｎＥの過剰発現は、極性分裂およびミニ細胞の産生をもたらす。同様に、染色体を欠くミニ細胞は、例えば枯草菌におけるｓｍｃ突然変異(Britton et al., Genes Dev. 12:  1254-9 (1998))、枯草菌におけるｓｐｏＯＪ欠失(Ireton et al., J. Bacteriol. 176: 5320-29 (1994))、大腸菌におけるｍｕｋＢ突然変異(Hiraga et al., J. Bacteriol. 171:  1496-1505 (1989))、および大腸菌におけるｐａｒＣ突然変異(Stewart and D’Ari, J. Bacteriol. 174:  4513-6 (1992))など、染色体分離の欠陥から生じることもある。さらに、ＣａｆＡは、細胞分裂速度を高め、かつ／または複製後の染色体分配を阻害し(Okada et al., J. Bacteriol. 176: 917-22 (1994))、連結細胞および染色体を欠くミニ細胞の形成をもたらす。
【０１０２】
よって、ミニ細胞は、本開示のためにいずれの細菌細胞（グラム陽性またはグラム陰性起源の細菌細胞である）からでも作製することができ、これはこれらの細菌において細菌細胞分裂の特性が保存されているためである。さらに、本開示で使用されるミニ細胞は、上記のように、無傷細胞壁を有するべきであり（すなわち、「無傷ミニ細胞」であるべきであり）、特定の遺伝子再配列またはエピソーム遺伝子発現によるものではない、膜ブレブなどの他の小型小胞から区別および分離されるべきである。
【０１０３】
所与の実施形態では、ミニ細胞の親（起源）細菌はグラム陽性であってよく、または記載のようにグラム陰性菌であってもよい。よって、一態様において、親細菌はテッラン(Terra)／グリドバクテリア下界(Glidobacteria)（ＢＶ１）、プロテオバクテリア門(Proteobacteria)（ＢＶ２）、スピロヘータ門(Spirochaetes)、スフィンゴバクテリア門(Sphingobacteria)、およびプランクトバクテリア門(Planctobacteria)を含むＢＶ４から選択される１以上である。別の態様によれば、細菌は、バチルス綱(Bacilli)、クロストリジウム綱(Clostridia)もしくはテネリクテス綱(Tenericutes)／モリクテス綱(Mollicutes)などのフィルミクテス門(Firmicutes)（ＢＶ３）、または放線菌目(Actinomycetales)もしくはビフィドバクテリウム目(Bifidobacteriales)など放線菌門(Actinobacteria)（ＢＶ５）から選択される１以上である。
【０１０４】
本発明によれば、死滅細菌細胞は、Bergey's Manual of Systematic Biology第２版に定義される、細菌、シアノバクテリア、真正細菌および古細菌の生きていない原核細胞である。このような細胞は、無傷細胞壁および／または細胞膜を有しており、かつ、その細菌種に内在する遺伝物質（核酸）を含んでいれば、「無傷」であると考えられる。死滅細菌細胞を調製する方法は例えば、米国特許出願公開第２００８／００３８２９６号に記載され、その内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
【０１０５】
さらなる態様では、細菌は、エオバクテリア下界(Eobacteria)（クロロフレクサス門(Chloroflexi)、デイノコッカス・テルムス門(Deinococcus-Thermus)）、シアノバクテリア、サーモデスルフォバクテリア門(Thermodesulfobacteria)、サーモフィルス門(thermophiles)（アクウィフェクス門(Aquificae)、テルモトガ門(Thermotogae））、アルファ、ベータ、ガンマ（腸内細菌科(Enterobacteriaceae)）、デルタまたはイプシロンプロテオバクテリア門、スピロヘータ門、フィブロバクター門(Fibrobacteres)、クロロビ／バクテロイデス門(Chlorobi/Bacteroidetes)、クラミジア／ベルコミクロビウム門(Chlamydiae/Verrucomicrobia)、プランクトミケス門(Planctomycetes)、アシドバクテリア(Acidobacteria)、クリシオゲネス門(Chrysiogenetes)、デフェリバクター門(Deferribacteres)、フソバクテリウム門(Fusobacteria)、ゲンマティモナス門(Gemmatimonadetes)、ニトロスピラ門(Nitrospirae)、シネルギステス門(Synergistetes)、ディクティオグロムス門(Dictyoglomi)、レンティスファエラ門(Lentisphaerae)、バシラス目(Bacillales)、バシラス科(Bacillaceae)、リステリア科(Listeriaceae)、ブドウ球菌科(Staphylococcaceae)、ラクトバシラス目(Lactobacillales)、エンテロコッカス科(Enterococcaceae)、ラクトバシラス科(Lactobacillaceae)、ロイコノストック科(Leuconostocaceae)、ストレプトコッカス科(Streptococcaceae)、クロストリジア目(Clostridiales)、ハロアナエロビウム目(Halanaerobiales)、テルモアナエロバクター目(Thermoanaerobacterales)、マイコプラズマ目(Mycoplasmatales)、エントモプラズマ目(Entomoplasmatales)、アナエロプラズマ目(Anaeroplasmatales)、アコレプラズマ目(Acholeplasmatales)、ハロプラズマ目(Haloplasmatales)、アクチノミセス亜科(Actinomycineae)、アクチノミセス科(Actinomycetaceae)、コリネバクテリウム科(Corynebacterineae）、ノカルジア科(Nocardiaceae)、コリネバクテリウム科(Corynebacteriaceae)、フラキア亜科(Frankineae）、フラキア科(Frankiaceae)、ミクロコッカス亜科(Micrococcineae)、ブレビバクテリウム科(Brevibacteriaceae)、およびビフィドバクテリウム科(Bifidobacteriaceae)から選択される１以上である。
【０１０６】
薬学的使用のためには、本開示の組成物は、免疫原性成分および他の毒性夾雑物からできる限り完全に単離されたミニ細胞または死滅細菌細胞を含むべきである。遊離内毒素および親細菌細胞を除去するために細菌由来ミニ細胞を精製するための方法は、ＷＯ２００４／１１３５０７に記載されており、その全内容は引用することにより本明細書の一部とされる。簡単に述べれば、精製プロセスは、（ａ）一般に０．２μｍより小さい膜ブレブなどの、より小さな小胞、（ｂ）細胞膜から放出された遊離内毒素、および（ｃ）遊離生死にかかわらず親細菌およびそれらの残渣（これもまた内毒素の供給源である）の除去を達成する。このような除去は、とりわけ、より小さな小胞および細胞残渣を除去するためには０．２μｍのフィルターを用いて、微細線維を形成させるよう親細胞を誘導した後の親細胞、生細菌細胞を死滅させるための抗生物質、および遊離内毒素に帯する抗体を除去するためには０．４５μｍのフィルターを用いて実施することができる。
【０１０７】
精製手順の基礎にあるのは、細菌の供給源の違いにかかわらず、総ての無傷ミニ細胞がおよそ４００ｎｍの大きさ、すなわち、膜ブレブおよびその他のより小さな小胞よりも大きく、さらには親細菌よりも小さいという本発明者による発見である。ミニ細胞のサイズの決定は、電子顕微鏡などの固体状態を用いることにより、または例えば動的光散乱などの液体に基づく技術によって行うことができる。このような各技術によって得られたサイズ値には一定の誤差範囲があり得るので、これらの値は技術間でいくらかの違いがある場合がある。よって、乾燥状態のミニ細胞の大きさは、電子顕微鏡によっておよそ４００ｎｍ±５０ｎｍと測定され得る。他方、動的光散乱は、同じミニ細胞をおよそ５００ｎｍ±５０ｎｍの大きさであると測定し得る。また、薬物が封入されたリガンド標的化ミニ細胞は、再び動的光散乱を用いておよそ４００ｎｍ〜６００ｎｍ±５０ｎｍであると測定され得る。
【０１０８】
このサイズ値の拡散は、上記のように、例えば免疫原性成分およびその他の毒性夾雑物からのミニ細胞の単離の目的で、実施上容易に適合される。すなわち、無傷細菌由来ミニ細胞は強固な膜によって取り囲まれた細胞質を特徴とし、これはミニ細胞に強固な球形構造を与える。この構造は透過電子顕微鏡写真で明らかであり、ミニ細胞の直径は、ミニ細胞を横切る強固な膜の外部限界間で測定される。この測定は４００ｎｍ±５０ｎｍという上述のサイズ値を与える。
【０１０９】
グラム陰性菌由来の死滅細菌細胞またはミニ細胞のもう１つの構造要素が、脂質Ａアンカーを介して外膜に埋め込まれているリポ多糖（ＬＰＳ）のＯ−多糖成分である。この成分は、炭水化物残基単位の繰り返しの鎖であり、一鎖当たり４〜５糖の単位の７０〜１００もの繰り返しを有する。これらの鎖はｉｎ  ｖｉｖｏのような液体環境では強固でないので、それらは珊瑚海の海藻の一般的な外観を呈する波打った柔軟な構造を採り得、すなわち、これらの鎖はミニ細胞膜にアンカーされたまま液体によって動く。
【０１１０】
Ｏ−多糖成分によって影響を受けるので、動的光散乱は上記に示すようにミニ細胞サイズに関して約５００ｎｍ〜約６００ｎｍの値を示し得る。しかしながらやはり、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌由来のミニ細胞は同様に０．４５μｍフィルターを容易に通り、これにより４００ｎｍ±５０ｎｍの有効ミニ細胞サイズが具現化される。上述のサイズの拡散は本発明により包含され、特に、「およそ４００ｎｍのサイズ」などの句で修飾語句「およそ」により表される。
【０１１１】
毒性夾雑物に関して、本開示の組成物は、約３５０ＥＵ未満の遊離内毒素を含み得る。これに関する例は、それぞれ約２５０ＥＵ、約２００ＥＵ、約１５０ＥＵ、約１００ＥＵ、約９０ＥＵ、約８０ＥＵ、約７０ＥＵ、約６０ＥＵ、約５０ＥＵ、約４０ＥＵ、約３０ＥＵ、約２０ＥＵ、約１５ＥＵ、約１０ＥＵ、約９ＥＵ、約８ＥＵ、約７ＥＵ、約６ＥＵ、約５ＥＵ、約４ＥＵ、約３ＥＵ、約２ＥＵ、約１ＥＵ、約０．９ＥＵ、約０．８ＥＵ、約０．７ＥＵ、約０．６ＥＵ、約０．５ＥＵ、約０．４ＥＵ、約０．３ＥＵ、約０．２ＥＵ、約０．１ＥＵ、約０．０５ＥＵ、および約０．０１ＥＵの遊離内毒素のレベルである。
【０１１２】
本開示の組成物はまた、少なくとも約１０９、例えば、少なくとも約１×１０９、少なくとも約２×１０９、または少なくとも約５×１０９のミニ細胞または死滅細菌細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、本組成物は、約１０１１以下、例えば、約１×１０１１以下または約９×１０１０以下、または約８×１０１０以下のミニ細胞または死滅細菌細胞を含む。
【０１１３】
（Ｆ）ミニ細胞または死滅細菌細胞への抗新生物薬の封入
核酸によりコードされ得るタンパク質および機能性核酸などの抗新生物薬は、抗新生物薬をコードするプラスミドなどのベクターを親細菌細胞に導入することによってミニ細胞に導入することができる。ミニ細胞が親細菌細胞から形成される場合、そのミニ細胞は特定コピーのプラスミドおよび／または発現産物、すなわち、抗新生物薬を保持する。ミニ細胞における発現産物の封入に関する詳細はＷＯ０３／０３３５１９に示されており、その内容は引用することによりその総てが本明細書の一部とされる。
【０１１４】
ＷＯ０３／０３３５１９に示されているデータは、例えば、哺乳動物遺伝子発現プラスミドを保持する組換えミニ細胞が食細胞および非食細胞に送達可能であることを実証している。この出願はまた、エピソームにより複製するプラスミドＤＮＡ上に保持されている異種核酸によるミニ細胞産生親細菌株の遺伝子形質転換を記載している。親細菌とミニ細胞の分離の際、エピソームＤＮＡの一部はミニ細胞へと分離した。生じた組換えミニ細胞は哺乳動物食細胞によって容易に取り込まれ、細胞内ファゴリソソーム内で分解されるようになった。さらに、組換えＤＮＡの一部はファゴリソソーム膜を逃れ、哺乳動物の細胞核へ輸送され、そこで組換え遺伝子が発現された。
【０１１５】
核酸はまた、ミニ細胞に直接封入することもできる。よって、核酸は、複数の無傷ミニ細胞と核酸をバッファー中で同時にインキュベートすることによって無傷ミニ細胞に直接封入できる。バッファー組成物は、無傷ミニ細胞内の核酸の負荷を最適化するために、当技術分野で周知の条件の関数として変更可能である。バッファーはまた、ミニ細胞に負荷される核酸のヌクレオチド配列および長さによって異なり得る。負荷のために好適なバッファーの例としては、限定されるものではないが、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。ひと度封入されれば、核酸はミニ細胞内に留まり、分解から保護される。無菌生理食塩水中でインキュベートされる、ｓｉＲＮＡが封入されたミニ細胞との長期インキュベーション研究では、例えば、ｓｉＲＮＡの漏出は見られなかった。
【０１１６】
他の実施形態では、異なるｍＲＮＡ標的に向けられた複数の核酸を同じミニ細胞に封入することができる。このようなアプローチは薬物耐性およびアポトーシス耐性に退行するために使用することができる。例えば、癌患者は通常化学療法薬耐性を示す。このような耐性はとりわけ、多剤耐性（ＭＤＲ）ポンプおよび抗アポトーシス遺伝子などの遺伝子の過剰発現によって媒介され得る。この耐性に対抗するために、ミニ細胞は、治療上有意な濃度の、ＭＤＲ関連遺伝子に対する機能性核酸を封入し、化学療法前に患者に投与することができる。さらに、ほとんどの分子標的は突然変異を受けており、複対立遺伝子を持っていることから、異なるｍＲＮＡ標的に向けられた複数の機能性核酸の封入は治療成果を高め得る。ミニ細胞への核酸の直接封入に関するさらなる詳細はＷＯ２００９／０２７８３０に示されており、その内容は引用することによりその総てが本明細書の一部とされる。
【０１１７】
小分子薬は、親水性であれ疎水性であれ、細胞外媒体を含有するミニ細胞とミニ細胞の細胞質の間に薬物の濃度勾配を作り出すことによってミニ細胞に封入することができる。細胞外媒体がミニ細胞の細胞質よりも高い薬物濃度を含む場合、その薬物は自然にミニ細胞の細胞質へとこの濃度勾配を下降する。しかしながら、濃度勾配が逆であれば、薬物はミニ細胞の外部に移動しない。薬物負荷プロセスおよびその驚くべき特性に関するさらなる詳細は、例えば、米国特許出願公開第２００８／００５１４６９号に見られる。
【０１１８】
ミニ細胞に通常水容性ではない薬物を負荷するためには、薬物をまず適当な溶媒に溶解させることができる。例えば、パクリタキセルは、エタノールとクレモフォールＥＬ（ポリエトキシル化ヒマシ油）の１：１ブレンドに溶かした後、ＰＢＳで希釈して、水性媒体中に部分的希釈され、薬物が溶液中に留まることを保証するために最少量の有機溶媒を含むパクリタキセル溶液を達成することができる。ミニ細胞を、薬物負荷のためのこの最終媒体中でインキュベートすることができる。よって、本発明者らは、疎水性薬物であってもミニ細胞の細胞質または膜に拡散させて、高い、治療上有意な細胞質薬物負荷を達成できることを見出した。ミニ細胞膜が疎水性のリン脂質二重層から構成される、これが疎水性分子の細胞質への拡散を妨げると思われたことから、このことは予期されないことである。
【０１１９】
サイズおよび化学特性の違いを実例とする多様な代表的小分子薬：ドキソルビシン、パクリタキセル、フルオロ−パクリタキセル、シスプラチン、ビンブラスチン、モンサトロール、チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）阻害剤ＯＳＩ−７９０４、イリノテカン、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、およびカルボプラチンのミニ細胞への負荷が実証される。さらに、全般にわたって、結果として得られた小分子薬が封入されたミニ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで有意な抗腫瘍有効性を示す。従って、本明細書に示されるこれらのデータは、本ミニ細胞負荷法の有効性および融通性を実証する。
【０１２０】
（Ｇ）特定の哺乳動物細胞へのミニ細胞または死滅細菌細胞の配向
本開示のさらなる態様によれば、組成物のミニ細胞または死滅細菌細胞は、上記のように、リガンドを介して標的哺乳動物腫瘍細胞に向けられる。いくつかの実施形態では、リガンドは「二重特異性」である。すなわち、リガンドは、リガンドが所与の小胞を標的細胞に結合させ、それにより標的細胞が小胞を取り込むように、ミニ細胞と哺乳動物（腫瘍）細胞の両方の成分に特異性を示す。ミニ細胞を腫瘍細胞に標的化するための二重特異性リガンドの使用は、ＷＯ０５／０５６７４９およびＷＯ０５／０７９８５４にさらに記載され、死滅細菌細胞を腫瘍細胞に標的化するための二重特異性リガンドの使用は、米国特許第８，５９１，８６２号にさらに記載され、それらの内容は引用することによりその総てが本明細書の一部とされる。このようなリガンドがひと度、小胞と結合すれば、リガンドの占有されていない特異性（「単一特異性」）は、そのリガンドが標的（腫瘍）哺乳動物細胞と相互作用するまで適合状態となる。
【０１２１】
リガンドは、リガンドと多糖、糖タンパク質、またはポリペプチドなどの細胞膜上の成分との間の相互作用によって小胞の細胞膜と結合され得る。発現されたリガンドは、小胞と哺乳動物細胞が接触するようになった際にリガンドの表面成分結合部分が標的哺乳動物細胞表面成分と結合できるようその部分が露出されるように小胞の表面に固定される。
【０１２２】
あるいは、リガンドは、細菌由来小胞の生きている相対物により、例えば、ミニ細胞の親細胞より、または死滅細胞となる前の細菌細胞により発現および提示され得る。本例では、リガンドは小胞に対して特異性を必要とせず、哺乳動物細胞の特徴である一成分に対して特異性を示すだけでよい。すなわち、このような成分はそれ自体、腫瘍細胞がそれらの表面にその成分を提示する限り、腫瘍細胞に対して、または処置下の特定の種類の腫瘍細胞に対してさえユニークである必要はない。
【０１２３】
静脈内投与の際、小胞は腫瘍の微小環境中に急速に蓄積する。上記の漏出性の腫瘍血管の働きとして起こるこの蓄積は、小胞に封入された治療用積載物の腫瘍細胞へ送達を果たし、その後その腫瘍細胞は封入された小胞を内部移行する。
【０１２４】
本発明者らは、この送達アプローチが、ミニ細胞の特異的結合およびエンドサイトーシスに通常不応である細胞を含む、一定範囲の哺乳動物腫瘍細胞に適用可能であることを見出した。例えば、抗ＨＥＲ２受容体または抗ＥＧＦ受容体に向けられた抗体を含んでなるリガンドは、肺癌細胞、卵巣癌細胞、脳癌細胞、乳癌細胞、前立腺癌細胞、および皮膚癌細胞などの一定範囲の標的非食作用細胞上の個々の受容体にミニ細胞を結合させることができる。
【０１２５】
このようにして達成された結合は、各種非食作用細胞による小胞の取り込みに先行する。すなわち、本発明の文脈では、好適な標的細胞は細胞表面成分を提示し、小胞上のリガンドによるその結合は、その小胞のエンドサイトーシスを惹起する。
【０１２６】
より具体的には、本発明者らは、（ａ）ミニ細胞または死滅細菌細胞上のリガンドと、（ｂ）哺乳動物細胞表面受容体との間の相互作用は、本明細書で「受容体媒介エンドサイトーシス」（ｒＭＥ）経路と呼ばれる、腫瘍細胞などの標的宿主細胞の後期エンドソーム／リソソームコンパートメントへの取り込み経路を活性化できることを見出した。このｒＭＥ経路により、本発明者らは、初期エンドソーム、後期エンドソームおよびリソソームによって処理され、その結果、それの積載物を哺乳動物宿主細胞の細胞質中に放出することを見出した。さらに、積載物、すなわち核酸は、後期エンドソーム／リソソームコンパートメント内での完全な分解を逃れるだけでなく、宿主細胞により発現もされる。
【０１２７】
リガンドは積載物保持小胞および標的細胞それぞれの上の表面成分と結合し、かつ、後期成分とのその相互作用がｒＭＥ経路への小胞の取り込みをもたらすことから、上記のように、この送達アプローチのためのリガンドは、「二重特異性」であり得る。
いずれにしても、成分との相互作用が標的細胞表面からのサイトゾル内部移行を必要とするエンドサイトーシス経路に事実上接近すれば、所与の標的細胞表面成分は、本発明に従えば、リガンドによる結合のための候補であり得る。このような候補は、その表面に候補成分を提示する細胞種がその候補と結合しかつまた蛍光色素または例えば共焦点顕微鏡により視覚的に検出され得る他のマーカーにと連結されたリガンドを保持するミニ細胞とともに同時にインキュベートされるアッセイにより、本発明における適性に関して容易に評価される（この種のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、MacDiarmid et al. (2007)の４３６頁の図３の凡例に記載されている）。よって、観察されるマーカーの内部移行は、このようなアッセイによる、試験した標的細胞表面成分が本発明に好適であるという肯定的な示唆をなす。
【０１２８】
候補標的細胞表面成分の例は、（Ａ）他の内在性膜タンパク質と同等の速度で構成的内部移行（エンドサイトーシス）を受ける膜貫通タンパク質のファミリーである受容体チロシンキナーゼまたは「ＲＫＴ」のメンバーである。Goh and Sorkin, Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5: a017459 (2013)参照。ＲＫＴのファミリーは、Lemmon and Schlessinger, Cell 141(7): 1117-134 (2010)により記載されている。以下の表はヒトプロテオームにおける２０のサブファミリーの全５８のＲＴＫを挙げ、そのいずれか１以上が上記のように本発明における適性に関して試験され得る（図７も参照）。
【０１２９】
【表１】
0006538031.tif 000003
【０１３０】
同様の例として（Ｂ）葉酸および還元型葉酸誘導体と結合し、テトラヒドロ葉酸の細胞内部への送達を媒介する膜結合性高親和性葉酸結合タンパク質（葉酸受容体）クラス、（Ｃ）ＩＬ１３などの同族サイトカインの内部移行に役割を果たす、膜結合サイトカイン受容体のサブグループ、（Ｄ）ある種の癌細胞上で発現され、同族モノクローナル抗体（例えば、ＣＤ２０の場合にはリツキシマブ）の内部移行を媒介する、ＣＤ２０、ＣＤ３３、メソテリンおよびＨＭ１．２４などの表面抗原、および（Ｅ）エンドソーム経路を介して輸送され、細胞外マトリックスへの癌細胞間接着の主要な媒介因子である膜貫通グリプロテイン(glyproteins)である接着受容体（インテグリン）ファミリーのメンバーがある。
【０１３１】
本発明によれば、リガンドは、場合に応じて１または複数の所望の特異性を示すいずれのポリペプチドまたは多糖であってもよい。好ましいリガンドは抗体である。この場合のその使用では、用語「抗体」は、免疫原性応答のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ生成によって得られる免疫グロブリン分子を包含する。よって、「抗体」の区分には、モノクローナル抗体およびヒト化抗体、例えば、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体などが含まれる。引用することによりその全内容が本明細書の一部とされるCaravella and Lugovskoy, Curr. Opin. Chem. Biol. 14: 520-28 (2010)の総説により明らかにされているように、多数の異なる二重特異性タンパク質および抗体に基づくリガンドは知られている。本開示に従う有用な抗体は、同様に、既知の組換えＤＮＡ技術によって得ることができる。
【０１３２】
よって、限定されない例として、腫瘍抗原などの表面成分に対して特異性を有する抗体は、本発明に従ってミニ細胞を腫瘍の細胞に標的化するために使用することができる。これに関する例示的な細胞表面受容体としては、ＲＴＫ、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）およびインスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦＲ）（それぞれ脳腫瘍を含む数種の固形腫瘍で発現が高い）、および葉酸受容体（一部の下垂体腺腫で過剰発現される）のいずれもが含まれる。このような二重特異性リガンドは、突然変異受容体または受容体変異体、例えば、ヒト多形性膠芽腫瘍の５０％〜８０％で発現され（Wykosky et al., Clin Cancer Res. 14: 199-208 (2008)、Jarboe et al., Cancer Res. 67: 7983-86 (2007)、Debinski et al., J. Neurooncol. 48: 103-11 (2000)、およびOkada et al., J. Bacteriol. 176: 917-22 (1994)参照）、正常組織で発現されるその生理学的相当物ＩＬ４Ｒ／ＩＬ１３Ｒとは異なるＩＬ−１３Ｒα２受容体にも同様に標的化され得る。Hershey, J. Allergy Clin. Immunol. 111: 677-90 (2003)参照。よって、ＩＬ１３Ｒα２は正常脳細胞には実質的に存在しない。Debinski and Gibo, Mol. Med. 6: 440-49 (2000)参照。さらに、脳に転移する腫瘍はある種の受容体を過剰発現する場合があり、これも好適な標的であり得る。例えば、Da Silva et al., Breast Cancer Res. 12: R46 (1-13) (2010)は、乳癌の脳転移はＲＴＫのＨＥＲファミリーの総てのメンバーを発現したことを示した。ＨＥＲ２は脳転移の２０％で増幅および過剰発現され、ＥＧＦＲは脳転移の２１％で過剰発現され、ＨＥＲ３は脳転移の６０％で過剰発現され、また、ＨＥＲ４は脳転移の２２％で過剰発現された。興味深いことに、ＨＥＲ３発現は、脳に存在している乳癌細胞で増強された。
【０１３３】
（Ｈ）ＩＦＮ−γレベルを高めるための薬剤
本組成物および方法は、患者におけるＩＦＮ−γのレベル（例えば、活性または発現レベル）を高める薬剤をさらに含み得る。
【０１３４】
一実施形態では、この薬剤として、ＩＦＮ−γタンパク質または類似体を含む。アクティミューン（登録商標）などのＩＦＮ−γの市販品が利用可能であるか、または利用可能となることであろう。アクティミューン（登録商標）は、ヒト免疫系の刺激を介して生体応答改変剤として働くタンパク質であるインターフェロンγの生物工学によって作られた形態である。上記のように、ＦＤＡは、アクティミューン（登録商標）を慢性肉芽腫症および重篤な悪性大理石骨を有する小児および成人で使用するために承認している。
【０１３５】
ＩＦＮ−γ産生は、ＡＰＣにより分泌されるサイトカイン、中でも注目すべきはインターロイキン（ＩＬ）−１２およびＩＬ−１８により制御される。これらのサイトカインは、自然免疫応答において感染をＩＦＮ−γ産生と連携される橋渡しとして働く。多くの病原体のマクロファージ認識は、ＩＬ−１２およびケモカインの分泌を誘導する。これらのケモカインはＮＫ細胞を炎症部位へ誘引し、ＩＬ−１２はこれらの細胞でＩＦＮ−γの合成を促進する。マクロファージ、ＮＫおよびＴ細胞では、ＩＬ−１２とＩＬ−１８刺激の組合せがＩＦＮ−γの産生をさらに増強する。よって、これらのタンパク質のいずれかまたはそれらの組合せは、本開示の目的に好適な薬剤である。
【０１３６】
ＩＦＮ−γ産生の負のレギュレーターとしては、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、トランスフォーミング増殖因子−β、およびグルココルチコイドが含まれる。これらの因子を阻害するタンパク質または核酸は、ＩＦＮ−γの産生を刺激することができるであろう。
【０１３７】
また、ＩＦＮ−γまたはＩＦＮ−γの産生および／もしくは分泌を活性化する遺伝子をコードするポリヌクレオチドもこれに関する使用に好適である。
【０１３８】
ＩＦＮ−γレベルを高める薬剤はまたウイルスワクチンであり得る。感染または他のタイプの有害な作用を引き起こさずにＩＦＮ−γ産生を誘導できるいくつかのウイルスワクチンが利用可能である。このクラスのウイルスワクチン剤の例として、流感（インフルエンザ）ワクチンがある。
【０１３９】
これらのデータは、薬物が負荷された二重特異性抗体標的化ミニ細胞または死滅細菌細胞の投与も受けている場合には、腫瘍細胞に対する宿主免疫応答を効果的に活性化するのに必要とされるＩＦＮ−γの血清濃度は低いことを示す。よって、一態様において、本発明の方法は、約３０，０００ｐｇ／ｍＬを超えない血清ＩＦＮ−γ濃度の増加をもたらす。別の態様において、血清ＩＦＮ−γ濃度は、約５０００ｐｇ／ｍＬ、１０００ｐｇ／ｍＬ、９００ｐｇ／ｍＬ、８００ｐｇ／ｍＬ、７００ｐｇ／ｍＬ、６００ｐｇ／ｍＬ、５００ｐｇ／ｍＬ、４００ｐｇ／ｍＬ、３００ｐｇ／ｍＬ、２００ｐｇ／ｍＬ、または１００ｐｇ／ｍＬを超えない程度に増加される。さらなる態様において、結果としての血清ＩＦＮ−γ濃度は、少なくとも約１０ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも約２０ｐｇ／ｍＬ、３０ｐｇ／ｍＬ、４０ｐｇ／ｍＬ、５０ｐｇ／ｍＬ、６０ｐｇ／ｍＬ、７０ｐｇ／ｍＬ、８０ｐｇ／ｍＬ、９０ｐｇ／ｍＬ、１００ｐｇ／ｍＬ、１５０ｐｇ／ｍＬ、２００ｐｇ／ｍＬ、３００ｐｇ／ｍＬ、４００ｐｇ／ｍＬまたは５００ｐｇ／ｍＬである。
【０１４０】
いくつかの態様によれば、薬剤は、ＩＦＮ−γタンパク質、操作型タンパク質または類似体である。いくつかの態様では、投与は、宿主血液１ｍｌ当たり約０．０２ｎｇ〜１ミリグラムのＩＦＮ−γを達成する。一態様において、達成される宿主血液中のＩＦＮ−γ濃度は、約０．１ｎｇ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、または約０．２ｎｇ〜約２００ｎｇ／ｍｌ、または約０．５ｎｇ〜約１００ｎｇ／ｍｌ、または約１ｎｇ〜約５０ｎｇ／ｍｌ、または約２ｎｇ〜約２０ｎｇ／ｍｌである。本開示の組成物中のＩＦＮ−γの治療用量は相応に決定することができる。
【０１４１】
（Ｉ）処方物および投与経路および計画
本開示の組成物の処方物は、例えば、アンプルもしくはバイアルなどの単位投与形で、または保存剤を添加したもしくは添加しない複数用量容器で提供することができる。処方物は油性または水性ビヒクル中の溶液、懸濁液、またはエマルションであり得、沈澱防止剤、安定剤および／または分散剤などの処方剤を含み得る。好適な溶液はレシピエントの血液と等張であり、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液により例示される。あるいは、処方物は、好適なビヒクル、例えば、無菌の発熱性物質除去水または生理食塩水で再構成するための凍結乾燥形態であり得る。処方物はまた、デポー製剤の形態であり得る。このような長期作用処方物は、移植（例えば、皮下または筋肉内）によってまたは筋肉内注射によって投与することができる。
【０１４２】
いくつかの態様では、治療上有効な量の抗新生物薬を含むミニ細胞または死滅細菌細胞含有組成物が提供される。抗新生物薬の「治療上有効な」量は、対象薬剤、例えば、本開示に従って対象に投与された際に薬理学的応答を引き出すｓｉＲＮＡまたは化学療法薬の用量である。
【０１４３】
いくつかの態様では、ＩＦＮ−γのレベルを高める薬剤の治療上有効な量を含む組成物が提供される。いくつかの態様では、記載のようなミニ細胞または死滅細菌細胞とＩＦＮ−γのレベルを高める薬剤の両方を含む組成物、キット、パッケージまたは製品が提供される。
【０１４４】
従って、本開示の文脈では、治療上有効な量は、治療用積載物を保持するミニ細胞または死滅細菌細胞が下記にさらに記載されるように投与される場合、動物モデルまたはヒト対象のいずれかにおいて、腫瘍または腫瘍の症状の予防または改善を参照することにより判断することができる。特定の対象に関して、所与の場合に「治療上有効な量」を示す量は、そのような用量が熟練の医師により「治療上有効な量」と考えられるとしても、腫瘍に関して同様に処置される対象の１００％に有効でなくてもよい。この点で適当な用量はまた、例えば、腫瘍のタイプ、ステージ、および重篤度の関数としても異なる。同様に、「治療上有効な」が医薬組成物中のミニ細胞の数を指して使用される場合、その数はどの抗新生物薬がミニ細胞中に封入されるかおよび腫瘍を処置する上でのその薬剤の有効性に基づいて確認することができる。この点で治療効果は、腫瘍量などの臨床または病理パラメーターを用いて測定することができる。よって、腫瘍量の減少または増加の減少を治療効果の測定に使用することができる。
【０１４５】
ＩＦＮ−γレベルを増強する薬剤に関して「治療上有効な量」は、前掲で示したように、投与時に所望の宿主血中濃度を達成する薬剤の量を意味し得る。
【０１４６】
本開示の範囲内の処方物は、局所的または全身的に１または複数の所望の治療効果を達成するために、種々の経路で哺乳動物身体の種々の部位に投与することができる。特定の態様において、投与経路は静注である。
【０１４７】
一般に、本開示の処方物は、潜在毒性を最小にしつつ最適な生理学的効果を得るために、慣例の試験により定義される適当な用量で使用することができる。投与計画は、患者の年齢、体重、性別、健康状態；腫瘍の重篤度またはステージ、投与経路、ならびに患者の腎機能および肝機能を含む種々の因子に従って選択することができる。
【０１４８】
最小の副作用で最大の有効性を得る範囲内のミニ細胞、死滅細菌細胞、および治療薬の濃度を達成する上での最適な決定は、標的部位および標的細胞に対する薬剤アベイラビリティの動態に基づく投与計画を必要とすることがあり、一般には必要とする。処置計画に最適な濃度を決定する際には、ミニ細胞または薬剤の分布、平衡、および排出を考慮することができる。ミニ細胞および治療薬の用量はそれぞれ、所望の効果を達成するために調整することができる。
【０１４９】
さらに、本処方物の用量投与は、薬物動態モデル系を用いて最適化することができる。よって、１以上の投与計画を選択することができ、１以上の投与計画の薬物動態プロファイルを決定するために薬物動態モデルを使用することができる。次に、このような特定のプロファイルに基づき、所望の薬物動態応答を達成する投与のための投与計画を選択することができる。例えば、ＷＯ００／６７７７６参照。
【０１５０】
抗新生物薬およびＩＦＮ−γのレベルを高める薬剤が封入されたミニ細胞または死滅細菌細胞は、組合せ処方物でもしくは別個の組成物として同時に、または一方を他方の後に逐次に投与することができる。逐次投与する場合、ミニ細胞または死滅細菌細胞は、ＩＦＮ−γのレベルを高める薬剤の前、または後に投与することができる。一態様において、ミニ細胞または死滅細菌細胞が投与後に最大血漿レベルまたは有効血漿レベルに達すると、宿主は最小ＩＦＮ−γレベルを達成しているか、または最小ＩＦＮ−γレベルを維持している。このような最小レベルは、その組成物間の共力作用の生成のために必要とされるものである。これは、ミニ細胞もしくは死滅細菌細胞を投与する前にＩＦＮ−γレベルを高める薬剤を投与することによるか、またはミニ細胞もしくは死滅細菌細胞が特に比較的高用量で投与された短時間の後に薬剤を投与することによって達成することができる。両組成物の投与は連続して行うことができることを注記しておく。この点で、次に、投与の結果、ミニ細胞または死滅細菌細胞とＩＦＮ−γを増強する薬剤の両方に宿主が絶えず曝されるようになる。
【０１５１】
本開示の処方物または処方物の組合せは、数週間のコースにわたって少なくとも週１回、腫瘍患者に投与することができる。よって、処方物は、数週間から数ヶ月の期間にわたって少なくとも週１回投与することができる。
【０１５２】
より具体的には、発明処方物は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３１日間、少なくとも１日１回投与することができる。あるいは、本処方物は、毎日１回、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０もしくは３１日もしくはそれより多くの日数ごとに約１回投与することができる。
【０１５３】
本開示の別の実施形態では、処方物は、毎週約１回または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０週間もしくはそれより多くの週数ごとに約１回投与することができる。あるいは、本処方物は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０週間もしくはそれより多くの週数、少なくとも週に１回投与することができる。
【０１５４】
あるいは、本処方物は、毎月約１回または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２か月もしくはそれより多い月数ごとに約１回投与することができる。
【０１５５】
本処方物は、単回の一日用量で投与することができる。あるいは、総一日用量を１日２回、３回、または４回の分割用量で投与することもできる。
【０１５６】
以下の実施例は、限定ではなく単に例示であり、本開示のより完全な理解を提供する。
【実施例】
【０１５７】
実施例１．インターフェロン−γレベルと相関した腫瘍サイズの減少
本実施例は、薬物が負荷されたミニ細胞による処置を受けているイヌにおける脳腫瘍体積の減少がインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）の発現レベルと相関したことを示す。従って、本実施例は、ＩＦＮ−γは薬物が負荷されたミニ細胞の有効性を高めることを示唆する。必要とされるＩＦＮ−γは低量であることを考えれば、本実施例はさらに、ＩＦＮ−γと薬物が負荷された二重特異性抗体標的化ミニ細胞の間の共力作用を示唆する。
【０１５８】
材料および方法
ドキソルビシンが封入されたイヌＥＧＦＲ標的化ミニ細胞の調製および投与
ミニ細胞は、チフス菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium)(S. typhimurium)のｍｉｎＣＤＥ染色体欠失突然変異株に由来し、精製され、ドキソルビシン（ｄｏｘ）が封入され、かつ、抗ミニ細胞表面Ｏ−多糖特異性と抗イヌＥＧＦＲ特異性を含んでなる二重特異性モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の結合によって標的化された（ＥＧＦＲミニ細胞Ｄｏｘと呼称）。
【０１５９】
本試験のイヌは、オーストラリアのシドニーのｔｈｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔ  Ｃｅｎｔｒｅ（ＶＳＣ）またはｔｈｅ  Ｓｍａｌｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＳＡＳＨ）に患者として存在するペットのイヌであった。標準療法がイヌの飼い主により拒否された場合または有意義な標準療法が存在しない進行した疾患の場合に、患者に対して試験の参加を申し出た。実験動物の管理と使用に関する国立保健医療研究委員会(the National Health and Medical Research Council)（オーストラリア）により発表されたガイドライン、およびＥｎｇｅｎｅＩＣ動物倫理委員会の承認に従って処置した。総ての飼い主からインフォームドコンセントに署名を得た。
【０１６０】
総ての脳腫瘍を、実施可能な限り、病歴または細胞診により診断した。生前診断は、磁気共鳴撮像法（ＭＲＩ）での特徴的な外観と臨床徴候の組合せに基づいた。組織学的診断は、これらの脳腫瘍症例において過度の浸潤性を認め、診断は剖検により確認した。
【０１６１】
一用量当たり１×１０１０  ＥＧＦＲミニ細胞Ｄｏｘによる処置を週単位で行った。処置は、無菌的に留置した末梢静脈カテーテル（左頭部）を介して２分の注入で２ｍｌを投与した。
【０１６２】
ＭＲＩ腫瘍撮像法
腫瘍撮像は、Ｐｈｉｌｉｐｓ  １．５Ｔ  Ａｃｈｉｅｖａスキャナを用いてＳｐｅｃｉａｌｉｓｔ磁気共鳴イメージングで行った。このプロトコールでは、８チャネル頭部用コイルまたは８チャネル膝用コイルをイヌの大きさに応じて使用した（小型犬では膝用コイルを用いた）。
【０１６３】
シーケンスは、３平面で得られたサジタルＴ１、アキシャルＴ２、コロナルグラジェントエコー、プレコントラストアキシャル拡散強調画像（ＤＷＩ）、コロナルメトリックフレアー(coronal volumetric fluid-attenuated inversion recovery)（ＦＬＡＩＲ）およびポストガドリニウムＴ１強調画像から得た。
【０１６４】
ＩＦＮ−γ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
ミニ細胞投与前に採血し、獣医診療所から直接、血清を収集した。ＩＦＮ−γの測定は、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ＳｙｓｔｅｍからのイヌＩＦＮ−γ  ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡキット（＃ＤＹ７８１Ｂ）を製造者の説明書に従って用い、２反復で行った。
【０１６５】
結果
結果は、ミニ細胞処置を受けている３個体のイヌにおける腫瘍体積の変化に関して、図１Ａ〜１Ｃに示す。線グラフは腫瘍測定値（左のｙ軸＝容積（ｍｍ３）または最大径（ｍｍ））をミニ細胞の用量数（ｘ軸）の関数として表す。×印は、腫瘍が視認され磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）により測定された用量数を表す。
【０１６６】
処置中、２個体のイヌは、一定の処置期間において腫瘍体積に劇的な減少を示した（図１Ａおよび１ＢのイヌＡおよびＢ）。予期しないことに、それらのイヌはその期間にウイルス感染を受けていたことが認められた。調べたいくつかの、ウイルス感染と関連する可能性のあるパラメーターの中で、ＩＦＮ−γの血清濃度が腫瘍体積減少率と高い相関があることが判明した。
【０１６７】
図１Ａ〜１Ｃのそれぞれで、三角のマーカーは、示された用量においてＥＬＩＳＡにより測定された血清インターフェロンγ（ＩＦＮγ）レベルを表す。右側のｙ軸はＩＦＮ−γレベルをｐｇ／ｍＬで示す。アッセイは行ったがＩＦＮ−γがアッセイの検出限界に満たない場合（＜５６ｐｇ／ｍＬ）には、それらのデータ点は、０ｐｇ／ｍＬに三角のマーカーで示されている。腫瘍の長さ（ｌ）、幅（ｗ）および高さ（ｈ）の測定を行い、腫瘍体積（Ｖ）を、楕円式（Ｖ＝（π／６）＊ｌ＊ｗ＊ｈ）を用いて計算した。
【０１６８】
従って、これらの図面は、血清ＩＦＮ−γレベルと脳腫瘍体積減少率の間に強い相関を示す。いずれの検出可能なＩＦＮ−γレベルでも抗腫瘍応答の増強をもたらしたことも驚くべきことである。示された最低ＩＦＮ−γレベルは、イヌＢの用量４１の約５００ｐｇ／ｍＬであった（図１Ｂ）。薬物負荷ミニ細胞の腫瘍処置に対するこのようなＩＦＮ−γの劇的な効果は、それらの間の共力作用の強い示唆である。
【０１６９】
実施例２．ＥＧＦＲミニ細胞ＤｏｘとＩＦＮ−γによる処置後のマウス異種移植片（ヒト肺胞腺癌）の有意な腫瘍退縮
本実施例は、二重特異性リガンド標的化およびドキソルビシン封入無傷ミニ細胞とＩＦＮ−γによる併用処置が、６週齢雌無胸腺ヌードマウスに確立されたヒト肺胞腺癌腫瘍異種移植片の退縮を果たし得ることを示す。
【０１７０】
上記のように、ミニ細胞は、ネズミチフス菌ｍｉｎＣＤＥ変異株から、MacDiarmid et al. (2007)に従前に記載されている勾配遠心分離／繊維形成／濾過／内毒素除去手順を用いて作製および精製した。精製したミニ細胞に、この場合にもMacDiarmid et al. (2007)に従って化学療法薬ドキソルビシンを封入した。
【０１７１】
二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、ミニ細上のネズミチフス菌Ｏ−多糖と肺胞腺癌細胞上で過剰発現されるヒトＥＧＦＲのそれぞれに対する結合特異性を含む単一のポリペプチドであった。Ｏ−多糖特異性は、可変領域がハイブリドーマ細胞株から単離されたマウスモノクローナル抗体に由来し、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）として提供された。ハイブリドーマ細胞株は、マウスを精製ＬＰＳで免疫し、リンパ球を腫瘍細胞と融合させることによって作製した。次に、これらのクローンを、Ｏ−多糖と結合し得る抗体に関してスクリーニングした。ｓｃＦｖとしても提供されるＥＧＦＲ特異性は、市販抗体エルビタックス（登録商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ、ＵＳＡ）に由来した。２つのｓｃＦｖ成分はフレキシブルリンカーにより隔て、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによる精製を助けるためにＮ末端に６ｘＨｉｓタグを組み込み、加えて検出を助けるためにＣ末端にｃ−ｍｙｃタグを組み込んだ。これらのｓｃＦｖ成分を連結するリンカーは、例えばGall et al., Protein Engineering, Design and Selection 17: 357-66 (2004)によって実証されているように周知である。
【０１７２】
ＢｓＡｂをコードする発現ベクターは、高レベル発現用のｈＣＭＶプロモーターと、
および細胞培養培地中へのＢｓＡｂの分泌のためのシグナルペプチドを含む。ＢｓＡｂをコードする発現ベクターは、化学的に定義されたタンパク質および動物起源不含培地中の懸濁に適応したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に安定にトランスフェクトされ、このタンパク質は培養１０日間にわたって発現される。
【０１７３】
固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＩＭＡＣ−ＨｉｓＴｒａｐ  Ｅｘｃｅｌ）およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラム（ＢｉｏＲａｄ  ＣＨＴ  Ｉ）の２つのクロマトグラフィーカラムを抗体の精製に使用した。このアプローチは＞９８％の抗体純度を達成した。製品のウイルス安全性については、抗体をＴＮＢＰ／Ｔｗｅｅｎを用いた溶媒／洗剤不活性化およびウイルス濾過にかけた。抗体の最終収量は、１Ｌの細胞培養上清から１０ｍｇであった。
【０１７４】
本実施例で使用したマウスは、Animal Resources Centre (パース、オーストラリア)から購入し、総ての動物実験は、実験動物の管理および使用のガイド第８版（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｅｓ  Ｐｒｅｓｓ、２０１１）および動物倫理委員会の承認に従って行った。実験はNSW Agriculture-accredited small animal facility at EnGeneIC Ltd. (シドニー、オーストラリア)で行った。
【０１７５】
ヒト肺胞腺癌細胞（Ａ５４９、ＡＴＣＣ）は、Ｔ−７５フラスコにて、５％ウシ血清およびグルタミンを添加したＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）の製品であるＧＩＢＣＯ（登録商標）−ＲＰＭＩ  １６４０培地中、９５％空気および５％ＣＯ２の加湿雰囲気、３７℃の組織培養でフルコンフルエンシーまで増殖させた。ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）の製品である増殖因子低減マトリゲル（登録商標）５０μＬを含む５０μＬ血清不含培地中、細胞（１×１０６）。次に、細胞を、２３ゲージニードルを用いて各マウスの肩甲骨の間に皮下注射した。
【０１７６】
得られた腫瘍を、電子デジタルカリパス（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ、日本、測定精度＋／−０．００１インチ）を用いて週２回測定し、平均腫瘍体積を式
長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ２）×０．５＝体積（ｍｍ３）
を用いて計算した。
【０１７７】
腫瘍が平均約２８５ｍｍ３に達した際に処置を開始し、マウスを各群７個体の４つの異なる群に無作為化した。総ての処置を全容量１００μｌで静脈内に（ｉ．ｖ．）投与した。総てのミニ細胞用量は、各タイプのミニ細胞１×１０９を含んだ。
【０１７８】
試験計画に関して、群１（対照）は無菌生理食塩水を受けた。群２（対照）は一用量当たりＩＦＮ−γ（０．５×１０４ＩＵ）を受けた。群３（対照）はＥＧＦＲミニ細胞Ｄｏｘを受けた。群４（試験）は一用量当たりＥＧＦＲミニ細胞ＤｏｘおよびＩＦＮ−γ（０．５×１０４ＩＵ）を受けた。
【０１７９】
結果（図２）は、ＥＧＦＲミニ細胞Ｄｏｘで処置したマウス（群３）は腫瘍の安定化を達成したことを明らかにした。対照的に、ＥＧＦＲミニ細胞ＤｏｘおよびＩＦＮ−γで処置したマウス（群４）は、合計６用量の後４３日までに有意性の高い腫瘍退縮を示した。ＩＦＮ−γ単独で処置したマウス（群２）は抗腫瘍有効性を示さず、生理食塩水処置群（群１）と同様に腫瘍が増殖した。
【０１８０】
実施例３．ＥＧＦＲミニ細胞ＤｏｘとＩＦＮ−γによる処置後のマウス異種移植片（ヒト乳癌−約１４５ｍｍ３の中サイズ腫瘍）における有意な腫瘍退縮
本実施例は、二重特異性リガンド標的化およびドキソルビシン封入無傷ミニ細胞とＩＦＮ−γによる併用処置が６週齢の雌無胸腺ヌードマウスに確立されたヒト乳房腫瘍異種移植片の退縮を果たし得ることを示す。
【０１８１】
上記のように、ミニ細胞を精製し、ドキソルビシンを封入し、抗Ｏ−多糖特異性と抗ＥＧＦＲ特異性を有する一本鎖二重特異性抗体を用いて標的化した。加えて、ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８；ＡＴＣＣ）をｎｕ／ｎｕマウスにおいて異種移植片として確立し、腫瘍体積を、この場合にも記載の通りに測定した。
【０１８２】
腫瘍が平均約１４５ｍｍ３に達した際に処置を開始し、マウスを各群７個体の４つの異なる群に無作為化した。総ての処置を全容量１００μｌでｉ．ｖ．投与した。総てのミニ細胞用量は、各タイプのミニ細胞１×１０９を含んだ。
【０１８３】
試験は次のように計画した：群１（対照）は無菌生理食塩水のみを受けた。群２（対照）は一用量当たりＩＦＮ−γ（０．５×１０４ＩＵ）を受けた。群３（対照）はＥＧＦＲミニ細胞Ｄｏｘを受けた。群４（試験）は一用量当たりＥＧＦＲミニ細胞ＤｏｘおよびＩＦＮ−γ（０．５×１０４ＩＵ）を受けた。
【０１８４】
結果は、図３に示されるように、ＥＧＦＲミニ細胞Ｄｏｘで処置したマウス（群３）は腫瘍の安定化を達成したが、おそらくはドキソルビシンに対する耐性の発達のために約２５日までに腫瘍が再び増殖し始めたことを明らかにした。対照的に、ＥＧＦＲミニ細胞ＤｏｘおよびＩＦＮ−γで処置したマウス（群４）は有意性の高い腫瘍退縮を示し、合計６用量の後３０日までにこれらの腫瘍は瘢痕組織により類似した。ＩＦＮ−γ単独で処置したマウス（群２）は抗腫瘍有効性を示さず、腫瘍は生理食塩水処置群（群１）と同様に増殖した。
【０１８５】
実施例４．ＥＧＦＲミニ細胞ＤｏｘおよびＩＦＮ−γで処置した後のマウス異種移植片（ヒト乳癌−約２５０ｍｍ３の大腫瘍）における有意な腫瘍退縮
この実施例は、二重特異性リガンド標的化およびドキソルビシン封入無傷ミニ細胞とＩＦＮ−γによる併用処置が、６週齢の雌無胸腺ヌードマウスに確立されたヒト乳房腫瘍異種移植片の大サイズの腫瘍（約２５０ｍｍ３）であっても退縮を果たし得ることを示す。
【０１８６】
上記のように、ミニ細胞を精製し、ドキソルビシンを封入し、抗Ｏ−多糖特性と抗ＥＧＦＲ特異性を有する一本鎖二重特異性抗体を用いて標的化した。ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）をｎｕ／ｎｕマウスにおいて異種移植片として確立し、腫瘍体積を、この場合にも上記の通りに測定した。
【０１８７】
腫瘍が平均約２５０ｍｍ３に達した際に処置を開始した。上記のように、マウスを各群７個体の４つの異なる群に無作為化した。ｉ．ｖ．投与およびミニ細胞の用量はここでも上記の通りとした。
【０１８８】
試験は次のように計画した。群１（対照）は無菌生理食塩水のみを受けた。群２（対照）は一用量当たりＩＦＮ−γ（０．５×１０４ＩＵ）を受けた。群３（対照）はＥＧＦＲミニ細胞Ｄｏｘを受けた。群４（試験）は一用量当たりＥＧＦＲミニ細胞ＤｏｘおよびＩＦＮ−γ（０．５×１０４ＩＵ）を受けた。
【０１８９】
結果は、図４に示されるように、ＥＧＦＲミニ細胞Ｄｏｘで処置したマウス（群３）は腫瘍退縮を達成したが、約２３日までに腫瘍が再び増殖し始めたことを明らかにし、前記のように、ドキソルビシン耐性の発達が可能性のある原因であった。他方、ＥＧＦＲミニ細胞ＤｏｘおよびＩＦＮ−γで処置したマウス（群４）は有意性の高い腫瘍退縮を示し、合計３用量の後に（すなわち、２８日までに）これらの腫瘍は瘢痕組織により類似した。ＩＦＮ−γ単独で処置したマウス（群２）は抗腫瘍有効性を示さず、腫瘍は生理食塩水処置群（群１）と同様に増殖した。
【０１９０】
実施例５．ＥＧＦＲミニ細胞ＤｏｘとＩＦＮ−γによる処置後のマウス異種移植片（ヒト乳癌−約２５０ｍｍ３〜６００ｍｍ３の極めて大きな腫瘍）における腫瘍退縮
本実施例は、二重特異性リガンド標的化およびドキソルビシン封入無傷ミニ細胞とＩＦＮ−γによる併用処置が、６週齢の雌無胸腺ヌードマウスに確立されたヒト乳房腫瘍異種移植片の極めて大サイズ（約２５０ｍｍ３〜６００ｍｍ３）の腫瘍であっても退縮を果たし得ることを示す。
【０１９１】
上記のように、ミニ細胞を精製し、ドキソルビシンを封入し、抗Ｏ−多糖特異性と抗ＥＧＦＲ特異性を有する一本鎖二重特異性抗体を用いて標的化した。ここでも記載のように、ヒト乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）細胞をｎｕ／ｎｕマウスにおいて異種移植片として確立し、腫瘍体積を測定した。
【０１９２】
腫瘍が約２５０ｍｍ３〜６００ｍｍ３に達した際に処置を開始した。個々のマウスをＥＧＦＲミニ細胞ＤｏｘとＩＦＮ−γ（一用量当たり０．５×１０４ＩＵ）で処置した。総ての処置を全容量１００μｌでｉ．ｖ．投与し、総てのミニ細胞用量は、各タイプのミニ細胞１×１０９を含んだ。
【０１９３】
結果を図５に示す。大サイズの腫瘍にもかかわらず、４個体のマウス総てが腫瘍退縮を達成した。これは、通常マウスを安楽死させるような極めて大きな腫瘍（約６００ｍｍ３）であっても、ＥＧＦＲミニ細胞ＤｏｘとＩＦＮ−γ（０．５×１０４ＩＵ）の組合せで効果的に処置可能であることを示す。
【０１９４】
実施例６．ＥＧＦＲミニ細胞Ｄｏｘと２種類の用量レベルのＩＦＮ−γによる処置後のマウス異種移植片（ヒト肺胞腺癌）における有意な腫瘍退縮
本実施例は、二重特異性リガンド標的化およびドキソルビシン封入無傷ミニ細胞と２種類の異なる用量レベルのＩＦＮ−γによる併用処置が、６週齢雌無胸腺ヌードマウスに確立されたヒト肺胞腺癌異種移植片の退縮を果たし得ることを示す。
【０１９５】
上記のように、ミニ細胞を精製し、ドキソルビシンを封入し、抗Ｏ−多糖特異性と抗ＥＧＦＲ特異性を有する一本鎖二重特異性抗体を用いて標的化した。ヒト肺胞腺癌（Ａ５４９）細胞をｎｕ／ｎｕマウスにおいて異種移植片として確立し、腫瘍体積を、この場合にも上記の通りに測定した。
【０１９６】
腫瘍が平均約１００ｍｍ３に達した際に処置を開始し、マウスを各群７個体の４つの異なる群に無作為化した。総ての処置を全容量１００μｌでｉ．ｖ．投与した。総てのミニ細胞用量は、各タイプのミニ細胞１×１０９を含んだ。
【０１９７】
群１（対照）は無菌生理食塩水を受けた。群２（対照）はＥＧＦＲミニ細胞Ｄｏｘ（週２回）を受けた。群３（試験）は一用量当たりＥＧＦＲミニ細胞ＤｏｘとＩＦＮ−γ（０．７５×１０４ＩＵ）を週２回受けた。群４（試験）は一用量当たりＥＧＦＲミニ細胞ＤｏｘとＩＦＮ−γ（０．５×１０４ＩＵ）を週３回受けた。
【０１９８】
図６に示すように、両用量（０．５×１０４ＩＵおよび０．７５×１０４ＩＵ；群３および４）のＥＧＦＲミニ細胞ＤｏｘおよびＩＦＮ−γで処置したマウスは腫瘍の安定化を達成した。対照的に、ＥＧＦＲミニ細胞Ｄｏｘで処置したマウス（群２）は抗腫瘍有効性を示さず、腫瘍は生理食塩水処置群（群１）と同様に増殖した。これらのデータは、通常、ＩＦＮ−γ処置単独またはＥＧＦＲミニ細胞Ｄｏｘ処置単独のいずれかに耐性のある腫瘍の処置において腫瘍の安定化を達成するためには、ＩＦＮ−γとＥＧＦＲミニ細胞Ｄｏｘを合わせることが両ＩＦＮ−γ用量レベルにおいて不可欠であったことを示す。    
本発明は以下の実施形態を包含する。   
[１]  対象において腫瘍を処置するための方法であって、複数の細菌由来無傷ミニ細胞または無傷死滅細菌細胞を含んでなり、そのそれぞれが抗新生物薬を包含しかつその表面に非食作用哺乳動物細胞表面受容体に特異性を有するリガンドを保持する第１の組成物と、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）または対象においてＩＦＮ−γの発現を増強する薬剤を含んでなる第２の組成物とを前記対象に投与することを含んでなる、方法。   
[２]  第２の組成物が精製されたＩＦＮ−γタンパク質を含んでなる、実施形態１に記載の方法。   
[３]  第２の組成物がウイルスワクチンを含んでなる、実施形態１に記載の方法。   
[４]  第２の組成物がＩＦＮ−γをコードする核酸を含んでなる、実施形態１に記載の方法。   
[５]  第１の組成物が約１０９〜約１０１０のミニ細胞または死滅細菌細胞を含んでなる、実施形態１〜４のいずれかに記載の方法。   
[６]  抗新生物薬が放射性核種である、実施形態１〜５のいずれかに記載の方法。   
[７]  抗新生物薬が化学療法薬である、実施形態１〜６のいずれかに記載の方法。   
[８]  化学療法薬が約９００ダルトン未満の分子量を有する小分子薬である、実施形態７に記載の方法。   
[９]  小分子薬が細胞傷害性である、実施形態８に記載の方法。   
[１０]  小分子薬がモルホリニルアントラサイクリン誘導体である、実施形態９に記載の方法。   
[１１]  小分子薬がＰＮＵ−１５９６８２である、実施形態１０に記載の方法。   
[１２]  前記抗新生物薬が機能性核酸または機能性核酸をコードするポリヌクレオチドである、実施形態１〜７のいずれかに記載の方法。   
[１３]  前記機能性核酸が、腫瘍細胞増殖、血管新生もしくは化学療法耐性を促進し、かつ／またはアポトーシスまたは細胞周期の停止を阻害する遺伝子を阻害する、実施形態１２に記載の方法。   
[１４]  前記機能性核酸がｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、またはリボザイムから選択される、実施形態１２に記載の方法。   
[１５]  複数の細菌由来無傷ミニ細胞または無傷死滅細菌細胞を含んでなり、そのそれぞれが抗新生物薬を包含しかつその表面に非食作用哺乳動物細胞表面受容体に特異性を有するリガンドを保持する第１の組成物と、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）または対象においてＩＦＮ−γの発現を増強する薬剤を含んでなる第２の組成物とを含んでなるパッケージ、製品、またはキット。   
[１６]  （ａ）それぞれ抗新生物薬を包含しかつその表面に非食作用哺乳動物細胞表面受容体に特異性を有するリガンドを保持する複数の細菌由来無傷ミニ細胞または無傷死滅細菌細胞と、（ｂ）インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）または対象においてＩＦＮ−γの発現を増強する薬剤とを含んでなる組成物。
【図１Ａ】
0006538031.tif 000004
【図１Ｂ】
0006538031.tif 000005
【図１Ｃ】
0006538031.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0006538031.tif 000010
【図６】
0006538031.tif 000011
【図７−１】
0006538031.tif 000012
【図７−２】
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