(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を浮遊培養し、胚様体を形成する胚様体形成工程と、
前記胚様体を浮遊培養し、中胚葉を誘導する中胚葉誘導工程と、
前記中胚葉誘導後の胚様体を浮遊培養し、心筋細胞を誘導する心筋細胞誘導工程とを含み、
前記心筋細胞誘導工程が、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理とを含み、
前記胚様体形成工程における培地が、第１の分化誘導培地に、ＲＯＣＫ阻害剤を加えた培地、及び一液式分化誘導培地に、ＲＯＣＫ阻害剤を加えた培地のいずれかであり、
前記中胚葉誘導工程における培地が、第２の分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル活性化物質を加えた培地、及び一液式分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル活性化物質を加えた培地のいずれかであり、
前記第１の心筋細胞誘導処理における培地が、第２の分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤、及びエストロゲン様作用物質を加えた培地、及び一液式分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤、及びエストロゲン様作用物質を加えた培地のいずれかであり、
前記第２の心筋細胞誘導処理における培地が、第２の分化誘導培地に、エストロゲン様作用物質を加えた培地、及び一液式分化誘導培地に、エストロゲン様作用物質を加えた培地のいずれかであり、
前記第１の分化誘導培地が、基礎培地に、インスリン、トランスフェリン、アルブミン、及び１−チオグリセロールを加えた培地であり、
前記第２の分化誘導培地が、イスコフ改変ダルベッコ培地に、アルブミン、ポリビニルアルコール、エタノラミン塩酸塩、亜セレン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン、ＤＬ−α−トコフェロール酢酸エステル、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、１−チオグリセロール、及びアスコルビン酸を加えた培地であり、
前記一液式分化誘導培地が、イスコフ改変ダルベッコ培地に、トランスフェリン、アルブミン、ポリビニルアルコール、エタノラミン塩酸塩、亜セレン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン、ＤＬ−α−トコフェロール酢酸エステル、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、１−チオグリセロール、及びアスコルビン酸を加えた培地であることを特徴とする多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法。
【請求項２】
胚様体形成工程における培地が、第１の分化誘導培地に、ＲＯＣＫ阻害剤を加えた培地であり、
中胚葉誘導工程における培地が、第２の分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル活性化物質を加えた培地であり、
第１の心筋細胞誘導処理における培地が、第２の分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤、及びエストロゲン様作用物質を加えた培地であり、
第２の心筋細胞誘導処理における培地が、第２の分化誘導培地に、エストロゲン様作用物質を加えた培地である請求項１に記載の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法。
【請求項３】
胚様体形成工程における培地が、一液式分化誘導培地に、ＲＯＣＫ阻害剤を加えた培地であり、
中胚葉誘導工程における培地が、一液式分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル活性化物質を加えた培地であり、
第１の心筋細胞誘導処理における培地が、一液式分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤、及びエストロゲン様作用物質を加えた培地であり、
第２の心筋細胞誘導処理における培地が、一液式分化誘導培地に、エストロゲン様作用物質を加えた培地である請求項１に記載の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法。
【請求項４】
第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間に、第２の分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、及びエストロゲン様作用物質を加えた培地、及び一液式分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、及びエストロゲン様作用物質を加えた培地のいずれかで培養する処理を含む請求項１から３のいずれかに記載の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法。
【請求項５】
第１の分化誘導培地が、更に、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン・Ｈ２Ｏ、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、チアミン、還元型グルタチオン、アスコルビン酸−２−２ＰＯ４のマグネシウム塩、ＡｇＮＯ３、ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、Ｂａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２、３ＣｄＳＯ４・８Ｈ２Ｏ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、Ｃｒ２（ＳＯ４）３・Ｈ２Ｏ、ＧｅＯ２、Ｎａ２ＳｅＯ３、ＫＢｒ、ＫＩ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＮａＦ、Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ、ＮａＶＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、ＲｂＣｌ、ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、及びＺｒＯＣｌ２・８Ｈ２Ｏを含み、
第２の分化誘導培地が、更に、Ｌ−グルタミン、及びトランスフェリンを含み、
一液式分化誘導培地が、更に、グリシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、チアミン、還元型グルタチオン、アスコルビン酸−２−２ＰＯ４のマグネシウム塩、ＡｇＮＯ３、ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、Ｂａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２、３ＣｄＳＯ４・８Ｈ２Ｏ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、Ｃｒ２（ＳＯ４）３・Ｈ２Ｏ、ＧｅＯ２、Ｎａ２ＳｅＯ３、ＫＢｒ、ＫＩ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＮａＦ、Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ、ＮａＶＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、ＲｂＣｌ、ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、及びＺｒＯＣｌ２・８Ｈ２Ｏを含む請求項１から４のいずれかに記載の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法。
【請求項６】
多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するための培地に添加する分化誘導調節剤であって、エストロゲン様作用物質を含むことを特徴とする分化誘導調節剤。
【請求項７】
多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するための培地であって、
アルブミン及び１−チオグリセロールの少なくともいずれかを含むことを特徴とする培地添加剤と、
請求項６に記載の分化誘導調節剤とを含み、
基礎培地が、ダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物Ｆ−１２ハム、ダルベッコ改変イーグル培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、及びαＭＥＭ培地からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする培地。
【請求項８】
前記培地添加剤が、更に、トランスフェリン、インスリン、ポリビニルアルコール、エタノラミン塩酸塩、亜セレン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン、ＤＬ−α−トコフェロール酢酸エステル、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、及びアスコルビン酸からなる群から選択される少なくとも１種を含む請求項７に記載の培地。
【請求項９】
前記培地添加剤が、更に、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン・Ｈ２Ｏ、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、チアミン、還元型グルタチオン、アスコルビン酸−２−２ＰＯ４のマグネシウム塩、ＡｇＮＯ３、ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、Ｂａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２、３ＣｄＳＯ４・８Ｈ２Ｏ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、Ｃｒ２（ＳＯ４）３・Ｈ２Ｏ、ＧｅＯ２、Ｎａ２ＳｅＯ３、ＫＢｒ、ＫＩ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＮａＦ、Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ、ＮａＶＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、ＲｂＣｌ、ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、及びＺｒＯＣｌ２・８Ｈ２Ｏからなる群から選択される少なくとも１種を含む請求項７又は８に記載の培地。
【請求項１０】
多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するための培地作製用キットであって、
アルブミン及び１−チオグリセロールの少なくともいずれかを含むことを特徴とする培地添加剤と、
請求項６に記載の分化誘導調節剤と、
ダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物Ｆ−１２ハム、ダルベッコ改変イーグル培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、及びαＭＥＭ培地からなる群から選択される少なくとも１種の基礎培地とを含むことを特徴とする培地作製用キット。
【請求項１１】
請求項７〜９のいずれか一項に記載の培地、及び請求項１０に記載の培地作製用キットの少なくともいずれかを含むことを特徴とする多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するためのキット。
【請求項１２】
請求項１から５のいずれかに記載の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法を教示する説明書を含む請求項１１に記載の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法、並びに該方法に好適な多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するための培地に添加する培地添加剤、多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するための培地に添加する分化誘導調節剤、多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するための培地、多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するための培地作製用キット、及び多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、多能性幹細胞の１つである人工多能性幹細胞（以下、「ｉＰＳ細胞」と称することがある）の研究が進められている。例えば、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞は、再生医療、創薬研究、薬物安全性試験などの様々な用途への応用が期待されている。
【０００３】
再生医療では、例えば、自己のｉＰＳ細胞やバンキングされたｉＰＳ細胞から分化誘導された心筋細胞を心臓に移植することにより、失われた心臓の機能を回復させることが期待されている。また、創薬研究では、例えば、健常者のｉＰＳ細胞や難病患者から作製された疾患特異的ｉＰＳ細胞から分化誘導された心筋細胞を解析やスクリーニングに利用し、循環器疾患や難病に対する新薬を開発することが期待されている。また、薬物安全性試験では、開発中もしくは開発された薬の心毒性のスクリーニングのために心筋細胞を用いたりすることが期待されている。
【０００４】
再生医療、創薬研究、薬物安全性試験などの様々な用途に心筋細胞が産業利用されるためには、多能性幹細胞から、大量に、安定して心筋細胞を得る必要があり、そのためには心筋細胞を分化誘導する方法が、技術的に容易で少ない手順から構成されており、かつ安価な方法でなければならない。また、前記心筋細胞は、大きく明瞭なプラトー相を有する活動電位を示し、大きなピークカリウム電流（３００ｐＡ以上）、ピークカルシウム電流（１ｎＡ以上）、ピークナトリウム電流（６．５ｎＡ以上）を安定して示す、高品質なものであることが好ましい。
【０００５】
これまでに、胚様体形成法で心筋細胞を分化誘導する方法が提案されている（例えば、非特許文献１参照）。
前記提案では、フィーダー細胞上で培養されているｉＰＳ細胞を剥離した後、一旦フィーダー細胞が無い状態で平面培養し、再度剥離した後に浮遊培養を行っている（図１参照）。また、前記提案では、浮遊培養時の培地として、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）３４（インビトロジェン社製）に、培地添加剤として、Ｌ−グルタミンを２ｍＭ、トランスフェリンを１５０μｇ／ｍＬ、アスコルビン酸を５０μｇ／ｍＬ、１−チオグリセロールを５０μｇ／ｍＬ加えた培地を用い、分化誘導調節剤として、浮遊培養開始時から１日目までは骨形成タンパク質４（以下、「ＢＭＰ４」と称することがある）を０．５ｎｇ／ｍＬ添加し、１日目から４日目まではＢＭＰ４を１０ｎｇ／ｍＬ、塩基性線維芽細胞成長因子（以下、「ｂＦＧＦ」と称することがある）を５ｎｇ／ｍＬ、及びアクチビンＡを６ｎｇ／ｍＬ添加し、４日目から８日目までは血管内皮増殖因子（以下、「ＶＥＧＦ」と称することがある）を１０ｎｇ／ｍＬ、及び分泌タンパク質Ｄｉｃｋｋｏｐｆ１（以下、「Ｄｋｋ−１」と称することがある）を１５０ｎｇ／ｍＬを添加し、８日目以降はＶＥＧＦを１０ｎｇ／ｍＬ、Ｄｋｋ−１を１５０ｎｇ／ｍＬ、及びｂＦＧＦを５ｎｇ／ｍＬ添加することで心筋細胞への分化を誘導している。
前記提案によれば、浮遊培養（三次元培養）により心筋細胞へ分化誘導することができるので、大量に心筋細胞を得ることができると考えられる。
しかしながら、前記提案では、高価で製造業者間による品質の差やロット間差の大きいサイトカイン（アクチビンＡ、ＢＭＰ４、Ｄｋｋ−１、ｂＦＧＦ、及びＶＥＧＦ）が用いられており、また、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）３４には、毒物である２−メルカプトエタノール、成分が明らかでない脂質成分であるＨｕｍａｎ−ＥｘＣｙｔｅ、及び高価でロット間差が大きいヒト血清アルブミンが用いられているため、安全性に優れ、安定して、安価に心筋細胞を得ることができないという問題がある。
【０００６】
また、サイトカインを使わずに心筋細胞を分化誘導する方法も提案されている（例えば、非特許文献２参照）。
前記提案では、フィーダーレス培養後、単細胞に単離し、その後、高密度で播種し、接着培養を行っている（図２参照）。
前記提案によれば、高価でロット間差の大きいサイトカインではなく、ＣＨＩＲ９９０２１やＩＷＰ２などの低分子化合物を用いているため、安定に、安価に心筋細胞を得ることができると考えられる。
しかしながら、前記提案は、接着培養により行われるものであり、大量に心筋細胞を得ることが困難であるという問題があり、また、フィーダーレス培養に馴化することが可能な細胞でなければ分化させることが困難であるという問題や、培養液を交換するタイミングが非常に厳密でかつ培養液を交換する際に細胞が剥がれやすいなど技術的に困難であるという問題がある。
【０００７】
また、接着培養と、浮遊培養とを併用し、心筋細胞を分化誘導する方法も提案されている（例えば、非特許文献３参照）。
前記提案では、フィーダー細胞培養後、浮遊培養を行い、その後、接着培養を介して、更に浮遊培養を行っている（図３参照）。
前記提案によれば、高価でロット間差の大きいサイトカインではなく、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、ＫＹ０２１１１などの低分子化合物を用いているため、安定に、安価に心筋細胞を得ることができると考えられる。
しかしながら、前記提案は、接着培養と、浮遊培養とを併用するため、技術的に困難な複数の手順から構成されており、非常に煩雑であるという問題がある。
【０００８】
したがって、高品質な心筋細胞を、大量に、安定して、安価に、かつ簡便に製造することが可能な心筋細胞の分化誘導方法の開発が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｙａｎｇ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．、  Ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ｆｒｏｍ  ａ  ＫＤＲ＋  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ−ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．、  Ｎａｔｕｒｅ．、  ２００８  Ｍａｙ  ２２；４５３（７１９４）：５２４−８
【非特許文献２】Ｌｉａｎ  Ｘ，  ｅｔ  ａｌ．、  Ｒｏｂｕｓｔ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．、  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．、  ２０１２  Ｊｕｌｙ  ３；１０９（２７）：Ｅ１８４８−５７
【非特許文献３】Ｍｉｎａｍｉ  Ｉ，  ｅｔ  ａｌ．、  Ａ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｕｎｄｅｒ  ｄｅｆｉｎｅｄ，  ｃｙｔｏｋｉｎｅ−  ａｎｄ  ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．、  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．、  ２０１２  Ｎｏｖ  ２９；２（５）：１４４８−６０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、高品質な心筋細胞を、大量に、安定して、安価に、かつ簡便に製造することが可能な多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法、並びに該方法に好適な培地添加剤、分化誘導調節剤、培地、培地作製用キット、及び多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するためのキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  多能性幹細胞を浮遊培養し、胚様体を形成する胚様体形成工程と、
前記胚様体を浮遊培養し、中胚葉を誘導する中胚葉誘導工程と、
前記中胚葉誘導後の胚様体を浮遊培養し、心筋細胞を誘導する心筋細胞誘導工程とを含み、
前記心筋細胞誘導工程が、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理とを含み、
前記胚様体形成工程における培地が、第１の分化誘導培地に、ＲＯＣＫ阻害剤を加えた培地、及び一液式分化誘導培地に、ＲＯＣＫ阻害剤を加えた培地のいずれかであり、
前記中胚葉誘導工程における培地が、第２の分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル活性化物質を加えた培地、及び一液式分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル活性化物質を加えた培地のいずれかであり、
前記第１の心筋細胞誘導処理における培地が、第２の分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、トランスフォーミング増殖因子β（以下、「ＴＧＦ−β」と称することがある）シグナル阻害剤、及びエストロゲン様作用物質を加えた培地、及び一液式分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤、及びエストロゲン様作用物質を加えた培地のいずれかであり、
前記第２の心筋細胞誘導処理における培地が、第２の分化誘導培地に、エストロゲン様作用物質を加えた培地、及び一液式分化誘導培地に、エストロゲン様作用物質を加えた培地のいずれかであり、
前記第１の分化誘導培地が、基礎培地に、インスリン、トランスフェリン、アルブミン、及び１−チオグリセロールを加えた培地であり、
前記第２の分化誘導培地が、イスコフ改変ダルベッコ培地に、アルブミン、ポリビニルアルコール、エタノラミン塩酸塩、亜セレン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン、ＤＬ−α−トコフェロール酢酸エステル、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、１−チオグリセロール、及びアスコルビン酸を加えた培地であり、
前記一液式分化誘導培地が、イスコフ改変ダルベッコ培地に、トランスフェリン、アルブミン、ポリビニルアルコール、エタノラミン塩酸塩、亜セレン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン、ＤＬ−α−トコフェロール酢酸エステル、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、１−チオグリセロール、及びアスコルビン酸を加えた培地であることを特徴とする多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法である。
＜２＞  多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するための培地に添加する培地添加剤であって、
アルブミン及び１−チオグリセロールの少なくともいずれかを含むことを特徴とする培地添加剤である。
＜３＞  多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するための培地に添加する分化誘導調節剤であって、
ＲＯＣＫ阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化物質、Ｗｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤、及びエストロゲン様作用物質からなる群から選択される少なくとも１種を含むことを特徴とする分化誘導調節剤である。
＜４＞  多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するための培地であって、
前記＜２＞に記載の培地添加剤と、
前記＜３＞に記載の分化誘導調節剤とを含み、
基礎培地が、ダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物Ｆ−１２ハム、ダルベッコ改変イーグル培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、及びαＭＥＭ培地からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする培地である。
＜５＞  多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するための培地作製用キットであって、
前記＜２＞に記載の培地添加剤と、
前記＜３＞に記載の分化誘導調節剤と、
ダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物Ｆ−１２ハム、ダルベッコ改変イーグル培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、及びαＭＥＭ培地からなる群から選択される少なくとも１種の基礎培地とを含むことを特徴とする培地作製用キットである。
＜６＞  前記＜４＞に記載の培地、及び前記＜５＞に記載の培地作製用キットの少なくともいずれかを含むことを特徴とする多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するためのキットである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、高品質な心筋細胞を、大量に、安定して、安価に、かつ簡便に製造することが可能な多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法、並びに該方法に好適な培地添加剤、分化誘導調節剤、培地、培地作製用キット、及び多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するためのキットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、従来の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の一例を説明する図である。
【図２】図２は、従来の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の他の一例を説明する図である。
【図３】図３は、従来の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の他の一例を説明する図である。
【図４】図４は、本発明の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の一例を説明する図である。
【図５】図５は、試験例１の結果を示す図である。
【図６】図６は、試験例２におけるクローン１の結果を示す図である。
【図７】図７は、試験例２におけるクローン２の結果を示す図である。
【図８】図８は、試験例３の結果を示す図である。
【図９】図９は、試験例４におけるクローン１の結果を示す図である。
【図１０】図１０は、試験例４におけるクローン２の結果を示す図である。
【図１１】図１１は、試験例５の結果を示す図−１である。
【図１２】図１２は、試験例５の結果を示す図−２である。
【図１３】図１３は、試験例６の結果を示す図である。
【図１４】図１４は、試験例７におけるｂＦＧＦを添加した場合の結果を示す図である。
【図１５】図１５は、試験例７におけるＣＨＩＲ９９０２１を添加した場合の結果を示す図である。
【図１６】図１６は、試験例８の結果を示す図である。
【図１７】図１７は、試験例９の結果を示す図である。
【図１８】図１８は、試験例１０の結果を示す図である。
【図１９】図１９は、試験例１１の結果を示す図である。
【図２０】図２０は、試験例１２の結果を示す図である。
【図２１】図２１は、試験例１３の結果を示す図である。
【図２２】図２２は、試験例１４の結果を示す図である。
【図２３】図２３は、試験例１５の結果を示す図である。
【図２４】図２４は、試験例１６の拍動している胚様体の割合を測定した結果を示す図である。
【図２５Ａ】図２５Ａは、試験例１６のパッチクランプ法で測定した活動電位の一例を示す図である。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、試験例１６のパッチクランプ法で測定したナトリウム電流の一例を示す図である。
【図２５Ｃ】図２５Ｃは、試験例１６のパッチクランプ法で測定したカリウム電流の一例を示す図である。
【図２５Ｄ】図２５Ｄは、試験例１６のパッチクランプ法で測定したカルシウム電流の一例を示す図である。
【図２６】図２６は、これまでに報告されているパッチクランプ法で測定した活動電位の結果の一例を示す図である。
【図２７】図２７は、これまでに報告されているパッチクランプ法で測定した活動電位の結果の他の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法）
本発明の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法は、胚様体形成工程と、中胚葉誘導工程と、心筋細胞誘導工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００１５】
本発明の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の一例を図４に示す。
図４中、Ｄａｙ  ０〜１は、前記胚様体形成工程であり（胚様体形成工程開始０日目〜１日目）、Ｄａｙ  １〜３は、前記中胚葉誘導工程であり（胚様体形成工程開始１日目〜３日目）、Ｄａｙ  ３〜６は、前記心筋細胞誘導工程における第１の心筋細胞誘導処理であり（胚様体形成工程開始３日目〜６日目）、Ｄａｙ  ６以降は、前記心筋細胞誘導工程における第２の心筋細胞誘導処理である（胚様体形成工程開始６日目以降）。
また、図４中、Ｙ２７６３２、ＣＨＩＲ９９０２１、ＩＷＰ２、ＳＢ４３１５４２、及びエストラジオール（Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）は、前記各工程の培地に添加する分化誘導調節剤の一例を示す。
【００１６】
＜胚様体形成工程＞
前記胚様体形成工程は、多能性幹細胞を浮遊培養し、胚様体を形成する工程である。
【００１７】
＜＜多能性幹細胞＞＞
前記多能性幹細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞などが挙げられる。これらの中でも、ｉＰＳ細胞が好ましい。
前記多能性幹細胞の種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００１８】
前記多能性幹細胞の調製方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、後述するフィーダー細胞培養工程により未分化状態で維持されている多能性幹細胞をコロニー状に解離したものを前記胚様体形成工程に用いることができる。
【００１９】
＜＜培地＞＞
前記胚様体形成工程における培地（以下、「胚様体形成工程用培地」、「胚様体形成工程用培養液」と称することがある）は、第１の分化誘導培地に、ＲＯＣＫ阻害剤を加えた培地、及び一液式分化誘導培地に、ＲＯＣＫ阻害剤を加えた培地のいずれかであり、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００２０】
−第１の分化誘導培地−
前記第１の分化誘導培地（以下、「第一培地」と称することがある）は、基礎培地に、培地添加剤（以下、「第１の分化誘導培地用培地添加剤」と称することがある）を加えた培地であり、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００２１】
−−基礎培地−−
前記第１の分化誘導培地における基礎培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物Ｆ−１２ハム（以下、「ＤＭＥＭ／Ｆ１２」と称することがある）、イスコフ改変ダルベッコ培地（以下、「ＩＭＤＭ」と称することがある）、ダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）（以下、「ＤＭＥＭ（高グルコース）」と称することがある）、ダルベッコ改変イーグル培地（低グルコース）（以下、「ＤＭＥＭ（低グルコース）」と称することがある）、αＭＥＭ培地などが挙げられる。これらの中でも、心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＩＭＤＭが好ましく、ＤＭＥＭ／Ｆ１２がより好ましい。
前記ＤＭＥＭは、高グルコースであってもよいし、低グルコースであってもよい。
前記基礎培地は、市販品を用いてもよいし、適宜調製したものを用いてもよい。
【００２２】
−−第１の分化誘導培地用培地添加剤−−
前記第１の分化誘導培地用培地添加剤は、インスリンと、トランスフェリンと、アルブミンと、１−チオグリセロールとを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００２３】
前記第１の分化誘導培地におけるインスリンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌが好ましく、５ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００２４】
前記第１の分化誘導培地におけるトランスフェリンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌが好ましく、２ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００２５】
前記第１の分化誘導培地におけるアルブミンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、４，０００ｍｇ／Ｌ〜１６，０００ｍｇ／Ｌが好ましく、６，０００ｍｇ／Ｌ〜１４，０００ｍｇ／Ｌがより好ましく、８，０００ｍｇ／Ｌ〜１２，０００ｍｇ／Ｌが特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
前記アルブミンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト血清アルブミン、牛血清アルブミン、リコンビナントヒトアルブミン、リコンビナント牛アルブミンなどが挙げられる。
【００２６】
前記第１の分化誘導培地における１−チオグリセロールの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２０ｍｇ／Ｌ〜８０ｍｇ／Ｌが好ましく、３０ｍｇ／Ｌ〜７０ｍｇ／Ｌがより好ましく、４０ｍｇ／Ｌ〜６０ｍｇ／Ｌが特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００２７】
前記第１の分化誘導培地用培地添加剤におけるその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン・Ｈ２Ｏ、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、チアミン、還元型グルタチオン、アスコルビン酸−２−２ＰＯ４のマグネシウム塩、ＡｇＮＯ３、ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、Ｂａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２、３ＣｄＳＯ４・８Ｈ２Ｏ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、Ｃｒ２（ＳＯ４）３・Ｈ２Ｏ、ＧｅＯ２、Ｎａ２ＳｅＯ３、ＫＢｒ、ＫＩ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＮａＦ、Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ、ＮａＶＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、ＲｂＣｌ、ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、及びＺｒＯＣｌ２・８Ｈ２Ｏを含むことが好ましい。
【００２８】
前記第１の分化誘導培地におけるグリシンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌが好ましく、１０ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００２９】
前記第１の分化誘導培地におけるＬ−アラニンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌが好ましく、５ｍｇ／Ｌ〜１５ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００３０】
前記第１の分化誘導培地におけるＬ−アスパラギン・Ｈ２Ｏの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌが好ましく、１０ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００３１】
前記第１の分化誘導培地におけるＬ−アスパラギン酸の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌが好ましく、１０ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００３２】
前記第１の分化誘導培地におけるＬ−グルタミンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５０ｍｇ／Ｌ〜１，０００ｍｇ／Ｌが好ましく、１００ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００３３】
前記第１の分化誘導培地におけるＬ−グルタミン酸の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌが好ましく、１０ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００３４】
前記第１の分化誘導培地におけるＬ−ヒスチジンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５ｍｇ／Ｌ〜３００ｍｇ／Ｌが好ましく、１０ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００３５】
前記第１の分化誘導培地におけるＬ−イソロイシンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５０ｍｇ／Ｌ〜４，０００ｍｇ／Ｌが好ましく、１００ｍｇ／Ｌ〜１，０００ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００３６】
前記第１の分化誘導培地におけるＬ−メチオニンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５ｍｇ／Ｌ〜２５０ｍｇ／Ｌが好ましく、１０ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００３７】
前記第１の分化誘導培地におけるＬ−フェニルアラニンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌが好ましく、１０ｍｇ／Ｌ〜４００ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００３８】
前記第１の分化誘導培地におけるＬ−プロリンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１ｍｇ／Ｌ〜１，２００ｍｇ／Ｌが好ましく、１０ｍｇ／Ｌ〜１，０００ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００３９】
前記第１の分化誘導培地におけるＬ−ヒドロキシプロリンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１ｍｇ／Ｌ〜６０ｍｇ／Ｌが好ましく、５ｍｇ／Ｌ〜４０ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００４０】
前記第１の分化誘導培地におけるＬ−セリンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１ｍｇ／Ｌ〜３００ｍｇ／Ｌが好ましく、１０ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００４１】
前記第１の分化誘導培地におけるＬ−スレオニンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０ｍｇ／Ｌ〜６５０ｍｇ／Ｌが好ましく、１００ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００４２】
前記第１の分化誘導培地におけるＬ−トリプトファンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２ｍｇ／Ｌ〜１５０ｍｇ／Ｌが好ましく、２０ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００４３】
前記第１の分化誘導培地におけるＬ−チロシンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌが好ましく、１０ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００４４】
前記第１の分化誘導培地におけるＬ−バリンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５ｍｇ／Ｌ〜６５０ｍｇ／Ｌが好ましく、１０ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００４５】
前記第１の分化誘導培地におけるチアミンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１ｍｇ／Ｌ〜２５ｍｇ／Ｌが好ましく、２ｍｇ／Ｌ〜１５ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００４６】
前記第１の分化誘導培地における還元型グルタチオンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１ｍｇ／Ｌ〜２５ｍｇ／Ｌが好ましく、１．５ｍｇ／Ｌ〜１５ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００４７】
前記第１の分化誘導培地におけるアスコルビン酸−２−２ＰＯ４のマグネシウム塩の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１ｍｇ／Ｌ〜２５０ｍｇ／Ｌが好ましく、１０ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００４８】
前記第１の分化誘導培地におけるＡｇＮＯ３の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００００００８ｍｇ／Ｌ〜０．００８ｍｇ／Ｌが好ましく、０．０００００８ｍｇ／Ｌ〜０．０００８ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００４９】
前記第１の分化誘導培地におけるＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００００１５ｍｇ／Ｌ〜０．００１５ｍｇ／Ｌが好ましく、０．０００１５ｍｇ／Ｌ〜０．００１５ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００５０】
前記第１の分化誘導培地におけるＢａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００００６ｍｇ／Ｌ〜０．００６ｍｇ／Ｌが好ましく、０．０００６ｍｇ／Ｌ〜０．００３ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００５１】
前記第１の分化誘導培地における３ＣｄＳＯ４・８Ｈ２Ｏの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００００５ｍｇ／Ｌ〜０．０５ｍｇ／Ｌが好ましく、０．０００５ｍｇ／Ｌ〜０．０４ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００５２】
前記第１の分化誘導培地におけるＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００００４ｍｇ／Ｌ〜０．００４ｍｇ／Ｌが好ましく、０．０００４ｍｇ／Ｌ〜０．００３ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００５３】
前記第１の分化誘導培地におけるＣｒ２（ＳＯ４）３・Ｈ２Ｏの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００００００２５ｍｇ／Ｌ〜０．００２５ｍｇ／Ｌが好ましく、０．０００００２５ｍｇ／Ｌ〜０．００１ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００５４】
前記第１の分化誘導培地におけるＧｅＯ２の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０００００９ｍｇ／Ｌ〜０．０００９ｍｇ／Ｌが好ましく、０．００００９ｍｇ／Ｌ〜０．０００８ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００５５】
前記第１の分化誘導培地におけるＮａ２ＳｅＯ３の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０００７ｍｇ／Ｌ〜０．０７ｍｇ／Ｌが好ましく、０．００１ｍｇ／Ｌ〜０．０１ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００５６】
前記第１の分化誘導培地におけるＫＢｒの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００００００９ｍｇ／Ｌ〜０．０００９ｍｇ／Ｌが好ましく、０．０００００９ｍｇ／Ｌ〜０．０００５ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００５７】
前記第１の分化誘導培地におけるＫＩの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００００１ｍｇ／Ｌ〜０．００１ｍｇ／Ｌが好ましく、０．００００５ｍｇ／Ｌ〜０．０００８ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００５８】
前記第１の分化誘導培地におけるＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０００００４ｍｇ／Ｌ〜０．００４ｍｇ／Ｌが好ましく、０．００００４ｍｇ／Ｌ〜０．００１ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００５９】
前記第１の分化誘導培地におけるＮａＦの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００００６ｍｇ／Ｌ〜０．００６ｍｇ／Ｌが好ましく、０．０００６ｍｇ／Ｌ〜０．００５ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００６０】
前記第１の分化誘導培地におけるＮａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００１ｍｇ／Ｌ〜１ｍｇ／Ｌが好ましく、０．０１ｍｇ／Ｌ〜０．５ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００６１】
前記第１の分化誘導培地におけるＮａＶＯ３の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０００００５ｍｇ／Ｌ〜０．００５ｍｇ／Ｌが好ましく、０．００００５ｍｇ／Ｌ〜０．００４ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００６２】
前記第１の分化誘導培地における（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００００８ｍｇ／Ｌ〜０．０８ｍｇ／Ｌが好ましく、０．０００８ｍｇ／Ｌ〜０．０５ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００６３】
前記第１の分化誘導培地におけるＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０００００２５ｍｇ／Ｌ〜０．０００２５ｍｇ／Ｌが好ましく、０．００００２５ｍｇ／Ｌ〜０．０００２５ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００６４】
前記第１の分化誘導培地におけるＲｂＣｌの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００００００９ｍｇ／Ｌ〜０．００９ｍｇ／Ｌが好ましく、０．０００００９ｍｇ／Ｌ〜０．００５ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００６５】
前記第１の分化誘導培地におけるＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０００００１ｍｇ／Ｌ〜０．００１ｍｇ／Ｌが好ましく、０．００００１ｍｇ／Ｌ〜０．０００１ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００６６】
前記第１の分化誘導培地におけるＺｒＯＣｌ２・８Ｈ２Ｏの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００００７ｍｇ／Ｌ〜０．００７ｍｇ／Ｌが好ましく、０．０００７ｍｇ／Ｌ〜０．００６ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００６７】
前記第１の分化誘導培地用培地添加剤は、市販品を用いてもよいし、化学合成したものを用いてもよい。
【００６８】
前記第１の分化誘導培地用培地添加剤は、各成分を含む１剤として培地に添加してもよいし、成分ごとに別々の剤として培地に添加してもよいし、任意の複数の成分を含む剤として培地に添加してもよい。
【００６９】
−一液式分化誘導培地−
前記一液式分化誘導培地（以下、「一液式培地」と称することがある）は、ＩＭＤＭに、培地添加剤（以下、「一液式分化誘導培地用培地添加剤」と称することがある）を加えた培地であり、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００７０】
−−基礎培地−−
前記一液式分化誘導培地における基礎培地は、ＩＭＤＭである。
前記基礎培地は、市販品を用いてもよいし、適宜調製したものを用いてもよい。
【００７１】
−−一液式分化誘導培地用培地添加剤−−
前記一液式分化誘導培地用培地添加剤は、トランスフェリンと、アルブミンと、ポリビニルアルコールと、エタノラミン塩酸塩と、亜セレン酸ナトリウムと、ヒドロコルチゾンと、ＤＬ−α−トコフェロール酢酸エステルと、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインと、１−チオグリセロールと、アスコルビン酸とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００７２】
前記一液式分化誘導培地におけるトランスフェリンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１ｍｇ／Ｌ〜１５０ｍｇ／Ｌが好ましく、２ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌがより好ましく、３ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌが特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００７３】
前記一液式分化誘導培地におけるアルブミンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５００ｍｇ／Ｌ超８，０００ｍｇ／Ｌ以下が好ましく、１，５００ｍｇ／Ｌ超７，０００ｍｇ／Ｌ以下がより好ましく、３，０００ｍｇ／Ｌ超６，０００ｍｇ／Ｌ以下が特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
前記アルブミンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト血清アルブミン、牛血清アルブミン、リコンビナントヒトアルブミン、リコンビナント牛アルブミンなどが挙げられる。
【００７４】
前記一液式分化誘導培地におけるポリビニルアルコールの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５００ｍｇ／Ｌ超４，０００ｍｇ／Ｌ以下が好ましく、６００ｍｇ／Ｌ超２,０００ｍｇ／Ｌがより好ましく、８００ｍｇ／Ｌ超１,５００ｍｇ／Ｌ以下が特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
前記ポリビニルアルコールの重量平均分子量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３０，０００〜７０，０００が好ましい。
【００７５】
前記一液式分化誘導培地におけるポリビニルアルコールの含有量と、アルブミンの含有量との組合せとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ポリビニルアルコールの含有量が５００ｍｇ／Ｌ〜１，５００ｍｇ／Ｌの場合は、アルブミンの含有量は、３，０００ｍｇ／Ｌ超が好ましく、ポリビニルアルコールの含有量が４，０００ｍｇ／Ｌの場合は、アルブミンの含有量は、５００ｍｇ／Ｌ以上が好ましい。
【００７６】
前記一液式分化誘導培地におけるエタノラミン塩酸塩の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２ｍｇ／Ｌ〜１８ｍｇ／Ｌが好ましく、５ｍｇ／Ｌ〜１５ｍｇ／Ｌがより好ましく、７ｍｇ／Ｌ〜１２ｍｇ／Ｌが特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００７７】
前記一液式分化誘導培地における亜セレン酸ナトリウムの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００２ｍｇ／Ｌ〜０．００８ｍｇ／Ｌが好ましく、０．００３ｍｇ／Ｌ〜０．００７ｍｇ／Ｌがより好ましく、０．００４ｍｇ／Ｌ〜０．００６ｍｇ／Ｌが特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００７８】
前記一液式分化誘導培地におけるヒドロコルチゾンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０２ｍｇ／Ｌ〜０．０８ｍｇ／Ｌが好ましく、０．０３ｍｇ／Ｌ〜０．０７ｍｇ／Ｌがより好ましく、０．０４ｍｇ／Ｌ〜０．０６ｍｇ／Ｌが特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００７９】
前記一液式分化誘導培地におけるＤＬ−α−トコフェロール酢酸エステルの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００１ｍｇ／Ｌ〜０．００８ｍｇ／Ｌが好ましく、０．００５ｍｇ／Ｌ〜０．０４ｍｇ／Ｌがより好ましく、０．０１ｍｇ／Ｌ〜０．０３ｍｇ／Ｌが特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００８０】
前記一液式分化誘導培地におけるＮ−アセチル−Ｌ−システインの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５００ｍｇ／Ｌ〜３，０００ｍｇ／Ｌが好ましく、１，０００ｍｇ／Ｌ〜２，５００ｍｇ／Ｌがより好ましく、１，５００ｍｇ／Ｌ〜２，０００ｍｇ／Ｌが特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００８１】
前記一液式分化誘導培地における１−チオグリセロールの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２０ｍｇ／Ｌ〜８０ｍｇ／Ｌが好ましく、３０ｍｇ／Ｌ〜７０ｍｇ／Ｌがより好ましく、４０ｍｇ／Ｌ〜６０ｍｇ／Ｌが特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００８２】
前記一液式分化誘導培地におけるアスコルビン酸の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２０ｍｇ／Ｌ〜８０ｍｇ／Ｌが好ましく、３０ｍｇ／Ｌ〜７０ｍｇ／Ｌがより好ましく、４０ｍｇ／Ｌ〜６０ｍｇ／Ｌが特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００８３】
前記一液式分化誘導培地用培地添加剤におけるその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、グリシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、チアミン、還元型グルタチオン、アスコルビン酸−２−２ＰＯ４のマグネシウム塩、ＡｇＮＯ３、ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、Ｂａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２、３ＣｄＳＯ４・８Ｈ２Ｏ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、Ｃｒ２（ＳＯ４）３・Ｈ２Ｏ、ＧｅＯ２、Ｎａ２ＳｅＯ３、ＫＢｒ、ＫＩ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＮａＦ、Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ、ＮａＶＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、ＲｂＣｌ、ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、及びＺｒＯＣｌ２・８Ｈ２Ｏを含むことが好ましい。
【００８４】
前記一液式分化誘導培地におけるグリシンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌが好ましく、１０ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００８５】
前記一液式分化誘導培地におけるＬ−グルタミンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５０ｍｇ／Ｌ〜１，０００ｍｇ／Ｌが好ましく、１００ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００８６】
前記一液式分化誘導培地におけるＬ−ヒスチジンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５ｍｇ／Ｌ〜３００ｍｇ／Ｌが好ましく、１０ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００８７】
前記一液式分化誘導培地におけるＬ−イソロイシンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５０ｍｇ／Ｌ〜４，０００ｍｇ／Ｌが好ましく、１００ｍｇ／Ｌ〜１，０００ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００８８】
前記一液式分化誘導培地におけるＬ−メチオニンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５ｍｇ／Ｌ〜２５０ｍｇ／Ｌが好ましく、１０ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００８９】
前記一液式分化誘導培地におけるＬ−フェニルアラニンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌが好ましく、１０ｍｇ／Ｌ〜４００ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００９０】
前記一液式分化誘導培地におけるＬ−プロリンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１ｍｇ／Ｌ〜１，２００ｍｇ／Ｌが好ましく、１０ｍｇ／Ｌ〜１，０００ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００９１】
前記一液式分化誘導培地におけるＬ−ヒドロキシプロリンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１ｍｇ／Ｌ〜６０ｍｇ／Ｌが好ましく、５ｍｇ／Ｌ〜４０ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００９２】
前記一液式分化誘導培地におけるＬ−セリンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１ｍｇ／Ｌ〜３００ｍｇ／Ｌが好ましく、１０ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００９３】
前記一液式分化誘導培地におけるＬ−スレオニンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０ｍｇ／Ｌ〜６５０ｍｇ／Ｌが好ましく、１００ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００９４】
前記一液式分化誘導培地におけるＬ−トリプトファンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２ｍｇ／Ｌ〜１５０ｍｇ／Ｌが好ましく、２０ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００９５】
前記一液式分化誘導培地におけるＬ−チロシンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌが好ましく、１０ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００９６】
前記一液式分化誘導培地におけるＬ−バリンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５ｍｇ／Ｌ〜６５０ｍｇ／Ｌが好ましく、１０ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００９７】
前記一液式分化誘導培地におけるチアミンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１ｍｇ／Ｌ〜２５ｍｇ／Ｌが好ましく、２ｍｇ／Ｌ〜１５ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００９８】
前記一液式分化誘導培地における還元型グルタチオンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１ｍｇ／Ｌ〜２５ｍｇ／Ｌが好ましく、１．５ｍｇ／Ｌ〜１５ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００９９】
前記一液式分化誘導培地におけるアスコルビン酸−２−２ＰＯ４のマグネシウム塩の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１ｍｇ／Ｌ〜２５０ｍｇ／Ｌが好ましく、１０ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１００】
前記一液式分化誘導培地におけるＡｇＮＯ３の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００００００８ｍｇ／Ｌ〜０．００８ｍｇ／Ｌが好ましく、０．０００００８ｍｇ／Ｌ〜０．０００８ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１０１】
前記一液式分化誘導培地におけるＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００００１５ｍｇ／Ｌ〜０．００１５ｍｇ／Ｌが好ましく、０．０００１５ｍｇ／Ｌ〜０．００１５ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１０２】
前記一液式分化誘導培地におけるＢａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００００６ｍｇ／Ｌ〜０．００６ｍｇ／Ｌが好ましく、０．０００６ｍｇ／Ｌ〜０．００３ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１０３】
前記一液式分化誘導培地における３ＣｄＳＯ４・８Ｈ２Ｏの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００００５ｍｇ／Ｌ〜０．０５ｍｇ／Ｌが好ましく、０．０００５ｍｇ／Ｌ〜０．０４ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１０４】
前記一液式分化誘導培地におけるＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００００４ｍｇ／Ｌ〜０．００４ｍｇ／Ｌが好ましく、０．０００４ｍｇ／Ｌ〜０．００３ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１０５】
前記一液式分化誘導培地におけるＣｒ２（ＳＯ４）３・Ｈ２Ｏの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００００００２５ｍｇ／Ｌ〜０．００２５ｍｇ／Ｌが好ましく、０．０００００２５ｍｇ／Ｌ〜０．００１ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１０６】
前記一液式分化誘導培地におけるＧｅＯ２の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０００００９ｍｇ／Ｌ〜０．０００９ｍｇ／Ｌが好ましく、０．００００９ｍｇ／Ｌ〜０．０００８ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１０７】
前記一液式分化誘導培地におけるＮａ２ＳｅＯ３の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０００７ｍｇ／Ｌ〜０．０７ｍｇ／Ｌが好ましく、０．００１ｍｇ／Ｌ〜０．０１ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１０８】
前記一液式分化誘導培地におけるＫＢｒの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００００００９ｍｇ／Ｌ〜０．０００９ｍｇ／Ｌが好ましく、０．０００００９ｍｇ／Ｌ〜０．０００５ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１０９】
前記一液式分化誘導培地におけるＫＩの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００００１ｍｇ／Ｌ〜０．００１ｍｇ／Ｌが好ましく、０．００００５ｍｇ／Ｌ〜０．０００８ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１１０】
前記一液式分化誘導培地におけるＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０００００４ｍｇ／Ｌ〜０．００４ｍｇ／Ｌが好ましく、０．００００４ｍｇ／Ｌ〜０．００１ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１１１】
前記一液式分化誘導培地におけるＮａＦの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００００６ｍｇ／Ｌ〜０．００６ｍｇ／Ｌが好ましく、０．０００６ｍｇ／Ｌ〜０．００５ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１１２】
前記一液式分化誘導培地におけるＮａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００１ｍｇ／Ｌ〜１ｍｇ／Ｌが好ましく、０．０１ｍｇ／Ｌ〜０．５ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１１３】
前記一液式分化誘導培地におけるＮａＶＯ３の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０００００５ｍｇ／Ｌ〜０．００５ｍｇ／Ｌが好ましく、０．００００５ｍｇ／Ｌ〜０．００４ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１１４】
前記一液式分化誘導培地における（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００００８ｍｇ／Ｌ〜０．０８ｍｇ／Ｌが好ましく、０．０００８ｍｇ／Ｌ〜０．０５ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１１５】
前記一液式分化誘導培地におけるＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０００００２５ｍｇ／Ｌ〜０．０００２５ｍｇ／Ｌが好ましく、０．００００２５ｍｇ／Ｌ〜０．０００２５ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１１６】
前記一液式分化誘導培地におけるＲｂＣｌの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００００００９ｍｇ／Ｌ〜０．００９ｍｇ／Ｌが好ましく、０．０００００９ｍｇ／Ｌ〜０．００５ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１１７】
前記一液式分化誘導培地におけるＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０００００１ｍｇ／Ｌ〜０．００１ｍｇ／Ｌが好ましく、０．００００１ｍｇ／Ｌ〜０．０００１ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１１８】
前記一液式分化誘導培地におけるＺｒＯＣｌ２・８Ｈ２Ｏの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００００７ｍｇ／Ｌ〜０．００７ｍｇ／Ｌが好ましく、０．０００７ｍｇ／Ｌ〜０．００６ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１１９】
前記一液式分化誘導培地用培地添加剤は、市販品を用いてもよいし、化学合成したものを用いてもよい。
【０１２０】
前記一液式分化誘導培地用培地添加剤は、各成分を含む１剤として培地に添加してもよいし、成分ごとに別々の剤として培地に添加してもよいし、任意の複数の成分を含む剤として培地に添加してもよい。
【０１２１】
−分化誘導調節剤−
前記ＲＯＣＫ阻害剤は、分化誘導調節剤の１つである。
前記胚様体形成工程用培地に添加する分化誘導調節剤（以下、「胚様体形成工程用分化誘導調節剤」と称することがある）としては、ＲＯＣＫ阻害剤を含む限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記ＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、Ｙ２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅなどが挙げられる。これらの中でも、心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、Ｙ２７６３２が好ましい。
前記ＲＯＣＫ阻害剤は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記ＲＯＣＫ阻害剤は、ヒトｉＰＳ細胞の細胞死を防ぐ作用がある物質として知られている。
【０１２２】
前記胚様体形成工程用培地における分化誘導調節剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、前記胚様体形成工程用培地における分化誘導調節剤としてＹ２７６３２を用いる場合には、２μＭ〜１０μＭが好ましく、３μＭ〜８μＭがより好ましく、４μＭ〜６μＭが特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１２３】
前記胚様体形成工程用分化誘導調節剤は、ＲＯＣＫ阻害剤以外の分化誘導調節剤を含んでもよいし、含まなくてもよいが、心筋細胞を安価、かつ簡便に得ることができる点で、ＲＯＣＫ阻害剤以外の分化誘導調節剤を含まないことが好ましい。
【０１２４】
前記胚様体形成工程用分化誘導調節剤におけるＲＯＣＫ阻害剤以外の分化誘導調節剤としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｂＦＧＦ、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ番号：２５２９１７−０６−９）などが挙げられる。
前記胚様体形成工程用培地にｂＦＧＦを添加する場合におけるｂＦＧＦの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬなどが挙げられる。
前記胚様体形成工程用培地にＣＨＩＲ９９０２１を添加する場合におけるＣＨＩＲ９９０２１の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５ｎＭ〜５μＭなどが挙げられる。
【０１２５】
前記胚様体形成工程用分化誘導調節剤は、市販品を用いてもよいし、化学合成したものを用いてもよい。
【０１２６】
前記胚様体形成工程用分化誘導調節剤は、各成分を含む１剤として培地に添加してもよいし、成分ごとに別々の剤として培地に添加してもよいし、任意の複数の成分を含む剤として培地に添加してもよい。
【０１２７】
前記胚様体形成工程用培地の好ましい態様としては、下記胚様体形成工程用培地（１）、（２）が挙げられる。これらの中でも、胚様体形成工程用培地（１）がより好ましい。
【０１２８】
−胚様体形成工程用培地（１）−
基礎培地としてＤＭＥＭ／Ｆ１２を用い、下記表１−１及び１−２に記載の組成となるように、第１の分化誘導培地用培地添加剤を添加した第１の分化誘導培地に、Ｙ２７６３２を５μＭとなるように添加した培地。
【０１２９】
【表１−１】
0006487654.tif 000002
【０１３０】
【表１−２】
0006487654.tif 000003
【０１３１】
−胚様体形成工程用培地（２）−
下記表２−１及び２−２に記載の組成となるように、一液式分化誘導培地用培地添加剤を添加した一液式分化誘導培地に、Ｙ２７６３２を５μＭとなるように添加した培地。
【表２−１】
0006487654.tif 000004
【０１３２】
【表２−２】
0006487654.tif 000005
【０１３３】
＜＜浮遊培養＞＞
前記浮遊培養の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、接着加工を行っていない培養皿や低接着加工を行った培養皿を用い、前記多能性幹細胞を培養する方法が挙げられる。
前記接着加工を行っていない培養皿や低接着加工を行った培養皿は、市販品を用いることができる。
【０１３４】
前記浮遊培養の培養条件としては、特に制限はなく、公知の培養条件を適宜選択することができる。
前記浮遊培養は、低酸素条件で行ってもよいし、大気条件で行ってもよいが、分化効率に優れる点で、低酸素条件が好ましい。
低酸素条件とは、常酸素濃度（２１％）を下回る酸素濃度条件をいう。
前記低酸素条件における酸素濃度としては、２１％未満であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．１％以上２１％未満が好ましく、１％以上１０％以下がより好ましく、４％以上６％以下が特に好ましい。
【０１３５】
前記胚様体形成工程の期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、２４時間〜４８時間などが挙げられる。
【０１３６】
＜中胚葉誘導工程＞
前記中胚葉誘導工程は、前記胚様体形成工程後の胚様体を浮遊培養し、中胚葉を誘導する工程である。
【０１３７】
＜＜培地＞＞
前記中胚葉誘導工程における培地（以下、「中胚葉誘導工程用培地」、「中胚葉誘導工程用培養液」と称することがある）は、第２の分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル活性化物質を加えた培地、及び一液式分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル活性化物質を加えた培地のいずれかであり、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【０１３８】
−第２の分化誘導培地−
前記第２の分化誘導培地（以下、「第二培地」と称することがある）は、基礎培地に、培地添加剤（以下、「第２の分化誘導培地用培地添加剤」と称することがある）を加えた培地であり、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【０１３９】
−−基礎培地−−
前記第２の分化誘導培地における基礎培地は、ＩＭＤＭである。
前記基礎培地は、市販品を用いてもよいし、適宜調製したものを用いてもよい。
【０１４０】
−−第２の分化誘導培地用培地添加剤−−
前記第２の分化誘導培地用培地添加剤は、アルブミンと、ポリビニルアルコールと、エタノラミン塩酸塩と、亜セレン酸ナトリウムと、ヒドロコルチゾンと、ＤＬ−α−トコフェロール酢酸エステルと、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインと、１−チオグリセロールと、アスコルビン酸とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【０１４１】
前記第２の分化誘導培地におけるアルブミンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５００ｍｇ／Ｌ超８，０００ｍｇ／Ｌ以下が好ましく、１，５００ｍｇ／Ｌ超７，０００ｍｇ／Ｌ以下がより好ましく、３，０００ｍｇ／Ｌ超６，０００ｍｇ／Ｌ以下が特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
前記アルブミンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト血清アルブミン、牛血清アルブミン、リコンビナントヒトアルブミン、リコンビナント牛アルブミンなどが挙げられる。
【０１４２】
前記第２の分化誘導培地におけるポリビニルアルコールの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５００ｍｇ／Ｌ超４，０００ｍｇ／Ｌ以下が好ましく、６００ｍｇ／Ｌ超２,０００ｍｇ／Ｌがより好ましく、８００ｍｇ／Ｌ超１,５００ｍｇ／Ｌ以下が特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
前記ポリビニルアルコールの重量平均分子量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３０，０００〜７０，０００が好ましい。
【０１４３】
前記第２の分化誘導培地におけるポリビニルアルコールの含有量と、アルブミンの含有量との組合せとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ポリビニルアルコールの含有量が５００ｍｇ／Ｌ〜１，５００ｍｇ／Ｌの場合は、アルブミンの含有量は、３，０００ｍｇ／Ｌ超が好ましく、ポリビニルアルコールの含有量が４，０００ｍｇ／Ｌの場合は、アルブミンの含有量は、５００ｍｇ／Ｌ以上が好ましい。
【０１４４】
前記第２の分化誘導培地におけるエタノラミン塩酸塩の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２ｍｇ／Ｌ〜１８ｍｇ／Ｌが好ましく、５ｍｇ／Ｌ〜１５ｍｇ／Ｌがより好ましく、７ｍｇ／Ｌ〜１２ｍｇ／Ｌが特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１４５】
前記第２の分化誘導培地における亜セレン酸ナトリウムの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００２ｍｇ／Ｌ〜０．００８ｍｇ／Ｌが好ましく、０．００３ｍｇ／Ｌ〜０．００７ｍｇ／Ｌがより好ましく、０．００４ｍｇ／Ｌ〜０．００６ｍｇ／Ｌが特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１４６】
前記第２の分化誘導培地におけるヒドロコルチゾンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０２ｍｇ／Ｌ〜０．０８ｍｇ／Ｌが好ましく、０．０３ｍｇ／Ｌ〜０．０７ｍｇ／Ｌがより好ましく、０．０４ｍｇ／Ｌ〜０．０６ｍｇ／Ｌが特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１４７】
前記第２の分化誘導培地におけるＤＬ−α−トコフェロール酢酸エステルの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００１ｍｇ／Ｌ〜０．００８ｍｇ／Ｌが好ましく、０．００５ｍｇ／Ｌ〜０．０４ｍｇ／Ｌがより好ましく、０．０１ｍｇ／Ｌ〜０．０３ｍｇ／Ｌが特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１４８】
前記第２の分化誘導培地におけるＮ−アセチル−Ｌ−システインの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５００ｍｇ／Ｌ〜３，０００ｍｇ／Ｌが好ましく、１，０００ｍｇ／Ｌ〜２，５００ｍｇ／Ｌがより好ましく、１，５００ｍｇ／Ｌ〜２，０００ｍｇ／Ｌが特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１４９】
前記第２の分化誘導培地における１−チオグリセロールの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２０ｍｇ／Ｌ〜８０ｍｇ／Ｌが好ましく、３０ｍｇ／Ｌ〜７０ｍｇ／Ｌがより好ましく、４０ｍｇ／Ｌ〜６０ｍｇ／Ｌが特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１５０】
前記第２の分化誘導培地におけるアスコルビン酸の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２０ｍｇ／Ｌ〜８０ｍｇ／Ｌが好ましく、３０ｍｇ／Ｌ〜７０ｍｇ／Ｌがより好ましく、４０ｍｇ／Ｌ〜６０ｍｇ／Ｌが特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１５１】
前記第２の分化誘導培地用培地添加剤におけるその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、Ｌ−グルタミン、及びトランスフェリンを含むことが好ましい。
【０１５２】
前記第２の分化誘導培地におけるＬ−グルタミンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５０ｍｇ／Ｌ〜１，０００ｍｇ／Ｌが好ましく、１００ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１５３】
前記第２の分化誘導培地におけるトランスフェリンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１ｍｇ／Ｌ〜１５０ｍｇ／Ｌが好ましく、２ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌがより好ましく、３ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌが特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１５４】
前記第２の分化誘導培地用培地添加剤は、前記その他の成分としてインスリンを含んでもよいが、含まないことが好ましい。
前記第２の分化誘導培地にインスリンを添加する場合におけるインスリンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５ｎｇ／ｍＬ〜１５ｎｇ／ｍＬなどが挙げられる。
【０１５５】
前記第２の分化誘導培地用培地添加剤は、市販品を用いてもよいし、化学合成したものを用いてもよい。
【０１５６】
前記第２の分化誘導培地用培地添加剤は、各成分を含む１剤として培地に添加してもよいし、成分ごとに別々の剤として培地に添加してもよいし、任意の複数の成分を含む剤として培地に添加してもよい。
【０１５７】
−一液式分化誘導培地−
前記一液式分化誘導培地は、上記胚様体形成工程の一液式分化誘導培地の項目に記載したものと同様である。
【０１５８】
−分化誘導調節剤−
前記中胚葉誘導工程用培地に添加する分化誘導調節剤（以下、「中胚葉誘導工程用分化誘導調節剤」と称することがある）としては、Ｗｎｔシグナル活性化物質を含む限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記Ｗｎｔシグナル活性化物質としては、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、Ｗｎｔ  アゴニスト（ＣＡＳ  ８５３２２０−５２−７）、Ｗｎｔ  アゴニストＩＩ（ＳＫＬ２００１）などが挙げられる。これらの中でも、細胞毒性が弱く、分化誘導効率に優れる点で、ＣＨＩＲ９９０２１が好ましい。
前記Ｗｎｔシグナル活性化物質は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【０１５９】
前記中胚葉誘導工程用培地における分化誘導調節剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、前記中胚葉誘導工程用培地における分化誘導調節剤としてＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合には、２μＭ〜６μＭが好ましく、３μＭ〜５μＭがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１６０】
前記中胚葉誘導工程用分化誘導調節剤は、Ｗｎｔシグナル活性化物質以外の分化誘導調節剤を含んでもよいし、含まなくてもよいが、心筋細胞を安価、かつ簡便に得ることができる点で、ＣＨＩＲ９９０２１以外の分化誘導調節剤を含まないことが好ましい。特に、Ｗｎｔシグナル活性化物質の中では、ＢＩＯ、Ｗｎｔ  アゴニスト、Ｗｎｔ  アゴニストＩＩを含まないことが好ましい。
【０１６１】
前記中胚葉誘導工程用分化誘導調節剤におけるＷｎｔシグナル活性化物質以外の分化誘導調節剤としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｂＦＧＦなどが挙げられる。
前記中胚葉誘導工程用培地にｂＦＧＦを添加する場合におけるｂＦＧＦの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬなどが挙げられる。
【０１６２】
前記中胚葉誘導工程用分化誘導調節剤は、市販品を用いてもよいし、化学合成したものを用いてもよい。
【０１６３】
前記中胚葉誘導工程用分化誘導調節剤は、各成分を含む１剤として培地に添加してもよいし、成分ごとに別々の剤として培地に添加してもよいし、任意の複数の成分を含む剤として培地に添加してもよい。
【０１６４】
前記中胚葉誘導工程用培地の好ましい態様としては、下記中胚葉誘導工程用培地（１）、（２）が挙げられる。これらの中でも、中胚葉誘導工程用培地（１）がより好ましい。
【０１６５】
−中胚葉誘導工程用培地（１）−
下記表３に記載の組成となるように、第２の分化誘導培地用培地添加剤を添加した第２の分化誘導培地に、ＣＨＩＲ９９０２１を４μＭとなるように添加した培地。
【表３】
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【０１６６】
−中胚葉誘導工程用培地（２）−
上記表２−１及び２−２に記載の組成となるように、一液式分化誘導培地用培地添加剤を添加した一液式分化誘導培地に、ＣＨＩＲ９９０２１を４μＭとなるように添加した培地。
【０１６７】
＜＜浮遊培養＞＞
前記浮遊培養の方法、培養条件としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、上記胚様体形成工程の浮遊培養の項目に記載したものと同様とすることができる。
【０１６８】
前記中胚葉誘導工程の期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、胚様体形成工程開始１日目〜３日目、胚様体形成工程開始１日目〜４日目、胚様体形成工程開始２日目〜４日目などとすることができる。
【０１６９】
＜心筋細胞誘導工程＞
前記心筋細胞誘導工程は、前記中胚葉誘導後の胚様体を浮遊培養し、心筋細胞を誘導する工程である。
前記心筋細胞誘導工程は、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の処理を含む。
【０１７０】
＜＜第１の心筋細胞誘導処理＞＞
前記第１の心筋細胞誘導処理は、前記中胚葉誘導後の胚様体を第１の心筋細胞誘導処理用培地（以下、「第１の心筋細胞誘導処理用培養液」と称することがある）で培養する処理である。
【０１７１】
−培地−
前記第１の心筋細胞誘導処理における培地（以下、「第１の心筋細胞誘導処理用培地」、「第１の心筋細胞誘導処理用培養液」と称することがある）は、第２の分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤、及びエストロゲン様作用物質を加えた培地、及び一液式分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤、及びエストロゲン様作用物質を加えた培地のいずれかであり、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【０１７２】
−−第２の分化誘導培地−−
前記第２の分化誘導培地は、上記中胚葉誘導工程の第２の分化誘導培地の項目に記載したものと同様である。
【０１７３】
−−一液式分化誘導培地−−
前記一液式分化誘導培地は、上記胚様体形成工程の一液式分化誘導培地の項目に記載したものと同様である。
【０１７４】
−−分化誘導調節剤−−
前記第１の心筋細胞誘導処理用培地に添加する分化誘導調節剤（以下、「第１の心筋細胞誘導処理用分化誘導調節剤」と称することがある）は、Ｗｎｔシグナル抑制物質と、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤と、エストロゲン様作用物質とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【０１７５】
前記第１の心筋細胞誘導処理用培地における分化誘導調節剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【０１７６】
前記Ｗｎｔシグナル抑制物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＩＷＰ２、ＩＷＲ１、ＸＡＶ９３９、ＫＹ０２１１１などが挙げられる。これらの中でも、ＩＷＰ２が、低濃度から優れた分化誘導効率を発揮する点で、好ましい。
前記Ｗｎｔシグナル抑制物質は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【０１７７】
前記第１の心筋細胞誘導処理用培地におけるＷｎｔシグナル抑制物質の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１μＭ〜１０μＭが好ましく、２μＭ〜９μＭがより好ましく、４μＭ〜７μＭが特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１７８】
前記ＴＧＦ−βシグナル阻害剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ５０５１２４、Ａ−８３−０１などが挙げられる。これらの中でも、ＳＢ４３１５４２が、分化誘導効率に優れる点で、好ましい。
前記ＴＧＦ−βシグナル阻害剤は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【０１７９】
前記第１の心筋細胞誘導処理用培地におけるＴＧＦ−βシグナル阻害剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１μＭ〜１０μＭが好ましく、２μＭ〜９μＭがより好ましく、３μＭ〜８μＭが特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１８０】
前記エストロゲン様作用物質とは、エストロゲン作用を示すホルモン、低分子化合物をいう。
前記エストロゲン様作用物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エストラジオール、エストロン、エストリオール、ゲニステインなどが挙げられる。これらの中でも、エストラジオールが、分化誘導効率に優れる点で、好ましい。
前記エストロゲン様作用物質は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【０１８１】
前記第１の心筋細胞誘導処理用培地におけるエストロゲン様作用物質の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１ｎＭ〜１０，０００ｎＭが好ましく、１０ｎＭ〜１，０００ｎＭがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【０１８２】
前記第１の心筋細胞誘導処理用分化誘導調節剤は、Ｗｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤、及びエストロゲン様作用物質以外の分化誘導調節剤を含んでもよいし、含まなくてもよい。
前記エストロゲン様作用物質の代わりに、ＶＥＧＦを１０ｎｇ／ｍＬの濃度で用いることも可能であるが、心筋細胞を安価、かつ簡便に得ることができる点で、Ｗｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤、及びエストロゲン様作用物質以外の分化誘導調節剤を含まないことが好ましい。
【０１８３】
前記第１の心筋細胞誘導処理用分化誘導調節剤におけるＷｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤、及びエストロゲン様作用物質以外の分化誘導調節剤としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｂＦＧＦなどが挙げられる。
前記第１の心筋細胞誘導処理用培地にｂＦＧＦを添加する場合におけるｂＦＧＦの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬなどが挙げられる。
【０１８４】
前記第１の心筋細胞誘導処理用分化誘導調節剤は、市販品を用いてもよいし、化学合成したものを用いてもよい。
【０１８５】
前記第１の心筋細胞誘導処理用分化誘導調節剤は、各成分を含む１剤として培地に添加してもよいし、成分ごとに別々の剤として培地に添加してもよいし、任意の複数の成分を含む剤として培地に添加してもよい。
【０１８６】
前記第１の心筋細胞誘導処理用培地の好ましい態様としては、下記第１の心筋細胞誘導処理用培地（１）、（２）が挙げられる。これらの中でも、第１の心筋細胞誘導処理用培地（１）がより好ましい。
【０１８７】
−第１の心筋細胞誘導処理用培地（１）−
上記表３に記載の組成となるように、第２の分化誘導培地用培地添加剤を添加した第２の分化誘導培地に、ＩＷＰ２を５μＭ、ＳＢ４３１５４２を５μＭ、及びエストラジオールを１００ｎＭとなるように添加した培地。
【０１８８】
−第１の心筋細胞誘導処理用培地（２）−
上記表２−１及び２−２に記載の組成となるように、一液式分化誘導培地用培地添加剤を添加した一液式分化誘導培地に、ＩＷＰ２を５μＭ、ＳＢ４３１５４２を５μＭ、及びエストラジオールを１００ｎＭとなるように添加した培地。
【０１８９】
−浮遊培養−
前記浮遊培養の方法、培養条件としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、上記胚様体形成工程の浮遊培養の項目に記載したものと同様とすることができる。
【０１９０】
前記第１の心筋細胞誘導処理の期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、胚様体形成工程開始３日目〜６日目、胚様体形成工程開始３日目〜５日目、胚様体形成工程開始４日目〜６日目などとすることができる。
【０１９１】
＜＜第２の心筋細胞誘導処理＞＞
前記第２の心筋細胞誘導処理は、前記第１の心筋細胞誘導処理後の胚様体を第２の心筋細胞誘導処理用培地（以下、「第２の心筋細胞誘導処理用培養液」と称することがある）で培養する処理である。
【０１９２】
−培地−
前記第２の心筋細胞誘導処理における培地（以下、「第２の心筋細胞誘導処理用培地」、「第２の心筋細胞誘導処理用培養液」と称することがある）は、第２の分化誘導培地に、エストロゲン様作用物質を加えた培地、及び一液式分化誘導培地に、エストロゲン様作用物質を加えた培地のいずれかであり、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【０１９３】
−−第２の分化誘導培地−−
前記第２の分化誘導培地は、上記中胚葉誘導工程の第２の分化誘導培地の項目に記載したものと同様である。
【０１９４】
−−一液式分化誘導培地−−
前記一液式分化誘導培地は、上記胚様体形成工程の一液式分化誘導培地の項目に記載したものと同様である。
【０１９５】
−−分化誘導調節剤−−
前記第２の心筋細胞誘導処理用培地に添加する分化誘導調節剤（以下、「第２の心筋細胞誘導処理用分化誘導調節剤」と称することがある）は、エストロゲン様作用物質を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【０１９６】
前記第２の心筋細胞誘導処理用培地における分化誘導調節剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【０１９７】
前記エストロゲン様作用物質、及びその含有量は、上記第１の心筋細胞誘導処理用培地の項目に記載したものと同様である。
【０１９８】
前記第２の心筋細胞誘導処理用分化誘導調節剤は、エストロゲン様作用物質以外の分化誘導調節剤を含んでもよいし、含まなくてもよい。
前記エストロゲン様作用物質の代わりに、ＶＥＧＦを１０ｎｇ／ｍＬの濃度で用いることも可能であるが、心筋細胞を安価、かつ簡便に得ることができる点で、エストロゲン様作用物質以外の分化誘導調節剤を含まないことが好ましい。
【０１９９】
前記第２の心筋細胞誘導処理用分化誘導調節剤におけるエストロゲン様作用物質以外の分化誘導調節剤としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｂＦＧＦなどが挙げられる。
前記第２の心筋細胞誘導処理用培地にｂＦＧＦを添加する場合におけるｂＦＧＦの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬなどが挙げられる。
【０２００】
前記第２の心筋細胞誘導処理用分化誘導調節剤は、市販品を用いてもよいし、化学合成したものを用いてもよい。
【０２０１】
前記第２の心筋細胞誘導処理用分化誘導調節剤は、各成分を含む１剤として培地に添加してもよいし、成分ごとに別々の剤として培地に添加してもよいし、任意の複数の成分を含む剤として培地に添加してもよい。
【０２０２】
前記第２の心筋細胞誘導処理用培地の好ましい態様としては、下記第２の心筋細胞誘導処理用培地（１）、（２）が挙げられる。これらの中でも、第２の心筋細胞誘導処理用培地（１）がより好ましい。
【０２０３】
−第２の心筋細胞誘導処理用培地（１）−
上記表３に記載の組成となるように、第２の分化誘導培地用培地添加剤を添加した第２の分化誘導培地に、エストラジオールを１００ｎＭとなるように添加した培地。
【０２０４】
−第１の心筋細胞誘導処理用培地（２）−
上記表２−１及び２−２に記載の組成となるように、一液式分化誘導培地用培地添加剤を添加した一液式分化誘導培地に、エストラジオールを１００ｎＭとなるように添加した培地。
【０２０５】
−浮遊培養−
前記浮遊培養の方法、培養条件としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、上記胚様体形成工程の浮遊培養の項目に記載したものと同様とすることができる。
【０２０６】
前記第２の心筋細胞誘導処理の期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、胚様体形成工程開始６日目以降、胚様体形成工程開始８日目以降などとすることができる。
【０２０７】
＜＜その他の処理＞＞
前記その他の処理としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、更なる心筋細胞誘導処理、洗浄処理などが挙げられる。
【０２０８】
−更なる心筋細胞誘導処理−
前記更なる心筋細胞誘導処理としては、前記第１の心筋細胞誘導処理と、前記第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理であり、前記第１の心筋細胞誘導処理後の胚様体を第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培地（以下、「第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培養液」と称することがある）で培養する処理が挙げられる。
【０２０９】
−−培地−−
前記第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培地は、第２の分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、及びエストロゲン様作用物質を加えた培地、及び一液式分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、及びエストロゲン様作用物質を加えた培地のいずれかであり、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【０２１０】
−−−第２の分化誘導培地−−−
前記第２の分化誘導培地は、上記中胚葉誘導工程の第２の分化誘導培地の項目に記載したものと同様である。
【０２１１】
−−−一液式分化誘導培地−−−
前記一液式分化誘導培地は、上記胚様体形成工程の一液式分化誘導培地の項目に記載したものと同様である。
【０２１２】
−−−分化誘導調節剤−−−
前記第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培地に添加する分化誘導調節剤（以下、「第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用分化誘導調節剤」と称することがある）は、Ｗｎｔシグナル抑制物質と、エストロゲン様作用物質とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【０２１３】
前記第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培地における分化誘導調節剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【０２１４】
前記Ｗｎｔシグナル抑制物質、及びその含有量は、上記第１の心筋細胞誘導処理用培地の項目に記載したものと同様である。
【０２１５】
前記エストロゲン様作用物質、及びその含有量は、上記第１の心筋細胞誘導処理用培地の項目に記載したものと同様である。
【０２１６】
前記第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用分化誘導調節剤を含んでもよいし、含まなくてもよい。
前記エストロゲン様作用物質の代わりに、ＶＥＧＦを１０ｎｇ／ｍＬの濃度で用いることも可能であるが、心筋細胞を安価、かつ簡便に得ることができる点で、Ｗｎｔシグナル抑制物質、及びエストロゲン様作用物質以外の分化誘導調節剤を含まないことが好ましい。
【０２１７】
前記第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用分化誘導調節剤におけるＷｎｔシグナル抑制物質、及びエストロゲン様作用物質以外の分化誘導調節剤としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｂＦＧＦなどが挙げられる。
前記第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培地にｂＦＧＦを添加する場合におけるｂＦＧＦの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬなどが挙げられる。
【０２１８】
前記第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用分化誘導調節剤は、市販品を用いてもよいし、化学合成したものを用いてもよい。
【０２１９】
前記第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用分化誘導調節剤は、各成分を含む１剤として培地に添加してもよいし、成分ごとに別々の剤として培地に添加してもよいし、任意の複数の成分を含む剤として培地に添加してもよい。
【０２２０】
前記第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培地の好ましい態様としては、下記第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培地（１）、（２）が挙げられる。これらの中でも、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培地（１）がより好ましい。
【０２２１】
−第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培地（１）−
上記表３に記載の組成となるように、第２の分化誘導培地用培地添加剤を添加した第２の分化誘導培地に、ＩＷＰ２を５μＭ、及びエストラジオールを１００ｎＭとなるように添加した培地。
【０２２２】
−第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培地（２）−
上記表２−１及び２−２に記載の組成となるように、一液式分化誘導培地用培地添加剤を添加した一液式分化誘導培地に、ＩＷＰ２を５μＭ、及びエストラジオールを１００ｎＭとなるように添加した培地。
【０２２３】
−−浮遊培養−−
前記浮遊培養の方法、培養条件としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、上記胚様体形成工程の浮遊培養の項目に記載したものと同様とすることができる。
【０２２４】
前記第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理の期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、胚様体形成工程開始６日目〜８日目、胚様体形成工程開始５日目〜８日目などとすることができる。
【０２２５】
−洗浄処理−
前記洗浄処理は、前記第１の心筋細胞誘導処理、前記第２の心筋細胞誘導処理、及び前記更なる心筋細胞誘導処理の少なくともいずれかの後に、前記胚様体を洗浄する処理であり、後述する洗浄工程と同様にして行うことができる。
【０２２６】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フィーダー細胞培養工程、洗浄工程などが挙げられる。
【０２２７】
＜＜フィーダー細胞培養工程＞＞
前記フィーダー細胞培養工程は、多能性幹細胞と、フィーダー細胞とを共に培養し、多能性幹細胞を未分化な状態で維持する工程である。
前記フィーダー細胞としては、特に制限はなく、公知のものを適宜選択することができる。
前記フィーダー細胞培養工程の培養条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【０２２８】
＜＜洗浄工程＞＞
前記洗浄工程は、上述した胚様体形成工程、中胚葉誘導工程、及び心筋細胞誘導工程の少なくともいずれかの後に、前記胚様体を洗浄する工程である。
前記洗浄の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培養後の胚様体を培養液ごと容器に回収し、静置して前記胚様体を沈殿させた後、上清を除去し、次いで、培養液又は緩衝液を加え、再度静置して前記胚様体を沈殿させた後、上清を除去する方法などが挙げられる。
前記洗浄の回数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、複数回行うことが好ましい。
【０２２９】
前記各工程における培地の組合せの態様としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、胚様体形成工程における培地が、第１の分化誘導培地に、ＲＯＣＫ阻害剤を加えた培地であり、中胚葉誘導工程における培地が、第２の分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル活性化物質を加えた培地であり、第１の心筋細胞誘導処理における培地が、第２の分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤、及びエストロゲン様作用物質を加えた培地であり、第２の心筋細胞誘導処理における培地が、第２の分化誘導培地に、エストロゲン様作用物質を加えた培地である態様、胚様体形成工程における培地が、一液式分化誘導培地に、ＲＯＣＫ阻害剤を加えた培地であり、中胚葉誘導工程における培地が、一液式分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル活性化物質を加えた培地であり、第１の心筋細胞誘導処理における培地が、一液式分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤、及びエストロゲン様作用物質を加えた培地であり、第２の心筋細胞誘導処理における培地が、一液式分化誘導培地に、エストロゲン様作用物質を加えた培地である態様が好ましく、胚様体形成工程における培地が、第１の分化誘導培地に、ＲＯＣＫ阻害剤を加えた培地であり、中胚葉誘導工程における培地が、第２の分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル活性化物質を加えた培地であり、第１の心筋細胞誘導処理における培地が、第２の分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤、及びエストロゲン様作用物質を加えた培地であり、第２の心筋細胞誘導処理における培地が、第２の分化誘導培地に、エストロゲン様作用物質を加えた培地である態様がより好ましい。
【０２３０】
上記方法により、多能性幹細胞から心筋細胞が得られたか否かは、胚様体が拍動しているか否かにより確認することができる。
また、得られた心筋細胞が高品質であるか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パッチクランプ法などが挙げられる。前記パッチクランプ法により、大きく明瞭なプラトー相を有する活動電位（活動電位振幅１４０ｍＶ以上）、大きなピークカリウム電流（３００ｐＡ以上）、大きなピークカルシウム電流（１ｎＡ以上）、大きなピークナトリウム電流（６．５ｎＡ以上）電流が確認された場合には、高品質な心筋細胞が得られたと判断することができる。
【０２３１】
（培地添加剤）
本発明の培地添加剤は、多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するための培地に添加する培地添加剤であって、アルブミン及び１−チオグリセロールの少なくともいずれかを含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
前記培地添加剤は、本発明の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法に好適に用いることができる。
【０２３２】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トランスフェリン、インスリン、ポリビニルアルコール、エタノラミン塩酸塩、亜セレン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン、ＤＬ−α−トコフェロール酢酸エステル、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、アスコルビン酸、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン・Ｈ２Ｏ、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、チアミン、還元型グルタチオン、アスコルビン酸−２−２ＰＯ４のマグネシウム塩、ＡｇＮＯ３、ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、Ｂａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２、３ＣｄＳＯ４・８Ｈ２Ｏ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、Ｃｒ２（ＳＯ４）３・Ｈ２Ｏ、ＧｅＯ２、Ｎａ２ＳｅＯ３、ＫＢｒ、ＫＩ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＮａＦ、Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ、ＮａＶＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、ＲｂＣｌ、ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ＺｒＯＣｌ２・８Ｈ２Ｏなどが挙げられる。
前記その他の成分は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよいが、トランスフェリン、インスリン、ポリビニルアルコール、エタノラミン塩酸塩、亜セレン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン、ＤＬ−α−トコフェロール酢酸エステル、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、及びアスコルビン酸からなる群から選択される少なくとも１種を含む態様、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン・Ｈ２Ｏ、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、チアミン、還元型グルタチオン、アスコルビン酸−２−２ＰＯ４のマグネシウム塩、ＡｇＮＯ３、ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、Ｂａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２、３ＣｄＳＯ４・８Ｈ２Ｏ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、Ｃｒ２（ＳＯ４）３・Ｈ２Ｏ、ＧｅＯ２、Ｎａ２ＳｅＯ３、ＫＢｒ、ＫＩ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＮａＦ、Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ、ＮａＶＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、ＲｂＣｌ、ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、及びＺｒＯＣｌ２・８Ｈ２Ｏからなる群から選択される少なくとも１種を含む態様が好ましい。
【０２３３】
前記培地添加剤の態様としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、下記培地添加剤（１）〜（３）の少なくともいずれかの態様が好ましい。
【０２３４】
＜培地添加剤（１）＞
前記培地添加剤（１）は、インスリンと、トランスフェリンと、アルブミンと、１−チオグリセロールとを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
前記培地添加剤（１）におけるその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン・Ｈ２Ｏ、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、チアミン、還元型グルタチオン、アスコルビン酸−２−２ＰＯ４のマグネシウム塩、ＡｇＮＯ３、ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、Ｂａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２、３ＣｄＳＯ４・８Ｈ２Ｏ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、Ｃｒ２（ＳＯ４）３・Ｈ２Ｏ、ＧｅＯ２、Ｎａ２ＳｅＯ３、ＫＢｒ、ＫＩ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＮａＦ、Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ、ＮａＶＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、ＲｂＣｌ、ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、及びＺｒＯＣｌ２・８Ｈ２Ｏを含むことが好ましい。
前記培地添加剤（１）は、上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の第１の分化誘導培地における第１の分化誘導培地用培地添加剤として好適に用いることができ、培地における含有量等も上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の第１の分化誘導培地用培地添加剤と同様とすることができる。
【０２３５】
＜培地添加剤（２）＞
前記培地添加剤（２）は、アルブミンと、ポリビニルアルコールと、エタノラミン塩酸塩と、亜セレン酸ナトリウムと、ヒドロコルチゾンと、ＤＬ−α−トコフェロール酢酸エステルと、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインと、１−チオグリセロールと、アスコルビン酸とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
前記培地添加剤（２）におけるその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、Ｌ−グルタミン、及びトランスフェリンを含むことが好ましい。
前記培地添加剤（２）は、前記その他の成分としてインスリンを含んでもよいが、含まないことが好ましい。
前記培地添加剤（２）は、上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の第２の分化誘導培地における第２の分化誘導培地用培地添加剤として好適に用いることができ、培地における含有量等も上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の第２の分化誘導培地用培地添加剤と同様とすることができる。
【０２３６】
＜培地添加剤（３）＞
前記培地添加剤（３）は、トランスフェリンと、アルブミンと、ポリビニルアルコールと、エタノラミン塩酸塩と、亜セレン酸ナトリウムと、ヒドロコルチゾンと、ＤＬ−α−トコフェロール酢酸エステルと、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインと、１−チオグリセロールと、アスコルビン酸とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
前記培地添加剤（３）におけるその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、グリシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、チアミン、還元型グルタチオン、アスコルビン酸−２−２ＰＯ４のマグネシウム塩、ＡｇＮＯ３、ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、Ｂａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２、３ＣｄＳＯ４・８Ｈ２Ｏ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、Ｃｒ２（ＳＯ４）３・Ｈ２Ｏ、ＧｅＯ２、Ｎａ２ＳｅＯ３、ＫＢｒ、ＫＩ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＮａＦ、Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ、ＮａＶＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、ＲｂＣｌ、ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、及びＺｒＯＣｌ２・８Ｈ２Ｏを含むことが好ましい。
前記培地添加剤（３）は、上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の一液式分化誘導培地における一液式分化誘導培地用培地添加剤として好適に用いることができ、培地における含有量等も上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の一液式分化誘導培地用培地添加剤と同様とすることができる。
【０２３７】
前記培地添加剤は、市販品を用いてもよいし、化学合成したものを用いてもよい。
【０２３８】
前記培地添加剤は、各成分を含む１剤であってもよいし、成分ごとに別々の剤としてもよいし、任意の複数の成分を含む剤を組み合わせたものであってもよい。
【０２３９】
（分化誘導調節剤）
本発明の分化誘導調節剤は、多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するための培地に添加する分化誘導調節剤であって、ＲＯＣＫ阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化物質、Ｗｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤、及びエストロゲン様作用物質からなる群から選択される少なくとも１種を含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
前記分化誘導調節剤は、本発明の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法に好適に用いることができる。
【０２４０】
＜ＲＯＣＫ阻害剤＞
前記ＲＯＣＫ阻害剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｙ２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅなどが挙げられる。これらの中でも、心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、Ｙ２７６３２が好ましい。
前記ＲＯＣＫ阻害剤は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【０２４１】
＜Ｗｎｔシグナル活性化物質＞
前記Ｗｎｔシグナル活性化物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、Ｗｎｔ  アゴニスト（ＣＡＳ  ８５３２２０−５２−７）、Ｗｎｔ  アゴニストＩＩ（ＳＫＬ２００１）などが挙げられる。これらの中でも、分化誘導効率に優れる点で、ＣＨＩＲ９９０２１が好ましい。
前記Ｗｎｔシグナル活性化物質は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【０２４２】
＜Ｗｎｔシグナル抑制物質＞
前記Ｗｎｔシグナル抑制物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＩＷＰ２、ＩＷＲ１、ＸＡＶ９３９、ＫＹ０２１１１などが挙げられる。これらの中でも、低濃度から優れた分化誘導効率を発揮する点で、ＩＷＰ２が好ましい。
前記Ｗｎｔシグナル抑制物質は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【０２４３】
＜ＴＧＦ−βシグナル阻害剤＞
前記ＴＧＦ−βシグナル阻害剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ５０５１２４、Ａ−８３−０１などが挙げられる。これらの中でも、分化誘導効率に優れる点で、ＳＢ４３１５４２が好ましい。
前記ＴＧＦ−βシグナル阻害剤は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【０２４４】
＜エストロゲン様作用物質＞
前記エストロゲン様作用物質とは、エストロゲン作用を示すホルモン、低分子化合物をいう。
前記エストロゲン様作用物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エストラジオール、エストロン、エストリオール、ゲニステインなどが挙げられる。これらの中でも、分化誘導効率に優れる点で、エストラジオールが好ましい。
前記エストロゲン様作用物質は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【０２４５】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦなどが挙げられる。
【０２４６】
前記分化誘導調節剤の態様としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、下記分化誘導調節剤（１）〜（５）の少なくともいずれかの態様が好ましい。
【０２４７】
＜分化誘導調節剤（１）＞
前記分化誘導調節剤（１）は、ＲＯＣＫ阻害剤を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
前記分化誘導調節剤（１）は、ＲＯＣＫ阻害剤以外の分化誘導調節剤を含んでもよいが、含まないことが好ましい。
前記分化誘導調節剤（１）は、上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の胚様体形成工程用分化誘導調節剤として好適に用いることができ、培地における含有量等も上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の胚様体形成工程用分化誘導調節剤と同様とすることができる。
【０２４８】
＜分化誘導調節剤（２）＞
前記分化誘導調節剤（２）は、Ｗｎｔシグナル活性化物質を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
前記分化誘導調節剤（２）は、Ｗｎｔシグナル活性化物質以外の分化誘導調節剤を含んでもよいが、含まないことが好ましい。特に、Ｗｎｔシグナル活性化物質の中では、ＢＩＯ、Ｗｎｔ  アゴニスト、Ｗｎｔ  アゴニストＩＩを含まないことが好ましい。
前記分化誘導調節剤（２）は、上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の中胚葉誘導工程用分化誘導調節剤として好適に用いることができ、培地における含有量等も上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の中胚葉誘導工程用分化誘導調節剤と同様とすることができる。
【０２４９】
＜分化誘導調節剤（３）＞
前記分化誘導調節剤（３）は、Ｗｎｔシグナル抑制物質と、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤と、エストロゲン様作用物質とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
前記分化誘導調節剤（３）は、Ｗｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤、及びエストロゲン様作用物質以外の分化誘導調節剤を含んでもよいが、含まないことが好ましい。
前記分化誘導調節剤（３）は、上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の第１の心筋細胞誘導処理用分化誘導調節剤として好適に用いることができ、培地における含有量等も上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の第１の心筋細胞誘導処理用分化誘導調節剤と同様とすることができる。
【０２５０】
＜分化誘導調節剤（４）＞
前記分化誘導調節剤（４）は、エストロゲン様作用物質を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
前記分化誘導調節剤（４）は、エストロゲン様作用物質以外の分化誘導調節剤を含んでもよいが、含まないことが好ましい。
前記分化誘導調節剤（４）は、上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の第２の心筋細胞誘導処理用分化誘導調節剤として好適に用いることができ、培地における含有量等も上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の第２の心筋細胞誘導処理用分化誘導調節剤と同様とすることができる。
【０２５１】
＜分化誘導調節剤（５）＞
前記分化誘導調節剤（５）は、Ｗｎｔシグナル抑制物質と、エストロゲン様作用物質とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
前記分化誘導調節剤（５）は、Ｗｎｔシグナル抑制物質、及びエストロゲン様作用物質以外の分化誘導調節剤を含んでもよいが、含まないことが好ましい。
前記分化誘導調節剤（５）は、上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用分化誘導調節剤として好適に用いることができ、培地における含有量等も上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用分化誘導調節剤と同様とすることができる。
【０２５２】
前記分化誘導調節剤は、市販品を用いてもよいし、化学合成したものを用いてもよい。
【０２５３】
前記分化誘導調節剤は、各成分を含む１剤であってもよいし、成分ごとに別々の剤としてもよいし、任意の複数の成分を含む剤を組み合わせたものであってもよい。
【０２５４】
（培地）
本発明の培地は、多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するための培地であって、本発明の培地添加剤と、本発明の分化誘導調節剤とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
前記培地は、本発明の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法に好適に用いることができる。
【０２５５】
前記培地に用いる基礎培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０培地、及びαＭＥＭ培地からなる群から選択される少なくとも１種である。
前記ＤＭＥＭは、高グルコースであってもよいし、低グルコースであってもよい。
【０２５６】
前記培地の態様としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、下記培地（１）〜（１０）の少なくともいずれかの態様が好ましい。
【０２５７】
＜培地（１）＞
前記培地（１）は、基礎培地として、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０培地、及びαＭＥＭ培地からなる群から選択される少なくとも１種を用い、前記培地添加剤として、前記培地添加剤（１）を含み、前記分化誘導調節剤として、前記分化誘導調節剤（１）を含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
前記基礎培地の中でも、ＤＭＥＭ／Ｆ１２が好ましい。
前記培地（１）は、上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の胚様体形成工程における第１の分化誘導培地に、ＲＯＣＫ阻害剤を加えた培地として好適に用いることができる。
前記培地（１）の好ましい態様としては、上記胚様体形成工程用培地（１）が挙げられる。
【０２５８】
＜培地（２）＞
前記培地（２）は、基礎培地として、ＩＭＤＭを用い、前記培地添加剤として、前記培地添加剤（３）を含み、前記分化誘導調節剤として、前記分化誘導調節剤（１）を含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
前記培地（２）は、上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の胚様体形成工程における一液式分化誘導培地に、ＲＯＣＫ阻害剤を加えた培地として好適に用いることができる。
前記培地（２）の好ましい態様としては、上記胚様体形成工程用培地（２）が挙げられる。
【０２５９】
＜培地（３）＞
前記培地（３）は、基礎培地として、ＩＭＤＭを用い、前記培地添加剤として、前記培地添加剤（２）を含み、前記分化誘導調節剤として、前記分化誘導調節剤（２）を含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
前記培地（３）は、上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の中胚葉誘導工程における第２の分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル活性化物質を加えた培地として好適に用いることができる。
前記培地（３）の好ましい態様としては、上記中胚葉誘導工程用培地（１）が挙げられる。
【０２６０】
＜培地（４）＞
前記培地（４）は、基礎培地として、ＩＭＤＭを用い、前記培地添加剤として、前記培地添加剤（３）を含み、前記分化誘導調節剤として、前記分化誘導調節剤（２）を含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
前記培地（４）は、上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の中胚葉誘導工程における一液式分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル活性化物質を加えた培地として好適に用いることができる。
前記培地（４）の好ましい態様としては、上記中胚葉誘導工程用培地（２）が挙げられる。
【０２６１】
＜培地（５）＞
前記培地（５）は、基礎培地として、ＩＭＤＭを用い、前記培地添加剤として、前記培地添加剤（２）を含み、前記分化誘導調節剤として、前記分化誘導調節剤（３）を含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
前記培地（５）は、上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の第１の心筋細胞誘導処理における第２の分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤、及びエストロゲン様作用物質を加えた培地として好適に用いることができる。
前記培地（５）の好ましい態様としては、上記第１の心筋細胞誘導処理用培地（１）が挙げられる。
【０２６２】
＜培地（６）＞
前記培地（６）は、基礎培地として、ＩＭＤＭを用い、前記培地添加剤として、前記培地添加剤（３）を含み、前記分化誘導調節剤として、前記分化誘導調節剤（３）を含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
前記培地（６）は、上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の第１の心筋細胞誘導処理における一液式分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤、及びエストロゲン様作用物質を加えた培地として好適に用いることができる。
前記培地（６）の好ましい態様としては、上記第１の心筋細胞誘導処理用培地（２）が挙げられる。
【０２６３】
＜培地（７）＞
前記培地（７）は、基礎培地として、ＩＭＤＭを用い、前記培地添加剤として、前記培地添加剤（２）を含み、前記分化誘導調節剤として、前記分化誘導調節剤（４）を含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
前記培地（７）は、上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の第２の心筋細胞誘導処理における第２の分化誘導培地に、エストロゲン様作用物質を加えた培地として好適に用いることができる。
前記培地（７）の好ましい態様としては、上記第２の心筋細胞誘導処理用培地（１）が挙げられる。
【０２６４】
＜培地（８）＞
前記培地（８）は、基礎培地として、ＩＭＤＭを用い、前記培地添加剤として、前記培地添加剤（３）を含み、前記分化誘導調節剤として、前記分化誘導調節剤（４）を含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
前記培地（８）は、上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の第２の心筋細胞誘導処理における一液式分化誘導培地に、エストロゲン様作用物質を加えた培地として好適に用いることができる。
前記培地（８）の好ましい態様としては、上記第１の心筋細胞誘導処理用培地（２）が挙げられる。
【０２６５】
＜培地（９）＞
前記培地（９）は、基礎培地として、ＩＭＤＭを用い、前記培地添加剤として、前記培地添加剤（２）を含み、前記分化誘導調節剤として、前記分化誘導調節剤（５）を含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
前記培地（９）は、上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の第１の心筋細胞誘導処理と、前記第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理における第２の分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、及びエストロゲン様作用物質を加えた培地として好適に用いることができる。
前記培地（９）の好ましい態様としては、上記第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培地（１）が挙げられる。
【０２６６】
＜培地（１０）＞
前記培地（１０）は、基礎培地として、ＩＭＤＭを用い、前記培地添加剤として、前記培地添加剤（３）を含み、前記分化誘導調節剤として、前記分化誘導調節剤（５）を含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
前記培地（１０）は、上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の第１の心筋細胞誘導処理と、前記第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理における一液式分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、及びエストロゲン様作用物質を加えた培地として好適に用いることができる。
前記培地（１０）の好ましい態様としては、上記第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培地（２）が挙げられる。
【０２６７】
（培地作製用キット）
本発明の培地作製用キットは、多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するための培地作製用キットであって、本発明の培地添加剤と、本発明の分化誘導調節剤と、基礎培地とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
前記培地作製用キットは、本発明の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法に好適に用いることができる。
前記その他の構成としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培地を作製するための方法を教示する説明書などが挙げられる。
【０２６８】
前記培地作製用キットにおける基礎培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０培地、及びαＭＥＭ培地からなる群から選択される少なくとも１種である。
前記ＤＭＥＭは、高グルコースであってもよいし、低グルコースであってもよい。
【０２６９】
前記培地作製用キットの態様としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、下記培地作製用キット（１）〜（１０）の少なくともいずれかの態様が好ましい。
【０２７０】
＜培地作製用キット（１）＞
前記培地作製用キット（１）は、前記培地添加剤（１）と、前記分化誘導調節剤（１）と、基礎培地として、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０培地、及びαＭＥＭ培地からなる群から選択される少なくとも１種とを含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
前記基礎培地の中でも、ＤＭＥＭ／Ｆ１２が好ましい。
前記培地作製用キット（１）は、上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の胚様体形成工程における第１の分化誘導培地に、ＲＯＣＫ阻害剤を加えた培地の作製用キットとして好適に用いることができる。
前記培地作製用キット（１）により作製する培地の好ましい態様としては、上記胚様体形成工程用培地（１）が挙げられる。
【０２７１】
＜培地作製用キット（２）＞
前記培地作製用キット（２）は、前記培地添加剤（３）と、前記分化誘導調節剤（１）と、基礎培地として、ＩＭＤＭとを含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
前記培地作製用キット（２）は、上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の胚様体形成工程における一液式分化誘導培地に、ＲＯＣＫ阻害剤を加えた培地の作製用キットとして好適に用いることができる。
前記培地作製用キット（２）により作製する培地の好ましい態様としては、上記胚様体形成工程用培地（２）が挙げられる。
【０２７２】
＜培地作製用キット（３）＞
前記培地作製用キット（３）は、前記培地添加剤（２）と、前記分化誘導調節剤（２）と、基礎培地として、ＩＭＤＭとを含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
前記培地作製用キット（３）は、上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の中胚葉誘導工程における第２の分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル活性化物質を加えた培地の作製用キットとして好適に用いることができる。
前記培地作製用キット（３）により作製する培地の好ましい態様としては、上記中胚葉誘導工程用培地（１）が挙げられる。
【０２７３】
＜培地作製用キット（４）＞
前記培地作製用キット（４）は、前記培地添加剤（３）と、前記分化誘導調節剤（２）と、基礎培地として、ＩＭＤＭとを含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
前記培地作製用キット（４）は、上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の中胚葉誘導工程における一液式分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル活性化物質を加えた培地の作製用キットとして好適に用いることができる。
前記培地作製用キット（４）により作製する培地の好ましい態様としては、上記中胚葉誘導工程用培地（２）が挙げられる。
【０２７４】
＜培地作製用キット（５）＞
前記培地作製用キット（５）は、前記培地添加剤（２）と、前記分化誘導調節剤（３）と、基礎培地として、ＩＭＤＭとを含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
前記培地作製用キット（５）は、上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の第１の心筋細胞誘導処理における第２の分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤、及びエストロゲン様作用物質を加えた培地の作製用キットとして好適に用いることができる。
前記培地作製用キット（５）により作製する培地の好ましい態様としては、上記第１の心筋細胞誘導処理用培地（１）が挙げられる。
【０２７５】
＜培地作製用キット（６）＞
前記培地作製用キット（６）は、前記培地添加剤（３）と、前記分化誘導調節剤（３）と、基礎培地として、ＩＭＤＭとを含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
前記培地作製用キット（６）は、上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の第１の心筋細胞誘導処理における一液式分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤、及びエストロゲン様作用物質を加えた培地の作製用キットとして好適に用いることができる。
前記培地作製用キット（６）により作製する培地の好ましい態様としては、上記第１の心筋細胞誘導処理用培地（２）が挙げられる。
【０２７６】
＜培地作製用キット（７）＞
前記培地作製用キット（７）は、前記培地添加剤（２）と、前記分化誘導調節剤（４）と、基礎培地として、ＩＭＤＭとを含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
前記培地作製用キット（７）は、上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の第２の心筋細胞誘導処理における第２の分化誘導培地に、エストロゲン様作用物質を加えた培地の作製用キットとして好適に用いることができる。
前記培地作製用キット（７）により作製する培地の好ましい態様としては、上記第２の心筋細胞誘導処理用培地（１）が挙げられる。
【０２７７】
＜培地作製用キット（８）＞
前記培地作製用キット（８）は、前記培地添加剤（３）と、前記分化誘導調節剤（４）と、基礎培地として、ＩＭＤＭとを含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
前記培地作製用キット（８）は、上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の第２の心筋細胞誘導処理における一液式分化誘導培地に、エストロゲン様作用物質を加えた培地の作製用キットとして好適に用いることができる。
前記培地作製用キット（８）により作製する培地の好ましい態様としては、上記第１の心筋細胞誘導処理用培地（２）が挙げられる。
【０２７８】
＜培地作製用キット（９）＞
前記培地作製用キット（９）は、前記培地添加剤（２）と、前記分化誘導調節剤（５）と、基礎培地として、ＩＭＤＭとを含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
前記培地作製用キット（９）は、上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の第１の心筋細胞誘導処理と、前記第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理における第２の分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、及びエストロゲン様作用物質を加えた培地の作製用キットとして好適に用いることができる。
前記培地作製用キット（９）により作製する培地の好ましい態様としては、上記第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培地（１）が挙げられる。
【０２７９】
＜培地作製用キット（１０）＞
前記培地作製用キット（１０）は、前記培地添加剤（３）と、前記分化誘導調節剤（５）と、基礎培地として、ＩＭＤＭとを含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
前記培地作製用キット（１０）は、上述した多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法の第１の心筋細胞誘導処理と、前記第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理における一液式分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、及びエストロゲン様作用物質を加えた培地の作製用キットとして好適に用いることができる。
前記培地作製用キット（１０）により作製する培地の好ましい態様としては、上記第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培地（２）が挙げられる。
【０２８０】
（多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するためのキット）
本発明の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するためのキットは、本発明の培地、及び本発明の培地作製用キットの少なくともいずれかを含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
前記多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するためのキットは、本発明の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法に好適に用いることができる。
【０２８１】
前記培地、及び前記培地作製用キットは、どちらか一方を含んでいてもよいし、両者を含んでいてもよい。
【０２８２】
前記培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、上述した本発明の培地の項目に記載した前記培地（１）〜（１０）の少なくともいずれかを含むことが好ましく、前記培地（１）、（３）、（５）、及び（７）を含むことがより好ましく、前記培地（１）、（３）、（５）、（７）、及び（９）を含むことが特に好ましい。
【０２８３】
前記培地作製用キットとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、上述した本発明の培地作製用キットの項目に記載した前記培地作製用キット（１）〜（１０）の少なくともいずれかを含むことが好ましく、前記培地作製用キット（１）、（３）、（５）、及び（７）を含むことがより好ましく、前記培地作製用キット（１）、（３）、（５）、（７）、及び（９）を含むことが特に好ましい。
【０２８４】
前記その他の構成としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培養皿、本発明の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法を教示する説明書などが挙げられる。これらの中でも、本発明の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法を教示する説明書を含むことが好ましい。
【実施例】
【０２８５】
以下に試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの試験例に何ら限定されるものではない。
【０２８６】
（試験例１）
中胚葉誘導工程における培地に添加するＷｎｔシグナル活性化物質の検討を以下のようにして行った。
【０２８７】
＜多能性幹細胞＞
多能性幹細胞として、国立大学法人  東京大学医学部附属病院にて樹立した２つのヒトｉＰＳ細胞（クローン１、クローン２）を用いた。
【０２８８】
＜胚様体形成工程＞
常法に則って未分化状態で維持されている前記ヒトｉＰＳ細胞をコロニー状に解離し、下記培地（以下、「胚様体形成工程用培養液」と称することがある）に懸濁した後、低接着加工を行った培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ超低接着加工表面（コーニング社製））で浮遊培養（培養条件：３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２）を開始し（０日目）、１日間培養することで、前記ヒトｉＰＳ細胞の凝集体（胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  Ｂｏｄｙ：ＥＢ）を形成させた。
−胚様体形成工程用培養液−
基礎培地として、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ナカライテスク株式会社製）を用い、前記基礎培地に、分化誘導調節剤として、ＲＯＣＫ阻害剤であるＹ２７６３２（シグマ社製、５μＭ）、培地添加剤として、下記表４−１〜表４−２に記載の濃度となるように各成分を添加し、胚様体形成工程用培養液とした。
【０２８９】
【表４−１】
0006487654.tif 000007
【０２９０】
【表４−２】
0006487654.tif 000008
【０２９１】
＜洗浄工程＞
前記胚様体を培養液ごと遠心管に回収し、静置して前記胚様体を沈殿させた後、上清を除去した。次いで、ＩＭＤＭを加え、再度静置して前記胚様体を沈殿させた後、上清を除去した。この作業を２回繰り返し行った。
【０２９２】
＜中胚葉誘導工程＞
前記洗浄工程後、下記培地（以下、「中胚葉誘導工程用培養液」と称することがある）を加え、前記培養皿で、浮遊培養を再開した（胚様体形成工程開始１日目〜３日目）。
−中胚葉誘導工程用培養液−
基礎培地として、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）３４（インビトロジェン社製）を用い、前記基礎培地に、分化誘導調節剤として、Ｗｎｔシグナル活性化物質であるＣＨＩＲ９９０２１（ミリポア社製、１μＭ、３μＭ、５μＭ、又は７μＭ）、培地添加剤として、Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社製、２ｍＭ）、トランスフェリン（シグマ社製、１５０μｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）、及び１−チオグリセロール（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）を添加し、中胚葉誘導工程用培養液とした。
なお、ネガティブコントロールとして、Ｗｎｔシグナル活性化物質を含まない培養液も調製した。
【０２９３】
＜洗浄工程＞
前記中胚葉誘導後の胚様体を培養液ごと遠心管に回収し、静置して前記胚様体を沈殿させた後、上清を除去した。次いで、ＩＭＤＭを加え、再度静置して前記胚様体を沈殿させた後、上清を除去した。この作業を２回繰り返し行った。
【０２９４】
＜心筋細胞誘導工程＞
＜＜第１の心筋細胞誘導処理＞＞
前記洗浄工程後、下記培地（以下、「第１の心筋細胞誘導処理用培養液」と称することがある）を加え、前記培養皿で、浮遊培養を再開した（胚様体形成工程開始３日目〜６日目）。
−第１の心筋細胞誘導処理用培養液−
基礎培地として、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）３４（インビトロジェン社製）を用い、前記基礎培地に、分化誘導調節剤として、ＩＷＰ２（シグマ社製、５μＭ）、ＳＢ４３１５４２（シグマ社製、５μＭ）及びＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製、１０ｎｇ／ｍＬ）、培地添加剤として、Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社製、２ｍＭ）、トランスフェリン（シグマ社製、１５０μｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）、及び１−チオグリセロール（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）を添加し、第１の心筋細胞誘導処理用培養液とした。
【０２９５】
＜＜洗浄処理＞＞
前記第１の心筋細胞誘導処理後の胚様体を培養液ごと遠心管に回収し、静置して前記胚様体を沈殿させた後、上清を除去した。次いで、ＩＭＤＭを加え、再度静置して前記胚様体を沈殿させた後、上清を除去した。この作業を２回繰り返し行った。
【０２９６】
＜＜第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理＞＞
前記洗浄処理後、下記培地（以下、「第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培養液」と称することがある）を加え、前記培養皿で、浮遊培養を再開した（胚様体形成工程開始６日目〜８日目）。
−第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培養液−
基礎培地として、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）３４（インビトロジェン社製）を用い、前記基礎培地に、分化誘導調節剤として、ＩＷＰ２（シグマ社製、５μＭ）、及びＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製、１０ｎｇ／ｍＬ）、培地添加剤として、Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社製、２ｍＭ）、トランスフェリン（シグマ社製、１５０μｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）、及び１−チオグリセロール（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）を添加し、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培養液とした。
【０２９７】
＜＜洗浄処理＞＞
前記第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理後の胚様体を培養液ごと遠心管に回収し、静置して前記胚様体を沈殿させた後、上清を除去した。次いで、ＩＭＤＭを加え、再度静置して前記胚様体を沈殿させた後、上清を除去した。この作業を２回繰り返し行った。
【０２９８】
＜＜第２の心筋細胞誘導処理＞＞
前記洗浄処理後、下記培地（以下、「第２の心筋細胞誘導処理用培養液」と称することがある）を加え、前記培養皿で、浮遊培養を再開した（胚様体形成工程開始８日目〜１６日目）。
−第２の心筋細胞誘導処理用培養液−
基礎培地として、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）３４（インビトロジェン社製）を用い、前記基礎培地に、分化誘導調節剤として、ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製、１０ｎｇ／ｍＬ）、及びｂＦＧＦ（和光純薬工業株式会社製、１０ｎｇ／ｍＬ）、培地添加剤として、Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社製、２ｍＭ）、トランスフェリン（シグマ社製、１５０μｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）、及び１−チオグリセロール（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）を添加し、第２の心筋細胞誘導処理用培養液とした。
【０２９９】
＜評価＞
前記第２の心筋細胞誘導処理後の胚様体を倒立顕微鏡（カール・ツァイス社製）により観察し、任意に選択した５０個の胚様体における拍動している胚様体の割合を求めた。結果を図５に示す。
【０３００】
図５中、ＣＨＩＲは、ＣＨＩＲ９９０２１を表し、各項目における左側（黒色）は、クローン１、右側（灰色）は、クローン２の結果を表す。
図５の結果から、中胚葉誘導工程における培地にＷｎｔシグナル活性化物質を添加することにより、拍動している胚様体が得られることが示された。
【０３０１】
（試験例２）
中胚葉誘導工程における培地に添加するＣＨＩＲ９９０２１の至適濃度の検討を以下のようにして行った。
【０３０２】
＜多能性幹細胞＞
前記試験例１と同様に、国立大学法人  東京大学医学部附属病院にて樹立した２つのヒトｉＰＳ細胞（クローン１、クローン２）を用いた。
【０３０３】
＜胚様体形成工程＞
前記試験例１と同様にして、胚様体形成工程を行った。
【０３０４】
＜洗浄工程＞
前記試験例１と同様にして、前記胚様体を洗浄した。
【０３０５】
＜中胚葉誘導工程＞
前記試験例１において、Ｗｎｔシグナル活性化物質をＣＨＩＲ９９０２１（濃度：１μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、５．５μＭ、６μＭ、又は７μＭ）とした以外は、前記試験例１と同様にして、中胚葉誘導工程を行った。
【０３０６】
＜洗浄工程＞
前記試験例１と同様にして、前記中胚葉誘導後の胚様体を洗浄した。
【０３０７】
＜心筋細胞誘導工程＞
＜＜第１の心筋細胞誘導処理＞＞
前記試験例１と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理を行った。
【０３０８】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例１と同様にして、前記第１の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０３０９】
＜＜第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理＞＞
前記試験例１と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理を行った。
【０３１０】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例１と同様にして、前記第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０３１１】
＜＜第２の心筋細胞誘導処理＞＞
前記試験例１と同様にして、第２の心筋細胞誘導処理を行った。
【０３１２】
＜評価＞
前記試験例１と同様にして、任意に選択した５０個の胚様体における拍動している胚様体の割合を求めた。結果を図６及び図７に示す。
【０３１３】
図６は、クローン１の結果を示し、図７は、クローン２の結果を示す。
図６及び図７の結果から、ＣＨＩＲ９９０２１の濃度が３μＭ以上６μＭ以下の範囲において、拍動している胚様体が得られることがわかった。
また、図６の結果から、クローン１におけるＣＨＩＲ９９０２１の至適濃度は、３．９１μＭであり、図７の結果から、クローン２におけるＣＨＩＲ９９０２１の至適濃度は、４．３１μＭであることがわかった。
【０３１４】
（試験例３）
第１の心筋細胞誘導処理、及び第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理における培地において添加するＷｎｔシグナル抑制物質の検討を以下のようにして行った。
【０３１５】
＜多能性幹細胞＞
前記試験例１と同様に、国立大学法人  東京大学医学部附属病院にて樹立した２つのヒトｉＰＳ細胞（クローン１、クローン２）を用いた。
【０３１６】
＜胚様体形成工程＞
前記試験例１と同様にして、胚様体形成工程を行った。
【０３１７】
＜洗浄工程＞
前記試験例１と同様にして、前記胚様体を洗浄した。
【０３１８】
＜中胚葉誘導工程＞
前記試験例１において、Ｗｎｔシグナル活性化物質をＣＨＩＲ９９０２１（濃度：４μＭ）とした以外は、前記試験例１と同様にして、中胚葉誘導工程を行った。
【０３１９】
＜洗浄工程＞
前記試験例１と同様にして、前記中胚葉誘導後の胚様体を洗浄した。
【０３２０】
＜心筋細胞誘導工程＞
＜＜第１の心筋細胞誘導処理＞＞
前記試験例１において、第１の心筋細胞誘導処理用培養液における分化誘導調節剤を、下記Ｗｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤であるＳＢ４３１５４２（シグマ社製、５μＭ）、及びＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製、１０ｎｇ／ｍＬ）に代えた以外は、前記試験例１と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理を行った。
なお、ネガティブコントロールとして、Ｗｎｔシグナル抑制物質に代えてＤＭＳＯ（シグマ社製）を添加した培養液も調製した。
【０３２１】
−−Ｗｎｔシグナル抑制物質−−
・  ＩＷＰ２（シグマ社製）
濃度：１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、又は１０μＭ
・  ＩＷＲ１（シグマ社製）
濃度：１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、又は１５μＭ
・  ＸＡＶ９３９（シグマ社製）
濃度：１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、又は２０μＭ
・  ＫＹ０２１１１（シグマ社製）
濃度：１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、又は４０μＭ
【０３２２】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例１と同様にして、前記第１の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０３２３】
＜＜第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理＞＞
前記試験例１において、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培養液における分化誘導調節剤を、前記第１の心筋細胞誘導処理用培養液に用いたＷｎｔシグナル抑制物質、及びＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製、１０ｎｇ／ｍＬ）に代えた以外は、前記試験例１と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理を行った。
なお、ネガティブコントロールとして、Ｗｎｔシグナル抑制物質に代えてＤＭＳＯ（シグマ社製）を添加した培養液も調製した。
【０３２４】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例１と同様にして、前記第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０３２５】
＜＜第２の心筋細胞誘導処理＞＞
前記試験例１と同様にして、第２の心筋細胞誘導処理を行った。
【０３２６】
＜評価＞
前記試験例１と同様にして、任意に選択した５０個の胚様体における拍動している胚様体の割合を求めた。結果を図８に示す。
【０３２７】
図８中、ｎｅｇａ  ｃｏｎ（ＤＭＳＯ）は、ネガティブコントロールを表し、各項目における左側（黒色）は、クローン１、右側（灰色）は、クローン２の結果を表す。
図８の結果から、いずれのＷｎｔシグナル抑制物質を用いた場合にも、拍動している胚様体が得られることが示された。これらの中でも、ＩＷＰ２が低濃度帯から最も安定して分化誘導能を発揮した。
【０３２８】
（試験例４）
第１の心筋細胞誘導処理、及び第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理における培地に添加するＩＷＰ２の至適濃度の検討を以下のようにして行った。
【０３２９】
＜多能性幹細胞＞
前記試験例１と同様に、国立大学法人  東京大学医学部附属病院にて樹立した２つのヒトｉＰＳ細胞（クローン１、クローン２）を用いた。
【０３３０】
＜胚様体形成工程＞
前記試験例１と同様にして、胚様体形成工程を行った。
【０３３１】
＜洗浄工程＞
前記試験例１と同様にして、前記胚様体を洗浄した。
【０３３２】
＜中胚葉誘導工程＞
前記試験例３と同様にして、中胚葉誘導工程を行った。
【０３３３】
＜洗浄工程＞
前記試験例１と同様にして、前記中胚葉誘導後の胚様体を洗浄した。
【０３３４】
＜心筋細胞誘導工程＞
＜＜第１の心筋細胞誘導処理＞＞
前記試験例３において、Ｗｎｔシグナル抑制物質をＩＷＰ２（濃度：１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、又は１０μＭ）とした以外は、前記試験例３と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理を行った。
【０３３５】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例１と同様にして、前記第１の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０３３６】
＜＜第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理＞＞
前記試験例３において、Ｗｎｔシグナル抑制物質をＩＷＰ２（濃度：１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、又は１０μＭ）とした以外は、前記試験例３と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理を行った。
【０３３７】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例１と同様にして、前記第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０３３８】
＜＜第２の心筋細胞誘導処理＞＞
前記試験例１と同様にして、第２の心筋細胞誘導処理を行った。
【０３３９】
＜評価＞
前記試験例１と同様にして、任意に選択した５０個の胚様体における拍動している胚様体の割合を求めた。結果を図９及び図１０に示す。
【０３４０】
図９は、クローン１の結果を示し、図１０は、クローン２の結果を示す。
図９及び図１０の結果から、少なくともＩＷＰ２の濃度が１μＭ以上１０μＭ以下の範囲において、拍動している胚様体が得られることがわかった。
また、図９の結果から、クローン１におけるＩＷＰ２の至適濃度は、６．２２μＭであり、図１０の結果から、クローン２におけるＩＷＰ２の至適濃度は、５．１１μＭであることがわかった。
【０３４１】
（試験例５）
第１の心筋細胞誘導処理、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理、及び第２の心筋細胞誘導処理における培地に添加するＶＥＧＦに代わる物質の検討を以下のようにして行った。
【０３４２】
＜多能性幹細胞＞
多能性幹細胞として、国立大学法人  東京大学医学部附属病院にて樹立したヒトｉＰＳ細胞（クローン３）を用いた。
【０３４３】
＜胚様体形成工程＞
前記試験例１と同様にして、胚様体形成工程を行った。
【０３４４】
＜洗浄工程＞
前記試験例１と同様にして、前記胚様体を洗浄した。
【０３４５】
＜中胚葉誘導工程＞
中胚葉誘導工程用培地として下記中胚葉誘導工程用培養液を用いた以外は、前記試験例１と同様にして、中胚葉誘導工程を行った。
−中胚葉誘導工程用培養液−
基礎培地として、ＩＭＤＭ（ナカライテスク株式会社製）を用い、前記基礎培地に、分化誘導調節剤として、ＣＨＩＲ９９０２１（ミリポア社製、４μＭ）、培地添加剤として、下記表５−１〜表５−２に記載の濃度となるように各成分を添加し、中胚葉誘導工程用培養液とした。
【０３４６】
【表５−１】
0006487654.tif 000009
【０３４７】
【表５−２】
0006487654.tif 000010
【０３４８】
＜洗浄工程＞
前記試験例１と同様にして、前記中胚葉誘導後の胚様体を洗浄した。
【０３４９】
＜心筋細胞誘導工程＞
＜＜第１の心筋細胞誘導処理＞＞
第１の心筋細胞誘導処理用培地として下記第１の心筋細胞誘導処理用培養液を用いた以外は、前記試験例１と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理を行った。
−第１の心筋細胞誘導処理用培養液−
本試験例５の中胚葉誘導工程用培養液における分化誘導調節剤をＩＷＰ２（シグマ社製、５μＭ）、ＳＢ４３１５４２（シグマ社製、５μＭ）、及び下記候補物質に代えた以外は、前記中胚葉誘導工程用培養液と同様として、第１の心筋細胞誘導処理用培養液とした。
なお、ネガティブコントロール（（−））として、下記候補物質を含まない培養液も調製した。
【０３５０】
−−候補物質−−
・  ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製）
濃度：１０ｎｇ／ｍＬ
・  レチノイン酸（シグマ社製）
濃度：１ｎＭ、又は１０ｎＭ
・  エストラジオール（シグマ社製）
濃度：１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、又は１０μＭ
【０３５１】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例１と同様にして、前記第１の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０３５２】
＜＜第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理＞＞
第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培地として下記第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培養液を用い、浮遊培養の期間を胚様体形成工程開始６日目〜８日目とした以外は、本試験例５の前記第１の心筋細胞誘導処理と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理を行った。
−第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培養液−
本試験例５の中胚葉誘導工程用培養液における分化誘導調節剤をＩＷＰ２（シグマ社製、５μＭ）、及び下記候補物質に代えた以外は、前記中胚葉誘導工程用培養液と同様として、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培養液とした。
なお、ネガティブコントロール（（−））として、下記候補物質を含まない培養液も調製した。
【０３５３】
−−候補物質−−
・  ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製）
濃度：１０ｎｇ／ｍＬ
・  レチノイン酸（シグマ社製）
濃度：１ｎＭ、又は１０ｎＭ
・  エストラジオール（シグマ社製）
濃度：１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、又は１０μＭ
【０３５４】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例１と同様にして、前記第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０３５５】
＜＜第２の心筋細胞誘導処理＞＞
第２の心筋細胞誘導処理用培地として下記第２の心筋細胞誘導処理用培養液を用いた以外は、前記試験例１と同様にして、第２の心筋細胞誘導処理を行った。
−第２の心筋細胞誘導処理用培養液−
本試験例５の中胚葉誘導工程用培養液における分化誘導調節剤を下記候補物質に代えた以外は、前記中胚葉誘導工程用培養液と同様として、第２の心筋細胞誘導処理用培養液とした。
なお、ネガティブコントロール（（−））として、下記候補物質を含まない培養液も調製した。
【０３５６】
−−候補物質−−
・  ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製）
濃度：１０ｎｇ／ｍＬ
・  レチノイン酸（シグマ社製）
濃度：１ｎＭ、又は１０ｎＭ
・  エストラジオール（シグマ社製）
濃度：１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、又は１０μＭ
【０３５７】
＜評価＞
前記試験例１と同様にして、任意に選択した５０個の胚様体における拍動している胚様体の割合を求めた。結果を図１１及び図１２に示す。
なお、本試験例５では、前記候補物質は、各処理で同一の候補物質とし、その濃度も同一とした。即ち、候補物質としてエストラジオール（１ｎＭ）を用いた例では、第１の心筋細胞誘導処理、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理、及び第２の心筋細胞誘導処理の全ての処理において、エストラジオール（１ｎＭ）を使用した。
【０３５８】
図１１中、ＲＡは、レチノイン酸を表す。
図１１及び図１２中、Ｅ２は、エストラジオールを表す。
図１１及び図１２の結果から、エストラジオールを１ｎＭ〜１０μＭの濃度で添加することにより、ＶＥＧＦを上回る分化効率が得られることが認められた。
【０３５９】
（試験例６）
胚様体形成工程における培地に用いる基礎培地の検討を以下のようにして行った。
【０３６０】
＜多能性幹細胞＞
前記試験例５と同様に、国立大学法人  東京大学医学部附属病院にて樹立したヒトｉＰＳ細胞（クローン３）を用いた。
【０３６１】
＜胚様体形成工程＞
胚様体形成工程用培養液として、下記（１）〜（６）の胚様体形成工程用培養液を用いた以外は、前記試験例１と同様にして、胚様体形成工程を行った。
−胚様体形成工程用培養液−
（１）〜（５）：
基礎培地  ・・・  ５ｍＬ
ＫｎｏｃｋＯｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製、以下、「ＫＳＲ」と称することがある）  ・・・１ｍＬ
ＭＥＭ  Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ（ナカライテスク株式会社製、以下、「ＭＥＭ  ＮＥＡＡ」と称することがある）  ・・・  ６０μＬ
１−チオグリセロール（シグマ社製）  ・・・  ５０ｍｇ／Ｌ
Ｙ２７６３２（シグマ社製）  ・・・  ５μＭ
ｂＦＧＦ（和光純薬工業株式会社製）  ・・・  １０ｎｇ／ｍＬ
前記基礎培地は、（１）ＤＭＥＭ（高グルコース）（ナカライテスク株式会社製）、（２）ＤＭＥＭ（低グルコース）（ナカライテスク株式会社製）、（３）ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ナカライテスク株式会社製）、（４）ＩＭＤＭ（ナカライテスク株式会社製）、又は（５）αＭＥＭ培地（ナカライテスク株式会社製）を用いた。
（６）（コントロール）：
ＲｅｐｒｏＦＦ２（株式会社リプロセル製）  ・・・  ５ｍＬ
Ｙ２７６３２  ・・・  ５μＭ
ｂＦＧＦ  ・・・  １０ｎｇ／ｍＬ
【０３６２】
＜洗浄工程＞
前記試験例１と同様にして、前記胚様体を洗浄した。
【０３６３】
＜中胚葉誘導工程＞
中胚葉誘導工程用培地として下記中胚葉誘導工程用培養液を用いた以外は、前記試験例１と同様にして、中胚葉誘導工程を行った。
−中胚葉誘導工程用培養液−
基礎培地として、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）３４（インビトロジェン社製）を用い、前記基礎培地に、分化誘導調節剤として、ＣＨＩＲ９９０２１（ミリポア社製、４μＭ）、培地添加剤として、Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社製、２ｍＭ）、トランスフェリン（シグマ社製、１５０μｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）、及び１−チオグリセロール（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）を添加し、中胚葉誘導工程用培養液とした。
【０３６４】
＜洗浄工程＞
前記試験例１と同様にして、前記中胚葉誘導後の胚様体を洗浄した。
【０３６５】
＜心筋細胞誘導工程＞
＜＜第１の心筋細胞誘導処理＞＞
第１の心筋細胞誘導処理用培地として下記第１の心筋細胞誘導処理用培養液を用いた以外は、前記試験例１と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理を行った。
−第１の心筋細胞誘導処理用培養液−
基礎培地として、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）３４（インビトロジェン社製）を用い、前記基礎培地に、分化誘導調節剤として、ＩＷＰ２（シグマ社製、５μＭ）、ＳＢ４３１５４２（シグマ社製、５μＭ）、及びＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製、１０ｎｇ／ｍＬ）、培地添加剤として、Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社製、２ｍＭ）、トランスフェリン（シグマ社製、１５０μｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）、及び１−チオグリセロール（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）を添加し、第１の心筋細胞誘導処理用培養液とした。
【０３６６】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例１と同様にして、前記第１の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０３６７】
＜＜第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理＞＞
第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培地として下記第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培養液を用い、浮遊培養の期間を胚様体形成工程開始６日目〜８日目とした以外は、本試験例６の第１の心筋細胞誘導処理と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理を行った。
−第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培養液−
基礎培地として、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）３４（インビトロジェン社製）を用い、前記基礎培地に、分化誘導調節剤として、ＩＷＰ２（シグマ社製、５μＭ）、及びＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製、１０ｎｇ／ｍＬ）、培地添加剤として、Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社製、２ｍＭ）、トランスフェリン（シグマ社製、１５０μｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）、及び１−チオグリセロール（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）を添加し、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培養液とした。
【０３６８】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例１と同様にして、前記第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０３６９】
＜＜第２の心筋細胞誘導処理＞＞
第２の心筋細胞誘導処理用培地として下記第２の心筋細胞誘導処理用培養液を用いた以外は、前記試験例１と同様にして、第２の心筋細胞誘導処理を行った。
−第２の心筋細胞誘導処理用培養液−
基礎培地として、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）３４（インビトロジェン社製）を用い、前記基礎培地に、分化誘導調節剤として、ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製、１０ｎｇ／ｍＬ）、培地添加剤として、Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社製、２ｍＭ）、トランスフェリン（シグマ社製、１５０μｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）、及び１−チオグリセロール（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）を添加し、第２の心筋細胞誘導処理用培養液とした。
【０３７０】
＜評価＞
前記試験例１と同様にして、任意に選択した５０個の胚様体における拍動している胚様体の割合を求めた。結果を図１３に示す。
図１３の結果から、基礎培地としてＤＭＥＭ／Ｆ１２を用いた場合には、コントロールであるＲｅｐｒｏＦＦ２よりも分化効率が優れていることが示された。また、ＤＭＥＭ／Ｆ１２以外の基礎培地であっても、拍動している胚様体が得られることが示された。
【０３７１】
（試験例７）
胚様体形成工程における培地に添加する分化誘導調節剤の検討を以下のようにして行った。
【０３７２】
＜多能性幹細胞＞
前記試験例５と同様に、国立大学法人  東京大学医学部附属病院にて樹立したヒトｉＰＳ細胞（クローン３）を用いた。
【０３７３】
＜胚様体形成工程＞
胚様体形成工程用培養液として、前記試験例６の胚様体形成工程用培養液（３）（基礎培地として、ＤＭＥＭ／Ｆ１２を使用したもの）に、ＣＨＩＲ９９０２１（ミリポア社製）及びｂＦＧＦ（和光純薬工業株式会社製）の添加濃度を下記の濃度とした胚様体形成工程用培養液を用いた以外は、前記試験例６と同様にして、胚様体形成工程を行った。なお、コントロールとして、前記試験例６の胚様体形成工程用培養液（６）（ＲｅｐｒｏＦＦ２を使用したもの、以下、「ＲｅｐｒｏＦＦ２」と称することがある）についても同様にして、胚様体形成工程を行った。
−ｂＦＧＦ及びＣＨＩＲ９９０２１の添加濃度−
・  ｂＦＧＦ：０ｎｇ／ｍＬ（以下、「ＦＧＦ  ０」と称することがある）、５０ｎｇ／ｍＬ（以下、「ＦＧＦ  ５０」と称することがある）、又は１００ｎｇ／ｍＬ（以下、「ＦＧＦ  １００」と称することがある）
・  ＣＨＩＲ９９０２１：０．００５μＭ（以下、「ＣＨＩＲ  ０．００５」と称することがある）、０．２５μＭ（以下、「ＣＨＩＲ  ０．２５」と称することがある）、又は５μＭ（以下、「ＣＨＩＲ  ５」と称することがある）
【０３７４】
＜洗浄工程＞
前記試験例６と同様にして、前記胚様体を洗浄した。
【０３７５】
＜中胚葉誘導工程＞
前記試験例６と同様にして、中胚葉誘導工程を行った。
【０３７６】
＜洗浄工程＞
前記試験例６と同様にして、前記中胚葉誘導後の胚様体を洗浄した。
【０３７７】
＜心筋細胞誘導工程＞
＜＜第１の心筋細胞誘導処理＞＞
前記試験例６と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理を行った。
【０３７８】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例６と同様にして、前記第１の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０３７９】
＜＜第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理＞＞
前記試験例６と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理を行った。
【０３８０】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例６と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０３８１】
＜＜第２の心筋細胞誘導処理＞＞
前記試験例６と同様にして、第２の心筋細胞誘導処理を行った。
【０３８２】
＜評価＞
前記試験例１と同様にして、任意に選択した５０個の胚様体における拍動している胚様体の割合を求めた。結果を図１４及び図１５に示す。
前記試験例６の結果、及び図１４の結果から、ｂＦＧＦを１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ加えてもＲｅｐｒｏＦＦ２よりも分化効率が優れていることが示されたが、ｂＦＧＦを含まない場合が最も分化効率が優れていた。
また、図１５の結果から、ＣＨＩＲ９９０２１を５ｎＭ〜５μＭ加えてもＲｅｐｒｏＦＦ２よりも分化効率が優れていることが示された。なお、ＣＨＩＲ９９０２１を５ｎＭ加えた場合が最も分化効率が優れていたが、ＣＨＩＲ９９０２１を添加しなくても十分な分化効率が得られることから、コスト及び手間を考慮すると、ＣＨＩＲ９９０２１を添加しない態様が好ましいと考えられた。
【０３８３】
（試験例８）
胚様体形成工程における培地の検討を以下のようにして行った。
【０３８４】
＜多能性幹細胞＞
前記試験例５と同様に、国立大学法人  東京大学医学部附属病院にて樹立したヒトｉＰＳ細胞（クローン３）を用いた。
【０３８５】
＜胚様体形成工程＞
胚様体形成工程用培養液として、以下の胚様体形成工程用培養液Ａ又はＢを用いた以外は、前記試験例６と同様にして、胚様体形成工程を行った。
−胚様体形成工程用培養液Ａ−
前記試験例１における胚様体形成工程用培養液。
−胚様体形成工程用培養液Ｂ−
前記試験例６の胚様体形成工程用培養液（３）（（基礎培地として、ＤＭＥＭ／Ｆ１２を使用したもの）において、ｂＦＧＦを除いた培養液。
【０３８６】
＜洗浄工程＞
前記試験例６と同様にして、前記胚様体を洗浄した。
【０３８７】
＜中胚葉誘導工程＞
前記試験例６と同様にして、中胚葉誘導工程を行った。
【０３８８】
＜洗浄工程＞
前記試験例６と同様にして、前記中胚葉誘導後の胚様体を洗浄した。
【０３８９】
＜心筋細胞誘導工程＞
＜＜第１の心筋細胞誘導処理＞＞
前記試験例６と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理を行った。
【０３９０】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例６と同様にして、前記第１の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０３９１】
＜＜第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理＞＞
前記試験例６と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理を行った。
【０３９２】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例６と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０３９３】
＜＜第２の心筋細胞誘導処理＞＞
前記試験例６と同様にして、第２の心筋細胞誘導処理を行った。
【０３９４】
＜評価＞
前記試験例１と同様にして、任意に選択した５０個の胚様体における拍動している胚様体の割合を求めた。結果を図１６に示す。
図１６の結果から、前記胚様体形成工程用培養液Ａを用いた場合のほうが、分化効率が優れていることが示された。前記胚様体形成工程用培養液Ａは、組成不明の脂質と結合したＢＳＡを使用した前記ＫＳＲ（インビトロジェン社製）が含まれていないため、例えば、心筋細胞の分化に脂質成分が与える影響を調べる実験など、実験の応用範囲が広がると考えられる。
【０３９５】
（試験例９）
中胚葉誘導工程、及び心筋細胞誘導工程における培地の検討を以下のようにして行った。
【０３９６】
＜多能性幹細胞＞
前記試験例５と同様に、国立大学法人  東京大学医学部附属病院にて樹立したヒトｉＰＳ細胞（クローン３）を用いた。
【０３９７】
＜胚様体形成工程＞
胚様体形成工程用培養液として、前記試験例８における胚様体形成工程用培養液Ｂを用いた以外は、前記試験例５と同様にして、胚様体形成工程を行った。
【０３９８】
＜洗浄工程＞
前記試験例５と同様にして、前記胚様体を洗浄した。
【０３９９】
＜中胚葉誘導工程＞
中胚葉誘導工程用培地として、前記試験例５の中胚葉誘導工程用培養液におけるポリビニルアルコール（以下、「ＰＶＡ」と称することがある）及び牛血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」と称することがある）の濃度を下記の濃度とした培養液を用いた以外は、前記試験例５と同様にして、中胚葉誘導工程を行った。
また、コントロール（以下、「ＳＰ３４」と称することがある）として、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）３４（インビトロジェン社製）に、分化誘導調節剤として、ＣＨＩＲ９９０２１（ミリポア社製、４μＭ）、培地添加剤として、Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社製、２ｍＭ）、トランスフェリン（シグマ社製、１５０μｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）、及び１−チオグリセロール（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）を添加した中胚葉誘導工程用培養液についても同様にして、中胚葉誘導工程を行った。
−ポリビニルアルコール及び牛血清アルブミンの濃度−
（１）ＰＶＡ  ４，０００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ５，０００ｍｇ／Ｌ（以下、「ＰＶＡ４０００／ＢＳＡ５０００」と称することがある）
（２）ＰＶＡ  ４，０００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ５００ｍｇ／Ｌ（以下、「ＰＶＡ４０００／ＢＳＡ５００」と称することがある）
（３）ＰＶＡ  ４，０００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ０ｍｇ／Ｌ（以下、「ＰＶＡ４０００／ＢＳＡ０」と称することがある）
（４）ＰＶＡ  １，０００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ５，０００ｍｇ／Ｌ（以下、「ＰＶＡ１０００／ＢＳＡ５０００」と称することがある）
（５）ＰＶＡ  １，０００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ５００ｍｇ／Ｌ（以下、「ＰＶＡ１０００／ＢＳＡ５００」と称することがある）
（６）ＰＶＡ  １，０００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ０ｍｇ／Ｌ（以下、「ＰＶＡ１０００／ＢＳＡ０」と称することがある）
（７）ＰＶＡ  ０ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ０ｍｇ／Ｌ（以下、「ＰＶＡ０／ＢＳＡ０」と称することがある）
【０４００】
＜洗浄工程＞
前記試験例５と同様にして、前記中胚葉誘導後の胚様体を洗浄した。
【０４０１】
＜心筋細胞誘導工程＞
＜＜第１の心筋細胞誘導処理＞＞
第１の心筋細胞誘導処理用培地として、本試験例９の前記中胚葉誘導工程用培養液におけるＣＨＩＲ９９０２１を、ＩＷＰ２（シグマ社製、５μＭ）、ＳＢ４３１５４２（シグマ社製、５μＭ）、及びＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製、１０ｎｇ／ｍＬ）に代え、インスリン（シグマ社製、１０ｎｇ／ｍＬ）を追加した以外は同様とした第１の心筋細胞誘導処理用培地を用い、浮遊培養の期間を胚様体形成工程開始３日目〜５日目に変えた以外は、前記試験例５と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理を行った。
また、コントロールとして、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）３４（インビトロジェン社製）に、分化誘導調節剤として、ＩＷＰ２（シグマ社製、５μＭ）、ＳＢ４３１５４２（シグマ社製、５μＭ）、及びＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製、１０ｎｇ／ｍＬ）、培地添加剤として、Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社製、２ｍＭ）、トランスフェリン（シグマ社製、１５０μｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）、及び１−チオグリセロール（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）を添加した培養液についても同様にして、第１の心筋細胞誘導処理を行った。
【０４０２】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例５と同様にして、前記第１の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０４０３】
＜＜第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理＞＞
第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培地として、本試験例９の前記中胚葉誘導工程用培養液におけるＣＨＩＲ９９０２１を、ＩＷＰ２（シグマ社製、５μＭ）、及びＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製、１０ｎｇ／ｍＬ）に代え、インスリン（シグマ社製、１０ｎｇ／ｍＬ）を追加した以外は同様とした第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培地を用い、浮遊培養の期間を胚様体形成工程開始５日目〜８日目に変えた以外は、前記試験例５と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理を行った。
また、コントロールとして、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）３４（インビトロジェン社製）に、分化誘導調節剤として、ＩＷＰ２（シグマ社製、５μＭ）、及びＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製、１０ｎｇ／ｍＬ）、培地添加剤として、Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社製、２ｍＭ）、トランスフェリン（シグマ社製、１５０μｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）、及び１−チオグリセロール（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）を添加した培養液についても同様にして、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理を行った。
【０４０４】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例５と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０４０５】
＜＜第２の心筋細胞誘導処理＞＞
第２の心筋細胞誘導処理用培地として、本試験例９の前記中胚葉誘導工程用培養液におけるＣＨＩＲ９９０２１を、ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製、１０ｎｇ／ｍＬ）に代え、インスリン（シグマ社製、１０ｎｇ／ｍＬ）を追加した以外は同様とした第２の心筋細胞誘導処理用培地を用いた以外は、前記試験例５と同様にして、第２の心筋細胞誘導処理を行った。
また、コントロールとして、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）３４（インビトロジェン社製）に、分化誘導調節剤として、ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製、１０ｎｇ／ｍＬ）、培地添加剤として、Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社製、２ｍＭ）、トランスフェリン（シグマ社製、１５０μｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）、及び１−チオグリセロール（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）を添加した培養液についても同様にして、第２の心筋細胞誘導処理を行った。
【０４０６】
＜評価＞
前記試験例１と同様にして、任意に選択した５０個の胚様体における拍動している胚様体の割合を求めた。結果を図１７に示す。
図１７の結果から、（１）ＰＶＡ  ４，０００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ５，０００ｍｇ／Ｌ、及び（４）ＰＶＡ  １，０００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ５，０００ｍｇ／Ｌの場合には、コントロールよりも優れた分化効率を示した。コントロールに用いたＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）３４には、毒物である２−メルカプトエタノール、成分が明らかでない脂質成分であるＨｕｍａｎ−ＥｘＣｙｔｅ、及び高価でロット間差が大きいヒト血清アルブミンが含まれているが、これらを含まない培地でも優れた分化効率を示す培地が得られることが示された。
【０４０７】
（試験例１０）
中胚葉誘導工程、及び心筋細胞誘導工程における培地の検討を以下のようにして行った。
【０４０８】
＜多能性幹細胞＞
前記試験例５と同様に、国立大学法人  東京大学医学部附属病院にて樹立したヒトｉＰＳ細胞（クローン３）を用いた。
【０４０９】
＜胚様体形成工程＞
前記試験例９と同様にして、胚様体形成工程を行った。
【０４１０】
＜洗浄工程＞
前記試験例９と同様にして、前記胚様体を洗浄した。
【０４１１】
＜中胚葉誘導工程＞
中胚葉誘導工程用培地として、前記試験例５の中胚葉誘導工程用培養液におけるポリビニルアルコール（以下、「ＰＶＡ」と称することがある）及び牛血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」と称することがある）の濃度を下記の濃度とした培養液を用いた以外は、前記試験例９と同様にして、中胚葉誘導工程を行った。
また、コントロール（以下、「ＳＰ３４」と称することがある）として、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）３４（インビトロジェン社製）に、分化誘導調節剤として、ＣＨＩＲ９９０２１（ミリポア社製、４μＭ）、培地添加剤として、Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社製、２ｍＭ）、トランスフェリン（シグマ社製、１５０μｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）、及び１−チオグリセロール（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）を添加した中胚葉誘導工程用培養液についても同様にして、中胚葉誘導工程を行った。
−ポリビニルアルコール及び牛血清アルブミンの濃度−
（８）ＰＶＡ  ５００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ５，０００ｍｇ／Ｌ（以下、「ＰＶＡ５００／ＢＳＡ５０００」と称することがある）
（９）ＰＶＡ  ５００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  １，５００ｍｇ／Ｌ（以下、「ＰＶＡ５００／ＢＳＡ１５００」と称することがある）
（１０）ＰＶＡ  ５００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ５００ｍｇ／Ｌ（以下、「ＰＶＡ５００／ＢＳＡ５００」と称することがある）
（１１）ＰＶＡ  ５００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ０ｍｇ／Ｌ（以下、「ＰＶＡ５００／ＢＳＡ０」と称することがある）
【０４１２】
＜洗浄工程＞
前記試験例９と同様にして、前記中胚葉誘導後の胚様体を洗浄した。
【０４１３】
＜心筋細胞誘導工程＞
＜＜第１の心筋細胞誘導処理＞＞
前記試験例９において、試験例９の中胚葉誘導工程用培養液に基づいて第１の心筋細胞誘導処理用培地を調製していた点を、本試験例１０の中胚葉誘導工程用培養液に基づいて第１の心筋細胞誘導処理用培地を調製した以外は、試験例９と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理を行った。また、前記試験例９と同様にして、コントロールについても第１の心筋細胞誘導処理を行った。
【０４１４】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例９と同様にして、前記第１の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０４１５】
＜＜第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理＞＞
前記試験例９において、試験例９の中胚葉誘導工程用培養液に基づいて第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培地を調製していた点を、本試験例１０の中胚葉誘導工程用培養液に基づいて第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培地を調製した以外は、試験例９と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理を行った。また、前記試験例９と同様にして、コントロールについても第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理を行った。
【０４１６】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例９と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０４１７】
＜＜第２の心筋細胞誘導処理＞＞
前記試験例９において、試験例９の中胚葉誘導工程用培養液に基づいて第２の心筋細胞誘導処理用培地を調製していた点を、本試験例１０の中胚葉誘導工程用培養液に基づいて第２の心筋細胞誘導処理用培地を調製した以外は、試験例９と同様にして、第２の心筋細胞誘導処理を行った。また、前記試験例９と同様にして、コントロールについても第２の心筋細胞誘導処理を行った。
【０４１８】
＜評価＞
前記試験例１と同様にして、任意に選択した５０個の胚様体における拍動している胚様体の割合を求めた。結果を図１８に示す。
図１８の結果から、（８）ＰＶＡ  ５００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ５，０００ｍｇ／Ｌの場合には、コントロールよりも優れた分化効率を示した。
【０４１９】
（試験例１１）
中胚葉誘導工程、及び心筋細胞誘導工程における培地の検討を以下のようにして行った。
【０４２０】
＜多能性幹細胞＞
前記試験例５と同様に、国立大学法人  東京大学医学部附属病院にて樹立したヒトｉＰＳ細胞（クローン３）を用いた。
【０４２１】
＜胚様体形成工程＞
前記試験例９と同様にして、胚様体形成工程を行った。
【０４２２】
＜洗浄工程＞
前記試験例９と同様にして、前記胚様体を洗浄した。
【０４２３】
＜中胚葉誘導工程＞
中胚葉誘導工程用培地として、前記試験例５の中胚葉誘導工程用培養液におけるポリビニルアルコール（以下、「ＰＶＡ」と称することがある）及び牛血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」と称することがある）の濃度を下記の濃度とした培養液を用いた以外は、前記試験例９と同様にして、中胚葉誘導工程を行った。
また、コントロール（以下、「ＳＰ３４」と称することがある）として、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）３４（インビトロジェン社製）に、分化誘導調節剤として、ＣＨＩＲ９９０２１（ミリポア社製、４μＭ）、培地添加剤として、Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社製、２ｍＭ）、トランスフェリン（シグマ社製、１５０μｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）、及び１−チオグリセロール（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）を添加した中胚葉誘導工程用培養液についても同様にして、中胚葉誘導工程を行った。
−ポリビニルアルコール及び牛血清アルブミンの濃度−
（１２）ＰＶＡ  １，５００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ５，０００ｍｇ／Ｌ（以下、「ＰＶＡ１５００／ＢＳＡ５０００」と称することがある）
（１３）ＰＶＡ  １，５００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ４，０００ｍｇ／Ｌ（以下、「ＰＶＡ１５００／ＢＳＡ４０００」と称することがある）
（１４）ＰＶＡ  １，５００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ３，０００ｍｇ／Ｌ（以下、「ＰＶＡ１５００／ＢＳＡ３０００」と称することがある）
（１５）ＰＶＡ  １，０００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ５，０００ｍｇ／Ｌ（以下、「ＰＶＡ１０００／ＢＳＡ５０００」と称することがある）
（１６）ＰＶＡ  １，０００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ４，０００ｍｇ／Ｌ（以下、「ＰＶＡ１０００／ＢＳＡ４０００」と称することがある）
（１７）ＰＶＡ  １，０００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ３，０００ｍｇ／Ｌ（以下、「ＰＶＡ１０００／ＢＳＡ３０００」と称することがある）
（１８）ＰＶＡ  ５００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ５，０００ｍｇ／Ｌ（以下、「ＰＶＡ５００／ＢＳＡ５０００」と称することがある）
（１９）ＰＶＡ  ５００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ４，０００ｍｇ／Ｌ（以下、「ＰＶＡ５００／ＢＳＡ４０００」と称することがある）
（２０）ＰＶＡ  ５００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ３，０００ｍｇ／Ｌ（以下、「ＰＶＡ５００／ＢＳＡ３０００」と称することがある）
【０４２４】
＜洗浄工程＞
前記試験例９と同様にして、前記中胚葉誘導後の胚様体を洗浄した。
【０４２５】
＜心筋細胞誘導工程＞
＜＜第１の心筋細胞誘導処理＞＞
前記試験例９において、試験例９の中胚葉誘導工程用培養液に基づいて第１の心筋細胞誘導処理用培地を調製していた点を、本試験例１１の中胚葉誘導工程用培養液に基づいて第１の心筋細胞誘導処理用培地を調製した以外は、試験例９と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理を行った。また、前記試験例９と同様にして、コントロールについても第１の心筋細胞誘導処理を行った。
【０４２６】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例９と同様にして、前記第１の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０４２７】
＜＜第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理＞＞
前記試験例９において、試験例９の中胚葉誘導工程用培養液に基づいて第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培地を調製していた点を、本試験例１１の中胚葉誘導工程用培養液に基づいて第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培地を調製した以外は、試験例９と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理を行った。また、前記試験例９と同様にして、コントロールについても第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理を行った。
【０４２８】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例９と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０４２９】
＜＜第２の心筋細胞誘導処理＞＞
前記試験例９において、試験例９の中胚葉誘導工程用培養液に基づいて第２の心筋細胞誘導処理用培地を調製していた点を、本試験例１１の中胚葉誘導工程用培養液に基づいて第２の心筋細胞誘導処理用培地を調製した以外は、試験例９と同様にして、第２の心筋細胞誘導処理を行った。また、前記試験例９と同様にして、コントロールについても第２の心筋細胞誘導処理を行った。
【０４３０】
＜評価＞
前記試験例１と同様にして、任意に選択した５０個の胚様体における拍動している胚様体の割合を求めた。結果を図１９に示す。
図１９の結果から、（１２）ＰＶＡ  １，５００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ５，０００ｍｇ／Ｌ、（１３）ＰＶＡ  １，５００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ４，０００ｍｇ／Ｌ、（１５）ＰＶＡ  １，０００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ５，０００ｍｇ／Ｌ、（１６）ＰＶＡ  １，０００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ４，０００ｍｇ／Ｌ、（１８）ＰＶＡ  ５００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ５，０００ｍｇ／Ｌ、及び（１９）ＰＶＡ  ５００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ４，０００ｍｇ／Ｌの場合には、コントロールよりも優れた分化効率を示した。
【０４３１】
（試験例１２）
中胚葉誘導工程、及び心筋細胞誘導工程における培地の検討を以下のようにして行った。
【０４３２】
＜多能性幹細胞＞
前記試験例５と同様に、国立大学法人  東京大学医学部附属病院にて樹立したヒトｉＰＳ細胞（クローン３）を用いた。
【０４３３】
＜胚様体形成工程＞
前記試験例９と同様にして、胚様体形成工程を行った。
【０４３４】
＜洗浄工程＞
前記試験例９と同様にして、前記胚様体を洗浄した。
【０４３５】
＜中胚葉誘導工程＞
中胚葉誘導工程用培地として、前記試験例５の中胚葉誘導工程用培養液におけるポリビニルアルコール（以下、「ＰＶＡ」と称することがある）及び牛血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」と称することがある）の濃度を下記の濃度とした培養液を用いた以外は、前記試験例９と同様にして、中胚葉誘導工程を行った。
また、コントロール（以下、「ＳＰ３４」と称することがある）として、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）３４（インビトロジェン社製）に、ＣＨＩＲ９９０２１（ミリポア社製、４μＭ）、培地添加剤として、Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社製、２ｍＭ）、トランスフェリン（シグマ社製、１５０μｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）、及び１−チオグリセロール（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）を添加した中胚葉誘導工程用培養液についても同様にして、中胚葉誘導工程を行った。
−ポリビニルアルコール及び牛血清アルブミンの濃度−
（２１）ＰＶＡ  ５００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ５，０００ｍｇ／Ｌ（以下、「ＰＶＡ５００／ＢＳＡ５０００」と称することがある）
（２２）ＰＶＡ  ０ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ５，０００ｍｇ／Ｌ（以下、「ＰＶＡ０／ＢＳＡ５０００」と称することがある）
（２３）ＰＶＡ  ０ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ４，０００ｍｇ／Ｌ（以下、「ＰＶＡ０／ＢＳＡ４０００」と称することがある）
（２４）ＰＶＡ  ０ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ３，０００ｍｇ／Ｌ（以下、「ＰＶＡ０／ＢＳＡ３０００」と称することがある）
【０４３６】
＜洗浄工程＞
前記試験例９と同様にして、前記中胚葉誘導後の胚様体を洗浄した。
【０４３７】
＜心筋細胞誘導工程＞
＜＜第１の心筋細胞誘導処理＞＞
前記試験例９において、試験例９の中胚葉誘導工程用培養液に基づいて第１の心筋細胞誘導処理用培地を調製していた点を、本試験例１２の中胚葉誘導工程用培養液に基づいて第１の心筋細胞誘導処理用培地を調製した以外は、試験例９と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理を行った。また、前記試験例９と同様にして、コントロールについても第１の心筋細胞誘導処理を行った。
【０４３８】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例９と同様にして、前記第１の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０４３９】
＜＜第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理＞＞
前記試験例９において、試験例９の中胚葉誘導工程用培養液に基づいて第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培地を調製していた点を、本試験例１２の中胚葉誘導工程用培養液に基づいて第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培地を調製した以外は、試験例９と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理を行った。また、前記試験例９と同様にして、コントロールについても第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理を行った。
【０４４０】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例９と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０４４１】
＜＜第２の心筋細胞誘導処理＞＞
前記試験例９において、試験例９の中胚葉誘導工程用培養液に基づいて第２の心筋細胞誘導処理用培地を調製していた点を、本試験例１２の中胚葉誘導工程用培養液に基づいて第２の心筋細胞誘導処理用培地を調製した以外は、試験例９と同様にして、第２の心筋細胞誘導処理を行った。また、前記試験例９と同様にして、コントロールについても第２の心筋細胞誘導処理を行った。
【０４４２】
＜評価＞
前記試験例１と同様にして、任意に選択した５０個の胚様体における拍動している胚様体の割合を求めた。結果を図２０に示す。
図２０の結果から、（２１）ＰＶＡ  ５００ｍｇ／Ｌ、ＢＳＡ  ５，０００ｍｇ／Ｌの場合には、コントロールよりも優れた分化効率を示した。
【０４４３】
（試験例１３）
中胚葉誘導工程、及び心筋細胞誘導工程における培地の検討を以下のようにして行った。
【０４４４】
＜多能性幹細胞＞
前記試験例５と同様に、国立大学法人  東京大学医学部附属病院にて樹立したヒトｉＰＳ細胞（クローン３）を用いた。
【０４４５】
＜胚様体形成工程＞
前記試験例９と同様にして、胚様体形成工程を行った。
【０４４６】
＜洗浄工程＞
前記試験例９と同様にして、前記胚様体を洗浄した。
【０４４７】
＜中胚葉誘導工程＞
中胚葉誘導工程用培地として、前記試験例５の中胚葉誘導工程用培養液におけるトランスフェリンの濃度を５ｍｇ／Ｌ、又は０ｍｇ／Ｌとした培養液を用いた以外は、前記試験例９と同様にして、中胚葉誘導工程を行った。
また、コントロール（以下、「ＳＰ３４」と称することがある）として、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）３４（インビトロジェン社製）に、ＣＨＩＲ９９０２１（ミリポア社製、４μＭ）、培地添加剤として、Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社製、２ｍＭ）、トランスフェリン（シグマ社製、１５０μｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）、及び１−チオグリセロール（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）を添加した中胚葉誘導工程用培養液についても同様にして、中胚葉誘導工程を行った。
【０４４８】
＜洗浄工程＞
前記試験例９と同様にして、前記中胚葉誘導後の胚様体を洗浄した。
【０４４９】
＜心筋細胞誘導工程＞
＜＜第１の心筋細胞誘導処理＞＞
前記試験例９において、試験例９の中胚葉誘導工程用培養液に基づいて第１の心筋細胞誘導処理用培地を調製していた点を、本試験例１３の中胚葉誘導工程用培養液に基づいて第１の心筋細胞誘導処理用培地を調製し、また、インスリン（１０ｎｇ／ｍＬ）の添加を行った場合と、行わなかった場合のそれぞれの培地を調製した以外は、試験例９と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理を行った。また、前記試験例９と同様にして、コントロールについても第１の心筋細胞誘導処理を行った。
【０４５０】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例９と同様にして、前記第１の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０４５１】
＜＜第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理＞＞
前記試験例９において、試験例９の中胚葉誘導工程用培養液に基づいて第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培地を調製していた点を、本試験例１３の中胚葉誘導工程用培養液に基づいて第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培地を調製し、また、インスリン（１０ｎｇ／ｍＬ）の添加を行った場合と、行わなかった場合のそれぞれの培地を調製した以外は、試験例９と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理を行った。また、前記試験例９と同様にして、コントロールについても第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理を行った。
【０４５２】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例９と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０４５３】
＜＜第２の心筋細胞誘導処理＞＞
前記試験例９において、試験例９の中胚葉誘導工程用培養液に基づいて第２の心筋細胞誘導処理用培地を調製していた点を、本試験例１３の中胚葉誘導工程用培養液に基づいて第２の心筋細胞誘導処理用培地を調製し、また、インスリン（１０ｎｇ／ｍＬ）の添加を行った場合と、行わなかった場合のそれぞれの培地を調製した以外は、試験例９と同様にして、第２の心筋細胞誘導処理を行った。また、前記試験例９と同様にして、コントロールについても第２の心筋細胞誘導処理を行った。
【０４５４】
＜評価＞
前記試験例１と同様にして、任意に選択した５０個の胚様体における拍動している胚様体の割合を求めた。結果を図２１に示す。
なお、本試験例１３では、各処理におけるインスリンの添加の有無は同一とした。即ち、第１の心筋細胞誘導処理用培養液にインスリンを添加した場合には、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培養液、及び第２の心筋細胞誘導処理用培養液においてもインスリンを添加し、第１の心筋細胞誘導処理用培養液にインスリンを添加しなかった場合には、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培養液、及び第２の心筋細胞誘導処理用培養液においてもインスリンを添加しなかった。
【０４５５】
図２１中、トランスフェリン、及びインスリンのそれぞれについて、培養液中に含まれる場合を＋、含まれない場合を−で示した。
図２１の結果から、トランスフェリンを含まなくてもコントロール（従来使用されていたＳｔｅｍＰｒｏ３４）を上回る分化効率を示すが、トランスフェリンを含むほうが、分化効率が優れることがわかった。また、心筋細胞誘導工程で用いる培地にインスリンが含まれていてもコントロールを上回る分化効率を示すが、インスリンを含まないほうが、分化効率が優れることもわかった。
【０４５６】
（試験例１４）
浮遊培養時の酸素条件、及び中胚葉誘導工程の培地へのインスリンの添加の有無の検討を以下のようにして行った。
【０４５７】
＜多能性幹細胞＞
前記試験例５と同様に、国立大学法人  東京大学医学部附属病院にて樹立したヒトｉＰＳ細胞（クローン３）を用いた。
【０４５８】
＜胚様体形成工程＞
浮遊培養時の酸素条件を、（１）低酸素条件（酸素濃度５％）、又は（２）低酸素でない条件（酸素濃度２１％）とした以外は、前記試験例９と同様にして、胚様体形成工程を行った。
【０４５９】
＜洗浄工程＞
前記試験例９と同様にして、前記胚様体を洗浄した。
【０４６０】
＜中胚葉誘導工程＞
中胚葉誘導工程用培地として、前記試験例５の中胚葉誘導工程用培養液に、インスリン（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加した培養液、又は添加しなかった培養液を用い、また、浮遊培養時の酸素条件を、（１）低酸素条件（酸素濃度５%）、又は（２）低酸素でない条件（酸素濃度２１％）とした以外は、前記試験例９と同様にして、中胚葉誘導工程を行った。
また、コントロール（以下、「ＳＰ３４」と称することがある）として、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）３４（インビトロジェン社製）に、ＣＨＩＲ９９０２１（ミリポア社製、４μＭ）、培地添加剤として、Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社製、２ｍＭ）、トランスフェリン（シグマ社製、１５０μｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）、及び１−チオグリセロール（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）を添加した中胚葉誘導工程用培養液についても同様にして、中胚葉誘導工程を行った。なお、コントロールにおける浮遊培養時の酸素条件は、低酸素条件である。
【０４６１】
＜洗浄工程＞
前記試験例９と同様にして、前記中胚葉誘導後の胚様体を洗浄した。
【０４６２】
＜心筋細胞誘導工程＞
＜＜第１の心筋細胞誘導処理＞＞
第１の心筋細胞誘導処理用培地として、インスリンを追加しなかった以外は、前記試験例９における第１の心筋細胞誘導処理用培養液と同様とした培地を用い、浮遊培養時の酸素条件を、（１）低酸素条件（酸素濃度５％）、又は（２）低酸素でない条件（酸素濃度２１％）とした以外は、前記試験例９と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理を行った。
また、前記試験例９と同様にして、コントロールについても第１の心筋細胞誘導処理を行った。なお、コントロールにおける浮遊培養時の酸素条件は、低酸素条件である。
【０４６３】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例９と同様にして、前記第１の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０４６４】
＜＜第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理＞＞
第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培地として、インスリンを追加しなかった以外は、前記試験例９における第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培養液と同様とした培地を用い、浮遊培養時の酸素条件を、（１）低酸素条件（酸素濃度５％）、又は（２）低酸素でない条件（酸素濃度２１％）とした以外は、前記試験例９と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理を行った。
また、前記試験例９と同様にして、コントロールについても第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理を行った。なお、コントロールにおける浮遊培養時の酸素条件は、低酸素条件である。
【０４６５】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例９と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０４６６】
＜＜第２の心筋細胞誘導処理＞＞
第２の心筋細胞誘導処理用培地として、インスリンを追加しなかった以外は、前記試験例９における第２の心筋細胞誘導処理用培養液と同様とした培地を用い、浮遊培養時の酸素条件を、（１）低酸素条件（酸素濃度５％）、又は（２）低酸素でない条件（酸素濃度２１％）とした以外は、前記試験例９と同様にして、第２の心筋細胞誘導処理を行った。
また、前記試験例９と同様にして、コントロールについても第２の心筋細胞誘導処理を行った。なお、コントロールにおける浮遊培養時の酸素条件は、低酸素条件である。
【０４６７】
＜評価＞
前記試験例１と同様にして、任意に選択した５０個の胚様体における拍動している胚様体の割合を求めた。結果を図２２に示す。
なお、本試験例１４では、各工程における浮遊培養時の酸素条件は同一とした。即ち、胚様体形成工程における酸素条件を低酸素条件とした場合には、中胚葉誘導工程、及び心筋細胞誘導工程における酸素条件は、低酸素条件とした。
【０４６８】
図２２中、低酸素条件の場合を＋、低酸素でない条件の場合を−で示し、中胚葉誘導工程における培養液にインスリンが含まれる場合を＋、含まれない場合を−で示した。
図２２の結果から、中胚葉誘導工程における培養液がインスリンを含まないことで、コントロール（従来使用されていたＳｔｅｍＰｒｏ３４）を上回る分化効率を示すことがわかった。また、従来の分化誘導方法は、低酸素条件下で行われていたが、本発明の培地を用いることにより、低酸素でない条件でもコントロールよりも優れた分化効率を示すことがわかった。
【０４６９】
（試験例１５）
各種培地の検討を以下のようにして行った。
【０４７０】
＜培地の調製＞
（１）  ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）３４（インビトロジェン社製）に、培地添加剤として、Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社製、２ｍＭ）、トランスフェリン（シグマ社製、１５０μｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）、及び１−チオグリセロール（シグマ社製、５０μｇ／ｍＬ）を添加した培地（以下、「ＳｔｅｍＰｒｏ３４」と称することがある）を調製した。
【０４７１】
（２）  ＲｅｐｒｏＦＦ２（株式会社リプロセル製、以下、「ＲｅｐｒｏＦＦ２」と称することがある）を用意した。
【０４７２】
（３）  基礎培地として、ＩＭＤＭ（ナカライテスク株式会社製）を用い、前記基礎培地に、培地添加剤として、下記表６−１〜表６−２に記載の濃度となるように各成分を添加した培地（以下、「一液式培地」と称することがある）を調製した。
【０４７３】
【表６−１】
0006487654.tif 000011
【０４７４】
【表６−２】
0006487654.tif 000012
【０４７５】
（４）  基礎培地として、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ナカライテスク株式会社製）を用い、前記基礎培地に、培地添加剤として、下記表７−１〜表７−２に記載の濃度となるように各成分を添加した培地（以下、「第一培地」と称することがある）を調製した。
【０４７６】
【表７−１】
0006487654.tif 000013
【０４７７】
【表７−２】
0006487654.tif 000014
（５）  基礎培地として、ＩＭＤＭ（ナカライテスク株式会社製）を用い、前記基礎培地に、培地添加剤として、下記表８に記載の濃度となるように各成分を添加した培地（以下、「第二培地」と称することがある）を調製した。
【０４７８】
【表８】
0006487654.tif 000015
【０４７９】
＜多能性幹細胞＞
前記試験例５と同様に、国立大学法人  東京大学医学部附属病院にて樹立したヒトｉＰＳ細胞（クローン３）を用いた。
【０４８０】
＜胚様体形成工程＞
上記で調製した培地（ＳｔｅｍＰｒｏ３４、ＲｅｐｒｏＦＦ２、一液式培地、又は第一培地）に、分化誘導調節剤として、Ｙ２７６３２（シグマ社製、５μＭ）を添加した培地を胚様体形成工程用培養液とした以外は、試験例５と同様にして、胚様体形成工程を行った。
【０４８１】
＜洗浄工程＞
前記試験例５と同様にして、前記胚様体を洗浄した。
【０４８２】
＜中胚葉誘導工程＞
上記で調製した培地（ＳｔｅｍＰｒｏ３４、一液式培地、又は第二培地）に、分化誘導調節剤として、ＣＨＩＲ９９０２１（ミリポア社製、４μＭ）を添加した培地を中胚葉誘導工程用培養液とした以外は、試験例５と同様にして、中胚葉誘導工程を行った。
【０４８３】
＜洗浄工程＞
前記試験例５と同様にして、前記中胚葉誘導後の胚様体を洗浄した。
【０４８４】
＜心筋細胞誘導工程＞
＜＜第１の心筋細胞誘導処理＞＞
上記で調製した培地（ＳｔｅｍＰｒｏ３４、一液式培地、又は第二培地）に、分化誘導調節剤として、ＩＷＰ２（シグマ社製、５μＭ）、ＳＢ４３１５４２（シグマ社製、５μＭ）、及びエストラジオール（シグマ社製、１００ｎＭ）を添加した培地を第１の心筋細胞誘導処理用培養液とした以外は、試験例５と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理を行った。
【０４８５】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例５と同様にして、前記第１の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０４８６】
＜＜第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理＞＞
上記で調製した培地（ＳｔｅｍＰｒｏ３４、一液式培地、又は第二培地）に、分化誘導調節剤として、ＩＷＰ２（シグマ社製、５μＭ）、及びエストラジオール（シグマ社製、１００ｎＭ）を添加した培地を第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培養液とした以外は、試験例５と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理を行った。
【０４８７】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例５と同様にして、前記第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０４８８】
＜＜第２の心筋細胞誘導処理＞＞
上記で調製した培地（ＳｔｅｍＰｒｏ３４、一液式培地、又は第二培地）に、分化誘導調節剤として、エストラジオール（シグマ社製、１００ｎＭ）を添加した培地を第２の心筋細胞誘導処理用培養液とした以外は、試験例５と同様にして、第２の心筋細胞誘導処理を行った。
【０４８９】
本試験例１５の各工程における培地と、分化誘導調節剤とを下記表９に示す。
【０４９０】
【表９】
0006487654.tif 000016
【０４９１】
＜評価＞
胚様体形成工程開始８日目、１２日目、及び１６日目に測定した以外は、前記試験例１と同様にして、任意に選択した５０個の胚様体における拍動している胚様体の割合を求めた。結果を図２３に示す。
図２３の結果から、本発明の培地と、分化誘導調節剤との組合せを用いたＢ−１、及びＦ−１では、従来の培地を用いたＡ−１、Ｃ−１、Ｄ−１、及びＥ−１よりも優れた分化効率が得られることが示された。また、一液式の培地であるＢ−１よりも、二液式の培地としたＦ−１のほうが心筋細胞の分化誘導効率に優れていることが示された。
【０４９２】
（試験例１６）
分化誘導調節剤の検討を以下のようにして行った。
【０４９３】
＜培地の調製＞
前記試験例１５と同様にして、第一培地、及び第二培地を調製した。
【０４９４】
＜多能性幹細胞＞
多能性幹細胞として、前記試験例１で用いたヒトｉＰＳ細胞のうち、クローン１を用いた。
【０４９５】
＜胚様体形成工程＞
上記で調製した第一培地に、分化誘導調節剤として、ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ社製、０．５ｎｇ／ｍＬ）、又はＹ２７６３２（シグマ社製、５μＭ）を添加した培地を胚様体形成工程用培養液とした以外は、試験例５と同様にして、胚様体形成工程を行った。
【０４９６】
＜洗浄工程＞
前記試験例５と同様にして、前記胚様体を洗浄した。
【０４９７】
＜中胚葉誘導工程＞
上記で調製した第二培地に、分化誘導調節剤として、（１）Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ（Ｒ＆Ｄ社製、６ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ社製、１０ｎｇ／ｍＬ）、及びｂＦＧＦ（ＦＧＦ２、Ｒ＆Ｄ社製、５ｎｇ／ｍＬ）、又は（２）ＣＨＩＲ９９０２１（ミリポア社製、４μＭ）を添加した培地を中胚葉誘導工程用培養液とし、浮遊培養の期間を胚様体形成工程開始１日目〜３日目、又は１日目〜４日目とした以外は、試験例５と同様にして、中胚葉誘導工程を行った。
【０４９８】
＜洗浄工程＞
前記試験例５と同様にして、前記中胚葉誘導後の胚様体を洗浄した。
【０４９９】
＜心筋細胞誘導工程＞
＜＜第１の心筋細胞誘導処理＞＞
上記で調製した第二培地に、分化誘導調節剤として、（１）Ｄｋｋ１（Ｒ＆Ｄ社製、１５０ｎｇ／ｍＬ）、ＳＢ４３１５４２（シグマ社製、５μＭ）、及びＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製、１０ｎｇ／ｍＬ）、又は（２）ＩＷＰ２（シグマ社製、５μＭ）、ＳＢ４３１５４２（シグマ社製、５μＭ）、及びエストラジオール（シグマ社製、１００ｎＭ）を添加した培地を第１の心筋細胞誘導処理用培養液とし、浮遊培養の期間を胚様体形成工程開始３日目〜６日目、又は４日目〜６日目とした以外は、試験例５と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理を行った。
【０５００】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例５と同様にして、前記第１の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０５０１】
＜＜第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理＞＞
上記で調製した第二培地に、分化誘導調節剤として、（１）Ｄｋｋ１（Ｒ＆Ｄ社製、１５０ｎｇ／ｍＬ）、ＳＢ４３１５４２（シグマ社製、５μＭ）、及びＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製、１０ｎｇ／ｍＬ）、又は（２）ＩＷＰ２（シグマ社製、５μＭ）、及びエストラジオール（シグマ社製、１００ｎＭ）を添加した培地を第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理用培養液とした以外は、試験例５と同様にして、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理を行った。
【０５０２】
＜＜洗浄処理＞＞
前記試験例５と同様にして、前記第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間の心筋細胞誘導処理後の胚様体を洗浄した。
【０５０３】
＜＜第２の心筋細胞誘導処理＞＞
上記で調製した培地（ＳｔｅｍＰｒｏ３４、一液式培地、又は第二培地）に、分化誘導調節剤として、エストラジオール（シグマ社製、１００ｎＭ）を添加した培地を第２の心筋細胞誘導処理用培養液とした以外は、試験例５と同様にして、第２の心筋細胞誘導処理を行った。
上記で調製した第二培地に、分化誘導調節剤として、（１）ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製、１０ｎｇ／ｍＬ）、及びｂＦＧＦ（ＦＧＦ２、Ｒ＆Ｄ社製、５ｎｇ／ｍＬ）、又は（２）エストラジオール（シグマ社製、１００ｎＭ）を添加した培地を第２の心筋細胞誘導処理用培養液とした以外は、試験例５と同様にして、第２の心筋細胞誘導処理を行った。
【０５０４】
本試験例１６の各工程における分化誘導調節剤と、培地とを下記表１０に示す。
【０５０５】
【表１０】
0006487654.tif 000017
【０５０６】
＜評価−１＞
前記試験例１５と同様にして、任意に選択した５０個の胚様体における拍動している胚様体の割合を求めた。結果を図２４に示す。
図２４の結果から、本発明の培地と、分化誘導調節剤との組合せを用いたＣ−２では、本発明の培地と、分化誘導調節剤との組合せではないＡ−２、及びＢ−２よりも優れた分化効率が得られることが示された。
【０５０７】
＜評価−２＞
本試験例１６の前記Ｃ−２により分化誘導を行い、得られた心筋細胞をパッチクランプ法により評価した。結果の一例を図２５Ａ〜図２５Ｄに示す。また、これまでに報告されているデータを図２６（リプロセル株式会社のホームページより）及び図２７（Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３０１：  Ｈ２００６−Ｈ２０１７，  ２０１１）に示す。
−パッチクランプ法−
得られた心筋細胞をＥＢから単離し、ゼラチンをコートしたカバーグラス上に播種した。５〜１０日間培養した後、自発的に拍動している単細胞をホールセル状態にし、活動電位は電流固定下（０ｐＡ）で自発性の活動電位を測定し、各種イオンチャネル電流は電位固定下で観察した。細胞外液の組成は、ＮａＣｌ  １５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＫＣｌ  ４ｍｍｏｌ／Ｌ、ＣａＣｌ２  １．２ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＣｌ２  １ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｄ（＋）−Ｇｌｕｃｏｓｅ  １０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ  １０ｍｍｏｌ／Ｌ（ＮａＯＨを用いてｐＨ７．４に調整）のものを用いた。電極内液の組成は、ＫＣｌ  １４０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＣｌ２  １ｍｍｏｌ／Ｌ、ＥＧＴＡ  ５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＡＴＰ  ５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ  １０ｍｍｏｌ／Ｌ（ＫＯＨを用いてｐＨ７．２に調整）のものを用いた。
イオンチャネル電流を測定する際の電位プロトコルは以下を用いた。
・  ナトリウム電流  ：  保持電位−９０ｍＶから−２０ｍＶまで２０ミリ秒の脱分極刺激を１秒間隔で与えた。
・  カルシウム電流  ：  保持電位−４０ｍＶから−０ｍＶまで１００ミリ秒の脱分極刺激を１０秒間隔で与えた。
・  カリウム電流  ：  保持電位−９０ｍＶから−４０ｍＶまで５０ミリ秒の脱分極の後、２０ｍＶ、２秒の脱分極、更に−４０ｍＶ、０．５秒に再分極させる刺激を１５秒間隔で与えた。
【０５０８】
図２５Ａは、活動電位を測定した結果を示し、図２５Ｂは、ナトリウム電流を測定した結果を示し、図２５Ｃは、カリウム電流を測定した結果を示し、図２５Ｄは、カルシウム電流を測定した結果を示す。
図２５Ａ〜図２７の結果から、本発明の方法により分化誘導された心筋細胞は、９５％が活動電位振幅１４０ｍＶ以上の大きな活動電位を有しており、過去に報告されているｉＰＳ細胞由来心筋細胞と比べて、大きく明瞭なプラトー相を有する活動電位が確認された。また、本発明の方法により分化誘導された心筋細胞は、３００ｐＡ以上のピークカリウム電流、１ｎＡ以上のピークカルシウム電流、及び６．５ｎＡ以上のピークナトリウム電流を示していた。したがって、本発明の方法により分化誘導された心筋細胞は、高品質な心筋細胞であることが示された。
【０５０９】
また、Ｗｎｔシグナル活性化物質及びＷｎｔシグナル抑制物質だけでは、心筋細胞への分化誘導効率は非常に低効率であることから、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤及びエストラジオールを追加することが、接着培養系を介することなく浮遊培養系のみで心筋細胞へ分化させるために必要であったと推察される。
【０５１０】
本発明の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法によれば、浮遊培養開始後に接着培養を介することなく心筋細胞を分化誘導することができるので、大量に、かつ簡便に高品質な心筋細胞を製造することができる。
また、本発明の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法では、安定して入手可能であり、ロット間差が少ない成分を分化誘導調節剤として用いるため、安定して高品質な心筋細胞を製造することができる。
また、本発明の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法に用いる培地は、安価な成分で構成されているため、安価に高品質な心筋細胞を製造することができる。
【０５１１】
更に、本発明の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法に用いる培地は、毒物（例えば、２−メルカプトエタノール）や、成分が明らかでない脂質成分（例えば、Ｈｕｍａｎ−ＥｘＣｙｔｅ）を含まないので、安全性にも優れる。
【０５１２】
また、本発明の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法によれば、クローン間差を問わずに、高品質な心筋細胞を製造することができる。
【０５１３】
また、本発明の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法では、ｉＰＳ細胞の単細胞培養、細胞外基質の培養皿へのコーティング、剥離しやすい細胞の培地交換、厳密なタイミングの培地交換、分化心筋の再浮遊などの特別な技術を用いなくても高品質な心筋細胞を製造することができる。
【０５１４】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞  多能性幹細胞を浮遊培養し、胚様体を形成する胚様体形成工程と、
前記胚様体を浮遊培養し、中胚葉を誘導する中胚葉誘導工程と、
前記中胚葉誘導後の胚様体を浮遊培養し、心筋細胞を誘導する心筋細胞誘導工程とを含み、
前記心筋細胞誘導工程が、第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理とを含み、
前記胚様体形成工程における培地が、第１の分化誘導培地に、ＲＯＣＫ阻害剤を加えた培地、及び一液式分化誘導培地に、ＲＯＣＫ阻害剤を加えた培地のいずれかであり、
前記中胚葉誘導工程における培地が、第２の分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル活性化物質を加えた培地、及び一液式分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル活性化物質を加えた培地のいずれかであり、
前記第１の心筋細胞誘導処理における培地が、第２の分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤、及びエストロゲン様作用物質を加えた培地、及び一液式分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤、及びエストロゲン様作用物質を加えた培地のいずれかであり、
前記第２の心筋細胞誘導処理における培地が、第２の分化誘導培地に、エストロゲン様作用物質を加えた培地、及び一液式分化誘導培地に、エストロゲン様作用物質を加えた培地のいずれかであり、
前記第１の分化誘導培地が、基礎培地に、インスリン、トランスフェリン、アルブミン、及び１−チオグリセロールを加えた培地であり、
前記第２の分化誘導培地が、イスコフ改変ダルベッコ培地に、アルブミン、ポリビニルアルコール、エタノラミン塩酸塩、亜セレン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン、ＤＬ−α−トコフェロール酢酸エステル、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、１−チオグリセロール、及びアスコルビン酸を加えた培地であり、
前記一液式分化誘導培地が、イスコフ改変ダルベッコ培地に、トランスフェリン、アルブミン、ポリビニルアルコール、エタノラミン塩酸塩、亜セレン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン、ＤＬ−α−トコフェロール酢酸エステル、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、１−チオグリセロール、及びアスコルビン酸を加えた培地であることを特徴とする多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法である。
＜２＞  胚様体形成工程における培地が、第１の分化誘導培地に、ＲＯＣＫ阻害剤を加えた培地であり、
中胚葉誘導工程における培地が、第２の分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル活性化物質を加えた培地であり、
第１の心筋細胞誘導処理における培地が、第２の分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤、及びエストロゲン様作用物質を加えた培地であり、
第２の心筋細胞誘導処理における培地が、第２の分化誘導培地に、エストロゲン様作用物質を加えた培地である前記＜１＞に記載の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法である。
＜３＞  胚様体形成工程における培地が、一液式分化誘導培地に、ＲＯＣＫ阻害剤を加えた培地であり、
中胚葉誘導工程における培地が、一液式分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル活性化物質を加えた培地であり、
第１の心筋細胞誘導処理における培地が、一液式分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤、及びエストロゲン様作用物質を加えた培地であり、
第２の心筋細胞誘導処理における培地が、一液式分化誘導培地に、エストロゲン様作用物質を加えた培地である前記＜１＞に記載の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法である。
＜４＞  第１の心筋細胞誘導処理と、第２の心筋細胞誘導処理との間に、第２の分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、及びエストロゲン様作用物質を加えた培地、及び一液式分化誘導培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、及びエストロゲン様作用物質を加えた培地のいずれかで培養する処理を含む前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法である。
＜５＞  第１の分化誘導培地が、更に、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン・Ｈ２Ｏ、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、チアミン、還元型グルタチオン、アスコルビン酸−２−２ＰＯ４のマグネシウム塩、ＡｇＮＯ３、ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、Ｂａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２、３ＣｄＳＯ４・８Ｈ２Ｏ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、Ｃｒ２（ＳＯ４）３・Ｈ２Ｏ、ＧｅＯ２、Ｎａ２ＳｅＯ３、ＫＢｒ、ＫＩ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＮａＦ、Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ、ＮａＶＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、ＲｂＣｌ、ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、及びＺｒＯＣｌ２・８Ｈ２Ｏを含み、
第２の分化誘導培地が、更に、Ｌ−グルタミン、及びトランスフェリンを含み、
一液式分化誘導培地が、更に、グリシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、チアミン、還元型グルタチオン、アスコルビン酸−２−２ＰＯ４のマグネシウム塩、ＡｇＮＯ３、ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、Ｂａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２、３ＣｄＳＯ４・８Ｈ２Ｏ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、Ｃｒ２（ＳＯ４）３・Ｈ２Ｏ、ＧｅＯ２、Ｎａ２ＳｅＯ３、ＫＢｒ、ＫＩ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＮａＦ、Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ、ＮａＶＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、ＲｂＣｌ、ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、及びＺｒＯＣｌ２・８Ｈ２Ｏを含む前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法である。
＜６＞  多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するための培地に添加する培地添加剤であって、
アルブミン及び１−チオグリセロールの少なくともいずれかを含むことを特徴とする培地添加剤である。
＜７＞  更に、トランスフェリン、インスリン、ポリビニルアルコール、エタノラミン塩酸塩、亜セレン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン、ＤＬ−α−トコフェロール酢酸エステル、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、及びアスコルビン酸からなる群から選択される少なくとも１種を含む前記＜６＞に記載の培地添加剤である。
＜８＞  更に、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン・Ｈ２Ｏ、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、チアミン、還元型グルタチオン、アスコルビン酸−２−２ＰＯ４のマグネシウム塩、ＡｇＮＯ３、ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、Ｂａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２、３ＣｄＳＯ４・８Ｈ２Ｏ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、Ｃｒ２（ＳＯ４）３・Ｈ２Ｏ、ＧｅＯ２、Ｎａ２ＳｅＯ３、ＫＢｒ、ＫＩ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＮａＦ、Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ、ＮａＶＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、ＲｂＣｌ、ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、及びＺｒＯＣｌ２・８Ｈ２Ｏからなる群から選択される少なくとも１種を含む前記＜６＞から＜７＞のいずれかに記載の培地添加剤である。
＜９＞  多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するための培地に添加する分化誘導調節剤であって、
ＲＯＣＫ阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化物質、Ｗｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤、及びエストロゲン様作用物質からなる群から選択される少なくとも１種を含むことを特徴とする分化誘導調節剤である。
＜１０＞  多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するための培地であって、
前記＜６＞から＜８＞のいずれかに記載の培地添加剤と、
前記＜９＞に記載の分化誘導調節剤とを含み、
基礎培地が、ダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物Ｆ−１２ハム、ダルベッコ改変イーグル培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、及びαＭＥＭ培地からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする培地である。
＜１１＞  多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するための培地作製用キットであって、
前記＜６＞から＜８＞のいずれかに記載の培地添加剤と、
前記＜９＞に記載の分化誘導調節剤と、
ダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物Ｆ−１２ハム、ダルベッコ改変イーグル培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、及びαＭＥＭ培地からなる群から選択される少なくとも１種の基礎培地とを含むことを特徴とする培地作製用キットである。
＜１２＞  前記＜１０＞に記載の培地、及び前記＜１１＞に記載の培地作製用キットの少なくともいずれかを含むことを特徴とする多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導するためのキットである。
＜１３＞  前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法を教示する説明書を含む前記＜１２＞に記載の幹細胞から心筋細胞を分化誘導するためのキットである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６】
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【図２７】
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