(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）胆汁酸又はその塩、（ｂ）ポリビニルアルコール、及び（ｃ）グラム陰性菌に対する抑制剤を含有する、腸球菌検出用培地。
【請求項２】
さらに、（ｄ）有色の色原体化合物を遊離し得るβ−グルコシダーゼ基質を含有する、請求項１に記載の腸球菌検出用培地。
【請求項３】
（ｂ）ポリビニルアルコールが、重量平均分子量５０００〜２０００００かつ鹸化度７５〜９９％のものである、請求項１又は２に記載の腸球菌検出用培地。
【請求項４】
アジ化ナトリウムを実質的に含有しない、請求項１〜３何れか一項に記載の腸球菌検出用培地。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか一項に記載の培地に検体を接種する工程、前記検体に含まれる微生物を培養する工程、及び前記微生物の培養コロニーを検出する工程を含む、腸球菌の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸球菌（Enterococcus）を検出するための培地、及び前記培地を用いる腸球菌の検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸球菌はグラム陽性の球菌であり、ヒトを含む哺乳類の腸管内に常在している一連の細菌である。腸球菌は病原性が弱いとされるが、術後の心内膜炎や院内感染の原因となることがある。加えて、腸球菌は糞便汚染の指標としても重要であることから、食品や飲料水の衛生状態を管理する上で、腸球菌を検出することは重要である。
【０００３】
腸球菌の選択分離培地としては、一般にＫＦ（Kenner Fecal）寒天培地やＡＣ（アザイド−クエン酸）ブイヨン培地が用いられている（非特許文献１）。これらの培地は、０．１重量％以上のアジ化ナトリウムを腸球菌の選択剤として含有するものである。しかしながら、アジ化ナトリウムを０．１重量％以上含有する組成物は、毒物として厳重に管理することが定められているため、市販の培地ではアジ化ナトリウムを別に添加するか、既に混合されている粉末培地ではそれ自体を鍵付き保管庫で保管する必要がある（非特許文献２）。
【０００４】
このような保管や流通上の煩雑さを解消するため、アジ化ナトリウムの含有量が０．１重量％未満であっても腸球菌を検出できる選択培地が求められている。例えば、０．１重量未満のアジ化ナトリウムとアミノグリコシド系抗生物質とを組み合わせて含有する腸球菌検出用培地が提案されている（特許文献１）。また、アジ化ナトリウムを含有せず、クリスタルバイオレットを特定濃度で含有することによって腸球菌の検出を可能とした培地も提案されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−１３１８９７号公報
【特許文献２】特開２００４−５２８８５６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】新 細菌培地学講座−下II−＜第二版＞株式会社 近代出版  監修 坂崎利一、著者 田村一満・吉崎悦郎・三木寛二  1990年1月20日発行
【非特許文献２】毒物及び劇物取締法  別表第１第２８号  最終改正：平成18年4月21日政令第176号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、培地の調製や保管等における取り扱いの容易さや、検出精度の観点から、腸球菌検出用培地にはさらなる改良の余地があった。
このような状況を鑑みて、本発明は、アジ化ナトリウムを実質的に含有せず、調製が簡便で、高い精度で選択的に腸球菌を検出できる、腸球菌検出用培地を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意研究の末、胆汁酸等のイオン性界面活性剤と、ポリビニルアルコールとを組み合わせると、腸球菌を選択的に検出できることを見出
し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］（ａ）イオン性界面活性剤、及び（ｂ）ポリビニルアルコールを含有する、腸球菌検出用培地。
［２］さらに、（ｃ）グラム陰性菌に対する抑制剤を含有する、［１］に記載の腸球菌検出用培地。
［３］さらに、（ｄ）有色の色原体化合物を遊離し得るβ−グルコシダーゼ基質を含有する、［１］又は［２］に記載の腸球菌検出用培地。
［４］（ａ）イオン性界面活性剤が、胆汁酸又はその塩、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、及びＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムからなる群から選択される、［１］〜［３］の何れかに記載の腸球菌検出用培地。
［５］（ｂ）ポリビニルアルコールが、重量平均分子量５０００〜２０００００かつ鹸化度７５〜９９％のものである、［１］〜［４］の何れかに記載の腸球菌検出用培地。
［６］アジ化ナトリウムを実質的に含有しない、［１］〜［５］の何れかに記載の腸球菌検出用培地。
［７］［１］〜［６］の何れかに記載の培地に検体を接種する工程、前記検体に含まれる微生物を培養する工程、及び前記微生物の培養コロニーを検出する工程を含む、腸球菌の検出方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の培地を用いれば、簡便な調製により、高い精度で選択的に腸球菌を検出できる。また、本発明の培地は、アジ化ナトリウムを含有させる必要がないため、保管及び流通上の煩雑さがないため、有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の培地は、（ａ）イオン性界面活性剤、及び（ｂ）ポリビニルアルコールを含有する。
本発明において（ａ）イオン性界面活性剤は、腸球菌以外の微生物の発育を抑制し、そのコロニーを排除する役割を担う。特に、グラム陽性菌は細胞外膜を有さないため、界面活性作用によって細胞壁が破壊されやすく、好適にその発育が抑制される。
イオン性界面活性剤としては、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤のいずれでもよく、例えば、アニオン性界面活性剤として胆汁酸又はその塩、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウムが、カチオン性界面活性剤として塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ジデシルジメチルアンモニウム塩、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム塩が、両性界面活性剤として塩化アルキルポリアミノエチルグリシン、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）が挙げられる。これらのうち、アニオン性界面活性剤がより好ましく、胆汁酸又はその塩、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等がさらに好ましく、胆汁酸又はその塩が特に好ましい。なお、腸球菌は他のグラム陽性菌に比べて、胆汁酸に対する抵抗性がややあることが知られている。
胆汁酸としては、例えば、Ｂｉｌｅ ｓａｌｔｓ Ｎｏ．３、コール酸、デオキシコール酸、タウロデオキシコール酸が挙げられる。胆汁酸の塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩が挙げられる。
本発明の培地におけるイオン性界面活性剤の含有量は、培地を後述の検出方法に用いる時（細菌生育時、以降同じ）の濃度として、好ましくは１〜１０ｇ／Ｌ、より好ましくは１〜６ｇ／Ｌである。このような含有量とすることにより、腸球菌以外の微生物、特に他のグラム陽性菌を好適に抑制することができる。
【００１１】
本発明において（ｂ）ポリビニルアルコールは、培地を成型するためのマトリックスと
なるゲル化剤としての役割を担う。さらに、（ａ）イオン性界面活性剤の生育抑制作用を腸球菌に対してのみ無効にして、本発明の培地に腸球菌特異的な選択性を付与する役割をも担う。
ポリビニルアルコールは、重量平均分子量が好ましくは５０００〜２０００００、また鹸化度が好ましくは７５〜９９％、より好ましくは８５〜９０％のものを用いる。
本発明の培地におけるポリビニルアルコールの含有量は、培地を後述の検出方法に用いる時の濃度として、好ましくは１４０〜３００ｇ／Ｌ、より好ましくは１６０〜２２０ｇ／Ｌである。このような含有量とすることにより、培地を取扱いやすく成型でき、また腸球菌の選択性を向上させることができる。
また、（ａ）イオン性界面活性剤と（ｂ）ポリビニルアルコールとの含有量の質量比は、好ましくは１：１５０〜５：７０、より好ましくは１：１５０〜２：１１０とする。このような比率で含有させることにより、腸球菌の選択性をより向上させることができる。
【００１２】
本発明の培地は、さらに、（ｃ）グラム陰性菌に対する抑制剤を含有することが好ましい。かかる成分は、グラム陰性菌の発育を抑制し、そのコロニーを排除する役割を担う。
グラム陰性菌に対する抑制剤としては、抗生物質が好ましく、例えば、硫酸ポリミキシンＢ、コリスチン硫酸塩、アズトレオナム、カルモナム、ナリジクス酸が挙げられ、とくに硫酸ポリミキシンＢ及びコリスチン硫酸塩が好ましい。
本発明の培地における前記抑制剤の含有量は、培地を後述の検出方法に用いる時の濃度として、好ましくは１ｍｇ〜１００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１０〜３０ｍｇ／Ｌである。
【００１３】
本発明の培地は、さらに、（ｄ）有色の色原体化合物を遊離し得るβ−グルコシダーゼ基質を含有することが好ましい。かかる成分は、腸球菌が有するβ−グルコシダーゼにより分解され、有色の色原体化合物が遊離することによって腸球菌に有色のコロニーを形成させる役割を担う。
そのようなβ−グルコシダーゼ基質としては、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−３−クロロ−４−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、エスクリンが挙げられる。これらのうち、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｘ−ＧＬＵＣ）が、呈色性の点および腸球菌の発育に対する影響が小さい点からより好ましい。
本発明の培地における前記β−グルコシダーゼ基質の含有量は、培地を後述の検出方法に用いる時の濃度として、好ましくは０．０１〜１．０ｇ／Ｌ、より好ましくは０．２〜０．６ｇ／Ｌである。
【００１４】
本発明の培地は、好ましくはアジ化ナトリウムを実質的に含有しない。ここで、実質的に含有しないとは、アジ化ナトリウムの含有量が培地を後述の検出方法に用いる時の濃度として０．１質量％未満であることをいい、好ましくは０．０１質量％未満、より好ましくは０．００１質量％未満であることをいう。
【００１５】
本発明の培地は、上記成分の他に、栄養成分、無機塩類、糖類、増粘剤、ｐＨ調整剤等を任意に含有してもよい。
栄養成分としては、例えば、ペプトン、獣肉エキス、酵母エキス、魚肉エキスが好ましい。
無機塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム等の無機酸金属塩、ピルビン酸ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸ナトリウム等の有機酸金属塩が挙げられる。
糖類としては、例えば、ラクトース、スクロース、キシロース、セロビオース、マルト
ースが挙げられる。
増粘剤としては、例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース等のセルロース誘導体；デンプン及びその誘導体；ヒアルロン酸、グアーガム、キサンタンガム等の多糖類；ポリアクリル酸、ポリアクリル酸塩、アクリル酸−ビニルアルコール共重合体等のアクリル酸誘導体；ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のポリエーテル；コラーゲン等のタンパク質が挙げられる。
ｐＨ調整剤としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムが挙げられる。
【００１６】
また、本発明の培地は、グラム陽性菌に対する抗生物質や、他の抗菌性物質等を含有してもよい。
グラム陽性菌に対する抗生物質としては、エリスロマイシン、クリンダマイシン等が挙げられる。
他の抗菌性物質としては、ポリリジン、プロタミン硫酸塩、グリシン、ソルビン酸等が挙げられる。また、真菌類の発育抑制のために、アンホテリシンＢ等の抗菌性化合物を含有してもよい。
【００１７】
また、本発明の培地は薬剤耐性菌の検出のために、対象薬剤を含有してもよい。例えば、バンコマイシン耐性腸球菌の検出のために、バンコマイシンを配合してもよい。
【００１８】
また、本発明の培地は、形成した腸球菌の発育の点から、検出時のｐＨが６．０〜８．０であることが好ましく、６．５〜７．５であることがより好ましい。
【００１９】
本発明の培地の形態は特に限定されず、シャーレ等に流し固めた固形培地の形態の他に、シート状の乾燥簡易培地等にすることもできる。
シート状の乾燥簡易培地としては、国際公開９７／２４４３２号公報に記載の、多孔質材料を含む層とゲル化剤を含む層とフィルム層とを積層して含む構成のシート形態のものが挙げられ、ゲル化剤を含む層の構成を本発明の培地とすればよい。
【００２０】
本発明の培地は、検体中の腸球菌を検出する方法に好適に利用できる。かかる方法は、培地に検体を接種する工程、前記検体に含まれる微生物を培養する工程、及び前記微生物の培養コロニーを検出する工程を含む。培養工程における条件としては、特に限定されないが、３５±２℃で２４〜４８時間が好ましい。
本発明の培地は、腸球菌以外のグラム陽性菌の生育を抑制し、かつ腸球菌の生育は阻害しないので、本発明の検出方法によれば種々のグラム陽性菌が存在し得る中から腸球菌を容易に選択・検出することができる。さらに好ましい態様では、本発明の培地は、腸球菌以外のグラム陽性菌及びグラム陰性菌の生育を抑制し、かつ腸球菌の生育は阻害しないので、本発明の検出方法によれば、種々の細菌が存在し得る中から腸球菌を容易に選択・検出することができる。
本発明の培地により選択・検出できる腸球菌（Enterococcus）は、E. faecalis、E. faecium、E. durans、E. gallinarum、E. casseliflavus、E. avium、E. hirae、E. raffinosus等が好ましく挙げられる。
【００２１】
本発明の培地に適用される検体としては、肉類、魚介類などの生鮮食料品、便などの臨床検体、飲料水、淡水、海水、調理場、病院などのふき取り検体等が挙げられるが、これらの検体を予めトリプトソイブイヨン等で培養した培養液や更にこれを増菌用培地で培養した培養液も用いることができる。
【実施例】
【００２２】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２３】
＜実施例１＞
（１）培地の作製
表１に示す組成で１ｍ２分の各成分を０．５リットルの精製水に加え、無水炭酸ナトリ
ウムでｐＨ７．４に調整し、９５℃で１分間加温溶解したものを、２０μｍ厚１×１ｍポリエステルフィルム上に全量を均一に塗布し、６５℃で完全に乾燥させた後、ナイロンメルトブローン不織布（９０ｇ／ｍ２）を張り合わせた。その後、１００μｍ厚の７０×８０ｍｍポリエステルフィルムに接着し、４５ｍｍ四方に裁断してシート状の簡易培地をそれぞれ作製した。シート状簡易培地の詳細な製造方法は、国際公開９７／２４４３２号公報を参照した。
また、対照として市販のViolet Red Bile Glucose寒天培地（ＶＲＢＧ；OXOID社製）、及び標準寒天培地（ＳＰＣ；日水製薬製）も調製した。
【００２４】
【表１】
0006589648.tif 000002
【００２５】
（２）菌株の供試
表２に示す各菌株についてトリプトソイ寒天培地で２４時間前培養したものを、滅菌綿棒を用いて、マクファーランド比濁＃１相当（約３．０×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）になるように滅菌生理食塩水に懸濁し、菌原液とした。各菌原液を１０−７ＣＦＵ／ｍＬまで、滅菌生理食塩水にて１０倍段階希釈を繰り返し、１０−７又は１０−２ＣＦＵ／ｍＬの各菌液の１ｍＬを各培地に供試した。３５℃、２４時間培養後、発育コロニー数を計測した。結果を表２に示す。
【００２６】
【表２】
0006589648.tif 000003
【００２７】
培地１では、グラム陽性菌のうちB. subtilis及びS. aureusの生育は抑制され、腸球菌（E. faecalis）は発育した。VRBG寒天培地では、腸球菌を含むグラム陽性菌全般の生育が抑制された。培地１の３倍量のクリスタルバイオレットを含有する培地２、培地１にＳＤＳを加えた培地３、及び培地１の２倍量の胆汁酸塩を含有する培地４でも、グラム陽性菌のうち腸球菌のみが生育が抑制されなかった。
本発明の培地は、アジ化ナトリウムを含有せずとも腸球菌を選択的に検出できることが示された。
また、VRBG寒天培地は、ゲル化剤としてポリビニルアルコールではなく寒天を用いている点でのみ培地１と相違し、他の組成はほぼ同じである。培地の構成に、胆汁酸、ＳＤＳ、クリスタルバイオレット等のグラム陽性菌に対する抑制剤と併用して、ポリビニルアルコールを含有させることによって、前記抑制剤が腸球菌に対してのみ抑制作用を示さなくなることは、従来の知見からは予測できない結果であった。
【００２８】
＜実施例２＞
（１）培地の作製
表３に示す組成で１ｍ２分の各成分を０．５リットルの精製水に加え、無水炭酸ナトリウムでｐＨ７．０に調整し、実施例１と同様にシート状の簡易培地を作製した。
また、対照として市販の標準寒天培地（ＳＰＣ；日水製薬製）も調製した。
【００２９】
【表３】
0006589648.tif 000004
【００３０】
（２）菌株の供試
表４に示す各供試菌株について、実施例１と同様に菌原液の調製、培地への供試、及び培養を行い、発育コロニー数を計測し、またコロニーの色を観察した。結果を表４に示す。
【００３１】
【表４】
0006589648.tif 000005
【００３２】
培地５では、腸球菌以外のグラム陽性菌及びグラム陰性菌の生育が抑制され、腸球菌のみ発育した。また、発育した腸球菌は青色のコロニーとして容易に精度高く検出された。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明により、簡便な調製により、高い精度で選択的に腸球菌を検出できる培地が提供される。また、本発明の培地は、アジ化ナトリウムを含有させる必要がないため、保管及び流通上の煩雑さがなく、産業上非常に有用である。