(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）で示される化合物ＰＡＣ−１のアモルファス。
【化１】
0006538976.tif 000020
【請求項２】
活性成分としての請求項１に記載の化合物ＰＡＣ−１のアモルファス、及び薬学上許容される担体を含有することを特徴とする経口医薬組成物。
【請求項３】
錠剤、カプセル剤、滴丸剤または丸剤であることを特徴とする、請求項２に記載の経口医薬組成物。
【請求項４】
さらに前記化合物ＰＡＣ−１またはその塩の結晶形態を含有し、且つ前記化合物ＰＡＣ−１またはその塩の結晶形態と前記化合物ＰＡＣ−１のアモルファスの総量に対して、前記化合物ＰＡＣ−１のアモルファスの含有量が１０重量％以上であることを特徴とする、請求項２または３に記載の経口医薬組成物。
【請求項５】
腫瘍の治療に用いられることを特徴とする、請求項２〜４のいずれかに記載の経口医薬組成物。
【請求項６】
腫瘍の転移の抑制に用いられるものであることを特徴とする、請求項２〜４のいずれかに記載の経口医薬組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物ＰＡＣ−１のアモルファスの、経口医薬組成物の製造における使用。
【請求項８】
前記経口医薬組成物は腫瘍の治療に用いられることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記経口医薬組成物は腫瘍の転移の抑制に用いられることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
腫瘍の治療に用いるための、請求項１に記載の化合物ＰＡＣ−１のアモルファス。
【請求項１１】
腫瘍の転移の抑制に用いるための、請求項１に記載の化合物ＰＡＣ−１のアモルファス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬品化学の技術分野に属し、具体的にはＺＹＳ−１（アモルファス形態のＰＡＣ−１）の製造方法、及びＺＹＳ−１を含有する医薬組成物及びその製薬における使用に係わるものである。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍は人類の健康を脅かす最大の原因であり、そのうち悪性腫瘍の死亡率はすべての死亡疾患のトップである。二十世紀半ば以来、人類は腫瘍の予防と治療に大量の人的資源及び物的資源を投下して来たが、しかしその危害は依然効果的に抑えられていなく、その発病率及び死亡率は依然年々上昇する傾向にある。現在の腫瘍治療における三大手法は化学療法、放射線療法及び手術療法であり、そのうち化学療法が主な手段である。抗腫瘍薬の絶えない開発及び合理的な利用により、化学療法は悪性腫瘍の治療においてますます重要な地位を占めるようになり、姑息的治療から根治性治療へ発展する趨勢を見せている。現在において常用される抗腫瘍薬は細胞毒系薬物、ホルモン剤、分子標的治療薬、免疫療法剤（ｂｉｏｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）、腫瘍分化誘導剤、腫瘍血管生成阻害剤及び腫瘍の治療を補助する医薬品等である。そのうち最もよく見られるのが細胞毒系薬物であり、しかし細胞毒系薬物は高い効果を示すと共に、毒副反応が大きく、選択性に欠けるなどの欠点を有する。近年、腫瘍の特性および本質に対する研究が深まることにより、抗腫瘍医薬品を用いた治療は従来の細胞毒性薬物を用いた治療から、細胞受容体、重要遺伝子及び制御分子を標的とする治療方向に発展している。抗腫瘍医薬品の臨床効果評価指標も、従来の腫瘍本体の実質的な縮小から、患者の生存期間を長くする及び／または生存クオリティを向上延長させることに変わっている。ＰＡＣ−１はこの発展の傾向に合う標的型の小分子抗腫瘍薬である。
【０００３】
ＰＡＣ−１は米国イリノイ大学Ｑｕｉｎｎ  Ｐ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ教授が２００００種類余りの化合物に対して体外スクリーニングを行う中で発見された初めてのプロカスパーゼ−３（ｐｒｏｃａｓｐａｓｓｅ−３）を直接活性化させることができる小分子化合物であり、ＰＡＣ−１と命名し、化学名称は１−Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ，４−（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）−２−［［２−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−（２−ｐｒｏｐｅｎ−１−ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ］であり、構造は式（Ｉ）に示す通りである。研究により以下が証明されている。即ち、ＰＡＣ−１は腫瘍細胞のアポトーシスを選択的に誘導でき、且つそのアポトーシス誘導作用は細胞内のｐｒｏｃａｓｐａｓｓｅ−３レベルと正比例関係にあり、正常細胞のｐｒｏｃａｓｐａｓｓｅ−３の含有量は比較的低いため、正常細胞に対する殺傷能力は比較的小さく、比較的優れた選択性を有している。その作用メカニズムは研究により以下のように証明されている。主にキレートにより亜鉛イオンを抑制することで、ｐｒｏｃａｓｐａｓｓｅ−３自身がｃａｓｐａｓｅ−３に活性化され、細胞アポトーシスを誘導する（Ｑｕｉｎｎ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２００９，３８８（１）：１４４−１５８．；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ＱＰ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，２００９，５２（１８）：５７２１−５７３１．）。これとともに複数種類の腫瘍細胞に対していずれもアポトーシス誘導作用を有し、且つｃａｓｐａｓｅ−３の発現と正比例関係にある（Ｒｏｙ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００１，９８（１１）：６１３２−６１３７．）。最近の研究からは以下が示されている。即ち、高濃度のＰＡＣ−１は内形質網細胞アポトーシス経路により細胞アポトーシスを誘導し、これにより独特な細胞アポトーシスの作用特徴を示している（Ｗｅｓｔ  ＤＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．２０１２，９（５）：１４２５−１４３４）。
【０００４】
【化１】
0006538976.tif 000002
式（Ｉ）
中国特許公開公報ＣＮ１０１１８４４９１Ａ及び米国特許公開公報ＵＳ２００７／００４９６０２Ａ１は大衆に初めての直接ｐｒｏｃａｓｐａｓｓｅ−３を活性化する小分子化合物ＰＡＣ−１について開示し、さらにはＰＡＣ−１、ＰＡＣ−１誘導体ライブラリー化合物について保護を求め、ＺＺ式、ＺＺ２式、ＺＺ３式、ＺＺ４式に示される関連化合物及びその合成方法を含む；これと共にがん細胞中において細胞アポトーシスを選択的に誘導する方法、体外及び細胞内において直接ｐｒｏｃａｓｐａｓｓｅ−３分子を修飾できる化合物を直接スクリーニング方法、がん細胞のプロカスパーゼ活性化化合物処理に対する潜在的な感受性を鑑定または判断する方法、がん患者の体内のプロカスパーゼの向上レベルを鑑定することによりプロカスパーゼ活性剤治療に用いる前記候補者をスクリーニングする方法について保護を行う。国際特許出願ＷＯ２０１０／０９１３８２  Ａ１はＰＡＣ−１、神経毒性のない化合物Ｓ−ＰＡＣ−１及びその類似体について保護を行うものである。
【０００５】
現在文献が報道しているＰＡＣ−１はいずれも結晶形態である。さらに、文献は既知のＰＡＣ−１の結晶形態は比較的強い神経毒性を有すると開示している（Ｑ  Ｐ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｄ  Ｃ．Ｈｓｕ，Ｃ  Ｊ．Ｎｏｖｏｔｎｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｃａｎｉｎｅ  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｎｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−３-Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１０；７０：７２３２−７２４１参照）、このためＰＡＣ−１を薬品として開発する見込みはあまりないものとして考えられてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者はＰＡＣ−１の神経毒性が強く、医薬品としての応用において制限を受けるなどの技術課題を解決すべく鋭意研究することにより、アモルファス形態のＰＡＣ−１を得て、さらにすでにあるＰＡＣ−１結晶体と比べた場合、アモルファス形態のＰＡＣ−１の神経毒性が顕著に低下していることを発見し、これにより本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
即ち、本発明は以下である。
１、アモルファス形態で存在する、式（Ｉ）で示される化合物ＰＡＣ−１。
【化２】
0006538976.tif 000003
【０００８】
２、活性成分としての請求項１に記載の化合物ＰＡＣ−１、及び薬学上許容される担体を含有することを特徴とする経口医薬組成物。
【０００９】
３、錠剤、カプセル剤、滴丸剤または丸剤であることを特徴とする、請求項２に記載の経口医薬組成物。
【００１０】
４、さらにＰＡＣ−１またはその塩の結晶形態を含有し、且つＰＡＣ−１またはその塩の結晶形態とＰＡＣ−１のアモルファス形態の総量に対して、ＰＡＣ−１のアモルファス形態の含有量が１０重量％以上であり、好ましくは５０重量％以上であり、より好ましくは８０重量％以上であり、さらに好ましくは９０重量％以上であり、よりさらに好ましくは９５重量％以上であり、そのうえにより好ましくは９７重量％以上であり、そのうえによりさらに好ましくは９９重量％以上であることを特徴とする、請求項２または３に記載の経口医薬組成物。
【００１１】
５、前記経口医薬組成物は腫瘍、好ましくは転移性腫瘍の治療に用いられることを特徴とする、請求項２〜４のいずれかに記載の経口医薬組成物。
【００１２】
６、前記経口医薬組成物は腫瘍の転移の抑制に用いられるものであることを特徴とする、請求項２〜４のいずれかに記載の経口医薬組成物。
【００１３】
７、請求項１に記載のアモルファス形態の化合物ＰＡＣ−１の経口医薬組成物の製造における使用。
【００１４】
８、前記経口医薬組成物は腫瘍、好ましくは転移性腫瘍の治療に用いられることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【００１５】
９、前記経口医薬組成物は腫瘍の転移の抑制に用いられることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、アモルファス形態のＰＡＣ−１はＰＡＣ−１結晶より明らかに低い神経毒性を示し、このため医薬品に開発して例えば腫瘍、特に転移性腫瘍などの疾患の治療に用いることに適している。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＰＡＣ−１及びその類似体の化学構造を示したものである。
【図２】ＰＡＣ−１針状結晶とＺＹＳ−１の顕微鏡写真を比較したものである。
【図３】ＰＡＣ−１針状結晶とＺＹＳ−１の走査型電子顕微鏡写真を比較したものである。
【図４】図４（Ａ）はＰＡＣ−１針状結晶のＸ線回折パターンであり、図４（Ｂ）はＺＹＳ−１のＸ線回折パターンを示したものである。
【図５】ＺＹＳ−１とＰＡＣ−１針状結晶のＨＧＣ−２７細胞増殖に対する影響を示したものである。
【図６】ＺＹＳ−１とＰＡＣ−１針状結晶のＫ５６２／Ａ０２細胞増殖に対する影響を示したものである。
【図７】ＺＹＳ−１とＰＡＣ−１針状結晶のＡ５４９細胞増殖に対する影響を示したものである。
【図８】ＺＹＳ−１とＰＡＣ−１針状結晶のＨＴ−１０８０細胞増殖に対する影響を示したものである。
【図９】異なる用量のＺＹＳ−１のＨＧＣ−２７細胞の二次元移動に対する影響（スクラッチ実験、Ｓｃｒａｔｃｈ  Ａｓｓａｙ）を示したものである。
【図１０】異なる用量のＺＹＳ−１のＨＧＣ−２７及びＨＴ−１０８０細胞の三次元移動に対する影響（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌアッセイ）を示したものである。
【図１１】異なる用量のＺＹＳ−１のＨＴ−１０８０細胞侵入に対する影響（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌアッセイ）を示したものである。
【図１２】ＺＹＳ−１のＨＵＶＥＣ細胞増殖及び小管の生成（ｔｕｂｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に対する影響を示したものである。図１２（Ａ）はＺＹＳ−１のＨＵＶＥＣ細胞増殖に対する影響、図１２（Ｂ）及び（Ｃ）はＺＹＳ−１の小管生成に対する影響を示したものである。
【図１３】異なる用量のＺＹＳ−１のＣａｓｐａｓｅ−３、ＮＦ−κＢ、ＶＥＧＦ、ＩＸＡＰタンパク質発現に対する影響を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書における定義と矛盾が生じない場合、本明細書中の用語は当業者が通常理解する意味を有しするものであり、しかし矛盾が生じる場合は、本明細書中の定義を基準とする。
【００１９】
ＰＡＣ−１
本明細書中において、ＰＡＣ−１はプロカスパーゼ３（Ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−３）を直接活性化させることのできる小分子化合物であり、その化学名称は１−Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ，４−（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）−２−［［２−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−（２−ｐｒｏｐｅｎ−１−ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ］（（Ｅ）−Ｎ’−（３−アリル−２−ヒドロキシベンジリデン）−２−（４−ベンジルピペラジン−１−イル）アセチルヒドラジン）であり、構造は式（Ｉ）であり、腫瘍細胞のアポトーシスを選択的に誘導できると考えられるため、抗腫瘍医薬品とすることができる。
【化３】
0006538976.tif 000004
【００２０】
アモルファス形態のＰＡＣ−１
従来技術において報道されて来たＰＡＣ−１はいずれも結晶形態で存在し、且つ比較的強い神経毒性を有し、これは大きくＰＡＣ−１の医薬品としての応用を制限している。本発明者は意外にも以下について発見した。即ち、アモルファス形態のＰＡＣ−１はＰＡＣ−１結晶体の神経毒性より明らかに低い神経毒性を示している。説明したいことは、通常的には、アモルファス形態の薬品は結晶体の医薬品よりもより高い分散性を有し、そのため薬品の吸収に有利で、対応するように示される毒性もより強いはずであるが、しかし本発明中において、意外的にもアモルファス形態のＰＡＣ−１（即ちＺＹＳ−１）がより低い毒性を示すことを見出した。そのため、アモルファス形態のＰＡＣ−１の低神経毒性は当業者が従来技術に基づいて予測できない技術効果である。
【００２１】
本明細書中において、アモルファス形態のＰＡＣ−１はＺＹＳ−１とも称され、ＺＹＳ−１は典型的なアモルファス物質の特徴を有する。即ち、明確なＸ線回折ピークを有しない。これに対して、いくつかの状況において、本明細書中のＰＡＣ−１はＰＡＣ−１結晶体を指すものである。
【００２２】
前記ＺＹＳ−１は例えば以下の方法によって製造でき、しかしその製造方法はこれに限られない。前記方法は以下を含む：
ステップ（１）：ＰＡＣ−１の結晶体を有機溶媒中に溶解させ、ＰＡＣ−１の第一溶液を得る。
ステップ（２）：攪拌下において、ステップ（１）で得られたＰＡＣ−１の溶液中に水を添加し、ＰＡＣ−１の第二溶液を得る。
ステップ（３）：引き続き攪拌を行い、析出された固体が白色または乳白色を呈する時、ろ過を行い、溶媒を除去し、析出物を得る；
ステップ（４）：得られた析出物に対して乾燥を行い、アモルファス形態のＰＡＣ−１を得る。
【００２３】
ステップ（１）において、ＰＡＣ−１の結晶体１ｇに対して、有機溶媒の用量は例えば１〜２０ｍｌ、好ましくは２〜１０ｍｌであり、さらに好ましくは４〜６ｍｌである。超音波処理、攪拌、振とうなどの手段によりＰＡＣ−１結晶体の溶解を促進する。前記有機溶媒は例えば無水エタノール、９５％エタノール、アセトニトリル、ジエチルエーテル、酢酸エチル、アセトン及びＤＭＳＯ中の一種類または複数種類であるが、これらに限られない。
【００２４】
ステップ（２）において、水の用量とステップ（１）における有機溶媒の用量の比率は例えば１：１〜１：５０であり、好ましくは３：１〜２０：１であり、さらに好ましくは５：１〜１５：１であるが、これらに限られない。攪拌速度は例えば１００〜５０００ｒ／分、好ましくは２００〜１０００ｒ／分、さらに好ましくは４００〜６００ｒ／分とすることができるが、これらに限られない。
【００２５】
ステップ（３）において、吸引ろ過を用いることができ、こうすることでろ過速度を加速させることができるが、これらに限られない。前記吸引ろ過はダイアフラム型真空ポンプまたは水ポンプ、オイルポンプなどによって実現できる。
【００２６】
ステップ（４）において、前記乾燥は常圧または減圧下で行うことができる。
前記ＺＹＳ−１はＸ線回折分析によって確認することができる。
【００２７】
ＺＹＳ−１を含有する経口医薬組成物
本発明者は以下について発見した。ＺＹＳ−１を経口投与する場合、ＰＡＣ−１結晶体より明らかに低い神経毒性を示している。そのため、本発明のＺＹＳ−１は好ましく経口医薬組成物に開発されることができる。
【００２８】
本発明は経口医薬組成物を提供し、それは活性成分（好ましくは唯一の活性成分）としてＺＹＳ−１、及び薬学上許容される担体を含有する。本発明の経口医薬組成物はさらにＰＡＣ−１またはその塩の結晶形態を含有する、または含有しないことができ、前記ＰＡＣ−１またはその塩の結晶形態は例えば活性成分とすることができる。ＰＡＣ−１またはその塩の結晶形態を含有する場合、ＰＡＣ−１のアモルファス形態に対して、ＰＡＣ−１またはその塩の結晶形態の総量に対して、ＰＡＣ−１のアモルファス形態の含有量は好ましくは１０重量％以上であり、好ましくは５０重量％以上であり、さらに好ましくは９０重量％以上であり、よりさらに好ましくは９５重量％以上であり、そのうえにより好ましくは９７重量％以上であり、そのうえによりさらに好ましくは９９重量％以上である。前記ＰＡＣ−１またはその塩の結晶形態は本発明の経口医薬組成物中に意図的に添加することができ、また前記ＰＡＣ−１のアモルファス形態中に含まれる不純物として本発明の経口医薬組成物中に添加することもできる。
【００２９】
本発明の経口医薬組成物は腫瘍の治療及び／または腫瘍転移の治療に用いることができ、特に本発明の経口医薬組成物は転移性腫瘍の治療に用いることができる。該使用において、本発明のＺＹＳ−１は好ましくは唯一の活性成分である。
【００３０】
本明細書中において、「腫瘍の治療」とは以下を指す。即ち、原発性腫瘍に対する治療である。「腫瘍の転移に対する治療」とは、転移性腫瘍及びその転移過程に対する治療であり、例えば腫瘍の転移に対する抑制である。「転移性腫瘍」とは、腫瘍細胞が原発部位からリンパ管、血管に侵入し、またはその他の経路により他の組織、臓器に移りそこで引き続き成長し、原発性部位の腫瘍と同じタイプの腫瘍または異種組織腫瘍を形成することであり、該過程を転移という。その形成される同種または異種組織腫瘍は転移性腫瘍または転移性がんといい、該過程において、転移性がんは初期であり、大量の新生血管を切実に必要とし、新生血管によりその迅速な成長に必要な栄養等を提供する必要があり、この過程及びその過程において新たに形成される腫瘍を合わせて転移性腫瘍という。
【００３１】
そのため、本発明はさらにＺＹＳ−１の経口医薬組成物の製造、好ましくは腫瘍の治療及び／または腫瘍の転移の治療に用いられる経口医薬組成物、特に転移性腫瘍の治療に用いられる経口医薬組成物の製造における使用について提供している。該使用において、本発明のＺＹＳ−１を活性成分として、好ましくは唯一の活性成分とする。
【００３２】
前記薬学上許容される担体として、当業者は剤型のニーズに従い、通常の選択を行うことができる。例えば、経口液体製剤（液体医薬組成物）を製造する際、活性成分を適切な液体（例えば水）中に溶解または懸濁させることができる。経口固体製剤（固体医薬組成物）を製造する際、活性成分中に賦形剤及び必要に応じて粘着剤、崩壊剤、湿潤剤、着色剤、矯味剤などを添加した後、通常の方法に従って錠剤、コーティング錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤または丸剤などに製造できる。賦形剤として、例えば乳糖、トウモロコシ澱粉、白砂糖、ブドウ糖、ソルビトール、結晶セルロース、二酸化ケイ素などを使用できる。粘着剤として、例えばポリビニルアルコール、エチルセルロース、メチルセルロース、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどを使用できる。湿潤剤として、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、二酸化ケイ素などを使用できる。着色剤として、医薬品において添加を許容される着色剤などを使用できる。矯味剤として、ココア粉末、メントール、芳香族酸、薄荷油、竜脳、桂皮粉末などを使用できる。言うまでもなく、前記錠剤、顆粒剤上に糖衣、ゼラチンコーティング、及びその他の必要なコーティングを被覆することもできる。
【００３３】
治療案
本発明はさらに腫瘍、特に転移性腫瘍を治療する方法、及び腫瘍の転移を治療する（例えば腫瘍の転移を抑制する）方法を提供し、該方法は腫瘍患者に対して前記本発明のＺＹＳ−１、または前記ＺＹＳ−１を含有する経口医薬組成物を投与するステップを含む。前記ＺＹＳ−１は好ましくは経口の形で使用される。ＺＹＳ−１を使用し、または前記ＺＹＳ−１を含有する経口医薬組成物を使用する場合、ＺＹＳ−１の用量は症状の程度、患者の年齢、性別、体重、感受性の差異、使用方法、使用時間、使用間隔、製剤の性質と種類、有効成分の種類によって異なり、特に制限がないが、通常の成人（体重６０ｋｇ）に対しては毎日０．１〜２０００ｍｇ、好ましくは０．２〜１０００ｍｇ、さらに好ましくは１〜５００ｍｇであり，前記用量は通常毎日１〜６回に分けて使用できる。
実施例
【実施例１】
【００３４】
実施例１はＺＹＳ−１の製造に関するものである。
ＰＡＣ−１針状結晶１ｇ（Ｑｕｉｎｎ  Ｐ．ＰｅｔｅｒｓｏｎらＪ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００９，５２，５７２１-５７３１の方法によって製造されるものを参照）を準備し、超音波を用いてＤＭＳＯ（５ｍＬ）中に溶解させ、５００ｒ／ｍｉｎの速度で攪拌しながら、５０ｍＬの水を添加し、引き続き１０ｍｉｎ攪拌し続け、析出物が乳白色を呈するようになってから、減圧にてろ過し、真空で乾燥させ、白色固体を得る。
【００３５】
顕微鏡、走査電子顕微鏡、Ｘ−線粉末回折によって分析することにより、明らかに、得られたものはアモルファスのＰＡＣ−１（ＺＹＳ−１）粉末である。顕微鏡及び走査電子顕微鏡下ではアモルファスと針状結晶の二者の形態は完全に異なり、針状結晶の表面は比較的滑らかで、典型的な針状結晶である一方、ＺＹＳ０１は嵩高く、多孔構造を呈し、結果は図２−３に示される通りである。両者のＸ−線粉末回折パターンから分かるように、ＺＹＳ−１は明らかな特徴ピークが見られなく、図４（Ａ）及び図４（Ｂ）を参照すること。
【実施例２】
【００３６】
実施例２はＺＹＳ−１とＰＡＣ−１針状結晶の溶解度の比較に関するものである。
適量のＺＹＳ−１とＰＡＣ−１針状結晶をそれぞれ適量のメタノール、無水エタノール、９５％エタノール、アセトニトリル、ジエチルエーテル、酢酸エチル、プロパノール、アセトン中に溶解させ、超音波で１時間処理し、室温で２４時間静置させ、飽和溶液を得る。４０００ｒ／ｍｉｎにて５ｍｉｎ遠心させ、上澄み液を取り出して希釈を行い、０．４５μｍ注射器用ろ過器でろ過を行い、ＨＰＬＣを用いて濃度を測定し、溶解度を計算する。
【００３７】
実験の結果は以下を示している：ＺＹＳ−１の溶解度はＰＡＣ−１針状結晶より高く、結果は表１に示す通りである。
【００３８】
表１はＺＹＳ−１とＰＡＣ−１針状結晶の溶解度の比較である。
【００３９】
【表１】
0006538976.tif 000005
【実施例３】
【００４０】
実施例３はＺＹＳ−１とＰＡＣ−１針状結晶の体内における薬物動態学（Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）の比較である。
【００４１】
１２匹のオスＷｉｓｔａｒラットをランダムにＺＹＳ−１グループ及びＰＡＣ−１グループに分け、投薬前に１２時間禁食を行い、自由に飲水できるようにする。６０ｍｇ／Ｋｇ計量に応じてそれぞれＺＹＳ−１とＰＡＣ−１針状結晶を胃内投与した後、０、５、２０、３０、４５、６０、１２０、１８０、２４０、３６０、４８０、７２０ｍｉｎにて目縁から０．５ｍＬ採血を行い、５０００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心させ、血漿２００μＬを取り、アセトン３ｍＬを添加し、１ｍｉｎ旋回（ｖｏｒｔｅｘ）させる。１５０００ｒ／ｍｉｎ条件下にて５ｍｉｎ遠心させ、上澄み液を取り、３７℃下において窒素ガスを吹き込んで乾燥させ、２００μＬアセトニトリルを添加して再度溶解させ、１０ｍｉｎ超音波処理後、１ｍｉｎ旋回（ｖｏｒｔｅｘ）させ、０．４５ミリポアフィルターを通過させ、引き続き濾液をとってＨＰＬＣ測定を行い、各時間における血中薬品濃度を計算し、血中薬品濃度の経時曲線を作成する。結果は表２に示す通りである。
【００４２】
その結果により、ＺＹＳ−１はＰＡＣ−１に比べてラット体内における生体利用度がより高いことが示されている。
【００４３】
表２はラットの体内薬物動態学パラメータ（ｎ＝６）について示している。
【表２】
0006538976.tif 000006
0006538976.tif 000007
【実施例４】
【００４４】
実施例４はＺＹＳ−１普通錠の製造に関するものである
【００４５】
ＺＹＳ−１  ２０ｇ、乳糖６０ｇ、澱粉５８ｇ、デキストリン５８ｇ、超微粉シリカ（  ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ  ｓｉｌｉｃａ  ｐｏｗｄｅｒ）２ｇ、ステアリン酸マグネシウム２ｇを取り、均一に混合し、錠剤にすることで、ＺＹＳ−１普通錠１０００錠を得る。
【実施例５】
【００４６】
実施例５はＺＹＳ−１徐放性マイクロスフェアの製造に関するものである。
【００４７】
まず１．５％のアルギン酸ナトリウム（Ｗ／Ｖ）、１．５％の澱粉（Ｗ／Ｖ）、ＺＹＳ−１  １０ｇを含有する混合水溶液５００ｍＬを取り、１０００ｍＬの液体パラフィンを添加して油相とし、３０ｍＬのスパン８０及びツイン８０の混合液（７：１）を乳化剤として、攪拌して、乳液Ａを形成する。
【００４８】
これと同じように、１００ｍＬの８％ＣａＣｌ２溶液を調製し、３００ｍＬの液体パラフィン、１０ｍＬの乳化剤（スパン８０：ツイン８０  ７：１）及び適量のエタノールを添加し、攪拌して、乳液Ｂを得る。
【００４９】
両者がいずれも安定的な乳液を形成してから、乳液Ｂを乳液Ａに添加して架橋反応を１５ｍｉｎ行い、遠心によりＺＹＳ−１マイクロスフェアを得て、順に酢酸エチル、無水エタノール、脱イオン水を用いて洗浄を行い、室温において放置して乾燥させる。得られたＺＹＳ−１徐放マイクロスフェアは、錠剤またはカプセル剤などの薬学上許容されるその他の製剤形態の製造に用いることができる。
【実施例６】
【００５０】
実施例６はＰＡＣ−１の経口投薬によるマウスに対する急性毒性実験に関するものである。
実験材料：ＰＡＣ−１針状結晶（Ｑｕｉｎｎ  Ｐ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００９，５２，５７２１-５７３１の方法によって製造されるものを参照）、ロット番号：２００９０８１８である。
【００５１】
試験動物及び飼育状況：ＩＣＲマウス、オスメスが半々ずつ。体重が２０±２ｇで、北京維通利華試験動物技術有限公司によって提供され、ＳＰＦ基準にて飼養を行い、合格証番号：ＳＣＸＫ（京）２００６−０００９である。北京科澳協力飼料有限公司がマウスに繁殖用顆粒飼料を提供した。動物は北京安貞医院のバリアレベル（二級）動物室内で飼育され、蛍光灯で照射し、１２時間の明暗サイクルを用いて、室内温度２２〜２４℃、湿度４０−４７％で、送風は１０−１２回／時間行い、ラボの許可証番号は：ＳＹＸＫ（京）２００５−００２８である。マウスを透明のプラスチックボックス内で飼育し、性別に応じてケージを分けて飼育し、各ケージ５匹である。
【００５２】
試験対象薬物の配合方法：ＰＡＣ−１針状結晶を、すり鉢中に入れて細かく研磨し、精密に適量を量り、０．５％ＣＭＣ−Ｎａで必要となる濃度に配合する。
【００５３】
動物のグループ分け：動物に対して禁食（禁水はせず）を１１時間行った後、体重に応じてランダムにグループ分けし、各グループ１０匹で、オスメスが５匹ずつで、試験では全部で８グループに分けられる。I〜VIIはＰＡＣ−１の異なる用量の投薬グループであり、医薬品のグループ間の投薬量間隔は０．７で、第VIIIグループは０．５％ＣＭＣ−Ｎａの陰性対照グループである。投薬量はそれぞれ１０００、７００、４９０、３４３、２４０．１、１６８．１、１１７．１ｍｇ／ｋｇである。各投薬成分を動物の体重に応じて投薬を行い、投薬体積は０．４ｍＬ／１０ｇ体重であり、実験は単回胃内投与法によって行われ、陰性対照グループは胃内に等体積の０．５％ＣＭＣ−Ｎａを投与し、投与の３時間後から動物に対して食事を与え始める。
【００５４】
観察指標：投薬後すぐに動物の薬物に対する反応の状況を観察する（例えば、一般的な表現、呼吸、痙攣の有無、立ち直り反射、疼痛反射、外部刺激に対する反応性などの複数の指標）。動物の投薬後の毒性反応の症状及び毒性反応が出る時間、持続時間、回復時間を観察記録し、及び動物が死亡した際、すぐに肉眼的解剖（ｇｒｏｓｓ  ａｎａｔｏｍｙ）を行い、肉眼により各主要臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、胃）に充血、体積増大、硬くなる、変色などの有無を観察し、生きている動物に対して、毎日７日以内に遅延型死亡及び遅延型毒性反応を有するか観察記録し、２日ごとに体重を量り、飼料を１回与える。７日間の観察が終了した後、生存している動物に対して肉眼的解剖を行い、各臓器の状況を観察する。各用量グループの動物の死亡数はＢｌｉｓｓ法に基づいてＬＤ５０を計算する（９５％信頼限界）。
【００５５】
実験結果：ＰＡＣ−１の単回胃内投与法によるマウスの急性毒性（ＬＤ５０）の用量は５５１．６１ｍｇ／ｋｇであり、９５％信頼限界でＣ．Ｌ＝６７４．９７０３〜４５０．８０３５ｍｇ／ｋｇである（結果は表３を参照）。１０００ｍｇ／ｋｇ用量グループの胃内投与後に動物に毒性反応が見られる時間は投薬後１０ｍｉｎであり、明らかな神経毒性症状が見られ，主に自発的な活動の明らかな減少、うつ伏せになる、お腹を床につける、突発性の跳躍、運動失調、尻尾を上に上げる、よだれが出るなどの症状を有し、さらには、間代性痙攣または強直性発作（ｏｐｉｓｔｈｏｔｏｎｕｓ）、呼吸不全の後に死亡し、死亡時間は主に投薬後３０〜６０ｍｉｎ以内に起こる；死亡しない動物の主な毒性反応は高用量グループと同じで、しかし毒性の程度は比較的低く、神経毒性症状と考えることができ、生存動物の大半は投薬後３時間以内に正常に回復した。１００％死亡用量は１０００ｍｇ／ｋｇ超である；０％の死亡用量は２４０．１ｍｇ／ｋｇである；明らかな毒性反応が見られない用量は１１７．７ｍｇ／ｋｇである。死亡動物に対して解剖を行い肉眼で各主要臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、胃など）に対して観察を行ったところ、明らかな異常が見られていない。実験マウスは当日に投薬により死亡した動物以外に、その他の時間ではいずれも死亡記録がない。生存している動物を投薬７日後まで観察を行い、動物の体重増加、摂食量、外観、行為、分泌物などを対照グループと比較したところ、いずれも明らかな差異が見られていない。観察が終了した後に、生存しているマウスに対して肉眼解剖を行い、肉眼観察により１０００、７００、４９０、３４３ｍｇ／ｋｇ投薬グループの一部の動物の腎臓に異なる程度の色が浅くなるという現象を有することが観察され、これは該薬物がある程度の腎臓毒性をもたらすためと推測することができ、且つ用量依存性があり、しかし各投薬グループの腎臓のパラメータと対照グループは統計学的差異がなく、その他の主要臓器にはいずれも明らかな異常が見られていない。
【００５６】
表３はＰＡＣ−１の単回胃内投与のマウス急性毒性（ＬＤ５０）の影響である。
【００５７】
【表３】
0006538976.tif 000008
【実施例７】
【００５８】
実施例７はＺＹＳ−１の経口投薬によるマウスに対する急性毒性実験に関するものである。
実験材料：ＺＹＳ−１
試験動物及び飼育状況：ＩＣＲマウス、オスメスが半々ずつ。体重が２０±２ｇで、北京維通利華試験動物技術有限公司によって提供され、ＳＰＦ基準にて飼養を行い、合格証番号：ＳＣＸＫ（京）２００６−０００９である。北京科澳協力飼料有限公司がマウスに繁殖用顆粒飼料を提供した。動物は北京安貞医院のバリアレベル（二級）動物室内で飼育され、蛍光灯で照射し、１２時間の明暗サイクルを用いて、室内温度２２〜２４℃、湿度４０−４７％で、送風は１０−１２回／時間行い、ラボの許可証番号は：ＳＹＸＫ（京）２００５−００２８である。マウスを透明のプラスチックボックス内で飼育し、性別に応じてケージを分けて飼育し、各ケージ５匹である。
【００５９】
試験対象薬品の配合方法：ＺＹＳ−１、白色粉末状。すり鉢中に入れて細かく研磨し、使用する前に精密に量り、０．５％ＣＭＣ−Ｎａで必要となる濃度に配合する。
【００６０】
動物のグループ分け：動物に対して禁食（禁水はせず）を１１時間行った後、体重に応じてランダムにグループ分けし、各グループ１０匹で、オスメスが５匹ずつで、試験では全部で８グループに分けられる。I〜VIIはＺＹＳ−１の異なる用量の投薬グループであり、医薬品のグループ間の投薬量間隔は０．７で、第ＩＸグループは０．５％ＣＭＣ−Ｎａの陰性対照グループである。投薬量はそれぞれ４１６４．９、２９１５．４、２０４０．８、１４２８．６、１０００、７００、４９０、３４３ｍｇ／ｋｇである。各投薬成分を動物の体重に応じて投薬を行い、投薬体積は０．４ｍＬ／１０ｇ体重であり、実験は単回胃内投与法によって行われ、陰性対照グループは胃内に等体積の０．５％ＣＭＣ−Ｎａを投与し、投与の３時間後から動物に対して食事を与え始める。
【００６１】
観察指標：投薬後すぐに動物の医薬品に対する反応の状況を観察する（例えば、一般的な表現、活動、呼吸、痙攣の有無、立ち直り反射、疼痛反射、外部刺激に対する反応性などの複数の指標）。動物の投薬後の毒性反応の症状及び毒性反応が出る時間、持続時間、回復時間を観察記録し、及び動物が死亡した際、すぐに肉眼的解剖（ｇｒｏｓｓ  ａｎａｔｏｍｙ）を行い、肉眼により各主要臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、胃）に充血、体積増大、硬くなる、変色などの有無を観察し、生きている動物に対して、７日以内に遅延型死亡及び遅延型毒性反応を有するか毎日観察記録し、２日ごとに体重を量り、飼料を１回与える。７日間の観察が終了した後、生存している動物に対して肉眼的解剖を行い、各臓器の状況を観察する。各用量の動物の死亡数についてＬＤ５０を計算する。
【００６２】
実験結果：投薬当日に、４１６４．９ｍｇ／ｋｇ用量グループの胃内投与後に動物に毒性反応が見られる時間を投薬後１５ｍｉｎであり、主な症状は自発的な活動の明らかな減少、うつ伏せになる、お腹を床につける、突発性の跳躍、運動失調、尻尾を上に上げる、よだれが出るなどの症状であり、さらには、間代性痙攣または強直性発作（ｏｐｉｓｔｈｏｔｏｎｕｓ）、呼吸不全の後に死亡し、その毒性反応は明らかな神経毒性症状であり、死亡時間は主に投薬後６ｈ以内である。明らかな毒性反応が見られない用量は３４３ｍｇ／ｋｇである。他の各用量グループの試験動物の主な毒性反応は高用量グループと同じで、しかし毒性の程度は比較的低く、主に神経毒性症状と考えることができ、生存動物の大半は投薬後１２時間以内に正常に回復した。死亡動物に対して解剖を行い肉眼で各主要臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、胃など）に対して観察を行ったところ、明らかな異常が見られていない。生存している動物を投薬７日後まで観察を行い、動物の体重増加、摂食量、外観、行為、分泌物などを対照グループと比較したところ、いずれも明らかな差異が見られていない。観察が終了した後に、生存しているマウスに対して肉眼解剖を行い、主要臓器にはいずれも明らかな異常が見られていない。結果は表４に示す通りである。
【００６３】
表４はＺＹＳ−１の単回胃内投与のマウス急性毒性（ＬＤ５０）に対する影響である。
【００６４】
【表４】
0006538976.tif 000009
【００６５】
ＺＹＳ−１の単回胃内投与のマウス急性毒性（ＬＤ５０）の用量は１６６５．７ｍｇ／ｋｇである。９５％信頼限界でＣ．Ｌ＝１０９１．８〜２２８５．３ｍｇ／ｋｇである；０％死亡用量は３４３ｍｇ／ｋｇである；明らかな毒性反応がない用量は３４３ｍｇ／ｋｇである。
【００６６】
ＺＹＳ−１とＰＡＣ−１の急性毒性実験の結果を比較することで分かるように、ＺＹＳ−１はより低い神経毒性を有している。
【実施例８】
【００６７】
実施例８はＺＹＳ−１とＰＡＣ−１針状結晶の抗腫瘍薬力学（ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ）の比較である。
実験細胞：胃がん細胞株ＨＧＣ−２７、非小細胞肺がんＡ５４９、ヒト慢性骨髄性白血病細胞アドリアマイシン耐薬株Ｋ５６２／Ａ０２、ヒト繊維肉腫ＨＴ−１０８０、ヒト慢性骨髄性白血病細胞Ｋ５６２。
【００６８】
実験材料：ＰＡＣ−１針状結晶（Ｑｕｉｎｎ  Ｐ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００９，５２，５７２１-５７３１の方法によって製造されたものを参照）、ＭＴＴ溶液（Ａｍｒｅｓｃｏ  規格：１ｇ  ロット番号：２０３５Ｂ３５８）、ＤＭＳＯ（分析用純度レベル、北京化工場）、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ＣＣＫ−８（日本同仁化学研究所  規格：５００ｔｅｓｔ，ロット番号：ＤＪ７０６）、ウシ胎児血清は米国ＧＩＢＣＯ社製品、ロット番号：６０８７５９、ＲＰＭＩ−ｌ６４０はＨｙｃｌｏｎｅ社製品，ロット番号：ＮＷＫ０４９２、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡは米国ＧＩＢＣＯ社製品、ロット番号：１０Ｔ７７４７６８、ＤＭＳＯは米国Ｓｉｇｍａ社製品である。
【００６９】
対数繁殖期にある細胞を取り、消化により細胞密度が１−５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調整し、各ウェルに１００μＬを９６ウェル培養プレート内に接種し、３７℃、５％ＣＯ２飽和湿度のインキュベーター中において培養を行う。細胞が壁に付着した後、投薬グループによって異なる濃度のＰＡＣ−１及びＺＹＳ−１を投与し、６つの用量グループに分け、各グループに少なくとも３つの平行ウェルを設ける；さらに陰性対照グループ（０．０５％ＤＭＳＯ培地を含有するもの）、陽性対照グループ（２０μＭのエトポシド）及び空白対照グループ（細胞を添加せず、培地のみを添加する）を設ける。３７℃において、５％ＣＯ２飽和湿度のインキュベーターにおいて培養を行う。それぞれ４８ｈ後に、各ウェルに２０μＬ  ＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬ）または１０μＬ  ＣＣＫ−８溶液を加える。３７℃にてインキュベーションし、１０ｍｉｎ振とうさせてホルマザンを完全に溶解させる。ＥＬＩＳＡリーダーを用いて、対応の測定波長条件下において光密度値（ＯＤ）を測定し、以下の式を用いて医薬品の細胞に対する抑制率を計算し、さらに以下のように計算する。ＩＣ５０：阻害率＝（陰性対照グループＯＤ値−投薬グループＯＤ値）／（陰性対照グループＯＤ値−空白グループＯＤ値）×１００％、実験を３回繰り返す。
【００７０】
実験結果は図に示す通りである：５−８。結果から以下を知ることができる：ＺＹＳ−１の抗腫瘍薬効作用はＰＡＣ−１針状結晶より強い。
【実施例９】
【００７１】
実施例９はＺＹＳ−１を用いてＨＧＣ−２７細胞の二次元移動を抑制する作用に関するものである。
実験材料：実施例８と同じである。
対数繁殖期にあるＨＧＣ−２７細胞を取り、細胞密度が５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように２４ウェルプレート（各ウェル０．５ｍＬ）上におき、１０％ウシ胎児血清を含有するＲＭＰＩ−１６４０培養液を添加し、２４時間培養し、単層細胞を形成する。２０μＬ移液用ピペットで単層細胞上において「一」型のスクラッチ痕を付け、ＰＢＳで３回洗浄し、それから２％ウシ胎児血清を含有する医薬品含有培地を添加し、濃度はそれぞれ２、４μＭであり、３７℃の５％ＣＯ２飽和湿度のインキュベーター中において培養を行う。０、４、８、１２ｈでサンプリングし、写真撮影を行う。ソフトウェアにより同一視野内における細胞がスクラッチ痕縁からスクラッチ痕内に移動した面積を統計する。
【００７２】
実験結果は図９及び表５に示す通りであり、スクラッチ実験の結果から以下が分かる：ＺＹＳ−１は明らかなＨＧＣ−２７細胞移動を抑制する作用を有する。
表５はＺＹＳ−１のＨＧＣ−２７細胞の二次元移動に対する影響である（ｎ＝３）。
【００７３】
【表５】
0006538976.tif 000010
0006538976.tif 000011
対照グループと比較した場合＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１である。
【実施例１０】
【００７４】
実施例１０はＺＹＳ−１を用いてＨＧＣ−２７及びＨＴ−１０８０細胞の三次元移動を阻害する作用に関するものである。
【００７５】
実験材料：Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ｃｏｓｔａｒ  品番：３４２２，ロット番号：２７９１１０３９規格）、その他は前記と同じである。
【００７６】
飢餓処理された細胞を消化収集して、無血清培地で細胞を懸濁させ、濃度が３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調整し、各ウェルに１００μＬの細胞懸濁液を上室に添加し、下室に７００μＬの１０％血清含有培地を添加する。実験設計に従って対照グループの各ウェルに５０μＬの無血清培地を添加し、投薬グループは薬品含有の無血清培地５０μＬを添加し、引き続きインキュベーターで２４時間培養する。上室を取り出し、メタノールで３０ｍｉｎ固定させ、ギムザ染色液を用いて３０ｍｉｎ染色させ、きれいな水で２回すすぎ、綿棒で上室底部膜の表面にある細胞を取り除き、乾燥させる。底を上にして、スライドガラス中に移して中性樹脂で封止する。顕微鏡下においてランダムに９つの視野を選び、膜通過細胞数をカウントし、平均値を統計及び計算する。
【００７７】
実験結果は図１０及び表６〜７に示す通りである。ＺＹＳ−１はＨＧＣ−２７及びＨＴ−１０８０細胞の三次元移動を明らかに抑制する能力を有し、且つ用量依存関係を示し、且つＺＹＳ−１はＨＴ−１０８０に対する阻害作用が比較的強い。
表６はＺＹＳ−１のＨＧＣ−２７細胞三次元移動能力に対する影響を示したものである（ｎ＝９）。
【００７８】
【表６】
0006538976.tif 000012
0006538976.tif 000013
対照グループと比較した場合＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１である。
表７はＺＹＳ−１のＨＴ−１０８０細胞の三次元移動能力に対する影響である（ｎ＝９）。
【００７９】
【表７】
0006538976.tif 000014
0006538976.tif 000015
対照グループと比較した場合＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１である。
【実施例１１】
【００８０】
実施例１１はＺＹＳ−１のＨＴ−１０８０の細胞侵入を抑制する作用に関するものである。
実験材料：Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ｃｏｓｔａｒ  品番：３４２２、ロット番号：２７９１１０３９  規格：８．０μｍ  ２４ウェルプレート）；Ｍａｔｒｉｇｅｌ  ＴＭマトリゲル（ＢＤ社ロット番号：３１４２５，規格５ｍｌ  品番：３５６２３４）；その他は上記と同じである。
【００８１】
Ｍａｔｒｉｇｅｌは４℃にて終夜溶融させ、４℃に予備冷却された無血清培地で１：２希釈させる；チャンバー上室底部中央に垂直に３０μＬの希釈されたＭａｔｒｉｇｅｌを添加し、室温にて２０ｍｉｎ静置し、それから３７℃にて６０ｍｉｎインキュベーションし、顕微鏡下にてゲルとなるまで観察し、無血清培地は水和してから使用に備える。薬物で４８時間処理された腫瘍細胞を消化収集し、無血清培地で細胞を懸垂させ、濃度を２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、インキュベーター中において引き続き２４時間培養させる。上室を取り出し、メタノールを用いて３０ｍｉｎ固定させ、サムザ染色液で３０ｍｉｎ染色させ、きれいな水で２回すすぎ、湿った綿棒で上室の底部膜表面にある細胞を除去し、乾燥させる。底を上にして、スライドガラスに移して中性樹脂で封止を行う。顕微鏡下でランダムに９つの視野を取ってから膜通過細胞をカウントし、平均値を統計及び計算する。
【００８２】
実験の結果から分かるように、ＺＹＳ−１は明らかにＨＴ−１０８０細胞の侵入能力を抑制でき、且つ用量と比例関係を有し、ＨＴ−１０８０対照グループは大量の細胞が下室に侵入し、２μＭ及び４μＭの投薬グループの侵入細胞数は対照グループの侵入細胞数より少なく、８μＭ投薬グループは同じ条件下では下室に進入した細胞がなく、図１１に示す通りである。
【実施例１２】
【００８３】
実施例１２はＺＹＳ−１のＨＵＶＥＣの活力及び小管の生成に対する影響に関するものである。
実験材料：ＥＣＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ社、ロット番号：９３９１、規格５００ｍＬ、品番：１００１）、Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリゲル（ＢＤ社、ロット番号：３１４２５、規格５ｍＬ、品番：３５６２３４）、０．２５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（米国ＧＩＢＣＯ社製品、規格５ｍＬ、ロット番号：１０Ｔ７７４７６８）、ヒト組み換えエンドスタチン注射液（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ，Ｅｎｄｏｓｔａｒ）（山東先声麦得津生物製薬有限公司、ロット番号：２０１２０５０１５、規格：３ｍＬ）、ＭＴＴ（Ａｍｒｅｓｃｏ、規格：１ｇ、ロット番号：２０３５Ｂ３５８）、ＤＭＳＯ（分析用純度レベル、北京化学場）、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、三回蒸留した水、ポリリジン（ＰＬＬ）、その他は以上と同じである。
【００８４】
実験方法：ＭＴＴ法を用いてＺＹＳ−１のＨＵＶＥＣｓ活力に対する影響を測定する：対数繁殖期にあるＨＵＶＥＣｓを取って０．２５％トリプシンで消化させ、遠心を行い、ＥＣＭ完全培地で再度懸濁させ、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの単細胞懸濁液を得て、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルの細胞量にて９６ウェル培養プレート中に接種し、ウェル当たりの体積が１００μＬである。３７℃において、５％ＣＯ２インキュベーターにて培養を行う。２４ｈ培養した後、６つの異なる濃度のＺＹＳ−１溶液を加え、薬品の最終濃度が０．１、０．５、１、５、１０、５０、１００μＭとなるようにする；これとともに陽性対照グループを最終濃度１０μＭのエトポシドで、陰性対照グループを等量の０．１％ＤＭＳＯ溶液にして、実験グループのそれぞれの濃度に対して、対照グループはいずれも５つの複数ウェルを設け、それぞれのウェルに薬品１００μＬを添加する。さらに空白対照グループを２００μＬ完全培地とする。３７℃において、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて培養を行う。４８ｈ培養した後、各ウェルに２０μＬのＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を加え、引き続き４ｈ培養し、培養を終了させ、ウェル内の培養上澄み液を丁寧に取り除く。各ウェルに１５０μＬのＤＭＳＯを添加し、１０ｍｉｎ振とうさせ、結晶を充分に溶液にする。ＥＬＩＳＡリーダーで各ウェルの光吸収値を測定し、計測波長は５７０ｎｍであり、結果を記録する。実験を３回繰り返す。
【００８５】
小管生成（ｔｕｂｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）実験：Ｍａｔｒｉｇｅｌを４℃にて終夜溶融させ、無血清ＥＣＭ培地を用いて１：１希釈を行い、９６ウェルプレートに被包させ、予備冷却されたピペットで希釈されたＭａｔｒｉｇｅｌを取り予備冷却された９６ウェルプレート中に入れ、各ウェルが５０μＬで、氷上において５ｍｉｎ放置してＭａｔｒｉｇｅｌの液面を水平にし、それから９６ウェルプレートを３７℃細胞インキュベーター中に入れて１ｈ放置させることでゲルを凝固させる。パンクレアチンで細胞を消化させ、カウントしてさらにそれぞれＥＣＭ培地で希釈させ、細胞密度を３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、被包された９６ウェルプレート中に接種し、各ウェル１００μＬである。ＭＴＴ実験の結果により、異なる濃度のＺＹＳ−１溶液にして、１００μＬを取り出して細胞を接種したウェル中に添加し、最終濃度を２、１、０．５μＭにする。これと共に陽性対照をヒト組み換えエンドスタチン（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ，Ｅｎｄｏｓｔａｒ）とする；陰性対照は薬品を添加せず培地のみを添加する。実験グループの各濃度に対して、対照グループはいずれも３つの複数ウェルを設け、インキュベーターに入れて培養を行う。１８ｈ顕微鏡下において観察及び撮影し、生成される管の周囲長さ、面積及び結節点の数を指標として小管の生成状況を観察する。実験を３回繰り返す。
【００８６】
結論：ＭＴＴ実験結果によりＺＹＳ−１はＨＵＶＥＣｓ細胞に対して明らかな抑制作用を有することが観察され、ＩＣ５０は２．５４２μＭであり、且つ明らかな用量依存関係を有し、結果は図１２に示す通りである；小管生成実験の結果が示すように、ＺＹＳ−１は体外誘導の内皮細胞小管生成実験において比較的強い抑制作用を有し、２μＭ  ＺＹＳ−１投薬グループと陽性対照グループ２．５μｇ／ｍＬＥｎｄｏｓｔａｒは比較的類似する抑制作用を有し、結果は図１２Ｂ及び１２Ｃを参照すること。
【実施例１３】
【００８７】
実施例１３はＺＹＳ−１のＮＦ−κＢ、ＸＩＡＰ、Ｃａｓｐａｓｅ−３、ＶＥＧＦの発現に対する影響に関するものである。
【００８８】
実験材料：抗ＸＩＡＰウサギポリクローナル抗体（ロット番号：９０９０９８Ｗ）は（ＢＩＯＳ）北京博奥森生物技術有限公司から、抗ＶＥＧＦウサギポリクローナル抗体（ロット番号：１０ＣＭ１９９）、抗Ｃａｓｐａｓｅ−３ウサギポリクローナル抗体、抗ＮＦ−κＢウサギポリクローナル抗体（ロット番号：Ｄ−Ｃ１−Ｏ７Ｃ１４Ｂ）、ＳＡＢＣ−ＦＩＴＣキット（ロット番号：０６Ｆ１０ＡＮ）はいずれも武漢博士徳生物技術有限公司から；パラホルムアルデヒド（北京化学試薬公司、ロット番号：０６０２２１）からであり、その他は以上と同じである。
【００８９】
滅菌された細胞移転膜を取り、２４ウェルプレートのウェル中に入れ、１ｍＬ（１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）の細胞懸濁液を添加接種し、２４ｈ培養し、医薬品含有培地を添加し、陰性対照グループと投薬グループを設け、実験グループでは２４−４８ｈ干渉させる。ＰＢＳで洗い、４％パラホルムアルデヒドで１５ｍｉｎ固定を行う。０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で膜破壊処理を行い、ＰＢＳで洗い、１：１０で希釈された正常血清封止液で１５ｍｉｎ封止させる。１：１００で希釈された一次抗体を添加し、４℃で終夜放置する。ＰＢＳで洗い、１：１００で希釈された二次抗体を添加し、室温にて３０ｍｉｎインキュベーションする。ＰＢＳで洗い、１：１００で希釈されたＳＡＢＣ−ＦＩＴＣを添加し、室温下で３０ｍｉｎインキュベーションし、ＰＢＳを用いて結合していないＦＩＴＣを洗い落とす。偏光顕微鏡下で観察してさらに撮影を行い、Ｂｉｏｆｌｕｘ  Ｍｏｎｔａｇｅソフトウェアを用いて蛍光強度分析を行う。各グループに対して顕微鏡下で６つの視野を取り、細胞の積算分光密度を計算する。
【００９０】
実験結果は以下を示している：ＺＹＳ−１はＮＦ−κＢとＸＩＡＰの発現を顕著に抑制でき、さらにｃａｓｐａｓｅ−３の発現を増加させることができる。そのためＺＹＳ−１によるＨＧＣ−２７アポトーシスの誘導はＮＦ−κＢタンパク質の発現を抑制することにより、転写調節によりＸＩＡＰタンパクの発現を低減させるものであり、そのｃａｓｐａｓｅファミリーに対する抑制作用を低減させることにより、ｃａｓｐａｓｅ経路依存の細胞アポトーシスを増加させる。これ以外にも、ＺＹＳ−１は明らかにＶＥＧＦタンパクの発現を抑制するものであり、ＺＹＳ−１は転移性腫瘍の発生、発展を抑制する作用を有することが分かる。図１３及び表８を参照すること。
【００９１】
表８はＺＹＳ−１のＨＧＣ−２７細胞ＮＦ−κＢ、ＸＩＡＰ、ｃａｓｐａｓｅ−３、ＶＥＧＦタンパク質の発現に対する影響である（ｎ＝６）。
【００９２】
【表８】
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対象グループと比較して＊Ｐ＜０．０５である。
【実施例１４】
【００９３】
実施例１４はＺＹＳ−１を用いてマウス自発性転移がんを抑制する実験である。
実験材料：マウス由来Ｌｅｗｉｓ肺がん細胞株、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＳＰＦ基準、オスメスが半々ずつ、１８−２２ｇ
【００９４】
実験方法：細胞懸濁液を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度に調整し、マウス右前足脇下において０．２ｍＬ／匹接種を行い、腫瘍が１０００ｍｍ３になった後、ランダムでグループ分けして投薬を行い、三週間後において処理を行う。全部でＺＹＳ−１高、中、低（１００、５０、２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ，胃内投与）及び陽性対照グループ（ゲフィチニブ１００ｍｇ／ｋｇ／ｄ、胃内投与）４グループを設ける。それぞれ動物の一般的な生存状態（飲食、活動、毛髪など）及び腫瘍抑制率及び転移抑制率の面からＺＹＳ−１に対して薬効評価を行う。
【００９５】
そのうち腫瘍抑制率の計算方法は以下である：バーニヤ（ｖｅｒｎｉｅｒ）で腫瘍の長さ、幅を測り、体積を計算する（一週間に一回）腫瘍体積＝長さ×幅２×０．５２であり、腫瘍の成長曲線を描く。治療サイクルが完了した次の日に体重を量り、採血した後に死亡させ、腫瘍組織を剥離し、重さを量り、腫瘍抑制率を計算し、−８０℃で保存する。
【００９６】
腫瘍抑制率（％）＝（１−実験グループの平均腫瘍重さ／対象グループの平均腫瘍重さ）×１００％であり、そのうち転移抑制率の計算方法は以下である：肺臓を取り、重さを量り、肺の表面と裏面、及び肺葉間の転移病巣数を記録し、転移抑制率を計算する。
転移率＝転移有りマウス数／全体のマウス数×１００％
転移病巣抑制率＝（対照グループの平均転移病巣数−実験グループの平均転移病巣数）／対照グループの平均転移病巣数×１００％
【００９７】
実験結果は以下である：
１、動物の一般状況の観察
腫瘍形成率：腫瘍細胞液を接種して約３日間経過した後、一部のマウス腋下で結節が触れられ、接種一週間後に、すべての接種されたマウスにいずれも塊状の腫瘍が触られ、腫瘍形成率は１００％である。
飲食状況：腫瘍を持っているマウスはいずれも飲食が減少し、低、中用量はモデルグループと同じぐらいであり、高容量はモデルグループより優れる。
活動状況：腫瘍を持っているマウスはいずれも活動量が減少、そのうちモデルグループと低用量マウスは倦怠感があり動きが少なく、高、中用量グループの状況は比較的優れている。
毛髪の状況：ＺＹＳ−１高、中用量グループは毛皮に光沢があり、毛が立つ現象は顕著ではなく、低用量グループはそれに続き、モデルグループと陽性対照グループのマウスの毛髪はいずれも光沢がなく、毛が立つ現象が顕著である。
【００９８】
各グループの腫瘍を持っているマウスの体の状況及び腫瘍抑制率の結果は表９−１０を参照すること。
【００９９】
表９は各グループのマウス腫瘍質量及び腫瘍抑制率を示したものである。
【０１００】
【表９】
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【０１０１】
Ｐ＜０．００１であれば、即ちモデルグループと比較した場合極めて顕著な差異を有する。Ｐ＜０．０１であれば、即ちモデルグループと比較した場合顕著な差異を有する。
表１０はマウス腫瘍転移抑制作用を示したものである。
【０１０２】
【表１０】
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【０１０３】
Ｐ＜０．００１であれば、即ちモデルグループと比較した場合極めて顕著な差異を有する。Ｐ＜０．０１であれば、即ちモデルグループと比較した場合顕著な差異を有する。
【０１０４】
前記結果が示すように、ＺＹＳ−１は比較的優れた抗腫瘍及び腫瘍転移抑制効果を有し、例えば１００ｍｇ／ｋｇ用量下において、その腫瘍転移抑制率は７０％を超え、且つ優れた用量依存関係を示している。
【０１０５】
当業者は本明細書が開示した内容を閲覧した後、ＰＡＣ−１の類似体またはその誘導体（例えば塩、エステル、溶媒和物など）のアモルファス形態も低神経毒性のものである可能性があると容易に想到することができる。本明細書の教示に基づいて、当業者は前記ＰＡＣ−１の類似体またはその誘導体を得て、さらにそれらの生物毒性に対して検証し、これにより低神経毒性のＰＡＣ−１類似体またはその誘導体を得る動機を有し、これは自明であるである。前記ＰＡＣ−１の類似体としては、例えば中国特許公開公報ＣＮ１０１１８４４９１Ａによって開示された化合物があり、例えばＰＡＣ−１誘導体ライブラリー化合物、ＺＺ式、ＺＺ２式、ＺＺ３式、ＺＺ４式で示される化合物である（図１参照）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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