(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象に埋め込むのに適した溶出マトリックスであって、前記溶出マトリックスが、タンパク質を発現する少なくとも１つの細胞を含み、
前記細胞が、前記タンパク質について浸透性であるＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出多孔性ポリマーマトリックスに被包されており、かつ、
埋め込み後少なくとも１カ月にわたり前記マトリックス周囲のエフェクターＴ細胞を退けるために、前記マトリックス中のＣＸＣＬ１２ポリペプチドの濃度が少なくとも１００ｎｇ／ｍＬである、
溶出マトリックス。
【請求項２】
前記ＣＸＣＬ１２ポリペプチドが、１００ｎｇ／ｍＬから１μｇ／ｍＬの濃度で、マトリックス中に存在する、請求項１に記載の溶出マトリックス。
【請求項３】
前記マトリックスがカプセルを形成する、請求項１または２に記載の溶出マトリックス。
【請求項４】
前記マトリックスの厚さが、２００〜５００ミクロンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の溶出マトリックス。
【請求項５】
前記少なくとも１つの細胞が、前記対象に対して同種細胞または異種細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の溶出マトリックス。
【請求項６】
前記少なくとも１つの細胞が、少なくとも１カ月間活性を保持する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の溶出マトリックス。
【請求項７】
前記活性が、対象の血中グルコースレベルを調節している、請求項６に記載の溶出マトリックス。
【請求項８】
前記少なくとも１つの細胞が、膵島細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の溶出マトリックス。
【請求項９】
前記膵島細胞が、インスリン産生細胞、ｉＰＳ細胞に由来する膵島細胞、ブタ膵島細胞またはヒト膵島細胞である、請求項８に記載の溶出マトリックス。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの細胞が、筋細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、線維筋芽細胞、腎臓細胞、肝細胞、膵臓細胞、腸細胞、骨芽細胞、造血細胞、神経細胞、平滑筋、骨格筋細胞、筋細胞、上皮細胞、肝実質細胞、または幹細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の溶出マトリックス。
【請求項１１】
前記マトリックスが、アルギン酸ゲルを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の溶出マトリックス。
【請求項１２】
前記アルギン酸ゲルが、２％ｗ／ｖである、請求項１１に記載の溶出マトリックス。
【請求項１３】
前記アルギン酸ゲルが、共有結合で架橋されている、請求項１１または１２に記載の溶出マトリックス。
【請求項１４】
前記アルギン酸ゲルが、１．５から２％ｗ／ｖの高マンヌロン酸のカルシウム架橋アルギン酸塩を含む、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の溶出マトリックス。
【請求項１５】
前記アルギン酸ゲルが、７５ｋＤａ未満の平均分子量のアルギン酸マトリックスのアルギン酸ポリマーを含む、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の溶出マトリックス。
【請求項１６】
前記アルギン酸ゲルが、７５ｋＤａから２００ｋＤａの平均分子量のアルギン酸マトリックスのアルギン酸ポリマーを含む、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の溶出マトリックス。
【請求項１７】
前記アルギン酸ゲルが、マンヌロン酸およびグルロン酸を含む、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の溶出マトリックス。
【請求項１８】
前記アルギン酸ゲルが、マンヌロン酸を、グルロン酸に対して１：１００〜１００：１の比で含む、請求項１７に記載の溶出マトリックス。
【請求項１９】
前記アルギン酸ゲルが、グルロン酸を、マンヌロン酸に対して３：２未満の比で含む、請求項１７に記載の溶出マトリックス。
【請求項２０】
前記ＣＸＣＬ１２ポリペプチドが、ヒトＣＸＣＬ１２ポリペプチドである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の溶出マトリックス。
【請求項２１】
前記ヒトＣＸＣＬ１２ポリペプチドが、ヒトＣＸＣＬ１２ポリペプチドアイソフォームガンマまたはアイソフォームデルタと少なくとも８５％アミノ酸配列同一性を有する、請求項２０に記載の溶出マトリックス。
【請求項２２】
前記ヒトＣＸＣＬ１２ポリペプチドが、ヒトＣＸＣＬ１２ポリペプチドアイソフォームガンマまたはアイソフォームデルタと少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有する、請求項２１に記載の溶出マトリックス。
【請求項２３】
前記マトリックス内のＣＸＣＬ１２ポリペプチドが、マトリックス内の細胞によって供給される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の溶出マトリックス。
【請求項２４】
前記マトリックスの平均孔径が、１３０ＫＤ超の分子を排除する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の溶出マトリックス。
【請求項２５】
ＣＸＣＬ１２ポリペプチドを発現する細胞の層をさらに含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の溶出マトリックス。
【請求項２６】
前記細胞が中皮細胞である、請求項２５に記載の溶出マトリックス。
【請求項２７】
少なくとも１つの細胞が、インビボで前記マトリックスに供給される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の溶出マトリックス。
【請求項２８】
インビトロで、ボイデンチャンバーにおいてエフェクターＴ細胞を退ける能力を特徴とする、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の溶出マトリックス。
【請求項２９】
それを必要とする対象に膵島細胞を供給するための請求項１〜２８のいずれか１項に記載の溶出マトリックスであって、前記細胞が膵島細胞であり、前記膵島細胞が、ある期間の間、対象の血中グルコースレベルを調節する溶出マトリックス。
【請求項３０】
前記期間が、少なくとも１か月である、請求項２９に記載の溶出マトリックス。
【請求項３１】
前記膵島細胞が、前記対象の空腹時血清グルコース濃度を、８０ｍｇ／ｄＬから１２０ｍｇ／ｄＬの間の血中レベルに維持する、請求項２９または３０に記載の溶出マトリックス。
【請求項３２】
前記溶出マトリックスの移植を、前記対象が繰り返し受ける、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の溶出マトリックス。
【請求項３３】
前記マトリックスが、エフェクターＴ細胞またはマクロファージによって分解されない、請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の溶出マトリックス。
【請求項３４】
制御性Ｔ細胞が、移植部位に存在する、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の溶出マトリックス。
【請求項３５】
エフェクターＴ細胞が、移植部位に存在しない、請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の溶出マトリックス。
【請求項３６】
前記制御性Ｔ細胞が存在すること、または前記エフェクターＴ細胞が存在しないことが、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学によって測定される、請求項２９〜３５のいずれか１項に記載の溶出マトリックス。
【請求項３７】
ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出多孔性ポリマーマトリックスに被包された同種移植または異種移植の膵島細胞を含む、対象に埋め込むのに適した溶出マトリックスであって、前記マトリックスが、
ａ）２００〜５００ミクロンのマトリックス厚、および１００ｎｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬのマトリックス中のＣＸＣＬ１２ポリペプチド濃度と、
ｂ）Ｉ型糖尿病である対象の血清グルコース濃度を調節する薬剤が、前記マトリックスを通じて拡散するような多孔性と、
ｃ）前記薬剤の前記膵島細胞との相互作用に基づく、前記膵島細胞によるインスリン産生と、ここで、前記インスリンは、前記マトリックスを通じて、前記対象の前記血清グルコース濃度を調節するのに充分な速さで放出され、
前記マトリックス中のＣＸＣＬ１２ポリペプチドの濃度が、埋め込み後少なくとも１カ月にわたり前記マトリックス周囲のエフェクターＴ細胞を退けるのに十分な濃度である
ことを特徴とし、前記マトリックス厚、ＣＸＣＬ１２ポリペプチド濃度および溶出の速さが、少なくとも４カ月の期間にわたって前記膵島細胞の分解を阻害するように選択され、それによって、前記期間の間、前記対象の血中グルコースレベルの制御が実現される、溶出マトリックス。
【請求項３８】
前記期間が６カ月間である、請求項３７に記載の溶出マトリックス。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
移植は、Ｉ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）などの自己免疫障害を有する個体にとって治療効果がある可能性があるアプローチであるが、その利用は、移植細胞の急性または慢性の免疫拒絶によって制限されている［Ｎ．Ｐａｐｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ８３，１７４（Ｊａｎ  ２７，２００７）；Ａ．Ｍ．Ｓｈａｐｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５５，１３１８（Ｓｅｐ  ２８，２００６）；Ｊ．Ｓ．Ｋａｄｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．ＪＡＭＡ  ３０１，１５８０（Ａｐｒ  １５，２００９）；Ｒ．Ｐ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５０，６９４  （Ｆｅｂ  １２，２００４）；Ｒ．Ｂ．Ｊａｌｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５９，２２１９（Ｓｅｐ，２０１０）；およびＶ．Ｖａｉｔｈｉｌｉｎｇａｍ，Ｔｈｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ：７，６２（Ｓｐｒｉｎｇ，２０１０）］。免疫拒絶は、現在のところ継続的な全身免疫抑制によって管理されるが、全身免疫抑制は、レシピエントを感染症およびがんのリスクの増加に曝す一方で、長期的にはあまり有効ではないアプローチである［Ａ．Ｇ．Ｍａｌｌｅｔｔ，Ｇ．Ｓ．Ｋｏｒｂｕｔｔ．Ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｐａｒｔ  Ａ  １５，１３０１（Ｊｕｎ，２００９）；Ｎ．Ｓａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｗｏｒｌｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ３，１９（Ｆｅｂ  １５，２０１２）；Ｍ．Ｃ．Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １０９，１１０１（Ａｐｒ，２００２）；およびＭ．Ｃ．Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６，５４３（Ｍａｙ，２０００）］。局所的な解剖学的部位に特異的な免疫調節を誘導することによって、全身免疫抑制の必要性を排することができる、代替の療法が望ましいことになる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
ＣＸＣＬ１２ポリペプチドは、免疫抑制性の制御性Ｔ細胞を解剖学的部位に動員する一方で、エフェクターＴ細胞を退けることができる。ＣＸＣＬ１２は、埋め込まれたマトリックスの、急性および慢性の両方における免疫による破壊を、部位特異的に克服可能なことが今では確かめられており、これにより、全身免疫抑制を同時に行う必要がなくなる。
【０００３】
一態様では、本明細書で提供されるのは、ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスに被包された少なくとも１つの細胞を含む組成物に関する。
【０００４】
いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスは、エフェクターＴ細胞を退けるのに充分な速さでＣＸＣＬ１２ポリペプチドを放出することを特徴としうる。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスは、少なくとも約１．０ｎｇ／ｍＬ／時の速さで、ＣＸＣＬ１２ポリペプチドを放出することを特徴としうる。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ１２ポリペプチドは、少なくとも約１．５ｎｇ／ｍＬ／時、少なくとも約２ｎｇ／ｍＬ／時、少なくとも約２．５ｎｇ／ｍＬ／時、少なくとも約３ｎｇ／ｍＬ／時、少なくとも約４ｎｇ／ｍＬ／時、少なくとも約５ｎｇ／ｍＬ／時またはそれを超える速さで、ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスから放出されうる。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ１２ポリペプチドは、約１．０ｎｇ／ｍＬ／時から約３ｎｇ／ｍＬ／時の速さで放出されうる。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ１２ポリペプチドは、約１．７５ｎｇ／ｍＬ／時の速さで放出されうる。ほんの一例として、本明細書に記載の組成物は、インビトロで、ボイデンチャンバーにおいてエフェクターＴ細胞を退ける能力を特徴としうる。
【０００５】
ＣＸＣＬ１２ポリペプチドは、任意の濃度で溶出マトリックスに存在してよい。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ１２ポリペプチドの濃度は、例えば、溶出マトリックスからのＣＸＣＬ１２ポリペプチドの所望の放出速度、および／またはその放出期間に対して、最適化されうる。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ１２ポリペプチドは、約１００ｎｇ／ｍＬの濃度でマトリックスに存在することができる。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ１２ポリペプチドは、約１００ｎｇ／ｍＬから約１μｇ／ｍＬの濃度でマトリックスに存在することができる。いくつかの実施形態では、溶出マトリックス内のＣＸＣＬ１２ポリペプチドの濃度は、約３カ月から約２年の間、約１００ｎｇ／ｍＬから約１μｇ／ｍＬの濃度で維持されうる。いくつかの実施形態では、溶出マトリックス内のＣＸＣＬ１２ポリペプチドの濃度は、対象に組成物を埋め込んで約３カ月から約２年の間、約１００ｎｇ／ｍＬから約１μｇ／ｍＬで維持されうる。いくつかの実施形態では、マトリックス内のＣＸＣＬ１２ポリペプチドの維持濃度は、約１００〜２００ｎｇ／ｍＬでありうる。
【０００６】
ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスを形成するために、ＣＸＣＬ１２ポリペプチドは、溶出マトリックス内に予め装填されるか、または溶出マトリックス中でインサイチューに産生されうる。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックス内のＣＸＣＬ１２ポリペプチドは、ＣＸＣＬ１２ポリペプチド分泌細胞、またはＣＸＣＬ１２ポリペプチドを分泌するように遺伝子改変された細胞によって供給されうる。いくつかの実施形態では、マトリックス内のＣＸＣＬ１２ポリペプチドは、マトリックス内の膵島細胞によって供給されうる。
【０００７】
いくつかの実施形態では、溶出マトリックスに存在するＣＸＣＬ１２ポリペプチドは、治療される対象の種に基づくアミノ酸配列を含みうる。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ１２ポリペプチドは、ヒトＣＸＣＬ１２ポリペプチドを含みうる。
【０００８】
ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスは、様々なマトリックス構造によって特徴付けられる。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスは、カプセルを形成することができる。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスは、固形または泡状のマトリックスの形態でありうる。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスは、多区画または多層のマトリックスを形成しうる。これらの実施形態では、細胞（複数でもよい）およびＣＸＣＬ１２ポリペプチドは、ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスのうち、同じまたは異なる区画もしくは層に存在することができる。
【０００９】
ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスの厚さは、様々な適用の要求に見合うように変化しうる。ほんの一例として、ＣＸＣＬ１２ポリペプチドの溶出は、溶出マトリックスからＣＸＣＬ１２ポリペプチドを速く放出させるかまたは遅く放出させるために、調整されうる。いくつかの実施形態では、該マトリックスの厚さは、約２００〜約５００ミクロンでありうる。
【００１０】
ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスに被包された細胞（複数でもよい）は、任意の供給源、任意の種、および／または任意の組織型から収集されうるかまたは由来しうる。追加的にまたは代替的に、ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスに被包された細胞（複数でもよい）を、幹細胞から特異的な細胞型に分化させることができる。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスに被包された細胞（複数でもよい）は、自家性でありうる。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスに被包された細胞（複数でもよい）は、同種細胞（複数でもよい）または異種細胞（複数でもよい）でありうる。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスに被包された細胞（複数でもよい）は、例えば対象に該組成物が埋め込まれた際、その機能および／または活性を所望の期間の間、保持することができる。いくつかの実施形態では、細胞（複数でもよい）は、その機能および／または活性を、少なくとも約１カ月またはそれを超える間、例えば少なくとも約２カ月、少なくとも約３カ月またはそれを超える間、保持することができる。いくつかの実施形態では、細胞（複数でもよい）は、その機能および／または活性を、本明細書に記載の組成物を対象に埋め込んだ後少なくとも約１カ月またはそれを超える間、保持することができる。
【００１２】
ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスに被包された細胞の種類に応じて、細胞は、異なる機能および／または活性を行うことができる。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスに被包された細胞（複数でもよい）は、対象の血中グルコースレベルを調節することができる。例えば、ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスに被包された細胞（複数でもよい）は、埋め込まれると、周囲または周辺のグルコースレベルに応答して、インスリンを放出することができる。これらの実施形態では、ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスに被包された細胞（複数でもよい）は、膵島細胞を含みうる。膵島細胞は、インスリン産生細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞由来の膵島細胞、ブタ膵島細胞、ヒト膵島細胞またはそれらの任意の組合せでありうる。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスに被包された細胞（複数でもよい）を取り出すことができる。いくつかの実施形態では、該細胞（複数でもよい）をＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスにインビボで供給することができる。
【００１４】
ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスは、少なくとも１つまたは複数の生体適合性バイオポリマーを含みうる。生体適合性ポリマーは、生体分解可能であるか、または非分解性である。生体適合性ポリマーは、炭水化物ベースであり、タンパク質ベースであり、および／または合成されうる。いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマーは、被包された細胞に対し不活性であり（例えば、細胞シグナリングの刺激または阻害がない）、溶出されるＣＸＣＬ１２ポリペプチドに浸透性があり、任意選択で、検知される標的分子に浸透性があるように選択されうる。いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマーは、溶出マトリックスの平均孔径が約１３０ｋＤ超の分子を排除するように、選択されうる。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスは、アルギン酸ゲルを含みうる。アルギン酸ゲルは、マンヌロン酸（Ｍ）およびグルロン酸（Ｇ）を、個々の適用に特異的な性質を達成するために選択される比（Ｍ／Ｇ）で含みうる。Ｍ／Ｇ比によって最適化することのできるアルギン酸ゲルの例示的な性質としては、分子量カットオフ、多孔性、孔径、ゲル強度、および／またはＣＸＣＬ１２ポリペプチドの放出プロファイルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
いくつかの実施形態では、アルギン酸ゲルは、高いマンヌロン酸含量を含みうる。いくつかの実施形態では、マンヌロン酸（Ｍ）およびグルロン酸（Ｇ）を約１または１超の比（Ｍ／Ｇ）で含みうる。いくつかの実施形態では、アルギン酸ゲルの濃度は、約１％ｗ／ｖから約５％ｗ／ｖまで様々でありうる。いくつかの実施形態では、アルギン酸ゲルの濃度は、約２％ｗ／ｖである。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物は、ＣＸＣＬ１２ポリペプチドを発現することができる細胞の層をさらに含みうる。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ１２ポリペプチドを発現する細胞は、中皮細胞を含みうる。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、溶出マトリックスの上にＣＸＣＬ１２ポリペプチドの吸収性層をさらに含みうる。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本化合物は、注射可能な組成物に製剤化されうる。
【００２０】
様々な実施形態では、本明細書に記載の組成物は、疾患または障害を治療するために、対象の標的部位に移植または注射されうる。いくつかの実施形態では、本組成物は、ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスに被包された少なくとも１つの膵島細胞を含みうる。したがって、いくつかの実施形態では、組成物、例えば糖尿病の治療に用いるものは、ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスに被包された同種移植または異種移植の膵島細胞を含む組成物であって、マトリックスが、（ａ）２００から５００ミクロンのマトリックス厚、および約１００ｎｇ／ｍＬから約１μｇ／ｍＬのマトリックス中のＣＸＣＬ１２ポリペプチドの濃度と、（ｂ）Ｉ型糖尿病である対象の血清グルコース濃度を調節する薬剤がマトリックスを通じて拡散するような多孔性と、（ｃ）薬剤の膵島細胞との相互作用に基づく膵島細胞によるインスリン産生であって、インスリンはマトリックスを通じて、対象の血清グルコース濃度または血中グルコースレベルを調節するのに充分な速さで放出される、インスリン産生とを特徴とする、組成物としての特徴を有しうる。マトリックス厚、ＣＸＣＬ１２濃度および／または溶出の速さは、少なくとも約４カ月または約４カ月までの期間にわたって膵島細胞の分解を阻害するように調整され、それによって、当該期間の間、対象の血中グルコースレベルの制御が実現されうる。いくつかの実施形態では、マトリックス厚、ＣＸＣＬ１２濃度および／または溶出の速さは、約６カ月またはそれを超える期間にわたって膵島細胞の分解を阻害するように調整されうる。
【００２１】
別の態様では、それを必要とする対象に膵島細胞を供給するための方法もまた、本明細書に記載される。本方法は、本明細書に記載の組成物の１つまたは複数の実施形態を対象に移植するステップを含み、ここで、膵島細胞は、ある期間の間、対象の血中グルコースレベルを調節する。ほんの一例として、ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスに被包された膵島細胞は、対象に埋め込まれると、少なくとも約１カ月またはそれを超える間、例えば少なくとも約２カ月、少なくとも約３カ月、少なくとも約６カ月、少なくとも約９カ月、少なくとも約１年、少なくとも約２年またはそれを超える間、対象の血中グルコースレベルを調節することができる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスに被包された膵島細胞は、対象の空腹時血清グルコース濃度を約８０ｍｇ／ｄＬと約１２０ｍｇ／ｄＬの間の血中レベルに維持することができるかまたは回復させることができる。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスは、エフェクターＴ細胞またはマクロファージによって分解されない。
【００２４】
いくつかの実施形態では、制御性Ｔ細胞は、移植部位に存在しうる。いくつかの実施形態では、エフェクターＴ細胞は、移植部位に不在でありうる。ほんの一例として、制御性Ｔ細胞が存在すること、またはエフェクターＴ細胞が存在しないことは、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学によって測定することができる。
【００２５】
いくつかの実施形態では、対象は、ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスに被包された少なくとも１つの膵島細胞を含む組成物の移植を繰り返し受けることができる。
【００２６】
本明細書に記載のさらに別の態様は、膵島細胞を、それを必要とする、異種移植の膵島細胞の蓄積がある対象に補充するための方法を提供する。本方法は、（ａ）前記対象に存在する膵島細胞の半減期を評価するステップと、（ｂ）膵島細胞の総半減期（ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）が、ある期間の間、対象のグルコースレベルの制御を提供できる治療レベルにあるように、対象に膵島細胞を供給するステップと、（ｃ）膵島細胞の半減期に基づいてステップ（ａ）および（ｂ）を繰り返すステップとを含む。いくつかの実施形態では、対象に存在する膵島細胞の半減期は、対象の血中グルコースレベルの変化をモニタリングすることによって評価されうるかまたは見積もられうる。例えば、血中グルコースが糖尿病状態に戻ることは、対象に膵島細胞を補給する必要があることを表しうる。
【００２７】
ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスを含む組成物もまた、本明細書に提供される。該マトリックスは、（ａ）ＣＸＣＬ１２ポリペプチドが、組成物からゆっくりと溶出され、自己免疫疾患の進行部位に浸透するようにする多孔性と、（ｂ）大部分のマトリックスが、投与部位中およびその周辺に局在したままとなるように、投与後に組成物を移動させないようにする薬剤とを特徴とし得、ここで、ＣＸＣＬ１２ポリペプチド濃度および溶出の速さが、前記自己免疫疾患のさらなる成長を阻害するように選択される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、注射によって投与することができる。これらの実施形態では、本組成物は、注射可能な組成物に製剤化されうる。
【００２８】
本発明の他の特徴または利点は、詳細な記載から、および特許請求の範囲から明らかになろう。それゆえ、本発明の他の態様は、以下の開示に記載され、本発明の範囲内にある。
【００２９】
以下の詳細な説明は、例として与えられており、記載される特定の実施形態に本発明を限定することを意図するものではないが、参照により本明細書の一部をなす添付の図面と併せて理解されうる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ−１Ｄ】高濃度のＣＸＣＬ１２を用いた同種膵島の被覆によって、拒絶が遅延されることを示す図である。図１Ａは、移植後の同種移植膵島の割合の生存曲線である。ＢＡＬＢ／Ｃの膵島を、約１００ｎｇ／ｍＬおよび約１μｇ／ｍＬの濃度のＣＸＣＬ１２、またはＰＢＳのみに曝露して、ＳＴＺ処置された糖尿病Ｃ５７ＢＬ／６レシピエントの腎被膜下に移植した。高血糖に戻ることは、移植片拒絶の指標であるものと考えられ、正常血糖が持続されることは、同種移植の生存の指標であるものと考えられた。約１μｇ／ｍＬのＣＸＣＬ１２を用いて膵島を被覆することによって、ＰＢＳ対照と比べて移植片拒絶が遅延されたが、約１００ｎｇ／ｍＬではそうではなかった（ｐ＝０．０１２、ログ・ランク検定）（１群あたり動物１２頭）。図１Ｂは、同種移植膵島を特徴付ける一連の画像である。被膜下の膵島の移植部位を示すヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色では、およそ１μｇ／ｍＬのＣＸＣＬ１２で被覆された膵島は、非被覆の対照と比べて、単核細胞の浸潤が減少することが示された（左パネル）。およそ１μｇ／ｍＬのＣＸＣＬ１２およびＰＢＳで被覆された膵島の移植範囲のインスリン染色では、ＣＸＣＬ１２被覆された膵島は、ＰＢＳ対照と比べて、機能的な膵島の数およびインスリン分泌のレベルが高いことが示された（中間パネル）。また、蛍光染色では、ＣＸＣＬ１２被覆された膵島は、対照と比べて、ＣＸＣＬ１２染色の証拠が示された（右パネル）。ＣＸＣＬ１２およびインスリンの共染色が、いっそう明るい色調に示されている。図１Ｃは、膵島移植片に存在するＣＤ３＋細胞の数をＣＤ３免疫染色に基づいて定量化した棒グラフであり、およそ１μｇ／ｍＬのＣＸＣＬ１２で被覆された移植片（ｐ＝０．００１）は、非被覆対照と比べて、移植範囲へのＣＤ３＋細胞の浸潤の有意な低下があることを示す（１群当たり動物６頭）。図１Ｄは、膵島移植片に存在するＦｏｘＰ３＋細胞の数をＦｏｘＰ３免疫染色に基づいて定量化した棒グラフであり、１μｇ／ｍＬのＣＸＣＬ１２で被覆された移植片では、ＦｏｘＰ３＋細胞の局在がＰＢＳ対照よりも有意に大きいことを示す（ｐ＝０．００１６）（ｎ＝６）。
【図２Ａ−２Ｃ】ＣＸＣＬ１２被覆された同種膵島を伴う、低用量のＣｓＡ処置が、移植片の生存を増加させないことを示す図である。図２Ａは、ＣｓＡ処置または非処置で、ＣＸＣＬ１２被覆または非被覆の膵島を移植した後に、非糖尿病のままであったマウスの割合の生存曲線である。ＣＸＣＬ１２被覆を、移植後２３日目にＣｓＡ処置と組み合わせた際に、移植片の生存時間に有意な減少があった（ｐ＝０．０２４５、ログ・ランク検定）。図２Ｂは、検討した各条件でのＣＤ３、ＦｏｘＰ３およびインスリンについての免疫組織化学染色の一連の画像である。染色は、図２Ａに示した生存データと一致しており、かつＣＸＣＬ１２＋ＣｓＡ膵島と比べて、ＣＸＣＬ１２被覆膵島では、ＣＤ３＋細胞の浸潤の低下およびＦｏｘＰ３＋細胞の浸潤の増加、ならびにいっそう大きなインスリンの発現を示す。図２Ｃは、検討した３つの条件それぞれでの、膵島移植片のＣＤ３＋細胞およびＦｏｘＰ３＋細胞の数の定量化を示す棒グラフである。ＣＸＣＬ１２＋ＣｓＡ移植片では、ＣＸＣＬ１２被覆のみと比べて、ＦｏｘＰ３＋細胞数の有意な低下（ｐ＝０．０１８８）およびＣＤ３＋細胞の数の有意な増加（ｐ＝０．０００２）が観察された。
【図３Ａ−３Ｃ】ＣＸＣＬ１２被覆が、Ｃ５７ＢＬ／６特異的なＣＤ４Ｔ細胞の数に影響を及ぼさないことを示す図である。ＢＡＬＢ／ｃの膵島の移植後１０日目に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから脾臓を取り出し、マイトマイシンＣ処置したＢＡＬＢ／ｃの脾細胞を用いて、１ｍＭのＢｒｄＵの存在下で脾細胞を刺激した。次いで、ＢｒｄＵ取込みについて細胞を染色した。図３Ａは、陰性染色対照（陰影部）と比べての脾細胞でのＢｒｄＵ取込みを示す図である。図３Ｂは、非被覆（実線）およびＣＸＣＬ１２被覆（陰影部）の膵島を受けたマウス由来のＣＤ４Ｔ細胞内へのＢｒｄＵ取込みに、差がなかったことを示す図である。図３Ｃは、各マウス群の脾臓当たりの同種特異的なＣＤ４Ｔ細胞の平均数を示し、ＣＸＣＬ１２を用いた被覆膵島が、同種の組織に対する全身免疫応答を変化させないことを表す棒グラフである（ｎ＝３）。
【図４Ａ−４Ｃ】ＳＴＺ処置された糖尿病ＮＯＤ／ＬｔＪマウスの腎被膜下に移植した、ＮＯＤ／ＬｔＪマウス同一遺伝子の膵島をＣＸＣＬ１２被覆またはＰＢＳ曝露した実験データを示す図である。図４Ａは、移植後に非糖尿病のままであったマウスの割合の生存曲線である。ＣＸＣＬ１２曝露された膵島とＰＢＳ曝露された膵島との間に有意差があり（ログ・ランク検定、ｐ＝０．０１７）、このことは、移植された同一遺伝子のＣＸＣＬ１２被覆膵島による生存および機能の延長を表す。図４Ｂは、膵島移植片中のＣＤ３＋細胞の数を定量化する棒グラフであり、ＣＸＣＬ１２被覆された膵島移植片内へのＣＤ３＋細胞の浸潤に有意な低下があったことを示す（ｐ＝０．００８１）。図４Ｃは、膵島移植片中のＦｏｘＰ３＋細胞の数を定量化する棒グラフであり、ＣＸＣＬ１２被覆された膵島へのＦｏｘＰ３＋細胞の局在に、ＰＢＳ曝露された膵島よりも有意な増加があったことを示す（ｐ＝０．００１９）。
【図５Ａ−５Ｄ】自然発生糖尿病ＮＯＤ／ＬｔＪマウスの腎被膜下に移植した、ＮＯＤ／ＬｔＪマウス同一遺伝子の膵島をＣＸＣＬ１２被覆またはＰＢＳ曝露した実験データを示す図である。図５Ａは、移植後に非糖尿病のままであったマウスの割合の生存曲線である。ＣＸＣＬ１２曝露された膵島とＰＢＳ曝露された膵島との間に有意差はなかった（ログ・ランク検定、ｐ＝０．２４）。図５Ｂは、１μｇ／ｍＬのＣＸＣＬ１２（左パネル）を用いて被覆された膵島移植片内への単核細胞の浸潤が低下したことを示すＨ＆Ｅ染色（左パネル）、ならびにＣＸＣＬ１２被覆移植片でインスリンおよびＣＸＣＬ１２のレベルが増加したことを示す、両タンパク質についての免疫蛍光染色（右パネル）の一連の画像である。図５Ｃは、膵島移植片中のＣＤ３＋細胞の数を定量化する棒グラフであり、生存率に差がなかったにも関わらず、ＣＸＣＬ１２被覆された膵島移植片内へのＣＤ３＋細胞の浸潤に有意な低下があったことを示す（ｐ＝０．００１５）。図５Ｄは、膵島移植片中のＦｏｘＰ３＋細胞の数を定量化する棒グラフであり、ＣＸＣＬ１２被覆された膵島へのＦｏｘＰ３＋細胞の局在に、ＰＢＳ曝露された膵島よりも有意な増加があったことを示している。
【図６Ａ−６Ｆ】Ｃａ−ＬＶＭアルギン酸カプセル内へＣＸＣＬ１２を組み込むことによって、腹腔内に移植された同種または異種の膵島の拒絶が遅延されることを示す図である。図６Ａは、細胞を含まないカルシウム架橋されたおよそ３．３％アルギン酸被包体からのＣＸＣＬ１２放出の、インビトロでの経時のカイネティクスを示す線グラフである。架橋されていないアルギン酸ナトリウム中のＣＸＣＬ１２の濃度は、１μｇ／ｍＬ（ｎ＝３）であり、ＣａＣｌ２架橋溶液中で著しい量のＣＸＣＬ１２が失われた。１．５％から３．３％のアルギン酸濃度についてのＣＸＣＬ１２放出のプロファイルに差はなかった（データ示さず）。最初の２４時間の間に１．５％アルギン酸カプセルから発されるＣＸＣＬ１２の初発の放出速度は、１．７５ｎｇ／ｍＬ／時＋／−０．０１ｎｇ／ｍＬ／時であり、４日後に０．１８ｎｇ／ｍＬ／時＋／−０．００２ｎｇ／ｍＬ／時の放出速度に安定した。図６Ｂは、ＣＸＣＬ１２とバリウム架橋されたアルギン酸カプセルとの静電的相互作用を示す棒グラフである。左パネルは、１ＭのＮａＣｌと共にインキュベートした後には、ＮａＣｌ非存在下でインキュベートした際と比べて、有意に低い量のＣＸＣＬ１２がベッドに残っていたことを示す。右パネルは、１ＭのＮａＣｌと共にインキュベートした後には、ＮａＣｌを含まない培地中でインキュベートした際と比べて、有意に高い量のＣＸＣＬ１２が培地中に溶出されたことを示す（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５）。図６Ｃは、カスパーゼ３活性の棒グラフであり、ＣＸＣＬ１２の組込みが、被包化マウス膵島中のカスパーゼ３の活性を有意に低減することを示す（対照に対し、およそ１００ｎｇ／ｍｌのＣＸＣＬ１２についてはｐ＝０．００１９、およびおよそ１μｇ／ｍｌのＣＸＣＬ１２についてはｐ＝０．０００２８）。マウス膵島は、Ｃａ−ＬＶＭ、またはおよそ１００ｎｇ／ｍＬもしくは１μｇ／ｍＬのどちらかのＣＸＣＬ１２を組み込んだＣａ−ＬＶＭ（Ｃａ−ＬＶＭ−ＣＸＣＬ１２）を用いて被包し、次いで、インビトロで４８時間インキュベートし、その後にカスパーゼ３活性を決定した。図６Ｄは、移植後の同種移植膵島の割合の生存プロットである。１μｇ／ｍＬのＣＸＣＬ１２をＣａ−ＬＶＭ被包体内に組み込むことは、両群で同種膵島（ｎ＝１２）の拒絶を遅延させる（ｐ＝０．０２３７、ゲーハン−ブレスロウ−ウィルコクソン検定）。図６Ｅは、移植後の同種移植膵島の割合の生存プロットである。およそ１μｇ／ｍＬのＣＸＣＬ１２を組み込むことはまた、同種感作されたＮＯＤ／ＬｔＪマウス内に移植された被包化同種膵島の拒絶を遅延させる（Ｃａ−ＬＶＭカプセル、ｎ＝７；Ｃａ−ＬＶＭ−ＣＸＣＬ１２カプセル、ｎ＝９；ｐ＝０．００６６、ゲーハン−ブレスロウ−ウィルコクソン検定）。図６Ｆは、移植後の同種移植膵島の割合の生存プロットである。およそ１μｇ／ｍＬのＣＸＣＬ１２を組み込むことは、糖尿病Ｃ５７ＢＬ／６マウス内に移植された被包化ブタ異種膵島の拒絶を、有意に遅延させる（ｐ＝０．０３８９、ログ・ランク検定）。対照群および実験群：Ｃａ−ＬＶＭカプセル、Ｃａ−ＬＶＭ−１０ｎｇ／ｍｌ  ＣＸＣＬ１２カプセル、Ｃａ−ＬＶＭ−１００ｎｇ／ｍｌ  ＣＸＣＬ１２カプ��ル（ｎ＝６）、Ｃａ−ＬＶＭ−１μｇ／ｍｌ  ＣＸＣＬ１２カプセル（＊ｐ＜０．０１）（群サイズ＝６）（ゲーハン−ブレスロウ−ウィルコクソン検定）。
【図７Ａ−７Ｇ】ＣＸＣＬ１２に対するＴ細胞サブ集団の遊走行動を示す図である。図７Ａおよび図７Ｃは、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の遊走応答を示す棒グラフである。図７Ｂおよび図７Ｄは、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ  Ｔ細胞の遊走応答を示す棒グラフである。ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１２を用いて被覆された膵島（Ｉ−ＣＸＣＬ１２）、およびＣＸＣＬ１２を用いて被包された膵島（Ｅ−ＣＸＣＬ１２）への応答の際の、細胞遊走応答を定量した。ＣＸＣＬ１２は、３つのセット全てにおいて、およそ１μｇ／ｍＬの濃度で使用した。ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ  Ｔ細胞は、およそ１μｇ／ｍＬのＣＸＣＬ１２（Ｍ／ＣＸＣＬ１２）と、ＣＸＣＬ１２を用いて被覆または被包された膵島とに対し、低いレベルの化学走性を受けた。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＸＣＬ１２被覆された膵島に応答して、化学反発（ｆｕｇｅｔａｘｉｓ）または化学反発（ｃｈｅｍｏｒｅｐｕｌｓｉｏｎ）を受けたが、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ  Ｔ細胞は化学反発または化学反発を受けなかった。最小レベルの化学走性と化学反発の両方が、ＣＸＣＬ１２を用いて被覆されていない膵島（Ｉ−Ｃｏｎｔ）に曝露されたＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ  Ｔ細胞について検出された。（ｎｓ＝有意ではない、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、スチューデントのｔ検定）。これらの異なる遊走応答を説明するために、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞上のＣＸＣＲ４発現を比較した。図７Ｅは、ＣＤ８＋Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞に用いるゲートストラテジーの例である。図７Ｆは、ＣＸＣＲ４発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示すプロットである。ＣＸＣＲ４を発現する各集団のパーセンテージを計算し、代表的なヒストグラムが図７Ｇである。図７Ｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞とを比較して、Ｔｒｅｇ細胞による発現の増加を示す（ｐ＜０．０００１、スチューデントのｔ検定）。
【図８】カルシウム架橋された３．３％アルギン酸被包体内のＣＸＣＬ１２保持の、インビトロでの経時のカイネティクスを示す線グラフである。架橋されていないアルギン酸ナトリウム中のＣＸＣＬ１２の濃度は、１μｇ／ｍＬ（ｎ＝３）であった。１．５％から３．３％のアルギン酸濃度についてのＣＸＣＬ１２放出のプロファイルに違いはなかった（データ示さず）。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
［定義］
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。相反する場合には、本願を、定義を含めて優先するものとする。
【００３２】
本明細書で使用される「アルギン酸（ａｌｇｉｎａｔｅ）」という用語は、アルギン酸（ａｌｇｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）としても知られ、概して、少なくとも２つのウロン糖を含む炭水化物ポリマー（例えば多糖類）を指す。
【００３３】
「同種の」という用語は、同じ種に属するかまたは同じ種から得られることを意味する。
【００３４】
「同種移植の」という用語は、同じ種から得られる細胞または組織の移植を指す。
【００３５】
「異種の」という用語は、異なる種に属するかまたは異なる種から得られることを意味する。
【００３６】
「異種移植の」という用語は、異なる種から得られる細胞または組織の移植を指す。
【００３７】
「エフェクターＴ細胞」という用語は、サイトカインを放出することによって特異的な免疫応答を上乗せすることが可能な、分化したＴ細胞を指す。
【００３８】
「制御性Ｔ細胞」という用語は、抗原に対するＢ細胞のまたは他のＴ細胞の免疫応答を低減または抑制するＴ細胞を指す。
【００３９】
「ＣＸＣＬ１２またはＳＤＦ−１ポリペプチド」とは、ＣＸＣＬ１２特異的な抗体に結合し、化学走性または化学反発活性を有するタンパク質またはその断片を意味する。化学走性または化学反発活性は、Ｔ細胞の遊走する方向（例えば、目的の作因へ向かうのかまたは離れるのか）をアッセイすることによって決定される。例えば、Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０００，６：５４３−８を参照されたい。
【００４０】
「対象」は、脊椎動物であり、ヒト、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ）および家畜（ｆａｒｍ）動物、および動物園、スポーツまたはペット動物を含めた哺乳綱の任意のメンバーを含み、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシや高等霊長類などである。
【００４１】
本明細書で使用されるとき、「治療する」、「治療している」、「治療」などは、障害および／またはそれに関連がある症状を低減または改善することを指す。症状または状態を治療することは、それに関連がある障害、状態または症状を完全に排除することを、除外はしないものの要求もしないことを理解されたい。
【００４２】
本開示では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法中でそれらが帰する意味を有することができ、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」など、「本質的になっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」は、同様に、米国特許法中でそれらに付与される意味を有することができ、当該用語は、オープンエンドであり、記載される基本的なまたは新規の特徴が、記載されるものよりも多くの存在によって変わらない限り、記載されるものよりも多くが存在してもよいが、先行技術の実施形態は除外する。
【００４３】
本開示を通じて文脈上、別の定義が現れる。
【００４４】
［本発明の組成物および方法］
本発明の組成物は、少なくとも１つの細胞を被包したＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスを目的とする。
【００４５】
ＣＸＣＬ１２ポリペプチドは、当技術分野に公知である。例えば、Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０００，６：５４３−８を参照されたい。ＣＸＣＬ１２およびＳＤＦ−１という用語は、互換的に使用される場合があることに留意されたい。一実施形態では、ＣＸＣＬ１２ポリペプチドは、ＮＰ＿００１０２９０５８と少なくとも約８５％、９０％、９５％または１００％のアミノ酸配列同一性を有し、ケモカインまたは化学反発活性を有する。例示的なＳＤＦ−１のアイソフォームを表１に示す（下記）。
【００４６】
【表１】
0006538042.tif 000002
【００４７】
別の実施形態では、例示的なＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１ポリペプチドの配列は、
mnakvvvvlvlvltalclsdgkpvslsyrcpcrffeshvaranvkhlkilntpncalqivarlknnnrqvcidpklkwiqeylekalnkg rreekvgkkekigkkkrqkkrkaaqkrkn
である。
【００４８】
さらに別の実施形態では、ＣＸＣＬ１２ポリペプチドは、ＣＸＣＬ１２アイソフォームデルタポリペプチドと、少なくとも約８５％、９０％、９５％または１００％のアミノ酸配列同一性を有し、ケモカイン活性または化学反発活性を有する。例示的なＣＸＣＬ１２アイソフォームデルタポリペプチドの配列は、
MNAKVVVVLVLVLTALCLSDGKPVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNRQVCIDPKLKWIQEYLEKALNNLISAAPAGKRVIAGARALHPSPPRACPTARALCEIRLWPPP EWSWPSPGDV
である。
【００４９】
ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスは、例えば、ＣＸＣＬ１２ポリペプチドを少なくとも約１．０ｎｇ／ｍＬ／時、例えば約１．０ｎｇ／ｍＬ／時から約３ｎｇ／ｍＬ／時の間の速さで放出することを特徴とする。具体的な実施形態では、ＣＸＣＬ１２ポリペプチドは、約１．７５ｎｇ／ｍＬ／時の速さで放出される。ＣＸＣＬ１２ポリペプチドは、マトリックスに、少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で、例えば約１００ｎｇ／ｍＬから約１μｇ／ｍＬの濃度で存在する。具体的な実施形態では、ＣＸＣＬ１２ポリペプチドは、マトリックスに、約１００ｎｇ／ｍＬから約１μｇ／ｍＬの濃度で、約３カ月から約２年の間存在する。濃度、放出の速さ、および期間は、選択された細胞の型および治療される障害によって変わることになり、適切なパラメーターの選択は、当業者に公知であるかまたは明らかであろう。概して、ＣＸＣＬ１２ポリペプチドは、特定の解剖学的部位からエフェクターＴ細胞を退けるのに充分な速さで放出される。ＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスがエフェクターＴ細胞を退ける能力は、Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１０９，１１０１（２００２）に以前に報告されているように、ボイデンチャンバーアッセイを使用して、インビトロで評価されうる。
【００５０】
溶出マトリックスは、被包化された細胞に対し不活性である（すなわち、細胞シグナリングを刺激または抑制しない）当技術分野に公知の生体適合性ポリマーを含み得、溶出されるＣＸＣＬ１２ポリペプチドおよび検知される分子（例えばグルコース）が透過できる。マトリックス厚は、約２００〜約５００ミクロンであり、具体的な実施形態では、細胞の周りにカプセルを形成する。生体適合性ポリマーは、生体分解性でも非分解性でもありうる。生体適合性ポリマーは、炭水化物ベース、タンパク質ベース、および／または合成されたもの、例えばＰＬＡでありうる。マトリックスに使用するのに適した生体適合性材料は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリグリセロールセバケート（ＰＧＳ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ−Ｌ−乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリ−Ｄ−乳酸（ＰＤＬＡ）、ポリグリコリド、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリラクチド−コグリコリド（ＰＬＧＡ）、ポリジオキサノン、ポリグルコネート、ポリ乳酸−ポリエチレンオキシドコポリマー、修飾セルロース、コラーゲン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシプロピオン酸、ポリホスホエステル、ポリ（アルファ−ヒドロキシ酸）、ポリカプロラクトン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリ無水物、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、分解性ウレタン、脂肪族ポリエステルポリアクリレート、ポリメタクリレート、アシル置換セルロースアセテート、非分解性ポリウレタン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリビニルイミダゾール、クロロスルホン化ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ナイロンシリコン、ポリ（スチレン−ブロック−ブタジエン）、ポリノルボルネン、およびハイドロゲルが挙げられるが、これらに限定されない。他の適切なポリマーは、Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）を参照することによって得ることができる。これらのポリマーの組合せもまた使用されてもよい。
【００５１】
一実施形態では、本発明のＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスは、中皮細胞など、ＣＸＣＬ１２ポリペプチドを発現する第２の細胞の層をさらに含む。別の実施形態では、マトリックスの外層は、ＣＸＣＬ１２ポリペプチドの吸収性層をさらに含む。
【００５２】
一実施形態では、溶出マトリックスは、アルギン酸［例えばアルギン酸（ａｌｇｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）］を含み、概して、少なくとも２つのウロン糖を含む炭水化物ポリマー（例えば多糖類）を指す。ウロン糖としては、マンヌロン酸塩［またはマンヌロン酸（ｍａｎｎｕｒｏｎａｔｅ）］、グルロン酸塩［またはグルロン酸（ｇｕｌｕｒｏｎａｔｅ）］、および／またはそれらの異性体を挙げることができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アルギン酸は、マンヌロン酸、グルロン酸および／またはそれらの異性体を含む線状の炭水化物ポリマー（例えば多糖類）でありうる。いくつかの実施形態では、アルギン酸は、マンヌロン酸、グルロン酸および／またはそれらの異性体の炭水化物コポリマーでありうる。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、「異性体」という用語は、同じ分子式であるが構造が異なる化合物を指す。立体配置および／または立体配座のみが異なる異性体を、「立体異性体」という。「異性体」という用語はまた、エナンチオマーを指すのにも使用される。「エナンチオマー」という用語は、互いに鏡像であり重ね合わせられない分子異性体の対の片方を表すのに使用される。エナンチオマーを示すまたは言及するのに使用される他の用語としては、「立体異性体」（キラル中心の周囲の異なる配置および立体化学に起因しており、全てのエナンチオマーは立体異性体であるが、全ての立体異性体がエナンチオマーである訳ではない）または「光学異性体」（純粋なエナンチオマーの光学活性に起因しており、この活性は、異なる純粋なエナンチオマーが異なる方向に平面偏光を回転させる能力である）が挙げられる。エナンチオマーは、概して、融点や沸点など、同一の物理的特性を有し、同一の分光特性をも有する。エナンチオマーは、平面偏光を伴う相互作用について、および生物活性について、互いに異なりうる。したがって、いくつかの実施形態では、マンヌロン酸塩［またはマンヌロン酸（ｍａｎｎｕｒｏｎａｔｅ）］は、β−Ｄ−マンヌロン酸を含みうる。いくつかの実施形態では、グルロン酸塩［またはグルロン酸（ｇｕｌｕｒｏｎａｔｅ）］は、アルファ−Ｌ−グルロン酸を含みうる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、アルギン酸は、マンヌロン酸の少なくとも１つまたは複数のホモポリマー領域（Ｍブロック）、グルロン酸の少なくとも１つまたは複数のホモポリマー領域（Ｇブロック）、マンヌロン酸およびグルロン酸の少なくとも１つまたは複数の変更された構造（ＭＧブロックまたはＧＭブロック）を含む、ブロックポリマーでありうる。
【００５５】
これらのブロックの比、配分および／または長さは、部分的には、アルギン酸ゲルの化学的および／または物理的特性を決定しうる。例えば、アルギン酸ポリマー中のＧモノマーおよびＭモノマーの相対含量は、例えば、以下に限定されないが、孔径、安定性および生体分解性、ゲル強度およびアルギン酸ゲルの弾力性に影響を及ぼしうる。理論に拘束されることを望むものではないが、アルギン酸中でＭ含量に対してＧ含量が低いほど、概して、いっそう生体適合性のあるゲルを生じうる。高いＧ含量のアルギン酸を有したゲルであるほど、概して、いっそう高いＭ含量のアルギン酸を有するゲルよりも大きな孔径および／または強いゲル強度を有し得、そのようなＭ含量は、いっそう小さい孔径と低いゲル強度とを有する。いくつかの実施形態では、アルギン酸マトリックスの１つまたは複数のアルギン酸ポリマーは、少なくとも約１０ｗｔ％、少なくとも約２０ｗｔ％、少なくとも約３０ｗｔ％、少なくとも約４０ｗｔ％、少なくとも約５０ｗｔ％、少なくとも約６０ｗｔ％、少なくとも約７０ｗｔ％、少なくとも約８０ｗｔ％、少なくとも約９０ｗｔ％またはそれを超えるＭブロック含量を含みうる。いくつかの実施形態では、アルギン酸マトリックスの１つまたは複数のアルギン酸ポリマーは、少なくとも約１０ｗｔ％、少なくとも約２０ｗｔ％、少なくとも約３０ｗｔ％、少なくとも約４０ｗｔ％、少なくとも約５０ｗｔ％、少なくとも約６０ｗｔ％、少なくとも約７０ｗｔ％、少なくとも約８０ｗｔ％、少なくとも約９０ｗｔ％またはそれを超えるＧブロック含量を含みうる。いくつかの実施形態では、アルギン酸マトリックスの１つまたは複数のアルギン酸ポリマーは、少なくとも約１０ｗｔ％、少なくとも約２０ｗｔ％、少なくとも約３０ｗｔ％、少なくとも約４０ｗｔ％、少なくとも約５０ｗｔ％、少なくとも約６０ｗｔ％、少なくとも約７０ｗｔ％、少なくとも約８０ｗｔ％、少なくとも約９０ｗｔ％またはそれを超えるＧＭブロックおよび／またはＭＧブロック含量を含みうる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、アルギン酸マトリックスの１つまたは複数のアルギン酸ポリマーは、約０．０１から約１００、または約０．１から約５０、または約０．５から約２５、または約１から約２０のグルロン酸とマンヌロン酸との比（Ｍ／Ｇ）を含みうる。いくつかの実施形態では、アルギン酸マトリックスの１つまたは複数のアルギン酸ポリマーは、約１から約１００、または約１から約５０、または約１から約２５、または約１から約２０、または約１から約１０、または約１から約５のＭ／Ｇ比を有しうる。
【００５７】
いくつかの実施形態では、アルギン酸マトリックスの１つまたは複数のアルギン酸ポリマーは、１．５を超えないかまたは１を超えないグルロン酸とマンヌロン酸との比（Ｇ／Ｍ）を含みうる。例えば、いくつかの実施形態では、アルギン酸マトリックスの１つまたは複数のアルギン酸ポリマーは、約１．５のＧ／Ｍ比を有しうる。いくつかの実施形態では、アルギン酸マトリックスの１つまたは複数のアルギン酸ポリマーは、約１のＧ／Ｍ比を有しうる。いくつかの実施形態では、アルギン酸マトリックスの１つまたは複数のアルギン酸ポリマーは、約１．５未満のＧ／Ｍ比を有し得、そのような比としては例えば、１．４未満、１．３未満、１．２未満、１．１未満、１．０未満、０．９未満、０．８未満、０．７未満、０．６未満、０．５未満、０．４未満、０．３未満、０．２未満、０．１未満、０．０５未満、０．０１未満、０．００７５未満、０．００５未満、０．００１未満、またはそれよりも低いものが挙げられる。いくつかの実施形態では、アルギン酸マトリックスの１つまたは複数のアルギン酸ポリマーは、約１未満のＧ／Ｍ比を有し得、そのような比としては例えば、０．９未満、０．８未満、０．７未満、０．６未満、０．５未満、０．４未満、０．３未満、０．２未満、０．１未満、０．０５未満、０．０１未満、０．００７５未満、０．００５未満、０．００１未満、０．０００１未満またはそれよりも低いものが挙げられる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、アルギン酸マトリックスの１つまたは複数のアルギン酸ポリマーは、少なくとも約１．５またはそれを超えるグルロン酸とマンヌロン酸との比（Ｇ／Ｍ）を含みうる。例えば、いくつかの実施形態では、アルギン酸マトリックスの１つまたは複数のアルギン酸ポリマーは、約１．５のＧ／Ｍ比を有しうる。いくつかの実施形態では、アルギン酸マトリックスの１つまたは複数のアルギン酸ポリマーは、約１．５を超えるのＧ／Ｍ比を有し得、そのような比としては例えば、２を超える、２．５を超える、３を超える、３．５を超える、４を超える、４．５を超える、５を超える、６を超える、７を超える、８を超える、９を超える、１０を超える、１５を超える、２０を超える、３０を超える、４０を超える、５０を超える、６０を超える、７０を超える、８０を超える、９０を超える、１００を超える、またはそれよりも高いものが挙げられる。
【００５９】
アルギン酸ポリマーの平均分子量は、例えばゲル化時間、孔径、ゲル強度および／またはゲルの弾力性に影響を及ぼしうる。アルギン酸ポリマーは、約２ｋＤａから１００００ｋＤａに及ぶ平均分子量を有しうる。理論に拘束されることを望むものではないが、低い分子量のアルギン酸ポリマーであるほど、概していっそう生体分解され易いゲルを生じうる。いくつかの実施形態では、アルギン酸マトリックスのアルギン酸ポリマーは、約５ｋＤａから約１０，０００ｋＤａ、または約１０ｋＤａから約５０００ｋＤａ、または約２５ｋＤａから約２５００ｋＤａ、または約５０ｋＤａから約１０００ｋＤａ、または約５０ｋＤａから約５００ｋＤａ、または約５０ｋＤａから約２５０ｋＤａの平均分子量を有しうる。いくつかの実施形態では、アルギン酸マトリックスのアルギン酸ポリマーは、約５ｋＤａから約３５０ｋＤａの平均分子量を有しうる。いくつかの実施形態では、アルギン酸マトリックスのアルギン酸ポリマーは、約２ｋＤａから約１００ｋＤａの平均分子量を有しうる。いくつかの実施形態では、アルギン酸マトリックスのアルギン酸ポリマーは、約５０ｋＤａから約５００ｋＤａの平均分子量を有しうる。いくつかの実施形態では、アルギン酸マトリックスのアルギン酸ポリマーは、約５０ｋＤａから約３００ｋＤａの平均分子量を有しうる。いくつかの実施形態では、アルギン酸マトリックスのアルギン酸ポリマーは、約７５ｋＤａから約２００ｋＤａの平均分子量を有しうる。いくつかの実施形態では、アルギン酸マトリックスのアルギン酸ポリマーは、約７５ｋＤａから約１５０ｋＤａの平均分子量を有しうる。いくつかの実施形態では、アルギン酸マトリックスのアルギン酸ポリマーは、約１５０ｋＤａから約２５０ｋＤａの平均分子量を有しうる。いくつかの実施形態では、アルギン酸マトリックスのアルギン酸ポリマーは、約１００ｋＤａから約１０００ｋＤａの平均分子量を有しうる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、アルギン酸マトリックスのアルギン酸ポリマーは、７５ｋＤａ未満の平均分子量を有しうる。いくつかの実施形態では、アルギン酸マトリックスのアルギン酸ポリマーは、少なくとも約７５ｋＤａ、少なくとも約８０ｋＤａ、少なくとも約９０ｋＤａ、少なくとも約１００ｋＤａ、少なくとも約１１０ｋＤａ、少なくとも約１２０ｋＤａ、少なくとも約１３０ｋＤａ、少なくとも約１４０ｋＤａ、少なくとも約１５０ｋＤａ、少なくとも約１６０ｋＤａ、少なくとも約１７０ｋＤａ、少なくとも約１８０ｋＤａ、少なくとも約１９０ｋＤａ、少なくとも約２００ｋＤａ、少なくとも約２５０ｋＤａ、少なくとも約３００ｋＤａ、またはそれを超える平均分子量を有しうる。
【００６１】
一実施形態では、アルギン酸マトリックスのアルギン酸ポリマーは、約１のグルロン酸とマンヌロン酸との比（Ｇ／Ｍ）である約７５ｋＤａから約２００ｋＤａの平均分子量を有する。一実施形態では、アルギン酸マトリックスのアルギン酸ポリマーは、１未満のグルロン酸とマンヌロン酸との比（Ｇ／Ｍ）である約７５ｋＤａから約２００ｋＤａの平均分子量を有する。
【００６２】
限定がなければ、分子量は、ピーク平均分子量（Ｍｐ）、数平均分子量（Ｍｎ）、または重量平均分子量（Ｍｗ）でありうる。
【００６３】
アルギン酸は、任意の供給源を由来としうるおよび／または当技術分野に認識されている任意の方法によって製造されうる。いくつかの実施形態では、アルギン酸は、海藻またはケルプの茎および／または葉を由来とする。いくつかの実施形態では、海藻は、緑藻［クロロフィタ（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）］、褐藻［ファエオフィタ（Ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）］、紅藻［ロドフィタ（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）］、またはそれらの組合せを由来とする。海藻またはケルプの例としては、コンブ属（Ｌａｍｉｎａｒｉａ）［例えば、以下に限定されないが、ラミナリア・ヒペルボレア（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｈｙｐｅｒｂｏｒｅａ）、ラミナリア・ディジタータ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｄｉｇｉｔａｔａ）およびマコンブ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）］、レソニア・ニグレッセンス（Ｌｅｓｓｏｎｉａ  ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）、レソニア・トラベクラタ（Ｌｅｓｓｏｎｉａ  ｔｒａｂｅｃｕｌａｔａ）、ダービリア・アンタークティカ（Ｄｕｒｖｉｌｌａｅａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、エクロニア・マキシマ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ  ｍａｘｉｍａ）、マクロイスティス・フィリフェラ（Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ｐｙｒｉｆｅｒａ）、アスコフィラム・ノドサム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｏｓｕｍ）の様々な型、およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
いくつかの実施形態では、アルギン酸は、細菌のアルギン酸であり得、例えば、バクテリアを使用した微生物発酵によって製造される。アルギン酸製造に使用することのできる細菌の例としては、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）［例えばシュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）］およびアゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）［例えばアゾトバクター・ビネランディ（Ａｚｏｂａｃｔｅｒ  Ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）］が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、該細菌は、アルギン酸に類似の構造を有する多糖類ポリマーを製造することができ、該ポリマーは、例えば、Ｃ２およびＣ３の水酸基部分にアセチル基を有する点で異なる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、アルギン酸は修飾されうる。いくつかの実施形態では、アルギン酸は化学修飾されうる。例えば、化学修飾されたアルギン酸は、アルギン酸プロピレングリコール（ＰＧＡ）でありうる。いくつかの実施形態では、ＰＧＡは、部分的に中和されたアルギン酸を、加圧下で酸化プロピレンガスに接触させることによって作製されうる。酸化プロピレンは、アルギン酸と発熱反応して、混合１級／２級エステルを形成しうる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、アルギン酸は、臨床グレード、例えばインビボでの使用に適したグレードでありうる。いくつかの実施形態では、アルギン酸は、細胞の被包に使用する前に精製されうる。Ｍａｌｌｅｔ  ａｎｄ  Ｋｏｒｂｕｔｔ，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ａ．２００９．１５（６）：１３０１−１３０９を参照されたい。いくつかの実施形態では、アルギン酸は、低量のエンドトキシンを含む。例えば、アルギン酸中に、エンドトキシンは、１５０ＥＵ／グラム以下、１００ＥＵ／グラム以下、７５ＥＵ／グラム以下、５０ＥＵ／グラム以下、２５ＥＵ／グラム以下、２０ＥＵ／グラム以下、１０ＥＵ／グラム以下、５ＥＵ／グラム以下、１ＥＵ／グラム以下、０．５ＥＵ／グラム以下、０．１ＥＵ／グラム以下の量で存在してよい。
【００６７】
当技術分野に認識されている任意のアルギン酸が、本明細書に記載の様々な態様の方法に際して使用されうる。本明細書に記載の組成物に使用されうるアルギン酸の例としては、限定なく、アルギン酸ナトリウム（アルギン酸のナトリウム塩）、アルギン酸カリウム（アルギン酸のカリウム塩）、アルギン酸カルシウム、アルギン酸マグネシウム、アルギン酸トリエタノールアミン、ＰＧＡ、およびそれらの任意の組合せが挙げられる。いくつかの実施形態では、可溶性のアルギン酸は、一価の塩の形態であり得、そのような塩としては、限定なく、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウムおよびアルギン酸アンモニウムが挙げられる。いくつかの実施形態では、アルギン酸は、アルギン酸カルシウムでありうる。一実施形態では、アルギン酸カルシウムは、アルギン酸ナトリウムから作製され、そこからナトリウム塩が除去され、カルシウムに置換されている。国際特許出願公開ＷＯ２００７／１４０３１２、ＷＯ２００６／０５１４２１、ＷＯ２００６／１３２６６１およびＷＯ１９９１／００７９５１、ならびに米国特許第８，４８１，６９５号に記載されているおよび／またはそれに記載の方法によって製造されるアルギン酸もまた、本明細書に記載の様々な態様の組成物および方法にて使用されうる。いくつかの実施形態では、市販のアルギン酸、例えばＦＭＣ  ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒおよびＮｏｖａｍａｔｒｉｘから入手されるものもまた、本明細書に記載の様々な態様の組成物および方法にありうる。
【００６８】
アルギン酸は、概して、二価イオンおよび／または三価イオンの存在下で、ゲルマトリックスを形成する。アルギン酸ゲルを形成するのに使用することができる二価および三価のイオンの非制限的な例としては、カルシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオン、銅イオン、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、コバルトイオン、鉛イオン、鉄イオン、アルミニウムイオン、およびそれらの任意の組合せが挙げられる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、アルギン酸マトリックスは、共有結合で架橋されうる。アルギン酸を共有結合で架橋するのに使用することができる共有結合架橋剤の例としては、カルボジイミド類、酸化アリルハライド類、ジアルデヒド類、ジアミン類およびジイソシアネー類が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
本発明の溶出マトリックス製剤としては、注射、点滴または移植（皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮膚内、非経口、直腸、および／もしくは膣内など）、吸入、経口／経鼻または局所投与に適したものが挙げられる。製剤は、単位剤形で簡便に供されてもよく、薬学の技術分野に公知の任意の方法によって調製されてもよい。剤形に組み合わせることのできるＣＸＣＬ１２ポリペプチドの量は、治療される宿主、具体的な投与方式、例えば注射または移植に応じて、変わることになる。本発明の製剤は、医薬品製造のための技術分野に公知の任意の方法に従って調製することができ、甘味剤、着香剤、着色剤および保存剤を含有することができる。製剤は、製造に適した医薬的に許容されうる非毒性の賦形剤と混合されうる。製剤は、１つまたは複数の希釈剤、乳化剤、保存料、緩衝剤、賦形剤などを含んでいてもよく、液体、エマルション、クリーム、ローション、ゲルなどの形態で、パッチ上およびインプラント中において提供されてもよい。
【００７１】
本発明のＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスは、少なくとも１つの細胞を被包する。被包される細胞としては、幹細胞、神経細胞、平滑筋もしくは骨格筋細胞、筋細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、線維筋芽細胞、延性のある細胞や皮膚細胞を含めた外胚葉細胞、肝実質細胞、腎臓細胞、肝細胞、心臓細胞、膵臓細胞、膵島細胞、腸管に存在する細胞、骨芽細胞および骨もしくは軟骨を形成する他の細胞、ならびに造血細胞が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施形態では、該細胞は、インスリン産生細胞であり、膵島細胞など（例えばブタ膵島細胞、ヒト膵島細胞、または幹細胞もしくはｉＰＳ細胞を由来とする膵島細胞）がある。
【００７２】
本発明の溶出マトリックスは、患者内に埋め込まれるかあるいは挿入される、再充填可能なＣＸＣＬ１２ポリペプチドデリバリーデバイスである。例えば、マトリックスは、患者からマトリックスを取り出すことなく細胞を注入または除去することができるように、針またはカテーテルのエントリーポートを備えていてもよい。あるいは、溶出マトリックスは、対象（例えば「感作された対象」）に、関連する免疫拒絶を生じることなく繰り返し投与することができる。
【００７３】
本発明のＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスは、自己免疫疾患の治療に有用であり、そのような自己免疫疾患としては、リウマチ性関節炎、インスリン依存性糖尿病、溶血性貧血、リウマチ熱、クローン病、ギラン・バレー症候群、乾癬、甲状腺炎、グレーブス病、重症筋無力症、糸球体腎炎、自己免疫性肝炎および全身性エリテマトーデスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
一実施形態では、本発明のＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスは、糖尿病の治療に使用するために、膵島細胞を用いて製剤化されうる。糖尿病は、身体が充分なインスリンを産生しないか、産生されたインスリンに身体の細胞が適正に応答しないためのどちらかの結果として、人間が高い血糖（グルコース）レベルを有する状態である。健康な人では、血中グルコースレベルは、主にホルモンインスリンの作用によって、狭い範囲内に維持される。インスリンは、循環グルコース濃度に応答して、適切な速さで膵臓のベータ細胞から放出され、その応答は、他の循環栄養素、膵島の神経支配ホルモンおよびインクレチンホルモンを含めた他の要因によって調節される。インスリンは、グルコースクリアランスの速さに合うように、肝臓のグルコース放出の速さを制限することによって、グルコース濃度を維持する。
【００７５】
このように、インスリンは、身体の細胞がグルコースを吸収して、エネルギーに変換できるようにする。身体の細胞がグルコースを吸収しない場合、グルコースが血中に蓄積し（高血糖症）、潜在的な様々な医学的合併症につながる。したがって、糖尿病は、血中グルコースが増加して、適正に制御されない場合に、結果として循環器疾患、腎不全、網膜症や神経障害など、二次的な合併症を生じることを特徴とする。
【００７６】
２つの主要な病態生理は、血糖の増加に関係がある。第１は、膵臓のインスリン産生ベータ細胞（１型糖尿病）に対する自己免疫攻撃であり、一方、第２は、ベータ細胞機能の不足および末梢インスリン抵抗性の増加（２型糖尿病）に関連がある。１型と同様に、ベータ細胞の死もまた２型糖尿病において観察される。１型およびしばしば２型糖尿病は、インスリンを注射するための人間を必要とする。
【００７７】
１型ＤＭは、典型的には、膵臓のランゲルハンス膵島のインスリン産生ベータ細胞を喪失し、インスリン欠乏をもたらすことを特徴とする。この糖尿病の型は、免疫媒介性または特発性にさらに分類することができる。１型糖尿病の大部分が、免疫媒介性であって、ベータ細胞の喪失は、Ｔ細胞媒介性の自己免疫攻撃による。２型のＤＭは、インスリン耐性と組み合わされたベータ細胞の機能不全を特徴とする。インスリンに対する身体組織の応答性が損なわれるのには、インスリン受容体が関係すると考えられている。１型糖尿病と同様に、ベータ細胞の量が不十分であることもまた、多くの２型糖尿病患者での病因である。２型糖尿病の早期の段階では、高血糖症は、インスリン分泌を向上させ、肝臓によるグルコース産生を低減する種々の処置および投薬によって回復させることができる。疾患が進行するとき、インスリン分泌の機能障害が発生し、ある患者では、時に、インスリンを治療的に代替する必要が生じることがある。
【００７８】
制御性Ｔ細胞は、胸腺を起源とするＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットであり、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、寛容の維持に重要な役割を果たすことが一般に知られている。制御性Ｔ細胞は、免疫調節に活発に関与し、移植拒絶の自己免疫応答を抑制する［Ｃ．Ａ．Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｏ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ４３，３９５（Ｓｅｐ，２００８）；Ｇ．Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １５３，６０（Ｆｅｂ，２００９）；Ｋ．Ｊ．Ｗｏｏｄ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ４３，２１３５（Ｊｕｌ−Ａｕｇ，２０１１）およびＧ．Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ８６，５７８（Ａｕｇ  ２７，２００８）］。制御性Ｔ細胞は、マウスの自己免疫性糖尿病を防ぎ、移植された膵島の免疫反応による破壊を制御する［Ｍ．Ｊ．Ｒｉｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ７，ｅ３１１５３（２０１２）およびＤ．Ｒ．Ｔｏｎｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８１，４５１６（Ｏｃｔ  １，２００８）］。膵島移植は、糖尿病に治効がある可能性があるアプローチともいえるが、以前の膵島移植の研究では、移植された膵島の免疫媒介性拒絶のために、全身免疫抑制は、長期にわたる血中グルコースレベルの制御を達成することができなかった。移植される膵島を被包しているマトリックス内へＣＸＣＬ１２を組み込むことによって、細胞媒介性および体液性の抗膵島免疫に対し、物理的障壁および生物学的障壁の両方をもたらす。ＣＸＣＬ１２ポリペプチドは、全身性の免疫抑制の必要性を低減または排除する一方で、エフェクターＴ細胞を退け、免疫抑制性の制御性Ｔ細胞を動員する。したがって、一実施形態では、本発明のＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスは、免疫抑制を付随することなく、膵臓細胞、具体的にはベータ細胞を欠損した患者の膵臓の少なくとも一部分を（部分的または全ての）再生させ、代替しまたは置換えるのに有用である。膵臓がインスリンを充分にまたは全く産生しない任意の患者が、そのような療法から恩恵を受けることがある。不十分なインスリン産生には、正常な（健康な）対象と比べてさらに低いレベルのインスリンの産生が含まれるだけでなく、正常な（健康な）対象に比肩しうるインスリンレベルを産生するものの、例えば、インスリン耐性、過剰な摂食、病的な肥満などに起因して高いインスリンレベルを必要とする患者も含まれる。
【００７９】
本発明のＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスは、制御性Ｔ細胞を選択的に動員し、それによって、埋め込まれたマトリックスの存続が延長し、感作された宿主においてすら、免疫による破壊からの保護がもたらされる。したがって、本発明のＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスは、回収可能であり、所望に応じて、免疫系拒絶を生じることなく繰り返し投与することができる。さらに、本発明のＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスは、膵島の生存の持続と、被包化された膵島からの継続的なＣＸＣＬ１２ポリペプチドの産生とを、少なくとも約１カ月から約２年の間もたらす。この間に、対象の血清グルコース濃度は、約８０ｍｇ／ｄＬから約１２０ｍｇ／ｄＬの間の血中レベルに維持される。したがって、本発明のＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスは、糖尿病の治療の際に特に有用である。
【００８０】
具体的な実施形態では、糖尿病を治療する際に使用するためのＣＸＣＬ１２ポリペプチド溶出マトリックスは、約１．５から約２％ｗ／ｖの高マンヌロン酸のカルシウム架橋アルギン酸塩と、約１００ｎｇ／ｍＬから約１μｇ／ｍＬのＣＸＣＬ１２ポリペプチドと、少なくとも１つの膵島細胞とを含み、そこでは、ＣＸＣＬ１２ポリペプチドが、約１．０ｎｇ／ｍＬ／時から約３ｎｇ／ｍＬ／時の間の速さで放出される。例示的な被包化の手順は、ドナーの膵島細胞を２ｍＬの濾過ジチゾン／ＰＢＳに混和することによる、膵島細胞の調製に始まる。８０ｍｇのアルギン酸−ＬＶＭ（Ｐｒｏｎｏｖａ  ＵＰ  ＬＶＭ  アルギン酸ナトリウム）を、５ｍＬの３００ミリオスモのＮａＣｌに溶解するまで混和する。約８００個から約１０００個の膵島をｃＲＰＭにて３００ｒｐｍ×Ｇで３分間、スピンダウンし、ＤＭＥＭに再懸濁して、３００ｒｐｍ×Ｇで３分間、再度スピンダウンする。１ｍＬのシリンジを使用して、０．７５ｍＬのアルギン酸を膵島に混和することができる。アルギン酸および膵島は、１８ｇの針を使用して６０ｍＬのシリンジ内に充填することができる。電圧を最大（例えば１．２１ｋＶ）に設定し、周波数を１５００に設定し、かつ振幅を最大に設定した被包化装置内に、充填されたシリンジを配置する。被包化した後に、カプセルを３００ミリオスモのＣａＣｌ２中で約５分間撹拌し、新しいビーカー内にカプセルを濾過し、洗浄してＤＭＥＭを用いて培養する。
【００８１】
本発明は、以下の説明によって追加的に記載され、該説明は、本発明およびその数多くの利点のより良い理解を提供する非限定的な例である。
【００８２】
［実施例］
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態および態様を説明する。関連分野の当業者には、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、様々な改変、添加、置換などを実施することができること、そのような改変および変形が、続く特許請求の範囲に規定されるような本発明の範囲内に包含されることが明らかであろう。以下の実施例は、本発明に何らかの限定を加えるものではない。
【００８３】
膵島移植は、１型糖尿病に治療効果がある可能性があるアプローチといえる。しかし、膵島移植は、概して、移植された膵島の免疫媒介性拒絶を制御するために全身免疫抑制を要し、ヒトの膵島の供給は限られている。以下の実施例は、ケモカインであるＣＸＣＬ１２が、免疫抑制性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を解剖学的部位に動員する一方で、エフェクターＴ細胞を退けることができること、およびＣＸＣＬ１２を用いて被覆または被包しているドナー膵島が、局所的な免疫隔離を誘導し、全身免疫抑制なしで、同種移植片または異種移植片を保護することを示す。以下の実施例では、膵島移植は、インスリン依存性糖尿病のマウスモデルで実施された。ＣＸＣＬ１２を用いた膵島の被覆、またはケモカインであるＣＸＣＬ１２を組み込んだアルギン酸を用いた膵島のマイクロカプセル化によって、同種および異種の膵島の生存および機能の延長、ならびにＴｒｅｇ浸潤の選択的な増加がもたらされた。下記に示すこれらのデータは、全身免疫抑制の必要性を排する一方で、同種または異種の膵島の移植用に局所的な免疫隔離を誘導するための、被覆またはアルギン酸被包体の成分としてのＣＸＣＬ１２の使用を表す。
【実施例１】
【００８４】
＜ＣＸＣＬ１２ポリペプチドを用いた同種膵島の直接被覆＞
この実施例では、移植前にＣＸＣＬ１２ポリペプチドを用いて被覆している同種膵島が、膵島の生存および機能の延長、ならびに移植部位での制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の蓄積をもたらすことができるか否かを決定しようとした。膵島カプセルは、概して、フィブロネクチンを含有し、また、理論に拘束されることを望むものではないが、ＣＸＣＬ１２は、このマトリックスタンパク質に安定に結合すること、およびそこから溶出することのどちらも可能である（１５）。したがって、ＢＡＬＢ／Ｃマウス由来の膵島を、緩衝溶液（例えばＰＢＳ）に曝露するか、または約１００ｎｇ／ｍＬもしくは約１μｇ／ｍＬの濃度のＣＸＣＬ１２を用いて被覆し、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処置した糖尿病Ｃ５７ＢＬ／６マウスの左腎被膜下に移植した。＞２５０ｍｇ／ｄＬの血中グルコースが２回連続して記録される糖尿病状態に戻った時点で、マウスを屠殺した。およそ１μｇ／ｍＬのＣＸＣＬ１２を用いて被覆された同種の膵島移植片は、ＰＢＳのみに曝露された同種膵島と比べて有意に長い時間にわたって、非糖尿病状態のレシピエントマウスの維持をもたらした（ｐ＝０．０１２、カプラン−マイヤー・ログ・ランク検定）（図１Ａ）。１００ｎｇ／ｍＬのＣＸＣＬ１２ポリペプチドを用いて被覆された膵島は、ＰＢＳ曝露された膵島と同等の速さで拒絶された（ｐ＝０．３１）。移植片内への単核細胞の浸潤は、約１μｇ／ｍＬでＣＸＣＬ１２被覆を行った場合、ＰＢＳ対照と比べて減少した（図１Ｂ）。ＰＢＳ処理された同種移植片と比べ、ＣＸＣＬ１２被覆された同種膵島にインスリンが発現し、ＣＸＣＬ１２が存在することも示された（図１Ｂ）。移植片内へのＣＤ３  Ｔ細胞およびＦｏｘＰ３  Ｔ細胞の浸潤を定量した。免疫組織化学によって判定したところ、膵島移植片内へのＣＤ３＋Ｔ細胞の浸潤は、ＣＸＣＬ１２では、ＰＢＳ曝露された同種膵島と比べて有意に減少した（図１Ｃ、ｐ＝０．００１）。さらに、膵島の同種移植片のＣＸＣＬ１２被覆は、ＰＢＳ曝露された同種膵島と比べて、ＣＸＣＬ１２被覆された移植片内またはその周囲におけるＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の浸潤の有意な増加を伴った（図１Ｄ、ｐ＝０．００１６）。
【実施例２】
【００８５】
＜ＣＸＣＬ１２被覆と低用量シクロスポリンＡとの同時使用＞
次に、全身免疫抑制を、例えば、低用量のシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）（例えばおよそ２ｍｇ／ｋｇ）処置の形で同時に使用することによって、ＣＸＣＬ１２被覆された同種膵島の生存を高めることができるか否かを決定しようとした。ＣＸＣＬ１２被覆のみだと、ＰＢＳ曝露された対照と比べて同種膵島の生存が延長されることがこれらの実験で示されたが（ｐ＝０．０２４５）、低用量のＣｓＡ処置と組み合わせたＣＸＣＬ１２被覆では、膵島の生存の延長は認められなかった。したがって、ＣＸＣＬ１２被覆とＣｓＡ処置とを組み合わせた結果、ＣＸＣＬ１２被覆のみと比べて膵島の生存の減少を生じる可能性がある（ｐ＝０．０４６）（図２Ａ）。膵島の生存についての対照群と実験群との間の有意な差は、移植後２３日目まで示された。ＣＸＣＬ１２被覆に加えてＣｓＡ処置された動物では、ＣＸＣＬ１２被覆のみ（ｐ＝０．０００２）またはＣｓＡ処置のみ（ｐ＝０．００２７）に比べて、膵島移植片の染色が、重度のＣＤ３＋細胞の浸潤を示した（図２Ｂ〜図２Ｃ）。ＣＸＣＬ１２被覆された膵島を受けた動物の処置に、低用量のＣｓＡを加えることもまた、ＣＸＣＬ１２被覆のみの膵島に比べた際の、移植片内へのＦｏｘＰ３細胞の浸潤の有意な減少につながった（ｐ＝０．０１８８）（図２Ｃ）。ＣｓＡが、ＣＸＣＬ１２に関するシグナリング経路、例えば、ケモカイン媒介性の細胞遊走の特異的な因子を阻害することは、以前に考察されていた（１６）。本明細書に提示された知見は、ＣＸＣＬ１２被覆と低用量のシクロスポリンＡとの同時使用による、同種膵島移植での免疫保護効果の増大は認められないことを表す。
【００８６】
ＣＸＣＬ１２被覆された膵島は、ＰＢＳ曝露された膵島よりも長期の生存を示すことから、次に、この現象が、細胞媒介性の抗膵島免疫へ及ぼすケモカインの効果に起因するのか否かを決定しようとした。同種反応性のレベルを見極めるために、ＣＸＣＬ１２被覆または非被覆のどちらかの膵島の移植を受けた後２１日目のマウスから、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を実施した。これら２グループ間には差が検出されず、このことは、ＣＸＣＬ１２が、Ｔ細胞媒介性拒絶を遅延させることができる解剖学的なニッチを作り出すものの、抗膵島免疫の発生には影響を及ぼさないことを表す（図３Ａ〜図３Ｃ）。理論に拘束されることを望むものではないが、このように、いくつかの実施形態では、ＣＸＣＬ１２被覆は、全身性の抗同種細胞媒介性応答の発生を防ぐというよりも、局所的な免疫隔離を誘導することができる。
【実施例３】
【００８７】
＜前糖尿病および糖尿病マウスモデルにおけるＣＸＣＬ１２被覆された同一遺伝子の膵島の移植＞
同一遺伝子の膵島を移植した場合、ＣＸＣＬ１２被覆が、拒絶を低減または予防する役割を果たすことができるか否かを決定するために、糖尿病ＮＯＤ／ＬｔＪマウスを使用した。このモデルでは、非糖尿病ＮＯＤ／ＬｔＪマウス由来の同一遺伝子の膵島を、ＳＴＺ処置された糖尿病ＮＯＤ／ＬｔＪマウス内に移植した。同一遺伝子の膵島をＣＸＣＬ１２被覆することによって、ＰＢＳ曝露された膵島よりも有意に長い期間の正常血糖がもたらされた（図４Ａ）（ｐ＝０．０１７）。組織病理学的および免疫組織化学的な試験では、ＰＢＳ処理された膵島内には重度の単核細胞の浸潤があったものの、ＣＸＣＬ１２被覆された膵島にはなかったことが示された（画像示さず）。すなわち、Ｈ＆Ｅ染色では、およそ１μｇ／ｍＬのＣＸＣＬ１２を用いて被覆された膵島移植片内への単核細胞の浸潤の減少が示され、インスリンおよびＣＸＣＬ１２の免疫蛍光染色では、ＣＸＣＬ１２被覆された移植片での両タンパク質のレベルの増加が示された。この実験でのＣＸＣＬ１２およびインスリンの染色では、ＰＢＳ曝露された膵島と比べて、健康なＣＸＣＬ１２陽性のインスリン産生膵島であることが示された。同一遺伝子の膵島をＣＸＣＬ１２被覆することはまた、ＰＢＳ曝露された同一遺伝子のＮＯＤ／ＬｔＪの膵島に比べて、ドナー膵島内へのＣＤ３＋Ｔ細胞の浸潤を低減した（図４Ｂ、ｐ＝０．００８１）。同一遺伝子のＮＯＤ／ＬｔＪの膵島をＣＸＣＬ１２被覆することは、ＰＢＳ処理された対照に比べて、膵島移植片中のＦｏｘＰ３＋細胞の数の有意な増加につながった（ｐ＝０．００１９）（図４Ｃ）。自然発生糖尿病ＮＯＤ／ＬｔＪマウスでは、同一遺伝子の膵島をＣＸＣＬ１２被覆することによる、糖尿病が再発する速さの低減は認められなかった一方で（図５Ａ）（ｐ＝０．２４）、ヘマトキシリンおよびエオシン染色ならびにインスリン／ＣＸＣＬ１２染色では、対照に比べて、ＣＸＣＬ１２被覆された膵島で単核細胞の浸潤が減少し、インスリン発現が増加することが示された（図５Ｂ〜図５Ｃ）。さらに、ＰＢＳ対照に比べて、一貫して、ＣＸＣＬ１２被覆された移植片内へのＣＤ３＋Ｔ細胞浸潤の減少およびＦｏｘＰ３＋細胞浸潤の増加があった（図５Ｄ）。これらを合わせると、同一遺伝子の膵島をＣＸＣＬ１２被覆することによって、前糖尿病モデルでは拒絶を防ぐことができるが、糖尿病モデルでは必ずしもそうではない。この同一遺伝子移植の状況で、このようなＣＸＣＬ１２被覆の生存推進効果の不足は、例えば、確立した体液性の抗膵島免疫応答は、移植する膵島をＸＣＬ１２被覆することによって効率よく途絶されないことに起因する可能性がある。
【実施例４】
【００８８】
＜感作または非感作のレシピエントでのＣＸＣＬ１２を組み込んだアルギン酸被包体（アルギン酸中に被包された膵島）の使用＞
早期のインスリン自己抗体の発現は、糖尿病の進行に相関し、おそらくは膵島炎を本質的に反映するのではないかと、以前に考察された（１７〜１９）。実施例３に示されるように、移植のための膵島のＣＸＣＬ１２被覆の効能は、抗膵島抗体が予め形成された状況における介入として、いっそう有効である。この実施例では、アルギン酸マイクロカプセル中にＣＸＣＬ１２を組み込むことが、細胞誘導性かつ体液性の抗膵島免疫に対し物理的障壁および生物学的障壁の両方をもたらすことによって、移植された膵島を保護することができるかを決定しようとした。
【００８９】
一実施形態では、被包化マトリックスは、２％の低粘性かつ高マンヌロン酸のカルシウム架橋アルギン酸（Ｃａ−ＬＶＭ）と、それに組み込まれるＣＸＣＬ１２ポリペプチドとを含む（以降、「Ｃａ−ＬＶＭ−ＣＸＣＬ１２」と称する）。図６Ａは、Ｃａ−ＬＶＭ−ＣＸＣＬ１２被包体が、最初の３時間にわたって最初に迅速に放出した後、インビトロで、約１．７５＋／−０．４ｎｇ／ｍＬ／時でのＣＸＣＬ１２の放出の延長をもたらすことを示す。また、アルギン酸マトリックス中でＣＸＣＬ１２の保持も延長され、その結果、細胞不含のカプセルをインビトロで２２日間インキュベートした後に、１００〜２００ｎｇ／ｍＬの間のＣＸＣＬ１２濃度がカプセル内に残った（データ示さず）。理論に拘束されることを望むものではないが、マトリックス中のＣＸＣＬ１２の保持の延長は、正電荷を有するケモカイン（ｐＩ９）と負電荷を有するアルギン酸（ｐＩ２）との静電的相互作用に起因する可能性があった（２０）。このことは、１ＭのＮａＣｌと共にインキュベートした結果、ＮａＣｌを含有しない培地に比べて、ＣＸＣＬ１２が培地中に効果的に溶出されるという観察によって、支持された。同様に、ＣＸＣＬ１２は、ＮａＣｌ非存在下でインキュベートされた際にカプセル内に保持されるが、１ＭのＮａＣｌ中ではカプセルから抽出される（図６Ｂ）。ＣＸＣＬ１２は、膵島の生存推進因子であることも示されていることから、Ｃａ−ＬＶＭ被包体内へのＣＸＣＬ１２の組込みが膵島の生存能に及ぼす効果も評価した。本明細書に提示された知見では、被包体内へのＣＸＣＬ１２の組込みによって、少なくとも４８時間のインビトロ培養後に決定された被包体膵島中のカスパーゼ３活性のレベルが、非修飾のＣａ−ＬＶＭアルギン酸に比べて有意に低下したことが示されている（１００ｎｇ／ｍｌ  ＣＸＣＬ１２、ｐ＝０．００１９）（１μｇ／ｍｌ  ＣＸＣＸＬ１２、ｐ＝０．０００２８）（図６Ｃ）。
【００９０】
自然発生糖尿病ＮＯＤ／ＬｔＪマウス内へのＣａ−ＬＶＭ−ＣＸＣＬ１２被包体の同種膵島移植を、全身免疫抑制なしで評価した。糖尿病ＮＯＤ／ＬｔＪマウスの腹腔内に同種膵島を移植したところ、Ｃａ−ＬＶＭアルギン酸内へのＣＸＣＬ１２の組込みによって、非修飾のＣａ−ＬＶＭアルギン酸に比べて、膵島の機能および生存率が有意に延長された（移植後の非糖尿病状態の平均日数は、Ｃａ−ＬＶＭ−ＣＸＣＬ１２＝１３６、Ｃａ−ＬＶＭ＝６２）（ｐ＝０．０４８）（図６Ｄ）。移植後１２週間目で回収されたＣａ−ＬＶＭ−ＣＸＣＬ１２カプセルの組織病理学的研究では、非修飾Ｃａ−ＬＶＭカプセルで膵島が壊死または変性していたのに対して、無傷の膵島の形態構造が示された（データ示さず）。移植後６週間目に位相差顕微鏡およびＨ＆Ｅ染色を使用すると、非修飾のＣａ−ＬＶＭ中に被包された膵島が壊死していたのに対して、Ｃａ−ＬＶＭ−ＣＸＣＬ１２を用いて被包化された膵島は、生存能力があり無傷であることが認められた。したがって、ＣＸＣＬ１２の組込みによって、移植後６週間目には、膵島の健全性が向上し、壊死が低下する。次いで、以前にＣ５７／Ｂ６マウス由来の皮膚移植を受けて拒絶した自然発生糖尿病ＮＯＤ／ＬｔＪマウス内に、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の同種膵島を移植した。Ｃａ−ＬＶＭ−ＣＸＣＬ１２を用いて被包化された同種膵島は、Ｃａ−ＬＶＭのみを用いて被包化された膵島よりも有意に長い間、レシピエント中で生存し、正常血糖の状態を維持した（図６Ｅ）。このことは、被包体へＣＸＣＬ１２を組み込むことによって、レシピエントマウスでの免疫記憶応答から膵島が保護されたことを示す。
【００９１】
次に、異種膵島が、ＣＸＣＬ１２を組み込んだアルギン酸被包体によって保護されうるか否かを決定しようとした。ブタ異種膵島を、Ｃａ−ＬＶＭ中、または約１０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬもしくは約１μｇ／ｍＬの濃度のＣＸＣＬ１２を含むＣａ−ＬＶＭ中に被包化し、糖尿病Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内に移植した。約１μｇ／ｍＬの濃度のＣＸＣＬ１２を含有するＣａ−ＬＶＭを用いて被包化されたブタ膵島は、Ｃａ−ＬＶＭまたはＣａ−ＬＶＭ−ＣＸＣＬ１２（およそ１０ｎｇ／ｍＬ）のどちらかで被包化された膵島よりも有意に長い期間にわたって、レシピエントマウスで正常血糖を持続した（図６Ｆ）。
【実施例５】
【００９２】
＜インビトロでのＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇ細胞上のＣＸＣＬ１２被覆または微小被包化の効果＞
被包体へのＣＸＣＬ１２被覆または組込みによって異種膵島または同種膵島の移植片の免疫隔離が持続される機構が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の選択的な化学反発と、移植部位へのＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の誘引とに関係するか否かを決定するために、ＮＯＤ／ＬｔＪマウス由来のＴ細胞サブ集団上のＣＸＣＲ４の発現、および該サブ集団の遊走を、フローサイトメトリーおよび遊出アッセイそれぞれによって検討した。培地のみ、組換えＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１２被覆された膵島、またはＣａ−ＬＶＭ−ＣＸＬ１２被包された膵島に応答した、ＮＯＤ／ＬｔＪマウスに由来するＴ細胞を、ボイデンチャンバーベースのアッセイで検討した。各条件について、上部チャンバーに、精製ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（図７Ａおよび図７Ｃ）またはＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ＋Ｔｒｅｇ細胞（図７Ｂおよび図７Ｄ）を充填した。上部および下部のウェルには、培地、ＣＸＣＬ１２（およそ１μｇ／ｍＬ）、またはＣＸＣＬ１２（およそ１μｇ／ｍＬ）を用いて被覆された膵島、もしくはＣａ−ＬＶＭ−ＣＸＣＬ１２（およそ１μｇ／ｍＬ）を用いて被包された膵島を充填した。ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋ＣＤ２５Ｈｉ  Ｔｒｅｇのどちらも、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１２被覆された膵島、もしくはＣａ−ＬＶＭ−ＣＸＣＬ１２被包された膵島に応答して化学走性を示した。しかし、ＣＤ８＋細胞を、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１２被覆された膵島、またはＣａ−ＬＶＭ−ＣＸＣＬ１２被包された膵島と共にインキュベートした際に、Ｔｒｅｇ細胞よりも有意に大きな化学反発性応答が検出された。実施した条件では、Ｔｒｅｇ細胞の検出されうる化学反発性のレベルは測定されなかった。
【００９３】
次に、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞との間のＣＸＣＬ１２に対する遊走応答の差が、部分的に、ケモカインの同系受容体であるＣＸＣＲ４の、これら２つのＴ細胞サブ集団上での発現の差に起因するか否かを決定しようとした。ＮＯＤ／ＬｔＪマウスの脾臓由来のＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５ＨｉＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞よりも有意に低いレベルのＣＸＣＲ４を発現した（ｐ＜０．００５）（図７Ｅおよび７Ｆ）。これらのデータは、ＣＸＣＬ１２被覆、または移植された同種膵島の周囲の被包体へのＣＸＣＬ１２の組込みによって、この移植モデルでＣＤ８＋Ｔ細胞が退けられる一方で、移植片内でのＴｒｅｇ細胞の優先的な動員がもたらされうることを示す。
【００９４】
＜考察＞
実施例１〜５に提示された知見は、ＣＸＣＬ１２を用いて膵島を被覆することによって、ＳＴＺ処置された糖尿病ＮＯＤ／ＬｔＪマウスで、同種または同一遺伝子の膵島移植での膵島拒絶の遅延をもたらしうることを示す。具体的には、糖尿病または感作されたＮＯＤ／ＬｔＪマウス内に移植する場合、ＣＸＣＬ１２を組み込んだＣａ−ＬＶＭベースのアルギン酸被包体が、既に存在する体液性および細胞誘導性の両方の抗膵島応答について、同種膵島を保護したことが観察された。
【００９５】
実施例１〜５の移植モデルは、ＣＸＣＬ１２を用いて膵島を被覆または被包することによって、移植部位にＴｒｅｇ細胞の蓄積がもたらされることを示す。
【００９６】
したがって、理論に拘束されることを望むものではないが、腫瘍と移植の両方の状況で、Ｔｒｅｇ細胞を保持／蓄積することは、免疫抑制的な微小環境の確立と関連がありうる。本明細書に提示された知見は、ＣＸＣＬ１２を用いて同種膵島または異種膵島を被覆または被包することが、局所的な免疫隔離の誘導を通じて、膵島拒絶の遅延およびそれに付随する膵島機能の延長につながりうることを示す。移植された同種膵島および異種膵島の周囲の臨床グレードのアルギン酸被包体内にＣＸＣＬ１２を組み込むことによって、感作された宿主で、全身免疫抑制を行うことなく、膵島機能の持続、および免疫による破壊からの保護が可能になるという発見は、驚くべきことであり、臨床に移行可能な知見でもある。
【００９７】
＜実施例１〜５にて使用された例示的な材料および方法＞
動物および糖尿病の誘導。６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２ｄ）マウス、６週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ２ｂ）マウスおよび６〜８週齢の雌ＮＯＤ／ＬｔＪ（Ｈ２ｇ７）マウスを使用した。動物は、例えばＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（バーハーバー、メイン州）から購入することができる。全ての手順は、実験動物の人道的管理に関する公衆衛生局方針に従って実施し、マサチューセッツ総合病院で研究動物管理に関する小委員会によって承認された。高血糖は、１８〜２０週齢のＮＯＤ／ＬｔＪマウスには自然発生し、４週齢および６週齢のＮＯＤ／ＬｔＪマウス、ならびに６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスには、２００ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）の腹腔内（ＩＰ）注射によって誘導された。３回連続して血中グルコースが２５０ｍｇ／ｄＬを上回る読み取りであったマウスは、高血糖であるものと考えた。
【００９８】
膵島の単離、ＣＸＣＬ１２被覆およびアルギン酸被包体へのケモカインの組込み。Ｐａｐｅｔａ  ｅｔ  ｌａ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ８３，１７４（２００７）に以前に報告されているように、初代膵島をドナーから単離した。例えば、膵島を、６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃドナー、６週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６ドナー、または４週齢の雌ＮＯＤ／ＬｔＪドナーから単離した。総胆管を介して、膵臓にＬｉｂｅｒａｓｅ  ＴＬ（例えば、およそ８３μｇ／ｍＬ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、インディアナポリス、インディアナ州）を注入し、およそ３７℃でおよそ２０分間、消化した。膵島をポリスクロース／グルコース密度勾配（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、マナサス、バージニア州）で精製し、顕微鏡下で選択した。膵島をＲＰＭＩ１６４０（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１％Ｌ−グルタミンを補充）中で少なくとも２日間以上培養し、回復させた。腎被膜を介して移植するための最少で４５０個の膵島を、移植前にＤＰＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）中で、およそ１００ｎｇ／ｍＬもしくはおよそ１μｇ／ｍＬのＣＸＣＬ１２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｉｎｃ、ロッキーヒル、ニュージャージー州）の存在下または非存在下、およそ３７℃でおよそ３時間インキュベートした。これとは別に、被包化前に、ＣＸＣＬ１２を、Ｎａ−ＬＶＭアルギン酸液（ｕｌｔｒａ−ｐｕｒｅ  ＬＶＭ、Ｎｏｖａｍａｔｒｉｘ）中に、およそ１μｇ／ｍＬの濃度で組み込んだ。
【００９９】
Ｃａ−ＬＶＭアルギン酸カプセルの製造および移植。ほぼ１０００個のＣ５７ＢＬ／６膵島を、およそ１μｇ／ｍＬのＣＸＣＬ１２の存在下または非存在下で、およそ１．５％のアルギン酸［ｕｌｔｒａ−ｐｕｒｅ  ＬＶＭ、Ｎｏｖａｍａｔｒｉｘ、ドランメン、ノルウェー）］のおよそ３００ミリオスモ  ＮａＣｌ溶液およそ０．７５ｍＬと混和した。次いで、１．２１ｋＶに荷電しかつ１５００Ｈｚで振動する３００μｍノズルを使用して、混和物をシリンジ動作型カプセル化装置（Ｉｎｏｔｅｃｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｏｒ、ＩＥ−５０Ｒ）に通した。アルギン酸を、例えば、３００ミリオスモ（ほぼ１１８ｍＭ）ＣａＣｌ２中で、約５分間架橋し、濾過し、ＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）で洗浄して余剰のカルシウムを除去した。
【０１００】
ＣＸＣＬ１２の保持およびアルギン酸カプセルからの放出ならびにカスパーゼ３アッセイ。カプセルを形成する前に、およそ３．６％のＬＶＭを、およそ１０μｇ／ｍＬのＣＸＣＬ１２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、ロッキーヒル、ニュージャージー州）ストック溶液に混和して、およそ１μｇ／ｍＬのＣＸＣＬ１２を含むおよそ３．３％のＬＶＭを生じた。静電液滴生成装置（Ｎｉｓｃｏ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、チューリヒ、スイス）を使用して、５ｋＶの電荷で、０．５ｍｍノズルおよび３０ｍＬ／時の流速を使用して、カルシウム架橋ＬＶＭカプセルを形成させた。ＣＸＣＬ１２を含有した無細胞カプセルを、組織培養用処理されていないマルチウェルプレートで、およそ１．６ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）中でインキュベートした。実験の経過を通じて、カプセルと培地との比を、約１：２ｖ／ｖに維持した。それぞれの時点で、およそ０．１ｍＬのカプセル試料を取り出し、１１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム溶液を使用して可溶化した。さらに、各時点で、全ての培地を除去し、新鮮な培地を添加した。培地および可溶化されたカプセルの両方の試料を、ＣＸＣＬ１２含量について、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）によってアッセイした。被包化とＣＸＣＬ１２との組合せが膵島のアポトーシスに及ぼす効果を決定するために、およそ１μｇ／ｍＬのＣＸＣＬ１２存在下または非存在下で、本明細書に記載されるように、アルギン酸被包体を用いてマウスの膵島を被包化した。対照として、膵島のアポトーシスの既知の誘発物質であるストレプトゾトシンに、膵島を曝露することもできる。例えば、膵島を、インビトロで４８時間、この条件で培養することができ、被包化された膵島中のカスパーゼ３活性は、ＥＬＩＳＡベースのアッセイ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）を使用して決定する。
【０１０１】
アルギン酸カプセルからのＣＸＣＬ１２脱塩。ＣＸＣＬ１２カプセルを、以下の修正を加えて上記に記載されたように形成した。すなわち、２０ｍＭ塩化カルシウムを使用してカプセルを架橋し、高濃度の塩化ナトリウム溶液に溶解するのを防いだ。カプセルを、およそ０．１％ＢＳＡを含むおよそ１ＭのＮａＣｌ中で、およそ６時間インキュベートし、その後、溶液を収集し、２００ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩（ＥＤ２ＳＳ）、ｐＨ９．０を使用して可溶化した。溶液および可溶化カプセル試料を、ＣＸＣＬ１２含量について、上記に記載されたようにＥＬＩＳＡによってアッセイした。対照カプセルは、ＮａＣＬ不含のＣａＣｌ２溶液中でインキュベートし、保持またはカプセルから放出されたＣＸＣＬ１２を決定した。
【０１０２】
膵島移植モデル。様々に処理された膵島を、レシピエントマウスの左腎被膜下に移植するか、またはＣａ−ＬＶＭアルギン酸中に被包して、腹腔を介して移植した。４つの異なる例示的な移植モデルを使用した。すなわち、（１）ＳＴＺ誘導された糖尿病Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腎被膜下に、ＢＡＬＢ／ｃ膵島を移植したもの、（２）自然発生糖尿病ＮＯＤ／ＬｔＪマウスの腎被膜下に、前糖尿病（前感作された）ＮＯＤ／ＬｔＪ膵島を移植したもの、（３）６週齢の糖尿病（前感作かつＳＴＺ誘導された糖尿病）ＮＯＤ／ＬｔＪマウスの腎被膜下に、前糖尿病（前感作された）ＮＯＤ／ＬｔＪ膵島を移植したもの、および（４）Ｃ５７ＢＬ／６膵島をＣａ−ＬＶＭアルギン酸中に被包化し、６週齢のＳＴＺ誘導された糖尿病ＮＯＤ／ＬｔＪマウスの腹腔内に移植したものである。
【０１０３】
モニタリングレシピエントの血糖制御。レシピエントの尾静脈の血中グルコースレベルを、１週間に少なくとも２回モニターし、膵島移植片の機能を解釈するために使用した。移植片拒絶を高血糖へ戻ることとして定義した（例えば、３回連続して２５０ｍｇ／ｄＬを上回る測定値であることを特徴とする）。移植片拒絶が生じると、マウスを屠殺した。
【０１０４】
免疫組織化学および免疫蛍光染色。被膜下の膵島移植片を含有する腎臓を４％ホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋して、移植片の５μｍ切片をスライド用に切った。何枚かの切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて染色した。ＣＤ３（Ｄａｋｏ、デンマーク）、ＦｏｘＰ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州）およびインスリン（Ｄａｋｏ、デンマーク）に対する一次抗体を使用して、免疫組織化学も実施した。次いで、適切な二次抗体を各一次抗体と対合させ、ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）を染色用の基質として使用した。アビジン−ビオチン複合体ＩＨＣ染色法に用いるために、マイヤーのヘマラムを用いて、核染色（青）を実施した。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１を用いて×１０の倍率でカメラ画像を撮影し、ＣＤ３＋および／またはＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の浸潤について、膵島の移植片を手作業でスコア化した。移植部位の近くで無作為に選択した５つの高出力の場で、それぞれのマーカーについて陽性であった細胞の数を記録した。インスリン（モルモット抗インスリン、１：８００、インビトロｇｅｎ）およびＣＸＣＬ１２（ウサギ抗マウスＣＸＣＬ１２、１：２００、Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対する蛍光一次抗体を使用して、免疫蛍光染色も実施した。スライドを洗浄し、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、次いで、適切な二次抗体と共に、室温で１時間インキュベートした［ヤギ抗モルモットＩｇＧ（Ｄｙｌｉｇｈｔ  ４８８，１：２００，Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）およびヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｄｙｌｉｇｈｔ  ５４９，１：２００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）］。二次抗体の適用に続いて、組織を洗浄し、Ｔｏ−Ｐｒｏ−３（１：５０００、インビトロｇｅｎ）を用いて対比染色し、重層した。免疫蛍光染色スライドのデジタル画像は、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ  ５  Ｐａｓｃａｌ，Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）によって得た。
【０１０５】
シクロスポリンＡ処置。ＰＢＳまたはＣＸＣＬ１２（およそ１μｇ／ｍＬ）を用いて被覆された４５０個のＢＡＬＢ／ｃ膵島を、糖尿病Ｃ５７ＢＬ／６マウスに移植した。レシピエントを３つの処置群、（Ａ）ＰＢＳ被覆された膵島のレシピエントにシクロスポリンＡ（ＣｓＡ、Ｓｉｇｍａ）注射、（Ｂ）ＣＸＣＬ１２被覆された膵島のレシピエントにＣｓＡ注射、および（Ｃ）ＣＸＣＬ１２被覆された膵島のレシピエントにＰＢＳ注射のうち１つを用いて処置した。Ａ群およびＢ群には、エタノールに溶解することによってＣｓＡを調製し、移植日および毎日、以降移植拒絶が生じるまで、およそ２ｍｇ／ｋｇで皮下に注射した。
【０１０６】
混合リンパ球反応。レスポンダー細胞を用意するためのＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３／群）を３群、すなわち、ＣＸＣＬ１２被覆された膵島の移植、無被覆の膵島の移植、および無処置のうち、１つに割り振った。種々の処置の１０日後に、脾臓を機械的に破砕して濾過し、赤血球をＭ−ｌｙｓｅ緩衝液（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して溶解した。非処置のＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓由来の同種の刺激細胞を、同様に調製して、２０μｇ／ｍＬ  マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に、３７℃で１時間インキュベートし、培地を用いて繰り返し洗浄し、１：１の比でレスポンダー細胞と共に３７℃、５％ＣＯ２で３日間、共培養した。刺激が完了する１８時間前に、１ｍＭ  ブロモデオキシウリジン溶液（ＢｒｄＵ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞をパルスした。培養７２時間後に、細胞を洗浄し、続いて、抗マウスＣＤ３（ＡＰＣ−Ｃｙ７）、ＣＤ８（ＰｅｒＣＰ）およびＣＤ４（ＰＥ−Ｃｙ７）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて染色した。Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞を浸透性とし、ＤＮａｓｅ消化（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に付し、ＰＥ−コンジュゲート抗ＢｒｄＵ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて染色した。フローサイトメトリー解析をＬＳＲＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で実施し、刺激されかつＢｒｄＵを取り込んだ脾臓当たりのＴ細胞から、ＢｒｄＵを取り込んだ脾臓当たりの非刺激細胞の数を引いたものについて、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて、データを解析した。
【０１０７】
＜遊出アッセイ＞
２種類の遊走アッセイを実施した。第１に、以前にＰｏｚｎａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１０９，１１０１  （２００２）に報告されているように、ボイデンチャンバー（９６ウェルフォーマット、３μｍ孔径、ＣｈｅｍｏＴｘ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃ、ゲイザースバーグ、メリーランド）を使用して、細胞遊走を測定した。例えば、０．５％ＦＢＳを補充したおよそ３０μＬのＲＰＭＩ１６４０を、５０個の対照の膵島または１μｇ／ｍＬ  ＣＸＣＬ１２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｉｎｃ、ロッキーヒル、ニュージャージー州）を用いて被覆した膵島と併せて、下部および上部のチャンバーに添加した。ＣＤ４、ＣＤ２５および／またはＣＤ８  ＭＡＣＳ分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、オーバーン、カリフォルニア州）をそれぞれ用いて単離した７，０００個のＴ−ｒｅｇ細胞またはＣＤ８  Ｔ細胞を、ボイデンチャンバーの上部チャンバー内に充填した。３７℃、５％ＣＯ２で３時間インキュベートした後、膜の上部表面の細胞を除去し、下部チャンバー中の遊走細胞を３連で計数した。これとは別に、ＣＸＣＬ１２がカプセルに組み込まれたまたは組み込まれない被包化された膵島に対する遊走も、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｓｙｓｔｅｍ（２４ウェルフォーマット、３μｍ孔径、Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用して測定した。端的に述べれば、０．５％ＦＢＳを補充した５００μＬのＲＰＭＩ１６４０を単独で、または１０個の対照の膵島もしくはおよそ１μｇ／ｍＬのＣＸＣＬ１２を組み込んだカプセルと共に、下部チャンバー内に充填した。１００μＬの培地を単独で、または様々に処理したカプセルと共に、所望の集団の１０５個の細胞と併せて、上部チャンバー内に充填した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で３時間インキュベートし、遊走細胞の数を３連で計数した。どちらのアッセイでも、遊出の指標を、ＣＸＣＬ１２存在下で計数された細胞数と、培地のみの対照で計数された細胞数との比として算出した。
【０１０８】
＜Ｔ細胞サブセットのＣＸＣＲ４発現の定量＞
脾細胞を非処置のＮＯＤ／ＬｔＪマウスから採取し、Ｍｏｕｓｅ  Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  （Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して赤血球を溶解した。次いで、細胞を表面マーカーＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２５およびＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）（ＣＤ３εはクローン１４５−２Ｃ１１、ＣＤ４はクローンＲＭ４−５、ＣＤ８αはクローン５３−６．７、ＣＤ２５はクローンＰＣ６１、ＣＸＣＲ４はクローン２Ｂ１１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）について染色し、固定し、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ  （ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い製造業者の取扱説明書に従って浸透させ、細胞内マーカーＦｏｘＰ３（クローンＭＦ２３、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）について染色した。フローサイトメトリーは、４  Ｌａｓｅｒ  ＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて実施した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を使用してデータを解析し、ゲーティングは、蛍光１項目除外ゲートストラテジーを使用して達成した。
【０１０９】
＜統計解析＞
群間の膵島移植片の生存率は、カプラン−マイヤー法を使用して比較し、生存データは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５統計ソフトウェアを使用することによって解析した。数値変数は、スチューデントのｔ検定を使用して比較した。０．０５を下回るｐ値を、統計的に有意であるものと考えた。
【０１１０】
前述の記載から、様々な使用法および状況に採り入れるために、変形および改変が、本明細書に記載の本発明に対し行われることがあることは明らかとなろう。そのような実施形態はまた、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。本明細書での任意の変動要素の定義内にある要素の列挙の記載は、列挙された要素のうちの任意の単独の要素または組合せ（もしくは準組合せ）として、当該変動要素の定義を含む。本明細書での実施形態の記載は、任意の単独の実施形態として、または任意の他の実施形態もしくはその一部分との組合せで、当該実施形態を含む。
【０１１１】
＜参考文献＞
本明細書中でふれた全ての特許、特許出願および刊行物は、それぞれの独立した特許および刊行物が、参照により組み入れられることを具体的におよび別個に表すかのごとく、同程度にまで参照により本明細書に組み入れられる。参照により本明細書に組み入れられるものとしては、以下が挙げられるが、それらに限定されない。
【表２Ａ】
0006538042.tif 000003
【表２Ｂ】
0006538042.tif 000004
【表２Ｃ】
0006538042.tif 000005
【図１Ａ】
0006538042.tif 000006
【図１Ｂ】
0006538042.tif 000007
【図１Ｃ】
0006538042.tif 000008
【図１Ｄ】
0006538042.tif 000009
【図２Ａ】
0006538042.tif 000010
【図２Ｂ】
0006538042.tif 000011
【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
0006538042.tif 000013
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ．７Ｇ】
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【図８】
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