(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリセロールのリン酸化物の製造方法であって、リン酸基供与体の存在下でリン酸化酵素をグリセロールに作用させる工程を含み、
前記リン酸化酵素が、下記（ＶＩＩ）又は（ＶＩＩＩ）に示されるポリペプチドからなるクラスＡの酸性ホスファターゼであることを特徴とする、前記製造方法：
（ＶＩＩ）配列番号３〜９、１３、１０４、１０５、１１６、１１７、及び１１９〜１２１のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ＶＩＩＩ）配列番号３〜９、１３、１０４、１０５、１１６、１１７、及び１１９〜１２１のいずれかに示されるアミノ酸配列において、活性中心のアミノ酸配列以外の領域の１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ当該置換、欠失、挿入又は付加が行われていない対応するポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド。
前記活性中心のアミノ酸配列は、
配列番号３の場合は、―Ｇｌｙ―Ａｌａ―Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ―、
配列番号４、及び７の場合は、―Ｇｌｙ―Ｓｅｒ―Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ―、
配列番号５、及び１２１の場合は、―Ｇｌｙ―Ｓｅｒ―Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ―、
配列番号６の場合は、―Ｇｌｙ―Ａｓｐ―Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ―、
配列番号８の場合は、―Ａｌａ―Ｓｅｒ―Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ―、
配列番号９の場合は、―Ａｌａ―Ｓｅｒ―Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ―、
配列番号１３の場合は、―Ｇｌｙ―Ｓｅｒ―Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ―、
配列番号１０４及び１０５の場合は、―Ｇｌｙ―Ｓｅｒ―Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ―、
配列番号１１６の場合は、―Ａｌａ―Ｓｅｒ―Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｌａ―、
配列番号１１７の場合は、―Ｇｌｙ―Ｓｅｒ―Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｌａ―、
配列番号１１９の場合は、―Ｐｈｅ―Ｓｅｒ―Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ―、並びに
配列番号１２０の場合は、―Ｐｈｅ―Ｓｅｒ―Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ―である。
【請求項２】
グリセロールのリン酸化物の製造方法であって、リン酸基供与体の存在下でリン酸化酵素をグリセロールに作用させる工程を含み、
前記リン酸化酵素が、下記（ｖｉｉ）又は（ｖｉｉｉ）に示されるポリペプチドからなるクラスＡの酸性ホスファターゼであることを特徴とする、前記製造方法：
（ｖｉｉ）配列番号９、１５〜１７、１９、２２及び２５のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）配列番号９、１５〜１７、１９、２２及び２５のいずれかに示されるアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列以外の領域の１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ当該置換、欠失、挿入又は付加が行われていない対応するポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
前記リン酸基供与体がポリリン酸である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記リン酸基供与体が、式：Hn+2PnO3n+1（ｎは３〜１００００）で表されるポリリン酸である、請求項１〜３のいずれかに記載される製造方法。
【請求項５】
前記グリセロールのリン酸化物がα−グリセロリン酸である、請求項１〜４のいずれかに記載される製造方法。
【請求項６】
前記リン酸基供与体の存在下でリン酸化酵素をグリセロールに作用させる工程において、反応液のｐＨが４〜５である、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
前記リン酸基供与体の存在下でリン酸化酵素をグリセロールに作用させる工程において、リン酸化酵素１重量部当たりのグリセロールの添加量が１０００〜５００００重量部である、請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
前記リン酸基供与体の存在下でリン酸化酵素をグリセロールに作用させる工程において、反応液中のリン酸基供与体の濃度が２〜１０重量％である、請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高効率でグリセロールのリン酸化物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グリセロールのリン酸化物は、化粧品原料や、医薬品製造のための中間体等として利用価値の高いことから、グリセロールのリン酸化物を効率よく取得する方法が検討されている。効率的なリン酸化を実現する一つの方法としては、例えば、グリセロールのリン酸化を触媒するリン酸化酵素を使用する方法が挙げられる。リン酸化酵素については、これまでに数多くの種類が知られており、多様な生物種由来のものが見出されている（非特許文献１）。しかしながら、このように多数存在するリン酸化酵素のいずれを用いてもリン酸化反応の効率が向上するというものではない。また、グリセロールのリン酸化物を得る反応においては、リン酸基供与体の存在下でリン酸化酵素とグリセロールを反応させる必要がある。しかし、従来使用されているリン酸化酵素は、リン酸基供与体として高価なＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を必要するため、製造コストがかかるという問題があった。一方、安価なリン酸基供与体としてポリリン酸が例示されるが、これを用いてグリセロールのリン酸化反応を触媒する酵素は知られていなかった（例えば、非特許文献２を参照）。このような背景から、工業上利用価値の高いグリセロールのリン酸化物を効率よく、且つより低コストで製造する方法が切望されていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．１９９８  Ａｕｇ；５４（８）：８３３−５０
【非特許文献２】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  １９９８  Ｄｅｃ；１１（１２）：１２１９−２７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、高いリン酸化効率を実現することが可能なグリセロールのリン酸化方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、特定の微生物に由来するリン酸化酵素を使用することにより、グリセロールのリン酸化効率が顕著に向上することを見出した。また、このようなリン酸化酵素によれば、ポリリン酸のような安価なリン酸基供与体を用いてリン酸化反応を行った場合でも効率よくリン酸化物が得られることを見出した。更に、本発明者らは、前記特定の微生物から得られたリン酸化酵素において活性を担うアミノ酸配列を特定した。本発明はこれらの知見に基づいて更に改良を重ねた結果完成されたものである。【０００６】
即ち、本発明は下記態様のリン酸化方法を提供する。
項１．グリセロールのリン酸化物の製造方法であって、リン酸基供与体の存在下でリン酸化酵素をグリセロールに作用させる工程を含み、
前記リン酸化酵素が、クラスＡの酸性ホスファターゼであり、且つ活性中心として下記配列（１）で表わされるアミノ酸配列を含むポリペプチドからなることを特徴とする、前記製造方法：
―Ｘ1―Ｘ2―Ｘ3−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｘ4―    （１）
ここで、
Ｘ1は、グリシン、アラニン又はフェニルアラニンを示し、
Ｘ2は、任意のアミノ酸を示し、
Ｘ3は、チロシン又はトリプトファンを示し、
Ｘ4は、トレオニン、セリン又はアラニンを示し、
且つ、Ｘ1がフェニルアラニンの場合は、Ｘ4がトレオニン又はセリンである。
項２．配列（１）におけるＸ1、及びＸ4が以下の（Ａ１）〜（Ａ８）のいずれかである、項１に記載の製造方法。
（Ａ１）Ｘ1がグリシン、且つＸ4がトレオニン；
（Ａ２）Ｘ1がグリシン、且つＸ4がセリン；
（Ａ３）Ｘ1がアラニン、且つＸ4がセリン；
（Ａ４）Ｘ1がアラニン、且つＸ4がトレオニン；
（Ａ５）Ｘ1がアラニン、且つＸ4がアラニン；
（Ａ６）Ｘ1がグリシン、且つＸ4がアラニン；
（Ａ７）Ｘ1がフェニルアラニン、且つＸ4がトレオニン；
（Ａ８）Ｘ1がフェニルアラニン、且つＸ4がセリン。
項３．配列（１）において、Ｘ2がセリン、アラニン又はアスパラギン酸である、項１又は２に記載の製造方法。
項４．配列（１）におけるＸ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4が以下の（Ｂ１）〜（Ｂ１１）のいずれかである、項１又は３に記載の製造方法。
（Ｂ１）Ｘ1がグリシン、Ｘ2がセリン、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がトレオニン；
（Ｂ２）Ｘ1がグリシン、Ｘ2がアラニン、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がトレオニン；
（Ｂ３）Ｘ1がグリシン、Ｘ2がセリン、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がセリン；
（Ｂ４）Ｘ1がグリシン、Ｘ2がアスパラギン酸、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がトレオニン；
（Ｂ５）Ｘ1がアラニン、Ｘ2がセリン、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がセリン；
（Ｂ６）Ｘ1がアラニン、Ｘ2がセリン、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がトレオニン；
（Ｂ７）Ｘ1がアラニン、Ｘ2がセリン、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がアラニン；
（Ｂ８）Ｘ1がグリシン、Ｘ2がセリン、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がアラニン；
（Ｂ９）Ｘ1がフェニルアラニン、Ｘ2がセリン、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がトレオニン；
（Ｂ１０）Ｘ1がフェニルアラニン、Ｘ2がセリン、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がセリン；
（Ｂ１１）Ｘ1がグリシン、Ｘ2がセリン、Ｘ3がトリプトファン、且つＸ4がセリン。
項５．配列（１）で表わされるアミノ酸配列において第７位のヒスチジン（Ｈｉｓ）残基が、リン酸化酵素として用いられるポリペプチドのＮ末端から数えて第１２０〜１６０位に位置する、項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
項６．前記リン酸化酵素が、更に下記（Ｉ）又は（ＩＩ）に示されるポリペプチドからなる、項１〜５のいずれかに記載される製造方法：
（ＩＩ）に示されるポリペプチドが挙げられる。
（Ｉ）前記配列（１）で表わされる活性中心をコードするアミノ酸配列部位よりもＮ末端側に配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ＩＩ）前記配列（１）で表わされる活性中心をコードするアミノ酸配列部位よりもＮ末端側に、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ前記（Ｉ）に示されるポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド。
項７．配列番号２で示されるアミノ酸配列における第１位のアミノ酸残基が、リン酸化酵素として用いられるポリペプチドのＮ末端側から数えて第５〜４０位に配置されている、項６に記載される製造方法。
項８．前記リン酸化酵素が、更に下記（ＩＩＩ）〜（ＶＩ）のいずれか示すポリペプチドからなる、項１〜５のいずれかに記載される製造方法：
（ＩＩＩ）配列（１）で表わされるアミノ酸配列のＮ末端側に、配列番号２６〜３２及び１０６〜１１０のいずれかに示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ＩＶ）配列（１）で表わされるアミノ酸配列のＮ末端側に、配列番号２６〜３２及び１０６〜１１０のいずれかに示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ（ＩＩＩ）に示される各々対応するポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド、
（Ｖ）配列（１）で表わされるアミノ酸配列のＣ末端側に、配列番号３３〜３９及び１１１〜１１５のいずれかに示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに
（ＶＩ）配列（１）で表わされるアミノ酸配列のＣ末端側に、配列番号３３〜３９及び１１１〜１１５のいずれかに示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ（Ｖ）に示される、対応するポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド。
項９．前記リン酸化酵素が、下記（ＶＩＩ）又は（ＶＩＩＩ）に示されるポリペプチドからなる、項１〜８のいずれかに記載の製造方法：
（ＶＩＩ）配列番号３〜９、１３、１０４、１０５、１１６、１１７、及び１１９〜１２１のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ＶＩＩＩ）配列番号３〜９、１３、１０４、１０５、１１６、１１７、及び１１９〜１２１のいずれかに示されるアミノ酸配列において、前記配列（１）で表わされるアミノ酸配列からなる活性中心以外の領域の１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ（ＶＩＩ）に示される、対応するポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド。
項１０．グリセロールのリン酸化物の製造方法であって、リン酸基供与体の存在下でリン酸化酵素をグリセロールに作用させる工程を含み、
前記リン酸化酵素が、クラスＡの酸性ホスファターゼであり、且つ下記（ｉ）又は（ｉｉ）に示されるポリペプチドからなることを特徴とする、前記製造方法：
（ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、グリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、且つ前記（ｉ）に示されるポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド。
項１１．配列番号２で示されるアミノ酸配列における第１位のアミノ酸残基が、リン酸化酵素として用いられるポリペプチドのＮ末端側から数えて第５〜４０位に配置されている、項１０に記載の製造方法。
項１２．前記リン酸化酵素が、配列番号２で表わされるアミノ酸配列よりもＣ末端側に、下記配列（１）で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる、項１０又は１１に記載される製造方法：
―Ｘ1―Ｘ2―Ｘ3−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｘ4―    （１）
ここで、
Ｘ1は、グリシン、アラニン又はフェニルアラニンを示し、
Ｘ2は、任意のアミノ酸を示し、
Ｘ3は、チロシン又はトリプトファンを示し、
Ｘ4は、トレオニン、セリン又はアラニンを示し、
且つ、Ｘ1がフェニルアラニンの場合は、Ｘ4がトレオニン又はセリンである。
項１３．配列（１）におけるＸ1及びＸ4が以下の（Ａ１）〜（Ａ８）のいずれかである、項１２に記載の製造方法。
（Ａ１）Ｘ1がグリシン、且つＸ4がトレオニン；
（Ａ２）Ｘ1がグリシン、且つＸ4がセリン；
（Ａ３）Ｘ1がアラニン、且つＸ4がセリン；
（Ａ４）Ｘ1がアラニン、且つＸ4がトレオニン；
（Ａ５）Ｘ1がアラニン、且つＸ4がアラニン；
（Ａ６）Ｘ1がグリシン、且つＸ4がアラニン；
（Ａ７）Ｘ1がフェニルアラニン、且つＸ4がトレオニン；
（Ａ８）Ｘ1がフェニルアラニン、且つＸ4がセリン。
項１４．配列（１）において、Ｘ2がセリン、アラニン又はアスパラギン酸である、項１２又は１３に記載の製造方法。
項１５．配列（１）におけるＸ1、Ｘ2、Ｘ3及びＸ4が以下の（Ｂ１）〜（Ｂ１１）のいずれかである、項１２〜１４のいずれかに記載の製造方法。
（Ｂ１）Ｘ1がグリシン、Ｘ2がセリン、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がトレオニン；
（Ｂ２）Ｘ1がグリシン、Ｘ2がアラニン、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がトレオニン；
（Ｂ３）Ｘ1がグリシン、Ｘ2がセリン、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がセリン；
（Ｂ４）Ｘ1がグリシン、Ｘ2がアスパラギン酸、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がトレオニン；
（Ｂ５）Ｘ1がアラニン、Ｘ2がセリン、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がセリン；
（Ｂ６）Ｘ1がアラニン、Ｘ2がセリン、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がトレオニン；
（Ｂ７）Ｘ1がアラニン、Ｘ2がセリン、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がアラニン；
（Ｂ８）Ｘ1がグリシン、Ｘ2がセリン、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がアラニン；
（Ｂ９）Ｘ1がフェニルアラニン、Ｘ2がセリン、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がトレオニン；
（Ｂ１０）Ｘ1がフェニルアラニン、Ｘ2がセリン、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がセリン；
（Ｂ１１）Ｘ1がグリシン、Ｘ2がセリン、Ｘ3がトリプトファン、且つＸ4がセリン。
項１６．配列（１）で表わされるアミノ酸配列において第７位のヒスチジン（Ｈｉｓ）残基が、リン酸化酵素として用いられるポリペプチドのＮ末端から数えて第１２０〜１６０位に位置する、項１２〜１５のいずれかに記載の製造方法。
項１７．前記リン酸化酵素が、更に下記（ｉｉｉ）〜（ｖｉ）に示すアミノ酸配列の少なくとも１種を含む、項１０〜１６のいずれかに記載される製造方法：
（ｉｉｉ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列のＮ末端側に、配列番号４０で示すアミノ酸配列を有し、グリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド、
（ｉｖ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列のＮ末端側に、配列番号４０で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、且つ（ｉｉｉ）に示されるポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド、
（ｖ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列のＣ末端側に、配列番号４１で示されるアミノ酸配列を有し、グリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド、ならびに
（ｖｉ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列のＣ末端側に、配列番号４１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ（ｖ）に示されるポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド。
項１８．前記リン酸化酵素が、下記（ｖｉｉ）又は（ｖｉｉｉ）に示されるポリペプチドからなる、項１０〜１７のいずれかに記載の製造方法：
（ｖｉｉ）配列番号９、１５〜１７、１９、２２及び２５のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）配列番号９、１５〜１７、１９、２２及び２５のいずれかに示されるアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列以外の領域の１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ前記（ｖｉｉ）のポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド。
項１９．前記リン酸基供与体がポリリン酸である、項１〜１８のいずれかに記載の製造方法。
項２０．前記グリセロールのリン酸化物がα−グリセロリン酸である、項１〜１９のいずれかに記載される製造方法。
項２１．前記リン酸基供与体の存在下でリン酸化酵素をグリセロールに作用させる工程において、反応液のｐＨが４〜５である、項１〜２０のいずれかに記載の製造方法。
項２２．前記リン酸基供与体の存在下でリン酸化酵素をグリセロールに作用させる工程において、リン酸化酵素１重量部当たりのグリセロールの添加量が１０００〜５００００重量部である、項１〜２１のいずれかに記載の製造方法。
項２３．前記リン酸基供与体の存在下でリン酸化酵素をグリセロールに作用させる工程において、反応液中のリン酸基供与体の濃度が２〜１０重量％である、項１〜２２のいずれかに記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のリン酸化方法によれば、グリセロールのリン酸化効率を顕著に高めることができる。また、リン酸供与体として安価なポリリン酸を用いることが可能となり、製造コストを抑えることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】各微生物由来のリン酸化酵素を用いてグリセロールのリン酸化を行った結果を示すグラフである。図１中、（ｉ）はグリセロール４Ｍ、ｐＨ５．０で反応を行った場合、（ｉｉ）はグリセロール４Ｍ、ｐＨ４．０で反応を行った場合、及び（ｉｉｉ）はグリセロール０．５Ｍ、ｐＨ４．５で反応を行った場合の結果を示すグラフである。
【図２】リン酸基供与体の種類をかえてグリセロールのリン酸化反応を行った結果を示すグラフである。
【図３】変異体ａを用いてグリセロールのリン酸化反応を行い、得られたグリセロール−３−リン酸の量を表すグラフである。
【図４】変異体ｂ〜ｇを用いてグリセロールのリン酸化反応を行い、得られたグリセロール−３−リン酸の量を表すグラフである。
【図５】図３中、（ｉ）及び（ｉｉ）はリン酸化酵素変異体Ａ〜Ｌの構造を示す。図３（ｉ）〜（ｉｉ）において、各変異体のアミノ酸配列中の変異箇所を下線で示す。
【図６】変異体Ａ〜Ｌを用いてグリセロールのリン酸化反応を行い、得られたグリセロール−３−リン酸の量を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１．リン酸化酵素
本発明はグリセロールのリン酸化物の製造方法を提供する。当該方法はリン酸基供与体の存在下において、所定のリン酸化酵素をグリセロールに作用させることを特徴とする。以下、本発明のグリセロールのリン酸化物の製造方法を「本発明の方法」と略記することがある。
【００１０】
本発明においてリン酸化の対象となるグリセロールはＣ3Ｈ8Ｏ3で表わされ、１，２，３−トリヒドロキシプロパン又はグリセリンとも呼ばれる。
【００１１】
本発明の方法においては、リン酸化酵素としてクラスＡの酸性ホスファターゼを用いてグリセロールのリン酸化反応を触媒し、グリセロールのリン酸化物を得る。ここで、酸性ホスファターゼとは、他の分子から遊離リン酸基を結合させる働きを持つモノリン酸エステラーゼである。また、クラスＡとは酸性ホスファターゼの分類の一つであり、ＥＤＴＡおよび無機リン酸で酵素活性が阻害されない特性を有する酵素のグループに属することを表す。更に、クラスＡの酸性ホスファターゼは、アミノ酸配列ＫＸ6ＲＰ−（Ｘ12-54）−ＰＳＧＨ−（Ｘ31-54）−ＳＲＸ5ＨＸ3Ｄ（Ｘは任意のアミノ酸を指す）を含む酵素の総称と定義されている（Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｖｏｌ１９，Ｎｏ．１１  ｐｐ２４１２−２４２３より）。
【００１２】
本発明で使用されるリン酸化酵素として、態様（α）：下記配列（１）で表わされる活性中心を含むリン酸化酵素、及び態様（β）：配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むリン酸化酵素が例示される。以下、各リン酸化酵素について詳述する。
【００１３】
（1-1）リン酸化酵素の態様（α）
本発明の方法において使用されるリン酸化酵素の態様（α）として、下記配列（１）（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなる活性中心を含み、且つグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するリン酸化酵素が挙げられる。
―Ｘ1―Ｘ2―Ｘ3−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｘ4―    （１）
ここで、
Ｘ1は、グリシン、アラニン又はフェニルアラニンを示し、
Ｘ2は、任意のアミノ酸を示し、
Ｘ3は、チロシン又はトリプトファンを示し、
Ｘ4は、トレオニン、セリン又はアラニンを示し、
且つ、Ｘ1がフェニルアラニンの場合は、Ｘ4がトレオニン又はセリンである。
【００１４】
前記配列（１）においてＸ2は、いずれのアミノ酸であってもよいが、好ましくは非電荷アミノ酸、非極性アミノ酸、又は酸性アミノ酸、更に好ましくはセリン、アラニン又はアスパラギン酸、特に好ましくはセリンが挙げられる。
【００１５】
また、本発明の方法に使用されるリン酸化酵素の具体的な態様として、配列（１）におけるＸ1、Ｘ2及びＸ4が以下の（Ａ１）〜（Ａ８）のいずれかであるものが挙げられる。
（Ａ１）Ｘ1がグリシン、且つＸ4がトレオニン；好ましくは、Ｘ1がグリシン、Ｘ2がセリン、アラニン、又はアスパラギン酸、且つＸ4がトレオニン；更に好ましくはＸ1がグリシン、Ｘ2がアラニン、且つＸ4がトレオニン、
（Ａ２）Ｘ1がグリシン、且つＸ4がセリン；好ましくは、Ｘ1がグリシン、Ｘ2がセリン、且つＸ4がセリン、
（Ａ３）Ｘ1がアラニン、且つＸ4がセリン；好ましくは、Ｘ1がアラニン、Ｘ2がセリン、且つＸ4がセリン、
（Ａ４）Ｘ1がアラニン、且つＸ4がトレオニン；好ましくは、Ｘ1がアラニン、Ｘ2がセリン、且つＸ4がトレオニン、
（Ａ５）Ｘ1がアラニン、且つＸ4がアラニン；好ましくは、Ｘ1がアラニン、Ｘ2がセリン、且つＸ4がアラニン、
（Ａ６）Ｘ1がグリシン、且つＸ4がアラニン；好ましくは、Ｘ1がグリシン、Ｘ2がセリン、且つＸ4がアラニン、
（Ａ７）Ｘ1がフェニルアラニン、且つＸ4がトレオニン；好ましくは、Ｘ1がフェニルアラニン、Ｘ2がセリン、且つＸ4がトレオニン、
（Ａ８）Ｘ1がフェニルアラニン、且つＸ4がセリン；好ましくはＸ1がフェニルアラニン、Ｘ2がセリン、且つＸ4がセリン。
【００１６】
前記（Ａ１）〜（Ａ８）の態様の中でも、グリセロールのリン酸化をより一層効率的に行うという観点から、好ましくは（Ａ１）の態様が挙げられる。
【００１７】
また、本発明の方法に使用されるリン酸化酵素のより具体的な態様として、配列（１）におけるＸ1、Ｘ2、及びＸ4が以下の（Ｂ１）〜（Ｂ１１）のいずれかであるものが挙げられる。
（Ｂ１）Ｘ1がグリシン、Ｘ2がセリン、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がトレオニン；
（Ｂ２）Ｘ1がグリシン、Ｘ2がアラニン、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がトレオニン；
（Ｂ３）Ｘ1がグリシン、Ｘ2がセリン、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がセリン；
（Ｂ４）Ｘ1がグリシン、Ｘ2がアスパラギン酸、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がトレオニン；
（Ｂ５）Ｘ1がアラニン、Ｘ2がセリン、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がセリン；
（Ｂ６）Ｘ1がアラニン、Ｘ2がセリン、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がトレオニン；
（Ｂ７）Ｘ1がアラニン、Ｘ2がセリン、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がアラニン；
（Ｂ８）Ｘ1がグリシン、Ｘ2がセリン、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がアラニン；
（Ｂ９）Ｘ1がフェニルアラニン、Ｘ2がセリン、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がトレオニン；
（Ｂ１０）Ｘ1がフェニルアラニン、Ｘ2がセリン、Ｘ3がチロシン、且つＸ4がセリン；
（Ｂ１１）Ｘ1がグリシン、Ｘ2がセリン、Ｘ3がトリプトファン、且つＸ4がセリン。
【００１８】
前記（Ｂ１）〜（Ｂ１１）の態様の中でも、グリセロールのリン酸化をより一層効率的に行うという観点から、好ましくは（Ｂ１）の態様が挙げられる。
【００１９】
クラスＡの酸性ホスファターゼのアミノ酸配列において、活性中心が配置される部位については公知であり、本発明で使用されるリン酸化酵素のアミノ酸配列において、上記配列（１）で表わされる活性中心が配置される部位は、当業者であれば適宜設定可能である。
【００２０】
また、クラスＡの酸性ホスファターゼのアミノ酸配列において、活性中心が２つ存在することが知られており、２つの活性中心の内、上記配列（１）で表わされる活性中心はＮ末端側に配置される。２つの活性中心の内、末端側に配置される活性中心は、通常ＲＸ5ＨＸ2Ｓからなるアミノ酸配列（Ｘは任意のアミノ酸を示す）を有しており、上記配列（１）で表わされる活性中心のＣ末端側から通常２０〜５０個、好ましくは３０〜４０個のアミノ酸残基を介して連結している。
【００２１】
また、クラスＡの酸性ホスファターゼのアミノ酸配列において、上記配列（１）で表わされる活性中心よりもＮ末端側およびＣ末端側の各アミノ酸配列も公知であり、本発明で使用されるリン酸化酵素のアミノ酸配列において、上記配列（１）で表わされる活性中心以外のアミノ酸配列は、当業者であれば適宜設定可能である。
【００２２】
態様（α）のリン酸化酵素の全アミノ酸配列における上記配列（１）で表わされる活性中心の位置は、グリセロールのリン酸化を触媒する活性を有する限り特に限定されないが、例えば、配列（１）で表わされるアミノ酸配列において第７位のヒスチジン（Ｈｉｓ）残基がリン酸化酵素（クラスＡの酸性ホスファターゼ）として用いられるポリペプチドのＮ末端から数えて第１２０〜１６０位、好ましくは１２５〜１５５位、更に好ましくは１３０〜１５０位となる位置が挙げられる。また、本発明のグリセロールのリン酸化物の製造方法において使用されるリン酸化酵素は、上記配列（１）で示される活性中心の他に、リン酸化酵素として用いられるポリペプチドのＮ末端から第１６０〜２００位、好ましくは１６５〜１９５位、更に好ましくは１７０〜１９０位となる位置に第２の活性中心としてヒスチジン残基を有していてもよい。
【００２３】
また、本発明において使用されるリン酸化酵素の一態様として、更に下記（Ｉ）又は（ＩＩ）に示されるポリペプチドが挙げられる。
（Ｉ）前記配列（１）で表わされる活性中心をコードするアミノ酸配列部位よりもＮ末端側に配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ＩＩ）前記配列（１）で表わされる活性中心をコードするアミノ酸配列部位よりもＮ末端側に、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ前記（Ｉ）に示されるポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド。
【００２４】
ここで、配列番号２で表わされるアミノ酸配列は、具体的には以下の通りである。
PDERLVLAPPPAPGSAAQ（配列番号２）
【００２５】
配列番号２で示されるアミノ酸配列は、前記配列（１）で表わされる活性中心をコードするアミノ酸配列部位に直接連結されていてもよく、グリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を損なわない限り、例えば７０〜１３０個、好ましくは８０〜１２０個、更に好ましくは９０〜１１０個のアミノ酸を介して連結されていてもよい。また、態様（α）のリン酸化酵素のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を損なわない限り、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＮ末端側に、例えば５〜５０個、好ましくは８〜４０個、更に好ましくは１０〜３０個の任意のアミノ酸配列を含んでいてもよい。更に、態様（α）のリン酸化酵素のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を損なわない限り、配列（１）で表わされる活性中心をコードするアミノ酸配列部位のＣ末端側に、例えば６０〜１２０個、好ましくは７０〜１１０個、更に好ましくは８０〜１００個の任意のアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【００２６】
態様（α）のリン酸化酵素を構成するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の位置は、グリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を損なわない限り特に限定されないが、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列における第１位のアミノ酸残基が、態様（α）のリン酸化酵素として用いられるポリペプチドのＮ末端側から数えて第５位〜４０位、好ましくは第８位〜３５位、更に好ましくは第１０位〜３０位に配置されている態様が挙げられる。
【００２７】
また、前記（ＩＩ）のポリペプチドにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列中の置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸の数としては、対応するポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有していることを限度として、特に制限されないが、例えば、１個又は数個、或いは例えば１〜１０個、より好ましくは１〜８個、更に好ましくは１〜５個、特に好ましくは1〜３個又は１若しくは２個が挙げられる。アミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加された変異体の取得方法については、下記「２．リン酸化酵素の調製」において詳述する。
【００２８】
アミノ酸を付加する場合であれば、付加されるアミノ酸の数としては、例えば１〜１０個、より好ましくは１〜８個、更に好ましくは１〜５個、特に好ましくは1〜３個又は１若しくは２個が挙げられる。また、これらとは別に、各アミノ酸配列のＣ末端に、必要に応じてＨｉｓタグ等のタンパク質精製用の配列が付加されていてもよい。
【００２９】
また、アミノ酸を欠失させる場合であれば、欠失させるアミノ酸の数としては、例えば１〜１０個、より好ましくは１〜８個、更に好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個又は１若しくは２個が挙げられる
【００３０】
また、アミノ酸を挿入する場合であれば、挿入させるアミノ酸の数としては、例えば１〜１０個、より好ましくは１〜８個、更に好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個又は１若しくは２個が挙げられる。
【００３１】
アミノ酸置換を行う場合には、側鎖官能基の性質に基づいて保存的置換を行うことができる。また、対応するポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有する限り、置換前のアミノ酸残基の性質と置換後のアミノ酸残基の性質が異なる非保存的置換であってもよい。天然アミノ酸は、側鎖官能基によって非極性アミノ酸、非電荷アミノ酸、酸性アミノ酸及び塩基性アミノ酸の各カテゴリーに分類される。保存的置換とは、もとのアミノ酸残基と置換後のアミノ酸残基が同一のカテゴリーに分類されるアミノ酸残基であることを指す。ここで、「非極性アミノ酸」として具体的には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプトファン；「非電荷アミノ酸」として、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミン；「酸性アミノ酸」として、アスパラギン酸及びグルタミン酸；「塩基性アミノ酸」として、リジン、アルギニン、及びヒスチジンがそれぞれ挙げられる。
【００３２】
更に、本発明において使用されるリン酸化酵素の他の一態様として、更に下記（ＩＩＩ）〜（ＶＩ）のいずれか示すポリペプチドが挙げられる。
（ＩＩＩ）配列（１）で表わされるアミノ酸配列のＮ末端側に、配列番号２６〜３２及び１０６〜１１０のいずれかに示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ＩＶ）配列（１）で表わされるアミノ酸配列のＮ末端側に、配列番号２６〜３２及び１０６〜１１０のいずれかに示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ（ＩＩＩ）に示される各々対応するポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド、
（Ｖ）配列（１）で表わされるアミノ酸配列のＣ末端側に、配列番号３３〜３９及び１１１〜１１５のいずれかに示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに
（ＶＩ）配列（１）で表わされるアミノ酸配列のＣ末端側に、配列番号３３〜３９及び１１１〜１１５のいずれかに示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ（Ｖ）に示される、対応するポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド。
【００３３】
配列番号２６〜３２、１０６及び１０７は、それぞれ配列番号３〜９、１０４及び１０５において前記配列（１）で表わされる活性中心よりもＮ末端側のアミノ酸配列に相当する。配列番号２６〜３２、１０６及び１０７で示される具体的なアミノ酸配列は以下の通りである。
【００３４】
配列番号２６：
MDAGYLTPATQPDATQYLPPPPQAGSARQAADDHAFESTRGLKGGARWALATSDADLRIEALLRSFSCAAGFTIDASKAPRLAALIHRMDVSEIPDMRNAKASWHRARPFVGNTQSICTEDDRSHLATS
配列番号２７：
MDAHGYLEKSELPDSLQLVPPPPQDDSAALANDETVSKAMLALRGTPRWELAAQDAVLRFPAAATHFSCALGIQIDQTSTPHLVRVLERSMRDASTATSAAKARYQRPRPFMRNAQPMCTPDDDAALRKN
配列番号２８：
MDHPHGYLTAENTPNAANFLPPPPAEGSLREQADIAAYRAMRSLEGSERWAIARADNEIETPGAPRAFDCALGFKFEPEQMPTLTLLMGKMLGDLEMIQTPAKKGYFRKRPFVVEPLPTCIAPETWLAAS
配列番号２９：
MDTAPYLAAGQYPDGMAILPPPPALDSPGAALDMAVFRATRKLEGTPRWRIATDDVTNDPLRRNACAMGMVLDVKTAPALARLLDRAGTGPVVGRVKAAYQVPRPYLREDGPICEAKTAHLASN
配列番号３０：
MDLSQSVSAHTEKSEPSSTYHFHSDPLLYLAPPPTSGSPLQAHDDQTFNSTRQLKGSTRWALATQDADLHLASVLKDYACAAGMNLDIAQLPHLANLIKRALRTEYDDIGRAKNNWNRKRPFVDTDQPICTEKDREGLGKQ
配列番号３１：
MDIGINSDPQLAWSETQFVSPQQVDLARLLPPPPAMDSAEQRDEIALLLQLQKDRTPDMVAFAQADAAREVFRFTDVVGPQFTAEKLPVAAAFFKAVKENGDAILGNAKKHWDRPRPYAASSQIDPCVPKPGN
配列番号３２：
MDTSATAQGGILPDSAAPDERLVLAPPPAPGSAAQSDDDRVFHVTRALKDTPRWKLAQSDADLDPAHVVRDFSCAAGFEIDLARAPHLARVLERIRHAVGHRTSDVKKYWHRTRPFVGTNLPICTSPEGLGLN
配列番号１０６：
MDTGPTVTDPHFKLAPGYLEPASLPVRLALLGGPPKPDSAAFARDEEARRAALALRGSAREKLAATDAELTFPAPAKSFSCALGTDINEKKTPHLYAMMQHVLTDAGGSTYAGKNAYNRTRPFVQHDEGTCRKDMEPVLRTD
配列番号１０７：
MEEAKPFITSQELDLTQYLPAPPADDSAQTQAELKELLQIQATRTPEQEKAAIADAQENVWRFADVMGPGFDAEKLPKTAALFERIVATEDVVDDHAKKAFNRPRPYMLDEQIHPLLKKSKS
【００３５】
配列番号１０８〜１１０は、クラスＡの酸性ホスファターゼのアミノ酸配列である配列番号１０〜１２において、活性中心よりもＮ末端側のアミノ酸配列に相当する。配列番号１０８〜１１０で示される具体的なアミノ酸配列は以下の通りである。
【００３６】
配列番号１０８：
MDALLDGYLSEAEMPDSLLLLSPPPEHNSSLFDLDLEHAKKAVESKDKERFLQAARDADLSFPFAVKSFEPILGIEISETKTPKFYVLMRRVMTDAGLSTYAAKNHYKRERPFMVNNQKTCTPDQENILYKV
配列番号１０９：
MDSAPSLEKDKLAAAAPKGYLSEEATPNLVAILPPPPAGHSAAEAADRAVYNAARAFQGSPRWALATDDVADGGAALLQDYACVLGQRIDQASVPDLMRLLDRARIDIARATRVAKRRYRRLRPFVGNDLPICVARTAELADS
配列番号１１０：
MDSSLFGYTAQAQQFTLPDGRAFLPPPPQAEEPAQQADLRAFEKTRGLKDKARWKLAQNDANLNPSHVIKDFSCAAGFNLDPEKLPAMVNLLTSLAQPVEQDVSNEKDFWKRRRPFVGTNKDICTAHSDGLDNS
【００３７】
配列番号３３〜３９、１１１及び１１２は、配列番号３〜９、１０４及び１０５において前記配列（１）で表わされる活性中心よりもＣ末端側のアミノ酸配列に相当する。配列番号３３〜３９、１１１及び１１２で示される具体的なアミノ酸配列は以下の通りである。
【００３８】
配列番号３３：
LLGWSTALVLAELLPDRSTEILQRGRVFGESRIVCGVHWASDVLEGYMTGAGDIAAMHGNPAFRADLDAARTELEGLRHEAPKPNPQACTIEHDAAAHSPL
配列番号３４：
AIGWTWGLILSEIAPAHRDALLARGRAFGDSRLVCNVHWQSDVIQGRMVGAAAVAALHGNPAFEKDLAAARREIEKAQAKQPTAAAAAACNAEREALKTVLPGVM
配列番号３５：
ALGWAWGLVLAELAPDRADAILRRGLAYGESRAVCGVHYPSDVEAGRIVGATIVTRLKADPAFQADFAKAKEEFDAARAAATEATAACPASLARQ
配列番号３６：
ANGWLEAQILAEVMPDKATAILARGRAYGESRAICGSHSKSAVEAGYMAGASVFAVLQTSPAYQRDLAAARQEAARLRTTAPRPDAQSCVAEAEALRVRP
配列番号３７：
TIGWSVALILAELIPDHAANILQRGQIFGTSRIVCGAHWFSDVQAGYIMASGEIAALHGDADFRRDMELARKELEKARTSAHTPDDLLCKIEQSAR
配列番号３８：
TYGTLMGIILANMVPEKAQALAARAEQYRFNREIGGVHYPSDVAAGRITGTVIAAFLFNSPEFQQQYAAARAEVRSALGLAQ
配列番号３９：
TAGYGMALLLAHLMPEHASAILQRGRVFGESRIVCGAHWKSDVQAGYLNASSLMDVLLARPELQDDLAAARQELLAMQGTAPVPDAGTCAVEHDAAIHSLLSE
配列番号１１１：
SAAGWAWGLVLAEVQPARATELLARGLAFGQSRVVCNAHWQSDVDAGRIMGAATVAVLHDNPAFLADLAAAKREVQDATNANLKPTEDCAAERVALSLSMH
配列番号１１２：
STIGYLMATVLGEMVPEKRNALFARASGYAENRLVAGFHYRSDTVMSRTGAALIAQKMEEQPDFKTEFDAAKAELRAQSGLK
【００３９】
配列番号１１３〜１１５は、クラスＡの酸性ホスファターゼのアミノ酸配列である配列番号１０〜１２において、活性中心よりもＣ末端側のアミノ酸配列に相当する。配列番号１１３〜１１５で示される具体的なアミノ酸配列は以下の通りである。
【００４０】
配列番号１１３：
AVGWAWSLVLIKLFPDKQEEILKRGHDFGESRVICNAHWYSDVEMGRVMGRAAVECLCVNSAFLSDLEEVKKEMAGA
配列番号１１４：
SQGWAYGLIMANLMPEKATQFLVRSRLYGESRVVCGVHWLSDIEAARTGASALVAVLLADPGFRTDLERARTDLKRALSGEGAKPDPALCAREDAAARQPLL
配列番号１１５：
TWGWLTASILASALPDRATQIMQRGRIFGESRIVCGVHWKSDVQAGYMNGSAIFAALQEQPTFTEQMAKVRQELLALRDAKTAPDAKTCAVEQQAAQD
【００４１】
本発明においては、グリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を損なわない限り、態様（α）のリン酸化酵素として、前記配列（１）と、上記Ｎ末端の配列（配列番号２６〜３２及び１０６〜１１０）から選択される１種と、Ｃ末端の配列（配列番号３３〜３９及び１１１〜１１５）から選択される１種との組み合わせを含むものであってもよい。
【００４２】
また、（ＩＶ）又は（ＶＩ）に記載されるポリペプチドにおいて、置換、欠失、挿入又は付加されるアミノ酸の数、置換するアミノ酸の種類等については、前記（ＩＩ）に記載されるポリペプチドの場合と同様である。
【００４３】
本発明の方法において使用される態様（α）のリン酸化酵素としてより具体的には、下記（ＶＩＩ）又は（ＶＩＩＩ）のポリペプチドからなるリン酸化酵素が挙げられる。
（ＶＩＩ）配列番号３〜９、１３、１０４、１０５、１１６、１１７、及び１１９〜１２１のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ＶＩＩＩ）配列番号３〜９、１３、１０４、１０５、１１６、１１７、及び１１９〜１２１のいずれかに示されるアミノ酸配列において、前記配列（１）で表わされるアミノ酸配列からなる活性中心以外の領域の１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ（ＶＩＩ）に示される、対応するポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド。
【００４４】
ここで、（ＶＩＩＩ）に記載されるポリペプチドにおいて、置換、欠失、挿入又は付加されるアミノ酸の数、置換するアミノ酸の種類等については、前記（ＩＩ）に記載されるポリペプチドの場合と同様である。また、これらのポリペプチドを構成するアミノ酸配列中に、配列番号２で示されるアミノ酸配列に相当する配列が含まれる場合、当該配列以外の箇所に変異を導入することが好ましい。
【００４５】
本発明のグリセロールのリン酸化物の製造方法においては、これらのリン酸化酵素から１種を選択して単独で使用してもよく、２種以上を組合せて用いてもよい。
【００４６】
（1-2）リン酸化酵素の態様（β）
本発明の方法において使用されるリン酸化酵素の態様（β）として、下記（ｉ）又は（ｉｉ）に記載されるポリペプチドからなるものが挙げられる。
（ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、グリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、且つ前記（ｉ）に示されるポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド。
【００４７】
上記（ｉｉ）に記載されるポリペプチドにおいて、置換、欠失、挿入又は付加されるアミノ酸の数、置換するアミノ酸の種類等については、前記（ＩＩ）に記載されるポリペプチドの場合と同様である。
【００４８】
配列番号２で示されるアミノ酸配列、及び配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列は、リン酸化酵素のアミノ酸配列における活性中心よりもＮ末端側に配置される部分配列である。態様（β）のリン酸化酵素のアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列は、活性中心よりもＮ末端側に配置されていればよいが、具体的には、配列番号２で示されるアミノ酸配列における第１位のアミノ酸残基が、リン酸化酵素のアミノ酸配列のＮ末端側から数えて第５位〜４０位、好ましくは第８位〜３５位、更に好ましくは第１０位〜３０位に配置されている態様が挙げられる。
【００４９】
また、上記（ｉ）及び（ｉｉ）のポリペプチドにおいて、活性中心のアミノ酸配列については、クラスＡの酸性ホスファターゼの活性中心として機能し得るものであることを限度として特に制限されないが、好ましくは、前記配列（１）で示されるアミノ酸配列が挙げられる。配列（１）で示されるアミノ酸配列については、上記「（1-1）リン酸化酵素の態様（α）」に記載される通りである。
【００５０】
上記（ｉ）及び（ｉｉ）のポリペプチドにおいて、活性中心として前記配列（１）で示されるアミノ酸配列が含まれる場合、配列番号２で示されるアミノ酸配列と配列（１）で表わされる活性中心をコードするアミノ酸配列部位が直接連結されていてもよいが、グリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を損なわない限り、例えば７０〜１３０個、好ましくは８０〜１１０個、更に好ましくは９０〜１１０個のアミノ酸を介して連結されていてもよい。また、上記（ｉ）及び（ｉｉ）のポリペプチドは、グリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を損なわない限り、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＮ末端側に例えば５〜５０個、好ましくは８〜４０個、更に好ましくは１０〜３０個の任意のアミノ酸配列を有するものであってもよい。
更に、上記（ｉ）及び（ｉｉ）のポリペプチドは、グリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を損なわない限り、活性中心をコードするアミノ酸配列部位のＣ末端側に、例えば６０〜１２０個、好ましくは７０〜１１０個、更に好ましくは８０〜１００個の任意のアミノ酸配列を有するものであってもよい。上記（ｉ）及び（ｉｉ）のポリペプチドにおいて、活性中心よりもＣ末端側のアミノ酸配列は、クラスＡの酸性ホスファターゼにおける活性中心よりもＣ末端側のアミノ酸配列と同様であればよい。
【００５１】
また、態様（β）のリン酸化酵素は、更に下記（ｉｉｉ）〜（ｖｉ）に示すアミノ酸配列の少なくとも１種を含むものであってもよい。
（ｉｉｉ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列のＮ末端側に、配列番号４０で示すアミノ酸配列を有し、グリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド、
（ｉｖ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列のＮ末端側に、配列番号４０で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、且つ（ｉｉｉ）に示されるポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド、
（ｖ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列のＣ末端側に、配列番号４１で示されるアミノ酸配列を有し、グリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド、ならびに
（ｖｉ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列のＣ末端側に、配列番号４１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ（ｖ）に示されるポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド。
【００５２】
配列番号４０は、配列番号９において配列番号２に対応するアミノ酸配列のＮ末端側のアミノ酸配列に相当する。配列番号４１は、配列番号９において配列番号２に対応するアミノ酸配列のＣ末端側のアミノ酸配列に相当する。これらの具体的なアミノ酸配列は以下の通りである。
【００５３】
配列番号４０：
MDTSATAQGGILPDSAA
配列番号４１：
SDDDRVFHVTRALKDTPRWKLAQSDADLDPAHVVRDFSCAAGFEIDLARAPHLARVLERIRHAVGHRTSDVKKYWHRTRPFVGTNLPICTSPEGLGLNASYPSGHTTAGYGMALLLAHLMPEHASAILQRGRVFGESRIVCGAHWKSDVQAGYLNASSLMDVLLARPELQDDLAAARQELLAMQGTAPVPDAGTCAVEHDAAIHSLLSE
【００５４】
前記（ｉｖ）又は（ｖｉ）に記載されるポリペプチドにおいて、置換、欠失、挿入又は付加されるアミノ酸の数、置換するアミノ酸の種類等については、前記（ＩＩ）に記載されるポリペプチドの場合と同様である。
【００５５】
本発明の方法において使用される態様（β）のリン酸化酵素としてより具体的には、下記（ｖｉｉ）又は（ｖｉｉｉ）のポリペプチドからなるリン酸化酵素が挙げられる。
（ｖｉｉ）配列番号９、１５〜１７、１９、２２及び２５のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）配列番号９、１５〜１７、１９、２２及び２５のいずれかに示されるアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列以外の領域の１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ前記（ｖｉｉ）のポリペプチドと比べて同等以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチド。
【００５６】
前記（ｉｖ）又は（ｖｉ）に記載されるポリペプチドにおいて、置換、欠失、挿入又は付加されるアミノ酸の数、置換するアミノ酸の種類等については、前記（ＩＩ）に記載されるポリペプチドの場合と同様である。
【００５７】
本発明のグリセロールのリン酸化物の製造方法においては、１種のリン酸化酵素から１種を単独で使用してもよく、２種以上のリン酸化酵素を組合せて用いてもよい。また、前記態様（α）のリン酸化酵素と、態様（β）のリン酸化酵素とを組み合わせて使用してもよい。
【００５８】
２．リン酸化酵素の調製
上述のようなグリセロールのリン酸化反応において触媒活性を有する酵素は、例えば、これらの酵素を有している微生物の培養物から得ることができる。或いは、これらの酵素を有している微生物から目的のリン酸化酵素をコードする塩基配列を取得し、組換えタンパク質として従来公知の方法に従って調製することができる。
【００５９】
配列番号３〜９、１０４及び１０５に示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素は、それぞれ以下の特定の微生物から取得することができる。
【００６０】
即ち、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素は、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｎｓｅｎｉｉから得ることができる。更に、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素はＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅ、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素はＢｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素は、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｔｒｕｅｐｅｒｉ、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素はＺｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素はＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｍａｇｎｅｔｉｃｕｓ、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素はＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓより得ることができる。配列番号１０４で示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素はＳｅｒｒａｔｉａ  ｐｌｙｍｕｔｉｃａより得ることができる。配列番号１０５で示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素はＲａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓより得ることができる。
【００６１】
配列番号３〜９、１０４及び１０５に示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素は、対応する各微生物を培養して菌体を処理することにより得ることができ、より具体的には以下の方法が例示される。
【００６２】
配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素をＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｎｓｅｎｉｉの培養菌体から得る場合、その培養条件は、当該微生物についての公知の培養方法から適宜設定することができるが、例えば、１％ポリペプトン、０．２％乾燥酵母エキス、０．１％硫酸マグネシウムを含む培地中、培養温度３０℃の好気的条件が挙げられる。
【００６３】
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素をＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅの培養菌体から得る場合、その培養条件は、当該微生物についての公知の培養方法から適宜設定することができるが、例えば、１％ポリペプトン、０．２％乾燥酵母エキス、０．１％硫酸マグネシウムを含む培地中、培養温度３０℃の好気的条件が挙げられる。
【００６４】
配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素をＢｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａの培養菌体から得る場合、その培養条件は、当該微生物についての公知の培養方法から適宜設定することができるが、例えば、１％ポリペプトン、０．２％乾燥酵母エキス、０．１％硫酸マグネシウム培地中、培養温度３０℃の好気的条件が挙げられる。
【００６５】
配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素をＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｔｒｕｅｐｅｒｉの培養菌体から得る場合、その培養条件は、当該微生物についての公知の培養方法から適宜設定することができるが、例えば、５％ペプトン、３％牛肉エキスを含む培地中、培養温度２６℃の好気的条件が挙げられる。
【００６６】
配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素をＺｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓの培養菌体から得る場合、その培養条件は、当該微生物についての公知の培養方法から適宜設定することができるが、例えば、０．５％乾燥酵母エキス、２％グルコースを含む培地中、培養温度３０℃の好気的条件が挙げられる。
【００６７】
配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素をＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｍａｇｎｅｔｉｃｕｓの培養菌体から得る場合、その培養条件は、当該微生物についての公知の培養方法から適宜設定することができるが、例えば、０．０２％リン酸２水素カリウム、６０ｐｐｍ塩化アンモニウム、５０ｐｐｍシステイン、０．０５８％フマル酸ナトリウム、０．０４４％ピルビン酸ナトリウム、０．２％鉄−キナ酸溶液、０．４％Ｗｏｌｆｅ’ｓビタミン溶液、０．２％Ｗｏｌｆｅ’ｓミネラル溶液を含む培地中、培養温度３０℃の嫌気的条件が挙げられる。
【００６８】
配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素をＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓの培養菌体から得る場合、その培養条件は、当該微生物についての公知の培養方法から適宜設定することができるが、例えば、０．５％ポリペプトン、０．５％乾燥酵母エキス、０．５％グルコース、０．１％硫酸マグネシウム培地中、培養温度３０℃の好気的条件が挙げられる。
【００６９】
配列番号１０４に示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素をＳｅｒｒａｔｉａ  ｐｌｙｍｕｔｉｃａの培養菌体から得る場合、その培養条件は、当該微生物についての公知の培養方法から適宜設定することができるが、例えば、１％ポリペプトン、０．２％乾燥酵母エキス、０．１％硫酸マグネシウムを含む培地中、培養温度３７℃の好気的条件が挙げられる。
【００７０】
配列番号１０５に示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素をＲａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓの培養菌体から得る場合、その培養条件は、当該微生物についての公知の培養方法から適宜設定することができるが、例えば、１％ポリペプトン、０．２％乾燥酵母エキス、０．１％硫酸マグネシウムを含む培地中、培養温度３０℃の好気的条件が挙げられる。
【００７１】
培養終了後、培養物よりリン酸化酵素を採取する方法は、通常の酵素採取方法を採用することができる。酵素採取方法としては、例えば、培養した菌体を超音波破砕して菌体抽出液を調製し、硫安分画、イオン交換、クロマトフォーカシング、ゲル濾過等の公知の酵素精製に供して採取する方法が挙げられる。また、菌体外に分泌された酵素を含む培養液を酵素溶液として用いても良い。
【００７２】
また、前記配列番号３〜９、１０４及び１０５で示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素を組換えタンパク質として調製し、本発明の方法において使用することもできる。組換えタンパク質としてリン酸化酵素を得る場合、公知の遺伝子工学の手法に基づいて調製を行うことができる。通常は、リン酸化酵素のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ）をベクターに挿入し、宿主細胞に導入して形質転換体を得て、これを培養することによりリン酸化酵素を組換えタンパク質として産生させることができる。配列番号３〜９、１０４及び１０５で示されるミノ酸配列からなるリン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号９４〜１００、１２２及び１２３で示される。なお、各リン酸化酵素の活性を損なわない範囲で後述するベクターに由来する配列が含まれていてもよい。また、リン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドは、コドン利用頻度を使用する宿主のコドン利用頻度に最適化してもよい。
【００７３】
ベクターとしては、適切な宿主細胞内で該ＤＮＡがコードする遺伝子を発現できるものであればいずれでもよい。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター、シャトルベクター等が挙げられる。
【００７４】
本発明においてベクターは、前記本発明の酵素変異体をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ）と作動可能に連結された、プロモーター（Ｔ７プロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の機能的プロモーター；転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位等）；シグナル配列（具体的には、核移行シグナル、小胞体移行シグナル、ＰＴＳ１（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  １）、ＰＴＳ２等）などの制御因子を含んでいてもよい。ここで、作動可能に連結とは、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。
【００７５】
ベクターとしては当該分野において一般的に使用されるものから適宜選択して用いることができるが、より具体的には、ｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＥＴ３９ｂ（＋）等が例示される。
【００７６】
宿主細胞としては、前述のリン酸化酵素をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を含む発現ベクターにより形質転換され、当該ポリヌクレオチドによりコードされたリン酸化酵素を発現することができる細胞であれば、特に制限はされない。
【００７７】
宿主細胞としては、より具体的には、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属等の細菌；ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属等の放線菌；サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等の酵母；ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等のカビなどの微生物が例示される。これらのうち、導入および発現効率の観点から細菌が好ましく、エシェリヒア属の細菌である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の細胞が好ましい。
【００７８】
形質転換の方法は公知であり、宿主細胞の種類等により適宜選択することができ、具体的には、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法、ヒートショック法等が例示される。
【００７９】
形質転換体の培養は、宿主細胞として用いた細胞の種類に応じて従来公知の培養条件に基づいて行うことができる。例えば、大腸菌細胞を宿主細胞として用いた場合の培養条件としては、振盪培養又は通気培養等の好気的条件のもと、培養温度２０〜４０℃、培養期間６〜２４時間、培養液のｐＨ５〜８を挙げることができる。
【００８０】
また、使用する培養培地についても、宿主細胞が生育可能且つ本発明の酵素変異体を産生可能あれば特に限定されず、当該分野において通常採用される、炭素源、窒素源、無機物、アミノ酸、核酸、ビタミン類等を必要量含有する培地を使用することができる。また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００８１】
また、培養終了後に目的のリン酸化酵素を回収する方法は、前述の培養菌体からリン酸化酵素を回収する手法に従えばよい。
【００８２】
更に、アミノ酸配列に、変異（置換、欠失、挿入、付加）を導入する場合は、従来公知の方法に従って行うことができる。アミノ酸変異の導入方法としては、例えば部位特異的変異導入法が挙げられ、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲに基づく手法やＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）の市販キットを利用することにより実施され得る。これらの手法により配列番号９４〜１００、１２２及び１２３で示される塩基配列に基づいて所望の変異を有するリン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを得ることができる。そして、得られたポリヌクレオチドを利用し、上記と同様の公知の遺伝子工学の手法に従って組換えタンパク質としてリン酸化酵素の変異体を調製することができる。
【００８３】
このような変異を有するポリペプチドからなるリン酸化酵素は、変異導入前の対応する各ポリペプチドに対するアミノ酸の配列同一性が２０％以上、好ましくは３０％以上、更に好ましくは４０％以上であり、且つ変異導入前の対応するポリペプチドからなるリン酸化酵素と同等又はそれ以上のグリセロールのリン酸化反応を触媒することが可能であるものが挙げられる。
【００８４】
ポリペプチドの配列同一性については、対比される２つのポリペプチドを最適に整列させ、アミノ酸が両方の配列で一致した位置の数を比較アミノ酸総数で除し、この結果に１００を乗じた数値で表わされる。具体的には、ポリペプチドの配列同一性は、「ＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．１０」（ゼネティックス社）のＭａｘｉｍｕｍ  ｍａｔｃｈｉｎｇプログラムを用いることで決定することができる。
【００８５】
３．グリセロールのリン酸化
本発明のグリセロールをリン酸化する方法においては、グリセロール、リン酸基供与体及び前記リン酸化酵素を溶媒に添加して反応液組成物を調製し、リン酸化反応を行うことができる。あるいは、前記リン酸化酵素を産生し得る前述の微生物の培養物又は前記形質転換体の培養物を、リン酸基供与体の存在下でグリセロールに作用させることによりグリセロールのリン酸化を行ってもよい。
【００８６】
本発明の方法において、培養物とは、菌体を含む培養液、培養菌体、又はその処理物を意味する。ここでその処理物とは、例えば、無細胞抽出液、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、またはそれら菌体の磨砕物等を意味する。さらに、これらの培養物は、固定化酵素あるいは固定化菌体として用いることもできる。なお、固定化は、当業者に周知の方法（例えば共有結合法、物理的吸着法、包括法等）で行うことができる。
【００８７】
リン酸基供与体としては、本発明の酵素変異体に対するリン酸基の供給源として機能し、グリセロールのリン酸化物が生成される限り特に限定されないが、例えば、式（１）：Ｈn+2ＰnＯ3n+1（式中、ｎ≧２）で表わされるポリリン酸が挙げられる。ポリリン酸の重合度は特に限定されないが、好ましくは２〜１００００個、更に好ましくは２〜１０００個の前記構成単位が重合しているものが挙げられる。ポリリン酸として具体的には、ジリン酸（ｎ＝２：ピロリン酸）、トリリン酸（ｎ＝３）、テトラリン酸（ｎ＝４）等が例示される。また、前記式（１）においてｎ＝５以上のリン酸が重合したものもリン酸基供与体として好適に使用することができる。これらの重合度の異なるポリリン酸を２種以上組み合せた混合物をリン酸基供与体として使用してもよい。
【００８８】
更に、本発明で使用されるリン酸基供与体として、前記ポリリン酸のエステルや、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等のポリリン酸塩を使用することもできる。ポリリン酸のエステルとして具体的には、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）等が例示される。また、ポリリン酸塩として具体的には、ピロリン酸ナトリウム（Ｎａ4Ｐ2Ｏ7）、トリポリリン酸ナトリウム（Ｎａ5Ｐ3Ｏ10）、トリポリリン酸カリウム（Ｋ5Ｐ3Ｏ10）、テトラポリリン酸ナトリウム（Ｎａ6Ｐ4Ｏ13）、ヘキサメタリン酸ナトリウム、ピロリン酸アンモニウム塩、トリポリリン酸アンモニウム塩等が例示される。また、リン酸基供与体として前記ポリリン酸の他に、パラニトロフェニルホスフェート、アセチルリン酸等が挙げられる。
【００８９】
本発明においてリン酸基供与体として、好ましくはジリン酸、トリリン酸、テトラリン酸等のポリリン酸；アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）等のポリリン酸のエステル；ピロリン酸ナトリウム、トリポリリン酸ナトリウム、トリポリリン酸カリウム、テトラポリリン酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム等のポリリン酸のアルカリ金属塩；パラニトロフェニルホスフェート、アセチルリン酸が挙げられ、より好ましくはポリリン酸、ポリリン酸のエステル、ポリリン酸のアルカリ金属塩が挙げられ、更に好ましくはポリリン酸、ポリリン酸のアルカリ金属塩が挙げられ、特に安価に入手可能であるという観点より好ましくはポリリン酸が挙げられる。これらのリン酸基供与体を１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合せてもよい。
【００９０】
反応に使用されるリン酸化酵素の濃度としては、反応液組成物中、０．０００１〜５重量％、好ましくは０．００１〜１重量％、更に好ましくは０．００１〜０．５重量％が挙げられる。また、リン酸基供与体の濃度としては、０．５〜２０重量％、好ましくは１〜１５重量％、更に好ましくは２〜１０重量％が挙げられる。また、グリセロールの濃度としては、０．１〜８０重量％、好ましくは１〜６０重量％、更に好ましくは５〜５０重量％が挙げられる。
【００９１】
リン酸化酵素（ポリペプチド）１重量部あたりのリン酸基供与体の添加割合としては、１００〜３００００重量部、好ましくは２５０〜２００００重量部、更に好ましくは５００〜１５０００重量部が挙げられる。また、リン酸化酵素（ポリペプチド）１重量部あたりのグリセロールの添加割合としては、１００〜１０００００重量部、好ましくは５００〜７００００重量部、更に好ましくは１０００〜５００００重量部が挙げられる。
【００９２】
リン酸化反応を実施する際の反応温度としては、１０〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃、更に好ましくは３０〜４０℃が挙げられる。
【００９３】
リン酸化反応を実施する際の反応溶液の至適ｐＨとしては、ｐＨ２〜７、好ましくはｐＨ４〜６、より好ましくはｐＨ３〜５、更に好ましくはｐＨ４〜５が挙げられる。ｐＨの調製は、塩酸、クエン酸、グルコン酸、コハク酸、酢酸、酒石酸、ソルビン酸、乳酸、マレイン酸、硫酸、リン酸、リンゴ酸、アルギニン、アンモニア水、ジイソプロパノールアミン、ジエタノールアミン、トリイソプロパノールアミン、トリエタノールアミン、モノエタノールアミン、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、及びこれらの塩等の緩衝剤従来公知の緩衝剤を用いて行うことができる。
【００９４】
リン酸化反応を実施する際の反応時間は、グリセロールのリン酸化物が生成され得る限り特に限定されないが、例えば、１〜５０時間、好ましくは５〜４０時間、更に好ましくは１０〜３０時間が挙げられる。
【００９５】
反応溶媒としては、通常、イオン交換水、蒸留水、超純水等の水性溶媒を使用することができる。また、水性溶媒中には、本発明の効果を損なわない範囲でメタノール、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の有機溶媒；ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリエチレングリコールｐ−オクチルフェニルエーテル（商品名Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（商品名Ｔｗｅｅｎ  ２０）等の非イオン界面活性剤が含まれていてもよい。
【００９６】
有機溶媒の添加量としては、通常０．１〜５０重量％、好ましくは１〜３０重量％、更に好ましくは５〜２０重量％が例示される。また、非イオン界面活性剤の添加量としては、通常０．０００１〜０．１重量％、好ましくは０．０００５〜０．０５重量％、更に好ましくは０．００１〜０．０１重量％が例示される。
【００９７】
上記反応により得られるグリセロールのリン酸化物を採取する方法としては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等のカラムクロマトグラフィーによる方法；エタノール、アセトニトリル等の有機溶剤を加えて析出させる方法等を挙げることができる。
【００９８】
また、リン酸化酵素（ポリペプチド）１重量部あたりグリセロール５０００〜５００００重量部、ｐＨ４〜６の条件下でグリセロールのリン酸化反応を行う場合、例えば、配列番号３〜９、１０４及び１０５に示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素又はそれらの変異体が挙げられ、好ましくは配列番号４〜８に示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素又はそれらの変異体が挙げられ、更に好ましくは配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素又はその変異体が挙げられる。
【００９９】
本発明のグリセロールのリン酸化物の製造方法において、リン酸化反応の条件を調整し、好適なリン酸化酵素を選択することによって、更に高いリン酸化効率を実現することができる。例えば、リン酸化酵素（ポリペプチド）１重量部あたりグリセロール５０００〜５００００重量部、ｐＨ３〜５の条件下でグリセロールのリン酸化反応を行う場合、例えば、配列番号３、４、８又は９に示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素、又はその変異体が挙げられ、更に好ましくは配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素又はその変異体が挙げられる。
【０１００】
更に、リン酸化酵素（ポリペプチド）１重量部あたりグリセロール２０００〜１００００重量部、ｐＨ４〜５の条件下でグリセロールのリン酸化反応を行う場合、例えば、配列番号３、５又は９に示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素又はその変異体が挙げられ、更に好ましくは配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素又はその変異体が挙げられる。
【０１０１】
本発明の方法においては、グリセロールがリン酸化され得る限り、リン酸基が付与される水酸基の位置は特に限定されないが、得られるリン酸化されたグリセロールの具体例としてグリセロール−３−リン酸（グリセロリン酸とも呼ばれる）が挙げられる。グリセロリン酸にはα体とβ体が存在し、本発明の方法によって得られるグリセロリン酸としてはいずれもが包含され得るが、好ましくはα体のグリセロリン酸が挙げられる。なお、後述する実施例においてはα体のグリセロール−３−リン酸（α−グリセロリン酸とも呼ばれる）が主に生成されることが確認されている。
【実施例】
【０１０２】
以下に試験例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されることを意図するものではない。【０１０３】
［リン酸化酵素の調製］
リン酸化酵素遺伝子の取得
下表１に示される各菌株よりゲノムＤＮＡを調製し、各菌株に対応するプライマーを用いてリン酸化酵素遺伝子をＰＣＲ法により増幅した。【０１０４】
【表１】
0006534612.tif 000002
【０１０５】
形質転換体の調製
配列番号３〜７、９〜１２、１０４及び１０５に関しては、得られたＰＣＲ産物を制限酵素（ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ）で消化し、ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理したｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）とライゲーションによりこれらを連結して、リン酸化酵素発現用ベクターを得た。配列番号８に関しては、得られたＰＣＲ産物を制限酵素（ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ）で消化し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理したｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）とライゲーションによりこれらを連結して、リン酸化酵素発現用ベクターを得た。なお、該ベクターには、リン酸化酵素をコードする領域の他に、更にＴ７プロモーター、産生されるタンパク質をペリプラズムに移行するためのｐｅｌＢシグナル、タンパク質精製のためのＨｉｓタグ遺伝子、及び薬剤選択のためのアンピシリン耐性遺伝子が保持されている。上記方法により得られたベクターをヒートショック法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。【０１０６】
リン酸化酵素の調製
リン酸化酵素発現用ベクターを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の形質転換体の培養は、０．２重量％グルコース、０．５重量％カザミノ酸、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地（ナカライテスク（株）製：（組成）１重量％トリプトン；０．５重量％乾燥酵母エキス；０．５重量％塩化ナトリウム）中で、培養温度２７℃にてインキュベートした。培養液の６００ｎｍにおける光学密度が０．５になったら、０．１ｍＭの濃度となるようにイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを添加し、更に培養温度２７℃で１６〜２４時間、培養を行った。【０１０７】
培養後、湿菌体重量１５ｇを１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波ホモジナイザー（ＴＯＭＹ  ＵＤ２０１）を用いて細胞抽出液を得た。この抽出液を２０，０００×ｇにて２０分間遠心分離操作を行い、上清画分を回収した。６０％飽和度となるよう硫酸アンモニウムを加え、２０，０００×ｇにて２０分間遠心分離操作を行い、沈殿を回収した。この硫安分画後の沈殿を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）にて透析を行った。透析後、Ｈｉｓ−Ｔｒａｐ  ＨＰカラムを用いたアフィニティー精製を行った。リン酸化酵素を含むフラクションを回収後、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）にて透析し、リン酸化酵素を取得した。アフィニティー精製の条件は次の通りである。【０１０８】
リン酸化酵素の精製条件
カラム：Ｈｉｓ−Ｔｒａｐ  ＨＰ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）
平衡化緩衝液：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ塩化ナトリウム
溶出緩衝液：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１Ｍ  イミダゾール
（溶出緩衝液を０〜５０％のグラジエントで溶出）
流速：５．０ｍｌ／ｍｉｎ
精製機器：ＡＫＴＡ  ｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）【０１０９】
得られた各リン酸化酵素の活性中心のアミノ酸配列及びその位置について表２に示す。【０１１０】
【表２】
0006534612.tif 000003
【０１１１】
［試験例１］
上述のようにして得られた各微生物由来のリン酸化酵素（配列番号３〜１２、１０４及び１０５により示される）を用いて、グリセロールのリン酸化を行った。リン酸化反応の条件及び結果を以下に示す。【０１１２】
グリセロールのリン酸化
超純水にグリセロール（４Ｍ又は０．５Ｍ）、リン酸基供与体としてポリリン酸（４重量％）（商品名：ポリリン酸、ナカライテスク社製）、及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００（０．１重量％）を添加して反応混合溶液を調製した。この時、グリセロール４Ｍを使用した場合はＫＯＨで反応液をｐＨ４．０又は５．０に調整し、グリセロール０．５Ｍを使用した場合はＫＯＨで反応液をｐＨ４．５に調整した。更に、反応混合溶液に配列番号３〜１２、１０４及び１０５で示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素を終濃度２０μｇ／ｍｌとなるよう添加した。この反応液を３７℃の恒温エアーインキュベーター内で一晩反応させた。その後、反応液０．１ｍｌを採取し、５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）にて５０〜５００倍に希釈した。このサンプル中におけるグリセロール−３−リン酸濃度を下記条件のグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた酵素法により検出した。【０１１３】
グリセロール−３−リン酸の検出方法
グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ１０Ｕ／ｍｌ、フェリシアンカリウム２ｍＭとなるよう５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）と混合した。この測定溶液０．９ｍｌにリン酸化反応後の溶液を０．１ｍｌ混合し、３７℃で３分間、４２０ｎｍにおける吸光度の減少速度を測定した。既知濃度のグリセロール−３−リン酸を用いた際の吸光度の減少速度から標準曲線を作製し、産生されたグリセロール−３−リン酸の濃度を算出した。結果を図１に示す。図１中、（ｉ）はグリセロール４Ｍ、ｐＨ５．０で反応させた場合、（ｉｉ）はグリセロール４Ｍ、ｐＨ４．０で反応させた場合、（ｉｉｉ）はグリセロール０．５Ｍ、ｐＨ４．５で反応させた場合の結果を示す。なお、コントロールとして５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）の吸光度を測定した（図中、「緩衝液」と示される）。【０１１４】
結果
図１（ｉ）より、グリセロール４Ｍ、ｐＨ５．０で反応させた場合には、配列番号３〜９、１０４及び１０５で示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素を使用してグリセロールのリン酸化を行った場合、他のリン酸化酵素と比較して、リン酸化効率が顕著に高かったことが示された。また、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素は、これらの中でも特に高いグリセロール−３−リン酸を生成し、前記条件下でグリセロールに対して高いリン酸化作用を有していることが示された。この結果から、活性中心として前記配列（１）に示すアミノ酸配列を有しているクラスＡの産生ホスファターゼは、グリセロールのリン酸化酵素として利用できることが明らかとなった。【０１１５】
図１（ｉｉ）より、グリセロール４Ｍ、ｐＨ４．０で反応させた場合には、配列番号３、４、８又は９に示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素を使用してグリセロールのリン酸化を行った場合、他のリン酸化酵素と比較して、リン酸化効率が顕著に高かったことが示された。また、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素は、これらの中でも特に高いグリセロール−３−リン酸を生成し、前記条件下でグリセロールに対して高いリン酸化作用を有していることが示された。【０１１６】
図１（ｉｉｉ）より、グリセロール０．５Ｍ、ｐＨ４．５で反応させた場合には、配列番号３、５又は９で示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素を使用してグリセロールのリン酸化を行った場合、他のリン酸化酵素と比較して、リン酸化効率が高いことが示された。特に配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるリン酸化酵素は、リン酸化効率が顕著に高いことが示された。【０１１７】
［試験例２］
リン酸基供与体の検討
リン酸基供与体の種類をかえて、各リン酸化酵素（配列番号３〜６及び８）によるグリセロールのリン酸化効率を検討した。リン酸基供与体としてピロリン酸ナトリウム、トリポリリン酸ナトリウム、テトラポリリン酸ナトリウム、トリポリリン酸カリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム、又はポリリン酸を使用した。なお、ポリリン酸としてナカライテスク社製  ポリリン酸を使用した。リン酸基供与体の濃度は０．２Ｍとした。但し、ポリリン酸について７．５重量％とした。リン酸化酵素（配列番号３〜６又は８で示されるリン酸化酵素：各０．０２ｍｇ／ｍｌ）、基質（グリセロール）濃度１Ｍ、及びリン酸基供与体を超純水に加えて反応液を調製した。なお、反応液のｐＨは水酸化カリウムもしくは酢酸にてｐＨ５．０となるように調整した。また、反応は、３７℃にて２４時間行った。反応後、生成されたグリセロール−３−リン酸の量を、試験例１と同様の方法に従ってグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた酵素法により測定した。結果を図２に示す。【０１１８】
図２に示されるように、いずれのリン酸基供与体を用いてもグリセロールのリン酸化物が得られることが示された。特に、配列番号３のリン酸化酵素の場合はリン酸基供与体としてトリポリリン酸ナトリウム、テトラポリリン酸ナトリウム、トリポリリン酸カリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム、又はポリリン酸を用いることによって更に効率よくリン酸化物を生成することができた。【０１１９】
また、配列番号４のリン酸化酵素の場合はリン酸基供与体としてヘキサメタリン酸ナトリウム、又はポリリン酸を用いることによって更に効率よくリン酸化物を生成することができた。【０１２０】
配列番号５のリン酸化酵素の場合はリン酸基供与体としてトリポリリン酸ナトリウム、トリポリリン酸カリウム、又はポリリン酸を用いることによって更に効率よくリン酸化物を生成することができた。【０１２１】
配列番号６のリン酸化酵素の場合はリン酸基供与体としてトリポリリン酸ナトリウム、テトラポリリン酸ナトリウム、トリポリリン酸カリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム、又はポリリン酸を用いることによって更に効率よくリン酸化物を生成することができた。【０１２２】
配列番号８のリン酸化酵素の場合はリン酸基供与体としてトリポリリン酸ナトリウム、トリポリリン酸カリウム、又はポリリン酸を用いることによって更に効率よくリン酸化物を生成することができた。【０１２３】
［試験例３］
リン酸化酵素の変異体によるグリセロールのリン酸化
(3-1)活性中心近傍に変異が導入された変異体−１
（変異の導入及び形質転換体の作製）
グリセロールのリン酸化活性が認められなかった配列番号１１に示すアミノ酸配列からなるリン酸化酵素に変異を導入し、変異体ａを作製した。作製方法を以下に示す。【０１２４】
変異体ａは、配列番号１１で示されるアミノ酸配列をコードしている塩基配列をテンプレートとして、表３に示されるプライマーの組み合わせを用い、ＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を、表３中、各変異体の欄に対応して記載される制限酵素で消化した。更に、ＰＣＲ産物を処理したものと同一の制限酵素で処理を行ったｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）と前記制限酵素処理されたＰＣＲ産物をライゲーションすることによりこれらを連結して、グリセロールリン酸化酵素発現用ベクターを得た。なお、該ベクターには、各変異体ａをコードする塩基配列の他、Ｔ７プロモーター、産生されるタンパク質をペリプラズムに移行するためのｐｅｌＢシグナル、タンパク質精製のためのＨｉｓタグ遺伝子、及び薬剤選択のためのアンピシリン耐性遺伝子が保持されている。上記方法により得られたベクターをヒートショック法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。【０１２５】
変異体ａの作製に使用したプライマーセット及び制限酵素サイト、ならびに各プライマーの塩基配列を表３及び４にそれぞれ示す。表３中、変異体の欄において、例えば変異体ａの「F144G/A151T」は、配列番号１１における１４４位のフェニルアラニン残基をグリシン残基に置換し、且つ１５１位のアラニン残基をトレオニン残基に置換したことを示す。【０１２６】
【表３】
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【０１２７】
【表４】
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【０１２８】
（形質転換体の培養）
グリセロールリン酸化酵素発現用ベクターを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の形質転換体の培養は、０．２重量％グルコース、０．５重量％カザミノ酸、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地（ナカライテスク（株）製：（組成）１重量％トリプトン；０．５重量％乾燥酵母エキス；０．５重量％塩化ナトリウム）中で、培養温度２７℃にてインキュベートした。培養液の６００ｎｍにおける光学密度が０．５になったら、０．１ｍＭとなるようにイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを添加し、更に培養温度２７℃で１６〜２４時間、培養を行った。【０１２９】
（グリセロールリン酸化酵素変異体の取得）
培養後、湿菌体重量１５ｇを１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波ホモジナイザー（ＴＯＭＹ  ＵＤ２０１）を用いて細胞抽出液を得た。この抽出液を２０，０００×ｇにて２０分間遠心分離操作を行い、上清画分を回収した。６０％飽和度となるよう硫酸アンモニウムを加え、２０，０００×ｇにて２０分間遠心分離操作を行い、沈殿を回収した。この硫安分画後の沈殿を２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）にて透析を行った。透析後、Ｈｉｓ−Ｔｒａｐ  ＨＰカラムを用いたアフィニティー精製を行った。グリセロールリン酸化酵素を含むフラクションを回収後、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）にて透析し、グリセロールリン酸化酵素変異体を取得した。配列番号１１に示すアミノ酸配列からなるリン酸化酵素と、変異体ａの活性中心のアミノ酸配列を表５に示す。【０１３０】
【表５】
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【０１３１】
精製条件
アフィニティー精製の条件は次の通りである。
カラム：Ｈｉｓ−Ｔｒａｐ  ＨＰ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）
平衡化緩衝液：２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ塩化ナトリウム
溶出緩衝液：２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１Ｍ  イミダゾール
（溶出緩衝液を０−５０％のグラジエントで溶出）
流速：５．０ｍｌ／ｍｉｎ
精製機器：ＡＫＴＡ  ｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）【０１３２】
（グリセロールリン酸化酵素変異体ａを用いたグリセロールのリン酸化）
以上のようにして得られた変異体ａのリン酸化酵素を用いてグリセロールのリン酸化反応を行った。超純水にグリセロール（４Ｍ）、リン酸基供与体としてポリリン酸（７．５重量％）（商品名：ポリリン酸、ナカライテスク社製）を添加して反応混合溶液を調製した。また、ＫＯＨで反応液をｐＨ５．０に調整した。更に、反応混合溶液に変異体ａのリン酸化酵素をそれぞれ終濃度５０μｇ／ｍｌとなるよう添加した。この反応液を３７℃の恒温エアーインキュベーター内で２４時間反応させた。このサンプル中におけるグリセロール−３−リン酸濃度をグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた酵素法により検出した。グリセロールのリン酸化及びグリセロール−３−リン酸の検出は試験例１と同様に行った。結果を図３に示す。【０１３３】
図３に示されるように、リン酸化酵素活性が極めて低かった配列番号１１のリン酸化酵素においてＦ１４４Ｇ／Ａ１５１Ｔの変異が導入された変異体ａは、顕著な酵素活性の向上が認められた。【０１３４】
(3-2)活性中心近傍に変異が導入された変異体−２
グリセロールのリン酸化活性が認められなかった配列番号１１に示すアミノ酸配列からなるリン酸化酵素に変異を導入し、変異体ｂ〜ｇを作製した。変異体ｂ〜ｇの作製方法は、配列番号１１で示されるアミノ酸配列をコードしている塩基配列（ワイルドタイプ）を大腸菌発現用としてコドンを最適化した塩基配列（配列番号１２８）をテンプレートとして用い、表６及び７に示すプライマーを使用したこと以外は、前記(3-1)と同様である。【０１３５】
【表６】
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【０１３６】
【表７】
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【０１３７】
配列番号１１に示すアミノ酸配列からなるリン酸化酵素と、変異体ｂ〜ｇの活性中心のアミノ酸配列を表８に示す。【０１３８】
【表８】
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【０１３９】
前記(3-1)と同条件で、形質転換体の培養、及びグリセロールリン酸化酵素変異体の取得、グリセロールのリン酸化を行った。【０１４０】
得られた結果を図４に示す。この結果から、変異体ｄには、グリセロールリン酸化活性が殆ど認められなかったが、変異体ｂ、ｃ及びｅ〜ｇには、優れたグリセロールのリン酸化活性が認められた。この結果からも、活性中心として前記配列（１）に示すアミノ酸配列を有しているクラスＡの産生ホスファターゼは、グリセロールのリン酸化酵素として利用できることが明らかとなった。【０１４１】
(3-2)Ｎ末端に変異が導入された変異体
配列番号１２に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡをテンプレートとして配列番号９の部分配列で置換された変異体Ａ〜Ｌを作製した。作製方法は、前記（３−１）に記載される変異体ａ〜ｄと同様に行い、下表９に示されるプライマーセット及びテンプレートを用いてＰＣＲ産物を得た。更に、表９中、各変異体に対応して記載される制限酵素サイトに作用する各制限酵素を用いてＰＣＲ産物を処理し、ベクターに挿入した。変異体Ａ〜Ｌの構造を図５（ｉ）及び（ｉｉ）に示す。【０１４２】
Ｎ末端側に変異を導入した変異体Ａ〜Ｌの作製に使用したプライマーセットの組み合わせ、制限酵素サイト及び使用したテンプレートを表９に示し、各プライマーの塩基配列を表１０に示す。表９中、変異体の欄において、例えば変異体Ａの「Ａ１４３−Ｅ２４４」の記載は、配列番号１２の第１４４〜２４２番に該当するアミノ酸配列を、配列番号９における第１４３番のアラニン残基から第２４４番のグルタミン酸残基に該当するアミノ酸配列で置換したことを表す。【０１４３】
【表９】
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【０１４４】
【表１０】
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【０１４５】
（グリセロールリン酸化酵素変異体Ａ〜Ｌを用いたグリセロールのリン酸化）
得られた変異体Ａ〜Ｌを用いてグリセロールのリン酸化反応を行った。グリセロールのリン酸化については前記変異体ａ〜ｄの場合と同様に行い、グリセロール−３−リン酸の検出は試験例１と同様に行った。結果を図６に示す。【０１４６】
図５に示されるように、変異体Ａ〜Ｌを用いてグリセロールのリン酸化反応を行った結果、変異体Ｂ、Ｃ及びＤの場合にグリセロール−３−リン酸の生成量が増加した。従って、配列番号９のアミノ酸配列のＮ末端側から第１〜７０番のアミノ酸配列がグリセロールのリン酸化酵素活性を担っていることが示された。また、変異体Ｆ〜Ｌを用いてグリセロールのリン酸化反応を行った結果、変異体Ｆ及びＩ、Ｌの場合にはリン酸化酵素活性の向上が認められた。一方、その他の変異体Ｇ、Ｈ、Ｊ及びＫについては変異体Ｆ及びＩと比較するとリン酸化酵素活性の向上は大きくはなかった。従って、配列番号９のアミノ酸配列において、Ｎ末端から第１８位のプロリン残基から第３５位のグルタミン残基がグリセロールのリン酸化酵素活性を担っていることが示された。【０１４７】
よって、配列番号２で示されるアミノ酸配列（PDERLVLAPPPAPGSAAQ）がグリセロールのリン酸化反応を触媒する酵素活性の発現に重要であることが示された。
【配列表フリーテキスト】
【０１４８】
配列番号１は配列（１）で表わされるアミノ酸配列である。
配列番号２はリン酸化酵素のＮ末端必須領域のアミノ酸配列である。
配列番号１３は変異体ａ（Ｆ１４４Ｇ／Ａ１５１Ｔ）のアミノ酸配列である。
配列番号１４は変異体Ａ（Ａ１４３−Ｅ２４４）のアミノ酸配列である。
配列番号１５は変異体Ｂ（Ｍ１−Ａ１４３）のアミノ酸配列である。
配列番号１６は変異体Ｃ（Ｍ１−Ｐ１２２）のアミノ酸配列である。
配列番号１７は変異体Ｄ（Ｍ１−Ｒ７０）のアミノ酸配列である。
配列番号１８は変異体Ｅ（Ｓ１２６−Ａ１４３）のアミノ酸配列である。
配列番号１９は変異体Ｆ（Ｐ１８−Ｒ７０）のアミノ酸配列である。
配列番号２０は変異体Ｇ（Ａ２９−Ｒ７０）のアミノ酸配列である。
配列番号２１は変異体Ｈ（Ｒ５３−Ｒ７０）のアミノ酸配列である。
配列番号２２は変異体Ｉ（Ｍ１−Ｐ５２）のアミノ酸配列である。
配列番号２３は変異体Ｊ（Ｍ１−Ａ２５）のアミノ酸配列である。
配列番号２４は変異体Ｋ（Ｍ１−Ａ１７）のアミノ酸配列である。
配列番号２５は変異体Ｌ（Ｍ１−Ｑ３５）のアミノ酸配列である。
配列番号４２はアミノ酸配列３で示されるリン酸化酵素に対するフォワードプライマーである。
配列番号４３はアミノ酸配列３で示されるリン酸化酵素に対するリバースプライマーである。
配列番号４４はアミノ酸配列４で示されるリン酸化酵素に対するフォワードプライマーである。
配列番号４５はアミノ酸配列４で示されるリン酸化酵素に対するリバースプライマーである。
配列番号４６はアミノ酸配列５で示されるリン酸化酵素に対するフォワードプライマーである。
配列番号４７はアミノ酸配列５で示されるリン酸化酵素に対するリバースプライマーである。
配列番号４８はアミノ酸配列６で示されるリン酸化酵素に対するフォワードプライマーである。
配列番号４９はアミノ酸配列６で示されるリン酸化酵素に対するリバースプライマーである。
配列番号５０はアミノ酸配列７で示されるリン酸化酵素に対するフォワードプライマーである。
配列番号５１はアミノ酸配列７で示されるリン酸化酵素に対するリバースプライマーである。
配列番号５２はアミノ酸配列８で示されるリン酸化酵素に対するフォワードプライマーである。
配列番号５３はアミノ酸配列８で示されるリン酸化酵素に対するリバースプライマーである。
配列番号５４はアミノ酸配列９で示されるリン酸化酵素に対するフォワードプライマーである。
配列番号５５はアミノ酸配列９で示されるリン酸化酵素に対するリバースプライマーである。
配列番号５６はアミノ酸配列１０で示されるリン酸化酵素に対するフォワードプライマーである。
配列番号５７はアミノ酸配列１０で示されるリン酸化酵素に対するリバースプライマーである。
配列番号５８はアミノ酸配列１１で示されるリン酸化酵素に対するフォワードプライマーである。
配列番号５９はアミノ酸配列１１で示されるリン酸化酵素に対するリバースプライマーである。
配列番号６０はアミノ酸配列１２で示されるリン酸化酵素に対するフォワードプライマーである。
配列番号６１はアミノ酸配列１２で示されるリン酸化酵素に対するリバースプライマーである。
配列番号６２はプライマー番号（１）の塩基配列である。
配列番号６３はプライマー番号（２）の塩基配列である。
配列番号６４はプライマー番号（３）の塩基配列である。
配列番号６５はプライマー番号（４）の塩基配列である。
配列番号６６はプライマー番号１の塩基配列である。
配列番号６７はプライマー番号２の塩基配列である。
配列番号６８はプライマー番号３の塩基配列である。
配列番号６９はプライマー番号４の塩基配列である。
配列番号７０はプライマー番号５の塩基配列である。
配列番号７１はプライマー番号６の塩基配列である。
配列番号７２はプライマー番号７の塩基配列である。
配列番号７３はプライマー番号８の塩基配列である。
配列番号７４はプライマー番号９の塩基配列である。
配列番号７５はプライマー番号１０の塩基配列である。
配列番号７６はプライマー番号１１の塩基配列である。
配列番号７７はプライマー番号１２の塩基配列である。
配列番号７８はプライマー番号１３の塩基配列である。
配列番号７９はプライマー番号１４の塩基配列である。
配列番号８０はプライマー番号１５の塩基配列である。
配列番号８１はプライマー番号１６の塩基配列である。
配列番号８２はプライマー番号１７の塩基配列である。
配列番号８３はプライマー番号１８の塩基配列である。
配列番号８４はプライマー番号１９の塩基配列である。
配列番号８５はプライマー番号２０の塩基配列である。
配列番号８６はプライマー番号２１の塩基配列である。
配列番号８７はプライマー番号２２の塩基配列である。
配列番号８８はプライマー番号２３の塩基配列である。
配列番号８９はプライマー番号２４の塩基配列である。
配列番号９０はプライマー番号２５の塩基配列である。
配列番号９１はプライマー番号２６の塩基配列である。
配列番号９２はプライマー番号２７の塩基配列である。
配列番号９３はプライマー番号２８の塩基配列である。
配列番号１１６は変異体ｂ（F144Ａ）のアミノ酸配列である。
配列番号１１７は変異体ｃ（F144Ｇ）のアミノ酸配列である。
配列番号１１８は変異体ｄ（A151Ｄ）のアミノ酸配列である。
配列番号１１９は変異体ｅ（A151Ｔ）のアミノ酸配列である。
配列番号１２０は変異体ｆ（A151Ｓ）のアミノ酸配列である。
配列番号１２１は変異体ｇ（F144G/A151Ｓ）のアミノ酸配列である。
配列番号１２４はアミノ酸配列１０４で示されるリン酸化酵素に対するフォワードプライマーである。
配列番号１２５はアミノ酸配列１０４で示されるリン酸化酵素に対するリバースプライマーである。
配列番号１２６はアミノ酸配列１０５で示されるリン酸化酵素に対するフォワードプライマーである。
配列番号１２７はアミノ酸配列１０５で示されるリン酸化酵素に対するリバースプライマーである。
配列番号１２８は、配列番号１１示されるリン酸化酵素をコードする遺伝子を大腸菌発現用としてコドンを最適化した塩基配列である。
配列番号１２９はプライマー番号（５）の塩基配列である。
配列番号１３０はプライマー番号（６）の塩基配列である。
配列番号１３１はプライマー番号（７）の塩基配列である。
配列番号１３２はプライマー番号（８）の塩基配列である。
配列番号１３３はプライマー番号（９）の塩基配列である。
配列番号１３４はプライマー番号（１０）の塩基配列である。
配列番号１３５はプライマー番号（１１）の塩基配列である。
配列番号１３６はプライマー番号（１２）の塩基配列である。
配列番号１３７はプライマー番号（１３）の塩基配列である。
配列番号１３８はプライマー番号（１４）の塩基配列である。
配列番号１３９はプライマー番号（１５）の塩基配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【配列表】
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