(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素をコードする遺伝子が導入された組換えα−ジオキシゲナーゼを過剰発現又は酵素をコードする遺伝子が導入された組換え脂肪酸レダクターゼと前記脂肪酸レダクターゼをホスホパンテテイニル化するホスホパンテテイニルトランスフェラーゼとの組み合わせを過剰発現し、更にトランスアミナーゼを過剰発現し、前記ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ及びトランスアミナーゼは酵素をコードする遺伝子が組み換えによって導入されている、原核細胞触媒。
【請求項２】
前記原核細胞触媒は、更にアミノ酸デヒドロゲナーゼを発現し、前記アミノ酸デヒドロゲナーゼは酵素をコードする遺伝子が組み換えによって導入されている、請求項１に記載の原核細胞触媒。
【請求項３】
前記原核細胞触媒は、更にアルカンヒドロキシラーゼを発現し、前記アルカンヒドロキシラーゼは酵素をコードする遺伝子が組み換えによって導入されている、請求項１又は２に記載の原核細胞触媒。
【請求項４】
前記原核細胞触媒は、更にＡｌｋＬファミリーのポリペプチドを発現し、前記ポリペプチドは酵素をコードする遺伝子が組み換えによって導入されている、請求項１から３までのいずれか１項に記載の原核細胞触媒。
【請求項５】
更にアルコールデヒドロゲナーゼを発現し、前記アルコールデヒドロゲナーゼは酵素をコードする遺伝子が組み換えによって導入されている、請求項１から４までのいずれか１項に記載の原核細胞触媒。
【請求項６】
β酸化に関与する少なくとも１種の酵素の活性が、低減されている、請求項１から５までのいずれか１項に記載の原核細胞触媒。
【請求項７】
ＢｉｏＨ又はその変異体の活性が、低減又は向上されている、請求項１から６までのいずれか１項に記載の原核細胞触媒。
【請求項８】
ＦａｄＬ又はその変異体の活性が、向上されている、請求項１から７までのいずれか１項に記載の原核細胞触媒。
【請求項９】
次の工程
ａ）  カルボン酸又はジカルボン酸又はそれらのモノエステルを準備する工程、
ｂ）  カルボン酸又はジカルボン酸又はこれらのモノエステルを、アルデヒド生成物の形成下で、ホスホパンテテイニル化された脂肪酸レダクターゼ又はα−ジオキシゲナーゼと接触させる工程、及び
ｃ）  工程ａ）からのアルデヒド生成物をトランスアミナーゼと接触させる工程
を有する、カルボン酸又はジカルボン酸又はそれらのモノエステルをアミン又はジアミンに変換する方法であり、
酵素をコードする遺伝子が導入された組換えα−ジオキシゲナーゼを過剰発現又は酵素をコードする遺伝子が導入された組換え脂肪酸レダクターゼと前記脂肪酸レダクターゼをホスホパンテテイニル化するホスホパンテテイニルトランスフェラーゼとの組み合わせを過剰発現し、更にトランスアミナーゼを過剰発現し、前記ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ及びトランスアミナーゼは酵素をコードする遺伝子が組み換えによって導入されている酵素が、請求項１から８までのいずれか１項に記載の原核細胞触媒の形態で準備される、方法。
【請求項１０】
工程ｃ）でアミノ酸デヒドロゲナーゼが存在している、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記カルボン酸又はジカルボン酸又はそれらのモノエステルは、式（Ｉ）
Ｒ1−Ａ−ＣＯＯＲ2          （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、−Ｈ及びＣＯＯＲ3を有する群から選択され、
Ｒ2及びＲ3は、それぞれ相互に無関係に、Ｈ、メチル、エチル及びプロピルを有する群から選択され、ただし、前記基Ｒ2及びＲ3の少なくとも一方はＨであり、
Ａは、少なくとも４個の炭素を有する、非分枝の、分枝した、線状の、環状の、置換又は非置換の炭化水素基を表す］の化合物である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ａは、式−（ＣＨ2）n−を有し、ｎは少なくとも４である、請求項９から１１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
カルボン酸又はジカルボン酸又はそれらのモノエステルのアミノ化のための、請求項１から８までのいずれか１項に記載の原核細胞触媒又は請求項９から１２までのいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項１４】
水溶液中の請求項１から８までのいずれか１項に記載の原核細胞触媒並びに、式（Ｉ）
Ｒ1−Ａ−ＣＯＯＲ2          （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、−Ｈ及びＣＯＯＲ3を有する群から選択され、
Ｒ2及びＲ3は、それぞれ相互に無関係に、Ｈ、メチル、エチル及びプロピルを有する群から選択され、ただし、前記基Ｒ2及びＲ3の少なくとも一方はＨであり、
Ａは、少なくとも４個の炭素を有する、非分枝の、分枝した、線状の、環状の、置換又は非置換の炭化水素基を表す］のカルボン酸又はジカルボン酸又はそれらのモノエステルを有する反応混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えα−ジオキシゲナーゼ及び／又は組換え脂肪酸レダクターゼと脂肪酸レダクターゼをホスホパンテテイニル化するホスホパンテテイニルトランスフェラーゼとの組み合わせを発現し、かつ更にトランスアミナーゼを発現し、このホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ及び／又はトランスアミナーゼは好ましくは組み換えられている全細胞触媒；並びにカルボン酸又はジカルボン酸又はこれらのモノエステルをホスホパンテテイニル化された脂肪酸レダクターゼ又はα−ジオキシゲナーゼと接触させかつこの生成物をトランスアミナーゼと接触させる工程を有するカルボン酸又はジカルボン酸又はそれらのモノエステルをアミン又はジアミンに変換する方法に関する。
【０００２】
ポリアミドは、繰り返すアミド基を特徴とする種類のポリマーである。「ポリアミド」の概念は、化学的に類似するタンパク質とは異なり、通常では合成の、市場で入手可能な熱可塑性プラスチックである。ポリアミドは、従来では分解された炭化水素を介して得られる第１級アミン又は第２級アミンから誘導される。しかしながら、誘導体、正確にはアミノカルボン酸、ラクタム及びジアミンは、ポリマー製造のために使用することもできる。更に、短鎖のガス状のアルカンは、再生可能な原料から出発して生物工学的方法で得ることができる出発材料として重要である。
【０００３】
この種のアミン及びジアミンの従来の化学工学的製造は化石原料の使用に依存していて、非効率であり、この場合、この合成の多くの工程で８０％までの大量の不所望な副生成物が生じる。このようなプロセスの例はラウリンラクタムの製造である。通常では、これは多工程の方法で行われ、この方法は低い収率が生じるだけでなく、同時に高価な設備を準備する必要がある。
【０００４】
この欠点を考慮して、再生可能な原料から出発して生体触媒を使用してアミン及びジアミンを得るための方法が開発された。再生可能な原料として、特に、ナタネ油、ヒゴタイ油（Kugeldisteloel）、パーム核油、ココナッツ油、ヒマワリ種子油及び多くの生物起源の、特に植物由来の類似の天然産物の形で得られる脂肪酸のための供給源が挙げられる。
【０００５】
PCT/EP 2008/067447は、一連の適切な酵素活性を有しかつ、カルボン酸を相応するω−アミノカルボン酸に変換することができる細胞を使用して、化学的に類縁の生成物、正確にはω−アミノカルボン酸を製造するための生物工学システムを記載している。この方法は、酵素による触媒反応のカスケード、特に脂肪酸の末端炭素原子のアルデヒドへの酸化及びトランスアミナーゼ及び、アミノ酸デヒドロゲナーゼを介して再生することができるアミン供与体としてのアミノ酸の使用下での引き続くアミノ化を有する。
【０００６】
しかしながら、この場合に使用されるプセウドモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＧＰＯ１由来のＡｌｋＢＧＴオキシダーゼ系の公知の欠点は、脂肪族アルカンから第１級アルコールへの選択的酸化を果たすことができない点にある。それどころか、多数の酸化生成物が生じ、特に反応時間の増加と共に、相応するアルデヒド、ケトン又は相応するカルボン酸のような高度に酸化された生成物の割合が高くなり（C. Grant, J. M. Woodley and F. Baganz (2011), Enzyme and Microbial Technology 48, 480-486）、これが所望のアミンの収率を相応して低下させる。
【０００７】
この比較的選択的でない酸化の問題は、生じる酸化生成物が構造的に極めて類似していることにより、より深刻となる。これが、所望の酸化生成物を効率的かつ明らかな収率の損失なしで分離することを極めて困難にしている。
【０００８】
この方法の他の欠点は、過剰に酸化された副生成物、例えば出発材料として使用された脂肪酸のジカルボン酸、PCT/EP2011/071491により水性反応混合物から生成物を分離するために使用できる疎水性の溶剤及び疎水性の液状カチオン交換体のリサイクルが、資源利用の効率を損なう点にある。
【０００９】
この関連で、PCT/EP 2008/067447に記載されているような、一つの反応が１つの所定の酵素によってそれぞれ触媒される反応のカスケードを有する生物工学的系の複雑性は、この反応条件の最適化を困難にすることを強調しなければならない。よって、生成物として基本的に反応性のω−アミノ脂肪酸の場合には、このω−アミノ脂肪酸が所定の臨界濃度から細胞の内部で生物の必須成分と反応し、従って毒性に作用する可能性がある。この場合、開発者はその毒性を直接認識できないか又は所定の出発物質、中間体又は生成物を全く分類することができずに、この生物の成長能力及び合成能力は細胞が死に至るまで損なわれる。どの生物が化学的に反応性の物質のどの程度の濃度に耐えられるかも同様に予想できない。
【００１０】
生成物収率の改善及び副生成物の生成の抑制に関しても、当業者は、PCT/EP2008/067447に記載されているように、一つの系において限定的な及び決定的な要因を型どおりに同定することはできない。生成物の収率が低すぎる場合、これは、考慮の対象となる酵素のどれが問題となるのかを知ることなしに酵素の一つが低すぎる濃度で存在する、つまり出発材料が所定の期間で又は競合する酵素による分解の前で、不十分な合成能力に基づいて反応しないことが要因であることがある。これとは別に、酵素が確かにポリペプチドの形で細胞中で検出可能で存在するが、この細胞中ではこの活性のために必須の折り畳みを示さないか又は今日まで未知であるが、活性のために必須の補因子が欠けていることも十分にあり得る。同様に、既に述べたように、代謝生成物が細胞にとって毒性であるか又は分解されることもあり得る。最後に、内在性の酵素、つまり全細胞触媒として使用される細胞中に天然で存在する酵素との交差する相互作用も考えられる。
【００１１】
従って、酵素による触媒反応が選択的に進行しかつ不所望な副生成物の生成が最小化される、脂肪酸からアルキルモノアミン及びアルキルジアミンを製造する方法が必要となる。
【００１２】
この背景から、本発明の基礎となる課題は、収率、炭素収支及び／又は窒素収支及び／又は純度に関してできる限り効率的に、脂肪酸からアルキルモノアミン及びアルキルジアミンを生物工学的に製造する方法を提供することである。
【００１３】
本発明の基礎となる他の課題は、収率、炭素収支及び／又は窒素収支、使用された薬剤の再使用性及び／又は生成物の純度に関してできる限り効率的に、脂肪酸からアルキルモノアミン及びアルキルジアミンを生物工学的に製造する方法を提供することである。この関連で、有効な炭素収支及び／又は窒素収支とは、好ましくは、カルボン酸又はカルボン酸エステルの反応のために適切な基質の形で細胞に消費された炭素及び／又は窒素のできる限り高い割合が、例えば所望ではない他の生成物に反応する代わりに、所望の最終生成物中に見出されることであると解釈される。
【００１４】
本発明の基礎となる他の課題は、脂肪酸からのアルキルモノアミン及び／又はアルキルジアミンの製造から生じる多相反応混合物の後処理性を、特に、後処理のために使用された疎水性溶剤及び液体イオン交換体の再利用性の観点で、並びにカルボン酸又はカルボン酸エステルの反応が進行する水相と、有機溶剤及び／又は液体イオン交換体を有する有機層とを有する二相系の場合の相形成及び相分離の観点で、改善することにある。
【００１５】
これらの課題及び他の課題は、本願の主題により、特に添付された独立請求項の主題により解決され、その際、従属請求項から実施態様が生じる。
【００１６】
本発明の基礎となる課題は、第１の観点で、組換えα−ジオキシゲナーゼ又は組換え脂肪酸レダクターゼと脂肪酸レダクターゼをホスホパンテテイニル化するホスホパンテテイニルトランスフェラーゼとの組み合わせを発現し、かつ付加的にトランスアミナーゼを発現し、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ及び／又はトランスアミナーゼは好ましくは組み換えられている全細胞触媒によって解決される。
【００１７】
この第１の観点の第１の実施態様の場合、この課題は、付加的に、好ましくは組み換えられているアミノ酸デヒドロゲナーゼを発現する全細胞触媒によって解決される。
【００１８】
第１の実施態様の一実施態様でもある第２の実施態様の場合、この課題は、付加的に、好ましくは組み換えられているアルカンヒドロキシラーゼを発現する全細胞触媒によって解決される。
【００１９】
第１〜第２の実施態様の一実施態様でもある第３の実施態様の場合、この課題は、付加的に、好ましくは組み換えられているＡｌｋＬファミリーのポリペプチドを発現する全細胞触媒によって解決される。
【００２０】
第２の実施態様の一実施態様でもある第４の実施態様の場合、この課題は、付加的に、好ましくは組み換えられているアルコールデヒドロゲナーゼを発現する全細胞触媒によって解決される。
【００２１】
第１〜第４の実施態様の一実施態様でもある第５の実施態様の場合、この課題は、β酸化に関与する少なくとも１種の酵素の活性が、全細胞触媒の野生型と比べて低減されている全細胞触媒によって解決される。
【００２２】
第１〜第５の実施態様の一実施態様でもある第６の実施多様の場合、この課題は、ＢｉｏＨ又はその変異体の活性が、全細胞触媒の野生型と比べて低減されているか又は高められている全細胞触媒によって解決される。
【００２３】
第１〜第６の実施態様の一実施態様でもある第７の実施態様の場合、この課題は、ＦａｄＬ又はその変異体の活性が、全細胞触媒の野生型と比べて高められている全細胞触媒によって解決される。
【００２４】
第２の観点において、本発明の基礎となる課題は、
ａ）  カルボン酸又はジカルボン酸又はそれらのモノエステルを準備し、ジカルボン酸である場合には、好ましくはカルボン酸のアルカンヒドロキシラーゼ及び／又はアルコールデヒドロゲナーゼとの接触により準備する工程、
ｂ）  カルボン酸又はジカルボン酸又はこれらのモノカルボン酸を、アルデヒド生成物の形成下で、ホスホパンテテイニル化された脂肪酸レダクターゼ又はα−ジオキシゲナーゼと接触させる工程、
ｃ）  工程ａ）からの生成物を、トランスアミナーゼと接触する工程を有する、
カルボン酸又はジカルボン酸又はそれらのモノエステルをアミン又はジアミンに変換する方法によって解決される。
【００２５】
第２の観点の場合、本発明の基礎となる課題は、工程ｃ）においてアミノ酸デヒドロゲナーゼが存在する方法により解決される。
【００２６】
第２の観点の第１の実施態様の場合、この課題は、ホスホパンテテイニル化された脂肪酸レダクターゼ、α−ジオキシゲナーゼ、トランスアミナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びアルカンヒドロキシラーゼを有する群からの少なくとも１つの酵素が、好ましくは前記群からの、使用される全ての酵素が、１つの全細胞触媒の形で、本発明の第１の観点に提供される方法により解決される。
【００２７】
第１の実施態様の一実施態様でもある第２の実施態様の場合に、この課題は、カルボン酸又はジカルボン酸又はそれらのモノエステルが、式（Ｉ）
Ｒ1−Ａ−ＣＯＯＲ2    （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、−Ｈ及びＣＯＯＲ3を有する群から選択され、
Ｒ2及びＲ3は、それぞれ及び相互に無関係に、Ｈ、メチル、エチル及びプロピルを有する群から選択され、
ただし、基Ｒ2及びＲ3の少なくとも一方はＨであり、
Ａは、少なくとも４個の炭素原子を有する、非分枝の、分枝した、線状の、環状の、置換された又は非置換の炭化水素基を表す］の化合物である、方法により解決される。
【００２８】
第１〜第２の実施態様の一実施態様でもある第３の実施態様の場合、この課題は、Ａが式−（ＣＨ2）n−を有し、ｎは少なくとも４、好ましくは少なくとも１０である、方法により解決される。
【００２９】
第３の観点で、本発明の基礎となる課題は、脂肪酸、ω−ヒドロキシ−脂肪酸、ω−オキソ−脂肪酸又はこれらのモノエステルのアミノ化のための、第１の観点による全細胞触媒又は第２の観点による方法の使用により解決される。
【００３０】
第４の観点で、本発明の基礎となる課題は、水溶液の形の第１の観点による全細胞触媒及び式（Ｉ）
Ｒ1−Ａ−ＣＯＯＲ2    （Ｉ）
［式中、Ｒ1は、−Ｈ、−ＣＨＯ、−ＯＨ及びＣＯＯＲ3を有する群から選択され、
Ｒ2及びＲ3は、それぞれ及び相互に無関係に、Ｈ、メチル、エチル及びプロピルを有する群から選択され、
ただし、基Ｒ2及びＲ3の少なくとも一方はＨであり、
Ａは、少なくとも４個の炭素原子を有する、非分枝の、分枝した、線状の、環状の、置換された又は非置換の炭化水素基を表し、好ましくは式−（ＣＨ2）n−を表し、ｎは、少なくとも４であり、特に好ましくは少なくとも１０である］の脂肪酸、ω−ヒドロキシ−脂肪酸、ω−オキソ−脂肪酸又はこれらのモノエステルを有する反応混合物により解決される。
【００３１】
本発明は、機能的に組み換えられた脂肪酸レダクターゼ又はα−ジオキシゲナーゼが、脂肪酸からアミン及びジアミンを製造するために使用されかつ相応する酵素装備を有する全細胞触媒中で、意外にもアミン及びジアミンの収率を高めるという発明者の知見に基づいている。
【００３２】
更に、本発明は、機能的に組み換えられた脂肪酸レダクターゼ又はα−ジオキシゲナーゼが、脂肪酸からアミン及びジアミンを製造するために使用されかつ相応する酵素装備を有する全細胞触媒中で、意外にも、生じた生成物中での有害な副生成物の濃度、特にジカルボン酸及びそのエステルの形の過剰酸化された脂肪酸の濃度を低減するという発明者の知見に基づいている。
【００３３】
更に、本発明は、機能的に組み換えられた脂肪酸レダクターゼ又はα−ジオキシゲナーゼが、脂肪酸からアミン及びジアミンを製造するために使用されかつ相応する酵素装備を有する全細胞触媒中で、全細胞触媒を有する発酵溶液からアミン及びジアミンを除去するために使用されるオレイン酸のような液体カチオン交換体の純度及び再使用性を改善するという発明者の知見に基づいている。
【００３４】
本発明は、多様な酸化状態にわたる脂肪酸をアミンに変換することを触媒する酵素の他に、脂肪酸レダクターゼ又はα−ジオキシゲナーゼを存在させ、好ましくは、この方法の実施のために全細胞触媒を使用することを特徴とする、カルボン酸又はジカルボン酸又はそれらのモノエステルをアミン又はジアミンに変換する改善された方法に関する。好ましい実施態様の場合に、ここで使用されるような「脂肪酸レダクターゼ」とは、ＡＴＰ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈを消費しながら、ω−カルボキシル酸（ジカルボン酸又はω−カルボキシ−脂肪酸とも言われる）の相応するω−オキソ脂肪酸への変換を触媒する酵素であると解釈される。先行技術において、例えばWO/2010/135624には、ω−ヒドロキシ脂肪酸の製造のための脂肪酸レダクターゼは記載されているが、ω−アミノ脂肪酸の製造する系の一部としては記載していない。更に好ましい実施態様の場合に、脂肪酸レダクターゼは、アミノ酸配列
0006556057.tif 000002
0006556057.tif 000003
0006556057.tif 000004
これらの変異体を有する脂肪酸レダクターゼの群から選択される。
【００３５】
脂肪酸レダクターゼは、その活性のために、ホスホパンテテイニル化、つまり酵素にホスホパンテテイニル補因子の共有結合が必要である酵素群である。従って、本発明により使用される脂肪酸レダクターゼはホスホパンテテイニル化されていて、かつこの脂肪酸レダクターゼを発現する全細胞触媒は、内因性に発現する酵素の装備の一部として又は組み換えられた形で、脂肪酸レダクターゼをホスホパンテテイニル化するホスホパンテテイニルトランスフェラーゼを発現する。好ましい実施態様の場合に、ここで使用されるような「ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ」の概念とは、ホスホパンテテイニル基を、ホスホパンテテイニルＣｏＡから酵素に、好ましくは脂肪酸レダクターゼに移す酵素であると解釈される。特に好ましい実施態様の場合に、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは、アミノ酸配列
0006556057.tif 000005
0006556057.tif 000006
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及びこれらの変異体を有するホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの群から選択される。特に好ましい実施態様の場合に、これは、データバンクコードＡＢＩ８３５６．１を有するホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ又はその変異体である。
【００３６】
これとは別に又は脂肪酸レダクターゼとホスホパンテテイニルトランスフェラーゼとの組み合わせに対して更に、全細胞触媒は、α−ジオキシゲナーゼを有することもできる。好ましい実施態様の場合に、ここで使用されるような「α−ジオキシゲナーゼ」の概念とは、酸素分子を消費しかつ二酸化炭素分子を脱離しながら、カルボン酸及び／又はジカルボン酸又はそれらのモノエステルから、末端のω−炭素原子について、出発材料として使用されたカルボン酸及び／又はジカルボン酸又はこれらのモノエステルと比べて炭素１個分短縮された、末端のω−炭素原子にアルデヒド基を有するカルボン酸及び／又はジカルボン酸又はこれらのモノエステルへの変換を触媒する酵素であると解釈される。特に好ましい実施態様の場合に、α−ジオキシゲナーゼは、アミノ酸配列
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及びその変異体を有するα−ジオキシゲナーゼの群から選択される。特に好ましい実施態様の場合に、これは、データバンクコードＮＰ＿００１０６６７１８．１を有するα−ジオキシゲナーゼ又はこの変異体である。
【００３７】
α−ジオキシゲナーゼ又は脂肪酸レダクターゼとホスホパンテテイニルトランスフェラーゼとの組み合わせの他に、本発明による全細胞触媒は、必然的に、末端のアルデヒド基をアミノ化するトランスアミナーゼを有する。好ましい実施態様の場合に、ここで使用されるような「トランスアミナーゼ」の概念とは、ドナー分子、好ましくはアミノ酸からアクセプター分子、好ましくはα−ケトカルボン酸へのα−アミノ基の移行を触媒する酵素であると解釈される。特に好ましい実施態様の場合に、トランスアミナーゼは、アミノ酸配列
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及びその変異体を有するトランスアミナーゼの群から選択される。
【００３８】
本発明により使用された脂肪酸レダクターゼ及び好ましくは本発明により使用された他の酵素は、組換え酵素である。好ましい実施態様の場合に、ここで使用されるような「組換え」の概念は、相応する酵素をコードする核酸分子が天然細胞中で生じるのではなく及び／又は遺伝子工学的方法を使用して製造されたことであると解釈される。好ましい実施態様において、相応するポリペプチドが組換えられた核酸によりコードされている場合に、組換えタンパク質という。好ましい実施態様の場合に、ここで使用されるような組換え細胞とは、少なくとも１つの組み換えられた核酸又は組み換えられたポリペプチドを有する細胞であると解釈される。当業者には、組換え分子又は組換え細胞の製造のために適した方法は公知であり、これは例えばSambrook/Fritsch/Maniatis (1989): Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press、第２版に記載されている。組換え酵素は、当業者に公知であるｐＥＴベクター系又はｐＧＥＸベクター系の使用下で、好ましくは過剰発現する。
【００３９】
生物の選択に関して、本発明により使用可能な全細胞触媒は、培養可能で、安定でかつ場合により遺伝子工学的に導入可能な修飾、例えば酵素活性を低減するための方法、例えばノックアウトを行うことができる限り、制限はない。これは同様に、原核細胞又は真核細胞であることができる。真核細胞の場合には、単細胞の真核生物が特に好ましく、特に酵母、例えばサッカロミケス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）及びピキア・パストリス（Pichia pastoris）である。原核細胞の場合には、例えば細菌であることができ、この細菌は、マグネトコックス（Magnetococcus）、マリプロフンズス（Mariprofundus）、アセトバクター（Acetobacter）、アセトバクテリウム（Acetobacterium）、アシジフィリウム（Acidiphilium）、アフィピア（Afipia）、アーレンシア（Ahrensia）、アスチッカウリス（Asticcacaulis）、アウランチモナス（Aurantimonas）、アゾリゾビウム（Azorhizobium）、アゾスピリルム（Azospirillum）、バシルス（Bacillus）、バルトネラ・トリボコルム（Bartonella tribocorum）、ベイジェリンキア（Beijerinckia）、ブラジリゾビウム（Bradyrhizobium）、ブレブンジモナス・スブビブリオイデス（Brevundimonas subvibrioides）、ブルセラ（Brucella）、カウロバクター（Caulobacter）、ケラチボランス（Chelativorans）、シトレイセラ（Citreicella）、シトロミクロビウム（Citromicrobium）、クロストリジウム（Clostridium）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、ジノロセオバクター（Dinoroseobacter）、エリトロバクタ−（Erythrobacter）、フルビマリナ（Fulvimarina）、グルコナセトバクター（Gluconacetobacter）、グラヌリバクター（Granulibacter）、ヒルスクヒア（Hirschia）、ホエフレア（Hoeflea）、ヒポミクロビウム（Hyphomicrobium）、ヒポモナス（Hyphomonas）、ケトグロニシゲニウム（Ketogulonicigenium）、ラブレニジア（Labrenzia）、ロクタネラ（Loktanella）、マグネトスピリルム（Magnetospirillum）、マリカウリス（Maricaulis）、マリチミバクター（Maritimibacter）、メソリゾビウム（Mesorhizobium）、メチロバクテリウム（Methylobacterium）、メチロシスチス（Methylocystis）、メチロシヌス（Methylosinus）、ニトロバクタ−（Nitrobacter）、ノボスピンゴビウム（Novosphingobium）、オセアニブルブス（Oceanibulbus）、オセアニカウリス（Oceanicaulis）、オセアニコラ（Oceanicola）、オクロバクトルム（Ochrobactrum）、オクタデカバクタ−（Octadecabacter）、オリゴトロファ（Oligotropha）、パラコックス（Paracoccus）、パルビバクルム（Parvibaculum）、パルブラルクラ（Parvularcula）、ペラギバカ（Pelagibaca）、ファエオバクター（Phaeobacter）、フェニロバクテリウム（Phenylobacterium）、ポリモルフム（Polymorphum）、プセウドビブリオ（Pseudovibrio）、ロドバクター（Rhodobacter）、ロドミクロビウム（Rhodomicrobium）、ロドプセウドモナス（Rhodopseudomonas）、ロドスピリルム（Rhodospirillum）、ロセイビウム（Roseibium）、ロセオバクター（Roseobacter）、ロセオモナス（Roseomonas）、ロセオバリウム（Roseovarius）、ルエゲリア（Ruegeria）、サギッツラ（Sagittula）、シリシバクター（Silicibacter）、スフィンゴビウム（Sphingobium）、スフィンゴモナス（Sphingomonas）、スフィンゴピキシス（Sphingopyxis）、スタルケイア（Starkeya）、スルフィトバクター（Sulfitobacter）、タラッシオビウム（Thalassiobium）、キサントバクター（Xanthobacter）、ジモモナス（Zymomonas）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、リゾビウム（Rhizobium）、シノリゾビウム（Sinorhizobium）、アナプラスマ（Anaplasma）、エールリキア（Ehrlichia）、ネオリケッチア（Neorickettsia）、オリエンチア（Orientia）、リケッチア（Rickettsia）、ボルバキア（Wolbachia）、ボルデテラ（Bordetella）、ブルクホルデリア（Burkholderia）、クプリアビズス（Cupriavidus）、タイワネンシス（Taiwanensis）、ラウトロピア（Lautropia）、リムノバクター（Limnobacter）、ポリヌクレオバクター（Polynucleobacter）、ラルストニア（Ralstonia）、クロモバクテリウム（Chromobacterium）、エイケネラ・コロデンス（Eikenella corrodens）、バスフィア（Basfia）、キンゲラ（Kingella）、ラリバクター（Laribacter）、ルチエラ（Lutiella）、ネイッセリア（Neisseria）、シモンシエイラ（Simonsieila）、アクロモバクター（Achromobacter）、アシドボラキス（Acidovorax）、アリシクリフィルム（Alicycliphilus）、アロマトレウム（Aromatoleum）、アゾアルクス（Azoarcus）、コマモナス（Comamonas）、デクロロモナス（Dechloromonas）、デルフチア（Delftia）、ガリオネラ（Gallionella）、ヘルバスピリウム（Herbaspirillum）、ヘルミニイモナス（Herminiimonas）、ヒレモネラ（Hylemonella）、ジャンチノバクテリウム（Janthinobacterium）、レプトトリキス（Leptothrix）、メチリビウム（Methylibium）、メチロバシルス（Methylobacillus）、メチロフィラレス（Methylophilales）、メチロベルサチリス（Methyloversatilis）、メチロボルス（Methylovorus）、ニトロソモナス（Nitrosomonas）、ニトロソスピラ（Nitrosospira）、オキサロバクター（Oxalobacter）、パラスッテレラ（Parasutterella）、ポラロモナス（Polaromonas）、ポラロモナス（Polaromonas）、プシリモナス（Pusillimonas）、ロドフェラキス（Rhodoferax）、ルブリビバキス（Rubrivivax）、シデロキシダンス（Sideroxydans）、スッテリラ・ワドスウォルテンシス（Sutterella wadsworthensis）、タイロレラ（Taylorella）、タウエラ（Thauera）、チオバシルス（Thiobacillus）、チオモナス（Thiomonas）、バリオボラキス（Variovorax）、ベルミネフロバクター（Verminephrobacter）、アナエロミキソバクター（Anaeromyxobacter）、ブデロビブリオ・バクテリオボルス（Bdellovibrio bacteriovorus）、ビロフィラ（Bilophila）、デスルファルクルス（Desulfarculus）、デスルファチバシルム（Desulfatibacillum）、デスルフォバッカ（Desulfobacca）、デスルフォバクテリウム（Desulfobacterium）、デスルフォブルブス（Desulfobulbus）、デスルフォコックス（Desulfococcus）、デスルフォハロビウム（Desulfohalobium）、デスルフィトバクテリウム（Desulfitobacterium）、
デスルフォミクロビウム（Desulfomicrobium）、デスルフォナトロノスピラ（Desulfonatronospira）、デスルフォタレア（Desulfotalea）、デスルフォビブリオ（Desulfovibrio）、デスルフロモナス（Desulfuromonas）、ゲオバクター（Geobacter）、ハリアンギウム（Haliangium）、ヒッペア（Hippea）、ラウソニア（Lawsonia）、ミキソコックス（Myxococcus）、ペロバクター（Pelobacter）、プレシオシスチス（Plesiocystis）、ソランギウム（Sorangium）、スチグマテラ（Stigmatella）、シントロフォバクター（Syntrophobacter）、シントロフス（Syntrophus）、アルコバクター（Arcobacter）、カミニバクター（Caminibacter）、カンピロバクター（Campylobacter）、ヘリコバクター（Helicobacter）、ニトラチフラクトル（Nitratifractor）、ニトラチルプトル（Nitratiruptor）、スルフリクルブム（Sulfuricurvum）、スルフリモナス（Sulfurimonas）、スルフロスピリウム（Sulfurospirillum）、スルフロブム（Sulfurovum）、ウォリネラ（Wolinella）、ブクネラ（Buchnera）、ブロクマニア（Blochmannia）、ハミルトネラ（Hamiltonella）、レギエイラ（Regieila）、リエシア（Riesia）、シトロバクター（Citrobacter）、クロノバクター（Cronobacter）、ジッケイア（Dickeya）、エドワルジシエラ（Edwardsiella）、エンテロバクター（Enterobacter）、エルウィニア（Erwinia）、エシェリキア（Escherichia）、クレブシエラ（Klebsiella）、パントエア（Pantoea）、ペクトバクテリウム（Pectobacterium）、プロテウス（Proteus）、プロビデンシア（Providencia）、ラーネラ（Rahnella）、サルモネラ（Salmonella）、セラチア（Serratia）、シゲラ（Shigella）、ソダリス（Sodalis）、ウィッグレスウォルチア（Wigglesworthia）、グロッシナ（Glossina）、キセノルハブズス（Xenorhabdus）、イエルシニア（Yersinia）、アシジチオバシルス（Acidithiobacillus）、アシネトバクター（Acinetobacter）、アエロモナス（Aeromonas）、アルカニボラキス（Alcanivorax）、アルカリリムニコラ（Alkalilimnicola）、アロクロマチウム（Allochromatium）、アルテロモナダレス（Alteromonadales）、アルテロモナス（Alteromonas）、バウマンニア（Baumannia）、ベッギアトア（Beggiatoa）、ベルマネラ（Bermanella）、カルソネラ（Carsonella）、ルチア（Ruthia）、ベシコミオソシウス（Vesicomyosocius）、カルジオバクテリウム（Cardiobacterium）、クロモハロバクター（Chromohalobacter）、コルウェリア（Colwellia）、コングレギバクター（Congregibacter）、コキシエラ（Coxiella）、ジケロバクター（Dichelobacter）、エンドリフチア（Endoriftia）、エンヒドロバクター（Enhydrobacter）、フェリモナス（Ferrimonas）、フランシセラ（Francisella）、グラシエコラ（Glaciecola）、ハヘラ（Hahella）、ハロモナス（Halomonas）、ハロロドスピラ（Halorhodospira）、ハロチオバシルス（Halothiobacillus）、イジオマリナ（Idiomarina）、カンギエラ（Kangiella）、レジオネラ（Legionella）、マリノバクター（Marinobacter）、マリノモナス（Marinomonas）、メチロバクター（Methylobacter）、メチロコックス（Methylococcus）、メチロミクロビウム（Methylomicrobium）、メチロファガ（Methylophaga）、モラキセラ（Moraxella）、モリテラ（Moritella）、ネプツニイバクター（Neptuniibacter）、ニトロコックス（Nitrococcus）、プセウドアルテロモナス（Pseudoalteromonas）、プシクロバクター（Psychrobacter）、プシクロモナス（Psychromonas）、レイネケア（Reinekea）、リケッチエラ（Rickettsiella）、サッカロファグス（Saccharophagus）、シェ���ネラ（Shewanella）、スッシナチモナス（Succinatimonas）、テレジニバクター（Teredinibacter）、チオアルカリミクロビウム（Thioalkalimicrobium）、チオアルカリビブリオ（Thioalkalivibrio）、チオミクロスピラ（Thiomicrospira）、トルモナス（Tolumonas）、ビブリオナレス（Vibrionales）、アクチノバシルス（Actinobacillus）、アッグレガチバクター（Aggregatibacter）、ガリバクテリウム（Gallibacterium）、ハエモフィルス（Haemophilus）、ヒストフィルス（Histophilus）、マンヘイミア（Mannheimia）、パスツレラ（Pasteurella）、アゾトバクター（Azotobacter）、セルビブリオ（Cellvibrio）、プセウドモナス（Pseudomonas）、アリイビブリオ（Aliivibrio）、グリモンチア（Grimontia）、ホトバクテリウム（Photobacterium）、ホトバクテリウム・ビブリオ（Photobacterium Vibrio）、プセウドキサントモナス（Pseudoxanthomonas）、ステノトロホモナス（Stenotrophomonas）、キサントモナス（Xanthomonas）、キシレラ（Xylella）、ボルレリア（Borrelia）、ブラキスピラ（Brachyspira）、レプトスピラ（Leptospira）、スピロカエタ（Spirochaeta）、トレポネマ（Treponema）、ホドグキニア（Hodgkinia）、プニセイスピリウム（Puniceispirillum）、リベリバクター（Liberibacter）、ペラギバクター（Pelagibacter）、オジッセラ（Odyssella）、アックムリバクター（Accumulibacter）、特に、Ｂ．スブチリス（B. subtilis）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｃ．グルタミクム（C. glutamicum）、大腸菌（E. coli）、プセウドモナス種（Pseudomonas sp.）、プセウドモナス・フルオレスセンス（Pseudomonas fluorescens）、プセウドモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、プセウドモナス・スツトゼリ（Pseudomonas stutzeri）、アキネトバクター種（Acinetobacter sp.）、ブルクホルデリア種（Burkholderia sp.）、ブルクホルデリア・タイランデニス（Burkholderia thailandensis）、シアノバクテリア、クレブシエラ種（Klebsiella sp.）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、サルモネラ種（Salmonella sp.）、リゾビウム種（Rhizobium sp.）及びリゾビウム・メリロチ（Rhizobium meliloti）を有する群から選択される。特に好ましい実施態様の場合に、これは腸内細菌、最も好ましくは大腸菌（Escherichia coli）である。
【００４０】
トランスアミナーゼにより末端のアルデヒド基のアミノ化の際に消費されたアラニンを無機窒素含有分子から再生するために、本発明による全細胞触媒が、脂肪酸レダクターゼ、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ及びトランスアミナーゼの他に、アラニンデヒドロゲナーゼを有する場合が好ましい。特に好ましい実施態様の場合に、ここで使用されるような「アラニンデヒドロゲナーゼ」の概念とは、水及びＮＡＤ+の消費のもとで、Ｌ−アラニンからピルバート、アンモニア及びＮＡＤＨへの転化又はその逆の反応を触媒する酵素であると解釈される。特に好ましい実施態様の場合に、このアラニンデヒドロゲナーゼは、バシルス・スブチリス（Bacillus subtilis）（データバンクコードＬ２０９１６）、リゾビウム・レグミノサルム（Rhizobium leguminosarum）（データバンクコードＣＰ００１６２２）、ビブリオ・プロテオリチクス（Vibrio proteolyticus）（データバンクコードＡＦ０７０７１６）、マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）（データバンクコードＸ６３０６９）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）（データバンクコードＡＢ０１３８２１）
0006556057.tif 000013
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からのアラニンデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列及びその変異体を有するアラニンデヒドロゲナーゼの群から選択される。アラニンデヒドロゲナーゼにより触媒される反応について、全細胞触媒としてあげられる全ての細胞の一次物質代謝の一部として生成されるピルバートの存在だけでなく、アンモニウムの存在も必要である。後者のアンモニウムは、典型的には、無機窒素塩の形で、例えばアンモニウム塩、硝酸塩などの形で提供される。好ましくは、水性反応媒体に、アンモニウム塩、例えば塩化アンモニウムが添加される。
【００４１】
更に、本発明による全細胞触媒は、特にジアミンの製造のための基質として末端カルボキシ官能基を１つだけ有する脂肪酸を使用する場合に、アルカンヒドロキシラーゼ及び任意に他の、アルカンヒドロキシラーゼの活性のために必要な酵素を発現する場合が好ましい。アルカンヒドロキシラーゼ及び／又は付加的に発現されたアルコールデヒドロゲナーゼは、末端の炭素原子を酸化して、アルデヒド基にし、これを引き続きトランスアミナーゼによってアミノ化することができるか、又はカルボキシ基にし、これをα−ジオキシゲナーゼ又は脂肪酸レダクターゼとホスホパンテテイニルトランスフェラーゼとの組み合わせによって末端アルデヒド基に変換し、これを引き続きトランスアミナーゼによってアミノ化することができる。好ましい実施態様の場合に、ここで使用されるような「アルカンヒドロキシラーゼ」の概念は、少なくとも６個、好ましくは１２個の炭素材料基（Kohlenstoffstoffreste）を有する非置換の線状アルキル基のヒドロキシル化を触媒する酵素であると解釈される。
【００４２】
アルカンヒドロキシラーゼとして、本発明の場合に、特にPCT/EP 2008/067447に記載されているような多数の酸化系が適している。好ましい実施態様の場合に、アルカンヒドロキシラーゼは、ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼである。好ましい実施態様の場合に、「ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ」の概念とは、アルカン結合部位を有しかつアルカンをヒドロキシル化する能力を有する細胞質ゾルのオキシダーゼであると解釈され、これは、更にフェレドキシン及びフェレドキシンレダクターゼを有する３成分系の一部である。特に好ましい実施態様の場合には、アルカニボラキス・ボルクメンシス（Alcanivorax borkumensis）ＳＫ２由来のＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（データバンクコードＹＰ＿６９１９２１）に対して、少なくとも８０％、好ましくは９０％、最も好ましくは９５％又は９９％の配列同一性を有する酵素であるか、又はアルカニボラキス・ボルクメンシス（Alcanivorax borkumensis）ＳＫ２由来のＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（データバンクコードＹＰ＿６９１９２１）に対して、少なくとも８０％、好ましくは９０％、最も好ましくは９５％又は９９％の配列同一性を有しかつ更にアルカンヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド配列を有する酵素である。上述のデータバンクコードは、本願の場合に一貫して、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information, Bethesda, USA）データバンクに関し、正確に言うと２０１２年１１月２１日付けのオンラインで使用可能なバージョンに関する。好ましい実施態様の場合に、「ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ」の概念とは、アルカン、少なくとも５個、好ましくは１２個の炭素材料基を有する非置換の線状アルキル基又は単にヒドロキシル化されたアルカンに対する結合部位を有し、かつそのペプチド鎖はモチーフＬＬ（Ｉ／Ｌ）（Ｖ／Ｉ）ＧＧＮＤＴＴＲＮを有する、膜結合しないオキシダーゼであると解釈される。好ましい実施態様の場合に、ここで使用されるような「ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ」は、好ましくはアルカンヒドロキシラーゼ活性を有する、アルカニボラキス・ボルクメンシス（Alcanivorax borkumensis）ＳＫ２からのＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（データバンクコードＹＰ＿６９１９２１）又はその変異体である。
【００４３】
還元剤、好ましくはＮＡＤＨから電子をＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼに最適に供給するために、細胞に、アルカンヒドロキシラーゼを、これと機能的に相互作用するフェレドキシンレダクターゼ及びこれと機能的に相互作用するフェレドキシンと一緒に発現させるのが好ましい。これは、単離されたポリペプチドであるか又は全細胞触媒の使用の際に同時発現するポリペプチドであるか又はＮ末端又はＣ末端がＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼにより官能化されたポリペプチドであることができる。フェレドキシンレダクターゼ又はフェレドキシンが、所与のＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼと互いに機能的に相互作用するかどうかは、当業者は、還元剤がアルカン基質及びこの３つのポリペプチドの存在で、この３つの内の少なくとも１つが欠ける場合よりも有効に酸化されるかどうかによって容易に確認できる。これとは別に、機能的に相互作用するポリペプチドの場合に反応速度の明らかな向上を示す、Scheps, D., Malca, H., Hoffmann, B., Nestl, B. M,及びHauer, B. (2011) Org. Biomol. Chem., 9, 6727に記載された酵素試験を使用することができる。特に好ましい実施態様の場合に、ＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、フェレドキシン及びフェレドキシンレダクターゼは、同一の生物に由来する。特に好ましい実施態様の場合に、アルカニボラキス・ボルクメンシス（Alcanivorax borkumensis）ＳＫ２由来のフェレドキシンレダクターゼ（データバンクコードＹＰ＿６９１９２３）又はその変異体、アルカニボラキス・ボルクメンシス（Alcanivorax borkumensis）ＳＫ２由来のフェレドキシン（データバンクコードＹＰ＿６９１９２０）又はその変異体、及びアルカニボラキス・ボルクメンシス（Alcanivorax borkumensis）ＳＫ２由来のＣＹＰ１５３ファミリーのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（データバンクコードＹＰ＿６９１９２１）又はその変異体である。
【００４４】
他の好ましい実施態様の場合に、アルカンヒドロキシラーゼは、まず、ＡｌｋＢモノオキシゲナーゼである。ＡｌｋＢは、プセウドモナス・プチダ（Pseudomonas putida）Ｇｐｏ１由来のＡｌｋＢＧＴ系から最初に公知となったオキシドレダクターゼであり、これは２つの他のポリペプチドＡｌｋＧ及びＡｌｋＴに依存する。ＡｌｋＴは、ＮＡＤＨから電子をＡｌｋＧへ引き渡すＦＡＤ依存性ルブレドキシンレダクターゼとして特徴付けられる。ＡｌｋＧは、ルブレドキシンであり、これはＡｌｋＢ用の直接的な電子供与体として機能する鉄含有の酸化還元タンパク質である。好ましい実施態様の場合に、「ＡｌｋＢモノオキシゲナーゼ」の概念は、アルカンを酸化する能力を有する、プセウドモナス・プチダ（Pseudomonas putida）Ｇｐｏ１のＡｌｋＢ（データバンクコード：ＣＡＢ５４０５０．１；このデータバンクコードは、この明細書に使用されている他の全てと同様に、先行技術から、つまりＮＣＢＩデータバンク、より詳細に２０１２年１０月１５日のオンラインで使用可能なリリースに由来する）の配列に対して、少なくとも７５、８０、８５、９０、９２、９６、９８又は９９％（この順序で増大する優位性を示す）の配列相同性を有するポリペプチドであると解釈される。特に好ましい実施態様の場合には、ＡｌｋＢモノオキシゲナーゼは、プセウドモナス・プチダ（Pseudomonas putida）Ｇｐｏ１由来のＡｌｋＧ（ＣＡＢ５４０５２．１）ポリペプチド及びＡｌｋＴ（ＣＡＢ５４０６３．１）ポリペプチドと機能的に相互作用する、アルカンを酸化するオキシドレダクターゼである。ＡｌｋＢアルカンヒドロキシラーゼに電子を最適に供給するために、細胞に、アルカンヒドロキシラーゼを、これと機能的に相互作用する補助タンパク質、好ましくはＡｌｋＧ及び／又はＡｌｋＴ又はこれらの変異体と一緒に発現させるのが好ましく、特に好ましい実施態様の場合に、これは、プセウドモナス・プチダ（Pseudomonas putida）Ｇｐｏ１由来のＡｌｋＧ（ＣＡＢ５４０５２．１）ポリペプチド又はＡｌｋＴ（ＣＡＢ５４０６３．１）ポリペプチドである。
【００４５】
全細胞触媒を使用する場合に、基質を細胞内に局在化された酵素と接触させ、それによって所望の反応を引き起こさなければならないという課題が課せられることがある。長鎖アルカン及びその誘導体の場合には、全細胞触媒がＡｌｋＬファミリーのポリペプチドを有することが好ましい。ＡｌｋＬは、プセウドモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来の膜タンパク質であり、これは、長鎖脂肪酸及びその誘導体を細菌細胞内へ取り込むことができる。好ましい実施態様の場合に、ここで使用されるような「ＡｌｋＬファミリーのポリペプチド」は、プセウドモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のＡｌｋＬ（データバンクコードＣＡＢ６９０８１）又はプセウドモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のＡｌｋＬの変異体に対して、２３０の互いに連続するアミノ酸の長さにわたり、少なくとも８０％、好ましくは９０％、更に好ましくは９０％の配列同一性を有し、かつ好ましくは長鎖アルカンの細胞内部への取り込みを支援する能力を有するポリペプチドである。他の実施態様の場合に、ここで使用されるような「ＡｌｋＬファミリーのポリペプチド」は、グラム陰性細菌の外側の膜中に局在する、配列モチーフＤＸＷＡＰＡＸＱ（Ｖ／Ａ）ＧＸＲ（この場合、Ｘは、タンパク質構成アミノ酸を表す）を有するポリペプチドであり、好ましくは更にプセウドモナス・プチダからのＡｌｋＬ（データバンクコードＣＡＢ６９０８１）又はその誘導体である。ＡｌｋＬファミリーの例示的な構成員は、プセウドモナス・プチダ（Pseudomonas putida）からのＡｌｋＬ（データバンクコードＣＡＢ６９０８１）、マリノバクター・アクアエオレイ（Marinobacter aquaeolei）ＶＴ８（データバンクコードＹＰ＿９５７７２２）、オセアニカウリス・アレクサンドリイ（Oceanicaulis alexandrii）ＨＴＴＣＣ２６３３（データバンクコードＺＰ＿００９５３５８４）、マリノバクター・マンガノキシダンス（Marinobacter manganoxydans）Ｍｎｌ７−９（データバンクコードＺＰ＿０９１５８７５６）、カウロバクター種（Caulobacter sp.）Ｋ３１（データバンクコードＹＰ＿００１６７２２１７）、プセウドモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）（データバンクコードＱ００５９５）及びこれらの変異体を有する。
【００４６】
本発明の教示は、ここで関連する正確なアミノ酸配列又は核酸配列を有するマクロ分子の使用下だけでなく、又はここで関連する正確なアミノ酸配列を有するポリペプチドの、それぞれの野生型と比べて低減された活性を有する細胞の使用下だけでなく、この種のマクロ分子の変異体の使用下、又は１つ又はそれ以上のアミノ酸又は核酸の欠失、付加又は置換により得られるポリペプチドの変異体の、それぞれの細胞のそれぞれの野生型と比べて低減された活性を有する細胞の使用下でも行うことができる。好ましい実施態様の場合には、核酸配列又はアミノ酸配列の「変異体」の概念は、以後、ここで使用されるような「相同体」の概念と同じ意味又は交換可能に使用され、相応する当初の野生型核酸配列又はアミノ酸配列に関して、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９４、９６、９８、９９％又はそれ以上のパーセントの相同性（ここでは同一性と同じ意味で使用される）を有する配列を有するか又は配列である他の核酸配列又はアミノ酸配列を意味し、この場合、好ましくは触媒活性中心を形成するアミノ酸又は構造及び折り畳みのために重要なアミノ酸とは異なるアミノ酸が欠失又は置換されているか、又は単に同類置換されている、例えばアスパルタートに代えてグルタマート、又はバリンに代えてロイシンで置換されている。先行技術は、２つの配列の相同性の程度を計算するために使用することができるアルゴリズムを記載している、例えばArthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics、第３版。本発明の他の好ましい実施態様の場合に、アミノ酸配列又は核酸配列の変異体は、好ましくは上述の配列相同性に加えて更に、主に野生型分子又は当初の分子と同じ酵素活性を有する。例えば、プロテアーゼとしての酵素活性のポリペプチドの変異体は、このポリペプチド酵素と同じ又はほぼ同じタンパク質分解活性、つまりペプチド結合の加水分解を触媒する能力を有する。特に好ましい実施態様の場合に、「ほぼ同じ酵素活性」の概念は、野生型ポリペプチドの基質に関して、バックグラウンド活性を明らかに越える及び／又は同じ基質に関して野生型ペプチドが有するＫM値及び／又はｋcat値の３桁未満異なる、好ましくは２桁未満異なる、更に好ましくは１桁未満異なる活性を意味する。他の好ましい実施態様の場合に、核酸配列又はアミノ酸配列の「変異体」の概念は、この核酸配列又はアミノ酸配列の少なくとも１つの活性部分／又は断片を有する。他の好ましい実施態様の場合に、ここで使用されるような「活性部分」の概念は、このアミノ酸配列の完全な長さよりは短い長さを有する又はアミノ酸の完全な長さよりは短い長さをコードするアミノ酸配列又は核酸配列を意味し、この場合、野生型アミノ酸配列よりも短い長さを有するアミノ酸配列又はコードされたアミノ酸配列は、野生型ペプチド又はその変異体、例えばプロテアーゼとほぼ同じ酵素活性を有する。特別な実施多様の場合に、核酸の「変異体」の概念は、その相補的な鎖が、好ましくはストリンジェントな条件下で、野生型核酸と結合する核酸を有する。ハイブリダイズ反応のストリンジェンシーは、当業者に容易に決定でき、かつ一般にプローブの長さ、洗浄時の温度及び塩濃度に依存する。一般に、比較的長いプローブはハイブリダイゼーションのために比較的高い温度を必要とし、比較的短いプローブは比較的低い温度で十分である。ハイブリダイゼーションが行われるかどうかは、一般に、変性されたＤＮＡの、その周囲に、しかも融点未満で存在している相補的鎖にアニーリングする能力に依存する。ハイブリダイズ反応のストリンジェンシー及び相応する条件は、F M Ausubel (1995), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc.に詳細に記載されている。ハイブリダイズを用いてＤＮＡ配列を同定するための手引きについて、当業者は、特にFirma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim,ドイツ国, 1993)社のハンドブック「The DIG System Users Guide for Filter Hybridization」及びLiebl et al.著（International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)）で得られる。このハイブリダイズは、好ましい実施態様の場合に、ストリンジェントな条件下で、つまり、このプローブと目標配列、つまりプローブで処理されるべきポリヌクレオチドとが少なくとも７０％同一である場合にだけハイブリッドを形成する条件下で行われる。洗浄工程を含めたハイブリダイズのストリンジェンシーとは、緩衝剤組成、温度及び塩濃度の変更により影響されるか又は決定されることは公知である。このハイブリダイズ反応は、一般に、洗浄工程と比較して、比較的低いストリンジェンシーで実施される（Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996）。このハイブリダイズ反応のために、例えば５×ＳＳＣ緩衝剤に相応する緩衝液が、約５０℃〜６８℃の温度で使用することができる。この場合、プローブは、プローブの配列に対して７０％未満の同一性を有するポリヌクレオチドともハイブリダイズすることができる。このようなハイブリッドはあまり安定でなく、ストリンジェントな条件下で洗浄により除去される。これは、例えば塩濃度を２×ＳＳＣに低下させかつ場合により引き続き０．５×ＳＳＣ（The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim、ドイツ国、1995）に低下させることによって達成することができ、その際、約５０℃〜６８℃、約５２℃〜６８℃、約５４℃〜６８℃、約５６℃〜６８℃、約５８℃〜６８℃、約６０℃〜６８℃、約６２℃〜６８℃、約６４℃〜６８℃、約６６℃〜６８℃の温度（この順序で優位性が増大する）に調節される。約６４℃〜６８℃又は約６６℃〜６８℃の温度範囲が好ましい。場合により、塩濃度を相応して０．２×ＳＳＣ又は０．１×ＳＳＣの濃度にまで低下させることもできる。ハイブリダイズ温度を、約１〜２℃の段階で段階的に５０℃から６８℃まで高めることにより、使用した核酸分子の配列に対して、少なくとも７０％又は少なくとも８０％又は少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性（例えば、この順序で優位性が増大する）を有するポリヌクレオチドフラグメントを単離することができる。ハイブリダイズの他の手引きは、いわゆるキットの形で市場で入手できる（例えば、Roeche Diagnostics GmbH社のDIG Easy Hyb, Mannheim, ドイツ国, カタログ番号: 1603558）。好ましい実施態様の場合に、ここで使用されるような核酸の「変異体」の概念は、当初の核酸と同じアミノ酸配列又はこのアミノ酸配列の、遺伝子コードの縮重の範囲内での変異体をコードする任意の核酸配列を有する。
【００４７】
好ましい実施態様の場合に、本発明により使用される細胞は、その野生型と比べて少なくとも１つの酵素の低減された活性を有し、この酵素は、脂肪酸のβ酸化の反応の一つを触媒し、好ましくは、脂肪酸ＣｏＡリガーゼ、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、２，４−ジエノイルＣｏＡレダクターゼ、エノイルＣｏＡヒドラターゼ及び３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ、脂肪酸インポーター又はこれらの変異体を有する群からなる酵素である。脂肪酸のβ酸化は広く知られた物質代謝経路であり、この物質代謝経路は、原核生物及び真核生物が同様に脂肪酸を酸化しかつその中に含まれる化学エネルギーを物質代謝に使用することを可能にしている。広い意味範囲では、これは脂肪酸の細胞内への取り込みから始まる。そこで、脂肪酸は、条件を必要とする限り、まずＣｏＡ脂肪酸エステルのβ位置でアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼによって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の場合にはＦａｄＥによって酸化される。類似の分子が、これとは別に、二価不飽和脂肪酸から、２，４−ジエノイルＣｏＡレダクターゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の場合にはＦａｄＨによる還元によって形成することもできる。多機能性酵素、エノイルＣｏＡヒドラターゼ／３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の場合にはＦａｄＢは、引き続き、第２級アルコールの形成下での水和、及びその引き続くケトンへの酸化を触媒する。最後の段階で、３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の場合にはＦａｄＡは、アセチルＣｏＡ及び出発分子と比べて炭素原子２個分短縮された脂肪酸のＣｏＡエステルを遊離する結果を伴って、ケトアシルＣｏＡの分解を触媒する。同様にアセチルＣｏＡが問題とならない場合には、後者は新たにβ酸化回路に供給され、酸化下で短縮される。脂肪酸のβ酸化の調節についてはＦａｄＲも関与し、これは脂肪酸分解のために必要な遺伝子を有するＦａｄオペロンのレギュレータであり、ＦａｄＲはβ酸化の反応を触媒することはない。好ましい実施態様の場合に、「脂肪酸のβ酸化の反応の一つを触媒する酵素」の概念とは、脂肪酸基質又はアセチルＣｏＡへの経路でその基質から生じる分子と直接相互作用する、好ましくはこれを基質として認識し、かつその分解経路で詳細にはアセチルＣｏＡでの分解経路にある物質代謝産物への変換を触媒する、好ましくは脂肪酸の細胞内への取り込みを行うことを含むあらゆる酵素であると解釈される。例えば、この酵素には、先行する定義により、アセチルＣｏＡデヒドロゲナーゼが挙げられる、というのも、これは脂肪酸ＣｏＡエステルと相互作用し、かつ詳細にはアセチルＣｏＡでのβ酸化の物質代謝経路で脂肪酸ＣｏＡエステルとして存在するエニオールＣｏＡへの変換を触媒するためである。特に好ましい実施態様の場合に、ここで使用されるような「脂肪酸のβ酸化の反応の一つを触媒する酵素」の概念とは、大腸菌（E. coli）由来の遺伝子産物ＦａｄＡ、ＦａｄＢ、ＦａｄＤ、ＦａｄＬ及びＦａｄＥ及び／又はその変異体又は他の生物由来の相同体を含む群からなるあらゆる酵素であると解釈される。大腸菌（E. coli）由来の遺伝子産物ＦａｄＡ、ＦａｄＢ、ＦａｄＤ、ＦａｄＬ及びＦａｄＥ、同様にその変異体及び多数の他の生���工学的に利用可能な生物由来の同族体及びその核酸配列及びポリペプチド配列は、先行技術に記載されていて、例えばＦａｄＡはアクセス番号ＡＰ００９０４８．１で、ＦａｄＢは、アクセス番号ＢＡＥ７７４５７．１で、ＦａｄＤは、アクセス番号ＢＡＡ１５６０９．１で、及びＦａｄＥは、アクセス番号ＢＡＡ７７８９１．２で記載されている。この先行技術は、脂肪酸のβ酸化の反応の一つを触媒する酵素の活性を測定するために特に適している多数の試験を、例えば、K Kameda & W D Nunn (1981) J. Biol. Chem. 256, 5702-5707, Hi Marrakchi, W E DeWolf, C Quinn, J West, B J Polizzi, C Y So et al. (2003) Biochem. J. 370, 1055-1062, Lobo et al. (2001 )及びX Yu, T Liu, F Zhu, and C Khosla (2011) PNAS、印刷前の電子公開版に開示している。
【００４８】
本発明による全細胞触媒の効率にとって、反応させる基質、好ましくはカルボン酸又はジカルボン酸又はそのモノエステルが、全細胞触媒の内部に局在している本発明による必要な酵素と容易に接触することができる場合が好ましい。従って、基質が細胞の内部にまで到達できることが重要である。これを容易にするために、全細胞触媒は、脂肪酸インポーターを、細菌性の、特にグラム陰性の全細胞触媒の場合には、特に好ましくは脂肪酸インポーターＦａｄＬ（データバンクコード：ＢＡＡ１６２０５．１）又はその変異体を発現する、好ましくは相応する全細胞触媒の野生型の活性と比べて高められた濃度でかつ活性で発現することが好ましい。細胞の野生型と比べてポリペプチドの活性を高めることは、当業者に日常的に用いられる多様な方法、例えば、プロモータと機能的に結合する、ポリペプチドをコードする核酸配列の付加的なコピーの組み込み又は天然のプロモータをより強いプロモータに交換することで達成することができる。
【００４９】
全細胞触媒中で内因性で発現される酵素に関する背景が、本発明による方法の又は本発明による細胞の使用下での出発物質、中間体及び生成物、好ましくはω−アミノカルボン酸、ω−ヒドロキシカルボン酸、ω−オキソカルボン酸及びジカルボン酸のメチルエステルを物質代謝経路で分解するか又は他の方法で修飾し、所望な生成物の生成を妨げる内因性酵素の活性を低減又は停止するように最適化されている場合に、アミン及びジアミンが本発明により比較的高い収率でかつ比較的高い純度で生産されることが明らかになった。この背景を前提として、本発明による全細胞触媒は、野生型と比較して、エステラーゼＢｉｏＨ［データバンクコードＹＰ＿４９２０２０．１］又はその変異体の低減された活性を有する細胞である場合が好ましい。低減されたＢｉｏＨ活性を有するこの種の細胞、その製造及び活性を決定する試験は、欧州特許出願EP 12007663.3に記載されている。
【００５０】
カルボン酸、ジカルボン酸又はこれらのモノエステルとして、例えばこれらの基質の有用性の改善又は遊離カルボン酸又はジカルボン酸の毒性の理由から、末端のカルボキシル基が高い程度で、好ましくは少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５又は９９パーセントまでエステルの形で存在するこれらの化合物の混合物を使用する場合について、モノエステルは、完全にエステル化されたジカルボン酸の部分的又は完全な加水分解により又は遊離カルボン酸は完全にエステル化されたカルボン酸の部分的又は完全な加水分解により準備されていてもよい。この場合について、細胞のエステル加水分解のための能力を適切なエステラーゼの過剰発現により高めることが好ましい。好ましい実施態様の場合には、このために、エステルヒドロラーゼＢｉｏＨ又はその変異体の活性を、使用された全細胞触媒の野生型と比べて、特に好ましくは過剰発現によって高める。相応するモノエステル及び／又はエステル化されていないカルボン酸又はジカルボン酸は、次いでエステルヒドロラーゼによってin situで準備される。完全にエステル化されたジカルボン酸の部分的又は完全な加水分解は、例えば低いｐＨ値の場合に、化学的に触媒される加水分解によって行うこともできる。
【００５１】
本発明による全細胞触媒は、カルボン酸又はジカルボン酸又はそれらのモノエステルを相応するアミン又はジアミンに反応させる方法において好ましくは使用することができ、この場合カルボン酸又はジカルボン酸又はそれらのモノエステルは、一般式（Ｉ）
Ｒ1−Ａ−ＣＯＯＲ2                （Ｉ）
であり、Ｒ1は、−Ｈ及びＣＯＯＲ3を有する群から選択され、Ｒ2及びＲ3は、それぞれ相互に無関係に、Ｈ、メチル、エチル及びプロピルを有する群から選択され、ただし、基Ｒ2及びＲ3の少なくとも一方はＨであり、Ａは、少なくとも４個の炭素原子を有する、非分枝の、分枝された、線状の、環状の、置換又は非置換の炭化水素基である。好ましい実施態様の場合に、Ａは式−（ＣＨ2）n−の構造であり、ｎは、好ましくは４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０である。最も好ましい実施態様の場合に、カルボン酸又はジカルボン酸は、ラウリン酸又はω−カルボキシラウリン酸である。他の最も好ましい実施態様の場合に、このカルボン酸は、式ＣＨ3−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨのカルボン酸であり、ｎは、好ましくは４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０であり、好ましくはヘキサン酸又はデカン酸である。他の最も好ましい実施態様の場合に、カルボン酸又はジカルボン酸は、式ＨＯＯＣ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨのジカルボン酸であり、ｎは、好ましくは４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０であり、好ましくはω−カルボキシヘキサン酸又はω−カルボキシデカン酸である。他の最も好ましい実施態様の場合に、カルボン酸又はジカルボン酸は、ω−カルボキシテトラデカン酸である。相応して、本発明により製造されたアミン又はジアミンは、好ましくは式ＣＨ3−（ＣＨ2）n−ＮＨ2又はＮＨ2−（ＣＨ2）n−ＮＨ2の化合物であり、ｎはそれぞれ、好ましくは４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０である。
【００５２】
カルボン酸又はジカルボン酸又はそれらのモノエステルに関して、本願明細書で記載された全ての化合物と同様に、それぞれ示された式は、それぞれの化合物の全ての塩、プロトン化された化合物又は脱プロトンされた化合物を含むことが当てはまる。例えば、ラウリン酸は、プロトン化された形だけではなく、全てのカチオンとのラウリン酸塩、例えばラウリン酸ナトリウムも含む。
【００５３】
本発明による方法は、本発明による方法のために使用される酵素が、任意に本発明による全細胞触媒の形で準備されて、カルボン酸又はジカルボン酸又はこれらのモノエステルと水溶液中で接触することを必要とする。好ましい実施態様の場合に、ここで使用されるような「接触」の概念とは、特に物理的なバリア、例えば透過膜等が介在することなくそれぞれの酵素がその基質と直接接触する状態になることであると解釈される。この接触は、最も簡単な場合には、基質を、酵素又は全細胞触媒が存在する水溶液中に添加することにより生じる。
【００５４】
本発明による教示の実施のために、水溶液中の本発明による全細胞触媒８並びに式（Ｉ）のカルボン酸、ジカルボン酸又はそのモノエステル（式中、Ｒ1は、−Ｈ、ＣＯＯＲ3を含む群から選択され、Ｒ2及びＲ3は、それぞれ互いに無関係に、Ｈ、メチル、エチル及びプロピルを有する群から選択され、ただし、基Ｒ2及びＲ3の少なくとも一方はＨであり、Ａは、少なくとも４個の炭素原子を有する非分枝の、分枝した、線状の、環状の、置換又は非置換の炭化水素基、好ましくは式−（ＣＨ2）n−であり、ｎは少なくとも４、特に好ましくは少なくとも１０である）を含む反応混合物が適している。この水溶液は、例えば組成、ｐＨ値及び温度に関して、この場合、全細胞触媒の生存能力又は少なくとも触媒能力を少なくとも一時的に支援するように作製されていなければならない。当業者には、細胞、特に生物工学的に重要な細胞の維持及び培養のために適している、水溶液として適した多数の水性培養基は公知である。その中には、ＬＢ培地のような均質な完全培地、Ｍ９培地のような最少培地、並びに選択培地、例えば高い塩濃度を有し、従って好塩性生物又は少なくとも耐塩性生物の成長だけが可能な選択培地が該当する。好ましい実施態様の場合に、ここで使用されるような「水性培養基」の概念は、全体で重要なファクタ、特にｐＨ値、塩含有量及び温度に関して、この水性培養基中に含まれる細胞、好ましくは微生物の生存性が維持又は促進され、かつ水性培養基も疎水性有機相も液状の形態で存在するように作製されている水を基礎とする反応媒体であると解釈される。多様な生物工学的に重要な細胞の温度要求は、微生物学及び分子生物学の教書、例えばFuchs/Schlegl, 2008から推知することができる。好ましい実施態様の場合に、水性培養基のｐＨ値は、接触の時点で、４〜９、好ましくは４．５〜８．５、最も好ましくは６．５〜７．５である。他の好ましい実施態様の場合に、温度は０〜４５℃、好ましくは１５〜４０℃、最も好ましくは２０〜３７℃である。この反応混合物は、典型的には発酵槽に含まれている。発酵槽として、滅菌でき、好ましくはオートクレーブ処理でき、かつ全細胞触媒の育成、通気及び反応条件の制御、例えば酸素含有率及び温度の制御が可能であるすべての反応容器が機能することができる。
【００５５】
好ましい実施多様の場合に、この反応混合物は、水溶液に対して付加的に、疎水性有機相を有する。この有機相は、有機溶剤及び／又はω−アミノ脂肪酸を水溶液から除去するための疎水性液状カチオン交換体を含むことができる。適切な溶剤及びカチオン交換体は、EP 11191520.3に記載されている。
【００５６】
本発明は、更に次の図面及び限定するものではない実施例によって具体的に示され、これらから、本発明の他の特徴、実施態様、観点及び利点を推知することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】菌株大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＡＣＹＣ｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ｃａｒＡ＿Ｍｓ−ｎｐｔ＿Ｎｏｃ］／ｐＪ２８１＿ａｌａＤＨ＿Ｂ．ｓ．＿ＴＡ＿Ｃ．ｖ．（ｃｔ）の、２１．７５時間のプロセス時間後の発酵液中でのモノアミン及びジアミンの検出を示す。
【００５８】
実施例１
ミコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）由来の遺伝子ＭＳＭＥＧ＿２９５６及びノカルジア種（Nocardia sp.）由来の遺伝子ｎｐｔの発現のための発現ベクターの製造
ミコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）由来の、脂肪酸レダクターゼ（ＹＰ＿８８７２７５．１）をコードするＭＳＭＥＧ＿２９５６（ｃａｒＡ、配列番号１）を、ノカルジア種（Nocardia sp.）由来の、前記脂肪酸レダクターゼをホスホパンテテイニル化するホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＡＢＩ８３６５６．１）をコードするｎｐｔ（配列番号２）と共に同時発現するためのベクターを製造するため、両方の遺伝子をＰＣＲによって、相同の範囲を取り入れながら組換えクローニングのために増幅した。この場合、遺伝子ＭＳＭＥＧ＿２９５６の増幅のためのドナー生物のゲノムＤＮＡ及び遺伝子ｎｐｔの増幅のための合成ＤＮＡ断片を原型として利用した。これらの遺伝子は、ｌａｃｕｖ５プロモータ（配列番号３）の制御下にあり、このプロモータも同様にＰＣＲによって存在するベクターから出発して組換えクローニングのために相同の範囲を取り入れながら増幅した。この場合、次のオリゴヌクレオチドを使用した：
Plac_H1_fw: 5'-TTATGCGACTCCTGCTGGCTATGGTGGGATTTCC-3'（配列番号４）
Plac_H2_rv: 5'-GATCGTCATATGCCACTCTCCTTGGTTCC-3'（配列番号５）
carA_H2_fw: 5'-TGGCATATGACGATCGAAACGCGCG-3'（配列番号６）
carA_H3_rv: 5'-TCCTTCTCTTACAGCAATCCGAGCATCT-3'（配列番号７）
npt_H3_fw: 5'-GCTGTAAGAGAAGGAGTTCTATCATGATCGAG-3'（配列番号８）
npt_H4_rv: 5'-GCAGCCTAGGTTAATTTATCAGGCGTACGCGATCG-3'（配列番号９）
【００５９】
次のパラメータを、Ｐlacuv5及び遺伝子ｎｐｔの増幅するＰＣＲのために使用した：１×：初期の変性、９８℃、０：３０ｍｉｎ；３５×：変性、９８℃、０：１０ｍｉｎ、アニーリング、５５℃、０：２０ｍｉｎ；伸長、７２℃、０：１５ｍｉｎ；１×：終端伸長、７２℃、１０ｍｉｎ。遺伝子ＭＳＭＥＧ＿２９５６の増幅のために次のパラメータを使用した：１×：初期の変性、９８℃、０：３０ｍｉｎ；３５×：変性、９８℃、０：１０ｍｉｎ、アニーリング、６５℃、０：２０ｍｉｎ；伸長、７２℃、１ｍｉｎ；１×：終端伸長、７２℃、１０ｍｉｎ。増幅のために、製造元の推奨に応じてNew England Biolabs（Frankfurt）のPhusionTM High-Fidelity Master Mixを、使用した。このＰＣＲ反応のそれぞれ５０μｌを、引き続き、１％のＴＡＥアガロースゲル上で分離した。ＰＣＲの実施、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡのエチジウムブロミド染色及びＰＣＲ断片サイズの決定は、当業者に公知の手法によって行った。全ての場合に、期待されたサイズのＰＣＲ断片を増幅することができた。Ｐlacuv5は３２５塩基対、ＭＳＭＥＧ＿２９５６は３．５キロ塩基対、及びｎｐｔは７１８塩基対であった。アガロースゲルからのＤＮＡの単離のために、目的ＤＮＡをメスでゲルから切り出し、QiaQuick Gel extraction Kitを用いて製造元（Qiagen, Hilden）の手引きに従って精製した。この精製されたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＮＩ切断及びＰａｃＩ切断されたベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１（Merck, Darmstadt）中へGeneart（登録商標）Seamless Cloning and Assembly Kitを使用して製造元（Life Technologies, Carlsbad, CA, USA）の手引きに従って組換えを用いてクローニングした。ケミカルコンピテント大腸菌（E. coli）ＤＨ１０β（New England Biolabs, Frankfurt）の形質転換は、当業者に公知の手法によって行った。目的遺伝子の正確な挿入は、制限分析によって調査し、導入された遺伝子の信頼性をＤＮＡ配列決定によって確認した。製造し終えた発現ベクターを、ｐＡＣＹＣ｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ｃａｒＡ＿Ｍｓ−ｎｐｔ＿Ｎｏｃ］（配列番号１０）とした。
【００６０】
実施例２
バシルス・スブチリス（Bacillus subtilis）由来の遺伝子ａｌｄ及びクロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）由来の遺伝子Ｃｖ２０２５の同時発現のための発現ベクターの製造
バシルス・スブチリス（Bacillus subtilis）由来の、アラニンデヒドロゲナーゼ（ＮＰ＿３９１０７１．１）をコードする遺伝子ａｌｄ（配列番号１１）及びクロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）由来の、トランスアミナーゼ（ＮＰ＿９０１６９５．１）をコードする遺伝子Ｃｖ＿２０２５（配列番号１２）のための大腸菌（E. coli）発現ベクターの製造のために、バシルス・スブチリス由来の遺伝子ａｌｄを、大腸菌（E. coli）発現ベクター中のバシルス・スファエリクス（Bacillus sphaericus）由来の遺伝子ａｌｄに代えて、大腸菌（E. coli）発現ベクターｐＪ２８１＿ａｌａＤ＿Ｂｓｐ＿ＴＡ＿Ｃ．ｖ．（ｃｔ）中にクローニングした（配列及び製造は、WO/2013/024114の実施例１及びそこに記載された配列番号１７を参照）。バシルス・スブチリス（Bacillus subtilis）由来の遺伝子ａｌｄは、ＰＣＲによって菌株バシルス・スブチリス（Bacillus subtilis）str.168の染色体ＤＮＡから増幅した。この場合、次のオリゴヌクレオチドを使用した：
alaDH_pCR22_fw: 5'-ATGATCATAGGGGTTCCTAAAGAG-3'（配列番号１３）
alaDH_pCR22_rev: 5'-TTAAGCACCCGCCACAGATG-3'（配列番号１４）。
【００６１】
次のパラメータをＰＣＲのために使用した：１×：初期の変性、９８℃、０：３０ｍｉｎ、３５×：変性、９８℃、０．１０ｍｉｎ、アニーリング、６５℃、０：３０ｍｉｎ；伸長、７２℃、０：２０ｍｉｎ；１×：終端伸長、７２℃、１０ｍｉｎ。増幅のために、製造元の推奨に応じてNew England Biolabs（フランクフルト）のPhusionTM High-Fidelity Master Mixを、使用した。このＰＣＲ反応のそれぞれ５０μｌを、引き続き、１％のＴＡＥアガロースゲル上で分離した。ＰＣＲの実施、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡのエチジウムブロミド染色及びＰＣＲ断片サイズの決定は、当業者に公知の手法によって行った。ＰＣＲ断片は、１１３７塩基対の期待されたサイズを示し、Qiagen（Hilden）のQuick PCR Purification Kitで製造元の手引きに従ってＰＣＲバッチから精製した。このＰＣＲ産物のベクターとのリゲーションのために、５′−ホスファートをポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs, Frankfurt）によってこのＰＣＲ産物に取り付けた。この場合、製造元の推奨を遵守した。
【００６２】
ベクターを、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｄｅＩで消化し、それにより含まれるバシルス・スファエリクス（Bacillus sphaericus）由来の遺伝子ａｌｄを除去した。制限消化したバッチを、１％のＴＡＥアガロースゲル上で分離した。サイズ５６９６ｂｐ及び１１２４を有する２つのバンドが同定できた。アガロースゲルからベクターＤＮＡを単離するために、５６９６ｂｐのＤＮＡバンドを、メスでゲルから切り出し、Qiagen（Hilden）のQuick Gel Extraction Kitを用いて製造元の手引きに従って精製した。平滑化された末端を作製するために、精製されたベクターＤＮＡの５′−突出部をＤＮＡポリメラーゼＩ（New England Biolabs, Frankfurt）のクレノウ断片で埋めた。この場合、製造元の説明を遵守した。５′−ホスファート基を有するバシルス・スブチリス（Bacillus subtilis）由来のａｌｄのＤＮＡ断片を、平滑化された末端を有するベクターにリゲーションした。この仕上げられた大腸菌（E. coli）発現ベクターを、ｐＪ２８１＿ａｌａＤＨ＿Ｂ．ｓ．＿ＴＡ＿Ｃ．ｖ．（Ｃｔ）（配列番号１５）とした。
【００６３】
実施例３
ミコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）由来の遺伝子ＭＳＭＥＧ＿２９５６及びノカルジア種（Nocardia sp.）由来の遺伝子ｎｐｔ及びバシルス・スブチリス（Bacillus subtilis）由来の遺伝子ａｌｄ及びクロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）由来のＣｖ２０２５を過剰発現する大腸菌（E. coli）株の製造
ミコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）由来の、脂肪酸レダクターゼ（ＹＰ＿８８７２７５．１）をコードする遺伝子ＭＳＭＥＧ＿２９５６及びノカルジア種（Nocardia sp.）由来の、脂肪酸レダクターゼをホスホパンテテイニル化するホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＡＢＩ８３６５６．１）をコードする遺伝子ｎｐｔを、バシルス・スブチリス（Bacillus subtilis）由来の、アラニンデヒドロゲナーゼ（ＮＰ＿３９１０７１．１）をコードする遺伝子ａｌｄ及びクロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）由来の、トランスアミナーゼ（ＮＰ＿９０１６９５．１）をコードする遺伝子Ｃｖ２０２５と組み合わせて同時発現する大腸菌（E. coli）株の作製のために、大腸菌（E. coli）株Ｗ３１１０を、プラスミドｐＡＣＹＣ｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ｃａｒＡ＿Ｍｓ−ｎｐｔ＿Ｎｏｃ］（配列番号１０）及びｐＪ２８１＿ａｌａＤＨ＿Ｂ．ｓ．＿ＴＡ＿Ｃ．ｖ．（ｃｔ）（配列番号１５）で、エレクトロポレーションによって形質転換し、クロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を有するＬＢ寒天プレート上で平板培養した。形質転換を、プラスミドプレパレーション及び分析的制限分析によって、正しいプラスミドの存在に関して調査した。作製された菌株を、大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＡＣＹＣ｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ｃａｒＡ＿Ｍｓ−ｎｐｔ＿Ｎｏｃ］／ｐＪ２８１＿ａｌａＤＨ＿Ｂ．ｓ．＿ＴＡ＿Ｃ．ｖ．（ｃｔ）とした。この菌株を、ドデカン二酸からドデカンジアミンを及びドデカン酸からドデシルアミンを生産する能力を試験するために使用した。過剰発現されたホスホパンテテイニルトランスフェラーゼｎｐｔにより活性化された脂肪酸レダクターゼの遺伝子産物ＣａｒＡが、基質のドデカン酸及びドデカン二酸を、それぞれアルデヒド及びジアルデヒドに変換した。遺伝子産物Ｃｖ＿２５０５の機能は、（ジ）アルデヒドを最終的にドデシルアミン又はドデカンジアミンに変換することにある。アミノ化反応のために必要なアミノドナーのアラニンは、ピルバートから遺伝子産物ａｌｄによって提供される。
【００６４】
実施例４
ミコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）由来の遺伝子ＭＳＭＥＧ＿２９５６及びノカルジア種（Nocardia sp.）由来の遺伝子ｎｐｔ用の発現ベクターを、バシルス・スブチリス（Bacillus subtilis）由来の遺伝子ａｌｄ及びクロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）由来のＣｖ２０２５用の発現ベクターと組み合わせて有する大腸菌（E. coli）株によるドデカンジアミン及びドデシルアミンの生産
ドデシルアミン及びドデカンジアミンを生産する能力を試験するために、実施例３で作製した菌株を使用した。ドデカン酸及びドデカン二酸からそれぞれドデシルアミン及びドデカンジアミンへの生物変換は、ＤＡＳＧＩＰの８倍のパラレル発酵システムで実施した。この場合、次のように行った：この発酵のために、１Ｌ反応器を使用した。ｐＨセンサを、ｐＨ４．０及びｐＨ７．０の標準液を用いた二点校正によって校正した。この反応器を、水道水３００ｍｌで満たし、滅菌を保証するために１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した。引き続き、ｐＯ２センサを一晩中（少なくとも６時間にわたり）ＤＡＳＧＩＰシステムで分極した。翌朝、水をクリーンベンチのもとで抜き出し、クロラムフェニコール５０ｍｇ／Ｌ及びカナマイシン５０ｍｇ／Ｌを有する高密度細胞培地３００ｍｌに置き換えた。次に、ｐＯ２センサを、１点校正（撹拌機：４００ｒｐｍ／通気：１０ｓＬ／ｈ空気）で校正し、供給手段経路、補正手段経路及び誘導手段経路を定置洗浄（Clean-in-Place）によって清浄化した。このために、ホースを７０％エタノールで、引き続き１Ｍ  ＮａＯＨで、次いで滅菌ＶＥ水で洗浄し、最後にその都度の媒体で満たした。
【００６５】
このドデカンジアミン及びドデシルアミンを産生する大腸菌（E. coli）株を、まず低温培養（Kryokultur）から、上述の抗生物質を有するＬＢ培地（１００ｍＬのバッフル付きフラスコ中で２５ｍＬ）中で、３７℃で一晩中かつ２００ｒｐｍで約１８時間培養した。引き続き、この培養２ｍＬを、上述の抗生物質を有する高密度細胞培地（グルコース１５ｇ／Ｌ（１％のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ及び２．２％のＮＨ4Ｃｌを有する、別個にオートクレーブ処理した５００ｇ／Ｌの母液３０ｍＬ／Ｌ）、（ＮＨ4）2ＳＯ4  １．７６ｇ／Ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4  １９．０８ｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4  １２．５ｇ／Ｌ、酵母抽出物６．６６ｇ／Ｌ、クエン酸三ナトリウム二水和物２．２４ｇ／Ｌ、クエン酸鉄アンモニウム溶液１７ｍＬ／Ｌ  別個にオートクレーブ処理した１％の母液、微量元素溶液５ｍＬ／Ｌ  別個にオートクレーブ処理した母液（ＨＣｌ（３７％）３６．５０ｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ  １．９１ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  １．８７ｇ／Ｌ、エチレンジアミン四酢酸二水和物０．８４ｇ／Ｌ、Ｈ3ＢＯ3  ０．３０ｇ／Ｌ、Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ  ０．２５ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ  ４．７０ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  １７．８０ｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ2・２Ｈ2Ｏ  ０．１５ｇ／Ｌ））（１００ｍＬのバッフル付きフラスコ中で２５ｍＬ）中に移し、３７℃／２００ｒｐｍで更に５．５時間インキュベーションした。
【００６６】
この反応器は、前培地の相応する容量を５ｍＬ注射器（滅菌条件下で）中に取り、反応器にカニューレを用いて、７０％のエタノールの上層をなす隔膜を介して接種することにより、０．１の光学密度で接種された。
【００６７】
次の標準プログラムを使用した：
【表１】
0006556057.tif 000015
【００６８】
この実施した実験は２つの相に分けることができ、それは、細胞が所定の光学密度に到達する育成と、それに引き続く生物変換であり、生物変換では基質のドデカン酸、オレイン酸又はドデカン二酸の添加後に、発現で形成された酵素によってドデシルアミン、オレイルアミン又はドデカンジアミンへの変換が行われる。ｐＨ値は、一方で、アンモニア（１２．５％）でｐＨ６．８に調節された。育成及び生物変換の間に、培養中の溶存酸素（ＤＯ、dissolved oxygen）は、撹拌機回転数及びガス供給速度によって３０％に調節した。この発酵は、流加回分式で実施し、この場合、供給開始、５ｇ／Ｌｈのグルコース供給（１％のＭｇＳＯ4・Ｈ2Ｏ及び２．２％のＮＨ4Ｃｌを有するグルコース５００ｇ／Ｌ）は、ＤＯピークによってトリガされた。供給開始によって、温度も、以前の３７℃から３０℃に低下した。トランスアミナーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、カルボン酸レダクターゼ及びホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの発現は、供給開始の２時間後に、１ｍＭ  ＩＰＴＧの自動添加によって誘導された。生物変換の開始前に、培養液の光学密度を測定した。
【００６９】
生物変換相の開始は、供給開始後の１ｈ又は１２ｈに行った。このために、ドデカン酸又はドデカン二酸及びオレイン酸（工業的９０％）からなる混合物１５０ｍｌ又は７５ｍＬをバッチとして発酵液に添加した。トランスアミナーゼのためのアミノ基供与体を提供するために、生物変換開始の３０分前に、３Ｍ硫酸アンモニウム溶液５ｍＬを発酵液に添加した。試料採取のために、槽から発酵液２ｍＬを取り出し、この１／２０の部分を８０％のアセトニトリル、２０％水及び０．１％ギ酸からなる混合物中で希釈しかつ抽出した。試料は、生物変換の開始後の１．２５ｈ、２．７５ｈ、４．２５ｈ、１８．２５ｈ及び２１．７５ｈですべての反応容器から採取した。酸素についての転化率（ＯＴＲ＝酸素移動速度（oxygen transfer rate））及び炭素についての転化率（ＣＴＲ＝炭素移動速度（carbon transfer rate）は、発酵の間に排ガス分析によってＤＡＳＧＩＰシステムで決定された。この発酵は、生物変換の開始後の２１．７５ｈで完了した。撹拌、通気、温度調節及びｐＨ調節を停止し、この槽を５〜１０分間落ち着かせた。
【００７０】
ＨＰＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ−スキャン法
試料の定性評価は、スキャンモードで高分解能ＭＳ検出器を用いたＨＰＬＣ／ＭＳカップリングによって行った。
この場合、次の装置を使用した：
・  オートサンプラー、クォータナリポンプ、ＰＤＡ−検出器及びカラムオーブンを備えたＨＰＬＣ装置Accela（Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA）
・  ＥＳＩ源を備えた質量分析計ＬＴＱ−ＦＴ（Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA）
・  ＨＰＬＣカラム：Kinetex C18、１００×２．１ｍｍ、粒子サイズ：２．６μｍ、細孔サイズ１００Å（Phenomenex; Aschaffenburg）
【００７１】
試料を、溶剤（８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、２０％二回蒸留Ｈ2Ｏ（ｖ／ｖ）＋０．１％ギ酸）１９５０μＬ及び試料５０μＬを２ｍＬ反応容器中へピペットで入れることによって準備した。この混合物を約１０秒間渦動させ、引き続き約１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。透明な上澄みをピペットで取り出した。
ＨＰＬＣ分離を、上述のＨＰＬＣカラムを用いて行った。注入容量は０．５μＬ、カラム温度は４０℃、流動速度は０．３ｍＬ／ｍｉｎであった。移動相は、溶離剤Ａ（０．０２％（ｖ／ｖ）の水性トリフルオロ酢酸）及び溶離剤Ｂ（０．０１５％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸を有するアセトニトリル）から構成されていた。次の勾配プロフィールを用いた：
時間［ｍｉｎ］      溶離剤Ａ［％］      溶離剤Ｂ［％］
０                  ９８                  ２
２                  ９８                  ２
１７                    ２                ９８
３２                    ２                ９８
【００７２】
ＥＳＩ−ＭＳ分析を、ポジティブモードで、ＥＳＩ源の次のパラメータを用いて行った：
・  ＥＳＩ電圧：４ｋＶ
・  キャピラリ温度：３００℃
・  シースガスフロー（Sheath Gas Flow）４０
・  補助ガスフロー（Aux Gas Flow）５
・  スイープガスフロー（Sweep Gas Flow）３
この検出は、ｍ／ｚ＝１００〜１０００の質量範囲で行った。質量分析分解能はＲ＝１００，０００であった。
【００７３】
この結果は，次の表に示されている。
【表２】
0006556057.tif 000016
菌株大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＡＣＹＣ｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ｃａｒＡ＿Ｍｓ−ｎｐｔ＿Ｎｏｃ］／ｐＪ２８１＿ａｌａＤＨ＿Ｂ．ｓ．＿ＴＡ＿Ｃ．ｖ．（ｃｔ）の、２１．７５時間のプロセス時間後の発酵液中でのモノアミン及びジアミンの定性検出（ｎ．ｎ．＝検出不能、ＬＳ＝ラウリン酸、ＤＤＳ＝ドデカン二酸）。
【００７４】
他のデータを、図１が明確に示す。
【００７５】
１，１２−ドデカンジアミン及びドデシルアミンの定量測定は、ＨＰＬＣ／ＵＶ測定によって、オルト−フタルジアルデヒドによる誘導化の後に行った。メタノール性の上澄みを測定した。最も重要なクロマトグラフィーパラメータは、次の表中にまとめられている。
【表３】
0006556057.tif 000017
【００７６】
この結果は、次の表に示されている。
【表４】
0006556057.tif 000018
菌株大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ｐＡＣＹＣ｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ｃａｒＡ＿Ｍｓ−ｎｐｔ＿Ｎｏｃ］／ｐＪ２８１＿ａｌａＤＨ＿Ｂ．ｓ．＿ＴＡ＿Ｃ．ｖ．（ｃｔ）の、２１．７５時間のプロセス時間後の発酵液中でのモノアミン及びジアミンの定量化（ｎ．ｎ．＝検出不能、*）測定限界未満、ＤＤＳ＝ドデカン二酸、ＬＳ＝ラウリン酸）。
【００７７】
この菌株は、ドデカン酸、ドデカン二酸及びオレイン酸からそれぞれのアミンのドデシルアミン、ドデカンジアミン及びオレイルアミンを製造できることが示された。
【００７８】
実施例５
オリザ・サチバ（Oryza sativa）由来のα−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子αＤＯＸの発現のための発現ベクターの製造
オリザ・サチバ（Oryza sativa）由来の、α−ジオキシゲナーゼ（ＮＰ＿００１０６６７１８．１）をコードするαＤＯＸ（Ｏｓ１２ｇ０４４８９００、配列番号１６）の発現のためのベクターを製造するために、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）中での発現のための遺伝子をコドン最適化し、合成しかつ同時にＮｄｅＩ切断部位を上流に及びＡｖｒＩＩ切断部位を下流に導入した。合成されたＤＮＡフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ及びＡｖｒＩＩで消化し、相応して切断されたベクターｐＡＣＹＣ｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ｃａｒＡ＿Ｍｓ−ｎｐｔ＿Ｎｏｃ］（配列番号１０）に、遺伝子ｃａｒＡ＿Ｍｓ及びｎｐｔ＿Ｎｏｃの除去下にリゲーションした。このベクター中に含まれるＬａｃｕｖ５プロモータ（配列番号３）はこの場合に維持した。製造し終えたベクターを、ｐＡＣＹＣ｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ＤＯＸ＿Ｏｓ（ｃｏ＿Ｅｃ）］（配列番号１７）とした。このベクターｐＡＣＹＣは、クロラムフェニコール耐性を媒介し、ｐ１５Ａ複製起点を有し、従って低コピー数（１細胞当たり１０〜１５コピー）を示す大腸菌（E. coli）ベクターである。
【００７９】
実施例６
オリザ・サチバ（Oryza sativa）由来の遺伝子αＤＯＸ、バシルス・スブチリス（Bacillus subtilis）由来の遺伝子ａｌｄ及びクロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）由来の遺伝子Ｃｖ２０２５を過剰発現する、遺伝子ｂｉｏＨに欠失を有する大腸菌（E. coli）菌株の製造
オリザ・サチバ（Oryza sativa）由来の、α−ジオキシゲナーゼ（ＮＰ＿００１０６６７１８．１）をコードする遺伝子αＤＯＸを、バシルス・スブチリス（Bacillus subtilis）由来の、アラニンデヒドロゲナーゼ（ＮＰ＿３９１０７１．１）をコードする遺伝子ａｌｄ（配列番号１１）及びクロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）由来の、トランスアミナーゼ（ＮＰ＿９０１６９５．１）をコードする遺伝子Ｃｖ２０２５（配列番号１２）と組み合わせて同時発現する大腸菌（E. coli）菌株の作製のために、菌株大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ΔｂｉｏＨ（製造はEP12007663の実施例１を参照）を、プラスミドｐＡＣＹＣ｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ＤＯＸ＿Ｏｓ（ｃｏ＿Ｅｃ）］（配列番号１７）及びｐＪ２８１＿ａｌａＤＨ＿Ｂ．ｓ．＿ＴＡ＿Ｃ．ｖ．（ｃｔ）（配列番号１５）でエレクトロポレーションによって形質転換し、クロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を有するＬＢ寒天プレート上で平板培養した。形質転換を、プラスミドプレパレーション及び分析的制限分析によって、正しいプラスミドの存在に関して調査した。作製された菌株を、大腸菌（E.coli）ΔｂｉｏＨ  ｐＡＣＹＣ｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ＤＯＸ＿Ｏｓ（ｃｏ＿Ｅｃ）］／ｐＪ２８１＿ａｌａＤＨ＿Ｂ．ｓ．＿ＴＡ＿Ｃ．ｖ．（ｃｔ）とした。この菌株を、ドデカン二酸メチルエステルから出発してアミノウンデカン酸メチルエステルを生産する能力を調査するために使用した。
【００８０】
実施例７
オリザ・サチバ（Oryza sativa）由来の遺伝子αＤＯＸ用の発現ベクターを、バシルス・スブチリス（Bacillus subtilis）由来の遺伝子ａｌｄ及びクロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）由来の遺伝子Ｃｖ＿２０２５用の発現ベクターと組み合わせて有する大腸菌（E. coli）菌株による、ドデカン二酸メチルエステルから出発するアミノウンデカン酸メチルエステルの生産
アミノウンデカン酸メチルエステルを生産する能力を試験するために、実施例８に記載した菌株を使用した。この場合、次のように行った：
試験されるべき菌株を、まず、クロラムフェニコール５０μｇ／ｍｌ及びカナマイシン５０μｇ／ｍｌを有するＬＢ寒天プレート上に塗りつけ、３７℃で一晩中インキュベーションした。対照として、付加的に、菌株大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ΔｂｉｏＨを、抗生物質なしのＬＢ寒天プレート上に塗りつけた。これらの菌株を、次いで、クロラムフェニコール５０μｇ／ｍｌ及びカナマイシン５０μｇ／ｍｌ（プラスミドを有する菌株用）を有するMiller（Merck, Darmstadt）によるLuria-Bertaniブロス中に、それぞれ個々のコロニーからなる２０ｍｌ前培養として接種した。主培養として、クロラムフェニコール５０μｇ／ｍｌ及びカナマイシン５０μｇ／ｍｌを有するＬＢブロス１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中に装入し、予備培養から２ｍｌと共にインキュベートした。この培養は、まず３７℃でかつ２００ｒｐｍでインキュベーション振盪器中で行った。０．５〜０．７の光学密度（６００ｎｍ）が達成された場合に、遺伝子発現を、１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加により誘導した。更なる培養を、２２℃及び２００ｒｐｍで一晩中行った。翌日に、この培養を４℃でかつ５５２５×ｇでの１０分間の遠心分離によって収穫した。上澄みを廃棄し、細胞ペレットを２００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中で洗浄した。この細胞ペレットを、最終的に塩化アンモニウム５０ｍＭ及び０．５％（ｗ／ｖ）グルコースを有するリン酸カリウム緩衝液２００ｍＭ中に取り、２０のＯＤ（６００ｎｍ）が達成された。この細胞懸濁液に、エタノール中のドデカン二酸メチルエステル１２．５ｍＭ（abcr, Karlsruhe）を添加し、３０℃で３００ｒｐｍで４時間軽度に振盪させた。インキュベーションの間に、０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、１８０ｍｉｎ及び２４０ｍｉｎの時点で試料を取り出し、８０％のアセトニトリル、２０％の水及び０．１％のギ酸からなる混合物中で抽出した。上澄みを、ＨＰＬＣ／ＭＳ分析で分析した。この結果は，次の表に示されている。
【００８１】
【表５】
0006556057.tif 000019
オリザ・サチバ（Oryza sativa）由来のαＤＯＸ、バシルス・スブチリス（Bacillus subtilis）由来のａｌｄ及びクロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）由来のＣｖ＿２０２５を過剰発現する大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０ΔｂｉｏＨを用いたアミノウンデカン酸メチルエステルメチルエステルの生産。ピーク面積が示されている（ｎ．ｎ．＝検出不能）。
【００８２】
菌株大腸菌（E. coli）Ｗ３１１０  ΔｂｉｏＨ  ｐＡＣＹＣ｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ＤＯＸ］／ｐＪ２８１＿ａｌａＤＨ＿Ｂ．ｓ．＿ＴＡ＿Ｃ．ｖ．（ｃｔ）は、ドデカン二酸メチルエステルから出発してアミノウンデカン酸メチルエステルを生成する能力があることを示すことができた。
【図１】
0006556057.tif 000020
【配列表】
0006556057000001.app