(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象となるヒト又は他の哺乳動物由来の多能性幹細胞のゲノム安定性を評価する方法であって、
前記多能性幹細胞の培養物を準備すること、
前記培養物中に以下のアミノ酸配列：
ＣＲＡＫＡＧＤＰＣ（配列番号１）；および
ＣＥＱＫＱＥＩＲＣ（配列番号２）；
のうちのいずれか、若しくは該アミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のシステイン残基(Ｃ）を欠失した改変アミノ酸配列のいずれか、からなるカルレティキュリン発現誘導ペプチド配列を含む合成ペプチドを少なくとも１回供給すること、および、
該培養物中の多能性幹細胞についてカルレティキュリンの発現量を調べ、該カルレティキュリンの発現量の程度に基づいて該多能性幹細胞のゲノム安定性若しくは不安定性を判別すること、
を包含し、
ここで、前記判別において、カルレティキュリン発現量が所定レベルを上回った多能性幹細胞をゲノム不安定性であると判別する、評価方法。
【請求項２】
前記カルレティキュリンの発現量の程度に基づいた多能性幹細胞のゲノム安定性若しくは不安定性の判別は、カルレティキュリン又はその断片と特異的に反応する抗体を用いた免疫学的手法で行う、請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
前記合成ペプチドは、前記カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に膜透過性ペプチド配列を有する、請求項１又は２に記載の評価方法。
【請求項４】
前記合成ペプチドは、前記膜透過性ペプチド配列として、以下のアミノ酸配列：
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号５）；
を有する、請求項３に記載の評価方法。
【請求項５】
前記合成ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が３０以下である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項６】
前記合成ペプチドは、以下のアミノ酸配列：
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＣＲＡＫＡＧＤＰＣ（配列番号１０）；
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＣＥＱＫＱＥＩＲＣ（配列番号１１）；
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＲＡＫＡＧＤＰ（配列番号１２）；および
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＥＱＫＱＥＩＲ（配列番号１３）；
のうちのいずれかを有する、請求項５に記載の評価方法。
【請求項７】
対象となるヒト又は他の哺乳動物由来の多能性幹細胞を含む培養物中からゲノム不安定な多能性幹細胞を除去する方法であって、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の評価方法によって該培養物中の多能性幹細胞のゲノム安定性若しくは不安定性を判別すること、および
該判別方法によりゲノム不安定性であると判別された多能性幹細胞を該培養物中から除去すること、
を包含する、除去方法。
【請求項８】
前記ゲノム不安定性であると判別された多能性幹細胞を、細胞選別機（セルソーター）を使用して除去する、請求項７に記載の除去方法。
【請求項９】
前記ゲノム不安定な多能性幹細胞が、染色体異常を有する多能性幹細胞である、請求項７又は８に記載の除去方法。
【請求項１０】
ヒト又は他の哺乳動物由来の多能性幹細胞を含む培養物を製造する方法であって、
該多能性幹細胞の培養過程において、請求項７〜９のいずれか一項に記載の除去方法によってゲノム不安定な多能性幹細胞を該多能性幹細胞の培養物中から除去することを包含する、製造方法。
【請求項１１】
ゲノム不安定な多能性幹細胞に対してカルレティキュリン発現誘導活性を奏する人為的に合成されたペプチドであって、以下のアミノ酸配列：
ＣＲＡＫＡＧＤＰＣ（配列番号１）；および
ＣＥＱＫＱＥＩＲＣ（配列番号２）；
のうちのいずれか若しくは該アミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のシステイン残基(Ｃ）を欠失した改変アミノ酸配列のいずれかからなるカルレティキュリン発現誘導ペプチド配列を含む合成ペプチド。
【請求項１２】
前記カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に膜透過性ペプチド配列を有する、請求項１１に記載の合成ペプチド。
【請求項１３】
前記膜透過性ペプチド配列として、以下のアミノ酸配列：
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号５）；
を有する、請求項１２に記載の合成ペプチド。
【請求項１４】
前記合成ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が３０以下である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の合成ペプチド。
【請求項１５】
以下のアミノ酸配列：
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＣＲＡＫＡＧＤＰＣ（配列番号１０）；
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＣＥＱＫＱＥＩＲＣ（配列番号１１）；
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＲＡＫＡＧＤＰ（配列番号１２）；および
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＥＱＫＱＥＩＲ（配列番号１３）；
のうちのいずれかを有する、請求項１４に記載の合成ペプチド。
【請求項１６】
ゲノム不安定な多能性幹細胞のカルレティキュリン発現量を増大するために用いられるカルレティキュリン発現誘導剤であって、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の合成ペプチドを含む、カルレティキュリン発現誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胚性幹細胞（embryonic stem cell；以下「ＥＳ細胞」ともいう）、誘導多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell；以下「ｉＰＳ細胞」ともいう）等の多能性幹細胞のゲノム安定性を評価する方法と該方法に用いる合成ペプチドに関する。また、多能性幹細胞を含む培養物中からゲノム不安定な多能性幹細胞を除去する方法に関する。
なお、本出願は２０１３年１０月３０日に出願された日本国特許出願２０１３−２２５９２２号に基づく優先権を主張しており、当該日本国出願の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
【背景技術】
【０００２】
ヒト又はヒト以外の哺乳動物由来の多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞）を再生医療（典型的には移植医療）に応用する際の一つの課題として、医療に利用可能な当該幹細胞を高効率に生産する技術の確立が挙げられる。
例えば、ゲノム不安定なｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞は生体内への移植に不適なため、再生医療に利用可能なｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を得るためには対象の多能性幹細胞集団の中からゲノム不安定な多能性幹細胞を除去する必要がある。上記ゲノム不安定な多能性幹細胞の除去に際しては、当然、多能性幹細胞のゲノム安定性を評価する必要がある。【０００３】
しかしながら、現在までに報告されている多能性幹細胞のゲノム安定性を評価する方法（例えば、染色体分染法や蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（Fluorescence in situ hybridization：ＦＩＳＨ）法等）は、煩雑な操作が必要であったり、或いは熟練の技術を要するものであった。そのため、より簡便で高効率に多能性幹細胞のゲノム安定性を評価する方法が求められている。また、従来の評価方法の多くは対象細胞の固定を必要とするため、実際に再生医療に用いる多能性幹細胞（即ち生きた状態の該細胞）自身のゲノム安定性を直接評価することが困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００９／０９３６９２号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】セル・サイクル（Cell Cycle）、８巻（６号）、２００９年、ｐｐ．８６０−８６９
【非特許文献２】キャンサー・リサーチ（Cancer Research）、６７巻（１７号）、２００７年、ｐｐ．７９４１−７９４４
【非特許文献３】カレント・バイオロジー（Current Biology）、１２巻、２００２年、ｐｐ．１２８７−１２９２
【発明の概要】
【０００６】
そこで本発明は、かかる多能性幹細胞の利用に関する従来の課題を解決するべく創出されたものであり、多能性幹細胞のゲノム安定性を高効率且つ高い信頼性で評価し得る方法を提供する。また、上記評価方法によりゲノム不安定性であると判別された多能性幹細胞を対象の多能性幹細胞の培養物中から除去する方法を提供する。さらに、上記評価方法および上記除去方法の効果を高めるために利用可能な、人為的に合成可能な比較的短い鎖長のペプチドの提供を他の目的とする。また、そのようなペプチドを含む組成物の提供を他の目的とする。
【０００７】
本発明者は、正常な細胞においては細胞内（典型的には小胞体内）にその局在が確認される一方で、がん細胞や病原体に感染した細胞においては免疫原性の細胞死を起こす際に該細胞の表面に発現誘導される免疫賦活性タンパク質（いわゆるイートミーシグナル、eat-me signal）として知られるカルレティキュリンタンパク質（Calreticulin、以下「カルレティキュリン」ともいう）に着目した（非特許文献１、２）。
そして、種々の多能性幹細胞におけるカルレティキュリンの発現量を調べたところ、驚くべきことに、ゲノム不安定な多能性幹細胞（例えばｉＰＳ細胞）はゲノム安定な同種の幹細胞と比較してカルレティキュリンの発現量が顕著に増大していることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
上記の目的を実現すべく、本発明によると、対象となるヒト又は他の哺乳動物由来のｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞の培養物を準備することと、該培養物中の多能性幹細胞についてカルレティキュリンの発現量（対象とする多能性幹細胞の細胞表面（典型的には細胞膜の表面）に発現するカルレティキュリンの存在量）を調べ、該カルレティキュリンの発現量の程度に基づいて該多能性幹細胞のゲノム安定性若しく不安定性を判別することと、を包含する多能性幹細胞のゲノム安定性を評価する方法（ゲノム安定性評価方法）を提供する。そして、ここで開示される多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法は、上記判別において、カルレティキュリン発現量が所定レベルを上回った多能性幹細胞をゲノム不安定性であると判別することを特徴とする。
【０００９】
ここで開示される多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法を用いると、多能性幹細胞培養物中（典型的にはｉＰＳ細胞培養物中若しくはＥＳ細胞培養物中）の多能性幹細胞のカルレティキュリンの発現量を調べるという簡便な操作によって、該幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性を判別することができる。したがって、簡便且つ高効率にｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞のゲノム安定性を評価することが可能である。このようなゲノム安定性評価方法は、多量の多能性幹細胞のゲノム安定性を評価する場合（例えば、ｉＰＳ細胞のクローン確立や再生医療に資するｉＰＳ細胞の準備等）に特に好適に利用できる。
【００１０】
ここで開示される多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法の好ましい一態様は、上記カルレティキュリンの発現量に基づいた多能性幹細胞のゲノム安定性若しくは不安定性の判別を、カルレティキュリン又はその断片と特異的に反応する抗体（即ち、抗カルレティキュリン抗体）を用いた免疫学的手法で行うことを特徴とする。
抗カルレティキュリン抗体を用いた免疫学的手法によると、対象の多能性幹細胞培養物中（典型的にはｉＰＳ細胞培養物中若しくはＥＳ細胞培養物中）の多能性幹細胞におけるカルレティキュリンの発現を、特異的かつ高感度に調べることができる。したがって、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性を高精度且つ高い信頼性をもって判別することが可能となる。また、免疫学的手法を用いた多能性幹細のゲノム安定性の評価は、従来のゲノム安定性を評価する方法（例えばＦＩＳＨ法）と比較して短時間かつ簡便な操作でｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞のゲノム安定性を評価し得るため好ましい。
【００１１】
また本発明者は、上記多能性幹細胞のゲノム安定性を評価する方法の効果を高めるため、ゲノム不安定な多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞若しくはＥＳ細胞）において特にカルレティキュリンの発現量を増大させる物質を模索した。鋭意検討の結果、本発明者は、ヒト由来のセントリン２（centrin 2、中心体関連タンパク質）のｓｉＲＮＡ（small interfering RNA、低分子干渉ＲＮＡ）を構成するＲＮＡ配列から翻訳されるアミノ酸配列を設計し、当該アミノ酸配列を含むように作製した合成ペプチドが、対象の多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞培養物の培地中）に供給された際にゲノム不安定な多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞）において特にカルレティキュリン発現量を増大し得る或いはカルレティキュリンの発現を誘導し得る能力（カルレティキュリン発現誘導活性）を有することを見出した。
本発明者は上記知見に基づき、本発明の他の側面として、ゲノム不安定な多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞若しくはＥＳ細胞）に対してカルレティキュリン発現誘導活性を奏する人為的に合成されたペプチド（以下、「カルレティキュリン発現誘導ペプチド」という）を完成するに至った。
具体的には、本発明者は、以下のアミノ酸配列：
ＣＲＡＫＡＧＤＰＣ（配列番号１）；および
ＣＥＱＫＱＥＩＲＣ（配列番号２）；
のうちのいずれか若しくは該アミノ酸配列において１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変アミノ酸配列のいずれかからなるカルレティキュリン発現誘導ペプチド配列を含む合成ペプチドを提供する。
【００１２】
ここで開示される合成ペプチドは、化学合成（若しくは生合成）によって容易に人為的に製造することができる。また、物質自体が単純な構造（直鎖状のペプチド鎖）であるため、取扱いが容易であり、例えば、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞（典型的には当該幹細胞培養物の培地中）に該カルレティキュリン発現誘導ペプチドを供給するという簡易な処理を行うことによって、ゲノム不安定な多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞）のカルレティキュリン発現量を増大させることができる。
【００１３】
また、本発明によると、ここで開示される多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法の好ましい一態様として、上記カルレティキュリンの発現量の程度に基づいて多能性幹細胞のゲノム安定性若しくは不安定性の判別を行うより前に、ここで開示される少なくとも1種のカルレティキュリン発現誘導ペプチドを対象の多能性幹細胞培養物中に少なくとも１回供給することをさらに含み、該合成ペプチドを少なくとも一回供給した当該多能性幹細胞培養物を所定時間培養した後に上記判別を行うことを特徴とする評価方法が提供される。
【００１４】
上記カルレティキュリン発現誘導ペプチドを用いてゲノム不安定な多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞若しくはＥＳ細胞）におけるカルレティキュリン発現量を増大させることで、ゲノム不安定な多能性幹細胞とゲノム安定な多能性幹細胞とのカルレティキュリン発現量の差を明確にすることができる。これにより、カルレティキュリンの発現の程度に基づいてｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性の判別がいっそう容易となるため、多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法の精度向上と信頼性向上を実現することができる。
【００１５】
また、ここで開示される好ましい一態様のカルレティキュリン発現誘導ペプチドは、上記改変アミノ酸配列が配列番号１又は２のアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のシステイン残基(Ｃ）を欠失したものである。
上記改変アミノ酸配列からなるカルレティキュリン発現誘導ペプチド配列もまた、配列番号１又は２に示すカルレティキュリン発現誘導ペプチド配列と同様に良好なカルレティキュリン発現誘導活性を発揮することができる。
【００１６】
また、ここで開示される好ましい一態様のカルレティキュリン発現誘導ペプチドは、上記カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に膜透過性ペプチド配列を有する。
このような膜透過性ペプチドを有する上記カルレティキュリン発現誘導ペプチドは、カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列を高効率にｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞内（細胞膜及び／又は核膜の内側）に移入することができるため、本発明の実施に好適に用いることができる。
【００１７】
また、ここで開示される好ましい一態様のカルレティキュリン発現誘導ペプチドは、上記膜透過性ペプチド配列として、以下のアミノ酸配列：
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号５）；
を有する。
配列番号５としてここで開示されるアミノ酸配列は、膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列の典型例であり、特にゲノム不安定な多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞）におけるカルレティキュリン発現を高効率に誘導することができる。
【００１８】
また、ここで開示される好ましい一態様のカルレティキュリン発現誘導ペプチドは、該合成ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が３０以下である。
このような短いペプチド鎖のペプチドは化学合成が容易であり、且つ、安価で取扱い性に優れるため、本発明の実施に特に好適に用いることができる。
【００１９】
また、ここで開示される好ましい一態様のカルレティキュリン発現誘導ペプチドは、以下のアミノ酸配列：
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＣＲＡＫＡＧＤＰＣ（配列番号１０）；
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＣＥＱＫＱＥＩＲＣ（配列番号１１）；
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＲＡＫＡＧＤＰ（配列番号１２）；および
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＥＱＫＱＥＩＲ（配列番号１３）；
のうちのいずれかを有する。
かかる合成ペプチドは、特に、ヒト由来のゲノム不安定なｉＰＳ細胞に対してカルレティキュリン発現誘導活性を奏する。ヒト由来のｉＰＳ細胞を好適な適用対象とする上記合成ペプチドは、医療産業上の利用価値が極めて高い。
【００２０】
また、本発明によると、他の側面として、対象となるヒト又は他の哺乳動物由来の多能性幹細胞を含む培養物中からゲノム不安定な多能性幹細胞を除去する方法であって、ここで開示される多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法のいずれかによって対象の多能性幹細胞培養物中の多能性幹細胞のゲノム安定性の有無又はその程度を判別すること、および、該判別方法によりゲノム不安定であると判別された多能性幹細胞を該多能性幹細胞培養物中から除去すること、を包含する方法が提供される。
対象の多能性幹細胞培養物中（典型的にはｉＰＳ細胞培養物中若しくはＥＳ細胞培養物中）からゲノム不安定と判別された多能性幹細胞を除去することで、ゲノム安定と判別された多能性幹細胞を主体とする（好ましくはゲノム安定と判別された多能性幹細胞からなる）多能性幹細胞培養物（例えばｉＰＳ細胞培養物）を作製することができる。そのため、上記ゲノム不安定な多能性幹細胞の除去方法は、再生医療に利用可能なｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞培養物の作製に好適に採用できる。また、上記多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法によって対象の多能性幹細胞のゲノム安定性若しくは不安定性を判別することにより、高効率且つ高精度にゲノム不安定な多能性幹細胞（好ましくはｉＰＳ細胞）の除去を実現することができる。
【００２１】
ここで開示される好ましい一態様のゲノム不安定な多能性幹細胞を除去する方法は、上記ゲノム不安定性であると判別された多能性幹細胞を、細胞選別機（セルソーター）を使用して除去することを特徴とする。
細胞選別機（セルソーター）を使用することで、多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞若しくはＥＳ細胞）を含む培養物中からゲノム不安定性であると判別された多能性幹細胞を効率よく除去することができる。そのため、細胞選別機を使用したゲノム不安定な多能性幹細胞の除去方法は、特に、多量の多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞）を含む培養物からの細胞除去に好適である。
【００２２】
典型的には、上記ゲノム不安定な多能性幹細胞を除去する方法によって除去される多能性幹細胞は、染色体異常を有する多能性幹細胞である。染色体異常を有するｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞（或いは該幹細胞を分化誘導して得られる細胞、細胞塊、組織等）は生体内に移植された後で腫瘍の原因となる虞があるため、染色体異常を有する多能性幹細胞を除去する上記方法は、再生医療に資するための多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞）を準備する方法として好適に利用できる。特に、上記除去される細胞が染色体異常を有するヒト由来のｉＰＳ細胞である上記除去方法は、本発明の好適な一実施形態である。
【００２３】
また、本発明によると、他の側面として、ヒト又は他の哺乳動物由来の多能性幹細胞を含む培養物を製造する方法であって、該多能性幹細胞の培養過程において、ここで開示されるゲノム不安定な多能性幹細胞の除去方法のいずれかによって、ゲノム不安定な多能性幹細胞を該多能性幹細胞培養物中から除去することを包含する方法が提供される。
かかる製造方法により製造された多能性幹細胞培養物（典型的にはｉＰＳ細胞培養物若しくはＥＳ細胞培養物）は、上記除去方法によりゲノム不安定な多能性幹細胞が除去された多能性幹細胞培養物であるため、当該培養物中に含まれる実質的に全ての多能性幹細胞がゲノム安定な多能性幹細胞である多能性幹細胞培養物として把握され得る。該多能性幹細胞培養物（典型的には該多能性幹細胞培養物中の多能性幹細胞）は、腫瘍化のリスクが低い再生医療用多能性幹細胞として好適に利用することができる。特にヒト由来のｉＰＳ細胞を含む培養物を製造する上記方法は、医療産業上の利用価値が極めて高いため好ましい一実施形態である。
【００２４】
また、本発明によると、他の側面として、ここで開示される少なくとも1種のカルレティキュリン発現誘導ペプチドを含む、ゲノム不安定な多能性幹細胞のカルレティキュリン発現量を増大するために用いられるカルレティキュリン発現誘導剤が提供される。
また、典型的には、上記カルレティキュリン発現誘導剤は、薬学上許容され得る少なくとも１種の担体（例えば上記ペプチドの安定性向上に資する少なくとも１種の基材、或いは生理食塩水や各種の緩衝液等の液状媒体）を含む。
かかるカルレティキュリン発現誘導剤は、単純な構造（直鎖状のペプチド鎖）の合成ペプチドを有効成分として含むため、例えば、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞（典型的には当該幹細胞培養物の培地中）に該カルレティキュリン発現誘導剤を供給するという簡易な処理を行うことによって、ゲノム不安定な多能性幹細胞のカルレティキュリン発現量を増大させることができる。これにより、上記幹細胞におけるカルレティキュリンの発現の程度に基づいて、当該幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性を高精度且つ高信頼性に判別可能となる。また、化学合成（若しくは生合成）によって容易に人為的に製造され得る合成ペプチドを有効成分として含むため、所望量のカルレティキュリン発現誘導剤を容易に調製することができる。なお、上記カルレティキュリン発現誘導剤は、特にゲノム不安定なヒト由来のｉＰＳ細胞のカルレティキュリンの発現量を増大させるために好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ゲノム安定なヒトｉＰＳ細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）であり、ＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）による核染色画像と、抗カルレティキュリン抗体を使用した免疫蛍光抗体法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた（マージした）画像である。
【図２】図２は、ゲノム不安定な（具体的には、１２番染色体が３倍体（トリソミー）である）細胞を含むヒトｉＰＳ細胞培養物におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）であり、ＤＡＰＩによる核染色画像と、抗カルレティキュリン抗体を使用した免疫蛍光抗体法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた（マージした）画像である。
【図３】図３は、ゲノム不安定な（具体的には、１２番染色体が３倍体（トリソミー）である）細胞を含むヒトｉＰＳ細胞の培養物中に一実施形態に係るカルレティキュリン発現誘導ペプチド（サンプル１）を培地中の濃度が１０μＭとなるように添加して培養した後、当該ｉＰＳ細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）であり、ＤＡＰＩによる核染色画像と、抗カルレティキュリン抗体を使用した免疫蛍光抗体法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた（マージした）画像である。
【図４】図４は、ゲノム安定なヒトｉＰＳ細胞に一実施形態に係るカルレティキュリン発現誘導ペプチド（サンプル１）を培地中の濃度が１０μＭとなるように添加して培養した後、当該ｉＰＳ細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）であり、ＤＡＰＩによる核染色画像と、抗カルレティキュリン抗体を使用した免疫蛍光抗体法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた（マージした）画像である。
【図５】図５は図２と同じ画像であり、ゲノム不安定な（具体的には、１２番染色体が３倍体（トリソミー）である）細胞を含むヒトｉＰＳ細胞の培養物をカルレティキュリン発現誘導ペプチド無添加で培養した後、当該ｉＰＳ細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）であり、ＤＡＰＩによる核染色画像と、抗カルレティキュリン抗体を使用した免疫蛍光抗体法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた（マージした）画像である。
【図６】図６は図１と同じ画像であり、ゲノム安定なヒトｉＰＳ細胞をカルレティキュリン発現誘導ペプチド無添加で培養した後、当該ｉＰＳ細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）であり、ＤＡＰＩによる核染色画像と、抗カルレティキュリン抗体を使用した免疫蛍光抗体法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた（マージした）画像である。
【図７】図７は、ゲノム不安定な（具体的には、１２番染色体が３倍体（トリソミー）である）細胞を含むヒトｉＰＳ細胞の培養物について、蛍光色素（フィコエリトリン、Phycoerythrin）で標識された抗カルレティキュリン抗体を用いて蛍光免疫染色を行い、該蛍光色素（Phycoerythrin）の蛍光発色の強度をＦＡＣＳを用いて分析した結果を示すヒストグラムである。横軸に蛍光強度を示し、縦軸に細胞数を示す。なお、対照試験区（ネガティブコントロール区）として、蛍光免疫染色を行っていないｉＰＳ細胞（Unstained cells）を、上記Phycoerythrinの蛍光発色強度測定と同様の条件で分析した結果を重ねて示す。
【図８】図８は、ゲノム安定なヒトｉＰＳ細胞について、蛍光色素（Phycoerythrin）で標識された抗カルレティキュリン抗体を用いて蛍光免疫染色を行い、該蛍光色素（Phycoerythrin）の蛍光発色の強度をＦＡＣＳを用いて分析した結果を示すヒストグラムである。横軸に蛍光強度を示し、縦軸に細胞数を示す。なお、対照試験区（ネガティブコントロール区）として、蛍光免疫染色を行っていないｉＰＳ細胞（Unstained cells）を、上記Phycoerythrinの蛍光発色強度測定と同様の条件で分析した結果を重ねて示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。本明細書において特に言及している事項（例えばここで開示される合成ペプチドの一次構造や鎖長）以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えばペプチドの化学合成法、細胞培養技法、ペプチドを成分とする薬学的組成物の調製に関するような一般的事項）は、細胞工学、生理学、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、遺伝学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。なお、以下の説明では、場合に応じてアミノ酸をIUPAC-IUBガイドラインで示されたアミノ酸に関する命名法に準拠した１文字表記（但し配列表では３文字表記）で表す。
また、本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
【００２７】
また、本明細書において「合成ペプチド」とは、そのペプチド鎖がそれのみ独立して自然界に安定的に存在するものではなく、人為的な化学合成或いは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって製造され、所定の組成物（例えばカルレティキュリン発現誘導剤）中で安定して存在し得るペプチド断片をいう。
また、本明細書において「ペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、ペプチド鎖に含まれるアミノ酸残基の数によって限定されないが、典型的には全アミノ酸残基数が概ね１００以下（好ましくは６０以下、例えば５０以下）のような比較的分子量の小さいものをいう。
また、本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸を包含する用語である。
なお、本明細書中に記載されるアミノ酸配列は、常に左側がＮ末端側であり右側がＣ末端側である。
【００２８】
本明細書において所定のアミノ酸配列に対して「改変アミノ酸配列」とは、当該所定のアミノ酸配列が有する機能（例えば上記カルレティキュリン発現誘導ペプチドが有するカルレティキュリン発現誘導活性）を損なうことなく、１個又は数個（例えば２個又は３個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列をいう。例えば、１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が保守的に置換したいわゆる同類置換（conservative amino acid replacement）によって生じた配列（例えば塩基性アミノ酸残基が別の塩基性アミノ酸残基に置換した配列：例えばリジン残基とアルギニン残基との相互置換）、或いは、所定のアミノ酸配列について１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が付加（挿入）した若しくは欠失した配列等は、本明細書でいうところの改変アミノ酸配列に包含される典型例である。従って、ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチドには、各配列番号のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列で構成される合成ペプチドに加え、各配列番号のアミノ酸配列において１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が置換（例えば上記同類置換）、欠失及び／又は付加したアミノ酸配列であって、同様にカルレティキュリン発現誘導活性を示すアミノ酸配列からなる合成ペプチドを包含する。
【００２９】
本明細書において「多能性幹細胞（pluripotent stem cell）」とは、胎盤などの胚体外組織を除いた一つの生物体を形成する種々の細胞種へ分化可能な能力（多分化能、多能性）を有し、さらに、未分化状態で自己複製能を有する幹細胞をいう。例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＧ細胞（胚性生殖細胞；embryonic germ cell）が挙げられる。特に「誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）」とは、分化した細胞（典型的には体細胞、例えば皮膚の線維芽細胞等）を人為的に初期化（リプログラミング）することで多分化能と自己複製能を獲得させた細胞をいう。分化細胞を初期化する方法としては、例えば数種の初期化因子（例えばOct3/4、klf4、c-Myc及びSox2の4種の遺伝子又はOct3/4、Sox2、Nanog及びLin28の４種の遺伝子等）を当該細胞内に導入する方法が挙げられる。なお、上記ｉＰＳ細胞は、上記多能性幹細胞の性質を維持する限り分子生物学的操作（例えば、カルレティキュリン発現を標識するためのマーカー遺伝子の導入、レポーター遺伝子の導入、蛍光タンパク質融合タンパク質発現ベクターの導入等）をされてもよい。
なお、本明細書においてｉＰＳ細胞の由来は特に限定されないが、特にヒト由来のｉＰＳ細胞は医療産業上の利用価値が高いため本発明の実施対象として特に好ましい。
【００３０】
本明細書において「ゲノム安定性」、「ゲノム不安定性」とは、広義に解釈される用語であり、典型的には以下に挙げるゲノムの構造的な及び／又は機能的な異常の有無又はその程度を指標として安定か不安定かで区分するために用られ得る用語である。例えば、ＤＮＡ塩基配列の局部的な異常（例えば、塩基置換、点変異、遺伝子重複、遺伝子間のＤＮＡ領域の混ぜ合わせ、又は遺伝子の水平伝播等）、染色体の異常（例えば、部分的な重複、逆位、欠失、転座、切断といった染色体の部分的異常、異数体といった染色体の数的異常、又は多核化等）、或いはエピジェネティックな異常（ＤＮＡメチル化の変化、ヒストン修飾の変化、クロマチン構造の変化、又は非翻訳ＲＮＡの変化等）の有無又はその程度に基づいて、ゲノム安定性若しくはゲノム不安定性を判別することが可能であるが、本発明の実施に好適なゲノム安定性若しくはゲノム不安定性の区分として、染色体異常を指標としてゲノム安定性かゲノム不安定性かを区分することができる。ここで、染色体異常とは、いわゆる「核型異常」を包含してもよい。染色体異常のなかでも特に、異数体、好ましくは重複異常、さらに好ましくは１２番染色体の重複、の有無又はその程度でゲノム安定性若しくはゲノム不安定性を区分け（評価）してもよい。
【００３１】
ここで開示されるヒト又は他の哺乳動物由来の多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞培養物若しくはＥＳ細胞培養物）のゲノム安定性を評価する方法は、対象となるｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を含む培養物を準備することと、該培養物中の多能性幹細胞（例えば、培養物中に含まれる多能性幹細胞集団の全部若しくは一部、又は、個々の多能性幹細胞）のカルレティキュリンの発現量（典型的には対象の多能性幹細胞の細胞膜上のカルレティキュリン存在量）を調べ、該カルレティキュリンの発現量の程度に基づいて対象の多能性幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性を判別することと、を特徴とする評価方法である。ゲノム不安定なｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞はゲノム安定な多能性幹細胞と比較してカルレティキュリン発現量が顕著に増大しているため、培養物中の多能性幹細胞のカルレティキュリンの発現量を調べることで当該幹細胞のゲノム安定性若しくは不安定性を判別することができる。
【００３２】
上記多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法は、上記判別において、カルレティキュリンの発現量が所定レベルを上回った多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞若しくはＥＳ細胞）をゲノム不安定と判別する。例えば、予めゲノム安定であることが確認されたｉＰＳ細胞（例えば、比較対象の基準例として正常な核型を有するｉＰＳ細胞として一般に入手可能な２０１Ｂ７クローン株等が挙げられる）におけるカルレティキュリン発現量及び／又は予めゲノム不安定な細胞を含むことが確認されたｉＰＳ細胞培養物（例えば、正常な１２番染色体が３倍体であるｉＰＳ細胞として一般に入手可能な２０１Ｂ２クローン株等）におけるカルレティキュリン発現量を比較することで、評価対象のｉＰＳ細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性を判別し得るカルレティキュリン発現量のレベルを設定することができる。多能性幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性を判別し得るカルレティキュリン発現量のレベルは、カルレティキュリン発現量の測定方法の感度や精度等によって異なるため、採用する測定方法に応じて設定することができる。例えば、予めゲノム安定であることが確認された比較対象である多能性幹細胞（例えばｉＰＳ細胞）におけるカルレティキュリン発現量に比べて好ましくは１．２倍以上（例えば１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは５倍以上、例えば１０倍以上）のカルレティキュリンを発現する多能性幹細胞をゲノム不安定と判別することができる。なお、上記評価対象の多能性幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性を判別し得るカルレティキュリン発現量のレベルは、由来が同じ多能性幹細胞を用いて設定することが好ましい。
【００３３】
ここで開示されるｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞におけるカルレティキュリン発現量を調べる方法（測定方法）は、カルレティキュリン発現量の程度が定性的もしくは定量的に把握可能な方法であれば特に限定されない。例えば、カルレティキュリン発現量の程度を直接把握し得る方法として、ウエスタンブロッティング、免疫抗体法（典型的には免疫組織化学法、Immunohistochemistry、IHC、なお「免疫染色法」ともいう）、又はそれらを応用した方法等が挙げられる。また、カルレティキュリン遺伝子の発現状態からカルレティキュリンの発現程度を間接的に把握し得る方法としては、例えば、ノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、in situハイブリダイゼーション、又はそれらを応用した方法等が挙げられる。或いは、対象のｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞に分子生物学的手法を用いて予め導入しておいた標識（典型的には導入遺伝子の転写産物或いは翻訳産物等）をマーカー（目印）にカルレティキュリン発現量の程度を把握し得る方法として、例えば、レポーターアッセイ法、蛍光タンパク質融合カルレティキュリンの測定等が挙げられる。なお、上記カルレティキュリン発現量の測定方法はあくまでも例示であり、これに限定されない。上記カルレティキュリン発現量の測定方法は、１つの方法を単独で用いてもよいし、２つ以上の方法を組み合わせて使用してもよい。
【００３４】
上記多能性幹細胞（例えばｉＰＳ細胞）のゲノム安定性若しくは不安定性の判別は、カルレティキュリン又はその断片と特異的に反応する抗体（即ち抗カルレティキュリン抗体）を用いた免疫学的手法（例えば、ウエスタンブロッティングや免疫抗体法等）によって好適に実施することができる。抗カルレティキュリン抗体を用いた免疫学的手法は、カルレティキュリン発現量の程度を高特異的且つ高感度に直接的な把握が可能なため好ましい。特に、免疫抗体法（典型的には免疫染色法）は、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞の形態を保ったまま（即ち、細胞破砕、細胞溶解をすることなく）当該幹細胞におけるカルレティキュリン発現量の程度を調べ得るため、個々の多能性幹細胞におけるカルレティキュリン発現量の程度を把握したい場合に特に好適な測定方法である。また、免疫抗体法（典型的には免疫染色法）によると、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞の細胞表面（典型的には細胞膜の表面）に存在するカルレティキュリンのみ（即ち、細胞内に恒常的に発現するカルレティキュリンの発現量の影響を受けることなく）を特異的に識別することができるため、上記多能性幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性の判別を高精度に実現することができる。
【００３５】
なお、免疫学的手法とは、典型的には、抗原（又はその断片）と特異的に反応する抗体とを抗原抗体反応させて免疫複合体を形成し、該抗体を検出（可視化）することで抗原量を把握する方法である。本発明においては、予め何らかの標識をした抗カルレティキュリン抗体を用いる方法（直接法）、又は、抗カルレティキュリン抗体を特異的に認識する標識二次抗体抗を用いる方法（間接法）のどちらの方法も好適に使用できる。間接法は直接法に比べて高感度にカルレティキュリン発現量の程度を把握し得るため特に好ましい。抗カルレティキュリン抗体を検出（可視化）する方法としては、例えば、免疫蛍光抗体法、酵素抗体法、オートラジオグラフィー、金コロイド法等が挙げられる。例えば、免疫蛍光抗体法は、抗カルレティキュリン抗体若しくは二次抗体を予め蛍光色素で標識しておき、抗原抗体反応の後に当該蛍光色素の励起光を当てることで蛍光色素を蛍光発色させ、蛍光顕微鏡等を用いて当該蛍光発色を検出する方法である。免疫蛍光抗体法は、高精度にカルレティキュリン発現量の程度を把握し得るため特に好ましい方法である。なお、本明細書において「抗体」とは、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のどちらも包含し、免疫動物（抗体産生動物、Host、Source）や免疫グロブリンの定常領域の違い（アイソタイプ、クラスともいう）に限定されない。
【００３６】
典型的には、ｉＰＳ細胞培養物中のｉＰＳ細胞に対して抗カルレティキュリン抗体を抗原抗体反応させ、次いで該抗カルレティキュリン抗体に対する蛍光標識二次抗体を反応させる。その後、該蛍光標識の蛍光発光を蛍光顕微鏡等で検出することにより、ｉＰＳ細胞におけるカルレティキュリン発現量（典型的にはｉＰＳ細胞の細胞表面に存在するカルレティキュリン発現量）を把握することができる。
【００３７】
或いはまた、対象の多能性幹細胞（例えばｉＰＳ細胞）が生きたままの状態で（即ち、細胞固定の操作をすることなく）該幹細胞におけるカルレティキュリン発現量の程度を調べ得る方法は、後述の多能性幹細胞を含む培養物の製造方法の実施に好適である。例えば、免疫抗体法や蛍光タンパク質融合カルレティキュリンの測定を応用することで、生きたままの多能性幹細胞（例えばｉＰＳ細胞若しくはＥＳ細胞）におけるカルレティキュリン発現量を調べ得る。
【００３８】
ここで開示されるヒト又は他の哺乳動物由来の多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞若しくはＥＳ細胞）の培養物を準備する方法は特に限定されず、従来公知の方法を採用することができる。例えば、ＥＳ細胞の培養条件と同様の条件を好適に採用し得る。フィーダー細胞（例えば、ＳＮＬ７６／７細胞、ＳＴＯ細胞、ＭＥＦ細胞等）の有無についても特に限定されないが、多能性幹細胞培養物中（例えばｉＰＳ細胞培養物中）の多能性幹細胞におけるカルレティキュリンの発現量を調べる観点からは、フィーダー細胞を必要としない培養物を準備することが好ましい。なお、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞の接着性向上の観点から、多能性幹細胞を培養する培養容器の底面（典型的には多能性幹細胞の接着面）は接着基質（例えば、マトリゲル、脱落膜由来細胞の細胞外マトリクス、ゼラチン、細胞接着タンパク質等）で処理（コート）しておくことが好ましい。例えば、底面をマトリゲルコートした培養皿中に一般的に市販されているｉＰＳ細胞用培地を注入し、当該培養容皿中に対象のｉＰＳ細胞を播種した後、所定時間培養することで該ｉＰＳ細胞培養物を準備することができる。
【００３９】
或いはまた、ここで開示される多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法は、対象の多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞若しくはＥＳ細胞）のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性を判別するより前に、当該幹細胞（典型的には当該幹細胞培養物の培地中）に上記カルレティキュリン発現誘導ペプチドを少なくとも一回供給し、該合成ペプチドを少なくとも一回供給した該幹細胞培養物を所定時間培養した後に上記判別を行うことでより好適に実施できる。
上記カルレティキュリン発現誘導ペプチドを対象の多能性幹細胞（例えばｉＰＳ細胞）に供給し、所定時間培養することで、ゲノム不安定な多能性幹細胞におけるカルレティキュリンの発現量を特に増大させることができる。これにより、ゲノム不安定な多能性幹細胞とゲノム安定な多能性幹細胞とのカルレティキュリン発現量の差を、カルレティキュリン発現誘導ペプチドを添加しない場合と比較してより明確にすることができる。そのため、該カルレティキュリンの発現量の程度に基づいた多能性幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性の判別を高精度且つ高い信頼性で実現可能となる。
なお、上記カルレティキュリン発現誘導ペプチドは、ゲノム不安定なヒト由来のｉＰＳ細胞のカルレティキュリン発現量を顕著に増大し得る。そのため、ここで開示されるｉＰＳ細胞のゲノム安定性評価方法は、特にヒト由来のｉＰＳ細胞について好適に実施することができる。
【００４０】
上記カルレティキュリン発現誘導ペプチドを対象の多能性幹細胞（例えばｉＰＳ細胞）の培養物中に添加した後に当該培養物を培養する時間は、ゲノム不安定な多能性幹細胞においてカルレティキュリンの発現を誘導可能或いはカルレティキュリンの発現量を増大可能な時間であれば、特に限定されない。典型的には数時間から数日間の培養を行う。例えば、２時間以上、好ましくは２４時間以上、より好ましくは４８時間以上の培養がよく、例えば培養開始から３日〜５日間、あるいは６日〜７日間、あるいは１０日間程度の培養を行うとよい。
【００４１】
上述のとおり、ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチドは、以下のアミノ酸配列：
ＣＲＡＫＡＧＤＰＣ（配列番号１）；および
ＣＥＱＫＱＥＩＲＣ（配列番号２）；
のうちのいずれか若しくは該アミノ酸配列において１個、又は２個、又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変アミノ酸配列のいずれかからなるカルレティキュリン発現誘導ペプチド配列を含む合成ペプチドである。配列番号１又は配列番号２に示される具体的なアミノ酸配列は、ヒト由来のセントリン２のｓｉＲＮＡを構成するＲＮＡ配列を翻訳して得られるアミノ酸配列（以下「セントリン２ｓｉＲＮＡ関連配列」ともいう）であることに加え、ゲノム不安定なｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞におけるカルレティキュリンの発現を誘導する或いはカルレティキュリンの発現量を増大させることが本発明者によって新たに見出された配列である。
ここで、セントリンとは、真核生物の中心体に存在し、中心子の構成タンパク質の一つとして中心子の複製や微小管の切断に関与する中心体関連タンパク質であり、セントリン２とは、セントリンファミリー（典型的には、セントリン１、セントリン２、セントリン３等）に属するタンパク質のうちの一つである（非特許文献３参照）。
【００４２】
また、ヒト由来のセントリン２ｓｉＲＮＡ関連配列の典型的な改変アミノ酸配列として、以下のアミノ酸配列：
ＲＡＫＡＧＤＰ（配列番号３）；および
ＥＱＫＱＥＩＲ（配列番号４）；
が挙げられる。配列番号３又は配列番号４に示すアミノ酸配列は、配列番号１又は配列番号２に示すアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のシステイン残基（Ｃ）を欠失した配列である。ここに挙げるセントリン２ｓｉＲＮＡ関連配列の改変アミノ酸配列もまた、カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列として好適に機能する。なお、配列番号３および配列番号４に示した上述の改変アミノ酸配列はあくまでも例示であり、使用可能なセントリン２ｓｉＲＮＡ関連配列の改変アミノ酸配列をかかる配列に限定することを意図するものではない。
【００４３】
或いはまた、ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチドは、配列番号１又は配列番号２に示すカルレティキュリン発現誘導ペプチド配列又はその改変アミノ酸配列のみから成る合成ペプチドであってもよいが、カルレティキュリン発現誘導活性を向上する観点からは、当該カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列のＮ末端側もしくはＣ末端側に膜透過性ペプチド配列を有する合成ペプチドが好ましい。膜透過性ペプチド配列を有する合成ペプチドであれば、目的の多能性幹細胞（例えばｉＰＳ細胞）に供給した際、細胞内に速やかに導入され得ることによりカルレティキュリン発現誘導活性を向上させることができる。
上記膜透過性ペプチド配列は、細胞膜及び／又は核膜を通過し得る膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列であれば特に限定なく使用することができる。多くの好適な膜透過性ペプチド配列が知られているが、例えばＮｏＬＳ（核小体局在シグナル、Nucleolar localization signal）に関連するアミノ酸配列（改変アミノ酸配列を含む）がカルレティキュリン発現誘導ペプチドの膜透過性ペプチド配列のアミノ酸配列として好ましい。例えば、配列番号５に示すＬＩＭキナーゼ２（LIM Kinase 2）に含まれるＮｏＬＳ並びに配列番号６に示すＩＢＶ（トリ伝染性気管支炎ウイルス：avian infectious bronchitis virus）のＮタンパク質（nucleocapsid protein）に含まれるＮｏＬＳのアミノ酸配列が挙げられる。また、他の膜透過性ペプチド配列の例として、配列番号７〜９に示すアミノ酸配列およびそれらの改変アミノ酸配列（膜透過性を保持しているものに限られる）が挙げられる。配列番号７は、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：Human Immunodeficiency Virus）のＴＡＴに含まれる膜透過性ペプチド配列のアミノ酸配列を示している。配列番号８は、上記ＴＡＴを改変した膜透過性ペプチド配列（ＰＴＤ４）のアミノ酸配列を示している。配列番号９は、ショウジョウバエ（Drosophila）の変異体であるAntennapediaのＡＮＴ関連アミノ酸配列を示している。
なお、配列表に示した上述の膜透過性ペプチド配列はあくまでも例示であり、使用可能なペプチド配列はこれに限定されない。本発明の実施に使用可能な様々な膜透過性ペプチド配列が本願出願当時に出版されている数々の文献に記載されている。それら膜透過性ペプチド配列のアミノ酸配列は一般的な検索手段によって容易に知ることができる。
【００４４】
特に、特許文献１にも記載されている配列番号５に示すアミノ酸配列（改変アミノ酸配列を含む）が膜透過性ペプチド配列として好ましい。かかる配列番号５に示す膜透過性ペプチド配列と上記カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列（配列番号１若しくは２）又はその改変アミノ酸配列とを組み合わせることにより、高いカルレティキュリン発現誘導活性を示す合成ペプチドを得ることができる。
【００４５】
ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチドは、以下のアミノ酸配列：
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＣＲＡＫＡＧＤＰＣ（配列番号１０）；
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＣＥＱＫＱＥＩＲＣ（配列番号１１）；
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＲＡＫＡＧＤＰ（配列番号１２）；および
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＥＱＫＱＥＩＲ（配列番号１３）；
のうちから選択されるいずれかのアミノ酸配列または該選択されたアミノ酸配列の改変アミノ酸配列を特に好ましく含有する。配列番号１０又は配列番号１１に示すアミノ酸配列は、上記配列番号１又は配列番号２に示すヒト由来のセントリン２ｓｉＲＮＡ関連配列と、上記配列番号５に示すＬＩＭキナーゼ２のＮｏＬＳ由来のアミノ酸配列とを、２個のグリシン（Ｇ）残基から成るリンカーを介して組み合わせることにより構築された合計２４アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。また、配列番号１２又は配列番号１３に示すアミノ酸配列は、上記配列番号３又は配列番号４に示すヒト由来のセントリン２ｓｉＲＮＡ関連配列の典型的な改変アミノ酸配列と、上記配列番号５に示すＬＩＭキナーゼ２のＮｏＬＳ由来のアミノ酸配列とを、２個のグリシン（Ｇ）残基から成るリンカーを介して組み合わせることにより構築された合計２２アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
【００４６】
ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチドのペプチド鎖（アミノ酸配列）のうちの幾つかは、上述したようなカルレティキュリン発現誘導ペプチド配列と、膜透過性ペプチド配列とを適宜組み合わせることにより構築することができる。カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列の何れが相対的にＣ末端側（Ｎ末端側）に配置されてもよい。また、カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列とは隣接して配置されるのが好ましい。即ち、カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列との間には、両配列部分に包含されないアミノ酸残基が存在しないか或いは存在していても該残基数が１〜３個程度が好ましい。例えば、カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列との間にリンカーとして機能する１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基（例えば１個又は数個のグリシン（G）残基）を含むものであり得る。
ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸残基がアミド化されているものが好ましい。アミノ酸残基（典型的にはペプチド鎖のＣ末端アミノ酸残基）のカルボキシル基のアミド化により、合成ペプチドの構造安定性（例えばプロテアーゼ耐性）を向上させることができる。
【００４７】
カルレティキュリン発現誘導ペプチドは、上記カルレティキュリン発現誘導活性を失わない限りにおいて、カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸配列以外の配列（アミノ酸残基）部分を含み得る。特に限定するものではないが、かかる部分配列としてはカルレティキュリン発現誘導ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列部分の３次元形状（典型的には直鎖形状）を維持し得る配列が好ましい。該カルレティキュリン発現誘導ペプチドは、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が１００以下が適当であり、６０以下が望ましく、５０以下が好ましい。例えば３０以下の合成ペプチドが特に好ましい。
このような鎖長の短いペプチドは、化学合成が容易であり、容易にカルレティキュリン発現誘導ペプチドを提供することができる。なお、ペプチドのコンホメーション（立体構造）については、使用する環境下（生体外若しくは生体内）でカルレティキュリン発現誘導活性を発揮する限りにおいて、特に限定されるものではないが、免疫原（抗原）になり難いという観点から直鎖状又はヘリックス状のものが好ましい。このような形状のペプチドはエピトープを構成し難い。かかる観点から、本発明に適用するカルレティキュリン発現誘導ペプチドとしては、直鎖状であり比較的低分子量（典型的には６０以下（特に３０以下）のアミノ酸残基数）のものが好適である。
【００４８】
全体のアミノ酸配列に対するカルレティキュリン発現誘導ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列の占める割合（即ちペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数に占めるカルレティキュリン発現誘導ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸残基数の個数％）は、カルレティキュリン発現誘導活性を失わない限り特に限定されないが、当該割合は概ね６０％以上が望ましく、８０％以上が好ましい。９０％以上が特に好ましい。カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列とから成る（即ち、これらの配列が全アミノ酸配列の１００％を占める）ペプチドは好適な一形態である。
なお、本発明のカルレティキュリン発現誘導ペプチドとしては、全てのアミノ酸残基がＬ型アミノ酸であるものが好ましいが、カルレティキュリン発現誘導活性を失わない限りにおいて、アミノ酸残基の一部又は全部がＤ型アミノ酸に置換されているものであってもよい。
【００４９】
ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチドは、一般的な化学合成法に準じて容易に製造することができる。例えば、従来公知の固相合成法又は液相合成法のいずれを採用してもよい。アミノ基の保護基としてＢｏｃ（t-butyloxycarbonyl）或いはＦｍｏｃ（9-fluorenylmethoxycarbonyl）を適用した固相合成法が好適である。
ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチドは、市販のペプチド合成機（例えば、Intavis AG社、Protein Technologies社等から入手可能である。）を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾（Ｃ末端アミド化等）部分を有するペプチド鎖を合成することができる。
【００５０】
或いは、遺伝子工学的手法に基づいてカルレティキュリン発現誘導ペプチドを生合成してもよい。すなわち、所望するカルレティキュリン発現誘導ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始コドンを含む。）のポリヌクレオチド（典型的にはＤＮＡ）を合成する。そして、合成したポリヌクレオチド（ＤＮＡ）と該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含する。）とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。
一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からペプチドを単離し、必要に応じてリフォールディング、精製等を行うことによって、目的のカルレティキュリン発現誘導ペプチドを得ることができる。
なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本発明を特徴づけるものではないため、詳細な説明は省略する。
【００５１】
例えば、宿主細胞内で効率よく大量に生産させるために融合タンパク質発現システムを利用することができる。すなわち、目的のカルレティキュリン発現誘導ペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を化学合成し、該合成遺伝子を適当な融合タンパク質発現用ベクター（例えばノバジェン社から提供されているｐＥＴシリーズ及びアマシャムバイオサイエンス社から提供されているｐＧＥＸシリーズのようなＧＳＴ(Glutathione S-transferase)融合タンパク質発現用ベクター）の好適なサイトに導入する。そして該ベクターにより宿主細胞（典型的には大腸菌）を形質転換する。得られた形質転換体を培養して目的の融合タンパク質を調製する。次いで、該タンパク質を抽出し、精製する。次いで、得られた精製融合タンパク質を所定の酵素（プロテアーゼ）で切断し、遊離した目的のペプチド断片（設計したカルレティキュリン発現誘導ペプチド）をアフィニティクロマトグラフィー等の方法によって回収する。また、必要に応じて適当な方法によってリフォールディングする。このような従来公知の融合タンパク質発現システム（例えばアマシャムバイオサイエンス社により提供されるＧＳＴ／Ｈｉｓシステムを利用し得る。）を用いることによって、ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチドを製造することができる。
或いは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型ＤＮＡ（即ちカルレティキュリン発現誘導ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片）を構築し、ペプチド合成に必要な種々の化合物（ＡＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸類等）を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロ（生体外、in vitro）合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文(Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット（例えば、日本の東洋紡績（株）から入手可能なPROTEIOS（商標）Wheat germ cell-free protein synthesis kit）が市販されている。
【００５２】
ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドは、従来公知の方法によって容易に製造（合成）することができる。すなわち、設計したアミノ酸配列を構成する各アミノ酸残基に対応するコドンを選択することによって、カルレティキュリン発現誘導ペプチドのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列が容易に決定され、提供される。そして、ひとたびヌクレオチド配列が決定されれば、ＤＮＡ合成機等を利用して、所望するヌクレオチド配列に対応するポリヌクレオチド（一本鎖）を容易に得ることができる。さらに得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、種々の酵素的合成手段（典型的にはＰＣＲ）を採用して目的の二本鎖ＤＮＡを得ることができる。また、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもよく、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）の形態であってもよい。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖で提供され得る。一本鎖で提供される場合は、コード鎖（センス鎖）であってもよく、それと相補的な配列の非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
こうして得られるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中で又は無細胞タンパク質合成システムにて、カルレティキュリン発現誘導ペプチド生産のための組換え遺伝子（発現カセット）を構築するための材料として使用することができる。
【００５３】
ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチドは、上記多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞若しくはＥＳ細胞）におけるカルレティキュリン発現誘導活性を損なわない限りにおいて塩の形態であってもよい。例えば、常法に従って通常使用されている無機酸又は有機酸を付加反応させることにより得られ得る該ペプチドの酸付加塩を使用することができる。或いは、上記多能性幹細胞におけるカルレティキュリン発現誘導活性を有する限り、他の塩（例えば金属塩）であってもよい。従って、本明細書及び特許請求の範囲に記載の「ペプチド」は、かかる塩形態のものを包含する。
【００５４】
ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導剤は、有効成分であるカルレティキュリン発現誘導ペプチドのカルレティキュリン発現誘導活性が失われない状態で保持し得る限りにおいて、使用形態に応じて種々の担体を含み得る。希釈剤、賦形剤等としてペプチド医薬において一般的に使用される担体が好ましい。カルレティキュリン発現誘導剤の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶媒が挙げられる。適当な濃度のアルコール（エタノール等）水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得る。或いはリポソームであってもよい。また、カルレティキュリン発現誘導剤に含有させ得る副次的成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料等が挙げられる。
カルレティキュリン発現誘導剤の形態に関して特に限定はない。例えば、典型的な形態として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏、水性ジェル剤等が挙げられる。また、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝液（例えばＰＢＳ、即ちリン酸緩衝生理食塩水）等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
なお、カルレティキュリン発現誘導ペプチド（主成分）及び種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の薬剤（組成物）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本発明を特徴づけるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修，Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。この書籍の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
【００５５】
ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導剤（即ち、カルレティキュリン発現誘導ペプチド）は、その形態及び目的に応じた方法や用量で使用することができる。
例えば、インビトロで培養（継代）している多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞若しくはＥＳ細胞）に対し、ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導剤（即ち、カルレティキュリン発現誘導ペプチド）の適当量を、培養過程のいずれかの段階（好ましくはゲノム安定性の評価を行うより前の段階）で培地に添加するとよい。添加量及び添加回数は、多能性幹細胞の種類や状態、細胞密度（培養開始時の細胞密度）、継代数、培養条件、培地の種類、等の条件によって異なり得るため特に限定されない。典型的には、培地中のペプチド濃度が概ね０．１μＭ〜１００μＭの範囲内、好ましくは０．５μＭ〜２０μＭ（例えば１μＭ〜１０μＭ）の範囲内となるように、１〜複数回添加する（例えば培養開始時並びに細胞の継代時や培地交換時に合わせて追加添加する）ことが好ましい。
また、ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導剤（即ち、カルレティキュリン発現誘導ペプチド）は、ゲノム安定性の評価に利用可能な多能性幹細胞の他の特徴（即ち、カルレティキュリン発現量ではない多能性幹細胞の特徴）を増強し得る他の化合物及び／又は該他の特徴を増強する方法と併用することも可能である。
【００５６】
ここで開示される多能性幹細胞培養物中（典型的にはｉＰＳ細胞培養物中若しくはＥＳ細胞培養物中）からゲノム不安定な多能性幹細胞を除去する方法は、上述の多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法によって対象の多能性幹細胞培養物中に含まれるｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性を判別し、該判別方法によりゲノム不安定であると判別された多能性幹細胞を当該幹細胞培養物中から除去することを特徴とする。
ゲノム不安定であると判別されたｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を対象の多能性幹細胞培養物中から除去することで、ゲノム安定な多能性幹細胞を主体とする多能性幹細胞培養物（例えばｉＰＳ細胞培養物）を製造することができる。例えば、培養物中に含まれる多能性幹細胞の大部分（例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９８％以上）をゲノム安定な多能性幹細胞が占める多能性幹細胞培養物を製造することができる。培養物中に含まれる実質的に全ての多能性幹細胞がゲノム安定な多能性幹細胞からなる（典型的には、ゲノム安定な多能性幹細胞が実質的に１００％を占める）多能性幹細胞培養物は、好適な一態様である。特に、ヒト由来のｉＰＳ細胞は医療産業上の利用価値が高いため、上記対象の多能性幹細胞の好適例である。
【００５７】
また、上記ゲノム不安定な多能性幹細胞の除去方法を実施することで得られるｉＰＳ細胞培養物等の多能性幹細胞培養物（即ち、対象の多能性幹細胞培養物中からゲノム不安定であると判別された多能性幹細胞を除去した後の当該幹細胞培養物）において、該培養物中に含まれる実質的に全ての多能性幹細胞が生細胞である（例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上）多能性幹細胞培養物は、産業上の利用価値が高い。特に、上記培養物中に含まれる多能性幹細胞が生細胞である（即ち、生細胞が実質的に１００％を占める）多能性幹細胞培養物は特に好適な一態様である。
【００５８】
上述の多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法によりゲノム不安定であると判別された多能性幹細胞を対象の多能性幹細胞培養物中（典型的にはｉＰＳ細胞培養物中若しくはＥＳ細胞中）から除去するために利用可能な多能性幹細胞の特徴（マーカー、標識、目印）としては、例えば、カルレティキュリンの発現状態、カルレティキュリン遺伝子の発現状態、カルレティキュリンの発現と相関性の高いタンパク質若しくはＲＮＡの発現状態、分子生物学的手法により多能性幹細胞に予め導入しておいた導入遺伝子の発現状態、染色体の状態（例えば、染色体異常、多核化等）、ゲノム不安定な細胞において発現量が変化することが知られているタンパク質若しくはＲＮＡの発現状態、又はゲノム不安定な多能性幹細胞特異的な生理的性質（増殖性、接着性、遊走性、細胞分裂の特徴、栄養要求性等）等が挙げられる。なお、上記多能性幹細胞の特徴はあくまでも例示であり、上記評価方法によりゲノム不安定であると判別された多能性幹細胞（例えばｉＰＳ細胞）を対象の多能性幹細胞培養物中から除去するために利用可能な多能性幹細胞の特徴であれば、特にこれに限定されない。また、上記多能性幹細胞の特徴は、１つの特徴を単独で利用することもできるし、２つ以上の特徴を組み合わせて利用することもできる。
【００５９】
対象の多能性幹細胞培養物中の多能性幹細胞（例えばｉＰＳ細胞）におけるカルレティキュリンの発現状態は、上記多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法における多能性幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性の判別基準として用いた多能性幹細胞の特徴と同じ特徴であるため、上記評価方法によってゲノム不安定であると判別されたｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を対象の多能性幹細胞培養物中（例えばｉＰＳ細胞培養物中）から正確に除去する観点で好適に利用することができる。特に、多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞）の細胞表面に存在するカルレティキュリンの存在状態は、ゲノム不安定であると判別されたｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を精度よく除去できるため、好ましい。
また、上記多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法で多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞若しくはＥＳ細胞）のカルレティキュリン発現量を把握するために用いた目印（マーカー、標識、特徴）、例えばカルレティキュリン発現量を測定するために用いた抗体の標識等、を当該除去方法においてもそのまま利用することができる。ゲノム安定性評価方法で用いた目印をそのまま利用すれば、ゲノム不安定であると判別されたｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞の除去に必要な操作を簡便化することができるため好ましい。
【００６０】
或いはまた、カルレティキュリンの発現状態は、抗カルレティキュリン抗体を用いた免疫学的手法（抗原抗体反応）による特異性の高い識別が可能であるため、ゲノム不安定であると判別されたｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を高精度かつ高信頼性に除去する観点で特に好適に利用することができる。典型的には、抗カルレティキュリン抗体若しくは抗カルレティキュリン抗体を特異的に認識する二次抗体に予め何らかの標識をしておき、該標識を目印として、対象の多能性幹細胞培養物中（例えばｉＰＳ細胞培養物中）からゲノム不安定であると判別されたｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を除去することができる。
上記抗体の標識としては、例えば、蛍光色素、マグネティックビーズ、ＧＳＴタグやＨｉｓタグといった各種のアフィニティータグ等を利用することができる。典型的には、蛍光標識した抗カルレティキュリン抗体若しくは蛍光標識した二次抗体を用いた免疫蛍光抗体法によりカルレティキュリンを蛍光標識し、該蛍光標識を目印とすることで、ゲノム不安定であると判別されたｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を対象の多能性幹細胞培養物中から高精度かつ高効率に除去することができる。
【００６１】
或いはまた、予め分子生物学的手法により導入しておいた導入遺伝子の転写産物或いは翻訳産物を目印としても、ゲノム不安定であると判別されたｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を対象の多能性幹細胞培養物中から効率よく除去することができる。例えば、蛍光タンパク質融合カルレティキュリンベクターを対象のｉＰＳ細胞に導入しておき、ゲノム不安定なｉＰＳ細胞において発現量が増加した蛍光タンパク質融合カルレティキュリンの蛍光発色を目印とすることで、対象のｉＰＳ細胞培養物中からゲノム不安定であると判別されたｉＰＳ細胞を除去することができる。
【００６２】
上記ゲノム不安定であると判別された多能性幹細胞を対象の多能性幹細胞培養液から除去する方法は、上記除去に用いる多能性幹細胞の特徴（マーカー、標識、目印）が所定レベルを上回った多能性幹細胞（例えばｉＰＳ細胞）を除去することで実現することができる。例えば、上記多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法でゲノム安定であると判別されたｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞における上記特徴のレベルと、ゲノム不安定であると判別されたｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞における上記特徴のレベルとを比較することで、上記除去に利用可能な多能性幹細胞の特徴の所定レベルを設定することができる。なお、当該所定レベルは、採用する多能性幹細胞の特徴、該特徴を調べる（測定する）方法、該測定方法の感度や精度によって異なるため、適宜設定する必要がある。
例えば、カルレティキュリン発現量が所定レベルを上回った多能性幹細胞を対象の多能性幹細胞培養物中（典型的にはｉＰＳ細胞培養物中若しくはＥＳ細胞培養物中）から除去することで、ゲノム不安定であると判別された多能性幹細胞を除去することができる。ゲノム不安定な多能性幹細胞を対象の多能性幹細胞培養物中から除去する際に利用可能なカルレティキュリンの発現レベルは、ゲノム不安定であると判別された多能性幹細胞の除去が可能であれば特に限定されない。典型的には、ゲノム安定性評価方法におけるカルレティキュリンの発現レベルと同程度の発現レベルを利用することができる。例えば、ゲノム安定なｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞（比較対象）におけるカルレティキュリン発現量に比べて好ましくは１．２倍以上（例えば１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは５倍以上、例えば１０倍以上）のカルレティキュリン発現量をゲノム不安定な多能性幹細胞を除去する基準とすることができる。なお、ゲノム不安定な多能性幹細胞を評価対象の多能性幹細胞培養物中から除去する際に利用可能なカルレティキュリンの発現レベルは、由来が同じ多能性幹細胞を用いて設定することが好ましい。
【００６３】
ここで開示されるゲノム不安定性であると判別された多能性幹細胞を対象の多能性幹細胞培養物中（典型的にはｉＰＳ細胞培養物中若しくはＥＳ細胞培養物中）から除去する方法は、特に限定されず、種々の細胞選別方法を利用することができる。例えば、蛍光標識式細胞分取器（ＦＡＣＳ、fluorescence-activated cell sorter）を用いた細胞選別、磁気細胞分離装置（ＭＡＣＳ（登録商標））を用いた細胞分別、顕微鏡下での細胞選別、光ピンセットを利用した細胞選別、各種カラムを用いた細胞選別、免疫的手法（抗原抗体反応）を利用した細胞選別、細胞染色を応用した細胞選別、特定導入遺伝子による標識を利用した細胞選別、細胞の生理的性質（増殖性、接着性、遊走性、細胞分裂の特徴、栄養要求性等）を利用した細胞選別などが挙げられる。特に、抗カルレティキュリン抗体を用いた免疫学的手法を利用した細胞選別方法は、高特異的かつ高い信頼性をもって細胞選別を行い得るため、特に好ましい。また、ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳおよび各種カラムを用いた細胞分別方法は、高効率に細胞を選別可能であるため好ましい。
なお、上記ゲノム不安定であると判別されたｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞の除去は、上記対象の多能性幹細胞培養物中の多能性幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性の判別と同時に行ってもよい。上記判別と上記除去を同時に行うと、ゲノム不安定な多能性幹細胞の除去に必要な操作を簡便化することができるため好ましい。
【００６４】
また、ここで開示されるゲノム不安定であると判別された多能性幹細胞を対象の多能性幹細胞培養物中（典型的にはｉＰＳ細胞培養物中若しくはＥＳ細胞培養物中）から除去するために用いられる細胞選別機は、特に限定されず、種々の細胞選別機を利用することができる。例えば、ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ（登録商標）、光ピンセットを応用した細胞選別装置、各種カラムを応用した細胞選別装置が挙げられる。ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ並びに光ピンセットを応用した細胞選別装置は、自動化により高効率にゲノム不安定であると判別されたｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を対象の多能性幹細胞培養物中から除去することができるため、本発明の実施に好適に用いることができる。特にＦＡＣＳおよびＭＡＣＳは、上記カルレティキュリン発現量に基づいた多能性幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性の判別とゲノム不安定な多能性幹細胞の除去とを同時に行い得るため、好ましい。
【００６５】
例えば、ＦＡＣＳを使用したゲノム不安定なｉＰＳ細胞の除去方法としては、以下の方法が挙げられる。対象のｉＰＳ細胞培養物中のｉＰＳ細胞に対して抗カルレティキュリン抗体を抗原抗体反応させ、次いで該抗カルレティキュリン抗体に対する蛍光標識二次抗体を反応させる。その後、該蛍光標識の蛍光発光をＦＡＣＳを用いて分析し、蛍光発光の強度が所定レベルを上回ったｉＰＳ細胞を対象のｉＰＳ細胞培養物中から除去することで、ゲノム不安定なｉＰＳ細胞を除去することができる。上記蛍光発光の強度が所定レベルを上回ったｉＰＳ細胞とは、典型的には、予めゲノム安定であることが確認されたｉＰＳ細胞（例えば上記２０１Ｂ７株）よりも蛍光強度が強い細胞、若しくは、予めゲノム不安定な細胞を含むことが確認されたｉＰＳ細胞（例えば上記２０１Ｂ２株）培養物中のゲノム不安定な細胞の蛍光強度と同程度もしくはそれ以上の蛍光強度の細胞である。
【００６６】
なお、上記ゲノム不安定な多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞若しくはＥＳ細胞）の除去方法で除去される多能性幹細胞の典型例としては、染色体異常及び／又は多核化を有する多能性幹細胞が挙げられる。上記多能性幹細胞（該多能性幹細胞を分化誘導して得られる細胞、細胞塊、組織等を含む）は、生体内に移植された後で腫瘍の原因となる虞があるため、再生医療目的の多能性幹細胞培養物中からの除去が特に望まれるゲノム不安定なｉＰＳ細胞である。特に染色体異常及び／又は多核化を有するヒト由来のｉＰＳ細胞の除去は、本発明の好適な一実施形態である。
【００６７】
以下、本発明に関するいくつかの実施例を説明するが、本発明をかかる実施例に示すものに限定することを意図したものではない。
【００６８】
以下の実施例においては、多能性幹細胞の例としてｉＰＳ細胞を用いた。具体的な供試細胞としては、ゲノム安定な（具体的には染色体異常のない）ヒト由来のｉＰＳ細胞株（クローン名：２０１Ｂ７、以下単に２０１Ｂ７ともいう）と、ゲノム不安定な（具体的には、１２番染色体が３倍体（トリソミー）である）細胞を含むヒト由来のｉＰＳ細胞株（クローン名：２０１Ｂ２、以下単に２０１Ｂ２ともいう）とを用いた。２０１Ｂ７と２０１Ｂ２はどちらも同じヒト線維芽細胞から樹立されたｉＰＳ細胞のクローンである（出典：Takahashi K et al., Cell, 131, 861-872(2007)）。なお、上記ｉＰＳ細胞は、京都大学ｉＰＳ細胞研究所から供与されたものを使用した。また、上記ｉＰＳ細胞の継代培養を行う際、フィーダー細胞としてBaylor College of Medicineよりライセンス供与されたマウス胎児線維芽細胞（細胞株：ＳＮＬ７６／７）を使用した。
【００６９】
＜実施例１：ｉＰＳ細胞培養物の準備（ｉＰＳ細胞の継代維持）＞
以下の方法で上記ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７及び２０１Ｂ２）を継代維持することで、ｉＰＳ細胞の培養物を準備した。詳細は以下のとおりである。
【００７０】
先ず、各ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７及び２０１Ｂ２）を播種するより１〜４日前に、マイトマイシンＣ処理して不活化したＳＮＬ７６／７細胞をゼラチンコートした培養容器（直径１０ｃｍの培養ディッシュ）に播種した。当該ＳＮＬ７６／７細胞は、５％ＣＯ２、３７℃条件下でｉＰＳ細胞を播種する直前まで培養した。そして、ｉＰＳ細胞をフィーダー細胞上に播種する直前に該フィーダー細胞をＰＢＳ（−）（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、４ｎｇ/ｍＬの組み換えｂＦＧＦ（Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor：和光純薬社製）を含む霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞培地（Primate ES Cell Medium：ReproCELL社製、以下ＥＳ培地とも呼ぶ）に交換することによって、フィーダー細胞を作製した。
次に、各ｉＰＳ細胞をそれぞれＣＴＫ溶液（０．１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼIV（Life Technologies社製品）、１ｍＭの塩化カルシウム、２０％のＫＳＲ（knockout serum replacement）を含む０．２５％トリプシン溶液）を用いて、ｉＰＳ細胞のコロニー辺縁部が剥離する程度に剥離処理した。ＣＴＫ溶液をＰＢＳ（−）で洗浄除去し、ＥＳ培地を添加した後、セルスクレーパーを用いてｉＰＳ細胞コロニーを完全に剥離した。１５ｍＬ容チューブ中にｉＰＳ細胞コロニーが懸濁した培養容器中のＥＳＣ培地を移し、さらに、培養容器に残ったｉＰＳ細胞コロニーをＥＳＣ培地で洗い込んで該１５ｍＬ容チューブに回収した。上記１５ｍＬ容チューブを５分間静置してｉＰＳ細胞コロニーを沈殿させ、上澄みを取り除いた後、新鮮なＥＳ培地中にピペッティングにてｉＰＳ細胞コロニーを分散懸濁し、ｉＰＳ細胞懸濁液を用意した。
このようにして得られたｉＰＳ細胞の懸濁物の適量（例えば、同容量の培養容器を用いて継代培養する場合は細胞懸濁液の全量の１／３〜１／８量程度）を上記のとおり作製しておいた培養容器中のフィーダー細胞上に播種した。そして培養容器をインキュベータに入れ、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で培養した。１〜２日毎に培地交換を行い、ｉＰＳ細胞が培養容器底面の８０〜９０％を占める状態（即ち、８０〜９０％コンフルエント）になるまで培養を継続した。上記８０〜９０％コンフルエントになったｉＰＳ細胞を上記の方法で継代培養することを繰り返した。このようにして、ｉＰＳ細胞の培養物を準備した。
【００７１】
＜実施例２：ｉＰＳ細胞におけるカルレティキュリン発現量の評価試験＞
ゲノム安定なｉＰＳ細胞とゲノム不安定なｉＰＳ細胞について、カルレティキュリンの発現を調べた。供試細胞として、上記２種のｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７及び２０１Ｂ２）を用いた。評価試験の詳細は以下のとおりである。
【００７２】
実施例１に記載の方法で準備した各ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７及び２０１Ｂ２）を、それぞれ上記継代培養と同様の方法で１５ｍＬ容チューブに回収し、５分間静置した。その後、上澄み液を除去し、新鮮なｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地（STEMCELL Technologies 社製）中にピペッティングにてｉＰＳ細胞コロニーを分散懸濁させた。そして、該ｉＰＳ細胞懸濁液を、マトリゲルコートした８穴（ウェル）スライド中に、１ウェルあたり凡そ１×１０４個の細胞密度となるように播種した。そして培養容器をインキュベータに入れ、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で一晩培養を行った。その一晩培養後、培地を新鮮なｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地に交換し、同条件でさらに５日間培養した。上記５日間の培養期間中は毎日培地交換を行った。
【００７３】
上記培養終了後、以下の免疫蛍光抗体法（蛍光免疫染色ともいう）により、各ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ２及び２０１Ｂ７）におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた。
具体的には、まず、各ｉＰＳ細胞の培養容器中の培地を除去し、ＰＢＳ（−）で洗浄した。次いで、メタノール１容量とアセトン１容量とを混和した溶液（メタノール／アセトン＝１：１溶液）を添加し、氷上に１５分静置してｉＰＳ細胞を固定した。その後、メタノール／アセトン＝１：１溶液を除去し、３％のＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）（３％のＢＳＡを含むＰＢＳ（−））を添加して室温で１時間のブロッキングを行った。所定時間経過後、３％のＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）を除去し、ＰＢＳ（−）にて洗浄した。
そして、一次抗体として抗カルレティキュリンモノクローナル[ＦＭＣ７５]抗体（マウス由来、Abcam社製、Cat No. ab22683、Lot No. GR56669-4）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（−）（１％のＢＳＡを含むＰＢＳ（−））で最終濃度：４×１０−３ｍｇ／ｍＬに調製した一次抗体希釈液を上記ｉＰＳ細胞の培養容器中に添加し、４℃で一晩若しくは室温で２時間静置した。かかる抗原抗体反応の所定時間経過後、一次抗体希釈液を除去し、ＰＢＳ（−）で洗浄した。次いで、二次抗体として蛍光色素（Alexa（登録商標）４８８）で標識した抗マウスＩｇＧ抗体（ヤギ：Life Technologies社製品、A11001）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（−）で最終濃度：１０×１０−３ｍｇ／ｍＬに調製した二次抗体希釈液を添加し、室温で２時間静置した。上記所定時間経過後、二次抗体希釈液を除去し、ＰＢＳ（−）で洗浄した。その後、ＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）含有封入液（Life Technologies社製）とカバーガラスを用いて封入を行い、共焦点レーザー顕微鏡による蛍光観察を行った。
【００７４】
結果を図１又は図２に示す。これらの図面は、各ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７又は２０１Ｂ２）におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真であり、上記免疫蛍光抗体法でカルレティキュリンの発現状態を調べた結果を示す蛍光画像とＤＡＰＩによる核染色画像とを重ねた（マージした）画像である。図１は２０１Ｂ７の結果を示し、図２には２０１Ｂ２の結果を示す。
【００７５】
図２に示すように、２０１Ｂ２の蛍光免疫顕微鏡写真では、図１の２０１Ｂ７の蛍光顕微鏡写真と比較してカルレティキュリンを検出する蛍光標識の強い発色を確認した。即ち、ゲノム不安定なｉＰＳ細胞（２０１Ｂ２）は、ゲノム安定なｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）と比較してカルレティキュリンの発現量が顕著に増大していることが認められた。なお、２０１Ｂ７において確認されるカルレティキュリンを検出する蛍光標識の弱い発色は、細胞内に恒常的に発現しているカルレティキュリンを検出したものと考察した。また、図１中にカルレティキュリンを検出する蛍光標識が強く発色している細胞を幾つか確認した。詳細なデータは示していないが、当該細胞はゲノム不安定なｉＰＳ細胞であったため、継代培養によってゲノムが不安定となったｉＰＳ細胞であると考察した。
このことは、対象の多能性幹細胞の培養物中の多能性幹細胞についてカルレティキュリン発現量を調べ、該カルレティキュリン発現量の程度に基づいて該幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性を判別できることを示している。また、上記判別には免疫学的手法が好適に使用できることも示している。
【００７６】
＜実施例３：ペプチド合成＞
配列番号１０〜１３のアミノ酸配列から成る合成ペプチドを後述のペプチド合成機を用いて製造した。なお、以下の説明では、当該合成ペプチドを配列番号の順番に対応してサンプル１〜４と呼称する。表１には、これら合成ペプチドのアミノ酸配列等の情報を列挙している。
【００７７】
【表１】
0006490010.tif 000002
【００７８】
表１に示すように、サンプル１〜４に係るペプチドは、ペプチド鎖のＮ末端側にＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列（配列番号５）を有し、そのＣ末端側に、２個のグリシン（Ｇ）残基から成るリンカー領域を介してカルレティキュリン発現誘導ペプチド配列（配列番号１〜４）を有している。
サンプル１又はサンプル２に係るペプチド（配列番号１０又は１１）は、カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列として配列番号１又は２に示すセントリン２ｓｉＲＮＡ関連配列をそれぞれ有する合計２４アミノ酸残基から成るペプチドである。
サンプル３又はサンプル４に係るペプチド（配列番号１２又は１３）は、カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列として配列番号３又は４に示すセントリン２ｓｉＲＮＡ関連配列の典型的な改変配列をそれぞれ有する合計２２アミノ酸残基から成るペプチドである。
【００７９】
なお、上記合成ペプチドはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）がアミド化（−ＣＯＮＨ２）されている、直鎖状のペプチドである。上記合成ペプチドは市販のペプチド合成機（Intavis AG社製品）を用いてマニュアルどおりに固相合成法（Ｆｍｏｃ法）を実施して合成した。なお、ペプチド合成機の使用態様自体は本発明を特徴づけるものではないため、詳細な説明は省略する。
合成したサンプル１〜４に係るペプチドは、ＰＢＳ（-）に溶かし、ペプチドストック液を調製した。
【００８０】
＜実施例４：合成ペプチドのカルレティキュリン発現誘導活性評価＞
上記実施例３で得られたサンプル１〜４に係るペプチドについて、カルレティキュリン発現誘導活性を調べた。供試細胞として、上記ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７及び２０１Ｂ２）を用いた。評価試験の詳細は以下のとおりである。
【００８１】
実施例２と同様にして、各ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７及び２０１Ｂ２）を、マトリゲルコートした８穴（ウェル）スライド中に１ウェルあたり凡そ１×１０４個となるように播種し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で一晩培養を行った。その一晩培養後、培地をペプチド濃度１０μＭとなる量のサンプル１〜４に係るペプチドを含有するｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地に交換し、５日間培養した。上記５日間の培養期間中は、毎日ペプチド濃度１０μＭとなる量のサンプル１〜４に係るペプチドを含有する含有ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地に培地交換をした。なお、比較対象の観点から、コントロール区として各ｉＰＳ細胞についてペプチド無添加区を設けたが、かかるペプチド無添加区の条件は実施例２と同じものである。
【００８２】
上記培養終了後、実施例２と同様にして、各試験区におけるカルレティキュリンの発現を、抗カルレティキュリン抗体を用いた免疫蛍光抗体法により調べた。
【００８３】
共焦点レーザー顕微鏡による蛍光観察を行った結果を図３〜図６に示す。図１又は図２と同様に、これらの図面は各試験区におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真であり、上記免疫蛍光抗体法でｉＰＳ細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた結果を示す蛍光画像とＤＡＰＩによる核染色画像とを重ねた（マージした）画像である。図３には２０１Ｂ２におけるサンプル１添加区の結果を示し、図４には２０１Ｂ７におけるサンプル１添加区の結果を示す。また、図５及び図６は、それぞれ図２及び図１と同じであり、２０１Ｂ２及び２０１Ｂ７におけるペプチド無添加区の結果である。
【００８４】
上記評価試験の結果、サンプル１に係る合成ペプチド（カルレティキュリン発現誘導ペプチド）を添加した２０１Ｂ２（図３）は、該細胞のペプチド無添加区（図５）と比較してカルレティキュリンを検出する蛍光標識の強い発色が認められた。即ち、サンプル１に係る合成ペプチドは、ゲノム不安定なｉＰＳ細胞においてカルレティキュリンの発現量を顕著に増大させることが認められた。また、ここには図示していないが、サンプル２〜４に係る合成ペプチドもまた、サンプル１と同様に２０１Ｂ２におけるカルレティキュリンの発現量を顕著に増大させることが確認された。
一方、２０１Ｂ７にサンプル１に係る合成ペプチドを添加して培養した場合（図４）は、当該細胞のペプチド無添加区（図６）と比較してカルレティキュリンを検出する蛍光標識の蛍光発色はほとんど増大しないことが確認された。即ち、ペプチド無添加区における２０１Ｂ７と２０１Ｂ２とのカルレティキュリン発現量を比較するよりも、サンプル１添加区における２０１Ｂ７と２０１Ｂ２とのカルレティキュリン発現量を比較した方が、ゲノム安定性の異なるｉＰＳ細胞間のカルレティキュリン発現量の差を明確に把握することができた。また、ここには図示していないが、サンプル２〜４に係る合成ペプチドもまた、サンプル１と同様に２０１Ｂ７におけるカルレティキュリンの発現量をほとんど増大させず、当該ペプチドを対象のｉＰＳ細胞培養物に添加して所定時間培養することでゲノム安定性の異なるｉＰＳ細胞間のカルレティキュリン発現量の差を明確にし得ることが確認された。
これらのことは、ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチド（即ち該ペプチドを有効成分として含むカルレティキュリン発現誘導剤）がゲノム不安定な多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞）のカルレティキュリン発現量を顕著に増加させ得るペプチド（組成物）であることを示している。さらに、ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチド（即ち該ペプチドを有効成分として含むカルレティキュリン発現誘導剤）を対象の多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞）に添加することで、多能性幹細胞のゲノム安定性の違いに起因するカルレティキュリン発現量の違いを増強し、より明確とし得ることも示している。以上より、ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチド（即ち該ペプチドを有効成分として含むカルレティキュリン発現誘導剤）を対象の多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞）に添加することで、該幹細胞におけるカルレティキュリン発現量の程度に基づいて該幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性を高感度かつ高精度に判別できることが示された。
【００８５】
＜実施例５：ｉＰＳ細胞培養物中からのゲノム不安定なｉＰＳ細胞の除去試験＞
上記ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７及び２０１Ｂ２）を供試細胞として用いて、該ｉＰＳ細胞の培養物中からゲノム不安定なｉＰＳ細胞を除去し得るか試験した。詳細は以下のとおりである。
【００８６】
まず、ｉＰＳ細胞培養物を以下のとおりに準備した。実施例１に記載の方法で準備した各ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７及び２０１Ｂ２）を、予めＧｅｌＴｒｅｘ（Life Technologies社製品）でコートした直径１０ｍｍの培養皿（１０ｍｍディッシュ）中に、１ウェルあたり凡そ１×１０6個の細胞密度となるように播種した（即ち、フィーダー細胞フリー）。培地としては、Essential 8（登録商標）培地（Life Technologies社製品）を使用した。そして培養容器をインキュベータに入れ、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で５日間培養を行った。上記５日間の培養期間中は毎日培地交換を行った。
【００８７】
上記培養終了後、各ｉＰＳ細胞に発現するカルレティキュリンを蛍光標識し、該カルレティキュリンを検出する蛍光標識の蛍光発色強度を指標とし、ＦＡＣＳを用いて各ｉＰＳ細胞の培養物中からゲノム不安定な細胞を除去した。具体的な試験方法は、以下のとおりである。
【００８８】
まず、上記５日間の培養終了後の各ｉＰＳ細胞をROCK(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase/Rho結合キナーゼ)阻害剤で処理した。具体的には、上記５日間の培養終了後の各ｉＰＳ細胞の培地中に、ROCK阻害剤であるY-27632を培地中の濃度が１０μＭとなるように添加し、その後５％ＣＯ２、３７℃のインキュベータ内に１時間静置した。かかるROCK阻害剤存在下での培養（ROCK阻害剤での処理）が終了した各ｉＰＳ細胞について、培養容器中の培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄した。
【００８９】
次に、上記ROCK阻害剤処理をした各ｉＰＳ細胞を所定の試験管にそれぞれ回収した。具体的には、まず、各ｉＰＳ細胞について、０．５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ（−）（以下、「ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）」ともいう）を各培養容器内に３ｍＬずつ添加し、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベータ内に１５分間静置した。次に、培養容器中のＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）を除去し、各培養容器内に４ｍＬのＰＢＳ（−）を添加し、ピペッティングした。かかるピペッティングにより、培養容器からｉＰＳを剥離し、上記ＰＢＳ（−）内にｉＰＳ細胞を分散させた。そして、上記ｉＰＳ細胞が分散した状態のＰＢＳ（−）を１５ｍＬ容チューブに回収し、該１５ｍＬ容チューブ内にさらに４ｍＬの霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞培地（Primate ES Cell Medium：ReproCELL社製）を添加した。かかる各ｉＰＳを回収した１５ｍＬ容チューブを１２０×ｇ（ここで、「×ｇ」は遠心力を示しており、地球の重力加速度に対する相対遠心加速度を意味する。例えば１２０×ｇは地球の重力加速度の１２０倍の相対加速度（遠心力）である。以下同じ。）で５分間の遠心処理を行い、上清（ＰＢＳ（−）および霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞培地）を除去し、２％のＦＢＳを含むＰＢＳ（以下、該ＦＢＳ含有ＰＢＳを「インキュベーションバッファー」ともよぶ）で１回洗浄（遠心処理条件：１２０×ｇ、５分間）した。そして、各ｉＰＳ細胞を１０μＭのY-27632を含むインキュベーションバッファー（以下、「Y-27632（１０μＭ）含有インキュベーションバッファー」ともいう）中に分散し、細胞密度が凡そ１×１０６細胞／１００μＬの細胞分散液を調整した。そして、かかるｉＰＳ細胞分散液のうちの一部を、それぞれ別に準備した１．５ｍＬチューブに分注し、以下の試験に用いた。
【００９０】
次に、以下の蛍光免疫染色（免疫蛍光抗体法）により、各試験区のｉＰＳ細胞の細胞表面に存在するカルレティキュリンを蛍光標識した。
抗カルレティキュリン抗体として、Phycoerythrin（以下、かかる蛍光色素を「ＰＥ」ともいう）で標識した抗体（即ち、蛍光ＰＥ標識抗体）である、抗カルレティキュリンモノクローナル[ＦＭＣ７５]−Phycoerythrin抗体（マウス由来、Abcam社製、Cat No. ab83220、Lot No. GR177933-2）を用いた。また、上記抗カルレティキュリンモノクローナル[ＦＭＣ７５]−Phycoerythrin抗体のアイソタイプコントロールとして、蛍光ＰＥ標識抗体である、Mouse IgG1(PE)-Isotype control（マウス由来、Abcam社製、Cat No. ab81200、Lot No. GR183088-1）を用いた。かかる抗カルレティキュリン抗体（或いは上記アイソタイプコントロール）をY-27632（１０μＭ）含有インキュベーションバッファーで最終濃度：１０μｇ／ｍＬに調製した抗体希釈液を各試験管に添加し、４℃の暗所に１．５時間静置した。かかる所定時間の抗原抗体反応を行った後、１３０×ｇで５分間の遠心処理を行い、抗体希釈液を除去し、各ｉＰＳ細胞を１ｍＬのインキュベーションバッファーで２回洗浄（遠心処理条件：１３０×ｇ、５分間）した。次いで、各ｉＰＳ細胞を３００μＬのOn-Chip Sample Buffer（オンチップバイオテクノロジーズ社製）で１回洗浄（遠心処理条件：２６０×ｇ、５分間）した。そして、各ｉＰＳ細胞を、On-Chip Sample Buffer中に分散し、細胞密度が少なくとも５×１０５細胞／１００μＬ以上の細胞分散液を調整した。
上述のとおり、上記の蛍光免疫染色では、細胞の固定および透過処理を行わなかった。即ち、抗カルレティキュリン抗体によって、細胞表面のカルレティキュリンを特異的に蛍光免疫染色した。
【００９１】
次に、上記蛍光免疫染色を行った各試験区のｉＰＳ細胞について、細胞表面におけるカルレティキュリンの存在量をＦＡＣＳを用いて分析し、該分析結果に基づいてゲノム不安定なｉＰＳ細胞を選別した。即ち、上記カルレティキュリンを検出する蛍光色素（Phycoerythrin）の蛍光発色（励起波長：４８８ｎｍ、最大蛍光波長：５７５ｎｍ）の強度を分析し、該蛍光標識の蛍光発色強度に基づいてｉＰＳ細胞の選別(ゲノム不安定なｉＰＳ細胞の除去)を行った。なお、ＦＡＣＳとしては、オンチップバイオテクノロジーズ社製のOn-Chip Sortを用いた。
【００９２】
上記抗カルレティキュリン抗体を用いて蛍光免疫染色を行った各試験区(抗カルレティキュリン抗体染色区)のｉＰＳ細胞（２０１Ｂ２又は２０１Ｂ７）について、上記カルレティキュリンを検出する蛍光色素（Phycoerythrin）の蛍光発色（励起波長：４８８ｎｍ、最大蛍光波長：５７５ｎｍ）の強度をＦＡＣＳを用いて分析（測定）した結果を、図７（２０１Ｂ２の結果）および図８（２０１Ｂ７の結果）に示す。図７および図８では、かかる試験区(抗カルレティキュリン抗体染色区)の結果を、「PE-Anti-Calreticulin antibody-stained cells」として示す。これらの図面は、各細胞の蛍光強度を示すヒストグラムであり、横軸に蛍光強度を示し、縦軸に細胞数を示す。
また、対照試験区（ネガティブコントロール区）として、蛍光免疫染色を行っていない各ｉＰＳ細胞（Unstained cells）を、上記Phycoerythrinの蛍光強度測定と同様の条件で分析した。かかるUnstained cellsの分析結果を、上記抗カルレティキュリン抗体を用いて蛍光免疫染色を行った試験区の蛍光強度を示すヒストグラム（図７および図８）に重ねて示す。図７および図８中では、かかる試験区(ネガティブコントロール区)の結果を、「Unstained cells (Negative control)」として示す。
【００９３】
上記ネガティブコントロール区において確認された蛍光強度ヒストグラムのピークは、該細胞の自家蛍光を検出したものと推察される。ここでは詳細なデータは示していないが、かかるネガティブコントロール区における蛍光強度ヒストグラムと、上記アイソタイプコントロールを用いて蛍光免疫染色を行った試験区の蛍光強度ヒストグラムとを比較したところ、２０１Ｂ２および２０１Ｂ７のいずれのｉＰＳ細胞においても、ヒストグラムのピークがほぼ同じであることを確認した。即ち、本試験で用いた抗カルレティキュリン抗体（抗カルレティキュリンモノクローナル[ＦＭＣ７５]−Phycoerythrin抗体）は、ｉＰＳ細胞に対する非特異的な抗原抗体反応が極めて少ないことを確認した。
【００９４】
図７に示すように、ゲノム不安定な細胞を含むｉＰＳ細胞（２０１Ｂ２）の培養物について、抗カルレティキュリン抗体染色区の蛍光強度ヒストグラムと、該細胞のネガティブコントロール区の蛍光強度ヒストグラムとを比較すると、上記抗カルレティキュリン抗体染色区の蛍光発色強度ヒストグラムのピークトップの右側（即ち、高蛍光強度側）が、ネガティブコントロール区の蛍光強度ヒストグラムで確認されるピークよりもなだらかであり、位相がずれていることを確認した。即ち、抗カルレティキュリン抗体染色区の細胞中には、ネガティブコントロール区の細胞と比較して、蛍光強度が強い細胞集団が存在することを確認した。かかる蛍光強度の強い細胞集団は、カルレティキュリンを細胞表面に多く発現している細胞集団である。本試験に用いたＦＡＣＳに搭載されるセルソータの機能を使用して、抗カルレティキュリン抗体染色区にかかる細胞中から上記ネガティブコントロール区の細胞よりも蛍光強度が強い細胞集団を選別することで、上記ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ２）の細胞培養物からゲノム不安定な細胞を除去することができる。
【００９５】
一方で、図８に示すように、ゲノム安定なｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）は、抗カルレティキュリン抗体染色区の蛍光発色強度ヒストグラムが、該細胞のネガティブコントロール区において確認された蛍光強度ヒストグラムと比較して、ピーク位置およびピーク形状がほぼ同一であった。即ち、上記ゲノム安定なｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）の細胞表面でのカルレティキュリンの発現量は極めて低いことを確認した。
【００９６】
以上の結果より、ｉＰＳ細胞培養物中の各ｉＰＳ細胞（典型的には細胞表面）におけるカルレティキュリン発現量を調べ、該カルレティキュリン発現量が所定レベルを上回ったｉＰＳ細胞をゲノム不安定性であると判別できることを確認した。また、ｉＰＳ細胞のカルレティキュリンの発現量の程度に基づいて、対象のｉＰＳ細胞培養物中からゲノム不安定なｉＰＳ細胞を除去し得ることを確認した。上記ｉＰＳ細胞のゲノム安定性の評価とゲノム不安定なｉＰＳ細胞の除去は、同一の標識（典型的には抗体の蛍光標識）を目印として同時に行うことができた。
なお、ここでは詳細なデータは示していないが、上記カルレティキュリンの発現量の程度を調べるより前にカルレティキュリン発現誘導ペプチド（即ちペプチドを有効成分として含むカルレティキュリン発現誘導剤）を該ｉＰＳ細胞培養物中に添加し所定時間培養することで、ゲノム不安定な細胞の細胞表面でのカルレティキュリンの発現を増大することができ、ゲノム不安定なｉＰＳ細胞の除去を高精度かつ高い信頼性に実現し得ることを確認した。
【００９７】
＜実施例６：顆粒剤の調製＞
上記サンプル１〜４に係る合成ペプチド（カルレティキュリン発現誘導ペプチド）５０ｍｇと結晶化セルロース５０ｍｇ及び乳糖４００ｍｇとを混合した後、エタノールと水の混合液１ｍＬを加え混練した。この混練物を常法に従って造粒し、ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチドを主成分とする顆粒剤（顆粒状組成物）を得た。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
上述のように、ここで開示される多能性幹細胞のゲノム安定性を評価する方法によると、多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞若しくはＥＳ細胞）のゲノム安定性を高効率かつ高い信頼性で判別することができるため、例えば、多能性幹細胞（好ましくはｉＰＳ細胞）の染色体検査に利用することができる。また、ここで開示されるゲノム不安定な多能性幹細胞の除去方法によると、ゲノム不安定と判別された多能性幹細胞が除去された多能性幹細胞培養物（典型的にはｉＰＳ細胞培養物若しくはＥＳ細胞培養物）を提供（製造）することができる。上記多能性幹細胞培養物は、例えば、再生医療目的に好適な医療用資材として利用することができる。また、ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチドおよび該ペプチドを有効成分として含むカルレティキュリン発現誘導剤は、ゲノム不安定な多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞）におけるカルレティキュリン発現量を増大させる（あるいはカルレティキュリンの発現を誘導する）カルレティキュリン発現誘導活性を有しているため、例えば、上記多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法、上記多能性幹細胞培養物からゲノム不安定な多能性幹細胞を除去する方法、ならびにゲノム不安定な多能性幹細胞を除去した多能性幹細胞培養物の製造方法に好適に利用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００９９】
配列番号１〜１３    合成ペプチド
【図１】
0006490010.tif 000003
【図２】
0006490010.tif 000004
【図３】
0006490010.tif 000005
【図４】
0006490010.tif 000006
【図５】
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【図６】
0006490010.tif 000008
【図７】
0006490010.tif 000009
【図８】
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【配列表】
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