(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における婦人科疾患状態を決定するための方法であって、
マクロファージガラクトース型レクチンに結合するＣＡ１２５（ＣＡ１２５ＭＧＬ）のレベルについて前記対象から採取した試料をアッセイするステップと、
前記試料中のＣＡ１２５ＭＧＬの検出レベルを対照試料のレベル又は所定の閾値と比較するステップと、
前記比較ステップに基づいて前記対象における婦人科疾患状態を決定するステップと
を含み、前記婦人科疾患は、卵巣上皮がん（ＥＯＣ）、子宮内膜症及び子宮内膜がんからなる群から選択される、上記方法。
【請求項２】
対照試料又は所定の閾値のＣＡ１２５ＭＧＬと比較した前記試料中のＣＡ１２５ＭＧＬのレベルの増加が、前記対象が卵巣上皮がん（ＥＯＣ）に罹患しているか、又はＥＯＣに罹患するリスクがあることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対照試料又は所定の閾値のＣＡ１２５ＭＧＬと比較した前記試料中のＣＡ１２５ＭＧＬのレベルの非増加が、前記対象がＥＯＣに罹患していないか、又はＥＯＣに罹患するリスクがないことを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＣＡ１２５タンパク濃度について前記対象から採取した試料をアッセイするステップと、
検出ＣＡ１２５タンパク濃度を対照試料の濃度又は所定の閾値と比較するステップ
をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＣＡ１２５ＭＧＬレベルの増加と組み合わせたＣＡ１２５タンパク濃度の増加が、前記対象がＥＯＣに罹患しているか、又はＥＯＣに罹患するリスクがあることをさらに示す、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＣＡ１２５ＭＧＬレベルの非増加と組み合わせたＣＡ１２５タンパク濃度の増加が、前記対象が子宮内膜症に罹患しているか、又は子宮内膜症に罹患するリスクがあることを示す、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ＨＥ４タンパク質濃度について前記対象から採取した試料をアッセイするステップと、
検出ＨＥ４タンパク質濃度を対照試料の濃度又は所定の閾値と比較するステップ
をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＣＡ１２５ＭＧＬレベルの増加と組み合わせたＨＥ４タンパク質濃度の増加が、前記対象がＥＯＣに罹患しているか、又はＥＯＣに罹患するリスクがあることをさらに示す、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＣＡ１２５ＭＧＬレベルの非増加と組み合わせたＨＥ４タンパク質濃度の増加が、前記対象が子宮内膜がんに罹患しているか、又は子宮内膜がんに罹患するリスクがあることを示す、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ＥＯＣ、子宮内膜症又は子宮内膜がんからなる群から選択される婦人科疾患を鑑別診断するための請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＥＯＣ、子宮内膜症又は子宮内膜がんからなる群から選択される婦人科疾患を診断、予測、又はモニタリングするための請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記モニタリングが、前記婦人科疾患の発症のモニタリング、前記婦人科疾患の罹患又は発生のリスクの任意の変化のモニタリング、処置に対する応答のモニタリング、前記婦人科疾患の再発のモニタリング、又は前記婦人科疾患の頻発のモニタリングのためのものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記モニタリングが、異なる時点で少なくとも２回アッセイステップを繰り返すことにより行なわれる、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記時点が、診断前の時点、診断後の時点、前記婦人科疾患の処置前の時点、前記婦人科疾患の処置中の時点、及び前記婦人科疾患の処置後の時点からなる群から互いに独立して選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記婦人科疾患の前記処置が手術、放射線療法及び化学療法からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記婦人科疾患がＥＯＣであり、モニタリングがＥＯＣの処置中又は処置後に行なわれ、ＣＡ１２５ＭＧＬのレベルが対照試料よりも高いか、又は所定の閾値を上回る場合に、前記対象がＥＯＣの再発若しくは頻発を有する、又はＥＯＣの再発若しくは頻発のリスクがあると判定される、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記対照試料がＥＯＣの処置前に同じ対象から採取された試料である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＣＡ１２５ＭＧＬのレベルが、ナノ粒子固定化ＭＧＬ（ＭＧＬ−ＮＰ）に結合するＣＡ１２５のレベルをアッセイすることによって決定される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＭＧＬ−ＮＰに結合するＣＡ１２５のレベルをアッセイすることが、
前記試料を抗ＣＡ１２５抗体に供して試料中に含有されるＣＡ１２５を捕捉することと、
捕捉ＣＡ１２５を検出可能なシグナルを利用してＭＧＬ−ＮＰへの結合のレベルについて測定することと
を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＭＧＬ−ＮＰに結合するＣＡ１２５のレベルをアッセイすることが、
前記試料をＭＧＬ−ＮＰに供して試料中に含有されるＣＡ１２５のＭＧＬ結合グリコフォームを捕捉することと、
捕捉ＣＡ１２５を検出可能なシグナルを利用して抗ＣＡ１２５抗体への結合のレベルについて測定することと
を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＭＧＬ−ＮＰに結合するＣＡ１２５のレベルをアッセイすることが、
前記試料を中皮に供して試料中に含有される中皮結合ＣＡ１２５を捕捉することと、
捕捉ＣＡ１２５を検出可能なシグナルを利用してＭＧＬ−ＮＰへの結合のレベルについて測定することと
を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＭＧＬ−ＮＰに結合するＣＡ１２５のレベルをアッセイすることが、
前記試料をＭＧＬ−ＮＰに供して試料中に含有されるＣＡ１２５のＭＧＬ結合グリコフォームを捕捉することと、
捕捉ＣＡ１２５を検出可能なシグナルを利用して中皮への結合のレベルについて測定することと
を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記試料が尿、血液、血清、血漿、腹腔液体及び組織試料からなる群から選択される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ＣＡ１２５結合剤、及び、
ＭＧＬ
を含むキットであって、
前記ＣＡ１２５結合剤又は前記ＭＧＬのいずれかが検出可能な標識を含む、
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法において使用するためのキット。
【請求項２５】
前記ＭＧＬがナノ粒子固定化ＭＧＬである、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記ＣＡ１２５結合剤がモノクローナル抗ＣＡ１２５抗体又は中皮である、請求項２４又は２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記ＣＡ１２５結合剤がマイクロタイタープレートなどの固相表面に結合される、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２８】
ＭＧＬ−ＮＰに結合するＣＡ１２５の測定値と比較するための対照をさらに含む、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９】
ＣＡ１２５タンパク濃度をアッセイするための１つ又は複数の試薬をさらに含む、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０】
ＨＥ４濃度をアッセイするための１つ又は複数の試薬をさらに含む、請求項２４〜２９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３１】
前記ナノ粒子のすべての寸法が約１０００ｎｍ未満、約５００ｎｍ以下、約１００ｎｍ以下、又は約５０ｎｍ以下である、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ナノ粒子のすべての寸法が約１０００ｎｍ未満、約５００ｎｍ以下、約１００ｎｍ以下、又は約５０ｎｍ以下である、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３３】
前記ナノ粒子が、タンパク質ナノ粒子、無機ナノ粒子、ガラスナノ粒子、ナノ粒子結晶体、金属ナノ粒子、プラスチックナノ粒子、ポリスチレンナノ粒子、ポリ（エチレングリコール）ナノ粒子、ポリエチレンナノ粒子、ポリ（アクリル酸）ナノ粒子、ポリ（メチルメタクリレート）ナノ粒子、多糖類ナノ粒子、コロイド金ナノ粒子、銀ナノ粒子、量子ドット、炭素ナノ粒子、多孔性シリカナノ粒子、及びリポソームからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記ナノ粒子が、タンパク質ナノ粒子、無機ナノ粒子、ガラスナノ粒子、ナノ粒子結晶体、金属ナノ粒子、プラスチックナノ粒子、ポリスチレンナノ粒子、ポリ（エチレングリコール）ナノ粒子、ポリエチレンナノ粒子、ポリ（アクリル酸）ナノ粒子、ポリ（メチルメタクリレート）ナノ粒子、多糖類ナノ粒子、コロイド金ナノ粒子、銀ナノ粒子、量子ドット、炭素ナノ粒子、多孔性シリカナノ粒子、及びリポソームからなる群から選択される、請求項３２に記載のキット。
【請求項３５】
前記ナノ粒子がユーロピウム（ＩＩＩ）などのランタニドキレートでドープされる、請求項３１又は３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記ナノ粒子がユーロピウム（ＩＩＩ）などのランタニドキレートでドープされる、請求項３２又は３４に記載のキット。
【請求項３７】
対象における婦人科疾患状態を、ＭＧＬに結合するＣＡ１２５のレベルについて前記対象から採取した試料をアッセイすることによって決定するためのナノ粒子固定化ＭＧＬ（ＭＧＬ−ＮＰ）の使用であって、前記婦人科疾患は、卵巣上皮がん（ＥＯＣ）、子宮内膜症及び子宮内膜がんからなる群から選択される、上記使用。
【請求項３８】
対象において、ＥＯＣ、子宮内膜症及び子宮内膜がんからなる群から選択される婦人科疾患を診断、予測及び／又はモニタリングするための請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
前記ナノ粒子のすべての寸法が約１０００ｎｍ未満、約５００ｎｍ以下、約１００ｎｍ以下、又は約５０ｎｍ以下である、請求項３７又は３８に記載の使用。
【請求項４０】
前記ナノ粒子が、タンパク質ナノ粒子、無機ナノ粒子、ガラスナノ粒子、ナノ粒子結晶体、金属ナノ粒子、プラスチックナノ粒子、ポリスチレンナノ粒子、ポリ（エチレングリコール）ナノ粒子、ポリエチレンナノ粒子、ポリ（アクリル酸）ナノ粒子、ポリ（メチルメタクリレート）ナノ粒子、多糖類ナノ粒子、コロイド金ナノ粒子、銀ナノ粒子、量子ドット、炭素ナノ粒子、多孔性シリカナノ粒子、及びリポソームからなる群から選択される、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ＣＡ１２５のグリコシル化パターンの変化に基づく、婦人科疾患、特に卵巣上皮がん（ＥＯＣ）の非侵襲的診断法に関し、ＥＯＣを含む婦人科疾患を診断、予測又はモニタリングする様々な方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
高感度で正確なバイオマーカーを用いる早期がん検出は、がん処置成功の鍵である。このようなバイオマーカーは、治療応答がほとんど達成されない播種ステージまで無症性のままのがんにとって、極めて重要である。卵巣上皮がん（ＥＯＣ）は、十分な感度と特異性を有する早期検出が無いことから、重要な医療問題である。初期ステージに診断された女性の５年生存率は９０％であるが、後期ステージに検出された場合は２０％である。
【０００３】
ムチン１６又はＭＵＣ１６としても知られているヒトがん抗原１２５（ＣＡ１２５）は、複合膜貫通糖タンパク質であり、ＥＯＣに対して最も広く使用されているバイオマーカーである。これは原発性卵巣上皮がんの診断だけでなく、術後の女性の疾患モニタリングにおいても重要な役割を果たす。既存のＣＡ１２５アッセイは、２つの異なるモノクローナル抗体によって２つの異なるＣＡ１２５タンパク質エピトープを検出することに基づく二重決定基イムノアッセイである。
【０００４】
しかし、ＣＡ１２５は、良性卵巣新生物及び子宮内膜症などの良性婦人科状態、並びに肝疾患においても、正常な排卵周期中でさえその発現が高いために、特にＥＯＣの初期ステージでの感度及びがん特異性を欠いている。したがって、ＣＡ１２５は、ＥＯＣのスクリーニングには推奨されない。
【０００５】
がんの進行中、多くのタンパク質のグリコシル化パターンが変化する。したがって、がん関連のグリコシル化パターンを検出することで、腫瘍検出における特異性の改善を達成するための新規診断アプローチを提示することができる。実際、正常な卵巣組織と比べた場合、グリカン組成の変化が卵巣癌腫で報告されており、さらには、グリカン構造の変化がＥＯＣに罹患した患者の血清ＣＡ１２５で報告されている。
【０００６】
Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．，２０１３，１２，１４０８−１４１８）は、ＣＡ１２５の異常Ｏ−グリコフォームが原発性ＥＯＣ患者由来の血清中に存在し、Ｏ−グリカン特異的モノクローナル抗体及びＶＶＬ（カラスノエンドウ（Ｖｉｃｉａ  Ｖｉｌｌｏｓａ）レクチン）を使用するサンドイッチイムノアッセイにより検出することができることを報告している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＣＡ１２５などの公知の腫瘍マーカーの糖鎖プロファイリング及び異なる腫瘍マーカーのパネルの使用は、多数の偽陽性結果を排除することによって卵巣がん検出の感度及び特異性を高めるのに有効であるように思われるが、今なお、良性疾患と初期の治療可能な卵巣上皮がんとを十分に識別することができる、利用しやすいより特異的の高いマーカーが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様において、本開示は、対象における婦人科疾患状態を決定する方法を提供する。前記方法は、
マクロファージガラクトース型レクチンに結合するＣＡ１２５（ＣＡ１２５ＭＧＬ）のレベルについて前記対象から採取した試料をアッセイするステップと、
前記試料中のＣＡ１２５ＭＧＬの検出レベルを対照試料のレベル又は所定の閾値と比較するステップと、
前記比較ステップに基づいて前記対象における婦人科疾患状態を決定するステップと
を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、ＣＡ１２５ＭＧＬのレベルの増加は、前記対象が卵巣上皮がん（ＥＯＣ）に罹患しているか、又は罹患するリスクがあることを示し、一方、ＣＡ１２５ＭＧＬのレベルの非増加は、前記対象がＥＯＣに罹患していないか、又は罹患するリスクはないが、子宮内膜症又は子宮内膜がんに罹患しているか、又は罹患するリスクがあり得る、或いは、子宮内膜症又は子宮内膜がんに関して見かけ上健康であり得ることを示す。
【００１０】
いくつかのさらなる実施形態において、本方法は、ＣＡ１２５タンパク濃度について前記対象から採取した試料をアッセイするステップと、検出ＣＡ１２５タンパク濃度を対照試料の濃度又は所定の閾値と比較するステップをさらに含んでいてもよい。ＣＡ１２５ＭＧＬレベルの増加と組み合わせたＣＡ１２５タンパク濃度の増加は、前記対象がＥＯＣに罹患しているか、又は罹患するリスクがあることをさらに示し、一方、ＣＡ１２５ＭＧＬレベルの非増加と組み合わせたＣＡ１２５タンパク濃度の増加は、前記対象が子宮内膜症に罹患しているか、又は罹患するリスクがあることを示し得る。
【００１１】
或いは、又は加えて、本方法は、ＨＥ４濃度について前記対象から採取した試料をアッセイするステップと、検出ＨＥ４濃度を対照試料の濃度又は所定の閾値と比較するステップをさらに含んでいてもよい。ＣＡ１２５ＭＧＬレベルの増加と組み合わせたＨＥ４濃度の増加は、前記対象がＥＯＣに罹患しているか、又は罹患するリスクがあることをさらに示し、一方、ＣＡ１２５ＭＧＬレベルの非増加と組み合わせたＨＥ４濃度の増加は、前記対象が子宮内膜がんに罹患しているか、又は罹患するリスクがあることを示し得る。
【００１２】
本方法は、例えば、ＥＯＣ、子宮内膜症若しくは子宮内膜がんからなる群から選択される婦人科疾患の鑑別診断法に使用することができ、又はＥＯＣ、子宮内膜症若しくは子宮内膜がんからなる群から選択される婦人科疾患の診断、予測若しくはモニタリングに使用することができる。いくつかの実施形態において、前記モニタリングは、前記婦人科疾患の発症のモニタリング、前記婦人科疾患の罹患又は発生のリスクの任意の変化のモニタリング、処置に対する応答のモニタリング、前記婦人科疾患の再発（ｒｅｌａｐｓｅ）のモニタリング、又は前記婦人科疾患の頻発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）のモニタリングのためを含み得る。
【００１３】
いくつかのさらなる実施形態において、前記のＣＡ１２５ＭＧＬレベルをアッセイするステップは、前記ＭＧＬ−ＮＰに結合するＣＡ１２５のレベルをアッセイすることにより実施することができ、そのアッセイすることには、捕捉剤、例えば、抗ＣＡ１２５抗体又は中皮を使用して試料に含有されているＣＡ１２５を捕捉することと、検出可能なシグナルを利用してＭＧＬ−ＮＰへの結合レベルについて捕捉ＣＡ１２５を測定することとが含まれ得る。言い換えると、前記試料は、ＣＡ１２５結合剤及び検出可能に標識されたＭＧＬ−ＮＰを使用することにより、ＣＡ１２５ＭＧＬの量についてアッセイされる。
【００１４】
いくつかの他の実施形態において、前記のＣＡ１２５ＭＧＬレベルをアッセイするステップは、前記ＭＧＬ−ＮＰに結合するＣＡ１２５のレベルのアッセイすることにより実施することができ、そのアッセイすることには、試料に含有されているＣＡ１２５のＭＧＬ結合グリコフォームを捕捉するために前記試料をＭＧＬ−ＮＰに供することと、検出可能なシグナルを利用した、抗ＣＡ１２５抗体又は中皮などのＣＡ１２５結合剤を使用し、捕捉ＣＡ１２５の量を測定することとが含まれ得る。言い換えると、前記試料は、ＭＧＬ−ＮＰ及び検出可能に標識されたＣＡ１２５結合剤を使用することにより、ＣＡ１２５ＭＧＬの量についてアッセイされる。
【００１５】
別の態様において、本開示は、本明細書に開示のいずれかの方法において使用するためのキットを提供する。前記キットは、ＣＡ１２５結合剤、例えば、モノクローナル抗ＣＡ１２５抗体又は中皮、及びＭＧＬ−ＮＰを含む。前記ＣＡ１２５結合剤又は前記ＭＧＬ−ＮＰのいずれかは、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態において、前記ＣＡ１２５結合剤又は前記ＭＧＬ−ＮＰのいずれかは、マイクロタイタープレートなどの固相表面に結合される。
【００１６】
さらなる態様において、本開示は、以下に示すようなＭＧＬ−ＮＰを提供する。前記ＭＧＬ−ＮＰは、例えば、対象における婦人科疾患状態の診断、予測及び／又はモニタリングで使用することができる。好ましくは、前記婦人科疾患は、ＥＯＣ、子宮内膜症及び子宮内膜がんからなる群から選択される。
【００１７】
本発明の他の目的、態様、実施形態、詳細及び利点は、以下の図面、詳細な説明、実施例、及び従属請求項から明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
以下において、本発明を添付の図面を参照して好ましい実施形態によりさらに詳しく述べる。
【図１】本明細書の異なるＣＡ１２５アッセイの原理を示す図である。従来のＣＡ１２５イムノアッセイでは（図１Ａ）、捕捉剤及びトレーサーの両方がモノクローナル抗体であり、ＣＡ１２５の異なるタンパク質エピトープを検出する。抗体−レクチンサンドイッチアッセイ（図１Ｂ）では、ＣＡ１２５タンパク質エピトープ−特異抗体が捕捉剤として使用され、一方、グリカン特異的Ｅｕ３＋標識レクチンがトレーサーとして使用される。抗体−レクチンナノ粒子サンドイッチアッセイ（図１Ｃ）では、ＣＡ１２５タンパク質エピトープ−特異抗体が捕捉剤として使用され、一方、グリカン特異的Ｅｕ３＋がドープされたナノ粒子標識レクチンがトレーサーとして使用される。
【図２】従来のＣＡ１２５イムノアッセイの結果を示す図である。原発性卵巣癌腫細胞系ＯＶＣＡＲ−３（ＯｖＣａ−ＣＡ１２５）、羊水（ＡＦ−ＣＡ１２５）及び胎盤ホモジェネート（Ｐｌａ−ＣＡ１２５）由来のＣＡ１２５がビオチン化Ｏｖ１９７  ｍＡｂ上で捕捉された。Ｅｕ３＋キレート標識Ｏｖ１８５  ｍＡｂをトレーサーとして使用した。ＣＡ１２５のすべての起源は、ほぼ類似のシグナル／バックグラウンド比を示し、起源にかかわらず同量のＣＡ１２５が使用されたことが示唆された。
【図３】４つの異なるＣＡ１２５含有試料、すなわち、原発性卵巣癌腫細胞系ＯＶＣＡＲ−３（ＯｖＣａ−ＣＡ１２５）、胎盤ホモジェネート（Ｐｌａ−ＣＡ１２５）、肝硬変腹水（ＬＣ−ＣＡ１２５）、及び未成熟奇形腫（ＩＴ−ＣＡ１２５）由来の精製ＣＡ１２５を用いた従来のＣＡ１２５イムノアッセイを示す図である。５〜２０００Ｕ／ｍｌの範囲の異なる量のＣＡ１２５（５〜１０００Ｕ／ｍｌの範囲の量のＩＴ−ＣＡ１２５を除く）がｂｉｏＯｖ１９７  ｍＡｂ上で捕捉され、トレーサーとして使用したＯｖ１８５−Ｅｕ３＋ｍＡｂによって追跡した。異なる試料を相互に識別することはできなかった。ＩＴ−ＣＡ１２５だけは、ＩＴ腹水中のＣＡ１２５濃度がわずか９０４Ｕ／ｍｌであったので基質効果によって高濃度（５００〜１０００Ｕ／ｍｌ）で偏りを示した。
【図４】ユーロピウムＮ１キレートで標識したレクチンをトレーサーとして使用した場合、ＡＡＬを除いて、ＣＡ１２５の３つの異なる起源の間で識別は達成されなかったことを示す図である。ＯＶＣＡＲ−３細胞系を癌性ＣＡ１２５の供給源として使用し（ＯｖＣａ−ＣＡ１２５）、一方、羊水及び胎盤ホモジェネートを正常ＣＡ１２５の供給源として使用した（それぞれ、ＡＦ−ＣＡ１２５及びＰｌａ−ＣＡ１２５）。ＡＡＬは、羊水由来のＣＡ１２５を癌性及び胎盤ＣＡ１２５と識別することができた。Ｙ軸に示した極めて低い特異的シグナル（シグナル−バックグラウンド）については、各レクチンに関する表３に記載した高レベルのバックグラウンドシグナルに注目されたい。
【図５】４つの臨床試料を用いた抗ＣＡ１２５抗体−ＡＡＬレクチンアッセイの結果を示す図である。２つのＥＯＣ血清試料及び２つの子宮内膜症血清試料由来のＣＡ１２５（それぞれ、ＥＯＣ−１、ＥＯＣ−２、Ｅｎｄｏ．１及びＥｎｄｏ．２）がｂｉｏＯｖ１９７  ｍＡｂ上、並びにそれらのＦａｂ２画分上で捕捉され、Ｅｕ３＋キレート標識したＡＡＬレクチンをトレーサーとして使用した。ＥＯＣ患者試料と子宮内膜症患者試料の間の有意な識別は達成されなかった。
【図６】抗ＣＡ１２５抗体−レクチンナノ粒子アッセイの結果を示す図である。ＴＳＡ−ＢＳＡ緩衝液中、５、５０又は１００Ｕ／ｍｌのいずれかの量の４つの異なる起源由来のＣＡ１２５がｂｉｏ−Ｏｖ１８５  ＭＡｂ上で捕捉された。Ｅｕ３＋ナノ粒子上に固定化された植物レクチン及びヒトレクチンのパネルをトレーサーとして使用した。ＭＧＬ−ＮＰだけが、ＯｖＣａ由来ＣＡ１２５と他の起源のＣＡ１２５とを明白に識別した。各レクチンのバックグラウンドシグナルを表４に示す。
【図７】異なるビオチン化捕捉抗体（Ｏｖｋ９５、Ｏｖ１８５及びＯｖ１９７）を用いた抗ＣＡ１２５抗体−ＭＧＬナノ粒子アッセイの結果を示す図である。Ｅｕ３＋標識したＭＧＬ−ＮＰをトレーサーとして使用した。それぞれの場合において、ＯｖＣａ−ＣＡ１２５は、Ｐｌａ−ＣＡ１２５のほぼ１０倍で識別された。最大の特異的シグナルは、ｂｉｏＯｖ１８５を捕捉抗体として使用した場合に得られた。
【図８】４つの異なる起源のＣＡ１２５を用いた、より広いダイナミックレンジにおけるＭＧＬ−ＮＰアッセイの結果を示す図である。原発性ＯｖＣａ細胞系ＯＶＣＡＲ−３（ＯｖＣａ−１２５）、胎盤ホモジェネート（Ｐｌａ−ＣＡ１２５）、及び肝硬変腹水（ＬＣ−ＣＡ１２５）及び未成熟奇形腫（ＩＴ−ＣＡ１２５）由来のＣＡ１２５を５〜２０００Ｕ／ｍｌの量で使用した（５〜１０００Ｕ／ｍｌの範囲の濃度のＩＴ−ＣＡ１２５を除く）。フック効果は、２０００Ｕ／ｍｌまでのＣＡ１２５濃度であっても観察されなかった。
【図９】プールした健常男性血漿（ＨＰ）又はＴＳＡ−ＢＳＡ  １％緩衝液（ＴＢ）でスパイクしたＣＡ１２５試料によるＭＧＬ−ＮＰアッセイの結果を示す図である。特異的シグナルは、ＴＳＡ−ＢＳＡ  １％のような単一基質とプールされた健常男性血漿の使用とでほぼ同じであった。
【図１０】本ＭＧＬ−ＮＰアッセイと従来のＣＡ１２５イムノアッセイで得られた特異的シグナルの比を示す図である。ＥＯＣ血清試料（１〜６）は、妊婦の血清試料（７〜８）及び子宮内膜症試料の２つのプール（９〜１０）と比べてシグナルの増加を示した。したがって、本ＭＧＬ−ＮＰアッセイは、ＥＯＣ関連ＣＡ１２５と正常又は良性ＣＡ１２５を識別することができる。
【図１１Ａ】５つの異なる臨床血清試料群（対照としての健常女性ｎ＝５１、子宮内膜症ステージ１〜２  ｎ＝３３、子宮内膜症ステージ３〜４  ｎ＝８８、ＥＯＣ進行／再発症例  ｎ＝４３（ＯｖＣａ進行）、及び子宮内膜がんｎ＝１６（ＥｍＣａ）を用いた従来のＨＥ４イムノアッセイのボックスプロット提示を示す図である。各群の中央値をボックス内に示す。
【図１１Ｂ】５つの異なる臨床血清試料群（対照としての健常女性ｎ＝５１、子宮内膜症ステージ１〜２  ｎ＝３３、子宮内膜症ステージ３〜４  ｎ＝８８、ＥＯＣ進行／再発症例  ｎ＝４３（ＯｖＣａ進行）、及び子宮内膜がんｎ＝１６（ＥｍＣａ）を用いた従来のＣＡ１２５イムノアッセイのボックスプロット提示を示す図である。各群の中央値をボックス内に示す。
【図１１Ｃ】５つの異なる臨床血清試料群（対照としての健常女性ｎ＝５１、子宮内膜症ステージ１〜２  ｎ＝３３、子宮内膜症ステージ３〜４  ｎ＝８８、ＥＯＣ進行／再発症例  ｎ＝４３（ＯｖＣａ進行）、及び子宮内膜がんｎ＝１６（ＥｍＣａ）を用いたＭＧＬ−ＮＰアッセイのボックスプロット提示を示す図である。ＥＯＣの中央値は６であるが、他のすべての群の中央値はわずかに１である。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｄは、従来のＣＡ１２５イムノアッセイ（図１２Ａ及び１２Ｃ）及びＣＡ１２５ＭＧＬアッセイ（図１２Ｂ及び１２Ｄ）を使用した、ＥＯＣと良性子宮内膜症及び健常対照の識別を示すボックスプロット提示を表す。図１２は、術前高悪性度漿液性ＥＯＣ（ｎ＝２１）及び子宮内膜症（ｎ＝１２１）におけるＣＡ１２５が、従来のＣＡ１２５イムノアッセイを用いた健常対照（ｎ＝５１）よりも有意に高かった（ｐ＜０．００１）ことを示す。図１２Ｂは、子宮内膜症と健常対照の間の有意差がＣＡ１２５ＭＧＬレベルでは観察されなかったが、術前ＥＯＣレベルは有意に高かった（ｐ＜０．００１）ことを示す。図１２Ｃは、診断において臨床的に最も挑戦課題である、わずかにＣＡ１２５濃度が増加した（３５〜２００Ｕ／ｍｌ）ＥＯＣ（ｎ＝３８）及び子宮内膜症（ｎ＝４４）試料で、ＣＡ１２５イムノアッセイとは違いはなかったことを示すが、図１２Ｄは、ＣＡ１２５ＭＧＬレベルは有意な差が維持されたことを示す。
【図１３Ａ】すべての経時的ＥＯＣ症例（ｎ＝２１３）対、子宮内膜症症例（ｎ＝１３３）のコホートにおける、単独又は組み合わせのいずれかのＨＥ４、ＣＡ１２５及びＣＡ１２５ＭＧＬに対するＲＯＣ曲線を示す図である。最高ＡＵＣ値は、３つのすべてのマーカーの組み合わせで得られた。
【図１３Ｂ】ＥＯＣの進行／再発症例（ｎ＝４３）対、子宮内膜症症例（ｎ＝１３３）のコホートにおける、単独又は組み合わせのいずれかのＨＥ４、ＣＡ１２５及びＣＡ１２５ＭＧＬに対するＲＯＣ曲線を示す図である。最高ＡＵＣ値は、３つのすべてのマーカーの組み合わせで得られた。
【図１３Ｃ】処置前ＥＯＣ症例（ｎ＝２９）対、子宮内膜症症例（ｎ＝１３３）のコホートにおける、単独又は組み合わせのいずれかのＨＥ４、ＣＡ１２５及びＣＡ１２５ＭＧＬに対するＲＯＣ曲線を示す図である。すべてのマーカーが高いＡＵＣ値を示したが、最高ＡＵＣ値は３つのすべてのマーカーの組み合わせで得られた。
【図１４】本ＭＧＬ−ＮＰアッセイが、ＨＥ４及びＣＡ１２５イムノアッセイよりも、早く、より強い相対的時間変化を示す図である。各パネルは、それぞれ異なる患者を表し、ＨＥ４、ＣＡ１２５及びＣＡ１２５ＭＧＬの相対的濃度を経時的に示す。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｃは、ホルモン状態がＣＡ１２５ＭＧＬ及びＨＥ４の血中レベルに影響を全く及ぼさないことを示す。ボックスは、示したように、測定サイクルの異なる段階での健常対照又は子宮内膜症罹患患者を表す。横方向の破線は、当該マーカーに対するカットオフ値を示す。ＣＡ１２５及びＨＥ４のボックスプロットは、Ｈａｌｌａｍａａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，２０１２，１２５：６６７−６７２）から応用した。略語：ｐｒｏｌ、ｐｒｏｌｉｆ、増殖；ｓｅｃｒ、分泌；ｅｎｄｏ、子宮内膜症；ＩＡ、イムノアッセイ。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本開示は、ＣＡ１２５グリコシル化パターンに基づいて、卵巣上皮がん（ＥＯＣ）−関連ＣＡ１２５を他のＣＡ１２５種と識別することを目的とする研究に基づく。この目的に従って、本開示は、特に婦人科疾患、特にＥＯＣ、子宮内膜症及び子宮内膜がんからなる群から選択される婦人科疾患を診断、予測又はモニタリングするための、前記婦人科疾患に罹患していること又は罹患するリスクがあることが疑われる対象における婦人科疾患状態を決定する手段及び方法を提供する。
【００２０】
本明細書で使用される場合、用語「又は」とは、「及び」及び「又は」の両方の意味を有する（すなわち、「及び／又は」）。さらに、単数名詞の意味は、複数名詞の意味を含み、したがって、単数の用語は、別段の定めがない限り、その複数形の意味も有し得る。言い換えると、用語「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ又は複数を意味し得る。
【００２１】
本明細書で使用される場合、用語「対象」とは、動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒト、最も好ましくは女性を指す。当該実施形態に応じて、前記対象は、診断の有無にかかわらず、婦人科疾患に罹患しているか、婦人科疾患に罹患していることが疑われるか、前記婦人科疾患のリスクがあり得るか、又は、既に婦人科疾患の処置を受けている可能性がある。いくつかの好ましい実施形態において、前記婦人科疾患は、ＥＯＣ、子宮内膜症及び子宮内膜がんからなる群から選択される。いくつかのさらに好ましい実施形態において、前記婦人科疾患はＥＯＣである。本明細書において、用語「ヒト対象」、「患者」及び「個体」は互換性がある。
【００２２】
本明細書で使用される場合、用語「試料」とは、組織試料、例えば、卵巣又は子宮内膜から採取された生検試料、並びに体液試料、例えば、対象から採取された腹水、尿、血液、血漿、血清及び腹腔液体を指す。いくつかの実施形態において、前記組織試料は、ホルマリン固定組織試料又はパラフィン包埋組織試料であり得る。一般に、分析しようとする試料を対象から採取することは、対象の婦人科疾患状態を決定する本方法の一部ではない。血液試料、血清試料又は血漿試料が、本方法及びそのすべての実施形態において使用される最も好ましい試料のタイプである。
【００２３】
２つ以上のバイオマーカーのレベルの評価に関する実施形態において、婦人科疾患状態を決定しようとする対象から採取した同一の又は異なる試料を各評価に対して使用することができる。前記異なる試料は、同一のタイプであっても異なるタイプであってもよい。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「レベル」は、他に指示のない限り、用語「量」及び「濃度」と互換性がある。
【００２５】
バイオマーカーの検出レベルが前記バイオマーカーに関連した疾患の存在又はリスクを示すかどうかを決定するには、関連する対照におけるそのレベルを決定しなければならない。対照レベルが分かったならば、決定マーカーレベルをそれと比較することが可能になり、差異の有意性を、標準的な統計方法を使用して評価することができる。いくつかの実施形態において、決定バイオマーカーレベルと対照レベルの間の統計的有意差が当該疾患を示す。いくつかのさらなる実施形態において、対照と比較する前に、標準的な方法を使用してバイオマーカーレベルを正規化する。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「対照」とは、見かけ上健常な個体から採取した対照試料又は見かけ上健常な個体のプールを指し得る。或いは、当該疾患の存在又は非存在を示す所定の閾値、すなわちカットオフ値を指し得る。適切な閾値を決定するための統計方法は、当業者には容易に理解されよう。閾値は、必要に応じて、同じ年齢、人口統計学的な特徴及び／又は疾患状態などの対象の試料から決定することができる。閾値は、当該疾患に罹病していない単一個体から得るものであってもよく、又は複数のこのような個体からプールした値であってもよい。適切な所定の閾値の非限定的な例としては、限定するものではないが、一般に認められているように、ＣＡ１２５については３５Ｕ／ｍｌ、ＨＥ４については７０ｐＭが挙げられる。
【００２７】
実験部分で試験したコホートでは、健常女性のほぼ９０％が２Ｕ／ｍｌ未満のＣＡ１２５ＭＧＬ濃度を示したが、試験した５１人の健常女性のうち４名だけが＞２Ｕ／ｍｌのＣＡ１２５ＭＧＬ濃度を示した。したがって、いくつかの実施形態において、ＣＡ１２５ＭＧＬに関する所定の閾値は、約２Ｕ／ｍｌ〜約３Ｕ／ｍｌ、例えば、約２Ｕ／ｍｌ又は約２．８Ｕ／ｍｌであり得る。しかし、所望の感度及び特異性に応じて、他のＣＡ１２５ＭＧＬに関する所定の閾値を使用することができる。このような他の閾値の非限定的な例としては、約２Ｕ／ｍｌ〜約７Ｕ／ｍｌ、約２Ｕ／ｍｌ〜約６Ｕ／ｍｌ、約２Ｕ／ｍｌ〜約５Ｕ／ｍｌ、及び約２Ｕ／ｍｌ〜約４Ｕ／ｍｌの範囲内にある任意の値が挙げられる。スクリーニング目的及びアッセイの臨床感度を最大限にする必要のある他の使用においては、約０．５〜２Ｕ／ｍｌのような低い閾値、例えば、約１Ｕ／ｍｌ又は１．５Ｕ／ｍｌを使用することもできる。一方、診断の実施形態又はアッセイの臨床特異性を最大限にする必要のある他の実施形態において、約５〜２０Ｕ／ｍｌのような高い閾値、例えば、約１０Ｕ／ｍｌ又は１５Ｕ／ｍｌを使用することもできる。しかし、これらの範囲はまた、アッセイに十分高い結合活性のＭＧＬを提供する検出技術又は手段の詳細に応じて変わり得る。
【００２８】
いくつかの実施形態において、用語「対照試料」とは、婦人科疾患状態を決定しようとする同じ対象から採取された試料であるが、疾患状態決定の時点とは異なる時点で採取された試料を指す。このような異なる時点の非限定的な例としては、疾患の診断前の１つ又は複数の時点、疾患の診断後の１つ又は複数の時点、疾患の処置前の１つ又は複数の時点、疾患の処置中の１つ又は複数の時点、及び疾患の処置後の１つ又は複数の時点が挙げられる。典型的には、同じ対象から採取されたこのような対照試料は、婦人科疾患状態決定の目的が前記疾患をモニターすること、特に疾患の発症又は疾患の発症リスク、処置に対する応答、疾患の再発、又は疾患の頻発をモニターすることである場合に使用される。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「見かけ上健常な」とは、当該疾患の徴候を示さず、したがって当該前記疾患に罹病していないと考えられるか、又は、当該前記疾患を発症しないと予測される個体又は個体のプールを指す。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「疾患を示す」とは、バイオマーカーに適用された場合、信頼水準が最低９５％設定の慣用統計方法を使用した、前記疾患又は前記疾患のステージの診断に関するレベルであって、その検出レベルが、前記疾患又は前記疾患のステージを有する対象において、前記疾患を有さない、又は前記疾患の別のステージである対象よりも有意に多く確認されるようなものを指す。好ましくは、疾患を示すレベルは、その疾患に罹患している対象の少なくとも８０％で確認され、その疾患に罹患していない対象の１０％未満で確認される。より好ましくは、前記疾患を示すレベルは、疾患に罹患している対象の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上で確認され、疾患に罹患していない対象の１０％未満、８％未満、５％未満、２．５％未満又は１％未満で確認される。
【００３１】
診断に日常的に使用されている既存のＣＡ１２５イムノアッセイは、ＣＡ１２５の異なるタンパク質エピトープを認識する２つの異なるモノクローナル抗体によって血清又は血漿中のＣＡ１２５タンパク質レベルを決定することに基づく。本明細書では「ＣＡ１２５タンパク濃度について試料をアッセイする」と呼ばれる、このような従来のイムノアッセイは、いくつかの異なる提供者から購入することができる。したがって、用語「ＣＡ１２５」とは、そのグリコシル化パターンにかかわらず、ＣＡ１２５のタンパク質成分を指す。一般に、３５Ｕ／ｍｌ以下のＣＡ１２５血清濃度が正常であると考えられる。しかし、このカットオフレベルを超えるＣＡ１２５濃度は、卵巣がん以外の状態、例えば子宮内膜症に罹患している患者において高頻度で確認され、ＥＯＣ診断法において偽陽性の結果をもたらす。
【００３２】
ＣＡ１２５イムノアッセイのこの一般に認められている欠点と一致して、卵巣上皮がん関連ＣＡ１２５と、胎盤ホモジェネート、羊水、肝硬変腹水又は未成熟奇形腫関連腹水由来の正常又は良性ＣＡ１２５との間には、本明細書の例２でより詳細に述べているように、区別はなかった。
【００３３】
ＣＡ１２５は、豊富なＮ−結合グリカン側鎖及びＯ−結合グリカン側鎖を有し、総炭水化物含有量が２４％〜２８％の高度にグリコシル化された分子である。がん細胞及び組織のグリコシル化における変化の同定については、レクチンが、すなわち、それらの糖部分構造及び配列に基づき所定のグリカンに対して高度に特異的な炭水化物−結合タンパク質の周知のファミリーのメンバーが提案されている。
【００３４】
このため、植物レクチン及びヒトレクチンのパネルを、例３でより詳細に述べている抗ＣＡ１２５抗体−レクチンサンドイッチアッセイにおいて使用した。結果によれば、使用したレクチンはいずれも、羊水又は正常胎盤由来の正常ＣＡ１２５と、ＯＶＣＡＲ−３と呼ばれる原発性卵巣癌腫細胞系由来の卵巣がん関連ＣＡ１２５とを識別することはできなかった。
【００３５】
しかし、意外なことに、ＥＯＣ関連ＣＡ１２５とＥＯＣ非関連ＣＡ１２５の間の良好な識別が、マクロファージガラクトース型レクチン（ＭＧＬ）を使用し、それをナノ粒子に固定化した場合に達成された。例３に示したように、本方法は、ＥＯＣ関連ＣＡ１２５を、胎盤ＣＡ１２５よりも少なくとも１０倍優先的に正常／良性ＣＡ１２５から識別する。ＥＯＣ関連ＣＡ１２５を妊娠関連ＣＡ１２５又は子宮内膜症関連ＣＡ１２５と識別する本方法の能力は、臨床血清試料で確認された。これらの結果は、ナノ粒子に固定化された場合のＭＧＬの使用に限定されず、他の技術によって適切な結合力効果及びシグナル増幅が得られる実施形態に適用される。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語「ＣＡ１２５ＭＧＬ」とは、ＭＧＬ、例えば、ナノ粒子固定化ＭＧＬ（ＭＧＬ−ＮＰ）に特異的に結合する、ＣＡ１２５のグリコフォームを指す。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「ＭＧＬ」とは、ヒトの免疫細胞上、より詳しくは樹状細胞及びマクロファージ上に天然に存在するＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）である、単離されたヒトマクロファージガラクトース型レクチンを指す。ヒトＭＧＬは、非常に稀な末端ＧａｌＮＡｃ構造に対する排他的特異性を有しており、これは腫瘍関連ムチンＭＵＣ１で判明している。用語「ＭＧＬ」はまた、当技術分野で公知の標準的な方法によりヒトＩｇＧ１−ＦｃにＣ末端で融合されたＭＧＬ（ＭＧＬ−Ｆｃ）も包含する。こうしたＭＧＬ−Ｆｃは市販されている。ＭＧＬはまた、ＣＤ３０１、及びＣ型レクチンドメインファミリー１０メンバーＡ（ＣＬＥＣ１０Ａ）の名称でも知られている。いかなるＦｃ融合も含まない組換えヒトＣＬＥＣ１０Ａは市販されている。
【００３８】
上記に従って、本発明は、前記対象から採取した試料ＣＡ１２５ＭＧＬについてアッセイすることにより、対象における婦人科疾患状態を決定する方法を提供する。対照試料又は所定の閾値と比較した場合、前記試料中のＣＡ１２５ＭＧＬレベルの増加は、前記対象がＥＯＣに罹患しているか、又はＥＯＣに罹患するリスクがあることを示す。一方、対照試料又は所定の閾値と比較した場合、前記試料中のＣＡ１２５ＭＧＬレベルの非増加又は正常は、前記対象がＥＯＣに関して見かけ上健常であるか、又は、ＥＯＣの罹患又は発症するリスクがないことを示す。いくつかの実施形態において、前記方法は、対象のＥＯＣ疾患状態を決定する方法であり得る。いくつかのさらなる実施形態において、前記方法は、ＥＯＣを診断、予測、モニタリングする方法であってもよく、ＥＯＣのモニタリングは、限定するものではないが、ＥＯＣの発症のモニタリング、ＥＯＣのリスクにおける任意の発生のモニタリング、処置に対する応答のモニタリング、ＥＯＣの再発のモニタリング、及びＥＯＣの頻発のモニタリングを包含する。
【００３９】
しかし、試験結果としてのＣＡ１２５ＭＧＬレベルの非増加又は正常は、婦人科疾患状態を決定しようとする対象が子宮内膜症又は子宮内膜がんなどのＥＯＣ以外の婦人科疾患に罹患しているか、又は罹患するリスクがあり得るという可能性を排除するものではない。他方、このような試験結果を有する対象はまた、ＥＯＣに関して見かけ上健常であり得るだけでなく、子宮内膜症及び子宮内膜がんに関しても見かけ上健常であり得る。したがって、本方法の目的が対象のＥＯＣ状態を決定するだけでなく、子宮内膜症又は子宮内膜がんなどの他の婦人科疾患に関する対象の疾患状態も決定し、前記試料中のＣＡ１２５ＭＧＬのレベルが非増加である場合、ＥＯＣ以外の婦人科疾患に罹患している前記対象のリスクを決定するためには、さらなる診断試験が当然必要となり得る。下記に述べるように、こうしたさらなる試験は、子宮内膜症又は子宮内膜がんに罹患している前記対象のリスクを決定するために、前記対象から採取した試料をＣＡ１２５及び／又はＨＥ４についてもアッセイすることを含み得る。或いは、又は加えて、前記のさらなる試験はまた、当技術分野で利用可能な任意の適切な診断方法の使用を含み得る。
【００４０】
いくつかの実施形態において、対象における婦人科疾患状態を決定する方法は、ＥＯＣと子宮内膜症又は子宮内膜がんとの鑑別診断法に使用することができる。
【００４１】
上記のように、試料中のＣＡ１２５ＭＧＬのレベルは、いくつかの実施形態において、ナノ粒子固定化ＭＧＬ（ＭＧＬ−ＮＰ）に結合するＣＡ１２５のレベルを決定することによって、例えば、本明細書で例示した任意のアッセイフォーマットを使用することによって、定量又はアッセイされ得る。本開示は、ＭＧＬ−ＮＰベースのアッセイに着目しているが、試料中のＣＡ１２５ＭＧＬレベルを決定する他の技術も同様に想定される。言い換えると、ナノ粒子は、本方法及びその様々な実施形態を実施するための適切な結合力効果及びシグナル増幅を提供する好ましい一方法にすぎない。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「ナノ粒子」（ＮＰ）とは、１つ又は複数の寸法、例えば、約１０００ｎｍ未満、例えば約５００ｎｍ以下、約１００ｎｍ以下、又は約５０ｎｍ以下の直径を有する合成又は天然の粒子を指す。本明細書で使用される場合、用語「約」とは、所定値の±１０％の範囲の値を指す。例えば、語句「約１００ｎｍ」とは、１００ｎｍの±１０％、又は９０ｎｍから１１０ｎｍまでを含む。ナノ粒子は、一般に球形を有し得るが、楕円体形状などの非球形も使用することができる。いくつかの実施形態において、前記ナノ粒子のすべての寸法は、約１０００ｎｍ未満、約５００ｎｍ以下、約１００ｎｍ以下、又は約５０ｎｍ以下である。
【００４３】
異なる様々な物質を本ナノ粒子に利用することができる。適切なポリマーの非限定的な例としては、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メチルメタクリラート）（ＰＭＭＡ）、多糖類、及びそれらのコポリマー又は組み合わせが挙げられる。他の適切なナノ粒子物質としては、限定するものではないが、コロイド金、銀、量子ドット、炭素、多孔性ケイ素及びリポソームが挙げられる。さらなる適切なナノ粒子物質としては、タンパク質ナノ粒子、無機ナノ粒子、ガラスナノ粒子、ナノ粒子結晶体、金属ナノ粒子及びプラスチックナノ粒子が挙げられる。
【００４４】
本方法における使用に適したナノ粒子は、任意の公知の手段によって、直接的又は間接的に、定性的又は定量的に検出することができる。例えば、ナノ粒子は、例えば、アップコンバージョンナノ粒子（ＵＣＮＰ）、共鳴粒子、量子ドット、及び金粒子の場合のような固有特性に基づいて検出可能である。他のいくつかの実施形態において、ナノ粒子は、例えば、蛍光標識、生物発光標識、化学発光標識によって検出可能となり得る。いくつかのさらなる実施形態において、ランタニドによるラベリング又はドーピング、すなわち、可視波長又は近赤外波長又は赤外波長においてルミネッセンス発光があり蛍光崩壊が長い発光ランタニドイオン、例えばユーロビウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、エルビウム（ＩＩＩ）及びネオジム（ＩＩＩ）は、本ナノ粒子を検出することができる好ましい手段である。
【００４５】
いくつかの非限定的な実施形態において、最も好ましいナノ粒子は、９７ｎｍ又は１０７ｎｍのいずれかの直径を有するポリスチレンナノ粒子である。このようなナノ粒子は、少なくともＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｅｒａｄｙｎ  Ｉｎｃ．から発売されている。
【００４６】
ＭＧＬは、限定するものではないが、例１に開示されているものを含む、当技術分野で公知の任意の適切な方法によってナノ粒子上に固定化され得る。本明細書では、ナノ粒子固定化ＭＧＬは、略してＭＧＬ−ＮＰと称する。
【００４７】
ＣＡ１２５のＭＧＬ−ＮＰへの結合は、様々な方法によって決定することができる。いくつかの実施形態において、前記結合は、ＣＡ１２５特異的モノクローナル抗体を捕捉剤として使用し、ＭＧＬ−ＮＰをトレーサーとして使用するサンドイッチアッセイによって決定される。いくつかの他の実施形態において、サンドイッチアッセイは、逆の方法を使用して実施することができる。そのような場合、ＭＧＬ−ＮＰが捕捉剤として使用され、ＣＡ１２５特異的モノクローナル抗体がトレーサーとして使用される。尿は、血液に比べて干渉するグリコシル化分子をほとんど含有しないため、逆サンドイッチアッセイは、血液試料よりも尿試料で良好に操作され得る。
【００４８】
本ＭＧＬ−ＮＰアッセイのいくつかのさらなる実施形態において、グリコシルホスファチジルイノシトール結合糖タンパク質であるメソセリンを、ＣＡ１２５特異的モノクローナル抗体の代わりに、捕捉剤又はトレーサーのいずれかとして使用することができる。
【００４９】
本発明の様々な実施形態に記載のサンドイッチアッセイは、マイクロタイタープレートなどの固相表面上で、又はラテラルフローフォーマットのいずれかで実施することができる。例えばストレプトアビジン−ビオチン複合体を介した、又はラテラルフローアッセイへの捕捉剤の組み込みを介した、捕捉剤を固相表面に結合させる手段及び方法は当技術分野で公知であり、当業者には容易に理解されよう。任意のトレーサーは、検出可能な標識、例えば、ユーロビウム（ｌｌｌ）、テルビウム（ｌｌｌ）、サマリウム（ｌｌｌ）及びジスプロシウム（ｌｌｌ）から選択されるランタニドキレートなどで標識されていてもよい。いくつかの特定の実施形態において、ユーロビウムキレートが検出可能な標識として使用される。非限定的な好ましい実施形態において、ＭＧＬ−ＮＰがトレーサーとして使用され、３００００Ｅｕキレートでドープされる。いくつかの他の特定の実施形態において、ＭＧＬはアップコンバージョンリン（ＵＣＰ）粒子に付着させるが、これはラテラルフローフォーマットでのトレーサーとしての使用に特に適している。
【００５０】
任意のモノクローナル抗ＣＡ１２５抗体を上記のサンドイッチアッセイに使用することができる。適切な市販の抗ＣＡ１２５抗体の非限定的な例としては、少なくともＦｕｊｉｒｅｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、スウェーデンから購入可能なＯｖ１８５、Ｏｖ１９７及びＯｖＫ９５が挙げられる。さらなるＣＡ１２５特異的モノクローナル抗体は、当技術分野で周知の方法によって産生することができる。
【００５１】
本ＭＧＬ−ＮＰアッセイでの使用に適した基質としては、限定するものではないが、ガラス、シリカ、アルミノケイ酸塩、ホウケイ酸塩、金属酸化物、例えばアルミナ及び酸化ニッケル、金、各種クレイ、ニトロセルロース、又はナイロンが挙げられる。いくつかの実施形態において、基質は、抗ＣＡ１２５抗体の基質への結合を増強する化合物でコーティングされていてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、１つ又は複数の対照抗体も基質に結合される。
【００５２】
当業者にはよく知られているように、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を利用して、マーカーの感度と特異性の間のトレードオフを実証することができる。感度は疾患を検出するマーカーの能力の尺度であり、特異性は疾患の非存在を検出するマーカーの能力の尺度である。ＲＯＣ曲線の水平Ｘ軸は１つの特異性を表し、これは偽陽性率とともに増加する。この曲線の垂直Ｙ軸は感度を表し、真陽性率とともに増加する。したがって、選択された特定のカットオフについて、特異性及び感度の値を決定することができる。言い換えると、ＲＯＣ曲線上のデータポイントは、様々な決定境界での真陽性及び偽陽性の分類の率を表す。真陽性率が１．０に接近し、偽陽性率が０．０に接近するにつれて、最適の結果が得られる。しかし、カットオフが特異性を高めるために変更されると、通常、感度は低下し、その逆も同様である。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語「偽陽性」とは、罹病していない対象を、罹病している対象として誤って分類する試験結果を指す。同様に、「偽陰性」とは、罹病している対象を、罹病していない対象として誤って分類する試験結果を指す。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語「真陽性」とは、疾患に罹患している対象を、罹病している対象として正確に分類する試験結果を指す。同様に、「真陰性」とは、罹病していない対象を、罹病していないものとして正確に分類する試験結果を指す。
【００５５】
上記によれば、用語「成功率」とは、陽性の結果を有する罹病した個体のパーセンテージを示した割合を意味し、一方、用語「偽陽性率」とは、陽性の結果を有する罹病していない個体のパーセンテージを示す割合を指す。
【００５６】
多くの場合ＡＵＣと呼ばれる、ＲＯＣ曲線下面積は、疾患対象の正確な識別におけるマーカーの有用性の尺度である。したがって、ＡＵＣを使用して試験の有効性を決定することができる。面積１とは完全な試験を表し；面積０．５とは無効な試験を表す。診断試験又は予測試験の正確性を分類するための従来のラフな基準は、下記のとおりである：ＡＵＣ値の０．９〜１は、診断力又は予測力が優れた試験を表し、ＡＵＣ値の０．８０〜０．９０は、診断力又は予測力が良好な試験を表し、ＡＵＣ値の０．７０〜０．８０は、診断力又は予測力が適正な試験を表し、ＡＵＣ値の０．６０〜０．７０は、診断力又は予測力が不十分な試験を表し、ＡＵＣ値の０．５０〜０．６０は、診断力又は予測力が不良な試験を表す。
【００５７】
実験部分に示したように、使用したＥＯＣ患者群（全２１３ＥＯＣ症例、ＥＯＣの初期ステージを表す４３症例、又はＥＯＣの進行ステージを表す２９症例）に応じて、本ＭＧＬ−ＮＰアッセイは、ＥＯＣを、０．８１５、０．８７０又は０．８９９のＡＵＣ値で子宮内膜症と識別することができた。ＥＯＣの初期進行／再発ステージを表す臨床コホートにおける本ＭＧＬ−ＮＰアッセイの成功率は、７１．９％であった。
【００５８】
上記の値は、ＭＧＬ−ＮＰアッセイを、そのグリコフォーム組成に関係なくＣＡ１２５タンパク質の全血清濃度を決定する従来のＣＡ１２５イムノアッセイと組み合わせた場合に改善された。ＥＯＣの初期ステージを表す臨床コホートにおけるＣＡ１２５ＭＧＬ及びＣＡ１２５の組み合わせ決定の成功率は、８１．２％に改善された。したがって、いくつかの実施形態において、対象における婦人科疾患状態を決定する本方法は、前記対象から採取した試料中、好ましくは血液試料中、より好ましくは血清又は血漿中のＣＡ１２５ＭＧＬ及びＣＡ１２５両方のレベルの決定を含み得る。このような組み合わせ決定は、少なくとも場合によっては、試験結果の精度を改善し、又はそれを確認することができる。
【００５９】
ＣＡ１２５ＭＧＬ及びＣＡ１２５の両レベルの組み合わせ決定は、ＥＯＣに罹患している対象又はＥＯＣのリスクのある対象と、子宮内膜症に罹患している対象又は子宮内膜症のリスクのある対象を相互に識別するのに特に有用であり、すなわち、ＥＯＣと子宮内膜症とを鑑別診断するのに特に有用である。これは、ＥＯＣ関連ＣＡ１２５を検出する優れた能力を有するが、ＣＡ１２５ＭＧＬ濃度が子宮内膜症に罹患している対象から採取した試料中で増加しないため、ＣＡ１２５ＭＧＬが見かけ上健常な対象と子宮内膜症に罹患している対象とを識別しないので、少なくとも部分的である。言い換えると、ＣＡ１２５ＭＧＬの正常レベル又は非増加レベルは、対象が、子宮内膜症に関して見かけ上健常であるか、又は子宮内膜症に罹患している、若しくは子宮内膜症のリスクがあるかどうかを区別しない。次に、ＣＡ１２５タンパク濃度は、典型的には、ＥＯＣと子宮内膜症の両方で増加する。したがって、ＣＡ１２５ＭＧＬ及びＣＡ１２５両方の濃度の増加は、ＥＯＣの存在又はリスクを示すが、ＣＡ１２５タンパク濃度の増加と同時のＣＡ１２５ＭＧＬレベルの非増加は、子宮内膜症の存在又はリスクを示す。一方、ＣＡ１２５ＭＧＬ及びＣＡ１２５両方の濃度の非増加は、ＥＯＣも子宮内膜症も存在せず、又はリスクがないことを示す。
【００６０】
したがって、いくつかの実施形態において、婦人科疾患状態を決定する本方法は、対象のＥＯＣ疾患状態を決定する方法、例えば、対象のＥＯＣを診断、予測又はモニタリングする方法であって、前記試料から採取した試料をＣＡ１２５ＭＧＬについてアッセイするステップと、前記対象から採取した同一の又は異なる試料をＣＡ１２５タンパク濃度についてアッセイするステップとを含む、上記方法であり得る。このような方法において、ＣＡ１２５タンパク濃度の増加と組み合わされたＣＡ１２５ＭＧＬレベルの増加は、前記対象がＥＯＣに罹患しているか、又はＥＯＣに罹患するリスクがあることを示し得る。一方、ＣＡ１２５タンパク濃度の非増加又は正常と組み合わされたＣＡ１２５ＭＧＬレベルの非増加又は正常は、前記対象がＥＯＣに罹患していないか、又はＥＯＣに罹患するリスクがないこと、すなわち、ＥＯＣに関して見かけ上健常であることを示し得る。
【００６１】
いくつかの他の実施形態において、本方法は、対象における子宮内膜症疾患状態を決定する方法、例えば、子宮内膜症を診断、予測、又はモニタリングする方法であって、前記試料から採取した試料をＣＡ１２５ＭＧＬについてアッセイするステップと、前記対象から採取した同一の又は異なる試料をＣＡ１２５タンパク濃度についてアッセイするステップとを含む、上記方法であり得る。このような方法において、ＣＡ１２５タンパク濃度の増加と組み合わされたＣＡ１２５ＭＧＬレベルの非増加は、前記対象が子宮内膜症に罹患しているか、又は子宮内膜症に罹患するリスクがあることを示し得る。一方、ＣＡ１２５タンパク濃度の非増加と組み合わされたＣＡ１２５ＭＧＬレベルの非増加は、前記対象が子宮内膜症に罹患していないか、又は子宮内膜症に罹患するリスクがないこと、すなわち、子宮内膜症に関して見かけ上健常であることを示し得る。
【００６２】
実験部分に示したように、ＥＯＣを有する対象と子宮内膜症を有する対象を識別するためのＭＧＬ−ＮＰアッセイの性能はまた、従来のＨＥ４イムノアッセイとの併用によって改善された。ＨＥ４（ヒト精巣上体タンパク質４）は公知の血清バイオマーカーであり、卵巣がん及び子宮内膜がんの両方で過剰発現される。ＥＯＣの初期ステージを表す臨床コホートにおけるＣＡ１２５ＭＧＬ及びＨＥ４の組み合わせ決定の成功率は、９３．７％に改善された。したがって、いくつかの実施形態において、対象における婦人科疾患状態を決定する本方法は、好ましくは血液中、より好ましくは血清又は血漿中のＣＡ１２５ＭＧＬ及びＨＥ４の両レベルの決定を含み得る。ＨＥ４測定を含む本方法のいずれかの実施形態において、検出したＨＥ４濃度と比較するための適切な所定の閾値としては、限定するものではないが、特に閉経前の対象又は５０歳未満の対象については７０ｐＭ、及び特に閉経後の対象又は５０歳を過ぎた対象については９０ｐＭ又は１４０〜１５０ｐＭが挙げられる。
【００６３】
したがって、いくつかの実施形態において、ＣＡ１２５ＭＧＬ及びＨＥ４両方の血清レベルの決定を使用して、対象におけるＥＯＣ疾患状態を決定することができ、より詳しくは、前記対象におけるＥＯＣを診断、予測、又はモニタリングすることができる。このような方法において、ＣＡ１２５ＭＧＬ及びＨＥ４の両濃度の増加はＥＯＣの存在又はリスクを示し得るが、ＣＡ１２５ＭＧＬ及びＨＥ４の両濃度の非増加は、前記対象がＥＯＣに罹患していないか、ＥＯＣに罹患するリスクがないこと、すなわち、ＥＯＣに関して見かけ上健常であることを示し得る。
【００６４】
いくつかの他の実施形態において、ＣＡ１２５ＭＧＬ及びＨＥ４両方の血清レベルの決定は、ＥＯＣ及び子宮内膜がんの鑑別診断に使用することができる。このような方法において、ＣＡ１２５ＭＧＬ及びＨＥ４の両濃度の増加は、ＥＯＣの存在又はリスクを示し得るが、ＨＥ４の濃度の増加と同時にＣＡ１２５ＭＧＬの濃度が非増加であった場合は、子宮内膜がんの存在又はリスクを示し得る。
【００６５】
いくつかのさらなる実施形態において、ＣＡ１２５ＭＧＬ及びＨＥ４両方の血清レベルの決定を使用して、対象における子宮内膜がん疾患状態を判定することができ、より詳しくは、前記対象における子宮内膜がんを診断、予測、又はモニタリングすることができる。このような方法においては、ＨＥ４濃度の増加と同時のＣＡ１２５ＭＧＬの濃度の非増加は、対象が子宮内膜がんに罹患しているか、又は子宮内膜がんのリスクがあることを示し得るが、一方、対象におけるＣＡ１２５ＭＧＬ及びＨＥ４両方の濃度の非増加は、前記対象が子宮内膜がんに罹患していないか、又は子宮内膜がんに罹患するリスクがないこと、すなわち、子宮内膜がんに関して見かけ上健常であることを示し得る。
【００６６】
いくつかのさらなる実施形態において、ＣＡ１２５ＭＧＬ、ＣＡ１２５及びＨＥ４は、特にＥＯＣ、子宮内膜症及び子宮内膜がんから選択される疾患に関する対象における婦人科疾患状態の決定において、ＥＯＣ、子宮内膜症及び子宮内膜がんの鑑別診断において、並びにＥＯＣ、子宮内膜症及び子宮内膜がんに関する診断、予測、又はモニタリングのいずれかの目的において、すべてを組み合わせて使用することができる。
【００６７】
以下の実施例に示したように、３つのバイオマーカーの組み合わせた使用は、ＥＯＣの子宮内膜症からの優れた識別を提供した。より詳細には、０．８９９、０．９４７及び０．９６７のＡＵＣ値が、非分類のＥＯＣ試料群（ｎ＝２１３）、ＥＯＣの初期ステージを表す血清試料群（ｎ＝４３）、及びＥＯＣの進行ステージを表す血清試料群（ｎ＝２９）でそれぞれ得られた。したがって、いくつかの実施形態において、同一の又は異なる試料を前記試料中のＣＡ１２５ＭＧＬ、ＣＡ１２５及びＨＥ４の濃度についてアッセイすることによる、対象におけるＥＯＣ疾患状態を決定する方法、例えば、前記対象におけるＥＯＣを診断、予測又はモニタリングする方法が提供される。このような方法においては、ＣＡ１２５ＭＧＬ、ＣＡ１２５及びＨＥ４の濃度の同時増加は、前記対象がＥＯＣに罹患しているか、又はＥＯＣに罹患するリスクがあることを示し得る。一方、ＣＡ１２５ＭＧＬ、ＣＡ１２５及びＨＥ４の濃度の同時非増加は、前記対象がＥＯＣに罹患していないか、又はＥＯＣに罹患するリスクがないことを示し得る。
【００６８】
いくつかのさらなる実施形態において、同一の又は異なる試料を前記試料中のＣＡ１２５ＭＧＬ、ＣＡ１２５及びＨＥ４の濃度についてアッセイすることによる、対象における子宮内膜症状態を決定する方法、例えば、前記対象における子宮内膜症を診断、予測又はモニタリングする方法が提供される。このような方法においては、ＣＡ１２５ＭＧＬ及びＨＥ４の濃度の同時非増加と組み合わされたＣＡ１２５の濃度の増加は、前記対象が子宮内膜症に罹患しているか、又は子宮内膜症に罹患するリスクがあることを示し得る。一方、ＣＡ１２５ＭＧＬ、ＣＡ１２５及びＨＥ４の濃度の同時非増加は、前記対象が子宮内膜症に罹患していないか、又は子宮内膜症に罹患するリスクがないことを示し得る。
【００６９】
また、いくつかのさらなる実施形態において、同一の又は異なる試料を前記試料中のＣＡ１２５ＭＧＬ、ＣＡ１２５及びＨＥ４の濃度についてアッセイすることによる、対象における子宮内膜がん状態を決定する方法、例えば、前記対象における子宮内膜がんを診断、予測、又はモニタリングする方法が提供される。このような方法においては、ＣＡ１２５ＭＧＬ及びＣＡ１２５の濃度の同時非増加と組み合わされたＨＥ４濃度の増加は、前記対象が子宮内膜症に罹患しているか、又は子宮内膜症に罹患するリスクがあることを示し得る。一方、ＣＡ１２５ＭＧＬ、ＣＡ１２５及びＨＥ４の濃度の同時非増加は、前記対象が子宮内膜がんに罹患していないか、又は子宮内膜がんに罹患するリスクがないことを示し得る。
【００７０】
さらに、本方法の様々な実施形態は、ＥＯＣ、子宮内膜症及び子宮内膜がんからなる群から選択される婦人科疾患と、限定するものではないが、結腸がん、潰瘍性大腸炎、過敏性大腸疾患、過敏性腸症候群及びクローン病を含む腹痛関連の他の疾患との鑑別診断に使用することができる。
【００７１】
上述のように、本方法は、いくつかの実施形態において、ＥＯＣ、子宮内膜症及び子宮内膜がんを含む婦人科疾患の診断に関し、すなわち、対象が前記婦人科疾患に罹患しているか、又は前記婦人科疾患のリスクがあるかどうかを決定することに関する。これはまた、婦人科疾患の存在又はリスクは最終的に決定されないが、さらなる診断検査が当然必要とされる場合を含むことを意味する。このような実施形態において、本方法は、それ自体、対象における婦人科疾患の存在若しくは非存在、又は婦人科疾患のリスクを決定するものではないが、さらなる診断検査が必要であるか、有益であることを示すことができる。したがって、本方法は、対象における婦人科疾患の存在若しくは非存在、又は婦人科疾患のリスクを最終決定する１つ又は複数の他の診断方法と組み合わせることができる。このような他の診断方法は、当業者には周知である。
【００７２】
非侵襲的であり、血清試料の分析に適切であるので、本方法及びその様々な実施形態は、ＥＯＣ、子宮内膜症若しくは子宮内膜がんに罹患しているか、又はＥＯＣ、子宮内膜症若しくは子宮内膜がんに罹患する、若しくは発症するリスクがある対象を同定するための集団スクリーニングプロトコルに容易に加えることができる。これにより、ＥＯＣ、子宮内膜症又は子宮内膜がんの初期診断が可能になるだけでなく、対象におけるＥＯＣ、子宮内膜症又は子宮内膜がんの発症に対して有効な監視が可能になり、その後の生活においてＥＯＣ、子宮内膜症又は子宮内膜がんを発症するリスクの増加が同定される。さらに、ＥＯＣ、子宮内膜症又は子宮内膜がんの早期検出によって、治癒のチャンスが最大である早期に、その疾患を処置することができるようになる。
【００７３】
本方法及びその様々な実施形態は、診断目的に使用することができるだけでなく、ＥＯＣ、子宮内膜症及び子宮内膜がんを含む婦人科疾患の予後若しくは転帰の予測、或いは前記婦人科疾患からの対象の回復若しくは生存、疾患の再発若しくは頻発の可能性、又は処置に対する応答のモニタリングに使用することができる。いくつかの実施形態において、本方法は、当該婦人科疾患の診断後の異なる時点で、及び／又は、例えば、当該婦人科疾患を緩和又は治癒するための手術、放射線療法、化学療法、他の適切な治療的処置又はそれらの任意の併用による治療的介入の前、途中及び後に、ＨＥ４及びＣＡ１２５の一方又は両方のレベルを同時に比較するかどうかにかかわらず、前記ＭＧＬ−ＮＰに結合するＣＡ１２５のレベルをＣＡ１２５ＭＧＬの量と比較することによって、前記対象における前記婦人科疾患状態をモニタリングすることを含む。他のいくつかの実施形態において、本方法は、前記ＭＧＬ−ＮＰに結合するＣＡ１２５のレベル若しくはＣＡ１２５ＭＧＬの量が対照よりも高い場合、又は所定の閾値を上回る場合、ＥＯＣの再発若しくは頻発がある、又はＥＯＣの再発若しくは頻発のリスクがあると、前記対象を決定することを含む。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているＥＯＣの診断、予測及び／又はモニタリングは、ＥＯＣの新規若しくは再発の徴候又は疑いがある「ＥＯＣ疾患状態を決定する」という表現によってすべて包含される。したがって、本方法は、前記対象から採取した試料中のＭＧＬ−ＮＰに結合するＣＡ１２５のレベル又はＣＡ１２５ＭＧＬのレベルをアッセイするステップと、ＭＧＬ−ＮＰに結合する前記ＣＡ１２５のレベル又は前記ＣＡ１２５ＭＧＬのレベルに基づいて前記対象におけるＥＯＣ疾患状態を決定するステップを含む、ＥＯＣへの罹患が疑われる対象におけるＥＯＣ疾患状態を決定する方法として策定することができる。言い換えると、ＥＯＣの罹患が疑われる対象又はＥＯＣのリスクがある対象におけるＥＯＣを診断、予測及び／又はモニタリングする方法は、前記対象から採取した試料中のＭＧＬ−ＮＰに結合するＣＡ１２５のレベル又はＣＡ１２５ＭＧＬのレベルをアッセイするステップと、前記ＭＧＬ−ＮＰに結合するＣＡ１２５のレベル又は前記ＣＡ１２５ＭＧＬのレベルに基づいて前記対象におけるＥＯＣを診断、予測及び／又はモニタリングするステップを含み得る。このような方法においては、関連する対照又は所定の閾値と比較した場合のＭＧＬ−ＮＰに結合するＣＡ１２５のレベルの増加又はＣＡ１２５ＭＧＬのレベルの増加は、ＥＯＣの存在、又はＥＯＣのリスクを示す。
【００７５】
分析しようとする試料中のＭＧＬ−ＮＰに結合するＣＡ１２５のレベル又はＣＡ１２５ＭＧＬのレベルと関連する対照のそれらのレベル又は所定の閾値との比較は、いくつかの実施形態において、コンピューター装置のプロセッサーによって実施することができる。コンピューター装置のプロセッサーが前記比較に使用されるかどうかに関わらず、ＭＧＬ−ＮＰに結合するＣＡ１２５のレベル又はＣＡ１２５ＭＧＬの量は、少なくともいくつかの実施形態において、試料中のＭＧＬ−ＮＰに結合するＣＡ１２５のレベル又はＣＡ１２５ＭＧＬの量が、例えば、所定の閾値、又は対照試料中のＭＧＬ−ＮＰに結合するＣＡ１２５のレベル又はＣＡ１２５ＭＧＬの量の少なくとも約１．５倍、１．７５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍若しくは３０倍である場合、「増加」又は「高い」と判定される。いくつかの実施形態において、分析しようとする試料中のＭＧＬ−ＮＰに結合するＣＡ１２５のレベル又はＣＡ１２５ＭＧＬの量と、所定の閾値又は対照試料中のＭＧＬ−ＮＰに結合するＣＡ１２５のレベル又はＣＡ１２５ＭＧＬの量との差異は、適切な診断結果、予測結果又は予見結果を提供するために統計的に有意でなければならない。ＨＥ４又はＣＡ１２５の濃度の「増加」濃度は、当業者には明らかなように、同様に定義され得る。
【００７６】
婦人科疾患状態を決定しようとする対象、又は婦人科疾患について診断、予測若しくはモニタリングしようとする対象から採取した試料中のＣＡ１２５ＭＧＬ、ＣＡ１２５又はＨＥ４の濃度は、関連する対照試料のそれらの濃度又は所定の閾値と比較した際に、検出したその濃度が低く、本質的に同じであるか、又は本質的に変化していなかった場合、「非増加」又は「正常」と考えられる。
【００７７】
いくつかの実施形態において、本方法は、ＥＯＣの早期診断、及びＥＯＣの再発、頻発及び進行の早期検出に特に好適である。同様に、ＣＡ１２５ＭＧＬは、ＥＯＣ並びにＥＯＣの再発、頻発及び／又は進行に関する早期腫瘍マーカーとして役立ち得る。したがって、本方法及びＣＡ１２５ＭＧＬは、診断、予測及びモニタリングの目的だけでなく、無症候性女性のＥＯＣ又はＥＯＣの発症リスクに関するスクリーニングにも使用することができる。
【００７８】
また本開示は、本方法及びその様々な実施形態において使用するためのキットを提供する。本キットは、ＣＡ１２５結合剤、例えば、モノクローナル抗ＣＡ１２５抗体又はメソセリン、及びＭＧＬが固定されたナノ粒子を含む。前記ＣＡ１２５結合剤又はＭＧＬ−ＮＰのいずれかは検出可能な標識を含み、マイクロタイタープレートなどの固相表面上に固定されていてもよい。また本方法の様々な詳細及び実施形態は、当業者には容易に理解されるように、本キットにも適用される。したがって、適切なナノ粒子の特性及び特徴は、例えば、本明細書では繰り返さない。
【００７９】
いくつかの実施形態において、前記抗ＣＡ１２５抗体は、マイクロタイタープレートなどの固相表面上に結合されている。いくつかのさらなる実施形態において、プレートのストレプトアビジンコーティング及び抗体のビオチン化が前記結合に使用される。同様のことを達成する代替方法は、当業者には容易に利用できる。
【００８０】
任意選択的に、本キットはまた、ＭＧＬ−ＮＰに結合するＣＡ１２５の測定値と比較するための対照を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、対照は、測定値と比較するための閾値である。
【００８１】
いくつかの実施形態において、本キットは、ＣＡ１２５及び／又はＨＥ４タンパク濃度をアッセイするための１つ又は複数の試薬をさらに含んでいてもよい。ＣＡ１２５タンパク濃度をアッセイするための典型的な試薬の非限定的な例としては、２つのＣＡ１２５結合剤、例えば、ＣＡ１２５中の異なるタンパク質エピトープに結合する２つのモノクローナル抗ＣＡ１２５抗体が挙げられる。ＣＡ１２５結合剤のうちの１つは、ＣＡ１２５ＭＧＬをアッセイするために提供されるＣＡ１２５結合剤と同一であってもよい。ＨＥ４タンパク濃度をアッセイするための典型的な試薬の非限定的な例としては、２つのＨＥ４結合剤、例えば、ＨＥ４中の異なるタンパク質エピトープに結合する２つのモノクローナル抗ＨＥ４抗体が挙げられる。２つのＣＡ１２５結合剤又はＨＥ４結合剤のうちの１つは固相表面上に固定化することができ、他方のＣＡ１２５結合剤又はＨＥ４結合剤は検出可能な標識を含んでいてもよい。
【００８２】
いくつかのさらなる実施形態において、本キットはまた、本開示のいずれかの方法も実施するためのコンピューター実行可能命令を含むコンピューター可読媒体を含んでいてもよい。
【００８３】
また、ＣＡ１２５ＭＧＬ、好ましくはＣＡ１２５及び／又はＨＥ４の濃度について試料をアッセイするための試薬を含有するキットの実施形態は、また他の任意のバイオマーカーについて、特にＥＯＣ、子宮内膜症又は子宮内膜がん以外の任意の疾患、例えば、他の婦人科疾患又は下腹部痛関連疾患に関連する１つ又は複数のバイオマーカーついて前記試料をアッセイするための試薬を含んでいてもよい。したがって、本キットは、ＥＯＣ、子宮内膜症及び／又は子宮内膜がんを診断、予測、又はモニタリングするために使用され得るだけでなく、例えば、濃度がアッセイされる１つ又は複数の他のバイオマーカーの特異性及び感度に応じて、他の婦人科疾患又は他の下腹部痛関連疾患を診断、予測、又はモニタリングするために使用することができる。
【００８４】
また、固定化ＭＧＬ（ＭＧＬ−ＮＰ）を含む本明細書に開示したナノ粒子；前記ＭＧＬ−ＮＰを含む組成物；対象における婦人科疾患、特にＥＰＣ、子宮内膜症及び子宮内膜がんからなる群から選択される婦人科疾患の状態を決定するためのＭＧＬ、前記ＭＧＬ−ＮＰ、又は前記組成物の使用；対象における婦人科疾患を診断、予測又はモニタリングするためのＭＧＬ、前記ＭＧＬ−ＮＰ又は前記組成物の使用；対象におけるＥＯＣを診断、予測又はモニタリングするためのＭＧＬ、前記ＭＧＬ−ＮＰ又は前記組成物の使用；対象における子宮内膜症を診断、予測又はモニタリングするためのＭＧＬ、前記ＭＧＬ−ＮＰ又は前記組成物の使用；対象における子宮内膜がんを診断、予測又はモニタリングするためのＭＧＬ、前記ＭＧＬ−ＮＰ又は前記組成物の使用；ＥＯＣ、子宮内膜症又は子宮内膜がんを鑑別診断するためのＭＧＬ、前記ＭＧＬ−ＮＰ又は前記組成物の使用；ＥＯＣ、子宮内膜症又は子宮内膜がんと、他の下腹部痛関連疾患、例えば、結腸がん、潰瘍性大腸炎、過敏性大腸疾患、過敏性腸症候群及びクローン病を識別するためのＭＧＬ、前記ＭＧＬ−ＮＰ又は前記組成物の使用も提供される。いくつかの実施形態において、ＭＧＬ、前記ＭＧＬ−ＮＰ又は前記組成物の前記使用は、所望の診断効果又は予測効果を達成するため、或いは当該疾患の発症、進行、再発若しくは頻発、又は処置に対する応答をモニタリングすることを可能にするためのＨＥ４及び／又はＣＡ１２５タンパク濃度を決定する試薬及び方法の併用を必要とし得る。本方法とその実施形態に関して開示したいずれの詳細及び施用は、たとえ、詳細及び適用が本明細書で繰り返されていなくとも、ＭＧＬ−ＮＰの様々な使用に適用される。
【００８５】
当業者には、技術の進歩とともに、本発明の概念が様々な方法で実施され得ることは明白であろう。本発明及びその実施形態は、下記に述べた実施例に限定されるものではなく、特許請求の範囲内で変更することができる。
【実施例】
【００８６】
例１：材料及び方法
ＣＡ１２５及び臨床試料の供給源
原発性卵巣癌腫（ＯｖＣａ）細胞系ＯＶＣＡＲ−３由来の精製ＣＡ１２５は、Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（スウェーデン）から入手した。本実験において、前記ＯＶＣＡＲ−３由来ＣＡ１２５抗原は、詳細に研究された唯一の抗原であるため（クローニング、グリコシル化、相互作用）、悪性ＣＡ１２５を表すために使用した。
【００８７】
すべての生体試料は、Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｄｉｓｔｒｉｃｔ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ  Ｆｉｎｌａｎｄの倫理指針に従い、適切な許可及びインフォームドコンセントのもとにフィンランドのＴｕｒｋｕ大学病理部によって提供された。
【００８８】
まず、正常な羊水及び胎盤ホモジェネート上清をＣＡ１２５の非悪性（すなわち正常）の供給源として使用した。その後、肝硬変患者（ＬＣ）及び未成熟奇形腫（ＥＯＣとは異なる生殖系卵巣がん；ＩＴ）の腹水を、ＣＡ１２５のさらなる供給源として含めた。各試料中のＣＡ１２５の含有量は、精製ＯＶＣＡＲ−３由来ＣＡ１２５を標準として使用する従来のＣＡ１２５イムノアッセイによって決定した。
【００８９】
表１に示したとおりの４つの臨床状態が異なる保存血清試料（ｎ＝４０１）も使用した。
【表１】
0006538887.tif 000002
【００９０】
抗ＣＡ１２５抗体
ＣＡ１２５の異なるタンパク質エピトープを検出する３つの異なるモノクローナル抗ＣＡ１２５抗体、すなわち、Ｏｖ１８５、Ｏｖ１９７及びＯｖＫ９５は、Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ヨーテボリ、スウェーデン）から入手した。
【００９１】
トレーサーとして使用するため、当技術分野で公知の標準プロトコルを使用して、抗体をＥｕ３＋キレートで標識した。
【００９２】
固相捕捉剤として使用するため、当技術分野で公知の標準手順を使用して、抗体を４０倍モル過剰のビオチンイソチオシアナートで室温（ＲＴ）にて４時間ビオチン化した。ビオチン化抗体は、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ及び０．５ｇ／ＬのＮａＮ３を含有する５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．７５）を使用することにより、ＮＡＰ−５及びＮＡＰ−１０ゲル濾過カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｃｈｅｎｅｃｔａｄｙ、ＮＹ、米国）で精製した。標識抗体は、１ｇ／ＬのＢＳＡ（Ｂｉｏｒｅｂａ、ニヨン、スイス）で安定化させ、＋４℃で保存した。
【００９３】
レクチン
植物レクチンのパネルはＶＥＣＴＯＲラボから購入し、２つのヒトレクチン、すなわちＭＧＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＶＵ大学メディカルセンター（アムステルダム、オランダ）からの提供をうけた。ＭＧＬの細胞外部分をＰＣＲによりｐＲｃ／ＣＭＶ−ＭＧＬ上で増幅させ、配列分析によって確認し、Ｓｉｇ−ｐｌｇＧ１−Ｆｃベクター中のヒトＩｇＧ１−ＦｃにＣ末端で融合させた。ＭＧＬ−Ｆｃは、ＣＨＯ細胞のトランジエントトランスフェクションによって産生された。本例において、ＭＧＬ−ＦｃはＭＧＬと呼称する。
【表２】
0006538887.tif 000003
【００９４】
レクチンは、Ｎ１ユーロピウムキレートで標識するか、又はＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｅｒａｄｙｎ  Ｉｎｃ．（インディアナポリス、インディアナ州）から入手したユーロピウムキレートドープされた、単分散のカルボキシル修飾Ｆｌｕｏｒｏ−Ｍａｘ（商標）ポリスチレンナノ粒子（直径１０７ｎｍ、カルボキシル含有量０．１５７ｍＥｑ／ｇ、パーキングエリア５６．６Å２）上に固定化した。使用したナノ粒子は、粒子当たり３０，０００キレート化イオンに相当する長持続時間の蛍光を生成する。
【００９５】
レクチンの一級アミノ基は、いくつかのマイナー変更を施した既に開示されている手順（Ｓｏｕｋｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，７３，２２５４−２２６０）を使用して、ナノ粒子の活性化カルボキシル基に共有結合させた。ナノ粒子（１ｅ１０１２粒子）を１０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、それらの表面を０．７５ｍｍｏｌ／ＬのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州、米国）及び１０ｍｍｏｌ／ＬのＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて活性化させた。カップリング反応におけるレクチンの濃度は０．６２５ｍｇ／ｍｌであり、その反応物は１００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含有していた。この活性化粒子をレクチンと混合した。カップリング反応は、＋２３℃で２時間、激しく振盪しながらインキュベートした。最終洗浄と残りの活性基のブロッキングは、Ｔｒｉｓベース緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ、０．５ｇ／Ｌ  ＮａＮ３、ｐＨ８．５）中で実施し、ナノ粒子−レクチンコンジュゲートを、４℃で２ｇ／Ｌ  ＢＳＡを補充した同一緩衝液中で保存した。最初に使用する前に、粒子を完全に混合し、超音波処理し、軽く遠心分離を行い（３５０ｇ、５分）、単分散懸濁液から非コロイド状凝集体を分離した。
【００９６】
ＣＡ１２５アッセイ
これらの実験で使用したＲｅｄアッセイ緩衝液、洗浄緩衝液、及びストレプトアビジンコーティング低蛍光マイクロタイタープレートは、Ｋａｉｖｏｇｅｎ  Ｏｙ（ツルク、フィンランド）から購入した。
【００９７】
ビオチン化固相抗体（２００ｎｇ）は、アッセイ緩衝液１００μＬ中でストレプトアビジンコーティングマイクロタイターウェル上に固定化した。室温にて９００ｒｐｍで振盪しながら１時間インキュベーションした後、ウェルを洗浄液で２回洗浄し、直ちにアッセイに使用した。
【００９８】
次に、５０μＬの希釈した試料（アッセイ緩衝液中１：５）を各ウェルに加え、振盪しながら室温で１時間インキュベートした。それによりウェル上に捕捉された異なる起源のＣＡ１２５抗原を、３つの異なるＥｕ３＋標識トレーサー、すなわち、ＣＡ１２５のタンパク質エピトープの検出に対してはＯｖ１８５−Ｅｕ３＋ｍＡｂ、及びＣＡ１２５のグリカンエピトープの検出に対しては様々なＥｕ３＋標識レクチン又はＥｕ３＋標識レクチン−ナノ粒子のいずれかを用いる、３つの異なる時間分解蛍光（ＴＲＦ）アッセイフォーマットに使用した。
【００９９】
従来のＣＡ１２５イムノアッセイにおいて固相捕捉ＣＡ１２５を検出するために（例２）、２５ｎｇのＯｖ１８５−Ｅｕ３＋ｍＡｂを含有するアッセイ緩衝液２００μＬを各ウェルに加え、振盪しながら室温で１時間インキュベートした。９００ｒｐｍで振盪しながら室温で１０分間増強溶液を加えた後、Ｖｉｃｔｏｒ３Ｖ  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌカウンターを使用して、ユーロピウムの時間分解蛍光を測定した（ｌｅｘ：３４０ｎｍ；ｌｅｍ：６１５ｎｍ）。
【０１００】
抗ＣＡ１２５抗体−レクチンサンドイッチアッセイにおいて固相捕捉ＣＡ１２５を検出するために（例３）、２５ｎｇのＥｕ＋３−レクチンを含有する２００μＬのアッセイ緩衝液を各ウェルに加え、振盪しながら室温で１時間インキュベートした。９００ｒｐｍで振盪しながら室温で１０分間増強溶液を加えた後、Ｖｉｃｔｏｒ３Ｖ  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌカウンターを使用して、ユーロピウムについての時間分解蛍光を測定した（ｌｅｘ：３４０ｎｍ；ｌｅｍ：６１５ｎｍ）。
【０１０１】
抗ＣＡ１２５抗体−レクチンナノ粒子サンドイッチアッセイにおいて固相捕捉ＣＡ１２５を検出するために（例４）、様々なレクチンでコーティングした５ｅ６  Ｅｕ３＋−ＮＰを含有するアッセイ緩衝液１００μＬを、ＣＬＲ（ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＭＧＬ）についてはさらなる６ｍＭのＣａＣｌ２と共に各ウェルに加え、振盪しながら室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを洗浄緩衝液で６回洗浄した。Ｖｉｃｔｏｒ３Ｖ  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌカウンターを使用して、乾燥ウェルからユーロピウムの時間分解蛍光を測定した（ｌｅｘ：３４０ｎｍ；ｌｅｍ：６１５ｎｍ）。
【０１０２】
臨床血清試料に対するＨＥ４アッセイ及びＣＡ１２５アッセイ
ヒト精巣上体タンパク質（ＨＥ４）及びＣＡ１２５タンパクの濃度を、製造業者の使用説明書に従い、ＥＬＩＳＡ分析（Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、モールヴァン、ペンシルベニア州、米国）により血清試料で分析した。
【０１０３】
例２：従来のＣＡ１２５イムノアッセイ
ビオチン化Ｏｖ１９７  ｍＡｂ（ストレプトアビジンプレート上のＣＡ１２５に対する捕捉抗体として）とＥｕ３＋標識Ｏｖ１８５  ｍＡｂ（トレーサー抗体として）の組み合わせを、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）時間分解蛍光（ＴＲＦ）イムノアッセイで使用した。使用したｍＡｂは、ＣＡ１２５上の異なるタンパク質エピトープを検出する。この従来のＣＡ１２５イムノアッセイの基本原理は図１Ａに示しており、一方、実験の詳細は例１に記載している。
【０１０４】
まず、３つの異なるＣＡ１２５含有試料、すなわち、ＯＶＣＡＲ−３由来精製ＣＡ１２５、羊水（ＡＦ）、及び胎盤ホモジェネート（Ｐｌａ）を上記のようにアッセイした。
【０１０５】
結果は、異なる起源のＣＡ１２５が、各試料中のＣＡ１２５タンパク質の量がほぼ同じであることを示すほぼ同じ正味シグナルを発することを示した（図２）。したがって、従来のＣＡ１２５イムノアッセイは、悪性ＣＡ１２５の正常ＣＡ１２５からの識別には使用することができない。
【０１０６】
次に、上記の結果を、ＣＡ１２５の別の起源のセットを用いて、より大きなダイナミックレンジにおいて確認した。この目的に向けて、４つの異なる起源のＣＡ１２５、すなわち、ＯＶＣＡＲ−３細胞系由来の癌性ＣＡ１２５、及び胎盤ホモジェネート（Ｐｌａ）由来の正常／良性ＣＡ１２５並びに肝硬変（ＬＣ）及び未成熟奇形腫（ＩＴ）の２つの腹水を、５〜１０００Ｕ／ｍｌの範囲の量で使用したＩＴ−ＣＡ１２５を除き、５〜２０００Ｕ／ｍｌの範囲の量でＯｖ１９７プレート上にアプライした。異なる起源のＣＡ１２５のＯｖ１９７に対する結合を検出するためのトレーサーとして、Ｏｖ１８５を使用した。これらの結果から、従来のＣＡ１２５イムノアッセイは、異なる起源のＣＡ１２５を相互識別に使用することができないことが確認された（図３）。
【０１０７】
例３：抗ＣＡ１２５抗体−レクチンサンドイッチアッセイ
これらの実験において、３つの異なる起源のＣＡ１２５を、ＴＳＡ−ＢＳＡ１％中１０〜１００Ｕ／ｍｌの範囲の量で使用した。ＣＡ１２５を、ビオチン化Ｏｖ１８５抗ＣＡ１２５抗体上で捕捉させた。Ｅｕ３＋標識植物レクチン及びヒトレクチンのパネルを、図１Ｂで図式的に示し、例１で詳細に述べたようなトレーサーとして使用した。ほとんどの反応は、極めて低い特異的シグナルに関して高いバックグラウンドを示した。
【０１０８】
図４は、使用したレクチンはいずれも、非悪性ＣＡ１２５とＥＯＣ由来ＣＡ１２５を識別することができなかったことを示す。最小バックグラウンドはＭＧＬで得られたが、ＣＡ１２５との反応からの正味シグナルは非常に弱かった。使用した各レクチンに対するバックグラウンドシグナルを下記の表３に示す。
【表３】
0006538887.tif 000004
【０１０９】
一方、ＡＡＬ（キノコのヒイロチャワンタケ由来のレクチン）は、羊水由来のＣＡ１２５と反応することができたが、癌性又は胎盤ＣＡ１２５とは反応することができなかった。子宮内膜症罹患患者の良性ＣＡ１２５の同定にＡＡＬを使用できるかどうかを試験するため、ＥＯＣ罹患患者から２つと子宮内膜症罹患患者から２つの計４つの臨床血清試料を用いた。図５に示すように、ＡＡＬは、ＥＯＣ由来ＣＡ１２５と子宮内膜症由来ＣＡ１２５との識別には使用することができない。捕捉抗体のＦａｂ画分を使用してバックグラウンドシグナルを減少させるよう試みたが、有意な改善は達成されなかった。
【０１１０】
例４：抗ＣＡ１２５抗体−レクチンナノ粒子サンドイッチアッセイ
レクチンの直接的Ｅｕキレート標識は、ＣＡ１２５の異なる起源間で識別しなかったので、機能的親和性（結合力効果）を改善するため、例１に述べたように、レクチンをＥｕ３＋ドープしたナノ粒子上に固定化した。特に、次のナノ粒子の２つの特徴が結果の改善の一因となることに注目した：１）１０７ｎｍ粒子における３０，０００キレートによって提供されるシグナル増幅、及び２）粒子上の高密度固定化レクチンによって提供される結合力効果によるそれらの標的エピトープへのレクチンの機能的親和性の強化。
【０１１１】
これらの実験では、４つの異なる起源のＣＡ１２５、すなわち、精製ＯＶＣＡＲ−３由来ＣＡ１２５（１５０９００Ｕ／ｍｌ）、胎盤ホモジェネート（Ｐｌａ）、肝硬変（ＬＣ）腹水、及び未成熟奇形腫（ＩＴ）腹水を使用した。次に、抗体−レクチンナノ粒子サンドイッチアッセイを使用して、ＴＳＡ−ＢＳＡにスパイクした全４種の異なる起源からのＣＡ１２５  ５〜１００Ｕ／ｍｌをアッセイした。ビオチン化Ｏｖ１８５  ｍＡｂを捕捉抗体として使用し、一方、数種類の異なる植物レクチン、すなわち、ＷＧＡ、ＷＦＡ、ＳＮＡ、ＰＨＡＥ、ＳＢＡ、ＡＡＬ、ＵＥＡ、ＭＡＡ、ＲＣＡ、ＰＳＡ、ＶＶＬ、ＴＪＡ若しくはＰＮＡ、又はヒトＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）、すなわちＭＧＬ及びＤＣ−ＳＩＧＮがロードされた、Ｅｕキレートドーブナノ粒子をトレーサーとして使用した。
【０１１２】
図６に示したように、ヒトレクチンＭＧＬナノ粒子だけが、ＥＯＣ由来ＣＡ１２５に対する特異性の増加を示した。ＥＯＣ由来ＣＡ１２５での正味シグナルは、胎盤ホモジェネート由来ＣＡ１２５（Ｐｌａ−ＣＡ１２５）でのシグナルよりも１０倍〜１２倍高かった。肝硬変由来ＣＡ１２５（ＬＣ−ＣＡ１２５）、及び未成熟奇形腫由来ＣＡ１２５（ＩＴ−ＣＡ１２５）での正味シグナルは、非常に低かった。使用した各レクチンに関するバックグラウンドシグナルを下記の表４に示す。
【表４】
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【０１１３】
ＷＧＡは、ＬＣ−１２５及びＩＴ−ＣＡ１２５での正味シグナルがＥＯＣ由来ＣＡ１２５又は胎盤ＣＡ１２５でのシグナルよりも４倍多いことを示し、一方、ＳＮＡ、ＰＨＡ−Ｅ、ＰＮＡ、ＶＶＬ及びＤＣ−ＳＩＧＮは、胎盤ＣＡ１２５でのみ反応性を示した（図６）。これらの結果は、これらのレクチンがいずれもＥＯＣ関連ＣＡ１２５と正常又は良性ＣＡ１２５の識別に適していないことを示唆している。
【０１１４】
次に、３つの抗ＣＡ１２５  ｍＡｂｓ（Ｏｖ１８５、Ｏｖ１９７及びＯｖＫ９５）のすべてをＭＧＬナノ粒子アッセイにおけるＣＡ１２５の捕捉剤として比較した。Ｏｖ１８５は、正味シグナルが最高であり、ＯｖＣａ由来ＣＡ１２５抗原と正常／良性ＣＡ１２５抗原の間の極めて良好な識別を示すシグナル／バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）比をもたらした。分析的検出限界は、ＯｖＣａ由来ＣＡ１２５について＜５Ｕ／ｍｌ未満であると推測された（図７）。
【０１１５】
非常に高濃度のＣＡ１２５がＭＧＬ−ＮＰアッセイで使用された場合であっても、フック効果は観察されなかった（図８）。これは、分析しようとする試料中の非常に高濃度のＣＡ１２５のせいで、本方法により偽陰性結果が得られることがないことを示す、重要な結果である。
【０１１６】
例５：抗ＣＡ１２５抗体−レクチンナノ粒子サンドイッチアッセイに対する血液試料の適合性
単一基質／緩衝液（ＴＳＡ−ＢＳＡ  １％）における本ＭＧＬ−Ｆｃ  ＮＰアッセイを用いてＯｖＣａ由来ＣＡ１２５を他の起源のＣＡ１２５から良好に分離した後、ヒト血清／血漿のような複合基質における同様の回収値を決定した。この目的において、異なる起源由来のＣＡ１２５の５〜１００Ｕ／ｍｌを、健常男性のプールした血漿中又は単一緩衝液（ＴＳＡ−ＢＳＡ  １％）中のいずれかで並行してスパイクさせ、ストレプトアビジンマイクロタイタープレート上のビオチン化Ｏｖ１８５  ｍＡｂで捕捉させ、洗浄後、最後に、ＭＧＬ−Ｆｃ  ＮＰで追跡し回収率を確認した。ほぼ９５〜１１０％の優れた回収率が達成され、固有の血漿成分が本ＭＧＬ−Ｆｃナノ粒子アッセイに干渉しないことが示された（図９）。
【０１１７】
例６：臨床試料の分析
ＯＶＡＣＡＲ−３細胞系ベースのＣＡ１２５抗原で得られた結果を臨床状況に置き換えることができるか否かを試験するため、臨床試料の小さなコホートを、本ＭＧＬ−ＮＰアッセイ及び従来のＣＡ１２５イムノアッセイで並行して分析した。コホートには、ＥＯＣ罹患の患者（ｎ＝１２）及び健常妊婦（ｎ＝２）の血清試料、並びに子宮内膜症罹患の患者（ｎ＝２）のプールした血清試料が含まれていた。２種の方法で得られたシグナル比は、臨床のＥＯＣ試料が、実際に、臨床の子宮内膜症試料と識別され得ることを明示した（図１０）。
【０１１８】
大きなコホートにおける結果を検証し、ＣＡ１２５ＭＧＬの診断力を従来のＣＡ１２５タンパク質マーカー及びＨＥ４と比較するために、いくつかの保存臨床血清試料（ｎ＝４０１）を使用した。ＨＥ４、ＣＡ１２５タンパク質及びＣＡ１２５ＭＧＬの血清濃度を、６８名の卵巣がん患者の２１３の経時的試料で評価し、１２１名の子宮内膜症患者、１６名の子宮内膜がん患者及び対照としての５１名の健常女性で得られた結果と比較した（表１）。すべてのＥＯＣ症例は疾患の進行ステージかのものであったが、３２の個別のＥＯＣ症例からの４３血清試料は、疾患の進行／再発ステージに属していた。これらの進行／再発血清試料（ｎ＝４３）は、疾患の初期ステージの近似と考えられ、したがって、実施した分析のいくつかにおいて臨床試料の個別の群として処理した。
【０１１９】
ボックスプロット分析
臨床試料５つの異なる群（健常対照ｎ＝５１、子宮内膜症ステージ１〜２  ｎ＝３３、子宮内膜症ステージ３〜４  ｎ＝８８、ＥＯＣ進行／再発症例ｎ＝４３、及び子宮内膜がんｎ＝１６）のそれらのＨＥ４タンパク質含有量、ＣＡ１２５タンパク質含有量（従来）及びＣＡ１２５ＭＧＬグリコフォーム含有量に関するボックスプロット分析を図１１Ａから図１１Ｃに示す。結果によれば、ＨＥ４含有量はＥＯＣ群において高く、また程度は低いが子宮内膜がんの群においても同様であった。従来のＣＡ１２５タンパク質含有量は、健常対照及び子宮内膜がんの群と比べ、ＥＯＣ進行／再発群で高かったが、ＣＡ１２５タンパク質含有量は子宮内膜症ステージ３〜４の群とオーバーラップしていた。次に、ＣＡ１２５ＭＧＬ含有量は、他のすべての群と比べ、ＥＯＣ進行／再発群においてのみ高かった。これらの結果を総合すると、試験したマーカーのうち、ＣＡ１２５ＭＧＬだけが、臨床ＥＯＣ症例と別の症例群の識別に都合よく使用することができることが示唆される。
【０１２０】
別の一連のボックスプロット分析において、健常個体（ｎ＝５１）、並びに子宮内膜症（ｎ＝１２１）及び高悪性度漿液性ＥＯＣ患者（ｎ＝２１）からの血清試料の分析にＣＡ１２５ＭＧＬアッセイを適用し、それらを従来のＣＡ１２５イムノアッセイ値と比較した。健常対照、子宮内膜症患者及びＥＯＣ患者の血清試料中の術前ＣＡ１２５中央値は、それぞれ６．４、２４．９及び７００Ｕ／ｍｌであり（図１２Ａ）、健常対照と比べ、子宮内膜症及びＥＯＣの両方で濃度が有意に高いことが明らかである。対照的に、術前ＣＡ１２５ＭＧＬ中央値（図１２Ｂ）は、健常対照（０．４８６Ｕ／ｍｌ）と子宮内膜症患者（０．８４１Ｕ／ｍｌ；ｐ＝０．０７３）の間では有意な差はなかった。ＥＯＣ群では、ＣＡ１２５ＭＧＬ中央値は３７．９３Ｕ／ｍｌであり、子宮内膜症よりも４５倍高かった。さらに、従来のＣＡ１２５イムノアッセイ及びＣＡ１２５ＭＧＬアッセイによる悪性状態と良性状態の識別を評価するため、ＣＡ１２５値が限界値（３５〜２００Ｕ／ｍｌ）である子宮内膜症患者（ｎ＝４４）及びＥＯＣ患者（ｎ＝３８）からの血清試料を試験した（図１２Ｃ及び図１２Ｄ）。図１２Ｄから明らかなように、ＣＡ１２５ＭＧＬアッセイは、子宮内膜症患者で測定したものと比べ、ＥＯＣ血清試料で有意に高いレベルを提供した（６．１倍、ｐ値＜０．００１）。一方、健常対照と子宮内膜症患者の差は有意に低かった。従来のアッセイでは８．３倍（ｐ＜０．００１）差が認められたが、ＣＡ１２５ＭＧＬアッセイでは２．５倍差で有意に達した（ｐ＝０．００５）。
【０１２１】
ＲＯＣ曲線分析及びＡＵＣ分析
すべての経時的ＥＯＣ症例（ｎ＝２１３）、進行／再発ＥＯＣ症例（ｎ＝４３）、又は進行期術前ＥＯＣ症例（ｎ＝２９）のいずれかから子宮内膜症（ｎ＝１２１）を識別するためのＲＯＣ曲線分析を、ＨＥ４、ＣＡ１２５及びＣＡ１２５ＭＧＬに関して、単独又は組み合わせのいずれかで実施した。ＲＯＣ曲線を図１３Ａ〜図１３Ｃに示す。一方、得られたＡＵＣ値を以下にまとめる。
【表５】
0006538887.tif 000006
【表６】
0006538887.tif 000007
【表７】
0006538887.tif 000008
【０１２２】
最初の２つの分析においては、ＨＥ４に対するＡＵＣ値は、ＨＥ４での子宮内膜症において偽陽性が無視できるレベルであったので（ＦＰ＝２．５％）、ＣＡ１２５又はＣＡ１２５ＭＧＬに対するＡＵＣ値よりも高かった。子宮内膜症におけるＣＡ１２５及びＣＡ１２５ＭＧＬに関する対応ＦＰ値は、それぞれ３７．２％及び７．４％である。
【０１２３】
術前血清試料、すなわち、ＥＯＣの進行ステージを表す試料に関する最後の分析では、ＣＡ１２５に対するＡＵＣ値が最も高かった。この結果は、特に進行したＥＯＣでのＣＡ１２５の既知の診断値と一致する。
【０１２４】
各ＡＵＣ分析において、３つのマーカーすべての組み合わせを用いて得られたＡＵＣ値は、個々のいずれかのマーカーの値よりも高かった。
【０１２５】
成功率の評価
単独又はペア化組み合わせいずれかにおけるマーカーＨＥ４、ＣＡ１２５及びＣＡ１２５ＭＧＬの成功率を、進行／再発症例の疾患群（ｎ＝３２、進行／再発の各個別患者からの第１の経時的試料）に関して決定した。各血清試料は、次のカットオフ値：ＣＡ１２５については３５ＩＵ／ｍｌ、ＨＥ４については７０ｐＭ、ＣＡ１２５ＭＧＬについては２ＩＵ／ｍｌを使用して、各マーカーについて陰性又は陽性のいずれかに分類した。
【表８】
0006538887.tif 000009
【０１２６】
これらの結果は、罹患個体として初期ＥＯＣ症例を同定するためのＣＡ１２５ＭＧＬの成功率が７１．９％から８１．２％に改善され、ＣＡ１２５とＨＥ４を組み合わせて使用した場合にはさらに９３．７％までそれぞれ改善され得ることを示唆している。
【０１２７】
長期的分析
疾患進行下のＥＯＣ症例（ｎ＝２９）からの経時的血清試料中のＨＥ４、ＣＡ１２５及びＣＡ１２５ＭＧＬの相対的濃度変化（濃度／カットオフ）を決定した。患者は全員、手術及び化学療法により播種性疾患が処置されており、疾患進行について監視下にあった。患者は全員、ＣＡ１２５値の低下と放射線学的応答基準の両方によって判断される有意な初期処置応答を有していたが、経過観察中に疾患進行の確認を経験した。陽性レベルが低い試料は含まれたが、高い術前／初期処置段階は分析から除外した。ＨＥ４、ＣＡ１２５及びＣＡ１２５ＭＧＬを使用したカットオフ値は、それぞれ、７０ｐＭ、３５Ｕ／ｍｌ及び２Ｕ／ｍｌであった。
【０１２８】
結果からは、症例の６９％（２０／２９）において、ＣＡ１２５ＭＧＬのレベルが、疾患の進行と同時に他の２つのマーカーよりも著しく増加したことが明らかであった。さらに、ＣＡ１２５ＭＧＬは、症例の３１％（９／２９）において、ＨＥ４及びＣＡ１２５よりも早期に増加を示した。したがって、ＣＡ１２５ＭＧＬを使用してＥＯＣ処置している患者をモニタリングする場合、臨床医は、再発可能性を非常に早く警告することができる。ＥＯＣ進行時又は進行直前に採取した試料中のＣＡ１２５ＭＧＬの中央濃度は７．９７Ｕ／ｍｌであった。実施した長期的分析のいくつかの例を図１４に示す。
【０１２９】
例７：ＣＡ１２５ＭＧＬの血清レベルに対するホルモン状態の影響
ＣＡ１２５及びＨＥ４について以前分析された閉経前の健常女性及び子宮内膜症女性の血清試料（Ｈａｌｌａｍａａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，２０１２，１２５：６６７−６７２）を、今回、本ＭＧＬ−ＮＰアッセイによりＣＡ１２５ＭＧＬについてアッセイした。結果は、ＣＡ１２５ＭＧＬアッセイ及びＨＥ４アッセイの両方は、月経周期のいずれの期でも、またホルモン薬剤の投与を問わず、結果を歪めることなく実施することができることを示している（それぞれ、図１５Ａ及び図１５Ｃ）。この知見は、臨床診療におけるこれら２つのマーカーの適用可能性を拡大する。一方、従来のＣＡ１２５アッセイは、月経周期の異なるステージ間で有意な差を示した（図１５Ｂ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0006538887.tif 000019
【図１１Ａ】
0006538887.tif 000020
【図１１Ｂ】
0006538887.tif 000021
【図１１Ｃ】
0006538887.tif 000022
【図１２Ａ】
0006538887.tif 000023
【図１２Ｂ】
0006538887.tif 000024
【図１２Ｃ】
0006538887.tif 000025
【図１２Ｄ】
0006538887.tif 000026
【図１３Ａ】
0006538887.tif 000027
【図１３Ｂ】
0006538887.tif 000028
【図１３Ｃ】
0006538887.tif 000029
【図１４−１】
0006538887.tif 000030
【図１４−２】
0006538887.tif 000031
【図１４−３】
0006538887.tif 000032
【図１５Ａ】
0006538887.tif 000033
【図１５Ｂ】
0006538887.tif 000034
【図１５Ｃ】
0006538887.tif 000035