(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＧＦ−βによって刺激を受けた幹細胞の馴化培地を有効成分として備え、
前記幹細胞は、臍帯血に由来する間充織幹細胞である、
脱毛防止および発毛促進のための組成物。
【請求項２】
前記ＴＧＦ−βによって刺激を受けた前記馴化培地は、
Ｗｎｔ３ａ、Ｐ−ＧＳＫ３β、Ｄｅｐ−ｐ−β−ｃａｔｅｎｉｎ、β−ｃａｔｅｎｉｎ、ＣｙｃｌｉｎＤ−１、Ｂｃｌ−２、Ｂａｘからなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質を含む、
請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＴＧＦ−βによって刺激を受けた前記馴化培地は、前記組成物に対し、１０％〜５０％の最終濃度を有する、
請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＴＧＦ−βによって刺激を受けた前記馴化培地は、
（ｉ）毛周期の間の休止期から成長期への転換時間を短縮し、
（ｉｉ）真皮乳頭細胞を発生させ、毛髪の長さの伸長を促進し、
（ｉｉｉ）毛包の数および大きさを増大させる、
作用を有する、
請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物は、医薬組成物または化粧品組成物である、
請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は、注射または塗布のためのものである、
請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
ＴＧＦ−βで幹細胞を刺激する段階によって、
脱毛を防止し、発毛を促進する幹細胞の馴化培地を製造する方法であって、
前記幹細胞は、臍帯血に由来する間充織幹細胞である、
方法。
【請求項８】
前記ＴＧＦ−βによって刺激を受けた前記馴化培地は、
Ｗｎｔ３ａ、Ｐ−ＧＳＫ３β、Ｄｅｐ−ｐ−β−ｃａｔｅｎｉｎ、β−ｃａｔｅｎｉｎ、ＣｙｃｌｉｎＤ−１、Ｂｃｌ−２、Ｂａｘからなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質を含む、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＴＧＦ−βによって刺激を受けた前記馴化培地は、
前記ＴＧＦ−βを前記幹細胞に加えた後で前記幹細胞を２２から２６時間刺激し、
その後、１日間から３日間までの選択された期間培養することで得られる、
請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記馴化培地を、１０％〜５０％の濃度まで希釈する段階をさらに含む、
請求項７から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴＧＦ−βによって刺激を受けた前記馴化培地は、
（ｉ）毛周期の間の休止期から成長期への転換時間を短縮し、
（ｉｉ）真皮乳頭細胞を発生させ、毛髪の長さの伸長を促進し、
（ｉｉｉ）毛包の数および大きさを増大させる、
作用を有する、
請求項７から１０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、参照によって開示の全体が本明細書に組み込まれる、２０１４年７月７日に申請された米国特許出願第６２／０２１，３６６号の優先権および利益を主張する。
【０００２】
本発明は、ＴＧＦ−βを含む特定の退行期誘導因子によって刺激を受けた幹細胞の馴化培地を有効成分として含む、脱毛を防止し、発毛を促進するための組成物と、それを製造するための方法と、それらの使用法とに関する。
【背景技術】
【０００３】
産業の発展、環境汚染、ストレス、加齢の進行に伴い、脱毛症の症状、抜け毛の症状は、より深刻になっている。また、健康の時代の到来と共に、生活の質および容貌に関する関心が増大まっている。頭皮からの脱毛を症状とする脱毛症は、例えば、遺伝形質および男性ホルモンの作用などの内因子、日常生活での精神的ストレス、脂質過酸化反応の蓄積などの外因子を含む、様々な原因によって引き起こされ、脱毛症の症状は、非常に複雑なプロセスによって引き起こされることが知られている。脱毛症とは、毛髪が失われ、二度と成長しないことを意味するのではなく、毛髪が次第に細くなり産毛となること、および、毛根に存在する真皮乳頭が小さくなることを意味する。真皮乳頭が小さくなるにつれて、毛髪の太さも細くなり、毛周期が短くなって、それにより新しく成長する毛髪が薄くなる。脱毛が継続的に進行するにつれて、毛髪は産毛となり、毛周期は短くなり、それにより、短い間成長した後で毛髪が失われる。さらに、自己免疫疾患であることが知られている円形脱毛、および、内分泌疾患、栄養不足、薬物、分娩などの身体または精神ストレスに起因して発生する一時的脱毛症も懸念されてきた。
【０００４】
近年、男性型脱毛症だけでなく、女性の肥満性脱毛症、および、若年性脱毛症も徐々に増加している。韓国のＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ｐｏｌｉｃｙ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｕｒａｎｃｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅによる２００９年の発表によると、２００８年における国内の脱毛症患者の数は、２００１年と比較して、少なくとも６０％増加した。さらに、子供および成人の脱毛症患者の数は、２００６年の２１，６４３人から２０１１年の２３，０２５人まで増加し、５年間で約６．４％増えたことが示されている。
【０００５】
上述の脱毛現象を治癒するべく、多くの種類の発毛剤およびヘアトニックが市販されてきた。Ｅｃｏｎｏｍｙ２１の報告によると、韓国における脱毛関連サービスの国内市場の中で、化粧品および医薬部外品が８０％を占め、医薬品が約２０％を占め、それらの中で、医者にかかる脱毛症患者はわずか５％を占めるに過ぎない。現在、発毛関連製品を使用する人の中で、約７２．７％のユーザはそれらの製品に満足しておらず、１９９８年、すなわち約１５年前に発表された、アメリカ食品医薬品局による承認済みの２つの製剤、ミノキシジル（登録商標）およびフィナステリド（登録商標）を除き、脱毛症処置のための立証済みの治療法は存在しない。従って、これら２つの製剤は、様々な脱毛関連の症状すべてを治療するのに不十分である。特に、フィナステリド製剤として調製されたプロペシア（登録商標）は、発毛剤ではなく、脱毛防止剤である。プロペシア（登録商標）は、５α-レダクターゼをブロックすることで、ＤＨＴ生産の抑制を通して、男性型脱毛症の進行を最大限に遅延させる効果のみを有する。
【０００６】
現在市販されている発毛剤およびヘアトニック（例えば、ミノキシジル（登録商標）およびフィナステリド（登録商標））の場合、薬剤は、ホルモン製剤の適用に起因する副作用を引き起こし得るか、または、毛根が活動している領域のみで効果を示す。従って、薬剤は脱毛の防止に関する効果を有するが、長期的な休止期にある毛髪の成長（すなわち発毛）に対する効果は無視できるほど小さいか、または、継続的に投与または適用された場合のみ効果を示し得るので、従って、脱毛症や抜け毛の症状を解決するための費用効果的かつ安定的な技術を開発する必要がある。韓国における脱毛症治療薬の研究開発の水準は、先進国と比較して技術的に遅れており、脱毛の防止、発毛の促進、および、毛髪再生のための治療薬の研究開発に対する緊急の必要性が存在する。韓国における脱毛症に関する研究については、発毛および毛根の再生に関する報告書が１９５０年から発表されているが、毛髪再生は過去５０年間、再現性の欠如などに起因して、不可能と見なされてきた。
【０００７】
しかしながら、米国ペンシルベニア大学医学部のＣｏｓｔａｒｅｌｉｓ教授は、１９９０年に、毛包幹細胞を最初に発見し（Ｃｅｌｌ，１９９０）、ヒト毛包幹細胞の分離に成功し（Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ，  ２００６）、そのときまで再現性は不可能であると考えられてきた毛包の再生の可能性に関する研究結果を発表し（Ｎａｔｕｒｅ，  ２００７）、脱毛の根本的な処置を研究する可能性を切り開いた。
【０００８】
近年、遺伝子および幹細胞を使用する脱毛症処置の方法が開発されている。本発明の基礎として、韓国特許出願第１０−０７７１１７１号（２００７年１０月２９日）は、単離の方法、毛包幹細胞の増殖および分化、ならびに、脱毛のための治療用組成物について記載している。韓国特許出願公開第１０−２００８−００９７５９３号（２００８年１１月６日）は、ヒト脂肪組織および毛包細胞に由来する多分化能幹細胞を有する細胞治療薬について記載している。さらに、韓国特許出願第１０−１２１８１０１号（２０１３年１月３日）は、有効成分として、羊水からの胎児由来間充織幹細胞の馴化培地を有する、発毛を促進し、脱毛症を防止するための組成物について記載している。
【０００９】
しかしながら、幹細胞を使用する上述の薬剤が発毛に及ぼす効果は不十分であるため、従って、脱毛症を処置するための有効な治療薬を開発するべく、幹細胞を使用する様々な試みが行われてきた。
【００１０】
これに関して、本発明者は、臍帯血に由来する間充織幹細胞の発毛に対する効果を特定することを試みる過程で、脱毛症を引き起こす物質として知られているＴＧＦ−βを臍帯血の幹細胞に処置することにより、過去の見解とは反対に、発毛に有効なタンパク質が分泌することを発見し、また、ＴＧＦ−βで刺激を受けた幹細胞を培養することにより得られた馴化培地は、過去に知られていた事例より遥かに優れた発毛促進効果を示すことを確認し、それにより本発明を完成させた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
１．韓国特許出願第１０−０７７１１７１（２００７年１０月２９日）
２．韓国特許出願第１０−１４２２５５９（２０１４年７月１７日）
３．韓国特許出願公開第１０−２０１３−０００９１１７（２０１３年１月２３日）
４．韓国特許出願公開第１０−２０１４−０１２５７３５（２０１４年１０月２９日）
５．韓国特許出願公開第１０−２００８−００９７５９３（２００８年１１月６日）
６．韓国特許出願第１０−１２１８１０１（２０１３年１月３日）
【非特許文献】
【００１２】
１．Dong L, Hao H, Xia L, Liu J, Ti D, Tong C, Hou Q, Han Q, Zhao Y, Liu H, Fu X, Han W; Treatment of MSCs with Wnt1a-conditioned medium activates DP cells and promotes hair follicle regrowth.; Sci Rep. 2014 Jun 25;4:5432. doi: 10.1038/srep05432.
２．Park BS, Kim WS, Choi JS, Kim HK, Won JH, Ohkubo F, Fukuoka H.; Hair growth stimulated by conditioned medium of adipose-derived stem cells is enhanced by hypoxia: evidence of increased growth factor secretion. ; Biomed Res. 2010 Feb; 31(1):27-34.
３．Jeong YM, Sung YK, Kim WK, Kim JH, Kwack MH, Yoon I, Kim DD, Sung JH.; Ultraviolet B preconditioning enhances the hair growth-promoting effects of adipose-derived stem cells via generation of reactive oxygen species.; Stem Cells Dev. 2013 Jan 1;22(1):158-68. doi: 10.1089/scd.2012.0167. Epub 2012 Aug 13.
【００１３】
本発明の明細書全体にわたって、多くの参考文献および特許文書が言及されており、それらの引用は適宜示される。引用された参考文献および特許文書の開示の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれ、それにより、本発明が関連する技術分野の水準、および、本発明の開示の内容が、より明確に説明される。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、特定の毛髪退行期誘導因子によって刺激を受けた幹細胞の馴化培地を利用する。当該因子は、幹細胞を刺激することにより、毛髪組織分化に関連するシグナル伝達タンパク質を分泌させる。本発明の主な目的は、特定の毛髪退行期誘導因子によって刺激された幹細胞の馴化培地を含む、脱毛症を防止し、発毛を促進するための組成物を提供することである。本発明の別の目的は、当該組成物を使用して、脱毛を防止し発毛を促進するための方法を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに別の目的は、当該組成物を効果的に使用する方法を提供することである。
【００１６】
上述の目的を達成するべく、本発明は、ＴＧＦ−βを含む特定の毛髪退行期誘導因子で幹細胞を刺激することによる、毛髪組織分化に関連するシグナル伝達タンパク質の分泌を介した、非常に有効な発毛作用を利用する様々な使用法を提供する。
【００１７】
例示的な実施形態において、本発明は、有効成分として、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＦＧＦ−５、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、Ｋ１７、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＢＤＮＦ、およびＢＭＰ２／４からなる群から選択される少なくとも１つの毛髪退行期誘導因子で刺激を受けた幹細胞の馴化培地を有する、脱毛を防止して発毛を促進するための組成物を提供する。望ましくは、本発明はＴＧＦ−βを含む少なくとも１つの因子によって刺激を受けた馴化培地を提供する。
【００１８】
脱毛を防止し発毛を促進する効果が達成されるのは、毛髪退行期誘導因子によって刺激を受けた幹細胞は、毛髪組織分化と関連するシグナル伝達タンパク質として知られているＷｎｔ３ａ、Ｂｃｌ−２、ＣｙｃｌｉｎＤ−１などを分泌する効果を付与されるからである。
【００１９】
より具体的には、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＦＧＦ−５、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、Ｋ１７、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＢＤＮＦ、およびＢＭＰ２／４からなる群から選択された少なくとも１つの毛髪退行期誘導因子によって刺激を受けた馴化培地は、（ｉ）毛周期の間の休止期から成長期までの転換時間を短縮する、（ｉｉ）真皮乳頭細胞を生成し、長さの伸長を促進する、（ｉｉｉ）毛包の数および大きさを増大させる、（ｉｖ）頭皮の皮膚の厚さを増大させる、という作用を有する。
【００２０】
幹細胞は特に、骨髄、臍帯血、脂肪、血液、肝臓および腸、皮膚、消化管、胎盤、神経、副腎、上皮、ならびに子宮に由来するヒト組織成体幹細胞と、胚性幹細胞とからなる群から少なくとも１つ選択され得る。望ましくは、幹細胞は、骨髄、臍帯血、または脂肪に由来し、さらに望ましくは、成体幹細胞は、臍帯血（例えば、臍帯血に由来する間葉細胞）に由来し得る。さらに、使用される臍帯血は、ヒトに由来するものであることが望ましい。
【００２１】
毛髪退行期誘導因子によって刺激を受けた幹細胞の馴化培地は、望ましくは最終濃度が１０％から３０％であり、さらに望ましくは、最終濃度が２５％である。
【００２２】
さらに、使用される馴化培地は、動物細胞の成長に適切な何らかの基礎培地であり得、培地の非限定的な例には、最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）、角化細胞用培地（ＫＭ）、ＫＢＭ（角化細胞用基礎培地）、ＥｐｉＬｉｆｅ  ＫＭ（角化細胞用ＥｐｉＬｉｆｅ培地）などが含まれ得て、望ましくは、ＫＭ（角化細胞用培地）、ＫＢＭ（角化細胞用基礎培地）、ＥｐｉＬｉｆｅ  ＫＭ（角化細胞用ＥｐｉＬｉｆｅ培地）である。  特に、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＦＧＦ−５、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、Ｋ１７、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＢＤＮＦ、ＢＭＰ２／４などからなる群から選択される毛髪退行期誘導因子によって刺激を受けた幹細胞の馴化培地は、毛髪退行期誘導因子を幹細胞に加えた後、幹細胞を２２〜２６時間刺激して、その後、１日間から３日間までの選択された期間培養することで得られ得る。より具体的な例は、本発明の実施例を参照できる。
【００２３】
本発明において、幹細胞の培養中にＴＧＦ−βを含む毛髪退行期誘導因子によって刺激を受けた幹細胞は、毛髪組織分化に関連するシグナル伝達タンパク質であることが知られているＷｎｔ３ａ、Ｂｃｌ−２、ＣｙｃｌｉｎＤ−１などを分泌し、本発明の幹細胞の馴化培地は、Ｗｎｔ３ａ、Ｂｃｌ−２、ＣｙｃｌｉｎＤ−１からなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質を馴化培地が含むことを特徴とする。
【００２４】
本発明の組成物は、医薬組成物または化粧品組成物の形態で調製および提供され得る。
【００２５】
一方、別の例示的な実施形態において、本発明は、上で説明されたように、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＦＧＦ−５、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、Ｋ１７、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＢＤＮＦ、およびＢＭＰ２／４からなる群から選択された毛髪退行期誘導因子によって刺激を受けた幹細胞の馴化培地を含む、脱毛を防止し発毛を促進する組成物の望ましい使用方法を提供し得る。
【００２６】
さらに、本発明は、発毛の促進による脱毛症処置の方法を提供し得る。当該方法は、有効成分として毛髪退行期誘導因子によって刺激を受けた幹細胞の馴化培地を含む発毛促進組成物を利用する。
【００２７】
本発明の方法において、望ましくは、局所的な塗布または注射による経皮投与が使用され得て、局所的な塗布がより望ましい。
【００２８】
このように、本発明は、臍帯血に由来する幹細胞に、脱毛誘導物質として知られているＴＧＦ−β、ＢＭＰａなどの毛髪退行期誘導因子、より望ましくは、ＴＧＦ−βを含む薬剤を処置することで、発毛に有効なタンパク質が分泌され得るという事実の発見に基づく。このことは、従来の見解と反対であり、本発明は、刺激を受けた幹細胞の馴化培地の優れた脱毛防止および発毛効果、および、その様々な使用方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
本発明の上記および他の特性および利点は、添付の図面を参照して、それらの例示的な実施形態を詳細に記載することによって、より明らかになるであろう。
【図１Ａ】様々な供給源に由来する、ＴＧＦ−βによる刺激を受けた幹細胞の馴化培地で処置したｈＤＰＣの細胞増殖の評価結果、および対照群を示すグラフの１つである。
【図１Ｂ】様々な供給源に由来する、ＴＧＦ−βによる刺激を受けた幹細胞の馴化培地で処置したｈＤＰＣの細胞増殖の評価結果、および対照群を示すグラフの１つである。
【図２】ＴＧＦ−βによる刺激を受けた幹細胞の馴化培地に含まれる、毛髪組織分化と関連するシグナル伝達系関連タンパク質の発現量を確認するためのウエスタンブロットの結果である。
【図３Ａ】ＴＧＦ−βによって刺激を受けた幹細胞の馴化培地で処置した後、および対照群の真皮乳頭（ＤＰ）細胞の長さの伸長を確認した結果の１つである。
【図３Ｂ】ＴＧＦ−βによって刺激を受けた幹細胞の馴化培地で処置した後、および対照群の真皮乳頭（ＤＰ）細胞の長さの伸長を確認した結果の１つである。
【図４Ａ】ＴＧＦ−βによって刺激を受けた幹細胞の馴化培地で処置した後、および対照群の毛包形成の数に関するグラフである。
【図４Ｂ】ＴＧＦ−βによって刺激を受けた幹細胞の馴化培地で処置した後、および対照群の毛包形成の数に関する実体顕微鏡写真である。
【図５】ＴＧＦ−βによって刺激を受けた、ＵＣＢ（臍帯血）に由来する幹細胞の馴化培地でＣＨ３マウスを３週間塗布した後、および対照群の発毛特性を確認した写真である。
【図６】ＴＧＦ−βによって刺激を受けた、脂肪および骨髄に由来する幹細胞の馴化培地でＣＨ３マウスを４週間（２８日間）塗布した後、および対照群の発毛特性を確認した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以後、添付図面を参照して、望ましい実施形態がより詳細に記載される。加えて、本発明の焦点を不必要に曖昧にしないように、広く知られた作用または構成の詳細な説明は省略される。本発明において使用される用語は、本明細書で以下に記載されるように定義され得る。「発毛促進」および「脱毛防止」は、似た意味を持つ用語であり、それらは、当技術分野における、毛髪の形成および発毛を促進する効果、ならびに、脱毛または毛髪の弱体化を防止する効果すべてを指す。
【００３１】
本明細書で使用される、「幹細胞」という用語は、いかなる組織にも成長できる細胞を指す。幹細胞の２つの基本的な特性は、分裂を繰り返すことで自分と同じ細胞を生成できる自己複製能、および、環境に応じて特定の役割を有する細胞へと分化できる多分化能である。
【００３２】
本明細書で使用される「間充織幹細胞」という用語は、ヒトまたは哺乳類から単離された未分化成体幹細胞の一種を指し、様々な組織に由来し得る。成体幹細胞の中で、造血幹細胞は、主に非接着状態で存在するが、間充織幹細胞は通常、接着細胞である。特に、間充織幹細胞は、臍帯由来の間充織幹細胞、臍帯血由来の間充織幹細胞、骨髄由来の間充織幹細胞、脂肪由来の間充織幹細胞、筋肉由来の間充織幹細胞、神経由来の間充織幹細胞、皮膚由来の間充織幹細胞、羊膜由来の間充織幹細胞、胎盤由来の間充織幹細胞であり得て、望ましくは臍帯血由来の間充織幹細胞である。幹細胞を各組織から単離する技術は、当技術分野ですでに公知である。
【００３３】
本明細書で使用される、「馴化培地」という用語は、幹細胞を培養することで得られる培地に含まれる構成成分を有する物質を指し、上記の馴化培地を調製するための幹細胞は、その種類に関して限定されない。例えば、馴化培地を調製するための幹細胞は、胚性幹細胞、または、成体幹細胞であり得る。さらに、成体幹細胞は、すべての組織の成体幹細胞に由来し得る。本発明の例示的な実施形態において、馴化培地は、臍帯血由来の成体幹細胞を使用して調製された。幹細胞は望ましくは、それにＴＧＦ−βを加えて２２〜２６時間刺激し、その後、１日間から３日間までの選択された期間培養することによって得られた。
【００３４】
本明細書で使用される「分化」という用語は、細胞分裂を通して、細胞成長の間に細胞の構造または機能が特殊化する、すなわち、それに割り当てられた役割を実行できるように、生物の細胞または組織の形状または機能が次第に変化する、細胞内の現象を指す。この用語は一般的に、比較的単純な系が、性質の異なる２またはより多くの部分的な系へと分かれる現象を指す。
【００３５】
本明細書で使用される、細胞の「増殖」または「成長」という用語は、細胞分裂を通して、同一の性質を有する細胞が増加することを指し、通常、多細胞生物の体における細胞数の増加を指す。増殖（増幅）の後で、細胞数が特定の段階に到達すると、細胞の形質は、変化（分化）させつつ制御されるようになる。
【００３６】
本明細書で使用される「培地」という用語は、アミノ酸、様々な栄養物質、血清、成長因子、無機物質など、細胞の成長および増殖に必須である要素を含む、細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの成長および増殖に必要な混合物を指す。特に、本発明の培地は、幹細胞の成長および増殖のための培地である。
【００３７】
本明細書で使用される「基礎培地」という用語は、血清、栄養物質、および様々な成長因子を除く、細胞の生存に必要な糖類、アミノ酸、水などを含む混合物を指す。本発明の基礎培地は、人工合成を通した調製後に使用され得るか、または、市販の培地を購入することで使用され得る。市販の培地には、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、内皮分化培地（ＥＤＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、α−最小必須培地（α−ＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ−ＭＥＭ）、イスコフ改変ダルベッコ培地が含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
本明細書で使用される「処置」という用語は、有利な、または望ましい臨床結果を得ることを目的とする手段を指す。本発明において、有利な、または望ましい臨床結果には、非限定的な例として、症状の軽減、疾患の範囲の減少、病状の安定化（すなわち悪化しない）、疾患の進行の遅延または減少、病状の（部分的または全体的な）改善または一時的な軽減および寛解、および、検出可能もしくは検出不可能な存在も含まれる。「処置」という用語は、治療的処置および予防的処置の両方の方法を指す。処置には、予防可能な障害だけでなく、すでに発生している障害に必要な処置も含まれる。「緩和」という用語は、処置なしの症例と比較して、病状の範囲、および／または、望ましくない臨床症候が減少すること、および／または、進行の時間経過が延長または拡大することを指す。
【００３９】
本明細書で使用される、「有効量」という用語は、有利または望ましい臨床的または生化学的結果に影響を与え得る適切な量を指す。有効量は、１回、または複数回投与され得る。有効量は、病状の進行を一時的に軽減、改善、安定化、回復、鈍化、または遅延させるのに適切な量である。本発明において、有効量は脱毛の進行を緩和または遅延する、または、発毛を促進するのに必要な量を指す。恩恵を得る動物が組成物の投与に耐えられる場合、または、投与が動物に適切である場合、当該組成物は、「薬学的または生理学的に許容される」と見なされる。投与量が生理学的に重要である場合、製剤は「治療有効量」で投与されたと見なされ得る。製剤の存在自体が、利益を受ける患者の数において、生理学的に検出可能な変化を引き起こした場合、当該製剤は、生理学的に意義があると見なされる。
【００４０】
本明細書で使用される、「約」という用語は、量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、大きさ、重量、または長さに関して、変化の程度が３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％である、量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、大きさ、重量、または長さを指す。
【００４１】
本発明の明細書において、文脈上必要である場合を除き、「含む」および「含み」という用語は、示唆される段階もしくは成分、または、段階もしくは成分の群を含むが、他の任意の段階もしくは成分、または、段階もしくは成分の群を除外しないものとして解釈される必要がある。本発明は、本明細書の以下において詳細に記載される。
【００４２】
本発明は、特定の因子で処置された幹細胞の馴化培地の特定の作用、すなわち、脱毛防止および発毛促進の作用、ならびにその使用方法に関する。
【００４３】
有意な脱毛の防止および発毛の促進のための毛髪退行期誘導因子として使用され得る因子は、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＦＧＦ−５、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、Ｋ１７、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＢＤＮＦ、ＢＭＰ２／４などからなる群から選択される少なくとも１つであり、もっとも望ましくは、ＴＧＦ−βを含むものである。
【００４４】
幹細胞とは、自己複製、および、２またはより多くの細胞への分化が可能な細胞であり、由来する供給源に応じて、胚性幹細胞または成体幹細胞を使用し得る。本発明において、使用される幹細胞は、例えば、脂肪、子宮、骨髄、筋肉、胎盤、臍帯血、または、皮膚（上皮）に由来する組織など、様々な起始組織に由来する成体幹細胞であり得る。特に、間充織幹細胞（ＭＳＣ）が望ましい。間充織幹細胞は一般的に、造血を助ける間質であり、様々な中胚葉細胞へと分化でき、未分化状態を維持しながら容易に増殖する。例示的な実施形態において、脂肪、骨髄、臍帯血に由来する間充織幹細胞（ＭＳＣ）が使用された。もっとも望ましくは、臍帯血に由来する間充織幹細胞が使用される。
【００４５】
臍帯血は、臍帯に由来する血液を指し、白血球、赤血球、血小板などを生産する大量の造血幹細胞、および、内皮前駆細胞を含み、また、軟骨、骨、筋肉、神経などを生産する間充織幹細胞を含み、従って高い薬効上の価値を有する血液を指す。臍帯血の特性は、造血幹細胞の数が、骨髄または末梢血と比較して、臍帯血中より高い濃度で存在するという点だけでなく、臍帯血は、骨髄内で見られる造血幹細胞より、増殖、自己複製、および分化の能力が有意に高いという点である。さらに、臍帯血は、単純な外科手術で破棄される臍帯から得られ、その量にしては比較的多くの量の造血幹細胞および幹細胞を含む。従って、望ましい実施形態において、本発明はヒト臍帯血由来の間充織幹細胞（ｈＵＣＢ−ＭＳＣ）を使用する。
【００４６】
特に、臍帯血由来の間充織幹細胞は、（ｉ）細胞治療薬として使用される場合に、他の組織に由来する幹細胞と異なり、免疫学的拒絶をほぼ示さず、（ｉｉ）破棄される胎盤および臍帯から採取されるので、幹細胞を得る被験者に苦痛を与えず、（ｉｉｉ）適用された場合に、疾患のある領域への直接的な適用が可能である。特に、実際の標的領域に移植される場合に、パラクリン効果が活性化され、その結果、疾患のある領域を治療、再生、または回復することができるセクレトーム因子（タンパク質、サイトカイン）が活性化され、その結果、疾患が治るという利点がある。
【００４７】
臍帯血から採取された間充織幹細胞を単離および培養するのに使用される方法は、当技術分野で公知である任意の方法であり得（Ｐｉｔｔｉｎｇｅｒ  ＭＦ，  Ｍａｃｋａｙ  ＡＭ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８４：１４３−７，  １９９９；  Ｌａｚａｒｕｓ  ＨＭ，  Ｈａｙｎｅｓｗｏｒｔｈ  ＳＥ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，  １６：５５７−６４，  １９９５）、例えば、韓国特許出願第１０−０４９４２６５号で開示されている方法を含む従来の方法すべてが使用され得る。本発明の一実施形態において、以下の方法が使用され得る。
【００４８】
単核球は、採取された臍帯血から遠心分離によって分離され、不純物を除去するべく数回洗浄される。その後、単核球は、適切な密度で培養容器に植え付けることによって培養され、当該細胞は、単層を形成しながら増殖できる。ここで、位相差顕微鏡で観察するとき、長い均一の紡錘形のコロニー形状で増殖する細胞が間充織幹細胞である。細胞が成長してコンフルエントになると、次に、適切な数の細胞が得られるまで、細胞を継代培養し、増殖させた。
【００４９】
特に本発明は、幹細胞が望ましくは特定の毛髪退行期誘導因子によって処置されることで刺激を受けるという点で特徴がある。退行期誘導因子は、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＦＧＦ−５、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、Ｋ１７、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＢＤＮＦ、およびＢＭＰ２／４からなる群から選択される少なくとも１つの因子を含み、もっとも望ましくはＴＧＦ−βである。
【００５０】
処置のための毛髪退行期誘導因子の濃度は、細胞体積に関して８〜１５ｎｇ／ｍＬであり、望ましくは８〜１２ｎｇ／ｍＬであり、もっとも望ましくは、９〜１１ｎｇ／ｍＬである。本発明の例示的な実施形態において、細胞コンフルエンスが８０％、またはそれより高いと判定されたときに、細胞は約１０ｎｇ／ｍＬの毛髪退行期誘導因子で処置された。
【００５１】
ＴＧＦ−βは、様々な作用を有するサイトカインであり、細胞質に存在する転写因子であるＳｍａｄｓを通したＴＧＦ−β関連遺伝子の発現制御による細胞の成長および分化、炎症反応、細胞のアポトーシス、細胞のマトリックス合成に密接な関連があることが知られている物質であり、毛包細胞の壊死に関与していることが報告されている。
【００５２】
脱毛の最大の原因は、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）と呼ばれるホルモンが、テストステロン、および、５α−レダクターゼと呼ばれる還元酵素と結合し、通常の毛髪細胞にＤＨＴが入り、核のＤＮＡ細胞破壊シグナルを発し、その結果、毛包が小さくなるか破壊され、脱毛につながる。特に、毛包細胞アポトーシス因子は、毛髪細胞のＤＮＡ破壊シグナルによって周囲の毛包細胞を攻撃し、それにより、脱毛につながる。毛包の壊死因子の例には、ＢＭＰ、ＤＫＫ−１、およびＴＧＦ−βが含まれる（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ２００６，Ｊ．Ａｎａｔ．２００３）。つまり、ＴＧＦ−β、またはＢＭＰなどは、脱毛を誘導することが知られている物質である。
【００５３】
したがって、脱毛の防止および発毛の促進の効果のためにこれらの物質で幹細胞を処置することは、当業者が容易に考え付くことができない技術であり、また、本発明の重要な特性を構成する特徴でもある。
【００５４】
本発明者は最初に、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＦＧＦ−５、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、Ｋ１７、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＢＤＮＦ、およびＢＭＰ２／４からなる群から選択される少なくとも１つの毛髪退行期誘導因子で処置することによって幹細胞を刺激することで、発毛に有効な物質が分泌されることを確認した。
【００５５】
これらの因子で刺激を受けた幹細胞は、毛髪組織分化に関連するシグナル伝達タンパク質として知られるＷｎｔ３ａ、Ｂｃｌ−２、ＣｙｃｌｉｎＤ−１などを分泌し、脱毛の防止および発毛の促進の作用は、これらのタンパク質によってさらに改善され得る。
【００５６】
従って、本発明において、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＦＧＦ−５、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、Ｋ１７、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＢＤＮＦ、ＢＭＰ２／４からなる群から選択される少なくとも１つの毛髪退行期誘導因子によって刺激を受けた幹細胞の馴化培地は、Ｗｎｔ３ａ、Ｂｃｌ−２、ＣｙｃｌｉｎＤ−１からなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質を含む。
【００５７】
望ましい実施形態では、例えば、ＴＧＦ−βなどの毛髪退行期誘導因子を加えることで、幹細胞の馴化培地を２２〜２６時間刺激し、もっとも望ましくは、幹細胞に約２４時間刺激を与える。刺激を受けた幹細胞は、１日間から３日間の選択された期間培養することが望ましい。代表的な調製方法は、本発明の実施例を参照できる。
【００５８】
従って、別の例示的な実施形態において、本発明は、毛髪退行期誘導因子で幹細胞を刺激することによる、脱毛を防止し、発毛を促進するための、幹細胞の馴化培地を調製する方法を含む。幹細胞の馴化培地の最終濃度は、望ましくは約１０％〜５０％であり、より望ましくは約１０％〜３０％であり、より一層望ましくは約２０％〜３０％であり、もっとも望ましくは約２５％である。
【００５９】
特に、本発明に係る幹細胞は、当技術分野で公知の方法によって増殖され、培養され得る。
【００６０】
適切な培地として、動物細胞を培養するのに必要な、またはそのために開発された適切な成分と共に実験室で調製され得る、任意の使用可能な培地が使用され得る。特に哺乳類細胞においては、例えば、同化のための炭素、窒素、および／または、微量の栄養素が使用され得る。
【００６１】
培地は、非限定的な例として、動物細胞の成長に適切な任意の基礎培地であり、培養で一般的に使用される基礎培地には、最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）、および、角化細胞用培地（ＫＭ）が含まれてよく、当技術分野で使用される任意の培地が制限なく使用され得る。望ましくは、この培地は、α−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）、ＫＭ（角化細胞用培地）、ＫＢＭ（角化細胞用基礎培地）、ＥｐｉＬｉｆｅ  ＫＭ（角化細胞用ＥｐｉＬｉｆｅ培地）培地、ＤＭＥＭ培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ）、ＭＣＤＢ１３１培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ）、ＩＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＰＣＭ培地、Ｍ１９９／Ｆ１２（混合物）（ＧＩＢＣＯ）、およびＭＳＣ増殖培地（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）からなる群から選択され得る。
【００６２】
基礎培地に対して、同化供給源である炭素、窒素、および、微量の栄養素が加えられ得て、非限定的な例として、血清供給源、成長因子、アミノ酸、抗生物質、ビタミン、還元剤、および／または糖類供給源などが挙げられる。しかしながら、当業者が、様々な組織起源由来の幹細胞にとってもっとも適切な培地を選択するか組み合わせ、既知の方法に従って適切に培養することは明らかである。本発明の一実施形態において、α−ＭＥＭ培地、Ｋ−ＳＦＭ培地などが使用された。
【００６３】
さらに、当技術分野における従来の知識に基づいて、培養環境、時間、温度などの条件を制御しながら幹細胞が培養され得ることは明らかである。
【００６４】
例示的な実施形態において、細胞コンフルエンスが約８０〜９０％、望ましくは約９０％になるまで、間充織幹細胞はα−ＭＥＭ培地内で培養され、例えば、間充織幹細胞はＰＢＳなどを使用して洗浄され、次に、Ｋ−ＳＦＭ培地内でさらに約２０〜２５時間、望ましくは２４時間培養される。
【００６５】
本明細書で使用される「コンフルエンス（％）」という用語は、当技術分野で通常使用されている面積あたりの細胞濃度（飽和度）を表す用語であり、実験において、当業者によって頻繁に使用される、単位面積あたりの細胞数（細胞濃度）を相対的に表す単位である。本発明はまた、大きさが８μｍまたはより小さいこれらの幹細胞、および、その馴化培地を調製する方法を含む。
【００６６】
一方、本方法は、本発明に係る培地で培養された幹細胞をトリプシンで処置する段階をさらに含む。
【００６７】
培養された幹細胞がトリプシンで処置されると、単核球の形状の幹細胞が得られる。特に、細胞間の凝集を抑制するべく、トリプシンが処置され、それにより、単一の細胞の形状が得られる。また、細胞間の凝集の形成を抑制できる任意の物質が使用され得る。
【００６８】
幹細胞の培養は、技術分野で従来から公知である容器を使用して実施され得る。例えば、幹細胞は、３次元バイオリアクターまたはスピナーを使用して、または一般的な接着性容器内で培養され得る。
【００６９】
本発明は、脱毛の防止および発毛の促進の極めて優れた効果を有し、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＦＧＦ−５、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、Ｋ１７、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＢＤＮＦ、ＢＭＰ２／４からなる群から選択される少なくとも１つの毛髪退行期誘導因子によって刺激を受ける、馴化培地の使用に関する。
【００７０】
特に、これらの因子によって刺激を受けた幹細胞の馴化培地には、毛髪組織分化に関連するシグナル伝達タンパク質であることが知られているＷｎｔ３ａ、Ｂｃｌ−２、ＣｙｃｌｉｎＤ−１などが含まれ、従って、これらは脱毛の症状を単純に遅延させる効果だけでなく、実際の真皮乳頭細胞の発生、長さの伸長の促進、毛包の数および大きさの増加、頭皮の厚さの増大などの効果による、発毛の効果、すなわち、毛髪の形成および成長の効果も有する。
【００７１】
これまで使用されてきた、脱毛の原因であるＤＨＴを減少させるのに使用される薬剤の例には、フィナステリドを使用して調製されるプロペシア（登録商標）が含まれる。しかしながら、当該薬剤の主な機序は、当該薬物が５−αレダクターゼの作用を抑制することによってＤＨＴを減少させ、それにより、脱毛を治癒することである。プロペシア（登録商標）は、５−αレダクターゼをブロックすることで、ＤＨＴの形成を抑制し、それにより、男性型脱毛の進行を最大限に遅延させる効果だけを有する。従って、プロペシア（登録商標）は男性用の治療薬であり、発毛を促進するための薬剤ではなく、脱毛を防止するための薬剤でしかないというという制限を有する。
【００７２】
しかしながら、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＦＧＦ−５、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、Ｋ１７、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＢＤＮＦ、ＢＭＰ２／４からなる群から選択された少なくとも１つの毛髪退行期誘導因子、もっとも望ましくは、ＴＧＦ−βを含む誘導因子によって刺激を受けた幹細胞の馴化培地は、脱毛を防止するための薬剤であると同時に、発毛を促進する優れた薬剤であるという利点を有する。
【００７３】
本明細書の以下において、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＦＧＦ−５、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、Ｋ１７、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＢＤＮＦ、ＢＭＰ２／４からなる群から選択された少なくとも１つの毛髪退行期誘導因子によって刺激を受けた幹細胞の馴化培地の脱毛防止および発毛の特性が記載される。
（ｉ）毛周期の間の休止期から成長期への転換時間を短縮する。
【００７４】
成長期、退行期、休止期を周期的に繰り返している間に、ヒトの毛髪は失われ、次に再び形成され、毛周期はホルモンの制御または多くの成長因子の制御によって確立される。真皮乳頭細胞は、成長が活性化する成長期、衰退が開始する退行期、および休止期からなるサイクルを有する。休止期の後、周囲の細胞からシグナルを受け取ると、真皮乳頭細胞は成長期に入り、細胞の再生が確立され、最終的に、新しい毛髪の形成につながる。誘導因子によって刺激を受けた本発明の馴化培地は、ホルモンなどによる一時的な効果を持たないが、毛周期の制御を正常化することによる長期的な発毛効果を有する。（ｉｉ）真皮乳頭（ＤＰ）細胞を発生させ、長さの伸長を促進し、毛包の数および大きさを有意に増加させる。
【００７５】
毛包は、哺乳類のみが保有する皮膚の副器官であり、胎児期より発生し、上皮と間充組織との間の相互作用によって形成される。
【００７６】
胎児期における毛包の発生は、真皮からのシグナルによって開始され、その結果、上皮は厚くなり、プレートを形成する。厚い上皮プレートから出る真皮シグナルは、間充組織に由来する真皮細胞の凝集を誘導し、このように形成された凝集体から、真皮シグナルが再び出てくる。このシグナルは、真皮細胞の増殖を促進し、同時に上皮細胞の真皮への侵入を誘導し、それにより、凝集体の周囲を包み、その後、真皮乳頭を形成する。このように、第１毛包構造が形成され、そして、上皮細胞が増殖および分化を継続するにつれて、毛髪を形成する成熟した毛包へと成長する。成熟した毛包における基底膜を通した毛包のマトリックス細胞と真皮乳頭細胞との間の相互作用は、毛包のマトリックス細胞の特定の分化を引き起こし、その結果、毛髪を形成し、成長させる。さらに、その相互作用は、毛包のサイクルを発生させ、器官を維持し、毛髪の濃さおよび形状など生物学的特性を決定する。
【００７７】
毛包において、生物学的特性を決定する２つの重要な因子は、毛包上皮である外毛根鞘（ＯＲＳ）、および、間充組織由来の真皮乳頭（ＤＰ）であり、毛髪は毛周期を繰り返す過程で成長し、失われる。
【００７８】
本発明の一実施形態において、ｈＤＰＣ、ＯＲＳ、ｈＫＣ、ＨａＣａＴ細胞を使用する、ＴＧＦ−βによって刺激を受けた幹細胞の馴化培地は、真皮乳頭（ＤＰ）細胞を効果的に増殖させることが確認された。
【００７９】
さらに、動物実験から、一次ＤＰ細胞の毛包の長さの促進、毛包形成の促進、発毛の速度、および量は、非常に優れていることが確認された。（ｉｉｉ）頭皮の皮膚の厚さを増大させる。
【００８０】
さらに、上述の因子によって刺激を受けた幹細胞の馴化培地は、皮膚の厚さおよび長さも効果的に増大させることができ、それにより、発毛に関連する全体的な環境を改善する。
【００８１】
このように、脱毛誘導物質として知られているが特にＴＧＦ−β、ＢＭＰなど毛髪退行期誘導因子を幹細胞に処置することにより、発毛に有効なタンパク質が分泌されるという新たな事実に基づき、本発明は、発毛に必要な全体的な環境を改善する効果を示す。
【００８２】
本発明の一実施形態において、マウスを使用したｉｎ  ｖｉｖｏ実験、ならびに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ実験を通して、臍帯血由来幹細胞の馴化培地が、極めて優れた発毛効果を示すことが確認された。
【００８３】
発毛の可能性を観察することができるｉｎ  ｖｉｖｏ実験の例として、通常の発毛サイクルのマウスにおける休止期の短縮、および、急激な成長期の誘導の効果を確認することがあり得る。特に、Ｃ５７／ＢＬ６マウスまたはＣ３Ｈマウスは、メラニン色素を有する毛髪の観察を可能にするので、これらのマウスが通常使用され得る。発毛および毛包の増殖を可能にするＤＰの増殖の観察を可能にするヌードマウスが使用される。本発明において、当技術分野で公知である、発毛効果の確認に使用される任意のマウスが使用され得る。
【００８４】
しかしながら、Ｃ３Ｈマウスを使用することが望ましい。休止期が約２週間である通常のマウスと異なり、Ｃ３Ｈマウスは休止期を少なくとも４週間維持するので、円形脱毛症マウスモデルとして、より有用である。つまり、発毛効果の優位性は、Ｃ３Ｈマウスの毛周期を成長期へと誘導する効果を確認することによって評価され得る。
【００８５】
従って、一態様において、本発明は、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＦＧＦ−５、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、Ｋ１７、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＢＤＮＦ、ＢＭＰ２／４からなる群から選択された少なくとも１つの毛髪退行期誘導因子、もっとも望ましくは、ＴＧＦ−βを含む誘導因子で刺激を受けた幹細胞の馴化培地を有効成分として含む、発毛促進のための組成物、それを調製するための方法、ならびに、それを使用して脱毛を防止し発毛を促進するための方法に関する。
【００８６】
この組成物は、いかなる細胞毒性も示さない１０％〜５０％（ｖ／ｖ）の有効濃度、望ましくは、２０％〜３０％（ｖ／ｖ）、もっとも望ましくは、２５％（ｖ／ｖ）の有効濃度で含まれ得るが、これらに限定されない。
【００８７】
本発明の一実施形態において、本発明の組成物は、医薬組成物および／または化粧品組成物を含み得る。  
［医薬組成物］
【００８８】
別の態様において、本発明は、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＦＧＦ−５、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、Ｋ１７、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＢＤＮＦ、ＢＭＰ２／４からなる群から選択される少なくとも１つの毛髪退行期誘導因子、もっとも望ましくは、ＴＧＦ−βを含む誘導因子によって刺激を受けた幹細胞の馴化培地を有効成分として含む、発毛を促進するための医薬組成物を提供し得る。
【００８９】
脱毛は、瘢痕性脱毛、および、非瘢痕性脱毛に大きく分けられ、非瘢痕性脱毛は、先天的脱毛、男性型脱毛、円形脱毛などを含む。本発明において、脱毛は上記すべてを含むが、また、これらに限定されない。
【００９０】
本発明の医薬組成物に含まれる、薬学的に許容される担体は通常、製造者によって通常使用される担体であり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、およびミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物はさらに、上記の成分に加え、潤滑剤、湿潤剤、甘味料、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを含み得る。
【００９１】
本発明の医薬組成物の適切な用量は、製剤方法、投与方法、患者の年齢、体重、性別、疾患の重症度、食品、投与期間、投与経路、放出速度、および反応感度を含む様々な要素によって異なり得て、熟練した医師は、目的とする処置に有効な用量を容易に決定し、処方することができる。一方、本発明の医薬組成物の用量は、これらに限定されず、１日あたり０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２０００ｍｇ／ｋｇ（体重）であり得る。
【００９２】
本発明の医薬組成物は、経口的または非経口的に投与され得る。非経口的に投与される場合、医薬組成物は、静脈注射、皮下注射、筋肉注射、腹腔内注射、および経皮投与を介して投与され得る。望ましくは、医薬組成物は非経口的に投与される。望ましくは、本発明の医薬組成物の投与経路は、疾患の種類に従って決定され得る。
【００９３】
例えば、本発明の医薬組成物は、局所的に投与するように皮膚に適用されることがより望ましい。本発明の医薬組成物を適用する領域は、頭皮だけでなく、発毛を必要とする、体の任意の部分を含む。例えば、怪我に起因する傷跡により、毛髪または他の体毛が破損している領域、または、広い前額部もしくはＭ字形の前額部、睫毛もしくは眉毛、および無毛など、美容の効果を必要とする領域で改善のために使用され得る。
【００９４】
望ましくは、本発明の組成物は、塗布または注射を介して、より望ましくは、塗布を介して、経皮投与により投与され得る。塗布投与を使用する場合、本発明は、単純に組成物を頭皮に１回〜３回塗布することで、脱毛の防止および発毛の促進の有意な効果を示す。 
【００９５】
特に、注射を介して投与する場合、組成物が皮膚の真皮層に十分拡散した後で毛細血管内に送られるように、すなわち、組成物が真皮層に短時間留まった後で即時に真皮層内に入ることを防止するべく、注射器の針の先端の開口部を上に向けながら、組成物を真皮層に注射することが推奨される。  
［化粧品組成物］
【００９６】
さらに別の態様において、本発明は、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＦＧＦ−５、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、Ｋ１７、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＢＤＮＦ、およびＢＭＰ２／４からなる群から選択された少なくとも１つの毛髪退行期誘導因子、もっとも望ましくは、ＴＧＦ−βを含む誘導因子で刺激を受けた幹細胞の馴化培地を有効成分として含む、発毛促進のための化粧品組成物に関する。
【００９７】
本発明の化粧品組成物は、当技術分野で通常製造される任意の剤形で調製され得る。例えば、化粧品組成物は、乳液、クリーム、化粧水、パック、ファンデーション、ローション、美容液、毛髪化粧品などに剤形化され得るが、これらに限定されない。
【００９８】
望ましくは、化粧品組成物は、通常の添加剤を加えることで、発毛促進のためのシャンプー、ヘアヘアリンス、ヘアトニック、ヘアジェル、ヘアローション、ヘアパック、ヘアスプレー、ヘアムース、ヘアトリートメント、染毛剤、ヘアコンディショナー、例えばシャンプーとヘアリンスとの混合型およびヘアリンスとトリートメントとの混合型などの混合型、発毛などのための液状剤などの組成物として調製され得て、これらのエアロゾル型が含まれ得る。
【００９９】
剤形タイプがペースト、クリーム、またはジェルである場合、担体の成分は、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルク、または酸化亜鉛などがあり得る。剤形タイプが粉末またはスプレーである場合、担体の成分は、ラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムまたはポリアミド粉末であり得て、特に、スプレーの場合、クロロフルオロハイドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのようなプロペラントが含まれ得る。剤形タイプが液体またはエマルジョンである場合、担体の成分は、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、またはソルビタンの脂肪酸エステルなどの溶剤、可溶化剤、または乳化剤があり得る。剤形タイプが懸濁液である場合、担体の成分は、例えば、水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液相の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステルおよびポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁液、微結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天、またはトラガカントなどがあり得る。剤形タイプが界面活性剤を含むクレンジングである場合、担体の成分は、脂肪族アルコール硫酸、脂肪族アルコールエーテル硫酸、スルホンコハク酸モノエステル、イセチオン酸、イミダゾニウム誘導体、メチルタウリン酸、サルコシン酸、脂肪酸アミドエーテル硫酸、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グルリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体、またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどがあり得る。
【０１００】
本発明の化粧品組成物に含まれる成分は、有効成分に加えて、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解剤、ビタミン、顔料と香料添加剤のような通常の補助剤、および担体など、化粧品組成物に通常使用される成分が含まれ得る。
【０１０１】
化粧品組成物は、通常使用される任意の方法によって調製され得る。
【０１０２】
望ましくは、脱毛を防止し発毛を促進するための化粧品組成物は、頭皮または毛髪に直接適用するか、またはそれらの上に注射することにより、経皮適用を通して使用され得る。
【０１０３】
本発明の組成物に含まれる有効成分である混合抽出物の適用量は、成人の場合に基づくと、４０ｍｇ／ｋｇ以下であり、望ましくは、２０ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇである。
【０１０４】
組成物を皮膚に適用する方法には、当技術分野で開示されている任意の方法が含まれ得る。本発明の化粧品組成物は、単回使用または反復使用され得るか、または、他の化粧品組成物と組み合わせて使用され得る。さらに、皮膚の保護の優れた効果を有する本発明の化粧品組成物は、通常の使用方法に従って使用され得て、その適用頻度は、皮膚の状態または使用者の嗜好に応じて異なり得る。［脱毛症処置の方法］  さらに、別の態様において、本発明は、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＦＧＦ−５、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、Ｋ１７、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＢＤＮＦ、ＢＭＰ２／４からなる群から選択された少なくとも１つの毛髪退行期誘導因子、もっとも望ましくはＴＧＦ−βを含む誘導因子によって刺激を受けた幹細胞の馴化培地を有効成分として含む、発毛を促進するための組成物を使用して発毛を促進することにより脱毛症を処置するための方法、当該組成物を調製するための方法、および、当該組成物を使用して脱毛を防止し、発毛を促進するための方法に関する。
【０１０５】
脱毛を処置する上記の方法において、幹細胞の馴化培地の詳細、または、その組成物は、上述したものと同一である。脱毛を処置する上述の方法では、特に、塗布または注射の方法を用いて経皮投与を使用することが望ましい。特に、組成物の有効成分は、組成物が皮膚の真皮層に十分拡散した後で毛細血管内に送られるように、すなわち、組成物が真皮層に短時間留まった後で即時に真皮層内に入ることを防止するべく、注射器の針の先端の開口部を上に向けながら、組成物を真皮層に注射することが望ましい。上述の通り、以前説明された毛髪退行期誘導因子によって刺激を受けた幹細胞の馴化培地の作用を、医薬組成物および化粧品組成物に関連して説明した。しかしながら、本発明と関係のある当業者にとって、本発明が、毛髪退行期誘導因子によって刺激を受けた幹細胞の馴化培地を有効成分として含む、脱毛を防止し発毛を促進するための様々な形態の組成物、および、様々な用途で当該組成物を使用する方法に関連することは明らかである。
【０１０６】
以降、添付の例示的な実施形態を参照して本発明を詳細に記載する。これらの実施形態は、例示目的のみで開示され、当業者にとって、それは本発明の範囲を限定するように解釈されるべきでないことは明らかである。
【０１０７】
本発明者は臍帯血由来幹細胞およびＴＧＦ−βを使用したが、当業者にとって、他の供給源に由来する幹細胞および他の毛髪退行期誘導因子（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９，Ｒ１３２−Ｒ１４２，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １０，  ２００９；Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １２４：６７５−６８５，２００５）も使用され得ることは明らかである。
［材料および方法］
１．幹細胞の馴化培地の調製  
（１）幹細胞の単離および培養  本発明では、Ｍｅｄｉｐｏｓｔ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．（韓国）によって提供されたヒト臍帯血由来間充織幹細胞を使用した。細胞は、臍帯血を採取する段階、および、間充織幹細胞を臍帯血から単離して、それを培養する段階から取得され得る。各段階の詳細は本明細書の以下に記載されている。臍帯血を採取する段階において、自然経膣分娩（ＮＳＶＤ）の場合、乳児の分娩後、胎盤がまだ子宮内に残っている状態で、排出された臍帯血管から臍帯血が採取される。あるいは、帝王切開の場合、乳児の分娩後、胎盤も子宮から排出された状態で、臍帯血管から臍帯血が採取される。
【０１０８】
本発明において、分娩後に子宮から排出された臍帯血管から臍帯血が採取される場合、臍帯血は新生児の分娩後に無菌手術を通して、胎盤および胎児に繋がっていた臍帯血管から採取される。臍帯血管が得られると、採取針を使用して、抗凝固剤を含む臍帯血採取袋に臍帯血を採取する。このように採取された臍帯血から幹細胞を単離し、それを培養する方法に関しては、韓国特許出願第１０−０４９４２６５に開示されているものを含む、任意の通常の方法が使用され得る（Ｐｉｔｔｉｎｇｅｒ  ＭＦ，  Ｍａｃｋａｙ  ＡＭ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８４：  １４３−７，  １９９９；  Ｌａｚａｒｕｓ  ＨＭ，  Ｈａｙｎｅｓｗｏｒｔｈ  ＳＥ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，  １６：  ５５７−６４，１９９５）。
【０１０９】
本発明者は、このように採取された臍帯血から遠心分離によって単核球を分離し、数回洗浄して不純物を除去し、当該単核球を適切な濃度で培養容器に植え付け、培養した。ここで、位相差顕微鏡で観察したとき、細胞は長い均一の紡錘状のコロニーの形状で増殖しており、間充織幹細胞であることが確認された。細胞がコンフルエントになるまで成長すると、次に、適切な数の細胞が得られるまで、細胞を継代培養し、増殖させた。さらに、骨髄および脂肪細胞に由来する間充織幹細胞（ＭＳＣ）を培養し、さらなる実験に使用した。以降、これらの細胞はそれぞれ、ＢＭ−ＭＳＣおよびＡＤ−ＭＳＣと記載される。   
（２）馴化培地サンプルの調製
【０１１０】
馴化培地サンプルをｈＵＣＢ−ＭＳＣ、ＡＤ−ＭＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣから各々調製した。３７℃、５％ＣＯ２で維持された培養器において、保管された（ＬＮ２タンク内で保管された）細胞を解凍および培養し、特に、ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）培地内で細胞コンフルエンスが約９０％に到達するまで、細胞を培養した。
【０１１１】
次に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、フェノールレッドが添加されていない角化細胞用培地（ＫＭ）で２４時間培養し、培地を採取した。このプロセス全体を３日間繰り返した。次に、採取された培地を各々濾過し（Ｔｏｐ  Ｆｉｌｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ，  Ｎｕｎｃ）、冷蔵保存、冷凍保存して使用した。  
（３）刺激を受けたＣＭの調製
【０１１２】
ＣＭ調製の方法は、上述の方法とほぼ同一であるが、骨髄、臍帯血、脂肪に由来する幹細胞を培養するとき、フェノールレッドを含まない培地内でＴＧＦ−β（１０ｎｇ／ｍＬ）によって細胞を処置し、幹細胞に２４時間刺激を与えた。
【０１１３】
ＴＧＦ−βで処置された培地を、ＰＢＳで３回洗浄し、フェノールレッドを含まない新鮮なＫ−ＳＦＭ培地で置き換え、２４時間培養を３日間繰り返した後で採取した。このように採取された、ＴＧＦ−βで処置された馴化培地を、各々濾過し、実験で使用するために、フェノールレッドを含まないＫ−ＳＦＭ培地で最終濃度１０％、２５％、５０％まで希釈して使用した。  
２．発毛を観察するためのＣ３Ｈマウスの準備
【０１１４】
実験施設はＧｙｅｏｎｇｉ  Ｂｉｏｃｅｎｔｅｒ  （ＩＡＣＵＣ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｎｏ：ＩＡＣＵＣ２０１４−４−１０）およびＭｅｄｉｐｏｓｔ（ＩＲＢ  Ａｐｐｒｏｖａｌ  Ｎｏ：  １３１０２１−１）であった。Ｃ３ＨマウスはＳａｅｒｏｎｂｉｏ  Ｉｎｃ．（韓国）によって購入され、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂ．で準備された。
【０１１５】
特に、本発明の実験で使用されるＣ３Ｈマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂ．、日本）は、毛髪が除去された後で、休止期が開始された。他の種と異なり、Ｃ３Ｈマウスは、成長期へと転換するのに必要な時間が極めて長いので、発毛効果を研究するための動物モデルとして使用される。つまり、他のマウス種と異なり、誘導因子の薬剤で処置しなくても、休止期が非常に長いので、発毛効果を確認するための優れた動物モデルである（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ（２００５）１２４，２８８−２８９）。
【０１１６】
Ｃ３Ｈマウスの皮膚表面の色は、発毛の期間である成長期の間に黒色に変化するが、皮膚表面は退行期の間にピンク色に変化するので、皮膚の色を観察することで、発毛の期間を確認できる。
【０１１７】
本発明者は７週齢Ｃ３Ｈマウスを入手し、１週間の適応期間を通して、新しい環境に適応させた。さらに、臍帯血に由来する間充織幹細胞の馴化培地をマウスに接種し、毛周期の休止期（退行期）、および、成長期への転換時間を観察した。この例では、陰性対照として、ＰＢＳを注射されたマウスが使用された。
【０１１８】
一方、毛髪を除去するべく、マウスを麻酔した。３．３６ｍｌのＲｏｍｐｕｎ（Ｂａｙｅｒ  Ｋｏｒｅａ  Ｌｔｄ．，２０９４Ｌ，韓国）を５ｍＬのＺｏｌｅｔｉｌ（バーコード番号３ＵＨＣ、韓国）と混合し、７．４７ｍＬの食塩水（ＪＷ−Ｐｈａｒｍａ、登録番号１００５５、韓国）を添加することで、１５．８３ｍｌの量の麻酔剤を調製し、インスリン用注射器（ＢＤ  Ｕｌｔｒａ−Ｆｉｎｅ（登録商標）ＩＩ、韓国）を使用して２０μＬの当該麻酔剤を用いてマウスを麻酔した。
【０１１９】
次に、マウスに麻酔が効いていることを確認後、ヘアトリマーを使用してマウスの毛髪を除去した。マウスを清潔な紙の上に置き、発毛方向と反対方向に一次毛髪除去を実施し、マウスをその場に２４時間放置した後で、残った毛髪が少しでも存在するかどうか観察し、次に、残った毛髪を除去した。  
３．本発明に係る幹細胞の馴化培地の局所適用
【０１２０】
局所的な方法として、周囲の領域に付着しないように慎重に注意しながら、本発明の馴化培地を１００μＬの量で、１２時間間隔で、マウスの皮膚の外層に適用し、皮膚に染み付くように同一方向に８回擦りつけた。馴化培地を１００μＬずつの量で４か所に適用し、発毛量、毛髪の太さ、色の場所などを肉眼で毎日観察した。  
４．ＭＴＴ分析
【０１２１】
細胞の毒性および増殖を試験するべく、３７℃、５％ＣＯ２に維持された培養器内の各々の培地で細胞を２４時間培養し、２４時間の飢餓状態に置き、各々の実験条件で、２４、４８、７２、および９６時間培養した。
【０１２２】
さらに、完了した各実験群を、細胞毒性および細胞増殖に関するＭＴＴ分析による測定にかけた。実験の信頼性を確保するべく、実験を少なくとも３回繰り返した。
【０１２３】
ＭＴＴ分析実験方法を確立するための培養が完了した実験群の各々を、最終濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ試薬で処置し、さらに４時間培養した。次に、上清を破棄した後で、ＤＭＳＯに溶解し、その溶液を２００μＬ／ウェルの量で９６ウェルプレートに移し、ＥＬＩＳＡリーダーによって５７０ｎｍの吸光度を測定した。  
５．Ｐｒｉｍａｒｙ  ｈＤＰＣおよびＰｒｉｍａｒｙ  ＯＲＳを一次細胞として分離する
【０１２４】
後頭部領域の剖検組織を食塩水内で調製し、球状部分を切るのに刃を使用しながら１つの毛包単位へと分離し、毛幹を除去した。２つの注射器のうち一方で毛球の下部（ＤＰの下部）を固定しながら、真皮乳頭（ＤＰ）が出てくるように、他方の注射器を使用して毛球の上部（ＤＰの上部）に軽く触れた。
【０１２５】
真皮乳頭細胞を注射器の先端に置き、混合物（ＤＭＥＭ＋２０％ＦＢＳ＋１％抗生物質＋１％  Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）、および、約１０個の真皮乳頭細胞を、３５ｍｍの１型コラーゲンで塗布した皿に加え、培地を交換することなく、不足量を追加しながら、１０日間培養した。真皮乳頭細胞が皿に接着したことを確認後、培地を３日に１回交換し、細胞コンフルエンスに到達したとき、または、第４週になったときのいずれかの場合に、継代培養して使用した。
６．パッチアッセイ
【０１２６】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスが出産したとき、皮膚を剥がし、血液の染みを洗い流し、ポビドンで殺菌し、食塩水で再度洗ってポビドンを除去した。
【０１２７】
剥がした皮膚から脂肪層を除去した後、コラーゲン／ディスパーゼでマウスを処置し、４℃で一晩培養した。鉗子を使用して真皮と表皮を分離し、１５分間ボルテックスを行い、濾過器で組織を篩過し、遠心分離で分離した（細胞が遠沈）。細胞の数を測定し、１＊１０＾６に分け、各々に１００μＬの培地を加え、再懸濁して細胞を遊離させた。インスリン用注射器を使用して、ヌードマウスの背中の４か所に皮下注射を行った。注射の２週間後、皮膚を剖検し、内部に形成された毛包の数を確認した。
７．一次毛髪器官の培養
【０１２８】
後頭部の領域の剖検によって毛髪器官を採取し、食塩水内で調製し、毛包単位で切り取り、皮脂腺のすぐ下のところまで切断した。培地を３日に１回交換し、長さを測定した。
例１：臍帯血由来の間充織幹細胞（ｈＵＣＢ−ＭＳＣ）培地の発毛効果の確認
【０１２９】
真皮乳頭（ＤＰ）の形成および増殖の間に発毛の開始があり得るので、ｈＵＣＢ−ＭＳＣ−ＣＭがＤＰ成長を増大させる特性を観察することで、発毛の可能性を検討した。馴化培地の最終濃度が１０％、２５％、５０％となるように、ＴＧＦ−βによる刺激を受けた幹細胞の馴化培地、および非刺激馴化培地による発毛効果の評価を実施し、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ実験で使用した。
１−１  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験
【０１３０】
一次ヒト真皮乳頭細胞（ＤＰＣ）を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験により、馴化培地の効果を検討した。
【０１３１】
最初に、細胞の毒性および増殖を試験するべく、３７℃、５％ＣＯ２で維持した培養器内の各々の培地で細胞を２４時間培養し、２４時間の飢餓状態に置き、各々の実験条件で２４、４８、７２、９６時間培養し、細胞の毒性および増殖をＭＴＴ分析によって測定した。
【０１３２】
その結果、図１Ａおよび図１Ｂに示されているように、ＴＧＦ−βで刺激を受けた臍帯血由来幹細胞の馴化培地が、もっとも高い細胞生存性を示した。
【０１３３】
さらに、ＡＤ−ＭＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣの増殖も測定した（図１Ａ、図１Ｂおよび表１）。
【表１】
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これらの結果から、ＴＧＦ−βで刺激を受けた幹細胞は、刺激を受けていない培地より優れた増殖性を有することが確認できた。
１−２  ウエスタンブロット
【０１３４】
一方、ＴＧＦ−βによって刺激を受けた幹細胞の馴化培地による毛髪組織分化と関連するシグナル伝達系を確認するべく、ｈＤＰＣを馴化培地候補で処置し、毛髪組織分化と関連するタンパク質の量をウエスタンブロットで確認した。その結果は図２に示されている。
【０１３５】
その結果、ＴＧＦ−βによって刺激を受けた幹細胞の馴化培地は、毛髪組織分化と関連するシグナル伝達タンパク質として知られているＷｎｔ３ａ、Ｂｃｌ−２、ＣｙｃｌｉｎＤ−１などの高い発現量を示した。これらの結果から、本発明のＴＧＦ−βは、毛髪組織分化に関して、幹細胞に効果があることが明らかとなった。
【０１３６】
つまり、ＴＧＦ−βによって刺激を受けた本発明の臍帯血由来幹細胞は、毛髪組織分化に関連するシグナル伝達タンパク質であるＷｎｔ３ａ、Ｂｃｌ−２、ＣｙｃｌｉｎＤ−１などを効果的に分泌し、その結果、それを含む馴化培地は、発毛に関してもっとも優れた発毛効果を示す（図２）。
１−３  ｅｘ  ｖｉｖｏ実験
【０１３７】
本発明者はさらに、一次毛髪器官を培養することにより、発毛効果に関するｅｘ  ｖｉｖｏ実験を実施した。
【０１３８】
このため、発毛の可能性に関する観察を可能とするｅｘ  ｖｉｖｏ実験モデルとして、ヒト頭皮組織から採取した毛包からヒト一次真皮乳頭（ＤＰ）を準備し、実験用プレートで培養した。処置する物質に応じたＤＰの長さの伸長促進を観察によって比較した。つまり、実験群と対照群とを処置することによって一次ＤＰの長さの伸長を観察し、有効なＣＭを選択、または、発毛に対するＣＭの効果を観察によって比較した。
【０１３９】
その結果、図３Ａおよび図３Ｂで示されているように、処置されていない対照群と比較して、刺激を受けていないＣＭ、および、ＴＧＦ−βで刺激を受けたＣＭの両方が毛髪増殖を誘導し、特に、ＴＧＦ−βで刺激を受けたＣＭは、刺激を受けていないＣＭより高い発毛効果を示した（図３Ａ）。
【０１４０】
さらに、４回の反復実験において、毛包の長さの伸長を比較したとき、ＴＧＦ−βで刺激を受けた馴化培地では、刺激を受けていない馴化培地と比較して、毛包の成長の長さの平均が高いことが示された（図３Ｂ）。  
例２：パッチアッセイ
【０１４１】
臍帯幹細胞でプライミングされた馴化培地の毛包形成に対する効果をパッチアッセイモデルで検討した。
【０１４２】
パッチアッセイモデルによるｅｘ  ｖｉｖｏ実験の結果、ＴＧＦ−βで刺激を受けた幹細胞の馴化培地は、対照培地、または、非刺激馴化培地で処置された群と比較して、一次毛包を形成する効果が有意に高いことが示された。特に、ＴＧＦ−βで刺激を受けた幹細胞の馴化培地は、一次毛包を形成した数がもっとも高いことが示された（図４Ａ）。
【０１４３】
また、実体顕微鏡で観察したとき、ＴＧＦ−βで刺激を受けた馴化培地は、対照培地、または、非刺激馴化培地で処置された群と比較して、一次毛包を形成する効果が有意に高いことが示された（図４Ｂ）。  
例３：マウスへの局所適用
【０１４４】
休止期のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスに対し、本発明の馴化培地を局所的に適用することで、発毛効果を評価した。
【０１４５】
脱毛防止および発毛促進の効果を評価するべく、様々な因子で刺激を受けた馴化培地を使用して、動物実験を比較および評価した。馴化培地を１日２回、各マウスの背中の４か所に適用し、発毛特性を約３週間検討した。
【０１４６】
その結果、ＴＧＦ−βで刺激を受けた幹細胞の馴化培地は、対照培地、または、非刺激馴化培地で処置された群と比較して、より高い発毛効果を示し、その中で、ＴＧＦ−βで刺激を受けた幹細胞の馴化培地は、すでに報告されている研究結果と比較した場合でも、発毛の速度、発毛の量、毛髪の太さなど、発毛の様々な分野において、もっとも優れた効果を示すことが確認された（図５）。
【０１４７】
さらに、ＣＭ、および、ＴＧＦ−βで刺激を受けたＣＭでＡＤ−ＭＳＣおよびＢＭ−ＭＳＣを処置した後、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスの発毛特性を約２８日間検討した結果、やはり、ＴＧＦ−βで刺激を受けたＣＭが局所的に適用されたマウスは、より優れた発毛効果を示した（図６）。このように、ＴＧＦ−βで刺激を受けた、本発明の幹細胞の馴化培地の発毛効果は、発毛速度、毛髪の量、毛髪の太さなどの面で、非常に優れていることが、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルを通して確認できる。
【０１４８】
これらの結果から、脱毛誘導物質として知られているＴＧＦ−βによって臍帯血由来幹細胞を処置することで、発毛に有効なタンパク質が驚くほど分泌されることが確認された。
【０１４９】
特に本発明に係る、ＴＧＦ−βによって刺激を受けた臍帯血由来の間充織幹細胞の馴化培地は、既存の幹細胞ベースの物質より遥かに優れた発毛効果を示し、従って、脱毛の防止および発毛の促進に非常に有用に使用されることが予測される。
［産業上の利用可能性］
【０１５０】
ＴＧＦ−βを含む毛髪退行期誘導因子によって刺激を受けた幹細胞の馴化培地は、毛髪組織分化に関連するシグナル伝達タンパク質として知られるＷｎｔ３ａ、Ｂｃｌ−２、ＣｙｃｌｉｎＤ−１などを含む。従って、幹細胞の馴化培地は、毛周期の間の休止期から成長期までの転換時間を短縮し、真皮乳頭細胞の長さの伸長を促進し、毛包の数および大きさを増加させ、頭皮の厚さを増加させ、それにより、脱毛の防止および発毛の促進のための優れた効果を示すので、それを利用できる分野において非常に役立つことが予測される。ここで、本実施形態に係る発明の例を項目として記載する。
［項目１］
ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＦＧＦ−５、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、Ｋ１７、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＢＤＮＦ、ＢＭＰ２／４からなる群から選択された少なくとも１つの毛髪退行期誘導因子によって刺激を受けた幹細胞の馴化培地を有効成分として備える、脱毛防止および発毛促進のための組成物。
［項目２］
上記毛髪退行期誘導因子は、ＴＧＦ−βを含む少なくとも１つの因子である、項目１に記載の組成物。
［項目３］
上記幹細胞は、骨髄、臍帯血、脂肪、血液、肝臓および腸、皮膚、消化管、胎盤、神経、副腎、上皮、子宮に由来するヒト組織成体幹細胞、および、胚性幹細胞からなる群から選択された少なくとも１つである、項目１または２に記載の組成物。
［項目４］
上記幹細胞は、臍帯血、骨髄または脂肪に由来する、項目３に記載の組成物。
［項目５］
上記幹細胞は、臍帯血に由来する、項目４に記載の組成物。
［項目６］
上記毛髪退行期誘導因子によって刺激を受けた上記馴化培地は、上記毛髪退行期誘導因子を上記幹細胞に加えた後で上記幹細胞を２２〜２６時間刺激し、その後、１日間から３日間までの選択された期間培養することで得られる、項目１から３のいずれか一項に記載の組成物。
［項目７］
上記毛髪退行期誘導因子によって刺激を受けた上記馴化培地は、Ｗｎｔ３ａ、Ｂｃｌ−２、ＣｙｃｌｉｎＤ−１からなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質を含む、項目１から３、または６のいずれか一項に記載の組成物。
［項目８］
上記毛髪退行期誘導因子によって刺激を受けた上記馴化培地は１０％〜３０％の最終濃度を有する、項目１から３、６、または７のいずれか一項に記載の組成物。
［項目９］
上記毛髪退行期誘導因子によって刺激を受けた上記馴化培地は、
（ｉ）毛周期の間の休止期から成長期への転換時間を短縮し、
（ｉｉ）真皮乳頭細胞を発生させ、長さの伸長を促進し、
（ｉｉｉ）毛包の数および大きさを増大させ、
（ｉＶ）頭皮の皮膚の厚さを増大させる
作用を有する、項目１から３、または６から８のいずれか一項に記載の組成物。
［項目１０］
上記組成物は、医薬組成物または化粧品組成物である、項目１から３、または６から９のいずれか一項に記載の組成物。
［項目１１］
ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＦＧＦ−５、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、Ｋ１７、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＢＤＮＦ、ＢＭＰ２／４からなる群から選択された少なくとも１つの毛髪退行期誘導因子で幹細胞を刺激することによって、脱毛を防止し、発毛を促進する幹細胞の馴化培地を製造する方法。
［項目１２］
上記毛髪退行期誘導因子がＴＧＦ−βを含む、項目１１に記載の方法。
［項目１３］
上記幹細胞は、臍帯血、骨髄または脂肪に由来する、項目１１または１２に記載の方法。
［項目１４］
局所的な塗布または注射によって、項目１または２に記載の上記組成物の経皮投与を含む、脱毛の防止および発毛の促進のために組成物を使用する方法。
［項目１５］
ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＦＧＦ−５、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、Ｋ１７、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＢＤＮＦ、ＢＭＰ２／４からなる群から選択された少なくとも１つの毛髪退行期誘導因子によって刺激を受けた幹細胞の馴化培地を使用して脱毛を処置する方法。
［項目１６］
上記毛髪退行期誘導因子は、ＴＧＦ−βを含む、少なくとも１つの因子である、項目１５に記載の方法。
［項目１７］
上記幹細胞は、臍帯血、骨髄または脂肪に由来する、項目１５または１６に記載の方法。
［項目１８］
刺激を受けた幹細胞の上記馴化培地は、Ｗｎｔ３ａ、Ｂｃｌ−２、ＣｙｃｌｉｎＤ−１からなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質を含む、項目１５から１７のいれか一項に記載の方法。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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