(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の標的が、第２の標的の近位にあるかどうかを決定するためにホルマリン固定パラフィン包埋組織試料を分析する方法であって、
該試料を、ビオチンリガーゼ及び第１の標的と結合するための特異的結合部分を含む第１のコンジュゲートプローブと接触させる工程と、
該試料を、ビオチンリガーゼ基質及び第２の標的と結合するための特異的結合部分を含む第２のコンジュゲートプローブと接触させる工程と、
第１の標的が第２の標的の近位にある場合、ビオチンリガーゼがビオチンリガーゼ基質をビオチン化するように、該試料をビオチン及びＡＴＰと接触させる工程と、
第１の標的が第２の標的の近位にある場合、ビオチンを検出する工程と
を含む方法。
【請求項２】
第１の標的と結合するための特異的結合部分が、第１の標的に特異的な第１の一次抗体であり、及び第２の標的と結合するための特異的結合部分が、第２の標的に特異的な第２の一次抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１の一次抗体が第１のハプテンで標識され、且つ試料を第１のコンジュゲートプローブと接触させる工程が、試料を第１のハプテンに特異的な第１の二次抗体と接触させる工程を含み、及び
第２の一次抗体が第２のハプテンで標識され、且つ試料を第２のコンジュゲートプローブと接触させる工程が、試料を第２のハプテンに特異的な第２の二次抗体と接触させる工程を含み、又は
第１の一次抗体が第１の種に由来し、且つ試料を第１のコンジュゲートプローブと接触させる工程が、試料を第１の種に特異的な第１の二次抗種抗体と接触させる工程を含み、及び
第２の一次抗体が第２の種に由来し、且つ試料を第２のコンジュゲートプローブと接触させる工程が、試料を第２の種に特異的な第２の二次抗種抗体と接触させる工程を含む、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第１の標的及び第２の標的が二量体化タンパク質である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
第１の標的が第１の核酸標的であり、且つ試料を第１のコンジュゲートプローブと接触させる工程が、試料を第１の核酸プローブと接触させる工程を含み、場合によって、
第２の標的が第２の核酸標的であり、且つ試料を第２のコンジュゲートプローブと接触させる工程が、試料を第２の核酸プローブと接触させる工程を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第１の核酸プローブが第３のハプテンで標識され、試料を第１のコンジュゲートプローブと接触させる工程が、試料を第３のハプテンに特異的な第３の二次抗体と接触させる工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ビオチンを検出する工程が、試料を、ビオチン結合抗体、アビジン、又は一若しくは複数の酵素にコンジュゲートされたストレプトアビジンを含むコンジュゲートと接触させる工程を含むか、又は
ビオチンを検出する工程が、試料を色素原と接触させる工程を含むか、又は
ビオチンを検出する工程が、試料をチラミドコンジュゲート又はキノンメチド前駆体コンジュゲートから選択される増幅試薬と接触させる工程を含む、
請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
１００ｎｍ未満離れているならば、第１の標的が第２の標的の近位にある、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ビオチンリガーゼが、リンカーを介して第１の標的と結合するための特異的結合部分とコンジュゲートされ、及び／又はビオチンリガーゼ基質が、リンカーを介して第２の標的と結合するための特異的結合部分とコンジュゲートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
リンカーが、ＰＥＧ２、ＰＥＧ３、ＰＥＧ４、ＰＥＧ５、ＰＥＧ６、ＰＥＧ７、ＰＥＧ８、ＰＥＧ９、ＰＥＧ１０、ＰＥＧ１１、ＰＥＧ１２、ＰＥＧ１３、ＰＥＧ１４、ＰＥＧ１５、ＰＥＧ１６、ＰＥＧ１７、ＰＥＧ１８、ＰＥＧ１９、ＰＥＧ２０、１，４−ジアミノヘキサン、キシレンジアミン、テレフタル酸、３，６−ジオキサオクタン二酸、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ−二酢酸、１，１’−エチレンビス（５−オキソ−３−ピロリジンカルボン酸）、４，４’−エチレンジピペリジン、スクシンイミジル−６−ヒドラジノ−ニコチンアミド（Ｓ−ＨｙＮｉｃ，ＨｙＮｉｃ−ＮＨＳ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−ホルミルベンゾエート（Ｓ−４ＦＢ，４−ＦＢ−ＮＨＳ）、マレイミドＨｙＮｉｃ（ＭＨＰＨ）、マレイミド４ＦＢ（ＭＴＦＢ）、スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−オクタエチレングリコール］エステル（Ｍａｌ−ＰＥＧ８−ＮＨＳ）、スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＮＨＳ）、４−ＦＢ−ＰＥＧ４−ＰＦＰ、アジドベンゾイルヒドラジド、Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリシルアミノ）ブチル］−３’−［２’−ピリジルジチオ］プロピオンアミド）、ビス−スルホスクシンイミジルスべレート、ジメチルアジピミデート、ジスクシンイミジル酒石酸塩、Ｎ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル［４−アジドフェニル］−１，３’−ジチオプロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート、グルタルアルデヒド、及びスクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）、及び４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
リンカーが２から２０ＰＥＧ単位を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
極近接にある第１の標的及び第２の標的の存在について、ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料を検査する方法に関連した一又は複数工程を行うために、自動染色装置を使用する工程を含む自動方法であって、
第１の標的が第１の特異的結合部分により認識され、第１の標的の近位にビオチンリガーゼのコンジュゲ−ション又は沈殿をもたらすように、試料を試薬の第１セットと接触させる工程と、
第２の標的が第２の特異的結合部分により認識され、第２の標的の近位にビオチンリガーゼ基質のコンジュゲ−ション又は沈殿をもたらすように、試料を試薬の第２セットと接触させる工程と、
第１の標的及び第２の標的が極近接にある場合、ビオチンリガーゼがビオチンリガーゼ基質をビオチン化するように、試料をビオチン及びビオチン化試薬と接触させる工程と、
ビオチンを検出する工程と
を含む方法。
【請求項１３】
以下の構造：
（ＳＢＭ）−（リンカー）ｍ−（ＢＬ／ＢＬＳ）ｎ
（式中、ＳＢＭは特異的結合部分であり、
ＢＬ／ＢＬＳはＢＬ又はＢＬＳのどちらかであり、
ＢＬはビオチンリガーゼであり、
ＢＬＳはビオチンリガーゼ基質であり、
ｍは０、１、２、３、４、又は５であり、ｎは１から１０の整数である）
を有する、少なくとも１つのコンジュゲートを含み、
以下の第２の構造：
（ＳＢＭ２）−（リンカー２）ｍ２−（ＢＬ／ＢＬＳ２）ｎ２
（式中、ＳＢＭ２は第２の特異的結合部分であり、
ＢＬ／ＢＬＳがＢＬＳである場合、ＢＬ／ＢＬＳ２はＢＬであり、ＢＬ／ＢＬＳがＢＬである場合、ＢＬ／ＢＬＳ２はＢＬＳであり、
ｍ２は０、１、２、３、４、又は５であり、ｎ２は１から１０の整数である）
を有する第２のコンジュゲートをさらに含む、キット。
【請求項１４】
少なくとも１つの特異的結合部分が抗体である、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
ビオチンリガーゼがＢｉｒＡ由来である、請求項１３又は１４に記載のキット。
【請求項１６】
ビオチン及びＡＴＰをさらに含む、請求項１３から１５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１７】
ストレプトアビジン又はストレプトアビジンコンジュゲートをさらに含む、請求項１６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
開示された実施態様は、試料中の標的物、典型的には試料中の近位に位置する標的物の検出に関し、さらにより詳細には、ビオチンリガーゼコンジュゲート及びビオチンリガーゼ基質コンジュゲートを用いる近接アッセイに関する。該方法を実施するのに有用な試薬及びキットも記載される。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質−タンパク質相互作用のネットワークは生物系の顕著な特徴である。タンパク質−タンパク質相互作用は、正常細胞及び癌性細胞における細胞機能のあらゆる側面を調節するシグナル経路を形成する。一過性受容体型チロシンキナーゼ二量体化及び細胞外増殖因子活性化後の複合体形成などの、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための方法が開発されている。しかし、これらの方法は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織で使用されるように特に設計されているわけではない。
【０００３】
近接ライゲーションアッセイは、近年ＯＬｉｎｋ ＡＢにより開発された。これは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織におけるタンパク質−タンパク質相互作用をｉｎ ｓｉｔｕ検出するための唯一公知の市販品である。近接ライゲーションアッセイ技術は、ＤＮＡリガーゼを使用してパッドロック環状ＤＮＡテンプレートのほか、ローリングサークル増幅用のＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを生成する。これらの酵素は高価である。さらに、これらの酵素は、自動化システム及び方法で使用するのに適していない。これらの理由のため、近接ライゲーションアッセイは、商業的応用には一般に有用と見なされていない。
【０００４】
乱れた細胞経路（複数）を理解することは、癌患者の個別化診断及び治療にますます重要となることから、ホルマリン固定パラフィン包埋組織でのｉｎ ｓｉｔｕタンパク質−タンパク質検出は、組織診断における満たされていない医学的ニーズとなる。
【発明の概要】
【０００５】
開示されるのは、組織診断法のための近接アッセイである。本発明の特定の開示された実施態様は、酵素的ビオチン化反応を利用して試料中の標的物を検出するｉｎ ｓｉｔｕ検出方法に関する。開示された実施態様は、特に自動染色プラットフォームにおいてホルマリン固定パラフィン包埋試料でｉｎ ｓｉｔｕ使用するための近接ライゲーションアッセイに関する上述された欠陥に対処する。アッセイは、試料の細胞状況を維持しながら標的分子及びその近接度の検出を提供する。
【０００６】
特定の実施態様は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料におけるタンパク質−タンパク質相互作用の高感度及び特異的検出のために、大腸菌由来の酵素などのビオチンリガーゼ及び適切なペプチド基質（ＢＴＳ（１８アミノ酸長ペプチド）など）を使用する。ビオチンリガーゼは、ビオチンの存在下で適切なペプチド基質を効率的にビオチン化することができ、反応は酵素がペプチド基質と物理的に接触するときにのみ生じ得るため（図１参照）、ビオチンリガーゼ及び基質は、目的とする標的（Ａ及びＢ）をそれぞれ認識する２つの抗体に別々にコンジュゲートされ得る。目的とする標的が十分に極近接している場合（例えば、シグナル伝達リレーの引き金を引く細胞膜上の受容体二量体化）、抗体コンジュゲートのそれぞれの標的タンパク質への結合は、ビオチンリガーゼ及びペプチド基質を十分に極近接にして、基質のビオチン化を可能にする。標的は、細胞表面上に存在しなくてもよい。代わりに、標的はいずれの細胞コンパートメントにあってもよい。さらに、標的は、抗体により認識されるタンパク質でなくてもよい。任意の他の生体分子、例えば脂質及び核酸が、開示された近接検出実施態様を用いて検出され得る。
【０００７】
１つの開示された実施態様は、ビオチンリガーゼ及び第１の標的と結合するための特異的結合部分を含む第１のコンジュゲートプローブと試料を接触させる工程と、基質のビオチン化を可能にする条件下で、ビオチンリガーゼ基質及び第２の標的と結合するための特異的結合部分を含む第２のコンジュゲートプローブと試料を接触させる工程とを含む。幾つかの試料において、第１の標的は第２の標的の近位に位置する。試料は、第１プローブ及び第２プローブと連続的に又は同時に接触されてもよい。いずれの特異的結合部分も本発明での使用に適合され得るが、実施態様は典型的には、第１の標的、第２の標的の一次抗体、又はその両方などの抗体を使用した。特定の実施態様において、一次抗体は第１の種から使用され、第２プローブコンジュゲートは第２の種の抗一次抗体を含んだ。
【０００８】
基質のビオチン化を可能にする条件は、ビオチン及びＡＴＰの添加を含む。方法はまた、試料を、ビオチンと特異的結合対を形成するストレプトアビジン−酵素基質と接触させる工程も含み得る。特定の実施態様に関して、酵素はホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）であり、方法はさらに、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）／Ｈ２Ｏ２による染色を含んだ。他の実施態様において、酵素はアルカリホスファターゼであり、方法はさらに、アルカリホスファターゼレッド（ｆａｓｔ ｒｅｄ）による染色を含んだ。
【０００９】
方法は、核酸標的及びタンパク質標的などの一般に生物学的標的を検出するのに適合され得、実施態様は、タンパク質標的を用いて本発明を例示する。したがって、特定の実施態様において第１の標的はタンパク質であり、第２の標的はタンパク質であり、又は両方の標的は、ｐ９５、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４などのタンパク質であった。
【００１０】
開示された実施態様は、第１の標的と第２の標的の間の距離を定性的に決定するのに使用することができる。あるいは、開示された実施態様は、第１の標的と第２の標的の間の距離を定量的に決定するのに使用することができる。この実施態様は、組織由来の第１の試料において近位に位置する標的を、該標的に結合される場合、第１の既知の距離に位置するように設計されたプローブの第１セットと接触させる工程を含む。第１の距離はビオチン化を可能にしない。組織由来の第２の試料は、ビオチン化のための条件下で標的に結合される場合、標的間の第２の既知の距離に位置するように設計されたプローブの第２セットと接触される。第２の距離はビオチン化を可能にし、これにより近位に位置する標的間の距離の定量的決定を可能にする。
【００１１】
シグナル増幅も、所望ならば使用することができる。例えば、特定の開示された実施態様は、チラミド増幅の使用を含んだ。したがって、１つの開示された実施態様は、試料を第１の標的の第１の一次抗体と接触させる工程と、基質を第２の標的の第２の一次抗体と接触させる工程とを含んだ。ＴＳＡが次いで行われた。試料は次いで、第１の一次抗体の抗抗体及びビオチンリガーゼを含む第１のコンジュゲートプローブ、並びに抗ハプテン抗体及びビオチンリガーゼ基質を含む第２のコンジュゲートプローブと接触された。ビオチン及びＡＴＰが添加され、それに続いて、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などのストレプトアビジン：酵素コンジュゲート、及びジアミノベンジジン（ＤＡＢ）／Ｈ２Ｏ２による染色が行われた。
【００１２】
特定の開示された実施態様は、ＨＥＲ２：ＨＥＲ３ダイマーの検出方法に関する。１つの開示された実施態様は、組織試料を一次抗ＨＥＲ２抗体及び一次抗ＨＥＲ３抗体と接触させる工程を含んだ。試料は次いで、ＨＥＲ３抗体の抗抗体及びホースラディッシュペルオキシダーゼを含むコンジュゲートプローブと接触された。ＴＳＡはハプテン沈殿により行われた。試料は次いで、ビオチンリガーゼ及びＨＥＲ２一次抗体の抗抗体を含む第１のコンジュゲートプローブ、並びにビオチンリガーゼ基質及び抗ハプテン抗体を含む第２のコンジュゲートプローブと接触された。ビオチン及びＡＴＰが添加され、それに続いてストレプトアビジン及び酵素を含むコンジュゲートプローブが添加され、最後に酵素の基質が添加された。
【００１３】
開示された方法を実施するためのコンジュゲートプローブ、及びコンジュゲートプローブを作成する方法も記載されている。第１の開示されたコンジュゲートプローブは、ｐ９５、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４などの選択された標的に対する一次抗体、抗抗体、又は抗ハプテン抗体を含む、ハプテン又は抗体などの特異的結合部分にコンジュゲートされたビオチンリガーゼを含む。ビオチンリガーゼは、例えば、大腸菌、サーモコッカス・コダカラエンシス（Thermococcus kodakarensis）、サーモコッカス・ジリギー（Thermococcus zilligii）ＡＮ１、サーモコッカス・ガンマトレランス（Thermococcus gammatolerans）ＥＪ３、パイロコッカス・アビシ（Pyrococcus abyssi）ＧＥ５、パイロコッカス・ホリコシイ（Pyrococcus horikoshii）ＯＴ３、及びＣ型ボツリヌス菌から得ることができる。ビオチンリガーゼは、特異的結合部分に直接コンジュゲートされてもよく、リンカーにより特異的結合部分にコンジュゲートされてもよく（特定の実施態様はＰＥＧ２からＰＥＧ２０リンカーを用いる）、及び／又は融合タンパク質が使用されてもよい。コンジュゲートは、１特異的結合部分あたり１つのビオチンリガーゼを有することができるが、実施態様は典型的には、１抗体あたり１から５つのビオチンリガーゼを含んだ。
【００１４】
特定の開示されたコンジュゲートは、式：
（ＳＢＭ）−［（リンカー）ｍ−（ＢＬ／ＢＬＳ）］ｎ
（式中、ＳＢＭは特異的結合部分であり、ＢＬはビオチンリガーゼであり、ＢＬＳはビオチンリガーゼ基質であり、ｍは０から５であり、ｎは１から１０である）を有する。ビオチンリガーゼコンジュゲートプローブの例には、
0006576835.tif 000002
0006576835.tif 000003
（式中、ｎは２から２０である）が含まれる。
【００１５】
第２の開示されたコンジュゲートプローブは、特異的結合部分にコンジュゲートされたビオチンリガーゼ基質を含む。ビオチンリガーゼ基質は、特異的結合部分に直接コンジュゲートされてもよく、ＰＥＧ２からＰＥＧ２０リンカーなどのリンカーにより特異的結合部分にコンジュゲートされてもよく、及び／又は融合タンパク質が使用されてもよい。単一のビオチンリガーゼ基質が特異的結合部分に結合されてもよいが、より典型的には、２から５個のビオチン基質分子が実施態様において抗体特異的結合部分に結合された。例示的なビオチンリガーゼ基質コンジュゲートプローブには、
0006576835.tif 000004
（式中、ｎは２−２０である）が含まれる。
【００１６】
コンジュゲートはまた、試料に関しても記載され得る。例えば、開示されたコンジュゲートは、試料、ビオチンリガーゼ及び試料の第１の標的と結合された特異的結合部分を含む第１プローブ、並びにビオチンリガーゼ基質及び試料の第２の標的と結合された第２の特異的結合部分を含む第２プローブも含む。コンジュゲートは、ビオチン化基質を含んでもよい。コンジュゲートはさらに、ビオチンに結合されたストレプトアビジンを含んでもよく、ストレプトアビジンは、酵素、ハプテン、発光団、及び／又はフルオロフォアなどのシグナル生成部分に結合される。
【００１７】
被検体を治療する方法もまた開示される。１つの実施態様は、１つの試料中の２つの標的物に関する、本発明の開示された実施態様による近接アッセイを得る工程を含んだ。該アッセイは病気の診断に役立つ。陽性の近接アッセイ結果を得ると、病気を治療するために選択された治療が被検体に行われる。アッセイを得ることは、アッセイ結果を受け取ること、又はアッセイを行うことを含み得る。該方法の１つの実施態様は、ＨＥＲタンパク質複合体を破壊する薬剤の治療的に有効量を投与する工程を含み得る。例えば、第１のＨＥＲタンパク質がＨＥＲ２であり、第２のＨＥＲタンパク質がＨＥＲ２であるならば、治療はトラスツズマブとなり得る。第１のＨＥＲタンパク質がＨＥＲ３であり、第２のＨＥＲタンパク質がＨＥＲ２である、又は第１のＨＥＲタンパク質がＨＥＲ２であり、第２のＨＥＲタンパク質がＨＥＲ３であるならば、治療はペルツズマブとなり得る。
【００１８】
開示された実施態様を実施するキットもまた開示される。例示的なキットは、ビオチンリガーゼ及び特異的結合部分を含む第１のコンジュゲート、並びにビオチンリガーゼ基質及び特異的結合部分を含む第２のコンジュゲートから選択される少なくとも１つのコンジュゲートを含む。
【００１９】
本発明の前述の及び他の目的、特徴、及び利点は、添付図を参照して進められる以下の詳細な記載からより明らかとなろう。
【００２０】
本開示のさらなる特徴は、現在認識されている本開示を実施する最良の形態を例示する例証的実施態様の以下の詳細な記載を考慮すると、当業者に明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ビオチン化産物が、例えば、シグナル増幅有り又は無しでストレプトアビジン−ＨＲＰ又はストレプトアビジン−ＡＰを用いてその後に検出され得るように、ビオチンリガーゼ（例えばＢｉｒＡ由来）及びペプチド基質（例えばＢＴＳ）を用いて第１の標的Ａ及び第２の標的Ｂをｉｎ ｓｉｔｕ近接検出するための本発明の１つの実施態様の略図である。
【図２】ビオチンリガーゼを抗体に化学的にコンジュゲートする方法の１つの実施態様の概略図である。
【図３】標的に結合された単一一次抗体に結合されたビオチンリガーゼ及びＢＴＳコンジュゲートを用いる、強制近接モデル系の１つの実施態様の概略図である。
【図４】単一抗体強制近接を用いるＨＥＲ２検出を例示する顕微鏡写真である。
【図５】ハプテン化抗体近接検出の有用性を確証する第２のモデル系を例示する概略図である。
【図６Ａ】標的近接効果を確証する、単一基質対２つの別個の基質における二重ハプテン標識標的を検出するための、ビオチンリガーゼ抗抗体コンジュゲート及びビオチンリガーゼ基質抗抗体コンジュゲートを使用する実施態様の概略図である。
【図６Ｂ】標的近接効果を確証する、単一基質対２つの別個の基質における二重ハプテン標識標的を検出するための、ビオチンリガーゼ抗抗体コンジュゲート及びビオチンリガーゼ基質抗抗体コンジュゲートを使用する実施態様の概略図である。
【図７】ハプテン標識ＢＳＡの合成、チオール化組織へのＢＳＡの架橋、及びハプテンＢＳＡ修飾スライドの成功裡の染色を例示する概略図である。
【図８Ａ】第１の標的（Ａ）及び第２の標的（Ｂ）が距離ｄ０により分離される、チラミドシグナル増幅等を用いる近接アッセイの略図である。
【図８Ｂ】第１の標的（Ａ）及び第２の標的（Ｂ）が距離ｄ０により分離される、チラミドシグナル増幅等を用いない近接アッセイの略図である。
【図９Ａ】ＡＴＰの非存在下、染色なしによる反応のＡＴＰ依存性をさらに例示する、開示された方法の１つの実施態様を用いたＥｃａｄ及びβ−カテニンの扁桃における検出を例示する顕微鏡写真である。
【図９Ｂ】ＡＴＰの存在下、染色による反応のＡＴＰ依存性をさらに例示する、開示された方法の１つの実施態様を用いたＥｃａｄ及びβ−カテニンの扁桃における検出を例示する顕微鏡写真である。
【図１０Ａ】ＴＳＡ増幅の使用の結果を例示する顕微鏡写真である。
【図１０Ｂ】ＴＳＡ増幅の使用の結果を例示する顕微鏡写真である。
【図１１】標的に結合したビオチンリガーゼの量の低減により弱まったシグナルをもたらし、これにより、検出されたシグナルがＥ−カドヘリン及びβ−カテニンに特異的であることを確認する、過剰なＧＡＲを用いて抗Ｅ−カドヘリンに対するＧＡＲ−ビオチンリガーゼ結合の競合的ブロッキングを利用した第２のコントロールの顕微鏡写真である。
【図１２】架橋として及び標的シグナルを増幅するための両方でのＴＳＡの使用を含む、Ｅ−カドヘリン及びβ−カテニン近接アッセイのためのｉｎ ｓｉｔｕ近接検出スキームの第３の開示された実施態様に関して得られた染色結果を例示する顕微鏡写真である。
【図１３】ＭＤＡ−１７５におけるＡＴＰの存在下（Ａ）及び非存在下（Ｂ）の特異的点状ＨＥＲ２：ＨＥＲ３ダイマーシグナルを例示する写真である。
【図１４】ＭＣＦ−７におけるＡＴＰの存在下（Ａ）及び非存在下（Ｂ）の本発明の実施態様によるＨＥＲ：ＨＥＲ３ ｉｎ ｓｉｔｕ近接検出の染色結果を例示する写真である。
【００２２】
配列リストの記載
配列番号１−９は、様々な供給源由来のビオチンリガーゼの配列、又は様々な供給源由来のビオチンリガーゼを作成するのに使用された配列である。
【００２３】
配列番号１：
CATATGGGAAGCGGCCATCACCACCACCATCACGGAGGCGGAGGTTCAGGCTGCAGCAACCTGTCTACCTGTGTGTTGAAGGATAACACCGTGCCAC
【００２４】
配列番号２：
GCTGTCGACTTATTTTTCTGCACTACGCAGGGATA
【００２５】
配列番号３：
MGSGHHHHHHGGGGSGCSNLSTCVLKDNTVPLKLIALLANGEFHSGEQLGETLGMSRAAINKHIQTLRDWGVDVFTVPGKGYSLPEPIQLLNAKQILGQLDGGSVAVLPVIDSTNQYLLDRIGELKSGDACIAEYQQAGRGRRGRKWFSPFGANLYLSMFWRLEQGPAAAIGLSLVIGIVMAEVLRKLGADKVRVKWPNDLYLQDRKLAGILVELTGKTGDAAQIVIGAGINMAMRRVEESVVNQGWITLQEAGINLDRNTLAAMLIRELRAALELFEQEGLAPYLSRWEKLDNFINRPVKLIIGDKEIFGISRGIDKQGALLLEQDGIIKPWMGGEISLRSAEK
【００２６】
配列番号４：
MEWNVIRLDEVDSTNEYAKKLIPDVSEGTVVVAKRQTSGRGRKGRAWASPEGGLWMSVILKPPMIDPRLVFVGALAVSDTLRDFGIGAWIKWPNDVWVGNRKISGVLTEVKGDFVIMGVGLNVNNEIPDGLKETATSMMEALGEPVDIGEVLERLLEYLGRWYKTFLENPPLVVEEVRGRTMLIGKEVRVLLDGNDLVGRVITISDDGSLILDVDGQTVKVVYGDVSVRINR
【００２７】
配列番号５：
MWKIIHLDEVDSTNDYAKSIAEESPEGTVVIAKRQTAGKGRKGRSWASPEGGLWMSVILKPERTDPRLVFVGALAVVDTLADFGIKGWIKWPNDVWVEGKKIAGVLTEGKAEKFVVMGIGLNVNNPVPEGLEREATSMIYHTGMELPLDSVLDRLLFHLGGWYGVYKERPELLVEKLRQRTFILGKAVRVTEDDKTIIGRALDVLDDGSLLLEVGGELRRILYGDVSVRPL
【００２８】
配列番号６：
MEWNIITLDEVDSTNEYARRIAPTAPEGTVVVAKRQTAGRGRKGRRWASPEGGLWMTVILKPKSGPEHVTKLVFVGALAVLDTLHEYGIRGELKWPNDVLVDGKKIAGILSECRLNHFALLGIGLNVNNEIPDELRESAVSMKEVLGRAIDLEEVLNRVLRNLSRWYGLFRNGRHGEILKAVKGSSAVLGKRVRIIEDGEIIAEGIAVDIDNSGALILKGEENTVRVLYGDVSLRFS
【００２９】
配列番号７：
MLGLKTSVIGRTIIYFQEVASTNDYAKAENLEEGTVIVADRQIKGHGRLERKWESPEGGLWMSVVLTPRVSQEDLPKIVFLGALAVVETLREFSIDARIKWPNDVLVNYRKVAGVLVEAKGEKVILGIGLNVNNKVPDGATSMKQELGSEIPMLNVFKTLVKTLDSLYLKFLESPGKILERAKRSMILGVRVKVLSDGEVEAEGIAEDVDEFGRLIVRLDDGRVKKILYGDVSLRFL
【００３０】
配列番号８：
MLGLKTSIIGRRVIYFQEITSTNEFAKTSYLEEGTVIVADKQTMGHGRLNRKWESPEGGLWLSIVLSPKVPQKDLPKIVFLGAVGVVETLKEFSIDGRIKWPNDVLVNYKKIAGVLVEGKGDKIVLGIGLNVNNKVPNGATSMKLELGSEVPLLSVFRSLITNLDRLYLNFLKNPMDILNLVRDNMILGVRVKILGDGSFEGIAEDIDDFGRLIIRLDSGEVKKVIYGDVSLRFL
【００３１】
配列番号９：
MKEEIISLLKENKDNFISGEKISEKFGITRAAIWKYMKAIKNEGYKIESVSRKGYKLISSPDLLTFQEINPYLTTNYIGKNIMYFNTIDSTNNKAKELGAKDILEGTVVISEEQTGGRGRLGRQWVSPKFKGIWMSIILRPNIEPMEAAKITQIAAAAVCSVIKELGIDVYIKWPNDIVLNNKKICGILTEMSGEINKINYIVLGIGINVNIDKEDFPEYIKDIATSIKIETGLNIQRKELIAKIFNKFEILYDEFINEGTIKKSIEICKGNSALLGKEVKIIRKSTEVFAKALTIAEDGELIVEYDDGKVEKIVSGEVSIRGMYGYV
【００３２】
配列番号１０は、例示的なビオチンリガーゼ基質のアミノ酸配列である：
GGSGLNDIFEAQKIEWHE
【００３３】
配列番号１１は、特異的結合部分に融合されたビオチンリガーゼをコードするＤＮＡ配列である。
ACATATGCGTGGTAGCCACCACCACCATCATCACGGTAGCGATTTGGGTAAGAAATTGCTGGAGGCAGCACGCGCAGGTCAGGATGACGAAGTGCGTATCCTGATGGCGAATGGCGCGGACGTGAACGCTAAAGACGAATACGGCCTGACGCCGCTGTATCTGGCAACCGCCCATGGCCACCTGGAAATCGTTGAAGTCCTGTTGAAAAACGGTGCCGACGTTAATGCTGTTGATGCGATTGGTTTCACCCCGCTGCATCTGGCCGCGTTTATCGGTCACCTGGAGATTGCGGAGGTGCTGCTGAAACACGGTGCGGATGTCAACGCACAGGATAAGTTTGGCACCGCGTTCGACATCAGCATTGGCAACGGCAATGAGGACCTGGCGGAGATTCTGCAAAAGCTGATGAAGGATAACACCGTGCCACTGAAATTGATTGCCCTGTTAGCGAACGGTGAATTTCACTCTGGCGAGCAGTTGGGTGAAACGCTGGGAATGAGCCGGGCGGCTATTAATAAACACATTCAGACACTGCGTGACTGGGGCGTTGATGTCTTTACCGTTCCGGGTAAAGGATACAGCCTGCCTGAGCCTATCCAGTTACTTAATGCTAAACAGATATTGGGTCAGCTGGATGGCGGTAGTGTAGCCGTGCTGCCAGTGATTGACTCCACGAATCAGTACCTTCTTGATCGTATCGGAGAGCTTAAATCGGGCGATGCTTGCATTGCAGAATACCAGCAGGCTGGCCGTGGTCGCCGGGGTCGGAAATGGTTTTCGCCTTTTGGCGCAAACTTATATTTGTCGATGTTCTGGCGTCTGGAACAAGGCCCGGCGGCGGCGATTGGTTTAAGTCTGGTTATCGGTATCGTGATGGCGGAAGTATTACGCAAGCTGGGTGCAGATAAAGTTCGTGTTAAATGGCCTAATGACCTCTATCTGCAGGATCGCAAGCTGGCAGGCATTCTGGTGGAGCTGACTGGCAAAACTGGCGATGCGGCGCAAATAGTCATTGGAGCCGGGATCAACATGGCAATGCGCCGTGTTGAAGAGAGTGTCGTTAATCAGGGGTGGATCACGCTGCAGGAAGCGGGGATCAATCTCGATCGTAATACGTTGGCGGCCATGCTAATACGTGAATTACGTGCTGCGTTGGAACTCTTCGAACAAGAAGGATTGGCACCTTATCTGTCGCGCTGGGAAAAGCTGGATAATTTTATTAATCGCCCAGTGAAACTTATCATTGGTGATAAAGAAATATTTGGCATTTCACGCGGAATAGACAAACAGGGGGCTTTATTACTTGAGCAGGATGGAATAATAAAACCCTGGATGGGCGGTGAAATATCCCTGCGTAGTGCAGAAAAATAACTCGAG
【００３４】
配列番号１２は、配列番号１１によりコードされたものに対応する融合タンパク質のアミノ酸配列である。
MRGSHHHHHHGSDLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNAKDEYGLTPLYLATAHGHLEIVEVLLKNGADVNAVDAIGFTPLHLAAFIGHLEIAEVLLKHGADVNAQDKFGTAFDISIGNGNEDLAEILQKLMKDNTVPLKLIALLANGEFHSGEQLGETLGMSRAAINKHIQTLRDWGVDVFTVPGKGYSLPEPIQLLNAKQILGQLDGGSVAVLPVIDSTNQYLLDRIGELKSGDACIAEYQQAGRGRRGRKWFSPFGANLYLSMFWRLEQGPAAAIGLSLVIGIVMAEVLRKLGADKVRVKWPNDLYLQDRKLAGILVELTGKTGDAAQIVIGAGINMAMRRVEESVVNQGWITLQEAGINLDRNTLAAMLIRELRAALELFEQEGLAPYLSRWEKLDNFINRPVKLIIGDKEIFGISRGIDKQGALLLEQDGIIKPWMGGEISLRSAEK#
【００３５】
配列番号１３は、ビオチンリガーゼ基質を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列である。
ATGGCTCAAGTACAACTGCAGCAATCTGGTACAGAGGTAGTTAAACCTGGCGCCTCTGTCAAATTGAGTTGCAAGGCTAGTGGTTACATTTTCACCTCTTATGACATTGACTGGGTTCGTCAAACTCCAGAACAAGGATTGGAATGGATTGGGTGGATCTTTCCTGGTGAGGGCTCTACGGAATACAACGAGAAGTTTAAGGGTAGAGCTACACTTAGTGTCGATAAGTCCTCCTCAACTGCTTACATGGAGCTTACGAGACTTACATCAGAAGATTCAGCCGTGTATTTCTGTGCTAGAGGAGATTACTACCGAAGGTACTTCGACTTATGGGGCCAGGGTACTACTGTGACAGTCAGTTCCGGAGGAGGAGGTTCCGGGGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGATCTGATATTGAGTTGACTCAATCACCCACTATCATGTCCGCTTCTCCTGGTGAAAGAGTTACCATGACATGTTCAGCATCTAGTTCAATCAGATACATCTATTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCTCCTCCCCACGTTTACTGATATACGACACCTCAAATGTTGCATCTGGTGTTCCATCAAGATTTTCTGGATCAGGATCCGGAACAAGTTATTCCCTAACCATAAACAGGATGGAAGCAGAGGATGCTGCCACGTATTACTGTCAAGAGTGGTCTGGCTATCCTTACACCTTTGGTGGTGGGACTAAGTTGGAATTGAAACAGGCCGCTGCAGGGCCCCGTCAAAAGGGCGACACAAAATTTATTCTAAATGCAGGTGGCGGTCTGAACGACATCTTCGAGGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAATAA
【００３６】
配列番号１４は、配列番号１３によりコードされたものに対応する融合タンパク質のアミノ酸配列である。
MAQVQLQQSGTEVVKPGASVKLSCKASGYIFTSYDIDWVRQTPEQGLEWIGWIFPGEGSTEYNEKFKGRATLSVDKSSSTAYMELTRLTSEDSAVYFCARGDYYRRYFDLWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPTIMSASPGERVTMTCSASSSIRYIYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNVASGVPSRFSGSGSGTSYSLTINRMEAEDAATYYCQEWSGYPYTFGGGTKLELKQAAAGPRQKGDTKFILNAGGGLNDIFEAQKIEWHE#
【００３７】
配列番号１５は、ビオチンリガーゼに融合されたＳＣＦＶのアミノ酸配列である。
MAQVQLQQSGTEVVKPGASVKLSCKASGYIFTSYDIDWVRQTPEQGLEWIGWIFPGEGSTEYNEKFKGRATLSVDKSSSTAYMELTRLTSEDSAVYFCARGDYYRRYFDLWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPTIMSASPGERVTMTCSASSSIRYIYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNVASGVPSRFSGSGSGTSYSLTINRMEAEDAATYYCQEWSGYPYTFGGGTKLELKQAAAGPRQKGDTKFILNAMKDNTVPLKLIALLANGEFHSGEQLGETLGMSRAAINKHIQTLRDWGVDVFTVPGKGYSLPEPIQLLNAKQILGQLDGGSVAVLPVIDSTNQYLLDRIGELKSGDACIAEYQQAGRGRRGRKWFSPFGANLYLSMFWRLEQGPAAAIGLSLVIGIVMAEVLRKLGADKVRVKWPNDLYLQDRKLAGILVELTGKTGDAAQIVIGAGINMAMRRVEESVVNQGWITLQEAGINLDRNTLAAMLIRELRAALELFEQEGLAPYLSRWEKLDNFINRPVKLIIGDKEIFGISRGIDKQGALLLEQDGIIKPWMGGEISLRSAEK
【００３８】
配列番号１６は、ＤＡＲＰｉｎに融合されたビオチンリガーゼ基質を含む融合タンパク質のアミノ酸配列である。
MRGSHHHHHHGSDLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNAKDEYGLTPLYLATAHGHLEIVEVLLKNGADVNAVDAIGFTPLHLAAFIGHLEIAEVLLKHGADVNAQDKFGTAFDISIGNGNEDLAEILQKLGGGLNDIFEAQKIEWHE#
【発明を実施するための形態】
【００３９】
Ｉ．用語
特に断りのない限り、専門用語は従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Oxford University Pressより刊行されたBenjamin Lewin, Genes V, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Blackwell Science Ltd.より刊行されたKendrewら (編), The Encyclopedia of Molecular Biology, 1994 (ISBN 0-632-02182-9); 及びVCH Publishers, Inc.より刊行されたRobert A. Meyers (編), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, 1995 (ISBN 1-56081-569-8)に見出すことができる。特に説明のない限り、本明細書に使用されている全ての専門用語及び科学用語は、本開示が属する当該技術分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。単数用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が特に明白に指示しない限り複数の指示対象を含む。同様に、語「又は（or）」は、文脈が特に明白に指示しない限り「及び（and）」を含むことが意図される。核酸又はポリペプチドに与えられた全ての塩基サイズ又はアミノ酸サイズ、及び全ての分子量又は分子質量値はおおよそであり、説明のために提供されていることがさらに理解されるべきである。本明細書に記載されたものと類似した又は同等の方法及び材料が本開示の実施又は検査において使用され得るが、適切な方法及び材料が下記に記載される。用語「含む（comprise）」は、「含む（include）」を意味する。
【００４０】
本明細書に言及された全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が出典明示により援用される。全てのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、２０１１年６月８日に該データベースに出現するように出典明示により本明細書に援用される。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法、及び例は例証であり、限定することを意図するものではない。
【００４１】
本開示の様々な実施態様の概説を容易にするために、特定の用語の以下の説明が示される。
【００４２】
投与（投与）：被検体に薬剤、例えば、任意の有効な経路によりＨＥＲ２を特異的に結合するモノクローナル抗体を含む組成物を提供する又は与えること。例示的な投与経路には、経口、注射（皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、及び静脈内など）、舌下、直腸、経皮（例えば、局所）、鼻腔内、膣内及び吸入経路が含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
薬剤：目標又は結果を達成するのに有用である物質又は物質の任意の組み合わせ。例えば、タンパク質−タンパク質相互作用を減少又は減少させるのに有用な物質又は物質の組み合わせ。幾つかの実施態様において、薬剤は癌を治療する治療剤などの治療剤である。
【００４４】
抗体：抗原のエピトープ又はその断片のエピトープを特異的に結合する少なくとも１つの軽鎖又は重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドリガンド。抗体には、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２断片、一本鎖Ｆｖタンパク質（ｓｃＦｖ）、及びジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）などの、当該技術分野でよく知られたインタクトな免疫グロブリン及びその変異体が含まれる。ｓｃＦｖタンパク質は、抗体の軽鎖可変領域及び抗体の重鎖可変領域がリンカーにより結合された融合タンパク質であるが、ｄｓＦｖでは、ジスルフィド結合を導入して鎖の結合を安定化するように鎖が変異されている。該用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）及びヘテロコンジュゲート抗体（二重特異性抗体など）などの遺伝子操作形態も含む。Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H. Freeman & Co., New York, 1997も参照のこと。
【００４５】
本明細書に開示された抗体は、既定の標的（又は二重特異性抗体の場合には複数の標的）を特異的に結合する。故に、ＨＥＲ２に特異的に結合する抗体は、ＨＥＲ２、例えばＨＥＲ２を発現する細胞又は組織に実質的に結合する抗体である。当然のことながら、ある程度の非特異的相互作用が抗体と非標的（例えば、ＨＥＲ２を発現しない細胞）の間に生じ得ることが認識される。
【００４６】
典型的には、特異的結合は、抗原を欠くタンパク質又は細胞と抗体より、抗原を有するタンパク質又は細胞と抗体の間にはるかに強い結合をもたらす。特異的結合は典型的には、エピトープを含むタンパク質又は標的エピトープを発現する細胞若しくは組織に、このエピトープを欠くタンパク質又は細胞又は組織と比較して、結合抗体の量（単位時間あたり）の２倍を超える増加（５倍を超える、１０倍を超える、又は１００倍を超える増加など）をもたらす。そのような条件下のタンパク質への特異的結合は、特定のタンパク質に対する特異性に関して選択された抗体を必要とする。様々なイムノアッセイフォーマットは、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体又は他のリガンドを選択するのに適している。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択するのに常套的に使用される。特異的免疫反応性を決定するのに使用することができるイムノアッセイフォーマット及び条件の説明については、Harlow及びLane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York (1988)参照。
【００４７】
ＡＴＰ：アデノシン三リン酸は、細胞において補酵素として使用されるヌクレオシド三リン酸である。
【００４８】
生体試料：ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ及びマイクロＲＮＡを含む）、核酸、タンパク質、ペプチド、及び／又はそれらの組み合わせを含む生体分子を含有する生体標本。幾つかの例において、生体試料は被検体から得られる。他の例において、生体試料は、被検体から得られた生体試料から増殖された細胞培養物を含む細胞培養物である。生体試料には、細胞、組織、並びに血液、血液の誘導体及び画分（血清など）などの体液；及び生検組織又は外科的に除去された組織、例えば非固定組織、凍結組織、又はホルマリン若しくはパラフィンに固定された組織を含むがこれらに限定されない、被検体における疾患（例えば、癌）を検出するのに有用な全ての臨床試料が含まれる。特定の例において、生体試料は、腫瘍を有する又は有することが疑われる被検体；例えば、乳癌、卵巣癌、胃癌又は子宮癌を有する又は有することが疑われる被検体から得られる。幾つかの実施態様において、被検体は、癌腫を有する又は有することが疑われる。
【００４９】
ビオチンリガーゼ：特定の開示された実施態様は、基質をビオチン化することができる、ビオチン−［アセチル−ＣｏＡ−カルボキシラーゼ］リガーゼなどの酵素を使用する。開示された実施態様を実施するのに適した酵素は、ＫＥＧＧエントリhttp://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?ec:6.3.4.15により示されているように、当業者により他の名前によっても呼ばれている。全てのそのような酵素は、本明細書ではまとめてビオチンリガーゼと呼ばれる。ビオチンリガーゼを用いる酵素的ビオチン化は、ビオチンをタンパク質に存在する残基に結合できるようにする。このビオチン化反応は完結することもできる。これは、産物が高い均一性で生成され、既定の配向でストレプトアビジンに結合され得ることを意味する。酵素的ビオチン化は、特定の基質を標的にすることにより最もしばしば達成され、特定の開示された実施態様は、ＡｖｉＴａｇ又はアクセプターペプチド（ＡＰ）などの１５アミノ酸ペプチドを標的にする。適切なビオチンリガーゼの１つの例は、ＢｉｒＡ由来である。大腸菌のビオチンリガーゼ遺伝子は、ビオチンオペロンリプレッサー活性及びビオチンホロ酵素シンテターゼ活性を含有する３５．３ ｋＤａｌ［３２１アミノ酸］二官能性タンパク質を産生する。ビオチンリガーゼは、シュードモナス・ムタビリス（Pseudomonas Mutabilis）を含む他の種からも産生されている。ＢＴＳのビオチンリガーゼＫｄは２５μＭもある。特定の開示された実施態様に関して、ビオチンリガーゼ及びＢＴＳコンジュゲートは約３０ｐＭ（すなわち、該Ｋｄより８００倍超少ない）で使用される。そのようなコンジュゲートを用いる、ＢＴＳへのビオチンリガーゼの結合とは無関係の潜在的標的は、故に極めて最小限となる。
【００５０】
乳癌：悪性である又は悪性である可能性を有する乳房組織の新生物性腫瘍。乳癌の約３０％がＨＥＲ２の過剰発現を示す。ＨＥＲ２の過剰発現は、疾患再発の増加及びより不良の予後を伴う。乳癌（breast cancer）の最も一般的なタイプは、乳管癌などの乳癌（breast carcinoma）である。非浸潤性乳管癌は、乳管の非浸潤性の新生物性状態である。小葉癌は浸潤性疾患ではないが、癌腫が進展し得る指標である。浸潤性（悪性）乳癌は、病期に分けられる（Ｉ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、及びＩＶ）。例えば、Bonadonnaら（編）, Textbook of Breast Cancer: A Clinical Guide the Therapy, 3rd; London, Tayloy & Francis, 2006参照。
【００５１】
バッファー：バッファー溶液は、生物系及び化学系にとって正しいｐＨレベルを維持するのに一般に使用される。本明細書に開示された例示的な実施態様の多くは、バッファー溶液を使用することを含む。バッファー中に存在してもよい代表的な緩衝剤又は緩衝塩には、トリス、トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＡＰＳ、ビシン、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジル酸塩、ＳＳＣ、ＭＥＳ、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、酢酸カリウム、酢酸ＮＨ４、グルタミン酸カリウム、ＮＨ４Ｃｌ、硫酸アンモニウム、ＭｇＣｌ２、酢酸マグネシウム等が含まれるが、これらに限定されない。１つの好ましいバッファー溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。別の好ましいバッファー溶液は、ビオチンリガーゼ反応バッファー（０．１Ｍ ＫＣｌ、５．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）、０．０５％ Ｂｒｉｊ−３５、０．１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、３ｍＭ ＡＴＰ、及び６０μＭビオチン）である。緩衝剤の量は典型的には、約５から１５０ｍＭ、通常は約１０から１００ｍＭ、及びより通常は約２０から５０ｍＭの範囲となろう。特定の好ましい実施態様において、緩衝剤は約６．０から約９．５の範囲のｐＨ、より典型的には室温で約６．５から約７．４のｐＨ範囲を提供するのに十分な量で存在するであろう。緩衝媒体に存在してもよい他の薬剤には、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ等などのキレート剤が含まれる。
【００５２】
化学療法剤：異常な細胞増殖を特徴とする疾患の治療において治療的有用性を有する任意の化学剤。例えば、化学療法剤は、乳癌を含む癌の治療に有用である。１つの実施態様において、化学療法剤は放射性化合物である。別の例には、ラパチニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤が含まれる。特定の例において、そのような化学療法剤は、ＨＥＲタンパク質のホモ又はヘテロ二量体化を減少又は低減させる治療とと組み合わせて投与される（例えば、ＨＥＲ２に特異的に結合する一若しくは複数の抗体又はそのコンジュゲートの治療的に有効量の投与前、投与中、投与後に）。当業者は、有用な化学療法剤を容易に同定することができる（例えば、Slapak及びKufe, Principles of Cancer Therapy, Chapter 86 in Harrison's Principles of Internal Medicine, 14th edition; Perryら, Chemotherapy, Ch. 17 in Abeloff, Clinical Oncology 2nd. ed., Copyright 2000 Churchill Livingstone、Inc; Baltzer, L., Berkery, R.（編）: Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2nd. ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1995; Fischer, D.S., Knobf, M.F., Durivage, H.J.（編）: The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1993;Chabner及びLongo, Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principles and Practice（4th ed.）. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins、2005; Skeel,. Handbook of Cancer Chemotherapy（6th ed.）. Lippincott Williams & Wilkins、2003参照）。併用化学療法は、癌を治療するための１つを超える薬剤の投与である。
【００５３】
発色染色：発色基質は、免疫組織化学には長年にわたって、及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにはより最近広く使用されている。発色検出は、簡単及び費用効率が高い検出方法を提供する。発色基質は伝統的に、適切な酵素により作用されると沈殿することにより機能してきた。すなわち、伝統的な発色物質は、酵素に接触すると可溶性試薬から不溶性の有色沈殿物に変換される。得られた有色沈殿物は、処理又は可視化のための特別な装置を必要としない。成功裡のＩＨＣ又はＩＳＨ発色基質が共有する幾つかの特質がある。第一に、該物質は、好ましくは極めて高いモル吸光計数で有色物質に沈殿するはずである。酵素基質は高い可溶性及び試薬安定性を有するはずであるが、沈殿された色素原産物は、好ましくは水性溶液及びアルコール溶液の両方において極めて不溶性のはずである。酵素代謝回転速度は、短時間で単一酵素からシグナルを高度に増幅させるために極めて高いはずである。現在までに、これらの特質の全てを確実に有する比較的少数の発色物質が同定されている。発色染色に関する開示については、出典明示によりその全体が本明細書に援用される米国仮特許出願第６１／６１６３３０号及び第６１／７１０６０７号を参照のこと。
【００５４】
コンジュゲート（conjugate）：例えば共有結合又は非共有結合相互作用により連結された２つ以上の分子。コンジュゲートを含む２つの成分は、リンカーを用いて直接結合又は間接的に結合され得る。１つの例において、コンジュゲートは、ビオチンリガーゼに結合された抗体などの、ビオチン化酵素に連結された特異的結合部分を含む。コンジュゲートの別の例は、リンカーにより直接的又は間接的にＢＴＳに連結された抗体などの、ビオチンリガーゼ基質に結合された特異的結合部分である。
【００５５】
コンジュゲート（conjugate(ing)）、結合（join(ing)）、結合（bond(ing)）又は連結（link(ing)）：第１の分子を第２の分子に結合すること。これには、１つの分子と別の分子との共有結合、１つの分子と別の分子との非共有結合（例えば、静電的結合）（例えば、米国特許第６９２１４９６号参照）、水素結合、ファンデルワールス力、及びそのような結合のありとあらゆる組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００５６】
接触（接触）：直接結合、例えば固体、液体又は気体形態で配置すること。
【００５７】
コントロール：生体試料、例えば、１人の患者（又は複数の患者）から得られた生体試料、又は細胞培養物などの、検査試料との比較に使用される試料又は基準。幾つかの実施態様において、検査薬とインキュベートされない細胞培養物は、検査薬とインキュベートされる細胞培養物のコントロールとしての役割を果たす。幾つかの実施態様においてコントロールは、正常な乳房試料などの、１人の健康な患者（又は複数の患者）から得られた試料である（本明細書では「正常な」コントロールとも呼ばれる）。幾つかの実施態様においてコントロールは、歴史的コントロール又は基準値（すなわち、以前に検査されたコントロール試料又はベースライン若しくは正常値を示す試料群）である。幾つかの実施態様においてコントロールは、複数の患者試料から得られた平均値（又は値の平均範囲）を示す基準値である。
【００５８】
結合された（coupled）：直接的又は間接的に互いに結合された２つ以上の分子。第１の原子又は分子は、第２の原子又は分子に直接結合又は間接的に結合され得る。二次抗体は、抗原に結合された一次抗体に結合されるとき、該抗原に間接的に結合される。
【００５９】
減少（decrease）又は低減（reduce）：何かの質、量、又は強度を低減させること。例えばタンパク質−タンパク質相互作用の低減。１つの例において、薬剤は、薬剤の非存在下のＨＥＲタンパク質のホモ又はヘテロ二量体化と比較して、生体試料（例えば被検体から得られた生体試料又は細胞培養物）中のＨＥＲタンパク質のホモ又はヘテロ二量体化を低減させる。特定の例において、薬剤は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の減少など、ＨＥＲタンパク質のホモ又はヘテロ二量体化を減少させる。そのような減少は、本明細書に開示された方法を用いて測定することができる。
【００６０】
検出（detecting）：何かの存在（existence）、発生、存在（presence）、又は事実を同定すること。一般的な検出方法は当業者に公知であり、本明細書に開示された手順及び試薬で補完することができる。例えば、本明細書に含まれるのは、生体試料中の第２の標的に近位の第１の標的を検出する方法である。
【００６１】
診断：徴候、症状及び／又は様々な検査の結果により疾患を同定するプロセス。そのプロセスを通じて下された結論もまた「診断」と呼ばれる。一般的に行われる検査の形態には、血液検査、医用画像、遺伝子解析、尿検査、生検、及び被検体から得られた生体試料の分析が含まれる。
【００６２】
診断的に有意な量：ある患者集団と別の患者集団との区別（ＨＥＲ２ホモダイマーの発現が高い乳癌を有する被検体と、ＨＥＲ２ホモダイマーの発現が低い又は発現がない乳癌を有する被検体との区別など）を可能にするのに十分な、測定可能な特徴の増減。本明細書に提供された第２の標的に近位の第１の標的の検出方法は、ＨＥＲタンパク質のヘテロ及びホモ二量体化がいかに検出され得るかの１つの例である。
【００６３】
有効量：単独、又は一若しくは複数のさらなる薬剤と一緒に、ＨＥＲ２との検出可能な免疫複合体の形成又は生体試料中のＨＥＲ２ホモ二量体化の減少などの所望の応答を誘導する薬剤（ＨＥＲ２特異的抗体又はＨＥＲ２特異的抗体を含むコンジュゲートなど）の量。
【００６４】
ＦＦＰＥ：ホルマリン固定パラフィン包埋試料。
【００６５】
ハプテン：ハプテンは分子、典型的には抗体と特異的に結合することができる小分子であるが、典型的には、担体分子との併用以外に実質的に免疫原性となることはできない。ジニトロフェニル、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、ローダミン、又はそれらの組み合わせなどの多くのハプテンが知られており、分析手順に頻用される。オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ニトロアリール、ベンゾフラン、トリテルペン、尿素、チオ尿素、ロテノイド、クマリン、シクロリグナン、及びそれらの組み合わせから選択されるハプテンを含む他のハプテンが、本出願の出願者、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．により特に開発されている。ハプテンの特定のハプテン例には、ベンゾフラザン、ニトロフェニル、４−（２−ヒドロキシフェニル）−１Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］ジアゼピン−２（３Ｈ）−オン、及び３−ヒドロキシ−２−キノキサリンカルバミドが含まれる。複数の種々のハプテンは、ポリマー担体に結合することができる。さらに、ハプテンなどの化合物は、ＮＨＳ−ＰＥＧリンカーなどのリンカーを用いて別の分子に結合することができる。
【００６６】
ヒト上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ）：少なくともＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４（別名、それぞれＥＧＦＲ１、ＥＧＦＲ２、ＥＧＦＲ３及びＥＧＦＲ４、又はそれぞれＥｒｂＢ−１、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３及びＥｒｂＢ−４）を含む、構造的に関連するタンパク質のファミリー。ＨＥＲ１、ＨＥＲ２及びＨＥＲ４は、受容体チロシンキナーゼである。ＨＥＲ３はＨＥＲ１、ＨＥＲ２及びＨＥＲ４と相同性を共有するが、ＨＥＲ３は不活性キナーゼである。ＨＥＲファミリーに含まれるのは、ＨＥＲ２細胞外ドメインの部分を欠く切断型ＨＥＲ２、ｐ９５である（例えば、Arribasら, Cancer Res., 71:1515-1519, 2011; Molinaら, Cancer Res., 61:4744-4749, 2001参照）。「ＨＥＲタンパク質（HER protein又はa HER protein）」は、少なくともＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４及びｐ９５を含むＨＥＲタンパク質のファミリーを指す。
【００６７】
ＨＥＲタンパク質は細胞増殖を媒介し、多くのタイプの癌において調節不全である。例えばＨＥＲ１及びＨＥＲ２は、多くのヒト癌においてアップレギュレートされ、その過剰なシグナル伝達は、これらの腫瘍の進展及び悪性度における重要な要因となり得る。受容体二量体化は、受容体リン酸化及び下流のシグナル伝達の形質導入をもたらすＨＥＲ経路活性化に不可欠である。ＨＥＲ１、３及び４とは異なり、ＨＥＲ２はリガンドがわかっておらず、その二量体化ドメインが他のリガンド活性化ＨＥＲ受容体との相互作用に曝露されるオープン構造と見なされている（例えば、Herbst, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 59:21‐6, 2004; Zhangら, J. Clin. Invest. 117（8）: 2051‐8, 2007参照）。
【００６８】
乳癌の約３０％は、ＨＥＲ２遺伝子の増幅又はそのタンパク質産物の過剰発現を有する。ＨＥＲ２過剰発現は、卵巣癌、胃癌、及び子宮漿液性子宮内膜癌などの生物学的に攻撃的な形態の子宮癌などの他の癌タイプでも生じる。例えば、Santinら, Int. J. Gynaecol. Obstet., 102 (2): 128‐31. 2008参照。ＨＥＲ２含有ホモ及びヘテロダイマーは、形質転換受容性タンパク質複合体である。ＨＥＲ２ホモ二量体化を防ぐヒト化抗体、トラスツズマブは、乳癌を含む特定のＨＥＲ２過剰発現癌を治療するのに使用される。さらに、癌組織におけるＨＥＲ２発現レベルは、ＨＥＲ２治療抗体（例えば、トラスツズマブ）に対する患者の応答を予測する。その予後的役割及びトラスツズマブに対する応答を予測するその能力のため、腫瘍（例えば、乳癌に関連する腫瘍）はＨＥＲ２の過剰発現について常套的にチェックされる。
【００６９】
ＨＥＲ経路は、卵巣癌の病因にも関与する。多くの卵巣腫瘍試料は、全てのＨＥＲタンパク質を発現する。ＨＥＲ１及びＨＥＲ２の共発現は、正常な卵巣上皮より卵巣癌でしばしば見られ、両方の受容体の過剰発現は不良な予後と相関する。ＨＥＲ２（ＨＥＲ１／ＨＥＲ２、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３）との好ましい二量体化、及び受容体リン酸化によるその後の経路活性化も、ＨＥＲ２過剰発現の非存在下でさえ卵巣腫瘍細胞増殖を駆動することが示されている。ＨＥＲ２二量体化（ＨＥＲ２自体及びＨＥＲ３との）を防ぐヒト化抗体、ペルツズマブは、ＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３過剰発現卵巣癌を有する患者に治療効果をもたらすことが示されている。
【００７０】
ＨＥＲ１アミノ酸配列の例には、ＮＣＢＩ／Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５２１９、ＣＡＡ２５２４０、ＡＡＴ５２２１２、ＡＡＺ６６６２０、ＢＡＦ８３０４１、ＢＡＨ１１８６９、ＡＤＺ７５４６１、ＡＤＬ２８１２５、ＢＡＤ９２６７９、ＡＡＨ９４７６１が含まれ、その全てが、２０１１年１０月２７日にＧｅｎｂａｎｋに提供されているように、出典明示により本明細書に援用される。ＨＥＲ２、アミノ酸配列の例には、ＮＣＢＩ／ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＢＡＪ１７６８４、Ｐ０４６２６、ＡＡＩ６７１４７、ＮＰ＿００１００５８６２、ＮＰ＿００４４３９、ＡＡＡ７５４９３、ＡＡＯ１８０８２が含まれ、その全てが、２０１１年１０月２７日にＧｅｎｂａｎｋに提供されているように、出典明示により本明細書に援用される。ＨＥＲ３アミノ酸配列の例には、ＮＣＢＩ／Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１９７３、Ｐ２１８６０、ＡＡＨ８２９９２、ＡＡＨ０２７０６、ＡＡＡ３５９７９が含まれ、その全てが、２０１１年１０月２７日にＧｅｎｂａｎｋに提供されているように、出典明示により本明細書に援用される。ＨＥＲ４アミノ酸配列の例には、ＮＣＢＩ／Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号、ＡＡＩ４３７５０、Ｑ１５３０３、ＮＰ＿００５２２６、ＮＰ＿００１０３６０６４、ＡＡＩ４３７４８が含まれ、その全てが、２０１１年１０月２７日にＧｅｎｂａｎｋに提供されているように、出典明示により本明細書に援用される。
【００７１】
免疫複合体：可溶性抗原への抗体の結合は免疫複合体を形成する。免疫複合体の形成は、当業者に公知の従来の方法、例えば免疫組織化学、免疫沈降、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡、ＥＬＩＳＡ、イムノブロッティング（すなわち、ウェスタンブロット）、磁気共鳴画像、ＣＴスキャン、Ｘ線、及び親和性クロマトグラフィーにより検出することができる。選択された抗体の免疫学的結合特性は、当該技術分野でよく知られた方法を用いて定量することができる。
【００７２】
リンカー：コンジュゲートの２つの成分は、結合を通じて直接又はリンカーにより間接的に結合される。典型的には、リンカーは二官能性であり、すなわち、リンカーは各末端に官能基を含み、官能基は、リンカーを２つのコンジュゲート成分に共有又は非共有結合するのに使用される。２つの官能基は同じであってもよく（すなわちホモ二官能性リンカー）、又は異なっていてもよい（すなわちヘテロ二官能性リンカー）が、より典型的にはヘテロ二官能性である。リンカーが使用される場合、適切な官能基は、コンジュゲートの２つの成分の結合を可能にし、一方で成分の官能性を損なわないように選択される。目的とするリンカーは、コンジュゲートの成分に応じて極めて広く異なり得る。多くの実施態様においてリンカーは、存在する場合、生物学的に不活性である。
【００７３】
新生物（neoplasia）、癌又は腫瘍：新生物（neoplasm）は、過剰な細胞分裂から生じる組織又は細胞の異常な増殖である。新生物増殖は腫瘍を生じ得る。個体における腫瘍の量（amount）は、腫瘍の数、体積、又は重量として測定することができる「腫瘍量（tumor burden）」である。転移しない腫瘍は「良性」と呼ばれる。周囲組織に浸潤し及び／又は転移し得る腫瘍は、「悪性」と呼ばれる。
【００７４】
同じ組織タイプの腫瘍は、特定の臓器（結腸、皮膚、乳房、前立腺、膀胱又は肺など）に由来する原発腫瘍である。同じ組織タイプの腫瘍は、種々のサブタイプの腫瘍に分類することができる。例えば、肺癌は、腺癌、小細胞、扁平上皮、又は非小細胞腫瘍に分類することができる。
【００７５】
肉腫（結合組織癌）及び癌腫（上皮細胞癌）などの固形腫瘍の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、及び他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸直腸癌、リンパ性腫瘍、膵臓癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺腫内癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫、 脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、精上皮腫、膀胱癌、及びＣＮＳ腫瘍（神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫など）が含まれる。
【００７６】
核酸：ホスホジエステル結合を介して結合されたヌクレオチド単位（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、関連する天然構造変異体、及びそれらの合成非天然アナログ）から成るポリマー、関連する天然構造変異体、及びそれらの合成非天然アナログ。故に、該用語は、ヌクレオチド及びヌクレオチド間の結合が非天然合成アナログ（例えば及びそれらに限定されることなく、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等などの）を含むヌクレオチドポリマーを含む。そのようなポリヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成装置を用いて合成することができる。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）により表される場合、これは、「Ｕ」が「Ｔ」に取って代わるＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も含むことが理解されよう。
【００７７】
ヌクレオチド：用語は、ピリミジン、プリン若しくはそれらの合成アナログなどの糖に結合された塩基、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）におけるようなアミノ酸に結合された塩基を含むが、これらに限定されない。ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドにおける１単位である。ヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチドにおける塩基の配列を指す。
【００７８】
ヌクレオチド配列を記載するのに従来の概念が本明細書で使用される。すなわち、一本鎖ヌクレオチド配列の左手の末端が５’末端であり、二本鎖ヌクレオチド配列の左手方向は５’方向と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写物へのヌクレオチドの５’から３’の付加の方向は、転写方向と呼ばれる。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は「コード鎖」と呼ばれる。ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡと同じ配列を有し、及びＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’側に位置するＤＮＡ鎖上の配列は、「上流配列」と呼ばれる。ＲＮＡと同じ配列を有し、コーディングＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’側にあるＤＮＡ鎖上の配列は、「下流配列」と呼ばれる。
【００７９】
核酸プローブ：分子ハイブリダイゼーションにより相補配列の存在を検出するのに使用される、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、又は少なくとも３０ヌクレオチド長などのヌクレオチドの短い配列。特定の例においてプローブは、プローブ：標的配列ハイブリダイゼーション複合体の検出を可能にする標識を含む。典型的な標識には、放射性同位体、酵素基質、補助因子、リガンド、化学発光剤又は蛍光剤、ハプテン、及び酵素が含まれる。これらの標識は、プローブに直接結合されてもよく、又はリンカーを介して結合されてもよい。様々な目的に適した標識方法及び標識を選択する際の手引きは、例えば、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、及びAusubelら, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Intersciences (1987)で論じられている。リンカーを核酸プローブに結合するのに適した方法は、当業者によく知られている。例えば、米国特許第５７３３５２３号、及びHermanson, “Bioconjugate Techniques,” Academic Press, San Diego, 1996参照。
【００８０】
プローブは、１０−６０ヌクレオチド、３０−６０ヌクレオチド、２０−５０ヌクレオチド、３０−５０ヌクレオチド、２０−４０ヌクレオチド、又は１０−４０ヌクレオチドなどの標的核酸分子に相補的な、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０又はそれ以上の隣接するヌクレオチドなどの、一般に少なくとも１０ヌクレオチド長である。プローブはまた、最大長、例えば１５、２５、４０、５０、７５又は１００ヌクレオチド長以下であることもできる。当業者は、特定のプローブの特異性がその長さと共に増すことを理解するであろう。
【００８１】
オリゴヌクレオチド：５から１００の間のヌクレオチド塩基長直鎖状ポリヌクレオチド配列。
【００８２】
近位（Proximal）：２つの分子間の質的又は量的距離、例えば、組織試料中の２つのタンパク質間の距離を指す。幾つかの実施態様において、互いに近位にある分子は、互いに少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約７５ｎｍ、少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約３５ｎｍ、少なくとも約３０ｎｍ、少なくとも約２５ｎｍ、少なくとも約２０ｎｍ、少なくとも約１５ｎｍ、少なくとも約１０ｎｍ、少なくとも約５ｎｍ又はそれ以下の距離にある。近位は機能的関係ももたらし得る。例えば、２つの標的（例えば、２つのタンパク質）は、第１の標的が、第１の標的と結合されたビオチンリガーゼが第２の標的と結合された基質のビオチン化を可能にするのに第２の標的から十分な距離にある場合、近位と見なすことができる。近位の別の機能的定義は、２つのタンパク質の二量体化である。近位の別の機能的定義は、遺伝子転座と関連している。ゲノムの２つの部分は、それらが互いに隣接しているとき、又は互いに５００，０００ｂｐ内、１００，０００ｂｐ内、５０，０００ｂｐ内、２５，０００ｂｐ内、１０，０００ｂｐ内、若しくは１，０００ｂｐ内にあるとき、近位と見なすことができる。これは、転座（別の染色体への移動又は逆位のいずれか）のため近位でない２つの部分とは対照的である。
【００８３】
試料：特定の開示された実施態様は生体試料を利用する。生体試料は典型的には、ヒトなどの目的とする哺乳動物被検体から得られる。試料は、生検、剖検及び病理標本からの組織を含むがこれらに限定されない任意の試料であってもよい。生体試料には、組織切片、例えば、組織学的目的で採取された凍結切片も含まれる。生体試料には、細胞培養物又は細胞培養物の部分、例えば、被検体から採取された生体試料から増殖された細胞培養物も含まれる。
【００８４】
生体試料は、当該技術分野で公知の任意の方法を用いて被検体から得ることができる。例えば、組織試料は、治療形態として腫瘍切除を受けた乳癌患者から得ることができる。これらの患者から、腫瘍組織及び周囲の非癌性組織の両方が得られ得る。幾つかの実施態様においてコントロールとして使用される非癌性組織試料は、死体から得られる。幾つかの実施態様において、生体試料は生検により得られる。生検試料は新鮮であっても、凍結されても又は固定（ホルマリン固定及びパラフィン包埋など）されてもよい。試料は、（例えば皮下注射針又は他のタイプの針による）摘出、マイクロダイセクション、レーザーキャプチャー、又は当該技術分野で公知の任意の他の手段により、外科的に患者から取り出すことができる。
【００８５】
幾つかの実施態様において、生体試料は組織試料、例えば、悪性又は良性乳癌腫瘍などの腫瘍と診断された被検体から得られた組織試料である。幾つかの場合において、組織試料は、健康な被検体又は死体ドナーから得られる。「試料」は、組織全体、又は組織の病変部分若しくは健康な部分のどちらかである組織の部分を指す。幾つかの実施態様において、悪性腫瘍組織試料はコントロールと比較される。幾つかの実施態様においてコントロールは、異なる被検体から得られた良性腫瘍組織試料である。幾つかの実施態様においてコントロールは、同じ被検体から得られた、腫瘍に隣接する良性腫瘍などの非癌性組織試料である。他の実施態様においてコントロールは、同じ被検体から得られた、悪性腫瘍を取り囲む非癌性組織などの非癌性組織試料である。他の実施態様においてコントロールは、死体からの非癌性組織試料である。他の実施態様においてコントロールは、歴史的値の平均に基づく標準値又は参照値などの参照試料である。
【００８６】
幾つかの実施態様において生体試料は、腫瘍、例えば癌腫を有する、有することが疑われる、又は発症するリスクがある被検体から得られる。例えば、被検体は乳癌、卵巣癌、子宮癌又は胃癌を有する、有することが疑われる、又は発症するリスクがある。
【００８７】
感度及び特異度：二項分類検定の成績の統計的測定。感度は、正しく同定される実際の陽性の割合（例えば、特定のウイルス由来の核酸を含むと同定される試料のパーセンテージ）を測定する。特異度は、正しく同定される陰性の割合（例えば、特定のウイルス又は細菌由来の核酸などの標的核酸を含まないとして同定される試料のパーセンテージ）を測定する。
【００８８】
配列同一性：２つの核酸配列間の類似性は、配列間の類似性の観点から表され、別名、配列同一性と呼ばれる。配列同一性は、パーセント同一性、類似性、又は相同性の観点からしばしば測定され、より高いパーセント同一性は、より高い程度の配列類似性を示す。
【００８９】
NCBI Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）、Altschulら, J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990は、配列分析プログラム、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘと共に使用するために、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含む幾つかのソースから入手可能である。ＢＬＡＳＴは、ＮＣＢＩウェブサイトを通じてアクセスすることができる。このプログラムを用いて配列同一性を決定する方法の記載も、該ウェブサイト上で入手可能である。
【００９０】
配列全体に満たない配列が配列同一性について比較される場合、ホモログは典型的には、１０−２０アミノ酸の短いウィンドウ上で少なくとも７５％の配列同一性を有し、参照配列に対するそれらの類似性に応じて少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は９５％の配列同一性を有し得る。そのような短いウィンドウ上の配列同一性を決定する方法は、例えばＮＣＢＩウェブサイトに記載されている。
【００９１】
これらの配列同一性範囲は、手引きとしてのみ示される。示された範囲の外にある強く意味のあるホモログが得られる可能性があることは、完全にあり得ることである。
【００９２】
２つの核酸分子が密接に関係していることの代替となるしるしは、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしていることである。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、種々の環境パラメータ下で異なる。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度及びｐＨでの特定の配列の融点温度（Ｔｍ）より約５℃から２０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が、完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度及びｐＨ下の）である。核酸ハイブリダイゼーションの条件及びストリンジェンシーの計算は、Sambrookら;及びTijssen, Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I: Theory and Nucleic Acid Preparation, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Ltd., 1993に見出すことができる。
【００９３】
特異的結合部分（複数可）：特異的結合対のメンバー。特異的結合対は、他の分子への結合を実質的に排除して互いに結合することを特徴とする分子の対である（例えば、特異的結合対は、生体試料中の他の分子との結合対の２つのメンバーのどちらかの結合定数より少なくとも１０−３大きい、１０−４大きい又は１０−５大きい結合定数を有することができる）。本明細書に開示された例示的なコンジュゲートを作成するのに使用される特異的結合部分は、それが標的に対する必要な結合親和性を示す限り、様々な種々のタイプの分子のいずれであってもよい。
【００９４】
特異的結合部分は、小分子又は大分子を含み得る。小分子は、約５０から約１０，０００ダルトン、より典型的には約５０から約５，０００ダルトン、さらにより典型的には約１００から約１０００ダルトンのサイズに及ぶであろう。大分子は、分子量が典型的には約１０，０００ダルトンより大きいものである。小分子は、標的に対する必要な親和性で結合することができるいずれかの分子、典型的には有機分子であり得る。小分子は典型的には、例えば疎水性、親水性、静電又は共有結合相互作用により小分子を標的と相互作用できるようにする一又は複数の官能基を含む。標的がタンパク質、脂質又は核酸である場合、小分子は典型的には、水素結合、疎水性−疎水性相互作用、静電相互作用等などの構造的相互作用を可能にする官能基を含むであろう。小分子リガンドは、アミン、アミド、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル又はカルボキシル基、及び好ましくはこれらの官能基の少なくとも２つをしばしば含む。
【００９５】
小分子は、一又は複数の上記の官能基で置換された環状及び／若しくはヘテロ環状非芳香族構造、並びに／又は芳香族若しくは多環芳香族構造をしばしば含む。同様に有用な小分子は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的アナログ、又はそれらの組み合わせを含む、生体分子の間で見出される構造を含む。
【００９６】
小分子は、合成又は天然化合物のライブラリーを含む多様な供給源から得ることができる天然又は合成化合物に由来し得る。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの調製を含む、多様な有機化合物及び生体分子のランダム合成及び指向性合成のための数多くの方法が利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態での天然化合物のライブラリーが利用可能であり、又は容易に作製される。さらに、天然ライブラリー又は合成的に作製されたライブラリー並びに化合物は、従来の化学的、物理学的及び生化学的手段により容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリーを作製するのに使用することができる。既知の小分子が、構造的アナログを作製するために、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等などの指向性又はランダム化学修飾に供され得る。
【００９７】
そのため、小分子は、コンビナトリアルな手段によって作製された化合物のライブラリー、すなわち化合物多様性コンビナトリアルライブラリーを含む、天然分子又は合成分子のライブラリーから得ることができる。そのようなライブラリーから得られる場合、使用された小分子は、簡便な結合親和性アッセイにおいて標的に対する幾つかの望ましい親和性を示していることになる。コンビナトリアルライブラリー並びにその作製及びスクリーニングの方法は、当該技術分野で公知であり、その開示が出典明示により本明細書に援用される米国特許第５７４１７１３号及び第５７３４０１８号に記載されている。特異的結合部分に関するさらなる情報は、同様に出典明示により本明細書に援用される、出願者の米国特許第７６９５９２９号により提供されている。特異的結合部分は大分子を含み得る。大分子特異的結合部分として特に興味深いのは、抗体、並びにその結合断片及び誘導体又はミメティックである。そのため、特異的結合部分は、モノクローナル又はポリクローナル抗体のいずれかであってもよい。同様に興味深いのは、一本鎖抗体すなわちｓｃＦｖ、又はキメラ抗体若しくはＣＤＲ移植抗体などの他の抗体誘導体などの、組換え的又は合成的に作製された抗体断片又は誘導体である。そのような組換え的又は合成的に作製された抗体断片は、上記の抗体の結合特性を保持する。そのような本発明の抗体断片、誘導体又はミメティックは、その開示が出典明示により本明細書に援用される米国特許第５８５１８２９号及び第５９６５３７１号に開示された方法などの任意の簡便な方法を用いて容易に調製することができる。
【００９８】
同様に大分子特異的結合部分としての使用に適しているのは、ポリ核酸アプタマーである。ポリ核酸アプタマーは、受容体又は抗体と同じ方法ではるかにタンパク質を選択的に結合するＲＮＡオリゴヌクレオチドであってもよく（Conradら, Methods Enzymol. (1996), 267(Combinatorial Chemistry), 336-367）、又は特異的ＤＮＡ標的配列を補完するＤＮＡオリゴマーであってもよい。
【００９９】
抗体ベースのペプチド／ポリペプチド又はタンパク質ベースの結合ドメインに加えて、特異的結合部分はまた、レクチン、その可溶性細胞表面受容体若しくは誘導体、ファージディスプレイ若しくはリボソームディスプレイ又は任意のタイプのコンビナトリアルペプチド若しくはタンパク質ライブラリー由来のアフィボディ又は任意のコンビナトリアル由来タンパク質若しくはペプチドであってもよい。任意の特異的結合部分の組み合わせが使用されてもよい。
【０１００】
重要には、特異的結合部分は、標的に対する特異的結合部分の結合親和性に実質的に影響を与えずに、コンジュゲートの第２の成分、又はリンカーへの結合を可能にするものとなろう。
【０１０１】
特異的結合部分の特定の例には、特異的結合タンパク質（例えば、抗体、レクチン、ストレプトアビジンなどのアビジン、及びプロテインＡ）が含まれる。特異的結合部分（複数可）はまた、そのような特異的結合タンパク質により特異的に結合される分子（又はその部分）を含む。
【０１０２】
被検体：ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ヒツジ、ウシ、齧歯類等などの任意の哺乳動物。故に、用語「被検体」は、ヒト及び獣医学的被検体の両方を含む。１つの例において、被検体は、ＨＥＲ＋腫瘍を有することが知られる又は疑われる被検体である。別の例において、被検体は、ペルツズマブ又はトラスツズマブなどのＨＥＲに特異的な抗体による治療が検討されている被検体である。
【０１０３】
標的：存在、位置及び／又は濃度が決定される、又は決定することができる任意の分子。標的分子の例には、タンパク質及びタンパク質に共有結合されたハプテンなどのハプテンが含まれる。標的分子は典型的には、特異的結合分子及び検出可能な標識の一又は複数のコンジュゲートを用いて検出される。特定の標的の例には、タンパク質、炭水化物、又は核酸分子が含まれる。例示的なタンパク質標的には、ｐ９５、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４が含まれる。標的核酸分子には、近接度、再配列、増幅、欠失、検出、定量、定性的検出、又はそれらの組み合わせが探索される分子が含まれる。例えば、標的は、核酸分子の定義された領域又は特定の部分、例えばゲノムの部分（遺伝子又は目的とする遺伝子（又はその部分）を含有するＤＮＡ又はＲＮＡの領域など）であってもよい。核酸分子は、精製された形態である必要はない。様々な他の核酸分子も標的核酸分子と共に存在してもよい。例えば、標的核酸分子は、特定の核酸分子（ＲＮＡ又はＤＮＡを含み得る）であってもよく、少なくともその一部分の増幅（ゲノム配列又はｃＤＮＡ配列の部分など）が意図される。幾つかの例において、標的核酸には、ウイルス核酸分子、又は大腸菌若しくはコレラ菌由来の核酸分子などの細菌核酸分子が含まれる。必要であれば、標的核酸分子の精製又は単離が、市販の精製キット等の使用によるなど当業者に公知の方法により行われ得る。
【０１０４】
治療（treating又はtreatment）：疾患又は疾患に関連した病的状態の徴候又は症状（腫瘍など）を改善する治療的介入（例えば、ＨＥＲ２を特異的に結合する抗体又はそのコンジュゲートの治療的に有効量の投与）。治療は、癌などの寛解又は状態の治癒も誘導することができる。特定の例において、治療は、例えば転移の進展又は原発腫瘍の進展の予防などの腫瘍の完全な進展を阻害することによる腫瘍の予防を含む。予防は、腫瘍の完全な欠如を必要としない。
【０１０５】
腫瘍に関連した徴候又は症状の低減は、例えば、り患しやすい被検体（まだ転移していない腫瘍を有する被検体など）における疾患の臨床症状の発症の遅延、疾患の幾つかの若しくは全ての臨床症状の重症度の低減、疾患のより緩徐な進行（例えば腫瘍を有する被検体の延命による）、疾患の再発回数の低減、健康全般の改善若しくは被検体のウェルビーイングにより、又は特定の腫瘍に特異的な当該技術分野でよく知られた他のパラメータにより証明することができる。
【０１０６】
腫瘍量：被検体における腫瘍（一又は複数）の全体の体積、数、転移、又はそれらの組み合わせ。
【０１０７】
チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）：ペルオキシダーゼ（ホースラディッシュペルオキシダーゼなど）の触媒活性を利用して標的分子（タンパク質又は核酸配列など）の高密度標識をｉｎ ｓｉｔｕで生成する酵素媒介検出方法。ＴＳＡは典型的には、３つの基本的工程を必要とする：（１）標的への特異的結合メンバー（例えば、抗体）の結合と、それに続く第２のペルオキシダーゼ標識特異的結合メンバーとの該特異的結合メンバーの二次検出、（２）ペルオキシダーゼによる標識チラミド誘導体（例えば、ハプテン標識チラミド）の複数コピーの活性化、及び（３）標的の近位にハプテンの沈殿（媒介された拡散及び反応性）をもたらす、ペルオキシダーゼ−標的相互作用部位に近位の残基（例えば、タンパク質チロシン残基のフェノール部分）への得られた高反応性チラミドラジカルの共有結合。ＴＳＡの幾つかの例において、より多くの又はより少ない工程が必要とされる。例えば、ＴＳＡ方法は、シグナルを増加させるために連続的に反復され得る。ＴＳＡの実施方法並びにＴＳＡを実施するための市販のキット及び試薬が利用可能である（例えば、ＴＳＡ（商標）を有するＡｍｐＭａｐ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、カタログ番号７６０−１２１、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＴＳＡキット番号Ｔ−２０９１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ参照）。幾つかの実施態様において、ＴＳＡは提供されたＰＴＤＭの成分である。他の酵素触媒された、ハプテン又はシグナル伝達連結反応性種が利用可能になり得ることから、それらが代わりに使用されてもよい。
【０１０８】
〜に十分な条件下（under conditions sufficient for）：所望の活性を可能にする任意の環境を記載するのに使用される句。１つの例において所望の活性は、免疫複合体の形成である。別の例において所望の活性は、チラミドとフェノール部分の間の共有結合のペルオキシダーゼ触媒形成、例えば過酸化水素の存在下で生じる触媒である。
【０１０９】
３’末端：末端残基の３’に結合されたヌクレオチドを持たない核酸分子の末端。
【０１１０】
５’末端：末端残基の５’位がヌクレオチドにより結合されていない核酸配列の末端。
【０１１１】
ＩＩ．方法の概要
【０１１２】
特定の開示された実施態様は、少なくとも第１の標的、及び典型的には、互いに十分近くに又は近位に位置する２つの別々に同定可能な標的の検出に関する。該方法は、例えば、生体試料中の近位のタンパク質又は核酸の存在又は非存在を検出するのに有用である。当業者は、核酸標的、炭水化物標的、及びタンパク質標的の組み合わせを含む他の生物学的標的が、開示された検出方法を用いて検出され得ることを認識するであろう。１つの実施態様において、該方法は、癌生検などの生体試料（特にＦＦＰＥ試料）中のＨＥＲタンパク質のヘテロ及びホモ二量体化の存在又は非存在を検出する。さらに開示されるのは、該方法、並びに提供された近位標的検出方法を利用する診断及びスクリーニング方法で使用するためのコンジュゲート及びキットである。
【０１１３】
幾つかの実施態様において、近位標的検出方法は、生体試料中の近位標的に選択的に結合する新規の試薬の組み合わせを使用する。簡単には、目的とする第１の標的がビオチンリガーゼで標識され、第２の標的がビオチンリガーゼに対するペプチド基質で標識される。該方法は、生体試料中の第１の標的及び第２の標的の近接度を決定する工程を含み得る。幾つかの実施態様において、第１の標的はタンパク質であり、第２の標的はタンパク質である。幾つかの実施態様において、第１の標的はｐ９５、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４であり、第２の標的はｐ９５、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４である。
【０１１４】
幾つかの実施態様において、該方法は、第１の標的が第２の標的に近い、又は近位にあることを決定する。例えば、第１の標的は、第２の標的の７５ｎｍ内、５０ｎｍ内、３５ｎｍ内、２５ｎｍ内、１０ｎｍ内又は５ｎｍ内などの（第２の標的の１ｎｍから５０ｎｍ、５ｎｍから５０ｎｍ、又は５ｎｍから２５ｎｍなどの）、生体試料中の第２の標的の約１００ｎｍ未満にあってもよい。
【０１１５】
図１は、標的Ｂと結合されたペプチド基質（本明細書では一般にＢＴＳと呼ばれる）をビオチン化するために標的Ａと結合されたビオチンリガーゼ（例えばＢｉｒＡ由来）を用いる、第１の標的Ａ及び第２の標的Ｂのｉｎ ｓｉｔｕ近接検出に関する１つの開示された実施態様の概略図である。ＢＴＳ−ビオチン産物は、その後、シグナル増幅有り又は無しでのストレプトアビジン−ＨＲＰ又はストレプトアビジン−ＡＰの使用によるなど、記載されているように検出することができる。該方法の特定の実施態様は、ＦＦＰＥ組織におけるタンパク質−タンパク質相互作用の高感度及び特異的検出のために、ビオチンリガーゼ（大腸菌由来の酵素）及び１８アミノ酸長ペプチド基質を利用した。ビオチンリガーゼは、ビオチンの存在下でＢＴＳを効率的にビオチン化することができるが、反応は、図１に描かれているように酵素がＢＴＳと物理的に接触するときにのみ生じ得る。したがって、特定の実施態様においてビオチンリガーゼ及びＢＴＳは、目的とする標的（Ａ及びＢ）をそれぞれ認識する２つの抗体に別々にコンジュゲートされた。目的とする標的が極近接している場合（例えばシグナル伝達リレーの引き金を引く細胞膜上の受容体二量体化）、特異的結合部分コンジュゲートのそれぞれの標的への結合は、ビオチンリガーゼ及びＢＴＳを極近接にし、ビオチン化をもたらす。その後、ビオチン化産物が検出される。
【０１１６】
標的は、抗体により認識されるタンパク質でなくてもよい。代わりに、任意の生体分子、例えば脂質及び核酸が、修飾され及び任意の親和性「結合剤」により認識される場合、開示された近接検出方法用に使用されてもよい。この手法は、癌生物学などの病気において役割を有する近位標的を検出する高感度方法を提供し、これにより新規の洞察及び診断検査を提供して臨床医が患者を治療できるようにする。
【０１１７】
ＩＩＩ．近位標的を検出するためのコンジュゲートプローブ
特定の実施態様には、第１のコンジュゲートが第１の標的Ａを検出するように設計され、第２のコンジュゲートが第２の標的Ｂを検出するのに使用される。第１のコンジュゲートは、特異的結合部分、及び基質分子にプローブを典型的には共有結合する酵素を含む。第２のコンジュゲートは、特異的結合部分、及び酵素の基質を含む。適切な酵素、基質及び補助因子の例には、基質としてＡＰ／ＡｖｉＴａｇ／ＢＴＳを用いるビオチンリガーゼ、並びに補助因子としてのビオチン及びＡＴＰ；補助因子としてＳＮＡＰタグ基質及びＯ６−ベンジルグアニンを用いるＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡ−アルキルトランスフェラーゼ；並びに基質としてＡＣＰタグ及び補助因子としてＣｏＡを用いる４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼが含まれる。
【０１１８】
方法は、ビオチンリガーゼ及びビオチンリガーゼ基質に関して本明細書で説明されている。したがって、ビオチンリガーゼコンジュゲートプローブは、特異的結合部分及び基質をビオチン化する酵素を含む。例示的な実施態様として、ビオチンリガーゼは、特定の標的に対して選択された一次又は二次抗体に共有結合された。標的Ａの近位に位置する、又は標的Ａとのダイマーである若しくはさもなければ標的Ａと空間的に結合された、標的Ｂに特異的な第２プローブ（ビオチンリガーゼ基質プローブ）は、第２の標的Ｂと直接的又は間接的に結合するためのビオチン化基質と第２の特異的結合部分の間のコンジュゲートを含む。
【０１１９】
Ａ．ビオチンリガーゼコンジュゲートプローブ
基質をビオチン化することができるいずれの酵素も、本発明の開示された実施態様による適切なビオチンリガーゼプローブを形成するのに使用することができる。切断されたタンパク質形態も、切断されたタンパク質が酵素活性を保持する限り使用することができる。例えば、アミノ末端にＤＮＡ結合ドメインを欠くタンパク質の切断形態はビオチンリガーゼ活性を保持し、使用することができる。少なくとも６０アミノ酸がＢｉｒＡ由来のビオチンリガーゼから除去され得、依然として酵素活性を保持すると現在は考えられている。酵素的ビオチン化は、ビオチンが特定の残基でタンパク質基質に典型的には共有結合されて、ストレプトアビジンにより検出可能なビオチン化産物を産生できるようにする。
【０１２０】
１．大腸菌由来のビオチンリガーゼ
【０１２１】
特定の開示された実施態様には、ビオチンリガーゼ（ＢｉｒＡ由来）がビオチン及びＡＴＰの存在下で適切な基質をビオチン化するのに使用された。ビオチン−［アセチル−ＣｏＡ−カルボキシラーゼ］リガーゼ（ＥＣ６．３．４．１５）は、以下の反応を触媒する：
ＡＴＰ＋ビオチン＋ａｐｏ−［アセチル−ＣｏＡ：二酸化炭素リガーゼ（ＡＤＰ形成）］
0006576835.tif 000005
ＡＭＰ＋二リン酸＋［アセチル−ＣｏＡ：二酸化炭素リガーゼ（ＡＤＰ形成）
【０１２２】
開示された実施態様を実施するのに有用な酵素の１つの例示的なクラスの系統名は、ビオチン：アポ−［アセチル−ＣｏＡ：二酸化炭素リガーゼ（ＡＤＰ形成）］リガーゼ（ＡＭＰ形成）である。他の一般名には、ビオチン−［アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ］シンテターゼ、ビオチン−［アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ］シンテターゼ、アセチル補酵素Ａホロカルボキシラーゼシンテターゼ、アセチルＣｏＡホロカルボキシラーゼシンテターゼ、ビオチン：アポカルボキシラーゼリガーゼ、ビオチンホロ酵素シンテターゼ、及びＨＣＳが含まれる。
【０１２３】
ビオチンリガーゼは様々な供給源から利用可能である。大腸菌由来のビオチンリガーゼが特定の実施態様に使用された。本出願は、実質的に大腸菌由来のビオチンリガーゼの使用に関して進められるが、当業者は、任意の供給源由来のビオチンリガーゼが使用され得ることを理解するであろう。特定の実施態様には、大腸菌由来のＢｉｒ Ａ遺伝子が、プラスミドｐＢＩＯＴＩＮ ＬＩＧＡＳＥｃｍ由来のＤＮＡテンプレートによるＰＣＲにより増幅された（ビオチンリガーゼは必須遺伝子であるため、いずれの大腸菌ゲノムＤＮＡも同じ目的を果たすことに留意）。５’プライマー配列は、配列番号１として以下に示される：
配列番号１
CATATGGGAAGCGGCCATCACCACCACCATCACGGAGGCGGAGGTTCAGGCTGCAGCAACCTGTCTACCTGTGTGTTGAAGGATAACACCGTGCCAC
【０１２４】
この配列は、ポリヒスチジンタグとそれに続くサケカルシトニン由来のジスルフィド架橋（CSNLSTCVL）を含む。ポリヒスチジンタグは、金属親和性精製による精製を促進し、ジスルフィド架橋は、抗体への化学的コンジュゲーションに使用された。３’プライマー配列は、配列番号２として以下に示される：
配列番号２
GCTGTCGACTTATTTTTCTGCACTACGCAGGGATA
【０１２５】
大腸菌由来のビオチンリガーゼ遺伝子は、以下の実施例１の方法によるビオチンリガーゼを作製するのに使用された。ビオチンリガーゼは、Ｎｉ−ＮＴＡカラムで精製されて１リットルの培養物から約２５ミリグラムを得た。特定の実施態様のための融合タンパク質配列が、配列番号３として以下に示される：
配列番号３
MGSGHHHHHHGGGGSGCSNLSTCVLKDNTVPLKLIALLANGEFHSGEQLGETLGMSRAAINKHIQTLRDWGVDVFTVPGKGYSLPEPIQLLNAKQILGQLDGGSVAVLPVIDSTNQYLLDRIGELKSGDACIAEYQQAGRGRRGRKWFSPFGANLYLSMFWRLEQGPAAAIGLSLVIGIVMAEVLRKLGADKVRVKWPNDLYLQDRKLAGILVELTGKTGDAAQIVIGAGINMAMRRVEESVVNQGWITLQEAGINLDRNTLAAMLIRELRAALELFEQEGLAPYLSRWEKLDNFINRPVKLIIGDKEIFGISRGIDKQGALLLEQDGIIKPWMGGEISLRSAEK
【０１２６】
ビオチンリガーゼ酵素アッセイが、実施例２に記載されているように、精製タンパク質及び抗体コンジュゲートの活性を評価するために開発された。反応産物は分析され、ビオチン化の前後にペプチド基質を検出してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより確認された。
【０１２７】
開示された実施態様を実施するのに適した例示的な酵素のさらなる例には、サーモコッカス・コダカラエンシスＫＯＤ１、サーモコッカス・ジリギーＡＮ１、サーモコッカス・ガンマトレランスＥＪ３、パイロコッカス・アビシＧＥ５、パイロコッカス・ホリコシイＯＴ３、及びＣ型ボツリヌス菌由来のものが含まれる。適切な酵素のこれらのさらなる例の配列は以下の通りである：
２．ビオチンタンパク質リガーゼ［サーモコッカス・コダカラエンシスＫＯＤ１］
配列番号４
MEWNVIRLDEVDSTNEYAKKLIPDVSEGTVVVAKRQTSGRGRKGRAWASPEGGLWMSVILKPPMIDPRLVFVGALAVSDTLRDFGIGAWIKWPNDVWVGNRKISGVLTEVKGDFVIMGVGLNVNNEIPDGLKETATSMMEALGEPVDIGEVLERLLEYLGRWYKTFLENPPLVVEEVRGRTMLIGKEVRVLLDGNDLVGRVITISDDGSLILDVDGQTVKVVYGDVSVRINR
３．ビオチンタンパク質リガーゼ［サーモコッカス・ジリギーＡＮ１］
配列番号５
MWKIIHLDEVDSTNDYAKSIAEESPEGTVVIAKRQTAGKGRKGRSWASPEGGLWMSVILKPERTDPRLVFVGALAVVDTLADFGIKGWIKWPNDVWVEGKKIAGVLTEGKAEKFVVMGIGLNVNNPVPEGLEREATSMIYHTGMELPLDSVLDRLLFHLGGWYGVYKERPELLVEKLRQRTFILGKAVRVTEDDKTIIGRALDVLDDGSLLLEVGGELRRILYGDVSVRPL
４．ビオチンタンパク質リガーゼ［サーモコッカス・ガンマトレランスＥＪ３］
配列番号６
MEWNIITLDEVDSTNEYARRIAPTAPEGTVVVAKRQTAGRGRKGRRWASPEGGLWMTVILKPKSGPEHVTKLVFVGALAVLDTLHEYGIRGELKWPNDVLVDGKKIAGILSECRLNHFALLGIGLNVNNEIPDELRESAVSMKEVLGRAIDLEEVLNRVLRNLSRWYGLFRNGRHGEILKAVKGSSAVLGKRVRIIEDGEIIAEGIAVDIDNSGALILKGEENTVRVLYGDVSLRFS
５．ビオチンタンパク質リガーゼ［パイロコッカス・アビシＧＥ５］
配列番号７
MLGLKTSVIGRTIIYFQEVASTNDYAKAENLEEGTVIVADRQIKGHGRLERKWESPEGGLWMSVVLTPRVSQEDLPKIVFLGALAVVETLREFSIDARIKWPNDVLVNYRKVAGVLVEAKGEKVILGIGLNVNNKVPDGATSMKQELGSEIPMLNVFKTLVKTLDSLYLKFLESPGKILERAKRSMILGVRVKVLSDGEVEAEGIAEDVDEFGRLIVRLDDGRVKKILYGDVSLRFL
６．ビオチンタンパク質リガーゼ［パイロコッカス・ホリコシイＯＴ３］
配列番号８
MLGLKTSIIGRRVIYFQEITSTNEFAKTSYLEEGTVIVADKQTMGHGRLNRKWESPEGGLWLSIVLSPKVPQKDLPKIVFLGAVGVVETLKEFSIDGRIKWPNDVLVNYKKIAGVLVEGKGDKIVLGIGLNVNNKVPNGATSMKLELGSEVPLLSVFRSLITNLDRLYLNFLKNPMDILNLVRDNMILGVRVKILGDGSFEGIAEDIDDFGRLIIRLDSGEVKKVIYGDVSLRFL
７．ビオチンリガーゼ二官能性タンパク質、推定［Ｃ型ボツリヌス菌］
配列番号９
MKEEIISLLKENKDNFISGEKISEKFGITRAAIWKYMKAIKNEGYKIESVSRKGYKLISSPDLLTFQEINPYLTTNYIGKNIMYFNTIDSTNNKAKELGAKDILEGTVVISEEQTGGRGRLGRQWVSPKFKGIWMSIILRPNIEPMEAAKITQIAAAAVCSVIKELGIDVYIKWPNDIVLNNKKICGILTEMSGEINKINYIVLGIGINVNIDKEDFPEYIKDIATSIKIETGLNIQRKELIAKIFNKFEILYDEFINEGTIKKSIEICKGNSALLGKEVKIIRKSTEVFAKALTIAEDGELIVEYDDGKVEKIVSGEVSIRGMYGYV
【０１２８】
適切なコンジュゲートを作成する方法の１つの実施態様が、図２に図式化して示されている。例えば、約２から約２０ＰＥＧ単位、より典型的には２から約１０ＰＥＧ単位、さらにより典型的には４から８ＰＥＧ単位を有するＰＥＧリンカーを含むヤギ抗ウサギ：ビオチンリガーゼコンジュゲートが作成された。反応前、ＰＥＧリンカーは一方の末端にマレイミド官能基、及び他方の末端にＮＨＳエステルを有し、これにより式ＭＡＬ−ＰＥＧ８−ＮＨＳを有した。抗体−リンカーコンジュゲートは、ＮＨＳエステル官能性により抗体をリンカーに結合して作成された。ビオチンリガーゼ−ＳＳは、反応性スルフヒドリル基を形成するために低減された。低減されたビオチンリガーゼ酵素は、スルフヒドリル基とペンダントマレイミド基の間の反応によりヤギ抗ウサギ：ビオチンリガーゼコンジュゲートを形成するために、抗体−リンカーコンジュゲートと結合された。コンジュゲートは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ １０／３０ゲルを用いてＧＥ ＡＫＴＡ ＦＰＬＣで精製された。タンパク質は、ＰＢＳ（１０ｍＭホスフェート、ｐＨ＝７．４）を用いて溶出された。この合成に関するさらなる詳細は、実施例３に提供されている。この手順は典型的には、１−３ビオチンリガーゼ：１抗体の結合をもたらした。
【０１２９】
ビオチンリガーゼ−抗ハプテン抗体コンジュゲートは、類似の方法で形成することができる。例えば、マウス抗ニトロフェニル：Ｂｉｒ Ａコンジュゲートが、ＭＡＬ−ＰＥＧ８−ＮＨＳを用いてこの方法で形成された。他のＩｇＧとのコンジュゲートは、同じ又は類似の条件下で合成された。
【０１３０】
コンジュゲートは、他の適切な方法により作成することができる。例えば、コンジュゲートは、以下に示された４ＦＢ−ＨｙＮｉｃ化学（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）を用いて作成された。
0006576835.tif 000006
【０１３１】
通常、抗体は、以下に示された４ＦＢ−ＮＨＳ（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）を用いて修飾された。
0006576835.tif 000007
【０１３２】
ビオチンリガーゼは、ＨｙＮｉｃ−ＮＨＳ（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）で修飾された。過剰な試薬の除去後、４ＦＢ−Ａｂは、ＨｙＮｉｃ−ビオチンリガーゼと混合されてビオチンリガーゼ−Ａｂコンジュゲートを形成した。反応は１０ｍＭアニリンを用いて触媒された。コンジュゲーション産物は、上記のように精製された。
【０１３３】
コンジュゲートの酵素活性は保持されなければならい。さもなければコンジュゲートは、近位標的検出での使用に適さない。それに応じて、コンジュゲートの活性がアッセイされた。特定の例示的なコンジュゲート活性アッセイの結果は、図４−６に示されている。
【０１３４】
Ｂ．ビオチンリガーゼ基質プローブ
同様に、近位対の標的Ｂに対する第２プローブには、ビオチンリガーゼ基質が、標的Ｂに対する特異的結合親和性について選択された特異的結合部分にコンジュゲートされる。コンジュゲーションは、ビオチンリガーゼ基質及び特異的結合部分を効率的に結合するいずれの方法であってもよいが、最も典型的には共有結合を伴う。
【０１３５】
特定の実施態様について、ペプチド基質ビオチンリガーゼ標的ペプチド配列（ＢＴＳ）は、
配列番号１０
GGSGLNDIFEAQKIEWHEであった。
【０１３６】
ＨｙＮｉｃ部分は、ヒドラゾン化学による化学的コンジュゲーションを促進するためにＮ末端に提供された。他の化学、例えばマレイミド化学によるスルフヒドリル修飾も、適切なコンジュゲートの形成に有用である。ＢＴＳ上の最初の３つのアミノ酸（ＧＧＳ）は、化学的コンジュゲーションのためのリンカーとして機能する。
【０１３７】
ビオチンリガーゼ基質コンジュゲートを作成するための例示的な方法において、抗体は４ＦＢ−ＰＥＧ−ＰＦＰ活性エステル（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ Ｓ−１０３４）と結合された。これらのコンジュゲートに対して、ＰＥＧリンカーは典型的には２から約２０ ＰＥＧ単位、より典型的には２から約１０ ＰＥＧ単位、さらにより典型的には４から８ ＰＥＧ単位を有する。特定の実施態様には、ＰＥＧリンカーはＰＥＧ４リンカーであった。混合物は精製され、ＨｙＮｉｃ標識ＢＴＳ（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｉｎｃ．製）が精製４ＦＢ−Ａｂに添加され、得られたコンジュゲートは、ＶＩＶＡＳＰＩＮフィルターを用いて精製された。ＢＴＳ対抗体の比は、２８０ｎｍ（Ａｂ）及び３５０ｎｍの吸光度（４ＦＢ−ＨｙＮｉｃ反応から形成されたヒドラゾン結合）を測定して決定された。典型的には、この合成法は、１抗体あたり２から約５ ＢＴＳ分子を提供した。このプロセスに従って作成されたコンジュゲートの例には、ヤギ抗ウサギ−ＢＴＳ、ヤギ抗マウス−ＢＴＳ、マウス抗ベンゾフラザン−ＢＴＳ、及びマウス抗ニトロフェニル−ＢＴＳが含まれる。
【０１３８】
Ｃ．リンカー
第１及び第２の両方のプローブに関して、ビオチンリガーゼ及びビオチンリガーゼ基質は、原子に干渉することなく特異的結合部分に直接結合され得る。逆に、第１及び第２プローブの１つ又は両方は、ビオチンリガーゼ又はリガーゼペプチド基質のどちらかの成分を特異的結合部分に連結する化学的リンカーを含むこともできる。種々の長さのリンカーが、例えば基質をビオチンリガーゼの十分近接にしてビオチン化を可能にするように選択され得る。
【０１３９】
典型的には、化学的リンカーは二官能性である。すなわち、リンカーは各末端に官能基を含み、官能基は、リンカーを２つのコンジュゲート成分に結合するのに使用される。２つの官能基は同じであってもよく（すなわち、ホモ二官能性リンカー）、又は異なっていてもよい（すなわち、ヘテロ二官能性リンカー）が、より典型的にはヘテロ二官能性である。リンカーが使用される場合、そのような基は、コンジュゲートの２つの成分の結合を可能にする一方で、官能性を損なわないように選択され得る。そのような末端官能基には、例として及び限定することなく、アミン、アルコール、チオール、ヒドラジド、カルボニル反応基（アルデヒド、酸及びエステルなど）、ビニルケトン、エポキシド、イソシアネート、マレイミドなど）、付加環化反応し、ジスルフィド結合を形成し、金属又は光反応基に結合することができる官能基が含まれる。特定の例には、第１級又は第２級アミン、ヒドロキサム酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネート、オキシカルボニルイミダゾール、ニトロフェニルエステル、トリフルオロエチルエステル、グリシジルエーテル、ビニルスルホン、及びマレイミドが含まれる。これらの基は、特異的結合部分及び他の所望の化合物への結合を促進する。
【０１４０】
幾つかの実施態様において、リンカーは一般に少なくとも約５０ダルトンであるが、より詳細には少なくとも約１００ダルトンであり、５００ダルトン以上の大きさであってもよい。開示されたコンジュゲートの形成に適したリンカーの第１のクラスは、一又は複数の不飽和部位を有する脂肪族炭化水素鎖、又はアルキル鎖などの脂肪族化合物である。鎖の長さは異なり得るが、典型的には約３０原子の実用上限界を有する。約３０炭素原子より大きい鎖長は、より小さい鎖長を有する化合物より効果が少ないことが証明されている。故に、脂肪族鎖リンカーは典型的には、約１炭素原子から約３０炭素原子の鎖長を有する。しかし、当業者は、特定のリンカーが３０より多い原子を有し、及びコンジュゲートが依然として所望された通りに機能するならば、そのような鎖長は依然として本発明の範囲内であることを理解するであろう。
【０１４１】
１つの実施態様において、リンカーは、非分岐鎖に２つを超える炭素原子を有する、アミノ又はメルカプト炭化水素などの反応基で官能化された直鎖又は分岐アルキル鎖である。例にはアミノアルキル、アミノアルケニル及びアミノアルキニル基が含まれる。あるいは、リンカーは１０−２０炭素長のアルキル鎖であり、Ｓｉ−Ｃ直接結合又はエステル，Ｓｉ−Ｏ−Ｃ，結合（出典明示により本明細書に援用されるＦｏｏｔｅに対する米国特許第５６６１０２８号参照）を通じて結合されてもよい。他のリンカーが利用可能であり、当業者に公知である（例えば、各々が出典明示により本明細書に援用される米国特許第５３０６５１８号、第４７１１９５５号及び第５７０７８０４号参照）。
【０１４２】
本発明を実施するのに有用なリンカーの第２のクラスは、アルキレンオキシドである。アルキレンオキシドは、エチレングリコールなどのグリコールを参照して本明細書に示される。本発明のコンジュゲートは、リンカーの親水性がコンジュゲートの炭化水素鎖と比べて増加される場合、特に有用であることがわかった。当業者は、酸素原子の数が増加するにつれて化合物の親水性も増加し得ることを理解するであろう。故に、本発明のリンカーは典型的には、（−ＯＣＨ２ＣＨ２−）ｎの式（ｎは約２から約２０であるが、より詳細にはｎは約２から約１０、さらにより典型的には約４から約８である）を有し、ＰＥＧ４からＰＥＧ８として表され得る。
【０１４３】
本発明の特定の開示された実施態様を実施するのに有用なヘテロ二官能性ポリアルキレングリコールリンカーなどのリンカーは、各々が出典明示により本明細書に援用される、２００６年４月２８日に出願された米国特許出願第１１／４１３７７８号、「Nanoparticle Conjugates」；２００９年３月１３日に出願された米国出願第１２／３８１６３８号、「Antibody Conjugates」；並びに２０１０年１月１４日に出願された米国特許出願第１２／６８７５６４号及び米国特許第７６９５９２９号、「Molecular Conjugate」を含む、本出願者の同時係属出願に記載されている。これらの出願に開示されたリンカーは、特異的結合部分、ビオチンリガーゼ、ビオチンリガーゼ基質、シグナル生成部分、及びハプテンをありとあらゆる所望の組み合わせで連結して、本発明の開示された実施態様で使用するためのコンジュゲートを形成するのに使用することができる。
【０１４４】
リンカーの他の例には、天然及び非天然ポリペプチド、炭水化物、ヘテロ原子を含有する可能性があり得る環状又は非環状系を含むペプチドが含まれるが、これらに限定されない。リンカー基はまた、金属イオンの存在が２つ以上のリガンドを統合して複合体を形成するように金属に結合するリガンドも含むことができる。別の実施態様においてリンカーは、互いに対する高い親和性を有する分子対である。そのような高親和性分子には、例えば、ストレプトアビジンとビオチン、ヒスチジンとニッケル（Ｎｉ）、及びＧＳＴとグルタチオンが含まれる。
【０１４５】
特定の例示的なリンカーには、エチレングリコール、ＰＥＧ２、ＰＥＧ３、ＰＥＧ４、ＰＥＧ５、ＰＥＧ６、ＰＥＧ７、ＰＥＧ８、ＰＥＧ９、ＰＥＧ１０、ＰＥＧ１１、ＰＥＧ１２、ＰＥＧ１３、ＰＥＧ１４、ＰＥＧ１５、ＰＥＧ１６、ＰＥＧ１７、ＰＥＧ１８、ＰＥＧ１９、ＰＥＧ２０などのポリアルキレングリコール、１，４−ジアミノヘキサン、キシレンジアミン、テレフタル酸、３，６−ジオキサオクタン二酸、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ−二酢酸、１，１’−エチレンビス（５−オキソ−３−ピロリジンカルボン酸）、４，４’−エチレンジピペリジン、スクシンイミジル−６−ヒドラジノ−ニコチンアミド（Ｓ−ＨｙＮｉｃ，ＨｙＮｉｃ−ＮＨＳ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−ホルミルベンゾエート（Ｓ−４ＦＢ，４−ＦＢ−ＮＨＳ）、マレイミドＨｙＮｉｃ（ＭＨＰＨ）、マレイミド４ＦＢ（ＭＴＦＢ）、スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−オクタエチレングリコール］エステル（Ｍａｌ−ＰＥＧ８−ＮＨＳ）、スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＮＨＳ）、４−ＦＢ−ＰＥＧ４−ＰＦＰ、アジドベンゾイルヒドラジド、Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリシルアミノ）ブチル］−３'−［２'−ピリジルジチオ］プロピオンアミド）、ビス−スルホスクシンイミジルスべレート、ジメチルアジピミデート、ジスクシンイミジル酒石酸塩、Ｎ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル［４−アジドフェニル］−１，３’−ジチオプロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート、グルタルアルデヒド、及びスクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）、４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）等が含まれる。
【０１４６】
Ｄ．融合タンパク質
化学的リンカーの代わりに、酵素又はペプチド基質が遺伝子レベルで特異的結合部分に結合されてもよい。例えば、ビオチンリガーゼ及び／又はビオチンペプチド基質が、リンカーを用いてコンジュゲートされるのではなく抗体に融合される融合タンパク質が使用されてもよい。
【０１４７】
ビオチンリガーゼ及び特異的結合部分の配列をコードする融合タンパク質が使用されてもよい。例えば、以下のＤＮＡヌクレオチド配列が、遺伝子合成、ＰＣＲ及びギブソンアセンブリの組み合わせにより作成された。
配列番号１１
ACATATGCGTGGTAGCCACCACCACCATCATCACGGTAGCGATTTGGGTAAGAAATTGCTGGAGGCAGCACGCGCAGGTCAGGATGACGAAGTGCGTATCCTGATGGCGAATGGCGCGGACGTGAACGCTAAAGACGAATACGGCCTGACGCCGCTGTATCTGGCAACCGCCCATGGCCACCTGGAAATCGTTGAAGTCCTGTTGAAAAACGGTGCCGACGTTAATGCTGTTGATGCGATTGGTTTCACCCCGCTGCATCTGGCCGCGTTTATCGGTCACCTGGAGATTGCGGAGGTGCTGCTGAAACACGGTGCGGATGTCAACGCACAGGATAAGTTTGGCACCGCGTTCGACATCAGCATTGGCAACGGCAATGAGGACCTGGCGGAGATTCTGCAAAAGCTGATGAAGGATAACACCGTGCCACTGAAATTGATTGCCCTGTTAGCGAACGGTGAATTTCACTCTGGCGAGCAGTTGGGTGAAACGCTGGGAATGAGCCGGGCGGCTATTAATAAACACATTCAGACACTGCGTGACTGGGGCGTTGATGTCTTTACCGTTCCGGGTAAAGGATACAGCCTGCCTGAGCCTATCCAGTTACTTAATGCTAAACAGATATTGGGTCAGCTGGATGGCGGTAGTGTAGCCGTGCTGCCAGTGATTGACTCCACGAATCAGTACCTTCTTGATCGTATCGGAGAGCTTAAATCGGGCGATGCTTGCATTGCAGAATACCAGCAGGCTGGCCGTGGTCGCCGGGGTCGGAAATGGTTTTCGCCTTTTGGCGCAAACTTATATTTGTCGATGTTCTGGCGTCTGGAACAAGGCCCGGCGGCGGCGATTGGTTTAAGTCTGGTTATCGGTATCGTGATGGCGGAAGTATTACGCAAGCTGGGTGCAGATAAAGTTCGTGTTAAATGGCCTAATGACCTCTATCTGCAGGATCGCAAGCTGGCAGGCATTCTGGTGGAGCTGACTGGCAAAACTGGCGATGCGGCGCAAATAGTCATTGGAGCCGGGATCAACATGGCAATGCGCCGTGTTGAAGAGAGTGTCGTTAATCAGGGGTGGATCACGCTGCAGGAAGCGGGGATCAATCTCGATCGTAATACGTTGGCGGCCATGCTAATACGTGAATTACGTGCTGCGTTGGAACTCTTCGAACAAGAAGGATTGGCACCTTATCTGTCGCGCTGGGAAAAGCTGGATAATTTTATTAATCGCCCAGTGAAACTTATCATTGGTGATAAAGAAATATTTGGCATTTCACGCGGAATAGACAAACAGGGGGCTTTATTACTTGAGCAGGATGGAATAATAAAACCCTGGATGGGCGGTGAAATATCCCTGCGTAGTGCAGAAAAATAACTCGAG
【０１４８】
この配列は、以下のアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードする：
配列番号１２
MRGSHHHHHHGSDLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNAKDEYGLTPLYLATAHGHLEIVEVLLKNGADVNAVDAIGFTPLHLAAFIGHLEIAEVLLKHGADVNAQDKFGTAFDISIGNGNEDLAEILQKLMKDNTVPLKLIALLANGEFHSGEQLGETLGMSRAAINKHIQTLRDWGVDVFTVPGKGYSLPEPIQLLNAKQILGQLDGGSVAVLPVIDSTNQYLLDRIGELKSGDACIAEYQQAGRGRRGRKWFSPFGANLYLSMFWRLEQGPAAAIGLSLVIGIVMAEVLRKLGADKVRVKWPNDLYLQDRKLAGILVELTGKTGDAAQIVIGAGINMAMRRVEESVVNQGWITLQEAGINLDRNTLAAMLIRELRAALELFEQEGLAPYLSRWEKLDNFINRPVKLIIGDKEIFGISRGIDKQGALLLEQDGIIKPWMGGEISLRSAEK#
【０１４９】
配列番号１２に関して、太字はビオチンリガーゼコード配列を識別する。太字でない文字は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料中のＨＥＲ２抗原を結合することが知られる抗Ｈｅｒ２ ＤＡＲＰｉｎの配列である。アミノ末端のヘキサヒスチジン配列は、タンパク質精製を促進する。Zahndら J. Mol. Boil. (2007) 369, 1015-1028。
【０１５０】
別の例は、遺伝子合成、ＰＣＲ及びギブソンアセンブリにより作成された以下のヌクレオチド配列を有するＤＮＡである。
配列番号１３
ATGGCTCAAGTACAACTGCAGCAATCTGGTACAGAGGTAGTTAAACCTGGCGCCTCTGTCAAATTGAGTTGCAAGGCTAGTGGTTACATTTTCACCTCTTATGACATTGACTGGGTTCGTCAAACTCCAGAACAAGGATTGGAATGGATTGGGTGGATCTTTCCTGGTGAGGGCTCTACGGAATACAACGAGAAGTTTAAGGGTAGAGCTACACTTAGTGTCGATAAGTCCTCCTCAACTGCTTACATGGAGCTTACGAGACTTACATCAGAAGATTCAGCCGTGTATTTCTGTGCTAGAGGAGATTACTACCGAAGGTACTTCGACTTATGGGGCCAGGGTACTACTGTGACAGTCAGTTCCGGAGGAGGAGGTTCCGGGGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGATCTGATATTGAGTTGACTCAATCACCCACTATCATGTCCGCTTCTCCTGGTGAAAGAGTTACCATGACATGTTCAGCATCTAGTTCAATCAGATACATCTATTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCTCCTCCCCACGTTTACTGATATACGACACCTCAAATGTTGCATCTGGTGTTCCATCAAGATTTTCTGGATCAGGATCCGGAACAAGTTATTCCCTAACCATAAACAGGATGGAAGCAGAGGATGCTGCCACGTATTACTGTCAAGAGTGGTCTGGCTATCCTTACACCTTTGGTGGTGGGACTAAGTTGGAATTGAAACAGGCCGCTGCAGGGCCCCGTCAAAAGGGCGACACAAAATTTATTCTAAATGCAGGTGGCGGTCTGAACGACATCTTCGAGGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAATAA
【０１５１】
この配列は、以下のアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードする：
配列番号１４
MAQVQLQQSGTEVVKPGASVKLSCKASGYIFTSYDIDWVRQTPEQGLEWIGWIFPGEGSTEYNEKFKGRATLSVDKSSSTAYMELTRLTSEDSAVYFCARGDYYRRYFDLWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPTIMSASPGERVTMTCSASSSIRYIYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNVASGVPSRFSGSGSGTSYSLTINRMEAEDAATYYCQEWSGYPYTFGGGTKLELKQAAAGPRQKGDTKFILNAGGGLNDIFEAQKIEWHE#
【０１５２】
太字は、ビオチンリガーゼによりビオチン化され得るＢＴＳアミノ酸配列を示す。太字でない配列は、モノクロ−ナル抗体Ａ１０Ｂに由来するマウス抗ウサギＳＣＦＶを表す。Shenら Anal. Chem. 2005, 77, 6834-6842。
【０１５３】
同様に、抗ウサギＳＣＦＶがビオチンリガーゼに融合される融合タンパク質が作成されており、配列は以下に示される：
配列番号１５
MAQVQLQQSGTEVVKPGASVKLSCKASGYIFTSYDIDWVRQTPEQGLEWIGWIFPGEGSTEYNEKFKGRATLSVDKSSSTAYMELTRLTSEDSAVYFCARGDYYRRYFDLWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPTIMSASPGERVTMTCSASSSIRYIYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNVASGVPSRFSGSGSGTSYSLTINRMEAEDAATYYCQEWSGYPYTFGGGTKLELKQAAAGPRQKGDTKFILNAMKDNTVPLKLIALLANGEFHSGEQLGETLGMSRAAINKHIQTLRDWGVDVFTVPGKGYSLPEPIQLLNAKQILGQLDGGSVAVLPVIDSTNQYLLDRIGELKSGDACIAEYQQAGRGRRGRKWFSPFGANLYLSMFWRLEQGPAAAIGLSLVIGIVMAEVLRKLGADKVRVKWPNDLYLQDRKLAGILVELTGKTGDAAQIVIGAGINMAMRRVEESVVNQGWITLQEAGINLDRNTLAAMLIRELRAALELFEQEGLAPYLSRWEKLDNFINRPVKLIIGDKEIFGISRGIDKQGALLLEQDGIIKPWMGGEISLRSAEK
【０１５４】
ビオチンリガーゼが太字により示されているのに対し、抗ウサギＳＣＦＶは太字でない。
【０１５５】
以下のアミノ酸配列を有するＤＡＲＰｉｎ融合タンパク質も作成されており、太字のＢＴＳ配列はＤＡＲＰｉｎのＣ末端に融合される。
配列番号１６
MRGSHHHHHHGSDLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNAKDEYGLTPLYLATAHGHLEIVEVLLKNGADVNAVDAIGFTPLHLAAFIGHLEIAEVLLKHGADVNAQDKFGTAFDISIGNGNEDLAEILQKLGGGLNDIFEAQKIEWHE#
【０１５６】
当業者は、ビオチンリガーゼ及び／又はビオチンリガーゼペプチド基質が、重鎖コード領域と軽鎖コード領域の間のスペーサーなどの一本鎖可変断片（ＳＣＦＶ）におけるＮ末端又はＣ末端となり得ることも理解するであろう。当業者は、ビオチンリガーゼ及び／又はビオチンリガーゼペプチド基質が、一方の末端又は両末端に１つを超えるコピーとして存在し得ることも理解するであろう。
【０１５７】
Ｅ．例示的なコンジュゲートの化学式
本発明のコンジュゲートは典型的には、ビオチンリガーゼ又はビオチンリガーゼ基質にコンジュゲートされる特異的結合部分（ＳＢＭ）を含む。本開示の特定の実施態様を記載する第１の一般式は、ＳＢＭ−（リガーゼ又は基質）である。そのような化合物はリンカーも含んでいてもよい。リンカーを有する実施態様は、式ＳＢＭ−リンカー−（リガーゼ又は基質）を満足する。特定の開示されたコンジュゲートの統合された一般式は、故にＳＢＭ−（［リンカー）ｍ−（ビオチンリガーゼ又はビオチンリガーゼ基質）］ｎ（ｍは０から５、及びｎは１から１０である）である。より詳細には、ｍは０から２、及びｎは１から５である。ｍが１より大きい場合、リンカーは複数の異なるサブコンポーネントを含む。例えば、ＳＢＭ及びビオチンリガーゼは両方とも、結合されたリンカーを含み得、リンカーは次いでＳＢＭ及びリガーゼ連結するように反応され得る。
【０１５８】
特定の実施態様において、本開示によるコンジュゲートは、一般構造体ＳＢＭ−（リンカー）ｍ−ビオチンリガーゼ（ｍ＝０から１０、及びより典型的にはｍ＝０から２）を有する。１つの例において、リンカーは、ＰＥＧ２、ＰＥＧ３、ＰＥＧ４、ＰＥＧ５、ＰＥＧ６、ＰＥＧ７、ＰＥＧ８、ＰＥＧ９、ＰＥＧ１０、ＰＥＧ１１、ＰＥＧ１２、ＰＥＧ１３、ＰＥＧ１４、ＰＥＧ１５、ＰＥＧ１６、ＰＥＧ１７、ＰＥＧ１８、ＰＥＧ１９又はＰＥＧ２０などのＰＥＧリンカーを含む。これらの実施態様に関して、ＰＥＧ４は、４つの別個のサブユニットを含むリンカーと対照的に単一のリンカーと見なされる。より特定の実施態様において、ＳＢＭは抗体である。さらにより特定の実施態様において、ビオチンリガーゼはＢｉｒＡ由来である。
【０１５９】
特定の例においてヤギ抗ウサギ（ＧＡＲ）は、ＰＥＧ８リンカーでビオチンリガーゼにコンジュゲートされた。これは、式ＳＢＭ−（リンカー）ｍ−ビオチンリガーゼ（ＳＢＭはＧＡＲであり、リンカーはＰＥＧ８であり、ｍ＝１、リガーゼはＢｉｒＡ由来である）を満足する。
0006576835.tif 000008
【０１６０】
ＰＥＧ８基は、ＰＥＧ鎖の一方の末端のカルボン酸官能基とＧＡＲ上のアミンの間に形成されたアミド結合を通じてＧＡＲに結合される。ＰＥＧ鎖の他方の末端は、ビオチンリガーゼ上の活性スルフヒドリル基に結合する活性マレイミド（ＭＡＬ）基を含む。
【０１６１】
ビオチンリガーゼ−抗体コンジュゲートの別の例は、マウス抗ニトロフェニル−ＰＥＧ８−ビオチンリガーゼなどの抗ハプテン抗体：ビオチンリガーゼコンジュゲートである。
0006576835.tif 000009
【０１６２】
以前の例のように、リンカーは、アミド結合を介して抗体に、及びＭＡＬ基を通じてビオチンリガーゼに結合された。
【０１６３】
さらに別の例は、マウス抗ニトロフェニル（ＭｓｘＮＰ）−４ＦＢ−ＨｙＮｉｃ−ビオチンリガーゼである。
0006576835.tif 000010
【０１６４】
この例においてリンカーは、ＭｓｘＮＰ上のアミンを４−ホルミルベンゾエートで活性化し、及びビオチンリガーゼ上のアミンをＨｙＮｉｃ基で活性化して形成された４ＦＢ−ＨｙＮｉｃである。これらの２つの基が次いで結合されてコンジュゲートを形成する。
【０１６５】
別の例において、本発明の開示された実施態様によるコンジュゲートは、一般構造体ＳＢＭ−（リンカー）ｍ−ビオチンリガーゼ基質（ｍ＝０から１０、より詳細にはｍ＝０から２）を有する。１つの例において、リンカーは、ＰＥＧ２、ＰＥＧ３、ＰＥＧ４、ＰＥＧ５、ＰＥＧ６、ＰＥＧ７、ＰＥＧ８、ＰＥＧ９、ＰＥＧ１０、ＰＥＧ１１、ＰＥＧ１２、ＰＥＧ１３、ＰＥＧ１４、ＰＥＧ１５、ＰＥＧ１６、ＰＥＧ１７、ＰＥＧ１８、ＰＥＧ１９又はＰＥＧ２０などのＰＥＧリンカーを含む。特定の実施態様において、基質はＢＴＳである。
【０１６６】
特定の例においてヤギ抗ウサギ（ＧＡＲ）は、ＰＥＧ４リンカーによりＢＴＳにコンジュゲートされる。これは、式ＳＢＭ−（リンカー）ｍ−基質（ＳＢＭはＧＡＲであり、リンカーはＰＥＧ４であり、ｍ＝１、基質はＢＴＳである）を満足する。
0006576835.tif 000011
【０１６７】
ＰＥＧ４基は、ＰＥＧ鎖の一方の末端のカルボン酸官能基とＧＡＲ上のアミンの間に形成されたアミド結合を通じてＧＡＲに結合される。ＰＥＧ鎖の他方の末端は、ＢＴＳに結合されたＨｙＮｉｃ基に結合された４ＦＢ基で活性化されている。
【０１６８】
別の例は、ヤギ抗マウス（ＧＡＭ）−ＰＥＧ４−ＢＴＳなどの抗抗体：ビオチンリガーゼ基質コンジュゲートである。
0006576835.tif 000012
【０１６９】
以前の例のように、ＧＡＭはアミド結合を介してＰＥＧ４に結合される。ＰＥＧ４は次いで４ＦＢ−ＨｙＮｉｃ化学によりＢＴＳに結合される。
【０１７０】
別の例は、マウス抗ＢＦ（ＭｓｘＢＦ）−ＰＥＧ４−ＢＴＳなどの抗ハプテン抗体：ビオチンリガーゼ基質コンジュゲートである。
0006576835.tif 000013
【０１７１】
抗ハプテン抗体：ビオチンリガーゼ基質コンジュゲートのさらに別の例は、マウス抗ニトロフェニル−ＰＥＧ４−ＢＴＳである。
0006576835.tif 000014
【０１７２】
ＩＶ．標的の検出方法
Ａ．一般的考察
図１は、２つの近位標的を検出するための本発明による方法の１つの実施態様を図式化して示す。２つの標的、Ａ及びＢは、試料中で潜在的に極近接に位置している。試料は、コンジュゲートが標的Ａと結合できるようにする条件下で、ビオチンリガーゼ及び抗Ａ抗体を含む第１プローブコンジュゲートと接触される。試料は、コンジュゲートが標的Ｂと結合できるようにする条件下で結合されたビオチンリガーゼ基質及び抗Ｂ抗体を含む第２プローブコンジュゲートと、同時に又は連続的に接触される。プローブがそれぞれの標的と結合した後、ビオチンリガーゼは、ビオチン化が生じるためには、ビオチンリガーゼ基質に近接した反応距離内になければならない。ビオチン化反応は、ビオチン及びＡＴＰ依存性である。これらの試薬を添加すると、及びビオチンリガーゼ及びビオチンリガーゼ基質が十分に極近接にあるならば、ビオチンリガーゼ基質はビオチン化される。
【０１７３】
Ｂ．モデル系
強制近接アッセイ（force proximity assay）が、ビオチンリガーゼ及びＢＴＳコンジュゲートに関して、コンジュゲートを同じ分子又は同じ分子に連結された異なる分子に結合して行われた。これらのアッセイは、組織スライドにおける様々なビオチンリガーゼコンジュゲートの活性を検査するための、及びＦＦＰＥ組織におけるタンパク質近接性のビオチンリガーゼベ−スのｉｎ ｓｉｔｕ検出の実現可能性を実証するためのモデル系として役立つ。３つのモデル系、すなわち、モデル系１−単一抗体強制近接、モデル系２−ハプテン化抗体強制近接、及びモデル系３−ハプテン標識ＢＳＡが使用された。
【０１７４】
モデル系１は、図３に図式化して示されている。試料中の単一の標的が、標的との結合用に選択されたウサギ抗体などの一次抗体と結合された。２つのコンジュゲートが次いで作成された。第１のコンジュゲートは、ヤギ抗ウサギ抗体：ビオチンリガーゼコンジュゲートであり、第２のコンジュゲートは、ヤギ抗ウサギ抗体：ＢＴＳコンジュゲートであった。試料はこれらの２つのコンジュゲートと接触され、コンジュゲートはウサギ一次抗体と結合された。ビオチンリガーゼ及びビオチンリガーゼ基質の両方と組織上の同じ分子との結合は極近接を誘導し、ビオチンリガーゼ活性部位とＢＴＳとの物理的接触を可能にした。これは、ビオチン及びＡＴＰを添加した際のＢＴＳのビオチン化をもたらした。該反応後のビオチンの存在は、ビオチンリガーゼ及びＢＴＳが、ビオチン化を可能にするのに十分に近い反応近接性にあることを肯定的に示すものであった。
【０１７５】
ビオチンは、任意の既知のプロセスにより検出することができる。図３は、ビオチンとストレプトアビジンの間の特異的結合対を形成するストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートの使用を例示している。ＨＲＰの存在は、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）／Ｈ２Ｏ２染色を用いて検出された。
【０１７６】
このプロセスは、ＦＦＰＥ組織において使用されている。例えば、扁桃組織におけるＫｉ−６７検出は、単一抗体強制近接アッセイを用いて達成されている。扁桃組織は、ウサギ抗Ｋｉ−６７抗体と接触された。試料は次いで、ヤギ抗ウサギ抗体：ビオチンリガーゼコンジュゲート、及びヤギ抗ウサギ抗体：ＢＴＳコンジュゲートを含む第１プローブコンジュゲートと接触された。ＡＴＰの添加は染色をもたらした。これは、ビオチン化基質の存在を示すのに対し、ＡＴＰの非存在下ではそのような染色は見られなかった。
【０１７７】
同様に、ＨＥＲ２は単一抗体強制近接アッセイを用いて検出された。より具体的には、ＨＥＲ２は、Ｃａｌｕ−３異種移植片においてビオチンリガーゼ−ＢＴＳビオチン化を用いて検出された。この場合もやはり、ウサギ抗ＨＥＲ２（４Ｂ５）と結合されたヤギ抗ウサギ抗体：ビオチンリガーゼコンジュゲート及びヤギ抗ウサギ抗体：ＢＴＳコンジュゲートの両方が、ＨＥＲ２検出を可能にするのに使用された。図４は、この検出手順から生じる染色の顕微鏡写真である。これらの結果は、ビオチンリガーゼベ−スのｉｎ ｓｉｔｕ近接アッセイの有用性を実証するさらなる例を提供するものである。
【０１７８】
図５は、ハプテン化抗体実施態様の有用性を確証するのに使用された第２のモデル系を例示する概略図である。極近接は、抗ハプテン及び抗種コンジュゲートを用いて達成され、ビオチンリガーゼによるＢＴＳの成功裡のビオチン化を可能にした。
【０１７９】
図５に関して、試料中の単一の標的が、所望の標的に対して選択的な一次（１０）抗体コンジュゲートと結合された。一次抗体コンジュゲートは、ベンゾフラザンハプテンなどのハプテンにコンジュゲートされたウサギ抗体を含んだ。試料は次いで、マウス抗ベンゾフラザン抗体などの抗ハプテン抗体と接触され、それに続いてヤギ抗ウサギ抗体：ビオチンリガーゼコンジュゲートを含むプローブと接触された。最後に、試料は、ヤギ抗マウス抗体：ＢＴＳコンジュゲートを含むプローブと接触された。このプロセスは、ビオチンリガーゼ及びＢＴＳの両方に同じ標的に結合することを強制し、２つの間の極近接を誘導し、ビオチン及びＡＴＰを添加した際のＢＴＳのビオチン化をもたらした。ビオチンは、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートと、それに続くＤＡＢ／Ｈ２Ｏ２染色を用いて検出された。ＢＴＳのビオチン化を促進するために、ビオチンリガーゼコンジュゲート及びビオチンリガーゼ基質コンジュゲートと組み合わせてハプテン化抗体を使用することの有用性は、陽性染色の観察により確証された。
【０１８０】
図６Ａ及び６Ｂは、ビオチン化により近位に位置する標的の検出を可能にするために、ビオチンリガーゼコンジュゲート及びビオチンリガーゼ基質コンジュゲートと組み合わせて、ハプテンの抗体媒介検出を使用することの有用性を確証する、さらなる第３の実施態様を例示している。図６Ａの例示的な実施態様において、ＢＳＡは、２つのハプテンを極近接に配置するように２つのハプテン（ハプテン１及びハプテン２）で同時に標識された。図６Ａは、試料中の単一の標的と第１のハプテン１及び第２のハプテン２との接触を例示している。試料は次いで、一次ウサギ抗ハプテン１抗体、及び一次マウス抗ハプテン２抗体と接触された。試料は次いで、ヤギ抗ウサギ抗体：ビオチンリガーゼコンジュゲート及びヤギ抗マウス抗体：ＢＴＳコンジュゲートと接触された。このプロセスは、ビオチンリガーゼ及びＢＴＳの両方に、試料上の近位に位置するハプテン１及びハプテン２に結合することを強制し、これによりビオチンリガーゼとＢＴＳの間の極近接を誘導し、ビオチン及びＡＴＰを添加した際のＢＴＳのビオチン化をもたらした。
【０１８１】
図６Ｂは、図６Ａに例示された実施態様のコントロ−ルを図式化して示している。図６Ｂは、第１のＢＳＡ分子とハプテン１との接触、及び第２のＢＳＡ分子とハプテン２との接触を例示している。ＢＳＡ−ハプテン１試料は、ウサギ抗ハプテン１抗体と接触され、それに続いてヤギ抗ウサギ抗体：ビオチンリガーゼコンジュゲートと接触された。ＢＳＡ−ハプテン２試料は、マウス抗ハプテン２抗体と接触され、それに続いてヤギ抗マウス抗体：ＢＴＳコンジュゲートと接触された。この試料へのビオチン及びＡＴＰの添加後、ビオチン化は検出されなかった。図６Ｂの方法において、ＢＳＡは単一のハプテンで別々に修飾され、故に２つのハプテンは同じＢＳＡ分子上になく、図６Ａよりはるかに大きい標的分離距離をもたらした。２つのタイプのハプテン修飾ＢＳＡ分子を共に混合し、及び図６Ａのために例示されたのと同じ検出方を使用してさえ、結合されたビオチンリガーゼとＢＴＳの間の距離は、ビオチン化を可能にするには依然として大き過ぎ、故に陰性染色をもたらした。
【０１８２】
Ｃ．ホルマリン固定パラフィン包埋試料
本発明の特定の開示された実施態様は特に、典型的には自動染色プラットフォームで使用されるようなホルマリン固定パラフィン包埋試料での使用が意図される。したがって、図７により例示されているように、ホルマリン固定パラフィン包埋試料で使用するための本発明の開示された実施態様の有用性を確証するモデル系が開発された。図７に関して、３つの異なるＢＳＡ−ハプテンコンジュゲートが形成された。第１のコンジュゲートは、同じＢＳＡ分子上で近位に位置するハプテン１及びハプテン２を含み、第２のコンジュゲートはＢＳＡ−ハプテン１コンジュゲートを含み、第３のコンジュゲートはＢＳＡ−ハプテン２コンジュゲートを含み、これにより、図６Ａ及び６Ｂに関して記載されたものと類似の３つのコンジュゲートを形成した。スライド上のホルマリン固定パラフィン包埋試料は次いで、これらの３つのコンジュゲートと接触された。第１のハプテンとしてのジニトロフェニル、及び第２のハプテンとしてのジゴキシゲニンで二重ハプテン標識するために、第１のＢＳＡ−ハプテン１／ハプテン２コンジュゲートが、過剰なＤｉｇ−ＮＨＳ（Ｒｏｃｈｅ）、過剰なＤＮＰ−ＰＥＧ８−ＮＨＳ（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）、及び過剰なＭＡＬ−ＰＥＧ８−ＭＡＬ（Ｑｕａｎｔａ）を用いて作成された。この産物は、図７の標識Ｄｉｇ／ＤＮＰ−ＢＳＡである。モノハプテン標識には、それぞれＭＡＬ−ＰＥＧ８−ＭＡＬ（Ｑｕａｎｔａ）を有する過剰なＤｉｇ−ＮＨＳ又はＤＮＰ−ＰＥＧ８−ＮＨＳが添加された。これらの産物は、使用されたハプテンに従って図７のＤｉｇ−ＢＳＡ又はＤＮＰ−ＢＳＡとして標識される。修飾ＢＳＡを産生する全ての３つの反応産物は、Ｚｅｂａミニスピンカラムを用いて精製された。
【０１８３】
ホルマリン固定パラフィン包埋胎盤組織スライドは脱パラフィンされ、抗原賦活は、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ（登録商標）ＸＴ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）染色プラットフォームでスタンダードコンディショニングを用いて行われた。各スライド上の８つの非接触組織切片が、組織の部分を除去して作成された。スライドは次いで、Ｔｒａｕｔ試薬で処理されて組織試料のジスルフィド基をチオールに変換し、チオール化スライドは直ちに使用された。
【０１８４】
次の工程は、チオール化組織試料をＢＳＡコンジュゲートと接触させることであった。４つのＢＳＡ濃度（４μＭ、２μＭ、１μＭ、及び０．５μＭ）が、二重標識ＢＳＡ又はモノハプテン標識ＢＳＡの１：１混合物のいずれかで使用された。全ての濃度に対して、０．５ｍｇ／ｍＬの非修飾ＢＳＡが非特異的結合を阻害するために添加された。二重標識ＢＳＡは次いで、スライドの左カラム中の各組織切片に添加された。４つの総濃度のモノ標識ＢＳＡの混合物がスライドの右カラムに添加され、「Ｍ」として標識された。組織試料上の遊離残留チオール基はクエンチされ、スライドは、いずれの非結合分子も除去するために水で完全にリンスされた。
【０１８５】
スライドは次いで、マウス抗ジゴキシゲニン抗体及びウサギ抗ジニトロフェニル抗体を含む一次抗体コンジュゲートと接触された。試料は次いで、ヤギ抗ウサギ抗体：ビオチンリガーゼコンジュゲート及びヤギ抗マウス抗体：ＢＴＳコンジュゲートを含む第２プローブと接触され、それに続いてビオチン及びＡＴＰが添加された。ビオチン化は、ストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＤＡＢ／Ｈ２Ｏ２染色により検出された。陽性染色は、二重ハプテン標識ＢＳＡについて全ての４つの濃度で観察されたが、混合モノハプテン標識ＢＳＡについては、最高ＢＳＡ濃度でさえ非常にかすかな染色のみが見られた。非常に高いＢＳＡ総濃度で、２つのモノ標識ＢＳＡ分子は極近接となり得、検出され得る。そのような事象の確率は、このモデル系で観察されたようにタンパク質濃度の減少と共に劇的に減少する。二重標識ＢＳＡに関して、いずれのＢＳＡ分子も極めて高い極近接を誘導するのに必要なハプテン含み、ＢＳＡ濃度依存性の実質的な低減をもたらしたため、２つのＢＳＡ分子の極近接は必要とされなかった。これらの結果は、組織中のタンパク質近接をｉｎ ｓｉｔｕ検出するためのビオチンリガーゼ媒介ビオチン化の距離的ストリンジェンシー及び実現可能性をさらに実証した。
【０１８６】
Ｄ．Ｅ−カドヘリン及びβ−カテニン
Ｅ−カドヘリン及びその細胞質結合タンパク質、カテニン、及びｐ１２０は、主要な細胞間接着複合体を形成する。該複合体は、細胞遊走、増殖、及び生存に関与する（例えばＷｎｔ及びＲｈｏ経路のシグナル伝達）。β−カテニンは多機能タンパク質であり、すなわちβ−カテニンは、細胞核へ移動して転写コアクチベーターとして機能することができる。極性化上皮細胞間結合において複合体を形成することが知られるＥ−カドヘリン及びβ−カテニンは、本発明の開示された実施態様によるホルマリン固定パラフィン包埋試料中のタンパク質相互作用のｉｎ ｓｉｔｕ検出を確認するのに使用された。
【０１８７】
３つの ｉｎ ｓｉｔｕ ビオチンリガーゼ近接アッセイが検査された。第１の２つの実施態様は、抗体及び抗体コンジュゲートスカフォールディングに基づいた。近接する２つの標的間の最大距離は、スカフォールドにおける抗体及び抗体コンジュゲートの数により決定された。第３の実施態様は、チラミド増幅を使用して、（１）低発現標的を検出するのに重要であり得る標的シグナルの１つを増幅し、及び（２）組織タンパク質への共有結合前のＴＳＡ反応からの活性化チラミド種の拡散を制限した。チラミドは故に、目的とする標的間の選択的な距離の架橋を可能にする試薬として役立つ。ビオチンリガーゼ−ＢＴＳ反応は、酵素間活性部位とペプチド基質との物理的接触を必要とすることから、ＦＦＰＥ組織中の固定されたタンパク質標的の検出は、標的分子の距離及び未知の配向のため常に達成され得るわけではない。チラミド沈殿プロセスにより達成される柔軟性は、これらの状況において有用である。本開示の特定の実施態様は、第１の標的と第２の標的の間に生じる共有結合又は特異的結合架橋の使用に関するが、ＴＳＡ試薬の使用は、少なくとも１つの標的のシグナル伝達範囲を拡大する（チラミド反応性種の拡散に従って）。そのため、増幅された標的は、複数の第３の標的（例えばハプテン）により置換される。第３の標的の幾つかは、標的間の実効距離が低減されるように、第１の標的により近い組織位置の組織に結合される。これは、本明細書に記載された近接アッセイをより遠い距離にある標的において使用できるようにする。
【０１８８】
図８Ａは、チラミドシグナル増幅等を用いない（図８Ａ）及び用いる（図８Ｂ）近接アッセイの１つの実施態様の略図である。図８Ａは、距離ｄ０により分離された第１の標的（Ａ）及び第２の標的（Ｂ）を示す。第１のコンジュゲート（例えばビオチンリガーゼコンジュゲート）の長さはｄ１として示され、第２のコンジュゲート（例えばＢＴＳコンジュゲート）の長さはｄ２として示される。ｄ０がｄ１及びｄ２、の合計より大きい場合、コンジュゲートは相互作用せず、結果としてシグナルは観察されない。図８（Ｂ）に関して、増幅（例えばチラミドシグナル増幅）は、標的の１つの実効サイズ（（Ｂ）の周囲の点線として示された）を増加させるのに使用され得る。増幅により、第３の標的は第２の標的の近くに沈殿され、それらの第３の標的の幾つかは第２の標的より第１の標的に近くなる。増幅の結果、第１と第２の標的の間の実効距離、ｄ３は低減される。実効距離、ｄ３が、ｄ１及びｄ２の合計より小さい場合、コンジュゲートは効果的に相互作用することができ、シグナルが観察されるであろう。
【０１８９】
試料中のＥ−カドヘリンがウサギ抗Ｅ−カドヘリン抗体と接触される、第１のｉｎ ｓｉｔｕ法が行われた。試料中のβ−カテニンは、マウス抗β−カテニン抗体と接触された。試料は次いで、ヤギ抗ウサギ抗体：ビオチンリガーゼコンジュゲート、及びヤギ抗マウス抗体：ＢＴＳコンジュゲートと接触された。ビオチン及びＡＴＰが試料に添加された。ビオチンの存在は、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート用いてアッセイされ、それに続いてジアミノベンジジン（ＤＡＢ）／Ｈ２Ｏ２染色が行われた。Ｅ−カドヘリン及びβ−カテニンダイマーシグナルは、この実施態様を用いて検出されなかった。これは、抗体スカフォールドがビオチンリガーゼ及びＢＴＳを直接接触させるには、一次抗体により認識されるエピトープ間の距離が大き過ぎることを示している。
【０１９０】
この結果は、ｐ１２０及び、Ｅ−カドヘリンとβ−カテニンの間に位置する他の膜タンパク質に関係している可能性があることが理解される。したがって、第２の検出スキームが行われた。Ｅ−カドヘリン及びβ−カテニンを含む試料が、最初にマウス抗β−カテニン抗体と、それに続いてウサギ抗Ｅ−カドヘリン抗体と接触された。抗抗体−ハプテンコンジュゲートは次いで、マウス抗β−カテニン抗体を検出するのに使用された。具体的には、試料は、ヤギ抗マウス抗体：ベンゾフラザンコンジュゲートと接触された。試料は次いで、抗抗体ビオチンリガーゼコンジュゲート及び抗ハプテン−ＢＴＳコンジュゲートと接触された。より詳細には、試料は、ヤギ抗ウサギ抗体：ビオチンリガーゼコンジュゲート及び抗ベンゾフラザン抗体：ＢＴＳコンジュゲートと接触された。ビオチン及びＡＴＰが添加され、それに続いてストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）／Ｈ２Ｏ２染色が行われた。故に、このスキームと第１のスキームの違いは、ハプテン標識抗抗体の添加である。
【０１９１】
図９Ａ及び９Ｂは、扁桃試料におけるＥ−カドヘリン及びβ−カテニン、及びＡＴＰを添加した際の検出依存性を検出するためのこの実施態様の使用を例示する、得られた染色結果の顕微鏡写真である。以前に論じられた実施態様と比較して、この実施態様によるＥ−カドヘリン及びβ−カテニン複合体の特異的検出は、１つのさらなる抗体（約１０−２０ｎｍ距離）がビオチンリガーゼとＢＴＳの間の距離を埋め、近位に位置するＥ−カドヘリン及びβ−カテニンのビオチン化及び検出を可能にすることを確証するものである。
【０１９２】
この同じアッセイはまた、ビオチンリガーゼビオチン化後、ただしＤＡＢ検出前にＴＳＡ増幅（ＯＰＴＩＶＩＥＷ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ， Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）を用いて行われた。図１０Ａ及び１０Ｂにより例示されている通り、特異的ビオチン化が観察されたが、バックグラウンドシグナルの増加はＡＴＰなしのスライドでは観察されなかった。故に、図１０Ａ及び１０Ｂは、本発明のビオチンリガーゼ反応実施態様の高い特異性をさらに実証している。さらに、この実施態様は、図８Ａ及び８Ｂに図式化して示されているように、ＴＳＡの結果、Ｅ−カドヘリン及びβ−カテニンが効果的により近づくことをさらに確証する。
【０１９３】
第１のコントロ−ル系も、検出されたシグナルがＥ−カドヘリン及びβ−カテニンに特異的であったことを示すのに使用された。コントロ−ルは、非標的結合ビオチンリガーゼとペプチド基質との親和性結合の結果、ビオチン化が生じなかったことを確証するのに使用された。Ｅ−カドヘリン及びβ−カテニンを含む試料は、最初にマウス抗β−カテニン抗体と接触された。しかし、試料は、ウサギ抗Ｅ−カドヘリン抗体と接触されなかった。抗抗体：ハプテンコンジュゲートが、マウス抗β−カテニン抗体を検出するのに次いで使用された。具体的には、試料は、ヤギ抗マウス抗体：ベンゾフラザンコンジュゲートと接触された。試料は次いで、抗抗体：ビオチンリガーゼコンジュゲート及び抗ハプテン：ＢＴＳコンジュゲートと接触された。より詳細には、試料は、ヤギ抗ウサギ抗体:ビオチンリガーゼコンジュゲート及び抗ベンゾフラザン抗体：ＢＴＳコンジュゲートと接触された。ビオチン及びＡＴＰが添加され、それに続いてストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）／Ｈ２Ｏ２染色が行われた。１つの一次抗体（抗Ｅ−カドヘリン）の除去が陰性コントロ−ルとして使用され、得られた染色はなかった。
【０１９４】
第２のコントロ−ル系は、検出されたシグナルがＥ−カドヘリン及びβ−カテニンに特異的であったことを確認するための、試料へのヤギ抗ウサギ：ビオチンリガーゼコンジュゲートの競合的ブロッキングを含んだ。Ｅ−カドヘリン及びβ−カテニンを含む試料は、最初にマウス抗β−カテニン抗体と、それに続いてウサギ抗Ｅ−カドヘリン抗体と接触された。試料は次いで、ヤギ抗マウス：ベンゾフラザンコンジュゲートと接触された。次に、試料は、（１）ヤギ抗ウサギ：ビオチンリガーゼコンジュゲート、（２）競合的ブロッカーとして作用する過剰なヤギ抗ウサギ抗体、及び（３）ヤギ抗マウス：ベンゾフラザンコンジュゲートと接触された。抗抗体：ハプテンコンジュゲートは次いで、マウス抗β−カテニン抗体を検出するのに使用された。ビオチン及びＡＴＰが添加され、それに続いてストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）／Ｈ２Ｏ２染色が行われた。抗Ｅ−カドヘリンに結合しているＧＡＲ−ビオチンリガーゼの、過剰なＧＡＲとの競合的ブロッキングは、より少ないビオチンリガーゼが標的に結合することになるため、検出シグナルを弱めると予想された。染色は図１１に示されている。ヤギ抗ウサギ競合的結合は、ポジティブコントロールよりはるかに弱いシグナルを生じた。
【０１９５】
ＴＳＡ増幅は、ハプテンを標的に隣接して置いて、標的シグナルを増幅し同時にＥ−カドヘリンとβ−カテニンの間の距離を埋めるのに使用された。第１の手法において、Ｅ−カドヘリン及びβ−カテニンを含む試料は、マウス抗β−カテニン抗体及びウサギ抗Ｅ−カドヘリン抗体と接触された。試料は次いで、ヤギ抗マウス：ＨＲＰコンジュゲートと接触された。ＴＳＡが次いで、チラミド−ベンゾフラザンコンジュゲートを用いて行われた。第２のアプロ−チにおいて、Ｅ−カドヘリン及びβ−カテニンを含む試料が、マウス抗β−カテニン抗体及びウサギ抗Ｅ−カドヘリン抗体と接触された。ＴＳＡが次いで行われた。試料は次いで、ヤギ抗ウサギ：ビオチンリガーゼコンジュゲートと、それに続く抗ベンゾフラザン：ＢＴＳコンジュゲートと接触された。ビオチン及びＡＴＰが添加され、試料がストレプトアビジン：ＨＲＰコンジュゲートと接触され、ＤＡＢ／Ｈ２Ｏｓ染色が行われた。
【０１９６】
ＡＴＰの存在下の染色結果は、図１２により示されている。この実施態様は、近位に位置するＥ−カドヘリン及びβ−カテニンを成功裡に検出した。スライドは、チラミド−ベンゾフラザンによるＴＳＡ、１６分間のインキュベーション、及び８分間のＴｙｒ−ＢＦインキュベーションにより作製された。より短いインキュベーション時間は、可視であるがより弱い染色をもたらした。ビオチン化後増幅は、シグナルをさらに増幅するのに使用することができたが、使用されなかった。シグナル強度の時間依存性が増幅工程の間観察された。８分間のインキュベーションと関連するシグナルは、１６分間のインキュベーションと関連するシグナルより弱かった。基本的に、インキュベーション時間が長いほどより強いシグナルを生じることが観察された。特定の理論に限定されるものでないが、インキュベーション時間が長いほど第３の標的数が増加し、シグナル伝達範囲が増大し、これにより２つの標的間の実効距離を低減することが理解される。チラミドシグナル増幅は、反応性チラミド種と反応する利用可能な基の標的の近くのタンパク質をほぼ枯渇させると理解される。そのため、利用可能な組織反応部位の数が激減されることから、反応性チラミド種の拡散距離は時間と共に増加することが予想される。
【０１９７】
近接シグナルは、実施態様２及び３によりＥ−カドヘリンとβ−カテニンの間で検出されたが、実施態様１では検出されなかった。実施態様１からの陰性結果は、抗体及び抗体コンジュゲートスカフォールドが、２つの標的間の距離のためビオチンリガーゼ及びＢＴＳを直接接触させないことを示した。しかし、スカフォールドの拡張により、ビオチンリガーゼ媒介ビオチン化が得られ、検出された。
【０１９８】
Ｅ．ＨＥＲ受容体チロシンキナーゼ
幾つかのヒト癌は、ヒト上皮増殖因子−２（ＨＥＲ２）癌遺伝子の増幅及び過剰発現を特徴とする。ＨＥＲ２は、乳癌との関連で最もよく研究されている。ＨＥＲ２過剰発現は、全ての乳癌の約２５％と関連し、該疾患の攻撃的形態と相関している。これは、ＨＥＲ２誘発性乳癌が、患者における腫瘍ＨＥＲ２の薬理的不活性化により効果的に治療し得ることを示唆するものである。しかし、ＨＥＲファミリーを標的にするチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）は、ＨＥＲ２増幅乳癌を有する患者において限られた臨床活性のみを示し、患者のサブセットに部分的な短期間の奏効のみをもたらす。
【０１９９】
ＨＥＲ２は、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）を含む、受容体チロシンキナーゼのＨＥＲ（又は上皮増殖因子受容体；ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバーである。これらの相同受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン、細胞内チロシンキナーゼドメイン、及びカルボキシル末端シグナル伝達尾部から成る共通の構造を共有している。細胞内シグナルは、受容体二量体化及びリン酸基転移の結果として生成される。ＨＥＲ２を除いて、細胞外ドメインは、リガンド結合により構造的に再構成されなければ二量体化を可能にしない。異なるメンバー間の二量体化は、このファミリーにおけるシグナル伝達の主な形態を成す。
【０２００】
この相互依存は、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３により最もよく例示される。ＨＥＲ２は最も強い触媒キナーゼ活性を有し、その細胞外ドメインはリガンド結合なしで二量体化を可能にする。ＨＥＲ２は、ほとんどの他のファミリーメンバーにとって好ましい二量体化パートナーである。ＨＥＲ３キナーゼドメインは触媒活性を欠く。ＨＥＲ３は、シグナル伝達をヘテロダイマーパートナーに依存する。ＨＥＲ２及びＨＥＲ３の機能は、互いに相補的である。ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ヘテロダイマーは、強いシグナル伝達ダイマーを形成する。ＨＥＲ２及びＨＥＲ３の相互依存的機能は、癌モデルにおけるそれらの挙動から明らかである。ＨＥＲ２は、過剰発現のみにより細胞を形質転換することができる。ＨＥＲ３は単独で細胞を形質転換することはできないが、その共発現はＨＥＲ２形質転換を相乗的に増強する。ＨＥＲ３発現は、ＨＥＲ２増幅乳癌における形質転換の律速である。ＨＥＲ３のノックダウンは、ＨＥＲ２増幅腫瘍における形質転換を戻させ、腫瘍アポトーシスを誘導する。
【０２０１】
ＨＥＲ２及びＨＥＲ３を含む試料は、最初に一次ウサギ抗ＨＥＲ２抗体及び一次マウス抗ＨＥＲ３抗体と接触された。抗抗体：ハプテンコンジュゲートが、次いで一次抗体の１つを検出するのに使用された。具体的には、試料は、ＨＥＲ３の一次抗体を検出するためのヤギ抗マウス抗体：ベンゾフラザンコンジュゲートと接触された。試料は次いで、ＨＥＲ２一次抗体を検出するためのヤギ抗ウサギ：ビオチンリガーゼコンジュゲート、及び抗ベンゾフラザン：ＢＴＳコンジュゲートと接触された。ビオチン及びＡＴＰが添加され、それに続いてストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）／Ｈ２Ｏ２染色が行われた。この実施態様は、ＨＥＲ２：ＨＥＲ３ダイマーを検出しなかった。これは、距離が、この実施態様において使用されたビオチンリガーゼ及びＢＴＳコンジュゲートプローブ系の範囲を超えていたことを示唆している。
【０２０２】
第３の実施態様は、ＨＥＲ２：ＨＥＲ３ダイマーを検出するのに使用された。ＨＥＲ２及びＨＥＲ３を含む試料が、最初に一次ウサギ抗ＨＥＲ２抗体及び一次マウス抗ＨＥＲ３抗体と接触された。抗抗体：酵素コンジュゲートが、次いで一次抗体の１つを検出するのに使用された。具体的には、試料は、ＨＥＲ３の一次抗体を検出するためのヤギ抗マウス抗体：ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートと接触され、それに続いてＴＳＡ及びベンゾフラザン沈殿が行われた。試料は次に、ＨＥＲ２一次抗体を検出するためのヤギ抗ウサギ：ビオチンリガーゼコンジュゲート、及び抗ベンゾフラザン：ＢＴＳコンジュゲートと接触された。ビオチン及びＡＴＰが添加され、それに続いてストレプトアビジン：アルカリホスファターゼコンジュゲート及びアルカリホスファターゼレッドで処理された。
【０２０３】
この検出方法を用いて得られた結果が図１３−１４に例示されている。図１３Ａ及び１３Ｂは、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ＭＤＡ−１７５癌細胞系におけるＡＴＰの存在下（図１３Ａ）、及びＡＴＰの非存在下（図１３Ｂ）の特異的点状ＨＥＲ２：ＨＥＲ３ダイマーシグナルを例示する顕微鏡写真である。図１４Ａ及び１４Ｂは、ＦＦＰＥ ＭＣＦ−７癌細胞系におけるＡＴＰの存在下（図１４Ａ）、及びＡＴＰの非存在下（図１４Ｂ）のＨＥＲ：ＨＥＲ３ ｉｎ ｓｉｔｕ近接検出の染色結果を例示する顕微鏡写真である。これらの結果は、１つの標的の周囲にハプテンを沈殿させるためのＴＳＡの使用が、ＨＥＲ２シグナルを増幅し、かつ２つの膜受容体間の距離を埋めることを実証するものである。
【０２０４】
Ｖ．チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）
幾つかの実施態様は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼ−ション（ＩＳＨ）、免疫細胞化学検出スキーム、及び免疫組織化学（ＩＨＣ）検出スキームに適合する、ペルオキシダーゼベ−スのシグナル増幅系であるＴＳＡを含む。ＴＳＡは、ペルオキシダーゼ酵素の触媒活性を利用して、チラミンにより提供されるようなフェノール部分を「活性化する」。過酸化物の存在下、幾つかのペルオキシダーゼ酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ）は、フェノール化合物の二量体化を触媒する。故に、幾つかの実施態様において、ペルオキシダーゼ触媒活性化は、他のフェノール部分に共有結合し、これによりチラミン、又はチラミン誘導体、残基を固相に共有結合するであろう推定フリーラジカルチラミン誘導体を形成する。固相は、例えば、細胞のタンパク質成分、又は顕微鏡スライドなどの基質に固定化された細胞構造であってもよい。故に、チラミンがホースラディッシュペルオキシダーゼ及び過酸化物（例えば、過酸化水素）の存在下、タンパク質含有試料に添加されるならば、チラミンフェノール基は、チロシンアミノ酸のフェノール部分とダイマーを形成することができる。しかし、所望の標的で又は所望の標的の極近接で、チラミンを試料と特異的に結合させることが望ましい。この目的は、本明細書に記載されているように、酵素を試料中の標的に固定化して達成することができる。
【０２０５】
固定化酵素により活性化されたチラミン分子は、固定化酵素の近位のフェノール部分（例えば、チロシン残基又は別のチラミン部分）と反応し、ダイマーを形成するであろう。例えば、研究はほとんどの活性化チラミン分子は、活性化ペルオキシダーゼの１０ｎｍ内に沈殿され、それらが生成された地点から半径１０ｎｍを超えて沈殿する分子の数は急速に低減することを示している（Bendayan及びMeyer, J. HistoChem. Cytochem., 421-429, 1999）。故に、幾つかの実施態様において、活性化チラミン（又はチラミドコンジュゲート）は、固定化酵素の約５０ｎｍ内、４０ｎｍ内、３０ｎｍ内、２０ｎｍ内、１０ｎｍ内、又は５ｎｍ内などの、固定化酵素の近位に沈殿される。
【０２０６】
ＴＳＡの適切な条件、並びにＴＳＡに使用するのに適切な試薬及びキットは、当業者に公知である（例えば、Bobrowら, J. Immuno. Meth., 125:279-285, 1989；ＴＳＡ（商標）を有するＡｍｐＭａｐ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、カタログ番号７６０−１２１、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ参照）。例えば、適切な条件には、過酸化物（例えば、過酸化水素）を含み、酵素が所望の機能を果たせるようにする塩濃度及びｐＨを有する、反応バッファー又は溶液が含まれる。反応は、酵素に適した温度で行われる。例えば、酵素がホースラディッシュペルオキシダーゼであれば、反応は３５−４０℃で行われ得る。そのような条件下で、チラミドは、試料中のフェノール部分に共有結合する活性形態にチラミドを変換する過酸化物及び酵素と反応する。実施例は、増幅の酵素基質としてチラミドコンジュゲートを使用しているが、他の酵素触媒反応性種が有効性を失うことなく代用されてもよい。他の酵素触媒反応性種を代用するにあたり、生成された種の反応性は特に重要である。特に、反応性がより低い種は反応前のより大きな拡散を可能にし、故に近位と見なされ得るより大きい領域をもたらす。同様に、反応性がより高い種は、標的とより密接に反応し得る。
【０２０７】
ＶＩ．自動方法
本発明の特定の開示された実施態様は、自動染色プラットフォーム、特に、一連の工程において試薬をホルマリン固定パラフィン包埋組織試料に分注する自動染色プラットフォームで使用するために特に適合される。例えば、特定の開示された実施態様は、本出願の出願者、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．から入手可能なＢｅｎｃｈＭａｒｋ（登録商標）ＸＴ染色プラットフォームとの組み合わせにおいて特に有用である。より具体的には、自動染色手順は、現在のＢｅｎｃｈＭａｒｋ（登録商標）ＸＴ ＩＨＣ／ＩＳＨ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｍｏｄｕｌｅでの使用が意図される。Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．製の自動染色プラットフォームに関する情報は、米国特許第７４１０７５３号及び第７６１５３７１号に見出すことができる。これらの特許は、出典明示により本明細書に援用されて、本明細書に記載されたビオチン化実施態様などの染色手順の実施態様を実施するための自動システムの使用に関する情報を提供する。
【０２０８】
ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（登録商標）ＸＴ染色プラットフォームのための１つの例示的な自動手順は、ヤギ抗ウサギ−ビオチンリガーゼコンジュゲートなどの抗抗体：ビオチンリガーゼコンジュゲート、及び抗ベンゾフラザン−ＢＴＳ基質などの抗ハプテン：ＢＴＳコンジュゲートを利用した。ＴＳＡ増幅も、チラミド−ベンゾフラザンコンジュゲートを用いて使用された。自動工程は次の通りであった：１．時限工程をスタート、２．ＥＺ Ｐｒｅｐを選択、３．過剰ＲＢ洗浄物を添加；ＬＣＳ ｄｅｐａｒ、ＴＳＡスタート（２回）；２回目のＴＳＡブロッカーを洗浄、４．スライドを６０℃に加温、５．カバースリップをのせる、６．４分間インキュベート、７．ＥＺＰｒｅｐ Ｖｏｌｕｍｅ Ａｄｊｕｓｔを適用、８．スライドを７５℃に加温、４分間インキュベート、９．スライドをリンス、１０．カバースリップをのせる、１１．４分間インキュベート、１２．ＥＺＰｒｅｐ Ｖｏｌｕｍｅ Ａｄｊｕｓｔを適用、１３．スライドを７５℃に加温、４分間インキュベート、１４．スライドをリンス、１５．カバースリップをのせる、１６．４分間インキュベート、１７．ＥＺＰｒｅｐ Ｖｏｌｕｍｅ Ａｄｊｕｓｔを適用、１８．スライドを７５℃に加温、４分間インキュベート、１９．スライドをリンス、２０．Ｄｅｐａｒ Ｖｏｌｕｍｅ Ａｄｊｕｓｔを適用、２１．カバースリップをのせる、２２．スライドヒーターを停止、２３．ショート−８分間のコンディショニング、２４．スライドをリンス、２５．長いＣｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ ＃１を適用、２６．ＣＣカバースリップ（ロング）をのせる、２７．ＳＳＣ Ｗａｓｈを選択、２８．スライドを９５℃に加温し、８分間インキュベート、２９．マイルド−３０分間のコンディショニング、３０．Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ ＃１を適用、３１．ＣＣミディアムカバースリップＮｏ ＢＢをのせる、３２．スライドを１００℃に加温し、４分間インキュベート、３３．ＣＣミディアムカバースリップＮｏ ＢＢをのせる、３４．Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ ＃１を適用、３５．ＣＣミディアムカバースリップＮｏ ＢＢをのせる、３６．Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ ＃１を適用、３７．ＣＣミディアムカバースリップＮｏ ＢＢをのせる、３８．Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ ＃１を適用、３９．ＣＣミディアムカバースリップＮｏ ＢＢをのせる、４０．Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ ＃１を適用、４１．ＣＣミディアムカバースリップＮｏ ＢＢをのせる、４２．Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ ＃１を適用、４３．ＣＣミディアムカバースリップＮｏ ＢＢをのせる、４４．スタンダード−６０分間のコンディショニング、４５．Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ ＃１を適用、４６．ＣＣミディアムカバースリップＮｏ ＢＢをのせる、４７．Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ ＃１を適用、４８．ＣＣミディアムカバースリップＮｏ ＢＢをのせる、４９．Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ ＃１を適用、５０．ＣＣミディアムカバースリップＮｏ ＢＢをのせる、５１．Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ ＃１を適用、５２．ＣＣミディアムカバースリップＮｏ ＢＢをのせる、５３．Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ ＃１を適用、５４．ＣＣミデ��アムカバースリップＮｏ ＢＢをのせる、５５．短いＣｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ ＃１を適用、５６．ＣＣミディアムカバースリップＮｏ ＢＢをのせる、５７．Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ ＃１を適用、５８．ＣＣミディアムカバースリップＮｏ ＢＢをのせる、５９．スライドヒーターを停止、６０．８分間インキュベート、６１．スライドを反応バッファーでリンス、６２．スライド容量を反応バッファーで調整、６３．カバースリップをのせる、６４．スライドを反応バッファーでリンス、６５．スライド容量を反応バッファーで調整、６６．カバースリップをのせる、６７．スライドを３７℃に加温し、４分間インキュベート、６８．ＵＶ ＩＮＨＩＢＩＴＯＲを一滴加え、８分間インキュベート、６９．スライドを反応バッファーでリンス、７０．スライド容量を反応バッファーで調整、７１．カバースリップをのせる、７２．スライドを反応バッファーでリンス、７３．スライド容量を反応バッファーで調整、７４．ストレプトアビジンを１００ｍｇ／Ｌで一滴加えて組織における内因性ビオチンをブロックし、カバースリップをのせ、インキュベート［３２分間］、７５．スライドを反応バッファーでリンス、７６．スライド容量を反応バッファーで調整、７７．カバースリップをのせる、７８．スライドを３７℃に加温し、４分間インキュベート、７９．スライドを反応バッファーでリンス、８０．スライド容量を反応バッファーで調整、８１．カバースリップをのせる、８２．標的に結合する一次抗体で滴定し、３２分間インキュベート、８３．スライドを反応バッファーでリンス、８４．スライド容量を反応バッファーで調整、８５．カバースリップをのせる、８６．スライドを反応バッファーでリンス、８７．スライド容量を反応バッファーで調整、８８．カバースリップをのせる、８９．チラミドハプテン＃１にＧＡＭ−ＨＲＰを使用、９０．スライドを反応バッファーでリンス、９１．スライド容量を反応バッファーで調整、９２．カバースリップをのせる、９３．スライドを反応バッファーでリンス、９４．スライド容量を反応バッファーで調整、９５．ＡｂはここではＴＳＡ用のＧＡＭ−ＨＲＰである、９６．［抗体６］（ＤＳ抗体）一滴を加え、カバースリップをのせ、１６分間インキュベート、９７．スライドを反応バッファーでリンス、９８．９００ｕｌの反応バッファーを加える、９９．カバースリップをのせる、１００．スライドを反応バッファーでリンス、１０１．スライド容量を反応バッファーで調整、１０２．カバースリップをのせる、１０３．スライドを反応バッファーでリンス、１０４．スライド容量を反応バッファーで調整、１０５．カバースリップをのせる、１０６．スライドを反応バッファーでリンス、１０７．スライド容量を反応バッファーで調整、１０８．オプション２及び３＜−−＞ここではＴｙ−Ｆｌｕｏ／ハプテン＋Ｈ２Ｏ２、１０９．チラミド−ハプテンコンジュゲート、例えばチラミド−ＢＦ一滴を加え、カバースリップをのせ、４分間インキュベート、１１０．チラミド反応用にＨ２Ｏ２一滴を加え、１６分間インキュベート、１１１．スライドを反応バッファーでリンス、１１２．９００ｕｌの反応バッファーを加える、１１３．カバースリップをのせる、１１４．スライドを反応バッファーでリンス、１１５．スライド容量を反応バッファーで調整、１１６．カバースリップをのせる、１１７．スライドを反応バッファーでリンス、１１８．スライド容量を反応バッファーで調整、１１９．カバースリップをのせる、１２０．ＤＡＢ検出を使用する場合、ＧＡＭ−ＨＲＰを死滅させ、２回目のＴＳＡなしでＡＰ検出を行う場合は選択しない、１２１．ＴＳＡハプテン＃２用のＧＡＲ−ＨＲＰ、１２２．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｒｋ １が選択される場合、試薬を手で加える、１２３．スライドを反応バッファーでリンス、１２４．スライド容量を反応バッファーで調整、１２５．カバースリップをのせる、１２６．スライドを３７℃に加温し、４分間インキュベート、１２７．ビオチンリガーゼコンジュゲート及びＢＴＳコンジュゲート、例えば抗ＢＦ−ＢＴＳ及びヤギ抗ウサギ−ビオチンリガーゼを滴定し、３２分間インキュベート、１２８．スライドを反応バッファーでリンス、１２９．スライド容量を反応バッファーで調整、１３０．カバースリップをのせる、１３１．スライドを反応バッファーでリンス、１３２．スライド容量を反応バッファーで調整、１３３．カバースリップをのせる、１３４．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｒｋ ＃２が選択される場合、試薬を手で加える、１３５．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｒｋ ＃３が選択される場合、試薬を手で加える、長いインキュベーション時間、１３６．スライドを反応バッファーでリンス、１３７．スライド容量を反応バッファーで調整、１３８．カバースリップをのせる、１３９．スライドを３７℃に加温し、４分間インキュベート、１４０．バッファー、ＡＴＰ、及びビオチンを含有する組織スライドにビオチンリガーゼ酵素反応バッファーを滴定し、１時間インキュベート、１４１．スライドを反応バッファーでリンス、１４２．９００ｕｌの反応バッファーを加える、１４３．カバースリップをのせる、１４４．スライドを反応バッファーでリンス、１４５．スライド容量を反応バッファーで調整、１４６．カバースリップをのせる、１４７．スライドを反応バッファーでリンス、１４８．スライド容量を反応バッファーで調整、１４９．カバースリップをのせる、１５０．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｒｋ ＃４が選択される場合、試薬を手で加える、１５１．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｒｋ ＃５が選択される場合、Ｇｌｙ／ＳＤＳ ５０Ｃ試薬を手で加える、１５２．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｒｋ ＃６が選択される場合、オプション６を分注又は手で加える、１５３．スライドを３７℃に加温し、４分間インキュベート、１５４．スライドを反応バッファーでリンス、１５５．スライド容量を反応バッファーで調整、１５６．オプション６はＳＡｖ−ＨＲＰ又はＳＡｖ−ＡＰである、１５７．オプション６インキュベーション時間、１５８．ＯＰＴＩＯＮ ６一滴を加え、カバースリップをのせ、０時間２４分インキュベート、１５９．スライドを反応バッファーでリンス、１６０．９００ｕｌの反応バッファーを加える、１６１．カバースリップをのせる、１６２．スライドを反応バッファーでリンス、１６３．スライド容量を反応バッファーで調整、１６４．カバースリップをのせる、１６５．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｒｋ ��７が選択される場合、試薬を手で加える、１６６．ＡＰレッド検出、１６７．スライドを反応バッファーでリンス、１６８．スライド容量を反応バッファーで調整、１６９．ＵＶ Ｒｅｄエンハンサー一滴を加え、カバースリップをのせ、４分間インキュベート、１７０．ＵＶ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ Ａ一滴、及びＵＶ Ｒｅｄナフトール一滴を加え、８分間インキュベート、１７１．ＵＶ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ Ｂ一滴を加え、８分間インキュベート、１７２．スライドを反応バッファーでリンス、１７３．スライド容量を反応バッファーで調整、１７４．カバースリップをのせる、１７５．スライドを反応バッファーでリンス、１７６．スライド容量を反応バッファーで調整、１７７．ＨＥＭＡＴＯＸＹＬＩＮ ＩＩ（対比染色）一滴を加え、カバースリップをのせ、４分間インキュベート、１７８．スライドを反応バッファーでリンス、１７９．スライド容量を反応バッファーで調整、１８０．カバースリップをのせる、１８１．スライドを反応バッファーでリンス、１８２．スライド容量を反応バッファーで調整、１８３．［ＢＬＵＩＮＧ試薬］一滴を加え（対比染色後）、カバースリップをのせ、４分間インキュベート、１８４．スライドを反応バッファーでリンス、１８５．スライド容量を反応バッファーで調整、１８６．カバースリップをのせる、１８７．スライドヒーターを停止、１８８．ミキサーを停止、１８９．スライドを反応バッファーでリンス、１９０．反応バッファーによるＪｅｔ Ｄｒａｉｎ、１９１．スライドを反応バッファーでリンス、１９２．スライド容量を反応バッファーで調整、１９３．カバースリップをのせる。
【０２０９】
したがって、第１の標的が第２の標的の近位にあるかどうかを決定するために試料を分析する方法は、第１の標的をビオチンリガーゼで標識する工程と；第２の標的をビオチンリガーゼ基質で標識する工程と；第１の標的が第２の標的の近位にある場合、ビオチンリガーゼがビオチンリガーゼ基質をビオチン化するように、ビオチン及びＡＴＰと試料を接触させる工程と；第１の標的が第２の標的の近位にある場合、ビオチンを検出する工程とを含む。１つの実施態様において、第１の標的を標識する工程は、第１の標的に特異的な第１の一次抗体と試料を接触させる工程を含み、及び第２の標的を標識する工程は、第２の標的に特異的な第２の一次抗体と試料を接触させる工程を含む。別の実施態様において、第１の一次抗体は第１のハプテンで標識され、及び第１の標的を標識する工程は、第１のハプテンに特異的な第１の二次抗体と試料を接触させる工程を含む。別の実施態様において、第２の一次抗体は第２のハプテンで標識され、及び第２の標的を標識する工程は、第２のハプテンに特異的な第２の二次抗体と試料を接触させる工程を含む。さらに別の実施態様において、第１の一次抗体は第１の種に由来し、及び第１の標的を標識する工程は、第１の種に特異的な第１の二次抗種抗体と試料を接触させる工程を含む。別の実施態様において、第２の一次抗体は第１の種に由来し、及び第２の標的を標識する工程は、第２の種に特異的な第２の二次抗種抗体と試料を接触させる工程を含む。１つの実施態様において、第１の標的を標識する工程は、チラミドコンジュゲート又はキノンメチド前駆体コンジュゲートから選択される第１の増幅試薬と試料を接触させる工程を含む。別の実施態様において、第２の標的を標識する工程は、チラミドコンジュゲート又はキノンメチド前駆体コンジュゲートから選択される増幅試薬と試料を接触させる工程を含む。
【０２１０】
さらなる例証的実施態様において、第１の標的及び第２の標的は二量体化タンパク質である。１つの実施態様において、第１の標的は第１の核酸標的であり、第１の標的を標識する工程は、第１の核酸プローブと試料を接触させる工程を含む。別の実施態様において、第２の標的は第２の核酸標的であり、第２の標的を標識する工程は、第２の核酸プローブと試料を接触させる工程を含む。別の実施態様において、第１の核酸プローブは第３のハプテンで標識され、第１の標的を標識する工程は、第３のハプテンに特異的な第３の二次抗体と試料を接触させる工程を含む。さらに別の実施態様において、ビオチンを検出する工程は、一又は複数の酵素にコンジュゲートされたストレプトアビジン又はアビジンを含むコンジュゲートと試料を接触させる工程を含む。別の実施態様において、ビオチンを検出する工程は、色素原と試料を接触させる工程を含む。１つの実施態様において、ビオチンを検出する工程は、チラミドコンジュゲート又はキノンメチド前駆体コンジュゲートから選択される増幅試薬と試料を接触させる工程を含む。別の実施態様において、試料はホルマリン固定パラフィン包埋組織である。別の実施態様において、約１００ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約２０ｎｍ未満離れている、約１０ｎｍ未満、約５ｎｍ未満、又は約２ｎｍ未満離れているならば、第１の標的は第２の標的の近位にある。
【０２１１】
さらなる例証的実施態様において、自動方法は、極近接にある第１の標的及び第２の標的の存在について、ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料を検査する方法に関連した一又は複数工程を行うために、自動染色装置を使用する工程を含む。方法は、第１の標的が第１の特異的結合部分により認識され、第１の標的の近位にビオチンリガーゼのコンジュゲ−ション又は沈殿をもたらすように、試薬の第１セットと試料を接触させる工程と；第２の標的が第２の特異的結合部分により認識され、第２の標的の近位にビオチンリガーゼ基質のコンジュゲ−ション又は沈殿をもたらすように、試薬の第２セットと試料を接触させる工程と；第１の標的及び第２の標的が極近接にある場合、ビオチンリガーゼがビオチンリガーゼ基質をビオチン化するようにビオチン及びビオチン化試薬と試料を接触させる工程と；ビオチンを検出する工程とを含む。別の実施態様において、方法は、第１の標的及び第２の標的が近位かどうかに従って被検体に治療薬を投与する工程を含む。
【０２１２】
ＶＩＩ．被検体を治療する方法
さらなる実施態様は、本発明の開示された実施態様を用いて決定されたタンパク質複合体を過剰発現する腫瘍を有する被検体を治療する方法を含む。一般に、方法は、第２の標的の近位に位置する、第２の標的とダイマーを形成する、又はさもなければ第２の標的に近接した空間関係にある第１の標的の発生を検出する検出方法の開示された実施態様の使用を含んだ。該検出方法に関連した陽性結果は、被検体が、特定の病気に対する既知の治療薬又は今後開発される治療薬による治療の候補であることを示すものである。
【０２１３】
例えば、方法は、第１のＨＥＲタンパク質及び第２のＨＥＲタンパク質に関して例示され得る。方法は、本発明の開示された実施態様により決定された第１のＨＥＲタンパク質及び第２のＨＥＲタンパク質を含む、タンパク質複合体を過剰発現する腫瘍を有する被検体を選択する工程を含む。ＨＥＲタンパク質複合体を破壊する治療的に有効量の薬剤が被検体に投与され、ＨＥＲタンパク質複合体の破壊が被検体における腫瘍を治療する。幾つかのそのような実施態様において、第１のＨＥＲタンパク質はＨＥＲ２であり、第２のＨＥＲタンパク質はＨＥＲ２であり、及び薬剤はトラスツズマブを含む。幾つかの実施態様において、第１のＨＥＲタンパク質はＨＥＲ３であり、第２のＨＥＲタンパク質はＨＥＲ２であり、又は第１のＨＥＲタンパク質はＨＥＲ２であり、第２のＨＥＲタンパク質はＨＥＲ３であり、及び薬剤はペルツズマブを含む。幾つかの実施態様において、第１のＨＥＲタンパク質はｐ９５であり、又は第２のＨＥＲタンパク質はｐ９５であり、及び薬剤は化学療法剤を含む。
【０２１４】
ＶＩＩＩ．キット
特定の開示された実施態様は、本発明の開示された実施態様を実施するのに有用な少なくとも１つのコンジュゲート、試薬、バッファー溶液、染色試薬等を有するキットに関する。例えば、開示されたキットの１つの実施態様は、ビオチンリガーゼ及び特異的結合部分を含む第１のコンジュゲート、並びにビオチンリガーゼ基質及び特異的結合部分を含む第２のコンジュゲートから選択される少なくとも１つのコンジュゲートを含む。特定の実施態様に関して、特異的結合部分は抗体であり、ビオチンリガーゼはＢｉｒＡ由来であり、及び／又は基質はＢＴＳである。キットはさらに、ビオチン及びＡＴＰを含んでもよい。ストレプトアビジン；ストレプトアビジン：ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート又はストレプトアビジン：アルカリホスファターゼなどのストレプトアビジン：酵素コンジュゲート；ジアミノベンジジン及び過酸化水素；及び／又はアルカリホスファターゼレッドなどの染色試薬も含まれてもよい。
【実施例】
【０２１５】
ＩＸ．実施例
以下の例は、開示された本発明の実施態様の特定の特徴を例示するために提供される。当業者は、本発明が、これらの実施態様により例示されたそれらの特徴に限定されないことを理解するであろう。
【０２１６】
実施例１：ビオチンリガーゼタンパク質発現
大腸菌由来のビオチンリガーゼ遺伝子を、プラスミドｐＢＩＯＴＩＮ ＬＩＧＡＳＥｃｍ由来のＤＮＡテンプレ−トを用いたＰＣＲ（Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により増幅した（ビオチンリガーゼは必須遺伝子であるため、いずれの大腸菌ゲノムＤＮＡも同じ目的を果たすことに留意）。使用した５’プライマ−配列は、ポリヒスチジンタグの配列を組み込んだ配列番号１と、それに続くサケカルシトニン由来のジスルフィド架橋（CSNLSTCVL）であった。ポリヒスチジンタグは、金属親和性精製によるビオチンリガーゼ精製を促進し、ジスルフィド架橋は、抗体への化学的コンジュゲ−ションに使用される。使用した３’プライマ−配列は配列番号２であった。
【０２１７】
ＰＣＲ断片を１％アガロースゲル（Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）から精製し、Ｐｔａｃベース発現ベクターｐＪＥｘｐｒｅｓｓ ４０４（ＤＮＡ２．０）にクローニングし、ＤＮＡ配列を配列決定（Ｅｕｒｏｆｉｎ／Ｏｐｅｒｏｎ）により検証した。検証したプラスミドコンストラクトを、タンパク質発現のために大腸菌５−アルファＦ’Ｉｑコンピテント細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に形質転換した。全ての大腸菌株は、１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン（Ｓｉｇｍａ）を補充したＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈで増殖させた。一晩の二次培養が約０．５でＡ２６０に達するとき、ビオチンリガーゼの発現を、０．５ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（Ｓｉｇｍａ）で誘導し、誘導は３７℃で４から５時間続行する。培地を４０００ｇで１０分間遠心分離し、細胞ペレットを−８０℃で保存した。Ｎｉ−ＮＴＡカラムでのビオチンリガーゼの精製は、製造業者からの指示書に従った（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＨｉｓＰｕｒ Ｎｉ−ＮＴＡ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ、３ｍＬ）。１リットル培養物からのビオチンリガーゼの典型的な収量は、約２５ｍｇであった。Ｎｉ−ＮＴＡカラム精製ビオチンリガーゼを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ １０／３０ ２５ｃｍカラムを備えるＧＥ ＡＫＴＡ ＦＰＬＣでさらに精製し、画分を回収し、１０％ＰＡＧＥゲルに流し、予想サイズの３５ＫＤａを有する画分をプールし、分子カットオフが１０ＫＤａのＶｉｖａｓｐｉｎ試料濃縮器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で濃縮した。
【０２１８】
実施例２：ビオチンリガーゼ活性アッセイ
ビオチンリガーゼ基質標的ペプチド配列（ＢＴＳ）HYNIC−GGSGLNDIFEAQKIEWHE−COOHを、Ｎ末端にＨｙＮｉｃ部分を有するＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ．（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ、ＴＸ）により合成した。
【０２１９】
１００ｕＬのビオチンリガーゼ反応バッファー（０．１Ｍ ＫＣｌ、５．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）、０．０５％ Ｂｒｉｊ−３５、０．１ｍＭジチオスレイト−ル（ＤＴＴ）、３ｍＭ ＡＴＰ、及び６０μＭビオチン）中の２０ｎＭビオチンリガーゼ及びＢＴＳ（１０μＭ）の混合物を３７℃で２０から６０分間インキュベートした。１０μＬの反応混合物アリコートを、標準的手順に従ってＺｉｐＴｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて精製し、精製ペプチドをＣＨＣＡ（アセトニトリル／水中１０ｍｇ／ｍＬ）で溶出した。ＭＡＬＤＩ分析を陽性イオンモードでＢｒｕｋｅｒ Ａｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩＩ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光計を用いて行った。
【０２２０】
非修飾ペプチド基質ＢＴＳの分子量は２２０５であり、ビオチン化ペプチドＢＴＳ−ビオチン産物は２４３１（ビオチンのＭｗは２４４である）である。
【０２２１】
ペプチドが実際にビオチン化されたことをさらに確認するために、１時間のインキュベーション後、ストレプトアビジン被覆電磁ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）を反応混合物に添加した。ビーズのインキュベーション及び分離後、上清を以前に記載したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより分析した。ＢＴＳ−ビオチンピーク（Ｍｗ＝２４３１）の非存在はＢＴＳのビオチン化をさらに裏付けた。
【０２２２】
ビオチンリガーゼ−抗体コンジュゲートにおけるビオチンリガーゼ活性を、同じ手順に従って分析した。
【０２２３】
実施例３：ヤギ抗ウサギ（ＧＡＲ）ビオチンリガーゼコンジュゲートの合成
ヤギ抗ウサギビオチンリガーゼコンジュゲートを作成する方法の１つの実施態様を以下にスキーム１で示す。
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スキーム１
【０２２４】
１ｍｇのＧＡＲを４００μＬのＰＢＳ（１００ｍＭホスフェート、ｐＨ＝７．２）に希釈して２．５ｍｇ／ｍＬの濃度を得た。この溶液にＤＭＳＯ中ＭＡＬ−ＰＥＧ８−ＮＨＳ（１０ｍＭストック）（ＧＡＲの１５又は３０当量）を添加し、室温で２時間インキュベートした。その間に、１ｍｇのビオチンリガーゼ−ＳＳ（ＧＡＲの３当量）を、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（ビオチンリガーゼの１．５当量）を用いて室温で２時間還元した。両方の修飾タンパク質を、Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｐｉｅｒｃｅ、７Ｋ ＭＷＣＯ、２ｍＬ）を用いて製造所の指示書に従って精製した。タンパク質をＰＢＳ（０．１Ｍ、ｐＨ＝６．５、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む）に溶出した。精製タンパク質を混合し、室温で一晩インキュベートした。コンジュゲートをＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ １０／３０ゲルを用いてＧＥ ＡＫＴＡ ＦＰＬＣで精製した。タンパク質をＰＢＳ（１０ｍＭホスフェート、ｐＨ＝７．４）を用いて溶出した。コンジュゲートにおけるビオチンリガーゼ活性を、６０分の反応インキュベーション時間で実施例２の手順を用いて分析した。
【０２２５】
実施例４：マウス抗ＮＰ（ＭｓｘＮＰ）ビオチンリガーゼコンジュゲートの合成
コンジュゲートは、以下のモル比、すなわちＭＡＬ−ＰＥＧ８−ＮＨＳ／ＭｓｘＮＰ １０／１；ＴＣＥＰ／ビオチンリガーゼ１．５／１；ビオチンリガーゼ／ＭｓｘＮＰ ３／１で実施例３からの方法を用いて合成した。酵素はＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ １０／３０ゲルを用いてＧＥ ＡＫＴＡ ＦＰＬＣで精製した。タンパク質はＰＢＳ（１０ｍＭホスフェート、ｐＨ＝７．４）を用いて溶出した。コンジュゲートにおけるビオチンリガーゼ活性は、６０分の反応インキュベーション時間で実施例２の手順を用いて分析した。
【０２２６】
実施例５：ヒドラジン化学を用いたＭｓｘＮＰビオチンリガーゼコンジュゲートの合成
ＭｓｘＮＰビオチンリガーゼコンジュゲートを作成するための合成戦略を以下にスキーム２で例示する。
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【０２２７】
１ｍｇのＭｓｘＮＰを４００μＬのＰＢＳ（１００ｍＭホスフェート、ｐＨ７．２）に希釈して２．５ｍｇ／ｍＬの濃度を得た。この溶液に、ＤＭＳＯ中５当量の４ＦＢ−ＮＨＳ（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）（１０ｍＭストック）を添加し、室温で２時間インキュベートした。その間に、ビオチンリガーゼ（ＭｓｘＮＰの３当量）をＳ−ＨｙＮｉｃ（ビオチンリガーゼの３当量）を用いて室温で２時間活性化した。両方の修飾タンパク質を、Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｐｉｅｒｃｅ、７Ｋ ＭＷＣＯ、２ｍＬ）を用いて製造所の指示書に従って精製した。タンパク質をＰＢＳ（０．１Ｍ、ｐＨ＝６．５、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む）に溶出した。精製タンパク質を混合し、触媒として添加した１０ｍＭアニリンと室温で一晩インキュベートした。コンジュゲートをＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ １０／３０ゲルを用いてＧＥ ＡＫＴＡ ＦＰＬＣで精製した。タンパク質をＰＢＳ（１０ｍＭホスフェート、ｐＨ＝７．４）を用いて溶出した。コンジュゲートにおけるビオチンリガーゼ活性を、６０分の反応インキュベーション時間で実施例２の手順を用いて分析した。
【０２２８】
実施例６：抗体へのビオチンリガーゼ標的配列（ＢＴＳ）の化学的コンジュゲ−ション
ＢＴＳ抗体コンジュゲートを作成する方法の１つの実施態様を以下にスキーム３で例示する。
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【０２２９】
０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ＝７．２）中〜２ｍｇ／ｍＬのＧＡＲ ０．２５ｍｇに、１０ｍＭ ＤＭＳＯストック溶液からの４ＦＢ−ＰＥＧ４−ＰＦＰ活性エステル（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ Ｓ−１０３４）（ＧＡＲの１５当量）を添加した。混合物を室温で２時間インキュベートし、４ＦＢ修飾ＧＡＲをＺｅｂａスピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて精製し、バッファーをＰＢＳ（０．１Ｍ、ｐＨ＝６）に交換した。ＨｙＮｉｃ標識ＢＴＳ（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．製）（１０当量）を精製４ＦＢ−ＧＡＲに添加し、室温で一晩インキュベートした。コンジュゲートはＭＷＣＯ＝５０ＫＤａを有するＶＩＶＡＳＰＩＮフィルタ−（ＧＥ）を用いて精製した。ＰＢＳ（０．１Ｍ、ｐＨ＝７．２）を用いて５回の洗浄を行い、コンジュゲートを回収した。ＢＴＳ対抗体の比は、２８０ｎｍ（ＧＡＲ）及び３５０ｎｍ（４ＦＢ−ＨｙＮｉｃ反応から形成されたヒドラゾン結合）の吸光度を測定して決定した。典型的には、１ ＧＡＲあたり２−５ ＢＴＳを得た。
【０２３０】
実施例７：ヤギ抗マウス（ＧＡＭ）−ＢＴＳの化学的コンジュゲ−ション
０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ＝７．２）中〜２ｍｇ／ｍＬのＧＡＭ ０．２５ｍｇに、１０ｍＭ ＤＭＳＯストック溶液からの４ＦＢ−ＰＥＧ４−ＰＦＰ活性エステル（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ Ｓ−１０３４）（ＧＡＭの１５当量）を添加した。混合物を室温で２時間インキュベートし、４ＦＢ修飾ＧＡＭをＺｅｂａスピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて精製し、バッファーをＰＢＳ（０．１Ｍ、ｐＨ＝６）に交換した。ＨｙＮｉｃ標識ＢＴＳ（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．製）（１０当量）を精製４ＦＢ−ＧＡＭに添加し、室温で一晩インキュベートした。コンジュゲートはＭＷＣＯ＝５０ＫＤａを有するＶＩＶＡＳＰＩＮフィルタ−（ＧＥ）を用いて精製した。ＰＢＳ（０．１Ｍ、ｐＨ＝７．２）を用いて５回の洗浄を行い、コンジュゲートを回収した。ＢＴＳ対抗体の比は、２８０ｎｍ（ＧＡＭ）及び３５０ｎｍ（４ＦＢ−ＨｙＮｉｃ反応から形成されたヒドラゾン結合）の吸光度を測定して決定した。典型的には、１ ＧＡＭあたり２−５ ＢＴＳを得た。
【０２３１】
実施例８：ＭｓｘＢＦ−ＢＴＳの化学的コンジュゲ−ション
０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ＝７．２）中〜２ｍｇ／ｍＬのＭｓｘＢＦ ０．２５ｍｇに、１０ｍＭ ＤＭＳＯストック溶液からの４ＦＢ−ＰＥＧ４−ＰＦＰ活性エステル（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ Ｓ−１０３４）（ＭｓｘＢＦの１５当量）を添加した。混合物を室温で２時間インキュベートし、４ＦＢ修飾ＭｓｘＢＦをＺｅｂａスピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて精製し、バッファーをＰＢＳ（０．１Ｍ、ｐＨ＝６）に交換した。ＨｙＮｉｃ標識ＢＴＳ（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．製）（１０当量）を精製４ＦＢ−ＭｓｘＢＦに添加し、室温で一晩インキュベートした。コンジュゲートはＭＷＣＯ＝５０ＫＤａを有するＶＩＶＡＳＰＩＮフィルタ−（ＧＥ）を用いて精製した。ＰＢＳ（０．１Ｍ、ｐＨ＝７．２）を用いて５回の洗浄を行い、コンジュゲートを回収した。ＢＴＳ対抗体の比は、２８０ｎｍ（ＭｓｘＢＦ）及び３５０ｎｍ（４ＦＢ−ＨｙＮｉｃ反応から形成されたヒドラゾン結合）の吸光度を測定して決定した。典型的には、１ ＭｓｘＢＦあたり２−５ ＢＴＳを得た。
【０２３２】
実施例９：ＭｓｘＮＰ−ＢＴＳの化学的コンジュゲ−ション
０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ＝７．２）中〜２ｍｇ／ｍＬのＭｓｘＮＰ ０．２５ｍｇに、１０ｍＭ ＤＭＳＯストック溶液からの４ＦＢ−ＰＥＧ４−ＰＦＰ活性エステル（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ Ｓ−１０３４）（ＭｓｘＮＰの１５当量）を添加した。混合物を室温で２時間インキュベートし、４ＦＢ修飾ＭｓｘＮＰをＺｅｂａスピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて精製し、バッファーをＰＢＳ（０．１Ｍ、ｐＨ＝６）に交換した。ＨｙＮｉｃ標識ＢＴＳ（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．製）（１０当量）を精製４ＦＢ−ＭｓｘＮＰに添加し、室温で一晩インキュベートした。コンジュゲートはＭＷＣＯ＝５０ＫＤａを有するＶＩＶＡＳＰＩＮフィルタ−（ＧＥ）を用いて精製した。ＰＢＳ（０．１Ｍ、ｐＨ＝７．２）を用いて５回の洗浄を行い、コンジュゲートを回収した。ＢＴＳ対抗体の比は、２８０ｎｍ（ＭｓｘＮＰ）及び３５０ｎｍ（４ＦＢ−ＨｙＮｉｃ反応から形成されたヒドラゾン結合）の吸光度を測定して決定した。典型的には、１ ＭｓｘＮＰあたり２−５ ＢＴＳを得た。
【０２３３】
実施例１０：二重ハプテン標識ＢＳＡ（Ｄｉｇ／ＤＮＰ−ＢＳＡ）の合成
５当量のＤｉｇ−ＮＨＳ（Ｒｏｃｈｅ）、５当量のＤＮＰ−ＰＥＧ８−ＮＨＳ（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）及び５当量のＭＡＬ−ＰＥＧ８−ＭＡＬ（Ｑｕａｎｔａ）を、０．１ ＰＢＳ（ｐＨ＝７．２）中ＢＳＡの１ｍｇ／ｍＬ溶液３０μＬ（ＢＳＡ ３０μｇ）に添加した。反応物を室温で２時間インキュベートし、修飾ＢＳＡをＺｅｂａミニスピンカラムを用いて精製し、バッファーをＰＢＳ（ｐＨ＝６．５、１ｍＭ、ＥＤＴＡを含む）に交換した。
【０２３４】
実施例１１：Ｄｉｇ標識ＢＳＡ（Ｄｉｇ−ＢＳＡ）の合成
１０当量のＤｉｇ−ＮＨＳ（Ｒｏｃｈｅ）及び５当量のＭＡＬ−ＰＥＧ８−ＭＡＬ（Ｑｕａｎｔａ）を、０．１ ＰＢＳ（ｐＨ＝７．２）中ＢＳＡの１ｍｇ／ｍＬ溶液３０μＬ（ＢＳＡ ３０μｇ）に添加した。反応物を室温で２時間インキュベートし、修飾ＢＳＡをＺｅｂａミニスピンカラムを用いて精製し、バッファーをＰＢＳ（ｐＨ＝６．５、１ｍＭ、ＥＤＴＡを含む）に交換した。
【０２３５】
実施例１２：ＤＮＰ標識ＢＳＡ（ＤＮＰ−ＢＳＡ）の合成
１０当量のＤＮＰ−ＰＥＧ８−ＮＨＳ（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）及び５当量のＭＡＬ−ＰＥＧ８−ＭＡＬ（Ｑｕａｎｔａ）を、０．１ ＰＢＳ（ｐＨ＝７．２）中ＢＳＡの１ｍｇ／ｍＬ溶液３０μＬ（ＢＳＡ ３０μｇ）に添加した。反応物を室温で２時間インキュベートし、修飾ＢＳＡをＺｅｂａミニスピンカラムを用いて精製し、バッファーをＰＢＳ（ｐＨ＝６．５、１ｍＭ、ＥＤＴＡを含む）に交換した。
【０２３６】
実施例１３：組織へのチオール基の導入
ＦＦＰＥ胎盤組織スライドを脱パラフィンし、抗原をＢｅｎｃｈｍａｒｋ ＸＴ（Ｖｅｎｔａｎａ）のスタンダードＣＣ１コンディションを用いて回収した。各スライド上の８つの非接触組織切片は、カミソリ刃を用いて組織の部分を除去して作成した。スライドを次いで０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ＝７．２）中３ｍｇ／ｍＬのＴｒａｕｔ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）で１時間処理して、組織上のアミノ基をチオールに変換した。スライドを水で完全に洗浄し、窒素気流下簡単に乾燥させた。チオール化スライドはすぐに使用した。
【０２３７】
実施例１４：チオール化組織へのＢＳＡの架橋
二重標識ＢＳＡ又はモノハプテン標識ＢＳＡの１：１混合物のいずれかで、４つのＢＳＡ濃度（４μＭ、２μＭ、１μＭ、及び０．５μＭ）を使用した。全ての濃度に対して、０．５ｍｇ／ｍＬの非修飾ＢＳＡを添加して非特異的結合を阻害した。各組織切片に、次いで３ｍｌのＢＳＡ溶液を添加した。左カラム中の４つの切片に４つの濃度の二重標識ＢＳＡを添加し、「Ｄ」として標識した。右カラム中の４つの切片に４つの総濃度のモノ標識ＢＳＡの混合物を添加し、「Ｍ」として標識した。スライドを湿箱に入れ、室温で４時間インキュベートした。スライドを水で完全にリンスし、組織上の遊離残留チオール基を、０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ＝６．５）中４０ｍＭ Ｎ−エチル−マレイミド１ｍＬの添加によりクエンチし、それに続いて１５分インキュベーションした。スライドを水で完全にリンスしていずれの非結合分子も除去した。
【０２３８】
修飾スライドを、ＭｓｘＤｉｇ＋ＲｂｘＤＮＰを一次抗体として、ＧＡＭ−ＢＴＳ及びＧＡＲ−ビオチンリガーゼを二次抗体として用いてＢｅｎｃｈｍａｒｋ ＸＴ（Ｖｅｎｔａｎａ）で染色し、それに続いて酵素反応のためにのビオチン及びＡＴＰを添加した。ビオチン化を、ストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＤＡＢ染色により検出した。
【０２３９】
開示された本発明の原理が適用され得る多くの可能性のある実施態様を考えると、例示された実施態様は本発明の好ましい例にすぎないことが理解されるべきであり、本発明の範囲を限定するものとして捉えられるべきではない。それどころか、本発明の範囲は以下の特許請求の範囲により定義される。本発明者らは故に、これらの特許請求の範囲及び趣旨に入る全てを本発明者らの発明として主張する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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