(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
【化１】
0006556129.tif 000030
の化合物又はその医薬上許容される塩の有効量を含有する、それを必要とする哺乳動物における、肥満症、インスリン抵抗性、および非アルコール性脂肪性肝疾患からなる群より選ばれる疾患又は障害の治療又は予防のための医薬製剤。
【請求項２】
疾患又は障害が肥満症である請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項３】
疾患又は障害がインスリン抵抗性である請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項４】
疾患又は障害が非アルコール性脂肪性肝疾患である請求項１に記載の医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本特許出願は、２０１３年８月１日に出願された米国仮特許出願第６１／８６１，１０９号、２０１４年５月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／００４，４３６号の利益を主張し、これらは参照により組み込まれる。
【０００２】
肥満症は世界的にまん延し、２型糖尿病、心血管疾患、脂肪肝及びがんのような慢性疾患に関連する。肥満症は、エネルギー消費量を超えるエネルギー摂取量の結果として発症し、脂肪組織内に脂肪の形態での余分なカロリーの最終的な貯蔵につながる。肥満症は、代謝的に、２型糖尿病（インスリン抵抗性）及び脂肪肝と関連し、後者は、脂肪性肝炎、肝細胞がんの発症及び肝不全をもたらし得る。したがって、食欲を抑制する、食事脂肪呼吸を阻害する、脂肪モビリゼーションを誘導する、或いは代謝を増大する医薬アプローチが、肥満症及び関連する代謝障害の治療に理想的であろう。
【０００３】
ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）は、ラット肝臓ｃＤＮＡライブラリーから初めて同定された核内オーファン受容体であり（Ｆｏｒｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ８１：６８７−６９３，１９９５）、それは、昆虫エクジソン受容体に最も密接に関連する。ＦＸＲは、ステロイド、レチノイド及び甲状腺ホルモンの受容体を含む転写因子の核内受容体のスーパーファミリーのメンバーである（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ８３：８４１−８５０，１９９５）。ノーザンブロット法及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析により、ＦＸＲが、肝臓、腸、腎臓及び副腎において最も豊富に発現することが示された（Ｂ．Ｍ．  Ｆｏｒｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ８１：６８７−６９３．１９９５；  Ｓｅｏｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ９：７２−８５，  １９９５）。ＦＸＲは、ビタミンＡ誘導体９−ｃｉｓレチノイン酸により活性化するレチノイン酸受容体α（ＲＸＲα）とのヘテロ二量体としてＤＮＡに結合するリガンド活性化核内受容体である。ＦＸＲ／ＲＸＲαヘテロ二量体は、逆方向反復として組織化され、単一のヌクレオチドにより分離されるコンセンサスＡＧ（Ｇ／Ｔ）ＴＣＡの２つの核内受容体半部位から構成される反応エレメント（ＩＲ−１モチーフ）に優先的に結合する（Ｆｏｒｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ８１：６８７−６９３，１９９５）。初期の報告では、ラットＦＸＲがマイクロモル濃度のファルネソイド類（例えばファルネソール）及び幼若ホルモンにより活性化されることが示されている（このように、そのオリジナル名が説明される。）（Ｆｏｒｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ８１：６８７−６９３，  １９９５）。しかしながら、これらの化合物は、弱いリガンドであり、また、対応するマウス及びヒトのＦＸＲを活性化することはできず、内因性ＦＸＲリガンドの性質は不明のままであった。しかしながら、いくつかの天然に存在する胆汁酸が生理的濃度でＦＸＲに結合して活性化することが見出された。（Ｍａｋｉｓｈｉｍａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１３６２−１３６５，  １９９９；  Ｐａｒｋｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１３６５−１３６８，  １９９９；  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  ３：５４３−５５３，１９９９；  ＰＣＴ  ＷＯ  ００／３７０７７（２０００年６月２９日公開））。ＦＸＲリガンドとして機能する胆汁酸としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）及びこれらの胆汁酸のタウリン及びグリシン複合体が挙げられる。
【０００４】
胆汁酸は、肝臓で形成し、腸の十二指腸に分泌されるコレステロール代謝物であり、それらは、食物の脂肪及びビタミンの可溶化及び吸収で重要な役割を果たす。次いで、約９５％の胆汁酸が、回腸で再吸収され、腸肝循環系を介して肝臓に戻される。肝臓でのコレステロールから胆汁酸への変換は、フィードバック調節に基づき、胆汁酸は、胆汁酸生合成における律速工程を触媒する酵素をコードするシトクロムＰ４５０  ７Ａ１（ＣＹＰ７Ａ１）の転写を下方調節する。ＦＸＲは、ＦＸＲ標的遺伝子の小ヘテロ二量体パートナー（ＳＨＰ）及び肝臓受容体ホモログ１に関連する間接的機構を介して胆汁酸によるＣＹＰ７Ａ１の発現の抑制に関与している（Ｇｏｏｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  ６：５１７−５２８，  ２０００；  ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｉｎ  Ｍａｔｓｕｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ３６８：１７−２９，  ２０１３）。回腸において、胆汁酸は、ＦＸＲに依存して、腸内胆汁酸結合タンパク質（ＩＢＡＢＰ）、細胞質タンパク質（胆汁酸と高い親和性で結合し、それらの細胞取り込み及び輸送に関与している可能性のあるもの）の発現を誘発する。現在、２つのグループが、胆汁酸は、ヒト、ラット、及びマウスのＩＢＡＢＰ遺伝子プロモーターに保存されているＩＲ−１型反応エレメントに結合するＦＸＲの活性化を通じてＩＢＡＢＰ発現に対するそれらの効果を媒介するということを証明している。したがって、ＦＸＲは、胆汁酸及びコレステロールのホメオスタシスに関与する標的遺伝子の刺激（ＩＢＡＢＰ）及び抑制（ＣＹＰ７Ａ１）の両方に関与している。また、ＦＸＲは、非抱合胆汁酸及び抱合胆汁酸／塩を肝細胞から胆汁に輸送する胆汁酸塩輸送ポンプ（ＢＳＥＰ、ＡＢＣ１１）の発現を誘導する （Ｍａｔｓｕｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ３６８：１７−２９，  ２０１３を見直し）。
【０００５】
テンポール（４−ヒドロキシ−２，２，６，６，−テトラメチルピペリジン−１−オキシル）（酸化防止剤及び放射線防護剤）がマウスの肥満症を防ぐことが報告された（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．  ３４：  ９３−１０２，  ２００３）。最近の質量分析に基づく研究は、テンポールが脂肪酸代謝に影響を与え得るということを明らかにし、疑わしい腸内微生物産生代謝物のレベルの変化により、テンポールがマイクロバイオームを変化し得るという初期の手掛かりを提供した（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．，  １２：１３６９−１３７６，  ２０１３）。これまでの研究により、腸内マイクロバイオームの変化が、肝臓、心臓及び腎臓における胆汁酸のレベルに影響を与え得るということが証明された（Ｓｗａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０８：４５２３−４５３０，  ２０１１）。高脂肪食は、ＦＸＲを含む核内受容体により制御される小腸における遺伝子の発現の変化を誘導し得る（ｄｅ  Ｗｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＭＣ  Ｍｅｄ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １：１４，  ２００８）。したがって、変化する腸内の胆汁酸と、ＦＸＲシグナル伝達との間に関係が存在する可能性があり、それにより、高脂肪食誘発性肥満症を改めさせることができる可能性がある。既知の天然型及び合成型ＦＸＲ作動薬が存在する一方で、ＦＸＲに拮抗する治療薬は開示されていない。最近の研究により、二次胆汁酸タウロ−β−ムリコール酸（ＴβＭＣＡ）が、腸内の胆汁酸シグナル伝達に拮抗できることが明らかとなった（Ｓａｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．  ２２５−２３５，  ２０１３；  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ４：２３８４，  ２０１３）。ＦＸＲ拮抗薬である三置換ピラゾールカルボキサミド類似体が合成されたが、代謝及び生理機能に対する影響を調べられていなかった（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２９１９−２９３８，  ２０１４）。
【０００６】
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、他の肝疾患又は大量のアルコール消費を伴わない肝臓における、大量の異所性トリグリセリド（ＴＧ）の蓄積により特徴づけられる（Ｗｅｉβ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｔｓｃｈ．  Ａｒｚｔｅｂ．ｌ  Ｉｎｔ．  ２０１４；  １１１：４４７−４５２，  ２０１４）。ＮＡＦＬＤは、世界中の成人人口の２０〜３０％、肥満の人々の８０％以上が冒されている最も一般的な肝臓障害である。ＮＡＦＬＤは、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、線維症、肝硬変、さらには肝細胞癌を発症させ得る（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１４：１４７−１５２，  ２００４）。メタボリックシンドロームの構成要因として、ＮＡＦＬＤは、肥満症、インスリン抵抗性／２型糖尿病、並びに冠動脈疾患及びアテローム性動脈硬化症と密接に関連している（Ｂｈａｔｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｈｅａｒｔ  Ｊ．  ３３：１１９０−１２００，  ２０１２）。現在までに、ＮＡＦＬＤ発症の根本的な分子機構は、ほとんど知られていないままであり、ＮＡＦＬＤの治療のための新規標的の同定が高い優先度にある。
【０００７】
上記は、ＦＸＲ受容体の拮抗薬、並びに体重損失、インスリン抵抗性及びＮＡＦＬＤを誘導する肥満患者の治療方法に満たされない必要性が存在することを示している。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、哺乳動物（特にヒト）における肥満症の治療又は予防のための核内受容体ファルネソイドＸ受容体の阻害剤を提供する。本発明の実施形態の化合物は、ファルネソイドＸ受容体を阻害し、ファルネソイドＸ受容体により媒介されるシグナル伝達を介する高脂肪食誘発性肥満症に作用する。本発明によれば、本発明は、肥満症の治療又は予防の治療剤としてのこれらの化合物を含む組成物及びこれらの化合物の使用方法を提供する。
【０００９】
また、本発明は、本発明の原理を具現化する化合物又は塩、及び医薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、本発明の原理を具現化する化合物又はその医薬上許容される塩を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるファルネソイドＸ受容体の阻害方法を提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、本発明の原理を具現化する化合物又はその医薬上許容される塩を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における肥満症の治療又は予防方法を提供する。
【００１２】
また、本発明は、本発明の原理を具現化する化合物又はその医薬上許容される塩を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における肥満症、インスリン抵抗性及びＮＡＦＬＤの治療又は予防方法を提供する。望ましくは、その化合物は、腸内のファルネソイドＸ受容体を阻害し、腸内のファルネソイドＸ受容体のみにより媒介され、肝臓のファルネソイドＸ受容体によっては媒介されないシグナル伝達を介して、肥満症、インスリン抵抗性及びＮＡＦＬＤに作用する。好ましくは、その化合物が任意の全身毒性を最小限に抑える肝臓のファルネソイドＸ受容体を阻害しないために、その化合物は最小限の全身生物学的利用能を有する。
【００１３】
さらに、本発明は、本発明の実施形態の化合物の合成方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、タウロ−β−ムリコール酸（ＴβＭＣＡ）が、培養された初代肝細胞においてＦＸＲ作動薬タウロコール酸（ＴＣＡ）によりファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）活性化に拮抗することを示すルシフェラーゼアッセイの結果を示す。
【図２】図２は、タウロ−β−ムリコール酸（ＴβＭＣＡ）が、Ｃａｃｏ２細胞においてＦＸＲ作動薬タウロコール酸（ＴＣＡ）によりＦＸＲ活性化に拮抗することを示すルシフェラーゼアッセイの結果を示す。
【図３】図３は、８週間高脂肪食で飼育されたＦｘｒｆｌ／ｆｌマウス及びＦｘｒΔＩＥマウスの回腸粘膜におけるＡＴＰレベルを説明する。
【図４】図４は、グリシン−β−ムリコール酸によるケノデオキシコール酸でのＳｈｐ  ｍＲＮＡの誘導阻害を説明する。
【図５】図５は、グリシン−β−ムリコール酸によるＧＷ４０６４でのＳｈｐ  ｍＲＮＡの誘導阻害を説明する。
【図６】図６は、グリシン−β−ムリコール酸によるＧＷ４０６４でのＦｇｆ１９  ｍＲＮＡの誘導阻害を説明する。
【図７】図７は、グリシン−β−ムリコール酸によるＧＷ４０６４でのＡｔｐ５ｇ  ｍＲＮＡ阻害の拮抗を説明する。
【図８】図８は、本発明の実施形態に従う化合物の合成を示す。
【図９】図９は、本発明の実施形態に従う化合物の合成を示す。
【図１０】図１０は、β−ムリコール酸、タウロ−β−ムリコール酸（ＴβＭＣＡ）、グリシン−β−ムリコール酸、ケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＡ）及びグリシン−ケノデオキシコール酸の構造を示す。
【図１１】図１１は、高脂肪食１０週間後にビヒクル又はテンポールで処置したＦｘｒｆｌ／ｆｌ及びＦｘｒΔＩＥマウスの体重増加を説明する。
【図１２】図１２は、高脂肪食１４週間後のＦｘｒｆｌ／ｆｌ及びＦｘｒΔＩＥマウスの体重の割合としてのグラムでの脂肪質量を説明する。
【図１３】図１３は、高脂肪食７週間後のＦｘｒｆｌ／ｆｌ及びＦｘｒΔＩＥマウスの耐糖試験（ＧＴＴ）の結果を説明する。
【図１４】図１４は、高脂肪食１３週間後のＦｘｒｆｌ／ｆｌ及びＦｘｒΔＩＥマウスのインスリン耐性試験（ＩＴＴ）の結果を説明する。
【図１５】図１５は、高脂肪食１５週間後のＦｘｒｆｌ／ｆｌ及びＦｘｒΔＩＥマウスの絶食時糖、絶食時血清インスリン及びＨＯＭＡ指数を説明する。
【図１６】図１６は、テンポールでの処置時に標準的な固形飼料を与えたマウスのファーミキューテス門からバクテロイデス門へのシフトを示す。
【図１７】図１７は、ファーミキューテス門のバクテロイデス門に対する比、及び標準的な固形飼料及びビヒクル処置マウス又はテンポール処置マウスの糞便中の胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素活性の比較を示す。
【図１８】図１８は、合成した作動薬ＧＷ４０６４及び多様な用量のＴＵＤＣＡ、ＴωＭＣＡ、ＴβＭＣＡ、ＴαＭＣＡを用いたヒトＦＸＲ競合アッセイを説明する。結果をウミシイタケ発現に標準化した。
【図１９Ａ】図１９Ａは、ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ＵｎｉＦｒａｃ  ｄｉｓｔａｎｃｅの主座標分析のプロットを示す。円は、ビヒクル処置マウスの盲腸コミュニティーを示し、四角は、テンポール処置マウスの盲腸コミュニティーを示す。両方のグループとも１０週間高脂肪食を与えた。
【図１９Ｂ−Ｇ】図１９Ｂ〜Ｇは、盲腸の内容物の種類レベルの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列解析を示す。データは、平均±ＳＤとして示す。
【図２０Ａ】図２０Ａは、１４週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びテンポール処置マウスの尿のイオンの主成分分析（ＰＣＡ）モデルのスコア散布図を示す。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、ＰＣＡモデルにおける全ての検出された尿のイオンの負荷散布図を示す。ｐ［１］及びｐ［２］値は、主成分１及び２に対する各イオンの寄与質量を示す。最も高い負荷値の２つのイオンの識別のために、プロットに注釈をつける。全てのデータは、エレクトロスプレイイオン化法ネガティブモード（ＥＳＩ−）で得た。
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、ｐ−クレゾールスルファート及びｐ−クレゾールグルクロニドの尿のレベルを示す。値をビヒクル処置マウスのものに標準化し、相対量として表した。
【図２０Ｄ】図２０Ｄは、ｐ−クレゾールスルファート（下パネル）及びｐ−クレゾールグルクロニド（上パネル）のタンデムＭＳ及び化学構造を示す。
【図２１Ａ】図２１Ａは、高脂肪食の処置の１４週間後のビヒクル処置マウス及びテンポール処置マウスの尿のイオンのＰＣＡモデルのスコア散布図を示す。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、ＨＦＤの１４週間後のビヒクル処置マウス及び抗生剤処置マウスにおける尿のイオンのＰＣＡモデルの負荷散布図を示す。ｐ［１］及びｐ［２］値は、主成分１及び２に対する各イオンの寄与質量を示す。最も高い負荷値の２つのイオンの識別のために、プロットに注釈をつける。全てのデータは、ネガティブモード（ＥＳＩ−）で得た。
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、高脂肪食の処置の１４週間後のビヒクル処置マウス及び抗生剤処置マウスにおけるｐ−クレゾールスルファート及びｐ−クレゾールグルクロニドの尿のレベルを示す。値をビヒクル処置マウスのものに標準化し、相対量として表した。グループあたりｎ＝５マウス。全てのデータは平均±ＳＤとして示す。分散分析に続いて両側スチューデントのｔ検定をした。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１は、ビヒクル処置マウスとの比較。
【図２２Ａ】図２２Ａは、１４週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びテンポール処置マウスの肝臓切片の代表的なＨ＆Ｅ染色を示す。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、１４週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びテンポール処置マウスの肝臓切片における脂質液滴の代表的なＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色を示す。
【図２２Ｃ】図２２Ｃは、１６週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びテンポール処置マウスの肝臓の質量を示す。
【図２２Ｄ】図２２Ｄは、１６週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びテンポール処置マウスにおける体重に対する肝臓の質量の比を示す。
【図２２Ｅ】図２２Ｅは、１６週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びテンポール処置マウスの肝臓トリグリセリド（ＴＧ）内容物を示す。
【図２３Ａ】図２３Ａは、１６週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びテンポール処置マウスの肝臓切片の代表的なＨ＆Ｅ染色を示す。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、１６週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びテンポール処置マウスの肝臓の質量を示す。
【図２３Ｃ】図２３Ｃは、１６週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びテンポール処置マウスの体重に対する肝臓の質量の比を示す。
【図２３Ｄ】図２３Ｄは、１６週間高脂肪食を与えたビヒクルで処置したもの及び抗生剤で処置したものの肝臓ＴＧ内容物を示す。
【図２４Ａ】図２４Ａは、７週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及び抗生剤処置マウスの回腸のイオンのＰＣＡモデルのスコア散布図を示す。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、７週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及び抗生剤処置マウスにおける回腸のイオンのＰＣＡモデルの負荷散布図を示す。ｐ［１］及びｐ［２］値は、主成分１及び２に対する各イオンの寄与質量を示す。最も高い負荷値を有する２つのイオンの識別のために、プロットに注釈をつける。全てのデータは、ネガティブモード（ＥＳＩ−）で得た。
【図２５Ａ】図２５Ａは、１４週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及び抗生剤処置マウスの回腸の総胆汁酸に対する単一タウリン結合胆汁酸の比を示す。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、７週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びテンポール処置マウスの回腸における総胆汁酸に対する単一タウリン結合胆汁酸の比を示す。
【図２６Ａ】図２６Ａは、７週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及び抗生剤処置マウスの糞便のＢＳＨ酵素活性を示す。グループあたりｎ＝４−５のマウス。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、１２週間高脂肪食を与えたマウスにおける回腸のＦＸＲ発現のウエスタンブロット解析を示す。各レーンは１匹のマウスを示す。
【図２６Ｃ】図２６Ｃは、１２週間高脂肪食を与えたマウスの回腸におけるＦｘｒ  ｍＲＮＡレベル及びＦＸＲ標的遺伝子Ｓｈｐ及びＦｇｆ１５のｍＲＮＡレベルを示す。グループあたりｎ＝３マウス。
【図２６Ｄ】図２６Ｄは、７週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及び抗生剤処置マウスの回腸におけるＦＸＲ標的遺伝子Ｓｈｐ及びＦｇｆ１５のｍＲＮＡレベルを示す。グループあたりｎ＝３マウス。
【図２６Ｅ】図２６Ｅは、７週間高脂肪食を与えたマウスの、ビヒクル、タウロコール酸（ＴＣＡ）及びタウリン−β−ムリコール酸（ＴβＭＣＡ）（ＴＣＡと共に）で処置した２４時間後の回腸におけるＦＸＲ標的遺伝子Ｓｈｐ及びＦｇｆ１５のｍＲＮＡレベルを示す。グループあたりｎ＝３マウス。
【図２７Ａ】図２７Ａは、１４週間高脂肪食を与えた対照フロックス（Ｆｘｒｆｌ／ｆｌ）マウス及び腸特異的ノックアウトマウス（ＦｘｒΔ１Ｅ）のマウスの肝臓切片の代表的なＨ＆Ｅ染色を示す。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、１４週間高脂肪食を与えたＦｘｒｆｌ／ｆｌ及びＦｘｒΔ１Ｅマウスの肝臓切片における脂質液滴の代表的なＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色を示す。
【図２７Ｃ】図２７Ｃは、１４週間高脂肪食を与えたＦｘｒｆｌ／ｆｌ及びＦｘｒΔ１Ｅマウスの肝臓の質量を示す。
【図２７Ｄ】図２７Ｄは、１４週間高脂肪食を与えたＦｘｒｆｌ／ｆｌ及びＦｘｒΔ１Ｅマウスの肝臓トリグリセリド内容物を示す。
【図２８Ａ】図２８Ａは、１４週間高脂肪食を与えたＦｘｒｆｌ／ｆｌ及びＦｘｒΔ１Ｅマウスの回腸粘膜のミトコンドリアの酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）関連酵素のｍＲＮＡレベルを示す。
【図２８Ｂ】図２８Ｂは、７週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及び抗生剤処置マウスの回腸粘膜のミトコンドリアの酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）関連遺伝子のｍＲＮＡレベルを示す。グループあたりｎ＝３マウス。
【図２８Ｃ】図２８Ｃは、１２週間高脂肪食を与えたＦｘｒｆｌ／ｆｌ及びＦｘｒΔ１Ｅマウスの回腸粘膜の複合体Ｉ及び複合体ＩＩ依存呼吸に対する測定された状態ＩＩＩ呼吸を示す。
【図２８Ｄ】図２８Ｄは、７週間高脂肪食を与えたＦｘｒｆｌ／ｆｌマウス及びＦｘｒΔＩＥマウスの回腸粘膜におけるＡＴＰレベルを示す。
【図２９Ａ】図２９Ａは、血清遊離脂肪酸類を示す。左から右への各脂肪酸のバーは、ビヒクルで処置したＦｘｒｆｌ／ｆｌ  マウス、テンポールで処置したＦｘｒｆｌ／ｆｌ  マウス、ビヒクルで処置したＦｘｒΔＩＥマウス及びテンポールで処置したＦｘｒΔＩＥマウスである。
【図２９Ｂ】図２９Ｂは、７週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及び抗生剤処置マウスの血清セラミドを示す。グループあたりｎ＝３マウス。
【図２９Ｃ】図２９Ｃは、１４週間高脂肪食を与えたＦｘｒｆｌ／ｆｌ及びＦｘｒΔＩＥマウスの回腸におけるセラミド合成関連酵素及びセラミド異化関連酵素をエンコードするｍＲＮＡの発現を示す。
【図２９Ｄ】図２９Ｄは、１４週間高脂肪食を与えたマウスの抗生剤の治療の７週間後の回腸におけるセラミド合成関連酵素及びセラミド異化関連酵素をエンコードするｍＲＮＡのレベルを示す。
【図３０Ａ】図３０Ａは、セラミド由来のＭＳフラグメントの構造を示す。
【図３０Ｂ−３０Ｇ】図３０Ｂ〜３０Ｇは、様々なセラミドのタンデムＭＳ及び化学構造を示す。
【図３１Ａ】図３１Ａは、高脂肪食を３日間与えたビヒクル処置マウス及び抗生剤処置マウスにおける肝臓ＴＧ内容物を示す。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、１４週間高脂肪食を与え、次いでビヒクル又は抗生剤で３日間処置したマウスの回腸におけるＦｘｒ、Ｓｈｐ及びＦｇｆ１５のｍＲＮＡレベルを示す。
【図３１Ｃ】図３１Ｃは、１４週間高脂肪食を与え、次いでビヒクル又は抗生剤で３日間処置したマウスの回腸に由来するセラミドのプロファイルを示す。
【図３１Ｄ】図３１Ｄは、ビヒクル及び２μＭ、５μＭ及び１０μＭセラミド（ｎ＝４）でのインキュベーションの２４時間後の初代肝細胞のトリグリセリド（ＴＧ）内容物を示す。
【図３１Ｅ】図３１Ｅは、ビヒクル及び２μＭ、５μＭ及び１０μＭセラミドでインキュベーションの１６時間後の初代肝細胞における脂肪酸合成、トリグリセリド合成、及び脂肪酸異化に関連する遺伝子のｍＲＮＡレベルを示す（各ｍＲＮＡについて左から右のバー、各ｎ＝５）。
【図３１Ｆ】図３１Ｆは、ビヒクル、及び２μＭ及び１０μＭセラミド（ｎ＝３）でのインキュベーションの２４時間後の初代肝細胞における核ＳＲＥＢＰ１−Ｎ発現のウエスタンブロット解析を示す。
【図３１Ｇ】図３１Ｇは、ビヒクル、及び２μＭ及び１０μＭセラミド（ｎ＝３）でのインキュベーションの２４時間後の初代肝細胞におけるＣＩＤＥＡ発現のウエスタンブロット解析を示す。
【図３２Ａ】図３２Ａは、１４週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及び抗生剤処置マウスの肝臓における脂肪酸合成及びトリグリセリド合成の関連酵素をエンコードするｍＲＮＡのレベルを示す。
【図３２Ｂ】図３２Ｂは、１４週間高脂肪食を与えたＦｘｒｆｌ／ｆｌ及びＦｘｒΔＩＥマウスの肝臓における脂肪酸及びトリグリセリドの合成に関連する酵素をエンコードするｍＲＮＡの発現を示す。
【図３２Ｃ】図３２Ｃは、７週間高脂肪食を与えたマウスの肝臓における脂肪酸の酸化関連遺伝子のｍＲＮＡレベルを示す。
【図３２Ｄ】図３２Ｄは、１４週間高脂肪食を与えたＦｘｒｆｌ／ｆｌマウス及びＦｘｒΔＩＥマウスの肝臓における脂肪酸酸化関連遺伝子のｍＲＮＡレベルを示す。
【図３２Ｅ】図３２Ｅは、７週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及び抗生剤処置マウスの肝臓におけるＳＲＥＢＰ１−Ｎタンパク質発現のウエスタンブロット解析を示す。ＬＡＭＩＮ  Ａ／Ｃを負荷対照として使用した（ｎ＝３）。
【図３２Ｆ】図３２Ｆは、７週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及び抗生剤処置マウスの肝臓におけるＣＩＤＥＡタンパク質発現のウエスタンブロット解析を示す。β−ＡＣＴＩＮを負荷対照として使用した（ｎ＝３）。
【図３２Ｇ】図３２Ｇは、７週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及び抗生剤処置マウスの肝臓におけるＣｙｐ７ａ１ｍＲＮＡレベルを示す（ｎ＝３）。
【図３２Ｈ】図３２Ｈは、７週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びテンポール処置マウスの肝臓におけるＣｙｐ７ａ１ｍＲＮＡレベルを示す（ｎ＝３）。
【図３２Ｉ】図３２Ｉは、７週間高脂肪食を与えた、ビヒクル及び抗生剤で処置したものの肝臓における炎症関連遺伝子のｍＲＮＡレベルを示す（ｎ＝３）。
【図３２Ｊ】図３２Ｊは、７週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びテンポール処置マウスの肝臓における炎症関連遺伝子のｍＲＮＡレベルを示す（ｎ＝３）。
【図３３Ａ】図３３Ａは、１４週間高脂肪食を与えた、ビヒクル及び抗生剤で処置したＦｘｒｆｌ／ｆｌ及びＦｘｒΔＩＥマウスの肝臓切片の代表的なＨ＆Ｅ染色を示す。
【図３３Ｂ】図３３Ｂは、１４週間高脂肪食を与えた、ビヒクル及び抗生剤で処置したＦｘｒｆｌ／ｆｌ及びＦｘｒΔＩＥマウスの肝臓切片における脂質液滴のＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色を示す。
【図３３Ｃ】図３３Ｃは、１４週間高脂肪食を与えた、ビヒクル及び抗生剤で処置したＦｘｒｆｌ／ｆｌ及びＦｘｒΔＩＥマウスの肝臓の質量を示す。
【図３３Ｄ】図３３Ｄは、１４週間高脂肪食を与えた、ビヒクル及び抗生剤で処置したＦｘｒｆｌ／ｆｌ及びＦｘｒΔＩＥマウスの体重に対する肝臓の質量の比を示す。
【図３３Ｅ】図３３Ｅは、１４週間高脂肪食を与えた、ビヒクル及び抗生剤で処置したＦｘｒｆｌ／ｆｌ及びＦｘｒΔＩＥマウスの肝臓トリグリセリド内容物を示す。
【図３３Ｆ】図３３Ｆは、１４週間高脂肪食を与えた、ビヒクル及び抗生剤で処置したＦｘｒｆｌ／ｆｌ及びＦｘｒΔＩＥマウスの回腸におけるセラミドのリピドミクスプロファイルを示す（各セラミドについてはそれぞれ左から右のバー）。
【図３３Ｇ】図３３Ｇは、１４週間高脂肪食を与えた、ビヒクル及び抗生剤で処置したＦｘｒｆｌ／ｆｌ及びＦｘｒΔＩＥマウスの血清セラミドレベルを示す（各セラミドについてはそれぞれ左から右のバー）。
【図３４Ａ】図３４Ａは、１４週間高脂肪食を与えた、ビヒクル及びテンポールで処置したＦｘｒｆｌ／ｆｌ及びＦｘｒΔＩＥマウスの肝臓切片の代表的なＨ＆Ｅ染色を示す。
【図３４Ｂ】図３４Ｂは、高脂肪食の１４週間でビヒクル及びテンポールで処置したＦｘｒｆｌ／ｆｌマウス及びＦｘｒΔＩＥマウスの肝臓切片における脂質液滴のＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色を示す。
【図３４Ｃ】図３４Ｃは、高脂肪食の１４週間でビヒクル及びテンポールで処置したＦｘｒｆｌ／ｆｌマウス及びＦｘｒΔＩＥマウスの肝臓の質量を示す。
【図３４Ｄ】図３４Ｄは、高脂肪食の１４週間でビヒクル及びテンポールで処置したＦｘｒｆｌ／ｆｌマウス及びＦｘｒΔＩＥマウスの体重に対する肝臓の質量の比を示す。
【図３４Ｅ】図３４Ｅは、高脂肪食の１４週間でビヒクル及びテンポールで処置したＦｘｒｆｌ／ｆｌマウス及びＦｘｒΔＩＥマウスの肝臓トリグリセリド値を示す。
【図３４Ｆ】図３４Ｆは、高脂肪食の１４週間でビヒクル及びテンポールで処置したＦｘｒｆｌ／ｆｌマウス及びＦｘｒΔＩＥマウスの肝臓における脂肪酸合成、トリグリセリド合成、及び脂肪酸異化に関連する遺伝子のｍＲＮＡレベルを示す。それぞれのｍＲＮＡに基づくバーは、左から右へに、ビヒクルで処置したＦｘｒｆｌ／ｆｌマウス、テンポールで処置したＦｘｒｆｌ／ｆｌマウス、ビヒクルで処置したＦｘｒΔＩＥマウス、テンポールで処置したＦｘｒΔＩＥマウスである。
【図３４Ｇ】図３４Ｇは、高脂肪食の１６週間でのＦｘｒｆｌ／ｆｌマウス及びＦｘｒΔＩＥマウスのテンポール処置後の肝臓核ＳＲＥＢＰ１−Ｎ発現のウエスタンブロット解析を示す。各レーンは単一のマウスを示す。
【図３４Ｈ】図３４Ｈは、脂肪食の１６週間でのＦｘｒｆｌ／ｆｌマウス及びＦｘｒΔＩＥマウスのテンポール処置後の肝臓ＣＩＤＥＡ発現のウエスタンブロット解析を示す。各レーンは単一のマウスを示す。
【図３５】図３５は、腸内細菌を含む糞便のタンパク質を用いたインキュベーション後の陽性対照タウロ−β−ムリコール酸（ＴβＭＣＡ）及びグリシン−β−ムリコール酸（Ｇｌｙ−ＭＣＡ）の生成物β−ムリコール酸（ＴβＭＣＡ）への代謝を示す。
【図３６】図３６は、０、１、５、及び５０ｍｇ／ｋｇのＧｌｙ−ＭＣＡの経口投与後のマウスの回腸におけるＧｌｙ−ＭＣＡの濃度を示す。
【図３７Ａ】図３７Ａは、Ｇｌｙ−ＭＣＡでの処置の２４時間後のマウスにおける血清アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを示す。
【図３７Ｂ】図３７Ｂは、Ｇｌｙ−ＭＣＡでの処置の２４時間後のマウスにおけるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを示す。
【図３８】図３８は、Ｇｌｙ−ＭＣＡの存在下及び不存在下で加えられたＦＸＲ作動薬ＧＷ４０６４の濃度の関数として、キメラ受容体構造と一時的に同時にトランスフェクトするＨＥＫ２９３Ｔ線維芽細胞で観察されたルシフェラーゼ活性を示す。
【図３９】図３９は、１００μＭのＣＤＣＡ及びビヒクル（対照）、又は１００μＭのＣＤＣＡと共に１００μＭ及び２００μＭのＧｌｙ−ＭＣＡ（ｎ＝３）で処理した分化Ｃａｃｏ−２細胞におけるＳｈｐのｍＲＮＡ発現を示す。
【図４０Ａ】図４０Ａは、１００μＭ及び２００μＭのＧｌｙ−ＭＣＡでの処置後、及び２μＭのＧＷ４０６４又は５μＭのＧＷ４０６４での処置後の分化Ｃａｃｏ−２細胞におけるＳｈｐのｍＲＮＡのレベルを示す（ｎ＝３）。Ｇｌｙ−ＭＣＡの各用量については、左から右に、さらなるＧＷ４０６４なし、２μＭのＧＷ４０６４、及び５μＭのＧＷ４０６４でさらに処置したことを示す。
【図４０Ｂ】図４０Ｂは、１００μＭ及び２００μＭのＧｌｙ−ＭＣＡでの処置後、及び２μＭのＧＷ４０６４又は５μＭのＧＷ４０６４での処置後の分化Ｃａｃｏ−２細胞におけるＦｇｆ１９のｍＲＮＡのレベルを示す（ｎ＝３）。Ｇｌｙ−ＭＣＡの各用量について、左から右に、さらなるＧＷ４０６４なし、２μＭのＧＷ４０６４、及び５μＭのＧＷ４０６４でさらに処置をしたことを示す。
【図４０Ｃ】図４０Ｃは、１００μＭ及び２００μＭのＧｌｙ−ＭＣＡでの処置後、及び２μＭ又は５μＭのＧＷ４０６４での処置後の分化Ｃａｃｏ−２細胞におけるＡｔｐ５ｇのｍＲＮＡレベルを示す（ｎ＝３）。Ｇｌｙ−ＭＣＡの各用量について、左から右に、ＧＷ４０６４なし、２μＭのＧＷ４０６４、及び５μＭのＧＷ４０６４で処置したことを示す。
【図４１Ａ−４１Ｂ】図４１Ａ及び４１Ｂは、高脂肪食を与え、ビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスそれぞれの、９週間にわたる、体重変化の成長曲線（Ａ）及び初期体重における％変化（Ｂ）を示す。グループあたりｎ＝５のマウス。
【図４１Ｃ−４１Ｄ】図４１Ｃ及び４１Ｄは、ＮＭＲで測定された身体組成を示し、ビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスそれぞれの、高脂肪食での９週間後の、脂肪質量（Ｃ）及び除脂肪質量に対する脂肪質量の比（Ｄ）を示す。グループあたりｎ＝５のマウス。
【図４２Ａ】図４２Ａは、高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスの１週間（６から７週）の期間にわたる平均された１日あたりの累積の食物摂取量を示す。
【図４２Ｂ】図４２Ｂは、高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスの１週間（６〜７週）の平均期間の間接的なエネルギー収支（ＴＥＥｂａｌ）を用いる２４時間のエネルギー消費量を示す。グループあたりｎ＝５のマウス。
【図４３Ａ】図４３Ａは、高脂肪食を与えて６〜７週間後のビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスの耐糖試験（ＧＴＴ）を示す。グループあたりｎ＝５のマウス。
【図４３Ｂ】図４３Ｂは、図４５Ａで示された耐糖試験の曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。
【図４３Ｃ】図４３Ｃは、高脂肪食を与えて６〜７週間後のビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスのインスリン耐性試験（ＩＴＴ）を示す。グループあたりｎ＝５のマウス。
【図４４Ａ】図４４Ａは、７週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスにおける肝臓切片の代表的なＨ＆Ｅ染色を示す。
【図４４Ｂ】図４４Ｂは、７週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスの肝臓の質量を示す。グループあたりｎ＝５のマウス。
【図４４Ｃ】図４４Ｃは、７週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスの体重に対する肝臓の質量の比を示す。グループあたりｎ＝５のマウス。
【図４４Ｄ】図４４Ｄは、９週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスの肝臓トリグリセリド内容物を示す。グループあたりｎ＝５のマウス。
【図４５Ａ−４５Ｂ】図４５Ａ及び４５Ｂは、９週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスそれぞれの血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）のレベルを示す。グループあたりｎ＝５のマウス。
【図４６Ａ】図４６Ａは、９週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスの糞便のイオンのＰＣＡモデルのスコア散布図を示す。
【図４６Ｂ】図４６Ｂは、９週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスの糞便のイオンの部分最小二乗法判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）の散布図を示す。各ポイントは単一のマウスの糞便のイオンを示す。標識イオンは、Ｇｌｙ−ＭＣＡ処置で影響される、β−ＭＣＡ、ＴβＭＣＡ、タウロコール酸（ＴＣＡ）及びＧｌｙ−ＭＣＡとして識別される。ｐ（ｃｏｒｒ）［１］Ｐ値は階級間差異を示し、ｐ［１］Ｐ値はイオンの相対量を示す。データをネガティブイオン化モード（ＥＳＩ−）で得た。
【図４６Ｃ】図４６Ｃは、９週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスの糞便のイオンにおける単一の胆汁酸の組成を示す。
【図４６Ｄ】図４６Ｄは、９週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスの糞便中のＧｌｙ−ＭＣＡレベルを示す。グループあたりｎ＝５のマウス。全てのデータを平均±ＳＤとして示す。
【図４７Ａ】図４７Ａは、９週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスにおける回腸のイオンのＰＣＡモデルのスコア散布図を示す。
【図４７Ｂ】図４７Ｂは、９週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスの回腸のイオンのＰＬＳ−ＤＡの散布図を示す。各ポイントは、単一のマウスの糞便のイオンを示す。標識イオンは、Ｇｌｙ−ＭＣＡ処置で誘導されるＴ−α−ＭＣＡ、ＴβＭＣＡ、タウロコール酸（ＴＣＡ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）及びタウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）及びＧｌｙ−ＭＣＡとして識別される。ｐ（ｃｏｒｒ）［１］Ｐ値は階級間差異を示し、ｐ［１］Ｐ値はイオンの相対量を示す。全てのデータをネガティブモード（ＥＳＩ−）で得る。
【図４７Ｃ】図４７Ｃは、９週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスの回腸の胆汁酸の組成を示す。
【図４７Ｄ】図４７Ｄは、９週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスの回腸におけるＧｌｙ−ＭＣＡレベルを示す。グループあたりｎ＝５のマウス。全てのデータは平均±ＳＤとして示される。
【図４８】図４８は、９週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスの血清の総トリグリセリド値を示す。グループあたりｎ＝５のマウス。図４８は、９週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスの血清トリグリセリド種のプロファイルを示す。グループあたりｎ＝５のマウス。全てのデータは平均±ＳＤとして示される。
【図４９】図４９は、９週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスの血清セラミドのプロファイルを示す。グループあたりｎ＝５のマウス。図４９は、９週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスの回腸セラミドのプロファイルを示す。グループあたりｎ＝５のマウス。全てのデータは平均±ＳＤとして示される。
【図５０Ａ】図５０Ａは、９週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスの回腸におけるＦＸＲ標的遺伝子のＳｈｐ及びＦｇｆ１５のｍＲＮＡレベルを示す。グループあたりｎ＝５のマウス。
【図５０Ｂ】図５０Ｂは、９週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスの回腸におけるセラミド代謝に関与する遺伝子をエンコードするｍＲＮＡのレベルを示す。グループあたりｎ＝５のマウス。全てのデータは平均±ＳＤとして示される。
【図５１Ａ】図５１Ａは、９週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスの肝臓におけるＦＸＲ標的遺伝子ＳｈｐのｍＲＮＡレベルを示す。グループあたりｎ＝５のマウス。
【図５１Ｂ】図５１Ｂは、９週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスの肝臓におけるＣｙｐ７ａ１のｍＲＮＡレベルを示す。グループあたりｎ＝５のマウス。全てのデータは平均±ＳＤとして示される。
【図５２】図５２は、ビヒクル及びＧｌｙ−ＭＣＡで６週間処置した遺伝的に肥満のレプチン受容体欠損（ｄｂ／ｄｂ）の成長曲線を示す。グループあたりｎ＝５のマウス。全てのデータは平均±ＳＤとして示される。
【図５３Ａ−５３Ｂ】図５３Ａ及び５３Ｂは、ビヒクル及びＧｌｙ−ＭＣＡで６週間処置したｄｂ／ｄｂマウスのＮＭＲで測定された身体組成、脂肪質量の身体組成、及び除脂肪質量に対する脂肪質量を示す。グループあたりｎ＝５のマウス。全てのデータは平均±ＳＤとして示される。
【図５４Ａ】図５４Ａは、６週間ビヒクル及びＧｌｙ−ＭＣＡで処置したｄｂ／ｄｂマウスにおける肝臓切片の代表的なＨ＆Ｅ染色を示す。グループあたりｎ＝５のマウス。
【図５４Ｂ−５４Ｃ】図５４Ｂ及び５４Ｃは、６週間ビヒクル及びＧｌｙ−ＭＣＡで処置したｄｂ／ｄｂマウスにおける肝臓の質量、及び体重に対する肝臓の質量の比を示す。グループあたりｎ＝５のマウス。
【図５４Ｄ】図５４Ｄは、６週間ビヒクル及びＧｌｙ−ＭＣＡで処置したｄｂ／ｄｂマウスの肝臓トリグリセリド内容物を示す。グループあたりｎ＝５のマウス。全てのデータは平均±ＳＤとして示される。
【図５５Ａ−５５Ｂ】図５５Ａ及び５５Ｂは、６週間ビヒクル及びＧｌｙ−ＭＣＡで処置したｄｂ／ｄｂマウスにおける血清ＡＬＴ及びＡＳＴレベルを示す。グループあたりｎ＝５のマウス。全てのデータは平均±ＳＤとして示される。
【図５６Ａ−５６Ｂ】図５６Ａ及び５６Ｂは、６週間ビヒクル及びＧｌｙ−ＭＣＡで処置したｄｂ／ｄｂマウスの糞便及び回腸における胆汁酸の組成を示す。グループあたりｎ＝５のマウス。
【図５６Ｃ】図５６Ｃは、６週間ビヒクル及びＧｌｙ−ＭＣＡで処置したｄｂ／ｄｂマウスの回腸、糞便、肝臓及び血清におけるＧｌｙ−ＭＣＡの相対的なレベルを示す。グループあたりｎ＝５のマウス。全てのデータは平均±ＳＤとして示される。
【図５７Ａ】図５７Ａは、６週間ビヒクル及びＧｌｙ−ＭＣＡで処置したｄｂ／ｄｂマウスにおける血清トリグリセリド種のプロファイルを示す。グループあたりｎ＝５のマウス。
【図５７Ｂ−５７Ｃ】図５７Ｂ及び５７Ｃは、９週間高脂肪食を与えたビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスの血清及び回腸セラミド種のプロファイルを示す。グループあたりｎ＝５のマウス。全てのデータは平均±ＳＤとして示される。
【図５８】図５８は、６週間ビヒクル及びＧｌｙ−ＭＣＡで処置したＨＦＤ誘導の肥満のマウスの体重の曲線を示す。グループあたりｎ＝５のマウス。
【図５９】図５９は、６週間ビヒクル及びＧｌｙ−ＭＣＡで処置した高脂肪食誘導の肥満のマウスにおけるＮＭＲ測定による身体組成を示す。グループあたりｎ＝５のマウス。
【図６０Ａ】図６０Ａは、６週間ビヒクル及びＧｌｙ−ＭＣＡで処置した高脂肪食誘導の肥満のマウスの肝臓切片の代表的なＨ＆Ｅ染色を示す。グループあたりｎ＝５のマウス。
【図６０Ｂ−６０Ｃ】図６０Ｂ及び６０Ｃは、６週間ビヒクル及びＧｌｙ−ＭＣＡで処置した高脂肪食誘導の肥満のマウスにおける肝臓の質量及び体重に対する肝臓の質量の比を示す。グループあたりｎ＝５のマウス。
【図６１Ａ−６１Ｂ】図６１Ａ及び６１Ｂは、６週間ビヒクル及びＧｌｙ−ＭＣＡで処置した高脂肪食誘導の肥満のマウスの糞便及び回腸における胆汁酸の組成を示す。グループあたりｎ＝５のマウス。
【図６１Ｃ】図６１Ｃは、６週間ビヒクル及びＧｌｙ−ＭＣＡで処置した高脂肪食誘導の肥満のマウスの回腸、糞便、肝臓及び血清におけるＧｌｙ−ＭＣＡの相対的なレベルを示す。グループあたりｎ＝５のマウス。全てのデータは平均±ＳＤとして示される。
【発明の詳細な説明】
【００１５】
実施形態において、本発明は、式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
【００１６】
【化１】
0006556129.tif 000002
【００１７】
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、アルキル、及びＣ（＝Ｏ）Ｒ３から選ばれ、
Ｒ４は、水素、アルキル、及びＣ（＝Ｏ）Ｒ３から選ばれ、
Ｘは、Ｃ＝Ｏ及びＣＨ２から選ばれ、
Ｙは、ＣＨ２、ＮＲ５、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、及びＳｅから選ばれるか、或いは
Ｘ及びＹが一緒になってＣ＝Ｃを形成し、
Ｚは、ＣＯＯＲ６、ＳＯ３Ｒ７、及びＰ（＝Ｏ）（ＯＲ８）２から選ばれ、
Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、独立して、水素、アルキル、及びアリールから選ばれ、
Ｒ４は、水素、アルキル、及びＣ（＝Ｏ）Ｒ３から選ばれ、
ｍは、１〜６の整数であり、且つ
ｎは、１〜６の整数である。］
の化合物又はその医薬上許容される塩を提供する（ただし、式（Ｉ）の化合物で、ｍ及びｎが２であり、ＸがＣ＝Ｏであり、ＹがＮＨであり、Ｒ１及びＲ２が共に水素であり、且つＲ４が水素である場合は、ＺがＳＯ３Ｈではない。）。
【００１８】
ある実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物で、ｍが２であり、ＸがＣ＝Ｏであり、ＹがＮＨであり、Ｒ１及びＲ２が共に水素であり、Ｒ４が水素であり、且つｎが１である場合は、ＺがＣＯＯＨではない。
【００１９】
ある実施形態によれば、化合物が式（Ｉ）の化合物である。
【００２０】
上記実施形態の何れかによれば、Ｒ４が水素である。
【００２１】
ある実施形態によれば、Ｒ１及びＲ２が水素である。
【００２２】
ある実施形態によれば、ＸがＣ＝Ｏである。
【００２３】
ある実施形態によれば、ｍが２である。
【００２４】
ある実施形態によれば、ＹがＮＨである。
【００２５】
ある実施形態によれば、ｎは１〜６の整数である。
【００２６】
ある好ましい実施形態によれば、化合物が：
【００２７】
【化２】
0006556129.tif 000003
【００２８】
から選ばれる。
【００２９】
ある好ましい実施形態によれば、化合物が：
【００３０】
【化３】
0006556129.tif 000004
【００３１】
から選ばれる。
【００３２】
ある実施形態によれば、ＸがＣＨ２である。
【００３３】
ある実施形態によれば、Ｙが、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、及びＳｅから選ばれる。
【００３４】
ある実施形態によれば、ｍが２である。
【００３５】
ある実施形態によれば、ｎが２である。
【００３６】
ある実施形態によれば、ＺがＳＯ３Ｈである。
【００３７】
ある好ましい実施形態によれば、化合物が：
【００３８】
【化４】
0006556129.tif 000005
【００３９】
から選ばれる。
【００４０】
ある実施形態によれば、化合物が式（ＩＩ）の化合物である。
【００４１】
ある実施形態によれば、Ｒ１及びＲ２が水素である。
【００４２】
ある実施形態によれば、ＸがＣ＝Ｏである。
【００４３】
ある実施形態によれば、ｍが２である。
【００４４】
ある実施形態によれば、ＹがＮＨである。
【００４５】
ある実施形態によれば、ｎは１〜６の整数である。
【００４６】
ある好ましい実施形態によれば、化合物が：
【００４７】
【化５】
0006556129.tif 000006
【００４８】
から選ばれる。
【００４９】
ある好ましい実施形態によれば、化合物が：
【００５０】
【化６】
0006556129.tif 000007
【００５１】
から選ばれる。
【００５２】
ある実施形態では、ＸがＣＨ２である。
【００５３】
ある実施形態によれば、Ｙが、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、及びＳｅから選ばれる。
【００５４】
ある実施形態では、ｍが２である。
【００５５】
ある実施形態では、ｎが２である。
【００５６】
ある実施形態では、ＺがＳＯ３Ｈである。
【００５７】
ある好ましい実施形態によれば、化合物が：
【００５８】
【化７】
0006556129.tif 000008
【００５９】
から選ばれる。
【００６０】
あるより好ましい実施形態によれば、化合物が：
【００６１】
【化８】
0006556129.tif 000009
【００６２】
【化９】
0006556129.tif 000010
【００６３】
【化１０】
0006556129.tif 000011
【００６４】
【化１１】
0006556129.tif 000012
【００６５】
から選ばれる。
【００６６】
また、本発明は、式（ＩＩＩ）：
【００６７】
【化１２】
0006556129.tif 000013
【００６８】
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、アルキル、及びＣ（＝Ｏ）Ｒ３から選ばれ、
Ｒ１１は、水素、ハロ、アルキル、ＯＲ２、及びＣ（＝Ｏ）Ｒ３であり、
Ｒ１２は、水素、ハロ、アルキル、ＯＲ４、又はＣ（＝Ｏ）Ｒ３であり、
Ｒ１３は、水素、アルキル、ＯＲ１４、又はＣ（＝Ｏ）Ｒ３であり、
Ｒ４は、水素、アルキル、及びＣ（＝Ｏ）Ｒ３から選ばれ、
Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、及びＲ１８は、独立して、水素及びハロから選ばれ、且つ
Ｒ１４は、グリシン、アラニン、β−アラニン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、トリプトファン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン酸メチル、アスパラギン酸、グルタミン酸メチル、グルタミン酸、メチルプロリン、プロリン、バリン、２−フルオロ−β−アラニン、２−ブロモアラニン、２−クロロアラニン、２−フルオロアラニン、２−ヨードアラニン、３−ブロモアラニン、３−クロロアラニン、３−フルオロアラニン、３−ヨードアラニン、４−ブロモフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、タウリン、及び４−ヨードフェニルアラニンから選ばれる。］
の化合物又はその医薬上許容される塩を提供する（ただし、Ｒ１が水素であり、Ｒ１１及びＲ１２が共にβ−ヒドロキシルであり、Ｒ１３、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、及びＲ１８が全て水素である場合は、Ｒ１４がグリシン又はタウリンではなく、Ｒ１が水素であり、Ｒ１１が、α−ヒドロキシルであり、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、及びＲ１８が全て水素である場合は、Ｒ１４がグリシン又はタウリンではない。）。
【００６９】
ある実施形態では、化合物が：
【００７０】
【化１３】
0006556129.tif 000014
【００７１】
【化１４】
0006556129.tif 000015
【００７２】
から選ばれる。
【００７３】
ある実施形態では、Ｒ１１がハロであり、Ｒ１２及びＲ１３がヒドロキシルであり、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、及びＲ１８が全て水素である。
【００７４】
ある実施形態では、Ｒ１１及びＲ１２が共にハロであり、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、及びＲ１８が全て水素である。
【００７５】
ある実施形態では、Ｒ１８がハロであり、Ｒ１５、Ｒ１６、及びＲ１７が全て水素である。
【００７６】
本明細書で一般的に用いられる用語を参照すれば、用語「アルキル」は、例えば、１ないし約６個の炭素原子、好ましくは１ないし約４個の炭素原子、より好ましくは１ないし２個の炭素原子を含む直鎖又は分枝鎖のアルキル置換基を意味する。このような置換基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソアミル、ヘキシル等が挙げられる。
【００７７】
用語「アリール」とは、当技術分野で一般的に理解されるような無置換又は置換された芳香族炭素環の置換基と言う。用語「Ｃ６−Ｃ１０アリール」としては、フェニル及びナフチルが挙げられる。用語アリールが、平面であり且つヒュッケル則に従って４ｎ＋２π個の電子を含む環状置換基に適用されることが理解される。
【００７８】
上記実施形態の何れかにおいて、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物又は塩のＣ−２０炭素原子は、Ｒ配置、Ｓ配置を有していてもよく、或いはＲ異性体及びＳ異性体の混合物であってもよい。
【００７９】
上記実施形態の何れかにおいて、不斉炭素原子の立体化学が指定されていない場合、不斉炭素原子は、Ｒ配置、Ｓ配置を有していてもよく、或いはＲ異性体及びＳ異性体の混合物であってもよい。
【００８０】
成句「医薬上許容される塩」は、従来の化学的手法により塩基性又は酸性の部分を含む親化合物から合成される非毒性塩を含むことを意図する。一般的に、このような塩は、遊離酸又は遊離塩基の形態のこれらの化合物を、化学量論量の適切な塩基又は酸と、水若しくは有機溶媒又はその２つの混合液中で反応させることにより調製することができる。一般的に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、又はアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。適切な塩のリストは、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ，  １９９０，  ｐ．  １４４５」及び「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ６６，  ２−１９  （１９７７）」で見出される。
【００８１】
望ましい塩基としては、アルカリ及びアルカリ土類金属の塩基のような無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のような金属カチオンを含む塩基）が挙げられる。望ましい塩基の非限定的な例としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、及び炭酸カリウムが挙げられる。望ましい酸類としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸等のような無機酸類、及びｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、シュウ酸、ｐ−ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸、マレイン酸、酒石酸、脂肪酸類、長鎖脂肪酸類等のような有機酸類が挙げられる。酸性の部分を有する本発明の化合物の好ましい医薬上許容される塩としては、ナトリウム塩及びカリウム塩が挙げられる。塩基性の部分（例、ジメチルアミノアルキル基）を有する本発明の化合物の好ましい医薬上許容される塩としては、塩酸塩及び臭化水素酸塩が挙げられる。酸性の部分又は塩基性の部分を含む本発明の化合物は、遊離塩基若しくは遊離酸の形態又はその医薬上許容される塩の形態で有用である。
【００８２】
本発明のあらゆる塩の一部を形成する特定の対イオンは、その塩が全体として薬理学に許容される限り、さらに対イオンが全体として塩に望ましくない性質を与えない限り、通常、重大な性質を示さないと理解されるべきである。
【００８３】
さらに、上記の化合物及び塩は、溶媒和物を形成していてもよく、或いは実質的に無水形態のような非複合体形態で存在していると理解される。本明細書で用いられる、用語「溶媒和物」とは、結晶化溶媒のような溶媒分子が結晶格子に組み込まれている分子複合体を言う。溶媒和物に組み込まれる溶媒が水である場合、分子複合体は水和物と呼ばれる。医薬上許容される溶媒和物としては、水和物、アルコール和物（例えば、メタノール和物及びエタノール和物）、アセトニトリル和物等が挙げられる。これらの化合物は多形体として存在していてもよい。
【００８４】
さらに、本発明は、医薬上許容される担体及び本明細書に記載の少なくとも１つの化合物又は塩を含む医薬組成物に関する。
【００８５】
医薬上許容される担体は、活性化合物に対して化学的に不活性であるもの、使用条件下で有害な副作用や毒性を示さないものであることが好ましい。
【００８６】
担体の選択は、選択される本発明の特定の化合物により、並びに組成物を投与するために用いられる特定の方法によりある程度決定され得る。従って、本発明の医薬組成物の適切な多種多様な製剤が存在する。ある実施形態では、製剤は、消化管への投与に適し、特に、小腸への投与に適する。
【００８７】
経口投与に適する製剤としては、（ａ）治療有効量の本発明の化合物を、水、食塩水又はオレンジジュースのような希釈液に溶解したような液剤、（ｂ）それぞれ、固体又は顆粒として所定量の活性成分を含む、カプセル剤、サシェ剤、錠剤、ロゼンジ剤、及びトローチ剤、（ｃ）散剤、（ｄ）適切な液体中の懸濁剤、及び（ｅ）適切な乳剤が挙げられる。液体製剤は、医薬上許容される界面活性剤、懸濁化剤、又は乳化剤を添加した或いは添加していない、水及びアルコール類（例えば、エタノール、ベンジルアルコール、及びポリエチレンアルコール類）のような希釈液を含んでいてもよい。カプセル剤の形態は、例えば、界面活性剤、滑沢剤及び不活性なフィラー（例えば、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム及びトウモロコシデンプン）を含む通常の硬殻或いは軟殻ゼラチン型のものであり得る。錠剤の形態を、１以上のラクトース、スクロース、マンニトール、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、アルギン酸、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、グアーガム、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、及びその他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、崩壊剤、湿潤剤、保存剤、香味剤、及び薬理学に適合する賦形剤を含んでいてもよい。芳香錠が、不活性な基剤（例えば、ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシア）中に活性成分を含み、乳剤、ゲル剤等が、活性成分に加えて、当技術分野で周知の賦形剤を含んでいるのと同様に、ロゼンジ剤の形態は、香味中に活性成分を含んでいてもよく、通常、スクロース及びアカシア又はトラガカントを含んでいてもよい。
【００８８】
いくつかの実施形態では、製剤は、本発明の化合物が哺乳動物の消化管（特に、哺乳動物の小腸）と接触する時間を延長するのに適していてもよい。この点において、持続放出製剤、及び化合物が小腸内に放出される前の胃の中で保持される時間が延長されるように設計された製剤のような様々な製剤が利用可能である。多くの好適な製剤が、レミントン「Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ａ．Ｒ．，  ｅｄ．，  ｐｐ．  ８５８−９２９，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ  （２０００）」に提示されている。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本発明の化合物又は塩は、食品又は飲料と混合して食品添加物の形態で投与することができる。食品添加物として使用するために、化合物又は塩は、それ自体を食品又は飲料と混合することができ、或いは１以上の適切な賦形剤を含む組成物として製剤化してから食品又は飲料と混合することができる。食品又は飲料は任意の適切な食品又は飲料であり得る。いくつかの実施形態では、食品又は飲料は比較的高い脂肪含量を有する。
【００９０】
前記の医薬組成物に加えて、本発明の化合物又は塩を、シクロデキストリン包接錯体のような包接錯体、又はリポソームとして製剤化してもよいことが当業者に理解されるであろう。リポソームは、化合物の標的をリンパ系組織又は癌性肝細胞のような特定の組織とするのに役立つ。また、リポソームは、本発明の化合物の半減期を増大させるために用いることができる。本発明において有用なリポソームは、乳剤、発泡体、ミセル、不溶解性単分子層、液晶、リン脂質分散体、ラメラ層等を含む。これらの調製において、送達される活性剤は、単独で又は適切な化学療法剤と共にリポソームの一部として組み込まれる。このように、望ましい本発明の化合物又はその塩を充填したリポソームは、特定の組織型の部位（例えば、肝細胞）に向かうことができ、次いでリポソームが選択された組成物を送達する。本発明で用いられるリポソームは、標準的な小胞形成脂質（一般的に、中性及び負電荷リン脂質及びステロール（例えば、コレステロール）が挙げられる。）から形成される。脂質は、一般的に、例えば、リポソームのサイズ及び血中でのリポソームの安定性を考慮して選択される。リポソームを調製するために、例えば、「Ｓｚｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｂｉｏｅｎｇ．，  ９，  ４６７  （１９８０）」及び米国特許４，２３５，８７１、４，５０１，７２８、４，８３７，０２８及び５，０１９，３６９で開示されているような、さまざまな方法が利用可能である。特定の組織型の細胞を標的にするために、リポソームに組み込むリガンドとしては、例えば、標的の組織型の細胞表面の決定要因に特異的な抗体又はそのフラグメントが挙げられる。本発明の化合物又は塩を含むリポソーム懸濁液は、投与形態、送達される薬剤、及び治療される疾患の病期に応じた投与量で、静脈投与、限局投与、局所投与等により投与してもよい。
【００９１】
ある実施形態では、医薬組成物は、非経口投与（例えば、静脈投与、皮下投与、皮内投与、又は筋肉内投与）することができる。このように、本発明は、本発明の化合物又は塩を非経口投与に適した許容される担体に溶解し或いは懸濁した溶液又は懸濁液（水性及び非水性の等張性滅菌注射液を含む）を含む非経口投与のための組成物を提供する。多くのこのような組成物が当技術分野で知られている。
【００９２】
実施形態によれば、本発明は、有効量の本発明の化合物を哺乳動物に投与することを含む、それを必要とする哺乳動物におけるファルネソイドＸ受容体の阻害方法を提供する。
【００９３】
好ましくは、動物は哺乳動物である。より好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００９４】
用語「哺乳動物」としては、げっ歯目（例えばマウス）及びウサギ目（例えばウサギ）が挙げられるが、これらに限定されない。哺乳動物は、ネコ類（ネコ）及びイヌ類（イヌ）を含むネコ目であることが好ましい。哺乳動物は、ウシ類（ウシ）及びブタ類（ブタ）を含むウシ目、又はウマ類（ウマ）を含むウマ目であることがより好ましい。哺乳動物は、サル目、セボイド（Ｃｅｂｏｉｄｓ）又はシモイド（Ｓｉｍｉｏｉｄｓ）（サル）、又は類人目（ヒト及び類人猿）であることが最も好ましい。特に好ましい哺乳動物はヒトである。
【００９５】
ある実施形態では、ＦＸＲ介在疾患又は状態は、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、高コレステロール血症、又は高脂血症、慢性肝疾患、胃腸疾患、腎疾患、心血管疾患、代謝性疾患、癌（即ち大腸癌）又は神経症状（例えば脳卒中）である。ある実施形態では、慢性肝疾患は、原発性胆汁性肝硬変症（ＰＢＣ）、脳腱黄色腫症（ＣＴＸ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、薬剤誘導性胆汁鬱滞、妊娠肝内胆汁鬱滞、非経口的栄養法関連胆汁鬱滞（ＰＮＡＣ）、細菌の異常増殖又は敗血症関連胆汁鬱滞、自己免疫性肝炎、慢性ウイルス性肝炎、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝移植関連移植片対宿主病、生体移植肝再生、先天性肝線維症、総胆管結石症、肉芽腫性肝疾患、肝内又は肝外悪性腫瘍、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、ウィルソン病、ゴーシェ病、ヘモクロマトーシス、又はアルファ１−抗トリプシン欠乏症である。ある実施形態では、胃腸疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む）、過敏性大腸症候群（ＩＢＳ）、細菌の異常増殖、吸収不良、放射線照射後大腸炎（ｐｏｓｔ−ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｃｏｌｉｔｉｓ）、又は顕微鏡的大腸炎である。ある実施形態では、腎疾患は、糖尿病性腎症、巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、高血圧性腎硬化症、慢性糸球体腎炎、慢性移植糸球体症、慢性間質性腎炎、又は多嚢胞性腎疾患である。ある実施形態では、心血管疾患は、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、脂質異常症、高コレステロール血症、又は高トリグリセリド血症である。
【００９６】
好ましい実施形態によれば、本発明は、哺乳動物に有効量の本発明の化合物又は塩を投与することを含むそれを必要とする哺乳動物における肥満症の治療又は予防方法を提供する。
【００９７】
本明細書で用いられる肥満症は、過剰な体脂肪がヒトに健康上の危険をもたらし得る状態として考えることができる（Ｂａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄｉｅｔｚ，  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １０２：  Ｅ２９，  １９９８；  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｏｂｅｓ．  Ｒｅｓ．  ６  （ｓｕｐｐｌ．  ２）：５１Ｓ−２０９Ｓ，  １９９８を参照）。過剰な体脂肪は、エネルギー摂取量及びエネルギー消費量の不均衡の結果である。一実施形態では、ヒトにおいて、肥満度指数（ＢＭＩ）が肥満症の評価に用いられる。一実施形態では、２５．０ｋｇ／ｍ２〜２９．９ｋｇ／ｍ２のＢＭＩは太り過ぎ（グレードＩの肥満症とも呼ばれる）であり、その一方、３０ｋｇ／ｍ２のＢＭＩは真性肥満（グレードＩＩの肥満症とも呼ばれる）である。
【００９８】
ヒトにおける他の実施形態では、胴囲が肥満症の評価に用いられる。この実施形態では、男性では１０２ｃｍ以上の胴囲が肥満とみなされ、その一方で、女性では８９ｃｍ以上の胴囲が肥満とみなされる。強力な証拠は、肥満症が個人の罹患率及び死亡率の両方に影響を与えることを示す。例えば、肥満者は、数ある中でもとりわけ、心疾患、非インスリン依存性（２型）糖尿病、高血圧症、脳卒中、癌（例、子宮内膜癌、乳癌、前立腺癌、及び結腸癌）、脂質異常症、胆嚢疾患、睡眠時無呼吸、低受精率、及び骨関節炎のリスクが増大する（Ｌｙｚｎｉｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｆａｍ．  Ｐｈｙｓ．  ６３：２１８５，  ２００１参照）。
【００９９】
本発明によれば、哺乳動物（特にヒト）に投与される用量は、所望の反応をもたらすのに十分な量であるべきである。このような反応には、治療が望まれる或いは所望の利益をもたらす、腸内で発現するファルネソイドＸ受容体により媒介される疾患又は障害の望ましくない影響の拮抗又は予防が含まれる。ある実施形態では、障害は、非アルコール性脂肪性肝疾患、肥満症及び２型糖尿病（インスリン抵抗性）である。当業者は、その用量が、ヒトの年齢、状態及び体重、並びにヒトにおける非アルコール性脂肪性肝疾患の程度を含む様々な要因に依存すると認識するであろう。また、用量サイズは、投与の経路、タイミング及び頻度、並びに特定の化合物の投与及び所望の生理学的効果に伴い得る任意の有害な副作用の存在、性質及び範囲により決定されるであろう。非アルコール性脂肪性肝疾患、肥満症、２型糖尿病（インスリン抵抗性）又はその他の疾患又は障害の有効な治療法は多回投与を含む長期の治療を必要とする可能性もあると当業者により理解されるであろう。
【０１００】
この点において、腸内のファルネソイドＸ受容体の阻害を介するＮＡＦＬＤの治療は、哺乳動物における脂肪肝の臨床症状の減少とみなすことができる。多くの場合、ＮＡＦＬＤは徴候又は症状を引き起こさない一方で、ＮＡＦＬＤは、疲労、疼痛（特に右上腹部におけるもの）及び体重減少を引き起こし得る。いくつかの例では、ＮＡＦＬＤは、非アルコール性脂肪性肝炎、肝臓における炎症に進行する可能性がある。ＮＡＦＬＤは、肝臓機能の顕著な低下を伴う肝臓の瘢痕である非アルコール性脂肪性肝疾患関連肝硬変に進行する可能性がある。時間が経つにつれ、瘢痕は、肝臓が十分に機能しなくなるほど深刻になり得る。
【０１０１】
ＮＡＦＬＤは、例えば、超音波、コンピューター断層撮影法、磁気共鳴試験、或いは肝生検により評価することができる。ある実施形態では、哺乳動物は高脂肪食を消費している。高脂肪食は、脂肪として３０％を上回るエネルギーを提供するものとみなすことができる（例えば、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  Ｅｘｅｒｃｉｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｓ．  Ｊｅｎｎｅｔｔ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，  ２００８を参照）。他の実施形態では、本発明は哺乳動物における非アルコール性脂肪性肝疾患の予防方法を提供する。非アルコール性脂肪性肝疾患の予防は、低脂肪食又は中間脂肪食から高脂肪食への食事の変更が行われた哺乳動物における脂肪肝の予測される兆候を低減することとみなすことができる。
【０１０２】
現在、ＮＡＦＬＤに対する標準的な治療法は存在しない。医師は、通常、疾患に寄与する危険因子を治療する。例えば、医師は、減量プログラム、並びに健康食の選択、糖尿病のコントロール、及びコレステロールの低減により罹患した患者を助ける。
【０１０３】
この点において、ファルネソイドＸ受容体の阻害を介する肥満症の治療は、哺乳動物の体重増加率を低減するものとしてみなすことができる。ある実施形態では、哺乳動物は高脂肪食を消費している。高脂肪食は、脂肪として３０％を上回るエネルギーを提供するものとみなすことができる（例えば、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  Ｅｘｅｒｃｉｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｓ．  Ｊｅｎｎｅｔｔ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，  ２００８を参照）。他の実施形態では、本発明は、哺乳動物における肥満症の予防方法を提供する。肥満症の予防は、低脂肪食又は中間脂肪食から高脂肪食への食事の変更が行われた標準体重の哺乳動物における予測される体重増加を低減することとみなすことができる。
【０１０４】
この点において、ファルネソイドＸ受容体の阻害を介する糖尿病の治療は、それに罹患した患者におけるインスリン抵抗性を低減することとみなすことができる。インスリン抵抗性は高血糖症をもたらし得る。インスリン抵抗性の減少は血糖値の低減をもたらし得る。ファルネソイドＸ受容体の阻害を介して治療される症状の非限定的な例としては、脳神経衰弱及び集中不能、高血糖、腸内膨満、眠気、体重増加、脂肪貯蔵、減量困難、血中トリグリセリド値上昇、血圧上昇、心血管疾患に関連する炎症誘発サイトカイン増大、鬱病、黒色表皮腫、並びに空腹亢進が挙げられる。
【０１０５】
本発明によれば、哺乳動物（特にヒト）に投与される用量は、所望の反応をもたらすのに十分な量であるべきである。このような反応には、治療が望まれる或いは所望の利益をもたらす、ファルネソイドＸ受容体により媒介される疾患又は障害の有害な影響の拮抗又は予防が含まれる。ある実施形態では、障害は肥満症である。当業者は、その用量が、ヒトの年齢、状態及び体重、並びにヒトにおける肥満症の程度を含む様々な要因に依存すると認識するであろう。また、用量サイズは、投与の経路、タイミング及び頻度、並びに特定の化合物の投与及び所望の生理学的効果に伴い得る任意の有害な副作用の存在、性質、及び範囲により決定されるであろう。肥満症又はその他の疾患又は障害の有効な治療法は、多回投与を含む長期の治療を必要とする可能性もあると当業者により理解されるであろう。
【０１０６】
この点において、ファルネソイドＸ受容体の阻害を介する肥満症の治療は、哺乳動物における体重増加の割合の減少とみなすことができる。ある実施形態では、哺乳動物は高脂肪食を消費している。高脂肪食は、脂肪として３０％を上回るエネルギーを提供するものとみなすことができる（例えば、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  Ｅｘｅｒｃｉｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｓ．  Ｊｅｎｎｅｔｔ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  （２００８）を参照）。他の実施形態では、本発明は哺乳動物における肥満症の予防方法を提供する。肥満症の予防は、低脂肪食又は中間脂肪食から高脂肪食への食事の変更が行われた標準体重の哺乳動物における予測される体重増加を低減することとみなすことができる。
【０１０７】
適切な投与量及び投与計画は、範囲を見出す当業者に周知の従来の技術により決定することができる。一般的に、治療は、化合物の最適な投与量未満のより低用量で開始される。その後、用量は、その条件下で最適な効果が得られるまで小量分ずつ増加される。本発明の方法は、通常、１種以上の上記化合物を、哺乳動物１ｋｇ体重あたり約０．１〜約３００ｍｇ（例えば、約０．１〜約１５０ｍｇ、約０．１〜約１００ｍｇ又は約０．１〜約５０ｍｇ）投与することを含むであろう。
【０１０８】
投与される化合物（単数又は複数）の治療有効量は、所望の効果及び上記の要因により変化し得る。通常、用量は、対象の体重に対して０．０１ｍｇ／ｋｇ及び２５０ｍｇ／ｋｇの間、より典型的には、約０．０５ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇの間（例えば、対象の体重に対して、約０．２〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約４０ｍｇ／ｋｇ又は約１０〜約３０ｍｇ／ｋｇ）である得る。このように、単位剤形は、上記の適切な範囲及び対象の体重に基づいて製剤化され得る。本明細書で用いられる用語「単位剤形」とは、治療対象に適切な物理的に別々の単位の治療剤を言う。
【０１０９】
別の方法として、用量は、体表面積に基づいて計算され、１日あたり約１ｍｇ／ｍ２〜約２００ｍｇ／ｍ２（例えば、約５ｍｇ／ｍ２〜約１００ｍｇ／ｍ２）が、対象に投与されるだろう。特定の実施形態では、化合物（単数又は複数）の治療有効量の投与には、１日あたり約５ｍｇ／ｍ２〜約５０ｍｇ／ｍ２（例えば、約１０ｍｇ／ｍ２〜約４０ｍｇ／ｍ２）を対象に投与することが含まれる。現在のところ、化合物（単数又は複数）を単回投与することが望ましいが、治療上の効果的な用量が、長期にわたる期間投与されてもよいし、或いは１日あたり複数回投与されてもよいと考えられている。このように、単位剤形は、また、上記の適切な範囲及び所望の投与スケジュールに基づき、対象の体表面積を用いて計算することができる。
【０１１０】
本明細書で実証されているように、ファルネソイドＸ受容体は肥満症の発症に関与する。したがって、ファルネソイドＸ受容体の阻害剤の投与により、特に高脂肪食を消費する哺乳動物における、肥満症の発症の治療又は予防が期待される。
【０１１１】
また、本明細書では、腸内ファルネソイドＸ受容体が、ＮＡＦＬＤの進行に絶対不可欠な役割を果たしていることが示されている。本発明の実施形態の腸内ファルネソイドＸ受容体の阻害は、高脂肪食により誘発されるＮＡＦＬＤを改善することが示されている。
【０１１２】
それぞれ、腸内細菌をリモデリングして殺す、テンポール及び抗生剤に対する研究を通じて、これらの薬剤が、腸内微生物叢の集団を変化させ、それにより、酵素胆汁酸塩ヒドロラーゼ（ＢＳＨ）を発現する細菌が減少する新たな経路が明らかになった。より少ないＢＳＨは、腸内の抱合胆汁酸（例えばＴ−β−ＭＣＡ）のレベルの増大をもたらす。次にＴ−β−ＭＣＡは腸内ＦＸＲの拮抗薬である。より少ない腸内のＦＸＲシグナル伝達が、高脂肪食を与えたマウス及び遺伝的に肥満のマウスにおいて、肥満症、インスリン抵抗性及びＮＡＦＬＤの減少をもたらす。これらの研究は、ＦＸＲの阻害が肥満症、インスリン抵抗性及びＮＡＦＬＤを伴う患者の治療の有望なアプローチであるだろうという仮説を導いた。新規化学物質グリシンβ−ムリコール酸（Ｇｌｙ−ＭＣＡ）の経口投与は、高脂肪食処置マウス及び遺伝的に肥満のマウスにおいて、肥満症、インスリン抵抗性及びＮＡＦＬＤを減少させた。経口投与され、腸内に保持される化合物であって、腸内ＦＸＲを阻害し、肝臓で発現するＦＸＲに対しては何の影響もない任意の化合物が、肥満症、インスリン抵抗性及びＮＡＦＬＤの患者の治療に対する有用性を有し得るということを提案している。
【０１１３】
（化学）
式１の化合物（ただし、ＷがＯＲ４（Ｒ４は水素である）であり、Ｒ１及びＲ２が水素であり、ＸがＣ＝Ｏであり、ｍが２であり、ＹがＮＨであるもの）（例えばβ−ムリコール酸９）及びその複合体（例えば、代表的な実施形態のタウロ−β−ムリコール酸１０及びグリシン−β−ムリコール酸１６）は、図８に記載のスキームで説明されるようにして調製することができる。酸触媒下でのジヒドロキシ酸１の例えばメタノールとのエステル化は、エステル２を提供する。Ａ環のヒドロキシル基のエチルクロロホルマートでの保護は、カーボネート３を提供する。７−ヒドロキシル基の例えばクロム酸カリウムでの酸化はケトン４を与える。例えばＨＢｒにおける臭素を用いる臭素化はブロモケトン５を与える。例えばケトンの還元はブロモアルコール６を与える。例えば亜鉛金属を用いる臭素の還元的脱離はオレフィン７を提供する。例えば四酸化オスミウムを用いるｃｉｓ−ジヒドロキシル化はｃｉｓジオール８を与える。両方のエステルの加水分解はβ−ムリコール酸９を提供する。β−ムリコール酸９は、適切なカップリング剤を用いてタウリンと結合させることができ、タウロ−β−ムリコール酸１０を提供することができる。グリシンは、タウリンと置き換えることができ、β−ムリコール酸のグリシン複合体（１６）を提供することができる。２−アミノエチルホスホン酸は、タウリンと置き換えることができ、タウロ−β−ムリコール酸のホスホン酸類似体を提供することができる。化学は、「Ｉｉｄａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｉｐｉｄ，  １６：    ８６３−５  （１９８１）」、「Ｉｉｄａ  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ３０：    １２６７−１２７９  （１９８９）」及び「Ｔｓｅｒｎｇ  Ｋ−Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １８：    ４０４−４０７  （１９７７）」に記載されている。
【０１１４】
式Ｉの化合物（ただし、ＸがＣＨ２であり、ｍが２であるもの）は、例えば、実例としての実施形態のβ−ムリコール酸９で開始する図９で説明される経路により調製することができる。カルボン酸を酸触媒エステル化により保護して化合物１１を提供する。化合物１１のヒドロキシル基を任意の適切な保護基（例えばベンジル（Ｂｚｌ））を用いて保護して、化合物１２を得ることができる。任意の適切な還元剤（例えば水素化アルミニウムリチウム）を用いるカルボキシル基の還元はアルコール１３を提供する。任意の適切な試薬（例えば、トリフェニルホスフィン及び四臭化炭素）を使用する、ヒドロキシル基の適切な脱離基（例えばブロモ）への変換は、化合物１４を与える。例えば、式：ＨＹＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３Ｈ（式中ＹはＮＨ、Ｏ、Ｓ、又はＳｅである）の求核試薬を用いる１３における脱離基の置換とそれに続く脱保護は、タウリン結合類似体１５を与える。
【０１１５】
実施形態において、本発明は、式（Ｉ）：
【０１１６】
【化１５】
0006556129.tif 000016
【０１１７】
［式中、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ４は水素であり、
Ｘは、ＣＨ２であり、
Ｙは、ＣＨ２、ＮＲ５、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、及びＳｅから選ばれ、
Ｚは、ＣＯＯＲ６、ＳＯ３Ｒ７、Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ８）２及びＮＲ９Ｒ１０から選ばれ、
Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、独立して、水素、アルキル、及びアリールから選ばれ、
Ｒ４は、水素、アルキル、及びＣ（＝Ｏ）Ｒ３から選ばれ、
ｍは、１〜６の整数であり、且つ
ｎは、１〜６の整数である。］
の化合物の合成方法であって、
（ｉ）式（ＩＶ）の化合物を提供する工程：
【０１１８】
【化１６】
0006556129.tif 000017
【０１１９】
（ｉｉ）式（ＩＶ）の化合物をアルコールで処理して、式（Ｖ）の化合物を提供する工程：
【０１２０】
【化１７】
0006556129.tif 000018
【０１２１】
（ｉｉｉ）式（Ｖ）の化合物におけるヒドロキシル基を保護して、式（ＶＩ）の化合物を提供する工程：
【０１２２】
【化１８】
0006556129.tif 000019
【０１２３】
（ｉｖ）式（ＶＩ）の化合物を還元剤で処理して、式（ＶＩＩ）の化合物を提供する工程：
【０１２４】
【化１９】
0006556129.tif 000020
【０１２５】
（ｖ）式（ＶＩＩ）の化合物を式（ＶＩＩＩ）（式中ＬＧは脱離基である）の化合物に変換する工程：
【０１２６】
【化２０】
0006556129.tif 000021
【０１２７】
（ｖｉ）式（ＶＩＩＩ）の化合物を式：ＨＹ（ＣＨ２）ｎＺ（式中ＹはＮＨ、Ｓ、Ｏ又はＳｅである。）の化合物で処理して、式（ＩＸ）の化合物を提供する工程：及び
【０１２８】
【化２１】
0006556129.tif 000022
【０１２９】
（ｖｉｉ）式（ＩＸ）の化合物を式（Ｉ）の化合物へ変換する工程を含む方法を提供する。
【０１３０】
実施形態において、本発明は式（ＩＩ）：
【０１３１】
【化２２】
0006556129.tif 000023
【０１３２】
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、水素であり、
Ｘは、ＣＨ２であり、
Ｙは、ＣＨ２、ＮＲ５、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、及びＳｅから選ばれ、
Ｚは、ＣＯＯＲ６、ＳＯ３Ｒ７、Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ８）２及びＮＲ９Ｒ１０から選ばれ、
Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、独立して、水素、アルキル、及びアリールから選ばれ、
Ｒ４は、水素、アルキル、及びＣ（＝Ｏ）Ｒ３から選ばれ、
ｍは、１〜６の整数であり、且つ
ｎは、１〜６の整数である。］
の化合物の合成方法であって、
（ｉ）式（Ｘ）の化合物を提供する工程：
【０１３３】
【化２３】
0006556129.tif 000024
【０１３４】
（ｉｉ）式（Ｘ）の化合物をアルコールで処理して、式（ＸＩ）の化合物を提供する工程：
【０１３５】
【化２４】
0006556129.tif 000025
【０１３６】
（ｉｉｉ）式（ＸＩ）の化合物におけるヒドロキシル基を保護して、式（ＸＩＩ）の化合物を提供する工程：
【０１３７】
【化２５】
0006556129.tif 000026
【０１３８】
（ｉｖ）式（ＸＩＩ）の化合物を還元剤で処理して、式（ＸＩＩＩ）の化合物を提供する工程：
【０１３９】
【化２６】
0006556129.tif 000027
【０１４０】
（ｖ）式（ＸＩＩＩ）の化合物を式（ＸＩＶ）（式中ＬＧは脱離基である。）の化合物に変換する工程：
【０１４１】
【化２７】
0006556129.tif 000028
【０１４２】
（ｖｉ）式（ＸＩＶ）の化合物を式：ＨＹ（ＣＨ２）ｎＺ（式中、ＹはＮＨ、Ｓ、Ｏ又はＳｅである。）の化合物で処理して、式（ＸＶ）の化合物を提供する工程：及び
【０１４３】
【化２８】
0006556129.tif 000029
【０１４４】
（ｖｉｉ）式（ＸＶ）の化合物を式（ＩＩ）の化合物に変換する工程を含む方法を提供する。
【０１４５】
以下の実施例により、さらに本発明を説明するが、もちろん、その範囲を限定するものとして解釈するべきではない。
【０１４６】
（ルシフェラーゼアッセイ）
ＰＧＬ４−Ｓｈｐ−ＴＫホタルルシフェラーゼ構造物及びヒトＦｘｒ発現プラスミドは、ラトガース大学のＧｒａｃｅ  Ｌ．  Ｇｕｏにより提供された。ヒトＡｓｂｔ発現プラスミドは、ウェイクフォレスト大学医学部のＰａｕｌ  Ａ．Ｄａｗｓｏｎにより提供された。プラスミドを、Ｘ−ＴＲＥＭＥＧＥＮＥＴＭＨＰ  ＤＮＡトランスフェクション試薬（ロシュ）を用いて細胞にトランスフェクトした。細胞を溶解して、ルシフェラーゼ活性をＤＵＡＬ−ＬＵＣＩＦＥＲＡＳＥＴＭアッセイキット（プロメガ）で測定した。ホタルルシフェラーゼ活性を、ウミシイタケ（Ｒｅｍｉｌｌａ）ルシフェラーゼ活性に対して標準化した。
【０１４７】
（ＡＴＰアッセイ）
ＡＴＰ検出を以下のプロトコルで行った。ＡＴＰの抽出については、１０ｍｇの回腸粘膜を、１．０ｍＬの氷冷ＴＥ飽和フェノール（シグマ−アルドリッチ）でホモジナイズした。２００μＬのクロロホルム及び１５０μＬの脱イオン水の混合物を加え、ホモジネートを２０秒間十分に振とうし、４℃にて１０，０００ｇで５分間遠心分離した。上清からのアリコートを１００倍に脱イオン水で希釈し、１０μＬの希釈抽出物をＡＴＰ測定キット（インビトロゲン社）で測定した（Ｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ７２７：    ８−１２  （２０１２））。
【０１４８】
テンポール、バシトラシン、ネオマイシン、及びストレプトマイシンは、シグマ−アルドリッチ（ミズーリ州セントルイス）から購入した。胆汁酸は、ステラロイズ社（ロードアイランド州ニューポート）及びシグマ（ミズーリ州セントルイス）で注文し、タウロコール酸−ｄ５ナトリウム塩は、トロントリサーチケミカルズ社（オンタリオ州トロント）で注文した。セラミドは、アバンティポーラリピッドから得た。ＨＦＤ（６０ｋｃａｌ％脂肪）は、Ｂｉｏ−Ｓｅｒｖ（ニュージャージー州フレンチタウン）で購入した。Ｔ−β−ＭＣＡ及びＧｌｙ−ＭＣＡは、図４１に示したスキームに従って合成し、実施例１に記載した。全ての溶媒及び有機試薬は、利用可能な最高グレードであった。
【０１４９】
（動物研究）
高脂肪食（ＨＦＤ）（６０％ｋｃａｌが脂肪からなるもの）を、Ｂｉｏｓｅｒｖ社から購入した。腸特異的Ｆｘｒ−ｎｕｌｌ（ＦｘｒΔＩＥ）マウス及び野生型（Ｆｘｒｆｌ／ｆｌ）マウスはＣ５７ＢＬ／６Ｎの遺伝的背景を有した。Ｆｘｒｆｌ／ｆｌ及びＦｘｒΔＩＥ（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．  ４８：２６６４−２６７２，  ２００７）マウスを、１０世代にわたってＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスと戻し交配した。抗生剤（バシトラシン、ネオマイシン及びストレプトマイシンの組み合わせ）の研究については、６週齢からのオスのＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスに高脂肪食（“ＨＦＤ）を与え、飲用水中で各０．１％（ｗ／ｖ）の化合物（バシトラシン、ネオマイシン、及びストレプトマイシンの組み合わせ）を投与した。テンポールの研究については、６週齢からのオスのＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスに、ＨＦＤを与え、飲用水中で０．０６４％（ｗ／ｖ）のテンポールを投与した。ｉｎ  ｖｉｖｏのＴβＭＣＡについては、６週齢からのオスのＣ５７ＢＬ／６ＮマウスにＨＦＤを与え、抗生剤（バシトラシン、ネオマイシン、及びストレプトマイシンの組み合わせの各０．１％の化合物）で３日間処置した。ビヒクル（食塩水）、ＴＣＡ（４００ｍｇ／ｋｇ体重、食塩水に溶解したもの）又はＴＣＡ及びＴβＭＣＡの組み合わせ（各化合物４００ｍｇ／ｋｇ体重、食塩水に溶解したもの）をマウスに経口投与し、続く第２の投与を１２時間後とした。マウスを組織採取のために２時間後に殺した。Ｇｌｙ−ＭＣＡの研究について、Ｇｌｙ−ＭＣＡをカスタム合成した。ベーコン風味の練り粉丸剤は、Ｇｌｙ−ＭＣＡ（０．２５ｍｇＧｌｙ−ＭＣＡ／丸剤、１０ｍｇ／ｋｇの用量）を経口投与するために開示されているようにして製造した（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２６０：６５−６９，  ２０１２）。研究の前にマウスが練り粉丸剤を食すように訓練した。肥満症、インスリン抵抗性及びＮＡＦＬＤの予防のために、オスの野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（６〜８週齢）に６週齢から高脂肪食（Ｂｉｏ−Ｓｅｒｖ、ニュージャージー州フレンチタウン；６０ｋｃａｌ％脂肪）を与え、ビヒクル（対照丸剤）又はＧｌｙ−ＭＣＡ（０．２５ｍｇ／丸剤／日、用量１０ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスに１２週間高脂肪食を与え、投与した（０．２５ｍｇＧｌｙ−ＭＣＡ／丸剤、用量５ｍｇ／ｋｇ）。レプチン欠損ｄｂ／ｄｂマウス（６〜８週齢）に固形飼料を与え、Ｇｌｙ−ＭＣＡ（０．２５ｍｇ／丸剤／日、１０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。マウスを個別にホームケージに収容した。累積の食物摂取量及びＴＥＥｂａｌを、６ないし７週間のＨＦＤのビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスで１週間測定した。ＴＥＥｂａｌを以前の開示のようにして測定した（Ｒａｖｕｓｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｏｂｅｓｉｔｙ  ３７：３９９−４０３，  ２０１３）。
【０１５０】
全ての動物研究は、実験動物資源ガイドライン協会に従って行い、ＮＣＩ動物実験委員会により承認された。
【０１５１】
（初代肝細胞の調製及び培養）
６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスの初代肝細胞を、コラゲナーゼ１（インビトロゲン、カリフォルニア州カールズバッド）のかん流により得た。細胞を４５％Ｐｅｒｃｏｌｌ（シグマ、ミズーリ州セントルイス）密度遠心分離により精製し、１０％ウシ胎仔血清及び１％インスリン−トランスフェリン−セレン−エタノールアミン（ＩＴＳ−Ｘ）（インビトロゲン、カリフォルニア州カールズバッド）を伴うＤＭＥＭ（インビトロゲン、カリフォルニア州カールズバッド）中にて培養した。肝細胞の生存率を、トリパンブルー色素排除を用いて測定し、８５％を超える高い生存率のものを用いた。培地を４時間の培養後に１％ウシ胎仔血清を伴うＤＭＥＭに変更した。４時間飢えさせた後、細胞をセラミドにさらした。所定の時点で、細胞を採取し、ｑＰＣＲ分析及びＴＧ内容物の検出を行った。
【０１５２】
（ＲＮＡ分析）
腸の粘膜を穏やかに擦り取り、肝臓を採取し、その両方を液体窒素中で急速冷凍し、ＲＮＡを調製するまで−８０℃で保存した。ＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロゲン、カリフォルニア州カールズバッド）を用いてＲＮＡを凍結した腸及び肝臓から抽出した。ｃＤＮＡをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（インビトロゲン、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて１μｇの全ＲＮＡから合成した。ｑＰＣＲプライマーをｑＰｒｉｍｅｒＤｅｐｏｔを用いて設計した。測定されたｍＲＮＡレベルを１８ＳリボソームＲＮＡのレベルに対して標準化し、対照群のレベルに対して相対的な倍数変化として表した。
【０１５３】
（ウエスタンブロット解析）
肝臓全細胞又は核抽出液を調製した。膜をＦＸＲ（サンタクルーズバイオテクノロジー社、カリフォルニア州サンタクルーズ）、ＳＲＥＢＰ１（ＢＤバイオサイエンス、カリフォルニア州サンノゼ）、及びＣＩＤＥＡ（アブカム、マサチューセッツ州ケンブリッジ）に対する抗体とインキュベートした。得られたシグナルを、全細胞抽出液についてはβ−ＡＣＴＩＮ（アブカム）及び核抽出液についてはＬＡＭＩＮ  Ａ／Ｃ（サンタクルーズ）に対して標準化した。
【０１５４】
（腸内マイクロバイオームの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子シークエンシング）
糞便中の細菌及び盲腸内容物をＰｏｗｅｒＳｏｉｌ  ＤＮＡ単離キット（モーバイオラボラトリーズ社、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて抽出した。ＰＣＲ生成物（およそ１０００ｂｐｓ）を、４５４  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃２０１１−００２のＳｈｏｒｔ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅに記載されたようにして、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ベックマンコールター、カリフォルニア州ブレア）を用いて精製した。精製後、生成物を、ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｉｂｒａｒｙ定量キット（ＫａｐａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、マサチューセッツ州ウーバン）を用いてＱｕｂｉｔ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ、カールズバッド、カリフォルニア州）及びｑＰＣＲの両方を定量化した（モル量に基づいて統合し、１％アガロースゲル上で行い、抽出した。）。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）で精製した後、質及び量を、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザ（アジレントテクノロジー、カリフォルニア州サンタクララ）上でＤＮＡ７５００ＬａｂＣｈｉｐ及びＱｕｂｉｔ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎを用いて評価した。シークエンシングを、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ＋（ロシュダイアグノスティックス、インディアナ州インディアナポリス）で４分の１のＰＴＰプレートを用いて行った。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列解析をこれまでに開示されたようにして行った（Ｌｏｚｕｐｏｎｅ  ａｎｄ  Ｋｎｉｇｈｔ，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ７１：８２２８−８２３５，  ２００５）。細菌の個体数の変化を評価するためのＷｅｉｇｈｔｅｄ  ＵｎｉＦｒａｃ解析を、Ｇａｌａｘｙのウェブ上のプラットフォームで行った（Ｂｌａｎｋｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２６：１７８３−１７８５，  ２０１０；  Ｇｏｅｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．  １１：  １２６，  ２０１０；  Ｇｉａｒｄｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １５：１４５１−１４５５，  ２００５）。
【０１５５】
（メタゲノムデータ分析）
質のフィルタリング及び重複排除の後、各サンプルには平均１１０００の読み込みが含まれた。Ｍｏｔｈｕｒソフトウェアパッケージを用いて、シークエンシングデータを前もって処理し、ＲＤＰ多分類装置を用いて、各シーケンスを分類学上のランクに割り当てた。前処理は、２０の平均的な質についてのフィルタリングの読み込み、重複配列の除去、バーコードによるサンプルの分割、その一方でのバーコードの一つのミスマッチの許可から構成された。サンプルあたりの全読み込みにおける差異を説明するために、分類を全読み込みの割合に変換した。このアプローチは、その後のグループ内及びグループ間の正確な比較を可能にした。
【０１５６】
（メタボロミクス解析）
リピドミクス解析：血清のリピドミクス解析については、２５μｌ血清を、内部標準として２μＭのＬＰＣ（１７：０）、ＰＣ（１７：０）、ＳＭ（１７：０）及びＣＥＲ（１７：０）（アバンティポーラリピッド、アラバマ州アラバスター）を含む４倍の冷クロロホルム：メタノール（２：１）溶液により抽出した。サンプルを３０秒間ボルテックスし、次いで室温で５分間静置した。混合物を１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、次いで、下層の有機相を回収し、真空下にて室温で留去した。ＵＰＬＣ−ＭＳ解析の前に、残渣をクロロホルム：メタノール（１：１）に溶解し、２μＭ  ＰＣ（１７：０）を含むイソプロパノール：アセトニトリル：Ｈ２Ｏ（２：１：１）で希釈した。組織のリピドミクス解析については、約５０ｍｇの正確に量った組織を、７００μＬメタノール：Ｈ２Ｏ（４：３）溶液でホモジナイズし、次いで内部標準として２μＭのＬＰＣ（１７：０）、ＳＭ（１７：０）及びＣＥＲ（１７：０）を含む８００μＬのクロロホルムを使用して抽出した。ホモジネートを３７℃で２０分間インキュベートし、続いて２０分間１３，０００ｒｐｍで遠心分離した。下層の有機相を新たなチューブに移し、真空下で乾燥した。注射の前に、残渣を１００μLのクロロホルム：メタノール（１：１）溶液に懸濁し、次いで２μＭのＰＣ（１７：０）を含むイソプロパノール：アセトニトリル：Ｈ２Ｏ（２：１：１）溶液で希釈した。リピドミクスの解明については、サンプルを、以下の条件下でＷａｔｅｒ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＣＳＨ  １．７ｕｍ  Ｃ１８カラム（２．１ｘ１００ｍｍ）を用いてＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＱＴＯＦ  ＭＳで分析した：ＵＰＬＣ：Ａ−アセトニトリル／水（６０／４０）、Ｂ−イソプロパノール／アセトニトリル（９０／１０）。Ａ及びＢには、共に１０ｍＭの酢酸アンモニウム及び０．１％のギ酸が含まれた。グラジエント：初期６０％Ａから２分で５７％Ａに、２．１分＊で５０％Ａに、１２分で４６％Ａに、１２．１分＊で３０％Ａに、１８分で１％Ａに、その後１８．５分で初期条件に戻し、さらに２分間の平衡を伴う（＊は加速度グラジエントを示す）。流速は０．４ｍｌ／分であった。カラム温度を５５℃に維持した。ＭＳはランタイムが１８分間である点を除いて上記と同様の条件であった。
【０１５７】
グローバルメタボロミクス解析：尿サンプルを２０μＬの尿を１８０μＬの５０％アセトニトリル水溶液（５０：５０水／アセトニトリル）に加えることにより調製した。サンプルを５分間ボルテックスし、４℃で１８０００×ｇにて２０分間遠心分離し、微粒子及び析出したタンパク質を除去した。上清を、分析のためにオートサンプラバイアルに移した。５μＭのクロルプロパミド（内部標準）を含む５００ｍＬの５０％アセトニトリル水溶液中で５０ｍｇ組織サンプルをホモジナイズした。サンプルをボルテックスし、４℃で１３，０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、微粒子及び析出タンパク質を除去した。上清を分析のためにオートサンプラバイアルに移した。メタボロミクス発見のため、上清サンプルの５μｌのアリコートを、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ  １．７ｕｍ  Ｃ１８（２．１ｘ５０ｍｍ）カラムを備えるＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＱＴＯＦＭＳシステム（Ｗａｔｅｒｓ、マサチューセッツ州ミルフォード）に注入した。グラジエント移動相は、水中の０．１％ギ酸（Ａ）及びアセトニトリル中の０．１％ギ酸（Ｂ）を含む。グラジエントは、最初の０．５分間９５％Ａに維持し、４分で４０％Ａに、次いで８分で１％Ａとした。カラムを１分間フラッシュし、次いで１．５分間初期条件で平衡化した。流速は０．５ｍｌ／分であった。カラム温度を６０℃に維持した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｎａｐｔ  ＨＤＭＳ  Ｑ−ＴＯＦを、０．３スキャン／秒の速度で５０−８５０ａｍｕにてスキャンしてポジティブモード及びネガティブモード両方で運転した。以下の機器条件を使用した：キャピラリー３ｋＶ、温度源１２０℃、サンプリングコーブ３０Ｖ、脱溶媒ガス流量５０Ｌ／ｈ（４００℃）。バイオマーカー同定及び定量:バイオマーカーを負荷散布図におけるイオンを分析することによりスクリーニングし、メタボロミクスデータベース（ＭＥＴＬＩＮ  ａｎｄ  Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  Ｄａｔａｂａｓｅ）を検索し、有力な候補を見つけ出した。推定指標の同一性を確認するために、真性の標準を、ＭＳ／ＭＳフラグメンテーションパターン及び保持時間に基づいて代謝物と比較した。代謝物の濃度を真性の標準を用いて標準曲線に基づき多重反応モニタリング質量分析により決定した。
【０１５８】
（データプロセシング及び多変量データ解析）
クロマトグラフの及びスペクトルデータをＭａｒｋｅｒＬｙｎｘソフトウエア（Ｗａｔｅｒｓ）により解析した。サンプル識別、イオン識別（保持時間及びｍ／ｚ）、及びイオン存在度の情報を含む多変量データマトリクスを質量中心、同位体分離、フィルタリング、ピーク認識、及び積分を通じて得る。各イオンの強度を全クロマトグラムにおいて総イオンカウントに対して単一のイオンカウントを標準化することにより計算した。さらに、データマトリクスをＳＩＭＣＡ−Ｐソフトウエア（Ｕｍｅｔｒｉｃｓ、ニュージャージー州キネロン）にエクスポートし、平均センタリング及びパレートスケーリング（ノイズの大幅な増幅なく低存在度イオンの重要性を増大させる技術）により変換した。主成分分析（ＰＣＡ）、部分最小二乗法判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）、及び潜在構造直交射影判別分析（ＯＰＬＳ−ＤＡ）を含む統計モデルは、データマトリクスにおける主要な潜在変数を表すために確立された。
【０１５９】
（ＮＭＲベースのメタボロミクス実験）
メタノール、Ｋ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４（全て分析グレード）、ナトリウム３−トリメチルシリル［２，２，３，３−ｄ４］プロピオナート（ＴＳＰ−ｄ４）及びＤ２Ｏ（Ｄが９９．９％）をシグマアルドリッチ(ミズーリ州セントルイス)から購入した。リン酸バッファー（０．１Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４及びＰＨ７．４）を、良好な溶解度及び低温安定性のためにＫ２ＨＰＯ及びＮａＨ２ＰＯ４を用いて調製した。肝臓サンプル（〜５０ｍｇ）を、ＰｒｅＣｅｌｌｙｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（ベルタンテクノロジーズ、メリーランド州ロックビル）を用いて０．６ｍＬ（６００μＬ）の予め冷却したメタノール−水の混合物（２／１、ｖ／ｖ）で三回抽出した。１１１８０×ｇにて４℃で１０分間遠心分離した後、まとめた上清を乾燥した。各水性抽出物を別々に５０％Ｄ２Ｏ及び０．００５％ＴＳＰ−ｄ４（化学シフト参照）を含む６００μＬリン酸バッファーに再構成した。遠心分離後、それぞれ５５０μＬの抽出物を５ｍｍのＮＭＲチューブに移した。盲腸内容物のサンプルは、以前に開示された最適化された手順（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）を用いて直接抽出した。簡単に説明すると、サンプル（〜５０ｍｇ）を６００μＬの予め冷却されたリン酸バッファーと混同し、３０秒間ボルテックスし、３連続で凍結解凍を行い、続いて、ＰｒｅｃｅｌｌｙｓＴＭ組織ホモジナイザーを用いて均質化した。１０分間遠心分離（１１，１８０×ｇ、４℃）した後、上清（５５０μＬ）を、ＮＭＲ分析のために５ｍｍのＮＭＲチューブに移した。
【０１６０】
（１Ｈ  ＮＭＲ分光法）
水性の肝臓抽出物及び糞便抽出物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒインバース極低温プローブ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｉｎ、独国）を備えるＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩＩ  ８５０ＭＨｚ分光計（１Ｈに対して８５０．２３ＭＨｚで作動）にて２９８Ｋで記録した。ＮＯＥＳＹパルスシーケンス（ＮＯＥＳＹＰＲ１Ｄ）の最初の増大を用いて、全ての各サンプルについて代表的な一次元ＮＭＲスペクトルを取得した。水のシグナルを抑制するために、繰り返し時間（２秒）及び混合時間（１００ミリ秒）の間に水のピークに対して弱い連続波照射を適用した。９０°のパルス幅を、各サンプルについておよそ１０マイクロ秒に調節した。６４の過渡信号を、２０ｐｐｍのスペクトル幅を有する各スペクトルについて３２ｋのデータポイントに回収した。ＮＭＲのシグナル帰属を容易にするために、選択されたサンプルについて、２Ｄ  ＮＭＲスペクトルの範囲を取得し、１Ｈ−１Ｈ相関分光法（ＣＯＳＹ）、１Ｈ−１Ｈ全相関分光法（ＴＯＣＳＹ）、１Ｈ−１３Ｃ異種核単量子相関（ＨＳＱＣ）、及び１Ｈ−１３Ｃ異核多結合相関分光法（ＨＭＢＣ）を含めて以前に開示されたようにして処理した（Ｄａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０；  Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。
【０１６１】
（スペクトルデータプロセシング及び多変量データ解析）
全ての自由誘導減衰（ＦＩＤ）をフーリエ変換の前に１Ｈｚ線拡大係数を用いて指数関数により掛け算をした。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを、位相及びベースラインの歪みを手動で補正し、スペクトル領域δ０．５−９．５を、ＡＭＩＸソフトウェアパッケージ（Ｖ３．８、Ｂｒｕｋｅｒ−Ｂｉｏｓｐｉｎ、独国）を用いて０．００４ｐｐｍの等しい幅（２．４Ｈｚ）を有する領域に統合した。領域δ４．４５−５．２０は不完全な水飽和により放棄した。また、領域δ１．１５−１．２３及びδ３．６２−３．６９は、マウス解剖プロセスの間における盲腸内容物のエタノール汚染のため除去した。次いで、それぞれのバケツ領域を、スペクトル積分の総和に対して標準化し、統計的データ解析の前に全体的な濃度差について補った。
【０１６２】
多変量データ解析は、ＳＩＭＣＡＰ＋ソフトウエア（ｖｅｒｓｉｏｎ１３．０、Ｕｍｅｔｒｉｃｓ、スウェーデン）を用いて行われた。はじめに、主成分分析（ＰＣＡ）を、ＮＭＲデータ上で行い、概略を得、データの質を評価した。次いで、判別分析を伴う潜在構造に対する直交射影（ＯＰＬＳ−ＤＡ）を、ＮＭＲデータ上で行った。ＯＰＬＳ−ＤＡモデルを、７倍相互検証法を用いて検証し、モデルの質をパラメーターＲ２Ｘ及びＱ２値により記載した。結果の解釈を容易にするため、ＯＰＬＳ−ＤＡから生じた負荷の逆変換（Ｃｌｏａｒｅｃ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ７７：５１７−５２６、２００５）を、負荷プロットを生み出すために行った。それを、ＭＡＴＬＡＢのために社内開発したスクリプト（マスワークス社；マサチューセッツ州ナトウィック）を用いて変数（又は代謝物）のピアソン線形相関係数で色分けした。本研究では、｜ｒ｜＞０．８１１（ｒ＞０．７５５及びｒ＜−０．７５５）のカットオフ値を、判別有意性（ｐ≦０．０５）に基づいて有意な相関関数のために選択した。
【０１６３】
（胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性）
糞便のタンパク質を、超音波処理を用いてｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、５．０ｍＬ）中の糞便サンプル（０．５ｇ）から調製した。胆汁酸塩ヒドロラーゼ（ＢＳＨ）活性を、糞便におけるＴＣＤＣＡからのＣＤＣＡの生成に基づいて測定した。簡潔に説明すると、インキュベーションを、２００μＬの最終体積中０．１ｍｇ／ｍｌの糞便のタンパク質及び５０μＭのＴＣＤＣＡ−ｄ５を含む３ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）中で行った。３７℃での２０分のインキュベーション後に、サンプルをドライアイスに落下させることにより反応を停止した。１００μＬのアセトニトリルを反応混合物に直接加えた。１４，０００×ｇで２０分間遠心分離した後、５μＬの上清を、オートサンプラバイアルに移して、ＸＥＶＯ三連四重極タンデム質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州ミルフォード）と連結したＵＰＬＣシステムにより分析した。
【０１６４】
（ミトコンドリアの単離及び機能的研究）
腸内のミトコンドリアについては、回腸の粘膜を穏やかに擦り取り、ＰＢＳで２回洗浄し、氷冷したミトコンドリアの０．２％ＢＳＡを含む均質化バッファー（２２５ｍＭマンニトール、７５ｍＭスクロース、５ｍＭ  ＭＯＰＳ、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ及び２ｍＭタウリン（ｐＨ７．２５））中でみじん切りにし、ゆったりしたホモジナイザーでホモジナイズした。ホモジネートを５００ｘｇにて４℃で１０分間遠心分離した。次いで、上清を１０，０００ｘｇにて４℃で１０分間遠心分離した。最終のミトコンドリアのペレットを、機能的評価の前に０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で０．２％ＢＳＡを含むミトコンドリアの単離緩衝液中で再懸濁した。
【０１６５】
単離されたミトコンドリアの酸素消費量を２５℃でクラーク型Ｏ２電極（Ｉｎｓｔｅｃｈ）及びＯ２モニター（Ｍｏｄｅｌ  ５３００、ＹＳＩ社）に接続したチャンバー内で測定した。ミトコンドリアを、コンプレックスＩ（５ｍＭグルタミン酸塩及び５ｍＭリンゴ酸塩）、又はコンプレックスＩＩ（５ｍＭコハク酸塩及び１μＭロテノン）の何れかに対する基質と共に呼吸バッファー（１２０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭＯＰＳ、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４及び０．２％ＢＳＡ）中でインキュベートした。状態３（最大）呼吸活性を１ｍＭのＡＤＰの添加後に測定した。ＡＤＰ独立呼吸活性（状態４）を、２μＭオリゴマイシンの添加後にモニターした。呼吸調節比は状態３／状態４の呼吸速度で決定される。
【０１６６】
（組織学的分析）
ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を、標準的なプロトコルを用いてホルマリン固定パラフィン包埋切片上で行った。Ｏｉｌ  ｒｅｄ  Ｏ染色を、標準的なプロトコルを用いて凍結された肝臓切片上で行った。それぞれのマウスについて少なくとも３つの不連続な肝臓切片を評価した。
【０１６７】
（トリグリセリド内容物の定量化）
肝臓の脂質を、２：１のクロロホルム−メタノール溶液を用いて抽出した。肝臓トリグリセリドを、製造業者（Ｂｉｏａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州ヘイワード）の推奨に従ってトリグリセリド比色分析キットを用いて測定した。
【０１６８】
（細胞培養）
Ｃａｃｏ−２（ＡＴＣＣＴＭＨＴＢ−３７ＴＭ）細胞を、上記の方法のようにして分化誘導した（Ｆｅｒｒａｒｅｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２７：３９１９−３９２５，  ２００７）。分化Ｃａｃｏ−２細胞を、１％  ウシ胎仔血清を伴うＤＭＥＭ培地と８時間インキュベートし、次いでＧｌｙ−ＭＣＡ／ＣＤＣＡ／ＧＷ４０６４に２４時間曝した。ＲＮＡを、トリゾール試薬（インビトロゲン）を用いて凍結された腸から抽出した。ｃＤＮＡをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（インビトロゲン）を用いて１μｇの全ＲＮＡから合成した。
【０１６９】
（腸内細菌によるＧｌｙ−ＭＣＡヒドロキシル化）
糞便のタンパク質を、超音波処理を用いてｐＨ７．４ＰＢＳ（５．０ｍｌ）中の糞便のサンプル（０．５ｇ）から調製した。インキュベーションを２００ｍｌの最終体積で０．１ｍｇ／ｍｌ糞便のタンパク質及び５０μＭのＧｌｙ−ＭＣＡ又はＴ−β−ＭＣＡを含む３ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）中で行った。３７℃で２０分インキュベーションした後、サンプルをドライアイスに投入し、反応を停止した。１００μＬのメタノールを１００ｍｌの反応混合物に直接加えた。１４，０００ｇで２０分間遠心分離した後、５ｍｌの上清を、オートサンプラバイアルに移し、ＸＥＶＯ三連四重極タンデム質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ社、マサチューセッツ州ミルフォード）に連結したＵＰＬＣシステムにより分析した。
【０１７０】
（動物研究）
高脂肪食（ＨＦＤ）（６０％ｋｃａｌが脂肪からなるもの）をＢｉｏｓｅｒｖ社から購入した。Ｇｌｙ−ＭＣＡをカスタム合成した。
【０１７１】
ベーコン風味の練り粉丸剤を、Ｇｌｙ−ＭＣＡ（０．２５ｍｇＧｌｙ−ＭＣＡ／丸剤）の経口投与のために開示されているようにして製造した（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２６０：６５−６９，  ２０１２）。マウスが研究の前に練り粉丸剤を食すように訓練した。
【０１７２】
オスの野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（６〜８週齢）に６週齢からＨＦＤ（Ｂｉｏ−Ｓｅｒｖ、ニュージャージー州フレンチタウン；６０ｋｃａｌ％脂肪）を与え、ビヒクル（対照丸剤）又はＧｌｙ−ＭＣＡ（０．２５ｍｇ／丸剤／日、１０ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した。マウスを個別にホームケージに収容した。累積の食物摂取量及びＴＥＥｂａｌを、６ないし７週間のＨＦＤのビヒクル処置マウス及びＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスで１週間測定した。ＴＥＥｂａｌを以前に開示されたようにして測定した（Ｒａｖｕｓｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｏｂｅｓｉｔｙ  ３７：３９９−４０３，  ２０１３）。全ての動物研究は、実験動物資源ガイドライン協会に従って行い、ＮＣＩ動物実験委員会により承認された。
【０１７３】
（代謝アッセイ）
耐糖試験（ＧＴＴ）のために、マウスを１６時間絶食させ、血液を採取し、マウスに１ｇ／ｋｇのブドウ糖を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。インスリン耐性試験（ＩＴＴ）のために、マウスを４時間絶食させ、血液を採取した、次いで、インスリン（イーライリリー、ワシントンＤＣ）を１Ｕ／ｋｇ体重の用量でｉ．ｐ．により注射した。血液サンプルを注射してから１５分後、３０分後、６０分後、及び９０分後に尾から採取した。ブドウ糖をＧｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（Ｂａｙｅｒ、ペンシルベニア州ピッツバーグ）を用いて測定した。
【実施例１】
【０１７４】
本実施例は、タウロ−β−ムリコール（ＴβＭＣＡ）酸が、一次マウス肝細胞においてタウロコール酸（ＴＣＡ）によるＦＸＲ活性化を拮抗するということを示す。
【０１７５】
Ｆｘｒ＋／＋及びＦｘｒ−／−マウスの初代肝細胞を、ＰＧＬ４−Ｓｈｐ−ＴＫホタルルシフェラーゼ構造物及び対照プラスミドｐｈＲＬ−ＳＶ４０でトランスフェクトした。２４時間後、細胞を１００μＭタウロコール酸（ＴＣＡ）、ＴβＭＣＡ又はＴＣＡを伴うＴβＭＣＡで処理した。細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を、本明細書に記載するようにして測定した。結果を図１に示す。
【０１７６】
図１に示された結果から明らかなように、ＴβＭＣＡは、Ｆｘｒ＋／＋マウスの初代肝細胞ではＴＣＡによるＦＸＲ活性化を拮抗したが、Ｆｘｒ−／−マウスの初代肝細胞では拮抗しなかった。
【実施例２】
【０１７７】
本実施例は、ＴβＭＣＡが、Ｃａｃｏ−２細胞においてＴＣＡによるＦＸＲ活性化を拮抗することを示す。
【０１７８】
Ｃａｃｏ−２細胞を、ＰＧＬ４−Ｓｈｐ−ＴＫホタルルシフェラーゼ構造物、対照プラスミドｐｈＲＬ−ＳＶ４０、及びヒトＦＸＲ及びヒトＡＳＢＴ発現プラスミドでトランスフェクトした。２４時間後、細胞を、１００μＭ  ＴＣＡ、ＴβＭＣＡ、又は１００μＬの１００μＭ  ＴＣＡを伴うＴβＭＣＡで処理した。細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を本明細書で記載されたようにして測定した。結果を図２に示す。
【０１７９】
図２に示された結果から明らかなように、ＴβＭＣＡは、Ｃａｃｏ−２細胞においてＴＣＡによるＦＸＲ活性化を拮抗した。
【実施例３】
【０１８０】
本実施例は、マウス回腸粘膜におけるＡＴＰレベルが、高脂肪食での１４週間後において、Ｆｘｒｆｌ／ｆｌマウスと比較してＦｘｒΔＩＥマウスで著しく高くなるということを示す。
【０１８１】
２つの個別の群のＦｘｒｆｌ／ｆｌマウス及びＦｘｒΔＩＥマウスを、１４週間高脂肪食で保持した。両群のマウスの回腸粘膜におけるＡＴＰレベルを、本明細書に記載されたようにして測定した。結果を図３に示す。
【０１８２】
図３に示された結果から明らかなように、腸においてファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）を発現しないＦｘｒΔＩＥマウスの回腸粘膜におけるＡＴＰレベルは、腸内ＦＸＲを発現する対照Ｆｘｒｆｌ／ｆｌマウスの回腸粘膜におけるＡＴＰレベルと比較して著しく高かった。これらの結果は、エネルギー消費量の増加が、核内受容体ＦＸＲの不存在の小腸で起こるということを示す。
【実施例４】
【０１８３】
本実施例は、グリシン−β−ムリコール酸（Ｇｌｙ−ＭＣＡ）がＦＸＲ拮抗薬であることを示す。
【０１８４】
肝臓において、マウスはＴβＭＣＡを産生し、その一方でヒトは優先的にＧｌｙ−ＭＣＡを産生する。したがって、Ｇｌｙ−ＭＣＡがＦＸＲ拮抗薬であるかどうかを決定することは興味深かった。１００μＭの用量でＦＸＲ作動薬ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）は、Ｆｘｒ標的遺伝子Ｓｈｐ  ｍＲＮＡの発現を４倍増加させ、ＣＤＣＡでのＳｈｐ  ｍＲＮＡの誘導を、用量依存的にＧｌｙ−ＭＣＡにより阻害した（図４）。合成したＦＸＲ作動薬Ｇｗ４０６４は、ＦＸＲ標的遺伝子Ｓｈｐ及びＦｇｆ１９の発現を２μＭ及び５μＭの濃度で共に誘導した。両方の遺伝子の誘導は、用量依存的にＧｌｙ−ＭＣＡ□により阻害された（図５及び６）。さらに、Ｇｗ４０６４での処置は、Ａｔｐ５ｇ  ｍＲＮＡ発現を阻害し、Ｇｌｙ−ＭＣＡはこの阻害を逆転させた（図７）。これらのデータは、ヒトにおいて産生されたＧｌｙ−ＭＣＡが、ＴβＭＣＡと同様のＦＸＲ拮抗薬であることを示す。
【実施例５】
【０１８５】
本実施例は、高脂肪食で処置したＦｘｒｆｌ／ｆｌ及びＦｘｒΔＩＥマウスの体重に対するテンポールの効果を示す。
【０１８６】
ビヒクル及びテンポールで処置したＦｘｒｆｌ／ｆｌ及びＦｘｒΔＩＥマウスを、１０週間高脂肪食で保持した。図１１は、高脂肪食を与えて１０週間後のビヒクル及びテンポールで処置したＦｘｒｆｌ／ｆｌ及びＦｘｒΔＩＥマウスのグラムでの体重増加を示す。
【０１８７】
図１１に示された結果から明らかなように、Ｆｘｒｆｌ／ｆｌマウスのテンポール処置は、ビヒクル処置マウスが示した体重増加のおよそ６５％未満の体重増加をもたらした。腸特異的なＦｘｒ−ｎｕｌｌマウスであるＦｘｒΔＩＥマウスのテンポール処置は、体重増加で有意な差をもたらさなかった。その結果、腸内ＦＸＲは、高脂肪食を与えられたマウスのテンポールによる体重増加の低減の媒介に関与している。
【実施例６】
【０１８８】
本実施例は、脂質及び糖代謝における腸内ＦＸＲの役割を示す。
【０１８９】
ＦｘｒΔＩＥマウスが高脂肪食誘発性肥満症に耐性であることを明らかにするためにオスのＦｘｒｆｌ／ｆｌ及びＦｘｒΔＩＥマウスに高脂肪食を与えた。グラムにおいて体重の割合としての脂肪質量を、Ｅｃｈｏ３−ｉｎ−１ＮＭＲ分析装置（Ｅｃｈｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、テキサス州ヒューストン）を用いて麻酔をかけていないマウスにおいて測定した。結果を図１２に示した。結果は、Ｆｘｒｆｌ／ｆｌマウスの脂肪質量及び脂肪と体重の比が、ＦｘｒΔＩＥマウスよりも高いということを示す。図１３に示される耐糖試験（ＧＴＴ）は、Ｆｘｒｆｌ／ｆｌマウスと比較してＦｘｒΔＩＥマウスの耐糖能異常が改善することを明らかにした。これは、時間の関数として血糖値（ｍｇ／ｄＬで）の曲線下面積を示す。図１４に示されるインスリン耐性試験（ＩＴＴ）により、ＦｘｒΔＩＥマウスにおけるインスリン感受性が、Ｆｘｒｆｌ／ｆｌマウスと比較して有意に増大することが示された。さらに、図１５に示されるように、ＦｘｒΔＩＥマウスにおける絶食時血清インスリン値及びＨＯＭＡは、Ｆｘｒｆｌ／ｆｌマウスと比較して有意に増加した一方で、絶食時糖は、両群のマウスともおおよそ同じであった。
【実施例７】
【０１９０】
本実施例は、テンポールがラクトバチルス属の阻害を介して胆汁酸のホメオスタシスに影響を与えることを示す。
【０１９１】
腸のマイクロバイオーム組成物におけるファーミキューテス門からバクテロイデス門への有意な門レベルのシフトが、通常の固形飼料でのマウスの強制飼養（２５０  ｍｇ／ｋｇ）でテンポール処置の５日後にマウスの盲腸において観察された。１６Ｓ  ｒＲＮＡシークエンシングのヒートマップ図は、テンポール処置がラクトバシラセエファミリーを劇的に減少させることを示した。テンポール処置が確実にラクトバチルス属を減少させることが見出された。強制飼養を介する急性処置の結果と同様、図１６に示されるように、高脂肪食を与えたマウスから得られた疑わしい糞便微生物のｑＰＣＲ分析から、テンポール処置がファーミキューテス門からバクテロイデス門へのシフトをもたらす一方で、総細菌量はビヒクル処置マウスとテンポール処置マウスとの間で変化しないままということが明らかとなった。これらの結果は、腸のマイクロバイオームに対するテンポールの影響が食事や肥満状態に無関係であるということを示す。さらに、図１７に示されるように、糞便中の胆汁酸塩ヒドロラーゼ（ＢＳＨ）酵素活性の有意なダウンレギュレーションと同時に、ラクトバシラセエのラクトバチルス属を減少させた。胆汁酸塩ヒドロラーゼ（ＢＳＨ）は、肝臓において製造されるタウリン結合胆汁酸を遊離胆汁酸に脱複合させる。
【０１９２】
これらの結果は、テンポールがラクトバチルス属の阻害を介して胆汁酸ホメオスタシスに影響を与えていることを示す。
【実施例８】
【０１９３】
本実施例は、合成作動薬Ｇｗ４０６４及び様々な用量のＴＵＤＣＡ、ＴωＭＣＡ、ＴβＭＣＡ、ＴαＭＣＡ４を用いるヒトＦＸＲ競合アッセイの結果を示す。結果をウミシイタケ発現に対して標準化した。
【０１９４】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１）構造的に活性のＳＶ４０プロモーターの調節制御下、ヒトＦＸＲ（天然リガンド結合ドメイン及びＡＦ２トランス活性化ドメインを含むもの）のカルボキシ末端部が、アミノ末端ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインと縮合した、キメラ受容体構造物；２）ＵＡＳ  ＧＡＬ４  ＤＮＡ反応エレメントにより誘導されるホタルルシフェラーゼレポータープラスミド；及び３）トランスフェクション効率制御としてのウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子（ｐＲＬ−ルシフェラーゼ；プロメガ；ウィスコンシン州マディソン）と同時にトランスフェクトした。ルシフェラーゼ検出を二重ルシフェラーゼレポーターアッセイキット（プロメガ社、ウィスコンシン州マディソン）及びＴｅｃａｎ  ＧｅｎｉｏｓＰｒｏ発光性プレートリーダー（ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パーク）を用いて行った。結果は図１８で説明する。
【０１９５】
図１８で説明された結果から明らかなように、胆汁酸複合体ＴＵＤＣＡ、ＴωＭＣＡ、ＴβＭＣＡ、及びＴαＭＣＡの全てが、合成作動薬Ｇｗ４０６４の存在下でＦＸＲを阻害した。
【実施例９】
【０１９６】
本実施例は、テンポールによってもたらされる腸内微生物叢における変化がＮＡＦＬＤと相関するということを示す。
【０１９７】
高脂肪食（ＨＦＤ）は、ＮＡＦＬＤのマウスモデルとして広く使用される。酸化防止剤テンポールは、通常の食事条件下で腸内微生物叢の組成物及び代謝を選択的に調節する（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ４：  ２３８４，  ２０１３）。テンポールが、ＨＦＤ誘導ＮＡＦＬＤモデルにおける腸のマイクロバイオームを改善するかどうかを決定するための試験として、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列解析が行われた。Ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ＵｎｉＦｒａｃＴＭ分析は、１２週間のＨＦＤでのビヒクル及びテンポールで処置した群から分離された盲腸のコミュニティーの明確なクラスター化を示す。主座標１（ＰＣ１）は、５６．０８％の変異を説明し、１２週間のＨＦＤでのマウスにおいてテンポールがビヒクルよりも微生物叢の組成物により強い影響を与えたことを示す（図１９Ａ）。主成分分析プロットのサンプルの分離は、ファーミキューテス門を有意に減少し、且つプロテオバクテリアを著しく増加する個体数の差を示す。デスルホビブリオ属が、プロテオバクテリアを増大させる主要な寄与因子として特定さた（図１９Ｂ）。それは、肥満の被験者において有意により低いことが見出された（Ｋａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｂｅｓｉｔｙ  ２０：２２５７−２２６１，  ２０１２）。ロゼブリア属の劇的な増加が観察された（図１９Ｃ）。それは、イヌの体重との負の相関性がある（Ｈａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｅｃｏｌ．  ８４３３２−３４３，  ２０１３）。また、クロストリジウム属（狹義）及びラクトバチラス属のレベルは、テンポール処置マウスで有意に減少している。その一方で、バクテロイデス属及びストレプトコッカス属のレベルは同じままであった（図１９Ｄ〜Ｇ）。
【０１９８】
尿における腸内微生物叢に関連するマーカーを特定するために、エレクトロスプレイイオン化四重極飛行時間型質量分析（ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＱＴＯＦＭＳ）と連結した超高性能液体クロマトグラフィーに基づくメタボロミクス解析を用いた。マウスの尿のＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＱＴＯＦＭＳネガティブモードデータのＰＣＡモデリングにより、テンポール群と対照群との間で明確な区別が示された（図２０Ａ）。負荷散布図の分析により、２つの化合物ｐ−クレゾールスルファート（保持時間２．６１分でｍ／ｓ  １８７．００６０）及びｐ−クレゾールグルクロニド（保持時間３．０４分でｍ／ｓ  ２８３．０８１２）が、テンポールで処置した群の尿で有意に減少することが明らかになった（図２０Ｂ及びＣ）。これらの化合物の同一性をＭＳ／ＭＳ分析により確認した（図２０Ｄ）。これらの結果は、１４週間ＨＦＤを与えたマウスにおいて、テンポールが腸内微生物叢の組成物を作り替え、腸内微生物叢関連代謝マーカーを変化させることを示した。特に腸内微生物叢を調節するテンポール処置モデルの結果と同様に、メタボロミクス解析により、ｐ−クレゾールスルファート及びｐ−クレゾールグルクロニドの尿中レベルが１４週間ＨＦＤを与えた抗生剤処置マウスにおいて殆ど存在しないということが明らかにされた（図２１Ａ〜Ｃ）。腸内微生物叢の組成組成物及び関連代謝物の変化の後、肝組織像が、１６週間ＨＦＤを与えたテンポール処置マウス及び７週間ＨＦＤを与えた抗生剤処置マウスの肝臓の脂質液滴の有意な減少を示す（図２２Ａ及びＢ、及び図２３Ａ）。腸内微生物叢の組成物も変化させるテンポール処置及び抗生剤処置は、肝臓の質量及び肝臓／体重の比を減少させた（図２２Ｃ及びＤ、図２３Ａ及びＢ）。肝臓のトリグリセリド（ＴＧ）内容物は、抗生剤及びテンポールで処置されたマウスで、それぞれ、およそ５０％及び３５％減少した（図２２Ｅ及び図２３Ｄ）。
【実施例１０】
【０１９９】
本実施例は、腸内微生物叢が胆汁酸代謝を変更し、ＦＸＲシグナル伝達に影響を与えるということを示す。
【０２００】
腸内微生物叢は胆汁酸代謝と密接に関連している。ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＱＴＯＦＭＳに基づくメタボロミクス解析が、腸における胆汁酸組成物及び胆汁酸代謝物のレベルを測定するために採用された。マウスの回腸のＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＱＴＯＦＭＳネガティブモードデータのＰＣＡモデルのスコア散布図は、ビヒクル群と抗生剤群との間の明確な代謝プロファイルを示した（図２４Ａ）。最も豊富な代謝物ＴβＭＣＡ（ｍ／ｚ  ５１４．２８７１、保持時間＝６．６４分）は、従来の方法に従う負荷散布図（図２４Ｂ）で明らかにされたように７週間ＨＦＤを与えた抗生剤処置マウスで増加した；この増加はテンポール処置で観察されたものと同様であった（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．，  １２：１３６９−１３７６，  ２０１３）。回腸の胆汁酸の組成物の分析により、タウリン結合胆汁酸ＴβＭＣＡのレベルが抗生剤処置後に有意に増加することが明らかにされた（図２５Ａ）。同様の結果が１６週間ＨＦＤを与えたテンポール処置マウスから生じた（図２５Ｂ）。腸内微生物叢は、微生物の酵素活性により胆汁酸組成物を変化させることができる。タウリン結合胆汁酸を遊離胆汁酸に加水分解する細菌の酵素胆汁酸塩ヒドロラーゼ（ＢＳＨ）の活性は、７週間ＨＦＤを与えた抗生剤処置マウスにおいて大幅に減少した（図２６Ａ）。これは、ＦＸＲ拮抗薬ＴβＭＣＡであったＨＦＤを与えた抗生剤処置マウス及びテンポール処置マウスの回腸における最も有意に豊富な胆汁酸を構成する可能性が高い（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．，  １２：１３６９−１３７６，  ２０１３；  Ｓａｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．  ２２５−２３５，  ２０１３）。ウエスタンブロット及びｑＰＣＲ分析は、ＦＸＲ標的遺伝子小ヘテロ二量体パートナー（Ｓｈｐ）のｍＲＮＡ及び線維芽細胞増殖因子１５（Ｆｇｆ１５）ｍＲＮＡを増大させることにより明らかなように、１２週間のＨＦＤ処置が回腸におけるＦＸＲタンパク質レベル（図２６Ｂ）及びＦＸＲシグナル伝達を誘導することを示した（図２６Ｃ）。逆に、抗生剤処置はＳｈｐ及びＦｇｆ１５のｍＲＮＡを減少させ、それは、ＦＸＲシグナル伝達を回腸において阻害することを示した（図２６Ｄ）。ＴβＭＣＡが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＨＦＤ処置マウスでＦＸＲシグナル伝達を阻害したかどうか疑問が生じた。ＴβＭＣＡ処置は３日間ＨＦＤを与えた抗生剤処置マウスの回腸においてＦＸＲ作動薬ＴＣＡによるＳｈｐ及びＦｇｆ１５誘導を有意に鈍らせた（図２６Ｅ）。これらの結果は、主に、ＨＦＤを与えたマウスの回腸におけるＦＸＲシグナル伝達を阻害するより低い細菌ＢＳＨ活性によりＴβＭＣＡを増加させることで、抗生剤及びテンポール処置の両方が胆汁酸組成物を調節することを示した。
【実施例１１】
【０２０１】
本実施例は、腸特異的なＦｘｒの断絶が、高脂肪食を与えたマウスでの肝臓の脂質蓄積を減少させることを示す。
【０２０２】
ＮＡＦＬＤの進行での腸内ＦＸＲの役割をさらに明確にするために、腸特異的なＦｘｒ−ｎｕｌｌ（ＦｘｒΔＩＥ）マウスを１４週間ＨＦＤで処置した。肝臓切片のＨ＆Ｅ染色及びＯｉｌ  ｒｅｄ  Ｏ染色は、野生型（Ｆｘｒｆｌ／ｆｌ）マウスと比較して、ＦｘｒΔＩＥマウスの肝臓の脂質蓄積において有意な減少を示した（図２７Ａ及びＢ）。ＦｘｒΔＩＥマウスは、肝臓の質量及び肝臓の質量の比の有意な減少を示した（図２７Ｃ）。この肝臓の質量の変化は、主に、１４週間ＨＦＤを与えたＦｘｒｆｌ／ｆｌマウスと比較してＦｘｒΔＩＥマウスで５０％低い肝臓トリグリセリド（ＴＧ）量によるものであった（図２７Ｄ）。メカニズムの研究により、ミトコンドリアの電子伝達系（ＥＴＣ）複合体ＩＩ関連遺伝子（例えば、コハク酸デヒドロゲナーゼ複合体、サブユニットＤ、内在性膜タンパク質（Ｓｄｈｄ）、複合体ＩＩＩ関連遺伝子（例えばシトクロムｃ１（Ｃｙｃ１））、複合体ＩＶ関連遺伝子（例えばミトコンドリアでエンコードされたシトクロムｃオキシダーゼＩＩ（ｍｔ−Ｃｏ２））、シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩＶアイソフォーム１（Ｃｏｘ４ｉ１）、シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶａ（Ｃｏｘ５ａ）、ＡＴＰ合成酵素、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ０複合体、サブユニットＣ１（サブユニット９）（Ａｔｐ５ｇ）及びＡＴＰ合成酵素、Ｈ＋輸送、ミトコンドリアＦ０複合体、サブユニットＤ（Ａｔｐ５ｈ））の発現が、ＦｘｒΔＩＥマウスの回腸上皮において高いということが明らかにされた（図２８Ａ）。同様の結果が抗生剤処置マウスで得られた（図２８Ｂ）。次いで、Ｆｘｒｆｌ／ｆｌマウスと比較してＦｘｒΔＩＥマウスの回腸ミトコンドリアにおいて、複合体ＩＩのおよそ７０％の活性増加があり、複合体Ｉの活性では有意な上昇はなかった（図２８Ｃ）。また、ＦｘｒΔＩＥマウスにおける回腸ＡＴＰレベルは、Ｆｘｒｆｌ／ｆｌマウスにおけるものに比べて有意に高かった（図２８Ｄ）。遊離脂肪酸類は脂肪肝の進行に密接に関連している（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１５：１３４３−１３５１，  ２００５２００５）。しかしながら、血清リピドミクスにより、遊離脂肪酸類の種類のサブセットがビヒクル及びテンポールで処置したＦｘｒΔＩＥマウス及びＦｘｒｆｌ／ｆｌマウスにおいて同様のレベルであることが明らかとなった（図２９Ａ）。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ定量により、回腸のＣ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０、Ｃ２４：０及びＣ２４：１のセラミドレベルが、７週間ＨＦＤを与えた抗生剤処置マウスで有意に減少したことが確認された（図２９Ｂ）。従って、抗生剤処置マウスにおける血清のＣ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２４：０及びＣ２４：１のセラミドレベルも、ビヒクル処置マウスにおけるものよりも有意に低かった（図２９Ｃ）。各セラミドの同一性はＬＣ−ＭＳフラグメントグラフィーにより確認された（図３０Ａ〜Ｇ）。さらに、ｄｅ  ｎｏｖｏセラミド合成関連遺伝子（例えば、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ、長鎖ベースサブユニット３（Ｓｐｔｌｃ３）、セラミド合成酵素４（Ｃｅｒｓ４）、変性精母細胞ホモログ１（Ｄｅｇｓ１）、及びスフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ３（Ｓｍｐｄ３））をエンコードする腸内のｍＲＮＡは、ＦｘｒΔＩＥマウス及び抗生剤処置マウスにおいて有意に減少した（図２９Ｃ及びＤ）。セラミド合成酵素２（Ｃｅｒｓ２）ｍＲＮＡレベルは、抗生剤処置マウスにおいて有意に減少し、ＦｘｒΔＩＥマウスで減少傾向（Ｐ＝０．０６）を有する。遺伝子の発現は、スフィンゴミエリンシンターゼ１及び２（Ｓｇｍｓ１及びＳｇｍｓ２）にようにセラミドの異化に関連し、アルカリ性セラミダーゼ１及び３（Ａｃｅｒ１及びＡｃｅｒ３）は、ＦｘｒΔＩＥマウス及び抗生剤処置マウスにおいて同様のままであった（図２９Ｃ及びＤ）。
【実施例１２】
【０２０３】
本実施例はセラミドが肝臓におけるＳＲＥＢＰ１ｃ−ＣＩＤＥＡ経路を調節することを示す。
【０２０４】
セラミドレベルの減少及びＮＡＦＬＤの改善の間の因果関係を確立するために、ＨＦＤを与えたマウスを、短い期間抗生剤で治療した。３日間の抗生剤処置により、肝臓においてトリグリセリド内容物を減少しなかった（図３１Ａ）。次いで、ＦＸＲ標的遺伝子Ｓｈｐ及びＦｇｆ１５  ｍＲＮＡｓの発現の減少により明らかになったようにＦＸＲシグナル伝達経路を阻害した（図３１Ｂ）。抗生剤処置後早ければ３日で、抗生剤処置マウスの回腸におけるセラミドレベルが有意に減少した（図３１Ｃ）。これらの結果は、ＮＡＦＬＤの進行の結果及びＮＡＦＬＤをモニターするバイオマーカーよりもむしろ、セラミドが原因である可能性があることを示した。さらに、セラミドのＮＡＦＬＤに対する寄与を、培養されたマウスの初代肝細胞において評価した。セラミドの処置は、用量依存的に初代肝細胞においてトリグリセリド内容物の増大を有意に誘導した（図３１Ｄ）。セラミドが脂肪肝をもたらすメカニズムを解明するために、肝臓の脂質生成及び脂肪酸酸化に関連する遺伝子の発現を測定した。脂肪酸合成関連遺伝子（例えば、ステロール反応エレメント結合タンパク質１ｃ（Ｓｒｅｂｐ１ｃ）、ＤＮＡ断片化因子α様エフェクター（Ｃｉｄｅａ）、極長鎖脂肪酸伸長酵素タンパク質６（Ｅｌｏｖｌ６））及びＴＧ構築関連遺伝子（例えば、ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ２（Ｄｇａｔ２））は、初代肝細胞においてセラミドにより有意にアップレギュレートされた（図３１Ｅ）。対照的に、脂肪酸β−酸化に関連する遺伝子（例えば、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１（Ｃｐｔ１）、アシル−補酵素Ａオキシダーゼ１（Ａｃｏｘ１）、エノイル−補酵素Ａ、ヒドラターゼ／３−ヒドロキシアシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼ（Ｅｈｈａｄｈ）、及びアセチル−補酵素Ａアシルトランスフェラーゼ１Ａ（Ａｃａａ１ａ））の発現は、セラミドの処置によっては影響しなかった（図３１Ｅ）。ｍＲＮＡの結果と一致して、２μＭ及び１０μＭでのセラミド曝露は、ＳＲＥＢＰ１−Ｎ及びＳＲＥＢＰ１−Ｎ標的遺伝子タンパク質ＣＩＤＥＡの成熟した核の形態のタンパク質レベルを有意に誘導した（図３１Ｆ及びＧ）。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、肝臓の脂肪酸合成関連遺伝子Ｓｒｅｂｐ１ｃ、Ｃｉｄｅａ、脂肪酸シンターゼ（Ｆａｓｎ）及びＥｌｏｖｌ６によりエンコードされたｍＲＮＡｓは、ビヒクル処置マウスと比較して抗生剤処置マウスで減少し、Ｆｘｒｆｌ／ｆｌマウスと比較してＦｘｒΔＩＥマウスで減少した（図３２Ａ及びＢ）。脂肪酸に関連する遺伝子の発現は、ビヒクル処置マウスと比較して抗生剤処置マウスで同様のレベルのままであり、Ｆｘｒｆｌ／ｆｌマウスと比較してＦｘｒΔＩＥマウスで同様のレベルのままであった（図３２Ｃ及びＤ）。さらに、ウエスタンブロット解析により、ＳＲＥＢＰ１−Ｎ及びＣＩＤＥＡの成熟した核の形態のタンパク質レベルが、７週間ＨＦＤを与えた抗生剤処置マウスの肝臓中で有意にダウンレギュレートされることが明らかとなった（図３２Ｅ及びＦ）。律速酵素コレステロール７α−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ７Ａ１）は、胆汁酸合成のための古典的経路を開始し、脂質代謝の調節に重要な役割を果たす。Ｃｙｐ７ａ１  ｍＲＮＡレベルを���生剤処置マウスでわずかに誘導するが、テンポール処置マウスでは誘導しない（図３２Ｇ及びＨ）。さらに、炎症関連遺伝子（例えば、トール様受容体２（Ｔｌｒ２）、トール様受容体４（Ｔｌｒ４）、トール様受容体９（Ｔｌｒ９）及び腫瘍壊死因子α（Ｔｎｆα））は、抗生剤マウス及びテンポールマウスで同等であった（図３２Ｉ及びＪ）。本結論により、セラミド代謝の阻害は、抗生剤処置マウスにおいてＨＦＤ誘導ＮＡＦＬＤの進行を改善する主要な要因である可能性があることが明らかになった。
【実施例１３】
【０２０５】
本実施例は、腸内ＦＸＲの阻害が腸のマイクロバイオームを媒介するＮＡＦＬＤの進行のために必要とされていることを示す。
【０２０６】
ＮＡＦＬＤの進行における腸内ＦＸＲの役割を決定するためにＦｘｒΔＩＥマウスを使用した。肝組織像は、抗生剤処置及びテンポール処置により１４週間及び１６週間ＨＦＤを与えたＦｘｒｆｌ／ｆｌマウスそれぞれで肝臓の脂質液滴が減少することを明らかにした；これらの処置をしたＦｘｒΔＩＥマウスでは、肝臓の脂質の変化が観察されなかった（図３３Ａ及びＢ及び図３４Ａ及びＢ）。抗生剤及びテンポールで処置したＦｘｒｆｌ／ｆｌマウスの肝臓の質量及び肝臓/体重の比は、有意に減少した。その一方で、肝臓の質量及び肝臓／体重の比はＦｘｒΔＩＥ及びＦｘｒｆｌ／ｆｌマウスで同様であった（図３３Ｃ及びＤ、図３４Ｃ及びＤ）。肝臓のトリグリセリド内容物分析により、抗生剤及びテンポール処置はＦｘｒΔＩＥマウスの脂肪肝を緩和しないということが確認された（図３３Ｅ及び図３４Ｅ）。回腸及び血清のＣ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０、Ｃ２４：０及びＣ２４：１のセラミドレベルがＦｘｒΔＩＥマウス及びテンポールで処置したＦｘｒｆｌ／ｆｌマウスで有意に減少したが、ＦｘｒΔＩＥマウスでは減少しなかった（図３３Ｆ及びＧ）。ＦｘｒΔＩＥマウスにおいて、肝臓の脂肪酸合成関連遺伝子（例えば、Ｓｒｅｂｐ１ｃ、Ｃｉｄｅａ、Ｆａｓｎ及びＥｌｏｖｌ６）は、ビヒクル処置マウス及び抗生剤処置マウスの間で変化しないままであった（図３４Ｆ）。さらに、ＳＲＥＢＰ１及びＣＩＤＥＡタンパク質の成熟した核の形態のタンパク質レベルは、テンポール処置マウスの肝臓において有意に減少した。その一方で、テンポールで処置したＦｘｒΔＩＥマウスでは減少が認められなかった（図３４Ｇ及びＨ）。本結論により、腸内ＦＸＲの阻害が、抗生剤及びテンポール処置によりもたらされるＮＡＦＬＤの改善を媒介するということが明らかとなった。
【実施例１４】
【０２０７】
本実施例は、テンポール及び抗生剤の処置に対する高脂肪食を与えたマウスの全身の反応を示す。
【０２０８】
アミノ酸類、炭水化物及びヌクレオチドの代謝に関連する合計５３の代謝物が、１Ｈ  ＮＭＲによって同定された。盲腸内容物の１Ｄ１Ｈ  ＮＭＲスペクトルでは、短鎖脂肪酸類（ＳＣＦＡ）、ヌクレオチド類、オリゴ糖類及びいくつかのアミノ酸類が主要なものである。グリコーゲン、ブドウ糖、アミノ酸類及びヌクレオチドが、肝臓の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルにおいて観察された主要な代謝物である。
【０２０９】
異なる生体サンプルグループに関連する代謝の変化を達成するために、ペアワイズＯＰＬＳ−ＤＡを、テンポール又は抗生剤処置後のマウスの盲腸の内容物又は肝臓で得られるデータ間で行った。さらに、ＯＰＬＳ−ＤＡ及びＰＬＳ−ＤＡモデルに対するＣＶ−ＡＮＯＶＡ（ｐ＜０．０５）及び並べ替え検定（２００試験）を用いた評価により、これらのモデルの質が有効であることを確認した。ビヒクルで処置した野生型マウスと比較して、テンポールでの処置は、ＳＣＦＡ(アセテート、プロピオナート、及びブチレート)のレベルを有意に減少させたが、盲腸の内容物においてオリゴ糖類及びブドウ糖のレベルを有意に上昇させた。また、ＳＣＦＡ及びオリゴ糖において同様の変化が、各対照のものに比べて、抗生剤で処置した野生型マウスの盲腸の内容物で観察された。しかしながら、ＳＣＦＡ及びオリゴ糖のレベルで有意な差は、テンポール処置したＦｘｒΔＩＥマウス及びビヒクルで処置したＦｘｒΔＩＥマウスの間で、盲腸の内容物において観察されなかった。
【０２１０】
テンポールでの処置は、肝臓における脂質及び不飽和脂肪酸（ＵＦＡ）のレベルを有意に減少させた。その一方で、テンポールでの処置は、ビヒクルで処置した野生型マウスと比較して、ブドウ糖、グリコーゲン、胆汁酸及び様々なヌクレオチド代謝物（例、ウリジン、ヒポキサンチン及び５’−ＩＭＰ）、ニコチヌレート及びコリンのレベルを有意に上昇させた。これらの観察は、テンポール処置による肝臓における脂質生成の減少と一致する。しかしながら、脂質及び糖代謝の有意な変化は、テンポールでの処置後、ＦｘｒΔＩＥマウスの肝臓において観察されなかった。さらに、抗生剤での処置は、肝臓において、胆汁酸、トリメチルアミンオキシド（ＴＭＡＯ、コリン、フマレート、ホルマート、アミノ酸類（分枝鎖アミノ酸類（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、アラニン、グリシン、チロシン及びフェニルアラニンを含む）及び一部の核酸類（例えばヒポキサンチン、ウリジン及び５’−ＩＭＰ）のレベルを有意に高めた。ビヒクルで処置したＦｘｒｆｌ／ｆｌマウスと比較して、ＦｘｒΔＩＥマウスは、肝臓において、より低い脂質及びＵＦＡレベルを示したが、より高いタウリン及びグリコーゲンのレベルを示した。
【実施例１５】
【０２１１】
本実施例は、本発明の実施形態に従うβ−ムリコール酸９、グリシン−β−ムリコール酸（Ｇｌｙ−ＭＣＡ）１０及びタウロ−β−ムリコール酸（Ｔ−β−ＭＣＡ）１１の合成を示す。
【０２１２】
β−ムリコール酸（β−ＭＣＡ）９を、文献の手順に従って、図４１で示されたようにして調製した（Ｉｉｄａ  Ｔ，  Ｍｏｍｏｓｅ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ３０：    １２６７−１２７９  （１９８９））。一般的に、酸触媒下でのジヒドロキシ酸１のメタノールとのエステル化により、定量的収率でエステル２を得た。３位のヒドロキシル基のエチルクロロホルマートを用いた保護により、カーボネート３を得た。６−ヒドロキシル基のクロム酸カリウムを用いた酸化は、定量的収率でケトン４を与えた。４７％ＨＢｒ溶液を用いた臭素化により、ブロモケトン５を与え、ＮａＢＨ４を用いた還元により中程度の収率でブロモヒドリン６を与えた。亜鉛金属を用いた還元的な脱臭化水素化により、約８０％収率でオレフィン７を得た。四酸化オスミウムを用いたＣｉｓ−ジヒドロキシル化により、ｃｉｓジオール８を得、続いて加水分解により定量的収率でｓ−ムリコール酸９を得た。ｒ−ムリコール酸９をグリシンと結合させ、グリシン−β−ムリコール酸（Ｇｌｙ−ＭＣＡ）１０を得た。エチルグリシナートの懸濁液を、終夜還流してβ−ＭＣＡ９及びＥＥＤＱと反応させた。ウォークアップ後に得られた残渣を、煮沸エタノール中に溶解し、１０％Ｋ２ＣＯ３で加水分解した。水溶液を酸性化し、収率６８％で白色粉末としてＧｌｙ−ＭＣＡ１０を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  ０．７５（ｓ、３Ｈ、１８−Ｍｅ）、１．０１（ｄ、３Ｈ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２１−Ｍｅ）、１．１４（ｓ、３Ｈ、１９−Ｍｅ）、３．４４−３．５６（ｍ、２Ｈ）、３．５８−３．６１（ｍ、１Ｈ）、３．９１（ｓ、２Ｈ）．
【０２１３】
ＴβＭＣＡ１１を、グリシンの代わりにタウリンと結合させることによって９から同様に調製した。
【実施例１６】
【０２１４】
本実施例は、Ｇｌｙ−ＭＣＡが腸内で安定であることを示す。
【０２１５】
糞便の抽出物を上記のように調製した。Ｇｌｙ−ＭＣＡ（５０μＭ）を糞便の抽出物（０．１ｍｇ／ｍＬ）とインキュベートした。陰性対照は、糞便の抽出物単独であった。陽性対照は、糞便の抽出物（０．１ｍｇ／ｍＬ）及びＴβＭＣＡ酸（５０μＭ）であった。試料をＵＰＬＣにより分析し、ββ−ＭＣＡ（加水分解生成物）の量を測定した。結果を図３５に示した。
【０２１６】
Ｇｌｙ−ＭＣＡは、０、１、５、及び５０ｍｇ／ｋｇのＧｌｙ−ＭＣＡの用量で経口投与によりマウスに与えた。ここで、Ｇｌｙ−ＭＣＡはトウモロコシ油中で投与された。Ｇｌｙ−ＭＣＡを、超高性能液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレイイオン化−四重極飛行時間型質量分析（ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＱＴＯＦＭＳ）を用いて検出した。結果を図３６に示す。
【０２１７】
図３５及び３６に示される結果から明らかなように、Ｇｌｙ−ＭＣＡは腸内で安定している。
【実施例１７】
【０２１８】
本実施例は、Ｇｌｙ−ＭＣＡで処置したマウスで有意な肝臓毒性が生じないことを示す。
【０２１９】
マウスに、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ及び５０ｍｇ／ｋｇでビヒクル又はＧｌｙ−ＭＣＡを投与した。２４時間後に、血清アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）のレベルを測定した。結果を図３７に示した。
【０２２０】
図３７で示される結果から明らかなように、Ｇｌｙ−ＭＣＡは、ビヒクルと比較して各用量で有意な肝臓毒性を示さなかった。
【実施例１８】
【０２２１】
本実施例は、Ｇｌｙ−ＭＣＡが合成ＦＸＲ作動薬ＧＷ４０６４により誘導されるＦＸＲ活性を有意に阻害することを示す。
【０２２２】
ＨＥＫ２９３Ｔ線維芽細胞を、（１）構造的に活性のＳＶ４０プロモーターの調節制御下、ヒトＦＸＲ（天然リガンド結合ドメイン及びＡＦ２トランス活性化ドメインを含むもの）のカルボキシ末端部が、アミノ末端ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインと縮合した、キメラ受容体構造物、（２）ＵＡＳ  ＧＡＬ４  ＤＮＡ反応エレメントにより誘導されるホタルルシフェラーゼレポータープラスミド、及び（３）トランスフェクション効率制御としてのウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子（ｐＲＬルシフェラーゼ；プロメガ；ウィスコンシン州マディソン）と一時的に同時にトランスフェクトした。ＧＷ４０６４又はＧＷ４０６４及びＧｌｙ−ＭＣＡを２４時間培地に加え、細胞を回収し、細胞抽出液を調製した。ルシフェラーゼ検出を二重ルシフェラーゼレポーターアッセイキット（プロメガ；ウィスコンシン州マディソン）及びＴｅｃａｎ  ＧｅｎｉｏｓＰｒｏＴＭ発光性プレートリーダー（ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パーク）を用いて行った。結果を図３８に示す。
【０２２３】
図３８で示される結果から明らかなように、Ｇｌｙ−ＭＣＡは、ＧＷ４０６４により誘導されるＦＸＲ活性を有意に阻害する
【実施例１９】
【０２２４】
本実施例はＧｌｙ−ＭＣＡがＦＸＲの強力な拮抗薬であること示す。
【０２２５】
分化Ｃａｃｏ−２細胞を、１００μＭのＦＸＲ作動薬ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）で処理し、０、１００μＭ、又は２００μＭのＧｌｙ−ＭＣＡで処理した。ＦＸＲ標的遺伝子Ｓｈｐ  ｍＲＮＡの発現を測定した。図３９で示された結果から明らかなように、ＣＤＣＡは、Ｓｈｐ  ｍＲＮＡの発現の４倍の増加をもたらした。Ｇｌｙ−ＭＣＡは、用量依存的にＣＤＣＡでのＳｈｐ  ｍＲＮＡの誘導を阻害した。
【０２２６】
分化Ｃａｃｏ−２細胞を、０．２μＭ又は５μＭのＧＷ４０６４で処理し、１００μＭ又は２００μＭのＧｌｙ−ＭＣＡで処理した。対照細胞は何れの薬剤でも処理しなかった。ＦＸＲ標的遺伝子ｍＲＮＡ類、Ｓｈｐ  ｍＲＮＡ、Ｆｇｆ１９  ｍＲＮＡ、及びＡｔｐ５ｇ  ｍＲＮＡの相対的な発現を測定した。結果をそれぞれ図４０Ａ−Ｃに示した。ＧＷ４０６４により誘導されるＳｈｐ  ｍＲＮＡ及びＦｇｆ１９  ｍＲＮＡの発現は、用量依存的にＧｌｙ−ＭＣＡにより阻害された（図４０Ａ及びＢ）。ＧＷ４０６４での処置はＦＸＲ標的遺伝子Ａｔｐ５ｇ  ｍＲＮＡの発現を阻害し、Ｇｌｙ−ＭＣＡは阻害を逆転させた（図４０Ｃ）。
【実施例２０】
【０２２７】
本実施例は、Ｇｌｙ−ＭＣＡによるＦＸＲシグナル伝達の阻害が、肥満症、インスリン抵抗性及びＮＡＦＬＤの治療のための強力な治療戦略であることを示す。
【０２２８】
腸内ＦＸＲの阻害が、高脂肪食（ＨＦＤ）誘導肥満症、インスリン抵抗性及びＮＡＦＬＤの治療標的であり得るかどうかを決定し、この転写因子が適切な創薬ターゲットであることを確認するために、ＨＦＤ処置マウスにＧｌｙ−ＭＣＡを経口投与した。Ｇｌｙ−ＭＣＡでの処置により、ＨＦＤでの処置の１週間後に体重上昇が抑えられた（図４１Ａ及びＢ）。ＮＭＲにより測定された絶対脂肪質量及び脂肪／除脂肪質量の比は、処置の７週間後に、ビヒクル処置マウスと比較して、Ｇｌｙ−ＭＣＡ処置マウスで有意に減少した（図４１Ｃ及びＤ）。Ｇｌｙ−ＭＣＡ処置マウスにおける脂肪症の減少メカニズムを調べるために、エネルギー収支技術を用いて、累積食物摂取量、エネルギー消費量（ＥＥ）（ＴＥＥｂａｌ：食品エネルギー摂取量及び身体組成の変化）を測定した。食物摂取量は２つの群の間は同等であった（図４４Ａ）。Ｇｌｙ−ＭＣＡでの処置は、ビヒクル処置マウスと比較して、ＨＦＤを与えたマウスの体重増加抑制に寄与し得るエネルギー消費量を有意に増加させた（図４２Ｂ）。肥満症関連ブドウ糖ホメオスタシスにおけるＧｌｙ−ＭＣＡの役割を明確にするために、耐糖試験及びインスリン耐性試験（それぞれＧＴＴ及びＩＴＴ）を行った。ＧＴＴにより、ビヒクル処置マウスと比較して、ＨＦＤを与えて６週間後のＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスが、ブドウ糖負荷後の血糖値を有意に減少させることを示すことが明らかとなった（図４３Ａ及びＢ）。ＩＴＴにより、インスリン感受性がＧｌｙ−ＭＣＡ処置後に有意に増加することが示された（図４３Ｃ）。これらの結果は、Ｇｌｙ−ＭＣＡがＨＦＤ誘導性肥満症及びインスリン抵抗性を改善することを示した。肝組織像は、７週間ＨＦＤを与えたマウスのＧｌｙ−ＭＣＡ処置後の肝臓の脂質液滴の顕著な減少を示した（図４４Ａ）。Ｇｌｙ−ＭＣＡでの処置は、肝臓の質量及び肝臓／体重の比を減少させた（図４４Ｂ）。肝臓トリグリセリド内容物が、Ｇｌｙ−ＭＣＡで処置したマウスで約５１％に減少した（図４４Ｄ）。これらの結果が、Ｇｌｙ−ＭＣＡでの処置がＨＦＤ誘導性非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）からマウスを保護したということを示す。体重及びＮＡＦＬＤに対するＧｌｙ−ＭＣＡの効果が非特異的な毒性効果によるものである可能性を排除するために、肝臓毒性の血清アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）のバイオマーカーを測定した。ＡＬＴ及びＡＳＴはＨＦＤに対して有意により高く、ＧｌｙＭＣＡでの処置は血清ＡＬＴ及びＡＳＴレベルを有意に減少させた（図４５Ａ及びＢ）。このように、使用したＧｌｙ−ＭＣＡの用量では毒性はなかったが、実質的にＨＦＤ誘導性の肝臓毒性を減少させることを示した。ＮＡＦＬＤは胆汁酸代謝と密接に関連がある。ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＱＴＯＦＭＳに基づくメタボロミクス解析が、糞便及び腸における胆汁酸組成物及び胆汁酸代謝物のレベルを測定するために採用された。マウスの糞便及び回腸のＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＱＴＯＦＭＳネガティブモードデータのＰＣＡモデルのスコア散布図により、ビヒクルで処置した群とＧｌｙ−ＭＣＡで処置した群との間での明確な代謝プロファイルが示された（図４６Ａ及びＢ）。負荷散布図において明らかなように、最も豊富な代謝物ＴβＭＣＡ（ｍ／ｚ  ５１４．２８７１、保持時間＝６．６４分）は、９週間ＨＦＤを与えたＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスで増加した（図４６Ｂ及び４７Ｂ）。Ｇｌｙ−ＭＣＡ処置後の糞便において、Ｔ−β−ＭＣＡのレベルが有意に増加した一方で、ＴＣＡのレベルは、有意に減少した（図４６Ｃ）。タウリン結合胆汁酸のレベルが、Ｇｌｙ−ＭＣＡ処置マウスの回腸において増加し、とりわけＴβＭＣＡのレベルが有意に増加した（図４６Ｃ）。Ｇｌｙ−ＭＣＡのレベルは、Ｇｌｙ−ＭＣＡ処置９週間後の糞便及び回腸において著しく増加した（図４６Ｄ及び４７Ｄそれぞれ）。血清トリグリセリド値は、ＨＦＤを９週間与えた２群の間で同じままであった（図４８Ａ及びＢ）。血清のＣ１６：０、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０及びＣ２４：１セラミドレベル、並びに回腸のＣ１６：０、Ｃ１８：１及びＣ２４：０セラミドレベルは、ＨＦＤを９週間与えたＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスで減少した（図４９Ａ及びＢ）。Ｇｌｙ−ＭＣＡ処置はＳｈｐ及びＦｇｆ１５  ｍＲＮＡを減少させ、それは、回腸においてＦＸＲシグナル伝達を阻害することを示す（図５０Ａ）。セラミドｄｅ  ｎｏｖｏ合成関連遺伝子をエンコードする腸内のｍＲＮＡ（例えば、セリンＳｐｔｌｃ３、Ｃｅｒｓ４、Ｄｅｇｓ１、及びＳｍｐｄ３）が、Ｇｌｙ−ＭＣＡ処置マウスにおいて有意に減少した（図５０Ｂ）。Ｓｈｐ  ｍＲＮＡの発現は二群の間で同様であり、それは、ＦＸＲシグナル伝達が肝臓において影響を受けなかったことを示す（図５１Ａ）。Ｃｙｐ７ａ１  ｍＲＮＡレベルがＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスで誘導された（図５１Ｂ）。Ｆｇｆ１５  ｍＲＮＡレベルがより低いので、これが、Ｇｌｙ−ＭＣＡ処置マウスにおけるＣｙｐ７ａ１  ｍＲＮＡレベルの増加に寄与する可能性がある。遺伝的誘導性肥満症のモデルにおいて、ビヒクル処置マウスと比べて、６週間Ｇｌｙ−ＭＣＡで処置したレプチン受容体欠損（ｄｂ／ｄｂ）マウスで体重減少した；処置のちょうど１週間後に有意に体重低下した（図５２）。ＮＭＲで測定された絶対脂肪質量及び脂肪／除脂肪質量の比は、ビヒクル処置マウスと比較して、Ｇｌｙ−ＭＣＡ処置ｄｂ／ｄｂマウスで、Ｇｌｙ−ＭＣＡ処置６週間後に有意に減少した（図５３Ａ及びＢ）。肝組織像は、Ｇｌｙ−ＭＣＡ処置後に肝臓の脂質液滴を有意に減少させることを示した（図５４Ａ）。Ｇｌｙ−ＭＣＡでの処置により、肝臓の質量及び肝臓／体重の比が減少した（図５４Ｂ及びＣ）。肝臓ＴＧ内容物が、Ｇｌｙ−ＭＣＡで処置したマウスで劇的に改善した（図５４Ｄ）。Ｇｌｙ−ＭＣＡ処置により、血清ＡＬＴ及びＡＳＴレベルが有意に減少した（図５５Ａ及び５５Ｂ）。したがって、これにより、用いたＧｌｙ−ＭＣＡの用量では、ｄｂ／ｄｂマウスに対する毒性がなく、このマウスモデルにおいて肝臓毒性を抑えるということが示された。Ｔ−α−ＭＣＡ及びＴβＭＣＡのレベルが、Ｇｌｙ−ＭＣＡの処置後の糞便及び回腸において有意に増加した（図５６Ａ及び５６Ｂ）。回腸におけるＧｌｙ−ＭＣＡの蓄積は、肝臓、糞便及び血清と比べてはるかに多い（図５６Ｃ）。血清トリグリセリド値は、Ｇｌｙ−ＭＣＡ処置の６週間後で同様のままであった（図５７Ａ）。血清のＣ１６：０、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０、及びＣ２４：１のセラミドレベル、並びに回腸のＣ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０、Ｃ２４：０及びＣ２４：１のセラミドレベルが、ビヒクル処置マウスに比べてＧｌｙ−ＭＣＡ処置マウスにおいて減少した（図５７Ｂ及びＣ）。ＨＦＤ誘導性肥満症の他のモデルにおいて、高脂肪食を与えてから１２週までに肥満になったＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスを、Ｇｌｙ−ＭＣＡで処置した。限られた量のＧｌｙ−ＭＣＡのため、これらのマウスを５ｍｇ／ｋｇのＧＭＣＡのみで処置した。より少ない用量にもかかわらず、それらは、処置の２週間後から、ビヒクル処置マウスに比べて体重増加が抑制された（図５８）。ＮＭＲで測定された絶対脂肪質量が、ビヒクル処置マウスと比較して処置の６週間後にＧｌｙ−ＭＣＡで処置した肥満のマウスで有意に減少した（図５９）。肝組織像は、Ｇｌｙ−ＭＣＡ処置後に肝臓の脂質液滴での著しい改善を示した（図６０Ａ）。Ｇｌｙ−ＭＣＡの処置により、肝臓の質量及び肝臓／体重の比が減少した（図６０Ｂ及びＣ）。ＴαＭＣＡ及びＴβＭＣＡのレベルは、Ｇｌｙ−ＭＣＡの処置後に糞便及び回腸において有意に増大した（図６１Ａ及び６１Ｂ）。回腸におけるＧｌｙ−ＭＣＡの蓄積は、肝臓、糞便、及び血清に比べてはるかに多い（図６１Ｃ）。
【０２２９】
本明細書に引用されている刊行物、特許出願及び特許を含むすべての文献は、各文献をそれぞれ具体的に参照により組み込むために示され、その全体が本明細書に記載されている場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３０】
本発明を説明する文脈における用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくとも１つ」及び類似の指示対象（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）の使用は、本明細書で特に指定がない或いは文脈により明らかに否定されない限り、単数及び複数の両方を網羅するものと解釈される。１以上の項目の列挙に続く用語「少なくとも１つ」の使用（例えば、「Ａ及びＢの少なくとも１つ」）は、本明細書で特に指定がない或いは文脈により明らかに否定されない限り、列挙された項目から選ばれる１つの項目（Ａ又はＢ）或いは列挙された項目の２以上の任意の組み合わせ（Ａ及びＢ）を意味するものと解釈するべきである。用語「備える」、「有する」、「包含する」及び「含む」は、特に断りのない限り、オープンエンドの用語（即ち、「を含むが、それらに限定されない」を意味する）と解釈すべきである。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書において、本明細書に特に指定がない限り、単に、その範囲内のそれぞれの個別の値に対して、個々に言及することの簡略法としての役割を果たすことを意図しており、それぞれの個別の値は、本明細書でそれぞれが列挙されているかのように、明細書に組み込まれる。本明細書に記載されている全ての方法は、本明細書に特に記載がない或いは文脈により明らかに否定されない限り、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書で提示される任意の例示及び全ての例示又は例示的言語（例、「のような」）の使用は、単に、本発明をよりよく説明することを意図しており、特に特許請求されていない限り、本発明の範囲を限定するものではない。明細書内のいかなる言語も、特許請求されていない任意の要素が、本発明の実施に絶対不可欠であることを示すものと解釈するべきではない。
【０２３１】
発明者が知る本発明を実施するための最良の形態を含めて、本発明の好ましい実施形態を本明細書に記載する。これらの好ましい実施態様の変形は、上述の記載を読んだ当業者により明らかになり得る。本発明者は、当業者がこのような変形を適宜使用することを予期しており、さらに本発明者は、本発明が本明細書に具体的に記載されたものとは別の方法で実施されることを意図している。従って、本発明は、準拠法により許容される限り、本明細書に添付した特許請求の範囲で述べられている主題のすべての変更及び均等物を含む。さらに、そのすべての可能な変形における上記の要素の任意の組合せが、本明細書で特に示されていない或いは文脈により明らかに否定されない限りは、本発明に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図１９Ｇ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２６Ｅ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２８Ｄ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３０Ｅ】
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【図３０Ｆ】
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【図３０Ｇ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３１Ｅ】
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【図３１Ｆ】
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【図３１Ｇ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
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【図３２Ｅ】
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【図３２Ｆ】
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【図３２Ｇ】
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【図３２Ｈ】
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【図３２Ｉ】
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【図３２Ｊ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３３Ｅ】
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【図３３Ｆ】
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【図３３Ｇ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３４Ｅ】
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【図３４Ｆ】
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【図３４Ｇ】
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【図３４Ｈ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４１Ｄ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４３Ｃ】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４４Ｄ】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４６Ｄ】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４７Ｃ】
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【図４７Ｄ】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５１Ａ】
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【図５１Ｂ】
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【図５２】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５４Ａ】
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【図５４Ｂ】
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【図５４Ｃ】
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【図５４Ｄ】
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【図５５Ａ】
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【図５５Ｂ】
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【図５６Ａ】
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【図５６Ｂ】
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【図５６Ｃ】
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【図５７Ａ】
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【図５７Ｂ】
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【図５７Ｃ】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０Ａ】
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【図６０Ｂ】
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【図６０Ｃ】
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【図６１Ａ】
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【図６１Ｂ】
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【図６１Ｃ】
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