(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）脱細胞化された細胞外基質を含む組織工学用構造体形成溶液、および心臓前駆細胞を含む第１バイオプリンティング用組成物と、前記組織工学用構造体形成溶液、間葉幹細胞および血管内皮成長因子を含む第２バイオプリンティング用組成物を交互に一方向で一つの層に印刷して第１バイオプリント層および第２バイオプリント層を製造し、それらを交互に積層して配置して３次元構造体を形成する段階；および
（ｂ）前記３次元構造体を熱的ゲル化してゲル化３次元構造体を得る段階を含み、
前記（ａ）段階は、熱的ゲル化が起こらない温度で行い、
前記（ｂ）段階で熱的ゲル化を起こす温度で行う、
心筋組織再生用３次元構造体の製造方法。
【請求項２】
前記脱細胞化された細胞外基質は、心臓組織から由来した請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記第１バイオプリンティング用組成物および前記第２バイオプリンティング用組成物中の脱細胞化された細胞外基質は、独立してそれぞれの総重量に対して、１ないし４重量％の含有量で存在する請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記心臓前駆細胞は、第１バイオプリンティング用組成物中、１０５ないし１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌの範囲で存在する請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
前記間葉幹細胞は、第２バイオプリンティング用組成物中、１０５ないし１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌの範囲で存在する請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
前記血管内皮成長因子は、第２バイオプリンティング用組成物中、５０ないし１０００ｎｇ／ｍｌの範囲で存在する請求項１に記載の製造方法。
【請求項７】
前記組織工学用構造体形成溶液は、ｐＨ６．５ないし７．５の範囲を有し、酸および蛋白質分解酵素をさらに含む請求項１に記載の製造方法。
【請求項８】
前記組織工学用構造体形成溶液は、
バイオプリンティング組成物の総重量に対して、
酸０．０３ないし３０重量％；および蛋白質分解酵素０．１ないし０．４重量％；
を含む請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記組織工学用構造体形成溶液は、
酢酸および塩酸からなる群から選択された１種以上の酸；
ペブシンおよびマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）からなる群から選択された１種以上の蛋白質分解酵素；および
ｐＨ調節剤；をさらに含む請求項７に記載の製造方法。
【請求項１０】
第１バイオプリンティング用組成物および第２バイオプリンティング用組成物は、独立して、
血管内皮前駆細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）、血管内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）および心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ）からなる細胞群より選択された１種以上の細胞；および
線維芽細胞成長因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ）、アンジオポエチン−１（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）、形質転換成長因子−ベータ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ、ＴＧＦ−β）、エリスロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ、ＥＰＯ）、幹細胞因子（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ、ＳＣＦ）、表皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）およびコロニー刺激因子（ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ、ＣＳＦ）からなる成長因子群より選択された１種以上の成長因子；
をさらに含む請求項１に記載の製造方法。
【請求項１１】
第１バイオプリンティング用組成物および第２バイオプリンティング用組成物は、独立して、
基質金属蛋白分解酵素（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＭＭＰ）および基質金属蛋白分解阻害酵素（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＴＩＭＰ）からなる酵素群より選択された１種以上の酵素をさらに含む請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
第１バイオプリンティング用組成物および第２バイオプリンティング用組成物は、独立して、１５℃で測定されたせん断率（ｓｈｅａｒ  ｒａｔｅ）１  ｓ−１での粘度が１ないし３０Ｐａ・Ｓの範囲である請求項１に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記第１バイオプリンティング用組成物および第２バイオプリンティング用組成物は、独立して、架橋剤をさらに含む請求項１に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記架橋剤は、第１バイオプリンティング用組成物および第２バイオプリンティング用組成物に独立してそれぞれの組成物の総重量に対して、０．００１ないし０．１重量％の含有量で含まれる請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記製造方法は、架橋化反応をさらに含む請求項１に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記架橋化は、１５℃以下で１ないし１０分間行われることを特徴とする請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
前記熱的ゲル化は、２５℃ないし３７℃で行う請求項１に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記心筋組織再生用３次元構造体は、５０ないし１０００μｍの厚さを有する請求項１に記載の製造方法。
【請求項１９】
第１バイオプリンティング用組成物と、第２バイオプリンティング用組成物を印刷して製造される第１バイオプリント層および第２バイオプリント層を熱的ゲル化して形成された心筋組織再生用３次元構造体であって、
前記第１バイオプリンティング用組成物は、脱細胞化された細胞外基質を含む組織工学用構造体形成溶液および心臓前駆細胞を含み、
前記第２バイオプリンティング用組成物は、前記組織工学用構造体形成溶液、間葉幹細胞および血管内皮成長因子を含み、
前記第１バイオプリント層および第２バイオプリント層は、独立して、第１バイオプリンティング用組成物と第２バイオプリンティング用組成物を交互に一方向で一つの層に印刷して製造される、心筋組織再生用３次元構造体。
【請求項２０】
前記第１バイオプリント層および第２バイオプリント層を形成するために印刷されたバイオプリンティング用組成物は繊維、テープ、または織物形態である請求項１９に記載の心筋組織再生用３次元構造体。
【請求項２１】
前記第１バイオプリント層および第２バイオプリント層が、それぞれ一方向繊維形態であり、前記第１バイオプリント層および第２バイオプリント層が互いに一定の交差角を有するように積層される請求項１９に記載の心筋組織再生用３次元構造体。
【請求項２２】
前記心筋組織再生用３次元構造体は、５０ないし１０００μｍの厚さを有する請求項１９に記載の心筋組織再生用３次元構造体。
【請求項２３】
前記心筋組織再生用３次元構造体は、１ｒａｄ／ｓでのモデュラスが１ないし１００ｋＰａである請求項１９に記載の心筋組織再生用３次元構造体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋組織再生用３次元構造体およびその製造方法に関する。より詳細には、本発明は、脱細胞化された細胞外基質および架橋剤を含む組織工学用構造体形成溶液および心臓前駆細胞を含む第１バイオプリンティング用組成物と、前記組織工学用構造体形成溶液、間葉系幹細胞および血管内皮成長因子を含む第２バイオプリンティング用組成物で印刷および架橋化して第１バイオプリント層および第２バイオプリント層を交互に配置して３次元構造体を形成する段階；および前記架橋された３次元構造体を熱ゲル化して架橋−ゲル化３次元構造体を得る段階；を含む心筋組織再生用３次元構造体の製造方法および心筋組織再生用３次元構造体に関する。
【背景技術】
【０００２】
３次元プリンティングは複雑な形状を有する組織（ｔｉｓｓｕｅ）や臓器（ｏｒｇａｎ）の医療データから得られた任意形状情報をＧ−ｃｏｄｅに変換した後、積層工程（ｌａｙｅｒ−ｂｙ−ｌａｙｅｒ  ｐｒｏｃｅｓｓ）により複雑な骨格構造を構築することをいう。このような３次元プリンティングはまた「３次元バイオプリンティング（ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｂｉｏｐｒｉｎｔｉｎｇ、３Ｄ  ｂｉｏｐｒｉｎｔｉｎｇ）」ともいう。例えば、「多軸組織臓器プリンティングシステム」は、代表的な３次元プリンティング技術の一つとして、材料を空圧で噴射する空圧式シリンジ２つとステップモータ（ｓｔｅｐ  ｍｏｔｏｒ）を用いてナノリットル単位で精密に噴射するピストン式シリンジの２つからなっており、多様な材料を同時に利用することができる。
【０００３】
通常、ＰＬＡ（Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＰＧＡ（Ｐｏｌｙ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＰＬＧＡ（Ｐｏｌｙ−ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄ  Ａｃｉｄ）、ＰＣＬ（Ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）、あるいはこれらの混合物のような熱可塑性生体適合性高分子を空圧式シリンジに装着して構造体を製作する。また、コラーゲン、ヒアルロン酸、ゼラチン、アルジネート、ケト酸またはフィブリン（ｆｉｂｒｉｎ）等からなるヒドロゲルをピストン式シリンジを利用して３次元構造体を製作する。
【０００４】
バイオプリンティングは、細胞−含有媒体の分配を必要としているため、バイオプリンティングの重要な側面は、プリンティング工程が細胞適合性（ｃｙｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）でなければならない。このような制限は、水性または水性ゲル環境で行わなければならない必要性があるため、材料の選択を減少させる。したがって、ゼラチン、ゼラチン／ケト酸、ゼラチン／アルジネート、ゼラチン／フィブロネクチン、ルトロール  Ｆ１２７（Ｌｕｔｒｏｌ  Ｆ１２７）／アルジネート、およびアルジネートなどの材料を用いたヒドロゲルが肝から骨に至るまで多様な組織を製造するためのバイオプリンティングに使用されている。バイオプリンティングに使用される前記ヒドロゲルまたはヒドロゲルと細胞の混合物などは「バイオインク（ｂｉｏｉｎｋ）」ともいう。
【０００５】
一般に、細胞は全体培養期間の間、元の置かれた位置に特異的に継続して位置しており、これは細胞が周囲のアルジネートゲルマトリックスを維持したり分解できないからである（Ｆｅｄｏｒｏｖｉｃｈ，  Ｎ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．１３，１９０５−１９２５（２００７））。したがって、細胞−プリント構造体のバイオプリンティングに関するいくつかの成功報告があったとしても、最小限の細胞−材料相互作用（ｃｅｌｌ−ｍａｔｅｒｉａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）および劣等な（ｉｎｆｅｒｉｏｒ）組織形成は最も重要な問題である。実際に、これら材料は天然の細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｃｅｓ、ＥＣＭｓ）の複雑性を現わすことができず、そのために生体組織の典型的な細胞−細胞連結（ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ）および３次元（ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ、３Ｄ）細胞構成を有する微細環境を再現するには十分でない。
【０００６】
したがって、前記ヒドロゲル中の細胞は、生体内で生きている組織の固有の形態および機能を表せない。したがって、細胞の母組織（ｐａｒｅｎｔ  ｔｉｓｓｕｅ）と類似の天然の微細環境を細胞に提供できるなら理想的であろう。脱細胞化された細胞外基質（ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ、ｄＥＣＭ）は、このようにするための最善の選択であり、これはいかなる天然のあるいは人工材料も天然の細胞外基質の特性のすべてを再現することができないからである。
【０００７】
さらに、各組織のＥＣＭは組成（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）および局所解剖学（ｔｏｐｏｌｏｇｙ）の観点から独特であり、前記組成および解剖学特性は、常駐する細胞（ｒｅｓｉｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ）と微細環境の間の力動的で、かつ相互的な相互作用により生成される。組織および臓器から分離された細胞とＥＣＭの最近研究では、選択された細胞機能および表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を保存するために組織特異性（ｔｉｓｓｕｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）の必要性を強調している（Ｓｅｌｌａｒｏ，  Ｔ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．  Ｐａｒｔ  Ａ  １６，  １０７５−１０８２（２０１０）；  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，  Ｔ．  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９，  ５３８−５４１（２０１０）；  Ｕｙｇｕｎ，  Ｂ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １６，  ８１４−８２１（２０１０）；  Ｏｔｔ，  Ｈ．  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １６，  ９２７−９３３（２０１０）；  Ｆｌｙｎｎ，  Ｌ．  Ｅ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３１，  ４７１５−４７２４（２０１０））。
【０００８】
得られたｄＥＣＭ材料は、典型的に皮膚、小腸粘膜下組織（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｕｂｍｕｃｏｓａ）を含む多様な組織から２次元（ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ、２Ｄ）スキャフォールドとして加工され、初期段階で浸透性またはシーディングされた細胞は支持性血管ネットワーク（ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｎｅｔｗｏｒｋ）ができる時まで生存のために酸素および栄養素の拡散に依存する。
【０００９】
しかし、プリンティングされた組織類似体構造は、栄養素の流れを許容するように開放された多孔性３Ｄ構造を考案する製造方法を必要とする。本発明者らは、３Ｄ構造組織の成長に適した最適化された微細環境を提供できるｄＥＣＭバイオインクを用いた細胞−担持（ｃｅｌｌ−ｌａｄｅｎ）構造のプリンティングのための３次元プリンティング方法を開発したことがあり、前記細胞−担持構造は固有の細胞形態および機能を再現することができる（Ｆａｌｇｕｎｉ  Ｐａｔｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．５，  ３９３５  （２０１４））。
【００１０】
一方、虚血性心疾患は、全世界的に非常に高い有病率を示しており、単一疾患全体の死亡原因中に１位を占めている。韓国も社会経済的な発電と西欧化された生活習慣によって虚血性心疾患患者が急増している。さらに重症の末期心不全患者の場合、心臓移植術や機械的左心室補助装置以外には完治法がないのが実情である。しかし、供与臓器の不足、臓器確保の困難、高い死亡率および高価の治療備用などの問題点を有している。
【００１１】
幹細胞の多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を用いた治療法は、損傷された組織再生を根本的に治療できるものとして期待されている。最近は成体幹細胞を血管内皮細胞およびその他間質細胞と配合したり多様なハイドローゼルと混合して注入することによって、心筋細胞への分化を促進し、細胞が病変から離脱する現象を防止し、心臓疾患治療の効率を高める研究が多様に進められている。また、幹細胞または幹細胞と多様な成体細胞を利用して細胞シート（ｃｅｌｌ  ｓｈｅｅｔｓ）を製作することによって、幹細胞の生体環境を模写して細胞間の相互作用を極大化する研究も活発に進められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の一例は、脱細胞化された細胞外基質および架橋剤を含む組織工学用構造体形成溶液、および心臓前駆細胞を含む第１バイオプリンティング用組成物と、前記組織工学用構造体形成溶液、間葉系幹細胞および血管内皮成長因子を含む第２バイオプリンティング用組成物を印刷および架橋化して第１バイオプリント層および第２バイオプリント層を交互に配置して３次元構造体を形成する段階；および前記架橋された３次元構造体を熱ゲル化して架橋−ゲル化３次元構造体を得る段階を含む心筋組織再生用３次元構造体の製造方法に関する。
【００１３】
本発明のまた他の一例は、第１バイオプリンティング用組成物と、第２バイオプリンティング用組成物を印刷して製造される第１バイオプリント層および第２バイオプリント層を架橋化し、熱ゲル化して形成された心筋組織再生用３次元構造体に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、心筋組織の微細環境（ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）が実現された３次元構造体の製造方法を開発するために多様な研究を行った。これに、本発明者らは、脱細胞化された細胞外基質および心臓前駆細胞（ｃａｒｄｉａｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）を含むバイオプリンティング用組成物と脱細胞化された細胞外基質、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）、および血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）を含むバイオプリンティング用組成物を交互に用いた積層工程による３次元プリンティングを行った時、心筋組織の微細環境を効果的に実現できることを発見した。特に、このような３次元プリンティング方法は、心臓前駆細胞を構造体内に均等に位置させるだけでなく、構造体内に血管細胞からなる血管ネットワークを実現することによって、細胞の生存能を長期間維持させることができるため、心筋内部への細胞伝達効率を顕著に向上させることができることを発見した。
【００１５】
これに、本発明の一例としては、
（ａ）脱細胞化された細胞外基質および架橋剤を含む組織工学用構造体形成溶液および心臓前駆細胞を含む第１バイオプリンティング用組成物と、前記組織工学用構造体形成溶液、間葉系幹細胞および血管内皮成長因子を含む第２バイオプリンティング用組成物で印刷および架橋化して第１バイオプリント層および第２バイオプリント層を交互に配置して３次元構造体を形成する段階；および
（ｂ）前記架橋された３次元構造体を熱ゲル化して架橋−ゲル化３次元構造体を得る段階；
を含む心筋組織再生用３次元構造体の製造方法に関する。
【００１６】
前記のように脱細胞化された細胞外基質および心臓前駆細胞を含む第１バイオプリンティング用組成物と；脱細胞化された細胞外基質、間葉系幹細胞および血管内皮成長因子を含む第２バイオプリンティング用組成物を交互に用いるプリンティングによる積層工程を行って製造される３次元構造体は、心臓前駆細胞が構造体内に均等に位置しているだけでなく、構造体内に血管細胞からなる血管ネットワークを実現することによって、心筋組織の微細環境を効果的に実現することができ、細胞の生存能を長期間維持させることができるので、心筋内部への細胞伝達効率を顕著に向上させることができる効果がある。
【００１７】
前記脱細胞化された細胞外基質（ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）は、心臓組織から由来したものであり得る。具体的には、体外に排出された心臓組織を脱細胞化することによって得られえ、人間、豚、牛、ウサギ、犬、ヤギ、羊、鶏、馬などの哺乳動物から排出された組織を脱細胞化することによって得られえ、好ましくは豚から得られた組織、さらに好ましくは豚から得られた心臓組織を脱細胞化することによって得られるが、これに限定されるものではない。
【００１８】
前記脱細胞化は、公知の方法、例えば、Ｏｔｔ，  Ｈ．  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １４，  ２１３−２２１（２００８），  Ｙａｎｇ，  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １６，  ８６５−８７６（２０１０）等に開示された方法を用いるか、あるいは若干変形して行い得る。好ましくは、本発明者らが報告した脱細胞化方法、つまり、Ｆａｌｇｕｎｉ  Ｐａｔｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．５，  ３９３５  （２０１４）に開示された脱細胞化方法を用いて行うことができる。前記脱細胞化された細胞外基質は、通常凍結乾燥された粉末形態で保管され得る。
【００１９】
前記脱細胞化された細胞外基質の使用量は、特に制限されないが、例えば、組成物の総重量に対して１ないし４重量％、１ないし３重量％、２ないし４重量％、好ましくは２ないし３重量％の含有量で用いられ得る。例えば、第１バイオプリンティング用組成物中の前記脱細胞化された細胞外基質は、第１バイオプリンティング用組成物の総重量に対して、１ないし４重量％の含有量で存在し得；第２バイオプリンティング用組成物中の前記脱細胞化された細胞外基質は、第２バイオプリンティング用組成物の総重量に対して、１ないし４重量％の含有量で存在し得る。前記範囲から外れて含有量が少ない場合は、材料が積層されない問題点が発生し、含有量が高い場合は、内部に封入された細胞が死滅する問題点が発生する。
【００２０】
前記心臓前駆細胞および血管内皮細胞は、人を含む動物から由来した細胞であって商業的に購入することが可能であり、公知の方法によって培養、増殖させることができる。
【００２１】
前記心臓前駆細胞は、第１バイオプリンティング用組成物中、１０５ないし１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、１０６ないし１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、１０５ないし５Ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、好ましくは１０６ないし５Ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌの範囲で存在し得る。前記範囲から外れて含有量が少ない場合は、効能が低い問題点が発生し、含有量が高い場合は、細胞を囲んでいるバイオインク−脱細胞化された細胞外基質を架橋させても脱細胞化された細胞外基質が架橋されず、３次元形状を維持させることができない問題点が発生する。
【００２２】
前記間葉系幹細胞は、第２バイオプリンティング用組成物中、１０５ないし１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、１０６ないし１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、１０５ないし５Ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、好ましくは１０６ないし５Ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌの範囲で存在し得る。前記範囲から外れて含有量が少ない場合は、効能が低い問題点が発生し、含有量が高い場合は、細胞を囲んでいるバイオインク−脱細胞化された細胞外基質を架橋させても脱細胞化された細胞外基質が架橋されず、３次元形状を維持させることができない問題点が発生する。
【００２３】
また、前記血管内皮成長因子は、第２バイオプリンティング用組成物中、５０ないし１０００ｎｇ／ｍｌ、５０ないし９００ｎｇ／ｍｌ、５０ないし８００ｎｇ／ｍｌ、５０ないし７００ｎｇ／ｍｌ、５０ないし６００ｎｇ／ｍｌ、５０ないし５００ｎｇ／ｍｌ、５０ないし４００ｎｇ／ｍｌ、５０ないし３００ｎｇ／ｍｌ、５０ないし２００ｎｇ／ｍｌ、１００ないし１０００ｎｇ／ｍｌ、１００ないし９００ｎｇ／ｍｌ、１００ないし８００ｎｇ／ｍｌ、１００ないし７００ｎｇ／ｍｌ、１００ないし６００ｎｇ／ｍｌ、１００ないし５００ｎｇ／ｍｌ、１００ないし４００ｎｇ／ｍｌ、１００ないし３００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１００ないし２００ｎｇ／ｍｌの範囲で存在し得る。前記範囲から外れて含有量が少ない場合は、効能が低い問題点が発生し、含有量が高い場合は、過度な血管形成による問題点が発生する。
【００２４】
第１バイオプリンティング用組成物および第２バイオプリンティング用組成物は、効率的な３次元プリンティングのため、ｐＨ６．５ないし７．５の範囲を有する粘弾性の均一な溶液の形態を有することが好ましい。
【００２５】
したがって、前記組織工学用構造体形成溶液は、酸；蛋白質分解酵素；およびｐＨ調節剤をさらに含み得る。前記酸、蛋白質分解酵素、およびｐＨ調節剤は、水性媒質中に含まれたものであり得るが、これに限定されるものではない。
【００２６】
また、前記酸は、酢酸および塩酸からなる群より選択された１種以上の酸であり得るが、これに限定されるものではない。前記酸は、脱細胞化された細胞外基質を溶解する機能を遂行し、好ましくは酢酸、塩酸などが用いられ得、さらに好ましくは、０．０１ないし１０Ｍ、０．０１ないし９Ｍ、０．０１ないし８Ｍ、０．０１ないし７Ｍ、０．０１ないし６Ｍ、０．０１ないし５Ｍ、０．０１ないし４Ｍ、０．０１ないし３Ｍ、０．０１ないし２Ｍ、０．０１ないし１Ｍ、０．１ないし１０Ｍ、０．１ないし９Ｍ、０．１ないし８Ｍ、０．１ないし７Ｍ、０．１ないし６Ｍ、０．１ないし５Ｍ、０．１ないし４Ｍ、０．１ないし３Ｍ、０．１ないし２Ｍ、０．１ないし１Ｍ酢酸水溶液、例えば、約０．５Ｍの酢酸水溶液、または０．０１ないし１０Ｍ、０．０１ないし９Ｍ、０．０１ないし８Ｍ、０．０１ないし７Ｍ、０．０１ないし６Ｍ、０．０１ないし５Ｍ、０．０１ないし４Ｍ、０．０１ないし３Ｍ、０．０１ないし２Ｍ、０．０１ないし１Ｍ、０．０１ないし０．１Ｍの塩酸水溶液、例えば、約０．０１Ｍの塩酸水溶液の形態で用いることができる。
【００２７】
前記蛋白質分解酵素は、脱細胞化された細胞外基質のテロペプタイト（ｔｅｌｏｐｅｐｔｉｄｅ）の消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）機能を遂行し、ペブシンおよびマトリックスメタロプロテアーゼ（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）からなる群から選択された１種以上であり得るが、これに限定されるものではない。前記蛋白質分解酵素の使用量は、脱細胞化された細胞外基質の含有量に応じて相異するが、例えば、脱細胞化された細胞外基質１００ｍｇに対して５ないし３０ｍｇ、５ないし２５ｍｇ、１０ないし３０ｍｇ、好ましくは１０ないし２５ｍｇの比率で用いられ得る。
【００２８】
前記ｐＨ調節剤は、脱細胞化された細胞外基質の溶解のために使用された酸を中和させて組成物のｐＨをｐＨ６．５ないし７．５、ｐＨ６．６ないし７．４、ｐＨ６．７ないし７．３、ｐＨ６．８ないし７．２、ｐＨ６．９ないし７．１、好ましくはｐＨ７の範囲で調節するためのものであり、例えば、水酸化ナトリウムであり得るが、これに限定されるものではない。
【００２９】
一実施例において、第１バイオプリンティング用組成物および第２バイオプリンティング用組成物は、独立して、それぞれの組成物の総重量に対して、酢酸および塩酸からなる群から選択された１種以上の酸０．０３ないし３０重量％；ペブシンおよびマトリックスメタロプロテアーゼからなる群から選択された１種以上の蛋白質分解酵素０．１ないし０．４重量％；およびｐＨ調節剤をさらに含み得る。
【００３０】
第１バイオプリンティング用組成物および第２バイオプリンティング用組成物は、それぞれ独立して、細胞、成長因子および酵素からなる群より選択された１種以上をさらに含み得る。
【００３１】
前記細胞は、血管内皮前駆細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）、血管内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）および心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ）からなる群より選択された１種以上であり得る。
【００３２】
前記成長因子は、線維芽細胞成長因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ）、アンジオポエチン−１（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）、形質転換成長因子−ベータ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ、ＴＧＦ−β）、エリスロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ、ＥＰＯ）、幹細胞因子（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ、ＳＣＦ）、表皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）およびコロニー刺激因子（ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ、ＣＳＦ）からなる群より選択された１種以上であり得る。
【００３３】
前記酵素は、基質金属蛋白分解酵素（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＭＭＰ）および基質金属蛋白分解阻害酵素（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＴＩＭＰ）からなる群より選択された１種以上であり得る。
【００３４】
一例で、前記第１バイオプリンティング用組成物および第２バイオプリンティング用組成物はそれぞれ独立して、
血管内皮前駆細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）、血管内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）および心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ）からなる細胞群より選択された１種以上の細胞；および
線維芽細胞成長因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ）、アンジオポエチン−１（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）、形質転換成長因子−ベータ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ、ＴＧＦ−β）、エリスロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ、ＥＰＯ）、幹細胞因子（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ、ＳＣＦ）、表皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）およびコロニー刺激因子（ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ、ＣＳＦ）からなる成長因子群より選択された１種以上の成長因子；
をさらに含み得る。
【００３５】
また、前記１種以上の細胞および１種以上の成長因子をさらに含む第１バイオプリンティング用組成物および第２バイオプリンティング用組成物は、それぞれ独立して、
基質金属蛋白分解酵素（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＭＭＰ）および基質金属蛋白分解阻害酵素（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＴＩＭＰ）からなる酵素群より選択された１種以上の酵素をさらに含み得る。
【００３６】
前記成長因子は、血管成長補充物（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＥＣＧＳ）の形態で含まれるものであり得るが、これに限定されるものではない。
【００３７】
第１バイオプリンティング用組成物および第２バイオプリンティング用組成物は、せん断率が増加するほど粘度が低くなる粘弾性物質であることが好ましく、例えば、約１５℃で測定される時、せん断率（ｓｈｅａｒ  ｒａｔｅ）１ ｓ−１での粘度が１ないし３０Ｐａ・Ｓの範囲であるのが好ましい。前記粘度は、水性媒質（例えば、水、蒸溜水、ＰＢＳ、生理食塩水など）の量を適切に調節することによって調節され得る。
【００３８】
前記第１バイオプリンティング用組成物と第２バイオプリンティング用組成物を交互に用いるプリンティングは、公知の３次元プリンティング方法（例えば、「多軸組織臓器プリンティングシステム」を用いたプリンティング方法）を用い、Ｆａｌｇｕｎｉ  Ｐａｔｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．５，  ３９３５  （２０１４）等に開示された方法により行うことができ、例えば、多軸組織臓器プリンティングシステムの２個のシリンジを用いて前記プリンティングを行い得る。
【００３９】
つまり、ポリカプロラクトンフレームワーク（ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ（ＰＣＬ）ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）をシリンジにロードし、約８０℃で加熱して重合体を溶融させる。前記プレゲル形態の３次元プリンティング用組成物を他のシリンジにロードし、温度を約１５℃以下、好ましくは約４ないし１０℃に維持させる。ＰＣＬフレームワークの製作（ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ）のために４００ないし６５０ｋＰａ範囲で空気圧（ｐｎｅｕｍａｔｉｃ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を加える。前記プレゲル形態の組成物をプランジャー系低容量噴射システム（ｐｌｕｎｇｅｒ−ｂａｓｅｄ  ｌｏｗ−ｄｏｓａｇｅ  ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いて噴射する。
【００４０】
また、前記第１バイオプリンティング用組成物と第２バイオプリンティング用組成物を交互に用いるプリンティングは、ポリカプロラクトンフレームワークを用いることなく、前記プレゲル形態の組成物のみをプランジャー系低容量噴射システム（ｐｌｕｎｇｅｒ−ｂａｓｅｄ  ｌｏｗ−ｄｏｓａｇｅ  ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いて噴射することによって行われることもできる。
【００４１】
一実施例において、前記第１バイオプリンティング用組成物と第２バイオプリンティング用組成物を交互に用いる積層は、第１バイオプリンティング用組成物と第２バイオプリンティング用組成物を互いに一定の交差角を有するように配列して積層し得る。
【００４２】
また、前記第１バイオプリンティング用組成物と第２バイオプリンティング用組成物は、繊維、テープ、または織物形態でプリンティングされ得る。
【００４３】
一例として前記第１バイオプリンティング用組成物および第２バイオプリンティング用組成物は、それぞれ繊維形態で一つの層にプリンティングされ、前記一つの層は、第１バイオプリンティング用組成物がプリンティングされた繊維と第２バイオプリンティング用組成物がプリンティングされた繊維が、互いに交代された一方向繊維形態で製造された層であり得、また他の層は、前記層と一定の交差角を有するように積層されたものであり得る。つまり、０度方向１層９０度方向１層を重ねて積層した構造であり得、このような積層形態の一例は図３に示す。
【００４４】
一実施例において、前記架橋剤は、リボフラビンであり得る。前記リボフラビンは、第１バイオプリンティング用組成物または第２バイオプリンティング用組成物の総重量に対して、０．００１ないし０．１重量％、好ましくは０．０１ないし０．１重量％の含有量で存在し得る。前記範囲を設定した理由は、心臓組織と類似の機械的特性を示す効果があるからである。
【００４５】
また、前記それぞれの積層工程は、前記プリンティングおよびＵＶＡ下での架橋化により行われ得る。前記プリンティングおよびＵＶＡ下での架橋化を繰り返して行うことによって、つまり、積層工程（ｌａｙｅｒ−ｂｙ−ｌａｙｅｒ  ｐｒｏｃｅｓｓ）を行うことによって、３次元構造体形状が形成される。
【００４６】
高い安全性を有するリボフラビンを架橋剤として用いて３次元プリンティングおよびＵＶＡ下での架橋化による積層工程を行い３次元構造体形状を製作した後、得られた３次元構造体形状を熱ゲル化することによって、高い機械的強度を均一に有する３次元構造体を製造できる効果がある。
【００４７】
前記ＵＶＡ下での架橋化は、３１５ないし４００ｎｍ、３２５ないし３９０ｎｍ、３３５ないし３８０ｎｍ、３４５ないし３７０ｎｍ、３５５ないし３６５ｎｍ、好ましくは約３６０ｎｍ波長のＵＶＡを用い得る。
【００４８】
また、前記ＵＶＡ下での架橋化は、１ないし１０分、１ないし９分、１ないし８分、１ないし７分、１ないし６分、１ないし５分、１ないし４分、２ないし１０分、２ないし９分、２ないし８分、２ないし７分、２ないし６分、２ないし５分、２ないし４分、好ましくは約３分間行い得る。
【００４９】
つまり、リボフラビンの使用を含む架橋−熱ゲル化方法（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ−ｔｈｅｒｍａｌ  ｇｅｌａｔｉｏｎ）によって高い機械的強度を均一に有する３次元構造体を製造できるということが本発明によって明らかになった。したがって、リボフラビンを用いる前記架橋−熱ゲル化方法によって高い機械的強度を提供できるだけでなく、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）のような毒性架橋剤の使用を必要とし、また、３次元構造体の内部には不均一な架橋を引き起こすプリント−後架橋（ｐｏｓｔ−ｐｒｉｎｔ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）の問題点を回避することができる。
【００５０】
したがって、前記３次元構造体は１ｒａｄ／ｓでのモデュラスが１ないし１００ｋＰａ、１ないし９０ｋＰａ、１ないし８０ｋＰａ、１ないし７０ｋＰａ、１ないし６０ｋＰａ、１ないし５０ｋＰａ、１ないし４０ｋＰａ、１ないし３０ｋＰａ、１ないし２０ｋＰａ、例えば、１０．５８ｋＰａであり得る。前記範囲を設定した理由は、心臓筋と類似の機械的強度で周辺環境を模写する効果があるからである。
【００５１】
一実施例において、第１バイオプリンティング用組成物および第２バイオプリンティング用組成物は、独立して、それぞれの組成物の総重量に対して、リボフラビン０．００１ないし０．１重量％；酢酸および塩酸からなる群から１種以上選択された酸０．０３ないし３０重量％；ペブシンおよびマトリックスメタロプロテアーゼからなる群から１種以上選択された蛋白質分解酵素０．１ないし０．４重量％；およびｐＨ調節剤をさらに含み得る。
【００５２】
前記実現例による第１バイオプリンティング用組成物および第２バイオプリンティング用組成物は、
【００５３】
酢酸および塩酸からなる群から選択された１種以上の酸溶液に脱細胞化された細胞外基質を添加する段階；
【００５４】
ペブシンおよびマトリックスメタロプロテアーゼからなる群から選択された１種以上の蛋白質分解酵素を添加する段階；および
【００５５】
リボフラビン、ｐＨ調節剤および心臓前駆細胞（第１バイオプリンティング組成物の場合）、またはリボフラビン、ｐＨ調節剤、間葉系幹細胞および血管内皮成長因子（第２バイオプリンティング組成物の場合）を添加する段階；
を含む製造方法によって製造され得る。
【００５６】
前記蛋白質分解酵素を加えた溶液を得る段階は、蛋白質分解酵素を加えた後、攪拌を行い得、前記攪拌は、脱細胞化された細胞外基質の完全な溶解を達成する時まで行うことができ、例えば、通常２４ないし４８時間の間行われ得るが、これに制限されるわけではない。
【００５７】
前記印刷および架橋化は、ゲル化を防止するために１５℃以下で行われ得、例えば、４ないし１５℃、好ましくは４ないし１０℃の低温で行われることが好ましい。
【００５８】
また、前記熱ゲル化は、１５℃超過で行われ得、例えば、２０℃以上、２５℃以上、好ましくは、２０℃ないし５０℃、２０℃ないし４０℃、２０℃ないし３７℃、２５℃ないし５０℃、２５℃ないし４０℃、さらに好ましくは、２５℃ないし３７℃の温度で行われ得る。
【００５９】
前記製造方法によって製造される第１バイオプリンティング用組成物および第２バイオプリンティング用組成物は、ｐＨ−調節されたプレゲル（ｐＨ−ａｄｊｕｓｔｅｄ  ｐｒｅ−ｇｅｌ）形態であって、約４℃で冷蔵保管することが好ましい。
【００６０】
また、前記熱ゲル化は、１５℃超過で行われ得、例えば、２０℃以上、２５℃以上、好ましくは、２０℃ないし５０℃、２０℃ないし４０℃、２０℃ないし３７℃、２５℃ないし５０℃、２５℃ないし４０℃、さらに好ましくは、２５℃ないし３７℃の温度で行われ得る。前記範囲を設定した理由は、脱細胞化された細胞外基質を物理的に架橋する効果があるからである。前記熱ゲル化は、インキュベータ（ｈｕｍｉｄ  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）内で行い得る。
【００６１】
また、前記熱ゲル化は、５ないし６０分、１０ないし５０分、１５ないし４０分、好ましくは２０ないし３０分間行い得る。前記範囲を設定した理由は、物理的架橋化反応が起こるのに要求される範囲であるからである。
【００６２】
前記製造方法によって製造された３次元構造体の厚さは、伝達しようとする細胞の量に応じて調節することができ、５０ないし１０００μｍ、５０ないし９００μｍ、５０ないし８００μｍ、５０ないし７００μｍ、５０ないし６００μｍ、５０ないし５００μｍ、１００ないし１０００μｍ、１００ないし９００μｍ、１００ないし８００μｍ、１００ないし７００μｍ、１００ないし６００μｍ、１００ないし５００μｍ、２００ないし１０００μｍ、２００ないし９００μｍ、２００ないし８００μｍ、２００ないし７００μｍ、２００ないし６００μｍ、２００ないし５００μｍ、３００ないし１０００μｍ、３００ないし９００μｍ、３００ないし８００μｍ、３００ないし７００μｍ、３００ないし６００μｍ、３００ないし５００μｍ、４００ないし１０００μｍ、４００ないし９００μｍ、４００ないし８００μｍ、４００ないし７００μｍ、４００ないし６００μｍ、４００ないし５００μｍの厚さ、例えば、５００μｍの厚さを有し得る。
【００６３】
前記製造方法は、心臓前駆細胞を構造体内に均等に位置させるだけでなく、構造体内に血管細胞からなる血管ネットワークを実現することによって、細胞の生存能を長期間維持させることができ、心筋内部への細胞伝達効率を顕著に向上させることができ、心臓前駆細胞が構造体内に均等に位置した場合を図９に示した。
【００６４】
本発明の他の一例は、心筋組織再生用３次元構造体に関する。
前記心筋組織再生用３次元構造体は、脱細胞化された細胞外基質および架橋剤を含む組織工学用構造体形成溶液、および心臓前駆細胞を含む第１バイオプリンティング用組成物と、前記組織工学用構造体形成溶液、間葉系幹細胞および血管内皮成長因子を含む第２バイオプリンティング用組成物を印刷および架橋化によって交互に積層された構造を１以上含み得る。
【００６５】
第１バイオプリンティング用組成物、第２バイオプリンティング用組成物、脱細胞化された細胞外基質、心臓前駆細胞、間葉系幹細胞、血管内皮成長因子に関する事項は前述したとおりである。
【００６６】
前記第１バイオプリンティング用組成物と第２バイオプリンティング用組成物が印刷および架橋化によって交互に積層された構造は、第１バイオプリンティング用組成物と第２バイオプリンティング用組成物を互いに一定の交差角を有するように配列して積層された構造であり得る。また、前記第１バイオプリンティング用組成物と第２バイオプリンティング用組成物は、繊維、テープ、または織物形態でプリンティングされ得る。
【００６７】
一例として、それぞれの層は、前記第１バイオプリンティング用組成物および第２バイオプリンティング用組成物は、それぞれ繊維形態で一つの層に印刷され、前記一つの層は、第１バイオプリンティング用組成物が印刷された繊維と第２バイオプリンティング用組成物が印刷された繊維が互いに交代された一方向繊維形態で製造された層であり得、また他の層は、前記層と一定の交差角を有するように積層されたものであり得る。つまり、０度方向１層９０度方向１層を重ねて積層した構造であり得る。前記それぞれの層が１回ずつ積層された構造は、約５０μｍの厚さであり得る。
【００６８】
前記３次元構造体の厚さは、伝達しようとする細胞の量に応じて調節することができ、５０ないし１０００μｍ、５０ないし９００μｍ、５０ないし８００μｍ、５０ないし７００μｍ、５０ないし６００μｍ、５０ないし５００μｍ、１００ないし１０００μｍ、１００ないし９００μｍ、１００ないし８００μｍ、１００ないし７００μｍ、１００ないし６００μｍ、１００ないし５００μｍ、２００ないし１０００μｍ、２００ないし９００μｍ、２００ないし８００μｍ、２００ないし７００μｍ、２００ないし６００μｍ、２００ないし５００μｍ、３００ないし１０００μｍ、３００ないし９００μｍ、３００ないし８００μｍ、３００ないし７００μｍ、３００ないし６００μｍ、３００ないし５００μｍ、４００ないし１０００μｍ、４００ないし９００μｍ、４００ないし８００μｍ、４００ないし７００μｍ、４００ないし６００μｍ、４００ないし５００μｍの厚さ、例えば、５００μｍの厚さを有し得る。
【発明の効果】
【００６９】
本発明は、特定細胞、つまり、心臓前駆細胞（ｃａｒｄｉａｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）および／または間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）と血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）を含むバイオプリンティング用組成物（ら）を用いて３次元プリンティングを行うことによって、心筋組織の微細環境を効果的に実現することができる。
【００７０】
また、本発明の製造方法は、心臓前駆細胞を構造体内に均等に位置させるだけでなく、構造体内に血管細胞からなる血管ネットワークを実現することによって、細胞の生存能を長期間維持させることができ、心筋内部への細胞伝達効率を顕著に向上させることができる。したがって、本発明の製造方法は、虚血性心疾患を含む多様な心臓疾患の治療のための３次元構造体の製造に有用に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】本発明の一実施例による心臓組織から得られた脱細胞化された細胞外基質（ｈｄＥＣＭ）の写真である。
【図２】本発明の一実施例による心臓組織から得られた脱細胞化された細胞外基質（ｈｄＥＣＭ）の光学顕微鏡写真および組織染色写真である。
【図３】本発明の一実施例により製造された３次元構造体の模式図である。
【図４】本発明の一実施例によるＰＣＬフレームワーク（ＰＣＬ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）を用いて製造された３次元構造体の形状を示す写真である。
【図５】本発明の一実施例により製造された３次元構造体をラット心筋梗塞モデルに移植した後、構造体移植前および移植８週後に撮影した心臓超音波（ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ）ｍ−ｍｏｄｅ写真である。
【図６】本発明の一実施例により製造された３次元構造体をラット心筋梗塞モデルに移植した後、構造体移植前、移植４週後、および移植８週後に、測定した心機能を数値化して示す写真である。
【図７】本発明の一実施例により製造された３次元構造体を移植した後、８週後に、犠牲にして組織学的分析を行った結果であって、マッソントリクローム染色（ｍａｓｓｏｎ’ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行って心筋組織の繊維化程度および心筋壁厚さの変化を観察した写真である。
【図８】本発明の一実施例により免疫蛍光染色（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）による心筋梗塞部位の機能性心筋の再生程度および血管再生程度を示す写真である。
【図９】本発明の一実施例により製造された心筋組織再生用３次元構造体内に心臓前駆細胞が均等に位置した場合を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
以下、本発明を下記の実施例によってさらに詳しく説明する。しかし、これら実施例は、本発明を例示するためのものだけであり、本発明の範囲はこれら実施例によって限定されるものではない。
【００７３】
製造例１：第１バイオプリンティング用組成物の製造
１−１：脱細胞化された細胞外基質の製造
脱細胞化された細胞外基質は、豚の心臓組織を用いてＦａｌｇｕｎｉ  Ｐａｔｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．５，  ３９３５  （２０１４）に開示された方法により製造した（以下、「ｈｄＥＣＭ」）。前記製造されたｈｄＥＣＭは、最終的に凍結乾燥して使用前まで冷凍保管した。前記製造されたｈｄＥＣＭの光学顕微鏡写真および組織染色写真を図２に示した。
【００７４】
１−２：プレゲル（ｐｒｅ−ｇｅｌ）状態の組織工学用構造体製造溶液の製造
前記得られた凍結乾燥されたｈｄＥＣＭに液体窒素を注ぎ、モルタルおよび乳棒で粉砕した。前記得られたｈｄＥＣＭ粉末（３３０ｍｇ）を０．５Ｍ酢酸水溶液（１０ｍｌ）に添加した後、ペブシン（３３ｍｇ）（Ｐ７１２５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた後、常温で４８時間攪拌した。得られた溶液の温度を１０℃以下に維持し、リボフラビン（２ｍｇ）を加えて１０℃以下に冷却させた１０Ｍ  ＮａＯＨ溶液を滴加してｐＨを約ｐＨ７に調節した。前記得られたプレゲル（ｐｒｅ−ｇｅｌ）状態の組織工学用構造体製造溶液は、約４℃で冷蔵保管した。
【００７５】
１−３：プレゲル（ｐｒｅ−ｇｅｌ）状態の組織工学用構造体製造溶液と細胞を含むプリンティング組成物の製造
プリンティング工程を行う直前に前記プレゲル状態の組織工学用構造体製造溶液に心臓前駆細胞５Ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌを添加して第１バイオプリンティング用組成物を製造した。前記心臓前駆細胞は、人間心筋組織由来の心臓前駆細胞、韓国釜山大学校医学専門大学院、生理学教室から得たものである。
【００７６】
製造例２：第２バイオプリンティング用組成物の製造
２−１：脱細胞化された細胞外基質の製造
脱細胞化された細胞外基質は、豚の心臓組織を用いてＦａｌｇｕｎｉ  Ｐａｔｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．５，  ３９３５  （２０１４）に開示された方法により製造した（以下、「ｈｄＥＣＭ」）。前記製造されたｈｄＥＣＭは、最終的に凍結乾燥して使用前まで冷凍保管した。前記製造されたｈｄＥＣＭの光学顕微鏡写真および組織染色写真を図２に示した。
【００７７】
２−２：プレゲル（ｐｒｅ−ｇｅｌ）状態の組織工学用構造体製造溶液の製造
前記得られた凍結乾燥されたｈｄＥＣＭに液剤窒素を注ぎ、モルタルおよび乳棒で粉砕した。０．５Ｍ酢酸水溶液（１０ｍｌ）にｈｄＥＣＭ粉末（３３０ｍｇ）を添加した後、ペブシン（３３ｍｇ）（Ｐ７１２５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた後、常温で４８時間攪拌した。得られた溶液の温度を１０℃以下に維持し、リボフラビン（２ｍｇ）を加えて１０℃以下に冷却させた１０Ｍ  ＮａＯＨ溶液を滴加してｐＨを約ｐＨ７に調節した。前記得られたプレゲル（ｐｒｅ−ｇｅｌ）状態の組織工学用構造体溶液は、約４℃で冷蔵保管した。
【００７８】
２−３：プレゲル（ｐｒｅ−ｇｅｌ）状態の組織工学用構造体製造溶液と細胞を含むプリンティング組成物の製造
プリンティング工程を行う直前に前記プレゲル状態の組織工学用構造体溶液に間葉系幹細胞５Ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌと血管内皮成長因子（製品番号：２９３−ＶＥ−１０、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）（１００ｎｇ／ｍｌ）をそれぞれ添加して第２バイオプリンティング用組成物を製造した。前記間葉系幹細胞は（下鼻甲介  （ｉｎｆｅｒｉｏｒ  ｔｕｒｂｉｎａｔｅ）由来間葉系幹細胞、韓国カトリック大学校耳鼻咽喉科学教室）から得たものである。
【００７９】
比較例１：組織工学用３次元構造体の製造
製造例１で得られた第１バイオプリンティング用組成物を用いてＦａｌｇｕｎｉ  Ｐａｔｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．５，  ３９３５  （２０１４）に開示された方法により３次元構造体を製作した。
【００８０】
具体的には、ＰＣＬフレームワーク（ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ（ＰＣＬ）ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）を多軸組織臓器プリンティングシステム（Ｊｉｎ−Ｈｙｕｎｇ  Ｓｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｅｎｇ．  ２２  ０８５０１４  （２０１２））のシリンジ（第１シリンジ）にロードし、約８０℃で加熱して重合体を溶融させた。製造例１で得られたプレゲル状態の第１バイオプリンティング用組成物を他のシリンジ（第２シリンジ）にロードし、温度を約１０℃以下に維持させた。第１シリンジに約６００ｋＰａの空気圧を加えて約１００ｕｍ以下の線幅を有して、約３００ｕｍの空隙を有する１２０ｕｍ厚さの薄いＰＣＬフレームワークを製作して、ＰＣＬフレームワークの上に第２シリンジの内容物を噴射した後、約３６０ｎｍのＵＶＡを３分間照射して架橋化した。その後、第２シリンジの内容物の噴射および前記架橋化による積層工程（ｌａｙｅｒ−ｂｙ−ｌａｙｅｒ  ｐｒｏｃｅｓｓ）を行い、３次元構造体形状を形成した。得られた３次元構造体形状を約３７℃のインキュベータ（ｈｕｍｉｄ  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）に入れて３０分間維持させて熱ゲル化させて３次元構造体（「ＣＰＣ  ｐｒｉｎｔｅｄ」という）を製造した。得られた３次元構造体は、約３００ないし４００ｕｍ厚さを有する。
【００８１】
実施例１：組織工学用３次元構造体の製造
製造例１および２で得られた第１バイオプリンティング用組成物および第２バイオプリンティング用組成物を用いて３次元構造体を製作した。
具体的には、ＰＣＬフレームワーク（ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ（ＰＣＬ）ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）を多軸組織臓器プリンティングシステム（Ｊｉｎ−Ｈｙｕｎｇ  Ｓｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｅｎｇ．  ２２  ０８５０１４  （２０１２））のシリンジ（第１シリンジ）にロードし、約８０℃で加熱して重合体を溶融させた。製造例１で得られたプレゲル形態の第１バイオプリンティング用組成物および製造例２で得られた第２バイオプリンティング用組成物を他のシリンジ（それぞれ、第２、３シリンジ）にロードし、温度を約１０℃以下に維持させた。第１シリンジに約６００ｋＰａの空気圧を加えて約１００ｕｍ以下の線幅を有して、約３００ｕｍの空隙を有する１２０ｕｍ厚さの薄いＰＣＬフレームワークを製作し、ＰＣＬフレームワークの上に第２シリンジの内容物を噴射した後、約３６０ｎｍのＵＶＡを３分間照射して架橋化した。その後、第２、３シリンジの内容物の噴射および前記架橋化による積層工程（ｌａｙｅｒ−ｂｙ−ｌａｙｅｒ  ｐｒｏｃｅｓｓ）を行い、３次元構造体形状を形成した。
【００８２】
得られた３次元構造体形状を約３７℃のインキュベータ（ｈｕｍｉｄ  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）に入れて３０分間維持して熱ゲル化させて組織工学用３次元構造体（「ＣＰＣ／ＭＳＣ  ｐｒｉｎｔｅｄ」という）を製造した。得られた３次元構造体は、約３００ないし４００ｕｍの厚さを有して、その形状は図３のとおりである。
【００８３】
試験例１．リボフラビン添加有無によるモデュラス（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｏｄｕｌｕｓ）の測定
製造例１で得られたプレゲル形態の溶液を約３６０ｎｍのＵＶＡを３分間照射して架橋化した後、約３７℃のインキュベータ（ｈｕｍｉｄ  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）に入れて３０分間維持して熱ゲル化を誘導してヒドロゲルを形成させた（架橋ヒドロゲルＡ）。また、リボフラビンを用いないことを除いては製造例１と同様な方法で製造したプレゲル状態の組織工学用構造体製造溶液を約３７℃のインキュベータ（ｈｕｍｉｄ  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）に入れて３０分間維持して熱ゲル化を誘導してヒドロゲルを形成させた（ヒドロゲルＢ）。
【００８４】
その後、得られたそれぞれのヒドロゲルに対して、頻度（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）１ｒａｄ／ｓでの複素モデュラス（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｏｄｕｌｕｓ）を測定し、その結果は下記表１のとおりである。
【表１】
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【００８５】
前記表１の結果から分かるように、本発明による架橋ヒドロゲルＡは、１ｒａｄ／ｓでのモデュラスが１０．５８ｋＰａであって、架橋なしにゲル化処理だけを行ったヒドロゲルＢに比べて架橋化によって約３０倍以上の強度向上を示すことが分かった。
【００８６】
試験例２．
４ないし５週齢のラット（重量：３００±３０ｇ）の胸部を切開して、左前下行枝（Ｌｅｆｔ  Ａｎｔｅｒｉｏｒ  Ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ  ａｒｔｅｒｙ、ＬＡＤ）の永久的な結紮（ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）を行い心筋梗塞を誘発した。
【００８７】
７日後に、比較例１で製造した３次元構造体（ＣＰＣ  ｐｒｉｎｔｅｄ）および実施例３で製造した３次元構造体（ＣＰＣ／ＭＳＣ  ｐｒｉｎｔｅｄ）をそれぞれ８ｍｍ直径の大きさで切断し、心筋梗塞部位に移植した後、封止した（それぞれｎ＝７）。移植後、４週および８週目に心臓超音波を撮影して左心室内径（ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ  ｄｉａｍｅｔｅｒ、ＬＶ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）を確認して、その結果を図５に示し、心筋の機能を示す左心室駆出係数（ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ  ｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ、ＬＶＥＦ）および区画短縮率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ、ＦＳ）を計算してｓｔｕｄｅｎｔ  Ｔ−ｔｅｓｔによる実験群間の有意性評価を行い、その結果を図６に示した。
【００８８】
図５および６から確認できるように、実施例３の本発明による３次元構造体移植４週および８週後、いかなる処理も行っていない実験群（対照群）対比左心室内径が顕著に減った。また、ＣＰＣグループに比べてＣＰＣ／ＭＳＣグループで左心室収縮機能が有意に増加したことを観察することができ、これは、構造体によって心臓リモデリング（ｃａｒｄｉａｃ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）が阻害することを示す。
【００８９】
移植８週後のネズミの心臓を摘出して個体ごとに同じ位置（心臓のａｐｅｘからｂａｓｅ方向に約１／３地点）で組織を獲得した後（３ｕｍ厚さ）マッソントリクローム染色を実施した。当該染色法を用いて心臓筋（赤色）と心筋梗塞部位の瘢痕組織（青色）を区別して、その結果を図７に示した。
【００９０】
図７から確認できるように、本発明により製造した３次元構造体移植８週後の左心室内壁の厚さが対照群に比べて厚く維持され、心筋梗塞部位の瘢痕組織（ｓｃａｒ  ｔｉｓｓｕｅ）の形成が少なかった。また、比較例１のように第１バイオプリンティング用組成物単独で形成させた３次元構造体（ＣＰＣ  ｐｒｉｎｔｅｄ）に比べて、実施例３のように第１バイオプリンティング用組成物および第２バイオプリンティング用組成物で形成させた３次元構造体（ＣＰＣ／ＭＳＣ  ｐｒｉｎｔｅｄ）を移植した時、瘢痕組織形成がさらに効果的に抑制され、左心室内壁は厚さが薄くならずに維持された。
【００９１】
図８から確認できるように、本発明により製造した３次元構造体を移植した心筋梗塞部位に心筋組織の収縮性を代表するベータミオシン重鎖（β−ｍｙｏｓｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ、βＭＨＣ）と血管形成を代表する分化クラスタ３１（ＣＤ３１）の発現量が顕著に増加し、特に第１バイオプリンティング用組成物および第２バイオプリンティング用組成物で形成させた３次元構造体（ＣＰＣ／ＭＳＣ  ｐｒｉｎｔｅｄ）（実施例３）を移植した時、その効果がさらに極大化された。
【００９２】
したがって、本発明の製造方法によって製造された３次元構造体は、構造体内に血管ネットワークを実現することによって（つまり、心筋組織の微細環境を効果的に実現することによって）、細胞の生存能を長期間維持させることができ、心筋内部への細胞伝達効率を顕著に向上させる可能性があることを確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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