(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生分解性高分子ブロックと幹細胞とを含む細胞構造体であって、複数個の前記幹細胞間の隙間に複数個の前記生分解性高分子ブロックが配置されている前記細胞構造体を含み、前記幹細胞が間葉系幹細胞、羊膜細胞、臍帯血由来細胞、骨髄由来細胞、又は脂肪由来幹細胞である、軟骨再生材料。
【請求項２】
前記生分解性高分子ブロックがリコンビナントペプチド又は化学合成ペプチドからなる、請求項１に記載の軟骨再生材料。
【請求項３】
前記生分解性高分子ブロックがリコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンからなる、請求項１又は２に記載の軟骨再生材料。
【請求項４】
前記リコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンが、下記式１で示される、請求項３に記載の軟骨再生材料。
式１：Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ］ｍ−Ｂ
式１中、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｍは２〜１０の整数であり、ｎは３〜１００の整数であり、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示す。
【請求項５】
前記リコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンが、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生分解性を有するペプチド；又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生分解性を有するペプチド；
の何れかである、請求項３又は４に記載の軟骨再生材料。
【請求項６】
前記幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項１から５の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
【請求項７】
前記生分解性高分子ブロックがリコンビナントゼラチンからなり、前記幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項１から６の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
【請求項８】
軟骨及び骨を再生するための、請求項１から７の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
【請求項９】
前記細胞構造体が、前記幹細胞１個当り０．００００００１μｇ以上１μｇ以下の前記生分解性高分子ブロックを含む、請求項１から８の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
【請求項１０】
前記生分解性高分子ブロックの一つの大きさが１０μｍ以上３００μｍ以下である、請求項１から９の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
【請求項１１】
前記細胞構造体の厚さ又は直径が１００μｍ以上１ｃｍ以下である、請求項１から１０の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
【請求項１２】
前記生分解性高分子ブロックにおいて、生分解性高分子が熱、紫外線又は酵素により架橋されている、請求項１から１１の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
【請求項１３】
前記生分解性高分子ブロックが、生分解性高分子の多孔質体を粉砕することにより得られる顆粒の形態にある、請求項１から１２の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
【請求項１４】
請求項１から１３の何れか一項に記載の軟骨再生材料と、生分解性高分子フィルムとを含む、軟骨再生材料。
【請求項１５】
前記生分解性高分子フィルムが、前記細胞構造体の移植面の一部又は全部を移植部位から隔離するためのフィルムである、請求項１４に記載の軟骨再生材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体親和性高分子ブロックと幹細胞とを含む細胞構造体を含む、軟骨再生材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節骨軟骨欠損は自然再生が一般に困難であることから、細胞移植治療による再生医療が盛んに試みられている。細胞移植治療としては、細胞を細胞凝集体の形で投与することが多数試みられている。例えば、特許文献１には、培養液が通過できる微細孔を有するチャンバー内に、被検動物又は患者から採取した組織由来細胞の細胞塊を入れ、細胞塊の一部が気相に接する程度の量の培養液がチャンバー内に含まれるようにしてチャンバー内の培養液よりも過剰量の培養液中で細胞塊を培養することによって組織プラグを製造し、製造した組織プラグを移植することが記載されている。非特許文献１には、滑膜由来細胞と軟骨細胞とから構成され、スキャフォールドを含まないスフェロイドを、膝軟骨欠損の治療のために移植することが記載されている。【０００３】
一方、特許文献２には、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とを含み、上記複数個の細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体が記載されている。特許文献２に記載の細胞構造体においては、外部から細胞構造体の内部への栄養送達が可能であり、十分な厚みを有するとともに、構造体中で細胞が均一に存在している。特許文献１の実施例においては、リコンビナントゼラチンや天然ゼラチン素材からなる高分子ブロックを用いて、高い細胞生存活性が実証されている。また、特許文献２の実施例１１においては、作製した細胞構造体は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の産生量が高く、軟骨分化が促進されていることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４１２２２８０号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１１／１０８５１７号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】European Cells and Materials, vol.22, 2011. p275-290 Transplantation of scaffold-free spheroids composed of synovium-derived cells and chondrocytes or the treatment of cartilage defects of the knee. J.I. Lee
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の通り、関節骨軟骨欠損に対しては、細胞移植治療による再生医療が試みられているが、細胞を投与するだけでは欠損部位に細胞が生着せず、再生効果が十分でないことから、細胞を細胞凝集体の形で投与することが多数試みられている（特許文献１及び非特許文献１など）。しかしながら、細胞を細胞凝集体の形で投与した場合でも、繊維性の軟組織の侵入を防ぎつつ、望ましい骨と軟骨を同時に再生させることは困難である。また、特許文献２には、細胞構造体は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の産生量が高いことが記載されているが、軟骨及び骨を同時に再生できることは実証されていない。上記の通り、細胞凝集体を用い、骨・軟骨欠損の再生治療を行った場合、遊離した単独の細胞を用いた場合より、再生治療効果等は高くはなるが、必ずしも十分なものではなく、より高い骨・軟骨再生効果を示す細胞構造体が求められている。【０００７】
本発明は、細胞を使用して骨及び軟骨を再生することができる、軟骨再生材料を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、生体親和性高分子ブロックと幹細胞とを含む細胞構造体であって、複数個の上記幹細胞間の隙間に複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている上記細胞構造体が、優れた軟骨再生能と優れた骨再生能とを有することを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。【０００９】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）生体親和性高分子ブロックと幹細胞とを含む細胞構造体であって、複数個の上記幹細胞間の隙間に複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている上記細胞構造体を含む、軟骨再生材料。
（２）軟骨及び骨を再生するための、（１）に記載の軟骨再生材料。
（３）上記幹細胞が、間葉系幹細胞である、（１）又は（２）に記載の軟骨再生材料。
（４）上記細胞構造体が、上記幹細胞１個当り０．００００００１μｇ以上１μｇ以下の上記生体親和性高分子ブロックを含む、（１）から（３）の何れか一に記載の軟骨再生材料。
（５）上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが１０μｍ以上３００μｍ以下である、（１）から（４）の何れか一に記載の軟骨再生材料。
（６）上記細胞構造体の厚さ又は直径が１００μｍ以上１ｃｍ以下である、（１）から（５）の何れか一に記載の軟骨再生材料。【００１０】
（７）上記生体親和性高分子ブロックがリコンビナントペプチド又は化学合成ペプチドからなる、（１）から（６）の何れか一に記載の軟骨再生材料。
（８）上記生体親和性高分子ブロックがリコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンからなる、（１）から（７）の何れか一に記載の軟骨再生材料。
（９）上記リコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンが、下記式１で示される、（８）に記載の軟骨再生材料。
式１：Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂ
式１中、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｍは２〜１０の整数であり、ｎは３〜１００の整数であり、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示す。
（１０）上記リコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンが、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである、（８）又は（９）に記載の軟骨再生材料。【００１１】
（１１）上記生体親和性高分子ブロックにおいて、生体親和性高分子が熱、紫外線又は酵素により架橋されている、（１）から（１０）の何れか一に記載の軟骨再生材料。
（１２）上記生体親和性高分子ブロックが、多孔質体の生体親和性高分子を粉砕することにより得られる顆粒の形態にある、（１）から（１１）の何れか一に記載の軟骨再生材料。
（１３）（１）から（１２）の何れか一に記載の軟骨再生材料と、生体親和性高分子フィルムとを含む、軟骨再生材料。
（１４）上記生体親和性高分子フィルムが、上記細胞構造体の移植面の一部又は全部を移植部位から隔離するためのフィルムである、（１３）に記載の軟骨再生材料。【００１２】
（１５）軟骨再生の治療において使用するための細胞構造体であって、上記細胞構造体が、生体親和性高分子ブロックと幹細胞とを含み、複数個の上記幹細胞間の隙間に複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている上記細胞構造体。
（１６）生体親和性高分子ブロックと幹細胞とを含む細胞構造体であって、複数個の上記幹細胞間の隙間に複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている上記細胞構造体を、軟骨再生を必要とする患者に移植する工程を含む、軟骨再生方法。
（１７）軟骨再生材料の製造のための、生体親和性高分子ブロックと幹細胞とを含む細胞構造体であって、複数個の上記幹細胞間の隙間に複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている上記細胞構造体の使用。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の軟骨再生材料は、優れた軟骨再生能と優れた骨再生能とを有し、細胞移植治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、条件Ａの液温プロファイルを示す。
【図２】図２は、条件Ｂの液温プロファイルを示す。
【図３】図３は、条件Ｃの液温プロファイルを示す。
【図４】図４は、条件ＡＡの液温プロファイルを示す。
【図５】図５は、条件ＢＢの液温プロファイルを示す。
【図６】図６は、スポンジのみを移植（フィルムなし）した組織の染色の結果を示す。
【図７】図７は、スポンジ（細胞なし）とフィルムを移植した組織の染色の結果を示す。
【図８】図８は、細胞培養スポンジとフィルムを移植した組織の染色の結果を示す。
【図９】図９は、細胞塊とフィルムを移植した組織の染色の結果を示す。
【図１０】図１０は、モザイク細胞塊とフィルムを移植した組織の染色の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の軟骨再生材料は、生体親和性高分子ブロックと幹細胞とを含む細胞構造体であって、複数個の上記幹細胞間の隙間に複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている上記細胞構造体を含む材料である。なお、本発明で用いる細胞構造体は、本明細書中において、モザイク細胞塊（モザイク状になっている細胞塊）と称する場合もある。
【００１６】
本発明の軟骨再生材料は、優れた軟骨再生能と優れた骨再生能とを有することから、軟骨を再生するために使用することに加え、軟骨及び骨を再生するために使用することもできる。本発明の軟骨再生材料は、例えば、軟骨欠損部位に移植するための移植材料として使用することができる。
【００１７】
生体親和性高分子ブロックと幹細胞とを含む細胞構造体であって、複数個の上記幹細胞間の隙間に複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている上記細胞構造体が、優れた軟骨再生作用に加えて優れた骨再生作用をも有することは、全く予想外な顕著な効果である。特許文献１及び非特許文献１においては、生体親和性高分子ブロックを使用することについては開示も示唆もない。特許文献１及び非特許文献１の技術は、生体親和性高分子ブロック等のスキャフォールドを含まないことを特徴とするものであり、この点において本発明とは相違する。特許文献２には、細胞構造体のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）産生量が高いことが記載されているが、ＧＡＧ産生量と、軟骨及び骨を同時に再生できることとは無関係である。軟骨分化と軟骨再生とは異なる現象であり、また軟骨再生能と骨再生能とは全く異なる概念である。また特許文献２におけるＧＡＧ産生は、生体外かつ軟骨分化を促進させる特異的な培地（軟骨分化培地）を用いた実験におけるものであり、この実験条件は生体内の環境とは大きく異なる。従って、特許文献２の知見からは生体内環境での軟骨再生は予測できず、特に、軟骨及び骨を同時に再生できることは特許文献２からは全く予想することができない。
【００１８】
（１）生体親和性高分子ブロック
本発明で用いる細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックを含む。生体親和性高分子ブロックについて以下に説明する。
（１−１）生体親和性高分子
生体親和性とは、生体に接触した際に、長期的かつ慢性的な炎症反応などのような顕著な有害反応を惹起しないことを意味する。本発明で用いる生体親和性高分子は、生体親和性を有するものであれば、生体内で分解されるか否かは特に限定されないが、生分解性高分子であることが好ましい。非生分解性高分子として具体的には、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコーン及びＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）などが挙げられる。生分解性高分子としては、具体的には、リコンビナントペプチド又は化学合成ペプチドなどのポリペプチド（例えば、以下に説明するゼラチン等）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、及びキトサンなどが挙げられる。上記の中でも、リコンビナントペプチドが特に好ましい。これら生体親和性高分子には細胞接着性を高める工夫がなされていてもよい。具体的には、「基材表面に対する細胞接着基質（フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン）や細胞接着配列（アミノ酸一文字表記で表される、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列）ペプチドによるコーティング」、「基材表面のアミノ化、カチオン化」、又は「基材表面のプラズマ処理、コロナ放電による親水性処理」といった方法を使用できる。
【００１９】
リコンビナントペプチド又は化学合成ペプチドなどのポリペプチドの種類は、生体親和性を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチンが好ましく、最も好ましくはゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲンである。本発明で用いるためのゼラチンは、好ましくは、天然ゼラチン、リコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンであり、より好ましくはリコンビナントゼラチンである。ここでいう天然ゼラチンとは天然由来のコラーゲンより作られたゼラチンを意味する。
化学合成ペプチド又は化学合成ゼラチンとは、人工的に合成したペプチド又はゼラチンを意味する。ゼラチン等のペプチドの合成は、固相合成でも液相合成でもよいが、好ましくは固相合成である。ペプチドの固相合成は当業者に公知であり、例えば、アミノ基の保護基としてＦｍｏｃ基（Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl基）を使用するＦｍｏｃ基合成法、及び、アミノ基の保護基としてＢｏｃ基（tert-Butyl Oxy Carbonyl基）を使用するＢｏｃ基合成法などが挙げられる。なお、化学合成ゼラチンの好ましい態様は、本明細書中、後記する（１−３）リコンビナントゼラチンの内容を当てはめることができる。
リコンビナントゼラチンについては、本明細書中後記する。
【００２０】
本発明で用いる生体親和性高分子の親水性値「１／ＩＯＢ」値は、０から１．０であることが好ましい。より好ましくは、０から０．６であり、さらに好ましくは０から０．４である。ＩＯＢとは、藤田穆により提案された有機化合物の極性／非極性を表す有機概念図に基づく、親疎水性の指標であり、その詳細は、例えば、"Pharmaceutical Bulletin", vol.2, 2, pp.163-173（1954）、「化学の領域」vol.11, 10, pp.719-725（1957）、「フレグランスジャーナル」, vol.50, pp.79-82（1981）等で説明されている。簡潔に言えば、全ての有機化合物の根源をメタン（ＣＨ4）とし、他の化合物はすべてメタンの誘導体とみなして、その炭素数、置換基、変態部、環等にそれぞれ一定の数値を設定し、そのスコアを加算して、有機性値（ＯＶ）、無機性値（ＩＶ）を求め、この値を、有機性値をＸ軸、無機性値をＹ軸にとった図上にプロットしていくものである。有機概念図におけるＩＯＢとは、有機概念図における有機性値（ＯＶ）に対する無機性値（ＩＶ）の比、すなわち「無機性値（ＩＶ）／有機性値（ＯＶ）」を意味する。有機概念図の詳細については、「新版有機概念図−基礎と応用−」（甲田善生等著、三共出版、２００８）を参照されたい。本明細書中では、ＩＯＢの逆数をとった「１／ＩＯＢ」値で親疎水性を表している。「１／ＩＯＢ」値が小さい（０に近づく）程、親水性であることを表す表記である。
【００２１】
本発明で用いる生体親和性高分子の「１／ＩＯＢ」値を上記範囲とすることにより、上記生体親和性高分子の親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用し、結果として、本発明における細胞構造体（モザイク細胞塊）中の細胞の安定化・生存しやすさに寄与するものと推定される。
【００２２】
本発明で用いる生体親和性高分子がポリペプチドである場合は、上記ポリペプチドのGrand average of hydropathicity（ＧＲＡＶＹ）値で表される親疎水性指標が、０．３以下、マイナス９．０以上であることが好ましく、０．０以下、マイナス７．０以上であることがより好ましい。Grand average of hydropathicity（GRAVY）値は、『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607』及び『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).』に記載の方法により得ることができる。
【００２３】
本発明で用いる生体親和性高分子のＧＲＡＶＹ値を上記範囲とすることにより、上記生体親和性高分子の親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用し、結果として、本発明における細胞構造体（モザイク細胞塊）中の細胞の安定化・生存しやすさに寄与するものと推定される。
【００２４】
（１−２）架橋
本発明で用いる生体親和性高分子は、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよいが、架橋されているものが好ましい。架橋されている生体親和性高分子を使用することにより、本発明の軟骨再生材料を培地中で培養する際及び生体に移植した際に瞬時に分解してしまうことを防ぐという効果が得られる。一般的な架橋方法としては、熱架橋、アルデヒド類（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）による架橋、縮合剤（カルボジイミド、シアナミドなど）による架橋、酵素架橋、光架橋、紫外線架橋、疎水性相互作用、水素結合、イオン性相互作用などが知られている。本発明で使用する架橋方法は、好ましくは熱架橋、紫外線架橋、又は酵素架橋であり、特に好ましくは熱架橋である。
【００２５】
酵素による架橋を行う場合、酵素としては、高分子間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼ及びラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いることができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋する高分子の具体例としては、リジン残基及びグルタミン残基を有するタンパク質であれば特に制限されない。トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、およびヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、Haematologic Technologies， Inc.社）などが挙げられる。
【００２６】
架橋（例えば、熱架橋）を行う際の反応温度は、架橋ができる限り特に限定されないが、好ましくは−１００℃〜５００℃であり、より好ましくは０℃〜３００℃であり、更に好ましくは５０℃〜３００℃であり、一層好ましくは１００℃〜２５０℃であり、より一層好ましくは１２０℃〜２００℃である。
【００２７】
（１−３）リコンビナントゼラチン
本発明で言うリコンビナントゼラチンとは、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。本発明で用いることができるリコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列（Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。好ましくは、細胞接着シグナルが一分子中に２配列以上含まれている。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを用いることができる。例えばＥＰ１０１４１７６号公報、ＵＳ特許６９９２１７２号公報、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号公報、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。
【００２８】
リコンビナントゼラチンは、天然のゼラチン本来の性能から生体親和性に優れ、且つ天然由来ではないことで牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などの懸念がなく、非感染性に優れている。また、リコンビナントゼラチンは天然セラチンと比べて均一であり、配列が決定されているので、強度及び分解性においても架橋等によってブレを少なく精密に設計することが可能である。
【００２９】
リコンビナントゼラチンの分子量は、特に限定されないが、好ましくは２０００以上１０００００以下（２ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下）であり、より好ましくは２５００以上９５０００以下（２．５ｋＤａ以上９５ｋＤａ以下）であり、さらに好ましくは５０００以上９００００以下（５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）であり、最も好ましくは１００００以上９００００以下（１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）である。
【００３０】
リコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有することが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ において、Ｇｌｙはグリシンを表し、Ｘ及びＹは、任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列は、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成及び配列において、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分構造においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。Ｘ及びＹで表されるアミノ酸にはイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％〜４５％を占めることが好ましい。好ましくは、リコンビナントゼラチンの配列の８０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸が、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙの繰り返し構造である。
【００３１】
一般的なゼラチンは、極性アミノ酸のうち電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン及びアルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン及びチロシンを指す。本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０〜４０％であり、好ましくは２０〜３０％である。且つ上記極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が５％以上２０％未満であることが好ましく、より好ましくは５％以上１０％未満である。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインのうちいずれか１つのアミノ酸、好ましくは２つ以上のアミノ酸を配列上に含まないことが好ましい。
【００３２】
一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、これらの細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列を一分子中に２以上有することが好ましい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で表される、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列が好ましい。より好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列及びＨＡＶ配列であり、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列の中では、ＥＲＧＤ配列が好ましい。細胞接着シグナルを有するリコンビナントゼラチンを用いることにより、細胞の基質産生量を向上させることができる。例えば、細胞として間葉系幹細胞を用いた場合、軟骨分化において、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の産生を向上させることができる。
【００３３】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０〜１００の間、好ましくは２５〜６０の間で均一でないことが好ましい。
この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、タンパク質１分子中３〜５０個であることが好ましく、より好ましくは４〜３０個、さらに好ましくは５〜２０個である。最も好ましくは１２個である。
【００３４】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤ配列（モチーフ）の割合は少なくとも０．４％であることが好ましい。リコンビナントゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、より好ましくは少なくとも０．６％であり、更に好ましくは少なくとも０．８％であり、一層好ましくは少なくとも１．０％であり、より一層好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。リコンビナントペプチド内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、より好ましくは少なくとも６、更に好ましくは少なくとも８、一層好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、本発明のリコンビナントゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明のリコンビナントゼラチンのさらなる態様としては、少なくとも４つのＲＧＤモチーフ、好ましくは少なくとも６つ、より好ましくは少なくとも８つ、さらに好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。
【００３５】
リコンビナントゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
【００３６】
好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、式１：Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂで示されるものである。ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。ｍは２〜１０の整数であり、好ましくは３〜５である。ｎは３〜１００の整数であり、１５〜７０が好ましく、５０〜６５がより好ましい。Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示す。
【００３７】
より好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、  式：Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）63］3−Ｇｌｙ（式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示されるものである。
【００３８】
繰り返し単位には、天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは、天然に存在するものであればいずれでも構わないが、好ましくはＩ型、II型、III型、IV型、又はV型コラーゲンである。より好ましくは、I型、II型、又はIII型コラーゲンである。別の形態によると、上記コラーゲンの由来は、好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウス又はラットであり、より好ましくはヒトである。
【００３９】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンの等電点は、好ましくは５〜１０であり、より好ましくは６〜１０であり、さらに好ましくは７〜９．５である。
【００４０】
好ましくは、リコンビナントゼラチンは脱アミン化されていない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
【００４１】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、特に好ましくは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
である。
【００４２】
「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１若しくは数個」とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００４３】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２号公報、米国特許第６９９２１７２号公報、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号公報、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定のリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、リコンビナントゼラチンが産生されるので、培養物から産生されたリコンビナントゼラチンを回収することにより、本発明で用いるリコンビナントゼラチンを調製することができる。
【００４４】
（１−４）生体親和性高分子ブロック
本発明では、上記した生体親和性高分子からなるブロック（塊）を使用する。
本発明における生体親和性高分子ブロックの形状は特に限定されるものではない。例えば、不定形、球状、粒子状（顆粒）、粉状、多孔質状（多孔質体）、繊維状、紡錘状、扁平状及びシート状であり、好ましくは、不定形、球状、粒子状（顆粒）、粉状及び多孔質状である。不定形とは、表面形状が均一でないもののことを示し、例えば、岩のような凹凸を有する物を示す。なお、上記の形状の例示はそれぞれ別個のものではなく、例えば、粒子状（顆粒）の下位概念の一例として不定形となる場合もある。
【００４５】
本発明における生体親和性高分子ブロックの一つの大きさは、特に限定されないが、好ましくは１μｍ以上１０００μｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上１０００μｍ以下であり、さらに好ましくは１０μｍ以上７００μｍ以下であり、一層好ましくは１０μｍ以上３００μｍ以下であり、より一層好ましくは１０μｍ以上２００μｍ以下であり、さらに一層好ましくは２０μｍ以上２００μｍ以下であり、特に好ましくは２０μｍ以上１５０μｍ以下であり、最も好ましくは５０μｍ以上１１０μｍ以下である。生体親和性高分子ブロックの一つの大きさを上記の範囲内にすることは、軟骨再生の観点から好ましい。なお、生体親和性高分子ブロックの一つの大きさとは、複数個の生体親和性高分子ブロックの大きさの平均値が上記範囲にあることを意味するものではなく、複数個の生体親和性高分子ブロックをふるいにかけて得られる、一つ一つの生体親和性高分子ブロックのサイズを意味するものである。
【００４６】
ブロック一つの大きさは、ブロックを分ける際に用いたふるいの大きさで定義することができる。例えば、１８０μｍのふるいにかけ、通過したブロックを１０６μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、１０６〜１８０μｍの大きさのブロックとすることができる。次に、１０６μｍのふるいにかけ、通過したブロックを５３μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、５３〜１０６μｍの大きさのブロックとすることができる。次に、５３μｍのふるいにかけ、通過したブロックを２５μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、２５〜５３μｍの大きさのブロックとすることができる。
【００４７】
（１−５）生体親和性高分子ブロックの製造方法
生体親和性高分子ブロックの製造方法は、特に限定されないが、例えば、生体親和性高分子の多孔質体を、粉砕機（ニューパワーミルなど）を用いて粉砕することにより、顆粒形態の一例である不定形の生体親和性高分子ブロックを得ることができる。
【００４８】
生体親和性高分子の多孔質体の製造方法は特に限定されないが、例えば、
（ａ）溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下であり、かつ、溶液内で最も液温の高い部分の温度が溶媒の融点以下の温度で、生体親和性高分子の溶液を、未凍結状態に冷却する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた生体親和性高分子の未凍結状態の溶液を凍結する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）で得られた凍結した生体親和性高分子の溶液を凍結乾燥する工程
を含む製造方法を挙げることができる。
【００４９】
生体親和性高分子の溶液を未凍結状態に冷却する際に、溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下（好ましくは２．３℃以下、より好ましくは２．１℃以下）、つまり温度の差を小さくすることによって、得られる多孔質のポアの大きさのばらつきが少なくなる。なお溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差の下限は特に限定されず、０℃以上であればよく、例えば０．１℃以上、０．５℃以上、０．８℃以上、又は０．９℃以上でもよい。これにより、製造された生体親和性高分子の多孔質体を用いて製造した生体親和性高分子ブロックを用いた細胞構造体は、高い細胞数を示すという効果が達成される。
【００５０】
工程（ａ）の冷却は、例えば、水よりも熱伝導率の低い素材（好ましくは、テフロン（登録商標））を介して冷却することが好ましく、溶液内で最も液温の高い部分は、冷却面から最も遠い部分と擬制することができ、溶液内で最も液温の低い部分は、冷却面の液温と擬制することができる。
【００５１】
好ましくは、工程（ａ）において、凝固熱発生直前の、溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下であり、より好ましくは２．３℃以下であり、さらに好ましくは２．１℃以下である。ここで「凝固熱発生直前の温度差」とは、凝固熱発生時の１秒前〜１０秒前の間で最も温度差が大きくなるときの温度差を意味する。
【００５２】
好ましくは、工程（ａ）において、溶液内で最も液温の低い部分の温度は、溶媒の融点−５℃以下であり、より好ましくは溶媒の融点−５℃以下かつ溶媒の融点−２０℃以上であり、更に好ましくは溶媒の融点−６℃以下かつ溶媒の融点−１６℃以上である。なお、「溶媒の融点」の溶媒とは、生体親和性高分子の溶液の溶媒である。
【００５３】
工程（ｂ）においては、工程（ａ）で得られた未凍結状態の生体親和性高分子の溶液を凍結する。工程（ｂ）にて凍結するための冷却温度は、特に制限されるものではなく、冷却する機器にもよるが、好ましくは、溶液内で最も液温の低い部分の温度より、３℃から３０℃低い温度であり、より好ましくは、５℃から２５℃低い温度であり、更に好ましくは、１０℃から２０℃低い温度である。
【００５４】
工程（ｃ）においては、工程（ｂ）で得られた凍結した生体親和性高分子の溶液を凍結乾燥する。凍結乾燥は、常法により行うことができ、例えば、溶媒の融点より低い温度で真空乾燥を行い、さらに室温（２０℃）で真空乾燥を行うことにより凍結乾燥を行うことができる。
【００５５】
（２）幹細胞
本発明で用いる幹細胞は、細胞移植を行うことができ、軟骨再生能を発揮できる限り、任意の幹細胞を使用することができ、その種類は特に限定されない。また、使用する幹細胞は１種でもよいし、複数種の幹細胞を組合せて用いてもよい。また、使用する幹細胞として、好ましくは、動物細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞、特に好ましくはヒト由来細胞である。脊椎動物由来細胞（特に、ヒト由来細胞）の種類は、万能細胞、又は体性幹細胞の何れでもよい。万能細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、生殖系列幹細胞（ＧＳ細胞）、又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を使用することができる。体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、羊膜細胞、臍帯血由来細胞、骨髄由来細胞、又は脂肪由来幹細胞を使用することができ、特に好ましくは間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。また、細胞の由来は、自家細胞又は他家細胞の何れでも構わない。
【００５６】
（３）細胞構造体
本発明においては、上記生体親和性高分子ブロックと上記幹細胞とを用いて、複数個の幹細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックをモザイク状に３次元的に配置させることによって細胞構造体を作製する。生体親和性高分子ブロックと幹細胞とがモザイク状に３次元に配置されることにより、細胞構造体中で幹細胞が均一に存在する細胞構造体が形成され、外部から細胞構造体の内部への、培地成分などの栄養の送達が可能となる。
【００５７】
本発明で用いる細胞構造体においては、複数個の幹細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されているが、ここで、「幹細胞間の隙間」とは、構成される幹細胞により、閉じられた空間である必要はなく、幹細胞により挟まれていればよい。なお、すべての幹細胞間に隙間がある必要はなく、幹細胞同士が接触している箇所があってもよい。生体親和性高分子ブロックを介した幹細胞間の隙間の距離、即ち、ある幹細胞とその幹細胞から最短距離に存在する幹細胞を選択した際の隙間距離は特に制限されるものではないが、生体親和性高分子ブロックの大きさであることが好ましく、好適な距離も生体親和性高分子ブロックの好適な大きさの範囲である。
【００５８】
また、生体親和性高分子ブロックは、幹細胞により挟まれた構成となるが、すべての生体親和性高分子ブロック間に幹細胞がある必要はなく、生体親和性高分子ブロック同士が接触している箇所があってもよい。幹細胞を介した生体親和性高分子ブロック間の距離、即ち、生体親和性高分子ブロックとその生体親和性高分子ブロックから最短距離に存在する生体親和性高分子ブロックを選択した際の距離は特に制限されるものではないが、使用される幹細胞が１〜数個集まった際の幹細胞の塊の大きさであることが好ましく、例えば、１０μｍ以上１０００μｍ以下であり、好ましくは１０μｍ以上１００μｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上５０μｍ以下である。
【００５９】
なお、本明細書中、「細胞構造体中で幹細胞が均一に存在する細胞構造体」等、「均一に存在する」との表現を使用しているが、完全な均一を意味するものではなく、外部から細胞構造体の内部への培地成分などの栄養の送達を可能とすることを意味するものである。
【００６０】
細胞構造体の厚さ又は直径は、所望の厚さとすることができるが、下限としては、２１５μｍ以上であることが好ましく、４００μｍ以上がより好ましく、５００μｍ以上であることがさらに好ましい。厚さ又は直径の上限は特に限定されないが、使用上の一般的な範囲としては３ｃｍ以下が好ましく、２ｃｍ以下がより好ましく、１ｃｍ以下であることが更に好ましい。また、細胞構造体の厚さ又は直径の範囲として、好ましくは、４００μｍ以上３ｃｍ以下、より好ましくは５００μｍ以上２ｃｍ以下、更に好ましくは５００μｍ以上１ｃｍ以下である。細胞構造体の厚さ又は直径を上記の範囲内とすることにより、軟骨再生能を発揮し易くなる。
【００６１】
細胞構造体においては、好ましくは、生体親和性高分子ブロックからなる領域と幹細胞からなる領域とがモザイク状に配置されている。尚、本明細書中における「細胞構造体の厚さ又は直径」とは、以下のことを示すものとする。細胞構造体中のある一点Ａを選択した際に、その点Ａを通る直線の内で、細胞構造体外界からの距離が最短になるように細胞構造体を分断する線分の長さを線分Ａとする。細胞構造体中でその線分Ａが最長となる点Ａを選択し、その際の線分Ａの長さのことを「細胞構造体の厚さ又は直径」とする。
【００６２】
細胞構造体における幹細胞と生体親和性高分子ブロックの比率は特に限定されないが、好ましくは幹細胞1個当りの生体親和性高分子ブロックの質量が０．００００００１μｇ以上１μｇ以下であることが好ましく、より好ましくは０．０００００１μｇ以上０．１μｇ以下、さらに好ましくは０．００００１μｇ以上０．０１μｇ以下、最も好ましくは０．００００２μｇ以上０．００６μｇ以下である。幹細胞と生体親和性高分子ブロックの比率を上記範囲とすることより、幹細胞をより均一に存在させることができる。また、下限を上記範囲とすることにより、上記用途に使用した際に幹細胞の効果を発揮することができ、上限を上記範囲とすることにより、任意で存在する生体親和性高分子ブロック中の成分を幹細胞に供給できる。ここで、生体親和性高分子ブロック中の成分は特に制限されないが、後述する培地に含まれる成分が挙げられる。
【００６３】
（４）細胞構造体の製造方法
細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックと、幹細胞とを混合することによって製造することができる。より具体的には、細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックと、幹細胞とを交互に配置することにより製造できる。製造方法は特に限定されないが、好ましくは生体親和性高分子ブロックを形成したのち、幹細胞を播種する方法である。
【００６４】
具体的には、生体親和性高分子ブロックと幹細胞含有培養液との混合物をインキュベートすることによって、細胞構造体を製造することができる。例えば、容器中、容器に保持される液体中で、幹細胞と、予め作製した生体親和性高分子ブロックとをモザイク状に配置する。配置の手段としては、自然凝集、自然落下、遠心、攪拌を用いることで、幹細胞と生体親和性高分子ブロックからなるモザイク状の配置の形成を促進又は制御することが好ましい。
【００６５】
用いられる容器としては、細胞低接着性材料又は細胞非接着性材料からなる容器が好ましく、より好ましくはポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレートからなる容器である。容器底面の形状は平底型、Ｕ字型、Ｖ字型であることが好ましい。
【００６６】
上記の方法で得られたモザイク状の配置を有する細胞構造体は、例えば、
（ａ）別々に作製したモザイク状細胞塊同士を融合させる、又は
（ｂ）分化培地又は増殖培地下でボリュームアップさせる、
などの方法により所望の大きさの細胞構造体を製造することができる。融合の方法、ボリュームアップの方法は特に限定されない。
【００６７】
例えば、生体親和性高分子ブロックと幹細胞含有培養液との混合物をインキュベートする工程において、培地を分化培地又は増殖培地に交換することによって、細胞構造体をボリュームアップさせることができる。好ましくは、生体親和性高分子ブロックと幹細胞含有培養液との混合物をインキュベートする工程において、生体親和性高分子ブロックをさらに添加することによって、所望の大きさの細胞構造体であって、細胞構造体中に幹細胞が均一に存在する細胞構造体を製造することができる。
【００６８】
別々に作製したモザイク状細胞塊同士を融合させる方法とは、具体的には、複数個の生体親和性高分子ブロックと、複数個の幹細胞とを含み、複数の幹細胞により形成される複数個の隙間の一部または全部に、一または複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体を複数個融合させる工程を含む、細胞構造体の製造方法である。
【００６９】
融合又はボリュームアップ前の各細胞構造体の厚さ又は直径が１０μｍ以上１ｃｍ以下であり、融合又はボリュームアップ後の厚さ又は直径が１００μｍ以上３ｃｍ以下であることが好ましい。ここで、融合前の各細胞構造体の厚さ又は直径として、より好ましくは１０μｍ以上２０００μｍ以下、更に好ましくは１５μｍ以上１５００μｍ以下、最も好ましくは、２０μｍ以上１３００μｍ以下であり、また、融合後の厚さ又は直径の範囲として、より好ましくは１００μｍ以上２ｃｍ以下、更に好ましくは１００μｍ以上１ｃｍ以下であり、一層好ましくは２００μｍ以上１ｃｍ以下であり、特に好ましくは４００μｍ以上１ｃｍ以下である。
【００７０】
融合させたい細胞構造体同士は、０μｍ以上５０μｍ以下の距離に配置することが好ましく、より好ましくは、０μｍ以上２０μｍ以下、更に好ましくは０μｍ以上５μｍ以下の距離である。細胞構造体同士を融合させる際、細胞の増殖・伸展によって細胞あるいは細胞が産生する基質が接着剤の役割を果たし、接合することが考えられ、上記範囲とすることにより、細胞構造体同士の接着が容易となる。
【００７１】
生体親和性高分子ブロックをさらに添加することによって、所望の大きさの細胞構造体を作製することもできる。具体的には、複数個の第一の生体親和性高分子ブロックと、複数個の幹細胞とを含み、複数の幹細胞により形成される複数個の隙間の一部または全部に、一または複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体に、更に、第二の生体親和性高分子ブロックを添加しインキュベートすることができる。
【００７２】
細胞構造体に、更に、第二の生体親和性高分子ブロックを添加しインキュベートする際の、第二の生体親和性高分子ブロックを添加するペースは、使用する幹細胞の増殖の速度に合わせて、適宜、選択することが好ましい。
【００７３】
具体的には、第二の生体親和性高分子ブロックを添加するペースが早いと幹細胞が細胞構造体の外側へと移動し、幹細胞の均一性が低くなり、添加のペースが遅いと、幹細胞の割合が多くなる箇所ができ、幹細胞の均一性が低くなるため、使用する幹細胞の増殖速度を考慮し、選択する。
【００７４】
（５）軟骨再生材料の使用方法
本発明において、上記した細胞構造体は、軟骨再生材料として使用する。本発明の軟骨再生材料は、軟骨欠損の疾患部位に細胞移植の目的で使用できる。軟骨欠損を伴う疾患としては、変形性関節症、骨軟骨欠損、離断性骨軟骨炎、外傷性軟骨損傷、骨関節炎、再発性多発軟骨炎、軟骨無形成症、椎間板損傷、又は椎間板ヘルニア等を挙げることができるが、特に限定されない。
移植方法としては、切開、注射、関節鏡、内視鏡等を使用した方法が挙げられる。本発明の細胞構造体は、細胞シート等の細胞移植物とは異なり、構造体のサイズを小さくすることができるため、注射による移植といった低侵襲の移植方法が可能となる。
【００７５】
本発明の軟骨再生材料を移植する際の量は、疾患の状態などに応じて適宜選択することができるが、移植する細胞数としては、１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ3〜１．０×１０10ｃｅｌｌｓ／ｃｍ3が好ましく、１．０×１０6ｃｅｌｌｓ／ｃｍ3〜１．０×１０9ｃｅｌｌｓ／ｃｍ3がより好ましい。
本発明の軟骨再生材料の移植回数としては、１回だけ移植してもよいし、必要応じ２回以上の移植を行うこともできる。
【００７６】
（６）生体親和性高分子フィルム
上記した本発明の軟骨再生材料は、単独で軟骨再生材料として使用してもよいが、生体親和性高分子フィルムと組み合わせて、軟骨再生材料として使用することもできる。上記した本発明の軟骨再生材料と、生体親和性高分子フィルムとは、それぞれ別々にキットの形態で提供してもよいし、上記した本発明の軟骨再生材料と、生体親和性高分子フィルムとを一緒に貼り合せた形態で提供してもよい。軟骨再生材料と生体親和性高分子フィルムとをそれぞれ別々にキットの形態で提供する場合、使用者は、軟骨再生材料と生体親和性高分子フィルムとを一緒に貼り合せた後に移植することができる。あるいは、使用者は、生体親和性高分子フィルムを移植した後に、軟骨再生材料を移植してもよい。
【００７７】
生体親和性高分子フィルムを使用する場合、生体親和性高分子フィルムは、細胞構造体の移植面の一部又は全部を移植部位から隔離するためのフィルムとして使用することが好ましい。例えば、生体親和性高分子フィルムを先ず移植部位に移植し、その後に、生体親和性高分子フィルムの上面（移植部位と接している面とは反対側の面）に、細胞構造体を移植することが好ましい。あるいは、本発明の細胞構造体を含む軟骨再生材料と生体親和性高分子フィルムとを一緒に貼り合せた後に移植する場合には、生体親和性高分子フィルムが移植部位に直接接触するように移植することが好ましい。
【００７８】
生体親和性高分子フィルムを構成する生体親和性高分子の具体例及び好ましい範囲については、生体親和性高分子ブロックを構成する生体親和性高分子の場合と同様であり、具体的には、本明細書中の上記（１−１）生体親和性高分子、（１−２）架橋、及び（１−３）リコンビナントゼラチンに記載した通りである。なお、生体親和性高分子フィルムを構成する生体親和性高分子は、生体親和性高分子ブロックを構成する生体親和性高分子と同一でもよいし、異なるものでもよい。
【００７９】
生体親和性高分子フィルムの製造方法は特に限定されず、常法により実施できる。例えば、生体親和性高分子の水溶液を、プラスチックトレーに流し込み、低温下（例えば、冷蔵庫中など）で乾燥することにより生体親和性高分子フィルムを製造することができる。
【００８０】
生体親和性高分子フィルムは架橋することができる。架橋する場合、架橋度は特に限定されないが、一般的には、４〜１５であり、より好ましくは６〜１３である。架橋度とは、１分子当たりの架橋数である。架橋度の測定は、実施例の[７] 架橋度の測定方法に記載したＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）法を用いて実施することができる。
【００８１】
生体親和性高分子フィルムの分解速度は、架橋度に応じて変動する。生体親和性高分子フィルムの分解速度は、後記する実施例の[８] 分解速度の測定方法に記載した方法により測定及び評価することができる。上記方法により測定した生体親和性高分子フィルムの分解速度は、特に限定されないが、一般的には、０．１〜１０[質量％／時間]であり、より好ましくは０．５〜６．９[質量％／時間]である。
【００８２】
（７）用途及び軟骨再生方法
本発明によれば、軟骨再生の治療において使用するための細胞構造体であって、上記細胞構造体が、生体親和性高分子ブロックと幹細胞とを含み、複数個の上記幹細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている上記細胞構造体が提供される。細胞構造体に加えて、上記した生体親和性高分子フィルムを組み合わせることもできる。生体親和性高分子ブロック、幹細胞、細胞構造体及び生体親和性高分子フィルムの好ましい範囲は本明細書中上記と同様である。
【００８３】
本発明によれば、上記した細胞構造体を、軟骨再生を必要とする患者に移植する工程を含む、軟骨再生方法が提供される。本発明の軟骨再生方法においては、上記した細胞構造体を軟骨再生材料として用いる。細胞構造体の移植の際に、上記した生体親和性高分子フィルムを移植してもよい。生体親和性高分子ブロック、幹細胞、細胞構造体及び生体親和性高分子フィルムの好ましい範囲は、本明細書中の上記と同様である。
【００８４】
更に本発明によれば、軟骨再生材料の製造のための、上記した細胞構造体の使用が提供される。細胞構造体に加えて、上記した生体親和性高分子フィルムを組み合わせることもできる。生体親和性高分子ブロック、幹細胞、細胞構造体及び生体親和性高分子フィルムの好ましい範囲は、本明細書中の上記と同様である。
【００８５】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００８６】
［１］リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）
リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）として以下のＣＢＥ３を用意した（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報に記載）。
ＣＢＥ３：
分子量：５１．６ｋＤ
構造：  ＧＡＰ［（ＧＸＹ）63］3Ｇ
アミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインは含まれていない。ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：９．３４
ＧＲＡＶＹ値：−０．６８２
１／ＩＯＢ値：０．３２３
アミノ酸配列（配列表の配列番号１）（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報の配列番号３と同じ。但し末尾のＸは「Ｐ」に修正）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
また、本明細書における多孔質体とスポンジとは同義である。【００８７】
[２] リコンビナントペプチド多孔質体の作製
[ＰＴＦＥ厚・円筒形容器]
底面厚さ３ｍｍ、直径５１ｍｍ、側面厚さ８ｍｍ、高さ２５ｍｍのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）製の円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は８ｍｍのＰＴＦＥで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も３ｍｍのＰＴＦＥで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。よって、円筒カップの内径は４３ｍｍになっている。以後、この容器のことをＰＴＦＥ厚・円筒形容器と呼称する。【００８８】
[アルミ硝子板・円筒形容器]
厚さ１ｍｍ、直径４７ｍｍのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は１ｍｍのアルミで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も１ｍｍのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚１ｍｍのテフロン（登録商標）を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は４５ｍｍになっている。また、この容器の底面にはアルミの外に２．２ｍｍの硝子板を接合した状態にしておく。以後、この容器のことをアルミ硝子・円筒形容器と呼称する。【００８９】
[温度差の小さい凍結工程、および乾燥工程]
ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、およびアルミ硝子板・円筒形容器に、それぞれＣＢＥ３水溶液を流し込み、真空凍結乾燥機（ＴＦ５−８５ＡＴＮＮＮ：宝製作所）内で冷却棚板を用いて底面からＣＢＥ３水溶液を冷却した。
この際の容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度、液量、および棚板温度の設定は、以下に記載の通りである。【００９０】
条件Ａ：
ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量４ｍＬ。棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０5Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。【００９１】
条件Ｂ：
アルミ硝子板・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量４ｍＬ。棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０5Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。【００９２】
条件Ｃ：
ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量１０ｍＬ。棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０5Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。【００９３】
[３]各凍結工程での温度差測定
条件Ａ〜条件Ｃのそれぞれについて、溶液内で冷却側から最も遠い場所の液温（非冷却面液温）として容器内の円中心部の液面の液温を、また、溶液内で冷却側に最も近い液温（冷却面液温）として容器内の底部の液温を測定した。
その結果、それぞれの温度とその温度差のプロファイルは図１〜図３の通りとなった。
この図１、図２、図３から、条件Ａ、条件Ｂ、条件Ｃでは棚板温度−１０℃設定区間（−２０℃度に下げる前）において液温が融点である０℃を下回り、かつその状態で凍結が起こっていない（未凍結・過冷却）状態であることがわかる。また、この状態で、冷却面液温と非冷却面液温との温度差が２．５℃以下となっていた。その後、棚板温度を−２０℃へ更に下げていくことによって、液温が０℃付近へ急激に上昇するタイミングが確認され、ここで凝固熱が発生し凍結が開始されたことが分かる。また、そのタイミングで実際に氷形成が始まっていることも確認できた。その後、温度は０℃付近で一定時間経過した。ここでは、水と氷の混合物が存在する状態となっていた。最後に０℃から再び温度降下が始まるが、この時、液体部分はなくなり氷となっていた。従って、測定している温度は氷内部の固体温度であり、つまり液温ではない。【００９４】
以下に、条件Ａ、条件Ｂ、条件Ｃについて、非冷却面の液温が融点（０℃）になった時の温度差、棚板温度を−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差と、凝固熱発生直前の温度差を記載する。なお、本明細書で言う「直前の温度差」とは、本イベントの１秒前〜２０秒前までの間で検知可能な温度差の内、最も大きい温度差を表す。【００９５】
条件Ａ
非冷却面の液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．１℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差：０．２℃
凝固熱発生直前の温度差：１．１℃【００９６】
条件Ｂ
非冷却面の液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．０℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差：０．１℃
凝固熱発生直前の温度差：０．９℃【００９７】
条件Ｃ
非冷却面の液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．８℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差：１．１℃
凝固熱発生直前の温度差：２．１℃【００９８】
これらを以後、「温度差の小さい凍結工程・多孔質体」と呼称する。【００９９】
[４]１質量％エタノール含有溶液での、温度差の小さい凍結工程、および乾燥工程
ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、およびアルミ硝子板・円筒形容器に、それぞれ１質量％（ｗ／ｗ）エタノール含有ＣＢＥ３水溶液を流し込み、真空凍結乾燥機（ＴＦ５−８５ＡＴＮＮＮ：宝製作所）内で冷却棚板を用いて底面からＣＢＥ３水溶液を冷却した。最終濃度１質量％のエタノール含有水溶液とすることで、融点は−０．４℃となる。エタノール／水濃度比における融点変化は文献「Pickering S.U.: A Study of the Properties of some Strong Solutions. J.Chem.Soc.London 63 (1893) 998-1027」から計算した。
この際の容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度、液量、および棚板温度の設定は、以下に記載の通りである。【０１００】
条件ＡＡ：
ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、エタノール最終濃度１質量％、水溶液量４ｍＬ。棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がるまで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。【０１０１】
条件ＢＢ：
アルミ硝子板・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、エタノール最終濃度１質量％、水溶液量４ｍＬ。棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がるまで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。【０１０２】
[１質量％エタノール含有溶液の、凍結工程での温度差測定]
条件ＡＡ及び条件ＢＢについて、溶液内で冷却側から最も遠い場所の液温（非冷却面液温）として容器内の円中心部の液面の液温を、また、溶液内で冷却側に最も近い液温（冷却面液温）として容器内の底部の液温を測定した。尚、ここでは１質量％エタノールが溶媒となる為、溶媒融点は−０．４℃となる。エタノール／水濃度比における融点変化は文献「Pickering S.U.: A Study of the Properties of some Strong Solutions. J.Chem.Soc.London 63 (1893) 998-1027」から計算した。【０１０３】
その結果、それぞれの温度とその温度差のプロファイルは図４及び図５の通りとなった。図４及び５から、条件ＡＡ及び条件ＢＢでは、棚板温度−１０℃設定区間において液温が融点である−０．４℃を下回り、かつその状態で凍結が起こっていない（未凍結・過冷却）状態であることがわかる。また、この状態で、冷却面液温と非冷却面液温の温度差が２℃以下となっていた。その後、棚板温度を−２０℃へ更に下げていくことによって、液温が−０．４℃付近へ急激に上昇するタイミングが確認され、ここで凝固熱が発生し凍結が開始されたことが分かる。また、そのタイミングで実際に氷形成が始まっていることも確認出来た。その後、温度は−０．４℃付近で一定時間経過した。ここでは、水と氷の混合物が存在する状態となっていた。最後０℃から再び温度降下が始まるが、この時、液体部分はなくなり氷となっていた。従って、測定している温度は氷内部の固体温度であり、つまり液温ではない。【０１０４】
以下に、条件ＡＡ、条件ＢＢについて、非冷却面の液温が融点（−０．４℃）になった時の温度差、棚板温度を−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差と、凝固熱発生直前の温度差を記載する。【０１０５】
条件ＡＡ
非冷却面の液温が融点（−０．４℃）になった時の温度差：０．８℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差：０．３℃
凝固熱発生直前の温度差：０．８℃【０１０６】
条件ＢＢ
非冷却面の液温が融点（−０．４℃）になった時の温度差：１．３℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差：０．０℃
凝固熱発生直前の温度差：１．３℃【０１０７】
これらの結果、条件ＡＡ及び条件ＢＢにおいても、条件Ａ及び条件Ｂと同様に、「温度差の小さい凍結工程・多孔質体」として作製できることが分かった。【０１０８】
［５] 温度差の小さい凍結工程・多孔質体からの花弁状ブロックの作製（多孔質体の粉砕と架橋）
上記［２］（温度差測定は［３］）で得られた条件Ａ及び条件ＢのＣＢＥ３多孔質体をニューパワーミル（大阪ケミカル、ニューパワーミルＰＭ−２００５）で粉砕した。粉砕は、最大回転数で１分間×５回、計５分間行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、２５〜５３μｍ、５３〜１０６μｍ、１０６μｍ〜１８０μｍの未架橋ブロックを得た。その後、減圧下１６０℃で熱架橋（架橋時間は８時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間の６種類を実施した）を施して、試料ＣＢＥ３ブロックを得た。以下、４８時間架橋を施した条件Ａの多孔質体由来ブロックをＥ、４８時間架橋を施した条件Ｂの多孔質体由来ブロックをＦと呼称する。つまり、Ｅ及びＦは、温度差の小さい凍結工程・多孔質体から作られた温度差小ブロックである。尚、架橋時間の違いは、本願発明の評価においては性能に影響が見られないため、ここでは４８時間架橋したものを代表として使用している。また、結果的にＥ及びＦでは性能に差が見られないことから、これらをまとめて花弁状ブロックとして、以後、使用した。【０１０９】
[６] リコンビナントペプチドフィルムの作製法
４質量％濃度のＣＢＥ３水溶液を調製し、このＣＢＥ３水溶液５．４ｍｌを、シリコン枠（８ｃｍ  ｘ  ３．５ｃｍ）を設置したプラスチックトレーに流し込んだ。このプラスチックトレーを冷蔵庫内に移し、水分が無くなるまで乾燥させることでリコンビナントペプチドのフィルムを得た。上記のリコンビナントペプチドのフィルムをプラスチックトレー／シリコン枠から取り出し、減圧下１６０℃で熱架橋（架橋時間は４８時間、７２時間）を施し、動物実験の試料を得た。【０１１０】
[７] 架橋度の測定方法
上記［６］で作製したフィルムの架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出した。測定にはＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）法を用いた。【０１１１】
＜サンプル調製＞
ガラスバイアルに、サンプル（約１０ｍｇ）、４質量％ＮａＨＣＯ3水溶液（１ｍＬ）及び１質量％ＴＮＢＳ水溶液（２ｍＬ）を添加し、混合物を３７℃で３時間振とうした。その後、３７質量％塩酸（１０ｍＬ）及び純水（５ｍＬ）を加えた後、混合物を３７℃で１６時間以上静置し、サンプルとした。【０１１２】
＜ブランク調整＞
ガラスバイアルに、サンプル（約１０ｍｇ）、４質量％ＮａＨＣＯ3水溶液（１ｍＬ）及び１質量％ＴＮＢＳ水溶液（２ｍＬ）を添加し、直後に３７質量％塩酸（３ｍＬ）を加え、混合物を３７℃で３時間振とうした。その後、３７質量％塩酸（７ｍＬ）及び純水（５ｍＬ）を加えた後、混合物を３７℃で１６時間以上静置し、ブランクとした。
純水で１０倍希釈したサンプル、及び、ブランクの吸光度（３４５nm）を測定し、以下の（式２）及び（式３）から架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出した。【０１１３】
（式２）  （Ａｓ−Ａｂ）／１４６００×Ｖ／ｗ
（式２）は、リコンビナントペプチド１ｇ当たりのリジン量（モル等量）を示す。
式２中、Ａｓはサンプル吸光度、Ａｂはブランク吸光度、Ｖは反応液量（ｇ）、ｗはリコンビナントペプチド質量（ｍｇ）を示す。
（式３）  １−（サンプル（式１）／未架橋リコンビナントペプチド（式１））×３４
（式３）は、１分子あたりの架橋数を示す。【０１１４】
その結果、上記［６］の４８時間架橋したフィルムは架橋度６であり、上記［６］の７２時間架橋したフィルムは架橋度１３であった。【０１１５】
[８] 分解速度の測定方法
上記［６］で作製したフィルムの分解速度を評価した。
予め質量を測定したプラスチック製のチューブに、上記［６］で作製した試料５ｍｇを添加し、実際の添加量を記録した。
放線菌由来のコラゲナーゼ２．５ｍｇを５０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解させ、コラゲナーゼ溶液を得た。このコラゲナーゼ溶液１ｍｌを、試料を添加したチューブに加え、ボルテックスにて混合後、３７℃で５時間振とうさせた。その後、チューブを１００００Ｇで１分間遠心し、上清をピペットで取り除いた。さらに、超純水１ｍｌをチューブに加え、ボルテックスにて混合後、チューブを１００００Ｇで１分間遠心し、上清をピペットで取り除いた。この操作をもう一度繰り返した。その後、試料を凍結乾燥し、試料の入ったチューブの質量を記録した。【０１１６】
フィルムの分解速度は以下の式（式４）から算出した。
（式４）  分解速度 = （（Ｗ−Ｗｅ）―ｗｏ）／ｗｏ／Ｔ
式４において、Ｗは、凍結乾燥後に記録した、試料の入ったチューブの質量を示し、Ｗｅは予め記録しておいた、チューブの空質量を示す。ｗｏは、試料の実際の添加量を示す。Ｔは、コラゲナーゼ溶液中での振とう時間を示し、今回の試験では５時間である。【０１１７】
その結果、上記［６］のフィルムは、４８時間の架橋で分解速度６．９[質量％／時間]、７２時間の架橋で分解速度０．５［質量％／時間］であった。【０１１８】
[９] ウサギ間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の採取
日本白色家兎（３週齢の雄）5羽の、大腿骨10本と脛骨10本から骨髄液を採取した。まず、イソジン希釈液で消毒し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で洗浄し、骨を１０ｃｍディッシュに移し、骨切バサミで骨の両端を切断した。１８Ｇの注射針を装着した１０ｍＬ注射筒で分注した培地を５ｍＬ採取し、ディスピンを用いて大腿骨を持ち、５０ｍＬチューブ上で骨髄内に注射針を刺した。【０１１９】
その後、培地を骨髄内に流し、５０ｍＬチューブ内に骨髄を採取した。採取した骨髄液をよくピペッティングし、セルストレーナーに通した。その後、１，０００ｒｐｍで５分間遠心後、上清を除去し、培地に懸濁したのちにフラスコへ播種した。播種後翌日に培地を交換し、播種後5日に接着した細胞を回収することで、ウサギMSC細胞の採取を完了した。以後、適宜、細胞は増殖のために継代を実施して使用した。なお、上記で使用している培地は、全てダルベッコ改変イーグル培地・高グルコース（ＤＭＥＭ high glucose）、１０体積％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、及びペニシリン・ストレプトマイシン (５０，０００Ｕ)の培地を用いた。【０１２０】
[１０]  花弁状ブロックを用いたモザイク細胞塊の作製（ウサギＭＳＣ）
上記［９］で採取したウサギ骨髄由来間葉系幹細胞（ウサギＭＳＣ）を培地にて１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬまたは４×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、上記［５］で作製した花弁状ブロック５３−１０６μｍを０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた後、得られた細胞懸濁液のうち２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径１ｍｍ又は直径１．３ｍｍ程度の球状の、花弁状ブロックとウサギＭＳＣ細胞からなるモザイク細胞塊を作製した（細胞1個当たり０．００１μｇのブロック）。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本モザイク細胞塊は球状であった。１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬで作製したモザイク細胞塊はモザイク細胞塊小、４×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬで作製したモザイク細胞塊はモザイク細胞塊大と称する。【０１２１】
[１１] 細胞塊の作製（ウサギＭＳＣ）
上記［９］で採取したウサギ骨髄由来間葉系幹細胞（ウサギＭＳＣ）を培地にて１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬまたは４×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。得られた細胞懸濁液のうち２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置した。これにより、直径約４００μｍ又は直径約１ｍｍの球状の細胞塊を作製した。１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬで作製した細胞塊は細胞塊小、４×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬで作製した細胞塊は細胞塊大と称する。【０１２２】
[１２] 細胞培養スポンジの作製（ウサギＭＳＣ）
上記［４］の条件ＡＡで作製したＣＢＥ３スポンジから直径５ｍｍ、厚さ１ｍｍサイズを切り出し、上記［９］で採取したウサギ骨髄由来間葉系幹細胞（ウサギＭＳＣ）を播種した細胞培養スポンジを用意した。【０１２３】
[１３]  ウサギ骨軟骨欠損モデルの作製
日本白色家兎（北山ラベス、ＳＰＦ）２２週齢オスの膝関節部位に直径５ｍｍ、深さ１ｍｍ程度の骨軟骨欠損を作製した。【０１２４】
[１４]  ウサギ骨軟骨欠損へのサンプル移植
上記［１３］にて作製したウサギ骨軟骨欠損部位に、まず、上記［６］で用意したフィルム（架橋度６のもの）を欠損の底面積大（直径５ｍｍ）に切り出したものを設置した。その上に、以下のものを移植した。
比較例２：上記［１２］での細胞を播種する工程を除いた細胞なしのスポンジ
比較例３：上記［１２］で作製した細胞培養スポンジ
比較例４：上記［１１］で作製した細胞塊小１４４個
実施例１：上記［１０］で作製したモザイク細胞塊小１４４個
また、比較例の一つとして、上記［６］で用意したフィルムを設置せずに、細胞なしのスポンジのみを移植した群（比較例１）も用意した。【０１２５】
[１５]  ウサギ骨軟骨欠損モデルでの骨・軟骨再生効果
上記［１４］で移植したウサギを８週後に剖検し、移植部位周辺の骨軟骨組織切片を作製した。組織はホルマリン固定を行った後、パラフィンで包埋し、モザイク細胞塊を含む皮膚の組織切片を作製した。切片の染色は、ＨＥ染色（ヘマトキシリン・エオシン染色）、またはサフラニンＯ染色を行った。【０１２６】
染色の結果を図６〜図１０に示す。また、以下の基準で、軟骨再生、骨再生、繊維性軟組織の抑制、及び骨・軟骨界面の形成を評価した。評価の結果を表１に示す。【０１２７】
軟骨再生
ＡＡ：全般に良好な軟骨再生が認められる。
Ａ：全般に軟骨再生が認められる。
Ｂ：一部でわずかな軟骨再生が認められる。
Ｃ：軟骨再生が認められない。【０１２８】
骨再生
Ａ：骨再生が認められる。
Ｂ：一部でわずかな骨再生が認められる。
Ｃ：骨再生が認められない。【０１２９】
繊維性軟組織の浸潤抑制
Ａ：繊維性軟組織の浸潤抑制が認められる。
Ｂ：繊維性軟組織の浸潤抑制が若干認められる。
Ｃ：繊維性軟組織の浸潤抑制は認められない。
Ｄ：炎症浸潤を抑制することができず、繊維性軟組織の浸潤抑制は不良である。【０１３０】
骨・軟骨界面の形成
Ａ：再生骨と再生軟骨の境目（タイドマーク）が正しい位置に形成される。
Ｂ：再生骨と再生軟骨の境目（タイドマーク）が若干形成される。
Ｃ：再生骨と再生軟骨の境目（タイドマーク）が形成されない。【０１３１】
【表１】
0006586160.tif 000002
【０１３２】
スポンジのみ移植（フィルムなし）した場合（図６）、並びにスポンジ（細胞なし）とフィルムを移植した場合（図７）においては、軟骨再生が認められず、骨再生も認められなかった。【０１３３】
細胞培養スポンジとフィルムを移植した場合（図８）においては、一部でわずかな軟骨再生及び骨再生が認められるが、ほとんどの組織は繊維性軟組織になってしまい、軟骨再生及び骨再生は成功しなかった。【０１３４】
細胞塊とフィルムを移植した場合（図９）においては、一部でわずかな軟骨再生が認められ、また骨再生が認められたが、軟骨になるべき位置ではほとんどが繊維性組織になっており、軟骨再生及び骨再生は成功しなかった。【０１３５】
モザイク細胞塊とフィルムを移植した場合（図１０）においては、全般にわたって良好な軟骨再生が認められ、また、再生骨と再生軟骨の境目（タイドマーク）が正しい位置に形成された。骨再生についても正しい位置で認められ、繊維性軟組織はほとんど形成されておらず、良好な軟骨再生及び骨再生を達成できた。
【図１】
0006586160.tif 000003
【図２】
0006586160.tif 000004
【図３】
0006586160.tif 000005
【図４】
0006586160.tif 000006
【図５】
0006586160.tif 000007
【図６】
0006586160.tif 000008
【図７】
0006586160.tif 000009
【図８】
0006586160.tif 000010
【図９】
0006586160.tif 000011
【図１０】
0006586160.tif 000012
【配列表】
0006586160000001.app