(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母の培養液を分離膜で濾過し、未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を培養液に追加してｐＨ３．５以下の条件で連続発酵する化学品の製造方法であって、前記酵母として、以下の条件（ａ）下で得られる培養液の６００ｎｍにおける吸光度が、以下の条件（ｂ）下で得られる培養液の６００ｎｍにおける吸光度の２０％以上である酵母を用いる、化学品の製造方法。
条件（ａ）：バニリン（終濃度１ｇ／Ｌ）入りのＹＰＡＤ培地（培養開始時の６００ｎｍにおける吸光度が０．２）で４０時間培養する。
条件（ｂ）：バニリンを含まないＹＰＡＤ培地とする以外は条件（ａ）と同様に培養する。
【請求項２】
前記酵母として前記条件（ａ）下で得られる培養液の６００ｎｍにおける吸光度が、前記条件（ｂ）下で得られる培養液の６００ｎｍにおける吸光度の５０％以上である酵母を用いる、請求項１に記載の化学品の製造方法。
【請求項３】
前記酵母として、以下の条件（ｃ）下で得られる培養液の６００ｎｍにおける吸光度が、以下の条件（ｄ）下で得られる培養液の６００ｎｍにおける吸光度の２０％以上である酵母を用いる、請求項１または請求項２に記載の化学品の製造方法。
条件（ｃ）：アセトン４％（ｖ／ｖ）入りのＹＰＡＤ培地（培養開始時の６００ｎｍにおける吸光度が０．２）で４０時間培養する。
条件（ｄ）：アセトンを含まないＹＰＡＤ培地とする以外は条件（ｃ）と同様に培養する。
【請求項４】
前記発酵原料の供給速度が４ｇ／（Ｌ・ｈｒ）以上である、請求項１から３のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【請求項５】
前記化学品が有機酸またはアルコールである、請求項１から４のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低ｐＨ条件下における連続発酵による化学品の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
乳酸などの生分解性ポリマー原料やエタノールなどのバイオ燃料に代表されるバイオマス由来の化学品は、大気中への二酸化炭素の排出問題やエネルギー問題の顕在化と共にサスティナビリティー（持続可能性）およびライフサイクルアセスメント（ＬＣＡ）対応型製品として強い注目を浴びている。【０００３】
乳酸などの有機酸を微生物により生産する場合、生産された有機酸による培養液ｐＨの低下は、目的とする有機酸の生産性低下を引き起こすことから、中和剤によって培養液のｐＨを一定に保つ必要がある。例えば特許文献１には、酵母を培養して乳酸を製造する方法が開示されており、酵母の乳酸生産性を維持するためにアルカリ中和により培養液のｐＨを維持している。しかし、培養液を水酸化カルシウム等のアルカリ性物質で中和すると、添加するアルカリ性物質の量によっては後段の分離・精製工程において乳酸塩を乖離するために添加する硫酸等の酸性物質の影響で石膏等の副生成物が生じる場合があり、それにより乳酸の分離・精製工程が煩雑になり、製造コスト高の要因になってしまう。すなわち、中和剤を使用する際は、中和剤そのものの原材料に加えて不要な石膏等の副生成物の除去・廃棄にさらなる費用がかかる。また、乳酸以外の有機酸においても、培養する際には培養液のｐＨを一定に保つために水酸化ナトリウムなどの中和剤が使用されている。そのため、細菌よりも低ｐＨに耐性のある酵母を用いた有機酸生産の検討が行われている。これは、酵母は細菌よりも低いｐＨで培養できるため、その分の中和剤の使用が低減できるからである。あるいは、低ｐＨに耐性を持つ微生物の改良が行われている。例えば特許文献３、特許文献４では、乳酸耐性を持つ変異株を用いた乳酸製造方法が開示されている。【０００４】
有機酸以外にエタノールなど他の化学品を生産する場合においても、低ｐＨで培養を行う場合がある。例えば特許文献２では、バイオマス資源を硫酸等の酸で加水分解した糖液を原料として酵母によるエタノール発酵を行う際にｐＨの調節が不要になり、さらに低ｐＨでは雑菌汚染のリスクが軽減されるため培地や発酵装置の殺菌が不要になることが記載されている。【０００５】
一般に、微生物の培養方法としてはバッチ培養法、フェドバッチ培養法または連続培養法などが用いられるが、特許文献５では分離膜を用いた連続培養方法によりも発酵産物の生産速度や収率が向上することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−１７１８７９号公報
【特許文献２】特開２００４−３４４０８４号公報
【特許文献３】特開２０１０−１１５１１２号公報
【特許文献４】ＷＯ２０１２／１４７９０３号
【特許文献５】ＷＯ２００７／０９７２６０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述したように特許文献５では、乳酸発酵微生物として乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を染色体中に導入したサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ１０５０５株、またはエタノール発酵微生物としてＮＢＲＣ１０５０５株を使用し、培養液をｐＨ５に調整しながら分離膜を用いた連続発酵することによる乳酸またはエタノールの製造方法が開示されており、乳酸またはエタノールは発酵原料である糖が余ることなく連続的に生産されている。【０００８】
しかしながら、本発明者は、低ｐＨ（ｐＨ３．５以下）条件下で特許文献５と同様の分離膜を用いた連続発酵を行うと、糖消費が非常に遅くなり、糖が消費されずに多量に余るという新たな課題を見出した。糖などの発酵原料が多量に余ると発酵に投じた発酵原料に対する生産物の収率が低下し、生産物のコストが高くなるばかりか、後の精製工程において発酵原料を除く負担が過度になるなどコスト面で悪影響が生じる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は鋭意検討した結果、分離膜を用いた連続発酵による化学品の製造方法において、バニリンに対して耐性を有する酵母を使用することで上記課題を解決できることを見出し、本発明に至った。【００１０】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（５）の通りである。
（１）酵母の培養液を分離膜で濾過し、未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を培養液に追加してｐＨ３．５以下の条件で連続発酵する化学品の製造方法であって、前記酵母として、以下の条件（ａ）下で得られる培養液の６００ｎｍにおける吸光度が、以下の条件（ｂ）下で得られる培養液の６００ｎｍにおける吸光度の２０％以上である酵母を用いる、化学品の製造方法。
条件（ａ）：バニリン（終濃度１ｇ／Ｌ）入りのＹＰＡＤ培地（培養開始時の６００ｎｍにおける吸光度が０．２）で４０時間培養する。
条件（ｂ）：バニリンを含まないＹＰＡＤ培地とする以外は条件（ａ）と同様に培養する。
（２）前記酵母として前記条件（ａ）下で得られる培養液の６００ｎｍにおける吸光度が、前記条件（ｂ）下で得られる培養液の６００ｎｍにおける吸光度の５０％以上である酵母を用いる、（１）に記載の化学品の製造方法。
（３）前記酵母として、以下の条件（ｃ）下で得られる培養液の６００ｎｍにおける吸光度が、以下の条件（ｄ）下で得られる培養液の６００ｎｍにおける吸光度の２０％以上である酵母を用いる、（１）または（２）に記載の化学品の製造方法。
条件（ｃ）：アセトン４％（ｖ／ｖ）入りのＹＰＡＤ培地（培養開始時の６００ｎｍにおける吸光度が０．２）で４０時間培養する。
条件（ｄ）：アセトンを含まないＹＰＡＤ培地とする以外は条件（ｃ）と同様に培養する。
（４）前記発酵原料の供給速度が４ｇ／（Ｌ・ｈｒ）以上である、（１）から（３）のいずれかに記載の化学品の製造方法。
（５）前記化学品が有機酸またはアルコールである、（１）または（４）のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ｐＨ３．５以下の条件下で分離膜を用いた連続発酵をおこなっても、濾液中に発酵原料が多量に余ることなく、効率よく化学品を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、比較例１から３、実施例１から３での前培養中の培養液の残糖濃度と、分離膜利用連続発酵開始から終了時までの濾液中の残糖濃度を示す。０時間は分離膜利用連続発酵開始時間を示し、それより前の時間は前培養期間（１９時間）を示す。
【図２】図２は、実施例４から８での前培養中の培養液の残糖濃度と、分離膜利用連続発酵開始から終了時までの濾液中の残糖濃度を示す。０時間は分離膜利用連続発酵開始時間を示し、それより前の時間は前培養期間（１９時間）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
まず、本発明で使用する酵母について説明する。
【００１４】
本発明に使用するバニリンに耐性を有する酵母（以下、バニリン耐性酵母、という。）は、以下の条件（ａ）下での培養液の吸光度と、以下の条件（ｂ）下での培養液の吸光度と比較した試験（以下、バニリン耐性試験、という。）の結果、条件（ａ）下での培養液の吸光度が、以下の条件（ｂ）下での培養液の吸光度の２０％以上であることを特徴とし、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、さらにより好ましくは６０％以上、特に好ましくは７０％以上、最も好ましくは８０％以上である。
条件（ａ）：バニリン（終濃度１ｇ／Ｌ）入りのＹＰＡＤ培地（培養開始時の６００ｎｍにおける吸光度が０．２）で４０時間培養する。
条件（ｂ）：バニリンを含まないＹＰＡＤ培地とする以外は条件（ａ）と同様に培養する。
【００１５】
メカニズムは不明であるが、バニリン耐性酵母はｐＨ３．５以下の分離膜を用いた連続発酵においても発酵原料が多量に余ることなく化学品が生産できる。なお、発酵原料が多量に余るとは、培養液を分離膜で濾過して得られた濾液中に発酵原料が消費されず残存している状態である。濾液中に発酵原料が多量に余ると、発酵に投じた発酵原料に対する生産物の収率が低下し、生産物のコストが高くなるばかりか、精製段階で発酵原料を除去する負担が増加するため、濾液に残存する発酵原料は、少ないほど好ましい。
【００１６】
バニリン耐性試験の条件（ａ）および（ｂ）について詳細に説明する。条件（ａ）および（ｂ）での培養開始は６００ｎｍにおける吸光度が０．２（ＯＤ６００ｎｍ＝０．２）となるように調整する。その方法は特に限定されないが、前培養により酵母菌体を増殖させ、培養液の吸光度を測定し、本培養液でＯＤ６００ｎｍ＝０．２になるように植菌量を調整する方法、または、菌体を寒天プレートに生育させ、ＯＤ６００ｎｍ＝０．２になるように寒天プレートからの植菌量を調整する方法が挙げられる。
【００１７】
バニリン耐性試験の培養に使用する培地はＹＰＡＤ培地を使用する。ここでいうＹＰＡＤ培地の組成は、酵母エキス１％（ｗ／ｖ）、バクトペプトン２％（ｗ／ｖ）、グルコース２％（ｗ／ｖ）、アデニン０．０４％（ｗ／ｖ）を含む培地である。
【００１８】
条件（ａ）で使用するバニリン（終濃度１ｇ／Ｌ）のＹＰＡＤ培地の調整は、滅菌済のＹＰＡＤ培地にバニリン濃縮液を添加することが好ましい。バニリン濃縮液は１００から２００ｇ／Ｌに調整することが好ましいが、２００ｇ／Ｌに調整することが最も好ましい。これはバニリンを溶かす有機溶媒による増殖の影響をできるだけ低減するためである。また、バニリンを溶かす有機溶媒はＤＭＳＯを使用するのが良い。例えばバニリン濃縮液（２００ｇ／Ｌ）を作成したとすると、バニリンを含むＹＰＡＤ培地の作成は、５ｍｌのＹＰＡＤ培地に対し、バニリン濃縮液を２５μｌ入れると良い。ここで、バニリン無添加のＹＰＡＤ培地にはＤＭＳＯのみを２５μｌ入れるのが良い。これはＤＭＳＯによる増殖への影響を考慮するためである。
【００１９】
本発明で使用するバニリン耐性酵母は、さらにアセトン耐性を有することが好ましい。バニリン耐性且つアセトン耐性を有する酵母を使用することで、ｐＨ３．５以下の分離膜を用いた連続発酵で得られる濾液中に残存する発酵原料をさらに低減することができ、より効率的に化学品を生産することができる。
【００２０】
本発明に使用するアセトンに耐性を有する酵母（以下、アセトン耐性酵母、という。）は、以下の条件（ｃ）下での培養液の吸光度と、以下の条件（ｄ）下での培養液の吸光度と比較した試験（以下、アセトン耐性試験、という。）の結果、条件（ｃ）下での培養液の吸光度が、条件（ｄ）下での培養液の吸光度の２０％以上であることを特徴とし、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上である。
条件（ｃ）：アセトン４％（ｖ／ｖ）入りのＹＰＡＤ培地（培養開始時の６００ｎｍにおける吸光度が０．２）で４０時間培養する。
条件（ｄ）：アセトンを含まないＹＰＡＤ培地とする以外は条件（ｃ）と同様に培養する。
【００２１】
アセトン耐性試験の条件（ｃ）および（ｄ）について詳細に説明する。条件（ｃ）および（ｄ）での培養開始は６００ｎｍにおける吸光度が０．２（ＯＤ６００ｎｍ＝０．２）となるように調整する。
【００２２】
アセトン耐性試験の培養に使用する培地はＹＰＡＤ培地を使用する。
【００２３】
条件（ｃ）で使用するアセトン４％（ｖ／ｖ）入りのＹＰＡＤ培地の調整は、滅菌済のＹＰＡＤ培地にアセトンを添加することが好ましい。
【００２４】
条件（ａ）〜（ｄ）の培養温度は、酵母菌体が十分に増殖する温度条件であれば特に限定されないが、２８〜３０℃が好ましく、３０℃がより好ましい。
【００２５】
条件（ａ）〜（ｄ）での培養液の吸光度の測定に使用する分光光度計は特に制限はないが、条件（ａ）〜（ｄ）では同じ分光光度計で測定する必要がある。
【００２６】
本発明で用いられるバニリン耐性酵母（およびバニリン耐性且つアセトン耐性酵母）は、当業者に公知の酵母株からバニリン耐性試験（およびアセトン耐性試験）のスクリーニングにより選択することができ、具体例としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ２２６０株、クリベロマイセス・マルキアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）ＮＢＲＣ２７２株、カンジダ・トロピカルス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＮＢＲＣ１９９株、リンドネラ・メイラエ（Ｌｉｎｄｎｅｒａ  ｆａｂｉｎｉｉ）ＮＢＲＣ１０８５８株、リンドネラ・ファビアニ（Ｌｉｎｄｎｅｒａ  ｆａｂｉａｎｉｉ）ＮＢＲＣ１２５３株、カンジダ・メタノソルボーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ）ＢＣＲＣ２１４８９株、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）ＢＣＲＣ２１７７７株、カンジダ・ボイジニ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）ＢＣＲＣ２２５２８株が挙げられる。また、バニリン耐性（およびアセトン耐性）のない酵母に当業者に公知の変異処理をすることによってバニリン耐性試験（およびアセトン耐性試験）の結果が２０％以上となった酵母についても、当然ながら本明細書でいうところのバニリン耐性酵母（およびバニリン耐性且つアセトン耐性酵母）に相当する。
【００２７】
次に、分離膜を用いた連続発酵による化学品の製造方法について説明する。
【００２８】
本発明の化学品の製造方法において使用する発酵原料としては、酵母が資化可能な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該酵母の培養を効率的に行うことができるものであれば、天然培地、合成培地のいずれも使用することができる。具体的には、炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、ガラクトース、マルトース、ラフィノース、トレハロース、ソルボース、セロビオース、ラクトース、メリビオース、メレジトース、イヌリン、キシロース、アラビノース、リボース、ラムノース、グルコサミン、エリスリトール、リビトール、マンニトール、グルシトール、サリシン、スターチ、デンプン等の炭水化物またはその加水分解物、バイオマス由来のセルロースなどからの糖化液、からなる群から選択される1種類または２種類以上の、いわゆる糖類を発酵原料の主成分として使用することが好ましい。また、酢酸、プロピオン酸、クエン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコールなどの炭素源も発酵原料の主成分として用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物の他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等を用いることができる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどを用いることができる。これら炭素源、窒素源、無機塩類等は、培養開始時に一括して添加しても良いし、培養中分割して、または連続的に添加することもできる。
【００２９】
本発明で使用される酵母が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加することができる。また、消泡剤も必要に応じて使用することができる。
【００３０】
本発明において、培養液とは、微生物が発酵原料を資化して増殖した結果得られる液のことを言う。追加する発酵原料の組成は、目的とする化学品の生産性が高くなるように、培養開始時の発酵原料組成から適宜変更しても良い。
【００３１】
発酵原料として糖類を主成分とする場合の総糖濃度は特に制限されず、酵母による化学品の生産を阻害しない範囲であれば可能な限り高い濃度であればよく、具体的には、１５〜５００ｇ／Ｌが好ましく、２０〜３００ｇ／Ｌがより好ましい。
【００３２】
化学品の生産効率は、微生物に資化された発酵原料の主成分に対する生産された化学品の収率で評価することができるが、本明細書では、次の式（１）で計算される値を収率として評価する。
【００３３】
収率（ｇ／ｇ）＝全生産物量（ｇ）÷｛全投入発酵原料（ｇ）−未利用発酵原料（ｇ）｝×１００・・・（式１）。
【００３４】
ここで、全投入発酵原料とは発酵に投じられた発酵原料の主成分の総量を表し、未利用発酵原料とは発酵終了時に消費されずに残存している発酵原料の主成分の総量を表し、具体的には、バッチ発酵であれば発酵終了時に微生物に資化されずに培養液中に残存した発酵原料の主成分、連続発酵であれば培養液を分離膜で濾過した濾液中に残存した発酵原料の主成分を表す。全生産物量とは化学品の全生産量（ｇ）である。
【００３５】
連続発酵中の発酵原料の供給速度については特に制限はされないが、４g／（Ｌ・ｈｒ）以上であることが好ましい。発酵原料の供給速度がこれよりも低くなると発酵原料の残存を抑制するという本発明の効果が薄れてしまう場合があるからである。ここで、発酵原料供給速度は、次の式（１）で計算される。
【００３６】
発酵原料供給速度（g／（Ｌ・ｈｒ））＝培地中の発酵原料濃度（ｇ／Ｌ）×発酵槽に送られる発酵原料供給速度（Ｌ／ｈｒ）÷装置の運転液量（Ｌ）・・・（式２）。
【００３７】
本発明に用いる分離膜については特に制限はなく、微生物の撹拌型培養器あるいは撹拌型バイオリアクターによる培養で得られた培養液を微生物から分離濾過する機能を有するものであればよく、例えば多孔質セラミック膜、多孔質ガラス膜、多孔質有機高分子膜、金属繊維編織体、不織布などを用いることができる。これらの中で特に多孔質有機高分子膜もしくはセラミック膜が好適である。
【００３８】
分離膜は、阻止性能および透水性能や分離性能、例えば、耐汚れ性の点から、多孔質樹脂層を含む分離膜であることが好ましい。
【００３９】
多孔質樹脂層を含む分離膜は、好ましくは、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜に強度を与える。
【００４０】
分離膜が、多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を有している場合、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。
【００４１】
多孔質基材の平均厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下である。
【００４２】
多孔質基材の材質は、有機材料および／または無機材料等からなり、有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維なる織布や不織布であり、より好ましくは、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が用いられる。
【００４３】
多孔質樹脂層は、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の材質としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂などが挙げられる。有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物であってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有することをいう。有機高分子膜の材質は、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂およびポリアクリロニトリル系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
【００４４】
ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましく用いられる。さらに、ポリフッ化ビニリデン系樹脂は、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三フッ化塩化エチレンなどが例示される。
【００４５】
分離膜は、発酵に使用される微生物が通過できなければよいが、発酵に使用される微生物の分泌物や発酵原料中の微粒子による目詰まりを起こりにくく、かつ、濾過性能が長期間安定に継続する範囲であることが望ましい。よって、分離膜の平均細孔径が、０.０１μｍ以上５μｍ未満であることが好ましい。また、分離膜の平均細孔径が、０.０１μｍ以上１μｍ未満であると、微生物がリークすることのない高い排除率と、高い透水性を両立させることができ、透水性を長時間保持することが、より高い精度と再現性を持って実施することができる。
【００４６】
微生物の大きさに近いと、これらが直接孔を塞いでしまう場合があるので、分離膜の平均細孔径は１μｍ未満であることが好ましい。分離膜の平均細孔径は、微生物の漏出、すなわち排除率が低下する不具合の発生を防止するため、微生物の大きさと比較して大きすぎないことが好ましい。微生物のうち、細胞の小さい細菌などを用いる場合には、平均細孔径として０.４μｍ以下が好ましく、０.２μｍ未満であればより好適に実施することができる。
【００４７】
また、微生物が所望の生産物である化学品以外の物質、例えば、タンパク質や多糖類など凝集しやすい物質を生産する場合があり、更に、発酵培養液中の微生物の一部が死滅することにより細胞の破砕物が生成する場合があり、これらの物質による分離膜の閉塞を回避するために、平均細孔径は０．１μｍ以下であることがさらに好適である。
【００４８】
分離膜の平均細孔径が小さすぎると分離膜の透水性能が低下し、膜が汚れていなくても効率的な運転ができなくなるため、分離膜の平均細孔径は、好ましくは０.０１μｍ以上であり、より好ましくは０．０２μｍ以上であり、さらに好ましくは０．０４μｍ以上である。
【００４９】
ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。平均細孔径は、あるいは、膜表面を走査型電子顕微鏡を用いて倍率１０,０００倍で写真撮影し、１０個以上、好ましくは２０個以上の細孔を無作為に選び、それら細孔の直径を測定し、数平均して求めることができる。細孔が円状でない場合、画像処理装置等によって、細孔が有する面積と等しい面積を有する円（等価円）を求め、等価円直径を細孔の直径とする方法により求めることができる。
【００５０】
分離膜の平均細孔径の標準偏差σは、０．１μｍ以下であることが好ましい。平均細孔径の標準偏差σは小さければ小さい方が望ましい。平均細孔径の標準偏差σは、上述の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔数をＮとして、測定した各々の直径をＸｋとし、細孔直径の平均をＸ（ａｖｅ）とした下記の（式３）により算出される。
【００５１】
【数１】
0006540515.tif 000002
【００５２】
本発明で用いられる分離膜においては、発酵培養液の透過性が重要な性能の一つである。分離膜の透過性の指標として、使用前の分離膜の純水透過係数を用いることができる。分離膜の純水透過係数は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、５．６×１０−１０ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましく、純水透過係数が、５．６×１０−１０ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。
【００５３】
本発明で用いられる分離膜において、表面粗さとは、表面に対して垂直方向の高さの平均値である。膜表面粗さは、分離膜表面に付着した微生物が、撹拌や循環ポンプによる液流による膜面洗浄効果で剥離しやすくするための因子の一つである。分離膜の表面粗さは、特に制限はなく、膜に付着した微生物、ならびにその他の固形物が剥がれる範囲であればよいが、０.１μｍ以下であることが好ましい。表面粗さが０．１μｍ以下であると、膜に付着した微生物、ならびにその他の固形物が剥がれやすくなる。
【００５４】
さらに好ましくは、分離膜の膜表面粗さが０.１μｍ以下であり、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満であり、分離膜の純水透過係数が２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上の分離膜を使用することにより、膜面洗浄に必要な動力を過度に必要としない運転が、より容易に可能であることがわかった。分離膜の表面粗さを、０.１μｍ以下とすることにより、微生物の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることができ、微生物の破壊が抑制され、分離膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が、より容易に可能になる。また、分離膜の表面粗さを、０.１μｍ以下とすることにより、より低い膜間差圧で連続発酵が実施可能であり、分離膜が目詰まりした場合でも高い膜間差圧で運転した場合に比べて、洗浄回復性が良好である。分離膜の目詰まりを抑えることにより、安定した連続発酵が可能になることから、分離膜の表面粗さは小さければ小さいほど好ましい。
【００５５】
ここで、分離膜の膜表面粗さは、下記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）を使用して、下記の条件で測定したものである。
・装置    原子間力顕微鏡装置（Digital Instruments（株）製“Nanoscope IIIa”）
・条件    探針        ＳｉＮカンチレバー（Digital Instruments（株）製）
走査モード  コンタクトモード（気中測定）
水中タッピングモード（水中測定）
走査範囲    １０μｍ、２５μｍ四方（気中測定）
５μｍ、１０μｍ四方（水中測定）
走査解像度  ５１２×５１２
・試料調製  測定に際し膜サンプルは、常温でエタノールに１５分浸漬後、ＲＯ水中に２４時間浸漬し洗浄した後、風乾し用いた。ＲＯ水とは、濾過膜の一種である逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いて濾過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。ＲＯ膜の孔の大きさは、概ね２ｎｍ以下である。
【００５６】
膜表面粗さｄｒｏｕｇｈは、上記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）により各ポイントのＺ軸方向の高さから、下記の（式４）により算出する。
【００５７】
【数２】
0006540515.tif 000003
【００５８】
分離膜の形状は、好ましくは平膜である。分離膜の形状が平膜の場合、その平均厚みは用途に応じて選択される。分離膜の形状が平膜の場合の平均厚みは、好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下である。
【００５９】
また、分離膜の形状は、好ましくは中空糸膜である。分離膜が中空糸膜の場合、中空糸の内径は、好ましくは２００μｍ以上５０００μｍ以下であり、膜厚は、好ましくは２０μｍ以上２０００μｍ以下である。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸の内部に含んでいても良い。
【００６０】
なお、前述の分離膜は、例えばＷＯ２００７／０９７２６０号に記載される製造方法により製造することができる。
【００６１】
また、別の好ましい形態として、本発明における分離膜は、少なくともセラミックスを含む膜であり得る。本発明におけるセラミックスとは金属酸化物を含有し、高温での熱処理により焼き固められたものをさす。金属酸化物としては、アルミナ、マグネシア、チタニア、ジルコニアなどが例示できる。分離膜は金属酸化物のみから形成されてもよく、シリカや炭化珪素、シリカと金属酸化物の化合物であるムライトやコージェライトなどを含んでもよい。
【００６２】
分離膜を形成するセラミックス以外の成分は、分離膜としての多孔質体をなすことができるものであれば特に限定されない。
【００６３】
分離膜がセラミックスを含む場合もその形状には特に制限はなく、モノリス膜、平膜、管状膜などいずれも用いることができる。容器内への充填効率の観点から柱状構造であり、長手方向に貫通孔を有する構造のものが好ましい。充填効率が上げられる点から、好ましくはモノリス膜である。
【００６４】
長手方向に貫通孔を有することが好ましい理由は以下のとおりである。柱状構造を有する分離膜をモジュール容器に収めて分離膜モジュールとして用いる場合は、分離膜は外圧式および内圧式のうちから好適な態様を選択してモジュール化、濾過することが可能となる。本発明においては、これ以降、分離膜が発酵培養液と接する側を１次側、濾過により化学品を含む濾液が得られる側を２次側とそれぞれ呼ぶこととする。
【００６５】
内圧式モジュールを用いると、１次側の流路が狭いため、クロスフロー濾過を行う場合に循環ポンプの出力が節約できる。さらに、分離膜表面に堆積した濁質をモジュール外に排出する作用が強くなり、分離膜表面が清浄に保たれやすいため好ましい。ただし、この効果を得るためには、内圧式の分離膜が発酵培養液の入り口および出口を有していることが前提となる。このときの入り口および出口は一直線に配された貫通孔の状態であると、通液抵抗が小さくなるため好ましい。さらに分離膜が柱状構造で、貫通孔が長手方向に空いていることによって、分離膜を収める容器を細くすることが可能となる。分離膜モジュールが細いと、製造や取り扱いの観点から好ましく用いることが出来る。
【００６６】
分離膜の気孔率は特に限定されないが、低すぎると濾過効率が悪くなり、高すぎると強度が低下してしまう。濾過効率と分離膜の強度を両立させ、繰り返し蒸気滅菌への耐性も持たせるためには、２０％以上６０％以下であることが好ましい。
【００６７】
なお気孔率は、以下の（式５）より決定される。
気孔率［％］＝１００×（湿潤膜重量[ｇ]−乾燥膜重量[ｇ]）／水比重[ｇ／ｃｍ３]／（膜体積［ｃｍ３］）・・・（式５）。
【００６８】
分離膜の平均気孔径は０．０１μｍ以上１μｍ以下であれば好ましく、この範囲の平均気孔径を有する膜であれば分離膜が閉塞しにくく、かつ濾過効率にも優れる。また、平均気孔径が０．０２μｍ以上０．２μｍ以下の範囲であれば、タンパク質、多糖類などに例示される微生物や培養細胞による発酵の副生成物や、培養液中の微生物/培養細胞が死滅して生じる細胞破砕物といった、分離膜を閉塞させやすい物質の閉塞が起きにくくなるため特に好ましい。
【００６９】
貫通孔を有する柱状構造の分離膜は、外表面が２次側となるため、濾過液を集めるためにモジュール容器を設け、モジュール容器内に分離膜を充填したモジュールとして用いることが好ましい。１本のモジュールに充填される分離膜は１本以上である。
【００７０】
モジュール容器は、繰り返しの蒸気滅菌処理に耐えうる原料からなることが好ましい。蒸気滅菌処理に耐えうる原料としては、たとえばステンレス鋼や、平均気孔率の低いセラミックスなどが例示される。
【００７１】
このようなセラミック膜モジュールは、例えばＷＯ２０１２／０８６７６３に記載される製造方法により製造することができるが、市販のものを利用することもできる。市販のものとして具体的に例示すると、ＭＥＭＢＲＡＬＯＸ精密ろ過膜（Ｐａｌｌ）、セラミック膜フィルターセフィルトＭＦ膜（日本ガイシ）などが挙げられる。
【００７２】
本発明での連続発酵は、酵母の培養液を分離膜で濾過し未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ発酵原料を培養液に追加して濾過液中から生産物を回収する連続発酵であることを特徴とする。
【００７３】
分離膜による濾過時の膜間差圧は特に制限されることはなく、発酵培養液を濾過できればよい。しかし、培養液を濾過するために、有機高分子膜において１５０ｋＰａより高い膜間差圧で濾過処理すると、有機高分子膜の構造が破壊される可能性が高くなり、化学品を生産する能力が低下することがある。また、０．１ｋＰａより低い膜間差圧では、発酵培養液の透過水量が十分得られない場合が多く化学品を製造するときの生産性が低下する傾向がある。したがって、本発明の化学品の製造方法では、有機高分子膜においては、濾過圧力である膜間差圧を好ましくは０．１ｋＰａから１５０ｋＰａの範囲とすることにより、発酵培養液の透過水量が多く、膜の構造の破壊による化学品製造能力の低下もないことから、化学品を生産する能力を高く維持することが可能である。膜間差圧は、有機高分子膜においては、好ましくは０.１ｋＰａ以上５０ｋＰａ以下の範囲であり、さらに好ましくは０.１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲である。
【００７４】
酵母の発酵における温度は、用いる酵母に適した温度を設定すればよく、微生物が生育する範囲であれば特に限定されないが、温度が２０〜７５℃の範囲で行われる。
【００７５】
連続発酵における培養液のｐＨは４以下に調整する。培養液のｐＨは、無機あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなどによって、ｐＨ４以下の範囲内のあらかじめ定められた値に調節する。
【００７６】
本発明の化学品の製造方法では、培養初期にバッチ培養またはフェドバッチ培養を行って微生物濃度を高くした後に、連続発酵（培養液の濾過）を開始しても良い。また、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続発酵を行っても良い。本発明の化学品の製造方法では、適当な時期から、培地供給および培養液の濾過を行うことが可能である。培地供給と培養液の濾過の開始時期は、必ずしも同じである必要はない。また、培地供給と培養液の濾過は連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。
【００７７】
培養液中の微生物の濃度は、化学品の生産性を高い状態で維持することが効率よい生産性を得るのに好ましい。培養液中の微生物の濃度は、一例として、乾燥重量として、５ｇ／Ｌ以上に維持することで良好な生産効率が得られる。
【００７８】
連続発酵の途中において必要に応じて、発酵槽内から微生物を含んだ培養液の一部を取り除いた上、培地で希釈することによって、培養槽内の微生物濃度を調整してもよい。例えば、発酵槽内の微生物濃度が高くなりすぎると、分離膜の閉塞が発生しやすくなることから、微生物を含んだ培養液の一部を取り除き、培地で希釈することで、閉塞から回避することができることがある。また、発酵槽内の微生物濃度によって化学品の生産性能が変化することがあり、生産性能を指標として、微生物を含んだ培養液の一部を取り除いて培地で希釈することで生産性能を維持させることも可能である。
【００７９】
本発明の化学品の製造方法では、菌体を増殖しつつ生産物を生成する連続発酵培養法であれば、発酵槽の数は問わない。
【００８０】
連続発酵装置は、酵母の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を前記の発酵培養液に追加して濾過液中の生産物を回収する連続発酵による化学品の製造装置であれば特に制限はないが、具体例を挙げると、有機高分子膜を使用する際は、ＷＯ２００７／０９７２６０に記載される装置が使用できる。
【００８１】
本発明により製造される化学品としては、当業者にとって公知の酵母（突然変異処理や遺伝子組換え操作が施された酵母も含む。）が生産できる化学品であれば特に制限はないが、好ましい例として有機酸またはアルコールを挙げることができる。有機酸の具体例としては、酢酸、乳酸、アジピン酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸を挙げることができ、アルコールの具体例としては、エタノール、１，３−プロパンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１,４−ブタンジオール、グリセロール、ブタノール、イソブタノール、２−ブタノール、イソプロパノールを挙げることができる。これら化学品は周知の方法（膜分離、濃縮、蒸留、晶析、抽出等）により濾過液より回収される。
【実施例】
【００８２】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。【００８３】
（参考例１）グルコース、エタノールの分析方法
培養液中のグルコース、エタノールの濃度は、下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＨ１０１１（昭和電工株式会社製）
移動相：５ｍＭ  硫酸（流速０．６ｍＬ／分）
反応液：なし
検出方法：ＲＩ（示差屈折率）
温度：６５℃。【００８４】
（参考例２）乳酸の分析方法
発酵液中の乳酸を下記に示すＨＰＬＣ条件で標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ  ＳＰＲ−Ｈ（株式会社島津製作所製）
移動相：５ｍＭ  ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ  ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ  ビストリス、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。【００８５】
（参考例３）Ｄ−乳酸脱水素酵素遺伝子のサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株のＰＤＣ１遺伝子座への導入
Ｄ−乳酸脱水素酵素遺伝子（Ｄ−ＬＤＨ）としてアメリカカブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）由来のもの（ＷＯ２０１０／１４０６０２号参照。）を使用した。Ｄ−ＬＤＨ遺伝子を含むＤＮＡを染色体中のＰＤＣ１遺伝子のプロモーターの下流に相同組み換えで挿入する方法としては、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子を含むＤＮＡの上流及び下流に、導入目的箇所に相同的な部分を付加するようにデザインしたプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ断片を酵母に形質転換する方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、形質転換株の選択を容易にするために、上記ＰＣＲ断片にはアミノ酸合成遺伝子や薬剤耐性遺伝子など酵母選択マーカーが含まれることが好ましい。【００８６】
形質転換は、“ＹＥＡＳＴＭＡＫＥＲ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ”（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ社製）を用いた酢酸リチウム法により行った。詳細は、付属のプロトコールに従った。宿主とするサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株はトリプトファン合成能を欠損した株であり、ＴＲＰ１遺伝子の働きにより、トリプトファン非添加培地上で遺伝子の導入された形質転換体の選択が可能である。【００８７】
このようにして得られた形質転換体へのＤ−ＬＤＨ遺伝子導入の確認は、ＹＰＡＤ培地で培養した形質転換株から、ゲノムＤＮＡ抽出キット“Ｇｅｎとるくん”（ＴＡＫＡＲＡ社製）によりプラスミドＤＮＡを含むゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型として“ＰｒｅＭｉｘ  Ｔａｑ”（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いたＰＣＲにより行った。その結果、全ての形質転換体において、ＰＤＣ１座にＤ−ＬＤＨ遺伝子が導入されていることが確認された。【００８８】
前記工程で得られた、ＰＤＣ１座にアメリカカブトガニ由来のＤ−ＬＤＨが導入されたサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を、以下、ＮＢＲＣ１０５０５／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株と称す。【００８９】
（参考例４）Ｄ−乳酸脱水素酵素遺伝子のサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株のＰＤＣ１遺伝子座への導入
Ｄ−乳酸脱水素酵素遺伝子（Ｄ−ＬＤＨ）としてアメリカカブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）由来のもの（ＷＯ２０１０／１４０６０２号参照。）を使用した。宿主とするサッカロマイセス・セレビシエ  ＮＢＲＣ２２６０株はアミノ酸要求性のない株であり、ジェネティシン（Ｇ４１８）やハイグロマイシンなどの薬剤の耐性遺伝子を使用することで、薬剤添加培地上でＤ−ＬＤＨ遺伝子の導入された形質転換体の選択が可能である。選択マーカーとしてＧ４１８を使用し、参考例３と同様の方法で形質転換を行った。得られた形質転換体は参考例３と同様の方法にてＤ−ＬＤＨ遺伝子導入の確認を行った。その結果、全ての形質転換体において、ＰＤＣ１座にＤ−ＬＤＨ遺伝子が導入されていることが確認された。【００９０】
前記工程で得られた、ＰＤＣ１座にアメリカカブトガニ由来のＤ−ＬＤＨが導入されたサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株を、以下、ＮＢＲＣ２２６０／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株と称す。【００９１】
（参考例５）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株のバニリン耐性試験およびアセトン耐性試験
［バニリン耐性試験］
サッカロマイセス・セレビセＮＢＲＣ１０５０５株をそれぞれ５ｍｌのＹＰＡＤ培地を入れた２０ｍｌ容試験管に白金耳にて植菌し、３０℃で一晩振とう培養をおこなった（前培養）。ＹＰＡＤ培地の組成は酵母エキス１％（ｗ／ｖ）、バクトペプトン２％（ｗ／ｖ）、グルコース２％（ｗ／ｖ）、アデニン０．０４％（ｗ／ｖ）で行った。バニリン濃縮液（２００ｇ／Ｌ  ｉｎ  ＤＭＳＯ）を作成し、５ｍｌのＹＰＡＤ培地に終濃度１ｇ／Ｌになるように、バニリン濃縮液を２５μＬ分注した。バニリン無添加のＹＰＡＤ培地にはＤＭＳＯのみを２５μl分注した。前培養液をＹＰＡＤ培地（バニリン入り）、バニリン無添加ＹＰＡＤ培地にＯＤ＝０．２になるように植菌し、３０℃で４０時間振とう培養を行った。培養後、それぞれの株の培養液のＯＤ６００ｎｍを測定し、以下の（式５）に従って値を算出し、表１に示した。
ＹＰＡＤ培地（バニリン入）の６００ｎｍにおける吸光度÷ＹＰＡＤ培地の６００ｎｍにおける吸光度×１００・・・（式６）。【００９２】
その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株はバニリン耐性を持たない酵母であることが判明した。【００９３】
［アセトン耐性試験］
サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株をそれぞれ５ｍｌのＹＰＡＤ培地を入れた２０ｍｌ容試験管に白金耳にて植菌し、３０℃で一晩振とう培養をおこなった（前培養）。ＹＰＡＤ培地の組成は酵母エキス１％（ｗ／ｖ）、バクトペプトン２％（ｗ／ｖ）、グルコース２％（ｗ／ｖ）、アデニン０．０４％（ｗ／ｖ）で行った。アセトンを、５ｍｌのＹＰＡＤ培地に終濃度４％（ｖ／ｖ）になるように、２００μｌ分注した。前培養液をＹＰＡＤ培地（アセトン入り）、アセトン無添加ＹＰＡＤ培地にＯＤ６００ｎｍ＝０．２になるように植菌し、３０℃で４０時間振とう培養を行った。培養後、それぞれの株の培養液のＯＤ６００ｎｍを測定し、以下の（式６）に従って値を算出し、表１に示した。
ＹＰＡＤ培地（アセトン入）の６００ｎｍにおける吸光度÷ＹＰＡＤ培地の６００ｎｍにおける吸光度×１００・・・（式７）。【００９４】
その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株はアセトン耐性を持たない酵母であることが判明した。【００９５】
（参考例６）カンジダ・ピングナリアエＮＢＲＣ１０３０７株のバニリン耐性試験およびアセトン耐性試験
カンジダ・ピングナリアエＮＢＲＣ１０３０７株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式６）および（式７）に従って値を算出した（表１）。その結果、カンジダ・ピングナリアエＮＢＲＣ１０３０７株はバニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であることが判明した。【００９６】
（参考例７）ピキア・メキシカーナＮＢＲＣ１０３２０株のバニリン耐性試験
ピキア・メキシカーナＮＢＲＣ１０３２０株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式６）および（式７）に従って値を算出した（表１）。その結果、ピキア・メキシカーナＮＢＲＣ１０３２０株はバニリン耐性酵母ではないが、アセトン耐性酵母であることが判明した。【００９７】
（参考例８）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株のバニリン耐性試験およびアセトン耐性試験
サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式６）および（式７）に従って値を算出した（表１）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株はバニリン耐性且つアセトン耐性酵母であることが判明した。【００９８】
（参考例９）クリベロマイセス・マルキアヌスＮＢＲＣ２７２株のバニリン耐性試験およびアセトン耐性試験
クリベロマイセス・マルキアヌスＮＢＲＣ２７２株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式６）および（式７）に従って値を算出した（表１）。その結果、クリベロマイセス・マルキアヌスＮＢＲＣ２７２株はバニリン耐性且つアセトン耐性酵母であることが判明した。【００９９】
（参考例１０）カンジダ・トロピカルスＮＢＲＣ１９９株のバニリン耐性試験およびアセトン耐性試験
カンジダ・トロピカルスＮＢＲＣ１９９株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式６）および（式７）に従って値を算出した（表１）。その結果、カンジダ・トロピカルスＮＢＲＣ１９９株はバニリン耐性且つアセトン耐性酵母であることが判明した。【０１００】
（参考例１１）リンドネラ・メイラエＮＢＲＣ１０８５８株のバニリン耐性試験およびアセトン耐性試験
リンドネラ・メイラエＮＢＲＣ１０８５８株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式６）および（式７）に従って値を算出した（表１）。その結果、リンドネラ・メイラエＮＢＲＣ１０８５８株はバニリン耐性且つアセトン耐性酵母であることが判明した。【０１０１】
（参考例１２）リンドネラ・ファビアニＮＢＲＣ１２５３株のバニリン耐性試験およびアセトン耐性試験
リンドネラ・ファビアニＮＢＲＣ１２５３株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式５）に従って値を算出した（表１）。その結果、リンドネラ・ファビアニＮＢＲＣ１２５３株はバニリン耐性且つアセトン耐性酵母であることが判明した。【０１０２】
（参考例１３）カンジダ・メタノソルボーサＢＣＲＣ２１４８９株のバニリン耐性試験およびアセトン耐性試験
カンジダ・メタノソルボーサＢＣＲＣ２１４８９株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式６）および（式７）に従って値を算出した（表１）。その結果、カンジダ・メタノソルボーサＢＣＲＣ２１４８９株はバニリン耐性且つアセトン耐性酵母であることが判明した。【０１０３】
（参考例１４）ピキア・スティピティスＢＣＲＣ２１７７７株のバニリン耐性試験アセトン耐性試験
ピキア・スティピティスＢＣＲＣ２１７７７株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式６）および（式７）に従って値を算出した（表１）。その結果、ピキア・スティピティスＢＣＲＣ２１７７７株はバニリン耐性酵母であるが、アセトン耐性酵母ではないことが判明した。【０１０４】
（参考例１５）カンジダ・ボイジニＢＣＲＣ２２５２８株のバニリン耐性試験およびアセトン耐性酵母
カンジダ・ボイジニＢＣＲＣ２２５２８株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式６）および（式７）に従って値を算出した（表１）。その結果、カンジダ・ボイジニＢＣＲＣ２２５２８株はバニリン耐性且つアセトン耐性酵母であることが判明した。【０１０５】
【表１】
0006540515.tif 000004
【０１０６】
（参考例１６）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株のバニリン耐性試験およびアセトン耐性試験
乳酸発酵酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式６）および（式７）に従って値を算出した（表２）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株はバニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であることが判明した。【０１０７】
（参考例１７）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株のバニリン耐性試験およびアセトン耐性酵母
乳酸発酵酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式６）および（式７）に従って値を算出した（表２）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株はバニリン耐性且つアセトン耐性酵母であることが判明した。【０１０８】
（参考例１８）サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ  ＢＰ−１０８７株のバニリン耐性試験およびアセトン耐性試験
ＷＯ２０１２／１４７９０３号に記載されている低ｐＨ耐性酵母株であるサッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ  ＢＰ−１０８７株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式６）および（式７）に従って値を算出した（表２）。その結果、ＮＩＴＥ  ＢＰ−１０８７株はバニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であることが判明した。【０１０９】
（参考例１９）サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ  ＢＰ−１０８８株のバニリン耐性試験およびアセトン耐性試験
ＷＯ２０１２／１４７９０３号に記載されている低ｐＨ耐性酵母株であるサッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ  ＢＰ−１０８８株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式６）および（式７）に従って値を算出した（表２）。その結果、ＮＩＴＥ  ＢＰ−１０８８株はバニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であることが判明した。【０１１０】
（参考例２０）サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ  ＢＰ−１０８９株のバニリン耐性試験およびアセトン耐性試験
ＷＯ２０１２／１４７９０３号に記載されている低ｐＨ耐性酵母株であるサッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ  ＢＰ−１０８９株について、参考例５と同様の方法にて試験し、（式６）および（式７）に従って値を算出した（表２）。その結果、ＮＩＴＥ  ＢＰ−１０８９株はバニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であることが判明した。【０１１１】
【表２】
0006540515.tif 000005
【０１１２】
（参考例２１）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株のバッチ発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を用い、培地としてグルコースを発酵原料の主成分とする連続発酵用ＹＰＡＤ培地を用いた。連続発酵用ＹＰＡＤ培地の組成は酵母エキス１％（ｗ／ｖ）、バクトペプトン２％（ｗ／ｖ）、グルコース８％（ｗ／ｖ）、アデニン０．０４％（ｗ／ｖ）で行った。サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を試験管で５ｍｌの表３に示す前培養培地に植菌し一晩振とう培養した（前々培養）。得られた培養液を、新鮮な前培養培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで８時間、３０℃の温度で振とう培養した（前培養）。前培養液を、２Ｌの連続発酵用ＹＰＡＤ培地（植菌前に４Ｎ  ＫＯＨによりｐＨ３.５に調整）に植菌し、以下の条件でバッチ発酵を行った（表４）。収率は（式１）に従って値を算出した。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、エタノールを生産することを確認した。
発酵反応槽容量：２（Ｌ）
発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
温度調整：３０（℃）
発酵反応槽通気量：５０（ｍＬ／分）
発酵反応槽撹拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：４Ｎ  ＫＯＨによりｐＨ３に調整
滅菌：培養槽、および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。【０１１３】
【表３】
0006540515.tif 000006
【０１１４】
（参考例２２）カンジダ・ピングナリアエＮＢＲＣ１０３０７株のバッチ発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるカンジダ・ピングナリアエＮＢＲＣ１０３０７株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表４）。その結果、カンジダ・ピングナリアエＮＢＲＣ１０３０７株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、エタノールを生産することを確認した。【０１１５】
（参考例２３）ピキア・メキシカーナＮＢＲＣ１０３２０株のバッチ発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性酵母ではないがアセトン耐性酵母であるピキア・メキシカーナＮＢＲＣ１０３２０株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表４）。その結果、ピキア・メキシカーナＮＢＲＣ１０３２０株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、エタノールを生産することを確認した。【０１１６】
（参考例２４）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株のバッチ発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表４）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、エタノールを生産することを確認した。【０１１７】
（参考例２５）クリベロマイセス・マルキアヌスＮＢＲＣ２７２株のバッチ発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるクリベロマイセス・マルキアヌスＮＢＲＣ２７２株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表４）。その結果、クリベロマイセス・マルキアヌスＮＢＲＣ２７２株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、エタノールを生産することを確認した。【０１１８】
（参考例２６）カンジダ・トロピカルスＮＢＲＣ１９９株のバッチ発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるカンジダ・トロピカルスＮＢＲＣ１９９株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表４）。その結果、カンジダ・トロピカルスＮＢＲＣ１９９株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、エタノールを生産することを確認した。【０１１９】
（参考例２７）リンドネラ・メイラエＮＢＲＣ１０８５８株のバッチ発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるリンドネラ・メイラエＮＢＲＣ１０８５８株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表４）。その結果、リンドネラ・メイラエＮＢＲＣ１０８５８株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、エタノールを生産することを確認した。【０１２０】
（参考例２８）リンドネラ・ファビアニＮＢＲＣ１２５３株のバッチ発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるリンドネラ・ファビアニＮＢＲＣ１２５３株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表４）。その結果、リンドネラ・ファビアニＮＢＲＣ１２５３株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、エタノールを生産することを確認した。【０１２１】
（参考例２９）カンジダ・メタノソルボーサＢＣＲＣ２１４８９株のバッチ発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるカンジダ・メタノソルボーサＢＣＲＣ２１４８９株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表４）。その結果、カンジダ・メタノソルボーサＢＣＲＣ２１４８９株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、エタノールを生産することを確認した。【０１２２】
（参考例３０）ピキア・スティピティスＢＣＲＣ２１７７７株のバッチ発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性酵母であるが、アセトン耐性酵母ではないピキア・スティピティスＢＣＲＣ２１７７７株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表４）。その結果、ピキア・スティピティスＢＣＲＣ２１７７７株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、エタノールを生産することを確認した。【０１２３】
（参考例３１）カンジダ・ボイジニＢＣＲＣ２２５２８株のバッチ発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるカンジダ・ボイジニＢＣＲＣ２２５２８株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表４）。その結果、カンジダ・ボイジニＢＣＲＣ２２５２８株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、エタノールを生産することを確認した。【０１２４】
【表４】
0006540515.tif 000007
【０１２５】
（比較例１）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を用い、培地として、参考例２１と同じグルコースを発酵原料の主成分とする連続発酵用ＹＰＡＤ培地を用い、分離膜を利用した連続培養を行なった。分離膜エレメントとしては中空糸の形態を採用した。連続発酵用ＹＰＡＤ培地の組成は酵母エキス１％、バクトペプトン２％（ｗ／ｖ）、グルコース８％（ｗ／ｖ）、アデニン０．０４％（ｗ／ｖ）で行った。サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を試験管で５ｍｌの表２に示す前培養培地に植菌し一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を、新鮮な前培養培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで８時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、連続発酵装置の１．５Ｌの連続発酵用ＹＰＡＤ培地（植菌前に４Ｎ  ＫＯＨによりｐＨ３に調整）に植菌し、発酵反応槽を付属の撹拌機によって４００ｒｐｍで撹拌し、発酵反応槽の通気量の調整、温度調整、ｐＨの調整を行い、１９時間培養を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに発酵液循環ポンプを稼動させ、さらに培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を１．５Ｌとなるよう培養液の濾過量の制御を行いながら以下の条件で２５０時間の連続培養を行い、エタノールを製造した（表５）。収率は（式１）に従って値を算出した。
発酵反応槽容量：２（Ｌ）
使用分離膜：ポリフッ化ビニリデン濾過膜
膜分離エレメント有効濾過面積：４７３（ｃｍ２）
温度調整：３０（℃）
発酵反応槽通気量：５０（ｍＬ／分）
発酵反応槽撹拌速度：４００（ｒｐｍ）
ｐＨ調整：４Ｎ  ＫＯＨによりｐＨ３に調整
発酵液の抜き量：５．５（Ｌ／Ｄａｙ）
滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は全て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。【０１２６】
また、使用した膜は以下の性質を持つ膜であり、濾過時の膜間差圧は０．１〜１９．８ｋＰａの間を推移させた。
平均細孔径：０．１μｍ
平均細孔径の標準偏差：０．０３５μｍ
膜表面粗さ：０．０６μｍ
純水透過係数：５０×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ。【０１２７】
前培養中の培養液の残糖濃度と、分離膜利用連続発酵開始から終了時までの濾液中の残糖濃度を、図１に示す。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株は分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）では、連続発酵中に消費されなかった多量の残糖が濾液中に生じてしまい、生産効率が低下することが判明した。【０１２８】
（比較例２）カンジダ・ピングナリアエＮＢＲＣ１０３０７株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるカンジダ・ピングナリアエＮＢＲＣ１０３０７株を用い、比較例１と同様の条件で２３０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表５）。前培養中の培養液の残糖濃度と、分離膜利用連続発酵開始から終了時までの濾液中の残糖濃度を、図１に示す。その結果、カンジダ・ピングナリアエＮＢＲＣ１０３０７株は分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）では、連続発酵中に消費されなかった多量の残糖が濾液中に生じてしまい、生産効率が低下することが判明した。【０１２９】
（比較例３）ピキア・メキシカーナＮＢＲＣ１０３２０株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性酵母ではないが、アセトン耐性酵母であるピキア・メキシカーナＮＢＲＣ１０３２０株を用い、比較例１と同様の条件で２１５時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表５）。前培養中の培養液の残糖濃度と、分離膜利用連続発酵開始から終了時までの濾液中の残糖濃度を、図１に示す。その結果、ピキア・メキシカーナＮＢＲＣ１０３２０株は分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）では連続発酵中に消費されなかった多量の残糖が濾液中に生じてしまい、生産効率が低下することが判明した。分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）の条件で残糖を抑制し、効率よく化学品を生産させるためには、バニリン耐性を有する株を用いることが必要であることが判明した。【０１３０】
（実施例１）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株を用い、比較例１と同様の条件で２４０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表５）。前培養中の培養液の残糖濃度と、分離膜利用連続発酵開始から終了時までの濾液中の残糖濃度を、図１に示す。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株は、連続発酵開始直後から顕著に残糖を抑制することができ、エタノールを効率よく生産できることが判明した。【０１３１】
（実施例２）クリベロマイセス・マルキアヌスＮＢＲＣ２７２株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性酵母且つアセトン耐性酵母であるクリベロマイセス・マルキアヌスＮＢＲＣ２７２株を用い、比較例１と同様の条件で２２０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表５）。前培養中の培養液の残糖濃度と、分離膜利用連続発酵開始から終了時までの濾液中の残糖濃度を、図１に示す。その結果、クリベロマイセス・マルキアヌスＮＢＲＣ２７２株は、連続発酵開始直後から顕著に残糖を抑制することができ、エタノールを効率よく生産できることが判明した。【０１３２】
（実施例３）カンジダ・トロピカルスＮＢＲＣ１９９株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性酵母且つアセトン耐性酵母であるカンジダ・トロピカルスＮＢＲＣ１９９株を用い、比較例１と同様の条件で２５０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表５）。前培養中の培養液の残糖濃度と、分離膜利用連続発酵開始から終了時までの濾液中の残糖濃度を、図１に示す。その結果、カンジダ・トロピカルスＮＢＲＣ１９９株は、連続発酵開始直後から顕著に残糖を抑制することができ、エタノールを効率よく生産できることが判明した。【０１３３】
（実施例４）リンドネラ・メイラエＮＢＲＣ１０８５８株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性酵母且つアセトン耐性酵母であるリンドネラ・メイラエＮＢＲＣ１０８５８株を用い、比較例１と同様の条件で２３０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表５）。前培養中の培養液の残糖濃度と、分離膜利用連続発酵開始から終了時までの濾液中の残糖濃度を、図２に示す。その結果、リンドネラ・メイラエＮＢＲＣ１０８５８株は、連続発酵開始直後から顕著に残糖を抑制することができ、エタノールを効率よく生産できることが判明した。【０１３４】
（実施例５）リンドネラ・ファビアニＮＢＲＣ１２５３株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性酵母且つアセトン耐性酵母であるリンドネラ・ファビアニＮＢＲＣ１２５３株を用い、比較例１と同様の条件で２３０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表５）。前培養中の培養液の残糖濃度と、分離膜利用連続発酵開始から終了時までの濾液中の残糖濃度を、図２に示す。その結果、リンドネラ・ファビアニＮＢＲＣ１２５３株は、連続発酵開始直後から顕著に残糖を抑制することができ、エタノールを効率よく生産できることが判明した。【０１３５】
（実施例６）カンジダ・メタノソルボーサＢＣＲＣ２１４８９株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性酵母且つアセトン耐性酵母であるカンジダ・メタノソルボーサＢＣＲＣ２１４８９株を用い、比較例１と同様の条件で２３０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表５）。前培養中の培養液の残糖濃度と、分離膜利用連続発酵開始から終了時までの濾液中の残糖濃度を、図２に示す。その結果、バニリン耐性且つアセトン耐性を有するカンジダ・メタノソルボーサＢＣＲＣ２１４８９株は、連続発酵開始直後から顕著に残糖を抑制することができ、エタノールを効率よく生産できることが判明した。【０１３６】
（実施例７）ピキア・スティピティスＢＣＲＣ２１７７７株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性酵母であるが、アセトン耐性酵母ではないピキア・スティピティスＢＣＲＣ２１７７７株を用い、比較例１と同様の条件で２３０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表５）。前培養中の培養液の残糖濃度と、分離膜利用連続発酵開始から終了時までの濾液中の残糖濃度を、図２に示す。その結果、ピキア・スティピティスＢＣＲＣ２１７７７株は、連続発酵開始直後は、濾液中に残糖が生じたが、その後も連続発酵を続けると、顕著に残糖を抑制することができ、エタノールを効率よく生産できることが判明した。【０１３７】
（実施例８）カンジダ・ボイジニＢＣＲＣ２２５２８株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるカンジダ・ボイジニＢＣＲＣ２２５２８株を用い、比較例１と同様の条件で２３０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表５）。前培養中の培養液の残糖濃度と、分離膜利用連続発酵開始から終了時までの濾液中の残糖濃度を、図２に示す。その結果、カンジダ・ボイジニＢＣＲＣ２２５２８株は、連続発酵開始直後時から顕著に残糖を抑制することができ、エタノールを効率よく生産できることが判明した。【０１３８】
【表５】
0006540515.tif 000008
【０１３９】
（参考例３２）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ５）によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を用い、植菌前にｐＨ３に調整しないことと、ｐＨ調整を５にする以外は比較例１と同様の条件で２００時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表６）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株は分離膜利用連続発酵（ｐＨ５）では効率よく、エタノールを生産することが判明した。【０１４０】
（参考例３３）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ５）によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株を用い、植菌前にｐＨ３に調整しないことと、ｐＨ調整を５にする以外は比較例１と同様の条件で２１０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表６）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株は効率よくエタノールを生産することが判明した。【０１４１】
【表６】
0006540515.tif 000009
【０１４２】
（参考例３４）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株のバッチ発酵（ｐＨ３）による乳酸の製造
乳酸発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、乳酸を製造した（表７）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、乳酸を生産することを確認した。【０１４３】
（参考例３５）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株のバッチ発酵（ｐＨ３）による乳酸の製造
乳酸発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、乳酸を製造した（表７）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、乳酸を生産することを確認した。【０１４４】
（参考例３６）サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ  ＢＰ−１０８７株のバッチ発酵（ｐＨ３）による乳酸の製造
乳酸発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ  ＢＰ−１０８７株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、乳酸を製造した（表８）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ  ＢＰ−１０８７株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、乳酸を生産することを確認した。【０１４５】
（参考例３７）サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ  ＢＰ−１０８８株のバッチ発酵（ｐＨ３）による乳酸の製造
乳酸発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性酵母を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ  ＢＰ−１０８８株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、乳酸を製造した（表８）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ  ＢＰ−１０８８株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、乳酸を生産することを確認した。【０１４６】
（参考例３８）サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ  ＢＰ−１０８９株のバッチ発酵（ｐＨ３）による乳酸の製造
乳酸発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ  ＢＰ−１０８９株を用い、参考例２１と同様の条件でバッチ発酵を行い、乳酸を製造した（表８）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ  ＢＰ−１０８９株はバッチ発酵（ｐＨ３）では残糖無く、乳酸を生産することを確認した。【０１４７】
（比較例４）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）による乳酸の製造
乳酸発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株を用い、比較例１と同様の条件で１９０時間の分離膜利用連続発酵を行い、乳酸を製造した（表７）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株は分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）では残糖が生じ、生産効率が低下することが判明した。【０１４８】
（実施例９）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０／△ＰＤＣ１::ＬＤＨ株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）による乳酸の製造
乳酸発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０／△ＰＤＣ１：：ＬＤＨ株を用い、前培養のｐＨ調整に５Ｎ  Ｃａ（ＯＨ）２を使用すること以外は比較例１と同様の条件で２００時間の分離膜利用連続発酵を行い、乳酸を製造した（表７）。前培養中の培養液の残糖濃度と、分離膜利用連続発酵開始から終了時までの濾液中の残糖濃度を、図４に示す。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０／△ＰＤＣ１::ＬＤＨ株は、連続発酵開始時から、顕著に残糖を抑制することができ、乳酸を効率よく生産できることが判明した。【０１４９】
（比較例５）サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ  ＢＰ−１０８７株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）による乳酸の製造
乳酸発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ  ＢＰ−１０８７株を用い、比較例１と同様の条件で１９０時間の分離膜利用連続発酵を行い、乳酸を製造した（表８）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ  ＢＰ−１０８７株は分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）では残糖が生じ、生産効率が低下することが判明した。つまり、低ｐＨ耐性酵母であってもバニリン耐性を持たなければ分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）では残糖が抑制されず、乳酸を効率よく生産できないことが判明した。【０１５０】
（比較例６）サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ  ＢＰ−１０８８株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）による乳酸の製造
乳酸発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ  ＢＰ−１０８８株を用い、比較例１と同様の条件で２００時間の分離膜利用連続発酵を行い、乳酸を製造した（表８）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ  ＢＰ−１０８８株は分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）では残糖が生じ、生産効率が低下することが判明した。つまり、低ｐＨ耐性酵母であってもバニリン耐性を持たなければ分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）では残糖が抑制されず、乳酸を効率よく生産できないことが判明した。【０１５１】
（比較例７）サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ  ＢＰ−１０８９株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）による乳酸の製造
乳酸発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ  ＢＰ−１０８９株を用い、比較例１と同様の条件で２１０時間の分離膜利用連続発酵を行い、乳酸を製造した（表８）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＩＴＥ  ＢＰ−１０８９株は分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）では残糖が生じ、生産効率が低下することが判明した。つまり、低ｐＨ耐性酵母であってもバニリン耐性を持たなければ分離膜利用連続発酵（ｐＨ３）では残糖が抑制されず、乳酸を効率よく生産できないことが判明した。【０１５２】
【表７】
0006540515.tif 000010
【０１５３】
【表８】
0006540515.tif 000011
【０１５４】
（参考例３９）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株のバッチ発酵（ｐＨ３.５）によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を用い、ｐＨ調整を３.５にする以外は参考例３７と同様の条件でバッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表９）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株はバッチ発酵（ｐＨ３.５）では残糖無く、乳酸を生産することを確認した。【０１５５】
（参考例４０）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株のバッチ発酵（ｐＨ３.５）によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株を用い、ｐＨ調整を３.５にする以外は参考例３７と同様の条件でバッチ発酵を行い、エタノールを製造した（表９）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株はバッチ発酵（ｐＨ３.５）では残糖無く、乳酸を生産することを確認した。【０１５６】
（比較例８）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３.５）によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を用い、ｐＨを３．５に調節する以外は比較例１と同様の条件で２２５時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表９）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株は分離膜利用連続発酵（ｐＨ３.５）では残糖が生じてしまい、生産効率が低下することが判明した。【０１５７】
（実施例１０）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３.５）によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株を用い、ｐＨを３．５に調節する以外は比較例１と同様の条件で２６０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表９）。その結果、顕著に残糖を抑制することができ、エタノールを効率よく生産できることが判明した。【０１５８】
【表９】
0006540515.tif 000012
【０１５９】
（比較例９）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３、糖供給速度２g／（Ｌ・ｈｒ））によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を用い、抜き速度を０．９Ｌ／ｄａｙに設定し、培地供給速度を２g／（Ｌ・ｈｒ）に設定する以外は比較例１と同様の条件で１９０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表１０）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株は分離膜利用連続発酵（糖供給速度２g／（Ｌ・ｈｒ））では残糖が生じてしまい、生産効率が低下することが判明した。【０１６０】
（比較例１０）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３、糖供給速度４g／（Ｌ・ｈｒ））によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を用い、抜き速度を１．８Ｌ／ｄａｙに設定し、糖供給速度を４g／（Ｌ・ｈｒ）に設定する以外は比較例１と同様の条件で２００時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表１０）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株は分離膜利用連続発酵（糖供給速度４g／（Ｌ・ｈｒ））では残糖が生じてしまい、生産効率が低下することが判明した。【０１６１】
（比較例１１）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３、糖供給速度５g／（Ｌ・ｈｒ））によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を用い、抜き速度を２．２５Ｌ／ｄａｙに設定し、糖供給速度を５g／（Ｌ・ｈｒ）に設定する以外は比較例１と同様の条件で２１０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表１０）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株は分離膜利用連続発酵（糖供給速度５g／（Ｌ・ｈｒ））では残糖が生じてしまい、生産効率が低下することが判明した。【０１６２】
（比較例１２）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３、糖供給速度８g／（Ｌ・ｈｒ））によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を用い、抜き速度を３．６Ｌ／ｄａｙに設定し、糖供給速度を８g／（Ｌ・ｈｒ）に設定する以外は比較例１と同様の条件で１９０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表１０）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株は分離膜利用連続発酵（糖供給速度８g／（Ｌ・ｈｒ））では残糖が生じてしまい、生産効率が低下することが判明した。【０１６３】
（比較例１３）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３、糖供給速度１０g／（Ｌ・ｈｒ））によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性およびアセトン耐性を持たない酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を用い、抜き速度を４．５Ｌ／ｄａｙに設定し、糖供給速度を１０g／（Ｌ・ｈｒ）に設定する以外は比較例１と同様の条件で２００時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表１０）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株は分離膜利用連続発酵（糖供給速度１０g／（Ｌ・ｈｒ））では残糖が生じてしまい、生産効率が低下することが判明した。【０１６４】
【表１０】
0006540515.tif 000013
【０１６５】
（実施例１１）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３、糖供給速度２g／（Ｌ・ｈｒ））によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を用い、抜き速度を０．９Ｌ／ｄａｙに設定し、糖供給速度を２g／（Ｌ・ｈｒ）に設定する以外は比較例１と同様の条件で１９５時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表１１）。その結果、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株は、顕著に残糖を抑制することができ、エタノールを効率よく生産できることが判明した。【０１６６】
（実施例１２）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３、糖供給速度４g／（Ｌ・ｈｒ））によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株を用い、抜き速度を１．８Ｌ／ｄａｙに設定し、糖供給速度を４g／（Ｌ・ｈｒ）に設定する以外は比較例１と同様の条件で１９５時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表１１）。その結果、顕著に残糖を抑制することができ、エタノールを効率よく生産できることが判明した。【０１６７】
（実施例１３）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３、糖供給速度５g／（Ｌ・ｈｒ））によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株を用い、抜き速度を２．２５Ｌ／ｄａｙに設定し、糖供給速度を５g／（Ｌ・ｈｒ）に設定する以外は比較例１と同様の条件で２１０時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表１１）。その結果、顕著に残糖を抑制することができ、エタノールを効率よく生産できることが判明した。【０１６８】
（実施例１４）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３、糖供給速度８g／（Ｌ・ｈｒ））によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株を用い、抜き速度を３．６Ｌ／ｄａｙに設定し、糖供給速度を８g／（Ｌ・ｈｒ）に設定する以外は比較例１と同様の条件で１９５時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表１１）。その結果、顕著に残糖を抑制することができ、エタノールを効率よく生産できることが判明した。【０１６９】
（実施例１５）サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株の分離膜利用連続発酵（ｐＨ３、糖供給速度１０g／（Ｌ・ｈｒ））によるエタノールの製造
エタノール発酵微生物として、バニリン耐性且つアセトン耐性酵母であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ２２６０株を用い、抜き速度を４．５Ｌ／ｄａｙに設定し、糖供給速度を１０g／（Ｌ・ｈｒ）に設定する以外は比較例１と同様の条件で２０５時間の分離膜利用連続発酵を行い、エタノールを製造した（表１１）。その結果、顕著に残糖を抑制することができ、エタノールを効率よく生産できることが判明した。【０１７０】
【表１１】
0006540515.tif 000014
【産業上の利用可能性】
【０１７１】
本発明によって、低ｐＨ条件下の分離膜を利用した連続発酵において糖が多量に余ることなく、種々の化学品の発酵生産の効率を向上させることができる。
【図１】
0006540515.tif 000015
【図２】
0006540515.tif 000016