(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非糖尿病の雌性哺乳動物において正常な妊孕力及び生殖能力を促すために、又は哺乳動物において生殖補助医療の効果を改善するために使用され、
該生殖補助医療は、排卵の誘発、人工授精、体外受精及び胚移植から選択される、タングステン酸塩又はその溶媒和物を含む医薬。
【請求項２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
雌性哺乳動物の体重１ｋｇ当たり０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇのタングステン酸塩の１日用量にて投与する、請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項４】
タングステン酸アニオン及び薬学的、獣医学的又は栄養学的に許容可能なカチオンを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項５】
前記カチオンがアルカリ金属カチオン又はアルカリ土類金属カチオンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項６】
前記カチオンがナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム及び亜鉛からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項７】
前記カチオンがナトリウムであることを特徴とする、請求項６に記載の医薬。
【請求項８】
前記カチオンが亜鉛である、請求項６に記載の医薬。
【請求項９】
前記タングステン酸アニオンがＷＯ４２−イオン、ＨＷＯ４−イオン、Ｗ２Ｏ７２−イオン及びＨＷ２Ｏ７−イオンから選択されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１０】
前記アニオンがＷＯ４２−であることを特徴とする、請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
前記溶媒和物が二水和物である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１２】
非糖尿病の雌性哺乳動物において正常な妊孕力及び生殖能力を促すための、又は哺乳動物に適用された生殖補助医療の効果を改善するための、１００ｍｇ／ｋｇ以上の濃度の請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタングステン酸塩又はその溶媒和物と少なくとも１つの薬学的、獣医学的又は栄養学的に許容可能な賦形剤又はベヒクルとを含み、
該生殖補助医療は、排卵の誘発、人工授精、体外受精及び胚移植から選択される、組成物。
【請求項１３】
前記賦形剤又はベヒクルが薬学的に又は獣医学的に許容可能であり、前記組成物が非糖
尿病の雌性哺乳動物において不妊症を治療するための医薬組成物であることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記賦形剤又はベヒクルが薬学的又は獣医学的に許容可能であり、前記組成物が哺乳動物に適用した生殖補助医療の効果を増大させるための医薬組成物であることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
ピル、錠剤、トローチ、カプセル、粉末、ウエハー、発泡性粉末若しくは錠剤、溶液、懸濁液、シロップ又は顆粒の形態であることを特徴とする、請求項１３又は１４に記載の組成物。
【請求項１６】
非糖尿病の雌性哺乳動物において正常な妊孕力及び生殖能力を促すための食品組成物であることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
液状組成物又は飲料であることを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
固形組成物であることを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記食品組成物が栄養補助剤又は補足物であることを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
スクロースを含むことを特徴とする、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
非糖尿病の雌性哺乳動物において正常な妊孕力及び生殖能力を促すための、又は哺乳動物に適用した生殖補助医療の効果を増大させるための、医薬品の製造における請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタングステン酸塩又はその溶媒和物の使用であって、
該生殖補助医療は、排卵の誘発、人工授精、体外受精及び胚移植から選択される、使用。
【請求項２２】
非糖尿病の雌性哺乳動物（ただし、ヒトを除く）において正常な妊孕力及び生殖能力を促すための、又は哺乳動物（ただし、ヒトを除く）に適用した生殖補助医療の効果を増大させるための方法であって、治療有効量の請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタングステン酸塩又はその溶媒和物を投与することを含み、
該生殖補助医療は、排卵の誘発、人工授精、体外受精及び胚移植から選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非糖尿病の雌性哺乳動物において正常な妊孕力（reproduction：生殖）及び生殖能力を促すための及び哺乳動物に適用される生殖補助医療の効果を改善させるための、不妊症の治療に使用されるタングステン（ＶＩ）塩及びこれを含有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の生殖には多段階のプロセスがあり、これら全てが生まれつき有効である訳ではない。年齢、食生活又は生活様式等の因子は、特にこのプロセスの成否を変化させる。このことにおいて、例えば２０歳〜２４歳の女性の妊娠率は約８６％であるが、３５歳〜３２歳の女性では５０％に減少することが知られている［非特許文献１；非特許文献２］。過体重又は低体重等の他の因子も自然妊娠の遅れ又は更には妊娠不能に関与している［非特許文献３］。カップルの約６６％が避妊を行わずに性交を行った期間のうち最初の３カ月間に自然に妊娠していないと推定されている。この数字は避妊を行わずに性交を行った期間の最初の１年ではカップルの１５％に低下する。不妊症は、１２カ月間の定期的な避妊を行わない性交後に妊娠できないこととして定義されている（ＷＨＯ、ＡＳＲＭ、ニース）。「低受胎」の用語は、カップルの生殖能力の何らかの形態又は程度の低下が妊娠を遅らせていることを定義するために、特に欧州において作成されたものである［非特許文献４］。
【０００３】
女性における不妊の主な原因として、排卵機能障害、生殖管の病態、卵母細胞の質の低下、及び加齢に伴う卵胞の枯渇が挙げられる。しかしながら、特発性不妊とも呼ばれる原因不明の不妊を伴う女性もかなりの割合存在し、その可能性のある原因の一つは、着床プロセスにおける欠損に関連する。
【０００４】
卵胞の発達、排卵、未成熟卵（卵母細胞）の移動並びに続く妊娠及び子宮壁での接合体の着床は、或る特定の内分泌器官、例えば脳下垂体、視床下部及び甲状腺等のホルモン分泌により制御される。女性の不妊症の様々な生物学的原因のうち、このプロセス全体を調節するホルモン刺激における障害に関連して生じることも指摘することができる。
【０００５】
特に、排卵障害に関与するホルモンに関する問題を処理するための医薬品（例えばクロミフェンクエン酸又はゴナドトロピン等）の投与を含む女性不妊症の様々な治療が知られている。同様に、一部の有益な効果として、ビタミン補助剤、特にビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＥ及び葉酸、ミネラル補助剤、例えばセレン、亜鉛又は鉄の錯体又は塩、必須脂肪酸（オメガ−３）、並びに植物、例えばセイヨウニンジンボク（chaste tree）（ヴァイテックス・アグヌスコスタス（Vitex agnus-castus））、ダミアナ、リコリス、アカツメクサ（red clover）の花、チェストベリー、ブラックコホシュ、ドンカイ（アンジェリカ・シネンシス（Angelica sinensis：カラトウキ））、ワイルドヤム又はサツマイモ（ディオスコレアウィロサ（Dioscorea villosa））、ファルスユニコーン根、緑茶、イラクサ（ウルティカ・ディオイカ（Urtica dioica））、野生カラスムギ（アベナ・サティバ（Avena sativa：エンバク））、タンポポ（タラキサカム・オフィシナレス（Taraxacum officinale））等の抽出物の摂取を基本とする種々の治療が提唱されているが、このような治療のいずれにおいても効果は明確に実証されていない。
【０００６】
上記の治療により実現する妊娠の割合は限られている。このことにおいて、例えば排卵が不規則又は無排卵の女性に対してスチルベンファミリーの薬剤であるクロミフェンクエン酸を投与することによる治療は、高い割合で排卵を回復させるが、妊娠率は依然として低く、約５０％以下であることが観察されている。
【０００７】
体外受精治療は、卵母細胞の受精工程において非常に有効である。しかし、子宮壁への胚の着床率は低い。この治療では、体外受精サイクル毎に複数の胚を移植することが推奨され、多胎妊娠のリスクの割合を高める結果となる。
【０００８】
最後に、糖尿病又は肥満等の代謝障害は生殖能力の制限を伴うことが知られている。妊孕機能を損傷した糖尿病又は肥満の雌性マウスの血糖、インスリン血症及び／又は体重の部分的又は完全な回復が生殖能力の改善に関与することが知られている。
【０００９】
メトホルミン又はタングステン（ＶＩ）塩等の様々な薬物治療又は更に生活様式の変化により、糖尿病又はインスリン障害、例えばインスリン欠乏又はインスリン耐性が改善され、例えば不妊症が糖尿病又はインスリン障害によるものであるとき、完全又は部分的に妊孕機能が回復することが示されている。
【００１０】
特にタングステン酸ナトリウムの場合、ストレプトゾトシンの注射によって誘発させた糖尿病及びインスリノペニア（insulinopenia：インスリン減少症）のラットは、タングステン酸ナトリウムの長期治療（１０週間）後に、糖尿病が部分的に回復し、その結果、部分的に血中インスリン（circulating insulin：循環インスリン）レベルが回復することが知られている。続いて、糖尿病が部分的に回復した雌性ラットと健常な雄性ラットとを交配させると、部分的な糖尿病の回復に並行して、雌性ラットが部分的に妊孕能を回復させたことが観察されている。特にタングステン酸ナトリウムによる治療後に部分的に糖尿病を回復させている雌性マウスにおける肯定的な（positive）掻爬術数当たりの出生の割合は６６％に増加したが、この割合は非糖尿病の雌性マウスの１００％より低いものであることが観察されている（非特許文献５を参照のこと）。それでもなお、タングステン（ＶＩ）塩の非糖尿病の雌性動物に対する効果について観察されず、提唱されることもなかった。
【００１１】
動物及び植物において、微量のタングステンが見つかっている。例えば、タングステン含量は植物において最大１００ｍｇ／ｋｇが報告されている［非特許文献６］。
【００１２】
上記の点から、哺乳動物、特にヒトにおける妊孕プロセスの理解及び取り扱いにおける広範な研究及び進歩にも関わらず、生殖能力を増大させるための今日利用可能な様々なアプローチが有効でないとしてその恩恵を受けられずにいる多くのカップルがいまだに存在する。それゆえ、自然な妊孕効率を改善し、及び／又は女性不妊症を治療するための、より大きな効果が得られる新たな代替法を見つけることがなお必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Management of the Infertile Woman by Helen A. Carcio
【非特許文献２】The Fertility Sourcebook by M. Sara Rosenthal, ASAS Summary of FAIR 2012
【非特許文献３】Fertil Steril 2013;100:631-7
【非特許文献４】Gnoth C et al Definition and prevalence of subfertility and infertility, Human reproduction 2005;20(5):1144-1147
【非特許文献５】J. Ballester et. al., "Tungstate administration improves the sexual and reproductive function in female rats with streptozotocin-induced diabetes", Human Reproduction, 2007, vol. 22, pp. 2128-2135
【非特許文献６】Gbaruko B.C. & Igwe J.C. Global Tungsten: Occurrence, Chemistry, Environmental and Health Exposure Issues. Journal of Environmental Research 2007;1(1):27-32
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
現在、タングステン（ＶＩ）塩又はその塩の溶媒和物の投与は、非糖尿病の雌性哺乳動物の不妊症を治療し、非糖尿病の雌性哺乳動物の正常な妊孕力及び生殖能力を促し、哺乳動物に適用した生殖補助医療の効果を増大させるのに有効であることがわかっている。タングステン酸ナトリウムは、血中グルコース値を正常化させることから、糖尿病の雌性マウスの妊孕機能の障害を部分的に回復させることができることが知られているにも関わらず、タングステン酸ナトリウムが非糖尿病の雌性哺乳動物における雌性の妊孕系の機能に対する効果を有し、非糖尿病の雌性哺乳動物における不妊症の治療法として挙げられ、及び／又は正常な妊孕力及び生殖能力を促すことができることは、報告も示唆もされていない。そこで、不妊症を治療し、又は生殖能力を改善し、若しくは正常化させるためのタングステン塩の投与の効果について、本発明の実施例において反映させた通り、動物モデル、具体的にはＩＲＳ２−／−雌性マウスにより実証した。胚の着床に対するタングステン塩の効果も上記に示した同じ動物モデルにおいて、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイにおいて子宮内膜の胚の接着に対する好ましい効果を実証し、その結果も実施例において示した。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
したがって、本発明の第１の態様は、非糖尿病の雌性哺乳動物において不妊症を治療するために、又は非糖尿病の雌性哺乳動物において正常な妊孕力及び生殖能力を促すために使用されるタングステン（ＶＩ）塩又はその溶媒和物に関する。
【００１６】
本発明の第２の態様は、非糖尿病の雌性哺乳動物において不妊症を治療するための、又は非糖尿病の雌性哺乳動物において正常な妊孕力及び生殖能力を促すための、１００ｍｇ／ｋｇを超える濃度のタングステン（ＶＩ）塩又はその溶媒和物と少なくとも１つの薬学的又は栄養学的に許容可能な賦形剤又はベヒクルとを含む組成物に関する。
【００１７】
本発明の第３の態様は、非糖尿病の雌性哺乳動物において不妊症を治療するための、又は非糖尿病の雌性哺乳動物において生殖能力を促すための、医薬品作製のための上記に定義されるタングステン（ＶＩ）塩又はその溶媒和物の使用に関する。
【００１８】
本発明の第４の態様は、非糖尿病の雌性哺乳動物において不妊症を治療するための、又は正常な妊孕力及び生殖能力を促すための方法であって、治療有効量の上記に定義されるタングステン（ＶＩ）塩又はその溶媒和物を投与することを含む、方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
上記の通り、第１の態様により、本発明は、非糖尿病の雌性哺乳動物において不妊症を治療するための、又は非糖尿病の雌性哺乳動物において正常な妊孕力及び生殖能力を促し、及び／又はそれらに寄与するためのタングステン（ＶＩ）塩又はその溶媒和物に関する。
【００２０】
「正常な妊孕力及び生殖能力を促す」又は「正常な妊孕力及び生殖能力に寄与する」という用語は、正常な妊孕力及び生殖能力に寄与する、又は正常な妊孕力及び生殖能力を改善する（妊娠までの期間を短縮する）ことを指し、「正常な妊孕力及び生殖能力」は、上記に挙げられた定義に従い妊娠した生殖の状態として理解される：
＊低受胎状態では：定期的な、避妊を行わない性交を行った１２カ月の間に妊娠する；及び、
＊不妊症状態では：定期的な、避妊を行わない性交を行った１２カ月を過ぎて妊娠する。本明細書において、排卵を回復及び／促進させ、卵母細胞及び胚の品質を改善させ、子宮壁への接合体の着床を増大させ、多嚢胞性卵巣症候群、メタボリックシンドローム、高プロラクチン血症、子宮内膜症、甲状腺機能低下症、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、肝硬変、関節リウマチ、セリアック病、慢性腎不全、特発性の原因及び摂食障害、例えば神経性無食欲症及び多食症を含む、視床下部−下垂体−卵巣軸の障害を調節する必要を含む。
【００２１】
本発明に関して、「生殖補助医療」の用語は、任意の生殖補助医療又は人工授精を包含し、妊孕中に生じる自然のプロセスの少なくとも１つを容易にし、若しくは取り換える生物医学技法又は方法の一分類として理解される。これらの技法には、排卵の誘発、人工授精（ドナー精子による授精を含む）及び体外受精（ドナー卵子の受精又はドナー精子による受精を含む）があるが、それらに限定されない。それゆえ、生殖補助医療を雌性哺乳動物（上記に定義されるように）と、雄性哺乳動物（例えば、セミノグラム（seminogram）において反映される雄性精子の変化、例えば雄性精子の運動性の変化、雄性精子の生命力の変化及び雄性精子の形態の変化）との両方において適用することができる。生殖補助医療は、何らかの生殖能力の問題自体はないにも関わらず、種々の理由において医療に頼らなければならない女性、例えば（それだけに限定されないが）、精子提供を必要とするパートナーのいない女性、遺伝的型若しくは別の型での不適合により卵子及び／又は精子提供に頼る必要があるカップル、又は生産性を改善するため胚移植を必要とする家畜に適用することができる。このような生殖補助医療は、概ね５０％又は更には４０％未満の低い成功率である。それは、生殖補助医療の使用では、妊孕プロセスの効率が元々低いことによる。生殖補助医療を用いたこの妊孕効率の低さの主な原因の１つは、胚の接着及び着床プロセスの難しさに関連する。
【００２２】
本発明において、「生殖補助医療の効果を改善させる」という表現の中の「改善させる」という用語は、このような生殖補助医療の成功率の増加を指す。それゆえ、生殖補助医療を適用した哺乳動物のカップルの年齢範囲における成功率が、これまでの統計によれば、例えば４３％である場合、４４％より高い割合は、このような医療における効果の改善に含まれるだろう。この改善は主に、タングステン（ＶＩ）塩を投与した結果として胚の接着及び着床を促すことによる。
【００２３】
カップルの雄性哺乳動物の生殖能力の変化に起因して、胚の接着及び着床を改善することによって生殖補助医療を適用する場合であっても、少なくとも雌性哺乳動物にタングステン（ＶＩ）塩を投与する。代替法として、タングステン（ＶＩ）塩を雌性哺乳動物及び雄性哺乳動物の両方に投与することができる。
【００２４】
本発明における哺乳類動物は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等を含むが、それらに限定されない任意の哺乳動物であってよい。特定の実施形態によれば、哺乳動物はヒトである。
【００２５】
別の特定の実施形態によれば、上記塩において、雌性哺乳動物の体重１ｋｇ当たりに０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇのタングステン（ＶＩ）塩を１日用量にて投与する。
【００２６】
別の特定の実施形態において、タングステン（ＶＩ）塩は、タングステン（ＶＩ）アニオン及び薬学的又は獣医学的に許容可能なカチオンを含む。「薬学的又は獣医学的に許容可能なカチオン」は、任意の許容可能な、非毒性の、有機又は無機カチオンを指し、これは、治療的に有効なタングステン（ＶＩ）塩を形成することが可能であるものであり、薬物治療又は獣医学的治療においてその使用が適しているものである。カチオンは、アルカリ金属カチオン又はアルカリ土類金属カチオンであることが好ましい。カチオンは、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム及び亜鉛からなる群から選択されることがより好ましい。特定の実施形態によれば、カチオンはナトリウムである。別の特定の実施形態によれば、カチオンは亜鉛である。
【００２７】
タングステン（ＶＩ）塩のタングステン（ＶＩ）アニオンは、ＷＯ４２−イオン、ＨＷＯ４−イオン、Ｗ２Ｏ７２−イオン及びＨＷ２Ｏ７−イオンから選択されることが好ましい。アニオンはＷＯ４２−であることが好ましい。
【００２８】
更に特定の実施形態によれば、タングステン（ＶＩ）塩の溶媒和物は、水和物、より好ましくは二水和物である。
【００２９】
本発明の様々な要素に対して個々に挙げられた特徴全てを互いに組み合わせることができ、全ての可能性のある組合せを本発明の範囲に含める。例えば、好ましい実施形態によれば、タングステン（ＶＩ）塩の溶媒和物は二水和物であり、カチオンはナトリウムカチオンである。同様に、それ以外の可能性のある組合せも本発明の範囲に含まれることが意図される。
【００３０】
本発明の更なる態様は、非糖尿病の雌性哺乳動物において不妊症を治療するための、非糖尿病の雌性哺乳動物において正常な妊孕力及び生殖能力を促すための、又は哺乳動物に適用された生殖補助医療の効果を増大させるための、１００ｍｇ／ｋｇ以上の濃度の上記に定義されるタングステン（ＶＩ）塩又はその溶媒和物と少なくとも１つの薬学的、獣医学的又は栄養学的に許容可能な賦形剤又はベヒクルとを含む組成物である。
【００３１】
「薬学的、獣医学的又は栄養学的に許容可能な賦形剤又はベヒクル」の用語は、組成物を調製するための薬学的、獣医学的又は食品技術において使用するのに適した賦形剤又はベヒクルを指す。これらの成分、賦形剤又は担体は、組成物の他の成分と混合可能でなければならない。また、これらの成分、賦形剤又は担体は、合理的なベネフィット／リスク比（benefit/risk ratio）にて、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応又は他の免疫学的問題若しくは合併症を伴わずに、ヒト及び動物の組織又は臓器との接触における使用に適していなければならない。これらは、薬学的形態に含まれる濃度にて薬理学的活性を欠失している物質である。賦形剤又はベヒクルを使用し、１つ又は複数の活性成分の安定性、バイオアベラビリティ、許容性及び投与の容易さを確保した薬学的又は獣医学的な形態特性を得る。賦形剤が活性成分の放出に影響を与える範囲において、バイオアベラビリティの変化により製剤の薬理学的活性の大きさ及び時間プロファイルを変更することができる。賦形剤を使用し、好適な形態又は一貫性を含む調製物も得られる。賦形剤の種類の例として、可溶化剤、崩壊剤又は崩壊性物質、乳化剤（乳化性物質）、染料、香味料、結合剤、抗酸化剤、潤滑剤、防腐剤、増粘剤等が挙げられる。
【００３２】
好ましい実施形態によれば、賦形剤又はベヒクルは、薬学的に又は獣医学的に許容可能であり、組成物は、非糖尿病の雌性哺乳動物の不妊症を治療するための又は哺乳動物に適用した生殖補助医療の効果を増大させるための医薬組成物である。
【００３３】
医薬組成物は、ピル、錠剤、トローチ、カプセル、粉末、ウエハー、発泡性粉末若しくは錠剤、溶液、懸濁液、シロップ又は顆粒の形態であることが好ましい。
【００３４】
別の好ましい実施形態によれば、組成物は、非糖尿病の雌性哺乳動物において正常な妊孕力及び生殖能力を促すための食品組成物である。
【００３５】
食品組成物は、液状組成物若しくは飲料、固形組成物又は栄養補助剤若しくは栄養補足物（栄養補助剤若しくは栄養補足物又は食品補助剤若しくは食品補足物とも呼ばれる）であってよい。本発明において、「食品組成物」の用語は、タングステン（ＶＩ）塩を多く含む任意の固形又は液状の食品及び少なくとも１つのタングステン（ＶＩ）塩を含有する任意の栄養補助剤又は栄養補足物を包含する。
【００３６】
食品組成物は、液状組成物、世間で最も一般的に使用される用語によれば、すなわち飲料であってよい。本発明において、このような液状組成物は、動物の乳汁又植物の分泌液及びそれらの任意の派生物、例えばミルクシェイク、ヨーグルト、ケフィア等；フルーツジュース及び／又は野菜ジュース；静水若しくは発泡水又は香付き（flavored）若しくは味付き（sweetened）（栄養甘味剤（スクロース、フルクトース等）又は人工甘味剤による）の水又は飲料；調味料、例えば任意のサルサ、ドレッシング、ケチャップ、油、酢又は酢調製品等；任意の種類のアルコール飲料；お茶、コーヒー；及び全ての種類の清涼飲料水又はソフトドリンク又は精力剤からなる群から選択される任意の飲料を含むがそれらに限定されない。
【００３７】
食品組成物は固形組成物であってもよい。このような固形組成物は、例えば動物の乳汁又は植物の分泌液の派生物、例えばチーズ、バター、マーガリン及び豆腐；新鮮な、包装された、又は冷凍されたパン、スライスされたパン、全麦のパン、香辛料入りのパン、甘いパン（sweet bread：スイートブレッド）、塩パン等を含む任意の種類のパン；任意の穀粉、例えば小麦又はセモリナ粉から作製されたパスタ（マカロニ、スパゲッティ、麺類等）；ケーキ、クッキー、マフィン、ドーナツ等を含む焼成食品；飲料を用意するための大量の又は小袋に入ったハーブティー（infusions：浸出液）、ティー又はコーヒー；「ソフトフルーツキャンディ」としての方が知られているグミキャンディを含むゼリー、キャンディー；及び任意の種類の固形の調味料、例えばオレガノ、塩、コリアンダー、パセリ、バジル等又はそれらの混合物からなる群から選択され得るが、それらに限定されない。
【００３８】
最後に、食品組成物は、栄養面、食事面又は食品の補助剤又は補足物、つまり同様に本発明において使用されるこれらの用語のいずれかであってもよい。これらの用語は通常、食事を補足することを目的とした成分、本発明の場合タングステン（ＶＩ）塩（単数又は複数）を含有する経口摂取組成物に使用される。これらは従来の食品に替わるものではなく、又は食べ物又は食事の成分に過ぎない。これらの組成物は、様々な提示物（presentations）、例えばトローチ、ピル、錠剤、カプセル、軟質ゼラチンカプセル、ゼラチンカプセル、ウエハー、発泡錠、液体（溶液、懸濁液、シロップ）、顆粒及び粉末において見つけることができ、これらが全て本発明の範囲内にある特定の実施形態として含まれる。上記の提示物のいずれかを得るための栄養学的又は薬学的に許容可能な賦形剤は当業者であれば明らかであり、これらの賦形剤は本発明の範囲に含まれる。
【００３９】
特定の実施形態によると、上記の組成物（医薬組成物、固形組成物、液状組成物又は栄養補助剤／栄養補足物）のいずれかは、その組成物中にスクロース又はフルクトース等の少なくとも１つの栄養甘味剤を含む。これらの栄養甘味剤の摂取は、糖尿病患者では制御され、また制限されなければならず、それゆえ、このような栄養甘味剤を含む食物組成物は糖尿病の哺乳動物において禁止され、又は食事を制御する際に少なくとも考慮されている。
【００４０】
特定の実施形態によると、非糖尿病の雌性哺乳動物は、排卵を回復及び／又は促進させ、卵母細胞及び胚の品質を改善させ、子宮壁への接合体の着床を増大させ、多嚢胞性卵巣症候群、メタボリックシンドローム、高プロラクチン血症、子宮内膜症、甲状腺機能低下症、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、肝硬変、関節リウマチ、セリアック病、慢性腎不全、特発性の原因及び摂食障害、例えば神経性無食欲症及び多食症を含む、視床下部−下垂体−卵巣軸の障害を調節する必要のある雌性哺乳動物からなる群から選択される。
【００４１】
別の特定の実施形態によると、非糖尿病の雌性哺乳動物は、インスリン耐性（インスリンに対する耐性又はインスリン抵抗性としても知られる）の雌性哺乳動物からなる群から選択され、インスリン耐性だけでは糖尿病の病態が引き起こされないが、インスリン耐性と高血糖とを併発するとき、糖尿病を発症するおそれがある。インスリン耐性を有する雌性哺乳動物は、以下の病態の１つ又は複数を有する雌性哺乳動物からなる群から選択されることが好ましい：肥満又は過体重、メタボリックシンドローム、前糖尿病状態、多嚢胞性卵巣症候群、高血圧、心臓病、高脂血症又は脂質異常症、甲状腺機能亢進症、上皮小体機能亢進症、高レプチン血症若しくはレプチン抵抗性、座業的な生活様式、摂食障害、閉塞性睡眠時無呼吸症候群、胎児栄養不良、プラダーウィリー症候群、ラブソンメンデンホール症候群、脂肪肝、妖精症、過度のグルココルチコイド分泌と関連する病態（例えば、末端肥大症）、薬剤治療（例えば、グルココルチコイド、チアジド利尿薬、βブロッカー）により生じたインスリン耐性、ストレス又は早発初経［Egas Bejar, Daniela et. al Insulinorresistencia/Insulin resistance. Medicina (Guayaquil);10(2):159-166, April 2005; Graves, Thomas K. WHY ISN'T THIS INSULIN WORKING? Western Veterinary Conference 2013 (SA113); Ximena Gaete V. Adelanto de la pubertad en Chile y el mundo. Rev Chil Pediatr 77 (5); 456-465, 2006; Leszek Szablewski Glucose Homeostasis and Insulin Resistance (eISBN: 978-1-60805-) Bentham e-books］。これらの適応症の多くは、前糖尿病状態を含む不妊症に関連しないことが報告されていた［Acta Diab. Latina 4, 507, 1967］。
【００４２】
本発明の組成物において、塩又はタングステン（ＶＩ）塩又はそれらの溶媒和物は、少なくとも１００ｍｇ／ｋｇの濃度にて含まれる。特定の実施形態によると、塩又はタングステン（ＶＩ）塩を少なくとも１５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも３００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも３５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも４００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも４５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも６００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも６５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも７００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも７５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも８００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも８５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも９００ｍｇ／ｋｇ又は少なくとも８５０ｍｇ／ｋｇの濃度にて組成物に含む。
【００４３】
別の特定の実施形態によると、タングステン（ＶＩ）塩の合計濃度は、１０００ｍｇ／ｋｇ以下である。
【００４４】
別の特定の実施形態によると、食品組成物は、雌性哺乳動物の体重１ｋｇ当たり０．００１ｍｇ（以降、ｍｇ／ｋｇ／日）〜該当する雌性哺乳動物種の最大忍容量の１日用量のタングステン塩の投与に適している。
【００４５】
より特定の実施形態によると、最大１日用量は、１０００ｍｇ／ｋｇ／日であり、更なる特定の実施形態によると、少なくとも０．００１ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも２５ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも５０ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも１００ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも２００ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも３００ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも４００ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも５００ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも６００ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも７００ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも８００ｍｇ／ｋｇ／日又は少なくとも９００ｍｇ／ｋｇ／日の用量にて投与が行われる。
【００４６】
本発明の第３の態様は、非糖尿病の雌性哺乳動物において不妊症を治療するための、又は非糖尿病の雌性哺乳動物において生殖能力を促すための、医薬品作製のための上記に定義されるタングステン（ＶＩ）塩又はその溶媒和物の使用に関する。
【００４７】
本発明の第４の態様は、非糖尿病の雌性哺乳動物において不妊症を治療するための、又は正常な妊孕力及び生殖能力を促すための方法であって、治療有効量の上記に定義されるタングステン（ＶＩ）塩又はその溶媒和物を投与することを含む、方法に関する。
【００４８】
本発明の第１の態様に関連して上記に挙げられた定義及び好ましい意味は全て本発明の他の態様に適用することができる。それゆえ、例えばタングステン（ＶＩ）塩は、タングステン（ＶＩ）アニオン及び栄養学的又は薬学的に許容可能なカチオンを含み、この塩は好ましくはアルカリ金属カチオン又はアルカリ土類金属カチオン、更により好ましくはナトリウム、カリウム、マグネシウム及びカルシウム及び亜鉛のカチオンである。特に塩はタングステン（ＶＩ）ナトリウム塩である。タングステン（ＶＩ）アニオンは、ＷＯ４２−イオン、ＨＷＯ４−イオン、Ｗ２Ｏ７２−イオン及びＨＷ２Ｏ７−イオン、好ましくはＷＯ４２−がここでも選択され、溶媒和物の形態で含まれている場合、溶媒和物は好ましくは水和物、より具体的には二水和物である。第１の態様における上記に挙げたそれ以外の特定の実施形態も他の態様に関連する。
【００４９】
一連の非限定的な例示のための本発明の実施例を以下に挙げる。
【実施例】
【００５０】
実施例１．動物モデル（ＩＲＳ２−／−雌性マウス）の説明
正常な妊孕力及び生殖能力を促すためのタングステン（ＶＩ）塩の活性を求めるために使用されたマウスモデルは、Ｉｒｓ２遺伝子ノックアウトマウスであるＩＲＳ２−／−である［Burks et. al., "IRS-2 pathways integrate female reproduction and energy homeostasis", Nature, 2000, vol. 407, pp. 377-382］。Ｉｒｓ２遺伝子の欠失が、生殖能力及び糖質代謝に関連する明らかな性的二型性を示すと解釈されている。
【００５１】
このモデルの雄性マウスは、幼い時期に発症するインスリン耐性及び重度の高血糖を有する。対照的に雌性マウスは幼い時期には比較的正常血糖のままであるが、軽度のインスリン耐性を発症し、それが遅い時期（４カ月齢〜５カ月齢）まで続く。約１０週齢の幼い時期のＩＲＳ２−／−雌性マウスは、ほとんどのマウスにおいて、卵胞の発達が遅く、持続的に無排卵となり、それに伴い発情周期の欠如を示す。ＩＲＳｗｔ（ＩＲＳ−２＋／＋野生型）雌性マウスにおける１００％の妊娠率と比べて、ＩＲＳ２−／−雌性マウスにおける妊娠率は９％である。このような週齢の雌性マウスでは正常血糖のままであり、軽度のインスリン耐性を発症するに過ぎないことを考えると、深刻な妊娠障害は、グルコース代謝の異常が直接の原因ではない。
【００５２】
使用したＩＲＳ２−／−雌性マウスは、６週齢〜８週齢である。Burks et alの刊行物である「IRS-2 pathways integrate female reproduction and energy homeostasis」Nature, 2000, vol. 407, pp. 377-382は、ＩＲＳ２−／−雄性マウスでは６週齢で既にグルコース不耐性は高いが、ＩＲＳ２−／−雌性マウスでは、１２０ｍｇ／ｄｌ〜１６０ｍｇ／ｄｌのグルコース基準値を最大４カ月齢〜５カ月齢まで維持したことが記載されている（３７８頁、カラム１、第２パラグラフの終わり）。さらに、同じ刊行物では、１０週齢未満の雌性マウスは比較的正常血糖であり、インスリン耐性が軽度であることが記載されている。それゆえ、この動物モデルにおける深刻な妊娠障害はＩＲＳ−２−／−雌性マウスの異常なグルコース代謝が直接の原因ではない。１２０ｍｇ／ｄｌ〜１６０ｍｇ／ｄｌの血中グルコース基準値は、正常なレベルと見なされている［「Ciencia y Tecnologia en proteccion y experimentacion animal」Ed McGraw-Hill/interamericana de Espana (2001). ISBN:84-486-0310-9（２７頁）:マウスにおける正常レベルは６３ｍｇ／ｄｌ〜１７６ｍｇ／ｄｌの間を示す（the normal levels in mice are indicated between 63 and 176 mg/dl））。
【００５３】
ＩＲＳ２−／−マウスを用いて行われた、他の更に最近の研究では、雄性マウスと雌性マウスとの間に存在する上記の違いを研究している；例えば、Biochemical Pharmacology 2011, 81, 279-288では、野生型のマウスとＩＲＳ２−／−雌性マウスとの血中インスリンレベルに大きな違いはなく、いくつかのグルコース濃度において、インスリン分泌におけるＩＲＳ２−／−雌性マウスの応答は野生型マウスである対照動物のものと同一である（２８１頁、カラム２、パラグラフ１；及び２８４頁、「Discussion」と題した章のカラム２、パラグラフ１）が、ＩＲＳ２−／−雄性マウスのインスリン分泌は、野生型対照と比べ増加していることが記載されている。
【００５４】
この動物モデルを用いて行った他の研究では、細胞増殖及び分化の協調に関与する細胞周期の機構の主要な成分を調節することにより、ＩＲＳ２が卵巣、特に卵胞の発達及び排卵における重要かつ直接的な機能を有することが示され、ＩＲＳ２発現の欠損と不妊症との明らかな直接的なつながりが示された［Biology of Reproduction 2007, 76, 1045-1053］。
【００５５】
ＩＲＳ２−／−動物モデルは、主なβ細胞障害モデルである［Am J Physiol Endocrinol Metab 2014, 306, E36-E47）］。この文献は、アポトーシスβ細胞数の増加によるβ細胞の消失の進行が、この動物モデルにおける糖尿病の進行を決定するのは高齢においてのみであることを記載している（Ｅ３６頁、カラム２、パラグラフ２を参照のこと）。β細胞の段階的な減少は、最初、持続細胞（persisting cells）の活性が高いことで相殺されており、高齢においてのみ、細胞数の低下を持続細胞によって相殺することができず、高血糖の発症及び続く糖尿病の発症を生じる。
【００５６】
生殖は、種々の因子が関与する複雑な機構である。「理想的な」動物モデルではないが、多くの動物モデル、例えばJackson Laboratoriesにより販売されているものがある（http://jaxmice.jax.org/list/ra861.html）。
【００５７】
生殖能力に影響を及ぼす重要な因子は、雄性及び雌性の両方の生殖能力に必要なレプチンホルモンである。雌性の排卵周期は、レプチンの影響を受け、レプチンレベルが理想の範囲にないと、卵子の品質に対して悪影響を及ぼすおそれがある。ＩＲＳ２−／−マウスは、血中レプチンレベルが高く、これはおそらく生殖能力に影響を及ぼす因子が別にある。
【００５８】
それゆえ、この動物モデルは一連の重要な不妊症関連因子を包含し、雌性哺乳動物の不妊症に対する本化合物の効果を試験するのに適したモデルである。
【００５９】
実施例２．排卵、着床及び妊娠の調査
Ａ．動物
６週齢〜８週齢の１０匹のＩＲＳ２−／−雌性マウス。
６週齢〜８週齢の６匹の「野生型」（ＩＲＳ２ｗｔ）雄性マウス。
【００６０】
雌性マウスと雄性マウスとを別々に通常の条件、すなわち、１２時間の明暗サイクル、並びに制御した温度及び湿度のもとで飼育した。動物を標準的な食餌により自発的に給餌（任意給餌とも呼ぶ）した。
【００６１】
Ｂ．方法
前処理段階
順応期間の後、ＩＲＳ２−／−雌性マウスを１つのケージ当たり４匹〜６匹のマウス群で飼育した。前処理段階（２週間）の間、動物にタングステン酸塩不含飲用水を投与した。
【００６２】
治療段階
前処理段階（治療０日目）後から動物を屠殺する４週間前まで、蒸留水中、タングステン酸ナトリウム二水和物（Carlo Erbaにより販売される）の２ｍｇ／ｍｌ溶液を用いた飲用水（任意）においてタングステン酸ナトリウムを投与した。マウスにより摂取されたタングステン酸ナトリウムの１日用量は体重１ｋｇ当たり約１８０ｍｇであった。
【００６３】
交配
治療の最初の３週間の後、ＩＲＳ２−／−雌性マウスをＩＲＳ２ｗｔ雄性マウスと継続的につがいでケージにおいて飼育した。
【００６４】
マウスを妊娠の兆候又は出産について毎日観察した。
【００６５】
４週間後、雄性マウスをケージ間で交換し、上記ケージ中に更に４週間維持した。
【００６６】
タングステン酸塩の投与を８週間に亘り継続し、雄性マウスと雌性マウスとを共に飼育した。この８週間の後、治療を中止し、雄性マウスと雌性マウスとを更に４週間共に飼育した。
【００６７】
屠殺
この期間の後、雌性マウスを屠殺し、妊娠の兆候を求めて生検を行った。
【００６８】
Ｃ．結果
排卵調査の結果
前処理期間中及び治療の最初の３週間の間、−８日目、−５日目、−２日目、−１日目、７日目、８日目、１４日目、１５日目及び２２日目に無作為に選択した６匹の雌性マウスにおいて膣垢検査を行い、それらのマウスの発情周期の段階を求めた。
【００６９】
１ｍｌ〜２ｍｌの生理食塩水溶液を、パスツールピペットを用いてマウスの膣に導入した。膣滲出液を同じピペットで採取し、スライド上に広げた。一度風乾して膣滲出液を固定し、パパニコロウ法により染色した。
【００７０】
パパニコロウ法は、以下のようにスライド上に固定された膣垢の染色を含む。
５０体積％アルコール中に１０回浸漬、
ハリスヘマトキシリン溶液中に３分間浸漬、
流水ですすぐ、
酸アルコール（１％塩酸）中に１０回浸漬、
流水ですすぐ、
９５体積％アルコール中に１０回浸漬、
ＯＧ−６溶液中に３０秒間浸漬、
９６体積％アルコール中に１０回浸漬、
エオシン溶液中に１分間浸漬、
９６体積％アルコール中に１０回浸漬、
８６体積％アルコール中に１０回浸漬、及び、
キシロール中に１０回浸漬。
【００７１】
観察者バイアスを排除するため単盲検法のコードを使用して熟練したスタッフにより調製物を分析した。
【００７２】
以下の段階、すなわち、発情間期、発情前期、発情期、発情後期、無発情期又は評価不能で試料を同定した。４日〜６日の期間での４つの段階の循環は正常な発情周期の指標であり、一方でこの循環の欠如及び無発情期、発情間期又は発情前期の段階の持続は発情周期の欠如の指標である。
【００７３】
調査した１０匹の雌性マウスについて、表１は、これらＩＲＳ２−／−雌性マウスのうち６匹のマウスにおいて行った膣垢検査の発情周期の段階を要約する。
【００７４】
【表１】
0006534439.tif 000002
【００７５】
発情周期の段階は、Ａ：無発情期、Ｄ：発情間期、Ｐ：発情前期、Ｅ：発情期及びＭ：発情後期である。
【００７６】
表１のＩＲＳ２−／−雌性マウスの膣垢に見られる発情周期の段階は、前処理期間中、全てのマウスが発情前期（Ｐ）又は発情間期（Ｄ）の段階にあり、すなわち、発情周期の欠如を伴うことを示す。
【００７７】
しかしながら、タングステン酸塩の投与の開始後、ＩＲＳ２−／−雌性マウスは、正常な発情周期の回復の指標である発情周期の後期、すなわち発情期（Ｅ）及び発情後期（Ｍ）にあることが観察される。
【００７８】
これらの結果は、タングステン（ＶＩ）塩の投与が、不妊の非糖尿病ＩＲＳ２−／−雌性マウスの分析した１００％のマウスにおいて発情周期の迅速な回復（治療７日目）を可能とすることを示す。
【００７９】
着床及び妊娠の調査の結果
Ｂ欄の方法の交配期間の後、雌性マウスを屠殺し、妊娠の兆候を求めて生検を行った。
【００８０】
表２は、治療時の年齢、妊娠の存否及び雌性マウス１匹当たりの胚の数を要約する。
【００８１】
【表２】
0006534439.tif 000003
【００８２】
表２の結果は、治療していないＩＲＳ２−／−雌性マウスにおける妊娠率が９％であるのに対し、タングステン酸塩で治療したＩＲＳ２−／−雌性マウスにおける妊娠率は最大８０％まで上昇することを示す。
【００８３】
さらに、これらの結果は、雌性マウスの１回の妊娠当たりの子／着床した胚の平均、すなわち、雌性マウスの子の数に相当するとされ得る数は約５であることも示す。
【００８４】
したがって、表１及び表２の結果は、タングステン（ＶＩ）塩が排卵の回復及び／又は卵母細胞の着床の増加に対する有効な治療であることを示す。したがって、本発明において規定されるタングステン（ＶＩ）塩の投与は、非糖尿病の雌性哺乳動物における不妊治療に有効である。
【００８５】
実施例３．血糖及び体重の調査
Ａ．動物
６週齢〜８週齢の６匹のＩＲＳ２−／−雌性マウス。
【００８６】
雌性マウスを通常の条件、すなわち、１２時間の明暗サイクル、並びに制御した温度及び湿度のもとで飼育した。動物を標準的な食餌により自発的に給餌（任意給餌とも呼ぶ）した。
【００８７】
Ｂ．方法
治療段階
順応期間の後、前処理段階（治療０日目）後に、及び１２日間に亘り、蒸留水中、タングステン酸ナトリウム二水和物（Carlo Erbaにより販売される）の２ｍｇ／ｍｌ溶液を用いた飲用水（任意）においてタングステン酸ナトリウムを投与した。
【００８８】
Ｃ．結果
治療期間の０日目、２日目、５日目、７日目、９日目及び１２日目に体重をモニターし、上述の日の各々において６時間の絶食の後、尾静脈からの採血及びグルコースセンサー（ドイツ国マンハイムのRocheのＡｃｃｕＴｒｅｎｄグルコースセンサー）により血中グルコースを求めた。
【００８９】
表３はｍｇ／ｄｌで表される血糖値を要約し、表４は調査したマウスのグラムで表される体重を要約する。
【００９０】
【表３】
0006534439.tif 000004
【００９１】
【表４】
0006534439.tif 000005
【００９２】
表３及び表４の結果は、タングステン酸ナトリウムの投与中、治療の最初の１２日間（その期間の中で、試験した雌性マウスにおける排卵が既に治療の７日目から再開に成功している）、体重又は血糖に何らの変化も観察されないことを示す（表１を参照）。
【００９３】
したがって、表１〜表４の結果は、タングステン（ＶＩ）塩は、体重の変化及び糖代謝の変化に関わらず、排卵の回復及び／又は卵母細胞の着床の増加に対して有効な治療であることを示す。したがって、本発明において規定されるタングステン（ＶＩ）塩又はタングステン（ＶＩ）塩を含む組成物の投与は、女性の生殖器系に対して直接的な効果を有し、したがって、非糖尿病の雌性哺乳動物において正常な妊孕力及び生殖能力を促すのに有効であることを示す。
【００９４】
実施例４．子宮内膜の胚の接着試験
Ａ．モデル
ＨＥＣ１−Ａ子宮内膜細胞株及びＪＥＧ−３栄養外胚葉細胞株から作製された「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」のヒト−ヒト胚の接着モデルを使用し、子宮内膜の受容性に対するタングステン酸ナトリウムの影響を求めた。
【００９５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル、特に上記細胞株（ＨＥＣ−１Ａ及びＪＥＧ−３）をベースとしたモデルの使用は、子宮内膜の受容性、特に栄養芽細胞の子宮内膜への接着を試験するための標準的モデルと考えられている（Fertility and Sterility 2011; 96,522-529; Methods in Enzymology 2006;420:3-18又はFASEB J.201;26:3715-3727）。
【００９６】
ヒト胚の栄養外胚葉細胞を刺激するＪＥＧ−３細胞株は、低接着のプレートを用いて実験室内で単層に成長させ、ヒト胚を模するスフェロイド（spheroids：細胞凝集塊）を形成することができる細胞であり、この細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏの胚の接着アッセイを行うのに最も一般的に使用されている細胞株の１つである。
【００９７】
Ｂ．方法
細胞株は、子宮内膜の胚の接着実験を行うために市販のものが購入された（米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）；米国メリーランド州ロックビル）。これらの細胞を解凍し、十分な細胞を得るため４回増殖させ、全てのアッセイを行った。
【００９８】
ＨＥＣ１−Ａ細胞を２４ウェルプレートにプレーティングし、1０％ウシ胎児血清及び０．１％抗生物質（ファンギゾン及びペニシリン）を補充したＭｃＣｏｙ５Ａ培養培地で９０％のコンフルエンスに達するまで培養した。コンフルエンスに達した後、タングステン酸ナトリウムを培養培地に添加して最終濃度を１０μＭとし、またＷｉｔｈａｆｅｒｉｎ  Ａ（対照物質、胚の接着を防ぐ化合物）を添加し又は任意の追加の成分を含まない培養培地（基準接着データ）を２４時間培養した。
【００９９】
ＪＥＧ−３細胞を１０％ウシ胎児血清及び０．１％抗生物質（ファンギゾン及びペニシリン）を補充したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）の培養培地を含む低接着のプレートにプレーティングした。接着アッセイの２４時間前に、ＪＥＧ−３栄養芽細胞のスフェロイドをこの培地から作製した。そのため、上記の培地のＪＥＧ−３細胞を６×１０５細胞／６ｍｌの濃度で撹拌しながら三角フラスコ内に撹拌させた。得られたスフェロイドを接着アッセイ用に回収した。
【０１００】
接着アッセイ用に、ＨＥＣ−１Ａ細胞をタングステン酸ナトリウム、若しくはＷｉｔｈａｆｅｒｉｎＡを添加した培養培地又は任意の処理を加えない培養培地に培養して２４時間後に、培養培地を、試験中処理を加えていない新鮮な培地に変更した。栄養外胚葉のスフェロイドをＨＥＣ−１Ａ細胞の単層に添加し、１ウェル当たり６個〜１０個のスフェロイドを置いた。６０分後にスフェロイドの接着を、培養培地に浮遊するスフェロイドは接着していないスフェロイドとして、及び浮遊していないスフェロイドは接着したスフェロイドとして計数することで測定した。試験は倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ  ３００；Nikon Corp.、日本、東京）を用いて行われた。アッセイを３連行った。
【０１０１】
Ｃ．結果
得られた結果を表５に挙げる。より高い割合の胚の接着は、ＨＥＣ−１Ａ株をタングステン酸ナトリウムで処理していないものに対してタングステン酸ナトリウムで処理した条件下において観察された。陰性対照（Ｃ−）である、ＷｉｔｈａｆｅｒｉｎＡで処理した細胞において接着は一切観察されなかった。
【０１０２】
【表５】
0006534439.tif 000006
【０１０３】
本発明の具体的な組成物
本発明による食品組成物を以下の説明のように調製する。組成物は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるものではない。
【０１０４】
実施例５
タングステン塩を多く含むサラダドレッシングを調製する。２５ｍｇのＮａ２ＷＯ４（１００ｍｇ／ｋｇ）を、２５０グラムの市販のドレッシングに添加し、それを３０分間機械により撹拌する。
【０１０５】
実施例６
タングステン塩を多く含むケチャップタイプサルサを調製する。そのため１７０ｍｇのＣａ２ＷＯ４を、２００グラムの市販のケチャップに添加し、それを１時間機械により撹拌する。
【０１０６】
実施例７
タングステン塩を多く含むミルクを調製する。そのため１ｋｇの全牛乳を用意し、１５０ｍｇのＺｎＷＯ４を添加し、それを２０分間機械により撹拌する。摂取直前にパッケージを振ることが推奨される。
【０１０７】
実施例８
タングステン塩を多く含むフルーツジュースを調製する。５００ｍｇのＭｇＷＯ４を１ｋｇの市販のジュースに添加し、それを１０分間機械により撹拌する。摂取直前にパッケージを振ることが推奨される。
【０１０８】
実施例９
以下の組成物でコーティングした錠剤を調製する：
ＰＨ２００微結晶セルロース（希釈剤／滑沢剤）  ２５０．００ｍｇ
コロイド状無水シリカ（滑沢剤／吸着剤）  ３．００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム（潤滑剤）  ５．００ｍｇ
タルク（潤滑剤）  ７．００ｍｇ
オパドライ（商標）ホワイト（オパドライ（商標）及び−１−７０００ホワイト）（＊）（コーティングフィルム）  ８．００ｍｇ
タングステン酸ナトリウム二水和物  ２００．００ｍｇ
（＊）ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレングリコール６０００及び酸化チタン（Ｅ−１７１）の混合物
【０１０９】
実施例１０
以下の組成物を含む発泡性錠剤を調製する：
ソルビトール、アスパルテーム、スクロース及びキシリトール（甘味剤）  １０ｍｇ当たり０．０２５ｍｇ
炭酸カルシウム  １０ｍｇ当たり０．３５０ｍｇ
クエン酸（酸味料）  １０ｍｇ当たり０．６５０ｍｇ
酸性炭酸ナトリウム（ｐＨ調整剤）  １０ｍｇ当たり０．３５０ｍｇ
オレンジ香味料  １０ｍｇ当たり０．２５ｍｇ
タングステン塩
【０１１０】
実施例１１
以下の組成物を含むゼラチンカプセルを調製する：
ニフェジピン  ６ｍｇ
キサンタンガム  ５ｍｇ
オレンジ香味料  ０．３ｍｇ
クエン酸  ０．４ｍｇ
ゲルシア（Ｇｅｌｕｃｉｒｅ）４４／１４  ９０ｍｇ
ＰＨ１０微結晶セルロース（希釈剤）  ９２．００ｍｇ／カプセル
タングステン酸ナトリウム二水和物  １００．００ｍｇ／カプセル