(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ胎子の胎膜水腫の発症しやすさを判定する方法であって、
前記ウシ胎子から単離された核酸において、SLC12A1遺伝子の変異の有無を検出する工程を含み、
前記変異は、配列番号１の第１６４番塩基において、グアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に置換される変異である、
上記方法。
【請求項２】
前記ウシ胎子から単離された核酸において、
前記変異があって、前記変異がホモ接合のとき、前記ウシ胎子は胎膜水腫を発症しやすい、または発症していると判定し、
前記変異がヘテロ接合の場合、及び前記変異が無い場合、前記ウシ胎子は胎膜水腫を発症しにくい、または発症しないと判定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ウシ胎子の胎膜水腫の発症しやすさを判定する方法であって、
前記ウシ胎子の両親のウシから単離された核酸において、SLC12A1遺伝子の変異の有無を検出する工程を含み、
前記変異は、配列番号１の第１６４番塩基において、グアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に置換される変異である、
上記方法。
【請求項４】
前記ウシ胎子の両親のウシから単離された核酸において、
前記両親の両方が変異を有し、
前記両親の両方がホモ接合の場合、
前記ウシ胎子は胎膜水腫を発症しやすい、または発症しており、
前記両親の一方がホモ接合で、もう一方がヘテロ接合の場合、及び
前記両親の両方がヘテロ接合の場合、
この順に前記ウシ胎子の胎膜水腫の発症しやすさが減少し、
前記ウシの少なくとも一方が変異を有さない場合は、
前記ウシ胎子は胎膜水腫を発症しにくい、または発症しない、
と判定する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ウシの胎膜水腫のキャリアを特定する方法であって、
前記ウシから単離された核酸において、SLC12A1遺伝子の変異の有無を検出する工程を含み、
前記変異は、配列番号１の第１６４番塩基において、グアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に置換される変異である、
上記方法。
【請求項６】
前記ウシから単離された核酸において、
前記変異がヘテロ接合のとき、前記ウシがキャリアであると判定する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ウシ胎子の胎膜水腫の発症しやすさを判定するためのキットであって、
SLC12A1遺伝子の、配列番号１の第１６４番塩基においてグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に置換される変異を含むＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーセットと、
前記ウシ胎子の胎膜水腫を判定するための指示が記録された媒体と、
を含むキット。
【請求項９】
ウシの胎膜水腫のキャリアを特定するキットであって、
SLC12A1遺伝子の、配列番号１の第１６４番塩基においてグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に置換される変異を含むＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーセットと、
前記ウシ胎子の胎膜水腫を判定するための指示が記録された媒体と、
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウシ胎子の胎膜水腫の発症しやすさを判定する方法及びウシの胎膜水腫のキャリアを特定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胎膜水腫は、胎膜腔内に大量の胎水が貯留する症状を有する疾患である。胎膜水腫には、羊膜腔内に羊水が貯留する羊膜水腫と、尿膜腔内に尿膜水が貯留する尿膜水腫があり、単独で発症することも、同時に発症することもある。胎膜水腫が妊娠した母ウシで生じると、流産や早産を起こし、胎子は死亡することもある。重症例では母ウシも死亡する場合があり、農家の損失は大きい。
【０００３】
羊膜水腫は、異常胎子に伴って先天的または遺伝的に生じることが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。具体的には、乳用牛エアシャー種で常染色体劣性の遺伝様式で発症する胎子の浮腫（水腫胎）を伴う羊膜水腫が報告されている（例えば、非特許文献２参照）。また、尿膜水腫は、乳用牛エアシャー種、乳用牛ガーンジ種、乳用牛ジャージー種、乳用牛レッドデニッシュ種、乳用牛ホルスタイン種、肉用牛黒毛和種で発生の報告がある（例えば、非特許文献３〜５参照）。しかしながら、現在、羊膜水腫発症の遺伝的原因は解明されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Roberts S.J.獣医産科・繁殖学―その診断と治療. （翻訳： 臼井和哉  & 河田啓一朗).p149-164 学窓社. （１９７８年発行）
【非特許文献２】Donald HP, Deas DW, Wilson AL: Genetical analysis of the incidence of dropsical calves in herds of Ayrshire cattle. Brit Vet Jour,108:227-245.（1952年発行）
【非特許文献３】Neal P.A. Bovine Hydramnios and Hydrallantois. Vet Rec 68, 89-97. (1956年発行)
【非特許文献４】Skydsgaard J.M. The pathogenesis of hydrallantois bovis. I. The concentrations of sodium,potassium, chloride and creatinine in the foetal fluids in cases of hydrallantois and during normal pregnancy. Acta Vet Scand 6, 193-207. (1965年発行)
【非特許文献５】島根県農畜産振興課:  牛の妊娠期後期の疾患（胎膜水腫）事例調査の結果について. URL: http://www.pref.shimane.lg.jp/industry/norin/seisan/shimane_wagyu/index.data/taimakusuishu-kekka.pdf. （２０１４年発行）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ウシ胎子の胎膜水腫の発症しやすさを判定する新規方法及びウシの胎膜水腫のキャリアを特定する新規方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ウシ胎子の胎膜水腫の原因となる遺伝子を明らかにし、その変異を検出する遺伝子診断法を確立すれば、胎膜水腫の原因変異を保因する個体を迅速に検出できるようになる。本発明者らは、鋭意研究の結果、胎膜水腫の原因遺伝子としてsolute carrier family 12, member 1 (SLC12A1, NM_001192058)をコードするSLC12A1遺伝子を同定することに成功し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明の一実施態様は、ウシ胎子の胎膜水腫の発症しやすさを判定する方法であって、前記ウシ胎子から単離された核酸において、SLC12A1遺伝子の変異の有無を検出する工程を含む方法である。ここで、前記ウシ胎子から単離された核酸において、前記変異があって、前記変異がホモ接合のとき、前記ウシ胎子は胎膜水腫を発症しやすい、または発症していると判定し、前記変異がヘテロ接合の場合、及び前記変異が無い場合、前記ウシ胎子は胎膜水腫を発症しにくい、または発症しないと判定する工程をさらに含んでもよい。
【０００８】
また、本発明の他の一実施態様は、ウシ胎子の胎膜水腫の発症しやすさを判定する方法であって、前記ウシ胎子の両親のウシから単離された核酸において、SLC12A1遺伝子の変異の有無を検出する工程を含む方法である。ここで、前記ウシ胎子の両親のウシから単離された核酸において、前記両親の両方が変異を有し、前記両親の両方がホモ接合の場合、前記ウシ胎子は胎膜水腫を発症しやすい、または発症しており、前記両親の一方がホモ接合で、もう一方がヘテロ接合の場合、及び前記両親の両方がヘテロ接合の場合、この順に前記ウシ胎子の胎膜水腫の発症しやすさが減少し、前記ウシの一方が変異を有さない場合は、前記ウシ胎子は胎膜水腫を発症しにくい、または発症しない、と判定する工程をさらに含んでもよい
【０００９】
また、本発明のさらなる一実施態様は、ウシの胎膜水腫のキャリアを特定する方法であって、前記ウシから単離された核酸において、SLC12A1遺伝子の変異の有無を検出する工程を含む方法である。前記変異がヘテロ接合のとき、前記ウシがキャリアであると判定する工程を含んでもよい。
【００１０】
上記いずれの方法においても、前記変異が、SLC12A1遺伝子の発現または陽イオン/Ｃｌ−共輸送機能を低下させる変異であってもよい。また、前記変異が配列番号１における第１６４番塩基における変異であってもよい。
【００１１】
また、本発明のさらなる一実施態様は、ウシ胎子の胎膜水腫の発症しやすさを判定する方法であって、前記ウシ胎子から単離された核酸において、SLC12A1遺伝子の発現レベルを調べる工程を含む方法である。前記核酸において前記発現が無い場合、前記ウシ胎子は胎膜水腫を発症しやすい、または発症していると判定し、前記発現がある場合、前記ウシは胎膜水腫を発症しにくい、または発症しないと判定する工程をさらに含んでもよい。
【００１２】
また、本発明のさらなる一実施態様は、ウシ胎子の胎膜水腫の発症しやすさを判定する方法であって、前記ウシ胎子の両親のウシから単離された核酸において、SLC12A1遺伝子の発現レベルを調べる工程を含む方法である。ここで、前記ウシ胎子の両親のウシから単離された核酸において、前記両親の両方でSLC12A1遺伝子の発現が無い場合、前記ウシ胎子は胎膜水腫を発症しやすい、または発症しており、前記両親の一方でSLC12A1遺伝子の発現が低下し、もう一方でSLC12A1遺伝子の発現が無い場合、及び前記両親の両方でSLC12A1遺伝子の発現が低下している場合、この順に前記ウシ胎子の胎膜水腫の発症しやすさが減少する、と判定する工程をさらに含んでもよい。
【００１３】
上記いずれの方法においても、前記核酸がＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。
【００１４】
また、本発明のさらなる一実施態様は、ウシ胎子の胎膜水腫の発症しやすさを判定するためのキットであって、SLC12A1遺伝子の変異を含むＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーセットと、前記ウシ胎子の胎膜水腫を判定するための指示が記録された媒体と、を含むキットである。また、本発明のさらなる一実施態様は、ウシの胎膜水腫のキャリアを特定するキットであって、SLC12A1遺伝子の変異を含むＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーセットと、前記ウシの胎膜水腫を判定するための指示が記録された媒体と、を含むキットである。いずれのキットにおいても、前記変異が配列番号１における第１６４番塩基における変異であってもよい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、ウシ胎子の胎膜水腫の発症しやすさを判定する新規方法及びウシの胎膜水腫のキャリアを特定する新規方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例で同定されたSLC12A1遺伝子の変異部分を示す図である。矢印は、変異部分を検出するためのPCRプライマーSLC12A1-F及びSLC12A1-Rの該当する位置、矢印の方向はプライマーの5'から3'への方向を示す。図１に示したPCR増幅断片の第１６４番塩基は、正常型ではグアニン（Ｇ）であり、胎膜水腫型ではアデニン（Ａ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
【００１８】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコルを用いる。
【００１９】
本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００２０】
＝＝SLC12A1遺伝子の変異を検出する方法＝＝
本明細書において、「SLC12A1遺伝子」とは、SLC12A1タンパク質をコードするコーディング領域及び3'-及び5'-UTR（非翻訳領域）を含むエクソンと、イントロンと、遺伝子発現制御に関わるプロモーター及びエンハンサーとを含むＤＮＡをいう。
【００２１】
本明細書において、「SLC12A1遺伝子の変異」とは、SLC12A1遺伝子において、UMD3.1ゲノムアセンブリ上の基準となる塩基配列と比較して相違することをいう。その基準となる塩基配列は、配列表の配列番号１に示す塩基配列を例示できる。なお、本明細書において、SLC12A1遺伝子内の特定の塩基に言及する場合、配列番号１に示す基準の配列における位置で表すものとする。
【００２２】
SLC12A1遺伝子は、ナトリウムイオン及びカルシウムイオンと、塩素イオンとを共輸送する陽イオン/Ｃｌ−共輸送体であるSLC12A1タンパク質をコードする。SLC12A1タンパク質は、腎臓の尿細管のヘンレのワナ上行部における塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の再吸収を行うことで、腎臓における対向流増幅機構を形成し、水の再吸収を行う。SLC12A1遺伝子に、SLC12A1遺伝子発現が低下するか、あるいはSLC12A1タンパク質自体の活性が低下するような変異が生じると、ウシ胎子でのSLC12A1タンパク質の機能、特に陽イオン/Ｃｌ−共輸送機能が低下する。その結果、ウシ胎子が胎膜水腫を発症する。
【００２３】
従って、本発明で検出する対象となる変異は、SLC12A1遺伝子の発現を低下させたり、SLC12A1タンパク質自体の活性を低下させたりすることによって、ウシ胎子の胎膜水腫を発症させることができる変異であれば限定されず、挿入変異、欠失変異、置換変異のいずれであってもよいが、配列番号１における第１６４番塩基における変異であることが好ましい。基準となる第１６４番塩基はグアニン（正常型塩基とも呼ぶ）であって、アデニン（胎膜水腫型塩基ともよぶ）、チミン、シトシンへのいずれの変異であってもよい。
【００２４】
変異を検出するための核酸は特に限定されず、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ（全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）、又はｃＤＮＡを用いることができる。ｃＤＮＡは、ウシからＲＮＡを単離し、これを鋳型とした逆転写反応により調製することができる。作業工程の簡便さから、ゲノムＤＮＡを用いることが好ましい。
【００２５】
単離した核酸中のSLC12A1遺伝子の変異を調べる具体的な方法は特に限定されず、例えば、常法によって核酸の塩基配列を決定し、変異の有無を調べる方法が挙げられる。変異により正常型塩基を含む配列と胎膜水腫型塩基を含む配列との間で制限酵素の認識部位に相違が生じる場合には、ＰＣＲ-ＲＦＬＰ法により変異の有無を調べることができるが、一般には、塩基配列を決定して変異の有無を調べる方法が汎用的である。
【００２６】
例えば、配列番号１の配列における第１６４番塩基を調べる場合、その塩基を含むＤＮＡ断片を核酸増幅法により増幅し、増幅断片の塩基配列を決定し、第１６４番塩基に変異があるか否かを確認すればよい。具体的な例としては、配列番号２及び３に示すプライマーセットを用いてPCRを行えば、SLC12A1遺伝子のうちで図１に示した領域（配列番号1）が増幅されるので、この増幅断片における１６４番目の塩基について、グアニンか、それ以外の塩基であるかを調べればよい。
【００２７】
＝＝SLC12A1遺伝子の発現を調べる方法＝＝
SLC12A1遺伝子の発現を調べる組織は、正常のウシにおいてSLC12A1遺伝子が発現している組織であれば特に限定されないが、腎臓などが好ましい。それらの組織から、周知の方法で、SLC12A1遺伝子の発現を調べるための核酸を抽出することができる。
【００２８】
SLC12A1遺伝子の発現を調べるために用いる核酸は、ＲＮＡ（全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）又はｃＤＮＡを用いることができる。核酸の種類により、周知の発現検出方法を適宜選択することができる。たとえば、ＲＮＡを用いる場合、ノーザン・ブロットやドット・ブロットなどによって、またｃＤＮＡを用いる場合、ＰＣＲなどによって発現を検出することができる。
【００２９】
＝＝ウシ胎子の胎膜水腫の発症しやすさを判定する方法  Ｉ＝＝
本発明のウシ胎子の胎膜水腫の発症しやすさを判定する方法の一実施形態は、ウシ胎子から単離された核酸において、SLC12A1遺伝子の変異の有無を検出する工程を含む。なお、本明細書において、母ウシが胎子を妊娠しているときに胎膜水腫が生じた場合、その原因となった胎子が胎膜水腫を「発症した」といい、母ウシで胎膜水腫が「生じた」というものとする。
【００３０】
上述のようにして、SLC12A1遺伝子の変異を調べた結果、SLC12A1遺伝子の変異の性質によって、当業者が容易に胎膜水腫の発症しやすさの判定方法を決めることができる。例えば、SLC12A1遺伝子の変異が劣性変異の場合、常染色体劣性遺伝様式をとるので、ホモ接合であるウシ胎子は胎膜水腫を発症しやすい、または発症していると判定し、ヘテロ接合であるウシ胎子及び野生型ウシ胎子は胎膜水腫を発症しにくい、または発症しないと判定する。また、SLC12A1遺伝子の変異が優性変異の場合、ホモ接合及びヘテロ接合であるウシ胎子は胎膜水腫を発症しやすい、または発症していると判定し、野生型ウシ胎子は胎膜水腫を発症しにくい、または発症しないと判定する。これ以外に、優性や劣性の中間的な性質を呈する場合であっても、当業者は容易に判定方法を決めることができる。
【００３１】
また、本明細書で、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の確率で胎膜水腫を発症する場合、「胎膜水腫を発症しやすい」という。そして、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下の確率で胎膜水腫を発症する場合、「胎膜水腫を発症しにくい」という。
【００３２】
例えば、第１６４番塩基の場合、これは劣性変異であるため、グアニン以外の塩基をホモ接合で有する場合、当該ウシ胎子は胎膜水腫を発症しやすい、または発症していると判定し、グアニン以外の塩基とグアニンとをヘテロ接合で有する場合及びグアニンをホモ接合で有する場合、当該ウシ胎子は胎膜水腫を発症しにくい、または発症しないと判定する。
【００３３】
また、上述したように、SLC12A1遺伝子内に、SLC12A1遺伝子の発現を低下させたり、SLC12A1タンパク質自体の活性を低下させたりする変異をウシ胎子が有することによって、ウシ胎子が胎膜水腫を発症し得る。従って、ウシ胎子の胎膜水腫の発症しやすさを判定するために、ウシ胎子から単離された核酸を用いて、SLC12A1遺伝子の発現レベルを調べてもよい。
【００３４】
ここで、ウシ胎子においてSLC12A1遺伝子の発現が無い場合、ウシ胎子は胎膜水腫を発症しやすい、または発症していると判定し、SLC12A1遺伝子の発現がある場合、ウシ胎子は胎膜水腫を発症しにくい、または発症しないと判定する。
【００３５】
このようにして、ウシ胎子から単離した核酸を用いて、その胎子の胎膜水腫の発症しやすさを調べることができる。
【００３６】
＝＝ウシ胎子の胎膜水腫の発症しやすさを判定する方法  ＩＩ＝＝
ウシ胎子の有するSLC12A1遺伝子は、両親から受け継がれたものである。従って、ウシ胎子の胎膜水腫の発症しやすさは、両親のウシのSLC12A1遺伝子の変異または発現を調べることによって、判定することができる。
【００３７】
まず、上述のようにして両親のウシのSLC12A1遺伝子の変異を調べた結果、その変異の性質によって、ウシ胎子の胎膜水腫の発症しやすさの判定方法を当業者が容易に決めることができる。例えば、変異が劣性変異の場合、両親ともホモ接合、一方がホモ接合で他方がヘテロ接合、両親ともヘテロ接合、の順で、ウシ胎子の胎膜水腫の発症の確率が下がる、すなわち発症しにくくなる。具体的には、両親ともホモ接合の場合は１００％の割合で、一方がホモ接合で他方がヘテロ接合の場合は約５０％の割合で、両親ともヘテロ接合の場合は約２５％の割合でウシ胎子が胎膜水腫を発症することが期待される。また、少なくとも一方が野生型である場合、ウシ胎子は胎膜水腫を発症しにくい、または発症しないと判定する。
【００３８】
また、上述のようにして両親のウシのSLC12A1遺伝子の発現を調べた結果、その発現レベルによって、ウシ胎子の胎膜水腫の発症しやすさの判定方法を当業者が容易に決めることができる。例えば、両親ともSLC12A1遺伝子の発現が無い場合、一方で発現が無く他方で発現が正常ウシと比べ低下している場合、両親とも発現が正常ウシと比べ低下している場合、の順で、ウシ胎子の胎膜水腫の発症の確率が下がる、すなわち発症しにくくなる。具体的には、両親ともSLC12A1遺伝子の発現が無い場合は１００％の割合で、一方で発現が無く他方で発現が正常ウシと比べ低下している場合は約５０％の割合で、両親とも発現が正常ウシと比べ低下している場合は約２５％の割合でウシ胎子が胎膜水腫を発症することが期待される。また、少なくとも一方で発現が正常である場合、ウシ胎子は胎膜水腫を発症しにくい、または発症しないと判定する。
【００３９】
＝＝ウシの胎膜水腫のキャリアを特定する方法＝＝
本発明のウシの胎膜水腫のキャリアを特定する方法は、ウシから単離された核酸において、SLC12A1遺伝子の変異の有無を検出する工程を含む。ここで、上述のようにして、SLC12A1遺伝子の変異を調べた結果、SLC12A1遺伝子の変異がヘテロ接合の場合に、そのウシを胎膜水腫のキャリアと特定する。
【００４０】
なお、本明細書で「胎膜水腫のキャリア」とは、胎膜水腫の原因遺伝子が劣勢変異である場合のヘテロ接合体であって、当該個体は胎膜水腫を発症しないが、その原因遺伝子をホモ接合で有する個体は胎膜水腫を発症しうる場合のヘテロ接合体をいうものとする。
【００４１】
この方法を用いて、ウシ集団内で胎膜水腫を発症しにくくすることができる。すなわち、キャリア同士を交配すると、４分の１の確率で子孫はホモ接合で変異を有する。また、キャリアと、変異型遺伝子を有さない野生型ウシを交配しても、２分の１の確率でキャリアが生じ、変異型遺伝子は集団から無くならず、子孫に受け継がれる。一方、変異型遺伝子を有さない野生型ウシ同士を交配すると、子孫は胎膜水腫を発症せず、変異型遺伝子は集団から排除されるようになる。
【００４２】
従って、本発明による胎膜水腫の判定方法を用い、野生型ウシ同士を交配することにより、胎膜水腫をへらすことができるだけでなく、ウシ集団から、胎膜水腫のリスク要因を減らすことが可能になり、ウシ集団内で胎膜水腫を発症しにくくすることができる。
【００４３】
＝＝プライマーセット及びキット＝＝
SLC12A1遺伝子の発現を低下させたり、SLC12A1タンパク質自体の活性を低下させたりすることによって、ウシ胎子の胎膜水腫を発症させることができる変異は、ウシ胎子の胎膜水腫の指標となるので、変異部位を含むＤＮＡを増幅するためのプライマーセットは、ウシ胎子の胎膜水腫の発症しやすさの判定試薬（以下、判定試薬と呼ぶ）及びウシの胎膜水腫のキャリアの特定試薬（以下、特定試薬と呼ぶ）として用いることができる。なお、このプライマーセットは、変異を有しない野生型配列のウシ由来の核酸を増幅した場合、変異部位に変異のないＤＮＡの増幅断片が得られる。
【００４４】
SLC12A1遺伝子領域内の変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットは、例えば、配列番号１における１６４番目の塩基を含むウシゲノム上の領域を増幅するプライマーセットであってもよい。プライマーの配列は、当業者の技術常識から容易に設計可能である。一例として、そのようなプライマーセットは、配列番号１の第１番〜第２０番塩基の領域内の部分領域に対するフォワード側プライマーと、配列番号１の第２２６番〜第２４５番塩基の領域内の部分領域に対するリバース側プライマーとのセットであってもよい。なお、「フォワード側プライマー」とは、配列表に実際に示されている塩基配列を有し、その相補鎖であるＤＮＡ鎖にハイブリダイズするプライマーであり、「リバース側プライマー」とは、配列表に実際に示されている塩基配列に相補的な配列を有し、配列表にある配列を有するＤＮＡ鎖にハイブリダイズするプライマーである。
【００４５】
下記実施例で用いられている、配列番号２に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号３に示す塩基配列からなるプライマーとのセットは、実施例で同定されたSLC12A1遺伝子領域における一塩基置換変異を検出するための好ましいプライマーセットの一例であるが、判定試薬や特定試薬に使用可能なSLC12A1遺伝子領域を増幅するプライマーセットはこれに限定されない。
【００４６】
これら判定試薬や特定試薬は、SLC12A1遺伝子の変異を含むＤＮＡを増幅するためのプライマーセットを含めばよく、その形状は限定されない。例えば、プライマーを緩衝液等に溶解させた溶液状であってもよく、また、乾燥させたプライマーであってもよい。さらに、該試薬は、プライマーの分解防止等に有用な添加剤等を含んでいてもよい。
【００４７】
これら判定試薬や特定試薬は、他の試薬類と組み合わせて、ウシ胎子の胎膜水腫の発症しやすさを判定するための判定キット及びウシの胎膜水腫のキャリアを特定するための特定キットとして提供することができる。例えば、判定キット及び特定キットには、ＰＣＲ等の核酸増幅法に必要なプライマー以外の周知の試薬を含んでもよく、反応液を調製するための緩衝液、ｄＮＴＰ、耐熱性ポリメラーゼ等を含んでもよい。
【００４８】
さらに、判定キット及び特定キットには、それぞれウシ胎子の胎膜水腫の発症しやすさを判定するための指示や方法及びウシの胎膜水腫のキャリアを特定するための指示や方法が具体的に記録された媒体が含まれていてもよい。媒体の形状は特に限定されず、紙であっても電子媒体であってもよい。
【００４９】
例えば、ウシ胎子の胎膜水腫の発症しやすさを判定するための指示や方法として、上述したように、変異や発現を調べた結果に対し、それぞれの判定方法が記載されている。例えば、配列番号１における１６４番目の塩基を調べる場合、グアニン以外の塩基をホモ接合で有する場合、当該ウシは胎膜水腫を発症しやすい、または発症していると判定し、ヘテロ接合、またはグアニンをホモ接合で有する場合、当該ウシは胎膜水腫を発症しにくい、または発症しないと判定するように指示した判定方法が記載されている。
【００５０】
また、ウシの胎膜水腫のキャリアを特定するための指示や方法として、上述したように、変異や発現を調べた結果に対し、それぞれの特定方法が記載されている。例えば、配列番号１における１６４番目の塩基を調べる場合、グアニンとグアニン以外の塩基をヘテロ接合で有する場合、そのウシを胎膜水腫のキャリアであると特定するように指示した特定方法が記載されている。
【実施例】
【００５１】
（１）  ウシSLC12A1遺伝子の胎膜水腫特異的変異
胎膜水腫を発症した胎子９頭のゲノムＤＮＡを抽出し、SLC12A1遺伝子内の配列番号１における第１６４番塩基の遺伝子型を調べたところ、９頭とも、Ａのホモ接合体であった。
【００５２】
次に、LC12A1遺伝子内の配列番号１における第１６４番塩基がＧ／Ａの雄牛の産子で、表現型が正常な７３頭のゲノムＤＮＡを抽出し、配列番号１における第１６４番塩基の遺伝子型を調べた結果、Ｇ／Ｇのホモ接合体が３６頭、Ｇ／Ａのヘテロ接合体が３７頭、Ａ／Ａのホモ接合体が0頭であった。Ａのアレル頻度が０．２８５であることからＡ／Ａのホモ接合体の期待頭数は約５頭と計算され、観測値が０頭である統計学的確率は有意に小さかった(P < 0.01)。
【００５３】
本実施例で調べた集団において、配列番号１における第１６４番塩基がＡ／Ａのホモ接合体は胎膜水腫を発症し、また、Ａ／Ａのホモ接合体の正常個体が存在しなかった。このように、配列番号１における第１６４番塩基Ｇの変異は、胎膜水腫の原因である。なお、胎膜水腫発症個体は、Robertsらの手法（Roberts S.J.獣医産科・繁殖学―その診断と治療. （翻訳： 臼井和哉  & 河田啓一朗）.p149-164 学窓社. (1978年発行)）に従い診断した。また、配列番号１における第１６４番塩基の遺伝子型は、GGP_SuperLDv2-0(GeneSeeK社製)を用いて調べた。
【００５４】
（２）配列番号１における第１６４番塩基の変異
SLC12A1遺伝子内にある配列番号１における第１６４番塩基がグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）に置換する変異は、SLC12A1タンパク質の３７２番目のプロリンをロイシンに置換する。この変異は、SLC12A1の機能を損なうことが、アミノ酸変異の影響を調べるソフトウエアであるPolyPhen-2（Adzhubei I.A., Schmidt S., Peshkin L. et al. (2010) A method and server for predicting damaging missense mutations. Nat Methods 7,248-9.）、SIFT（Sim N.L., Kumar P., Hu J. et al. (2012) SIFT web server: predicting effects of amino acid substitutions on proteins.Nucleic Acids Res 40 W452-7.）によって推定された。
【００５５】
（３）ウシゲノムＤＮＡの配列番号１における第１６４番塩基の決定
ウシの血液（抗擬固剤としてEDTA、ヘパリンを含む）より、自動核酸分離装置NA-1000（クラボウ社製）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。これらのゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマーSLC12A1-F（配列番号２）及びSLC12A1-R（配列番号３）を用いたＰＣＲ（９８℃で２０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分間からなる工程を１サイクルとした３５サイクル反応）を行い、３７３０蛍光ＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてＰＣＲ生成物の塩基配列を決定した。胎膜水腫を発症したウシのSLC12A1遺伝子を鋳型にＰＣＲで増幅させたＤＮＡ断片（配列番号１）では、配列番号１６４番目の塩基が常にグアニン（Ｇ）であったが、正常型由来の増幅断片ではアデニン（Ａ）であった。
【００５６】
このように、SLC12A1遺伝子は胎膜水腫の発生の原因遺伝子であり、SLC12A1遺伝子における変異の有無を判定する本発明の診断法によって、確実にウシの胎膜水腫を判別可能である。
【図１】
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【配列表】
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