(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）又は（ｂ）のいずれか１つのタンパク質：
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質；又は
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のヌクレオチド配列からなる遺伝子：
（ａ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列；又は
（ｂ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列において、１又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、及び／又は付加されたヌクレオチド配列であって、且つ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【請求項４】
請求項２又は３のいずれかの遺伝子を含む（−）−ビボ−クエルシトール変換用組換えベクター。
【請求項５】
請求項２又は３のいずれかの遺伝子又は請求項４の組換えベクターを導入した（−）−ビボ−クエルシトール変換用形質転換体。
【請求項６】
請求項５の形質転換体を、２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質の生産に適した条件下及び時間培養し、培養物から当該タンパク質を精製して回収することを特徴とする、２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素の生産方法。
【請求項７】
下記（ａ）乃至（ｅ）のいずれか１つのタンパク質：
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号６で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質；又は
（ｅ）配列番号８で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質、
を２−デオキシ−シロ−イノソースと接触させ、ｐＨ５．０〜１０．０の条件下で反応させ、生成した（−）−ビボ−クエルシトールを反応液から回収することを特徴とする、（−）−ビボ−クエルシトールの製造方法。
【請求項８】
下記（ａ）乃至（ｅ）のいずれか１つのタンパク質：
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号６で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質；又は
（ｅ）配列番号８で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質、
を２−デオキシ−シロ−イノソースと接触させ、ｐＨ５．０〜１０．０の条件で反応させることを特徴とする、２−デオキシ−シロ−イノソースを（−）−ビボ−クエルシトールへと変換する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素及び当該酵素をコードする遺伝子に関する。また、本発明は、２−デオキシ−シロ−イノソースを（−）−ビボ−クエルシトールに直接変換することができる酵素を利用した、（−）−ビボ−クエルシトールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（−）−ビボ−クエルシトール（（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１，２，３，４，５−ｐｅｎｔｏｌ）は、ガガイモ科植物から見出された、以下の化学構造を有する化合物である。
【化１】
0006487852.tif 000002
【０００３】
これまでに、（−）−ビボ−クエルシトールは、強力な血糖効果作用を有することが示されている。また、（−）−ビボ−クエルシトールのアミノ化によって得ることができるデオキシイノサミン及びデオキシイノサミジンは、各種の医農薬の合成用中間体となりうる化合物でもある（特許文献１及び２）。【０００４】
更に、近年になって、（−）−ビボ−クエルシトールの工業的有用性も明らかになってきている。例えば、特許文献３には、（−）−ビボ−クエルシトールが、燃料電池の冷却液の凍結を防止するための添加剤として有用であることが記載されている。当該目的に使用された場合、（−）−ビボ−クエルシトールは、長期間使用した後でさえも酸化されることがなく、好適な特性を維持するとされている。【０００５】
また、特許文献４には、（−）−ビボ−クエルシトールが溶解と凝固の過程で大量の潜熱を吸熱及び放熱し得ることに着目し、当該化合物を太陽熱の蓄熱や、低廉な夜間電力の効率的な利用のための蓄熱材に応用することが開示されている。【０００６】
従って、（−）−ビボ−クエルシトールを単純な工程により、且つ効率的に生産することの明白な必要性が存在する。（−）−ビボ−クエルシトールを医薬の有効成分として利用する場合、当該化合物の原体は可能な限り純粋で、未同定の不純物を含むべきではないから、その製造工程もまた可能な限り簡素で、その製造履歴を容易に追跡できるべきである。また、（−）−ビボ−クエルシトールを前記のような工業目的に使用する場合、その生産コストが当該技術の実現性を左右し得る。【０００７】
古典的には、（−）−ビボ−クエルシトールはガガイモ科の植物から抽出されていた。しかし、近年、より効率的な方法として、ミオ−イノシトールを基質に用いてアグロバクテリウム属又はサルモネラ属の微生物を培養し、その培養液中に（＋）−プロト−クエルシトール及び（＋）−エピ−クエルシトールとともに（−）−ビボ−クエルシトールを生産させて、当該培養液から（−）−ビボ−クエルシトールを単離する方法が提案されている。或いは、当該アグロバクテリウム属又はサルモネラ属の微生物の菌体をミオ−イノシトールに接触させ、やはりその反応液中に（＋）−プロト−クエルシトール及び（＋）−エピ−クエルシトールとともに（−）−ビボ−クエルシトールを生産させて、その反応液から（−）−ビボ−クエルシトールを単離する方法が提案されている（特許文献１及び２）。【０００８】
しかしながら、この方法において、ミオ−イノシトールを（−）−ビボ−クエルシトールに変換するいかなる酵素も単離されておらず、その反応が１つの酵素によるものなのか、又は２つ以上の酵素が関与しているものなのかさえも明らかではない。従って、この方法では、ミオ−イノシトールを基質として微生物を培養するか、或いは少なくとも当該微生物の培養物から得た菌体を利用することが必須になるので、依然としてその工程は煩雑であり、未知の不純物で汚染される危険性を伴う。そしてまた、この方法は、明らかに非効率的である。【０００９】
特許文献５も、ミオ−イノシトールを基質に用いてエンテロバクター属の微生物であるエンテロバクター  ｓｐ．ＡＢ１０１１４株（ＦＥＲＭ  Ｐ-１９３１９）を培養し、その培養液中に（−）−ビボ−クエルシトールを生産させて、当該培養液から（−）−ビボ−クエルシトールを単離する方法が提案されている。この方法では、ミオ−イノシトールから約２５％程度の収率で（−）−ビボ−クエルシトールが得られた（実施例１参照）。しかしながら、やはりこの方法においても、ミオ−イノシトールを（−）−ビボ−クエルシトールに変換するいかなる酵素も単離されていない。従って、この方法でも、ミオ−イノシトールを基質として微生物を培養することが必須になるので、やはりその工程は煩雑であり、未知の不純物で汚染される危険性を伴う。そしてまた、この方法でさえ、目的の（−）−ビボ−クエルシトールを得る際には、労力と時間が要求される微生物発酵工程を避けることはできない。【００１０】
なお、特許文献６には、前掲の特許文献５の方法で使用されたエンテロバクター  ｓｐ．ＡＢ１０１１４株（ＦＥＲＭ  Ｐ-１９３１９）との接触により、（−）−ビボ−クエルシトールを２−デオキシ−シロ−イノソースに変換する方法が開示されている。つまり、エンテロバクター  ｓｐ．ＡＢ１０１１４株（ＦＥＲＭ  Ｐ-１９３１９）は、（−）−ビボ−クエルシトールを８０％もの収率で２−デオキシ−シロ−イノソースに変換したとされている（実施例１参照）。特許文献６においてもいかなる酵素も単離されていないため、その詳細は明らかではないが、仮にその反応が１つの酵素により触媒されるとしても、少なくとも当該酵素活性は、（−）−ビボ−クエルシトールを２−デオキシ−シロ−イノソースに変換する方向に対して優勢であり、実質的な逆反応は進行し難いと看做すのが合理的であろう。【００１１】
しかるに、本発明者らは、これまでに、下記の反応スキームのようにして、２−デオキシ−シロ−イノソースを（−）−ビボ−クエルシトールに直接変換することができる酵素が報告された事実を知らない。
【化２】
0006487852.tif 000003
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開平１１−１２２１０号公報
【特許文献２】特開２０００−４８９０号公報
【特許文献３】国際公開第ＷＯ２００５／０９１４１３号パンフレット
【特許文献４】特開２０１０−２１５８７６号公報
【特許文献５】特開２００５−７０号公報
【特許文献６】特開２００５−７２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、本発明は、（−）−ビボ−クエルシトールを単純な工程により、且つ効率的に生産することを目的とする。単純な工程による生産は、不純物の混入のリスクを最小化する。また、効率的な生産により、（−）−ビボ−クエルシトールの工業分野における利用も可能になると予測される。【００１４】
特に、２−デオキシ−シロ−イノソースを（−）−ビボ−クエルシトールに直接変換することができる酵素の利用が意図される。つまり、２−デオキシ−シロ−イノソース（以下、「ＤＯＩ」と略すことがある。）は、グルコースから僅か２段階の酵素反応を介して容易に発酵生産されることが知られており（ＷＯ２０１０／１０９９１６号パンフレット、ＷＯ１０／０５３０５２号パンフレット及びＷＯ０６／１０９４７９号パンフレット等）、非常に安価な原料となり得ると期待される。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、（−）−ビボ−クエルシトール生産能を有する微生物をスクリーニングして、２−デオキシ−シロ−イノソースを（−）−ビボ−クエルシトールに変換することができる微生物を見出した。更に、本発明者らは当該微生物から、２−デオキシ−シロ−イノソースを（−）−ビボ−クエルシトールに直接変換する触媒活性を有する酵素を単離することに成功した。そして、本発明者らは、当該酵素のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を解明した。従って、本発明の第１の局面は以下のものを包含する。
（１）  （−）−ビボ−クエルシトールを資化する能力を有する微生物由来であって、下記の（ａ）乃至（ｃ）の特性を有する２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素：
（ａ）２−デオキシ−シロ−イノソースを（−）−ビボ−クエルシトールに変換する触媒活性を有する；
（ｂ）ｐＨ７．０〜９．０で最大活性を示す；及び
（ｃ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した当該酵素のポリペプチド部分の分子質量が３６ｋＤａである。
（２）  前記微生物が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属又はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属に属する微生物である、上記（１）の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素。
（３）  下記（ａ）乃至（ｅ）のいずれか１つのタンパク質：
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して５８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列に対して５６％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号６で表されるアミノ酸配列に対して５４％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質；又は
（ｅ）配列番号８で表されるアミノ酸配列に対して５４％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質
。
（４）  前記タンパク質が（ｂ）乃至（ｅ）のいずれか１つであって、但し配列番号２、４、６及び８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は除く、上記（３）のタンパク質。
（５）  上記（３）又は（４）に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
（６）  以下の（ａ）又は（ｂ）のヌクレオチド配列からなる遺伝子：
（ａ）配列番号1で表されるヌクレオチド配列；又は
（ｂ）配列番号1で表されるヌクレオチド配列中の少なくとも連続した１８塩基からなるヌクレオチド配列と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハンブリダイズし、且つ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
（７）  前記（ｂ）における少なくとも連続した１８塩基からなるヌクレオチド配列が、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１及び配列番号２３からなる群から選択される配列の全部又は一部である、上記（６）の遺伝子。【００１６】
また、本発明により、２−デオキシ−シロ−イノソースを（−）−ビボ−クエルシトールに直接変換する触媒活性を有する酵素を生産する方法も提供される。従って、本発明の第２の局面は以下のものを意図する。
（８）  上記（５）乃至（７）のいずれかの遺伝子を含む（−）−ビボ−クエルシトール変換用組換えベクター。
（９）  上記（５）乃至（７）のいずれかの遺伝子又は上記（８）の組み換えベクターを導入した（−）−ビボ−クエルシトール変換用形質転換体。
（１０）  上記（９）の形質転換体を、２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質の生産に適した条件下及び時間培養し、培養物から当該タンパク質を精製して回収することを特徴とする、２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素の生産方法。【００１７】
また、本発明では、上記の酵素を用いた（−）−ビボ−クエルシトールの生産方法が提供される。当該生産方法に関して、本発明者らは、本発明者らが初めて見出した本発明の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素とのアミノ酸配列相同性検索を行い、その結果これまでにイノシトール  ２−デヒドロゲナーゼ活性を有すると推定されていた幾つかのタンパク質が、本発明の新規な２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素と高いアミノ酸同一性を示し、且つ２−デオキシ−シロ−イノソースを（−）−ビボ−クエルシトールに直接変換する触媒活性を有することを見出した。本発明者らの知る限りにおいて、これらのタンパク質が２−デオキシ−シロ−イノソースを（−）−ビボ−クエルシトールに直接変換する触媒活性を有することは報告されていない。【００１８】
従って、本発明の第３の局面は以下のとおりである。
（１１）  上記（１）又は（２）の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素を２−デオキシ−シロ−イノソースと接触させ、ｐＨ５．０〜１０．０の条件下で反応させ、生成した（−）−ビボ−クエルシトールを反応液から回収することを特徴とする、（−）−ビボ−クエルシトールの製造方法。
（１２）  下記（ａ）乃至（ｅ）のいずれか１つのタンパク質：
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して５８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列に対して５６％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号６で表されるアミノ酸配列に対して５４％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質；又は
（ｅ）配列番号８で表されるアミノ酸配列に対して５４％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質、
を２−デオキシ−シロ−イノソースと接触させ、ｐＨ５．０〜１０．０の条件下で反応させ、生成した（−）−ビボ−クエルシトールを反応液から回収することを特徴とする、（−）−ビボ−クエルシトールの製造方法。【００１９】
更に、本発明により、上記の酵素を用いて２−デオキシ−シロ−イノソースを（−）−ビボ−クエルシトールへと変換する方法が提供される。従って、本発明の第４の局面は以下のとおりである。
（１３）  上記（１）又は（２）に記載の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素を２−デオキシ−シロ−イノソースと接触させ、ｐＨ５．０〜１０，０の条件下で反応させることを特徴とする、（２−デオキシ−シロ−イノソースを（−）−ビボ−クエルシトールへと変換する方法。
（１４）  下記（ａ）乃至（ｅ）のいずれか１つのタンパク質：
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して５８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列に対して５６％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号６で表されるアミノ酸配列に対して５４％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質；又は
（ｅ）配列番号８で表されるアミノ酸配列に対して５４％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質、を２−デオキシ−シロ−イノソースと接触させ、ｐＨ５．０〜１０．０の条件で反応させることを特徴とする、２−デオキシ−シロ−イノソースを（−）−ビボ−クエルシトールへと変換する方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により新規な反応を触媒する酵素が提供される。本発明の酵素を用いることで、（−）−ビボ−クエルシトールを簡易且つ効率的に生産することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、２−デオキシ−シロ−イノソースを（−）−ビボ−クエルシトールに変換する能力を有することが確認された微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を示す。
【図２】図２は、本発明の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素（以下、「ＤＯＩ還元酵素」又は「ＤＯＩＲ」と略すことがある。）の各精製段階からの試料をＳＤＳ-ＰＡＧＥした結果を示す写真である。右端のレーンから順に：Ｌａｎｅ  Ｍ：Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  ＸＬ−Ｌａｄｄｅｒ（Ｂｒｏａｄ）；Ｌａｎｅ  １：  粗酵素液；Ｌａｎｅ  ２：  硫安分画；Ｌａｎｅ  ３：  Ｂｕｔｙｌ−トヨパール画分；Ｌａｎｅ  ４：  ＲｅｓｏｕｒｅＱ画分；及びＬａｎｅ  ５：  ゲルろ過画分（アセトン濃縮）；である。
【図３】本発明のＤＯＩ還元酵素の最適ｐＨを示すグラフである。横軸はｐＨを、縦軸は吸光度(３４０ｎｍ）の減少速度を指標にした相対活性示す。グラフ中、黒塗りの四角印はクエン酸緩衝液、白抜きの四角印はリン酸カリウム緩衝液（以下、「ＫＰＢ」と略す。）、黒塗りの丸印はＴｒｉｓ−塩酸緩衝液、及び白抜きの丸印はグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を示す。縦棒は標準偏差を表している。
【図４】図４は、既知のイノシトールデヒドロゲナーゼ配列（各配列の左側にＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．が示されている。）、本発明のＤＯＩ還元酵素のＮ末端側アミノ酸配列（ＤＯＩ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  Ｎｔｅｒｍ）及び本発明のＤＯＩ還元酵素の内部配列（ＤＯＩ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｉｎｔｅｒｎａｌ）のアラインメントを示す。また、本発明のＤＯＩ還元酵素遺伝子を取得するために用いた様々なプライマーの位置を示す。アラインメント中、配列相同性の高い部分を枠で囲んでいる。右向きの矢印（→）はセンス鎖方向のプライマーの位置を、左向きの矢印（←）はアンチセンス鎖方向のプライマーの位置を示す。なお、図中の丸囲い数字は、本文中では括弧囲い数字に対応する。
【図５】図５は、本発明のＤＯＩ還元酵素遺伝子の増幅に用いたＰＣＲの温度サイクル条件を示す。上段はｇｒａｄｉｅｎｔ  ＰＣＲの条件であり、下段はＴＡＩＬ-ＰＣＲの条件である。
【図６】図６は、本発明のＤＯＩ還元酵素遺伝子のクローニングの概要を示すスキームである。
【図７】図７は、本発明のＤＯＩ還元酵素遺伝子の発現用ベクターの構造を示す。
【図８】図８は、ＡＫＣ−０２０株が生産する２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素のアミノ酸配列と、既知のイノシトール脱水素酵素であるＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＥＫＳ７０３５６．１、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＤＵ７２５０８．１、及びＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＥＩＫ６９１５４．１のアミノ酸配列のアラインメントである。それらの既知のイノシトール脱水素酵素が、２−デオキシ−シロ−イノソースを（−）−ビボ−クエルシトールに変換する触媒活性を有することはこれまで報告されていない。
【図９】図９は、本発明のＡＫＣ−０２０株由来のＤＯＩ還元酵素のアミノ酸配列との配列同一性が低く、２−デオキシ−シロ−イノソースを（−）−ビボ−クエルシトールに変換する能力が低いことが明らかにされたイノシトール脱水素酵素遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＧ４４８１６．１）のコード化領域のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。
【図１０】図１０は、本発明のＡＫＣ−２０株由来のＤＯＩ還元酵素のアミノ酸配列との配列同一性が低く、２−デオキシ−シロ−イノソースを（−）−ビボ−クエルシトールに変換する能力が低いことが明らかにされたイノシトール脱水素酵素遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＡＢ１２９２４．１）のコード化領域のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。
【図１１】図１１は、本発明のＡＫＣ−０２０株由来のＤＯＩ還元酵素のアミノ酸配列との配列同一性が低く、２−デオキシ−シロ−イノソースを（−）−ビボ−クエルシトールに変換する能力が低いことが明らかにされたイノシトール脱水素酵素遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＡＢ１５３５８）のコード化領域のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。
【図１２】図１２は、組換え生産した酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥした結果を示し写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
１．  ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素
本発明の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素は、（−）−ビボ−クエルシトールを資化する能力を有する微生物から単離された。従って、本明細書に具体的に記載されたものの他にも、（−）−ビボ−クエルシトールを資化する能力を有する他の微生物から本発明の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素を得ることができる。そのような微生物を選択する方法としては、例えば、（＋）−プロト−クエルシトール、（−）−プロト−クエルシトール、（＋）−ビボ−クエルシトール、（−）−ビボ−クエルシトール、（＋）−エピ−クエルシトール、（−）−エピ−クエルシトール、（＋）−ガラ−クエルシトール、（−）−ガラ−クエルシトール、（＋）−タロ−クエルシトール、（−）−タロ−クエルシトール、（＋）−アロ−クエルシトール、（−）−アロ−クエルシトール、シロ−クエルシトール、ネオ−クエルシトール、ｃｉｓ−クエルシトール、ムコ−クエルシトールのうちの一種以上を唯一の炭素原として培養した際に、良好な生育を示す微生物を分離すればよい。これらのうち、好ましい炭素源としては、直接的な目的物である（−）−ビボ−クエルシトールがより好ましいが、（−）−ビボ−クエルシトール及びその他クエルシトール異性体を含有した混合物を用いても構わない。例えば、特開２０００−４８９０号公報に記載の方法を実施して得られる（＋）−プロト−クエルシトール、（＋）−エピ−クエルシトール及び（−）−ビボ−クエルシトールの混合物や、化学触媒を用いて２−デオキシ−シロ−イノソース（ＤＯＩ）に水添することで得られる（−）−ビボ−クエルシトールとシロ−クエルシトールの混合物を利用してもよい。
【００２３】
より具体的な例としては、土壌サンプルの希釈液を、約０．６％（Ｗ／Ｖ）の（−）−ビボ−クエルシトールとシロ−クエルシトールの混合物を含む寒天平板上に接種する。当該培地には、好ましくは無機窒素原（例えば、約０．６％（Ｗ／Ｖ）の硫酸アンモニウム）及び一般的な微生物の生育に必要な無機塩（例えば、ＭｇＳＯ４、ＫＨ２ＰＯ４及びＮａＣｌ等）を添加してよい。その後、寒天平板を２０〜３０℃程度の温度で１日〜１週間程度培養し、出現したコロニーを単離すればよい。
【００２４】
また、そのようにして単離した微生物の中から、より高い２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を示す菌株を選抜することは有利である。当該目的のために、単離した菌株の細胞を超音波処理により破砕して細胞抽出液を得る。当該抽出液を基質：２−デオキシ−シロ−イノソース（ＤＯＩ）を含む緩衝液と混合し、そこに補酵素：ＮＡＤＨを加えることで酵素反応を開始させる。そして、当該反応液中でＮＡＤＨがＮＡＤＨ＋に変換する速度、つまり２−デオキシ−シロ−イノソースが還元される速度を、反応液が所定時間内に示す吸光度の変化として測定して、より高い２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を示す菌株を選抜することができる。
【００２５】
更に、本発明の酵素は高いジアステレオマー過剰率で（−）−ビボ−クエルシトールを生成すべきである。それにより、生成物から一方のジアステレオマーを分離するという、非効率的な工程を省略し得るからである。従って、選抜した菌株をジアステレオマーの生産性に関して特性化することが好ましい。この目的のために、例えば、細胞抽出液をＤＯＩ及びＮＡＤＨと混合する。また、その反応を実施する際に補酵素再生系としてギ酸脱水素酵素及びギ酸ナトリウムを共存させることで、酵素反応を十分に進行させる。反応後、例えばＳｈｏｄｅｘ  ＫＳ−８０１（商品名。昭和電工株式会社製）によるＨＰＬＣで反応液を分析して、
【化３】
0006487852.tif 000004
を計算することで、高いジアステレオマー過剰率で（−）−ビボ−クエルシトールを生成する菌株を同定することができる。８０％以上のジアステレオマー過剰率で２−デオキシ−シロ−イノソースを（−）−ビボ−クエルシトールに変換できる菌株が好ましく、８５％以上のジアステレオマー過剰率で２−デオキシ−シロ−イノソースを（−）−ビボ−クエルシトールに変換できる菌株がより好ましく、９５％以上のジアステレオマー過剰率で２−デオキシ−シロ−イノソースを（−）−ビボ−クエルシトールに変換できる菌株が最も好ましい。
【００２６】
本発明者らは、上記した方法により菌株の単離、選抜及び特性化を行った結果、６株のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、１株のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｅｄｉｍｉｎｉｃｏｌａ、２株のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｅｒｒａｅ、及び１株のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．が、ＤＯＩから８０％以上の高いジアステレオマー過剰率で（−）−ビボ−クエルシトールを生産する能力を有していることを見出した。
【００２７】
従って、本発明の（−）−ビボ−クエルシトールを資化する能力を有する微生物は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属又はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属の微生物からスクリーニングすることが有利であり得る。特に好ましい微生物としては、本発明者らが単離し命名した、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｅｒｒａｅ  ＡＫＣ−０２０株及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＡＫＣ−０１９株が挙げられる。
【００２８】
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｅｒｒａｅ  ＡＫＣ−０２０株は、２０１３年１１月１日に、ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７４５として、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）により受託されている。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＡＫＣ−０１９株は、２０１３年１０月２４日に、ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７４０として、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）により受託されている。
【００２９】
更に本発明者らは、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｅｒｒａｅ  ＡＫＣ−０２０株から本発明の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素を精製することに成功した。簡単にいうと、ＡＫＣ−０２０株の培養細胞を超音波破砕し、その上清に硫酸アンモニウムとＫＰＢを加えて３０％飽和硫酸アンモニウム溶液とした。当該３０％飽和硫酸アンモニウム溶液の上清を疎水クロマトグラフィーに通し、硫酸アンモニウムの濃度勾配で活性画分を溶出した。次ぎに活性画分をＭＯＰＳ緩衝液で透析後、陰イオン交換クロマトグラフィーに付し、ＮａＣｌの濃度勾配で活性画分を溶出した。最後に、ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。ゲル濾過クロマトグラフィーにおいては、活性画分は分子質量が約１３０ＫＤａに対応する保持時間で溶出したが、その後、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより更に純度を確認したところ、約３６ＫＤａに単一のバンドが認められた。従って、ＡＫＣ−０２０株が生産する本発明の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素は、溶液中でホモ４量体を形成していることが推定される。
【００３０】
更に、本発明者らはＡＫＣ−０２０株が生産する本発明の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素の諸性質を調べた。当該酵素はｐＨ７．０〜９．０で最大活性を示した。また、当該酵素は、酸化活性評価、つまり２−デオキシ−シロ−イノソースを還元して（−）−ビボ−クエルシトールを生成するのとは逆反応の評価において、ミオイノシトールより（−）−ビボ−クエルシトールに対して高い基質特異性を示した。
【００３１】
従って、本発明の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素は、（−）−ビボ−クエルシトールを資化する能力を有する微生物由来であって、以下の特性を有するものとして定義できる：
（ａ）２−デオキシ−シロ−イノソースを（−）−ビボ−クエルシトールに変換する触媒活性を有する；
（ｂ）ｐＨ７．０〜９．０で最大活性を示す；及び
（ｃ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した当該酵素のポリペプチド部分の分子質量が３６ｋＤａである。
【００３２】
上記に加えて、本発明の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素は、以下の特性を有するものとしても定義できる：
（ｄ）８０％以上のジアステレオマー過剰率で２−デオキシ−シロ−イノソースを（−）−ビボ−クエルシトールに変換する；及び
（ｅ）酸化活性評価において、ミオイノシトールより（−）−ビボ−クエルシトールに対して高い基質特異性を示す。
【００３３】
２.  ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質
本発明者らは、更に、ＡＫＣ−０２０株が生産する２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素のＮ末端配列及び内部配列、並びにそれと関連性があると想定された既知のイノシトールデヒドロゲナーゼ（以下、「ＩＤＨ」と略すことがある。）遺伝子のコード化配列を考慮して、およそ２０個の縮重プライマーを作製し、ＡＫＣ−０２０株が生産する２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子を取得することに成功した。そして、同遺伝子のコード化領域から、ＡＫＣ−０２０株が生産する２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素のアミノ酸配列を以下のように同定した：
【化４】
0006487852.tif 000005
【００３４】
従って、上記アミノ酸配列を有するタンパク質が本発明の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を示すことは明らかであるが、それとの均等物を本発明の目的のために使用できることも当業者は理解するであろう。その目的のために、本発明者らは更に上記の配列番号２と相同性を示す既知アミノ酸配列を検索した。そして、本発明者らは検索された配列を有するタンパク質を大腸菌内で組換え発現させ、それらのアミノ酸配列を有するタンパク質の酵素活性を測定した。その結果、イノシトール脱水素酵素の幾つかは、本発明の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を示すことが判明した。
【００３５】
より具体的にいうと、配列番号２と５８％以上のアミノ酸配列同一性を示す以下の３つの配列（図８参照）を有するタンパク質は、ＡＫＣ−０２０株が生産する２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素と同程度の２−デオキシ−シロ−イノソースを（−）−ビボ−クエルシトールに変換する触媒活性を示した。
【化５】
0006487852.tif 000006
【００３６】
しかしながら、上記３つのイノシトール脱水素酵素のいずれについても、これまでに、２−デオキシ−シロ−イノソースを（−）−ビボ−クエルシトールに変換する触媒活性を有することは報告されていない。更に、配列番号２とより低い相同性（５０％以下）を示すイノシトール脱水素酵素では、２−デオキシ−シロ−イノソースを（−）−ビボ−クエルシトールに変換する触媒活性が僅かであるか、全くないことが判明した。
【００３７】
従って、本発明の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質は、配列番号２に表されるアミノ酸配列に対して５８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり得る。配列番号２に表されるアミノ酸配列に対して６８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が好ましく、７９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質がより好ましく、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が更に好ましく、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質がいっそう好ましく、９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が特に好ましい。
【００３８】
また、本発明の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質は、配列番号４に表されるアミノ酸配列に対して５６％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり得る。配列番号４に表されるアミノ酸配列に対して６４％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が好ましく、７９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質がより好ましく、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が更に好ましく、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質がいっそう好ましく、９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が特に好ましい。
【００３９】
更に、本発明の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質は、配列番号６に表されるアミノ酸配列に対して５４％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり得る。配列番号６に表されるアミノ酸配列に対して６５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が好ましく、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質がより好ましく、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が更に好ましく、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質がいっそう好ましく、９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が特に好ましい。
【００４０】
そして、本発明の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質は、配列番号８に表されるアミノ酸配列に対して５４％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり得る。配列番号８に表されるアミノ酸配列に対して６４％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が好ましく、６８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が好ましく、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質がより好ましく、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が更に好ましく、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質がいっそう好ましく、９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が特に好ましい。
【００４１】
上記において、配列番号４と配列番号６は５６％の同一性を示し、配列番号４と配列番号８は６４％の同一性を示し、配列番号６と配列番号８は５４％の同一性を示す。
【００４２】
なお、本明細書において、アミノ酸配列の同一性は、二つの配列を最適の態様で整列させた場合に、二つの配列間で共有する一致したアミノ酸の個数の百分率で示される（一致した位置のアミノ酸の個数／整列させたアミノ酸の個数×１００）。インターネットサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎ／ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｇｉ−ｇｉｎ／ＢＬＡＳＴで実装可能なＢＬＡＳＴアルゴリズムによって算出される。
【００４３】
加えて、本発明のＡＫＣ−０２０株が生産する２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素と５８％以上のアミノ酸配列同一性を示す上記３つイノシトール脱水素酵素との間では、以下の８つの部分配列が高度に保存されていた（図８参照）。従って、本発明の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質はそれら８つの部分配列のうちの１つ以上を有していることが好ましい。
【化６】
0006487852.tif 000007
【００４４】
更に、２つのタンパク質分子のアミノ酸配列が完全に同一でなくとも、両方の分子が実質的に類似の構造を有する場合、それらが同じ生物活性を示すことが知られている。例えば、ロイシンをバリンに、リシンをアルギニンに、グルタミンをアスパラギンに置換してもタンパク質の機能を変化させないこともありうる。従って、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質も本発明の目的のために好適に使用し得る。
【００４５】
３.  遺伝子
後記のとおり、本発明の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素及び当該酵素活性を有するタンパク質を生産するにあたり、当該酵素又はタンパク質をコードする遺伝子を使用することは有利である。
【００４６】
例えば、本発明者らがＡＫＣ−０２０株から分離し配列決定した２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子で適切な宿主細胞を形質転換して、当該酵素を効率的に生産させることができる。当該遺伝子のコード化領域のヌクレオチド配列を以下に示す。
【化７】
0006487852.tif 000008
【００４７】
また、本発明の目的に利用できる２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子は、自然界で発生し得るすべての変異や、人工的に導入された変異及び修飾を有していてもよい。例えば、特定のアミノ酸をコードする種々のコドンには余分のコドン（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）が存在することが知られている。そのため本発明においても同一のアミノ酸に最終的に翻訳されることになる代替コドンを利用してよい。つまり、遺伝子コードは縮重しているので、ある特定のアミノ酸をコードするのに複数のコドンを使用でき、そのためアミノ酸配列は任意の１セットの類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドでコードされ得る。そのセットの唯一のメンバーだけが天然型酵素の遺伝子配列に同一であるが、ミスマッチのあるＤＮＡオリゴヌクレオチドでさえストリンジェントな条件下で天然型配列にハイブリダイズでき、天然型配列をコードするＤＮＡを同定、単離でき、更にそのような遺伝子も本発明において利用できる。なお、本明細書において、ストリンジェントな条件とは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に記載の、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温しハイブリダイズさせ、その後、例えば２ｘＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ及び６８℃で洗浄する条件をいう。
【００４８】
前記のとおり、本発明者らが発見した２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素と５８％以上のアミノ酸配列同一性を示す既知の３つのイノシトール脱水素酵素（ＩＤＨ）が存在した。そして、本発明者らは、これら３つのＩＤＨも、これまでに報告されていなかった２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を示すことを初めて明らかにした。更に、本発明者らは、本発明者らが発見した２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素のアミノ酸配列と当該３つのＩＤＨのアミノ酸配列のアラインメントにより、前記８つの領域でアミノ酸配列が高度に保存されていることを見出した。従って、当該８つの領域のいずれかのアミノ酸配列をコードするヌクレオチドの全長またはその一部に相補的なＤＮＡをプローブとして用いることで、本発明の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を示すタンパク質をコードする遺伝子を容易に分離できることを当業者は理解するであろう。つまり、典型的には下記の８つのヌクレオチド配列のいずれかに相補的な配列の全長又はその一部、例えば連続した１５塩基、１８塩基、２０塩基からなるＤＮＡを、本発明の遺伝子を検索するプローブとして利用することが好ましい。
【化８】
0006487852.tif 000009
【００４９】
更に、ほとんどの生物は特定のコドン（最適コドン）のサブセットを優先的に用いることが知られているので（Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ．１０５、ｐｐ．６１−７２、１９９１等）、宿主微生物に応じて「コドン最適化」を行うことは本発明においても有用であり得る。従って、本発明の遺伝子は、配列番号１で表されるヌクレオチド配列において、１又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、及び／又は付加されたヌクレオチド配列であって、且つ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有していてもよい。
【００５０】
４.  ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素の生産方法
本発明の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素及び２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質は、遺伝子組換え技術を利用して容易に製造することができる。典型的には、それらの酵素タンパク質をコードする遺伝子が発現カセットとして宿主細胞に導入される。そして、そのような形質転換宿主細胞内（以下、「形質転換体」ともいう。）で安定的にタンパク質を発現させ得る。
【００５１】
本明細書において、発現カセットとは、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子に機能的に結合された転写および翻訳をレギュレートする塩基配列を含むヌクレオチドを意味する。典型的に、本発明の発現カセットは、コード配列から５’上流にプロモーター配列、３’下流にターミネーター配列、場合により更なる通常の調節エレメントを機能的に結合された状態で含み、そのような場合に、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子が宿主細胞に「発現可能に導入」される。
【００５２】
プロモーターは、構造性プロモーターであるか調節プロモーターであるかに拘わらず、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させ、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列と定義される。強いプロモーターとはｍＲＮＡ合成を高頻度で開始させるプロモーターであり、本発明においても好適に使用される。ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ又はＴＲＣ系、λファージの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、解糖系酵素（例えば、３−ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド‐３‐リン酸脱水素酵素）、グルタミン酸デカルボキシラーゼＡ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼに対するプロモーター等が、その宿主細胞の性質等に応じて利用可能である。プロモーターおよびターミネーター配列のほかに、他の調節エレメントの例として挙げられ得るのは、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などである。好適な調節配列については、例えば、”Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５”、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９０）に記載されている。
【００５３】
上記で説明した発現カセットは、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、コスミド、又は線状もしくは環状のＤＮＡ等から成るベクターに組み入れて（つまり、組換えベクター）、宿主細胞中に挿入される。プラスミドおよびファージが好ましい。これらのベクターは、宿主細胞中で自律複製されるものでもよいし、また染色体により複製されてもよい。好適なプラスミドは、例えば、大腸菌のｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１、λｇｔ１１又はｐＢｄＣＩ；桿菌のｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４又はｐＢＤ２１４；コリネバクテリウム属のｐＳＡ７７又はｐＡＪ６６７などである。これらの他にも使用可能なプラスミド等は、”Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８５に記載されている。ベクターへの発現カセットの導入は、適当な制限酵素による切り出し、クローニング、及びライゲーションを含む慣用の方法によって可能である。
【００５４】
上記ようにして本発明の発現カセットを有する組換えベクターが構築された後、該ベクターを宿主細胞に導入して形質転換するために適用できる手法として、例えば、共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどの慣用のクローニング法およびトランスフェクション法が使用される。それらの例は、「分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｆ．  Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｐｕｂｌ．Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９７、またはＳａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュアル」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９に記載されている。
【００５５】
本発明の宿主細胞としては、原核細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属やＰｉｃｈｉａ属等の酵母、ＳＦ９等の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ７等の動物細胞があげられる。好ましい宿主は、エッシェリシア、シュードモナス、バチルス、ゲオバチルス、メタノモナス、メチロバシラス、メチロフィリウス、プロタミノバクター、メチロコッカス、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、ザイモモナスおよびリステリア属の細菌である。特に、工業的発酵生産において利用が確立している、大腸菌、バチルス属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ザイモモナス属細菌がいっそう好ましい。大腸菌は、その迅速な生育能力や発酵管理の容易さ故に、とりわけ好ましい本発明の宿主微生物の例である。
【００５６】
上記のようにして得られる形質転換微生物は、本発明の酵素タンパク質の生産のために、前記形質転換微生物の生育に適した条件下で培養される。各種の宿主微生物細胞に由来する形質転換体のための好適な培地組成、培養条件、培養時間は当業者に公知である。培地は、1つ以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン、及び場合により微量元素乃至ビタミン等の微量成分を含む天然、半合成、合成培地であってよい。しかし、使用する培地は、培養すべき形質転換微生物の栄養要求を適切に満たさなければならないことは言うまでもない。更に培地は、形質転換微生物が有用な付加的形質を発現する場合、例えば抗生物質への耐性マーカーを有する場合、対応する抗生物質を含んでいてよい。それにより、発酵中の雑菌による汚染リスクが低減される。なお、付加的形質に関連して、後の精製が容易になるように、本発明の酵素及びタンパク質を、他のタンパク質やタグ、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡ、ヘキサヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ等との融合タンパク質として形質転換体に生産させることも可能である。生産させた融合型は、適当なプロテアーゼ、例えばトロンビン等を用いて切り出すことが可能である。
【００５７】
培養は、バッチ式であっても連続式であってもよい。また、いずれの場合にも、培養の適切な時点で追加の前記炭素源等を補給する形式であってもかまわない。更に、培養は、好適な温度、酸素濃度、ｐＨ等を維持しながら継続されるべきである。一般的な微生物宿主細胞に由来する形質転換体の好適な培養温度は、通常１５℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜３７℃の範囲である。宿主微生物が好気性の場合、発酵中の適切な酸素濃度を確保するために振盪（フラスコ培養等）、攪拌／通気（ジャー・ファーメンター培養等）を行う必要がある。それらの培養条件は、当業者にとって容易に設定可能である。
【００５８】
次いで、本発明の酵素タンパク質の生産に適した条件下で適切な時間培養された培養物から、本発明の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質を精製する。つまり、当該タンパク質が形質転換微生物の細胞内に蓄積される場合には培養細胞からタンパク質を精製すればよく、それが形質転換微生物の細胞外に放出される場合には培養上清からタンパク質を精製すればよい。幾つかの精製方法が利用できる。例えば、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーの種々の組合せ、又は個々の適用により、細胞溶解液又は抽出液或いは培養上清から本発明の酵素タンパクを精製できる。
【００５９】
本発明の酵素タンパク質の精製に関する具体的な例としては、培養細胞を超音波破砕し、その上清に硫酸アンモニウムを加えて３０％飽和硫酸アンモニウム溶液とする。当該３０％飽和硫酸アンモニウム溶液の上清を疎水クロマトグラフィーに通し、硫酸アンモニウムの濃度勾配で活性画分を溶出する。次に活性画分を透析後、陰イオン交換クロマトグラフィーに付し、ＮａＣｌの濃度勾配で活性画分を溶出する。最後に、ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製することができる。
【００６０】
５.  （−）−ビボ−クエルシトールの製造方法
本発明の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質を利用することで、極めて簡便且つ効率的に２−デオキシ−シロ−イノソースから（−）−ビボ−クエルシトールを製造することができる。つまり、本発明者らが発見した配列番号２のアミノ酸配列を有する２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素を利用できるのは勿論のこと、これまでにイノシトール脱水素酵素活性を示すことしか知られていなかったが、本発明者らが初めて２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性をも有していたことを明らかにした、配列番号４、６及び８で各々示されるタンパク質も（−）−ビボ−クエルシトールの製造方法において利用可能である。なお、それらの遺伝子のコード化領域は、それぞれ以下のとおりである。
【化９】
0006487852.tif 000010
【００６１】
本発明の当該酵素反応は、本発明の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素が最大活性を示すｐＨであるｐＨ約５．０〜約１０．０の範囲の緩衝液内で行えばよい。前記ｐＨは、好ましくは５．５〜９．５であり、最も好ましくは７．０〜９．０である。例えば、そのようなｐＨ範囲に調整したＫＰＢやＴｒｉｓ−塩酸緩衝液を用いることができる。反応に使用する本発明の酵素の量は、基質濃度や所望の反応時間等により適宜選択できるが、通常、５〜５００Ｕ／Ｌであればよい。
【００６２】
当該酵素反応の基質である２−デオキシ−シロ−イノソースは、例えば、ＷＯ２０１０／１０９９１６号パンフレット、ＷＯ１０／０５３０５２号パンフレット及びＷＯ０６／１０９４７９号パンフレット等に記載の方法により容易に得ることができる。当該基質を前記緩衝液に所望の濃度で溶かせばよく、１０〜５００ｍＭを例示できるが、これに限定されない。一方、本発明の還元酵素反応を行うためには、補酵素としてＮＡＤＨを反応系に添加することが必須である。添加するＮＡＤＨの量は基質の量より過剰であればよいが、通常、基質の１．２〜２倍程度であれば十分である。反応時間は、反応液中の（−）−ビボ−クエルシトールの濃度を経時的にモニターし、その生成量が最大となった時点とすればよいが、より簡便には、ＮＡＤＨがＮＡＤＨ＋に変換することで変化する緩衝液の吸光度（例えば、波長３４０ｎｍ）を観察し、その変化が起こらなくなった時点とすることもできる。好適な反応時間の例としては、２０分〜１２０時間が挙げられ、      酵素の安定性の観点から、３０分〜６０時間が好ましく、３０分〜１０時間がより好ましく、３０分〜３時間が最も好ましい。反応温度は、本発明の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質の最大活性に照らして決定すればよく、典型的には約１５〜４０℃、好ましくは２５〜３０℃であり得る。
【００６３】
上記の酵素反応物から（−）−ビボ−クエルシトールを極めて簡単に且つ高純度で単離することができる。つまり、本発明の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有するタンパク質はきわめて高い収率及びジアステレオマー過剰率で２−デオキシ−シロ−イノソースを（−）−ビボ−クエルシトールに変換するから、クロマトグラフィーのような煩雑な工程の使用を回避し得る。例えば、反応が終了した反応液を適宜濃縮し、低級アルコールを加えて再結晶するだけで（−）−ビボ−クエルシトールを単離することができる。具体的な例としては、（−）−ビボ−クエルシトールの含有量が２０〜５０％（Ｗ/Ｖ）になる程度に酵素反応液を濃縮し、そこに０．５〜２倍量のエタノールを添加する方法が挙げられる。
【００６４】
以上の説明を与えられた当業者は、本発明を十分に実施できる。以下、更なる説明の目的として実施例を与え、従って、本発明は当該実施例に限定されるものではない。なお、本明細書において得に断りのない限り、「％」は質量／容量の百分率（％（Ｗ／Ｖ））を表す。また、ヌクレオチド配列は５’から３’方向に向けて記載される。
【実施例】
【００６５】
１．（−）−ビボ−クエルシトール資化菌のスクリーニング
０．８５％食塩滅菌水に土壌を約０．１ｇ加え、よく撹拌した。その後、３時間静置し、砂や植物の根等を沈殿させ、０．１ｍｌの上澄み液をクエルシトール寒天培地（組成は表１に示す。）に塗布した。３０℃で１−２日間培養し、生育した菌の単離作業をＬＢ寒天培地（組成は表１に示す。）によって行った。シングルコロニーにした菌株は、スラント培地（クエルシトール寒天培地）に植菌し３０℃で培養後、４℃で保存した。本実験を６３回実施することで、１０９株の土壌菌を取得した。
【表１】
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【００６６】
２．２−デオキシ−シロ−イノソース（ＤＯＩ）を（−）−ビボ−クエルシトールへと変換する能力を有する微生物の取得
上記で取得した１０９株の土壌菌をそれぞれ２ｍＬのクエルシトール培地（組成は、上記寒天培地から寒天を除いた組成）に植菌し、３０℃で１〜２日間培養した。これらのうち４５株については良好な生育が認められたため、培養液を遠心（１，５０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）し、集菌した。集菌した菌体を２ｍＬの２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁して超音波破砕装置（株式会社トミー精工、ＵＤ−２００、出力：６０Ｗ、周波数：２０ｋＨｚ）で３０秒間の処理を５回繰り返し、菌体を破砕し、遠心（１，５０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）して上清を回収した。回収液を粗酵素液とし、以下の手順で酵素反応評価を行った。【００６７】
（１）酵素反応の評価
反応液の組成は以下のとおりである。なお、使用した粗酵素液は１０μｌであった。
【表２】
0006487852.tif 000012
【００６８】
酵素反応は補酵素ＮＡＤＨがＮＡＤ＋に変換する量を分光光度計で定量する事で測定した。すなわち、ＤＯＩ以外の反応組成液（９９０μｌ）をキュベットに取り、２５℃で約５分間予備加温した。ＤＯＩ溶液（１０μｌ）を加えた後、速やかに混和し、水を対照に２５℃に制御された分光光度計（島津製作所、ＵＶ−２５５０）を用いて２分間の吸光度（波長３４０ｎｍ）の減少速度を測定し、１分間当たりの吸光度減少量を算出した。次に波長３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨの分子吸光係数を６．２２ｍＭ−１ｃｍ−１とし１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨが減少する量を１ｕｎｉｔ（Ｕ）と定義して、粗酵素液１ｍＬ当たりのＵを算出して各菌株の評価を行った。これらの結果、０．２Ｕ／ｍＬ（粗酵素液）を超える活性を示す１０株の微生物を取得することに成功した。【００６９】
（２）ジアステレオマー過剰率の評価
次にこれら１０株から上記と同様に粗酵素液を取得し、ＤＯＩから（−）−ビボ−クエルシトールへの反応におけるジアステレオマー過剰率を評価した。具体的に、ギ酸脱水素酵素（以下ＦＤＨ、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社  製品番号２４４６７８）による補酵素再生系を用いて、ＤＯＩ変換を行った。表３に変換反応液の組成を示す。反応液は３０℃で振盪しながら３時間インキュベートした。反応終了後、遠心（１５，０００ｒｐｍ，１５分間）し、上清のＨＰＬＣ分析（条件は表４に示す。）により（−）−ビボ−クエルシトールとシロ−クエルシトールの定量を行った。
【表３】
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【００７０】
【表４】
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【００７１】
ジアステレオマー過剰率の計算は、以下の式で算出した。１０株すべてにおいて、８０％以上の高いジアステレオマー過剰率を達成していた。
【化９】
0006487852.tif 000015
【００７２】
３．微生物の同定
微生物の同定のため、ゲノムの抽出を行った。４ｍｌのＬＢ培地で培養・集菌後、０．７２ｍｌの０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、リゾチームを添加した。３７℃で３０分間インキュベート後、さらに０．０８ｍｌの２Ｍ  ＮａＣｌ及びプロティナーゼＫ、０．０８ｍｌの１０％ＳＤＳ添加し３７℃で１０分間処理した。トリス飽和フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（比率５０：４８：２）溶液を等量添加し、激しく攪拌後、遠心（１，５０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）した。上層を新しいチューブに移し、２倍量のエタノールを添加し、遠心（１，５０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）して上清を捨てた。７０％エタノールでリンスを２回行い、０．１ｍｌの０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁し、ＲＮａｓｅを加え、３７℃で１時間処理した。０．４ｍｌの０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と０．１ｍｌの２Ｍ  ＮａＣｌを加え、フェノール／クロロホルム抽出を繰り返し、エタノール沈殿後、７０％エタノールでリンスを２回行った。得られゲノムを０．５ｍｌの０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁した。得られたゲノムを鋳型に１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の一部配列をＰＣＲで増幅し、その一部塩基配列をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて決定した。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の増幅条件を表５に示す。【００７３】
【表５】
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【００７４】
ＢＬＡＳＴ  ｓｅａｒｃｈ（検索対象となるデータベースとして１６Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓを使用。）を用いた１６ＳｒＲＮＡ遺伝子による同定の結果、先に取得した１０株の微生物は、６株がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、１株がＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｅｄｉｍｉｎｉｃｏｌａ、２株がＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｅｒｒａｅ、最後の１株がＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．として帰属された。これらの菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を図１中に、それぞれ配列番号７４〜８３として示した。また、これら菌株のうち、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｅｒｒａｅに属する菌株の一株をＡＫＣ−０２０株、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．に属する菌株の一株をＡＫＣ−０１９株と命名した。【００７５】
４．ＤＯＩ還元酵素の精製  
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｅｒｒａｅ  ＡＫＣ−０２０株をＬＢ液体培地を用いて３０℃で一晩振とう培養し、これを前培養液とした。１ｍｌの前培養液を１００ｍｌの酵母エキス／Ｔｒｙｐｔｏｎｅ／ＤＯＩ培地（組成は表６に示す。）に加えて本培養を行った。本培養は５００ｍｌ容積の坂口フラスコに１００ｍｌの培地を入れ、回転数１２０ｒｐｍ、３０℃、２４時間の条件で行った。
【表６】
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【００７６】
１００ｍｌの培養液を集菌し、２５ｍｌの０．０２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）（ｐＨ７．０）に再懸濁後、氷上で３０秒の間隔で５分間超音波破砕（株式会社トミー精工、超音波破砕装置ＵＤ−２００、出力：２００Ｗ、周波数：２０ｋＨｚ）を行った。破砕液を遠心（１５，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）して上清に５．４ｇの硫酸アンモニウムとＫＰＢを加えて３５ｍｌの３０％飽和硫安濃度溶液とした。氷上で４０分間冷却後に遠心（１，５０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）して上清を硫安沈殿画分とした。【００７７】
次に疎水クロマトグラフィーを行った。使用カラム剤はトヨパールＢｕｔｙｌ−６５０Ｍ（東ソー株式会社）であり、使用したオープンカラムのサイズはφ２．５ｃｍ×６．５ｃｍ、カラム体積は約３０ｍｌ、流速は約０．８ｍｌ／分、フラクションサイズは約５ｍｌ／本、流量４００ｍｌで３０％から０％の硫酸アンモニウム濃度勾配にして溶出した。【００７８】
疎水クロマトグラフィーの画分をＭＯＰＳ緩衝液で透析後、次に陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。使用カラムはＲＥＳＯＵＲＣＥ  Ｑ  １ｍｌ（ＧＥヘルスケア）、流速は１ｍｌ／分、フラクションサイズは１ｍｌ／本、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて流量２０ｍｌで０Ｍから０．５ＭのＮａＣｌ濃度勾配で溶出した。使用機器ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒ  （ＧＥヘルスケア）を用いた。【００７９】
最後にゲルろ過クロマトグラフィーを行った。使用カラムはＴＳＫ−ＧｅｌＧ３０００ＳＷ（カラムサイズ２１．５ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ、東ソー社製）、流速は１ｍｌ／分、フラクションサイズは１ｍｌ／本、０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む０．０２Ｍ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）で溶出した。分子量マーカ−としてオリエンタル酵母株式会社製のＭＷ−Ｍａｒｋｅｒ（商品名）を用いた。使用機器として島津製作所製ＨＰＬＣを用いた。【００８０】
酵素液中のタンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄ法によって測定した。タンパク質定量試薬にはＰｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）、スタンダードにはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を用いた。Ｂ．ｔｅｒｒａｅ  ＡＫＣ−０２０株はＤＯＩ還元酵素を発現させるためにＤＯＩ含む培地で培養した。培養の結果、１００ｍｌの培地で湿重量０．３ｇの菌体が得られた。ＤＯＩに対する全活性は７８．７Ｕであった。硫安分画、Ｂｕｔｙｌ−トヨパール６５０Ｍ、ＲｅｓｏｕｒｅＱ、ＴＳＫ−ＧｅｌＧ３０００ＳＷでＤＯＩ還元酵素の精製を行った際の精製結果とＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果をそれぞれ、表７及び図２に示す。【００８１】
【表７】
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【００８２】
ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷカラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーの結果より、精製酵素の保持時間は７６．６６分であった。また同ＨＰＬＣ条件でのＭＷ−Ｍａｒｋｅｒ（馬心筋チトクロームｃ（分子量１２，４００）酵母ミオキナーゼ（分子量３２，０００）酵母エノラーゼ（分子量６７，０００）豚心筋乳酸脱水素酵素（分子量１４２，０００）酵母グルタミン酸脱水素酵素（分子量２９０，０００））のそれぞれの保持時間は１０５．４４、９４．８９、８６．４０、７６．７０、６５．０１分であった。よって水溶液中の精製酵素は、分子質量が約１３０ｋＤａと同定された。一方、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（図２）より、モノマーの分子質量は約３６ｋＤａのため、本酵素はホモ４量体であると推定される。【００８３】
５．精製ＤＯＩ還元酵素の諸性質
（１）最適ｐＨ
ＤＯＩの還元は補酵素ＮＡＤＨがＮＡＤ＋に変換する量を分光光度計で定量する事で測定した。０．３μｍｏｌのＮＡＤＨを含む各ｐＨの０．１Ｍの緩衝液９８０μＬに１０μＬ酵素液を加えて、２５℃で５分間予備加温を行った。０．１ＭのＤＯＩを１０μＬ加えてから素早く混合し、分光光度計で２分間の吸光度（波長３４０ｎｍ）の減少速度を測定し、各ｐＨにおける活性を比較した。結果を図３に示した。【００８４】
（２）基質特異性
還元反応と逆方向に進行する際のＤＯＩの基質特異性を、補酵素ＮＡＤ＋がＮＡＤＨに変換する量を分光光度計で定量する事で測定した。１．０μｍｏｌのＮＡＤ＋を含む０．１Ｍの緩衝液９８０μＬに１０μＬ酵素液を加えて、２５℃で５分間予備加温を行った。０．１Ｍの各基質を１０μＬ加えてから素早く混合し、分光光度計で２分間の吸光度（波長３４０ｎｍ）の増加速度を測定し、各基質による活性を比較した。波長３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨの分子吸光係数を６．２２ｍＭ−１ｃｍ−１とし１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨが変換する量を１ｕｎｉｔ（Ｕ）と定義した。結果を表８に示した。表中、Ｎ．Ｄ．は反応が認められなかったことを表す。
【表８】
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【００８５】
（３）Ｋｍ値及びＶｍａｘ
酵素活性は、補酵素ＮＡＤＨまたはＮＡＤ＋が変化する量を分光光度計で定量する事で測定した。波長３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨの分子吸光係数を６．２２ｍＭ−１ｃｍ−１とし１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨが変換する量を１ｕｎｉｔ（Ｕ）と定義した。またＢｒａｄｆｏｒｄ法によって酵素液中のタンパク質濃度を測定した。０．０２、０．０４、０．０６、０．０８、０．１、０．２、０．３、１．０、２．０ｍＭの基質濃度における活性を測定してＤＯＩに対するＫｍ値及びＶｍａｘを算出した。また、０．０４、０．０６、０．０８、０．１、０．２ｍＭの補酵素濃度における活性を測定してＮＡＤＨに対するＫｍ値を算出した。更に、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０ｍＭのクエルシトール濃度における活性を測定し、クエルシトールに対するＫｍ値及びＶｍａｘを算出した。同じく、０．０２ｍＭから０．０４、０．０６、０．１、０．２、０．３ｍＭのＮＡＤ＋濃度における活性を測定してＮＡＤ＋に対するＫｍ値を算出した。結果を表９に示した。
【表９】
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【００８６】
６．ＤＯＩ還元酵素遺伝子（ＤＯＩＲ遺伝子）のクローニング
論文等によりｉｎｏｓｉｔｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＩＤＨ）活性を持つことが報告されている既知酵素のアミノ酸配列をデータベースより取得した。これらのアミノ酸配列の相同性の高い領域とＤＯＩＲのＮ末端アミノ酸配列および内部アミノ酸配列により、合計８か所の縮重プライマー設計領域を選抜した。作成したアライメントおよび縮重プライマー配列を表１０及び図４に示す。ＰＣＲ条件を表１１及び図５に示す。【００８７】
詳しく説明すると、Ｂ．ｔｅｒｒａｅ  ＡＫＣ−０２０株より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にして、上記のように設計した縮重プライマーを用いて１ｓｔ  ＰＣＲ（アニール温度条件を４５〜６０℃の範囲のｇｒａｄｉｅｎｔ  ＰＣＲ）を行った。様々なプライマーの組合せによるＰＣＲを行った結果、ＤＯＩＲｄｇＦ１／ＤＯＩＲｄｇＲ８  のプライマーセット（表１０と図４の（１）及び（１７）で、アニーリング温度６０℃程度で約９００ｂｐのバンドの増幅が確認できた。この増幅断片を鋳型に用い、内部領域のプライマーを用いた２ｎｄ  ＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）による増幅断片の絞り込みを行った結果、ＤＯＩＲｄｇＦ１／ＤＯＩＲｄｇＲ７Ｑのプライマーセット（表１０と図４の（１）及び（１５））において約７００ｂｐの断片が増幅し、この塩基配列がコードするアミノ酸配列は既知のＩＤＨアミノ酸配列と３４〜５３％程度の相同性を示した。【００８８】
そこで、取得したＤＯＩＲ遺伝子の部分断片の配列情報を基にプライマー（（１８）〜（２３））を作製し、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍａｌ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ  ＰＣＲ）を実施した（それらのプライマーも表１０に示した。）。なお、下流領域のクローニングのためのｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒに（１８）〜（２０）を用いｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒに（２５）を用いたＴＡＩＬ−ＰＣＲと、ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒに（３１）を用いｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒに（２１）〜（２３）を用いたＴＡＩＬ−ＰＣＲにより、それぞれ下流領域と上流領域の配列を含むＰＣＲ産物が得られた。これらの塩基配列情報からＤＯＩＲのＯＲＦを含む約３．０ｋｂの塩基配列が推定できた。ＤＯＩＲ遺伝子のＯＲＦの上流の約１５０ｂｐと下流の約７０ｂｐの位置の配列を用いてプライマー（表１０と図４の
（３２）及び（３３））を作製し、再度Ｂ．ｔｅｒｒａｅゲノムＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲを行い、ＤＯＩＲ遺伝子のＯＲＦ全長を含む約１．２ｋｂの領域を増幅した。この増幅断片を精製し、ダイレクトシークエンスによりＤＯＩＲ遺伝子配列を確定した。
【表１０】
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【００８９】
【表１１】
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【００９０】
７．ＤＯＩＲ遺伝子と既知遺伝子の相同性
ＤＯＩＲ遺伝子は全長９９０ｂｐ、３３０アミノ酸残基からなるＯＲＦを有していた（配列番号１及び２）。アミノ酸配列から推定される分子量は３６１９５．１２であり、またそのアミノ酸配列中には精製酵素の配列解析から得られたＮ末端”ＭＩＲＩＡＶＬＧＡＧＲＩ”（配列番号６６）及び内部アミノ酸配列”ＡＥＬＥＡＦＶＤＡＬＮＴＮ”（配列番号６７）を含んでいた。ＤＯＩＲのアミノ酸配列をＢＬＡＳＴ相同性検索（検索対象となるデータベースとしてUniProtKB/SwissProtを使用。）した結果、ある種の微生物由来ｉｎｏｓｉｔｏｌ  ２−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＩＤＨ）と約８０％の相同性を有する例がある事が分かった。ただし、これらの既知配列はアミノ酸配列の相同性からＩＤＨと分類されているものが大半であり、実際にＩＤＨ活性が報告されているものは表１２に示した程度である。
【表１２】
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【００９１】
８．発現用ベクターｐＥＴｄｕｅｔ−ＤＯＩＲの構築
大腸菌によるＤＯＩＲの異種宿主発現を行うため、ＤＯＩＲ発現用ベクターｐＥＴｄｕｅｔ−ＤＯＩＲを構築した（図７）。プライマー（３４）及び（３５）を用いてＡＫＣ０−０２０株のＤＯＩＲ遺伝子を増幅し、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ（上記の表１０を参照。）を用いてｐＥＴＤｕｅｔ−１（Ｍｅｒｃｋ社）のそれぞれの制限酵素認識サイトへクローニングした。ｐＥＴｄｕｅｔ−ＤＯＩＲはＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株へ形質転換した。【００９２】
また、前記のとおりに、ＢＬＡＳＴ検索を行った結果、ＡＫＣ０−０２０株のＤＯＩＲと相同性を示す複数のｉｎｏｓｉｔｏｌ  ２−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅの存在が判明したので、それらのｉｎｏｓｉｔｏｌ  ２−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅがＤＯＩ還元を触媒するかどうかを調べるために、当該ｉｎｏｓｉｔｏｌ  ２−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ遺伝子を合成し、上記ＤＯＩＲ遺伝子と同様の方法で発現させた。すなわち、ＤＯＩＲのアミノ酸配列とＢＬＡＳＴＰ検索（検索対象となるデータベースとしてGenBank、PDB、SwissProtを使用。）により約８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、
３０％の相同性を示す６つのイノシトール脱水素酵素を選んだ（表１３を参照。）。
【表１３】
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【００９３】
表１３に示した遺伝子の合成の際にＢｓ−ｉｏｌＸの開始コドンはＧＴＧのためＡＴＧに変更した。なお、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｆｒｅｄｉｉ  ＵＳＤＡ１９１由来イノシトール脱水素酵素遺伝子（Ｓｆ-Ｉｄｈ）はｍｙｏ−イノシトールを酸化する酵素であり、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８由来ｉｏｌＸ（Ｂｓ-ＩｏｌＸ）とｉｏｌＷ（Ｂｓ-ＩｏｌＷ）はｓｃｙｌｌｏ−イノシトールに対する活性を示す酵素をコードしている事が報告されている。また、ｉｏｌＷ（Ｂｓ-ＩｏｌＷ）はＮＡＤＰＨ依存型イノシトール脱水素酵素とされている。これら６遺伝子を発現ベクターｐＥＴ２１ｂ（＋）(ＭＥＲＣＫ社)に導入し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株によって発現させた。それぞれの培養液当たりの活性を表１４に示す。
【表１４】
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【００９４】
ＤＯＩＲとＢｈ−ＩｏｌＧ、Ｐａ−Ｉｄｈ、Ｐｓ−Ｉｄｈ、Ｓｆ−Ｉｄｈの組換えタンパクの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。このゲル中のバンドをＩｍａｇｅＪ  １．４６を用いて発現量を比較した所、ＤＯＩＲに対してＢｈ−ＩｏｌＧ、Ｐａ−Ｉｄｈ、Ｐｓ−Ｉｄｈ、Ｓｆ−Ｉｄｈ発現量はそれぞれ０．６１倍、０．９９倍、１．２５倍、０．９７倍であった（図１２）。これらはＤＯＩに対して活性を示した（表１４）。【００９５】
ＤＯＩ変換率と生成物のジアステレオマー過剰率を表１５に示した。
ＤＯＩＲ及びＢＨ−ＩｏｌＧ、Ｐａ−Ｉｄｈ、Ｐｓ−ＩｄｈはＤＯＩを８９％ｄ．ｅ．以上のジアステレオマー過剰率で（−）−ビボ−クエルシトールに変換した。【００９６】
ＢＳ−ＩｏｌＸはＤＯＩを９９％ｄ．ｅ．のジアステレオマー変換率でｓｃｙｌｌｏ−クエルシトールに変換した。Ｓｆ-Ｉｄｈは培養液当たりのＤＯＩの還元が弱く、過剰に菌体破砕液を添加したが生産物であるクエルシトールは検出できなかった。
【表１５】
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【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明は、（−）−ビボ−クエルシトールの極めて簡便、効率的、且つ高純度の工業的発酵生産に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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