(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜３からなる群より選択された１種以上のアミノ酸配列で表示されるペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドは、ＴＬＲ４（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４）シグナル伝逹経路抑制用であることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ＴＬＲ４シグナル伝逹経路は、ＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）により誘導されることを特徴とする、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドは、インターロイキン−６（ＩＬ−６；  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）、ＮＯ又はＲＯＳ（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）を抑制することを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドは、ＮＦκＢ又はＭＡＰＫｓの活性を抑制することを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドは、ＴＬＲ４／ＭＤ２複合体に結合することを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
配列番号１〜３からなる群より選択された１種以上のアミノ酸配列で表示されるペプチドを含む、ＴＬＲ４（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４）拮抗剤。
【請求項８】
配列番号１〜３からなる群より選択された１種以上のアミノ酸配列で表示されるペプチドを有効成分として含む、自己免疫疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項９】
配列番号１〜３からなる群より選択された１種以上のアミノ酸配列で表示されるペプチドを有効成分として含む、炎症性疾患の予防又は治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、TLR4シグナル伝逹経路を抑制するペプチド、前記ペプチドを含むTLR4拮抗剤、自己免疫疾患及び炎症性疾患の予防又は治療用組成物に関する。さらに詳細には、TLR4/MD2複合体に結合して、インターロイキン-6(IL-6)、NO及びROSの分泌とNFκB及びMAPKsの活性化を抑制するペプチド、前記ペプチドを含むTLR4拮抗剤、自己免疫疾患及び炎症性疾患の予防又は治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
先天性免疫は、哺乳類の免疫システムにおいて細菌感染に対抗する第1次の防御作用であって、トル様受容体(TLRs; Toll-like receptors、以下で‘TLRs’という)のようなパターン認識収容体(PRRs; pattern recognition receptors)が病源体関連分子パターン(PAMPs; pathogen-associated molecular patterns)や危険関連分子パターン(DAMPs; danger-associated molecular patterns)を認識するで活性化される。
【０００３】
TLRsは、先天性免疫反応において重要な役目を果たしており、TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6及びTLR11を含む原形質膜で作用をする細胞外TLRsと、TLR3、TLR7、TLR8及びTLR9を含むリソゾームやエンドソームのような細胞内で作用をする細胞内TLRsとに分けられる。構造的に、TLRsは、細胞外ドメインのN-末端に、リガンド又はアクセサリー分子(accessory molecule)により認識されるロイシン・リッチ・リピート(LRR; leucine-rich repeat)部位を有しており、細胞内部分のC-末端に、シグナルを伝達するトル/インターロイキン1受容体(TIR; Toll/interleukin 1 receptor)ドメインを有している。
【０００４】
特に、トル様受容体4(TLR4; Toll-like receptor 4、以下で‘TLR4’という)は、TLRファミリーで初めて究明された受容体であって、MyD88(myeloid differentiation 88)-依存性シグナル伝逹過程及びMyD88-非依存性シグナル伝逹過程を通じて増幅される先天性免疫シグナリングを活性化させる。このようなTLR4の役目のために、様々な免疫疾病を治療するためのターゲット(標的)としてTLR4を活用するための研究についての関心が高まっている。LPS(lipopolysaccharide)-結合タンパク質(LBP)、CD14(cluster of differentiation 14)及びMD2(myeloid differentiation factor 2)のようなアクセサリー分子を通じて認識されたLPSは、TLR4を活性化させる。活性化されたTLR4は、Myd88-依存性シグナル伝逹過程を通じて、NFκB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)の初期活性化及び核への移動、MAPKs(mitogen-activated protein kinases)の活性化を誘導する。前記NFκB及びMAPKsの活性化は、TNF-α(tumor necrosis factor α)、IL-1β(interleukin 1β)及びIL-6(interleukin 6)のような炎症性サイトカインを分泌させる。MyD88-非依存性シグナル伝逹過程は、トラム/トリフ(TRAM/TRIF)、インターフェロン調節因子(IRFs; interferon-regulatory factors)及びNFκBの活性化により誘導されて、1型インターフェロンを分泌させる。また、LPSにより誘導されたTLR4は、大食細胞で一酸化窒素(以下で‘NO’という)と活性酸素(以下で‘ROS’という)のような酸化ストレス性物質を生成する。
【０００５】
このように、TLR4は、自己免疫疾患、炎症性疾患及び癌のような多様な疾患を治療するためのターゲットになり得るので、TLR4をターゲットにする物質と、TLR4に関連する疾病を治療するための医学的組成物についての研究がなされつつある。特に、脂質A(lipid A)の主要骨格構造を変形することで多くの数のTLR4促進剤と拮抗剤を得たし、エリトラン(eritoran)、脂質A(lipid A)及びロドバクター・スフェロイデス脂質A(RsLA;  Rhodobacter sphaeroids lipid A)がLPSとMD2との相互作用を抑制して、マウスでLPSにより誘導されたショックを予防可能なことが明らかになった。
【０００６】
一方、酵母ツーハイブリッド分析法(yeast two-hybrid assay)とファージディスプレイ(phage display)のような多様な技術を通じて、病源体関連分子パターン(PAMPs)と類似した作用又はそれに反対する作用をし、ターゲットタンパク質らと相互作用することができる小さなペプチドを掘り出し、治療とワクチン補助剤に関する分野においてこのようなペプチドを活発に研究しつつある。ペプチドらは、一般的な治療剤に比べて副作用が少なくて、TLRsを活性化させる菌の脂質又はタンパク質を除去するような変形が容易であるものと知られている。
【０００７】
しかしながら、依然として、TLR4シグナル伝逹経路を効果的に遮断することができ、それによって関連疾患を治療することができる新規な拮抗剤についての研究の必要性が頭をもたげてきている。  
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者等は、配列番号1〜3のペプチドがリポ多糖(LPS; lipopolysaccharide)により誘導されたTLR4シグナル伝逹経路を抑制して、インターロイキン-6(IL-6)、NO及びROSの分泌とNFκB及びMAPKsの活性化を抑制することを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
従って、本発明の目的は、配列番号1〜3からなる群より選択された1種以上のアミノ酸配列で表示されるペプチド、及び、これを含む新規なTLR4拮抗剤を提供することにある。
【００１０】
また、本発明の他の目的は、前記ペプチドを有効成分として含む、自己免疫疾患の予防又は治療用組成物を提供することにある。
【００１１】
さらに、本発明のさらに他の目的は、前記ペプチドを有効成分として含む、炎症性疾患の予防又は治療用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記のような目的を達成するために、本発明は、配列番号1〜3からなる群より選択された1種以上のアミノ酸配列で表示されるペプチドを提供する。
【００１３】
また、本発明は、配列番号1〜3からなる群より選択された1種以上のアミノ酸配列で表示されるペプチドを含む、TLR4拮抗剤を提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、配列番号1〜3からなる群より選択された1種以上のアミノ酸配列で表示されるペプチドを有効成分として含む、自己免疫疾患の予防又は治療用組成物を提供する。
【００１５】
なお、本発明は、配列番号1〜3からなる群より選択された1種以上のアミノ酸配列で表示されるペプチドを有効成分として含む、炎症性疾患の予防又は治療用組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によるペプチドは、リポ多糖(LPS)により誘導されるTLR4シグナル伝逹経路を抑制することで、インターロイキン-6(IL-6)、NO及びROSの分泌とNFκB及びMAPKsの活性化を抑制する効果に優れていることから、TLR4シグナル伝逹経路により発生する自己免疫疾患及び炎症性疾患の予防又は治療用組成物として有用に活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】組換えヒトTLR4/MD2複合体に対する15マー(15-mer)及び12マー(12-mer)ペプチドライブラリーのバイオパニングの各ラウンド別アウトプット/インプット割合を示す図である(横軸の1R〜5Rは、バイオパニングの各ラウンドを意味する。)。
【図２】HEK-BlueTMhTLR4細胞に、濃度を異ならせてTAPs(TAP1、TAP2及びTAP3)又はTAPsとLPSを一緒に処理した場合、SEAP活性を示す図である。
【図３】マウス大食細胞であるRAW264.7細胞に、濃度を異ならせてTAPs又はTAPsとLPSを一緒に処理した場合、IL-6分泌量を示す図である。
【図４】マウス大食細胞であるRAW264.7細胞に、濃度を異ならせてTAPs又はTAPsとLPSを一緒に処理した場合、NO分泌量を示す図である。
【図５】マウス大食細胞であるRAW264.7細胞に、濃度を異ならせてTAPs又はTAPsとLPSを一緒に処理した場合、iNOS発現量をウェスタンブロッティング(Western Blotting)を通じて確認した結果を示す図である。
【図６】マウス大食細胞であるRAW264.7細胞に、TAPs又はTAPsとLPSを一緒に処理した場合、細胞質でのNO発生量を示す図である。
【図７】マウス大食細胞であるRAW264.7細胞に、TAPs又はTAPsとLPSを一緒に処理した場合、DCF-DAで染色された細胞数と、細胞質内ROSの発生量を示す図である。
【図８】マウス大食細胞であるRAW264.7細胞に、TAPs又はTAPsとLPSを一緒に処理した場合、MitoSOXで染色された細胞数と、ミトコンドリアのROSの発生量を示す図である。
【図９】マウス大食細胞であるRAW264.7細胞に、TAPs又はTAPsとLPSを一緒に、或いはTAPsとPAM3CSK4を一緒に処理した場合、NFκBの活性をウェスタンブロッティングを通じて確認した結果を示す図である。
【図１０】マウス大食細胞であるRAW264.7細胞に、TAPs又はTAPsとLPSを一緒に処理した場合、MAPKsの活性を調べるために、ERK、JNK、p38のリン酸化された程度及びATF3の発現程度をウェスタンブロッティングを通じて確認した結果を示す図である。
【図１１】HEK-BlueTMhTLR4細胞に、LPS又はTAPsとLPSを一緒に処理した場合、NFκBが細胞質から核へと移動するか否かを確認した結果を示す図である。
【図１２】TAPs及びTLR4により誘導されるシグナル伝逹過程を模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１９】
本発明は、配列番号1〜3からなる群より選択された1種以上のアミノ酸配列で表示されるペプチドを提供する。
【００２０】
本発明において用語“ペプチド”は、ペプチド結合によりアミノ酸残基らが相互に結合して形成された線形の分子を意味する。前記ペプチドは、当業界に公知された化学的合成方法に従って製造されることができ、好ましくは固体相合成技術に従って製造されることができるが、これに限定されない。
【００２１】
本発明において用語“TLR4”は、病原体感染に対する監視者として機能する膜貫通(tranmembrane)タンパク質ファミリーであるTLRsに属するタンパク質であって、TLR4遺伝子によりコードされるタンパク質のことをいい、CD284(cluster of differentiation 284)と名付けられることもある。前記TLR4は、グラム陰性菌(Gram-negative bacteria)のLPSを初めとする多様なPAMPs(pathogen-associated molecular patterns)を認知することから、先天性免疫システムの活性化において非常に重要である。
【００２２】
本発明において用語“TLR4シグナル伝逹経路”は、TLR4を通じるシグナル伝逹経路のことをいい、TLR4及びMD2により形成された膜横断複合体であるTLR4/MD2複合体に依存するLPS反応であることができ、これを通じてシグナルが伝達される。TLR4は、様々なアダプタータンパク質(Adaptor Protein)によりシグナルを伝達し、前記シグナル伝逹経路は、Mal(TIRAPとも称される)とMyD88、及びトラム(TRAM)とトリフ(TRIF)として働く。活性化されたTLR4は、Myd88-依存性シグナル伝逹過程を通じてNFκBを活性化させて核へと移動させ、MAPKsの活性化を誘導する。前記NFκB及びMAPKsの活性化のために、TNF-α、IL-1β及びIL-6のような炎症性サイトカインが分泌され、大食細胞で一酸化窒素(以下で‘NO’という)と活性酸素(以下で‘ROS’という)のような酸化ストレス性物質を生成する。また、トラム/トリフ(TRAM/TRIF)、インターフェロン調節因子(IRFs)及びNFκBの活性化により、MyD88-非依存性シグナル伝逹過程が誘導されて、1型インターフェロンが分泌される。
【００２３】
本発明において用語“抑制”は、欠乏、不調和(失調)及びその他の多くの原因によって生物活動や活性が低下される現象のことをいい、TLR4の活性を部分的に又は完全にブロッキングするか、減少させるか、予防するか、活性化を遅延させるか、不活性化させるか、あるいは下向き調節することであり得る。
【００２４】
本発明において用語“TLR4/MD2複合体”は、TLR4及びMD2により形成された膜横断複合体を意味しており、本発明における配列番号1〜3で表示されるペプチドは、TLR4/MD2複合体に結合することで、TLR4シグナル伝逹経路を抑制することができる。
【００２５】
したがって、本発明は、配列番号1〜3で表示されるペプチドのTLR4シグナル伝逹経路抑制の用途を提供する。
【００２６】
本発明における“配列番号1〜3からなる群より選択された1種以上のペプチド”は、TLR4/MD2複合体に効果的に結合する能力を有する限り、配列番号1〜3の配列と同一のペプチドだけではなく、そのアミノ酸が保存的置換によって置き換えられたペプチド、これと配列相同性が70%以上、好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上であるペプチドを全て含むことができる。前記用語“相同性”とは、野生型(wild type)アミノ酸配列及び野生型核酸配列との類似程度を示すためのものをいう。
【００２７】
本発明の一実施例によれば、本発明における配列番号1〜3で表示されるペプチドは、リポ多糖(LPS)により誘導されるTLR4シグナル伝逹経路を抑制することで、インターロイキン-6(IL-6)、NO及びROSの分泌とNFκB及びMAPKsの活性化を抑制する効果に優れていることから、TLR4シグナル伝逹経路により発生する自己免疫疾患及び炎症性疾患の予防又は治療用組成物として有用に活用することができる。
【００２８】
また、本発明は、前記ペプチドを含むTLR4拮抗剤を提供する。
【００２９】
本発明において用語“拮抗剤”は、任意のメカニズムによって、受容体又は細胞内媒介体のような他の分子の影響を、部分的に又は完全に阻害する分子を意味する。
【００３０】
本発明において用語“TLR4拮抗剤”は、TLR4の生物学的活性を直間接的に、或いは実質的に邪魔、減少又は阻害することができる物質のことをいい、好ましくはTLR4と反応性であるペプチドは、TLR4又はTLR4/MD2複合体に直接結合し、TLR4の活性を中和させることで、TLR4シグナル伝逹経路を遮断して、NFκB及びMAPKsの活性化の減少を誘発して炎症性サイトカイン、NO及びROSの分泌を減少させることができる物質をいう。
【００３１】
さらに、本発明は、前記ペプチドを有効成分として含む、自己免疫疾患の予防又は治療用組成物を提供する。
【００３２】
本発明において用語“自己免疫疾患”は、自己寛容を誘導するか維持し続ける上で問題が発生して、自己抗原に対する免疫反応が起き、そのために、自分自身の組職を攻撃する現象が発生する過程により発症する疾患を意味する。前記自己寛容とは、自己(self)を構成している抗原物質に対しては有害に反応しない免疫学的無反応性(immunologic unresponsiveness)のことをいう。本発明における自己免疫疾患は、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髓炎、リウマチ性関節炎、実験的自己免疫関節炎、重症筋無力症、甲状腺炎、実験的形態のブドウ膜炎、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎(autoimmune metaplastic atrophic gastritis)、アジソン病、早期閉経(早発閉経)、男性不妊症、小児(子供)糖尿病、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡(Pemphigus vulgaris)、類天疱瘡(bullous pemphigoid)、交感性眼炎、水晶体原性ブドウ膜炎(lens-induced uveitis)、自己免疫性溶血性貧血、特発性白血球減少、原発性胆管硬化症(primary biliary sclerosis)、慢性活動性肝炎Hbs-ve、潜在性肝硬変症、潰瘍性大腸炎、ショーグレン症侯群、強皮症、ヴェグナー肉芽腫症(Wegener’s granulomatosis)、多発筋炎／皮膚筋炎、円板状LE(エリテマトーデス)及び全身性紅斑性狼瘡(systemic lupus erythematosus)を含むが、これに限定されるものではない。
【００３３】
本発明における自己免疫疾患の予防又は治療用組成物は、薬学的に有効な量の前記ペプチドを単独で含むか、一つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤又は 希釈剤を含むことができる。前記“薬学的に有効な量”とは、自己免疫疾患の症状を予防、改善及び治療するのに十分な量のことをいう。
【００３４】
前記“薬学的に許容される”とは、生理学的に許容され、ヒトに投与されるとき、通常、胃腸障害、めまいのようなアレルギー反応又はこれと類似した反応を生じない組成物のことをいう。前記担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトル、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、 リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油(ミネラルオイル)が挙げられる。また、充填剤、 抗凝固剤、滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤などを追加に(さらに)含むことができる。
【００３５】
また、本発明における組成物は、前記ペプチドと一緒に自己免疫疾患治療の効果を有する公知の有効成分を、1種以上含むことができる。
【００３６】
本発明における組成物は、ヒトを除く哺乳動物に投与された後、活性成分の 迅速な(即時)放出、持続(延長)放出又は遅延放出を提供することができるように、当業界に公知の方法を使用して剤形化され得る。剤形は、粉末、顆粒、錠剤、エマルジョン、シロップ、エアロゾル、軟質又は硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射用水、滅菌粉末の形態であり得る。
【００３７】
本発明における組成物は、経口、経皮、皮下、静脈又は筋肉を含む様々な経路を通じて投与されることができ、活性成分の投与量は、投与経路、患者の年齢、性別、体重及び患者の重症度などの様々な因子に応じて適切に選択され得、本発明による自己免疫疾患の予防又は治療用組成物は、自己免疫疾患の症状を予防、改善又は治療する効果を有する公知の化合物と並行して投与することができる。
【００３８】
また、本発明は、前記ペプチドを有効成分として含む、炎症性疾患の予防又は治療用組成物を提供する。
【００３９】
本発明において用語“炎症性疾患”は、炎症誘発因子又は放射線照射などの有害な刺激のために、免疫体系を過度に亢進させて大食細胞のような兔疫細胞から分泌されるTNF-α、IL-1、IL-6、プロスタグランジン(prostaglandin)、ロイコトリエン(leukotriene)又はNOのような炎症誘発物質(炎症性サイトカイン)により誘発される疾患を意味しており、本発明における炎症性疾患は、喘息、湿疹、乾癬、アレルギー、リウマチ関節炎、乾癬性関節炎(psoriatic arthritis)、接触性皮膚炎(contact dermatitis)、アトピー性皮膚炎、にきび、アトピー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、慢性副鼻腔炎(蓄膿症)、脂漏性皮膚炎(seborrheic dermatitis)、胃炎、 痛風、痛風性関節炎、潰瘍、慢性気管支炎、肺炎症、クローン病、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎(ankylosing spondylitis)、敗血症、血管炎(脈管炎)、滑液包炎、狼瘡(lupus)、リウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎、多発性硬化症、固形癌、アルツハイマー病、動脈硬化症、肥満及びウイルス感染を含むが、これに限定されるものではない。
【００４０】
前記炎症性疾患の予防又は治療用組成物は、上述した前記ペプチドを有効成分として含む薬学的製剤を含むことから、上述した本発明における組成物と重複する内容は、重複する内容の記載による本願明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【００４１】
また、本発明は、配列番号1〜3からなる群より選択された1種以上のアミノ酸配列で表示されるペプチドを個体に投与する段階;  を含む、自己免疫疾患の予防又は治療方法を提供する。
【００４２】
さらに、本発明は、配列番号1〜3からなる群より選択された1種以上のアミノ酸配列で表示されるペプチドを個体に投与する段階; を含む、炎症性疾患の予防又は治療方法を提供する。
【００４３】
以下、本発明の内容を実施例及び実験例を用いて、より具体的に説明する。後記する実施例及び実験例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容がこれらの実施例及び実験例により限定されるものではない。
【００４４】
実施例1 : TLR4/MD2特異的ペプチドの選別
TLR4/MD2複合体に特異的に結合するペプチドを選別するために、15マー(15-mer)ペプチドはfUSE55、12マー(12-mer)ペプチドはpHEN2ファージディスプレイライブラリー(phage display library)を構築し、ファージディスプレイ法(phage display method)を行った。
【００４５】
実施例1-1 : ライブラリーの作製
まず、15マー(15-mer)ペプチドライブラリーを作製するために、順方向(フォワード)プライマー5'-TTG ATC GCA AGG ATC GGC TAG C-3'、逆方向(リバス)プライマー5'-AA GGC CTT GGT ACC GCT GCC ACC (MNN)15 GCT AGC CGA TCC TTG CGA TCA A-3'及びPfuDNA重合酵素(SolGent、Daejeon、Korea)を用いて、90℃で30秒間変性し、55℃で30秒間アニールし、72℃で60秒間伸長する過程を、25回繰り返してDNAを増幅させた。増幅したDNA 鎖をNheＩ/KpnＩで切断した後、T4DNAリガーゼ(New England Biolabs、Inc.、Ipswich、MA、USA)を使用して、fUSE55ベクター中に連結させた。3つのDNAライブラリーを、エレクトロコンピテント大膓菌細胞(electrocompetent E.coli cells)であるDH10B菌株内へと移して、結果として6.6 X 107個のクローンを作成した後、大膓菌菌株TG-1で増幅させ繁殖させた。
【００４６】
また、ランダム(無作為)な12マー(mer)ペプチドライブラリーを作製して、 pHEN2のpIII地域に挿入するために、順方向プライマー5'-GCC CAG CCG GCC ATG GCC (NNK)12 TCG AGT GGT GGA GGC GGT TCA G-3'、逆方向プライマー5'-GCC AGC ATT GAC AGG AGG TTG AG-3'及びPfuDNA重合酵素を用いて、前記したのと同じ条件の過程を25回繰り返して、3回の独立したPCRを行った。前記PCRの結果物をNheＩ/KpnＩで切断した後、T4DNAリガーゼを使用してpHEN2ベクター中に連結させ、前記ライブラリーDNAらを、エレクトロコンピテント大膓菌細胞(electrocompetent E.coli cells)であるXL-1 Blue(Stratagene、Santa Clara、CA、USA)菌株内に導入させた。ファージら(pahge particle)は、ハイパーファージM13K07△pIII(PROGEn Biotechnik GmbH、Heidelberg、Germany)を使用して、2.0 X 109個の多様なクローンらを有するように作製したし、その後、大膓菌菌株XL-1で増幅させた。
【００４７】
実施例1-2 : バイオパニング(Biopanning)
変形されたグリフィン-1ライブラリー(Griffin-1 library)(Griffin H.、 MRC、Cambridge、UK、unpublished data)でバイオパニング(Biopanning)を行った。より具体的に、コートされたバッファーで再懸濁された(resuspended)組換えヒトTLR4/MD2複合体(R&D Systems、Inc.、Minneapolis、MN、USA)を5μg/ml、ヌンクマキシソープ96ウェルプレート(Nunc Maxisorp 96-well plate)(Thermo Fisher Scientific Inc.、Waltham、MA、USA)でコートした後、一晩の間冷蔵させた。それから、常温で2時間の間、PBSで1%のBSAによりブロッキングした後、最終濃度0.05%のTween 20を含むPBS(PBST)で、BSAの濃度が1%になるように、常温で2時間の間、前記冷蔵したウェルらをファージライブラリーに露出させた。ライブラリーに結合されたファージらは、溶出緩衝液(100mM HCl)100μlで溶かして分離し、PBSTで洗浄(washing)した後、pH11を示す1M Tris HClの1/8体積(嵩)で中和させた。15マー(15-mer)ライブラリー用のファージ力価(titer)は、200μg/mlのテトラサイクリン(Tet、tetracycline)と10μg/mlのアンピシリン(Amp、ampicillin)を含むLB(Luria-Bertani)寒天プレート上の大膓菌TG1で、12マー(12-mer)ライブラリー用は、大膓菌を前記寒天プレート上のXL-1 BlueでCFUにより計算した。この後、ファージを大膓菌TG1、Xl1 Blueで増幅させ、PEG(polyethylene0glycol)/NaCl沈殿を通じて、続くパニングラウンドの間精製した。全5ラウンドの各ラウンドで、インプット/アウトプットの割合(入出力比)は、濃縮効率を測定して計算し、その結果を図1に示した。
【００４８】
図1に示しているように、15マー陽性及び12マー陽性ペプチドライブラリーの組換えヒトTLR4/MD2複合体に対するアウトプット/インプットの割合が、ラウンドを重ねるほどさらに増加しており、そのことから、本発明による5ラウンドのバイオパニングの効率に優れることが分かる。
【００４９】
実施例1-3 : TLR4/MD2複合体に対する高い結合親和度を呈するファージスクリーニング
前記実施例1-2において感染された細胞の分離された独立型クローンを、15マーライブラリーのLB/Tetと12マーライブラリーのLB/Amp寒天プレートで、U-バトム(bottom)96ウェルプレートに集めた。それから、5回のバイオパニングのラウンド後、37℃で一晩の間育て、これをLB/TetやLB/Amp寒天プレートに置いた後、上層液のファージ製剤を得るために、3000gの条件で30分間遠心分離させた。ファージ結合親和度を測定するために、PBSに2%のBSAが含まれたバインディングバッファー(binding buffer)と同じ体積(嵩)で混じっている前記上層液を、1.25μg/mlのTLR4/MD2-陽性96ウェルプレートとTLR4/MD2-陰性96ウェルプレートに添加した。前記ウェルらを2時間の間、ブロッキングバッファー(2%のBSAが含まれたPBST)にブロッキングした後、PBSで洗浄した。常温で1時間の間結合反応をさせた後、結合しないファージはPBSTで洗浄して除去し、結合したファージらは、HRP(horseradish peroxidase)にコンジュゲーションされた(conjugated)抗M13抗体100μlで培養した後、結合しない余分のファージらを、PBSTで洗浄して除去することで、結合したファージらを検出した。この後、テトラメチルベンジディン100μl(Thermo Fisher Scientific Inc.)を各ウェルに添加した後、前記混合物を色変化が現われるまで常温に置いた後、反応を止めるために、1N H3PO4を100μl添加した。ELISA(BioTek Instruments、Inc.、Winooski、VT、USA)を用いて、450nmで吸光度を測定することで、高い結合親和度を呈したファージらを選択し、選択されたファージらを下記の実験に使用した。
【００５０】
実施例2 :DNA シーケンシング及びTAPs 合成
前記実施例1-3において選択されたファージからファージDNAを分離するために、ミニプレップキット(Miniprerp Kit)(GeneAll Biotechnology、Seoul、Korea)を使用したし、15マーDNAは5'-TGA ATT TCC TGT ATG AGG-3'の塩基配列を有するプリマーを、12マーDNAは5'-TTG TGA GCG GAT AAC AAT TTG-3'の塩基配列を有するプリマーを用いて、マクロジェン(Macrogen、Inc.、Seoul、Korea)でDNAシーケンシング(DNA sequencing)をした。前記シーケンシングを通じて確認したDNA塩基配列をアミノ酸配列へと翻訳し、バイオエディットソフトウェア(Bioedit software)を使用して変異を測定した後、整列した。それから、TLR4/MD2に高い結合親和度を呈する表1のアミノ酸配列を有するペプチド(TAPs; TLR4  agonistic  peptidesであって、TAP1、TAP2及びTAP3を総称しており、以下で‘TAPs’という)を、95%以上の純度を有するように、ペップトロン(PEPTRON)(Daejeon、Korea)で合成し、最終濃度が10mg/mlになるように、TAP1は水に、TAP2とTAP3はジメチルスルホキシド(Dimethyl sulfoxide)に溶かした後、-20℃で適当にアリコート(aliquote)して保管した。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
実施例3 : 細胞培養及び準備
HEK-BlueTMhTLR4細胞(InvivoGen、San Diego、CA、USA)を、10%のウシ胎児血清(FBS; fetal bovine serum)(Thermo Fisher Scientific Inc.)、50IU/mlのペニシリン、50μg/mlのストレプトマイシン(Thermo Fisher Scientific Inc.)、100mg/mlのノルモシン(normocin)(InvivoGen)及び抗生剤のHEK-Blue混合物(500ml当たり2ml)(InvivoGen)が添加されたDMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)(Thermo Fisher Scientific Inc.)培地に入れて、5%のCO2、37℃の湿った条件の培養システム(Thermo Fisher Scientific Inc.)で培養した。マウス大食細胞であるRAW264.7細胞(ATCC、Manassas、VA、USA)は、10%のFBS、100IU/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシンが添加された低グルコースDMEM(Low-Glucose DMEM)(Thermo Fisher Scientific Inc.)に入れて、培養システムで培養した。LPSはSigma-Aldrich Co.(St. Louis、MO、USA)より、PAM3CSK4はInvivogGenより購入した。
【００５３】
実験例1 : TAPsのTLR4/MD2結合親和度の確認
TAPs(TAP1、TAP2、TAP3)のTLR4/MD2結合親和度を確認するために、前記実施例3において培養したHEK-BlueTMhTLR4細胞で、NFκBの活性を測定した。NFκBとAP-1(activator protein 1)のDNAが結合する部位を含むIL-12 p40 最小プロモーター(Minimal Promoter)(IL-12 p40は、TLR4の刺激後、NFκBとAP-1の活性化により生成される。)の調節部分の下に、誘導性SEAP(secreted embryonic alkaline phosphatase) レポーター遺伝子を位置させた。その後、TAPsの濃度を10、50、100 μg/mlのように多様にして、HEK-BlueTMhTLR4細胞に処理した後、SEAP活性の平均値を計算してTLR4の活性を測定し、その結果を図2に示した。
【００５４】
図2に示しているように、ただTAPsのみを添加した場合、SEAPの活性は大きな変化がないが、TAPsを処理した後、LPSでTLR4を刺激したとき、LPSにより誘導されたSEAP活性が濃度依存的に減少した。このことから、本発明におけるTAPsは、TLR4/MD2拮抗剤と作用して、LPSにより誘導されるNFκBの活性を効果的に抑制することが分かる。
【００５５】
実験例2 : TAPsがIL-6及びNO分泌とROS発生に及ぶ影響
前記実施例 2において製造したTAPsを、前記実施例3において培養したマウス大食細胞であるRAW264.7細胞に処理したとき、IL-6(interleukin-6)とNO(Nitric Oxide)の分泌及び細胞質と核内のROS(reactive oxygen species)の発生が抑制されるか否かを確認するために、下記のような実験を行った。
【００５６】
実験例2-1 : TAPsがIL-6及びNO分泌に及ぶ影響
前記実施例2において製造したTAPsを処理した前記実施例3におけるRAW264.7細胞の培養上層液のIL-6、NOの数値を、マウスIL-6 ELISAキットReady-SET-Go!(eBioscience San Diego、CA、USA)と、NO検出キット(iNtRON Biotechnology、Gyeonggi、Korea)を使用して測定した。マイクロプレートリーダー(Microplate Reader)分光光度計(Molecular Devices In.)を使用して、IL-6は450nm、NOは540nmで吸光度を測定し、その結果をソフトマックスのプロ 5.3ソフトウェア(Molecular Devices Inc.)を使用して分析して、図3及び図4に示した。
【００５７】
図3及び図4に示しているように、ただTAPsのみを添加した場合、IL-6及びNOの分泌量には大きな変化がないが、TAPsとLPSを一緒に処理したとき、IL-6及びNOの分泌量が減少することを確認した。このことから、本発明によるTAPsがLPSにより誘導されたIL-6及びNOの分泌を抑制することが分かる。
【００５８】
実験例2-2 : iNOS(inducible nitric oxide synthase)のウェスタンブロッティング
ウェスタンブロッティング(Western Blotting)を行うために、全タンパク質抽出溶液(M-PER、Thermo Fisher Scientific Inc.)を、プロテアーゼ及びホスファターゼ抑制混合物と混ぜて、前記実施例3におけるRAW264.7細胞ペレット(pellet)に添加した。前記ペレットを10分間冷凍させた後、10分間16000Xgで前記溶解物を遠心分離した。それから、NE-PER核及び細胞質抽出試薬(Thermo Fisher Scientific Inc.)を使用して、細胞質と核のタンパク質をそれぞれ抽出し、BCAキット(Sigma-Alderich Co. LLC)を使用して、前記タンパク質の濃度を測定した。この後、同じ量のタンパク質をSDS-ポリアクリルアマイドゲルに展開し、Hybond-ECL ニトロセルロース膜(Amersham Pharmacia Biotech、Inc.、Piscataway、NJ、USA)へと移した。前記膜を1時間の間、脱イオン水で0.05%の脱脂粉乳によりブロッキングした後、1次抗体により4℃の温度で、一晩の間軽くシェイキング(shaking)して免疫ブロッティング(Immunoblotting；イムノブロット法)した(前記1次抗体は、iNOS(BD Biosciences、San Jose、CA、USA)及びβ-アクチン(Santa Cruz Biotechnology、Inc.、Dallas、TX、USA)に対する抗体である。)。それから、PBSTで徹底的にシェイキングした後、前記膜を抗マウス/ウサギHRP-コンジュゲーションされた(conjugated)2次抗体(Thermo Fisher Scientific Inc.)と共に2時間の間培養し、SuperSignal West Pico ECL溶液(Thermo Fisher Scientific Inc.)でタンパク質を検出し、Fuji LAS-3000システム(Fujifilm、Tokyo、Japan)で前記タンパク質を視覚化したし、その結果を図5に示した。
【００５９】
図5に示しているように、対照群であるβ-アクチンと比較したとき、LPSの添加時、iNOSの発現が増加したが、これにTAPsを一緒に処理すると、iNOSの発現が濃度依存的に減少することを確認した。このことから、本発明によるTAPsが、LPSにより誘導されたiNOSの発現を抑制することが分かる。
【００６０】
実験例2-3 : TAPsがNO及びROSの発生に及ぶ影響
また、前記実施例2において製造したTAPsが細胞質でNO及びROS(reactive oxygen species)の発生に及ぶ影響を確認するために、前記実施例3において培養したマウス大食細胞であるRAW264.7細胞にTAPsを処理し、それぞれDAF-FM(Invitrogen Corp.、CA、USA)、DCF-DA(Invitrogen Corp.)及びMitoSOX(Invitrogen Corp.)で染色した後、1時間の間培養した。その後、5分当たりに200Xgで遠心分離して収集し、褐色チューブへと移して、4℃の温度でPBSに保管した。前記DAF-FM染色でNOを、DCF-DA 染色で細胞質のROSを、MitoSOX染色でミトコンドリアのROSをそれぞれ定量化(quantification)した。 ディーバソフトウェアとしてFACSAria IIIを使用し、DAF-FM、DCF-DA及びMitoSOX蛍光物質の強度を測定して前記定量化をしたし、WinMDIソフトウェアを使用してイメージを得ており、その結果を図6乃至図8に示した。
【００６１】
図6乃至図8に示しているように、LPSの添加時、細胞質内でNOとROS、核内でROSの発生程度が増加したが、これにTAPsを一緒に処理すると、NOとROSの発生程度が濃度依存的に減少した。このことから、本発明によるTAPsが、細胞質及び核内でLPSにより誘導されたNOとROSの発生を抑制することが分かる。
【００６２】
実験例3 : TAPsがNFκB及びMAPKsの活性に及ぶ影響
前記実施例2において製造したTAPsがNFκB及びMAPKsの活性に及ぶ影響を確認するために、下記の実験を行った。
【００６３】
実験例3-1 : NFκB及びMAPKsのウェスタンブロッティング
前記実施例2において製造したTAPsがNFκB及びMAPKsの活性に及ぶ影響を確認するために、ウェスタンブロッティングを前記実験例2-2と同様な方法で行った。このときに使用した1次抗体は、HDAC1(Merck Millipore、Billerica、MA、USA)、NFκB (p65)、IκBα、p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38、p38、ATF3及びβ-アクチン(Santa Cruz Biotechnology、Inc.、Dallas、TX、USA)に対する抗体であり、2次抗体は、抗マウス/ウサギHRP-コンジュゲーションされた(conjugated)2次抗体(Thermo Fisher Scientific Inc.)である。ウェスタンブロッティングを行って得た結果を、図9及び図10に示した。
【００６４】
図9に示しているように、対照群であるマウス大食細胞であるRAW264.7細胞に、ただLPSのみを処理した場合、NFκBの活性が増加してIκBαが分解された反面、TAPsを一緒に処理した場合、NFκBの活性が抑制されてIκBαが分解される程度が減少した。特に、TLR1/2のリガンドであるPAM3CSK4をTAPsとともに処理したとき、NFκBの活性及びIκBαの分解程度に影響はなかった。このことから、本発明によるTAPsは、TLR4に特異的に結合して、LPSにより誘導されたNFκBの活性を抑制することが分かる。
【００６５】
また、図10に示しているように、対照群であるマウス大食細胞であるRAW264.7細胞にただ LPSのみを処理した場合、MAPKsの活性が増加してERK、JNK、p38がリン酸化されてATF3の発現が増加するが、TAPsを一緒に処理した場合、MAPKsの活性が抑制されて前記酵素らのリン酸化された程度が減少したし、ATF3の発現量も減少した。このことから、本発明によるTAPsは、LPSにより誘導されたMAPKsの活性及びATF3の発現を抑制することが分かる。
【００６６】
実験例3-2 : NFκBの核への移動可否の確認
前記実施例3において培養したHEK-BlueTMhTLR4細胞を、104/wellの96ウェルプレートにシーディング(seeding)した後、2日間インキュベーターで育てた。上層液を交換した後、前記インキュベーター中の細胞にそれぞれTAPsを処理し、1時間後に20μg/mlのLPSをそれぞれ処理した。その後、前記HEK-BlueTMhTLR4細胞を、10分間3.7%のフォルムアルデヒドで固定し、15分間0.2%のトリトンX-100に浸漬した後、1時間の間5.0%のFBSでブロッキングした。前記ブロッキングされた細胞らを、1時間の間1次抗体と共に培養した後、1時間の間AlexaFluor546-コンジュゲーションされた(conjugated)2次抗体(Invitrogen Corp.)と共に培養した。この後、5μMのHoechst33258(Sigma-Aldrich Co.)を用いて、常温で30分間染色をし、共焦点顕微鏡(LSM-700、Carl Zeiss MicroImaging GmbH、Jena、Germany)を使用して、前記蛍光染色された細胞の数を数えたし、Zen2009ソフトウェア(Carl Zeiss MicroImaging GmbH.)を使用して、イメージを分析した後、その結果を図11に示した。
【００６７】
図11に示しているように、LPSのみを処理した場合、NFκBは細胞質と核に一様に分布しているが、TAPsを一緒に処理した場合、NFκBが細胞質のみに存在していた。このことから、本発明によるTAPsは、LPSにより誘導されたNFκBの核への移動を抑制して、NFκBにより発現される炎症性因子とiNOS及びATF3の発現を抑制することが分かる。
【００６８】
[産業上の利用可能性]
本発明におけるペプチドは、TLR4シグナル伝逹経路を抑制することで、インターロイキン-6(IL-6)、NO及びROSの分泌を抑制する効果と、NFκB及びMAPKsの活性化を抑制する効果に優れていることから、TLR4の拮抗剤として作用することができ、TLR4に関連する自己免疫疾患及び炎症性疾患の予防又は治療用組成物として有用に利用され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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