(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
固形腫瘍の逐次併用又は同時併用治療のための、Ａ）ヒトＣＤ４０に特異的に結合してヒトＣＤ４０を活性化する抗体又はその抗体の抗原結合部分を有効成分として含む第一の成分；及びＢ）ＰＤ−Ｌ１に結合してＰＤ−Ｌ１を阻害するＰＤ−Ｌ１抗体を有効成分として含む第二の成分を含む，薬学的製品であって、
Ａ）における第一の成分が、
配列番号３のＶＬ及び配列番号４のＶＨを含む抗ＣＤ４０抗体；又は
抗体２１．４．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３６０５）の重鎖及び軽鎖可変ドメインアミノ配列を含む抗ＣＤ４０抗体
を有効成分として含み、且つ
Ｂ）における第二の成分が、上記ＰＤ−Ｌ１抗体を有効成分として含む
薬学的製品。
【請求項２】
ヒトＣＤ４０に特異的に結合してヒトＣＤ４０を活性化する抗体又はその抗体の抗原結合部分が、ヒトＣＤ４０に４ｘ１０−１０Ｍ以下のＫＤで結合するＩｇＧ２サブクラスの完全ヒト抗体である、請求項１に記載の薬学的製品。
【請求項３】
ＰＤ−Ｌ１抗体が、ＫＤ値１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌ以下、又はＫＤ値１．０ｘ１０−９ｍｏｌ／ｌ以下の結合親和性でヒトＰＤ−Ｌ１抗原に特異的に結合する、請求項１又は２に記載の薬学的製品。
【請求項４】
ＰＤ−Ｌ１抗体が、ＫＤ値１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌ〜１．０ｘ１０−１３ｍｏｌ／ｌの間の結合親和性でヒトＰＤ−Ｌ１抗原に特異的に結合する、請求項１から３のいずれか一項に記載の薬学的製品。
【請求項５】
Ａ）  配列番号３のＶＬ及び配列番号４のＶＨを含む抗ＣＤ４０抗体；又は
抗体２１．４．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３６０５）の重鎖及び軽鎖可変ドメインアミノ配列を含む抗体を有効成分として含む第一の成分；及び
Ｂ）  有効成分として、
ａ）  配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号８の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号９の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１０の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１１の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１２の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｆ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１３の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｇ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１４の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｈ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１５の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｉ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｊ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１７の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｋ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１８の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｌ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１９の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｍ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２０の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｎ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２１の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｏ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２２の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｐ）  配列番号７の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２３の軽鎖可変ドメインＶＬ
を含む抗体から選択されるＰＤ−Ｌ１抗体を含む第二の成分を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の薬学的製品。
【請求項６】
Ａ）配列番号３のＶＬ及び配列番号４のＶＨを含む抗体を有効成分として含む第一の成分と、Ｂ）配列番号８のＶＬ及び配列番号５のＶＨを含む抗体を有効成分として含む第二の成分とを含む、固形腫瘍の逐次併用又は同時併用治療のための、請求項１に記載の薬学的製品。
【請求項７】
成分Ａ）及びＢ）が別々に投与される、請求項１から６のいずれか一項に記載の薬学的製品。
【請求項８】
成分Ａ及び／又はＢが静脈内（ｉ．ｖ．）又は皮下（ｓ．ｃ．）に投与される、請求項７に記載の薬学的製品。
【請求項９】
成分Ａが４から１６ｍｇの間の固定用量で投与され、成分Ｂが１２００ｍｇの固定用量で投与される、請求項８に記載の薬学的製品。
【請求項１０】
成分Ａ及びＢの投与が１から４２日、好ましくは１又は７又は１４又は２１又は４２日離れている、請求項９に記載の薬学的製品。
【請求項１１】
成分Ａが成分Ｂと共に１〜４回投与され、次に疾患の進行まで成分Ｂのみで治療が継続される、請求項１０に記載の薬学的製品。
【請求項１２】
固形腫瘍の逐次併用又は同時併用治療のための医薬の製造のための、ヒトＣＤ４０に特異的に結合してヒトＣＤ４０を活性化する請求項１に記載の抗体又はその抗原結合部分；及び請求項１に記載のＰＤ−Ｌ１抗体の使用。
【請求項１３】
第三の成分（Ｃ）としてサイトカイン阻害剤をさらに含む、請求項１に記載の薬学的製品。
【請求項１４】
サイトカイン阻害剤が抗ＴＮＦアルファ抗体である、請求項１３に記載の薬学的製品。
【請求項１５】
固形腫瘍を治療するためのキットであって、請求項１から１１、１３及び１４のいずれか一項に記載の薬学的製品と、該薬学的製品を使用する方法の説明書とを含む、キット。
【請求項１６】
固形腫瘍を有する患者を治療するための医薬であって、請求項１から１１、１３及び１４のいずれか一項に記載の薬学的製品を含む、医薬。
【請求項１７】
固形腫瘍を有する患者を、ヒトＣＤ４０に特異的に結合してヒトＣＤ４０を活性化する請求項１に記載の抗体又はその抗原結合部分のいずれかと組み合わせて治療するための医薬であって、請求項１に記載のＰＤ−Ｌ１抗体を含む、医薬。
【請求項１８】
固形腫瘍を有する患者を、請求項１に記載のＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせて治療するための医薬であって、請求項１に記載のヒトＣＤ４０に特異的に結合してそれを活性化する抗体又はその抗原結合部分のいずれかを含む、医薬。
【請求項１９】
固形腫瘍を有する患者を治療するための医薬であって、請求項１に記載のヒトＣＤ４０に特異的に結合してそれを活性化する抗体又はその抗原結合部分のいずれかと、請求項１に記載のＰＤ−Ｌ１抗体が組み合わされる、医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＣＤ４０に結合する特異的抗体とヒトＰＤ−Ｌ１に結合する特異的抗体の併用療法に関する。このような組み合わせは、がん治療の分野において特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
免疫調節抗体は、治療法を提供し、抗腫瘍免疫応答を直接的に増強するために使用するか、又は抗がんワクチンのアジュバントとして使用することもできる(Melero, I., et al. Nat Rev Cancer 7, 2007, 95-106)。アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、これらの試薬の最も有効なクラスの一つを構成する。ＣＤ４０は、樹状細胞、Ｂ細胞、及びマクロファージ等の抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で発現される腫瘍壊死因子スーパーファミリーの細胞表面メンバーである。抗ＣＤ４０アゴニストによる前臨床試験は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の架橋抗体によるＣＤ４０の誘発が、通常はＣＤ４０リガンドを介して提供されるＣＤ４  Ｔ細胞ヘルプに代わることができ、ＣＤ８エフェクターＴ細胞の活性化及び増殖を促進することを示唆している(Li, F. et al, Science 333, 2011, 1030-1034)。さらに、ＣＤ４０活性化マクロファージは、直接殺腫瘍機能も発揮し得る(Beatty, G. L., et al. Science 331, 2011, 1612-1616; Vonderheide, R. H., et al., Oncoimmunology 2, 2013, e23033)。ＣＤ４０アゴニストは、国際公開第２００３／０４０１７０号に記載されている。
【０００３】
最近、Ｔ細胞の機能障害又はアネルギーが、抑制受容体、すなわちプログラム死１ポリペプチド（ＰＤ−１）発現の誘導及び維持と同時に起こることが発見された。結果として、治療標的のＰＤ−１と、ＰＤ−１との相互作用によりシグナル伝達する他の分子、例えばプログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）及びプログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）は、非常に興味深い領域である。ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達の阻害は、がん並びに急性及び慢性（例えば持続性）感染を含む感染の治療のためのＴ細胞免疫（例えば，腫瘍免疫）を向上させる手段として提示された。ＰＤ−Ｌ１に対する抗体は、例えば国際公開第２０１０／０７７６３４号に記載されている。
【０００４】
Ｔ細胞に対する二つの異なるシグナルの共刺激又は提供は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による静止Ｔリンパ球のリンパ球活性化の広く受け入れられたモデルである。Lafferty et al., Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 53: 27-42 (1975)。共刺激シグナルの操作が、細胞に基づく免疫応答を増加又は終了させる手段を提供することが示されているため、共刺激の機序は治療的関心事である。しかしながら、ＣＤ４０とＰＤ−Ｌ１を同時標的とする最適な治療は、未だ商業化されておらず、未だ満たされていない大きな医学的必要性が存在している。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、増殖性疾患、特にがんの治療における使用のための、ヒトＰＤ−Ｌ１に結合する抗体とヒトＣＤ４０に結合する抗体との併用療法を含む。
【０００６】
本発明は、増殖性疾患、特にがんの逐次併用又は同時併用治療のための、Ａ）ヒトＣＤ４０に特異的に結合してそれを活性化する抗体又はその抗体の抗原結合部分を有効成分として含む第一の成分；及びＢ）有効成分としてＰＤ−Ｌ１抗体を含む第二の成分を含む薬学的製品をさらに含む。
【０００７】
本発明は、がんなどの増殖性疾患、好ましくは固形腫瘍の逐次併用又は同時併用治療のための医薬の製造のための、ヒトＣＤ４０に特異的に結合してそれを活性化する抗体又はその抗原結合部分；及びＰＤ−Ｌ１抗体の使用をさらに含む。
【０００８】
本発明は、上記の薬学的製品を含むキットをさらに含む。
【０００９】
本発明は、増殖性疾患、特にがんに罹患している患者を治療する方法であって、抗ＣＤ４０抗体とＰＤ−Ｌ１抗体の同時併用又は逐次併用投与を含む方法をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】（ａ）ビヒクル及び単剤療法コントロールと比較した、同所性Ｐａｎｃ０２−Ｈ７−Ｆｌｕｃ膵臓癌モデルにおけるｍｕＦＧＫ４．５（抗ＣＤ４０）と抗−ＰＤ−Ｌ１との併用での腫瘍増殖阻害の分析、（ｂ）ａ−ＣＤ４０＋ａ−ＰＤＬ１併用群マウスの個々の腫瘍の増殖曲線。
【図２】個々のマウスは、治療２２日目にｍｕＦＧＫ４．５と抗−ＰＤ−Ｌ１とを併用して治療された。
【図３】同所性Ｐａｎｃ０２−Ｈ７−Ｆｌｕｃ膵臓癌モデルｖｓコントロール及び単独療法におけるｍｕＦＧＫ４．５と抗ＰＤ−Ｌ１抗体の併用（「Ｃｏｍｂｏ」）の免疫薬力学（ＰＤ）的分析。
【図４】ヒト抗ＣＤ４０抗体と抗ＰＤ−Ｌ１抗体との併用治療を含む臨床試験のための投薬量及び投薬スケジュール。ＰＤ−Ｌ１抗体の用量は、１２００ｍｇに固定される。
【図５】第三の成分としての抗ＴＮＦアルファの添加が、抗ＣＤ４０／抗ＰＤ−Ｌ併用治療により誘発されるマウスの体重減少を防ぐ。
【図６】第三の成分としての抗ＴＮＦアルファの添加が、抗ＣＤ４０／抗ＰＤ−Ｌ併用治療の抗腫瘍活性を損なうことはない。
【００１１】
配列表
配列番号１：ヒトＣＤ４０
配列番号２：ヒトＰＤ−Ｌ１
配列番号３：本発明のＣＤ４０抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
配列番号４：本発明のＣＤ４０抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）
配列番号５：重鎖可変ドメインＶＨ変異体１、抗ＰＤ−Ｌ１  ２４３．５５
配列番号６：重鎖可変ドメインＶＨ変異体２、抗ＰＤ−Ｌ１  ２４３．５５
配列番号７：重鎖可変ドメインＶＨ変異体３、抗ＰＤ−Ｌ１  ２４３．５５
配列番号８：軽鎖可変ドメインＶＬ変異体１、抗ＰＤ−Ｌ１  ２４３．５５
配列番号９：軽鎖可変ドメインＶＬ変異体２、抗ＰＤ−Ｌ１  ２４３．５５
配列番号１０：軽鎖可変ドメインＶＬ変異体３、抗ＰＤ−Ｌ１  ２４３．５５
配列番号１１：軽鎖可変ドメインＶＬ変異体４、抗ＰＤ−Ｌ１  ２４３．５５
配列番号１２：軽鎖可変ドメインＶＬ変異体５、抗ＰＤ−Ｌ１  ２４３．５５
配列番号１３：軽鎖可変ドメインＶＬ変異体６、抗ＰＤ−Ｌ１  ２４３．５５
配列番号１４：軽鎖可変ドメインＶＬ変異体７、抗ＰＤ−Ｌ１  ２４３．５５
配列番号１５：軽鎖可変ドメインＶＬ変異体８、抗ＰＤ−Ｌ１  ２４３．５５
配列番号１６：軽鎖可変ドメインＶＬ変異体９、抗ＰＤ−Ｌ１  ２４３．５５
配列番号１７：軽鎖可変ドメインＶＬ変異体１０、抗ＰＤ−Ｌ１  ２４３．５５
配列番号１８：軽鎖可変ドメインＶＬ変異体１１、抗ＰＤ−Ｌ１  ２４３．５５
配列番号１９：軽鎖可変ドメインＶＬ変異体１２、抗ＰＤ−Ｌ１  ２４３．５５
配列番号２０：軽鎖可変ドメインＶＬ変異体１３、抗ＰＤ−Ｌ１  ２４３．５５
配列番号２１：軽鎖可変ドメインＶＬ変異体１４、抗ＰＤ−Ｌ１  ２４３．５５
配列番号２２：軽鎖可変ドメインＶＬ変異体１５、抗ＰＤ−Ｌ１  ２４３．５５
配列番号２３：軽鎖可変ドメインＶＬ変異体１６、抗ＰＤ−Ｌ１  ２４３．５５
【発明を実施するための形態】
【００１２】
ＰＤ−Ｌ１（プログラム死リガンド１）は、Ｔ細胞の活性化後にＴ細胞上に発現される阻害性受容体であるＰＤ−１に結合する二つのリガンド（ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２）のうちの一つであり、慢性感染症又はがんなどの慢性刺激の状態で持続される(例えばBlank C et al, Cancer Immunol Immunother, 2005, 54:307-14; and Keir ME et al, Annual Rev Immunol, 2008, 26:677-704を参照のこと)。腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１の異常発現は、腫瘍細胞の免疫原性をかなり低下させること(Dong H et al, Nat Med, 2002, 8:793-800)、また抗腫瘍免疫を妨げ、その結果免疫回避を招くこと(Blank C et al, Cancer Immunol Immunother, 2007, 56:739-45)が報告されている。モノクローナル抗体によるＰＤ  Ｌ１又はＰＤ  １の遮断は、いくつかのマウス腫瘍モデルにおいて強力でしばしば迅速な抗腫瘍効果をもたらす(例えば、Iwai Y. et al, Proc Natl Acad Sci USA , 2002; 99:12293-7; Strome SE et al, Cancer Res 2003; 63:6501-5参照)。これは、腫瘍特異的Ｔ細胞が不活性又は抑制状態の腫瘍微小環境に存在し得ること、またＰＤ１／ＰＤ  Ｌ１経路の阻害が腫瘍特異的Ｔ細胞応答を再活性化し得ることを示唆している。実験データに基づいて、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−１の遮断は、腫瘍抗原に対する進行中の免疫応答を増強することが期待される(Merelli B et al, Crit Rev Oncol Hematol., 2014; 89:140-65)。ＰＤ−Ｌ１に対する抗体は、例えば国際公開第２０１０／０７７６３４号に記載されている。
【００１３】
腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーであるＣＤ４０は、Ｂリンパ球、樹状細胞（ＤＣ）、及び単球を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）上でのその発現を介した抗腫瘍免疫応答の決定的な調節因子である(例えば、Grewal IS et al, Ann Rev Immunol, 1998;16:111-35; Van Kooten C et al, J Leukoc. Biol , 2000;67:2-17; or O’Sullivan B et al, Crit Rev Immunol. 2003;23(1 2):83-107を参照)。ＣＤ４０刺激ＤＣは、抗原プロセシング及び提示経路を増加させ、リンパ節に移動してナイーブＴ細胞を活性化する。アゴニストＣＤ４０抗体は、マウスモデルにおいて樹立されたリンパ腫を除去することができる細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）拡張をもたらすＣＤ４＋リンパ球の機能を代替することが示された(例えば、Sotomayor EM et al, Nature Medicine, 1999;5(7):780-7; Gladue RP et al, Cancer Immunol Immunother, 2011;60(7):1009-17参照)。ＣＤ４０アゴニストは、宿主ＡＰＣを活性化することによって免疫刺激を誘発し、次いで腫瘍に対して向けられるＴ細胞応答を駆動する(例えば、Vonderheide RH, Clin Cancer Res, 2007;13:1083-8参照）。
【００１４】
したがって、ＣＤ４０アゴニストとＰＤ−Ｌ１阻害剤の併用は、ＣＤ４０アゴニスト活性を介して二次リンパ器官における抗腫瘍Ｔ細胞のプライミング及び増殖を引き起こし得、同時にＰＤ  １／ＰＤ−Ｌ１媒介性の抗腫瘍Ｔ細胞免疫抑制を取り除き得る。しかし、免疫療法、より具体的にはＴ細胞媒介性免疫応答は、注入関連反応、サイトカイン放出（ＣＲＳ、「サイトカインストーム」又は「高サイトカイン血症」）、及び免疫関連毒性などの重篤な有害事象（ＡＥ）も引き起こし得る。
【００１５】
本発明によれば、ＣＤ４０アゴニスト及びＰＤ−Ｌ１阻害剤の逐次併用又は同時併用の適用は、腫瘍増殖の相加的な（すなわち相乗的）阻害を超え、個々の腫瘍のインビボ寛解さえも引き起こすことが今や見出されている。好ましい実施態様では、二つの成分、すなわちＣＤ４０アゴニスト及びＰＤ−Ｌ１阻害剤の投与は、逐次的である。
【００１６】
したがって、一実施態様において、本発明は、ＣＤ４０アゴニスト及びＰＤ−Ｌ１阻害剤を含む相乗的併用を提供する。
【００１７】
別の実施態様において、本発明は、前記ＣＤ４０アゴニスト及び前記ＰＤ−Ｌ１阻害剤のヒトにおいて許容される（すなわち忍容される）適用のための投薬量及び投薬レジメンを提供する。これらの投薬量及び投薬レジメンは、免疫関連毒性のリスクを低減または排除し、本併用治療の安全性プロファイル及び忍容性を改善する。
【００１８】
ヒトＣＤ４０抗原は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）ファミリーに属する５０ｋＤａの細胞表面糖タンパク質である(Stamenkovic et al., EMBO J. 8:1403-10 (1989))。ヒトＣＤ４０抗原は、「腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー５」としても知られている。別の名称は、Ｂ細胞表面抗原４０、Ｂｐ５０、ＣＤ４０Ｌ受容体、ＣＤｗ４０、ＣＤＷ４０、ＭＧＣ９０１３、ｐ５０又はＴＮＦＲＳＦ５を含む。たとえば、ヒトＣＤ４０抗原は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｅｎｔｒｙ  Ｎｏ．Ｐ２５９４２に登録されている。一実施態様において、ヒトＣＤ４０抗原は、配列番号１の配列を有する（表１参照）。
表１：ヒトＣＤ４０抗原のタンパク質配列
0006586454.tif 000002
【００１９】
ヒトＰＤ−Ｌ１（又はＰＤＬ１）抗原は、「プログラム細胞死１リガンド１」又はＣＤ２７４分子とも呼ばれる。別の名称は、Ｂ７−Ｈ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７ホモログ１、ＭＧＣ１４２２９４、ＭＧＣ１４２２９６、ＰＤＣＤ１Ｌ１、ＰＤＣＤ１ＬＧ１、ＰＤＣＤ１リガンド１、ＰＤＬ１、ＰＤ−Ｌ１、プログラム死リガンド１を含む。Ｉ一実施態様において、ヒトＰＤ−Ｌ１抗原は、例えばＵｎｉＰｒｏｔ  Ｅｎｔｒｙ  Ｎｏ．Ｑ９ＮＺＱ７として登録されている、配列番号２の配列（表２）を有する。
表２：ヒトＰＤ−Ｌ１抗原のタンパク質配列
0006586454.tif 000003
【００２０】
本発明によれば、「抗ＣＤ４０抗体」（又は「ＣＤ４０抗体」、「Ａ−ＣＤ４０抗体」）は、ヒトＣＤ４０に結合するか又は特異的に結合し、かつそれを活性化する抗体である。一実施態様において、ヒトＣＤ４０は、配列番号１の配列を有する。本明細書で使用する場合、「ヒトＣＤ４０に結合」又は「ヒトＣＤ４０に特異的に結合」又は「ヒトＣＤ４０に結合する」又は「抗ＣＤ４０抗体」は、ＫＤ値１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌ以下、一実施態様ではＫＤ値１．０ｘ１０−９ｍｏｌ／ｌ以下の結合親和性でヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合する抗体を指す。結合親和性は、例えば表面プラズモン共鳴法（スウェーデン、ウプサラのＧＥ−ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））などの標準的な結合アッセイで決定される。したがって、本明細書で使用する「ヒトＣＤ４０に結合し、それを活性化する抗体」は、ＫＤ１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌ以下（一実施態様では１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌ〜１．０ｘ１０−１３ｍｏｌ／ｌ）、一実施態様ではＫＤ１．０ｘ１０−９ｍｏｌ／ｌ以下（一実施態様では１．０ｘ１０−９ｍｏｌ／ｌ〜１．０ｘ１０−１３ｍｏｌ／ｌ）の結合親和性で、ヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合する抗体を指す。別の実施態様では、本発明による抗ＣＤ４０抗体は、４×１０−１０Ｍ以下のＫＤでヒトＣＤ４０に結合する。
【００２１】
本発明の一実施態様では、ヒトＣＤ４０に結合する抗体は、アゴニスト（「ＣＤ４０アゴニスト」）である。「アゴニスト」は細胞上の受容体と結合し、受容体の天然リガンドによって開始される反応又は活性と類似若しくは同一の反応又は活性を開始する。「ＣＤ４０アゴニスト」は、次の応答のいずれか又はすべてを誘導する：Ｂ細胞の増殖及び／又は分化；ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、ＶＣ  ＡＭ等の分子を介する細胞間接着の亢進；ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＴＮＦなどの炎症誘発性サイトカインの分泌；ＴＲＡＦ（例えばＴＲＡＦ２及び／又はＴＲＡＦ３）、ＮＩＫ（ＮＦ−ｋＢ誘発キナーゼ）などのＭＡＰキナーゼ、Ｉ−カッパＢキナーゼ（ＩＫＫ／．ｂｅｔａ．）、転写因子ＮＦ−ｋＢ、Ｒａｓ、及びＭＥＫ／ＥＲＫ経路、ＰＩ３Ｋ  ＡＫＴ経路、Ｐ３８  ＭＡＰＫ経路等の経路によるＣＤ４０受容体を介するシグナル伝達；ＸＩＡＰ、ｍｃｌ−１、ｂｃｌ−ｘ等の分子による抗アポトーシスシグナルの伝達；Ｂ及び／又はＴ細胞のメモリー生成；Ｂ細胞抗体産生；Ｂ細胞アイソタイプスイッチ、ＭＨＣクラスＩＩ及びＣＤ８０／８６等の細胞表面発現の増加（但しこれらに限定されない）。
【００２２】
アゴニスト活性は、Ｂ細胞応答のアッセイにおいて測定される、ネガティブコントロールにより誘導されるアゴニスト活性よりも少なくとも３０％、１０  ３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％高いことが意図される。
【００２３】
別の実施態様では、ＣＤ４０アゴニストは、Ｂ細胞応答のアッセイで測定される、ネガティブコントロールにより誘導されるアゴニスト活性より少なくとも２倍又は少なくとも３倍大きいアゴニスト活性を有する。
【００２４】
したがって、例えば目的のＢ細胞応答がＢ細胞増殖である場合、アゴニスト活性は、ネガティブコントロールにより誘導されるＢ細胞増殖のレベルよりも少なくとも２倍又は少なくとも３倍高いレベルのＢ細胞増殖の誘導であろう。
【００２５】
本明細書で使用する「ＣＤ４０アゴニスト」は、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用をアゴナイズする任意の部分を含む。典型的には、このような部分は、アゴニスト性ＣＤ４０抗体又はアゴニスト性ＣＤ４０Ｌポリペプチドであろう。このような抗体は、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ結合相互作用を特異的にアゴナイズする、例えばヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、ｓｃＦｖ、及び抗体フラグメントを含む。一実施態様において、アゴニスト性ＣＤ４０抗体は、キメラ、完全ヒト又はヒト化ＣＤ４０抗体を含む。別の好ましい実施態様において、アゴニスト性ＣＤ４０抗体は、キメラ、完全ヒト又はヒト化ＣＤ４０抗体を含む。
【００２６】
一実施態様において、前記ＣＤ４０抗体は、ＩｇＧ２サブクラスの完全ヒト抗体である。さらに別の実施態様では、前記抗体は、国際公開第２００３／０４０１７０号に具体的に開示されている抗ＣＤ４０抗体のいずれかである。さらに別の実施態様では、本発明のＣＤ４０アゴニストは、国際公開第２００３／０４０１７０号にある３．１．１、７．１．２、１０．８．３、１５．  １．１、２１．４．１、２１．２．１、２２．１．１、２３．５．１、２３．２５．１、２３．２９．１、及び２４．２．１と命名された抗体の群から選択される。これらの抗体を分泌するハイブリドーマは、ブダペスト条約に従って寄託されている。寄託番号は、国際公開第２００３／０４０１７０号の段落［０２５０］で見つけることができる。別の実施態様では、本発明のＣＤ４０抗体は、抗体２１．４．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３６０５）の重鎖及び軽鎖可変ドメインアミノ配列を含む。別の実施態様では、本発明のＣＤ４０抗体は、抗体２１．４．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３６０５）の重鎖及び軽鎖アミノ配列からなる。
【００２７】
一実施態様では、本発明によるヒト抗ＣＤ４０抗体は、アミノ酸配列番号３の軽鎖可変ドメイン及びアミノ酸配列番号４の重鎖可変ドメインを含む（表３）。
表３：本発明のＣＤ４０アゴニストの軽（ＶＬ）及び重（ＶＨ）鎖可変ドメインのアミノ酸配列
0006586454.tif 000004
【００２８】
本発明によれば、「ＰＤ−Ｌ１抗体」）は、ヒトＰＤ−Ｌ１に結合するか又は特異的に結合する抗体である。一実施態様において、ヒトＰＤ−Ｌ１は、配列番号２の配列を有する。本明細書で使用する場合、「ヒトＰＤ−Ｌ１に結合」又は「ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合」又は「ヒトＰＤ−Ｌ１に結合する」又は「抗ＰＤ−Ｌ１抗体」は、ＫＤ値１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌ以下、一実施態様ではＫＤ値１．０ｘ１０−９ｍｏｌ／ｌ以下の結合親和性でヒトＰＤ−Ｌ１抗原に特異的に結合する抗体を指す。結合親和性は、例えば表面プラズモン共鳴法（スウェーデン、ウプサラのＧＥ−ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））などの標準的な結合アッセイで決定される。したがって、本明細書で使用する「ヒトＰＤ−Ｌ１に結合する抗体」は、ＫＤ値１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌ以下（一実施態様では１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌ〜１．０ｘ１０−１３ｍｏｌ／ｌ）、一実施態様ではＫＤ値１．０ｘ１０−９ｍｏｌ／ｌ以下（一実施態様では１．０ｘ１０−９ｍｏｌ／ｌ〜１．０ｘ１０−１３ｍｏｌ／ｌ）の結合親和性でヒトＰＤ−Ｌ１抗原に特異的に結合する抗体を指す。
【００２９】
一実施態様では、本明細書に記載の併用療法において使用されるヒトＰＤ−Ｌ１に結合する抗体は、
２４３．５５．Ｓ７０、２４３．５５．Ｈ１、２４３．５５．Ｈ１２、２４３．５５．Ｈ３７、２４３．５５．Ｈ７０、２４３．５５．Ｈ８９、２４３．５５．Ｓ１、２４３．５５．５、２４３．５５．８、２４３．５５．３０、２４３．５５．３４、２４３．５５．Ｓ３７、２４３．５５．４９、２４３．５５．５１、２４３．５５．６２、及び２４３．５５．８４
からなる群より選択される。
【００３０】
これらの抗体は、国際公開第２０１０／７７６３４号に記載されており（配列は国際公開第２０１０／７７６３４号の図１１に示されている）、以下の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含むことを特徴とする（表４）。
表４：選択されたＰＤ−Ｌ１抗体のＶＨ及びＶＬの組み合わせ
0006586454.tif 000005
表５：表４の配列番号の配列
0006586454.tif 000006
0006586454.tif 000007
0006586454.tif 000008
0006586454.tif 000009
0006586454.tif 000010
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0006586454.tif 000012
0006586454.tif 000013
0006586454.tif 000014
0006586454.tif 000015
0006586454.tif 000016
0006586454.tif 000017
【００３１】
したがって、本発明によれば、ヒトＰＤ−Ｌ１に結合する抗体（すなわち成分Ｂの抗体）は、以下により特徴付けられる。
ａ）  配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号８の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号９の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１０の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１１の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１２の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｆ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１３の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｇ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１４の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｈ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１５の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｉ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｊ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１７の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｋ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１８の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｌ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１９の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｍ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２０の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｎ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２１の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｏ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２２の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｐ）  配列番号７の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２３の軽鎖可変ドメインＶＬ
【００３２】
したがって、一実施態様では、本発明は、増殖性疾患、特にがんの逐次併用又は同時併用治療のための、Ａ）ヒトＣＤ４０に特異的に結合してそれを活性化する抗体又はその抗原結合部分を有効成分として含む第一の成分と、Ｂ）有効成分としてＰＤ−Ｌ１抗体を含む第二成分とを含む薬学的製品を提供する。
【００３３】
この実施態様の範囲内で、Ａ）に含まれる抗体は、ヒトＣＤ４０に４ｘ１０−１０Ｍ以下のＫＤで結合するＩｇＧ２サブクラスの完全ヒト抗体；又は
配列番号３のＶＬ及び配列番号４のＶＨを含む抗体；又は
抗体２１．４．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３６０５）の重鎖及び軽鎖可変ドメインアミノ配列を含む抗体；又は
抗体２１．４．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３６０５）の重鎖及び軽鎖アミノ配列を含む抗体であり；また
Ｂ）に含まれる抗体は、前述のａ）からｐ）に記載のＰＤ−Ｌ１抗体のいずれかである。
【００３４】
さらに別の実施態様では、本発明は、Ａ）４ｘ１０−１０Ｍ以下のＫＤでヒトＣＤ４０に結合するＩｇＧ２サブクラスの完全ヒト抗体を有効成分として含む第一の成分と、Ｂ）有効成分として以下：
ａ）  配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号８の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号９の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１０の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１１の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１２の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｆ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１３の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｇ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１４の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｈ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１５の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｉ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｊ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１７の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｋ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１８の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｌ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１９の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｍ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２０の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｎ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２１の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｏ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２２の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｐ）  配列番号７の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２３の軽鎖可変ドメインＶＬ
を含む抗体から選択されるＰＤ−Ｌ１抗体を含む第二の成分とを含む、増殖性疾患、特にがんの逐次併用又は同時併用治療のための薬学的製品を提供する。
【００３５】
さらに別の実施態様様では、本発明は、Ａ）配列番号３のＶＬ及び配列番号４のＶＨを含む抗体を有効成分として含む第一の成分と、Ｂ）有効成分として、以下：
ａ）  配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号８の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号９の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１０の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１１の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１２の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｆ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１３の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｇ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１４の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｈ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１５の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｉ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｊ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１７の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｋ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１８の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｌ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１９の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｍ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２０の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｎ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２１の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｏ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２２の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｐ）  配列番号７の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２３の軽鎖可変ドメインＶＬ
を含む抗体から選択されるＰＤ−Ｌ１抗体を含む第二の成分とを含む、増殖性疾患、特にがんの逐次併用又は同時併用治療のための薬学的製品を提供する。
【００３６】
さらに別の実施態様では、本発明は、Ａ）抗体２１．４．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３６０５）の重鎖及び軽鎖可変ドメインアミノ配列を含む抗体を有効成分として含む第一の成分と、Ｂ）有効成分として、以下：
ａ）  配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号８の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号９の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１０の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１１の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１２の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｆ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１３の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｇ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１４の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｈ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１５の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｉ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｊ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１７の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｋ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１８の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｌ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１９の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｍ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２０の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｎ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２１の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｏ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２２の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｐ）  配列番号７の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２３の軽鎖可変ドメインＶＬ
を含む抗体から選択されるＰＤ−Ｌ１抗体を含む第二の成分とを含む、増殖性疾患、特にがんの逐次併用又は同時併用治療のための薬学的製品を提供する。
【００３７】
さらに別の実施態様では、本発明は、Ａ）抗体２１．４．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３６０５）の重鎖及び軽鎖アミノ配列を含む抗体を有効成分として含む第一の成分と、Ｂ）有効成分として、以下：
ａ）  配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号８の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号９の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１０の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１１の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１２の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｆ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１３の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｇ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１４の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｈ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１５の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｉ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｊ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１７の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｋ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１８の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｌ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１９の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｍ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２０の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｎ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２１の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｏ）  配列番号６の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２２の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｐ）  配列番号７の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２３の軽鎖可変ドメインＶＬ
を含む抗体から選択されるＰＤ−Ｌ１抗体を含む第二の成分とを含む、増殖性疾患、特にがんの逐次併用又は同時併用治療のための薬学的製品を提供する。
【００３８】
さらに別の実施態様様では、本発明は、Ａ）配列番号３のＶＬ及び配列番号４のＶＨを含む抗体を有効成分として含む第一の成分と、Ｂ）有効成分として、配列番号８のＶＬ及び配列番号５のＶＨを含む抗体を含む第二の成分とを含む、増殖性疾患、特にがんの逐次併用又は同時併用治療のための薬学的製品を提供する。
【００３９】
さらに別の実施態様では、本発明は、Ａ）抗体２１．４．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３６０５）の重鎖及び軽鎖可変ドメインアミノ配列を含む抗体を有効成分として含む第一の成分と、Ｂ）有効成分として、抗体２４３．５５．Ｓ７０の重鎖及び軽鎖可変ドメインアミノ配列を含む抗体を含む第二の成分とを含む、増殖性疾患、特にがんの逐次併用又は同時併用治療のための薬学的製品を提供する。
【００４０】
さらに別の実施態様では、本発明は、Ａ）抗体２１．４．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３６０５）の重鎖及び軽鎖アミノ配列を含む抗体を有効成分として含む第一の成分と、Ｂ）有効成分として、抗体２４３．５５．Ｓ７０の重鎖及び軽鎖アミノ配列を含む抗体を含む第二の成分とを含む、増殖性疾患、特にがんの逐次併用又は同時併用治療のための薬学的製品を提供する。
【００４１】
一実施態様では、成分Ａ）及びＢ）は、好ましくは１又は２又は３又は４又は５又は６又は７日間の時間差で別々に投与される。別の実施態様において、成分Ａ）及びＢ）の投与の差は、１日から２１日の間、好ましくは１日から１４日の間、又は１日から１０日の間、又は１日から７日の間のいずれの時間差であってもよい。
【００４２】
別の実施態様では、本発明は、がん、好ましくは固形腫瘍などの増殖性疾患の逐次併用又は同時併用治療のための医薬の製造のための、ヒトＣＤ４０に特異的に結合してそれを活性化する抗体又はその抗原結合部分及びＰＤ−Ｌ１抗体の使用を提供する。
【００４３】
本発明は、患者に対して治療的有効量の本発明による抗体を投与することを特徴とする、治療を必要とする患者の治療のための方法をさらに含む。本発明は、記載の治療法のための、本発明による抗体の使用を含む。
【００４４】
したがって、本発明の一実施態様は、本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体との併用でのがんの治療における使用のための、本明細書に記載のＣＤ４０抗体又はその抗原結合部分である。本明細書で使用される用語「がん」は、例えば、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞上皮細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚黒色腫又は眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん(stomach cancer)、胃がん(gastric cancer)、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、リンパ腫、リンパ性白血病（任意の、上記がんの難治性型、又は上記がんの一又は複数の組み合わせを含む）であり得る。好ましい一実施態様では、そのようながんは、乳がん、結腸直腸がん、メラノーマ、頭頚部がん、肺がん又は前立腺がんである。別の実施態様では、そのようながんは、乳がん、肺がん、結腸がん、卵巣がん、メラノーマがん、膀胱がん、腎がん、腎臓がん、肝臓がん、頭頚部がん、結腸直腸がん、膵臓がん、胃がん、食道がん、中皮腫又は前立腺がんから選択される固形腫瘍である。別の実施態様において、そのようながんは、白血病（例えばＡＭＬ、ＣＬＬ）、リンパ腫、骨髄腫等の血液腫瘍である。さらに別の実施態様において、がんは、乳がん、肺がん、結腸がん、結腸直腸がん、膵臓がん、胃がん又は前立腺がんである。
【００４５】
一実施態様では、本併用療法は、転移の予防又は治療における使用のためのものである。
【００４６】
一実施態様では、本併用療法は、腫瘍免疫などの免疫関連疾患の治療又は進行遅延における使用のためのものである。
【００４７】
一実施態様では、本併用療法は、Ｔ細胞活性などの免疫応答又は機能の刺激における使用のためのものである。
【００４８】
用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合することができるヒトＣＤ４０又はＰＤ−Ｌ１のタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、特定の三次元構造特性及び特定の電荷特性を通常有する。立体構造エピトープと非立体構造エピトープは、変性溶媒の存在下で後者でなく前者への結合が失われるという点で区別される。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「可変ドメイン」（軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ））は、抗原への抗体の結合に直接関与する軽鎖ドメイン及び重鎖ドメインの対の各々を意味する。可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインは、同じ一般構造を有し、各ドメインは、三つの「超可変領域」（又は相補性決定領域、ＣＤＲ）によって接続された、配列が広く保存されている四つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域は、ベータ−シートコンフォメーションを採り、ＣＤＲは、ベータ−シート構造を接続するループを形成し得る。各鎖におけるＣＤＲは、フレームワーク領域によりその三次元構造に保持され、もう一方の鎖に由来するＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３領域は、本発明による抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たし、それ故、本発明のさらなる目的を提供する。
【００５０】
本明細書において使用される場合、「抗体の抗原結合部分」という用語は、抗原結合に関与する、抗体のアミノ酸残基を指す。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」のアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」すなわち「ＦＲ」領域は、本明細書で定義している超可変可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖及び重鎖の可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合に最も寄与する領域であり、抗体の特性を定義する。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的な定義及び／又は「超可変可変ループ」からの残基に従って決定される。
【００５１】
本発明の一実施態様では、ヒトＣＤ４０に特異的に結合してそれを活性化する抗体の「抗原結合部分」は、抗体２１．４．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３６０５）の重鎖及び軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
【００５２】
本明細書で使用する場合、用語「核酸」又は「核酸分子」は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００５３】
本願内で使用される場合、用語「アミノ酸」は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシアルファ−アミノ酸の群を意味する。
【００５４】
抗体の「Ｆｃ部分」は、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、様々なエフェクター機能を発揮する。「抗体のＦｃ部分」は、当業者に周知であり、抗体のパパイン切断に基づいて定められる用語である。抗体又は免疫グロブリンは、その重鎖定常領域のアミノ酸配列に応じて、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭのクラスに分類され、これらのうちいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２にさらに分類されることがある。重鎖定常領域に応じて、免疫グロブリンの異なるクラスは、それぞれａ、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。抗体のＦｃ部分は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、及びＦｃ受容体結合に基づいて、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性）及びＣＤＣ（補体依存性細胞傷害性）に直接関与する。補体活性化（ＣＤＣ）は、ほとんどのＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部分への補体因子Ｃ１ｑの結合により開始される。補体系に対する抗体の影響は特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃ部分に規定された結合部位により引き起こされる。そのような結合部位は当該技術分野で既知であり、例えばBoackle, R.J., et al., Nature 282 (1979) 742-743, Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560, Brunhouse, R.及び Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917, Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344, Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004, Idusogie, E.E., et al., J. Immunol.164 (2000) 4178-4184, Hezareh, M., et al., J. Virology 75 (2001) 12161-12168, Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324, EP 0 307 434により記載されている。そのような結合部位は、例えばＬ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、及びＰ３２９（Ｋａｂａｔ，Ｅ．ＡのＥＵインデックスに従い番号付け、下記参照）である。通常、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ３の抗体は、補体活性化並びにＣ１ｑ及びＣ３結合を示すが、一方ＩｇＧ４は補体系を活性化せず、Ｃ１ｑ及びＣ３に結合しない。
【００５５】
一実施態様において、本発明による抗体はヒト起源由来のＦｃ部分、好ましくはヒト定常領域の他のすべての部分を含む。本明細書で使用される場合、用語「ヒト起源由来のＦｃ部分」は、サブクラスＩｇＧ１又はＩｇＧ２又はＩｇＧ３又はＩｇＧ４のヒト抗体のＦｃ部分、好ましくはヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ２サブクラスのＦｃ部分、（Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａに変異を有する一実施態様において）ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ２サブクラスの変異Ｆｃ部分、ヒトＩｇＧ４サブクラスのＦｃ部分、又はＳ２２８Ｐに変異を有する一実施態様において、ヒトＩｇＧ４サブクラスの変異Ｆｃ部分のいずれかであるＦｃ部分を指す。別の実施態様では、前記抗体は、低下した又は最小のエフェクター機能を有する。一実施態様では、最小のエフェクター機能は、エフェクターなし（ｅｆｆｅｃｔｏｒｌｅｓｓ）Ｆｃ突然変異に起因し得る。一実施態様では、エフェクターなしＦｃ突然変異は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ又はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ又はＮ２９７Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａである。一実施態様では、エフェクターなしＦｃ突然変異は、各抗体に対して、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ、Ｎ２９７Ａ、及びＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａを含む群から互いに独立して選択され得る。
【００５６】
一実施態様では、本発明による抗体は、モノクローナル抗体である。別の実施態様では、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧクラスの（すなわちＩｇＧ１又はＩｇＧ２又はＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブクラスの）抗体である。さらに別の実施態様では、一方の抗体が好ましくはＩｇＧ２サブクラスであり、他方はＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブクラスのものである。
【００５７】
一実施態様において、本明細書に記載の抗体は、定常鎖がヒト起源であることを特徴とする。そのような定常鎖は、当該技術分野でよく知られており、例えばＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．により記載されている(例えばJohnson, G.及びWu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218参照)。
【００５８】
本明細書に記載の抗体は、好ましくは組み換え手段により生成される。そのような方法は当該技術分野において広く知られており、原核細胞及び真核細胞におけるタンパク質の発現、それに続く抗体ポリペプチドの単離、及び通常は薬学的に許容される純度への精製を含む。タンパク質発現について、軽鎖及び重鎖又はその断片をコードする核酸は、標準的な方法により発現ベクターに挿入される。発現は、適切な原核宿主細胞又は真核宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母、又は大腸菌細胞において実施され、抗体は、その細胞から（上清から又は細胞溶解後に）回収される。
【００５９】
抗体の組み換え生成は、当該技術分野で周知であり、例えば総説Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880に記載がある。
【００６０】
抗体は、細胞全体に、細胞溶解物に、又は部分的に精製された形態若しくは実質的に純粋な形態で存在しうる。精製は、他の細胞成分又は他の夾雑物、例えば他の細胞核酸又はタンパク質を、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当該技術分野で周知のその他の技術を含む標準的な技術により除去するために実施される。Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)参照。
【００６１】
ＮＳ０細胞における発現は、例えばBarnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270に記載されている。一過性発現は、例えばDurocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9に記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87に記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ  ２９３）は、Schlaeger, E.-J.及びChristensen, K., Cytotechnology 30 (1999) 71-83、並びにSchlaeger, E.-J., J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199に記載されている。
【００６２】
本発明の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、発現ベクターコンストラクトが形成されるように、プロモーター配列、翻訳開始配列、定常領域配列、３’非翻訳領域配列、ポリアデニル化配列及び転写終結配列と組み合わせたものである。重鎖発現コンストラクト及び軽鎖発現コンストラクトを単一のベクターに組み込み、宿主細胞にコトランスフェクション、連続トランスフェクション又は別々のトランスフェクションを行い、次いでその宿主細胞を融合させて、両方の鎖を発現する単一の宿主細胞を形成することができる。
【００６３】
原核生物に適切な制御配列は、例えばプロモーター、任意選択的にオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。
【００６４】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、その核酸は「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるならば、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されており；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作動可能に連結されており；又はリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置されているならば、コード配列に作動可能に連結されている。通常、「作動可能に連結」とは、連結されるＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合には、連続していて、かつリーディングフレームにあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは必ずしも連続している必要はない。連結は、簡便な制限部位におけるライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合は、慣行に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。
【００６５】
モノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーといった一般的な免疫グロブリン精製手順により、培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、一般的な手順を使用し、容易に単離及び配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡ及びＲＮＡの供給源としての機能を果たし得る。単離したら、ＤＮＡを発現ベクター内に挿入し、次いでこれらの発現ベクターを、そうしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞又は骨髄腫細胞内にトランスフェトし、宿主細胞において組換えモノクローナル抗体の合成を得る。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」という表現は互換的に用いられ、すべてのそのような名称は子孫を含む。したがって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という語は、初代の対象細胞と、導入回数に関係なく、これに由来する培養物とを含む。また、すべての子孫が、計画的な又は意図しない突然変異の影響で、ＤＮＡ量において正確に同一であるわけではない。元々の形質転換細胞においてスクリーニングしたものと同じ機能又は生物活性を有する変異体子孫が含まれる。
【００６７】
本発明に従って使用される特異的抗体を製造する方法は、国際公開第２００３／０４０１７０号（抗ＣＤ４０抗体について）及び国際公開第２０１０／７７６３４号（ＰＤ−Ｌ１抗体について）においても開示されている。
【００６８】
別の態様において、本発明は、組成物、例えば薬学的に許容される担体と共に製剤化された、本発明のモノクローナル抗体若しくはその抗原結合部分のうちの一つ又はそれらの組み合わせを含有する薬学的組成物を提供する。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合する、あらゆるすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤、並びに吸収／再吸収遅延剤等を含む。好ましくは、担体は、注射又は注入に適している。
【００７０】
本発明の組成物は、当該技術分野において知られている多様な方法により投与され得る。当業者により認識されているように、投与経路及び／又は投与様式は、所望の結果に応じて変化するものである。
【００７１】
薬学的に許容される担体は、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射溶液若しくは分散液の調製用の滅菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野で知られている。水の他に、担体は、例えば等張緩衝生理食塩水とすることができる。
【００７２】
選択された投与経路に関わらず、適切な水和形態で使用され得る本発明の化合物及び／又は本発明の薬学的組成物は、当業者に知られている一般的な方法により薬学的に許容される剤形に製剤化される。
【００７３】
本発明に従って使用される特異的抗体の薬学的組成物は、当業者に既知の標準的な調製物であってよく、例えば国際公開第２００３／０４０１７０号（抗ＣＤ４０抗体について）及び国際公開第２０１０／７７６３４号（ＰＤ−Ｌ１抗体について）において開示されている。
【００７４】
本発明の薬学的組成物中の有効成分の実際の用量レベルは、患者に対して毒性でなく（有効量）、特定の患者、組成物、及び投与様式に関して所望の治療的応答を達成するために効果的な有効成分の量を得るために、多様であってよい。選択された用量レベルは、使用される本発明の特定の組成物又はそのエステル、塩若しくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄速度、使用される特定の組成物と併用で用いられる他の薬物、化合物、及び／又は物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康状態、及び既往歴、並びに医学の技術分野において周知である同様の要因を含む多様な薬物動態因子に依存するであろう。
【００７５】
用語「治療方法」又はこれと同義の用語は、例えばがんに適用される場合、患者におけるがん細胞の数を減少若しくは消滅させるように、又はがんの症状を緩和するように設計された手順又は一連の行為を指す。がん又は他の増殖性疾患の「治療方法」は、がん細胞若しくは他の疾患が実際に取り除かれること、細胞の数若しくは疾患が実際に低減されること、又はがん若しくは他の疾患の症状が実際に緩和されることを必ずしも意味しない。がんを治療する方法はしばしば、成功の可能性が低くても実施されるが、患者の病歴及び推定余命を考慮すると、それでも全体的に有利な作用過程を誘導するとみなされている。
【００７６】
用語「との併用で投与される」又は「共投与」、「共投与すること」、「併用療法」又は「併用治療」は、例えば複数の別々の処方／適用としての（又は単一の処方／適用としての）、本明細書に記載の抗ＣＤ４０抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体の投与を指す。共投与は、同時であっても又は任意の順序で逐次的であってもよいが、両方（又はすべて）の活性剤がそれらの生物活性を同時に発揮する期間があることが好ましい。一実施態様では、本明細書で使用される成分Ａ及びＢのいずれも、静脈内経路（ｉ．ｖ．）を使用して、例えば連続注入で、又は皮下経路（ｓ．ｃ．）を介して投与することができる。一実施態様において、成分Ａ及びＢは、ｉ．ｖ．経路／調製物により別々に共投与される。別の実施態様において、成分Ａ及びＢは、ｓ．ｃ．経路／調製物により別々に共投与される。さらに別の実施態様において、成分Ａ及びＢは、一つはｓ．ｃ．経路／調製物により、又他方は、ｉ．ｖ．経路／調製物により別々に共投与される。
【００７７】
それぞれの化合物の量又は併用量が研究者、獣医、医師又は他の臨床家が求める組織、系、動物又はヒトの生物学的又は医学的奏功を引き出す量である「治療的有効量」（又は単に「有効量」）で抗体が患者に投与されることは、自明である。
【００７８】
共投与における各成分の投薬量及び共投与のタイミングは、治療される患者のタイプ（人種、性別、年齢、体重等）及び状態、並びに治療される疾患又は状態の重篤度に依存するであろう。特に、免疫系の活性化に基づく治療は一般に、時にはサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）又は抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答と呼ばれる、圧倒的な免疫応答のリスクを負う可能性がある。ＣＤ４０アゴニストを伴う、治療的で臨床的に適切な治療レジメン、すなわち許容可能で有効な用量及び投薬スケジュールを見出すことが、現在満たされていない医学的必要性となる。
【００７９】
したがって、一実施態様において、成分（Ａ及びＢ）は逐次的に共投与され、各単一成分の用量は２回の別々の投与（ｉ．ｖ．又はｓ．ｃ．）で同じ日に投与されるか、又は成分の一方が１日目に投与され、第二の成分が２日目から４２日目の間、又は２日目から２１日目の間、又は２日目から１４日目の間、又は２日目から７日目の間の任意の日に共投与される。別の実施態様において、第二の成分は、第一の成分の投与後２日目又は７日目又は１４日目又は２１日に共投与される。別の実施態様において、第二の成分は、第一の成分の投与後２日目又は２１日に共投与される。
【００８０】
別の実施態様において、第一の投与成分は、成分Ａ、すなわち本明細書に記載の抗ＣＤ４０抗体である。この実施態様の範囲内で、成分Ａは、４ｍｇから１６ｍｇの間、好ましくは４ｍｇ又は８ｍｇ又は１６ｍｇの固定用量で投与される。
【００８１】
別の実施態様では、成分Ａを１日目に１６ｍｇの用量で１回投与し、続いて成分Ｂを４２日目に投与し、さらに成分Ｂを３週間毎又は１４若しくは７日毎に維持投与する。
【００８２】
別の実施態様では、成分Ａを１日目に１６ｍｇの用量で１回投与し、続いて成分Ｂを２１日目に初回投与し、さらに成分Ｂを３週間毎又は１４若しくは７日毎に維持投与する。
【００８３】
別の実施態様では、成分Ａを１日目に４ｍｇの用量で１回投与し、続いて成分Ｂを２１日目に初回投与し、さらに成分Ｂを３週間毎又は１４若しくは７日毎に維持投与する。
【００８４】
別の実施態様では、成分Ａを１日目に４ｍｇの用量で１回投与し、続いて成分Ｂを１４日目に初回投与し、さらに成分Ｂを３週間毎又は１４若しくは７日毎に維持投与する。
【００８５】
別の実施態様では、成分Ａを１日目に４ｍｇの用量で１回投与し、続いて成分Ｂを７日目に初回投与し、さらに成分Ｂを３週間毎又は１４若しくは７日毎に維持投与する。
【００８６】
別の実施態様では、成分Ａを１日目に１６ｍｇの用量で１回投与し、続いて成分Ｂを１４日目に初回投与し、さらに成分Ｂを３週間毎又は１４若しくは７日毎に維持投与する。
【００８７】
別の実施態様では、成分Ａを１日目に１６ｍｇの用量で１回投与し、続いて成分Ｂを７日目に初回投与し、さらに成分Ｂを３週間毎又は１４若しくは７日毎に維持投与する。
【００８８】
別の実施態様では、成分Ｂを１日目に投与し、続いて２日目に成分Ａを４ｍｇから１６ｍｇの間の固定用量で単回投与し、さらに続いて成分Ｂを３週間毎又は１４若しくは７日毎に維持投与する。この実施態様の範囲内で、成分Ａの固定用量は、４ｍｇ、８ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ又は１６ｍｇから好ましくは選択される。
【００８９】
さらに別の実施態様において、成分Ｂは、治療の１日目に投与され、その後３週間（２１日）毎にさらに投与され、また成分Ａは、治療の２日目に投与され、その後それぞれ６週間（４２日）以内の間隔で３回追加投与される。この実施態様の範囲内で、成分Ａは、４ｍｇから１６ｍｇの間、好ましくは４ｍｇ、８ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ又は１６ｍｇの固定用量で投与される。
【００９０】
さらに別の実施態様において、成分Ｂは、治療の１日目に投与され、その後３週間（２１日）毎にさらに投与され、また成分Ａは、治療の２日目に投与され、その後それぞれ３週間（２１日）以内の間隔で３回追加投与される。この実施態様の範囲内で、成分Ａは、４ｍｇから１６ｍｇの間、好ましくは４ｍｇ、８ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ又は１６ｍｇの固定用量で投与される。
【００９１】
投与／投薬スキームに関する上記すべての実施態様内では、成分Ｂ（すなわち抗ＰＤ−Ｌ１抗体）は１２００ｍｇの固定用量で投与される。成分Ｂを用いる治療又は「維持投与」は、疾患の進行まで継続される。
【００９２】
さらに別の実施態様では、本発明は、抗ＣＤ４０抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体を伴う併用療法のための、図４に示す任意の投与スケジュールを提供する。
【００９３】
したがって、一実施態様では、本発明は、成分Ａ）及びＢ）が別々に投与される、本明細書において先に定義した成分Ａ及びＢを含む薬学的製品を提供する。
【００９４】
別の実施態様において、本発明は、成分Ａ及び／又はＢが静脈内（ｉ．ｖ）又は皮下（ｓ．ｃ）に投与される前記薬学的製品を提供する。
【００９５】
さらに別の実施態様において、本発明は、成分Ａが４から１６ｍｇの間の固定用量で投与され、成分Ｂが１２００ｍｇの固定用量で投与される前記薬学的製品を提供する。
【００９６】
さらに別の実施態様では、本発明は、成分Ａ及びＢの投与が１から４２日、好ましくは１又は７又は１４又は２１又は４２日離れている、前記薬学的製品を提供する。
【００９７】
さらに別の実施態様において、本発明は、成分Ａが成分Ｂと共に１〜４回投与され、次に疾患の進行まで成分Ｂのみで治療が継続される、前記薬学的製品を提供する。
【００９８】
別のより具体的な実施態様において、本発明は、成分Ａが配列番号３のＶＬ及び配列番号４のＶＨを含む抗体を有効成分として含む成分で、かつ成分Ｂが配列番号８のＶＬ及び配列番号５のＶＨを含む抗体を有効成分として含む成分である、上記投与スケジュールを提供する。
【００９９】
別の実施態様では、本発明は、がん、好ましくは固形腫瘍などの増殖性疾患の逐次併用又は同時併用治療のための医薬の製造のための、ヒトＣＤ４０に特異的に結合してそれを活性化する抗体又はその抗原結合部分及びＰＤ−Ｌ１抗体の使用を提供する。
【０１００】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体と併用の抗ＣＤ４０抗体に加えて、化学療法剤又は放射線療法などの追加的な治療選択肢も想定することができる。
【０１０１】
一実施態様では、そのような追加の化学療法剤は、本明細書に記載の抗ＣＤ４０抗体及び本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体と共に投与することができ、限定されないが、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン及びクロラムブシルなどのナイトロジェンマスタードを含むアルキル化剤を含む抗新生物剤；カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）等のニトロソ尿素）；テモダール（Ｔｅｍｏｄａｌ）（ＴＭ）（テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌａｍｉｄｅ）、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホラミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルテレタミン）等のエチレンイミン／メチルメラミン；ブスルファンなどのアルキルスルホネート；ダカルバジン（ＤＴＩＣ）などのトリアジン；葉酸アナログ、例えばメトトレキサート及びトリメトレキサート、ピリミジンアナログ、例えば５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５−アザシチジン、２，２’−ジフルオロデオキシシチジン、プリンアナログ、例えば６−メルカプトプリン（６−ｍｅｒｃａ．ｒｈｏ．ｔｏｐｕｒｉｎｅ）、６−チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｍｎｅ）、アザチオプリン、Ｔ−デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリトロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン、及び２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ）を含む代謝拮抗薬；抗有糸分裂薬、例えばパクリタキセル、ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン、及びビノレルビンを含むビンカアルカロイド、タキソテール、エストラムスチン、及びリン酸エストラムスチンを含む天然物；ピポドフィロトキシン、例えばエトポシド及びテニポシド；抗生物質、例えばアクチノマイシンＤ、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシンＣ、及びアクチノマイシン；酵素、例えばＬ−アスパラギナーゼ；生体応答修飾物質、例えばインターフェロン−アルファ、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ、及びＧＭ−ＣＳＦ；白金配位錯体、例えばオキサリプラチン、シスプラチン、及びカルボプラチン、アントラセンジオン、例えばミトキサントロン、置換尿素、例えばヒドロキシウレア、Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）及びプロカルバジンを含むメチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、例えばミトタン（ｏ、ｐ−ＤＤＤ）及びアミノグルテチミドを含む様々な薬剤；副腎皮質ステロイドアンタゴニスト、例えばプレドニゾンとその等価物、デキサメタゾン及びアミノグルテチミドを含むホルモン及びアンタゴニスト；ジェムザール（ＴＭ）（ゲムシタビン）、プロゲスチン、例えばカプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、メドロキシプロゲステロンアセテート及び酢酸メゲストロール；エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール等価物；抗エストロゲン、例えばタモキシフェン；テストステロンプロピオナート及びフルオキシメステロン／等価物を含むアンドロゲン；抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモンアナログ及びロイプロリド；並びに非ステロイド性抗アンドロゲン、例えばフルタミドを含む。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、脱メチル化剤（例えばビダーザ）及び転写抑制解除（ＡＴＲＡ）療法を含むがこれらに限定されないエピジェネティックなメカニズムを標的とする療法も、抗原結合タンパク質と組み合わせることができる。一実施態様では、化学療法剤は、タキサン（例えばパクリタキセル（タキソール））、ドセタキセル（タキソテール）、修飾されたパクリタキセル（例えばアブラキサン及びオパキシオ））、ドキソルビシン、スニチニブ（スーテント）、ソラフェニブ（ネクサバール）、及び他の多種キナーゼ阻害剤、オキサリプラチン、シスプラチン及びカルボプラチン、エトポシド、ゲムシタビン、並びにビンブラスチンからなる群より選択される。一実施態様では、化学療法剤は、タキサン（例えばタキソール（パクリタキセル）、ドセタキセル（タキソテール）、修飾されたパクリタキセル（例えアブラキサン及びオパキシオ）からなる群より選択される。一実施態様では、追加的化学療法剤は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、イリノテカン又はオキサリプラチンから選択される。一実施態様では、化学療法剤は、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、及びイリノテカン（ＦＯＬＦＩＲＩ）である。一実施態様では、化学療法剤は、５−フルオロウラシル及びオキサリプラチン（ＦＯＬＦＯＸ）である。
【０１０２】
追加的化学療法剤との併用療法の特定の例は、例えば、乳がんの治療のためのタキサン（例えばドセタキセル又はパクリタキセル）又は修飾されたパクリタキセル（例えばアブラキサン又はオパキシオ）、ドキソルビシン）、カペシタビン及び／又はベバシズマブ（アバスチン）を用いる療法；卵巣がんのためのカルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン、パクリタキセル、ドキソルビシン（又は修飾されたドキソルビシン（Ｃａｅｌｙｘ又はドキシル）），又はトポテカン（ハイカムチン）を用いる療法；腎臓がんの治療のための多種キナーゼ阻害剤、ＭＫＩ、（スーテント、ネクサバール又は７０６）、及び／又はドキソルビシンを用いる療法；扁平上皮癌の治療のためのオキサリプラチン、シスプラチン、及び／又は放射線を用いる療法；肺がんの治療のためのタキソール及び／又はカルボプラチンを用いる療法を含む。
【０１０３】
本発明は、有効量の本発明の抗ＣＤ４０抗体及び／又はＰＤ−Ｌ１抗体を薬学的に許容される担体と共に含む医薬の製造方法をさらに提供する。
【０１０４】
本発明は、がん、好ましくは固形腫瘍などの増殖性疾患の逐次併用又は同時併用治療のための、Ａ）ヒトＣＤ４０に特異的に結合してそれを活性化する抗体又はその抗原結合部分とＢ）ＰＤ−Ｌ１抗体とを含む薬学的製品を、当業者、例えば医師、腫瘍専門医又は他の医療従事者のための前記薬学的製品を医薬としてどのように使用するかの説明書とともに含むキットをさらに提供する。
【０１０５】
さらに別の実施態様では、本発明による薬学的製品、すなわち本明細書に開示の成分Ａ及びＢを含む製品は、抗サイトカイン（サイトカイン阻害剤）、例えば抗ＩＬ６（ａ−ＩＬ６）及び／又は抗ＴＮＦアルファ（ａ−ＴＮＦａ、抗ＴＮＦａ）である第三の成分（Ｃ）と共に投与することができる。前記サイトカイン阻害剤の追加は、上に開示の成分Ａ及びＢでの治療の有効性を維持しながら、忍容性を改善することが分かった（実施例２参照）。
【０１０６】
したがって、別の実施態様では、増殖性疾患、特にがんの逐次併用又は同時併用治療のための、Ａ）ヒトＣＤ４０に特異的に結合してそれを活性化する抗体又はその抗原結合部分を有効成分として含む第一の成分と、Ｂ）有効成分としてＰＤ−Ｌ１抗体を含む第二成分と、Ｃ）有効成分としてサイトカイン阻害剤を含む第三の成分とを含む薬学的製品が提供される。
【０１０７】
この実施態様の範囲内で、前記サイトカイン阻害剤は、ＴＮＦａを阻害する分子である。複数のＴＮＦａ阻害剤、小分子、及び抗体が、ヒトにおける治療のために承認されている。したがって、適用可能な薬学的調製物、投与経路、及び用量に関する情報は、当業者に周知である。本発明による特定の一実施態様において、ＴＮＦａ阻害剤は、抗体、好ましくはＴＮ３−１９．１２と称される抗体のヒトアナログである。本発明に従って用いられ得る他のＴＮＦアルファ阻害剤は、レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）、エンブレル（登録商標）（エタネルセプト）、ヒュミラ（登録商標）（アダリムマブ）、シムジア（登録商標）（セルトリズマブペゴル）、及びシンポニー（ゴリムマブ）を含む。また、この実施態様の範囲内で、成分Ｃは、成分Ａ及びＢと同時に又は別々に投与することができる。本明細書に開示されている、成分Ａ及びＢの投与のための任意の投薬レジメンは、三重併用にも適用可能である。成分Ｃは、好ましくは成分Ａ及び／又はＢと同時に、同じか又は異なる薬学的調製物に投与される。本明細書に開示の、成分Ｃと併せた成分Ａ及びＢのための任意の投薬レジメンは、本発明による別の実施態様を形成する。この実施態様の範囲内で、成分Ｃは、成分Ａ又はＢも投与される場合、常に投与される。
【０１０８】
別の実施態様において、成分Ｃの投与は、成分Ａ及びＢの投与前に開始される。好ましくは、成分Ｃの投与を治療の１日目に開始し、成分Ａ及びＢについて上に定義した投与レジメンに従って、成分Ａ及びＢは、２日目から与えられる。
【０１０９】
別の実施態様において、成分Ｃは、好ましくは治療の１、２、３、及び４日目に投与され；成分Ａは２日目に投与され；かつ成分Ｂは２日目に投与され、その後成分Ｂを単独で又は成分Ｃとの併用で毎週投与する。
【０１１０】
さらに別の実施態様において、成分Ｃは、好ましくは治療の１、２、３、及び４日目に投与され；成分Ａは２日目に投与され；かつ成分Ｂは９日目に投与され、その後成分Ｂを単独で又は成分Ｃとの併用で毎週投与する。
【０１１１】
さらに別の実施態様において、成分Ｃは、好ましくは治療の１、２、３、及び４日目に投与され；成分Ａは２日目に投与され；かつ成分Ｂは１６日目に投与され、その後成分Ｂを単独で又は成分Ｃとの併用で毎週投与する。
【０１１２】
以下の実施例は、本発明の理解を助けるために提示されるが、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の精神から逸脱することなく、記載された手順で改変がなされ得る。
【実施例】
【０１１３】
実施例１
本実施例は、同所性Ｐａｎｃ０２−Ｆｌｕｃ膵臓同系がんモデルにおける抗ＰＤＬ−１と併用での抗マウスＣＤ４０の治療効果を実証する。本試験において、腫瘍増殖は、生物発光イメージングで週に２回評価される。
実験スケジュール：
0006586454.tif 000018
試験群
0006586454.tif 000019
各群の動物は、終了基準が満たされたら殺処分される。ビヒクル群の２匹のスカウト動物を使用して、治療開始時の腫瘍負荷を評価する。
【０１１４】
物質及び方法
細胞培養及び適用
ＰＡＮＣ−０２−Ｆｌｕｃｅ細胞クローン（ヒト膵臓癌細胞）は、もともとＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション）から入手され、増殖後Ｒｏｃｈｅ−Ｇｌｙｃａｒｔ社内の細胞バンクに寄託された。Ｐａｎｃ−０２−Ｆｌｕｃ細胞を、１０％ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ）及び１％Ｇｌｕｔａｍａｘ＋５００ｕｇ／ｍｌハイグロマイシンを含有するＲＰＭＩ培地で培養した。該細胞は、５％ＣＯ２の水飽和雰囲気下３７℃で培養した。麻酔したＣ５７ＢＬ／６マウスの腹部の左脇腹に小切開を行った。腹腔壁を開き、膵臓を鉗子で慎重に分離した。細胞懸濁液１０マイクロリットル（ＲＰＭＩ培地中０．２×１０６細胞）を膵臓の尾部に注射した。５／０吸収性（ｒｅｓｏｒｖａｂｌｅ）縫合糸を用いて腹腔壁及び皮膚創傷を閉じた。
【０１１５】
動物
実験開始時に週齢８〜９のＢｌａｃｋ  ６メスマウス６０匹（ドイツのＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓより購入）を、専用のガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って特定病原体不含条件下、毎日１２時間／１２時間の明暗サイクルで保持した。実験研究プロトコールが審査され、地方自治体により承認された（Ｐ２０１１−１２８）。動物は、到着後１週間、新しい環境への馴致及び観察のために保持された。継続的な健康モニタリングが定期的に実施された。
【０１１６】
治療
試験０日目、ＲＰＭＩ中２×１０５のＰａｎｃ０２−Ｆｌｕｃ細胞をマウスの膵臓内に注射した（継代１８は生存率９５．９％）。７日目、マウスに静脈内注射した：ビヒクル（１５匹）、１０ｍｇ／ｋｇのａ−ＣＤ４０（１５匹）、１０ｍｇ／ｋｇのａ−ＰＤ−Ｌ１、１０ｍｇ／ｋｇのａ−ＣＤ４０＋１０ｍｇ／ｋｇのａ−ＰＤ−Ｌ１。このスケジュールは、ａ−ＰＤ−Ｌ１及びビヒクルについて週１回、３週間であった。Ａ−ＣＤ４０は、７日目に１回のみ投与された。
【０１１７】
試験化合物（抗体）
化合物の詳細
0006586454.tif 000020
抗体は４℃で保存した。
【０１１８】
全マウスに２００μＬの適切な溶液をｉ．ｖ．注射した。ビヒクル群のマウスにヒスチジン緩衝液を、治療群に抗体を注射した。適当量の抗体を得るために、抗体溶液を必要に応じてヒスチジン緩衝液で希釈した。マウスの最大治療回数は３回であった。
【０１１９】
抗体調製：
１０ｍｇ／ｋｇは、２００μｇ／マウスに等しい。
以下は、マウスあたりのコンストラクトに必要な量を計算したものである。
0006586454.tif 000021
【０１２０】
研究
モニタリング
動物は、臨床症状及び副作用の検出のために毎日制御された。動物の終了基準は、臨床病状、歩行障害、毛並の悪さであった。
【０１２１】
腫瘍マーカー分析のための血清抽出
腫瘍細胞注射の３日前、１回目の抗体治療の２４時間後、及び殺処分の日に、全治療動物から血清試料を採取した。試料は−２０℃で保存した。
【０１２２】
剖検
マウスは、終了基準に従って殺処分にした。後の組織病理学的分析（ＰＦＡ、凍結）のために、全動物から脾臓及び肝臓腫瘍を採取した（ＰＦＡ、凍結）。
【０１２３】
試料処理
膵臓腫瘍を切除し、直ちにホルマリン溶液に固定し、続いてパラフィン包埋(ト゛イツ、Leica Automatic Tissue Processor TP1020)およびミクロトーム(micotone)(ドイツ、Leica RM2235 Rotary Microtome)４μｍ切片作製のために処理した。標準的なプロトコールを用いてヘマトキシリン染色及びエオシン染色を実施した。ラット抗マウスＣＤ６８(スイス、AbD Serotec)を用い、製造業者の指示に従って、マウス免疫細胞を検出した。
【０１２４】
生化学分析
ラット  ＩｇＧ−ＥＬＩＳＡ及びｍＥＧＦＲ  ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ
１回目の抗体治療の２４時間後（試験８日目）にマウスから採血し、血清のヒトＩｇＧ濃度を分析した。プロトコールに従って、ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体のためのＥＬＩＳＡ  ｆｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ドイツ、Roche Pharma Penzberg; TR-TNA5）を用いて血清中の治療抗体濃度を試験した。試薬のｍＡｂ＜ｈｆｃｙ＞ＩｇＧ−Ｂｉ（Ｍ−Ｒ１０Ｚ８Ｅ９；Ｃｈ．０２  ＧＧ）、ｍＡｂ＜ＣＤ２０＞ｒＨ−ＩｇＧ（ＲＯ５０７２７５９）、ｍＡｂ＜ｈｆｃｙ＞ＩｇＧ−Ｄｉｇ（ＸＯＳＵ−Ｓｕｘ）（Ｍ−Ｒ１０Ｚ８Ｅ９；Ｃｈ．０３）は、Roche PenzbergのJ. Schleypenの好意により提供された。血清試料は、段階希釈（１：２０００；１：２００００；１：２０００００）で分析した。吸収は、４０５ｎｍの測定波長及び４９２ｎｍの基準波長を使用して測定した（Molecular Devices、VersaMax可変波長マイクロプレートリーダー）。
【０１２５】
結果
同系同所性Ｐａｎｃ０２モデルにおいて、ｍｕＦＧＫ４．５と抗ＰＤ−Ｌ１抗体の併用は、ビヒクル及び抗ＰＤ−Ｌ１と比較して著しい腫瘍増殖阻害を示した。さらに、ｍｕＦＧＫ４．５と抗ＰＤ−Ｌ１抗体は組み合わさって、インビボでエフェクターＴ−細胞の増殖を相乗的に増強し、このモデルにおいて９匹中４匹のマウスの腫瘍の完全な消失につながった（図１及び２）。
【０１２６】
免疫薬力学（ＰＤ）分析は、ｍｕＦＧＫ４．５がマウスの脾臓及び血液ならびにリンパ節において活性化Ｔ細胞（ＣＤ４及びＣＤ８）の数を約２倍増加させることを実証した。興味深いことに、ｍｕＦＧＫ４．５と抗ＰＤ  Ｌ１抗体との併用はさらに、治療開始の９日後にマウス脾臓における活性化Ｔ細胞の数を約６から７倍に増強した（図３）。
【０１２７】
実施例２
本実施例は、二の異なる抗サイトカインであるａ−ＩＬ６及びａ−ＴＮＦａを単独で又は共にａ−ＰＤＬ−１及びａ−ＣＤ４０と組み合わせた有効性を実証する。これらの抗体を用いてａ−ＣＤ４０注射後のサイトカイン放出を中和することからも、この情報は有用である。
【０１２８】
物質及び方法
細胞培養及び適用
ＰＡＮＣ−０２−Ｆｌｕｃ細胞クローン（ヒト膵臓癌細胞）は、もともとＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション）から入手され、増殖後に自社の細胞バンクに寄託された。Ｐａｎｃ−０２−Ｆｌｕｃ細胞を、１０％ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ）＋１％ｇｌｕｔａｍａｘ＋５００ｕμｇ／ｍｌハイグロマイシンを含有するＲＰＭＩ培地で培養した。該細胞は、５％ＣＯ２の水飽和雰囲気下３７℃で培養した。
【０１２９】
麻酔したＣ５７ＢＬ／６マウスの腹部の左脇腹に小切開を行った。腹腔壁を開き、膵臓を鉗子で慎重に分離した。細胞懸濁液１０マイクロリットル（ＲＰＭＩ培地中０．２×１０６細胞）を膵臓の尾部に注射した。５／０分解性縫合糸を用いて腹腔壁及び皮膚創傷を閉じた。
【０１３０】
動物
実験開始時に週齢８〜９のＣ５７ＢＬ／６メスマウス６０匹（ドイツのＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓより購入）を、専用のガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って特定病原体不含条件下、毎日１２時間／１２時間の明暗サイクルで保持した。実験研究プロトコールが審査され、地方自治体により承認された（Ｐ  ２０１１−１２８）。動物は、到着後１週間、新しい環境への馴致及び観察のために保持された。その後、識別のため背中の右側にトランスポンダをそれらの皮下に埋め込み、回復のためさらに１週間保持した。継続的な健康モニタリングが定期的に実施された。
【０１３１】
治療
試験０日目、ＲＰＭＩ中２×１０５のＰａｎｃＯ２−Ｆｌｕｃ細胞をマウスの膵臓内に注射した（継代１６は生存率９０．５％）。
【０１３２】
６日目、７日目、８日目、及び９日目に、群あたり１２匹のマウスに異なる化合物を腹腔内注射した。７日目、１４日目、及び２１日目に、群あたり１０匹のマウスに異なる化合物をｉ．ｐ．注射した（試験群参照）。
【０１３３】
試験化合物（抗体）
化合物の詳細
0006586454.tif 000022
２００μＬの適切な溶液を全マウスに注射した。抗体はすべてｉ．ｐ．注射された。ビヒクル群のマウスにヒスチジン緩衝液を、治療群に抗体を注射した。２００μＬにつき適当量の抗体を得るために、抗体溶液を必要に応じてヒスチジン緩衝液で希釈した。マウスの最大治療回数は４回であった。
【０１３４】
研究
モニタリング
動物は、臨床症状、及び副作用の検出のために毎日制御された。動物の終了基準は、臨床病状、歩行障害、毛並の悪さであった。
【０１３５】
化合物分析のための血清抽出
血清試料を、治療動物の半数から２回目、５回目、及び６回目の抗体治療の１時間後に採取し、残りの半分からは２回目、５回目、及び６回目の抗体治療の２４時間後に採取した。動物はすべて、殺処分当日に放血させた。試料は-２０℃で保存した。
【０１３６】
剖検
マウスは、終了基準に従って殺処分にした。その後の組織病理学的分析のために、群あたり４匹のマウスから脾臓、肝臓、及び膵臓腫瘍を採取した（４％ホルムアルデヒド、急速冷凍）。
【０１３７】
試料処理
膵臓腫瘍、肝臓、及び脾臓を切除し、直ちに１０％ホルマリン溶液に固定し、続いてパラフィン包埋（ドイツ、Leica Automatic Tissue Processor TP1020）及びミクロトーム（ドイツ、Leica RM2235 Rotary Microtome）４μｍ切片作製のために処理した。標準的なプロトコールを用いてヘマトキシリン染色及びエオシン染色を実施した。ラット抗マウスＣＤ６８（スイス、AbD Serotec）を用い、製造業者の指示に従って、マウス免疫細胞を検出した。
【０１３８】
生化学分析
ｍＣＤ４０  ＩｇＧ−ＥＬＩＳＡ及びｍＰＤＬ−１  ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ
プロトコール（スイス、Roche-Glycart）に従って、抗ＣＤ４０の定量のためのＣＤ４０／Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｒ＆Ｄ、１２１５−ＣＤ−０５０）ＥＬＩＳＡを用いて血清中の抗ＣＤ４０濃度を調べた。試薬：捕捉タンパク質；６ｘＨｉｓタグＢｉｏｔｉｎ（Ａｂｃａｍ、ａｂ２７０２５）及びＣＤ４０／Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｒ＆Ｄ、１２１５−ＣＤ−０５０）、検出抗体：抗マウスＩｇＧ（ＨＲＰ）（Ａｂｃａｍ、ａｂ９８８０８）を使用した。血清試料は、段階希釈（１：３００、１：１５００、１：７５００）で分析した。吸収は、４０５ｎｍの測定波長及び４９０ｎｍの基準波長を使用して測定した（Molecular Devices、VersaMax可変波長マイクロプレートリーダー）。
【０１３９】
プロトコール（スイス、Roche-Glycart）に従って、抗ＰＤ−Ｌ１の定量のためのマウスＰＤ−Ｌ１（Ｒ＆Ｄ、１０１９−Ｂ７−１００）ＥＬＩＳＡを用いて血清中の抗ＰＤ−Ｌ１濃度を調べた。試薬：捕捉タンパク質；ＩｇＧ−ＦＣ  Ｂｉｏｔｉｎ（Ａｂｃａｍ、ａｂ９８５６１）及びマウスＢ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１（Ｒ＆Ｄ、１０１９−Ｂ７−１００）、検出抗体：抗マウスＩｇＧ（ＨＲＰ）（Ａｂｃａｍ、ａｂ９８８０８）を使用した。血清試料は、段階希釈（１：２５００、１：１２５００、１：６２５００）で分析した。吸収は、４０５ｎｍの測定波長及び４９０ｎｍの基準波長を使用して測定した（Molecular Devices、VersaMax可変波長マイクロプレートリーダー）。
【０１４０】
サイトカイン分析
サイトカインは、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ（Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｐｒｏマウスサイトカイン（cyokine）２３プレックスアッセイ）により、製造者の指示に従って測定された。
【０１４１】
結果
第三の成分としての抗サイトカインの付加は、ＣＤ４０アゴニストとＰＤ−Ｌ１阻害剤（それぞれ成分Ａ及びＢ）のダブレット単独と比較して体重減少が少ないことによって示される改善された忍容性をもたらす。特に、第三の成分（成分Ｃ）としての抗ＴＮＦアルファの付加は、例えば治療中の体重減少のモニタリングによって示される、改善された忍容性をもたらす（図５参照）。同時に、ＣＤ４０／ＰＤ−Ｌ１併用の活性は、第三の成分の抗サイトカインと共に注射する場合に保持される（図６参照）。
【図１】
0006586454.tif 000023
【図２】
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【図３】
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【図４−１】
0006586454.tif 000026
【図４−２】
0006586454.tif 000027
【図５】
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【図６】
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【配列表】
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