(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスポザーゼ活性を有し、Ｐｒｏ２１４および／またはＡｌａ３３８の位置に対応する変異を含む配列番号１または配列番号１１を含み、
任意に、配列番号１または配列番号１１におけるＧｌｕ５４および／またはＭｅｔ５６および／またはＬｙｓ２１２および／またはＬｅｕ３７２と機能的に同等な位置で置換変異を含み、
任意に、Ｐｒｏ２１４および／またはＡｌａ３３８の位置で前記変異は置換変異である、変異Ｔｎ５トランスポザーゼ。
【請求項２】
配列番号１または配列番号１１におけるＰｒｏ２１４、Ａｌａ３３８、およびＬｙｓ２１２の位置で変異を含み、
任意に、配列番号１または配列番号１１におけるＧｌｕ５４および／またはＭｅｔ５６および／またはＬｅｕ３７２と機能的に同等な位置で置換変異を含む、請求項１に記載の変異Ｔｎ５トランスポザーゼ。
【請求項３】
位置Ｌｙｓ２１２での前記置換変異はアルギニンへの変異を含む、請求項１または２に記載の変異Ｔｎ５トランスポザーゼ。
【請求項４】
位置Ｐｒｏ２１４での前記置換変異はアルギニンへの変異を含む、請求項１〜３の何れかに記載の変異Ｔｎ５トランスポザーゼ。
【請求項５】
位置Ａｌａ３３８での前記置換変異はバリンへの変異を含む、請求項１〜４の何れかに記載の変異Ｔｎ５トランスポザーゼ。
【請求項６】
前記トランスポザーゼはさらに、Ｇｌｙ２５１での置換変異を含み、
任意に、位置Ｇｌｙ２５１での前記置換変異はアルギニンへの変異を含む、請求項１〜５の何れかに記載の変異Ｔｎ５トランスポザーゼ。
【請求項７】
ポリペプチド融合ドメインに融合した、請求項１〜６の何れかに記載の変異Ｔｎ５トランスポザーゼを含む、融合タンパク質。
【請求項８】
前記ポリペプチド融合ドメインは前記変異Ｔｎ５トランスポザーゼのＮ末端に融合し、
前記ポリペプチド融合ドメインは前記変異Ｔｎ５トランスポザーゼのＣ末端に融合する、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記ポリペプチド融合ドメインは可溶性を高めるタグを含む、または
前記ポリペプチド融合ドメインは、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、伸長因子Ｔｓ（Ｔｓｆ）、５−メチルシトシン結合ドメイン、およびタンパク質Ａから選択されるドメインを含む、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れかで定義される変異または融合タンパク質Ｔｎ５トランスポザーゼをコードする、核酸分子。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１３】
次の構成要素：（ｉ）請求項１〜９の何れか一項に記載の変異または融合タンパク質Ｔｎ５トランスポザーゼを含むトランスポソーム複合体と；（ｉｉ）標的ＤＮＡとが、相互作用することを可能にするステップを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転移のための方法。
【請求項１４】
標的ＤＮＡを配列決定するための方法であって、
（ａ）前記標的ＤＮＡをトランスポソーム複合体と共にインキュベーションするステップであって、該トランスポソーム複合体は、
（１）請求項１〜７の何れか一項に記載の変異または融合タンパク質Ｔｎ５トランスポザーゼと；
（２）第１ポリヌクレオチドとを含み、該第１ポリヌクレオチドは、
（ｉ）トランスポゾン端配列を有する３’部分と、
（ｉｉ）第１配列決定タグドメインを有する第１タグとを備え、
該ステップは、前記標的ＤＮＡを断片化し、そして、前記第１ポリヌクレオチドの３’トランスポゾン端配列を前記断片の５’端に移動させる条件下で行われ、
それにより、二本鎖断片が生成され、ここにおいて前記５’端は前記第１タグでタグ付けされ、前記５’タグ付き鎖の３’端には一本鎖ギャップがある、ステップと；
（ｂ）第２タグが前記５’タグ付き鎖の３’端に付着する条件下で、前記断片を核酸修飾酵素と共にインキュベーションするステップと；
（ｃ）ポリメラーゼおよび前記第１ポリヌクレオチドの一部分に対応する増幅プライマーを提供することにより、前記断片を任意に増幅し、それにより、前記５’端に前記第１タグを、前記３’端に第２タグを有する、２つタグ付けされた断片の代表ライブラリを生成するステップと；
（ｄ）前記第１配列決定タグドメインに対応する部分を含む第１配列決定プライマーを提供するステップと；
（ｅ）前記第１配列決定プライマーを伸長し、並行して、２つタグ付けされた断片の前記代表ライブラリの第１配列決定タグドメインに隣接するヌクレオチドの同一性を検出するステップと、を含む方法。
【請求項１５】
（１）請求項１〜９の何れか一項に記載の変異または融合タンパク質Ｔｎ５トランスポザーゼと；
（２）トランスポゾン端配列を有する３’部分を備えるポリヌクレオチドとを備えたトランスポソーム複合体を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転移反応を実行するためのキット。
【請求項１６】
次の構成要素：（ｉ）トランスポザーゼ酵素を含むトランスポソーム複合体と；（ｉｉ）標的ＤＮＡと、（ｉｉｉ）Ｍｇ２＋を含むバッファ中の同一酵素と比較して、ＧＣバイアスを縮小するのに十分効果的な濃度でＣｏ２＋を含む反応バッファとが、相互作用することを可能にするステップを含み、
前記トランスポザーゼ酵素は、請求項１〜９の何れか一項に記載の変異または融合タンパク質Ｔｎ５トランスポザーゼを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転移のための方法。
【請求項１７】
配列番号２６を含む、請求項７の融合タンパク質。
【請求項１８】
配列番号１９のアミノ酸配列を含む、請求項１の変異Ｔｎ５トランスポザーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔関連出願〕
本出願は、２０１４年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／９７９，８７１号、２０１４年１０月９日に出願された同第６２／０６２，００６号、２０１４年１１月１７日に出願された同第６２／０８０，８８２号の優先権を主張し、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
トランスポザーゼ酵素は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転移系において有用である。これはゲノムＤＮＡの大量の断片化とタグ付けを可能にし、次世代シーケンシングなどの核酸分析法および増幅法で用いるタグ付きＤＮＡ断片のライブラリを、標的ＤＮＡから作るのに有用である。改善された特性を有し、元になるサンプルの標的核酸を質的および量的に代表するタグ付きＤＮＡ断片を生成する修正トランスポザーゼは、いまだ必要とされている。
【０００３】
〔配列表〕
本出願は、電子フォーマットの配列表と共に出願されている。配列表は、２０１５年４月１３日作成のIP-1198-TW_Sequencelisting.txtというファイルで提供され、サイズは１０３Ｋｂである。配列表の電子フォーマットの情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書で提示するのは、改善された断片化および核酸サンプルのタグ付けのためのトランスポザーゼ酵素である。本発明者らは、驚くべきことに、挿入配列バイアスを改善し他の多くの関連利点を有する、ある改変トランスポザーゼを特定した。
【０００５】
本明細書で提示するのは、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼと比較し修正した変異Ｔｎ５トランスポザーゼである。一部の実施形態において、該変異トランスポザーゼは位置Ａｓｐ２４８で変異を含むことが可能である、ある態様では、位置Ａｓｐ２４８における変異は置換変異である。ある態様では、位置Ａｓｐ２４８における置換変異には、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、およびＨｉｓからなる群から選択される残基への変異が含まれ得る。
【０００６】
ある態様では、位置Ａｓｐ２４８での変異は、位置Ａｓｐ２４８の後ろにおける挿入変異である。ある態様では、挿入変異には、位置Ａｓｐ２４８の後ろへの疎水性残基の挿入が含まれ得る。ある態様では、挿入変異には、位置Ａｓｐ２４８の後ろへのバリン残基の挿入が含まれ得る。
【０００７】
本明細書では、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼと比較し修正した変異Ｔｎ５トランスポザーゼであって、位置Ａｓｐ１１９で変異を含む変異トランスポザーゼも提示する。ある態様では、位置Ａｓｐ１１９での変異は置換変異である。ある態様では、位置Ａｓｐ１１９での置換変異には、疎水性残基への変異が含まれ得る。ある態様では、位置Ａｓｐ１１９での置換変異には、親水性残基への変異が含まれ得る。ある態様では、位置Ａｓｐ１１９での置換変異には、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、およびＶａｌからなる群から選択される残基への変異が含まれ得る。
【０００８】
本明細書では、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼと比較し修正した変異Ｔｎ５トランスポザーゼであって、位置Ｔｒｐ１２５で変異を含む変異トランスポザーゼも提示する。ある態様では、Ｔｒｐ１２５での変異は置換変異である。ある態様では、位置Ｔｒｐ１２５での置換変異には、メチオニン残基への変異が含まれ得る。
【０００９】
本明細書では、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼと比較し修正した変異Ｔｎ５トランスポザーゼであって、位置Ｌｙｓ１２０で変異を含む変異Ｔｎ５トランスポザーゼも提示する。ある態様では、位置Ｌｙｓ１２０での変異は置換変異である。ある態様では、位置Ｌｙｓ１２０での置換変異には、嵩高い芳香族残基への変異が含まれ得る。ある態様では、位置Ｌｙｓ１２０での置換変異には、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、およびＧｌｕからなる群から選択される残基への変異が含まれ得る。
【００１０】
本明細書では、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼと比較し修正した変異Ｔｎ５トランスポザーゼであって、Ｌｙｓ２１２および／またはＰｒｏ２１４および／またはＡｌａ３３８の位置で変異を含む変異トランスポザーゼも提示する。ある態様では、Ｌｙｓ２１２および／またはＰｒｏ２１４および／またはＡｌａ３３８の位置での変異は、置換変異である。ある態様では、位置Ｌｙｓ２１２での置換変異には、アルギニンへの変異が含まれる。ある態様では、位置Ｐｒｏ２１４での置換変異には、アルギニンへの変異が含まれる。ある態様では、位置Ａｌａ３３８での置換変異には、バリンへの変異が含まれる。一部の実施形態では、トランスポザーゼは、Ｇｌｙ２５１での置換変異をさらに含むことが可能である。ある態様では、位置Ｇｌｙ２５１での置換変異には、アルギニンへの変異が含まれる。
【００１１】
本明細書では、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼと比較し修正した変異Ｔｎ５トランスポザーゼであって、Ｇｌｕ１４６および／またはＧｌｕ１９０および／またはＧｌｙ２５１の位置で変異を含む変異トランスポザーゼも提示する。ある態様では、Ｇｌｕ１４６および／またはＧｌｕ１９０および／またはＧｌｙ２５１の位置での変異は、置換変異である。ある態様では、位置Ｇｌｕ１４６での置換変異には、グルタミンへの変異が含まれ得る。ある態様では、位置Ｇｌｕ１９０での置換変異には、グリシンへの変異が含まれ得る。ある態様では、位置Ｇｌｙ２５１での置換変異には、アルギニンへの変異が含まれ得る。
【００１２】
配列番号２１のアミノ酸配列を備える半保存されたドメインへの置換変異を含む改変トランスポザーゼも提示する。該置換変異には、位置２における、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、またはＬｙｓ以外の任意の残基への変異が含まれる。ある実施形態では、該変異には位置２におけるＭｅｔへの置換が含まれる。
【００１３】
上記実施形態の何れかにおいて、変異Ｔｎ５トランスポザーゼはさらに、Ｔｎ５トランスポザーゼのアミノ酸配列のＧｌｕ５４および／またはＭｅｔ５６および／またはＬｅｕ３７２と機能的に同等な位置で置換変異を含むことが可能である。ある実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼのアミノ酸配列のＧｌｕ５４Ｌｙｓおよび／またはＭｅｔ５６Ａｌａおよび／またはＬｅｕ３７２Ｐｒｏに対し相同な置換変異を含む。
【００１４】
本明細書では、配列番号２〜１０および１２〜２０の何れか一つのアミノ酸配列を含む変異Ｔｎ５トランスポザーゼも提示する。
【００１５】
本明細書では、追加ポリペプチドに融合した、上記実施形態の何れかで定義した変異Ｔｎ５トランスポザーゼを含む融合タンパク質も提示する。一部の実施形態では、トランスポザーゼに融合したポリペプチドドメインは、精製タグ、発現タグ、溶解タグ、またはその組合せを含むことが可能である。一部の実施形態では、トランスポザーゼに融合したポリペプチドドメインは、例えばマルトース結合タンパク質（Ｍａｌｔｏｓｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭＢＰ）を含むことが可能である。一部の実施形態では、トランスポザーゼに融合したポリペプチドドメインは、例えば伸長因子Ｔｓ（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｔｓ、Ｔｓｆ）を含むことが可能である。
【００１６】
本明細書では、上記実施形態の何れかで定義した変異Ｔｎ５トランスポザーゼをコードする核酸分子も提示する。本明細書では、上記核酸分子を含む発現ベクターも提示する。本明細書では、上記ベクターを含む宿主細胞も提示する。
【００１７】
本明細書では、次の構成要素：（ｉ）上記実施形態の何れか一つに記載の変異Ｔｎ５トランスポザーゼを含むトランスポソーム複合体と；（ｉｉ）標的ＤＮＡとが、相互作用することを可能にするステップを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転移のための方法も提示する。
【００１８】
本明細書では、上記のＴｎ５トランスポザーゼを利用して標的ＤＮＡを配列決定する方法も提示する。一部の実施形態で、該方法は、（ａ）標的ＤＮＡをトランスポソーム複合体と共にインキュベーションするステップであって、該トランスポソーム複合体は、（１）上記実施形態の何れか一つに記載の変異Ｔｎ５トランスポザーゼと；（２）第１ポリヌクレオチドとを含み、該第１ポリヌクレオチドは、（ｉ）トランスポゾン端配列を有する３’部分と、（ｉｉ）第１配列決定タグドメインを有する第１タグとを備え、該ステップは、前記標的ＤＮＡを断片化し、そして、前記第１ポリヌクレオチドの３’トランスポゾン端配列を前記断片の５’端に移動させる条件下で行われ、それにより二本鎖断片が生成され、ここにおいて前記５’端は前記第１タグでタグ付けされ、前記５’タグ付き鎖の３’端には一本鎖ギャップがある、ステップと；（ｂ）第２タグが前記５’タグ付き鎖の３’端に付着する条件下で、前記断片を核酸修飾酵素と共にインキュベーションするステップと；（ｃ）ポリメラーゼおよび前記第１ポリヌクレオチドの一部分に対応する増幅プライマーを提供することにより、前記断片を任意に増幅し、それにより、前記５’端に前記第１タグを、前記３’端に第２タグを有する２つタグ付けされた断片の代表ライブラリを生成するステップと；（ｄ）前記第１配列決定タグドメインに対応する部分を含む第１配列決定プライマーを提供するステップと；（ｅ）前記第１配列決定プライマーを伸長し、並行して、２つタグ付けされた断片の前記代表ライブラリの第１配列決定タグドメインに隣接するヌクレオチドの同一性を検出するステップと、を含むことが可能である。
【００１９】
本明細書では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転移反応を実行するためのキットも提示する。一部の実施形態において、該キットはトランスポソーム複合体を含むことが可能であり、該トランスポソーム複合体は、（１）上記実施形態の何れか一つに記載の変異Ｔｎ５トランスポザーゼと；（２）トランスポゾン端配列を有する３’部分を備えるポリヌクレオチドとを含む。
【００２０】
１つまたは複数の実施形態の詳細を、添付の図面および以下の記載において説明する。他の特徴、目的、および利点は、該記載および図面、ならびに請求項により明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】Ｔｎ５トランスポザーゼ（１ＭＵＨ）、Ｈｅｒｍｅｓトランスポザーゼ（２ＢＷ３）、ＨＩＶインテグラーゼ（１ＩＴＧ）、Ｍｕトランスポザーゼ（１ＢＣＭ）、およびＭｏｓ１トランスポザーゼ（３ＨＯＳ）の触媒コアドメインの、構造アライメントを示す図である。図示されたナンバリングは、Ｔｎ５トランスポザーゼのアミノ酸残基のナンバリングを表す。
【図１Ｂ】Ｔｎ５トランスポザーゼ（１ＭＵＨ、ピンク色）、Ｈｅｒｍｅｓトランスポザーゼ（２ＢＷ３、黒色）、ＨＩＶインテグラーゼ（１ＩＴＧ、黄褐色）、Ｍｕトランスポザーゼ（１ＢＣＭ）、およびＭｏｓ１トランスポザーゼ（３ＨＯＳ、黄色）の構造アライメント触媒コアドメインを示す図である。Ｔｎ５トランスポザーゼＷ１２５位置を、スティック表現（ｓｔｉｃｋ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）で示す。
【図２】Ｄ２４８Ｙ変異Ｔｎ５トランスポザーゼの改変配列挿入バイアスを、Ｔｎ５対照と比較して示すＩＶＣプロットである。
【図３】Ｄ１１９Ｌ変異Ｔｎ５トランスポザーゼの改変配列挿入バイアスを、Ｔｎ５対照と比較して示すＩＶＣプロットである。
【図４】Ｗ１２５Ｍ変異Ｔｎ５トランスポザーゼの改変配列挿入バイアスを、Ｔｎ５対照と比較して示すＩＶＣプロットである。
【図５】ｉａ２４８Ｖ挿入変異Ｔｎ５トランスポザーゼの改変配列挿入バイアスを、Ｔｎ５対照と比較して示すＩＶＣプロットである。
【図６】Ｋ１２０ＹＴｎ５トランスポザーゼ挿入変異体、Ｋ１２０ＦＴｎ５トランスポザーゼ挿入変異体、およびＫ１２０ＷＴｎ５トランスポザーゼ挿入変異体の改変配列挿入バイアスを、Ｔｎ５対照と比較して示すＩＶＣプロットである。
【図７】３つの変異Ｔｎ５トランスポザーゼの改変配列挿入バイアスを、Ｔｎ５対照と比較して示すＩＶＣプロットである。
【図８】８Ａは、３つの変異Ｔｎ５トランスポザーゼにより生成したセレウス菌ライブラリにおけるＡＴ／ＧＣドロップアウトを、Ｔｎ５対照と比較して示すグラフである。８Ｂは、３つの変異Ｔｎ５トランスポザーゼにより生成したセレウス菌ライブラリの推定ライブラリサイズを、Ｔｎ５対照と比較して示すグラフである。
【図９】９Ａは、２つの変異Ｔｎ５トランスポザーゼにより生成したライブラリにおけるＲａｐｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ実験でのカバレッジ均一性を、Ｔｎ５対照と比較して示すグラフである。９Ｂは、２つの変異Ｔｎ５トランスポザーゼにより生成したライブラリにおけるＲａｐｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ実験での、１０Ｘ標的カバレッジ、２０Ｘ標的カバレッジ、および平均標的カバレッジを、Ｔｎ５対照と比較して示すグラフである。
【図１０】１０Ａは、２つの変異Ｔｎ５トランスポザーゼにより生成したライブラリにおけるＲａｐｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ実験での固有リードのフィルタ通過割合およびハイブリッド選択ライブラリサイズを、Ｔｎ５対照と比較して示すグラフである。１０Ｂは、２つの変異Ｔｎ５トランスポザーゼにより生成したライブラリにおけるＲａｐｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ実験での、１０Ｘ、２０Ｘ、および３０Ｘのカバレッジに及ぶペナルティスコアを、Ｔｎ５対照と比較して示すグラフである。
【図１１】異なるタグメント化バッファを用いて調製した、ＴＳ−Ｔｎ５０５９およびＴＳ−Ｔｎ５のタグメント化ＤＮＡライブラリにおける固有分子数の棒グラフを示す図である。
【図１２】異なるタグメント化バッファ用いて調製した、ＴＳ−Ｔｎ５０５９およびＴＳ−Ｔｎ５のタグメント化ＤＮＡライブラリにおけるＧＣドロップアウト率の棒グラフを示す図である。
【図１３】異なるタグメント化バッファ用いて調製した、ＴＳ−Ｔｎ５０５９およびＴＳ−Ｔｎ５のタグメント化ＤＮＡライブラリにおけるＡＴドロップアウト率の棒グラフを示す図である。
【図１４】標準バッファ（ＴＤ）配合およびコバルトバッファ（Ｃｏ）配合を用いて調製したＴＳ−Ｔｎ５０５９ライブラリにおける、断片サイズ分布についてのバイオアナライザトレースのプロットを示す図である。
【図１５】コバルト−ＤＭＳＯ（Ｃｏ−ＤＭＳＯ）バッファ配合、ＮＦ２バッファ配合、およびＨＭＷバッファ配合を用いて調製したＴＳ−Ｔｎ５０５９ライブラリにおける、断片サイズ分布についてのバイオアナライザトレースのプロットを示す図である。
【図１６】標準バッファ配合（ＴＤ）およびコバルトバッファ（Ｃｏ）を用いて調製したＴＳ−Ｔｎ５ライブラリにおける、断片サイズ分布についてのバイオアナライザトレースのプロットを示す図である。
【図１７】コバルト−ＤＭＳＯ（Ｃｏ−ＤＭＳＯ）バッファ配合、ＮＦ２バッファ配合、およびＨＭＷバッファ配合を用いて調製したＴＳ−Ｔｎ５ライブラリにおける、断片サイズ分布についてのバイオアナライザトレースのプロットを示す図である。
【図１８】１８Ａは、ＴＳ−Ｔｎ５ライブラリにおける配列含有量のバイアスグラフを示す図である。１８Ｂは、ＴＳ−ＴＮ５−Ｃｏライブラリにおける配列含有量のバイアスグラフを示す図である。１８Ｃは、ＴＳ−Ｔｎ５−Ｃｏ−ＤＭＳＯライブラリにおける配列含有量のバイアスグラフを示す図である。１８Ｄは、ＴＳ−Ｔｎ５−ＮＦ２ライブラリにおける配列含有量のバイアスグラフを示す図である。
【図１９】１９Ａは、ＴＳ−Ｔｎ５０５９ライブラリにおける配列含有量のバイアスグラフを示す図である。１９Ｂは、ＴＳ−ＴＮ５０５９−Ｃｏライブラリにおける配列含有量のバイアスグラフを示す図である。１９Ｃは、ＴＳ−Ｔｎ５０５９−Ｃｏ−ＤＭＳＯライブラリにおける配列含有量のバイアスグラフを示す図である。１９Ｄは、ＴＳ−Ｔｎ５０５９−ＮＦ２ライブラリにおける配列含有量のバイアスグラフを示す図である。
【図２０】異なるタグメント化バッファを用いて調製したＭＢＰ−Ｍｏｓ１タグメント化ライブラリにおける、平均リード総数および平均多様性の棒グラフを示す図である。
【図２１】ＭＢＰ−Ｍｏｓ１タグメント化ライブラリにおけるＧＣおよびＡＴのドロップアウトの棒グラフを示す図である。
【図２２】２２Ａは、Ｍｏｓ１−ＨＥＰＥＳライブラリにおける配列含有量のバイアスグラフを示す図である。２２Ｂは、Ｍｏｓ１−ＨＥＰＥＳ−ＤＭＳＯライブラリにおける配列含有量のバイアスグラフを示す図である。２２Ｃは、Ｍｏｓ１−ＨＥＰＥＳ−ＤＭＳＯ−Ｃｏライブラリにおける配列含有量のバイアスグラフを示す図である。２２Ｄは、Ｍｏｓ１−ＨＥＰＥＳ−ＤＭＳＯ−Ｍｎライブラリにおける配列含有量のバイアスグラフを示す図である。
【図２３】エクソームの配列決定のためにゲノムＤＮＡライブラリを調製し濃縮する方法の一例のフロー図である。
【図２４】２４Ａは、ＴＳ−Ｔｎ５０５９トランスポソームを用いて調製したタグメント化セレウス菌ゲノムＤＮＡライブラリにおける、カバレッジのプロットを示す図である。２４Ｂは、ＮｅｘｔｅｒａＶ２トランスポソームを用いて調製したタグメント化セレウス菌ゲノムＤＮＡライブラリにおける、カバレッジのプロットを示す図である。
【図２５】２５Ａは、ＴＳ−Ｔｎ５０５９トランスポソームを用いて調製したタグメント化セレウス菌ゲノムＤＮＡライブラリにおける、ギャップ位置とギャップ長のプロットを示す図である。２５Ｂは、ＮｅｘｔｅｒａＶ２トランスポソームを用いて調製したタグメント化セレウス菌ゲノムタグメント化ＤＮＡライブラリにおける、ギャップ位置とギャップ長のプロットを示す図である。
【図２６】４０ｎＭ（１Ｘ正規化濃度）のＴＳ−Ｔｎ５０５９に正規化した、ＴＤＥ１（Ｔｎ５バージョン−１）およびＴＳ−Ｔｎ５を用いて調製したタグメント化ゲノムＤＮＡライブラリにおける、２５ｎｇヒトｇＤＮＡに対する、断片サイズ分布についてのバイオアナライザトレースパネルを示す図である。
【図２７】２５ｎｇヒトｇＤＮＡを用いる、４０ｎＭ（１Ｘ正規化濃度）のＴＳ−Ｔｎ５０５９に正規化したＴＤＥ１（Ｔｎ５バージョン−１）およびＴＳ−Ｔｎ５を用いて調製したタグメント化ゲノムＤＮＡライブラリにおける、サイズ分布の分析を示す図である。
【図２８】ある範囲のＤＮＡインプットを用いて調製したタグメント化ゲノムＤＮＡライブラリの断片サイズ分布についての、バイオアナライザトレースのパネルを示す図である。
【図２９】２９Ａは、第１ユーザが調製し、ＣｏｒｉｅｌヒトＤＮＡを用いたＴＳ−Ｔｎ５０５９タグメント化ライブラリにおける、断片サイズ分布についてのバイオアナライザトレースのプロットを示す図である。２９Ｂは、第２ユーザが調製し、ＣｏｒｉｅｌヒトＤＮＡを用いたＴＳ−Ｔｎ５０５９タグメント化ライブラリにおける、断片サイズ分布についてのバイオアナライザトレースのプロットを示す図である。
【図３０】２５ｎｇ〜１００ｎｇのｇＤＮＡを用い、６Ｘ「正規化」濃度のＴＤＥ１により調製した、Ｔｎ５バージョン１（ＴＤＥ１）タグメント化ライブラリにおける断片サイズ分布についてのバイオアナライザトレースのプロットを示す図である。
【図３１】２５ｎｇ〜１００ｎｇのｇＤＮＡを用い、６Ｘ「正規化」濃度のＴＳ−Ｔｎ５により調製した、ＴＳ−Ｔｎ５タグメント化ライブラリにおける断片サイズ分布についてのバイオアナライザトレースのプロットを示す図である。
【図３２】１０ｎｇ〜１００ｎｇのｇＤＮＡを用い、６Ｘ「正規化」濃度のＴＳ−Ｔｎ５０５９により調製した、ＴＳ−Ｔｎ５０５９タグメント化ライブラリにおける断片サイズ分布についてのバイオアナライザトレースのプロットを示す図である。
【図３３】より広い範囲のｇＤＮＡ（５ｎｇ〜５００ｎｇ）を用い、６Ｘ「正規化」濃度のＴＳ−Ｔｎ５０５９により調製した、ＴＳ−Ｔｎ５０５９タグメント化ライブラリにおける断片サイズ分布についてのバイオアナライザトレースのプロットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
ＤＮＡ配列決定のための一部のサンプル調製方法では、各テンプレートは挿入物の何れかの端にアダプタを含み、そして、ＤＮＡまたはＲＮＡを修飾し、所望の修飾反応生成物を精製するために、多くのステップをしばしば必要とする。これらのステップは、典型的には、適応断片をフローセルに付加する前に溶液中で実行し、ここで該適応断片は、プライマーの伸長反応により表面に結合し、これにより、ハイブリダイズされた断片は、表面に共有結合的に付着したプライマーの端にコピーされる。これらの「播種」テンプレートは、その後、数回の増幅サイクルを通し、コピー済みテンプレートのモノクローナルクラスタを発生させる。しかしながら、内容の全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１０／０１２００９８号明細書に開示されるように、クラスタ形成および配列決定のために用意した溶液中のアダプタ修正テンプレートに、ＤＮＡを形質転換するのに必要なステップの数は、トランスポザーゼが仲介する断片化およびタグ付け（本明細書ではタグメント化という）を用いることにより最小化することが可能である。例えば、タグメント化は、例えばＮｅｘｔｅｒａ（登録商標）ＤＮＡサンプル調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）のワークフロー等で例示されるように、ＤＮＡの断片化のために用いることが可能であり、ここではゲノムＤＮＡを、インプットＤＮＡを同時に断片化およびタグ付けする設計トランスポソームにより断片化することにより、断片の端に固有アダプタ配列を含む断片化核酸分子の集団を生成することが可能である。しかしながら、改善された挿入バイアスを呈すトランスポザーゼ酵素が必要である。
【００２３】
従って、本明細書では、核酸サンプルの改善された断片化およびタグ付けのためのトランスポザーゼを提示する。本発明者らは驚くべきことに、改善された挿入配列バイアスを呈し、多くの他の関連する利点を有する、ある改変トランスポザーゼを特定した。本明細書に提示する改変トランスポザーゼの一実施形態は、改善された挿入バイアスを呈すトランスポザーゼである。
【００２４】
本明細書で用いる場合、用語「正規化トランスポソームアクティビティ」は、２５ｎｇｇＤＮＡインプット収量において、曲線下の全面積についてバイオアナライザ断片サイズ分布をもたらすトランスポソームの最小濃度を意味する：５０μＬ反応において、１００〜３００ｂｐ＝２０％〜３０％；３０１〜６００ｂｐ＝３０％〜４０％；６０１〜７，０００ｂｐ＝３０〜４０％；１００〜７，０００ｂｐ≧９０％である。この最小濃度を１Ｘという。
【００２５】
本出願全体で用いる場合、トランスポソーム濃度を正規化アクティビティと区別せずに用いる。加えて、本出願全体で用いる場合、トランスポソーム濃度をトランスポザーゼ濃度と区別せずに用いる。
【００２６】
本明細書で用いる場合、用語「挿入バイアス」は、挿入部位に対するトランスポザーゼの配列優先性を意味する。例えば、ポリヌクレオチドサンプルにおいてＡ／Ｔ／Ｃ／Ｇのバックグラウンド頻度が等しく分布している場合（２５％Ａ、２５％Ｔ、２５％Ｃ、２５％Ｇ）、トランスポザーゼの結合部位または切断部位で他の３つより１つのヌクレオチドが過剰出現することは、該部位における挿入バイアスを映す。挿入バイアスは、当技術分野で既知である多くの方法のうち何れか一つを用いて測定することが可能である。例えば、下記の実施例１で概ね説明するように、挿入部位を配列決定し、挿入部位の各位置における任意の特定のヌクレオチドの相対存在量を比較することが可能である。
【００２７】
「挿入バイアスにおける改善」は、改変トランスポザーゼの結合部位の１つまたは複数の位置における特定の塩基の頻度が低減または増加し、ポリヌクレオチドサンプルの該塩基のバックグラウンド頻度により近づくことを示す。改善とは、非改変トランスポザーゼの該位置における頻度と比較し、該位置における頻度の増加とすることが可能である。あるいは、改善とは、該位置における頻度の減少とすることが可能である。したがって、例えば、ポリヌクレオチドサンプルにおけるＴヌクレオチドのバックグラウンド頻度が０．２５であり、改変トランスポザーゼがトランスポザーゼ結合部位の特定位置において、Ｔヌクレオチド頻度を０．２５超の頻度から０．２５により近い頻度に低減する場合、改変トランスポザーゼは挿入バイアスが改善されている。同様に、例えば、ポリヌクレオチドサンプルのＴヌクレオチドのバックグラウンド頻度が０．２５であり、改変トランスポザーゼがトランスポザーゼ結合部位の特定位置において、Ｔヌクレオチド頻度を０．２５未満の頻度から０．２５により近い頻度に増加させる場合、改変トランスポザーゼは挿入バイアスが改善されている。
【００２８】
挿入バイアスを測定する一方法論は、挿入部位の大規模配列決定により、結合部位の各位置における塩基頻度を挿入部位と比較して測定することである。これは例えばGreen et al. Mobile DNA (2012) 3:3に記載されており、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。各位置における存在量を表示する典型的なツールは、例えば図２に示すような強度対サイクルの分布プロットである。下記の実施例１に記載するように、トランスポゾンが仲介するタグ化および断片化により生成される断片端は、大規模で配列決定することが可能であり、挿入部位の各位置での塩基の分布頻度を測定して該挿入部位の１つまたは複数の位置のバイアスを検出することが可能である。したがって、例えば図２に示すように、位置（１）において、「Ｇ」ヌクレオチドについては０．５５、「Ａ」ヌクレオチドについては０．１６という頻度の塩基分布は、該位置におけるＧに対する著しい優先性と、Ａを避けるバイアスを映す。別の例としては、対照的に、図３に示すように、位置（２０）での塩基分布は、４塩基のそれぞれについて原則的に０．２５であり、これは該位置において配列バイアスがほとんど、または全くないことを映す。
【００２９】
本明細書に提示する一部の実施形態では、改変トランスポザーゼ酵素は、挿入部位から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１塩基以上上流または下流に位置する１つまたは複数の部位で、挿入バイアスの縮小をもたらす。一部の実施形態では、改変トランスポザーゼ酵素は、挿入部位から１〜１５塩基下流に位置する１つまたは複数の部位で、挿入バイアスの縮小をもたらす。一部の実施形態では、改変トランスポザーゼ酵素は、挿入部位から１〜１５塩基上流に位置する１つまたは複数の部位で、挿入バイアスの縮小をもたらす。
【００３０】
本明細書の下記でより詳細に記載するように、発明者らは驚くべきことに、トランポザーゼのアミノ酸配列のある位置における残基への１つまたは複数の変異が、転移事象中に改善された配列挿入バイアスをもたらすことを発見した。これらの改変トランスポザーゼは、高多様性および低多様性の核酸サンプルのタグメント化において改善された性能を提供し、これは、配列決定される様々な領域において、より優れたカバレッジ均一性とドロップアウトの減少をもたらす。
【００３１】
本明細書で用いる場合、用語「ＤＮＡインプット許容差」は、ある範囲のインプットＤＮＡ量にわたり均一なＤＮＡ断片サイズを生成する、トランスポザーゼの能力を意味する。
【００３２】
本明細書で用いる場合、伸長因子：ＴＳについての表記は、Ｔｓｆと区別せずに用いる。
【００３３】
一部の実施形態では、インプットＤＮＡはゲノムＤＮＡである。一部の実施形態では、インプットＤＮＡの範囲は、０．００１μｇ〜１ｍｇ、１ｎｇ〜１ｍｇ、１ｎｇ〜９００ｎｇ、１ｎｇ〜５００ｎｇ、１ｎｇ〜３００ｎｇ、１ｎｇ〜２５０ｎｇ、１ｎｇ〜１００ｎｇ、５ｎｇ〜２５０ｎｇ、または５ｎｇ〜１００ｎｇとすることが可能であり、トランスポザーゼの濃度は、５ｎＭ〜５００ｎＭである。一部の実施形態では、上記範囲のインプットＤＮＡに対するトランスポザーゼの濃度は、およそ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３５ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、６５ｎＭ、７０ｎＭ、７５ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、９５ｎＭ、１００ｎＭ、１２５ｎＭ、１３０ｎＭ、１４０ｎＭ、１５０ｎＭ、１７５ｎＭ、１８０ｎＭ、１９０ｎＭ、２００ｎＭ、２１０ｎＭ、２２５ｎＭ、２３０ｎＭ、２４０ｎＭ、２５０ｎＭ、２６０ｎＭ、２７５ｎＭ、２８０ｎＭ、２９０ｎＭ、３００ｎＭ、３２５ｎＭ、３５０ｎＭ、３６０ｎＭ、３７５ｎＭ、３８０ｎＭ、３９０ｎＭ、４００ｎＭ、４２５ｎＭ、４５０ｎＭ、４７５ｎＭ、または５００ｎＭである。一部の実施形態では、上記範囲のインプットＤＮＡに対するトランスポザーゼまたは正規化トランスポソームの、正規化濃度の濃度は、およそ、０．１Ｘ〜１０Ｘ、１Ｘ〜１０Ｘ、３Ｘ〜８Ｘ、４Ｘ〜７Ｘの範囲から選択する。一部の実施形態では、上記範囲のインプットＤＮＡに対するトランスポザーゼまたは正規化トランスポソームの正規化濃度は、およそ、０．１Ｘ、０．２Ｘ、０．３Ｘ、０．４Ｘ、０．５Ｘ、０．６Ｘ、０．７Ｘ、０．８Ｘ、０．９Ｘ、１Ｘ、１．１Ｘ、１．２Ｘ、１．３Ｘ、１．４Ｘ、１．５Ｘ、１．６Ｘ、１．７Ｘ、１．８Ｘ、１．９Ｘ、２Ｘ、２．１Ｘ、２．２Ｘ、２．３Ｘ、２．４Ｘ、２．５Ｘ、２．６Ｘ、２．７Ｘ、２．８Ｘ、２．９Ｘ、３Ｘ、３．１Ｘ、３．２Ｘ、３．３Ｘ、３．４Ｘ、３．５Ｘ、３．６Ｘ、３．７Ｘ、３．８Ｘ、３．９Ｘ、４Ｘ、４．１Ｘ、４．２Ｘ、４．３Ｘ、４．４Ｘ、４．５Ｘ、４．６Ｘ、４．７Ｘ、４．８Ｘ、４．９Ｘ、５Ｘ、５．１Ｘ、５．２Ｘ、５．３Ｘ、５．４Ｘ、５．５Ｘ、５．６Ｘ、５．７Ｘ、５．８Ｘ、５．９Ｘ、６Ｘ、６．１Ｘ、６．２Ｘ、６．３Ｘ、６．４Ｘ、６．５Ｘ、６．６Ｘ、６．７Ｘ、６．８Ｘ、６．９Ｘ、７Ｘ、または７．５Ｘ、８Ｘ、８．５Ｘ、９Ｘ、９．５Ｘ、１０Ｘである。
【００３４】
一部の実施形態では、インプットＤＮＡの量は、１ｎｇ、２ｎｇ、３ｎｇ、４ｎｇ、５ｎｇ、６ｎｇ、７ｎｇ、８ｎｇ、９ｎｇ、１０ｎｇ、１１ｎｇ、１２ｎｇ、１３ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、４５ｎｇ、５０ｎｇ、５５ｎｇ、６０ｎｇ、６５ｎｇ、７０ｎｇ、７５ｎｇ、８０ｎｇ、８５ｎｇ、９０ｎｇ、９５ｎｇ、１００ｎｇ、１１０ｎｇ、１１５ｎｇ、１２０ｎｇ、１２５ｎｇ、１３０ｎｇ、１３５ｎｇ、１４０ｎｇ、１５０ｎｇ、１５５ｎｇ、１６０ｎｇ、１６５ｎｇ、１７０ｎｇ、１８０ｎｇ、１８５ｎｇ、１９０ｎｇ、１９５ｎｇ、２００ｎｇ、２１０ｎｇ、２２０ｎｇ、２２５ｎｇ、２３０ｎｇ、２３５ｎｇ、２４０ｎｇ、２４５ｎｇ、２５０ｎｇ、２６０ｎｇ、２７０ｎｇ、２８０ｎｇ、２９０ｎｇ、３００ｎｇ、３２５ｎｇ、３５０ｎｇ、３７５ｎｇ、４００ｎｇ、４２５ｎｇ、４５０ｎｇ、４７５ｎｇ、５００ｎｇ、５２５ｎｇ、５５０ｎｇ、６００ｎｇ、６５０ｎｇ、７００ｎｇ、７５０ｎｇ、８００ｎｇ、８５０ｎｇ、または９００ｎｇである。一部の実施形態では、上記量のインプットＤＮＡに対するトランポザーゼの濃度は、およそ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３５ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、６５ｎＭ、７０ｎＭ、７５ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、９５ｎＭ、１００ｎＭ、１２５ｎＭ、１３０ｎＭ、１４０ｎＭ、１５０ｎＭ、１７５ｎＭ、１８０ｎＭ、１９０ｎＭ、２００ｎＭ、２１０ｎＭ、２２５ｎＭ、２３０ｎＭ、２４０ｎＭ、２５０ｎＭ、２６０ｎＭ、２７５ｎＭ、２８０ｎＭ、２９０ｎＭ、３００ｎＭ、３２５ｎＭ、３５０ｎＭ、３６０ｎＭ、３７５ｎＭ、３８０ｎＭ、３９０ｎＭ、４００ｎＭ、４２５ｎＭ、４５０ｎＭ、４７５ｎＭ、または５００ｎＭである。一部の実施形態では、上記量のインプットＤＮＡに対するトランポザーゼまたは正規化トランスポソームの、正規化濃度の濃度は、およそ、０．１Ｘ〜１０Ｘ、１Ｘ〜１０Ｘ、３Ｘ〜８Ｘ、４Ｘ〜７Ｘの範囲から選択する。一部の実施形態では、上記量のインプットＤＮＡに対するトランポザーゼまたは正規化トランスポソームの正規化濃度は、およそ、０．１Ｘ、０．２Ｘ、０．３Ｘ、０．４Ｘ、０．５Ｘ、０．６Ｘ、０．７Ｘ、０．８Ｘ、０.９Ｘ、１Ｘ、１．１Ｘ、１．２Ｘ、１．３Ｘ、１．４Ｘ、１．５Ｘ、１．６Ｘ、１．７Ｘ、１．８Ｘ、１．９Ｘ、２Ｘ、２．１Ｘ、２．２Ｘ、２．３Ｘ、２．４Ｘ、２．５Ｘ、２．６Ｘ、２．７Ｘ、２．８Ｘ、２．９Ｘ、３Ｘ、３．１Ｘ、３．２Ｘ、３．３Ｘ、３．４Ｘ、３.５Ｘ、３．６Ｘ、３．７Ｘ、３．８Ｘ、３．９Ｘ、４Ｘ、４．１Ｘ、４．２Ｘ、４．３Ｘ、４．４Ｘ、４．５Ｘ、４．６Ｘ、４．７Ｘ、４．８Ｘ、４．９Ｘ、５Ｘ、５．１Ｘ、５．２Ｘ、５．３Ｘ、５．４Ｘ、５．５Ｘ、５．６Ｘ、５．７Ｘ、５．８Ｘ、５．９Ｘ、６Ｘ、６．１Ｘ、６．２Ｘ、６．３Ｘ、６．４Ｘ、６．５Ｘ、６．６Ｘ、６．７Ｘ、６．８Ｘ、６．９Ｘ、７Ｘ、または７．５Ｘ、８Ｘ、８．５Ｘ、９Ｘ、９．５Ｘ、１０Ｘである。
【００３５】
一部の実施形態では、ｎｇ量のインプットＤＮＡに対するトランスポザーゼのｎＭ濃度比率はおよそ、０．５〜５、１〜５、２〜５、２．１〜３、または２．１〜２．５である。
【００３６】
本明細書で用いる場合、用語「ゲノムＤＮＡ」は、様々な細胞タンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む細胞に存在する核酸を意味する。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡは原核生物、例えば細菌および古細菌に由来する。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡは真核生物、例えば、ヒト、植物、菌類、アメーバに由来する。
【００３７】
本明細書で用いる場合の用語「変異」または「修正」は、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に配列および／または機能特性において修正（つまり、改変特性）を示す、遺伝子または遺伝子産物を意味する。「変異」または「修正」はまた、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に配列および／または機能特性における修正（つまり、改変特性）を示す、特異的なヌクレオチド位置での配列、特定のコドン位置での配列、または特定のアミノ酸位置での配列を意味する。
【００３８】
本明細書で用いる場合の「含んで（including）」は、用語「含んで（comprising）」と同じ意味を持つ。
【００３９】
本明細書で用いる場合の「約（およそ）」は、数量的にプラス１０％またはマイナス１０％を意味する。
【００４０】
下記でさらに詳細に記載するように、本発明者らは驚くべきことに、トランスポザーゼのアミノ酸配列のある位置での残基への１つ又は複数の変異は、ＤＮＡインプット許容差の拡大をもたらし、結果として、変異トランスポザーゼは野生型トランスポザーゼと比較し、ある範囲のインプットＤＮＡ量にわたって均一なＤＮＡフラグメントサイズを生成することを発見した。一実施形態では、ＴＳ−Ｔｎ５０５９トランスポザーゼは、他のトランスポザーゼ、例えばＴＳ−Ｔｎ５およびＴｎ５バージョン１（ＴＤＥ１）と比較し、拡大したＤＮＡインプット許容差を呈す。
【００４１】
一部の実施形態では、ＴＳ−Ｔｎ５０５９は他のトランスポザーゼと比較し、ＤＮＡインプット許容差の拡大を呈すが、該実施形態ではインプットＤＮＡの範囲は１ｎｇ〜２００ｎｇのゲノムＤＮＡであり、ＴＳ−Ｔｎ５０５９の濃度は１００〜３００ｎＭである。一部の実施形態では、ＴＳ−Ｔｎ５０５９は他のトランスポザーゼと比較しＤＮＡインプット許容差の拡大を呈すが、該実施形態ではインプットＤＮＡの範囲は５ｎｇ〜２００ｎｇのゲノムＤＮＡであり、ＴＳ−Ｔｎ５０５９の濃度は１００〜２５０ｎＭである。一部の実施形態では、ＴＳ−Ｔｎ５０５９は他のトランスポザーゼと比較しＤＮＡインプット許容差の拡大を呈すが、該実施形態では、インプットＤＮＡの範囲は５ｎｇ〜１００ｎｇのゲノムＤＮＡであり、ＴＳ−Ｔｎ５０５９の濃度は２４０ｎＭ〜２５０ｎＭである。
【００４２】
拡大したＤＮＡインプット許容差を有する改善された挿入バイアスは、現在のＮｅｘｔｅｒａ（登録商標） Ｒａｐｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）より、より速くより柔軟なサンプル調製およびエクソーム濃縮プロトコルを提供する。
【００４３】
本明細書で用いる場合、用語「タグメント化」はトランスポソーム複合体によるＤＮＡの修飾を意味し、該トランスポソーム複合体は、トランスポゾン端配列を備えるアダプタと複合体化した、トランスポザーゼ酵素を含む。タグメント化は、ＤＮＡの同時断片化と、二重断片の両鎖の５’端へのアダプタのライゲーションとをもたらす。
【００４４】
本明細書で用いる場合、「トランスポソーム複合体」または「トランスポソーム」は、少なくとも一つのトランスポザーゼ酵素とトランスポザーゼ認識部位からなる。一部のこのような系において、トランスポザーゼは、トランスポゾン認識部位と機能的複合体を形成することが可能であり、これは転移反応に触媒作用を及ぼすことが可能である。トランスポザーゼは、トランスポザーゼ認識部位に結合し、本明細書でタグメント化と呼ぶプロセスにおいて、該トランスポザーゼ認識部位を標的核酸に挿入することができる。このような挿入事象の一部では、トランスポザーゼ認識部位の一方の鎖を標的核酸に移動させることができる。
【００４５】
本明細書で示す改変トランスポザーゼ酵素は、トランスポソーム複合体の一部を形成することが可能である。例示的転移複合体には過活動Ｔｎ５トランスポザーゼおよびＴｎ５型トランスポザーゼ認識部位が含まれるが、これらに限定されない。過活動Ｔｎ５トランスポザーゼには、米国特許第５９２５５４５号明細書、同第５９６５４４３号明細書、同第７０８３９８０号明細書、および同第７６０８４３４号明細書、ならびにGoryshin and Reznikoff, J. Biol. Chem., 273:7367 (1998)の開示内容に記載のものも含まれ、これらの各内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、本明細書で示す改変トランスポザーゼ酵素は、意図した目的のために十分効率的に、ランダムまたはほぼランダムなやり方で、トランスポゾン端をタグ標的核酸に挿入することができる任意の転移系で利用可能であり、そして、提示した方法で用いることが可能であることが理解されよう。
【００４６】
例えば、提示する改変トランスポザーゼは、Ｔｎ５アミノ酸配列の部位と機能的に同等の位置で少なくとも一つのアミノ酸置換変異を含むことが可能である。図１に例示するように、Ｔｎ５に対して相同な領域を本明細書で説明し、他のトランスポザーゼ酵素、例えば、Ｈｅｒｍｅｓトランスポザーゼ、ＨＩＶインテグラーゼ、Ｍｕトランスポザーゼ、およびＭｏｓ１トランスポザーゼにおける機能的に同等な部位の特定を可能にする。同様に、他のトランスポザーゼ酵素またはインテグラーゼ酵素における機能的に同等の部位は、例えば、Ｔｎ５アミノ酸配列の配列アライメントを実行し、保存または半保存された残基またはドメインを特定することにより、当業者に即座に明らかになろう。したがって、本明細書で提供するある実施形態で用いることが可能な転移系には、Ｔｎ５の部位と機能的に同等な部位を有する任意の既知のトランスポザーゼが含まれることが理解されよう。例えば、このような系は、ＭｕＡトランスポザーゼ、ならびに、Ｒ１およびＲ２の端配列を備えるＭｕトランスポザーゼ認識部位が含まれ得る（Mizuuchi, K., Cell, 35: 785, 1983; Savilahti, H, et al., EMBO J., 14: 4893, 1995）。
【００４７】
本明細書で提供するある実施形態に含まれる転移系のより多くの例には、黄色ブドウ球菌Ｔｎ５５２（Colegio et al., J. Bacteriol., 183: 2384-8, 2001; Kirby C et al., Mol. Microbiol., 43: 173-86, 2002）、Ｔｙ１（Devine & Boeke, Nucleic Acids Res., 22: 3765-72, 1994および国際公開Ｗ９５/２３８７５）、トランスポゾンＴｎ７（Craig, N L, Science. 271: 1512, 1996; Craig, N L, Review in: Curr Top Microbiol Immunol., 204:27-48, 1996）、Ｔｎ／ＯおよびＩＳ１０（Kleckner N, et al., Curr Top Microbiol Immunol., 204:49-82, 1996）、Ｍａｒｉｎｅｒトランスポザーゼ（(Lampe D J, et al., EMBO J., 15: 5470-9, 1996）、Ｔｃ１（Plasterk R H, Curr. Topics Microbiol. Immunol., 204: 125-43, 1996）、Ｐ因子（Gloor, G B, Methods Mol. Biol., 260: 97-114, 2004), Tn3 (Ichikawa & Ohtsubo, J Biol. Chem. 265:18829-32, 1990）、細菌挿入配列（Ohtsubo & Sekine, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204: 1-26, 1996）、レトロウイルス（Brown, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86:2525-9, 1989）、ならびにイーストのレトロトランスポゾン（Boeke & Corces, Annu Rev Microbiol. 43:403-34, 1989）が含まれる。上記で引用した参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４８】
簡潔に言えば、「転移反応」は、１つ又は複数のトランスポゾンを標的核酸のランダムな部位またはほぼランダムな部位に挿入する反応である。転移反応において必須の構成要素は、トランスポザーゼ、および、トランスポゾンのヌクレオチド配列を呈すＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、移動するトランスポゾン配列およびその相補体（つまり、非移動トランスポゾン端配列）、ならびに、機能転移またはトランスポソーム複合体を形成するのに必要な他の構成要素が含まれる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドはさらに、必要に応じてまたは所望により、追加配列（例えば、アダプタまたはプライマー配列）を含むことが可能である。
【００４９】
核酸の５’および／または３’端に付加するアダプタは、ユニバーサル配列を含むことが可能である。ユニバーサル配列は、２つ以上の核酸分子に共通する、つまり共有されるヌクレオチド配列領域である。任意で、２つ以上の核酸分子はまた、配列の異なる領域を有する。したがって、例えば、５’アダプタは同一またはユニバーサルな核酸配列を含むことが可能であり、３’アダプタは同一またはユニバーサルな配列を含むことが可能である。複数の核酸分子の異なるメンバーに存在し得るユニバーサル配列は、ユニバーサル配列に対して相補的な単一ユニバーサルプライマーを用いて多数の異なる配列の複製または増幅を可能にする。
【００５０】
トランスポザーゼ変異
したがって、本明細書では、野生型とトランスポザーゼと比較し修正した変異トランスポザーゼを提示する。改変トランスポザーゼは、下記の表１に記載の残基に機能的に同等な位置において、少なくとも１つのアミノ酸置換変異を含むことが可能である。表１は、トランスポザーゼ残基における置換変異を記載し、これは改善された挿入バイアスをもたらすことが示されている。表１に記載するように、本明細書で示す置換変異は、本明細書で配列番号１として例示する野生型Ｔｎ５トランスポザーゼ、または、他の部位に更なる変異を有するトランスポザーゼといった、任意の機能的トランスポザーゼバックボーンに存在し得、これには、過活動Ｔｎ５トランスポザーゼとして知られ、本明細書では配列番号１１として例示するトランスポザーゼ配列にあるもの、例えば、米国特許第５９２５５４５号明細書、同第５９６５４４３号明細書、同第７０８３９８０号明細書、および同第７６０８４３４号明細書に組み込まれた事項に記載される１つまたは複数の変異が含まれる。
【００５１】
【表１−１】
0006490710.tif 000002
【表１−２】
0006490710.tif 000003
【００５２】
当技術分野で理解されるように、上記表に挙げた参照番号は、野生型Ｔｎ５配列（配列番号１）のアミノ酸位置を意味する。当業者は、ナンバリングはＮ末端の切断、挿入、または融合により変わり得ることを理解しよう。上に挙げたアミノ酸の機能的位置は、位置のナンバリングが変わったとしても同じままだろう。例えば、配列番号２５に記載の配列のうち最初の２８５個のアミノ酸残基は大腸菌ＴＳのＮ末端融合を含み、その後ろに配列番号１１のアミノ酸残基２〜４７６が続く。したがって、例えば配列番号２５のＰｒｏ６５６は、配列番号１１のＰｒｏ３７２と機能的に対応する。
【００５３】
したがって、ある実施形態では、本明細書で提示する改変トランスポザーゼは、野生型トランスポザーゼと比較し、例えば、Ｔｎ５トランスポザーゼのアミノ酸配列のＡｓｐ２４８、Ａｓｐ１１９、Ｔｒｐ１２５、Ｌｙｓ１２０、Ｌｙｓ２１２、Ｐｒｏ２１４、Ｇｌｙ２５１、Ａｌａ３３８、Ｇｌｕ１４６、および／またはＧｌｕ１９０と機能的に同等の位置で少なくとも１つのアミノ酸置換変異を含む。
【００５４】
一部の実施形態では、変異トランスポザーゼは、位置Ａｓｐ２４８で変異を含む。位置Ａｓｐ２４８での変異は、例えば、置換変異または挿入変異とすることが可能である。ある実施形態では、変異はＡｓｐ以外の任意の残基への置換変異である。ある実施形態では、位置Ａｓｐ２４８での置換変異は、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、およびＨｉｓからなる群から選択される残基への変異を含む。
【００５５】
ある実施形態では、位置Ａｓｐ２４８での変異は、位置Ａｓｐ２４８の後ろにおける挿入変異である。ある態様では、挿入変異には、Ａｓｐ２４８の後ろへの任意の残基の挿入が含まれ得る。ある態様では、挿入変異には、位置Ａｓｐ２４８の後ろへの疎水性残基の挿入が含まれ得る。疎水性残基は当業者には既知であり、該疎水性残基には、例えば、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、およびＣｙｓが含まれる。ある態様では、挿入変異には、位置Ａｓｐ２４８の後ろへのバリン残基の挿入が含まれ得る。
【００５６】
本明細書で提示する一部の実施形態には、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼと比較し修正した変異Ｔｎ５トランスポザーゼを含み、該変異トランスポザーゼは位置Ａｓｐ１１９で変異を含む。ある態様では、位置Ａｓｐ１１９における変異は置換変異である。ある態様では、位置Ａｓｐ１１９における置換変異には、疎水性残基への変異が含まれ得る。疎水性残基は当業者に既知であり、例えば、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、およびＣｙｓが含まれる。ある態様では、位置Ａｓｐ１１９における置換変異には、親水性残基への変異が含まれ得る。親水性残基は当業者に既知であり、例えば、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、およびＧｌｕが含まれる。ある態様では、位置Ａｓｐ１１９での置換変異には、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、およびＶａｌからなる群から選択される残基への変異が含まれ得る。
【００５７】
本明細書で提示する一部の実施形態には、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼと比較し修正した変異Ｔｎ５トランスポザーゼを含み、該変異トランスポザーゼは位置Ｔｒｐ１２５で変異を含む。ある態様では、位置Ｔｒｐ１２５での変異は置換変異である。ある態様では、位置Ｔｒｐ１２５での置換変異には、メチオニン残基への変異が含まれ得る。
【００５８】
本明細書に提示する一部の実施形態には、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼと比較し修正した変異Ｔｎ５トランスポザーゼを含み、該変異トランスポザーゼは、位置Ｌｙｓ１２０で変異を含む。ある態様では、位置Ｌｙｓ１２０における変異は置換変異である。ある態様では、位置Ｌｙｓ１２０での置換変異には、嵩高い芳香族残基への変異が含まれ得る。嵩高い芳香族残基として特徴付けられる残基は当業者にとって既知であり、例えば、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐが含まれる。ある態様では、位置Ｌｙｓ１２０での置換変異に、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、およびＧｌｕからなる群から選択される残基への変異が含まれ得る。
【００５９】
本明細書で提示される一部の実施形態には、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼと比較し修正した変異Ｔｎ５トランスポザーゼを含み、該変異トランスポザーゼはＬｙｓ２１２および／またはＰｒｏ２１４および／またはＡｌａ３３８の位置で変異を含む。ある態様では、Ｌｙｓ２１２および／またはＰｒｏ２１４および／またはＡｌａ３３８の位置での変異は、置換変異である。ある態様では、位置Ｌｙｓ１２０での置換変異にはアルギニンへの変異が含まれる。ある態様では、位置Ｐｒｏ２１４での置換変異にはアルギニンへの変異が含まれる。ある態様では、位置Ａｌａ３３８での置換変異にはバリンへの変異が含まれる。一部の実施形態では、トランスポザーゼはＧｌｙ２５１で置換変異をさらに含むことが可能である。ある態様では、位置Ｇｌｙ２５１での置換変異にはアルギニンへの変異が含まれる。
【００６０】
本明細書で提示する一部の実施形態は、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼと比較し修正した変異ＴＮ５トランスポザーゼを含み、該変異トランスポザーゼはＧｌｕ１４６および／またはＧｌｕ１９０および／またはＧｌｙ２５１の位置で変異を含む。ある態様では、Ｇｌｕ１４６および／またはＧｌｕ１９０および／またはＧｌｙ２５１の位置での変異は置換変異である。ある態様では、位置Ｇｌｕ１４６での置換変異にはグルタミンへの変異が含まれ得る。ある態様では、位置Ｇｌｕ１９０での置換変異にはグリシンへの変異が含まれ得る。ある態様では、位置Ｇｌｙ２５１での置換変異にはアルギニンへの変異が含まれ得る。
【００６１】
上記実施形態の何れかにおいて、変異Ｔｎ５トランスポザーゼはさらに、Ｔｎ５トランスポザーゼのアミノ酸配列のＧｌｕ５４および／またはＭｅｔ５６および／またはＬｅｕ３７２と機能的に同等の位置で置換変異を含むことが可能である。ある実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼのアミノ酸配列のＧｌｕ５４Ｌｙｓおよび／またはＭｅｔ５６Ａｌａおよび／またはＬｅｕ３７２Ｐｒｏに対し相同な置換変異を含む。
【００６２】
本明細書に提示する一部の実施形態には、配列番号２〜１０および１２〜２０の何れか一つのアミノ酸配列を含む変異Ｔｎ５トランスポザーゼが含まれる。
【００６３】
本明細書では、半保存されたドメインへの置換変異を含む改変トランスポザーゼも提示する。本明細書で用いる場合、用語「半保存されたドメイン」は、様々なトランスポザーゼおよび／または様々な種のうち、完全に保存された、または、少なくとも部分的に保存された、トランスポザーゼの一部分を意味する。半保存されたドメインは、トランスポザーゼの触媒コアドメインに存在するアミノ酸残基を含む。驚くべきことに、半保存されたドメインにある１つまたは複数の残基の変異はトランスポザーゼアクティビティに影響を及ぼし、挿入バイアスにおいて改善をもたらすということを発見した。
【００６４】
一部の実施形態では、半保存されたドメインは配列番号２１に記載される配列を有するアミノ酸を含む。配列番号２１はＴｎ５トランスポザーゼのアミノ酸配列の残基１２４〜１３３に対応し、これは本明細書では配列番号１と記載する。半保存されたドメインにおける、様々なトランスポザーゼのうち保存を示す構造アライメントを図１に記載する。図１に示すトランスポザーゼ配列には、Ｔｎ５トランスポザーゼ（１ＭＵＨ）、Ｈｅｒｍｅｓトランスポザーゼ（２ＢＷ３）、ＨＩＶインテグラーゼ（１ＩＴＧ）、Ｍｕトランスポザーゼ（１ＢＣＭ）、およびＭｏｓ１トランスポザーゼ（３ＨＯＳ）の触媒コアドメインが含まれる。
【００６５】
半保存されたドメインにおける１つまたは複数の残基への変異は、驚くべきことに、挿入バイアスの改善をもたらすことが分かっている。例えば、本明細書で提示する改変トランスポザーゼの一部の実施形態では、置換変異には、配列番号２１の位置２でＴｒｐ以外の任意の残基への変異が含まれる。ある実施形態では、改変トランスポザーゼは、配列番号２１の位置２でＭｅｔへの変異を含む。
【００６６】
「機能的に同等な」とは、異なるトランスポザーゼを全面的に用いる研究の場合に、対照トランスポザーゼが、酵素において同一の機能的役割を有する他のトランスポザーゼのアミノ酸位置で起きると考えられるアミノ酸置換を含むことを意味する。例えば、Ｍｕトランスポザーゼの位置２８８におけるリシンからメチオニンへの変異（Ｋ２８８Ｍ）は、Ｔｎ５トランスポザーゼの位置１２５におけるトリプトファンからメチオニンへの置換（Ｗ１２５Ｍ）と機能的に同等だろう。
【００６７】
２つ以上の異なるトランスポザーゼにおいて通常機能的に同等な置換変異は、トランスポザーゼのアミノ酸配列における相同なアミノ酸位置において起きる。つまり、用語「機能的に同等な」を本明細書で用いる場合、変異アミノ酸の特定の機能が既知であるか否かに関わらず、所定の変異に「位置的に同等」または「相同」である変異も含む。２つ以上の異なるトランスポザーゼのアミノ酸配列において、位置的に同等または相同なアミノ酸残基は、配列アライメントおよび／または分子モデリングを基に特定することが可能である。位置的に同等および／または機能的に同等な残基を特定するための配列アライメントおよび分子モデリングの例を図１に記載する。したがって、例えば、図１に示すように、半保存されたドメインにおける残基は、Ｔｎ５トランスポザーゼのアミノ酸配列の位置１２４〜１３３として特定される。Ｈｅｒｍｅｓトランスポザーゼ、ＨＩＶインテグラーゼ、Ｍｕトランスポザーゼ、およびＭｏｓ１トランスポザーゼにおける対応残基は、垂直に並べた図において特定される。これらは、Ｔｎ５トランスポザーゼのアミノ酸配列の対応残基と機能的に同等であると同時に、位置的に同等であると考えられる。
【００６８】
上記の改変トランスポザーゼは追加の置換変異を含むことが可能であり、これは、トランスポザーゼアクティビティの１つまたは複数の態様を高めることが知られている。例えば、一部の実施形態では、上記の変異のうち何れかに加え、改変Ｔｎ５トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼのアミノ酸配列のＧｌｕ５４および／またはＭｅｔ５６および／またはＬｅｕ３７２と機能的に同等な位置で置換変異をさらに含むことが可能である。当技術分野で既知のように、そして、米国特許第５９２５５４５号明細書、同第５９６５４４３号明細書、同第７０８３９８０号明細書、および同第７６０８４３４号明細書の開示内容、ならびに、Goryshin and Reznikoff, J. Biol. Chem., 273:7367 (1998)の開示内容（これらは各々、その全体が参照により組み込まれる）により例示されるように、Ｔｎ５トランスポザーゼのアミノ酸配列のＧｌｕ５４および／またはＭｅｔ５６および／またはＬｅｕ３７２と機能的に同等な位置にある１つまたは複数の位置において、改善されたアクティビティをもたらす種々の置換変異のうち何れかを行うことが可能である。実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼのアミノ酸配列のＧｌｕ５４Ｌｙｓおよび／またはＭｅｔ５６Ａｌａおよび／またはＬｅｕ３７２Ｐｒｏに相同な置換変異を含む。例えば、置換変異には、Ｔｎ５トランスポザーゼのアミノ酸配列のＧｌｕ５４Ｌｙｓおよび／またはＭｅｔ５６Ａｌａおよび／またはＬｅｕ３７２Ｐｒｏに相同な置換変異を含み得る。
【００６９】
トランスポザーゼ変異
様々な型の突然変異誘発を本開示で任意に用いて、例えば、上記のトランスポザーゼモデルおよびモデル予測に従って、または、ランダムもしくは半ランダムな変異アプローチを用いて、例えば、トランスポザーゼを修飾して多様体を生成する。通常、任意の利用可能な突然変異誘発手順を、トランスポザーゼ変異体を作成するために用いることが可能である。このような突然変異誘発手順には、対象の１つまたは複数のアクティビティ（例えば、改善された挿入バイアス）のために、変異核酸および変異ポリペプチドを選択することが任意で含まれる。用いることが可能な手順には、部位特異的点突然変異誘発、ランダム点突然変異誘発（random point mutagenesis）、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの相同組み換え（ＤＮＡシャッフリングおよびコンビナトリアルオーバーラップＰＣＲ）、テンプレートを含むウラシルを用いた突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、ホスホロチオエート修正ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップ付き二重ＤＮＡを用いた突然変異誘発、点不一致修復、欠損修復宿主株を用いた突然変異誘発、制約選択および制約精製、欠失突然変異誘発、全遺伝子合成による突然変異誘発、縮重ＰＣＲ、二重鎖切断修復、ならびに、当業者に既知の他の多くのものが含まれるが、これらに限定されない。変異用開始トランスポザーゼは本明細書に記載のもののうち何れかとすることが可能であり、これには、例えば、米国特許第５９２５５４５号明細書、同第５９６５４４３号明細書、同第７０８３９８０号明細書、および同第７６０８４３４号明細書、ならびにGoryshin and Reznikoff, J. Biol. Chem., 273:7367 (1998) の開示内容（これらはそれぞれ、参照によりその全体が組み込まれる）で特定されるものといった、利用可能なトランスポザーゼ変異体が含まれる。
【００７０】
任意で、突然変異誘発は、天然発生トランスポザーゼ分子からの既知の情報、または、既知の改変もしくは変異したトランスポザーゼ（例えば、上記参考文献に記載される既存の変異トランスポザーゼを用いる）についての既知の情報、例えば、上記のような、配列、配列比較、物理特性、および／または結晶構造等により誘導することが可能である。しかしながら、別の種類の実施形態では、修飾は、（例えば、標準的または「ファミリー」のＤＮＡシャッフリングのように（例えば、Crameri et al. (1998) "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution" Nature 391:288-291を参照））、基本的にランダムとすることが可能である。
【００７１】
変異フォーマットについての追加情報は以下にある：Sambrook et al., Molecular Cloning--A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000 ("Sambrook")；Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 2011) ("Ausubel")) and PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds) Academic Press Inc. San Diego, Calif. (1990) ("Innis")。以下の刊行物およびその中で引用される参考文献は、変異フォーマットについてさらなる詳細を提供する：Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993)；Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245 (1988)；Bordo and Argos (1991) Suggestions for "Safe" Residue Substitutions in Site-directed Mutagenesis 217:721-729; Botstein & Shortle, Strategies and applications of ｉｎ ｖｉｔｒｏ mutagenesis, Science 229:1193-1201 (1985)；Carter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985)；Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986)；Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987)；Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57:369-374 (1996)；Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986)；Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions ｉｎ ｖｉｔｒｏ, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988)；Grundstrom et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale `shot-gun` gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985)；Hayes (2002) Combining Computational and Experimental Screening for rapid Optimization of Protein Properties PNAS 99(25) 15926-15931；Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlin)) (1987)；Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)；Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987)；Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984)；Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154:350-367 (1987)；Kramer et al., Point Mismatch Repair, Cell 38:879-887 (1984)；Kramer et al., Improved enzymatic ｉｎ ｖｉｔｒｏ reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988)；Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997)；Lorimer and Pastan Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995)；Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181(1986)；Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction end onuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986)；Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301(1984)；Sakamar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988)；Sayers et al., Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16:791-802 (1988)；Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction end onucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814；Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001)；Smith, Ｉｎ ｖｉｔｒｏ mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19:423-462 (1985)；Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983)；Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987)；Stemmer, Nature 370, 389-91(1994)；Taylor et al., The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985)；Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985)；Wells et al., Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986)；Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985)；Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M 13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982)；Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed  mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol. 100:468-500 (1983)；Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154:329-350 (1987)；Clackson et al. (1991) "Making antibody fragments using phage display libraries" Nature 352:624-628；Gibbs et al. (2001) "Degenerate oligonucleotide gene shuffling (DOGS): a method for enhancing the frequency of recombination with family shuffling" Gene 271:13-20；および、Hiraga and Arnold (2003) "General method for sequence-independent site-directed chimeragenesis: J. Mol. Biol. 330:287-296。上記方法の多くについてのさらなる詳細はMethods in Enzymology Volume 154に見られ、これまた、様々な突然変異誘発法にまつわるトラブルシューティング問題に対する有用な制御について記載する。
【００７２】
組み換えトランスポザーゼの作成と単離
概して、本明細書に提示するトランスポザーゼをコードする核酸は、クローニング、組み換え、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅、および／または他の利用可能な方法により作成することが可能である。種々の組み換え方法を、本明細書に提示するトランスポザーゼをコードする発現ベクターを発現するために用いることが可能である。組み換え核酸を作成する方法、発現産物を発現する方法、および発現産物を単離する方法は、当技術分野では周知であり、記載されている。多くの例示的変異および変異の組み合わせ、ならびに所望の変異を設計するための方法を本明細書では記載する。トランスポザーゼの触媒ドメインにおいて変異を作成し選択する方法は、本明細書にあるほか、米国特許第５９２５５４５号明細書、同第５９６５４４３号明細書、同第７０８３９８０号明細書、および同第７６０８４３４号明細書で例示されており、これらはその全体が参照により組み込まれる。
【００７３】
変異、組み換え、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸操作の方法（クローニング、発現、およびＰＣＲ等を含む）についての追加の有用な参考文献には、Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger)；Kaufman et al. (2003) Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine Second Edition Ceske (ed) CRC Press (Kaufman)；The Nucleic Acid Protocols Handbook Ralph Rapley (ed) (2000) Cold Spring Harbor, Humana Press Inc (Rapley)；Chen et al. (ed) PCR Cloning Protocols, Second Edition (Methods in Molecular Biology, volume 192) Humana Press；およびin Viljoen et al. (2005) Molecular Diagnostic PCR Handbook Springer, ISBN 1402034032が含まれる。
【００７４】
加えて、多量のキットが、細胞からプラスミドまたは他の関連核酸を精製するために商業的に利用可能である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社によるＥａｓｙＰｒｅｐ（登録商標）およびＦｌｅｘｉＰｒｅｐ（登録商標）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社によるＳｔｒａｔａＣｌｅａｎ（登録商標）、ならびに、Ｑｉａｇｅｎ社によるＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）を参照）。任意の単離および／または精製した核酸をさらに操作して、細胞をトランスフェクトするのに用いる、および／または、関連ベクターに組み込んで発現のために有機体を感染させるなどする他の核酸を、生成することが可能である。典型的なクローニングベクターは、転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター、転写開始配列および翻訳開始配列、ならびに、特定の標的核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは任意で、少なくとも１つの独立ターミネーター配列を含む汎用発現カセットと、真核生物、原核生物、またはその両方において該カセットの複製を可能にする配列（例えば、シャトルベクター）と、原核生物系および真核生物系の両方のための選択マーカーとを含む。ベクターは、原核生物、真核生物、またはその両方における複製および統合に適している。
【００７５】
一部の実施形態において、本明細書で提示するトランスポザーゼは融合タンパク質として発現する。融合タンパク質は、例えば、トランスポザーゼの可溶性、発現、および／または精製などの特性を高めることが可能である。本明細書で用いる場合、用語「融合タンパク質」は、天然の単一ポリペプチドには普通は存在しない少なくとも２つのポリペプチドドメインを有する、単一ポリペプチド鎖を意味する。したがって、天然に発生するタンパク質およびその点変異体は、本明細書で用いる「融合タンパク質」ではない。好適には、対象のポリペプチドはペプチド結合を介して少なくとも１つのポリペプチドドメインと融合し、該融合タンパク質はまた、別々のタンパク質に由来するアミノ酸部分間で、アミノ酸の連結領域を含み得る。対象のポリペプチドに融合したポリペプチドドメインは、対象のポリペプチドの可溶性および／または発現を高めることができ、そして、精製タグを提供して、組み換え融合タンパク質を宿主細胞、培養上清、またはその両方から精製することを可能にすることができる。発現、精製、および／または保存中に可溶性を高めるポリペプチドドメインは当技術分野で周知であり、該ポリペプチドドメインには、Fox, J.D. and Waugh D.S., E. coli Gene Expression Protocols Methods in Molecular Biology, (2003) 205:99-117およびHan et al. FEMS Microbiol. Lett. (2007) 274:132-138（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）等で例示されるように、例えばマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）および伸長因子Ｔｓ（Ｔｓｆ）が含まれる。対象のポリペプチドに融合したポリペプチドドメインは、対象のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端で融合することができる。用語「組み換え」は、例えば、アミノ酸もしくは核酸の単離セグメントを、遺伝子工学技術により化学的に合成する、または、操作することにより、さもなければ分離している２つの配列セグメントを人工的に組み合わせることを意味する。
【００７６】
一実施形態では、本発明は修正Ｔｎ５トランスポザーゼおよび伸長因子Ｔｓ（Ｔｓｆ）を含むトランスポザーゼ融合タンパク質を提供する。Ｔｓｆ−Ｔｎ５融合タンパク質は、融合トランスポザーゼおよびフリートランスポゾン端を含む、機能的二量体トランスポソーム複合体に組み込むことができる。Ｔｓｆ−Ｔｎ５融合タンパク質の可溶性および熱安定性は、非融合Ｔｎ５タンパク質と比較し高い。
【００７７】
別の実施形態では、本発明は、修正Ｔｎ５トランスポザーゼと、５−メチルシトシンを認識するタンパク質ドメインとを含むトランスポザーゼ融合タンパク質を提供する。５−メチルシトシンを提供する。５−メチルシトシン−Ｔｎ５融合タンパク質は、融合トランスポザーゼおよびフリートランスポゾン端を含む、機能的二量体トランスポソーム複合体に組み込むことができる。５−メチルシトシン結合タンパク質ドメインを用いて、例えば、Ｔｎ５トランスポソーム複合体をゲノムのメチル化領域に標的させることができる。
【００７８】
さらに別の実施形態では、本発明は、修正Ｔｎ５トランスポザーゼおよびドメインを結合するタンパク質Ａ抗体を含む、トランスポザーゼ融合タンパク質を提供する。タンパク質Ａ−Ｔｎ５融合タンパク質は、融合トランスポザーゼおよびフリートランスポゾン端を含む機能的二量体トランスポソーム複合体に組み込むことができる。タンパク質Ａのドメインを結合する抗体は、例えば、Ｔｎ５トランスポソーム複合体を、ゲノムの抗体結合領域に標的させるのに用いることができる。
【００７９】
本発明は、修正Ｔｎ５トランスポザーゼと、伸長因子ＴＳ（Ｔｓｆ）の全てまたは一部とを含む、トランスポザーゼ融合タンパク質を提供する。Ｔｓｆはタンパク質タグであり、これを用いて、細菌の発現系、例えば大腸菌発現系で発現した異種タンパク質の可溶性を高めることができる。異種タンパク質の可溶性を高めるＴｓｆの機能は、Ｔｓｆタンパク質に固有の高い折りたたみ効率に起因し得る。タンパク質精製実験において（データ表示なし）、Ｔｓｆをタンパク質Ｔｕとの複合体として精製した。Ｔｕを複合体中で結合させるには、Ｔｓｆを正しく折りたたむことが必要である、Ｔｓｆ−Ｔｕ複合体の精製は、Ｔｓｆが正しく折りたたまれたことを示唆する。例示的な、核酸および大腸菌伸長因子ＴＳの対応核酸配列は、それぞれ、配列番号２２および２３と示す。
【００８０】
一例では、ＴＳ−Ｔｎ５融合タンパク質を、ＴＳを過活動Ｔｎ５トランスポザーゼのＮ末端に融合させることにより構築した。変異Ｔｎ５トランスポザーゼタンパク質とのＴＳ−融合の例示的アミノ酸配列は、それぞれ配列番号２５および２６と示す。配列番号２４は、配列番号２５のＴＳ−変異タンパク質融合をコードする核酸配列に対応する。
【００８１】
ＴＳの全てまたは一部はＮ末端またはＣ末端で融合することが可能だが、当業者は、リンカー配列をＴＳ配列とトランスポザーゼのＮ末端またはＣ末端との間に挿入可能であることを理解するだろう。一部の実施形態では、リンカー配列は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０以上のアミノ酸長とすることが可能である。一部の実施形態では、融合タンパク質のトランスポザーゼ部分の１つまたは複数のアミノ酸は、削除する、または、リンカー配列と置き換えることができる。一部の実施形態では、融合タンパク質のトランスポザーゼ部分の第一メチオニンは、２つのアミノ酸、例えば、配列番号２５および２６で示されるＧｌｙ−Ｔｈｒと置き換えることができる。
【００８２】
ＴＳ−Ｔｎ５融合構築物を大腸菌で発現させ、発現、可溶性、および熱安定性について評価した。Ｔｎ５のＮ末端へのＴＳの融合はＴｎ５の可溶性を高めた。可溶性の向上は、トランスポソーム複合体のロバスト性の増大とタンパク質凝集の低下と関連付けることができる。ＴＳ−Ｔｎ５トランスポソームの熱安定性は、非融合Ｔｎ５トランスポソームの熱安定性と比較し実質的に改善する。一例では、熱によるＴｎ５の凝集は、非融合Ｔｎ５対照と比較し、Ｔｓｆ−Ｔｎ５融合構築物において実質的に縮小する。
【００８３】
一応用例では、ＴＳ−Ｔｎ５融合タンパク質は、次世代配列決定プラットフォーム（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＧＡまたはＨｉＳｅｑプラットフォーム）での配列決定向けに、ディレクショナルＲＮＡ−ｓｅｑライブラリの構築において用いる。
【００８４】
別の適用例では、ＴＳ−Ｔｎ５融合タンパク質を正規化プロセスで用いることができる。別の適用例では、ＴＳ可溶化タグを、他の修正（変異）Ｔｎ５トランスポザーゼ酵素の発現および精製のために用いることができる。
【００８５】
ＴＳ融合タグに特異的な抗体をプルダウンプロセスに用いて、トランスポソームタグ付き配列を捕捉することができる。一例では、ＴＳ融合タグ抗体はウサギポリクローナルである。
【００８６】
別の適用例では、ＴＳ−Ｔｎ５トランスポソームおよび抗ＴＳ抗体を、混合トランスポソームプロセスで用いることができる。例えば、トランスポソーム反応を、Ｔｓｆ−Ｔｎ５トランスポソームおよびＴｎ５トランスポソーム（つまり、ＴＳでタグ付けされてない）を用いて実行する。抗ＴＳ抗体を用いて、Ｔｓｆ−Ｔｎ５トランスポソームタグ付き配列を特異的にプルダウンする。
【００８７】
本発明は、修正Ｔｎ５トランスポザーゼと、５−メチルシトシンを認識するタンパク質ドメインとを含む、トランスポザーゼ融合タンパク質を提供する。タンパク質ドメインを結合する５−メチルシトシンは、例えば、Ｔｎ５トランスポソーム複合体をゲノムのメチル化領域に標的させるために用いることができる。一適用例では、ドメイン−Ｔｎ５トランスポソーム複合体を結合する５−メチルシトシンを用いて、メチル濃縮し断片化した、そしてタグを付けた（タグメント化）ライブラリを、メチル化分析用に生成することができる。
【００８８】
一部の実施形態では、トランスポザーゼに融合したポリペプチドドメインは、タンパク質Ａのドメインを結合する抗体を含む。タンパク質Ａは、強固な折りたたみ特性のない、比較的小さいコンパクトな分子である。タンパク質Ａのドメインを結合する抗体は、例えば、Ｔｎ５トランスポソーム複合体を、ゲノムの抗体結合領域に標的させるために用いることができる。例えば、５−メチルシトシンに特異的な抗体を用いて、ゲノムのメチル化領域に結合する、および、該領域を特定することができる。ゲノムの抗体結合領域は、タンパク質Ａ−Ｔｎ５融合トランスポソーム複合体を用いて、断片化およびタグ付け（つまり、タグメント化）のために実質的に標的とすることができる。
【００８９】
一部の実施形態では、トランスポザーゼに融合したポリペプチドドメインは精製タグを含む。本明細書で用いる場合の用語「精製タグ」は、ポリペプチドの精製または特定に適切な任意のペプチド配列を意味する。精製タグは、該精製タグに対し親和性のある別の部分に特異的に結合する。精製タグに特異的に結合するこのような部分は、通常、アガロースビーズなどの母材または樹脂に付着する。精製タグに特異的に結合する部分には、抗体、他のタンパク質（例えば、タンパク質Ａまたはストレプトアビジン）、ニッケルまたはコバルトのイオンまたは樹脂、ビオチン、アミロース、マルトース、およびシクロデキストリンが含まれる。例示的な精製タグには（ヘキサヒスチジンペプチドなどの）ヒスチジン（ＨＩＳ）タグが含まれ、これはニッケルイオンまたはコバルトイオンなどの金属イオンに結合するだろう。他の例示的精製タグは、ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐ）タグ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）、フラグ（Ｆｌａｇ）タグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）、およびＶ５タグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）である。用語「精製タグ」にはまた、「エピトープタグ」、つまり、抗体により特異的に認識されるペプチド配列が含まれる。例示的エピトープタグにはＦＬＡＧタグが含まれ、これはモノクローナル抗ＦＬＡＧ抗体により特異的に認識される。抗ＦＬＡＧ抗体により認識されるペプチド配列は、配列ＤＹＫＤＤＤＤＫまたは実質的に同一であるその多様体からなる。一部の実施形態では、トランスポザーゼに融合したポリペプチドドメインは、ＳＵＭＯタグおよびＳＴＲＥＰタグなど、下記の実施例１で例示するような２つ以上のタグを含む。用語「精製タグ」にはまた、実質的に同一の精製タグ多様体が含まれる。本明細書で用いる場合、「実質的に同一の多様体」は、精製タグの誘導体または断片を意味し、これは元の精製タグと比較し、（例えば、アミノ酸の置換、削除、または挿入を介して）修正されているが、精製タグを特異的に認識する部分に特異的に結合するという精製タグの特性は保持する。
【００９０】
一部の実施形態では、トランスポザーゼに融合するポリペプチドドメインは発現タグを含む。本明細書で用いる場合、用語「発現タグ」は、第２ポリペプチドに付着することが可能で、対象の組み換えポリペプチドの可溶性、安定性、および／または発現をサポートするとされる、任意のペプチドまたはポリペプチドを意味する。例示的発現タグには、Ｆｃ−タグおよびＳＵＭＯ−タグが含まれる。原則として、任意のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は発現タグとして用いることが可能である。
【００９１】
例えば、細胞単離および培養についての（例えば、後続核酸単離についての）他の有用な参考文献には、Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York、ならびに、そこで言及された参考文献；Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, N.Y.；Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)、およびAtlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, Flaが含まれる。
【００９２】
本明細書で開示する組み換えトランスポザーゼをコードする核酸はまた、本明細書で提示する実施形態の特徴である。特定のアミノ酸を多数のコドンによりコードすることが可能であり、ある翻訳系（例えば、原核細胞または真核細胞）はしばしばコドンバイアスを呈し、例えば、異なる有機体はしばしば、同一のアミノ酸をコードするいくつかの同義語コドンのうち一つを好む。このように、本明細書で提示する核酸は任意で「コドン最適化」されており、これは、トランスポザーゼを発現するのに用いられる特定の翻訳系に好まれるコドンを含むように核酸を合成することを意味する。例えば、細菌細胞において（または、細菌の特定株であっても）トランスポザーゼを発現することが望ましい場合、トランスポザーゼの効率的な発現のために、該細菌細胞のゲノムに最も多く見受けられるコドンを含むように核酸を合成することが可能である。真核細胞においてトランスポザーゼを発現することが望ましい場合、同様の手法を用いることができ、例えば、核酸は該真核細胞に好まれるコドンを含むことが可能である。
【００９３】
種々のタンパク質の単離方法および検出方法は既知であり、例えば、本明細書で提示する組み換えトランスポザーゼを発現する細胞の組み換え培養物から、トランスポザーゼを単離するために用いることが可能である。種々のタンパク質単離方法および検出方法は、当技術分野では周知であり、例えば、以下に記載のものを含む：R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982)；Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y. (1990)；Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.；Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2.sup.nd Edition Wiley-Liss, NY；Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England；Harris and Angal Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England；Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3.sup.rd Edition Springer Verlag, NY；Janson and Ryden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY；およびWalker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ；ならびにそこに引用される参考文献。タンパク質の精製方法および検出方法に関する更なる詳細は、Satinder Ahuja ed., Handbook of Bioseparations, Academic Press (2000)に見られる。
【００９４】
使用方法
本明細書で提示する改変トランスポザーゼは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転移技法などの配列決定手順において用いることが可能である。簡潔に言うと、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転移は、トランスポソーム複合体と標的ＤＮＡを接触させることにより開始することが可能である。本開示のトランスポザーゼとともに用いるのに容易に適応させることが可能な例示的な転移手順および系は、例えば、国際公開第１０／０４８６０５；米国特許出願公開第２０１２／０３０１９２５号明細書；同第２０１３／０１４３７７４号明細書に記載されており、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００９５】
例えば、一部の実施形態では、（例えば、次世代配列決定または増幅のテンプレートとして用いるために）対象の任意のｄｓＤＮＡを含む標的ＤＮＡからタグ付きＤＮＡ断片のライブラリを精製する方法において、本明細書で提示するトランスポザーゼ酵素を用いることが可能であり、該方法は、少なくとも一つのトランスポザーゼと該トランスポザーゼが転移複合体を共に形成するトランスポゾン端組成物とを用いて、標的ＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ転移反応でインキュベーションするステップであって、該トランスポゾン端組成物は、標的ＤＮＡへの多数の挿入が起きる条件および十分な時間において、（ｉ）移動トランスポゾン端配列、および、任意で、該移動トランスポゾン端配列の追加配列５’−を呈する移動鎖と、（ｉｉ）移動トランスポゾン端配列と相補的な配列を呈す非移動鎖とを含み、それぞれは、移動鎖を含む、または移動鎖からなる第１タグを、標的ＤＮＡにおいてヌクレオチドの５’端につなぎ合わせ、それにより標的ＤＮＡの断片化とアニールした５’タグ付きＤＮＡ断片集団の生成をもたらし、該集団はそれぞれが５’端に第１タグを有する、ステップと、その後、５’タグ付きＤＮＡ断片の３’端を第１タグまたは第２タグにつなぎ合わせ、それによりタグ付きＤＮＡ断片の、（例えば、タグ付き環状ｓｓＤＮＡ断片または５’タグ付きおよび３’タグ付きのＤＮＡ断片（つまり、「２つタグ付けされたＤＮＡ断片」）の何れかを含む）ライブラリを生成するステップと、を含む。
【００９６】
一部の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転移反応で用いる、トランスポザーゼおよびトランスポゾン端組成物の量またはトランスポソーム組成物の量は、５０マイクロリットル反応につき５０ナノグラムの標的ＤＮＡに対し約１ピコモル〜約２５ピコモルである。本発明の任意の方法の一部の好適な実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転移反応で用いるトランスポザーゼおよびトランスポゾン端組成物の量またはトランスポソーム組成物の量は、５０マイクロリットル反応につき５０ナノグラムの標的ＤＮＡに対し約５ピコモル〜約５０ピコモルである。トランスポザーゼが過活動Ｔｎ５トランスポザーゼであって、トランスポゾン端組成物がＭＥＤＳトランスポゾン端組成物を含むか、または、トランスポソーム組成物が前記過活動Ｔｎ５トランスポザーゼと、ＭＥＤＳトランスポゾン端を備えるトランスポゾン端組成物とを含む、本発明の何れかの方法の一部の好適な実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転移反応で用いる前記トランスポザーゼおよびトランスポゾン端組成物の量または前記トランスポソーム組成物の量は、５０マイクロリットル反応につき５０ナノグラムの標的ＤＮＡに対し約５ピコモル〜約２５ピコモルである。トランスポザーゼが過活動Ｔｎ５トランスポザーゼまたはＭｕＡトランスポザーゼである、本発明の何れかの方法の一部の好適な実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転移反応で用いる、トランスポザーゼおよびトランスポゾン端組成物の最終濃度またはトランスポソーム組成物の最終濃度は、少なくとも２５０ｎＭであり；一部の他の実施形態では、過活動Ｔｎ５トランスポザーゼまたはＭｕＡトランスポザーゼの最終濃度、および、その各々のトランスポゾン端組成物またはトランスポソーム組成物の最終濃度は、少なくとも５００ｎＭである。
【００９７】
一部の実施形態では、本発明は、エクソーム配列決定のためにゲノムＤＮＡライブラリを調製し濃縮する方法を提供する。様々な実施形態において、本発明の方法は、ゲノムライブラリの調製のために、改変Ｔｎ５トランスポザーゼ、例えば、ＴＳ−Ｔｎ５０５９を用いる。一実施形態では、本発明の方法は、改変トランスポザーゼ、例えば、ＴＳ−ＴＮ５０５９の縮小挿入配列バイアスによって引き起こされる、縮小バイアスを有するゲノムライブラリの調製を可能にする。ＴＳ−Ｔｎ５０５９を用いたゲノムＤＮＡのタグメント化は、広いＧＣ／ＡＴ範囲にわたり、ゲノムのより完全なカバレッジをもたらす。
【００９８】
別の実施形態では、本発明は、ＤＮＡインプット許容差が拡大した改変トランスポザーゼを用いたゲノムライブラリの調製方法を提供する。ＴＳ−Ｔｎ５０５９を用いたゲノムＤＮＡのタグメント化は、ある範囲のＤＮＡインプット量にわたって均一な挿入サイズをもたらす。一部の実施形態では、本発明はエクソーム配列決定方法を提供する。
【００９９】
タグメント化反応条件
本明細書では、タグメント化反応用の、反応条件およびバッファを提示する。一部の実施形態では、二価カチオンをタグメント化反応バッファに含む。特定の実施形態では、二価カチオンは、例えば、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｄ２＋、またはＣａ２＋とすることが可能である。二価カチオンは、塩化物塩といった任意の適切な塩の形態で、例えば、ＣｏＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、酢酸マグネシウム、ＣｄＣｌ２、またはＣａＣｌ２として含めることが可能である。特定の実施形態では、下記の実施例で例示するようにタグメント化バッファはＣｏＣｌ２を含む。実施例５の実験証拠により示すように、タグメント化バッファ配合におけるＣｏＣｌ２の追加は、驚くべきことにタグメント化中の配列バイアスを改善する。
【０１００】
ある実施形態では、タグメント化バッファは、ある濃度の二価カチオン、つまり、およそ、０．０１ｍＭ、０．０２ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、８ｍＭ、１０ｍＭ、１２ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、もしくはそれ以上の濃度の二価カチオン、または、これらのうち任意の値の間の範囲にある濃度の二価カチオン、例えば、０．０１ｍＭ〜０．０５ｍＭ、０．０２ｍＭ〜０．５ｍＭ、８ｍＭ〜１２ｍＭ等の二価カチオンを有することができる。一部の実施形態では、タグメント化バッファは、ある濃度のＣｏＣｌ２、つまり、およそ、０．０１ｍＭ、０．０２ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、８ｍＭ、１０ｍＭ、１２ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、もしくはそれ以上の濃度のＣｏＣｌ２、または、これらのうち任意の値の間の範囲にある濃度の二価カチオン、例えば、０．０１ｍＭ〜０．０５ｍＭ、０．０２ｍＭ〜０．５ｍＭ、８ｍＭ〜１２ｍＭ等の濃度の二価カチオンを有することができる。一部の実施形態では、タグメント化バッファは、ある濃度のＭｎＣｌ２、つまり、およそ、０．０１ｍＭ、０．０２ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、８ｍＭ、１０ｍＭ、１２ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、もしくはそれ以上の濃度のＭｎＣｌ２、または、これらのうち任意の値の間の範囲にある濃度の二価カチオン、例えば、０．０１ｍＭ〜０．０５ｍＭ、０．０２ｍＭ〜０．５ｍＭ、８ｍＭ〜１２ｍＭ等の濃度の二価カチオンを有することができる。一部の実施形態では、タグメント化バッファは、ある濃度のＭｇＣｌ２、つまり、およそ、０．０１ｍＭ、０．０２ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、８ｍＭ、１０ｍＭ、１２ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、もしくはそれ以上の濃度のＭｇＣｌ２、または、これらのうち任意の値の間の範囲にある濃度の二価カチオン、例えば、０．０１ｍＭ〜０．０５ｍＭ、０．０２ｍＭ〜０．５ｍＭ、８ｍＭ〜１２ｍＭ等の濃度の二価カチオンを有することができる。一部の実施形態では、タグメント化バッファは、ある濃度のＣｄＣｌ２、つまり、およそ、０．０１ｍＭ、０．０２ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、８ｍＭ、１０ｍＭ、１２ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、もしくはそれ以上の濃度のＣｄＣｌ２、または、これらのうち任意の値の間の範囲にある濃度の二価カチオン、例えば、０．０１ｍＭ〜０．０５ｍＭ、０．０２ｍＭ〜０．５ｍＭ、８ｍＭ〜１２ｍＭ等の濃度の二価カチオンを有することができる。一部の実施形態では、タグメント化バッファは、ある濃度のＣａＣｌ２、つまり、およそ、０．０１ｍＭ、０．０２ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、８ｍＭ、１０ｍＭ、１２ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、もしくはそれ以上の濃度のＣａＣｌ２、または、これらのうち任意の値の間の範囲にある濃度の二価カチオン、例えば、０．０１ｍＭ〜０．０５ｍＭ、０．０２ｍＭ〜０．５ｍＭ、８ｍＭ〜１２ｍＭ等の濃度の二価カチオンを有することができる。
【０１０１】
一部の実施形態では、トランスポザーゼまたはタグメント化反応によるゲノムＤＮＡの断片化は、２５℃〜７０℃、３７℃〜６５℃、５０℃〜６５℃、または５０℃〜６０℃の温度範囲で実行することが可能である。一部の実施形態では、トランスポザーゼまたはタグメント化反応によるゲノムＤＮＡ断片化は、３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、または６５℃で実行することが可能である。
【０１０２】
改変トランスポザーゼをコードする核酸
本明細書ではさらに、本明細書で提示する改変トランスポザーゼ酵素をコードする核酸分子を提示する。トランスポザーゼの変異バージョンである任意の所定改変トランスポザーゼであって、該改変トランスポザーゼのアミノ酸配列と、好適には、該トランスポザーゼをコードする野生型ヌクレオチド配列も既知である、改変トランスポザーゼについては、分子生物学の基本原則に従って変異をコードするヌクレオチド配列を得ることが可能である。例えば、Ｔｎ５トランスポザーゼをコードする野生型ヌクレオチド配列が既知である場合、１つまたは複数のアミノ酸置換を有する、Ｔｎ５の任意の所定変異バージョンをコードするヌクレオチド配列を、標準遺伝子コードを用いて推定することが可能である。同様に、ヌクレオチド配列は、他のトランスポザーゼの変異バージョンについても容易に導き出すことが可能である。その後、必要なヌクレオチド配列を有する核酸分子を、当技術分野で既知の標準分子生物学を用いて構築することができる。
【０１０３】
本明細書で提示する実施形態によると、定義した核酸は、同一の核酸だけでなく、任意のマイナーな塩基バリエーションも含み、特に、保存アミノ酸置換にある縮重コードに従って同義語コドン（同一のアミノ酸残基を特定する異なるコドン）をもたらす場合、置換を含む。用語「核酸配列」には、塩基バリエーションに関して与えられる任意の単一鎖配列に対し、相補的な配列も含まれる。
【０１０４】
本明細書に記載の核酸分子はまた、有利には、適切な発現ベクターに含まれ、そこからコードされるトランスポザーゼタンパク質を、適切な宿主において発現することができる。クローン化ＤＮＡを、前記細胞をその後形質転換し、そして、形質転換された細胞をその後選択するために適切な発現ベクターに組み込むことは、当業者にとって周知であり、これはSambrook et al. (1989), Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory（これはその全体が参照により組み込まれる）で提示されている。
【０１０５】
このような発現ベクターには、前記ＤＮＡ断片の発現に影響を及ぼすことが可能な、プロモーター領域などの調節配列に操作可能に連結する、本明細書に提示の実施形態に記載の核酸を有するベクターが含まれる。用語「操作可能に連結する」とは並列を意味し、ここでは記載した構成要素が、意図したやり方で機能することができる関係にある。このようなベクターを適切な宿主細胞に形質転換して、本明細書に提示の実施形態に記載のタンパク質を発現させることができる。
【０１０６】
核酸分子は、成熟タンパク質、または、プレタンパク質にリーダー配列をコードし、その後宿主細胞により切断され成熟タンパク質を形成するものを含む、プロ配列を有するタンパク質をコードすることができる。ベクターは、例えば、複製起点とともに提供されるプラスミドベクター、ウイルスベクター、またはファージベクター、および、任意で、前記ヌクレオチドの発現用プロモーター、および、任意で、該プロモーターの調節因子とすることができる。ベクターは、例えば抗生物質耐性遺伝子などの１つまたは複数の選択可能なマーカーを含むことができる。
【０１０７】
発現に必要な調節エレメントには、ＲＮＡポリメラーゼを結合し、リボソーム結合のために転写開始配列と翻訳開始配列の適切なレベルを指示する、プロモーター配列が含まれる。例えば、細菌発現ベクターには、ｌａｃプロモーターなどのプロモーター、ならびに、翻訳を開始するためのシャイン・ダルガノ配列および開始コドンＡＵＧが含まれ得る。同様に、真核発現ベクターには、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ用の異種または相同のプロモーター、下流ポリアデニレーションシグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボソームを分離するための停止コドンが含まれ得る。このようなベクターは、商業的に得るか、または、当技術分野で周知の方法により、記載される配列から組み立てることができる。
【０１０８】
高等真核生物による、トランスポザーゼをコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクターに含めることにより最適化することができる。エンハンサーは、ＤＮＡのｃｉｓ作用エレメントであり、これは、プロモーターに影響を与えて転写レベルを上げる。ベクターは、概して、選択可能なマーカーに加え、複製起点も含むだろう。
【実施例】
【０１０９】
（実施例１）
アッセイ法および条件の概略
以下の段落に下記に提示する実施例で用いるアッセイ条件の概略を記載する。
【０１１０】
ヒトｇＤＮＡにおいてＷＧＳに対しＴＮ５を用いたタグメント化
このセクションでは、トランスポザーゼの挿入バイアスをモニタリングするために、下記の実施例で用いるタグメント化アッセイについて記載する。簡潔に言うと、５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡを、１０ｍＭＴｒｉｓ酢酸、ｐＨ７．６、２５ｍＭ酢酸マグネシウムにおいて、５μＬのＴＤＥ１と共に５分間５５℃でインキュベーションした。その後、１２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ２の反応体積の１／５を加え、続いて、Ｔｎ５トランスポソームを１００ｎＭまで加え、６０分間３０℃でインキュベーションした。反応物はその後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＮｅｘｔｅｒａ手順に記載されているように浄化および増幅し、ＨｉＳｅｑ２０００機器を用いた配列決定向けに提出した。
【０１１１】
Ｔｎ５トランスポソームアセンブリ
Ｔｎ５を、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、１２５ｍＭのＫＣｌ、１８．７５ｍＭのＮａＣｌ、０．３７５ｍＭのＥＤＴＡ、３１．７５％のグリセロールにおいて、３０分間室温で、アニール化トランスポゾンと共に２０μＭまでインキュベーションした。
【０１１２】
トランスポゾンアセンブリ
トランスポゾンを、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡにおいて、反応物を９４℃まで加熱し、それをゆっくりと室温まで冷却することにより、４０μＭまで別々にアニールした。Ｔｎ５−ＭＥ−Ａでは、Ｔｎ５モザイク端配列Ａ１４（Ｔｎ５ＭＥＡ）をＴｎ５非移動配列（ＮＴＳ）にアニールし、Ｔｎ５−ＭＥ−Ｂでは、Ｔｎ５端配列Ｂ１５（Ｔｎ５ＭＥＢ）をＴｎ５非移動配列（ＮＴＳ）にアニールした。これらの配列を以下に示す。
Tn5MEA: 5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’
Tn5MEB: 5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3’
Tn5 NTS: 5’- CTGTCTCTTATACACATCT-3’
【０１１３】
２．トランスポザーゼのクローニングおよび発現
このセクションでは、下記の実施例で用いる様々なトランスポザーゼ変異体のクローニングおよび発現で用いるアプローチについて記載する。
【０１１４】
突然変異誘発を、標準の部位特異的突然変異誘発方法論を用い、トランスポザーゼに対しバックボーン遺伝子配列をコードする遺伝子において実行した。作成した各変異について、クローン遺伝子配列を配列決定することにより、変異遺伝子の適切な配列を確かめた。
【０１１５】
Ｔｎ５トランスポザーゼ遺伝子を修正ｐＥＴ１１ａプラスミドにクローン化した。修正プラスミドは、ｐＡＳＫ５ｐｌｕｓに由来する精製タグＳｔｒｅｐＴａｇ−ＩＩと、ｐＥＴ−ＳＵＭＯに由来するＳＵＭＯとを含んだ。発現をＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＹコンピテント細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて実行した。細胞を２５℃で０．５ＯＤ６００ｎｍまで成長させ、その後、１００μＭのＩＰＴＧを用いて誘導した。発現を１８℃で１９時間実行した。細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤の存在下で、１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡにおいて、ミクロ流動化剤を用いて溶解した。溶解後、細胞溶解物を、デオキシコール酸を用いて最終濃度が０．１％になるまで３０分間インキュベーションした。３００００ｘｇで２０分間遠心分離する前に、ポリエチレンイミンを０．５％まで加えた。上清を集め、同量の飽和硫酸アンモニウム溶液と混ぜ、その後、氷の上で少なくとも１時間撹拌した。溶液をその後２０分間３００００ｘｇで遠心分離し、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、および１ｍＭのＤＴＴにおいてペレットを再懸濁した。再懸濁し、ろ過した溶液を、その後、ＡＫＴＡ精製システムを用いてＳｔｒｅｐｔａｃｔｉｎカラムに適応した。カラムを、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、４ＭのＮａＣｌで洗浄し、その後１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１００ｍＭのＮａＣｌで洗浄した。溶出を、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１００ｍＭのＮａＣｌ、および５ｍＭ デスチオビオチンを用いて実行した。溶出物を、１００ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、および２ｍＭのＤＴＴを用いて、ヘパリントラップカラム（ｈｅｐａｒｉｎ ｔｒａｐ ｃｏｌｕｍｎ）に乗せた。同じバッファを用いて洗浄した後、Ｔｎ５多様体を、１００ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ ７．５、１ＭのＮａＣｌ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、および２ｍＭのＤＴＴを用いて、塩勾配で溶出した。画分を集め、プールし、濃縮化し、そして、グリセロールを加え、−２０℃での長期保存の前に５０％最終濃度を生成した。
【０１１６】
３．大腸菌ゲノムＤＮＡにおける挿入バイアスのＩＶＣ分析
挿入配列バイアスの分析を、ＩＶＣ−プロットデータ（強度対サイクル）を用いて実行した。このデータは、各ＤＮＡトランスポザーゼを用いて生成したＤＮＡライブラリを配列決定した後に、利用可能に生成した。簡潔に言うと、突然変異誘発および発現を上記のように実行した。トランスポザーゼを上記のトランスポゾンＡおよびトランスポゾンＢを用いてインキュベーションし、大腸菌ゲノムＤＮＡと共にインキュベーションして、ＤＮＡライブラリを生成した。各ライブラリを、製造業者の指示書に従い、ＭｉＳｅｑ Ｆａｓｔ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、カリフォルニア州、サンディエゴ）を行うＩｌｌｕｍｉｎａ社のＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒにおいて、少なくとも３５サイクルほど配列決定した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＲＴＡ ソフトウェアを用いて、各サイクルでベースコール（ｂａｓｅ ｃａｌｌ）と強度値を生成した。ＩＶＣプロットを生成するため、配列決定リードを大腸菌参照ゲノムに位置合わせし、各サイクルで４つの塩基それぞれの強度（発生）を、位置合わせした全ての配列決定リードの全強度値の画分としてプロットした。
【０１１７】
（実施例２）
挿入バイアスに対するＴｎ５トランスポザーゼ変異の特定
この実施例は、ＩＶＣ−プロットデータ（強度対サイクル）を用いた挿入配列バイアスの分析について記載する。このデータは、各ＤＮＡトランスポザーゼを用いて生成したＤＮＡライブラリを配列決定した後に利用可能となった。この分析は、安定した結果をもたらすのにいくらかの配列決定リード（２０ｋ〜４０ｋ）のみを必要とし、各Ｔｎ５トランスポザーゼ多様体を発現するのに用いる大腸菌細胞溶解物で実行することが可能で、ＨＴＳ（ハイスループットスクリーニング）目的に適っていた。
【０１１８】
様々な単一アミノ酸置換Ｔｎ５多様体についての代表的な結果を、図２〜７に記載する。図示する多様体は、例えば、位置２４８での置換による対称性の喪失（図２）、位置１１９での置換によるＩＶＣプロットの平坦化（図３）、位置１２５での置換または位置２４８の後ろへの挿入による、ＩＶＣプロット後半におけるＩＶＣの縮小（図４、５）、および、位置Ｋ１２０で異なる芳香族アミノ酸を使用することによる、９ｂｐから１０ｂｐへの複製の増加（図６、対称性が１および９番目のｂｐから１および１０番目のｂｐへ変化することを示す）を示す。これらの結果は、特定の変異が、ｗｔ対照と比較し、改善した挿入バイアスをもたらすことを示す。
【０１１９】
（実施例３）
細菌ｇＤＮＡにおける全ゲノム配列決定
これらの実験は、ａ）推定ライブラリサイズ／多様性およびｂ）ＡＴ／ＧＣ−ドロップアウトについて、様々なトランスポザーゼ変異体を比較するために行った。これらの実験は、精製し、アクティビティを正規化したＴｎ５トランスポザーゼ多様体を用いて行った。これらの実験は、５００ｋ〜１Ｍの配列決定リード／実験を必要とする。
【０１２０】
示した精製Ｔｎ５トランスポザーゼ多様体を用いてセレウス菌ｇＤＮＡにおいてタグメント化を実行することにより、結果を得た。酵素をアクティビティにより正規化し、Ｎｅｘｔｅｒａ（登録商標）キットと共に販売されている商業ＴＤＥ１酵素のアクティビティに合うように設定した。
【０１２１】
Ｔｎ５００１として示す変異体は配列番号１１と同じアミノ酸配列を有し、「ｗｔ」対照の役割をする。上記表で示すように、Ｔｎ５０５８、Ｔｎ５０５９、およびＴｎ５０６１として示す変異体は、それぞれ配列番号１８、１９、および２０と同じアミノ酸配列を有する。実験は三回行い、データは、集めたデータの平均と標準偏差を示す。「推定ライブラリサイズ」は、最適複製を用いることなしに計算し、再現可能な結果をもたらす。
【０１２２】
図８Ａに示すように、ＧＣ−ドロップアウトは低く維持するのに対し、Ｔｎ５０５８およびＴｎ５０５９のＡＴ−ドロップアウトは、Ｔｎ５００１と比較し顕著に減少する。同様に、図８Ｂに示すように、ライブラリサイズは１．７ｘ（Ｔｎ５０５８）および２．２ｘ（Ｔｎ５０５９）と、著しく増加する。これらの結果は、変異体Ｔｎ５０５８および変異体Ｔｎ５０５９は、野生型トランスポザーゼと比較し、配列挿入バイアスを大きく改善することを示し、下記の実施例４で記載するさらなる実験につながる。
【０１２３】
（実施例４）
ヒトｇＤＮＡについてのＮｅｘｔｅｒａ Ｒａｐｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ実験
以下の実験を、実施例３で上記したものと同じ、精製し、アクティビティを正規化したＴｎ５トランスポザーゼ多様体を用いて行った。これらの実験は、典型的には４０Ｍ〜１００Ｍの配列決定リード／実験を必要とし、配列決定データを分析して、ａ）多様性、ｂ）濃縮、ｃ）カバレッジ、ｄ）カバレッジ均一性、ｅ）ペナルティスコアを比較した。
【０１２４】
Ｎｅｘｔｅｒａ Ｒａｐｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｅｘｏｍｅ （Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）） ＣＥＸのプールキャプチャプローブ（ｐｏｏｌ ｃａｐｔｕｒｅ ｐｒｏｂｅｓ）を製造業者の指示書に従って用い、キャプチャを三重に実行した。図９Ａに示すように、示した変異体は、ｗｔ対照Ｔｎ５００１と比較し、カバレッジ均一性において顕著な改善をもたらした。さらに、図９Ｂに示すように、平均標的カバレッジはより低いにも関わらず、標的カバレッジについて１０ｘおよび２０ｘでテストした変異体により、統計的に著しい改善がもたらされた。
【０１２５】
図１０Ａに示すように、示した変異体は、固有リード数およびハイブリッド選択ライブラリサイズの増大をもたらした。同様に、図１０Ｂに示すように、変異体は、Ｔｎ５００１と比較してより低いペナルティスコアをもたらし、これは、カバレッジ深さが１０x、２０x、または３０xに到達するのに必要な、倍強い配列決定である。これらの結果は、テストした変異体が、対照と比較し、より優れた挿入バイアスおよびより均一なカバレッジをもたらすことを示す。
【０１２６】
（実施例５）
Ｔｎ５アクティビティに対するタグメント化バッファ組成物の効果
以下の実験を行い、ライブラリアウトプットおよび配列決定測定基準に対する、Ｔｎ５タグメント化バッファ組成物の効果および反応条件を特徴付けた。
【０１２７】
ライブラリアウトプットおよび配列決定測定基準に対する、Ｔｎ５タグメント化バッファ組成物の効果および反応条件を評価するため、Ｔｎ５タグメント化ＤＮＡライブラリを、セレウス菌ゲノムＤＮＡを用いて構築した。２つの異なるＴｎ５トランスポザーゼを、タグメント化ライブラリ、つまり変異Ｔｎ５（「ＴＳ−Ｔｎ５０５９」）および対照過活動Ｔｎ５（「ＴＳ−Ｔｎ５」）の構築のために用いた。Ｔｓは融合タグであり、これはＴｎ５およびＴｎ５０５９のタンパク質の精製のために用いる。Ｔｎ５０５９は、過活動Ｔｎ５アミノ酸配列（配列番号１１）に関し、４つの追加変異体、Ｋ２１２Ｒ、Ｐ２１４Ｒ、Ｇ２５１Ｒ、およびＡ３３８Ｖを有する。ＴＳ−Ｔｎ５０５９は、Ｔｎ５０５９のＮ末端にＴＳタグを含む。一部の実施形態では、ＴＳ−タグのＣ末端は、リンカーによりＴｎ５０５９のＮ末端に融合することができ、これは、第１メチオニン残基を置換する。一部の実施形態では、リンカーはＧｌｙ−Ｔｈｒである。
【０１２８】
ＴＳ−Ｔｎ５０５９を１０、４０、および８０ｎＭの最終濃度で用いた。ＴＳ−Ｔｎ５を、４、１５、および３０ｎＭの最終濃度で用いた。ＴＳ−Ｔｎ５０５９およびＴＳ−Ｔｎ５に対する酵素濃度を（標準バッファ配合を用いて）正規化し、ほぼ同じレベルのタグメント化アクティビティを提供した。つまり、１０、４０、および８０ｎＭのＴＳ−Ｔｎ５０５９は、４、１５、および３０ｎＭのＴｎ５とそれぞれほぼ同じレベルのアクティビティを有する。各タグメント化ライブラリを、２５ｎｇのセレウス菌ゲノムＤＮＡインプットを用いて調製した。セレウス菌のゲノム内容量は約４０％のＧＣと約６０％のＡＴである。
【０１２９】
タグメント化バッファを２ｘ配合で調製した。２ｘ配合とは以下である：標準バッファ（ＴＤ;２０ｍＭのＴｒｉｓ酢酸、ｐＨ７．６、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、および２０％ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ））；コバルトバッファ（Ｃｏ；２０ｍＭのＴｒｉｓ酢酸、ｐＨ７．６、および２０ｍＭのＣｏＣｌ２）；コバルト＋ＤＭＳＯバッファ（Ｃｏ−ＤＭＳＯ；２０ｍＭのＴｒｉｓ酢酸、ｐＨ７．６、２０ｍＭのＣｏＣｌ２、および２０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））；高分子量バッファ（ＨＭＷ；２０ｍＭのＴｒｉｓ酢酸、ｐＨ７．６、および１０ｍＭの酢酸マグネシウム）；ＮＦ２バッファ（ＮＦ２；２０ｍＭのＴｒｉｓ酢酸、ｐＨ７．６、２０ｍＭのＣｏＣｌ２、および２０％ＤＭＦ）。ＣｏＣｌ２を含むタグメント化バッファは、毎日新しく調製した。各ライブラリについて、５０μＬの総反応体積中で、２０μＬのセレウス菌ゲノムＤＮＡ（２５ｎｇ）、２５μＬの２ｘタグメント化バッファ、および５μＬの酵素（１０ｘ Ｔｓ−Ｔｎ５０５９または１０ｘ Ｔｓ−Ｔｎ５）を混ぜることにより、タグメント化反応を行った。反応物を５５℃で５分間インキュベーションした。タグメント化反応に続き、サンプルを標準Ｎｅｘｔｅｒａ（登録商標）サンプル調製プロトコルに従って処理した。ライブラリを、ＭｉＳｅｑ装置において、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＳＢＳ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）化学反応を用いて配列決定した。配列決定ランは、Ｖ２ ＭｉＳｅｑキットを用いて２ｘ７１サイクルだった。各ライブラリにおける断片サイズ分布は、配列決定ランはＶ２ＭｉＳｅｑキットを用いて２ｘ７１サイクルだった。各ライブラリの断片サイズ分布は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで評価した。
【０１３０】
図１１は、異なるタグメント化バッファを用いて調製した、ＴＳ−Ｔｎ５０５９およびＴＳ−Ｔｎ５のタグメント化ＤＮＡライブラリにおける固有分子数についての棒グラフ１００を示す。ライブラリ中の固有分子数は、ライブラリの多様性（複雑性）の表れである。グラフの各棒は、タグメント化ライブラリを表す。実験は３回繰り返した（ｎ＝３）。対照ライブラリ（つまり、標準タグメント化バッファを用いて調製したライブラリ）は、「酵素−酵素濃度−ＤＮＡインプット」により指定する。例えば、棒グラフ１００の１番目の棒は「ＴＳ−Ｔｎ５０５９−１０ｎＭ−２５ｎｇ」とラベル付けされるが、これは、標準バッファ配合において最終濃度が１０ｎＭのＴＳ−Ｔｎ５０５９と、２５ｎｇのインプットＤＮＡとを用いて調製した対照ライブラリを指定する。修正タグメント化バッファ配合を用いて調製したライブラリは、「酵素−酵素濃度−バッファ添加物−ＤＮＡインプット」により指定する。例えば、棒グラフ１００の４番目の棒は「ＴＳ−Ｔｎ５０５９−１０ｎＭ−Ｃｏ−２５ｎｇ」とラベル付され、これは、１０ｍＭのＣｏＣｌ２を含む修正タグメント化バッファにおいて最終濃度が１０ｎＭのＴＳ−Ｔｎ５０５９を用いて調製したライブラリを指定する。データは、１０ｍＭのＣｏＣｌ２を含むタグメント化バッファ（つまり、Ｃｏバッファ、Ｃｏ−ＤＭＳＯバッファ、およびＮＦ２バッファ）を用いて調製した、ＴＳ−Ｔｎ５０５９およびＴＳ−Ｔｎ５のタグメント化ライブラリは、ＣｏＣｌ２の添加なしのバッファ（つまり、標準バッファまたはＨＭＷ）において調製したライブラリと比較し、平均多様性がより高い。
【０１３１】
図１２は、異なるタグメント化バッファを用いて調製した、ＴＳ−Ｔｎ５０５９およびＴＳ−Ｔｎ５のタグメント化ＤＮＡライブラリにおける、ＧＣドロップアウト率についての棒グラフ２００を示す。対照ライブラリおよび修正タグメント化バッファを用いて調製したライブラリは、図１１に記載するように指定する。ＧＣドロップアウトは、タグメント化ライブラリからドロップした（なくなった）、ゲノム中のＧＣリッチ領域の割合として定義することができる。データは、標準タグメント化バッファを用いて調製した、ＴＳ−Ｔｎ５０５９およびＴＳ−Ｔｎ５の対照ライブラリでは、ＧＣドロップアウト率が比較的低いことを示す。データはまた、１０ｍＭのＣｏＣｌ２を含むタグメント化バッファ（つまり、Ｃｏバッファ、Ｃｏ−ＤＭＳＯバッファ、およびＮＦ２バッファ）を用いて調製した、ＴＳ−Ｔｎ５０５９およびＴＳ−Ｔｎ５のタグメント化バッファは、ＣｏＣｌ２の添加なしのバッファ（つまり、標準バッファまたはＨＭＷ）で調製したライブラリと比較し、ＧＣドロップアウト率がより高い（つまり、最大約６％）ことを示す。Ｃｏ含有バッファを用いて調製したライブラリにおけるＧＣドロップアウトの増加は、ＴＳ−Ｔｎ５０５９およびＴＳ−Ｔｎ５の濃度の上昇により改善する。例えば、ＴＳ−Ｔｎ５０５９−１０ｎｍ−Ｃｏ−２５ｎｇライブラリにおけるＧＣドロップアウト率は、ＴＳ−Ｔｎ５０５９−１０ｎｍ−２５ｎｇ対照ライブラリと比較し、比較的高い。ＴＳ−Ｔｎ５０５９の濃度を４０ｎＭ（つまり、ＴＳ−Ｔｎ５０５９−４０ｎｍ−Ｃｏ−２５ｎｇ）および８０ｎＭ（つまり、ＴＳ−Ｔｎ５０５９−８０ｎｍ−Ｃｏ−２５ｎｇ）まで上昇させると、ＧＣドロップアウト率は低下する。
【０１３２】
図１３は、異なるタグメント化バッファを用いて調製したＴＳ−Ｔｎ５０５９およびＴＳ−Ｔｎ５のタグメント化ＤＮＡライブラリにおけるＡＴドロップアウト率についての棒グラフ３００を示す。対照ライブラリおよび修正タグメント化バッファを用いて調製したライブラリを、図１１に記載するように指定する。ＡＴドロップアウトは、タグメント化ライブラリからドロップした（なくなった）、ゲノム中のＡＴリッチ領域の割合として定義することができる。データは、標準タグメント化バッファを用いて調製した、ＴＳ−Ｔｎ５０５９およびＴＳ−Ｔｎ５の対照ライブラリでは、ある量のＡＴドロップアウト（つまり、それぞれ、約１％〜約３％、および約７％〜約３％）が観察されることを示す。データはまた、低濃度（つまり、１０ｎＭ）の酵素と１０ｍＭのＣｏＣｌ２を含むタグメント化バッファ（つまり、Ｃｏバッファ、Ｃｏ−ＤＭＳＯバッファ、およびＮＦ２バッファ）とを用いて調製したＴＳ−Ｔｎ５０５９タグメント化ライブラリは、ＣｏＣｌ２の添加なしのバッファ（つまり、標準バッファまたはＨＭＷ）において調製したライブラリと比較し、ＡＴドロップアウト率が低いことを示す。同様に、１０ｍＭのＣｏＣｌ２を含むタグメント化バッファ（つまり、Ｃｏバッファ、Ｃｏ−ＤＭＳＯバッファ、およびＮＦ２バッファ）を用いて調製したＴＳ−Ｔｎ５ライブラリは、ＣｏＣｌ２の添加のないバッファ（つまり、標準バッファまたはＨＭＷ）において調製したライブラリと比較し、ＡＴドロップアウト率はより低い。
【０１３３】
ここで図１２および１３を参照すると、タグメント化バッファにＣｏＣｌ２（１０ｎＭ）を添加すること（つまり、Ｃｏバッファ、Ｃｏ−ＤＭＳＯバッファ、およびＮＦ２バッファ）は、タグメント化ライブラリにおけるＧＣおよびＡＴのドロップアウト率を「フリップ（ｆｌｉｐ）」することができる。例えば、ＴＳ−Ｔｎ５０５９−１０ｎｍ−Ｃｏ−２５ｎｇライブラリにおけるＧＣドロップアウト率（図１２）は、ＴＳ−Ｔｎ５０５９−１０ｎｍ−２５ｎｇ対照ライブラリと比較し比較的高い。一方、ＴＳ−Ｔｎ５０５９−１０ｎｍ−Ｃｏ−２５ｎｇライブラリにおけるＡＴドロップアウト率（図１３）は、ＴＳ−Ｔｎ５０５９−１０ｎｍ−２５ｎｇ対照ライブラリと比較し、比較的低い（または、ない）。
【０１３４】
図１４は、標準バッファ（ＴＤ）配合およびコバルトバッファ（Ｃｏ）配合を用いて調製したＴＳ−Ｔｎ５０５９ライブラリにおける、断片サイズ分布についてのＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒトレースのプロット４００を示す。プロット４００は、Ｔｓ−Ｔｎ５０５９−１０ｎＭ−Ｃｏ−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線４１０、Ｔｓ−Ｔｎ５０５９−４０ｎＭ−Ｃｏ−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線４１５、Ｔｓ−Ｔｎ５０５９−８０ｎＭ−Ｃｏ−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線４２０、Ｔｓ−Ｔｎ５０５９−１０ｎＭ−ＴＤ−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線４２５、Ｔｓ−Ｔｎ５０５９−１０ｎＭ−ＴＤ−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線４３０、および、Ｔｓ−Ｔｎ５０５９−８０ｎＭ−ＴＤ−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線４３５を示す。プロット４００はまた、塩基対（ｂｐ）におけるＤＮＡ断片サイズの標準ラダー（ｓｔａｎｄａｒｄ ｌａｄｄｅｒ）である曲線４４０を示す。ラダー（左から右へ）における断片サイズを表２に示す。
【０１３５】
【表２】
0006490710.tif 000004
【０１３６】
データは、タグメント化反応で用いるＴＳ−Ｔｎ５０５９の濃度を１０ｎＭから４０ｎＭおよび８０ｎＭへ増加させることは、断片サイズ分布をより小さい断片サイズにシフトさせることを示す。断片サイズ分布のシフトは、標準バッファ（ＴＤ）配合を用いて調製したライブラリにおいてより顕著である。例えば、コバルトバッファ（Ｃｏ）配合を用いて調製したライブラリにおけるフラグメントサイズ分布は、１０ｎＭのＴＳ−Ｔｎ５０５９（曲線４１０）を用いて調製したライブラリでは約３０００ｂｐであり、４０ｎＭのＴＳ−Ｔｎ５０５９および８０ｎＭのＴＳ−Ｔｎ５０５９（それぞれ、曲線４１５および曲線４２０）を用いて調製したライブラリでは約１０００〜約２０００ｂｐである。標準バッファ（ＴＤ）配合および８０ｎＭのＴＳ−Ｔｎ５０５９（曲線４３５）を用いて調製したライブラリでは、断片サイズ分布は、約２００ｂｐ〜約１０００ｂｐである。
【０１３７】
図１５は、コバルト−ＤＭＳＯ（Ｃｏ−ＤＭＳＯ）、ＮＦ２、およびＨＭＷのバッファ配合を用いて調製したＴＳ−Ｔｎ５０５９における断片サイズ分布についての、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒトレースのプロット５００を示す。プロット５００は、Ｔｓ−Ｔｎ５０５９−１０ｎＭ−Ｃｏ−ＤＭＳＯ−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線５１０、Ｔｓ−Ｔｎ５０５９−１０ｎＭ−ＮＦ２−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線５１５、Ｔｓ−Ｔｎ５０５９−１０ｎＭ−ＨＭＷ−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線５２０、Ｔｓ−Ｔｎ５０５９−４０ｎＭ−Ｃｏ−ＤＭＳＯ−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線５２５、Ｔｓ−Ｔｎ５０５９−４０ｎＭ−ＮＦ２−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線５３０、Ｔｓ−Ｔｎ５０５９−４０ｎＭ−ＨＭＷ−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線５３５、Ｔｓ−Ｔｎ５０５９−８０ｎＭ−Ｃｏ−ＤＭＳＯ−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線５４０、Ｔｓ−Ｔｎ５０５９−８０ｎＭ−ＮＦ２−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線５４５、およびＴｓ−Ｔｎ５０５９−８０ｎＭ−ＨＭＷ−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線５５０を示す。プロット５００はまた、図１４のプロット４００の曲線４４０を示し、これは、塩基対（ｂｐ）単位のＤＮＡ断片サイズの標準ラダーである。
【０１３８】
データは、概して、タグメント化反応で用いるＴＳ−Ｔｎ５０５９の濃度を１０ｎＭから４０ｎＭおよび８０ｎＭへ増加させることは、断片サイズ分布をより小さい断片サイズにシフトさせることを示す。断片サイズ分布のシフトは、ＣｏＣｌ２を含まないＨＭＷバッファを用いて調製したライブラリ（例えば、曲線５２０および曲線５３５）において、Ｃｏ−ＤＭＳＯを用いて調製したライブラリ（例えば、曲線５１０および曲線５２５）と比較し、より顕著である。
【０１３９】
図１６は、標準バッファ配合（ＴＤ）およびコバルトバッファ（Ｃｏ）配合を用いて調製したＴＳ−Ｔｎ５ライブラリにおける断片サイズ分布についてのＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒトレースのプロット６００を示す。プロット６００は、Ｔｓ−Ｔｎ５−４ｎＭ−Ｃｏ−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線６１０、Ｔｓ−Ｔｎ５−１５ｎＭ−Ｃｏ−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線６１５、Ｔｓ−Ｔｎ５−３０ｎＭ−Ｃｏ−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線６２０、Ｔｓ−Ｔｎ５−４ｎＭ−ＴＤ−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線６２５、Ｔｓ−Ｔｎ５−１５ｎＭ−ＴＤ−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線６３０、および、Ｔｓ−Ｔｎ５−３０ｎＭ−ＴＤ−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線６３５を示す。プロット６００はまた、図１４のプロット４００の曲線４４０も示し、これは、塩基対（ｂｐ）単位のＤＮＡ断片サイズの標準ラダーである。
【０１４０】
データは、タグメント化反応において用いるＴＳ−Ｔｎ５の濃度を４ｎＭから１５ｎＭおよび３０ｎＭへ増加させることは、断片サイズ分布をより小さい断片サイズにシフトさせることを示す。断片サイズ分布におけるシフトは、標準バッファ（ＴＤ）配合を用いて調製したライブラリにおいてより顕著である。この観察結果は、図１４のＴＳ−Ｔｎ５０５９ライブラリでの断片サイズ分布と同様である。
【０１４１】
図１７は、コバルト−ＤＭＳＯ（Ｃｏ−ＤＭＳＯ）、ＮＦ２、およびＨＭＷのバッファ配合を用いて調製したＴＳ−Ｔｎ５ライブラリにおける断片サイズ分布についての、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒトレースのプロット７００を示す。プロット７００は、Ｔｓ−Ｔｎ５−４ｎＭ−Ｃｏ−ＤＭＳＯ−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線７１０、Ｔｓ−Ｔｎ５−４ｎＭ−ＮＦ２−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線７１５、Ｔｓ−Ｔｎ５−４ｎＭ−ＨＭＷ−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線７２０、Ｔｓ−Ｔｎ５−１５ｎＭ−Ｃｏ−ＤＭＳＯ−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線７２５、Ｔｓ−Ｔｎ５−１５ｎＭ−ＮＦ２−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線７３０、Ｔｓ−Ｔｎ５−１５ｎＭ−ＨＭＷ−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線７３５、Ｔｓ−Ｔｎ５−３０ｎＭ−Ｃｏ−ＤＭＳＯ−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線７４０、Ｔｓ−Ｔｎ５−３０ｎＭ−ＮＦ２−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線７４５、およびＴｓ−Ｔｎ５−３０ｎＭ−ＨＭＷ−２５ｎｇライブラリにおける断片サイズ分布の曲線である曲線７５０を示す。プロット７００はまた、図１４のプロット４００の曲線４００も示し、これは、塩基対（ｂｐ）単位のＤＮＡ断片サイズの標準ラダーである。
【０１４２】
データは、タグメント化反応において用いるＴＳ−Ｔｎ５の濃度を４ｎＭから１５ｎＭおよび３０ｎＭへ増加させることは、断片サイズ分布をより小さい断片サイズにシフトさせることを示す。断片サイズ分布におけるシフトは、標準バッファ（ＴＤ）配合を用いて調製したライブラリにおいてより顕著である。この観察結果は、図１５のＴＳ−Ｔｎ５０５９ライブラリにおける断片サイズ分布と同様である。
【０１４３】
概して、ここで図１４〜１７を参照すると、１０ｎＭのＣｏＣｌ２（例えば、Ｃｏバッファ、Ｃｏ−ＤＭＳＯバッファ、およびＮＦ２バッファ）を含むタグメント化バッファを用いて調製したＴｎ５０５９およびＴＳ−Ｔｎ５のライブラリにおける断片サイズは、ＣｏＣｌ２なしのタグメント化バッファ（つまり、ＴＤおよびＨＭＷバッファ）を用いて調製したＴＳ−Ｔｎ５０５９およびＴＳ−Ｔｎ５のライブラリよりも大きい。
【０１４４】
図１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｄはそれぞれ、ＴＳ−Ｔｎ５ライブラリにおける配列含有量のバイアスグラフ８００、ＴＳ−ＴＮ５−Ｃｏライブラリにおける配列含有量のバイアスグラフ８３０、ＴＳ−Ｔｎ５−Ｃｏ−ＤＭＳＯライブラリにおける配列含有量のバイアスグラフ８４０、およびＴＳ−Ｔｎ５−ＮＦ２ライブラリにおける配列含有量のバイアスグラフ８５０を示す。バイアスグラフ（つまり、強度対サイクル数（ＩＶＣ）のグラフ）は、ＳＢＳサイクル数の関数として、観察された塩基（Ａ，Ｃ，Ｇ、またはＴ）の比率をプロットし、タグメント化中にＴｎ５が有する好適配列コンテキストを示す。
【０１４５】
バイアスグラフ８００、８３０、８４０、および８５０はそれぞれ、サイクル数によるＡ含有量の曲線である曲線８１０、サイクル数によるＣ含有量の曲線である曲線８１５、サイクル数によるＧ含有量の曲線である曲線８２０、およびサイクル数によるＴ含有量の曲線である曲線８２５を示す。例えば、図１８ＡのＴＳ−ＴＮ５のライブラリにおいて、塩基Ｇを表す曲線８２０は、サイクル１で観察される塩基の約３８％がＧであることを示し；塩基Ｔを表す曲線８２５は、サイクル１で観察される塩基の約１５％がＴであることなどを示す。
【０１４６】
図１８Ａを参照すると、データは、Ｔｎ５配列バイアスが、標準タグメント化バッファ配合を用いて調製したＴＳ−Ｔｎ５ライブラリにおけるＳＢＳの、最初の１５サイクルあたりで観察されることを示す。約１５サイクル後、配列バイアスは徐々に縮小し、Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧの含有量は予想されるゲノム組成物を反映する。セレウス菌については、ゲノムは約４０％のＧＣと約６０％のＡＴであり、これはサイクル１６または１７あたりからサイクル３５までのバイアスグラフで表され、ここで、曲線８１０（つまり、Ａ）および曲線８２５（つまり、Ｔ）は約３０％（Ａ＋Ｔ〜６０％）に収束し；曲線８１５（つまり、Ｃ）および曲線８２０（つまり、Ｇ）は、約２０％（Ｃ＋Ｇ〜４０％）に収束する。
【０１４７】
図１８Ｂ、１８Ｃ、および１８Ｄを参照すると、データはまた、Ｔｎ５配列バイアスが、ＣｏＣｌ２を含んだタグメント化バッファを用いて調製したライブラリである、ＴＳ−Ｔｎ５−Ｃｏ、ＴＳ−Ｔｎ５−Ｃｏ−ＤＭＳＯ、およびＴｓ−Ｔｎ５−ＮＦ２のライブラリにおいて、ＳＢＳの最初の１５サイクルあたりで観察されることを示す。この場合もやはり、図１８Ａに関して記載したように、約１５サイクルより後で配列バイアスは徐々に縮小し、Ａ，Ｔ、Ｃ、およびＧの含有量は、予想されるゲノム組成物を反映する。しかしながら、ＴＳ−Ｔｎ５−Ｃｏ、ＴＳ−Ｔｎ５−Ｃｏ−ＤＭＳＯ、およびＴｓ−Ｔｎ５−ＮＦ２のライブラリでは、曲線８１０（つまり、Ａ）および曲線８２５（つまり、Ｔ）は、サイクル１０〜サイクル１５あたりで、予想されるゲノム組成物に向かってシフトし始め、曲線８１５（つまり、Ｃ）および曲線８２０（つまり、Ｇ）は、サイクル１０〜サイクル１５あたりで、予想されるゲノム組成物に向かってシフトし始める。加えて、サイクル２〜８の間のバイアスは、図１８Ａと比べた場合、縮小する。データは、タグメント化バッファ配合におけるＣｏＣｌ２の添加が、タグメント化中にＴｎ５配列を改善することを示す。
【０１４８】
図１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、および１９Ｄはそれぞれ、ＴＳ−Ｔｎ５０５９ライブラリにおける配列含有量のバイアスグラフ９００、ＴＳ−ＴＮ５０５９−Ｃｏライブラリにおける配列含有量のバイアスグラフ９３０、ＴＳ−Ｔｎ５０５９−Ｃｏ−ＤＭＳＯライブラリにおける配列含有量のバイアスグラフ９４０、およびＴＳ−Ｔｎ５０５９−ＮＦ２ライブラリにおける配列含有量のバイアスグラフ９５０を示す。バイアスグラフ９００、９３０、９４０、および９５０はそれぞれ、サイクル数によるＡ含有量の曲線である曲線９１０、サイクル数によるＣ含有量の曲線である曲線９１５、サイクル数によるＧ含有量の曲線である曲線９２０、および、サイクル数によるＴ含有量の曲線である曲線９２５を示す。
【０１４９】
図１９Ａを参照すると、データは、Ｔｎ５０５９配列バイアスが、ＴＳ−Ｔｎ５０５９タグメント化ライブラリにおいて、ＳＢＳの最初の１５サイクルあたりで観察されることを示す。約１５サイクルより後で配列バイアスは縮小し、Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧの含有量は、図１８Ａに関して記載したように、予想されるゲノム組成物を反映する。しかしながら、変異体Ｔｎ５０５９は、図１８Ａに示すＴｎ５配列バイアスと比較し、配列バイアスの縮小を示す。ＴＳ−Ｔｎ５０５９ライブラリでは、曲線９１０（つまり、Ａ）および曲線９２５（つまり、Ｔ）は、サイクル１０〜サイクル１５あたりで、予想されるゲノム組成物に向かってシフトし始め、曲線９１５（つまり、Ｃ）および曲線９２０（つまり、Ｇ）は、サイクル１０〜サイクル１５あたりで、予想されるゲノム組成物に向かってシフトし始める。
【０１５０】
図１９Ｂ、１９Ｃ、および１９Ｄを参照すると、データはまた、Ｔｎ５０５９配列バイアスが、ＣｏＣｌ２を含んだタグメント化バッファを用いて調製したライブラリである、ＴＳ−Ｔｎ５０５９−Ｃｏ、ＴＳ−Ｔｎ５０５９−Ｃｏ−ＤＭＳＯ、およびＴｓ−Ｔｎ５０５９−ＮＦ２のライブラリにおいて、ＳＢＳの最初の１５サイクルあたりで観察されることを示す。この場合もやはり、図１８Ａに関して記載したように、約１５サイクルより後で配列バイアスは徐々に縮小し、Ａ，Ｔ、Ｃ、およびＧの含有量は、予想されるゲノム組成物を反映する。しかしながら、ＴＳ−Ｔｎ５０５９−Ｃｏライブラリでは、曲線９１０（つまり、Ａ）および曲線９２５（つまり、Ｔ）は、サイクル５あたりで、予想されるゲノム組成物に向かってシフトし始め、曲線９１５（つまり、Ｃ）および曲線９２０（つまり、Ｇ）は、サイクル５あたりで、予想されるゲノム組成物に向かってシフトし始める。ＴＳ−Ｔｎ５０５９−Ｃｏ−ＤＭＳＯ、およびＴｓ−Ｔｎ５０５９−ＮＦ２のライブラリでは、曲線９１０（つまり、Ａ）および曲線９２５（つまり、Ｔ）は、サイクル５より前に、予想されるゲノム組成物に向かってシフトし始め、曲線９１５（つまり、Ｃ）および曲線９２０（つまり、Ｇ）は、サイクル５より前に、予想されるゲノム組成物に向かってシフトし始める。
【０１５１】
（実施例６）
Ｍｏｓ１アクティビティに対するタグメント化バッファ組成物の影響
以下の実験を行い、ライブラリアウトプットおよび配列決定測定基準に対する、Ｔｎ５タグメント化バッファ組成物の効果および反応条件を特徴付けた。
【０１５２】
Ｍｏｓ１タグメント化ＤＮＡライブラリを、セレウス菌ゲノムＤＮＡを用いて構築した。タグメント化ライブラリの構築で用いるＭｏｓ１トランスポザーゼは、ＭＢＰ−Ｍｏｓ１融合タンパク質だった。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）は融合タグであり、これはＭｏｓ１タンパク質の精製に用いる。ＭＢＰ−Ｍｏｓ１は、１００μＭという最終濃度で用いた。各タグメント化ライブラリは、５０ｎｇのセレウス菌ゲノムＤＮＡインプットを用いて調製した。
【０１５３】
タグメント化配合を２ｘ配合で調製した。２ｘ配合は以下の通りである：標準バッファ（ＴＤ；２０ｍＭのＴｒｉｓ酢酸、ｐＨ７．６、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、および２０％のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）；ＴＤ＋ＮａＣｌ（ＴＤ−ＮａＣｌ； ２０ｍＭのＴｒｉｓ酢酸、ｐＨ７．６、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、２０％のＤＭＦ、および２００ｍＭのＮａＣｌ）；高分子量バッファ（ＨＭＷ；２０ｍＭのＴｒｉｓ酢酸、ｐＨ７．６、および１０ｍの酢酸マグネシウム）；ＨＥＰＥＳ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、２０％のＤＭＦ）；ＨＥＰＥＳ−ＤＭＳＯ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、および２０％のＤＭＳＯ）；ＨＥＰＥＳ−ＤＭＳＯ−Ｃｏ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、２０％のＤＭＳＯ、および２０ｍＭのＣｏＣｌ２）；ならびに、ＨＥＰＥＳ−ＤＭＳＯ−Ｍｎ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、２０％のＤＭＳＯ、および２０ｍＭのマンガン（Ｍｎ））。ＣｏＣｌ２を含むタグメント化バッファは、毎日新しく調製した。
【０１５４】
各ライブラリについて、５０μＬの総反応体積中で、２０μＬのセレウス菌ゲノムＤＮＡ（５０ｎｇ）、２５μＬの２ｘタグメント化バッファ、および５μＬの酵素（１０ｘ ＭＢＰ−Ｍｏｓ１）を混ぜることにより、タグメント化反応を行った。反応物を３０℃で６０分間インキュベーションした。タグメント化反応に続き、サンプルを標準Ｎｅｘｔｅｒａ（登録商標）サンプル調製プロトコルに従って処理した。ライブラリを、ＭｉＳｅｑ装置において、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＳＢＳ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）化学反応を用いて配列決定した。配列決定ランは、２ｘ７１サイクルだった。
【０１５５】
図２０は、異なるタグメント化バッファを用いて調製した、ＭＢＰ−Ｍｏｓ１タグメント化ＤＮＡライブラリにおける平均総リード数および平均多様性についての棒グラフ１０００を示す。総リード数とは、フローセルからの総リード数である。多様性とは、ライブラリ中の固有分子数であり、ライブラリの複雑性の指標として用いる。グラフの棒の各対は、タグメント化ライブラリを表す。実験は３回繰り返した（ｎ＝３）。最初の２つのグラフ棒、ＥＺＴｎ５−ｓｔｄ−ｂｃｅｒｅｕｓおよびＮｅｘｔｅｒａＶ２−３０Ｃは、比較ライブラリであり、これはそれぞれ、Ｔｎ５および標準バッファ配合を用いて、５５℃および３０℃で調製した。タグメント化反応のためにＭＢＰ−Ｍｏｓ１を用いて調製したライブラリは、「酵素−酵素濃度−バッファ」により指定する。例えば、グラフ棒の３番目の対は「ＭＢＰＭｏｓ１−１００μＭ−ＴＤ」とラベル付してあり、これは、標準タグメント化バッファ（ＴＤ）において、最終濃度が１００μＭのＭＢＰＭｏｓ１を用いて調製したライブラリを指定する。データは、比較的同一の数または配列決定リードの下、Ｍｏｓ１タグメント化により調製したライブラリの多様性に対する、異なるバッファの効果を示す。特に、ＨＥＰＥＳ−ＤＭＳＯ−Ｍｎバッファは、ライブラリの多様性の増大に寄与する。
【０１５６】
図２１は、ＭＢＰ−Ｍｏｓ１タグメント化ライブラリにおける、ＧＣとＡＴのドロップアウトについての棒グラフ１１００を示す。ＧＣおよびＡＴのドロップアウトはそれぞれ、タグメント化ライブラリからドロップした（なくなった）、ゲノム中のＧＣリッチ領域およびＡＴリッチ領域の割合として定義することができる。ライブラリは図２０に記載するように指定する。データは、ＥＺＴｎ５およびＮｅｘｔｅｒａＶ２（つまり、Ｔｎ５トランスポザーゼ）を用いて調製したライブラリでは、ＧＣドロップアウトは基本的にないが、ＡＴリッチ領域は、それぞれ約７％および約５％がタグメント化ライブラリからドロップすることを示す。ＭＢＰ−Ｍｏｓ１および標準タグメント化バッファ（ＭＢＰＭｏｓ１−１００μＭ−ＴＤ）を用いて調製したライブラリでは、ＡＴドロップアウトは基本的にないが、ＧＣリッチ領域の約２％以下がタグメント化ライブラリからドロップする。ＭＢＰ−Ｍｏｓ１タグメント化ライブラリにおけるＧＣドロップアウト率は、タグメント化バッファの組成物により影響を受ける。ＧＣドロップアウト率は、ＨＭＷ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ−ＤＭＳＯ、ＨＥＰＥＳ−ＤＭＳＯ−Ｃｏ、およびＨＥＰＥＳ−ＤＭＳＯ−Ｍｎバッファを用いて調製したＭＢＰ−Ｍｏｓ１タグメント化ライブラリにおいて増加する。
【０１５７】
図２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃ、および２２Ｄはそれぞれ、Ｍｏｓ１−ＨＥＰＥＳライブラリにおける配列含有量についてのバイアスグラフ１２００、Ｍｏｓ１−ＨＥＰＥＳ−ＤＭＳＯライブラリにおける配列含有量についてのバイアスグラフ１２３０、Ｍｏｓ１−ＨＥＰＥＳ−ＤＭＳＯ−Ｃｏライブラリにおける配列含有量についてのバイアスグラフ１２４０、および、Ｍｏｓ１−ＨＥＰＥＳ−ＤＭＳＯ−Ｍｎライブラリにおける配列含有量についてのバイアスグラフ１２５０を示す。バイアスグラフ１２００、１２３０、１２４０、および１２５０はそれぞれ、サイクル数によるＡ含有量の曲線である曲線１２１０、サイクル数によるＣ含有量の曲線である曲線１２１５、サイクル数によるＧ含有量の曲線である曲線１２２０、および、サイクル数によるＴ含有量の曲線である曲線１２２５を示す。
【０１５８】
図２２Ａおよび２２Ｂを参照すると、データは、Ｍｏｓ１配列バイアスが、Ｍｏｓ１−ＨＥＰＥＳおよびＭｏｓ１−ＨＥＰＥＳ−ＤＭＳＯのタグメント化ライブラリにおいて、ＳＢＳの最初の数サイクルで観察されることを示す。第１ＳＢＳサイクルでは、Ｔの検出はフローセルを通して約１００％である。第２ＳＢＳサイクルでは、Ａの検出はフローセルを通して約１００％である。約４サイクルより後で配列バイアスは縮小し、Ａ，Ｔ、Ｃ、およびＧの含有量は、予想されるゲノム組成物を反映する。
【０１５９】
図２２Ｃおよび２２Ｄを参照すると、データはまた、Ｍｏｓ１配列バイアスが、マグネシウム（Ｍｇ）をそれぞれコバルト（Ｃｏ）またはマンガン（Ｍｎ）で置き換えたタグメント化バッファを用いて調製したライブラリである、Ｍｏｓ１−ＨＥＰＥＳ−ＤＭＳＯ−ＣｏおよびＭｏｓ１−ＨＥＰＥＳ−ＤＭＳＯ−Ｍｎのタグメント化ライブラリにおいて、ＳＢＳの最初の数サイクルで観察されることを示す。この場合もやはり、約４サイクルより後で配列バイアスは縮小し、Ａ，Ｔ、Ｃ、およびＧの含有量は、予想されるゲノム組成物を反映する。しかしながら、Ｍｏｓ１−ＨＥＰＥＳ−ＤＭＳＯ−ＣｏおよびＭｏｓ１−ＨＥＰＥＳ−ＤＭＳＯ−Ｍｎのライブラリ、つまり、曲線１２１０（つまり、Ａ）および曲線１２２５（つまり、Ｔ）では、予想されるゲノム組成物へのシフトは、サイクル１およびサイクル２において観察される。予想されるゲノム組成物へのシフトは、Ｍｏｓ１−ＨＥＰＥＳ−ＤＭＳＯ−Ｍｎライブラリにおいてより顕著である。
【０１６０】
（実施例７）
ＴＳ−Ｔｎ５０５９ライブラリ調製およびエクソーム濃縮プロトコル
一実施形態では、本発明の方法は、Ｔｎ５トランスポソームベースのエクソームライブラリの調製および濃縮に対し、合理化ワークフローを提供する。
【０１６１】
図２３は、エクソーム配列決定用のゲノムＤＮＡライブラリを調製し濃縮する方法１２６０の一例のフロー図を示す。方法１２６０は、ＴＳ−Ｔｎ５０５９トランスポソームと、現在のＮｅｘｔｅｒａ（登録商標） Ｒａｐｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅプロトコルのあるプロセスステップへの修正とを用いて、ある範囲のＤＮＡインプット量にわたる改善されたライブラリ収量および配列決定測定基準を提供する。例えば、方法１２６０は、「両面」固相可逆固定（ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ、ＳＰＲＩ（登録商標））プロトコル（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用いて標的ＤＮＡを精製し、そして、ＰＣＲ増幅の前に、第１ＤＮＡ断片サイズ選択ステップおよび第２ＤＮＡ断片サイズ選択ステップを提供する。別の例では、前濃縮プロセスを用いて、エクソーム濃縮の前に標的ＤＮＡライブラリを濃縮する。方法１２６０は、以下のステップを含むが、それらに限定されない。
【０１６２】
ステップ１２７０で、ゲノムＤＮＡをトランスポソームによりタグメント化（タグ付けおよび断片化）する。トランスポソームはゲノムＤＮＡを同時に断片化して端にアダプタ配列を加え、後続のＰＣＲによる増幅を可能にする。一例では、トランスポソームはＴＳ−Ｔｎ５０５９である。タグメント化反応の完了時に、タグメント化停止バッファを反応物に加える。タグメント化停止バッファは、ＴＳ−Ｔｎ５０５９トランスポソーム複合物をタグメント化ＤＮＡから確実に十分に変性することができるように、修正することができる（例えば、停止バッファにおけるＳＤＳ濃度を、高熱と組み合わせて、０．１％から１．０％へ増加させる）。
【０１６３】
ステップ１２７５では、第１浄化を行ってトランスポソームからタグメント化ＤＮＡを精製し、第１ＤＮＡ断片サイズ選択ステップを提供する。ＤＮＡ断片サイズは、ＤＮＡに対するＳＰＲＩビーズの、体積対体積の比率を変更することにより選択することができる（例えば、１ｘＳＰＲＩ＝１：１体積ＳＰＲＩ：ＤＮＡ）。例えば、第１サイズ選択では、ＤＮＡに対するＳＲＰＩビーズの体積比率を選択し、あるサイズよりも大きいＤＮＡ断片を結合させ（つまり、より大きいＤＮＡ断片をサンプルから取り除く）、一方で、あるサイズよりも小さいＤＮＡ断片は上清に残す。サイズを選択したＤＮＡ断片を有する上清を、次の処理のため浄化反応容器に移す。より大きいＤＮＡ断片が付いたＳＰＲＩビーズは廃棄してよい。一実施形態では、ＳＰＲＩビーズの濃度は０．８Ｘ〜１．５Ｘまで変えることが可能である。一実施形態では、ＳＰＲＩビーズの濃度は０．８Ｘである。
【０１６４】
ステップ１２８０では、第２浄化を行って、あるサイズ範囲のＤＮＡ断片をさらに選択する。例えば、ＤＮＡに対するＳＰＲＩビーズの体積比率を選択して、あるサイズより大きいＤＮＡ断片を結合させる（つまり、所望のサイズ範囲のＤＮＡ断片をＳＰＲＩビーズに結合させる）。より小さいＤＮＡ断片は上清に残し、廃棄する。結合ＤＮＡ断片はその後、次の処理のためにＳＰＲＩビーズから溶出する。
【０１６５】
任意のステップ１２８５では、ＤＮＡ断片サイズ分布を求める。ＤＮＡ断片サイズ分布は、例えば、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて求める。
【０１６６】
ステップ１２９０では、精製タグメント化ＤＮＡを限定サイクル（ｌｉｍｉｔｅｄ−ｃｙｃｌｅ）ＰＣＲプログラムを用いて増幅する。ＰＣＲステップはまた、次のクラスタ生成および配列決定に必要な共通アダプタ（Ｐ５およびＰ７）と同様に、インデックス１（ｉ７）およびインデックス２（ｉ５）、ならびに、配列決定を加える。両面ＳＰＲＩプロセス（つまり、ステップ１２７５およびステップ１２８０）を用いて所望のＤＮＡ断片サイズ範囲を選択することから、所望のサイズ範囲にあるタグメント化ＤＮＡ断片のみ、ＰＣＲ増幅で利用可能となる。その結果、ライブラリ収量は著しく増加し、次の配列決定測定基準（例えば、リード濃縮率）は改善する。
【０１６７】
ステップ１２９５では、増幅したタグメント化ＤＮＡライブラリを、ビーズベースの精製プロセスを用いて精製する。
【０１６８】
任意のステップ１３００では、ＰＣＲ後のＤＮＡ断片サイズ分布を求める。ＤＮＡ断片サイズ分布は、例えば、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて求める。
【０１６９】
ステップ１３１０では、タグメント化ＤＮＡライブラリを、次のエクソーム濃縮のためのハイブリダイゼーションの前に予め濃縮する。例えば、タグメント化ＤＮＡライブラリを約５０μＬから約１０μＬへ予め濃縮する。タグメント化ＤＮＡライブラリを予め濃縮することにより、ハイブリダイゼーション速度はより速くなり、ハイブリダイゼーションの時間は減る。
【０１７０】
ステップ１３２０では、エクソーム濃縮用の第１ハイブリダイゼーションを行う。例えば、ＤＮＡライブラリを、対象領域に標的させたビオチン化捕捉プローブと混ぜる。ＤＮＡライブラリを約９５℃で約１０分間変性し、約５８℃で約３０分間プローブにハイブリダイズし、総反応時間を約４０分とする。
【０１７１】
ステップ１３２５では、ストレプトアビジンビーズを用いて、対象標的領域にハイブリダイズしたビオチン化プローブを捕捉する。２つの加熱洗浄手順を用いて、非特異的に結合したＤＮＡをビーズから取り除く。濃縮ライブラリをその後ビーズから溶出し、ハイブリダイゼーションの第２ラウンドに備える。
【０１７２】
ステップ１３３０では、エクソーム濃縮用の第２ハイブリダイゼーションを、第１ハイブリダイゼーションと同じプローブおよび遮断薬を用いて行う。例えば、ステップ１５５により溶出したＤＮＡライブラリを約９５℃で約１０分間変性し、約５８℃で約３０分間ハイブリダイズし、総反応時間を約４０分とする。第２ハイブリダイゼーションを用いて、捕捉領域の高特異性を確保する。
【０１７３】
ステップ１３３５では、ストレプトアビジンビーズを用いて、対象標的領域にハイブリダイズしたビオチン化プローブを捕捉する。２つの加熱洗浄手順を用いて、非特異的に結合したＤＮＡをビーズから取り除く。エクソーム濃縮ライブラリをその後ビーズから溶出し、配列決定に備えて１０サイクルのＰＣＲにより増幅する。
【０１７４】
ステップ１３４０では、エクソーム濃縮捕捉サンプル（つまり、エクソーム濃縮ＤＮＡライブラリ）を、ビーズベースの精製プロトコルを用いて精製する。
【０１７５】
ステップ１３４５では、エクソーム濃縮ＤＮＡライブラリを配列決定のためにＰＣＲ増幅する。
【０１７６】
ステップ１３５０では、増幅した濃縮ＤＮＡライブラリを、ビーズベースの精製プロトコルを用いて任意で精製する。例えば、１Ｘ ＳＰＲＩビーズプロトコルを用いて、次のクラスタ増幅および配列決定を妨げる可能性のある不要な産物（例えば、過剰プライマー）を取り除く。
【０１７７】
方法１００は、約１１時間でライブラリ調製とエクソーム濃縮を可能にする。任意のステップ１２８５および１３００を省略する場合、方法１２６０は約９時間でライブラリ調製とエクソーム濃縮を可能にする。
【０１７８】
（実施例８）
ＴＳ−Ｔｎ５０５９挿入バイアス
トランスポザーゼは、タグメント化反応において、ある挿入部位（ＤＮＡ配列）バイアスを有する場合がある。ＤＮＡ配列バイアスは、ゲノムのある領域（例えば、ＧＣ−リッチ、またはＡＴ−リッチ）をタグメント化ライブラリからドロップさせ得る。例えば、Ｔｎ５トランスポザーゼは、ゲノムのＧＣ−リッチ領域に対しあるバイアスを有する。その結果、ゲノムのＡＴ領域はＴｎ５タグメント化ライブラリにおいてドロップする場合がある。より完全なゲノムカバレッジを提供するため、最少の配列バイアスが望ましい。
【０１７９】
ライブラリアウトプットおよび配列決定測定基準に対するＴＳ−Ｔｎ５０５９トランスポソームの影響を評価するため、ＴＳ−Ｔｎ５０５９タグメント化ＤＮＡライブラリを、全ゲノム配列決定用標準Ｎｅｘｔｅｒａ（登録商標）ＤＮＡライブラリ調製キットおよびセレウス菌ゲノムＤＮＡを用いて調製した。ＴＳ−Ｔｎ５０５９は最終濃度４０ｎＭで用いた。参照対照ライブラリを、２５ｎＭのＮｅｘｔｅｒａＶ２トランスポソームという標準反応条件を用いて調製した。ライブラリをｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＢＳ）により評価した。
【０１８０】
図２４Ａは、ＴＳ−Ｔｎ５０５９トランスポソームを用いて調製したタグメント化セレウス菌ゲノムＤＮＡライブラリにおけるカバレッジについてのプロット１４００を示す。ＴＳ−Ｔｎ５０５９トランスポソームは、ＧＣ含有量が増えるにつれ、増加するバイアスレベルに対し耐性を示すようになる。図２４Ｂは、ＮｅｘｔｅｒａＶ２トランスポソームを用いて調製したタグメント化セレウス菌ゲノムＤＮＡライブラリにおけるカバレッジについてのプロット１４５０を示す。図２４Ｂは、ＧＣ含有量が増えると、ＧＣリッチ領域のＮｅｘｔｅｒａＶ２カバレッジはバイアスの増加とともに歪み出す。データは、ＴＳ−Ｔｎ５０５９を用いて調製したタグメント化ＤＮＡライブラリが、ＮｅｘｔｅｒａＶ２を用いて調製したタグメント化ライブラリと比較し、より挿入バイアスが低く、広いＧＣ／ＡＴ範囲にわたって、改善されたさらに均一のカバレッジを有することを示す。
【０１８１】
図２５Ａは、ＴＳ−Ｔｎ５０５９トランスポソームを用いて調製したタグメント化セレウス菌ゲノムＤＮＡライブラリにおける、ギャップ位置およびギャップ長についてのプロット１５００を示す。図２５Ｂは、ＮｅｘｔｅｒａＶ２トランスポソームを用いて調製したタグメント化セレウス菌ゲノムタグメント化ＤＮＡライブラリにおける、ギャップ位置およびギャップ長についてのプロットを示す。ＴＳ−Ｔｎ５０５９タグメント化ライブラリにおけるギャップ数は２７である。ＮｅｘｔｅｒａＶ２タグメント化ライブラリにおけるギャップ数は２０８である。データは、ＴＳ−Ｔｎ５０５９トランスポソームを用いて調製したタグメント化ＤＮＡライブラリが、ＮｅｘｔｅｒａＶ２トランスポソームを用いて調製したタグメント化ライブラリと比較し、よりギャップの少ない、さらに均一なカバレッジを有することを示す。
【０１８２】
（実施例８）
ＴＳ−Ｔｎ５０５９ＤＮＡインプット許容差
タグメント化ライブラリの調製に、酵素ＤＮＡ断片化ステップ（例えば、トランスポソーム仲介タグメント化）を用いることから、例えば機械的断片化方法と比較し、ＤＮＡインプットに対しより影響を受けやすい場合がある。一実施例では、現在のＮｅｘｔｅｒａ（登録商標） Ｒａｐｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔプロトコルは、５０ｎｇの総ゲノムＤＮＡインプットに対し最適化されている。より高質量のゲノムＤＮＡインプットは、不完全なタグメント化およびより大きい挿入サイズをもたらす可能性があり、これは、次の濃縮動作に影響を与え得る。より低質量のゲノムＤＮＡインプットまたは低品質のゲノムＤＮＡは、タグメント化反応において、予想より小さい挿入サイズを生成する可能性がある。より小さい挿入物は、次の浄化ステップ中に失われ、ライブラリ多様性が低下する場合がある。
【０１８３】
断片（挿入）サイズ分布に対する異なるＤＮＡインプット量の影響を評価するため、様々な酵素濃度で、様々な量のインプットゲノムＤＮＡを用いてＴＳ−Ｔｎ５０５９タグメント化ライブラリを調製し、断片サイズを他トランスポザーゼで得た断片サイズと比較した。該他トランスポザーゼのアクティビティは、４０ｎＭのＴＳ−Ｔｎ５０５９および２５ｎｇのゲノムＤＮＡインプットのアクティビティに対し正規化する。
【０１８４】
４０ｎＭのＴＳ−Ｔｎ５０５９、正規化ＴＤＥ１（Ｔｎ５バージョン−１）、および正規化ＴＳ−Ｔｎ５により、２５ｎｇのヒトゲノムＤＮＡを用いて生成した断片サイズ分布は、図２６および２７に示すように類似していた。
【０１８５】
しかしながら、ＴＳ−Ｔｎ５０５９は、より高い酵素濃度で、広範囲のインプットＤＮＡ量にわたり、ＤＮＡインプット許容差の拡大を示した。図２８は、ある範囲のＤＮＡインプットを用いて調製したタグメント化ゲノムＤＮＡライブラリにおける断片サイズ分布についての、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒトレースのパネル１６００を示す。２４０ｎＭのＴＳ−Ｔｎ５０５９タグメント化ライブラリを、タグメント化、１．８Ｘ ＳＰＲＩ浄化により調製し、その後Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒトレースを続けた。参照対照ライブラリを、現在のＮｅｘｔｅｒａ（登録商標） Ｒａｐｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅキット（「Ｎｅｘｔｅｒａ」）およびＡｇｉｌｅｎｔ ＱＸＴキット（「Ａｇｉｌｅｎｔ ＱＸＴ」）を用いて調製した。タグメント化ライブラリを、２５ｎｇ、５０ｎｇ、７５ｎｇ、および１００ｎｇのセレウス菌ゲノムＤＮＡを用いて調製した。データは、ＴＳ−Ｔｎ５０５９トランスポソームを用いて調製したタグメント化ＤＮＡライブラリの断片サイズ分布は、ＮｅｘｔｅｒａトランスポソームまたはＡｇｉｌｅｎｔＱＸＴトランスポソームを用いて調製したライブラリと比較し、２５〜１００ｎｇのＤＮＡインプット範囲にわたってより一貫していることを示す。ＤＮＡインプットの量が２５ｎｇから１００ｎｇに増加するにつれ、ＴＳ−Ｔｎタグメント化ライブラリにおいてタグメント化ＤＮＡの収量は増えるが、断片サイズ分布は実質的に同じままである。対照的に、７５ｎｇおよび１００ｎｇのＤＮＡインプットでは、ＮｅｘｔｅｒａおよびＡｇｉｌｅｎｔ ＱＸＴのタグメント化ライブラリは、ＤＮＡ断片サイズ分布が大きい断片サイズへ実質的にシフトすることを示す。
【０１８６】
図２９Ａは、５ｎｇから１００ｎｇへ変動するヒトＣｏｒｉｅｌＤＮＡインプットを用いて第１ユーザが調製した、ＴＳ−Ｔｎ５０５９タグメント化ライブラリにおける断片サイズ分布についての、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒトレースのプロット１７００を示す。図２９Ｂは、第２ユーザが調製したＴＳ−Ｔｎ５０５９タグメント化ライブラリにおける断片サイズ分布についての、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒトレースのプロット１７５０を示す。タグメント化ライブラリは、５ｎｇ、１０ｎｇ、２５ｎｇ、５０ｎｇ、７５ｎｇ、および１００ｎｇのセレウス菌ゲノムＤＮＡを用いて調製した。図２９Ａのプロット１７００および図２９Ｂのプロット１７５０は両者とも、５ｎｇのＤＮＡインプットを用いて調製したタグメント化ライブラリにおける断片サイズ分布のライン１７１０、１０ｎｇのＤＮＡインプットを用いて調製したタグメント化ライブラリにおける断片サイズ分布のライン１７１５、２５ｎｇのＤＮＡインプットを用いて調製したタグメント化ライブラリにおける断片サイズ分布のライン１７２０、５０ｎｇのＤＮＡインプットを用いて調製したタグメント化ライブラリにおける断片サイズ分布のライン１７２５、７５ｎｇのＤＮＡインプットを用いて調製したタグメント化ライブラリにおける断片サイズ分布のライン１７３０、および１００ｎｇのＤＮＡインプットを用いて調製したタグメント化ライブラリにおける断片サイズ分布のライン１７３５を示す。データは、ＴＳ−Ｔｎ５０５９タグメント化ＤＮＡライブラリにおける断片サイズ分布が、５〜１００ｎｇのＤＮＡインプット範囲で一貫していることを示す。断片サイズ分布における一貫性は、異なるユーザについて観察される。
【０１８７】
別の例では、表３に、５〜２００ｎｇのＤＮＡインプット範囲にわたるＴＳ−Ｔｎ５０５９タグメント化ＤＮＡライブラリでの、ライブラリ挿入サイズの中央値を示す。
【０１８８】
【表３】
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【０１８９】
さらに別の例では、表４に、２５ｎｇ、５０ｎｇ、７５ｎｇ、および１００ｎｇのＤＮＡインプットを用いて調製したＴＳ−Ｔｎ５０５９タグメント化ＤＮＡについての、ライブラリ挿入サイズとエクソーム濃縮配列決定測定基準を示す。データは、リード濃縮率（％）が約８０％であることを示す。現在のＮｅｘｔｅｒａ（登録商標）Ｒａｐｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔプロトコルを用いて調製したタグメント化ライブラリについてのリード濃縮率は、約６０％である（データ表示なし）。データはまた、１５ｎｇ〜１００ｎｇのＤＮＡインプット範囲にわたり、一貫した挿入サイズを示す。
【０１９０】
【表４】
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【０１９１】
別の例では、表５に、ＴＳ−Ｔｎ５０５９タグメント化ライブラリにおける、２５ｎｇ〜１００ｎｇのＤＮＡインプット範囲にわたる前濃縮ライブラリの収量を示す。
【０１９２】
【表５】
0006490710.tif 000007
【０１９３】
さらに別の例では、表６に、ＴＳ−Ｔｎ５０５９タグメント化ＤＮＡライブラリについてのエクソーム濃縮配列決定測定基準を示す。５０ｎｇのインプットＤＮＡで開始し、ライブラリは、エクソーム濃縮に対し５００ｎｇ、６２５ｎｇ、および７５０ｎｇのライブラリＤＮＡインプットを用いて調製した。データは、エクソーム濃縮測定基準は、ある範囲の前濃縮ライブラリインプット量（つまり、５００ｎｇ〜７５０ｎｇ）にわたり一貫していることを示す。
【０１９４】
【表６】
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【０１９５】
さらに別の例では、表７に現在のＮｅｘｔｅｒａ（登録商標） Ｒａｐｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔハイブリダイゼーションプロトコル（「ＮＲＣ」）と、図２３の方法１２６０の濃縮ステップ１３１０〜１３５０とを用いて調製したタグメント化ＤＮＡライブラリについての、エクソーム濃縮配列決定測定基準を示す。データは、エクソーム濃縮測定基準が、現在のＮｅｘｔｅｒａ（登録商標） Ｒａｐｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔプロトコル（「ＮＲＣ」）においてハイブリダイゼーションプロトコル用いて調製したライブラリと比較し、図２３の方法１２６０を用いて調製したＴＳ−Ｔｎ５０５９タグメント化ライブラリにおいて改善および／または維持されることを示す。
【０１９６】
【表７】
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【０１９７】
別の実験では、ＴＳ−Ｔｎ５０５９は、より高い濃度（６Ｘに正規化）で、同じ濃度に正規化したＴｎ５バージョン−１およびＴＳ−Ｔｎ５トランスポザーゼと比較し、ＤＮＡインプット許容差の改善を示す。結果を図３０〜３３を示す。６Ｘ「正規化」濃度のＴｎ５バージョン１（図３０）およびＴＳ−Ｔｎ５（図３１）は、両者とも、ｇＤＮＡインプットを２５〜１００ｎｇの間で変動させると断片サイズ分布のシフトを示す。対照的に、６Ｘ正規化濃度のＴＳ−Ｔｎ５０５９は、１０〜１００ｎｇのＤＮＡインプットでは顕著なサイズシフトを示さない（図３２）。断片サイズ分布は、２００〜５００ｎｇへｇＤＮＡを増加させると、シフトし始める（図３３）。ＴＳ−Ｔｎ５０５９のＤＮＡインプット許容差の拡大についての結果を下記の表８にまとめる。
【０１９８】
【表８】
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【０１９９】
このように、ＴＳ−Ｔｎ５０５９では、≧２．４（ｎＭ ＴＳ−Ｔｎ５０５９：ｎｇインプットＤＮＡ）の比率においてＤＮＡインプット許容差の拡大を示すサイズシフトはなかった。
【０２００】
本出願を通して、様々な刊行物、特許、および／または特許出願を参照した。これらの刊行物の開示内容はその全体が、本出願で参照されることにより本明細書に組み込まれる。
【０２０１】
用語「含む」は本明細書では非限定的であることを意図し、言及された要素だけを含むのでなく、任意の追加要素をさらに包含する。
【０２０２】
多くの実施形態が記載されている。そうは言うものの、様々な修正が可能であることが理解されよう。したがって、他の実施形態も以下の請求項の範囲内にある。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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