(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Formula）４の重合体：
【化１】
0006576330.tif 000046
その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩を含む、着色剤組成物であって、
式中、ｎは、２〜２０の整数であり；
式中、各Ａは、独立して、式５’Ａ、式５’Ｂ、式５’Ｃ：
【化２】
0006576330.tif 000047
それらの幾何異性体、それらの互変異性体、それらの塩、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、
式中、Ｒ１は、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、またはｔｅｒｔ−ブチルであり；かつ式中、Ｔ１は、水素またはメチル基であり；かつＴ２は、水素またはＡ−Ｔ１であり、式中、ＡおよびＴ１は上記で定義され；
該着色剤組成物は、以下の式２’、式３’Ａ、式３’Ｂ：
【化３】
0006576330.tif 000048
それらの幾何異性体、それらの互変異性体、およびそれらの塩からなる群より選択される第一の付加化合物の含有量が５重量％未満である
ことを特徴とする着色剤組成物。
【請求項２】
前記着色剤組成物は、以下の式１Ａ、式１Ｂ：
【化４】
0006576330.tif 000049
それらの幾何異性体、それらの互変異性体、およびそれらの塩からなる群より選択される第二の付加化合物の含有量が５重量％未満である
請求項１に記載の着色剤組成物。
【請求項３】
乾燥重量で純度８０％以上に精製された式４の重合体：
【化７】
0006576330.tif 000050
その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩であって、
式中、ｎは、２〜２０の整数であり；
式中、各Ａは、式５’Ａ（Ｍｅ）のもの：
【化８】
0006576330.tif 000051
その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩であり、
式中、Ｔ１は、水素またはメチル基であり；かつＴ２は、水素またはＡ−Ｔ１であり、式中、ＡおよびＴ１は、上記で定義される
ことを特徴とする重合体。
【請求項４】
基質に青色を付与する方法であって、該基質を、請求項１または２に記載の着色剤組成物、または請求項３に記載の重合体と接触させる工程を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項５】
（ａ）請求項１または２に記載の着色剤組成物または請求項３に記載の重合体と、（ｂ）食品要素と、医薬品と、栄養補助食品と、化粧品と、医療用デバイスとのいずれかとを含む
ことを特徴とする製品。
【請求項６】
前記食品要素は、固形食品要素または液状食品要素である
請求項５に記載の製品。
【請求項７】
前記医薬品または栄養補助食品は、錠剤、ゲルカプセル剤、ビーズ剤、ペレット剤、丸剤、ドラジェ、ロゼンジ、軟膏、カプセル剤、散剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、および懸濁剤からなる群より選択される剤形になっている
請求項５に記載の製品。
【請求項８】
前記着色剤組成物は、炭水化物の含有量が５重量％未満である
請求項１または２に記載の着色剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ゲニパ・アメリカナ（Ｇｅｎｉｐａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）ジュース、ゲニピン、またはゲニピン類似体と、アミンとの反応から単離される着色剤化合物、これを含む組成物、ならびにその作製法および使用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
合成着色剤の使用に対する消費者の不信感は、主にそれらの毒性によるものであるが、そのような不信感から、天然の着色化合物の調査および開発が行われてきた。こうした化合物は、多くの国々で利用されるようになったが、近年の技術進歩により、これらの着色剤は、産業的にも商業的にも存立可能になるとともに合成着色剤に匹敵するものとなった。非特許文献１を参照。国際的には、天然の着色物、例えばゲニパ・アメリカナの青色および黒色着色剤は、両方とも、食料製品、化粧品、および繊維産業で使用されている。
【０００３】
青色着色剤の調製方法は、報告されている。例えば、ゲニパ・アメリカナ果肉から得られる未加工の生ジュースとグリシンを混合することに由来する、ｐＨ安定な青色着色剤の作成方法が、Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉらにより記載された（特許文献１）。この内容は、その全体が本明細書中に参照として援用される。青色着色剤を調製する他の例として、以下が挙げられる：Ｈ．Ｏｋｕｙａｍａらの特許文献２および３、これらは、第一級アミンとゲニピンの自然反応から作られる青紫色着色剤を記載する；ならびにＷｕら（特許文献４）、これは、ゲニパ・アメリカナジュースを他の果物のジュース（例えばスイカ）およびアミノ酸と混合することを記載する。これら既存の方法は、一般に、得られた粗混合物をそれ以上精製することなく使用するが、そうするのは、恐らく、当該分野で認識されているとおり、混合物を精製することの困難さによる。（ゲニピンまたはその構造類似体とアミノ酸の反応に由来する青色顔料は、「そのクロマトグラフィー挙動、解析不能な１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル、および分子量測定に基づき、高分子量の重合体からなる手に負えない混合物であることがわかった」）（非特許文献２）を参照。青色顔料材料の分子構造については、これまで限られた記載しか存在しない。なぜならこの材料は、非常に高い極性があるために、ほとんど水にしか溶解せず、このことがＴＬＣ追跡を困難にしている。分子量９０００の重合体が報告されている（非特許文献３を参照）。さらに最近では、ＷｕおよびＨｏｒｎ（特許文献５）が、ゲニパ・アメリカナからゲニピンを濃縮する方法およびゲニピン濃縮材料の使用法を報告した。しかしながら、この「富ゲニピン抽出物」は、ゲニピンが３０〜９７％（ｗ／ｗ）であり、組成物の残部には、水分、脂肪、少量の酸、および窒素含有化合物が含まれ、そして残りは炭水化物であると開示されている（特許文献５、３頁、左欄を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第７，９２７，６３７号
【特許文献２】日本特許第５２０５３９３２号公報
【特許文献３】日本特許第５２０５３９３４号公報
【特許文献４】国際公開第２００９／１２０５７９号パンフレット
【特許文献５】米国特許出願公開第２０１３／０１１５２５２号明細書
【０００５】
【非特許文献１】「Ｍａｒｋｅｔ  Ｂｒｉｅｆ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｕｎｉｏｎ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｎａｔｉｖｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ；  Ｇｅｎｉｐａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ」、国連貿易開発会議での発表（２００５）
【非特許文献２】Ｔｏｕｙａｍａ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂｌｕｅ  Ｐｉｇｍｅｎｔｓ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｆｒｏｍ  ｇｅｎｉｐｉｎａｎｄ  ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ．  Ｉ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｒｏｗｎｉｓｈ−Ｒｅｄ  Ｐｉｇｍｅｎｔｓ，  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  Ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｂｌｕｅ  Ｐｉｇｍｅｎｔｓ，  Ｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ  ４２，  ６６，  １９９４
【非特許文献３】Ｈ．  Ｊｎｏｕｙｅ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２６ｔｈ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔ，  Ｋｙｏｔｏ，  Ａｂｓｔｒ．  ｐｐ  ５７７−５８４，  １９８３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ゲニピンとアミノ酸の反応に由来する青色顔料材料の分子構造に関する知見の欠如を克服するのに貢献する。本明細書中提供されるのは、実質的に精製された着色剤化合物（例えば、重合体）を含む着色剤組成物、ならびに着色剤化合物を単離する方法および単離した着色剤化合物を使用する方法である。
【０００７】
ある特定の実施形態は、実質的に精製された式（Formula）１Ａまたは式１Ｂの化合物、あるいはその幾何異性体（geometric isomer）、その互変異性体（taotomer）、その塩、またはそれらの組み合わせに関する；
【０００８】
【化１】
0006576330.tif 000002
【０００９】
ある特定の実施形態は、実質的に精製された式２、３Ａ、または３Ｂの化合物、あるいはその幾何異性体、その互変異性体、その塩、またはそれらの組み合わせに関する；
0006576330.tif 000003
【００１０】
ある特定の実施形態は、式４の重合体：
【００１１】
【化２】
0006576330.tif 000004
【００１２】
その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩、
を含む着色剤組成物に関し、
式中、ｎは、２〜２００の整数であり；
式中、各Ａは、独立して、式５Ａ、式５Ｂ、式５Ｃ、それらの幾何異性体、それらの互変異性体、それらの塩、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され：
【００１３】
【化３】
0006576330.tif 000005
【００１４】
式中：
Ｒ１は、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、またはｔｅｒｔ−ブチルであり；
Ｒ２およびＲ’２は、それぞれ独立して、水素またはＣ１−１０アルキルであり；
Ｒ３は、水素またはＣＯＯＨであり；
かつ、式中、Ｔ１は、水素またはメチル基であり；かつＴ２は、水素またはＡ−Ｔ１であり、式中、ＡおよびＴ１は、上記で定義され；
この場合、着色剤組成物は、式６、式７、式８、それらの幾何異性体、それらの互変異性体、およびそれらの塩からなる群より選択される第一の付加化合物を実質的に含まない：
【００１５】
【化４】
0006576330.tif 000006
【００１６】
いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、式４の重合体：
【００１７】
【化５】
0006576330.tif 000007
【００１８】
その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩、
を含み、
式中、ｎは、２〜２０の整数であり；
式中、各Ａは、独立して、式５’Ａ、式５’Ｂ、式５’Ｃ、それらの幾何異性体、それらの互変異性体、それらの塩、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され：
【００１９】
【化６】
0006576330.tif 000008
【００２０】
式中：
Ｒ１は、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、またはｔｅｒｔ−ブチルであり；
かつ、式中、Ｔ１は、水素またはメチル基であり；かつ、Ｔ２は、水素またはＡ−Ｔ１であり、式中、ＡおよびＴ１は、上記で定義され；
この場合、着色剤組成物は、式２’、式３’Ａ、式３’Ｂ、それらの幾何異性体、それらの互変異性体、およびそれらの塩からなる群より選択される第一の付加化合物を実質的に含まない：
【００２１】
【化７】
0006576330.tif 000009
【００２２】
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、メチルである。いくつかの実施形態において、第一の付加化合物の全重量は、重合体の１重量％未満である。
【００２３】
ある特定の実施形態は、実質的に精製された式３’Ａ（Ｍｅ）または式３’Ｂ（Ｍｅ）の化合物、その幾何異性体、その互変異性体、その塩、またはそれらの組み合わせに関する：
【００２４】
【化８】
0006576330.tif 000010
【００２５】
ある特定の実施形態は、実質的に精製された式４の重合体：
【００２６】
【化９】
0006576330.tif 000011
【００２７】
その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩、
に関し、
式中、ｎは、２〜２０の整数であり；
式中、各Ａは、式５’Ａ（Ｍｅ）のもの、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩であり：
【００２８】
【化１０】
0006576330.tif 000012
【００２９】
式中、Ｔ１は、水素またはメチル基であり；かつ、Ｔ２は、水素またはＡ−Ｔ１であり、式中、ＡおよびＴ１は、上記で定義される。
【００３０】
ある特定の実施形態は、ゲニピンとグリシンの反応に由来する着色剤化合物を精製したもの、およびこの着色剤化合物の単離方法に関する。いくつかの実施形態において、着色剤化合物は、精製ゲニピン（例えば、８０重量％超、８５重量％超、９０重量％超、９５重量％超、または９９重量％超）とグリシンの反応に由来する。いくつかの実施形態において、着色剤化合物は、グリシンと、ゲニピン含有ジュースの反応に由来する。いくつかの実施形態において、着色剤化合物は、グリシンと、ゲニパ・アメリカナ由来の果汁の反応に由来する。いくつかの実施形態において、着色剤化合物は、精製グリシンとゲニピンの反応に由来し、ゲニピンは、精製ゲニピン（例えば、８０重量％超、８５重量％超、９０重量％超、９５重量％超、または９９重量％超）またはゲニピン含有ジュースである。いくつかの実施形態において、着色剤化合物は、ゲニピンと、グリシン含有混合物（例えば、グリシン含有ジュース、またはグリシン含有乾燥混合物、例えばグリシン含有ジュースを濃縮したものなど）の反応に由来し、ゲニピンは、精製ゲニピン（例えば、８０重量％超、８５重量％超、９０重量％超、９５重量％超、または９９重量％超）またはゲニピン含有ジュースである。いくつかの実施形態において、着色剤化合物は、グリシン含有ジュース（例えば、スイカ、白ブドウ、パイナップル、ライチ、マスクメロン、バナナ、オレンジ、リンゴ、ナシ、レモン、パッションフルーツ、赤ブドウ、ブルーベリー、タマリンド、モモ、パパイヤ、アサイー、プラム、グアバ、タンジェリン、ボロホ（ｂｏｒｏｊｏ）、クプアス（ｃｕｐｕａｃｕ）、クコ、またはキウィ由来のジュースなどの果汁）と、ゲニピン含有ジュース（例えば、ゲニパ・アメリカナ由来のジュースなどの果汁）の反応に由来する。いくつかの実施形態において、着色剤化合物は、スイカ由来ジュースとゲニパ・アメリカナ由来ジュースの反応に由来する。
【００３１】
ある特定の実施形態は、着色剤化合物を単離する方法に関し、本方法は、以下を含む：ゲニピンとグリシンの反応に由来する青色混合物に、アルコール溶媒を用いて抽出を行い、アルコール溶解性画分およびアルコール不溶性画分とする工程；および、アルコール溶解性画分またはアルコール不溶性画分いずれかを精製する工程。いくつかの実施形態において、青色混合物は、ゲニピンとグリシンの反応に由来する乾燥粉末（例えば、凍結乾燥粉末）である。
【００３２】
ある特定の実施形態は、精製された式４の重合体、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩を含む実質的に精製された着色剤化合物に関する。いくつかの実施形態において、実質的に精製された着色剤化合物は、式２、３’Ａ（Ｍｅ）、または３’Ｂ（Ｍｅ）の二量体を含む。いくつかの実施形態において、実質的に精製された着色剤化合物、例えば、重合体（例えば、式４のもの、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩）は、炭水化物（例えば、糖類）を含まない。いくつかの実施形態において、実質的に精製された着色剤化合物は、炭水化物を少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％含まず、かつ他の不純物（例えば、単量体、二量体、脂肪酸、脂肪、タンパク質、および／または有機酸）を少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％含まない重合体（例えば、式４のもの、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩）を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態において、基質に青色を付与する方法は、基質を、本明細書中記載される着色剤組成物と接触させる工程を含む。いくつかの実施形態において、基質は、食品要素、医薬品または栄養補助食品、化粧品、あるいは医療用デバイスである。いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、精製された式４の重合体、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩を含む。いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、実質的に純粋な、式２、３’Ａ（Ｍｅ）、または３’Ｂ（Ｍｅ）の二量体を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】（ａ）化合物番号１の異性体形の化学式、（ｂ）化合物番号１の異性体形の化学式
【図２】（ａ）化合物番号１の異性体形の化学式の別の表し方、（ｂ）化合物番号１の異性体形の化学式の別の表し方
【図３】（ａ）化合物番号３の異性体形の化学式、（ｂ）化合物番号３の異性体形の化学式
【図４】（ａ）化合物番号３の異性体形の化学式の別の表し方、（ｂ）化合物番号３の異性体形の化学式の別の表し方
【図５】ゲニピンとグリシンの反応から単離された化合物１の核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光スペクトル
【図６】ゲニピンとグリシンの反応から単離された化合物３のＮＭＲ分光スペクトル
【図７】ゲニピンとグリシンの反応から単離されたＳ３１画分、Ｓ３２画分、Ｓ３３画分、およびＳ３４画分（Ｓ３画分に由来）のＮＭＲ分光スペクトル
【図８】式４を有する重合体構造の模式図
【図９】ゲニピンとグリシンの反応から単離された不溶性画分のＮＭＲスペクトル
【図１０】ゲニピンとグリシンの反応から単離された重合体の１Ｈ−１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトル
【図１１】ゲニピンとグリシンの反応から単離された重合体の分子量選択濾過により得られた質量特性
【図１２】ゲニピンとグリシンの反応から単離された重合体のＩＲ特性
【図１３】（Ａ）ゲニパ・アメリカナジュースとグリシンの反応による青色重合体を含有する４つの試料（Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のトレース。Ａ）ピンク線２４０ｎｍ、青線５９０ｎｍ、青線の方が吸光度が低い、（Ｂ）ゲニパ・アメリカナジュースとグリシンの反応による青色重合体を含有する４つの試料（Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のトレース。Ｂ）２４０および５９０ｎｍでほぼ等しい吸光度、（Ｃ）ゲニパ・アメリカナジュースとグリシンの反応による青色重合体を含有する４つの試料（Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のトレース。Ｃ）５９０ｎｍの吸光度のほうが高い、（Ｄ）ゲニパ・アメリカナジュースとグリシンの反応による青色重合体を含有する４つの試料（Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のトレース。Ｄ）キャリアを含む原液バッチ。
【図１４Ａ】青色重合体の参照標準溶液についての較正曲線１
【図１４Ｂ】青色重合体の参照標準溶液についての較正曲線２
【図１４Ｃ】青色重合体の参照標準溶液についての較正曲線３
【図１４Ｄ】青色重合体の参照標準溶液についての較正曲線４
【図１４Ｅ】青色重合体の参照標準溶液についての較正曲線５
【図１４Ｆ】青色重合体の参照標準溶液についての較正曲線６
【図１５】試料ＰＦ、ＦＣ、およびＰＣ（ＰＦ、ＦＣ、およびＰＣの定義については実施例１０を参照）のＨＰＬＣスペクトルおよびＵＶ吸収
【図１６】試料ＰＦ、ＦＣ、およびＰＣの呈色パラメーター
【図１７】ＸＡＤ−７樹脂から溶出した重合体画分および水性画分のＨＰＬＣスペクトル
【図１８】ゲニパ・アメリカナジュースと様々なアミノ酸との反応生成物のＵＶ−ｖｉｓ吸収スペクトル
【図１９Ａ】ゲニパ・アメリカナジュースと様々なアミノ酸との反応生成物のＨＰＬＣ分析を、アミノ酸によって分類して示す説明図。各アミノ酸のうち、（１９Ａ）グリシン、リシン、およびバリンについて示し、条件は以下のとおりである：実施例６の方法を用いたゲニパ・アメリカナジュースとアミノ酸との反応生成物のＨＰＬＣスペクトル；重合体が同定されるＨＰＬＣ領域の拡大図；および選択したシグナルのＵＶ−ｖｉｓスペクトル。
【図１９Ｂ】ゲニパ・アメリカナジュースと様々なアミノ酸との反応生成物のＨＰＬＣ分析を、アミノ酸によって分類して示す説明図。各アミノ酸のうち、（１９Ｂ）メチオニンおよびプロリンについて示し、条件は以下のとおりである：実施例６の方法を用いたゲニパ・アメリカナジュースとアミノ酸との反応生成物のＨＰＬＣスペクトル；重合体が同定されるＨＰＬＣ領域の拡大図；および選択したシグナルのＵＶ−ｖｉｓスペクトル。
【図１９Ｃ】ゲニパ・アメリカナジュースと様々なアミノ酸との反応生成物のＨＰＬＣ分析を、アミノ酸によって分類して示す説明図。各アミノ酸のうち、（１９Ｃ）チロシンおよびトリプトファンについて示し、条件は以下のとおりである：実施例６の方法を用いたゲニパ・アメリカナジュースとアミノ酸との反応生成物のＨＰＬＣスペクトル；重合体が同定されるＨＰＬＣ領域の拡大図；および選択したシグナルのＵＶ−ｖｉｓスペクトル。
【図２０】様々なアミノ酸とゲニパ・アメリカナジュースとの反応生成物を、ｐＨ３．０の緩衝液に入れ、２５４ｎｍの紫外線を照射した場合の安定性を示す説明図（半減期で表す）
【図２１】（Ａ）新鮮なゲニパ・アメリカナ果物の中果皮から水抽出したもののＨＰＬＣスペクトル。ゲニピンの保持時間（２２〜２３分）に近い、保持時間が１９〜２０分のピークを持ち、最大吸収波長が２４０ｎｍであり、（Ｂ）２１Ａのものと同じ熟成度であるが、ただし抽出前に室温で３日間放置した、ゲニパ・アメリカナ果物の中果皮（皮）から水抽出したもののＨＰＬＣスペクトル。保持時間が１９〜２０分のピークおよび２２〜２３分のピークを有する。
【図２２】ゲニパ・アメリカナ果物の中果皮（皮）の水抽出物とグリシンから得られる紫色生成物の１Ｈ  ＮＭＲ
【図２３】ゲニパ・アメリカナ果物の中果皮（皮）の水抽出物を予め加熱したものとグリシンを反応させる方法で得られる青色生成物の１Ｈ  ＮＭＲ
【図２４】ゲニパ・アメリカナ（ハグワ（Ｊａｇｕａ））の熟していない果物を示し、果皮（外側の皮）、内果皮（果肉）、および中果皮（皮）の標識が付いている。
【図２５】（Ａ）ゲニピン（２５Ａ）のＣＤ３ＯＤ（水を低減したもの）中の１Ｈ  ＮＭＲ、（Ｂ）中果皮で見られる前駆体（２５Ｂ）のＣＤ３ＯＤ（水を低減したもの）中の１Ｈ  ＮＭＲ
【図２６】（Ａ）の水抽出物（２６Ａ）のＨＰＬＣ特性（２４０ｎｍ）、（Ｂ）水抽出物の酢酸エチル溶媒分配物（２６Ｂ）のＨＰＬＣ特性（２４０ｎｍ）
【図２７】収穫後数日間室内条件に維持したハグワ果物の中果皮の水抽出物のＨＰＬＣ特性（２４０ｎｍ）
【図２８】中果皮の水抽出物の１Ｈ  ＮＭＲ実験結果を示し、図中、アルデヒドピークが存在することが予想される領域を拡大して示す。
【図２９】ハグワ中果皮に見られるゲニピン前駆体の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル
【図３０】ゲニピン（１）およびゲニポシド（２）の化学構造を示す。
【図３１】Ｍｅ−Ｇｌｙ（ゲニパ・アメリカナジュースとグリシンおよびメチオニンとの同時反応）；１＋２（メチオニンとゲニパ・アメリカナジュースの反応、続いてグリシンとの反応）；およびＲＮ（ゲニパ・アメリカナジュースとグリシンのみとの反応）により得られるクロマトグラム
【発明を実施するための形態】
【００３５】
定義
本明細書中使用される場合、「重合体」という用語は、重合により形成される、基本的に繰返し構造単位で構成される、化合物または化学混合物を意味する。
【００３６】
精製重合体は、本明細書中、特定の分子構造および固定された個数の繰返し構造単位を持つ精製された単一種の化合物であると理解することができる。精製重合体は、重合反応で形成された、重合度が様々に異なる（すなわち、繰返し構造単位の個数が異なっている可能性がある）重合体化合物の混合物であるとも理解することができる。
【００３７】
スキーム（scheme）１は、反応体（reactant）１（例えば、ゲニピン、Ｒ１＝Ｍｅ）および反応体２（例えば、グリシン、Ｒ３＝ＣＯＯＨ、Ｒ２およびＲ’２はＨである）の重合反応の例を示す。そうすると、スキーム１に記載の反応による重合体の精製物は、単一種の重合体分子（単一種の式４の重合体分子とは、式中のＴ１、Ｔ２、Ａ、およびｎが固定されていることを意味する）をある特定の純度で（例えば、重合体を重量で７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、または９５％超含有する）含む単離された重合体組成物であることが可能である。スキーム１に記載の反応による重合体の精製物はまた、同じ繰り返し構造単位を共有するが、重合度が様々に異なる（例えば、式４中、重合体化合物は、同じ内容のＡを有するがｎの値は異なる）反応混合物で形成された重合体混合物をある特定の純度で（例えば、重合体を重量で７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、または９５％超含有する）含む単離された重合体組成物であることも可能である。
【００３８】
【化１１】
0006576330.tif 000013
【００３９】
ある特定の実施形態において、重合体は、本明細書中、分子式（例えば、式４）、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩であることを特徴とする。本明細書中使用される場合、「式４の重合体」または式４の複数の重合体は、式４に記載の構造を有する重合体または複数の重合体、あるいはその幾何異性体、その互変異性体、またはその塩であることを意味する。ある特定の実施形態において、重合体は、本明細書中、物理データ（例えば、スペクトルデータ、分子量分布）により特性決定される。重合体を特性決定する方法は、当該分野で既知である。例えば、重合体は、分光学的方法（例えば、ＩＲ、ＵＶ／ｖｉｓ、ＮＭＲ、ＭＳなど）により特性決定することが可能であり；および、重合体の分子量を分析することで、数平均分子量（Ｍｎ）および／または重量平均分子量（Ｍｗ）を得ることができる。
【００４０】
幾何異性体（geometric isomer）という用語は、本明細書中使用される場合、同一の構造を有するが、ただし二重結合における配置が異なる異性体を意味する（すなわち、ＥもしくはＺ異性体、またはシス／トランス異性体）。例示として、スキーム２に、２つの幾何異性体の対を示す。この２つの異性体の唯一の違いは二重結合における配置である。
【００４１】
【化１２】
0006576330.tif 000014
【００４２】
互変異性体（taotomer）または互変異性型異性体という用語は、本明細書中使用される場合、互変異性を通じて相互転換可能な化合物を意味する。互変異性は、当該分野で既知であり、一般に、スキーム３Ａに示すとおりの反応を示す。ほとんどの場合、この反応の基Ｇは、水素である。
【００４３】
【化１３】
0006576330.tif 000015
【００４４】
互変異性体のさらなる例をスキーム３Ｂに示す。スキーム３Ｂは、可能な互変異性体構造の全てを示しているわけではない。
【００４５】
【化１４】
0006576330.tif 000016
【００４６】
スキーム２、３Ａ、および３Ｂで用いた矢印は、例示を目的としており、異性体または互変異性体間の実際の平衡と解釈されることを意図しない。
【００４７】
本明細書中使用される場合、「塩」という用語は、特に記載がないかぎり、内塩または外塩の両方を含むものとする。外塩の例として、カウンターイオンとしてカチオン、例えばアルカリ金属イオン（例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋など）、アルカリ土類金属イオン（例えば、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋など）、アンモニウムイオン（例えば、ＮＨ４＋、または有機アンモニウムイオン）などを有する塩が挙げられる。外塩の例としてまた、カウンターイオンとしてアニオン、例えば無機アニオン（例えば、ＣＩ−、ＳＯ４２−、Ｂｒ−、ＨＳＯ４−、など）または有機アニオン（例えば、カルボン酸アニオン、例えばギ酸アニオン、酢酸アニオンなど）などを有する塩が挙げられる。
【００４８】
本明細書中使用される場合、化合物番号１、２、および３は、実施例の部で記載されるとおりのゲニピンとグリシンの反応から単離された化合物を示す。
【００４９】
本明細書中使用される場合、二量体または二量体化合物は、基本的に２つの単量体からなる化合物を意味する。二量体の例として、化合物番号１、番号２、番号３、ならびに式１Ａ、１Ｂ、２、３Ａ、３Ｂ、２’、３’Ａ、３’Ｂ、３’Ａ（Ｍｅ）、３’Ｂ（Ｍｅ）、６、７、および８の化合物が挙げられる。
【００５０】
本明細書中使用される場合、ある化合物（例えば、第一の付加化合物、第二の付加化合物、またはそれらの組み合わせ）を「実質的に含まない」とは、その化合物の全重量が、参照物（例えば、式４の重合体、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩）の５重量％未満であることを意味する。いくつかの実施形態において、ある化合物を「実質的に」含まないとは、その化合物の全重量が、参照物（例えば、式４の重合体、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩）の４．５重量％未満、４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満、０．１重量％未満、または０．０１重量％未満であることを意味する。いくつかの実施形態において、ある化合物を「実質的に含まない」組成物（例えば、着色剤組成物）とは、その組成物が、その化合物を含まないことを意味する。いくつかの実施形態において、ある化合物を「実質的に含まない」とは、その化合物の全重量が、参照物（例えば、式４の重合体、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩）の、０．０１〜５重量％、０．０１〜４．５重量％、０．０１〜４重量％、０．０１〜３重量％、０．０１〜２重量％、０．０１〜１重量％、０．０１〜０．５重量％、または０．０１〜０．１重量％であることを意味する。
【００５１】
本明細書中使用される場合、「実質的に精製された」または実質的に純粋な化合物（例えば、実質的に精製された重合体、実質的に精製された二量体）という用語は、重量で（例えば、乾燥重量、すなわち、溶媒など（例えば、水、ＣＨ３ＣＮ、ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨなど）の揮発性成分を勘定に入れないで）、８０％超（例えば、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、または９９％超）の純度を有する化合物を意味する。いくつかの実施形態において、実質的に純粋な、式４の重合体、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩は、重合体、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩を、乾燥重量で、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、または９９％超含む。
【００５２】
本明細書中使用される「精製ゲニピン」という用語は、ゲニピンを８０重量％超、８５重量％超、９０重量％超、９５重量％超、または９９重量％超含む物質を示す。同様に、本明細書中使用される「精製グリシン」という用語は、グリシンを８０重量％超、８５重量％超、９０重量％超、９５重量％超、または９９重量％超含む物質を示す。
【００５３】
本開示の着色剤の純度は、既知の分析方法（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析）で測定することができる。すなわち、試料中の化合物（例えば、二量体、重合体）の定量は、ＨＰＬＣ法、例えば、実施例の部で記載される方法と同様なものにより達成することができる。
【００５４】
二量体を含む着色剤組成物
本発明は、ゲニパ・アメリカナのゲニピンとグリシンの反応に由来する着色剤化合物およびその分子構造式、ならびに着色剤化合物を単離する方法を提供する。いくつかの実施形態において、着色剤化合物は、反応で得られる物質をクロマトグラフィーで複数回分画することにより得られる。いくつかの実施形態において、分子構造式は、１Ｈ核磁気共鳴分光法（１Ｈ  ＮＭＲ）、Ｊ変調（ＪＭＯＤ）、Ｈ−Ｈ相関分光（ＣＯＳＹ１Ｈ−１Ｈ）実験、および他の分子構造解析ツールによる分析で決定される。
【００５５】
いくつかの実施形態において、式３Ａの着色剤化合物（本出願において、式３Ａは、化合物番号３についての好適な異性体型のものである）：
【００５６】
【化１５】
0006576330.tif 000017
【００５７】
別の実施形態において、着色剤化合物は、式３Ｂの異性体型を有する（本出願において、式３Ｂは、化合物番号３についての異性体型のものである）：
【００５８】
【化１６】
0006576330.tif 000018
【００５９】
ある特定の実施形態は、式３Ａの着色剤化合物を単離する方法に関する：
【００６０】
【化１７】
0006576330.tif 000019
【００６１】
この場合、本方法は以下を含む：
Ａ．ゲニパ・アメリカナジュースからゲニピンを単離する工程；
Ｂ．グリシンとこのゲニピンを反応させて、メタノール溶解性の材料を得る工程；
Ｃ．メタノール溶解性の材料を、クロマトグラフィーにより、Ｓ１画分、Ｓ２画分、Ｓ３画分、およびＳ４画分へと分離する工程。
Ｄ．Ｓ３画分を、クロマトグラフィーにより、Ｓ３１画分、Ｓ３２画分、Ｓ３３画分、およびＳ３４画分へと再度分離する工程。逆相クロマトグラフィーにより、Ｓ３３画分から、式Ｉの化合物を単離する工程。
【００６２】
次善の好適な実施形態は、式３Ｂの異性体型を有する化合物を単離する方法に関し：
【００６３】
【化１８】
0006576330.tif 000020
【００６４】
本方法は、以下を含む：
Ａ．ゲニパ・アメリカナジュースからゲニピンを単離する工程；
Ｂ．グリシンとこのゲニピンを反応させて、メタノール溶解性の材料を得る工程；
Ｃ．メタノール溶解性の材料を、クロマトグラフィーにより、Ｓ１画分、Ｓ２画分、Ｓ３画分、およびＳ４画分へと分離する工程。
Ｄ．Ｓ３画分を、クロマトグラフィーにより、Ｓ３１画分、Ｓ３２画分、Ｓ３３画分、およびＳ３４画分へと再度分離する工程。
Ｅ．逆相クロマトグラフィーにより、Ｓ３３画分から、式Ｉの化合物を単離する工程。
【００６５】
図３Ａおよび図４Ａは、化合物番号３の好適な異性体型を表す化学式を示す。化合物番号３は、非常に濃い青色着色剤物質である。図３Ｂおよび図４Ｂは、化合物番号３の次善の好適な異性体型を示す。図６は、化合物番号３の核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光特性を示す。化合物番号３のＮＭＲ分光特性の分析結果を以下に示す：
【００６６】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）．δ８．６，８．０，７．９，６．７，３．９０，  １．８ｐｐｍ。
【００６７】
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）．δ１７２．２，１６６．３，１３８．８，１３５．６，１３５．１，１３３．３，１３１．４，１２７．１，１２０．４６，１１８．９，６１．０，５３．３，１１．２ｐｐｍ。
ｍ／ｚ５０５［Ｍ＋Ｈ］
【００６８】
化合物番号３をさらに分析したところ、以下が示された：
【００６９】
化合物３の質量スペクトルは、質量分析法でｍ／ｚ＝５０５［Μ＋Η］＋．を提示したので、これまでに記載された化合物の異性体であることを示している。しかしながら、１Ｈおよび１３ＣＮＭＲスペクトルは、先のものと大きく異なっていた。プロトンスペクトルにおいて、以下の一重項が検出された：δ８．０、δ７．９、およびδ６、７（各シグナルは２Ｈ）ならびにもう１つ、δ８．６の積算して１Ｈになる一重項。他のシグナルとしては、δ４．７の一重項（Ｎ−ＣＨ２）ならびにδ３．９（ＯＣＨ３）およびδ１．８（ＣＨ３ビニル）の２つのメチル基があった。ＪＭＯＤ実験により、以下の炭素原子もまた観測された：δ１７２．２のカルボキシル基、δ１６６．３のメチルエステル（ＣＯＯＨ）、δ１３８．８、δ１３５．１、δ１２７．１、δ１２０．４、δ１１８．９の５個の第四級炭素原子、δ１３５．６、δ１３３．３、δ１３１．４、δ１３１．４の４つのメチン、δ６１．０の１つのメチレン（Ｎ−ＣＨ２）、ならびにδ５３．３（ＯＣＨ３）およびδ１１．２（ＣＨ３ビニル）の２つのメチル基。各単量体単位の構造は、ＨＭＢＣ実験により帰属を行った：δ７．９およびδ８．０のシグナルは、ピリジル基のプロトンであると帰属された、なぜなら、δ６１．０でのＮ−メチレン基との長距離相関が検出されたからである；さらに、最後のプロトンは、δ１７２．２で、メチルエステルカルボニルとの３Ｊカップリングを示している。加えて、他の重要なカップリングが、δ１３１．４（Ｃ−７）の一重項とメチル基のプロトンの間で示された。芳香族およびビニルプロトンの量が少ないことから、図３Ａ〜図３Ｂに示すような対称二量体分子が存在することが示された。メチルエステル基の相対的な方向に従ってこの分子を２種の構造に帰属させることが可能である（図３Ａ〜図３Ｂ）が、またしても、構造Ｂは立体障害により可能性が低い。
【００７０】
別の実施形態において、着色剤化合物番号３を単離する方法は、以下を含む：
Ａ．ゲニパ・アメリカナジュースからゲニピンを単離する工程；
Ｂ．グリシンとこのゲニピンを反応させて、メタノール溶解性の材料を得る工程；
Ｃ．メタノール溶解性の材料を、クロマトグラフィーにより、Ｓ１画分、Ｓ２画分、Ｓ３画分、およびＳ４画分へと分離する工程。
Ｄ．Ｓ３画分を、クロマトグラフィーにより、Ｓ３１画分、Ｓ３２画分、Ｓ３３画分、およびＳ３４画分へと再度分離する工程（図７）。逆相クロマトグラフィーにより、Ｓ３３画分から、式Ｉの化合物を単離する工程。
【００７１】
本出願において、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、ならびにＳ３１、Ｓ３２、Ｓ３３およびＳ３４という用語は、方法で記載される工程に由来する画分を指定するためのものである。しかしながら、これらの用語（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、ならびにＳ３１、Ｓ３２、Ｓ３３、およびＳ３４）は、Ｓ３と同様な画分およびＳ３由来画分（図７に示すものと同様なＮＭＲ分光分析結果のもの）がもたらされる同様なクロマトグラフィー工程により得られる任意の画分を包含し、その画分はゲニピンとグリシンの反応に由来するものであり得る。図７は、Ｓ３画分に由来するＳ３１画分、Ｓ３２画分、Ｓ３３画分、およびＳ３４画分のＮＭＲ分光分析を示す。
【００７２】
いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、ゲニピンとグリシンの反応から単離された、実質的に純粋な、式１Ａ、１Ｂ、２、３’Ａ（Ｍｅ）、および３’Ｂ（Ｍｅ）の化合物を含む。
【００７３】
いくつかの実施形態において、着色剤化合物番号３を単離する方法は、以下を含む：
Ａ．ゲニパ・アメリカナジュースからゲニピンを単離する工程；
Ｂ．グリシンとこのゲニピンを反応させて、メタノール溶解性の材料を得る工程；
Ｃ．メタノール溶解性の材料を、クロマトグラフィーにより、Ｓ１画分、Ｓ２画分、Ｓ３画分、およびＳ４画分へと分離する工程。
Ｄ．Ｓ３画分を、クロマトグラフィーにより、Ｓ３１、Ｓ３２、Ｓ３３、およびＳ３４画分へと再度分離する工程（図７）。逆相クロマトグラフィーにより、Ｓ３３画分から、化合物３を単離する工程。
【００７４】
本出願の目的に関して、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、およびＳ３１、Ｓ３２、Ｓ３３、Ｓ３４、およびＭ２Ｓ１Ｒ、Ｍ２Ｓ２Ｒ、Ｍ２Ｓ３Ｒ、Ｍ２Ｓ４Ｒ、ならびにｉ１およびｉ２という用語は、方法で記載される工程に由来する画分を指定するためのものである。しかしながら、これらの用語（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、ならびにＳ３１、Ｓ３２、Ｓ３３、およびＳ３４）は、Ｓ３と同様な画分およびＳ３由来画分（図７に示すものと同様なＮＭＲ分光分析結果のもの）がもたらされる同様なクロマトグラフィー工程により得られる任意の画分を包含し、その画分はゲニピンとグリシンの反応に由来するものであり得る。図７は、Ｓ３画分に由来するＳ３１画分、Ｓ３２画分、Ｓ３３画分、およびＳ３４画分のＮＭＲ分光分析を示す。
【００７５】
ある特定の実施形態は、実質的に精製された、式３’Ａ（Ｍｅ）または式３’Ｂ（Ｍｅ）の化合物、その幾何異性体、その互変異性体、その塩、またはそれらの組み合わせに関する：
【００７６】
【化１９】
0006576330.tif 000021
【００７７】
ある特定の実施形態は、実質的に精製された、式１Ａまたは式ＩＢの化合物、その幾何異性体、その互変異性体、その塩、またはそれらの組み合わせに関する；
【００７８】
【化２０】
0006576330.tif 000022
【００７９】
重合体を含む組成物
ある特定の実施形態において、本開示の精製重合体（例えば、式４の重合体、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩）は、そのものを単独のまたは主要着色剤として、または別の着色剤（例えば、式１Ａ、１Ｂ、２、３Ａ、３Ｂ、２’、３’Ａ、３’Ｂ、３’Ａ（Ｍｅ）、３’Ｂ（Ｍｅ）の二量体、またはそれらの任意の組み合わせ）と組み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態において、本開示の精製重合体（例えば、式４の重合体、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩）は、重合体を希釈剤（例えば、水）と混合することにより希釈することができる。いくつかの実施形態において、本開示の精製重合体（例えば、式４の重合体、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩）は、重合体および希釈剤（例えば、メタノール、水、などの溶媒）を含む組成物から、希釈剤を除去することにより濃縮することができる。
【００８０】
いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、式４の重合体：
【００８１】
【化２１】
0006576330.tif 000023
【００８２】
その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩、
を含み、
式中、ｎは２〜２００の整数であり；
式中、各Ａは、独立して、式５Ａ、式５Ｂ、式５Ｃ、それらの幾何異性体、それらの互変異性体、それらの塩、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され：
【００８３】
【化２２】
0006576330.tif 000024
【００８４】
式中：
Ｒ１は、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、またはｔｅｒｔ−ブチルであり；
Ｒ２およびＲ’２は、それぞれ独立して、水素またはＣ１−１０アルキルであり；
Ｒ３は、水素またはＣＯＯＨであり；
かつ、式中、Ｔ１は、水素またはメチル基であり；かつＴ２は、水素またはＡ−Ｔ１であり、式中ＡおよびＴ１は、上記で定義され；
この場合、着色剤組成物は、式６、式７、式８、それらの幾何異性体、それらの互変異性体、およびそれらの塩からなる群より選択される第一の付加化合物を実質的に含まない：
【００８５】
【化２３】
0006576330.tif 000025
【００８６】
いくつかの実施形態において、Ｒ３はＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ３は、ＣＯＯＨである。
【００８７】
いくつかの実施形態において、Ｒ２およびＲ’２のうち１つは水素である。いくつかの実施形態において、Ｒ２およびＲ’２は両方とも水素である。いくつかの実施形態において、Ｒ２およびＲ’２のうち１つは水素であり；Ｒ２およびＲ’２の残りの１つは、無置換のＣ１−１０直鎖アルキル鎖（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルなど）、または１−３メチル基（イソプロピル、イソブチル、イソペンチル、など）で置換されたＣ１−１０直鎖アルキル鎖である。
【００８８】
いくつかの実施形態において、
【００８９】
【化２４】
0006576330.tif 000026
【００９０】
は、アミノ酸残基（Ｒ３はＣＯＯＨであり、Ｒ２および／またはＲ’２は、側鎖を表す）を表す。いくつかの実施形態において、アミノ酸残基は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、システイン、トレオニン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、タウリン、カルニチン、オルニチン、シトルリン、またはグルタミンの残基である。いくつかの実施形態において、アミノ酸残基は、グリシン残基である。
【００９１】
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、またはｔｅｒｔ−ブチルが可能であり、例えば、Ｒ１は、水素、メチル、またはエチルが可能である；またはＲ１は、メチルが可能である。
【００９２】
いくつかの実施形態において、Ｔ１は、水素またはメチルが可能である。
【００９３】
いくつかの実施形態において、ｎは、２〜２００、２〜１５０、２〜１００、２〜５０、２〜２５、２〜２０、２〜１５、２〜１０、または２〜５である。
【００９４】
いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、式４の重合体：
【００９５】
【化２５】
0006576330.tif 000027
【００９６】
その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩、
を含み、
式中、ｎは、２〜２０の整数であり；
式中、各Ａは、独立して、式５’Ａ、式５’Ｂ、式５’Ｃ、それらの幾何異性体、それらの互変異性体、それらの塩、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され：
【００９７】
【化２６】
0006576330.tif 000028
【００９８】
式中：
Ｒ１は、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、またはｔｅｒｔ−ブチルであり；かつ、式中、Ｔ１は、水素またはメチル基であり；かつＴ２は、水素またはＡ−Ｔ１であり、式中ＡおよびＴ１は、上記で定義され；
この場合、着色剤組成物は、式２’、式３’Ａ、式３’Ｂ、それらの幾何異性体、それらの互変異性体、およびそれらの塩からなる群より選択される第一の付加化合物を実質的に含まない：
【００９９】
【化２７】
0006576330.tif 000029
【０１００】
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、メチルである。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、適切な式４の重合体、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩は、様々な繰返し単位（すなわち、異なる「Ａ」が式４に存在する）、様々な末端基（例えば、異なるＴ１、Ｔ２、または両方）、および／または様々な鎖長を有する。別の実施形態において、適切な式４の重合体、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩は、特徴的なＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトル（例えば、最大吸収波長（λｍａｘ））、ＮＭＲスペクトル、ＩＲスペクトル、平均分子量（例えば、数平均分子量（Ｍｎ））、またはそれらの組み合わせを有するものを含む。別の実施形態において、適切な式４の重合体、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩は、ある特定レベルの純度を有するものを含む。
【０１０２】
重合体構造
いくつかの実施形態において、式４の重合体の各Ａは、それぞれ独立して、式５’Ａ、式５’Ｂ、式５’Ｃ、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩である。いくつかの実施形態において、式４の重合体の各Ａは、式５’Ａ、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩である。いくつかの実施形態において、式４の重合体の各Ａは、式５’Ｂ、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩である。いくつかの実施形態において、式４の重合体の各Ａは、式５’Ｃ、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩である。他の実施形態において、式４の重合体は、式５’Ａおよび式５’Ｂ両方、式５’Ａおよび式５’Ｃ両方、式５’Ｂおよび式５’Ｃ両方、または式５’Ａ、式５’Ｂ、および式５’Ｃを含む繰返し単位を含むことができる。
【０１０３】
様々なＲ１基（例えば、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、またはｔｅｒｔ−ブチル）を持つ式４の重合体が、青色着色剤化合物として有用である。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、水素、メチル、またはエチルが可能である。いくつかの実施形態において、式４の重合体の各Ａは、式５’Ａ、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩であり、式５’ＡのＲ１は、水素である。いくつかの実施形態において、式４の重合体の各Ａは、式５’Ａ、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩であり、式５’ＡのＲ１は、メチルである。いくつかの実施形態において、式４の重合体の各Ａは、式５’Ａ、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩であり、式５’ＡのＲ１は、エチルである。いくつかの実施形態において、式４の重合体の各Ａは、式５’Ｂ、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩であり、式５’ＢのＲ１は、水素である。いくつかの実施形態において、式４の重合体の各Ａは、式５’Ｂ、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩であり、式５’ＢのＲ１は、メチルである。いくつかの実施形態において、式４の重合体の各Ａは、式５’Ｂ、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩であり、式５’ＢのＲ１は、エチルである。いくつかの実施形態において、式４の重合体の各Ａは、式５’Ｃ、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩であり、式５’ＣのＲ１は、水素である。いくつかの実施形態において、式４の重合体の各Ａは、式５’Ｃ、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩であり、式５’ＣのＲ１は、メチルである。いくつかの実施形態において、式４の重合体の各Ａは、式５’Ｃ、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩であり、式５’ＣのＲ１は、エチルである。
【０１０４】
本開示はまた、異なる末端基を持つ式４の重合体も提供する。いくつかの実施形態において、適切な末端基は、スキーム１に示す反応に従って形成されるもののいずれかである。いくつかの実施形態において、Ｔ１は、水素またはメチル基であり；かつＴ２は、水素またはＡ−Ｔ１であり、式中ＡおよびＴ１は、本明細書中記載されている。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、重合度が様々に異なる式４の精製重合体、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩は、本開示に開示される様々な用途に適している。いくつかの実施形態において、式４のｎは、２〜２０、２〜１８、２〜１６、２〜１４、２〜１２、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜４、４〜２０、４〜１８、４〜１６、４〜１４、４〜１２、４〜１０、４〜８、４〜６、６〜２０、６〜１８、６〜１６、６〜１４、６〜１２、６〜１０、６〜８、８〜２０、８〜１８、８〜１６、８〜１４、８〜１２、８〜１０、１０〜２０、１０〜１８、１０〜１６、１０〜１４、または１０〜１２の整数である。いくつかの実施形態において、精製重合体が精製された単独種の一般式４の化合物である場合、式４のｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である。
【０１０６】
重合体の特性決定
ある特定の実施形態において、ある特定の特性を有する重合体（例えば、式４の重合体、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩）は、着色剤組成物に使用するのに適している。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、重合体は、ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルにおいて約５８０〜約６１０ｎｍの範囲に最大吸収波長（λｍａｘ）を有する。いくつかの実施形態において、重合体は、約５８０、約５８５、約５９０、約５９５、約６００、約６０５、または約６１０ｎｍの最大吸収波長（λｍａｘ）を有する。いくつかの実施形態において、重合体は、約５８０ｎｍ未満（例えば、約５７０、約５６０ｎｍなど）の最大吸収波長（λｍａｘ）を有する。いくつかの実施形態において、重合体は、約６１０ｎｍ超（例えば、約６２０、約６３０ｎｍなど）の最大吸収波長（λｍａｘ）を有する。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、重合体は、約１０．３分のＨＰＬＣ保持時間（例えば、実施例６に記載の方法により分析した場合）を有することを特徴とする。いくつかの実施形態において、重合体は、２４０ｎｍでの吸収と比較して５９０ｎｍでの吸収の方が強いことを特徴とする。いくつかの実施形態において、重合体は、図１３Ｃのスペクトルと実質的に同一なＨＰＬＣトレースを有することを特徴とする。
【０１０９】
ある特定の実施形態において、様々に異なる平均分子量を有する式４の重合体、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩は、着色剤組成物に使用するのに適している。いくつかの実施形態において、重合体は、約１０００〜約２０，０００の範囲の平均分子量を有する。いくつかの実施形態において、重合体は、約３０００〜約１５，０００、または約３０００〜約１０，０００の範囲の平均分子量を有する。いくつかの実施形態において、重合体は、約４，５００〜約７，５００の範囲の平均分子量を有する。いくつかの実施形態において、重合体は、約５０００、約５５００、約６０００、約６５００、または約７０００の平均分子量を有する。いくつかの実施形態において、重合体は、約６０００の平均分子量を有する。いくつかの実施形態において、平均分子量は、数平均分子量（Ｍｎ）である。いくつかの実施形態において、平均分子量は、重量平均分子量（Ｍｗ）である。いくつかの実施形態において、平均分子量は、当該分野で既知の任意の平均分子量、例えば粘度平均分子量（Ｍｖ）、Ｚ平均分子量（Ｍｚ）などである。平均分子量（例えば、Ｍｎ、Ｍｗ、Ｍｖ、またはＭｚ）を測定および／または計算する方法は、当該分野で既知である。
【０１１０】
ある特定の実施形態において、指定されたＩＲ吸収を有する重合体は、着色剤組成物に使用するのに適している。いくつかの実施形態において、重合体は、以下のピーク（±５ｃｍ−１）を有するＩＲスペクトルを特徴とする：３３９３、２９４９、１７２６、１６３０、および１５４０ｃｍ−１。いくつかの実施形態において、重合体は、図１２に示すスペクトルと実質的に同一のＩＲスペクトルを有することを特徴とする。いくつかの実施形態において、重合体は、以下のピーク（±５ｃｍ−１）を有するＩＲスペクトル：３３９３、２９４９、１７２６、１６３０、および１５４０ｃｍ−１、または図１２に示すスペクトルと実質的に同一のＩＲスペクトルを有することを特徴とする。
【０１１１】
１Ｈ  ＮＭＲは、重合体を特性決定する別の分光学的方法である。いくつかの実施形態において、重合体は、図９に示すとおりの１Ｈ  ＮＭＲを有する。いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、重合体を含み、この重合体の１Ｈ  ＮＭＲは、図９のスペクトルと実質的に同一である。いくつかの実施形態において、重合体は、図９のスペクトルと実質的に同一である１Ｈ  ＮＭＲおよび／または図１２のスペクトルと実質的に同一であるＩＲスペクトルを有する。
【０１１２】
質量分析法は、重合体を特性決定するさらに別の方法である。いくつかの実施形態において、ｍ／ｅが７０１および／または４７５のＭＳ断片を有する重合体は、青色着色剤組成物に使用するのに適している。いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、７０１または４７５のＭＳ断片（ｍ／ｅ）を有することを特徴とする重合体を含む。いくつかの実施形態において、重合体は、７０１および４０５のＭＳ断片（ｍ／ｅ）を有することを特徴とする。いくつかの実施形態において、７０１および４０５のＭＳ断片（ｍ／ｅ）は、それぞれ、式９の左側および右側に該当する。
【０１１３】
【化２８】
0006576330.tif 000030
【０１１４】
いくつかの実施形態において、重合体は、７０１および４７５のＭＳ断片（ｍ／ｅ）を有するとともに、図９のスペクトルと比較して実質的に同一である１Ｈ  ＮＭＲも有することを特徴とする。いくつかの実施形態において、重合体は、さらに、図１２のスペクトルと実質的に同一であるＩＲスペクトルを有することを特徴とする。いくつかの実施形態において、重合体は、図１１に示されるものと実質的に同一の質量特性を有することを特徴とする。いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、式６、７、または８の第一の付加化合物を実質的に含まない。
【０１１５】
重合体の純度
ある特定の実施形態において、適切な重合体として、例えば、本明細書中記載されるものである特定のレベルの純度を持つものが挙げられる。いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、式４の重合体を含み、この場合の着色剤組成物は、式６、式７、式８、それらの幾何異性体、それらの互変異性体、およびそれらの塩からなる群より選択される第一の付加化合物を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、式２’、式３’Ａ、式３’Ｂ、それらの幾何異性体、それらの互変異性体、およびそれらの塩からなる群より選択される第一の付加化合物を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、式２、式３’Ａ（Ｍｅ）、式３’Ｂ（Ｍｅ）、それらの幾何異性体、それらの互変異性体、およびそれらの塩からなる群より選択される第一の付加化合物を実質的に含まない：
【０１１６】
【化２９】
0006576330.tif 000031
【０１１７】
いくつかの実施形態において、第一の付加化合物の全重量は、重合体の４．５重量％未満、４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満、０．１％重量％未満、または０．０１重量％未満である。いくつかの実施形態において、第一の付加化合物の全重量は、重合体の１重量％未満である。いくつかの実施形態において、第一の付加化合物の全重量は、重合体の０．１重量％未満である。他の実施形態において、第一の付加化合物の全重量は、重合体の０．０１重量％未満である。いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、第一の付加化合物を含まない。いくつかの実施形態において、第一の付加化合物の全重量は、重合体の０．０１〜５重量％、０．０１〜４．５重量％、０．０１〜４重量％、０．０１〜３重量％、０．０１〜２重量％、０．０１〜１重量％、０．０１〜０．５重量％、または０．０１〜０．１重量％である。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、式４の重合体を含み、この場合の着色剤組成物は、式１Ａ、式１Ｂ、それらの幾何異性体、それらの互変異性体、およびそれらの塩からなる群より選択される第二の付加化合物を実質的に含まない：
【０１１９】
【化３０】
0006576330.tif 000032
【０１２０】
いくつかの実施形態において、第二の付加化合物の全重量は、重合体の１重量％未満である。いくつかの実施形態において、第二の付加化合物の全重量は、重合体の０．１重量％未満である。他の実施形態において、第二の付加化合物の全重量は、重合体の０．０１重量％未満である。いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、第二の付加化合物を含まない。いくつかの実施形態において、第二の付加化合物の全重量は、重合体の０．０１〜５重量％、０．０１〜４．５重量％、０．０１〜４重量％、０．０１〜３重量％、０．０１〜２重量％、０．０１〜１重量％、０．０１〜０．５重量％、または０．０１〜０．１重量％である。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、第一の付加化合物を実質的に含まない着色剤組成物は、さらに、第二の付加化合物も実質的に含まない。重合体の重量に対する第一または第二の付加化合物の適切な重量パーセンテージは、本明細書中記載される。いくつかの実施形態において、第一および第二の付加化合物をまとめた重量は、重合体の５重量％未満（例えば、４．５重量％未満、４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満、０．１重量％未満、０．０１重量％未満）である。いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、第一および第二の付加化合物を含まない。いくつかの実施形態において、第一および第二の付加化合物の全重量は、重合体の０．０１〜５重量％、０．０１〜４．５重量％、０．０１〜４重量％、０．０１〜３重量％、０．０１〜２重量％、０．０１〜１重量％、０．０１〜０．５重量％、または０．０１〜０．１重量％である。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、式４の重合体を含み、この重合体の他には、５８０〜６１０ｎｍの範囲に最大吸収波長（λｍａｘ）を有する化合物を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、式４の重合体以外の５８０〜６１０ｎｍの範囲に最大吸収波長（λｍａｘ）を有する化合物の全重量は、重合体の５重量％未満（例えば、４．５重量％未満、４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満、０．１重量％未満、０．０１重量％未満）である。いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、式４の重合体の他には、５８０〜６１０ｎｍの範囲に最大吸収波長（λｍａｘ）を有する化合物を含まない。いくつかの実施形態において、式４の重合体以外の５８０〜６１０ｎｍの範囲に最大吸収波長（λｍａｘ）を有する化合物の全重量は、重合体の０．０１〜５重量％、０．０１〜４．５重量％、０．０１〜４重量％、０．０１〜３重量％、０．０１〜２重量％、０．０１〜１重量％、０．０１〜０．５重量％、または０．０１〜０．１重量％である。
【０１２３】
ある特定の実施形態は、実質的に精製された式４の重合体、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩に関する。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、実質的に精製された重合体は、以下：
【０１２５】
【化３１】
0006576330.tif 000033
【０１２６】
その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩、
を含み、
式中、ｎは、２〜２０の整数であり；
式中、各Ａは、式５’Ａ（Ｍｅ）のもの、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩であり：
【０１２７】
【化３２】
0006576330.tif 000034
【０１２８】
式中、Ｔ１は、水素またはメチル基であり；かつＴ２は、水素またはＡ−Ｔ１であり、式中、ＡおよびＴ１は、上記で定義される。いくつかの実施形態において、実質的に精製された重合体は、本明細書中記載される平均分子量を有する（例えば、約６，０００の数平均分子量（Ｍｎ）を有する）ことを特徴とする。いくつかの実施形態において、実質的に精製された重合体は、本明細書中記載されるＩＲスペクトル（例えば、以下のピーク（±５ｃｍ−１）を有するＩＲスペクトル：３３９３、２９４９、１７２６、１６３０、および１５４０ｃｍ−１）を有することを特徴とする。いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、式４の重合体を含み、この場合の着色剤組成物は、炭水化物、例えば、糖類を含まない、または実質的に含まない。いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、炭水化物を含まず、他の不純物（例えば、単量体、二量体、脂肪酸、脂肪、タンパク質、または有機酸など）を少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％含まない。
【０１２９】
精製重合体を調製する方法
ある特定の実施形態において、本開示の重合体は、スキーム１に開示されるとおり、ゲニピン誘導体（例えば、ゲニピン）とアミン（例えば、グリシン）を反応させることで調製される。いくつかの実施形態において、精製重合体は、スキーム１に開示されるとおり、ゲニピン誘導体（例えば、ゲニピン）とアミン（例えば、グリシン）を反応させた混合物を精製することで得られる。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、重合体は、ゲニピンとアミンを反応させることで調製される。いくつかの実施形態において、重合体は、ゲニピンと第一級アルキルアミン（例えば、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、または他のＣ１−１０第一級アミンなど）を反応させることで調製される。いくつかの実施形態において、重合体は、ゲニピンと第二級アルキルアミン（例えば、イソプロピルアミン、または他のＣ１−１０第二級アミンなど）を反応させることで調製される。いくつかの実施形態において、重合体は、ゲニピンとアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、リシン、チロシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニンなど）を反応させることで調製される。いくつかの実施形態において、重合体は、ゲニピンとグリシンを反応させることで調製される。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、ゲニピンは、精製ゲニピン、またはゲニピン含有ジュースである。いくつかの実施形態において、本開示の重合体は、精製ゲニピン（例えば、８０重量％超、８５重量％超、９０重量％超、９５重量％超、または９９重量％超）とグリシンの反応により形成された生成物である。いくつかの実施形態において、本開示の重合体は、グリシンとゲニピン含有ジュースの反応から得られた生成物を精製したものである。いくつかの実施形態において、ゲニピン含有ジュースは、果汁である。いくつかの実施形態において、果汁は、ゲニパ・アメリカナに由来する。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、グリシンは、精製グリシンである。いくつかの実施形態において、グリシンは、グリシン含有混合物（例えば、グリシン含有ジュース、またはグリシン含有乾燥混合物、たとえばグリシン含有ジュースを濃縮したもの）である。いくつかの実施形態において、グリシンは、グリシン含有ジュース（例えば、スイカ、白ブドウ、パイナップル、ライチ、マスクメロン、バナナ、オレンジ、リンゴ、ナシ、レモン、パッションフルーツ、赤ブドウ、ブルーベリー、タマリンド、モモ、パパイヤ、アサイー、プラム、グアバ、タンジェリン、ボロホ、クプアス、クコ、またはキウィなどに由来するジュースなどの果汁）である。いくつかの実施形態において、グリシンは、スイカに由来するグリシン含有ジュースである。いくつかの実施形態において、グリシンは、新鮮なスイカに由来するグリシン含有ジュースである。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、重合体は、スイカ由来のジュースとゲニピンの反応に由来する。いくつかの実施形態において、重合体は、スイカ由来のジュースとゲニパ・アメリカナ由来のジュースの反応に由来する。いくつかの実施形態において、重合体は、スイカ由来のジュースと精製ゲニピン（例えば、８０重量％超、８５重量％超、９０重量％超、９５重量％超、または９９重量％超）の反応に由来する。
【０１３４】
ある特定の実施形態は、ゲニピンとアミンの反応混合物から重合体を単離する方法に関する。いくつかの実施形態において、本方法は、（ａ）ゲニピンとアミンの反応に由来する青色混合物に、溶媒（例えば、メタノール）を用いて抽出を行い、溶解性画分および不溶性画分とする工程；ならびに（ｂ）不溶性画分を精製する工程、を含む。いくつかの実施形態において、精製工程（ｂ）は、不溶性画分をＨＰＬＣ精製に供する工程を含む。
【０１３５】
ある特定の実施形態は、ゲニピンとグリシンの反応混合物から重合体を単離する方法に関する。いくつかの実施形態において、本方法は、（ａ）ゲニピンとグリシンの反応に由来する青色混合物に、メタノールを用いて抽出を行い、メタノール溶解性画分およびメタノール不溶性画分とする工程；ならびに（ｂ）メタノール不溶性画分を精製する工程、を含む。いくつかの実施形態において、青色混合物は、精製ゲニピン（例えば、８０重量％超、８５重量％超、９０重量％超、９５重量％超、または９９重量％超）とグリシンの反応に由来する。いくつかの実施形態において、青色混合物は、グリシンとゲニパ・アメリカナ由来のジュースの反応に由来する。いくつかの実施形態において、青色混合物は、ゲニピンとグリシンの反応に由来する乾燥粉末（例えば、凍結乾燥粉末）である。いくつかの実施形態において、精製工程は、不溶性画分をＨＰＬＣ精製に供する工程を含む。いくつかの実施形態において、ＨＰＬＣ精製は、逆相ＨＰＬＣ精製である。いくつかの実施形態において、精製工程（ｂ）は、実施例の部に開示される精製工程と同様である。いくつかの実施形態において、精製方法は、本明細書中記載されるとおりの精製重合体をもたらす。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、着色剤生成物は、本明細書中記載される方法により生成される。いくつかの実施形態において、着色剤生成物は、（ａ）ゲニピンとグリシンの反応に由来する青色混合物に、メタノールを用いて抽出を行い、メタノール溶解性画分およびメタノール不溶性画分とする工程；ならびに（ｂ）メタノール不溶性画分を精製して着色剤生成物を得る工程、により生成される。いくつかの実施形態において、青色混合物は、ゲニピンとグリシンの反応に由来する乾燥粉末（例えば、凍結乾燥粉末）である。いくつかの実施形態において、着色剤生成物は、本明細書中開示される式６、７、または８の化合物いずれも実質的に含まない。いくつかの実施形態において、着色剤生成物は、（ａ）図９に示すものと実質的に同一なＮＭＲスペクトル；（ｂ）以下のピークを有するＩＲスペクトル（±５ｃｍ−１）：３３９３、２９４９、１７２６、１６３０、および１５４０ｃｍ−１；（ｃ）約６，０００の平均分子量（例えば、数平均分子量（Ｍｎ））；（ｄ）７０１および／または４７５のＭＳ断片を示すＭＳスペクトル；または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせを有することにより特性決定することができる。
【０１３７】
炭水化物を実質的に含まない着色剤組成物
ある特定の実施形態は、精製重合体（例えば、式４の重合体）を含む着色剤組成物に関し、この場合の着色剤組成物は、炭水化物（例えば、単糖類、二糖類、少糖類、または多糖類）を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、炭水化物は、糖（例えば、単糖類および二糖類）である。いくつかの実施形態において、炭水化物を実質的に含まない着色剤組成物は、他の不純物（例えば、式１Ａ、１Ｂ、２、３Ａ、または３Ｂの二量体）も実質的に含まない。いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、炭水化物を含まない、例えば、着色剤組成物は、例えば、実施例７に記載の方法により検出可能な炭水化物をまったく含有しない。「炭水化物」および「糖」という用語は、本明細書中、他に何か区別がないかぎり、同義に用いられる。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、炭水化物を含まないまたは実質的に含まない着色剤組成物として、精製重合体以外の追加材料（例えば、単量体、二量体、脂肪酸、脂肪、タンパク質、または有機酸）を含む組成物が挙げられる。いくつかの実施形態において、炭水化物を含まないまたは実質的に含まない着色剤組成物は、さらに、追加化合物（例えば、式１Ａ、１Ｂ、２、３Ａ、または３Ｂの二量体、追加着色剤（例えば、ＦＤＡに認可された着色添加物））を含む。いくつかの実施形態において、炭水化物を含まないまたは実質的に含まない着色剤組成物は、例えば、単量体、二量体（例えば、式１Ａ、１Ｂ、２、３Ａ、または３Ｂの二量体）、追加着色剤（例えば、ＦＤＡに認可された着色添加物）、脂肪酸、脂肪、タンパク質、または有機酸も、含まないまたは実質的に含まない。いくつかの実施形態において、炭水化物を含まないまたは実質的に含まない着色剤組成物は、炭水化物を実質的に含まない精製重合体と炭水化物を実質的に含まない追加化合物（例えば、式１Ａ、１Ｂ、２、３Ａ、または３Ｂの二量体、追加着色剤（例えば、ＦＤＡに認可された着色添加物））を混合する工程を含むプロセスにより調製される。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、精製重合体は、ゲニピンとグリシンの反応に由来する。いくつかの実施形態において、精製重合体は、精製ゲニピン（例えば、８０重量％超、８５重量％超、９０重量％超、９５重量％超、または９９重量％超）とグリシンの反応に由来する。いくつかの実施形態において、精製ゲニピンは、ゲニパ・アメリカナに由来する。いくつかの実施形態において、精製重合体は、ゲニピン含有ジュースとグリシンの反応に由来する。いくつかの実施形態において、精製重合体は、果汁（例えば、ゲニパ・アメリカナ由来のジュース、ゲニパ・アメリカナ由来のゲニピン濃縮ジュース））とグリシンの反応に由来する。いくつかの実施形態において、精製重合体は、ゲニピンとグリシン含有ジュース（例えば、スイカジュースなどの果汁および本明細書中記載される他のもの）の反応に由来する。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、精製重合体は、例えば、実施例６に記載の方法により分析した場合に、約１０．３分のＨＰＬＣ保持時間を有することを特徴とする。いくつかの実施形態において、精製重合体は、２４０ｎｍでの吸収と比較して５９０ｎｍでの吸収の方が強いことを特徴とする。いくつかの実施形態において、精製重合体は、図１３Ｃのスペクトルと実質的に同一のＨＰＬＣトレースを有することを特徴とする。
【０１４１】
ある特定の実施形態は、炭水化物を実質的に含まない着色剤組成物を調製する方法に関する。いくつかの実施形態において、本方法は、以下を含む：粗着色剤組成物をカラムクロマトグラフィー（例えば、分子ふるいカラムクロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣなど）で精製する工程；炭水化物の存在について画分を分析する工程（例えば、薄層クロマトグラフィーにより）；および炭水化物を実質的に含まない画分を収集する工程。いくつかの実施形態において、粗着色剤組成物は、ゲニピン（例えば、精製ゲニピン、ゲニパ・アメリカナ由来のジュース、ゲニピン濃縮ジュース、ゲニパ・アメリカナ由来のゲニピン濃縮ジュース）とグリシンの反応に由来する。いくつかの実施形態において、本方法は、図１３Ａ、１３Ｂ、または１３Ｃのスペクトルと実質的に同一のＨＰＬＣトレースを有する着色剤組成物を生成する。いくつかの実施形態において、本方法は、図１３Ｃのスペクトルと実質的に同一のＨＰＬＣトレースを有する着色剤組成物を生成する。
【０１４２】
ある特定の実施形態は、糖を含まない着色剤組成物を生成する方法に関する。いくつかの実施形態において、本方法は、以下：（ａ）ゲニパ・アメリカナジュースと、グリシン、バリン、リシン、メチオニン、プロリン、チロシン、トリプトファン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸を混合する工程；（ｂ）（ａ）の混合物から糖を除去する工程；および（ｃ）（ｂ）の糖を含まない生成物から着色剤組成物を単離する工程を含み、本方法で得られる着色剤組成物の強度は、糖を除去していない工程（ａ）の混合物から得られる着色剤組成物の強度より、例えば少なくとも２倍、高い。いくつかの実施形態において、着色剤組成物の強度は、ある特定の波長（例えば、着色剤組成物のλｍａｘで、５８０〜６１０ｎｍの範囲の波長で、５９０ｎｍの波長で、など）でのＵＶ−ｖｉｓ吸光度により測定される。いくつかの実施形態において、重合体含有量は、パーセンテージ％（ｇ／試料１００ｇ）であってＨＰＬＣ測定により決定され、呈色強度は、分光光度計を用いて決定される（例えば、０．６の吸光度値）。いくつかの実施形態において、本方法は、発酵、カラムクロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）、逆浸透濾過、限外濾過、精密濾過、透析（例えば、浸透圧勾配を利用する透析方法）、樹脂を介した分離（例えば、ＸＡＤ４、ＸＡＤ７、もしくはＸＡＤ８樹脂を介した分離）、またはそれらの任意の組み合わせにより、糖を（例えば、ゲニパ・アメリカナジュースとアミノ酸（例えば、グリシン、バリン、リシン、メチオニン、プロリン、チロシン、トリプトファン、それらの組み合わせ）の反応混合物から）除去する工程を含む。ある特定の実施形態において、発酵生成物の微生物学的安定性は、含まれる糖、例えば、中温性微生物病原体（真菌および酵母菌など）を容易に発生させることができるものを除去することにより改善される。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、本方法は、発酵により糖を除去する工程を含む。いくつかの実施形態において、発酵は、酵母菌（例えば、天然酵母菌、遺伝子修飾された酵母菌、例えば、糖分解の効率が向上したものなど）または細菌（遺伝子修飾された、糖分解の効率が向上した細菌を含む）を用いて行われる。いくつかの実施形態において、酵母菌または細菌は、固定されている（例えば、固体支持体に固定されている；マイクロカプセルに封入されている）。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、着色剤組成物を調製する方法は、以下：（ａ）ゲニパ・アメリカナジュースと、グリシン、バリン、リシン、メチオニン、プロリン、チロシン、トリプトファン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸を混合する工程；（ｂ）工程（ａ）の混合物を滅菌する工程；（ｃ）工程（ｂ）の滅菌混合物に酵母菌または細菌を播種する工程；（ｄ）工程（ｃ）の播種混合物を、発酵条件下でインキュベートして、発酵生成物を生成させる工程；および（ｅ）クレーム（ｄ）の発酵生成物から着色剤組成物を単離する工程を含み、本方法で得られる着色剤組成物の強度は、発酵していない工程（ａ）の混合物から得られる着色剤組成物の強度より、例えば少なくとも２倍、高い。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、工程（ｄ）のインキュベーションは、少なくとも６時間（例えば、６〜２４、６〜１８、６〜１２、６〜９、９〜２４、９〜１８、９〜１２、１２〜２４、１２〜１８、または２４時間超）である。いくつかの実施形態において、工程（ｄ）のインキュベーションは、６時間未満（例えば、６、５、４、３、２、１、０．５時間）である。ある特定の実施形態は、試料中の重合体を定量する方法に関し、本方法は、外部参照として純粋な形の重合体を用いてＨＰＬＣ法を行うことを含む。いくつかの実施形態において、重合体は、ゲニピンとグリシンの反応に由来する青色重合体である。いくつかの実施形態において、外部参照としての純粋な形の重合体は、炭水化物を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、外部参照としての純粋な形の重合体は、図１３Ｃのスペクトルと実質的に同一のＨＰＬＣトレースを有することを特徴とする。
【０１４６】
着色剤組成物を生成する方法
ある特定の実施形態は、着色剤組成物を調製する方法に関する。いくつかの実施形態において、着色剤組成物を調製する方法は、以下を含む：（ａ）ゲニパ・アメリカナ果物からジュースを単離する工程；（ｂ）ジュースと、グリシン（ＧＬＹ）、バリン（ＶＡＬ）、リシン（ＬＹＳ）、プロリン（ＰＲＯ）、メチオニン（ＭＥＴ）、チロシン（ＴＹＲ）、およびトリプトファン（ＴＲＰ）からなる群より選択される第一のアミノ酸と、グリシン（ＧＬＹ）、バリン（ＶＡＬ）、リシン（ＬＹＳ）、プロリン（ＰＲＯ）、メチオニン（ＭＥＴ）、チロシン（ＴＹＲ）、およびトリプトファン（ＴＲＰ）からなる群より選択される第二のアミノ酸とを混合する工程；（ｃ）（ｂ）の後、着色剤組成物を単離する工程。ある特定の実施形態は、ゲニパ・アメリカナ果物から得られるジュースと、アミノ酸の組み合わせ、例えば、グリシンおよびメチオニンとを反応させることにより形成された生成物を含む着色剤組成物に関する。ある特定の実施形態において、新鮮な果物が、収穫から１日または２日以内（例えば、約０〜６、０〜１２、０〜１８、０〜２４、０〜３６、または０〜４８時間以内）に使用される。他の実施形態において、果物は、冷蔵条件で貯蔵して１．５週間以内（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２日以内）または２週間以内（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日以内）に使用される。別の実施形態において、果物は熟成しておらず、例えば、熟成した果物が柔らかくでこぼこした表面を持つのに比べて、固く表面も滑らかな果物である。いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、青、青緑、緑、紫、赤、または黒色である。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、着色剤組成物を調製する方法は、以下を含む：（ａ）ゲニピンまたはゲニピン誘導体と、グリシン（ＧＬＹ）、バリン（ＶＡＬ）、リシン（ＬＹＳ）、プロリン（ＰＲＯ）、メチオニン（ＭＥＴ）、チロシン（ＴＹＲ）、またはトリプトファン（ＴＲＰ）からなる群より選択される第一のアミノ酸と、グリシン（ＧＬＹ）、バリン（ＶＡＬ）、リシン（ＬＹＳ）、プロリン（ＰＲＯ）、メチオニン（ＭＥＴ）、チロシン（ＴＹＲ）、またはトリプトファン（ＴＲＰ）からなる群より選択される第二のアミノ酸とを混合する工程、ならびにそれにより形成された着色剤組成物を単離する工程。ある特定の実施形態は、ゲニピンまたはゲニピン誘導体と、アミノ酸の組み合わせ、例えば、グリシンおよびメチオニンとを反応させることにより形成された生成物を含む着色剤組成物に関する。いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、青、青緑、緑、紫、赤、または黒色である。
【０１４８】
紫色着色剤組成物
ゲニパ・アメリカナの未成熟果物は、ゲニピンの原料であるが、ゲニピンは、イリドイド代謝産物であり、これがアミンと反応して青く着色した生成物をもたらす。ゲニパ・アメリカナ果物（ハグワ）において、ゲニピンは、内果皮（果肉）に見られるので、果物のその他の部分は廃棄される。ハグワ中果皮（皮）部分は、ゲニピン含有量が少ないため、廃棄される。
【０１４９】
ある特定の実施形態は、紫色着色剤組成物を調製する方法に関する。いくつかの実施形態において、紫色着色剤組成物を調製する方法は以下を含む：（ａ）ゲニパ・アメリカナ果物から中果皮を単離する工程；（ｂ）中果皮からジュース抽出物を調製する工程；（ｃ）ジュース抽出物とグリシンを混合する工程；（ｄ）（ｃ）の後、ジュースとグリシンの混合物を加熱する工程；および（ｅ）（ｄ）の後、紫色着色剤組成物を単離する工程。いくつかの実施形態において、工程（ｄ）の加熱は、少なくとも９０分（例えば、９０分〜約３、４、５、または６時間、あるいは６時間超）である。本明細書中使用される場合、「中果皮」は、果物、例えば、ゲニパ・アメリカナ果物の皮を示す。ある特定の実施形態において、新鮮な果物が、収穫から１日または２日以内（例えば、約０〜６、０〜１２、０〜１８、０〜２４、０〜３６、または０〜４８時間以内）に使用される。他の実施形態において、果物は、冷蔵条件で貯蔵して１．５週間以内（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２日以内）または２週間以内（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日以内）に使用される。別の実施形態において、果物は熟成しておらず、例えば、熟成した果物が柔らかくでこぼこした表面を持つのに比べて、固く表面も滑らかな果物である。
【０１５０】
ある特定の実施形態は、ゲニピン誘導体を含有する水抽出物とアミン（例えば、グリシン、バリン、プロリン、リシン、トリプトファン、チロシン、またはメチオニンなどのアミノ酸）を反応させることにより形成される生成物を含む着色剤組成物に関する。いくつかの実施形態において、ゲニピン誘導体を含有する水抽出物は、以下を含む方法により調製される：（ａ）ゲニパ・アメリカナ果物から中果皮を単離する工程；および（ｂ）中果皮を水で抽出する工程。いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、ゲニパ・アメリカナ果物の中果皮の水抽出物とグリシンにより形成された生成物を含む紫色着色剤組成物である。いくつかの実施形態において、水抽出物は、ＡＵＣ（ＨＰＬＣスペクトルの曲線の下の面積）に基づいて、ゲニピンを、２０％、１５％、１０％、５％、３％、２％、１％、０．５％、または０．１％未満有する。いくつかの実施形態において、アミノ酸はグリシンである。いくつかの実施形態において、生成物は、ゲニパ・アメリカナ果物の中果皮の水抽出物とグリシンを混合し、次いで混合物を加熱することにより形成されるが、この場合、水抽出物を予め加熱することはない。いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、ゲニピン前駆体を含み、ゲニピン前駆体は、ゲニパ・アメリカナ果物の中果皮（皮）に由来する、（＋）−ゲニポシドすなわちゲニピンのイリドイドＢ−グリコシド前駆体を含む。
【０１５１】
ゲニポシドは、ゲニピンのグリコシドである。ゲニポシドは、ゲニピンとは異なる動態および化学的性質を有する。グルコースは、ゲニポシド構造の一部分である。
【０１５２】
グルコースは、果肉（内果皮）のゲニパ・アメリカナジュース中に、遊離グルコースとして存在する。しかしながら、ゲニピンは、内果皮で見られるものであり、これは、グリシンと反応すると青色着色剤を生成する。グリシンと中果皮由来のゲニポシドを反応させると、紫色着色剤をもたらす。
【０１５３】
ある特定の実施形態は、着色剤組成物を調製する方法に関し、本方法は以下を含む：（ａ）ゲニパ・アメリカナ果物から中果皮を単離する工程；（ｂ）中果皮からゲニポシドを単離する工程；（ｃ）ゲニポシドと、グリシン（ＧＬＹ）、バリン（ＶＡＬ）、リシン（ＬＹＳ）、プロリン（ＰＲＯ）、メチオニン（ＭＥＴ）、チロシン（ＴＹＲ）、トリプトファン（ＴＲＰ）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸を混合する工程；および（ｄ）（ｃ）の後、着色剤組成物を単離する工程。いくつかの実施形態において、ゲニポシドは、凍結乾燥または瞬間凍結により、安定化される。いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、紫色である。
【０１５４】
緑色着色剤組成物および黒色着色剤組成物
ある特定の実施形態は、緑色または黒色着色剤組成物を調製する方法に関する。ゲニパ・アメリカナジュースを様々なアミノ酸と反応させると、様々な色の生成物、例えば、青色（ＧＬＹおよびＬＹＳ）、青緑色（ＶＡＬ、ＭＥＴ、およびＴＹＲ）、緑色（ＴＲＰ）、および黒色（ＰＲＯ）のものが生成した。いくつかの実施形態は、黒色着色剤組成物を調製する方法に関し、本方法は以下を含む：（ａ）ゲニパ・アメリカナ果物からジュース抽出物を調製する工程；（ｃ）ジュース抽出物とプロリンを混合する工程；および（ｅ）（ｃ）から黒色着色剤組成物を単離する工程。いくつかの実施形態は、緑色着色剤組成物を調製する方法に関し、本方法は以下を含む：（ａ）ゲニパ・アメリカナ果物からジュース抽出物を調製する工程；（ｃ）ジュース抽出物とトリプトファンを混合する工程；および（ｅ）（ｃ）から緑色着色剤組成物を単離する工程。
【０１５５】
重合体および／または二量体を含む着色剤組成物の使用
ある特定の実施形態は、基質（例えば、食品要素、化粧品、医薬品または栄養補助食品、繊維製品、あるいは医療用デバイスなどのデバイス）に青色を付与するための、精製重合体（例えば、式４の重合体、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩、または炭水化物を実質的に含まない重合体（例えば、ゲニピンとグリシンの反応に由来する重合体）など）または精製二量体（例えば、実質的に純粋な化合物番号１、２、３、または実質的に純粋な式１Ａ、１Ｂ、２、３’Ａ（Ｍｅ）、３’Ｂ（Ｍｅ）の化合物、またはそれらの組み合わせ）の使用に関する。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、基質（例えば、食品要素、化粧品、医薬品または栄養補助食品、繊維製品、あるいは医療用デバイスなどのデバイス）に青色を付与する方法は、基質を、精製重合体（例えば、式４の重合体、その幾何異性体、その互変異性体、もしくはその塩、または炭水化物を実質的に含まない重合体（例えば、ゲニピンとグリシンの反応に由来する重合体）など）または精製二量体（例えば、実質的に純粋な化合物番号１、２、３、または実質的に純粋な式１Ａ、１Ｂ、２、３’Ａ（Ｍｅ）、３’Ｂ（Ｍｅ）の化合物）を含む着色剤組成物、本明細書中記載される着色剤組成物、またはそれらの任意の組み合わせと接触させる工程を含む。いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、式４の重合体、その幾何異性体、その互変異性体、またはその塩を含む。いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、二量体を含む。いくつかの実施形態において、二量体は、実質的に精製された式１Ａ、１Ｂ、２、３’Ａ（Ｍｅ）、または３’Ｂ（Ｍｅ）の化合物である。いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、式１Ａ、１Ｂ、２、３’Ａ（Ｍｅ）、または３’Ｂ（Ｍｅ）の化合物と、本明細書中開示される重合体のいずれかとを混合するプロセスにより調製される。いくつかの実施形態において、着色剤組成物は、本明細書中開示される重合体または二量体と、着色添加物（例えば、ＦＤＡに認可された着色添加物）を混合することにより調製される。いくつかの実施形態において、基質は食品要素である。いくつかの実施形態において、基質は、医療用デバイスである。いくつかの実施形態において、基質は医薬品である。いくつかの実施形態において、基質は、栄養補助食品である。いくつかの実施形態において、基質は、化粧品である。
【０１５７】
ある特定の実施形態は、食品要素および本明細書中開示される着色剤組成物（例えば、本明細書中開示される精製重合体を含む着色剤組成物、または本明細書中開示される精製二量体を含む着色剤組成物）を含む食料製品に関する。食品要素は、固形食品要素も可能であるし、液状食品要素も可能である。いくつかの実施形態において、食品要素は、乳製品、ベーカリー製品、ソフトドリンク、菓子類（例えば、キャンディ、またはシリアルバーなど）、または飲料である。いくつかの実施形態において、食品要素は、飲料である。いくつかの実施形態において、食品要素は、炭酸飲料である。いくつかの実施形態において、食品要素は、ヒトが消費するためのものである。いくつかの実施形態において、食品要素は、動物用食品要素、例えばペットフード（例えば、キャットフード、ドッグフードなど。）または家畜飼料（例えば、ウシの餌）である。いくつかの実施形態において、食品要素は、植物の栄養になるもの、例えば肥料などである。いくつかの実施形態において、食品要素は、単位計量された食品要素、例えば単位計量されたヨーグルト、プリン、スープなどである。
【０１５８】
ある特定の実施形態は、薬物（例えば、ＦＤＡ承認薬）および本明細書中開示される着色剤組成物（例えば、本明細書中開示される精製重合体を含む着色剤組成物、または本明細書中開示される精製二量体を含む着色剤組成物）を含む医薬品に関する。いくつかの実施形態において、薬物は、液状剤形になっている。いくつかの実施形態において、薬物は固形剤形になっている。いくつかの実施形態において、薬物は、錠剤、ゲルカプセル剤、ビーズ剤、ペレット剤、丸剤、ドラジェ、ロゼンジ、軟膏、カプセル剤、散剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、および懸濁剤からなる群より選択される剤形になっている。いくつかの実施形態において、薬物は、シロップ剤の形状になっている。
【０１５９】
ある特定の実施形態は、栄養補助物と、および本明細書中開示される着色剤組成物（例えば、本明細書中開示される精製重合体を含む着色剤組成物、または本明細書中開示される精製二量体を含む着色剤組成物）とを含む栄養補助食品（例えばビタミン、ビタミン補助食品、または総合栄養混合物および総合栄養パック）に関する。いくつかの実施形態において、栄養補助物は、液状剤形になっている。いくつかの実施形態において、栄養補助物は、固形剤形になっている。いくつかの実施形態において、栄養補助物は、錠剤、ゲルカプセル剤、ビーズ剤、ペレット剤、丸剤、ドラジェ、ロゼンジ、軟膏、カプセル剤、散剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、および懸濁剤からなる群より選択される剤形になっている。いくつかの実施形態において、栄養補助物は、錠剤、またはゲルカプセル剤の形状になっている。
【０１６０】
ある特定の実施形態は、化粧品要素および本明細書中開示される着色剤組成物（例えば、本明細書中開示される精製重合体を含む着色剤組成物、または本明細書中開示される精製二量体を含む着色剤組成物）を含む化粧品に関する。いくつかの実施形態において、化粧品要素は、入浴製品、例えばシャワージェル、バスジェル、または石鹸などである。いくつかの実施形態において、化粧品要素は、目および顔の化粧用製品、美爪料、口紅、または入れ墨用の製品が可能である。いくつかの実施形態において、化粧品要素は、口腔の手入れ用製品（例えば、洗口液、歯磨き用ジェル、または練り歯磨きなど）が可能である。いくつかの実施形態において、化粧品要素は、肌の手入れ用製品（例えば、スキンコンディショナー、ジェル（例えば、ハンドジェル）、ローションおよびクリーム、またはマスクなど）が可能である。いくつかの実施形態において、化粧品要素は、ひげ剃り用製品（例えば、シェービングクリームなど）が可能である。いくつかの実施形態において、化粧品要素は、頭髪の手入れ用製品（例えば、髪の染色用製品）が可能である。
【０１６１】
ある特定の実施形態は、本明細書中開示される着色剤組成物（例えば、本明細書中開示される精製重合体を含む着色剤組成物、または本明細書中開示される精製二量体を含む着色剤組成物）で染色された医療用デバイスに関する。いくつかの実施形態において、医療用デバイスは、手術用デバイス（例えば、縫合糸、はさみ、グローブなど）である。
【０１６２】
ある特定の実施形態は、本明細書中開示される着色剤組成物で染色された繊維製品に関する。
【０１６３】
ある特定の実施形態において、食料製品、化粧品、医薬品、医療用デバイス、または繊維製品に組み込まれる着色剤組成物の量は、最終的に得ようとする色に依存する。いくつかの実施形態において、食料製品、化粧品、医薬品、医療用デバイス、または繊維製品は、本明細書中開示される着色剤組成物を、それ自身の量としてまたは他の着色剤と組み合わせた量として、食料製品、化粧品、医薬品、または医療用デバイスに、以下からなる群より選択される色を与えるのに有効な量で含む：ライトブルー、エアフォースブルー、エアシューペリオリティーブルー、アリスブルー、空色、ベビーブルー、ブルードフランス、青、青灰色、ボンダイブルー、ブランダイスブルー、ケンブリッジブルー、カロライナブルー、セレステｃｅｌｅｓｔｅ、セルリアン、コバルトブルー、コロンビアブルー、コーンフラワーブルー、シアン、暗青色、紺碧、デニム、ドジャーブルー、デュークブルー、エジプシャンブルー、エレクトリックブルー、イートンブルー、グローカスブルー、エレクトリックインディゴ、インディゴ、インターナショナルクラインブルー、淡紫色、ライトブルー、マジョレールブルー、マヤブルー、ミディアムブルー、ミッドナイトブルー、ネイビーブルー、ノンフォトブルー、オックスフォードブルー、パラチナトブルー、ペリウィンクル、藍色、フタロブルー、パウダーブルー、プルシアンブルー、ロイヤルブルー、サファイヤスカイブルー、スチールブルー、ティール、ティファニーブルー、トゥルーブルー、タフトブルー、ターコイズ、ＵＣＬＡブルー、ウルトラマリン、青紫色、エールブルー、および呉須。着色剤組成物の有効性は、得ようとする色（例えば、ライトブルー）と、ある量の着色剤組成物で着色された製品またはデバイスとを比較する（例えば、目視による比較）ことにより、判定することができる。
【０１６４】
本発明の好適な実施形態について記載してきたものの、各部の形状および配置について、請求項により包含される理念および基本原則から逸脱することなく、さらなる変化を加えることができる。
【０１６５】
（実施例１）
ゲニパ・アメリカナジュースからのゲニピン単離
ゲニパ・アメリカナの生ジュース１０リットルを凍結乾燥（凍結乾燥）させた固形物（９００グラム）を、ジクロロメタンでのソックスレー抽出に供した；生じた溶媒を減圧蒸留して、褐色残渣（２４０ｇ）を得た；残渣から１ｇを分取して、移動相にヘキサン／メタノール／ジクロロメタン（２：２：１）の混合物を用いて、分子ふるいクロマトグラフィーにより分離させ、その結果、４つの画分が得られた；薄層クロマトグラフィーを用いて、既に分かっているゲニピンパターンと比較することで、４つの画分のうちの１つにおいてゲニピンを同定した。ＮＭＲスペクトルで確認して純粋な生成物（ゲニピン２００ｍｇ）が得られるまで、ゲニピン含有画分を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにヘキサン／酢酸エチル移動相を用いて、複数回精製した。
【０１６６】
（実施例２）
ゲニピンとグリシンの反応
グリシン（２ｇ）を水（２００ｍＬ）に溶解させて、７０℃に加熱した。次いで、ゲニピン（５ｇ）のメタノール（１０ｍＬ）溶液を加え、混合物を４時間撹拌した。反応混合物を凍結乾燥（凍結乾燥）させ、青色粉末を酢酸エチル抽出に供して、過剰なゲニピンおよび他の低極性成分を除去した。
【０１６７】
（実施例３）
成分の分画
青色粉末（５．７ｇ）を、メタノール（５×１００ｍＬ）抽出に供し、生じた溶媒を減圧蒸留して、青色樹脂（２．２ｇ）を得た。青色樹脂をメタノール９０％に溶解させて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ＬＨ２０（メタノール移動相）で分離させて、４つの画分を得た。画分は、Ｓ１（１．５ｇ）、Ｓ２（０．３ｇ）、Ｓ３（１００ｍｇ）、およびＳ４（５ｍｇ）と名付けた（この特許出願の目的上）。
【０１６８】
Ｓ１画分を、吸着樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−７）を用い、最初に１５％エタノールおよび最後に純水を用いて分離させた。同一のＩＲスペクトルおよびＮＭＲスペクトルを持つ３つの画分が分離された。３つの画分を１つにまとめて、重合体であると決定した。
【０１６９】
Ｓ２画分を、吸着樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−７）を用い、最初に１５％エタノールおよび最後に９５％エタノールを用いて分離させた。４つのサブ画分がＳ２から生じた。これらのＳ２サブ画分を、Ｍ２Ｓ１Ｒ、Ｍ２Ｓ２Ｒ、Ｍ２Ｓ３Ｒ、およびＭ２Ｓ４Ｒと名付けた（この特許出願の目的上）。２種の化合物が得られるまで、Ｍ２Ｓ１Ｒを、ＲＰ−Ｃ１８に様々な移動相（エタノール−水混合物およびメタノール−水混合物）を用いて、複数回分離させた。得られた２種の化合物のうちの１種を化合物番号１（７ｍｇ）と名付けた。化合物番号１（図５）の分光学的特徴は以下のとおり：
【０１７０】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）．δ８．７７，８．５３，７．５４，５．３０−４．９５，３．９４，２．２５，１．６６ｐｐｍ。
【０１７１】
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）．δ１７０．０，１６４．１６，１５７．８０，１５７．４４，１４８．２９，１４６．４１，１３９．７６，１３７．８３，１２４．１６，６３．３５，６２．６，５６．１９，５３．８９，１７．４３，１４．９３ｐｐｍ。
【０１７２】
化合物番号１をさらに分析したところ、以下が示された：
【０１７３】
１Ｈ  ＮＭＲで、いくつかのシグナルが示された：δ８．７７および８．５３の一重項として現れた２つの芳香族プロトン、７．５４のビニルプロトン、４．９５の一重項（２Ｈ）、ならびに３．９４に重なり合った積算して３Ｈになる３つの一重項（ＯＣＨ３）、２．２５（ビニルのメチル基）、および１．６６。
【０１７４】
ＪＭＯＤ実験から、以下のシグナルが示された：１４．９３、１７．４３、および５３．８９の３つのメチル基、６２．６８の１つのメチレン（グリシン由来のメチレンと帰属させることができる）、１５７．４４、１４６．４１、１３７．８３の３つのメチン、そして最後に、１７０．００（カルボキシル）、１６４．１６（メチルエステルカルボニル）、１５７．８０、１４８．２９、１３９．７６、１２４．１６、および５３．８９の７個の第四級炭素原子。すなわち、ゲニピン部分およびグリシン残基は、保存されているが、しかし、ＮＭＲスペクトルでのプロトンおよび炭素原子の（ピーク）位置から、分子は今やピリジル（ｐｙｒｉｄｉｌ）残基を持つ芳香族である。しかしながら、この構造で出現する新たなメチル基およびその位置は、ＪＭＯＤ、ＨＭＱＣ、およびＨＭＢＣ実験に基づいて帰属させることができた。すなわち、ＣＯＳＹ１Ｈ−１Ｈは、２．２５のメチル基と７．５４のビニルプロトンとの間にアリル結合性があることを示した；ＨＭＢＣ実験では、このプロトンは、これらのメチル（１３Ｃ  ＮＭＲで１５７．４４）および１４．９３の脂肪族メチル基（１Ｈ  ＮＭＲで１．６６）と３Ｊカップリングしていることを示し、このことから、５３．８９の第四級炭素原子ならびに１５７．８０および１４８．２９の芳香族との相関が確立される。他に検出された長距離結合性は以下のとおりであった：Ｎ−ＣＨ２（６２．６８）と８．７７および８．５３の芳香族プロトン両方との、ならびに前者とメチルエステルカルボニルとの結合性。最後に、ＭＳは、ｍ／ｚ５２２［Ｍ＋＋Ｈ］を示し、図１Ａ〜図１Ｂおよび図２Ａ〜図２Ｂに見ることができるとおりの、対称二量体分子であることを示した。単量体間の連結は、Ｃ−８およびＣ−８’炭素原子を通じたものと推定された。なぜなら、メチル基は一重項として現れており、このメチル基は、ＨＭＢＣ実験では、他方のメチル基と相互にカップリングしているからである。式１Ａまたは１Ｂを有しているような、２種の異性体の可能性が存在する（図１Ａ、図１Ｂ、図２Ａ、および図２Ｂを参照）。
【０１７５】
Ｓ３画分を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）に９５％メタノール移動相を用いたクロマトグラフィーで分離させたところ、４つのＳ３画分が得られた。これらを、この特許出願の目的上、Ｓ３１、Ｓ３２、Ｓ３３、およびＳ３４と名付けた。化合物番号３（４ｍｇ）と名付けた化合物が得られるまで、Ｓ３３画分を、様々な移動相（エタノール−水混合物およびメタノール−水混合物）を用いたＲＰ−Ｃ１８逆クロマトグラフィーにより、複数回分離させた。化合物番号３（図６）の分光学的特徴は以下のとおり：
【０１７６】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）．δ８．６，８．０，７．９，６．７，３．９０，１．８ｐｐｍ。
【０１７７】
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ），δ１７２．２，１６６．３，１３８．８，１３５．６，１３５．１，１３３．３，１３１．４，１２７．１，１２０．４６，１１８．９，６１．０，５３．３，１１．２ｐｐｍ。
【０１７８】
ｍ／ｚ５０５［Ｍ＋Ｈ］
【０１７９】
化合物番号３をさらに分析したところ、以下が示された：
【０１８０】
質量分析で、化合物３の質量スペクトルはｍ／ｚ＝５０５［Μ＋Η］＋．と示された。すなわち、先に記載した化合物の異性体であることを示した。しかしながら、１Ｈおよび１３ＣＮＭＲスペクトルはその化合物のものとは大きく異なっていた。プロトンスペクトルでは、以下の一重項が検出された：δ８．０、δ７．９、およびδ６、７（２Ｈ、各シグナルにつき）、δ８．６の積算して１Ｈになる１つのさらなる一重項。他のシグナルは、δ４．７の一重項（Ｎ−ＣＨ２）、ならびにδ３．９（ＯＣＨ３）およびδ１．８（ＣＨ３ビニル）の２つのメチル基であった。ＪＭＯＤ実験によれば、以下の炭素原子も観測された：δ１７２．２のカルボキシル基、δ１６６．３のメチルエステル、（ＣＯＯＨ）、δ１３８．８、δ１３５．１、δ１２７．１、δ１２０．４、δ１１８．９の５つの第四級炭素原子、δ１３５．６、δ１３３．３、δ１３１．４、δ１３１．４の４つのメチン、δ６１．０の１つのメチレン（Ν−ＣＨ２）、ならびにδ５３．３（ＯＣＨ３）およびδ１１．２（ＣＨ３ビニル）の２つのメチル基。各単量体単位の構造は、ＨＭＢＣ実験に従って帰属を行った：δ７．９およびδ８．０のシグナルは、ピリジル（ｐｙｒｉｄｉｌ）基のプロトンであると帰属した、というのもδ６１．０のＮ−メチレン基との長距離相関が検出されたからであった；さらに、最後のプロトンは、δ１７２．２のメチルエステルカルボニルとの３Ｊカップリングを示した。この他、他の重要なカップリングが、δ１３１．４の一重項（Ｃ−７）とメチル基のプロトンの間に示された。芳香族プロトンおよびビニルプロトンの量が少ないことは、図３Ａ〜図３Ｂに示すような対称二量体分子の存在を示していた。この分子には、メチルエステル基の相対的な向きに従って２種の構造を帰属させることが可能である（図３Ａ〜図３Ｂ）が、立体障害故に、構造Ｂの可能性は低い。
【０１８１】
（実施例４）
メタノール不溶性画分の精製
メタノール不溶性成分を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０を用い、ＭｅＯＨ−水で溶出させて分離させ、サブ画分ｉ１（３．１ｇ）およびｉ２（１００ｍｇ）を集めた。サブ画分ｉ２を、反復ＲＰ−Ｃ１８カラムを用い、ＭｅＯＨ／水で溶出させて分離させ、純粋な化合物番号２（２５ｍｇ）を得た。化合物２は、式２の構造を有することが示された。
【０１８２】
サブ画分ｉ１は、ＲＰ−Ｃ１８カラムを用いて、２つの主要な画分へと分離させた。しかしながら、この２つの画分は、同一のＩＲスペクトルおよびＮＭＲスペクトルを有していたので、１つにまとめて精製重合体を得た。精製重合体の模式構造を図８に示す。
【０１８３】
精製重合体のＮＭＲ、ＩＲ、および質量分析による分析は、以下を示す：
【０１８４】
ＩＲスペクトル（図１２）は、カルボン酸（３３９３ｃｍ−１）、脂肪族ＣＨ（２９４９）、エステル（１７２６）、および芳香族ピリジニウム系（１６３０、１５４０）に帰属することができるバンドを示した。
【０１８５】
青色小分子、特に既に単離および同定された二量体、およびゲニピンを指紋のように特定する１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを構築した。１Ｈ  ＮＭＲ（図９）は、以下のシグナルを示した：δ９．５０（二重結合架橋部のプロトン）、δ８．００−９．００（芳香族ピリジン誘導体または縮合した二重結合）、δ５．０−７．０（シクロペンタン環の二重結合）、δ５．０−４．５（第四級窒素に結合したＣＨ２）、δ３．８−４．１（ＯＣＨ３）、δ１．５−２．３（ＣＨ３）。１３Ｃ  ＮＭＲは、δ１６０−１７５（カルボキシル基およびエステル基）、δ１５０．０−１２０．０（芳香族および／または二重結合）、δ６０．０−６２．０（第四級窒素に結合したＣＨ２）、δ５０．０−５５．０（ＯＣＨ３）、δ４２．０−４８．０（ＣＨ２）、および最後にδ１０，０−１５．０（ＣＨ３）にシグナルを示した。
【０１８６】
続いて、固相１Ｈ−１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル（図１０）を測定して、特徴バンドまたはピークを検出した：カルボニル、芳香族、二重結合、Ｎ−メチレン、メトキシ、およびメチレン基。メチル基または環外メチレンのシグナルは存在せず、このことは、（ｈｅ）元々あった環外メチレン（またはヒドロメチル基）が重合化プロセスに関与していることを示す。
【０１８７】
ＨＰＬＣ／ＭＡＬＤＩ分析は、精製重合体が約６０００の分子量を有する、すなわち二量体が約１２単位存在することを示した。７０１および４７５のｍ／ｅに該当するＭＳ断片が観測された。式９に示す構造を参照。
【０１８８】
（実施例５）
ゲニパ・アメリカナジュースとグリシンの反応
原液ジュース（１００ｍＬ）をグリシン（０．８ｇ、グリシンの量は、グリシンとゲニピンのモル比が約１：１であるように、原液ジュースのゲニピン含量に応じて調整することができる）と混合し、反応温度を、２時間７０℃に維持した。それから、溶媒を蒸留して減圧にし、または凍結乾燥させて、暗青色粉末混合物を得た。
【０１８９】
次いで、暗青色粉末を、最初に酢酸エチルで抽出に供し、次いでメタノールでより激しい抽出に供した。メタノールに溶解する成分（８００ｍｇ）を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０、およびメタノールを用いたカラムクロマトグラフィーにより分離させた。最初の画分から、メタノールを留去すると、深青色生成物の大部分（６００ｍｇ）が、精製重合体として得られた。少量の化合物１（１ｍｇ）、化合物２（１．５ｍｇ）、および化合物３（１ｍｇ）もまた、メタノール溶解性画分から得られた。
【０１９０】
メタノール不溶性画分（１．２ｇ）もまた、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラムを用い、メタノール：水（９：１）で溶出させることによって分離させた。その後、逆相Ｃ−１８分離を行って、精製重合体を得た。メタノール不溶性画分から得られた精製重合体を、メタノール溶解性画分から得られた精製重合体とまとめて、合計で１．８グラムの重合体を得た。ゲニパ・アメリカナジュースとグリシンを反応させることにより得られた重合体の分析データは、精製ゲニピンとグリシンを反応させることにより得られたものと同一である。
【０１９１】
（実施例６）
重合体の定量
青色重合体の純度を評価するため、およびハグワ抽出物中の青色重合体（ゲニパ・アメリカナジュースとグリシンの反応から得られるもの）の含量を定量するために、ＨＰＬＣ／ＰＤＡ方法を開発した。
【０１９２】
島津製作所Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＵＦＬＣに、システムコントローラ（ＣＢＭ  ２０Ａ）で制御する形で、オンライン脱気ユニット（ＤＧＵ−２０  Ａ５）、送液ポンプ（ＬＣ  ２０ＡＴ）、オートサンプラ（ＳＩＬ  ２０Ａ  ＨＴ）、カラムオーブン（ＣＴＯ  ２０Ａ）、およびフォトダイオードアレイ検出器（ＳＰＤ  Ｍ２０Ａ）を装備して、この分析実験に用いた。
【０１９３】
数種のカラム、逆相Ｌｕｎａ  Ｃ１８（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）１５０×４，６ｍｍ  ５μｍ、ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ（Ｓｉｇｍａ）Ｃ８、１５０×４，６ｍｍ  ５μｍ、およびＬｕｎａ  ＰＦＰ１５０×４，６ｍｍ  ５μｍなどを用いた。
【０１９４】
ハグワ抽出物中の重合体は非常に極性が高い性質であるため、順相カラムの使用は限界があった。
【０１９５】
アセトニトリルおよびメタノールを、１００％から水１００％までの範囲の多様な比率で用いた。
【０１９６】
流速は１ｍＬ／分とし、展開プロセスを通じて修飾することはなかった。
【０１９７】
ＰＤＡ検出器を用いて、ｍａｘ  ｐｌｏｔモードで２００〜８００ｎｍの波長を監視し、５９０ｎｍの波長で青色重合体を検出した。
【０１９８】
数種のカラムおよび検出器セル温度を検討したものの、Ｌｕｎａ  ＰＦＰカラムを用いると最適な結果が得られた。他のカラムで行った分析の結果は、満足のいくものではなかった。なぜなら、溶媒混合物、カラムおよび検出器温度、流速、または注入体積に何を用いたかに関わらず、保持されないピークしか観測されなかったからである。
【０１９９】
カラム選択後、溶媒の勾配について検討したところ、溶離液としてメタノールおよび水を用いると分離に最適な結果が得られたが、この段階ではピークの形および幅を改善する必要があり、様々なカラムオーブン温度で複数回試運転することにより、保持時間に影響を及ぼすことなく、良好な形および幅を得ることができた。
【０２００】
最適な分離条件の概要は、以下のとおりであった：
【０２０１】
カラムは、Ｌｕｎａ  ＰＦＰ  １００Ａ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）にｓｅｃｕｒｉｔｙ  ｇｕａｒｄカートリッジを装着したもの：
長さ１５０ｍｍ
内径４．６ｍｍ
粒子径５μｍ。
【０２０２】
移動相：溶離液Ａ：水、および溶離液Ｂ：メタノール
【０２０３】
直線勾配：
0006576330.tif 000035
【０２０４】
流速：１ｍＬ／分
【０２０５】
温度：
Ｔｓａｍｐｌｅｓ：常温（２０〜２４℃）
Ｔｃｏｌｕｍｎ：４０℃
ＴＤｅｔｅｃｔｏｒｃｅｌｌ：４０℃
【０２０６】
検出：Ｍａｘｐｌｏｔ２３０−８００ｎｍ（抽出物特性曲線）；
Ｍａｘｐｌｏｔ５９０ｎｍ（青色重合体の定量）。
【０２０７】
試料調製：１０ｍＬまたは２５ｍＬのメスフラスコ中；分析しようとするバッチ試料１０ｍｇを量り入れ、脱イオン水を加えて定容積とする。この溶液１０μＬをオートサンプラを使って注入する。
【０２０８】
システム性能：標準方法において、青色重合体は１０．３分で溶出した。
【０２０９】
（実施例７）
糖を含まない青色重合体の精製
Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０を用いたカラムクロマトグラフィーにより、糖を含まない青色重合体を精製した。
【０２１０】
凍結乾燥させたハグワ抽出物（ゲニパ・アメリカナジュースとグリシンの反応から得られたもの）１０ｇを、脱イオン水１０ｍＬに溶解させて、濾過した。それから、着色剤溶液をカラムの頂部に添加した。移動相の組成は、１００％メタノール、８０％メタノール、５０％メタノール、そして１００％水であった。合計で１４の画分を集め、イソプロパノール：水：酢酸（２：０．５：０．５）溶液で溶出させる薄層クロマトグラフィーにより、糖含量について確認した。プレートに硫酸（５％＞）を吹き付けて、１０５℃で加熱した。最初に溶出してくるもので糖を含まない画分を混合し、減圧条件下で乾燥させ、次いで、所望の純度がＨＰＬＣにより検出されるまで、上記と同じ溶出条件を用いて、精製工程に供した。
【０２１１】
画分から一定量を取り分けて、希釈し、０．４５μｍナイロン膜フィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ、Ｐａｌｌ）で濾過してから、実施例６の方法を用いてＨＰＬＣにより分析した。
【０２１２】
ハグワ抽出物から得られる青色重合体が所望の純度であることの選択基準は、ＵＶ−ｖｉｓおよびＨＰＬＣ標準を用いた、すなわち、それぞれ、Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムの画分は、ＴＬＣ方法下では糖を含んでいなかった、および５９０ｎｍで検出される主要ピークの吸光度が、２４０ｎｍでの吸光度に等しいかそれより大きかった、というのが基準であった。
【０２１３】
図１３Ａ〜Ｄは、原バッチおよび純度の異なる３つの画分のＨＰＬＣトレース（スペクトル）を示す。図１３Ｃは、糖を含まない純粋な青色重合体（「参照標準」として用いた）のＨＰＬＣトレースを表す。
【０２１４】
（実施例８）
ハグワ抽出物試料中の青色重合体含有量の定量
参照標準である、実施例７で調製した糖を含まない青色重合体を、外部標準として用いて、実施例６に記載の分析方法により、ハグワ抽出物試料中の青色重合体含有量を定量した。
【０２１５】
較正曲線
青色重合体参照標準から参照標準溶液を調製した。参照標準から得られる各曲線下面積（ＡＵＣ）を、濃度に対してプロットし、線形回帰を行って、較正曲線方程式を得た。
【０２１６】
５種の濃度について３つ組で、参照標準溶液を注入し、場合によってはそれより多い回数、注入を行った。
【０２１７】
この方法は、２０〜１００μｇ／ｍＬの範囲で線形であることがわかった。
【０２１８】
６つの異なる較正曲線が得られた。較正曲線１〜６を、それぞれ図１４Ａ〜Ｆに示す。
【０２１９】
検出限界および定量限界
ハグワ抽出物中の青色重合体濃度を測定するために開発した方法は、５９０ｎｍで監視して、検出下限濃度２μｇ／ｍＬで、１０．２分のシグナルを検出することができた。式２Ｈ／ｈによれば、式中、Ｈは、標準参照ピークの高さであり、ｈは、ブランククロマトグラム（メタノールまたは水１０μＬを注入したもの）におけるその保持時間での高さである。値（２×３４２３／２８３６＝２．４）は、検出限度として許容できる下限値である。標準参照ピーク高さおよびブランククロマトグラムの平均値を計算に使用した。
【０２２０】
青色重合体の定量限界は、２０μｇ／ｍＬであることがわかった。
【０２２１】
ハグワ抽出物試料中の青色重合体の定量
ハグワ抽出物から得られる青色重合体を、外部標準法を用いてパーセンテージで定量した。
【０２２２】
各バッチを３つ組で量り取り、２日の内に１０ｍＬ希釈物の３つの独立した測定を行った；２５ｍＬ希釈物は、一日以内に３つ組で行った。バッチ５３１２００５については、１０ｍＬ希釈物のみを分析した、なぜなら、２種類の体積の試料希釈物とする目的は、濃度が、ハグワ抽出物を分析するときに考慮すべきパラメーターであるかどうかを判断するためであったからである。表１において、バッチ５３１２００１〜５３１２００４で得られる結果は、２５ｍＬ希釈物および１０ｍＬ希釈物について示されており、平均値を比較することができる。
【０２２３】
以下の式を用いて、試料を１０ｍＬに希釈した場合の青色重合体濃度を計算した：
【０２２４】
（式１）
0006576330.tif 000036
【０２２５】
試料を２５ｍＬに希釈する場合；ｙ＝５９０ｎｍでの青色重合体の検査ピーク面積；ｂ＝回帰直線の切片；ａ＝回帰直線の傾き；ｗ＝試料の重量（ｍｇ）。
【０２２６】
試料中の濃度パーセンテージを、作成した各較正曲線について計算した。較正曲線１によるデータは排除した。分析した各バッチについて６つの較正曲線方程式によるデータが得られたときに、較正曲線１による結果は、他の値と異なっており、もしそれらが平均して％ＲＳＤを上げていたならば、おそらくそれは、希釈および試料調製において、または秤量工程において、誤りがあったためである。
【０２２７】
【表１】
0006576330.tif 000037
【０２２８】
（実施例９）
発酵による糖の除去
ハグワ抽出物（４．５Ｌ、ゲニパ・アメリカナジュースとグリシンの反応から得られたもの、Ｂａｔｃｈ５１１３００３）を、縦型オートクレーブＴｕｔｔｎａｕｅｒ  ３８７０  ＥＬＶ（８５リットル）（Ｔｕｔｔｎａｕｅｒ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＢＶ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に入れて、１２１℃、１５ｐｓｉで２０分間滅菌した。次いで、滅菌したハグワ抽出物を、オートクレーブ内で放冷した。得られるブロスに、市販純度（Ｌｅｖａｐａｎ、Ｃｏｌｏｍｂｉａ）の酵母菌（サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））２５ｇを播種した。この酵母菌は、同じ滅菌ブロス中３０℃で予め活性化されていた。発酵は、７Ｌバイオリアクター中、５Ｌの作業体積で行った。
【０２２９】
混合物を、バイオリアクターＢｉｏＦｌｏ  １１０（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）中で２４時間インキュベートし、ソフトウェアＢｉｏｃｏｍｍａｎｄ  ６．１．７６０１  Ｂａｔｃｈ  Ｃｏｎｔｒｏｌの監視用変数を用いた。４つの５００ｍＬ試料を試験した（インキュベーションの最初の１２時間の間は、３時間ごとに）。その後、操作体積は、ブロス約２．５Ｌとなった。
【０２３０】
発酵プロセスの操作条件を表２に示す。発酵系は、嫌気生活で開始し、発酵プロセスの間、外部から酸素を加えることはなかった。検出された酸素割合（ＤＯ２（％））は、外部酸素を加えることなく、試料中に存在する酸素を示す。発酵プロセスの間、温度は、３０±２℃で一定に保った。
【０２３１】
【表２】
0006576330.tif 000038
【０２３２】
２３時間１９分後、発酵プロセスを終わらせた。反応混合物を冷却し、Ｌａｂｏｆｕｇｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＮＪ、ＵＳＡ）に入れて２００〜４８００ｒｐｍで２０分間遠心した。続いて、酵母菌を除去した。
【０２３３】
遠心した試料を、溶解性固形分（°Ｂｒｉｘ）についてデジタル屈折計Ａｔａｇｏ  ＰＡＬ−３（Ａｔａｇｏ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて分析し、水分量についてＭＡ３５Ｍ  Ｂｒａｎｄ  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ（Ｔｈｅ  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｇｒｏｕｐ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて分析した。試料の糖含有量は、アルミニウム板をシリカゲル６０  Ｆ２５４でコーティングしたもの４×５ｃｍを用い、イソプロパノール：酢酸：水（２：０．５：０．５）の混合液で溶出させるＴＬＣ方法により分析した。ＴＬＣプレートに１０％硫酸のエタノール溶液を吹き付けて１１０℃に加熱した。純粋なグルコース、フルクトース、およびスクロースを標準として用いた。３、６、９、および１２時間の時点での反応混合物の分析は、６時間の発酵で、糖を全て除去するのに十分であったことを示した。発酵６時間後の反応混合物において、上記のＴＬＣ方法により糖は観測されなかった。
【０２３４】
（実施例１０）
発酵生成物と非発酵生成物の特性の比較
試料調製
実施例９で調製した発酵ハグワ抽出物（遠心および濾過したもの）をロータリーエバポレーターで濃縮し、次いでキャリアビヒクル（変性食物デンプン（Ｃａｐｓｕｌ（登録商標）））を用いてまたは用いずに、Ｂｕｃｈｉ  Ｂ−２９０（ＢＵＣＨＩ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ  ＡＧ、Ｆｌａｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で噴霧乾燥させた。乾燥条件は以下のとおりであった：１５０℃の導入温度および１０３〜１１０℃の放出温度；ポンピング２５％（２９０ｍＬ／ｈ）、空気乾燥流速４００、および吸引８５％。
【０２３５】
非発酵ハグワ抽出物（発酵生成物の調製に用いたのと同じバッチによる）は、発酵生成物について本明細書中で記載されるのと同じ条件で乾燥させた。
【０２３６】
まとめると、３種の生成物を調製した：
（１）ＰＦ：発酵生成物、遠心しおよび濃縮したもの、ビヒクルなし；
（２）ＦＣ：発酵生成物、遠心しおよび濃縮したもの、ビヒクルあり（ビヒクルとしてＣａｐｓｕｌ（登録商標））（生成物による全固形分６０％−ビヒクルによる全固形分４０％）；
（３）ＰＣ：非発酵、ビヒクルあり（Ｃａｐｓｕｌ（登録商標））（生成物による全固形分６０％−ビヒクルによる全固形分４０％）。
【０２３７】
３種の粉末生成物（ＰＦ、ＦＣ、およびＰＣ）の特性を、水分量、重合体含有量、呈色強度、およびｐＨ３の緩衝液中での安定性について分析した。生成物の微生物学的安定性についても試験は行われるだろう。
【０２３８】
重合体含量
ＰＦ、ＦＣ、およびＰＣの重合体含量を、実施例６〜８に記載のとおりに、ＨＰＬＣ方法により測定した。ＨＰＬＣの結果を、表３に示した。ＨＰＬＣクロマトグラムを図１５に示す。
【０２３９】
【表３】
0006576330.tif 000039
【０２４０】
呈色強度
呈色パラメーター
ＰＦ、ＦＣ、およびＰＣの色素水溶液（０．０１５ｇの粉末／４０ｍＬ）を、ＣＩＥＬａｂパラメーターについて、ＧＥＮＥＳＹＳ  １０Ｓ  ＵＶ−ＶＩＳ分光計にＶＩＳＩＯＮｌｉｔｅソフトウェアを用いて、３つ組で分析した。３つの試料の呈色パラメーターを図１６に示す。
【０２４１】
ＣＩＥＬａｂパラメーターは、発酵生成物（ＰＦおよびＦＣ）が、非発酵生成物よりも強度の強い青色を有していたことを示した。ＰＦおよびＦＣの両方とも、ＰＣに比べて、よりＬ値が低く（明るさがより低く）、ａの負の値がより小さく（より紫色に近いことを意味し得る）、しかしｂ値は同様であった。図１６はまた、ＰＦが最も高い吸光度（ＰＣの２倍）を有していたこと；およびＦＣが、ＰＣの１．６倍高い吸光度を有していたことも示した。
【０２４２】
ｐＨ３の緩衝液中での生成物安定性
ＰＦ、ＦＣ、およびＰＣの安定性を、ｐＨ３．０の緩衝液中、３通りの貯蔵条件下で評価した：冷蔵庫（６℃）、常温（２０℃）、およびチャンバー（４５℃）中で１９日間。
【０２４３】
生成物（ＰＦ、ＦＣ、およびＰＣ）はそれぞれ、試料１５ｍｇを緩衝液４０ｍＬに加えた濃度で、３つ組で試験した。試料は、同じ分光光度計で３５０〜８００ｎｍ（２ｎｍ刻みで測定）で監視した。呈色変化は、ＶＩＳＩＯＮｌｉｔｅソフトウェアバージョン２を用いて、Ｄ６５で、および観測角度１０°で、ＣＩＥＬａｂパラメーターにより測定した。呈色変化は、式［１］（以下に示す）を用い、パラメーターＬ（光線、白色０／黒色１００）、ａ（−緑色／赤色＋）、およびｂ（−青色／黄色＋）を用いて計算した。
【０２４４】
（式２）
0006576330.tif 000040
【０２４５】
ＰＦ、ＦＣ、およびＰＣの呈色関連パラメーター、Ａ（吸光度）、Ｌ、ａ、ｂ、およびΔＥａｂを、経時的に監視した。
【０２４６】
半減期は、一次反応に従って、反応速度定数（Ｌｎ（青色面積）ｔ／（青色面積）0対時間のプロットから得られる傾き）から計算した。Ｓｔａｔｇｒａｐｈｉｃｓ  ＣｅｎｔｕｒｉｏｎＸＶトライアル版を用いて、統計分析を行った。フィッシャー最小有意差（ＬＳＤ）法を用いて、平均を識別した。
【０２４７】
表４は、ＰＦ、ＦＣ、およびＰＣの半減期についての結果を日数で示す。
【０２４８】
【表４】
0006576330.tif 000041
【０２４９】
ＰＦ、ＦＣ、およびＰＣの水分量は、水分量分析計（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｂｒａｎｄ  ＭＡ３５Ｍ）で測定した場合、それぞれ、４．１２％、３．２４％、および３．１５％であった。
【０２５０】
発酵プロセスは、効率的に、６時間以内にハグワ抽出物から全ての糖を除去した。得られる発酵生成物（ＰＦおよびＰＣ）は、より強い青色を呈した。ＰＦは、非発酵生成物ＰＣの発光強度の２倍強い青色を呈した。
【０２５１】
発酵生成物ＰＦは、ビヒクル被包材料（例えば、デンプン）を添加せずに噴霧乾燥させた場合に、安定であった。
【０２５２】
発酵生成物の微生物学的安定性は、既知量の微生物（例えば、細菌、真菌、または酵母菌）を発酵生成物に添加し、次いで（例えば、７日後）発酵生成物の微生物学的安定性を測定することにより（例えば、添加した微生物の活性を測定することにより）試験することができるだろう。
【０２５３】
（実施例１１）
ＸＡＤ−７によるハグワ抽出物からの糖除去
粗ゲニパ・アメリカナジュース（１５０ｍＬ）を、グリシン（１．５ｇ）と、７０℃で２時間反応させた。反応混合物を室温まで放冷させた。次いで、ＸＡＤ−７樹脂（１００ｇ）を、冷却した反応混合物に加えた。２４時間後、ＸＡＤ−７樹脂を濾別した。
【０２５４】
得られる樹脂を、最初に水で溶出させて、水性画分を得、次いで水とエタノールの混合物で溶出させて、重合体画分を得た。重合体画分に含まれる重合体の同定は、ＨＰＬＣ分析で、実施例６の方法を用いて確認した。重合体画分の糖含有量は、実施例９に記載のＴＬＣ法により測定した。ＴＬＣによる分析は、重合体画分に糖が存在しないことを示した。一方で、水性画分は、糖が豊富であった。ＨＰＬＣ分析はまた、水性画分がいくらか重合体を含んでいることも示した。図１７は、重合体画分および水性画分のＨＰＬＣスペクトルを示す。
【０２５５】
表５は、ＨＰ  ＸＡＤ７樹脂での精製により得られる画分の分光測定特性を示す。
【０２５６】
【表５】
0006576330.tif 000042
【０２５７】
ＲＮ：ゲニパ・アメリカナジュースとグリシンの反応。
ＰＯＬ：重合体画分；エタノールで溶出、重合体の大部分を含有。
Ｈ２Ｏ：水性画分；水で溶出、糖が豊富
【０２５８】
（実施例１２）
ゲニパ・アメリカナジュースと様々なアミノ酸の反応
ゲニパ・アメリカナジュースを、いくつかのアミノ酸と反応させて、得られる呈色特性を明らかにした。１００ｍＬ三角フラスコ中、ゲニパ・アメリカナジュース（５０ｍＬ）（ゲニピン含有量２．４２％、ダイオードアレイ検出器およびＰＤＡを接続した島津製作所Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＵＦＬＣ（Ｊａｐａｎ）でＨＰＬＣ測定）を、等モル量のグリシン（ＧＬＹ）、バリン（ＶＡＬ）、リシン（ＬＹＳ）、プロリン（ＰＲＯ）、メチオニン（ＭＥＴ）、チロシン（ＴＹＲ）、またはトリプトファン（ＴＲＰ）と混合した。得られるジュース＋アミノ酸混合物を、７０℃で２時間撹拌した。反応は、アルミニウム板をシリカゲルＦ２５４で覆ったもの４×５ｃｍからメタノール−水の４：１混合物で溶出させる薄層クロマトグラフィーにより監視した。反応生成物を、実施例６に記載の方法によりＨＰＬＣ分析した。反応生成物の分光測定特性決定は、ＧＥＮＥＳＹＳ  １０Ｓ分光光度計ＵＶ−ＶＩＳにＶＩＳＩＯＮｌｉｔｅソフトウェアバージョン２．０を用いて行った。特性決定実験のため、反応溶液２０μＬを脱イオン水５ｍＬで希釈して試料を調製したが、ただしトリプトファンおよびプロリンとの反応の場合は、試料はそれぞれ、反応溶液１００および２００μＬを脱イオン水５ｍＬで希釈して調製した。
【０２５９】
反応生成物の安定性は、実施例１０に記載の方法と同様に、ｐＨ３．０の緩衝液中で評価したが、ただしこの実施例では、反応生成物に対して紫外線ランプＵＶＧＬ−５８  Ｈａｎｄｈｅｌｄ  ＵＶ（Ｕｌｔｒａ−Ｖｉｏｌｅｔ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌｔｄ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用いて２５４ｎｍで７．４６時間の照射も行った。反応生成物は、ｐＨ３．０の緩衝液１０ｍＬあたり反応生成物４０μＬの濃度で、３つ組で試験した。
【０２６０】
図１８は、ゲニパ・アメリカナジュースと様々なアミノ酸の反応生成物の吸収スペクトルを示す。これらの生成物の呈色パラメーターを、表６に示す。
【０２６１】
【表６】
0006576330.tif 000043
【０２６２】
＊ＰＲＯ２００については、粗反応混合物２００マイクロリットルを用い、一方ＰＲＯでは、２０マイクロリットルを用いた。ＴＲＰ１００について。粗反応混合物１００マイクロリットルを用い、一方ＴＲＰでは、２０マイクロリットルを用いた。
【０２６３】
図１９Ａ〜Ｃは、ゲニパ・アメリカナジュースと様々なアミノ酸の反応生成物のＨＰＬＣ分析結果を示すものであり、アミノ酸によって分類してある。図１９Ａ〜Ｃは、ゲニパ・アメリカナジュースと様々なアミノ酸の反応生成物の、実施例６の方法によるＨＰＬＣスペクトルを、各アミノ酸について、示す；重合体が同定される領域のＨＰＬＣの拡大表示；および選択したシグナルのＵＶ−ｖｉｓスペクトル。
【０２６４】
アミノ酸ＬＹＳ、ＶＡＬ、ＭＥＴ、およびＰＲＯとゲニパ・アメリカナジュースの反応生成物は、保持時間が、１０．３分の範囲内（１０．３分±５％）である。この保持時間は、ゲニパ・アメリカナジュースとグリシンに由来する重合体で観測される保持時間と類似しているが、しかしながら、ゲニパ・アメリカナジュースとアミノ酸ＬＹＳ、ＶＡＬ、ＭＥＴ、およびＰＲＯの反応生成物のシグナルは、ゲニパ・アメリカナジュースとグリシンの反応生成物で観測されるシグナルよりも複雑であった（図１９Ａ〜Ｂを参照）。理論的根拠はないが、これらの結果は、アミノ酸ＬＹＳ、ＶＡＬ、ＭＥＴ、およびＰＲＯを使用することで大きさの異なる化合物または重合体鎖がより多数形成されたことを示唆している可能性がある。
【０２６５】
ゲニパ・アメリカナジュースとチロシンまたはトリプトファンの反応は、保持時間が１０．３分の範囲内（すなわち、１０．３分±５％）である生成物を形成しなかった。これらの生成物の最大吸収波長（λｍａｘ）は、６００ｎｍを超えていた（図１９Ｃを参照）。
【０２６６】
図２０は、様々なアミノ酸とゲニパ・アメリカナジュースの反応生成物を、ｐＨ３の緩衝液に入れて２５４ｎｍのＵＶ照射を行った場合の安定性を示す（半減期で表す）。
【０２６７】
ゲニパ・アメリカナジュースと様々なアミノ酸の反応は、様々な色の生成物をもたらした：青色（ＧＬＹおよびＬＹＳ）、青緑色（ＶＡＬ、ＭＥＴ、およびＴＹＲ）、緑色（ＴＲＰ）、および黒色（ＰＲＯ）。
【０２６８】
メチオニン（ＭＥＴ）とゲニパ・アメリカナジュースの反応で形成される生成物は、ｐＨ３．０の緩衝液に入れて２５４ｎｍのＵＶ照射を７．４６時間行って試験した場合、ｐＨ安定性が、グリシン（ＧＬＹ）とゲニパ・アメリカナジュースに由来する生成物より２倍高かった。
【０２６９】
ＨＰＬＣ分析は、ゲニパ・アメリカナジュースとチロシン（ＴＹＲ）またはトリプトファン（ＴＲＰ）の反応が、グリシン（ＧＬＹ）とゲニパ・アメリカナジュースに由来する重合体と比べて、少し極性の低い化合物を形成したことを示した（ＴＹＲおよびＴＲＰとの反応による生成物の保持時間が、ＧＬＹと比べて長いことから示されるとおり）。
【０２７０】
（実施例１３）
ゲニパ・アメリカナ果物中果皮の抽出物とグリシンの反応でもたらされる色
ゲニパ・アメリカナ果物中果皮の水抽出物
ゲニパ・アメリカナ果物中果皮（すなわち、果物の皮）から水抽出物を調製した。熟していない果物は、熟した果物が柔らかくでこぼした表面を持つのとは対照的に、固くて表面が滑らかであるが、これを用いた。新鮮な（すなわち、収穫して１〜２日以内の）ゲニパ・アメリカナ果物の中果皮（７６ｇ）を、脱イオン水３００ｍＬで液化した。このジュースを濾過し、ＴＬＣおよびＨＰＬＣ（島津製作所Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＵＦＬＣにダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）を接続したもの）で分析して、ゲニピンおよび他のイリドイドゲニピン含有量を測定した。比較のため、同熟成度の果物を無処置で室温で３日間放置（新鮮ではない果物）してから、上記のとおり脱イオン水で抽出した。これで得られるジュースも、ＴＬＣおよびＨＰＬＣで分析して、ゲニピンおよび他のイリドイドゲニピン含有量を測定した。
【０２７１】
図２１Ａは、新鮮なゲニパ・アメリカナ果物の中果皮の水抽出物のＨＰＬＣスペクトルを示す。この水抽出物は、ゲニピンの保持時間（２２〜２３分）に近い、保持時間が１９〜２０分のピークを有しており、最大吸収波長が２４０ｎｍであった。
【０２７２】
図２１Ｂは、図２１Ａのものと同熟成度であるが室温で３日間放置（新鮮ではない果物）してから抽出したゲニパ・アメリカナ果物の中果皮の水抽出物のＨＰＬＣスペクトルを示す。スペクトルは、保持時間が１９〜２０分および２２〜２３分の、ピークを有していた。
【０２７３】
中果皮（皮）の水抽出物とグリシンの反応
５００ｍＬ三角フラスコ中、上記のとおり調製した中果皮の水抽出物（濾過したジュース、３００ｍＬ）をグリシン（４５０ｍｇ）と混合した。次いで、得られる混合物を、ホットプレート上で磁気撹拌（ＶＥＬＰ、Ｉｔａｌｙ）により、９０分間、４０００ｒｐｍおよび７５℃で撹拌した。この方法により、深紫色を持つ生成物が得られた。
【０２７４】
反応生成物を濾過し、ＧＥＮＥＳＹＳ  １０Ｓブランドの分光光度計ＵＶ−ＶＩＳにＶＩＳＩＯＮｌｉｔｅソフトウェアバージョン２．０を用いて、特性決定した。粗反応生成物を、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析（ＭＳ）により特性決定した。図２２は、水抽出物とグリシンを混合するこの方法で得られた紫色生成物の１Ｈ  ＮＭＲを示す。
【０２７５】
表７は、紫色色素混合物で検出されたいくつかのシグナルを示す。
【０２７６】
【表７】
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【０２７７】
表７で行った逆重畳積分は、成分のシグナルの逆重畳積分がｍ／ｚ２５７．２であることを示す。
【０２７８】
あるいは、この方法は、水抽出物を予め７０℃に加熱してからグリシンを加えて行われ、その場合得られる生成物は青色を有していた。生成物は、ゲニピンとグリシンの混合物から得られるのと同じ青色であった。図２３は、予め加熱した水抽出物とグリシンを混合するこの方法から得られる青色生成物の１Ｈ  ＮＭＲを示す。
【０２７９】
これらの結果は、ゲニパ・アメリカナ果物中果皮から得られるジュースとグリシンの反応生成物が、水抽出物を予め加熱してからグリシンを添加するかどうかに左右されたことを示す。グリシンを水抽出物（予め加熱せず）と混合する手順に従えば、形成される生成物は深紫色を有していた。水抽出物を予め７０℃に加熱してからグリシンを加える手順に従えば、形成される生成物は青色を有していた。
【０２８０】
中果皮の水抽出物から得られるゲニピン前駆体の特性決定
Ｉ．水抽出および凍結乾燥方法
ゲニパ・アメリカナの新鮮な熟していない果物（収穫から２日）を、４つに切り分け、中果皮（皮）を、内果皮（果肉）および果皮（外皮）から分離した。熟していないゲニパ・アメリカナの画像を図２４に示す。ブレンダー中、中果皮３６０ｇを脱イオン水３００ｍＬとともに粉砕し、得られるジュースを、コットン越しに吸引濾過し、そしてＬＡＢＣＯＮＣＯ装置を用いてジュースを直ちに一晩凍結乾燥させた。
【０２８１】
凍結乾燥生成物５０ｍｇを、ＣＤ３ＯＤ１ｍＬに入れて５分間超音波処理して抽出を行い、濾過した。溶液を、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｆｏｕｒｉｅｒ  ３００で、水を抑制した状態で、１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲで、それぞれ３００ＭＨＺおよび７５ＭＨｚで分析した。
【０２８２】
ＩＩ．液体窒素凍結する方法
新鮮な切断中果皮を、液体窒素で凍結させてから粉砕し、得られる粉末５０ｍｇを、ＣＤ３ＯＤ１ｍＬに入れて５分間超音波処理して抽出を行い、濾過し、溶液を、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｆｏｕｒｉｅｒ  ３００で、水を抑制した状態で、１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲで、それぞれ３００ＭＨＺおよび７５ＭＨｚで分析した。
【０２８３】
ＩＩＩ．結果
中果皮を凍結乾燥させたものおよび窒素凍結させたものの１Ｈ  ＮＭＲの結果は、ゲニピンの指紋的固有パターンと類似したパターンを持つ非常に良好な解像度のスペクトルを示した（図２５Ａ〜Ｂ）
【０２８４】
ハグワ中果皮の水抽出物は、１９分のところにＨＰＬＣ（２４０ｎｍ）ピークを有したが、このピークは加熱後または酢酸エチルでの抽出後、消失した。２１〜２２分のゲニピンピークは検出された。図２６Ａ〜Ｂは、それぞれ、中果皮の水抽出物および水抽出物を酢酸エチル溶媒で分配したもののＨＰＬＣ特性（２４０ｎｍ）を示す。
【０２８５】
ハグワ果物の中果皮における前駆体からのゲニピン形成は、図２６Ａに示される分析後数日間室温条件に維持した果物で調製した水抽出物のＨＰＬＣ特性から判断した場合には、自発的であった。ゲニピンは２１〜２２分のところに見られ、１９分のところにあるその前駆体は、２４０ｎｍで検出することができた（図２７）。
【０２８６】
ハグワ中果皮で見られるゲニピン前駆体からのゲニピンの迅速かつ自発的な形成は、酸素または加熱により引き起こされる前駆体の構造的変化（すなわちヘミアセタール環の形成）、これがゲニピンをもたらすこと、または前駆体分子の酵素による切断がゲニピンを果物の内果皮に放出することの両方を示した。中果皮の水抽出物の１Ｈ  ＮＭＲ実験は、アルデヒドプロトン（１２ｐｐｍ）を表示していない、図２８を参照。
【０２８７】
５．１および４．７ｐｐｍの２つの二重項ならびに１００および７０−８０ｐｐｍの炭素一重項が検出されたが、これらは、ゲニピンには存在しなかったものであり、糖のアノマープロトンおよびＣＨＯ部分の特徴である。このことは、前駆体がゲニピンのグリコシドであったことを支持する。ゲニピン前駆体の１Ｈ（図２９）および１３Ｃ（図３０）データは、（＋）−ゲニポシド分子およびゲニピンのイリドイドＢ−グリコシド前駆体に一致する。
【０２８８】
（＋）−ゲニポシドのスペクトルデータ：
【０２８９】
１Ｈ  ＮＭＲ：（３００ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）：δ７，５３（ｓ，  １Ｈ），  δ５，８１（ｓ，  １Ｈ），  δ５，１７（ｄ，  Ｊ＝７，６，  １Ｈ），  δ４．７３（ｄ，  Ｊ＝７．８Ｈｚ，  １Ｈ），  δ４，３３（ｄ，  Ｊ＝１４，６Ｈｚ，  １Ｈ），  δ４，２０（ｄ，  Ｊ＝１４，３Ｈｚ，  １Ｈ），  δ３，８３（ｄ，  Ｊ＝１１，７Ｈｚ，  １Ｈ），  δ３，７２（ｓ，  ３Ｈ），  δ３，６６（ｄｄ，  ｊ＝１２，２，  ５，７Ｈｚ，  １Ｈ），  δ３，３９−３，４２（ｍ，  １Ｈ），  δ３，１５−３，２８（ｍ，  ３Ｈ），  δ２，８３（ｄｄ，  １６，５，  ８，４Ｈｚ，  １Ｈ），  δ２．５３（ｄｄ，  Ｊ＝７．９５，  １５．７５Ｈｚ，  １Ｈ），  δ２，０５−２，１４（ｍ，  １Ｈ）
【０２９０】
１３Ｃ  ＮＭＲ：（７５ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）：δ１６８．７１，  １５２．２３，  １４２．９８，  １２７．３７，  １１１．１５，  ９８．９０，  ９６．９９，  ７６．８２，  ７６．３４，  ７３．３９，  ７１．４３，  ６１．１２，  ６０．００，  ５０．７７，  ４５．５８，  ３８．２９，  ３５．０３。
【０２９１】
（実施例１４）
ゲニパ・アメリカナジュースへのメチオニンおよびグリシンの添加
ゲニパ・アメリカナジュースを、メチオニンおよびグリシンと反応させて、得られる色の特性を明らかにした。メチオニン１００ｍｇとグリシン１００ｍｇの混合物に、ゲニパ・アメリカナジュース（５０ｍＬ）を加え、反応物を２時間７０℃に維持した。
【０２９２】
第二の実験では、最初にメチオニン１００ｍｇにゲニパ・アメリカナジュース（５０ｍＬ）を加え、反応の１時間後、さらにグリシン１００ｍｇを加え、反応物をさらに１時間維持した。
【０２９３】
これらの反応のそれぞれで生じる呈色を、粉末色素を０．０１５ｇ／４０ｍＬの水溶液にすることで、ＧＥＮＥＳＹＳ  １０Ｓ分光光度計で、４００〜７００の波長範囲のＵＶ−ｖｉｓ吸収について測定して、最大吸光度およびＣＩＥＬａｂパラメーターを求めた。
【０２９４】
アミノ酸を加える順番に関係なく、結果は、深青色の形成である。薄層クロマトグラフィーは、重合体の形成を示した。また、主要化合物が、反応体を加える順番に関係なく同じであったこと、および呈色が、メチオニンまたはグリシンを単独で用いてもメチオニンとグリシンの混合物を用いても同じであったことを示す。ＴＬＣは、青色色素形成を示した。反応生成物を、表８に示すとおり、分光測定で分析した。
【０２９５】
【表８】
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【０２９６】
Ｍ＋Ｇ：ゲニパ・アメリカナジュースとグリシンおよびメチオニンを同時に反応させたもの
１＋２：メチオニンとゲニパ・アメリカナジュースを反応させ、続いてグリシンと反応させたもの。
ＲＮ：ゲニパ・アメリカナジュースとグリシンを反応させたもの。
【０２９７】
ゲニパ・アメリカナジュースとアミノ酸混合物の大部分において、重合体のＨＰＬＣクロマトグラムにおける保持時間が同定され、その保持時間は、グリシンとゲニパ・アメリカナジュースのみの反応により生成する色素と同じであった。最大吸収は、５９０ｎｍであった。グリシンおよびメチオニンは、ゲニパ・アメリカナジュースに同時に添加した。ゲニパ・アメリカナジュースとアミノ酸類グリシンおよびメチオニンならびにグリシン単独の反応により得られるクロマトグラムを図３１に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0006576330.tif 000059
【図９】
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【図１０】
0006576330.tif 000061
【図１１】
0006576330.tif 000062
【図１２】
0006576330.tif 000063
【図１３】
0006576330.tif 000064
【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５】
0006576330.tif 000071
【図１６】
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【図１７】
0006576330.tif 000073
【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
0006576330.tif 000076
【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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