(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の糖化アルブミンの測定方法であって、
（１）プロテアーゼにより糖化アルブミンから分解生成物質を生成せしめた試料と、１２Ｕ／ｍＬ以上のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと、を、３００ｍｍｏｌ／Ｌ以上のヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物の存在下で反応させ、還元されたヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物を生成せしめる工程と、
（２）工程（１）における反応の状態を、くし型電極を使用して電気化学的方式で検出する工程と、
を含み、
前記くし型電極は、総面積が１．８ｍｍ2〜４ｍｍ2であり、電極間距離が５０μｍ未満であり、作用極の電極幅が５μｍ〜５０μｍであり、かつ対極の電極幅が５μｍ〜１００μｍであり、
前記フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと前記ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物を含む組成物が、前記くし型電極に配置されている、
測定方法。
【請求項２】
試料中の糖化アルブミンの測定方法であって、
（１）プロテアーゼにより糖化アルブミンから分解生成物質を生成せしめた試料と、１２Ｕ／ｍＬ以上のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと、を、２００ｍｍｏｌ／Ｌ以上のヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物の存在下で反応させ、還元されたヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物を生成せしめる工程と、
（２）工程（１）における反応の状態を、くし型電極を使用して電気化学的方式で検出する工程と、
を含み、
前記くし型電極は、総面積が１．８ｍｍ2〜４ｍｍ2であり、電極間距離が５０μｍ未満であり、作用極の電極幅が５μｍ〜５０μｍであり、かつ対極の電極幅が５μｍ〜１００μｍであり、
前記フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと前記ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物を含む組成物が、前記くし型電極に配置されている、
測定方法。
【請求項３】
前記電気化学的方式が定電位電流測定方式である、請求項１又は２に記載の測定方法。
【請求項４】
試料中の糖化アルブミンの測定用バイオセンサであって、
（１）３００ｍｍｏｌ／Ｌ以上のヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物及び１２Ｕ／ｍＬ以上のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを含む組成物と、
（２）総面積が１．８ｍｍ2〜４ｍｍ2であり、電極間距離が５０μｍ未満であり、作用極の電極幅が５μｍ〜５０μｍであり、かつ対極の電極幅が５μｍ〜１００μｍであるくし型電極と、
を備え、
前記フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと前記ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物を含む組成物が前記くし型電極に配置されており、
プロテアーゼを接触させた糖化アルブミンから生成せしめた分解生成物質が前記フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと反応させられる、バイオセンサ。
【請求項５】
試料中の糖化アルブミンの測定用バイオセンサであって、
（１）２００ｍｍｏｌ／Ｌ以上のヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物及び１２Ｕ／ｍＬ以上のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを含む組成物と、
（２）総面積が１．８ｍｍ2〜４ｍｍ2であり、電極間距離が５０μｍ未満であり、作用極の電極幅が５μｍ〜５０μｍであり、かつ対極の電極幅が５μｍ〜１００μｍであるくし型電極と、
を備え、
前記フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと前記ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物を含む組成物が前記くし型電極に配置されており、
プロテアーゼを接触させた糖化アルブミンから生成せしめた分解生成物質が前記フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと反応させられる、バイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の糖化タンパク質の測定法、及び、その測定用バイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖化タンパク質の血中濃度は過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、その血中濃度の測定値が、糖尿病の症状の診断及び管理の重要な指標となり得ることが知られている。糖化タンパク質としてはヘモグロビンの糖化タンパク質であるヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）やアルブミンの糖化タンパク質である糖化アルブミン（ＧＡ）が知られている。糖化タンパク質の血中濃度は長期（数週間〜数ヶ月）の血糖値を反映した安定した指標であるため、糖尿病の診断及び治療のために行う血糖コントロールの成否の判定に有用である。
【０００３】
この糖化タンパク質の血中濃度の測定法としては、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＦＡＯＤ」と記す場合がある。）を利用して測定する方法が、特許文献１に開示されている。特許文献１に開示された方法は、試料と、ＦＡＯＤと、を反応させる前に、プロテアーゼにより試料を前処理して糖化タンパク質を糖化ペプチド及び糖化アミノ酸に分解して、ＦＡＯＤの反応速度を高め、糖化タンパク質の検出感度を高めている。ＦＡＯＤ力価測定には、比色法、蛍光法、及び電気化学的方法等の公知の方法が用いられる。
【０００４】
一方、０．３〜１０μＬ（マイクロリットル）程度の液体試料をセンサユニット内に吸い上げ、センサユニット内部で種々の試薬により試料を処理してその反応を計測することにより、試料の分析を行う手法が種々提案されている。また特に、試薬として酵素を用い、酵素の基質特異性を利用して試料中の特定の物質の濃度を測定可能なバイオセンサは、種々の物質を含む生体試料の分析に適するため、医療用の検査機器を始め、様々な分野で用いられるようになっている。このようなバイオセンサを上記の糖化タンパク質の血中濃度の測定に応用した例として、特許文献２に開示されたものが知られている。特許文献２に開示されたバイオセンサは、水溶性光硬化性樹脂により人工電子メディエータと共に電極上にＦＡＯＤを固定化したバイオセンサであって、電気化学的方法により糖化タンパク質濃度を測定するバイオセンサである。
【０００５】
また、くし型電極を用いたバイオセンサを、グルコース等の血液成分の測定に応用した測定方法が特許文献３に開示されている。特許文献３に開示された方法においては、くし型電極を有するバイオセンサが、酸化還元酵素により血液成分を酸化し、その反応生成物による酸化電流を電極で検出し、血液成分を測定する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第９８／４８０４３号
【特許文献２】特開２００９−１７１８７４号公報
【特許文献３】国際公開第２０１４／１１２５６９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１及び２に開示の糖化タンパク測定方法は、ＦＡＯＤの力価測定に、電気的測定法等公知の方法を用いており、いずれも感度、データの安定性が不十分であり、実用化が困難であった。一方特許文献３のバイオセンサを用いた測定方法は、グルコース等の血液成分の測定に関するものであり、糖化タンパク質の測定への応用は未知である。
【０００８】
本発明は、このような問題を解決し、簡便かつ安価に試料中の糖化タンパク質濃度を高感度測定できるようにすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、前記課題を解決すべく、鋭意検討したところ、プロテアーゼを接触させ、糖化タンパク質から分解生成物質を生成せしめた試料に、電子メディエータとくし型電極を組み合わせて反応させることにより、驚くべきことに簡便かつ安価に試料中の糖化タンパク質濃度を高感度定量できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち本発明は以下に関する。
［１］試料中の糖化タンパク質の測定方法であって、（１）プロテアーゼにより糖化タンパク質から分解生成物質を生成せしめた試料と、酸化還元酵素と、を、電子メディエータの存在下で反応させ、還元された電子メディエータを生成せしめる工程と、（２）工程（１）における反応の状態を、くし型電極を使用して電気化学的方式で検出する工程と、を含む測定方法。
【００１１】
［２］酸化還元酵素と電子メディエータを含む組成物がくし型電極上に配置されている、［１］に記載の測定方法。
【００１２】
［３］酸化還元酵素がフルクトシルアミノ酸オキシダーゼである、［１］又は［２］に記載の測定方法。
【００１３】
［４］電子メディエータがヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物である、［１］から［３］のいずれかに記載の測定方法。
【００１４】
［５］電気化学的方式が定電位電流測定方式である、［１］から［４］のいずれかに記載の測定方法。
【００１５】
［６］糖化タンパク質が糖化アルブミンである、［１］から［５］のいずれかに記載の測定方法。
【００１６】
［７］くし型電極は、総面積が１．８ｍｍ2〜４ｍｍ2であり、電極間距離が５０μｍ未満であり、作用極の電極幅が５μｍ〜５０μｍであり、かつ対極の電極幅が５μｍ〜１００μｍである、［１］から［６］のいずれかに記載の測定方法。
【００１７】
［８］上記（１）工程におけるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの濃度が１２Ｕ／ｍＬ以上である、［３］に記載の測定方法。
【００１８】
［９］上記（１）工程におけるヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物の濃度が３００ｍｍｏｌ／Ｌ以上である、［４］に記載の測定方法。
【００１９】
［１０］試料中の糖化タンパク質の測定用バイオセンサであって、（１）電子メディエータ及び酸化還元酵素を含む組成物と、（２）くし型電極と、を備え、プロテアーゼにより糖化タンパク質から生成せしめた分解生成物質を酸化還元酵素と反応させる、バイオセンサ。
【００２０】
［１１］試料中の糖化アルブミンの測定用バイオセンサであって、（１）３００ｍｍｏｌ／Ｌ以上のヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物及び１２Ｕ／ｍＬ以上のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを含む組成物と、（２）総面積が１．８ｍｍ2〜４ｍｍ2であり、電極間距離が５０μｍ未満であり、作用極の電極幅が５μｍ〜５０μｍであり、かつ対極の電極幅が５μｍ〜１００μｍであるくし型電極と、を備え、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼとヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物を含む組成物がくし型電極に配置されており、プロテアーゼを接触させた糖化タンパク質から生成せしめた分解生成物質がフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと反応させられる、バイオセンサ。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、プロテアーゼにより糖化タンパク質から分解生成物質を生成せしめた試料に、電子メディエータとくし型電極を組み合わせて反応させることによって、簡便かつ安価に試料中の糖化タンパク質濃度を高感度定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施例に係るベンジルオキシカルボニル−フルクトシルリジン測定時の感度と、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ濃度との関係を示すグラフである。
【図２】実施例に係るベンジルオキシカルボニル−フルクトシルリジン測定時の感度と、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物濃度との関係を示すグラフである。
【図３】比較例に係るベンジルオキシカルボニル−フルクトシルリジン測定時の標準曲線（カーボン印刷電極）を示すグラフである。
【図４】実施例に係るベンジルオキシカルボニル−フルクトシルリジン測定時の標準曲線（くし型電極）を示すグラフである。
【図５】実施例に係る試薬を配置したカーボン電極及びくし型電極使用時のベンジルオキシカルボニル−フルクトシルリジン測定時の標準曲線を示すグラフである。
【図６】比較例に係る糖化アルブミンのプロテーゼ消化物測定時の反応の時間変化（カーボン印刷電極）を示すグラフである。
【図７】実施例に係る糖化アルブミンのプロテーゼ消化物測定時の反応の時間変化（くし型電極）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の実施の形態（以下、「本実施の形態」という。）につき具体的に説明する。ただし、以下の本実施の形態が、本発明を限定すべきものであると理解するべきではない。
【００２４】
本実施の形態は、試料中の糖化タンパク質の測定方法であって、
（１）プロテアーゼにより糖化タンパク質から分解生成物質を生成せしめた試料と、酸化還元酵素と、を、電子メディエータの存在下で反応させ、還元された電子メディエータを生成せしめる工程と、
（２）工程（１）における反応の状態を、くし型電極を使用して電気化学的方式で検出する工程と、
を含む測定方法である。
【００２５】
本実施の形態に係る方法で測定される糖化タンパク質は、タンパク質の糖化物であれば特に限定されない。例えばタンパク質に含まれるアミノ基と糖とがメイラード反応によってシッフ塩基を形成しアマドリ転位した物質が好ましいが、これに限定されない。具体的には、糖化アルブミンが一例として挙げられる。
【００２６】
「プロテアーゼにより糖化タンパク質から分解生成物質を生成せしめた試料」とは、プロテアーゼと、試料が含んでいる可能性のある糖化タンパク質とを接触させ、糖化タンパク質の分解生成物質を生成せしめる行為を行った試料をいうが、実際に分解生成物質が生成されたがどうかは問わない。試料は糖化タンパク質を含む可能性のある試料であるが、測定の結果、試料が糖化タンパク質を含んでいないことが明らかになる場合もある。
【００２７】
プロテアーゼは、糖化タンパク質を酸化還元酵素の基質に分解できれば特に限定されないが、例えばトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）、キモトリプシン（Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）等の動物由来のプロテアーゼ、パパイン（Ｐａｐａｉｎ）、ブロメライン（Ｂｒｏｍｅｌａｉｎ）等の植物由来のプロテアーゼ、微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。
【００２８】
微生物由来のプロテアーゼの例としては、オリエンターゼ２２ＢＦ（エイチビィアイ社製）等に代表されるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来プロテアーゼ、プロテアーゼタイプ−ＸＩＩＩ（シグマ社製）等に代表されるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、ＰＤ酵素（キッコーマン社製）等に代表されるペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）由来プロテアーゼ、プロナーゼ（Ｐｒｏｎａｓｅ）等に代表されるストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−ｃ（シグマ社製）等に代表されるリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）由来プロテアーゼ、プロテイナーゼＡ（ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＡ；シグマ社製）  等に代表される酵母（Ｙｅａｓｔ）由来プロテアーゼ、プロテイナーゼＫ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ；シグマ社製）等に代表されるトリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）由来プロテアーゼ、アミノペプチダーゼＴ（ＡｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＴ；ベーリンガー・マンハイム社製）等に代表されるサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ（ＥｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＡｓｐ−Ｎ；和光純薬社製）等に代表されるシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓ）由来、リジルエンドペプチダーゼ（Ｌｙｓｙｌｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ和光純薬社製）等に代表されるアクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）由来プロテアーゼが挙げられる。これらの具体的な例は１例に過ぎず、なんら限定されるものではない。好ましくはオリエンターゼ２２ＢＦ（エイチビィアイ社製）である。
【００２９】
本実施の形態における電子メディエータとしては特に限定されないが、例えばフェリシアン化カリウム、ｍ−ＰＭＳ（１−ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）やヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物を用いることができる。好ましくはヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物である。
【００３０】
上記（１）工程における電子メディエータの濃度は、糖化タンパク質を測定できれば特に限定されないが、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物の場合は例えば３００ｍｍｏｌ／Ｌ以上である。３００ｍｍｏｌ／Ｌを下回ると、測定に必要な電流が得られない場合がある。
【００３１】
本実施の形態における酸化還元酵素としては、特に限定されないが、例えば、濃度を測定しようとする糖化タンパク質のプロテアーゼ分解生成物質を基質とするフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）である。具体的には、ギベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属又はデバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが用いられるが、これに限定されない。上記（１）工程におけるＦＡＯＤの濃度は、糖化タンパク質を測定できれば特に限定されないが、例えば１２Ｕ／ｍＬ以上、好ましくは６０Ｕ／ｍＬ以上である。１２Ｕ／ｍＬを下回ると、測定に必要な電流が得られない場合がある。
【００３２】
本実施の形態に係る方法におけるくし型電極は、それぞれ交互に配置された作用極と対極を備える。くし型電極の形状は、糖化タンパク質を測定できれば特に限定されないが、例えば総面積が１．８ｍｍ2〜４ｍｍ2であり、電極間距離が５０μｍ未満であり、作用極の電極幅が５μｍ〜５０μｍであり、かつ対極の電極幅が５μｍ〜１００μｍである。
【００３３】
本実施の形態におけるくし型電極の製造方法としては、以下の４つの態様を挙げることができる。
（１）電気絶縁性の基板上に貴金属の膜を形成し、その上にスクリーン印刷法によりレジストをくし型形状に印刷して、レジストで覆われていない部分の貴金属の膜をエッチングする。その後、レジストを除去することにより、くし型電極を形成する。
（２）電気絶縁性の基板上に貴金属の膜を形成し、その上にレジストを塗布又は貼付し、フォトマスクを介して露光を行なってくし型電極を形成する部分のレジストを硬化させる。その後、くし型電極を形成する部分以外のレジスト及び貴金属の膜をエッチングし、さらに、くし型電極を形成する部分のレジストを除去することにより、くし型電極を形成する。
（３）電気絶縁性の基板上に、製造すべきくし型電極パターンを抜いたテンプレートを重ね、テンプレートを介して電気絶縁性の基板上に貴金属の膜を形成した後、テンプレートを除去することにより、くし型電極を形成する。
（４）電気絶縁性の基板上に、スクリーン印刷法により、くし型電極を形成しない部分にレジストを印刷し、電気絶縁性の基板及びレジスト上に貴金属の膜を形成する。その後、レジスト及びレジスト上に形成された貴金属の膜を除去することにより、くし型電極を形成する。
電気絶縁性の基板の材料としては、例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレンテレフタレート、及びエンジニアリングプラスチック等が挙げられる。貴金属としては、例えば、金、白金、銀、パラジウム、ルテニウム、イリジウム、ロジウム、及びこれらの混合物が挙げられる。ただし、くし型電極の製造方法は、上記に限定されない。
【００３４】
本実施の形態に係る方法における電気化学方式としては、公知の方法を用いればよい。例えば定電位法等が用いられるが、これに限定されない。
【００３５】
定電位法による糖化タンパク質の測定原理の一例は、以下のとおりである。まず試料中に含まれる糖化タンパク質にプロテアーゼを接触させ、糖化タンパク質の分解生成物質を生成せしめる。次に、生成した糖化タンパク質の分解生成物質を、酸化還元酵素で酸化する。分解生成物質の酸化反応により、その酸化反応の電子受容体としての電子メディエータが還元される。くし型電極に定電位を印加すると、還元された電子メディエータが再酸化され、応答電流が得られる。当該応答電流の強さは、糖化タンパク質の濃度と相関するため、応答電流の値を測定することにより、糖化タンパク質の濃度を測定することが可能となる。
【００３６】
本実施の形態における方法においては、電子メディエータと共に酸化還元酵素をくし型電極上に配置する場合があるが、これに限定されない。電子メディエータと酸化還元酵素をくし型電極上に配置する方法としては、公知の方法を用いればよい。例えば、電子メディエータと酸化還元酵素の混合液をくし型電極上に滴下した後、乾燥させて配置させる、乾燥等が用いられるが、これに限定されない。
【００３７】
また、本実施の形態は、試料中の糖化タンパク質の測定用バイオセンサであって、
（１）電子メディエータ及び酸化還元酵素を含む組成物と、
（２）くし型電極と、
を備え、プロテアーゼにより糖化タンパク質から生成せしめた分解生成物質を酸化還元酵素と反応させる、バイオセンサである。
【００３８】
本実施の形態に係るバイオセンサで測定される糖化タンパク質は、タンパク質に含まれるアミノ基と糖とがメイラード反応によってシッフ塩基を形成しアマドリ転位した物質であれば、特に限定されないが、例えば糖化アルブミンである。
【００３９】
「プロテアーゼにより糖化タンパク質から分解生成物質を生成せしめた試料」とは、プロテアーゼと、試料が含んでいる可能性のある糖化タンパク質とを接触させ、糖化タンパク質の分解生成物質を生成せしめる行為を行った試料をいうが、実際に分解生成物質が生成されたかどうかは問わない。
【００４０】
試料は糖化タンパク質を含む可能性のある試料であるが、測定の結果、試料が糖化タンパク質を含んでいないことが明らかになる場合もある。プロテアーゼは、糖化タンパク質を酸化還元酵素の基質に分解できれば特に限定されないが、例えばトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）、キモトリプシン（Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）等の動物由来のプロテアーゼ、パパイン（Ｐａｐａｉｎ）、ブロメライン（Ｂｒｏｍｅｌａｉｎ）等の植物由来のプロテアーゼ、微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。
【００４１】
微生物由来のプロテアーゼの例としては、オリエンターゼ２２ＢＦ（エイチビィアイ社製）等に代表されるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来プロテアーゼ、プロテアーゼタイプ−ＸＩＩＩ（シグマ社製）等に代表されるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、ＰＤ酵素（キッコーマン社製）等に代表されるペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）由来プロテアーゼ、プロナーゼ（Ｐｒｏｎａｓｅ）等に代表されるストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−ｃ（シグマ社製）等に代表されるリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）由来プロテアーゼ、プロテイナーゼＡ（ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＡ；シグマ社製）  等に代表される酵母（Ｙｅａｓｔ）由来プロテアーゼ、プロテイナーゼＫ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ；シグマ社製）等に代表されるトリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）由来プロテアーゼ、アミノペプチダーゼＴ（ＡｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＴ；ベーリンガー・マンハイム社製）等に代表されるサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ（ＥｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＡｓｐ−Ｎ；和光純薬社製）等に代表されるシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）由来、リジルエンドペプチダーゼ（Ｌｙｓｙｌｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ和光純薬社製）等に代表されるアクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）由来プロテアーゼが挙げられる。これらの具体的な例は１例に過ぎず、なんら限定されるものではない。好ましくはオリエンターゼ２２ＢＦ（エイチビィアイ社製）である。
【００４２】
本実施の形態に係るバイオセンサにおける電子メディエータとしては特に限定されないが、例えばフェリシアン化カリウム、ｍ−ＰＭＳ（１−ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）やヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物を用いることができる。好ましくはヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物である。
【００４３】
電子メディエータの濃度は、糖化タンパク質を測定できれば特に限定されないが、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物の場合、バイオセンサに試料溶液を加えたときに、例えば３００ｍｍｏｌ／Ｌ以上となるよう設定される。３００ｍｍｏｌ／Ｌを下回ると、測定に必要な電流が得られない場合がある。
【００４４】
本実施の形態に係るバイオセンサにおける酸化還元酵素としては、特に限定されないが、例えば、濃度を測定しようとする糖化タンパク質のプロテアーゼ分解生成物質を基質とするフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）である。具体的には、ギベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属又はデバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが用いられるが、これに限定されない。ＦＡＯＤの濃度は、糖化タンパク質を測定できれば特に限定されないが、バイオセンサに試料溶液を加えたときに、例えば１２Ｕ／ｍＬ以上となるよう設定される。１２Ｕ／ｍＬを下回ると、測定に必要な電流が得られない場合がある。
【００４５】
本実施の形態に係るバイオセンサにおけるくし型電極は、それぞれ交互に配置された作用極と対極を備える。くし型電極の形状は、糖化タンパク質を測定できれば特に限定されないが、例えば総面積が１．８ｍｍ2〜４ｍｍ2であり、電極間距離が５０μｍ未満であり、作用極の電極幅が５μｍ〜５０μｍであり、かつ対極の電極幅が５μｍ〜１００μｍである。
【００４６】
また本実施の形態に係るバイオセンサにおけるくし型電極の製造方法としては、以下の４つの態様を挙げることができる。
（１）電気絶縁性の基板上に貴金属の膜を形成し、その上にスクリーン印刷法によりレジストをくし型形状に印刷して、レジストで覆われていない部分の貴金属の膜をエッチングする。その後、レジストを除去することにより、くし型電極を形成する。
（２）電気絶縁性の基板上に貴金属の膜を形成し、その上にレジストを塗布又は貼付し、フォトマスクを介して露光を行なってくし型電極を形成する部分のレジストを硬化させる。その後、くし型電極を形成する部分以外のレジスト及び貴金属の膜をエッチングし、さらに、くし型電極を形成する部分のレジストを除去することにより、くし型電極を形成する。
（３）電気絶縁性の基板上に、製造すべきくし型電極パターンを抜いたテンプレートを重ね、テンプレートを介して電気絶縁性の基板上に貴金属の膜を形成した後、テンプレートを除去することにより、くし型電極を形成する。
（４）電気絶縁性の基板上に、スクリーン印刷法により、くし型電極を形成しない部分にレジストを印刷し、電気絶縁性の基板及びレジスト上に貴金属の膜を形成する。その後、レジスト及びレジスト上に形成された貴金属の膜を除去することにより、くし型電極を形成する。
電気絶縁性の基板の材料としては、例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレンテレフタレート、及びエンジニアリングプラスチック等が挙げられる。貴金属としては、例えば、金、白金、銀、パラジウム、ルテニウム、イリジウム、ロジウム、及びこれらの混合物が挙げられる。ただし、くし型電極の製造方法は、上記に限定されない。
【００４７】
本実施の形態に係るバイオセンサは、電気化学方式で、糖化タンパク質の分解生成物質と酸化還元酵素との反応の状態を検出する。電気化学方式としては、公知の方法を用いればよい。例えば定電位法等が用いられるが、これに限定されない。
【００４８】
定電位法による糖化タンパク質の測定原理の一例は、以下のとおりである。まず試料中に含まれる糖化タンパク質にプロテアーゼを接触させ、糖化タンパク質の分解生成物質を生成せしめる。次に、生成した糖化タンパク質の分解生成物質を、バイオセンサの酸化還元酵素で酸化する。分解生成物質の酸化反応により、その酸化反応の電子受容体としての電子メディエータが還元される。くし型電極に定電位を印加すると、還元された電子メディエータが再酸化され、応答電流が得られる。当該応答電流の強さは、糖化タンパク質の濃度と相関するため、応答電流の値を測定することにより、糖化タンパク質の濃度を測定することが可能となる。
【００４９】
本実施の形態に係るバイオセンサにおいては、電子メディエータと共に酸化還元酵素をくし電極上に配置する場合があるが、これに限定されない。電子メディエータと酸化還元酵素をくし型電極上に配置する方法としては、公知の方法を用いればよい。例えば、電子メディエータと酸化還元酵素の混合液をくし型電極上に滴下した後、乾燥させて配置させる、乾燥等が用いられるが、これに限定されない。
【００５０】
さらに、本実施の形態は、試料中の糖化アルブミンの測定用バイオセンサであって、
（１）試料溶液を加えられたときに３００ｍｍｏｌ／Ｌ以上となるよう設定されたヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物及び試料溶液を加えられたときに１２Ｕ／ｍＬ以上となるよう設定されたフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを含む組成物と、
（２）総面積が１．８ｍｍ2〜４ｍｍ2であり、電極間距離が５０μｍ未満であり、作用極の電極幅が５μｍ〜５０μｍであり、かつ対極の電極幅が５μｍ〜１００μｍであるくし型電極と、
を備え、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼとヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物を含む組成物がくし型電極に配置されており、プロテアーゼにより糖化タンパク質から生成せしめた分解生成物質をフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと反応させる、バイオセンサであり得る。
【実施例】
【００５１】
以下、試料中の糖化アルブミン濃度（ＧＡ）を、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）を利用して測定した実施例について説明するが、測定対象の試料や用いる酵素等がこれらに限られないことは、もちろんである。糖化アルブミン測定は以下の原理に基づいている。まず試料中に含まれるＧＡをプロテアーゼにより消化し、リジン残基のε位のアミノ基が糖化された構造である、フルクトシルリジン（ε−ＦＫ）を遊離させる。遊離のε−ＦＫをＦＡＯＤにより酸化する。ε−ＦＫの酸化反応により、その酸化反応の電子受容体としての人工電子受容体（メディエータ）が還元される。くし型電極に定電位を印加すると、還元されたメディエータが再酸化され、応答電流が得られる。当該応答電流の強さは、ＧＡの濃度と相関するため、応答電流の値を測定することにより、ＧＡの濃度を測定することが可能となる。以下の実施例では、ε−ＦＫの合成基質としてα位のアミノ基がベンジルオキシカルボニル基でマスクされた、ベンジルオキシカルボニル−フルクトシルリジン（Ｚ−ＦＫ）を用いた。
【００５２】
（実施例１）ＦＡＯＤ濃度の最適化
＜試薬（終濃度）＞
・１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸カリウム緩衝液（ＰＰＢ） （ｐＨ８．０）
・ＦＡＯＤ（１.２〜２４０Ｕ／ｍＬ）
・ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）
＜基質（終濃度）＞
・Ｚ−ＦＫ溶液（０〜５００μｍｏｌ／Ｌ）
＜使用電極＞
・くし型電極（国際公開第２０１４／１１２５６９号に記載の田中貴金属社開発のくし型電極）
【００５３】
ＦＡＯＤを４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＰＢに４.８、９.６、２４、４８、９６、１９２、２４０、４８０、６４０、９６０Ｕ／ｍＬになるように溶解した。ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物を４００ｍｍｏｌ／Ｌになるように精製水に溶解した。Ｚ−ＦＫを１００、２００、６００、１０００μｍｏｌ／Ｌになるように精製水に溶解した。
【００５４】
ＦＡＯＤ溶液３μＬ、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物水溶液３μＬを混合した後に、Ｚ−ＦＫ水溶液又は精製水を６μＬと混合した。この時、ＦＡＯＤの終濃度は１.２、２.４、６、９、１２、２４、４８、６０、１２０、１６０、２４０Ｕ／ｍＬとなり、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物の終濃度は１００ｍｍｏｌ／Ｌとなり、Ｚ−ＦＫの終濃度は０、５０、１００、３００、５００μｍｏｌ／Ｌとなる。上記混合液をくし型電極の作用極及び対極上に３μＬ滴下した。室温で６０秒反応させた後、１００ｍＶ印加して定電位測定をおこない、５秒後の電流値をそれぞれ比較した。感度（電流値／Ｚ−ＦＫ濃度）と、ＦＡＯＤ濃度との関係を解析した結果、図１に示すように、ＦＡＯＤ濃度依存的に感度の上昇が観察された。観察の結果、ＦＡＯＤを終濃度で１２Ｕ／ｍＬ以上含ませると感度が安定し、６０Ｕ／ｍＬ以上含ませると、反応効率が十分良いと考えられた。
【００５５】
（実施例２）メディエータ濃度の最適化
＜試薬（終濃度）＞
・１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸カリウム緩衝液（ＰＰＢ） （ｐＨ８．０）
・ＦＡＯＤ （１２Ｕ／ｍＬ）
・ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物（１〜４００ｍｍｏｌ／Ｌ）
＜基質（終濃度）＞
・Ｚ−ＦＫ溶液（０〜５００μｍｏｌ／Ｌ）
＜使用電極＞
・くし型電極（国際公開第２０１４／１１２５６９号に記載の田中貴金属社開発のくし型電極）
ＦＡＯＤを１２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＰＢに１４４Ｕ／ｍＬになるように溶解した。ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物を４、４０、２００、４００、６００、８００、１２００、１６００ｍｍｏｌ／Ｌになるように精製水に溶解した。Ｚ−ＦＫを７５、１５０、４５０、７５０μｍｏｌ／Ｌになるように精製水に溶解した。
【００５６】
ＦＡＯＤ溶液１μＬ、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物水溶液３μＬを混合した後に、Ｚ−ＦＫ水溶液又は精製水８μＬと混合した。この時、ＦＡＯＤの終濃度は１２Ｕ／ｍＬとなり、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物の終濃度は１、１０、５０、１００、１５０、３００、４００ｍｍｏｌ／Ｌとなり、Ｚ−ＦＫの終濃度は０、５０、１００、３００、５００μｍｏｌ／Ｌとなる。上記混合液をくし型電極の作用極及び対極上に３μＬ滴下し、室温で６０秒反応させた後、１００ｍＶ印加して定電位測定をおこない、５秒後の電流値をそれぞれ比較した。感度（電流値／Ｚ−ＦＫ濃度）と、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物濃度との関係を解析した結果、図２に示すように、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物の濃度依存的に、感度の上昇が観察された。観察の結果、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物を終濃度で３００ｍｍｏｌ／Ｌ以上含ませることが好ましいことが判明した。
【００５７】
（実施例３）カーボン印刷電極とくし型電極の比較
＜試薬（終濃度）＞
・１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸カリウム緩衝液（ＰＰＢ） （ｐＨ８．０）
・ＦＡＯＤ （６０Ｕ／ｍＬ）
・ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物（３００ｍｍｏｌ／Ｌ）
＜基質（終濃度）＞
・Ｚ−ＦＫ水溶液（０〜５００μｍｏｌ／Ｌ）
＜使用電極＞
・くし型電極（国際公開第２０１４／１１２５６９号に記載の田中貴金属社開発のくし型電極）
・カーボン印刷電極（バイオデバイステクノロジー社製）
【００５８】
ＦＡＯＤを１２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＰＢに７２０Ｕ／ｍＬになるように溶解した。ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物を１２００ｍｍｏｌ／Ｌになるように精製水に溶解した。Ｚ−ＦＫを７５、１５０、４５０、７５０μｍｏｌ／Ｌになるように精製水に溶解した。
【００５９】
ＦＡＯＤ溶液１μＬ、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物水溶液３μＬを混合した後に、Ｚ−ＦＫ水溶液を８μＬ混合した。くし型電極とカーボン印刷電極のそれぞれに３μＬ滴下して、６０秒反応させ、１００ｍＶ印加して定電位測定をおこない、５秒後（くし型電極）、２０秒後（カーボン印刷電極）の電流値を比較した。Ｚ−ＦＫ濃度と、電流値と、の相関を解析した結果、図３に示すカーボン印刷電極と比較して、図４に示すくし型電極におけるＺ−ＦＫ測定時の検量線の傾きが約７倍になった。また、くし型電極を用いた場合の方が観察される電流密度が高かった。即ち、観察される電流値を作用極の面積で除した値；電流密度をくし型電極とカーボン印刷電極とで比較すると、例えば、今回の計測の最高濃度であるＺ−ＦＫ濃度５００μｍｏｌ／Ｌにおいて、それぞれ、１．９１μA／ｍｍ2及び１１９ｎA／ｍｍ2となり、くし型電極で観察される電流密度はカーボン印刷電極で観察される電流密度の約１６倍であった。このように、くし型電極を適用することで高感度化が達成されることが判明した。
【００６０】
（実施例４）くし型電極への試薬の配置
＜試薬（終濃度）＞
・１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸カリウム緩衝液（ＰＰＢ） （ｐＨ８．０）
・ＦＡＯＤ （６０Ｕ／ｍＬ）
・ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物（３００ｍｍｏｌ／Ｌ）
・スクロース（０．２５％）和光純薬工業製
＜基質（終濃度）＞
・Ｚ−ＦＫ水溶液（０〜５００μｍｏｌ／Ｌ）
＜使用電極＞
・くし型電極（国際公開第２０１４／１１２５６９号に記載の田中貴金属社開発のくし型電極）
・カーボン印刷電極（バイオデバイステクノロジー社製）
【００６１】
ＦＡＯＤを１２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＰＢに７２０Ｕ／ｍＬになるように溶解した。ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物を１２００ｍｍｏｌ／Ｌになるように精製水に溶解した。スクロースを０．３７５％になるように精製水に溶解した。Ｚ−ＦＫを終濃度５０、１００、３００、５００μｍｏｌ／Ｌになるように精製水に溶解した。ＦＡＯＤ溶液１μＬ、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物水溶液３μＬ、及びスクロース８μＬを混合した後に、カバー付きのくし型電極及びカーボン印刷電極にそれぞれ０．８μＬと１．３μＬ吸引させ、２５℃の恒温インキュベータで３０分乾燥させてＦＡＯＤを配置したセンサを作製した。作製したＦＡＯＤが配置されたセンサに、Ｚ−ＦＫ溶液をそれぞれ０．８μＬと１．３μＬ吸引させた。６０秒反応させた後、１００ｍＶ印加して定電位測定をおこない、それぞれ、５秒後（くし型電極）、２０秒後（カーボン印刷電極）の電流値を比較した。Ｚ−ＦＫ濃度と電流値の相関を解析した結果、図５に示すとおり、カーボン印刷電極と比較して、くし型電極を用いた時に、Ｚ−ＦＫ測定時の検量線の傾きが約６倍になった。また、くし型電極を用いた場合の方が観察される電流密度が高かった。即ち、観察される電流値を作用極の面積で除した値；電流密度をくし型電極とカーボン印刷電極とで比較すると、例えば、今回の計測の最高濃度であるＺ−ＦＫ濃度５００μｍｏｌ／Ｌにおいて、それぞれ、１．４４μＡ／ｍｍ2及び１１４ｎＡ／ｍｍ2となり、くし型電極で観察される電流密度はカーボン印刷電極で観察される電流密度の約１３倍であった。くし型電極の適用によって高感度に測定可能なセンサを作製することができた。
【００６２】
（実施例５）糖化アルブミンのプロテアーゼ消化物の測定
＜サンプル＞
・糖化アルブミン（Ｌｏｗ／Ｈｉｇｈ）
＜試薬１（終濃度）＞
・オリエンターゼ２２ＢＦ（エイチビィアイ社製） （５０ｍｇ／ｍＬ）
＜試薬２（終濃度）＞
・１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸カリウム緩衝液（ＰＰＢ） （ｐＨ８．０）
・ＦＡＯＤ （６０Ｕ／ｍＬ）
・ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物（３００ｍｍｏｌ／Ｌ）
・スクロース（０．２５％）  和光純薬工業社製
＜使用電極＞
・くし型電極（国際公開第２０１４／１１２５６９号に記載の田中貴金属社開発のくし型電極）
・カーボン印刷電極（バイオデバイステクノロジー社製）
【００６３】
オリエンターゼ２２ＢＦ（エイチビィアイ社製）を５０ｍｇ／ｍＬになるように精製水に溶解した。また、糖化アルブミン（Ｌｏｗ／Ｈｉｇｈ）と、オリエンターゼ２２ＢＦ溶液と、を１：１の容量比で混合して、３７℃、１時間反応させ、糖化アルブミンのプロテアーゼ消化物を作製した。さらに、ＦＡＯＤを１２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＰＢに７２０Ｕ／ｍＬになるように溶解し、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物を１２００ｍｍｏｌ／Ｌになるように精製水に溶解し、スクロースを０．３７５％になるように精製水に溶解し、Ｚ−ＦＫを終濃度５０、１００、３００、５００μｍｏｌ／Ｌになるように精製水に溶解した。
【００６４】
ＦＡＯＤ溶液１μＬ、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物水溶液３μＬ、及びスクロース８μＬを混合した後に、カバー付きのくし型電極及びカーボン印刷電極にそれぞれ０．８μＬと１．３μＬ吸引させ、２５℃の恒温インキュベータで３０分乾燥させてＦＡＯＤ配置センサを作製した。ＦＡＯＤが配置されたセンサにプロテアーゼ消化物を、それぞれ０．８μＬ（くし型電極）、１．３μＬ（カーボン印刷電極）吸引させた後に、６０秒反応させ、１００ｍＶ印加して定電位測定をおこない、それぞれ、５秒後（くし型電極）、２０秒後（カーボン印刷電極）の電流値を比較した。糖化アルブミン（Ｌｏｗ／Ｈｉｇｈ）測定時の電流値の差を解析した結果、カーボン印刷電極では、図６に示すとおり、２０秒後の電流値の差異が２１ｎＡであったが、くし型電極では、図７に示すとおり、５秒後の電流値の差異が１０４ｎＡであった。従来のカーボン印刷電極と比較して、糖化アルブミン測定時においても、くし型電極の適用によって高感度に測定することができることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
以上説明してきたように、本発明による糖化タンパク質濃度測定方法又はバイオセンサによれば、簡単な操作かつ短時間で試料中の糖化タンパク質濃度を高感度定量することができる。従って、この発明を適用することにより、例えば、臨床診断分野の血液検査で使用できる、簡便かつ安価な分析器具を提供することができる。糖化タンパク質の血中濃度は、糖尿病の症状の診断及び管理の重要な指標となり得ることから、このような分析器具は、糖尿病の症状の診断及び管理に関する有用なツールとなることが期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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