(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
官能性ポリマークロマトグラフィー担体の製造方法であって、
（Ｉ）互いに上下に積層した２以上の不織シートであって、それぞれ１以上のポリマーナノファイバーを含む上記シートを提供すること、
（ＩＩ）同時にシートのスタックを加熱及び圧縮し、隣接したシートのナノファイバー間の接点を融合すること、及び
（ＩＩＩ）圧縮及び加熱された生成物を試薬と接触させ、クロマトグラフィー担体として工程（ＩＩ）の生成物を官能化すること
を含み、
前記同時の加熱及び圧縮は、前記接点が融合し始める温度と、前記ポリマーナノファイバーのポリマーのガラス転移温度との間の温度で行われることを特徴とする、方法。
【請求項２】
工程（Ｉ）と工程（ＩＩ）との間に、前記シートのスタックを湿潤する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（Ｉ）において、５ないし３０の上記シートが、互いに上下に積層される請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ＩＩ）において、０．０１ないし５ＭＰａの圧力が、シートのスタックに適用される請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ＩＩ）において、１ｋＰａより大きい圧力が、シートのスタックに適用される請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ＩＩ）において、５００ｋＰａ以下の圧力が、シートのスタックに適用される請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
各不織シートが、単一のポリマーナノファイバーからなるか、又は２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０のポリマーナノファイバーを含む請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
ポリマーが、セルロース、セルロースアセテート、ポリスルホン、ポリアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、ポリエチレンオキシド、及びそれらの混合物からなる群から選ばれる請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
上記ナノファイバーがセルロースアセテートナノファイバーであり、且つ工程（ＩＩ）と（ＩＩＩ）の間において、圧縮及び加熱された生成物を処置して、セルロースアセテートをセルロースに変換する請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ＩＩ）において、シートのスタックを、１９０ないし２２０℃の温度で加熱する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ＩＩＩ）が、圧縮及び加熱された生成物をバッチ方式において少なくとも二回試薬と接触させ、クロマトグラフィー担体として圧縮及び加熱された生成物を官能化することを含む請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
バッチ方式での試薬との各接触工程が、（ａ）試薬との接触、（ｂ）工程（ａ）の生成物の試薬からの単離、（ｃ）工程（ｂ）の生成物のアルカリ水での任意の処理、及び（ｄ）工程（ｂ）の生成物又は工程（ｃ）の任意の生成物の水での任意の洗浄を含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
バッチ式の官能化を２ないし４回行う請求項１１又は請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ＩＩＩ）が、圧縮及び加熱された生成物をホルダー内に入れること、及び（ＩＶ）試薬が圧縮及び加熱された生成物と接触して流れるように試薬をホルダーを介して流し、クロマトグラフィー担体として工程（ＩＩ）の生成物を官能化することを含む、請求項１ないし１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ＩＶ）が、
−試薬を、圧力下でホルダーを介して流すこと；及び／又は
−試薬を、ポンプを用いてホルダーを介して流すこと；及び／又は
−試薬を、循環する様態でホルダーを介して流すこと；及び／又は
−試薬を、１ないし２０分間の期間でホルダーを介して流すこと
を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
得られた官能性クロマトグラフィー担体が、イオン交換、親和性捕捉、疎水性相互作用及び混合モード法からなる群から選ばれるクロマトグラフィー法での使用に適するように、試薬が圧縮及び加熱された生成物を官能化する請求項１〜１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
−クロマトグラフィー法が陽イオン交換法であり、且つ試薬がカルボキシラート、スルホナート又はホスホナート基でクロマトグラフィー担体を官能化するか；
−クロマトグラフィー法が陰イオン交換法であり、且つ試薬が第四級アミノ又はジエチルアミン基でクロマトグラフィー担体を官能化するか；
−クロマトグラフィー法が親和性捕捉クロマトグラフィー法であり、且つ試薬が、タンパク質、ペプチド、抗体若しくはそのフラグメント、色素、ヒスチジン、又は金属カチオンを含む基でクロマトグラフィー担体を官能化するか；
−クロマトグラフィー法が疎水性相互作用クロマトグラフィー法であり、且つ試薬が、プロピル、ブチル、フェニル、又はオクチル基でクロマトグラフィー担体を官能化するか；或いは
−クロマトグラフィー法が混合モードクロマトグラフィー法であり、且つ試薬が、ＭＥＰ、オクチルアミン、Ｎ−ベンジルメチルエタノールアミン又はＮ−ベンゾイル−ホモシステイン基でクロマトグラフィー担体を官能化する請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
試薬が、クロマトグラフィー担体上のヒドロキシル、アミノ又はカルボン酸基を官能化する請求項１〜１７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９】
試薬との接触工程より前に、圧縮及び加熱された生成物を処理して、ポリマー上の任意の官能基を脱保護又は活性化する請求項１〜１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
−工程（Ｉ）において、５ないし２５の上記シートを互いに上下に積層し、各シートが１、２又は３のポリマーナノファイバーを含み、各シートが５ないし４０μｍの厚さを有し、且つ／或いは
−工程（ＩＩ）において、ポリマーの融点未満の温度及び０．０１ないし５ＭＰａの圧力を１ないし１２０分間適用し、２５０ないし７５０ｋｇ／ｍ３の平均密度及び０．０５ないし１０ｍｍの厚さを有する圧縮及び加熱された生成物を得る
請求項１〜１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２１】
−工程（Ｉ）において、５ないし２０の上記シートを互いに上下に積層し、各シートが単一のポリマーナノファイバーからなり、各シートが５ないし１２０μｍの厚さ及び１ないし４０ｇ／ｍ２の面密度を有し、且つ／或いは
−工程（ＩＩ）において、ポリマーの融点未満の温度及び１ないし５００ｋＰａの圧力を１ないし３０分間適用し、２００ないし１０００ｋｇ／ｍ３の平均密度及び０．０５ないし１０ｍｍの厚さを有する圧縮及び加熱された生成物を得る
請求項１〜１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１の何れか１項に記載の方法により得られる官能性クロマトグラフィー担体。
【請求項２３】
クロマトグラフィーカートリッジの製造方法であって、請求項１〜２１の何れか１項に記載の方法を行い、こうして得られた生成物をカートリッジに組み込むことを含む方法。
【請求項２４】
（ａ）請求項２３に記載の方法により得られるか、或いは（ｂ）請求項２２に記載の１以上の官能性クロマトグラフィー担体を含むクロマトグラフィーカートリッジ。
【請求項２５】
クロマトグラフィーにおける、請求項２２に記載の官能性クロマトグラフィー担体、又は請求項２４に記載のクロマトグラフィーカートリッジの使用。
【請求項２６】
移動相からの１以上の生体分子の単離方法であって、移動相における１以上の生体分子を、請求項２２に記載の官能性クロマトグラフィー担体又は請求項２４に記載のクロマトグラフィーカートリッジと接触させることを含む方法。
【請求項２７】
イオン交換、親和性捕捉又は疎水性相互作用クロマトグラフィー法である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ポリマー担体の製造方法であって、請求項１〜３、２０及び２１の何れかに定義されたようにして、２以上の不織シートを提供すること、請求項１、７〜９、２０及び２１の何れかに定義されたようにして、それぞれ１以上のポリマーナノファイバーを含む上記シートを互いに上下に積層すること、及び請求項１、４〜６、１０、２０及び２１の何れかに定義されたようにして、同時にシートのスタックを加熱及び圧縮し、隣接したシートのナノファイバーの間の接点を融合することを含む方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法により得られるポリマー担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移動相からの生体分子の単離に適する官能性クロマトグラフィー担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジー市場は、２０１２年の全ての市場の売上高の２０％（１５３０億ドル）を占める、世界の医薬品市場において最も成長の著しい分野である。２００２年の市場シェアの１０％からのこの成長は、２０１２年と２０１８年との間で１５３０億ドルから２１５０億ドルへの４１％の増加に向かっている。現在およそ２００のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）製品が市場に存在し、１０００を超えるものが臨床試験にあり、この分野の技術進歩の必要性が明確である。過去１０年間にわたって、生体分子の代表的な発酵力価が、０．５ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌから増加し、そして、下流の精製プロセスはいくらかの研究開発がなされてきたが、この領域における改善は、上流のものと一致するものではなかった。結合／溶出クロマトグラフィーのユニットオペレーションへの大きな依存が、ＭＡｂのような生体分子の下流のプロセシングの向上のための経済用語での鍵である。クロマトグラフィーは、生体分子の下流のプロセシングのコストの非常に大きな部分を占め、それにより生体分子自体の総コストに影響がでる。
【０００３】
歴史的に、従来の充填床クロマトグラフィーが非常に強力な分離ツールであった。しかしながら、生体分子の製造後に効果的に且つ経済的に回収できるようにするために、根本的に新しいシステムを用いなければならないことがより明らかになってきている。
【０００４】
進展を見せている一つの領域は、現在高価な親和性リガンドを置き換えるための新しいリガンドの合成である。
【０００５】
探索された他の経路は、多孔質ビーズ充填床吸着材のような従来の支持構造の改良である。これは、通常、このような吸着材に関連する欠点、特に、圧力損失及び滞留時間に関する問題を有する。これらの欠点は、通常、非効率的な分離をもたらす。流量の独立した操作を考慮した新しい吸着材構造の開発は、処理能力を増加させる利点をもたらすが、一般的に小スケールでのみ有用であることが分かっている。吸着材の汚染の問題は一般的であり、これにより、多くの場合、クロマトグラフ分離技術が後期の磨き操作に制限される。トレードオフは、吸着材の細孔径に関連する汚染と捕捉能力との間で行わなければならない。小さな細孔径は、鋭い破過曲線を伴う良好な分離のために必要とされるが、汚染の増加をもたらす。逆に、より大きな細孔径の吸着材（１０μｍ−１５０＋μｍ）は汚染物質の良好な対処をもたらし得るが、小さな標的生体分子が、このような吸着材に結合することなく通過する可能性がある。
【０００６】
より最近、膜クロマトグラフィーが、汚染物質捕捉モードにおける潜在的に実行可能な代替法として報告されている。
【０００７】
研究の他の焦点は、表面上に存在する比較的大きな細孔によりプラスミドやウイルスのような大きな生体分子の良好な分離をもたらすことが分かっているモノリス構造の開発である。単回使用系に移っている現在の業界の傾向では、単回使用膜の経済性が単回使用充填床カラムよりも有利であるため膜クロマトグラフィーが好まれる。
【０００８】
開発のための他の経路は、連続的なプロセシングへ移すことである。連続的なプロセシングに移すことは、多くの系で達成される効率を可能にし得る。したがって、連続的な操作は、予想される製品仕様、人件費削減及び他の連続的なプロセスとの統合を含むポテンシャル利益と共に、リアルタイムプロセスのモニタリング及び自動制御の機会を提供する。しかしながら、真の連続クロマトグラフィー操作の方法でこれまでにほとんど開発されていない。
【０００９】
したがって、生体分子を回収するための改良された方法を提供するために用いられる多くの異なる研究の手段が存在することが理解されよう。
【００１０】
電界紡糸ポリマーナノファイバーは、下流のバイオプロセシングで用いられる従来のサポートマトリックスで観察された問題に対する１つの可能な解決策をもたらす特性を有する。それらの特性は、それ自体を、高い容量及び高い物質移動速度の動作に対するポテンシャルを有するリガンドサポート表面に容易に与え、それゆえに、高い空隙率及び比較的小さな表面細孔径の系と独立して結合した流量を生み出す。
【００１１】
ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）の官能性を伴う電界紡糸ポリマーナノファイバーを含む吸着材カートリッジは、代表的な充填床系のおよそ１０％の結合能を有するものの、代表的な充填床系のおよそ５０倍の流量を伴うことが報告されている。このようなナノファイバー系は、多孔質ビーズ系と同様の表面積体積比を提供する。しかしながら、このような既存のナノファイバー系は、代表的な充填床系よりも少々低い結合能を有する。また、既知のナノファイバー系は、同じ膜を複数回使用する場合に貧弱な再現性を示す。これは、生体分子を回収する場合のそれらの有用性の限界を示している。
【００１２】
これにより、これまで、ナノファイバー系と関連がある空隙率及び安定して再現可能な動作を維持する一方で、代表的な充填床系の約１０％よりも高い結合能を伴うナノファイバー吸着材系を製造することができなかった。
【００１３】
電界紡糸により製造されるナノファイバー吸着材系の厚さは、接地コレクタ表面上へのナノファイバーの堆積が、堆積増加時の接地表面の減少をもたらすような製造中に限定される。したがって、堆積繊維中の残留電荷は、コレクタ表面上でのさらなる繊維の拡散をもたらす継続的な堆積にあまり引き付けられない領域になる。これは、電界紡糸により製造されたナノファイバーマットの厚さを約１００〜２００μｍに制限する効果を有する。これらのナノファイバーマットの限定された厚さは、クロマトグラフィーのようなプロセスアプリケーションに対する材料の有用性を制限する全体的なマットの物理的強度に固有の限度をもたらす。
【００１４】
１つの既知のナノファイバー吸着材系が、Ｍａ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５  （２００５）  １１５−１２３に開示されている。当該文献には、セルロースアセテートナノファイバーからなる単一層の不織繊維メッシュを加熱処理して、加熱したセルロースアセテート繊維をＮａＯＨで処理して、結果として得られたセルロース繊維をＣｉｂａｃｒｏｎ  Ｂｌｕｅで官能化することを含むセルロースナノファイバー膜の製造方法が開示されている、複数の膜を積層し、その端を接着し、スタックをフィルターホルダーに入れてもよい。
【発明の概要】
【００１５】
その最も広い意味において、本発明は、官能性クロマトグラフィー担体の製造方法であって、物理プロセシング工程及び化学プロセシング工程の組み合わせで１以上のポリマーナノファイバーを処理して、クロマトグラフィー法においてクロマトグラフィー担体として用いるのに適した官能化生成物を得ることを含む方法を提供する。
【００１６】
現在、特定の一連の物理プロセシング工程及び化学プロセシング工程は、ナノファイバー吸着材系の結合能を大幅に増大させ、通常は、代表的な動作条件下で上記結合能を２５０％以上増大させることがわかっている。また、ある特定の物理プロセシング工程が、ナノファイバー吸着材系の化学的抵抗性を改善することがわかった。これは、本発明の吸着材系がより厳しい条件下で用いることができること、また、吸着材系を、パフォーマンスを損なうことなく複数回用いることができることの両方を意味している。
【００１７】
したがって、本発明は、官能性ポリマークロマトグラフィー担体の製造方法であって、
（Ｉ）互いに上下に積層した２以上の不織シートであって、それぞれ１以上のポリマーナノファイバーを含む上記シートを提供すること、
（ＩＩ）同時にシートのスタックを加熱及び圧縮し、隣接したシートのナノファイバー間の接点を融合すること、及び
（ＩＩＩ）圧縮及び加熱された生成物を試薬と接触させ、クロマトグラフィー担体として工程（ＩＩ）の生成物を官能化することを含む方法を提供する。
【００１８】
より具体的には、隣接したシートのナノファイバー間の接点を融合することは、シートにおけるポリマーナノファイバーのセクションと隣接したシートにおけるポリマーナノファイバーのセクションとの間の接点を融合することを含む。また通常、これは、シートにおけるポリマーナノファイバーのセクションと同じナノファイバーの他のセクションとの間の接点を融合することを含む。
【００１９】
また、本発明は：
−  本発明の方法で得られる官能性クロマトグラフィー担体、
−  クロマトグラフィーカートリッジの製造方法であって、本発明の方法を実施し、それにより得られた生成物をカートリッジに組み込むことを含む方法、
−  （ａ）上記方法により得られるクロマトグラフィーカートリッジ、または（ｂ）本発明の１以上の官能性クロマトグラフィー担体を含むクロマトグラフィーカートリッジ、
−  クロマトグラフィーにおける本発明の官能性クロマトグラフィー担体又は本発明のクロマトグラフィーカートリッジの使用、
−  移動相からの１以上の生体分子の単離方法であって、移動相における１以上の生体分子を本発明の官能性クロマトグラフィー担体又は本発明のクロマトグラフィーカートリッジと接触させることを含む方法を提供する。
【００２０】
また、本発明は、互いに上下に積層した、本明細書で定義される２以上の不織シートであって、それぞれ本明細書で定義される１以上のポリマーナノファイバーを含む上記シートを提供すること、および同時にシートのスタックを加熱及び圧縮し、本明細書で定義されるように隣接したシートのナノファイバー間の接点を融合することを含むポリマー担体の製造方法を提供する。また、その方法で得られるポリマー担体も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、陰イオン交換クロマトグラフィーにおける本発明の官能性クロマトグラフィー担体のパフォーマンスを示す。
【図２】図２は、陰イオン交換クロマトグラフィーにおける本発明の官能性クロマトグラフィー担体のパフォーマンスを示す。
【図３】図３は、クロマトグラフィー膜の化学安定性を測定する実験の構成を示す。
【図４】図４は、ＮａＯＨへの曝露後の本発明のものではない膜及び本発明の膜の写真を示す。
【図５】図５は、本発明のものではない膜及び本発明の膜の厚さ及び密度を示す。
【図６】図６は、本発明のものではない膜及び本発明の膜の流動性を示す。
【図７】図７は、本発明の膜の厚さ及び密度に対する圧力効果を示す。
【図８】図８は、本発明の膜の流動性に対する圧力効果を示す。
【図９】図９は、本発明の膜の動的結合能に対する圧力効果を示す。
【図１０】図１０は、本発明の膜の流動性に対する官能化サイクル数の効果を示す。
【図１１】図１１は、本発明の膜の動的結合能に対する官能化サイクル数の効果を示す。
【図１２】図１２は、本発明のＳＰ官能性膜の結合溶出特性を示す。
【図１３】図１３は、本発明のＣＭ官能性膜の結合溶出特性を示す。
【図１４】図１４は、本発明のＱ官能性膜の結合溶出特性を示す。
【図１５】図１５は、本発明のプロテインＡ官能性膜の結合溶出特性を示す。
【図１６】図１６は、本発明のフェニル官能性膜の結合溶出特性を示す。
【図１７】図１７は、ＮａＯＨへの暴露後の本発明のものではない膜の写真を示す。
【図１８】図１８は、本発明のものではない膜及び本発明の膜の厚さ及び密度を示す。
【図１９】図１９は、本発明のものではない膜及び本発明の膜の流動性を示す。
【図２０】図２０は、本発明のものではない膜及び本発明の膜の動的結合能を示す。
【図２１】図２１は、多くの官能化サイクル後の本発明の膜（上図）及び本発明のものではない膜（下図）の写真を示す。
【発明の詳細な説明】
【００２２】
（ポリマーナノファイバー）
本発明の官能性クロマトグラフィー担体は、１以上のポリマーナノファイバーから形成される。ポリマーナノファイバーは、通常、電界紡糸ポリマーナノファイバーである。このような電界紡糸ポリマーナノファイバーは、当業者によく知られており、それらの製造の最適化条件を、例えば、Ｏ．  Ｈａｒｄｉｃｋ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｍａｔｅｒ．  Ｓｃｉ．  ４６  （２０１１）  ３８９０で見出すことができ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明の方法は、通常、ポリマーをエレクトロスピニングして１以上のポリマーナノファイバーを製造する初期工程を含む。これは、ポリマーをエレクトロスピニングして、それぞれ１以上のポリマーナノファイバーを含む１以上の不織シートを製造することを含んでもよい。
【００２３】
本発明において使用するためのポリマーナノファイバーは、通常１０ｎｍないし１０００ｎｍの平均直径を有している。いくつかの用途では、２００ｎｍないし８００ｎｍの平均直径を有するポリマーナノファイバーが適している。２００ｎｍないし４００ｎｍの平均直径を有するポリマーナノファイバーが、特定の用途に適している可能性がある。
【００２４】
本発明の使用のためのポリマーナノファイバーの長さは特に限定されない。したがって、従来のエレクトロスピニング法は、数百メートル或いは数百キロメートルの長さのポリマーナノファイバーを製造することができる。しかしながら、通常、１以上のポリマーナノファイバーは、最大で１０ｋｍ、好ましくは１０ｍから１０ｋｍの長さを有する。
【００２５】
通常、１以上のポリマーナノファイバーは、それぞれ１以上のポリマーナノファイバーを含む１以上の不織シートの形態で提供される。１以上のポリマーナノファイバーを含む不織シートは、それぞれ基本的に無作為に配向したナノファイバーを有する上記の１以上のポリマーナノファイバーのマットである。即ち、ナノファイバー（単数又は複数）は特定のパターンを採るようには製造されていない。ポリマーナノファイバーを含む不織シートは、通常、Ｏ．  Ｈａｒｄｉｃｋ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｍａｔｅｒ．  Ｓｃｉ．  ４６  （２０１１）  ３８９０で開示されているような既知の方法で提供される。不織シートは、特定の状況では、単一のポリマーナノファイバーからなり得る。代替的には、不織シートは、２以上のポリマーナノファイバー、例えば２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のポリマーナノファイバーを含んでいてもよい。
【００２６】
不織シートは、通常、１ないし４０ｇ／ｍ２の面密度、好ましくは５ないし２５ｇ／ｍ２の面密度、いくつかの状況では１ないし２０ｇ／ｍ２、又は５ないし１５ｇ／ｍ２の面密度を有する。
【００２７】
不織シートは、通常、５ないし１２０μｍの厚さ、好ましくは１０ないし１００μｍの厚さ、いくつかの状況では５０ないし９０μｍの厚さ、他の状況では５ないし４０μｍの厚さ、１０ないし３０μｍの厚さ又は１５ないし２５μｍの厚さを有する。
【００２８】
本発明の方法において使用されるナノファイバーを製造するために用いられるポリマーは、そのポリマーがクロマトグラフィー用途での使用に適している限り、特に限定されない。したがって、通常、ポリマーは、クロマトグラフィー法において、クロマトグラフィー担体、即ち、吸着材としての使用に適したポリマーである。適切なポリマーとしては、ナイロンのようなポリアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリカプロラクトン、コラーゲン、キトサン、ポリエチレンオキシド、アガロース、アガロースアセテート、セルロース、セルロースアセテート、及びそれらの組み合わせが挙げられる。セルロース及びセルロースアセテートが好ましい。
【００２９】
通常、本発明の方法は、官能性セルロースクロマトグラフィー担体を製造するためのものであり、その方法は１以上のセルロースアセテートナノファイバーを提供することを含む。好ましくは、その方法は、それぞれ１以上のセルロースアセテートナノファイバーを含む１以上の不織シートを提供することを含む。セルロースアセテートは、容易にエレクトロスピニングされ、エレクトロスピニング後に容易にセルロースに変換することができる。したがって、好ましくは、その方法は、それぞれ１以上の電界紡糸セルロースアセテートナノファイバーを含む１以上の不織シートを提供することを含む。
【００３０】
（ナノファイバーの物理的修飾）
本発明の方法は、化学修飾に先立つ不織シートにおけるポリマーナノファイバーの物理的修飾（即ち加熱及び圧縮）を含む。これらの工程は材料の構造的安定性を向上させる。また、結果として得られた材料の厚さ及び／又は空隙率が変化させるために圧縮及び加熱の条件は多様であり得る。
【００３１】
ポリマーナノファイバーの複数の不織シートの使用は、吸着性のより高い能力を有するより厚い材料を製造（１回官能化）することを可能にする。また、ポリマーナノファイバーの複数の不織シートの加熱及び圧縮により製造された膜は、熱処理されたポリマーナノファイバーの単一のシートから形成されるスタックと比較して改善された特性を有することが見出された。したがって、本発明の方法は、それぞれ１以上のポリマーナノファイバーを含む互いに上下に積層した２以上の不織シートを提供し、同時にシートのスタックを加熱及び圧縮し、隣接したシートのナノファイバーの間の接点を融合することを含む。したがって、本発明の方法は、工程（Ｉ）において本明細書で定義される２以上の不織シートのスタックを提供することを含み、そして、本発明は、官能性ポリマークロマトグラフィー担体の製造方法であって、
（Ｉ）それぞれ１以上のポリマーナノファイバーを含む２以上の不織シートのスタックを提供すること、
（ＩＩ）同時にシートのスタックを加熱及び圧縮し、隣接したシートのナノファイバーの間の接点を融合すること、及び
（ＩＩＩ）圧縮及び加熱された生成物を試薬と接触させ、クロマトグラフィー担体として工程（ＩＩ）の生成物を官能化することを含む方法を提供する。
【００３２】
通常、２ないし３０の不織シートのスタックを提供する。特定の状況では、５と２５の間の不織シートのスタックを提供し得る。特定の状況では、１０と２０の間の不織シートのスタックを提供し得る。用いる不織シートの数は、最終的なクロマトグラフィー担体の厚さ、及び液体に対するその透過性に影響を与え得る。したがって、より厚い担体は、一般的により薄い担体に比べてより低い透過性を有する。したがって、高い透過性が要求される場合は、通常、より少ない数のシートが用いられる。より低い透過性の担体が要求される場合は、より多い数のシートを用いてもよい。
【００３３】
誤解を避けるために、不織シートは、それらの最薄の次元に平行な方向に圧縮（加熱下）される。不織シートは、通常、第３の次元に比べてはるかに大きな２つの次元を有し、シートはこの第３の次元に平行に圧縮される。２以上の不織シートを提供し及び圧縮する場合、２以上の不織シートを、実質的に重なるように該スタックを互いに上下に積層させ、各不織シートの最小の次元を位置合わせする。これは、シートのスタックを形成し、その後加熱及び圧縮する。スタックにおけるシートを互いに重ね合わせ、各不織シートの最小の次元を位置合わせする。
【００３４】
通常、ポリマーナノファイバー又は不織シートを圧縮することは、それらを０．０１ないし５ＭＰａ、より典型的には０．０５ないし３ＭＰａ、例えば、０．１ないし１ＭＰａの圧力に付すことを含む。本発明の方法で用いられる適切な圧力は、通常１ｋＰａよりも大きく、好ましくは５ｋＰａよりも大きく、いくつかの状況では１０ｋＰａよりも大きい。通常、５００ｋＰａ以下、好ましくは２００ｋＰａ以下、より好ましくは１５０ｋＰａ以下、例えば、１００ｋＰａ以下、５０ｋＰａ以下又は３０ｋＰａ以下の圧力が用いられる。適切な圧力範囲は、例えば、１ないし５００ｋＰａ、５ないし２００ｋＰａ、５ないし１５０ｋＰａ、５ないし１００ｋＰａ、５ないし５０ｋＰａ、又は１０ないし３０ｋＰａであり得る。圧力は任意の適切な手段により適用することができる。例えば、圧力は手動プレス又は油圧プレスを用いて適用することができる。適用される圧力は、担体の物理的性質を変化させるために変えてもよい。一般的に、より高い圧力は、より低い空隙率及びより薄い厚さを有するより強固な担体をもたらし得る。より低い圧力は、より高い空隙率及びより厚い厚さを伴う比較的に強固とは言えない担体を生成する傾向がある。結合特性を最大化することが望まれる場合は、より厚いクロマトグラフィー担体が好まれ得る。
【００３５】
ポリマーナノファイバー又は不織シートを圧縮する時間の長さは、特に限定されず、代表的な圧縮時間は当業者により決定され得る。１以上のポリマーナノファイバー又は１以上の不織シートを同時に加熱及び圧縮する場合、これは、通常１ないし３０分、好ましくは１ないし１０分、より好ましくは３ないし７分、さらに好ましくはおよそ５分間行われる。
【００３６】
１以上のポリマーナノファイバー又は１以上の不織シートの加熱は、従来の手段（例えばオーブンの使用）によって行うことができる。１以上のポリマーナノファイバー又は１以上の不織シートを同時に加熱及び圧縮する場合、加熱は、加熱プレスにより、或いは加熱されたオーブン内で重り（例えば金属シート）の間に１以上のポリマーナノファイバー又は１以上の不織シートを配置することにより行ってもよい。
【００３７】
不織シートのスタックを加熱及び圧縮して隣接したシートのナノファイバーの間の接点を融合する。
【００３８】
それぞれ１以上のナノファイバーを含む２以上の不織シートを互いに上下に積層して加熱及び圧縮の条件に付す場合、シートにおけるポリマーナノファイバーのセクションを、同じナノファイバーのセクション及び／又は同じ不織シートの他のナノファイバーのセクション、及び／又は隣接した不織シートのナノファイバーのセクションと接触させてもよい。通常、不織シートのナノファイバーのセクションを、隣接していない他の不織シートのナノファイバーのセクションと接触させない。
【００３９】
したがって、２以上の不織シートのスタックの加熱及び圧縮は、シートのナノファイバーのセクションと、同じナノファイバーの他のセクションとの間、及び／又はシートのナノファイバーのセクションと、同じ不織シートの他のナノファイバー（存在する場合）のセクションとの間、及び／又はシートのナノファイバーのセクションと、隣接した不織シートのナノファイバーのセクションとの間の接点を融合することができる。通常、２以上の不織シートの同時の加熱及び圧縮は、シートにおけるポリマーナノファイバーのセクションと、隣接したシートにおけるポリマーナノファイバーのセクションとの間の接点を融合する。好ましくは、２以上の不織シートの同時の加熱及び圧縮は、シートにおけるポリマーナノファイバーのセクションと、同じナノファイバーの他のセクションとの接点を融合し、且つシートにおけるポリマーナノファイバーのセクションと、隣接したシートにおけるポリマーナノファイバーのセクションとの接点を融合する。より好ましくは、２以上の不織シートの加熱及び圧縮は、シートにおけるナノファイバーのセクションと、同じナノファイバーの他のセクションとの間、及びシートにおけるナノファイバーのセクションと、同じ不織シートにおける他のナノファイバー（存在する場合）のセクションとの間、及び／又はナノファイバーのセクションと、隣接した不織シートにおけるナノファイバーのセクションとの間の接点を融合する。最も好ましくは、２以上の不織シートの加熱及び圧縮は、シートにおけるナノファイバーのセクションと、同じナノファイバーの他のセクションとの間、及びシートにおけるナノファイバーのセクションと、同じ不織シートにおける他のナノファイバーのセクション（存在する場合）との間、及びシートにおけるナノファイバーのセクションと、隣接した不織シートにおけるナノファイバーのセクションとの間の接点を融合する。
【００４０】
それぞれの不織シートが単一のポリマーナノファイバーを含む２の不織シートを提供する単純な例において、第一及び第二の不織シートの加熱及び圧縮は、好ましくは、第一の不織シートにおけるポリマーナノファイバーのセクションと、第一の不織シートにおけるポリマーナノファイバーの他のセクションとの間、及び第一の不織シートにおけるポリマーナノファイバーのセクションと、第二の不織シートにおけるポリマーナノファイバーのセクションとの間の接点を融合し、また、通常第二の不織シートにおけるポリマーナノファイバーのセクションと、第二の不織シートにおけるポリマーナノファイバーの他のセクションとの間の接点も融合する。
【００４１】
通常、ポリマーナノファイバー又は不織シートは、ポリマーの融点未満の温度に加熱される。より高い温度の使用は、ナノファイバー構造の破壊をもたらし得る。いくつかの状況では、ポリマーのガラス転移温度未満の温度を用いることが有利である。他の状況では、ポリマーのガラス転移温度より高い温度を用いてもよい。特許請求の範囲の方法で用いられる適切なポリマーの融点及びガラス転移温度は、当業者によく知られている。
【００４２】
通常、ポリマーナノファイバー又は不織シートは、１以上のポリマーナノファイバーのセクション間の接点が融合し始める温度と、ポリマーの融点との間の温度に加熱される。好ましくは、ポリマーナノファイバー又は不織シートは、１以上のポリマーナノファイバーのセクション間の接点が融合し始める温度と、ポリマーのガラス転移温度との間の温度に加熱される。
【００４３】
通常、ポリマーの融点よりも４０℃、好ましくは３０℃、より好ましくは２０℃低い温度よりも高い温度が用いられる。通常、ポリマーの融点よりも１℃、好ましくは２℃、より好ましくは５℃低い温度よりも低い温度が用いられる。したがって、通常、温度範囲は、ポリマーの融点よりも４０℃低い温度からポリマーの融点よりも１℃低い温度が、好ましくは、ポリマーの融点よりも３０℃低い温度からポリマーの融点よりも２℃低い温度が、より好ましくはポリマーの融点よりも２０℃低い温度からポリマーの融点よりも５℃低い温度が用いられる。
【００４４】
ポリマーがセルロースアセテートである場合に、セルロースアセテートナノファイバー又はそれぞれ１以上のセルロースアセテートナノファイバーを含む不織シートは、１９０ないし２２０℃、好ましくは１９５ないし２１８℃、例えば、１９５ないし２１５℃、１９５ないし２１０℃、１９０ないし２１０℃、１９５ないし２０５℃又は２１０ないし２１５℃の温度に加熱或いは温度で加熱される。用いることができる他の適切な温度範囲は、２００ないし２２０℃、好ましくは２０５ないし２１８℃、例えば２０５ないし２１０℃、又は２１０ないし２１５℃を含む。セルロースアセテートナノファイバー又は不織のセルロースアセテートシートが同時に加熱及び圧縮される場合、通常１９０ないし２２０℃の温度が用いられ、例えば、１９０ないし２１０℃、１９５ないし２１８℃、１９５ないし２１５℃、１９５ないし２１０℃、１９５ないし２０５℃、２１０ないし２１５℃、２００ないし２２０℃、２０５ないし２１８℃、又は２０５ないし２１０℃、いくつかの状況ではおよそ２０７℃の温度が用いられる。
【００４５】
ポリマーナノファイバー又は不織シートは、通常１ないし１２０分間、例えば５ないし６０分間加熱される。ポリマーナノファイバー又は不織シートが同時に加熱及び圧縮される場合、加熱は、通常１ないし３０分間、好ましくは１ないし１０分間、より好ましくは３ないし７分間、さらに好ましくはおよそ５分間行われる。
【００４６】
通常、圧縮及び加熱の後に、ポリマーナノファイバー又は不織シート（即ち、結果として得られる圧縮及び加熱された生成物）は、０．１ないし１．０μｍ、好ましくは０．３ないし０．９μｍ、より好ましくは０．４ないし０．８μｍ、さらに好ましくは０．５ないし０．７μｍ、なお一層より好ましくは０．６ないし０．７μｍ、例えば０．６ないし０．６５μｍの平均細孔径を有する。
【００４７】
通常、圧縮及び加熱の後に、ポリマーナノファイバー又は不織シート（即ち、結果として得られる圧縮及び加熱された生成物）は、２００ないし１０００ｋｇ／ｍ３、好ましくは２５０ないし７５０ｋｇ／ｍ３、より好ましくは３５０ないし６５０ｋｇ／ｍ３、いくつかの状況では４５０ないし５５０ｋｇ／ｍ３の平均密度を有する。他の好ましい密度は、２００ないし７５０ｋｇ／ｍ３、２００ないし６５０ｋｇ／ｍ３、２００ないし５５０ｋｇ／ｍ３、２５０ないし７５０ｋｇ／ｍ３、２５０ないし６５０ｋｇ／ｍ３、及び２５０ないし５５０ｋｇ／ｍ３を含む。
【００４８】
ポリマーナノファイバー又は不織シートは、通常同時に加熱及び圧縮される。いくつかの実施形態は、ポリマーナノファイバー又は不織シートを圧縮し、次いでその後それらを加熱すること；又はポリマーナノファイバー又は不織シートを加熱し、次いでその後それらを圧縮することを含み得る。ポリマーナノファイバー又は不織シートが同時に加熱及び圧縮される場合、加熱及び圧縮は、通常、加熱プレス内で、或いは加熱されたオーブン内で重り（例えば金属シート）の間にポリマーナノファイバー又は不織シートを配置することにより行われる。
【００４９】
また、本発明の方法は、圧縮及び加熱の前にポリマーナノファイバー又は不織シートを湿潤させることを含んでいてもよい。従って、方法は、工程（Ｉ）と（ＩＩ）の間にシートのスタックを湿潤させる追加の工程を含んでいてもよい。代替的には、方法は、工程（Ｉ）において湿潤させた不織シートのスタックを形成することを含んでいてもよい。ポリマーナノファイバー／不織シート／シートのスタックを湿潤させるために、通常、必要に応じて水性の有機溶媒が用いられ、好ましくは水性の有機溶媒が用いられる。有機溶媒は、通常、ポリマーナノファイバーが溶解しないようなものが選択される。ポリマーナノファイバーが溶解しないような使用可能な溶媒は当業者によく知られているだろう。有機溶媒としては、アルコール類が好ましく、例えば、メタノール、エタノール又はイソプロパノール、好ましくはエタノールである。いくつかの場合に水性エタノールが好ましい。したがって、いくつかの実施形態は、湿潤させること、その後の同時の加熱及び圧縮を含んでいてもよい。他の実施形態は、湿潤させること、その後の圧縮、それに続く加熱を含んでいてもよい。一層さらなる実施形態は、湿潤させること、その後の加熱、それに続く圧縮を含んでいてもよい。
【００５０】
通常、圧縮及び加熱されたポリマーナノファイバー又はシート（即ち圧縮及び加熱された生成物）は、０．０５ないし１０ｍｍ、例えば０．１ないし５ｍｍの厚さを有する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、１以上のポリマーナノファイバーを提供すること、１以上のポリマーナノファイバーを圧縮すること、および１以上のポリマーナノファイバーを加熱すること、それにより、１以上のポリマーナノファイバーのセクション間の接点を融合することを含む。好ましくは、本発明の方法は、それぞれ１以上のポリマーナノファイバーを含む１以上の不織シートを提供すること、１以上の不織シートを圧縮すること、および１以上の不織シートを加熱すること、それにより、１以上のポリマーナノファイバーのセクション間の接点を融合することを含む。１以上のポリマーナノファイバーのセクション間の接点の融合とは、１以上の不織シートに含まれる１以上のポリマーナノファイバーを言う。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、本明細書で定義される湿潤、及び本明細書で定義される２以上の不織シートのスタックの圧縮、その後のそれに続く本明細書で定義される加熱を含む。代表的な湿潤、圧縮及び加熱の条件は上記定義の通りである。したがって、この実施形態では、本発明は、官能性ポリマークロマトグラフィー担体の製造方法であって、
（Ｉ）それぞれ本明細書で定義される１以上のポリマーナノファイバーを含む、互いに上下に積層した本明細書で定義される２以上の不織シートを提供すること、
（ＩＩ）本明細書で定義されるように任意に水性の有機溶媒を用いてシートのスタックを湿潤させること、
（ＩＩＩ）本明細書で定義されるようにシートのスタックを圧縮すること、
（ＩＶ）本明細書で定義されるように圧縮されたスタックを加熱して、隣接したシートのナノファイバーの間の接点を融合すること、及び
（Ｖ）本明細書で定義されるように試薬と、湿潤、圧縮及び加熱された生成物を接触させ、本明細書で定義されるようにクロマトグラフィー担体として工程（ＩＩ）の生成物を官能化することを含む方法を提供する。
【００５３】
（ナノファイバーの化学修飾）
本発明の方法は、通常、クロマトグラフィーで用いるために１以上のポリマーナノファイバー又は１以上の不織シートを化学修飾してそれらを官能化することを含む。最も単純な形態では、これは、クロマトグラフィー担体として生成物を官能化するために試薬と１以上のポリマーナノファイバー又は１以上の不織シート（圧縮及び加熱されていてもよい）を接触させることを含む。
【００５４】
必要に応じて、試薬と接触させるこの工程より前に、１以上のポリマーナノファイバー又は１以上の不織シート（圧縮及び加熱されていてもよい）を処理して、ポリマー上の任意の官能基を脱保護又は活性化してもよい。
【００５５】
官能基が試薬と反応することができるように、通常、官能基の脱保護が行われる。例えば、ポリマーがセルロースである場合、通常、１以上のセルロースアセテートナノファイバー又はそれぞれ１以上のセルロースアセテートナノファイバーを含む不織シートを提供し、そして、試薬と接触する前に、セルロースアセテートを処理してセルロースに変換する。これは、アセチル化されたヒドロキシル基を脱保護してヒドロキシル基を与えることを含む。セルロースアセテートのセルロースへの変換は、通常、１２時間以上（例えば１２ないし３６時間）の期間で、アルカリ水（好ましくは水：エタノール中のＮａＯＨ、より好ましくは水：エタノール２：１中のＮａＯＨ）を用いて行われる。この工程は、通常、１以上のセルロースアセテートナノファイバー又はそれぞれ１以上のセルロースアセテートナノファイバーを含む不織シートを圧縮及び加熱した後に行われる。代替的には、この工程は、１以上のセルロースアセテートナノファイバー又はそれぞれ１以上のセルロースアセテートナノファイバーを含む不織シートを圧縮及び加熱する前に行われてもよい。官能基の活性化は、以下でさらに議論される。
【００５６】
通常試薬は、クロマトグラフィー担体として使用するのに適する１以上の部分を含む官能化生成物にする１以上の部分を導入することによりクロマトグラフィー担体を官能化する。導入する１以上の部分は、担体が使用される特定のクロマトグラフィー技術に依存するだろう。適切な部分及び試薬は以下でさらに議論される。通常、試薬は、通常１以上の不織シートに含まれる１以上のポリマーナノファイバー上に存在する１以上の官能基と反応し、１以上の部分を生み出す。代表的な官能基としては、ヒドロキシル基、アミノ基及びカルボキシ基が挙げられる。したがって、通常１以上のヒドロキシル基、アミノ基及び／又はカルボキシ基を、本発明の方法で官能化する。
【００５７】
本発明は、試薬との単一の処理のみを含む方法を想定しているが、複数の官能化工程を含む方法が好ましい。このような方法は、改良された結合特性を有する生成物をもたらし得る。
【００５８】
したがって、通常、試薬との接触による官能化は、バッチ方式での２回以上の試薬との接触により行われる。バッチ式の官能化は、ポリマーナノファイバー材料（圧縮、加熱、脱保護及び／又は活性化されていてもよいもの）を、それを官能化する試薬と反応させ、次いで、反応を停止し、結果として得られた（部分的）官能化材料を、試薬の別のバッチと反応させることを意味する。バッチ方式での反応は、例えば、単に、反応容器により多くの量の試薬を加えることを指すものではない。
【００５９】
バッチ式の官能化は、通常２〜１０回（即ち、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０回）行われる。好ましくは、バッチ式の官能化は２回ないし４回行われる。
【００６０】
バッチ方式での試薬との接触工程は、それぞれ、通常、（ａ）試薬との接触、（ｂ）工程（ａ）の生成物の試薬からの単離、（ｃ）工程（ｂ）の生成物のアルカリ水での任意の処理、及び（ｄ）工程（ｂ）／（ｃ）の生成物の水での任意の洗浄を含む。好ましくは、バッチ方式での試薬との接触工程は、それぞれ、（ａ）試薬との接触、（ｂ）工程（ａ）の生成物の試薬からの単離、（ｃ）工程（ｂ）の生成物のアルカリ水での処理、及び（ｄ）工程（ｂ）／（ｃ）の生成物の水での任意の洗浄を含む。より好ましくは、バッチ方式での試薬との接触工程は、それぞれ、（ａ）試薬との接触、（ｂ）工程（ａ）の生成物の試薬からの単離、（ｃ）工程（ｂ）の生成物のアルカリ水での処理、及び（ｄ）工程（ｂ）／（ｃ）の生成物の水での洗浄を含む。
【００６１】
アルカリ水での処理工程は、通常、熱アルカリ水（即ち７０℃ないし９０℃のもの）を使用する。代替的には、アルカリ水での処理工程は、室温で行われ得る。
【００６２】
バッチ方式での試薬との各接触工程に用いられる試薬は、同一であってもよく、或いは異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。
【００６３】
バッチ方式での試薬との２〜４の接触工程を用いる状況では、圧縮、加熱及び／又は脱保護されていてもよい、１以上のポリマーナノファイバー又はそれぞれ１以上のポリマーナノファイバーを含む１以上の不織シートは、通常、
−（１）（ａ１）試薬との接触、（ｂ１）工程（ａ１）の生成物の試薬からの単離、（ｃ１）工程（ｂ１）の生成物のアルカリ水での任意の処理、及び（ｄ１）工程（ｂ１）／（ｃ１）の生成物の水での任意の洗浄、並びに
（２）（ａ２）工程（ｂ１）／（ｃ１）／（ｄ１）の生成物の試薬との接触、（ｂ２）工程（ａ２）の生成物の試薬からの単離、（ｃ２）工程（ｂ２）の生成物のアルカリ水での任意の処理、及び（ｄ２）工程（ｂ２）／（ｃ２）の生成物の水での任意の洗浄；或いは
−（１）（ａ１）試薬との接触、（ｂ１）工程（ａ１）の生成物の試薬からの単離、（ｃ１）工程（ｂ１）の生成物のアルカリ水での任意の処理、及び（ｄ１）工程（ｂ１）／（ｃ１）の生成物の水での任意の洗浄、
（２）（ａ２）工程（ｂ１）／（ｃ１）／（ｄ１）の生成物の試薬との接触、（ｂ２）工程（ａ２）の生成物の試薬からの単離、（ｃ２）工程（ｂ２）の生成物のアルカリ水での任意の処理、及び（ｄ２）工程（ｂ２）／（ｃ２）の生成物の水での任意の洗浄、並びに
（３）（ａ３）工程（ｂ２）／（ｃ２）／（ｄ２）の生成物の試薬との接触、（ｂ３）工程（ａ３）の生成物の試薬からの単離、（ｃ３）工程（ｂ３）の生成物のアルカリ水での任意の処理、及び（ｄ３）工程（ｂ３）／（ｃ３）の生成物の水での任意の洗浄；或いは
−（１）（ａ１）試薬との接触、（ｂ１）工程（ａ１）の生成物の試薬からの単離、（ｃ１）工程（ｂ１）の生成物のアルカリ水での任意の処理、及び（ｄ１）工程（ｂ１）／（ｃ１）の生成物の水での任意の洗浄、
（２）（ａ２）工程（ｂ１）／（ｃ１）／（ｄ１）の生成物の試薬との接触、（ｂ２）工程（ａ２）の生成物の試薬からの単離、（ｃ２）工程（ｂ２）の生成物のアルカリ水での任意の処理、及び（ｄ２）工程（ｂ２）／（ｃ２）の生成物の水での任意の洗浄、
（３）（ａ３）工程（ｂ２）／（ｃ２）／（ｄ２）の生成物の試薬との接触、（ｂ３）工程（ａ３）の生成物の試薬からの単離、（ｃ３）工程（ｂ３）の生成物のアルカリ水での任意の処理、及び（ｄ３）工程（ｂ３）／（ｃ３）の生成物の水での任意の洗浄、並びに
（４）（ａ４）工程（ｂ３）／（ｃ３）／０（ｄ３）の生成物の試薬との接触、（ｂ４）工程（ａ４）の生成物の試薬からの単離、（ｃ４）工程（ｂ４）の生成物のアルカリ水での任意の処理、及び（ｄ４）工程（ｂ４）／（ｃ４）の生成物の水での任意の洗浄により処理される。
【００６４】
通常、バッチ方式での試薬との各接触工程は、１ないし２０分間の試薬での処理を含む。
【００６５】
特定の状況では、試薬との接触は、圧縮、加熱、脱保護及び／又は活性化されていてもよい、１以上のポリマーナノファイバー又はそれぞれ１以上のポリマーナノファイバーを含む１以上の不織シート（即ち、ポリマー材料）をホルダーに入れること、そして、ポリマー材料と接触して試薬が流れるように試薬をホルダーを介して流し、それにより、クロマトグラフィー担体としてポリマー材料を官能化することを含んでいてもよい。このようにしてポリマー材料を官能化することは、特定の状況では、例えばフラスコやビーカー内でポリマー材料を試薬と単に接触させるよりも効率的であり得る。
【００６６】
通常、ホルダーは、ポリマー材料を保持するのに適したフィルターホルダーである。通常、フィルターホルダーは、フィルターホルダーを通過する水性又は液体物質がポリマー材料と接触して流れるようにポリマー材料を保持する。したがって、本発明の背景において、フィルターホルダーは、好ましくは、フィルターホルダーを介して流れる試薬がポリマー材料と接触して流れるようにポリマー材料を保持する。
【００６７】
通常、試薬を、圧力下でホルダーを介して流す。
【００６８】
通常、試薬を、ポンプ（好ましくはＨＰＬＣポンプ）を用いてホルダーを介して流す。
【００６９】
通常、試薬を、循環する様態でホルダーを介して流す。したがって、ホルダーから出た任意の試薬は、再利用され、さらに何度かホルダーの１つを通過する。
【００７０】
通常、試薬を、１ないし２０分の期間にわたってホルダーを介して流す。
【００７１】
通常、試薬を、１０ないし１００ｍＬ／分の速度でホルダーを介して流す。
【００７２】
通常、試薬を、ホルダーを介して流した後、結果として得られた生成物をアルカリ水で処理して、必要に応じて水で洗浄する。好ましくは、試薬を、ホルダーを介して流した後、結果として得られた生成物をアルカリ水で処理して、水で洗浄する。アルカリ水での処理は、好ましくは、上記定義のように、熱アルカリ水での処理である。通常、試薬を、ホルダーを介して流した後、結果として得られた生成物を、任意のさらなる処理工程の前にホルダーから除去する。したがって、好ましくは、試薬をホルダーを介して流した後、結果として得られた生成物をホルダーから除去し、アルカリ水で処理し、必要に応じて水で洗浄する。より好ましくは、試薬を、ホルダーを介して流した後、結果として得られた生成物をホルダーから除去し、アルカリ水で処理し、水で洗浄する。
【００７３】
試薬により、前の物理プロセシング工程及び化学プロセシング工程の生成物を官能化して、クロマトグラフィー担体（特に官能性クロマトグラフィー担体）を得る。通常、試薬により、イオン交換、親和性捕捉又は疎水性クロマトグラフィー法で用いるのに適するように前の工程の生成物を官能化する。したがって、試薬との接触により、通常、１以上の負電荷の部分、１以上の正電荷の部分、１以上のタンパク質、タンパク質リガンドの作用を模倣する模倣リガンド若しくは合成リガンド、ペプチド、抗体若しくはそのフラグメント、色素、ヒスチジン、金属カチオンを含む基、又は疎水基で官能化されたクロマトグラフィー担体が得られる。このような基の例は、以下にさらに定義される。このような基を導入するための適切な試薬は当業者には明らかであろう。特に官能性クロマトグラフィー担体を陰イオン交換クロマトグラフィー法で使用する場合、２−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン塩酸塩（ＤＥＡＣＨ）及びギシジルトリメチルアンモニウムが、試薬として好ましい。特に官能性クロマトグラフィー担体を陽イオン交換クロマトグラフィー法で使用する場合、他の好ましい試薬は、ＴＥＭＰＯ、その次に過塩素酸ナトリウム、又はアリルギシジルエーテル、その次に二亜硫酸ナトリウムである。特に官能性クロマトグラフィー担体を親和性クロマトグラフィー法で使用する場合、他の好ましい試薬はＮａＩＯ４その次にプロテインＡである。特に官能性クロマトグラフィー担体を疎水性クロマトグラフィー法で使用する場合、他の好ましい試薬はスチレンオキシドである。
【００７４】
（クロマトグラフィー担体及び方法）
本発明の方法の生成物は、官能性クロマトグラフィー担体、即ち、１以上のクロマトグラフィー法での使用に適するように化学的に修飾させたクロマトグラフィー担体である。具体的な化学修飾は以下でより詳細に説明される。一般論として、このような化学修飾は、クロマトグラフィー担体の化学的性質及び／又は物理的性質を変化させる。これにより、クロマトグラフィー法で使用した場合に、クロマトグラフィー担体がどのような性質を示すかということに影響する。修飾は、例えば、非官能性型と比べて官能性クロマトグラフィー担体の、極性、疎水性又は生物学的結合特性を変化させ得る。修飾は、特定の状況では、非官能性型と比べて官能性クロマトグラフィー担体の、極性、疎水性又は生物学的結合特性のうち１つより多くを変化させ得る。一実施形態では、修飾は、非官能性型と比べて官能性クロマトグラフィー担体の極性及び疎水性を変化させる。
【００７５】
クロマトグラフィー担体は、通常、膜の形態である。このような膜は、膜クロマトグラフィー法で用いるのに適している。膜クロマトグラフィー法は、当業者によく知られており、「“Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ”  ｅｄ．  Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｃｈａｒｃｏｓｓｅｔ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  ２０１２」で議論されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７６】
通常、官能性ポリマークロマトグラフィー担体は、イオン交換クロマトグラフィー、親和性捕捉クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー及び混合モードクロマトグラフィーから選択されるクロマトグラフィー法での使用に適している。特定の状況では、クロマトグラフィー法は、「混合モード」、即ち、相互作用（即ち、イオン交換、親和性捕捉及び疎水性相互作用）のうち１つより多くの形態を用いて作動する。通常、このような「混合モード」クロマトグラフィーは、イオン交換（イオン）及び疎水性相互作用を含む。好ましくは、官能性ポリマークロマトグラフィー担体は、イオン交換クロマトグラフィー、親和性捕捉クロマトグラフィー、及び疎水性クロマトグラフィーから選択されるクロマトグラフィー法での使用に適している。作動時に、このようなクロマトグラフィー法は、吸着相（ここに官能性クロマトグラフィー担体が存在する）上を、所望の分子を含む移動相を通過させることを含む。吸着相は、通常、所望の分子を移動相に存在する他の成分に優先してその上に保持するようなものが選択される。
【００７７】
通常、ポリマークロマトグラフィー担体は、ＤＥＡＥ基、Ｑ基、ＳＰ基、ＣＭ基、プロテインＡ基、フェニル基、又はＭＥＰ基、例えば、ＤＥＡＥ基又はＣＭ基で官能化される。一般的に、ポリマーがセルロースであり且つクロマトグラフィー担体が、ＤＥＡＥ基、Ｑ基、ＳＰ基、ＣＭ基、プロテインＡ基、フェニル基、又はＭＥＰ基、例えば、ＤＥＡＥ基又はＣＭ基で官能化される。したがって、官能性クロマトグラフィー担体は、ＤＥＡＥ基、Ｑ基、ＳＰ基、ＣＭ基、プロテインＡ基、フェニル基、又はＭＥＰ基、例えば、ＤＥＡＥ基又はＣＭ基で誘導体化されたセルロースであり得る。
【００７８】
イオン交換クロマトグラフィーは、分子、通常、イオン又は極性分子を、それらのイオン交換に基づいて分離する技術である。したがって、このような方法で用いられる官能性クロマトグラフィー担体は、正電荷又は負電荷の１以上の部分を含む。官能性クロマトグラフィー担体における正電荷及び／又は負電荷は、通常、１以上の対イオンとバランスを取っている。イオン交換クロマトグラフィーは、１以上の陽イオン交換クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーを含む。
【００７９】
陽イオン交換クロマトグラフィーで用いられる官能性クロマトグラフィー担体は、負電荷の１以上の部分を含む。代表的な負電荷の部分は、１以上のカルボキシラート基、スルホナート基又はホスホナート基、又はその混合基を含む。即ち、その部分は、通常、１以上の−ＣＯＯ−基、−ＳＯ３−基、又は−Ｐ（ＯＨ）２Ｏ−基、又はその混合基を含む。陽イオン交換クロマトグラフィーで用いられる代表的な官能性クロマトグラフィー担体は、１以上の−Ｏ−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＳＯ３−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−、又は−Ｐ（ＯＨ）２Ｏ−の部分を含む。
【００８０】
陰イオン交換クロマトグラフィーで用いられる官能性クロマトグラフィー担体は、正電荷の１以上の部分を含む。代表的な正電荷の部分は、１以上の第四級アミン基を含む。陰イオン交換クロマトグラフィーで用いられる代表的な官能性クロマトグラフィー担体は、１以上の−Ｎ＋（ＣＨ３）３、−Ｎ＋（Ｃ２Ｈ５）Ｈ、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（Ｃ２Ｈ５）Ｈ、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（Ｃ２Ｈ５）２（ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３）、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３、又は−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）２Ｈの部分を含む。
【００８１】
親和性捕捉クロマトグラフィーは、分子を特定のリガンド（常にというわけではないが通常は生物学的リガンド）に対するそれらの親和性に基づいて分離する技術である。当該方法は、例えば、抗体と抗原との間、或いは酵素と基質との間の吸引力に依存し得る。親和性捕捉クロマトグラフィーで用いられる官能性クロマトグラフィー担体は、通常、１以上のタンパク質、ペプチド、抗体若しくはそのフラグメント、色素、ヒスチジン、又は金属カチオンを含む基から選ばれる１以上の部分を含む。別の形態では、親和性捕捉クロマトグラフィーで用いられる官能性クロマトグラフィー担体は、タンパク質リガンドの作用を模倣する模倣リガンド又は合成リガンドを含み得る。
【００８２】
親和性捕捉クロマトグラフィーで用いられる代表的なタンパク質は、当業者によく知られており、プロテインＡ、プロテインＧ及びプロテインＬを含む。
【００８３】
親和性捕捉クロマトグラフィーで用いられる代表的な抗体及びそのフラグメントは、当業者によく知られており、ＩｇＧを含む。
【００８４】
親和性捕捉クロマトグラフィーで用いられる代表的な色素は、当業者によく知られており、イエローＨＥ−４Ｒ、レッドＨＥ−３Ｂ及びシバクロンブルーＦ３Ｇを含む。
【００８５】
親和性捕捉クロマトグラフィーで用いられる代表的な金属カチオンを含む基は、当業者によく知られている。このような基は、通常、金属カチオンを固定するキレート剤を含む。金属カチオンは、通常、銅、ニッケル、亜鉛及びコバルトのカチオンから選ばれ、好ましくはＣｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋及びＣｏ２＋である。
【００８６】
疎水性相互作用クロマトグラフィーは、分子をそれらの疎水性に基づいて分離する技術である。したがって、このような方法で用いられる官能性クロマトグラフィー担体は、１以上の疎水基を含む１以上の部分を含む。代表的な疎水基は、プロピル基、ブチル基、フェニル基、及びオクチル基を含む。
【００８７】
混合モード（又はマルチモーダル）クロマトグラフィーは、分子を、２以上の特徴、通常は疎水性及びイオン電荷に基づいて分離する技術である。これは、疎水性とアニオン性の性質の組み合わせ、又は疎水性及びカチオン性の性質の組み合わせを含み得る。したがって、通常、このような方法で用いられる官能性クロマトグラフィー担体は、通常上記定義の通りの正電荷又は負電荷であり、且つ、通常上記定義の通りの１以上の疎水基を含む１以上の部分を含む。官能性クロマトグラフィー担体における正電荷及び／又は負電荷は、通常、１以上の対イオンとバランスを取っている。また、このような方法で用いられる官能性クロマトグラフィー担体は、いわゆる疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）で用いられる１以上のイオン性の疎水基を含んでいてもよい。したがって、一実施形態では、混合モードクロマトグラフィーは、疎水性電荷誘導クロマトグラフィーである。このような方法で用いられる適切な基は、４−メルカプト−エチル−ピリジン（ＭＥＰ）基及びオクチルアミン基である。
【００８８】
疎水性及びアニオン性相互作用の組み合わせを含む混合モードクロマトグラフィー法で用いられる官能性クロマトグラフィー担体は、通常上記定義の通りの正電荷であり且つ通常上記定義の通りの１以上の疎水基である１以上の部分を含む。このような方法で用いられる適切な基は、Ｎ−ベンジルメチルエタノールアミン基及びＮ−ベンゾイル−ホモシステイン基である。疎水性及びカチオン性相互作用の組み合わせを含む混合モードクロマトグラフィー法で用いられる官能性クロマトグラフィー担体は、通常上記定義の通りの負電荷であり且つ通常上記定義の通りの１以上の疎水基である１以上の部分を含む。このような方法で用いられる適切な基は、Ｎ−ベンゾイル−ホモシステイン基である。
【００８９】
本発明の特許請求の範囲の官能性クロマトグラフィー担体の製造方法は、通常、結果として得られた１以上の部分を含む官能化生成物がクロマトグラフィー法でクロマトグラフィー担体として用いるのに適するように、１以上の部分をクロマトグラフィー担体に導入することを含む。代表的な部分、担体、試薬及び方法は、上記定義の通りである。１以上の部分は、試薬を、通常、圧縮、加熱、脱保護及び／又は活性化された１以上のポリマーナノファイバー又はそれぞれ１以上のポリマーナノファイバーを含む１以上の不織シートに含まれる１以上の官能基と反応させることにより誘導される。代表的な官能基は、ヒドロキシル基、アミノ基及びカルボキシル基を含む。
【００９０】
１以上の官能基は、試薬と反応させる前に活性化させてもよい。当技術分野で周知の従来の活性化方法を用いてもよい。したがって、官能基がヒドロキシル基である場合、このような基は、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ビスオキシラン、シアヌル酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）又は２−フルオロ−１−メチルピリジニウムトルエン−４スルホナート（ＦＭＰ）で処理することにより活性化してもよい。官能基がアミノ基である場合、このような基は、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド又はエポキシドで処理して活性化してもよい。官能基がカルボキシル基である場合、このような基は、ＣＤＩ又は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）で処理して活性化してもよい。
【００９１】
当業者は、特定の部分を特定のポリマーに導入するための適切な試薬を、例えばこれらのポリマーに含まれる官能基に基づいて選択することができる。代表的な試薬は、２−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン塩酸塩（ＤＥＡＣＨ）を含む。
【００９２】
通常、
−クロマトグラフィー法が陽イオン交換法であり、試薬により、クロマトグラフィー担体が、カルボキシラート基、スルホナート基又はホスホナート基で官能化されるか；
−クロマトグラフィー法が陰イオン交換法であり、試薬により、クロマトグラフィー担体が、第四級アミノ基又はジエチルアミン基で官能化されるか；
−クロマトグラフィー法が親和性捕捉クロマトグラフィー法であり、試薬により、クロマトグラフィー担体が、タンパク質、ペプチド、抗体又はそのフラグメント、色素、ヒスチジン、又は金属カチオンを含む基で官能化されるか；
−クロマトグラフィー法が疎水性相互作用クロマトグラフィー法であり、試薬により、クロマトグラフィー担体が、プロピル基、ブチル基、フェニル基、又はオクチル基で官能化されるか；或いは
−クロマトグラフィー法が混合モードクロマトグラフィー法であり、試薬により、クロマトグラフィー担体が、ＭＥＰ、オクチルアミン、Ｎ−ベンジルメチルエタノールアミン又はＮ−ベンゾイル−ホモシステイン基で官能化される。
【００９３】
好ましくは、
−クロマトグラフィー法が陽イオン交換法であり、試薬により、クロマトグラフィー担体が、カルボキシラート基、スルホナート基又はホスホナート基で官能化されるか；
−クロマトグラフィー法が陰イオン交換法であり、試薬により、クロマトグラフィー担体が、第四級アミノ又はジエチルアミン基で官能化されるか；
−クロマトグラフィー法が親和性捕捉クロマトグラフィー法であり、試薬により、クロマトグラフィー担体が、タンパク質、ペプチド、抗体又はそのフラグメント、色素、ヒスチジン、又は金属カチオンを含む基で官能化されるか；或いは
−クロマトグラフィー法が疎水性相互作用クロマトグラフィー法であり、試薬により、クロマトグラフィー担体が、プロピル基、ブチル基、フェニル基、又はオクチル基で官能化される。
【００９４】
（本発明の方法の特定の実施形態）
その最も広い意味において、本発明は、官能性クロマトグラフィー担体の製造方法であって、クロマトグラフィー法でクロマトグラフィー担体としての使用に適した官能化生成物を得るために物理プロセシング工程及び化学プロセシング工程の組み合わせで１以上のポリマーナノファイバーを処理することを含む方法を提供する。
【００９５】
通常、１以上のポリマーナノファイバーは本明細書で定義される。１以上のポリマーナノファイバーは、それぞれ１以上のポリマーナノファイバーを含む１以上の不織シートとして提供され得る。通常、２以上の不織シートは、それぞれ１以上のポリマーナノファイバーを含むものが提供される。
【００９６】
通常、物理プロセシング工程は、本明細書で定義される加熱及び圧縮工程である。通常、加熱及び圧縮工程は同時に行われる。
【００９７】
通常、化学プロセシング工程は、本明細書で定義される試薬との接触工程である。
【００９８】
通常、クロマトグラフィー法は、本明細書で定義される。
【００９９】
本発明は、通常、官能性ポリマークロマトグラフィー担体の製造方法であって、（Ｉ）それぞれ本明細書で定義される１以上のポリマーナノファイバーを含む、互いに上下に積層した本明細書で定義される２以上の不織シートを提供すること、（ＩＩ）本明細書で定義されるように同時にシートのスタックを加熱及び圧縮して、隣接したシートのナノファイバーの間の接点を融合すること、及び（ＩＩＩ）本明細書で定義されるように圧縮及び加熱された生成物を試薬と接触させ、本明細書で定義されるようにクロマトグラフィー担体として工程（ＩＩ）の生成物を官能化することを含む方法を提供する。
【０１００】
好ましい本発明の実施形態において、試薬での官能化工程は、バッチ方式で行われる。これは、結果として得られた官能性ポリマークロマトグラフィー担体の結合能を増加させる。したがって、当該好ましい実施形態において、本発明は、官能性ポリマークロマトグラフィー担体の製造方法であって、（Ｉ）それぞれ本明細書で定義される１以上のポリマーナノファイバーを含む、互いに上下に積層した本明細書で定義される２以上の不織シートを提供すること、及び（ＩＩ）本明細書で定義されるように同時にシートのスタックを加熱及び圧縮して、隣接したシートのナノファイバーの間の接点を融合すること、及び（ＩＩＩ）本明細書で定義されるように、試薬と、少なくとも二回、工程（ＩＩ）の生成物をバッチ方式で接触させて、本明細書で定義されるようにクロマトグラフィー担体として工程（ＩＩ）の生成物を官能化することを含む方法を提供する。
【０１０１】
さらに好ましい本発明の実施形態において、試薬での官能化工程は対流で行われる。このような方法は、通常、標準的な拡散方法よりも効率的である。したがって、当該さらに好ましい実施形態において、本発明は、官能性ポリマークロマトグラフィー担体の製造方法であって、（Ｉ）それぞれ本明細書で定義される１以上のポリマーナノファイバーを含む、互いに上下に積層した本明細書で定義される２以上の不織シートを提供すること、（ＩＩ）本明細書で定義されるように、同時にシートのスタックを加熱及び圧縮して、隣接したシートのナノファイバーの間の接点を融合すること、及び（ＩＩＩ）本明細書で定義されるように、ホルダー内に工程（ＩＩ）の生成物を入れること、及び（ＩＶ）本明細書で定義されるような試薬を、工程（ＩＩ）の生成物と接触して試薬が流れるように、ホルダーを介して流し、本明細書で定義されるように、クロマトグラフィー担体として工程（ＩＩ）の生成物を官能化することを含む方法を提供する。
【０１０２】
官能性ポリマークロマトグラフィー担体は、官能性セルロースクロマトグラフィー担体であることが好ましい。
【０１０３】
より好ましい本発明の実施形態において、本発明は、官能性セルロースクロマトグラフィー担体の製造方法であって、（ｉ）それぞれ本明細書で定義される１以上のセルロースアセテートナノファイバーを含む、互いに上下に積層した本明細書で定義される２以上の不織シートを提供すること、（ｉｉ）本明細書で定義されるように、同時にシートのスタックを加熱及び圧縮して、隣接したシートのセルロースアセテートナノファイバーの間の接点を融合すること、（ｉｉｉ）本明細書で定義されるように、圧縮及び加熱された生成物を処理して、セルロースアセテートをセルロースに変換すること、及び（ｉｖ）本明細書で定義されるように、こうして得られた生成物を試薬と接触させ、本明細書で定義されるように、クロマトグラフィー担体として工程（ｉｉｉ）の生成物を官能化することを含む方法を提供する。
【０１０４】
最も好ましい本発明の実施形態において、本発明は、官能性セルロースクロマトグラフィー担体の製造方法であって、（ｉ）それぞれ本明細書で定義される１以上のセルロースアセテートナノファイバーを含む、互いに上下に積層した本明細書で定義される２以上の不織シートを提供すること、（ｉｉ）本明細書で定義されるように、同時にシートのスタックを加熱及び圧縮して、セルロースアセテートナノファイバーの隣接した層の間の接点を融合すること、（ｉｉｉ）本明細書で定義されるように、圧縮及び加熱された生成物を処理して、セルロースアセテートをセルロースに変換すること、及び（ｉｖ）本明細書で定義されるように、バッチ方式においてこうして得られた生成物を２ないし４回試薬と接触させ、本明細書で定義されるように、クロマトグラフィー担体として工程（ｉｉｉ）の生成物を官能化することを含む方法を提供する。
【０１０５】
さらに最も好ましい本発明の実施形態において、本発明は、官能性セルロースクロマトグラフィー担体の製造方法であって、（ｉ）それぞれ本明細書で定義される１以上のセルロースアセテートナノファイバーを含む、互いに上下に積層した本明細書で定義される２以上の不織シートを提供すること、（ｉｉ）本明細書で定義されるように、同時にシートのスタックを加熱及び圧縮して、隣接したシートのセルロースアセテートナノファイバーの間の接点を融合すること、（ｉｉｉ）本明細書で定義されるように、圧縮及び加熱された生成物を処理して、セルロースアセテートをセルロースに変換すること、（ｉｖ）本明細書で定義されるように、こうして得られた生成物をホルダー内に入れること、及び（ｖ）本明細書で定義されるような試薬を、工程（ｉｉｉ）で得られた生成物と接触して試薬が流れるようにホルダーを介して流し、本明細書で定義されるように、クロマトグラフィー担体として工程（ｉｉｉ）の生成物を官能化することを含む方法を提供する。
【０１０６】
好ましくは、それぞれ１、２又は３のポリマーナノファイバーを含み、且つそれぞれ５ないし４０μｍの厚さを有する、２ないし３０、より好ましくは５ないし２５の上記シートが、工程（Ｉ）において互いに上下に積層される。
【０１０７】
また、工程（ＩＩ）において、好ましくは、シートのスタックは、１ないし１２０分間、同時に、ポリマーの融点未満の温度で加熱され、０．０１ないし５ＭＰａの圧力下で圧縮され、隣接したシートのナノファイバーの間の接点が融合される。結果として得られた圧縮及び加熱された生成物は、２５０ないし７５０ｋｇ／ｍ３の平均密度及び０．０５ないし１０ｍｍの厚さを有する。
【０１０８】
より好ましくは：
−それぞれ１、２又は３のポリマーナノファイバーを含み、且つそれぞれ５ないし４０μｍの厚さを有する、２ないし３０、より好ましくは５ないし２５の上記シートが、工程（Ｉ）において互いに上下に積層され；且つ
−工程（ＩＩ）において、シートのスタックは、１ないし１２０分間、同時に、ポリマーの融点未満の温度で加熱され、０．０１ないし５ＭＰａの圧力下で圧縮され、隣接したシートのナノファイバーの間の接点が融合され、結果として得られた圧縮及び加熱された生成物は、２５０ないし７５０ｋｇ／ｍ３の平均密度及び０．０５ないし１０ｍｍの厚さを有する。
【０１０９】
好ましくは、それぞれ単一のポリマーナノファイバーからなり、且つそれぞれ５ないし１２０μｍの厚さ及び１ないし４０ｇ／ｍ２の面密度を有する、２ないし３０、より好ましくは５ないし２５の上記シートが、工程（Ｉ）において互いに上下に積層される。
【０１１０】
また、工程（ＩＩ）において、好ましくは、シートのスタックは、１ないし３０分間、同時にポリマーの融点未満の温度で加熱され、１ないし５００ｋＰａの圧力下で圧縮され、隣接したシートのナノファイバーの間の接点が融合される。結果として得られた圧縮及び加熱された生成物は、２００ないし１０００ｋｇ／ｍ３の平均密度及び０．０５ないし１０ｍｍの厚さを有する。
【０１１１】
より好ましくは：
−それぞれ単一のポリマーナノファイバーからなり、且つそれぞれ５ないし１２０μｍの厚さ及び１ないし４０ｇ／ｍ２の面密度を有する、２ないし３０、より好ましくは５ないし２５の上記シートが、工程（Ｉ）において互いに上下に積層され；且つ
−工程（ＩＩ）において、シートのスタックが、１ないし３０分間、同時にポリマーの融点未満の温度で加熱され、１ないし５００ｋＰａの圧力下で圧縮され、隣接したシートのナノファイバーの間の接点が融合され、結果として得られた圧縮及び加熱された生成物は、２００ないし１０００ｋｇ／ｍ３の平均密度及び０．０５ないし１０ｍｍの厚さを有する。
【０１１２】
好ましい実施形態では、１以上のポリマーナノファイバーを圧縮及び加熱する。これは、結果として得られた官能性ポリマークロマトグラフィー担体の構造特性を改良する。したがって、当該好ましい実施形態において、本発明は、官能性ポリマークロマトグラフィー担体の製造方法であって、（Ｉ）本明細書で定義されるように１以上のポリマーナノファイバーを提供すること、（ＩＩ）本明細書で定義されるように１以上のポリマーナノファイバーを圧縮すること、（ＩＩＩ）本明細書で定義されるように、１以上のポリマーナノファイバーを加熱し、１以上のポリマーナノファイバーのセクション間の接点を融合すること、及び（ＩＶ）本明細書で定義されるように圧縮及び加熱された生成物を試薬と接触させ、本明細書で定義されるようにクロマトグラフィー担体として工程（ＩＩＩ）の生成物を官能化することを含む方法を提供する。
【０１１３】
当該好ましい実施形態において、１以上のポリマーナノファイバーを提供する工程は、通常、それぞれ１以上のポリマーナノファイバーを含む１以上の不織シートを提供することを含む。
【０１１４】
さらに好ましい実施形態において、試薬での官能化工程は、バッチ方式において行われる。これは、結果として得られた官能性ポリマークロマトグラフィー担体の結合能を増加させる。したがって、当該さらに好ましい実施形態において、本発明は、官能性ポリマークロマトグラフィー担体の製造方法であって、（Ｉ）本明細書で定義されるように、１以上のポリマーナノファイバーを提供すること、（ＩＩ）本明細書で定義されるように、１以上のポリマーナノファイバーを圧縮してもよいこと、（ＩＩＩ）本明細書で定義されるように、１以上のポリマーナノファイバーを加熱し、１以上のポリマーナノファイバーのセクション間の接点を融合してもよいこと、及び（ＩＶ）本明細書で定義されるように、バッチ方式において工程（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の生成物を少なくとも二回試薬と接触させ、本明細書で定義されるように、工程（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の生成物をクロマトグラフィー担体として官能化することを含む方法を提供する。
【０１１５】
当該さらに好ましい実施形態において、１以上のポリマーナノファイバーを提供する工程は、通常、それぞれ１以上のポリマーナノファイバーを含む１以上の不織シートを提供することを含む。
【０１１６】
当該さらに好ましい実施形態は、好ましくは、（Ｉ）本明細書で定義されるように、１以上のポリマーナノファイバーを提供すること、（ＩＩ）本明細書で定義されるように、１以上のポリマーナノファイバーを圧縮すること、（ＩＩＩ）本明細書で定義されるように、１以上のポリマーナノファイバーを加熱し、１以上のポリマーナノファイバーのセクション間の接点を融合すること、及び（ＩＶ）本明細書で定義されるように、バッチ方式において工程（ＩＩＩ）の生成物を少なくとも二回試薬と接触させ、本明細書で定義されるように、クロマトグラフィー担体として、工程（ＩＩＩ）の生成物を官能化することを含む。
【０１１７】
当該さらに好ましい実施形態は、より好ましくは、（Ｉ）本明細書で定義されるように、それぞれ１以上のポリマーナノファイバーを含む、１以上の不織シートを提供すること、（ＩＩ）本明細書で定義されるように、１以上の不織シートを圧縮すること、（ＩＩＩ）本明細書で定義されるように、１以上の不織シートを加熱し、１以上のポリマーナノファイバーのセクション間の接点を融合すること、及び（ＩＶ）本明細書で定義されるように、バッチ方式において工程（ＩＩＩ）の生成物を少なくとも二回試薬と接触させ、本明細書で定義されるように、クロマトグラフィー担体として、工程（ＩＩＩ）の生成物を官能化することを含む。
【０１１８】
なおさらに好ましい実施形態において、試薬での官能化工程は、対流により行われる。このような方法は、通常、標準的な拡散方法よりも効率的である。したがって、当該さらに好ましい実施形態において、本発明は、官能性ポリマークロマトグラフィー担体の製造方法であって、（Ｉ）本明細書で定義されるように、１以上のポリマーナノファイバーを提供すること、（ＩＩ）本明細書で定義されるように、１以上のポリマーナノファイバーを圧縮してもよいこと、（ＩＩＩ）本明細書で定義されるように、１以上のポリマーナノファイバーを加熱し、１以上のポリマーナノファイバーのセクション間の接点を融合させてもよいこと、（ＩＶ）本明細書で定義されるように、工程（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の生成物をホルダー内におくこと、及び（Ｖ）本明細書で定義されるような試薬を、工程（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の生成物と接触して試薬が流れるようにホルダーを介して流し、本明細書で定義されるように、クロマトグラフィー担体として工程（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の生成物を官能化することを含む方法を提供する。
【０１１９】
当該なおさらに好ましい実施形態は、好ましくは、（Ｉ）本明細書で定義されるように、１以上のポリマーナノファイバーを提供すること、（ＩＩ）本明細書で定義されるように、１以上のポリマーナノファイバーを圧縮すること、（ＩＩＩ）本明細書で定義されるように、１以上のポリマーナノファイバーを加熱し、１以上のポリマーナノファイバーのセクション間の接点を融合すること、（ＩＶ）本明細書で定義されるように、工程（ＩＩＩ）の生成物をホルダー内に入れること、及び（Ｖ）本明細書で定義されるような試薬を、工程（ＩＩＩ）の生成物と接触して試薬が流れるようにホルダーを介して流し、本明細書で定義されるようにクロマトグラフィー担体として工程（ＩＩＩ）の生成物を官能化することを含む。
【０１２０】
当該なおさらに好ましい実施形態は、より好ましくは、（Ｉ）本明細書で定義されるように、それぞれ１以上のポリマーナノファイバーを含む、１以上の不織シートを提供すること、（ＩＩ）本明細書で定義されるように、１以上の不織シートを圧縮すること、（ＩＩＩ）本明細書で定義されるように、１以上の不織シートを加熱し、１以上のポリマーナノファイバーのセクション間の接点を融合すること、（ＩＶ）本明細書で定義されるように、工程（ＩＩＩ）の生成物をホルダー内に入れること、及び（Ｖ）本明細書で定義されるような試薬を、工程（ＩＩＩ）の生成物と接触して試薬が流れるようにホルダーを介して流し、本明細書で定義されるようにクロマトグラフィー担体として工程（ＩＩＩ）の生成物を官能化することを含む。
【０１２１】
好ましくは、官能性ポリマークロマトグラフィー担体は、官能性セルロースクロマトグラフィー担体である。
【０１２２】
最も好ましい実施形態において、本発明は、官能性セルロースクロマトグラフィー担体の製造方法であって、（ｉ）それぞれ本明細書で定義される１以上のセルロースアセテートナノファイバーを含む、本明細書で定義される１以上の不織シートを提供すること、（ｉｉ）本明細書で定義されるように、１以上の不織シートを圧縮すること、（ｉｉｉ）本明細書で定義されるように、１以上の不織シートを加熱し、１以上のセルロースアセテートナノファイバーのセクション間の接点を融合すること、（ｉｖ）本明細書で定義されるように、圧縮及び加熱された生成物を処理して、セルロースアセテートをセルロースに変換すること、及び（ｖ）本明細書で定義されるように、バッチ方式においてこうして得られた生成物を２ないし４回試薬と接触させ、本明細書で定義されるようにクロマトグラフィー担体として工程（ｉｖ）の生成物を官能化することを含む方法を提供する。
【０１２３】
さらに最も好ましい実施形態において、本発明は、官能性セルロースクロマトグラフィー担体の製造方法であって、（ｉ）それぞれ本明細書で定義される１以上のセルロースアセテートナノファイバーを含む、本明細書で定義される１以上の不織シートを提供すること、（ｉｉ）本明細書で定義されるように、１以上の不織シートを圧縮すること、（ｉｉｉ）本明細書で定義されるように、１以上の不織シートを加熱し、１以上のセルロースアセテートナノファイバーのセクション間の接点を融合すること、（ｉｖ）本明細書で定義されるように、圧縮及び加熱された生成物を処理して、セルロースアセテートをセルロースに変換すること、（ｖ）本明細書で定義されるように、こうして得られた生成物をホルダー内に入れること、及び（ｖｉ）本明細書で定義されるような試薬を、工程（ｉｖ）で得られた生成物と接触して試薬が流れるようにホルダーを介して流し、本明細書で定義されるようにクロマトグラフィー担体として工程（ｉｖ）の生成物を官能化することを含む方法を提供する。
【０１２４】
（本発明の官能性クロマトグラフィー担体）
また、本発明は、本発明の方法で得られる官能性クロマトグラフィー担体を提供する。
【０１２５】
また、本発明の方法で得られた官能性クロマトグラフィー担体を提供する。
【０１２６】
本発明の官能性クロマトグラフィー担体は、通常０．１ないし１．０μｍ、好ましくは０．３ないし０．９μｍ、より好ましくは０．４ないし０．８μｍ、さらに好ましくは０．５ないし０．７μｍ、さらに一層より好ましくは０．６ないし０．７μｍ、例えば０．６ないし０．６５μｍの空隙率を有する。
【０１２７】
本発明の官能性クロマトグラフィー担体は、２００ないし１０００ｋｇ／ｍ３、好ましくは２５０ないし７５０ｋｇ／ｍ３、より好ましくは３５０ないし６５０ｋｇ／ｍ３、いくつかの状況では４５０ないし５５０ｋｇ／ｍ３の密度を有する。他の好ましい密度は、２００ないし７５０ｋｇ／ｍ３、２００ないし６５０ｋｇ／ｍ３、２００ないし５５０ｋｇ／ｍ３、２５０ないし７５０ｋｇ／ｍ３、２５０ないし６５０ｋｇ／ｍ３、及び２５０ないし５５０ｋｇ／ｍ３を含む。
【０１２８】
通常、本発明の官能性クロマトグラフィー担体は、０．０５ないし１０ｍｍ、例えば、０．１ないし５ｍｍの厚さを有する。
【０１２９】
好ましくは、本発明の官能性クロマトグラフィー担体は、本明細書で定義されるようなクロマトグラフィー法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、親和性捕捉クロマトグラフィー及び疎水性クロマトグラフィー）での使用に適するように官能化される。
【０１３０】
本発明の官能性クロマトグラフィー担体は、通常、膜の形態である。
【０１３１】
（本発明のクロマトグラフィーカートリッジ）
また、本発明は、クロマトグラフィーカートリッジを提供する。本発明のクロマトグラフィーカートリッジは、１以上の本発明の官能性クロマトグラフィー担体を含む。別の形態では、本発明のクロマトグラフィーカートリッジは、本発明の方法を行い、得られた生成物を、カートリッジに組み込むことにより得られる。
【０１３２】
また、本発明の方法を行い、得られた生成物をカートリッジに組み込むことを含むクロマトグラフィーカートリッジの製造方法を提供する。
【０１３３】
クロマトグラフィーカートリッジは、通常、クロマトグラフィー、好ましくは、本明細書で定義されるようなクロマトグラフィー法での使用に適している。
【０１３４】
本発明のクロマトグラフィーカートリッジは、通常、ホルダー内、例えば、上記定義の通りのホルダー内に１以上の本発明の官能性クロマトグラフィー担体を含む。ホルダーは、通常、円筒状である。
【０１３５】
通常、クロマトグラフィーカートリッジは、円筒状ホルダー内に積層した１以上の本発明の官能性クロマトグラフィー担体を含む。
【０１３６】
通常、クロマトグラフィーカートリッジは、２以上の本発明の官能性クロマトグラフィー担体を含む。通常、クロマトグラフィーカートリッジは、２０以下の本発明の官能性クロマトグラフィー担体を含む。
【０１３７】
また、通常、クロマトグラフィーカートリッジは、通常円筒状ホルダー内に１以上のフリットを含む。フリットは、当業者によく知られており、高強度多孔質構造（通常は、剛性金属、剛直ポリマーの又は高強度セラミック、好ましくは剛性金属又は高強度セラミックの多孔質構造）を言う。フリットは、通常、カートリッジを通過する流量分布を改善し、及び／又は１以上の本発明の官能性クロマトグラフィー担体を支持するために、クロマトグラフィーカートリッジに含まれる。代表的なフリットの細孔は、１ないし１０００μｍ、好ましくは５ないし５００μｍ、より好ましくは１０ないし１５０μｍの直径を有する。他の適切なフリット細孔直径は、１ないし２０μｍ、好ましくは５ないし１０μｍ、より好ましくは３ないし７μｍを含む。
【０１３８】
また、通常、クロマトグラフィーカートリッジは、１以上の注入口の流体分配手段及び／又は排液口の流体貯留手段を含む。このような手段は、当業者によく知られている。
【０１３９】
（本発明のクロマトグラフィー法）
また、本発明は、クロマトグラフィー、特に、本明細書で定義されるようなクロマトグラフィー法における、本発明の官能性クロマトグラフィー担体又は本発明のクロマトグラフィーカートリッジの使用を提供する。
【０１４０】
また、本発明は、移動相からの１以上の生体分子の単離方法であって、移動相における１以上の生体分子を、本発明の官能性クロマトグラフィー担体又は本発明のクロマトグラフィーカートリッジと接触させることを含む方法を提供する。クロマトグラフィー担体又はクロマトグラフィーカートリッジは、通常、移動相に存在する他の成分（例えば他の生体分子）に優先して、移動相における１以上の生体分子に優先的に結合する。これは、このようなクロマトグラフ法の結合相について知られている従来の方法に従って行うことができる。
【０１４１】
したがって、通常、当該クロマトグラフ法は、イオン（陰イオン又は陽イオン）交換、親和性捕捉、疎水性相互作用又は混合モードクロマトグラフィー法である。
【０１４２】
好ましくは、クロマトグラフ法が、陰イオン交換クロマトグラフィー法であり、クロマトグラフィー担体が、ＤＥＡＥ又はＱで官能化されているか；クロマトグラフ法が、陽イオン交換クロマトグラフィー法であり、クロマトグラフィー担体が、ＳＰ又はＣＭで官能化されているか；クロマトグラフ法が、親和性捕捉クロマトグラフィー法であり、クロマトグラフィー担体が、プロテインＡで官能化されているか；或いはクロマトグラフ法が、疎水性相互作用クロマトグラフィー法であり、クロマトグラフィー担体が、フェニル基で官能化されている。
【０１４３】
したがって、本発明は、上記工程を含むクロマトグラフィー法を提供する。通常、クロマトグラフィー法は、上記定義の通りのクロマトグラフィー法に従って行われる。
【０１４４】
クロマトグラフィー法は、通常、さらに、官能性クロマトグラフィー担体又はクロマトグラフィーカートリッジからの１以上の生体分子の回収工程を含む。当該工程は、通常、１以上の生体分子が吸着した官能性クロマトグラフィー担体又はクロマトグラフィーカートリッジを溶出バッファーに接触させることにより行うことができる。これは、このようなクロマトグラフ法の溶出相について知られている従来の方法に従って行うことができる。したがって、その方法は、通常、結合溶出クロマトグラフ法である。
【０１４５】
結合工程と溶出工程の間で、その方法は、さらに、１以上の生体分子が吸着した官能性クロマトグラフィー担体又は本発明のクロマトグラフィーカートリッジの洗浄工程を含んでいてもよい。当該洗浄工程は、官能性クロマトグラフィー担体又はクロマトグラフィーカートリッジに結合していない任意の成分を除去するために行われる。これは、このようなクロマトグラフ法の洗浄相について知られている従来の方法に従って行うことができる。
【０１４６】
溶出工程の後、その方法は、さらに、本発明の官能性クロマトグラフィー担体又はクロマトグラフィーカートリッジの再生工程を含んでいてもよい。通常、これは、１以上の生体分子が溶出する官能性クロマトグラフィー担体又はクロマトグラフィーカートリッジをバッファーと接触させることにより行われる。これは、このようなクロマトグラフ法の再生相について知られている従来の方法に従って行うことができる。
【０１４７】
通常、１以上の生体分子は、例えば、組み換えタンパク質、モノクローナル抗体、ウイルス性ワクチン及びプラスミドＤＮＡを含む、タンパク質、ポリペプチド、抗体、アミノ酸、ウイルス及び核酸から選ばれる。
【０１４８】
モノクローナル抗体は、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）又はドメイン欠失抗体であってもよい。好ましくは、モノクローナル抗体は、ヒト化抗体又はヒト抗体である。モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントを用いてもよい。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメント、ダイアボディ及び一本鎖抗体を含む。
【０１４９】
通常、クロマトグラフ法は、擬似又は実際の移動床システムを用いる。したがって、通常、その方法は、移動相における１以上の生体分子を、複数の連結されたクロマトグラフィーカラムを備える１以上の擬似又は実際の移動床クロマトグラフィー装置に導入することを含む。ここで、クロマトグラフィーカラムは、吸着材として本発明の官能性クロマトグラフィー担体を含む。
【０１５０】
任意の既知の擬似又は実際の移動床装置が、クロマトグラフ法を行うために用いられてもよく、それは、吸着材として本発明の官能性クロマトグラフィー担体を含む。
【０１５１】
擬似及び実際の移動床クロマトグラフィーは、当業者によく知られた公知技術である。動作の原理は、液体溶離液相と固体吸着相の向流移動を伴う。当該動作は、溶媒の最小限の使用で、経済的に実施可能な方法を可能にする。このような分離技術は、膜吸着材を用いる生体分子の精製を含む多様な分野での用途を見出す。
【０１５２】
擬似の移動床システムは、直列に接続された吸着材を含む多くの個々のカラムからなる。溶離液は第一の方向でカラムを通過する。システムにおける原料及び溶離液の注入点、および分離成分の収集点は、周期的に一連のバルブを用いてシフトされる。全体的な趣旨は、固体吸着材の移動床を含む単一のカラムの動作をシミュレートすることである。したがって、擬似の移動床システムは、従来の固定床システムのように、溶離液が通過する固体吸着材の固定床を含むカラムで構成されるが、擬似の移動床システムでは、その動作は、連続向流移動床をシミュレートするようなものである。
【０１５３】
実際の移動床システムは、擬似の移動床システムと動作が類似している。しかしながら、供給される混合液や溶離液の注入点がシフトするというよりむしろ、分離された成分の収集点が、一連の吸着ユニット（即ちカラム）の代わりのバルブのシステムにより、供給点及び流出点に対して物理的に移動する。この場合もやはり、動作は、連続向流移動床をシミュレートするようなものである。
【０１５４】
（本発明のポリマー担体）
また、本発明は、ポリマー担体の製造方法であって、それぞれ本明細書で定義される２以上のポリマーナノファイバーを含む本明細書で定義される互いに上下に積層した２以上の不織シートを提供すること、及び本明細書で定義されるように同時にシートのスタックを加熱及び圧縮して隣接したシートのナノファイバーの間の接点を融合することを含む方法を提供する。また、その方法で得られるポリマー担体も提供する。
【０１５５】
方法の第一工程は、２以上の不織シートのスタックを提供することを含む。したがって、本発明は、ポリマー担体の製造方法であって、それぞれ本明細書で定義される２以上のポリマーナノファイバーを含む本明細書で定義される２以上の不織シートのスタックを提供すること、及び本明細書で定義されるように同時にシートのスタックを加熱及び圧縮して隣接したシートのナノファイバーの間の接点を融合することを含む方法も提供する。また、その方法で得られるポリマー担体も提供する。
【０１５６】
また、当該方法は、本明細書で定義される湿潤及び本明細書で定義される２以上の不織シートのスタックの圧縮、その後のそれに続く本明細書で定義される加熱も含み得る。代表的な湿潤、圧縮及び加熱の条件は上記定義の通りである。したがって、この実施形態では、本発明は、ポリマー担体の製造方法であって、
（Ｉ）それぞれ本明細書で定義される１以上のポリマーナノファイバーを含む互いに上下に積層した本明細書で定義される２以上の不織シートを提供すること、
（ＩＩ）本明細書で定義される任意に水性の有機溶媒でシートのスタックを湿潤させること、
（ＩＩＩ）本明細書で定義されるシートのスタックを圧縮すること、及び
（ＩＶ）本明細書で定義されるように圧縮されたスタックを加熱して隣接したシートのナノファイバーの間の接点を融合することを含む方法を提供する。
【０１５７】
本発明のポリマー担体及びそのポリマー担体の製造方法の好ましい特徴は、本発明のクロマトグラフィー担体及びクロマトグラフィー担体の製造に用いられる方法についての上記定義の通りである。
【０１５８】
以下の実施例は本発明を説明する。
【０１５９】
（材料及び器具）
特に明記しない限り、以下の材料、器具及び技術を用いた。
【０１６０】
ＢＳＡプロテインウシアルブミン血清フラクションＶ（＞９６％、〜６６ｋＤａの分子量を伴う）及び全ての他の化学薬品は、特に明記しない限り、利用可能な最高純度のものをシグマ−アルドリッチ社（シグマ−アルドリッチカンパニーリミテッド、英国ドーセット）から購入し、さらに精製することなく用いた。
【０１６１】
ウマの心臓由来のシトクロムｃ（≧９０％、〜１２ｋＤＡの分子量を伴う）を、メルクケミカル（メルクセローノ社、英国ミドルセックス）から購入した。
【０１６２】
（製造例１）
ナノファイバー膜の製造
２９，０００ｇ／ｍｏｌの相対分子質量を有するセルロースアセテートの０．２０ｇ／ｍＬ溶液を、アセトン／ジメチルホルムアミド／エタノール（２：２：１）に溶解した。エレクトロスピニングを、周囲条件の温度及び湿度の制御を可能にするためにＣｌｉｍａｔｅ  Ｚｏｎｅ環境制御キャビネット（ａ１−ｓａｆｅｔｅｃｈ、英国ルートン）内で行った。「Ｏ．  Ｈａｒｄｉｃｋ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｍａｔｅｒ．  Ｓｃｉ．  ４６  （２０１１）  ３８９０」の最適化条件が、低分布の繊維直径、２０ミクロンの平均の厚さ及び１０ｇ／ｍ２の平均面密度を有する電界紡糸セルロースアセテートナノファイバーの不織シートの製造に用いられた。
【０１６３】
一度エレクトロスピンした後、１００ｃｍ２の外面の表面積を有するナノファイバーの１５の不織シートを互いに上下に積層し、手動油圧プレス内で１ＭＰａの圧力にて２分間圧縮した。圧縮後、材料のシートを、すぐに予熱したオーブン内の金属シート間に２１３℃にて５分間入れた。金属シート間の圧力は２０ｋＰａとした。次いで圧縮及び加熱した材料を複数の直径２５ｍｍのディスクに切断した。
【０１６４】
（実施例１）
対流による化学修飾
セルロースアセテートナノファイバーディスクを、上記のようにして製造し、陰イオン交換表面の官能性を得るために化学的に修飾した。０．１８８ｍｍの厚さ及び総体積０．１ｍＬを有するディスクを、下記のようにして修飾した。
【０１６５】
ナノファイバーディスクを誘導体化の前にフィルターホルダーに詰めた。脱アセチルを、３０ｍＬの脱イオン水：エタノール（２：１）中の０．１Ｍ  ＮａＯＨを用いて、ダイオネックスのＰ６８０ＨＰＬＣポンプを使用して２５ｍＬ／分の速度で２４時間循環させてディスクを介して送り出して行った。次いで、ディスクを２５ｍＬ／分の速度にて３００ｍＬの脱イオンＨ２Ｏで洗浄した。次いで、４０ｍＬ／分で１０分間ディスクを介して２０ｍＬの温（４０℃）１５％２−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジエチルエチルアミン塩酸塩９９％（ＤＥＡＣＨ）水溶液を循環させることにより陰イオン交換表面の官能性を付与した。次いで、ディスクをフィルターホルダーハウジングから取り出し、３０秒間放置して絞らずに乾燥し、その後、シェーカーテーブル上の５０ｍＬサンプル管内の２０ｍＬの熱（８０℃）０．５Ｍ  ＮａＯＨに入れ、１０分間穏やかに攪拌した。最後にディスクを大量の脱イオンＨ２Ｏで洗浄し、使用前に放置して乾燥した。
【０１６６】
（実施例２）
使用するセルロースアセテートナノファイバーディスクが０．３７６ｍｍの厚さ及び総体積０．２ｍＬを有することを除いて、上記実施例１に記載されたようにして実験を行った。
【０１６７】
（実施例３）
拡散による化学修飾
セルロースアセテートナノファイバーディスクを上記のようにして製造した。０．１８８ｍｍの厚さ及び総体積０．１ｍＬを有するディスクを、下記のようにして修飾した。
【０１６８】
ディスクを、実験室シェーカーテーブル上で３０ｍＬの脱イオン水：エタノール（２：１）中の０．１Ｍ  ＮａＯＨを含む５０ｍＬサンプル管内に２４時間入れ、セルロースアセテートを脱アセチル化し、再生セルロースを形成した。次いで、ディスクを、それぞれシェーカーテーブル上の１０×３０ｍＬの体積の脱イオン水内で５分間十分に洗浄した。次いで、洗浄したディスクを２０ｍＬの温（４０℃）１５％２−クロロ−Ｎ，Ｎジエチルエチルアミン塩酸塩９９％（ＤＥＡＣＨ）水溶液を伴うサンプル管に１０分間入れることにより、陰イオン交換表面の官能性を導入した。吸着材を除去し、３０秒間絞らずに乾燥させ、その後、シェーカーテーブル上の新しいサンプル管内の２０ｍＬの熱（８０℃）０．５Ｍ  ＮａＯＨに１０分間入れた。最後にディスクを大量の脱イオンＨ２Ｏで洗浄し、使用前に放置して乾燥した。
【０１６９】
（実施例４）
使用するセルロースアセテートナノファイバーディスクが０．３７６ｍｍの厚さ及び総体積０．２ｍＬを有することを除いて、上記実施例１に記載されたようにして実験を行った。
【０１７０】
（実施例５）
バイオセパレーションパフォーマンスの分析
実施例１ないし４に従って製造及び修飾されたナノファイバーディスクを分析し、２つの異なる方法により誘導化された等価質量及び体積のナノファイバー膜のタンパク質結合パフォーマンスを比較した。これは、これらのナノファイバー系により示される表面域の修飾の程度を測定することであった。
【０１７１】
実験を、ＵＶ吸光度（２８０ｎｍ）、ｐＨ及び伝導性のオンライン計測を伴ってＡＫＴＡ  Ｂａｓｉｃ（ＧＥヘルスケアライフサイエンス、英国バッキンガムシャー）を用いて行った。
【０１７２】
実施例１ないし４に従って製造及び修飾されたナノファイバーディスクを、４８０ｃｍ／ｈの速度で５ｍＬの２０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ５．３）の洗浄バッファーで平衡化し、次いで、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ及び０．２５ｍｇ／ｍＬシトクロムＣを含む１ｍＬの２成分タンパク質溶液で満たした。次いで、５ｍＬ洗浄バッファーを、吸着材を通過させて、その後、５ｍＬの０．４Ｍ  ＮａＣｌ  ２０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ５．３）の溶出バッファーを導入した。次いで、溶出量は、Ｕｎｉｃｏｒｎ  ５．０ソフトウエアを用いて分析され、ピーク面積の積分により測定される。
【０１７３】
ＢＳＡ及びシトクロムＣの混合物を、それらの異なる等電点の利点、および、それによる、イオン交換クロマトグラフィーでの分離の適合性を得るために用いた。２５℃の水中において、シトクロムＣは１０．０のｐＩを有し、その一方で、ＢＳＡは４．７のｐＩを有する。これは、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓバッファー液（ｐＨ５．３）において、シトクロムＣは、正味の正電荷を持つこととなり、ＤＥＡＥ吸着材の弱い陰イオン交換表面には結合しないということを意味する。対照的に、ＢＳＡのｐＩより高い当該ｐＨでは、ＢＳＡは、正味の負の表面電荷を有し、それにより、ＤＥＡＥ吸着材に結合し得る。塩濃度が溶出時に増加する場合、ＢＳＡの負の表面電荷と陰イオン交換体の間の相互作用は、塩イオンにより打ち負かされ、そして、ＢＳＡが吸着材から除去され、回収される。
【０１７４】
吸着材のパフォーマンスを、多くの動作サイクルにわたって分析し、吸着材の寿命に関して再現性を決定した。以下の表は、試験したディスクについての平均結合能を示す。
【０１７５】
【表１】
0006500027.tif 000002
【０１７６】
ナノファイバーディスクの両方の厚さについて、対流修飾法は、拡散修飾法に比べてより高い結合能を与えた。この効果は、より厚いディスクでより顕著であった。
【０１７７】
また、ポリマー系の官能表面に到達する化学試薬の能力が、ナノファイバー膜の厚さに依存するということが観察された。したがって、試験されたより厚いナノファイバー膜に関して、対流により誘導体化されたＤＥＡＥナノファイバー吸着材について観察された有意に改善した結合能があった。これは、研究されたプロトコルについて、拡散が、全ての結合表面域に到達する化学試薬に対して不十分であることを示唆している。
【０１７８】
（実施例６）
反復拡散化学修飾
セルロースナノファイバーディスクの陰イオン交換表面の誘導体化を、上記の実施例４に記載されたようにして行った。即ち、０．３７６ｍｍの厚さ及び総体積０．２ｍＬを有するセルロースアセテートナノファイバーディスクを使用した。次いで、化学修飾については、ＤＥＡＣＨ導入点からプロトコルの最後までを繰り返した。
【０１７９】
したがって、実施例４で得られたディスクを、２０ｍＬの温（４０℃）１５％２−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジエチルエチルアミン塩酸塩９９％（ＤＥＡＣＨ）水溶液と共に１０分間サンプル管に入れた。吸着材を除去し、３０秒間絞らずに干し、その後、シェーカーテーブル上の新しいサンプル管内の２０ｍＬの熱（８０℃）０．５Ｍ  ＮａＯＨに１０分間入れ、次いで、大量の脱イオンＨ２Ｏで洗浄した。
【０１８０】
（実施例７）
化学修飾をさらなる時間繰り返したことを除いて、実施例６のようにして実験を行った。
【０１８１】
したがって、実施例６で得られたディスクを、２０ｍＬの温（４０℃）１５％２−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジエチルエチルアミン塩酸塩９９％（ＤＥＡＣＨ）水溶液と共に１０分間サンプル管に入れた。吸着材を除去し、３０秒間絞らずに干し、その後、シェーカーテーブル上の新しいサンプル管内の２０ｍＬの熱（８０℃）０．５Ｍ  ＮａＯＨに１０分間入れ、次いで、大量の脱イオンＨ２Ｏで洗浄した。
【０１８２】
（実施例８）
化学修飾をさらなる時間繰り返したことを除いて、実施例７のようにして実験を行った。
【０１８３】
したがって、実施例７で得られたディスクを、２０ｍＬの温（４０℃）１５％２−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジエチルエチルアミン塩酸塩９９％（ＤＥＡＣＨ）水溶液と共に１０分間サンプル管に入れた。吸着材を除去し、３０秒間絞らずに干し、その後、シェーカーテーブル上の新しいサンプル管内の２０ｍＬの熱（８０℃）０．５Ｍ  ＮａＯＨに１０分間入れ、次いで、大量の脱イオンＨ２Ｏで洗浄した。
【０１８４】
（実施例９）
実施例４及び６ないし８で製造されたディスクを、上記の実施例５に示されたプロトコルを用いて結合能について分析した。また、各ディスクの圧力損失を測定した。
【０１８５】
以下の表は、試験したディスクの平均結合能及び圧力損失を示す。
【０１８６】
【表２】
0006500027.tif 000003
【０１８７】
これらの結果は、誘導体化プロトコル工程の繰り返しでの官能基置換の明らかな改善を示す。結合能において全体的に２７０％の改善が、誘導化中の反復プロトコル工程を用いて試験した吸着材について観察された。圧力損失は、修飾の繰り返しによっては影響されなかった。
【０１８８】
反復誘導体化ＤＥＡＥナノファイバー吸着材の構造的安定性は、影響を受けないようであった。これは、５０サイクルの典型的な動作にわたって一定のパフォーマンスを示した再現性研究によって確認された。
【０１８９】
図１は、２成分混合物のローディング及び第二ピークとしてのＢＳＡの溶出の間の第一ピークとしてのシトクロムＣ＋非結合ＢＳＡの流れを示す。５０当量の結合ランの平均結果については、±１の標準偏差のサンプル集合でプロットする（同じ色の主曲線の周りの破曲線により示される）。これらの結果は、５０当量の結合ランに対する再現性を示し、選択される条件について、ナノファイバー吸着材は、再現性良く行われ、９９％のロードされたＢＳＡを捕捉し、溶出した。標準偏差が、計算され、ナノファイバー吸着材が一貫して動作することを示した。
【０１９０】
図２は、２成分混合物のローディング及び第二ピークとしてのＢＳＡの溶出の間の第一ピークとしてのシトクロムＣ＋非結合ＢＳＡの流れを示す。多結合ランを行い、ランについてプロットされた曲線は、別々の５００ランを記録した。２つのランについて記録された曲線は、ほぼ完全に重さなる。また、これは、本発明に従って製造された膜と共に得られる優れた再現性を証明する。これは、先行技術の膜で報告された複数のランの後のパフォーマンスの大幅な落ち込みとは対照的である。
【０１９１】
（製造例２）
２９，０００ｇ／ｍｏｌの相対的な分子質量を有するセルロースアセテートの０．２０ｇ／ｍＬ溶液を、一般的な溶媒（例えば、アセトン／ジメチルホルムアミド／エタノール）に溶解した。「Ｏ．  Ｈａｒｄｉｃｋ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｍａｔｅｒ．  Ｓｃｉ．  ４６  （２０１１）  ３８９０」の最適条件が、低分布の繊維直径、２０ミクロンの平均の厚さ及び２０ｇ／ｍ２の平均面密度を有する電界紡糸セルロースアセテートナノファイバーの不織シートの製造に用いられた。
【０１９２】
一度エレクトロスピンした後、１００ｃｍ２の外面の表面積を有するナノファイバーの１０の不織シートを互いに上下に積層し、予め加熱されたオーブン内の金属シート間に２０８℃にて３０分間入れた。金属シート間の圧力は２０ｋＰａとした。次いで、圧縮及び加熱した材料を、複数の直径２５ｍｍのディスクに切断した。
【０１９３】
（分析例１−加熱及び圧縮の効果）
セルロースアセテートナノファイバーの１０のシートを、製造例２に記載されたようにして得た。シートを互いに上下に積層して、同時に２０７℃に加熱しながら加熱プレス内で２０ｋＰａの圧力に付した。積層したシートを５分間プレス内で圧縮及び加熱した。圧縮及び加熱の後、得られた膜のディスクをカットした。実施例３で説明した方法を用いてセルロースアセテート繊維をセルロースに脱アセチルした。このように製造されたサンプルは、加熱が加熱プレス内で行われたという事実を反映して「プレス」サンプルとして以下に言及される。
【０１９４】
「プレス」ディスクを、所定の位置にＯリングを保持するための容器としての５０ｍｌシリンジ内のゴム製Ｏリングに置いた。１０ｍｌピペットチップの形態での重量（質量５．８１ｇ）を、ナノファイバーディスクの中心に置いた。１Ｍ  ＮａＯＨの溶液を容器に加え、タイマーを用いて破壊点を決定した。破壊点は、ピペットチップがディスクを介して落下する時点として測定された。ピペットチップがディスクを介して落下するのにかかる時間の長さは、ディスクの化学的抵抗性を示す。当該実験は、三回繰り返した。
【０１９５】
当該実験の手順は図３で示される。
【０１９６】
さらに、初めに１０のナノファイバーシートを、２０ｋＰａの圧力で１時間プレス内にて圧縮（加熱せずに）し、続いて５分間２０７℃でオーブン内にて加熱（圧縮せずに）したことを除いて、ナノファイバーディスクを、上記のように製造した。このように製造されたサンプルは、加熱がオーブン内で行われたという事実を反映して「オーブン」サンプルとして以下に言及される。
【０１９７】
「オーブン」ディスクをゴム製Ｏリング内に置き、上記の化学的抵抗性試験に付した。再び、これを三回繰り返した。
【０１９８】
「プレス」及び「オーブン」ディスクの結果を、以下の表に示す。
【０１９９】
【表３】
0006500027.tif 000004
【０２００】
これらの結果からわかるように、同時に圧縮及び加熱されるディスクは、圧縮（加熱することなく）され、次いで加熱（圧縮することなく）されるものに対する優れた化学的抵抗性を有する。
【０２０１】
「オーブン」ディスクは、１Ｍ  ＮａＯＨへの曝露１０分以内に変色及び孔食を示した。「プレス」ディスクは、１２０時間の暴露後でさえも殆ど分解を示さなかった。各ディスクの写真を図４として示す。
【０２０２】
多くの「プレス」及び「オーブン」ディスクの厚さ及び密度を測定した。これらのディスクの厚さ及び平均密度を図５に示す。「プレス」ディスクは、「オーブン」ディスクよりもより薄く且つより密度が高いことがわかった。
【０２０３】
「プレス」及び「オーブン」ディスクの流量特性を、ディスクを介するＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８）の増大する流速（２、５、１０、２０、３０、４０、６０ｍｌ／分）でのデルタカラム圧力損失を測定することにより分析した。得られたデータは、図６として示される。「プレス」及び「オーブン」ディスクが同様の流量特性を有することが分かった。
【０２０４】
（分析例２−変化する圧力の効果）
再生セルロースディスクを、「プレス」ディスクのための分析例1に記載の方法を用いて製造した。当該方法で製造されたディスクを「２０ｋＰａ」ディスクとして以下に言及する。
【０２０５】
さらに、ディスクを、２００ｋＰａの圧力を２０ｋＰａの代わりに用いたことを除いて、「２０ｋＰａ」ディスクのための上記に記載の方法を用いて製造した。当該方法で製造されたディスクは、「２００ｋＰａ」ディスクとして以下に言及される。
【０２０６】
多くの「２０ｋＰａ」及び「２００ｋＰａ」ディスクの厚さ及び密度を測定した。これらのディスクの厚さ及び平均密度を図７に示す。「２００ｋＰａ」ディスクは、「２０ｋＰａ」ディスクよりもより薄く且つより密度が高いことが分かった。
【０２０７】
「２０ｋＰａ」及び「２００ｋＰａ」ディスクの流量特性を、分析例１に記載の方法を用いて分析した。得られたデータを図８として示す。「２００ｋＰａ」ディスクに対する圧力損失は、「２０ｋＰａ」ディスクに対するものよりもより高いということがわかった。
【０２０８】
「２０ｋＰａ」及び「２００ｋＰａ」再生セルロースディスクを、実施例３の方法を用いてＤＥＡＥで官能化した。これらのディスクの動的結合能（ＤＢＣ）を、実施例５で示されたものと同様のプロトコルを用いて測定した。動的結合能（ＤＢＣ）は、１Ｍ  ＮａＣｌ溶出工程で、異なる質量のＢＳＡ（１ｍｇ、２ｍｇ、４ｍｇ）を用い、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８）を用いて３０ｍｌ／分の流量で測定された。ＤＢＣ分析の結果を図９に示す。「２０ｋＰａ」ディスクのＤＢＣは、「２００ｋＰａ」ディスクのものよりも高い。
【０２０９】
（実施例１０）
ナノファイバーディスクは、製造例２の方法に従って製造された。ディスクを脱アセチル化し、室温でＤＥＡＣＨに浸漬し、次いで室温の０．５Ｍ  ＮａＯＨで洗浄した。ＤＥＡＣＨでの浸漬及び０．５Ｍ  ＮａＯＨでの洗浄を、５回以下繰り返した。官能化のサイクルの数としては、以下に言及される。したがって、ディスクを、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル及び５サイクルを用いて官能化した。
【０２１０】
１、２、３、４及び５サイクルのディスクの流量特性を、増加する流速（２、５、１０、２０、３０、４０、６０、８０ｍｌ／分）を用い、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８）を用いる分析例１に記載の方法を使用して分析した。得られたデータを図１０として示す。圧力損失は、サイクル数と共に増加することが分かった。
【０２１１】
１、２、３、４及び５サイクルのディスクの動的結合能（ＤＢＣ）を、分析例２に示される方法を用いて分析した。ＤＢＣ分析の結果を図１１に示す。ＤＢＣは、１から４サイクルで増加し、５サイクル目で減少する。
【０２１２】
（実施例１１−ＳＰ官能性ディスクの製造）
再生セルロースディスクを、製造例２及び実施例１の方法を用いて製造した。
【０２１３】
１０ｍｌのＤＭＳＯ及び５ｍＬの１Ｍ  ＮａＯＨの溶液に、２ｍＬアリルグリシジルエーテルを加え、続いて、１０の再生セルロースファイバーディスクを加えた。３０ｍＬのＨ２Ｏ中の二亜硫酸ナトリウム（３ｇ）の溶液を、ＮａＯＨ（１Ｍ）を添加してｐＨ６．５に調整した。次いで、上記の第一工程で得られたディスクを、当該混合物で処理した。次いで、ディスクを、０．１Ｍ  ＨＣｌで洗浄し、続いて水で洗浄した。
【０２１４】
動的結合能を測定するために、ＳＰ官能性ディスクを、上記の実施例５で説明したのと同様の方法を用いて分析した。ＡＫＴＡ精製システム（ＧＥヘルスケア）を、１０ｍＭ酢酸Ｎａの５ｐＨバッファーを用いて平衡化した。１ｍｇ／ｍｌリゾチームのサンプルを３０ｍＬ／分でシステムに充填した。１ＭのＮａＣｌの溶液（１０ｍＭ酢酸Ｎａの５ｐＨバッファー）を溶出のために使用した。オンラインＵＶトレース（２８０ｎｍ）により、図１２に示されるクロマトグラムを作製した。
【０２１５】
（実施例１２−ＣＭ官能性ディスクの製造）
再生セルロースディスクを、製造例２及び実施例１の方法を用いて製造した。
【０２１６】
これらを、ＮａＢｒ（２４．３ｍｍｏｌ）及びＴＥＭＰＯ（１．６０ｍｍｏｌ）の水溶液に加え、ＮａＯＨを用いてｐＨ１０に調整した。これに、ｐＨにさらなる変化がなくなるまでＮａＯＣｌ（５．０ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、ディスクをＥｔＯＨで洗浄した。
【０２１７】
ディスクの動的結合能を測定するために、ＡＫＴＡシステムを、３０ｍｌ／分の流速で運転し、使用するサンプルは、１ｍｇ／ｍｌの濃度のリゾチームであり、１ｍｌ充填注入する。１０ｍＭ酢酸ナトリウムの５ｐＨバッファーを用いて平衡化し、システムを洗浄した。１Ｍ  ＮａＣｌの溶液（１０ｍＭ酢酸ナトリウムのｐＨ５バッファー）を溶出のために用いる。オンラインＵＶトレース（２８０ｎｍ）により、図１３で示されるクロマトグラムを作製した。
【０２１８】
（実施例１３−Ｑ官能性ディスクの製造）
再生セルロースディスクを、製造例２及び実施例１の方法を用いて製造した。
【０２１９】
これらを、２：１：０．１のＤＭＳＯ：１Ｍ  ＮａＯＨ：グリシジルトリメチルアンモニウムの溶液に加えた。次いで、ディスクを、０．１Ｍ  ＨＣｌ及び水で洗浄した。
【０２２０】
動的結合能を測定するために、ＡＫＴＡ精製システム（ＧＥヘルスケア）を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌのｐＨ８バッファーを用いて平衡化した。１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡのサンプルを、２０ｍＬ／分でシステムに充填した。１Ｍ  ＮａＣｌの溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌのｐＨ８バッファー）を、溶出のために使用する。オンラインＵＶトレース（２８０ｎｍ）により、図１４で示されるクロマトグラムを作製した。
【０２２１】
（実施例１４−プロテイン官能性ディスク）
再生セルロースディスクを、製造例２及び実施例１の方法を用いて製造した。
【０２２２】
これらを、６．５ｇＮａＩＯ４を含む８０ｍＬ酢酸ナトリウムのバッファー溶液（ｐＨ５．５）に加えた。次いで、ディスクを、５０ｍＬエチレングリコールで洗浄し、続いて水で洗浄した。次いで、ディスクを、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１００ｍＭ炭酸塩／重炭酸塩ｐＨ９．０で洗浄した。プロテインＡリガンドを、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１００ｍＭ炭酸塩／重炭酸塩ｐＨ９．０で透析し、次いでディスクに加えた。次いで、溶液をデカントし、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１００ｍＭ炭酸塩／重炭酸塩ｐＨ９．０を加えた。これに、１００ｍＭ水素化ホウ素ナトリウム溶液を加え、４ｍＭの最終ボロヒドリド濃度を得た。次いで、この溶液をデカントし、５０ｍＭリン酸塩１５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ６．７バッファー中の２０％エタノールを加えた。上記洗浄工程を９回繰り返した。
【０２２３】
動的結合能を測定するために、ＡＫＴＡシステムを３０ｍｌ／分の流速で運転し、使用するサンプルは、１ｍｇ／ｍｌの濃度のプロテインＡ精製ＩｇＧであり、１ｍｌ充填注入した。ＰＢＳのｐＨ７．４バッファーを用いて、平衡化し、システムを洗浄した。０．１Ｍクエン酸ナトリウムのｐＨ３．０バッファー溶液を、溶出のために使用する。オンラインＵＶトレース（２８０ｎｍ）により、図１５で示されるクロマトグラムを作製した。
【０２２４】
（実施例１５−フェニル官能性ディスク）
再生セルロースディスクを、製造例２及び実施例１の方法を用いて製造した。
【０２２５】
これらを、７５ｍＬのＤＭＳＯ：１Ｍ  ＮａＯＨの２：１混合物の溶液に加えた。次いで、スチレンオキシド（７．５ｍＬ）を、室温で４時間攪拌した反応混合物に加えた。次いで、ディスクをメタノールで洗浄し、次いで水で洗浄した。
【０２２６】
動的結合能を測定するために、ＡＫＴＡシステムを、１０ｍｌ／分の流速で運転し、使用したサンプルは、０．１ｍｇ／ｍｌリゾチーム（１．５Ｍ硫酸アンモニウムを有するもの）であり、１ｍｌ充填注入した。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８を有する１．５Ｍ硫酸アンモニウムを用いて平衡化し、システムを洗浄した。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８を溶出のために使用する。オンラインＵＶトレース（２８０ｎｍ）により、図１６で示されるクロマトグラムを作製した。
【０２２７】
（分析例３−圧縮及び加熱の前の積層効果）
分析例１において前述のとおり、本発明に従って製造された再生セルロースディスク（「プレス」ディスク）は、化学的抵抗性試験において＞１２０時間耐久した（図３で示される）。「プレス」ディスクは、１２０時間ＮａＯＨに曝した後でさえほとんど分解を示さなかった（図４で示されるように）。
【０２２８】
セルロースアセテートナノファイバーの単一のシートを、製造例２の記載のようにして得た。Ｍａ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５（２００５）１１５−１２３に記載の方法に従って、単一の層シートを、２つの平面ＰＴＦＥシートに挟み込み、オーブン内に２０８℃で１時間入れた。得られたシートを、実施例３で説明した方法を用いて脱アセチル化した。１０のディスクを、得られたセルロースシートから切り出し、Ｍａ，  ｅｔ  ａｌに記載されたようにして一緒にして積層した。このように製造されたサンプルを、「Ｍａ，  ｅｔ  ａｌ」サンプルとして以下に言及する。当該方法を８回繰り返し、８・１０ディスクスタックを作製した。
【０２２９】
「Ｍａ，  ｅｔ  ａｌ」の１０のディスクスタックを、ゴム製のＯリングに入れ、上記の分析例１に記載の化学的抵抗性試験に付した。これを３回繰り返した。試験した３つの「Ｍａ，  ｅｔ  ａｌ」ディスクは、それぞれ１０分後、１０分後及び２分後に不合格となった。
【０２３０】
これらの結果からわかるように、まず積層し、次いで同時に圧縮及び加熱されるナノファイバーの複数の不織シートから形成されるディスクは、個々のナノファイバーシートを加熱し、そして、それに続いて積層して形成したものに比べて優れた化学的抵抗性を有する。
【０２３１】
「Ｍａ，  ｅｔ  ａｌ」ディスクは、図１７に示されるように、１Ｍ  ＮａＯＨに曝露して１０分以内に変色及び孔食を示した。「加熱プレス」ディスクは、曝露の１２０時間後でさえ、ほとんど分解を示さなかった（図４）。
【０２３２】
多くの「加熱プレス」ディスク及び「Ｍａ，  ｅｔ  ａｌ」ディスクの厚さ及び密度を測定した。これらのディスクの厚さ及び平均密度を、図１８に示す。「加熱プレス」ディスクは「Ｍａ，  ｅｔ  ａｌ」ディスクよりもより薄く且つより密度が高いことがわかった。
【０２３３】
「加熱プレス」及び「Ｍａ，  ｅｔ  ａｌ」ディスクの流量特性を、ディスクを介してＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８）の増加する流速で、デルタカラム圧力損失を測定することにより分析した。得られたデータを図１９に示す。「加熱プレス」ディスク及び「Ｍａ，  ｅｔ  ａｌ」ディスクは、同様の流量特性を有することがわかった。
【０２３４】
「加熱プレス」ディスク及び「Ｍａ  ｅｔ  ａｌ」ディスクを、実施例３に記載の方法を用いてＤＥＡＥリガンドで官能化した。これらのディスクの動的結合能を、実施例５に示されるものと同様のプロトコルを用いて測定した。動的結合能（ＤＢＣ）を、１Ｍ  ＮａＣｌ溶出工程で、異なる質量のＢＳＡ（１ｍｇ、２ｍｇ、４ｍｇ）を用い、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８）を用いて３０ｍｌ／分の流量で測定した。ＤＢＣ分析の結果を図２０に示す。「加熱プレス」ディスクのＤＢＣは、「Ｍａ，  ｅｔ  ａｌ」ディスクのものよりもより高い。
【０２３５】
「加熱プレス」ディスク及び「Ｍａ，  ｅｔ  ａｌ」ディスクの反復官能化を行うことの可能性を決定した。実施例１０に記載のディスクの反復ＤＥＡＥ官能化の方法を、「加熱プレス」及び「Ｍａ，  ｅｔ  ａｌ」の再生セルロースディスクの両方で行った。「Ｍａ，  ｅｔ  ａｌ」材料の乏しい化学安定性は、複数の官能化サイクルを用いることによりＤＢＣを増加させることができなかったことを意味する。「Ｍａ，  ｅｔ  ａｌ」材料について可能であることがわかった最大ＤＢＣは、およそ７ｍｇ／ｍｌであった（図２０に示されるように）。複数の官能化サイクルを用いることにより、「加熱プレス」材料のＤＢＣをおよそ１６ｍｇ／ｍｌに増加させることが可能であった（図１１を参照）。「Ｍａ，  ｅｔ  ａｌ」材料は、複数のＤＥＡＥサイクルの後に有意に分解した。この問題は、「加熱プレス」材料では観察されなかった。複数の官能化サイクルの後の「Ｍａ，  ｅｔ  ａｌ」及び「加熱プレス」材料の写真を、図２１に示す。図２１において、「Ｍａ，  ｅｔ  ａｌ」材料を下写真として示し、「加熱プレス」材料は上写真として示す。
【０２３６】
本発明のいくつかの好ましい実施形態を以下に示す。
【０２３７】
［１］  官能性セルロースクロマトグラフィー担体の製造方法であって、（ｉ）それぞれ１以上のセルロースアセテートナノファイバーを含む１以上の不織シートを提供すること、（ｉｉ）１以上の不織シートを圧縮すること、（ｉｉｉ）１以上の不織シートを加熱し、１以上のセルロースアセテートナノファイバーのセクション間の接点を融合すること、（ｉｖ）圧縮及び加熱された生成物を処理して、セルロースアセテートをセルロースに変換すること、及び（ｖ）こうして得られた生成物をバッチ方式で２ないし４回試薬に接触させて、クロマトグラフィー担体として工程（ｉｖ）の生成物を官能化することを含む方法。
【０２３８】
［２］  それぞれの試薬との接触工程が、（ａ）試薬との接触、（ｂ）工程（ａ）の生成物の試薬からの単離、（ｃ）工程（ｂ）の生成物のアルカリ水での任意の処理、及び（ｄ）工程（ｂ）／（ｃ）の生成物の水での任意の洗浄を含む［１］に従う方法。
【０２３９】
［３］  工程（ｖ）が、
−（１）（ａ１）工程（ｉｖ）の生成物の試薬との接触、（ｂ１）工程（ａ１）の生成物の試薬からの単離、（ｃ１）工程（ｂ１）の生成物のアルカリ水での任意の処理、及び（ｄ１）工程（ｂ１）／（ｃ１）の生成物の水での任意の洗浄、及び
（２）（ａ２）工程（ｂ１）／（ｃ１）／（ｄ１）の生成物の試薬との接触、（ｂ２）工程（ａ２）の生成物の試薬からの単離、（ｃ２）工程（ｂ２）の生成物のアルカリ水での任意の処理、及び（ｄ２）工程（ｂ２）／（ｃ２）の生成物の水での任意の洗浄；或いは
−（１）（ａ１）工程（ｉｖ）の生成物の試薬との接触、（ｂ１）工程（ａ１）の生成物の試薬からの単離、（ｃ１）工程（ｂ１）の生成物のアルカリ水での任意の処理、及び（ｄ１）工程（ｂ１）／（ｃ１）の生成物の水での任意の洗浄、
（２）（ａ２）工程（ｂ１）／（ｃ１）／（ｄ１）の生成物の試薬との接触、（ｂ２）工程（ａ２）の生成物の試薬からの単離、（ｃ２）工程（ｂ２）の生成物のアルカリ水での任意の処理、及び（ｄ２）工程（ｂ２）／（ｃ２）の生成物の水での任意の洗浄、及び
（３）（ａ３）工程（ｂ２）／（ｃ２）／（ｄ２）の生成物の試薬との接触、（ｂ３）工程（ａ３）の生成物の試薬からの単離、（ｃ３）工程（ｂ３）の生成物のアルカリ水での任意の処理、及び（ｄ３）工程（ｂ３）／（ｃ３）の生成物の水での任意の洗浄；或いは
−（１）（ａ１）工程（ｉｖ）の生成物の試薬との接触、（ｂ１）工程（ａ１）の生成物の試薬からの単離、（ｃ１）工程（ｂ１）の生成物のアルカリ水での任意の処理、及び（ｄ１）工程（ｂ１）／（ｃ１）の生成物の水での任意の洗浄、
（２）（ａ２）工程（ｂ１）／（ｃ１）／（ｄ１）の生成物の試薬との接触、（ｂ２）工程（ａ２）の生成物の試薬からの単離、（ｃ２）工程（ｂ２）の生成物のアルカリ水での任意の処理、及び（ｄ２）工程（ｂ２）／（ｃ２）の生成物の水での任意の洗浄、
（３）（ａ３）工程（ｂ２）／（ｃ２）／（ｄ２）の生成物の試薬との接触、（ｂ３）工程（ａ３）の生成物の試薬からの単離、（ｃ３）工程（ｂ３）の生成物のアルカリ水での任意の処理、及び（ｄ３）工程（ｂ３）／（ｃ３）の生成物の水での任意の洗浄、及び
（４）（ａ４）工程（ｂ３）／（ｃ３）／（ｄ３）の生成物の試薬との接触、（ｂ４）工程（ａ４）の生成物の試薬からの単離、（ｃ４）工程（ｂ４）の生成物のアルカリ水での任意の処理、及び（ｄ４）工程（ｂ４）／（ｃ４）の生成物の水での任意の洗浄
を含む［１］又は［２］に従う方法。
【０２４０】
［４］試薬との各接触工程が、１ないし２０分間の期間である前記実施形態の何れか１つに従う方法。
【０２４１】
［５］官能性セルロースクロマトグラフィー担体の製造方法であって、（ｉ）それぞれ１以上のセルロースアセテートナノファイバーを含む１以上の不織シートを提供すること、（ｉｉ）１以上の不織シートを圧縮すること、（ｉｉｉ）１以上の不織シートを加熱し、１以上のセルロースアセテートナノファイバーのセクション間の接点を融合すること、（ｉｖ）圧縮及び加熱された生成物を処理して、セルロースアセテートをセルロースに変換すること、（ｖ）こうして得られた生成物をホルダー内に入れること、及び（ｖｉ）試薬が工程（ｉｖ）で得られた生成物と接触して流れるように、試薬をホルダーを介して流し、クロマトグラフィー担体として工程（ｉｖ）の生成物を官能化することを含む方法。
【０２４２】
［６］工程（ｖｉ）が、
−試薬を、圧力下でホルダーを介して流すこと；及び／又は
−試薬を、ポンプを用いてホルダーを介して流すこと；及び／又は
−試薬を、循環する様態でホルダーを介して流すこと；及び／又は
−試薬を、１ないし２０分間の期間でホルダーを介して流すこと
を含む［５］に従う方法。
【０２４３】
［７］工程（ｖｉ）の生成物のアルカリ水での処理工程、及びこうして得られた生成物の水での任意の洗浄工程をさらに含む［６］又は［７］に従う方法。
【０２４４】
［８］官能性セルロースクロマトグラフィー担体が、イオン交換、親和性捕捉又は疎水性相互作用法から選ばれるクロマトグラフィー法で用いるのに適している前記実施形態の何れか１つに従う方法。
【０２４５】
［９］
−クロマトグラフィー法が陽イオン交換法であり、且つクロマトグラフィー担体が１以上のカルボキシラート、スルホナート又はホスホナート基で官能化されているか；
−クロマトグラフィー法が陰イオン交換法であり、且つクロマトグラフィー担体が１以上の第四級アミノ又はジエチルアミン基、好ましくは１以上のＤＥＡＥ基で官能化されているか；
−クロマトグラフィー法が親和性捕捉クロマトグラフィー法であり、且つクロマトグラフィー担体が１以上のタンパク質、ペプチド、抗体若しくはそのフラグメント、色素、ヒスチジン、又は金属カチオンを含む基で官能化されているか；或いは
−クロマトグラフィー法が疎水性相互作用クロマトグラフィー法であり、且つクロマトグラフィー担体が１以上のプロピル、ブチル、フェニル、又はオクチル基で官能化されている［８］に従う方法。
【０２４６】
［１０］セルロースクロマトグラフィー担体上の１以上のヒドロキシル基が官能化されている前記実施形態の何れか１つに従う方法。
【０２４７】
［１１］１以上のセルロースナノファイバーが１０ｎｍないし１０００ｎｍの平均直径を有する前記実施形態の何れか１つに従う方法。
【０２４８】
［１２］１以上の不織シートの圧縮工程で０．０１ないし５ＭＰａの圧力を用いる前記実施形態の何れか１つに従う方法。
【０２４９】
［１３］１以上の不織シートの加熱工程で２００ないし２２０℃の温度を用いる前記実施形態の何れか１つに従う方法。
【０２５０】
［１４］官能性ポリマークロマトグラフィー担体の製造方法であって、（Ｉ）１以上のポリマーナノファイバーを提供すること、（ＩＩ）１以上のポリマーナノファイバーを圧縮すること、（ＩＩＩ）１以上のポリマーナノファイバーを加熱し、１以上のポリマーナノファイバーのセクション間の接点を融合すること、及び（ＩＶ）圧縮及び加熱された生成物を試薬と接触させ、クロマトグラフィー担体として工程（ＩＩＩ）の生成物を官能化することを含む方法。
【０２５１】
［１５］官能性ポリマークロマトグラフィー担体の製造方法であって、（Ｉ）１以上のポリマーナノファイバーを提供すること、（ＩＩ）１以上のポリマーナノファイバーを圧縮してもよいこと、（ＩＩＩ）１以上のポリマーナノファイバーを加熱し、１以上のポリマーナノファイバーのセクション間の接点を融合してもよいこと、及び（ＩＶ）工程（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の生成物を、バッチ方式において少なくとも二回試薬と接触させ、クロマトグラフィー担体として工程（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の生成物を官能化することを含む方法。
【０２５２】
［１６］官能性ポリマークロマトグラフィー担体の製造方法であって、（Ｉ）１以上のポリマーナノファイバーを提供すること、（ＩＩ）１以上のポリマーナノファイバーを圧縮してもよいこと、（ＩＩＩ）１以上のポリマーナノファイバーを加熱し、１以上のポリマーナノファイバーのセクション間の接点を融合してもよいこと、（ＩＶ）工程（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の生成物をホルダー内に入れること、及び（Ｖ）試薬が工程（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の生成物と接触して流れるようにして、試薬をホルダーを介して流し、クロマトグラフィー担体として工程（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の生成物を官能化することを含む方法。
【０２５３】
［１７］官能性クロマトグラフィー担体が請求項［８］又は［９］で定義されるクロマトグラフィー法で用いるのに適する［１４］ないし［１６］の何れか１つに従う方法。
【０２５４】
［１８］クロマトグラフィー担体上の１以上のヒドロキシル、アミノ又はカルボン酸基を官能化する［１４］ないし［１６］の何れか１つに従う方法。
【０２５５】
［１９］ポリマーが、セルロース、セルロースアセテート、ポリスルホン、ポリアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、ポリエチレンオキシド、及びそれらの混合物から選ばれる［１４］ないし［１６］の何れか１つに従う方法。
【０２５６】
［２０］前記実施形態の何れか１つに従う方法により得られる官能性クロマトグラフィー担体。
【０２５７】
［２１］クロマトグラフィーカートリッジの製造方法であって、［１］ないし［１９］の何れか１つの方法を行うこと、及びこうして得られた生成物をカートリッジに組み込むことを含む方法。
【０２５８】
［２２］（ａ）［２１］の方法により得られるか、又は（ｂ）［２０］に従う１以上の官能性クロマトグラフィー担体を含む、クロマトグラフィーカートリッジ。
【０２５９】
［２３］クロマトグラフィーにおける［２０］に従う官能性クロマトグラフィー担体又は［２２］に従うクロマトグラフィーカートリッジの使用。
【０２６０】
［２４］移動相からの１以上の生体分子の単離方法であって、移動相における１以上の生体分子を、［２０］に従う官能性クロマトグラフィー担体、又は［２２］に従うクロマトグラフィーカートリッジと接触させることを含む方法。
【０２６１】
［２５］イオン交換、親和性捕捉又は疎水性相互作用クロマトグラフィー法である［２４］に従う方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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