(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択された分子又は薬剤を細胞膜を越えて輸送するための細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）であって、
アミノ酸配列：ＲＲＶＱＩＷＦＱＮＫＲＡＫＶＫＲからなる、細胞浸透性ペプチド。
【請求項２】
前記膜が天然に生じるか又は合成されている、請求項１に記載のＣＰＰ。
【請求項３】
前記膜が生体膜である、請求項１又は２に記載のＣＰＰ。
【請求項４】
前記ＣＰＰが、前記膜を越えて選択された分子又は薬剤を輸送することを目的として、選択された分子又は薬剤の少なくとも一つと接合ないしコンジュゲートしている、請求項１から３のいずれか一項に記載のＣＰＰ。
【請求項５】
前記ＣＰＰが、前記分子又は薬剤と共有結合的に又は非共有結合的に接着ないし結合している、請求項４に記載のＣＰＰ。
【請求項６】
前記選択された分子又は薬剤が、小分子、ペプチドを含むタンパク質および超分子粒子、タンパク質、プラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む核酸配列、化学物質、治療薬、抗体、有機染料、蛍光標識、量子ドット又はナノ粒子を含む群から選択される、請求項４又は５に記載のＣＰＰ。
【請求項７】
前記ＣＰＰが、インビボ又はインビトロの組換えによって前記選択された分子又は薬剤に接着している、請求項４又は５に記載のＣＰＰ。
【請求項８】
前記ＣＰＰが、インビトロの組換えによって前記選択された分子又は薬剤に接着している、請求項７に記載のＣＰＰ。
【請求項９】
前記ＣＰＰが、そのアミノ末端又はカルボキシ末端で前記選択された分子又は薬剤にコンジュゲートしている、請求項４から８のいずれか一項に記載のＣＰＰ。
【請求項１０】
前記ＣＰＰが、少なくとも一つのさらなるスペーサーアミノ酸残基の存在により、前記選択された分子又は薬剤から遠位に位置する、請求項４から８のいずれか一項に記載のＣＰＰ。
【請求項１１】
前記ＣＰＰが、前記選択された分子又は薬剤から、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０アミノ酸残基遠位に位置する、請求項１０に記載のＣＰＰ。
【請求項１２】
選択された治療的薬剤に接合又はコンジュゲートした請求項１から１１のいずれか一項に記載のＣＰＰの少なくとも一つを含んでなる、治療薬。
【請求項１３】
前記治療的薬剤が、小分子化学的阻害因子又は活性因子、タンパク質、ペプチドを含む超分子粒子、プラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む核酸配列、化学物質、治療的薬剤又は抗体を含む群から選択される、請求項１２に記載の治療薬。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載の治療薬の少なくとも一つと、少なくとも一つの他の治療的薬剤とを含む、併用治療薬。
【請求項１５】
請求項１２又は１３に記載の治療薬又は請求項１４に記載の併用治療薬を、薬学的に許容可能な担体とともに含む、薬学的組成物。
【請求項１６】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のＣＰＰをコードする核酸分子。
【請求項１７】
請求項１２又は１３に記載の治療薬をコードする核酸分子。
【請求項１８】
請求項１６又は１７に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載のベクターを形質移入又は形質導入した宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のＣＰＰ、又は請求項１２又は１３に記載の治療薬の製造方法であって、前記ＣＰＰ又は前記治療薬をコードする核酸分子を形質移入した宿主細胞を、前記ＣＰＰおよび／又は前記治療薬の転写および翻訳が起こる条件下で培養することと、それらを回収することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞膜、特に、限定するものではないが、生体膜を越えて分子を輸送するための新規のポリペプチド、前記ポリペプチドの少なくとも一つと前記ポリペプチドに接合ないしコンジュゲートした選択された分子ないし薬剤の少なくとも一つとを含む、細胞膜を越えて前記分子ないし薬剤を輸送するためのコンジュゲート、前記ポリペプチドの少なくとも一つの使用を伴う、細胞膜を越えて少なくとも一つの選択された分子ないし薬剤を輸送する方法、前記コンジュゲートの少なくとも一つを含む治療薬、前記コンジュゲートの少なくとも一つとその他の治療薬の少なくとも一つとを含む併用治療薬、前記コンジュゲート又は前記治療薬の少なくとも一つの使用を伴う治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜ないしは原形質膜は生細胞の細胞質を取り囲み、特に細胞内成分を細胞外環境から分離している。細胞膜はイオンおよび有機分子を選択的に通し、細胞の内外への物質の移動を制御している。この膜は、細胞を周囲環境から分離する働きがあり、これによって化学的および物理的環境の変化から保護し、かつ細胞内外への分子の移入／移出の制御を可能としている。主に、リン脂質分子の二層（二重層）からなり、脂質二層を直接通り抜けて、膜の片側から他方側に行くことができるのはわずかな分子のみである。この膜には、必要な分子を細胞の内外へ輸送するためのチャネルおよびポンプとして働くさまざまなタンパク質分子が埋没している。したがって、細胞は選択的透過性があり、細胞に入り細胞から出て行くものを調節することが可能であるので、生存に必要な物質の輸送を促すといわれている。
【０００３】
生物学的に生きている間、これらの膜は多くの治療薬の輸送を困難にすることがある。この治療薬の有効性はその分子が体内の水性環境をめぐりその後細胞膜の疎水性のバリアを通り抜けることができる能力に依存している。
【０００４】
細胞透過ないしは細胞浸透性のペプチド（ＣＰＰ）（タンパク質導入ドメイン又は膜転位配列としても知られている）は、原形質膜の不透過性を克服するために用いられている。典型的には、３０アミノ酸残基以下の長さであるＣＰＰは、細胞の膜を超え、細胞内部へ通過することができるので、分子（一般的には「カーゴ」と称される）を内在化する生システムでは採用されている。現在のところ何百もの異なるＣＰＰ配列が明らかにされており、単独であろうとカーゴと会合していようともすべてが生物学的な膜を破り、細胞へ入る共通の能力を有する。ＣＰＰの機能は典型的には細胞内へカーゴを運ぶことであり、生きている哺乳動物細胞のエンドソームを介して運ばれるカーゴのエンドサイトーシスにより共通して生じるプロセスである。よって、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸および他の薬学的に活性な化合物へのＣＰＰのカップリングは、他の膜不透過性分子の細胞輸送にとって期待できる戦略となる。
【０００５】
ＣＰＰの共通の用途には、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＤＮＡおよびプラスミドなどの核酸ベースの高分子の輸送が含まれる。これらすべては、遺伝子発現の調節において期待できる生物学的および薬理学的治療薬として認識されている。近年、さまざまな方法を用いて、ＣＰＰをビヒクルとして用いて生物学的に活性な全長タンパク質、例えば西洋わさびペルオキシダーゼ、ＲＮアーゼＡおよびＣＰＰ架橋結合Ｆａｂ断片さえも生細胞へ輸送できることが報告された。
【０００６】
大まかに言えば、ＣＰＰは一般に３つのグループに分類されるが、すべて原形質膜の位置を変え、細胞質への又は細胞小器官へのさまざまな分子カーゴの輸送を促すという能力を共通して持つ。
１．高密度の塩基性（＋）荷電のアミノ酸の短い配列、一般に一連のリジン又はアルギニン残基。例として、オクタアルギニン。
２．ウイルスペプチド、そのうち最も研究されているＨＩＶ由来のトランス作動性転写活性化因子（ＴＡＴ）配列。又は、
３．アンテナペディアペプチドおよびその誘導体。１９９０年代に発見された、ショウジョウバエの発生に伴うアンテナペディアタンパク質内の重要な転写因子。
【０００７】
さらに又はあるいは、ＣＰＰは、そのペプチド配列および脂質への結合性質に基づいて、一次両親媒性ＣＰＰ、二次両親媒性ＣＰＰおよび非両親媒性ＣＰＰに分類されうる。
【０００８】
機構的に、ＣＰＰの膜の位置を変える能力は現在研究されている。作用のメカニズムはＣＰＰごとに異なり得、いくつかのＣＰＰは１より多くのメカニズムを用いていると考えられている。一般に、ＣＰＰは、１）膜の直接的な浸透、２）エンドサイトーシスを介した移入、又は３）一時的な構造の形成による転座により移入すると考えられている。
【０００９】
直接的な浸透は、近年、脂質二層の両側上の細胞浸透性ペプチドとリン酸塩基との間の強い相互作用、一時的な間隙の形成を核とする荷電した側鎖の挿入、その後の間隙表面上に拡散することによる細胞浸透性ペプチドの転座を伴うことが提唱されている。 
【００１０】
エンドサイトーシスは、原形質膜が内側に向かって折りたたまれ、細胞内に物質を運ぶことによる細胞摂取のプロセスであるが、大部分はエネルギー依存性であると考えられている。
【００１１】
これとは対照的に、ＣＰＰの第三クラスは、古典的なエンドサイトーシスとは無関係のメカニズムを介して細胞によって内在化される性質を持っている。このメカニズムの物理的性質はあまり理解されていないが、他のクラスとは異なり、クラス３のペプチドは、膜を横断することができるが、生体表面の受容体や細胞由来のＡＴＰのエネルギーを必要としない。
【００１２】
アンテナペディアペプチド配列（ｐＡｎｔ）に加え、このクラス３の例には、最も一般的に用いられているＣＰＰの一つであり、アンテナペディアホメオプロテインのＤＮＡ結合ドメイン由来の１６アミノ酸ペプチドである、合成由来のペネトラチンＴＭがある。 
【００１３】
クラス３のアンテナペディアペプチド配列（ｐＡｎｔ）は、生き物のゲノムの中でヒト、マウス、ハエおよび単純なミミズと同じくらい多様であることがわかっているが、真核生物のタマホコリカビ属のアメーバのゲノム内にはアンテナペディア配列はない。
【００１４】
発明者らは、本明細書において、社会性アメーバであるキイロタマホコリカビ（Dictyostelium discoideum）のゲノムから、その起源に関連してＣＵＰＩＤ  ＡおよびＣＵＰＩＤ  Ｂ（Cellular Permeating peptides In Dictyostelium）と称する２つの新規なクラス３  ＣＰＰの同定を開示する。組換え法を用いて、より大きなポリペプチドまたはタンパク質配列にこれらの配列を組み込むことにより、そのポリペプチドまたはタンパク質の機能を保持しながら、細胞を透過することができる製品を提供する。有利なことに、これらのＣＵＰＩＤペプチドは、一般的に用いられるペネトラチンＴＭなどの他の試験ＣＰＰと比較して、細胞内へのカーゴの輸送に優れていることが示された。したがって、ＣＵＰＩＤペプチドは他の細胞不浸透性分子の細胞内送達のための改良された輸送性能を提供する。
【発明の概要】
【００１５】
本発明の第一の態様によると、
i）RRVQIWFQNKRAKVKR、 
ii）RSVQIWFQNRRAKAR、又は
iii）i）又はii）のペプチドに少なくとも７５％相同な配列
を含む群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、選択された分子ないしは薬剤を細胞膜を越えて輸送するための細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）が提供される。
【００１６】
本明細書においてＣＰＰへの言及は、短いペプチド、典型的には３０未満のアミノ酸であり、少なくとも一つの選択された分子と結合した場合に原形質膜の位置を変え、それによって前記分子の細胞ないしは細胞小器官内への輸送を促す能力を有するペプチドを指す。
【００１７】
本明細書において細胞性の膜ないしは細胞膜の言及には、生体膜又は、真核性起源又は原核性起源の生体膜（原形質膜およびすべての細胞内の膜）と同じないしは類似する性質に基づくか、その性質を有する人工ないしは合成の膜への言及が包含される。
【００１８】
本発明の好適な実施形態では、前記細胞性の膜は生体膜である。
【００１９】
本明細書において生体膜への言及は、人工ないしは合成の膜とは対照的に、天然に生じるないしは生きている膜に関する。
【００２０】
当業者には明らかであろうが、本明細書において選択された分子ないしは薬剤への言及は、細胞又は細胞小器官へ輸送することを目的としてＣＰＰに結合ないしはコンジュゲートされうる任意のカーゴを指し、例として、限定するものではないが、小分子、ペプチドを含むタンパク質および超分子粒子、タンパク質、プラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む核酸配列、化学物質、治療薬、抗体、有機染料、蛍光標識、または量子ドットやナノ粒子などの造影剤を指す。
【００２１】
当業者には明らかであろうが、前記生体膜は細胞を囲む膜であってよい。これには、限定するものではないが、単純な原形質膜などの膜や、より特殊化した膜構造、例えば、心尖部、基底外側、シナプス前およびシナプス後の膜、鞭毛、繊毛、微絨毛、糸状仮足および葉状仮足の膜、筋肉細胞の筋細胞膜、ならびにニューロンの特化ミエリンおよび樹状突起棘の膜が包含されうる。これには、細胞小器官、限定するものではないが例として、エンドソーム；滑面小胞体および粗面小胞体；筋小胞体；ゴルジ体；リソソーム；ミトコンドリア（内側と外側の膜）；核（内側と外側の膜）；ペルオキシソーム；液胞；細胞質顆粒；細胞小胞（ファゴソーム、オートファゴソーム、クラスリン被覆小胞、ＣＯＰＩ被覆小胞およびＣＯＰＩＩ被覆小胞）および分泌小胞が包含されうる。
【００２２】
さらに、前記生体膜には真核性起源又は原核性起源の任意の膜への言及が包含される。
【００２３】
本発明のＣＰＰの相同物又は誘導体も本発明の文脈で用いられうることは当業者に明らかであろう。ゆえに、例えば、一又は複数の付加、欠損、置換などを含むＣＰＰは本発明に包含される。さらに、一つのアミノ酸を他の類似の「タイプ」のものに置き換えることも可能である。例えば、一つの疎水性のアミノ酸を他のものに置き換えることは、アミノ酸配列を比較するためのＣＬＵＳＴＡＬプログラムなどのプログラムを用いてよい。このプログラムは、アミノ酸配列を比較し、適切に配列内にスペースを挿入することにより適切なアライメントを見つける。ある適切なアライメントについてアミノ酸の同一性又は類似性（アミノ酸型の同一性と保存）を算出することができる。ＢＬＡＳＴｘのようなプログラムは、最も長い範囲の類似配列を整列し、その一致度に値を割り当てる。ゆえに、いくつかの領域に類似が見られる場合の比較を行い、それぞれに異なるスコアを得ることができる。両方のタイプの分析が本発明で検討される。
【００２４】
本明細書で用いられる「相同」なる用語は、RRVQIWFQNKRAKVKR又はRSVQIWFQNRRAKARのアミノ酸配列に少なくとも７５％相同ないしは同一な配列を有し、RRVQIWFQNKRAKVKR又はRSVQIWFQNRRAKARの生物学的活性又は膜輸送機能を保持するアミノ酸配列を指す。相同性は、i）又はii）のペプチド配列に少なくとも７５％相同であることが好ましく、順に、RRVQIWFQNKRAKVKR又はRSVQIWFQNRRAKARに少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％相同であることが好ましい。 
【００２５】
本発明の第一の態様のさらに好適な実施形態では、前記ＣＰＰは、配列RRVQIWFQNKRAKVKR又はRSVQIWFQNRRAKARを含むか、又はそれからなる。
【００２６】
本発明の第二の態様によると、膜、典型的には限定するものではないが、生体膜を越えて選択される分子又は薬剤を輸送することを目的として、前記ＣＰＰと、前記ＣＰＰに共有結合ないしは非共有結合するか又は会合している少なくとも一つの選択された分子又は薬剤とを含むコンジュゲートが提供される。
【００２７】
本発明の第二の態様の好適な実施形態では、前記選択された薬剤は、当業者に知られる多くの方法によって前記ＣＰＰに接着されてよく、例えば限定するものではないが、共有又は非共有の連結がある。あるいは、より好ましくは、前記カーゴはインビボ又はインビトロの組換えによって前記ＣＰＰに付加されうる。
【００２８】
理想的には、前記選択された薬剤はそのアミノ末端又はカルボキシ末端で前記ＣＰＰ分子にコンジュゲートされうる。
【００２９】
本発明の第二の態様のさらに好適な実施形態では、前記選択された分子又は薬剤は、前記ＣＰＰのアミノ酸残基のすぐ隣に又は前記ＣＰＰのアミノ酸残基にコンジュゲートされる。あるいは、前記選択された分子又は薬剤は、少なくとも一つのさらなるアミノ酸残基又は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０のアミノ酸残基を含む群から選択される数のアミノ酸残基で好ましくは表されるスペーサーの存在により、前記ＣＰＰのアミノ酸残基から遠位に位置する。当業者には明らかであろうが、これにより選択された薬剤の透過性が改善されうるが、同様に機能しうる他のスペーサーが本発明の実施に用いられてよい。
【００３０】
本発明の第三の態様では、細胞性の膜を越えて少なくとも一つの選択された分子又は薬剤を輸送する方法であって、前記膜を越えて輸送する少なくとも一つの分子又は薬剤と共有結合又は非共有結合的に結合した少なくとも一つの前記ＣＰＰの使用を含む方法が提供される。
【００３１】
本発明のさらなる態様では、選択された分子又は薬剤と共有結合又は非共有結合的に結合した、本発明に係る少なくとも一つのＣＰＰを含み、前記分子又は薬剤が治療薬である、治療薬が提供される。
【００３２】
当業者には明らかであろうが、前記治療薬は、小分子化学的阻害因子又は活性因子、タンパク質、ペプチドを含む超分子粒子、プラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む核酸配列、化学物質、治療的薬剤又は抗体であってよい。ゆえに、これには、発現が欠損しているか又は発現が正しくない遺伝子産物の発現を達成する遺伝子治療のための、細胞質又はここの細胞小器官、例えば核内で治療的作用を発揮するために細胞内への薬剤の輸送、疾患治療のためのリソソーム内の欠損するリソソーム酵素の輸送、および癌治療のためのミトコンドリアでのアポトーシス促進性の抗癌薬の輸送が包含される。
【００３３】
他の態様では、治療薬に共有結合又は非共有結合的に結合した少なくとも一つのＣＰＰと、一つのさらなる治療薬とを含む併用治療薬が提供される。ゆえに、治療ないしは予防する疾患や症状に適する又は効果的と思われるような、他の活性な物質があってもよい。例えば、併用治療は抗生物質又は抗菌薬を含んでもよい。
【００３４】
理想的には、前記併用治療薬は、本発明に係る複数のＣＰＰを含み、それぞれが治療薬と共有結合的に又は非共有結合的に結合している。理想的には、前記薬剤は、同じ症状、理想的にはその異なる態様や症状を治療するために選択されるが、場合によっては、患者が患っている異なる症状を治療するように選択されてよい。ゆえに、本発明のＣＰＰは、治療薬の選択と組み合わせて、オーダーメイドの治療を可能としうる。
【００３５】
他の態様では、本発明は、本発明に係る治療薬又は本発明に係る併用治療薬の有効量を治療する個体に投与することを含む、治療方法を提供する。
【００３６】
本発明の他の態様では、本発明に係る治療薬又は本発明に係る併用治療薬を、薬学的に許容可能な担体とともに含む、薬学的組成物が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
担体、２以上存在する場合にはそれぞれの担体は、製剤の他の成分と混合可能であり、受容者に有害でないという意味では許容されるものでなければならない。
【００３８】
製剤には、経口、直腸、経鼻、気管支（吸入器）、局所（点眼剤、頬および舌下を含む）、経膣または非経口投与（皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮内を含む）に適したものが含まれ、製薬業界でよく知られる任意の方法によって調製されてよい。
【００３９】
投与経路は治療する症状に応じるが、好ましい組成物は、静脈内、非経口、経口、経鼻、気管支または局所の投与のために製剤化される。
【００４０】
組成物は、本発明の治療薬又は本発明の併用治療薬と担体とを結合させることによって調製してよい。一般に、製剤は、活性剤を、液体担体又は細かくした固形担体あるいはこの両方と均一かつ密接に関連させて、必要があれば生成物を成形することによって調製される。本発明は、本発明のペプチドを薬学的または獣医学的に許容可能な担体またはビヒクルと併せる、または関連させることを含む、薬学的組成物の調整方法に関する。
【００４１】
本発明における経口投与用の製剤は、カプセル、小袋又は錠剤といったそれぞれが所定量の活性剤を含む個別の単位として、粉末または顆粒として、水溶液または非水溶液中の活性剤の溶液または懸濁液として、あるいは水中油型液体エマルジョンまたは油中水型液体エマルジョンとして、又はボーラス等として提示されてよい。
【００４２】
経口投与用の組成物（例えば錠剤およびカプセル剤）のために、「許容可能な担体」なる用語には、一般的な賦形剤などのビヒクル、例えば結合剤、例えばシロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロースおよび澱粉；充填剤および担体、例えばトウモロコシデンプン、ゼラチン、乳糖、ショ糖、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウムおよびアルギン酸；およびステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウムおよび他の金属ステアリン酸塩、ステアリン酸グリセロール、ステアリン酸、シリコーン油、タルクワックス、油およびコロイド状シリカなどの潤滑剤が包含される。ペパーミント、ウィンターグリーン油、チェリーフレーバーなどの香味剤を使用することもできる。剤形を容易に識別可能にするために着色剤を添加することが望ましい場合がある。錠剤はまた、当分野でよく知られる方法によってコーティングしてよい。
【００４３】
錠剤は、場合により１又は複数の補助成分とともに、圧縮または成型することにより製造されてよい。圧縮錠剤は、場合により結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、界面活性剤または分散剤と混合して、粉末または顆粒のような流動形態に活性成分を好適な機械で圧縮することにより調製されてよい。成型錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末状化合物の混合物を好適な機械で成型することにより製造されてよい。これらの錠剤は場合により被覆または刻み目をつけてよく、活性成分の遅延放出性または徐放性を与えるように製剤化してもよい。
【００４４】
経口投与に好適な他の製剤には、通常スクロースおよびアカシアゴムまたはトラガカントゴムなどの矯味基剤中に活性剤を含んでなるトローチ剤；ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアゴムなどの不活性基剤に活性剤を含んでなる香錠；および好適な液体担体に活性剤を含んでなる口中洗浄剤が包含される。
【００４５】
皮膚への局所適用のための、組成物は、クリーム、軟膏、ゼリー、溶液又は懸濁液等に作製されてよい。薬剤に用いられうるクリームまたは軟膏製剤は、当分野においてよく知られる従来の製剤であり、例えば、英国薬局方などの薬剤学の標準的教科書に記載されている。
【００４６】
非経口製剤は通常滅菌される。
【００４７】
本発明の他の態様によると、本発明に係るＣＰＰをコードする核酸分子が提供される。
【００４８】
本発明の他の態様によると、本発明に係るコンジュゲート又は治療薬をコードする核酸分子が提供される。
【００４９】
本発明の他の態様によると、前記核酸分子を含むベクターが提供される。
【００５０】
本発明の他の態様によると、前記ベクターを形質移入又は形質導入した宿主細胞が提供される。
【００５１】
本発明の他の態様によると、前記ＣＰＰ、又は前記コンジュゲート、又は前記治療薬の製造方法であって、本発明に係る前記ＣＰＰ又は前記コンジュゲート又は前記治療薬をコードする核酸分子を形質移入した宿主細胞を、前記ＣＰＰおよび／又は前記コンジュゲートおよび／又は前記治療薬の転写および翻訳が起こる条件下で培養することと、それらを回収することを含む方法が提供される。
【００５２】
本明細書の記載および請求項を通して、「含む」および「含有する」なる用語、ならびにこれらが変化した用語、例えば「含んでいる」および「（３人称単数が主語の）含む」は、「これらだけに限定されないが含んでいる」ことを意味し、他の部分、添加物、成分、整数値またはステップを排除するものではない。本明細書の記載および請求項を通して、文脈が別に求める場合を除いて、単数は複数を包含する。特に、不明確な物品が使用される場合、本明細書は、文脈が別に求める場合を除いて、単独と同様に複数も考慮するものとして理解されたい。
【００５３】
あらゆる特許または特許出願を含む、本明細書において引用される全ての参考文献は、出典明記により本明細書に組み込まれる。いかなる参考文献も先行技術を構成するものと認められない。さらに、先行技術のいずれも、当該技術分野における共通の一般的知識の一部を構成するものと認められない。
【００５４】
本発明の各態様の好ましい特徴は、他の態様のいずれかと関連して記載される場合がある。
【００５５】
本発明の他の特徴は、以下の実施例から明らかになるであろう。一般的に言えば、本発明は、（添付の特許請求の範囲および図面を含む）本明細書に開示された特徴の任意の新規な１つ、または任意の新規な組合せにまで及ぶ。ゆえに、本発明の特定の態様、実施形態、または実施例に関連して記載された特徴、整数、特性、化合物または化学的部分は、本明細書に記載された任意の他の態様、実施形態、または実施例に、それらと適合しないことがない限り、適用できることは理解されているはずである。
【００５６】
さらに、他の記述がない限り、本明細書で開示された任意の特徴は、同じまたは類似した目的を果たす代替の特徴に置き換えられてもよい。
【００５７】
本発明を、以下の実施例および図面を参照としてのみ用いて実施例により記載する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】培養１時間後に細胞に移入する蛍光標識したペプチド（１０μＭ）。（Ａ）タマホコリカビ細胞中のＦＩＴＣ−Ｃｕｐｉｄ  Ａ。（Ｂ）タマホコリカビ細胞中のＦＩＴＣ−Ｃｕｐｉｄ  Ｂ、（Ｃ）ヒト線維芽細胞中のＦＩＴＣ−Ｃｕｐｉｄ  Ｂ、（Ｄ）ヒト腎細胞中のＦＩＴＣ−Ｃｕｐｉｄ  Ｂ。
【図２】培養したタマホコリカビ細胞内の蛍光標識したペプチド（１０マイクロモルのＣｕｐｉｄ  Ａ、Ｃｕｐｉｄ  Ｂ又はｐＡＮＴ）蓄積の時間経過。
【図３】蛍光標識したＣｕｐｉｄ  Ｂペプチド（１０マイクロモル）の蓄積を培養したタマホコリカビ細胞においてモニターした。（Ａ〜Ｃ）４分後（Ａ）、１６分後（Ｂ）、３２分後（Ｃ）。３２分後に培養液を洗い流し、細胞蛍光をモニターした。（Ｄ〜Ｆ）洗浄後４分（Ｄ）、１６分（Ｅ）、３２分（Ｆ）。
【図４】調製し乾燥させたペプチドのＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル。ゲルはクーマシーブルータンパク質染料により染色し、Ｃｕｐｉｄ−ＰＫＩ（Ａ）、ＣｕｐｉｄＢ（Ｂ）および分子量の基準（Ｃ）のバンドを可視化した。
【図５】蛍光標識したＣｕｐｉｄ  Ｂ−ＰＫＩペプチド、１０マイクロモルを培養したタマホコリカビ細胞に添加し１時間置いた。次いで細胞を洗浄し、光学（Ａ）および蛍光（Ｂ）顕微鏡にて分析した。
【図６】Ｃｕｐｉｄは細胞内に小分子カーゴを輸送することができる。欠乏させたタマホコリカビ細胞の培養物を、ペプチドなし（Ａ）、Ｃｕｐｉｄ  Ｂペプチド（Ｂ）、ＰＫＩペプチド（Ｃ）およびＣｕｐｉｄ  Ｂ−ＰＫＩペプチド（Ｄ）にて処理し、凝集について分析した。未処理の培養物（Ａ）又は１０マイクロモルのＣｕｐｉｄ  Ｂペプチド（Ｂ）又はＰＫＩペプチド（Ｃ）にて処理した培養物では、細胞が密接な塊に凝集した。対照的に、１０マイクロモルのＣｕｐｉｄ−ＰＫＩペプチドにて処理した培養物（Ｄ）は凝集しなかった。
【図７】蛍光標識したＣｕｐｉｄ  Ｂ−ＰＴＥＮペプチド、１０マイクロモルを培養したタマホコリカビ細胞に添加し、１時間置いた。次いで細胞を洗浄し、蛍光顕微鏡用に調整した。
【図８】Ｃｕｐｉｄは細胞内に大分子カーゴを輸送することができる。欠乏させたタマホコリカビ培養物を、ペトリ皿の欠乏バッファ中に置き、１０時間後に可視化した。未処理の野生型（ＷＴ）培養物（Ａ）では、細胞は凝集中心へ一体となって移動し、細胞から細胞へのシグナル伝達により連動した。ＰＴＥＮヌル変異体培養物（Ｂ）、又は１０マイクロモルのＣｕｐｉｄ−ＰＴＥＮペプチドにて処理したＷＴ培養物（Ｃ）では、細胞は連動や凝集を生じなかった。
【図９】欠乏させた野生型タマホコリカビ細胞における４つのイノシトール・リン脂質（ＰＩ、ＰＩＰ、ＰＩＰ２およびＰＩＰ３）のレベルを、細胞培養物の溶媒抽出法にて測定し、薄層クロマトグラフィを用いて分析した。Ｃｕｐｉｄ  Ｂ−ＰＴＥＮペプチド処理（１０マイクロモル、１時間）の影響を基準（未処理）レベルに対するパーセント変化として算出した。
【図１０】欠乏させたタマホコリカビ培養物において、いくつかのタンパク質は、投与したサイクリックＡＭＰに反応して急速なリン酸化／脱リン酸化を起こす。この反応の強さはＰＴＥＮ酵素活性によって制限される。この応答は、ｃＡＭＰの投与後に示される時点で抽出した培養物から調製したリンタンパク質の抗体検出を用いてＳＤＳゲル上で可視化した。野生型（ＷＴ）培養物と比較して、１０マイクロモルのＣｕｐｉｄ−ＰＴＥＮペプチドにて１時間前処理した培養物では、細胞が非常に大きなリン酸化反応を示し、これによりＰＴＥＮ活性の減少が示唆される。
【図１１】Ｃｕｐｉｄは生物活性が可能である細胞内へ大きなカーゴを輸送することができる。蛍光のない精製Ｃｕｐｉｄ−ＧＦＰ（表１に示される配列）を、終濃度４０マイクロモルで細胞培地に添加し、１時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、Ｆｌｕｏｒｓａｖｅ（メルク）を用いてスライド上にマウントし、顕微鏡により観察した。細胞は、位相差顕微鏡（Ａ）および蛍光顕微鏡（Ｂ）下で観察した。ＧＦＰを観察し、Ｃｕｐｉｄ−緑色蛍光タンパク質ペプチド（Ｃｕｐｉｄ−ＧＦＰ）が細胞に浸透し、リフォールディングし、細胞が蛍光を発するという結論を導いた。
【実施例】
【００５９】
材料および方法
Ｃｕｐｉｄ結合ペプチドの生成
Ｃｕｐｉｄ  Ｂベクターの作製
ベクターの基本骨格
ｐＢＲ３２２（ニュー・イングランド・バイオラボ社）ＤＮＡベクターをＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩ  ＤＮＡ制限酵素（ニュー・イングランド・バイオラボ社）で切断した。試料は、製造業者提供の制限酵素緩衝液中でインキュベートし、ＥｃｏＲＩ（１μｌ）およびＣｌａＩ（１μｌ）制限酵素とともに３７℃でインキュベートし、直鎖状ＤＮＡ分子（ａ）とした。この分子は、両端に「スティッキー」ＥｃｏＲＩおよびＣｌａ１部位を持つという特徴を有する。試料は、氷上で保存するか又は−２０℃に凍結した。
【００６０】
Ｃｕｐｉｄ  Ｂ挿入物配列
はじめのＣｕｐｉｄ  Ｂ挿入物配列である［GAATCCATGCACCATCACCATCACCATAGAAGAGTTCAAATTTGGTTCCAAAATAAACGTGCTAAAGTAAAGAGAATCGAT］は、２本の相補的なＤＮＡ鎖として合成した（シグマ社、英国）。これは、ＥｃｏＲＩ制限酵素部位（GAATCC）、開始コドン（ATG）、６×ヒスチジン（CACCATCACCATCACCAT）、Ｃｕｐｉｄ  Ｂ配列（AGAAGAGTTCAAATTTGGTTCCAAAATAAACGTGCTAAAGTAAAGAGA）、およびＣｌａＩ制限酵素部位（ATCGAT）に特徴を有する。
【００６１】
これら相補的な鎖を、混合、加熱および冷却によりアニーリングし、ＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩ  ＤＮＡ制限酵素（ニュー・イングランド・バイオラボ社）で切断した。試料は、製造業者提供の制限酵素緩衝液中でインキュベートし、ＥｃｏＲＩ（１μｌ）およびＣｌａＩ（１μｌ）制限酵素とともに３７℃でインキュベートし、ＥｃｏＲＩおよびＣｌａ１の「スティッキー末端」を有する二本鎖Ｃｕｐｉｄ  Ｂ挿入ＤＮＡ（ｂ）とした。試料は、氷上で保存するか又は−２０℃に凍結した。
【００６２】
Ｃｕｐｉｄ  Ｂベクター
直鎖状のＤＮＡベクター（ａ）をＣｕｐｉｄ挿入物（ｂ）と混合し、ＤＮＡリガーゼキット（ニュー・イングランド・バイオラボ社）にて、「スティッキー末端」を介して円形にライゲートした。このＤＮＡを大腸菌にクローニングし、アンピシリン（１００マイクログラム／ｍＬ）を補充したＬＢアガープレートに播いた。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性バクテリアコロニーから抽出し、プラスミド配列を決定した（ダンディーシーケンス、英国）。正しい配列を含むクローンを増殖させ、プラスミドを抽出し（プラスミド抽出キット、キアゲン社）、完成したＣｕｐｉｄ  Ｂプラスミドベクター（ｃ）の供給源を得た。簡単に言うと、クローンを、アンピシリン（１００マイクログラム／ｍＬ）を補充したＬＢアガープレート上で増殖させた。単一コロニーを採取し、３７℃で８時間アンピシリンを含むＬＢ培地中で増殖させた。培養物を、アンピシリンを補充したＬＢ中で１／５００に希釈し、３７℃で一晩増殖させた。製造業者の説明書に従って、培養物を遠心分離によってペレット化し、その後溶解および精製した（プラスミド抽出キット、キアゲン社）。
【００６３】
Ｃｕｐｉｄ  Ｂ−カーゴＤＮＡプラスミドの作製
カーゴＤＮＡ挿入物
カーゴＤＮＡ挿入物は、ＰＣＲ増幅技術を用いてゲノムＤＮＡから作製した。この反応のためのプライマーは、シグマ社（英国）から合成・注文した。
フォワードプライマー：［ＣｌａＩ部位］−カーゴ開始ＤＮＡ
リバースプライマー：カーゴ終末ＤＮＡ−停止コドン−［ＨｉｎｄＩＩＩ部位］
【００６４】
ＰＣＲ反応から増幅されたＤＮＡは、Ｃｌａ１およびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素にて処理して精製し（ＰＣＲ精製キット、キアゲン社）、ゲル精製（ゲル精製キット、キアゲン社）を行った。この最終的なカーゴＤＮＡ挿入物（ｅ）分子は両端の「スティッキー」Ｃｌａ１およびＨｉｎｄＩＩＩ部位に特徴を有する。
【００６５】
Ｃｕｐｉｄ  Ｂベクター（ｃ）をＣｌａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡ制限酵素（ニュー・イングランド・バイオラボ社）で切断した。試料は、製造業者提供の制限酵素緩衝液中でインキュベートし、ＨｉｎｄＩＩＩ（１μｌ）およびＣｌａＩ（１μｌ）制限酵素とともに３７℃でインキュベートし、直鎖状ＤＮＡ分子（ｄ）とした。この分子は、両端に「スティッキー」Ｃｌａ１およびＨｉｎｄＩＩＩ部位を持つという特徴を有する。試料は、氷上で保存するか又は−２０℃に凍結した。
【００６６】
直鎖状のＣｕｐｉｄ  ＢベクターＤＮＡ（ｄ）をカーゴ挿入物ＤＮＡ（ｅ）と混合し、ＤＮＡリガーゼキット（ニュー・イングランド・バイオラボ社）にて、「スティッキー末端」を介して円形にライゲートした。このＤＮＡを大腸菌にクローニングし、アンピシリン（１００マイクログラム／ｍＬ）を補充したＬＢアガープレートに播いた。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性バクテリアコロニーから抽出し、プラスミド配列を決定した（ダンディーシーケンス、英国）。正しい配列を含むクローンを増殖させ、上記のようにプラスミドを抽出し（プラスミド抽出キット、キアゲン社）、完成したＣｕｐｉｄ  Ｂ−カーゴＤＮＡプラスミド（ｆ）を提供した。
【００６７】
大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を１０ｎｇの適当なプラスミドにて形質転換し、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を補充した１ＬのＬＢ培地に移し、対数期中期（Ａ６００＝０．５〜０．６）になるまで３７℃で一晩増殖させた。ペプチドは、１ｍＭのＩＰＴＧにより３時間かけて誘導し、細菌を遠心分離により回収した。細菌ペレットを、４体積の緩衝液Ａ（５０ｍＭリン酸塩緩衝液、１５のｐＨ７．５、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）中で超音波処理により溶解した。遠心分離（１６０００ｇで１５分間）の後、上清をＮｉ−ＮＴＡ  Ｈｉｓ結合樹脂に通過させた。必要があれば、従来技術を用いてポリヒスチジンアミノテールをコンストラクトに添加し、生成物がＮｉ−ＮＴＡ  Ｈｉｓ結合樹脂に接着し、混入物質から分離するようにした。結合したペプチドは、緩衝液Ａで洗浄し、イミダゾール勾配（緩衝液Ａ中０〜０．５Ｍ）を適用することにより溶出した。溶出したペプチド（培養物の３ｍｇ／Ｌ）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌにより一晩透析した。長期保存のために、ペプチドを最終的に乾燥させ、使用するまで−２０℃で保存した。
【００６８】
ペプチドの蛍光標識および顕微鏡
ペプチドは、指示書（ピアース社、英国）にあるように、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識キットを用いてＦＩＴＣで標識した。細胞培養物に添加した場合、標識したペプチドは、４８８ｎｍのスペクトル線、アルゴンイオンレーザー（４９４ｎｍの励起波長および５１８ｎｍの発光波長）にてＦＩＴＣを励起することによって蛍光顕微鏡を用いて可視化した。
【００６９】
タマホコリカビの細胞培養
ＡＸ２野生型タマホコリカビ細胞は、アエロバクター・エロゲネス菌（クレブシエラ・エロゲネスともいう）を食料源として播種したＳＭアガープレート上で増殖させた。
【００７０】
結果
Ｃｕｐｉｄ  ＡおよびＣｕｐｉｄ  ＢがＣＰＰであることの確認
Ｃｕｐｉｄ  Ａ（RSVQIWFQNRRAKAR）とＣｕｐｉｄ  Ｂ（RRVQIWFQNKRAKVKR）は、化学的に合成し、アミノ末端でFITCにて標識した。ペプチドをキイロタマホコリカビアメーバの培養した真核細胞に加え、最大２時間の時間量を変えた。次いで、細胞を洗浄し、蛍光顕微鏡下で検査のために調製した（図１）。浸透の時間経過はクラス３のＣＰＰ、アンテナペディアペプチド、化学合成でＦＩＴＣ標識したｐＡＮＴと比較した（図２）。
【００７１】
他の実験においても、発明者らは、ヒト線維芽細胞、ヒト胎児腎臓細胞（図１）およびニワトリニューロン（図示せず）を含む、試験したすべての細胞へ広がることができるＣｕｐｉｄペプチドの透過能力を見出した。
【００７２】
発明者らは、２０マイクロモルのＦＩＴＣ標識Ｃｕｐｉｄ  ＡおよびＣｕｐｉｄＢペプチドがいずれも可視化された細胞へ３０分以内に急速に浸透することができたことを観察した。取り込みはいずれのペプチドに関しても１００分以内に最大に達し、最大半量の透過にかかる時間はＦＩＴＣ−Ｃｕｐｉｄ  Ｂでは１７分、ＦＩＴＣ−Ｃｕｐｉｄ  Ａでは２８分であった。同じ条件下でＦＩＴＣ−ｐＡＮＴは２３分で最大半量の透過を達成した。ＦＩＴＣ−Ｃｕｐｉｄ  Ｂの透過は可逆性であり、ＦＩＴＣペプチドを含む培地をペプチドを含まない培地と交換した場合には、ペプチドは同様の期間内に細胞の外へ透過した（図３）。
【００７３】
（i）様々な生きている細胞に進入する能力、（ii）進入するだけでなく生きている細胞から出て行く機能、および（iii）アンテナペディアペプチドとのサイズおよび主構造の類似性により、Ｃｕｐｉｄ  ＡおよびＢは、ＣＰＰの第三クラスの新規なメンバーに分類されることが証明された。
【００７４】
Ｃｕｐｉｄが生きている細胞内へ生物活性ペプチドカーゴを輸送することができることの確認
内在化され生物活性カーゴを輸送するＣｕｐｉｄ  Ｂの能力を調べるために、キイロタマホコリカビモデルシステムを用いた。
【００７５】
飢餓（starvation）によりタマホコリカビに発生プログラムを開始させ、自由生活性（free-living）アメーバの凝集を促した。遺伝的研究により、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）がタマホコリカビのｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＤｄＰＫＡ）による初期凝集過程において細胞外化学誘引物質として統合するように機能するという重要な役割を明らかにした。ＤｄＰＫＡは、ＰＫＡの阻害因子由来の２０アミノ酸ペプチド配列であるＰＫＩがＰＫＡの触媒ユニットに直接結合することによって阻害されうる。Ｃｕｐｉｄ  Ｂ−ＰＫＩ融合タンパク質を作製することによって、発明者らは、飢餓タマホコリカビ細胞のインビボでの凝集が妨げられることを確認することを目的とした。
【００７６】
生きている細胞に添加したＣｕｐｉｄ  Ｂ−ＰＫＩペプチドを用いた実験
記載のようにＣｕｐｉｄ結合ペプチドを生成し、ＳＤＳ存在下でのゲル電気泳動法により分析し、Ｃｕｐｉｄ  Ｂ又はＣｕｐｉｄ  Ｂ−ＰＫＩペプチドに相当する分子量の主バンドが存在することを確認した（図４）。
【００７７】
Ｃｕｐｉｄ  Ｂ−ＰＫＩ融合タンパク質が生きている細胞に透過することができることを示すために、発明者らは、フルオレセインペプチド標識キット（ピアース社、英国）を用いてペプチドを蛍光標識した。１０マイクロモルのＦＩＴＣ−Ｃｕｐｉｄ  Ｂ−ＰＫＩをタマホコリカビ細胞に添加し、１時間後に蛍光顕微鏡にて観察したところ、Ｃｕｐｉｄ  Ｂ−ＰＫＩは細胞透過性であることが示された（図５）。
【００７８】
発明者らは、Ｃｕｐｉｄ  Ｂ−ＰＫＩが細胞への進入に有効であり、１０マイクロモルの濃度ではタマホコリカビの凝集のＰＫＡ依存性プロセスが完全に減弱されることを報告する（図６Ｄ）。同様な用量では、Ｃｕｐｉｄ  ＢペプチドもＰＫＩペプチドも単独では凝集に何の影響も示さなかった。（図６Ｂおよび図Ｃ）
【００７９】
Ｃｕｐｉｄは大きなペプチドカーゴを細胞内へ輸送することができる
大きなペプチドカーゴを生きている細胞へ輸送するためにＣｕｐｉｄ  Ｂを用いて、カーゴが生物学的および生化学的な性質の生物活性を保持していることを示した。これを行うために、ＰＴＥＮタンパク質の１６７アミノ酸領域を選択し、上記の方法を用いてＣｕｐｉｄ  Ｂペプチドに融合した。この長さのアミノ酸（ヒトＰＴＥＮの１８６〜３５２番目）はＣ２領域であり、ＰＴＥＮ酵素活性の自己抑制に関与することが知られている。この大きな融合ペプチドが生きている細胞に透過することができることを示すために、フルオレセインペプチド標識キット（ピアース社、英国）を用いてペプチドを蛍光標識した。２０マイクロモルのＦＩＴＣ−Ｃｕｐｉｄ  Ｂ−ＰＴＥＮをタマホコリカビ細胞に添加し、１時間後に蛍光顕微鏡にて観察したところ、Ｃｕｐｉｄ  Ｂ−ＰＴＥＮは細胞透過性であることが示された（図７）。
【００８０】
タマホコリカビにおいて、ＰＴＥＮ遺伝子を欠損している遺伝子変異体は表現型の顕著な変化を示す。例えば、低速度撮影画像解析により、飢餓条件の間のＰＴＥＮヌル変異株は、細胞は凝集しようとするが繰り返しそれに失敗するという特徴的な凝集行動を示す（図８Ｂ）。野生型のタマホコリカビ細胞は同じ条件下で１０マイクロモル用量のＣｕｐｉｄ  Ｂ−ＰＴＥＮペプチドが与えられると、ＰＴＥＮヌル細胞株と同じ特徴的な行動を示す（図８Ｃ）。
【００８１】
ＰＴＥＮタンパク質は、イノシトールベースの脂質からリン酸基を除去するように機能するホスホリパーゼ酵素活性を有し、それ自体、細胞表面に存在する様々な種類のイノシトールリン脂質の間のバランスを維持することに関与している。飢餓を受けた野生型細胞では、３と４のリン酸基（ＰＩＰ２およびＰＩＰ３）を有するイノシトールリン脂質は、主としてＰＴＥＮの作用により、低く保たれている。
【００８２】
発明者らは、タマホコリカビ培養物におけるイノシトールリン脂質レベルに対するＣｕｐｉｄ  Ｂ−ＰＴＥＮペプチドの効果を決定した。Ｃｕｐｉｄ  Ｂ−ＰＴＥＮペプチド処理した細胞（１０マイクロモル、１時間）はタマホコリカビ細胞におけるイノシトールリン脂質の基礎レベルを変化させる。ＰＩＰ２およびＰＩＰ３のレベルは、それぞれ未処理の基礎レベルの＋７５％および＋１５０％に上昇し、これはＰＴＥＮのホスホリパーゼ活性の阻害と一致する（図９）。
【００８３】
飢餓タマホコリカビ培養物では、サイクリックＡＭＰの投与に応答していくつかのタンパク質が迅速なリン酸化／脱リン酸化事象を受けている。この最初のリン酸化反応の強さはＰＴＥＮ酵素活性によって制限され、ＰＩＰ２およびＰＩＰ３イノシトールリン脂質レベルの変化と関連している。１０マイクロモルのＣｕｐｉｄ  Ｂ−ＰＴＥＮペプチドで予め１時間処理した培養物中のリン酸化パターンは未処理の培養物と比較すると、サイクリックＡＭＰに対して非常に強い初期リン酸化反応を示し、これによりＰＴＥＮ活性の減少が裏付けられた（図１０）。
【００８４】
これらのデータをまとめると、Ｃｕｐｉｄ  Ｂ−ＰＴＥＮペプチドは、生きている細胞の培養物に添加された場合には、透過し、ＰＴＥＮ活性を阻害するという考えと一致している。これは、発明者らの方法によって生成された大きなＣｕｐｉｄ  Ｂ連結ペプチドの細胞透過生物活性は小さなカーゴに限定されないことを示す。
【００８５】
Ｃｕｐｉｄペプチドは大きなカーゴを輸送することが可能であり、カーゴ機能を妨げない
Ｃｕｐｉｄが細胞透過ペプチド担体として働くのに有効であることを示すために、発明者らは、オワンクラゲ（Aequorea victoria、クラゲ；ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ４２２１２）由来の野生型緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に連結したＣｕｐｉｄペプチド配列を合成した。ＧＦＰは、青〜紫外線領域の光に曝されると明るい緑色蛍光を示す２３８アミノ酸タンパク質である。
【００８６】
表１に示すＣｕｐｉｄペプチドにＧＦＰを添加した。Ｃｕｐｉｄ−ＧＦＰを粉末に精製し、滅菌水に溶解した場合、Ｃｕｐｉｄ−ＧＦＰ粉末もＣｕｐｉｄ−ＧＦＰ溶液（１ミリモル）も蛍光発色しなかった。しかしながら、Ｃｕｐｉｄ−ＧＦＰを細胞培養物に添加した場合（４０マイクロモル、１時間）、蛍光顕微鏡下で観察するとＣｕｐｉｄ−ＧＦＰは細胞へ透過し、蛍光発色し始めることがわかった（図１１）。
【００８７】
ＧＦＰに連結したＣＰＰを用いた以前の研究はＴＡＴとＡｒｇ×８  ＣＰＰＳによるものであった(Lundber, Wikstrom S, Johansson M. Mol Ther. 2003 Jul;8(1):143-50. PMID: 12842437)。これらＧＦＰペプチドは既に蛍光発色していた。著者らは、ＣＰＰペプチド（および融合タンパク質）両方の主な特性は細胞表面接着を媒介することであり、これらＣＰＰの内在化はエンドサイトーシスによって生じたと結論付けた。しかしながら、本明細書では、精製したＣｕｐｉｄ−ＧＦＰは（誤って折りたたまれているために）蛍光発色しないので、緑色蛍光として検出されることは、Ｃｕｐｉｄ−ＧＦＰが、細胞のタンパク質機構により正しく折りたたまれている細胞に透過したことを示唆する。これにより、Ｃｕｐｉｄの真の細胞透過性ペプチドとしての役割が裏付けられ、生物活性が可能である生きている細胞内へ大きなカーゴペプチドを運ぶことが可能である。
【００８８】
まとめ
本発明者らは、本明細書において、生物学的な膜などの細胞性の膜を横断し、それによって細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）として作用することができる新規のペプチド配列（一般的にＣｕｐｉｄと称する）の同定を開示する。したがって、これら新規のＣＰＰは、生物学的な障害壁を越えて分子又は薬剤を輸送および運送するために使用することが可能であり、幅広い治療学的又は生物学的な分子の細胞内輸送への使用にも繋がる。
【００８９】
表１：開示した分子のアミノ酸配列。
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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