(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非多能性の真核細胞における多能性を誘導するための細胞培養培地組成物であって、前記組成物が、前記非多能性の真核細胞の多能性細胞への再プログラミングを誘導するのに有効な量で、以下の群
（１）グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）阻害剤、
（２）ＴＧＦβ受容体阻害剤、
（３）環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）アゴニスト、
（４）Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（ＳＡＨ）阻害剤、および
（５）場合によっては、ヒストンアセチル化を促進する薬剤、
のそれぞれからの多能性の化学的誘導物質（ＣＩＰ）を含む、細胞培養培地組成物。
【請求項２】
前記ＧＳＫ阻害剤が、［６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル］（ＣＨＩＲ）であり、前記ＴＧＦβ受容体阻害剤が、［２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン］（６１６４５２）であり、前記ｃＡＭＰアゴニストが、フォルスコリン（ＦＳＫ）でありかつ前記ＳＡＨ阻害剤が、３−デアザンプラノシンＡ（ＤＺＮｅｐ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＨＤＡＣ阻害剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
バルプロ酸（ＶＰＡ）、トラニルシプロミンまたはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
後期再プログラミングを促進する小分子をさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
後期再プログラミング促進薬が、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）およびロリプラムからなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
５−アザシチジン、酪酸ナトリウムおよびＲＧ１０８［Ｎ−フタリル−Ｌ−トリプトファン］からなる群から選択されるエピジェネティックな修飾物質をさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ＳＦ１６７０［Ｎ−（９，１０−ジオキソ−９，１０−ジヒドロフェナントレン−２−イル）ピバルアミド］、ＤＹ１３１［Ｎ−（４−（ジエチルアミノベンジリデニル）−Ｎ’−（４−ヒドロキシベンゾイル）−ヒドラジン］、ＵＮＣ０６３８［２−シクロヘキシル−６−メトキシ−Ｎ−［１−（１−メチルエチル）−４−ピペリジニル］−７−［３−（１−ピロリジニル）プロポキシ］−４−キナゾリンアミン］、ＳＲＴ１７２０［Ｎ−（２−（３−（ピペラジン−１−イルメチル）イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾール−６−イル）フェニル）キノキサリン−２−カルボキサミド塩酸塩］、ＲＧ１０８、２−Ｍｅ−５ＨＴ（２−メチル−５−ヒドロキシトリプタミン）、ＩＢＭＸ［３，７−ジヒドロ−１−メチル−３−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−プリン−２，６−ジオネアンド］およびＴＴＮＰＢ［４−［（Ｅ）−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１−プロペニル］安息香酸］からなる群から選択される化学的再プログラミング効率を改善／増大する小分子をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
Ｄ４４７６（Ｄ４４７６（ＣＡＳ３０１８３６−４３−１）、Ｃｈ５５（［４−［（１Ｅ）−３−［３，５−ビス（１，１−ジメチルエチル）フェニル］−３−オキソ−１−プロペニル］安息香酸］、ＡＭ５８０（［４−［（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸］、およびＥＰＺ００４７７７「１−（３−（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メチル）（イソプロピル）アミノ）プロピル）−３−（４−（ｔｅｒｔ−ブチル）フェニル）尿素」（ＥＰＺ）からなる群から選択される１種または複数の化合物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
タンパク質成長因子を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
細胞培養培地を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
低分子量化合物が、多能性を誘導するために分化した細胞用の細胞培養培地に入れるための相対量で存在する、キットにおける請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
部分的または完全に分化した細胞において多能性を誘導する方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物で誘導される前記細胞を多能性を誘導するのに有効な期間培養するステップを含む方法。
【請求項１４】
前記分化した細胞が、多分化能幹細胞、血液学的起源の細胞、胚性起源の細胞、皮膚由来細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、上皮細胞、内皮細胞、間葉細胞、実質細胞、神経系細胞、および結合組織細胞からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
誘導される細胞が、線維芽細胞、脂肪由来細胞、神経由来細胞および腸上皮細胞からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が、Ｏｃｔ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、Ｃ−ＭｙｃまたはＮＡＮＯＧのいずれかを発現するためにトランスフェクトされていない、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
誘導される細胞が、前記ＣＩＰを含む再プログラミング培地中で２６〜３６日の間の期間培養される、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
細胞培養培地が、２ｉ培地の使用前の全時間６１６４５２およびフォルスコリンを含む、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記培地が、少なくとも最初の１２日間ＣＨＩＲ９９０２１を含む、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記培地が、ＣＨＩＲ、６１６４５２、ＦＳＫおよびＤＺＮｅｐ（Ｃ６ＦＺ）を含む、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記培地が、ＶＰＡ、ＣＨＩＲ、６１６４５２、トラニルシプロミンＦＳＫ（集合的に、ＶＣ６ＴＦ）またはＶＰＡ、ＣＨＩＲ、６１６４５２、トラニルシプロミン、ＦＳＫ、ＤＺＮｅｐ（集合的に、ＶＣ６ＴＦＺ）を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記培地が、２８日目から４８日目の間に２ｉ培地に変えられる、請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
他の小分子の初期処置後１２から４０日目の間にＤＺＮｅｐを加えるステップを含む、請求項１３〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が、ＶＣ６ＴＦを含む再プログラミング培地中で１６〜２０日間培養され、次いでＶＣ６ＴＦＺ中で前記細胞を多能性細胞に変換するのに必要な残りの期間培養される、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞培養培地が、ｃＡＭＰアゴニスト、エピジェネティックな修飾物質および化学的再プログラミング効率を改善／増大する小分子からなる群から選択される後期再プログラミングを促進する小分子をさらに含む、請求項１３〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
細胞が、処置後２８日後にグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３阻害剤および分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼシグナル伝達阻害剤と共にＥＳＣ培養培地中で４日間培養される、請求項１３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記培地が、再プログラミング効率を増大する小分子、ＴＴＮＰＢを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
形態、倍加時間、３種の胚性胚葉の組織に分化する細胞の能力、ＥＳＣマーカーの発現およびそれらの組み合わせに基づいて前記多能性細胞を特定するステップを含む、請求項１３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＥＳＣマーカーが、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１、Ｓｏｘ２、Ｄａｘ１、Ｓａｌｌ４、未分化胚細胞転写因子（Ｕｔｆ１）、ステージ特異的胚抗原−４（ＳＳＥＡ−４）およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記多能性細胞を単離するステップをさらに含む、請求項１３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物で非多能性の真核細胞を培養する工程を含む、多能性細胞の製造方法。
【請求項３２】
前記培養後の細胞を、注射、補綴具の移植または組織工学マトリックスによる個体への投与用に調製する工程を含む、請求項３１記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に真核細胞を多能性細胞に再プログラミングするための小分子組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ＥＳＣ）などの、多能性幹細胞は、自己複製および全ての体細胞型に分化し得る。体細胞は、卵母細胞への核移植によってまたは特定因子の異所性発現を通して多能性になるように再プログラムされてきた（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３および非特許文献４）。しかしながら、外因性の多能性関連因子、特にＯｃｔ４は、多能性を確立するためのこれらの方法において不可欠である（非特許文献５、非特許文献６および非特許文献７）。さらに、これらの再プログラミング方法におけるｃ−Ｍｙｃのような腫瘍形成遺伝子の要件は、がん性細胞を誘導する危険をもたらす。したがって、再プログラミング方式は、臨床応用に関する問題を引き起こしてきた（非特許文献８および非特許文献９）。
【０００３】
体細胞の多能性細胞への再プログラミングを駆動し得る小分子の必要性がある。小分子はより容易に細胞に進入するので、多能性を誘導し得る小分子は利点を有し、それらは非免疫原性であり、費用効率がより高く、かつより容易に合成、保存、および標準化される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｗｉｌｍｕｔら著、Ｎａｔｕｒｅ、３８５：８１０〜８１３、１９９７年
【非特許文献２】Ｔａｋａｈａｓｈｉら著、Ｃｅｌｌ、１２６：６６３〜６７６、２００６年
【非特許文献３】Ｙａｍａｎａｋａら著、Ｎａｔｕｒｅ、４６５：７０４〜７１２、２０１０年
【非特許文献４】Ｓｔａｄｔｆｅｌｄら著、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、２４：２２３９〜２２６３、２０１０年
【非特許文献５】Ｚｈｕ著、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．、１３：７３〜９０、２０１１年
【非特許文献６】Ｌｉ著、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、２１：１９６〜２０４、２０１１年
【非特許文献７】Ｌｉら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０９：２０８５３〜２０８５８、２０１２年
【非特許文献８】Ｓａｈａら著、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、５：５８４〜５９５、２００９年
【非特許文献９】Ｗｕら著、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１３：４９７〜５０５、２０１１年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
部分的にまたは完全に分化した細胞を多能性細胞に再プログラムするために用いてよい小分子を提供することが、本発明の目的である。
【０００６】
部分的にまたは完全に分化した細胞を多能性細胞に再プログラミングする方法を提供することも、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
Ｏｃｔ４などの１種または複数の多能性のマーカーを発現するように遺伝子操作されておらず、かつＯｃｔ４を自然には発現しない細胞を含めた、部分的にまたは完全に分化した細胞を、多能性細胞に再プログラムするために用いられ得る小分子が、特定された。必要とされる多能性の化学的誘導物質（ＣＩＰ）には、（１）グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）阻害剤、（２）ＴＧＦβ受容体阻害剤、（３）環状ＡＭＰアゴニスト、（４）Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（ＳＡＨ）阻害剤、（５）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤（例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ））などの、ヒストンアセチル化を促進する薬剤、およびそれらの組み合わせが含まれる。ＣＩＰは、別々にまたはＣＩＰ組成物としての組み合わせにおいて提供され得る。１種または複数のエピジェネティックな修飾物質およびレチノイン酸受容体アゴニスト、例えば、レチノイン酸受容体リガンドも、ＣＩＰと共に投与され得る。一部の好ましい実施形態において、ＣＩＰには、ＳＡＨ阻害剤としてＤＺＮｅｐが含まれる。
【０００８】
好ましい実施形態において、ＧＳＫ阻害剤は、化学名［６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル］を有するアミノピリミジン、ＣＨＩＲ９９０２１（「ＣＨＩＲ」）であり、ＴＧＦβ受容体阻害剤は、［２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン］（６１６４５２）であり、ｃＡＭＰアゴニストは、フォルスコリン（ＦＳＫ）でありかつＳＡＨ阻害剤は、３−デアザンプラノシンＡ（ＤＺＮｅｐ）である。一部の実施形態において、ＣＩＰは、ＣＨＩＲ、６１６４５２、ＦＳＫおよびＤＺＮｅｐ（Ｃ６ＦＺ）の組み合わせである。より好ましい実施形態において、ＣＩＰは、ＶＰＡ、ＣＨＩＲ、６１６４５２、トラニルシプロミン（Ｐａｒｎｅｔ）、ＦＳＫ（集合的に、ＶＣ６ＴＦ）およびＤＺＮｅｐ（集合的に、ＶＣ６ＴＦＺ）の組み合わせである。
【０００９】
好ましい実施形態において、ＣＩＰ組成物に含まれていてよいエピジェネティックな修飾物質には、５−アザシチジン、酪酸ナトリウムおよびＲＧ１０８のうちの１種または複数ならびにそれらの組み合わせが含まれる。一部の実施形態において、後期再プログラミングを促進する小分子およびＶＣ６ＴＦＺで見られるレベルを超えて化学的再プログラミング効率を改善／増大する小分子が含まれる。好ましい実施形態において、後期再プログラミングを促進する小分子は、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）などのｃＡＭＰアゴニスト、ＦＳＫおよびロリプラムまたはそれらの組み合わせである。化学的再プログラミング効率を改善／増大する小分子には、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、［Ｎ−（９，１０−ジオキソ−９，１０−ジヒドロフェナントレン−２−イル）ピバルアミド］（ＳＦ１６７０）、［Ｎ−（４−（ジエチルアミノベンジリデニル）−Ｎ’−（４−ヒドロキシベンゾイル）−ヒドラジン］（ＤＹ１３１  ＤＹ１３１）、［２−シクロヘキシル−６−メトキシ−Ｎ−［１−（１−メチルエチル）−４−ピペリジニル］−７−［３−（１−ピロリジニル）プロポキシ］−４−キナゾリンアミン］（ＵＮＣ０６３８）、［Ｎ−（２−（３−（ピペラジン−１−イルメチル）イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾール−６−イル）フェニル）キノキサリン−２−カルボキサミド塩酸塩］（ＳＲＴ１７２０）、［Ｎ−フタリル−Ｌ−トリプトファン］（ＲＧ１０８）、２−Ｍｅ−５ＨＴ（２−メチル−５−ヒドロキシトリプタミン）、［３，７−ジヒドロ−１−メチル−３−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−プリン−２，６−ジオネアンド］（［３，７−Ｄｉｈｙｄｒｏ−１−ｍｅｔｈｙｌ−３−（２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｙｌ）−１Ｈ−ｐｕｒｉｎｅ−２，６−ｄｉｏｎｅａｎｄ］）（ＩＢＭＸ）および［４−［（Ｅ）−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１−プロペニル］安息香酸］（ＴＴＮＰＢ）が含まれる。化学的再プログラミング効率を増大するために好ましい小分子は、ＴＴＮＰＢである。
【００１０】
組換え型塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）などの、いくつかのタンパク因子は、化学的再プログラミングのための後続のプロトコールにおいて有効であることが実証されている。
【００１１】
体細胞など、多能性細胞ではない第１種の細胞の、多能性細胞への再プログラミングを誘導する方法も、提供される。再プログラムするために好ましい細胞には、線維芽細胞、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）、神経由来の幹細胞および腸上皮細胞が含まれる。好ましい実施形態において方法は、Ｏｃｔ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、Ｃ−ＭｙｃまたはＮＡＮＯＧのいずれかを発現するように再プログラムされる細胞をトランスフェクトすることは含まない。本実施形態において、方法は、再プログラムされる細胞を転写因子などのポリペプチドと接触させることも含まない。再プログラムされる細胞は、細胞を化学的誘導多能性幹細胞（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）（ＣｉＰＳＣ）に再プログラムするのに十分な期間ＣＩＰと接触させる。再プログラムされた細胞は、形態、倍加時間、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１、Ｓｏｘ２、Ｄａｘ１、Ｓａｌｌ４、未分化胚細胞転写因子（Ｕｔｆ１）、ステージ特異的胚抗原−４（ＳＳＥＡ−４）などのＥＳＣマーカーの発現、および細胞が３種の胚性胚葉の組織に分化する能力などのＥＳＣ様特性に基づいて多能性細胞として特定される。ＣｉＰＳＣは、単離されてさらに培養され得る。
【００１２】
好ましい実施形態において、細胞は、初めにＣＩＰを含有する再プログラミング培地で２６〜３６日の期間培養される。細胞は、次いで２ｉ培地（グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３および分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼシグナル伝達の二重阻害を有するＥＳＣ培養培地）において４日を超えて培養される。一部の実施形態において、細胞は、２ｉ培地において４から２０日間培養される。一部の実施形態において、２ｉ培地における培養は、再プログラミング培地での処置後約２８日目に開始される。細胞の小分子（ＣＩＰ）への暴露の異なる継続期間が試験されている。６１６４５２およびフォルスコリンは、２ｉ培地の使用前の全時間に存在する必要がある。ＣＨＩＲ９９０２１は、最初の１２日間に用いられるべきであり、かつ好ましくは２ｉ培地の使用前の全時間に存在する。ＤＺＮｅｐは、再プログラミングの後期段階（１２日目から４０日目）、好ましくは他の小分子の初期の処置後１６〜２０日目までに加えられるべきである。小分子の組み合わせ（ＶＣ６ＴＦＺ）は、２８日目から４８日目の間、好ましくは４０日目に２ｉ培地に変えられるべきである。
【００１３】
細胞は、好ましくはＣＩＰ成分ＶＣ６ＴＦを含む再プログラミング培地において約１６〜２０日間培養され、次いで細胞を多能性細胞に変換するために必要な残りの期間ＶＣ６ＴＦＺ中で培養される。一部の実施形態において、細胞は、本明細書に開示されるように、後期再プログラミングを促進する小分子、例えば、ｃＡＭＰアゴニストおよびエピジェネティックな修飾物質ならびに／または化学的再プログラミング効率を改善／増大する小分子とさらに接触させる。化学的再プログラミング効率を増大するために好ましい小分子は、ＴＴＮＰＢである。
【００１４】
単離された化学的誘導多能性幹細胞（ＣｉＰＳＣ）は、自然に発生する多能性幹細胞ではない。ＣｉＰＳＣは、ＥＳＣ形態、ＥＳＣと同様の倍加時間、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１、Ｓｏｘ２、Ｄａｘ１、Ｓａｌｌ４、未分化胚細胞転写因子（Ｕｔｆ１）、ステージ特異的胚抗原−４（ＳＳＥＡ−４）などのＥＳＣマーカーの発現、および細胞が３種の胚性胚葉の組織に分化する能力などのＥＳＣ様の特性を保有する。ＣｉＰＳＣは、例えば、それらが胚盤胞の内部細胞塊から直接誘導／単離されないという点においてＥＳＣと異なる。ＣｉＰＳＣは、それらがＯｃｔ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ｃ−ＭｙｃまたはＮＡＮＯＧを発現する遺伝子などの導入遺伝子を発現するように作り変えられていないか、あるいはそれらが得られる細胞をこれらの導入遺伝子のいずれかを発現するようにトランスフェクトすることを含むプロセスによって産生されていないという点において他の誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）と異なる。ＣｉＰＳＣは、それらが非多能性細胞をＫｌｆ、Ｏｃｔ、ＭｙｃまたはＳｏｘなどの１種または複数のポリペプチドと接触させることを含むプロセスによって産生されないという点においても他の誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）と異なる。好ましい実施形態において、ＣｉＰＳＣは、遺伝子操作されていない、すなわち、ＣｉＰＳＣは、細胞から遺伝要素を導入または除去することにより変質されていない。ＣｉＰＳＣ、ｉＰＳＣおよびＥＳＣの間に明白な違いは無い。しかしながら、本明細書に開示されているＣｉＰＳＣは、少なくともそれらを発生させるために用いられる方法によって、すなわちそれらの起源によってＥＳＣと区別され得る。ＥＳＣが自然に発生する細胞の場合、一方でＣｉＰＳＣは、自然に発生せずかつ本明細書に述べるような、非多能性細胞を小分子の組み合わせで処置することによって得られる。
【００１５】
ＣｉＰＳＣは、所望の種類の細胞に分化するために培養または誘導してよい。ＣｉＰＳＣおよびそれらの子孫は、これに限らないが細胞療法および組織工学を含めた多数の用途において用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】ＳＫＭ（図１Ａ）に加えて化学物質またはＯｃｔ４に感染したＭＥＦから誘導されたｉＰＳＣコロニーの数を示す。エラーバー、平均±ＳＤ（ｎ＝３生物製剤の反復ウェル）。
【図１Ｂ】ＳＫ（図１Ｂ）に加えて化学物質またはＯｃｔ４に感染したＭＥＦから誘導されたｉＰＳＣコロニーの数を示す。エラーバー、平均±ＳＤ（ｎ＝３生物製剤の反復ウェル）。
【図１Ｃ】ＭＥＦ、ＳＫＭ−ＦＳＫ−ｉＰＳＣおよびＥＳＣ（Ｒ１）における多能性マーカー遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図１Ｄ】ＳＫＭ−ＦＳＫ−ｉＰＳＣおよびＳＫ−ＦＳＫ−ｉＰＳＣのゲノムＰＣＲ分析を示す。
【図１Ｅ】化学物質処置でＳＫＭまたはＳＫによって誘導されたｉＰＳＣコロニーのＪＲＴ−ＰＣＲ（図１Ｅ）分析を示す。略語：Ｍ（２−Ｍｅ−５ＨＴ）、Ｄ（Ｄ４４７６）、Ｖ（ＶＰＡ）。Ｔｇは、外因により誘導された遺伝子を示す。スケールバー、１００μＭ。
【図１Ｆ】化学物質処置でＳＫＭまたはＳＫによって誘導されたｉＰＳＣコロニーのゲノムＰＣＲ（図１Ｆ）分析を示す。略語：Ｍ（２−Ｍｅ−５ＨＴ）、Ｄ（Ｄ４４７６）、Ｖ（ＶＰＡ）。Ｔｇは、外因により誘導された遺伝子を示す。スケールバー、１００μＭ。
【図２】ＭＥＦ、ＧＦＰ陰性細胞、ＧＦＰ陽性集団およびＥＳＣ（Ｒ１）においてＲＮＡ−ｓｅｑ分析によって検出された多能性関連遺伝子のｍＲＮＡレベルを示す。ＧＦＰ陰性細胞およびＧＦＰ陽性集団は、２４日目に収集した。Ｃｄｈ１＝Ｅ−カドヘリン。
【図３】示された小分子での処置後のｉＰＳＣコロニーの相対数を示す棒グラフである。（−）対照、ＤＭＳＯ。エラーバーは、ｓ．ｄ（ｎ≧２）を示す。略語：ＰＥＧ２（プロスタグランジンＥ１２）、５−ａｚａ−Ｃ（５−アザシチジン、ＮａＢ（酪酸ナトリウム）。
【図４Ａ】３６日目のＤＺＮｅｐ処置後に誘導されたＧＦＰ陽性コロニーの数を示す。エラーバー、平均±ＳＤ（ｎ＝２生物製剤の反復ウェル）。
【図４Ｂ】ＯＧ−ＭＥＦから誘導されたＧＦＰ−陽性細胞のＦＡＣＳ分析である。左、初期ＭＥＦにおいてＧＦＰ−陽性細胞無し、中および右、４４日目にＶＣ６ＴＦ（中）およびＶＣ６ＴＦＺ（右）によって誘導されたＧＦＰ−陽性細胞の割合。
【図４Ｃ】ＣｉＰＳＣ生成のプロセスを例示する概略図である。スケールバー、１００ｍｍ。（図４Ａ）に関して、再プログラミングのための細胞を、１２日目に再播種した。
【図４Ｄ】ＭＥＦ、ＧＦＰ陽性コロニーおよびＥＳＣ（Ｒ１）においてＲＮＡ−ｓｅｑ分析によって検出された多能性関連遺伝子のｍＲＮＡレベルを示す。マウスＥＳＣコロニーと異なり、これらのＧＦＰ陽性コロニーは、上皮様かつ密であり、ＥＳＣ培養条件において維持できず３６日目に収集した。
【図４Ｅ】ＭＥＦ、ＣｉＰＳＣおよびＥＳＣ（Ｒ１）においてＲＮＡ−ｓｅｑ分析によって検出された多能性関連遺伝子のｍＲＮＡレベルを示す。
【図５Ａ】ＶＣ６ＴＦＺ条件における個々の化学物質のための濃度および処置継続期間の最適条件を示す。示されるような（ＣｉＰＳＣ誘導時に滴定された）小分子の濃度の関数としてＣｉＰＳＣ細胞のコロニーの数を示す。
【図５Ｂ】ＶＣ６ＴＦＺ条件における個々の化学物質のための濃度および処置継続期間の最適条件を示す。示されるような（ＣｉＰＳＣ誘導時に滴定された）小分子の濃度の関数としてＣｉＰＳＣ細胞のコロニーの数を示す。
【図５Ｃ】ＶＣ６ＴＦＺ条件における個々の化学物質のための濃度および処置継続期間の最適条件を示す。示されるような（ＣｉＰＳＣ誘導時に滴定された）小分子の濃度の関数としてＣｉＰＳＣ細胞のコロニーの数を示す。
【図５Ｄ】ＶＣ６ＴＦＺ条件における個々の化学物質のための濃度および処置継続期間の最適条件を示す。示されるような（ＣｉＰＳＣ誘導時に滴定された）小分子の濃度の関数としてＣｉＰＳＣ細胞のコロニーの数を示す。
【図５Ｅ】ＶＣ６ＴＦＺ条件における個々の化学物質のための濃度および処置継続期間の最適条件を示す。示されるような（ＣｉＰＳＣ誘導時に滴定された）小分子の濃度の関数としてＣｉＰＳＣ細胞のコロニーの数を示す。
【図５Ｆ】ＶＣ６ＴＦＺ条件における個々の化学物質のための濃度および処置継続期間の最適条件を示す。示されるような（ＣｉＰＳＣ誘導時に滴定された）小分子の濃度の関数としてＣｉＰＳＣ細胞のコロニーの数を示す。
【図５Ｇ】ＶＣ６ＴＦＺ条件における個々の化学物質のための濃度および処置継続期間の最適条件を示す。示されるような（ＣｉＰＳＣ誘導時に滴定された）小分子の濃度の関数としてＣｉＰＳＣ細胞のコロニーの数を示す。
【図５Ｈ】ＶＣ６ＴＦＺ条件における個々の化学物質のための濃度および処置継続期間の最適条件を示す。それぞれの小分子の持続時間を示す。
【図５Ｉ】ＶＣ６ＴＦＺ条件における個々の化学物質のための濃度および処置継続期間の最適条件を示す。化学物質の組み合わせの持続時間を示す。化学的再プログラミング培地に加えてＶＣ６ＴＦＺを、異なる時点において２ｉ培地で置換した。エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ≧２）を示す。
【図５Ｊ】ＶＣ６ＴＦＺ条件における個々の化学物質のための濃度および処置継続期間の最適条件を示す。化学物質の組み合わせの持続時間を示す。化学的再プログラミング培地に加えてＶＣ６ＴＦＺを、異なる時点において２ｉ培地で置換した。エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ≧２）を示す。
【図５Ｋ】ＶＣ６ＴＦＺ条件における個々の化学物質のための濃度および処置継続期間の最適条件を示す。化学物質の組み合わせの持続時間を示す。化学的再プログラミング培地に加えてＶＣ６ＴＦＺを、異なる時点において２ｉ培地で置換した。エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ≧２）を示す。
【図６Ａ】化学的再プログラミング効率または反応速度論を改善する確証された小分子を示す。ＭＥＦにおいてＶＣ６ＴＦＺと併用して化学的再プログラミング効率を改善する確証された小分子を示す。０日目から１２日目に加えた化学物質：ＰＧＥ２、ＤＹ１３１、ＲＧ１０８、２−Ｍｅ−５ＨＴおよびＩＢＭＸ、１２日目後に加えた化学物質：ＳＦ１６７０、ＵＮＣ０６３８およびＳＲＴ１７２０。（−）対照、ＤＭＳＯ。エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ≧２）を示す。
【図６Ｂ】化学的再プログラミング効率または反応速度論を改善する確証された小分子を示す。ＭＥＦにおいてＣ６ＦＺまたはＶＣ６ＴＦＺと併用して化学的再プログラミング効率を改善するＴＴＮＰＢの効果を示す。ＣｉＰＳＣコロニーは、それぞれ、５０日目および４０日目にＣ６ＦＺおよびＶＣ６ＴＦＺによる化学的再プログラミングに関して定量化された。ｉＰＳＣコロニーは、それぞれ、ＯＳＫおよびＯＳＫＭ誘導再プログラミングに関して２４日目および１６日目に定量化された。エラーバーは、ｓ．ｄ（ｎ＝３）を示す。
【図６Ｃ】化学的再プログラミング効率または反応速度論を改善する確証された小分子を示す。ＭＥＦにおいてＶＣ６ＴＦＺと併用して化学的再プログラミング反応速度論を改善するＴＴＮＰＢの効果を示す。ＧＦＰ陽性コロニーは、示された日に定量化された。（−）対照、ＶＣ６ＴＦＺ。エラーバーは、ｓ．ｄ（ｎ＝３）を示す。
【図６Ｄ】化学的再プログラミング効率または反応速度論を改善する確証された小分子を示す。ＣｉＰＳＣのゲノムＰＣＲ分析を示す。
【図６Ｅ】化学的再プログラミング効率または反応速度論を改善する確証された小分子を示す。ＣｉＰＳＣのゲノムＰＣＲ分析を示す。
【図６Ｆ】化学的再プログラミング効率または反応速度論を改善する確証された小分子を示す。
【図７Ａ】ＣｉＰＳＣは導入遺伝子汚染が無いことを示しているゲノムＰＣＲおよびサザンブロット分析を示す。使用されたウイルスベクターの２つの組に関するゲノムＰＣＲを示す。
【図７Ｂ】ＣｉＰＳＣは導入遺伝子汚染が無いことを示しているゲノムＰＣＲおよびサザンブロット分析を示す。使用されたウイルスベクターの２つの組に関するゲノムＰＣＲを示す。
【図７Ｃ】ＣｉＰＳＣは導入遺伝子汚染が無いことを示しているゲノムＰＣＲおよびサザンブロット分析を示す。ウイルス組み込み事象を検出するためのサザンブロット分析である。ＤＮＡプローブは、プサイ（ｐｓｉ）配列上でｐＬＬ３．７−ΔＵ６およびｔｅｔ−ｏｎベクターの両方を標的とするように設計された。ＣｉＰＳＣが分析されてＴｅｔ−Ｏ−ｉＰＳ、ｐＬＬ−Ｏ−ｉＰＳおよびＭＥＦＳが対照として用いられた。
【図７Ｄ】ＣｉＰＳＣは導入遺伝子汚染が無いことを示しているゲノムＰＣＲおよびサザンブロット分析を示す。サザンブロットのために使用された臭化エチジウム染色ゲルを示す。
【図８Ａ】ＶＣ６ＴＦＺから個々の化学物質を取り除くことによって誘導されたＧＦＰ陽性（図８Ａ）コロニーの数を示す。３つの独立した実験の結果は、異なる色で示される（白色、灰色および黒色）。
【図８Ｂ】ＶＣ６ＴＦＺから個々の化学物質を取り除くことによって誘導されたＣｉＰＳＣ（図８Ｂ）コロニーの数を示す。３つの独立した実験の結果は、異なる色で示される（白色、灰色および黒色）。
【図９Ａ】ＲＴ−ＰＣＲによって例示されるような、ＭＥＦＳと比較したＣｉＰＳ細胞の異なるクローンにおける多能性マーカー発現を示す。
【図９Ｂ】ＭＡＦ−ＣｉＰＳ細胞、ＡＤＳＣ−ＣｉＰＳＣおよびＭＮＦ−ＣｉＰＳＣにおける多能性マーカーのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図９Ｃ】ＭＡＦ−ＣｉＰＳ細胞、ＡＤＳＣ−ＣｉＰＳＣおよびＭＮＦ−ＣｉＰＳＣにおける多能性マーカーのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図９Ｄ】ＭＡＦ−ＣｉＰＳ細胞、ＡＤＳＣ−ＣｉＰＳＣおよびＭＮＦ−ＣｉＰＳＣにおける多能性マーカーのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図１０】ＣｉＰＳＣから生成されたキメラの生存曲線を示す。ｎ、調査したキメラの総数。
【図１１Ａ】リアルタイムＰＣＲによって測定されるような多能性関連遺伝子（図１１Ａ）の発現を示す。
【図１１Ｂ】リアルタイムＰＣＲによって測定されるようなＧａｔａ６、Ｇａｔａ４、およびＳｏｘ１７（図１１Ｂ）の発現を示す。
【図１１Ｃ】リアルタイムＰＣＲによって確証されたＳａｌｌ４、Ｓｏｘ２、Ｇａｔａ６、Ｇａｔａ４およびＳｏｘ１７の発現を示す。折れ目は、０日目のＭＥＦにおける発現と比較して４、８、１２、１６、２０および２４日目（図１１Ｃ）でＳａｌｌ４、Ｓｏｘ２、Ｇａｔａ６、Ｇａｔａ４およびＳｏｘ１７発現において変化する。エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝２）を示す。
【図１１Ｄ】リアルタイムＰＣＲによって確証されたＳａｌｌ４、Ｓｏｘ２、Ｇａｔａ６、Ｇａｔａ４およびＳｏｘ１７の発現を示す。折れ目は、０日目のＭＥＦにおける発現と比較して４、８、１２、１６、２０および１２時間（図１１Ｄ）でＳａｌｌ４、Ｓｏｘ２、Ｇａｔａ６、Ｇａｔａ４およびＳｏｘ１７発現において変化する。エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝２）を示す。
【図１１Ｅ】個々のおよび組み合わされた化学物質またはＶＣ６ＴＦ（またはＶＣ６ＴＦＺ）から化学物質の使用を中止することの遺伝子の発現への影響を示す。個々のおよび組み合わせられた化学物質の１２日目のＳａｌｌ４およびＳｏｘ２の発現への影響を示す。
【図１１Ｆ】個々のおよび組み合わされた化学物質またはＶＣ６ＴＦ（またはＶＣ６ＴＦＺ）から化学物質の使用を中止することの遺伝子の発現への影響を示す。個々のおよび組み合わせられた化学物質の１２日目のＳａｌｌ４およびＳｏｘ２の発現への影響を示す。
【図１１Ｇ】個々のおよび組み合わされた化学物質またはＶＣ６ＴＦ（またはＶＣ６ＴＦＺ）から化学物質の使用を中止することの遺伝子の発現への影響を示す。ＶＣ６ＴＦから化学物質を除去することの１２日目のＳａｌｌ４およびＳｏｘ２の発現への影響を示す。
【図１１Ｈ】個々のおよび組み合わされた化学物質またはＶＣ６ＴＦ（またはＶＣ６ＴＦＺ）から化学物質の使用を中止することの遺伝子の発現への影響を示す。ＶＣ６ＴＦから化学物質を除去することの１２日目のＳａｌｌ４およびＳｏｘ２の発現への影響を示す。
【図１１Ｉ】個々のおよび組み合わされた化学物質またはＶＣ６ＴＦ（またはＶＣ６ＴＦＺ）から化学物質の使用を中止することの遺伝子の発現への影響を示す。３２日目のＶＣ６ＴＦＺから個々の化学物質（ＣＨＩＲ、６１６４５２およびＦＳＫ）の使用を中止することの多能性マーカー遺伝子の発現への影響を示す。
【図１１Ｊ】３２日目のＶＣ６ＴＦＺから個々の化学物質（ＣＨＩＲ、６１６４５２およびＦＳＫ）の使用を中止することのＧａｔａ６、Ｇａｔａ４およびＳｏｘ１７の発現への影響を示す。エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝２）を示す。
【図１１Ｋ】ＤＺＮｅｐの存在下および不在下における３２日目の多能性関連遺伝子の発現を示す。
【図１１Ｌ】ＤＺＮｅｐの存在下および不在下における３２日目のＨ３Ｋ９メチル化を示す。
【図１２Ａ】リアルタイムＰＣＲによって確証された形質導入後４日目のＭＥＦにおけるＳａｌ４（図１２Ａ）の相対的な発現レベルを示す。エラーバーは、ｓ．ｄ（ｎ＝２）を示す。
【図１２Ｂ】リアルタイムＰＣＲによって確証された形質導入後４日目のＭＥＦにおけるＳｏｘ２（図１２Ｂ）の相対的な発現レベルを示す。エラーバーは、ｓ．ｄ（ｎ＝２）を示す。
【図１２Ｃ】Ｓａｌｌ４または／およびＳｏｘ２プラスミドでトランスフェクトされたＭＥＦにおいて確認されたＯｃｔ４プロモーター駆動性ルシフェラーゼ活性を示す。エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝３）を示す。
【図１２Ｄ】Ｃ６ＦがＶＣ６ＴＦＺから取り除かれた状態で、Ｓａｌｌ４およびＳｏｘ２の過剰発現によって誘導されたＯｃｔ４活性化（図１２Ｄ）の数を示す。
【図１２Ｅ】Ｃ６ＦがＶＣ６ＴＦＺから取り除かれた状態で、Ｓａｌｌ４およびＳｏｘ２の過剰発現によって誘導されたＧＦＰ陽性およびｉＰＳＣコロニー（図１２Ｅ）の数を示す。
【図１３Ａ】２４日目のＳａｌｌ４、Ｇａｔａ６、Ｇａｔａ４またはＳｏｘ１７のノックダウンによる遺伝子発現変化を示す。Ｓａｌｌ４、Ｇａｔａ６またはＧａｔａ４ノックダウンによるＳａｌｌ４、Ｇａｔａ６およびＧａｔａ４の相対的発現変化を示す。
【図１３Ｂ】２４日目のＳａｌｌ４、Ｇａｔａ６、Ｇａｔａ４またはＳｏｘ１７のノックダウンによる遺伝子発現変化を示す。Ｓｏｘ１７ノックダウンによるＳｏｘ１７、Ｓａｌｌ４、Ｇａｔａ６、Ｇａｔａ４およびＯｃｔ４の相対的発現変化を示す。
【図１３Ｃ】２４日目のＳａｌｌ４、Ｇａｔａ６、Ｇａｔａ４またはＳｏｘ１７のノックダウンによる遺伝子発現変化を示す。Ｓａｌｌ４、Ｇａｔａ６またはＧａｔａ４のノックダウンによるＳｏｘ１７の相対的発現変化を示す。
【図１３Ｄ】２４日目のＳａｌｌ４、Ｇａｔａ６、Ｇａｔａ４またはＳｏｘ１７のノックダウンによる遺伝子発現変化を示す。Ｓａｌｌ４、Ｇａｔａ６またはＧａｔａ４のノックダウンによるＳｏｘ２の相対的発現変化を示す。エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝２）を示す。
【図１３Ｅ】Ｓａｌｌ４、Ｇａｔａ６またはＧａｔａ４ノックダウンのＯｃｔ４およびｉＰＳＣ形成の発現への影響を示す。３２日目のＳａｌｌ４、Ｇａｔａ６またはＧａｔａ４ノックダウンによるＯｃｔ４発現変化を示す。エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝２）を示す。
【図１３Ｆ】化学的再プログラミング中にＳａｌｌ４、Ｇａｔａ６またはＧａｔａ４がノックダウンされた場合のＧＦＰ陽性およびｉＰＳＣコロニーの数を示す。エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝３）を示す。
【図１３Ｇ】化学的再プログラミング中の多能性回路の段階的な確立を例示する概略図である。
【図１４Ａ】化学的再プログラミング中のＤＺＮｅｐの生物活性を示す。ＨＰＬＣ分析によって測定されるようなＭＥＦにおける物と比較した細胞内レベルのＳＡＨのＳＡＭに対する相対比率を示す。エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝２）を示す。
【図１４Ｂ】化学的再プログラミング中のＤＺＮｅｐの生物活性を示す。ＶＣ６ＴＦ処置と併用してＣｉＰＳＣ発生を誘導するＳＡＨヒドロラーゼ阻害剤（Ｎｅｐ  Ａ、ＡｄｏｘおよびＤＺＡ）によるＤＺＮｅｐの置き換えの使用を示す。エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝３）を示す。略語：ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）。
【図１４Ｃ】ウエスタンブロット分析によって分析されたＥＺＨ２のタンパク質レベルを示す。
【図１４Ｄ】ＶＣ６ＴＦに加えてｓｈＲＮＡまたはＤＺＮｅｐによって誘導されたｉＰＳＣコロニーの数を示す。エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝３）を示す。
【図１４Ｅ】Ｅｚｈ２がＥｚｈ２のｓｈＲＮＡ仲介ノックダウン後に抑制されたことを示しているリアルタイムＰＣＲを示す。エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝２）を示す。
【図１４Ｆ】ＭＥＦにおける細胞内ｃＡＭＰレベルと比較した相対的な細胞内ｃＡＭＰレベルを示す。
【図１４Ｇ】２’５’ｄｄＡｄｏによるアデニル酸シクラーゼの阻害のＶＣ６ＴＦＺによって発生したＣｉＰＳＣコロニーの数への影響を示す。（−）対照、ＤＭＳＯ。
【図１４Ｈ】ＦＳＫをＶＣ６Ｔに加えてＤＺＮｅｐ（ＶＣ６ＴＺ）処置を伴ってｃＡＭＰ類似体（ＩＢＭＸ有りまたは無しのＤＢｃＡＭＰ）で、またはＣｉＰＳＣ誘導中にＶＣ６ＴＺと併用してホスホジエステラーゼ阻害剤（ロリプラムおよびＩＢＭＸ）を置き換えることの化学的再プログラミングへの影響を示す。
【図１４Ｉ】ＦＳＫをＶＣ６Ｔに加えてＤＺＮｅｐ（ＶＣ６ＴＺ）処置を伴ってｃＡＭＰ類似体（ＩＢＭＸ有りまたは無しのＤＢｃＡＭＰ）で、またはＣｉＰＳＣ誘導中にＶＣ６ＴＺと併用してホスホジエステラーゼ阻害剤（ロリプラムおよびＩＢＭＸ）を置き換えることの化学的再プログラミングへの影響を示す。
【図１４Ｊ】ＦＳＫをＶＣ６Ｔに加えてＤＺＮｅｐ（ＶＣ６ＴＺ）処置を伴ってｃＡＭＰ類似体（ＩＢＭＸ有りまたは無しのＤＢｃＡＭＰ）で、またはＣｉＰＳＣ誘導中にＶＣ６ＴＺと併用してホスホジエステラーゼ阻害剤（ロリプラムおよびＩＢＭＸ）を置き換えることの化学的再プログラミングへの影響を示す。
【図１４Ｋ】示された化学物質を用いた、ＭＥＦの処置後の細胞内ｃＡＭＰレベルの定量化である。エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ≧２）を示す。
【図１５】化学的再プログラミング系の構築における主なステップの略図である。青色の六角形は、再プログラミング転写因子を表し、赤色の正方形は、それぞれのステップで特定された主な小分子を表す。再プログラミングの効果促進剤は、異なる再プログラミング条件に対応して、右側に表示されている。別のＯｃｔ４代替品Ｄ４４７６および２−Ｍｅ−５ＨＴは、ＦＳＫの下に表示されている。略語：Ｏ（Ｏｃｔ４）、Ｓ（Ｓｏｘ２）、Ｋ（Ｋｌｆ４）、Ｍ（ｃ−Ｍｙｃ）、Ｔｒａｎｙｌ（トラニルシプロミン）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
Ｉ．定義
本明細書で使用する場合「化学的誘導多能性幹細胞」（ＣｉＰＳＣ）と言う語は、多能性ではない細胞、すなわち、多分化能のあるいは１種または複数のトランスフェクトされた遺伝子の発現によってではなく、非多能性細胞を化学化合物と接触させることによって、分化した細胞の、細胞由来の多能性細胞を指す。
【００１８】
本明細書で使用する場合「培養物」は、培地において成長したおよび場合によっては継代された細胞の集団を意味する。細胞培養物は、初代培養（例えば、継代されていない培養）であってもよくまたは二次もしくはそれに続く培養（例えば、継代培養されたまたは１回もしくは複数回継代した細胞の集団）であってもよい。
【００１９】
本明細書で使用する場合「エピジェネティックな」と言う語は、突然変異に基づかないが、場合によっては何世代にもわたってなお伝えられ得るＤＮＡの共有結合修飾を指す。ＤＮＡ配列における如何なる変化もなく活性化または抑制された遺伝子は、エピジェネティックに制御される。エピジェネティックな修飾は安定であるが、ＤＮＡ配列における恒久的な変化を伴わずに発生する遺伝子発現において潜在的に可逆性の改変である。エピジェネティックなプロセスの多くの種類は、特定されており、それらにはヒストンのメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、およびＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｌｙａｔｉｏｎ）ならびにＤＮＡメチル化が含まれる。
【００２０】
本明細書で使用する場合「エピジェネティックな修飾物質」と言う語は、エピジェネティックなプロセスを修飾する薬剤を指す。ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤およびＤＮＡメチル化の阻害剤は、エピジェネティックな修飾物質の例である。
【００２１】
本明細書で使用する場合「グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）阻害剤」と言う語は、ＧＳＫを阻害する薬剤を指す。ＧＳＫには、ＧＳＫ１、ＧＳＫ２およびＧＳＫ３が含まれる。
【００２２】
本明細書で使用する場合「ヒストンアセチル化を促進する薬剤」と言う語には、ヒストン脱アセチル化の阻害剤またはヒストンアセチル化剤（ｈｉｓｔｏｎｅ  ａｃｅｔｙｌａｔｏｒ）が含まれる。
【００２３】
本明細書で使用する場合「ヒストン脱アセチル化の阻害剤」と言う語は、ヒストン上のリジン残基からのアセチル基の除去を妨げる薬剤を指す。
【００２４】
「誘導多能性幹細胞」（ｉＰＳＣ）と言う語は、本明細書で使用する場合、非多能性細胞から人工的に導かれた多能性幹細胞の種類である。ＣｉＰＳＣは、ｉＰＳＣであるが、それらは、それらが遺伝子操作されていないという点において一部のｉＰＳＣとは異なる。
【００２５】
「単離された」または「精製された」と言う語は、ＣｉＰＳＣを指す場合非多能性細胞などの細胞種汚染が少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％無い化学的誘導多能性幹細胞を意味する。単離された幹細胞は、実質的に可溶性の、自然に発生する分子も含まない場合がある。
【００２６】
本明細書で使用する場合「多能性」（または多能性の）と言う語は、３種の胚葉、内胚葉（例えば、胃内壁、消化管、肺）、中胚葉（例えば、筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、または外胚葉（例えば、表皮組織および神経系）のいずれかに分化する可能性を有する幹細胞を指す。「多能性ではない」と言う語は、細胞が３種の胚葉の全てに分化する可能性を有さないことを意味する。多分化能幹細胞は、形成性がより小さくより分化され、かつ所与の器官内で細胞のいくつかの種類のうちの１つになり得る。例えば、多分化能血液幹細胞は、赤血球前駆体、白血球または血小板産生細胞になり得る。成体の幹細胞は、多分化能幹細胞である。脂肪由来幹細胞は、多分化能である。
【００２７】
本明細書で使用する場合「再プログラミング」は、１種の特異的細胞種の他種への変換を指す。例えば、多能性ではない細胞は、多能性細胞に再プログラムされ得る。化学化合物を用いて非多能性細胞が多能性細胞に再プログラムされる場合、得られる細胞は、化学的誘導多能性幹細胞である。
【００２８】
本明細書で使用する場合「再プログラミング培地」は、多能性の１種または複数の化学的誘導物質を含む細胞培養培地を指す。
【００２９】
本明細書で使用する場合「Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（ＳＡＨ）阻害剤」は、ＳＡＨを阻害する薬剤を指す。ＳＡＨは、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインのアデノシンおよびホモシステインへの可逆的水和を担う、活性メチルサイクルの酵素である。
【００３０】
本明細書で使用する場合「２ｉ培地」は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３および分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼシグナル伝達の二重阻害を有するＥＳＣ培養培地、例えば、２ｉを添加したＥＳＣ培養培地（ＣＨＩＲ９９０２１およびＰＤ０３２５９０１）を指す。「小分子」と言う語は、２，０００ダルトン未満、より好ましくは１，５００ダルトン未満、最も好ましくは１，０００ダルトン未満の分子量を有する、有機または有機金属化合物などの、分子を指す。
【００３１】
本明細書で使用する場合「トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）受容体阻害剤」は、ＴＧＦβ受容体を阻害する薬剤を指す。ＴＧＦβ受容体は、一回貫通セリン／トレオニンキナーゼ型受容体である。３種のＴＧＦ−β受容体型には、受容体Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型すなわち、ＴＧＦ−β受容体１、ＴＧＦ−β受容体２およびＴＧＦ−β受容体３が含まれる。
【００３２】
ＩＩ．  組成物
Ａ．  多能性を誘導する小分子
多能性を誘導する化学化合物すなわち、多能性の化学的誘導物質（ＣＩＰ）には、単独でまたはタンパク質と組み合わせて、２，０００ダルトン未満、より好ましくは１，５００ダルトン未満、最も好ましくは１，０００ダルトン未満の分子量を有する小分子が含まれる。小分子は、９００ダルトン以下または、５００ダルトン以下の分子量を有していてよい。より大きい分子は、好ましくはここで特定された小分子と同じ経路を標的とする、化学的に誘導された再プログラミングにおいて用いてよい。組換えｂＦＧＦなどの、いくつかのタンパク因子は、化学的再プログラミングのための後続のプロトコールにおいて有効であることが実証されている。
【００３３】
部分的にまたは完全に分化した細胞を多能性細胞に再プログラムするために用いられ得る小分子が、特定されている。必要とされる多能性の化学的誘導物質（ＣＩＰ）には、（１）グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）阻害剤、（２）ＴＧＦβ受容体阻害剤、（３）環状ＡＭＰアゴニスト、（４）Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（ＳＡＨ）阻害剤、（５）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤などの、ヒストンアセチル化を促進する薬剤、およびそれらの組み合わせが含まれる。ＣＩＰは、別々にまたはＣＩＰ組成物としての組み合わせにおいて提供され得る。１種または複数のエピジェネティックな因子およびレチノイン酸受容体アゴニストも、ＣＩＰと共に投与され得る。
【００３４】
好ましい実施形態において、ＧＳＫ阻害剤は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３阻害剤、例えば、化学名［６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル］（「ＣＨＩＲ」）を有するアミノピリミジン、ＣＨＩＲ９９０２１であり、ＴＧＦβ受容体阻害剤は、ＴＧＦβ受容体１型阻害剤、例えば、［２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン］（６１６４５２）であり、ｃＡＭＰアゴニストは、フォルスコリン（ＦＳＫ）でありかつＳＡＨ阻害剤は、３−デアザンプラノシンＡ（ＤＺＮｅｐ）である。
【００３５】
一部の実施形態において、ＣＩＰは、ＣＨＩＲ、６１６４５２、ＦＳＫおよびＤＺＮｅｐの組み合わせ（Ｃ６ＦＺ）である。より好ましい実施形態において、ＣＩＰは、ＶＰＡ、ＣＨＩＲ、６１６４５２、トラニルシプロミン、ＦＳＫ（集合的に、ＶＣ６ＴＦ）およびＤＺＮｅｐ（集合的に、ＶＣ６ＴＦＺ）の組み合わせである。
【００３６】
好ましい実施形態において、ＳＡＨ阻害剤は、３−デアザンプラノシンＡ（ＤＺＮｅｐ）である。本明細書に開示されているＣＩＰ組み合わせ組成物に含まれていてよい他の有用なＳＡＨヒドロラーゼ阻害剤には、これに限定されないが、（−）ネプラノシンＡ（Ｎｅｐ  Ａ）、過ヨウ素酸アデノシン（Ａｄｅｎｏｚｉｎｅ  ｐｅｒｉｏｄａｔｅ）（酸化型）Ａｄｏｘおよび３−デアザアデノシン（ＤＺＡ）ならびにそれらの組み合わせが含まれる。
【００３７】
ヒストンアセチル化を促進する適した薬剤には、ＨＤＡＣ阻害剤が含まれる。ＨＤＡＣ阻害剤の例には、トリコスタチン（Ａ）などのヒドロキサム酸、環状テトラペプチド、ベンズアミド、求電子性ケトン、酪酸ナトリウムならびにフェニル酪酸およびバルプロ酸（ＶＰＡ）などの化合物が含まれる。好ましいＨＤＡＣ阻害剤は、ＶＰＡである。
【００３８】
好ましい実施形態において、ＣＩＰ組成物に含まれていてよいエピジェネティックな修飾物質には、ＤＮＡメチル化を阻害する薬剤、例えば、５−アザシチジン、ＲＧ１０８およびそれらの組み合わせのうちの１種または複数が含まれる。
【００３９】
一部の実施形態において、後期再プログラミングを促進する小分子およびＶＣ６ＴＦＺで見られるレベルを超えて化学的再プログラミング効率を改善／増大する小分子が含まれる。改善／増大された効率は、こうした多能性細胞を生成するために必要な時間を減少することによって（例えば、多能性細胞の発生の時間を小分子を伴わない類似または同一のプロセスと比較して少なくとも一日短くすることによって）証明され得る。代わりに、または組み合わせて、小分子は、特定のプロセスによって生成される多能性細胞の数を増加し得る（例えば、所与の期間における数を小分子を伴わない類似または同一のプロセスと比較して少なくとも１０％、５０％、１００％、２００％、５００％、など増加する）。
【００４０】
後期再プログラミングを促進する小分子には、ｃＡＭＰアゴニスト（例えば、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ＦＳＫおよびロリプラム）ならびにエピジェネティックな修飾物質（例えば、５−アザシチジン、酪酸ナトリウムおよびＲＧ１０８）が含まれる。
【００４１】
化学的再プログラミング効率を改善／増大する小分子には、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、［Ｎ−（９，１０−ジオキソ−９，１０−ジヒドロフェナントレン−２−イル）ピバルアミド］（ＳＦ１６７０）、［Ｎ−（４−（ジエチルアミノベンジリデニル）−Ｎ’−（４−ヒドロキシベンゾイル）−ヒドラジン（ＤＹ１３１  ＤＹ１３１）、［２−シクロヘキシル−６−メトキシ−Ｎ−［１−（１−メチルエチル）−４−ピペリジニル］−７−［３−（１−ピロリジニル）プロポキシ］−４−キナゾリンアミン］（ＵＮＣ０６３８）、［Ｎ−（２−（３−（ピペラジン−１−イルメチル）イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾール−６−イル）フェニル）キノキサリン−２−カルボキサミド塩酸塩］（ＳＲＴ１７２０）、［Ｎ−フタリル−Ｌ−トリプトファン］（ＲＧ１０８）、２−Ｍｅ−５ＨＴ（２−メチル−５−ヒドロキシトリプタミン）、［３，７−ジヒドロ−１−メチル−３−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−プリン−２，６−ジオネアンド］（［３，７−Ｄｉｈｙｄｒｏ−１−ｍｅｔｈｙｌ−３−（２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｙｌ）−１Ｈ−ｐｕｒｉｎｅ−２，６−ｄｉｏｎｅａｎｄ］）（ＩＢＭＸ）および［４−［（Ｅ）−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１−プロペニル］安息香酸］（ＴＴＮＰＢ）が含まれる。化学的再プログラミング効率を増大するために好ましい小分子は、ＴＴＮＰＢである。
【００４２】
多能性を誘導する組成物に含まれていてもよいさらなる分子には、Ｄ４４７６（Ｄ４４７６（ＣＡＳ  ３０１８３６−４３−１）、高純度カゼインキナーゼ阻害剤）、Ｃｈ５５（［４−［（１Ｅ）−３−［３，５−ビス（１，１−ジメチルエチル）フェニル］−３−オキソ−１−プロペニル］安息香酸］、ＲＡＲ−αおよびＲＡＲ−β受容体に対する高親和性ならびに細胞レチノイン酸結合タンパク質（ＣＲＡＢＰ）に対する低親和性を有する高活性合成レチノイド］、ＡＭ５８０（［４−［（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸］、選択的ＲＡＲαアゴニストとして働くレチノイン酸の類似物）、ならびにＥＰＺ００４７７７、「１−（３−（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メチル）（イソプロピル）アミノ）プロピル）−３−（４−（ｔｅｒｔ−ブチル）フェニル）尿素（ＥＰＺ）が含まれる。
【００４３】
細胞を再プログラムするために用いられ得る小分子の組み合わせの例は、表１Ａに示される。
【００４４】
【表１】
0006538669.tif 000002
【００４５】
本明細書に開示されている配合物に含まれていてもよい例示的な小分子のための濃度範囲は、表１Ｂに提供される。
【００４６】
【表２】
0006538669.tif 000003
【００４７】
Ｂ．タンパク因子
組換え型塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）などの、タンパク因子は、化学的再プログラミングのための後続のプロトコールにおいて有効であることが実証されている。ｂＦＧＦは、１０ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬの濃度で用いられ得る。
【００４８】
Ｃ．誘導される細胞
誘導された多能性幹細胞は、任意の哺乳動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、霊長類）などの哺乳動物、好ましくはヒトから得られる部分的にまたは完全に分化した細胞を誘導することによって得られる。供給源には、骨髄、線維芽細胞、胎児組織（例えば、胎児肝組織）、末梢血、臍帯血、膵臓、皮膚あるいは任意の器官または組織が含まれる。好ましい実施形態において、ＣｉＰＳＣは、化学的に誘導された線維芽細胞、脂肪由来幹細胞、神経幹細胞または腸上皮からの細胞から得られる。より好ましい実施形態において、ＣｉＰＳＣは、化学的に誘導された新生児（例えば包皮）または成体線維芽細胞から得られる。しかしながら、ＣｉＰＳＣは、これに限らないが多分化能幹細胞、血液学的起源の細胞、胚性起源の細胞、皮膚由来細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、上皮細胞、内皮細胞、間葉細胞、実質細胞、神経系細胞、および結合組織細胞を含めた他の細胞種から取得してよい。多分化能幹細胞、血液学的起源の細胞、胚性起源の細胞、皮膚由来細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、上皮細胞、内皮細胞、間葉細胞、実質細胞、神経系細胞、および結合組織細胞。再プログラムされる細胞は、哺乳類の対象から得られる試料から取得してよい。対象は、ヒトを含めた、任意の哺乳動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、霊長類）であってよい。細胞の試料は、例えば、骨髄、胎児組織（例えば、胎児肝臓組織）、末梢血、臍帯血、膵臓、皮膚あるいは任意の器官または組織を含めた多数の異なる供給源のいずれかから取得してよい。
【００４９】
好ましい実施形態において、ＣｉＰＳＣは、線維芽細胞および脂肪由来幹細胞から取得される。より好ましい実施形態において、ＣｉＰＳＣは、新生児（例えば包皮線維芽細胞）または成体線維芽細胞であってよい、線維芽細胞から取得される。さらに別の好ましい実施形態において、非多能性細胞は、Ｏｃｔ４を発現しないかつ／あるいは１種または複数のより多くの多能性のマーカーを発現するために遺伝子操作されていない。
【００５０】
細胞は、当業者に既知の技術を用いて細胞供給源としての機能を果たすためである適切な器官または組織を解離することによって単離してよい。例えば、組織または器官は、組織が相当の細胞破壊を伴わずに分散して個々の細胞の懸濁液を形成し得るように、機械的にならびに／あるいは隣接細胞間の連結を弱める消化酵素および／またはキレート剤で処置されて解離され得る。酵素的解離は、組織を細かく刻むことならびに細かく刻まれた組織を例えばトリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、および／またはヒアルロニダーゼ、ＤＮａｓｅ、プロナーゼ、ディスパーゼなどの１種または複数の酵素で処理することによって達成され得る。機械的破壊は、これに限らないが、粉砕機、混合機、篩、細胞破砕機、受圧器、または超音波破砕機（ｉｎｓｏｎａｔｏｒ）の使用を含めたいくつかの方法によっても達成され得る。
【００５１】
Ｄ．化学的誘導多能性幹細胞（ＣｉＰＳＣ）
ＣｉＰＳＣは、生理学的および形態学的に胚性幹細胞（ＥＳＣ）と区別不能である。実施例は、ＣｉＰＳＣが、ＥＳＣと同様の倍加時間で成長し、かつＥＳＣのように、多能性マーカーを発現し、ＥＳＣと同様の遺伝子発現プロファイルを有し、かつＯｃｔ４およびＮａｎｏｇプロモーターにおいて同様のＤＮＡメチル化およびヒストン修飾を有することを示す。核型分析は、ＣｉＰＳＣが染色体異常を獲得しないことも実証する。ＣｉＰＳＣが多能性であるさらなる証拠は、３種の胚性胚葉の組織に分化するそれらの能力である。これらの発見は、患者に特異的な多能性幹細胞の無制限の供給を生成するために分化したヒト細胞を操作する能力を実証する。
【００５２】
ＣｉＰＳＣは、ＥＳＣ形態、ＥＳＣと同様の倍加時間、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１、Ｓｏｘ２、Ｄａｘ１、Ｓａｌｌ４、未分化胚細胞転写因子（Ｕｔｆ１）、ステージ特異的胚抗原−４（ＳＳＥＡ−４）などのＥＳＣマーカーの発現、および細胞が３種の胚性胚葉の組織に分化する能力などのＥＳＣ様特性を保有する。こうした細胞は、ＣｉＰＳＣがそこから誘導された分化細胞のマーカー特性の下向き調節によっても特徴づけられ得る。例えば、線維芽細胞由来のＣｉＰＳＣは、線維芽細胞マーカーＴｈｙ１の下向き調節および／またはＳＳＥＡ−１の上向き調節によって特徴づけられ得る。ＣｉＰＳＣ上に示されなければならない多能性マーカーの最小数は無い。多能性に関するゴールドスタンダードは、３種の胚葉全ての細胞種への分化能である。奇形腫アッセイ、キメラアッセイおよび生殖細胞移行（ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）能力は、それらの分化能を試験するためのいくつかの直接アッセイである。
【００５３】
ＩＩＩ．作成の方法
Ａ．ＣｉＰＳＣの誘導
ＣｉＰＳＣは、部分的にまたは完全に分化した細胞を、細胞の化学的誘導多能性幹細胞（ＣｉＰＳＣ）への再プログラミングをもたらすために十分な期間ＣＩＰを含有する培養培地中に提供することによって誘導される。再プログラムされた細胞は、形態、倍加時間、ＥＳＣマーカーの発現例えばアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１、Ｓｏｘ２、Ｄａｘ１、Ｓａｌｌ４、未分化胚細胞転写因子（Ｕｔｆ１）、ステージ特異的胚抗原−４（ＳＳＥＡ−４）、および３種の胚性胚葉の組織に分化する細胞の能力などのＥＳＣ様特性の保有に基づいて多能性細胞として定義される。
【００５４】
ＣＩＰ化合物は、非多能性細胞の多能性細胞への再プログラミングを誘導および／または増強するために有効な量の誘導される細胞と接触させる。当業者は、下記の実施例において略述されている方法、または当技術分野において既知の他の方法を用いて完全な再プログラミングを提供するために必要な本明細書に開示されているＣＩＰ化合物の濃度を容易に決定し得る。一部の好ましい実施形態において、ＣＩＰには、ＳＡＨ阻害剤が含まれる。
【００５５】
一部の実施形態において、ＶＰＡは、５００μＭから０．５ｍＭの間の濃度まで細胞に投与され、ＣＨＩＲは、１０から２０μＭの間の濃度まで投与され、６１６４５２は、５から１０μＭの間の濃度まで投与され、ＦＳＫは、１０から５０μＭの間の濃度まで投与されかつＤＺＮｅｐは、２０ｎＭから０．１μＭの間の濃度まで投与され、好ましくは、０．０５から０．１μＭの間、およびより好ましくは、２０から２００ｎＭの間である。非多能性細胞における多能性を誘導するために用いられ得る小分子の例示的な組み合わせおよび濃度範囲は、表１ＡおよびＢに提供される。
【００５６】
６１６４５２およびフォルスコリンは、２ｉ培地の使用前の全時間に存在する必要がある。ＣＨＩＲ９９０２１は、最初の１２日間において用いられるべきであり、かつ好ましくは２ｉ培地の使用前の全時間に存在する。ＤＺＮｅｐは、再プログラミングの後期段階（１２日目から４０日目）、好ましくは他の小分子の初期の処置後２０日目に加えられるべきである。小分子の組み合わせ（ＶＣ６ＴＦＺ）は、２８日目から４８日目の間の時点の後、好ましくは４０日目に２ｉ培地に変えられるべきである。異なる細胞種は、異なる小分子の最適濃度を有する。これらは、本明細書に述べる調査に基づく日常実験によって決定され得る。曝露の順番および暴露の期間は、細胞種間で同様である。
【００５７】
好ましい実施形態において、方法には、ＣＩＰを含有する再プログラミング培地中で細胞を２６〜３６日間培養すること、ならびに再プログラミング培地での処置後約２８日後にグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ３）および分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達の二重阻害でＥＳＣ培養培地中で細胞を約４日間さらに培養することが含まれる。一実施形態において、ＧＳＫ３およびＭＡＰＫの二重阻害は、ＣＨＩＲ９９０２１およびＰＤ０３２５９０１を用いて達成される。
【００５８】
細胞は、好ましくはＣＩＰ成分ＶＣ６ＴＦを含有する再プログラミング培地中で約１６〜２０日間、およびＶＣ６ＴＦＺを含有する培地中でその間に細胞が再プログラミング培地に暴露される残りの期間培養される。一部の実施形態において、方法には、細胞を後期再プログラミングを促進する小分子、例えば、フォルスコリン以外のｃＡＭＰアゴニストおよび／または本明細書に開示されているエピジェネティックな修飾物質、ならびに／あるいは本明細書に開示されている化学的再プログラミング効率を改善／増大する小分子と接触させることがさらに含まれる。エピジェネティックな修飾物質は、ＶＣ６ＴＦを含有する組成物に含まれていてよい。あるいは、これらの小分子は、ＶＣ６ＴＦでの細胞の処置の後に細胞培養培地に含まれていてよい。細胞は、好ましくは小分子に１日を超えて暴露される。一部の実施形態において、細胞のｃＡＭＰアゴニストおよびエピジェネティックな修飾物質での処置は、ＶＣ６ＴＦでの処置の期間を超えない。他の実施形態において細胞のｃＡＭＰアゴニストおよびエピジェネティックな修飾物質での処置は、ＶＣ６ＴＦＺでの処置の期間を超えない。さらに他の実施形態において、細胞のｃＡＭＰアゴニストおよびエピジェネティックな修飾物質での処置は、ＶＣ６ＴＦに加えＶＣ６ＴＦＺでの処置の期間を超えない。化学的再プログラミング効率を増大するために好ましい小分子は、ＴＴＮＰＢである。
【００５９】
開示されている方法は、Ｏｃｔ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、Ｃ−ＭｙｃまたはＮＡＮＯＧなどの遺伝子で細胞をトランスフェクトする必要が無くあるいは細胞をＫＬＦ、Ｏｃｔ、Ｍｙｃおよび／またはＳｏｘポリペプチドのいずれかと接触させる必要が無く誘導された多能性幹細胞を与える。
【００６０】
Ｂ．ＣｉＰＳＣの単離
ＥＳ細胞の未分化状態および多能性を維持し得るまたは分化を誘導し得る培地は、本分野において既知である。単離された誘導多能性幹細胞の分化および増殖能力は、ＥＳ細胞に広く適用されている確認手段を用いることによって当業者により容易に確認され得る。
【００６１】
実質的に精製されたＣｉＰＳＣの集団は、例えば、培養源からの抽出によって（例えば、密度勾配遠心分離法および／またはフローサイトメトリーによって）取得され得る。純度は、任意の適切な方法によって測定され得る。多能性細胞は、例えば、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ分析）によって９９％〜１００％精製され得る。ヒト誘導多能性幹細胞は、例えば、誘導された多能性幹細胞上でマーカー（例えば、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−１−６１またはマーカーの組み合わせ）に結合する分子（例えば、抗体、抗体誘導体、リガンドまたはＦｃ−ペプチド融合分子）を利用しそれによって分子に結合する細胞を陽性に選択すること（すなわち、陽性選択）によって単離され得る。陽性選択法の他の例には、望ましいおよび望ましくない細胞種の混合された集団において望ましい細胞種の成長を優先的に促進する方法が含まれる。あるいは、望ましい細胞種上に存在しないが、望ましくない細胞種上に存在するマーカーに結合する分子を用いることによって、こうしたマーカーを含有する望ましくない細胞が、望ましい細胞から除去され得る（すなわち、陰性選択）。他の陰性選択法には、望ましいおよび望ましくない細胞種の混合された集団において望ましくない細胞種の成長を優先的に死滅させるまたは阻害することが含まれる。したがって、陰性選択、陽性選択、またはそれらの組み合わせを用いることによって、幹細胞の濃縮集団が作成され得る。
【００６２】
分離のための手順には、抗体被覆磁気ビーズを用いる、磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、モノクローナル抗体に結合した細胞毒性剤、またはモノクローナル抗体と併用して用いられるこうした薬剤、例えば、補体および細胞毒素、ならびに固体マトリックス（例えば、プレート）に付着した抗体での「パニング」、あるいは他の好都合な技術が含まれ得る。正確な分離を提供する技術には、様々な洗練化の程度、例えば、多色チャンネル、低角および鈍角光散乱検出チャンネル、ならびにインピーダンスチャンネルを有していてよい、蛍光活性化セルソーターが含まれる。抗体は、支持するために結合したアビジンまたはストレプトアビジンと共に除去され得る、ビオチン、あるいは特定の細胞種の分離を容易にするために、蛍光活性化セルソーターと共に用いてよい、蛍光色素の直接分離を可能にする、磁気ビーズなどの、マーカーと結合してよい。誘導された多能性幹細胞の生存度に過度に害を及ぼさない任意の技術を採用してよい。一実施形態において、細胞は、マーカーに対抗する抗体（例えば、ＴＲＡ−１−８１抗体）と共にインキュベートされてマーカーに関して陽性に染色する細胞が手動で選択されて継代培養される。
【００６３】
濃縮方法の組み合わせを、精製または濃縮の時間または効率を改善するために用いてよい。例えば、濃縮ステップ後に当該の細胞種を示していないマーカーを有する細胞を除去するために、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）または高特異性を有する他の方法論によって細胞をさらに分離または濃縮してよい。多色分析は、ＦＡＣＳと共に用いてよい。細胞は、特定の抗原またはその不在に関する染色のレベルに基づいて分離してよい。蛍光色素は、特定の抗原に特異的な抗体を標識するために用いてよい。こうした蛍光色素には、フィコビリタンパク質、例えば、フィコエリトリンおよびアロフィコシアニン、フルオレセイン、ならびにＴｅｘａｓ  ｒｅｄが含まれる。
【００６４】
マーカーに特異的な任意の細胞種は、特定の細胞種を選択または対抗するために用いてよい。濃縮のために有用な誘導幹細胞マーカーは、ＴＲＡ−１−８１などの発現されたマーカーおよびレトロウイルスのベクターまたは他の外生のベクターと関連したマーカー（例えば、ＧＦＰ）の減少を含む。
【００６５】
Ｃ．ＣｉＰＳＣ（およびそれらの子孫）の培養および保存
ＣｉＰＳＣは、培養物中で拡大されて後の回収および使用のために貯蔵され得る。細胞の培養物または混合された幹細胞の培養物が一旦確立されると、細胞の集団は、組織形成を伴ってまたは伴わずに、細胞増殖につながる条件下で細胞密度が必然的に決めるようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで継代により有糸分裂によって拡大されて培地を新しくする。こうした培養方法には、例えば、分化を誘導する特定の成長因子（例えば、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、および／または他の成長因子）が無い培養培地中で細胞を継代することが含まれ得る。培養された細胞は、十分な細胞密度が達成された場合に培地を新しくするために移動してよい。いくつかの幹細胞種は、典型的な接触阻害アポトーシスを実証しないまたはそれらは密度が最大である場合に静止状態になる。したがって、適切な継代技術を、接触阻害および静止状態を低減するために用いてよい。
【００６６】
細胞は、Ｄｏｙｌｅら、（編）、１９９５年、Ｃｅｌｌ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、チチェスターに記載されている物などの、既知の方法に従って貯蔵のために凍結保存してよい。例えば、細胞は、５〜１０％グリセロール有りまたは無しで、例えば、約４〜１０×１０６細胞／ｍｌの密度で、１５〜２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する培養培地などの「凍結用培地」に懸濁させてよい。細胞は、ガラス製またはプラスチック製のバイアルに分注されこれらは次いで密封されてプログラム制御可能なフリーザーまたはパッシブフリーザーの冷凍室に移される。凍結の最適速度は、経験的に決定してよい。例えば、融解熱によって−１℃／分の温度の変化を与える凍結プログラムを用いてよい。細胞を含有するバイアルが−８０℃に達すると、それらは液体窒素貯蔵領域に移される。凍結保存された細胞は、数年間にわたって貯蔵してよい。
【００６７】
ＩＶ．使用方法
所望の細胞種または形態をもたらし得る容易に利用可能な幹細胞の供給源の特定は、治療処置、組織工学および研究のために重要である。幹細胞の使用可能性は、移植、組織工学、血管新生の調節、脈管形成、および細胞置換または細胞療法ならびにある種の疾病の予防において極めて有用であろう。こうした幹細胞は、遺伝子療法投与計画の一部として遺伝子を対象に導入するためにも用いてよい。
【００６８】
Ａ．分化された体細胞（再分化細胞）の提供
幹細胞の培養物は、確立されたら、子孫細胞、例えば、新しい組織を産生する能力がある線維芽細胞を産生するために用いてよい。ＣｉＰＳＣは、３種の胚葉、例えば、上皮細胞を含めた皮膚および有毛細胞、ケラチン合成細胞、メラニン形成細胞、脂肪細胞、骨、筋肉および筋細胞などの結合組織を形成する細胞、軟骨細胞、骨細胞、肺胞細胞、肝細胞などの実質細胞、腎細胞、副腎細胞、および島細胞、血液細胞、網膜細胞（および耳内の有毛細胞または舌上の味蕾を形成する物など知覚に関与する他の細胞）、ならびに神経を含めた神経組織のいずれかの細胞に分化するために誘導され得る。
【００６９】
一実施形態において、ＣｉＰＳＣは、誘導されて「外胚葉分化」培地に細胞を暴露することによって外胚葉起源の細胞に分化する。別の実施形態においてＣｉＰＳＣは、誘導されて「中胚葉分化培地」に細胞を暴露することによって中胚葉起源の細胞に分化する。さらに別の実施形態において、ＣｉＰＳＣは、誘導されて「内胚葉培地」に細胞を暴露することによって内胚葉起源の細胞に分化する。「内胚葉」、「中胚葉」および「外胚葉」培地の成分は、当業者に既知である。細胞が本当に対応する細胞培養培地の系統の細胞に分化していることを検証するために既知の細胞表面マーカーを用いてよい。３種の胚葉の分化を確認するために最も一般に認められているマーカーは、内胚葉細胞についてはアルファ胎児タンパク質、中胚葉についてはアルファ平滑筋アクチン、および外胚葉についてはベータ−ＩＩＩチューブリンの発現であり、それらは全て、通常これらの組織の発生におけるごく初期に発現される。
【００７０】
そこからの組織の産生が後に続く、幹細胞の線維芽細胞または他の細胞種への分化は、特異的な外因性成長因子によってまたは幹細胞培養の培養条件（例えば、密度）の変化によって引き起こされ得る。細胞の所望の細胞種の細胞への分化を誘導する方法は、当技術分野において既知である。例えば、ＣｉＰＳＣは、物質（例えば、成長因子、酵素、ホルモン、または他のシグナル伝達分子）を細胞の環境に添加することによって誘導されて分化し得る。分化を誘導するために用いてよい因子の例には、エリスロポイエチン、コロニー刺激因子、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、またはＭ−ＣＳＦ、インターロイキン、例えば、ＩＬ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、白血病抑制因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒｙ）（ＬＩＦ）、または造血幹細胞因子（Ｓｔｌ）、組織委任細胞との共培養、または特定の系統に委任されつつあるように幹細胞を誘導する他の系統委任細胞型が含まれる。
【００７１】
再分化細胞は、培養物において拡大して後の回収および使用のために貯蔵してよい。
【００７２】
Ｂ．細胞療法
誘導された多能性幹細胞の治療用途には、がん、創傷、新生物、外傷、ウイルス感染、糖尿病など生じる疾病および障害を含めた種々の病理学的状態を治療するために誘導された多能性幹細胞、幹細胞集団、またはそれらの子孫を個体に移植することが含まれる。治療は、現在当技術分野において知られているまたは将来開発される任意の方法に従う、新しい組織を産生するための細胞の使用、およびこのようにして産生された組織の使用を必要とし得る。細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで新しい組織を産生するように移植、注入またはそうでない場合は組織損傷の部位に直接投与してよい。一実施形態において、投与には、遺伝子改変ＣｉＰＳＣまたはそれらの子孫の投与が含まれる。
【００７３】
好ましい実施形態において、ＣｉＰＳＣは、自己細胞から取得され、すなわちドナー細胞は自己細胞である。しかしながら、細胞は、異種細胞から取得してよい。一実施形態において、ドナー細胞は、被移植者に遺伝的に関連したドナーから取得される。別の実施形態において、ドナー細胞は、被移植者に遺伝的に関連しないドナーから取得される。
【００７４】
ヒトＣｉＰＳＣが、被移植対象者と比較して異種の（非自己／同種の）供給源に由来する場合、併用免疫抑制療法は、免疫抑制剤シクロスポリンまたはＦＫ５０６の投与などが、典型的には投与される。しかしながら、ヒト誘導多能性幹細胞の未成熟状態が原因でこうした免疫抑制療法は、必要がない場合がある。したがって、一実施形態において、ヒト誘導多能性幹細胞は、免疫調節性（例えば、免疫抑制）療法の非存在下で被移植者に投与してよい。あるいは、細胞は、流体の交換は可能にするが細胞／細胞接触を妨げる、薄膜内に封入してよい。マイクロカプセル化細胞の移植は、Ｂａｌｌａｄｕｒら、Ｓｕｒｇｅｒｙ、１１７：１８９〜９４、１９９５年、およびＤｉｘｉｔら、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １：２７５〜７９（１９９２年）など、当技術分野において既知である。
【００７５】
（ｉ）糖尿病
真性糖尿病（ＤＭ）は、膵臓が十分なインスリンを産生しないため、または細胞が産生されるインスリンに応答しないためのいずれかで、対象が高血糖を有する代謝性疾患の群である。インスリン療法の期待できる置き換えは、インスリンの必要な患者への島細胞の供給である。Ｓｈａｐｉｒｏら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．、３４３（４）：２３０〜８（２０００年）は、ベータ細胞／島の移植が、糖尿病を有する患者のための療法を提供することを実証している。非常に多くのインスリンの種類が市販されているが、これらの配合物は、注射剤として提供される。ヒト誘導多能性幹細胞は、糖尿病を予防または治療するために島細胞の代替供給源を提供する。例えば、誘導された多能性幹細胞は、単離され膵細胞種に分化されて対象に送達され得る。あるいは、誘導された多能性幹細胞は、対象の膵臓に送達されてｉｎ  ｖｉｖｏで島細胞に分化され得る。したがって、細胞は、糖尿病の発生を予防または治療するための移植に有用である。膵島細胞の生存能力および薬効に影響すること無くサイトカイン暴露後の炎症を減少するための方法は、例えばＮａｚｉｒｕｄｄｉｎらの米国特許第８，６３７，４９４号に開示されている。
【００７６】
（ｉｉ）神経変性障害
神経変性障害は、疾病、遺伝性状態あるいは外傷性または虚血性の脊髄または脳外傷などの、外傷の結果としてのニューロンの変質に関与する状態によって特徴づけられる。神経変性の状態には、ニューロンの損傷または変質に関与する任意の疾病または障害あるいはそれらの症状または原因または影響が含まれる。神経変性の状態には、これに限定されないが、アレキサンダー病、アルパース病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、カナバン病、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン病、ケネディ病（Ｋｅｎｎｅｄｙ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）、クラッベ病、レビー小体型認知症、マチャド−ジョセフ病、多発性硬化症、パーキンソン病、ペリツェウス−メルツバッハー病、ニーマン−ピック病、原発性側索硬化症、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、スティール−リチャードソン−オルスゼフスキー病、脊髄癆または損傷したニューロンに関連した任意の他の状態が含まれ得る。他の神経変性の状態は、外傷性脊髄外傷、虚血性脊髄外傷、卒中、外傷性脳外傷、および遺伝性状態が含まれ得るまたはそれによって引き起こされ得る。
【００７７】
具体的には、開示されている方法には、それらが必要な対象に細胞が神経変性の状態を改善し得るようなｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大されたＮＳＣ、神経前駆細胞、または神経前駆体を移植することが含まれる。拡大された神経幹細胞の移植は、痙攣、硬直、発作、麻痺または任意の他の筋肉の活動過多の症状を有する脊髄症の種々の形態を患っている対象における歩行機能を改善するために用いてよい。異なる神経変性の状態の治療のための神経細胞および神経前駆細胞を拡大および移植するための方法は、例えば、Ｊｏｈｅらの米国特許第８，２３６，２９９号に開示されている。
【００７８】
（ｉｉｉ）がん療法
ＣｉＰＳＣおよびそれらの子孫の治療用途には、がんに関連した症状を治療および／または改善するために誘導された多能性幹細胞、幹細胞集団、またはそれらの子孫を個体に移植することが含まれる。例えば、一実施形態において、ＣｉＰＳＣは、対象の細胞を死滅、減少、または損傷させた化学療法を受けたがん患者に投与され得る。典型的ながんのための幹細胞移植において、全てのがん細胞を破壊することを試みるために、しばしば放射療法と共に、非常に高用量の化学療法が用いられる。この治療は、骨髄中の幹細胞も死滅させる。治療のすぐ後に、幹細胞が、破壊されたこれらを置き換えるために与えられる。
【００７９】
別の実施形態において、ＣｉＰＳＣは、（脱分化因子に加えて）少なくとも１つのさらなる治療因子でトランスフェクトまたは形質転換され得る。例えば、ＣｉＰＳＣが単離されると、細胞は、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチで形質転換し次いで対象に移植または投与されてもよく、あるいは所望の細胞種に分化され移植されて対象に送達されてもよい。こうした条件下でポリヌクレオチドは、ポリペプチド産生物の送達のために対象内で発現される。
【００８０】
（ｉｉｉ）組織工学
ＣｉＰＳＣおよびそれらの子孫は、当技術分野において既知の方法を用いて、組織工学による構造を作成するために用いてよい。組織工学による構成は、損傷した器官または組織の修復または置き換えのための人工器官装置としてを含めた種々の目的のために用いてよい。それらは、タンパク質または構成の細胞によって分泌された他の分子のためのｉｎ  ｖｉｖｏでの送達系としてあるいは一般に薬剤送達系としての機能も果たし得る。組織工学による構成は、組織機能のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルとしてあるいは種々の治療または医薬品の影響を試験するためのモデルとしての使用法も見つかる。幹細胞の移植のための最も一般的に用いられる生体材料骨格は、Ｗｉｌｌｅｒｔｈ、Ｓ．Ｍ．およびＳａｋｉｙａｍａ−Ｅｌｂｅｒｔ、Ｓ．Ｅ．、Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２００８年７月９日）、ＳｔｅｍＢｏｏｋ，  ｅｄ．Ｔｈｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ、ＳｔｅｍＢｏｏｋにおいて概説されている。組織工学技術は、組織成長を維持および促進するための適切な培養基質の選択にしばしば関与する。一般には、これらの基質は、３次元であるべきかつ当該の組織のための所望の形状の骨格を形成するために加工可能であるべきである。
【００８１】
米国特許第６，９６２，８１４号は、一般に組織工学による構成および工学による本来の組織を産生するための方法を開示している。特定の実施例に関して、Ｖａｃａｎｔｉらの米国特許第７，９１４，５７９号は、組織工学による靱帯および腱を開示している。米国特許第５，７１６，４０４号は、ポリマーマトリックスと組み合わせて移植された分離した筋肉細胞を用いる乳房組織の再構築または増大のための方法および組成物を開示している。米国特許第８，７２８，４９５号は、自己真皮線維芽細胞を用いる軟骨の修復を開示している。Ｄｕａｉｌｉｂｉらの米国特許出願公開第２００９００２９３２２号は、歯の代用品の作成において使用するための歯組織を形成するための幹細胞の使用を開示している。米国特許出願公開第２００６／００１９３２６号は、頭蓋内動脈瘤の治療のための細胞−種子組織工学によるポリマーを開示している。Ａｔａｌａによる米国特許出願公開第２００７／００５９２９３号は、損傷した器官例えば腎臓、心臓、肝臓、脾臓、膵臓、膀胱、尿管および尿道を置き換えるために用いられ得る組織工学による構成（およびこうした構成を作成するための方法）を開示している。
【００８２】
（ｉｉ）ＣｉＰＳＣから産生された細胞（子孫）
ＣｉＰＳＣは、３種の胚葉、例えば、上皮細胞を含めた皮膚および有毛細胞、ケラチン合成細胞、メラニン形成細胞、脂肪細胞、骨、筋肉および筋細胞などの結合組織を形成する細胞、軟骨細胞、骨細胞、肺胞細胞、肝細胞などの実質細胞、腎細胞、副腎細胞、および島細胞（例えば、アルファ細胞、デルタ細胞、ＰＰ細胞、およびベータ細胞）、血液細胞（例えば、白血球、赤血球、マクロファージ、およびリンパ球）、網膜細胞（および耳内の有毛細胞または舌上の味蕾を形成する物など、知覚に関与する他の細胞）、ならびに神経を含めた神経組織のいずれかの細胞に誘導されて分化し得る。
【００８３】
（ｉｉｉ）治療組成物
ＣｉＰＳＣは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｅｘ  ｖｉｖｏでの脱分化を促進するために投与、送達または対象、組織もしくは細胞と接触させるために配合してよい。成長因子などのさらなる因子、分化または脱分化を誘導する他の因子、分泌産生物、免疫調節物質、抗炎症剤、退縮因子、神経支配を促進する生物学的活性化合物、脈管化またはリンパ管網の増強、および薬剤を、組み込んでよい。
【００８４】
誘導された多能性細胞は、単独のあるいは担体または支持構造の上または内のＣｉＰＳＣまたはＣｉＰＳＣ子孫の集団を含む組成物を手段として患者に投与してよい。多くの実施形態において、担体は必要とされないであろう。細胞は、細胞が必要とされる部位上または中への注射によって投与してよい。これらの場合において、細胞は、典型的には細胞培養培地を除去するために洗われており生理学的緩衝液に懸濁されるであろう。
【００８５】
他の実施形態において、細胞は、支持構造と共にまたは上もしくは中に組み込まれて提供される。支持構造は、メッシュ、密な支持体、骨格、管、多孔質構造、および／またはヒドロゲルであってよい。支持構造は、全体にまたは部分的に、生分解性または非生分解性であってよい。支持体は、天然または合成のポリマー、チタンなどの金属、骨またはヒドロキシアパタイト、あるいはセラミックで形成されていてよい。天然のポリマーには、コラーゲン、ヒアルロン酸、多糖類、およびグリコサミノグリカンが含まれる。合成のポリマーには、ポリ乳酸などのポリヒドロキシ酸、ポリグリコール酸、およびそれらのコポリマー、ポリヒドロキシ酪酸などのポリヒドロキシアルカン酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリウレタン、ポリカーボネート、およびポリエステルが含まれる。これらは、移植片、管、メッシュ、またはヒドロゲルの形態のために入っていてよい。
【００８６】
密な支持体
支持構造は、細胞がメッシュの中または上に接種される、緩くおられたまたは不織のメッシュであってよい。構造には、密な構造の支持体が含まれ得る。支持体は、管、例えば、神経軸索の再成長のための神経管であってよい。支持体は、ステントまたは弁であってよい。支持体は、細胞の内植および／または多孔質構造内への細胞の接種を可能にする多孔質の界面を有する、膝関節または股関節などの人工関節、あるいはそれらの一部であってよい。支持構造の多くの他の種類も有り得る。例えば、支持構造は、スポンジ、発泡体、珊瑚、または内部孔を有する生体適合性無機構造、あるいは織り合わされたポリマー繊維のメッシュシートから形成され得る。これらの支持構造は、既知の方法を用いて調製してよい。
【００８７】
支持構造は、ヒドロゲル−細胞混合物を成形および支持する孔状の空洞または間隙を有する透過性の構造であってよい。例えば、支持構造は、多孔質のポリマーメッシュ、天然もしくは合成のスポンジ、または金属でできた支持構造あるいは骨またはヒドロキシアパタイトなどの材料であってよい。支持構造の多孔率は、栄養素が構造内に拡散でき、それによって細胞内部に効率的に到達し、かつ細胞によって産生された老廃物が構造の外に拡散し得るようにあるべきである。
【００８８】
支持構造は、新しい組織が所望される空間に適合するように成形され得る。例えば、支持構造は、火傷した皮膚の領域あるいは失われた軟骨または骨の部分の形状に適合するように成形され得る。支持構造は、それが作られる材料に応じて、切断、成型、鋳造、または所望の形状を生成する任意の他の方法によって成形され得る。支持体は、下記で述べるように、支持構造が細胞と共に接種されるまたはヒドロゲル−細胞混合物で満たされる前または後のいずれかに成形してよい。
【００８９】
適したポリマーの例は、グリコリドとラクチドとの９０：１０コポリマーである、ポリグラクチンであり、ＶＩＣＲＹＬ（商標）ブレイド吸収性縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｃｏ．、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、ニュージャージー州）として製造されている。ポリマー繊維（ＶＩＣＲＹＬ（商標）など）は、フェルト状ポリマーシートに織られていてよくまたは圧縮されていてよく、次いでこれは任意の所望の形状に切断され得る。あるいは、ポリマー繊維は、合わせてそれらを支持構造のための所望の形状に鋳造する型内で圧縮してよい。場合によっては、さらなるポリマーを、それらが成型されて繊維メッシュにさらなる構造を変えるまたは与える時にポリマー繊維に追加してよい。例えば、ポリ乳酸溶液を、このポリグリコール繊維メッシュのシートに加えてよく、かつ組み合わせを多孔質の支持構造を形成するために合わせて成型してよい。ポリ乳酸は、ポリグリコール酸繊維の架橋を結合させ、それによってこれらの個々の繊維を被覆して成型された繊維の形状を固定させる。ポリ乳酸は、繊維間の空間も満たす。したがって、多孔率は、支持体に導入されたポリ乳酸の量に従って変化し得る。繊維メッシュを望ましい形状に成型するために必要な圧力は、いたって適度であってよい。必要なのは、効力を生じさせるためのポリ乳酸に結合および被膜作用のために十分に長く繊維が適所に保持されることだけである。
【００９０】
代わりに、または加えて、支持構造には、当技術分野において既知の技術によって生成されるポリマー繊維またはポリマー構造の他の種類が含まれていてよい。例えば、ポリマー薄膜は、ポリマー溶液から溶媒を蒸発することによって取得され得る。これらの膜は、ポリマー溶液が所望の形状のレリーフパターンを有する型から蒸発した場合に所望の形状に鋳造されうる。ポリマーゲルは、当技術分野において既知の圧縮成型技術を用いて薄い、透過性のポリマー構造に鋳造してもよい。
【００９１】
ヒドロゲル
別の実施形態において、細胞は、ヒドロゲルと混合されて細胞−ヒドロゲル混合物を形成する。ヒドロゲルは、注射またはカテーテルによって、あるいは他の支持構造の移植時に投与され得る。架橋は、投与前、投与中または投与後に発生し得る。
【００９２】
Ｖ．キット
本明細書に開示されている多能性の化学的誘導物質（ＣＩＰ）を含むキットが提供される。ＣＩＰは、上述の通りである。これらは、細胞培養培地への追加を容易にして所望の濃度を生成するために定義された濃度を有する形態であってよい。キットには、誘導される細胞の種類に基づいて所望の濃度範囲および投与の時間を提供する手引きが含まれていてよい。キットには、多能性を誘導するための細胞の培養のためにＣＩＰと予備混合された細胞培養培地も含まれていてよい。
【００９３】
本発明は、以下の非限定的な実施例への参照によってさらに理解されるであろう。
【実施例】
【００９４】
材料および方法
マウス
マウス株Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（ＧＯＦＧＦＰ）１１Ｉｍｅｇ／Ｒｂｒｃ（ＯＧ）、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌＶｒ（Ｃ５７）、ＩＣＲおよび１２９Ｓ２／ＳｖＰａｓＣｒｌＶｒ（１２９）を、Ｌｉ、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、２１：１９６〜２０４（２０１１年）によって述べられている通りに購入した。ＯＧマウスを、他の株と交配してＯｃｔ４プロモーター駆動性ＧＦＰを保有する子を作成した。ＩＣＲ、Ｃ５７  Ｘ  １２９、ＯＧ  Ｘ  ＩＣＲ、ＯＧ  Ｘ  １２９およびＯＧ  Ｘ  Ｃ５７を含むマウス株を用いて、一次マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）、マウス新生仔線維芽細胞（ＭＮＦ）、マウス成体線維芽細胞（ＭＡＦ）および脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）を単離した。これらの細胞を、ＣｉＰＳＣ誘導のために用いた。使用した新生仔マウスは２〜３日齢であり使用した成体マウスは７週齢であった。Ｔｅｔ−Ｏｎ  ＰＯＵ５Ｆ１  マウス株Ｂ６、１２９ｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１（ｒｔＴＡ＊Ｍ２）Ｊａｅ  Ｃｏｌ１ａ１ｔｍ２（ｔｅｔＯ−Ｐｏｕ５ｆ１）Ｊａｅ／Ｊを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒら、Ｃｅｌｌ、１２１：４６５〜４７７（２００５年））から購入してＯｃｔ４に加えてＶＣ６Ｔでの再プログラミングのためにのみ使用した。動物実験を、中国、北京大学のＡｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓに従って実行した。
【００９５】
細胞培養
一次ＭＥＦを、生殖隆起の除去に細心の注意を払って、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ、１２６：６６３〜６７６（２００６年））によって述べられている通りに単離した。皮膚からのＭＮＦ、肺からのＭＡＦおよび鼠蹊部脂肪パッドからのＡＤＳＣを、Ｌｉｃｈｔｉら、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．３：７９９〜８１０（２００８年）、Ｓｅｌｕａｎｏｖら、Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．２０１０：２０３３（２０１０年）、Ｔａｔら、Ｃｅｌｌ
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１９：５２５〜５３６（２０１０年）およびＭｃＱｕａｌｔｅｒら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２７：６２３〜６３３（２００９年）によって述べられている通りに単離した。
【００９６】
ＭＥＦ、ＭＮＦ、ＭＡＦおよびＡＤＳＣを、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含有するＤＭＥＭ／高グルコース（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中で培養した。再プログラミングにおいて用いられる細胞は、１から５継代であった。
【００９７】
マウスＥＳＣ（Ｒ１およびＴＴ２）、ｉＰＳＣおよびＣｉＰＳＣを、１０％ノックアウト血清代替物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ−Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１，０００Ｕ／ｍｌの白血病抑制因子（ＬＩＦ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））または２ｉ培地（２ｉ（３μＭのＣＨＩＲ９９０２１および１μＭのＰＤ０３２５９０１）を添加したＥＳＣ培養培地）を含有するＥＳＣ培養培地（ＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてマイトマイシンＣ処置したＭＥＦのフィーダー層上に維持した。培地は毎日変えた。ＥＳＣ、ｉＰＳＣおよびＣｉＰＳＣを、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって継代した。ＣｉＰＳＣ誘導のために、２０〜１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を添加したＬＩＦを含まないＥＳＣ培養培地を化学的再プログラミング培地として用いた。
【００９８】
小分子化合物およびライブラリ
本調査において用いた小分子化合物は、表１Ｄに記載のように購入または合成した。それぞれの化合物の濃度を、表１Ｄに示す。スクリーニングのために用いた小分子ライブラリは、表１Ｃに記載のように購入または組織内で生成した。
【００９９】
【表３】
0006538669.tif 000004
【０１００】
【表４−１】
0006538669.tif 000005
【０１０１】
【表４−２】
0006538669.tif 000006
【０１０２】
【表４−３】
0006538669.tif 000007
【０１０３】
【表４−４】
0006538669.tif 000008
【０１０４】
プラスミド構築およびレンチウイルス産生
ｐＬＬ３．７−ΔＵ６ベクターは、（ＭｃＱｕａｌｔｅｒら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２７：６２３〜６３３（２００９年）によって記述された。マウスＳａｌｌ４を、ＲＴ−ＰＣＲによってＥＳＣ（ＴＴ２）から増幅し、ｐＥＡＳＹ−Ｂｌｕｎｔベクター（ＴｒａｎｓＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にクローン化し、配列決定により確認し次いでｐＬＬ３．７−ΔＵ６のＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ部位に導入した。表２にプライマーを示す。
【０１０５】
【表５】
0006538669.tif 000009
【０１０６】
他の個々の再プログラミング因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４またはｃ−Ｍｙｃ）を含有するレンチウイルスベクターは、Ｚｈａｏら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、３：４７５〜４７９（２００８年）によって記述された。ｔｅｔ−ｏｎ  Ｏｃｔ４系について、Ｆｕ−ｔｅｔ−ｈＯｃｔ４およびＦＵｄｅｌｔａＧＷ−ｒｔＴＡは、Ｌｉら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、２１：１９６〜２０４（２０１１年）、Ｍａｈｅｒａｌｉら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、３：３４０〜３４５（２００８年）によって記述された物と同じであった。製造業者のプロトコールに従ってｓｈＲＮＡ（ＳＩＧＭＡ  ＭｉｓｓｉｏｎＲ  ｓｈＲＮＡ）を用いて遺伝子ノックダウンを実行した。表３にｓｈＲＮＡ配列を示す。レンチウイルス産生、収集および感染は、Ｚｈａｏら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、３：４７５〜４７９（２００８年）によって記述されている通りであった。
【０１０７】
【表６】
0006538669.tif 000010
【０１０８】
ＣｉＰＳＣ誘導
初期細胞（ＭＥＦ、ＭＮＦ、ＭＡＦまたはＡＤＳＣ）を、６ウェルプレートのウェル当り５０，０００細胞の密度または１００ｍｍ皿当り３００，０００細胞で接種した。翌日（０日目）、元の培地を、小分子の組み合わせを含有する化学的再プログラミング培地で置き換えた。小分子の組み合わせ含有培地を、４日毎に変えた。１２日目、これらの細胞を、ＰＢＳ中で洗って０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３７℃で３〜５分消化した。中和後、細胞集塊を、綿密なピペット操作によって単細胞に解離させた。細胞を、採取（６ウェルプレートのウェル当り３００，０００〜１，０００，０００細胞）して６ウェルプレートのウェル当り３００，０００〜５００，０００細胞の密度で小分子の組み合わせを含有する化学的再プログラミング培地中に再播種した。ＤＺＮｅｐを、１６日目または２０日目に細胞培養物に加えた。２８〜３６日目に、ＤＺＮｅｐを含む小分子の組み合わせを除去した。その間に、化学的再プログラミング培地を２ｉ培地で置き換えた。さらに８〜１２日間後、２ｉコンピテント、ＥＳＣ様およびＧＦＰ陽性コロニーを、一次ＣｉＰＳＣコロニーとして計数した。ＯＧレポーター無しの野生型細胞からのＣｉＰＳＣ誘導について、２ｉコンピテントおよびＥＳＣ様コロニーを、一次ＣｉＰＳＣコロニーとして計数した。これらのＣｉＰＳＣコロニーを、拡大および特性評価のためにピックアップした。あるいは、ＣｉＰＳＣは、１２日目の再播種無しで誘導可能であった。
【０１０９】
免疫蛍光法、ＲＴ−ＰＣＲ、ゲノムＰＣＲ、奇形腫形成および核型分析
免疫蛍光法、ＲＴ−ＰＣＲ、ゲノムＰＣＲおよび奇形腫形成を、先述の通りに全て実行した。免疫蛍光法について、一次抗体にはＳＳＥＡ−１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ４３０１）、ＯＣＴ４（Ａｂｃａｍ、ａｂ１８９７６）、ＳＯＸ２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−１７３２０）、ＫＬＦ４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−２０６９１）、ＲＥＸ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−９９０００）、ＮＡＮＯＧ（Ｒ＆Ｄ、ＡＦ２７２９）、ＵＴＦ１（Ａｂｃａｍ、ａｂ２４２７３）、ＳＡＬＬ４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−１６６０３３）が含まれた。二次抗体は、ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、７１５−０２５−１５０）、ロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、７０５−０２５−１４７）、およびロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、７１１−０２５−１５２）を含めた、ローダミンコンジュゲートであった。ＲＴ−ＰＣＲのためのプライマーは、前に記述された物（Ｌｉら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、２１：１９６〜２０４（２０１１年））と同じであった。ゲノムＰＣＲのためのプライマーを、表２に示す。核型分析を、報告されている通りに実行した（Ｌｏｎｇｏら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．６：３２１〜３２８（１９９７年））。
【０１１０】
リアルタイムＰＣＲ
培養された細胞のウェル全体からの全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  ＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて単離した。単コロニーについては、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＲＮＡを単離した。ＲＮＡを、ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（ＴｒａｎｓＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてｃＤＮＡに変換した。Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いかつＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７３００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ上で行ってＰＣＲを実行した。データを、デルタ−デルタＣｔ法を用いて分析した。リアルタイムＰＣＲに用いたプライマーを、表２に示す。
【０１１１】
キメラ構築
キメラマウスを、尖鋭な注射針を用いるＣｉＰＳ細胞の胚盤胞への注入またはＸＹ  Ｃｌｏｎｅレーザーシステム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＴｈｏｒｎｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いる８細胞胚内への注入によって取得した。胚盤胞注入については、１０〜１５個のＣｉＰＳ細胞を、３．５日（交尾後日数）でＦ２（Ｂ６Ｄ２Ｆ１の異系交配）またはＣＤ−１（アルビノ）雌マウスの被移植者胚腔に注入した。宿主８細胞胚を、２．５日で雌マウスから収集して、７〜１０個のＣｉＰＳ細胞を、それぞれの胚に注入した。注入後、胚盤胞および８細胞胚（それぞれの卵管または子宮の突起部において６〜８個の胚）を、それぞれ、２．５日または０．５日の偽妊娠ＣＤ−１雌に移した。キメラマウスを、毛色によって識別し次いでＩＣＲマウスと交配することにより生殖系列伝達について評価した。
【０１１２】
ＤＮＡマイクロアレイおよびＲＮＡ−ｓｅｑ
全ｍＲＮＡを、マウス線維芽細胞、ＣｉＰＳＣよびＥＳＣから単離した。マイクロアレイを、Ｌｉら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、２１：１９６〜２０４（２０１１年）によって報告されている通りに実行した。ＲＮＡ配列決定ライブラリを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｍＲＮＡ−ｓｅｑ  Ｐｒｅｐキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて構築した。断片化およびランダムプライム法を行った２００ｂｐペアドエンドライブラリを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００を用いて配列決定した。マイクロアレイデータの階層クラスタリングを、Ｌｉら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、２１：１９６〜２０４（２０１１年）によって報告されている通りに実行した。ヒートマップを、Ｒ（Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）を用いて生成した。
【０１１３】
バイサルファイトゲノム配列決定法
ゲノムＤＮＡを、製造業者のプロトコールに従ってＭｅｔｈｙｌＣｏｄｅＴＭ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてバイサルファイト処置によって修飾して精製した。表２にプライマーを示す。増幅した断片を、ｐＥＡＳＹ−ｂｌｕｎｔ  Ｖｅｃｔｏｒ（導入遺伝子）にクローン化した。それぞれの試料からランダムに選択した１０個のクローンを、配列決定した。
【０１１４】
ｃＡＭＰ、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）およびＳ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）定量化
ｃＡＭＰを、製造業者のプロトコールに従ってＤｉｒｅｃｔ  ｃＡＭＰ  ＥＬＩＳＡキット（Ｅｎｚｏ）を用いて定量化した。ＳＡＭおよびＳＡＨ定量化については、培養した細胞（１，０００，０００細胞）を、トリプシン処置して２００μｌのＰＢＳ中で超音波処置によって均質化した。次いで４００ｍｇ／ｍｌのＴＣＡの４０μｌを加えた。細胞抽出物を、氷上で３０分間インキュベーションした。４℃（１３，０００ｒｐｍ、１５分）での遠心分離後、０．２２μｍフィルターを通して上清をろ過してＨＩＬＩＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ）を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ）によって分析した。
【０１１５】
比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）分析
ＣＧＨ実験のために、ゲノムＤＮＡを抽出して参照としてＣ５７ＢＬ／６  ＭＥＦ  ＤＮＡ（Ｇｅｎｅ  ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ）を用いてＩｍａｇｅｎｅｓによるＮｉｍｂｌｅＧｅｎ  ３ｘ７２０Ｋマウス全ゲノムタイリングアレイにハイブリダイズした。
【０１１６】
フローサイトメトリー分析
培養した細胞を、単細胞にトリプシン処置し次いで３％ウシ胎児血清を含有するＰＢＳに再懸濁した。内生Ｏｃｔ４−ＧＦＰを用いて、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＦＡＣＳ分析を実行した。データを、ＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ４（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ）で分析した。
【０１１７】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）
ＣｈＩＰを、製造業者のプロトコールに従ってＥＺ−Ｍａｇｎａ  ＣｈＩＰ  Ａ／Ｇキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて実行した。抗Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（Ａｂｃａｍ、ａｂ６００２）、抗Ｈ３Ｋ９ｍｅ２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、０７−４４１）、抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（Ａｂｃａｍ、ａｂ８５８０）および抗Ｈ３Ｋ９ａｃ（Ａｂｃａｍ、ａｂ４４４１）抗体を用いた。免疫沈降後に、リアルタイムＰＣＲによってＤＮＡを分析した。表２に使用したプライマーを示す。
【０１１８】
サザンブロット
「Ｒｏｃｈｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＩＧ−ｌａｂｅｌｅｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｔｏ  ａ  Ｂｌｏｔ」を参照して、ＤＩＧ  Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  ＬａｂｅｌｉｎｇおよびＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ、１１  ５８５  ６１４  ９１０）でサザンブロットを実行した。ｉＰＳ細胞またはＭＥＦから単離された２０μｇのゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化した。ＤＮＡプローブは、プサイ（ｐｓｉ）配列に基づいて設計され、これはｐＬＬ３．７−＿Ｕ６ベクターおよびＦｕ−ｔｅｔベクター内に存在ししたがってウイルス感染後に外因性導入遺伝子と共にゲノムに組み込むことができた。
【０１１９】
ルシフェラーゼ活性アッセイ
ＭＥＦを、２４ウェルプレートのウェル当り４０，０００細胞の密度で平板培養し製造業者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ＆Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＯｃｔ４プロモーターレポーターで一過的にトランスフェクトした。ｐＲＬ−ＴＫプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、内部参照としてそれぞれのウェルにおいて共トランスフェクトして、全てのトランスフェクションの合計ＤＮＡ濃度を、空のｐＬＬ３．７−＿Ｕ６ベクターを加えることによって等化した。トランスフェクション後４８時間で、細胞をＰＢＳ中で洗って受動的溶解緩衝液（ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）に溶解した。ルシフェラーゼ活性を、Ｃｅｎｔｒｏ  ＬＢ９６０  ９６ウェル照度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＤｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定してウミシイタケルシフェラーゼ活性に正規化した。空の発現ベクタープラスミドを、陰性対照として用いた。活性化倍率（ｆｏｌｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）は、空のベクター対照の物と比較したそれぞれの条件についてのウミシイタケルシフェラーゼ活性に対するホタルの比率を表わす。
【０１２０】
ウエスタンブロット分析
細胞を、１００ｍｍ皿内で培養し、ＰＢＳ内で洗って溶解緩衝液内にかき落とした。アリコートを、８〜１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に載せてニトロセルロース膜上でブロットした。膜を、１：１０００の希釈でウサギ抗ＥＺＨ２（Ａｂｃａｍ、ａｂ３７４８）と共に４℃で一晩インキュベーションした。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）／ＨＲＰ（ＺＳＢＩＯ、ＺＢ−２３０１）を、二次抗体として用いた。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて検出を実行した。
【０１２１】
実施例１：Ｏｃｔ４の化学代用物
Ｏｃｔ４の化学代用物を特定するために、ＯＧマウスからのＭＥＦを、１２ウェルプレートのウェル当り２０，０００細胞の密度で平板培養してＳｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃをコードするレンチウイルスに感染させた。感染後、培地を、ＬＩＦを含まないＥＳＣ培養培地で置き換えた。小分子ライブラリからの個々の化学物質を、それぞれのウェルに加えた。培地および化学物質は、４日毎に変えた。化学的処置を、１４〜２０日間またはＧＦＰ陽性コロニーが出現するまで継続した。さらなる確認および最適化のために一次ヒット（Ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｉｔ）を選択した。
【０１２２】
Ｏｃｔ４の非存在下で再プログラミングを可能にする小分子を、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃのウイルス性発現と共に、Ｏｃｔ４プロモーター駆動性緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現（ＯＧ）マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を用いて調査した。１０，０００個までの小分子のスクリーニング後（表１Ｃ）、フォルスコリン（ＦＳＫ）、２−メチル−５−ヒドロキシトリプタミン（２−Ｍｅ−５ＨＴ）、およびＤ４４７６（表１Ｄ）を、Ｏｃｔ４の化学的「代用物」として特定した（図１Ａから１Ｆ）。
【０１２３】
継代したＳＫＭ−ＦＳＫ−ｉＰＳＣは、典型的なＥＳＣ形態を示して
ＧＦＰを均一発現する（図１Ｂ）。ＳＫＭ−ＦＳＫ−ｉＰＳＣは、性腺組織を含め、キメラマウスに寄与し得る。同様に、２−Ｍｅ−５ＨＴ処置でＳＫＭによって誘導されたｉＰＳＣは、キメラマウスに寄与し得る。
【０１２４】
単一遺伝子、Ｏｃｔ４（Ｌｉら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、２１：１９６〜２０４（２０１１年））での再プログラミング可能にする、小分子の組み合わせ「ＶＣ６Ｔ」［ＶＰＡ、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ）、６１６４５２、トラニルシプロミン］を、次に導入遺伝子の非存在下でＯＧ−ＭＥＦに加えてＯｃｔ４の化学代用物を処置するために用いた。データは、ＶＣ６Ｔに加えてＦＳＫ（ＶＣ６ＴＦ）が、Ｅ−カドヘリン、間葉上皮移行マーカー、転写因子による早期再プログラミングの暗示を発現しているいくつかのＧＦＰ陽性集団を誘導したことを示す（Ｌｉら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、７：５１〜６３（２０１０年）、Ｓａｍａｖａｒｃｈｉ−Ｔｅｈｒａｎｉら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、７：６４〜７７（２０１０年））（図２）。しかしながら、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇの発現は、検出できず、かつそれらのプロモーターは過剰メチル化のままであり、抑制されたエピジェネティックな状態を示唆した（図２Ａおよび２Ｂ）。
【０１２５】
実施例２：後期再プログラミングを促進する小分子
後期再プログラミングを促進する小分子を特定するために、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）誘導性のＯｃｔ４発現スクリーニング系を用いた（Ｌｉら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２１：１９６〜２０４（２０１１年））。
【０１２６】
ＯＧマウスからのＭＥＦを、上述の通りに平板培養してＦｕ−ｔｅｔ−ｈＯｃｔ４およびＦＵｄｅｌｔａＧＷ−ｒｔＴＡレンチウイルスに感染させた。上述のように誘導プロトコールを実行した。
【０１２７】
感染後、培養培地を、ＶＣ６Ｔ（ＶＰＡ、ＣＨＩＲ９９０２１、６１６４５２、トラニルシプロミン）に加えてＤＯＸ（１μｇ／ｍｌ）を含有するＬＩＦを含まないＥＳＣ培養培地で置き換えた。あるいは、ＭＥＦが宿るＴｅｔ−Ｏｎ  ＰＯＵ５Ｆ１マウス株Ｂ６、１２９−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１（ｒｔＴＡ＊Ｍ２）ＪａｅＣｏｌ１ａ１ｔｍ２（ｔｅｔＯ−Ｐｏｕ５ｆ１）Ｊａｅ／ＪからのＤＯＸ−誘導性Ｏｃｔ４を、本スクリーニングにおいて用いた（Ｌｉら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、２１：１９６〜２０４（２０１１年））。これらの２つのＤＯＸ−誘導性の系は、本スクリーニングにおいてのみ用いたが、完全な化学的再プログラミングには用いなかった。小分子ライブラリからの個々の化学物質を、それぞれのウェルに加えた。小分子の濃度を、表１Ｄに示す。小分子を、培養の異なる時点において追加した。５−ａｚａ−Ｃ（５−アザシチジン）およびＤＺＮｅｐを、８日目から加えた。培地および化学物質を４日毎に変え、ＤＯＸを最初の４〜８日間のみ加えた。化学的処置を、１６〜２４日間またはＧＦＰ陽性コロニーが出現するまで継続した。さらなる確認および最適化のために一次ヒットを選択した。ＣｉＰＳＣコロニーを、４４日目に計数した。さらなる確認および最適化のために一次ヒットを選択した。
【０１２８】
いくつかのｃＡＭＰアゴニスト（ＦＳＫ、プロスタグランジンＥ２、およびロリプラム）およびエピジェネティックな修飾物質［３−デアザンプラノシンＡ（ＤＺＮｅｐ）、５−アザシチジン、酪酸ナトリウム、およびＲＧ１０８］を含めた、小分子ヒットが、本スクリーニングにおいて特定された（図３および表１Ｄ）。
【０１２９】
実施例３：Ｏｃｔ−４誘導性の系無しでの完全な化学的再プログラミング
Ｏｃｔ４誘導性の系無しで完全な化学的再プログラミングを達成するために、小分子を導入遺伝子の無いＯＧ−ＭＥＦの化学的再プログラミングにおいてさらに試験した。ＤＺＮｅｐをＶＣ６ＴＦ（ＶＣ６ＴＦＺ）での処置後１６日に加えた場合、ＧＦＰ−陽性細胞は、ＶＣ６ＴＦで処置した物よりも最大６５倍頻繁に得られ、密な、上皮様の、輪郭のはっきりした縁部が無いＧＦＰ陽性コロニーを形成していた（図４Ａ〜Ｂおよび４Ｅ）。これらの細胞において、ほとんどの多能性マーカー遺伝子の発現レベルは上昇したがそれでもまだＥＳＣにおけるよりも低く、不完全な再プログラミング状態を示唆していた（図４ＧおよびＨ）。処置後２８日後にグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３および分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼシグナル伝達の二重阻害（２ｉ）を有する２ｉ培地に切り換えた後、ある種のＧＦＰ陽性コロニーは、ＥＳＣ様形態（ドーム形、フェーズブライト（ｐｈａｓｅ−ｂｒｉｇｈｔ）、輪郭のはっきりした縁部を有する均質な）を発生した（図４Ｃ）（Ｓｉｌｖａら、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．、６：ｅ２５３（２００８年）、Ｔｈｅｕｎｉｓｓｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、２１：６５〜７１（２０１１年））。これらのコロニーは、ＥＳＣ様形態を維持して、３０継代より多くさらに培養することができた（図４Ａ、４Ｄおよび４Ｇ）。これらは、化学的誘導多能性幹細胞（ＣｉＰＳＣ）として２ｉ−コンピテント、ＥＳＣ様、およびＧＦＰ−陽性細胞と呼ばれる。上述のようなＣｉＰＳＣの形成の概略図を、図４Ｆに示す。
【０１３０】
次に、小分子の用量および処置持続時間を、５０，０００個の当初平板培養されたＭＥＦから１から２０個のＣｉＰＳＣコロニーの生成へ至るように最適化した（図５Ａ〜Ｋ）。図５Ａ〜Ｆは、ＣｉＰＳＣの誘導におけるＶＰＡ、ＣＨＩＲ９９０２１、６１６４５２、トラニルシプロミンおよびフォルスコリンの可能な濃度を示す。それらは、再プログラミング効率が、異なる濃度の小分子を用いる実験とは異なり得ることも示す。それぞれの小分子に関して好ましい濃度を示す（ＶＰＡ、０．５ｍＭ、ＣＨＩＲ９９０２１、１０μＭ、６１６４５２、１０μＭ、フォルスコリン、５０μＭおよびＤＺＮｅｐ  ５０ｎＭ）。図５Ｇは、ｂＦＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）の好ましい濃度を示し、これはｂＦＧＦがＣｉＰＳＣの誘導において必要なことを示す。図５Ｈ、Ｉ、Ｊは、ＣｉＰＳＣの誘導において用いられる小分子およびｂＦＧＦの好ましい持続時間を示す。図５Ｋは、ＶＣ６ＴＦを含有する培地を２ｉ培地に変える好ましい時点を示す。図５Ａ〜Ｆは、ＣｉＰＳＣの誘導におけるＶＰＡ、ＣＨＩＲ９９０２１、６１６４５２、トラニルシプロミンおよびフォルスコリンの可能な濃度を示す。それらは、再プログラミング効率が、異なる濃度の小分子を用いる実験とは異なり得ることも示す。それぞれの小分子に関して好ましい濃度を示す（ＶＰＡ、０．５ｍＭ、ＣＨＩＲ９９０２１、１０μＭ、６１６４５２、１０μＭ、フォルスコリン、５０μＭおよびＤＺＮｅｐ  ５０ｎＭ）。図５Ｇは、ｂＦＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）の好ましい濃度を示し、これはｂＦＧＦがＣｉＰＳＣの誘導において必要なことを示す。図５Ｈ、Ｉ、Ｊは、ＣｉＰＳＣの誘導において用いられる小分子およびｂＦＧＦの好ましい持続時間を示す。図５Ｋは、ＶＣ６ＴＦを含有する培地を２ｉ培地に変える好ましい時点を示す。
【０１３１】
さらなるスクリーニング後、いくつかの化学的再プログラミングの小分子効果促進剤を特定し、その中で、合成レチノイン酸受容体リガンド、ＴＴＮＰＢは、化学的再プログラミング効率を最大４０倍、転写因子誘導再プログラミング（最大０．２％）に相当する頻度に向上した（図６Ａ〜Ｃ、および表１Ｄ）。ＭＡＦ由来のＣｉＰＳＣで産生された成体キメラマウス（クローンＭＡＦ−ＣｉＰＳ−８４）（Ｆ）およびＭＡＦ由来のＣｉＰＳＣで産生された黒色のＦ２子（クローンＭＡＦ−ＣｉＰＳ−８５）。ゲノムＰＣＲ分析は、ＣｉＰＳＣが導入遺伝子汚染物を含まないことを示した（図６ＤおよびＥ）。
【０１３２】
小分子の組み合わせＶＣ６ＴＦＺを用いて、ＣｉＰＳＣ系統を、ＭＥＦから取得されるよりも約１０倍低い効率でＯＧカセットを持つマウス新生仔線維芽細胞（ＭＮＦ）、マウス成体線維芽細胞（ＭＡＦ）、および脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）から取得した。表４。
【０１３３】
【表７−１】
0006538669.tif 000011
【０１３４】
【表７−２】
0006538669.tif 000012
【０１３５】
【表７−３】
0006538669.tif 000013
【０１３６】
【表７−４】
0006538669.tif 000014
【０１３７】
【表７−５】
0006538669.tif 000015
【０１３８】
【表７−６】
0006538669.tif 000016
【０１３９】
さらに、ＣｉＰＳＣを、ＯＧカセットを持たない野生型ＭＥＦからまたは任意の他の遺伝子修飾からＯＧカセットをもつＭＥＦから達成される物に相当する効率で誘導した。ＣｉＰＳＣは、ゲノムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびサザンブロット分析によってウイルスベクターを含まないことも確認した（図７Ａ〜Ｄ）。
【０１４０】
さらには、小分子の組み合わせを、神経幹細胞および腸上皮から取得される細胞からＣｉＰＳＣを生成するために用いた（表５）。
【０１４１】
【表８】
0006538669.tif 000017
【０１４２】
次にこれらの小分子のどれがＣｉＰＳＣの誘導において重要かを決定するために実験を行った。組み合わせからそれらの個々の使用を中止した４種の必須の小分子（下記に示す）は、有意に減少したＧＦＰ陽性コロニーを生成しかつＣｉＰＳＣは特定されなかった（図８Ａ〜Ｂ）。
【化１】
0006538669.tif 000018
【０１４３】
これらの小分子（Ｃ６ＦＺ）は、ＣＨＩＲ（Ｃ）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３阻害剤（Ｙｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、４５３：５１９〜５２３（２００８年））、６１６４５２（Ｚｈａｎｇら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２１：１９６〜２０４（２０１１年））、形質転換成長因子−ベータ受容体阻害剤（Ｍａｈｅｒａｌｉら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、１９：１７１８〜１７２３（２００９年））、ＦＳＫ（Ｆ）、ｃＡＭＰアゴニスト（図１４Ｆ）（Ｉｎｓｅｌら、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、２３：３０５〜３１４（２００３年））、およびＤＺＮｅｐ（Ｚ）、Ｓ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）ヒドロラーゼ阻害（図１４Ａ）（Ｃｈｉａｎｇら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、Ｔｈｅｒ．７７：１１５〜１３４（１９９８年）、Ｇｏｒｄｏｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０：３５０７〜３５１７（２００３年））である。
【０１４４】
Ｃ６ＦＺは、ＶＣ６ＴＦＺによって誘導された物より１０倍低い効率によるにもかかわらず、ＭＥＦおよびＭＡＦの両方からＣｉＰＳＣを誘導可能であった（表４）。
【０１４５】
アデニル酸シクラーゼを阻害することのＶＣ６ＴＦＺによって生成されたコロニーの数への影響を試験した。２’５’ｄｄＡｄｏによるアデニル酸シクラーゼの阻害は、ＶＣ６ＴＦＺによって形成されたコロニーの数を減少した（図１４Ｆ）。ＦＳＫを、ｃＡＭＰ類似物（ＤＢｃＡＭＰ）単独であるいはホスホジエステラーゼ阻害剤、ＩＢＭＸ、またはホスホジエステラーゼ阻害剤、ロリプラムおよびＩＢＭＸと組み合わせて置き換えることの細胞再プログラミングへの影響も試験した。併用処置においてＤＢｃＡＭＰおよびＩＢＭＸは共に、５０μＭで使用した。データを図１４Ｇ〜Ｊに示す。ロリプラム（１０ｕＭ）、ＩＢＭＸ（５０μＭ）、ＤＢｃＡＭＰ（５０μＭ）およびＦＳＫ（１０μＭ）で処置後のＭＥＦにおけるｃＡＭＰ濃度の細胞内レベルを、対照（−）ＤＭＳＯと比較した（図１４Ｋ）。フォルスコリンは、ｃＡＭＰレベルを有意に上昇し、これは他のｃＡＭＰアゴニスト（ロリプラムおよびＩＢＭＸ）または類似物（ＤＢｃＡＭＰ）と同様である。ＧＦＰ＋多能性幹細胞を、他のｃＡＭＰアゴニストまたは類似物で誘導し、これをフォルスコリンを置換するために使用した。ｃＡＭＰ阻害剤、２’５’ｄｄＡｄｏは、ＣｉＰＳＣ誘導の効率を抑制した。これらを総合すれば、フォルスコリンがｃＡＭＰシグナリング経路を調節することによって化学的再プログラミングを促進することを示唆する。
【０１４６】
実施例４：ＣｉＰＳＣ系統の特性評価
確立されたＣｉＰＳＣ系統を、次いでさらに特性評価した。それらは、ＥＳＣ（１４．７時間）の物と同様の倍加時間（１４．１から１５．１時間）で成長し、アルカリホスファターゼ活性を維持し、かつ免疫蛍光法および逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲによって検出されたように、多能性マーカーを発現した（図９Ａ〜９Ｄ）。具体的には、２１継代からのＣｉＰＳ−２５、７継代からのＣｉＰＳ−２６および２２継代からのＣｉＰＳ−３０を、別の６継代のために培養した。２９継代からのＥＳＣ（Ｒ１）を、対照として用いた。細胞を、３日毎に継代して１２ウェルプレート中でウェル当り２０，０００細胞の密度で２ｉ培地中にフィーダー層無しで接種した。エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝３）を示す。計算されたこれらの細胞の集団倍加時間は、１４．８±２．１（ＣｉＰＳ−２５）、１５．１±１．９（ＣｉＰＳ−２６）、および１４．１±１．７（ＣｉＰＳ−３０）時間であった。これらの時間は、ＥＳＣの物（１４．７±１．２時間）に相当した。
【０１４７】
遺伝子発現プロファイルは、ＣｉＰＳＣ、ＥＳＣ、およびＯＳＫＭ−ｉＰＳＣ（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃによって誘導されたｉＰＳＣ）と同様であった。ＣｉＰＳＣ中のＯｃｔ４およびＮａｎｏｇプロモーターにおけるＤＮＡメチル化状態およびヒストン修飾は、ＥＳＣにおける物と同様であった。加えて、ＣｉＰＳＣは、１３継代まで正常な核型および遺伝的完全性を維持した、すなわち、ＣｉＰＳ細胞は、正常な染色体数、わずかなコピー数多型および遺伝子突然変異を維持し、それらをさらなる臨床応用のために安全な物にしている。
【０１４８】
それらの分化可能性を特性評価するために、ＣｉＰＳＣを、免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに注入した。細胞は、３種全ての胚葉の組織−呼吸上皮（内胚葉）、筋肉細胞（中胚葉）、神経上皮（内胚葉）および色素上皮（外胚葉）に分化可能であった。８細胞胚または胚盤胞に注入した場合、ＣｉＰＳＣは、性腺を含めた、３種全ての胚葉の器官内への組み込みおよび次の世代への伝達の能力があった。成体キメラマウスを、クローンｃｉＰＳ−３４ならびにＦ２子から産生した。クローンＣｉＰＳ−４５の生殖系列寄与は、精巣において示された。成体キメラマウスを、ＭＮＦ由来のＣｉＰＳＣでも産生した（クローンＭＮＦ−ＣｉＰＳ−１）。成体キメラマウスを、ＭＡＦ由来のＣｉＰＳＣで産生した（クローンＭＡＦ−ＣｉＰＳ−６２）。黒色Ｆ２子を、ＭＡＦ由来のＣｉＰＳＣで産生した（クローンＭＡＦ−ＣｉＰＳ−６２）。黒色Ｆ２子を、ＭＡＦ由来のＣｉＰＳＣで産生した（クローンＭＡＦ−ＣｉＰＳ−６３）。キメラを、ＷＴ  ＭＥＦ由来のＣｉＰＳＣで産生し（クローンＣｉＰＳ−ＷＴ１、ＩＣＲ）これを（Ｃ５７×ＤＢＡ）×ＩＣＲ胚に微量注入した。ｃ−Ｍｙｃ（Ｎａｋａｇａｗａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７：１４１５２〜１４１５７（２０１０年））を含めた転写因子によって誘導されたｉＰＳＣから生成されたキメラマウスとは異なり、ＣｉＰＳＣから生成されたキメラマウスは、最大６か月間１００％生存可能でありかつ見掛け上健康であった（図１０）。これらの観察は、ＣｉＰＳＣが多能性に完全に再プログラムされたことを示す（表４）。
【０１４９】
実施例５：小分子の多能性誘導特性
これらの小分子の多能性誘導特性をより良く理解するために、化学的再プログラミング中の全般的遺伝子発現を概略にまとめた。化学的再プログラミング中の遺伝子発現プロファイルの集団化を決定するために、化学的再プログラミング中１２、２０および３２日目にＶＣ６ＴＦＺ（Ｚは２０日目から加えた）で処置した細胞培養試料を分析した。０日目のＭＥＦ、ＣｉＰＳＣおよびＥＳＣを、対照として用いた。リアルタイムＰＣＲおよび免疫蛍光法によって確証された、ある種の鍵多能性遺伝子の逐次活性化が観察された。ＭＥＦ（０日目）と比較して１０倍より多いＥＳＣにおいて発現する遺伝子および３倍より多い試料（３２日目）において発現する遺伝子には、Ｓａｌｌ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８ａ、Ｄｐｐａ２、Ｅｓｒｒｂ、Ｋｌｆ４およびＰｏｕ５ｆ１が含まれる。ＭＥＦ（０日目）およびＥＳＣと比較して３倍より多い試料（３２日目）において発現する遺伝子には、Ｓｏｘ１７、Ｇａｔａ６およびＧａｔａ４が含まれる。２つの多能性関連遺伝子、Ｓａｌｌ４およびＳｏｘ２の発現レベルは、いくつかの胚外内胚葉（ＸＥＮ）マーカーＧａｔａ４、Ｇａｔａ６、およびＳｏｘ１７の発現であったように、ＶＣ６ＴＦに反応して初期に最も有意に誘導された（図１１Ａ〜Ｊ）。Ｓａｌｌ４の発現は、小分子処置後早くも１２時間で最も有意に増大し、Ｓａｌｌ４が化学的再プログラミングにおける多能性への第一歩に関与し得ることを示唆した（図１１Ｄ）。用いた処置から小分子を使用中止にした実験に関して、データは、フォルスコリン、ＣＨＩＲ９９０２１および６１６４５２のそれぞれが、１２日後のＳａｌｌ４およびＳｏｘ２の内因性発現（図１１Ｇおよび１１Ｈ）、ならびにそれに続く他の多能性遺伝子の発現の（図１１Ｉ）の活性化において必須であることを示す。これらの分子は、Ｇａｔａ６、Ｇａｔａ４およびＳｏｘ１７などの、ＸＥＮ遺伝子の活性化においても必要であった。
【０１５０】
化学的再プログラミングにおけるこれらの遺伝子の内因性発現の役割を、遺伝子過剰発現およびノックダウン方式を用いて調査した。データは、Ｓａｌｌ４およびＳｏｘ２の併用過剰発現は、Ｏｃｔ４プロモーター駆動性ルシフェラーゼレポーターを活性化することができ（図１２Ａ〜Ｃ）かつＯｃｔ４発現を誘導することおよびｉＰＳＣを生成することにおいてＣ６Ｆを置き換えるのに十分であった（図１２Ｄ〜Ｅ）ことを示す。Ｓａｌｌ４の内因性発現は、ＸＥＮ遺伝子の活性化を必要とするが、Ｓｏｘ２は必要とせず、逆の場合も同様である（図１３Ａ〜Ｄ）。これは、マウスＸＥＮ形成において前述した物と同様の、Ｓａｌｌ４、Ｇａｔａ４、Ｇａｔａ６、およびＳｏｘ１７によって形成された陽性のフィードバック網を示唆する（Ｌｉｍら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、３：５４３〜５５４（２００８年））。Ｓａｌｌ４またはこれらのＸＥＮ遺伝子のノックダウンは、Ｏｃｔ４活性化およびそれに続く多能性の確立を弱め（図１３Ｅ〜Ｆ）、Ｇａｔａ４およびＧａｔａ６が多能性を誘導することに寄与し得るという以前の発見とは矛盾した（Ｓｈｕら、Ｃｅｌｌ、１５３：９６３〜９７５（２０１３年））。総合すれば、これらの発見は、化学的再プログラミングの早期に作用するＳａｌｌ４仲介分子経路を明らかにした（図１３Ｇ）。このステップは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの両生類の四肢再生中のＳａｌｌ４仲介脱分化プロセスと類似する（Ｎｅｆｆら、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．、２４０：９７９〜９８９（２０１１年））。
【０１５１】
次に、化学的再プログラミングの後期に加えられた、ＤＺＮｅｐの役割を調査した。データは、Ｏｃｔ４発現が、化学的再プログラミングにおけるＤＺＮｅｐの追加後に有意に増大し（図１１Ａ）、かつＤＺＮｅｐが、Ｏｃｔ４の発現を刺激するためには不可欠であるが他の多能性遺伝子にはそうでない（図１１Ｋ）ことを示す。ＳＡＨヒドロラーゼ阻害剤として、ＤＺＮｅｐは、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）に対するＳＡＨの濃度比率を上昇させかつそれによってＳＡＭ依存性の細胞メチル化プロセスを抑制し得る（図１４Ａ）。ＣｉＰＳＣ生成を誘導するためにＶＣ６ＴＦ処置と組み合わせた、ＳＡＨヒドロラーゼ阻害剤（（−）ネプラノシンＡ（Ｎｅｐ  Ａ）、過ヨウ素酸アデノシン（酸化型）Ａｄｏｘおよび３−デアザアデノシン（ＤＺＡ））（（Ｃｈｉａｎｇら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．、７７：１１５〜１３４（１９９８年）、Ｇｏｒｄｏｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３５０７〜３５１７（２００３年））によるＤＺＮｅｐの置き換えを、図１４Ｂに示す。データは、ＮＥＰＡ、ＡＤＯＸおよびＤＺＡが、再プログラミングにおけるＤＺＮｅｐの置き換えにおいてそれぞれ有用であることを示す。それらは、ＤＺＮｅｐと同じ標的を調節し、かつＣｉＰＳＣの生成においてＤＺＮｅｐを置換し得る。
【０１５２】
一貫して、ＤＺＮｅｐは、Ｏｃｔ４プロモーターにおけるＤＮＡメチル化およびＨ３Ｋ９メチル化を有意に減少し（図１１Ｌ）、これはＯｃｔ４活性化におけるその役割を説明し得る（Ｆｅｌｄｍａｎら、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、８：１８８〜１９４（２００６年）、Ｃｈｅｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、４５：３４〜４２（２０１３年））。ＣｉＰＳＣを誘導することにおけるＤＺＮｅｐの機能は、Ｅｚｈ２発現を下向き調節することによって置き換えできなかった（図１４Ｃ〜Ｅ）。初代培養におけるＧＦＰ＋／ＥＳ様コロニーは、ＥＳＣおよび確立されたＣｉＰＳＣに類似して、他のコロニーと違い、高ｍＲＮＡレベルのＮａｎｏｇおよび低レベルのＧａｔａ６を発現する（データは示さず）。それによってマスター多能性遺伝子、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２は、２ｉの存在下で、Ｎａｎｏｇの活性化およびＧａｔａ６のサイレンシングと共に、他の多能性関連遺伝子を活性化して化学的再プログラミングプロセスを実現し得る（Ｓｉｌｖａら、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．６：ｅ２５３（２００８年）、Ｔｈｅｕｎｉｓｓｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、２１：６５〜７１（２０１１年）。Ｂｏｙｅｒら、Ｃｅｌｌ、１２２：９４７〜９５６（２００５年）、Ｃｈａｚａｕｄら、Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ、１０：６１５〜６２４（２００６年））。
【０１５３】
要約すれば、多能性を制御するマスタースイッチとして、多数のエピジェネティックな修飾によって体細胞内で抑制状態に保たれている、Ｏｃｔ４発現は、エピジェネティックな修飾物質ＤＺＮｅｐによって化学的再プログラミングにおいてロックを解除されてＣ６Ｆ誘導性のＳｏｘ２およびＳａｌｌ４の発現によって刺激される（図１３Ｇ）。
【０１５４】
本原理証明研究は、多能性に向けた体細胞の再プログラミングが、小分子化合物のみを用いて操作され得ることを実証する（図１５）。これは、内因性の多能性プログラムが、外因的に提供される「マスター遺伝子」によってではなく、小分子を介した多能性に非特異的な分子経路の調節によって確立され得ることを立証した。これらの発見は、細胞同一性の確立に関する我々の理解を向上しかつ遺伝子操作および製造困難な生物製剤の代わりに、特有の化学物質または薬剤を用いて細胞運命再プログラミングによって再生医療における機能的に望ましい細胞種を生成することの可能性を広げる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図５Ｋ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
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【図１１Ｊ】
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【図１１Ｋ】
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【図１１Ｌ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
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【図１４Ｈ】
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【図１４Ｉ】
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【図１４Ｊ】
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【図１４Ｋ】
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【図１５】
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【配列表】
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