(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えアデノウイルスであって、前記組換えアデノウイルスは、
（ｉ）Ｒｂ結合部位中に欠失または置換を含むＥ１Ａポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｉｉ）Ｅ４ｏｒｆ６／７エクソンの一方または両方の欠失；および
（ｉｉｉ）アデノウイルスＥ１ＡおよびＥ４プロモーター
を含み、
ここで、前記組換えアデノウイルスは、Ｒｂ欠損細胞内で選択的に複製する、組換えアデノウイルス。
【請求項２】
前記Ｅ１Ａポリペプチドが、２つのＲｂ結合部位を含み、かつ前記Ｅ１Ａポリペプチドが、両方のＲｂ結合部位中に欠失または置換を含む、請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３】
前記Ｅ１ＡポリペプチドがＬＸＣＸＥモチーフの欠失を含む、請求項１または請求項２に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４】
前記Ｅ１Ａポリペプチドが、アミノ酸残基１２２〜１２６の欠失、アミノ酸残基２〜１１の欠失、またはその両方を含む、請求項３に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項５】
前記Ｅ１Ａポリペプチドが、残基Ｙ４７における置換、残基Ｃ１２４における置換、またはその両方を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６】
前記残基Ｙ４７における置換はＹ４７Ｈ置換であるか、または前記残基Ｃ１２４における置換はＣ１２４Ｇ置換であるか、またはその両方である、請求項５に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７】
２つのＥ４ｏｒｆ６／７エクソンの一方のみの欠失を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８】
Ｃ末端領域中に欠失を含むＥ４ｏｒｆ１ポリペプチドをコードする遺伝子；あるいはＥ４ｏｒｆ１遺伝子のすべての欠失をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９】
前記Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドが、Ｃ末端領域中に欠失を含む、請求項８に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１０】
前記Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドが、Ｃ末端領域中の最後の４アミノ酸の欠失を含む、請求項９に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１１】
前記Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドが、残基１２５〜１２８の欠失を含む、請求項９に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１３】
対象におけるがんを処置するための組成物であって、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスを含む、組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、静脈内、脈管内、クモ膜下、筋肉内、皮下、腹腔内、または経口的に投与されることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記がんが、肺がん、前立腺がん、結腸直腸がん、乳がん、甲状腺がん、腎がん、肝がん、または白血病である、請求項１３または請求項１４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１３年３月１４日に出願した米国出願第６１／７８２，９３２号に対する優先権を主張する。米国出願第６１／７８２，９３２号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
連邦政府支援の研究の下での権利に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所からの認可番号５Ｔ３２ＧＭ００７２４０−３５の下での政府の資金提供によって行われた。政府は、本発明におけるある特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
がんは、毎年５０万人超の死亡の主原因となる複雑な消耗性疾患である。がんに対するより有効な、選択的な、かつ安全な処置の深刻な必要性がある。この蔓延している生命を危うくする疾患のための現存する処置、例えば、化学療法および手術などは、すべての悪性細胞を稀にしか排除せず、治療上の利益より勝り得る有害な副作用を呈することが多い。
現在のがん処置の欠点の多くに対処する潜在性を有する一手法は、腫瘍溶解性アデノウイルス療法である（Pesonen,  S.ら、Molecular  Pharmaceutics、８巻（１号）：１２〜２８頁（２０１０年））。アデノウイルス（Ａｄ）は、自己複製生物マシンである。これは、タンパク質コート内に包み込まれた直鎖状二本鎖３６ｋｂ  ＤＮＡゲノムからなる。アデノウイルスは、再生するための細胞複製マシナリーに侵入し、これを乗っ取り、アセンブルすると、溶解細胞死を誘導して細胞を脱出し、周囲細胞に広がり、侵入する。これらのまったく同じ細胞性制御は、がんにおける突然変異によって標的にされる。この知識は、腫瘍細胞内で特異的に感染および複製し、これらをバーストさせて、可能な耐性を克服しながら遠位転移を捜し出し、破壊することができる数千のウイルス子孫を放出する、誘導ミサイルのように作用する合成ウイルスを創製するのに活用することができる。したがって、腫瘍溶解性ウイルス設計のゴールは、がん細胞内で特異的に複製するが、正常細胞を無傷のままにするウイルスを生成することである。しかし、がん細胞内で選択的に複製するウイルスを設計することにおいて課題が存在している。したがって、がん細胞内で選択的に複製する追加のウイルスの必要性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Pesonen,  S.ら、Molecular  Pharmaceutics、８巻（１号）：１２〜２８頁（２０１０年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
概要
１つまたは複数の改変を含むＥ１Ａポリペプチド、１つまたは複数の改変を含むＥ４ｏｒｆ６／７ポリペプチド、もしくは１つまたは複数の改変を含むＥ４ｏｒｆ１ポリペプチド、またはこれらの組合せを含むアデノウイルスが本明細書に提供される。改変アデノウイルスを含む組成物およびキットも提供される。さらに、対象における増殖性障害を処置する方法であって、１つまたは複数の改変を含むＥ１Ａポリペプチド、１つまたは複数の改変を含むＥ４ｏｒｆ６／７ポリペプチド、もしくは１つまたは複数の改変を含むＥ４ｏｒｆ１ポリペプチド、またはこれらの組合せを含むアデノウイルスを対象に投与するステップを含む、方法が提供される。
【０００６】
１つまたは複数の実施形態の詳細を、添付の図面および以下の記載で示す。他の特徴、目的、および利点は、本記載および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
１つまたは複数の改変を含むＥ１Ａポリペプチドを含み、１つまたは複数の改変を含むＥ４ｏｒｆ６／７ポリペプチドを含む、アデノウイルス。
（項目２）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが、Ｅ１ＡのＲｂ結合部位中に改変を含む、項目１に記載のアデノウイルス。
（項目３）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが、２つのＲｂ結合部位を含み、かつ前記Ｅ１Ａポリペプチドが、両方のＲｂ結合部位中に改変を含む、項目１に記載のアデノウイルス。
（項目４）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが、前記Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基１２０〜１３０の１つまたは複数において改変を含む、項目１に記載のアデノウイルス。
（項目５）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが、前記Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基１２２〜１２６の１つまたは複数において改変を含む、項目１に記載のアデノウイルス。
（項目６）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが、前記Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基３５〜５５の１つまたは複数において改変を含む、項目１から５のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
（項目７）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが、前記Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基３７〜４９の１つまたは複数において改変を含む、項目１から６のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
（項目８）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが欠失を含む、項目１から７のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
（項目９）
前記欠失が、前記Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基１２２〜１２６の欠失である、項目８に記載のアデノウイルス。
（項目１０）
前記欠失が、前記Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基２〜１１の欠失である、項目８に記載のアデノウイルス。
（項目１１）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが欠失ΔＬＸＣＸＥを含む、項目１に記載のアデノウイルス。
（項目１２）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが、１つまたは複数の置換を含む、項目１から１１のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
（項目１３）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが、残基Ｙ４７、残基Ｃ１２４、または残基Ｙ４７および残基Ｃ１２４の両方において置換を含む、項目１２に記載のアデノウイルス。
（項目１４）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが置換Ｙ４７Ｈを含む、項目１２に記載のアデノウイルス。
（項目１５）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが置換Ｃ１２４Ｇを含む、項目１２に記載のアデノウイルス。
（項目１６）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが、置換Ｙ４７ＨおよびＣ１２４Ｇを含む、項目１２に記載のアデノウイルス。
（項目１７）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが、アミノ酸残基２〜１１の欠失をさらに含む、項目１２から１６のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
（項目１８）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが、Ｅ１Ａのアミノ酸残基１２２〜１２６の欠失および残基Ｙ４７における置換を含む、項目１に記載のアデノウイルス。
（項目１９）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが配列番号１を含む、項目１から１８のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
（項目２０）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが配列番号２を含む、項目１から１８のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
（項目２１）
前記Ｅ４ｏｒｆ６／７ポリペプチドが、Ｅ４ｏｒｆ６／７エクソンの一方または両方において改変を含む、項目１から２０のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
（項目２２）
前記Ｅ４ｏｒｆ６／７ポリペプチドが、Ｅ４ｏｒｆ６／７エクソンの一方または両方の欠失を含む、項目１から２０のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
（項目２３）
前記Ｅ４ｏｒｆ６／７ポリペプチドが配列番号３を含む、項目１から２２のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
（項目２４）
前記Ｅ４ｏｒｆ６／７ポリペプチドが配列番号４を含む、項目１から２２のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
（項目２５）
１つまたは複数の改変を含むＥ４ｏｒｆ１ポリペプチドをさらに含む、項目１から２４のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
（項目２６）
前記Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドが、１つまたは複数の欠失を含む、項目２５に記載のアデノウイルス。
（項目２７）
前記Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドが、Ｅ４ｏｒｆ１のＣ末端領域中に欠失を含む、項目２５に記載のアデノウイルス。
（項目２８）
前記Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドが、前記Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドの残基１２５〜１２８の欠失を含む、項目２５に記載のアデノウイルス。
（項目２９）
前記Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドが配列番号５を含む、項目２５から２８のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
（項目３０）
１つまたは複数の改変を含むＥ１Ａポリペプチドを含み、１つまたは複数の改変を含むＥ４ｏｒｆ１ポリペプチドを含むアデノウイルス。
（項目３１）
前記Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドが、１つまたは複数の欠失を含む、項目３０に記載のアデノウイルス。
（項目３２）
前記Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドが、Ｅ４ｏｒｆ１のＣ末端領域中に欠失を含む、項目３１に記載のアデノウイルス。
（項目３３）
前記Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドが、前記Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドの残基１２５〜１２
８の欠失を含む、項目３１に記載のアデノウイルス。
（項目３４）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが、Ｅ１ＡのＲｂ結合部位中に改変を含む、項目３０から３３のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
（項目３５）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが、２つのＲｂ結合部位を含み、かつ前記Ｅ１Ａポリペプチドが、両方のＲｂ結合部位中に改変を含む、項目３４に記載のアデノウイルス。
（項目３６）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが、前記Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基１２０〜１３０の１つまたは複数において改変を含む、項目３０から３３のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
（項目３７）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが、前記Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基１２２〜１２６の１つまたは複数において改変を含む、項目３０から３３のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
（項目３８）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが、前記Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基３５〜５５の１つまたは複数において改変を含む、項目３０から３３のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
（項目３９）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが、前記Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基３７〜４９の１つまたは複数において改変を含む、項目３０から３３のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
（項目４０）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが欠失を含む、項目３０から３３のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
（項目４１）
前記欠失が、前記Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基１２２〜１２６の欠失である、項目４０に記載のアデノウイルス。
（項目４２）
前記欠失が、前記Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基２〜１１の欠失である、項目４０に記載のアデノウイルス。
（項目４３）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが、欠失ΔＬＸＣＸＥを含む、項目３０から３３のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
（項目４４）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが、１つまたは複数の置換を含む、項目３０から３３のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
（項目４５）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが、残基Ｙ４７、残基Ｃ１２４、またはＹ４７およびＣ１２４の両方において置換を含む、項目４４に記載のアデノウイルス。
（項目４６）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが置換Ｙ４７Ｈを含む、項目４４に記載のアデノウイルス。
（項目４７）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが置換Ｃ１２４Ｇを含む、項目４４に記載のアデノウイルス。
（項目４８）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが、置換Ｙ４７ＨおよびＣ１２４Ｇを含む、項目４４に記載のアデノウイルス。
（項目４９）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが、アミノ酸残基２〜１１の欠失をさらに含む、項目４４から４８のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
（項目５０）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが、Ｅ１Ａのアミノ酸残基１２２〜１２６の欠失および残基Ｙ４７における置換を含む、項目３０から３３のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
（項目５１）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが配列番号１を含む、項目３０から５０のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
（項目５２）
前記Ｅ１Ａポリペプチドが配列番号２を含む、項目３０から５０のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
（項目５３）
Ｒｂ欠損細胞内で選択的に複製する、項目１から５２のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
（項目５４）
項目１から５３のいずれか一項に記載のアデノウイルスおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
（項目５５）
項目５４に記載の医薬組成物および使用のための指示書を含むキット。
（項目５６）
１種または複数の追加の治療剤をさらに含む、項目５５に記載のキット。
（項目５７）
前記治療剤が化学療法剤である、項目５６に記載のキット。
（項目５８）
対象における増殖性障害を処置する方法であって、項目１から５３のいずれか一項に記載のアデノウイルスまたは項目５４に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。
（項目５９）
前記アデノウイルスまたは医薬組成物が、静脈内、脈管内、クモ膜下、筋肉内、皮下、腹腔内、または経口的に投与される、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
１種または複数の追加の治療剤を前記対象に投与するステップをさらに含む、項目５８または５９に記載の方法。
（項目６１）
前記治療剤が化学療法剤である、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記増殖性障害が、肺がん、前立腺がん、結腸直腸がん、乳がん、甲状腺がん、腎がん、肝がん、および白血病からなる群から選択される、項目５８から６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
およそ１０３〜１０１２プラーク形成単位の前記アデノウイルスが前記対象に投与される、項目５８から６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記増殖性障害が転移性である、項目５８から６３のいずれか一項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、腫瘍溶解性ウイルスがん療法の一般的な原理を示す概略図である。
【０００８】
【図２】図２は、アデノウイルス（Ａｄ）の構造的特徴、ならびにボックス内の転写単位、および標識遺伝子を伴ったアデノウイルスゲノムのマップを示す概略図である。
【０００９】
【図３】図３は、野生型Ａｄ５および「ＲＢ／ｐ１６／Ｅ２Ｆ経路」選択的ウイルスに感染した、感染した初代小気道上皮細胞および腫瘍細胞に由来する細胞可溶化物の免疫ブロットのイメージである。腫瘍および初代ヒト細胞を、野生型ウイルス、ＯＮＹＸ−８３８（Ｅ１Ａ  ΔＬＸＣＸＥ）、またはＯＮＹＸ−４１１に感染させ、感染後の様々な時点で回収した。溶解産物を、ウイルス複製の尺度であるウイルスカプシドタンパク質（抗ａｄ５、３つのバンドは、ヘキソン、ペントン、および繊維を含む）の発現について分析した。ＯＮＹＸ−８３８は、腫瘍および初代肺上皮細胞内で無差別に複製する。Ｅ１Ａ  ΔＬＸＣＸＥをアデノウイルスＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、およびＥ４領域（図２に示した）の細胞Ｅ２Ｆ制御と組み合わせるＯＮＹＸ−４１１は、正常細胞に対して腫瘍細胞内で選択的な複製を実証する（Johnsonら、Cancer  Cell、１巻（４号）：３２５〜３３７頁（２００２年））。しかし、Ｅ２Ｆプロモーターは、組換えをもたらし、また、複製を腫瘍細胞内の野生型ウイルスレベルに制限する。
【００１０】
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、Ｅ２Ｆを活性化し、制御されていない複製を誘発するＲｂ／ｐ１６腫瘍抑制因子経路を活性化することに収束させる腫瘍突然変異およびアデノウイルス初期タンパク質を示す概略図である。図４Ａは、Ｒｂ／ｐ１６経路腫瘍抑制因子機能の喪失を生じさせる一般的な突然変異を示す。図４Ｂは、ＲｂおよびＥ２Ｆを直接的に調節解除して細胞をＳ期へと推進するアデノウイルスタンパク質を示す。
【００１１】
【図５】図５は、Ｒｂ−Ｅ２Ｆ細胞周期チェックポイントを調節解除するタンパク質をコードする複数のアデノウイルスを示す概略図である。アデノウイルスＥ１Ａは、保存ＬＸＣＸＥモチーフによって細胞Ｒｂに結合し、Ｅ２Ｆを放出してウイルスおよび細胞のＤＮＡ複製に要求される細胞遺伝子の転写を活性化する。Ｅ１Ａは、アデノウイルスがＲｂチェックポイントを不活化し、Ｅ２Ｆ標的遺伝子を活性化する非常に重要な機構であると考えられている。さらに、別のアデノウイルスタンパク質、Ｅ４ｏｒｆ６／７は、Ｅ２Ｆ−ＤＰ１を安定化させ、細胞およびウイルスのＥ２プロモーターにおいて二量体化して転写活性化を増強する（Schaley,  J.ら、Protein  J.  Virol.、７４巻（５号）：２０８４〜２０９３頁（２０００年）；Cressら、Genes  &  Development、７巻（１０号）：１８５０〜６１頁（１９９３年））。
【００１２】
【図６】図６は、本研究における最初の一連の突然変異アデノウイルスの構築を示す概略図である。野生型Ａｄ５ゲノムを転写単位によってモジュールに分割し、モジュールのそれぞれを、異なるプラスミド中に入れた。突然変異をモジュールプラスミドに対して行い、ＰＣＲベース手法（ＡｄＳｌｉｃＲ）を使用して、モジュールを再アセンブルして完全ゲノムにし、組換えアデノウイルスの産生を可能にした。
【００１３】
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、Ｅ４ｏｒｆ６／７欠失を示す概略図である。２つのエクソンは、Ｅ４ｏｒｆ６／７をコードする。Ｅ４ｏｒｆ６およびＥ４ｏｒｆ６／７は、同じ開始コドンを利用し、５８個のアミノ酸Ｎ末端残基を共有する。Ｅ４ｏｒｆ６／７転写物は、Ｅ４ｏｒｆ６終止コドンの直後でスプライスする。終止コドンを含むＥ４ｏｒｆ６／７の第２のエクソン全体を欠失させた。図７Ａは、野生型Ｅ４領域を示す。図７Ｂは、得られたＥ４  ΔＥ４ｏｒｆ６／７領域を示す。
【００１４】
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、突然変異体Ａｄ感染細胞からのアデノウイルス初期Ｅ１Ａの発現を示す細胞可溶化物の免疫ブロットの画像である。細胞を、モック（ｍｏｃｋ）（ΔＥ１）、Ａｄ−１０２（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０２とも本明細書で呼ばれる）（野生型）、Ａｄ−１８１（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８１とも本明細書で呼ばれる）（Ｅ１Ａ  ΔＬＸＣＸＥ／ΔＥ４ｏｒｆ６／７）、Ａｄ−１８９（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ−１８９とも本明細書で呼ばれる）（Ｅ１Ａ  ΔＬＸＣＸＥ）、またはＯＮＹＸ−８３８（Ｅ１Ａ  ΔＣＲ２）に感染させた。ＯＮＹＸ−８３８は、Ｅ１ＡのＣＲ２ドメイン内にあるΔＬＸＣＸＥも欠く。図８Ａについては、静止状態ヒト初代小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）を、ＭＯＩ１０で感染させた。溶解産物をＥ１Ａ発現について分析した。Ａｄ−１０２（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０２）は、感染中のより遅い時間においてＥ１Ａレベルの予期される低下を示す。同様に、Ａｄ−１８９（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８９）およびＯＮＹＸ−８３８は、感染中のより遅い時間においてＥ１Ａの低下を示すが、より早い時点でより強い発現を有する。Ａｄ−１８１（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８１）は、感染全体にわたってＥ１Ａのより強い、かつ継続した発現を示し、それは、アデノウイルスライフサイクルを通じて進行することができないことを示す。図８Ｂについては、コンフルエントな肺腺癌細胞（Ａ５４９）をＭＯＩ３０で感染させた。溶解産物をＥ１Ａ発現について分析した。すべての感染は、感染中のより遅い時間においてＥ１Ａレベルの予期される低下を示し、一般的なアデノウイルスライフサイクル進行を示す。
【００１５】
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、感染した初代細胞および腫瘍細胞内の細胞サイクリンの発現およびアデノウイルス後期タンパク質発現を示す細胞可溶化物の免疫ブロットの画像である。細胞を、モック（ΔＥ１）、Ａｄ−１０２（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０２）（野生型）、Ａｄ−１８１（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８１）（Ｅ１Ａ  ΔＬＸＣＸＥ／ΔＥ４ｏｒｆ６／７）、Ａｄ−１８９（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８９）（Ｅ１Ａ  ΔＬＸＣＸＥ）、またはＯＮＹＸ−８３８（Ｅ１Ａ  ΔＣＲ２）に感染させた。図９Ａについては、静止状態ヒト初代小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）を、ＭＯＩ１０で感染させた。野生型およびＥ１Ａ突然変異単独を有するウイルスと対照的に、Ａｄ−１８１（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８１）は、Ｅ２Ｆ依存性細胞周期標的、Ｓ期サイクリンＡおよびサイクリンＢを活性化することができない。さらに、Ｅ４ｏｒｆ６／７突然変異を有するＡｄ−１８１（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８１）およびＡｄ−２１０（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ２１０）は、後期タンパク質発現および複製について欠損している。これらの欠損の両方は、Ａｄ−２１０（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ２１０）では、より少ない程度に明らかである。図９Ｂについては、ヒト肺腺癌細胞（Ａ５４９）を、ＭＯＩ３０で感染させた。感染した初代細胞と対照的に、後期構造タンパク質の発現において明らかな欠損はまったくなく、サイクリンＡおよびサイクリンＢは、すべての感染させたＡ５４９試料中で存在したままである。
【００１６】
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、感染したＳＡＥＣおよびＡ５４９における、ＦＡＣＳによってＰＩで定量化したＤＮＡ複製を示すＦＡＣＳヒストグラムである。細胞を、モック（ΔＥ１）、Ａｄ−１０２（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０２）（野生型）、Ａｄ−１８１（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８１）（Ｅ１Ａ  ΔＬＸＣＸＥ／ΔＥ４ｏｒｆ６／７）、Ａｄ−１８９（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８９）（Ｅ１Ａ  ΔＬＸＣＸＥ）、またはＡｄ−２１０（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ２１０）（ΔＥ４ｏｒｆ６／７）に感染させ、感染させて４８時間後に収集した。非感染細胞のＤＮＡ含量は、バックグラウンドプロファイル中に示されている。Ｙ軸は、細胞の相対存在量であり、Ｘ軸は、細胞内のＰＩからの蛍光であり、これは、ＤＮＡの量に比例する。図１０Ａについては、静止状態ＳＡＥＣを、ＭＯＩ１０で感染させた。Ａｄ−１８１（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８１）感染により、Ａｄ−１０２（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０２）と比べてＳＡＥＣ内の強いＤＮＡ複製欠損が明らかになり、これは、ウイルス複製の低下に関係している。中程度の欠損が、この時点でＡｄ−２１０（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ２１０）感染ＳＡＥＣにおいても明らかである。図１０Ｂについては、ヒト肺腺癌細胞（Ａ５４９）を、ＭＯＩ３０で感染させた。ＤＮＡ複製欠損は、いずれの突然変異ウイルス感染についても明らかでない。
【００１７】
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、感染したＳＡＥＣおよびＡ５４９からのアデノウイルスバーストを示すグラフである。細胞を、モック（ΔＥ１）、Ａｄ−１０２（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０２）（野生型）、Ａｄ−１８１（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８１）（Ｅ１Ａ  ΔＬＸＣＸＥ／ΔＥ４ｏｒｆ６／７）、Ａｄ−１８９（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８９）（Ｅ１Ａ  ΔＬＸＣＸＥ）、Ａｄ−２１０（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ２１０）（ΔＥ４ｏｒｆ６／７）、またはＯＮＹＸ−８３８（Ｅ１Ａ  ΔＣＲ２）に感染させ、培地を、感染させて４８および７２時間後に収集した。培地中の感染性ウイルス粒子をＥＬＩＳＡによって定量化した。図１１Ａについては、静止状態ＳＡＥＣを、ＭＯＩ１０で感染させた。Ａｄ−１８１（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８１）およびＡｄ−２１０（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ２１０）感染はともに、Ａｄ−１０２（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０２）と比べてＳＡＥＣ内の強い複製欠損を明らかにする。図１１Ｂについては、Ａ５４９細胞を、ＭＯＩ３０で感染させた。これらの時点におけるＡｄ−２１０（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ２１０）を例外として、ウイルス複製における欠損はまったくない。
【００１８】
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂは、感染させて７日後の感染したＳＡＥＣおよびＡ５４９の細胞生存率を示すグラフである。細胞を、モック（ΔＥ１）、Ａｄ−１０２（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０２）（野生型）、Ａｄ−１８１（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８１）（Ｅ１Ａ  ΔＬＸＣＸＥ／ΔＥ４ｏｒｆ６／７）、Ａｄ−１８９（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８９）（Ｅ１Ａ  ΔＬＸＣＸＥ）、Ａｄ−２１０（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ２１０）（ΔＥ４ｏｒｆ６／７）、またはＯＮＹＸ−８３８（Ｅ１Ａ  ΔＣＲ２）の連続希釈液に感染させ、細胞の代謝活性を、ＷＳＴ−１アッセイ（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、スイス）によって定量化した。図１２Ａに示したように、Ａｄ−１０２（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０２）と比較して、Ａｄ−１８１（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８１）は、ＳＡＥＣ内の細胞殺傷能力の低下を提示する。図１２Ｂに示したように、本発明者らがデータを有するウイルスのうち、野生型と比べて、突然変異ウイルスによる細胞殺傷の欠損はまったくない。
【００１９】
【図１３】図１３Ａは、細胞可溶化物の免疫プロットの画像であり、図１３Ｂおよび１３Ｃは、Ａｄ−１８１（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８１）が正常ヒト星状細胞（ＮＨＡ）内で弱毒化された感染を有することを示すグラフである。図１３Ａについては、ＭＯＩ１０感染ＮＨＡを免疫ブロットに付して、アデノウイルス後期構造タンパク質発現および細胞サイクリン誘導を検出した。Ａｄ−１８１（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８１）は、サイクリンＡを誘導せず、Ａｄ−１０２（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０２）と比べて後期ウイルスタンパク質発現の遅延および低下を実証し、これらのことは、複製効率を示す。図１３Ｂについては、ＮＨＡを、ウイルスのパネルによって感染させ、培地中の感染性粒子の数を、感染させて４８および７２時間後に定量化した。Ａｄ−１８１（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８１）およびＡｄ−１８９（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８９）は、Ａｄ−１０２（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０２）と比べてＮＨＡ内の複製欠損を実証する。図１３Ｃについては、ＤＮＡ複製を、ＰＩ  ＦＡＣＳによって、感染させて４８時間後にＭＯＩ１０感染ＮＨＡ内で定量化した。非感染細胞のＤＮＡ含量は、ヒストグラムのバックグラウンドプロファイル中に示されている。Ｙ軸は、細胞の相対存在量であり、Ｘ軸は、細胞内のＰＩからの蛍光であり、これは、核酸の量に比例する。Ａｄ−１８１（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８１）は、Ａｄ−１０２（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０２）と比べてＤＮＡ複製の誘導の縮小を実証し、これは、ウイルス複製の低下に関係する。
【００２０】
【図１４】図１４Ａは、感染したグリア芽細胞腫Ｕ８７細胞からの細胞可溶化物の免疫ブロットの画像であり、図１４Ｂおよび１４Ｃは、突然変異Ａｄが、グリア芽細胞腫Ｕ８７細胞内で複製欠損をまったく有さないことを示すグラフである。図１４Ａについては、ＭＯＩ２０感染Ｕ８７細胞を免疫ブロットに付して、アデノウイルス後期構造タンパク質発現および細胞サイクリン誘導を検出した。Ｂ）Ｕ８７を、ウイルスのパネルによって感染させ、培地中の感染性粒子の数を、感染させて４８および７２時間後に定量化した。Ｃ）ＤＮＡ複製を、ＰＩ  ＦＡＣＳによって、感染させて４８時間後にＭＯＩ２０感染Ｕ８７内で定量化した。非感染細胞のＤＮＡ含量は、ヒストグラムのバックグラウンドプロファイル中に示されている。Ｙ軸は、細胞の相対存在量であり、Ｘ軸は、細胞内のＰＩからの蛍光であり、これは、核酸の量に比例する。
【００２１】
【図１５】図１５Ａは、感染したグリア芽細胞腫Ｕ１１８細胞からの細胞可溶化物の免疫ブロットの画像であり、図１５Ｂおよび１５Ｃは、突然変異Ａｄが、グリア芽細胞腫Ｕ１１８細胞内で複製欠損をまったく有さないことを示すグラフである。図１５Ａについては、ＭＯＩ２０感染Ｕ１１８細胞を免疫ブロットに付して、アデノウイルス後期構造タンパク質発現および細胞サイクリン誘導を検出した。Ｂ）Ｕ８７を、ウイルスのパネルによって感染させ、培地中の感染性粒子の数を、感染させて４８および７２時間後に定量化した。Ｃ）ＤＮＡ複製を、ＰＩ  ＦＡＣＳによって、感染させて４８時間後にＭＯＩ２０感染Ｕ１１８内で定量化した。非感染細胞のＤＮＡ含量は、ヒストグラムのバックグラウンドプロファイル中に示されている。Ｙ軸は、細胞の相対存在量であり、Ｘ軸は、細胞内のＰＩからの蛍光であり、これは、核酸の量に比例する。
【００２２】
【図１６】図１６Ａは、ゲルの画像であり、図１６Ｂおよび１６Ｃは、Ａｄ−１８１（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８１）が、ヒト線維芽細胞（ＩＭＲ９０）内で中程度の複製欠損を有することを示すグラフである。図１６Ａについては、ＭＯＩ１０感染線維芽細胞を免疫ブロットに付して、後期構造タンパク質発現を検出した。Ａｄ−１８１（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８１）は、Ａｄ−１０２（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０２）と比べて後期ウイルスタンパク質発現の遅延および低下を実証し、これらのことは、複製効率を示す。図１６Ｂについては、線維芽細胞を、ウイルスのパネルによって感染させ、培地中の感染性粒子の数を、感染させて４８および７２時間後に定量化した。これらの時点におけるこのアッセイでは、突然変異アデノウイルスの複製能力において明確な差異はまったくなかった。図１６Ｃについては、ＤＮＡ複製を、ＰＩ  ＦＡＣＳによって、感染させて４８時間後にＭＯＩ２０感染線維芽細胞内で定量化した。非感染細胞のＤＮＡ含量は、ヒストグラムのバックグラウンドプロファイル中に示されている。Ｙ軸は、細胞の相対存在量であり、Ｘ軸は、細胞内のＰＩからの蛍光であり、これは、核酸の量に比例する。Ａｄ−１８１（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８１）は、Ａｄ−１０２（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０２）と比べてＤＮＡ複製の誘導の縮小を実証し、これは、ウイルス複製の低下に関係する。
【００２３】
【図１７】図１７は、感染させて１０日後の感染した初代正常ヒト星状細胞細胞（ＮＨＡ）の細胞生存率を示すグラフである。細胞を、ｗｔおよび突然変異ウイルスの連続希釈液に感染させた（以下の表１を参照）。代謝活性を、ＷＳＴ−１アッセイ（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、スイス）によって定量化した。細胞１個当たり３個および１０個の感染性粒子での細胞の生存率は、より少ない殺傷およびより多い殺傷の２つの群へのウイルスによる細胞殺傷の分離を示す。より少ない殺傷を呈するウイルスの群は、Ｒｂ結合突然変異およびＥ４ｏｒｆ６／７の欠失を有するＥ１Ａの両方を持つ。より多い殺傷を呈するウイルスの群は、野生型Ｅ１または野生型Ｅ４を有する。
【００２４】
【図１８】図１８は、感染させて９日後の感染した静止状態ＳＡＥＣ−ｈＴＥＲＴ細胞の細胞生存率を示すグラフである。細胞を、ｗｔおよび突然変異ウイルスの連続希釈液に感染させた（以下の表１を参照）。代謝活性を、ＷＳＴ−１アッセイ（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、スイス）によって定量化した。細胞１個当たり３個および１０個の感染性粒子での細胞の生存率は、より少ない殺傷およびより多い殺傷の２つの群へのウイルスによる細胞殺傷の分離を示す。より少ない殺傷を呈するウイルスの群は、Ｒｂ結合突然変異およびＥ４ｏｒｆ６／７の欠失を有するＥ１Ａの両方を持つ。より多い殺傷を呈するウイルスの群は、野生型Ｅ１または野生型Ｅ４を有する。
【００２５】
【図１９】図１９は、感染させて９日後の感染した増殖中のＳＡＥＣ−ｈＴＥＲＴ細胞の細胞生存率を示すグラフである。細胞を、ｗｔおよび突然変異ウイルスの連続希釈液に感染させた（以下の表１を参照）。代謝活性を、ＷＳＴ−１アッセイ（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、スイス）によって定量化した。細胞１個当たり３個および１０個の感染性粒子での細胞の生存率は、より少ない殺傷およびより多い殺傷の２つの群へのウイルスによる細胞殺傷の分離を示す。より少ない殺傷を呈するウイルスの群は、Ｒｂ結合突然変異およびＥ４ｏｒｆ６／７の欠失を有するＥ１Ａの両方を持つ。より多い殺傷を呈するウイルスの群は、野生型Ｅ１または野生型Ｅ４を有する。
【００２６】
【図２０】図２０は、感染させて７日後の感染したＡ５４９細胞の細胞生存率を示すグラフである。細胞を、ｗｔおよび突然変異ウイルスの連続希釈液に感染させた（以下の表１を参照）。代謝活性を、ＷＳＴ−１アッセイ（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、スイス）によって定量化した。
【００２７】
【図２１】図２１は、感染させて７日後の感染したヒト乳がん細胞（ＭＤＡ  ＭＢ２３１）の細胞生存率を示すグラフである。細胞を、ｗｔおよび突然変異ウイルスの連続希釈液に感染させた（以下の表１を参照）。代謝活性を、ＷＳＴ−１アッセイ（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、スイス）によって定量化した。
【００２８】
【図２２】図２２は、感染させて７日後の感染したグリア芽細胞腫細胞（Ｕ８７）の細胞生存率を示すグラフである。細胞を、ｗｔおよび突然変異ウイルスの連続希釈液に感染させた（以下の表１を参照）。代謝活性を、ＷＳＴ−１アッセイ（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、スイス）によって定量化した。
【００２９】
【図２３】図２３は、図１７〜２２に示した、感染した初代ＮＨＡ、ＳＡＥＣ−ｈＴＥＲＴ（静止状態）、ＳＡＥＣ−ｈＴＥＲＴ（増殖中）、Ａ５４９、ＭＤＡ  ＭＢ２３１、およびＵ８７細胞についての細胞生存率アッセイの定量化を示す表である。
【００３０】
【図２４】図２４は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８２およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８３に感染した２９３細胞のＣＰＥ顕微鏡イメージである。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８２およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８３はともに、Ｅ１Ａ  ΔＬＸＣＸＥおよびΔＥ４ｏｒｆ６／７突然変異を持ち、Ｅ３−１２．５Ｋ  ｏｒｆ中に挿入をさらに持つ。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８２では、Ｅ３−１２．５Ｋ  ＯＲＦは、蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙをコードする配列によって置き換えられている。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８３では、Ｅ３−１２．５Ｋ  ＯＲＦは、アポトーシスのシグナルを送る切断不可能なＦａｓＬをコードする配列によって置き換えられている。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
詳細な説明
Ｒｂ／ｐ１６／Ｅ２Ｆ経路は、ほとんどあらゆる形態のヒトがんにおいて突然変異によって、または他の機構、例えば、ウイルス機構を通じて不活化されている。例として、経路は、Ｒｂ中の突然変異、ｐ１０７突然変異、ｐ１３０突然変異、ｐ１６突然変異／エピジェネティックなサイレンシング、サイクリン突然変異および増幅、ＣＤＫ突然変異および増幅、サイクリン依存性キナーゼ（cyclin  depdent  kinase）阻害剤をダウンレギュレートする突然変異、Ｅ２Ｆ転写因子をアップレギュレートする突然変異、ならびに増殖因子受容体経路突然変異（ＥＧＦＲ、ＲＴＫ、ＲＡＳ、ＰＩ−３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＲＡＦ、ＭＹＣ）を通じて不活化され得る。しかし、最も受け入れられている化学療法は、増殖毒であり、これは、Ｅ２Ｆ転写標的を阻害するが、正常細胞にも有毒であり、壊滅的な医原性合併症を有することが多い。腫瘍突然変異および小さなＤＮＡウイルスのタンパク質は、Ｒｂを不活化することに収束させる。アデノウイルスＥ１Ａを用いた試験は、ＲｂおよびＥ２Ｆへの影響力の大きい洞察をもたらした。腫瘍溶解性アデノウイルスの元の概念は、Ｅ１ＡΔＬＸＣＸＥ変異体であったが、作用物質は、少なくとも初代細胞培養において選択的でない。Ｅ１Ａは、保存された（ＣＲ２）ＬＸＣＸＥモチーフを介してＲｂに結合し、これを不活化し（Whyteら、Nature、３３４巻（６１７８号）：１２４〜９頁（１９８８年））、それにより、Ｅ２Ｆ依存性転写が活性化される（Kovesdiら、PNAS、８４巻（８号）：２１８０〜４頁（１９８７年））。これは、Ｅ１ＡがＥ２Ｆを活性化し、細胞およびウイルスゲノム複製に要求される細胞およびウイルス遺伝子の発現を推進する機構であると考えられている。したがって、アデノウイルスＥ１ＡΔＣＲ２突然変異体は、Ｒｂ／ｐ１６腫瘍抑制因子経路内に突然変異を有していた腫瘍細胞内で選択的に複製するはずであることが提案された（Heiseら、Nat.  Med.、６巻（１０号）：１１３４〜９頁（２０００年））。しかし、意外にも、Ｅ１ＡΔＣＲ２ウイルス突然変異体は、Ｅ２Ｆを依然として活性化し、初代ヒト上皮細胞内で複製する（Johnsonら、Cancer  Cell、１巻（４号）：３２５〜３３７頁（２００２年））。本明細書に記載するように、アデノウイルスは、Ｅ１Ａとは独立にＥ２Ｆを活性化する追加のウイルスタンパク質、Ｅ４ｏｒｆ６／７をコードすることが発見された。以前の試験では、Ｅ４ｏｒｆ６／７は、Ｅ２ＦおよびＤＰ１に結合してウイルスＥ２プロモーターの転写を活性化することが示されていた（HelinおよびHarlow、J.  Virol.、６８巻（８号）：５０２７〜５０３５頁（１９９４年））。Ｅ１Ａ  ＣＲ２突然変異体がＥ２Ｆを依然として活性化し、初代細胞内で複製することを考慮して、Ｅ４ｏｒｆ６／７は、Ｅ１Ａとは独立に、Ｅ２Ｆ依存性細胞標的を活性化してＳ期エントリーおよびウイルス複製を推進すると仮定された。したがって、正常細胞に対して腫瘍内で選択的に複製するウイルスを設計するために、Ｅ１ＡおよびＥ４ｏｒｆ６／７の両方において突然変異を有するアデノウイルスを設計した。したがって、以下の実施例に記載するように、Ｅ１ＡΔＣＲ２および／またはΔＥ４ｏｒｆ６／７複合突然変異（compound  mutation）を有する新規ウイルスが、正常細胞に対��て腫瘍内で選択的な溶解性複製を起こすか否かを探索した。野生型およびＥ１ＡΔＣＲ２ウイルスと対照的に、Ｅ１ＡΔＣＲ２／ΔＥ４ｏｒｆ６／７およびまたΔＥ４ｏｒｆ６／７ウイルスは、カプシドタンパク質発現を欠いていること、Ｅ２Ｆ標的遺伝子−サイクリンＡおよびＢを誘導することができないこと、Ｓ期エントリーおよびウイルス複製を誘発することができないことによって立証されるように、初代細胞内で不十分に複製する。対照的に、これらのウイルスは、Ａ５４９細胞および腫瘍細胞株のパネル内で野生型（ＷＴ）ウイルスレベルまで複製する。したがって、提供されるアデノウイルスは、選択的ながん治療剤である。
【００３２】
新規Ｒｂ／ｐ１６／Ｅ１Ｆ腫瘍選択的腫瘍溶解性ウイルス療法が本明細書に提供される。これらのウイルスは、自己永続的である潜在性を有し、調節された細胞死によって腫瘍細胞を殺し、腫瘍内だけでなく、転移部にも広がり得る子孫を産生する。
【００３３】
定義
本明細書に言及される場合、用語「アデノウイルス」は、ヒトから単離された５２超のアデノウイルスサブタイプ、ならびに他の哺乳動物およびトリからの同数のものを示す。例えば、The  Adenoviruses、Ginsberg編、Plenum  Press、New  York、N.Y.中のStrauss、「Adenovirus  infections  in  humans」、４５１〜５９６頁（１９８４年）を参照。用語「アデノウイルス」は、血清型を示す数値が後に続いた略語「Ａｄ」、例えば、Ａｄ５を用いて本明細書に言及され得る。この用語は、２つのヒト血清型、Ａｄ２およびＡｄ５に任意選択で適用する。これらのアデノウイルスの例示的な核酸配列としては、それだけに限らないが、ヒトアデノウイルス５（配列番号７）およびヒトアデノウイルス２（配列番号８）がある。
【００３４】
用語「Ｅ１Ａ」は、アデノウイルス初期領域１Ａ（Ｅ１Ａ）遺伝子およびこの遺伝子から発現されるポリペプチドを指す。用語「Ｅ１Ａポリペプチド」は、Ｅ１Ａ遺伝子から発現されるポリペプチドを指し、この用語は、アデノウイルス血清型のいずれかによって産生されるＥ１Ａポリペプチドを含む。例として、Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくともＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＥ０１１４７．１、ＡＰ＿０００１６１．１（配列番号１）、およびＡＰ＿０００１９７．１（配列番号２）において見つけることができる。これらのポリペプチドをコードする核酸は、少なくともＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＣ＿０００００８．１（配列番号７）およびＡＣ＿０００００７．１（配列番号８）において見つけることができる。配列番号１または配列番号２と６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ超の配列同一性を含むＥ１Ａポリペプチドも提供される。Ｅ１Ａポリペプチドは、細胞を細胞周期へと推進することによってウイルスゲノム複製において役割を有する。様々なヒトおよびサルアデノウイルス血清型のＥ１Ａ配列の比較により、保存アミノ酸相同性の３つの領域が同定された。Ａｄ５では、保存領域１（ＣＲ１）は、配列番号２と比較してアミノ酸残基４０〜８０の間にマップしており、ＣＲ２は、配列番号２と比較してアミノ酸残基１２１〜１３９の間にマップしており、ＣＲ３は、配列番号２と比較して残基１４０〜１８８の間にマップしている。
【００３５】
用語「Ｅ４ｏｒｆ１」は、アデノウイルスの、いくつかのオープンリーディングフレームを含有するＥ４遺伝子から産生されるアデノウイルスＥ４ｏｒｆ１ポリペプチドを指す。用語「Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチド」は、アデノウイルス血清型のいずれかに由来するＥ４遺伝子によって産生されるＥ４ｏｒｆ１ポリペプチドを含む。例として、Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくともＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＰ＿０００１９６．１（配列番号５）およびＡＰ＿０００２３２．１（配列番号６）において見つけることができる。これらのポリペプチドをコードする核酸は、少なくともＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＣ＿０００００８．１（配列番号７）およびＡＣ＿０００００７．１（配列番号８）において見つけることができる。配列番号５または配列番号６と６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ超の配列同一性を含むＥ４ｏｒｆ１ポリペプチドも提供される。
【００３６】
用語「Ｅ４ｏｒｆ６／７」は、アデノウイルスの、いくつかのオープンリーディングフレームを含有するＥ４遺伝子から産生されるアデノウイルスＥ４ｏｒｆ６／７ポリペプチドを指す。用語「Ｅ４ｏｒｆ６／７ポリペプチド」は、アデノウイルス血清型のいずれかに由来するＥ４遺伝子によって産生されるＥ４ｏｒｆ６／７ポリペプチドを含む。例として、Ｅ４ｏｒｆ６／７ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくともＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＰ＿０００１９１．１（配列番号３）およびＡＰ＿０００２２７．１（配列番号４）において見つけることができる。これらのポリペプチドをコードする核酸は、少なくともＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＣ＿０００００８．１（配列番号７）およびＡＣ＿０００００７．１（配列番号８）において見つけることができる。配列番号３または配列番号４と６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ超の配列同一性を含むＥ４ｏｒｆ６／７ポリペプチドも提供される。
【００３７】
「核酸」は、一本鎖または二本鎖形態でのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、およびこれらのポリマー、ならびにこれらの相補体を指す。この用語は、合成の、天然に存在する、および天然に存在しないものであり、参照核酸と同様の結合性を有し、かつ参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される公知のヌクレオチド類似体または修飾骨格残基もしくは連結を含有する核酸を包含する。このような類似体の例としては、限定することなく、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、ホスホン酸メチル、キラルホスホン酸メチル、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）がある。
【００３８】
別段の指定のない限り、特定の核酸配列は、その保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）および相補配列、ならびに明示的に示された配列も暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって実現され得る（Batzerら、Nucleic  Acid  Res.、１９巻：５０８１頁（１９９１年）；Ohtsukaら、J.  Biol.  Chem.、２６０巻：２６０５〜２６０８頁（１９８５年）；Rossoliniら、Mol.  Cell.  Probes、８巻：９１〜９８頁（１９９４年））。用語の核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換的に使用される。
【００３９】
特定の核酸配列は、「スプライスバリアント」も暗黙的に包含する。同様に、核酸によってコードされる特定のタンパク質は、その核酸のスプライスバリアントによってコードされる任意のタンパク質を暗黙的に包含する。「スプライスバリアント」は、名称が示唆するように、遺伝子の代替スプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物がスプライスされ得、その結果、異なる（代替の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードする。スプライスバリアントの産生の機構は様々であるが、エクソンの代替のスプライシングを含む。リードスルー転写によって同じ核酸に由来する代替のポリペプチドも、この定義によって包含される。スプライス産物の組換え型を含めたスプライシング反応の任意の産物がこの定義内に含まれる。カリウムチャネルスプライスバリアントの一例が、Leicherら、J.  Biol.  Chem.、２７３巻（５２号）：３５０９５〜３５１０１頁（１９９８年）に論じられている。
【００４０】
核酸は、これが別の核酸配列と機能的な関係に置かれているとき、「作動可能に連結している」。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーのＤＮＡは、これがポリペプチドの分泌に参加するタンパク質前駆体として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結しており、プロモーターもしくはエンハンサーは、これが配列の転写に影響する場合、コード配列に作動可能に連結しており、またはリボソーム結合部位は、これが翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に作動可能に連結している。一般に、「作動可能に連結した」は、連結されているＤＮＡ配列が互いに近くにあり、分泌リーダーの場合では、連続しており、リーディング相内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、必ずしも連続している必要はない。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーは、従来の慣行に従って使用される。
【００４１】
２つまたはそれ超の核酸またはポリペプチド配列の脈絡における用語「同一の」またはパーセント「同一性」は、以下に記載されるデフォルトのパラメータを用いてＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを使用して、またはマニュアル整列および目視検査（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトなどを参照）によって測定される場合、同じである、または同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定されたパーセンテージ（すなわち、比較ウインドウもしくは指定領域にわたって最大対応について比較および整列されるとき、特定された領域にわたる約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ超の同一性）を有する２つまたはそれ超の配列または部分配列を指す。このとき、このような配列は、「実質的に同一」であると言われる。この定義は、試験配列の相補体（compliment）も指し、またはそれに適用され得る。この定義は、欠失および／または付加を有する配列、ならびに置換を有するものも含む。以下に記載するように、好適なアルゴリズムは、ギャップなどを説明することができる。好ましくは、同一性は、長さが少なくとも約２５アミノ酸もしくはヌクレオチドである領域にわたって、またはより好ましくは、長さが５０〜１００アミノ酸もしくはヌクレオチドである領域にわたって存在する。
【００４２】
配列比較について、典型的には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験および参照配列がコンピューター中に入力され、部分配列座標が指定され、必要であれば、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。好ましくは、デフォルトのプログラムパラメータを使用することができ、または代替のパラメータが指定され得る。次いで、配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメータに基づいて、参照配列と比べた試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【００４３】
「比較ウインドウ」は、本明細書において、２つの配列が最適に整列された後、配列が連続した位置の同じ数値の参照配列と比較され得る２０〜６００、通常約５０〜約２００、より通常には約１００〜約１５０からなる群から選択される連続した位置の数値の任意の１つのセグメントへの言及を含む。比較のために配列を整列する方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適な整列は、例えば、Smith  &  Waterman、Adv.  Appl.  Math.、２巻：４８２頁（１９８１年）の局所相同性アルゴリズムによって、Needleman  &  Wunsch、J.  Mol.  Biol.、４８頁：４４３巻（１９７０年）の相同性整列アルゴリズムによって、Pearson  &  Lipman、Proc.  Nat’l.  Acad.  Sci.  USA、８５巻：２４４４頁（１９８８年）の類似性探索法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化されたインプリメンテーション（ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、またはマニュアル整列および目視検査（例えば、Current  Protocols  in  Molecular  Biology（Ausubelら編、１９９５年増補）を参照）によって行うことができる。
【００４４】
パーセント配列同一性および配列類似性を判定するのに適したアルゴリズムの好適な例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Altschulら、Nuc.  Acids  Res.、２５巻：３３８９〜３４０２頁（１９７７年）およびAltschulら、J.  Mol.  Biol.、２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）に記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、核酸およびタンパク質のパーセント配列同一性を判定するのに、本明細書に記載のパラメータを用いて使用される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、当技術分野で公知であるように、国立バイオテクノロジー情報センターによって公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードで整列されるとき、いくつかの正の値の閾値スコアＴにマッチし、またはそれを満たすクエリー配列中の長さＷのショートワードを同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を最初に同定する。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschulら、上記）。これらの初期近隣ワードヒットは、これらを含有するより長いＨＳＰを見つけるための探索を開始するためのシードとして作用する。ワードヒットは、累積的な整列スコアが増大され得る限り、各配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（マッチ残基の対についてのリワードスコア；常に０超）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティースコア；常に０未満）を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスが累積スコアを計算するのに使用される。各方向でのワードヒットの拡張は、累積的整列スコアがその最大達成値から量Ｘ離れ；累積スコアが、１つもしくは複数の負のスコア残基整列の蓄積に起因してゼロもしくはゼロ未満に向かい；またはいずれかの配列の最後に到達するとき、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、整列の感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列についての）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長、１０の期待値（Ｅ）、および５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff  &  Henikoff、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８９巻：１０９１５頁（１９８９年）を参照）整列（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。
【００４５】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すのに本明細書で互換的に使用される。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人為的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーに、かつ天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用する。
【００４６】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素に結合しているα炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する化学化合物を指す。
【００４７】
アミノ酸は、これらの一般に公知の３文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨された１文字記号によって本明細書で参照される場合がある。ヌクレオチドは、同様に、これらの一般に受け入れられている１文字コードによって参照される場合がある。
【００４８】
「保存的に改変されたバリアント」は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用する。特定の核酸配列に関して、保存的に改変されたバリアントは、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指し、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝コードの縮重のために、多数の機能的に同一の核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンが一コドンによって特定されるあらゆる位置で、そのコドンは、コードされるポリペプチドを変更することなく、記載した対応するコドンのいずれかに変更され得る。このような核酸バリエーションは、「サイレントバリエーション」であり、これは、保存的に改変されたバリエーションの１つの種である。ポリペプチドをコードする本明細書のあらゆる核酸配列は、核酸のあらゆる可能なサイレントバリエーションも記述する。当業者は、核酸中の各コドン（通常、メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常、トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）は、改変されて機能的に同一の分子を生じ得ることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントバリエーションは、実際のプローブ配列に関してではなく、発現産物に関してそれぞれの記載された配列中に潜在している。
【００４９】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列中の単一アミノ酸または小パーセンテージのアミノ酸を変更し、付加し、または欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失、または付加は、変更が一アミノ酸の化学的に同様のアミノ酸との置換をもたらす「保存的に改変されたバリアント」であることを認識するであろう。機能的に同様のアミノ酸をもたらす保存的置換表は、当技術分野で周知である。このような保存的に改変されたバリアントは、多型バリアント、種間同族体、および対立遺伝子に加えてのものであり、これらを除外しない。
【００５０】
以下の８つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton、Proteins（１９８４年）を参照）。
【００５１】
用語「組換え体」は、例えば、細胞、ウイルス、核酸、タンパク質、あるいはベクターを参照して使用される場合、細胞、ウイルス、核酸、タンパク質、またはベクターが、異種の核酸もしくはタンパク質の導入または天然の核酸もしくはタンパク質の変更によって改変されており、あるいは細胞がそのように改変された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）型内で見出されない遺伝子を発現し、または別の方法で異常に発現され、過少発現され、もしくはまったく発現されない天然遺伝子を発現する。
【００５２】
語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブが、典型的には核酸の複合混合物中でその標的部分配列にハイブリダイズするが、他の配列にまったくハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況で異なることになる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションへの広範なガイドは、Tijssen、Techniques  in  Biochemistry  and  Molecular  Biology--Hybridization  with  Nucleic  Probes、「Overview  of  principles  of  hybridization  and  the  strategy  of  nucleic  acid  assays」（１９９３年）に見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度、ｐＨで特定配列の熱融点（Ｔｍ）より約５〜１０℃低いように選択される。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度、ｐＨ、および核濃度下の）である（標的配列は過剰に存在するので、Ｔｍで、プローブの５０％が平衡状態で占有される）。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加しても実現され得る。選択的または特異的なハイブリダイゼーションについて、陽性信号は、バックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下の通りであり得る：６５℃での０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの洗浄を伴った、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベーション、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベーション。
【００５３】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、これらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合、依然として実質的に同一である。これは、例えば、１コピーの核酸が遺伝子コードによって許容される最大コドン縮重を使用して作られるとき起こる。このような場合では、核酸は、典型的には、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。例示的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」としては、３７℃での４０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳの緩衝液中のハイブリダイゼーション、および４５℃での１×ＳＳＣ中の洗浄がある。陽性のハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも２倍である。当業者は、代替のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を利用して、同様のストリンジェンシーの条件をもたらすことができることを容易に認識するであろう。ハイブリダイゼーションパラメータを判定するための追加のガイドラインは、多数の参考文献、例えば、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、Ausubelら編、John  Wiley  &  Sonsに提供されている。
【００５４】
ＰＣＲについて、約３６℃の温度が低ストリンジェンシー増幅で典型的であるが、アニーリング温度は、プライマー長に応じて約３２℃から約４８℃の間で変化し得る。高ストリンジェンシーＰＣＲ増幅については、約６２℃の温度が典型的であるが、高ストリンジェンシーアニーリング温度は、プライマー長および特異性に応じて約５０℃〜約６５℃の範囲であり得る。高および低ストリンジェンシー増幅の両方についての典型的なサイクル条件は、３０秒〜２分間の９０℃〜９５℃の変性相、３０秒〜２分続くアニーリング相、および１〜２分間の約７２℃の伸長相を含む。低および高ストリンジェンシー増幅反応についてのプロトコールおよびガイドラインは、例えば、Innisら、（１９９０年）、PCR  Protocols,  A  Guide  to  Methods  and  Applications、Academic  Press,  Inc.、N.Y.に提供されている。
【００５５】
用語「組換え体」は、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに言及して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが、実験室法によって改変されている、または実験室法の結果であることを示す。したがって、例えば、組換えタンパク質は、実験室法によって生成されるタンパク質を含む。組換えタンパク質は、タンパク質の天然（非組換え）型内に見つからないアミノ酸残基を含み得、修飾された、例えば、標識されたアミノ酸残基を含み得る。
【００５６】
用語「異種の」は、核酸の部分を参照して使用される場合、核酸が、自然において互いに同じ関係内に見つからない２つまたはそれ超の部分配列を含むことを示す。例えば、新しい機能的な核酸を作製するように手配された無関係の遺伝子に由来する２つまたはそれ超の配列、例えば、１つの源に由来するプロモーターおよび別の源に由来するコード配列を有する核酸が、典型的には組換えで生成される。同様に、異種タンパク質は、タンパク質が、自然において互いに同じ関係内に見つからない２つまたはそれ超の部分配列を含むことを示す（例えば、融合タンパク質）。
【００５７】
本明細書において、用語「改変」は、核酸またはポリペプチド配列の配列変更を指す。例えば、アミノ酸配列改変は、典型的には、３つのクラス：置換、挿入、または欠失バリアントの１つまたは複数に入る。挿入としては、アミノおよび／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入がある。欠失は、タンパク質配列からの１つまたは複数のアミノ酸残基の除去によって特徴付けられる。本明細書において、記号Δまたはデルタは、欠失を指す。例えば、Ｅ１ＡΔＬＸＣＸＥは、ＬＸＣＸＥドメインの欠失を有するＥ１Ａポリペプチドを指す。置換改変は、少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入されたものである。アミノ酸置換は、典型的には、単一残基のものであるが、いくつかの異なる位置で一度に起こり得る。置換、欠失、挿入、またはこれらの任意の組合せは、最終的なコンストラクトに達するように組み合わせることができる。これらの改変体は、タンパク質をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドを改変し、それによって改変体をコードするＤＮＡを生成することによって調製され得る。公知の配列を有するＤＮＡ中の所定の部位で挿入、欠失、および置換突然変異を行うための技法は、周知である。改変技法では、１つまたは複数のポリペプチド領域をコードするＤＮＡ配列を操作するための組換えＤＮＡ技術を使用することができる。任意選択で、改変技法は、例えば、組換え、Ｍ１３プライマー突然変異誘発、およびＰＣＲ突然変異誘発を含む。
【００５８】
用語「トランスフェクション」、「トランスダクション」、「トランスフェクトする」、または「トランスダクトする」は、互換的に使用することができ、細胞に核酸分子またはタンパク質を導入するプロセスとして定義される。核酸は、非ウイルスまたはウイルスベース方法を使用して細胞に導入される。核酸分子は、完全なタンパク質をコードする配列またはその機能的な部分であり得る。典型的には、タンパク質発現に必要なエレメント（例えば、プロモーター、転写開始部位など）を含む核酸ベクター。トランスフェクションの非ウイルス方法としては、細胞内に核酸分子を導入するための送達システムとしてウイルスＤＮＡまたはウイルス粒子を使用しない任意の適切な方法がある。例示的な非ウイルストランスフェクション法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソームトランスフェクション、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショックによるトランスフェクション、マグネトフェクション（magnetifection）、および電気穿孔がある。ウイルスベース方法については、任意の有用なウイルスベクターを本明細書に記載の方法において使用することができる。ウイルスベクターの例としては、それだけに限らないが、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスベクターがある。一部の態様では、核酸分子は、当技術分野で周知の標準手順に従ってアデノウイルスベクターを使用して細胞内に導入される。用語「トランスフェクション」または「トランスダクション」は、外部環境から細胞内にタンパク質を導入することも指す。典型的には、タンパク質のトランスダクションまたはトランスフェクションは、細胞膜を横断することができるペプチドまたはタンパク質の目的のタンパク質への付着を利用する。例えば、Fordら（２００１年）、Gene  Therapy、８巻：１〜４頁、およびProchiantz（２００７年）、Nat.  Methods、４巻：１１９〜２０を参照。
【００５９】
「対照」または「標準対照」は、検査試料、測定値、または値との比較のための参照、通常公知の参照として機能を果たす試料、測定値、または値を指す。例えば、検査試料を、所与の疾患（例えば、自己免疫疾患、炎症性自己免疫疾患、がん、感染症、免疫疾患、または他の疾患）を有すると疑われる患者から採取し、既知の正常な（非疾患の）個体（例えば、標準対照対象）と比較することができる。標準対照は、所与の疾患を有さない同様の個体（例えば、標準対照対象）の集団（すなわち、標準対照集団）、例えば、同様の医学的背景、同じ年齢、体重などを有する健康な個体から集めた平均の測定値または値も代表し得る。標準対照値は、同じ個体、例えば、疾患発症前の患者からのより早期に得られた試料から得ることもできる。標準対照を、任意の数のパラメータ（例えば、ＲＮＡレベル、タンパク質レベル、特定の細胞型、特定の体液、特定の組織、滑膜細胞、滑液、滑膜組織、線維芽細胞様滑膜細胞、マクロファージ様滑膜細胞など）を評価するために設計することができることを、当業者は認識するであろう。
【００６０】
当業者は、どの標準対照が、所与の状況において最も適切であるかを理解し、標準対照値との比較に基づいてデータを分析することができるであろう。標準対照は、データの有意性（例えば、統計的有意性）を判定するのにも有益である。例えば、所与のパラメータの値が標準対照中で広く変わっている場合、検査試料中の変動は、有意であると見なされない。
【００６１】
本明細書において、用語「増殖性障害」は、細胞が正常組織の増殖より急速に増殖する任意の細胞障害を指す。増殖性障害には、それだけに限らないが、がんが含まれる。
【００６２】
本明細書において、用語「がん」は、白血病、癌腫、および肉腫を含めた、哺乳動物において見つかるすべてのタイプのがん、新生物、または悪性腫瘍を指す。例示的ながんとしては、脳、乳房、子宮頸、大腸、頭頚部、肝臓、腎臓、肺、非小細胞肺、黒色腫、中皮腫、卵巣、肉腫、胃、子宮、および髄芽腫のがんがある。追加の例としては、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、卵巣がん、横紋筋肉腫、原発性血小板増多症、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、がん、悪性膵インスリノーマ（malignant  pancreatic  insulanoma）、悪性カルチノイド、膀胱がん、前悪性皮膚病変、精巣がん、リンパ腫、甲状腺がん、神経芽細胞腫、食道がん、尿生殖路がん、悪性高カルシウム血症、子宮内膜がん、副腎皮質がん、内分泌および膵外分泌腺の新生物、ならびに前立腺がんがある。
【００６３】
用語「白血病」は、造血臓器の進行性悪性疾患を広く指し、一般に、血液および骨髄中の白血球およびこれらの前駆体のゆがめられた増殖および発達によって特徴付けられる。白血病は一般に、（１）急性または慢性の疾患の継続時間および特性；（２）関与される細胞のタイプ；骨髄性（myeloid）（骨髄性（myelogenous））、リンパ性（lymphoid）（リンパ性（lymphogenous））、または単球；および（３）白血病または無白血病（亜白血病）の血液中の異常細胞の数の増加または非増加に基づいて臨床的に分類される。Ｐ３８８白血病モデルは、ｉｎ  ｖｉｖｏ抗白血病活性を予測するものとして広く受け入れられている。Ｐ３８８アッセイで陽性の結果が出る化合物は、一般に、処置されている白血病のタイプにかかわらずｉｎ  ｖｉｖｏであるレベルの抗白血病活性を呈すると考えられている。したがって、本願は、白血病を処置する方法、好ましくは、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、非白血性白血病、白血球血症性白血病、好塩基球性（basophylic）白血病、芽細胞白血病、ウシ白血病、慢性骨髄球性白血病、皮膚白血病、胎生細胞性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、ヘアリー細胞白血病、血芽球性白血病、血球母細胞性白血病、組織球性白血病、幹細胞白血病、急性単球白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病（lymphatic  leukemia）、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ性白血病（lymphogenous  leukemia）、リンパ性白血病（lymphoid  leukemia）、リンパ肉腫細胞白血病、肥満細胞性白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄性顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病、プラズマ細胞白血病、多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞白血病、シリング白血病、幹細胞白血病、亜白血性白血病、および未分化細胞白血病を処置する方法を含む。
【００６４】
用語「肉腫」は、一般に、胎生結合組織のような物質で作られた腫瘍を指し、一般に、小繊維のまたは均質な物質中に包埋した密に詰まった細胞から構成される。抗新生物性チオール結合性ミトコンドリアオキシダントおよび抗がん剤の組合せを用いて処置され得る肉腫としては、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アバーネシー肉腫（Abemethy's  sarcoma）、脂肪肉腫（adipose  sarcoma）、脂肪肉腫（liposarcoma）、胞巣状軟部肉腫、エナメル上皮肉腫、ブドウ状肉腫、緑色腫肉腫、絨毛癌、胎児性肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫、Ｂ細胞の免疫芽球性肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞の免疫芽球性肉腫、イエンセン肉腫、カポジ肉腫、クッパー細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉細胞腫肉腫、傍骨性骨肉腫、細網肉腫、ラウス肉腫、漿液嚢胞性肉腫、滑膜肉腫、および毛細血管拡張性（telangiectaltic）肉腫がある。
【００６５】
用語「黒色腫」は、皮膚および他の臓器のメラニン細胞系から生じる腫瘍を意味するものと解釈される。抗新生物性チオール結合性ミトコンドリアオキシダントおよび抗がん剤の組合せを用いて処置され得る黒色腫としては、例えば、肢端黒子型黒色腫、無色素性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、Ｓ９１黒色腫、ハーディング−パッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子黒色腫、悪性黒色腫、結節型黒色腫、爪下（subungal）黒色腫、および表在拡大型黒色腫がある。
【００６６】
用語「癌腫」は、周囲組織に浸潤し、転移を引き起こす傾向のある、上皮細胞で作られた悪性新生物（new  growth）を指す。抗新生物性チオール結合性ミトコンドリアオキシダントおよび抗がん剤の組合せを用いて処置され得る例示的な癌腫としては、例えば、腺房癌（acinar  carcinoma）、腺房癌（acinous  carcinoma）、腺嚢癌、腺様嚢胞癌、腺腫性癌、副腎皮質の癌腫、肺胞癌、肺胞細胞癌、基底細胞癌、基底細胞性癌、類基底細胞癌、基底有棘細胞癌（basosquamous  cell  carcinoma）、気管支肺胞上皮癌、細気管支癌、気管支原性癌、大脳様癌、胆管細胞癌、絨毛癌（chorionic  carcinoma）、膠様癌（colloid  carcinoma）、面皰癌、子宮体癌（corpus  carcinoma）、篩状癌、鎧状癌、皮膚癌、円柱癌（cylindrical  carcinoma）、円柱細胞癌、導管癌、硬膜癌、胎生期癌、脳様癌、類表皮（epiermoid）癌、腺様上皮癌（carcinoma  epitheliale  adenoides）、外向発育癌、潰瘍癌、繊維性癌（carcinoma  fibrosum）、ゼラチン状癌（gelatiniforni  carcinoma）、膠様癌（gelatinous  carcinoma）、巨細胞癌（giant  cell  carcinoma）、巨細胞癌（carcinoma  gigantocellulare）、腺癌、顆粒膜細胞癌、毛母癌、血様癌（hematoid  carcinoma）、肝細胞癌、ヒュルトレ細胞癌、硝子様癌、副腎様（hypemephroid）癌、乳児胎生期癌、上皮内癌（carcinoma  in  situ）、表皮内癌、上皮内癌（intraepithelial  carcinoma）、クロムペッヘル癌（Krompecher's  carcinoma）、クルチツキー細胞癌（Kulchitzky-cell  carcinoma）、大細胞癌、レンズ状癌（lenticular  carcinoma）、レンズ状癌（carcinoma  lenticulare）、脂肪腫性癌（lipomatous  carcinoma）、リンパ上皮癌、髄様癌（carcinoma  medullare）、髄様癌（medullary  carcinoma）、黒色癌、軟性癌（carcinoma  molle）、粘液癌（mucinous  carcinoma）、粘液癌（carcinoma  muciparum）、粘液細胞性癌（carcinoma  mucocellulare）、粘表皮癌、粘液癌（carcinoma  mucosum）、粘液性癌、粘液腫様癌、上咽頭癌、燕麦細胞癌、骨化性癌（carcinoma  ossificans）、骨様癌、乳頭状癌、門脈周囲癌、上皮内癌（preinvasive  carcinoma）、有棘細胞癌、粥状癌（pultaceous  carcinoma）、腎臓の腎細胞癌、予備細胞癌、肉腫様癌（carcinoma  sarcomatodes）、シュナイダー癌、硬性癌、陰嚢癌、印環細胞癌、単純癌、小細胞癌、バレイショ様癌（solanoid  carcinoma）、球状細胞癌、紡錐体細胞癌、海綿様癌、扁平上皮癌、扁平上皮細胞癌、ストリング癌、毛細管拡張性癌（carcinoma  telangiectaticum）、毛細管拡張性癌（carcinoma  telangiectodes）、移行上皮癌、結節癌（carcinoma  tuberosum）、結節癌（tuberous  carcinoma）、いぼ状癌、および絨毛癌（carcinoma  villosum）がある。
【００６７】
本明細書において、用語「転移」、「転移性」、および「転移性がん」は、互換的に使用することができ、１つの臓器または別の隣接しない臓器もしくは身体部分からの増殖性疾患または障害、例えば、がんの広がりを指す。がんは、発生部位、例えば、乳房で起こり、その部位は、原発性腫瘍、例えば、原発性乳がんと呼ばれる。原発性腫瘍または発生部位中のいくつかのがん細胞は、局所的な範囲内の周囲正常組織を貫通し、それに浸潤する能力、ならびに／またはリンパ系もしくは血管系の壁を貫通し、体内の他の部位および組織に系を通じて循環する能力を取得する。原発性腫瘍のがん細胞から形成される第２の臨床的に検出可能な腫瘍は、転移性または二次性腫瘍と呼ばれる。がん細胞が転移する場合、転移性腫瘍およびその細胞は、元の腫瘍のものと同様であると推定される。したがって、肺がんが乳房に転移する場合、乳房の部位の二次性腫瘍は、異常な肺細胞からなり、異常な乳腺細胞からなっていない。乳房内の二次性腫瘍は、転移性肺がんと呼ばれる。したがって、語句転移性がんは、対象が原発性腫瘍を有しており、または有していたことがあり、かつ１つまたは複数の二次性腫瘍を有する疾患を指す。語句非転移性がん、または転移性でないがんを有する対象は、対象が原発性腫瘍を有するが、１つまたは複数の二次性腫瘍を有していない疾患を指す。例えば、転移性肺がんは、原発性肺腫瘍を有し、またはその履歴を有し、かつ第２の位置または複数の位置に、例えば、乳房内に１つまたは複数の二次性腫瘍を有する対象における疾患を指す。
【００６８】
用語「用量」および「投与量」は、本明細書で互換的に使用される。用量は、各投与で個体に与えられる活性成分の量を指す。用量は、いくつかの要因に応じて様々となり、要因としては、所与の療法についての正常な用量の範囲、投与の頻度；個体のサイズおよび耐容性；病状の重症度；副作用のリスク；ならびに投与経路がある。用量は、上記要因に応じて、または治療の進行に基づいて修正され得ることを当業者は認識するであろう。用語「剤形」は、医薬品または医薬組成物の特定のフォーマットを指し、投与経路に依存する。例えば、剤形は、噴霧用、例えば、吸入剤用の液体形態、例えば、経口送達用の錠剤もしくは液体、または例えば、注射剤用の食塩液であり得る。
【００６９】
本明細書において、病状、疾患、もしくは障害、または病状、疾患、もしくは障害に関連する症状を「処置する」またはその「処置」は、臨床結果を含めた有益なまたは所望の結果を得るための手法を指す。有益なまたは所望の臨床結果として、それだけに限らないが、部分的であっても全体的であっても、１つまたは複数の症状または病状の軽減または寛解、病状、障害、または疾患の程度の縮小、病状、障害、または疾患の状態の安定化、病状、障害、または疾患の発達の防止、病状、障害、または疾患の広がりの防止、病状、障害、または疾患進行の遅延または減速、病状、障害、または疾患発症の遅延または減速、病状、障害、または疾患状態の寛解または緩和、および緩解を挙げることができる。「処置する」は、処置が無い場合に予期されるものを超える対象の生存期間の延長も意味し得る。「処置する」は、一時的な病状、障害、または疾患の進行の阻害、病状、障害、または疾患の減速も意味し得るが、一部の場合では、これは、永久に病状、障害、または疾患の進行を停止させる。本明細書において、用語の処置、処置する（treat）、または処置する（treating）は、プロテアーゼの発現によって特徴付けられる疾患もしくは病状の１つもしくは複数の症状の効果、またはプロテアーゼの発現によって特徴付けられる疾患もしくは病状の症状を低減する方法を指す。したがって、開示される方法では、処置は、確立した疾患、病状、または疾患もしくは病状の症状の重症度の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の低減を指すことができる。例えば、疾患を処置するための方法は、対照と比較して対象における疾患の１つまたは複数の症状の１０％の低減がある場合、処置と見なされる。したがって、低減は、天然または対照のレベルと比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または１０％から１００％の間の任意のパーセントの低減であり得る。処置は、必ずしも疾患、病状、または疾患もしくは病状の症状の治癒または完全な切除を指す必要はないことが理解される。さらに、本明細書において、低下、低減、または阻害への言及は、対照レベルと比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ超の変化を含み、このような用語は、完全な排除を含み得るが、必ずしもそれを含む必要はない。
【００７０】
「治療有効用量または量」は、本明細書において、それが投与される効果（例えば、疾患を処置または防止する）を生じさせる用量を意味する。厳密な用量および配合は、処置の目的に依存し、公知の技法を使用して当業者によって確かめられる（例えば、Lieberman、Pharmaceutical  Dosage  Forms（１〜３巻、１９９２年）；Lloyd、The  Art,  Science  and  Technology  of  Pharmaceutical  Compounding（１９９９年）；Remington:The  Science  and  Practice  of  Pharmacy、２０版、Gennaro、編（２００３年）、およびPickar、Dosage  Calculations（１９９９年）を参照）。例えば、所与のパラメータについて、治療有効量は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、または少なくとも１００％の増大または低下を示す。治療有効性は、「〜倍の」増大または低下として表現することもできる。例えば、治療有効量は、標準対照に対して少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、５倍、またはそれ超の効果を有し得る。治療有効用量または量は、疾患の１つまたは複数の症状を寛解させ得る。治療有効用量または量は、それが投与されている効果が、疾患を発生するリスクにある者を処置することである場合、疾患、または疾患の１つもしくは複数の症状の発症を防止し、または遅延させることができる。
【００７１】
用語「薬学的に許容される塩」または「薬学的に許容される担体」は、本明細書に記載の化合物に見つかる特定の置換基に応じて相対的に無毒性の酸または塩基を用いて調製される活性化合物の塩を含むことを意味する。本願の化合物が相対的に酸性の官能性を含有する場合、中性形態のこのような化合物を純粋の、または適当な不活性溶媒中の十分な量の所望の塩基と接触させることによって、塩基付加塩を得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩の例としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、もしくはマグネシウムの塩、または同様の塩がある。本願の化合物が相対的に塩基性の官能性を含有する場合、中性形態のこのような化合物を純粋の、または適当な不活性溶媒中の十分な量の所望の酸と接触させることによって、酸付加塩を得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸（monohydrogencarbonic  acid）、リン酸、一水素リン酸（monohydrogenphosphoric  acid）、二水素リン酸（dihydrogenphosphoric  acid）、硫酸、一水素硫酸（monohydrogensulfuric  acid）、ヨウ化水素酸、または亜リン酸などのような無機酸に由来するもの、および酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などのような相対的に無毒性の有機酸に由来する塩がある。アルギン酸塩（arginate）などのアミノ酸の塩、およびグルクロン酸またはガラクツロン酸（galactunoric  acid）などのような有機酸の塩も含まれる（例えば、Bergeら、Journal  of  Pharmaceutical  Science、６６巻：１〜１９頁（１９７７年）を参照）。当業者に公知の他の薬学的に許容される担体も、本願の組成物に適している。
【００７２】
「対象」、「個体」、または「患者」は、本明細書で互換的に使用され、これは、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。哺乳動物としては、それだけに限らないが、マウス、サル、ヒト、家畜、競技動物、およびペットがある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養される生物学的実体の組織、細胞、およびこれらの子孫も包含される。
【００７３】
本明細書において、「Ｒｂ欠損」腫瘍もしくは細胞、または「Ｒｂ欠損の表現型を有する腫瘍もしくは細胞」は、腫瘍抑制因子Ｒｂのレベルが正常もしくは対照細胞内のものより低い、またはＲｂ経路が混乱されており、もしくは不活性である腫瘍または細胞である。用語「Ｒｂ経路」または「Ｒｂシグナル伝達経路」は、ｐＲｂ／ｐ１０７、Ｅ２Ｆ−１／−２／−３、およびＧ１サイクリン／ｃｄｋ複合体を含むｐＲｂ活性に影響する分子を少なくとも部分的に指す。現在公知でない分子もこの定義に入ることが察知されるであろう。
【００７４】
本明細書において、「腫瘍溶解性ウイルス」は、増殖性障害の細胞、例えば、がん細胞を選択的に殺すウイルスである。がん細胞の殺傷は、当技術分野で確立された任意の方法、例えば、生細胞数、細胞変性効果、死（die）新生物細胞のアポトーシス、がん細胞内のウイルスタンパク質の合成（例えば、代謝標識、ウイルスタンパク質のウエスタン分析、または複製に必要なウイルス遺伝子の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応による）、または腫瘍のサイズの低減の判定などによって検出され得る。
【００７５】
本明細書において、用語「複製欠損ウイルス」は、ウイルス複製を支持する所与の表現型を有する所定の細胞集団（例えば、ｐＲｂシグナル伝達経路内の分子に応答性の腫瘍細胞）内で細胞増殖を優先的に阻害し、細胞溶解を引き起こし、またはアポトーシスを誘導する（一括して殺傷と見なされる）ウイルスを指す。このようなウイルスは、所定の細胞表現型を有さない細胞内で、細胞増殖を阻害し、細胞溶解を引き起こし、アポトーシスを誘導し、または別の方法で複製することができず、またはそうする能力が限られている。
【００７６】
改変アデノウイルス
１つまたは複数の改変を含むＥ１Ａポリペプチドを含み、かつ／または１つまたは複数の改変を含むＥ４ｏｒｆ６／７ポリペプチドを含むアデノウイルス（Ａｄ）が本明細書に提供される。アデノウイルスは、任意選択で１つまたは複数の改変を含むＥ４ｏｒｆ１ポリペプチドを含む。１つまたは複数の改変を含むＥ１Ａポリペプチドを含み、１つまたは複数の改変を含むＥ４ｏｒｆ１ポリペプチドを含むアデノウイルスも本明細書に提供される。したがって、Ｅ１Ａ、Ｅ４ｏｒｆ１、およびＥ４ｏｒｆ６／７中に改変を伴った改変アデノウイルスが提供される。提供される改変アデノウイルスは、腫瘍溶解性である。提供される改変アデノウイルスはまた、調節が解除されたＥ２Ｆおよび正常細胞サイクルチェックポイントを伴ったがん細胞内で選択的に複製する。提供される改変アデノウイルスは、不活性なＲｂ／ｐ１６腫瘍抑制因子経路を伴った細胞内で選択的に複製する。提供される改変アデノウイルスは、その全体が本明細書に参照により組み込まれている国際公開第ＷＯ２０１２／０２４３５０号および同第ＷＯ２０１３／１３８５０５号に記載のものを含めた１つまたは複数のさらなる改変を含み得る。
【００７７】
用語「改変アデノウイルス」は、自然において見つからない遺伝子配列を有するアデノウイルス（例えば、非野生型アデノウイルス）を指す。任意選択で、改変アデノウイルスは、組換えアデノウイルスである。本明細書において、用語「改変Ｅ１Ａ」は、それぞれポリペプチドまたは核酸配列中に１つまたは複数の改変を有するＥ１Ａポリペプチドおよび／またはＥ１ＡポリペプチドをコードするＥ１Ａ遺伝子もしくは核酸を指す。本明細書において、用語「改変Ｅ４ｏｒｆ１」は、それぞれポリペプチドまたは核酸配列中に１つまたは複数の改変を有するＥ４ｏｒｆ１ポリペプチドおよび／またはＥ４ｏｒｆ１ポリペプチドをコードするＥ１ｏｒｆ１遺伝子もしくは核酸を指す。本明細書において、用語「改変Ｅ４ｏｒｆ６／７」は、それぞれポリペプチドまたは核酸配列中に１つまたは複数の改変を有するＥ４ｏｒｆ６／７ポリペプチドおよび／またはＥ４ｏｒｆ６／７ポリペプチドをコードするＥ４ｏｒｆ６／７遺伝子もしくは核酸を指す。
【００７８】
用語「Ｒｂ／ｐ１６／Ｅ２Ｆ複製が損なわれており、または欠損している」は、本明細書において、細胞が感染した後、アデノウイルス複製が、Ｒｂ／ｐ１０７／ｐ１３０／ｐ１６／Ｅ２Ｆ／ＣＤＫ−サイクリンチェックポイントを含む正常レベルの機能細胞「ポケットタンパク質ファミリー」メンバーの存在下で部分的または十分に減弱されていることを意味する。例えば、感染細胞が、Ｒｂ／ｐ１６経路が損なわれており、または欠損している（すなわち、感染細胞が、Ｒｂ／ｐ１６経路内で正常レベルの十分に機能的なＲｂまたは他のタンパク質を発現しない）場合、Ｒｂ／ｐ１６／Ｅ２Ｆ経路複製が損なわれているアデノウイルスの複製が、正常に進行する。反対に、細胞が正常レベルの機能的なＲｂを発現する場合（例えば、正常な活性を有するＲｂ、「Ｒｂ発現細胞」とも本明細書で呼ばれる）、Ｒｂ複製が損なわれており、または欠損しているアデノウイルスの複製は、減弱され、または防止される。細胞は、正常レベルのＲｂを発現することができない（例えば、Ｒｂ遺伝子の調節（例えば、プロモーター）領域への突然変異）、または正常未満のＲｂ活性を有する突然変異Ｒｂを発現することによってＲｂが損なわれており、または欠損している場合がある。正常レベルのＲｂおよび正常なＲｂ活性レベルは、同じタイプの健康な非疾患細胞内で見つかる。したがって、Ｒｂが損なわれた細胞は、突然変異Ｒｂ遺伝子を含む。任意選択で、Ｒｂが損なわれた細胞は、Ｒｂ遺伝子が完全または部分的に欠失されているゲノムを含む。Ｒｂが損なわれた細胞は、がん（例えば、新生物）細胞であり得る。正常なＲｂ機能の喪失をもたらし得る他のゲノム損傷としては、それだけに限らないが、ＣＤＫ突然変異、サイクリン突然変異および増幅、ｐ１６突然変異、ならびに／またはエピジェネティックなサイレンシング、ｐ１０７突然変異、ｐ１３０突然変異、ならびに増殖因子受容体経路突然変異がある。
【００７９】
用語「Ｒｂ／ｐ１６腫瘍抑制因子経路」または「Ｒｂ／ｐ１６経路」は、網膜芽細胞腫タンパク質（ＲＢ）、ならびにそれだけに限らないが、Ｃｄｋ、Ｅ２ｆ、非定型プロテインキナーゼＣ、およびＳｋｐ２を含めた経路内の他のタンパク質／タンパク質ファミリーを含む分子シグナル伝達のシグナル伝達経路全体を指す。用語「Ｒｂ／ｐ１６腫瘍抑制因子経路が損なわれており、または欠損している」は、シグナル伝達経路中の１つまたは複数の分子が、例えば、正常レベルのタンパク質を発現することができず、または正常未満の活性を有する突然変異タンパク質を発現し、その結果、経路が異常に機能することによって損なわれており、または欠損していることを意味する。このような欠損は、遊離Ｅ２Ｆの高発現レベルおよびＥ２Ｆプロモーターの高活性をもたらす。したがって、細胞は、Ｒｂ／ｐ１６腫瘍抑制因子経路内で正常レベルのタンパク質を発現することができない、または正常未満の活性を有する突然変異タンパク質を発現することによってＲｂ／ｐ１６経路が損なわれており、または欠損している場合がある。
【００８０】
用語「Ｅ１Ａが損なわれている」、「Ｅ１Ａが欠損している」、「Ｅ４ｏｒｆ１が欠損している」、「Ｅ４ｏｒｆ１が損なわれている」、「Ｅ４ｏｒｆ６／７が損なわれている」、および「Ｅ４ｏｒｆ６／７が欠損している」は、本明細書において、アデノウイルスが、正常レベルのかつ／または十分に機能的なＥ１Ａ、Ｅ４ｏｒｆ１、またはＥ４ｏｒｆ６／７遺伝子産物を産生することができないことを意味する。例えば、ウイルスは、正常レベルのＥ１Ａ、Ｅ４ｏｒｆ１、もしくはＥ４ｏｒｆ６／７遺伝子産物を発現することができない（例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ４ｏｒｆ１、もしくはＥ４ｏｒｆ６／７遺伝子の調節（例えば、プロモーター）領域への突然変異）、または正常未満のＥ１Ａ、Ｅ４ｏｒｆ１、もしくはＥ４ｏｒｆ６／７遺伝子産物活性を有する突然変異したＥ１Ａ、Ｅ４ｏｒｆ１、もしくはＥ４ｏｒｆ６／７遺伝子産物を発現することによって、Ｅ１Ａ、Ｅ４ｏｒｆ１、またはＥ４ｏｒｆ６／７が欠損しており、または損なわれている場合がある。したがって、Ｅ１Ａ、Ｅ４ｏｒｆ１、および／またはＥ４ｏｒｆ６／７が欠損しているアデノウイルスは、突然変異したＥ１Ａ、Ｅ４ｏｒｆ１、および／またはＥ４ｏｒｆ６／７遺伝子を含む。任意選択で、Ｅ１Ａ、Ｅ４ｏｒｆ１、および／またはＥ４ｏｒｆ６／７が欠損しているアデノウイルスは、Ｅ１Ａ、Ｅ４ｏｒｆ１、および／またはＥ４ｏｒｆ６／７遺伝子が完全または部分的に欠失されているゲノムを含む。アデノウイルスのＥ１ＡおよびＥ４領域は、公知であり、全体にわたって、かつ実施例に記載されている方法、および当技術分野で公知の他の方法を使用して改変され得る。例えば、その全体が本明細書に参照により組み込まれている国際公開第ＷＯ１９９８／０４６７７９号、米国特許第８４６５７３２号、および国際公開第２０１２／０２４３５０号を参照。例として、Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくともＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＥ０１１４７．１、ＡＰ＿０００１６１．１（配列番号１）、およびＡＰ＿０００１９７．１（配列番号２）において見つけることができ、Ｅ４ｏｒｆ６／７ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくともＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＰ＿０００１９１．１（配列番号３）およびＡＰ＿０００２２７．１（配列番号４）において見つけることができる。Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくともＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＰ＿０００１９６．１（配列番号５）およびＡＰ＿０００２３２．１（配列番号６）において見つけることができる。これらのポリペプチドをコードする核酸は、少なくともＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＣ＿０００００８．１（配列番号７）およびＡＣ＿０００００７．１（配列番号８）において見つけることができる。配列番号１または配列番号２と６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ超の配列同一性を含むＥ１Ａポリペプチド、配列番号５または配列番号６と６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ超の配列同一性を含むＥ４ｏｒｆ１ポリペプチド、および配列番号３または配列番号４と６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ超の配列同一性を含むＥ４ｏｒｆ６／７ポリペプチドも提供される。
【００８１】
タンパク質（Ｒｂ、Ｅ１Ａ遺伝子産物、Ｅ４ｏｒｆ１遺伝子産物、Ｅ４ｏｒｆ６／７遺伝子産物など）のレベルおよび活性を判定するための様々なアッセイ、例えば、増幅／発現法、免疫組織化学検査法、ＦＩＳＨおよびｓｈｅｄ抗原アッセイ、サザンブロット法、またはＰＣＲ技法などが利用可能である。さらに、タンパク質の発現または増幅は、例えば、検出されるタンパク質に結合し、検出可能標識（例えば、放射性同位体）でタグ付けされる分子（抗体など）を投与し、標識の局在化について患者を外部からスキャンすることによって、ｉｎ  ｖｉｖｏ診断アッセイを使用して評価され得る。したがって、細胞内のタンパク質レベルのレベルを測定する方法は、当技術分野で一般に公知であり、適用可能な場合、本明細書に提供される方法および組成物とともにタンパク質レベルおよび／または活性を評価するのに使用され得る。これらのアッセイは、Ｅ１Ａ、Ｅ４ｏｒｆ１、およびＥ４ｏｒｆ６／７ポリペプチド、ならびにこれらの組合せ中の改変の効果を判定して、例えば、改変がポリペプチドの正常レベルのまたは十分に機能的な遺伝子産物を産生することができないアデノウイルスをもたらすか否かを判定し、Ｅ１Ａ、Ｅ４ｏｒｆ１、およびＥ４ｏｒｆ６／７ポリペプチド、またはこれらの組合せの１つまたは複数のすべてまたは一部の欠失を含むアデノウイルスを確認するのに使用することができる。
【００８２】
Ｒｂ欠損細胞内で選択的に複製するアデノウイルス（Ａｄ）が提供される。具体的には、１つまたは複数の改変を含むＥ１Ａポリペプチドを含み、１つまたは複数の改変を含むＥ４ｏｒｆ６／７ポリペプチドを含み、１つまたは複数の改変を含むＥ４ｏｒｆ１ポリペプチドならびにこれらの様々な組合せを含むアデノウイルスが提供される。Ｅ１Ａ遺伝子、Ｅ４ｏｒｆ１遺伝子、および／またはＥ４ｏｒｆ６／７遺伝子のすべてまたは一部の欠失を含むゲノムを含むアデノウイルスも提供される。したがって、Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドをコードする核酸配列を欠き、かつ／またはＥ４ｏｒｆ６／７ポリペプチドをコードする核酸配列を欠き、１つまたは複数の改変を有するＥ１Ａをコードする核酸を含むゲノムを含むアデノウイルスが提供される。上記に論じたように、用語「改変」は、遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列中の改変を指す。改変としては、それだけに限らないが、挿入、置換、および欠失がある。アミノ酸配列改変は、典型的には、３つのクラス：置換、挿入、または欠失改変の１つまたは複数に入る。挿入としては、アミノおよび／または末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入がある。欠失は、タンパク質配列からの１つまたは複数のアミノ酸残基の除去によって特徴付けられる。アミノ酸置換は、典型的には単一残基のものであるが、いくつかの異なる位置で一度に起こり得る。置換改変は、少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入されたものである。置換、欠失、挿入、またはこれらの任意の組合せは、最終的なコンストラクトに達するように組み合わせることができる。
【００８３】
任意選択で、Ｅ１Ａの改変は、Ｅ１ＡのＲｂ結合部位中の改変を含む。任意選択で、Ｅ１Ａの改変は、配列番号１または配列番号２と比較して、Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基１２２〜１２６の１つまたは複数、例えば、アミノ酸残基１２２〜１２６において改変を含む。任意選択で、改変は欠失である。したがって、任意選択で、Ｅ１Ａおよび／またはＥ４ｏｒｆ６／７の改変は、欠失を含む。任意選択で、Ｅ１Ａの改変は、例えば、配列番号１または配列番号２と比較して、Ｅ１Ａのアミノ酸残基１２２〜１２６の欠失である。任意選択で、改変は、Ｅ１Ａの保存されたＬＸＣＸＥモチーフにおける欠失であり、ΔＬＸＣＸＥと全体にわたって呼ばれる。例として、保存されたモチーフは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸残基１２２〜１２６において見つけることができる。Ｅ４ｏｒｆ６／７は、図２および６に示した２つのエクソンによってコードされる。任意選択で、Ｅ４ｏｒｆ６／７の改変は、Ｅ４ｏｒｆ６／７エクソンの一方または両方において改変を含む。任意選択で、Ｅ４ｏｒｆ６／７の改変は、Ｅ４ｏｒｆ６／７エクソンの一方または両方の欠失である。任意選択で、Ｅ４ｏｒｆ６／７の改変は、ΔＥ４ｏｒｆ６／７である。任意選択で、アデノウイルスは、Ｅ１Ａ  ΔＬＸＣＸＥおよびΔＥ４ｏｒｆ６／７を含み、Ａｄ  Ｅ１Ａ  ΔＬＸＣＸＥ／ΔＥ４ｏｒｆ６／７またはＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８１と全体にわたって呼ばれる。
【００８４】
したがって、１つまたは複数の改変を含むＥ１Ａポリペプチドを含み、かつ／または１つまたは複数の改変を含むＥ４ｏｒｆ６／７ポリペプチドを含むアデノウイルスが提供される。Ｅ１Ａポリペプチドは、Ｅ１ＡのＲｂ結合部位中に改変を含み得る。Ｅ１Ａポリペプチドは、２つのＲｂ結合部位を含み得、ここでＥ１Ａポリペプチドは、両方のＲｂ結合部位中に改変を含む。任意選択で、Ｅ１Ａポリペプチドは、Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基１２０〜１３０の１つもしくは複数における改変、Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基１２２〜１２６の１つもしくは複数における改変、Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基３５〜５５の１つもしくは複数における改変、Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基３７〜４９の１つもしくは複数における改変、またはこれらの組合せを含む。例えば、改変は、配列番号１または配列番号２と比較して、アミノ酸残基１２０〜１３０、１２２〜１２６、３５〜５５、３７〜４９、またはこれらの組合せの１つまたは複数において起こり得る。例として、Ｅ１Ａポリペプチドは、Ｅ１Ａポリペプチのアミノ酸残基１２２〜１２６の１つまたは複数において、かつアミノ酸残基３７〜４９の１つまたは複数において改変を含み得、Ｅ１Ａは、任意選択で配列番号１または配列番号２を含む。したがって、提供されるＥ１Ａポリペプチドは、１つまたは複数の置換を含み得る。任意選択で、Ｅ１Ａポリペプチドは、残基Ｙ４７、残基Ｃ１２４において、または残基Ｙ４７およびＣ１２４の両方において置換を含み、Ｅ１Ａは、任意選択で配列番号１または配列番号２を含む。代替としてまたは追加的に、Ｅ１Ａポリペプチドは、欠失を含む。任意選択で、欠失は、Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基１２２〜１２６の欠失および／またはＥ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基２〜１１の欠失である。任意選択で、Ｅ１Ａポリペプチドは、欠失ΔＬＸＣＸＥを含む。上記に論じたように、改変されるＥ１Ａポリペプチドは、配列番号１または配列番号２を含み得る。
【００８５】
提供されるアデノウイルスでは、Ｅ４ｏｒｆ６／７ポリペプチドは、Ｅ４ｏｒｆ６／７エクソンの一方または両方において改変を含み得る。したがって、Ｅ４ｏｒｆ６／７ポリペプチドは、挿入、置換、および欠失、ならびにこれらの組合せを含めた１つまたは複数の改変を含み得る。任意選択で、Ｅ４ｏｒｆ６／７ポリペプチドは、Ｅ４ｏｒｆ６／７エクソンの一方または両方の欠失を含む。任意選択で、Ｅ４ｏｒｆ６／７は、例えば、配列番号３または４と比較して、４〜３８、４〜５８、または３８〜５８個のＮ末端アミノ酸からなる群から選択されるＮ末端欠失を含む。例えば、その全体が本明細書に参照により組み込まれているSchaleyら、J.  Virol.、７９巻（４号）：２３０１〜８頁（２００５年）を参照。任意選択で、Ｅ４ｏｒｆ６／７ポリペプチドは、ｄｌ３５５、ｄｌ３５６、およびｄｌ３６６からなる群から選択される改変を含む（その全体が本明細書に参照により組み込まれているHuangおよびHearing、Genes  &  Development、３巻：１６９９〜１７１０頁（１９８９年））。上記に論じたように、改変のためのＥ４ｏｒｆ６／７ポリペプチドは、配列番号３または配列番号４を含み得る。
【００８６】
提供されるアデノウイルスでは、アデノウイルスは、１つまたは複数の改変を含むＥ４ｏｒｆ１ポリペプチドを含み得る。任意選択で、Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドは、１つまたは複数の欠失を含む。任意選択で、Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドは、Ｅ４ｏｒｆ１のＣ末端領域中に欠失を含む。任意選択で、Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドは、Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドのＣ末端領域中の最後の４個のアミノ酸の欠失を含む。任意選択で、Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドは、Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドの残基１２５〜１２８の欠失を含み、任意選択で、Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドは、配列番号５または配列番号６を含む。任意選択で、Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドは、Ｄ６８Ａ、Ｐ１７Ａ、Ｙ２６Ａ、Ｌ１０９Ａ、Ｐ１１７Ａ、Ｅ３Ａ、Ｌ５Ａ、Ｇ１３Ｔ、Ｐ３１Ａ、Ｇ５８Ｔ、Ｅ８５Ａ、およびＬ８６Ａからなる群から選択される改変を含む（その全体が本明細書に参照により組み込まれているChungら、J.  Virol.、８１巻（９号）：４７８７〜９７頁（２００７年））。上記に論じたように、改変のためのＥ４ｏｒｆ１ポリペプチドは、配列番号５または配列番号６を含み得る。したがって、１つまたは複数の改変を含むＥ１Ａポリペプチドを含み、１つまたは複数の改変を含むＥ４ｏｒｆ１ポリペプチドを含むアデノウイルスも提供される。上述したように、アデノウイルスは、１つまたは複数の改変を含むＥ４ｏｒｆ６／７ポリペプチドをさらに含み得る。
【００８７】
上述した改変アデノウイルスをコードする核酸も本明細書に提供される。任意選択で、改変アデノウイルスをコードする１つの核酸が提供される（例えば、プラスミド）。任意選択で、改変アデノウイルスをコードする複数の核酸が提供される（例えば、複数のプラスミド）。
【００８８】
改変は、当技術分野で公知の任意の数の方法を使用してウイルスの核酸中に生成される。例えば、部位指向性突然変異誘発を、核酸配列を改変するのに使用することができる。部位指向性突然変異誘発の最も一般的な方法の１つは、オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発である。オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発では、配列中の所望の変化（複数可）をコードするオリゴヌクレオチドがアニールされて目的のＤＮＡの一本鎖にされ、ＤＮＡ合成を開始するためのプライマーとして機能する。このようにして、配列変化を含有するオリゴヌクレオチドが新しく合成される鎖中に組み込まれる。例えば、Kunkel、１９８５年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８２巻：４８８号；Kunkelら、１９８７年、Meth.  Enzymol.、１５４巻：３６７頁；Lewis  &  Thompson、１９９０年、Nucl.  Acids  Res.、１８巻：３４３９頁；Bohnsack、１９９６年、Meth.  Mol.  Biol.、５７巻：１頁；Deng  &  Nickoloff、１９９２年、Anal.  Biochem.、２００巻：８１頁；およびShimada、１９９６年、Meth.  Mol.  Biol.、５７巻：１５７頁を参照。他の方法も、配列中に改変を導入するのに当技術分野でごく普通に使用されている。例えば、改変核酸は、ＰＣＲもしくは化学合成を使用して生成され、またはアミノ酸配列中に所望の変化を有するポリペプチドが化学合成され得る。例えば、Bang  &  Kent、２００５年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、１０２巻：５０１４〜９頁、およびその中の参考文献を参照。ウイルスが通常増殖されない細胞型（例えば、ヒト細胞）についての選択および／または化学的突然変異誘発（例えば、Rudd  &  Lemay、２００５年、J.  Gen.  Virology、８６巻：１４８９〜９７頁を参照）もウイルスの核酸中に改変を生成するのに使用され得る。
【００８９】
全体にわたって記載された改変アデノウイルスに感染した細胞も提供される。細胞は、上述した改変アデノウイルスによって形質転換され得る。任意選択で、細胞は、上述した改変アデノウイルスの遺伝物質の取込み、組込み、および発現の結果として遺伝子改変されている。任意選択で、細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞である。アデノウイルスは、ヒトアデノウイルスなどの哺乳動物アデノウイルスであり得る。任意選択で、細胞は、両生類細胞（例えば、カエル細胞）または爬虫類細胞（例えば、ヘビ細胞）である。
【００９０】
組成物
改変ウイルス（または改変アデノウイルスをコードする１種もしくは複数の核酸）を含む組成物が本明細書に提供される。組成物は、任意選択で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの配合および投与に適している。任意選択で、組成物は、提供される作用物質の１種または複数、および薬学的に許容される担体を含む。適当な担体およびこれらの製剤は、Remington:The  Science  and  Practice  of  Pharmacy、２２版、Loyd  V.  Allenら編、Pharmaceutical  Press（２０１２年）に記載されている。薬学的に許容される担体とは、生物学的または別段に望ましくなくない材料を意味し、すなわち、その材料は、望ましくない生物学的効果を生じさせることなく、またはそれが含有されている医薬組成物の他のコンポーネントと有害な様式で相互作用することなく対象に投与される。対象に投与される場合、担体は、活性成分の劣化を最小限にし、対象における有害な副作用を最小限にするよう任意選択で選択される。
【００９１】
改変ウイルス（または改変アデノウイルスをコードする１種もしくは複数の核酸）は、静脈内投与などの公知の方法に合わせて、例えば、ボーラスとして、またはある時間にわたる持続注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内（intracerobrospinal）、皮下、関節内、滑液包内、髄腔内、経口、局部的、腫瘍内、または吸入経路によって投与される。投与は、局所的であっても全身的であってもよい。組成物は、局部的、経口的、非経口的、静脈内、関節内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、経皮的、肝内、頭蓋内、噴霧／吸入を含めたいくつかの投与経路のいずれかを介して、または気管支鏡を介したインストールによって投与され得る。したがって、組成物は、局所的処置が望まれているか、全身的処置が望まれているかに応じて、かつ処置される範囲に応じていくつかの方法で投与される。
【００９２】
投与用組成物は、一般に、薬学的に許容される担体、好ましくは水性担体中に溶解した本明細書に記載の作用物質（例えば、改変アデノウイルス、または改変アデノウイルスをコードする１種もしくは複数の核酸）を含むことになる。様々な水性担体、例えば、緩衝食塩水などが使用され得る。これらの溶液は、滅菌されており、一般に、望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、慣例的な周知の滅菌技法によって滅菌され得る。組成物は、おおよその生理的条件に要求される薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有し得る。これらの製剤中の活性剤の濃度は、変化に富む場合があり、選択される特定の投与モードおよび対象の必要性によって、液量、粘度、体重などに主に基づいて選択されることになる。
【００９３】
特に改変ウイルスの医薬製剤は、所望の程度の純度を有する改変アデノウイルス（または改変アデノウイルスをコードする１種もしくは複数の核酸）を、任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって調製され得る。このような製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液であり得る。
【００９４】
許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに無毒性である。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、酢酸、リン酸、クエン酸、および他の有機酸；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、防腐剤、低分子量ポリペプチド；血清アルブミンなどのタンパク質、またはゼラチン、またはポリビニルピロリドン（polyvinylpyllolidone）などの親水性ポリマー；ならびにアミノ酸、単糖、二糖、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含めた他の炭水化物；キレート化剤；ならびにイオン性および非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート）；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤であり得る。改変アデノウイルス（または改変アデノウイルスをコードする１種もしくは複数の核酸）は、任意の適切な濃度の感染単位で製剤化され得る。
【００９５】
経口投与に適した製剤は、（ａ）水、生理食塩水、またはＰＥＧ４００などの希釈剤中に懸濁された有効量の改変アデノウイルスなどの溶液；（ｂ）液体、固体、顆粒剤、またはゼラチンとして所定量の活性成分をそれぞれ含有するカプセル剤、サッシェ剤、または錠剤；（ｃ）適切な液体中の懸濁液；および（ｄ）適当なエマルジョンからなり得る。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、微結晶性セルロース、ゼラチン、コロイド二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、香味剤、色素、崩壊剤、および薬学的に適合性の担体の１種または複数を含み得る。ロゼンジ剤形態は、香料、例えば、スクロース、ならびに活性成分に加えて当技術分野で公知の担体を含有する不活性基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアエマルジョン、ゲルなどの中に活性成分を含む香錠中に活性成分を含み得る。
【００９６】
単独の、または他の適当なコンポーネントと組み合わせた改変アデノウイルス（または改変アデノウイルスをコードする１種もしくは複数の核酸）は、吸入を介して投与されるエアゾール製剤にすることができる（すなわち、これらは、「噴霧され」得る）。エアゾール製剤は、加圧された許容される噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの中に入れることができる。
【００９７】
例えば、関節内（intraarticular）（関節（joint）内）、静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮内、腹腔内、ならびに皮下経路などによる非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、および製剤を意図されたレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有し得る水性および非水性等張性滅菌注射液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および防腐剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液がある。提供される方法では、組成物は、例えば、静脈内注入、経口的、局部的、腹腔内、膀胱内、腫瘍内、またはクモ膜下によって投与され得る。非経口投与、腫瘍内投与、および静脈内投与が投与の好適な方法である。化合物の製剤は、単位用量または複数用量のシール容器、例えば、アンプルおよびバイアルなどで提供することができる。
【００９８】
注射液および懸濁液は、以前に記載した種類の滅菌散剤、顆粒剤、および錠剤から調製され得る。ｅｘ  ｖｉｖｏ療法のためにアデノウイルスによってトランスダクトもしくは感染され、または核酸をトランスフェクトされた細胞は、上述したように、静脈内または非経口的に投与され得る。
【００９９】
医薬製剤は、好ましくは単位剤形である。このような形態では、調製物は、適切な量の活性コンポーネントを含有する単位用量に細分される。したがって、医薬組成物は、投与方法に応じて様々な単位剤形で投与され得る。例えば、経口投与に適した単位剤形としては、それだけに限らないが、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、およびロゼンジ剤がある。
【０１００】
処置の方法
提供される改変アデノウイルスおよび／または改変アデノウイルスを含む組成物は、治療的または予防的処置のために投与され得る。
【０１０１】
したがって、対象における増殖性障害を処置する方法が提供される。本方法は、提供されるアデノウイルスまたは組成物を対象に投与するステップを含む。全体にわたって記載されているように、アデノウイルスまたは医薬組成物は、それだけに限らないが、静脈内、脈管内、クモ膜下、筋肉内、皮下、腹腔内、または経口的を含めた任意の数の方法で投与される。任意選択で、本方法は、１つまたは複数の追加の治療剤を対象に投与するステップをさらに含む。任意選択で、治療剤は、化学療法剤である。
【０１０２】
全体にわたって記載されているように、増殖性障害は、がんであり得る。任意選択で、増殖性障害は、肺がん、前立腺がん、結腸直腸がん、乳がん、甲状腺がん、腎がん、肝がん、および白血病からなる群から選択される。任意選択で、増殖性障害は、転移性である。上記に論じたように、がんは、急速に増殖する細胞増殖または新生物によって特徴付けられる温血動物における異常な状態または病状を含む。新生物疾患には、白血病などのびまん性新生物、ならびに悪性または良性のがんおよび腫瘍（任意の癌腫、肉腫、または腺腫を含む）を含めた悪性または良性の新生物が含まれる。新生物は一般に、正常なものより急速な細胞増殖によって増殖する異常組織として認識され、新生物（new  growth）を開始した刺激が止んだ後に増殖し続けることができる。新生物疾患としては、例えば、腫瘍、例えば、乳房、下垂体、甲状腺、または前立腺の腫瘍；脳、肝臓、髄膜、骨、卵巣、子宮、子宮頸などの腫瘍；ならびに単球白血病および骨髄性白血病の両方、腺癌、腺腫、神経膠星状細胞腫、膀胱腫瘍、脳腫瘍、バーキットリンパ腫、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、直腸癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、軟骨肉腫、絨毛癌、線維腫、線維肉腫、グリア芽細胞腫、神経膠腫、肝細胞癌、組織球腫、平滑筋芽細胞腫、平滑筋肉腫、リンパ腫、脂肪肉腫細胞、乳腺腫瘍、髄芽腫、骨髄腫、プラズマ細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、骨原性肉腫、膵臓腫瘍、下垂体腫瘍、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、精巣腫瘍、胸腺腫、ウィルムス腫瘍などがある。腫瘍としては、乳房、大腸、直腸、肺、中咽頭、下咽頭、食道、胃、膵臓、肝臓、胆嚢および胆管、小腸、尿路（腎臓、膀胱、および尿路上皮を含む）、雌生殖路（子宮頸、子宮、および卵巣、ならびに絨毛癌および妊娠性絨毛性疾患を含む）、雄生殖路（前立腺、精嚢、精巣、および胚細胞腫瘍を含む）、内分泌腺（甲状腺、副腎、および脳下垂体を含む）、および皮膚の癌腫、ならびに血管腫、黒色腫、肉腫（骨および軟組織から生じるもの、ならびにカポジ肉腫を含む）、ならびに脳、神経、眼、および髄膜の腫瘍（神経膠星状細胞腫、神経膠腫、グリア芽細胞腫、網膜芽細胞腫、神経腫、神経芽細胞腫、シュワン腫、および髄膜腫を含む）を含めた原発性および転移性固形腫瘍の両方がある。一部の態様では、リンパ腫（ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫の両方）の処置においてと同様に、白血病などの造血器悪性腫瘍から生じる固形腫瘍（すなわち、緑色腫、プラズマ細胞腫、ならびに菌状息肉腫および皮膚Ｔ細胞リンパ腫／白血病のプラークおよび腫瘍）が処置され得る。さらに、処置は、本明細書に記載の腫瘍からの転移の防止において有用であり得る。
【０１０３】
治療用途では、組成物は、「治療有効用量」で増殖性疾患または障害（例えば、がん）を罹患している対象に投与される。この使用に有効な量は、疾患の重症度、および患者の健康の一般的な状態に依存することになる。組成物の単一または複数の投与は、患者が必要とし、耐容性を示す投与量および頻度に応じて投与され得る。「患者」または「対象」には、ヒトおよび他の動物の両方、特に哺乳動物が含まれる。したがって、本方法は、ヒト療法および獣医学的用途に両方に適用可能である。
【０１０４】
改変配列を有するウイルスの有効量は、個別的に判定され、使用される特定のウイルス；個体のサイズ、年齢、性別；ならびに増殖中の細胞のサイズおよび他の特性に少なくとも部分的に基づく。例えば、ヒトの処置については、増殖中の細胞または存在する新生物のタイプ、サイズ、および数に応じて、およそ１０３〜１０１２プラーク形成単位（ＰＦＵ）のウイルスが使用される。有効量は、約１．０ｐｆｕ／体重１ｋｇ〜約１０１５ｐｆｕ／体重１ｋｇ（例えば、約１０２ｐｆｕ／体重１ｋｇ〜約１０１３ｐｆｕ／体重１ｋｇ）であり得る。ウイルスは、単一用量または複数用量（例えば、２、３、４、６、もしくはそれ超の用量）で投与される。複数用量は、同時に、または連続して（例えば、数日もしくは数週間の期間にわたって）投与される。改変配列を有するウイルスを用いた処置は、疾患の縮小が実現されるまで、数日〜数カ月続く。
【０１０５】
任意選択で、提供される方法は、１種または複数の追加の治療剤を対象に投与するステップを含む。したがって、提供される方法は、他のがん療法、放射線療法、ホルモン療法、または化学療法と組み合わせることができる。適当な追加の治療剤としては、それだけに限らないが、化学療法剤、ＣＤＫ阻害剤、抗炎症剤、抗生物質、抗ウイルス剤、免疫学的薬剤、ビタミン、増殖因子、およびホルモンからなる群から選択される治療剤がある。したがって、提供される方法は、任意選択で、公知の抗がん化合物または化学療法剤を対象に投与するステップを含む。化学療法剤としては、それだけに限らないが、５−フルオロウラシル；マイトマイシンＣ；メトトレキセート；ヒドロキシウレア；シクロホスファミド；ダカルバジン；ミトキサントロン；アントラサイクリン（anthracyclins）（エピルビシンおよびドキソルビシン（doxurubicin））；ハーセプチンなどの受容体に対する抗体；エトポシド；プレグナソーム（pregnasome）；タモキシフェンおよび抗エストロゲンなどのホルモン療法；インターフェロン；アロマターゼ阻害剤；黄体ホルモン剤；ならびにＬＨＲＨ類似体がある。ＣＤＫ（サイクリン依存性キナーゼ）阻害剤は、ＣＤＫの機能を阻害する作用物質である。提供される方法で使用するのに適したＣＤＫ阻害剤としては、それだけに限らないが、ＡＧ−０２４３２２、ＡＴ７５１９、ＡＺＤ５４３８、フラボピリドール、インジスラム、Ｐ１４４６Ａ−０５、ＰＤ−０３３２９９１、およびＰ２７６−００がある（例えば、その全体が本明細書に参照により組み込まれているLapennaら、Nature  Reviews、８巻：５４７〜５６６頁（２００９年）を参照）。作用物質および投与量の選択は、処置されている所与の疾患に基づいて当業者によって容易に判定され得る。組合せ投与は、別個の製剤または単一の医薬製剤を使用する同時投与、および好ましくは両方（またはすべて）の活性剤がその生物活性を同時的に発揮する時間がある、いずれかの順序での連続投与を企図する。作用物質または組成物の組合せは、同時に（例えば、混合物として）、別個であるが同時的に（例えば、別個の静脈内ラインを介して）、または逐次（例えば、１つの作用物質が最初に投与され、その後、第２の作用物質の投与が続く）投与され得る。したがって、用語の組合せは、２種またはそれ超の作用物質または組成物の同時、同時的、または逐次投与を指すのに使用される。
【０１０６】
本明細書に教示の方法によれば、対象は、有効量の本明細書に提供される作用物質の１種または複数を投与される。用語の有効量および有効投与量は、互換的に使用される。用語の有効量は、所望の生理的応答（例えば、がん細胞の殺傷）を生じさせるのに必要な任意の量として定義される。治療剤は典型的には、毎日約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇの初期投与量で投与される。約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量範囲が使用され得る。しかし、投与量は、対象の必要量、処置されている病状の重症度、および使用されている化合物に応じて様々となり得る。例えば、投与量は、特定の対象において診断されるがんのタイプおよびステージを考慮して経験的に判定され得る。対象に投与される用量は、提供される方法との関連で、経時的に患者における有益な治療応答に影響するのに十分であるべきである。特定の状況についての適切な投与量の判定は、開業医のスキルの範囲内である。したがって、作用物質を投与するための有効量およびスケジュールは、当業者によって経験的に判定され得る。投与のための投与量範囲は、疾患または障害の１つまたは複数の症状が影響される所望の効果（例えば、低減または遅延される）を生じさせるのに十分大きいものである。投与量は、実質的な有害な副作用、例えば、望まれない交差反応、アナフィラキシー反応などを引き起こすほど大きくないべきである。一般に、投与量は、年齢、病状、性別、疾患のタイプ、疾患もしくは障害の程度、投与経路、または他の薬物がレジメンに含まれるか否かによって様々となり、当業者によって判定され得る。投与量は、任意の禁忌のイベントにおいて個々の医師によって調整され得る。投与量は、様々となり得、１日または数日にわたって毎日１つまたは複数の用量の投与で投与され得る。所与のクラスの医薬品に関する適切な投与量についてのガイダンスは、文献で見つけることができる。
【０１０７】
本明細書において、用語の処置、処置する（treat）、または処置する（treating）は、プロテアーゼの発現によって特徴付けられる疾患もしくは病状の１つもしくは複数の症状の効果、またはプロテアーゼの発現によって特徴付けられる疾患もしくは病状の症状を低減する方法を指す。したがって、開示される方法では、処置は、確立された疾患、病状、または疾患もしくは病状の症状の重症度の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の低減を指すことができる。例えば、疾患を処置するための方法は、対照と比較して対象における疾患の１つまたは複数の症状の１０％の低減がある場合、処置であると見なされる。したがって、低減は、天然または対照のレベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または１０％から１００％の間の任意のパーセントの低減であり得る。処置は、必ずしも疾患、病状、または疾患もしくは病状の症状の治癒または完全な切除を指すわけではないことが理解される。さらに、本明細書において、低下、低減、または阻害への言及は、対照レベルと比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ超の変化を含み、このような用語は、完全な排除を含み得るが、必ずしもそれを含む必要はない。
【０１０８】
キット
提供される改変アデノウイルスおよび／または改変アデノウイスを含む組成物の１種または複数を含むキットが本明細書で提供される。したがって１つもしくは複数の改変を含むＥ１Ａポリペプチドを含み、かつ／もしくは１つもしくは複数の改変を含むＥ４ｏｒｆ６／７ポリペプチドを含むアデノウイルス（Ａｄ）、および／またはこのアデノウイルスを含む組成物を含むキットが提供される。任意選択で、アデノウイルスは、１つまたは複数の改変を含むＥ４ｏｒｆ１ポリペプチドをさらに含む。１つもしくは複数の改変を含むＥ１Ａポリペプチドを含み、１つもしくは複数の改変を含むＥ４ｏｒｆ１ポリペプチドを含むアデノウイルス（Ａｄ）、および／またはこのアデノウイルスを含む組成物を含むキットも提供される。任意選択で、組成物は、医薬組成物である。任意選択で、キットは、１種または複数の追加の治療剤をさらに含む。任意選択で、治療剤は、化学療法剤である。提供される医薬組成物の１種または複数、および使用のための指示書を含むキットが本明細書で提供される。任意選択で、キットは、Ｒｂ／ｐ１６腫瘍抑制因子経路欠損細胞内で選択的に複製するアデノウイルスを含む有効量の組成物の１つまたは複数の用量を含む。任意選択で、アデノウイルスは、アップレギュレートされたＥ２Ｆ活性を有する細胞内で選択的に複製する。任意選択で、組成物は、容器（例えば、バイアルまたは小包）内に存在する。任意選択で、キットは、組成物を投与する手段、例えば、シリンジ、針、管類、カテーテル、パッチなどを含む。キットは、使用する前に滅菌および／または希釈を必要とする製剤および／または材料も含み得る。
【０１０９】
開示される方法および組成物に使用され得る、これらと併せて使用され得る、これらの調製に使用され得る、またはこれらの生成物である材料、組成物、およびコンポーネントが開示される。これらおよび他の材料が本明細書に開示されており、これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、群などが開示されているとき、これらの化合物のそれぞれの様々な個々および集団の組合せおよび並び換えの特定の言及は、明示的に開示されていない場合がある一方、それぞれは、具体的に企図され、本明細書に記載されていると理解される。例えば、一方法が開示され、論じられ、この方法を含むいくつかの分子に行うことができるいくつかの改変が論じられている場合、この方法のありとあらゆる組合せおよび並び換え、ならびに可能である改変は、それとは反対に具体的に示されていない限り、具体的に企図されている。同様に、これらの任意のサブセットまたは組合せも、具体的に企図され、開示されている。この概念は、それだけに限らないが、開示される組成物を使用する方法におけるステップを含めて、本開示のすべての態様に当てはまる。したがって、実施され得る様々な追加のステップがある場合、これらの追加のステップのそれぞれは、開示される方法の任意の特定の方法ステップまたは方法ステップの組合せとともに実施することができ、それぞれのこのような組合せまたは組合せのサブセットは、具体的に企図されており、開示されていると見なされるべきであることが理解される。
【０１１０】
本明細書に引用される刊行物、およびこれらが引用されている資料は、その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれている。
【０１１１】
いくつかの実施形態を記載してきた。それでもやはり、様々な改変を行い得ることが理解されるであろう。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲の射程内である。
【実施例】
【０１１２】
（実施例１）
調節が解除されたＥ２Ｆ活性を有する腫瘍細胞内で選択的に複製する腫瘍溶解性アデノウイルス
改変アデノウイルスを、以下に参照したコンポーネントを用いて作製した。Ｇａｔｅｗａｙ  ＤＯＮＲベクターを使用した。ヒトＡｄ５  ＤＮＡから、Ｅ１モジュールをＰＣＲによって得、ＳＬＩＣを使用してベクターｐＤＯＮＲ  Ｐ１Ｐ４中に挿入した。ａｔｔＬ１およびａｔｔＬ４組換え部位を含むｐＤＯＮＲ  Ｐ１Ｐ４ベクター骨格を、ＰＣＲを使用して増幅し、ＳＬＩＣによってＡｄ５  Ｅ１モジュールと組み合わせた。Ｅ３モジュールをＰＣＲによって得ることによって、ａｔｔＢ５およびａｔｔＢ３ｒ組換え部位が隣接した産物を生成した。産物を、ｇａｔｅｗａｙ  ＢＰ反応によってｐＤＯＮＲ  Ｐ５Ｐ３ｒベクター中に挿入した。Ｅ４モジュールをＰＣＲによって得ることによって、ａｔｔＢ３およびａｔｔＢ２組換え部位が隣接した産物を生成した。産物を、ｇａｔｅｗａｙ  ＢＰ反応によってｐＤＯＮＲ  Ｐ３Ｐ２ベクター中に挿入した。ｐＤＯＮＲ  Ｐ５Ｐ２ベクターに由来するａｔｔＲ５−ｃｃｄＢ−Ｃｍ（ｒ）−ａｔｔＲ２断片をＰＣＲによって増幅し、Ａｄｓｅｍｂｌｙ  ＤＥＳＴベクター中に挿入した。「ＭｕｌｔｉＳｉｔｅ  Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ」、カタログ番号１２５３７−１００；およびSone,  T.ら、J  Biotechnol.、２００８年９月１０日；１３６巻（３〜４号）：１１３〜２１頁を参照。Ａｄｓｅｍｂｌｙ法は、その全体が本明細書に参照により組み込まれている国際公開第ＷＯ２０１２／０２４３５１号に記載されている。
【０１１３】
Ａｄｓｅｍｂｌｙ  ＤＥＳＴベクターのベクター骨格は、３つの異なる源に由来する部分から構成されている。Ａｍｐ（ｒ）カセットおよびｌａｃＺ遺伝子をプラスミドｐＵＣ１９から増幅した。これを、プラスミドｐＳＢ３Ｋ５−Ｉ５２００２、ＢｉｏＢｒｉｃｋｓｉＧＥＭ  ２００７パーツ配布（parts  distribution）の一部から得たｐ１５Ａ複製起点と組み合わせた。ｐ１５Ａ  ｏｒｉは、より低い（１０〜１２）コピー数でプラスミドを維持し、Ｅ１毒性を低減するのに必要である。最後に、自己切除性ウイルス（self-excising  virus）を創製するために、酵素ＩＳｃｅＩの哺乳動物発現カセットをプラスミドｐＡｄＺ５−ＣＶ５−Ｅ３＋からＰＣＲにかけた。このカセットをベクター骨格中にクローニングして、ｐ１５Ａ−ＳｃｅＩと呼ばれるベクターを創製した。これは、ゲノムアセンブリーを開始するのに使用されるベクターである。遺伝子モジュールはすべて、野生型Ａｄ５ウイルスから精製したＤＮＡまたはプラスミドｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から得た。
【０１１４】
ヒトＡｄ５のＤＥＳＴベクターに関して、Ｅ２およびＬ３モジュールを３断片ＳＬＩＣによってプラスミドｐ１５Ａ−ＳｃｅＩ中に挿入した。ａｔｔＲ５およびａｔｔＲ２部位が隣接したｃｃｄＢおよびＣｈｌｏｒ（ｒ）を発現する対抗選択マーカーを、プラスミドｐＤＯＮＲ  Ｐ５Ｐ２からＰＣＲによって得た。第２の対抗選択マーカーをベクターｐＤＯＮＲ  Ｐ１Ｐ４からＰＣＲによって得た。２つの対抗選択マーカーを、Ｅ２およびＬ４モジュールの末端に操作されたユニークな制限酵素で切断した後、ＳＬＩＣによってｐ１５Ａ−ＳｃｅＩ  Ｅ２−Ｌ４の右側および左側に挿入して、ＤＥＳＴベクターを創製した。
【０１１５】
Ａｍｐ（ｒ）カセット：プラスミドｐＵＣ１９に関して、ｐ１５Ａ  ｏｒｉ：プラスミドｐＳＢ３Ｋ５−Ｉ５２００２は、ＢｉｏＢｒｉｃｋｓｉＧＥＭ  ２００７パーツ配布の一部であった。アデノウイルス遺伝子モジュールに関して、Ａｄ５粒子から精製したＤＮＡ、またはプラスミドｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。ＤＯＮＲベクターｐＤＯＮＲ  Ｐ１Ｐ４、Ｐ５Ｐ２、Ｐ５Ｐ３Ｒ、Ｐ３Ｐ２は、Ｊｏｎ  Ｃｈｅｓｎｕｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から受領した。
【０１１６】
ＰＣＲに関して、すべてのＰＣＲは、Ｐｈｕｓｉｏｎ酵素（ＮＥＢ）を使用して実施した。Ａｄ５からＡＤＥＮＯＶＩＲＡＬ  ＧＥＮＥモジュールを得るためのＰＣＲは、１×ＨＦ緩衝液、２００μＭのそれぞれのｄＮＴＰ、０．５μＭのそれぞれのプライマー、および鋳型１０ｎｇを用いて実施した。Ｅ２−Ｌ２モジュールについては、３％  ＤＭＳＯも添加した。鋳型は、プラスミドｐＡｄ／ＰＬ−ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｅ２−Ｌ２、Ｌ３−Ｌ４、およびＥ４モジュールについて）、またはＡｄ５ゲノムＤＮＡ（Ｅ１およびＥ３モジュールについて）であった。ＰＣＲ条件は、以下の通りであった。Ｅ２−Ｌ２およびＬ３−Ｌ４：９８℃  ３０秒−１０サイクルの９８℃  １０秒、６５℃  ３０秒（２サイクル毎に温度を１℃低下させる）、７２℃  ７分−２９サイクルの９８℃  １０秒、６０℃  ３０秒、７２℃  ８分−７２℃  １０分−４℃保持。Ｅ３：９８℃  ３０秒−１０サイクルの９８℃  １０秒、７０℃  ３０秒（サイクル毎に温度を０．５℃低下させる）、７２℃  ２分３０秒−２５サイクルの９８℃  １０秒、６８℃  ３０秒、７２℃  ２分３０秒−７２℃  １０分−４℃保持。Ｅ４：９８℃  ３０秒−６サイクルの９８℃  １０秒、６３℃  ３０秒（サイクル毎に温度を０．５℃低下させる）、７２℃  ２分−２９サイクルの９８℃  １０秒、６０℃  ３０秒、７２℃  ２分−７２℃  ５分−４℃保持。
【０１１７】
精製ウイルスからウイルスゲノムＤＮＡを得ることに関して、精製ウイルス最大１００μｌを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．２％  ＳＤＳを含有する溶解緩衝液３００μｌに添加する。混合物を６０℃で５分間インキュベートし、その後、プロテイナーゼＫストック（約２０ｍｇ／ｍＬ）５μｌを添加し、６０℃で１時間さらにインキュベートする。次いで試料を氷上に５分間置き、その後、１５Ｋ×ｇで１５分間回転させる。上清を取り出し、等体積のイソプロパノールに添加し、十分混合し、４℃にて１５Ｋ×ｇで１５分間回転させる。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、４℃で１５分間再回転させる。ペレットを乾燥させ、使用のために再懸濁させる。
【０１１８】
ＳＬＩＣに関して、線状断片は、以下の２０μｌの反応中で室温にて２０分間処理したエキソヌクレアーゼである：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、２００ｍＭ尿素、５ｍＭ  ＤＴＴ、およびＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌ。反応は、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １μｌを添加することによって停止し、その後７５℃で２０分間インキュベートする。次いで等量のＴ４処理ＤＮＡを混合して、新しいチューブ中で体積約２０μｌにする。２断片を組み合わせるＳＬＩＣについて、各反応物１０μｌを使用する。３断片を組み合わせるＳＬＩＣについて、各反応物７μｌを使用する。断片を６５℃で１０分間加熱することによってアニールし、その後、５秒毎に温度を０．５℃低下させて２５℃まで徐々に冷却する。アニールした後、反応物５μｌを形質転換し、クローンをスクリーニングする。
【０１１９】
ＡｄＳｌｉｃＲに関して、３断片ＳＬＩＣ反応を、Ｔ４処理ｐ１５Ａ−ＳｃｅＩ（ＰＣＲによって線状化した）１００ｎｇ、ならびにＥ２およびＬ３モジュール（これらのそれぞれのエントリーベクターからＰＣＲによって得た）のそれぞれ３００ｎｇを使用して実施する。これにより、ベクターｐ１５Ａ−ＳｃｅＩ  Ｅ２−Ｌ４が創製される。ｐ１５Ａ−ＳｃｅＩ  Ｅ２−Ｌ４  ５μｇをＳｗａＩで切断し、Ｑｉａｇｅｎ  ＱｉａｅｘＩＩを使用してゲルを精製する。Ｅ３およびＥ４モジュールは、これらのそれぞれのエントリーベクターからＰＣＲによって得られる。線状化ベクター（４５０ｎｇ）およびＰＣＲ産物（２００ｎｇ）のそれぞれをＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理し、ＳＬＩＣを、ベクター１５０〜２００ｎｇおよび各モジュールＰＣＲ約１００ｎｇを使用して、通常通り実施する。陽性クローンを単離した後、新しいベクター５μｇをＰａｃＩで切断し、ゲルを精製し、次いで新しいＳＬＩＣ反応においてＥ１  ＰＣＲ産物（Ｔ４処理したもの１００ｎｇ）と組み合わせる。これによりゲノムアセンブリーが完了し、プラスミドは、ウイルスを再構成するためのトランスフェクションの準備ができている。
【０１２０】
Ｅ１およびＥ４突然変異領域の構築に関して、個々のモジュールエントリーベクターに対して操作を実施した。ベクター骨格を有するＥ１モジュールを、プライマーを用いてＰＣＲにかけてＬＴＣＨＥ配列（残基１２２〜１２６）を欠く産物を生成し、次いでＳＬＩＣを使用して環状化することによってｐＥＮＴＲ−Ｅ１−Ｅ１Ａ−ΔＬＸＣＸＥを生成した。代わりに、ベクター骨格を有するＥ１モジュールを、プライマーを用いてＰＣＲにかけて、Ｙ４７をＨに、残基Ｃ１２４をＧに突然変異させ、または残基２〜１１を欠失させるＥ１Ａコドン変化を有する産物を生成することによって、それぞれｐＥＮＴＲ−Ｅ１−Ｅ１Ａ−Ｙ４７Ｈ、ｐＥＮＴＲ−Ｅ１−Ｅ１Ａ−Ｃ１２４Ｇ、またはｐＥＮＴＲ−Ｅ１−Ｅ１Ａ−Δ２−１１を生成した。これらの産物を、さらなるＰＣＲ突然変異のための鋳型として使用して、これらの突然変異の組合せ：ｐＥＮＴＲ−Ｅ１−Ｅ１Ａ−Ｙ４７Ｈ−Ｃ１２４ＧおよびｐＥＮＴＲ−Ｅ１−Ｅ１Ａ−Ｙ４７Ｈ−Ｃ１２４Ｇ−Δ２−１１を生成した。ベクター骨格を有するＥ４モジュールを、プライマーを用いてＰＣＲにかけてＥ４ｏｒｆ６終止コドンの下流のＥ４ｏｒｆ６／７特異的エクソン配列（２９７ｂｐ）を欠く産物を生成することによって、ｐＥＮＴＲ−Ｅ４−ΔＥ４ｏｒｆ６／７を生成した。この産物はまた、プライマーを用いたＰＣＲのための鋳型として使用して、Ｅ４ｏｒｆ１のＰＤＺ結合モチーフ、または全Ｅ４ｏｒｆ１配列を欠く産物（それぞれｐＥＮＴＲ−Ｅ４−ΔＥ４ｏｒｆ６／７−Ｅ４ｏｒｆ１ΔＰＤＺｂおよびｐＥＮＴＲ−Ｅ４−ΔＥ４ｏｒｆ６／７−ΔＥ４ｏｒｆ１）を生成した。
【０１２１】
突然変異を持つ完全ウイルスゲノムを生成するために、ＡｄＳｌｉｃＲを、ｗｔ  Ｅ３モジュールおよびｗｔ  Ｅ４または突然変異体Ｅ４モジュールと組み合わせて、次いでｗｔ  Ｅ１または突然変異体Ｅ１と組み合わせて、ｐ１５Ａ−ＳｃｅＩ  Ｅ２−Ｌ４を使用して実施した。野生型ＡｄＳｌｉｃＲアデノウイルスは、以下に示した表１に指定されている。
【表１−１】
0006576326.tif 000002
【表１−２】
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【表１−３】
0006576326.tif 000004
【０１２２】
ウイルスの産生、濃度、および精製に関して、２９３  Ｅ４細胞を感染性粒子に感染させ、ＣＰＥが明らかである、感染させておよそ４８時間後に細胞を収集し、５００×ｇで５分間遠心分離することによって単離する。ＴＭＮ緩衝液（１０ｍＭ  ＴｒｉｓＣｌ  ｐＨ  ７．５、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中で３×凍結／解凍を介して細胞を溶解させ、３Ｋ×ｇおよび３．５Ｋ×ｇで１５分間、２ラウンドの遠心分離によって細胞残屑を取り出す。塩化セシウム勾配（０．５ｇ／ｍＬ）を使用して、３７Ｋ×ｇで１８〜２４時間、超遠心分離を介してウイルス粒子をバンド化する。バンドを収集し、１０％グリセロールを含むＴＭＮ中で４℃にて一晩（１２〜１８時間）、１０ｋ  ＭＷＣＯ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内で透析し、次いで−８０℃で貯蔵する。精製ウイルスの力価を、抗アデノウイルス５型一次抗体（ａｂ６９８２、Ａｂｃａｍ）、およびＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ抗ウサギアルカリホスファターゼ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた細胞ベース連続希釈感染ＥＬＩＳＡによって、力価測定された野生型標準に対して判定する。
【０１２３】
原発性ヒト小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）の感染中のアデノウイルスタンパク質発現の評価に関して、１２ウェルプレート中の静止状態ＳＡＥＣをＭＯＩ３０アデノウイルスに感染させた。感染させて４時間後の細胞について培地を置き換える。感染させて２４、３６、および４８時間後に、細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、冷ＰＢＳ  ５００μＬ中に回収し、５Ｋ  ｒｐｍで４℃にて５分間ペレット化し、スナップ凍結させ、−８０℃で貯蔵した。細胞ペレットを、ＲＩＰＡ緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、２％デオキシコレート、２ｍＭ  ＮａＦ、０．２ｍＭ  ＮａＶＯ４、２ｍＭ  ＤＴＴ）中で、カップ超音波処理器内での超音波処理（４℃にて６０振幅（60  amplitude）で２×６０秒パルス）を含めて、４℃で１時間溶解させた。細胞残屑を、１３Ｋ  ｒｐｍで４℃にて２０分間遠心分離することによってペレット化した。タンパク質濃度を、Ｂｉｏ−ｒａｄのＤＣ（商標）タンパク質アッセイを使用して判定し、試料のタンパク質濃度を正規化した。ゲル電気泳動を、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＮｏｖｅｘ（登録商標）ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して、製造者のプロトコールに従って実施した。タンパク質をウエスタンブロットによって検出した。タンパク質を検出するのに使用した一次抗体は、以下の通りである：Ｅ１Ａ（ａｂ２８３０５、Ａｂｃａｍ）、β−アクチン（Ａ５４４１、Ｓｉｇｍａ）、Ａｄ５後期タンパク質（ａｂ６９８２、Ａｂｃａｍ）、サイクリンＡ（Ａｂ−６  ６Ｅ６、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ）、サイクリンＢ（Ａｂ−３  ＧＮＳ１、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ）。Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）抗体を二次抗体として使用し、信号をＬＩ−ＣＯＲ  ＯＤＹＳＳＥＹ（登録商標）計測器を使用して検出した。肺腺癌Ａ５４９細胞および正常ヒト星状細胞（ＮＨＡ）の感染中のアデノウイルスタンパク質発現の評価に関して、１２ウェルプレート中のコンフルエントな細胞をＭＯＩ１０アデノウイルスに感染させ、ＳＡＥＣについて記載したのと同様にプロセシングした。グリア芽細胞腫Ｕ８７細胞、グリア芽細胞腫Ｕ１１８細胞、ヒト血管内皮細胞（ＨｕＶＥＣ）、およびヒト線維芽細胞の感染中のアデノウイルスタンパク質発現の評価に関して、１２ウェルプレート中のコンフルエントな細胞をＭＯＩ２０アデノウイルスに感染させ、ＳＡＥＣについて記載したのと同様にプロセシングした。
【０１２４】
細胞周期分析に関して、細胞をタンパク質発現についてと同じＭＯＩで感染させた。感染させて４８時間後、細胞をトリプシン処理してプレートから剥がし、冷ＰＢＳで洗浄した。細胞を冷ＰＢＳ  ５００μＬ中に再懸濁させ、冷えた７０％  ＥｔＯＨ／１５ｍＭグリシン、ｐＨ２．８  ３ｍＬで固定した。試料を４℃で保ち、ＦＡＣＳの前に、細胞をペレット化し、冷ＰＢＳ中で洗浄し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）／ＲＮａｓｅ  Ａ溶液中に再懸濁させ、次いで３７℃にて１時間インキュベートした。少なくとも１０Ｋイベントを各試料についてＦＡＣＳによって収集した。
【０１２５】
感染からのアデノウイルスバーストに関して、１２ウェルプレート中の静止状態細胞を、ＭＯＩ１または１０アデノウイルスに感染させた。感染させて４時間後の細胞について培地を置き換える。ウェルからの培地を感染させて４８および７２時間後に収集し、一度フラッシュ凍結させ、解凍し、７Ｋ  ｒｐｍで４℃にて５分間遠心分離して細胞残屑をペレット化する。培地の体積を測定し、フラッシュ凍結させ、−８０℃で貯蔵する。培地中のウイルスの力価を、抗アデノウイルス５型一次抗体（ａｂ６９８２、Ａｂｃａｍ）、およびＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ抗ウサギアルカリホスファターゼ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた細胞ベース連続希釈感染ＥＬＩＳＡによって、力価測定された野生型標準に対して判定する。
【０１２６】
細胞生存率アッセイに関して、細胞を９６ウェルプレート中に播種し、ＭＯＩ３０で、連続希釈で三つ組で感染させた。感染後、ＭＯＩ１０感染ウェル中で完全なＣＰＥがある７〜１０日に、代謝活性を、細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、製造者の仕様書に従って測定する。
【０１２７】
データを図１〜１６に示す。上記に論じたように、がんは、追加の治療的処置の必要のある問題の疾患であり続ける。１つのこのような処置には、腫瘍溶解性ウイルスが含まれる。腫瘍溶解性ウイルスがん療法の一般的原理を示す概略図について図１を参照。アデノウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスとして使用するために探索されているウイルスの１種である。図２は、アデノウイルス（Ａｄ）の構造的特徴、ならびにボックス内の転写単位、および標識遺伝子を伴ったアデノウイルスゲノムのマップを示す概略図である。網膜芽細胞腫（Ｒｂ）腫瘍抑制因子経路機能は、Ｒｂの直接の突然変異、突然変異／メチル化に起因するＣＤＫ阻害剤ｐ１６機能の喪失、またはＣＤＫ／サイクリンの増幅によってほとんどあらゆるヒトがんにおいて失われている。正常な非分裂細胞では、Ｒｂは、低リン酸化型のままであり、その標的プロモーターにおいて転写因子Ｅ２Ｆに結合し、Ｅ２Ｆトランス活性化ドメインをマスキングし、かつクロマチン−リモデリング複合体およびヒストン修飾活性を動員することによって転写を抑制する。細胞周期のＧ１−Ｓ移行中、ＣＤＫは、Ｒｂをリン酸化し、それによりＥ２Ｆ抑制が緩和される。アデノウイルスは、初期ウイルス腫瘍性タンパク質を発現し、これは、Ｒｂ腫瘍抑制因子経路を不活化して細胞を強制的に複製させ、同時にウイルスゲノムを再生させる。アデノウイルスＥ１Ａは、部分的にＬＸＣＸＥモチーフを介してＲｂに結合し、その腫瘍抑制因子活性を調節解除する。したがって、Ｅ１Ａ中のＬＸＣＸＥモチーフを欠失させると、Ｒｂ不活化が排除され、選択的に複製するウイルス（ＯＮＹＸ−８３８）が作製されるはずであることが提案された。しかし、Johnsonら、Cancer  Cell、１巻（４号）：３２５〜３３７頁（２００２年）は、Ａｄ  Ｅ１Ａ  ＬＸＣＸＥ突然変異は、Ｓ期エントリー、ウイルスＤＮＡ複製、および後期タンパク質発現を防止するのに十分でないという証拠を提供した。これは、本明細書に記載の実験からの結果と一致している。Ｅ１Ａ突然変異体のＲｂ選択性は、議論の余地があるけれども、この突然変異は、悪性脳腫瘍の第ＩＩ相臨床試験へと移りつつある腫瘍溶解性ウイルス（ＤＮＸ−２４０１）の基礎として進展された。より高いＲｂ選択性を実現する試みにおいて、アデノウイルスＥ１およびＥ４領域のプロモーターをＥ２Ｆプロモーターと置き換え、それをＥ１Ａ  ΔＬＸＣＸＥモチーフと組み合わせたアデノウイルスが生成されて、ＯＮＹＸ−４１１が生成された（Johnsonら、Cancer  Cell、１巻（４号）：３２５〜３３７頁（２００２年）；およびDubenskyら、Cancer  Cell、１巻（４号）：３０７〜３０９頁（２００２年））。これらのウイルスを試験するために、腫瘍および初代ヒト細胞を野生型ウイルス、ＯＮＹＸ−８３８（Ｅ１Ａ  ΔＬＸＣＸＥ）、またはＯＮＹＸ−４１１に感染させ、感染後の様々な時点で回収した（図３）。図３に示したように、ＯＮＹＸ−８３８は、腫瘍および初代肺上皮細胞内で無差別に複製する。Ｅ１Ａ  ΔＬＸＣＸＥをアデノウイルスＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、およびＥ４領域（図２に示した）の細胞Ｅ２Ｆ制御と組み合わせるＯＮＹＸ−４１１は、正常細胞に対して腫瘍細胞内で選択的な複製を実証する（Johnsonら、Cancer  Cell、１巻（４号）：３２５〜３３７頁（２００２年））。しかし、Ｅ２Ｆプロモーターは、組換えをもたらし、また、腫瘍細胞内の野生型ウイルスレベルまで複製を制限する。したがって、これらのウイルスは、問題のままである。
【０１２８】
本明細書に記載するように、Ｅ１ＡによるＲｂ抑制からのＥ２Ｆ放出とは独立に、細胞およびＡｄプロモーターにおいてＥ２Ｆタンパク質をさらに安定化させる別のＡｄタンパク質、Ｅ４ｏｒｆ６／７がある。一緒に、Ｅ１ＡおよびＥ４ｏｒｆ６／７は、Ｅ２Ｆ媒介転写を推進し、Ｓ期開始を引き起こし、同時にウイルスＤＮＡゲノムを伝播する。したがって、機能的なＲｂを欠く腫瘍細胞の選択的腫瘍溶解性ウイルス療法である、Ｅ１Ａ改変およびＥ４ｏｒｆ６／７改変の両方を持つアデノウイルスが本明細書に提供される。具体的には、Ｅ１Ａ／Ｅ４ｏｒｆ６／７中の複合突然変異を操作して、これらが腫瘍細胞内で選択的に複製するが、初代細胞内で複製しないかどうかを判定した。これらの突然変異の組合せは、がんの有効な自己増幅療法をもたらすことが提案されている。図４Ａおよび４Ｂは、腫瘍突然変異およびアデノウイルス初期タンパク質が、制御されていない複製を誘発するＲｂ経路を活性化することに収束させることを示す概略図である。Ａ）Ｒｂ−腫瘍抑制因子機能を喪失させる一般的な突然変異。Ｂ）アデノウイルスタンパク質は、ＲｂおよびＥ２Ｆを直接的に調節解除して細胞をＳ期に推進する。図５は、アデノウイルスが複数のタンパク質をコードしてＲｂ−Ｅ２Ｆ細胞周期チェックポイントを調節解除することを示す概略図である。アデノウイルスＥ１Ａは、細胞Ｒｂに結合し、Ｅ２Ｆを放出して転写を活性化する。アデノウイルスＥ４ｏｒｆ６／７は、プロモーターにおいてＥ２Ｆを安定化させて、下流遺伝子の発現を増強する。図６は、本研究における突然変異アデノウイルスの構築を示す概略図である。野生型Ａｄ５ゲノムを転写単位によってモジュールに分割し、モジュールのそれぞれを異なるプラスミド中に入れた。突然変異をモジュールプラスミドに対して行い、ＡｄＳｌｉｃＲを使用して、モジュールを再アセンブルして完全ゲノムにし、組換えアデノウイルスの産生を可能にした。図７は、Ｅ４ｏｒｆ６／７欠失を示す概略図である。２つのエクソンがＥ４ｏｒｆ６／７をコードする。Ｅ４ｏｒｆ６およびＥ４ｏｒｆ６／７は、同じ開始コドンを利用し、５８個のアミノ酸Ｎ末端残基を共有する。Ｅ４ｏｒｆ６／７転写物は、Ｅ４ｏｒｆ６終止コドンの直後にスプライスする。終止コドンを含むＥ４ｏｒｆ６／７の第２のエクソン全体を欠失させた。図７Ａは、野生型Ｅ４領域を示す。図７Ｂは、得られたＥ４  ΔＥ４ｏｒｆ６／７領域を示す。
【０１２９】
これらのウイルスを試験するために、細胞を、モック（ΔＥ１）、Ａｄ−１０２（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０２）（野生型）、Ａｄ−１８１（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８１）（Ｅ１Ａ  ΔＬＸＣＸＥ／ΔＥ４ｏｒｆ６／７）、Ａｄ−１８９（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８９）（Ｅ１Ａ  ΔＬＸＣＸＥ）、またはＯＮＹＸ−８３８（Ｅ１Ａ  ΔＣＲ２）に感染させた。ＯＮＹＸ−８３８は、Ｅ１ＡのＣＲ２ドメイン内にあるΔＬＸＣＸＥも欠く。静止状態ヒト初代小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）をＭＯＩ１０で感染させた。Ａｄ−１０２（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０２）は、感染中のより遅い時間におけるＥ１Ａレベルの予期された低下を示す（図８Ａ）。同様に、Ａｄ−１８９（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８９）およびＯＮＹＸ−８３８は、感染中のより遅い時間でＥ１Ａレベルの低下を示すが、より早い時点でより強い発現を有する。Ａｄ−１８１（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８１）は、感染全体にわたってＥ１Ａのより強いかつ継続した発現を示し、それは、アデノウイルスライフサイクルを通じて進行することができないことを示す。コンフルエントな肺腺癌細胞（Ａ５４９）をＭＯＩ３０で感染させた。すべての感染は、感染中のより遅い時間にＥ１Ａレベルの予期された低下を示し、一般的なアデノウイルスライフサイクル進行を示す（図８Ｂ）。感染細胞内のアデノウイルス後期タンパク質、および突然変異アデノウイルスのサイクリンの発現の試験を図９に示す。後期構造タンパク質の発現の明らかな欠損はまったくなく、サイクリンは、すべての感染させたＡ５４９試料中で存在したままである。感染したＳＡＥＣおよびＡ５４９細胞のＤＮＡ複製を図１０に示す。ＤＮＡ複製欠損は、いずれの突然変異ウイルス感染でも明らかでない。図１１は、感染したＳＡＥＣおよびＡ５４９からのアデノウイルスバーストを示す。このバーストアッセイについてのこれらの時点におけるＡｄ−２１０（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ２１０）を例外として、ウイルス複製の欠損はまったくない。図１２は、感染させて７日後の感染したＳＡＥＣおよびＡ５４９の細胞生存率を示す。ウイルスのうち、野生型と比べて、突然変異ウイルスによる細胞殺傷の欠損はまったくない。図１３は、突然変異ウイルスが正常ヒト星状細胞（ＮＨＡ）内で減弱された感染を確かに有し、図１４および１５は、突然変異アデノウイルスがそれぞれグリア芽細胞腫Ｕ８７およびＵ１１８細胞内で複製欠損をまったく有さないことを示す。
【０１３０】
したがって、データは、野生型およびＥ１ＡΔＣＲ２ウイルスと対照的に、Ｅ１ＡΔＣＲ２／ΔＥ４ｏｒｆ６／７およびまたΔＥ４ｏｒｆ６／７ウイルスは、カプシドタンパク質発現を欠いていること、Ｅ２Ｆ標的遺伝子−サイクリンＡおよびＢを誘導することができないこと、Ｓ期エントリーおよびウイルス複製を誘発することができないことによって立証されるように、初代細胞内で不十分に複製することを示す。例えば、図９、１０、および１１を参照。対照的に、これらのウイルスは、Ａ５４９細胞、および腫瘍細胞株のパネル内で野生型（ＷＴ）ウイルスレベルまで複製する。したがって、提供されるアデノウイルスは、選択的ながん治療剤である。
【０１３１】
Ｅ４ｏｒｆ１中の突然変異を含む突然変異アデノウイルスのより大きいセットの複製特異性の結果（表１を参照）を、図１７〜２２に示し、図２３に要約する。図１７は、感染させて１０日後の感染した初代正常ヒト星状細胞（ＮＨＡ）の細胞生存率を示すグラフである。図１８は、感染させて９日後の感染した静止状態正常小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ−ｈＴＥＲＴ）の細胞生存率を示すグラフである。図１９は、感染させて１０日後の感染した増殖中のＳＡＥＣ−ｈＴＥＲＴ細胞の細胞生存率を示すグラフである。図２０は、感染させて７日後の感染したヒト肺腺癌細胞（Ａ５４９）の細胞生存率を示すグラフである。図２１は、感染させて７日後の感染したヒト乳がん細胞（ＭＤＡ  ＭＢ２３１）の細胞生存率を示すグラフである。図２２は、感染させて７日後の感染したグリア芽細胞腫細胞（Ｕ８７）の細胞生存率を示すグラフである。図２３は、感染させて７日後の感染した初代ＮＨＡ、ＳＡＥＣ−ｈＴＥＲＴ（静止状態）、ＳＡＥＣ−ｈＴＥＲＴ（増殖中）、Ａ５４９、ＭＤＡ  ＭＢ２３１、およびＵ８７細胞についての細胞生存率アッセイの定量化を示すヒートマップ表である。これらのデータは、Ｅ１ＡおよびＥ４ｏｒｆ６／７の様々な改変の組合せが、欠損したＲｂ腫瘍抑制因子経路を有するがん細胞内で特異的に複製する選択的な腫瘍溶解性アデノウイルスをもたらすことを示す。
【０１３２】
実施形態
実施形態１．  １つまたは複数の改変を含むＥ１Ａポリペプチドを含み、１つまたは複数の改変を含むＥ４ｏｒｆ６／７ポリペプチドを含む、アデノウイルス。
実施形態２．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが、Ｅ１ＡのＲｂ結合部位中に改変を含む、実施形態１に記載のアデノウイルス。
実施形態３．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが、２つのＲｂ結合部位を含み、かつ前記Ｅ１Ａポリペプチドが、両方のＲｂ結合部位中に改変を含む、実施形態１に記載のアデノウイルス。
実施形態４．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが、前記Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基１２０〜１３０の１つまたは複数において改変を含む、実施形態１に記載のアデノウイルス。
実施形態５．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが、前記Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基１２２〜１２６の１つまたは複数において改変を含む、実施形態１に記載のアデノウイルス。
実施形態６．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが、前記Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基３５〜５５の１つまたは複数において改変を含む、実施形態１から５のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
実施形態７．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが、前記Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基３７〜４９の１つまたは複数において改変を含む、実施形態１から６のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
実施形態８．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが欠失を含む、実施形態１から７のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
実施形態９．  前記欠失が、前記Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基１２２〜１２６の欠失である、実施形態８に記載のアデノウイルス。
実施形態１０．  前記欠失が、前記Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基２〜１１の欠失である、実施形態８に記載のアデノウイルス。
実施形態１１．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが欠失ΔＬＸＣＸＥを含む、実施形態１に記載のアデノウイルス。
実施形態１２．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが、１つまたは複数の置換を含む、実施形態１から１１のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
実施形態１３．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが、残基Ｙ４７、残基Ｃ１２４、または残基Ｙ４７および残基Ｃ１２４の両方において置換を含む、実施形態１２に記載のアデノウイルス。
実施形態１４．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが置換Ｙ４７Ｈを含む、実施形態１２に記載のアデノウイルス。
実施形態１５．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが置換Ｃ１２４Ｇを含む、実施形態１２に記載のアデノウイルス。
実施形態１６．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが、置換Ｙ４７ＨおよびＣ１２４Ｇを含む、実施形態１２に記載のアデノウイルス。
実施形態１７．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが、アミノ酸残基２〜１１の欠失をさらに含む、実施形態１２から１６のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
実施形態１８．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが、Ｅ１Ａのアミノ酸残基１２２〜１２６の欠失および残基Ｙ４７における置換を含む、実施形態１に記載のアデノウイルス。
実施形態１９．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが配列番号１を含む、実施形態１から１８のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
実施形態２０．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが配列番号２を含む、実施形態１から１８のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
実施形態２１．  前記Ｅ４ｏｒｆ６／７ポリペプチドが、Ｅ４ｏｒｆ６／７エクソンの一方または両方において改変を含む、実施形態１から２０のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
実施形態２２．  前記Ｅ４ｏｒｆ６／７ポリペプチドが、Ｅ４ｏｒｆ６／７エクソンの一方または両方の欠失を含む、実施形態１から２０のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
実施形態２３．  前記Ｅ４ｏｒｆ６／７ポリペプチドが配列番号３を含む、実施形態１から２２のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
実施形態２４．  前記Ｅ４ｏｒｆ６／７ポリペプチドが配列番号４を含む、実施形態１から２２のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
実施形態２５．  １つまたは複数の改変を含むＥ４ｏｒｆ１ポリペプチドをさらに含む、実施形態１から２４のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
実施形態２６．  前記Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドが、１つまたは複数の欠失を含む、実施形態２５に記載のアデノウイルス。
実施形態２７．  前記Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドが、Ｅ４ｏｒｆ１のＣ末端領域中に欠失を含む、実施形態２５に記載のアデノウイルス。
実施形態２８．  前記Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドが、前記Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドの残基１２５〜１２８の欠失を含む、実施形態２５に記載のアデノウイルス。
実施形態２９．  前記Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドが配列番号５を含む、実施形態２５から２８のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
実施形態３０．  １つまたは複数の改変を含むＥ１Ａポリペプチドを含み、１つまたは複数の改変を含むＥ４ｏｒｆ１ポリペプチドを含むアデノウイルス。
実施形態３１．  前記Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドが、１つまたは複数の欠失を含む、実施形態３０に記載のアデノウイルス。
実施形態３２．  前記Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドが、Ｅ４ｏｒｆ１のＣ末端領域中に欠失を含む、実施形態３１に記載のアデノウイルス。
実施形態３３．  前記Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドが、前記Ｅ４ｏｒｆ１ポリペプチドの残基１２５〜１２８の欠失を含む、実施形態３１に記載のアデノウイルス。
実施形態３４．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが、Ｅ１ＡのＲｂ結合部位中に改変を含む、実施形態３０から３３のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
実施形態３５．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが、２つのＲｂ結合部位を含み、かつ前記Ｅ１Ａポリペプチドが、両方のＲｂ結合部位中に改変を含む、実施形態３４に記載のアデノウイルス。
実施形態３６．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが、前記Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基１２０〜１３０の１つまたは複数において改変を含む、実施形態３０から３３のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
実施形態３７．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが、前記Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基１２２〜１２６の１つまたは複数において改変を含む、実施形態３０から３３のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
実施形態３８．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが、前記Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基３５〜５５の１つまたは複数において改変を含む、実施形態３０から３３のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
実施形態３９．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが、前記Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基３７〜４９の１つまたは複数において改変を含む、実施形態３０から３３のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
実施形態４０．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが欠失を含む、実施形態３０から３３のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
実施形態４１．  前記欠失が、前記Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基１２２〜１２６の欠失である、実施形態４０に記載のアデノウイルス。
実施形態４２．  前記欠失が、前記Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基２〜１１の欠失である、実施形態４０に記載のアデノウイルス。
実施形態４３．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが、欠失ΔＬＸＣＸＥを含む、実施形態３０から３３のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
実施形態４４．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが、１つまたは複数の置換を含む、実施形態３０から３３のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
実施形態４５．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが、残基Ｙ４７、残基Ｃ１２４、またはＹ４７およびＣ１２４の両方において置換を含む、実施形態４４に記載のアデノウイルス。
実施形態４６．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが置換Ｙ４７Ｈを含む、実施形態４４に記載のアデノウイルス。
実施形態４７．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが置換Ｃ１２４Ｇを含む、実施形態４４に記載のアデノウイルス。
実施形態４８．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが、置換Ｙ４７ＨおよびＣ１２４Ｇを含む、実施形態４４に記載のアデノウイルス。
実施形態４９．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが、アミノ酸残基２〜１１の欠失をさらに含む、実施形態４４から４８のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
実施形態５０．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが、Ｅ１Ａのアミノ酸残基１２２〜１２６の欠失および残基Ｙ４７における置換を含む、実施形態３０から３３のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
実施形態５１．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが配列番号１を含む、実施形態３０から５０のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
実施形態５２．  前記Ｅ１Ａポリペプチドが配列番号２を含む、実施形態３０から５０のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
実施形態５３．  Ｒｂ欠損細胞内で選択的に複製する、実施形態１から５２のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
実施形態５４．  実施形態１から５３のいずれか一項に記載のアデノウイルスおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
実施形態５５．  実施形態５４に記載の医薬組成物および使用のための指示書を含むキット。
実施形態５６．  １種または複数の追加の治療剤をさらに含む、実施形態５５に記載のキット。
実施形態５７．  前記治療剤が化学療法剤である、実施形態５６に記載のキット。
実施形態５８．  対象における増殖性障害を処置する方法であって、実施形態１から５３のいずれか一項に記載のアデノウイルスまたは実施形態５４に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。
実施形態５９．  前記アデノウイルスまたは医薬組成物が、静脈内、脈管内、クモ膜下、筋肉内、皮下、腹腔内、または経口的に投与される、実施形態５８に記載の方法。
実施形態６０．  １種または複数の追加の治療剤を前記対象に投与するステップをさらに含む、実施形態５８または５９に記載の方法。
実施形態６１．  前記治療剤が化学療法剤である、実施形態６０に記載の方法。
実施形態６２．  前記増殖性障害が、肺がん、前立腺がん、結腸直腸がん、乳がん、甲状腺がん、腎がん、肝がん、および白血病からなる群から選択される、実施形態５８から６１のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６３．  およそ１０３〜１０１２プラーク形成単位の前記アデノウイルスが前記対象に投与される、実施形態５８から６２のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６４．  前記増殖性障害が転移性である、実施形態５８から６３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６５．  １つまたは複数の改変を含むＥ１Ａを含み、１つまたは複数の改変を含むＥ４ｏｒｆ６／７を含むアデノウイルス。
実施形態６６．  Ｅ１Ａの改変が、Ｅ１ＡのＲｂ結合部位中の改変を含む、実施形態６５に記載のアデノウイルス。
実施形態６７．  Ｅ１Ａの改変が、Ｅ１Ａポリペプチドのアミノ酸残基１２２〜１２６の１つまたは複数において改変を含む、実施形態６５に記載のアデノウイルス。
実施形態６８．  Ｅ１Ａの改変が欠失を含む、実施形態６５に記載のアデノウイルス。
実施形態６９．  欠失が、Ｅ１Ａのアミノ酸残基１２２〜１２６の欠失である、実施形態６５に記載のアデノウイルス。
実施形態７０．  Ｅ１Ａの改変がΔＬＸＣＸＥである、実施形態６５に記載のアデノウイルス。
実施形態７１．  Ｅ４ｏｒｆ６／７の改変が、Ｅ４ｏｒｆ６／７エクソンの一方または両方における改変を含む、実施形態６５から７０のいずれか１つに記載のアデノウイルス。
実施形態７２．  Ｅ４ｏｒｆ６／７の改変が、Ｅ４ｏｒｆ６／７エクソンの一方または両方の欠失である、実施形態６５から７０のいずれか１つに記載のアデノウイルス。
実施形態７３．  Ｅ４ｏｒｆ６／７の改変がΔＥ４ｏｒｆ６／７である、実施形態６５から７０のいずれか１つに記載のアデノウイルス。
実施形態７４．  Ｅ１Ａ  ΔＬＸＣＸＥおよびΔＥ４ｏｒｆ６／７を含む、実施形態６５に記載のアデノウイルス。
実施形態７５．  Ｒｂ欠損細胞内で選択的に複製する、実施形態６５から７４のいずれか１つに記載のアデノウイルス。
実施形態７６．  実施形態６５から７５のいずれか一項に記載のアデノウイルスおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
実施形態７７．  実施形態７６に記載の医薬組成物および使用のための指示書を含むキット。
実施形態７８．  １種または複数の追加の治療剤をさらに含む、実施形態７７に記載のキット。
実施形態７９．  前記治療剤が化学療法剤である、実施形態７８に記載のキット。
実施形態８０．  対象における増殖性障害を処置する方法であって、実施形態６５から７５のいずれか一項に記載のアデノウイルスまたは実施形態７６に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。
実施形態８１．  前記アデノウイルスまたは医薬組成物が、静脈内、脈管内、クモ膜下、筋肉内、皮下、腹腔内、または経口的に投与される、実施形態８０に記載の方法。
実施形態８２．  １種または複数の追加の治療剤を前記対象に投与するステップをさらに含む、実施形態８０または８１に記載の方法。
実施形態８３．  前記治療剤が化学療法剤である、実施形態８２に記載の方法。
実施形態８４．  前記増殖性障害が、肺がん、前立腺がん、結腸直腸がん、乳がん、甲状腺がん、腎がん、肝がん、および白血病からなる群から選択される、実施形態６５から８３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態８５．  およそ１０３〜１０１２プラーク形成単位の前記アデノウイルスが前記対象に投与される、実施形態６５から８４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態８６．  前記増殖性障害が転移性である、実施形態６５から８５のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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