(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の生理的流体中のグルコース濃度をモニタリングするシステムであって、
光ファイバと、前記光ファイバの遠位領域に沿って配置されたヒドロゲルに固定化された平衡蛍光化学指示薬とを含むセンサであって、
前記固定化された化学指示薬系を含む前記ヒドロゲルが乾燥状態であり、
前記生理的流体中に前記光ファイバの前記遠位領域を配置する際、固定化された化学指示薬系を有する前記ヒドロゲルが乾燥状態で配置され、
固定化された化学指示薬系を有する前記ヒドロゲルが前記生理的流体中で水和される、センサと、
前記センサを用いて前記生理的流体中で、独立して測定されたグルコース濃度、および、任意でｐＨ値に対する化学指示薬系のｉｎ  ｖｉｖｏ較正を実行し、且つ、
前記生理的流体中のグルコース濃度をモニタリングする、モニタと、
を備えるシステム。
【請求項２】
前記生理的流体が間質液である、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記生理的流体が血液である、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記光ファイバの遠位領域が皮下に配置される、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記光ファイバの遠位領域が血管内に配置される、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記化学指示薬系が酸および塩基形態を有する蛍光体を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項７】
前記生理的流体のｐＨが、前記蛍光体の酸および塩基形態の蛍光発光比率に基づいて推定される、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ較正が、前記生理的流体の任意に測定されたｐＨに対して実行される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項９】
前記生理的流体の温度を測定する温度センサをさらに備える、請求項１〜８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１０】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ較正が、前記生理的流体の測定温度に基づいて補正される、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記ヒドロゲルが前記生理的流体中で少なくとも約１０分間水和される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１２】
前記ヒドロゲルが前記生理的流体中で少なくとも約１〜２時間水和される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１３】
前記センサの前記化学指示薬系は、既知のグルコース溶液に対して工場較正されており、前記モニタは、前記工場較正に関するデータを保存している、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１４】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ較正が、式
Ｇ＝Ｍ＊Ｌｎ（Ｇｌｕ）＋Ｂ
（式中、Ｇは前記化学指示薬系の蛍光強度であり、Ｇｌｕは前記生理的流体中の前記グルコース濃度であり、Ｍは較正の直線近似の傾きであり、Ｂは較正の直線近似の切片であり、
Ｇは、式
【数１】
0006534616.tif 000045
を用いてｐＨを考慮するように較正係数によって調整され、
式中、ＣＡＬｇｕｌは較正係数であり、Ｇｌｕｃａｌは前記独立して測定された生理学的サンプル中のグルコース濃度の値であり、Ｌｎ（ｇｌｕｃａｌｃ）はドロー時間のグルコース値の自然対数である）を適用することを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１５】
グルコースセンサであって、光ファイバであって、前記光ファイバの遠位端領域に沿って配置されたヒドロゲル内に固定化された平衡蛍光化学指示薬系を含み、前記固定化された化学指示薬系を含む前記ヒドロゲルが乾燥状態である、光ファイバと、前記光ファイバの近位端領域に沿って配置される光結合と、を含むグルコースセンサ。
【請求項１６】
流体の検体濃度をモニタリングするシステムであって、
光ファイバと、前記光ファイバの遠位領域に沿って配置されたヒドロゲルに固定化された平衡蛍光化学指示薬とを含むセンサであって、
前記固定化された化学指示薬系を含む前記ヒドロゲルが乾燥状態であり、
事前較正せずに前記流体に前記光ファイバの前記遠位領域が配置されるセンサと、
前記センサを用いて前記流体中の独立して測定されたグルコース濃度に対して前記化学指示薬系を較正し、且つ、
前記流体中のグルコース濃度をモニタリングする、モニタと、
を備えるシステム。
【請求項１７】
前記流体が哺乳動物の間質液である、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
前記流体が哺乳動物の血液である、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１９】
前記流体が発酵ブロスである、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２０】
前記光ファイバの遠位領域が皮下に配置される、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２１】
前記光ファイバの遠位領域が血管内に配置される、請求項１６に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ｉｎ  ｖｉｖｏで光検体センサを較正する方法およびアルゴリズムが、本明細書で開示される。
【背景技術】
【０００２】
サンプル中の異なる化学種の存在を検出して測定するための検体センサ、例えばグルコースセンサは周知である。検体の測定精度を保証するために、存在する検体の量の基準として、または他の計器によってなされた測定値と一致させるように、検体センサは一般的に較正が必要となる。センサ対センサの差異およびセンサが配置される環境の違いを説明するために、このような較正はしばしば必要である。
【０００３】
現在のセンサ較正は、患者にとって時間がかかり、不快であり、侵入的であって、検体センサの出力を含む信号を比較するため、血糖濃度のｅｘ  ｖｉｖｏ分析用に複数回の採血または持続的なサンプル採取を必要とする場合がある。検体濃度と比較する際にセンサ出力が線形でない、またはある濃度範囲でだけ線形である場合、更なる複雑さおよび潜在的な不確定さが発生し、信頼性の高い較正を実行することに、より大きな注意、より多くの時間およびより多くの難しさを要する。
【０００４】
また異なる手順によって得られた同じサンプルの検体測定値は、報告されている検体の濃度とは異なる場合がある。同じサンプルで報告されたこれらの濃度の違いは、分析技術の違い、サンプル調製の違い、または他の理由にも起因している可能性がある。例えば、いくつかの検体測定技術は、溶液中の検体濃度を決定する前に血液サンプルを希釈し、一方で他の技術は単に非希釈の血液サンプルで検体濃度を決定する。場合によってはこのような希釈が、血液サンプルに存在する細胞から抽出される追加の検体をもたらすことがあり、異なる方法によって報告されるかもしれない検体量の変化を生じさせることがある。技術の他の変更が、手順の一部としてサンプルがろ過されるもしくは遠心分離される場合、または異なる技術に基づくセンサが用いられた場合のように、報告された値の変化を引き起こすこともあり得る。場合によっては、患者のための測定がある方法によってなされて、そして治療プロトコルは別の方法に基づいて決定されていた場合、問題が発生することがあり得る。
【０００５】
上記の課題により、いくつかのセンサ較正は患者の血流外で行われてきた。患者に与える不快感が少なくなるとはいえ、患者の体外での較正は、センサが患者の生理的条件を考慮できたかもしれない患者の血流または間質液内での較正ほど正確ではない可能性がある。検体センサ較正におけるエラーは、間違った測定値につながりかねない。例えば治療のためにこのような誤った測定値に依存すること、または分析技術と治療プロトコルのミスマッチは、有害反応およびことによると致命的な状況に結びつきかねない。これらの観点から、患者の不便を最小化しつつ、ｉｎ  ｖｉｖｏ検体センサの較正の改良された方法が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，１３７，８３３号
【特許文献２】米国特許第５，５１２，２４６号
【特許文献３】米国特許第５，５０３，７７０号
【特許文献４】米国特許第６，３０４，７６６号
【特許文献５】米国特許第６，７６６，１８３号
【特許文献６】米国特許第６，８０４，５４４号
【特許文献７】米国特許出願公開第２０１１／０１０５８６６Ａ１号
【特許文献８】米国特許出願公開第２０１１／０２２４５１６Ａ号
【特許文献９】米国特許第７，７５１，８６３号
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００８／０１８８７２５号
【特許文献１１】米国特許第７，４１７，１６４号
【特許文献１２】米国特許第７，４７０，４２０号
【特許文献１３】米国特許出願公開第２００８／０１８７６５５号
【特許文献１４】米国特許第６，６５３，１４１号
【特許文献１５】米国特許第６，６２７，１７７号
【特許文献１６】米国特許第６，８００，４５１号
【特許文献１７】米国特許第６，７９４，１９５号
【特許文献１８】米国特許第６，００２，９５４号
【特許文献１９】米国特許第６，３１９，５４０号
【特許文献２０】米国特許第５，７６３，２３８号
【特許文献２１】米国特許出願公開第２００５／０２３３４６５号
【特許文献２２】米国特許出願公開第２００５／００９００１４号
【特許文献２３】米国特許出願公開第２００８／０１８８７２２号
【特許文献２４】米国特許出願公開第２００４／００２８６１２号
【特許文献２５】米国特許出願公開第２００６／００８３６８８号
【特許文献２６】米国特許出願公開第２００６／０１０５１７４号
【特許文献２７】米国特許第４，８８６，３３８号
【特許文献２８】米国特許第４，７９８，７３８号
【特許文献２９】米国特許第５，１１４，６７６号
【特許文献３０】米国特許第７，９６８，７１４号
【特許文献３１】米国特許第７，７６７，８４６号
【特許文献３２】米国特許第８，１１０，２５１号
【特許文献３３】米国特許第８，２０２，７３１号
【特許文献３４】米国特許第７，９３９，６６４号
【特許文献３５】米国特許第８，０８８，０９７号
【特許文献３６】米国特許第３，９９６，３４５号
【特許文献３７】米国特許出願公開第２０１０／０３１２４８３号
【特許文献３８】米国特許第８，４７３，２２２号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】LumaSense Technologies, Inc. (Santa Clara, CA), "Fluoroptic Temperature Monitoring" http://www.lumasenseinc.com/technology/fluoroptic_thermometry.html
【非特許文献２】バドゥグ，Ｒ．ら（Badugu, R et al.）2005 Talanta 65 (3):762-768
【非特許文献３】バドゥグ，Ｒ．ら（Badugu, R et al.）2005 Bioorg. Med. Chem. 13 (1):113-119
【非特許文献４】シュウ・Ｚ、Ａ・ロリンズら（Xu, Z., A. Rollins, et al.）(1998) "A novel fiber-optic pH sensor incorporating carboxy SNAFL-2 and fluorescent wavelength-ratiometric detection" Journal of Biomedical Materials Research 39:9-15
【非特許文献５】ソン・Ａ、Ｓ・パルスら（Song, A., S. Parus, et al.）(1997) "High-performance fiber-optic pH microsensors for practical physiological measurements using a dual-emission sensitive dye" Analytical Chemistry 69:863-867
【非特許文献６】ウルフベイス，Ｏ・Ｓ，Ｅ・フューリンガーら（Wolfbeis, O. S., E. Fuerlinger, et al.）(1983). "Fluorimetric analysis.I. Study on fluorescent indicators for measuring near neutral ('physiological') pH values" Fresneius' Z. Anal. Chem. 314(2):119-124
【非特許文献７】アゲイン，Ｖ・ＩおよびＤｒ．Ｒ・ウォルト（Agayn, V. I. and Dr. R. Walt）(1993). "Fiber-optic sensor for continuous monitoring of fermentation pH." Biotechnology 72 (6):6-9
【非特許文献８】ラッティ，Ｇ・Ａ（Lutty, G. A.）(1978). "The acute intravenous toxicity of stains, dyes, and other fluorescent substances." Toxical Pharmacol. 44:225-229
【非特許文献９】シュシュン，ＺおよびＷ・Ｒ・ザイツ（Zhujun, Z. and W. R. Seitz）(1984). "A fluorescence sensor for quantifying pH in the range from 6.5 to 8.5." Analytical Chimica Acta 160: 47-55
【非特許文献１０】オッフェンバッハ，Ｈ、Ｏ・Ｓ・Ｗｏｌｆｂｅｉｓら（Offenbacher, H., O. S. Wolfbeis, et al.）(1986). "Fluorescence optical sensors for continuous determination of near-neutral pH values." Sensor Actuator 9:73-84
【非特許文献１１】シュルマン，Ｓ・Ｇ、Ｓ・チェンら（Schulman, S. G., S. Chen, et al.）(1995) "Dependence of the fluorescence of immobilized l-hydroxypyrene-3,6,8-trisulfonate on solution pH: extension of the range of applicability of a pH fluorosensor." Anal Chim Acta 304:165-170
【非特許文献１２】ゲーリック，Ｊ・Ｌ、Ｄ・Ｗ・ルベルスら（Gehrich, J. L., D. W. Lubbers, et al.）(1986). "Optical fluorescence and its application to an intravascular blood gas monitoring system." IEE TBio-med Eng BME-33: 117-132
【非特許文献１３】チャン，Ｓ、Ｓ・タナカら（Zhang, S., S. Tanaka, et al.）(1995). "Fibre-optical sensor based on fluorescent indicator for monitoring physiological pH values." Med Biol Eng Comput33: 152-156
【非特許文献１４】コストフ，Ｙ、Ｐ・ハームズら（Kostov, Y., P. Harms, et al.）(2001). "Low-cost microbioreactor for high-throughput bioprocessing." Biotechnol Bioeng 72: 346-352
【非特許文献１５】The Immunoassay Handbook, デービッド・ワイルド（David Wild）編,Macmillan Press 1994
【非特許文献１６】メドウズおよびシュルツ（Meadows and Shultz）(Anal. Chim. Acta(1993 280: pp21-30)
【非特許文献１７】ラコヴィッツら（Lakowitz et al）, Analytica Chimica Acta, 271, (1993), 155-164
【非特許文献１８】パイパー，ハンナ・Ｇ（Piper, Hannah G.） "Real-Time Continuous Glucose Monitoring in Pediatric Patients During and After Cardiac Surgery," in Pediatrics, Vol. 118, No. 3, Sept. 2006
【非特許文献１９】ゴールドバーグら（Goldberg et al.）“Diabetes Technol Ther." 2004; 6: 339-347
【非特許文献２０】グエルチら（Guerci et al.）"Diabetes Care" 2003; 26: 582-589
【非特許文献２１】ヴリーゼンドープら（Vriesendorp et al.） "Diabetes Technol Ther." 2005; 7: 315-322
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
患者の生理的流体内のグルコース濃度をモニタリングする方法が、開示される。本方法は、光ファイバの遠位領域に沿って配置されたヒドロゲルに平衡蛍光化学指示薬を固定化するステップと；固定化された化学指示薬系を乾燥するステップと；光ファイバの遠位領域を生理的流体に配置するステップであって、固定化された化学指示薬系を有するヒドロゲルが乾燥状態で配置されている、ステップと；固定化された化学指示薬系を有するヒドロゲルを生理的流体で水和させるステップと；該生理的流体中の、独立して測定されたグルコース濃度、および、任意でｐＨ値に対する化学指示薬系のｉｎ  ｖｉｖｏ較正を実行するステップと；生理的流体中のグルコース濃度をモニタリングするステップと；を含む。
【０００９】
一実施形態において、生理的流体は間質液であってもよい。一実施形態において、生理的流体は血液であってもよい。一実施形態において、光ファイバの遠位領域は皮下に配置されてもよい。一実施形態において、光ファイバの遠位領域は血管内に配置されてもよい。
【００１０】
一実施形態において、化学指示薬系は酸および塩基形態を有する蛍光体を含む。生理的流体のｐＨは、蛍光体の酸および塩基形態からの蛍光発光の比率に基づいて推定されてもよい。ｉｎ  ｖｉｖｏ較正は、生理的流体の推定ｐＨに基づいて修正することができる。
【００１１】
一実施形態において、前記方法はさらに生理的流体の温度を測定するステップを含む。ｉｎ  ｖｉｖｏ較正は、生理的流体の測定温度に基づいて修正することができる。
【００１２】
前記方法のいくつかの実施形態において、ヒドロゲルは少なくとも約１０分間水和される。他の実施形態において、ヒドロゲルは約１〜２時間水和される。
【００１３】
前記方法の一実施形態において、ｉｎ  ｖｉｖｏ較正は式
Ｇ  ＝  Ｍ＊Ｌｎ（Ｇｌｕ）  ＋  Ｂ
を適用することを含む。
【００１４】
式中、Ｇは化学指示薬系の蛍光強度であり、Ｇｌｕは生理的流体中のグルコース濃度であり、Ｍは較正の直線近似の傾きであり、Ｂは較正の直線近似の切片であり、
Ｇは、式
【数１】
0006534616.tif 000002
を用いて、ｐＨを考慮するように較正係数によって調整され、
式中、ＣＡＬｇｕｌは較正係数であり、Ｇｌｕｃａｌは独立して測定された生理学的サンプル中のグルコース濃度の値である。
【００１５】
グルコースセンサが、実施形態にしたがって開示される。センサは、光ファイバの遠位端領域に沿って配置されたヒドロゲル内に固定化された平衡蛍光化学指示薬系を含む光ファイバを備え、固定化された化学指示薬系は乾燥状態であり、光結合は光ファイバの近位端領域に沿って配置されている。
【００１６】
患者の生理的流体中のグルコース濃度をモニタリングするための方法が開示されており、該方法は、光ファイバの遠位領域に沿って配置されたヒドロゲルに固定化された平衡蛍光化学指示薬を含むセンサを提供するステップと、ｅｘ  ｖｉｖｏ較正を行うことなく該生理的流体に光ファイバの遠位領域を配置するステップと、該生理的流体中の独立して測定されたグルコース濃度に対する化学指示薬系のｉｎ  ｖｉｖｏ較正を実行するステップと、生理的流体中のグルコース濃度をモニタリングするステップと、を含むことができる。
【００１７】
一実施形態において、生理的流体は間質液であってよい。一実施形態において、生理的流体は血液であってよい。一実施形態において、光ファイバの遠位領域は皮下に配置することができる。一実施形態において、光ファイバの遠位領域は血管内に配置することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】らせん構造（helical configuration）を形成する一連の孔を有するグルコースセンサを示す図である。
【図１Ｂ】ある角度で穿孔されたまたは形成された一連の孔を有するグルコースセンサを示す図である。
【図１Ｃ】少なくとも１つのらせん溝（spiral groove）を有するグルコースセンサの図である。
【図１Ｄ】一連の三角状楔形切り取り部を有するグルコースセンサの図である。
【図２Ａ】センサの遠位部に空洞を有すると共に温度プローブを有するグルコースセンサの一実施形態の断面図である。
【図２Ｂ】図２Ａに示されるグルコースセンサの斜視図である。
【図３Ａ】センサの遠位部に空洞を有するグルコースセンサの別の実施形態の断面図である。
【図３Ｂ】図３Ａに示されるグルコースセンサの斜視図である。
【図４】センサの遠位部の空洞に窓開口部を有するグルコースセンサの別の実施形態の断面図である。
【図５】ケージに囲われたセンサの遠位部に空洞を有すると共に追加の標準物質を有するグルコースセンサの別の実施形態の断面図である。
【図６】センサの遠位部に空洞を有すると共に追加の標準物質を有するグルコースセンサの別の実施形態の断面図である。
【図７】ケージに囲われたセンサの遠位部に空洞を有すると共に非外傷性先端部へ伸びている標準物質を有するグルコースセンサの別の実施形態の断面図である。
【図８】ケージに囲われたセンサの遠位部に空洞を有すると共にケージの直径にわたって伸びた棒である標準物質を有するグルコースセンサの別の実施形態の断面図である。
【図９】標準物質に囲われ、さらにケージに囲われたセンサの遠位部に空洞を有するグルコースセンサの別の実施形態の断面図である。
【図１０】ケージに囲われたセンサの遠位部に空洞を有すると共に光ファイバ内に埋め込まれた棒として標準物質を有するグルコースセンサの別の実施形態の断面図である。
【図１１】ケージに囲われたセンサの遠位部内に並んでいる空洞と標準物質とを有するグルコースセンサの別の実施形態の断面図である。
【図１２】ケージに囲われたセンサの遠位部に空洞を有すると共に光ファイバと空洞との間に透光性標準物質を有するグルコースセンサの別の実施形態の断面図である。
【図１３】基準光ファイバに隣接したグルコース検知光ファイバを有するグルコースセンサの他の実施形態の概略説明図である。
【図１４】励起光パルス後、経時的に蛍光発光が減衰することを示すグラフである。
【図１５】発光信号と励起信号の間の関係を示すグラフである。
【図１６Ａ】ドナー蛍光体に結合したグルコース結合分子およびアクセプタ分子に結合したグルコース類似体を含むＦＲＥＴを使用して、グルコースを測定する競合的結合系を概略的に示す図である。
【図１６Ｂ】ドナー蛍光体に結合したグルコース結合分子およびアクセプタ分子に結合したグルコース類似体を含むＦＲＥＴを使用して、グルコースを測定する競合的結合系を概略的に示す図である。
【図１６Ｃ】ドナー蛍光体に結合したグルコース結合分子およびアクセプタ分子に結合したグルコース類似体を含むＦＲＥＴを使用して、グルコースを測定する競合的結合系を概略的に示す図である。
【図１７】異なるグルコース濃度における３７℃でのＧ２とｐＨの間の対数−線形（Ln-linear）関係を示すグラフである。
【図１８】適用可能なグルコース濃度の範囲における３７℃での、Ｇ２切片とｐＨの関係を示すグラフである。
【図１９】適用可能なグルコース濃度の範囲における３７℃での、Ｇ２とｐＨの傾きの関係を示すグラフである。
【図２０】１点ｉｎ  ｖｉｖｏ較正を伴う乾燥挿入された光学グルコースセンサと、ＹＳＩラボ分析装置とを使用し、これらのグルコース測定法を比較するグラフである。
【図２１】乾燥挿入された光学グルコースセンサとラボｐＨ計（参照ｐＨ）とを使用し、これらのレシオメトリックｐＨ推定値を比較するグラフである。
【図２２】Ｇ２とＧ１の差、およびその差から平均をひいた値を示すグラフである。
【図２３】乾燥挿入された光学グルコースセンサおよびラボｐＨ計（参照ｐＨ）を使用し、これらのレシオメトリックｐＨ推定値の比較を示すグラフである。
【図２４】修正ミカエリス−メンテン式に対するＬｎ線形法の相関関係を示すグラフである。
【図２５】ＹＳＩラボ分析装置を使用して求めたグルコース濃度と比較した、１点ｉｎ  ｖｉｖｏ較正を伴う乾燥挿入された光学グルコースセンサを用いて求めたグルコース濃度を表すテストケースを示すグラフである。
【図２６】ＹＳＩラボ分析装置を使用して求めたグルコース濃度と比較した、１点ｉｎ  ｖｉｖｏ較正を伴う乾燥挿入された光学グルコースセンサを用いて求めたグルコース濃度を表す別のテストケースを示すグラフである。
【図２７】動脈カテーテルの端に取り付けた蛍光センサの実施形態を示す図である。
【図２８】ピラニン系蛍光体、ボロン酸レセプタおよび消光剤複合物を含む複合物の実施形態におけるグルコースの効果を示す図である。
【図２９】検体センサの一実施形態について、動脈内配置の実現可能性を実証する、最初の２４時間の臨床試験結果を示すグラフである。
【図３０】検体センサの実施形態にしたがって、特定の手順および装置の改善による、多施設導入の被験者への試験（multi-center lead-in subject experience）結果を示すグラフである。
【図３１Ａ】検体センサの実施形態を使用する、プロスペクティブと後処理試験の比較を示すグラフである。
【図３１Ｂ】検体センサの実施形態を使用する、プロスペクティブと後処理試験の比較を示すグラフである。
【図３２Ａ】検体センサの実施形態を使用する、４８時間臨床試験の結果を示すグラフである。
【図３２Ｂ】検体センサの実施形態を使用する、４８時間臨床試験の結果を示すグラフである。
【図３３】５人の被験者での１施設４８時間導入の結果を示す。
【図３４Ａ】乾燥挿入センサの実施形態を使用する、試験結果を示すグラフである。
【図３４Ｂ】乾燥挿入センサの実施形態を使用する、試験結果を示すグラフである。
【図３４Ｃ】乾燥挿入センサの実施形態を使用する、試験結果を示すグラフである。
【図３５】参照ｐＨのないｐＨ補正の開示された方法の実施形態を使用する、試験結果を示すグラフである。
【図３６】参照ｐＨのないｐＨ補正の開示された方法の実施形態を使用する、試験結果を示すグラフである。
【図３７】参照ｐＨのないｐＨ補正の開示された方法の実施形態を使用する、試験結果を示すグラフである。
【図３８】参照ｐＨのないｐＨ補正の開示された方法の実施形態を使用する、試験結果を示すグラフである。
【図３９】参照ｐＨのないｐＨ補正の開示された方法の実施形態を使用する、試験結果を示すグラフである。
【図４０】参照ｐＨのないｐＨ補正の開示された方法の実施形態を使用する、試験結果を示すグラフである。
【図４１】参照ｐＨのないｐＨ補正の開示された方法の実施形態を使用する、試験結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下の説明および実施例が、本開示のいくつかの実施形態を詳細に示す。当業者は、本範囲に包含される、本開示の多数の修正および変更があることを認識するだろう。したがって特定の例示的実施形態の説明が、本開示の範囲を制限すると考えるべきではない。
【００２０】
検体濃度の測定ができる検体センサを較正する方法が、本明細書において開示される。前記較正方法は、蛍光系システム、寿命化学系システム、電気化学システムおよび当技術分野で周知の他のシステムなどの、検体の濃度を測定するために構成されている種々のシステムで使用することができる。種々の実施形態において、較正はセンサで使用されて、存在する検体の量、または存在するとして別の方法もしくは計器が測定した量を決定し、いくつかの実施形態において、検体濃度をコンピュータ画面に表示し、検体濃度を計器画面に表示し、検体濃度を紙もしくはコンピュータの可読媒体に記録し、濃度を別の装置に送信し、または送達する薬剤の量を決定し、薬剤を患者に送達させることができる。いくつかの実施形態において、較正方法は同様に、グルコース投与装置と共に使用されて、患者の血糖値に関して血糖コントロールを達成するグルコースセンサの較正に使用される。いくつかの好適な実施形態において、較正方法は、他の方法、技術またはセンサによって得られた、十分に線形または線形化可能である読み取り値に対する、較正されたセンサによって得られた読み取り値の関連づけに使用されて、目的の検体濃度範囲に関して満足できる一致を提供することができる。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示された方法は、光センサの較正で使用することができ、ここで感光性化合物は、検体の結合部分を、有するか、もしくは結合し、または機能的に相互作用しており、前記検体の結合部分は、結合部分に結合した検体の量の変化に反応して、放出、吸収もしくは反射スペクトル、もしくは光の強さを、再現性のある可逆的な方法で変えることができる。いくつかの実施形態において、放射光量は増減でき、または入射光がセンサと相互作用した後異なる波長を検出し得、それは特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、米国特許出願１１／６７１，８８０号、米国特許出願１２／０２７，１５８号、米国特許出願１１／６７１，８８０号、米国特許出願１２／０２７，１５８号、米国特許出願１２／１７２，０５９号、米国特許出願１２／１１８，４０１号および米国特許出願１１／７８２，５５３号で開示され、それぞれの内容全体を参照により本明細書に組み入れる。
【００２２】
いくつかの実施形態において、ボロン酸基または亜ヒ酸基またはゲルマニウム酸基を含むことができる、官能化色素を使用することができる。いくつかの実施形態において、蛍光色素は、単一複合物において官能基を消光している（quenching）アミン窒素および誘導体化されたボロン酸、ゲルマニウム酸または亜ヒ酸と組み合わせることができる。いくつかの実施形態において、誘導体化されたボロン酸、ゲルマニウム酸または亜ヒ酸は、目的検体と結合することができる。特定の目的検体は、複数のヒドロキシル基、特に隣位のヒドロキシル基を有するようなものを挙げることができ、および、単糖（例えばグルコース）などの炭水化物であり得る。好ましい誘導体化されたボロン酸、ゲルマニウム酸または亜ヒ酸は、検体と結合可能なものを含み、目的検体によって異なり、隣位のヒドロキシル基を有する検体については、アリールまたは好ましくはフェニル基を含むことができる。
【００２３】
いくつかの実施形態において、検体濃度を上昇させることが、センサに付随するレシーバによって検知され得る特定の波長の光量の増加を生じさせることがある。いくつかの実施形態において、検体濃度を上昇させることが、センサに付随するレシーバによって検知され得る特定の波長の光量の減少を生じさせることがある。いくつかの実施形態において、検体濃度の上昇が、センサに付随するレシーバによって検知され得る１つの波長の光量の増加を生じさせることがあり、およびセンサに付随するレシーバによって検知され得る別の波長の光量を減少させることがあり得る。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載する方法は、センサがさらされる検体濃度の変化に対して蛍光応答を生じる、蛍光体系検体センサに適用することができる。好適な検体センサには、センサの少なくとも一部上にポリマ外面を有する検体センサを含む。外面の一部として利用できるポリマ物質は、ポリオレフィン（例えばポリエチレンおよびポリプロピレン）、ポリカーボネート、ポリスルホン並びにフルオロカーボンなどの、疎水性ポリマを含む。センサは、センサにより利用される検知化学／技術に適する様々な方法で作製することができる。センサがさらされる検体濃度に対して蛍光応答を生じるセンサのような、光学センサの一実施形態において、光学センサは、センサアセンブリの一部に多孔ポリマ外面を有することができる。このようなセンサは、例えばマークルらの米国特許出願第１２／０２６，３９６号に記載されており、その全てを参照により本明細書に組み入れる。
【００２５】
いくつかの実施形態において、センサは化学指示薬系を固定化している不溶性ポリマーマトリックスを含むことができ、該ポリマーマトリックスは目的検体に対して十分に透過性がある。好適なポリマーマトリックス材料は、アクリル系ポリマに関連するものが含まれる。いくつかの実施形態において、蛍光体および／または結合剤／消光剤は、ポリマーマトリックスに組み入れることができる。
【００２６】
ヒドロゲルポリマーマトリックスを用いる市販の現在の検体センサは、一般的に「湿式」センサとして保管されており、ヒドロゲルは無菌の液体に保管されている。これにより、センサを包装して保管することに対する懸念が生じていて、液体は潜在的に漏れる可能性があり、またはセンサの無菌性が危うくなり得る。すなわち、一実施形態によれば、関連する化学指示薬系を備えたポリマーマトリックスは、乾燥されて、無菌の乾燥状態で保管される―患者内（例えば、血液内、または皮下で組織および／または間質液に）に配置された時点でｉｎ  ｓｉｔｕで水和される。いくつかの実施形態において、センサは乾燥前に工場で較正できる。
【００２７】
一実施形態において、生理的流体中のグルコースをモニタリングする方法が開示される。前記方法は、例えば特許文献７に記載されているような、平衡、非消耗、蛍光、光学グルコースセンサを作製することを含む。センサは任意に、既知のｐＨおよび既知の温度で既知のグルコース濃度からなる溶液に対して、較正される（例えば、特許文献８を参照）。較正データ、例えば、既定のｐＨおよび温度での蛍光とグルコースの関係を表示する線状の数学モデルは、「工場較正」データとして後の用途のために保管することができる。それから安定的な保管、包装、輸送などのために、センサを乾燥させて（例えば、室温で約１時間の空気中で、もちろん他の乾燥条件を使用してもよい）、無菌化される（例えば、当該技術分野において周知のようにＥｔＯを使用する）。使用場所で、例えば重篤な患者用のＩＣＵで、センサが乾燥状態のまま患者の生理的流体内に（例えば血管内または皮下に）配置される。開示された乾燥挿入方法を利用することによって、意外にも「湿式」化学物質が、しばしば１つ以上の制御温度で、配置直前に周知のグルコース濃度を有する１つ以上の溶液にさらされる較正室を使用する必要がなくなる。ｉｎ  ｖｉｖｏで検知化学物質は水和し、および１点ｉｎ  ｖｉｖｏ較正が、実行される。センサの蛍光発光は、生理的流体中の独立して測定された、例えばＹＳＩラボ分析装置で測定された、グルコース濃度に対して較正される。いくつかの実施形態では、センサ化学物質は、ｐＨで変化する２つの形態を示す蛍光色素を含み、２つの形態は２つの異なる蛍光発光によって特徴づけられる―それによってｐＨのレシオメトリック推定を可能にする（例えば、特許文献９を参照）。いくつかの実施形態において、センサは測温体（例えば、サーミスタまたは熱電対）を備える。一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏ較正は、（プレ配置「湿式」較正なしで、またはいかなるｅｘ  ｖｉｖｏ較正を必要としないで、）独立して測定されたグルコース濃度に対して蛍光発光を較正することと、推定ｐＨおよび生理的流体の検出温度を修正することとを含む。
【００２８】
［検体センサ］
図１Ａ〜図１Ｄを参照すると、特定の従来技術の実施形態（特許文献１０を参照）が示される。図１Ａのグルコースセンサ１１７は、光ファイバの側面をまっすぐ抜けて穿孔された一連の孔１１６を有する光ファイバである。ある実施形態において、孔１１６は１つ以上のグルコース検知化学指示薬系が充填されている。これらの孔は選択的浸透性膜で覆われていてもよく、その透過率は化学指示薬系の分子（例えば、蛍光体および消光剤）が空洞内に保持されるが、一方でグルコースは自由に浸透できるように選定される。ある実施形態において、グルコースセンサ１１７を貫通して穿孔された一連の孔１１６は、均等に水平に一定間隔で配置されて、グルコースセンサ１１７の側面の周りを均等に回って、らせん形またはらせん構成を形成する。ある実施形態において、一連の孔はグルコースセンサの直径を通るように穿孔される。
【００２９】
図１Ｂを参照すると、ある実施形態において、グルコースセンサ１１７は、ある角度でファイバの側面を抜けて穿孔された一連の孔１１６を備える、固体光ファイバである。ある実施形態において、ヒドロゲル／化学指示薬系が充填されている、ある角度で穿孔された一連の孔は、均等に水平に一定間隔で配置され、かつ、グルコースセンサ１１７の側面の周りを均等に回っている。図１Ｃを参照すると、ある実施形態において、光ファイバは、光ファイバの長さに沿って溝１１６を備え、該溝はヒドロゲル／化学指示薬系が充填されている。ある実施形態において、溝の深さは、光ファイバの中心まで伸びる。ある実施形態において、溝は光ファイバの周りをらせん状に回る。ある実施形態において、溝は光ファイバの周りをらせん状に、少なくとも１回周回する。ある実施形態において、溝は光ファイバの周りをらせん状に回り、光ファイバの周りを複数回周回する。
【００３０】
図１Ｄを参照すると、ある実施形態において、グルコースセンサ１１７は、ファイバから切り取った三角状楔１１６を備える固体光ファイバである。ある実施形態において、三角状楔領域は、ヒドロゲル／化学指示薬系が充填される。ある実施形態において、三角状楔切り取り部は、グルコースセンサ１１７の側面の周りに、均等に水平に一定間隔で配置されている。ある実施形態において、グルコースセンサ１１７内を伝わる全ての光は、ヒドロゲル／化学指示薬系を充填された少なくとも１つの孔または溝１１６を介して伝達される。
【００３１】
ある実施形態において、図２〜６で示されるように、グルコースセンサ１１７は、遠位端１３２を有する光ファイバ１３０と、近位端１３６および遠位端１３８を有する非外傷性先端部分１３４と、光ファイバ１３０の遠位端１３２と非外傷性先端部分１３４の近位端１３６の間の空所または空洞１１６と、光ファイバ１３０の遠位端１３２を非外傷性先端部分１３４の近位端１３６に接続しているロッド１４０とを有し、該ロッドは空所または空洞を横断する。好ましい実施形態において、化学指示薬系の分子は、空所または空洞１１６内に配置されて固定化され（共有結合もしくは非共有相互作用によって）、またはその他の方法でヒドロゲルマトリックス内で結合されている。例えば、特許文献１１および特許文献１２で開示されている化学指示薬系を参照。空洞１１６は、当該技術分野で周知のどのような方法によっても、ヒドロゲル／化学指示薬系を充填することができる。好ましい実施形態において、空洞１１６は、液体状態のヒドロゲル／化学指示薬系が充填される。ヒドロゲル／化学指示薬系は好ましくは、同時係属米国特許出願第１２／０２６，３９６号（特許文献１３として公開）において詳述されるように、ｉｎ  ｓｉｔｕで重合される。
【００３２】
いくつかの実施形態において、センサは、例えば、組織、真皮、皮膚の下の脂肪層、皮下空隙および皮下配備を介して接近可能な他のいかなる空間などへの皮下配置のために、大きさを設定されて構成される。いくつかの実施形態において、センサは間質液に直接さらされる。他の実施形態において、センサは、例えば、末梢血管または中心的な血管（動脈もしくは静脈）などへの血管内配置のために、大きさを設定されて構成される。いくつかの実施形態において、センサは、腹腔内空間または後腹膜空間内配置のために、大きさを設定されて構成される。もちろんセンサの大きさは、基本構成を逸脱することなく、体内腔および解剖学的空間を含む身体内のどこへでも配置するために変形することができる。センサのサイズ設定および構成は、皮下、血管内または腹腔内／後腹膜配置を意図するかどうかに関係なく、特に制限はなく、配置の選択された／所望の位置に基づいて当業者によって決定することができる。一般的に皮下配置は、約３／１６インチ〜約５／８インチの範囲の深さ（身体位置によって異なる）での、皮下の脂肪層への挿入を含む。それに対し、血管内（例えば、静脈内）配置は、少なくとも約１インチまたは少なくとも約１．５インチの深さ（静脈か動脈かによって異なる）での血管内への挿入を含む。
【００３３】
ある実施形態において、ロッド１４０は、光ファイバ１３０および非外傷性先端部１３４を加熱して膨張させて、その間にロッド１４０を埋め込むことによって、光ファイバ１３０および／または非外傷性先端部１３４に取り付けられる。ある実施形態において、光ファイバ１３０は、約１００℃〜約１６０℃の間まで、好ましくは約１１０℃〜約１４０℃の間まで加熱される。他の実施形態において、光ファイバ１３０は、最初に加熱されて、次いで１回以上冷却される。ある実施形態において、ロッド１４０は、接着剤を塗布することによって、光ファイバ１３０および／または非外傷性先端部１３４に取り付けられる。好ましい実施形態において、接着剤は、例えばシアノアクリレート、エポキシ、光硬化接着剤、シリコーンおよびウレタンなどのような生体適合性である。ある実施形態において、接着剤を塗布して、ロッド１４０を光ファイバ１３０および非外傷性先端部１３４に接合した後、接着剤は、室温で、加熱によってまたはＵＶ／可視光線を適用することによって硬化する。ある実施形態において、ロッド１４０を光ファイバ１３０および／または非外傷性先端部１３４に取り付ける時間は、約５秒〜約６０秒まで、約１５分〜約５時間まで、約６０秒〜約１０分まで、または約２４時間まで変化する可能性がある。
【００３４】
いくつかの実施形態において、ロッドの近位面１４４は反射性であるため、一部の励起光信号（または参照光信号）が光ファイバ１３０の近位で反射して伝達され、検出器（図示せず）に至る。ロッドという用語は、その形状に関係なく、非外傷性先端部を光ファイバに接続するように構成される、細長い構造部材を指して、本明細書で用いられる。ロッドは、（図示するように）同軸上に中心が置かれてもよく、またはファイバおよび非外傷性先端部の断面に対して中心がずれていてもよい。いくつかの実施形態において、ファイバと非外傷性先端部の間に伸びる複数のロッドがあってもよい。複数のロッドが使用される場合、ロッドはファイバおよび非外傷性先端部の断面に対して対称に、または非対称に配置することができる。
【００３５】
ある実施形態において、図５および６で示したように、標準物質１９０は、ロッドの近位面１４４に装着することが可能である。標準物質１９０は反射性であってもよく（例えば、鏡）、かつ、ロッドの近位面１４４が少なくとも一部の励起光信号（または参照光信号）を反射により光ファイバ１３０内に伝達して検出器（図示せず）に至らせる、実施形態と同様に機能する。他の実施形態において、標準物質１９０は、グルコース非感受性蛍光色素のような異なる色素指示薬系を有する。光ファイバ１３０からの励起光は、ヒドロゲル／化学指示薬系からの発光信号の基準とするために、グルコース非感受性蛍光体が検出器（図示せず）へ蛍光を放射させるようにする。ある実施形態において、異なる色素指示薬系は、異なるグルコース非感受性信号を発するように構成された蛍光色素を注入された、例えばポリカーボネート、ポリエチレンまたはポリスチレンなどのプラスチック材料から形成される。
【００３６】
ヒドロゲルおよびグルコース検知化学指示薬系は、空洞１１６内に配置される。好ましい実施形態において、ヒドロゲル／化学指示薬系を充填した空洞１１６は、グルコースのヒドロゲル／化学薬品化学指示薬系への出入りを許容する選択的浸透性膜１４２によって覆われる。これらの実施形態はグルコースセンサ１１７を使用して記載されているが、センサ１１７が、例えば検知化学物質、および必要に応じて選択的浸透性膜１４２を変えることによって、他の検体を測定するために変更され得ることは、当業者によって理解されるべきである。
【００３７】
ある実施形態において、選択的浸透性膜１４２は、接着剤によって、光ファイバ１３０および非外傷性先端部１３４に取り付けられる。好ましい実施形態において、接着剤は、例えばシアノアクリレート、エポキシ、光硬化接着剤、シリコーンおよびウレタンなどのような生体適合性である。ある実施形態において、接着剤を塗布して、選択的浸透性膜１４２を光ファイバ１３０および非外傷性先端部１３４に取り付けた後、接着剤は、室温で、加熱によって、またはＵＶ／可視光線を適用することによって硬化する。ある実施形態において、選択的浸透性膜１４２を光ファイバ１３０および／または非外傷性先端部１３４に接着する時間は、約５秒〜約６０秒まで、約１５分〜約５時間まで、約６０秒〜約１０分まで、または約２４時間まで変化する可能性がある。他の実施形態において、選択的浸透性膜１４２はスリーブ（sleeve）として前もって作られる。スリーブは擢動により所定の位置に収まり、接着剤を用いて封止され、および／または加熱されて、グルコースセンサ１１７にぴったり合うことができる。ある実施形態において、選択的浸透性膜１４２はグルコースセンサ１１７の全周囲を囲い込む。他の実施形態において、選択的浸透性膜１４２は、血流において空所または空洞１１６を検体にさらしているグルコースセンサ１１７の窓１８０または開口部を覆う。
【００３８】
いくつかの実施形態において、図２Ａおよび２Ｂで示すように、センサ１１７は遠位部分および近位部分を含む。センサ１１７の遠位部分は、非外傷性先端部１３４、ヒドロゲル／化学指示薬系を充填した空洞１１６、ロッド１４０、選択的浸透性膜１４２の少なくとも空洞１１６を覆う部分、および光ファイバ１３０の遠位端１３２を含む。センサ１１７の近位部分は、光ファイバ１３０の近位部分を含む。いくつかの実施形態において、センサ１１７の遠位部分の直径Ｄ１は、センサ１１７の近位部分の直径Ｄ２より大きい。例えば、センサ１１７の遠位部分の直径Ｄ１は約０．００８０インチ〜０．０２０インチの間であり、一方でセンサ１１７の近位部分の直径Ｄ２は約０．００５インチ〜０．０１５インチの間であり得る。いくつかの実施形態において、センサ１１７の遠位部分の直径Ｄ１は約０．０１２インチであり、一方でセンサ１１７の近位部分の直径Ｄ２は約０．０１０インチである。
【００３９】
いくつかの実施形態において、選択的浸透性膜１４２を含むセンサ１１７は、滑らかな表面を備える。滑らかな表面は、例えば同時係属米国特許出願第１２／０２６３９６号（特許文献１３として公開）において開示される方法によって、作られることができる。要約すると、前記方法の１つの好ましい実施形態は、空洞１１６にモノマ、架橋剤および例えば熱開始剤のような開始剤を含む溶液を充填することが含まれる。センサ１１７への充填が終わると、センサ１１７は液体ワックスに浸漬され、該液体ワックスはセンサ１１７および選択的浸透性膜１４２周囲で硬化することができる。
【００４０】
液体ワックスは、熱開始温度より高い融点を有する。したがってワックスの浸漬およびコーティング工程中における、開始の可能性を減らすために、充填されたセンサ１１７は、ワックスの浸漬およびコーティング工程の前に冷却することができる。センサ１１７がワックスでコーティングされた後、空洞１１６の溶液は、浴槽中に窒素などの不活性ガスを泡立たせた水浴内に、センサ１１７を配置することによって脱酸素化される。
【００４１】
脱酸素化の後、センサ１１７を熱開始温度以上、かつワックスの融点以下の温度まで加熱することによって、重合が開始される。溶液が実質的にヒドロゲルに重合した時点で、ワックスは、ヘキサンなどの溶媒を用いてセンサから除去することができ、滑らかな表面を有するセンサ１１７が残る。
【００４２】
いくつかの実施形態において、図３Ａおよび３Ｂで示したように、センサ１１７は遠位部分および実質的に同じ直径を有する近位部分からなる。いくつかの実施形態において、センサ１１７の直径は、約０．００５インチ〜０．０２０インチの間である。他の実施形態において、センサ１１７の直径は、約０．００８インチ〜０．０１４インチの間である。他の実施形態において、センサ１１７の直径は、約０．０１０インチまたは約０．０１２インチである。
【００４３】
いくつかの実施形態において、ロッド１４０は、光ファイバ１３０の遠位部分に接続している近位部分、および非外傷性先端部１３４の近位部分に接続している遠位部分を有する。ロッド１４０は、金属、合金、プラスチック、ポリマ、セラミック、複合材料、または非外傷性先端部１３４と光ファイバ１３０の遠位部分を接続するために適切な機械的特性を有する他のいかなる材料からも作成することができる。例えばロッド１４０は、ステンレス鋼、チタンまたはニチノールで作成することができる。ロッド１４０は、円筒状か、または、正方形、長方形、卵形もしくは楕円形の断面を有する棒のような非円筒状であり得る。いくつかの実施形態において、ロッド１４０の直径は通常約０．００１〜０．０１０インチの間である。他の実施形態において、ロッド１４０の直径は通常約０．００４〜０．００８インチの間である。他の実施形態において、ロッド１４０の直径は約０．００１インチ、約０．００２インチまたは０．００４インチである。いくつかの実施形態において、ロッド１４０の直径は約０．００１インチ未満でもよい。いくつかの実施形態において、ロッド１４０の直径は約０．０１０インチ超でもよい。いくつかの実施形態において、ロッド１４０の長さは通常約０．００５インチ未満である。いくつかの実施形態において、ロッド１４０の長さは約０．００５〜０．０４０インチの間である。他の実施形態において、ロッド１４０の長さは通常約０．０２０〜０．０４０インチの間である。他の実施形態において、ロッド１４０の長さは通常約０．０１５インチである。いくつかの実施形態において、ロッド１４０の長さは通常約０．００５インチ超である。
【００４４】
ロッド１４０は、機械的安定性をセンサ１１７の遠位部分に付加する。いくつかの実施形態において、ロッド１４０は、可撓性もセンサ１１７の遠位部分に付加して、非外傷性先端部１３４が光ファイバ１３０の位置に対して前後に曲がるのを可能にする。ロッド１４０の可撓性、およびこのように非外傷性先端部１３４が曲がることができる度合いは、ロッド１４０の直径を減少もしくは増加させることによって、増加するまたは減少することができる。加えてロッド１４０の可撓性は、堅いまたは可撓性材料からロッド１４０を製造することによって変えることができる。
【００４５】
いくつかの実施形態において、図２Ａおよび３Ａで示すように、反射面１４４は、光ファイバ１３０に挿入されるロッド１４０の近位端に配置される。反射面１４４は、光源から発される、少なくとも参照光または励起光のいずれか一部を反射することができる。ロッド１４０の他端は、非外傷性先端部１３４に挿入される。ある実施形態において、非外傷性先端部は、例えばポリエチレン（例えば、ブラックポリエチレン）またはポリプロピレンなどの無反射材料から作られることができる。ロッド１４０の直径に相当する部分の光ファイバ１３０を通過する参照光または励起光は、ヒドロゲルを充填した空洞１１６内に入らずに反射面１４４から反射され、ヒドロゲル／化学指示薬系に入る光の量は、ロッドの直径／断面積を変化させることによって、および／または選択された断面積を有する鏡もしくは他の反射性部材１９０（図５および図６に示される）をロッドの近位端に取り付けることによって、調節できる。ヒドロゲルを充填した空洞１１６は好ましくは、選択的浸透性膜１４２によって覆われ、該選択的浸透性膜は少なくともグルコースに対して浸透性である。したがって反射された参照光または励起光、並び反射光および放射光の間の比率は、温度、ｐＨ、グルコース濃度およびヒドロゲル充填空洞１１６の化学組成に無関係である。しかしながら反射光および放射光の間の比率は、ロッドの直径およびセンサ面積に対するロッドの直径の比率に依存している。ある実施形態において、ロッド１４０は、ヒドロゲル空洞１１６を通して伝達されるどんな光も光ファイバ１３０へ反射されないように、ヒドロゲル充填空洞１１６を光ファイバ１３０に対して一定の位置に保つのに十分な固さを有している。
【００４６】
図３Ｂに関して、図３Ａに示されるセンサ１１７の遠位領域の斜視図が示される。図で示した実施形態において、光ファイバ１３０から、ヒドロゲル空洞を覆う膜１４２を経て、先細の非外傷性遠位先端部１３４まで、センサ直径の変化がないことが認識されるだろう。
【００４７】
いくつかの実施形態において、図４に示すように、窓１８０を切り取ってハイポチューブ１４０を得る。光ファイバ１３０の遠位端１３２は反射面１４４（例えば、環状鏡）上に挿入されて次いで、光ファイバ１３０が膨張してハイポチューブ１４０の反射面１４４に完全に接触するように、加熱される。ある実施形態において、光ファイバ１３０を加熱することは、ガラス管内で実施される。別の実施形態において、光ファイバ１３０を加熱することは、オーブン内で実施される。さらに他の実施形態において、光ファイバ１３０は、接着剤を使用してハイポチューブ１４０に取り付けられる。好ましい実施形態において、接着剤は、例えばシアノアクリレート、エポキシ、光硬化接着剤、シリコーンおよびウレタンなどのような生体適合性である。ある実施形態において、接着剤を塗布して、光ファイバ１３０をハイポチューブ１４０に取り付けた後、接着剤は、室温で、加熱によってまたはＵＶ／可視光線を適用することによって硬化する。ある実施形態において、光ファイバ１３０をハイポチューブ１４０に接着する時間は、約５秒〜約６０秒まで、約１５分〜約５時間まで、約６０秒〜約１０分まで、または約２４時間まで変化する可能性がある。類似方法が、ハイポチューブ１４０を非外傷性先端部１３４に取り付けるために使用できる。前述の実施形態と同様に、参照光または励起光は、ヒドロゲル／化学指示薬系で満たされる空洞１１６に対し開口している窓１８０に入らずに、反射面１４４から反射される。したがって反射された参照光または励起光、並びに、反射光および放射光の間の比率は、温度、ｐＨ、グルコース濃度およびヒドロゲルの化学的性質に無関係である。反射面の表面積は変化して、ヒドロゲル／化学指示薬系が充填された空洞１１６に入る励起光の量を調節できる。前述の実施形態のように、ハイポチューブ１４０の遠位端１３６は、ヒドロゲル／化学指示薬系を充填した空洞１１６に入る光が光ファイバ１３０内に反射されないように、例えばポリエチレン製ブラックプラグなどの無反射表面を有することができる。いくつかの実施形態において、ヒドロゲル／化学指示薬系を充填した空洞１１６を含む窓１８０は、選択的浸透性膜（図示せず）によって覆われる。
【００４８】
いくつかの実施形態において、図５で示すように、グルコースセンサ１１７は、外殻として、非外傷性先端部１３４と光ファイバ１３０を接続するケージ１９５を備える。ケージ１９５は、機械的安定性をセンサ１１７の遠位部分に付加することができる。いくつかの実施形態において、ケージ１９５は、可撓性もセンサ１１７の遠位部分に付加して、非外傷性先端部１３４が光ファイバ１３０の向きに対して前後に曲がるのを可能にする。ケージ１９５の可撓性、およびこのように非外傷性先端部１３４が曲がることができる度合いは、ケージ１９５の壁の厚さを減少もしくは増加させることによって、増加するまたは減少することができる。加えてケージ１９５の可撓性は、堅いまたは可撓性材料からケージ１９５を製造することによって変えることができる。ある実施形態において、ケージ１９５の壁の厚さは、約０．００１インチ、約０．００２インチまたは約０．００４インチである。いくつかの実施形態において、ケージ１９５の壁の厚さは約０．００１インチ未満でもよい。いくつかの実施形態において、ケージ１９５の壁の厚さは約０．０１０インチ超でもよい。
【００４９】
いくつかの実施形態において、光ファイバ１３０の直径は、光ファイバ１３０をケージ１９５の内部に適合させて、空所または空洞１１６を取り囲めるようにするために、ケージ１９５の内径より小さくてもよい。例えば光ファイバ１３０の直径は、約０．００５インチ〜約０．０２０インチの間、約０．００８インチ〜約０．０１４インチの間、または約０．０１０インチ〜約０．０１２インチの間であり得る。ケージ１９５の内径は、約０．００１インチより大きくてもよい。
【００５０】
ある実施形態において、ケージ１９５は、選択的浸透性膜１４２（図示せず）に覆われた窓または開口部１８０を有し、該窓または開口部は空所または空洞１１６内への少なくともグルコースのような検体の透過を可能にする。特定の好ましい実施形態において、空所または空洞１１６は、ヒドロゲル／化学指示薬系で充填される。ロッド１４０は、標準物質１９０を有するグルコースセンサ１１７内に配置することができる。上記のように、標準物質１９０は、光ファイバ１３０からの励起光を検出器（図示せず）に反射するための鏡でもよく、またはグルコース非感受性標準信号を検出器（図示せず）へ発するためのグルコース非感受性蛍光色素でもよい。ケージ１９５およびロッド１４０の組み合わせは、空所または空洞１１６に入る励起光が標準物質１９０に入る光から分離したままでいるように、十分に強固な構造を提供してもよい。
【００５１】
いくつかの実施形態において、図６で示すように、グルコースセンサ１１７は、空所または空洞１１６を取り囲むケージ１９５を備えていない。その代わりに図２Ａおよび３Ａと同様にロッド１４０は、光ファイバ１３０と非外傷性先端部１３４を接続して、グルコースセンサ１１７用の構造を提供しており、空所または空洞１１６に取り囲まれており、該空所または空洞１１６はさらに選択的浸透性膜１４２に覆われている。図３Ａと同様に、光ファイバ１３０の直径は、ヒドロゲル／化学指示薬系入り空洞１１６の直径と同じである。図５に関して述べたように、ロッドは、前述のように機能するロッド１４４の近位面に装着された標準物質１９０を有することができる。
【００５２】
図７〜１１は、標準物質１９０のための異なる構成を含む、特定の実施形態を示す。上述のように、これらの各実施形態の標準物質１９０は、少なくとも一部の励起光を検出器（図示せず）に戻す反射材料、または発光信号を検出器（図示せず）に戻す異なる色素指示薬系を含む。前述の実施形態と同様に、励起光または参照光は、ヒドロゲル／化学薬品化学指示薬系が充填された空洞１１６に入らずに、反射面１９０から反射される。同様に、異なる色素指示薬系からの放射光または参照光は、グルコース濃度とは無関係である。したがって、参照光および参照光と発されたグルコース濃度に依存する光との間の比率は、温度、ｐＨ、グルコース濃度およびヒドロゲルの化学的性質とは無関係である。標準物質１９０の表面積、形状および構成を変化させて、ヒドロゲル／化学指示薬系が充填された空洞１１６に入る励起光の量を調節できる。前述の実施形態のように、ロッドもしくはハイポチューブ１４０の遠位端１３６、または標準物質１９０は、ヒドロゲル／化学指示薬系を充填した空洞１１６に入る光が光ファイバ１３０内に反射されないように、例えばポリエチレン製ブラックプラグなどの無反射表面を有することができる。
【００５３】
図７において、標準物質１９０は、ケージ１９５の下で空所または空洞１１６に接して、非外傷性先端部１３４へ伸びて、非外傷性先端部１３４を含む。ある実施形態において、非外傷性先端部１３４は、グルコース非感受性赤色色素プラスチック材料で形成される。図８において、標準物質１９０は、ヒドロゲル充填空洞１１６の直径にわたる反射片である。反射片という用語は、その形状、幅または厚さに関係なく、少なくともグルコースセンサ１１７の断面にわたる細長い部材を指して、本明細書で用いられる。反射片１９０は、（図示するように）グルコースセンサ１１７の直径に中心が置かれてもよく、またはケージ１９５もしくは光ファイバ１３０の断面に対して中心がずれていてもよい。いくつかの実施形態において、複数の反射片が、グルコースセンサ１１７内の１つ以上の場所にあってもよい。複数の反射片が使用される場合、反射片は、グルコースセンサ１１７の断面に対して、対称に、または非対称に配置することができる。ある実施形態において、反射片１９０は、約０．００１インチ〜約０．００５インチの間の幅であり、かつ約０．００１インチ〜約０．００５インチの間の厚さであり得る。
【００５４】
図９において、標準物質１９０は、ヒドロゲル充填空洞１１６を含み、かつハイポチューブ１４４の近位面で反射面または環状鏡を備えるハイポチューブとして、ケージ１９５内に配置される。ある実施形態において、ハイポチューブ１４４は、光ファイバ１３０の外径に等しい外径を有する。図８と類似の図１０において、標準物質１９０は反射片であるが、図１０の反射片は、ヒドロゲル充填空洞１１６に接するというよりも、光ファイバ１３０に穿孔された孔内に配置されている。図１１は、標準物質１９０が空洞１１６内に位置して、ヒドロゲル／化学指示薬系と共に並んだ構成になっている、実施形態を示している。
【００５５】
ある実施形態において、図１２で示すように、標準物質２００は、半透明材料を含む。ある実施形態において、この半透明材料は、前述したグルコース非感受性蛍光色素などの赤色色素を含む。赤色色素は、励起光の一部がヒドロゲル充填空洞１１６に伝達されることを可能にし、励起光がヒドロゲル充填空洞１１６に達する前に励起光の一部を検出器（図示せず）へ反射させ、検出器（図示せず）に異なるグルコース非感受性信号を発信する。
【００５６】
当業者は、上記の実施形態または上記の実施形態の構成要素が本発明の範囲内で組み合わせられることを容易に理解するだろう。例えば、グルコースセンサは、本発明の範囲内で、ケージ、ハイポチューブおよび／またはロッドなどの１つ以上の構造要素を含むことができる。加えてグルコースセンサは、本発明の範囲内で異なる位置および構成において、反射面としておよび／または異なる色素指示薬系として機能する、１つ以上の標準物質を含むことができる。
【００５７】
いくつかの実施形態において（例えば、図２〜１２を参照）、グルコースセンサ１１７は非外傷性先端部１３４を含む。非外傷性先端部１３４は、湾曲していて、かつ実質的に鋭端のない遠位端１３８を有する。加えて非外傷性先端部１３４は、可撓性かつ変形可能であり得る。非外傷性先端部１３４の遠位端１３８は、半球状、放物線状、楕円状、または患者への負傷の危険を減少する他の任意の好適な形状で湾曲していることができる。非外傷性先端部１３４は、例えばプラスチック、ポリマ、ゲル、金属およびこれらの複合物などの様々な材料から作られることが可能である。
【００５８】
いくつかの実施形態において、グルコースセンサ１１７は、熱電対もしくはサーミスタなどの温度センサまたはプローブ１４６（例えば図２Ａ参照）を含む。温度センサ１４６は、ヒドロゲルおよびグルコース検知化学物質系、並びに／または血管内に配置する際の血液の温度を測定することができる。温度センサ１４６は、グルコース検知化学物質が温度に影響を受ける際に、特に好ましい。例えば、いくつかの実施形態において、蛍光体系によって発光される蛍光強度は、蛍光体系の温度に依存している。蛍光体系の温度を測定することによって、蛍光体蛍光強度における温度により誘発された変化の説明が可能となり、グルコース濃度のより正確な定量ができるようになる。
【００５９】
ある実施形態において、温度センサは、サーミスタ（図２符号１４６に関しては上記の通り）、プラチナ抵抗温度装置（「ＲＴＤ」）、他のＲＴＤ、熱電対、赤外線を使用した測温体、蛍光体を使用した温度検知素子、または定量可能な温度依存特性を有する他の温度検知素子であってもよい。
【００６０】
サーミスタ、プラチナＲＴＤおよび他のＲＴＤなどの装置は一般的に、センサの出力を、出力を温度信号に変換する受信ユニットへ導くために、１つ以上のコンダクタ、例えばワイヤなどを必要とする。コンダクタは、上記のような蛍光体系グルコースセンサの光ファイバと一緒にまとまっていてもよく、または別のルートを介していてもよい。１つの実施形態において、温度センサは本体内に置かれて、レシーバは本体の外に配置される。別の実施形態において、温度センサは本体内に置かれて、送信機、信号プロセッサなども本体内に置かれて、温度センサと接続しているかまたは温度センサの一部である。好ましい実施形態において、温度検知素子は、グルコース検出部分またはその近くに位置する。
【００６１】
別の実施形態において、蛍光を使用した温度検知技術が、用いられることが可能である。蛍光を使用した温度検知技術は、蛍光減衰に基づく技術を含み、それは例えば、励起光が蛍光体に提供され、励起光が停止され、蛍光が、蛍光体温度に関連している蛍光の減少率と共に、対時間でモニタリングされるものである。様々な技術には、位相測定および位相角分析も含まれる場合がある。
【００６２】
蛍光を使用した温度測定を実行する方法は、記載されている。例えば、非特許文献１を参照。蛍光を使用した温度測定で用いられることが可能な蛍光材料は、当業者に周知であるか、当業者によって直ちに特定される。
【００６３】
いくつかの実施形態において、蛍光材料は、蛍光材料と血液成分の間の化学的相互作用を防止するまたは阻害する材料によって取り囲まれることができる。適した材料は、ガラス（例えば、ホウケイ酸塩、石灰ソーダまたは光ファイバケーブルに使用するものを含むその他のタイプ）、ポリマ（例えば、テフロン（登録商標）、フルオロポリマ、シリコーン、ラテックス、ポリオレフィン、ポリイソプレン並びに他の強固なおよび堅くないポリマ材料）、金属（例えば、３００系ステンレス鋼、４００系ステンレス鋼、ニッケル、ニッケル合金、クロム鋼、ジルコニウムおよびその合金、チタンおよびその合金、並びに特殊金属および合金を含む他の耐食金属および合金）、セラミック（例えば、酸化アルミニウム、シリカおよび酸化物などに関連するセラミック材料、ジルコニウム、炭化物など）およびこれらの組み合わせを含む。
【００６４】
いくつかの実施形態において、温度センサは、グルコースセンサ内に、またはその近くに配置することができる。１つの好ましい実施形態において、温度センサは、グルコースセンサのグルコース検知化学指示薬系に可能な限り近くに（例えば、中に）配置することができる一方で、測定された温度が、温度測定がなされる目的であるその使用のために許容できる誤差の範囲内で、グルコース検知位置の温度を示すような場所を含む、いくらか離れた位置でも成功裏に利用することができる。
【００６５】
いくつかの実施形態において、温度センサおよび／もしくはその導線と血液成分の間の化学的もしくは物理的な相互作用を防止するもしくは阻害する材料で、様々な部分のコーティング、被覆もしくは包み込みなどを行うことによって、温度センサおよび／またはセンサへの導線は、生理環境から分離することができる。回避されるほうがよい化学的相互作用は、腐食、化学種の浸出、追加信号の発生（例えば、光信号、電気信号など）およびセンサまたは導線に存在する材料本体による吸収を含む。この場合、そうした存在が、製造、腐食もしくは銅、銀、有機化合物、有機金属化合物などを含む、一部の患者の生理的反応を引き起こしている化合物、金属もしくはイオンなどの他の手段から生じていたとしても、関係ない。
【００６６】
物理的相互作用は、破損および物理的な分離（例えば、切断および潜在的損失）、信号漏れ（例えば、光信号、電気信号など）、信号低下（抵抗、信号検出妨害、ノイズ、静電容量、電気化学的影響、誘導電圧、接地ループなどを含む）を含むことができる。適した材料は、ガラス（例えば、ホウケイ酸塩、石灰ソーダ、並びに光ファイバ製造で使用するようなその他のタイプのガラス）、ポリマ（例えば、テフロン、フルオロポリマ、シリコーン、ラテックス、ポリオレフィン、ポリイソプレン、アクリル樹脂、ポリカーボネート並びに他の強固なおよび堅くないポリマ材料）、金属（例えば、３００系ステンレス鋼、４００系ステンレス鋼、ニッケル、ニッケル合金、クロム鋼、ジルコニウムおよびその合金、チタンおよびその合金、並びに特殊金属および合金を含む他の耐食金属および合金）、セラミック（例えば、酸化アルミニウム、シリカおよび酸化物などに関連するセラミック材料、ジルコニウム、炭化物など）およびこれらの組み合わせを含む。
【００６７】
絶縁材料を温度センサまたは導線に塗布するための好適な方法には、いかなる適当な方法も含まれる。上記は、鋳造、塗装、浸漬、接着、反応、延伸、堆積、機械的付着、封入などを含む。
【００６８】
いくつかの実施形態において、グルコースセンサに組み込まれる温度センサの好適な寸法は、結果としてグルコースセンサの全長が約０．００５インチ〜０．０２０インチの間になる、温度感知要素の寸法を含む。
【００６９】
図１３は、基準信号と比較してグルコース濃度を測定する、別の実施形態を示す。この実施形態では、ＬＥＤ源１３００は、２つの別の隣接する光ファイバ１３１０、１３２０に励起信号を送る。第１の光ファイバまたはグルコースファイバ１３１０は、近位先端部および遠位先端部を有する。遠位先端部は、蛍光体または色素、消光剤およびグルコース結合受容体を含む、グルコース検知ヒドロゲル１３３０を有する。第２の光ファイバまたは参照ファイバ１３２０も、近位先端部および遠位先端部を有する。参照ファイバの遠位先端部は、標準物質１３４０を有する。ある実施形態において、標準物質１３４０は、同じもしくは異なる蛍光体もしくは色素を含み、消光剤を含むことまたは含まないことが可能であるが、グルコース受容体を含まない。他の実施形態において、標準物質１３４０は全く同じグルコース検知ヒドロゲルを有するが、それはグルコース不浸透性膜に覆われている。これらの実施形態両方において、参照ファイバ１３２０は、グルコース濃度とは無関係に蛍光戻り信号を発する。
【００７０】
励起光がグルコース繊維１３１０および参照ファイバ１３２０を通過した後、グルコース検知ヒドロゲル１３３０および標準物質１３４０は、レシオメトリック処理のために、２つの別の検出器、グルコース信号検出器１３５０および参照信号検出器１３６０へ蛍光信号を発する。二重ファイバ構成の利点は、両方のファイバ１３１０、１３２０が同じ外圧、曲げ、温度および他の外的要因を経験するということである。加えて、両方のファイバ１３１０、１３２０は、グルコース検知ヒドロゲル１３３０および標準物質１３４０中に実質的に同一材料を含む。これによって、検出器１３５０、１３６０で測定されるように、２つのファイバ１３１０、１３２０の間の強度の比率は、とりわけＬＥＤ出力における変動または光ファイバを介した伝達の変化の影響を除去する、較正グルコース信号を作りだし、このことによりグルコース濃度の測定の精度を上げる。
【００７１】
［化学指示薬系］
（蛍光体）
「蛍光体」は、特定の波長の光によって照らされたとき、より長い波長の光を発する、すなわち蛍光発光する、物質を意味する。蛍光体は、有機色素、有機金属化合物、金属キレート化合物、蛍光共役ポリマ、量子ドットまたはナノ粒子および上記の組み合わせを含むが、これらに限定されない。蛍光体は、ポリマに付着する単体の部分または置換基でもよい。
【００７２】
好ましい実施形態で用いられることができる蛍光体は、約４００ｎｍまたはそれより大きい波長の光によって励起されることができ、励起および発光波長が少なくとも１０ｎｍで分離可能である、十分に大きなストークス偏移を有する。いくつかの実施形態において、励起および発光波長間の分離は、約３０ｎｍと同じまたはそれ以上でもよい。これらの蛍光体は好ましくは、ビオロゲンなどの電子受容分子によって消光されやすく、かつ光退色に対する耐性がある。また、これらの蛍光体は好ましくは、光酸化、加水分解および生分解に対して安定である。
【００７３】
いくつかの実施形態において、蛍光体は単体の化合物でもよい。
【００７４】
いくつかの実施形態において、蛍光体は、約１０，０００ダルトンまたはそれ以上の分子量を有する、水溶性もしくは水分散性ポリマの、色素ポリマ単位を形成する、ペンダント基または鎖単位でもよい。一実施形態では、このような色素ポリマ単位は、非共有的に水不溶性ポリマーマトリックスＭ１と会合し、かつ物理的にポリマーマトリックスＭ１内に固定化され、該Ｍ１は検体溶液に透過性があるか、または接触している。別の実施形態では、色素ポリマ単位の色素は負に帯電してもよく、かつ色素ポリマ単位は陽イオン性水溶性ポリマを有する複合物として固定化されることができ、該複合物は、検体溶液に透過性がある、または接触している。一実施形態では、色素は、ヒドロキシピレントリスルホン酸のポリマ誘導体の１つでもよい。ポリマ色素は、水溶性、水膨潤性、または水分散性でもよい。いくつかの実施形態において、ポリマ色素は架橋されてもよい。好ましい実施形態において、色素は負電荷を有する。
【００７５】
他の実施形態において、色素分子は、水不溶性ポリマーマトリックスＭ１に共有結合してもよく、該Ｍ１は、検体溶液に透過性があるか、または接触している。Ｍ１に結合する色素分子は、Ｍ１−Ｌ１−色素の構造を形成できる。Ｌ１は、検知部分をポリマまたはマトリックスに共有的に結合する、加水分解的に安定な共有結合リンカである。Ｌ１の例としては、低級アルキレン（例えば、Ｃ１−Ｃ８アルキレン）が挙げられ、これらは任意に、スルホンアミド（−ＳＯ２ＮＨ−）、アミド−（Ｃ＝Ｏ）Ｎ−、エステル−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、エーテル−Ｏ−、スルフィド−Ｓ−、スルホン（−ＳＯ２−）、フェニレン−Ｃ６Ｈ４−、ウレタン−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、尿素−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、チオ尿素−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ−、アミド−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、アミン−ＮＲ−（該Ｒは、１〜６つの炭素原子を有するアルキルと定義する）など、またはこれらの組み合わせから選択される１つ以上の２価の連結基によって、末端化されているかまたは挿入されている。一実施形態において、色素は、スルホンアミド官能基を介してポリマーマトリックスに結合される。
【００７６】
いくつかの実施形態において、有用な色素は、ピラニン誘導体（例えば、ヒドロキシピレントリスルホンアミド誘導体など）を含み、それは以下の式を有する。
【化１】
0006534616.tif 000003
【００７７】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ−ＮＨＲ４であり、Ｒ４は−ＣＨ２ＣＨ２（−ＯＣＨ２ＣＨ２−）ｎＸ１であり、Ｘ１は、−ＯＨ、−ＯＣＨ３ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨ２またはＯＭｅであり、および、ｎは約７０〜１０，０００の間である。一実施形態において、色素は、スルホンアミド官能基を介してポリマに結合されてもよい。他の実施形態において、色素は、ヒドロキシピレントリスルホン酸のポリマ誘導体の１つでもよい。
【００７８】
いくつかの実施形態において、蛍光色素は、８−ヒドロキシピレン−１，３，６−トリスルホネート（ＨＰＴＳ）でもよい。対イオンは、Ｈ＋または任意の他の陽イオンであり得る。ＨＰＴＳは、４０５ｎｍ近辺および４５０ｎｍ近辺で２つの励起波長を示し、これらは酸およびその共役塩基の吸収波長に相当する。励起波長のシフトは、ＨＰＴＳのヒドロキシル基のｐＨ依存性のイオン化に起因する。ｐＨが増大するにつれ、ＨＰＴＳは、約４５０ｎｍでの吸光度の増加、および約４２０ｎｍ以下での吸光度の減少を示す。吸収極大のｐＨ依存性変化は、生理学的範囲における二色励起レシオメトリック検出を可能にする。この色素は５００ダルトン未満の分子量を有し、そのためそれはポリマーマトリックス内にとどまらないが、陰イオン除膜と共に使用することができる。
【化２】
0006534616.tif 000004
（ＨＰＴＳのＮａ＋塩―「ピラニン」）
【００７９】
別の実施形態において、蛍光色素は、８−アセトキシ−ピレン−１，３，６−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリス−（メタクリルプロピルアミドスルホンアミド）（アセトキシ−ＨＰＴＳ−ＭＡ）のポリマでもよい。
【化３】
0006534616.tif 000005
【００８０】
陰イオン基を有しないアセトキシ−ＨＰＴＳ−ＭＡ（上記）のような色素が、作用可能な状態でビオロゲン消光剤、特に単一のボロン酸部分だけを有するビオロゲン消光剤にカップリングする際、あまり強いグルコース応答をすることができないことに注意する。
【００８１】
別の実施形態において、蛍光色素は、８−ヒドロキシ−ピレン−１，３，６−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリス−（カルボキシプロピルスルホンアミド）（ＨＰＴＳ−ＣＯ２）でもよい。
【化４】
0006534616.tif 000006
【００８２】
他の実施形態では、蛍光色素は、８−ヒドロキシ−ピレン−１，３，６−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリス−（メトキシポリエトキシエチル（〜１２５）スルホンアミド）（ＨＰＴＳ−ＰＥＧ）でもよい。
【化５】
0006534616.tif 000007
【００８３】
陰イオン基を有しないＨＰＴＳ−ＰＥＧ（上記）のような色素が、作用可能な状態でビオロゲン消光剤、特に単一のボロン酸部分だけを有するビオロゲン消光剤にカップリングする際、あまり強いグルコース応答をすることができないことに注意する。
【００８４】
単体の化合物として代表的な色素は、８−アセトキシピレン−１，３，６−トリスルホニルクロリド（ＨＰＴＳ−Ｃ１）がアミノ酪酸などのアミノ酸と反応することによって形成されるトリス付加物である。ポリマと結合し、１つ以上の陰イオン基を有するヒドロキシピレントリスルホンアミド色素、例えば８−ヒドロキシピレン−１−Ｎ−（メタクリルアミドプロピルスルホンアミド）−Ｎ’，Ｎ”−３，６−ビス（カルボキシプロピルスルホンアミド）ＨＰＴＳ−ＣＯ２−ＭＡと、ＨＥＭＡ、ＰＥＧＭＡなどとのコポリマなどが最も好ましい。
【００８５】
別の実施形態では、蛍光色素はＨＰＴＳ−ＴｒｉＣｙｓ−ＭＡでもよい。
【化６】
0006534616.tif 000008
【００８６】
この色素は、３，３’−ｏＢＢＶのようなボロン酸を含む消光剤と共に使用することができる。
【００８７】
当然ながら、いくつかの実施形態において、ＨＰＴＳコアのＣｙｓ−ＭＡ以外の置換基が負に帯電しかつ重合性基を有するものであれば、その置換基は本発明の態様に適合する。システインのＬ立体異性体またはＤ立体異性体のいずれを使用してもよい。いくつかの実施形態において、スルホン酸の１つまたは２つだけが置換されてもよい。同様に、上記で示されるＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡの変形において、ＮＢｕ４＋の他に、Ｎａ＋などの正に帯電された金属を含む他の対イオンを使用してもよい。他の変形では、スルホン酸基が、例えばリン酸基、カルボン酸基などの官能基で置き換えられてもよい。
【００８８】
別の適切な色素はＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡであり、以下の通りに示される。
【化７】
0006534616.tif 000009
【００８９】
他の例は、８−アセトキシピレン−１，３，６−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリス（メタクリルアミドプロピルスルホンアミド）と、ＨＥＭＡ、ＰＥＧＭＡまたは他の親水性コモノマの、可溶性コポリマを含む。色素中のフェノール置換基は、重合終了後、加水分解によって取り出すことができる保護基によって、重合中に保護されている。そのような好適な保護基、例えばアセトキシ、トリフルオロアセトキシなどは、当業者には周知である。
【００９０】
ＨＰＴＳおよびその誘導体を含む蛍光色素は周知であり、多くが検体検出において使用されている。例えば、特許文献１４、特許文献１５、特許文献２、特許文献１、特許文献１６、特許文献１７、特許文献６、特許文献１８、特許文献１９、特許文献５、特許文献３、および特許文献２０、並びに、同時係属米国特許出願第１１／２９６，８９８号および同時係属米国特許出願第６０／８３３，０８１号を参照。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００９１】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ製ＳＮＡＲＦおよびＳＮＡＦＬ色素も、本発明の態様として有用な蛍光体であり得る。ＳＮＡＲＦ−１およびＳＮＡＦＬ−１の構造を、以下に示す。
【化８】
0006534616.tif 000010
【００９２】
そのうえ、波長−レシオメトリックおよび比色分析におけるような形で、スペクトルシフトおよびｐＨの強度変化を示す、６−アミノキノリニウムおよびボロン酸部分の両者に基づく、１組の異性体の水溶性蛍光プローブは、本発明のいくつかの実施形態において有用であり得（非特許文献２および非特許文献３を参照）、その全体を参照により本明細書に組み入れる。
【００９３】
ｐＨおよびサッカリド感受性でもよい蛍光色素の別の例は、テトラキス（４−スルホフェニル）ポルフィン（ＴＳＰＰ）である―下記に示す。ＴＳＰＰは、血液中、最適に作用ができず、血液中ではポルフィリン環は第ＩＩ鉄のような特定の金属イオンと反応して、非蛍光体になる可能性がある。
【化９】
0006534616.tif 000011
（ＴＳＰＰ）
【００９４】
本発明のセンサの、ｐＨおよびグルコースの同時定量に有用な、ｐＨ感受性蛍光指示薬の追加の例が、特許文献２１および特許文献２２に記載されており、それぞれ、その全体が参考として本明細書に組み入れられる。
【００９５】
ある好適な実施形態において、蛍光色素は、別個の波長で発光し、かつ、酸および塩の形態の相対的比率はｐＨに依存するような、識別可能な酸および塩の構造で存在するように選択されることができる。酸および塩の発光の強度の比率は、血液ｐＨの定量に使用することができる（特許文献２３で詳述され、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。励起光との比較で、酸または塩の発光強度比率を、血液中のグルコース濃度の定量に用いることができる。もちろんこの１色励起−２色発光の蛍光体系のバリエーションにおいて、ｐＨの同時レシオメトリック定量をせずに、グルコース濃度検出に１色励起−１色発光を使用できるかもしれない。実際、豊富な種類の設計方法が利用でき（例えば、特許文献１０、特許文献２３参照）、ここで化学指示薬および光学系は、好ましい使用に基づいて選択することができる。
【００９６】
（検体結合部分―消光剤）
本開示の広い態様にしたがって、検体の結合部分は、検体を結合することが可能で、かつ、検体結合の量に関連する形で、蛍光体の見かけの（例えば、発光信号強度の変化として検出される）濃度を調整することが可能な少なくとも二重機能性を提供する。好ましい実施形態において、検体の結合部分は、消光剤と結合している。「消光剤」は、その存在時に、蛍光体の発光を低減する化合物を指す。消光剤（Ｑ）は、単体化合物、第２の単体化合物もしくは重合性化合物に転換できる反応性中間体から選択され、またはＱは、該反応性中間体もしくは重合性化合物から調製されるポリマの、ペンダント基もしくは鎖単位であり、このポリマは水溶性もしくは水分散性であり、もしくは不溶性ポリマであり、該ポリマは任意に架橋されている。
【００９７】
一実施例において、実施形態においてグルコース認識を提供する部分は、芳香族ボロン酸である。ボロン酸は、共役窒素含有の複素環式芳香族ビス−オニウム構造（例えば、ビオロゲン）に共有結合している。「ビオロゲン」は一般に、２，２’−、３，３’−または４，４’−Ｎ，Ｎ’−ビス（ベンジル）ビピリジウムジハライド（すなわち、二塩化物、塩化臭化物）などの窒素含有共役Ｎ置換複素環式芳香族ビス−オニウム塩の基本構造を有する化合物を指す。ビオロゲンは、置換フェナントロリン化合物も含む。ボロン酸置換消光剤は好ましくは、約４〜９の間のｐＫａを有し、かつ、約６．８〜７．８のｐＨの水性媒体で可逆的にグルコースと反応して、ボロン酸エステルを形成する。反応進行度は、媒体のグルコース濃度に関連する。ボロン酸エステルの形成は、ビオロゲンによる蛍光体の消光を減少させ、結果としてグルコース濃度に依存している蛍光発光の増加を生じさせる。有用なビス−オニウム塩は検体溶液と相溶性があり、かつ、検出される検体の存在下で、色素の蛍光発光の検出可能な変化を生じることができる。
【００９８】
本開示の実施形態におけるビス−オニウム塩は、共役複素環芳香族二窒素化合物から調製される。共役複素環芳香族二窒素化合物は、ジピリジル、ジピリジルエチレン、ジピリジルフェニレン、フェナントロリンおよびジアザフルオレンから選択され、ここで２つの窒素原子は異なる芳香環にあって、オニウム塩を形成することが可能である。両方の窒素を置換することができる、前記共役複素環式芳香族二窒素化合物の全ての異性体が、本開示で有用であることが理解される。一実施形態において、消光剤は、３，３’−ジピリジル、４，４’−ジピリジルおよび４，７−フェナントロリンに由来するビス−オニウム塩の１つでもよい。
【００９９】
いくつかの実施形態において、ビオロゲン−ボロン酸付加物は、約４００ダルトンまたはそれ以上の分子量を有する単体化合物でもよい。他の実施形態において、それは、約１０，０００ダルトンを超える分子量を有する、水溶性もしくは水分散性ポリマのペンダント基または鎖単位でもよい。一実施形態において、消光剤−ポリマ単位は、ポリマーマトリックスと非共有的に会合していてもよく、かつ、そこで物理的に固定化される。さらに別の実施形態では、消光剤−ポリマ単位は、負に帯電する水溶性ポリマを有する複合物として固定化されてもよい。
【０１００】
他の実施形態において、ビオロゲン−ボロン酸部分は、平衡を確立可能にするような、検体（例えば、グルコース）に対して十分に浸透性のある、架橋された親水性ポリマまたはヒドロゲル中の、ペンダント基または鎖単位でもよい。
【０１０１】
他の実施形態において、消光剤は、第２の水不溶性ポリマーマトリックスＭ２に共有結合してもよく、それは、Ｍ２―Ｌ２―Ｑという構造により表すことができる。Ｌ２は、低級アルキレン（例えば、Ｃ１−Ｃ８アルキレン）、スルホンアミド、アミド、４級アンモニウム、ピリジニウム、エステル、エーテル、スルフィド、スルホン、フェニレン、尿素、チオ尿素、ウレタン、アミンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるリンカである。消光剤は、いくつかの実施形態において、１つか２つの位置でＭ２に結合することができる。
【０１０２】
前記重合消光剤前駆体のために、複数のオプションが、ボロン酸部分と反応基の結合に利用でき、該反応基は、重合性基、または、ヘテロ芳香族の中心に位置する基の２つの異なる窒素に対するカップリング基であってもよい。これらは、
ａ）第１の芳香族部分の反応基は１つの窒素と結合し、かつ、少なくとも１つの−Ｂ（ＯＨ）２基を含む第２の芳香族基は第２の窒素と結合することと、
ｂ）１つ以上のボロン酸基が１つの窒素と結合する第１の芳香族部分に結合され、かつ１つのボロン酸および反応基が第２の窒素に結合する第２の芳香族基に結合されることと、
ｃ）１つのボロン酸基および反応基は、第１の芳香族部分に結合され、第１の芳香族基は１つの窒素と結合し、かつボロン酸基および反応基が、第２の窒素に結合する第２の芳香族部分に結合されることと、
ｄ）１つのボロン酸は各窒素に結合されて、かつ反応基がヘテロ芳香族環に結合されること、である。
【０１０３】
好ましい実施形態は、２つのボロン酸部分および１つの重合性基またはカップリング基を含み、ここで芳香族基は窒素に結合したベンジル置換基であり、ボロン酸基はベンジル環に結合され、かつオルト−、メタ−もしくはパラ−位に存在していてもよい。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ検知に有用な単体化合物としてボロン酸置換ビオロゲンが、以下の式の１つによって示すことができる。
【化１０】
0006534616.tif 000012
【０１０５】
式中、ｎ＝１−３であり、Ｘはハロゲンであり、Ｙ１およびＹ２は独立してフェニルボロン酸（ｏ−、ｍ−、またはｐ−異性体）およびナフチルボロン酸から選択される。他の実施形態において、消光剤は、ビオロゲンの複素環の置換基としてのボロン酸基を含むことができる。
【０１０６】
ＴＳＰＰと共に使用される具体例は、ｍ−ＢＢＶである。
【化１１】
0006534616.tif 000013
ｍ−ＢＢＶ
【０１０７】
センサの製造に適している消光剤前駆体は、以下から選択することができる。
【化１２】
0006534616.tif 000014
【化１３】
0006534616.tif 000015
【０１０８】
消光剤前駆体３，３’−ｏＢＢＶは、ＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡまたはＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡと共に用いられて、本開示の好ましい態様にしたがってヒドロゲルを作成することができる。
【０１０９】
好ましい消光剤は、窒素上でベンジルボロン酸基によって、および他の位置で、ジピリジル環上で重合性基またはカップリング基によって置換された３，３’−ジピリジルから誘導されるビオロゲンを含む前駆体から調製される。
代表的なビオロゲンは、
【化１４】
0006534616.tif 000016
を含む。
【０１１０】
ここで、ＬはＬ１またはＬ２であり、かつ連結基である。
【０１１１】
Ｚは、反応基である。
【０１１２】
Ｒ’はベンジル環のオルト−、メタ−またはパラ位にある−Ｂ（ＯＨ）２であり、Ｒ”はＨ−であり、または任意にＲ”は、本願明細書において定義されるカップリング基であり、もしくはフルオロ−もしくはメトキシ−などのボロン酸の酸性度を変えるために特に用いられる置換基である。
【０１１３】
Ｌは、検知部分と、ビオロゲンをポリマまたはマトリックスに結合するために用いられる反応基が共有的に結合する、二価部分である。Ｌの例は、直接結合、または、１〜８の炭素原子を有する低級アルキレンであって、任意に、スルホンアミド（−ＳＯ２ＮＨ−）、アミド−（Ｃ＝Ｏ）Ｎ−、エステル−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、エーテル−Ｏ−、スルフィド−Ｓ−、スルホン（−ＳＯ２−）、フェニレン−Ｃ６Ｈ４−、ウレタン−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、尿素−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、チオ尿素−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ−、アミド−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、アミン−ＮＲ−（該Ｒは、１〜６つの炭素原子を有するアルキルと定義される）などから選択される１つ以上の２価の連結基によって末端化または挿入されている低級アルキレンからそれぞれ独立して選択されるものを含む。
【０１１４】
Ｚは、メタクリルアミド−、アクリルアミド−、メタクリロイル−、アクリロイル−もしくはスチリル−より選択されるが、これらに限定されない重合性エチレン性不飽和基であるか、または任意にＺは、ポリマもしくはマトリックスと共有結合を形成するのが可能な、反応性官能基である。このような基は、−Ｂｒ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯ２Ｈ、およびＮＨ２を含むが、これらに限定されない。
【０１１５】
ボロン酸置換ポリビオロゲンは，別の種類の好ましい消光剤である。ポリビオロゲンという用語には、連結基によって共有的に結合された２つ以上のビオロゲンを含む単体化合物、鎖中にビオロゲン繰り返し単位を含むポリマ、主鎖から枝分かれしたビオロゲン基を有するポリマ、ビオロゲン単位を含む、好ましくはビオロゲン末端基を含むデンドリマ、ビオロゲン単位を含む、好ましくはビオロゲン末端基を含むオリゴマ、およびこれらの組み合わせが含まれる。モノ−ビオロゲン基が微量成分を形成するポリマは、含まれない。好ましい消光剤は、水溶性もしくは水分散性ポリマ、または、グルコースに十分に透過性がありセンサの一部として機能する架橋した親水性ポリマもしくはヒドロゲル、である。あるいは、ポリビオロゲンボロン酸は、不活性基材に直接結合することができる。
【０１１６】
ビオロゲン繰り返し単位を含むポリマとしてのポリビオロゲン消光剤は、下式を有する。
【化１５】
0006534616.tif 000017
【０１１７】
他の実施形態において、ポリビオロゲンボロン酸付加物は、２つ以上のビオロゲン／ボロン酸中間体を共有結合することによって形成される。架橋基は一般的には、各ビオロゲンの１つの窒素に、もしくは各ビオロゲンの芳香環の炭素に結合した小さな二価ラジカルであり、または、１つの結合が、１つのビオロゲンの環炭素および別のビオロゲンの窒素に対するものであってもよい。２つ以上のボロン酸基が、ポリビオロゲンに結合される。任意ではあるが、ポリビオロゲンボロン酸付加物は、重合性基、またはビオロゲンもしくは架橋基に直接結合されたカップリング基で置換される。好ましくはポリビオロゲン部分は、そのような基の１つだけを含む。好ましくは架橋基は、ボロン酸とグルコースの協同的結合を強化するように選択される。
【０１１８】
カップリング部分は、先に定義された連結基であり、ただし、連結基が任意ではあるがさらにボロン酸、重合性基、追加のカップリング基で置換されていること、または、連結基が、ビオロゲンが鎖単位、ペンダント基もしくはこれらの組み合わせであるポリマ鎖の一セグメントであること、を条件とする。
【０１１９】
（ポリマーマトリックス（固定化手段））
ｉｎ  ｖｉｖｏ適用の場合、センサは、生理的流体が移動している流れの中で（例えば、血管内で）、または皮内空間、皮下空間内で、もしくは間質液にまみれた組織の中で使用され、ここで生理的流体（血液または間質液）は１つ以上のポリヒドロキシル有機化合物を含む。したがって、検知部分はいずれもセンサアセンブリから抜け出ないことが好ましい。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に関して、検知構成成分は好ましくは、有機ポリマ検知アセンブリの一部である。可溶性色素および消光剤は、検体の通過を可能にするが検知部分の通過を阻止する、半浸透性膜により閉じ込められ得る。このことは、検体分子よりも実質的に大きい可溶性分子（検体の分子量の少なくとも２倍、または１０００より大きい、好ましくは５０００より大きい分子量）を検知部分として使用すること、および検知部分が量的に保持されるように２つの間の特定の分画分子量を有する、透析または限外ろ過膜などの選択的半浸透性膜を用いることにより実現することができる。
【０１２０】
好ましくは、検知部分は、グルコースにとって自由に透過性である不溶性ポリマーマトリックスに固定化される。ポリマーマトリックスは、有機ポリマ、無機ポリマまたはそれらのポリマの組み合わせを含む。マトリックスは、生体適合材料からなってもよい。あるいはマトリックスは、目的の検体にとって透過性である、第２の生体適合性ポリマでコーティングされる。
【０１２１】
ポリマーマトリックスの機能は、検体との接触を可能とし、かつ検体をボロン酸に結合させると同時に、蛍光体および消光剤部分を一緒に保持および固定化することである。この効果を達成するには、マトリックスは媒体中では不溶性でなくてはならず、マトリックスと検体溶液との間で高表面積の界面を確立することにより媒体と密接に結びつかなくてはならない。例えば、超薄膜または微多孔支持体マトリックスが使用される。あるいは、マトリックスは検体溶液中で膨潤性があり、例えばヒドロゲルマトリックスは水性系で使用される。場合によっては、検知ポリマは、光導管の表面のような表面に結合されるか、または微孔質膜中に含浸される。全ての場合において、マトリックスは、結合部位への検体の輸送を妨害してはならず、その結果、平衡が２相間で確立することができる。超薄膜、微孔質ポリマ、微孔質ゾル−ゲルおよびヒドロゲルを調製するための技法は、当該技術分野で確立されている。有用なマトリックスは全て、検体透過性であると定義される。
【０１２２】
ヒドロゲルポリマが、いくつかの実施形態で用いられる。本明細書中で使用する場合、ヒドロゲルという用語は、実質的に膨潤するが、水に溶解しないポリマを指す。このようなヒドロゲルは、直鎖状、分枝状もしくは網状ポリマ、または高分子電解質複合物であってもよいが、ただし可溶性または浸出性の画分を含有しないものとする。通常ヒドロゲルの網状構造は、水溶性ポリマ上で実施される架橋工程により調製されるため、膨潤するが水性媒体に溶解しない。あるいはヒドロゲルポリマは、親水性モノマと架橋モノマとの混合物を共重合することによって調製されて、水膨潤性の網状ポリマが得られる。前記ポリマは、付加重合もしくは縮合重合、または組み合わせプロセスのいずれかによって形成される。このような場合、検知部分は、網状構造形成モノマと組み合わせてモノマ誘導体を用いた共重合によって、ポリマ中に組み込まれる。あるいは反応部分は、後重合反応を用いて既に調製されたマトリックスとカップリングされる。前記検知部分は、ポリマ鎖、または鎖と結合するペンダント基中の単位である。
【０１２３】
また本発明において有用なヒドロゲルは、色素および消光剤が共に共有結合する単一の網状構造等の一体化したポリマ、または多成分ヒドロゲルである。多成分ヒドロゲルとしては、相互貫入網状構造、高分子電解質複合物、並びに水膨潤性複合材料を得るための２つ以上のポリマの様々な他の混合物を含み、該水膨潤性複合材料はヒドロゲルマトリックス中に第２のポリマの分散体および交互ミクロ層アセンブリを含む。
【０１２４】
一体化したヒドロゲルは一般的には、ＨＥＭＡ、ＰＥＧＭＡ、メタクリル酸、ヒドロキシエチルアクリレート、Ｎ−ビニルピロリドン、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド等を含むがこれらに限定されない、親水性モノマ混合物のフリーラジカル共重合によって形成され、イオン性モノマとしては、メタクリロイルアミノプロピルトリメチルアンモニウムクロリド、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド、スルホプロピルメタクリル酸ナトリウム等が挙げられ、架橋剤としては、エチレンジメタクリレート、ＰＥＧＤＭＡ、トリメチロールプロパントリアクリレート等が挙げられる。モノマの比は、当該技術分野において十分に確立されている原理を用いて、透過性、膨潤指数およびゲル強度を含む、網状構造特性を最適にするように選択される。一実施形態では、色素部分は、８−アセトキシピレン−１，３，６−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリス（メタクリルアミドプロピルスルホンアミド）などの、色素分子のエチレン性不飽和誘導体から誘導され、消光剤部分は、４−Ｎ−（ベンジル−３−ボロン酸）−４’−Ｎ’−（ベンジル−４エテニル）−ジピリジニウムジハライド（ｍ−ＳＢＢＶ）などのエチレン性不飽和ビオロゲンから誘導され、並びにマトリックスは、ＨＥＭＡおよびＰＥＧＤＭＡから作成される。色素の濃度は、発光強度を最適にするために選択される。色素に対する消光剤の比率は、所望の測定可能な信号が生じるのに十分な消光をもたらすように調節される。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、一体化したヒドロゲルは縮合重合によって形成される。例えば、アセトキシピレントリスルホニルクロリドを、過剰なＰＥＧジアミンと反応させて、未反応のジアミンに溶解したトリス−（アミノＰＥＧ）付加物を得る。過剰なトリメソイルクロリドおよび酸受容体の溶液を、４−Ｎ−（ベンジル−３−ボロン酸）−４’−Ｎ’−（２−ヒドロキシエチル）ビピリジニウムジハライドと反応させて、ビオロゲンの酸クロリド官能性エステルを得る。２つの反応混合物をお互いに接触させて、反応させて、例えば１つの混合物の薄膜をキャスト成形（casting）して、それをもう１つの混合物に浸漬することによって、ヒドロゲルを形成する。
【０１２６】
他の実施形態において、色素が１つの成分に取りこまれており、かつ消光剤が別の成分に取りこまれている多成分ヒドロゲルは、本発明のセンサ製造にとって好ましい。さらにこのような系は、任意に分子的にすり込まれて、成分間の相互作用を強化して、かつグルコースに対する選択性が他のポリヒドロキシ検体に対する選択性を上回るようにする。好ましくは多成分系は、相互貫入ポリマーネットワーク（ＩＰＮ）または半相互貫入ポリマーネットワーク（半ＩＰＮ）である。
【０１２７】
ＩＰＮポリマは一般的には、逐次重合によって作られる。第１に、消光剤を含む網状構造が形成される。次いで網状構造は、色素モノマを含むモノマ混合物で膨潤されて、第２の重合が実施されてＩＰＮヒドロゲルを得る。
【０１２８】
半ＩＰＮヒドロゲルは、色素部分を含む可溶性ポリマを消光剤モノマを含むモノマ混合物に溶かして、該混合物を重合することによって形成される。いくつかの実施形態において、検知部分は、ポリヒドロキシル化合物にとって自由に透過できる、不溶性ポリマーマトリックスによって固定化される。ヒドロゲル系に関するさらなる詳細は、特許文献２４号および特許文献２５に開示されており、その内容全体を参照により本明細書に組み入れる。
【０１２９】
ポリマーマトリックスは、有機ポリマ、無機ポリマまたはそれらのポリマの組み合わせを含む。マトリックスは、生体適合材料からなってもよい。あるいはマトリックスは、目的の検体にとって透過性である、第２の生体適合性ポリマでコーティングされる。ポリマーマトリックスの機能は、検体（例えば、ポリヒドロキシル化合物、Ｈ＋およびＯＨ−）との接触を可能とし、かつポリヒドロキシル化合物をボロン酸に結合させると同時に、蛍光色素および消光剤部分を一緒に保持および固定化することである。したがってマトリックスは媒体に不溶性であり、マトリックスと検体溶液との間で高表面積界面を確立することにより検体と密接に結びつけられる。そのうえマトリックスは、結合部位への検体の輸送を妨害せず、その結果、平衡を２相間で確立させることができる。一実施形態において、超薄膜または微孔質支持体マトリックスを使用することができる。別の実施形態において、検体溶液中で膨潤性があるマトリックス（例えばヒドロゲルマトリックス）は、水性系で使用することができる。いくつかの実施形態において、検知ポリマは、光導管の表面のような表面に結合されるか、または微孔質膜中に含浸される。超薄膜、微孔質ポリマ、微孔質ゾル−ゲルおよびヒドロゲルを調製するための技法は、当該技術分野で確立されている。
【０１３０】
１つの好ましい実施形態において、ボロン酸置換ビオロゲンは、蛍光色素に共有結合されてもよい。付加物は、重合性化合物またはポリマの単位でもよい。例えば１つのこのような付加物は１つの窒素にベンジル−３−ボロン酸基を、他の窒素原子にアミノエチル基を結合することによって、４，４’−ジピリジルから非対称的ビオロゲンを最初に形成することで調製できる。ビオロゲンは、最初に１：１のモル比で８−アセトキシ−ピレン−１，３，６−トリスルホニルクロリドと順次縮合されて、次いで過剰なＰＥＧジアミンと反応して、プレポリマ混合物が得られる。酸受容体は両方の工程に含まれて、副生成物の酸を除去する。プレポリマ混合物は、ポリイソシアネートとの反応によって架橋されて、ヒドロゲルを得る。前記生成物は塩基で処理されて、アセトキシ保護基を除去する。不完全な反応生成物および未反応の出発材料は、さらに使用される前に脱イオン水による徹底的な抽出によって、ヒドロゲルから取り出される。前記生成物は、本明細書に記載されている検知成分として用いられるとき、グルコースに反応する。
【０１３１】
あるいは、このような付加物は、エチレン性不飽和モノマ誘導体である。例えば、ジメチルビス−ブロモメチルベンゼンボロネートは、過剰な４，４’−ジピリジルと反応して、半ビオロゲン付加物を形成する。過剰なジピリジルを除去した後、前記付加物は、過剰なブロモエチルアミンヒドロクロリドとさらに反応させて、ビス−ビオロゲン付加物を形成する。この付加物は、酸受容体の存在下で１：１のモル比で８−アセトキシピレン−トリススルホニルクロリドと反応させて、続いて過剰なアミノプロピルメタクリルアミドと反応させて、ピラニン色素にカップリングされる。最後に、残留するどのアミノ基も、メタクリロールクロリドと反応させることができる。精製後、色素／ビオロゲンモノマは、ＨＥＭＡおよびＰＥＧＤＭＡと共重合されて、ヒドロゲルを得ることができる。
【０１３２】
［レシオメトリックｐＨ検知］
レシオメトリックｐＨ検知は、周知である。例えば、特許文献２６、特許文献２２を参照し、その全体を参照により本明細書に組み入れる。２つの形態（酸形態および塩基形態）で存在する蛍光体（例えば、蛍光指標色素）を含む指示薬系が与えられば、２つの波長の発光強度の比率を使用して、蛍光体濃度に関係なくｐＨを測定できる。レシオメトリックｐＨ検知に適している蛍光指標色素は、（１）２つの励起波長（酸および共役塩基の形態に対応する）および１つの発光波長を示す色素（例えば、ＨＰＴＳ色素）、（２）１つの励起波長および２つの発光波長（酸および塩基形態）、または（３）２つの励起―２つの発光色素であり得る。ＳＮＡＲＦまたはＳＮＡＦＬ色素などのいくつかの色素は、２色発光および２色励起の、両方の特性を有することができる。しかしながらＳＮＡＲＦなどの２色−２色の色素は、１色−２色または２色−１色として用いられることができる。
【０１３３】
強度比とｐＨとを迅速かつ確実に相関させているセミナフトフルオレセインおよびカルボキシナフトフルオレセインに基づく２色発光ファイバ光学系センサについては、説明されている。例えば、非特許文献４および非特許文献５を参照。これらの色素について観察した広範な光退色は、レシオメトリック法によって説明可能だが、それによってセンサの使用寿命は制限されるだろう。
【０１３４】
蛍光色素８−ヒドロキシ−１，３，６−ピレントリスルホン酸トリナトリウム塩（ＨＰＴＳ）は、３つのスルホン酸基およびヒドロキシル基を有するピレンコアからなり、約７．３ｐＫａのｐＨ感度を与える（非特許文献６）。ウルフベイスらはまた、固定化されたＨＰＴＳに関していくつかの特許を有する。ヤフソおよびホイ（Yafuso and Hui）は、他の固定化された蛍光色素ｐＨセンサを特許文献２７に記載しており、その記載は参照により本明細書に組み入れられる。ＨＰＴＳは、酸およびその共役塩基に対応する、４０５ｎｍおよび４５７ｎｍの２つの励起波長を示す（非特許文献７）。ｐＫａ値７．３について励起極大における一連のｐＨ依存性シフトは、生理学的範囲の２色励起／１色発光レシオメトリック検出を可能にする。これは、毒性が低いこと（非特許文献８）および、酸素濃度に対する無感受性（非特許文献９）と合わせて、ＨＰＴＳを生理的およびバイオプロセスｐＨ測定にとって適切なプローブにしている。
【０１３５】
３つの強陰イオン性スルホン酸基の存在は、ＨＰＴＳを陽イオン支持体にイオン結合によって固定させることができる。現在までに、ＨＰＴＳの共有結合は、スルホンアミドカップリング（特許文献２８）を介していた。色素を固定化して、ｐＨ感度を保持することに効果的である一方で、ポリマ基材は１級アミンを含むものに限られている。さらにカップリング後基材上に残るアミン基は、ポリマーマトリックス内部で局所ｐＨに影響を及ぼすだろう。色素は、中性および酸性の環境で運用する蛍光系ｐＨセンサの開発、並びにｐＨおよびｐＣＯ２検出のために使用される血管内血液ガス監視システム（非特許文献１２）において、細孔径の多孔質ガラス（非特許文献１０）およびアミノエチルセルロース（非特許文献１１）に共有結合されてきた。ファイバ−光学系ｐＨセンサは、陰イオン交換膜（非特許文献９）または樹脂（非特許文献１３）に結合され、かつ光学ファイバの先端に固定されたＨＰＴＳと共に詳述されている。
【０１３６】
例えば、特許文献２９（全て参照により、本明細書に組み入れられる）は、粒子にまたは微結晶セルロースファイバに共有結合できる蛍光指示薬を備える、ｐＨセンサを提供する。前記センサは、光学的に透明な基材、熱可塑性層およびヒドロゲルを備える。一部に指示薬が固着した粒子が、基材にコーティングされて、熱および圧力を使用して機械的に接着された熱可塑性層に埋め込まれる。大部分の粒子／指示薬は、熱可塑性層上に適用されたヒドロゲル層内に埋め込まれる。ｐＨセンサは、光導波路の先端に置かれる。
【０１３７】
さらに低コストＵＶ  ＬＥＤが近年利用できるようになったため、色素は、ＵＶおよび青色ＬＥＤ、並びにフォトダイオードモジュールを組み合わせた比較的安価な器具を用いて、測定することができる。このような、発酵媒体に直接溶解するＨＰＴＳを介した、高度の処理能力を持つマイクロバイオリアクタシステムのｐＨを検出するための構成は、記載されている（非特許文献１４）。
【０１３８】
本発明の一実施形態において、好ましい検出装置は、少なくとも１つの光源、検出器および蛍光レポータ色素系を含むセンサを備える。一実施形態において、蛍光レポータ色素系は、作用可能な状態で検体結合消光剤にカップリングする蛍光色素を含む。色素は、消光剤に共有結合して、または消光剤と単に会合していてもよい。色素および消光剤は、好ましくは作用可能な状態で連結されており、それは作動中に、消光剤が色素の十分近くにあって、その色素と相互作用し蛍光性を調整することを意味する。一実施形態において、色素および消光剤は、検体透過性ヒドロゲルまたは他のポリマーマトリックス内に一緒に拘束することができる。適切な波長の光によって励起されると、蛍光色素は光（例えば、蛍光）を発する。光の強さは、検体結合の量によって変化する消光範囲に依存している。他の実施形態において、蛍光色素および消光剤は、互いの代わりにヒドロゲルまたは他のポリマーマトリックスに共有結合できる。
【０１３９】
一実施形態において、別々のｐＨ指示色素は、検体結合部分で官能化された異なる色素と結合されて、２つの色素系がセンサにおいて一緒に（例えば、ヒドロゲル内で）固定化されるようになる。
【０１４０】
いくつかの蛍光ｐＨ指示薬分子は、特定の波長で光を吸収して、第２のより長い波長で光を発する。このｐＨ指示機能は通常、プロトン化および脱プロトン化を含む。これは、これらの蛍光ｐＨ指示薬が、あるｐＨ範囲においてはその分子の一部を形成する（分子に結合されている）水素原子（陽子、Ｈ＋）を含むが、他のｐＨ範囲内では陽子が分子から解離されていることを意味する。陽子が分子から解離されるときに、分子は負電荷を帯び、それは溶液中の正に荷電するイオン（例えば、Ｎａ＋）によって指示薬と釣り合っている。この配置は、式１で示される。Ｒ―Ｈ←→Ｒ−＋Ｈ＋
【０１４１】
Ｒが蛍光分子を表す場合、通常、それがＲ−Ｈ形態かまたはＲ−形態かによって異なる波長で、蛍光を発するだろう（全く異なる色として見えるだろう）。Ｒで表される大部分の分子にとって、この変化は一般的に、非常に狭いｐＨ範囲内で全く突然発生し、それは、Ｒがとても単純で信頼性の高いｐＨ指示薬として機能することを可能にする。溶液中に置かれるときに、１つのとてもはっきりした色（Ｒ−Ｈ形態と関連した色）、およびそのＲ−と関連した別のはっきりした色を示す。
【０１４２】
例えば、８−ヒドロキシル−１，３，６−ピレントリスルホネート（ＨＰＴＳ）は、その優れた光安定性、高い量子収率、２色励起、大きいストークス性および長い蛍光発光により、ｐＨ定量の最高に有望な指示薬の１つと考えられている。この指示薬の好ましい特徴は、酸（付随性ＨＰＴＳ形態）および塩基（解離性ＰＴＳ−）形態が、４１８ｎｍの等吸収点で、４０６並びに４６０ｎｍの異なる励起波長を有するが、５１５ｎｍで同じ蛍光発光極大を示すということである。２色励起および１色発光は、ＨＰＴＳをｐＨのレシオメトリック検出に好適なものにする。ｐＨが色素の酸から塩基形態への転換を伴いながら上昇するとき、酸形態の４０６ｎｍの蛍光強度は減少するが、塩基形態の４６０ｎｍの強度は増加する。
【０１４３】
ＨＰＴＳおよびその誘導体などの色素上のヒドロキシル（−ＯＨ）基により、これらの色素は環境のｐＨ変化に敏感である。ヒドロキシル基のｐＨ−依存的イオン化は、これらのピラニン誘導体が、その酸形態および塩基形態において異なる吸収極大を備えた、ｐＨ−依存的吸収スペクトルを有する原因となる。第１の吸収極大は第１の励起波長であり、第２の吸収極大は第２の励起波長である。第１の励起波長および第２の励起波長で蛍光色素により吸収される光の量は、蛍光色素が接触している媒体のｐＨに依存するかまたはそれに関連する。発光波長で色素により発される光（例えば、蛍光発光）の量は、色素が励起波長で照射されるときの、光吸収の量に依存する。吸収が媒体のｐＨに影響を受けるので、蛍光発光もｐＨに影響を受ける。これは、ポリヒドロキシル化合物濃度の測定を可能にする一方で、ｐＨ測定法の根拠を提供する。
【０１４４】
本発明の１つの好ましい実施形態において、レシオメトリックｐＨ検知は、作用可能な状態で光ファイバの近位端部分にカップリングする少なくとも１つの励起光源であって、該ファイバはファイバの光路内の遠位端部分に沿って配置されている励起光源と、励起光に反応して検出可能な発光信号を生じるように構成された指示薬系と、を備える光学センサを使用して達成される。好ましいセンサの実施形態はさらに、検出器に発光信号を送るための光学的手段を含む。前記光学的手段は当該技術分野において周知であり、例えば、光を戻すための鏡、フィルタ、レンズ、ビームスプリッタ、並びに光ファイバ束およびスプリット構造を含むことができる。
【０１４５】
好ましい実施形態において、指示薬系は、少なくとも２つの異なる形態およびこれらの異なる形態間でｐＨ依存性シフトを示す、蛍光体を含み、このシフトは、１つの波長でまたは２つの異なる波長で発光強度の変化として検出することができる。例えば、レシオメトリックｐＨ検知のための１つの指示薬系は、色素が酸形態かまたは塩形態かに依存する、２つの異なる波長極大（λａｃｉｄおよびλｂａｓｅ）で光を吸収する蛍光色素（例えば、ＨＰＴＳ）を含み、並びにそれは１つのより長い発光波長で光を発する。より詳細には、ｐＨが増加するにつれて、ＨＰＴＳは、λｂａｓｅに対応する吸光度の増加、およびλａｃｉｄに対応する吸光度の減少を示す。この変化は、ヒドロキシル基のｐＨ−依存的イオン化による。ＨＰＴＳの発光スペクトルは、ｐＨとは無関係であり、約５１１ｎｍのピーク発光波長を有するが、発光強度は吸収された光量（ｐＨおよび励起波長によって変化する）に依存している。したがって例えば、第１の波長（例えば、λａｃｉｄ）の光を用いて所定のｐＨでＨＰＴＳを励起する場合、１つの発光波長で発光強度を測定でき、該強度は色素の形態（すなわち、電離度―これはｐＨに依存する）に依存する。第２の波長（例えば、λｂａｓｅ）で励起させることもでき、同じ所定のｐＨで発光強度を測定することもできる。発光強度の比率はｐＨに関連しており、色素の量および系内の特定の光学的人工物（artifact）には関係しない。いかなる励起波長もレシオメトリック検知に使用できるが、λａｃｉｄおよびλｂａｓｅが本発明の一実施形態によれば好ましいことに注意する。吸収が色素の酸および塩基形態で同じである波長は、等吸収点と呼ばれており―この波長（λｉｓｏ）での励起は、本発明の他の好ましい変形例にしたがって、レシオメトリック検知で使用されてもよい。発光強度の比率（例えば、Ｉｂａｓｅ／ＩｉｓｏまたはＩｂａｓｅ／Ｉａｃｉｄ）がｐＨに対してプロットされる際、標準または較正曲線が生じる（例えば、図３、５および９参照）。レシオメトリック法は、色素がスペクトル特性の検出可能な変化を生じる形態で、ｐＨ感受性のシフトが行われている限り、使用される色素が２色励起−１色発光（ＨＰＴＳのような）または１色励起−２色発光または２色励起−２色発光かを問わず、同様である。
【０１４６】
［光学グルコース検知］
いくつかの好ましい蛍光色素、グルコース結合部、およびグルコース濃度を光学的に定量する方法に関する詳細は、特許文献２０、特許文献１４、特許文献１５、特許文献２、特許文献１、特許文献１６、特許文献１７、特許文献６、特許文献１８、特許文献１９、特許文献５、特許文献３、特許文献１２、特許文献３０、特許文献９、特許文献１１、特許文献３１、特許文献３２、特許文献３３、特許文献３４、および特許文献３５に開示されており、それぞれの内容は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
【０１４７】
［寿命化学］
別の実施形態において、グルコース濃度は、蛍光共鳴エネルギ移動（ＦＲＥＴ）の現象を利用することによって求めることができる。ＦＲＥＴは、ドナー蛍光体からアクセプタ分子へのエネルギ伝達である。ＦＲＥＴは、アクセプタ分子によって少なくとも部分的に吸収される波長で蛍光を発するドナー蛍光体が、アクセプタに近接している際に発生して、ドナー蛍光体がエネルギをアクセプタに分子相互作用を介して伝達できるようになる。蛍光体の蛍光寿命、該蛍光寿命は蛍光体が励起状態にとどまる時間であり、これはＦＲＥＴによって変化する。すなわち蛍光体の蛍光寿命を測定することは、蛍光体がアクセプタに結合しているかどうかを判定することである。
【０１４８】
寿命は、蛍光体が励起光の短いパルスによって励起されて、蛍光強度が経時的に測定される、時間領域法を用いて測定することができる。励起パルスは、ピコ秒範囲の持続期間から、最大で約２、３ナノ秒までの持続期間を有する、レーザからのパルスであり得る。他の実施形態において、パルス持続期間は約２、３ナノ秒より長くてもよい。時間関数としての蛍光体の蛍光強度は、次の式によって与えられる。
【数２】
0006534616.tif 000018
【０１４９】
Ｉ（ｔ）は時間（ｔ）での蛍光強度であり、Ｉ０は励起後の初期強度であり、およびτはＩ（ｔ）がＩ０／ｅに減衰するために必要な時間として定義される蛍光寿命である。式Ａは、蛍光の単一の指数的減衰、および励起パルスより実質的に長い寿命を有する、蛍光体に適用できる。図１４は、励起光パルス４０２の後、経時的に蛍光発光４００が減衰することを示すグラフである。初期強度Ｉ０がＩ０／ｅへと低下するのにかかる時間が寿命τに等しい。
【０１５０】
寿命を測定する他の方式は、蛍光体が周波数変調励起光により励起される、周波数領域法による。蛍光寿命τは、以下の式を用いて、励起光と関連する蛍光体からの発光の位相シフトを測定することによって、または、変調比を測定することによって求めることができる。
【数３】
0006534616.tif 000019
【０１５１】
τφは、位相シフトφを測定することにより求めた寿命であり、ωは周波数変調励起光の角周波数であり、ｆは線形周波数である。τＭは、変調比Ｍを測定することにより求めた寿命である。ＡＣは、信号の交流部分の大きさまたは波の振幅であり、一方でＤＣは、信号のＤＣ部分の振幅である。ＥＭは発光信号を指し、ＥＸは励起信号を指す。図１５は、発光信号５００と、励起信号５０２と、式Ｂ〜Ｅに記載されている変数との関係を示すグラフである。
【０１５２】
センサに用いられる好ましい結合分析構成は、可逆競合的で試薬制限された結合分析を含み、その構成成分は、検体類似体および目的の検体と検体類似体の両方の可逆的結合を可能にする検体結合剤を含む。目的の検体および検体類似体は、検体結合剤の同じ結合部位と結合するために競合する。前記の競合結合分析構成は、臨床検査で周知の技術であり、例えば、非特許文献１５に記載されている。分析に用いられる好適な検体結合剤は、検体結合部位（例えばＦａｂフラグメント）、レクチン（例えばコンカナバリンＡ）、ホルモン受容体、薬物受容体、アプタマおよび分子インプリントポリマを保持する、抗体または抗体フラグメントを含む。好ましくは検体類似体は、それによりセンサから自由に拡散できないように、検体より高い分子量の物質であるべきである。例えばグルコースの分析は、検体類似体としてデキストランのような高分子量グルコースポリマを使用できる。
【０１５３】
本開示にしたがって分析読み出し情報として使うことができる好適な光信号は、蛍光共鳴エネルギ移動、蛍光偏光、蛍光消光、リン光技術、発光増強、発光消光、回折またはプラズモン共鳴により生成されるもののような、近接解析によって生成可能ないかなる光信号も含む。
【０１５４】
本開示のセンサのいくつかの好ましい実施形態において、光学読み出し情報を生成する、競合的で試薬制限された結合分析は、蛍光共鳴エネルギ移動の技術を使用することを包含する。この分析構成において、検体類似体は第１の発色団で標識され、検体結合剤は第２の発色団で標識される。第１および第２の発色団の１つはドナー発色団として作用し、残りの発色団はアクセプタ発色団として作用する。ドナー発色団の蛍光発光スペクトルがアクセプタ発色団の吸収スペクトルと重なり合うことは、前記分析の重要な特徴である。これにより、ドナーおよびアクセプタ発色団が結合剤によって近接するようになったとき、（ドナー発色団により吸収される波長の入射光での照射に引き続いて）ドナー発色団により発される蛍光を正常に生み出すエネルギの一部は、ＦＲＥＴとして周知のプロセスである、近接のアクセプタ発色団に非放射的に移動する。この結果、ドナー発色団によって発せられた蛍光信号の一部が消光される、および、場合によってはアクセプタ発色団が蛍光を発する。蛍光共鳴エネルギ移動は一般的に、検体類似体と検体結合剤が結合することによって、ドナーおよびアクセプタ発色団が近接するようになったときにのみ生じる。すなわち、検体結合剤に結合することを検体類似体と競合する検体の存在下で、標識された検体類似体が検体結合剤との結合から離れているため、消光の量は減少される（結果として、ドナー発色団により発される蛍光信号の強度の測定可能な増加、またはアクセプタ発色団により発される信号の強度の低下を生じる）。このように、ドナー発色団から発される蛍光信号の強度または寿命は、センサを浸している流体中の検体濃度と関連がある。
【０１５５】
蛍光共鳴エネルギ移動分析構成の追加の有利な特徴は、アクセプタ発色団の吸収スペクトル内の波長での入射光ビームでの励起後の、アクセプタ発色団による発せられるいかなる蛍光信号も、蛍光共鳴エネルギ移動プロセスによる影響を受けないという事実から生じる。したがって、例えばセンサの連続較正において、またはセンサの劣化の程度を監視してセンサ交換の必要性を示すために、内部基準信号として、アクセプタ発色団によって発せられる蛍光信号の強度を使用することが可能である。センサが劣化するにつれて、センサに存在するアクセプタ発色団の量は減少し、したがってアクセプタ発色団の励起時に検出される蛍光信号の強度も減少する。容認できる基準レベル以下へのこの信号の低下が、新しいセンサの埋め込みまたは注入の必要性を示す。本開示のセンサ用に構成されることが可能な蛍光共鳴エネルギ移動技術を用いた競合的結合分析は、当業者には周知である。特許文献３６は、抗体、および蛍光体−消光剤発色団の組み合わせ間の蛍光共鳴エネルギ移動を利用する免疫測定法を記述している。非特許文献１６は、標識グルコース類似体（ＦＩＴＣ標識デキストラン）および標識グルコース結合剤（ローダミン標識コンカナバリンＡ）間の蛍光共鳴エネルギ移動に基づくグルコース測定のための均一分析法を記述している。これらの構成の全てにおいて、アクセプタおよびドナー発色団／消光剤は、結合剤または検体類似体どちらかに連結することができる。
【０１５６】
蛍光寿命測定または蛍光強度測定を行うことができる。非特許文献１７で説明されているように、蛍光寿命は位相変調技術で測定することができる。
【０１５７】
図１６Ａ、１６Ｂおよび１６Ｃに示すいくつかの好ましい実施形態において、ＦＲＥＴを使用したグルコースを測定するための競合的結合システムは、ドナー蛍光体６０２に連結されるグルコース結合分子６００およびアクセプタ分子６０６に連結されるグルコース類似体６０４を含む。グルコース結合分子６００は、グルコース６０８およびグルコース類似体６０４の両方と結合できる。図１６Ａで示すように、グルコース類似体６０４がグルコース結合分子６００に結合される際、蛍光体５０２がアクセプタ６０６と近接しているため、蛍光体６０２からの蛍光発光５００は大きさが弱められ、ＦＲＥＴ６１０によって位相および寿命がシフトする。他の実施形態において、蛍光体６０２は分子６００である。
【０１５８】
図１６Ｂで示すように、グルコース６０８は、グルコース類似体６０４とグルコース結合分子６００の結合部位を競う。図１６Ｃで示すように、グルコース分子６０８はグルコース類似体６０４をグルコース結合分子６００から離すことができ、それによってアクセプタ６０６がＦＲＥＴ６１０を介して蛍光体６０２の発光寿命５００を変えないようになる。
【０１５９】
一定の濃度のグルコース結合分子、グルコース類似体およびグルコース分子があるシステムにおいて、結合グルコース分子の数と結合グルコース類似体の数の間に平衡が生じる。前記システムのグルコース分子の数の変化は、結合グルコース分子と結合グルコース類似体の間の平衡を変える。これは同様に、蛍光発光の平均寿命を変える。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、前記システムは、約１ＭＨｚ未満の、約１〜２００ＭＨｚの間の、または約２００ＭＨｚ以上の周波数変調された励起光によって励起される。いくつかの実施形態において、周波数は、約０．０５、０．１、１、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００ＭＨｚである。システムの位相シフトの程度を測定することによって、システムの平均ＦＲＥＴ誘導位相シフトが求められ、それは上記の式ＢおよびＣで定義されるようにシステムの平均寿命値に相当する。位相シフトおよび寿命値の両方が、グルコース濃度と相関している。位相シフトの大きさは、発光の振幅とは無関係である。
【０１６１】
他の実施形態において、システムはパルスによって励起されて、蛍光の減衰は経時的に測定される。寿命は上記の式Ａを使用して決定されることができ、グルコース濃度は寿命値と相関し得る。
【０１６２】
実施形態において、ドナー蛍光体を有するグルコース結合分子およびアクセプタを有するグルコース類似体は、上記のヒドロゲル内に実質的に固定化されることができ、それによりヒドロゲルからのグルコース結合分子およびグルコース類似体の拡散が実質的に減らされるようになる。またセンサは、上記のドナー蛍光体により吸収される波長で励起光を発するように構成される。いくつかの実施形態において、励起光は、レーザまたは発光ダイオード（ＬＥＤ）からの短いパルスとして提供される。他の実施形態において、励起光は周波数変調されている。いくつかの実施形態では、周波数変調励起光はレーザによって提供される。いくつかの実施形態では、周波数変調励起光はＬＥＤによって提供される。センサも、経時的な発光の振幅、並びに／または発光の位相シフト、並びに／または発光および励起光のＡＣ並びにＤＣ部分の振幅を検出する検出器を備えている。検出器は、１つの光検出器または複数の光検出器であり得る。励起光および発光は、光ファイバを介してセンサ全体に伝達することができる。
【０１６３】
［検体センサの乾燥挿入］
いくつかの実施形態において、センサは患者への挿入用として構成されて、そこでヒドロゲルは上記の通り「乾燥している」。具体的には、センサおよびヒドロゲルは、包装後および挿入前に、液体外に保管されるように構成することができる。現在市販されているセンサは、包装の間および陳列の間、滅菌液に保管される。これらのセンサは、液体の無菌性に関する違反など関連する問題が生じて、全体的に製造費用が増加した。乾燥センサは少なくとも、使用前のセンサの包装および保管に関連する時間およびコストを減らすという利点を加える。乾燥ヒドロゲルに関して、液体は保管のために必要とされず、したがって患者への挿入前に十分に水分を補うことは、必要でない。任意の変調試験の完了後に、センサは洗浄することができる（例えば、ｐＨ５の水溶液で）。次いでセンサは、大気中、室温で、ある時間、例えば、約１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、１時間、２時間、３時間、４時間など、好ましくは約１時間、乾燥することができる。他の乾燥方法が、吸収剤、加熱、真空下での加熱、冷凍真空乾燥などの乾燥を含めて、用いられることが可能である。次いでセンサは、包装されて殺菌することができる。いくつかの実施形態において、センサはＥｔＯ消毒により殺菌される。いくつかの実施形態にいて、センサは、患者の生理的流体に挿入されるまで再び濡らされない。
【０１６４】
乾燥ヒドロゲルセンサは、患者内に、例えば患者の血流、組織または間質液内に、乾燥状態で挿入することができる。センサは、例えば橈骨動脈Ａラインのような長期のカニューレにより挿入され、またはセンサを配置後追加部品なしで患者の体内に残すことができる着脱可能なカニューレを用いることにより挿入させることができる。水和の後センサは、検体濃度を定量するためにｉｎ  ｖｉｖｏで較正されることができ、かつ連続的検体検知のためにさらに用いられることが可能である。いくつかの実施形態において、センサは、患者への乾燥挿入後約１〜２時間後に水和することができる。他の実施形態において、センサは、患者への挿入後約１０分後、２０分後、３０分後、４０分後または５０分後に水和することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏ水和時間は、ポリマーマトリックスの化学的特性に応じて変化することができる。一度水和されると、センサは、１点ｉｎ  ｖｉｖｏ較正（独立して測定されたグルコース濃度（例えば、ＹＳＩラボ分析装置）、ｐＨおよび温度に対して）によって完全に較正が行われて、かつ、１点ｉｎ  ｖｉｖｏ較正は、例えばＥＰＲＯＭまたはセンサと関連した他のメモリによって―例えば近位端結合で―保管された事前の工場較正データと任意に比較されることはできるが、いかなる事前の工場較正も必要としない。
【０１６５】
乾燥センサは、他のシステム構成要素と共に用いられることが可能である。例えば、モニタは、センサに接続されてセンサが完全に水和されるとき、警報をだすことができる。これは、センサがｉｎ  ｖｉｖｏ較正および検体検知の前に適当な水和状態になるのを可能にする。そのうえセンサは、センサが完全に水和されたとき、聴覚または視覚の情報を提供できる警報に取り付けられることが可能である。
【０１６６】
乾燥センサは、いかなる外部較正装置、例えば、検体センサを較正するために以前用いられていた較正室の使用も必要としない。例えば乾燥センサは、他の外部較正装置の中でも特に、加熱室、電気制御、流体注入、廃物袋、管類の使用を必要としない。さらに下記に詳述するように、較正および検出は全てｉｎ  ｖｉｖｏで行われることができ、したがってこの外部較正装置の必要性が排除される。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、センサは任意に、乾燥、殺菌および包装前に工場較正される。それらは、例えば０、５０、１５０、２５０グルコース濃度のような、１組のグルコースパラメータによって実施されて、集められた信号データを使用して、ミカエリス−メンテンパラメータが導出される。これらは特許文献３７に記載されており、その全てが参照により本明細書に組み込まれる。このデータは、センサのいかなる表示にも配置されること、電子的に保管されること、および／またはセンサが用いられる際にモニタに入力することができる。
【０１６８】
［センサ較正］
本願明細書の検体センサ、特にグルコースセンサにおいて、これらのセンサのグルコース濃度に対する蛍光応答が、一般的な手順である較正室または工場較正を用いる場合のように周知のキャリブレーション溶液および温度からの値を使用する代わりに、患者の血流または間質液内などのｉｎ  ｖｉｖｏで較正することができるということがわかった。全ての較正は、一度患者からとられる参照情報を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏでなされ得る。参照情報は、例えば家庭の血糖値モニタリング、フィンガースティック試験、ＹＳＩ試験、電極、動脈の血液ガス分析または他の任意の臨床血液化学データ分析などの、いかなる測定方法によってもとられることが可能である。参照情報を得るための方法には、制限がない。参照情報は、例えば、グルコース値、ｐＨ値、温度値、または他の身体の読み取り値などの、特定の患者情報を任意の組み合わせで含むことができる。いくつかの実施形態では、グルコースおよびｐＨ値は、参照情報のために得られることが可能である。他の実施形態において、グルコース値は、参照情報のために得られることが可能である。前記較正方法はさらに患者から複数の採血を回避し、それはこれまで開示されているｉｎ  ｖｉｖｏ較正の他の試みと比較しても類をみないものであり、したがって不快感を軽減する。センサのｉｎ  ｖｉｖｏ較正および検体を、特にいくつかの実施形態においてはグルコースを算出する新しい方法は、さらに後述される。
【０１６９】
システムの検体センサの蛍光強度の反応とグルコースの量との間に対数−線形（Ln-linear）関係があるということが、予想外に発見された。特にこの関係は、５０ｍｇ／ｄＬと２５０ｍｇ／ｄＬのグルコースの間でモデル化され得るが、これらの範囲は制限されない。対数−線形関係は、式１により記載され得る。
【数４】
0006534616.tif 000020
【０１７０】
式中、Ｇがシステムの蛍光強度であり、Ｍは工場「較正」の直線近似（straight line approximation）の傾きであり、およびＢは工場「較正」の切片である。工場較正はセンサの包装前に実行されることができ、工場較正の結果はセンサと共に引き渡され得る。ＭｆａｃｔｏｒｙおよびＢｆａｃｔｏｒｙは、システムの蛍光対グルコース応答曲線に合わせた、対数−線形曲線から導き出される。Ｇは、システムの緑の蛍光信号、Ｇ１またはＧ２を表すために用いることができる。Ｇ１およびＧ２は、上記で詳述したように、蛍光体の酸および塩基形態の蛍光を表す。当然ながら上述した工場較正のための対数−線形変換は、１点ｉｎ  ｖｉｖｏ較正にも適用され、その式は、Ｇ＝Ｍ＊Ｌｎ（Ｇｌｕ）＋Ｂであり、式中、Ｇはシステムの蛍光強度であり、Ｍは直線近似の傾きであり、およびＢは切片である。
【０１７１】
式１に記載されている対数−線形関係は、前述に開示されたミカエリス−メンテン修正モデルと比較して、Ｒ２値＞９９．５％を維持でき、それは特許文献３７に記載されており、その全内容を参照により本明細書に組み入れる。
【０１７２】
そのうえ上記の対数−線形関係は、システムのｐＨと相関するために用いることができる。センサは、例えば患者の血流内のような変動するグルコースと共にシステムで用いられることが可能であるので、それはシステムのｐＨを測定し、かつどのように検体センサの較正に影響を及ぼすのか判断するのに必要になる可能性がある。線形関係が、いかなる温度でもＧ１およびＧ２値とｐＨとの間に存在することがわかっている。前記の関係は、式２により記載することができる。
【数５】
0006534616.tif 000021
【０１７３】
式２において、ＭおよびＢはシステムのグルコース値の関数である。これらの値は、実験によるデータにより決定された。式の傾きＭは、式３として定義することができる。
【数６】
0006534616.tif 000022
【０１７４】
同様に、式の切片Ｂは、式４のように定義することができる。
【数７】
0006534616.tif 000023
【０１７５】
Ｇ２は、ｐＨおよびグルコースによって変化することもできる。ｐＨとＧ２の関係は、実質的に線形であることが示される。図１７は、Ｇ２とｐＨの間の直線関係を示す。図１７に示すように、示される線はほとんど平行かつ線形である。しかしながら、記入された線の傾斜およびそれらの切片は、システムのグルコース値に対して変化する。
【０１７６】
Ｇ２とグルコースとの相違のため、Ｇ２とｐＨの一般形式は式５として定義することができる。
【数８】
0006534616.tif 000024
【０１７７】
図１７に基づいて、Ｍｐｈが式６として定義され、およびＢが式７として定義することができる。
【数９】
0006534616.tif 000025
【０１７８】
式６および７は、Ｇ２の初期蛍光を表す、Ｇ２ｉ０値の初回通過推定の根拠を、ｐＨおよびグルコース値、特にセンサ較正時にｉｎ  ｖｉｖｏで決定されたこれらの値に基づいて提供できる。
【０１７９】
そのうえ、どのようにＧ２の傾き並びに切片がｐＨによって変化するのか判断できる。図１８および１９は、所定の温度でのｐＨに対する、Ｇ２の切片およびＧ２の傾きのプロット線をそれぞれ示す。これらの図は、蛍光強度とグルコース濃度の間の対数−線形傾きおよび切片関係に基づいている。ｐＨに関するＧ２の傾きおよび切片値は、式８および９として定義することができる。
【数１０】
0006534616.tif 000026
【０１８０】
一括してこれらの式は、初期強度Ｉ０値および患者の体内のグルコース追跡方法を確立するために、基礎をなす方法論を説明できる。
【０１８１】
［温度補償］
上記の式がグルコースセンサのような検体センサの較正を提供する一方、考慮されてもよい他の要因は温度補償である。例えば本明細書で開示される乾燥挿入検体センサなどの検体センサは、熱電対、または患者の温度読み取り値を得るためのサーミスタなどの他のいかなる温度検出器も含むことができる。センサの温度は検体読み取り値に変動を生じさせることがあり、それは温度補償を用いて取り除かれることができる。Ｇ２の温度係数は、約０．５〜１％／℃、より好ましくは約０．８％／℃まで変化できる。Ｇ１の温度係数は、約０．５〜１％／℃、より好ましくは約０．６５％／℃まで変化できる。しかしながら、これらの温度係数は、システムのｐＨおよびグルコース値に基づいて変化でき、これらの値は制限されない。下記の式のために、好ましい値が使用される。
【０１８２】
Ｇ１およびＧ２の温度補償は、Ｇ１およびＧ２をそれらの３７℃での「当量」に調整することに基づいており、なぜならそれが本来のミカエリス−メンテン式（例えば、特許文献３７参照）に基づく温度だからである。また、「公称」体温にも基づいている。Ｇ２の補償は、式１０として定義することができる。
【数１１】
0006534616.tif 000027
【０１８３】
ここで、Ｇ２ｃは温度を考慮したＧ２の「修正された」値であり、Ｇ２ｔは測定によるＧ２の現在の値である。
【０１８４】
Ｇ１の補償は、式１１として定義することができる。
【数１２】
0006534616.tif 000028
【０１８５】
ここで、Ｇ１ｃは温度を考慮したＧ１の「修正された」値であり、Ｇ１ｔは測定によるＧ１の現在の値である。式１０および１１の両方とも、ｔはシステムの熱電対値の加重平均である。いくつかの式において、これは２、３、４、５、６、７、８、９または１０点加重平均であり得るが、これらに限定されず、他の点加重平均を使うことができる。
【０１８６】
［センサ較正の方法］
（対数−線形方程式）
検体センサによって測定された蛍光強度を、センサ周囲の検体濃度に関連させるために使用される、上記の対数−線形方程式の値を決定する方法が本明細書で開示されている。センサは、完全にｉｎ  ｖｉｖｏで較正することができる。ある種の方法において、検体はグルコースであり、および該グルコースセンサはより詳細にはＧｌｕＣａｔｈセンサである。ＧｌｕＣａｔｈセンサは、蛍光色素（好ましくはＨＰＴＳ−ＴｒｉＣｙｓ−ＭＡ）を有する化学指示薬系、検体結合部分（好ましくは３，３’−ｏＢＢＶ）および固定化手段（色素および結合部モノマは好ましくはＨＥＭＡおよびＰＥＧＤＭＡと共重合されて、ヒドロゲルを得る）を含む、光学グルコースセンサである。ある種の方法において、対数−線形方程式は寿命化学に基づく検体センサに関連して決定される。しかしながら、後述の方法の説明において、参照は、グルコースセンサまたはさらに詳細にはＧｌｕＣａｔｈセンサになされる。にもかかわらず開示された方法が、対数−線形方程式を使用してモデル化され得る検体センサを較正するために、用いることができることは理解されるべきである。
【０１８７】
後述の方法は、実験的測定およびグルコースへのセンサ応答を説明する対数−線形方程式の適切な値を決めるための数値計算の組み合わせを含む。多くの化学系のように、ＧｌｕＣａｔｈセンサ化学物質の反応は、目的検体に加えて、他の化学的パラメータに影響される。例えば、温度補償が上述されている。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、検体センサは、ある時間の計算値を使用して較正することができる。いくつかの実施形態において２つの時間を使用することができ、「ドロー」時間は血液が患者から採取された時間を指し、および「アプライ」時間はセンサが開示された対数−線形方程式を使用して較正される時間を指す。ドロー時間に患者からとられたサンプルは、ドロー時間のグルコースおよびｐＨ値などの異なる生理的濃度の評価を含むことができる。ドロー時間にとられたサンプルは、例えば当該技術分野で周知のＹＳＩ検出方法で試験されて生理的濃度が分析される。
【０１８９】
ドロー時間に患者から採取した血液を用いて、Ｇ２対ｐＨの傾きおよび切片を、式６および７から得る。次いで傾きおよび切片はドロー時間に得られたｐＨと共に、式５に代入できる。式５から、Ｇ２ｉ０、初期Ｇ２蛍光の値は、式１２で定義されるように得られることができる。
【数１３】
0006534616.tif 000029
【０１９０】
一度Ｇ２の初期値が決定されると、Ｇ２／Ｇ２ｉ０の比率は、前記アプライ時間以降は全測定値について算出される。式１０は、温度補償された比率を計算するために、Ｇ２／Ｇ２ｉ０比率に適用することができる。
【０１９１】
Ｇ２ｉ０が確定されたため、式２、３および４が、Ｇ２ｉ０の算出方法と同様の方法で、Ｇ１ｉ０、初期Ｇ１蛍光を算出するために、適用することができる。最初にＭおよびＢが式３および４を使用して算出されて、次いでドロー時間のｐＨを用いて、Ｇ１ｉ０が式２を使用して算出される。一度Ｇ１ｉ０が算出されると、比率Ｇ１／Ｇ１ｉ０もアプライ時間から算出される。一度比率が算出されると、温度補償された比率を計算するために、式１１をＧ１／Ｇ１ｉ０に適用することができる。
【０１９２】
一度２つの温度補償比率が等しいとされると、比率は、式１３で定義される式を使用して計算することができる。
【数１４】
0006534616.tif 000030
【０１９３】
この比率は、例えば較正定数またはｐＨスケーリング係数を使用することによって較正することができる。一実施例として、スケーリング係数は式１４により定義することができる。
【数１５】
0006534616.tif 000031
【０１９４】
ここで、ｐＨ値は、ドロー時間に得られた同じｐＨ値である。次いでＳＦｐＨは、ｐＨの推定値を一つ一つ提供するために式１３に適用される。
【０１９５】
ｐＨが確定されたため、式８および９が使用されて、式１に記載されるグルコースの対数−線形方程式のＭ（傾き）およびＢ（オフセット）が計算される。上記の式の結果を用いることで、グルコースの較正係数を決定でき、式１５で定義できる。
【数１６】
0006534616.tif 000032
【０１９６】
ここで、ＣＡＬｇｌｕが較正係数であり、Ｇｌｕｃａｌはドロー時間のグルコース値であり、Ｌｎ（ｇｌｕｃａｌｃ）はドロー時間のグルコース値の自然対数である。
【０１９７】
次いで較正係数ＣＡＬｇｌｕをアプライ時間およびそれ以降に適用することができ、それにより正確なセンサ較正を継続検体検知に提供する。
【０１９８】
さらに検体センサは、上記の通りにほぼ同じ方法によって再較正することができる。Ｉ０をＧ２およびＧ１の両方のために、再び定めることができ、その後上記の式を計算して、別のＣＡＬｇｌｕ較正係数を得ることができる。
【０１９９】
図２０を参照すると、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ試験における経時的なおよび注入されたグルコースを用いたグルコース測定の結果は、本開示の好ましい実施形態に従った持続型グルコースセンサ（―ＧｌｕＣａｔｈ）および血糖測定値のゴールドスタンダードであるＹｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔのグルコースオキシダーゼラボ分析装置（●ＹＳＩ）と比較される。センサは、ドロー時間８：０１およびアプライ時間８：２０において、較正のため対数−線形方程式を使用した。ドローは、センサの患者への挿入から約６０分後だった。この試験で使用されたＧｌｕＣａｔｈ平衡蛍光グルコースセンサは、ＨＰＴＳ−ｔｒｉＣｙｓＭＡ色素および３，３’−ｏＢＢＶグルコース結合部分を含む。図２０は、４０〜２００ｍｇ／ｄＬの範囲で循環するグルコースの変化の８時間の経過を示す。データは、平衡蛍光グルコースセンサが、ＹＳＩラボ分析装置と同じくらい正確な血糖の連続モニタリングを提供することを示す。そのうえ図２０は、グルコース濃度が減少しつつある場合でも、センサが較正し、継続して追跡することを示している。
【０２００】
図２１を参照すると、経時的なｐＨ測定の結果が参照ｐＨ（ラボｐＨ計）と比較されている。グラフは、７．２５〜７．４という極めて狭いｐＨ範囲および８時間の経過を示す。図に示されるように、式は、０．１ｐＨ未満の最小エラーが生じただけで、参照ｐＨに非常によく合致した上記の軌跡を開示した。
【０２０１】
図２２を参照すると、Ｇ１およびＧ２は、どのように未加工の信号がシミュレーションした較正の経過において変化するかを示している。これらの値は、エラー警告または不良信号の指標を含む、信号品質測定基準のために使用することができる。
【０２０２】
図２３は、Ｇ１およびＧ２、蛍光体の酸および塩基形態の蛍光波長を示す。これらの値は、エラー警告または不良信号の指標を含む、信号品質測定基準のために使用することができる。
【０２０３】
図２４は上記で示した、対数−線形変換方法とミカエリス−メンテン修正変換法との密接な相関を示す。このようにほぼあらゆるセンサの相関は＞９９．５％であり、グルコース測定用のより単純な対数−線形方程式の有効性を実証する。
【０２０４】
追加のデータが図２５および２６に関して示されており、ヒトのｉｎ  ｖｉｖｏ試験を例示する。試験前に乾燥センサを患者の血管内に挿入して、約５〜６時間留置した。上記のように単回較正が試験開始時に行われたが、更なる再較正はされなかった。また示すようにセンサは、ＹＳＩラボ分析装置によく合致した軌跡を示した。全ての値はシステムでｉｎ  ｖｉｖｏで取り出され、したがって較正室の必要性が避けられた。
【０２０５】
（参照ｐＨを使用しないｐＨ補正）
上述の通り、１点基準値は１点の較正中に記録されることでき、そこから特定の補正係数（ＣＦ）が算出できる。上記の開示が対数−線形方程式に関するものである一方で、ミカエリス−メンテン（ＭＭ）修正式に基づくいくつかの補正係数があり得る。
１−ｐＨ補正係数は、ｐＨ計算に適用することができる。
２−グルコースＣＦは、ＭＭａおよびＭＭｂに適用することができる。
【０２０６】
開示された方法のいくつかの実施形態において、温度およびｐＨは、蛍光信号の処理に用いる、適当な応答曲線を導き出すことによって使用することが可能である。いくつかの実施形態では、ミカエリス−メンテン修正式は、グルコース濃度をモデル化するために使用することができる。
【数１７】
0006534616.tif 000033
【０２０７】
ここで、Ｇｉは蛍光信号Ｇ１またはＧ２であり、［Ｇｌｕ］はグルコース濃度であり、並びにａ、ｂおよびｃは３つのＭＭ定数である。ミカエリス−メンテン修正式の使用に関する更なる説明は、特許文献３８および特許文献３７に見いだすことができ、その両方の内容全体を参照により本明細書に組み入れる。パラメータを再編成することで、グルコース出力に用いられる一般式がもたらされる。
【数１８】
0006534616.tif 000034
【０２０８】
開示されたセンサの実施形態は、較正（例えば３７℃、ｐＨ７．４）で定められるＭＭパラメータを用いた式（ｉｉ）に十分に表すことができる。しかしながら、温度およびｐＨが較正の温度およびｐＨからはずれる場合、較正で定めるＭＭパラメータはもはや正確にセンサ応答を表すことはできない。
【０２０９】
したがって、グルコース出力の応答プロファイルは、温度と共に変化し得る。任意の温度Ｔにおけるグルコース濃度［Ｇｌｕ］および蛍光ＧｌｕＣａｔｈ信号Ｇｉの関係が、温度依存的ミカエリス−メンテン（ＭＭ）修正式（ｉｉｉ）で表すことができる。
【数１９】
0006534616.tif 000035
式中、
Ｇｉ＝蛍光信号（ｉ＝２）
ａΤ＝温度ＴでのＭＭ‘ａ’パラメータ
ｂＴ＝温度ＴでのＭＭ‘ｂ’パラメータ
ｃＴ＝温度ＴでのＭＭ‘ｃ’パラメータ、である。
【０２１０】
同様にグルコース出力の応答プロファイルは、ｐＨと共に変化し得る。任意のｐＨにおけるグルコース濃度［Ｇｌｕ］および蛍光信号（Ｇ２）の関係は、ｐＨ依存的ミカエリス−メンテン（ＭＭ）修正式で表すことができる。
【数２０】
0006534616.tif 000036
式中、
Ｇｉ＝蛍光信号（ｉ＝１，２）、参照または非参照のいずれか
ａｐＨ＝任意のｐＨでのＭＭ‘ａ’パラメータ
ｂｐＨ＝任意のｐＨでのＭＭ‘ｂ’パラメータ
ｃｐＨ＝任意のｐＨでのＭＭ‘ｃ’パラメータ、である。
【０２１１】
任意の時点ｔにおけるミカエリス−メンテンパラメータは、最初のＭＭパラメータａ０、ｂ０、ｃ０（較正において測定または工場較正により提供）にτｘ（Ｔ）およびρｘ（ｐＨ）を掛けることによって決定される。
【数２１】
0006534616.tif 000037
【０２１２】
ここで、ａｔ、ｂｔ、ｃｔは、測定時ｔのＭＭパラメータである。これによりグルコースの最終的なアルゴリズムは、以下の通りであり得る。
【数２２】
0006534616.tif 000038
【０２１３】
代入すると、これは以下のように書くこともできる。
【数２３】
0006534616.tif 000039
【０２１４】
式中、ａ０、ｂ０、ｃ０は最初のＭＭ係数であり、τｘ（Ｔ）は温度補正係数を表し、およびρｘ（ｐＨ）はｐＨ補正係数を表す。
【０２１５】
しかしながら特定の状況下では、ｐＨはグルコース濃度の決定に利用できない場合がある。例えば、適合したｐＨセンサが利用できない場合があり、またはｐＨセンサが機能していない場合がある。参照ｐＨが利用できなくなったときに、本開示で詳述する検体センサなどの検体センサを較正する方法が、本明細書において開示される。実際にはセンサが挿入されるとき、ｐＨは７．４とみなされて、ρＨ０＝７．４となる。例えば開示された方法が、ミカエリス−メンテン修正またはＬｎ−線式と使用されることは可能であり、および、使用される式の種類は制限されない。
【０２１６】
ｐＨ７．４だとすると、ｐＨ補正係数は以下のようになることができる。
【数２４】
0006534616.tif 000040
【０２１７】
したがって、上記の式ｖｉｉは以下のように単純化することができる。
【数２５】
0006534616.tif 000041
【０２１８】
したがって検体測定値は、ｐＨ補正係数を使わずに、温度変化に対してだけ補正することができる。
【０２１９】
上述の通り開示された方法は、１点較正の間、２つの異なる補正係数を生み出すことができる。第１にｐＨ補正係数が計算され、それはｐＨ値を算出する際に使うことができ、次いで第２の補正係数ＣＦ（ａ、ｂ）は算出したｐＨ値を使用して生み出すことができ、それはＭＭａおよびＭＭｂパラメータに適用することができる。これらの２つの補正係数の複合効果、ＣＦ（複合）は、直接採血およびラボ分析で測定されたもののような参照グルコース値に一致した、グルコース濃度分析値をもたらすことができる。したがっていくつかの実施形態において、参照グルコース値および上記式（ｖｉｉｉ）で得られたグルコース値のパーセンテージの違いは、計算上は、上記の開示によって生じるグルコース値のＣＦ（複合）の効果であると見積もることができる。したがって２つの式を用いることができる。
ＣＦ（複合）＝（参照グルコース−Ｇｌｕ（ｖｉｉｉ）／Ｇｌｕ（ｖｉｉｉ）  （ｉｘ）
参照グルコース＝Ｇｌｕ（ｖｉｉｉ）＊ＣＦ（複合）＋Ｇｌｕ（ｖｉｉｉ）  （ｘ）
【０２２０】
ここで、Ｇｌｕ（ｖｉｉｉ）は、最初の１点較正においてｐＨ＝７．４で式（ｖｉｉｉ）から導き出されたグルコース値である。したがって式（ｉｘ）からのＣＦ（複合）は、式（ｘ）を用いて、ここから全てのグルコース値に適用することができる。それゆえ連続的１点較正において、算出ｐＨ値（７．４ではない）が、式（ｉｘ）を使用している新しいＣＦ（複合）と共に使用することができる。新しいＣＦ（複合）は、式（ｘ）を使用して適用することができる。
【０２２１】
［検体モニタリングシステムへの導入］
いくつかの実施形態において、検体センサを、機能的に検体モニタへ接続することができる。種々の実施形態において、検体モニタは、蛍光読み取り値を検体測定値に変換し、検体読み取り値を表示し、検体読み取り値を送信し、検体読み取り値を保存し、検体読み取り値を比較し、またはこれらの機能の組み合わせを行うことができる。キーボードまたはデータ入力サブシステムは、機能的にモニタに取り付けられるまたは組み込まれることができる。様々な部品は、ワイヤ、ケーブルおよび／またはワイヤレス接続によって相互接続し、および電気、光学、無線信号または他の適切な技術を含み得る。
【０２２２】
モニタは、較正式および補正係数ＣＡＬｇｌｕの１つ以上の値を利用できる。いくつかの実施形態では、較正式の値は、ユーザまたは他の当事者によって、１つ以上の値をメモリに保存するなどしてモニタに予め搭載することができる。いくつかの実施形態において、較正式の１つ以上の値は較正処理に続いて、機能的に接続している検体センサで当該モニタに、または、接続している検体センサで異なるモニタもしくは読出装置に、入力することができる。いくつかの実施形態において異なるモニタまたは読出装置が較正に使用されるとき、較正中、較正に関する情報は、機能的に検体センサに接続しているモニタと異なるモニタもしくは読出装置の間で、直接または間接的に伝達することができる。いくつかの実施形態において、モニタは、異なる装置でまたは異なる技術により測定される検体濃度の測定値に関する情報を受けて、較正中該情報を使用する。場合によっては情報は、キーボードもしくはタッチスクリーンもしくは他の手動の方法などの手動入力で、または検体濃度を測定する別々のデバイスを用いた直接的または間接的な伝達によって、または書き込みまたは印刷情報のスキャン、バーコードのスキャン、ディスク、ストリップ、ＲＡＭ、フラッシュドライブなどを含む磁気、光学もしくはコンピュータ記憶媒体の読み取りなど情報記憶媒体からの値の読み取りによって、モニタに送られることが可能である。
【０２２３】
いくつかの実施形態において、較正は、検体の濃度が既知のものまたは検体濃度に関連可能な検体センサによる応答を引き起こすものなど、購入されたまたは調製された標準物質により実行することができる。いくつかの実施形態において、購入されたまたは調製された標準物質は、モニタまたは機能的にモニタに接続している装置によって読み込まれる、タグ、ラベル、封入物などに記録されたような情報を含むことができる。
【０２２４】
いくつかの実施形態において、モニタは、メモリに保存される複数組の較正値を備えていることができる。異なる値は、特定の種類の分析器に相関するように、または特定の方法により実行される分析のために、異なるセンサ、異なるクラスのセンサ、異なるタイプのセンサ、異なるタイプのディスプレイまたは異なるタイプの検体読み取り相関性と関連づけることができる。異なる較正値間の移行は、スイッチ、ソフトスイッチ、ジャンパ、安全なコネクタまたは他の適切な技術によるものであり得る。セキュリティプロトコルおよび／またはアクセス制限技術は、不注意にまたは権限を与えられて較正値を変えることを防ぐために利用できる。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、モニタは、単一検体決定用の単一センサ用などの専用モニタであり得る。いくつかの実施形態において、モニタは、他の患者のモニタリングおよび／もしくはデータ格納機能を含む、多目的装置であり得る、または他の条件のモニタリングに使用される患者モニタリングシステムに検体モニタリング機能を組み込むことができる。
【０２２６】
いくつかの実施形態においてモニタは上述のように、検体濃度の決定の一部としてＬｎ−線式を利用できる、もしくはこれ以外にも検体濃度を決定するために補正係数を利用できるソフトウェアまたはファームウェアを備える、蛍光検体測定と共に使うのに適したコンピュータまたはマイクロプロセッサを含むことができる。いくつかの実施形態において、これらのパラメータ値を決めることが可能なモニタが利用できる。
【０２２７】
いくつかの実施形態において、モニタリングシステムは、追加モニタ、リモートディスプレイを含むディスプレイ、テレビ、データ入力場所、コンピュータ、ＰＤＡ、電話、モニタリングステーション、医院、病院など他の装置を含む、ネットワークに組み込まれることができる。ネットワークは、インターネット、ローカルエリアネットワーク、ワイドエリアネットワーク、安全なネットワーク、プライベートネットワークなどを介することができる。
【０２２８】
［特定の種類の検体センサとの使用］
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている較正技術および方法は、上述のように、機能的にアミン、並びにボロン酸、亜ヒ酸およびゲルマニウム酸の誘導体（それらの塩の誘導体を含む）に結合している蛍光体を有するもの、並びにボロン酸、亜ヒ酸およびゲルマニウム酸の誘導体（それらの塩の誘導体を含む）と機能的に結合した蛍光体を有するものなどの、蛍光系検体センサと共に利用できる。特定の実施形態において、蛍光系検体センサは、２つの異なる形態の蛍光体が異なる波長で蛍光発光する場合のような、第２の検体濃度に応じて少なくとも２つの異なる形態で存在する、蛍光体を有することができる。センサは、第１の検体と結合する結合部分も含むことができ、かつ該結合部分は蛍光体に作用可能な状態でカップリングすることができ、第１の検体濃度に関連した蛍光体の見かけの濃度の光学変化を引き起こす。蛍光体は蛍光色素であり得、それは、単体化合物であるか、または、より大きな分子の一部であるような蛍光色素であり得る。蛍光体とし使用可能な典型的な材料は、ＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡおよびＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡを含む。一実施形態において結合部分は、第１の検体を可逆的に結合できる結合部分において、蛍光色素からの蛍光を変えられるまたは除去できる、消光剤を含む。結合部分として使用可能な典型的な材料は、ビオロゲン、ベンジルボロン酸基を含む化合物、およびビオロゲン−ボロン酸付加物を含む化合物を含む。他の実施形態では、結合部分は、３，３’−ｏＢＢＶおよびその誘導体を含む。実施形態は、血液を含む流体中のグルコース濃度測定が可能な、それらの蛍光体系センサを含む。好適なセンサは、米国特許出願第１１／６７１，８８０号および同第１２／０２７，１５８号に記載されているものを含む。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、本明細書で記載されている較正技術および方法が、上記の通り寿命化学に基づく検体センサで利用できる。
【０２３０】
［較正精度］
いくつかの実施形態で較正の目的は、「正しい」と考えられるまたは他の分析と一致する検体測定値を得ることにあまり重きを置かずに、検体濃度に関して信号読み取り値を線形化することであり得る。線形化はもっぱら、経時的な相対値が対象になっている状況を含む様々な状況において、および他の理由でも、有用であり得る。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、較正の目的は、検体濃度の実際値を決定すること、または他のセンサ、方法もしくは計器によってなされた測定値と一致する検体濃度測定値を得ることであり得る。いくつかの好適な実施形態において、較正の目的は、読み取り値を線形化すること、すなわち、存在するまたは存在していると判断された検体の濃度に対してプロットされるときに読み取り値をより線に近づく形に変換すること、および同様に線形化できる他の計器または技術からの読み取り値と関連づけることであり得る。いくつかの好ましい実施形態において、読み取り値は、特定の範囲で線形化することができる、または線形化可能である。異なるセンサ、方法もしくは計器によって得られた測定値（または測定値および正しいと認められる数値）間の一致を正確に測定する１つの方法は、複数の読み取り値（または読み取り値および数値）間のパーセンテージの違い、つまり２つの読み取り値（または読み取り値および数値）の差をそれらの平均で割った値を決定することである。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、特定の範囲内の読み取り値において、その範囲外の読み取り値と比較してそのような一致または精度があることがより望ましい。生理学的パラメータに関して、読み取り値に関する望ましい範囲は、パラメータに関する正常の読み取り値付近の範囲とすることができるが、何が「正常」かは、個々人によって、状況によって、および時間によって、いくらか異なる傾向がある。検体センサに関する較正は非常に広い範囲にわたって行うことができるが、較正は、より限られた範囲にわたって行うこともでき、例えば、正常値または目標値の約５％、１０％、２５％、５０％、１００％、２００％、４００％、もしくは約６００％の範囲内の標準較正溶液を選択することによって行うこともできる。
【０２３３】
［連続グルコースモニタリングシステム］
いくつかの実施形態において、蛍光強度がグルコース濃度に応答して変化する化学センサは、光ファイバに配置することができる。化学センサは、例えばセンサの先端に配置することができるが、その位置は制限されない。光ファイバは１００ミクロン、１５０ミクロン、２００ミクロン、２５０ミクロンまたは３００ミクロンのファイバであってよいが、ファイバのサイズは制限されない。センサは、直径が例えば０．３０、０．４０または０．５５ｍｍ、好ましくは約０．４２ｍｍであり得る。いくつかの実施形態において、センサは、圧力モニタリングに使用される２０Ｇａ橈骨動脈カテーテルなどの、標準動脈センサを介して、図２７に示すように挿入することができる。青色光は、光ファイバを流れてセンサに進んで、センサを励起して緑の蛍光を生じることができ、緑の蛍光はファイバを逆方向に進むことができるが、光の色は制限されない。いくつかの実施形態において、グルコース測定値は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５秒おきに、１２、２４、３６、４８または７２時間にわたって得ることが可能である。いくつかの実施形態において、センサは、任意の毎日の再較正と共に、１つのｉｎ  ｖｉｖｏ基準点を使用して較正することができる。そのうえセンサは、ｐＨおよび／または温度補償に合わせて調整されるように構成することができる。
【０２３４】
センサ化学的組成は、三構成系（レセプタ、消光剤および蛍光体）を使用できる。いくつかの実施形態において、ピラニン系蛍光体、ボロン酸レセプタおよび消光剤複合物が、用いられることができる。グルコースがない場合、消光剤は、蛍光体の蛍光を阻害できる。グルコースがある場合には、消光剤と蛍光色素間の結合は変えられることができ、周囲のグルコースに比例して、例えば青色光により励起されるときに、色素は緑色光を発することができる。ボロン酸レセプタはグルコースと、可逆的非酵素的共有結合を形成でき、レセプタ−消光剤複合体は、グルコース選択性に応じて調整できる。図２８は、三構成系の実施形態を示す。
【０２３５】
ボロン酸系レセプタを使用するセンサは、他の糖類に対する感度を有するように構成することができる。いくつかの実施形態において、レセプタは２つのボロン酸を使用できる。これは、分子構造を変えることができ、フルクトースまたは他の糖類よりもグルコースと結合するという親和性選好を作り出す。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、センサは、改善された平均絶対的相対的差異値を有することができる。その内容全体を参照により本明細書に組み入れるが、非特許文献１８は、皮下に埋め込まれた連続（４８時間）グルコースセンサの性能特性を議論している（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ  Ｍｉｎｉｍｅｄ製「Ｇｕａｒｄｉａｎ  ＲＴ」−グルコースオキシダーゼ電気化学的センサであり、平衡蛍光センサは当時（または現在）利用できなかった）。前記論文で述べられたように（例えば、「統計解析および結果」を参照）、平均絶対的相対的差異（「ＭＡＲＤ」）が、Ｇｕａｒｄｉａｎ  ＲＴと基準動脈値の精度を比較するために用いられた。センサーグルコース値と動脈サンプル間の全体ＭＡＲＤは、１７．６％であった。Ｇｕａｒｄｉａｎ  ＲＴセンサの多くのＭＡＲＤが、１７．６％よりかなり高かったことに注意されたい（センサ１２−ＭＡＲＤ１００．１％、センサ１３−ＭＡＲＤ４３．２％、センサ１４−ＭＡＲＤ５７．９％など）。論文は、Ｇｕａｒｄｉａｎ  ＲＴリアルタイム皮下センサは「血糖濃度［動脈基準値］と比較したとき、臨床的に信頼性が高い測定値を提供した…」と結論づけている。この研究のセンサ読み取り値とラボ血糖値間のＭＡＲＤは１７．６％だったが、他のグループは１６％〜１９％の範囲を報告した（非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１を引用）（ディスカッションの第１文を参照）。非特許文献１９を、その内容全体を参照により本明細書に組み入れる。
【０２３７】
図２９は、動脈内配備の実現可能性を示す、最初の２４時間の臨床試験を示す。示すように、センサは、優れた精度を示す、ＭＡＲＤ値８．９％である。
【０２３８】
図３０は、治療（procedural）および装置の改善を特定する、多施設導入の被験者の試験を示す。治療の改善は、例えば心臓血管外科フォーカスおよびサンプル採取前のマーキング時間を含むことができる。装置の改善は、拡張セット、確保および温度補償を含むことができる。そのうえ示すように、センサは、フィルタリングなしおよび脱落ポイントなしで、予め較正することができる。
【０２３９】
図３１ＡおよびＢは、後処理方法を使用する測定アルゴリズム強化のバックテスティングを示す。図は、４１３のペアポイント（Paired Points）を有する、待機ＣＶ手術後被験者２０人の単一カ所データセットを示す。示すように、図３１ＡのプロスペクティブデータはＩＳＯが８４％およびＭＡＲＤが１２．３％であるが、後処理されたデータはＩＳＯが９２％およびＭＡＲＤが８．０％である。除外されたデータは、光信号シフト（＜１％）、フラッシュ汚染（８％）およびセンサ故障（２％）を含むものであった。使用された方法は、サンプル採取直前にセンサ読み取り値と対になる参照値、および温度およびｐＨ補償のための改善アルゴリズムを使用する再較正を含むものであった。
【０２４０】
図３２ＡおよびＢは、プロスペクティブ評価（prospective validating）の改善を検証する、最近の４８時間臨床試験を示す。図３２Ａは、フィルタリングなしおよび脱落ポイントなしで、予め較正された結果を示す。図３２Ｂは、５分平均および脱落ポイントなしで、予め較正された結果を示す。
【０２４１】
図３３は、５人の異なる被験者による、１カ所４８時間導入試験を示す。下記の表Ｉは、異なる被験者のＭＡＲＤ判定を示す。試験は、フィルタリングなしおよび脱落ポイントなしで、予め較正された。
【表１】
0006534616.tif 000042
【０２４２】
開示されたセンサのいくつかの実施形態において、センサは、迅速な応答時間を備えつつ、真に持続性があり、グルコースに対して高い選択性があり得る。１点較正は、毎日の再較正で使用することができる。そのうえ開示されたセンサは、救命医療環境に適しており、例えばセンサは橈骨動脈カテーテルにより挿入することができ、およびセンサはいくつかの実施形態において小型かつ携帯計器として構成される。
【０２４３】
［臨床試験］
（対数−線形法）
試験は、トマス・ジェファーソン大学において、開示された乾燥挿入およびｉｎ  ｖｉｖｏ較正方法の実施形態で行われた。図３４Ａ〜Ｃは、３人の異なる被験者のテスト結果を示す。示すように、センサは良好なＭＡＲＤ結果を示した。患者８のセンサがＭＡＲＤ７．７％、患者９のセンサがＭＡＲＤ８．５％、患者１０のセンサがＭＡＲＤ８．７％の結果を示した。
【０２４４】
患者８〜１０の試験に使用したセンサは、患者への挿入前に水和されず、ミカエリス−メンテン係数は盛り込まれなかった。
【０２４５】
表ＩＩは、特許文献８および特許文献３７に記載された、ミカエリス−メンテンパラメータと比較して、上記で開示されたＬｎ―線形法の実施形態を使用した試験結果を比較する。なお、特許文献８および特許文献３７は、その両方は全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【表２】
0006534616.tif 000043
【表３】
0006534616.tif 000044
【０２４６】
示すように、特定の前記実施形態で説明したように対数−線形方法を使用することで、ＭＡＲＤ値が３．０％の低さになることがあり得る。さらに、開示されたＬｎ―線形法の実施形態を使用している全体の平均は、全体のＭＡＲＤ平均で約１０．６％である。
【０２４７】
（参照ｐＨのないｐＨ補正）
ランダムに選択された患者ファイルを用いて、上記で開示された参照ｐＨのないｐＨ補正を使用した試験も行われた。全ての変動は、１０ｍｇ／ｄＬ未満である。図３５〜４１は、上記で開示された参照ｐＨのないｐＨ補正の試験結果を示す。例えば図３５は、ｐＨ対温度のグラフを示す。図３６は、温度対グルコース濃度のグラフを示す。図３７および３８はそれぞれ、加重Ｇ２値、およびＧ２とＧ１値の差を示す。図３９は、グルコース濃度対時間を示し、モニタされたグルコースおよび後処理されたグルコースの両方を有する。示すように、ｐＨ参照値を有しない、およびそれを有する、後処理グルコース値は、同程度である。図４０は、異なるｐＨ値を使用した、グルコース濃度対時間を示す。図４１は、試験を受けた患者の未加工信号値を示し、それは最初の熱電対値および加重２０点平均温度を含む。
【０２４８】
上記の説明が、本教示の基本的な新規の特徴を示し、記載し、および指摘しているが、示されたような装置の詳細な形態において、様々な省略、置き換え、および変更が、その用途においてと同様に、本教示の範囲を逸脱せずに、当業者によりなされてもよいことは理解されるだろう。したがって、本教示の範囲は、上記の考察に限定されるべきでなく、添付の特許請求の範囲によって定義されなければならない。
【図１Ａ】
0006534616.tif 000046
【図１Ｂ】
0006534616.tif 000047
【図１Ｃ】
0006534616.tif 000048
【図１Ｄ】
0006534616.tif 000049
【図２Ａ】
0006534616.tif 000050
【図２Ｂ】
0006534616.tif 000051
【図３Ａ】
0006534616.tif 000052
【図３Ｂ】
0006534616.tif 000053
【図４】
0006534616.tif 000054
【図５】
0006534616.tif 000055
【図６】
0006534616.tif 000056
【図７】
0006534616.tif 000057
【図８】
0006534616.tif 000058
【図９】
0006534616.tif 000059
【図１０】
0006534616.tif 000060
【図１１】
0006534616.tif 000061
【図１２】
0006534616.tif 000062
【図１３】
0006534616.tif 000063
【図１４】
0006534616.tif 000064
【図１５】
0006534616.tif 000065
【図１６Ａ】
0006534616.tif 000066
【図１６Ｂ】
0006534616.tif 000067
【図１６Ｃ】
0006534616.tif 000068
【図１７】
0006534616.tif 000069
【図１８】
0006534616.tif 000070
【図１９】
0006534616.tif 000071
【図２０】
0006534616.tif 000072
【図２１】
0006534616.tif 000073
【図２２】
0006534616.tif 000074
【図２３】
0006534616.tif 000075
【図２４】
0006534616.tif 000076
【図２５】
0006534616.tif 000077
【図２６】
0006534616.tif 000078
【図２７】
0006534616.tif 000079
【図２８】
0006534616.tif 000080
【図２９】
0006534616.tif 000081
【図３０】
0006534616.tif 000082
【図３１Ａ】
0006534616.tif 000083
【図３１Ｂ】
0006534616.tif 000084
【図３２Ａ】
0006534616.tif 000085
【図３２Ｂ】
0006534616.tif 000086
【図３３】
0006534616.tif 000087
【図３４Ａ】
0006534616.tif 000088
【図３４Ｂ】
0006534616.tif 000089
【図３４Ｃ】
0006534616.tif 000090
【図３５】
0006534616.tif 000091
【図３６】
0006534616.tif 000092
【図３７】
0006534616.tif 000093
【図３８】
0006534616.tif 000094
【図３９】
0006534616.tif 000095
【図４０】
0006534616.tif 000096
【図４１】
0006534616.tif 000097