(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＰ３３抗体の抗原結合ポケットに結合可能である抗体又はその抗原結合断片であって、それぞれ、配列番号１、配列番号２及び配列番号２３のアミノ酸配列からなるＶＬ ＣＤＲ１（Ｌ１）、ＶＬ ＣＤＲ２（Ｌ２）及びＶＬ ＣＤＲ３（Ｌ３）を含み、かつ、それぞれ、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６のアミノ酸配列からなるＶＨ ＣＤＲ１（Ｈ１）、ＶＨ ＣＤＲ２（Ｈ２）及びＶＨ ＣＤＲ３（Ｈ３）を含む、前記抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
抗体又はその抗原結合断片が、配列番号２０のアミノ酸配列からなるＶＬアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
抗体又はその抗原結合断片が、配列番号２２のアミノ酸配列からなるＶＨアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
抗体又はその抗原結合断片が、配列番号２０のアミノ酸配列からなるＶＬアミノ酸配列を含み、抗体又はその抗原結合断片が、配列番号２２のアミノ酸配列からなるＶＨアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
その抗原結合断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｒＩｇＧ及びダイアボディーからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
その抗原結合断片が、ｓｃＦｖであり、前記ｓｃＦｖが、配列番号１１又は配列番号１２又は配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項８】
配列番号１９及び配列番号２１のヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
請求項７又は８に記載のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項１０】
請求項７又は８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１１】
重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードする核酸と作動可能に連結している発現制御配列をさらに含む、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
細胞が真核細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
真核細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞である、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
抗体又はその抗原結合断片を製造する方法であって、コードされる重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインが、請求項１２〜１４のいずれかに記載の宿主細胞によって発現されるように、前記細胞をインキュベートすること、並びに発現された前記抗体又はその抗原結合断片を回収することを含む、前記方法。
【請求項１６】
回収された抗体又はその抗原結合断片を単離すること、及び／又は精製することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含む組成物。
【請求項１８】
担体タンパク質をさらに含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
担体タンパク質が、破傷風トキソイド及びＣＲＭ１９７変異体ジフテリア毒素からなる群から選択される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
アジュバントをさらに含む、請求項１７〜１９のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
ヒトにおいて使用するために製剤化された、請求項１７〜２０のいずれかに記載の組成物。
【請求項２２】
哺乳動物において、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質に対する免疫応答を誘導可能であり、かつ、ＡＰ３３抗体の抗原結合ポケットに結合可能である抗体又はその抗原結合断片であって、それぞれ、配列番号１、配列番号２及び配列番号２３のアミノ酸配列からなるＶＬ ＣＤＲ１（Ｌ１）、ＶＬ ＣＤＲ２（Ｌ２）及びＶＬ ＣＤＲ３（Ｌ３）を含み、かつ、それぞれ、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６のアミノ酸配列からなるＶＨ ＣＤＲ１（Ｈ１）、ＶＨ ＣＤＲ２（Ｈ２）及びＶＨ ＣＤＲ３（Ｈ３）を含む、前記抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２３】
請求項１〜６及び２２のいずれかに記載の抗体若しくはその抗原結合断片、請求項７〜９のいずれかに記載の核酸、請求項１０若しくは１１に記載のベクター、又は請求項１７〜２１のいずれかに記載の組成物を含む、哺乳動物における、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質に対する免疫応答の誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ２タンパク質に対する免疫応答を生じさせることができる抗体又はその断片に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝硬変及び肝臓がんの主因であるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による感染から保護するワクチンが緊急に必要である。現在このようなワクチンは存在せず、ＨＣＶ感染は、主要な世界的な公衆衛生問題である。ワクチン開発における障害の１つは、ウイルスエンベロープ糖タンパク質の遺伝的多様性が高いことである。
【０００３】
ＨＣＶワクチン開発は、エンベロープ糖タンパク質の遺伝的多様性が高いこと、及びその内部に免疫優性の超可変領域が存在することによって阻まれてきた。保護抗体を誘発するためには、免疫応答は、保存された、機能的に重要な領域に対して集中している必要がある。したがって、広域中和抗体（ｂｎＡｂ）のエピトープは、ワクチン設計のための魅力的な手がかりである。
【０００４】
１つのこのようなｂｎＡｂとして、公知の抗体ＡＰ３３があり、これは、ＨＣＶ  Ｅ２エンベロープ糖タンパク質上の保存された線状エピトープ（残基４１２〜４２３）と結合し、ＨＣＶのすべての遺伝子型を強力に中和する。
【０００５】
ＨＣＶ  Ｅ２の残基４１２〜４２３にまたがるＡＰ３３エピトープは、線状であり、高度に保存されており、ＣＤ８１認識において重要な役割を果たすトリプトファン残基を包含する。抗体は、すべての主要な遺伝子型にわたってＨＣＶを中和可能であるとわかっている。このようなエピトープを模倣し、ＡＰ３３様抗体を誘発し得る免疫原の合理的開発は、ウイルス糖タンパク質に使用可能である詳細な構造情報がないことを含めた当技術分野におけるさまざまな因子によって妨げられてきた。さらに、エピトープに相当するペプチドを用いるワクチン接種は、Ｅ２を認識する抗体を誘発しなかった。
【０００６】
Ｅ２を認識する抗体を誘発することが、当技術分野における問題である。
【０００７】
本発明は、先行技術と関連している問題を克服しようとする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の広域中和抗体の作製は、当技術分野において問題であった。ＨＣＶ  Ｅ２の重要なエピトープに相当するペプチド（Ｅ２の残基４１２〜４２３）を用いた免疫などの従来のアプローチは、Ｅ２を認識する抗体を誘発できなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、Ｅ２ペプチド免疫に基づく従来のアプローチを拒否した。本発明者は、代わりに、抗イディオタイプアプローチを進めた。より詳しくは、本発明者らは、確立されたＡＰ３３広域中和抗体に対する抗イディオタイプ抗体を作製した。本発明者らが、注目に値する特性を有するＢ２．１Ａ抗イディオタイプ抗体を得ることを可能にする革新的な選択技術を設計するために、ＡＰ３３抗体のエピトープ結合ポケットの構造解析から得た洞察を適用するまで、このアプローチでも、最初は失敗した。
【００１０】
本発明は、Ｂ２．１Ａ抗体及びその独特の特徴に基づいている。
【００１１】
したがって、一態様では、本発明は、ＡＰ３３抗体の抗原結合ポケットに結合可能である抗体又はその抗原結合断片を提供し、前記抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ、配列番号１、配列番号２及び配列番号２３のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ１（Ｌ１）、ＶＬ  ＣＤＲ２（Ｌ２）及びＶＬ  ＣＤＲ３（Ｌ３）を含み、それぞれ、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１（Ｈ１）、ＶＨ  ＣＤＲ２（Ｈ２）及びＶＨ  ＣＤＲ３（Ｈ３）を含む。
【００１２】
適宜、前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２０のアミノ酸配列からなるＶＬアミノ酸配列を含む。
【００１３】
適宜、前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２２のアミノ酸配列からなるＶＨアミノ酸配列を含む。
【００１４】
適宜、前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２０のアミノ酸配列からなるＶＬアミノ酸配列を含み、前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２２のアミノ酸配列からなるＶＨアミノ酸配列を含む。
【００１５】
別の態様では、本発明は、上記の抗体又はその抗原結合断片に関し、その抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｒＩｇＧ及びダイアボディーからなる群から選択される。
【００１６】
適宜、前記抗原結合断片は、ｓｃＦｖであり、前記ｓｃＦｖは、配列番号１１又は配列番号１２又は配列番号１３のアミノ酸配列を含む。
【００１７】
別の態様では、本発明は、上記の抗体又は抗原結合断片の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
【００１８】
適宜、核酸は、配列番号１９及び配列番号２１からなる群から選択される１種又は２種以上のヌクレオチド配列を含む。
【００１９】
別の態様では、本発明は、上記のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、上記の核酸を含むベクターに関する。
【００２１】
適宜、ベクターは、重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードする核酸と作動可能に連結している発現制御配列をさらに含む。
【００２２】
別の態様では、本発明は、上記のベクターを含有する宿主細胞に関する。
【００２３】
適宜、細胞は、真核細胞である。
【００２４】
適宜、真核細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞である。
【００２５】
別の態様では、本発明は、コードされる重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインが宿主細胞によって発現されるように、上記の宿主細胞をインキュベートすること及び発現された抗体又はその抗原結合断片を回収することを含む、抗体又はその抗原結合断片を製造する方法に関する。
【００２６】
適宜、方法は、回収された抗体又はその抗原結合断片を単離すること及び／又は精製することをさらに含む。
【００２７】
別の態様では、本発明は、上記の抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む組成物に関する。
【００２８】
別の態様では、本発明は、担体タンパク質をさらに含む上記の組成物に関し、担体タンパク質は、好ましくは、破傷風トキソイド及びＣＲＭ１９７変異体ジフテリア毒素からなる群から選択される。
【００２９】
適宜、前記組成物は、アジュバントをさらに含む。
【００３０】
別の態様では、本発明は、ヒトにおいて使用するために製剤化された上記の組成物に関する。
【００３１】
別の態様では、本発明は、哺乳動物において、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質に対する免疫応答を誘導可能である抗体又はその抗原結合断片に関し、前記抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナルＡＰ３３抗体の抗原結合ポケットに結合可能である。
【００３２】
別の態様では、本発明は、哺乳動物において、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質に対する免疫応答を誘導可能な抗体又はその抗原結合断片に関し、前記抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ、配列番号１、配列番号２及び配列番号２３のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ１（Ｌ１）、ＶＬ  ＣＤＲ２（Ｌ２）及びＶＬ  ＣＤＲ３（Ｌ３）を含み、かつ、それぞれ、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１（Ｈ１）、ＶＨ  ＣＤＲ２（Ｈ２）及びＶＨ  ＣＤＲ３（Ｈ３）を含む。
【００３３】
別の態様では、本発明は、ＡＰ３３抗体と結合可能な抗体又はその抗原結合断片に関し、前記抗体又はその抗原結合断片は、ＡＰ３３抗体とのその結合の５０％未満の、ＡＰ３３抗体変異体ＦＬ３２Ａ、ＮＬ９１Ａ、ＷＬ９６Ａ、ＹＨ３３Ａ、ＹＨ５０Ａ、ＹＨ５８Ａ、ＩＨ９５Ａ及びＹＨ１００Ａとの結合を示す。
【００３４】
別の態様では、本発明は、ＡＰ３３抗体又はその断片ではない上記の抗体又はその抗原結合断片と結合する抗体に関する。
【００３５】
適宜、前記抗体は、上記の抗体又はその抗原結合断片を用いた哺乳動物の免疫によって得られる。
【００３６】
別の態様では、本発明は、哺乳動物においてＣ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質に対する免疫応答を誘導する方法に関し、方法は、前記哺乳動物に、上記の抗体、上記の核酸、上記のベクター又は上記の組成物を投与することを含む。
【００３７】
別の態様では、本発明は、哺乳動物において、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質に対する免疫応答を誘導するための、上記の抗体、上記の核酸、上記のベクター又は上記の組成物に関する。
【００３８】
一態様では、本発明は、ＨＣＶに対する免疫のための組成物の製造において使用するための、上記の抗体、核酸、ベクター又は組成物に関する。
【００３９】
一態様では、本発明は、哺乳動物においてＣ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質に対する免疫応答を誘導するための、上記の抗体、核酸、ベクター又は組成物に関する。
【００４０】
適宜、誘導される前記免疫応答は、体液性又は抗体免疫応答である。適宜、誘導される前記抗体は、ＨＣＶ  Ｅ２と結合し、適宜、結合は、４１２〜４２３  ＡＰ３３エピトープにおけるものである。適宜、誘導される抗体は、ＨＣＶ粒子と結合する。適宜、誘導される抗体は、中和抗体である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
ＨＣＶ  Ｅ２  ４１２〜４２３エピトープの３次元結合表面を正しく表す分子を得るために、本発明者らは、抗イディオタイプアプローチを進めた。
【００４２】
マウスを、ＡＰ３３（Ａｂ１）を用いて免疫して、多数の抗イディオタイプ（Ａｂ２）モノクローナル抗体を作製し、そのすべては、ＡＰ３３−Ｅ２結合を強力に阻害できた。そのペプチドエピトープと複合体を形成したＡＰ３３  Ｆａｂの結晶構造は、どのアミノ酸残基が抗原結合ポケットを含むかを示す。これらをアラニンと個々に置換することによって、本発明者らは、Ｅ２結合にどの残基が必要であるかを正確に確立した。次いで、ＡＰ３３変異体を使用して、Ａｂ２間を区別した。このスクリーニングによって、Ｅ２のものと極めて同様の結合プロファイルを有するＡｂ２を１つ同定した。
【００４３】
マウスにおいて免疫原として使用される場合には、このＡｂ２は、ＡＰ３３と同一エピトープ及びその中の同一残基を認識するＡｂ３抗体を誘導した。Ｅ２のＡｂ３抗体の親和性は、ＡＰ３３のものと同様であり、それらは、ＡＰ３３のものの約２倍であるＩＣ５０で細胞培養物感染性ＨＣＶの感染力を中和する。
【００４４】
一態様では、本発明のポリペプチドは、Ｂ２．１Ａ  ＩｇＧ分子を含む。
【００４５】
Ｂ２．１Ａ  ＩｇＧ分子は、適宜、Ｂ２．１ＡのＣＤＲ、例えば、配列番号１、２、２３、２４、２５及び２６に示されるようなＣＤＲのアミノ酸配列を含むＩｇＧ分子である。
【００４６】
適宜、本発明のポリペプチドは、Ｂ２．１Ａ  ＩｇＧ  のＦａｂ断片である。本発明者は、驚くべきことに、Ｂ２．１Ａ抗体のＦａｂ断片は、実際、親抗体自体よりも良好に実施することを発見した。さらに、Ｆａｂ断片は、より小さく、操作するのが容易である。さらに、抗原認識に必要ではない配列を除去することによって、Ｆａｂ断片は、レシピエントの免疫システムにとってより少ない不適切な配列を提示し、したがって、免疫のための効率的な抗原を提供する。
【００４７】
適宜、本発明のポリペプチドは、Ｂ２．１Ａ抗体配列に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり得る。これは、抗原結合活性を保持しながら最小のあり得る大きさであるという利点を有する。ｓｃＦｖはまた、組換え手段によって製造するのに安価であり、効率的であり得る。
【００４８】
本発明のポリペプチド又は抗体若しくはその抗原結合断片は、公知の形態のいずれかをとり得る。例えば、ポリペプチドは、ＩｇＧを含み得る。例えば、ポリペプチドは、Ｆ（ａｂ’）２を含み得る。例えば、ポリペプチドは、Ｆａｂ’を含み得る。例えば、ポリペプチドは、Ｆａｂを含み得る。例えば、ポリペプチドは、Ｆｖを含み得る。例えば、ポリペプチドは、ｒＩｇＧを含み得る。
【００４９】
当業者ならば、その選択及び／又は所望の適用に従って、これらの又は任意の他の抗体変異体を作製できる。これらの及び任意の他の抗体変異体各々の製造は、本明細書において提供されるＢ２．１Ａ抗体の可変領域のアミノ酸配列、特に、ＣＤＲの正確な配列によって可能にされる。例えば、ＩｇＧを製造するために、ＣＤＲなどの可変領域配列（すなわち、ＣＤＲ又はより大きな可変領域をコードするヌクレオチド配列）が、標準重鎖／軽鎖発現ベクター中に挿入され得る。
【００５０】
例えば、Ｂ２．１Ａ抗体鎖は、本明細書において開示されるようなＢ２．１ＡのＣＤＲを組み込んでいる従来の抗体発現システムを使用して製造され得る。適宜、5, rue Jean Rodier, F-31400 Toulouse, France のInvivoGen社から市販されている「抗体作製」システムなどの従来の発現システムが使用され得る。
【００５１】
このベクターは、次いで、任意の適した宿主細胞中にトランスフェクトされ得る。適宜、宿主細胞は、哺乳動物などの真核細胞である。例えば、適した宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ細胞又は任意の他の適した細胞株を含み得る。トランスフェクション後、宿主細胞は、抗体鎖の発現を可能にするようにインキュベートされる。これらは、例えば、細胞がインキュベートされる上清から回収されたものである。
【００５２】
その上清からの抗体鎖の精製が実施され得る。
【００５３】
精製は、クロマトグラフィー、例えば、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、ペプチドＭなど）といった任意の公知の手段又は当技術分野で公知の任意の他の適した手段によってであり得る。
【００５４】
したがって、全ＩｇＧが望まれる場合には、発現ベクターは、全ＩｇＧの鎖を発現するように選択される。そのＩｇＧからＦａｂ断片を製造することが望まれる場合には、そのＦａｂを作製するために、パパイン消化、ペプシン消化又はフィシン消化などの当技術分野で公知の任意の標準法が使用され得る。最も適当には、Ｆａｂを作製するためにＩｇＧのパパイン消化が使用される。
【００５５】
例えば、3747 N Meridian Rd, Rockford, IL 61101, USA のThermoScientific（ThermoFisher Scientific）社としても知られるPierce（Pierce Protein Biology Products）社などの市販の試薬を使用する抗体断片化による抗体又はその抗原結合断片の作製は、当技術分野で周知である。
【００５６】
適宜、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ヒトにおいて使用するのに適している担体とともに投与され得、それとともに組成物に製剤化され得る。
【００５７】
適宜、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ヒトにおいて使用するのに適しているアジュバントとともに投与され得、それとともに組成物に製剤化され得る。
【００５８】
ミョウバンは、ヒトワクチン接種において最もよく使用されるアジュバントである。ジフテリア−破傷風−百日咳、ヒトパピローマウイルス及び肝炎ワクチンを含む多数のワクチンにおいて見られる。ミョウバンは、強力なＴｈ２反応を引き起こす。適宜、アジュバントは、ミョウバンを含む。適宜、ミョウバンは、湿潤ゲル懸濁液の形態などの水酸化アルミニウムを意味する。
【００５９】
アジュバントは、適宜、Ｔｈ１及びＴｈ２反応の両方を誘導する。
【００６０】
アジュバントに関するさらなるガイダンスは、ヒト使用のための医薬品のための欧州医薬品庁（ＥＭＥＡ，European Medicines Agency）の委員会によって提供されている。特に、ヒト使用のためのワクチン中のアジュバントに関するそれらのガイドライン文書が参照され、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【００６１】
適宜、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ヒトにおける使用に適している製剤として投与され得る、又は提供され得る。
【００６２】
公知の担体タンパク質として、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、フェリチン又はルミナーゼ（luminaze）シンターゼなどの自己組織化担体タンパク質が挙げられる。ヒトワクチンなどの組成物において一般的に使用される多数の担体タンパク質があり、適宜、担体タンパク質は、破傷風トキソイド又はＣＲＭ  １９７変異体ジフテリア毒素である。当業者には明らかであろうが、これらは、それ自体で、それぞれ破傷風及びジフテリアに対するワクチンである。それらはまた、それ自体では不十分にしか免疫原性ではない細菌多糖などの分子の免疫原性担体タンパク質として有効である。
【００６３】
原則として、承認されたヒトワクチンにおいて使用される任意のタンパク質分子は、適した担体であり得る。担体の選択は、当業者によって行われ、実験によって及び／又は臨床治験によって確認され得る。
【００６４】
同一原則が、適したアジュバントに当てはまる。多数の候補アジュバント及び特に、製薬産業内でのより良好なヒトアジュバントへの現在進行中の研究があるが、ヒト使用のために承認されたアジュバントは、限られた数しかない。原則として、ヒトワクチンにおいて使用するために承認された任意のアジュバントが適したものであり得る。アジュバントの選択は、当業者によって行われ、実験によって及び／又は臨床治験によって確認され得る。
【００６５】
同一原則が、適したワクチン接種レジメンに当てはまる。適宜、抗体又はその断片（又は核酸若しくはベクター若しくは組成物）の第１の投与が提供される。これは、一次（又は「プライム」）注射と呼ばれ得る。これは、０日目である。例えば、抗体力価によって測定されるような免疫応答は、哺乳動物では、一次注射後２週間、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、１年で又はそれを超えて、抗体又はその断片（又は核酸若しくはベクター若しくは組成物）の１回若しくは２回以上のさらなる又は追加免疫注射を提供することによって維持又は増強され得る（「追加免疫され得る」）。一次及びさらなる又は追加免疫注射は、同一である必要はない。担体タンパク質は、変わってもよい、又は核酸は、操作者が選択するようにペプチド成分と交替してもよいなど、製剤は、注射間で異なり得る。
【００６６】
同一原則が、適した製剤に当てはまる。原則として、ヒトワクチンにおいて使用するのに適した任意の製剤が使用され得る。製剤の選択は、当業者によって行われ、実験によって及び／又は臨床治験によって確認され得る。
【００６７】
組成物は、医薬組成物であり得る。
【００６８】
組成物は、適宜、本明細書において記載されるようなＢ２．１Ａ抗体又はその断片などの抗体に対する免疫応答を作製するのに適した組成物である。
【００６９】
適宜、誘導される前記免疫応答は、体液性又は抗体免疫応答である。適宜、誘導される前記抗体は、ＨＣＶ  Ｅ２と結合し、適宜、結合は、４１２〜４２３  ＡＰ３３エピトープで、である。適宜、誘導される抗体は、ＨＣＶ粒子と結合する。適宜、誘導される抗体は、中和抗体である。
【００７０】
適宜、組成物は、ワクチン組成物、適宜、ヒトにおいて使用するためのワクチン組成物である。適宜、誘導される抗体は、ＨＣＶ感染に対して保護性である。
【００７１】
本発明において有用な医薬組成物は、対象において免疫応答を誘導するのに有効な抗体又はその断片の量及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤（それらの組合せを含む）を含み得る。
【００７２】
医薬組成物は、ヒト医学及び獣医学におけるヒト又は動物使用のためであり得、通常、任意の１種又は２種以上の薬学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤を含む。治療的使用のための許容される担体又は希釈剤は、製薬の技術分野において周知であり、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. （A. R. Gennaro edit. 1985）に記載されている。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントにとって非毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化物質；保存料（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリドなど；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール；メチル若しくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；オリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン若しくはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖及びグルコース、マンノース若しくはデキストリンを含むその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；並びに／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【００７３】
医薬担体、賦形剤又は希釈剤の選択は、意図される投与経路及び標準的薬学のプラクティスに関して選択され得る。医薬組成物は、担体、賦形剤又は希釈剤として、又はそれに加えて、任意の適した結合剤、滑沢剤、沈殿防止剤、コーティング剤又は可溶化剤を含み得る。
【００７４】
保存料、安定化剤、色素及びさらには香味剤が、医薬組成物中に提供され得る。保存料の例として、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。抗酸化物質及び懸濁剤もまた使用され得る。
【００７５】
異なる送達システムに応じて、異なる組成物／製剤必要条件があり得る。例として、本発明において有用な医薬組成物は、例えば、吸入又は摂取可能な溶液の鼻腔スプレー又はエアゾールとしてミニポンプを使用して又は粘膜経路によって投与されるように、又は組成物が、例えば、静脈内、筋肉内若しくは皮下経路による送達のための注射用形態によって製剤化される非経口的に投与されるように製剤化され得る。或いは、製剤は、多数の経路によって投与されるように設計され得る。最も適当には、製剤は、皮下に又は筋肉内になど、免疫応答を誘導するのに有効な経路による注射によって投与されるように設計される。
【００７６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用されるべき製剤は、無菌でなくてはならない。これは、滅菌濾過メンブレンを通す濾過によって容易に達成される。
【００７７】
抗体又はその断片は、治療されている対象においてｉｎ  ｓｉｔｕでさらに調製され得る。この点において、前記抗体又はその断片をコードするヌクレオチド配列は、前記タンパク質が、前記ヌクレオチド配列から発現されるように、非ウイルス技術（例えば、リポソームの使用によって）及び／又はウイルス技術（例えば、レトロウイルスベクターの使用によって）の使用によって送達され得る。
【００７８】
医薬組成物は、本明細書において記載される方法のいずれかにおいて使用され得る。
【００７９】
医薬組成物は、ＨＣＶによる感染に対して感受性のそれらの対象（例えば、ヒト）の間で、すなわち、ＨＣＶに対する免疫反応を誘導することなどによって、ＨＣＶ感染の発症を防ぐ又は低減／減少させるために使用され得る。
【００８０】
医薬組成物は、すでにＨＣＶに感染したそれらの対象（例えば、ヒト）の間で、すなわち、ＨＣＶ感染を治療するために使用され得る。このような治療は、肝臓移植を受けている感染患者を含む、急性又は慢性に感染しているそれらの対象から、ウイルスのクリアランスを促進し得る。
【００８１】
したがって、さらなる態様において、本発明は、抗体若しくは抗体断片又は医薬組成物の使用を含む、Ｃ型肝炎ウイルス感染を治療及び／又は予防する方法を提供する。適宜、有効量の抗体若しくはその断片又は医薬組成物は、免疫応答を誘導するために対象に投与される。
【００８２】
対象においてＣ型肝炎ウイルス感染の治療及び／又は予防において使用するための抗体若しくはその断片又は医薬組成物も提供される。
【００８３】
好ましくは、投与された抗体／その断片は、実質的に精製されている（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判断されるように、好ましくは、少なくとも９５％の均一性、より好ましくは、少なくとも９７％の均一性、及び最も好ましくは、少なくとも９８％の均一性）。
【００８４】
本発明の能動免疫獲得法は、コンセンサスペプチドエピトープＥ２の４１２〜４２３のものに対していくつかのアミノ酸相違を含有する非常に稀な変異体単離株を除いて、さまざまなＨＣＶ遺伝子型の範囲のウイルス、より適切には、ＨＣＶの遺伝子型１〜６のいずれかによる感染に対する個体の保護又は治療を可能にするはずである。
【００８５】
上記で概説されるような標準抗体発現システムの構築及び操作は、十分に、当業の読者の範囲内である。このようなシステムは、広く市販されており、所望のＣＤＲを有する抗体分子を製造するためのルーチンの手法として使用される。
【００８６】
一態様では、本発明のポリペプチドは、Ｂ２．１Ａ抗体の少なくとも６つのＣＤＲを含むポリペプチドである。
【００８７】
特に断りのない限り、本明細書におけるヌクレオチド及び／又はアミノ酸番号付けのすべての考察は、通常の慣習に従う。ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列の番号付けは、野生型版又は文脈から明らかな版の番号付けに従う。抗体ポリペプチド／残基／変異体などの番号付けは、確立されたKabat番号付け（Kabat EA、Wu TT、Perry HM、Gottesman KS、Foeller C. 1991. Sequences of proteins of immunological interest、5th ed. U.S. Department of Health and Human Services/NIH、Bethesda、MD.）に従う。
【００８８】
本発明のポリペプチドは、担体ポリペプチド、スキャフォールドポリペプチド又は任意の他のポリペプチドなどの別のポリペプチドに融合され得る。
【００８９】
Ｂ２．１Ａ  のＦａｂ断片は、Ｂ２．１ＡのｓｃＦｖよりも良好に実施したことはさらに驚くべきことである。Ｂ２．１ＡのＦａｂ断片は、特に、Ｆａｂ断片は、その二価を失っているが、その性能に悪影響を及ぼすと思われなかったので、非常にうまく実施したことはさらに驚くべきことである。
【００９０】
本発明者らは、Ｂ２．１Ａの選択において普通ではないアプローチをとった。最初に、標的抗体（ＡＰ３３）を用いた免疫、及び抗ＡＰ３３抗イディオタイプ血清の作製の従来のアプローチを試みた。しかし、それらの血清は、繰り返し失敗した。この問題に対処するために、本発明者らは、その標的、線状Ｅ２ペプチドと複合体形成しているＡＰ３３の結晶構造を研究した。この結晶構造に基づいて、本発明者らは、ＡＰ３３抗体上の１５の異なる注意深く選択した部位でアラニン変異体を作製した。このようにして、本発明者らは、ＡＰ３３に厳密に基づいた、各々、重要な抗原結合ポケット中に別個の単一アラニン変異を有する１５種の変異抗体のパネルを作製した。本発明者らは、これらのＡＰ３３変異体のＥ２ポリペプチドとの結合を試験した。本発明者らは、これらの注意深く選択した部位の各々での単一変異は、ＡＰ３３変異体の、Ｅ２ポリペプチド上のＡＰ３３エピトープとの結合を抑止するのに十分であることを見出した。本発明者らは、卓越した新規アプローチにおいて、次いで、変異体抗体のこのパネルを取り上げ、ＡＰ３３を用いた免疫によって生じた候補抗イディオタイプ抗体のパネルとのその結合を解析した。この解析から得られた結果は、非常に多様であった。研究した抗イディオタイプ抗体のすべてが、ＡＰ３３とのＥ２結合を阻害した。しかし、抗イディオタイプ抗体は、１５種の変異体ＡＰ３３抗体のパネルとのその結合が非常に多様であった。本発明者らは、抗イディオタイプ候補抗体の、１５種のアラニン変異体ＡＰ３３抗体との結合の注意深い解析によって、卓越したＢ２．１Ａ抗イディオタイプ抗体を選択することができた。これは、個々のアラニン変異ＡＰ３３変異体抗体の各々によって負の影響を受けた結合を示した、解析における唯一の抗イディオタイプ抗体であった。この特筆すべき結果は、表１に示されている。ＡＰ３３軽鎖及び重鎖中の重要な変異残基は、表の「Ｅ２」横列において強調されている。これらは、Ｅ２との結合を９０％超低減する８種のアラニン置換に相当する。したがって、これらの残基は、ＡＰ３３−Ｅ２相互作用にとって重要であると考えられる。「Ｂ２．１Ａ」と題された横列に見られるように、この抗イディオタイプ抗体はまた、重要な残基に置換を有するＡＰ３３アラニン変異体の各々との大幅に低減した結合を示した。際立って対照的に、表１に示される他の候補抗イディオタイプ抗体のすべては、重要な残基にアラニン置換を有するＡＰ３３由来抗体のうち少なくとも１種との高レベルの結合を維持した。例えば、Ｌ１．１Ａは、Ｎ９１Ａ  ＡＰ３３変異体抗体とでさえ８５％の結合を示す。したがって、Ｂ２．１Ａは、ＡＰ３３−Ｅ２相互作用について、重要な残基にアラニン置換を有するＡＰ３３変異体抗体のすべてに対して低下した結合のパターンを示した点で、解析した候補抗イディオタイプ抗体のすべての中で独特であった。これを、本発明者らは、その３次元構造が、Ｅ２ポリペプチド自体の重要なエピトープの３次元構造を最も厳密に模倣している抗イディオタイプ抗体を作製したことの、考え得る限り最も強い証拠と解釈した。
【００９１】
これらのすべての理由で、Ｂ２．１Ａ抗体は、予測され得ず、任意の他の公知の抗体によって、また本発明者によって研究された任意の他の候補抗体によっても示されない、独特の、価値ある特徴を有することは明確である。
【００９２】
より従来型のアプローチは、候補抗イディオタイプ抗体のすべてを使用して免疫することであった可能性がある。Ｅ２を認識する抗体を示す得られた血清（抗Ａｂ２又は抗（抗イディオタイプ）血清）が、次いで、選択される。しかし、本発明者らがこのアプローチに従った場合には、彼らは、問題のある割合の失敗を経験した。実際、本発明者らは、２５種の候補抗Ａｂ２血清についてこれを行った。抗Ａｂ２血清は、ＡＰ３３のＥ２との結合の阻害を示したが（それらが抗Ａｂ２抗体を含有していたことを示す）、抗Ａｂ２血清は、Ｅ２と結合せず、細胞培養においてＨＣＶを阻害しなかった。したがって、本発明者らは、上記のようにそれらのアプローチを再考した。
【００９３】
例示／比較目的で、失敗した血清結果の選択が、比較例に示されている（以下を参照のこと）。
【００９４】
注目すべきは、Ｂ２．１Ａ抗体は、製造することが極めて難しいということである。例えば、上記のように、本発明者らは、最初にＡＰ３３抗体を用いた免疫によって生じた２５種の別個の免疫血清を使用して、この抗体を得ようとした。上記で説明されるように、それらのうち、Ｂ２．１Ａの特徴を有する成功した抗イディオタイプ抗体をもたらしたものはない。さらに、４１２〜４２３  Ｅ２抗原を含むペプチドなどのＥ２ペプチドを用いた免疫によって抗ＨＣＶ  Ｅ２  ４１２〜４２３抗体を誘導する先の試みは、不成功であった。成功した免疫原性抗イディオタイプ抗体を作製するためのこれらの頑強な試みを考慮して、予測は、このような抗体は製造され得ないということであった。しかし、この明確な科学的状況を前にしても、本発明者らは、本明細書において記載されるような長期間の困難な研究にわたって適応し、進歩することができた。結果は、その配列、特に、ＣＤＲの及び／又はＶＬ鎖の及び／又はＶＨ鎖の独特の新規配列の点で構造的に新規であり、また、産業上の利用／有用性の影響を受けやすいものにする両方で、有益であり、特筆すべき、独特の特徴を提供するＢ２．１Ａ抗体であった。これらの特性を、以下により詳細に論じる。
【００９５】
より詳しくは、本発明者らは、広域中和ＡＰ３３抗体と、Ｅ２の残基４１２〜４２３のその標的エピトープとの間の重要な結合特徴を複製可能である抗体を製造できたという事実は、予期せぬ、極めて価値のある成果である。
【００９６】
Ｅ２及び抗イディオタイプ抗体の、野生型及び変異体ＡＰ３３に対する、結合特性を示す表１を参照して、「高い」結合は、野生型ＡＰ３３に対するＥ２の結合の５０％又はそれを超えるスコアでの、ＡＰ３３変異体に対する試験ポリペプチドの結合を意味する。特に、考慮流の重要な変異体は、ＦＬ３２Ａ、ＮＬ９１Ａ、ＷＬ９６Ａ；ＹＨ３３Ａ、ＹＨ５０Ａ、ＹＨ５８Ａ、ＩＨ９５Ａ及びＹＨ１００Ａである。
【００９７】
抗体
抗体は、すべて免疫グロブリンフォールディングに基づいて変動する構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子である。例えば、ＡＰ３３などのＩｇＧ抗体は、２つの「重」鎖及び２つの「軽」鎖を有し、これらはジスルフィド結合されて機能的抗体を形成する。各重鎖及び軽鎖はそれ自体が、「定常」（Ｃ）及び「可変」（Ｖ）領域を含む。Ｖ領域は、抗体の抗原結合特異性を決定するが、Ｃ領域は、構造的支持体及び免疫エフェクターとの非抗原特異的相互作用における機能を提供する。抗体又は抗体の抗原結合断片の抗原結合特異性は、抗体又はその断片の、特定の抗原と特異的に結合する能力である。
【００９８】
抗体の抗原結合特異性は、Ｖ領域の構造的特徴によって決定される。可変性は、可変ドメインの１１０個のアミノ酸の長さにわたって均一に分配されるわけではない。そうではなく、Ｖ領域は、各９〜１２個のアミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる極度に可変性のより短い領域によって分けられている１５〜３０個のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる相対的に不変のストレッチからなる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、β−シート構造をつなげる、いくつかの場合には、その一部を形成するループを形成する３つの超可変領域によってつながっている、大部分がβ−シート立体配置をとる４つのＦＲを含む。各鎖中の超可変領域は、ＦＲによって極近接してまとまっており、他の鎖に由来する超可変領域は、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. （1991）を参照のこと）。定常ドメインは、抗体の抗原との結合には直接関与しないが、抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）における抗体の参加などの種々のエフェクター機能を示す。
【００９９】
いくつかの実施形態では、超可変領域は、抗原結合に関与している抗体のアミノ酸残基である。超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基（例えば、ＶＬ中のおよそ残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）及び８９〜９７（Ｌ３）並びにＶＨ中のおよそ３１〜３５Ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）及び９５〜１０２（Ｈ３）（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. （1991））及び／又は「超可変ループ」に由来するそれらの残基（例えば、ＶＬ中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）及び９１〜９６（Ｌ３）並びにＶＨ中の２６〜３２（Ｈ１）、５２Ａ〜５５（Ｈ２）及び９６〜１０１（Ｈ３）（Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 （1987））を含み得る。
【０１００】
各Ｖ領域は、通常、３つの相補性決定領域（その各々が、「超可変ループ」を含有する「ＣＤＲ」）及び４つのフレームワーク領域を含む。したがって、抗体結合部位、特定の所望の抗原に相当な親和性で結合するのに必要な最小構造単位は、通常、３つのＣＤＲ及び適当な立体配置でＣＤＲを保持し、提示するように間に散在された少なくとも３つの、好ましくは、４つのフレームワーク領域を含む。ＡＰ３３などの古典的な四本鎖抗体は、ＶＨ及びＶＬドメインによって協力して定義される抗原結合部位を有する。ラクダ及びサメ抗体などの特定の抗体は、軽鎖を欠き、重鎖のみによって形成される結合部位に頼る。結合部位が、ＶＨとＶＬとの間の協力の不在下で重鎖又は軽鎖単独で形成される、単一ドメイン遺伝子操作された免疫グロブリンを調製できる。
【０１０１】
本明細書及び特許請求の範囲を通じて、特に断りのない限り、免疫グロブリン重鎖の定常ドメイン中の残基の番号付けは、参照により明確に組み込まれる、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. （1991）におけるようなＥＵインデックスのものである。「KabatにおけるようなＥＵインデックス」とは、ヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。Ｖ領域中の残基は、順次又は他の番号付けシステムが具体的に示されない限り、Kabat番号付けに従って番号付けられる。
【０１０２】
本明細書において記載される抗体又は抗体断片は、任意の程度に単離又は精製され得る。本明細書において、「単離された」とは、抗体又は抗体断片が、その天然環境から取り出されていることを意味する。いくつかの実施形態では、その天然環境の夾雑成分は、抗体の診断又は治療又は免疫使用を干渉する材料であり、これには、酵素、ホルモン及びその他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質が含まれ得る。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｌｏｗｒｙ法によって決定されるような（１）９５重量％超の抗体に、最も好ましくは、９９重量％超に、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によって、少なくとも１５残基のＮ末端又は内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度に、又は（３）クマシーブルー若しくは、好ましくは、銀染色を使用して還元又は非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一に精製される。単離された抗体は、抗体の天然環境の少なくとも１種の成分が存在しないので、組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕでの抗体を含む。しかし、普通、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
【０１０３】
「精製された」とは、抗体又は抗体断片の純度が増大され、その結果、その天然環境において存在する、及び／又は最初に合成された及び／又は実験室条件下で増幅されたときよりも、純粋な形態で存在することを意味する。純度は、相対的な用語であり、必ずしも絶対的な純度を意味しない。
【０１０４】
ＡＰ３３抗体
ＡＰ３３は、Ｅ２（可溶性Ｅ２、Ｅ１Ｅ２及びウイルス様粒子を含む種々の形態の）とＣＤ８１との間の相互作用を強力に阻害し得るマウスモノクローナル抗体（ＭＡｂ）である（Clayton RF, et al. 2002. Analysis of antigenicity and topology of E2 glycoprotein present on recombinant hepatitis C virus-like particles. J. Virol. 76:7672-7682、Owsianka A, Clayton RF, Loomis-Price LD, McKeating JA, Patel AH. 2001. Functional analysis of hepatitis C virus E2 glycoproteins and viruslike particles reveals structural dissimilarities between different forms of E2. J. Gen. Virol. 82:1877-1883、Owsianka A, et al. 2005. Monoclonal antibody AP33 defines a broadlyneutralizing epitope on the hepatitis C virus E2 envelope glycoprotein. J. Gen. Virol. 79:11095-11104）。
【０１０５】
ＨＣＶ  Ｅ２の残基４１２〜４２３に及ぶＡＰ３３エピトープは、線状であり、高度に保存されており、ＣＤ８１認識において重大な役割を果たすトリプトファン残基を包含する。実際、抗体は、主要な遺伝子型すべてにわたって感染を強力に中和可能であるとわかっている。
【０１０６】
任意の公知のＡＰ３３抗体が、本明細書において記載される方法及び技術において使用され得る。ＡＰ３３は、例えば、ＷＯ２００９／０８１２８５におけるようにヒト化されている。適宜、「ＡＰ３３抗体」への本明細書における言及は、野生型マウスモノクローナルＡＰ３３抗体を指す。最も適当には、「ＡＰ３３抗体」は、ＡＰ３３  ＣＤＲを含む、より適当には、以下に記載されるようにＡＰ３３  ＶＬ及び／又はＶＨ配列を含む抗体又はその抗原結合断片を意味する。
【０１０７】
ＡＰ３３（ＷＴ）ｖｈ及びｖＬコード配列
ＡＰ３３  ＷＴ  ＶＨ配列
配列は、配列されたリーダー−ｖＨである。
リーダー配列は、四角で囲まれている。
【数１】
0006538151.tif 000002
【０１０８】
アミノ酸配列は、普遍的遺伝子コードを使用してアミノ酸配列に翻訳され得る上記のコード配列によって開示されている。
【０１０９】
ＡＰ３３  ＷＴ  ＶＬ配列
配列は、配列されたリーダー−ｖＬである。
リーダー配列は、四角で囲まれている。
【数２】
0006538151.tif 000003
【０１１０】
アミノ酸配列は、普遍的遺伝子コードを使用してアミノ酸配列に翻訳され得る上記のコード配列によって開示されている。
【０１１１】
ＶＬ／ＶＨ配列を仮定してＣＤＲを同定することは、当業者にとって通例の事柄であるので、ＡＰ３３のＣＤＲの配列は、ＡＰ３３抗体のＶＬ及びＶＨ領域の上記のヌクレオチドコード配列によって開示されるように適している。
【０１１２】
「モノクローナルＡＰ３３抗体の抗原結合ポケット」は、例えば、抗原結合ポケットの具体的な開示のために、参照により本明細書に組み込まれるPotter et al 2012 （J. Virol. vol 86 No 23 pages 12923-12932 “Toward a Hepatitis C Virus Vaccine: the Structural Basis of HepatitisC Virus Neutralization by AP33, a Broadly Neutralizing Antibody”）において当技術分野で公知のように定義され、Potter et al 2012の図３が特に参照される。
【０１１３】
任意のさらなるガイダンスが必要である場合には、本明細書における実施例の節が参照される。
【０１１４】
適宜、「モノクローナルＡＰ３３抗体の抗原結合ポケット」は、表１に示されるＡＰ３３残基を含むＡＰ３３の一部である。
【０１１５】
最も適当には、「モノクローナルＡＰ３３抗体の抗原結合ポケット」は、表１において強調されている（「ＷＴ  ＡＰ３３」の横列において表の上部で二重の下線が引かれ、太字である）ＡＰ３３残基を含むＡＰ３３の一部である。
【０１１６】
ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質
ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質は、当技術分野で公知である。参照を容易にするために、代表的なＨＣＶ  Ｅ２配列（アミノ酸及びヌクレオチド配列の両方）が、図５に提供されている。
【０１１７】
提示される配列は、ＨＣＶ株Ｈ７７ｃの翻訳である。
【０１１８】
示される配列は、注釈がつけられたようにウイルスタンパク質コア、Ｅ１及びＥ２をコードするＨＣＶヌクレオチド１〜２６００に由来する。アミノ酸残基３８４〜７４６に由来するＥ２配列には、下線が引かれている。
【０１１９】
Ｂ２．１Ａ抗体
Ｂ２．１Ａ軽鎖及び重鎖可変領域の配列は、以下に示されている。
【０１２０】
慣習に従って、ｖＬ  ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として記載される。或いは、軽鎖ＣＤＲは、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３と、重鎖ＣＤＲは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３と呼ばれ得る。
【０１２１】
ＣＤＲは、アミノ酸配列上で四角で囲まれた文字で示されている（四角で囲まれた文字の３つの部分は、それぞれ、ＣＤＲ１、２及び３である）。これらもまた、参照を容易にするために別個に示される。特定の配列に下線がある場合には、任意の下線が引かれていない配列は、本発明者らの配列決定において現れなかった、すなわち、プライマーに近すぎたために配列から失われていた配列の始まりのヌクレオチド／残基である。したがって、それらは、得られた配列の残りと対応する生殖系列配列からとられる。
【０１２２】
好ましい配列では：
Kabat解析によって定義されるＣＤＲは、太字である。
【０１２３】
Chothia解析によって定義されるＣＤＲは、下線が引かれている。
【０１２４】
結晶構造に基づく好ましいＣＤＲは、四角で囲まれている。すべての例において、文脈から別に明らかでない限り、Ｂ２．１Ａ抗体のＣＤＲ（又はその誘導体）への言及は、上記で四角で囲まれるような好ましいＣＤＲを指す。
【０１２５】
重鎖の好ましい配列では、イタリック体のＴは、元々Ａとして配列決定されたが、Ｔに訂正された。対応するコドンは、ＡＣＴである。
【０１２６】
【表１】
0006538151.tif 000004
0006538151.tif 000005
【０１２７】
例示的配列と比較して好ましい配列に関して、いくつかのわずかな相違がある：（１）ＬＣ配列の始まりに、ＤIVをコードする３つの余分のコドンがある、（２）ＬＣ可変領域のａａ配列をコードしないＬＣ配列の３’末端の余分のヌクレオチドが、欠失されている、（３）ＨＣ可変領域のａａ配列をコードしないＨＣ配列の５’末端の余分のヌクレオチドが、欠失されている、（４）ＨＣのコード配列内のＮとして与えられるヌクレオチドは、実際には、Ｔである、すなわち、最初の２つのコドンは、ＣＡＧ  ＧＴＴである（ａａのＱＶをコードする）、（５）ＨＣの９番目のａａは、ＡではなくＴである。対応するコドンは、ＧＣＴではなくＡＣＴである。
【０１２８】
好ましいＣＤＲ配列に関して、当業者ならば理解するであろうが、抗体ＶＬ／ＶＨ鎖においてＣＤＲ配列を割り当てる／同定するための種々のモデルがある。最も一般的な／広く受け入れられている版は、Chothia及びKabatモデルであるが、ＡＢＭ及びＣＯＮＴＡＣＴモデルなどの他のものも存在する。「例示的配列」ＣＤＲ配列は、当技術分野において従来法であるように、Kabatモデルを使用して決定された。したがって、Kabatによって決定されたＣＤＲは、堅固な決定を表すが、それらは、実際には、単にモデル化された／予測されたＣＤＲである。絶対的な／正確なＣＤＲ配列は、実験によって決定されたものである。本発明者らは、結晶構造を作製することによってこの労働集約的解析を実施した。実験によって決定されたＣＤＲは、「好ましい配列」である。
【０１２９】
組換え抗体の発現
Ｂ２．１Ａ抗体などの本明細書において記載される抗体及びその断片をコードする単離された核酸、核酸を含むベクター及び宿主細胞並びに抗体を製造するための組換え技術も提供される。本明細書において記載される抗体は、組換え発現によって製造され得る。
【０１３０】
本明細書において記載されるような軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸は、定常領域と連結され、発現ベクター中に挿入されていてもよい。軽鎖及び重鎖は、同一又は異なる発現ベクター中にクローニングされ得る。免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする発現ベクター中の制御配列に、作動可能に連結される。発現制御配列として、それだけには限らないが、プロモーター（例えば、天然に関連している又は異種プロモーター）、シグナル配列、エンハンサーエレメント及び転写終結配列が挙げられる。
【０１３１】
適宜、発現制御配列は、真核生物宿主細胞（例えば、ＣＯＳ７細胞などのＣＯＳ細胞又はＣＨＯ細胞）を形質転換又はトランスフェクト可能なベクター中の真核細胞プロモーターシステムである。ひとたび、ベクターが適当な宿主中に組み込まれると、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベルの発現、交差反応性抗体の収集及び精製に適した条件下で維持される。
【０１３２】
これらの発現ベクターは、通常、エピソームとして、又は宿主染色体ＤＮＡの一体部分としてのいずれかで宿主生物中で複製可能である。
【０１３３】
選択遺伝子成分−一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列を用いて形質転換されたこれらの細胞の検出を可能にするために、選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性又はネオマイシン耐性）を含有する（例えば、Itakura et al.,米国特許第４，７０４，３６２号明細書を参照のこと）。いくつかの実施形態では、選択遺伝子は、（ａ）抗生物質又は他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート又はテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性欠陥を補完し、又は（ｃ）複合培地からは入手できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする、例えば、桿菌のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子。
【０１３４】
選択スキームの一例は、宿主細胞の成長を停止する薬物を利用する。異種遺伝子を用いて成功裏に形質転換されているこれらの細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を産生し、したがって、選択レジメンを生き延びる。このようなドミナント選択の例は、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
【０１３５】
哺乳動物細胞の適した選択マーカーの別の例として、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉ及びIII、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどといった、Ｂ２．１Ａ抗体などの本明細書において記載される抗体又はその断片をコードする核酸を取り込む能力のある細胞の同定を可能にするものがある。
【０１３６】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子を用いて形質転換された細胞はまず、メトトレキサート（Ｍｔｘ）、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストを含有する培養培地中で形質転換体のすべてを培養することによって同定される。野生型ＤＨＦＲが用いられる適当な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）。
【０１３７】
或いは、本明細書において記載された抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質及びアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などの別の選択マーカーをコードするＤＮＡ配列を用いて形質転換又は共形質転換された（co-transformed）宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）が、アミノグリコシド系抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン又はＧ４１８などの選択マーカーの選択剤を含有する培地における細胞増殖によって選択され得る。米国特許第４，９６５，１９９号を参照のこと。
【０１３８】
酵母において使用するための適した選択遺伝子として、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子がある（Stinchcomb et al., Nature, 282:39 （1979））。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファンにおいて増殖する能力を欠く酵母の変異体株、例えば、受託番号４４０７６又はＰＥＰ４−１の選択マーカーを提供する。Jones， Genetics, 85:12 （1977）。酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１損傷の存在は、次いで、トリプトファンの不在下での増殖によって形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２に欠陥のある酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２又は３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する公知プラスミドによって補完される。
【０１３９】
さらに、１．６μｍの環状プラスミドｐＫＤ１に由来するベクターを、クリベロマイセス属（Kluyveromyces）酵母の形質転換に使用できる。或いは、Ｋ．ラクチス（lactis）の組換え仔ウシキモシンの大規模製造のための発現システムが報告された。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 （1990）。クリベロマイセス属の工業用菌株による成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定なマルチコピー発現ベクターも開示されている。Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 （1991）。
【０１４０】
シグナル配列成分−Ｂ２．１Ａ抗体などの本明細書において記載される抗体は、直接的にだけではなく、好ましくは、シグナル配列又は成熟タンパク質若しくはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして組換え製造され得る。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識されプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、１ｐｐ及び熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物のシグナル配列で置換され得る。酵母分泌のために、天然シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（サッカロマイセス属（Saccharomyces）及びクリベロマイセス属α−因子リーダーを含む）又は酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンス（albicans）グルコアミラーゼリーダー又はＷＯ９０／１３６４６に記載されるシグナルによって置換され得る。哺乳動物細胞発現では、哺乳動物シグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。
【０１４１】
このような前駆体領域のＤＮＡは、リーディングフレームで、Ｂ２．１Ａ抗体などの本明細書において記載される抗体をコードするＤＮＡとライゲーションされる。
【０１４２】
複製起点（Origin of Replication）−発現及びクローニングベクターは両方とも、１種又は２種以上の選択された宿主細胞においてベクターが複製することを可能にする核酸配列を含有する。一般に、クローニングベクターでは、この配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡと独立して複製することを可能にするものであり、複製起点又は自立複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母及びウイルスについて周知である。プラスミドpBR322に由来する複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に適しており、酵母については２μプラスミド起点が適しており、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターについては、種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）が有用である。一般に、哺乳動物発現ベクターには複製起点成分は、必要ではない（ＳＶ４０起点は、通常、単に、初期プロモーターを含有するので使用され得る）。
【０１４３】
プロモーター成分−発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、Ｂ２．１Ａ抗体などの本明細書において記載される抗体をコードする核酸と作動可能に連結しているプロモーターを含有する。原核生物宿主とともに使用するのに適したプロモーターとして、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーターシステム、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム及びｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかし、他の公知細菌プロモーターが適している。細菌システムにおいて使用するためのプロモーターはまた、抗体をコードするＤＮＡと作動可能に連結しているシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno；Ｓ．Ｄ．）配列を含有する。
【０１４４】
真核生物のプロモーター配列は、公知である。事実上すべての真核生物の遺伝子は、転写が開始される部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多数の遺伝子の転写の開始から７０〜８０塩基上流に見られる別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域であり、Ｎは、任意のヌクレオチドであり得る。ほとんどの真核生物の遺伝子の３’末端に、コード配列の３’末端へのポリＡテールの付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列のすべては、真核生物の発現ベクター中に適宜挿入される。
【０１４５】
酵母宿主とともに使用するための適したプロモーター配列の例として、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又はエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼなどの他の解糖酵素のプロモーターが挙げられる。
【０１４６】
増殖条件によって制御される転写のさらなる利点を有する、誘導プロモーターである他の酵母プロモーターとして、アルコール脱水素酵素２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝と関連している分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素並びにマルトース及びガラクトース利用に関与する酵素のプロモーター領域がある。酵母発現において使用するための適したベクター及びプロモーターは、欧州特許第７３，６５７号にさらに記載されている。酵母プロモーターとともに酵母エンハンサーも使用されることが有利である。
【０１４７】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからのＢ２．１Ａ抗体などの本明細書において記載される抗体の転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスなどのウイルス及び最も好ましくは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから得られたプロモーターによって、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから、このようなプロモーターが、宿主細胞システムと適合するという条件で制御される。
【０１４８】
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として得られることが好都合である。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、HindIII E制限断片として得られることが好都合である。ベクターとしてウシパピローマウイルスを使用して哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現するためのシステムが、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。このシステムの修飾は、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。また、単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現に関しては、Reyes et al., Nature 297:598-601 （1982）を参照のこと。或いは、ラウス肉腫ウイルス長い末端反復配列が、プロモーターとして使用され得る。
【０１４９】
エンハンサーエレメント成分−高等真核生物によるＢ２．１Ａ抗体などの本明細書において記載される抗体をコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増大されることが多い。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェトプロテイン及びインスリン）に由来する多数のエンハンサー配列が現在では知られている。しかし、通常、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例として、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核細胞プロモーターの活性化の増強エレメントに関しては、Yaniv, Nature 297:17-18 （1982）も参照のこと。エンハンサーは、ＨＣＶ結合抗体をコードする配列の５’又は３’位でベクターにスプライシングされ得るが、プロモーターから５’部位に位置することが好ましい。
【０１５０】
転写終結成分−真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト又は他の多細胞生物に由来する有核細胞）において使用される発現ベクターはまた、転写の終結に、及びｍＲＮＡを安定化するのに必要な配列を含有する。このような配列は、真核生物若しくはウイルスＤＮＡの５’及び場合により３’非翻訳領域又はｃＤＮＡから一般に入手可能である。１つの有用な転写終結成分として、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域がある。ＷＯ９４／１１０２６及び本明細書において開示される発現ベクターを参照のこと。
【０１５１】
ポリヌクレオチド配列（例えば、重鎖可変及び／又は軽鎖可変鎖をコードする配列及び任意選択の発現制御配列）を含有するベクターは、周知の方法によって宿主細胞中に移され得、これは細胞性宿主の種類に極めて左右される。例えば、原核細胞のためには、塩化カルシウムトランスフェクションが一般に利用されるが、他の細胞性宿主のためには、リン酸カルシウム処理、エレクトロポレーション、リポフェクション、微粒子銃又はウイルスベースのトランスフェクションが使用され得る。（一般に、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual （Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989を参照のこと）。哺乳動物細胞を形質転換するために使用される他の方法として、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーション及びマイクロインジェクションの使用が挙げられる（一般に、Sambrook et al., 前掲を参照のこと）。トランスジェニック動物の製造のために、導入遺伝子が受精卵母細胞中にマイクロインジェクションされ得るか、又は胚幹細胞のゲノム中に組み込まれ得、このような細胞の核が、脱核卵母細胞中に移される。
【０１５２】
重鎖及び軽鎖が、別個の発現ベクターにクローニングされる場合には、ベクターは、インタクトな免疫グロブリンの発現及び集合（assembly）を得るためにコトランスフェクトされる。全抗体、それらの二量体、個々の軽鎖及び重鎖又は他の免疫グロブリン形態は、ひとたび発現されると、硫酸アンモニウム沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動などを含む、当業者の標準手順に従って精製され得る（一般に、Scopes, Protein Purification （Springer-Verlag, N.Y., （1982）を参照のこと）。製薬用途には、少なくとも約９０〜９５％の均一性の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８〜９９％又はより高い均一性が最も好ましい。
【０１５３】
構築物
本発明はさらに、本明細書において記載されるようなポリヌクレオチドを含む核酸構築物を提供する。
【０１５４】
通常、構築物は、適した宿主における、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの発現を可能にする発現ベクターとなる。構築物は、例えば、以下のうち１種又は２種以上を含み得る：宿主において活性なプロモーター；エンハンサーなどの１種又は２種以上の調節配列；複製起点；及びマーカー、好ましくは、選択マーカー。宿主は、真核生物又は原核生物の宿主であり得るが、真核生物の（特に、哺乳動物）宿主が好ましいものであり得る。適したプロモーターの選択は、明らかに、幾分か、使用される宿主細胞に応じて変わるが、ＨＳＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶなどといったヒトウイルス由来のプロモーターを含み得る。多数のプロモーターが、当業者に公知である。
【０１５５】
構築物は、３つの軽鎖超可変ループ又は３つの重鎖超可変ループを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得る。或いは、ポリヌクレオチドは、適当な長さの適宜可動性のリンカーによって接続された、３つの重鎖超可変ループ及び３つの軽鎖超可変ループを含むポリペプチドをコードし得る。別の可能性は、単一構築物が、２つの別個のポリペプチド−軽鎖ループを含む１つ及び重鎖ループを含む１つをコードするポリヌクレオチドを含み得るということである。別個のポリペプチドは、独立に発現され得るか、又は単一の共通オペロンの一部を形成し得る。
【０１５６】
構築物は、エンハンサー、複製起点などの１種又は２種以上の調節特徴及び１種又は２種以上のマーカー（選択可能な又は別のもの）を含み得る。構築物は、プラスミド、酵母人工染色体、酵母ミニ染色体の形態をとり得るか、又はウイルス、特に、弱毒化ウイルス若しくはヒトにとって非病原性である同様のもののゲノムのすべて若しくは一部に組み込まれ得る。
【０１５７】
構築物は、哺乳動物、好ましくは、ヒト、対象への安全な投与のために製剤化され得ることが好都合であり得る。通常、それらは、複数のアリコートで提供され、各アリコートは、少なくとも１人の正常な成人ヒト対象の有効な免疫にとって十分な構築物を含有する。
【０１５８】
構築物は、液体又は固体形態で、好ましくは、通常、使用前に滅菌水性液で再水和される凍結乾燥粉末として提供され得る。
【０１５９】
構築物は、構築物の投与に応じて、対象の免疫応答（例えば、特異的抗体力価によって測定されるような）を増大する効果を有するアジュバント又は他の成分を用いて製剤化され得る。
【０１６０】
ベクター
用語「ベクター」は、発現ベクター及び形質転換ベクター及びシャトルベクターを含む。
【０１６１】
用語「発現ベクター」は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現可能な構築物を意味する。
【０１６２】
用語「形質転換ベクター」は、ある実体から、その種のものであり得るか、又は別の種のものであり得る別の実態へ移されることが可能な構築物を意味する。大腸菌（Escherichia. coli）プラスミドからバチルス属（Bacillus）のものなどの細菌へなど、構築物がある種から別のものへ移されることが可能である場合には、形質転換ベクターは、「シャトルベクター」と呼ばれることがある。さらに、大腸菌プラスミドからアグロバクテリウムへ植物へ移されることが可能な構築物であり得る。
【０１６３】
ベクターは、以下に記載されるような、適した宿主細胞中に移され、本発明に包含されるポリペプチドの発現を提供し得る。したがって、さらなる態様において、本発明は、ポリペプチドをコードするコード配列のベクターによる発現を提供するための条件下で、上記のような発現ベクターを形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞を培養すること及び発現されたポリペプチドを回収することを含む、本発明において使用するためのポリペプチドを調製するためのプロセスを提供する。
【０１６４】
ベクターは、例えば、複製起点を備え、前記ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター及びプロモーターのレギュレーターを備えていてもよいプラスミド、ウイルス又はファージベクターであり得る。
【０１６５】
ベクターは、当技術分野で周知の１種又は２種以上の選択マーカー遺伝子を含有し得る。
【０１６６】
多数の公知の重鎖及び軽鎖発現ベクターが市販されている。当業者ならば、元の抗体と同一の定常領域サブタイプを発現するベクターを選択できる。次いで、重鎖及び軽鎖可変領域の配列は、それに応じてベクター中に容易に配置される。
【０１６７】
適宜、InvivoGen社（5、rue Jean Rodier、F-31400 Toulouse、France製の）ベクターが、本発明の抗体又は抗原結合断片の異種発現のために使用され得る。例えば、Ｂ２．１Ａは、κ軽鎖のｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｍｋ及びＩｇＧ１重鎖可変領域のｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｍＧ１を使用して発現され得る。
【０１６８】
同様に、ｓｃＦＶ発現のために、幅広い公知のベクターが市販されている。Ｂ２．１Ａ  ｓｃＦｖを作製するために、適宜、ｐＤｉｓｐｌａｙ又はその誘導体などのベクターが使用され得る。
【０１６９】
宿主細胞
本発明はさらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで本明細書において記載されるポリヌクレオチド又は構築物を含む宿主細胞などの宿主細胞を提供する。宿主細胞は、例えば、細菌、酵母又は他の真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞であり得る。
【０１７０】
本発明はまた、本発明に従ってポリペプチドを産生するよう遺伝子操作されているトランスジェニック多細胞宿主生物を提供する。生物は、例えば、トランスジェニック哺乳動物生物（例えば、トランスジェニックヤギ又はマウス系統）であり得る。
【０１７１】
大腸菌は、使用され得る１種の原核生物宿主である。他の微生物宿主として、枯草菌（Bacillus subtilis）などの桿菌並びにサルモネラ属（Salmonella）、セラチア属（Serratia）及び種々のシュードモナス属（Pseudomonas）の種などの他の腸内細菌科（enterobacteriaceae）が挙げられる。これらの原核生物の宿主では、通常、宿主細胞と適合する発現制御配列（例えば、複製起点）を含有する発現ベクターを作製できる。さらに、ラクトースプロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、ベータ−ラクタマーゼプロモーターシステム又はファージラムダ由来のプロモーターシステムなどの種々の周知のプロモーターのうち任意の数が存在する。プロモーターは、通常、転写及び翻訳を開始及び完了するために、オペレーター配列を用いてもよい発現を制御し、リボソーム結合部位配列などを有する。
【０１７２】
酵母などの他の微生物が、発現のために使用され得る。サッカロミセス属（Saccharomyces）は、要求通りに発現制御配列（例えば、プロモーター）、複製起点、終結配列などを有する、適したベクターを有する好ましい酵母宿主である。通常のプロモーターは、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ及び他の解糖酵素を含む。誘導性酵母プロモーターとして、中でも、アルコール脱水素酵素、イソチトクロームＣ並びにマルトース及びガラクトース利用に関与する酵素に由来するプロモーターが挙げられる。
【０１７３】
微生物に加えて、哺乳動物組織細胞培養物も、本明細書に記載される抗体又はその断片を発現させ、製造するために使用され得、いくつかの場合には、好ましい（Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. （1987）を参照のこと）。いくつかの実施形態について、異種タンパク質（例えば、インタクトな免疫グロブリン）を分泌可能ないくつかの適した宿主細胞株が、当技術分野において開発されているので、真核細胞（例えば、ＣＯＳ７細胞）が好ましいものであり得、これとして、ＣＨＯ細胞株、種々のＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、好ましくは、骨髄腫細胞株又は形質転換されたＢ細胞又はハイブリドーマが挙げられる。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、脊椎動物宿主細胞である。有用な哺乳動物宿主細胞株の例として、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胎児由来腎臓株（懸濁培養において増殖についてサブクローニングされた２９３又は２９３細胞、Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 （1977））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 （1980））又はＣＨＯ−ＤＰ−１２株；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 （1980））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳がん（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 （1982））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝細胞腫株（Ｈｅｐ  Ｇ２）がある。
【０１７５】
或いは、抗体をコードする配列は、トランスジェニック動物のゲノムへの導入及びトランスジェニック動物の乳におけるその後の発現のために導入遺伝子中に組み込まれ得る（例えば、Deboer et al.、米国特許第５，７４１，９５７号、Rosen、米国特許第５，３０４，４８９号及びMeade et al.、米国特許第５，８４９，９９２号を参照のこと）。適した導入遺伝子は、カゼイン又はベータラクトグロブリンなどの乳腺特異的遺伝子に由来するプロモーター及びエンハンサーと作動可能に連結している軽鎖及び／又は重鎖のコード配列を含む。
【０１７６】
或いは、本明細書において記載される抗体は、トランスジェニック植物（例えば、タバコ、トウモロコシ、ダイズ及びアルファルファ）において製造され得る。改善された「プランチボディー（plantibody）」ベクター（Hendy et al. （1999） J. Immunol. Methods 231:137-146）及び精製戦略は、形質転換可能な作物種の増大と相まって、このような方法を、ヒト及び動物療法のためだけでなく、同様に産業上の利用のための（例えば、触媒抗体）組換え免疫グロブリン産生の実際的な効率的な手段にする。さらに、植物によって製造された抗体は、安全で、有効であり、動物由来材料の使用を避けることがわかっている。さらに、植物及び哺乳動物細胞によって製造された抗体のグリコシル化パターンの相違は、抗原結合又は特異性に対してほとんど効果がないか、又は全く効果がない。さらに、植物由来分泌性二量体ＩｇＡ抗体の局所経口適用を受けている患者において、毒性又はＨＡＭＡの証拠は観察されていない（Larrick et al. （1998） Res. Immunol. 149:603-608を参照のこと）。
【０１７７】
全長抗体、抗体断片及び抗体融合タンパク質は、細菌において製造され得、特に、治療用抗体が細胞傷害性薬剤（例えば、毒素）コンジュゲートされている場合など、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ではない場合には、免疫複合体それ自体が、腫瘍細胞破壊において有効性を示す。全長抗体は、循環においてより長い半減期を有する。大腸菌における製造は、より迅速で、より費用効率が高い。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、発現及び分泌を最適化するための翻訳開始領域（ＴＩＲ）及びシグナル配列を記載する米国特許第５，６４８，２３７号（Carter et. al.）、同５，７８９，１９９号（Joly et al.）及び同５，８４０，５２３号（Simmons et al.）を参照のこと、これらの特許は参照により本明細書に組み込まれる。発現後、抗体は、可溶性画分中に大腸菌細胞ペーストから単離され、アイソタイプに応じて、例えば、プロテインＡ又はＧカラムによって精製され得る。最終精製は、例えば、ＣＨＯ細胞において発現された抗体を精製するためのプロセスと同様に実施され得る。
【０１７８】
グリコシル化Ｂ２．１Ａ抗体などのグリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する。脊椎動物細胞における例として、植物及び昆虫細胞が挙げられる。スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（幼虫）、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）（蚊）、ヒトスジシマカ（Aedes albopictus）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）（ショウジョウバエ）及びカイコ（Bombyx mori）などの宿主から、多数のバキュロウイルス株及び変異体並びに対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）ＮＰＶのＬ−１変異体及びカイコＮＰＶのＢｍ−５株が公的に入手可能であり、このようなウイルスは、特に、スポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションのために本発明に従って、本明細書においてウイルスとして使用され得る。
【０１７９】
抗体の精製
組換え技術を使用する場合には、抗体は細胞内で、細胞膜周辺腔において製造され得るか、又は培地中に直接分泌され得る。抗体が細胞内で製造される場合には、第１のステップとして、宿主細胞又は溶解断片のいずれかの微粒子状破片が、例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去される。Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 （1992）には、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順が記載されている。手短には、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分かけて解凍する。細胞破片は、遠心分離によって除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合には、このような発現システムからの上清を、一般に、まず、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Amicon又はMillipore Pellicon限外濾過ユニットを使用して濃縮する。タンパク質分解を阻害するために前述のステップのいずれかにＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を含めてもよく、外来性混入物の増殖を防ぐために抗生物質を含めてもよい。
【０１８０】
細胞から調製される抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及びアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製され得、アフィニティークロマトグラフィーは、好ましい精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種類及びアイソタイプに応じて変わる。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２又はγ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用され得る（Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 （1983））。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプに対して及びヒトγ３に対して推奨されている（Guss et al., EMBO J. 5:15671575 （1986））。親和性リガンドを結合させるマトリックスは、アガロースであることが最も多いが、他のマトリックスも利用可能である。制御孔ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースを用いて達成され得るものよりも速い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体が、Ｃ．ｓｕｂ．Ｈ３ドメインを含む場合には、Bakerbond ABX（商標）樹脂（J. T. Baker, Phillipsburg、N.J.）が、精製のために有用である。回収されるべき抗体に応じて、イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿法、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）でのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製のための他の技術も利用可能である。
【０１８１】
任意の予備的精製ステップ後に、対象の抗体及び混入物を含む混合物は、好ましくは、低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で実施される、約２．５〜４．５の間のｐＨの溶出バッファーを使用する低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに付され得る。
【０１８２】
抗体断片
Ｆ（ａｂ’）２（１１０，０００ダルトン）断片は、ジスルフィドによってヒンジで接続している２つの抗原結合領域を含有する。この断片は、Ｆｃ領域のすべてではないがほとんどを欠いている。
【０１８３】
Ｆａｂ’（５５，０００ダルトン）断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片の還元によって形成され得る。Ｆａｂ’断片は、アルキル化され得る、又は酵素、毒素若しくは他の対象のタンパク質とのコンジュゲーションにおいて利用され得る遊離スルフヒドリル基含有する。Ｆａｂ’は、Ｆ（ａｂ’）２から導かれ、したがって、Ｆｃの小さい部分を含有し得る。
【０１８４】
Ｆａｂ（５０，０００ダルトン）は、分子内ジスルフィド結合によって連結されたＶＨ、ＣＨ１及びＶＬ、ＣＬ領域からなる、ＩｇＧ及び／又はIgMから製造され得る一価断片である。
【０１８５】
Ｆｖ（２５，０００ダルトン）は、完全抗原結合部位を含有する、ＩｇＧ及び／又はＩｇＭから製造される最小断片である。Ｆｖ断片は、Ｆａｂと同一の結合特性及び同様の３次元結合特徴を有する。Ｆｖ断片のＶＨ及びＶＬ鎖は、非共有結合相互作用によって一緒に結びついている。これらの鎖は、希釈の際に解離する傾向があり、そのため、グルタルアルデヒド、分子間ジスルフィド又はペプチドリンカーによって鎖を架橋するための方法が開発されている。ｓｃＦｖは、一本鎖Ｆｖであり、組換えによって作製されることが好都合であり得る。
【０１８６】
「ｒＩｇＧ」断片又は「ｒＩｇＧ」とは、還元されたＩｇＧ（７５，０００ダルトン）又はハーフＩｇＧを指す。ヒンジ領域のジスルフィド結合のみを選択的に還元した生成物である。いくつかのジスルフィド結合が、ＩｇＧ中に生じるが、ヒンジ領域中のものは、特に、２−メルカプトエチルアミン（２−ＭＥＡ）のような穏やかな還元剤を用いて還元するために最も近づきやすく容易である。ハーフＩｇＧは、コンジュゲーション、抗体固定化又は酵素標識いずれかのために標的化され得る、露出しているヒンジ領域スルフヒドリル基を標的化する目的で頻繁に調製される。
【０１８７】
これらの種々の断片を製造するための技術は、当技術分野で周知である。必要とされる製造及び試薬の例は、任意のさらなるガイダンスが必要とされる場合における実施例の節においてなど、以下に提供される。
【０１８８】
免疫及び感作（Challenge）研究
Marcus Dornerによって開発された免疫適格性のＣｒｅ−ｌｏｘマウスモデルは、ＨＣＶワクチンを試験するための最も適当なモデルである（Dorner et al 2011; Dorner et al 2013）。市販のトランスジェニックマウス、株FVB.129S6（B6）-Gt（ROSA）26Sortm1（Luc）Kael/Jは、ホタルルシフェラーゼ発現を制限するＬｏｘＰが両側に隣接するＳＴＯＰカセットを含有する。環化組換え（ＣＲＥ）リコンビナーゼの発現が、２つのｌｏｘＰ部位間の組換えを触媒し、これがＳＴＯＰカセットを取り出し、ルシフェラーゼリポーター遺伝子を活性化し、細胞内ルシフェラーゼ発現につながる。マウスは、必要不可欠な細胞表面受容体（ヒトＣＤ８１、オクルーディン、クローディン１及びＳＲ−ＢＩ）をコードするアデノウイルスによる感染によって、ＨＣＶ進入にとって許容的にされ、次いで、環化組換え（ＣＲＥ）リコンビナーゼを発現する組換えバイシストロニックＨＣＶｃｃに感染する。組換えウイルスゲノムは、マウス肝細胞に侵入すると、翻訳され、ＣＲＥタンパク質が発現される。ＣＲＥリコンビナーゼは、ＳＴＯＰカセットを切り出し、ルシフェラーゼリポーターを活性化し、ルシフェラーゼの発現につながる。その後のルシフェリンの注射は、生物発光をもたらし、これは、全身生物発光イメージャーを使用して測定され得る。マウス細胞がＨＣＶ複製及び集合を支持しないので、ＨＣＶ−ＣＲＥウイルスは、全感染サイクルを経ない。したがって、感染は、進入ステップを越えて進行しない。
【０１８９】
Rosa26-Flucマウスは、それらが正常な免疫システムを有することを仮定し、可能性あるワクチン、例えば、Ｂ２．１Ａ  Ｆａｂ−ＫＬＨを用いて免疫処置され得る。マウスに、一次ワクチン接種と、続いて、数回の追加免疫ワクチン接種を施す。抗Ｅ２抗体の誘導をモニタリングするために、各追加免疫後に、試験採血する。ワクチン接種が抗Ｅ２抗体を誘導する場合には、上記のようにアデノウイルスベクターを投与することによって、ワクチン接種された及びワクチン接種されていないマウスを、ＨＣＶ感染にとって許容的にし、次いで、ＨＣＶ−ＣＲＥを用いて感作する。ＨＣＶの肝細胞への進入は、本明細書において記載されるように生物発光として検出される。ＨＣＶ進入と抗Ｅ２力価の間の逆相関は、ワクチンがＨＣＶ感作に対して保護することを示す。さらなる詳細は、実施例の節に提供されている。
【０１９０】
Ｂ２．１Ａの特性
Ｂ２．１Ａは、抗イディオタイプ抗体である。
【０１９１】
Ｂ２．１Ａは、ＡＰ３３モノクローナル抗体と結合する。
【０１９２】
Ｂ２．１Ａは、ＡＰ３３モノクローナル抗体の、Ｅ２  ４１２〜４２３エピトープとの結合を阻害する。
【０１９３】
Ｂ２．１Ａは、ＦＬ３２Ａ、ＮＬ９１Ａ、ＷＬ９６Ａ；ＹＨ３３Ａ、ＹＨ５０Ａ、ＹＨ５８Ａ、ＩＨ９５Ａ及び／又はＹＨ１００Ａなどの変異体ＡＰ３３抗体と結合しない（又は低結合、すなわち、野生型ＡＰ３３との結合と比較して５０％未満の結合を有する）。
【０１９４】
利点
実施された徹底した研究の間の種々の失敗にもかかわらず、Ｂ２．１Ａ抗体及び誘導体が提供されることが、本発明の利点である。
【０１９５】
本発明の抗体を得るために、複雑な構造に基づいた選択手順が考案されたことが本発明の利点である。
【０１９６】
構造的に新規の抗体／抗体誘導体が、Ｂ２．１Ａ及びＢ２．１ＡのＣＤＲの形態で提供されることが本発明の利点である。
【０１９７】
本明細書に記載された抗体及び抗体誘導体は、従来の経路によって得ることはできなかったことが本発明の利点である。
【０１９８】
本明細書に記載される抗体及び抗体誘導体の利点は、それらがＡＰ３３変異体に対して、Ｅ２のそれらのＡＰ３３変異体との結合パターンを厳密にエミュレートする結合のパターンを示すことである。
【０１９９】
本発明は、Ｅ２ポリペプチドを認識可能な免疫応答を誘導するのに有用な抗イディオタイプ抗体を提供することが利点である。
【０２００】
ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドを標的とする免疫応答の誘導を可能にすることが、本発明の利点である。
【０２０１】
ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドに対する免疫応答の誘導を可能にすることが、本発明の利点である。
【０２０２】
Ｂ２．１Ａ及びその誘導体によって提示されるパラトープが、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドの重要な広域中和エピトープの３次元構造の優れた模倣物であることが本発明の利点である。
【０２０３】
Ｂ２．１Ａ及びその誘導体によって提示されるパラトープが、ＡＰ３３と同一のエピトープを認識する抗体を誘導することが、本発明の利点である。誘導された抗体が、ＡＰ３３が認識するものと同一の、そのエピトープ内の残基を認識することは、さらに有利である。
【０２０４】
Ｅ２に対する、Ａｂ３抗体（すなわち、本発明のＢ２．１Ａ抗体又は誘導体によって誘導される抗体）の親和性が、ＡＰ３３のものと同様であることが、本発明の利点である。誘導された抗体が、細胞培養物感染性ＨＣＶの感染力を中和することが、さらなる利点である。それらは、ＡＰ３３のものの約２倍であるのＩＣ５０で感染力を中和する。
【０２０５】
Ｂ２．１Ａ抗体を得るためにより少ない動物しか必要ではないことが、本発明の利点である。
【０２０６】
ＡＰ３３−Ｅ２相互作用の入手可能な構造データが、選択スキームの合理的設計において広く使用されたことが、アプローチの特徴である。
【０２０７】
番号付けした段落によって、本発明を以下にさらに説明する：
【０２０８】
段落１。ＡＰ３３抗体の抗原結合ポケットに結合可能な抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ、配列番号１、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ１（Ｌ１）、ＶＬ  ＣＤＲ２（Ｌ２）及びＶＬ  ＣＤＲ３（Ｌ３）を含み、かつ、それぞれ、配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１（Ｈ１）、ＶＨ  ＣＤＲ２（Ｈ２）及びＶＨ  ＣＤＲ３（Ｈ３）を含む。
【０２０９】
段落２。前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号７のアミノ酸配列からなるＶＬアミノ酸配列を含む、段落１に記載の抗体。
【０２１０】
段落３。前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号８のアミノ酸配列からなるＶＨアミノ酸配列を含む、段落１に記載の抗体。
【０２１１】
段落４。前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号７のアミノ酸配列からなるＶＬアミノ酸配列を含み、前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号８のアミノ酸配列からなるＶＨアミノ酸配列を含む、段落１に記載の抗体。
【０２１２】
段落５。その抗原結合断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｒＩｇＧ及びダイアボディーからなる群から選択される、段落１〜４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。
【０２１３】
段落６。前記抗原結合断片がｓｃＦｖであり、前記ｓｃＦｖが、配列番号１１又は配列番号１２又は配列番号１３のアミノ酸配列を含む、段落５に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【０２１４】
段落７。段落１〜６のいずれかに記載の抗体又は抗原結合断片の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【０２１５】
段落８．配列番号９及び配列番号１０からなる群から選択される１種又は２種以上のヌクレオチド配列を含む、段落７の核酸。
【０２１６】
段落９。段落７又は段落８のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む核酸。
【０２１７】
段落１０。段落７又は段落８の核酸を含むベクター。
【０２１８】
段落１１。重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードする核酸と作動可能に連結している発現制御配列をさらに含む、段落１０のベクター。
【０２１９】
段落１２。段落１０又は段落１１のベクターを含有する宿主細胞。
【０２２０】
段落１３。細胞が真核細胞である、段落１２の宿主細胞。
【０２２１】
段落１４。真核細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞である、段落１３の宿主細胞。
【０２２２】
段落１５。コードされる重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインが、段落１２〜１４のいずれかに記載の宿主細胞によって発現されるように、前記細胞をインキュベートすること、並びに発現された抗体又はその抗原結合断片を回収することを含む、抗体又はその抗原結合断片を製造する方法。
【０２２３】
段落１６。回収された抗体又はその抗原結合断片を単離すること及び／又は精製することをさらに含む、段落１５の方法。
【０２２４】
段落１７。段落１〜６のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む組成物。
【０２２５】
段落１８。担体タンパク質をさらに含み、担体タンパク質が、好ましくは、破傷風トキソイド及びＣＲＭ１９７変異体ジフテリア毒素からなる群から選択される、段落１７に記載の組成物。
【０２２６】
段落１９。アジュバントをさらに含む段落１７又は段落１８に記載の組成物。
【０２２７】
段落２０。ヒトにおける使用のために製剤化された段落１７〜１９のいずれかに記載の組成物。
【０２２８】
段落２１。哺乳動物において、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質に対する免疫応答を誘導可能な抗体又はその抗原結合断片であって、モノクローナルＡＰ３３抗体の抗原結合ポケットに結合可能である抗体又はその抗原結合断片。
【０２２９】
段落２２．哺乳動物において、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質に対する免疫応答を誘導可能な抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ、配列番号１、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ１（Ｌ１）、ＶＬ  ＣＤＲ２（Ｌ２）及びＶＬ  ＣＤＲ３（Ｌ３）を含み、かつ、それぞれ、配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１（Ｈ１）、ＶＨ  ＣＤＲ２（Ｈ２）及びＶＨ  ＣＤＲ３（Ｈ３）を含む。
【０２３０】
段落２３。ＡＰ３３抗体と結合可能な抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその抗原結合断片は、ＡＰ３３抗体とのその結合の５０％未満の、ＡＰ３３抗体変異体ＦＬ３２Ａ、ＮＬ９１Ａ、ＷＬ９６Ａ、ＹＨ３３Ａ、ＹＨ５０Ａ、ＹＨ５８Ａ、ＩＨ９５Ａ及びＹＨ１００Ａに対する結合を示す。
【０２３１】
段落２４。ＡＰ３３抗体又はその断片ではない、段落１〜６のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片と結合する抗体。
【０２３２】
段落２５．段落１〜６のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片を用いる哺乳動物の免疫処置によって得られる、段落２４に記載の抗体。
【０２３３】
段落２６。哺乳動物において、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質に対する免疫応答を誘導する方法であって、前記哺乳動物に、段落１〜６若しくは２１〜２５のいずれかに記載の抗体、段落７〜９のいずれかに記載の核酸、段落１０若しくは段落１１に従うベクター又は段落１７〜２０のいずれかに従う組成物を投与することを含む方法。
【０２３４】
段落２７。哺乳動物においてＣ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質に対する免疫応答を誘導するための、段落１〜６若しくは２１〜２５のいずれかに記載の抗体、段落７〜９のいずれかに記載の核酸、段落１０若しくは段落１１に記載のベクター又は段落１７〜２０のいずれかに記載の組成物。
【０２３５】
さらなる態様及び応用
広い態様では、本発明は、モノクローナルＡＰ３３抗体に対して結合可能な抗体又はその抗原結合断片に関する。
【０２３６】
広い態様では、本発明は、それぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ１（Ｌ１）、ＶＬ  ＣＤＲ２（Ｌ２）、ＶＬ  ＣＤＲ３（Ｌ３）、ＶＨ  ＣＤＲ１（Ｈ１）、ＶＨ  ＣＤＲ２（Ｈ２）及びＶＨ  ＣＤＲ３（Ｈ３）のうち少なくとも１種を含む、上記のような抗体又はその抗原結合断片に関する。適宜、前記抗体又はその抗原結合断片は、前記配列のうち少なくとも２種を含み、適宜、前記抗体又はその抗原結合断片は、前記配列のうち少なくとも３種を含み、適宜、前記抗体又はその抗原結合断片は、前記配列のうち少なくとも４種を含み、適宜、前記抗体又はその抗原結合断片は、前記配列のうち少なくとも５種を含み、適宜、前記抗体又はその抗原結合断片は、前記配列のうち６種すべてを含む。前記抗体又はその抗原結合断片が、前記配列のうち少なくとも３種を含む場合には、適宜、３種のＶＬ配列の各々又は３種のＶＨ配列の各々を含む。
【０２３７】
一態様では、本発明は、ＡＰ３３エピトープ残基４１２〜４２３  ＨＣＶ  Ｅ２と本質的に同一の３次元構造を有する領域若しくはドメインを有する、又は含むポリペプチドを同定する方法に関し、前記方法は、
（ｉ）前記ポリペプチドのＡＰ３３抗体との結合をアッセイすること、及び
（ｉｉ）前記ポリペプチドのＡＰ３３抗体変異体ＦＬ３２Ａ、ＮＬ９１Ａ、ＷＬ９６Ａ、ＹＨ３３Ａ、ＹＨ５０Ａ、ＹＨ５８Ａ、ＩＨ９５Ａ及びＹＨ１００Ａとの結合をアッセイすること
を含み、
ポリペプチドが、ＡＰ３３抗体とのその結合の５０％未満の、ＡＰ３３抗体変異体ＦＬ３２Ａ、ＮＬ９１Ａ、ＷＬ９６Ａ、ＹＨ３３Ａ、ＹＨ５０Ａ、ＹＨ５８Ａ、ＩＨ９５Ａ及びＹＨ１００Ａとの結合を示す場合には、前記ポリペプチドは、ＡＰ３３エピトープ残基４１２〜４２３  ＨＣＶ  Ｅ２と本質的に同一の３次元構造を有すると同定される。
【０２３８】
適宜、ポリペプチドは、抗体又はその抗原結合断片である。
【０２３９】
適宜、ポリペプチドは、ＡＰ３３抗体を用いる哺乳動物の免疫処置によって作製された抗体又はその抗原結合断片である。
【０２４０】
適宜、結合は、ＥＬＩＳＡによってアッセイされる。
【０２４１】
適宜、ＡＰ３３抗体変異体との結合は、ＡＰ３３抗体との結合の６０％未満である。
【０２４２】
一態様では、本発明は、ＡＰ３３エピトープ残基４１２〜４２３  ＨＣＶ  Ｅ２と本質的に同一の３次元構造を有する領域若しくはドメインを有する、又は含む抗体又はその抗原結合断片を製造する方法に関し、前記方法は、上記のようなＡＰ３３エピトープ残基４１２〜４２３  ＨＣＶ  Ｅ２と本質的に同一の３次元構造を有する領域若しくはドメインを有する、又は含むポリペプチドを同定すること及び前記抗体又はその抗原結合断片をｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させること、及びそれを精製していてもよいことを含む。
【０２４３】
一態様では、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片を投与するための、上記のような抗体又はその抗原結合断片を含むキット及び使用説明書に関する。
【０２４４】
一態様では、本発明は、有効量の、上記のような抗体又はその抗原結合断片を投与することを含む、ヒトにおいてＣ型肝炎ウイルス感染を治療又は予防するための方法に関する。適宜、その抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｒＩｇＧ及びダイアボディーからなる群から選択される。
【０２４５】
適宜、Ｃ型肝炎ウイルス感染は、急性Ｃ型肝炎ウイルス感染である。
【０２４６】
適宜、Ｃ型肝炎ウイルス感染は、慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染である。
【０２４７】
適宜、Ｃ型肝炎ウイルス感染を治療することは、ウイルス負荷を低減することを含む。
【０２４８】
適宜、Ｃ型肝炎ウイルス感染を治療又は予防することは、Ｃ型肝炎ウイルスに対する、適当には、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ２タンパク質に対する、最も適当には、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ２タンパク質のＡＰ３３エピトープ４１２〜４２３に対する、免疫応答を誘導することを含む。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、適宜、Ｃ型肝炎ウイルス感染を治療又は予防するための方法は、第２の治療剤を投与することを含む。
【０２５０】
さらに特定の及び好ましい態様は、添付の独立及び従属クレームにおいて示されている。従属クレームの特徴は、必要に応じて独立クレームの特徴と、また特許請求の範囲において明確に示されるもの以外との組合せにおいて組み合わされ得る。
【０２５１】
装置特徴が、機能を提供するように作動可能であると記載される場合には、これは、その機能を提供するか、又はその機能を提供するように適応している若しくは構成されている装置特徴を含むということが認められよう。
【図面の簡単な説明】
【０２５２】
本発明の実施形態を、ここで、添付の図面を参照してさらに記載する。
【図１】グラフ図である。
【図２】グラフ図である。
【図３】棒グラフ図である。
【図４】略図である。
【図５】ＨＣＶ  Ｅ２配列を示す図である。
【図６】本発明の抗体及び抗原結合断片の例を示す図である。
【図７】図７は、ＡＰ３３結合ポケットの分子表面を示す図である。
【図８】棒グラフ図である。
【図９】グラフ図である。
【図１０】棒グラフ図である。
【図１１】グラフ図である。
【図１２】グラフ図である。
【図１３】リボン図である。
【図１４】Ｂ２．１Ａが、ＡＰ３３抗原結合部位中にドッキングすることを示す図である。（ａ）Ｂ２．１Ａ  ｓｃＦｖ（Ａｂ２；重鎖：紫、軽鎖：桃）及び（ｂ）ＨＣＶ  Ｅ２エピトープに対応するペプチド（Ａｇ；ティール；ｐｄｂ受託コード４ｇａｇ）との複合体中のＡＰ３３  Ｆａｂ（Ａｂ１；重鎖：橙、軽鎖：黄）のリボン及び表面表示。
【図１５】Ｂ２．１Ａによる抗原模倣を示す。Ａｂ１−Ａｇ複合体（ＡＰ３３重鎖：青、軽鎖：ティール；ペプチド：マゼンタ；ｐｄｂ受託コード４ｇａｇ）とのＡｂ１−Ａｂ２複合体（ＡＰ３３重鎖：橙、軽鎖：黄；Ｂ２．１Ａ重鎖：紫、軽鎖：桃）の構造アラインメント。Ａｂ１−Ａｂ２複合体中の水素結合は、黒色破線として示され、Ａｂ１−Ａｇ複合体中のものは、灰色破線として示される。水分子は、赤色球として示される。パネルは、Ｅ２残基Ｗ４２０（ａ）、Ｇ４１８（ｂ）、Ｎ４１５（ｃ）及びＬ４１３（ｄ）とＡＰ３３とのその相互作用のＢ２．１Ａによる模倣を示す。
【図１６】Ｂ２．１Ａの部位特異的変異原性を示す。示された変異を有する精製されたＭＢＰ−Ｂ２．１Ａ  ｓｃＦｖタンパク質が、固定化されたＡＰ３３上に捕獲され、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて抗ＭＢＰ−ＨＲＰコンジュゲートによって検出された。（ａ）ＷＴタンパク質及び結合を保持していた変異体Ｆ９８Ｗ及びＮ１００Ｇ；（ｂ）ＷＴタンパク質及び結合しなかった変異体。Ｓ字形曲線を、吸光度データにフィッティングした。
【図１７】Rosa26-Flucマウスの抗Ｅ２力価を示す図である。３匹のマウス（Ａ、Ｂ、Ｃ）に、ＫＬＨと結合しているＢ２．１Ａ  Ｆａｂを用いる一次ワクチン接種と、それに続く５回の追加免疫ワクチン接種を施した。各追加免疫の７〜１０日後に試験採血し、最後の追加免疫の１５日後にさらなる採血した。血清を、ＥＬＩＳＡによってＥ２反応性について試験した。示された値は、２回の独立した力価測定の平均である。
【図１８】ワクチン接種したRosa26-FlucマウスにおけるＡｂ３抗体が、ＡＰ３３エピトープに対して特異的であることを示す図である。Ｒｏｓａ２６  ＦｌｕｃマウスＢ＆Ｃから得られたプールされた高力価血清を、さまざまなペプチド濃度を用いてプレインキュベートし、次いで、Ｅ２でコーティングしたマイクロタイタープレートに移した。２種のペプチドを使用し、一方は、ＷＴ  ＡＰ３３エピトープに対応し（Ｅ２のａａ残基４１２〜４２４）、もう一方は、Ｗ４２０Ｒ置換を含有する。モノクローナル抗体ＡＰ３３及びＡＬＰ９８は、それぞれ、陽性及び陰性対照として働いた。結合している抗体は、抗マウス−ＨＲＰコンジュゲートと、続いて、ＴＭＢ基質を用いて検出された。
【０２５３】
［実施例］
【実施例１】
【０２５４】
抗イディオタイプ抗体の作製
抗原としてＡＰ３３を用いる抗体製造のための標準免疫処置プロトコールを使用して、ＡＰ３３に対する抗体を作製した。抗イディオタイプ（Ａｂ２）抗体を、競合ＥＬＩＳＡにおいてＡＰ３３−Ｅ２相互作用を阻害するその能力によって同定した。９種の融合物から、以下の表Ａに示されるＡｂ２抗体を分泌する１２２種のハイブリドーマが生じた。
【０２５５】
【表２】
0006538151.tif 000006
0006538151.tif 000007
0006538151.tif 000008
【０２５６】
１８カ月の経過にわたって、２５種のＡｂ２を無作為に選び、マウスにワクチン接種するために使用し（表Ａ）、ＨＣＶ  Ｅ２に対する免疫応答を誘発可能であろう１種又は２種以上のインターナルイメージ抗体（Ａｂ２β）を同定した。免疫血清を、
１．ＡＰ３３−Ａｂ２相互作用の遮断。
２．Ｅ２との結合。
３．細胞培養物におけるＨＣＶ感染の阻害
についてＥＬＩＳＡによって試験した。
【０２５７】
結果：免疫血清は、ＡＰ３３のＡｂ２との結合を強力に阻害し、それらが抗Ａｂ２抗体を含有していることを示した。しかし、抗Ａｂ２抗体は、Ｅ２と結合せず、細胞培養物においてＨＣＶを阻害しなかった。これは、重大な問題であった。これらの陰性結果の例については、図２及び３を参照のこと。
【０２５８】
図１は、免疫血清によるＡ１６４とのＡＰ３３結合の阻害を示す。
【０２５９】
６匹のＢａｌｂ／ｃマウスに、ＫＬＨとコンジュゲートしているＡ１６４を用いてワクチン接種した。一次ワクチン接種に、４回の追加免疫を１４日間隔で続け、最後の追加免疫の５日後に最終採血した。
【０２６０】
免疫前及び免疫血清の段階希釈を、Ａ１６４でコーティングしたマイクロタイタープレート上でビオチン化ＡＰ３３（ｂ−ＡＰ３３）とともに共インキュベート（co-incubate）した。ｂ−ＡＰ３３の結合を、ストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＴＭＢを用いて検出した。シグナルの減少は、競合血清抗体によるｂ−ＡＰ３３−Ａ１６４相互作用の遮断を示す。グラフは、群内の２匹のマウス（１番及び２番）の応答を表す。すべての他の動物は、同一応答を示した。
【０２６１】
結果：免疫血清は、Ｅ２とのＡＰ３３結合を遮断するＡ１６４特異的抗体を含有するが、免疫前採血は、相互作用に対して効果を有さない。
【０２６２】
図２は、Ｅ２との血清抗体の結合−陰性結果の例を示す。
【０２６３】
６匹のＢａｌｂ／ｃマウスに、ＫＬＨとコンジュゲートしているＡ１６４を用いてワクチン接種した。一次ワクチン接種に、４回の追加免疫を１４日間隔で続け、最後の追加免疫の５日後に最終採血した。
【０２６４】
免疫血清の段階希釈を、Ｅ２でコーティングしたマイクロタイタープレート上でインキュベートした。血清抗体の結合を、抗マウス−ＨＲＰ及びＴＭＢを用いて検出した。シグナルの増大は、Ｅ２特異的抗体の存在を示す。ＡＰ３３は、陽性対照として役立てた。グラフは、群内の２匹のマウス（１番及び２番）の応答を表す。すべての他の動物は、同一応答を示した。
【０２６５】
結果：Ａ１６４を用いて免疫処置したマウスから得た免疫血清は、Ｅ２を認識する抗体を含有しない。
【０２６６】
図３は、免疫血清によるウイルス中和−陰性結果の例を示す。
【０２６７】
野生型ＪＦＨ１ウイルス（ＷＴ）及び２種のＥ２変異体ウイルス、Ｇ４５１Ｒ及びＷ４２０Ｙを、Ａｂ２  Ｐ１Ｔを用いて免疫処置したマウスから得られた血清（１／１００希釈）ともインキュベートした（ＴＢ＝最終採血）。血清を、同一マウスから免疫処置に先立って採取し、対照として役立てた（ＰＢ＝前採血）。３７℃で１時間後、ウイルス／血清混合物を使用して、Ｈｕｈ７−Ｊ２０細胞に感染させた。Ｈｕｈ７−Ｊ２０細胞株は、ＨＣＶ感染後、分泌性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）リポーターを培地中に放出し、したがって、ウイルス感染力の迅速な、高感度定量を可能にするように遺伝子操作されている。感染後３時間で、接種菌液を新鮮培地と置換し、７２時間インキュベートした。培地中に放出されたＳＥＡＰの測定によってウイルス感染力レベルを調べた。そのそれぞれの対照非免疫血清（ＰＢ）に対してマウス免疫血清（ＴＢ）の存在下でのウイルス感染力を定量することによって感染力パーセントを算出した。エラーバーは、平均からの標準偏差を示す。Ａ３３は、対照として含まれる。Ｇ４５１Ｒウイルスは、ＡＰ３３による中和に対してＷＴよりも感受性である。Ｗ４２０Ｙウイルスは、ＡＰ３３による中和に対して耐性である。
【０２６８】
結果：ＷＴ及びＧ４５１Ｒウイルスの感染力は、ＡＰ３３とのプレインキュベーションによって大幅に低減するが、マウス血清のいずれかによっては低減せず、これは、Ｐ１Ｔを用いて免疫処置されたマウスから得た免疫血清は、中和抗体を含有しないことを示す。
【０２６９】
Ｂ２．１Ａ抗体を得ること
これらの結果は、重大な課題を提示した：いかにしてＡｂ２βを同定すべきか？
・Ａｂ３を製造するための免疫処置によって
・ＡＰ３３軽鎖及び重鎖との結合について試験することによって。
これは、図４に示されている。
結果：１２０種すべてのＡｂ２が、Ａｂ２βのように挙動する。
【０２７０】
本発明者らは、例えば、時間的制約及び／又は必要とされる動物の数、ワクチン接種による１２２種の抗体のスクリーニングに問題があることに気付き、そこで、本発明者らは、以下を行った：
【０２７１】
１．本発明者らは、（ａ）ＡＰ３３全ＩｇＧ、（ｂ）ＡＰ３３軽鎖単独並びに（ｃ）ＡＰ３３重鎖及び不適切なκ軽鎖を含むハイブリッドとのＡｂ２の結合を比較した。このアプローチは、図４に示されており、Ａｂ２βは、（ａ）中に存在する全抗原結合ポケットに結合するが、（ｂ）又は（ｃ）と結合しないが、抗原結合ポケットのインターナルイメージを表さなかったＡｂ２は、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかと結合するという予想に基づいている。実際には、すべてのＡｂ２が、Ａｂ２βとして挙動し、（ａ）とのみ結合し、そのため、このアッセイは、それらの間を区別することに失敗した。
２．本発明者らは、すべてのＡｂ２の可変領域を配列決定して、任意の重複を除去した。これにより、パネルが１８種の独特の抗体に低減された。
【０２７２】
本発明者らの、そのエピトープに対応するペプチドと複合体化したＡＰ３３  Ｆａｂの結晶構造によって、本発明者らは、ＡＰ３３の抗原結合ポケットを構成するアミノ酸残基を同定することが可能であった。これらの残基がアラニンによって個々に置換された変異体ＡＰ３３抗体のパネルを使用して、本発明者らは、どのアミノ酸残基がＥ２結合に関与しているか、どれが関与していないかを確立した（Potter et al. 2012及び以下の表１）。
【０２７３】
変異体ＡＰ３３抗体の同一パネルを使用して、Ａｂ２間を区別した。このアプローチは、Ａｂ２間で特筆すべき相違を示したので大躍進であるとわかった。一部は、変異によって影響を受けなかったが、他のものは結合特徴をＥ２と共有していた。Ｂ２．１Ａの結合プロファイルが、Ｅ２のものと最もよく似ていた（表１）。
【０２７４】
【表３】
0006538151.tif 000009
0006538151.tif 000010
【０２７５】
結果：Ｅ２とのＡＰ３３結合は、軽鎖残基Ｆ３２、Ｎ９１及びＷ９６の、並びに重鎖残基Ｙ３３、Ｙ５０、Ｙ５８、Ｉ９５及びＹ１００の変異によって９０％を超えて低減した（太字、二重下線で強調された値）。同一の８種の変異が、抗Ｉｄ  Ｂ２．１Ａ抗体とのＡＰ３３結合を低減した（上の行、太字で四角で囲まれた強調された値）が、他の抗Ｉｄ抗体との結合は、影響を及ぼす変異の数がより少ないか、又は影響を与える変異はなかった。これは、Ｂ２．１Ａが、Ｅ２に最もよく似ることを示す。一部の抗Ｉｄ抗体との結合は、Ｅ２結合に影響を及ぼさなかった変異（例えば、ＹＬ２８Ａ）によって低減し、したがって、これらの低減した値は、強調されず、スコアに含まれない。
【実施例２】
【０２７６】
［実施例２．１］
ＡＰ３３パラトープのインターナルイメージを表す抗イディオタイプ抗体の選択
図７は、ＡＰ３３結合ポケットの分子表面を示す。結合を９０％を超えて低減した８つのアラニン置換の位置が紫色で着色されており、Ｅ２結合に対してほとんど効果がないか、全く効果がなかったものは青緑色で着色されている。エピトープペプチドは、黄色炭素原子を有するスティックとして示されている。
【０２７７】
図７はまた、抗イディオタイプネットワーク理論の原理を示す模式図を示す。抗原に対する曝露は、Ａｂ１と呼ばれる抗体の製造を誘導する。Ａｂ１抗体の特異性は、その超可変領域の配列及び構造によって決定され、並びにこの独特の抗原結合部位はまた、免疫システムによって、イディオタイプエピトープのセット又はイディオトープのセットとして認識される。Ａｂ１に対して作製された抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体は、Ａｂ２と呼ばれ、Ａｂ２βと呼ばれるこれらのサブセットは、その「インターナルイメージ」及び同様に、元の抗原の有効な模倣物であるように十分に正確にＡｂ１の抗原結合部位（パラトープ）に適合する。Ａｂ２β抗体はしたがって、Ａｂ１と同一の結合特性を有する抗−抗Ｉｄ抗体（Ａｂ３）を誘発するための代理抗原として使用され得る。
【０２７８】
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＡＰ３３を用いてワクチン接種して、多数のハイブリドーマを作製した。これらを、ＡＰ３３−Ｅ２相互作用を、ＡＰ３３の超可変領域との結合によって遮断できるＡｂ２抗体の製造についてスクリーニングした。
【０２７９】
種々の抗イディオタイプのこのパネルから、ＡＰ３３パラトープの「インターナルイメージ」を表す所望のＡｂ２βを同定するために、本発明者らは、抗原結合ポケット内の各残基がアラニンに個別に変異されたＡＰ３３抗体変異体のパネルを使用した。ポケットの中央の８個の残基が、Ｅ２認識にとって必須であり、同じ８個の残基がまた、Ｂ２．１Ａと名付けられたＡｂ２のうちの１種の結合にとって必要であった。これは、Ｂ２．１Ａの分子表面が、Ｅ２上のＡＰ３３エピトープのものとよく似ていることを示す。
【０２８０】
［実施例２．２］
Ｂ２．１Ａを用いるワクチン接種は、ＨＣＶ  Ｅ２を認識するＡｂ３抗体を誘発する
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＫＬＨとコンジュゲートしているＢ２．１Ａを用いてワクチン接種した。４匹のマウスの各群に、異なるアジュバントを使用した：（Ａ）完全フロイント／不完全フロイント（ＣＦＡ／ＩＦＡ）；（Ｂ）ミョウバン；（Ｃ）ミョウバン＆リポ多糖類（ＬＰＳ）；（Ｄ）Ｑｕｉｌ−Ａ。免疫及び免疫前血清を、以下についてＥＬＩＳＡによって試験した
１．ＡＰ３３−Ｂ２．１Ａ相互作用の遮断：１：３００希釈の血清を、Ｂ２．１Ａでコーティングしたマイクロタイタープレート上でビオチン化ＡＰ３３（ｂ−ＡＰ３３）とともに共インキュベートした。ｂ−ＡＰ３３のＢ２．１Ａとの結合の減少は、競合血清抗体による相互作用の遮断を示す。
２．Ｅ２との結合：１：３００希釈の血清を、Ｅ２でコーティングしたマイクロタイタープレート上でインキュベートした。血清抗体の結合は、Ｅ２特異的Ａｂ３抗体の存在を示す。
【０２８１】
結果
すべての免疫血清は、ｂ−ＡＰ３３のＢ２．１Ａとの結合を強力に阻害し、それらがＢ２．１Ａ特異的抗体を含有することを示した。しかし、それらのすべてが、Ｅ２特異的抗体を含有するわけではない。免疫血清Ａ２及びＤ３は、最も強いＥ２反応性を示し、３００を超える抗Ｅ２力価を有する。予想されるように、免疫前血清は、一様に陰性である。これらの結果は、Ｂ２．１Ａは、Ｅ２特異的応答を誘発できることを示す。
図８を参照のこと。
【０２８２】
［実施例２．３］
Ｂ２．１Ａを用いるワクチン接種は、ＡＰ３３と同一エピトープと結合するＡｂ３抗体を誘発する
Ａ）ペプチド阻害
免疫血清Ａ２及びＤ３並びに抗Ｅ２モノクローナル抗体（ＭＡｂ）ＡＰ３３及びＡＬＰ９８を、ペプチドとともにプレインキュベートし、Ｅ２でコーティングしたマイクロタイタープレートに移し、抗マウスＨＲＰを用いて結合された抗体を検出した。
【０２８３】
結果
免疫血清中のＡｂ１（ＡＰ３３）の及びＡｂ３のＥ２との結合は、ＡＰ３３エピトープに相当するペプチドによって特異的に阻害される。Ｗ４２０、ＡＰ３３の必要不可欠な接触残基が、Ｒによって置換されているペプチドによっても、又は無関係の制御配列によっても阻害はない。予想されるように、Ｅ２上の異なる線状エピトープと結合するＡＬＰ９８は、阻害されない。
図９を参照のこと。
【０２８４】
Ｂ）ＡＰ３３エピトープにわたるアラニンスキャニング
ＥＬＩＳＡを使用して、ＡＰ３３エピトープにわたる各残基が、アラニンによって個別に置換されたＥ２変異体のパネルを用いて、免疫血清Ａ２及びＤ３におけるＡｂ３抗体の反応性を試験した。ＭＡｂ  ＡＰ３３及びＡＬＰ９８は、それぞれ、陽性及び陰性対照として役立てた。
【０２８５】
結果
ＡＰ３３のＥ２との結合は、Ｌ４１３、Ｎ４１５、Ｇ４１８又はＷ４２０のアラニン置換によって低減された。これは、本発明者らのこれまでのデータ２と及びこれら４種の残基が分子界面で埋もれているＡＰ３３−ペプチド複合体の結晶構造と１一致する。Ａｂ３抗体の結合プロファイルは、ＡＰ３３のものと極めて類似していた：Ｅ２とのその結合は、同じ４種の変異によって、またＩ４１４のアラニン置換によっても低減又は抑止された。予測されたように、ＡＬＰ９８の結合は、置換のいずれかによって影響を受けなかった。
【０２８６】
これは、Ｂ２．１Ａを用いるワクチン接種がＡＰ３３様抗体を誘発するという有力な証拠である。
図１０を参照のこと。
【０２８７】
［実施例２．４］
免疫血清におけるＥ２特異的Ａｂ３抗体の力価
図１１Ａは、免疫血清Ａ２及びＤ３から得た、非免疫マウス血清（ＮＩＭ）から得た、並びに抗Ｉｄ  Ａ１６４を用いてワクチン接種されたマウスから得た精製総ＩｇＧの段階希釈を、ＥＬＩＳＡによってＥ２結合について試験したことを示す。ＭＡｂ  ＡＰ３３及びＡＬＰ９８は、陽性対照として役立てた。
【０２８８】
図１１Ｂは、免疫血清Ａ２及びＤ３から得たＥ２特異的Ａｂ３抗体が、固定化されたＥ２上で親和性精製されたことを示す。精製Ａｂ３抗体の、及びＡＰ３３の段階希釈を、Ｅ２結合についてＥＬＩＳＡによって試験した。
【０２８９】
結果
血清Ａ２及びＤ３から得た総ＩｇＧの抗Ｅ２力価は、ＡＰ３３のものよりも約１０００倍低かったが、Ｅ２特異的親和性精製されたＩｇＧの抗Ｅ２力価は、ＡＰ３３のものよりも２〜３倍低いだけであった。総合すると、これらのデータは、免疫血清中の総ＩｇＧに対するＥ２特異的抗体の割合は、１／５００〜１／２０００の範囲であることを示す。
【０２９０】
［実施例２．５］
Ｂ２．１Ａを用いるワクチン接種は、ウイルスを中和するＡｂ３抗体を誘発する
ＨＣＶｃｃを、Ｂ２．１Ａを用いてワクチン接種されたマウスの血清から親和性精製されたＥ２特異的ＩｇＧの段階希釈とともに１時間プレインキュベートした。ウイルス−ＩｇＧ混合物を使用して、Ｈｕｈ７−Ｊ２０リポーター細胞を感染させた３。３日後に細胞培養培地中に存在する分泌性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）リポーターのレベルによってウイルス増殖を測定した。別の抗Ｉｄを用いてワクチン接種されたマウスから精製されたＭＡｂ  ＡＰ３３及びＩｇＧは、それぞれ、陽性及び陰性対照として役立てた。
【０２９１】
結果
Ｂ２．１Ａによって誘発されたＡｂ３抗体は、ウイルス感染力を極めて効率的に中和し、ＡＰ３３のものの約２倍であるＩＣ５０を有する。
【０２９２】
概要
本発明者らは、ワクチン接種の際に同様の抗体を誘導する免疫原をリバースエンジニアリングするために、広域中和抗体、ＡＰ３３を、鋳型として使用した。これは、ＡＰ３３結合ポケットのインターナルイメージを表し、したがって、保護的エピトープを模倣する抗イディオタイプ抗体を単離することによって達成された。本発明者らは、このような集中された構造ベースのアプローチの成功を、ＨＣＶワクチンの分野において初めて実証する。
【０２９３】
実施例２の参考文献
1. Potter, J.A. et. al （2012）.  Towards a hepatitis C virus vaccine: the structural basis of hepatitis C virus neutralization by AP33, a broadly neutralizing antibody.  J. Virol. 86, 12923-12932.
2. Tarr, A. W. et. al （2006）. Characterization of the hepatitis C virus E2 epitope defined by the broadly neutralizing monoclonal antibody AP33. Hepatology 43, 592-601.
3. Iro, M. et. al （2009）. A reporter cell line for rapid and sensitive evaluation of hepatitis C virus infectivity and replication. Antivir. Res. 83, 148-155.
【実施例３】
【０２９４】
ｓｃＦｖ
Ｂ２．１ＡからｓｃＦｖを製造した。哺乳動物などの真核生物発現のための及び細菌などの原核生物発現のためのｓｃＦｖアミノ酸配列が以下に示されている。
【０２９５】
哺乳動物発現構築物。
Ｂ２．１Ａ  ｓｃＦｖ配列を含有する哺乳動物発現構築物を作製した。この配列を、ＣＨＯ細胞において発現させ、精製した。精製された生成物は、ＥＬＩＳＡにおいてＡＰ３３と相互作用するとわかった。Ｂ２．１Ａ  ｓｃＦｖタンパク質配列を以下に示す。
【数３】
0006538151.tif 000011
【０２９６】
点線で下線が引かれた文字列＝ｓｃＦｖの細胞培養培地への分泌を可能にするＩｇＫリーダー配列
四角で囲まれた文字列＝ｖＨ配列；ＣＤＲは、下線が引かれ；好ましいＣＤＲは、影が付けられている
太字の文字列＝ｖＬ配列；ＣＤＲは、下線が引かれ；好ましいＣＤＲは影が付けられている
破線で下線が引かれた文字列＝リンカー配列
二本の下線が引かれた文字列＝ｃＦｖのアフィニティー精製のための６−ｈｉｓタグ
【０２９７】
細菌発現構築物
上記のＢ２．１Ａ  ｓｃＦｖ哺乳動物発現構築物を鋳型として使用して、ｓｃＦｖをコードする配列を提供し、これを、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）に対してインフレームで、細菌発現ベクターｐＭＢＰ中にサブクローニングした。ＭＢＰ−Ｂ２．１Ａ  ｓｃＦｖアミノ酸配列を以下に示す。ｓｃＦｖを細菌中で発現させ、ＭＢＰドメインの切断後に精製し、マウス免疫処置実験において試験した。細菌ｓｃＦｖは、ＡＰ３３様抗体の誘発において有効であったが、哺乳動物ｓｃＦｖよりも有効ではなかった。
【０２９８】
ＭＢＰ−Ｂ２．１Ａ  ｓｃＦｖ融合タンパク質配列を以下に示す：
【数４】
0006538151.tif 000012
【０２９９】
切断された配列：
【数５】
0006538151.tif 000013
点で下線が引かれた文字列＝ＭＢＰ配列
／＝ＭＢＰ−ｓｃＦｖ融合タンパク質からＭＢＰを除去するためのタンパク質分解による切断部位
四角で囲まれた文字列＝ｖＨ配列；ＣＤＲは、下線が引かれ；好ましいＣＤＲは、影が付けられている
太字の文字列＝ｖＬ配列；ＣＤＲは、下線が引かれ；好ましいＣＤＲは影が付けられている
破線で下線が引かれた文字列＝リンカー配列
【０３００】
核酸構築物
以下に示される例示的配列では、当業者が望む場合には、コード配列は別個に取り出され、選択したベクター中に配置され得る。
【０３０１】
pDisMod2−Ｂ２．１Ａ−ｓｃＦｖ−例示的配列
Ｂ２．１Ａ  ｓｃＦｖ配列を保持する修飾されたpDisplayベクター（コード配列は強調されている）
以下のようなｓｃＦｖコード配列キー：
【数６】
0006538151.tif 000014
0006538151.tif 000015
0006538151.tif 000016
0006538151.tif 000017
【０３０２】
pDisMod2−Ｂ２．１Ａ−ｓｃＦｖ−好ましい配列
Ｂ２．１Ａ  ｓｃＦｖ配列を保持する修飾されたpDisplayベクター（コード配列は強調されている）。上記の例示的配列（配列番号１６）に対して２つの変化がある−これらは、行７８１中にあり、太字で印が付けられている。
【０３０３】
以下のようなｓｃＦｖコード配列キー：
【数７】
0006538151.tif 000018
0006538151.tif 000019
0006538151.tif 000020
0006538151.tif 000021
【実施例４】
【０３０４】
Ｂ２．１Ａ抗体の製造
本明細書において開示されるようにＢ２．１ＡのＣＤＲを組み込む従来の抗体発現システムを使用して、Ｂ２．１Ａ抗体鎖を製造する。
【０３０５】
この実施例では、使用される従来の発現システムは、5、rue Jean Rodier、F-31400 Toulouse、FranceのInvivoGen社から市販されている「抗体作製」システムである。
【０３０６】
pFUSEss−ＣＨＩｇ−ｍＧ１−Ｂ２．１ａ−ｖＨ−実施例配列
全重鎖を作製するためにpFUSEss−ＣＨＩｇ−Ｍｇ１中にクローニングされたＢ２．１Ａ  ｖＨ配列。
強調されたコード配列：
【数８】
0006538151.tif 000022
0006538151.tif 000023
0006538151.tif 000024
【０３０７】
pFUSEss−ＣＨＩｇ−ｍＧ１−Ｂ２．１ａ−ｖＨ−好ましい配列
全重鎖を作製するためにpFUSEss−ＣＨＩｇ−Ｍｇ１中にクローニングされたＢ２．１Ａ  ｖＨ配列。上記の例示的配列（配列番号１７）に関連して１つの変更がある−これは、行６０１中にあり、太字で印が付けられている。
強調されたコード配列：
【数９】
0006538151.tif 000025
0006538151.tif 000026
0006538151.tif 000027
【０３０８】
pFUSE2ss−ＣＬＩｇ−ｍｋ−Ｂ２．１ａ−ｖＬ
全軽鎖を作製するためにpFUSEss−ＣＬＩｇ−Ｍｋ中にクローニングされたＢ２．１Ａ  ｖＬ配列
強調されたコード配列：
【数１０】
0006538151.tif 000028
0006538151.tif 000029
0006538151.tif 000030
【実施例５】
【０３０９】
マウスにおける感作研究
マウスモデル
本発明者らは、Dorner et alによって開発された免疫適格性マウスモデルを使用する（Dorner et al 2011 Hepatology Vol 54 No 5 pages 1873-1875; Dorner et al 2011 Nature Vol 474 pages 208-211; Dorner et al 2013 Methods Vol 59 pages 249-257; Zeisel et al 2011）。これは、ＨＣＶワクチンを試験するのに最も適当なモデルである。
【０３１０】
市販のトランスジェニックGt（ROSA）26Sortm1（Luc）Kaelinマウス（Rosa26-Fluc）は、ホタルルシフェラーゼ発現を制限するＬｏｘＰ−が両側に隣接するＳＴＯＰカセットを含有する。それらは、必要不可欠な細胞表面受容体（ヒトＣＤ８１、オクルーディン、クローディン１及びＳＲ−ＢＩ）をコードするアデノウイルスによる感染によってＨＣＶ進入にとって許容的にされ、次いで、環化組換え（ＣＲＥ）リコンビナーゼを発現する組換えバイシストロニックＨＣＶｃｃに感染する。ＨＣＶがマウス肝細胞に侵入すると、組換えウイルスゲノムは、翻訳され、ＣＲＥタンパク質が発現される。ＣＲＥリコンビナーゼは、ＳＴＯＰカセットを切り出し、ルシフェラーゼリポーターを活性化し、生物発光をもたらし、これは、全身生物発光イメージャーを使用して測定され得る。
【０３１１】
実験の詳細
１．市販のトランスジェニック（Rosa26-Fluc ＣＲＥリポーターマウスの小コロニー（約３０）を確立する。
２．  Ｂ２．１Ａ  Ｆａｂ−ＫＬＨを用いて小規模ワクチン接種（６〜８匹の動物）を実施し、各ワクチン接種後にＥＬＩＳＡによって抗Ｅ２血清力価を調べる。（フロイントの完全アジュバント中の免疫原を用いる一次ワクチン接種と、それに続くフロイントの不完全アジュバント中の免疫原を用いる５回の追加免疫）。
３．適当な抗Ｅ２血清力価が得られると、上記のように多数（２４）にワクチン接種する。
４．ヒトＣＤ８１及びＯＣＬＮ並びにヒト又はマウスＳＲ−ＢＩ及びＣＬＤＮ１をコードするアデノウイルスベクターを投与することによって、免疫処置マウスを遺伝子的にヒト化する。
５．２４時間後、ＨＣＶ−ＣＲＥの２ｘ１０７  ＴＣＩＤ５０を投与する。さまざまな遺伝子型を表す４種の異なるＨＣＶウイルスを使用する。
６．７２時間後、全身イメージャーを使用して生物発光を測定し、抗Ｅ２力価をＨＣＶ感染と相関させる。逆相関は、ワクチンがＨＣＶ感作から保護することを示す。
【実施例６】
【０３１２】
Ｂ２．１Ａ構造
ＡＰ３３のＦａｂ断片を、Ｂ２．１Ａの一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）との複合体において再結晶化し、構造を１．８Åの解像度に決定し、これは、すべてのアミノ酸側鎖の位置及び２つの抗体間の界面の水分子の位置を明確に示す。このＡｂ１−Ａｂ２複合体の非対照ユニットは、ＡＰ３３  Ｆａｂの１つの分子及びＢ２．１Ａ  ｓｃＦｖの１つの分子から構成されていた。構造座標を決定した。
【０３１３】
構造（図１３）は、Ｂ２．１ＡのＣＤＲループは、Kabat et alによってよりもChothia et alによって記載されるＩｇＧ領域の定義に厳密に対応することを示す。
【０３１４】
Ｂ２．１Ａの結合部位は、全体的に凹面表面を有し、それから、ＡＰ３３のＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３とＣＤＲ−Ｈ３ループとの間に形成される溝に向かって、ＣＤＲ−Ｌ１及びＣＤＲ−Ｈ３ループが外向きに突出する。ＡＰ３３上の溝は、全体的に負電荷を有し、Ｂ２．１Ａ上のＬ１ループは、完全に正電荷を有する。全体的に、両方の結合部位は、多数の芳香族残基の存在のために疎水性を有する。Ｂ２．１Ａのすべての重鎖及び軽鎖ＣＤＲは、水素結合によるＡＰ３３との相互作用及び他の親水性相互作用、疎水性相互作用並びにファンデルワールス接触に関与している。界面の面積は、１０６９Åであり、これは、Ｂ２．１ａ  ｓｃＦｖの総表面のおよそ９％である。
【実施例７】
【０３１５】
Ｂ２．１Ａによる抗原模倣
このＡｂ１−Ａｂ２複合体の、Ａｂ１−Ａｇ  複合体（すなわち、そのＥ２エピトープに対応するペプチドとの複合体中のＡＰ３３の構造（Potter et al. 2012;ｐｄｂ受託コード４ｇａｇ））との比較は、Ｂ２．１ＡがＡＰ３３抗原結合部位中にドッキングすることを示す（図１４）。Ｂ２．１ＡのＣＤＲ−Ｈ３は、配列類似性がなくても、Ｅ２エピトープの形状及び特徴を模倣することを明らかにする。Ａｂ１−Ａｇ複合体において深く埋もれている重要なＥ２残基Ｗ４２０は、Ａｂ１−Ａｂ２複合体においてＢ２．１ＡのＦＨ９８によって模倣される（図１５ａ）。
【０３１６】
Ａｂ１−Ａｇ界面での他の重要なＥ２残基として、Ｇ４１８、Ｎ４１５及びＬ４１３がある。Ｇ４１８の周囲の抗原の形状は、ＡＰ３３のＷＬ９６と広範な接触を形成するＢ２．１Ａ  ＹＨ１００Ａの側鎖によって保存されている（図１５ｂ）。Ａｂ１−Ａｇ複合体中に深く埋もれているＥ２残基Ｎ４１５の極性特徴は、Ｂ２．１ＡのＮＨ１００によって付与され、隣接するＹＨ１００Ａは、ＡＰ３３のＹＨ５０に水素結合を提供する（図１５ｃ）。興味深いことに、Ｌ４１３のＡＰ３３との相互作用は、アミノ酸残基によってではなくＡｂ１−Ａｂ２複合体中の５つの水分子によって模倣される（図１５ｄ）。
【０３１７】
本発明者らの生化学的及び免疫処置データと一致して（表１及び図９〜１２に示される）、この構造解析によって、Ｂ２．１Ａは、Ａｂ２β、すなわち、その「インターナルイメージ」であるように十分に正確にＡｂ１の抗原結合部位（パラトープ）に適合する抗イディオタイプ抗体であること、同様に、元の抗原の有効な模倣であることが確認される。
【実施例８】
【０３１８】
Ｂ２．１Ａ結合親和性
本発明者らは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってＡＰ３３に対するＢ２．１Ａの結合親和性を測定した。Ｂ２．１Ａ  ｓｃＦｖを３種の異なる方法で固定化した：（ａ）ＣＭ５チップへのアミンカップリング；（ｂ）ＣＭ４チップへのアミンカップリング；（ｃ）ＮＴＡチップへのヒスチジンタグによる捕獲。次いで、シングルサイクルカイネティクスを使用してＡＰ３３を表面に注射した。すべてのデータセットは、高品質であり、３回の実験から、それぞれ、２９ｎｍ、２０ｎｍ及び８ｎｍの親和性定数を得た：
【０３１９】
【表４】
0006538151.tif 000031
【０３２０】
これらの値は、抗体ＭＲＣＴ１０（ヒト化ＡＰ３３−ＷＯ２００９／０８１２８５）の可溶性Ｅ２６６１との結合についてＳＰＲによって測定された５．５〜６．６ｎｍの親和性定数に匹敵する（Pantua et al 2013）。
【実施例９】
【０３２１】
Ｂ２．１Ａ変異原性
Ｂ２．１Ａ  ｓｃＦｖの結晶学的構造は、タンパク質−タンパク質相互作用予測サーバーと一緒に、本発明者らを、ＡＰ３３に対するその結合親和性を増大する目的で点変異を設計するように刺激した。本発明者らは、これは、Ｂ２．１Ａを用いるワクチン接種によって誘発されるＡｂ３抗体のＨＣＶ  Ｅ２に対する親和性の増大に翻訳され得ると推論した。
【０３２２】
以下の変異をＢ２．１Ａの重鎖配列中に導入した：Ｂ２．１Ａ  ｓｃＦｖのマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）との融合を含む野生型（ＷＴ）タンパク質中のＷ３３Ｖ、Ｅ５０Ｆ、Ｅ５０Ｙ、Ｆ９８Ｙ、Ｆ９８Ｗ、Ｎ１００Ｇ、Ｎ１００ｄｅｌ及びＧ１００ＢＦ。
【０３２３】
変異体タンパク質のＡＰ３３に対する親和性を、検出タグとしてＭＢＰを使用するＡＰ３３捕獲ＥＬＩＳＡによって評価した。図１６ｂに示されるように、変異体のほとんどは、ＡＰ３３との結合をほとんど示さないか、又は全く示さなかった。変異体のうち２種、Ｆ９８Ｗ及びＮ１００Ｇのみが、結合を保持したが、ＷＴよりも弱かった（図１６ａ）。
【０３２４】
Ｓ字形曲線をデータにフィッティングすることによって推定されたＥＣ５０値は、ＷＴについて１．４８μｇ／ｍｌ及びＦ９８Ｗについて４．６μｇ／ｍｌであった。
【０３２５】
したがって、変異原性によってＡＰ３３に対するＢ２．１Ａの親和性を改善することは可能ではないと思われる。
【０３２６】
これらの結果は、ＡＰ３３は、最良の可能性ある抗体を表すようであるということを実証し、合理的に設計された代替物よりも証明できるほどに優れており、したがって、異なるアミノ酸配列を有する他の抗体種を上回る相当な技術的利点を有することをさらに示す。
【実施例１０】
【０３２７】
Ｂ２．１Ａを用いるワクチン接種／ＨＣＶ感染からの保護
Marcus Dornerによって開発された免疫適格性マウスモデル（Dorner et al 2011; Dorner et al 2013）を使用して、Ｂ２．１Ａを用いるワクチン接種が、ＨＣＶによる感染から保護し得るか否かを試験した。これは、ＨＣＶワクチンを試験するための最も適当なモデルである。市販のトランスジェニックRosa26-Flucマウスは、ホタルルシフェラーゼ発現を制限するＬｏｘＰが両側に隣接するＳＴＯＰカセットを含有する。それらは、必要不可欠な細胞表面受容体（ヒトＣＤ８１、オクルーディン、クローディン１及びＳＲ−ＢＩ）をコードするアデノウイルスによる感染によって、ＨＣＶ進入にとって許容的にされ、次いで、環化組換え（ＣＲＥ）リコンビナーゼを発現する組換えバイシストロニックＨＣＶｃｃに感染する。ＨＣＶが、マウス肝細胞に侵入すると、組換えウイルスゲノムは、翻訳され、ＣＲＥタンパク質が発現される。ＣＲＥリコンビナーゼは、ＳＴＯＰカセットを切り出し、ルシフェラーゼリポーターを活性化し、生物発光をもたらし、これは、全身生物発光イメージャーを使用して測定される。
【０３２８】
マウスにおける免疫処置及び感作実験の詳細なプロトコール
マウス
株FVB.129S6（B6）-Gt（ROSA）26Sortm1（Luc）Kael/J、（Rosa26-Flucと略される；Jackson Laboratoriesストック番号００５１２５）。２〜３交配対を購入し、マウスを繁殖させて、免疫処置にとって十分な数を得る。
【０３２９】
免疫処置プロトコール１
免疫原：（Ａ）ＫＬＨとコンジュゲートしているＢ２．１Ａ  Ｆａｂ、１ｍｇ／ｍｌ
（Ｂ）ＫＬＨとコンジュゲートしているペプチドＩＱＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩＮＳ、１ｍｇ／ｍｌ
（ペプチドは、ＡＰ３３エピトープ、すなわち、ＨＣＶ  Ｅ２のａａ４１２〜４２３と対応する）
【０３３０】
一次ワクチン接種のために、免疫原（Ａ）とフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）の１：１エマルジョンを作製する。最終タンパク質濃度は、０．５ｍｇ／ｍｌとする。
すべての追加免疫ワクチン接種のために、必要に応じて免疫原（Ａ）又は（Ｂ）と、フロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）の１：１  エマルジョンを作製する。
【０３３１】
０日目  免疫前採血
７日目  一次ワクチン接種。ＣＦＡ中、免疫原（Ａ）の、マウスあたり１００μｌ中５０μｇの皮下注射。
２８日目  追加免疫１。ＩＦＡ中、免疫原（Ａ）の、マウスあたり１００μｌ中５０μｇの皮下注射。
３５日目  試験採血１。
４２日目  追加免疫２。ＩＦＡ中、免疫原（Ｂ）の、マウスあたり１００μｌ中５０μｇの皮下注射。
４９日目  試験採血２。
５６日目  追加免疫３。ＩＦＡ中、免疫原（Ａ）の、マウスあたり１００μｌ中５０μｇの皮下注射。
６３日目  試験採血３。
７０日目  追加免疫４。ＩＦＡ中、免疫原（Ｂ）の、マウスあたり１００μｌ中５０μｇの皮下注射。
７７日目  試験採血４。
８４日目  追加免疫５。ＩＦＡ中、免疫原（Ａ）の、マウスあたり１００μｌ中５０μｇの皮下注射。
９１日目  試験採血５。
【０３３２】
タイミングは、正確に上記の通りでなくてもよい。第１の追加免疫は、一次免疫処置後少なくとも３週間でなくてはならず、その後の追加免疫は、少なくとも２週間の間隔でなくてはならない。追加免疫後７〜１０日に試験採血されなくてはならない。
【０３３３】
免疫処置プロトコール２
免疫原：ＫＬＨとコンジュゲートしているＢ２．１Ａ  Ｆａｂ、１ｍｇ／ｍｌ
一次ワクチン接種のために、免疫原とフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）の１：１エマルジョンを作製する。最終タンパク質濃度は、０．５ｍｇ／ｍｌである。
【０３３４】
すべての追加免疫ワクチン接種のために、免疫原とフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）の１：１エマルジョンを作製する。
０日目  免疫前採血
７日目  一次ワクチン接種。ＣＦＡ中、免疫原の、マウスあたり１００μｌ中５０μｇの皮下注射。
２８日目  追加免疫１。ＩＦＡ中、免疫原の、マウスあたり１００μｌ中５０μｇの皮下注射。
３５日目  試験採血１。
４２日目  追加免疫２。ＩＦＡ中、免疫原の、マウスあたり１００μｌ中５０μｇの皮下注射。
４９日目  試験採血２。
５６日目  追加免疫３。ＩＦＡ中、免疫原の、マウスあたり１００μｌ中５０μｇの皮下注射。
６３日目  試験採血３。
７０日目  追加免疫４。ＩＦＡ中、免疫原の、マウスあたり１００μｌ中５０μｇの皮下注射。
７７日目  試験採血４。
８４日目  追加免疫５。ＩＦＡ中、免疫原の、マウスあたり１００μｌ中５０μｇの皮下注射。
９１日目  試験採血５。
【０３３５】
タイミングは、正確に上記の通りでなくてもよい。第１の追加免疫は、一次免疫処置後少なくとも３週間でなくてはならず、その後の追加免疫は、少なくとも２週間の間隔でなくてはならない。追加免疫後７〜１０日に試験採血されなくてはならない。
【０３３６】
試験採血により、マウスが、ＨＣＶ  Ｅ２特異的抗体を発達させたことが示された場合には、以下のプロトコールに従う遺伝子ヒト化及び感作を進める。試験採血により、マウスが、２回又は３回の追加免疫後にＨＣＶ  Ｅ２特異的抗体の高い力価（１：１０，０００を超える）を発達させたことが示された場合には、すべての追加免疫を与える必要はない。
【０３３７】
本発明者らは、２種の免疫処置プロトコールを記載した。第１のプロトコールは、Ｂ２．１ＡのＣＤＲによって模倣されるＥ２エピトープに対応するペプチドを用いる追加免疫を含む。これは、Ｂ２．１Ａの所望の領域での免疫応答に集中することを目的とする。第２のプロトコールは、Ｂ２．１Ａ  Ｆａｂ単独を用いて追加免疫する。本発明者らのデータは、本発明者らが、Ｂ２．１Ａ  Ｆａｂ単独を使用してＥ２特異的抗体を明確に誘発し得ることを示す。ペプチドを用いて追加免疫することは、利点を付与する場合も付与しない場合もある。当業者ならば、その必要性に従ってプロトコールを選択できる。
【０３３８】
試験採血液を、当技術分野で公知のように、すなわち、試験採血し、それを凝血させ、上清をとり、遠心分離して、血餅とともに除去されない任意の細胞をペレットとし、１ｍＭアジ化ナトリウムを添加し、必要とされるまで４℃で保存することによって処理する。
【０３３９】
ＥＬＩＳＡによるｓＥ２によるマウス血清の滴定１
１．１００μｌのＰＢＳ中、０．２μｇ／ウェルの精製された可溶性ＨＣＶ  Ｅ２２を用いて、９６ウェルImmulon ２  ＨＢプレートのウェルをコーティングする。室温で一晩インキュベートする。
２．ｓＥ２を廃棄し、ＰＢＳＴ３中、２％脱脂粉乳、２００μｌ／ウェルを用いてブロッキングする。室温で２時間インキュベートする。
３．ＰＢＳＴを用いて３回洗浄する。プレートは、この段階で−２０℃又は４℃で保存され得る。
４．１００μｌのＰＢＳＴ中の２倍希釈の血清を添加する。室温で２時間インキュベートする。
５．ＰＢＳＴを用いて３回洗浄する。
６．ＰＢＳＴで１／３０００希釈した、１００μｌ／ウェルの抗マウスＨＲＰコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ  Ａ４４１６）を添加する。室温で１時間インキュベートする。
７．ＰＢＳＴを用いて４回洗浄する。
８．１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質を添加する。室温で３０分間インキュベートする。
９．  ５０μｌ／ウェルの０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加することによって反応を停止する。
１０．マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍでの吸光度を読み取る。
【０３４０】
１血清の力価は、陽性抗原特異的シグナルをもたらす最低濃度として定義される。このアッセイでは、陽性シグナルは、同一希釈の非免疫、対照血清によって生じるものよりも３倍高いＡ４５０読み取りとして定義される。いくつかの非免疫血清からの平均シグナルが、対照として使用される。
２昆虫細胞から発現され、精製された可溶性Ｅ２（ｓＥ２）。ＨＣＶポリタンパク質のａａ３８４〜６６１、すなわち、膜に隣接した及び膜貫通領域を含まないエクトドメインを含む。
３ＰＢＳＴ＝ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０
【０３４１】
遺伝子的にヒト化されたRosa26-FlucマウスのＨＣＶ−ＣＲＥの感染
アデノウイルス及び組換えＨＣＶ−ＣＲＥの調製並びにｉｎ  vivｏ生物発光イメージングによるＨＣＶ進入の解析は、当技術分野で公知のように、例えば、特にこの技術の実施の詳細な説明のために参照により明確に本明細書に組み込まれるDorner et al, 2013の節２．２．１、２．２．２及び２．３．２に記載の通り、正確に実施される。
【０３４２】
この実施例では、本発明者らは、６匹のマウスのデータを示す。３匹のマウスは、ＫＬＨとカップリングしているＢ２．１Ａ  Ｆａｂを用いる一次ワクチン接種、続いて、５回の追加免疫ワクチン接種を受けた。これは、２匹のマウスにおいて１：１２，８００の、３匹目のマウスにおいて１：１，６００の堅固な抗Ｅ２力価を誘発した（図１７）。
【０３４３】
Ｅ２反応性は、ＡＰ３３エピトープを含有するペプチドによって阻害されることから、Rosa26-Flucマウスにおいて誘発されたＡｂ３抗体は、ＡＰ３３と同一の特異性を有することが分かる（図１８）。これは、Rosa26 Fluc免疫血清におけるＡＰ３３の及びＡｂ３のＥ２との結合が、ＡＰ３３エピトープを含有するＷＴペプチドによって濃度依存的な様式に特異的に阻害されることを示す。Ｗ４２０、ＡＰ３３の必要不可欠な接触残基が、Ｒによって置換されているペプチドによる阻害はない。予想されるように、Ｅ２上の異なる線状エピトープ（ａａ残基６４４〜６５１）と結合するＡＬＰ９８は、ペプチドのいずれかによって阻害されない。
【０３４４】
したがって、Rosa26Flucマウスは、良好な免疫応答を示した。ワクチン接種された及びワクチン接種していないマウスは、上記のように、ＨＣＶ感染に対して許容的にされ、次いで、２ｘ１０７  ＴＣＩＤ５０のＨＣＶ−ＣＲＥを用いて感作される。
【０３４５】
実施例の参考文献
1. Chothia, C., A. M. Lesk, A. Tramontano, M. Levitt, S. J. Smith-Gill, G. Air, S. Sheriff, E. A. Padlan, D. Davies, W. R. Tulip et al. (1989).  Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature 342, 877---883
2. Dorner, M., Horwitz, J.A., Robbins, J.B., Barry, W.T., Feng, Q., Mu, K., Jones, C.T., Schoggins, J.W., Catanese, M.T., Burton, D.R., Law, M., Rice, C.M. & Ploss, A. (2011).  A genetically humanized mouse model for hepatitis C virus infection.  Nature 474, 208-211
3. Dorner, M., Rice, C.M. & Ploss, A. (2013).  Study of hepatitis C virus entry in genetically humanized mice.  Methods 59, 249-257
4. Kabat, E. A., T. T. Wu, H. M. Perry, K. S. Gottesman, and C. Foeller. (1991). Sequences of proteins of immunological interest.  5th Edition ed. U.S. Department of Health and Human Services/NIH, Bethesda, MD
5. Potter, J.A., Owsianka, A.M., Jeffery, N., Matthews, D,J, Keck, Z.-Y., Lau, P.L., Foung, S.K.H., Taylor, G.L. & Patel, A.H. (2012).  Towards a hepatitis C virus vaccine: the structural basis of hepatitis C virus neutralization by AP33, a broadly neutralizing antibody.  J. Virol. 86, 12923-12932
6. Pantua, H., Diao, J., Ultsch, M., Hazen, M., Mathieu, M., McCutcheon, K., Takeda, K., Date, S., Cheung, T.K., Phung, Q., Hass, P., Arnott, D., Hongo, J-A., Matthews, D.J., Brown, A., Patel, A.H., Kelley, R.F., Eigenbrot, C. and Kapadia, S.B. (2013).  Glycan shifting on hepatitis C virus (HCV) E2 glycoprotein is a mechanism for escape from broadly neutralizing antibodies.  J. Mol. Biol. 425, 1899-1914
【０３４６】
本発明の例示的実施形態を、添付の図面を参照して本明細書において詳細に開示したが、本発明は、正確な実施形態に制限されず、種々の変法及び改変が、添付の特許請求の範囲に定義されるような本発明の範囲及びその等価物から逸脱することなく当業者によって達成され得るということは理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６】
0006538151.tif 000040
【図７】
0006538151.tif 000041
【図８】
0006538151.tif 000042
【図９】
0006538151.tif 000043
【図１０】
0006538151.tif 000044
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
0006538151.tif 000047
【図１４】
0006538151.tif 000048
【図１５】
0006538151.tif 000049
【図１６】
0006538151.tif 000050
【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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