(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分及び薬学的に許容されるキャリアを含む配合医薬組成物であって、その有効成分は、クェルセチン-3-Ｏ-β-D-グルクロノシド、イソクェルシトリンとクェルセチンが、1.1-2.4：1.3-3.3：1.2-3.1のモル比で構成される
ことを特徴とする脂質代謝障害症の治療又は予防のための配合医薬組成物。
【請求項２】
クェルセチン-3-Ｏ-β-D-グルクロノシド、イソクェルシトリンとクェルセチンのモル比が1.3-2.1：1.6-3.0：1.5-2.9である
ことを特徴とする請求項１に記載の脂質代謝障害症の治療又は予防のための配合医薬組成物。
【請求項３】
クェルセチン-3-Ｏ-β-D-グルクロノシド、イソクェルシトリンとクェルセチンのモル比が1.4-1.9：1.8-2.6：1.8-2.6である
ことを特徴とする請求項２に記載の脂質代謝障害症の治療又は予防のための配合医薬組成物。
【請求項４】
請求項１、２又は３に記載される配合医薬組成物を使用し、脂質代謝障害症を治療又は予防する医薬を調製するための使用。
【請求項５】
前記脂質代謝障害症は、肥満、脂肪肝、アテローム性動脈硬化又は高リポタンパク血症を含む請求項４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は天然医薬の分野に関わり、具体的には、毛チコリの有効成分であるクェルセチン-3-Ｏ-β-D-グルクロノシド、イソクェルシトリンとクェルセチンを配合した組成物に関わる。
【背景技術】
【０００２】
経済の発展、国民生活のレベルアップに伴い、様々な脂質代謝障害の病症、例えば、高脂血症、脂肪肝、肥満など病症の発症率が上昇している。2007年に発表された「中国成人血中脂質異常防止マニュアル」によると、中国において血中脂質異常の罹患率は急速に18.6％にも上った。また、最近数年、脂肪肝の発症率も急に上昇し、欧米成人の脂肪肝の罹患率は、20世紀80年代の10％から現在の31％にも上昇し、肥満な人たちとII型糖尿病患者のうち、脂肪肝の発病率が50％に昇り、酒好きやアルコール依存症の人の脂肪肝の発病率は58％にもなっている。しかし、現在、臨床に使われる脂肪降下薬の効果は満足できず、脂肪降下薬の開発は求められている。
【０００３】
漢方医薬は、数千年の歴史を経て、独特な理論体系が形成されており、漢方薬の現代研究開発の貴重な素材である。しかし、伝統的な漢方薬は複方成分が複雑であり、品質を維持しにくいため、脂肪降下漢方薬はより広い範囲で利用されることが実現されていない。漢方薬組成物は、複雑な漢方薬から無効な成分、毒性成分を取り除き、病症に対する医薬有効成分を抽出し、その割合を最適化し、最大限にその医薬効果を発揮する。クェルセチン-3-Ｏ-β-D-グルクロノシド、イソクェルシトリンとクェルセチンは、漢方薬の毛チコリ（Cichorium glandulosum Boiss et Huet）の脂肪降下有効成分である。クェルセチン-3-Ｏ-β-D -グルクロノシドは顕著な脂肪降下作用を有し、（１）肝細胞の脂肪酸の酸化を促進し、細胞内のトリグリセライドと脂質滴の含有量を減少させ、（２）血漿におけるトリグリセライドとコレステロールのレベルを下げることができる。イソクェルシトリンは、ラジカルを排除することができ、脂質の過酸化を抑制し、高脂レベルでの機体酸化ダメージに抵抗する。クェルセチンは、肝細胞におけるTNF-αとIL-6のレベルを下げ、炎症因子の表現と釈放を減らし、インスリン抵抗を改善し、脂質代謝障害の病理的な修復を促進することができる。構造式は次の通りである。
【化１】
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【０００４】
今まで、クェルセチン-3-Ｏ-β-D-グルクロノシド、イソクェルシトリン、クェルセチンを配合し、脂質代謝障害症を治療する医薬として使われることはまだ報道されていない。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は上記従来の問題点を鑑みてなされ、配合医薬組成物を開示し、その有効成分は、クェルセチン-3-Ｏ-β-D-グルクロノシド、イソクェルシトリン、クェルセチンより構成される。薬効学の試験により、三つの成分を組み合わせ、協同的に脂質代謝障害症を治療することができ、特に肥満、脂肪肝、動脈硬化又は高リポタンパク血症などの病症を治療することができる。
【０００６】
試験結果により、クェルセチン-3-Ｏ-β-D-グルクロノシド、イソクェルシトリンとクェルセチンの配合組成物は、モル比が1.1-2.4：1.3-3.3：1.2-3.1である時に、ラット初代肝細胞内の脂質滴の含有量を大幅に減少でき、脂肪減少効果は平均的に20％以上に達する。また、三者のモル比が1.3-2.1：1.6-3.0：1.5-2.9であることは好ましく、この範囲内で脂肪減少効果は平均的に30％以上に達することができる。三者のモル比が1.4-1.9：1.8-2.6：1.8-2.6であることはより好ましく、この範囲内で脂肪減少効果は平均的に40％以上にも達することができる。
【０００７】
本発明の配合医薬組成物は薬学分野における多種の製剤を調製することができ、例えば、錠剤、粒剤、注射薬、ドリッピング丸薬、カプセル、エアゾール剤、座薬、絆創膏などあり、また、経口用、又は静脈、筋肉、皮下又は他の方法の注射を経て、口、直腸、膣、皮膚で吸収し或いは鼻腔により吸入し、有効成分が含まれる医薬製剤の形で、薬学に許容される製剤の形で投与する。本発明の組成物において、医薬有効成分のほかに、薬学に許容されるキャリアとして1種又は多種の薬学的に通常使用される医薬製剤の補助剤、例えば、賦形剤、希釈剤、接着剤、安定剤等、及び化学添加物、例えば、色素、防腐剤、増味剤等を添加してもよい。
【０００８】
本発明の一部の薬効試験及びその結果は以下通りである。
【０００９】
被験薬の配合組成物溶液の調合方法は以下の通りである。クェルセチン-3-Ｏ -β-D-グルクロノシド、イソクェルシトリン、クェルセチンはジメチルスルフォキシドを溶剤として、そのうちジメチルスルフォキシドの最終濃度が0.1％未満である。
【００１０】
本発明に係る組成物溶液はD-最適設計法に基づき調合し、１４組の配合を用意し、各配合に含まれる3種類の単量体のモル比は以下の通りである。
【表１】
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【００１１】
注：各配合組成物は、クェルセチン-3-Ｏ-β-D-グルクロノシド、イソクェルシトリン、クェルセチンから構成され、総モル濃度はいずれも20μMであり、表１はモル濃度の比を示す。
【００１２】
一、本医薬はラット初代肝細胞脂質滴（Lipid droplet）の含有量への影響
Seglen原位二歩門脈灌流法に従いSDラットの肝臓から肝細胞を取り出し、百目ふるいで濾過し、500rpm、4℃にて3分間遠心し、上清液を捨て、同じ方法で肝細胞を三回洗う。細胞の数をカウントし、生きている細胞数と細胞の生存率が得られ、1.0×106cell/mLで培地をプレートに滴下する。細胞を24時間に培養した後、上清液を捨て、PBSで二回洗い、細胞を比較組、高脂モデル組、高脂モデル＋配合組に分ける。各細胞高脂モデル組に終濃度が1mmol/Lの遊離脂肪酸（free fatty acid、FFA）を添加し、ほかの組は血清を含まないWilliams'E培地を利用し最終体積が2mLまで培養する。24時間に投与した後、37℃のPBSで三回洗い、パンクレアチンで消化し、遠心し、上清液を捨て、PBSで細胞を再懸濁し、最終濃度が1μg/mLまでナイルレッド染液を添加し、励起光489nmでの蛍光値を流式検出し、蛍光強度の幾何メジアンデータを抽出し分析する。
【００１３】
実験結果は表2に示す通りである。
【表２】
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【００１４】
注：脂質滴量の含有率の削減率（%）＝（モデル組における脂質滴量の含有率の平均値-薬剤投入組における脂質滴量の含有率の平均値）×100 %/モデル組における脂質滴量の含有率の平均値。
【００１５】
流式細胞分析により以下のことが分かる。代表蛍光強度とするメジアンは、スペクトルのピックの右への移動につれて増加し、これは蛍光強度が徐々に増加することを示し、脂質滴量も増加している。配合組1〜11はクェルセチン-3-Ｏ-β-D-グルクロノシド、イソクェルシトリン、クェルセチンからなり、組番号12〜14はそれぞれ単量体クェルセチン-3-Ｏ-β-D-グルクロノシド、イソクェルシトリンとクェルセチンからなる。単量体化合物組12〜14と比べて、配合組における脂質滴の含有量減少効果はより優れている。また、各配合組は細胞内における脂質滴の含有量減少効果について差異が顕著であり、その中に、配合組2、3、4、5、6、9、10、11の脂質滴含有量の減少効果はより優れている。
【００１６】
二、三つの単量体化合物の配合協同効果の分析
【表３】
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【００１７】
表３において、Aはクェルセチン-3-Ｏ-β-D-グルクロノシドを表し、Bはイソクェルシトリンを表し、Ｃはクェルセチンを表わす。
【００１８】
以下、表３における相互作用の予測係数を分析する。係数が大きいほど化合物の間に相互作用が強いことを表わす。上記表３からわかるように、脂質滴の含有量減少効果は、クェルセチン-3-Ｏ-β-D-グルクロノシド、イソクェルシトリンとクェルセチンの三者の間の相互作用が最も強く、二者の場合、又は単体の場合より強い。
【００１９】
三、応答曲面分析法により配合比率の3D図と等高線図を計算する
混合実験設計におけるD-最適実験方法を用い、応答曲面分析法を利用しDesign expert8.05bというソフトで計算する。MixtureオプションのD-optimalを選択し、配合組の配合比率を入力し表２の実験結果を分析し、実験結果に調整R側と予測R側における数値が最大のモデルを選択し実験結果をフィッティングし、フィッティングで得られたモデルにより、クェルセチン-3-Ｏ-β-D-グルクロノシド、イソクェルシトリンとクェルセチンの割合が異なる比率の状態における脂質滴の含有量減少効果を予測し、3D-応答面図と対応する等高線図が得られる。図１を参照されたい。
【００２０】
図１の3D図におけるドットは実験値であり、曲面はクェルセチン-3-Ｏ-β-D-グルクロノシド、イソクェルシトリンとクェルセチンを、異なる割合での予測値により構成される。図１に示す応答結果を分析する。F値が5.19であり、多元相関係数R2が0.8862であり、モデルは実際の状況に良く合っていることが分かる。Signal-Noise比（Adeq Precision）は8.017であるため、信頼性が高く、応答値の予測に使用することができる。
【００２１】
3D図の分析からわかるように、クェルセチン-3-Ｏ-β-D-グルクロノシド、イソクェルシトリンとクェルセチンのモル比が（1.1-2.4）：（1.3-3.3）：（1.2-3.1）である時に、脂肪削減率は20％以上であり、モル比が（1.3-2.1）：（1.6-3.0）：（1.5-2.9）である時に、脂肪削減率は30％以上に達し、モル比が（1.4-1.9）：（1.8-2.6）：（1.8-2.6）である時に、脂肪削減率は40％以上に達する。
【００２２】
そして、3D図から上から下へ三つの点H、MとLを選出し、それぞれ脂肪削減効果が良いから悪いまでの3つの配合比率を代表し、この三つの点の配合比率を油赤染色して（oil Red staining）検証する。
【００２３】
四、油赤染色して（oil Red staining）検証
Seglen原位二歩門脈灌流法を用いてSDラットの肝臓から肝細胞を取り出し、百目ふるいで濾過し、500rpm、4℃にて3分間遠心し、上清液を捨て、同じ方法で肝細胞を三回洗う。細胞の数をカウントし、生きている細胞数と細胞の生存率が得られ、1.0×106cell/mLで培地をプレートに滴下する。細胞を24時間に培養した後、上清液を捨て、PBSで二回洗い、細胞を比較組、高脂モデル組、高脂モデル＋配合組に分ける。各細胞高脂モデル組に終濃度が1mmol/Lの遊離脂肪酸（free fatty acid、FFA）を添加し、ほかの組は血清を含まないＤＭＥＭを利用し最終体積が2mLまで培養する。24時間に投与した後、37℃のPBSで三回洗い、4％パラホルムアルデヒドで30分間固定し、PBSで三回洗い、油赤染液を加え50分間染色した後、PBSで三回洗い、400×倒立顕微鏡で観察する。実験の結果は図２に示すようである。
【００２４】
油赤酸素は脂溶性の染料であり、細胞内に、特異性に、トリグリセリド等の中性脂肪を着色させることができ、顕微鏡で観察すれば細胞内の脂質が赤色に染められており、油赤酸素のこの性質を利用して細胞内の脂質含有量を判別することができる。油赤染色の結果によると、細胞に1mM FFAで24時間に刺激を与えた後に、初代の肝臓細胞に脂質堆積が顕著に増え、その表現として脂質滴の数が増加し体積が大きくなる。陽性薬ベザフィブラートはPPAR -αアゴニストであり、細胞内脂肪酸の酸化を促進することにより細胞内の脂質滴の含有量を下げることができる。モデル組に比べると、ベザフィブラート、配合組と単量体組はいずれもある程度、高脂モデルでラット初代肝細胞内の脂質滴の含有量を下げることができ、且つ配合組H、M、Lが単量体組の脂質滴の含有量よりも少ないため、三つの薬が配合されると脂肪を減らす効果がより優れている。また、配合組H、M、Lの脂質滴の含有量が徐々に増えることは、3D図の予測結果と一致し、採用したアルゴリズムのモデルの信頼性がさらに検証された。
【００２５】
五、配合組成物は高脂食事誘導のラットの脂質代謝障害症モデルに与える影響
実験方法：90匹のSDラットを１週間に通常通りに育てた後に、正常組の10匹に普通の飼料を与え、ほかの80匹に高脂飼料（基礎飼料が88％、ラードが10％、コレステロールが2％）を与える。4週間の後に、高脂飼料を投入するラットがランダムに5組に分け、組毎に10匹である。実験の組分けは以下の通りである。（１）空白比較組：普通飼料＋0.5%CMC-Na、（２）高脂モデル組：高脂飼料＋0.5%CMC-Na、（３）ベザフィブラート組（100mg/kg）：高脂飼料＋ベザフィブラート、（４）配合組1（100 mg/kg）：高脂飼料＋配合組成物1（クェルセチン-3-Ｏ-β-D-グルクロノシド、イソクェルシトリン、クェルセチンのモル濃度の割合は1.968：2.551：1. 481である）、（５）配合組2（100mg/kg）：高脂飼料＋配合組成物2（クェルセチン-3-Ｏ-β-D-グルクロノシド、イソクェルシトリンとクェルセチンのモル濃度の割合は1.728：2.743：1.529である）、（６）配合組3（100mg/kg）：高脂飼料＋配合組成物3（クェルセチン-3-Ｏ-β-D-グルクロノシド、イソクェルシトリン、クェルセチンのモル濃度の割合は2.128：2.479：1.393である）。ベザフィブラートは、高脂飼料を与えると共それぞれにベザフィブラートを100mg/kgを投入し、被験サンプル組は高脂飼料を与えると共に、それぞれに毎日に1回の頻度で胃に100mg/kgのサンプルを与える。実験動物は自由に飲食し、25±2℃のSPFレベルの動物実験室において明るい場所と暗い場所を12時間ごとにそれぞれに飼育する。実験を実行してから8週間の後、16時間に断食し、動脈を採血し頸椎を切断して殺し、肝臓を取り出し、通常の方法で血清、肝臓組織をホモジネートに調製する。血清と肝臓におけるトリグリセリド（TG）、総コレステロール（TC）、高密度リポタンパク（HDL-C）、低密度リポタンパク（LDL-C）、アラニンアミノ基転移酵素（ALT）とアスパラギン酸アミノ基転移酵素（AST）の含有量を検出する。
【表４】
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【００２６】
分析：空白比較組と比べると、モデル組は、体重、TG、TC、ALT、ASTの含有量は著しく上昇し、差異が顕著であるため、ラットの脂質代謝障害症モデルが上手く構築されていることが分かる。モデル組と比べると、ベザフィブラート組、配合組1、配合組2、配合組3はそれぞれある程度で体重、TG、TC、ALT、AST、HDL-C含有量を下げ、LDL-C含有量を上げた。上記実験結果から、配合組は脂肪を減らす保護作用を有することが分かる。また、配合組成物1は配合組成物2と配合組成物3よりも優れ、最も良い効果を備えている。
【００２７】
六、配合組成物は遊離脂肪酸（FFA）誘導のHepG2細胞脂質滴の含有量に与える影響
実験方法：対数生長期に生育密度が約80％のHepG2細胞を対象とし、各ウェルに1×105の数で6ウェルのプレートに播種する。細胞を24時間に培養した後、上清液を捨て、PBSで三回洗い、細胞を以下の組に分ける。（１）空白比較組：0.1%のDMSO、（２）モデル組：1mMのFFA、（３）ベザフィブラート組（100μM）：100μMのベザフィブラート、（４）配合組1（100mg/kg）：1mMのFFA＋配合組成物1（クェルセチン-3-Ｏ-β-D-グルクロノシド、イソクェルシトリン、クェルセチンのモル濃度の割合は1.968：2.551：1.481である）、（５）配合組2（100mg/kg）：1mMのFFA＋配合組成物2（クェルセチン-3-Ｏ-β-D-グルクロノシド、イソクェルシトリン、クェルセチンのモル濃度の割合は1.728：2.743：1.529である）、（６）配合組3（100 mg/kg）：1mMのFFA＋配合組成物3（クェルセチン- 3-Ｏ-β-D-グルクロノシド、イソクェルシトリン、クェルセチンのモル濃度の割合は2.128：2.479：1.393である）。空白比較組を除き、他の組はいずれもが最終濃度1mmol/LのFFAを添加し、足りない体積は10％牛胎児血清を含むDMEM培地で2mLになるまで投入する、投与してから24時間後に、37℃のPBSで三回洗い、パンクレアチンで消化し、遠心し、上清液を捨て、PBSで細胞を再懸濁し、最終濃度が1μg/mLまでにナイルレッド染液を添加し、励起光489nmでの蛍光値を流式検出し、蛍光強度の幾何メジアンデータを抽出し分析する。
【表５】
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【００２８】
分析：陽性薬ベザフィブラートはPPAR-αアゴニストであり、細胞内の脂肪酸の酸化を促進することにより、細胞内の脂質滴の含有量を下げることができる。モデル組と比べると、ベザフィブラート、配合組、単量体組はいずれもがある程度に1mMのFFAの刺激でのHepG2細胞内の脂質滴の含有量を下げることができ、且つ配合組1の方は他の配合組と比べて上記効果が最も優れている。単量体組と比べて、配合組は細胞内の脂質滴の含有量減少効果が更に顕著であるため、ヒントクェルセチン-3-Ｏ-β-D-グルクロノシド、イソクェルシトリンとクェルセチンの共同使用は協同効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は配合組の脂質滴含有量の抑制率の3 D曲面図と等高線図（CG4：クェルセチン-3-Ｏ-β-D-グルクロノシド、CG10：イソクェルシトリン、CG14：クェルセチンである）である。
【図２】図２はFFA誘導のラット初代肝細胞の高脂モデル油赤染色（400×）（a）比較組、（b）モデル組、（c）陽性薬ベザフィブラート100μM、（d）H：クェルセチン-3-Ｏ-β-D-グルクロノシド、イソクェルシトリンとクェルセチンのモル濃度の割合は1.946：2.096：1.958、（e）M：1.661：1.322：3.018；（f）L-2.072：2.878：1.050、（g）CG4：クェルセチン-3-Ｏ-β-D-グルクロノシド20μM、（h）CG10：イソクェルシトリン20μM、（i）CG14：クェルセチン20μMである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
実施例1
錠剤
【表６】
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【００３１】
1000錠を投入し、1錠の成分は上記の表の通りであり、粉末を混合し、打錠機にて打錠、1錠500mgの錠剤に製造する。
【００３２】
実施例2
錠剤
【表７】
0006487531.tif 000009
【００３３】
実施例1と同じ方法で調製する。
【００３４】
実施例3
錠剤
【表８】
0006487531.tif 000010
【００３５】
実施例1と同じ方法で調製する。
【図１】
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【図２】
0006487531.tif 000012