(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ粒子またはナノ粒子組成物の製造方法であって、
工程（１）：水に不溶または難溶性の化合物を水、または医薬品製造に許容される水溶性溶媒と水の混合液に、密封容器中４０〜１５０℃にて溶解させ、
工程（２）：得られた溶液を冷却することで得られる均一な結晶を含む懸濁液または単離した結晶を得て、
工程（３）：得られた懸濁液または単離した結晶を破砕する
を含み、
水に不溶または難溶性の化合物がシロスタゾール、トラニラスト、インドメタシン、アセメタシン、またはそれらの医薬的に許容される塩であることを特徴とする方法。
【請求項２】
工程（２）で懸濁液を得て、工程（３）で得られた懸濁液を水中破砕法で破砕する請求項１の製造方法。
【請求項３】
工程（２）で単離した結晶を得て、工程（３）で単離した結晶を乾式または湿式破砕法で破砕する請求項１の製造方法。
【請求項４】
前記ナノ粒子の粒子径が２００ｎｍ以下の平均粒子径である請求項１〜３のいずれかに記載のナノ粒子またはナノ粒子組成物の製造方法。
【請求項５】
工程（１）における水、または医薬品製造に許容される水溶性溶媒と水の混合液中に、シクロデキストリン類、分散剤、および／またはドキュセートＮａを添加することを含む請求項１〜４のいずれかに記載のナノ粒子またはナノ粒子組成物の製造方法。
【請求項６】
シクロデキストリン類が２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）、および／または
分散剤が低置換メチルセルロース
である請求項５に記載のナノ粒子またはナノ粒子組成物の製造方法。
【請求項７】
工程（３）の破砕工程において、シクロデキストリン類、分散剤、および／またはドキュセートＮａを添加することを含む請求項１〜６のいずれかに記載のナノ粒子またはナノ粒子組成物の製造方法。
【請求項８】
シクロデキストリン類が２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）、および／または
分散剤が低置換メチルセルロース
である請求項７に記載のナノ粒子またはナノ粒子組成物の製造方法。
【請求項９】
工程（１）での温度が１２０℃〜１４０℃である請求項１〜８のいずれかに記載のナノ粒子またはナノ粒子組成物の製造方法。
【請求項１０】
水に不溶または難溶性の化合物が、シロスタゾールまたはその医薬的に許容される塩である請求項１〜９のいずれかに記載のナノ粒子またはナノ粒子組成物の製造方法。
【請求項１１】
工程（１）：シロスタゾールを水、または医薬品製造に許容される水溶性溶媒と水の混合液に、密封容器中４０〜１５０℃にて溶解させ、
工程（２）：得られた溶液を冷却することで得られる均一な結晶を含む懸濁液または単離した結晶を得て、
工程（３）：得られた懸濁液または単離した結晶を破砕する
を含むことを特徴とする、シロスタゾールのナノ粒子またはシロスタゾールのナノ粒子組成物の製造方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の製造方法により製造されたシロスタゾールのナノ粒子またはシロスタゾールのナノ粒子組成物を用いて、ステントまたはバルーンカテーテルをコーティングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水に不溶または難溶な医薬品のナノ粒子及びナノ粒子組成物の製造方法およびそのナノ粒子及びナノ粒子組成物に関する。より詳しくは、水に不溶または難溶性の化合物を水等に高温・高圧下溶解させ、得られた溶液を冷却することで得られる均一な結晶を含む懸濁液又は単離した結晶を破砕することを特徴とする方法およびそれによって得られるナノ粒子及びナノ粒子組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
水溶性もしくは投与可能な溶媒に可溶な薬物を注射剤等の液剤として医薬品を調製する場合、薬物を水または適当な溶媒に溶解して溶液とし、投与することは可能である。一方、薬物が水や他の投与可能な溶媒に難溶性の場合は、可能であれば溶解補助剤を添加して溶液を調製したり（例えば特許文献１）、あるいは薬物を粉砕して微粒子にし、懸濁溶液などに調製して投与する方法が用いられている（例えば特許文献２）。しかしながら、溶解補助剤を通常用いられる量で添加しても溶解しない場合や溶解が不十分な場合もあり、また溶解補助剤により得られた溶液のｐＨが生体で許容される中性付近を大きく外れる場合もあった。【０００３】
また、懸濁溶液を調製した場合であっても、懸濁している薬物の粒子の大きさが十分に小さいものでない場合や、調製直後や保存において粒子が凝集してしまう場合もあり、必ずしも万能な手段とは言えなかった。特に懸濁溶液を注射剤として用いる場合、懸濁溶液の無菌濾過等の滅菌工程は必須であり、粒子径が０．２μｍ（２００ｎｍ）以下の濾過滅菌可能な安定なナノ粒子である薬物を含む懸濁溶液の調製が必要であるが、現実的にそのような安定なナノ粒子の薬物を含む懸濁溶液の調製は容易ではなく、注射可能な難溶性薬物の懸濁溶液の調製は困難であった。【０００４】
また、近年生活習慣の変化に伴い、心筋梗塞、狭心症、脳卒中、末梢血管疾患等の動脈硬化性疾患が益々増加している。このような動脈硬化性疾患に対する確実な治療法として、例えば心臓の冠状動脈における経皮的冠動脈形成術に代表されるような、血管の狭窄部或いは閉塞部を外科的に開大させる経皮的血管形成術（Percutaneous Transluminal Angioplasty；以下ＰＴＡという）が広く用いられている。ＰＴＡとは、先端にバルーン（風船）が付いた細いチューブ（バルーンカテーテル）やステントを腕や大腿部の動脈から挿入して心臓冠動脈の狭窄部に通した後、先端のバルーンを膨らませ、狭窄した血管を押し拡げることで、血流を回復させる手技である。しかし、ＰＴＡを行った血管部位は、内皮細胞の剥離あるいは弾性板損傷等の傷害を受けており、血管壁の治癒反応である血管内膜の増殖が起こり、ＰＴＡにより狭窄病変部の開大に成功したうちの約３０〜４０％に再狭窄が生じる。【０００５】
そこで、金属や高分子材料で形成されたステントやバルーンカテーテルの表面に、抗炎症剤や平滑筋細胞の増殖抑制剤を担持させた薬物溶出型の管腔内留置用医療デバイスを用いることにより、管腔内の留置部位で長期にわたって局所的に薬物を放出させ、再狭窄率の低減化を図る試みが盛んに提案されている（特許文献３、４）。例えば特許文献３には、治療のための生理活性物質を内包させた生体適合性ナノ粒子をステント本体にコーティングした薬物溶出型ステント（Drug-Eluting Stent：以下、ＤＥＳと略す）及びその製造方法が提案されており、生体適合性ナノ粒子の製造方法として球形晶析法が記載されている。しかし、抗血栓作用のあるシロスタゾール等の、水にほとんど溶解しない難水溶性薬物は、ステントやバルーン表面にナノ粒子として有効量を保持させることは難しく、そのコーティング方法などに関しては、いろいろな方法が試みられているが、未だ有効な手段が見つかっていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ ２００９／０１７２５９
【特許文献２】ＷＯ ２００６／０５２０１８
【特許文献３】特開２００７−２１５６２０号公報
【特許文献４】ＷＯ ２０１１／０２４８３１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
かくして、上記のとおり、難溶性薬物の注射剤等の液剤として安定な医薬品を調製することは未だ困難であり、特に濾過滅菌可能な安定なナノ粒子である薬物を含む懸濁溶液（分散溶液）の安定な調製方法の確立、およびナノ粒子を用いたステント等へのコーティング方法の確立が切望されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、種々研究を重ねるうちに、水に不溶または難溶性の化合物をナノ粒子またはナノ粒子を含む組成物の安定な製造方法を見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明者は、水に不溶または難溶性の化合物を水またはエタノール等を含む水に高温・高圧下溶解させ、一旦冷却させることで得られる均一な結晶を含む懸濁液又は単離した結晶を調製し、これを粉砕することで該化合物がナノ粒子として含まれる分散溶液または固形粉末を製造する新規な方法を見出した。【０００９】
すなわち、本発明は以下の発明に関する。【００１０】
［１］ナノ粒子またはナノ粒子組成物の製造方法であって、
工程（１）：水に不溶または難溶性の化合物を水、医薬品製造に許容される溶媒、またはその混合液に高温・高圧下溶解させ、
工程（２）：得られた溶液を冷却することで得られる均一な結晶を含む懸濁液または単離した結晶を得て、
工程（３）：得られた懸濁液または単離した結晶を破砕する
を含むことを特徴とする方法。【００１１】
［２］工程（２）で懸濁液を得て、工程（３）で得られた懸濁液を水中破砕法で破砕する［１］の製造方法。すなわち、
ナノ粒子またはナノ粒子組成物（ナノ粒子を含む分散溶液）の製造方法であって、
工程（１）水に不溶または難溶性の化合物を水、医薬品製造に許容される溶媒、またはその混合液に高温・高圧下溶解させ、
工程（２）得られた溶液を冷却することで得られる均一な結晶を含む懸濁液を得て、
工程（３）得られた懸濁液を水中破砕法で破砕する
を含むことを特徴とする方法。【００１２】
［３］工程（２）で単離した結晶を得て、工程（３）で単離した結晶を乾式または湿式破砕法で破砕する［１］の製造方法。すなわち、
ナノ粒子またはナノ粒子組成物（結晶）の製造方法であって、
工程（１）水に不溶または難溶性の化合物を水、医薬品製造に許容される溶媒、またはその混合液に高温・高圧下溶解させ、
工程（２）得られた溶液を冷却することで得られる均一な結晶を含む懸濁液から単離した結晶を得て、
工程（３）単離した結晶を乾式または湿式破砕法で破砕する
を含むことを特徴とする方法。【００１３】
［４］前記ナノ粒子の粒子径が２００ｎｍ以下の平均粒子径である［１］〜［３］のいずれかに記載のナノ粒子またはナノ粒子組成物の製造方法。【００１４】
［５］工程（１）における溶解溶媒中に、シクロデキストリン類、分散剤、および／または荷電中和剤を添加することを含む［１］〜［４］のいずれかに記載のナノ粒子またはナノ粒子組成物の製造方法。【００１５】
［６］シクロデキストリン類が２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）、および／または
分散剤が低置換メチルセルロース、および／または
荷電中和剤がドキュセートＮａ
である［５］に記載のナノ粒子またはナノ粒子組成物の製造方法。【００１６】
［７］工程（３）の破砕工程において、シクロデキストリン類、分散剤、および／または荷電中和剤を添加することを含む［１］〜［６］のいずれかに記載のナノ粒子またはナノ粒子組成物の製造方法。【００１７】
［８］シクロデキストリン類が２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）、および／または
分散剤が低置換メチルセルロース、および／または
荷電中和剤がドキュセートＮａ
である［７］に記載のナノ粒子またはナノ粒子組成物の製造方法。【００１８】
［９］工程（１）での高温温度が１２０℃〜１４０℃である［１］〜［８］のいずれかに記載のナノ粒子またはナノ粒子組成物の製造方法。【００１９】
［１０］工程（１）での高圧条件が、化合物を含んだ溶解溶媒を容器に密封し、それを高温にすることで得られる圧力である［１］〜［９］のいずれかに記載のナノ粒子またはナノ粒子組成物の製造方法。【００２０】
［１１］水に不溶または難溶性の化合物が、シロスタゾール、トラニラスト、インドメタシン、アセメタシン、またはそれらの医薬的に許容される塩である［１］〜［１０］のいずれかに記載のナノ粒子またはナノ粒子組成物の製造方法。【００２１】
［１２］水に不溶または難溶性の化合物が、シロスタゾールまたはその医薬的に許容される塩である［１１］に記載のナノ粒子またはナノ粒子組成物の製造方法。【００２２】
［１３］［１］〜［１２］のいずれかに記載の製造方法により製造されたナノ粒子またはナノ粒子組成物。【００２３】
［１４］工程（１）：シロスタゾールを水、医薬品製造に許容される溶媒、またはその混合液に高温・高圧下溶解させ、
工程（２）：得られた溶液を冷却することで得られる均一な結晶を含む懸濁液または単離した結晶を得て、
工程（３）：得られた懸濁液または単離した結晶を破砕する
製造方法により製造されたシロスタゾールのナノ粒子またはシロスタゾールのナノ粒子組成物。【００２４】
［１５］平均粒子径が２００ｎｍ以下のナノ粒子であるシロスタゾール。【００２５】
［１６］平均粒子径が２００ｎｍ以下のナノ粒子であるシロスタゾールを含む注射用脳梗塞治療剤。【００２６】
［１７］［１］〜［１２］のいずれかに記載の製造方法により製造されたナノ粒子またはナノ粒子組成物をコーティングしたステントまたはバルーンカテーテル。【００２７】
［１８］水に不溶または難溶性の化合物が、シロスタゾールまたはその医薬的に許容される塩である［１７］に記載のステントまたはバルーンカテーテル。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、水に不溶または難溶性の化合物であっても、安定な注射水溶剤の調製が可能となり、その中に含まれる化合物粒子は濾過滅菌可能なナノ粒子である。また、本発明によって得られる注射水溶剤は、凍結乾燥して用時調製用の注射用製剤とすることも可能である。
また、工程（２）で結晶を単離し、工程（３）でその結晶を破砕することによって得たナノ粒子粉末組成物においては、用時調製用の注射用製剤の調製が可能であり、また塗布剤への適用も可能である。
更に、平均粒子径が２００ｎｍ以下のナノ粒子であるシロスタゾールにおいては、後述の試験例２などで示したように、新たな脳梗塞治療剤としての適用が期待される。
また、本発明のナノ粒子組成物は、有効量をステントやバルーン表面に保持させることができる。更に、従来これら医療器具へのコーティングの際に使用されている高分子の量を、本発明のナノ粒子組成物を用いることで、ごく少量にとどめることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】実施例３での結果として、シロスタゾール原末の研和前後の顕微鏡写真を示す。
【図２】実施例３での結果として、シロスタゾール水溶媒結晶の研和前後の顕微鏡写真を示す。
【図３】実施例３での結果として、シロスタゾール５０％エタノール溶媒結晶の研和前後の顕微鏡写真を示す。
【図４】実施例３での結果として、トラニラスト原末の研和前後の顕微鏡写真を示す。
【図５】実施例３での結果として、トラニラスト水溶媒結晶の研和前後の顕微鏡写真を示す。
【図６】実施例３での結果として、トラニラスト５０％エタノール溶媒結晶の研和前後の顕微鏡写真を示す。
【図７】試験例１での結果として、シロスタゾールの血中動態とパラメーターを示す。図中ＣＬＺはシロスタゾールを示す（以下同じ）。
【図８】試験例２での結果として、シロスタゾール・ナノ粒子分散液の静脈投与が脳血流に与える影響を示す。
【図９】試験例３でのシロスタゾール軟膏の組成を示す。
【図１０】試験例３での結果として、シロスタゾール軟膏のｉｎ ｖｉｔｒｏラット皮膚及び模擬皮膚の透過性を示す。
【図１１】試験例３での結果として、シロスタゾール軟膏のｉｎ ｖｉｔｒｏラット皮膚透過における速度論的解析結果を示す。
【図１２】ラットの腹部に軟膏を塗布するディバイスを示す。
【図１３】試験例３での結果として、シロスタゾール軟膏のｉｎ ｖｉｖｏラット皮膚の透過性における薬物の血中動態を示す。
【図１４】試験例３での結果として、シロスタゾール軟膏のｉｎ ｖｉｖｏラット皮膚の透過性における薬物の血中動態を示す。
【図１５】試験例４での結果として、トラニラストゲル軟膏投与後のラットの足の浮腫の経時変化を示す。ここでグラフＡは右足変化を示し、グラフＢは左足変化を示す。図中、ＴＲＡはトラニラストを、Paw edemaは足の浮腫を、Day after adjuvant injectionはアジュバント関節炎作成後の日にちを示す（以下同じ）。
【図１６】試験例４での結果として、トラニラストゲル軟膏のｉｎ ｖｉｔｒｏラット皮膚透過性を示す。
【図１７】試験例４での結果として、トラニラストゲル軟膏投与後のトラニラストの血中濃度を示す。
【図１８】試験例４での結果として、トラニラストゲル軟膏投与後のトラニラストの皮膚への滞留濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明の「水に不溶または難溶性の化合物」とは、水に不溶または難溶であれば特に制限なく、特に水に不溶または難溶性の医薬品化合物、例えばシロスタゾール、トラニラスト、インドメタシン、アセメタシン、またはそれらの医薬的に許容される塩が挙げられる。その中でも特に、抗血栓活性を有する経口剤シロスタゾールの注射剤への転用や、抗アレルギー活性を有する経口剤トラニラストの塗布剤への転用が本発明の技術により期待される。
【００３１】
本発明における「ナノ粒子」とは、平均粒子径がナノオーダー（１μｍ未満）の粒子をいうが、一般的には濾過滅菌可能な２００ｎｍ以下の粒子、好ましくは１００ｎｍ以下の粒子である。
本発明における「ナノ粒子組成物」とは、ナノ粒子を含む組成物をいい、例えばナノ粒子を含む懸濁液や、更に他の医薬的に許容される成分を含むナノ粒子またはその懸濁液などが挙げられる。またナノ粒子自身もナノ粒子組成物に包含される。
また、微粒子を含む懸濁液で、その微粒子がナノ粒子である場合は、懸濁液と溶液の間の「分散溶液」と通常定義される。
【００３２】
特に本発明の「平均粒子径が２００ｎｍ以下のナノ粒子であるシロスタゾール」においては、後述の試験例２で示したように、脳虚血モデルに対して完全に溶解したシロスタゾール溶液よりも静脈内投与において治療効果が高く、ｔＰＡなどの脳梗塞治療薬に代わる新たな脳梗塞治療剤として期待される。ここで用いる静脈内投与は、点滴による投与を含む。
【００３３】
本発明の工程（１）において用いられる「医薬品製造に許容される溶媒」としては、医薬品製造で通常用いられる溶媒であれば特に制限なく、エタノールなどのアルコール類、アセトンなどのケトン類、アセトニトリルなどのニトリル類、ジエチルエーテル、ＴＨＦなどのエーテル類など水溶性溶媒が一般的に用いられ、好ましくはエタノールである。
本発明の工程（１）における「水、医薬品製造に許容される溶媒、またはその混合液」としては、好ましくは水または、医薬品製造に許容される溶媒と水の混合液であり、特に好ましくは水またはエタノールと水の混合液である。
また、工程（２）において懸濁液を得て、工程（３）において懸濁液として破砕する場合で、その後得られた分散溶液を濾過滅菌して注射液とする場合は、「水、医薬品製造に許容される溶媒、またはその混合液」は水が好ましい。
ここで用いられる「水」は、医薬品製造に用いられるグレードであり、例えば精製水が挙げられる。
【００３４】
本発明の「高温・高圧」とは、水に不溶または難溶性の化合物が水、医薬品製造に許容される溶媒、またはその混合液に溶解し、且つ該化合物が分解等されなければ特に制限されないが、例えば４０〜１５０℃、好ましくは６０〜１４０℃、８０〜１４０℃、または１００〜１４０℃であり、より好ましくは１２０〜１４０℃、更により好ましくは１２０〜１３０℃であり、高圧条件は化合物を含んだ溶解溶媒を容器に密封し、それを高温にすることで得られる圧力が好ましい。
【００３５】
本発明の工程（１）での溶解に要する時間は、化合物が溶解するまでの時間であり、通常は１０分〜２時間程度である。
【００３６】
本発明の工程（２）での「冷却」とは、例えば水冷、氷水冷、空気冷却などが挙げられるが、好ましくは水冷である。
【００３７】
本発明の工程（２）での「単離した結晶」とは、工程（２）で得られた懸濁液を濾過し、濾上物として得られた結晶をいう。また遠心沈降してデカンテーションによって得ることもできる。
【００３８】
本発明の工程（３）での「破砕」とは、懸濁液を破砕する場合は、例えば水中破砕法で行い、単離した結晶を破砕する場合は、例えば乾式破砕法または湿式破砕法で行う。
ここで水中破砕法とはビーズミル及びマイクロフルダイザー等の破砕装置を用いての破砕をいう。乾式破砕法とはボールミル及びローラーミル等の破砕装置を用いての破砕をいう。湿式破砕法とはボールミル及びローラーミル等の破砕装置を用いての破砕をいう。
【００３９】
本発明のナノ粒子組成物においては、医薬化合物以外に種々製剤に添加される成分を含んでいてもよい。好ましくは、溶解補助剤、分散剤、荷電中和剤などが挙げられ、具体的には溶解補助剤としてシクロデキストリン類（例えば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）、分散剤として低置換メチルセルロース、荷電中和剤としてドキュセートＮａなどが挙げられる。
ここで加えられる製剤成分の添加量は、医薬品の活性、ナノ粒子化に悪影響を及ぼさなければ特に制限はなく、例えば医薬品化合物に対して製剤成分の合計が５０００％（ｗ／ｗ）以下であり、好ましくは１０％（ｗ／ｗ）〜２０００％（ｗ／ｗ）である。
これらの製剤成分の添加の方法は特に制限されないが、工程（２）において懸濁液を得る場合は、工程（１）において、工程（２）において単離した結晶を得る場合は、工程（３）において添加するのが好ましい。
【００４０】
本発明の工程（１）での化合物の濃度は、高温・高圧条件で溶解し、工程（２）の冷却で結晶が析出すれば特に制限されないが、例えば５％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは２％（ｗ／ｖ）以下、更に好ましくは２〜０．２％（ｗ／ｖ）が挙げられる。
【００４１】
本発明において、ステント、バルーンカテーテル等の医療器具へのコーティングは、電気泳動法などの電気的修飾法や、超音波ミスト法、スプレー法、エアーブラシ法などの噴霧法など、通常のコーティング方法を用いて行うことができる。
【実施例】
【００４２】
以下に実施例、参考例及び試験例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。【００４３】
実施例１．難溶性医薬品の水中結晶化
水難溶性医薬品であるシロスタゾール、トラニラスト、インドメタシン及びアセメタシンを用い、表１の条件にて均一な結晶を含む懸濁液を調製した（本発明の製造方法における工程（１）から工程（２）に相当する）。
いずれの医薬品の水中結晶化においても、１００ｍｌのスクリュー栓付き耐圧性ガラス瓶を使用し、表１の各条件にて混合物を調製して、加温・加圧し全てを溶解後、直ちに冷水中にて冷却し、結晶の析出を促進させた。析出した結晶の結晶形を確認し、実施例１−１、１−４、１−７、１−１０を除く全てにおいて、医薬品結晶を吸引濾過により濾紙上に回収後、減圧下６０℃にて乾燥し、結晶を回収し、回収物の秤量を行い、回収率を求めた（結晶を単離しなかった実施例１−１、１−４、１−７、１−１０においては回収率を１００％とした）。
実施例１−１、１−４、１−７、１−１０を除く単離した乾燥結晶は、下記の実施例２において乾式破砕法によるナノ粒子化医薬品の調製に用いた。実施例１−１、１−４、１−７、１−１０の結晶を含む懸濁液は、下記の実施例２において水中破砕法によるナノ粒子化医薬品の調製に用いた。
【表１−１】
0006547228.tif 000002
【表１−２】
0006547228.tif 000003
【００４４】
実施例２．水中結晶化法により得られた結晶医薬品の破砕によるナノ粒子化
上記実施例１で得られた実施例１−１〜１−１２の医薬品結晶を用いて、表２の実施例２−１〜２−１２にそれぞれ対応した条件にて結晶を破砕した（本発明の製造方法における工程（３）に相当する）。
実施例２−１、２−４、２−７、２−１０では、実施例１で得られた懸濁液を水中破砕法で破砕し、一方、実施例２−２、２−３、２−５、２−６、２−８、２−９、２−１１、２−１２では、実施例１で得られた乾燥結晶を乾式破砕法で破砕した。乾式破砕法においては表２の添加剤を添加して破砕を行った（水中破砕法において表２に記載した添加剤は、実施例１にて添加された分散媒を示した）。
得られたナノ粒子結晶の平均粒子径と粒度分布を求め、その値を表２に示す。回収率はメンブランフィルター（細孔径２００ｎｍ）で濾過された粒子に基づいて求めた。
表２に示す医薬品のナノ粒子の平均粒子径は、いずれも１５０ｎｍ以下であり、得られたナノ粒子を水に分散後、メンブランフィルター（細孔径２００ｎｍ）にて濾過した濾液中の薬物の回収率はいずれも高く、また水中破砕法によって調製されたナノ粒子の回収率は特に高かった（９０％以上）。
【表２−１】
0006547228.tif 000004
【表２−２】
0006547228.tif 000005
【００４５】
比較例１．水中結晶化を経ずに破砕した粒子
本発明の水中結晶化の効果を確認する目的から、水中結晶化を経ずに、医薬品原末（結晶化処理をしていないもの）を水中破砕法または乾式破砕法により破砕した場合の粒子を調製し、その粒子径および回収率を求めた。表３にその破砕条件と得られた粒子の粒子径および回収率を示す。
水中結晶と破砕の２段階でナノ粒子化した上記実施例２の各実施例での粒子径に比べ、水中結晶化を経ずに破砕した比較例３−１〜３−８では粒子径も大きく、粒子径のばらつきも大きく、また２００ｎｍ以下のナノ粒子の回収率は低値（２〜３０％）を示した。
【表３】
0006547228.tif 000006
【００４６】
実施例３．シロスタゾール及びトラニラストの再結晶化による粉砕性の変化
シロスタゾール（ＣＬＺ）原末、ＣＬＺ水溶媒結晶（実施例１−２で得られた結晶）、ＣＬＺ ５０％エタノール溶媒結晶（実施例１−３で得られた結晶）、トラニラスト（ＴＲＡ）原末、ＴＲＡ水溶媒結晶（実施例１−５で得られた結晶）、ＴＲＡ ５０％エタノール溶媒結晶（実施例１−６で得られた結晶）をそれぞれ１ｇ秤取し、メノウ乳鉢に加え、室温にて手動にて３０分間研和したものを走査型顕微鏡にて観察した（倍率はいずれも１００倍、実際の大きさはスケールに示した）。結果を図１〜図６に示す。いずれの場合も再結晶化したものの方が、細粉化されていた。【００４７】
試験例１．シロスタゾール・ナノ粒子分散液の静脈投与後の血中動態
シロスタゾール・ナノ粒子分散液を静注投与した場合の血中動態が、ＨＰ−β−ＣＤによりシロスタゾールを完全に溶解したシロスタゾール溶液を静注投与した場合の血中動態とどの程度異なるか確認するために以下の実験を行った。
上記表２に示す実施例２−１で得られたシロスタゾール・ナノ粒子分散液（０．５％）及びシロスタゾール溶液（０．０５％、１０％ＨＰ−β−ＣＤ溶液中）を滅菌濾過（０．２μｍボアーサイズ、メンブランフィルター）し、Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット（体重約２００ｇ）に０．６ｍｇ／ｋｇ（シロスタゾールとして）の量で大腿静脈より注射し、頸静脈より経時的に採血を行い血中動態について解析した。
得られた血中シロスタゾール濃度を図７示した。ナノ粒子シロスタゾール及び溶液シロスタゾール共に２相性の消失挙動を示し、ここから２−コンパートメントモデルにより解析した速度論的パラメータは、両者の間には有意な差異は認められず（図７）、ナノ粒子分散液はシロスタゾールの血中動態において、溶液とほぼ同等であった。【００４８】
試験例２．シロスタゾール・ナノ粒子分散液の静脈投与後の脳梗塞治療効果
シロスタゾールの抗血栓活性について、上記試験例１のシロスタゾール・ナノ粒子分散液（０．５％）及びシロスタゾール溶液（０．０５％、１０％ＨＰ−β−ＣＤ溶液中）を用い、以下のラット脳虚血モデルに静脈投与を行い、その治療効果について検討し、両者の効果を比較した。【００４９】
（ラット前脳虚血モデルの作成）
ラットにソムノペンチル麻酔（２９．８ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を行い、両側総頸動脈を露出し、動脈クレンメで血流を遮断する。１５分後再灌流し、２０分後（その間大腿静脈を露出する）、シロスタゾール・ナノ粒子分散液及びシロスタゾール溶液を静脈投与し、開腹部を縫合し、２４時間後脳血流を測定する。【００５０】
（脳血流の測定）
被験ラットにウレタン麻酔（１．２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を行い、頭部を切開し頭蓋骨に穴を開ける。レーザー組織血流計オメガフローＦＬＯ−Ｎ１（オメガウェーブ社製）を用いて脳血流を測定し、以下の式より血流量、血液量、血流速度を求める。
血流量＝k1∫ωP(ω)dω/I2
血液量＝In[1-k2∫P(ω)dω]/I2
血液速度＝k3[血流量／血液量]
k1−k3：比例定数
ω：角周波数（２πｆ）
P(ω)：信号のパワースペクトル
I：受光量【００５１】
（結果）
結果を図８に示す。脳虚血モデルラットにおいては、より高い効果が期待されたシロスタゾール溶液の投与よりも、ナノ粒子分散液の投与の方がむしろ治療効果が高く、図８の結果からは０．６ｍｇ／ｋｇの投与量でシロスタゾール・ナノ粒子分散液の静脈投与のみに、脳血流量及び脳血液量の改善が認められた。【００５２】
試験例３．シロスタゾール・ナノ粒子含有ゲル軟膏の経皮適用後の血中動態
シロスタゾール・ナノ粒子を含有する水性ゲル軟膏経皮適用した場合の血中動態について、原末のシロスタゾールを含有する同ゲル軟膏と比較して、以下の実験を行った。
シロスタゾール・ナノ粒子を含有する水性ゲル軟膏とＰＥＧ軟膏、および原末のシロスタゾールを含有する同ゲル軟膏を図９に示す組成にて調製した。
との比較を行った。【００５３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏラット皮膚及び模擬皮膚透過実験
（試験方法）
実験前処置として７週齢Ｗｉｓｔａｒ雄性ラット腹部を除毛した。翌日、除毛部の腹部皮膚（直径３．５ｃｍ）を適出し拡散型セルに装着した。また、これとは別にラット皮膚の代わりにラバーシート（厚さ７５μｍ）を模擬皮膚として用い実験を行った。セル下部はリン酸緩衝液ｐＨ ７．２で満たし、セル上部の角質層側に軟膏０．３ｇを塗布後、アルミホイルで密閉した。セル下部を撹拌子で撹拌し恒温層で３７℃に保ち、経時的にセル下部から０、２、４、６、８、１０、２４、２８、３２、５０時間後に試料１００μｌを採取するとともに、同容量の緩衝液を補充した。試料中のシロスタゾール量はＨＰＬＣにて測定した。
さらに得られたデータは以下に示す拡散式（１）および（２）に当てはめ、５つの速度論的パラメータを求めた。
0006547228.tif 000007
Ｊｃは薬物透過速度、Ｋｍは皮膚/製剤の分配係数、Ｄは皮膚内での拡散係数、τはラグタイム、δは皮膚の厚さ（平均０．０７１ｃｍ）、Ａは用いた皮膚の有効面積（２．０１ｃｍ２）、Ｑはｔ時間にセル下部に透過した積算薬物量、Ｃｃはシロスタゾール軟膏製剤中のシロスタゾール濃度を示す。皮膚透過係数ＫｐはＪｃ／Ｃｃから算出した。【００５４】
（ＨＰＬＣによるシロスタゾール濃度の測定）
サンプル１０μＬと内標であるメチルフェニトイン溶液（１５μｇ／ｍＬ）９０μＬを加え、撹拌後、遠心分離（４℃、２０ｍｉｎ、１５０００ｒｐｍ）を行い、この上清を用いて測定を行った。高速液体クロマトグラフィー装置ＬＣ−１０ＡＤ（島津製作所）、３５℃に保たれたクロマトチャンバーＣＴＯ−６Ａ及びＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（２．１×５０ｍｍ、ジーエルサイエンス株式会社）を用い、移動相ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ＝３５／１５／５０（ｖ／ｖ／ｖ）にて平衡化を行った。移動相の流速は０．２５ｍＬ／ｍｉｎ、試料注入量は４μＬとし、オートインジェクターＳＩＬ−９Ａを用いて自動的にカラムに注入した。シロスタゾールの検出はフロースルーセル型検出器ＳＰＤ−１０Ａを用い、吸収波長２５４ｎｍにて行い、クロマトグラフＥＰＣ−５００にて記録、測定を行った。【００５５】
（結果）
結果を図１０及び図１１に示す。シロスタゾール・ナノ粒子を含有する水性ゲル軟膏とＰＥＧ軟膏では、原末のシロスタゾールを含有する同ゲル軟膏より、シロスタゾールのラット皮膚透過性の高いことが判明した。ただし、シリコンラバー膜（厚さ７５μｍ）の模擬皮膚をいずれの軟膏も透過しなかった。このことは、シロスタゾールナノ粒子の皮膚透過が、薬物の単純拡散によるものではなく、生体膜を形成する細胞のトランスサイトーシス作用であることが明らかとなった。【００５６】
ｉｎ ｖｉｖｏ経皮吸収実験
一方、シロスタゾールの経皮適用後の血中動態についてｉｎ ｖｉｖｏでも以下のように確認を行った。
（試験方法）
実験前処置として７週齢Ｗｉｓｔａｒ雄性ラット腹部の除毛及び頸静脈カニュレーションを行った（頸静脈カニュレーションの方法については後述参照）。翌日、除毛部に軟膏０．２２ｇを図１２に示したディバイスを用いて塗布した。ディバイスは外径２４ｍｍ、内径１８ｍｍの円形に切り出したシリコーンゴムシート及びアルミホイル（日本製箔社製）にて作製した。軟膏適用０、２、４、６、８、１０、１２、２４、２８、３２、５０時間後に頸静脈から血液を採取した。採取した血液を遠心分離（４℃、１５０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）により上清を採取し、上記ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験の際のＨＰＬＣ条件にて測定を行った。【００５７】
（頸静脈カニュレーション法）
ラットからの採血は頸静脈カニュレーションにより行った。ラットをソムノペンチル麻酔下（３０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）背位に固定し、頸部の皮膚を右寄り約１．５ｃｍ切開し、ピンセットを用いて筋肉を分離し、外頸静脈を露出させた。その後、ヘパリン（１０ＩＵ／ｍＬヘパリンナトリウム注）で満たしたファイコンチューブ（ＳＨ Ｎｏ．００）を皮下を通して頚背部より体外に貫通させ、注射筒と接続した。次に、外頸静脈に二本の縫合糸をかけ、心臓側の糸を引っ張り固定し血流を止め、頸部側を強く結紮した。露出している血管にはさみで切れ目を入れ、先ほどのファイコンチューブを３ｃｍ程挿入して注射筒でチューブに血流を確認後、心臓側の結紮を行った。その後、切開部を縫合した。軟膏塗布後の血中濃度の変化は無麻酔下にて行い、経時的に採血を行った。採血した血液約０．２ｍＬは０．５ｍＬのマイクロチューブに入れ、遠心機（ＭＸ−２００ ＴＯＭＹ）にて４℃、２０ｍｉｎ、１５０００ｒｐｍの条件で遠心し、この上清をＨＰＬＣ法による定量に用いた。【００５８】
結果を図１３および図１４に示す。シロスタゾール・ナノ粒子を含有する水性ゲル軟膏とＰＥＧ軟膏では、シロスタゾールの血中濃度は高く、経皮吸収率が高いことが確認された。特に水性ゲル軟膏において吸収速度（ｋａ）及び吸収率が高かった。一方、原末のシロスタゾールを含有するゲル軟膏では、血中でのシロスタゾールの確認はできなかった。【００５９】
試験例４．トラニラスト・ナノ粒子含有ゲル軟膏の調製とその経皮適用によるアジュバント関節炎ラットに対する治癒効果
トラニラストの抗アレルギー活性について、トラニラスト・ナノ粒子を含有する水性ゲル軟膏及び原末のトラニラストを含有する同ゲル軟膏を用い、以下のラットのリュウマチ関節炎のモデルに経皮投与し、その治療効果について検討し、両者の効果を比較した。【００６０】
（ラットリュウマチ関節炎モデルの作成）
実験には７週齢Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラットを用いた。ＤＡラットを吸入麻酔後、右後足及び尾部にそれぞれアジュバントを５０μＬ注入しアジュバント誘発関節リウマチ（ＡＡ）ラットとした。アジュバントの調製は以下のようにして行った。Mycobacterium Butyricum死菌体１００ｍｇ（ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）をメノウ乳鉢にとりよく研磨後、Ｂａｙｏｌ Ｆ （Ｗａｋｏ社製）１０ｍＬを少量ずつ加えかき混ぜながらさらに研磨した。その後、懸濁液５００μＬずつＰｒａｓｔｉｃ Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ Ｖｉａｌ（ＩＷＡＫＩ社製）に小分けし、蓋をしてアルミホイルで包みオートクレーブ（１２０℃、１５ ｍｉｎ）にて滅菌を行った。滅菌後は使用時まで冷蔵庫にて保存した。【００６１】
（トラニラスト・ナノ粒子を含有する水性ゲル軟膏及び原末のトラニラストを含有する同ゲル軟膏の調製）
カルボポール９３４（登録商標、カルボキシビニルポリマー）を精製水に溶かし１時間放置後、５％アンモニア水を加えて攪拌しながら中和し、トラニラスト・ナノ粒子分散液を加え、適宜精製水を加えて攪拌し、トラニラスト・ナノ粒子を含有する水性ゲル軟膏を調製する。
原末のトラニラストを含有する同ゲル軟膏については、上記方法にてトラニラスト・ナノ粒子分散液の代わりに、トラニラスト原末の懸濁液を用いて調製する。【００６２】
ラット浮腫測定方法
（試験方法）
軟膏はアジュバント投与１４日後から毎朝９：００に１日１回０．３ｇを右足のみに適用した。ラット関節における炎症の程度は足容積を測定することで表した。足容積測定には精製水４００ｍＬにカルボキシメチルセルロースナトリウム塩を小さじ１杯分入れ溶かし、Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅ ３、４粉にて染色した溶液を用いた。この溶液に足をつけ浮腫変化を測定した。【００６３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ経皮透過実験
（試験方法）
実験前処置として７週齢Ｗｉｓｔａｒ雄性ラット腹部を除毛した。翌日、除毛部の腹部皮膚（直径３．５ｃｍ）を適出し拡散型セルに装着した。セル下部はリン酸緩衝液ｐＨ ７．２で満たし、セル上部の角質層側に軟膏０．３ｇを塗布後、アルミホイルで密閉した。セル下部を撹拌子で撹拌し恒温層で３７℃に保ち、経時的にセル下部から試料１００μｌを採取するとともに、同容量の緩衝液を補充した。試料中のトラニラスト量はＨＰＬＣにて測定した。【００６４】
（ＨＰＬＣによるＴＲＡ濃度の測定）
サンプル１０μＬと内標であるｐ−オキシ安息香酸エチル（３μｇ／ｍＬ）９０μＬを加え、撹拌後、遠心分離（４℃、２０ｍｉｎ、１５０００ｒｐｍ）を行い、この上清を用いて測定を行った。高速液体クロマトグラフィー装置ＬＣ−１０ＡＤ（島津製作所）、３５℃に保たれたクロマトチャンバーＣＴＯ−６Ａ及びＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（２．１×５０ｍｍ、ジーエルサイエンス株式会社）を用い、移動相（ＣＨ３ＣＮ／５０ｍＭ酢酸アンモニウム＝２０／８０）にて平衡化を行った。移動相の流速は０．２５ｍＬ／ｍｉｎ、試料注入量は４μＬとし、オートインジェクターＳＩＬ−９Ａを用いて自動的にカラムに注入した。ＴＲＡの検出はフロースルーセル型検出器ＳＰＤ−１０Ａを用い、吸収波長２３０ｎｍにて行い、クロマトグラフＥＰＣ−５００にて記録、測定を行った。【００６５】
ｉｎ ｖｉｖｏ経皮吸収実験
（試験方法）
実験前処置として７週齢Ｗｉｓｔａｒ雄性ラット腹部の除毛及び頸静脈カニュレーションを行った（頸静脈カニュレーションの方法については後述参照）。翌日、除毛部に軟膏０．３ｇを図１２に示したディバイスを用いて塗布した。ディバイスは外径２４ｍｍ、内径１８ｍｍの円形に切り出したシリコーンゴムシート及びアルミホイル（日本製箔社製）にて作製した。軟膏適用０〜１２時間にわたり、経時的に頸静脈から血液を採取した。採取した血液を遠心分離（４℃、１５０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）により上清を採取し、上記ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験の際のＨＰＬＣ条件にて測定を行った。【００６６】
（頸静脈カニュレーション法）
ラットからの採血は頸静脈カニュレーションにより行った。ラットをソムノペンチル麻酔下（３０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）背位に固定し、頸部の皮膚を右寄り約１．５ｃｍ切開し、ピンセットを用いて筋肉を分離し、外頸静脈を露出させた。その後、ヘパリン（１０ＩＵ／ｍＬヘパリンナトリウム注）で満たしたファイコンチューブ（ＳＨ Ｎｏ．００）を皮下を通して頚背部より体外に貫通させ、注射筒と接続した。次に、外頸静脈に二本の縫合糸をかけ、心臓側の糸を引っ張り固定し血流を止め、頸部側を強く結紮した。露出している血管にはさみで切れ目を入れ、先ほどのファイコンチューブを３ｃｍ程挿入して注射筒でチューブに血流を確認後、心臓側の結紮を行った。その後、切開部を縫合した。軟膏塗布後の血中濃度の変化は無麻酔下にて行い、経時的に採血を行った。採血した血液約０．２ｍＬは０．５ｍＬのマイクロチューブに入れ、遠心機（ＭＸ−２００ ＴＯＭＹ）にて４℃、２０ｍｉｎ、１５０００ｒｐｍの条件で遠心し、この上清をＨＰＬＣ法による定量に用いた。【００６７】
ｉｎ ｖｉｖｏ皮膚滞留性実験
（試験方法）
実験前処置として７週齢Ｗｉｓｔａｒ雄性ラット腹部を除毛した。翌日、除毛部に軟膏０．３ｇを下記に示したディバイスを用いて塗布した。ディバイスは外径２４ｍｍ、内径１８ｍｍの円形に切り出したシリコーンゴムシート及びアルミホイル（日本製箔社製）にて作製した。軟膏適用１２時間経過後、トラニラストゲル軟膏又はトラニラストｎａｎｏゲル軟膏塗布部を生理食塩水を含ませた脱脂綿にて５回ふき取り角質を剥離後、皮膚（脂肪は含まない）を剥離した。得られた皮膚を０．５ｍＬのマイクロチューブに入れ、精製水５００μＬを加えホモジナイズした後、遠心機にて４℃、２０ｍｉｎ、１５０００ｒｐｍの条件で遠心し、得られた上清を上記ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験の際のＨＰＬＣ条件にて測定を行った。【００６８】
（結果）
投与後のラットの足の浮腫の経時変化を図１５に、投与後のトラニラストゲル軟膏のｉｎ ｖｉｔｒｏラット皮膚透過性を図１６に、投与後のトラニラストの血中濃度を図１７に、投与後のトラニラストの皮膚への滞留濃度を図１８に示す。
図１５の結果から、トラニラスト・ナノ粒子含有ゲル軟膏の経皮適用によりリュウマチ関節炎のモデルとされるラットアジュバント関節炎による浮腫を強力に抑制した。比較とした原末トラニラストを含む同様な軟膏においてはこの作用は認められなかった。
図１６の結果から、０．３５〜０．７５％トラニラスト含有ゲル軟膏において、いずれの含有量においても原末懸濁に比較し、ナノ分散粒子を含む軟膏において、優れた透過性を示した。
図１７の結果から、トラニラスト・ナノ粒子を含有する水性ゲル軟膏では、原末のトラニラストを含有する同ゲル軟膏より血中移行性は有意に高かった。
図１８の結果から、皮膚内のトラニラスト濃度は原末のトラニラストを含有する水性ゲル軟膏の方が、トラニラスト・ナノ粒子を含有する水性ゲル軟膏より高値を示した。
また、トラニラスト・ナノ粒子含有ゲル軟膏適用後のラット皮膚からの薬物の吸収には容量相関性が認められた。
【図１】
0006547228.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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