(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質がメントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる作用を有する物質であるかどうかを評価する被験物質の評価方法であって、ＴＲＰＶ１発現細胞を、ＴＲＰＶ１アゴニストと被験物質とメントールとを含有する被験試料およびＴＲＰＶ１アゴニストとメントールとを含有する比較試料のそれぞれに接触させ、前記被験試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化と、前記比較試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化とを測定し、前記被験試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化と前記比較試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化とに基づき、前記被験物質がメントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる物質であるかどうかを評価する被験物質の評価方法であり、前記被験試料および比較試料のそれぞれにおけるメントールの濃度が１０ｍＭ以下であることを特徴とする被験物質の評価方法。
【請求項２】
前記被験試料および比較試料のそれぞれにおけるメントールの濃度が少なくとも３ｍＭである請求項１に記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験物質の評価方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、外用剤の開発などに有用な被験物質の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＲＰＶ１は、カプサイシン、熱などに感受性を有するイオンチャネルである（例えば、非特許文献１参照）。また、ＴＲＰＶ１の活性化は、炎症性疼痛と関連していることが知られている。したがって、炎症性疼痛の鎮痛剤として、ＴＲＰＶ１の活性を阻害する物質の臨床治験が進められている。しかし、従来のＴＲＰＶ１活性阻害剤には熱に対する感覚の低下または発熱をもたらす傾向があることから、より臨床応用に適したＴＲＰＶ１活性阻害剤が求められている。
【０００３】
ところで、メントールは、鎮痛作用を有していることが知られているが、その詳細なメカニズムは明らかになっていなかった。冷感センサーであるＴＲＰＭ８と鎮痛に関与していることからメントールの鎮痛効果はＴＲＰＭ８を活性化することによるという報告や、オピオイド受容体を活性化することによるという報告などがあるが、どちらもメントールの鎮痛効果を説明するには不十分であった（例えば、非特許文献１参照）。そのため、メントールの鎮痛メカニズムを明らかにし、その鎮痛効果を制御することで効率的に鎮痛効果を付与ことが可能になると考えらえる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】中川貴之、「痛みの受容機構と新規鎮痛薬創製の可能性」、生化学、公益社団法人日本生化学会、平成２５年７月２５日、第８５巻、第７号、ｐ．５６１−５６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
また、本発明者らは、現時点では、メントールとＴＲＰＶ１の活性の抑制との関連性や、前記関連性を利用して、被験物質がメントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる作用を有しているかどうかを評価する方法を具体的に記載した文献を発見していない。
さらに、メントール単独での鎮痛効果は十分ではないことから、より優れた鎮痛効果を発揮する処方の開発が求められている。
【０００６】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、被験物質がメントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる作用を有する物質であるかどうかを簡便な操作で、かつ高い再現性で評価する被験物質の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、
（１）  被験物質がメントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる作用を有する物質であるかどうかを評価する被験物質の評価方法であって、ＴＲＰＶ１発現細胞を、被験物質とＴＲＰＶ１アゴニストとメントールとを含有する被験試料およびＴＲＰＶ１アゴニストとメントールとを含有する比較試料のそれぞれに接触させ、前記被験試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化と、前記比較試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化とを測定し、前記被験試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化と前記比較試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化とに基づき、前記被験物質がメントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる物質であるかどうかを評価する被験物質の評価方法であり、前記被験試料および比較試料のそれぞれにおけるメントールの濃度が１０ｍＭ以下であることを特徴とする被験物質の評価方法、ならびに
（２）  前記被験試料および比較試料のそれぞれにおけるメントールの濃度が少なくとも３ｍＭである前記（１）に記載の評価方法
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の被験物質の評価方法は、被験物質がメントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる作用を有する物質であるかどうかを簡便な操作で、かつ高い再現性で評価することができるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】参考例１において、ＴＲＰＶ１発現細胞における電流の経時的変化を調べた結果を示すグラフである。
【図２】参考例２において、メントール濃度と活性との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図３】実施例１において、被験試料に含まれる被験物質の種類と活性との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図４】実施例１において、被験試料に含まれる被験物質の種類と抑制比率との関係を調べた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の被験物質の評価方法は、被験物質がメントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる作用を有する物質であるかどうかを評価する被験物質の評価方法であって、ＴＲＰＶ１発現細胞を、被験物質とＴＲＰＶ１アゴニストとメントールとを含有する被験試料およびＴＲＰＶ１アゴニストとメントールとを含有する比較試料のそれぞれに接触させ、前記被験試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化と、前記比較試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化とを測定し、前記被験試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化と前記比較試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化とに基づき、前記被験物質がメントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる物質であるかどうかを評価することを特徴とする。
【００１１】
本発明者らは、従来、ＴＲＰＶ１の活性化を抑制する物質について鋭意研究を重ねたところ、ＴＲＰＶ１の活性化を抑制しないと考えられていたメントールが、意外なことに、ＴＲＰＶ１の活性化を抑制すること見出した。本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。
【００１２】
本発明の被験物質の評価方法は、ＴＲＰＶ１発現細胞を、被験物質とＴＲＰＶ１アゴニストとメントールとを含有する被験試料およびＴＲＰＶ１アゴニストとメントールとを含有する比較試料のそれぞれに接触させ、前記被験試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化と、前記比較試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化とを測定し、前記被験試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化と前記比較試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化とに基づき、前記被験物質がメントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる物質であるかどうかを評価するという一連の操作は採用されている点に１つの大きな特徴を有する。このように、本発明の被験物質の評価方法によれば、前記操作が採用されているので、メントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用に対する被験物質が有する増幅作用を簡便な操作で的確に評価することができる。また、本発明の被験物質の評価方法によれば、ＴＲＰＶ１発現細胞における前記細胞内カルシウム濃度の変化は、ヒトの主観に影響されることなく、同一条件下に同時に何回も並行して精密に測定することができる。したがって、本発明の被験物質の評価方法によれば、被験物質がメントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる作用を有する物質であるかどうかを簡便な操作で、かつ高い再現性で評価することができる。
【００１３】
前記被験物質としては、例えば、無機化合物、有機化合物、植物抽出物、微生物培養物、微生物抽出物などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記被験物質は、そのまま用いてもよく、必要に応じて、溶媒に溶解させて用いてもよい。前記溶媒は、ＴＲＰＶ１発現細胞の生育、ＴＲＰＶ１の生理学的機能の発現に影響を与えない溶媒であるのが望ましい。被験物質を溶解させる溶媒としては、例えば、エタノール、生理的食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００１４】
前記ＴＲＰＶ１発現細胞は、野生型ＴＲＰＶ１の生理学的機能と同様の生理学的機能を発現する細胞である。前記野生型ＴＲＰＶ１の生理学的機能と同様の生理学的機能としては、例えば、ＴＲＰＶ１アゴニストによる化学刺激、熱覚刺激（例えば、４３℃前後の刺激）などの刺激による細胞外から細胞内への陽イオンの透過などが挙げられる。
【００１５】
前記ＴＲＰＶ１発現細胞としては、内因性ＴＲＰＶ１を発現している野生型の細胞であってもよく、ＴＲＰＶ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された外因性ＴＲＰＶ１発現細胞などが挙げられる。前記ＴＲＰＶ１発現細胞のなかでは、かかるＴＲＰＶ１を介して引き起こされる生理学的事象を簡便な操作で測定する観点から、外因性ＴＲＰＶ１発現細胞が好ましい。
【００１６】
前記内因性ＴＲＰＶ１を発現している野生型の細胞としては、特に限定されないが、例えば、感覚神経の細胞、脳の細胞、膀胱上皮の細胞などが挙げられる。
【００１７】
前記外因性ＴＲＰＶ１発現細胞は、宿主細胞に導入された前記核酸が、染色体外要素として存在している細胞であってもよく、宿主細胞に導入された前記核酸が組み込みにより染色体に組み込まれている細胞であってもよい。前記外因性ＴＲＰＶ１発現細胞は、慣用の形質転換方法によって、前記ＴＲＰＶ１をコードする核酸を保持する組換えベクターなどにより宿主細胞を形質転換することにより得られる。
【００１８】
ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、ヒトＴＲＰＶ１をコードする核酸であってもよく、他の動物のＴＲＰＶ１をコードする核酸であってもよい。ヒトへの適用に適した物質を的確に評価する観点から、ヒトＴＲＰＶ１をコードする核酸であることが好ましい。前記ＴＲＰＶ１をコードする核酸としては、例えば、配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸などが挙げられるが、本発明は、特に限定されるものではない。配列番号：２に示されるアミノ酸配列は、配列番号：１に示される塩基配列中の２７６位〜２７９５位の塩基配列にコードされている。配列番号：１に示される塩基配列は、アクセッション番号：ＮＭ＿０８０７０４としてＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＴＲＰＶ１をコードする核酸の塩基配列である。前記ＴＲＰＶ１をコードする核酸は、前記核酸によりコードされるポリペプチドが前記生理学的機能を発現するのであれば、ＴＲＰＶ１の構造遺伝子の塩基配列中に変異を有するバリアントの核酸であってもよい。
【００１９】
バリアントの核酸としては、例えば、
（Ｉ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードし、コードされるポリペプチドが、前記ＴＲＰＶ１の生理学的機能の少なくとも１種を発現するポリペプチドである核酸、
（ＩＩ）配列番号：２において、１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドが、前記ＴＲＰＶ１の生理学的機能の少なくとも１種を発現するポリペプチドである核酸、
（ＩＩＩ）配列番号：１に示される塩基配列中の２７６位〜２７９５位からなる塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ前記ＴＲＰＶ１の生理学的機能の少なくとも１種を少なくとも発現するポリペプチドをコードする核酸、
（ＩＶ）配列番号：１に示される塩基配列中の２７６位〜２７９５位の配列からなる核酸とオルタナティブスプライシングを介して異なる塩基配列からなり、かつ前記ＴＲＰＶ１の生理学的機能の少なくとも１種を発現するポリペプチドである核酸（以下、「スプライシングバリアント」という）
などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されない。
【００２０】
なお、前記（Ｉ）において、「配列同一性」の値は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対して、評価対象のアミノ酸配列をアラインメントし、一致したアミノ酸残基数を全アミノ酸残基数で除したものを百分率で表わした値である。アラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムに基づくＰＲＯＴＥＩＮ  ＢＬＡＳＴなどを用いて行なうことができる。また、前記（ＩＩ）において、「１個または数個」は、１〜３０個であるが、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１個または２個である。前記（ＩＩ）において、アミノ酸残基の置換、欠失または付加（以下、置換、欠失または付加を総称して「変異」ともいう）は、ＴＲＰＶ１の生理学的機能の発現に関与する領域以外の領域に存在していてもよく、ＴＲＰＶ１の生理学的機能の発現に影響のない範囲であれば、ＴＲＰＶ１の生理学的機能の発現に関与する領域の発現に関与する領域に存在していてもよい。なお、アミノ酸残基の変異がＴＲＰＶ１の生理学的機能の発現に関与する領域に存在する場合、ＴＲＰＶ１の生理学的機能を十分に発現させる観点から、前記変異は、保存的置換であることが好ましい。また、本明細書において、「ストリンジェントな条件」は、配列番号：２のアミノ酸配列からなるポリペプチドの生理学的機能と同等またはそれ以上の生理学的機能を有するポリペプチドをコードする核酸を得る観点から、好ましくは配列番号：１に示される塩基配列中の２７６位〜２７９５位からなる塩基配列からなる核酸の相補鎖と、配列番号：１に示される塩基配列中の２７６位〜２７９５位からなる塩基配列からなる核酸に対する配列相同性が少なくとも８０％である塩基配列からなる核酸とが特異的にハイブリダイゼーションする条件である。前記ストリンジェントな条件としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列中の２７６位〜２７９５位の配列からなる核酸の相補鎖とハイブリダイゼーション対象の核酸とを、ハイブリダイゼーション用溶液〔組成：６×ＳＳＣ（組成：０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５質量％ドデシル硫酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、５０体積％ホルムアミド〕中、４２℃でインキュベーションし、つぎに、０．１質量％ドデシル硫酸ナトリウム含有０．１×ＳＳＣ中、５０℃の温度で洗浄を行なう条件などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。なお、ストリンジェントな条件は、モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル第２版〔ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．）、１９９８年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス発行〕に記載された手法にしたがい、適宜より高いストリンジェンシーが得られる条件に変更することができる。前記スプライシングバリアントとしては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１８７２７．５、ＮＭ＿０８０７０５．３、ＮＭ＿０８０７０６．３などの塩基配列で示される核酸が挙げられるが、本発明は、特に限定さ���るものではない。
【００２１】
前記組換えベクターは、前記ＴＲＰＶ１をコードする核酸を、慣用のベクターと連結させることにより得られる。前記ベクターは、例えば、選択マーカー遺伝子、発現プロモーターなどを有していてもよい。前記宿主細胞としては、前記ＴＲＰＶ１が効率よく発現され、かつ培養が容易なものであればよく、例えば、動物細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの宿主細胞のなかでは、ヒトへの適用に適した物質を的確に評価する観点から、、好ましくは動物細胞である。前記動物細胞としては、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞などのヒト細胞；ＣＯＳ−７細胞などのサル細胞；ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などのマウス細胞；ｏｏｃｙｔｅ細胞などのアフリカツメガエルの卵細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの動物細胞のなかでは、ヒトへの適用に適した物質を的確に評価する観点から、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞が好ましく、ＨＥＫ２９３細胞がより好ましい。
【００２２】
形質転換後の細胞からの外因性ＴＲＰＶ１発現細胞の選択は、例えば、用いられた組換えベクターが選択マーカー遺伝子を有する場合、選択マーカー遺伝子に応じた選択培地で培養することなどにより行なうことができる。また、得られた細胞が外因性ＴＲＰＶ１発現細胞であることの確認は、例えば、細胞を、カプサイシンと接触させ、後述の細胞内カルシウムイオン濃度の測定方法により、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定することにより行なうことができる。細胞が外因性ＴＲＰＶ１発現細胞である場合、カプサイシン接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度は、カプサイシンと接触させていない細胞の細胞内カルシウムイオン濃度よりも大きくなる。
【００２３】
まず、ＴＲＰＶ１発現細胞を、被験物質とＴＲＰＶ１アゴニストとメントールとを含有する被験試料およびＴＲＰＶ１アゴニストとメントールとを含有する比較試料のそれぞれに接触させる。
【００２４】
なお、本発明においては、ＴＲＰＶ１発現細胞と被験試料および比較試料のそれぞれとの接触に先立ち、ＴＲＰＶ１発現細胞とＴＲＰＶ１アゴニストとを接触させることができる。この場合、ＴＲＰＶ１発現細胞におけるＴＲＰＶ１を予め活性化させることができることから、メントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用に対する被験物質が有する増幅作用をより的確に評価することができる。ＴＲＰＶ１発現細胞とＴＲＰＶ１アゴニストとの接触は、例えば、ＴＲＰＶ１アゴニストを含有する液体中でＴＲＰＶ１発現細胞をインキュベーションすることなどによって行なうことができる。
【００２５】
前記ＴＲＰＶ１アゴニストとしては、例えば、カプサイシン、レシニフェラトキシン、アナンダミド、カンフル、２−アミノエトキシジフェニルホウ酸塩、アリシン、（５Ｚ，８Ｚ，１０Ｚ，１２Ｓ，１４Ｚ）−１２−ヒドロペルオキシ−５，８，１０，１４−イコサテトラエン酸、（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１３Ｅ，１５Ｓ）−１５−ヒドロペルオキシ−５，８，１１，１３−イコサテトラエン酸、ロイコトリエンＢ、酸、ピペリンなどが挙げられるが、本発明は、特に限定されるものではない。
【００２６】
前記ＴＲＰＶ１アゴニストを含有する液体に用いられる溶媒としては、例えば、溶媒Ａ〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭヘペス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）〕、ダルベッコ改変イーグル培地などが挙げられるが、特に限定されない。
【００２７】
前記ＴＲＰＶ１アゴニストを含有する液体におけるＴＲＰＶ１アゴニストの濃度は、ＴＲＰＶ１アゴニストの種類、ＴＲＰＶ１発現細胞の数などによって異なるので、一概には決定することができないことから、ＴＲＰＶ１アゴニストの種類、ＴＲＰＶ１発現細胞の数などに応じて適宜決定することが望ましい。前記ＴＲＰＶ１アゴニストが、レシニフェラトキシンまたはロイコトリエンＢである場合、前記ＴＲＰＶ１アゴニストを含有する液体におけるＴＲＰＶ１アゴニストの濃度は、ＴＲＰＶ１に対するＴＲＰＶ１アゴニストの作用を十分に発現させる観点から、好ましくは０．０１ｎＭ以上、より好ましくは０．１ｎＭ以上であり、抑制効果をより効率良く比較する観点から、好ましくは１００ｎＭ以下、より好ましくは５０ｎＭ以下である。また、前記ＴＲＰＶ１アゴニストが、カプサイシン、ピペリン、アナンダミドまたはアリシンである場合、前記ＴＲＰＶ１アゴニストを含有する液体におけるＴＲＰＶ１アゴニストの濃度は、ＴＲＰＶ１に対するＴＲＰＶ１アゴニストの作用を十分に発現させる観点から、好ましくは０．０１μＭ以上、より好ましくは０．１μＭ以上であり、抑制効果をより効率良く比較する観点から、好ましくは１０μＭ以下、より好ましくは１μＭ以下である。さらに、前記ＴＲＰＶ１アゴニストが、カンフル、２−アミノエトキシジフェニルホウ酸塩、（５Ｚ，８Ｚ，１０Ｚ，１２Ｓ，１４Ｚ）−１２−ヒドロペルオキシ−５，８，１０，１４−イコサテトラエン酸または（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１３Ｅ，１５Ｓ）−１５−ヒドロペルオキシ−５，８，１１，１３−イコサテトラエン酸である場合、ＴＲＰＶ１に対するＴＲＰＶ１アゴニストの作用を十分に発現させる観点から、好ましくは０．０１ｍＭ以上、より好ましくは０．１ｍＭ以上であり、抑制効果をより効率良く比較する観点から、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下である。
【００２８】
前記ＴＲＰＶ１アゴニストを含有する液体とＴＲＰＶ１発現細胞との接触に際して、前記ＴＲＰＶ１アゴニストを含有する液体１ｍＬあたりのＴＲＰＶ１発現細胞の数は、試験データの信頼性の観点から、１×１０３細胞以上、より好ましくは１×１０４細胞以上であり、ＴＲＰＶ１発現細胞におけるＴＲＰＶ１の生理学的機能を十分に発揮させる観点から、１×１０５細胞以下、より好ましくは５×１０４細胞以下である。
【００２９】
前記ＴＲＰＶ１アゴニストを含有する液体とＴＲＰＶ１発現細胞との接触に際して、接触温度は、ＴＲＰＶ１発現細胞の種類などによって異なるので、一概には決定することができないことから、ＴＲＰＶ１発現細胞の種類などに応じて適宜決定することが望ましい。
【００３０】
前記ＴＲＰＶ１アゴニストを含有する液体とＴＲＰＶ１発現細胞との接触に際して、接触時間は、ＴＲＰＶ１アゴニストの種類、ＴＲＰＶ１アゴニストを含有する液体におけるＴＲＰＶ１アゴニストの濃度、ＴＲＰＶ１発現細胞の種類などによって異なるので、一概には決定することができないことから、ＴＲＰＶ１アゴニストの種類、ＴＲＰＶ１アゴニストを含有する液体におけるＴＲＰＶ１アゴニストの濃度、ＴＲＰＶ１発現細胞の種類などに応じて適宜決定することが望ましい。
【００３１】
ＴＲＰＶ１発現細胞と被験試料との接触は、例えば、被験試料中において、ＴＲＰＶ１発現細胞と被験試料とを混合してインキュベーションすることなどによって行なうことができる。また、ＴＲＰＶ１発現細胞と比較試料との接触は、例えば、比較試料中において、ＴＲＰＶ１発現細胞と比較試料とを混合してインキュベーションすることなどによって行なうことができる。
【００３２】
前記被験試料は、被験物質とＴＲＰＶ１アゴニストとメントールとを含有する。前記被験試料は、ＴＲＰＶ１アゴニストに接触後のＴＲＰＶ１発現細胞との接触が容易であることから、通常、液状の試料である。被験試料が液状の試料である場合、溶媒は、前記ＴＲＰＶ１アゴニストを含有する液体に用いられる溶媒と同じ溶媒である。
【００３３】
前記被験試料における被験物質の濃度は、被験物質の種類、ＴＲＰＶ１発現細胞の数などによって異なるので、一概には決定することができないことから、被験物質の種類、ＴＲＰＶ１発現細胞の数などに応じて適宜決定することが望ましい。
【００３４】
前記被験試料におけるＴＲＰＶ１アゴニストの濃度は、ＴＲＰＶ１アゴニストの種類、ＴＲＰＶ１発現細胞の数などによって異なるので、一概には決定することができないことから、ＴＲＰＶ１アゴニストの種類、ＴＲＰＶ１発現細胞の数などに応じて適宜決定することが望ましい。前記ＴＲＰＶ１アゴニストが、レシニフェラトキシンまたはロイコトリエンＢである場合、前記被験試料におけるＴＲＰＶ１アゴニストの濃度は、通常、ＴＲＰＶ１に対するＴＲＰＶ１アゴニストの作用を十分に発現させる観点から、好ましくは０．０１ｎＭ以上、より好ましくは０．１ｎＭ以上であり、抑制効果をより効率良く比較する観点から、好ましくは１００ｎＭ以下、より好ましくは５０ｎＭ以下である。また、前記ＴＲＰＶ１アゴニストが、カプサイシン、ピペリン、アナンダミドまたはアリシンである場合、前記被験試料におけるＴＲＰＶ１アゴニストの濃度は、ＴＲＰＶ１に対するＴＲＰＶ１アゴニストの作用を十分に発現させる観点から、好ましくは０．０１μＭ以上、より好ましくは０．１μＭ以上であり、抑制効果をより効率良く比較する観点から、好ましくは１０μＭ以下、より好ましくは１μＭ以下である。さらに、前記ＴＲＰＶ１アゴニストが、カンフル、２−アミノエトキシジフェニルホウ酸塩、（５Ｚ，８Ｚ，１０Ｚ，１２Ｓ，１４Ｚ）−１２−ヒドロペルオキシ−５，８，１０，１４−イコサテトラエン酸または（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１３Ｅ，１５Ｓ）−１５−ヒドロペルオキシ−５，８，１１，１３−イコサテトラエン酸である場合、前記被験試料におけるＴＲＰＶ１アゴニストの濃度は、ＴＲＰＶ１に対するＴＲＰＶ１アゴニストの作用を十分に発現させる観点から、好ましくは０．０１ｍＭ以上、より好ましくは０．１ｍＭ以上であり、抑制効果をより効率良く比較する観点から、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下である。なお、ＴＲＰＶ１発現細胞と被験試料および比較試料のそれぞれとの接触に先立ち、前記ＴＲＰＶ１アゴニストを含有する液体を用いてＴＲＰＶ１発現細胞とＴＲＰＶ１アゴニストとを接触させた場合、前記被験試料におけるＴＲＰＶ１アゴニストの濃度は、前記ＴＲＰＶ１アゴニストを含有する液体におけるＴＲＰＶ１アゴニストの濃度と同じ濃度である。
【００３５】
前記被験試料におけるメントールの濃度は、ＴＲＰＶ１発現細胞の数などによって異なるので、一概には決定することができないことから、ＴＲＰＶ１発現細胞の数などに応じて適宜決定することが望ましい。前記被験試料におけるメントールの濃度は、通常、ＴＲＰＶ１に対するメントールの作用を十分に発現させる観点から、好ましくは３ｍＭ以上、より好ましくは４ｍＭ以上であり、前記被験試料にメントールを十分に溶解させる観点から、好ましくは１５ｍＭ以下、より好ましくは１０ｍＭ以下である。
【００３６】
前記比較試料は、ＴＲＰＶ１アゴニストとメントールとを含有する。前記比較試料は、ＴＲＰＶ１アゴニストに接触後のＴＲＰＶ１発現細胞との接触が容易であることから、被検試料と同様に、通常、液状の試料である。比較試料が液状の試料である場合、溶媒は、前記ＴＲＰＶ１アゴニストを含有する液体および被験試料に用いられる溶媒と同じ溶媒である。
【００３７】
前記比較試料におけるＴＲＰＶ１アゴニストの濃度およびメントールの濃度は、前記被験試料におけるＴＲＰＶ１アゴニストの濃度およびメントールの濃度と同じ濃度である。
【００３８】
ＴＲＰＶ１発現細胞と、前記被験試料および前記比較試料のそれぞれとの接触に際して、前記被験試料または前記比較試料１ｍＬあたりのＴＲＰＶ１発現細胞の数は、試験データの信頼性の観点から、１×１０５細胞以上、より好ましくは５×１０５細胞以上であり、ＴＲＰＶ１発現細胞におけるＴＲＰＶ１の生理学的機能を十分に発揮させる観点から、５×１０６細胞以下、より好ましくは１×１０６細胞以下である。なお、ＴＲＰＶ１発現細胞と被験試料および比較試料のそれぞれとの接触に先立ち、前記ＴＲＰＶ１アゴニストを含有する液体を用いてＴＲＰＶ１発現細胞とＴＲＰＶ１アゴニストとを接触させた場合、前記被験試料または前記比較試料１ｍＬあたりのＴＲＰＶ１発現細胞の数は、前記ＴＲＰＶ１アゴニスト含有する液体１ｍＬあたりのＴＲＰＶ１発現細胞の数と同様である。
【００３９】
ＴＲＰＶ１発現細胞と、被験試料および比較試料のそれぞれとの接触の際の接触温度は、ＴＲＰＶ１発現細胞の種類などによって異なるので、一概には決定することができないことから、ＴＲＰＶ１発現細胞の種類などに応じて適宜決定することが望ましい。前記ＴＲＰＶ１発現細胞と被験試料との接触の際の接触温度と、前記ＴＲＰＶ１発現細胞と比較試料との接触の際の接触温度は、同じ温度である。なお、ＴＲＰＶ１発現細胞と被験試料および比較試料のそれぞれとの接触に先立ち、前記ＴＲＰＶ１アゴニストを含有する液体を用いてＴＲＰＶ１発現細胞とＴＲＰＶ１アゴニストとを接触させた場合、ＴＲＰＶ１発現細胞と、被験試料および比較試料のそれぞれとの接触の際の接触温度は、前記ＴＲＰＶ１アゴニストを含有する液体とＴＲＰＶ１発現細胞との接触の際の接触温度と同様である。
【００４０】
前記ＴＲＰＶ１発現細胞と、被験試料および比較試料のそれぞれとの接触の際の接触時間は、ＴＲＰＶ１アゴニストの種類、被験試料および比較試料のそれぞれにおけるＴＲＰＶ１アゴニストの濃度、被験試料および比較試料におけるメントールの濃度、被験試料における被験物質の濃度、ＴＲＰＶ１発現細胞の種類などによって異なるので、一概には決定することができないことから、ＴＲＰＶ１アゴニストの種類、被験試料および比較試料のそれぞれにおけるＴＲＰＶ１アゴニストの濃度、被験試料および比較試料におけるメントールの濃度、被験試料における被験物質の濃度、ＴＲＰＶ１発現細胞の種類などに応じて適宜決定することが望ましい。前記ＴＲＰＶ１発現細胞と被験試料との接触の際の接触時間と、前記ＴＲＰＶ１発現細胞と比較試料との接触の際の接触時間は、同じ時間である。
【００４１】
前記被験試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化および前記比較試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化は、例えば、
ａ）カルシウムイオンと特異的に結合するカルシウム指示薬をＴＲＰＶ１発現細胞に導入するステップ、
ｂ）前記ステップａ）でカルシウム指示薬が導入されたＴＲＰＶ１発現細胞内のカルシウムイオンに前記カルシウム指示薬を結合させ、カルシウムイオンと結合したカルシウム指示薬の量を継時的に測定する方法などによって測定することができる。
【００４２】
前記カルシウム指示薬は、カルシウムイオンと結合したカルシウム指示薬の量を簡便な操作で測定することができることから、カルシウムイオンとの結合前後の変化を光学的特性の変化などによって検出することができる試薬であることが好ましい。前記光学的特性の変化としては、例えば、蛍光強度の変化、吸光度の変化などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものでない。前記カルシウム指示薬としては、例えば、カルシウムイオンとの結合前後に蛍光強度が変化する蛍光カルシウム指示薬などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記カルシウム指示薬のなかでは、測定が容易であり、かつＴＲＰＶ１発現細胞内に存在する夾雑物質の動態との区別化が容易である観点から、カルシウムイオンとの結合前後に蛍光強度が変化する蛍光カルシウム指示薬が好ましい。前記蛍光カルシウム指示薬としては、例えば、ＦＵＲＡ  ２、ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記蛍光カルシウム指示薬は、１種類の励起波長を有していてもよく、２種類以上の励起波長を有していてもよい。前記カルシウム指示薬が前記蛍光カルシウム指示薬である場合、当該蛍光カルシウム指示薬は、蛍光強度の測定が容易であり、しかも被験物質がメントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる物質であるかどうかの評価の精度をより高めることができることから、２種類の励起波長を有する蛍光カルシウム指示薬が好ましい。
【００４３】
前記細胞内カルシウム濃度の変化の測定に際して、１種類の励起波長を有する蛍光カルシウム指示薬を用いる場合、当該励起波長における蛍光強度に基づき、細胞内カルシウム濃度の変化を測定することができる。
【００４４】
また、前記細胞内カルシウム濃度の変化の測定に際し、２種類以上の励起波長を有する蛍光カルシウム指示薬を用いる場合、被験物質がメントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる物質であるかどうかの評価の精度をより高める観点から、当該２種類以上の励起波長から選ばれた２種類の励起波長（第１励起波長および第２励起波長）を選択し、第１励起波長および第２励起波長のそれぞれにおける蛍光強度から算出された蛍光強度比に基づき、細胞内カルシウム濃度の変化を測定することができる。細胞内カルシウム濃度の測定に際し、例えば、２種類の励起波長を有する蛍光カルシウム指示薬であるＦＵＲＡ  ２−ＡＭを用いる場合、第１励起波長における蛍光強度（以下、「第１蛍光強度」ともいう）として３４０ｎｍにおける蛍光強度および第２励起波長における蛍光強度（以下、「第２蛍光強度」ともいう）として３８０ｎｍにおける蛍光強度を用いることができる。この場合、前記蛍光強度比は、例えば、式（Ｉ）：
【００４５】
【数１】
0006576203.tif 000002
【００４６】
に基づいて求めることができる。なお、本明細書において、「蛍光強度340nm」は励起波長３４０ｎｍにおける蛍光強度を示し、「蛍光強度380nm」は励起波長３８０ｎｍにおける蛍光強度を示す。
【００４７】
前記ＴＲＰＶ１アゴニストに接触させたＴＲＰＶ１発現細胞内では、ＴＲＰＶ１アゴニストに接触させていないＴＲＰＶ１発現細胞に比べて、ＴＲＰＶ１を介するＴＲＰＶ１発現細胞外からＴＲＰＶ１発現細胞内へのカルシウムイオンの流入量が増大する。これに対し、前記ＴＲＰＶ１アゴニストとメントールとに接触させたＴＲＰＶ１発現細胞は、前記ＴＲＰＶ１アゴニストに接触させ、かつメントールと接触させていないＴＲＰＶ１発現細胞に比べて、ＴＲＰＶ１を介するＴＲＰＶ１発現細胞外からＴＲＰＶ１発現細胞内へのカルシウムイオンの流入量が減少する。
【００４８】
なお、蛍光カルシウム指示薬が２種類の励起波長を有する場合、より精度を高める観点から、各励起波長における蛍光強度から蛍光強度比を算出することが好ましい。例えば、蛍光カルシウム指示薬であるＦＵＲＡ  ２−ＡＭの励起波長は、３４０ｎｍおよび３８０ｎｍである。この場合、前記被験試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化は、Δ蛍光強度比被験物質に基づき測定することができる。前記Δ蛍光強度比被験物質は、式（ＩＩ）：
【００４９】
【数２】
0006576203.tif 000003
【００５０】
に基づいて算出することができる。また、前記比較試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化は、Δ蛍光強度比メントールに基づき測定することができる。
前記Δ蛍光強度比メントールは、式（ＩＩＩ）：
【００５１】
【数３】
0006576203.tif 000004
【００５２】
に基づいて算出することができる。前記被験物質がメントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる作用を有する物質であるかどうかは、Δ蛍光強度比被験物質に基づいて算出される抑制率被験物質とΔ蛍光強度比メントールに基づいて算出される抑制率メントールとを比較することによって評価することができる。抑制率被験物質は、式（ＩＶ）：
【００５３】
【数４】
0006576203.tif 000005
【００５４】
に基づいて算出することができる。また、抑制率メントールは、式（Ｖ）：
【００５５】
【数５】
0006576203.tif 000006
【００５６】
に基づいて算出することができる。なお、Δ蛍光強度比アゴニストは、式（ＶＩ）：
【００５７】
【数６】
0006576203.tif 000007
【００５８】
に基づいて算出することができる。なお、前記対照は、被験試料および比較試料の種類などによって異なるので、一概には決定することができないことから、被験試料および比較試料の種類などに応じて適宜決定することが望ましい。被験試料および比較試料が液状の試料である場合、前記対照としては、例えば、前記被験試料および前記比較試料に用いられる溶媒と同じ溶媒などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００５９】
抑制率被験物質と抑制率メントールとの比較は、例えば、式（ＶＩＩ）：
【００６０】
【数７】
0006576203.tif 000008
【００６１】
に基づいて算出される抑制比率を用いて行なうことができる。ここで、前記被験物質がメントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用の増幅作用を有することの判断基準としては、例えば、抑制比率が、好ましくは１３０以上、より好ましくは１４０以上、さらに好ましくは１５０以上、より一層好ましくは２００以上であることなどが挙げられる。抑制比率が１３０以上である場合、メントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用が被験物質によって相加的ではなく、相乗的に増幅されていると考えられる。
【００６２】
鎮痛剤としてメントールを単独で用いた場合、十分な鎮痛効果を得にくい。本発明の被験物質の評価方法に供することによって、メントールによるＴＲＰＶ１の活性抑制作用を増幅させる物質であることが判明した被験物質は、メントールとの併用により、メントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させることができることから、ＴＲＰＶ１を介して痛みを示す部位などでより高い鎮痛効果を得ることができる物質であると考えられる。そのため、本発明の被験物質の評価方法によれば、例えば、外用剤、内服剤などの成分として用いられる化合物などを被験物質として用いることにより、前記化合物などが、メントールとの併用により、ＴＲＰＶ１を介した皮膚などでの痛み感覚をより効果的に抑制することができるかどうかを調べることができる。また、本発明の被験物質の評価方法によれば、メントールによるＴＲＰＶ１の活性抑制作用を増幅させる物質のスクリーニング、薬理学的評価などを行なうことができる。したがって、本発明の被験物質の評価方法は、鎮痛作用を有する外用剤、内服剤などの開発に用いられることが期待されるものである。
【実施例】
【００６３】
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。
【００６４】
（製造例１）
ヒトＴＲＰＶ１をコードするｃＤＮＡ〔配列番号：３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＭＮ＿０８０７０４．３）に示される塩基配列の２７６位〜２７９５位のポリヌクレオチド〕を、哺乳動物細胞用ベクター〔ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製、商品名：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）〕のクローニングサイトに挿入し、ヒトＴＲＰＶ１発現ベクターを得た。得られたヒトＴＲＰＶ１発現ベクター１μｇと、遺伝子導入用試薬〔ライフテクノロジーズ社製、商品名：ＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ〕６μＬとを混合し、混合物Ｉを得た。また、遺伝子導入用カチオン性脂質〔ライフテクノロジーズ社製、商品名：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ〕４μＬと、血清使用量低減培地〔インビトロジェン社製、商品名：Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ〕２００μＬとを混合し、混合物ＩＩを得た。
【００６５】
また、５体積％二酸化炭素の雰囲気中、３７℃に維持された直径３５ｍｍのシャーレ上の１０質量％ウシ胎仔血清アルブミン含有ダルベッコ改変イーグル培地（以下、「ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ」ともいう）中において、５×１０５細胞のＨＥＫ２９３細胞を７０％のコンフルエンシーになるまで培養した。
【００６６】
得られた細胞培養物に、前記混合物Ｉと混合物ＩＩとを添加することにより、ＨＥＫ２９３細胞に前記ヒトＴＲＰＶ１発現ベクターを導入し、ＴＲＰＶ１発現細胞を得た。
【００６７】
（製造例２）
カプサイシンをその濃度が０．１μＭとなるように溶媒Ａ〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭヘペス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）〕に溶解させ、カプサイシン含有試料料を得た。
【００６８】
（製造例３）
メントールおよびカプサイシンをメントールの濃度が５ｍＭおよびカプサイシンの濃度が０．１μＭとなるように溶媒Ａに溶解させ、カプサイシン−メントール含有試料を得た。
【００６９】
（製造例４〜９）
メントールをその濃度が０．０３ｍＭ（製造例４）、０．１ｍＭ（製造例５）、０．３ｍＭ（製造例６）、１ｍＭ（製造例７）、３ｍＭ（製造例８）または１０ｍＭ（製造例９）となるように溶媒Ａに溶解させ、メントール含有試料を得た。
【００７０】
（製造例１０〜１５）
製造例３において、メントールをその濃度が０．０３ｍＭ（製造例１０）、０．１ｍＭ（製造例１１）、０．３ｍＭ（製造例１２）、１ｍＭ（製造例１３）、３ｍＭ（製造例１４）または１０ｍＭ（製造例１５）となるように溶媒Ａに溶解させたことを除き、製造例３と同様の操作を行ない、カプサイシン−メントール含有試料を得た。
【００７１】
（参考例１）
製造例１で得られたＴＲＰＶ１発現細胞を溶媒Ａ中、３７℃で２分間振盪させながらインキュベーションすることにより、ＴＲＰＶ１発現細胞を洗浄した。つぎに、洗浄後のＴＲＰＶ１発現細胞を溶媒Ａが入った循環定温チャンバーに入れた。循環定温チャンバー中のＴＲＰＶ１発現細胞に、電極の先端を接触させ、電流記録ソフトウェア〔モルキュラーデバイス社製、商品名：ｐＣＬＡＭＰ１０〕と電流記録装置〔モルキュラーデバイス社製、商品名：Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ〕とを用い、電圧を−６０ｍＶに固定したときの電流変化を測定した。測定開始時から３０秒間経過後に、ＴＲＰＶ１発現細胞が入った循環定温チャンバー内において、製造例２で得られたカプサイシン含有試料を循環させることにより、ＴＲＰＶ１発現細胞をカプサイシンに曝露した。前記カプサイシン含有試料循環開始時から２０秒間経過後に、ＴＲＰＶ１発現細胞が入った循環定温チャンバー内において、製造例３で得られたカプサイシン−メントール含有試料を循環させることにより、ＴＲＰＶ１発現細胞をカプサイシンとメントールとに曝露した。前記カプサイシン−メントール含有試料循環開始時から１５秒間経過後に、ＴＲＰＶ１発現細胞が入った循環定温チャンバー内において、製造例２で得られたカプサイシン含有試料を循環させることにより、ＴＲＰＶ１発現細胞をカプサイシンに曝露した。前記カプサイシン含有試料循環開始時から３０秒間経過後に、電流変化の測定を終了した。
【００７２】
参考例１において、ＴＲＰＶ１発現細胞における電流の経時的変化を調べた結果を図１に示す。図中、黒色バーはＴＲＰＶ１発現細胞をカプサイシンに曝露した期間、白色バーはＴＲＰＶ１発現細胞をカプサイシンとメントールとに曝露した期間を示す。
【００７３】
図１に示された結果から、ＴＲＰＶ１発現細胞をカプサイシンのみに曝露した期間における電流に比べ、ＴＲＰＶ１発現細胞をカプサイシンとメントールとに曝露した期間における電流が低いことがわかる。したがって、これらの結果から、メントールは、ＴＲＰＶ１活性抑制作用を示すことがわかる。
【００７４】
（参考例２）
（１）ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞の調製
製造例１で得られたＴＲＰＶ１発現細胞を、細胞内カルシウムイオン測定用試薬であるＦＵＲＡ  ２−ＡＭ（ライフテクノロジーズ社製）を最終濃度５μＭで含む１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中、室温（２５℃）で６０分間インキュベーションすることにより、前記ＴＲＰＶ１発現細胞にＦＵＲＡ  ２−ＡＭを導入し、ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞を得た。
【００７５】
（２）蛍光強度の測定
参考例２（１）で得られたＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞を循環定温チャンバー付蛍光測定装置〔浜松ホトニクス（株）製、商品名：ＡＲＧＵＳ−５０〕の循環定温各チャンバーに入れた。その後、各チャンバー中のＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞を、溶媒Ａで洗浄した。以下において、循環定温チャンバーにおいて、励起波長３４０ｎｍにおけるＴＲＰＶ１発現細胞に導入され、かつ細胞内のカルシウムイオンに結合したＦＵＲＡ  ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度３４０ｎｍ」という）および励起波長３８０ｎｍにおけるＴＲＰＭ１発現細胞に導入されたＦＵＲＡ  ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度３８０ｎｍ」という）を経時的に測定した。
【００７６】
洗浄後のＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞が入った循環定温チャンバー内において、製造例４で得られたメントール含有試料を循環させることにより、ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞をメントールに曝露した。メントール含有試料循環開始時から７５秒間経過後、ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞が入った循環定温チャンバー内において、製造例１０〜１５で得られたカプサイシン−メントール含有試料を循環させることにより、ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞をカプサイシンとメントールとに曝露した。カプサイシン−メントール含有試料循環開始時から７５秒間経過後、ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞が入った循環定温チャンバー内において、製造例４で得られたメントール含有試料を循環させることにより、ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞をメントールに曝露した。メントール含有試料循環開始時から７５秒間経過後、ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞が入った循環定温チャンバー内において、溶媒Ａを循環させた。溶媒Ａの循環開始時から１００秒間経過後、ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞が入った循環定温チャンバー内において、製造例２で得られたカプサイシン含有試料を５０秒間循環させた。
【００７７】
（３）活性の算出
ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞をカプサイシンのみに曝露したときの測定された蛍光強度３４０ｎｍおよび蛍光強度３８０ｎｍから、Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。前記Δ蛍光強度比アゴニストは、式（ＶＩ）に基づいて算出した。なお、前記対照は、溶媒Ａである。
【００７８】
また、ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞をカプサイシンとメントールとに曝露したときの蛍光強度３４０ｎｍおよび蛍光強度３８０ｎｍから、Δ蛍光強度比メントールを算出した。前記Δ蛍光強度比メントールは、式（ＩＩＩ）に基づいて算出した。なお、前記対照は、溶媒Ａである。
【００７９】
算出されたΔ蛍光強度比アゴニストとΔ蛍光強度比メントールとから、活性メントールを算出した。なお、活性メントールは、式（ＶＩＩＩ）：
【００８０】
【数８】
0006576203.tif 000009
【００８１】
に基づいて算出した。また、前記において、製造例４で得られたメントール含有試料を用いる代わりに、製造例５〜９で得られたメントール含有試料を用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、活性メントールを求めた。
【００８２】
参考例２において、メントール濃度と活性との関係を調べた結果を図２に示す。
【００８３】
図２に示された結果から、被験試料におけるメントール濃度が少なくとも３ｍＭである場合、活性（活性メントール）が顕著に抑制されることがわかる。したがって、これらの結果から、メントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用は、被験試料におけるメントール濃度が少なくとも３ｍＭであることが好ましいことがわかる。
【００８４】
（製造例１６）
メントール、被験物質としてのポリエチレングリコール（オキシエチレン基の平均付加モル数が１５００；以下、「ＰＥＧ１５００」いう）およびカプサイシンをメントールの濃度が５ｍＭ、ＰＥＧ１５００の濃度が０．０１質量％およびカプサイシンの濃度が０．１μＭとなるように溶媒Ａに溶解させ、被験試料を得た。
【００８５】
また、メントールおよびＰＥＧ１５００をメントールの濃度が５ｍＭおよびＰＥＧ１５００の濃度が０．０１質量％となるように溶媒Ａに溶解させ、比較試料を得た。
【００８６】
（製造例１７）
製造例１６において、被験物質としてＰＥＧ１５００を用いる代わりにポリエチレングリコール（オキシエチレン基の平均付加モル数が１５００；以下、「ＰＥＧ４００」いう）を用いたことを除き、製造例１６と同様の操作を行ない、被験試料および比較試料を得た。
【００８７】
（製造例１８）
メントール、被験物質としてのエタノールおよびカプサイシンをメントールの濃度が５ｍＭ、エタノールの濃度が１Ｍおよびカプサイシンの濃度が０．１μＭとなるように溶媒Ａに溶解させ、被験試料を得た。
【００８８】
また、メントールおよびエタノールをメントールの濃度が５ｍＭおよびエタノールの濃度が１Ｍとなるように溶媒Ａに溶解させ、比較試料を得た。
【００８９】
（製造例１９）
製造例１８において、被験物質としてエタノールを用いる代わりにプロピレングリコールを用いたことを除き、製造例１８と同様の操作を行ない、被験試料および比較試料を得た。
【００９０】
（製造例２０）
メントール、被験物質としてのカプサゼピンおよびカプサイシンをメントールの濃度が５ｍＭ、カプサゼピンの濃度が１μＭおよびカプサイシンの濃度が０．１μＭとなるように溶媒Ａに溶解させ、被験試料を得た。
【００９１】
また、メントールおよびカプサゼピンをメントールの濃度が５ｍＭおよびカプサゼピンの濃度が１μＭとなるように溶媒Ａに溶解させ、比較試料を得た。
【００９２】
（製造例２１）
製造例２０において、被験物質としてカプサゼピンを用いる代わりにルテニウムレッドを用いたことを除き、製造例２０と同様の操作を行ない、被験試料および比較試料を得た。
【００９３】
（製造例２２）
メントールをその濃度が５ｍＭとなるように溶媒Ａに溶解させ、メントール含有試料を得た。
【００９４】
（実施例１）
（１）ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞の調製
参考例２（１）と同様の操作を行ない、ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞を得た。
【００９５】
（２）蛍光強度の測定
実施例１（１）で得られたＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞を循環定温チャンバー付蛍光測定装置〔浜松ホトニクス（株）製、商品名：ＡＲＧＵＳ−５０〕の各循環チャンバーに入れた。その後、各チャンバー中のＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞を、溶媒Ａで洗浄した。以下において、循環定温チャンバーにおいて、蛍光強度３４０ｎｍおよび蛍光強度３８０ｎｍを経時的に測定した。
【００９６】
洗浄後のＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞が入った循環定温チャンバー内において、製造例２２で得られたメントール含有試料を循環させた。前記メントール含有試料循環開始時から７５秒間経過後、ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞が入った循環定温チャンバー内において、製造例３で得られたカプサイシン−メントール含有試料を循環させた。前記カプサイシン−メントール含有試料循環開始時から７５秒間経過後、ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞が入った循環定温チャンバー内において、製造例２２で得られたメントール含有試料を循環させた。前記メントール含有試料循環開始時から７５秒間経過後、ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞が入った循環定温チャンバー内において、溶媒Ａを循環させた。溶媒Ａの循環開始時から１００秒間経過後、ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞が入った循環定温チャンバー内において、製造例２で得られたカプサイシン含有試料を５０秒間循環させ、ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞をカプサイシンのみに曝露した。
【００９７】
（３）活性の算出
ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞をカプサイシンのみに曝露したときの測定された蛍光強度３４０ｎｍおよび蛍光強度３８０ｎｍを用い、式（ＶＩ）に基づいてΔ蛍光強度比アゴニストを算出した。
【００９８】
また、ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞をカプサイシンとメントールとに曝露したときの蛍光強度３４０ｎｍおよび蛍光強度３８０ｎｍから、Δ蛍光強度比メントールを算出した。前記Δ蛍光強度比メントールは、式（ＩＩＩ）に基づいて算出した。
【００９９】
算出されたΔ蛍光強度比アゴニストとΔ蛍光強度比メントールとから、活性メントールを算出した。なお、活性メントールは、式（ＶＩＩＩ）に基づいて算出した。
【０１００】
また、前記において、製造例２２で得られたメントール含有試料を用いる代わりに製造例１６〜２１で得られた比較試料を用いたことおよび製造例３で得られたカプサイシン−メントール含有試料を用いる代わりに製造例１６〜２１で得られた被験試料を用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、蛍光強度３４０ｎｍおよび蛍光強度３８０ｎｍを経時的に測定した。
【０１０１】
ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞をカプサイシンのみに曝露したときの測定された蛍光強度３４０ｎｍおよび蛍光強度３８０ｎｍを用い、式（ＶＩ）に基づいてΔ蛍光強度比アゴニストを算出した。
【０１０２】
また、ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞に被験試料を接触させることによってＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入ＴＲＰＶ１発現細胞を被験物質とカプサイシンとメタノールとに曝露したときの蛍光強度３４０ｎｍおよび蛍光強度３８０ｎｍから、Δ蛍光強度比被験物質を算出した。前記Δ蛍光強度比被験物質は、式（ＩＩ）に基づいて算出した。なお、前記対照は、溶媒Ａである。
【０１０３】
算出されたΔ蛍光強度比アゴニストとΔ蛍光強度比被験物質とから、活性被験物質を算出した。なお、活性被験物質は、式（ＩＸ）：
【０１０４】
【数９】
0006576203.tif 000010
【０１０５】
に基づいて算出した。
【０１０６】
実施例１において、被験試料に含まれる被験物質の種類と活性との関係を調べた結果を図３に示す。図中、レーン１はメントール含有試料（メントールのみ）を用いたときの活性（活性メントール）、レーン２は被験物質としてＰＥＧ１５００を含む製造例１６で得られた被験試料を用いたときの活性（活性被験物質）、レーン３は被験物質としてＰＥＧ４００を含む製造例１７で得られた被験試料を用いたときの活性（活性被験物質）、レーン４は被験物質としてエタノールを含む製造例１８で得られた被験試料を用いたときの活性（活性被験物質）、レーン５は被験物質としてプロピレングリコールを含む製造例１９で得られた被験試料を用いたときの活性（活性被験物質）、レーン６は被験物質としてカプサゼピンを含む製造例２０で得られた被験試料を用いたときの活性（活性被験物質）、レーン７は被験物質としてルテニウムレッドを含む製造例２１で得られた被験試料を用いたときの活性（活性被験物質）を示す。
【０１０７】
図３に示された結果から、メントール含有試料を用いたときの活性（活性メントール）および被験物質としてカプサセピンおよびルテニウムレッドのそれぞれを含む被験試料を用いたときの活性（活性被験物質）は、１００％未満であることがわかる。なお、被験物質としてカプサセピンおよびルテニウムレッドのそれぞれを含む被験試料を用いたときの活性（活性被験物質）は、８０％を超えているのに対し、メントール含有試料を用いたときの活性（活性メントール）は、５０％未満であることがわかる。したがって、これらの結果から、カプサセピンおよびルテニウムレッドは、メントールと比べて顕著に弱いＴＲＰＶ１活性抑制作用を有していることが示唆される。これに対し、被験物質としてＰＥＧ１５００、ＰＥＧ４００、エタノールおよびプロピレングリコールのそれぞれを含む被験試料を用いたときの活性（活性被験物質）は、１００％を超えていることから、ＴＲＰＶ１活性化作用を有していることがわかる。
【０１０８】
（４）抑制比率の算出
実施例１（３）で算出されたΔ蛍光強度比アゴニストおよびΔ蛍光強度比被験物質を用い、抑制率被験物質を算出した。抑制率被験物質は、式（ＩＶ）に基づいて算出した。また、実施例１（３）で算出されたΔ蛍光強度比アゴニストおよびΔ蛍光強度比メントールを用い、抑制率メントールを算出した。抑制率メントールは、式（Ｖ）に基づいて算出した。算出された抑制率被験物質および抑制率メントールを用い、抑制比率を算出した。抑制比率は、式（ＶＩＩ）に基づいて算出した。
【０１０９】
実施例１において、被験試料に含まれる被験物質の種類と抑制比率との関係を調べた結果を図４に示す。図中、レーン１はメントール含有試料（メントールのみ）を用いたときの抑制比率、レーン２は被験物質としてＰＥＧ１５００を含む製造例１６で得られた被験試料を用いたときの抑制比率、レーン３は被験物質としてＰＥＧ４００を含む製造例１７で得られた被験試料を用いたときの抑制比率、レーン４は被験物質としてエタノールを含む製造例１８で得られた被験試料を用いたときの抑制比率、レーン５は被験物質としてプロピレングリコールを含む製造例１９で得られた被験試料を用いたときの抑制比率、レーン６は被験物質としてカプサゼピンを含む製造例２０で得られた被験試料を用いたときの抑制比率、レーン７は被験物質としてルテニウムレッドを含む製造例２１で得られた被験試料を用いたときの抑制比率を示す。
【０１１０】
抑制比率が、１３０以上である場合、メントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用が被験物質によって相加的ではなく、相乗的に増幅されていることが示唆される。図４に示された結果から、被験物質としてカプサゼピンを含む製造例２０で得られた被験試料および被験物質としてルテニウムレッドを含む製造例２１で得られた被験試料のそれぞれを用いたときの抑制比率は、１４０を超えていることがわかる。なお、図３に示された結果から、カプサゼピンおよびルテニウムレッドは、ＴＲＰＶ１活性抑制作用を有していることが、メントールと比べて著しく小さいことが示唆されている。したがって、これらの結果から、カプサゼピンおよびルテニウムレッドは、メントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用を相乗的に増幅していることがわかる。
【０１１１】
これに対し、被験物質としてＰＥＧ１５００を含む製造例１６で得られた被験試料、被験物質としてＰＥＧ４００を含む製造例１７で得られた被験試料、被験物質としてエタノールを含む製造例１８で得られた被験試料および被験物質としてプロピレングリコールを含む製造例１９で得られた被験試料のそれぞれを用いたときの抑制比率は、８０未満であることがわかる。したがって、これらの結果から、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ４００、エタノールおよびプロピレングリコールは、メントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅していないことがわかる。
【０１１２】
以上の結果から、ＴＲＰＶ１アゴニストと被験物質とメントールとを含有する被験試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化と、ＴＲＰＶ１アゴニストとメントールとを含有する比較試料の接触前後のＴＲＰＶ１発現細胞の細胞内カルシウム濃度の変化と基づき、被験物質がメントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる物質であるかどうかを評価することができることがわかる。また、前記被験物質がメントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる物質であるかどうかを評価する際に、前記ＴＲＰＶ１発現細胞を用いることにより、同一条件下に同時に何回も並行して評価を行なうことができることから、前記操作を行なうことにより、被験物質がメントールによるＴＲＰＶ１活性抑制作用を増幅させる物質であるかどうかを再現性よく評価することができることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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