(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルスを表面誘起分解から保護する方法であって、前記アデノウイルスが、エチレン酢酸ビニルバッグ中の溶液に含有され、前記方法が、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを前記溶液に１％（ｗ／ｗ）〜３０％（ｗ／ｗ）の濃度で添加するステップを含む、方法。
【請求項２】
アデノウイルスを表面誘起分解から保護するための２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンの使用であって、前記アデノウイルスが、エチレン酢酸ビニルバッグ中に含有される溶液中に含有される、使用。
【請求項３】
２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを含む、エチレン酢酸ビニルバッグ中に含有されるアデノウイルスを表面誘起分解から保護するための組成物。
【請求項４】
２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを含む、エチレン酢酸ビニルバッグ中にアデノウイルスを保管するための組成物。
【請求項５】
アデノウイルスと２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンとを含む溶液を含む、エチレン酢酸ビニルバッグ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオプロセスバッグ中の生物学的製剤の表面誘起分解（surface-induced degradation）を防止する方法に関する。特に、本発明は、バイオプロセスバッグ中に含有される溶液中のウイルスの劣化を防止するためのβ−シクロデキストリンの使用に関する。本発明の方法は、有されるウイルスの量、構造、効力および品質を保持することにより、前記ウイルスとプラスチックバイオプロセスバッグとの適合性を含改善する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品業界では使い捨て方式に向かう傾向が明確にあるため、ウイルスの分野における目下の課題は、前記ウイルスを含有する液体組成物の製造およびバルク保管の方法をもたらすことである。特に、医薬品の現実的な保管温度範囲内、例えば約２℃〜約８℃でより長期間にわたって前記ウイルスが安定化するものである。実際的なロジスティクスに関する理由から、ウイルスを保管するために、プラスチック容器であるバイオプロセスバッグが使用されることが多い。前記大構造物は、ほとんど未解明の機序により、これらのプラスチック容器の内部で劣化することが多い。
【０００３】
ウイルスの生物学的活動は、少なくともアミノ酸のコア配列のコンフォメーションの完全性に依存している。従来の有機および無機の低分子と異なり、ウイルスはきわめて複雑な生物学的構造体であり、些細な化学的または物理的ストレッサーがウイルスの分解の一因となり得る。適切な保管期限を確保するには、バルク保管に適合する一次包装がきわめて重要であるが、業界で使用されている使い捨て保管容器の性質を考慮すると、その性質が特別な課題をもたらす。バイオプロセスバッグ中に含有されるウイルスは、表面誘起分解の結果、効力を失う傾向にある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、当技術分野において、ウイルスと、ウイルスの製造および保管に使用されるバイオプロセスバッグとの適合性を改善する方法を見出す必要がある。特に、バイオプロセスバッグ中に含有されるウイルスを表面誘起分解から保護し、それと共にプロセシングおよびバルク保管中の前記ウイルスの保管期限を改善する方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、バイオプロセスバッグ中に含有されるウイルスを表面誘起分解から保護する方法を発見した。これらを本明細書に記載する。これらの方法は、以前に開示された方法と比較すると、ウイルスの量、構造、効力および品質を保持することにより、ウイルスとプラスチックバイオプロセスバッグとの適合性を改善する。注目すべきことに、バイオプロセスバッグ中に含有される、ウイルスを含む任意の溶液へのβ−シクロデキストリンの添加は、前記ウイルスの構造および効力の顕著な保持をもたらし、それと共に、意外にも、β−シクロデキストリンを含まない同じ溶液と比較して、前記ウイルスとバルク保管容器のプラスチック表面との全体的な適合性を改善した。
【０００６】
したがって、本発明は、ウイルスを表面誘起分解から保護する方法であって、前記ウイルスが、プラスチックで構成されるバッグ中の溶液に含有され、前記方法が、β−シクロデキストリンを前記溶液に約１％（ｗ／ｗ）〜約３０％（ｗ／ｗ）の濃度で添加するステップを含む、方法に関する。本発明の好ましい実施形態では、前記シクロデキストリンは、ジメチル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、３−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよびトリメチル−β−シクロデキストリンの群から選択されるβ−シクロデキストリンである。さらに一層好ましい実施形態では、前記β−シクロデキストリンは２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである。
【０００７】
本発明による一層好ましい実施形態では、プラスチックの流体接触層は、エチレン酢酸ビニル、ポリエチレン、ポリアミドおよびポリエチレンの群から選択される。一層好ましくは、前記層はエチレン酢酸ビニルである。一定の実施形態では、前記プラスチックは気体遮断剤を含む。好ましくは、前記気体遮断剤はエチルビニルアルコールからできている。本発明による好ましい実施形態では、前記バッグはバイオプロセスバッグである。本発明による別の好ましい実施形態では、前記ウイルスはアデノウイルスである。
【０００８】
一層好ましい実施形態では、本発明は、アデノウイルスを表面誘起分解から保護する方法であって、前記アデノウイルスが、プラスチックで構成されるバッグ中の溶液に含有され、前記方法が、β−シクロデキストリンを前記溶液に約１％（ｗ／ｗ）〜約３０％（ｗ／ｗ）の濃度で添加するステップを含む、方法に関する。好ましくは、前記バッグは、エチレン酢酸ビニルバッグで構成される流体接触層を有する。一層好ましくは、前記β−シクロデキストリンは２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである。
【０００９】
一層好ましい実施形態では、本発明は、アデノウイルスを表面誘起分解から保護する方法であって、前記アデノウイルスが、エチレン酢酸ビニルで構成されるバッグ中の溶液に含有され、前記方法が、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを前記溶液に約１％（ｗ／ｗ）〜約３０％（ｗ／ｗ）の濃度で添加するステップを含む、方法に関する。
【００１０】
本明細書において、β−シクロデキストリンの添加は、バイオプロセスバッグ中に保管されているときにウイルスを表面誘起分解から保護し得ることが初めて実証された。したがって、本発明はまた、ウイルスを表面誘起分解から保護するためのβ−シクロデキストリンの使用であって、前記ウイルスが、プラスチックバイオプロセスバッグ中に含有される溶液中に含有される、使用にも関する。
【００１１】
好ましくは、前記β−シクロデキストリンは、ジメチル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、３−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよびトリメチル−β−シクロデキストリンの群から選択される。さらに一層好ましい実施形態では、前記β−シクロデキストリンは２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである。
【００１２】
本発明による一層好ましい実施形態では、プラスチックはポリマーである。好ましくは、前記プラスチックは、エチレン酢酸ビニル、ポリエチレン、ポリアミドおよびポリエチレンの群から選択される。一定の実施形態では、前記プラスチックは気体遮断剤を含む。好ましくは、前記気体遮断剤はエチルビニルアルコールである。
【００１３】
本発明による別の一層好ましい実施形態では、前記ウイルスはアデノウイルスである。
【００１４】
本発明はまた、アデノウイルスを表面誘起分解から保護するための２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンの使用であって、前記アデノウイルスが、バイオプロセスバッグ中に含有される溶液中に含有される、使用にも関する。
【００１５】
本発明はまた、アデノウイルスを表面誘起分解から保護するための２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンの使用であって、前記アデノウイルスが、エチレン酢酸ビニルバイオプロセスバッグ中に含有される溶液中に含有される、使用にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】内部タンパク質蛍光によってモニターした、５℃（左）または２５℃（右）で４週間まで保管したときの製剤１中のＡｄ２６と、プラスチックＦｌｅｘｂｏｙバッグ（黒丸および実線）またはガラスバイアル（白抜き菱形および点線）との適合性である。平均値および標準偏差が示され、各線は傾向を示す。
【図２】ＲＰ−ＵＰＬＣによるヘキソン含量によってモニターした、５℃（左）または２５℃（右）で４週間まで保管したときの製剤１中のＡｄ２６と、プラスチックＦｌｅｘｂｏｙバッグ（黒丸および実線）またはガラスバイアル（白抜き菱形および点線）との適合性である。平均値および標準偏差が示され、各線は傾向を示す。
【図３】２８０ｎｍでの吸光度によるタンパク質濃度によってモニターした、５℃（左）または２５℃（右）で４週間まで保管したときの製剤１中のＡｄ２６と、プラスチックＦｌｅｘｂｏｙバッグ（黒丸および実線）またはガラスバイアル（白抜き菱形および点線）との適合性である。平均値および標準偏差が示され、各線は傾向を示す。
【図４】ｖｐ−ＱＰＣＲによるアデノウイルス力価によってモニターした、５℃（左）または２５℃（右）で４週間まで保管したときの製剤１中のＡｄ２６と、プラスチックＦｌｅｘｂｏｙバッグ（黒丸および実線）またはガラスバイアル（白抜き菱形および点線）との適合性である。平均値および標準偏差が示され、各線は傾向を示す。
【図５】ＡＥＸ−ＵＰＬＣによるアデノウイルス濃度によってモニターした、５℃（左）または２５℃（右）で４週間まで保管したときの製剤１中のＡｄ２６と、プラスチックＦｌｅｘｂｏｙバッグ（黒丸および実線）またはガラスバイアル（白抜き菱形および点線）との適合性である。平均値および標準偏差が示され、各線は傾向を示す。
【図６】ＱＰＡによる効力によってモニターした、５℃（左）または２５℃（右）で４週間まで保管したときの製剤１中のＡｄ２６と、プラスチックＦｌｅｘｂｏｙバッグ（黒丸および実線）またはガラスバイアル（白抜き菱形および点線）との適合性である。平均値および標準偏差が示され、各線は傾向を示す。
【図７】内部タンパク質蛍光（Ａ）およびＲＰ−ＵＰＬＣによるヘキソン含量（Ｂ）によってモニターした、１回の凍結／融解サイクル（０．０３２℃／分で室温から−７０℃へ、および室温に戻る）中の製剤１中のＡｄ２６と、プラスチックＦｌｅｘｂｏｙバッグ（黒丸）またはガラスバイアル（白抜き菱形）との適合性である。平均値および標準偏差が示されている。
【図８】製剤１中のＡｄ２６と、（左から右へ）Ｆｌｅｘｂｏｙ（登録商標）バイオプロセシングバッグ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ）、ＨｙＱ  Ｃｘ５−１４バイオプロセシングバッグ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、ＰｕｒｅＦｌｅｘ  Ｍｏｂｉｕｓバイオプロセシングバッグ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、またはガラスバイアル（Ｎｕｏｖａ  Ｏｍｐｉ）との適合性である。製剤を５℃（黒四角）または２５℃（白抜き三角）で２４週間まで保管し、適合性をＱＰＡによる効力によってモニターした。平均値および標準偏差が示され、データに直線の当てはめをし、９５％信頼区間にグレーで陰影を付けている。
【図９】内部タンパク質蛍光によってモニターした、２５℃で１週間までにわたる保管中のＨＢＣＤを添加しない（白抜き丸および破線）または５％（ｗ／ｗ）ＨＢＣＤを添加した（十字および実線）製剤１、２および３（左から右へ）中のＡｄ２６と、プラスチックＦｌｅｘｂｏｙバッグとの適合性である。平均値および標準偏差が示され、各線は傾向を示す。
【図１０】ＲＰ−ＵＰＬＣによるヘキソン含量によってモニターした、２５℃で１週間までにわたる保管中のＨＢＣＤを添加しない（白抜き丸および破線）または５％（ｗ／ｗ）ＨＢＣＤを添加した（十字および実線）製剤１、２および３（左から右へ）中のＡｄ２６と、バイオプロセスバッグとの適合性である。平均値および標準偏差が示され、各線は傾向を示す。
【図１１】ＣＥによるアデノウイルス粒子濃度によってモニターした、２５℃で１週間までにわたる保管中のＨＢＣＤを添加しない（白抜き丸および破線）または５％（ｗ／ｗ）ＨＢＣＤを添加した（十字および実線）製剤１および２（左から右へ）中のＡｄ２６と、バイオプロセスバッグとの適合性である。各線はデータへの直線の当てはめを表し、９５％信頼区間にグレーで陰影を付けている。ＨＢＣＤを添加していない製剤３は、バイオプロセスバッグと接触させた後、ウイルス粒子濃度が何ら測定され得ない程度まで分解した。
【図１２】内部タンパク質蛍光によってモニターした、２５℃で８日間の保管後の０、０．２、１または５％（ｗ／ｗ）ＨＢＣＤを添加した製剤２中のＡｄ２６と、プラスチックＦｌｅｘｂｏｙバッグとの適合性である。個別のデータポイントが示され、線は傾向を示す。
【図１３】２８０ｎｍでの吸光度によるタンパク質濃度によってモニターした、２５℃で８日間の保管後の０、０．２、１または５％（ｗ／ｗ）ＨＢＣＤを添加した製剤２中のＡｄ２６と、プラスチックＦｌｅｘｂｏｙバッグとの適合性である。個別のデータポイントが示され、線は傾向を示す。
【図１４】ＲＰ−ＵＰＬＣによるヘキソン含量によってモニターした、２５℃で８日間の保管後の０、０．２、１または５％（ｗ／ｗ）ＨＢＣＤを添加した製剤２中のＡｄ２６と、プラスチックＦｌｅｘｂｏｙバッグとの適合性である。個別のデータポイントが示され、線は傾向を示す。
【図１５】ＣＥによるアデノウイルス粒子濃度によってモニターした、２５℃で８日間の保管後の０、０．２、１または５％（ｗ／ｗ）ＨＢＣＤを添加した製剤２中のＡｄ２６と、プラスチックＦｌｅｘｂｏｙバッグとの適合性である。線はデータへの直線の当てはめを表し、９５％信頼区間にグレーで陰影を付けている。
【図１６】ＱＰＡによる効力によってモニターした、２５℃で８日間の保管後の０、０．２、１または５％（ｗ／ｗ）ＨＢＣＤを添加した製剤２中のＡｄ２６と、プラスチックＦｌｅｘｂｏｙバッグとの適合性である。線はデータへの直線の当てはめを表し、９５％信頼区間にグレーで陰影を付けている。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
上に述べたように、バイオプロセスバッグ中に含有されるウイルスを表面誘起分解から保護し、それにより、含有されるウイルスの量および効力を保持することによってウイルスと、プロセスおよびバルク保管の材料との適合性を改善する方法を見出す必要がある。ウイルスはバイオプロセスバッグ中で急速に分解することと、バイオプロセスバッグ中に保管された溶液中のウイルスへの２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（全モル置換、ＨＢＣＤ）のようなβ−シクロデキストリンの添加は、驚くべきことに、前記ウイルスのプラスチック表面誘起分解を防止することが本明細書に示された。
【００１８】
本発明者らは、バイオプロセスバッグ中でウイルスを保持する方法を発見した。これらを本明細書に記載する。特に、これらの方法は、ウイルスがプラスチックで構成されるバッグ中の溶液中に含有されているときに前記ウイルスを表面誘起分解から保護する。これらの方法は、使用される製剤マトリックスには関係なく、以前に開示された方法と比較すると、ウイルスの量および効力および品質を保持することにより、プラスチックとの生物学的適合性を改善する。本発明の方法が適しているウイルスの例として、以下に限定されるものではないが、（活性）ウイルス、ワクチン、非エンベロープウイルス、エンベロープウイルス、ウイルス様粒子、組換えウイルス、ならびに不活化ウイルスおよび弱毒ウイルスがある。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態では、ウイルスは組換えアデノウイルスである。アデノウイルスベクターの構築および増殖は、当技術分野においてよく理解されており、標準的な分子生物学的技術、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，２ｄ  ｅｄ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ（１９９２）、米国特許第６，４９２，１６９号明細書または国際公開第０３／１０４４６７号パンフレット、米国特許第５，５５９，０９９号明細書、同第５，８３７，５１１号明細書、同第５，８４６，７８２号明細書、同第５，８５１，８０６号明細書、同第５，９９４，１０６号明細書、同第５，９９４，１２８号明細書、同第５，９６５，５４１号明細書、同第５，９８１，２２５号明細書、同第６，０４０，１７４号明細書、国際公開第９６／２６２８１号パンフレット、国際公開第００／０３０２９号パンフレット、およびＴｈｏｍａｓ  Ｓｈｅｎｋ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”に記載されている技術を使用するものであり、これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。本発明の一定の実施形態では、ヒトアデノウイルスの血清型は、血清型２、４、５、７、１１、２６、３４、３５、３６、４８、４９もしくは５０または任意のハイブリッドもしくは変異型アデノウイルス血清型のいずれか１つを含む。本発明の好ましい実施形態では、組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型５、２６または３５に由来する。さらなる実施形態では、本発明のアデノウイルスは、サルアデノウイルス、好ましくはチンパンジーまたはゴリラアデノウイルスである。これらのアデノウイルスは、一般に、ヒト集団において、血清有病率が低く、および／または既存の中和抗体価が低い。さらなる実施形態では、本発明のアデノウイルスは、異種核酸をさらに含む。好適な異種核酸は当業者に周知であり、例えば、導入遺伝子オープンリーディングフレーム、例えば、ベクターがワクチン接種目的で使用される場合に免疫応答が望まれるポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、例えばマラリア（例えば、国際公開第２００４／０５５１８７号パンフレットを参照されたい）、ＨＩＶ、エボラ、ＲＳＶ、ＨＰＶ、ジカウイルス、ＨＳＶ、結核（例えば、国際公開第２００６／０５３８７１号パンフレットを参照されたい）、一定のウイルスなどに対する免疫応答を発生させるのに好適な導入遺伝子を含んでもよく、これらはすべて当業者に周知である。実際には、導入遺伝子の性質は本発明に重要ではなく、いずれの異種核酸配列でもよいため、ここではさらなる詳述の必要はない。
【００２０】
アデノウイルスの製剤用の添加剤として、シクロデキストリンの使用を開示している参考文献がいくつかある。国際公開第０２９０２４号パンフレットは、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを、凍結乾燥製剤の調製に使用される凍結乾燥保護剤になり得るものの膨大なリストの一部として開示している。国際公開第０２９０２４号パンフレットは、本発明に開示している液体組成物と異なり、凍結乾燥した組成物に関する。液体製剤の利点は、費用が少なく、投与前の取り扱いにかかる時間が短く、臨床の投薬または再構成の間違いを起こしにくいことである。さらに、凍結乾燥プロセスの規模拡大は厄介な試みになり得る。Ｒｅｎｔｅｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．は、ＨＢＣＤを、一定のタンパク質の安定性を高め、鼻腔内投与中の凝集を避けるために使用される添加物の１つとして特定している。Ｒｅｎｔｅｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．は、粘膜取込みを増強する鼻腔内投与に適切な製剤に関連して、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンの使用を開示している。
【００２１】
国際公開第２０１５／０４００２号パンフレットは、成分の１つとしてＨＢＣＤを含有する、複雑な多成分ウイルス含有組成物を開示している。国際公開第２０１５／０４００２号パンフレットに例示されている、このＨＢＣＤを含むウイルス含有組成物は、すべてガラスバイアル中に含有されている。国際公開第２０１５／０４００２号パンフレットは、アデノウイルスとプラスチックバイオプロセスバッグとの不適合性について言及していない。
【００２２】
ＨＢＣＤは、通常、低分子（例えば、ジクロフェナクまたはイブプロフェン）の溶解性を高めるために使用される。これは、その独特な構造と関係がある。ＨＢＣＤ分子は、その外側の親水性の性質の空間分布が理由で、極性親水性の外側および非極性疎水性の空洞があるドーナツ状の環である。第二のＯＨ基は反対側の縁にある。これらのヒドロキシル基が、ＨＢＣＤにその外側の親水性の性質を付与する。ＨＢＣＤ環の内側は直径が小さく（ウイルス粒子より大幅に小さく）、低分子にのみ適合する。それは、疎水性水素およびグリコシドのエーテル様酸素の表面で構成されている。この特殊な構造のために、ＨＢＣＤは、超低分子を被包または包括し、それを可溶化して、いわゆる包接化合物を形成するために使用される。ＨＢＣＤのこの構造的特性は、バイオプロセスバッグにおける不適合性の問題を解決する際に使用するための当然の選択をＨＢＣＤに付与するものではない。
【００２３】
「適合性」という用語は、２つの材料または成分が、その成分の一方または両方の量、構造、効力または品質などの特性に悪影響を及ぼさず、互いに接触または隣接して存在する能力を指す。本明細書で使用する場合、それは、バイオプロセスバッグまたは他の包装材料の表面に接触または隣接したウイルス粒子の分解に対する相対的な耐性を指す。
【００２４】
本明細書で使用する「効力」という用語は、以下で説明する細胞ベースの効力アッセイで測定される、
【００２５】
「副生物」という用語は、特定の製剤中の治療的／予防的なアデノウイルスの割合を減じるかまたは減少させる不所望な生成物を含む。典型的な副生物には、例えば、タンパク質変性、アミド分解、加水分解、またはこれらの組合せから生じるアデノウイルスの凝集体およびアデノウイルスの断片が含まれる。通常、凝集体は、単離されたウイルス粒子より分子量が大きい複合体である。
【００２６】
本明細書で使用する、ウイルスを表面誘起分解から保護し、それによりプラスチックとの適合性を改善する方法は、バイオプロセスバッグ中での保管時にウイルスの物理的および／もしくは化学的完全性ならびに／または生物学的活動を保持する方法である。これは、バイオプロセスバッグ中のウイルスの効力および／または他の品質面などの様々な特性を、ある期間にわたってかつ一定の保管条件下で測定することによって評価することができる。前記ウイルスのこれらの特性は、高温で（実時間の温度を予測して）、または他のストレス条件下で測定することができ、例えば、ウイルスを２５℃でインキュベートして、生物学的保管期限を最大にする様々な条件の効果を試験することができる。ウイルスの分解を決定する前記特性は、目視検査、ウイルス粒子定量的ポリメラーゼ連鎖反応法（ｖｐ−ＱＰＣＲ）、ＱＰＣＲベースの効力アッセイ（ＱＰＡ）、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＵＰＬＣ）、ＡＥＸ−ＵＰＬＣ、２８０ｎｍでの吸光度による内部蛍光およびタンパク質濃度からなる群から選択される方法の少なくとも１つによって判定することができる。
【００２７】
ウイルス粒子定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｖｐ−ＱＰＣＲ）
ｖｐ−ＱＰＣＲは、アデノウイルスベクター内に存在する導入遺伝子カセットのＣＭＶプロモーターの１００ｂｐ領域を標的にするプライマーを使用するアデノウイルス粒子の定量化のために開発された。簡単に言うと、このＱＰＣＲ法は、Ｔａｑポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に基づいており、それは、１００ｂｐアンプリコンの中央でアニールされた特定の蛍光プローブの分解を起こす。このプローブは発光体および消光体に共有結合しており、その分解は、発光体を消光体から解放し、その結果、テンプレートの量に比例する蛍光発光が生じる。定量値は、蛍光シグナルの増加が閾値を超えるサイクルである閾値サイクル（Ｃｔ）から得られる。ＤＮＡベースの蛍光の検出の閾値は、バックグラウンドよりわずかに高く設定される。蛍光が閾値を超えるサイクルの数は、閾値サイクル（Ｃｔ）、またはＭＩＱＥガイドラインによれば定量化サイクル（Ｃｑ）と呼ばれる（Ｂｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ，２００９）。対数増殖期中、標的ＤＮＡ配列はサイクル毎に２倍になる。例えば、Ｃｔが別の試料のＣｔより３サイクル高いＤＮＡ試料は、２３＝８倍多くのテンプレートを含んでいた。したがって、Ｃｔ値が高いほど、標的ＤＮＡの量が少ないことを表し、Ｃｔ値が低いほど、標的ＤＮＡの利用可能性が高いことを表す。絶対的な定量化は、濃度が２６０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ２６０）により決定されたストックアデノウイルスの段階希釈液によって作成された標準曲線を比較することで行うことができる。試験物質のＣｔ値は、標準曲線のＣｔ値に対してプロットされ、これによりベクター粒子の正確で精密な数が得られる。
【００２８】
Ｅ１コンピテント細胞上でのインキュベーション後の読み出しとして使用される場合（ＱＰＡ、以下を参照されたい）、分解が進んだ試料ほどデルタ（ｔ＝０を減算）Ｃｔ値が高く、安定性の高い製剤ほどＣｔ値が低いであろう。
【００２９】
ＱＰＣＲベースの効力アッセイ（ＱＰＡ）
ＱＰＡは、アデノウイルス効力を定量化するためにＱＰＣＲを組織培養ベースの感染力アッセイと組み合わせるものである。アッセイは、新たに合成されたウイルスＤＮＡの出現が、細胞単層の接種後にきわめて急速であり、広範囲の感染多重度（ＭＯＩ）にわたってウイルス投入（ｉｎｐｕｔ）濃度に比例するという実験観察に基づいている。試料の希釈液（非終点希釈）を９６ウェルプレート中のＨＥＫ２９３細胞単層に接種する。３５℃で３時間、感染を進行させる。ウェルを吸引し、アデノウイルスを含有しない培地を補充する。プレートをさらに４２時間インキュベートしてから、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液を用いて細胞溶解し、１回の凍結／解凍ステップに供してアデノウイルスＤＮＡを放出する。上記の方法に従って希釈した細胞ライセートにＱＰＣＲを実施する。感染価は、終点滴定（ｅｎｄｐｏｉｎｔ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）により決定される、既知の感染力の試料のＣｔ値により作成された標準曲線との比較により計算される。あるいは、感染価または効力がＣｔ値に直接相関しているため、デルタ効力はＣｔ値として直接表すことができる。特に製剤間の効力の相対的な差違の比較において、これは迅速で確実な方法である。
【００３０】
逆相超高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＵＰＬＣ）
アデノウイルスタンパク質および他のタンパク質の存在および（相対的）量など、アデノウイルスのいくつかの品質特性を決定するために、アデノウイルスタンパク質のプロファイルを逆相超高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＵＰＬＣ）によって分析することができる。
【００３１】
ＵＰＬＣは、試料と、移動相（緩衝液または溶媒）と、固定相（カラム中のクロマトグラフィーの充填材）との間の種々の化学的相互作用を利用して、混合物の成分を分離する。高圧ポンプが移動相をカラム内で移動させ、その間に分析物は２つの相間に分配され、その溶離は、固定相および移動相に対する分析物の相対的な親和性に依存する。検出器は、例えばＵＶ吸光度検出を使用して、分子の保持時間（ｔＲ；試料注入とピーク最大値の出現との間の時間）を測定する。
【００３２】
ＲＰ−ＵＰＬＣの分離機序は疎水性の差違に基づいている。アデノウイルスタンパク質プロファイル法では、非極性の固定相は疎水性アルキルＣ４鎖で作られ、一方、移動相は水／アセトニトリル／ＴＦＡ混合物からなり、疎水性を漸増させる。アデノウイルス粒子は分離してその構成タンパク質になり、これが最初に固定相と相互作用し、次いでその疎水性表面積に応じた保持時間に溶離する。保持時間および各タンパク質の量は、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度検出によってモニターされる。典型的なアデノウイルスのＲＰ−ＵＰＬＣプロファイルは、コアタンパク質（ＶＩＩ）、ペントン塩基（ＩＩＩ）およびヘキソン（ＩＩ）を含む１０種または１４種のタンパク質からなる。
【００３３】
陰イオン交換超高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＵＰＬＣ）
アデノウイルス粒子の数を定量化するために、陰イオン交換超高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＵＰＬＣ）によってウイルス粒子をマトリックスから分離することができ、それをＵＶ吸光度によって定量化することができる。
【００３４】
ＵＰＬＣは、試料と、移動相（緩衝液または溶媒）と、固定相（カラム中のクロマトグラフィーの充填材）との間の種々の化学的相互作用を利用して、混合物の成分を分離する。高圧ポンプが移動相をカラム内で移動させ、その間に分析物は２つの相間に分配され、その溶離は、固定相および移動相に対する分析物の相対的な親和性に依存する。検出器は、例えばＵＶ吸光度検出を使用して、分析物の保持時間（ｔＲ；試料注入とピーク最大値の出現との間の時間）を測定する。
【００３５】
アデノウイルス粒子を定量化するためのＡＥＸ−ＵＰＬＣ法では、第四級アンモニウム陽イオンを含有する正に帯電したカラムとの相互作用により、負に帯電した粒子が捕捉される。移動相中の塩濃度が増加すると、静電相互作用が弱くなり、それによりウイルス粒子はその血清型に特異的な保持時間に溶離し、マトリックス成分および不純物から分離する。次いで、粒子は２１４ｎｍでのＵＶ吸光度によって定量化される。
【００３６】
キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＥ）
キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＥ）は、アデノウイルス粒子濃度を測定するために使用される。この方法では、ウイルス粒子を含有する試料は、電気浸透流によって小径キャピラリー中を移動する。試料中の種々の成分は、サイズ、電荷および摩擦の違いのため、異なる電気泳動移動度を有する。このため、異なる成分が分離してバンドになる。
【００３７】
溶離すると、アデノウイルス粒子のピークが検出され、２１４ｎｍでの吸光度によって定量化される。シグナルは較正標準によって濃度に変換される。
【００３８】
内部蛍光アッセイ
アデノウイルスのカプシドタンパク質は、励起後に光を再放射する芳香族アミノ酸、とりわけトリプトファン、および程度は低いがチロシンおよびフェニルアラニンを含有する。トリプトファンの発光極大および量子収量は、その環境の極性に強く依存する。極性水性環境（例えば、球状タンパク質の表面）では、量子収量は比較的低く、非極性環境（例えば、凝集体の内部）では、量子収量は増加する。この特徴のため、トリプトファン蛍光は、タンパク質のコンフォメーション変化、凝集、および分子相互作用の試験に有用なツールである。
【００３９】
内部蛍光アッセイでは、試料をＵＶ透過平底マイクロプレートに三連で移す。プレートをＵＶ透過シールで覆う。トリプトファンの蛍光は、中心波長が２８０ｎｍでバンド幅が１０ｎｍの励起フィルター、および中心波長が３４０ｎｍでバンド幅が１０ｎｍの発光フィルターを使用して、マイクロプレートリーダーにより測定する。シールおよびメニスカス形状の影響を最小限にするため、底部光学部品（Ｂｏｔｔｏｍ  ｏｐｔｉｃ）を使用する。
【００４０】
蛍光強度は、アデノウイルス分解の感度の高い尺度であることが当技術分野において公知である。ストレスを受けると、試料中に起こる変化の性質に応じて増加または減少が観察され得る。タンパク質がアンフォールディングし、カプシドが分離すると内部蛍光が減少すると予測され、タンパク質が凝集すると内部蛍光が増加すると予測される。アッセイの精度は、使用した範囲で５％（ＣＶ％）未満である。
【００４１】
ストレスを受けた試料に関して得られた蛍光は、常に対照試料と比較しなければならない。ストレスを加えた後の増加または減少は、分解経路に依存し、各医薬品原体（ＡＰＩ）に特異的であるため、予測することができない。ｔ＝０試料と比較した変化（増加でも減少でも）は、製剤の安定性の低さを示す。ストレスを受けてもｔ＝０試料値に近いままの試料は、より安定である。
【００４２】
２８０ｎｍでの吸光度によるタンパク質濃度
アデノウイルスのカプシドタンパク質は、２８０ｎｍ付近の紫外光を吸収する芳香族アミノ酸、とりわけトリプトファン、および程度は低いがチロシンおよびフェニルアラニンを含有する。ランベルト・ベールの法則によれば、吸光度は光学的距離内のアミノ酸の数と線形的に相関しており、このため、タンパク質濃度と線形的に相関している。ウイルス粒子も光を散乱させるため、得られるのは波長に依存する見かけの吸光度であるため、真の吸光度シグナルを得るには、最初にこの散乱シグナルについてシグナルを補正する。次いで、２８０ｎｍでの吸光度を較正曲線によってタンパク質濃度に変換するか、またはタンパク質濃度の定量的尺度として試料間で直接比較する。
【００４３】
ウイルスは、とりわけバイオプロセスバッグなどの一次バルク容器と適合性があり、それは量および効力に関して損失が最小限であり（すなわち０．３ｌｏｇ／２年）、大幅な変更を示さない。さらに、目視調査で凝集、沈殿、色および／または透明性の変化の徴候が観察されてはならない。
【００４４】
本出願で使用する「約」とは、特に指定のない限り、±１０％を意味する。
【００４５】
本出願で使用する「プラスチック」とは、１つまたは複数の有機分子の合成または半合成の可鍛性（コ）ポリマーを意味する。これには、流体接触層、気体遮断剤層および外層などの複数層からなり、少なくとも流体接触層がプラスチックであるフィルムが含まれる。本出願において使用されるプラスチックの例として、エチレン酢酸ビニル（単層を含む）、（超低密度）ポリエチレン、ポリアミドおよびポリエチレンがある。
【００４６】
本出願で使用する「バッグ」とは、ウイルスの製造プロセス中、プロセス中間体または（バルク）ウイルスを保持するために、または一次包装として使用することができる、プラスチックからできているバイオプロセス容器を意味する。本出願で使用するバッグの例として、例えば、Ｆｌｅｘｂｏｙバッグ、ＨｙＱバッグ、ＰｕｒｅＦｌｅｘバッグ、ｗａｖｅバッグ、バイオリアクターなどがある。これらのバッグは一般にバイオプロセスバッグと呼ばれる。「バッグ」および「バイオプロセスバッグ」という用語は、本出願中では互換的に使用することができる。
【００４７】
本出願で使用する「ポリマー」とは、多数のサブユニット（モノマー）の繰り返しで構成される大分子または高分子を意味する。
【００４８】
本出願で使用する「コポリマー」とは、合体した２種以上の異なるモノマーを意味する。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態では、バイオプロセスバッグはポリマーからできている。本発明の一層好ましい実施形態では、前記ポリマーは、エチレン酢酸ビニル（単層を含む）、（超低密度）ポリエチレン、ポリアミドおよびポリエチレンの群から選択される。
【００５０】
本出願で使用する「シクロデキストリン」とは、環状オリゴ糖の群を意味する。最もよく使用される形態の例には、それぞれ６個、７個および８個のグルコース分子を有するα−、β−およびγ−シクロデキストリンがある。本発明によれば、バッグ中でウイルスを表面誘起分解から保護するシクロデキストリンは、β−シクロデキストリンである。ジメチル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、３−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよびトリメチル−β−シクロデキストリンならびに２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンのような置換誘導体も利用可能である。後者の分子群について、本出願で使用する「モル置換（ＭＳ）」とは、無水グルコース１単位当たりのヒドロキシプロピル基の平均数を意味する。
【００５１】
本出願で使用する「置換度（ＤＳ）」とは、シクロデキストリンの１分子当たりのヒドロキシプロピル基の数を意味する。
【００５２】
本出願で使用する「気体遮断剤」とは、モノマーの２つの層間の気体不透過性層、例えばエチルビニルアルコールなどを意味する。
【００５３】
本出願で使用する「ｗ／ｗ」とは、「重量に対する重量」または「重量毎の重量」を意味し、重量または質量で測定される、混合物中の特定の物質の割合のことである。
【００５４】
本発明は、バイオプロセスバッグ中でウイルスを表面誘起分解から保護する方法に関する。これらの方法は、以前に開示された方法と比較すると、ウイルスの量および効力（感染力）および品質を保持することによってプラスチックとの適合性を改善する。注目すべきことに、バイオプロセスバッグ中に含有される、ウイルスを含む溶液へのβ−シクロデキストリンの添加は、前記ウイルスの量、効力（感染力）および品質の顕著な保持をもたらし、それと共に、β−シクロデキストリンを含まない溶液と比較して、前記ウイルスとバイオプロセスバッグとの全体的な適合性を改善した。
【００５５】
本発明は、好ましくは遺伝子治療および／またはワクチン適用に使用するための、溶液中のウイルスおよび関連する医薬品を保持する方法に関する。ウイルスを含有する溶液は、２〜８℃の範囲で製造および保管するのに適切であり、同時に非経口投与に適合するものでもある。これらの溶液は、さらに低温で、例えば−２０℃以下、−４０℃以下、−６５℃以下、−８０℃以下で保管することも可能である。それらは８℃を超える温度、例えば２５℃またはさらにそれより高温で保管することもできる。
【００５６】
本発明において使用される溶液は、様々な濃度のウイルスにプラスチックへの適合性を付与し、種々の脊椎動物、好ましくは哺乳動物、特にヒトに投与することができる。本発明の方法において使用される安定化した溶液は、例えばウイルスベースの組成物であり、それは、例えば、以前に感染していない個体に対して予防的な利点を付与し、および／または治療効果を付与することができるワクチンとして投与することができる。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法において使用されるβ−シクロデキストリンは、ジメチル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、３−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよびトリメチル−β−シクロデキストリンの群から選択される。さらに一層好ましい実施形態では、前記β−シクロデキストリンは２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである。
【００５８】
好ましい実施形態では、ウイルスを含有する溶液中のβ−シクロデキストリンの濃度は、約１％（ｖ／ｖ）〜３０％（ｖ／ｖ）、例えば約１．５％（ｖ／ｖ）〜２５％（ｖ／ｖ）、例えば約２％（ｖ／ｖ）〜２０％、例えば約２．５％（ｖ／ｖ）〜２０％（ｖ／ｖ）、例えば約３％（ｖ／ｖ）〜１５％（ｖ／ｖ）、例えば約３．５％（ｖ／ｖ）〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲であり、例えば約５％（ｖ／ｖ）である。
【００５９】
下記の実施例は本発明を例示するために挙げるものであるが、本発明をこれらに限定するものではない。
【実施例】
【００６０】
実施例１
実験計画および方法
Ａｄ２６アデノウイルスを含むアデノウイルス製剤（［１］に記載）の、ガラスおよびプラスチックとの適合性を試験した。Ａｄ２６アデノウイルスを標準製剤１（表１を参照されたい）に２．４×１０１１ＶＰ／ｍＬの濃度で入れて、Ｆｌｅｘｂｏｙ（登録商標）バイオプロセシングバッグ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ）中およびガラスバイアル（Ｎｕｏｖａ  Ｏｍｐｉ）中に充填した。５０ｍＬ  Ｆｌｅｘｂｏｙ（登録商標）バイオプロセシングバッグに製剤２０ｍＬを充填し、３ｍＬバイアルに１．５ｍＬを充填した（両方の場合とも条件および時点毎に２連において）。バッグおよびバイアルに充填する前のＴ＝０時点で対照試料を製剤から採取した。
【００６１】
アデノウイルス製剤と、プラスチックおよびガラスの各表面との適合性を評価するために、バッグおよびバイアルを５±３℃または２５±２℃で４週間までインキュベートし、１日、２日、４日、７日および２８日の時点を設けた。各時点で試料をバッグおよびバイアルから取り出し、試料分析まで≦−６５℃で保管した。
【００６２】
ガラスと比較した際の、およびＴ＝０対照試料と比較した際の、アデノウイルス製剤とプラスチックとの適合性を、上記のとおり、以下の方法で分析した：内部タンパク質蛍光強度；ＲＰ−ＵＰＬＣによるヘキソンタンパク質含量；２８０ｎｍでの吸光度による総タンパク質含量；ｖｐ−ＱＰＣＲによるアデノウイルス粒子濃度；ＡＥＸ−ＵＰＬＣによるアデノウイルス粒子濃度；およびＱＰＣＲベースの効力アッセイ（ＱＰＡ）による効力（感染力）。分析は、選択した試料のみに行ったｖｐ−ＱＰＣＲ分析を除き、すべての時点ですべてのバッグおよびバイアルに対して行った。
【００６３】
標準製剤１がバイオプロセスバッグと不適合であった（結果の項を参照されたい）という予想外の発見をさらに評価するために、追加の接触材料および時点を試験した。製剤１中に３．０×１０１１ＶＰ／ｍＬの濃度で入れたＡｄ２６アデノウイルスを、５±３℃または２５±２℃で６カ月まで、Ｆｌｅｘｂｏｙ（登録商標）バイオプロセシングバッグ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ）中、ＨｙＱ  Ｃｘ５−１４バイオプロセシングバッグ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中、またはＰｕｒｅＦｌｅｘ  Ｍｏｂｉｕｓバイオプロセシングバッグ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中でインキュベートした。すべての場合において、製剤２５ｍＬを５０ｍｌバッグに充填した。ガラスバイアル（Ｎｕｏｖ  ａＯｍｐｉ）を対照として含めた。
【００６４】
０日、１日、２日、５日、６日、７日および１４日、ならびに１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月および６カ月の各時点で試料をバッグおよびバイアルから取り出し、上記の方法を使用して適合性を分析した。
【００６５】
結果および結論
図１〜３は、製剤１中のＡｄ２６アデノウイルスと、ガラスまたはプラスチックとの適合性を示す。内部蛍光はタンパク質の含量およびコンフォメーションを示し、ヘキソンピーク面積はヘキソンタンパク質の量を示し、２８０ｎｍでの吸光度は総タンパク質濃度を示す。その結果は、驚くべきことに、製剤１がプラスチック表面と接触した場合、５℃または２５℃で１日後に既に（総およびウイルスの）タンパク質の量が減少することを示している。減少は第一週が最も激しく、その間にタンパク質含量の約２０〜３０％の低下が起こる。低い方の温度では分解がごくわずかに軽減されている。この作用は明らかにプラスチック表面の存在によって引き起こされる。なぜなら、この物質は、ガラスバイアル中でインキュベートすると、タンパク質含量にこれらの変化を示さないからである。プラスチックバイオプロセシングバッグは、タンパク質、ウイルスおよび他の生物学的製剤の製造および保管によく使用されているため、このウイルスとプラスチックとの不適合性はきわめて予想外の発見である。
【００６６】
ウイルス粒子濃度は、ガラスバイアル中の試料では有意な減少がないのに比較して、バイオプロセスバッグに接触した試料ではほぼ５０％減少するという類似の傾向を示す（図４および５）。図６は、感染粒子がこの作用に悪影響を受け、それにより、バイオプロセスバッグに入れた試料中のウイルスのタンパク質および粒子と同時に効力が減少することを示す。
【００６７】
類似の作用が、試料に凍結／融解ストレスを施した場合に観察された（図７）。１回の凍結／融解サイクル後、バッグ中の物質はタンパク質含量の明らかな減少を示し、ガラス中の試料は、この物質自体がこのストレス条件に対して耐性であることを示した。したがって、このウイルス物質の凍結保管は表面誘起分解を防止できる解決策ではない。
【００６８】
この不適合性が、図１〜７で使用したバイオプロセスバッグの種類に特異的であるかどうかを調査するために、いくつかの他の種類のプラスチックのバッグについても適合性を試験した。図８は、ガラスバイアルと比較した際の、３種類のバイオプロセスバッグ中に保管したウイルス製剤の感染粒子の濃度として表した効力を示す。ウイルス物質がいずれのプラスチックと接触した場合にも、５℃および２５℃の両方で効力は激しく低下した。一方、ガラスバイアル中に保管されたウイルス物質は良好な適合性を示し、両方の温度において、分解する速度がバイオプロセスバッグ中より大幅に遅い。これは、ウイルスとプラスチックとの不適合性がプラスチックの種類とは無関係であることと、異なる種類のバッグに交換することで問題が容易に軽減されるものではないこととを示す。
【００６９】
これらの結果は、標準製剤１がプラスチック表面と接触すると急速に分解することと、この不適合性が、例えば、温度の低下でも、凍結保管でも、異なる種類のプラスチックでも容易に軽減され得ないこととを示している。プラスチックは使い捨てのバイオプロセシングバッグおよび保管容器に広く使用されているため、これは、このような物質の製造、輸送および保管に関する現実の問題を提起するものである。
【００７０】
実施例２
実験計画および方法
Ａｄ２６アデノウイルスを含むアデノウイルス製剤（［１］に記載）を濃縮し、限外濾過／透析濾過（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  Ｂｉｏｍａｘ  ３００フィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製を備えたＳａｒｔｏｓｌｉｃｅ装置を使用）により、表１に規定している製剤１、２および３に再び製剤化した。製剤１は実施例１で使用した標準製剤であり、製剤２は文献［２］に記載され、広く使用されているアデノウイルス製剤であり、製剤３は広く使用されている緩衝液ＰＢＳである。３つの製剤は、ｐＨ、緩衝の種類、ならびに他の添加剤の存在および濃度において異なる。
【００７１】
次いで、物質の半分を、適切な製剤緩衝液を使用して１．０×１０１１ＶＰ／ｍＬ（製剤１）または１．５×１０１１ＶＰ／ｍＬ（製剤２および３）に希釈した。残りの半分に、適切な製剤緩衝液に入れたヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン（ＨＢＣＤ）のストックを、最終濃度５％（ｗ／ｗ）ＨＢＣＤになるまで添加して、製剤１、２および３＋ＨＢＣＤ（表１）を得た。これらの製剤も適切な製剤緩衝液を使用して同じ力価になるまで希釈した。物質とバイオプロセスバッグとの適合性を試験する前のＴ＝０時点で、すべての製剤から対照試料を採取した。
【００７２】
【表１】
0006487604.tif 000002
【００７３】
ＨＢＣＤを含むまたは含まないアデノウイルス製剤１、２および３のプラスチック適合性を評価するために、各製剤２５ｍＬずつを５０ｍＬ  Ｆｌｅｘｂｏｙ（登録商標）バイオプロセシングバッグ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ）中に１製剤当たりｎ＝３で充填した。バッグを２５±２℃でインキュベートし、２日または３日、および７日または８日の時点を設けた。各時点で試料をバッグから取り出し、試料分析まで≦−６５℃で保管した。
【００７４】
アデノウイルス製剤のプラスチック適合性を、上記のとおり、以下の方法で分析した：内部タンパク質蛍光強度；ＲＰ−ＵＰＬＣによるヘキソンタンパク質含量；およびＣＥによるアデノウイルス粒子濃度。タンパク質蛍光およびＲＰ−ＵＰＬＣは、１製剤当たり３バッグのすべてについて、それぞれ３連および２連において行った。ＣＥは３バッグのうちの２バッグについて行い、各バッグおよび各時点につき１つの報告可能な値を得た。
【００７５】
結果および結論
図９〜１１に示した結果によると、ＨＢＣＤを含まないアデノウイルス製剤１、２および３は、２５℃での短期保管中にプラスチックと不適合であることが明確に示されている。内部タンパク質蛍光、ヘキソン含量およびウイルス粒子濃度の減少が観察されている。これは、製剤中の（感染性）ウイルス粒子およびタンパク質の濃度が１週間にわたって約３分の１減少することを示す。実施例１に示したように、製剤１中のＡｄ２６は、これらの条件下でガラスなどの適合性のある一次包装材料中に保管した場合、例えばタンパク質および粒子の含有量に関して安定である。製剤２は、文献［２］に記載されている安定なアデノウイルス製剤である。したがって、観察された不適合性は、バイオプロセスバッグ表面に特異的である。
【００７６】
製剤１、２または３＋ＨＢＣＤ中に５％（ｗ／ｗ）のＨＢＣＤが存在することにより、アデノウイルスは表面誘起分解から保護された。図９〜１１は、ＨＢＣＤを添加したこれらの製剤中のＡｄ２６が、タンパク質および粒子の含量に関してプラスチックと適合性があることを示す。これらのデータは、β−シクロデキストリンが、バイオプロセスバッグに入れた液体製剤中に含有されるウイルスのプラスチック表面誘起分解に対して保護効果を付与することを示す。重要なことに、この作用は、ｐＨおよび添加剤に差違があるにもかかわらず、３つの製剤すべてにおいて観察されているため、この作用はＨＢＣＤに特異的であり、製剤に依存するものではない。
【００７７】
実施例３
実験計画および方法
上記の実施例において、意外にも、ウイルス製剤がプラスチックバイオプロセシングバッグと不適合であることと、ＨＢＣＤを添加すると前記バッグからの表面誘起分解に対して保護が付与されることとが実証された。ＨＢＣＤが表面誘起分解に対して保護する濃度範囲を決定するために、以下の実験を行った。Ａｄ２６アデノウイルスを含むアデノウイルス製剤（［１］に記載）を濃縮し、限外濾過／透析濾過（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  Ｂｉｏｍａｘ  ３００フィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製を備えたＳａｒｔｏｓｌｉｃｅ装置を使用）により、表１に規定している製剤２に再び製剤化した。製剤２は文献［２］に記載され、広く使用されているアデノウイルス製剤である。次いで、製剤に０、０．２、１または５％（ｗ／ｗ）ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン（ＨＢＣＤ）を添加した。すべての製剤を製剤緩衝液２で希釈することによって同じ力価にした。物質のプラスチック適合性を試験する前のＴ＝０時点ですべての製剤から対照試料を採取した。
【００７８】
ＨＢＣＤ濃度が異なるアデノウイルス製剤のプラスチックとの適合性を評価するために、各製剤４ｍＬずつを５ｍＬ  Ｆｌｅｘｂｏｙ（登録商標）バイオプロセシングバッグ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ）中に１製剤当たりｎ＝２で充填した。バッグを適合性試験用に２５±２℃でインキュベートし、３日および８日の時点を設けた。各時点で試料をバッグから取り出し、試料分析まで≦−６５℃で保管した。
【００７９】
アデノウイルス製剤のプラスチック適合性を、上記のとおり、以下の方法で分析した：内部タンパク質蛍光強度；ＲＰ−ＵＰＬＣによるヘキソンタンパク質含量；２８０ｎｍでの吸光度による総タンパク含量；ＣＥによるアデノウイルス粒子濃度；およびＱＰＣＲベースの効力アッセイ（ＱＰＡ）による効力（感染力）。
【００８０】
結果および結論
図１２〜１６は、それぞれプラスチックバイオプロセシングバッグと８日間接触させた後の４種の製剤の、内部タンパク質蛍光、２８０ｎｍでの吸光度による総タンパク質濃度、ＲＰ−ＵＰＬＣによるヘキソンタンパク質含量、ＣＥによるアデノウイルス粒子濃度およびＱＰＡによる効力を示す。Ｔ＝０時点で、すべての製剤のタンパク質および粒子の含量は同じであったが、インキュベーション後、製剤中のＨＢＣＤ濃度に依存してこれらの特性における明らかな低下がある。ＨＢＣＤが５％の製剤はプラスチックと適合性があるが、ＨＢＣＤが０または０．２％の製剤はプラスチックとの接触中に大幅に分解し、ウイルスのタンパク質濃度、粒子含量および効力において２０〜３０％の低下が観察されている。ＨＢＣＤが１％の製剤は適合性に幾分改善が見られるが、ＨＢＣＤが５％の製剤ほど多くはない。このように、ＨＢＣＤは１％の濃度で既に表面誘起分解に対して保護することができるが、濃度が高い方がその有効性は高くなる。
【００８１】
５％を超え、少なくとも３０％までは十分な保護が実現し、製剤はプラスチックと適合性がある。したがって、ＨＢＣＤ濃度の上限は、安全性および注入可能限界によって決定される。ＨＢＣＤは水溶液に高溶解性であり、および粘度と、それにより製剤の注入可能性とは、５０％のＨＢＣＤ濃度まで実行可能範囲内にある［３］。ＨＢＣＤは安全性および忍容性プロファイルが良好であり、１日当たりＨＢＣＤ２４ｇまでの非経口投与後に副作用は観察されなかった［４］。３０％ＨＢＣＤの溶液は、モル置換に依存して約２００〜２１５ｍＯｓｍ／Ｌの容積オスモル濃度を有し、したがって等張製剤の一部になり得る。適合性、粘度および注入可能性、安全性および忍容性の各要因を考慮すると、ＨＢＣＤが表面誘起分解に対して保護するために適用され得る範囲は１％（ｗ／ｗ）〜３０％（ｗ／ｗ）である。
【００８２】
参考文献
１．Ｚａｈｎ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄ３５  ａｎｄ  ａｄ２６  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｆｉｌｏｖｉｒｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ．２０１２。
２．Ｅｖａｎｓ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｔａｂｌｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ，２００４．９３（１０）：ｐ．２４５８−７５。
３．Ｄｕｓａｕｔｏｉｓ，Ｃ．ａｎｄ  Ｓ．Ｎｅｖｅｓ，Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ  Ｂｅｔａｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ：Ａｎ  Ｅｎａｂｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｒｏｑｕｅｔｔｅ，２００９。
４．Ｌｏｆｔｓｓｏｎ，Ｔ．ａｎｄ  Ｍ．Ｅ．Ｂｒｅｗｓｔｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓ：ｂａｓｉｃ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２０１０．６２（１１）：ｐ．１６０７−１６２１。
また、本発明は以下を提供する。
［１］  ウイルスを表面誘起分解から保護する方法であって、前記ウイルスが、プラスチックで構成されるバッグ中の溶液に含有され、前記方法が、β−シクロデキストリンを前記溶液に約１％（ｗ／ｗ）〜約３０％（ｗ／ｗ）の濃度で添加するステップを含む、方法。
［２］  前記β−シクロデキストリンが、ジメチル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、３−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよびトリメチル−β−シクロデキストリンの群から選択される、［１］に記載の方法。
［３］  前記β−シクロデキストリンが２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである、［２］に記載の方法。
［４］  前記プラスチックが、エチレン酢酸ビニル、ポリアミドおよびポリエチレンの群から選択される、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］  前記バッグがバイオプロセスバッグである、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］  前記ウイルスがアデノウイルスである、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］  ウイルスを表面誘起分解から保護するためのβ−シクロデキストリンの使用であって、前記ウイルスが、プラスチックバイオプロセスバッグ中に含有される溶液中に含有される、使用。
［８］  前記β−シクロデキストリンが、ジメチル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、３−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよびトリメチル−β−シクロデキストリンの群から選択される、［７］に記載のウイルスを表面誘起分解から保護するためのβ−シクロデキストリンの使用。
［９］  前記β−シクロデキストリンが２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである、［８］に記載のウイルスを表面誘起分解から保護するためのβ−シクロデキストリンの使用。
［１０］  前記プラスチックが、エチレン酢酸ビニル、ポリアミドおよびポリエチレンの群から選択される、［７］〜［９］のいずれか一項に記載のウイルスを表面誘起分解から保護するためのβ−シクロデキストリンの使用。
［１１］  アデノウイルスを表面誘起分解から保護するための２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンの使用であって、前記アデノウイルスが、エチレン酢酸ビニルバイオプロセスバッグ中に含有される溶液中に含有される、使用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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