(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料中の細胞によって分泌される酸化還元物質を検出するためのナノ流体電極アッセンブリであって、以下からなる：
（ａ）基板の中に配置されるナノ流体チャネル；
（ｂ）ナノ流体チャネルと流体接続する入口および出口ポートで、入口および出口ポートは、前記ナノ流体チャネルからまたは前記ナノ流体チャネルへ前記液体試料から液体を添加および／または除去するように配列されている；
（ｃ）前記ナノ流体チャネルに配置された第１の作用電極で、前記第１の作用電極は、酸化還元物質を酸化するに十分な電位を印加するのに適している；
（ｄ）前記ナノ流体チャネルに配置された第２の作用電極で、前記第２の作用電極は、酸化還元物質を還元するに十分な電位を印加するのに適している；
（ｅ）前記ナノ流体チャネルに配置された基準電極；および
（ｆ）細胞によって酸化還元物質の分泌を刺激する化学薬品を含むマトリクスで、前記マトリクスは、化学薬品を放出する能力があり、および前記マトリクスは、１または２以上の下記のサイトに配置される：
（１）前記ナノ流体チャネル内に；
（２）入口および出口ポート内に；
（３）第１の作用電極の表面の少なくとも一部上に；
（４）第２の作用電極の表面の少なくとも一部上に；
（５）基準電極の表面の少なくとも一部上に；および
（６）基板面の少なくとも一部上で、基板面は前記入口および出口ポートに隣接し；
前記酸化還元物質は、前記第１および第２の作用電極を介して電流の流れとして検出される。
【請求項２】
請求項１のナノ流体電極アッセンブリ、およびナノ流体チャネルと流体接続する対電極からなる装置。
【請求項３】
前記化学薬品が、アミノ酸であり、アミノ酸がチロシンまたはバリンである、請求項１のナノ流体電極アッセンブリ。
【請求項４】
マトリクスが、ゼラチン、キトサン、アルギン酸塩、フィブリン、コラーゲン、エラスチン、寒天、アガロース、ヒアルロン酸、デキストラン、セルロース、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（N-ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテル、ポリ（アクリル酸）、ポリメタクリレート、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）またはポリ（乳酸）を含む、請求項１のナノ流体電極アッセンブリ。
【請求項５】
前記酸化還元物質がシデロフォアであり、前記シデロフォアがピオシアニンである、請求項１のナノ流体電極アッセンブリ。
【請求項６】
基準電極、及び／又は第１の作用電極、及び／又は第２の作用電極が、ナノ流体チャネルの壁の少なくとも一部を形成する、請求項１のナノ流体電極アッセンブリ。
【請求項７】
基板の少なくとも一部分が、細胞のナノ流体電極アッセンブリへの接着を促進する、請求項１のナノ流体電極アッセンブリ。
【請求項８】
請求項１のナノ流体電極アッセンブリ、および作用電極を通じて電流の流れを用いるデータ解析を行う能力を有するプロセッサからなる装置。
【請求項９】
１または２以上の細胞のタイプによって分泌される複数の酸化還元物質の同時検出用の装置で、当該装置は、複数の請求項１のナノ流体電極アッセンブリからなる。
【請求項１０】
以下を備える装置：
（ａ）少なくとも１個の請求項１のナノ流体電極アッセンブリ；および
（ｂ）液体試料を受容可能なマイクロ流体チャネルで、当該マイクロ流体チャネルは、入口および出口ポートを介してナノ流体チャネルと流体接続する。
【請求項１１】
マトリクスが、入口ポートおよび／または出口ポートに隣接するマイクロ流体チャネル内に配置される、請求項１０の装置。
【請求項１２】
ナノ流体チャネルの寸法は、マイクロ流体チャネルからナノ流体チャネルへの細胞の通過を排除する大きさである、請求項１０の装置。
【請求項１３】
液体試料中の細胞によって分泌される酸化還元活性物質の検出方法で、該方法は以下からなる：
（ａ）請求項１のナノ流体電極アッセンブリを提供するステップ；
（ｂ）マトリクスに液体試料を曝露し、化学薬品がマトリクスから放出されるステップ；
（ｃ）その電位を安定化するために基準電極を帯電するステップ：
（ｄ）第１の作用電極で酸化還元活性物質を酸化するために適した電位を印加し、第２の作用電極で、酸化還元活性物質を還元するために適した電位を印加するステップで、酸化還元活性物質は、第１の作用電極及び第２の作用電極の電位の中間電位値を有し；
（ｅ）第１および第２の作用電極を通じて電流の流れを測定するステップ；
閾値を超える電流の流れは酸化還元活性物質の存在を示し、閾値以下の電流の流れは、酸化還元活性物質が存在しないことを示す。
【請求項１４】
酸化還元活性物質の存在の検出が、酸化還元活性物質を分泌する細胞の存在を示し、酸化還元活性物質の不存在の検出が、酸化還元活性物質を分泌する細胞の不存在を示す、請求項１３の方法。
【請求項１５】
液体試料中の細胞によって分泌される第１および第２の酸化還元活性物質を同時に検出する方法で、第１および第２の酸化還元活性物質が異なる酸化還元電位を有し、当該方法は、以下からなる：
（ａ）請求項１のナノ流体電極アッセンブリを提供する；
（ｂ）マトリクスに液体試料を曝露し、１または２以上の化学薬品がマトリクスから放出されるステップ；
（ｃ）その電位を安定化するために基準電極を帯電するステップ；
（ｄ）第１の作用電極で第１の酸化還元活性物質を酸化するために適した酸化電位の第１のセットおよび第２の酸化還元活性物質を酸化するために適した酸化電位の第２のセットを印加し、第２の作用電極で第１の酸化還元活性物質を還元するために適した還元電位の第１のセット、および第２の酸化還元活性物質を還元するために適した還元電位の第２のセットを交互に印加する； および
（ｅ）第１および第２の作用電極を流れる電流を測定する；
酸化還元電位の第１のセットを印加中に、第１の閾値を上回る電流の流れは、第１の酸化還元活性物質の存在を示し、第１の閾値以下の電流の流れは、第１の酸化還元活性物質が存在しないことを示し；
酸化還元電位の第２のセットを印加中に、第２の閾値を上回る電流の流れは、第２の酸化還元活性物質の存在を示し、第２の閾値以下の電流の流れは、第２の酸化還元活性物質が存在しないことを示す。
【請求項１６】
前記液体試料が、嚢胞性繊維症に罹患する患者からの試料である、請求項１３〜１５の何れか１項の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願への相互参照］
本願は、米国仮出願番号61/871,373号、出願日：2013年8月29日の、名称：迅速なスクリーニング用のアップレギュレートした独得の分泌細菌分子、の優先権を請求し、ここに当該出願は、その全体を参照して組込まれる。
【０００２】
［連邦支援研究開発に関する陳述］
本発明は、国立科学基金から許可番号1125535の支援を受けて開発された。よって、アメリカ合衆国は本発明の幾分かの権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
緑膿菌は、病院内グラム陰性細菌感染症の主要な原因の一つである(H. Fazeli, R. Akbari, S. Moghim, T. Narimani, M. R. Arabestani および A. R. Ghoddousi, J. Res. Med. Sci., 2012, 17, 332-337; V. H. Tam, K. T. Chang, K. Abdelraouf, C. G. Brioso, M. Ameka, L. A. McCaskey, J. S. Weston, J. P. Caeiro およびK. W. Garey, Antimicrob. Agents Chemother., 2010, 54, 1160-1164)。この日和見病原体は、しばしば、嚢胞性線維症の患者(T. W. Lee, K. G. Brownlee, M. Denton, J. M. Littlewood and S. P. Conway, Pediatr. Pulmonol., 2004, 37, 104-110; J. B. Lyczak, C. L. Cannon およびG. B. Pier, Clin. Microbiol. Rev., 2002, 15, 194-222; and F. Ratjen およびG. Doring, Lancet, 2003, 361, 681-689) 、火傷被害者、およびAIDS患者のような重篤な免疫不全のホスト(J. B. Lyczak, C. L. Cannon and G. B. Pier, Microbes Infect., 2000, 2, 1051-1060) にリンクされている。それは健康な個体における感染症には殆ど責任がないが、いくつかの要因が、病院環境で繁栄する能力および抗生物質に対する増大する抵抗を含む折衷物において緑膿菌の成功に貢献している(H. Fazeli, R. Akbari, S. Moghim, T. Narimani, M. R. Arabestani および A. R. Ghoddousi, J. Res. Med. Sci., 2012, 17, 332-337)。緑膿菌感染症は、この患者集団のために深刻な懸念を提起し、それを科学や医学界で研究するための重要な細菌にする。
【０００４】
ピオシアニン、酸化還元活性クオラムセンシング分子の生産は、緑膿菌に独特で、バイオフィルム形成にリンクされる、細菌の病原性における多大な貢献者である(E. Kipnis, T. Sawa and J. Wiener-Kronish, Med. Mal. Infect., 2006, 36, 78-91; G. W. Lau, D. J. Hassett, H. Ran and F. Kong, Trends Mol. Med., 2004, 10, 599-606; and L. E. Dietrich, A. Price-Whelan, A. Petersen, M. Whiteley and D. K. Newman, Mol. Microbiol., 2006, 61, 1308-1321)。それは酸化還元活性であるので、ピオシアニンは、電気化学的に検出することができる(T. A. Webster および E. D. Goluch, Lab Chip, 2012, 12, 5195-5201; V. B. Wang, S. L. Chua, B. Cao, T. Seviour, V. J. Nesatyy, E. Marsili, S. Kjelleberg, M. Givskov, T. Tolker-Nielsen, H. Song, J. S. Loo および L. Yang, PLoS One, 2013, 8, e63129; D. Sharp, P. Gladstone, R. B. Smith, S. Forsythe and J. Davis, Bioelectrochemistry, 2010, 77, 114-119; T. A. Webster, H. J. Sismaet および E. D. Goluch, Nano LIFE, 2013, 03, 1340011; and T. A. Webster, H. J. Sismaet, J. L. Conte, I. P. Chan および E. D. Goluch, Biosens. Bioelectron., 2014, 60, 265-270)。最近公表された文献は、アミノ酸の付加は、緑膿菌のバイオフィルム形成をアップレギュレートすることが示されている(S. P. Bernier, D. G. Ha, W. Khan, J. H. Merritt and G. A. O'Toole, Res. Microbiol., 2011, 162, 680-688)。しかし、これらの研究は、ピオシアニン生産と緑膿菌の成長の間のリンクには対応していない。1950年代に、アミノ酸がピオシアニン生産を決定するためにアミノ酸が如何に影響するかの研究は、再検討或いはセンシング戦略に適用されなかった(E. Hellinger, J. Gen. Microbiol., 1951, 5, 633-639; N. Grossowicz, P. Hayat and Y. S. Halpern, J. Gen. Microbiol., 1957, 16, 576-583)。
【０００５】
アミノ酸は、タンパク質合成のための構成要素であり、こうして、細胞壁形成のためのペプチドグリカンのような細菌増殖のための主要コンポーネントとして働くことはよく知られている(W. He, C. Li and C. D. Lu, J. Bacteriol., 2011, 193, 2107-2115)。トーマスらは、痰中のアミノ酸濃度は、嚢胞性線維症のより重篤な症例のアミノ酸の濃度よりも高いことを見出した(S. R. Thomas, A. Ray, M. E. Hodson およびT. L. Pitt, Thorax, 2000, 55, 795-797)。ピアソンらは、 ピオシアニンための生合成経路を提案し、その前駆体は、芳香族アミノ酸の分岐点合成を含み、調節分子としてアミノ酸を使用する信頼性に役立っている（ L.S. ピアソン, 3rd、およびE.A.ピアソン、Appl. Microbiol. Biotechnol., 2010、86，1659-1670）。アミノ酸合成は、代謝的に高価なプロセスであるため、緑膿菌などの細菌は、環境中の遊離アミノ酸の豊富な量が与えられる、それらの代謝経路を適応させることが可能でる。 6個のアミノ酸（プロリン、ヒスチジン、アルギニン、ロイシン、チロシン、およびバリン）は、緑膿菌培養におけるバイオフィルム形成をアップレギュレートすることはよく知られている(S. P. Bernier, D. G. Ha, W. Khan, J. H. Merritt および G. A. O'Toole, Res. Microbiol., 2011, 162, 680-688)。
早期の感染の同定のための改善された電気化学的技術を開発するニーズが残存している。
【発明の概要】
【０００６】
細胞によって分泌されるレドックス（酸化還元）活性物質の電気化学的測定のための装置、装置の組立て方法、および装置を使用して酸化還元活性物質を検出する方法が提供される。
【０００７】
本明細書で使用する場合、用語「ナノスケール」は、オブジェクトまたはフィーチャーの大きさの範囲で、約1nmから約999nmを指す。用語「マイクロスケール」は、約１μmから約999μm、または1mm未満のオブジェクトまたはフィーチャーを指す。本明細書で使用される「ナノ流体チャネル」は、ナノサイズの断面寸法を有する形状で、一般に空間を指す。例えば、ナノ流体チャネルのその長さの如きその他の寸法は、マイクロスケールのサイズ以上であることができ、またはさらにナノサイズにすることができる。本明細書で使用される「マイクロ流体チャネル」は、マイクロスケール範囲またはそれ以上の全断面寸法を有するチャネルである。
【０００８】
本発明の一態様は、液体試料中の細胞により分泌されるレドックス活性物質を検出するためのナノ流体電極アッセンブリであり、以下を含む：ナノ流体電極アセンブリ基板内に配置されたナノ流体チャネル；ナノ流体チャネルと流体接続する入口及び出口ポートは、入口および出口ポートの追加、および／または、ナノ流体流路からの液体試料から液体を除去するように構成される。作用電極は、交互に酸化還元し、酸化還元活性物質を減少させるのに十分な電位を印加することに適しているナノ流体チャネル内に配置された作用電極である；ナノ流体チャネル内に配置された基準電極;および、マトリックスは、細胞が酸化還元活性物質の分泌を刺激する薬剤を含み、薬剤を放出することが可能であり、そしてマトリックスは、１または２以上のナノ流体チャネルの上または中に配置され、入口ポート、出口ポート、作用電極の表面の少なくとも一部、基準電極の表面の少なくとも一部、及び基板の表面の少なくとも一部が、基板表面が入口または出口ポートに隣接しており;レドックス活性物質が作用電極を流れる電流として検出されるようになっている。
【０００９】
別の態様では、ナノ流体電極アッセンブリは、第一及び第二作用電極を有し、第一作用電極は、酸化還元活性物質を酸化するのに十分な電位を印加することに適しており、第二作用電極は、酸化還元活性物質を還元するのに十分な電位を印加することに適しており、およびマトリックスは、１または２以上のナノ流体チャネル上または中、入口ポート、出口ポート、第１の作用電極の少なくとも一部の表面、第２の作用電極の少なくとも表面の一部、基準電極の表面の少なくとも一部、並びに基板表面の一部に配置され、作用電極、及びその表面は、入口および/または出口ポートに隣接している。関連する実施態様においては、第1および第2の作用電極は、ナノ流体チャネルを横切る約20〜100nmの距離で隔てられている。
【００１０】
マトリックスは、細胞への化学薬品の放出を可能にする材料で作られている。いくつかの実施態様では、マトリックスは、ポリマー、生体適合性ポリマー、ヒドロゲル、または親水性ポリマーを含む。例えば、マトリックスは、ゼラチン、キトサン、アルギン酸塩、フィブリン、コラーゲン、エラスチン、寒天、アガロース、ヒアルロン酸、デキストラン、セルロース、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（N-ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテル、ポリアクリレート）、ポリメタクリレート、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）またはポリ（乳酸）からできている。
【００１１】
マトリックスは、細胞への化学薬品の放出を可能にするように据えられている。いくつかの実施態様においては、マトリックスは、１または２以上の接続ポートに隣接するナノ流体チャネル内に配置されている。いくつかの実施態様においては、マトリックスは、１または２以上の接続ポートに隣接するマイクロ流体チャネル内に配置されている。いくつかの実施態様においては、マトリックスは、作用電極の表面の少なくとも一部に取り付けられている。いくつかの実施態様においては、マトリックスは、酸化作用電極の表面の少なくとも一部に取り付けられている。いくつかの実施態様においては、マトリックスは、還元作用電極の表面の少なくとも一部に取り付けられている。
【００１２】
いくつかの実施態様においては、マトリックスは、細胞の１つまたは２以上のタイプによって、１つ以上のレドックス活性物質の分泌を刺激する、１つまたは２以上の化学薬品を含有する。
本発明の様々な実施態様においては、装置の１または複数の作用電極は、金、導電性ダイヤモンド、プラチナ、およびガラス状炭素からなる群から選択される材料を含む。
本発明の他の関連する実施態様においては、装置の基板は、屈折率が1.5よりも高いガラスを含む。 例えば、屈折率が1.6 〜1.9の範囲である。例えば、ガラスは約100nmの厚さを有する。
本発明の関連する実施態様は、相補型金属酸化膜半導体（CMOS）電子機器と無線送信機を統合した装置を含む。
【００１３】
いくつかの実施態様において、細胞は、例えば、シデロフォア、例えばハイダーとコングによって記述されるもの（R. C.HiderとX.Kong、2010年、Nat. Prod. Rep. 27巻：637から657 ）を分泌する細菌または真菌である。いくつかの実施態様において、細胞は、ウスチラゴのスフフェロジーナ（sphaerogena）、ストレプトミセスピロサス、ストレプトミセス・コエリカラー、ストレプトミセスコエリカラー、フサリウム・ロゼウム、バークホルデリア・セパシア、ロドトルラピリマナエ、大腸菌、枯草菌、炭疽菌、ビブリオコレラ、アゾトバクタービネランジー、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、およびペスト菌からなる群から選択される細菌または真菌である。いくつかの実施態様において、細胞は、細菌、緑膿菌である。
【００１４】
いくつかの実施態様において、化学薬品は、アミノ酸、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニントリプトファン、チロシン、またはバリンである。
いくつかの実施態様において、基準電極は、Pdを含む。
【００１５】
いくつかの実施態様において、電極はナノ流体チャネルの１または２以上の壁を構成している。いくつかの実施態様においては、基準電極は、ナノ流体チャネルの壁の少なくとも一部を形成する。いくつかの実施態様においては、作用電極は少なくともナノ流体チャネルの壁の一部を形成する。いくつかの実施態様では、第一作用電極及び／又は第二作用電極は、ナノ流体チャネルの壁の部分の少なくとも一部を形成する。本発明のいくつかの実施態様においては、例えば、1つの作用電極を有する装置において、基準電極と作用電極の各々は、ナノ流体チャネルの壁の少なくとも一部を形成し、及びナノ流体チャネルの絶縁部分によって分離されていて、当該絶縁部分は、ナノ流体チャネルの長さに沿って約30nmから約50μmまで延びる。本発明のいくつかの実施態様において、 例えば、1つの作用電極を有する装置において、基準電極と作用電極はナノ流体チャネルの反対側の壁と対向する壁の少なくとも一部を形成し、対向する壁は、20から100 nmの距離のだけ離れている。本発明のいくつかの実施態様において、例えば、第1および第2の作用電極を有する装置において、基準電極および第１作用電極の各々は、装置内のナノ流体チャネルの壁の少なくとも一部を形成し、ナノ流体チャネルの絶縁部によって分離されていて、当該絶縁部は、ナノ流体チャネルの長さに沿って約30nmから約50μmまで延びる。
【００１６】
本発明のいくつかの実施態様は、対向する壁の一部を形成する、第1および第２作用電極を有し、ナノ流体チャネルの対向する壁は約20- 100 nmの距離だけ離れている。他の関連する実施態様においては、基準電極と第一及び第二作用電極各々は、ナノ流体チャネルの壁の少なくとも一部を形成し、基準電極は、ナノ流体チャネルの両方の作用電極から、絶縁部によって分離され、当該絶縁部は、ナノ流体チャネルの長さに沿って約30nmから約50μm延びる。
いくつかの関連する実施態様において、１または複数の作用電極は、基準電極よりも大きな表面積を有する。
【００１７】
本発明の実施態様は、作用電極と基準電極を含み、当該作用電極は、少なくとも100 nm2の表面積を有するように加工した装置を含む。関連する実施態様においては、作用電極の面積は100,000未満、50,000未満、20,000未満、10,000未満、または500nm2未満である。
【００１８】
別の実施態様において、作用電極はそれぞれ、少なくとも1μm2の表面積を有する。関連する実施態様において、各作用電極の面積は、100未満、50未満、20未満、10未満、または5μm2未満である。
【００１９】
本発明の関連する実施態様において、電極が配置されたナノ流体流路の容積が少なくとも、約50ナノリットル（ｎＬ）、約10 ｎＬ未満、約1 ｎＬ未満、約100ピコリットル（ｐＬ）未満、約10ｐＬ未満、約50ｐＬ未満、約5ｐＬ未満、または約1ｐＬ未満である。
【００２０】
いくつかの実施態様において、酸化還元活性物質は、例えば、真菌や細菌によって分泌されるシデロフォア、フェリクロム、デスフェリオキサミンB、デフェロキサミン、デスフェリオキサミンE、フサリニンC、オルニバクチン、ロドトルル酸、エンテロバクチン、バシリバクチン、ビブリオバクチン、アゾトバクチン、ピオバジン、ヤーシニアバクチン、またはピオシアニンである。
いくつかの実施態様において、ナノ流体電極アッセンブリは、医療装置または医療装置の構成要素として使用するために構成されている。いくつかの実施態様において、ナノ流体電極アセンブリは使い捨てである。いくつかの実施態様において、ナノ流体電極アセンブリは、患者への移植に適している。
【００２１】
いくつかの実施態様において、ナノ流体電極アセンブリの基板の少なくとも一部は、ナノ流体電極アセンブリへの細胞の接着を促進するコーティングで被覆されている。いくつかの実施態様では、コーティングは、正に帯電したイオン、例えば、ポリ-L-リジンを含んでいる。
【００２２】
本発明の別の態様は、ナノ流体電極アセンブリ及びナノ流体チャネルと流体接続する対電極を含む装置である。例えば、対電極が基準電極に流れる電流を監視し、例えば約1nA未満のような低レベルに基準電極を通る電流の流れを維持するのに有用である。いくつかの実施態様において、対電極は、例えば、PtやHgのような不活性な材料で作られている。いくつかの実施態様において、対電極は、ナノ流体チャネルの壁の少なくとも一部を形成する。
【００２３】
本発明の別の態様は、作用電極を流れる電流を使用してデータ分析を実行するプロセッサと電磁接続する、ナノ流体電極アッセンブリを含む装置である。
本発明の別の態様は、作用電極を流れる電流又はレドックス活性物質の濃度を表示するディスプレイと電子接続するナノ流体電極アッセンブリを含む装置である。
本発明の別の態様は、細胞の1つまたは複数のタイプによって分泌された酸化還元活性物質の複数の同時検出を可能にする、ナノ流体電極アッセンブリを複数有する装置である。いくつかの実施態様において、装置は、1つの作用電極を有する複数のナノ流体電極アセンブリを有している。いくつかの実施態様において、装置は、2つの作用電極を有する、複数のナノ流体電極アセンブリを有する。
【００２４】
本発明の別の態様は、ナノ流体電極アセンブリと、入口ポートおよび出口ポートを介してナノ流体電極アセンブリのナノ流体チャネルと流体接続したマイクロ流体チャネルを含む装置である。いくつかの実施態様において、マトリックスは、入口および/または出口ポートに隣接するマイクロ流体チャネル内に配置されている。いくつかの実施態様においては、ナノ流体チャネルの寸法は、ナノ流体チャネル内へマイクロ流体チャネルからの細胞の通過を排除する。いくつかの実施態様においては、マイクロ流体チャネルは、マイクロ流体チャネルと流体接続する少なくとも１つの入口ポートと少なくとも１つの出口ポートを有し、マイクロ流体入口ポートは、液体をマイクロ流体チャネルへ添加し、およびマイクロ流体出口ポートは、マイクロ流体から液体を除去するように構成されている。いくつかの実施態様においては、装置は、細胞の１つまたは２以上のタイプの細胞によって分泌された複数の酸化還元活性物質の同時検出を可能にする、マイクロ流体チャネルと流体接続した、ナノ流体電極アセンブリを含む。
【００２５】
本発明の一態様は、液体サンプル中の細胞によって分泌される酸化還元活性物質を検出するための装置であって、装置は以下を含む：交互に酸化還元し、酸化還元活性物質を減少させるのに十分な電位を印加するのに適した作用電極；細胞によってレドックス活性物質の分泌を刺激する薬剤を含むマトリックスで、当該マトリクスは、化学薬品を放出することが可能である；およびマトリクスが取付けられる基板；前記細胞及び／又はレドックス活性物質は、作用電極を流れる電流として検出される。
【００２６】
本発明の一態様は、液体サンプル中の細胞によって分泌されるレドックス活性物質を検出するための装置であって、装置は以下を含む：交互に酸化・還元し、酸化還元活性物質を還元するために十分な電位を印加するために適した作用電極；マトリックスは、薬剤を放出することが可能である；細胞により物質の分泌を刺激する薬剤を含むマトリックスで、当該マトリックスは、作用電極の表面の少なくとも一部に取り付けられている；前記細胞及び／又はレドックス活性物質は、作用電極を流れる電流として検出される。
【００２７】
いくつかの実施態様では、装置は、作用電極と接触した液体試料を収容可能な流体区画を含む。いくつかの実施態様においては、流体区画は、マトリックスが取り付けられた基板である。
本発明の別の態様は、液体試料中の細胞と基準電極によって分泌されるレドックス活性物質を検出するための装置を含む電気化学セルである。いくつかの実施態様では、電気化学セルは、対電極を含む。
本発明の一態様は、液体試料中の細胞により分泌されるレドックス活性物質の検出のための装置を製造するための方法であって、セルが酸化還元活性物質の分泌を刺激する薬剤を含むマトリックスを堆積させることを含む方法で、当該マトリックスは、作用電極の表面の少なくとも一部に、化学薬品を放出することが可能である。
いくつかの実施態様において、作用電極は、ナノ流体チャネルのまたはナノ流体チャネルを形成するために使用される構造内に配置される。
【００２８】
本発明の一態様は、液体試料中の細胞により分泌されるレドックス活性物質を検出するためのナノ流体電極アッセンブリを製造する方法であって、当該方法は以下の工程を含む：基板上に第１の作用電極層を堆積させる。第１の作用電極層上に犠牲層を堆積させる。必要に応じて、犠牲層の部分に第２の作用電極層を堆積する工程と犠牲層の一部上に基準電極層を堆積させる。絶縁層を堆積し、前記絶縁層を覆う第１の作用電極層、犠牲層、もし存在するならば第２作用電極層、及び基準電極層の露出面を被覆する；絶縁層を介して2つ以上の孔を形成し、犠牲層への流体接続をもたらし、当該孔は、少なくとも1つの入口ポート及び少なくとも1つの出口ポートを構成する；孔を貫通してエッチング剤を塗布し、犠牲層は、ナノ流体チャネルを形成するためにエッチング除去され、前記第1の作用電極層、存在する場合に第2の作用電極層、及び基準電極層は、各々ナノ流体チャネルの壁の少なくとも一部を形成する；マトリックスを堆積し、当該マトリクスは、セルによってレドックス活性物質の分泌を刺激する化学薬品を表面の少なくとも一部のナノ流体チャネル、入口ポート、出口ポート、マトリックスを堆積させる第1の作用電極層、存在する場合、第2の作用電極層の表面の少なくとも一部、基準電極層の表面の少なくとも一部、及び入口ポートおよび／または出口ポートに隣接する基板の表面の少なくとも一部へ放出することが可能である。
【００２９】
関連する実施態様においては、方法はさらに、１または２以上の層の上にレジスト材料を塗布し、次の層を塗布する前にパターニングされたマスクを作成するためにリソグラフィを施工することを含む。この方法の別の関連する実施態様では、電極層にワイヤをボンディングすることを含む。
いくつかの実施態様においては、第２作用電極層を堆積するステップが行われる。いくつかの実施態様では、第２作用電極層を堆積する工程は行われない。
いくつかの実施態様においては、マトリックスは、化学薬品で浸透されている。いくつかの実施態様において、マトリックスは、マトリックスを堆積する工程の前に化学薬品が浸透されている。いくつかの実施態様においては、マトリックスは、マトリックスを堆積する工程の後に化学薬品が浸透されている。いくつかの実施態様においては、マトリックスは、１種以上の化学薬品で浸透されている。
【００３０】
いくつかの実施態様において、前記方法はさらに、絶縁層の上にナノ流体電極アッセンブリへのセルの接着を促進するコーティングを堆積させる工程を含む。いくつかの実施態様においては、コーティングを堆積するステップは、後続のエッチング工程と、マトリックスを堆積する工程の前に行われる。いくつかの実施態様においては、コーティングを堆積するステップは、マトリックスを堆積させるステップに続いて行われる。
【００３１】
本発明の別の態様は、以下の工程を含むマイクロ流体・ナノ流体装置を製造する方法である：任意の順序で、別々に少なくとも一つのナノ流体電極アッセンブリを作製し、基板内のマイクロ流体チャネルを組立てる；少なくとも一つのマイクロ流体チャネルを有するものと、少なくとも1つのナノ流体電極アッセンブリとを組み合わせて、１または複数のナノ流体チャネルは１または複数の入口ポート及び出口ポートを介してマイクロ流体チャネルと流体接続されるようする。種々の態様において、マイクロ流体チャネルは、チャネル、リザーバー、オープンアクセスポート、および半透過膜で覆われたオープンアクセスポートの群から選択される形体を有する。
【００３２】
他の関連する実施態様によれば、ナノスケール装置を作製する方法において、第１の電極層の厚さは約20 nmである。他の実施態様においては、基準電極層の厚さは約120nmである。関連の実施態様においては、犠牲層の厚さが約20〜200nmである方法を含む。さらに、他の関連する実施態様において、絶縁層の厚さは約500 nmである。実施態様には、絶縁層が二酸化ケイ素を含むものを含む。実施態様はまた、絶縁層が酸化物の第１層、窒化物層、及び酸化物の第２の層とを含むものが含まれる。例えば、第一および第２の酸化物層はSiO2を含み、窒化物の層はSi3N4を含む。
【００３３】
種々の関連する実施態様においては、当該方法において、第1の電極層は、金、導電性ダイヤモンド、プラチナ、およびガラス状炭素からなる群から選択される材料を含む。他の関連する実施態様において、基準電極層は、パラジウムを含む。いくつかの実施態様では、電極層は、以下からなる群から選択される方法：電子ビーム蒸着法、物理蒸着法、および化学蒸着法によって堆積される。関連する実施態様においては、当該方法はさらに、第2電極層を犠牲層上に堆積させること、第2層および基準層は、本質的に同一平面で、隣接していない。種々の実施態様においては、基板はSiO2の表面層を有するシリコンウエハである。
【００３４】
本発明の一態様は、液体試料中の細胞（セル）により分泌されるレドックス活性物質を検出する方法であり、当該方法は以下を含む：装置を含む電気化学セルを提供し、電気化学セル、すなわち本明細書に記載のナノ流体電極アッセンブリは；装置のマトリックスへの細胞を含む液体試料を曝露し、薬剤がマトリックスから放出され、細胞による酸化還元活性物質の分泌を刺激する；その電位を安定化するために基準電極を帯電する；作用電極でレドックス活性物質を酸化するために適した電位、および酸化還元活性物質を還元するために適した電位を交互に印加し；そして作用電極を流れる電流を測定する；前記閾値を上回る電流の流れは、レドックス活性物質の存在を示し、閾値以下の電流の流れは、レドックス活性物質が存在しないことを示している。
【００３５】
いくつかの実施態様において、この方法は、本明細書に記載の第1及び第2作用電極を有するナノ流体電極アセンブリを提供する。第１作用電極で酸化還元活性物質を酸化するために適する電位を印加し、第2の作用電極で酸化還元活性物質を還元するために適する電位を印加する。
【００３６】
本発明の一態様は、液体試料中の細胞の1つまたは複数のタイプによって分泌される第一および第二のレドックス活性物質を同時に検出する方法であり、第一及び第二の酸化還元活性物質の各々は、異なる酸化還元電位を有し、当該法は以下を含む：装置を含む電気化学セルを提供し、電気化学セル、すなわち本明細書に記載のナノ流体電極アセンブリは；一つまたは２以上の細胞タイプからなる液体試料を装置のマトリクスに曝露し、一つ以上の化学薬品はマトリックスから放出され、一つ以上の細胞タイプによって酸化還元物質の分泌を刺激し；その電位を安定化するために基準電極を帯電し；作用電極における第一の酸化還元活性物質を酸化および還元するのに適した電位の第一のセット、および作用電極における第二酸化還元活性物質を酸化および還元するのに適した電位の第二のセットを交互に印加し；作用電極を流れる電流を測定し；前記第一の電位のセットの印加時に、閾値を上回る電流の流れは、第一の酸化還元活性物質の存在を示し、閾値以下の電流の流れは、第一のレドックス活性物質が存在しないことを示し、及び電位の第二のセットの印加時に、閾値を上回る前記電流の流れは、第二の酸化還元活性物質の存在を示し、閾値以下の電流の流れは、第二の酸化還元活性物質が存在しないことを示している。
【００３７】
いくつかの実施態様においては、液体試料中の細胞の1つまたは複数のタイプによって分泌された第一及び第二の酸化還元活性物質を同時に検出する方法であって、第一及び第二の酸化還元活性物質の各々は、異なる酸化還元電位を有し、当該方法は以下を含む：作用電極において、第一及び第二の酸化還元活性物質を酸化するのに適した第一の電位のセット、および作用電極において第一及び第二の酸化還元活性物質を還元させるのに適した第二の電位のセットを交互に印加する。前記第一の電位の印加時に、第一の閾値を上回る電流の流れは、第一の酸化還元活性物質の存在を示し、第一の閾値以下の電流の流れは、第一のレドックス活性物質が存在しないことを示している。第二の電位の印加時に、第二の閾値を上回る前記電流の流れは、第二の酸化還元活性物質の存在を示し、第二の閾値以下の電流の流れは、第二の酸化還元活性物質が存在しないことを示している。
【００３８】
いくつかの実施態様において、液体試料中の細胞の1つまたは複数のタイプによって分泌された第一及び第二の酸化還元活性物質を同時に検出する方法であって、第一及び第二の酸化還元活性物質の各々は、異なる酸化還元電位を有し、当該方法は以下を含む：
本明細書に記載の第一及び第二の作用電極を有するナノ流体電極アッセンブリを提供する；第一作用電極において第一のレドックス活性物質を酸化するために適した酸化電位の第一のセット、及び第二の酸化還元活性物質を酸化するために適した電位の第二のセットを印加し、および第二作用電極で第一の酸化還元物質を還元するために適した電位の第１のセット及び第二の酸化還元活性物質を還元させるのに適した電位の第２のセットを印加する；第一及び第二作用電極を流れる電流を測定する；第一のセットの電位の印加中、第1の閾値を超える電流の流れは、第一酸化還元活性物質の存在を示し、第一の閾値以下の電流の流れは、第一のレドックス活性物質が存在しないことを示している。そして酸化及び還元の第2の電位のセットの印加中、第二の閾値を上回る前記電流の流れは、第二の酸化還元活性物質の存在を示し、第二の閾値以下の電流の流れは、第二の酸化還元活性物質が存在しないことを示している。
【００３９】
いくつかの実施態様では、液体試料中の細胞の1つまたは複数のタイプによって分泌された第一及び第二の酸化還元活性物質を同時に検出する方法であって、第一及び第二の酸化還元活性物質の各々は、異なる酸化還元電位を有し、当該方法は以下を含む：第1の作用電極において第一及び第二の酸化還元活性物質を酸化するために適した電位のセット、および第二作用電極において第一及び第二の酸化還元活性物質を還元させるために適した電位のセットを印加し、；前記第一の電位の印加時に、第一の閾値を上回る電流の流れは、第一の酸化還元活性物質の存在を示し、第一の閾値以下の電流の流れは、第一のレドックス活性物質が存在しないことを示している。第二電位の印加時に第二の閾値を上回る前記電流の流れは、第二の酸化還元活性物質の存在を示し、第二の閾値以下の電流の流れは、第二の酸化還元活性物質が存在しないことを示している。
【００４０】
いくつかの実施態様では、第三のレドックス活性物質は、同時に検出され、作用電極において、第三の活性物質を酸化するために適した電位の第三のセットが印加され、第三の電位のセットの印加時に閾値を上回る電流の流れは、第三のレドックス活性物質の存在を示し、閾値以下の電流の流れは、第三の活性物質が存在しないことを示している。
【００４１】
いくつかの実施態様において、酸化還元活性物質の存在の検出は、酸化還元活性物質を分泌する細胞の存在を示し、レドックス活性物質の非存在下の検出は、酸化還元活性物質を分泌する細胞が存在しないことを示している。
【００４２】
本発明の一態様は、液体試料中の細胞により分泌されるレドックス活性物質を検出する方法であり、当該方法は以下を含む：作用電極を有するナノ流体電極アッセンブリを提供するステップ；液体試料をナノ流体電極アッセンブリと接触させるステップで、液体試料は、入口および出口ポートに流体接続されていて、細胞がマトリックスの近傍の領域に進入し、それによってマトリックスからの薬剤が細胞によって酸化還元活性物質の分泌を刺激し；その電位を安定化するために基準電極を帯電させるステップ;作用電極でレドックス活性物質を酸化するに適した電位、および酸化還元活性物質を還元させるのに適した電位を交互に印加するステップ；作用電極を流れる電流を記録するステップ；酸化還元活性物質の既知濃度と作用電極を流れる電流との間の以前に決定された相関関係を使用して、酸化還元活性物質を検出するステップ。
【００４３】
本発明の一態様は、液体試料中の細胞により分泌されるレドックス活性物質を検出する方法である、当該方法は以下のステップを含む：本明細書に記載の第1の及び第2の作用電極を有するナノ流体電極アッセンブリを提供するステップ；液体試料をマトリックスから放出される薬剤に曝露するステップ；液体試料は、入口および出口ポートに流体接続されていて、当該細胞はマトリックスの近くの領域に進入し、それによってマトリックスからの薬剤が細胞による活性酸化還元の分泌を刺激するステップ；その電位を安定化するために基準電極を帯電させるステップ；第一作用電極に酸化還元活性物質を酸化するために適する電位を印加し、及び第二作用電極に酸化還元活性物質を還元するために適する電位を印加し、レドックス活性物質が第1の作用電極の電位と第２の作用電極の電位の中間の電位値を有し；第一及び第二作用電極を流れる電流を記録するステップ；酸化還元活性物質の既知濃度と作用電極を流れる電流との間の以前に決定された相関関係を使用して、酸化還元活性物質を検出するステップ。
【００４４】
いくつかの実施態様において、液体試料は、体液、例えば、気管支洗浄液、痰、尿、唾液、髄液、または血液である。いくつかの実施態様において、液体試料は、嚢胞性線維症を有する患者から採取したものである。
いくつかの実施態様において、この方法は、ナノ流体チャネル内に配置されたpH電極を用いて液体試料のpHを測定するステップを含み、そして既知のpHの媒体中で酸化還元活性物質の既知量と酸化還元活性物質の既知量との間の予め決定された相関関係を適用するステップを含む。
いくつかの実施態様において、記録するステップにおける電流の流れは、1つまたは複数の方形波電位に応答して測定される。
いくつかの実施態様において、マトリックスの近傍領域は、マイクロ流体チャネル内である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の装置の一態様の概略図で、当該装置は、作用電極、化学薬品を含むマトリックス、およびマトリックスが取付けられる基板を有する。
【図２】本発明の装置の一態様の概略図で、当該装置は、薬剤を含むマトリックスが取付けられる作用電極を有する。
【図３】２つの作用電極を有するナノ流体電極アセンブリを組立てるための製造スキームの概略図である。左のパネルは、側面図を示し、右側のパネルは、（a）絶縁基板上に第一作用電極の堆積を示し、（b）犠牲層の堆積、（c）第二作用電極の堆積、（d）基準電極の堆積、（e）絶縁層の堆積、（f）絶縁層内のアクセスホールの穿孔、（ｇ）犠牲層を除去し、（h）マトリクスの堆積を示す端面図を表す。
【図４】２つの作用電極を有するナノ流体電極アッセンブリの側面図である。
【図５】１つの作用電極を有するナノ流体電極アッセンブリの平面図である。
【図６】２つの作用電極を有するナノ流体電極アッセンブリの平面図である。
【図７】２つの作用電極を有するナノ流体電極アッセンブリの側面図である。
【図８】２つの作用電極を有するナノ流体電極アッセンブリおよびマイクロ流体チャネルを備える本発明の装置の側面図である。
【図９Ａ】緑膿菌細胞の方形波ボルタモグラムは、個々のアミノ酸の存在下で10時間増殖させた。図９Aの細胞は、M63の最小培地で培養された。アミノ酸は、以下の濃度（ミリモーラー）で使用された：プロリン、27.2;ヒスチジン、8;アルギニン、4.8;ロイシン、25.6;チロシン、3.2;そしてバリン、17.6。
【図９Ｂ】緑膿菌細胞の方形波ボルタモグラムは、個々のアミノ酸の存在下で10時間増殖させた。図9 Bの細胞は、トリプチケースソイブロス中で培養された。アミノ酸は、以下の濃度（ミリモーラー）で使用された：プロリン、27.2;ヒスチジン、8;アルギニン、4.8;ロイシン、25.6;チロシン、3.2;そしてバリン、17.6。
【図１０Ａ】図10 A及びBは、様々な時間における、緑膿菌細胞によるピオシアニンの製造に起因する約-0.25 V 対Ag / AgClにおける最大電流を示すグラフである。図10 A中の細胞は、M63最小培地で培養され、図10 Bは、トリプチケースソイブロス中で培養された。アミノ酸は、以下の濃度（mM）で使用した：プロリン、27.2;ヒスチジン、8;アルギニン、4.8;ロイシン、25.6;チロシン、3.2;そしてバリン、17.6。
【図１０Ｂ】図10 A及びBは、様々な時間における、緑膿菌細胞によるピオシアニンの製造に起因する約-0.25 V 対Ag / AgClにおける最大電流を示すグラフである。図10 A中の細胞は、M63最小培地で培養され、図10 Bは、トリプチケースソイブロス中で培養された。アミノ酸は、以下の濃度（mM）で使用した：プロリン、27.2;ヒスチジン、8;アルギニン、4.8;ロイシン、25.6;チロシン、3.2;そしてバリン、17.6。
【図１１Ａ】図11 A及びBは、それぞれ、チロシン及びバリンの種々の濃度の存在下で、8時間トリプチケースソイブロス中で増殖させた緑膿菌細胞の方形波ボルタモグラムである。
【図１１Ｂ】図11 A及びBは、それぞれ、チロシン及びバリンの種々の濃度の存在下で、8時間トリプチケースソイブロス中で増殖させた緑膿菌細胞の方形波ボルタモグラムである。
【図１２Ａ】図12 A及びBは、様々な時間における、緑膿菌細胞によるピオシアニンの製造に起因する約-0.25 V 対Ag / AgClにおける最大電流を示すグラフである。図12 A及びB中の細胞は、チロシン及びバリンの様々な濃度の存在下で補充されたTSB中で培養された。
【図１２Ｂ】図12 A及びBは、様々な時間における、緑膿菌細胞によるピオシアニンの製造に起因する約-0.25 V 対Ag / AgClにおける最大電流を示すグラフである。図12 A及びB中の細胞は、チロシン及びバリンの様々な濃度の存在下で補充されたTSB中で培養された。
【図１３Ａ】図13 A及びBは、トリプチケースソイブロス中で8時間増殖させた緑膿菌細胞の方形波ボルタモグラムである。図13 A中の細胞は、16mMのチロシンの存在、または不存在下で、培養された。 図13 Bは、17.6 mMのバリンの存在下または非存在下で培養された。補足アミノ酸の存在下での細胞は、１mL当たり4、20、40、400百万個の細胞の濃度で使用した。補足アミノ酸の非存在下における細胞は、１mL当たり400万個の細胞の濃度で使用した。補足的なアミノ酸を含むが細胞のない対照試料を用いた。
【図１３Ｂ】図13 A及びBは、トリプチケースソイブロス中で8時間増殖させた緑膿菌細胞の方形波ボルタモグラムである。図13 A中の細胞は、16mMのチロシンの存在、または不存在下で、培養された。 図13 Bは、17.6 mMのバリンの存在下または非存在下で培養された。補足アミノ酸の存在下での細胞は、１mL当たり4、20、40、400百万個の細胞の濃度で使用した。補足アミノ酸の非存在下における細胞は、１mL当たり400万個の細胞の濃度で使用した。補足的なアミノ酸を含むが細胞のない対照試料を用いた。
【図１４Ａ】図14 A及び14Bは、様々な時間における、緑膿菌細胞によるピオシアニンの製造に起因する、約-0.25 V 対Ag / AgClにおける最大電流を示すグラフである。図中14 Aの細胞 は、または16mMのチロシンの存在下、または不存在下で培養した。 図14 Bは、17.6 mMのバリンの存在下または不存在下で培養した。補足アミノ酸の存在下での細胞は、１mL当たり4、20、40、400百万個の細胞の濃度で使用した。補足アミノ酸の不存在下における細胞は、１mL当たり400万個の細胞の濃度で使用した。補足的なアミノ酸を含むが細胞がない対照試料を用いた。
【図１４Ｂ】図14 A及び14Bは、様々な時間における、緑膿菌細胞によるピオシアニンの製造に起因する、約-0.25 V 対Ag / AgClにおける最大電流を示すグラフである。図中14 Aの細胞 は、または16mMのチロシンの存在下、または不存在下で培養した。 図14 Bは、17.6 mMのバリンの存在下または不存在下で培養した。補足アミノ酸の存在下での細胞は、１mL当たり4、20、40、400百万個の細胞の濃度で使用した。補足アミノ酸の不存在下における細胞は、１mL当たり400万個の細胞の濃度で使用した。補足的なアミノ酸を含むが細胞がない対照試料を用いた。
【図１５Ａ】図15は5μMのピオシアニンで補充された様々な体液の方形波ボルタモグラムを示している。試験された体液は、（A）気管支肺胞洗浄、（B）痰、（C）尿、（D）無添加全血、及び（E）ヘパリンナトリウムを有する全血である。ブランクはピオシアニンを補っていなかった体液のサンプルを示している。
【図１５Ｂ】図15は5μMのピオシアニンで補充された様々な体液の方形波ボルタモグラムを示している。試験された体液は、（A）気管支肺胞洗浄、（B）痰、（C）尿、（D）無添加全血、及び（E）ヘパリンナトリウムを有する全血である。ブランクはピオシアニンを補っていなかった体液のサンプルを示している。
【図１５Ｃ】図15は5μMのピオシアニンで補充された様々な体液の方形波ボルタモグラムを示している。試験された体液は、（A）気管支肺胞洗浄、（B）痰、（C）尿、（D）無添加全血、及び（E）ヘパリンナトリウムを有する全血である。ブランクはピオシアニンを補っていなかった体液のサンプルを示している。
【図１５Ｄ】図15は5μMのピオシアニンで補充された様々な体液の方形波ボルタモグラムを示している。試験された体液は、（A）気管支肺胞洗浄、（B）痰、（C）尿、（D）無添加全血、及び（E）ヘパリンナトリウムを有する全血である。ブランクはピオシアニンを補っていなかった体液のサンプルを示している。
【図１５Ｅ】図15は5μMのピオシアニンで補充された様々な体液の方形波ボルタモグラムを示している。試験された体液は、（A）気管支肺胞洗浄、（B）痰、（C）尿、（D）無添加全血、及び（E）ヘパリンナトリウムを有する全血である。ブランクはピオシアニンを補っていなかった体液のサンプルを示している。
【図１６Ａ】図16 AとBは、1日成長後の細菌培養物からの上清の方形波ボルタモグラムを示す。図16 A中の細胞は、TSB中で培養した。図16B中の細胞は、LB培地で培養した。以下の細菌種を試験した：CFPを表現緑膿菌、YFPを表す黄色ブドウ球菌、GFPを表す表皮、YFP、緑膿菌、およびセレウス菌を表す大腸菌である。
【図１６Ｂ】図16 AとBは、1日成長後の細菌培養物からの上清の方形波ボルタモグラムを示す。図16 A中の細胞は、TSB中で培養した。図16B中の細胞は、LB培地で培養した。以下の細菌種を試験した：CFPを表現緑膿菌、YFPを表す黄色ブドウ球菌、GFPを表す表皮、YFP、緑膿菌、およびセレウス菌を表す大腸菌である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明は、装置、および細胞によって分泌される酸化還元活性物質の高感度電気化学的検出のための方法を提供する。いくつかの実施態様において、物質は液体試料のピコリットル容量で検出することができる。装置は、電極および細胞によるレドックス活性物質の分泌を刺激することができる化学薬品を放出することができるマトリックスを使用する。いくつかの実施態様において、装置は、ナノ流体チャネル内に統合された、基準電極と１又は２以上の作用電極を有するナノ流体電極アッセンブリである。本発明はさらに、ナノ流体用電極構造体を組み込んだセンサ装置、当該センサ装置とセンサを組み込んだ医療用装置との組み合わせ、並びに当該装置を作製し、用いるための方法を提供する。
【００４７】
本発明の方法は、マトリックスと結合された電極を作製するための方法、マトリックスを含むナノ流体電極アセンブリを作製するための方法を含む。本発明の方法はまた、レドックス活性物質を検出するために、マトリックスと結合された電極、電極、マトリックス及びナノ流体電極アセンブリを含む電気化学セルを含む装置を使用する方法を含む。適切なボルタメトリープロトコルを利用することによって、酸化還元活性物質が、任意の電極の表面修飾を用いることなく、選択的に錯体溶液中で検出することができる。
【００４８】
装置ナノチャネルの内側に、統合されたパラジウム電極、二つの近接した作用電極（酸化作用電極および還元作用電極）を有する微細加工されたナノ流体電極アッセンブリは、また、本明細書に記載されている。そのような装置は、リアルタイムでピオシアニン濃度中の変化をボルタメトリー的に監視するために使用されている。変化を連続2時間の電流を測定しながら、ファラデー電流（R2 = 0.96）での線形応答が、ピオシアニン濃度の生物医学的に関連する範囲（0〜100μM）にわたって観察された。装置のナノチャネル内部の2つの近接した電極でのピオシアニンの繰り返し酸化および還元からもたらされる電流の測定は、電気化学セルを電気的に分離することなく、1.07μMの検出限界を生み出した。基準電極は、これらのセンサのナノ流体チャネルの内部に統合されているので、それらのセンサは、スペースが限られている、医療、環境設定の広い範囲で、ピオシアニンならびに他のレドックス活性分子を検出するために、基準または他の電極上のバイオフィルムを形成するリスクなしに、潜在的に使用され得る。ナノ流体電極アッセンブリは、例えば、患者サンプルまたは培養培地の如き溶液中で、酸化還元活性物質の濃度を測定するために、外部Ag / AgCl基準電極と一緒に使用することができる。このタイプの分析は、2分未満で完了し、またサブマイクロモル検出限界を有している。
【００４９】
ボルタメトリー検出は、溶液中の電気活性種の濃度を測定する簡単な手段を提供する。これは、電極に目的の分子を酸化または還元する電位を印加することによって行われる。目的の分子は、電極表面と相互作用するので、１または２以上の電子が両者間を転送され、測定可能な電流の流れをもたらす。ヒスタミン、グルタチオンおよびドーパミンを含む多数の化合物が、このアプローチを利用してうまく検出された（Lacherら、2001年、電気泳動  22巻、2526頁〜2536頁；Damら、2007年、Analyst  132、365-370；Pihelら、1995年、Anal. Cem.  67、4514〜4521頁）。しかし、多くの場合、目的の分子は、同じ電位で反応する複数の電気活性種を含有する複合媒体中にあり、こうして電気化学的検出が、例えば液体クロマトグラフィー（LC）またはキャピラリー電気泳動(CE）のような、分離技術と結合されることが求められている。選択性および感度を改善しながら、これらのアプローチは、追加の処理時間および試薬を必要とし、装置の設置面積を増大させる。特定の状況では、これを回避することができる。目的の分子が少なくとも一回、電子を受け入れ、供与することの両方が可能である場合、酸化還元サイクルとして知られている技術は、不安定な分子に対して測定された電流を増幅するために使用され得る。
【００５０】
酸化還元サイクルは、標的分子を酸化するように設定された１個の電極の電位で典型的には、2つの作用電極を使用し、一方、第２の電極は、標的分子が還元電極と相互作用するときに電子を供与し、還元電極と相互作用するときに電子を取り戻してプロセスを繰り返すことができる。この循環プロセスは、単一作用電極と比較して、著しく信号を増加させる。Straverら （2012）は、最近、上部電極と下部電極との間の間隔が、1ミクロンのオーダーであった、マイクロ流体電極アセンブリを作製することにより、この効果を実証した（Straverら、Lab Chip, 12巻、1548〜1553頁）。
【００５１】
制限されたチャネル内で、レドックスを行う電気化学分子の与えられた濃度のための理論的な限定電流は、以下の式によって与えられ:
【数１】
0006487919.tif 000002
ここで、iは限界電流、nは転送された電子の数、Fはファラデー定数、Sは、2つの電極間の重なりの面積、Dが研究された分子の拡散定数、Cは酸化還元種の濃度、およびzは２電極間の距離である（Glouchら、Anal Bioanal Chem, 394巻、447-456頁）。
【００５２】
式1は、所与の分子について、電極で測定された正味の電流は、電極間の重なりの面積を増加させるか、または電極間の間隔を減少させる間に大きくするのいずれかによって増加させることができることを示している。 2つの電極間の垂直方向の間隔を小さく（すなわち、二つの電極が互いの上に配置されている）すると、これらの装置の正味の電流応答を増加させる（Goluchら。2009年、Anal Bioanal Chdem, 394巻、447-456頁）。重なりの面積を増大させることに対する電極間の間隔を減少させる利点は、より小さな装置の設置面積を可能にすることである。
【００５３】
ナノ流体チャネル内の酸化還元サイクルを利用した電気化学的検出システムは、それらの大規模な対応物より増加した感度を有することが示されており、単一分子を検出することが示された（Zevenbergenら,2007年、MNanoLett年、Nano Lett. 11巻、2881〜2886頁）。この方法の使いやすさは、生物学的に関連する分子の検出に役立つ（Goluchら、2009年、Anal Bioanal Chem, 394巻、447〜456頁；Wolfrumら、2008年、Anal Chem, 80巻、972〜977頁；WebsterとGoluch、2012年、Lab Chip 12巻、5195〜5201頁）。しかし、これらの従前の研究はいずれも、統合された基準電極を利用していない。対照的に、本発明は、統合された基準電極を有する微細加工された電気化学的センサを提供する。全体の電極アッセンブリを含むセンサの全体の専有面積は、例えば、約15μm×250μmであり得る。
【００５４】
電位差分析のために使用される電気化学セルは、典型的には作用電極、基準電極、および対電極からなる3つの電極から構成されている。測定は、作用電極の表面で行われ、得られた電位は、基準電極で起こる半反応と比較される。理想的な基準電極は、高電流の交換密度を有する材料から構成され、非分極性であり、そして起こる反応によって破壊されない。対電極は、基準電極を通過する電流が電極を損傷する程大きくはないことを確認するために用いられる。例えば1nA未満の小さな電流が、作用電極で測定された場合、基準電極は、2つの電極の設定を可能にする、対向電極として用いることができる。装置または別個の構成要素の一部であるボルタメトリー回路を用いて測定し得る作用電極を流れる電流は、選択された分析対象の濃度又は量の尺度として使用し得る。
【００５５】
電極アッセンブリの大きさを小さくすることにより、多くの個別に対処可能な電極アセンブリは、単一の検出プラットフォームに包括させることができる。電極アセンブリは、100nm未満に離れて構築することによって、これらの限られた空間内の電極間の短い分子輸送時間の結果として、電気化学素子の感度がいくつ倍かに増加させることができる（Wolfrumら2008年、Anal Chem、80巻、972〜977頁；Zevenbergenら、2007年、Nano Lett、7巻、384〜388頁；Zevenbergenら、2011年、Nano Lett、11巻、2881〜2886頁）。しかし、微細化は、基準電極の安定性、信頼性についてはごく最近に対処された（Goluch、Edger D.、およびWebster, T.、国際公開公報WO2014015333）。
【００５６】
本明細書に記載のナノ流体の電極アッセンブリの例示的な使用は、微生物から放出されるレドックス活性化合物を検出することにより、ヒト病原体のような微生物として検出することである。人工呼吸器関連肺炎は病院で多くの免疫無防備状態の患者を苦しめる、高い死亡率が観察されている。人工呼吸器関連肺炎だけでなく、傷および火傷犠牲者感染に対する重要な貢献者は、日和見病原体緑膿菌（PA）である。緑膿菌によって産生され、分泌された多くの毒素の一つはピオシアニン（pyocyanin）： 
【００５７】
【化１】
0006487919.tif 000003
である。
【００５８】
ピオシアニンは、他の分子を酸化し、還元させる能力を有しており、好中球のアポトーシス（プログラム細胞死）を誘導することが示されており、上皮細胞におけるグルタチオンレベルが減少され、肺繊毛の鼓動を阻害し、その全てが、細菌性感染を起こし、細胞に酸化ストレスを引き起こし、慢性感染症の有病率を増加させ得る。
【００５９】
現在、微生物病原体を同定するための最も一般的な方法は、24時間以上を要する、培養コロニーである。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に基づく試験は、速いが、まだ１時間以上を要し、高価な試薬を必要とする。緑膿菌肺感染症の場合には、患者の痰は130μMまでのピオシアニンの濃度を含むことができ、ミリモーラー範囲の濃度は、緑膿菌の耳の感染症を有する患者から得られた耳の分泌物で報告されている。これらの濃度は、電気化学的検知技術の診断マーカーとして、ピオシアニンを使用することを可能にする。ピオシアニン分子が酸化還元活性であるので、電気化学的に検出することができる。炭素電極を選択的にバルクPA培養におけるピオシアニンを検出するために、シャープら（2010）によって使用された。しかし、電極のサイズが大きいマイクロ流体システムに役立てていなかった（Sharpら、2010年、Bioelectrochem、77巻、114-119頁）。
【００６０】
装置および方法は、微生物病原体を検出するための既存の方法を超えるいくつかの利点を提供する。まず、本明細書に記載のナノ流体電極アッセンブリの実施態様は、試料のわずか数百マイクロリットルを用いてPAのいくつかの株によってピオシアニンの産生を監視するために使用することができる。また、酸化還元活性物質の産生を刺激する薬剤を含むマトリックスの使用は、検出の感度を増加させる。薬剤は、細胞によって酸化還元活性物質の分泌を促進し、より迅速な検出を可能にする。単独の薬剤を提供することは、しかし、酸化還元活性物質および/または微生物のレベルの増加につながり、患者の体液と連続的に接触する医療機器で使用される場合に、有害であるかもしれない。これらの潜在的な副作用は、マトリックス中に薬剤を組み込むことによって軽減され、酸化還元活性物質及び/又は微生物のレベルの系統的変化を引き起こすことなく、電極の近くに高い局所濃度で放出されることを可能にする。このようなナノ電極アセンブリを採用するセンサ装置は、例えば、チューブまたはマスクなどの呼吸器、またはそれらの使い捨て構成要素、などの医療機器に組み込むことができる。センサは、直接的な電気接続によって、または無線送信機のいずれかの電子機器を制御または監視するために接続することができ、リアルタイムで、または選択された時間または時間間隔で、重要な患者監視情報を提供することができる。
【００６１】
本発明は、液体試料中の細胞により分泌されるレドックス活性物質を検出するための装置を含む。図1に示すように、装置は、電極（110）と、化学薬品（130）を含むマトリックス（390）を含む。図1に示す実施態様においては、マトリックスは、基板（140）に取り付けられ、電極は、電気リード線（150）に取り付けられる。電極、マトリックス、および基板は、ハウジング（160）内に収容されている。装置は、液体試料を含むことができ、流体室（図示せず）を含むことができる。代替する実施態様においては、図2に示すように、マトリックスは、電極に取り付けられている。
【００６２】
電極は、ボルタメトリーのために使用される電気化学セルにおける作用電極の一部とすることができる。例えば、電極は、一定の電位を維持し、作用電極での酸化還元事象に対抗するために電流を流す、第二の電極を含む、2電極系における作用電極とすることができる。あるいは、電極は、定電位と電流通過対電極を維持する基準電極を含む、３電極系における作用電極として使用することができる。別の実施態様においては、電極は、第2の作用電極と基準電極とを含む、3電極システム内における1つの作用電極として使用することができる。
【００６３】
レドックス活性物質は、還元および酸化状態の間にサイクルすることができる分子である。レドックス活性物質は、真菌や細菌によって分泌されるシデロフォア、例えば、ハイダーとコングによって記載されたシデロフォアであり得る（R. C. Hide とX. Kong、2010年、Nat. Prod. Rep. 27巻、637〜657頁）。シデロフォアは、フェリクロム、デスフェリオキサミンB、デフェロキサミン、デスフェリオキサミンE、フサリニン C、オルニバクチン、ロードトルリック酸、エンタロバキチン、バシリバクチン、ビブリオバクチン、アゾトバクチン、ピオヴァジン、ヤーシニアバクチン、またはピオシアニンであり得る。
【００６４】
マトリックスは、多孔性ポリマー組成物で、それを通して水溶液を流すことができ、そこから化学薬品を放出することができる。マトリックスは、ポリマー、生体適合性ポリマー、ヒドロゲル、または親水性ポリマーを含むことができる。例えば、マトリックスは、ゼラチン、キトサン、アルギン酸塩、フィブリン、コラーゲン、エラスチン、寒天、アガロース、ヒアルロン酸、デキストラン、セルロース、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（N-ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシエチルを挙げることができますメタクリレート）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテル、ポリアクリレート）、ポリメタクリレート、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）またはポリ（乳酸）であり得る。マトリックスは、１または２以上の化学薬品を含有してもよい。
【００６５】
薬剤は、酸化還元活性物質を放出するために細胞を刺激する有機分子または分子複合体である。化学薬品は、レドックス活性物質を分泌する菌類または細菌を刺激する有機分子または分子複合体、例えば、シデロフォアをであり得る。化学薬品は、アミノ酸、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンであり得る。
【００６６】
本発明はまた、作用電極、基準電極、および化学薬品を含むマトリックスを含む電気化学セルを包含する。基準電極はパラジウムを含有してもよく、例えば、PdHである。電気化学セルはまた、対電極を含んでもいてもよい。対電極は、不活性材料で作ることができ、例えば、白金（Pt）または水銀（Hg）である。電気化学セルは、液体試料を含有することができる流体区画を含むことができる。
【００６７】
本発明は、酸化還元反応を促進することができる電気化学セルを含む。図3に示すように、酸化還元活性物質（400）は、酸化還元活性物質を酸化するのに十分な電位を印加する第一の電極（510）に接触するようにする。酸化還元活性物質は、次いで、酸化還元活性物質を還元させるのに十分な電位を供給する第2の電極（520）に接触させる。これらのステップが繰り返されるので、酸化還元活性物質は、酸化および還元状態の間の行き来を繰り返す。第1及び第2の電極は、それぞれ、酸化および還元電位を与えることができ、または役割を逆にしてもよい。
【００６８】
第1の電極は、2電極システムにおいて作用電極であり、第2の電極は、定電位を維持する電極であり、電流を流す。本実施態様において、作用電極によって印加される電位は、酸化および還元電位の間を交互に行き来することができる。別の実施態様において、第1の電極は作用電極であり、第2の電極は、基準電極を含む三電極系における対電極である。別の実施態様において、第一の電極は、第1作用電極であり、第二の電極は、基準照電極を含む三電極系の第2の作用電極である。
【００６９】
本発明は、また、液体サンプル中の細胞によって分泌されるレドックス活性物質を検出するための装置を含む。 図4は、液体サンプル中の細胞によって分泌されるレドックス活性物質を検出するための装置の実施態様と、その使用を示している。セル（1790）を含む液体試料がマイクロ流体チャネル（1770）を通って流れるので、細胞は、マトリックス（390）の近傍の領域に入って来る。細胞がマトリックスと直接接触し得る、またはそれは、細胞がマトリックスから拡散する薬剤（図示せず）の高い局所濃度にさらされる、マトリックスに十分に近くの、例えば、１０μmを通過することができる。化学薬品への曝露は、細胞がレドックス活性物質（400）を分泌するようにし、それは、第一（510）及び第二電極（520）における還元- 酸化サイクルを受ける。電極における酸化還元活性物質の濃度の増加は、電流の変化として検出される。
【００７０】
液体試料は、マトリックスと直接接触させることができる。或いは、液体試料は、マトリックスに接触する前に処理することができる。たとえば、液体試料は、化学的に（例えば、希釈、化学反応によって）変化されてもよく、物理的に（例えば、遠心分離、放射線などによって）、生物学的に（例えば、ウイルス、微生物、抗体を用いた治療などによって）、生化学的に（例えば、酵素で処理することによって）、または任意の他の手段によって変化させることが出来る。
液体試料は、酸化還元活性物質を分泌する細胞を含む任意の試料であってもよい。たとえば、液体試料は、細胞に感染した可能性がある、被験者からの体液であってもよい。たとえば、液体試料は、気管支洗浄液、痰、尿、唾液、髄液、または血液であってもよい。被験者は、嚢胞性線維症の患者であってもよい。
【００７１】
細胞は、酸化還元活性物質を分泌する任意の細胞であり得る。例えば、細胞は、例えばシデロフォアを分泌する細菌または真菌であり得、HiderとKongによって報告された１つである（R. C.HiderおよびX. Kong、2010年、Nat. Prod. Rep. 27巻、637から657頁）。細胞は、次のいずれかから選択される細菌または真菌であり得る：ウスチラゴ・スファロジーナ、ストレプト・ピロサス、ストレプトミセス・コエリカラー、フザリウム・ロゼウム、バークホルデリア・セパシア、ロドトルラ・ピリマネ、大腸菌、枯草菌、炭疽菌、コレラ菌、アゾトバクター・ビネランジー：緑膿菌、およびペスト菌。
【００７２】
装置は、マトリックスの近傍の領域に接触している、細胞の接着を促進するコーティングを含み得る。一実施態様において、図4に示すように、他の構成も可能ではあるが、コーティング（1760）は、マイクロ流体チャネル内にある。細胞を捕捉またはチャネルを介してその進捗を遅らせることにより、コーティングは、化学薬品への細胞の曝露を増加させ、その結果、酸化還元活性物質の分泌増をもたらす。従って、コーティングは、装置の感度を向上させる。コーティングは、細胞の接着を促進する任意の材料であり得る。例えば、コーティングは、正帯電ポリマー、例えば、ポリ-L-リジンであり得る。
【００７３】
また、本発明は、液体サンプル中の細胞によって分泌されるレドックス活性物質を検出するためのナノ流体電極アッセンブリを含む。ナノ流体電極アッセンブリは、基板内のナノ流体チャネルを有している。ナノ流体チャネルの一方の端部に、液体試料がナノ流体チャネルに入ることを可能にする、少なくとも1つの入口ポートがある。ナノ流体チャネルのもう一方の端部に、液体試料がナノ流体チャネルを出ることを可能にする、少なくとも1つの出口ポートがある。第1および第2の電極は、ナノ流体チャネル内に含まれる。電極はナノ流体チャネルの壁、または壁の一部を構成し得る。チャネルの両端の電極間の距離は、約20ｎｍ〜約100nm、または約20nm〜約40nm、または約40nm〜約60nm、または約60nm〜約80nm、または約80nm〜約100nm、または約100nm〜約150nmの範囲内になるように、第1及び第2の電極は、ナノ流体チャネルの反対側の壁に配置される。大きな表面積を有すると、信号と装置の感度を向上させるが、作用電極の表面積は、装置の設計の優先順位に応じて選択することができる。例えば、別の実施態様において、各作用電極の表面積は約100、200、300、400、500、800 1000、2000、3000、5000、10000、50000、100000、200000、または500000 nm2とすることができる；または1、2、5、又は10μm2、またはそれ以上にし得る。電極が配置されているナノ流体チャネルの容量は、約10 ナノリットル（nL）未満、約50nL未満、約1 nL未満、約100ピコリットル（pL）未満、約50pL未満、約10pL未満、約5pL未満、又は約1pL未満であり得る。ナノ流体電極アッセンブリは、化学薬品を放出することができるマトリックスを含む。図5は、ナノ流体チャネル内の第一（510）及び第二（520）電極を有するナノ流体電極アセンブリの実施態様を示している。マトリックス（390）は、酸化還元活性物質（400）に対して透過性であり、酸化還元活性物質がナノ流体チャネル内に拡散し、電極に接触するようにすることを可能にする。
【００７４】
マトリクスは、セルがマトリクスの近傍の地域に進入ることを可能にする、ナノスケール電極アッセンブリ上のどこにでも配置することができる。例えば、マトリックスは、以下のサイトの1つまたは複数に結合することができる：ナノ流体チャネル;入口ポート、出口ポート；基準電極の面、またはその一部の面、１または複数の作用電極の面、またはその一部の面、および基板面で、基板面は、1または複数の入口ポートまたは出口ポート、またはそのような表面の一部分に隣接している。
【００７５】
図６に示すように、一実施態様において、ナノ流体電極アセンブリは、作用電極および基準電極を有している。作用電極（310）と基準電極（350）は、各ナノ流体チャネル（平面図からは見えず）に接触する。液体試料がナノ流体電極アセンブリに塗布されたときに、ナノ流体チャネルへのアクセス孔（370）は、入口および出口ポートとして作用する。他の構成も可能であるが、マトリックス（390）内に配置され、入口および出口ポートに隣接し得る。いくつかの実施態様において、作用電極と基準電極は、ナノ流体チャネルの対向壁の部分を形成し、対向壁は、チャネルの両端から約20-100nmの距離だけ離れている。本発明のいくつかの実施態様において、基準電極と作用電極の各々は、ナノ流体チャネルの壁の少なくとも一部を形成し、及びナノ流体チャネルの絶縁部分によって分離され、絶縁部分は、ナノ流体チャネルの長さに沿って、約30nm〜約50μmに伸びる。基準電極と作用電極はまた、ナノ流体チャネルの反対側の壁にすることができるが、電極が互いに接触しないようにすべきである。いくつかの実施態様において、１または複数の作用電極は、基準電極よりも大きな表面積を有する。作用電極と基準電極は、それぞれ、少なくとも100 nm2、または100,000未満、50,000未満、20,000未満、10,000未満、または 500nm2未満の表面積を有することができる。一実施態様において、このナノ流体電極アッセンブリは、二つの電極の電気化学セルとして動作することができる。他の実施態様において、ナノ流体電極アセンブリは、対向電極を含み、その結果、システムは三電極電気化学セルとして動作する。対電極は、ナノ流体チャネルに含まれてもよく、またはそれは外部にあってもよい。
【００７６】
図７に示すように、別の実施態様において、ナノ流体電極アセンブリは、2つの作用電極および基準電極を有している。前記第１の作用電極（310）、第２の作用電極（340）、及び基準電極（350）は、各々ナノ流体チャネル（380）に接触している。他の構成も可能であるが、マトリックス（390）は、入口および出口ポートとして機能するアクセス孔（370）の近傍に配置される。第１及び第２の作用電極は、ナノ流体チャネルの反対側の対向壁を形成し、当該対向壁は、チャネルを横断して約20〜100nm の距離によって分離されている。他の関連する実施態様において、基準電極と作用電極は各々少なくともナノ流体チャネルの壁の一部を形成し、基準電極はナノ流体チャネルの絶縁部分によって、両方の作用電極から分離され、絶縁部は、ナノ流体チャネルの長さに沿って約30nmから約50μmまで伸びる。いくつかの実施態様において、作用電極はそれぞれ、少なくとも1μm2、または100未満、50未満、20未満、10未満、または5μm2未満の表面積を有する。
【００７７】
ナノ流体電極アセンブリは、またはマトリックスに接触するか、マトリクスの近傍の領域に細胞の接着を促進するコーティングを含み得る。一実施態様において、他の構成も可能であるが、図4に示すように、コーティング（1760）は、絶縁層（360）に施されている。
ナノ流体電極アセンブリは、データを分析し、作用電極を流れる電流に基づいて計算を実行することができる、プロセッサと電磁通信し得る。プロセッサは、作用電極からのナノ流体電極アセンブリに配線されて、液体試料から電流の測定値および液体試料に関する情報を受信する。代替的に、プロセッサは、無線機構を介して、作用電極から電流の測定値、および液体サンプルについての他の情報を受信するように接続され得る。
【００７８】
ナノ流体電極アッセンブリは、作用電極を流れる電流を表示することが可能で、電磁通信することができる。ディスプレイは、作用電極からの電流の測定値を受信するために、ナノ流体電極アセンブリに配線され得る。代替的に、ディスプレイは、無線機構を介して作用電極からの電流測定値を受信することができる。
【００７９】
ナノ流体電極アセンブリは、液体試料が通過可能なマイクロ流体チャネルに結合されていてもよい。図4に示すように、マイクロ流体チャネル（1770）は、流動的にナノ流体チャネルの入口および出口ポートに接続されている。液体試料がマイクロ流体チャネルを通って流れるので、試料の内容物は、入口ポートを介してナノ流体チャネルに進入し、出口ポートを介してナノ流体チャネルを退去することができる。したがって、液体試料中の任意のレドックス活性物質は、ナノ流体チャネルに入り、作用電極（S）と基準電極と接触することができる。マイクロ流体チャネルは、１つまたは２以上の入口ポート（1800）と1つまたは２以上の出口ポート（1810）を有していて、それらが、液体試料がマイクロ流体チャネルをそれぞれ出入りすることを可能にする。マイクロ流体及びナノ流体チャネルの寸法は、酸化還元活性物質を分泌する細胞が、マイクロ流体チャネルを通過することができるが、ナノ流体チャネルを通過することができないような大きさにし得る。例えば、ナノ流体チャネルは、高さおよび/または幅が、２００ｎｍ未満、または５００ｎｍ未満、または７００未満、または８００ｎｍ未満、または９００ｎｍ未満、または１０００ｎｍ未満とすることができる。
【００８０】
本発明は、液体試料中の1つまたは複数のタイプの細胞によって分泌される、酸化還元活性物質の複数の同時検出のための装置を含む。一実施態様において、このような装置は、液体試料を処理するための複数のナノ流体電極アセンブリを含む。一実施態様においては、そのような装置は、マイクロ流体チャネルと流体接続し、複数のナノ流体電極アッセンブリを含む。
本発明は、液体試料中の細胞により分泌されるレドックス活性物質を検出するための装置を作製する方法を含む。一実施態様においては、本方法は、表面上の電極化学薬品を放出することができるマトリックスを堆積させるステップを含む。別の実施態様において、本方法は、基板上にマトリックスを堆積させることを含む。一実施態様においては、本方法は、第1の作用電極又は基材にマトリックスを付着させた後、薬剤とマトリックスを浸透させることを含む。別の実施態様において、マトリックスは、まず、化学薬品が浸透し、次いで、作用電極または基板に取り付けられる。
【００８１】
本発明は、液体試料中の細胞により分泌されるレドックス活性物質を検出するためのナノ流体電極アッセンブリを製造する方法を含む。図8に示すように、第一のステップは、基板（320）上に第1の作用電極層（310）を堆積することを伴う。
作用電極層は、金、導電性ダイヤモンド、プラチナ、またはガラス状炭素であってもよい。基板層は、SiO 2の表面層を有するシリコンウエハであってもよい。作用電極層と後続の電極層は、電子ビーム蒸着、物理蒸着、又は化学蒸着によって堆積させることができる。
次のステップでは、犠牲層（330）は、第一の電極層上に堆積される。
犠牲層は、クロム（Cr）からなることができる。
次のステップにおいて、第2の作用電極層（340）が犠牲層上に堆積されてもよい。方法の一実施態様においては、このステップが実行される。方法の別の実施態様において、このステップは実行されない。第２の作用電極層は、存在する場合には、犠牲層の全長未満に及んでもよい。
【００８２】
次のステップでは、基準電極層（350）が犠牲層上に堆積される。基準電極層は、犠牲層の全長未満に及んでもよい。第2作用電極層が存在する場合、基準電極層は、第2の作用電極層と本質的に同一平面で隣接していない。基準電極及び第２の作用電極層との間のギャップは、約30ｎｍ〜約50μmとすることができる。
次のステップでは、絶縁層（360）が存在する場合、第一の電極層、犠牲層、第2の作用電極層、並びに基準電極層を、基板の露出表面上に堆積させる。絶縁層は、基板層に使用されるのと同じ材料で作ることができ、またはそれらは異なる材料で作ることができる。絶縁層はSiO 2から形成することができる。
次のステップでは、アクセス孔（370）は、犠牲層の下の絶縁層に穿設されている。ナノ流体電極アセンブリの作製中に、アクセス孔は、犠牲層への流体のアクセスを可能にする。完成したナノ流体電極アッセンブリでは、アクセス孔はナノ流体チャネルを通る流体の流れのための入口および出口ポートとして機能する。
【００８３】
次のステップにおいて、犠牲層は、ナノ流体チャネル（380）を作製するために除去される。これは、例えば、アクセス孔を通してエッチング剤を適用することによって、達成することができる。次のステップでは、マトリックス（390）は、ナノ流体電極アセンブリに堆積される。示された方法の実施態様においては、マトリックスは、絶縁基板のアクセス孔と隣接した領域に付加される。しかし、マトリックスは、次のサイトの一つ以上に添加することができる：ナノ流体チャネル、入口ポート、出口ポート、基準電極、またはその一部の面、１または２以上の作用電極の表面、またはその一部、基板の表面、その表面は、入口ポートまたは出口ポート、またはそのような表面の一部分に隣接している。マトリックスは、それが形成し、ナノ流体電極アッセンブリの所望の領域に付着することを可能にする如何なる手段によっても添加することができる。例えば、水溶液、非水溶液、またはゲルとして添加することができる。これは、pHの変化、温度変化、化学反応、電磁放射、又は任意の他の手段によって形成されるポリマーであることができる。
【００８４】
本発明は、液体試料中の細胞により分泌されるレドックス活性物質を検出するために、上述の装置または電気化学セルの使用方法を含む。最初のステップは、例えば、本発明の装置を提供することを伴い、電極および薬剤を含むマトリックス、電極および薬剤を含むマトリックスを含む電気化学薬品、または1つまたは2つの作用電極を有するナノ流体電極アッセンブリを提供する。装置は、基準電極を含んでいない場合は、外部基準電極を設けてもよい。
【００８５】
次のステップでは、液体試料がマトリックスと接触させ、液体試料中の細胞が、マトリックス中の薬剤にさらされるのを引き起こす。液体試料は、マトリックスと直接接触させることができる。代替的に、液体試料は、マトリックスに接触する前に処理することができる。たとえば、液体試料は、化学的（例えば、希釈、化学反応によって）に変性されてもよく、物理的に（例えば、遠心分離、放射線などによって）、生物学的に（例えば、ウイルス、微生物、抗体を用いた治療などによって）、生化学的に（例えば、酵素で処理することによって）、または任意の他の手段によって変性されてもよい。液体試料中の細胞の曝露は、細胞が、電極に拡散する酸化還元活性物質を分泌するのを引き起こす。
次のステップにおいて、基準電極は、その電位を安定化させるために帯電される。いくつかの実施態様においては、電位は基準電極で起こる化学半反応によって測定される。
【００８６】
次のステップでは、酸化及び酸化還元活性物質を還元することができるボルタメトリー電位が交互に作用電極を介して印加される。電位のボルタメトリー変化の任意のタイプ、例えば、リニアスイープボルタメトリー、階段ボルタメトリー、矩形波ボルタメトリー、サイクリックボルタメトリー等を用いることができる。電位は、例えば電位以上のセット、例えば、電圧範囲内の電位、または数学的関係によって定義される、交流電位内の電位を印加することができる。セットには、単一の電位または複数の電位を含んでいてもよい。
【００８７】
次のステップでは、作用電極を流れる電流が測定される。この工程は、液体試料中のレドックス活性物質の存在および/または濃度を測定することができる。レドックス活性物質の既知の濃度を用いて、酸化還元活性物質のボルタメトリー電流と濃度との関係が、温度、pH、他の電解質の存在、などの定義された条件の下で確立することができる。作用電極で測定された電流のこの関係を適用することにより、液体試料中のレドックス活性物質の存在および/または濃度を測定し得る。
【００８８】
いくつかの実施態様において、本方法は、複数の酸化還元活性物質の存在および/または濃度を決定することを含む。異なる酸化還元電位を有する酸化還元活性物質は、異なる印加電位での電流のピークを生成し、したがって、単一のボルタモグラムに区別することができる。上記のように、ボルタメトリー電流と濃度との関係は、独立して定義された条件の下でそれぞれのレドックス活性物質について測定することができる。作用電極で測定された電流にこれらの関係を適用することにより、複数のレドックス物質の存在および／または濃度は、液体試料中の活性物質を決定することができる。これは、各々酸化還元活性剤のための電位の別のセットを適用することにより達成することができる。あるいは、それぞれのレドックス活性薬剤のための電流の別個のピークを誘発電位の一組を適用することにより達成することができる。作用電極を有する装置を使用する方法の一実施態様においては、酸化及び還元電位を、作用電極から交互に印加することができる。 2つの作用電極を有する装置を使用する方法の一実施態様においては、酸化及び還元位を別個の作用電極から印加することができる。
【００８９】
いくつかの実施態様において、本方法は、液体試料中のレドックス活性物質を分泌する細胞の存在および/または濃度を決定するステップを含む。液体試料中の細胞の既知の数および/または濃度を使用して定義された条件下で作製されたレドックス活性物質の量を測定することにより、細胞数およびレドックス活性物質の量との関係を決定することができる。この関係は、上記のように決定されたボルタメトリー電流とレドックス活性物質の量との関係と一緒になって、ボルタメトリー電流とセル数との関係を決定することができる。
【００９０】
本発明は、液体試料中の細胞により分泌されるレドックス活性物質を検出するために、ナノ流体電極アセンブリを使用する方法を含む。第１のステップにおいて、液体試料は、ナノ流体電極アセンブリと接触させ、その結果、サンプルは、図４に示すように、入口および出口ポートとの流体接続を形成する。前記液体試料は、ナノ流体電極アセンブリと直接接触させることができる。代替的に、液体試料は、マトリックスに接触する前に処理することができる。たとえば、液体試料は、化学的に（例えば、希釈、化学反応によって）、物理的に（例えば、遠心分離によって、放射線など）、生物学的に（例えば、ウイルス、微生物、抗体で処理することによって）、生態学的に（例えば、酵素で処理することによって）、または任意の他の手段による変化させることができる。液体試料に接触するナノ流体電極アッセンブリとしては、液体試料中の細胞（1790）は、マトリクス（390）への近傍の領域に進入する。細胞は、マトリックスと直接接触し得る、細胞がマトリックスに十分に近く、例えば、10ミクロンを通過することができ、細胞は、マトリックスから拡散する化学薬品（図示せず）の高い局所濃度にさらされることになる。化学薬品への曝露は、細胞が酸化還元活性物質（400）を分泌させるのを引き起こす。
【００９１】
次のステップにおいて、基準電極（図示せず）は、以下に記載のように、その電位を安定化するように帯電させる。
次のステップでは、酸化還元活性物質を酸化、還元可能なボルタメトリー電位を１または２以上の作用電極に印加させる。作用電極とナノ流体電極アセンブリを含む方法の実施態様については、酸化還元活性物質を酸化、還元可能なボルタメトリー電位が作用電極を介して交互に印加される。 2つの作用電極とナノ流体電極アセンブリを含む方法の実施態様については、酸化還元活性物質を酸化できるボルタメトリー電位は、1つの作用電極を介して印加され、酸化還元活性物質を還元することができるボルタメトリー電位電極（510）及び第二電極（520）は、2つの作用電極を有するナノ流体電極アセンブリにおける第１及び第２の作用電極として働くことができる。第1の作用電極は、酸化電位を提供し得、第2の作用電極は、その逆の還元電位を提供する、またはすることができる。ボルタメトリー電位変化の任意の種類は、例えば、リニアスイープボルタメトリー、階段ボルタメトリー、方形波ボルタメトリー、サイクリックボルタメトリー等を用いることができる。
【００９２】
次のステップでは、作用電極を流れる電流が測定される。上述したように、このステップは、液体試料中の存在および／または１または２以上のレドックス活性物質の濃度を決定することができる。
【００９３】
いくつかの実施態様において、本方法は、液体試料中の細胞の存在および/または数を決定することを含む。液体試料中の細胞の既知の数および／または濃度を使用して定義された条件下で製造されたレドックス活性物質の量を測定することにより、細胞数およびレドックス活性物質の量との関係を決定することができる。上記のように決定されたボルタメトリー電流とレドックス活性物質の量との関係と一緒になって、この関係は、ボルタメトリー電流とセル数との関係を決定することができる。
【００９４】
いくつかの実施態様において、本方法は、ナノ流体チャネル内のpH電極を用いて、液体試料のpHを測定することによって、酸化還元活性物質の濃度を決定することを含む。レドックス活性物質の濃度と電流とのボルタメトリーの関係に対するpHの影響は、独立して特徴付けることができる。制御された条件下で、この依存性を確立した後、ボルタメトリー電流およびpHのデュアル入力は、より正確かつ高い感度で酸化還元活性物質の存在および/または濃度を決定するために使用することができる。
【実施例１】
【００９５】
材料
すべての細菌試験は、野生型の緑膿菌株PA14を使用して完了した。細胞培養物は、日常的に37℃でトリプチケースソイブロス（TSB）（BD Biosciences社 211768）中で増殖させ、後に使用しないときは、4℃で寒天プレートTSB上に保存した。全てのアミノ酸は、Sigma-Aldrich社（セントルイス、ミズーリ州）から購入し、培地TSBまたはM63最小塩（フィッシャー触媒 50-751-6740）[（NH 4）2 SO 4（15mM）、KH 2 PO 4（100 mM）]のいずれかを使用して溶液中に溶解し、MgSO 4（1mM）およびグリセロール（0.027mMを添加した。電気化学測定は、炭素作用電極と対電極を備えた市販のZensor TE100（EDAQ ET077）にスクリーン印刷された電極を用いて実施した。 Zensor TE100電極は銀ペーストのレファレンスを含んでいるが、別個の1 モーラー KClをAg / AgClの基準電極（CHI 111を採用し、基準電極である場合に発生し得る、数時間持続する測定中に基準電位のドリフトの可能性を最小限にするために使用された試料液と直接接触させた。全ての電気化学的測定は、ポテンシオスタット（CHI842C、CH Instruments社）を用いて記録した。
【実施例２】
【００９６】
培養細胞および電流測定
個々のアミノ酸は、TSBまたはM63培地の10 mLのいずれかを特定の濃度で溶解した。各溶液は、緑膿菌の特定の濃度で接種し、37℃で培養した。各溶液の100mLを指定された時点で取り出し、電気化学的試験用Zensor電極上に載せた。矩形波ボルタメトリースキャンは0.050 Vの振幅電圧と15ヘルツの周波数で-0.4から-0.1 Vの範囲の電位で行われた。スキャンは、各試験条件について3つの複製を用いて、各サンプルについて3回行った。データをOriginPro9.1（OriginLab社（株））を用いて分析した。ベースラインは、8個のベースポイントでスプライン補間を使用して、各データセットについて作成された。得られたベースラインを差し引いたデータセットは、ピオシアニンから観察された最大電流を測定するために使用した。
【実施例３】
【００９７】
緑膿菌によるピオシアニン製造に対する特定のアミノ酸の効果
緑膿菌の液体培養物を、M63最小培地またはTSBのいずれかの中で、実施例2に記載の方法を用いてピオシアニンの細菌産生に対するアミノ酸添加の効果を観察するために、増殖させた。株PA14培養の10μLを6個の異なるアミノ酸のうちの1種（１mLにつき4百万個の細胞の最終濃度）をそれぞれ含有する10 mLの液体培養にロードした。個々のアミノ酸がピオシアニン産生に及ぼす影響を最大にするために、選択されたアミノ酸の濃度は、その低溶解度に起因して４倍増加にしかならないチロシンを除き、嚢胞性線維症に感染した患者に見られる濃度より16倍高くした（S. P. Bernier, D. G. Ha, W. Khan, J. H. Merritt and G. A. O'Toole, Res. Microbiol., 2011年, 162巻, 680-688頁；および G. C. Palmer, K. L. Palmer, P. A. 頁）。電気化学的スキャンは、24時間の期間のコースにわたっておよそ2時間毎に取った。
【００９８】
図 9AとBは、スキャンはM63最小培地およびトリプチケース大豆ブロス中でそれぞれ10時間増殖の後に行ったことを示す。アミノ酸を加えていない対照サンプルも試験した。ピオシアニンは、Ag/ AgClの基準に対して電気信号約-0.25 Vを生成することが予想され、この結果、TSB培地中で増殖させた全てのサンプルについて観察された。しかし、統計的に有意な差は、10時間後のM63最小培地中のサンプルのいずれにおいても観察されなかった。
【００９９】
TSB中で増殖したサンプルは、ピオシアニン信号をM63培地中で増殖させたものよりも高速で生成することは、すべてのテストにおいて、一貫していた。細胞が成長し、両方の培地に通常分かれるが、TSBは、M63最小培地では見られない追加の一連の栄養素が含まれている。しかし、より重要なことは、チロシンおよびバリンを含むサンプルによって実証されるように、選択アミノ酸はピオシアニン産生に当たってアップレギュレートの効果を持っていたということである。結果は、最小培地にチロシンを添加するのはピオシアニンによって生成される電流の検出により、試料中の緑膿菌の存在を検出するために必要な時間の量を低下させることを示している。スキャンは1日かけて取り、最大電流は、図10 AとBに報告されている。 アミノ酸は、両方の培地で最大のアップレギュレートの効果を持つチロシンと一緒に、ピオシアニンの緑膿菌の生産に変化する効果を有していた。これらの結果は、個々のアミノ酸の添加によって誘導される増加したバイオフィルムの形成と一緒に、ピオシアニン産生のアップレギュレートとリンクすることを示した（S. P. Bernier, D. G. Ha, W. Khan, J. H. Merritt および G. A. O'Toole, Res. Microbiol., 2011年, 162巻, 680-688頁）。アミノ酸の添加なしに、M63培地で観察されるピオシアニン信号に対してほぼ24時間を要した。一方で、TSBを用いた対照実験では、信号は10時間以内観察された。 M63最小培地では、チロシンおよびヒスチジンの添加は、有意に短い時間でピオシアニン信号の出現をもたらした。 TSBへのアミノ酸の添加は、しかしながら、ピオシアニン信号を観察するために必要な時間の量をあまり変化させなかった。全ての場合において、信号は、実験の開始後6~8時間で現れた。しかし、それ以降に産生されたピオシアニンの量は大幅に変化した。正の電位（<0.10 V）に向かう小さなシフトは、周囲の培地の塩およびpH濃度における若干の違いに帰することができ、M63培地中で成長したサンプルについて観察された。図に示すエラーバーは、細菌集団の異質性故に、時間とともに増加する。時間の経過とともに細胞の数が増えると、すべて分割しないか、正確に同じ速度でピオシアニン産生しない。これは、各実験のために、時間をかけてピオシアニン濃度の高い変動性をもたらす。しかし、検出機構として、主な関心事は、ピオシアニンの産生を誘導し、実際の変動は二次的であることである。
【実施例４】
【０１００】
緑膿菌によるピオシアニン産生に対するチロシン、およびバリンの濃度の影響
次に、最適なチロシンおよびバリンの濃度、およびピオシアニン産生を最大にするための増殖培地が決定された。チロシンおよびバリンは、それらが試験された6個のアミノ酸の最大のアップレギュレート効果を実証したので、TSB培地に適用するために、標的アミノ酸として選択された。 TSBの増殖培地中で増殖した細胞は、最速のピオシアニン応答を与えたとして、TSBは、次の段階の研究のための成長培地として選ばれた。チロシンおよびバリンは、 TSB中のアミノ酸の溶解限度に達する80倍の増加に対して、典型的な嚢胞性線維症の感染レベル（チロシン：0.2mMル、バリン：1.1 mM）を定量したものの範囲の濃度で調製された。各サンプルにロードされた緑膿菌の初期濃度は、1mLあたりおよそ400万個細胞を一定で維持し、電気化学的なスキャンは10時間に渡り2時間ごとに行った。図 11 AとBは、スキャンをアミノ酸無添加のコントロールに加えて、8時間増殖後に行った。ここでも、Ag / AgCl基準に対して-0.25 Vのピオシアニンピークの観察は、すべてのスキャン間で一貫性を示した。興味深いことはバリンを用いた実験のための最大のピオシアニン濃度は17.6 mMの濃度を記録し、バリン濃度が88 mMにさらに上昇したときに、ピオシアニン産生が減少したということである。バリンは、このような高濃度でピオシアニン産生の抑制効果を有することが可能である。そのような阻害は、他の分子にも観察されている（D. J. Musk, D. A. Banko およびP. J. Hergenrother, Chem. Biol., 2005年, 12巻, 789-796頁）が、緑膿菌は、通常、緑膿菌感染症に見られるものよりも100倍を超えるバリン濃度で以前に研究はされていなかった。
【０１０１】
図12 AとBは、試験したチロシンおよびバリンの濃度のそれぞれについての経時的にピオシアニンの増加を示している。図12 Aに示したデータから、 統計学的に有意な増加は、6時間〜8時間の間での電流出力で観察され、電気化学的に処理された試料中の緑膿菌感染症を検出するために必要な最小時間を記録した。溶液に添加したチロシンおよびバリンの濃度を変化させることは、ピオシアニン産生をアップレギュレートする細胞のために必要な時間に最小の効果を有するが、この重要な時点後に生成量に大きな影響を与える。 16mMのチロシンおよび17.6 mMのバリンでの細胞によるピオシアニン産生の速度はほぼ同一である。
【実施例５】
【０１０２】
ピオシアニン産生に対する緑膿菌濃度の影響
テストの次のセットは、様々な初期緑膿菌の細胞濃度が、アミノ酸の存在下でピオシアニンの産生に如何に影響を与えるかについて検討した。 TSB培地は、チロシンおよびバリンを添加した増殖培地として使用した。緑膿菌の様々な量が、サンプルに添加された（１mlにつき4、20、40、400百万個の細胞）一方で、チロシン（16mM）およびバリン（17.6 mM）濃度は一定に保たれた。二つの対照実験も含まれた：１つは、追加のアミノ酸を含まない１ｍｌ当たり400万個の細胞の初期緑膿菌濃度と、２つ目は、アミノ酸が添加されたが、細菌なしのものである。電気化学的スキャンは、10時間かけて2時間ごとに行った。図13 AとBは、8時間増殖後に行ったスキャンを示す。生産菌の増加開始濃度と一定の時間にわたって産生されたピオシアニンの量との間に明確な相関関係が認められた。 １mL当たり400万個の細胞を超える初期細胞濃度に対して、16mMのチロシンは、緑膿菌が、17.6 mMのバリンよりもピオシアニンを多く産生させる。緑膿菌感染の増加を検出するのに必要な最小培養時間は、初期細胞濃度の減少と共に増加する（図14 A及びB）。図14 Aに示したデータから、電流出力の統計的に有意な増加は、実験開始後4〜6時間の間、最高の初期細胞濃度（１mlにつき400万個の細胞）について得られる。これらの結果は、ピオシアニン産生に起因する電流変化を検出するのに必要な時間は、試料中に存在する初期細胞の数を定量するために使用することができることを示している。
【０１０３】
サンプルを予備濃縮しない発明者らの検討のための検出の理論的な細胞の限界は、１ミリリットル当たり0.1細胞である。 10mLの試料容量が分析に使用されるので、この場合には、試料中に1つの細胞が存在するであろう。それは、この最小濃度のために、ピオシアニンピークを観察するのに約1日かかる。新鮮な増殖培地をプレートに緑膿菌のコロニーから数個の細胞のみを培養した従前の研究は、ピオシアニンの5 mMの濃度を生成するのに約24時間を要したことを示し（T. A. Webster および E. D. Goluch, Lab Chip, 201年, 12巻, 5195-5201頁）、それは、我々の分析を支持している。
【実施例６】
【０１０４】
体液中の流体におけるピオシアニンの検出
矩形波ボルタメトリーは、ピオシアニンが、様々な体液中で検出することができるかどうかを分析した。 20人の健康な患者からプールされた尿、痰、気管支洗浄、ヘパリンによる全血のヒトのサンプルは、Bioreclamation社から1mLのアリコートで購入された。全血サンプルを除いて、全ての生物学的流体は、-20℃で保存された。試料は、実験前に水浴中で解凍された。全血サンプルは、細胞溶解を回避するために、4℃の冷蔵庫で保存された。 1~100μMの希釈系列が、500μLのヒト生体液サンプルのストックピオシアニン溶液（500μM）の適切な量を添加することにより調製した。
【０１０５】
緑膿菌PA14を37℃で24時間、3mLのTSBの培地中で、それらが定常増殖期に達するまで増殖させた（約5×107細胞/ mL）。細胞は、遠心機でスピンダウンし、生物学的流体中にスパイクされる寸前に、新鮮なTSB培地3mLに再懸濁した。各生体液の500μLを150μLの緑膿菌PA14培地をスパイクし、37℃で培養した。各スパイク生体液の150μLが毎日除去され、Zensor電極上に置かれた。サンプルは、15Hzの周波数及び50 mVの振幅電圧でSWVを使用し、-0.5 〜0ボルトまでスキャンした。それらには、ナトリウム、カリウム、および塩化物イオンのかなりの量を含むので、何らの電解質をサンプルに添加しなかった。各サンプルは、三つの異なるセンサで3回測定し合計9つの測定値を得た。
ピークに達したピオシアニンからピーク電流を与えた電位は、約-0.32 Vから-0.2 Vに変化したが、緑膿菌からのピオシアニン信号は、気管支肺胞洗浄（図15A）、痰（図15B）、尿（図15C）、全血（図15D）、およびヘパリンナトリウム（図15E）のサンプルを補充した全血中で容易に検出された。
【実施例７】
【０１０６】
緑膿菌検出の特異性
ピオシアニンによる矩形波ボルタメトリー信号は、特に緑膿菌を同定することができる。感染性細菌の他の種が、ピオシアニンに起因するものと同様の電気化学的信号を生成する化合物を分泌する能力について試験した。以下の菌株を分析した：CFPまたはYFP、のいずれかを発現するように形質転換された緑膿菌菌株PA01、GFPまたはYFP、黄色ブドウ球菌株25923（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手した）を発現するように形質転換された大腸菌K12株、表皮株35984（ATCC）、およびセレウス菌株（Yunrong Chais氏、ノースイースタン大学生物学科から入手）。
細胞は、TSBまたは溶原性培養液のいずれかで培養し、上記のように分析した。約-0.25 Vでのピーク電流は、緑膿菌培養物中では明らかで、TSB（図16A）で成長させた他の細菌種のいずれかの培養のものではない。細菌は、溶原性培養液で培養した場合、同様の結果が観察された（図16B）。
【０１０７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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