(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを備え、グルカゴン、ＧＬＰ−１、及びＧＬＰ−２との交差反応性を示さないことを特徴とする抗プログルカゴン抗体。
【請求項２】
配列番号１４に示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを備え、プログルカゴンに特異的に結合し、グルカゴン、ＧＬＰ−１、及びＧＬＰ−２との交差反応性を示さないことを特徴とする抗プログルカゴン抗体。
【請求項３】
配列番号２、４、及び６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域と、配列番号８、１０、及び１２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域とを備え、グルカゴン、ＧＬＰ−１、及びＧＬＰ−２との交差反応性を示さないことを特徴とする抗プログルカゴン抗体。
【請求項４】
配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるプログルカゴンの１１１〜１１５番目のアミノ酸残基内のエピトープに結合することを特徴とする請求項３記載の抗プログルカゴン抗体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の抗プログルカゴン抗体をコードすることを特徴とする抗プログルカゴン抗体遺伝子。
【請求項６】
配列番号１３に示される塩基配列を有する重鎖可変領域遺伝子と、配列番号１５に示される塩基配列を有する軽鎖可変領域遺伝子とを備えたことを特徴とする請求項５に記載の抗プログルカゴン抗体遺伝子。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の抗プログルカゴン抗体を用いることを特徴とするプログルカゴンの検出方法。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれかに記載の抗プログルカゴン抗体を備えたことを特徴とするプログルカゴンの検出用キット。
【請求項９】
請求項８に記載のプログルカゴンの検出用キットを用いた、プログルカゴンを産生する腫瘍の診断のためのデータを収集する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、抗プログルカゴン抗体や、抗プログルカゴン抗体遺伝子や、プログルカゴンの検出方法や、プログルカゴンの検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】  グルカゴン（Glucagon）は、膵臓のα細胞においてプログルカゴンの切断（プロセッシング）により生じる、２９アミノ酸から成るペプチドホルモンである。グルカゴンは、肝臓に作用してグリコーゲンをグルコースへと変換し、血糖値を上昇させる働きがある。ヒトの膵グルカゴンのアミノ酸配列は、ウシ及びブタの膵グルカゴンのアミノ酸配列と一致することが知られている（非特許文献１）。【０００３】  グルカゴンの前駆体であるプログルカゴンは、アミノ（Ｎ）末端から順にグリセンチン関連膵ペプチド（Glicentin-related pancreatic polypeptide：ＧＲＰＰ）、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド（Glucagon-like peptide：ＧＬＰ）−１、及びＧＬＰ−２を有するタンパク質である。プログルカゴンのプロセッシングは膵臓と腸管で異なり、膵臓においては、主にＧＲＰＰとグルカゴンが生成されるのに対して、腸管においては、主にＧＲＰＰとグルカゴンが連結したグリセンチン（Glicentin）、グルカゴンのＣ端に８アミノ酸残基を有するオキシントモジュリン（Oxyntomodulin）、ＧＬＰ−１、及びＧＬＰ−２がそれぞれ生成される。【０００４】  腫瘍マーカーとは、癌の進行とともに増加する生体因子のことである。主に血液中に遊離してくる因子に対し、抗体等を使用して検出する臨床検査項目の一つである。癌の早期発見のためのスクリーニング検査として用いられることもあるが、個体差による偽陰性及び偽陽性の影響から、現時点ではむしろ、治療中の経過観察や再発チェックの面において有用と考えられている。ペプチドホルモンの腫瘍マーカーとしては、甲状腺髄様癌、肺小細胞癌、骨髄腫などで高値を示すカルシトニン、肺小細胞癌で高値を示すガストリン放出ペプチド前駆体（Progastrin releasing peptide：ＰｒｏＧＲＰ）、肺癌、前立腺癌で高値を示すインスリン様増殖因子−１（Insulin-like growth factor-1：ＩＧＦ−１）などが知られている。【０００５】  膵臓ランゲルハンス島α細胞腫瘍であるグルカゴノーマは、特徴的な皮疹、口内炎、糖尿、高グルカゴン血症などを主徴とするが、その病態として、グルカゴンの前駆体である生物学的活性の低いプログルカゴンが血中に増加する（非特許文献２）。【０００６】  本発明者らは先にプログルカゴンが、胃癌マーカーの候補物質であると提案している（特許文献１）。ヒト胃癌由来培養細胞株であるＡＺ５２１、ＡＺ５２１の腹膜転移株であるＡＺ５２１−Ｐ７ａ、腹水転移株であるＡＺ５２１−Ｐ７ａ−Ａｓｃｉｔｅｓが培養上清にプログルカゴンを放出するという知見を得ている。【０００７】  前記ＡＺ５２１細胞は、日本人研究者によって日本で樹立され、１９８９年に論文発表されている胃癌由来の細胞株として、東北大細胞バンクから理研細胞バンクに移管を受け（理研登録番号ＲＣＢ２０８７）、また同細胞は、医薬基盤研究所ＪＣＲＢ細胞バンクにも寄託されていた（登録記号ＪＣＲＢ）。しかしながら、２０１４年３月２６日付独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターにより、理研及びＪＣＲＢバンクのＡＺ５２１細胞は、寄託された時点での取り違えにより、十二指腸癌細胞株のＨｕＴu８０細胞であることが発表されている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−２９２７４６号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Thomsen J. et. al., The amino acid sequence of human glucagon., FEBS Lett. 1972 Apr 1;21(3):315-319.
【非特許文献２】川原田 嘉文 編，「肝・胆・膵の外科―疾患編」:III 膵疾患, 12.グルカゴノーマ，医学図書出版，1994年3月発売
【非特許文献３】中村幸夫，ＡＺ５２１細胞について緊急のお知らせ，独立行政法人理化学研究所・細胞材料開発室，平成２６年３月２６日
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】  本発明の課題は、特異性が高い、あるいは検出感度の高い抗プログルカゴン抗体や、かかる抗プログルカゴン抗体をコードする遺伝子や、十二指腸癌細胞等の細胞中に発現するプログルカゴンを高感度で検出できる検出方法及び検出用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】  本発明者らは、抗プログルカゴン抗体を作製するための抗原として、プログルカゴンを構成するペプチドを長年の経験と勘にたよりながら選択し、かかる抗原を用いてポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を作製したところ、プログルカゴンを特異的に認識する抗体が得られた。また、かかる抗体の中には、市販の抗プログルカゴン抗体よりも検出感度の高い抗体が含まれることが確認された。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。【００１２】  すなわち、本発明は、（１）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを備えたことを特徴とする抗プログルカゴン抗体や、（２）配列番号１４に示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを備え、プログルカゴンに特異的に結合することを特徴とする抗プログルカゴン抗体や、（３）配列番号２、４、及び６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域と、配列番号８、１０、及び１２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域とを備えたことを特徴とする抗プログルカゴン抗体や、（４）配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるプログルカゴンの１１１〜１４４番目のアミノ酸残基内のエピトープに結合することを特徴とする抗プログルカゴン抗体や、（５）配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるプログルカゴンの１１１〜１１５番目のアミノ酸残基内のエピトープに結合することを特徴とする上記（４）記載の抗プログルカゴン抗体に関する。【００１３】  また本発明は、（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の抗プログルカゴン抗体をコードすることを特徴とする抗プログルカゴン抗体遺伝子や、（７）配列番号１３に示される塩基配列を有する重鎖可変領域遺伝子と、配列番号１５に示される塩基配列を有する軽鎖可変領域遺伝子とを備えたことを特徴とする上記（６）に記載の抗プログルカゴン抗体遺伝子に関する。【００１４】  また本発明は、（８）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の抗プログルカゴン抗体を用いることを特徴とするプログルカゴンの検出方法に関する。【００１５】  また本発明は、（９）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の抗プログルカゴン抗体を備えたことを特徴とするプログルカゴンの検出用キットや、（１０）上記（９）に記載のプログルカゴンの検出用キットを用いた、プログルカゴンを産生する腫瘍の診断方法に関する。【００１６】  また本発明の実施の他の形態として、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるプログルカゴンの６１〜９０番目のアミノ酸残基内のエピトープに結合することを特徴とする抗プログルカゴン抗体や、かかる抗プログルカゴン抗体を用いることを特徴とするプログルカゴンの検出方法や、かかる抗プログルカゴン抗体を備えたことを特徴とするプログルカゴンの検出用キットを挙げることができる。
【発明の効果】
【００１７】  本発明の抗プログルカゴン抗体や上記他の態様の抗プログルカゴン抗体は、検出感度及び特異性の面で優れている。また、本発明の抗プログルカゴン抗体や上記他の態様の抗プログルカゴン抗体は、従来の抗プログルカゴン抗体よりも検出感度が高いため、従来の抗プログルカゴン抗体では検出できなかった十二指腸癌等の細胞中に含まれるプログルカゴンを検出することができ、プログルカゴンを産生する十二指腸癌等の癌の有無を判定する方法や、かかる癌の再発リスクを評価する方法や、上記癌に対する抗癌剤の有効性の判定方法や、上記癌の抑制剤・治療剤のスクリーニング方法等に有利に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】プログルカゴン特異抗体の作製における抗原デザインを示す図である。
【図２】ＡＺ５２１無血清培養上清のＨＰＬＣ各フラクション中のプログルカゴンに対するポリクローナル抗体の免疫反応性を示す図である。
【図３】ポリクローナル抗体のエピトープ解析に用いたペプチド群を示す図である。
【図４】ポリクローナル抗体のプログルカゴン２−３０抗原に対する、化学発光免疫測定法によるエピトープ解析の結果を示す図である。
【図５】ポリクローナル抗体のプログルカゴン１１１−１４４抗原に対する、化学発光免疫測定法によるエピトープ解析の結果を示す図である。
【図６】ポリクローナル抗体のエピトープ解析の結果をまとめた図である。
【図７】プログルカゴンを含む各腫瘍細胞株の無血清培養上清サンプルと、作製したポリクローナル抗体によるウェスタンブロッティング解析の結果を示す図である。
【図８】プログルカゴンを含む各腫瘍細胞株の無血清培養上清サンプルと、市販のポリクローナル抗体（抗血清）によるウェスタンブロッティング解析の結果を示す図である。
【図９】モノクローナル抗体のエピトープ解析に用いたペプチド群を示す図である。
【図１０】モノクローナル抗体８１１Ａｂのプログルカゴン６１−９０抗原に対する、化学発光免疫測定法によるエピトープ解析の結果を示す図である。
【図１１】モノクローナル抗体８１２Ａｂのプログルカゴン６１−９０抗原に対する、化学発光免疫測定法によるエピトープ解析の結果を示す図である。
【図１２】モノクローナル抗体８１３Ａｂのプログルカゴン６１−９０抗原に対する、化学発光免疫測定法によるエピトープ解析の結果を示す図である。
【図１３】モノクローナル抗体９１１Ａｂのプログルカゴン１１１−１４４抗原に対する、化学発光免疫測定法によるエピトープ解析の結果を示す図である。
【図１４】モノクローナル抗体９１２Ａｂのプログルカゴン１１１−１４４抗原に対する、化学発光免疫測定法によるエピトープ解析の結果を示す図である。
【図１５】モノクローナル抗体９１３Ａｂのプログルカゴン１１１−１４４抗原に対する、化学発光免疫測定法によるエピトープ解析の結果を示す図である。
【図１６】モノクローナル抗体９１４Ａｂのプログルカゴン１１１−１４４抗原に対する、化学発光免疫測定法によるエピトープ解析の結果を示す図である。
【図１７】プログルカゴンを含む各腫瘍細胞株の無血清培養上清サンプルと、作製したモノクローナル抗体によるウェスタンブロッティング解析の結果を示す図である。
【図１８】９１３Ａｂに対するシークエンス解析のプライマー設定を示す図である。
【図１９】抗プログルカゴン抗体（９１３Ａｂ）重鎖のアミノ酸及び塩基配列を示す図である。
【図２０】抗プログルカゴン抗体（９１３Ａｂ）軽鎖のアミノ酸及び塩基配列を示す図である。
【図２１】ポリクローナル抗体７０２Ｓ、モノクローナル抗体８１２Ａｂ、及びモノクローナル抗体９１３Ａｂを用いたプログルカゴン測定系について、市販品のグルカゴン、ＧＬＰ−１、及びＧＬＰ−２との交差反応性を検討した結果を示す図である。
【図２２】ＨｕｔＵ８０無血清培養上清のＨＰＬＣ各フラクション中に含まれるタンパク質を質量分析計を用いて分析し、各タンパク質がどのフラクションに溶出されているかを示した図である。
【図２３】図２２にて集めた各分画中のタンパク質を、新規プログルカゴン測定系を用いて測定した結果を示す図である。
【図２４】図２２にて集めた各分画中のタンパク質を、市販のグルカゴン測定キットを用いて測定した結果を示す図である。
【図２５】図２２にて集めた各分画中のタンパク質を、市販のＧＬＰ−１測定キットを用いて測定した結果を示す図である。
【図２６】図２２にて集めた各分画中のタンパク質を、市販のＧＬＰ−２測定キットを用いて測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】  本発明の抗プログルカゴン抗体としては、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（Ｆｖ）と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを備えた抗体や、配列番号１４に示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを備え、プログルカゴンに特異的に結合する抗体や、配列番号２、４、及び６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域（complementarity-determining region；ＣＤＲ）（それぞれ重鎖ＣＤＲ１〜３）を含む重鎖可変領域と、配列番号８、１０、及び１２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ（それぞれ軽鎖ＣＤＲ１〜３）を含む軽鎖可変領域とを備えた抗体や、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるプログルカゴンの１１１〜１４４番目のアミノ酸残基内のエピトープに結合する抗体であれば特に制限されない。
【００２０】  本発明の抗プログルカゴン抗体や上記他の態様の抗プログルカゴン抗体としては、抗プログルカゴンモノクローナル抗体を好適に例示することができ、ここで抗プログルカゴンモノクローナル抗体のアイソタイプは特に制限されない。
【００２１】  本発明の抗プログルカゴン抗体や上記他の態様の抗プログルカゴン抗体における重鎖及び軽鎖の定常領域（Ｆｃ）としては、同じ生物種由来の免疫グロブリン定常領域からなる抗体であってもよく、また、異なる生物種由来の免疫グロブリン定常領域からなるキメラ抗体であってもよい。
【００２２】  本発明において、「８０％以上の同一性」とは、同一性が８０％以上であることを意味し、好ましくは８５％以上、より好ましくは８８％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を意味する。配列同一性は、当該分野で慣用のプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等）を用いて算出することができる。
【００２３】  本発明の抗プログルカゴン抗体や上記他の態様の抗プログルカゴン抗体の種類としては、モノクローナル抗体の他、モノクローナル抗体をペプシンで消化して得られるＦ（ａｂ′）２抗体フラグメントや、Ｆ（ａｂ′）２抗体フラグメントを還元して得られるＦａｂ′抗体フラグメントや、モノクローナル抗体をパパインで消化して得られるＦａｂ等の抗体フラグメントや、上記重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを、アミノ酸架橋によって連結させたｓｃＦｖ（１本鎖抗体）等を挙げることができる。
【００２４】  本発明の抗プログルカゴン抗体遺伝子としては、上記本発明の抗プログルカゴン抗体をコードする抗体遺伝子であれば特に制限されず、例えば、配列番号１３に示される塩基配列を有する重鎖可変領域遺伝子と、配列番号１５に示される塩基配列を有する軽鎖可変領域遺伝子とを備えた抗体遺伝子を具体的に例示することができる。
【００２５】  本発明の抗プログルカゴン抗体は、遺伝子組換え技術により、上記抗プログルカゴン抗体遺伝子を発現させることにより、組換え抗体として作製することができる。組換え抗体を作製する方法としては、例えば抗プログルカゴン抗体遺伝子を発現ベクターに組み込み、かかる発現ベクターをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳類細胞株や、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞等の宿主細胞へ導入して、宿主細胞において組換え抗体を生産させる方法を挙げることができる（P.J.Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY、P.Shepherd and C.Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, J.W.Goding., Monoclonal Antibodies:principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS）。特に、キメラ抗体は、特開２００５−２４５３３７に記載の技術に基づいて作製することができる。発現ベクターに組み込む抗体遺伝子の塩基配列は、発現させる宿主細胞に合わせてコドン配列の最適化がされていてもよい。
【００２６】  また、トランスジェニック動物作製技術を用いて本発明の抗プログルカゴン抗体遺伝子が組み込まれたマウス、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、ブタ等のトランスジェニック動物を作製し、かかるトランスジェニック動物の血液、ミルク中などから上記抗プログルカゴン抗体遺伝子に由来する抗体を大量に産生させることもできる。
【００２７】  さらに、慣用のプロトコールを用いて、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるプログルカゴンの１１１〜１４４番目、好ましくは１１１〜１１５番目のアミノ酸残基からなるペプチドをマウス、ラット等のヒト以外の動物へ投与し、抗プログルカゴン抗体を産生する細胞クローンを細胞融合技術（ハイブリドーマ法［Nature 256, 495-497, 1975］、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法［Immunology Today 4, 72, 1983］及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法［MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc.,1985］等）によりスクリーニングすることにより、本発明の抗プログルカゴン抗体を得ることができる。また、上記他の態様の抗プログルカゴン抗体については、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるプログルカゴンの６１〜９０番目、好ましくは７１〜７７番目のアミノ酸残基からなるペプチドを用いて上述のとおりの方法でスクリーニングすることにより得ることができる。
【００２８】  形質転換細胞、トランスジェニック動物、ハイブリドーマ等により産生された本発明の抗プログルカゴン抗体や上記他の態様の抗プログルカゴン抗体は、例えばＰｒｏｔｅｉｎＡ、ＰｒｏｔｅｉｎＧカラムによるクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、硫安塩析法、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー等を用いて精製することができる。
【００２９】  本発明のプログルカゴンの検出方法や上記他の態様のプログルカゴンの検出方法としては、本発明の抗プログルカゴン抗体や上記他の態様の抗プログルカゴン抗体を用いてプログルカゴンを検出する方法であればよく、具体的には本発明の抗プログルカゴン抗体や上記他の態様の抗プログルカゴン抗体を用いたＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法、ウェスタンブロッティング法、免疫組織化学等の免疫学的測定方法を挙げることができ、これらの中でもウェスタンブロッティング法を好適に例示することができる。本発明の抗プログルカゴン抗体や上記他の態様の抗プログルカゴン抗体を用いたプログルカゴンの検出は、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）、Sambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの標準的な実験室マニュアルに記載される方法等により行うことができる。
【００３０】  本発明のプログルカゴンの検出用キットや上記他の態様のプログルカゴンの検出用キットは、「プログルカゴンを検出するため」という用途が限定された本発明の抗プログルカゴン抗体や上記他の態様の抗プログルカゴン抗体を含むものである。かかるキットには、プログルカゴンに結合した本発明の抗プログルカゴン抗体や上記他の態様の抗プログルカゴン抗体を検出するための、蛍光物質、西洋ワサビペルオキシダーゼ(Horse Radish Peroxidase;ＨＲＰ)等の標識物質をコンジュゲートした抗体（２次抗体）や、一般にこの種の検出（測定）キットに用いられる成分、例えば担体、ｐＨ緩衝剤、安定剤、取扱説明書等の添付文書が通常含まれる。
【００３１】  以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３２】［細胞の培養上清の調製］  十二指腸癌由来の３種類の細胞株（ＡＺ−５２１、ＡＺ５２１−Ｐ７ａ、及びＨｕＴu８０）１×１０６個を１０ｃｍシャーレに播種し、１０％のウシ胎児血清（fetal bovine serum：ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培養液（Sigma社製）存在下で培養し、２４時間後にリン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline：ＰＢＳ）で２回洗浄した後、ＦＢＳを含まないＲＰＭＩ１６４０培養液に交換し、１時間培養した後、培養液を新しいＲＰＭＩ１６４０培養液に置換し、さらに４８時間培養した。４８時間後に培養液を回収し、本実施例における培養上清として用いた。なお、細胞培養は、３７℃、５％ＣＯ２条件下で行った。【００３３】［抗原の作製］  図１に示す３種類の抗原のアミノ酸配列に相当するペプチドを化学合成した。化学合成は、自動ペプチド合成機（430A、Applide biosystems社製）を用い、合成機搭載のプログラムによりＦ−ｍｏｃ−アミノ酸を端より順次結合して行った。合成ペプチドの精製は分取用逆相ＨＰＬＣにより行い、純度は分析用逆相ＨＰＬＣで確認した。合成品の分子量は質量分析により理論値に一致することを確認した。【００３４】［ポリクローナル抗体の作製］  上記３種類のプログルカゴンペプチド（１ｍｇ）それぞれをキーホールリンペットヘモシアニン（KLH、５ｍｇ）と結合したコンジュゲートを、日本白色種ウサギ２匹に週１回、全６回注射して免疫した後、最終の免疫から１週間後にその全血を採取し、血清を全回収し、保存料として０．０９％のアジ化ナトリウムを加えた。すなわち、プログルカゴンの２〜３０番目のアミノ酸残基からなるペプチドを免疫して得られた血清２種（ＳＣＣ−ＭＧＤ−７０１Ｓ及びＳＣＣ−ＭＧＤ−７０２Ｓ）、プログルカゴンの６１〜９０番目のアミノ酸残基からなるペプチドを免疫して得られた血清２種（ＳＣＣ−ＭＧＤ−８０１Ｓ及びＳＣＣ−ＭＧＤ−８０２Ｓ）、及びプログルカゴンの１１１〜１４４番目のアミノ酸残基からなるペプチドを免疫して得られた血清２種（ＳＣＣ−ＭＧＤ−９０１Ｓ及びＳＣＣ−ＭＧＤ−９０２Ｓ）の計６種の血清が得られた。【００３５】［ポリクローナル抗体の免疫反応性とエピトープの検定］  抗体の免疫反応性を検定するために、４種類の血清（ＳＣＣ−ＭＧＤ−７０１Ｓ及びＳＣＣ−ＭＧＤ−７０２Ｓ、並びにＳＣＣ−ＭＧＤ−８０１Ｓ及びＳＣＣ−ＭＧＤ−８０２Ｓ）を用いてＨＰＬＣで分画したＡＺ−５２１細胞株の培養上清画分と反応させた（図２参照）。その結果、プログルカゴンが特に多く含まれる画分（Ｆ１０−１２）に対する免疫反応性が高いことが示された。  また、抗体のエピトープについて詳細に解析したところ（図３〜６参照）、血清２種（ＳＣＣ−ＭＧＤ−７０１Ｓ及びＳＣＣ−ＭＧＤ−７０２Ｓ）の抗体のエピトープは、プログルカゴンの１２〜２２番目のアミノ酸残基の範囲内に含まれることや（図４、６参照）、血清２種（ＳＣＣ−ＭＧＤ−８０１Ｓ及びＳＣＣ−ＭＧＤ−８０２Ｓ）の抗体のエピトープは、プログルカゴンの７２〜７８番目のアミノ酸残基の範囲内に含まれることや（図６参照）、血清２種（ＳＣＣ−ＭＧＤ−９０１Ｓ及びＳＣＣ−ＭＧＤ−９０２Ｓ）の抗体のエピトープは、プログルカゴンの１１６〜１２６番目のアミ���酸残基の範囲内に含まれることが明らかとなった（図５、６参照）。  以上の結果は、プログルカゴンを特異的に認識するポリクローナル抗体６種が作製されたことを示している。【００３６】［ポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティング法］  上記６種類の抗プログルカゴンポリクローナル抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法によりプログルカゴンタンパク質を検出した。上記［細胞の培養上清の調製］の項目で調製した３種類の培養上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）法によりポリアクリルアミドゲル上でタンパク質を分子量で分離した。このタンパク質をポリアクリルアミドゲルからＰＶＤＦ膜（Bio-Rad社製）に転写させ、ブロッキング液（５％スキムミルク／ＴＢＳＴ）でブロッキングした後、一次抗体として上記６種類の抗プログルカゴンポリクローナル抗体を反応させた。一次抗体は上記の抗血清をＴＢＳＴで１０００倍に希釈して用いた。ＴＢＳＴ溶液で洗浄後、１万倍に希釈したＨＲＰ（horseradish peroxidase）標識抗ウサギ抗体を二次抗体として用い、検出はECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare社製)により蛍光検出した（図７参照）。なお、コントロールとして市販の抗プログルカゴンポリクローナル抗体３種［Anti-Glicentin (Y324), Anti-GLP-1 (Y320), Anti-GLP-2 (Y322), 全て株式会社矢内原研究所製］を用いた（図８参照）。【００３７】  その結果、上記６種類の抗プログルカゴンポリクローナル抗体を用いた場合、プログルカゴンの分子量に相当する位置に目的のバンドが検出された。また、上記６種類の抗プログルカゴンポリクローナル抗体は、全て市販の抗体よりも検出感度が高いことが示された。【００３８】［モノクローナル抗体の作製］  上記［抗原の作製］の項目で作製した３種類のプログルカゴンペプチド（１ｍｇ）とキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、５ｍｇ）とをそれぞれ結合したコンジュゲートをＣ５７Ｂｌ６マウスに週１回、全６回注射により免疫した後、最終の免疫から１週間後に脾臓を採取し、定法にしたがってハイブリドーマを樹立した。樹立したハイブリドーマが上記３種類のプログルカゴンペプチドに対する抗体を産生しているか、スクリーニングをＥＬＩＳＡにより行った。プログルカゴンの６１〜９０番目のアミノ酸残基からなるペプチドを免疫したマウス由来のハイブリドーマを調べたところ、プログルカゴンに対する抗体を産生するハイブリドーマ１３クローンが得られ、そのうち３クローン（８１１Ａｂ、８１２Ａｂ、及び８１３Ａｂ）が確立された（図９参照）。また、プログルカゴンの１１１〜１４４番目のアミノ酸残基からなるペプチドを免疫したマウス由来のハイブリドーマを調べたところ、ハイブリドーマ６クローンが得られ、そのうち４クローン（９１１Ａｂ、９１２Ａｂ、９１３Ａｂ、及び９１４Ａｂ）が確立された（図９参照）。なお、プログルカゴンの２〜３０番目のアミノ酸残基からなるペプチドを免疫したマウス由来のハイブリドーマからは陽性クローンは得られなかった。【００３９】［モノクローナル抗体の免疫反応性とエピトープの検定］  抗体のエピトープについてポリクローナル抗体と同様に解析したところ（図９〜１６参照）、ハイブリドーマ３クローン（８１１Ａｂ、８１２Ａｂ、及び８１３Ａｂ）が産生する抗体（ＳＣＣ−ＭＧＤ−８１１Ａｂ、ＳＣＣ−ＭＧＤ−８１２Ａｂ及びＳＣＣ−ＭＧＤ−８１３Ａｂ）のエピトープは、プログルカゴンの７２〜７８番目のアミノ酸残基の範囲内に含まれることや（図１０〜１２参照）、ハイブリドーマ３クローン（９１１Ａｂ、９１２Ａｂ、及び９１４Ａｂ）が産生する抗体（ＳＣＣ−ＭＧＤ−９１１Ａｂ、ＳＣＣ−ＭＧＤ−９１２Ａｂ及びＳＣＣ−ＭＧＤ−９１４Ａｂ）のエピトープは、プログルカゴンの１２６〜１３５番目のアミノ酸残基の範囲内に含まれることや（図１３〜１４及び図１６参照）、ハイブリドーマ１クローン（９１３Ａｂ）が産生する抗体（ＳＣＣ−ＭＧＤ−９１３Ａｂ）のエピトープは、プログルカゴンの１１１〜１１５番目のアミノ酸残基の範囲内に含まれることが明らかとなった（図１５参照）。  以上の結果は、プログルカゴンを特異的に認識するモノクローナル抗体７種が作製されたことを示している。【００４０】［モノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティング法］  上記７種類の抗プログルカゴンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養上清を用いて、ウェスタンブロッティング法によりプログルカゴンタンパク質を検出した。上記［細胞の培養上清の調製］の項目で調製した３種類の培養上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）法によりポリアクリルアミドゲル上でタンパク質を分子量で分離した。このタンパク質をポリアクリルアミドゲルからＰＶＤＦ膜（Bio-Rad社製）に転写させ、ブロッキング液（５％スキムミルク／ＴＢＳＴ）でブロッキングした後、一次抗体として上記７種類の抗プログルカゴンモノクローナル抗体を反応させた。一次抗体は上記の抗血清をＴＢＳＴで１０００倍に希釈して用いた。ＴＢＳＴ溶液で洗浄後、１万倍に希釈したＨＲＰ（horseradish peroxidase）標識抗マウス抗体を二次抗体として用い、検出はECL Prime Western Blotting Detection Reagent（GE Healthcare社製）により蛍光検出した（図１７参照）。【００４１】  その結果、ハイブリドーマ６クローン（８１１Ａｂ、８１２Ａｂ、及び８１３Ａｂ、並びに９１２Ａｂ、９１３Ａｂ、及び９１４Ａｂ）の培養上清を用いた場合、プログルカゴンの分子量に相当する位置に目的のバンドが検出された。また、上記ハイブリドーマ６クローンのうち、４クローン（８１２Ａｂ及び８１３Ａｂ、並び９１３Ａｂ及び９１４Ａｂ）の培養上清を用いた場合、市販の抗体を用いた場合よりも高い感度でプログルカゴンを検出できることが示された。【００４２】  さらに、プログルカゴン１１１−１４４抗原を用いて作製したモノクローナル抗体ＳＣＣ−ＭＧＤ−９１３のエピトープは１１１−１１５領域であり、グリセンチン、グルカゴン、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２配列を含まないことから、ＳＣＣ−ＭＧＤ−９１３と他の１種あるいは２種類の抗体との組み合わせによるサンドイッチ法により、プログルカゴンのみを特異的に測定することができることが明らかとなった。【００４３】［モノクローナル抗体遺伝子の同定］  市販の抗体よりも検出感度が高かった上記ハイブリドーマ４クローンのうち、特に検出感度が高いハイブリドーマクローン（９１３Ａｂ）から、RNeasy Mini kit (Qiagen社製、Cat.No.74104)を用いてトータルＲＮＡを抽出した後、GeneRacer Kit （Invitrogen社製 Cat. No.L1502-01［SuperScript III RTとTOTP TA Cloning Kit for Sequencingを含む］）を用いた５’−ＲＡＣＥ法により重鎖及び軽鎖可変領域を増幅した（図１８参照）。なお、重鎖及び軽鎖可変領域の増幅に用いたプライマーを以下に示す。mIgG-CH1プライマー；5’- ctcaattttcttgtccaccttggtgc -3’（配列番号１７で示される塩基配列）mIgG-CLkプライマー；5’- ctcattcctgttgaagctcttgacaat -3’（配列番号１８で示される塩基配列）5’RACEプライマー；5’- cgactggagcacgaggacactga -3’（配列番号１９で示される塩基配列）  抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子は、Blend Taq（TOYOBO社製、Cat. No.BTQ-101）を用いたＰＣＲにより単離し、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Invitrogen社製）ベクターを用いてクローニングした。クローニングした各ＤＮＡ断片の塩基配列は、BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems社製）を用い、ＤＮＡシークエンサーにて決定した（図１９及び２０参照）。また、同定した重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子配列を基に、ＩＧＢＬＡＳＴにより検索し、重鎖及び軽鎖相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）を同定した（図１９及び２０参照）。【００４４】  得られた抗プログルカゴン抗体の遺伝子配列及びそれがコードするアミノ酸配列を以下に示す。重鎖ＣＤＲ１塩基配列：配列番号１で示される塩基配列重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号２で示されるアミノ酸配列重鎖ＣＤＲ２遺伝子配列：配列番号３で示される塩基配列重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号４で示されるアミノ酸配列重鎖ＣＤＲ３遺伝子配列：配列番号５で示される塩基配列重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号６で示されるアミノ酸配列軽鎖ＣＤＲ１遺伝子配列：配列番号７で示される塩基配列軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８で示されるアミノ酸配列軽鎖ＣＤＲ２遺伝子配列：配列番号９で示される塩基配列軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１０で示されるアミノ酸配列軽鎖ＣＤＲ３遺伝子配列：配列番号１１で示される塩基配列軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１２で示されるアミノ酸配列重鎖可変領域遺伝子配列：配列番号１３で示される塩基配列重鎖可変領域アミノ酸配列：配列番号１４で示されるアミノ酸配列軽鎖可変領域遺伝子配列：配列番号１５で示される塩基配列軽鎖可変領域アミノ酸配列：配列番号１６で示されるアミノ酸配列【００４５】  ［作製した抗体を用いた新規プログルカゴン測定系の確立］  上記抗プログルカゴンポリクローナル抗体（ＳＣＣ−ＭＧＤ−７０２Ｓ）、及び抗プログルカゴンモノクローナル抗体２種（ＳＣＣ−ＭＧＤ−８１２Ａｂ、及びＳＣＣ−ＭＧＤ−９１３Ａｂ）の計３種類の抗体について、グルカゴン、ＧＬＰ−１、及びＧＬＰ−２との交差反応性を検討した。【００４６】  ＥＬＩＳＡ法を用い、上記３種類の抗体と、市販品のグルカゴン、ＧＬＰ−１、及びＧＬＰ−２との交差反応性を検討した。市販品は、化学合成品であるヒトグルカゴン（矢内原研究所社製）、ヒトＧＬＰ−１（矢内原研究所社製）、及びヒトＧＬＰ−２（矢内原研究所社製）を用いた。  ＳＣＣ−ＭＧＤ−７０２ＳＡｂを用いたＥＬＩＳＡ法では、標識抗原にビオチル化プログルカゴン（２−３０）１０ｎｇ／ｍＬ、標準抗原にプログルカゴン（２−３０）０−２００ｎｇ／ｍＬを用いた。ＳＣＣ−��ＧＤ−８１２Ａｂを用いたＥＬＩＳＡ法では、標識抗原にビオチル化プログルカゴン（６１−９０）１０ｎｇ／ｍＬ、標準抗原にプログルカゴン（６１−９０）０−２００ｎｇ／ｍＬを用いた。ＳＣＣ−ＭＧＤ−９１３Ａｂを用いたＥＬＩＳＡ法では、標識抗原にビオチル化プログルカゴン（１１１−１４４）１０ｎｇ／ｍＬ、標準抗原にプログルカゴン（１１１−１４４）０−２００ｎｇ／ｍＬを用いた。上記標識抗原及び標準抗原はすべて、上記［抗原の作製］の項目で作製したペプチド、若しくは上記［抗原の作製］の項目で作製したペプチドにビオチン(Sigma-Aldorich社製)を導入してビオチン化したペプチドである。【００４７】  ９６穴プレートの各ウェルに、抗ウサギＩｇＧ（５μｇ／ｍＬ）(MP Biomedical社製)とマウスＩｇＧ（５μｇ／ｍＬ）(MP Biomedical社製)を各１００μＬ添加し、４℃で２４時間静置した。その後、Tween-20(Biorad社製)を含むＰＢＳで３回洗浄した。更にブロックエース(DSファーマバイオメディカル社製)３００μＬを添加し、４℃で一晩放置しブロッキングした。  ブロッキングした９６穴プレートの各ウェルに、標識抗原溶液５０μＬを加えた後、標準抗原溶液あるいは測定試料（ＨＰＬＣ画分）５０μＬを添加し、更に検出抗体５０μＬを加え、室温で３時間放置した。その後、Tween-20を含むＰＢＳで４回洗浄後、各ウェルにストレプトアビジン−ＨＲＰ(メルク社製)を加え、室温で２時間反応させた。その後、ＰＢＳで４回洗浄し、各ウェルに発光基質溶液（Ｒ＆Ｄ社製）５０μＬを加え、室温・暗所で２０分間反応させた後、発光強度を４５０ｎｍにおける紫外部吸収で測定した。（図２１参照）。【００４８】  その結果、ＳＣＣ−ＭＧＤ−７０２ＳＡｂ、ＳＣＣ−ＭＧＤ−８１２Ａｂ、及びＳＣＣ−ＭＧＤ−９１３Ａｂを用いたいずれのＥＬＩＳＡ系においても、グルカゴン、ＧＬＰ−１、及びＧＬＰ−２との交差反応性は認められなかった。これより、上記ＥＬＩＳＡ系はプログルカゴンに特異的であり、これらＥＬＩＳＡ系を用いることにより、プログルカゴンとグルカゴン、ＧＬＰ−１、及びＧＬＰ−２とを区別できることが示された。【００４９】  ［確立したプログルカゴン測定系と、市販のグルカゴン、ＧＬＰ−１、及びＧＬＰ−２各測定キットとの、プログルカゴン検出能の比較］  まず、逆相ＨＰＬＣ及び質量分析を用い、ＨｕｔＵ８０細胞の条件培地内に含まれるプログルカゴンの検出を行った。  ＨｕｔＵ８０細胞を無血清培地で培養し、得た培養上清液５００μＬをIntrada WP-RPカラム（２５０×４．６ｍｍ）(Imtakt社製)に添加した。試料の分離溶出は、溶離液Ａ（０．１％ＴＦＡ／精製水）と溶離液Ｂ（０．０８％ＴＦＡ／アセトニトリル）の混合比を３０分間で０−１００％に変化させる直線濃度勾配法で行った。流速は毎分０．７５ｍＬとし、溶出液を９６穴プレートを用いて１５秒ごとに集めた【００５０】  集めた各分画中のタンパク質を質量分析計(Applide Biosystems社製)で分析した結果（図２２参照）、主にフラクションＧ１−Ｇ８にプログルカゴンが検出された。フラクションＦ９−Ｆ１２、及びフラクションＧ９−Ｇ１２にもわずかであるがプログルカゴン及び、プログルカゴンのＣ端部と思われるタンパク質が検出された。【００５１】  次に、集めた各分画中のタンパク��を、上記にて作製した新規プログルカゴン測定系を用いて測定した（図２３参照）。結果、ＳＣＣ−ＭＧＤ−７０２ＳＡｂ、ＳＣＣ−ＭＧＤ−８１２Ａｂ、及びＳＣＣ−ＭＧＤ−９１３Ａｂを用いたいずれのＥＬＩＳＡ系においても、フラクションＧ１−Ｇ４に強く反応した。ＳＣＣ−ＭＧＤ−８１２Ａｂ、及びＳＣＣ−ＭＧＤ−９１３ＡｂはフラクションＧ５−Ｇ８にも強く反応したが、ＳＣＣ−ＭＧＤ−７０２ＳＡｂ、ＳＣＣ−ＭＧＤ−８１２Ａｂ、及びＳＣＣ−ＭＧＤ−９１３Ａｂのいずれも、フラクションＧ９−Ｇ１２にはほとんど反応しなかった。【００５２】  更に、集めた各分画中のタンパク質を、市販の測定キットを用いて測定した。用いたキットは以下のとおりである。測定は各キットに付属の説明書に従って行った。  １．グルカゴン測定キット（図２４参照）。    １−１．Glucagon EIA: YK090（矢内原研究所社製)；腸管グルカゴン、ＧＬＰ−１、及びＧＬＰ−２とは交差しないとされている。    １−２．Glucagon ELISA: EZGGLU-30K（Millipore社製）;グルカゴン（１−１８）、及びグルカゴン（１９−２９）とは交差しないが、オキシントモジュリンとは０．５％交差するとされている。  ２．ＧＬＰ−１測定キット（図２５参照）。    ２−１．Total GLP-1-HS ELISA: YK161（矢内原研究所社製)；抗原はＧＬＰ−１（７−３６）であり、グルカゴン、及びＧＬＰ−２とは交差しないが、ＧＬＰ−１（１−３６）、及びＧＬＰ−１（９−３６）とは同等に交差し、ＧＬＰ−１（１−３７）、及びＧＬＰ−１（７−３７）とは約９％交差するとされている。    ２−２．GLP-1 Total ELISA : EZGLP1T-36K（Millipore社製）;抗原はＧＬＰ−１（７−３６）であり、グルカゴン、ＧＬＰ−２、及びオキシントモジュリンとは交差しないが、ＧＬＰ−１（９−３６）とは１００％交差するとされている。  ３．ＧＬＰ−２測定キット（図２６参照）。    ３−１．Human GLP-2 EIA : YK141（矢内原研究所社製)；抗原はＧＬＰ−２（１−３３）であり、グルカゴン、及びＧＬＰ−１とは交差しないとされている。    ３−２．GLP-2 ELISA : EZGLP2-37K（Millipore社製）;抗原はＧＬＰ−２（１−３３）であり、ＧＬＰ−２（３−３３）とも同等に交差するとされている。【００５３】  市販のグルカゴン測定キットを用いた測定（図２４参照）では、矢内原研究所社製品及びMillipore製品共に、反応した免疫活性溶出画分は主なプログルカゴン溶出画分とは異なっていた。  市販のＧＬＰ−１測定キットを用いた測定（図２５参照）では、矢内原研究所製品に反応した免疫活性溶出画分は主なプログルカゴン溶出画分とは異なっていた。一方、Millipore製品を用いた測定では、主なプログルカゴン溶出画分を含む広範囲な溶出画分に反応が認められた。しかし、その免疫活性は顕著に低値であり、その測定値は上記にて作製した新規プログルカゴン測定系と比べ、０．５％以下であった。  市販のＧＬＰ−１測定キットを用いた測定（図２６参照）では、矢内原研究所製品、及びMillipore社製品共に、主なプログルカゴン溶出画分に反応が認められたが、その測定値は上記にて作製した新規プログルカゴン測定系と比べ１６％以下であった。【００５４】  これより、上記にて作製した新規プログルカゴン測定系は、未変性のプログルカゴン測定に関しては、既存のグルカゴン、ＧＬＰ−１���及びＧＬＰ−２測定キットと比較し特異性及び検出能において優れていることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５５】  本発明の抗プログルカゴン抗体や上記他の態様の抗プログルカゴン抗体は、従来の抗プログルカゴン抗体よりも特異性が高い、又は検出感度が高いため、従来の抗プログルカゴン抗体では検出できなかった十二指腸癌等の細胞中に含まれるプログルカゴンを検出することができ、プログルカゴンを産生する十二指腸癌等の癌の有無を判定する方法や、かかる癌の再発リスクを評価する方法や、上記癌に対する抗癌剤の有効性の判定方法や、上記癌の抑制剤・治療剤のスクリーニング方法等に有利に用いることができ、プログルカゴンを産生する癌の治療薬の開発に資するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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