(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＧＦ−１８、アルギネート、コラーゲン、安定剤としてのショ糖、及びジカチオン塩を含むか又はそれらから成る、均一なヒドロゲル。
【請求項２】
以下の２つの溶液：
ａ．ＦＧＦ−１８、アルギネート、コラーゲン及び安定剤としてのショ糖を含むか又はそれらから成る、第１の均一溶液（溶液１）、及び
ｂ．ジカチオン塩を含むか又はそれから成る第２の溶液（溶液２）
から形成される、請求項１に記載の均一なヒドロゲル。
【請求項３】
前記ジカチオン塩が、カルシウム塩、マグネシウム塩、銅塩、又は亜鉛塩である、請求項１又は２に記載の均一なヒドロゲル。
【請求項４】
ＦＧＦ−１８が、
ａ）配列番号１のアミノ酸残基２８〜２０７を含むか又はそれから成るポリペプチド、
ｂ）配列番号１のアミノ酸残基２８〜１９６を含むか又はそれから成るポリペプチド、及び
ｃ）配列番号２を含むか又はそれから成るポリペプチド
からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の均一なヒドロゲル。
【請求項５】
前記各溶液において、アルギネートが３〜４重量％の濃度であり、コラーゲンが１〜２ｍｃｇ／ｍｌの濃度であり、ショ糖が１０〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度であり、塩が１〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の均一なヒドロゲル。
【請求項６】
溶液１：溶液２の比率が２：１（体積対体積）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の均一なヒドロゲル。
【請求項７】
ａ．ＦＧＦ−１８、アルギネート、コラーゲン、安定剤としてのショ糖を含むか又はそれらから成る、第１の均一溶液を調製する工程と、
ｂ．ジカチオン塩を含むか又はそれから成る第２の溶液を調製する工程と、
ｃ．両方の溶液を注入又は同時注入する前に前記２つの溶液を混合して、ヒドロゲルを形成する工程と
を含む、均一なヒドロゲルの製造方法。
【請求項８】
前記ジカチオン塩が、カルシウム塩、マグネシウム塩、銅塩、又は亜鉛塩である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＦＧＦ−１８が、
ａ）配列番号１のアミノ酸残基２８〜２０７を含むか又はそれから成るポリペプチド、
ｂ）配列番号１のアミノ酸残基２８〜１９６を含むか又はそれから成るポリペプチド、及び
ｃ）配列番号２を含むか又はそれから成るポリペプチド
からなる群から選択される、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記各溶液において、アルギネートが３〜４重量％の濃度であり、コラーゲンが１〜２ｍｃｇ／ｍｌの濃度であり、ショ糖が１０〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度であり、塩が１〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
溶液１：溶液２の比率が２：１（体積対体積）である、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
２つの容器を含む、軟骨障害を治療するための製品であって、
ａ．第１の容器は、第１の均一溶液を含むか又はそれから成り、ここで、前記第１の溶液は、ＦＧＦ−１８、アルギネート、コラーゲン、及び安定剤としてのショ糖を含むか又はそれらから成り、及び
ｂ．第２の容器は、第２の溶液を含むか又はそれから成り、ここで、前記第２の溶液はジカチオン塩を含むか又はそれから成る、製品。
【請求項１３】
前記ジカチオン塩が、カルシウム塩、マグネシウム塩、銅塩、又は亜鉛塩である、請求項１２に記載の製品。
【請求項１４】
ＦＧＦ−１８が、
ａ）配列番号１のアミノ酸残基２８〜２０７を含むか又はそれから成るポリペプチド、
ｂ）配列番号１のアミノ酸残基２８〜１９６を含むか又はそれから成るポリペプチド、及び
ｃ）配列番号２を含むか又はそれから成るポリペプチド、
からなる群から選択される、請求項１２又は１３に記載の製品。
【請求項１５】
前記各溶液において、アルギネートが３〜４重量％の濃度であり、コラーゲンが１〜２ｍｃｇ／ｍｌの濃度であり、ショ糖が１０〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度であり、塩が１〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度である、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の製品。
【請求項１６】
溶液１：溶液２の比率が２：１（体積対体積）である、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の製品。
【請求項１７】
第１の容器及び第２の容器は、２重チャンバーシステムの２つのコンパートメントであるか、又は２重針注入装置の２つのコンパートメントである、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬製剤の分野に関する。より具体的には本発明は、アルギネート／コラーゲンヒドロゲル中の線維芽細胞増殖因子１８（ＦＧＦ−１８）タンパク質製剤と、このようなヒドロゲル製剤の製造方法と、に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維芽細胞増殖因子１８（ＦＧＦ−１８）は、ＦＧＦ−８及びＦＧＦ−１７に密接に関連するタンパク質の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバーである。ＦＧＦファミリーのメンバーは、ヘパリン結合ドメインにより性状解析される。このような推定されるヘパリン結合ドメインは、ＦＧＦ−１８について同定されている。受容体を介したシグナル伝達は、細胞表面のヘパリン硫酸プロテオグリカンと複合体を形成したＦＧＦリガンドの結合により開始されると、言われている。
【０００３】
ＦＧＦ−１８は、軟骨細胞及び骨芽細胞の増殖剤であることが示されている（Ellsworth et al., 2002; Shimoaka et al., 2002）。ＦＧＦ−１８は、骨関節炎（ＯＡ）及び軟骨損傷（ＣＩ）などの軟骨障害の治療の、単独の治療（国際公開第２００８／０２３０６３号）又はヒアルロン酸との組み合わせ治療（国際公開第２００４／０３２８４９号）について、提唱されている。
【０００４】
ＦＧＦポリペプチドを含む医薬組成物は、当該分野で公知である。国際公開第２０１２１７２０７２号は、ＦＧＦ−１８を含有する凍結乾燥製剤を記載し、ここで、前記組成物は、ＦＧＦ−１８、緩衝液、ポロキサマー界面活性剤、及び安定化剤としての糖を含む。前記ＦＧＦ−１８の凍結乾燥製剤は、ＯＡ又はＣＩの治療で有望な結果を示している。前記凍結乾燥製剤を使用する現在の投薬処方は、週１回で３週間の注射の治療サイクルである。治療サイクルは繰り返すことができる。
【０００５】
ＣＩの場合、現在の製剤の主要な欠点は、関節内（ｉ.ａ.）にいったん注射すると、滑液中のＦＧＦ−１８の存在が、健康な領域でも軟骨の制御不能な増殖を誘導し得ることである。これは当然ながら、関節の可動性の低下などの望ましくない作用を誘導することがある。標的部位のレベルでのＦＧＦ−１８の選択的送達は、損傷部位においてのみ軟骨の成長を促進するであろう。具体的には損傷部位のレベルでのＦＧＦ−１８の送達は、微小破壊と組み合わせるとＣＩの治療のために極めて有益であろう。微小破壊は、下層の骨に小さな骨折を作成することにより作用する、関節軟骨の修復手術技術である。これは、骨髄由来の多能性間葉系幹細胞の放出を引き起こす（Ringe J. et al., 2012）。ＦＧＦ−１８を含有する注射可能なゲルで軟骨穴を充填することは、細胞をゲル内に導き、これは次に、細胞増殖及び同時に薬物貯蔵のための機械的支持体として作用するであろう。このため、ＦＧＦ−１８はゲルから放出されず、マトリックス内に捕捉されたままであることが好ましいであろう。
【０００６】
組織工学における典型的な手法は、受容体部位の形状とするための、機械的特性に応じて移植又は注入することができる３Ｄマトリックス、すなわち足場への、増殖因子の閉じ込めである。足場の必須特性は、生体適合性と吸収性である。さらに足場は、細胞が成長し、増殖し、損傷組織を修正するための理想的な環境を、細胞に提供することができなければならない。理想的にはマトリックスは、元の組織と同じ機械的性質に似ており、細胞を収容できる微空隙率（充分な大きさの連通する空孔）を提示しなければならない（Tessmar and Gopferich, 2007）。
【０００７】
例えば国際公開第２０１２１１３８１２号は、少なくとも１つの層のポリアニオンと１つの層のポリカチオンで被覆されたナノファイバー足場を記載する。ＦＧＦ１８などの治療用分子は、足場中に含めることができる。具体的には、治療用分子はポリアニオンの層を形成することができる。この足場は、任意選択的に、コラーゲンヒドロゲル内に骨芽細胞を含んでよく、アルギネートヒドロゲル内に軟骨細胞を含んでよく、各ヒドロゲルは、被覆された足場の上に堆積される。足場は、手術を介してイン・サイチュで移植されるべきである。
【０００８】
ヒドロゲルは、大量の水を吸収し保持できる親水性ポリマー鎖の３次元ネットワークである。これらの主要な特徴は、これらは膨潤又は縮小することができるが、水性媒体に溶解しないことである。従って、これらのマトリックス中に活性分子（活性医薬成分、すなわちＡＰＩ）を捕捉することが可能であり、次にこれは、マトリックスとＡＰＩとの特異的相互作用の有無に応じて、ゆっくりと放出又は保持される（Lo Presti et al., 2011）。軟骨障害を治療するために注射可能なヒドロゲルを使用する利点は、固体の足場を利用するいかなる侵襲的手術も必要とせずに、軟骨欠損において関節鏡検査によって足場を注入できる可能性である。
【０００９】
既に知られている多様なヒドロゲルの中で、一部の製剤は、特定の物理的又は化学的刺激に応答して、ゲル化プロセスを受けることができるポリマーに基づいている。これらはいったん注入されると、温度、ｐＨ、又はイオン強度の変化などの注射部位の環境刺激に応答して巨視的なゲルに変わる、粘性の注入可能な液体として存在する。製剤の組成は、粘弾性、微空隙率などの異なる特性を有するヒドロゲルを得るために調整することができる（国際公開第２００８０６３４１８号；Lo Presti et al., 2011; C. Dispenza et al, 2011）。
【００１０】
生物活性タンパク質を含む医薬組成物を調製する場合、この組成物は、タンパク質の活性が適切な時間維持されるように、調製しなければならない。タンパク質の活性／安定性の喪失は、タンパク質の化学的又は物理的不安定性、特に変性、凝集、又は酸化により生じることがある。従って得られる生成物は、薬学的に許容されない場合がある。賦形剤及び／又はヒドロゲルの使用は、特定のタンパク質の安定性を上昇させることが知られているが、これらの賦形剤の安定化作用は、ゲル中のポリマー、賦形剤の性質、及び生物活性タンパク質自体に、大きく依存する。
【００１１】
活性成分としてＦＧＦ−１８を含む製剤であって、活性成分の生物活性を保持し、注射、好ましくは関節内注射での使用に適し、治療に必要な注射の回数を減らすことを可能にする、更なる製剤に対するニーズが、いまだに存在する。このような特徴は、手術や侵襲性移植を必要としないため、感染症のリスクの低減を可能にし、患者の利便性を高めることになるであろう。前記製剤は、骨関節炎や軟骨損傷などの患者の軟骨障害の治療における投与に有用であろう。
【発明の概要】
【００１２】
発明の概要
本発明の目的は、ＦＧＦ−１８タンパク質を含む新規製剤を提供することである。さらに詳しくは、前記製剤はＦＧＦ−１８を含有する均一なヒドロゲルであり、このヒドロゲルは好ましくはイオン応答性ヒドロゲル、より好ましくはアルギネート／コラーゲンヒドロゲルである、本発明はまた、本発明の均一なヒドロゲルを調製するための方法を提供する。本明細書に記載のＦＧＦ−１８を含有するヒドロゲルは、軟骨障害の治療での投与に有用であり得る。特に関係するものは、ＦＧＦ−１８タンパク質をさらに含むアルギネート／コラーゲンヒドロヒドロゲルである。
【００１３】
第１の態様において本発明は、アルギネート、コラーゲン、ＦＧＦ−１８、等張剤／安定剤としての糖、並びに塩を含むか又はそれらから成る、均一であるヒドロゲル（すなわち、ゲル製剤）を提供する。この製剤は、各システムが分離された時に液体形態である、２成分ゲル化システムとして提供される。あるいは、アルギネートを含む前記成分ゲル化システムは、凍結乾燥型でもよい。成分の１つは、アルギネート、コラーゲン、ＦＧＦ−１８、及び糖の液体組成物又は凍結乾燥組成物を含むか又はそれからなる（溶液１）。この成分は均一な組成物を形成する。第２の成分は、同様に液体形態の塩を含むか又はそれから成る（溶液２）。２成分ゲル化システム（溶液１と溶液２）が一緒に混合（又は組み合わ）されると、ゲルが形成される。このゲルもまた均一である。好適な実施態様において、前記安定剤は、ショ糖、マンニトール、トレハロース、Ｄ−ソルビトールなどの糖又は糖−アルコールであり、塩はジカチオン塩（例えば、マグネシウム塩、銅塩、亜鉛塩、又はカルシウム塩、例えば塩化カルシウム）である。好適な実施態様において、第１成分−ゲル化システム（すなわち、溶液１）においてアルギネートの濃度は、１〜５重量％又は約１〜約５重量％、好ましくは２．５〜４．５又は約２．５〜約４．５、更により好ましくは３若しくは４重量％又は約３若しくは約４重量％であり、前記コラーゲンの濃度は、０．１〜５μｇ／ｍｌ又は約０．１〜約５μｇ／ｍｌ、好ましくは１若しくは２μｇ／ｍｌ又は約１若しくは約２μｇ／ｍｌであり、ショ糖の濃度は１０〜１００ｍｇ／ｍｌ又は約１０〜約１００ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは３０〜７０ｍｇ／ｍｌ又は約３０〜約７０ｍｇ／ｍｌ、例えば３０、４０、５０、６０、若しくは７０μｇ／ｍｌ、又は約３０、約４０、約５０、約６０、又は約７０μｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは７０ｍｇ／ｍｌである。第２成分−ゲル化システム（すなわち溶液２）中の塩溶液の濃度は、１〜２０μｇ／ｍｌ又は約１〜約２０μｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌである。一緒に混合されると、溶液１：溶液２の体積比は、５：１〜１：２、好ましくは２：１である（凍結乾燥製剤の場合、溶液１の体積は、凍結乾燥プロセス前と考えられる）。好ましくは、ＦＧＦ−１８は、以下からなる群から選択される：１）配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基２０７（Ａｌａ）を含むか又はそれから成る配列に対応する、ヒトＦＧＦ−１８の成熟型を含むか又はそれから成るポリペプチド、２）配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基１９６（Ｌｙｓ）を含むか又はそれから成る、ヒトＦＧＦ−１８の切断型を含むか又はそれから成るポリペプチド、及び３）配列番号２を含むか又はそれから成るポリペプチド。より好ましくは、ＦＧＦ−１８は、後に定義されるスプリフェルミン（sprifermin）である。第１成分ゲル化システムは、緩衝液、及び／又は任意の他の賦形剤をさらに含んでよい。
【００１４】
溶液１は好ましくは、溶液２と同時注入されてイン・サイチュでヒドロゲルを形成する。
【００１５】
第２の態様において本発明は、ＦＧＦ−１８の均一なヒドロゲルを調製するための方法であって、
１）アルギネート、コラーゲン、及び等張剤／安定剤と一緒にＦＧＦ−１８を含むか又はそれから成る溶液を調製し、そして
２）塩を含むか又はそれから成る溶液２を調製し、そして
３）両方の溶液を同時注入してゲルを形成する、工程を含み、
ここで、前記等張剤／安定剤は、ショ糖、マンニトール、トレハロース、Ｄ−ソルビトールなどの糖又は糖−アルコールであり、塩はジカチオン塩、例えば、マグネシウム塩、銅塩、亜鉛塩、又はカルシウム塩（例えば塩化カルシウム）である。好ましくは最終製剤のｐＨは、６〜８又は約６〜約８、さらに詳しくは７又は約７で維持される。好適な実施態様において、ＦＧＦ−１８は、以下からなる群から選択される：１）配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基２０７（Ａｌａ）を含むか又はそれから成る配列に対応する、ヒトＦＧＦ−１８の成熟型を含むか又はそれから成るポリペプチド、２）配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基１９６（Ｌｙｓ）を含むか又はそれから成る、ヒトＦＧＦ−１８の切断型を含むか又はそれから成るポリペプチド、及び３）配列番号２を含むか又はそれから成るポリペプチド。より好ましくはＦＧＦ−１８は、後に定義されるスプリフェルミンである。溶液１は、緩衝液、及び／又は任意の他の賦形剤をさらに含んでよい。
【００１６】
第３の態様において本発明は、医薬的又は獣医学的使用のための製品であって、
１）アルギネート、コラーゲン、ＦＧＦ−１８タンパク質、及び等張剤／安定剤（溶液１）を含む第１の容器と
２）塩（溶液２）を含む第２の容器と、
を含む、製品を提供し、
ここで、前記等張剤／安定剤は、ショ糖、マンニトール、トレハロース、Ｄ−ソルビトールなどの糖又は糖−アルコールであり、塩はジカチオン塩、例えば、マグネシウム塩、銅塩、亜鉛塩、又はカルシウム塩（例えば塩化カルシウム）である。好ましくは、ＦＧＦ−１８は、以下からなる群から選択される：１）配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基２０７（Ａｌａ）を含むか又はそれから成る配列に対応する、ヒトＦＧＦ−１８の成熟型を含むか又はそれから成るポリペプチド、２）配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基１９６（Ｌｙｓ）を含むか又はそれから成る、ヒトＦＧＦ−１８の切断型を含むか又はそれから成るポリペプチド、及び３）配列番号２を含むか又はそれから成るポリペプチド。より好ましくはＦＧＦ−１８は、後に定義されるスプリフェルミンである。溶液１は、緩衝液及び／又は任意の他の賦形剤をさらに含んでよい。次に各容器の内容物は、同時注入時に一緒にイン・サイチュで混合される。好ましくは前記製品の第１の容器と第２の容器は、２重チャンバー又は２重注入システムの２つのコンパートメントである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】３重量％のアルギネート系ゲル：プラセボ（ＦＧＦ無し）、アルギネート溶液中にＦＧＦ−１８  ５４ｍｃｇ／ｍｌを含むもの（ＦＧＦ（５４）有り）、アルギネート溶液中にＦＧＦ−１８  ５４０ｍｃｇ／ｍｌを含むもの（ＦＧＦ（５４０）有り）に、ついて行った周波数掃引試験を示す。
【図２】４重量％のアルギネート系ゲル：プラセボ（ＦＧＦ無し）、アルギネート溶液中にＦＧＦ−１８  ５４ｍｃｇ／ｍｌを含むもの（ＦＧＦ（５４）有り）、アルギネート溶液中にＦＧＦ−１８  ５４０ｍｃｇ／ｍｌを含むもの（ＦＧＦ（５４０）有り）に、ついて行った周波数掃引試験を示す。
【図３】３重量％の薬剤等級（PharmaGrade）アルギネート系ゲル：プラセボ（ＦＧＦ無し）、アルギネート溶液中にＦＧＦ−１８  ５４ｍｃｇ／ｍｌを含むもの（ＦＧＦ（５４）有り）、アルギネート溶液中にＦＧＦ−１８  ５４０ｍｃｇ／ｍｌを含むもの（ＦＧＦ（５４０）有り）、について行った周波数掃引試験を示す。
【図４】４重量％の薬剤等級（PharmaGrade）アルギネート系ゲル：プラセボ（ＦＧＦ無し）、アルギネート溶液中にＦＧＦ−１８  ５４ｍｃｇ／ｍｌを含むもの（ＦＧＦ（５４）有り）、アルギネート溶液中にＦＧＦ−１８  ５４０ｍｃｇ／ｍｌを含むもの（ＦＧＦ（５４０）有り）、について行った周波数掃引試験を示す。
【図５】非ＰＧアルギン酸ナトリウムを用いて調製された、プラセボ（ＦＧＦ無し）と、活性なアルギネート系ゲル（ＦＧＦ有り）との膨潤比を示す。
【図６】非ＰＧアルギン酸ナトリウムを用いて調製された、プラセボ（ＦＧＦ無し）と、Ｉ型コラーゲンの無い活性なアルギネート系ゲル（ＦＧＦ有り）との膨潤比を示す。
【図７】ＰＧアルギン酸ナトリウムを用いて調製された、候補プラセボ（ＦＧＦ無し）と、活性なアルギネート系ゲル（ＦＧＦ有り）の膨潤比を示す。
【図８】０、１、又は２ｍｃｇ／ｍｌのＩ型コラーゲンとＦＧＦ−１８  ５４ｍｃｇ／ｍｌとを含む、３重量％又は４重量％のポリマー液体溶液からのアルギネート系ゲルのＳＥＭ画像（１００×）を示す。
【図９】（ａ）ＨＴＢ９４細胞を用いて７２時間インキュベーション後の、２μｇ／ｍｌのＩ型コラーゲンを有するアルギネート系ゲル、及び（ｂ）ＨＴＢ９４細胞を用いて１４４時間インキュベーション後の、コラーゲンの無いアルギネート系ゲルについて、ＣＬＳＭにより得られた３Ｄ画像の断面図を示す。白は、ローダミンＢで標識されたＨＴＢ９４。右側：ゲルの上面；左側；ゲルの底。
【図１０】２ｍｃｇ／ｍｌのＩ型コラーゲンを有する４重量％アルギネートゲルのＦＧＦ−１８バイオアッセイを示す。
【図１１ａ】配列番号１に対応するヒトＦＧＦ−１８の配列を示す。
【図１１ｂ】配列番号２に対応するスプリフェルミンの配列を示す。
【図１２】通常の保存条件（５℃）、加速条件（２５℃）、及びストレス条件（４０℃）での３ヵ月安定性における、凍結乾燥（ＦＤ）製剤のｐＨの経時的変化を示す。
【図１３】通常の保存条件（５℃）、加速条件（２５℃）、及びストレス条件（４０℃）での３ヵ月安定性における、凍結乾燥（ＦＤ）製剤の水分含有量％の経時的変化を示す。
【図１４】通常の保存条件（５℃）、加速条件（２５℃）、及びストレス条件（４０℃）での３ヵ月安定性における、凍結乾燥（ＦＤ）製剤のＦＧＦ−１８含有量の経時的変化を示す。
【図１５】通常の保存条件（５℃）、加速条件（２５℃）、及びストレス条件（４０℃）での３ヵ月安定性における、凍結乾燥（ＦＤ）製剤のアルギネート含有量の経時的変化を示す。
【図１６ａ】通常の保存条件（５℃）、加速条件（２５℃）、及びストレス条件（４０℃）での３ヵ月安定性における、凍結乾燥（ＦＤ）製剤の、剪断速度１０〜５０ｓ-1内の平均±標準偏差として算出された、固有粘度の経時的変化を示す。
【図１６ｂ】通常の保存条件（５℃）、加速条件（２５℃）、及びストレス条件（４０℃）での、時間０と３ヵ月安定性後における、凍結乾燥（ＦＤ）製剤の固有剪断粘度に対する剪断速度の影響を示す。
【図１７ａ】機械的特性評価を示す。通常の保存条件（５℃）、加速条件（２５℃）、及びストレス条件（４０℃）での３ヵ月安定性における、凍結乾燥（ＦＤ）製剤の貯蔵弾性率（Ｇ’）の経時的変化を示す。ＸＸＸ。
【図１７ｂ】機械的特性評価を示す。通常の保存条件（５℃）、加速条件（２５℃）、及びストレス条件（４０℃）での、時間０と３ヵ月安定性における、凍結乾燥（ＦＤ）製剤に対して行われた周波数掃引試験を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義
−  本明細書において用語「ＦＧＦ−１８タンパク質」又は「ＦＧＦ−１８」は、ヒトＦＧＦ−１８タンパク質の少なくとも１つの生物活性を維持しているタンパク質であることが意図される。ＦＧＦ−１８は、未変性でも、成熟型でも、切断型でもよい。ヒトＦＧＦ−１８タンパク質の生物活性は、特に骨芽細胞活性（国際公開第９８／１６６４４号を参照）又は軟骨形成（国際公開第２００８／０２３０６３号を参照）の上昇を含む。未変性の又は野生型のヒトＦＧＦ−１８は、関節軟骨の軟骨細胞により発現されるタンパク質である。ヒトＦＧＦ−１８は最初ｚＦＧＦ−５と呼ばれ、国際公開第９８／１６６４４号に詳細に記載されている。配列番号１は未変性のヒトＦＧＦ−１８のアミノ酸配列に対応し、アミノ酸残基１（Ｍｅｔ）〜２７（Ａｌａ）からなるシグナルペプチドを有する。ヒトＦＧＦ−１８の成熟型は、配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基２０７（Ａｌａ）からのアミノ酸配列（１８０アミノ酸）に対応する。
【００１９】
本発明においてＦＧＦ−１８は、例えば国際公開第２００６／０６３３６２号に教示された組換え法により製造することができる。その発現系及び条件に応じて、本発明のＦＧＦ−１８は、出発メチオニン（Ｍｅｔ）残基又は分泌のためのシグナル配列を有する組換え宿主細胞で発現される。大腸菌（E. coli）などの原核生物宿主中で発現される時、ＦＧＦ−１８は、その配列のＮ末端に追加のＭｅｔ残基を含む。例えばヒトＦＧＦ−１８のアミノ酸配列は、大腸菌（E. coli）で発現される時、配列番号１のＮ末端のＭｅｔ残基（１位）で開始され、残基２８（Ｇｌｕ）〜残基２０７（Ａｌａ）が続く。
【００２０】
−  本明細書において用語ＦＧＦ−１８の「切断型（truncated form）」は、配列番号１の残基２８（ＧＬｕ）〜１９６（Ｌｙｓ）を含むか又はそれから成るタンパク質を指す。好ましくはＦＧＦ−１８タンパク質の切断型は、「ｔｒＦＧＦ−１８」と呼ばれるポリペプチド（１７０アミノ酸）であり、これは、野生型ヒトＦＧＦ−１８のＭｅｔ残基（Ｎ末端中）から始まり、アミノ酸残基２８（ＧＬｕ）〜１９６（Ｌｙｓ）が続く。ｔｒＦＧＦ−１８のアミノ酸配列は配列番号２に示される（配列番号２のアミノ酸残基２〜１７０は、配列番号１のアミノ酸残基２８〜１９６に対応する）。ｔｒＦＧＦ−１８はヒトＦＧＦ−１８の組換え切断型であり、大腸菌（E. coli）により産生される（国際公開第２００６／０６３３６２号を参照）。この特殊な型のＦＧＦ−１８の国際一般名（The International Nonproprietary Name：ＩＮＮ）はスプリフェルミンである。スプリフェルミンは、成熟ヒトＦＧＦ−１８と同様の活性を示すことが証明されており、例えばこれは、軟骨細胞増殖と軟骨沈着を上昇させて、種々の軟骨組織の修復と再建につながる（国際公開第２００８／０２３０６３号を参照）。
【００２１】
−  用語「活性分子」及び「活性成分」は、活性医薬成分（Active Pharmaceutical Ingredient）、すなわちＡＰＩに関する。好適なＡＰＩは、本発明の文脈において、ＦＧＦ−１８である。
【００２２】
−  用語「ゲル」又は「ヒドロゲル」は、本出願において互換的に使用される。これらは、医薬製剤として有用な３Ｄマトリックス、又は足場を指す。これらは固体の足場である。
【００２３】
−  本明細書で用いられる用語「均一 (homogeneous)」は、製剤の種々の成分が一緒に混合、ブレンド、攪拌、又は溶融され、すなわちこれらが成分の別の層を形成しないことを意味する。
【００２４】
−  用語「アルギネート (alginate)」は、アルギン酸 (alginic acid)又はアルギン (algin)としても知られており、任意の形態のアルギネートを指す。これは、特にジカチオン塩とともに使用される時、周知のゲル化剤である。本発明の文脈において使用することができる形態の一つは、アルギン酸ナトリウムである。
【００２５】
−  用語「コラーゲン」は、天然に存在するタンパク質の一群である。ほぼ３０種の異なる形態のコラーゲンが存在するが、主要なものはＩ型のコラーゲンである。Ｉ型のコラーゲン並びにII型のコラーゲンは、本発明の文脈において使用することができる好適な形態である。しかし、他の形態のコラーゲンも使用することができる。
【００２６】
−  本明細書において用語「アルギネート／コラーゲン」は、アルギネートとコラーゲンとの組み合わせを指す。
【００２７】
−  用語「ジカチオン塩 (dicationic salt)」は、特に限定されないが、例えばマグネシウム、亜鉛、又はカルシウムを含む塩を指す。塩化マグネシウム、塩化銅、塩化亜鉛、又は塩化カルシウムが含まれる。好ましくは本発明のジカチオン塩は、ポリカチオン塩ではなく、ポリカチオン成分から得られるもの（例えば、国際公開第２０１２／１１３８１２号に開示されたもの）でもない。
【００２８】
−  本明細書において用語「安定な (stable)」溶液又は製剤は、その中のタンパク質の分解、修飾、凝集、生物活性の喪失などの程度が、許容される程度に制御され、時間とともに許容できないほど上昇するものではない１つの溶液又は製剤である。好ましくはこの製剤は、室温で少なくとも１２ヵ月の期間にわたって、ＦＧＦ−１８活性の少なくとも８０％超を保持する。ＦＧＦ−１８を含む本発明の安定化された製剤は、室温で又は２〜８℃で貯蔵される時、少なくとも約１２ヵ月、１８ヵ月、より好ましくは少なくとも２０ヵ月、さらにより好ましくは約２４ヵ月の寿命を有する。本発明のＦＧＦ−１８製剤の安定性を追跡するための方法は、当該分野において入手可能である。
【００２９】
−  本明細書において用語「安定剤 (stabilizing agent)」、「安定剤 (stabilizer)」又は「等張剤 (isotonicity agent)」は、生理学的に許容され、製剤に適切な安定性／張性を付与する化合物である。これは特に、製剤と接触している細胞膜を横切る水の正味の流れを防止する。凍結乾燥（freeze-drying）(リュフィリゼーション (lyophilisation))プロセス中、安定剤はまた凍結保護剤(cryoprotectant) (すなわちリオプロテクタント (lyoprotectant))としても有効である。グリセリンなどの化合物は一般的に、このような目的に使用される。他の適切な安定剤には、特に限定されないが、アミノ酸又はタンパク質（例えばグリシン又はアルブミン）、塩（例えば塩化ナトリウム）、及び糖又は糖−アルコール（例えばブドウ糖、マンニトール、トレハロース、ショ糖、Ｄ−ソルビトール、又は乳糖）が挙げられる。本発明において好適な安定性／等張化剤は、糖、さらにより好ましくはショ糖である。
【００３０】
−  本明細書において用語「緩衝液」は、医薬的又は獣医学的使用のための製剤中で安全であることが知られており、製剤のｐＨを製剤について所望されるｐＨ範囲に維持又は制御する作用を有する、化合物の溶液を指す。ｐＨを中程度に酸性のｐＨ〜中程度に塩基性のｐＨに制御する許容される緩衝液は、特に限定されないが、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、アルギニン、ＴＲＩＳ、及びヒスチジン緩衝液を含む。「ＴＲＩＳ」は、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、及びその任意の医薬的に許容し得る塩を指す。好適な緩衝液は、ヒスチジン緩衝液でもよい。
【００３１】
−  本明細書において用語「溶媒」は、水性又は非水性の液体溶媒を指す。溶媒の選択は特に、その溶媒上の薬剤化合物の溶解度及び投与様式に依存する。水性溶媒は、水のみからなってもよく、又は水と１つ以上の混和性溶媒からなってもよく、糖、緩衝液、塩、又は他の賦形剤などの溶解された溶質を含んでもよい。より一般的に使用される非水性溶媒は、短鎖有機アルコール、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、短鎖ケトン、例えばアセトン、及び多価アルコール、例えばグリセロールである。本発明において好適な溶媒は、水又は食塩水溶媒などの水性溶媒である。
【００３２】
−  本明細書において用語「バイアル」又は「容器」は、アルギネート／コラーゲンを液体の形態で、又は凍結乾燥型で保持するのに適した広義のリザーバーを指す。本発明において使用し得るバイアルの例は、シリンジ、アンプル、カートリッジ、又は、注射、好ましくは関節内注射を介して患者にＦＧＦ−１８製剤を送達するのに適した他のリザーバーを含む。あるいは、アルギネート／コラーゲン溶液を保持するバイアル及び塩を保持するバイアルは、２重チャンバーシステム（例えばシリンジ又はカートリッジ、２重チャンバーシリンジ又は２重針注入装置など）の２つのコンパートメントとして提示される。関節内投与用の製品をパッケージするのに適したバイアルは、当該分野で公知であり認識されている。
【００３３】
−  本明細書において用語「軟骨障害」は、外傷又は軟骨疾患に起因する損傷から生じる障害を包含する。本明細書に記載のＦＧＦ−１８製剤の投与により治療し得る軟骨障害の例は、特に限定されないが、骨関節炎又は関節リウマチなどの関節炎、及び軟骨損傷を含む。
【００３４】
−  用語「骨関節炎」は、関節炎の最も一般的な形態を意味するのに使用される。これは、軟骨の破壊によって引き起こされることがある。軟骨の破片は割れて、骨の間の関節の痛みや腫れを引き起こすことがある。時間が経つにつれて、軟骨は完全に摩耗し、骨が一緒にこすれるであろう。骨関節炎はすべての関節に影響を与え得るが、通常は手や体重を支える関節（例えば股関節、膝関節、足、背骨）に影響を与える。好適な例において骨関節炎は、膝骨関節炎又は股関節骨関節炎でもよい。当業者は、当該分野で使用される骨関節炎分類法、特にＯＡＲＳＩ評価システム（例えば、Custers et al., 2007を参照）を充分認識している。骨関節炎は、本発明のＦＧＦ−１８化合物を投与することによって治療することができる好適な軟骨障害の一つである。
【００３５】
−  本明細書において用語「軟骨損傷」は、特に外傷から生じる軟骨障害又は軟骨損傷である。外傷性機械的破壊の結果として、特に事故又は手術（例えば微小破壊技術）により、軟骨損傷が発生することがある。また関節組織のスポーツ関連の損傷又はスポーツ関連の摩耗も、この定義の範囲内であると考えられる。
−  用語「μｇ」又は「ｍｃｇ」は互換的に使用され、質量のＳＩ単位の一部を指す。
【００３６】
発明の詳細な説明
本発明の主要な目的は、アルギネート、コラーゲン、ＦＧＦ−１８タンパク質、安定剤としての糖、及び塩を含むか又はそれらから成るアルギネート／コラーゲンゲル製剤（又はヒドロゲル）である。前記ヒドロゲルは、均一である。このヒドロゲルは、緩衝液及び／又は任意の他の賦形剤をさらに含んでよい。好適な実施態様において安定剤は、糖又は糖−アルコール、例えばショ糖、マンニトール、トレハロース、又はＤ−ソルビトールであり、緩衝液はジカチオン塩、例えばマグネシウム塩、銅塩、亜鉛塩、又はカルシウム塩（例えば塩化カルシウム）である。
【００３７】
前記ヒドロゲルは、軟骨レベルでの注射に適している。好ましくはＦＧＦ−１８タンパク質は、以下からなる群から選択される：１）配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基２０７（Ａｌａ）を含むか又はそれから成る配列に対応する、ヒトＦＧＦ−１８の成熟型を含むか又はそれから成るポリペプチド、２）配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基１９６（Ｌｙｓ）を含むか又はそれから成る、ヒトＦＧＦ−１８の切断型を含むか又はそれから成るポリペプチド、及び３）配列番号２を含むか又はそれから成るポリペプチド。より好ましくはＦＧＦ−１８は、スプリフェルミンである。
【００３８】
注射可能な均一なヒドロゲルを使用することの利点は、固体足場を使用する侵襲的手術の必要性無しで、軟骨欠損に、すでにＦＧＦ−１８を含有する足場（又は足場の成分）を注射できる可能性である。好ましくは、ヒドロゲルのこのような注射は関節鏡により行われる。
【００３９】
最も好ましくは本発明の均一なヒドロゲルは、２つの溶液［１つはポリマー（本発明ではアルギネートシステム；溶液１）を含む溶液で、他の１つはイオン（ここでは、塩の形態；溶液２）を含む溶液］から調製され、この２つの溶液を混合する（又は組み合わせる）ことにより、注入時にイン・サイチュで形成される。２つの溶液の混合（又は組み合わせ）は、好ましくは同時注入により行われる。溶液１は、緩衝液、及び／又は任意の他の賦形剤をさらに含んでよい。
【００４０】
好適な実施態様において本発明は、いったん患者に投与されると、イオン濃度変化によりゲル化過程を受けることができる均一な液体ポリマー溶液の使用に関する。別の実施態様において、ポリマー溶液は凍結乾燥型でもよい。ポリマー溶液がこのような凍結乾燥型である時、前記溶液は任意選択的に、凍結保護剤をさらに含んでよい。公知の凍結保護剤は、例えば糖、及び一般にポリオール、例えばショ糖、マンニトール、トレハロース、又はＤ−ソルビトールである。
【００４１】
溶液１が凍結乾燥型である場合、凍結乾燥は好ましくは通常の方法を使用して行われる。
【００４２】
溶液１中のＦＧＦ−１８の濃度は、好ましくは０．１〜３００ｍｃｇ／ｍｌ又は約０．１〜約３００ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、５４、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、若しくは３００ｍｃｇ／ｍｌ、又は約０．１、約１、約５、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約５４、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、若しくは約３００ｍｃｇ／ｍｌである。より好ましくは、ＦＧＦ−１８は、０．１〜１００ｍｃｇ／ｍｌ又は約０．１〜約１００ｍｃｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは１０〜６０ｍｃｇ／ｍｌ又は約１０〜約６０ｍｃｇ／ｍｌである。ＦＧＦ−１８は、製剤化中に発生し得るタンパク質喪失の可能性を防ぐために、５％を超えて添加することができる。例えば、３０ｍｃｇ／ｍｌのＦＧＦ−１８濃度については、化合物は３１．５ｍｃｇ／ｍｌの量で添加することができる。
【００４３】
溶液１中のゲル化成分すなわちアルギネートは、１〜５重量％又は約１〜約５重量％、好ましくは２．５〜４．５重量％又は約２．５〜約４．５重量％、さらに好ましくは３若しくは４重量％又は約３若しくは約４重量％である。本発明の安定剤は好ましくは、糖又は糖−アルコール、例えばショ糖、マンニトール、トレハロース、又はＤ−ソルビトールである。好適な糖はショ糖である。好ましくは溶液１中の安定剤の濃度は、１０〜１００ｍｇ／ｍｌ又は約１０〜約１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは３０〜７０ｍｇ／ｍｌ又は約３０〜約７０ｍｇ／ｍｌ、例えば３０、４０、５０、６０、若しくは７０ｍｇ／ｍｌ、又は約３０、約４０、約５０、約６０、若しくは約７０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは７０ｍｇ／ｍｌ又は約７０ｍｇ／ｍｌである。
【００４４】
溶液１中の本発明のコラーゲンは、好ましくは０．１〜５ｍｃｇ／ｍｌ又は約０．１〜約５ｍｃｇ／ｍｌ、より好ましくは１〜２ｍｃｇ／ｍｌ又は約１〜約２ｍｃｇ／ｍｌ、さらに詳しくは１若しくは２ｍｃｇ／ｍｌ又は約１若しくは約２ｍｃｇ／ｍｌである。
【００４５】
第２成分ゲル化システム（すなわち溶液２）において塩は、好ましくはジカチオン塩、例えばマグネシウム塩、銅塩、亜鉛塩、又はカルシウム塩（例えば塩化カルシウム）である。塩溶液の濃度は、１〜２０ｍｇ／ｍｌ又は約１〜約２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ又は約１０ｍｇ／ｍｌである。
【００４６】
好適な実施態様において、溶液１は、０．１〜１００ｍｃｇ／ｍｌ又は約０．１〜約１００ｍｃｇ／ｍｌのＦＧＦ−１８、４重量％又は約４重量％のアルギネート、７０ｍｇ／ｍｌ又は約７０ｍｇ／ｍｌのショ糖、及び２ｍｃｇ／ｍｌ又は約２ｍｃｇ／ｍｌのコラーゲンを含むか又はそれから成り；及び溶液２は、１０ｍｇ／ｍｌ又は約１０ｍｇ／ｍｌのジカチオン塩（例えば塩化カルシウム）を含むか又はそれから成る。溶液１は、緩衝液、及び／又は他の賦形剤をさらに含んでよい。溶液１は均一である。
【００４７】
一緒に混合されると、溶液１：溶液２の体積比は、５：１〜１：２、より好ましくは２：１である（凍結乾燥型の場合、溶液１の体積は凍結乾燥プロセス前であると考えられる）。
【００４８】
いったん混合されると、各成分の最終濃度は好ましくは以下の通りである：
−  ＦＧＦ−１８：０．００００６〜０．２％ｗ／ｖ、例えば０．００３６％ｗ／ｖ（実施例欄に示されたＦＧＦ−１８濃度に基づいて、ＦＧＦ−１８が混合前に０．１〜３００ｍｃｇ／ｍｌである時）、
−  アルギネート：０．６〜３．３３％ｗ／ｖ、例えば２．６７％ｗ／ｖ（アルギネートが混合前に４重量％である時）、
−  コラーゲン：０，００００６〜０．００３％ｗ／ｖの範囲、例えば０．０００１３３％ｗ／ｖ（コラーゲンが混合前に２ｍｃｇ／ｍｌである時）、
−  安定剤：０．６〜６％ｗ／ｖ、例えば４．６７％ｗ／ｖ（例えばショ糖が混合前に７０ｍｇ／ｍｌである時）、
−  ジカチオン塩：０．０３３〜０．６６％ｗ／ｖ、例えば０．３３％ｗ／ｖ（塩が混合前に１０ｍｇ／ｍｌである時）。
【００４９】
好適な実施態様においては、最終製剤のｐＨは、６〜８又は約６〜約８、さらに詳しくは７又は約７である。
【００５０】
本発明はさらに、ＦＧＦ−１８の均一なヒドロゲルを調製するための方法であって、
１）アルギネート、コラーゲン、及び安定剤と一緒に、ＦＧＦ−１８を含むか又はそれから成る第１の溶液（溶液１）を調製する工程、
２）塩を含むか又はそれから成る第２の溶液（溶液２）を調製する工程、及び
３）両方の溶液を同時注入して、ゲルを形成する工程、
を含み、
ここで、前記安定剤は、糖又は糖−アルコール、例えばショ糖、マンニトール、トレハロース、又はＤ−ソルビトールであり、塩はジカチオン塩、例えばマグネシウム塩、銅塩、亜鉛塩、又はカルシウム塩（例えば塩化カルシウム）である。溶液１は、緩衝液及び／又は任意の他の賦形剤をさらに含んでよい。溶液１は均一である。好適な実施態様において、最終製剤のｐＨは、６〜８又は約６〜約８、及びさらに詳しくは７又は約７である。好ましくは、ＦＧＦ−１８は、以下からなるからなる群から選択される：１）配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基２０７（Ａｌａ）を含むか又はそれから成る配列に対応する、ヒトＦＧＦ−１８の成熟型を含むか又はそれから成るポリペプチド、２）配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基１９６（Ｌｙｓ）を含むか又はそれから成る、ヒトＦＧＦ−１８の切断型を含むか又はそれから成るポリペプチド、及び３）配列番号２を含むか又はそれから成るポリペプチド。より好ましくはＦＧＦ−１８は、本明細書で定義されるスプリフェルミンである。
【００５１】
化合物の各々（すなわち、ＦＧＦ−１８、アルギネート、コラーゲン、安定剤、及び塩）は、上記した濃度、ｐＨ、及び／又は比率のいずれかに従って使用することができる。好ましくは、溶液１：溶液２の比率（体積対体積、すなわちｖ：ｖ）は、１：２〜５：１又は約１：２〜約５：１、さらに詳しくは２：１又は約２：約１である（凍結乾燥型の場合、溶液１の体積は、凍結乾燥プロセス前であると考えられる）。
本発明のヒドロゲルの溶液１が凍結乾燥型である時、これは、工程３の前に（すなわち、同時注入前に）再構成される (reconstituted)。
【００５２】
第３の態様において本発明は、
１）アルギネート、コラーゲン、ＦＧＦ−１８タンパク質、及び安定剤（溶液１）を含むか又はそれから成る第１の容器、及び
２）塩（溶液２）を含むか又はそれから成る第２の容器
を含む、医薬的又は獣医学的使用のための製品を提供し、
ここで、安定剤は、糖又は糖−アルコール、例えばショ糖、マンニトール、トレハロース、又はＤ−ソルビトールであり、塩はジカチオン塩、例えばマグネシウム塩、銅塩、亜鉛塩、又はカルシウム塩（例えば塩化カルシウム）である。溶液１は、緩衝液及び／又は任意の他の賦形剤をさらに含んでよい。溶液１は均一である。好ましくは、ＦＧＦ−１８は、以下からなる群から選択される：１）配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基２０７（Ａｌａ）を含むか又はそれから成る配列に対応する、ヒトＦＧＦ−１８の成熟型を含むか又はそれから成るポリペプチド、２）配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基１９６（Ｌｙｓ）を含むか又はそれから成る、ヒトＦＧＦ−１８の切断型を含むか又はそれから成るポリペプチド、及び３）配列番号２を含むか又はそれから成るポリペプチド。より好ましくはＦＧＦ−１８は、本明細書で定義されるスプリフェルミンである。
【００５３】
化合物の各々（すなわち、ＦＧＦ−１８、アルギネート、コラーゲン、安定剤、及び塩）は、上記した濃度、ｐＨ、及び／又は比率のいずれかに従って使用することができる。好ましくは、溶液１：溶液２の体積比（ｖ：ｖ）は、１：２〜５：１又は約１：２〜約１：２〜５：１５：１、さらに詳しくは２：１又は約２：約１である（凍結乾燥型の場合、溶液１の体積は、凍結乾燥プロセス前であると考えられる）。各容器の内容物は、同時の注入（例えば、同時注射）時に一緒にイン・サイチュで混合される。
【００５４】
好ましくは、ＦＧＦ−１８製剤を保持する容器及び塩を保持する容器は、２重チャンバーシステム又は２重注入システム（例えばシリンジ又はカートリッジ）の２つのコンパートメントに対応する。
【００５５】
ポリマー溶液（すなわち溶液１）が凍結乾燥型である時、製品は、再構成に必要な溶媒、例えば水又は食塩水溶液（例えば、注射用０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム）を含むか又はそれから成る第３の容器を、さらに含んでよい。
【００５６】
また、好ましくはイン・サイチュで本発明のヒドロゲルを形成するための説明書を提供する包装材料も記載される。
【００５７】
重要なことに、２つの溶液の同時注入を可能にするシリンジコネクターを使用してゲルが形成される時、残存する液相はどのポリマー濃度でも観察されなかった。実際、２つの溶液の状況的注入は、２つの流れのより迅速でより均一な混合を可能にし、即時ゲル化につながる。
【００５８】
本発明のヒドロゲルの異なる成分は、少なくとも約１２ヶ月〜約２４ヵ月保存することができる。好適な保存条件下では、最初に使用する前に、製剤は、明るい光を避けて（好ましくは暗所で）、冷蔵温度（２〜８℃又は約２〜約８℃）で保持される。
【００５９】
本発明のヒドロゲルは、注入中に調製される必要がある。
【００６０】
本発明のヒドロゲルの溶液１が凍結乾燥型である時、これは、使用前に再構成しなければならない。これは好ましくは、使用前に、すなわち溶液２と組み合わせる（混合する）前に、従って注入前に、無菌条件下で、水又は食塩水溶液（例えば、０．９％ｗ／ｖの注射用塩化ナトリウム）などの溶媒を用いて、再構成される。再構成後、その体積は好ましくは凍結乾燥前と同じであり、例えば約０．５ｍｌ〜約５ｍｌ、より好ましくは０．５、１、若しくは２ｍｌ、又は約０．５、約１、若しくは約２ｍｌである。このシステムは、例えばこれが、注射に準備できる前３０分間中に、溶解され均一にされなければならない。前記溶液は、再構成の１時間以内に使用すべきである。
【００６１】
本発明は、特に単回使用のための、医薬的又は獣医学的使用に適した、ＦＧＦ−１８を含む均一なヒドロゲルを提供する。本発明のＦＧＦ−１８を含むヒドロゲルは、軟骨修復を改善するための、又は骨関節炎又は軟骨損傷などなどの軟骨疾患の治療のための、投与に使用することができる。
【００６２】
これらの均一なヒドロゲルは、注入及び代替送達システムにおける使用に適している。特に好適な実施態様において、本発明の製剤は関節内（ｉ.ａ.）注入のためである。これらは欠陥部への直接注入によって投与することができ、ここで、ゲルは好ましくはイン・サイチュで形成される。本発明の好適な実施態様において、ｉ.ａ.投与は、股関節、膝、肘、手首、足首、脊椎、脚、指、つま先、手、肩、肋骨、肩甲骨、大腿、すね、かかとの関節から選択される関節に、及び背骨の骨張った点に沿って行われる。さらに別の好適な実施態様において、ｉ.ａ.投与は、股関節又は膝関節で行われる。
【００６３】
以下の実施例は、本発明の液体製剤及びヒドロゲルの調製をさらに例示するために提供される。本発明の範囲は、単に以下の実施例からなるものと解釈してはならない。
【実施例】
【００６４】
材料
本実施例の組換え切断型ＦＧＦ−１８（ｔｒＦＧＦ−１８又はスプリフェルミン）は、国際公開第２００６／０６３３６２号に記載された技術に従って、大腸菌（E. coli）での発現により自家調製された。以下の実施例では、スプリフェルミンとＦＧＦ−１８は交換可能に使用される。
【００６５】
本実施例で使用されるその他の主要な物質は、以下のとおりである：
−  アルギン酸ナトリウム、Sigma Aldrich, A2158。
−  アルギン酸ナトリウム、FMC BioPolymer Keltone LVCR (薬剤等級アルギネート)
−  ショ糖, Merck 1.07653.9029
−  ヒトの皮膚からのＩ型コラーゲン、CalbioChem 234149、及びCalbioChem 234138
−  塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、Merck 1.02382.0250,
−  Ｄ−（＋）−グルコン酸δ−ラクトン、Sigma Aldrich G4750
−  キトサン７５％  ＤＤ  ＨＭＷ、Sigma Aldrich 419419
−  キトサン９５％  ＤＤ  ＬＭＷ、Faravelli 43000
−  キトサン９５％  ＤＤ  ＨＭＷ、Heppe medical 24711。
【００６６】
以下の例は、２種類のヒドロゲル（すなわち、イオン応答性ヒドロゲルと温度感応ヒドロゲル）を報告する。イオン応答性ヒドロゲルは、特に２価カチオンの存在下でヒドロゲルを形成することができるアルギン酸ナトリウムを用いて調製され、一方、温度感受性ヒドロゲルは、特に温度感受性多糖であることが知られているキトサンを用いて調製された（Tomme et al., 2008）。本試験で使用した両方のポリマーは、生体適合性の天然多糖類である。
【００６７】
ゲル化プロセスの前の製剤、及びゲルが形成された後の製剤を明確に区別するために、本項では、それぞれ前者を「液体溶液」そして後者を「ゲル」と呼ぶ。
【００６８】
方法
ゲル化時間と温度
すべての製剤について、ゲル化時間を「傾斜試験 (tilting test)」により評価した。直径３ｃｍのガラス製のシャーレでゲルを調製し、異なる温度でインキュベートした。所定の時間間隔でシャーレを傾け、ゲル化時間は、製剤が流れを示さなくなる時間と見なした。
【００６９】
機械的特性
ヒドロゲルのレオロジー特性を、直径４０ｍｍので円錐−プレート形状（１°の傾き）を有するAR2000レオメーター（TA Instruments）を使用して試験した。試験中に試料がスライドするのを回避するために、両方のプレートに研磨ディスクを塗布した。全ての試料の厚さは、試料の体積に応じて、約１〜２ｍｍに含まれた。溶媒トラップを使用して、水飽和雰囲気を維持して、測定中の溶媒の蒸発を防いた。
【００７０】
シャーレ中の元の液体溶液からヒドロゲルが完全に膨潤した後、試料をレオメーターにのせて、３７℃で２分間平衡化させた。次に試料は、０．１から１００ｒａｄ／ｓの周波数範囲にわたって周波数掃引実験で試験した。振動応力を１０Ｐａに設定し、貯蔵弾性率Ｇ’および損失弾性率Ｇ”を周波数の関数として記録した。
【００７１】
膨潤挙動アッセイ
ヒドロゲルの典型的な特性の１つは、その親水性のために、水溶液の存在下で膨潤できる能力である。ゲルの膨潤挙動を評価するために、これらをモック滑液（ＭＳＦ）中に浸漬し、経時的に重量を測定した。この実験は、底部に０．４μｍの多孔性膜を有する吊りインサートを備えた１２ウェルプレート中で、三重測定で行った。
【００７２】
この試験のために、アルギネートゲルのみを選択した。ゲルは実施例２に記載のように、２００μｌの塩化カルシウム溶液と４００μｌのポリマー液体溶液を混合することにより、５ｍｌのバイアル中に調製し、３７℃で３０分間インキュベートした。次にゲルを、予め秤量した空のインサートに移した。ゲル試料を有するインサートを秤量し、対応する質量を時間０の基準重量とした。ゲルを含むインサートをプレートに入れ、１．５ｍｌのＭＳＦをウェルに加え、インサートの多孔性底部が溶液中に浸漬していることを確認した。プレートはパラフィルムで閉じて、ウェルの蒸発現象を回避し、オービタルシェーカーで３７℃にてインキュベートした。所定の時点で、ゲルを含有するインサートをウェルから取り出した。多孔底部を濾紙でブロッティングすることにより過剰のＭＳＦを除去し、次にゲルを有するインサートを秤量した。ウェル中の溶液を回収し、−８０℃で保存し、新鮮なＭＳＦで置換した。ＭＳＦの組成は、ＰＢＳ緩衝液１×、ｐＨ７．３、Ｆ６８（すなわちポロキサマー１８８）０．２５ｇ／Ｌ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）１重量％、PenStrep 1重量％であった。使用前に、ＭＳＦを０．２２μｍのフィルターを通して濾過した。結果は、膨潤比、すなわち時間ｔでの重量と時刻ｔ＝０での重量との比率として報告した。
【００７３】
走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）分析
いったんゲルが形成されたら、走査電子顕微鏡法を使用してポリマーネットワークの三次元構造を分析した。活性なアルギネート系ゲルは、「ゲル化時間」に関する項で報告された手順に従って、１ｍｌのポリマー液体溶液と０．５ｍｌのカルシウム溶液を混合して、直径３ｃｍのガラスシャーレ中で調製した。次に、得られたゲルを３７℃で３０分間インキュベートした。６つの試料を、３重量％又は４重量％のアルギネートの濃度のポリマー液体溶液（いずれも０、１、又は２μｇ／ｍｌのＩ型コラーゲンを含む）から出発して調製した。次にゲルを４８時間凍結乾燥した。凍結乾燥サイクルは、凍結工程、１次乾燥工程、及び２次乾燥工程を含んた。凍結工程中に、室温から−４５℃への温度勾配を適用し、次に−４５℃の段階を４時間行った。この後に１次乾燥工程が続き、５０ｍＴｏｒｒの圧力で１℃／分の速度で−４５℃から−１０℃への温度勾配を適用し、次に−１０℃で５０ｍＴｏｒｒの段階を２４時間３０分続けた。２次乾燥工程は、２つの段階を含んだ：５０ｍＴｏｒｒの圧力で１℃／分の速度で−１０℃〜２１℃への第１の温度勾配を適用し、次に２１℃で５０ｍＴｏｒｒの段階を１２時間３０分続け、次に５０ｍＴｏｒｒの圧力で１℃／分の速度で２１℃〜３７℃への第２の温度勾配を適用し、次に３７℃で５０ｍＴｏｒｒの段階を６時間続けた。最後に、室温と大気圧に達した。次に各試料を染色し、次にＳＥＭにより分析した。
【００７４】
インビトロ放出試験
膨潤試験に使用したものと同じ試料を、インビトロ放出試験でも分析した。具体的には、−８０℃で保存した回収相（「膨潤挙動アッセイ」のセクションに記載のように）をＨＰＬＣにより分析した。選択された試料は、ビアコア(Biacore)でも分析した（データは示していない）。
【００７５】
動物モデルでのエクスビボ試験
エクスビボ動物モデルで予備試験を行い、アルギネート製剤が実際の膝関節に接着する能力を調べた。試験した製剤は、実施例９に報告される細胞浸潤アッセイの結果に基づいて選択した。具体的には、使用されたモデルは、牛の膝を構成する脛骨の上部と大腿骨の下部とから構成された。微小破壊術を行う際に外科医が作成する孔を模倣するために、芯抜き器を使用して、深さ１ｃｍで直径０．４ｃｍの孔を膝の両方の部分に作成した。次に孔に、最終濃度１．３μｇ／ｍｌのＩ型コラーゲンと３６μｇ／ｍｌのＦＧＦ−１８をゲル中に含有する４重量％のアルギネート製剤を充填した。２つの異なるシリンジ（１つはアルギネート溶液を含有し、１つはカルシウム溶液を含有する）を連結するために、注入用の弁を使用して試験を行った。２つのシリンジのプランジャーを同時に押して、弁が溶液を混合できるようにした。この製剤を直立と逆さまの位置で孔に注入して、異なる可能な現実のシナリオでのインビボ投与の可能性を検証した。３７℃で約２時間インキュベーション後、孔からゲルを取り出して目視検査によりその状態を確認した。
【００７６】
インビトロバイオアッセイ
発光法用の９６ウェルプレート（アッセイプレート）を、５０μＬ／ウェルのアルギン酸ナトリウムの４％溶液と２５μＬ／ウェルの１０ｍｇ／ｍＬ塩化カルシウムの溶液で被覆し、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートして、基底ヒドロゲルの形成を可能にする。
【００７７】
９６ウェルプレート（マスタープレート）の行Ｂ〜行Ｈに、１６０μＬ／ウェルのアッセイ培地を分配した。次に、ＦＧＦ−１８標準物質と試料をアッセイ培地で１０μｇ／ｍｌに希釈し、列の群をレプリカとして見なして三重測定（１００μＬ／ウェル）で行Ａに加える。マルチチャンネルピペットを用いて、行Ａから行Ｈに１：５倍連続希釈を行って、４０μＬを行Ａから行Ｈまで移す。
【００７８】
マスタープレートから２５μＬ／ウェルＦＧＦ−１８標準物質希釈液を、基底ヒドロゲルを被覆した９６ウェルプレート（アッセイプレート）に移し、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートする。
【００７９】
７５ｃｍ２のフラスコに１０，０００，０００ＳＭで播種し、アッセイの前に２４時間飢餓させたＢａＦ３／ＦＧＦＲ３ｃ細胞培養物を、アッセイ培地で８００，０００細胞／ｍＬに希釈し、次に２５μＬ／ウェルを、ＦＧＦ−１８及び基底ハイドロゲルを３７℃、５％ＣＯ２で４８時間被覆したプレートの各ウェルに、加える（２０，０００細胞／ウェル）。
【００８０】
１００μＬ／ウェルの「ATPlite 1 step」試薬を加え、ゆっくりプレートを混合し、発光カウンターで放出される発光を読んで、増殖を明らかにする。
【００８１】
実施例１
予備調製
予備調製作業中に、ｉ.ａ.注射液について許容されるオスモル濃度（目標：３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ）を有する水溶液を得るために、アルギネート又はキトサンに他の賦形剤を混合した。次に液体溶液を、それらのゲル化時間と温度について試験した。５分以内に及び／又は約３７℃の温度でヒドロゲルを形成することができる製剤を、異なる濃度のＦＧＦ−１８を用いてさらに調製した（データは示していない）。
【００８２】
実施例２
イオン応答性ゲルの調製（アルギネート）
総論
ポリマー鎖間の架橋剤として作用する２価カチオン（例えばＣａ2+）の存在下で、ポリマーネットワークを形成してヒドロゲルを生じることができるため、アルギン酸ナトリウムを使用して、イオン応答性ゲルを得た。この製剤は、２つの溶液からなり、１つはポリマーを含有し、他の１つはイオンを含有した。いったん一緒に混合されると、溶液はゲルを形成した。
【００８３】
プラセボと活性ゲルの両方についてカルシウム溶液は同じであり、ミリＱ水中の１０ｍｇ／ｍｌ濃度の塩化カルシウムＣａＣｌ2からなっていた。ポリマー液体溶液中では、アルギネートに加えて、Ｉ型コラーゲンと活性分子（ここではスプリフェルミン）が、オスモル濃度値を調整するためのショ糖とともに添加された。プラセボポリマー液体溶液は、以下のように調製された：ミリＱ水中７０ｍｇ／ｍｌ濃度のショ糖の溶液を調製し、これを使用して、３重量％又は４重量％濃度のアルギン酸ナトリウムを攪拌しながら溶解した。いったんアルギネートが可溶化されたら、塩酸に溶解しミリＱ水で３０μｇ／ｍｌ又は６０μｇ／ｍｌ濃度に希釈したＩ型コラーゲンの溶液を攪拌しながら加えて、ポリマー液体溶液中それぞれ１μｇ／ｍｌ又は２μｇ／ｍｌのコラーゲン濃度が得られた。活性ポリマー液体溶液の調製のために、３重量％又は４重量％濃度のアルギネートを、５４μｇ／ｍｌ濃度のバルクＦＧＦ−１８を含有する７０ｍｇ／ｍｌ濃度のミリＱ水中のショ糖の溶液を用いて溶解した。次に、植物細胞について報告したものと同じ手順でＩ型コラーゲンを加えた。ポリマー液体溶液をカルシウム溶液と２：１（ｖ：ｖ）の比率で混合して、ゲルを調製した。さらに性状解析する前に、ゲルを３７℃で３０分間インキュベートした。
【００８４】
プラセボ製剤の予備スクリーニング：
生理的なイオン量がゲル化プロセスを促進するのに十分ではなかったことを試験した後、２価カチオンＣａ2+を塩化カルシウムの形態で、架橋剤として選択した。不要な石灰化現象の原因である可能性のあるカルシウムの使用を避けるために、塩化マグネシウムも試験したが、この試みは成功しなかった。
【００８５】
次に、可能な製剤のスクリーニングを行い、予備プラセボ製剤を選択した。スクリーニング中、異なるパラメータを考慮し変化させ、例えばアルギネート濃度、ＣａＣｌ2濃度、ポリマーとカルシウム溶液の体積比、他の賦形剤の存在、例えばゲル化の遅延剤として使用されたＤ−（＋）−グルコン酸δ−ラクトン、又はＨＳＡをＰＢＳに加えて、生理学的条件をより模倣させた。ＨＳＡ又はＤ−グルコン酸の存在は、生じるゲルに大きな影響を与えないことが見出され、従って、有用でない成分の添加を避けるために、これらは廃棄された。
【００８６】
また、試験された値のうち最適なアルギネートの濃度は２．５重量％〜４．５重量％、特に３重量％又は４重量％であることも観察された。実際に、より低いアルギネート濃度、すなわち１重量％または２重量％は、完全なゲル形成を示さなかったため、適用されなかった。一方、高すぎるアルギネート濃度（５重量％）は非常に粘稠なポリマー液体溶液を与え、取り扱いが非常に困難であった。
【００８７】
選択された予備プラセボ製剤は、水中の３重量％濃度のアルギネートと、ＰＢＳ中で２：１（ｖ：ｖ）の比率の１０ｍｇ／ｍｌ濃度のＣａＣｌ2のカルシウム溶液との液体溶液からなっていた。
【００８８】
ＦＧＦ−１８の添加
活性な製剤を得るために、２つの溶液へのＦＧＦ−１８の添加の試験をした。以下のすべての試験において、２つの溶液の比を、２：１体積／体積のアルギネート溶液対カルシウム溶液で一定に保った。アルギネート溶液へのＦＧＦ−１８アルギネート溶液の添加は、目視検査によって検出される沈殿現象を引き起こした。可能な解決策として、アルギネートは、０．２５ｇ／ＬのＦ６８界面活性剤を含有するＰＢＳ緩衝液に溶解した。しかしそれでもまだ沈殿が起きていた。この問題を克服するために、アルギネートの可溶化の前に、ＦＧＦ−１８を緩衝液に添加した。こうして、ポリマー溶液中の沈殿は回避され、タンパク質は均一に分布したが、得られたゲルの物理的な一貫性は、水中で調製されたプラセボと比較して劣っているように見えた。さらに、ゲル形成後に残存液相を分析すると、微細な沈殿が見つかった。さらなる試験により、塩化カルシウムとＰＢＳとの間の相互作用により沈殿が引き起こされ、これがおそらくリン酸カルシウムの形成をもたらすことが証明された。このため、ポリマーの液体溶液とカルシウム溶液の両方からＰＢＳは除去され、ミリＱ水のみが溶媒として使用された。
【００８９】
製剤の最適化
より高密度のメッシュサイズを有するゲルを得る目的で、４重量％までのアルギネート濃度の上昇が考慮された。これは、材料に、インビボでより長く抵抗する能力と、封入されたタンパク質のより長期の保持を付与する能力とを、与えるはずである。可能性のある副作用を低減するために、カルシウム含有量の最小化も検討された：他の全てのパラメータ一定に保って、ゲルを得るために最低限必要な量は、４ｍｇ／ｍｌであることがわかった。カルシウムとポリマー溶液との混合は、ゲルの迅速な形成を引き起こすため、最終製剤のｐＨおよびオスモル濃度を測定することはできなかった。従って、ポリマー液体溶液の浸透圧は、７０ｍｇ／ｍｌのショ糖を用いて、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇの値に調整した。この添加はゲル形成に変化を引き起こし、ショ糖の非存在下では残存液相は観察されなかった。これは、ショ糖がアルギネート又はカルシウムと相互作用することによりゲル形成を妨害した、という仮説が立てられた。従って、再度カルシウム濃度を１０ｍｇ／ｍｌに上げて、ゲルを形成させると、残存液体と沈殿は生じなかった。
【００９０】
ポリマー溶液のｐＨを測定して、７．０の値を得た。カルシウム溶液はｐＨ５．３とオスモル濃度約１７０ｍＯｓｍ／ｋｇを示した。
【００９１】
ポリマー液体溶液に添加されるタンパク質の量は、５４μｇ／ｍｌに設定した。
【００９２】
最後に、Rayatpisheh et al. (2011) に報告されているように、ゲルの細胞浸潤能を向上させるために、Ｉ型コラーゲンをポリマー液体溶液に添加した。文献（Tsai et al., 1998）に従って２つの異なる濃度（１μｇ／ｍｌと２μｇ／ｍｌ）を試験した。
【００９３】
この予備スクリーニングの最後に、４つの候補製剤が選択された。表１に示すようにこれらのすべてについて、カルシウム溶液はミリＱ水中１０ｍｇ／ｍｌの塩化カルシウムからなり、ポリマー溶液は、アルギネートとＩ型コラーゲン含有量について異なる。
【００９４】
全ての実験は、Sigma Aldrichにより提供された容易に入手可能なアルギン酸ナトリウムを使用して行われた。試験の最後の部分では、同じ特性を有するが、薬剤等級（ＰＧ）として認定されたアルギン酸ナトリウムを、FMC BioPolymer Keltoneから購入した。次に４つの候補製剤を、ＰＧアルギネートを使用して再調製し、非ＰＧと比較すると、目視検査で同等の結果を得られた。ＰＧ及び非ＰＧアルギネートで得られたゲルを、これらの膨潤および機械的特性についても比較した。
【００９５】
なお、実験は塩化カルシウムを用いて行われたが、マグネシウム塩、銅塩、亜鉛塩のような更なるジカチオン塩でも、同様の結果が得られたであろうと予想される。
【００９６】
実施例３
温度応答性ゲル（キトサン）の調製
総論
キトサン製剤のスクリーニングのために、ポリマー液体溶液の調製は、３種類の異なるキトサンを利用した：高分子量（ＨＭＷ）を有する９５％の脱アセチル化度（ＤＤ）、低ＭＷ（ＬＭＷ）を有する９５％ＤＤ、及び高ＭＷ（ＨＭＷ）を有する７５％ＤＤ。ポリマーの液体溶液は、５℃で又は２５℃で激しく撹拌しながら、酢酸０．１Ｎ溶液に徐々にキトサンを添加することにより調製した。ポリマーの量は、ポリマー液体溶液中で１重量％、１．５重量％、又は２％重量の最終ポリマー濃度を有するように計算された。いったんキトサンが完全に可溶化された後、ミリＱ水中の１０ｍＭ、１００ｍＭ、又は５００ｍＭの濃度のＫＨ2ＰＯ4の溶液を撹拌しながら添加して、ポリマー液体溶液中の１ｍＭ、１０ｍＭ、又は５０ｍＭのいずれかの最終濃度を得た。最後に、ミリＱ水中２０重量％濃度のβ−グリセロリン酸（β−ＧＰ）の溶液を加えて、最終的な液体溶液のｐＨを６．０、６．５、又は７．０のいずれかに調整した。これは、多すぎる量のβ−ＧＰを必要として、３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの目標オスモル濃度値を超えるか、又は既に室温でゲルを得られてしまうため、絶えず所望のｐＨ値に到達することは必ずしも可能ではなかった。ポリマーの液体溶液は適宜、ゲル形成まで３７℃でインキュベートした。すべてのスクリーニングした製剤のオスモル濃度を測定し、３５０ｍＯｓｍ／ｋｇより高いオスモル濃度を有する製剤、すなわち最終β−ＧＰ濃度が２．５重量％超の製剤を捨てた。
【００９７】
プラセボ製剤の予備的スクリーニング：
温度応答性ゲルは、局所環境の温度を変化することにより溶液−ゲル化（ゾル−ゲル）遷移を受けるポリマー材料に基づく。キトサンは、温度変化に伴うゾル−ゲル遷移を受け得ることが報告されているが、このプロセスは、ポリマーの分子量（ＭＷ）、その脱アセチル化度（ＤＤ）、溶液中のポリマー濃度、温度、時間、ポリマーの可溶化中の混合速度、溶液の最終ｐＨ、及び他の賦形剤の存在により大きく影響される。
【００９８】
従って、異なる可能な組み合わせの網羅的スクリーニングが必要とされた。キトサンは、酸性ｐＨの水にのみ可溶化することができることは、注目に値する。ｐＨの上昇は、その凝集及び沈殿を引き起こす。この問題を克服するための方法は、β−ＧＰを使用して、溶液中にキトサンを維持しながらｐＨを上昇させることである。
【００９９】
本試験は最初に、７５％ＤＤを有するＨＭＷキトサンに注目いた。いくつかのポリマーの液体溶液は、キトサン濃度が１重量％〜２．５重量％で異なり、最終β−ＧＰが１．６重量％〜５０重量％（１．６、５、５．６、８、３０、５０％）で異なり、異なる賦形剤、すなわちゼラチン、グルコサミン、ヒアルロン酸、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、トレハロース、６．０から７．０の異なる最終ｐＨ値、を有する塩酸０．１Ｎ中で調製された。これらの賦形剤は、ゲル形成の誘導において役割を果たすことが報告された（Cheng et al., 2010; Schuetz et al., 2008; Yan et al, 2010）。
【０１００】
スクリーニングされた製剤の１つのみが３７℃で５分間のインキュベーション後にゲルを形成することができたが、β−ＧＰの量は、それを超えると細胞障害性が記録されている限界値として文献（Ahmadi et al., 2008）に報告されている８重量％より高かった。従って、すべての以下の製剤は、その限界値を考慮して調製された。スクリーニングは、より高いＤＤ値を持つキトサンを得るまで続けた。最初の試験は、９５％ＤＤを有するＬＭＷキトサンに基づいていた。ポリマー溶液は、いつも塩酸０．１Ｎ中で調製し、５℃又は２５℃のいずれかで激しく撹拌してポリマーを溶解した。
【０１０１】
ポリマーの完全な可溶化後、他の賦形剤が添加され、β−ＧＰは最後にのみ添加された。β−ＧＰはｐＨ値の上昇の原因であり、ゲル化プロセスを促進した。最初の試験は、相対濃度の異なる組み合わせのキトサンとβ−ＧＰとのみに基づく製剤に注目した。高濃度（２重量％又は３重量％）のキトサンと、高濃度のβ−ＧＰ（８重量％）を使用すると、すでに室温で、ある場合には５℃でもゲル形成が起きることが観察された。
【０１０２】
いずれかの成分の濃度を減少させると、製剤は液体のままであり、３７℃で長時間のインキュベーション後も液体のままであった。１つの場合でのみ、ゲルが形成されたが、これは３７℃で２時間インキュベーション後であり、この研究の目的のためにはあまりにも長い時間であった。従って賦形剤の添加は、製剤を改良するために必須であった。最も適切な賦形剤としてヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）が選択され、さらなるスクリーニングを行った。この評価中のキトサンの濃度は１．５重量％〜２重量％の範囲であり、開始ＨＥＣ濃度は０．５重量％であったが、これらの条件下では、β−ＧＰの添加中にその濃度が１．８重量％を超えていた場合は、室温でさえポリマー溶液はゲルになった。以下の組成（１．５重量％のキトサン、０．５重量％のＨＥＣ、及び１．７重量％のβ−ＧＰ）を用いて、３７℃で１３分間のインキュベーション後にゲルになることができる液体溶液が得られた。
【０１０３】
製剤の最適化
この製剤を改善するために、β−ＧＰの濃度を１．６５〜１．７重量％の値でほぼ一定に維持し、キトサン濃度を１．５重量％〜１．８重量％に変化させ、及びＨＥＣの量を徐々に０．１重量％まで低下させて、以下の試験を行った。
【０１０４】
いくつかの製剤候補が、この戦略を用いて選択された。しかし、細胞傷害性であり、他方では、キトサンの存在下でゲル化プロセスの調節の原因であると報告された汚染物質をＨＥＣ賦形剤が含み得ることが判明したため、試験はこの方向を継続しなかった（Hoemann et al., 2007）。ゼラチンやグルコサミンなどの以前の実験で試験した他の賦形剤は、有望な結果を与えなかった。
【０１０５】
次に、分子量とＤＤとが異なる３種類のキトサンポリマー（７５％ＤＤを有するＨＭＷキトサン、９５％ＤＤを有するＨＭＷキトサン、及び９５％ＤＤを有するＬＭＷキトサン）を使用して、最終スクリーニング作業を開始した。この作業は８５％ＤＤを有するＬＭＷキトサンでも計画されたが、この試験の終了前に、この材料が入手できなかった。この作業では、各キトサンを３つの固定濃度（１、１．５、及び２重量％）で試験し、最終ｐＨ値を６．０、６．５、及び７．０にするために、ポリマー溶液を調製した。溶液のｐＨ値を上昇させるのに使用されるβ−ＧＰの量を減少させるために、ポリマーは、前の実験で使用した０．１Ｎ塩酸の代わりに０．１Ｎ酢酸に溶解した。最終溶液のオスモル濃度も追跡し、約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの値より低く維持した。従って、、所望のｐＨに達するために多すぎる量のβ−ＧＰを必要とし、高すぎるオスモル濃度の値ももたらす製剤は破棄された。これらのスクリーニング試験において、塩の存在が、ゲル化プロセスに対して陽性の寄与をする可能性があったため（Filion et al., 2007）、イオン強度の寄与もまた試験された。
【０１０６】
ナトリウム塩は、タンパク質との相互作用の可能性があるために避けなければならなかったために、ＫＨ2ＰＯ4が選択され、最終濃度１ｍＭ、１０ｍＭ、又は５０ｍＭでポリマー溶液に添加された。７５％ＤＤを有するキトサンは有望な結果を与えず、これは完全に放棄された。９５％ＤＤを有するＨＭＷキトサンはいずれも有望な結果を与えなかった：１重量％より高いキトサン濃度は、固定ｐＨ値に達するために多すぎる量のβ−ＧＰを必要とし、目標オスモル濃度のを超え、１重量％の製剤は３７℃でゲルを形成することができなかった。２つの製剤候補は３７℃でゾル−ゲル転移を受けたため、９５％ＤＤを有するＬＭＷキトサンを用いてこれらの製剤を選択したが、これらのポリマー溶液の調製は完全には再現性がなかった。実際、ポリマー液体溶液のゲルを得るために及び物理的巨視的特性を得るために必要な時間は、ポリマーを溶解させるのに費やされる時間に応じて、ポリマー溶解中及び賦形剤の混合中の混合速度に応じて、及び最後に、調製される溶液の温度と体積に応じて、顕著に変化することが観察された。
【０１０７】
この試験の大きな変動性は、このポリマーについての試験を中止するという決断につながった。
【０１０８】
実施例４
ゲル化時間と温度
この作業で試験されるすべての製剤は、イン・サイチュで形成されるゲルとして使用するように計画される。従って、重要な要件は、イオン応答性ゲルと温度応答性ゲルの両方についての、迅速なゲル化時間である。実際、良好なゲル化プロセスを有するが、そのゲル化プロセスは速すぎることも無く（注入を可能にする）、遅すぎることも無い（材料を失うリスクが無い）製剤を同定することが重要であった。ゲル化時間は、傾斜試験により決定された：溶液を上下反対にすると、液体の流れが観察されない時、ゲルが形成されると考えられた。
【０１０９】
イオンに基づく製剤
アルギネート系の製剤の場合、ゲル化プロセスは、カルシウム溶液濃度とカルシウムとアルギネート溶液との相対的比率により、影響を受けた。ガラス製シャーレにまずアルギネートを加え、次にカルシウム溶液を加え、２つの溶液をできるだけ均一にするようにして、ゲルを調製した。塩化カルシウムの量が充分でない場合、３７℃で長時間インキュベートした後でも、ゲル形成は観察されなかった。架橋剤（カルシウム）の量を増やし、ポリマー溶液：カルシウム溶液の比率を調整すると、２つの溶液を一緒に混合すると、ほぼ瞬間的にゲルが形成された。ある場合には、残存する液体相が観察された。３７℃でインキュベーション後の液体の完全な消失に必要な時間は、ゲル化時間と見なされた。
【０１１０】
ゲル化時間は５分から２時間まで変動し、ある場合には液体の完全な消失に達しなかった。ゲル化は、３重量％濃度のアルギネートより４重量％濃度のアルギネートのポリマー液体溶液で、より速かった。Ｉ型コラーゲンの添加は、ゲル化時間に何の影響を与えなかった。結果は表２に要約される。４重量％のアルギネート濃度のポリマー溶液の２つの候補製剤は、ゲル化時間５分を示し、３重量％ポリマー溶液の２つの候補は、１５分で完全なゲル化を示した。
【０１１１】
重要なことに、２つの溶液の同時注入を可能にするシリンジコネクターを使用してゲルを形成すると、どのポリマー濃度でも残存する液体相は観察されなかった。実際、２つの溶液の状況的注入は、２つの流れのより迅速でより均一な混合を可能にし、即時的ゲル化につながる。
【０１１２】
実験は塩化カルシウムを用いて行われたが、任意の更なるジカチオン塩、例えばマグネシウム塩、銅塩、又は亜鉛塩などを用いても、同様の結果が得られたであろうと予測される。
【０１１３】
温度に基づく製剤
調製と取り扱い段階中に室温で液体であり、注入後に、すなわち３７℃にて生理学的条件下でゲルになるように、温度応答性ゲルが設計された。試験は、異なるキトサン系の製剤を５℃、２５℃、及び３７℃でインキュベートして、ゲル化時間を温度の関数として追跡して傾斜試験により行われた。結果は表３に要約される。
【０１１４】
キトサンとβ−ＧＰ濃度に依存して、挙動は大きく変化した。β−ＧＰが濃縮されすぎている溶液を使用すると、液体溶液の調製中にすでに室温でゲル化が起きた。このため、成分の濃度を変化させて製剤を最適化するのみでなく、すべての成分を５℃で溶解し混合し、次に液体溶液を３７℃でインキュベートすることも重要であった。実施例３に開示されるように、正しく最適化後、３７℃でのゲル形成が１５分後に得られたが、結果は再現性が無いことがわかった。特にゲル化時間は、キトサンを溶解しこれを他の成分と混合するのに必要な速度と時間により、影響を受けることが観察された。
【０１１５】
実施例５
機械的特性
ヒドロゲルは、高い水保持能力を有する親水性ポリマーネットワークでできた１群の半固体材料である。一般にヒドロゲルは、粘性液体と弾力性固体との中間の機械的特性（粘弾性）を有する（Anseth et al., 1996）。これらの機械的特性は、インビボ環境の標的と似た条件下で決定され測定されることが重要である。
【０１１６】
動的機械的分析は、振動応力（典型的には剪断応力）の適用時に、組み合わせた粘性応答と弾性応答を反映するヒドロゲルの、粘弾性挙動を特徴づけることができる。粘弾性材料は、貯蔵弾性率Ｇ’と損失弾性率又は粘性弾性率Ｇ”により特徴付けられ、これは、動的応力−歪み挙動の、それぞれ弾性寄与と粘性寄与の尺度を与える。
【０１１７】
ヒドロゲルは、レオロジー用語で、Ｇ’＞Ｇ”を示し、Ｇ’とＧ”の両方とも振動周波数に依存しない粘弾性材料として、定義される（Peppas et al., 2000）。特に、Ｇ’が大きいほどヒドロゲルの強度は高く、Ｇ’とＧ”の差が大きいほど、液体様挙動と固体様挙動との差は小さい。本項では、円錐−プレート形状（実験の項を参照）を備えたレオメーターを使用して、周波数掃引試験 (frequency sweep tests)を行うことによる、アルギネートヒドロゲルの粘弾性特性の検討を報告する。周波数掃引試験では、振動剪断応力 (oscillatory shear stress)は周波数（０．１〜１００ｒａｄ／秒）の範囲で適用される。次にＧ’及びＧ”は、周波数に対してプロットされる。
【０１１８】
図１は、アルギネート溶液中の異なるコラーゲン含有量（０、１、２μｇ／ｍｌ）とアルギネート溶液中の異なるＦＧＦ−１８含有量（０、５４、５４０μｇ／ｍｌ）を用いる、３重量％アルギネートゲルに対する周波数掃引試験の結果を示す。全ての試料は、カルシウム溶液の添加後、３７℃で３０分インキュベーション後に分析した。アルギネート溶液中で５４０μｇ／ｍｌのＦＧＦ−１８を用いて測定を行い、１０倍高いタンパク質濃度が、材料の内部構造に影響を与え得るかどうかを調べた。
【０１１９】
目に見えるため、全ての試料は、Ｇ’＞＞Ｇ”（いずれも角周波数 (angular frequency)に依存しない）を示すゲルの典型的な挙動を示した。Ｇ’値は、すべての試料について約３００〜４００Ｐａの間で構成されている。Ｇ’におけるこれらの相違は、これらの材料の弾性応答における実質的な差異を示すものではなかった。これは、製剤中の低濃度のコラーゲン（１または２μｇ／ｍｌ）が、時間ゼロでゲルの機械的特性に影響を与えなかったことを意味する。これは次項で示されるように、インキュベーション時のゲルのより高い安定性を促進することができる。
【０１２０】
ＦＧＦ−１８の存在が、アルギネート溶液中の５４及び５４０μｇ／ｍｌの材料の機械的特性に影響を与えなかったことに、注目することも重要である。実際には、２つの異なるタンパク質濃度でプラセボと活性ゲルの間に、有意な差又は傾向は同定することができまなかった。これは、マトリックスの特性を損なうことなく、アルギネート溶液中の広い範囲のタンパク質濃度（０〜５４０μｇ／ｍｌ）のＦＧＦ−１８の調製を可能にするため、これは重要なパラメータである。
【０１２１】
図２は、４重量％アルギネート候補、対応するプラセボ、及びコラーゲンのないプラセボで得られた結果を示す。この場合も、全ての試料は、Ｇ’＞＞Ｇ”（いずれも角周波数に依存しない）を有するゲルの典型的な挙動を示した。再度、アルギネート溶液中のコラーゲンとＦＧＦ−１８（５４又は５４０μｇ／ｍｌ）の両方の影響は見られず、すべてのＧ’値は約３８０〜５００Ｐａの間にあった。アルギネートのより高い濃度が、より高い架橋密度をもたらし、従って高いｉ弾性率Ｇ’を与えることは、予測できた。その代わり、記録された差は顕著ではなかった。
【０１２２】
いずれにしても、３重量％および４重量％のアルギネート溶液の両方に添加されたカルシウム溶液が同じであった事実を、強調することは重要である。これは、３重量％アルギネート溶液が、より高い相対濃度の架橋剤に曝露され、これが、溶液中のポリマー鎖の再配列に応じて、より密度の高いメッシュにつながる可能性を示す、ことを意味する。
【０１２３】
試験終了時に薬剤等級（ＰＧ）のアルギネートが入手できた。アルギネートの純度レベルがゲルの構造に影響を与えないことを確認するために、ＰＧアルギン酸系ゲルについて周波数掃引試験を行った。結果は図３及び図４に示される。
【０１２４】
ＰＧアルギネートについて得られた結果は、非ＰＧアルギネートで得られたものと完全に同等であった。唯一の違いは、３重量％および４重量％ゲルの両方における結果の若干広い分散であった。これは、ＰＧ及び非ＰＧアルギネートの技術シートが同じスペックを報告するという事実にもかかわらず、原料の分子量分布の若干の違いが原因である可能性がある。
【０１２５】
いずれにしても、３重量％および４重量％のシステム内に特定の傾向又は顕著な差異は観察されず、４重量％のシステムについて観察されたわずかに高いＧ’値が、ＰＧ原料でも確認された。
【０１２６】
実施例６
膨潤挙動
ヒドロゲル材料について評価すべき典型的なパラメータは、液体の存在下で膨潤または収縮する能力である。いったんインビボ条件下で注入された材料の挙動を予測するために試験が使用され、ここで、これは生理滑液と接触するであろう。
【０１２７】
実施例３で説明されたようにキトサン製剤は廃棄されたため、試験は、実施例２のアルギネート系ゲルのみについて行われた。４つの候補アルギネート系ゲルを、ＭＳＦと接触して３７℃でインキュベートし、これらの挙動を、３０日間追跡した（方法の項の「膨潤挙動アッセイ」を参照）。
【０１２８】
図５において、４つの候補アルギネート系ゲルについての１ヶ月を超える膨潤挙動が、プラセボと活性ゲルの両方について報告される。参照として、Ｉ型コラーゲンの無い同じゲルも試験して、ゲルの構造特性に及ぼす影響を調べた。これらの結果は図６に報告される。図５と図６の両方とも、非薬剤等級のアルギネート（非ＰＧ）に言及している。
【０１２９】
両方の場合に、アルギネートの濃度が高いほど、膨潤率が高い。この挙動は明らかに、レオロジー測定により得られた結果とは対照的である。具体的には、より高いポリマー濃度は、より高密度のネットワークを形成するはずであり、次にこれは、通常水溶液を吸収する低い能力と関連している。ところで、Ｃａ2+の濃度は一定に維持され、従って、ポリマーと架橋剤との比率がポリマー濃度を変えることによって変化したことを、考慮しなければならない。架橋剤の低い利用可能性が、ポリマーが架橋されず水が容易に浸透する領域の形成に、つながる可能性がある。これは、３重量％アルギネートと４重量％のアルギネートの候補間の膨潤率の差を説明できる可能性があり、次の項で示されるＳＥＭ写真により確認された。
【０１３０】
図５と図６の比較は、Ｉ型コラーゲンの存在が、特に動力学観点で膨潤挙動に影響を与えていることを示す。コラーゲンの非存在下では、すべてのゲルはその重量を約１５日間にわたって単調に上昇させ、次にプラトーに達し、コラーゲンの存在は、濃度とは独立して、正弦波傾向につながった。コラーゲンの存在下で２日後に到達した最初のプラトーは、ゲルが保持できる水の最大量に相当する平衡膨潤を示している。この値は、コラーゲンの非存在下における対応する膨潤比の値よりも小さく、コラーゲンの添加後に予想されるように、ゲルの緊密な構造を示唆している。１５日間のインキュベーション後の膨潤率の上昇は、ネットワーク浸食現象の開始を示し、メッシュが緩くなったため、結果としてＭＳＦ溶液の吸収が起きた。次に２４日後に第２のプラトーに達し、１ヶ月の観察期間の終了まで維持された。ネットワークのさらなる浸食は、さらに重量につながると予測され、従って膨潤比の上昇後に、完全な浸食が発生するまで低下が起きた。コラーゲンの非存在下（図６）では、連続的な膨潤比の上昇が観察され、次にゆっくりした浸食が観察された。この挙動は、同時浸食やゲルの緩い構造に起因する水の取り込みに関連する可能性があった。
【０１３１】
すでに述べたように、ポリマー溶液中１または２μｇ／ｍｌのＩ型コラーゲンのいずれかを用いて得られたゲルの間に、差は記録されなかった。
【０１３２】
興味深いことに、プラセボと活性ゲルとの間にも差は観察されなかった。これは、ゲル中のＦＧＦ−１８の最終濃度３６μｇ／ｍｌが、材料の内部構造に影響を与えなかったことを示唆した。この実験は同じ製剤で繰り返され、今度はＰＧアルギン酸を用いて調製され、結果は図７に報告される。
【０１３３】
目に見えるため、結果は、非ＰＧアルギネートで得られたものと完全に一致し、唯一の違いは、非ＰＧ材料と比較して、３％重量と４重量％アルギネートゲルの膨潤比の間の小さい偏差であった。この実験は４重量％ゲルについて最大５０日まで継続され、これは、予測された挙動、すなわちゆっくりした浸食を示す第２プラトー後の重量低下を示した。
【０１３４】
実施例７
走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）分析
いったんゲルが形成された時の材料の微細構造を調べるために、ＳＥＭ画像を取った。分析は、新たに調製し次に凍結乾燥したゲルについて行った。
【０１３５】
図８で示された両方のポリマー濃度で、Ｉ型コラーゲンを含む試料及び含まない試料の比較は、コラーゲンが３重量％アルギネートゲルの微空隙率に大きな影響を与えず、４重量％ゲル（これは、１又は２μｇ／ｍｌのコラーゲンを添加されると、わずかに堅い構造を示した）に対してほんの小さな影響を与えることを証明した。
【０１３６】
顕微鏡写真から、４％重量アルギン酸ゲル３重量％ゲルよりも大きな空隙率を示し、２つの材料間の空隙率の差が明らかである。これは再度、３重量％アルギネート製剤中の架橋剤の相対濃度が、４重量％ゲルの場合より高いという事実により説明することができる。これは、３重量％ゲル中でより高密度の構造を誘導することができる可能性がある。
【０１３７】
これらの画像は、膨潤結果と一致し、機械的特性の分析とは明らかに矛盾していた。実際、４重量％ゲル中に存在するより大きな空洞は、３重量％ゲルと比較して観察されるより大きな膨潤度を説明する。一方、４重量％ゲルで観察されたわずかに高い弾性率Ｇ’は、大きな孔中の架橋していないか又は緩く架橋したアルギネート鎖の存在（これは、Ｇ’に寄与した）により説明することができる。
【０１３８】
実施例８
インビトロ放出試験
膨潤試験の状況から、考慮された各時点で各ウェルの受容相を採取して、インビトロ放出試験を行った。活性アルギネート系ゲルからのすべての試料を、ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。さらに、選択された試料は、ＲＰ−ＨＰＬＣで得られた結果を確認するために、より特異的で高感度の分析法であるビアコアによっても分析された。
【０１３９】
この実験を開始する前に、試験の実行可能性を評価した。具体的には、ウェルプレートシステム中のＦＧＦ−１８の回収を調べた。実際、前の試験から、タンパク質が異なるプラスチック材料、例えばポリスチレン及び膜上に固着することがわかった。既知量の遊離ＦＧＦ−１８の回収を、異なる実験条件で評価した。Ｆ６８界面活性剤の存在の有益な作用、及び／又はＨＳＡ又はＦＧＦ−１８の濃縮溶液を用いるウェルの前処理の可能性を試験した。この実験は、５００μｇ／ｍｌ濃度のＦＧＦ−１８を、インサート中に及び以下の溶液中の各ウェルに加えることにより行った：
ａ）ＰＢＳ中１重量％のＨＳＡの溶液、
ｂ）ＰＢＳ＋Ｆ６８中１重量％のＨＳＡの溶液、
ｃ）及びｄ）  ａ）及びｂ）と同じであるが、ＨＳＡの濃縮溶液でウェルを前処理、
ｅ）及びｆ）  ａ）及びｂ）と同じであるが、ＦＧＦ−１８の濃縮バルクでウェルを前処理。
【０１４０】
３７℃で１６時間インキュベーション後、ウェル中及びバスケット中の相を分析すると、回収率はすべての試料について約７５％であった。従って、試験を改良するためのどの戦略も、回収率は同等であり、顕著に有効な作用はなかった。次に、ＰＢＳ中のＨＳＡ  １％の溶液を使用して、Ｆ６８  ０．２５ｇ／Ｌを受容相として、インビトロ放出を行った。
【０１４１】
実験は、ゲルを３０日間インキュベートしながら維持した。ＨＰＬＣ又はビアコアによる回収画分のいずれにも、ＦＧＦ−１８は検出されなかった。これは、観察期間中、ゲルマトリックス中にタンパク質が捕捉されることを示唆する。
【０１４２】
これらの結果は、ＦＧＦ−１８とアルギネートとの間で起きる強い相互作用を考慮すると、予測することができる。実際、２つの分子の構造を考慮すると、イオン性相互作用と疎水性相互作用の両方が起きる可能性がある。さらにＦＧＦ−１８は、ヘパリンと高エネルギー２次相互作用を示すヘパリン結合タンパク質である。アルギネートは、ヘパリンと類似の分子構造を有する天然の炭水化物であり、従って、２つの巨大分子の間で強い２次相互作用が起きる可能性が高い。
【０１４３】
これを確認するために、分離実験を行い、ＨＩＣ又はヘパリン被覆クロマトグラフィーカラムのみが、アルギネートからＦＧＦ−１８を分離することができることを示した。
【０１４４】
実施例９
インビトロ細胞浸潤アッセイ
アルギネート系のヒドロゲルの場合のように、注入後３Ｄ構造を生成することができる製剤中のＦＧＦ−１８の投与は、注入部位に活性分子（ＡＰＩ）を局在化させる目的を有する。同時にこの製剤は、成長する軟骨が固定される足場を作成する。このため、選択されたアルギネート系ゲルの重要な要件は、材料と軟骨細胞との適合性、及び細胞により侵潤される能力である。従って、ＦＧＦ−１８を有するヒドロゲルをイン・サイチュで形成することに基づいて、代替製剤の細胞浸潤、細胞障害性、及び化学走化性について試験を行った。
【０１４５】
軟骨細胞の挙動を調べるために一般的に使用される２つの軟骨肉腫細胞株（ＡＴＤＣ５マウス軟骨細胞株とＣＲＬ−７８９１ヒト軟骨肉腫細胞株）を用いて、インビトロの細胞浸潤アッセイを行った。実験は、０、１、又は２μｇ／ｍｌのＩ型コラーゲン及び５４μｇ／ｍｌのＦＧＦ−１８を含有する、３重量％又は４重量％のアルギネート液体溶液から調製したゲルについて行った。
【０１４６】
細胞浸潤は、２４、４８、７２、及び１４４時間のインキュベーション後に追跡した。ゲルをウェルから取り出し、切片を切り出し、ガラスの上にのせ、Zeiss A-Plan １０×／０．２５対物ガラスを備えた顕微鏡Axiovert 200で観察した。こうして、ゲル選択を分析し、細胞を異なるレベルの貫通深さに局在化させることができた。写真をキャプチャし、Software AxioVision 4.2 により処理した。一部の試料はまた、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）により、デモ使用で限定された期間だけ利用可能なFV10 Olympus を使用して分析した。これらの実験のために、ゲルをＰＢＳ中０．２μｇ／ｍｌ濃度のローダミンＢの溶液で処理し、分析の１時間前に、ウェル中の培地に加えた。ローダミンＢは細胞を染色するために使用し、これは次に、試料を５５３ｎｍのレーザーで励起して視覚化した。
【０１４７】
コラーゲンを含むか又は含まない３％重量又は４重量％のポリマー液溶液を有するアルギネート系ゲルにおける細胞浸潤を、２４、４８、７２、及び１４４時間目に追跡した。各時点で、ゲル切片を切り出し、ゲルの切片を観察した（データは示していない）。最初の観察は製剤と細胞との良好な適合性であり、アルギネート系ゲルは両方の細胞株に対して毒性は無いようであり、これは、異なる種（マウスとヒト）でも同等の挙動を示した。
【０１４８】
４％重量のアルギネートゲルを有する製剤では、より多くの細胞および細胞クラスターがゲル中に見いだされた。２μｇ／ｍｌのＩ型コラーゲンを含有する４重量％のアルギネートゲルについて、異なる挙動が観察された。他の製剤と比較して、より多くの細胞が浸潤した。さらに、細胞はクラスターを生成しなかったが、単一の及び充分分離した細胞として、ゲルに沿って充分に分布しているように見えた。この態様は、これらが健康な状態にあることを証明している。最後に、これらは時間の経過と共にゲルマトリックス内に浸透することが観察された。２μｇ／ｍｌのコラーゲンを含む４重量％のゲルとコラーゲンを含まないゲルとを比較すると、コラーゲンの存在下では、浸潤はより速くより均一であることが観察された（図９参照）。ＣＬＳＭにより行われたこの分析は、ゲルマトリックスに浸潤する細胞の能力を確認した。
【０１４９】
実施例１０
これらのアルギネート製剤に基づく処置は、微小破壊戦略に連結することができる。すなわち、この技術とのゲルの適合性を証明するために、エクスビボの動物モデルについて予備試験が必要とされ、このために牛の膝を使用した。
【０１５０】
実験は、２μｇ／ｍｌのＩ型コラーゲンを含む４重量％アルギネートの候補ゲルについて行った。このゲルは、上記したように細胞浸潤の観点から最も有望な結果を示したため、他の候補の中から選択された。
【０１５１】
微小破壊手術（深さ１ｃｍＸ直径４ｍｍ）について予想される同じ寸法を有する、脛骨の上部と大腿骨の下部の両方で、孔を作成した。孔を候補ゲルで充填し、注入の時にアルギネート溶液とカルシウム溶液と混合するシリンジコネクターを用いて注入した。これにより、滴下現象無しで、均一なゲルを即時に得ることが可能であった。注入は、直立と上下逆の位置の両方で行い、両方の場合に、ゲルは孔内にとどまり、材料の滴下が観察されないことを確認した。また関節に、振盪及び迅速運動を行い、ゲルが孔内に充分固定され、材料の喪失が観察されないことを証明した。次に、注入されたゲルを有する関節を、３７℃で２時間インキュベーション後に評価した；ゲルはまだ全孔を充填し、いったん取り出すと、わずかに赤色に見え、骨折から来る血液がゲルにより吸収されたことを示していた。
【０１５２】
これらの予備試験は、微小破壊戦略におけるアルギネート調製の実行可能性を示唆した。
【０１５３】
実施例１１
方法欄に記載のように行われた細胞増殖アッセイは、ゲル中に捕捉されたＦＧＦ−１８が、図１０に示されるように、生物活性があり、明瞭な用量応答曲線を有することを示した。
【０１５４】
結論
イオン応答性ゲルは、架橋剤として塩化カルシウムを添加するとアルギン酸ナトリウムから得られ、一方、温度応答性ゲルは、β−ＧＰを添加してｐＨを調整すると、ポリマーの沈殿無しでキトサンから得られた。
【０１５５】
アルギネート又はキトサンに基づく製剤は、異なるポリマー濃度で試験され、他の賦形剤の添加は、製剤のｐＨとオスモル濃度を調整すると考えられ、ある場合には、ゲル化プロセスを促進すると考えられた。
【０１５６】
ゲル化時間の結果は、アルギネート系ゲルが、キトサンと比較して極端に速く再現性のあるゲル化を示すことを証明した。従ってアルギネートゲルは、更なる開発のために選択された。
【０１５７】
３％又は４重量％のアルギネート、１又は２μｇ／ｍｌのＩ型コラーゲン、ショ糖７０ｍｇ／ｍｌ、及びＦＧＦ−１８  ５４μｇ／ｍｌを含むアルギネート溶液への、塩化カルシウム溶液１０ｍｇ／ｍｌの添加により形成される、４つのゲル製剤が、機械的特性、膨潤、インビボ放出、及び細胞浸潤の観点から性状解析するために選択された。アルギネート溶液の体積対カルシウムの体積比は、２：１であった。
【０１５８】
候補ゲルの機械的特性は、最大５４０μｇ／ｍｌまでのコラーゲン濃度又はＦＧＦ−１８濃度により影響を受けなかった。最終ゲルの特性を付与することなく、広範囲の濃度でこれらのマトリックス中のＦＧＦ−１８を調製する可能性を可能にする、ヒドロゲル中のＦＧＦ−１８の目標濃度はまだ決定されていないため、これは重要な目標である。３重量％と４重量％のアルギネートゲルの弾性率Ｇ’に大きな差は観察されず、すべてが約３００〜５００Ｐａ内に有り、４重量％ゲルにより、より高い値が提示された。
【０１５９】
すべての候補ゲルは同じ膨潤プロフィールを示し、同様の水和と分解プロセスを示した。唯一の差は絶対値にあり、４重量％アルギネートゲルについてわずかに高かった。この結果は、これらのゲルについてより大きな寸法の孔を証明したＳＥＭ顕微鏡写真と一致している。
【０１６０】
モック滑液中で３７℃にて１５日間インキュベーション後、すべての候補は、重量増加により示される最初の分解プロセスを示した。実際、ネットワークの最初の分解は通常、より緩い構造をもたらし、従ってこれはより多量の水を収容する。１ヵ月後、連続ネットワーク分解は、重量低下で示される巨視的ゲル浸食の開始に至る。ところで、５０日間の観察後、多孔性バスケット内の一部のゲルの存在（５０日目の膨潤比の値）で示されるように、ゲルはまだ完全には浸食されていない（Lo Presti C. et al., 2011; Dang et al., 2011）。
【０１６１】
細胞浸潤アッセイが開発された。最も有望な細胞浸潤結果を示すゲル製剤は、アルギネート４重量％とコラーゲン２μｇ／ｍｌを含有した。次に、製剤を、ゲルの接着性についてのエクスビボ実験について選択した。牛の関節で行ったこれらのエクスビボ実験は、アルギネート及びカルシウム溶液について２重注入器を上向き又は上下逆で使用して、滴下することなしに、候補アルギネートゲルを注入することができることを示した。さらにゲルは、軟骨の孔を完全に充填し接着し、微小破壊状態を模倣していた（データは示していない）。
【０１６２】
細胞増殖アッセイは、ゲル中に捕捉されたＦＧＦ−１８が生物活性であり、明確な用量応答曲線を有することを示した。５０日間の観察後、ゲルはまだ完全には分解されておらず、インビトロ放出実験は、モック滑液中にＦＧＦ−１８を放出したという証拠を示さず、これは、ＦＧＦ−１８がゲル中にとどまり、従ってこれは、長期的には、ゲル中に移動した細胞に対してより効率的であることを示唆する。従ってこれらの結果は、有望である。
【０１６３】
実施例１２
凍結乾燥製剤
ＦＧＦ−１８、糖（ショ糖）、及びＩ型コラーゲンを含むポリマー液体溶液を調製後（実施例２を参照）、溶液をバイアルに分配した。各バイアル（１０ｍｌ，Fiolax Clear 45×24、forma vitrum SCHOTT）に、２ｍｌのポリマー液体溶液を充填した。すべての充填バイアルを、凍結乾燥プロセスに供した。詳細には、このプロセスは以下の工程を含んだ：
−  ２５℃から−４０℃へ１時間の冷却段階。ここで、製品の凍結が開始する。
−  −４０℃で４時間の凍結段階。ここで、製品は凍結して維持される。
−  真空段階。ここで、圧力が真空まで劇的に低下する。
−  第１の乾燥段階。３０分で温度が−４０℃から−１０℃に進み、次に−１０℃に１０時間とどまる。
−  第２の乾燥段階。３０分で温度が−１０℃から２１℃に進み、次に２１℃に３４時間とどまる。
−  第２の乾燥段階。１６時間で温度が２１℃から３７℃に進み、次に３７℃に２０時間とどまる。
【０１６４】
凍結乾燥プロセスが完了後、バイアルの栓を閉じ、２〜８℃で保存した。
【０１６５】
凍結乾燥製品は、注入用に使用する前に再構成しなければならない。これは室温で平衡化し、次に２ｍｌのＷＦＩ（注入用の水）をバイアルに注入し、次にこれを回転させ、ケーキの再構成を促進するように動かさなければならない。このシステムは、溶解され、３０分間ホモジナイズされ、次にこれは注入の準備ができる。
【０１６６】
次に、凍結乾燥製剤を、３つの異なる温度で３ヵ月の安定性試験に供した：５℃で通常の保存条件、２５℃で加速安定性試験、及び４０℃のストレス条件で試験する。０、２、８、及び１２週の時点で、試料を２ｍｌの水で再構成後、分析を行った。以下のパラメータを追跡した：
・  ｐＨ
・  水分含有量
・  ＦＧＦ１８含有量
・  アルギネート含有量
・  アルギネートＭＷ分布
・  粘度
・  機械的特性
・  細胞浸潤能力。
【０１６７】
以下は、１２週までの主要な結果である。
ｐＨ：  すべての３つの異なる温度でのインキュベーション時間にわたって、製剤のｐＨ値の顕著な変動は記録されなかった。ＦＤ製剤のｐＨは液体製剤より高い（これが供された濾過及び凍結乾燥プロセスに起因する可能性が最も高い）が、これは経時的には変化しなかった。図１２に示されたデータは、製剤が通常の保存条件下で１２週まで安定であることを示唆した。
【０１６８】
水分含有量：  残存水分含有量はいつも許容基準（３％）以内であった。この値は２〜８℃で保存された製剤について一定であったが、２５℃で１２週間インキュベーション後、さらに４０℃ではすでに２週間後に、予測されるように、経時的にわずかに上昇した。このデータ（図１３を参照）は、製剤が通常の保存条件下では１２週まで安定であることを示唆した。
【０１６９】
ＦＧＦ−１８含有量：  すべての３つの異なる温度で、製剤には、ＦＧＦ−１８含有量に経時的に顕著な変動は観察されず、総含有量は目標濃度の５４μｇ／ｍｌよりわずかに低く、これは、異なる製造工程中の、具体的には濾過中の材料の喪失に起因する可能性が高かった。異なる時点で観察された差は、まだ開発中の方法の変動に、ＦＧＦ−１８の量が方法の検出限界に近かったという事実に、及び結果の顕著なＳＴＤ  ＤＥＶによっても証明されるバイアル含有量の変動に、起因する可能性が高かった。実際、溶液の高い粘度は、実験室スケールで操作される充分正確な充填体積を可能にしなかった。一般的に、このデータは、製剤が通常の保存条件下で１２週まで安定であることを示唆した（図１４を参照）。
【０１７０】
アルギネート含有量：  すべての３つの異なる温度で、アルギネート含有量に経時的な顕著な変化は観察されなかった。観察された変動は、まだ開発中の方法の変動に、及び、溶液の粘度が実験室スケールで充分正確な充填プロセスを得ることを可能にしないため、バイアル含有量の変動に、起因する可能性が高かった。図１５のデータは、製剤が通常の保存条件下で１２週まで安定であることを示唆した。
【０１７１】
アルギネートＭＷ分布：  すべての３つの異なる温度で経時的に、製剤のクロマトグラフィープロフィールに変化は観察されず、従って全体のポリマー分子量分布に変化は観察されなかった：ピークは、８７０ｋＤａ超〜薬局４０ｋＤａまで広いＭＷ分布を示し、最大は約５２０ｋＤａであった。ＭＷ分布は、充分に決定されたＭＷを有する標準物質との比較により評価された。ピークの左部分に検出された小さなショルダーは、コラーゲンに起因した。このデータは、製剤が通常の保存条件下で１２週まで安定であることを示唆した（データは示していない）。
【０１７２】
粘度：  ２５℃及び４０℃で保存された試料の時間０に対して、加速分解条件のために、製剤の粘度のわずかな低下が観察され、通常の条件（２〜８℃）で保存された試料については、顕著な差は観察されなかった：観察された変動は、方法及び充填プロセスの変動に関連する可能性が高かった。このデータは、製剤が通常の保存条件下では１２週まで安定であることが示唆した（図１６を参照）。
【０１７３】
機械的特性：  安定性試験の各時点で、水で再構成されるアルギネートＦＤ製剤を使用して、塩化カルシウム溶液と混合することにより、ヒドロゲルを形成した。得られたヒドロゲルの機械的特性が試験された。貯蔵弾性率Ｇ’に変化は観察されず、従って、すべての３つの異なる温度で、機械的特性に経時的変化は観察されなかった。図１７に示された結果は、製剤が通常の保存条件下では１２週まで安定であることが示唆した。
【０１７４】
細胞浸潤能力：  安定性試験の各時点で、水で再構成されるアルギネートＦＤ製剤を使用して、塩化カルシウム溶液と混合することにより、ヒドロゲルを形成した。得られたヒドロゲルの細胞浸潤能力が、ヒドロゲルを細胞と７２時間インキュベートし、次に試料を共焦点レーザー走査顕微鏡により分析することにより、検討された。同じ温度条件で保存された試料を考慮すると、ヒドロゲルマトリックスに貫通できる生きた細胞の数に顕著な経時的変動は観察されなかった（データは示していない）。各時点で、４０℃で保存されたが試料は、２〜８℃で保存された試料より多い数の貫通細胞を示し、高温でのインキュベーションが、ポリマーマトリックスの部分的変化を引き起こしたことを示唆した。このデータは、製剤が通常の保存条件下では１２週まで安定であることが示唆した。
【０１７５】
結論：  凍結乾燥されたアルギネート製剤は、通常の保存条件（２〜８℃）で１２週まで、良好な安定性を示し、少なくとも対応する液体製剤と同程度に安定であるように思えた。
【０１７６】
【表１】
0006487448.tif 000002
【０１７７】
【表２】
0006487448.tif 000003
【０１７８】
【表３】
0006487448.tif 000004
【０１７９】
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【配列表フリーテキスト】
【０１８０】
配列の説明：
配列番号１：未変性のヒトＦＧＦ−１８のアミノ酸配列。
配列番号２：組換え切断型ＦＧＦ−１８（スプリフェルミン）のアミノ酸配列。
【図１】
0006487448.tif 000005
【図２】
0006487448.tif 000006
【図３】
0006487448.tif 000007
【図４】
0006487448.tif 000008
【図５】
0006487448.tif 000009
【図６】
0006487448.tif 000010
【図７】
0006487448.tif 000011
【図８】
0006487448.tif 000012
【図９（ａ）】
0006487448.tif 000013
【図９（ｂ）】
0006487448.tif 000014
【図１０】
0006487448.tif 000015
【図１１ａ】
0006487448.tif 000016
【図１１ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
0006487448.tif 000019
【図１４】
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【図１５】
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【図１６ａ】
0006487448.tif 000022
【図１６ｂ】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【配列表】
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