(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オートタキシンに結合する、塩基長が２１以上のアプタマーであって、下式：
ＧＷＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵ（配列番号４２）
（式中、ＷはＡ又はＵである）
で表わされるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）を含み、かつ以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかである、アプタマー：
（ａ）該アプタマーに含まれるヌクレオチドにおいて、
（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位がフッ素原子であり、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位がヒドロキシ基である、アプタマー；
（ｂ）該（ａ）のアプタマーにおいて、
（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のフッ素原子が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシ基が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー。
【請求項２】
ＷがＡである、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項３】
配列番号１６で表わされるヌクレオチド配列を含む、請求項１又は２に記載のアプタマー。
【請求項４】
オートタキシンに結合する、塩基長が２１以上のアプタマーであって、下式：
ＧＷＡＡＣＡＧＧＵＹＹＹＧＣＵ（配列番号４９）
（式中、ＷはＡ又はＵであり、ＹはＵ又はＣである）
で表わされるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）を含み、かつ以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかである、オートタキシンに結合するアプタマー：
（ａ）該アプタマーに含まれるヌクレオチドにおいて、
（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位がフッ素原子であり、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位がヒドロキシ基である、アプタマー；
（ｂ）該（ａ）のアプタマーにおいて、
（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のフッ素原子が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシ基が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー。
【請求項５】
オートタキシンに結合する、塩基長が２１以上のアプタマーであって、
下記（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）：
（Ａ）配列番号４、８、１４〜２０、２４、２９、３０、３２、４０、４１、４４〜４８及び５０〜５３から選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）；
（Ｂ）配列番号４、８、１４〜２０、２４、２９、３０、４０、４４、４５、４７、４８及び５０〜５３から選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）（ＧＷＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵ（配列番号４２）（式中、ＷはＡ又はＵである）で表わされる配列を除く）において、１〜５個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列；
（Ｃ）配列番号４、８、１４〜２０、２４、２９、３０、４０、４４、４５、４７、４８及び５０〜５３から選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と７０％以上の同一性を有する（但し、ＧＷＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵ（配列番号４２）（式中、ＷはＡ又はＵである）で表わされる配列は同一である）ヌクレオチド配列；
のいずれかのヌクレオチド配列を含み、かつ
以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかである、アプタマー：
（ａ）該アプタマーに含まれるヌクレオチドにおいて、
（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位がフッ素原子であり、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位がヒドロキシ基である、アプタマー；
（ｂ）該（ａ）のアプタマーにおいて、
（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のフッ素原子が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシ基が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー。
【請求項６】
オートタキシンに結合する、塩基長が２１以上のアプタマーであって、
下記（Ａ’）、（Ｂ’）又は（Ｃ’）：
（Ａ’）配列番号１６で表わされるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）；
（Ｂ’）配列番号１６で表わされるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）（ＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵ（配列番号１０）で表わされる配列を除く）において、１〜７個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列；
（Ｃ’）配列番号１６で表わされるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と７０％以上の同一性を有する（但し、ＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵ（配列番号１０）で表わされる配列は同一である）ヌクレオチド配列；
のいずれかのヌクレオチド配列を含み、かつ
以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかである、アプタマー：
（ａ）該アプタマーに含まれるヌクレオチドにおいて、
（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位がフッ素原子であり、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位がヒドロキシ基である、アプタマー；
（ｂ）該（ａ）のアプタマーにおいて、
（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のフッ素原子が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシ基が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー。
【請求項７】
少なくとも一つのヌクレオチドが修飾もしくは改変されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項８】
inverted dT又はポリエチレングリコールで修飾されている、請求項７に記載のアプタマー。
【請求項９】
inverted dT又はポリエチレングリコールが、アプタマーの５’末端もしくは３’末端に結合している、請求項８に記載のアプタマー。
【請求項１０】
アプタマーに含まれるリン酸基の少なくとも一つが、ホスホロチオエート化又はホスホロジチオエート化されたものである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項１１】
オートタキシンに結合するアプタマーであって、配列番号１６で表わされるヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列中、ＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵ（配列番号１０）で表わされる配列におけるリン酸基の少なくとも一つがホスホロチオエート化又はホスホロジチオエート化されたものであり、アプタマーの５’末端もしくは３’末端がそれぞれinverted dT又はポリエチレングリコールで修飾されたものであり、かつ以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかである、アプタマー：
（ａ）該アプタマーに含まれるヌクレオチドにおいて、
（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位がフッ素原子であり、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位がヒドロキシ基である、アプタマー；
（ｂ）該（ａ）のアプタマーにおいて、
（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のフッ素原子が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシ基が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアプタマーと機能性物質とを含む複合体。
【請求項１３】
機能性物質が、親和性物質、標識用物質、酵素、薬物、毒素又は薬物送達媒体である、請求項１２に記載の複合体。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の塩基長が２３以上のアプタマー、あるいは請求項１２又は１３に記載の複合体を含む医薬。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の塩基長が２３以上のアプタマー、あるいは請求項１２又は１３に記載の複合体を含む抗線維化剤。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアプタマー、あるいは請求項１２又は１３に記載の複合体を含むオートタキシンの検出用プローブ。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアプタマー、あるいは請求項１２又は１３に記載の複合体を用いることを特徴とする、オートタキシンの検出方法。
【請求項１８】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の塩基長が２３以上のアプタマーを含んでなる、オートタキシンの阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オートタキシンに対するアプタマー及びその利用方法などに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
オートタキシンはメラノーマ細胞の運動性を亢進させる分子として同定された分泌タンパク質である。Ｅｎｐｐ（ｅｃｔｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ／ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ）ファミリータンパク質に属しＥｎｐｐ２としても知られている。ホスホジエステラーゼ活性を有し細胞外のヌクレオチド代謝に関わる。また、ＬｙｓｏＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｄ活性（ＬｙｓｏＰＬＤ活性）を持ち、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）をリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）とコリンに分解する酵素でもある。産生されたＬＰＡは脂質メディエーターとして、細胞運動活性化、細胞増殖、血管新生など様々な生理活性を示す。ＬＰＡはがん細胞の増殖、転移などに関係していると言われ、多くの研究がなされている。またＬＰＡの産生酵素であるオートタキシンもがん患者の血中や腹水中で発現や活性が上昇しているという報告が多数存在する。
最近、ブレオマイシン誘導による肺線維症モデルにおいて、ＬＰＡ受容体ＬＰＡ１のノックアウトマウスやＬＰＡ１阻害剤による線維化抑制効果が報告され、ＬＰＡと肺線維症との関わりが示唆されており、ＬＰＡの産生酵素であるオートタキシンについても肺線維症との関わりに注目が集まっている。
その中で抗オートタキシンモノクローナル抗体が間質性肺炎及び／又は肺線維症に対する予防及び／又は治療効果を有することが報告された。またオートタキシン低分子阻害剤により、ブレオマイシン誘導による肺線維症モデルにおける線維症抑制効果も報告された。いずれの報告でも、特発性肺線維症患者の肺胞洗浄液中にオートタキシンが存在し、健常人と比較してその濃度や活性が高いことが示されている。
特発性肺線維症は５年生存率が３０％という極めて予後の悪い疾患である。そのメカニズムは不明な点が多いが、一般的に肺胞などが損傷を受けることで、組織修復機構が過剰に働き、肺間質部において、線維芽細胞の異常増殖や結合組織タンパク質の過剰生産が起こるとされている。現在、世界的な標準治療としてステロイド、免疫抑制剤などが使用されているが、２００８年、世界に先駆けて日本において特発性肺線維症の治療薬として、ピレスパ（一般名：ピルフェニドン）が承認され、その有効性などが臨床の場でも検討されている。しかし、ピレスパが何を標的としているのかなど、その作用機序は不明な点が多い。【０００３】
アプタマーは標的分子（タンパク質、糖鎖、ホルモン等）に特異的に結合する核酸を意味する。一本鎖のRNA（又はDNA）がとる三次元立体構造によって、標的分子に結合する。その取得にはＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）と呼ばれるスクリーニング法が用いられる（特許文献１〜３）。ＳＥＬＥＸ法で得られるアプタマーは８０ヌクレオチド程度の鎖長であり、その後標的分子の生理阻害活性を指標に短鎖化を図る。さらに生体内での安定性向上を目的に化学修飾を加え、医薬品としての最適化を図る。
アプタマーは標的分子との結合特性が高く、同様な機能をもつ抗体と比較してもその親和性は高い場合が多い。さらに免疫排除を受けにくく、抗体特有の抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）や補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）などの副作用は起こりにくいとされる。デリバリーの観点では、アプタマーは抗体の１／１０程度の分子サイズであるため組織移行が起こりやすく、目的の部位まで薬物を送達させることがより容易である。また同じ分子標的医薬の低分子においては、中には難溶性のものもあり、その製剤化には最適化が必要である場合もあるが、アプタマーは水溶性が高いため、その点でも有利である。さらに化学合成により生産されるので、大量生産すればコストダウンを図ることができる。その他、長期保存安定性や熱・溶媒耐性もアプタマーの優位な特徴である。一方で、一般にアプタマーの血中半減期は抗体よりも短い。しかし、この点も毒性を考慮した場合はメリットとなる場合がある。
２００４年１２月には世界初のＲＮＡアプタマー医薬であるＭａｃｕｇｅｎが加齢黄斑変性症の治療薬として米国で承認されており、ＲＮＡアプタマーの治療薬、診断薬、試薬への応用が注目され、次世代医薬品として期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第９１／１９８１３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９４／０８０５０号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９５／０７３６４号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、オートタキシンに対するアプタマー及びその利用方法などを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、オートタキシンに対する良質なアプタマーを作製することに成功し、もって本発明を完成するに至った。【０００７】
即ち、本発明は、以下の発明などを提供するものである。
［１］オートタキシンに結合するアプタマーであって、下式：
ＧＷＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵ（配列番号４２）
（式中、ＷはＡ又はＵである）
で表わされるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）を含み、かつ以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかである、アプタマー：
（ａ）該アプタマーに含まれるヌクレオチドにおいて、
（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位がフッ素原子であり、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位がヒドロキシ基である、アプタマー；
（ｂ）該（ａ）のアプタマーにおいて、
（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のフッ素原子が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシ基が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー。
［２］ＷがＡである、［１］に記載のアプタマー。
［３］配列番号１６で表わされるヌクレオチド配列を含む、［１］又は［２］に記載のアプタマー。
［４］［１］〜［３］のいずれかに記載のアプタマーにおいて、配列番号１０で表わされるヌクレオチド配列中で１〜数個のヌクレオチドが置換、挿入又は付加され、かつ以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかである、オートタキシンに結合するアプタマー：
（ａ）該置換、挿入又は付加されたヌクレオチドにおいて、
（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位がフッ素原子であり、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位がヒドロキシ基である、アプタマー；
（ｂ）該（ａ）の置換、挿入又は付加されたヌクレオチドにおいて、
（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のフッ素原子が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシ基が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー。
［５］オートタキシンに結合するアプタマーであって、
下記（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）：
（Ａ）配列番号４、８、１４〜２０、２４、２９、３０、３２、４０、４１、４４〜４８及び５０〜５３から選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）；
（Ｂ）配列番号４、８、１４〜２０、２４、２９、３０、４０、４４、４５、４７、４８及び５０〜５３から選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において、１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列；
（Ｃ）配列番号４、８、１４〜２０、２４、２９、３０、４０、４４、４５、４７、４８及び５０〜５３から選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と６０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列；
のいずれかのヌクレオチド配列を含み、かつ
以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかである、アプタマー：
（ａ）該アプタマーに含まれるヌクレオチドにおいて、
（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位がフッ素原子であり、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位がヒドロキシ基である、アプタマー；
（ｂ）該（ａ）のアプタマーにおいて、
（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のフッ素原子が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシ基が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー。
［６］オートタキシンに結合するアプタマーであって、
下記（Ａ’）、（Ｂ’）又は（Ｃ’）：
（Ａ’）配列番号１６で表わされるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）；
（Ｂ’）配列番号１６で表わされるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）（ＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵ（配列番号１０）で表わされる配列を除く）において、１〜７個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列；
（Ｃ’）配列番号１６で表わされるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と７０％以上の同一性を有する（但し、ＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵ（配列番号１０）で表わされる配列は同一である）ヌクレオチド配列；
のいずれかのヌクレオチド配列を含み、かつ
以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかである、アプタマー：
（ａ）該アプタマーに含まれるヌクレオチドにおいて、
（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位がフッ素原子であり、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位がヒドロキシ基である、アプタマー；
（ｂ）該（ａ）のアプタマーにおいて、
（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のフッ素原子が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシ基が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー。
［７］塩基長が２３以上である、［１］〜［６］のいずれかに記載のアプタマー。
［８］少なくとも一つのヌクレオチドが修飾もしくは改変されている、［１］〜［７］のいずれかに記載のアプタマー。
［９］inverted dT又はポリエチレングリコールで修飾されている、［８］に記載のアプタマー。
［１０］inverted dT又はポリエチレングリコールが、アプタマーの５’末端もしくは３’末端に結合している、［９］に記載のアプタマー。
［１１］アプタマーに含まれるリン酸基の少なくとも一つが、ホスホロチオエート化又はホスホロジチオエート化されたものである、［１］〜［１０］のいずれかに記載のアプタマー。
［１２］オートタキシンに結合するアプタマーであって、配列番号１６で表わされるヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列中、
ＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵ（配列番号１０）で表わされる配列におけるリン酸基の少なくとも一つがホスホロチオエート化又はホスホロジチオエート化されたものであり、アプタマーの５’末端もしくは３’末端がそれぞれinverted dT又はポリエチレングリコールで修飾されたものであり、かつ以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかである、アプタマー：
（ａ）該アプタマーに含まれるヌクレオチドにおいて、
（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位がフッ素原子であり、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位がヒドロキシ基である、アプタマー；
（ｂ）該（ａ）のアプタマーにおいて、
（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のフッ素原子が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシ基が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー。
［１３］［１］〜［１２］のいずれかに記載のアプタマーと機能性物質とを含む複合体。
［１４］機能性物質が、親和性物質、標識用物質、酵素、薬物、毒素又は薬物送達媒体である、［１３］に記載の複合体。
［１５］［１］〜［１２］のいずれかに記載のアプタマー、あるいは［１３］又は［１４］に記載の複合体を含む医薬。
［１６］［１］〜［１２］のいずれかに記載のアプタマー、あるいは［１３］又は［１４］に記載の複合体を含む抗線維化剤。
［１７］［１］〜［１２］のいずれかに記載のアプタマー、あるいは［１３］又は［１４］に記載の複合体を含むオートタキシンの検出用プローブ。
［１８］［１］〜［１２］のいずれかに記載のアプタマー、あるいは［１３］又は［１４］に記載の複合体を用いることを特徴とする、オートタキシンの検出方法。
［１９］［１］〜［１２］のいずれかに記載のアプタマーを含んでなる、オートタキシンの阻害剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のアプタマー及び複合体は、例えば線維症やがんなどのオートタキシンに起因する種々の疾患に対する医薬、あるいは診断薬、試薬として有用であり得る。本発明のアプタマー及び複合体はまた、オートタキシンの精製及び濃縮、並びにオートタキシンの検出及び定量に有用であり得る。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】配列番号４及び１６で表わされるアプタマーの、ＭＦＯＬＤプログラムにより予想される二次構造を示す図である。配列番号１０で表わされる配列のヌクレオチドを丸囲み文字で示す。
【図２】配列番号４で表わされるアプタマーがオートタキシンに結合する様子を示す図である。３０Ｎは３０ヌクレオチドのランダム配列を含んだＲＮＡプールである。キャプチャー分子として、アプタマー又はネガティブコントロールの３０Ｎを固定化し、アナライトとしてヒトオートタキシンを流した。測定はＧＥヘルスケア社製のＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００で行った。
【図３】配列番号１６（２３）で表わされるアプタマーがＦＧＦ２に対して結合活性を有していないことを示す図である。
【図４】ブレオマイシン誘導型肺線維症モデルマウスにおける肺中ハイドロキシプロリン量に及ぼすオートタキシンアプタマー投与の効果を示す図である。ブレオマイシン投与の翌日から、２通りの用量のオートタキシンアプタマー（配列番号１６（４９））を連日投与した群と、ビークル投与群とで、投与終了後に摘出した左肺中の肺重量当たりのハイドロキシプロリン量の測定し、比較した。コントロール群は無処置（ブレオマイシン非投与）のマウスを示す。
【図５】ブレオマイシン誘導型肺線維症モデルマウスにおける線維化の臨床所見に及ぼすオートタキシンアプタマー投与の効果を示す図である。ブレオマイシン投与の翌日から、２通りの用量のオートタキシンアプタマー（配列番号１６（４９））を連日投与した群と、ビークル投与群とで、投与終了後に肺を摘出して組織切片を作製し、線維化をクリニカルスコアで評価した。コントロール群は無処置（ブレオマイシン非投与）のマウスを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、オートタキシンに対して結合活性を有するアプタマー（以下、本発明のアプタマーともいう）を提供する。また本発明のアプタマーは、オートタキシンの活性を阻害し得る。
【００１１】
アプタマーとは、所定の標的分子に対する結合活性を有する核酸分子をいう。アプタマーは、所定の標的分子に対して結合することにより、所定の標的分子の活性を阻害し得る。本発明のアプタマーは、オートタキシンに対して結合活性を有し、オートタキシンの活性を阻害し得るアプタマーである。また本発明のアプタマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾核酸又はそれらの混合物であり得る。本発明のアプタマーはまた、直鎖状又は環状の形態であり得る。
【００１２】
オートタキシン（ＥＣ．３．１．４．３９）は血液中に存在する糖たんぱく質で、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）をリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）とコリンに分解する酵素である。本発明のアプタマーは、任意の哺乳動物に由来するオートタキシンに対する阻害活性を有し得る。このような哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット、ハムスター）、並びにペット、家畜及び使役動物（例、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）が挙げられるが、好ましくはヒトである。
【００１３】
ヒトオートタキシンはα、β、γ、δの４つのアイソタイプが報告されているが、本発明においてヒトオートタキシンは特にβタイプを意味する。ヒトβ―オートタキシンのアミノ酸配列はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１０３５１８１で特定されるアミノ酸配列を有するヒトオートタキシンをいうが、これらと実質的に同等のＬＰＡ合成活性を有する部分タンパク質又は一部のアミノ酸が置換、欠損、付加もしくは挿入された変異タンパク質もこれに含まれる。
【００１４】
本発明のアプタマーは、生理的な緩衝液中で、オートタキシンへ結合する。緩衝液としては特に限定されるものではないが、ｐＨが約５．０〜１０．０程度のものが好ましく用いられ、このような緩衝液としては、例えば後述する溶液Ａ（実施例１参照）が挙げられる。本発明のアプタマーは、以下のいずれかの試験により検出可能な程度の強度で、オートタキシンへ結合するものである。
結合強度の測定にはＧＥヘルスケア社製のＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００を用いる。一つの測定方法としては、まずセンサーチップにアプタマーを固定化する。固定化量は約１５００ＲＵとする。アナライト用のオートタキシン溶液は０．０２０μＭに調製したものを２０μＬインジェクトし、オートタキシンのアプタマーへの結合を検出する。３０ヌクレオチドからなるランダムなヌクレオチド配列を含むＲＮＡをネガティブコントロールとし、該コントロールＲＮＡと比較してオートタキシンが有意に強くアプタマーに結合した場合、該アプタマーはオートタキシンへの結合能を有すると判定することができる。
別の測定方法としては、まずセンサーチップにオートタキシンを固定化する。固定化量は約２７００ＲＵとする。アナライト用のアプタマー溶液は０．３０μＭに調製したものを２０μＬインジェクトし、アプタマーのオートタキシンへの結合を検出する。３０ヌクレオチドからなるランダムなヌクレオチド配列を含むＲＮＡをネガティブコントロールとし、該コントロールＲＮＡと比較してアプタマーが有意に強くオートタキシンに結合した場合、該アプタマーはオートタキシンへの結合能を有すると判定する。
【００１５】
オートタキシンに対する阻害活性とは、オートタキシンが保有する任意の活性に対する阻害能を意味する。オートタキシンは加水分解によりホスホジエステル結合を切断するホスホジエステラーゼ活性をもっているが、それを阻害するということである。酵素活性に対する基質として許容されるのは生体内に存在するホスホジエステル結合含有物質（例えばＡＴＰなど）に限らず、それが含まれる化合物に発色物質や蛍光物質が付加した基質を含む。発色物質や蛍光物質は、当業者に公知である。また、オートタキシンはリゾホスホリパーゼＤ活性を持っている。この活性はリゾリン脂質のホスホジエステルのグリセロール骨格とは反対側の結合を切断して、主にリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）を産生するが、この産生を抑制することもオートタキシン活性を阻害することに含まれる。
【００１６】
オートタキシンの基質とはオートタキシンにより加水分解をうけ、切断されるホスホジエステル結合をもつ物質のことをいう。生体内に存在するオートタキシンの基質はリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）とスフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）が知られている。本明細書におけるオートタキシンの基質としては様々な炭素鎖長と不飽和度をもつＬＰＣやＳＰＣ、それらに発色物質や蛍光物質が付加された基質も含まれる。
【００１７】
オートタキシンの酵素活性をアプタマーが阻害するか否かは、例えば以下の試験により評価することができる。オートタキシンの基質として、ホスホジエステル結合含有合成基質 ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈeｎｙｌ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ５’−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＮＰ−ＴＭＰ）（ＳＩＧＭＡ）を用いる。加水分解によりホスホジエステル結合が切断され、ｐ−ニトロフェノールが遊離する。このｐ−ニトロフェノールは黄色く発色し、それを検出する。アッセイには９６ウェルプレート（９６−Ｗｅｌｌ  ＥＩＡ／ＲＩＡ  Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  Ｐｌａｔｅｓ、  Ｃｏｓｔａｒ社）を使用し、反応液量２００μＬで行う。核酸を溶液Ａ（後述する実施例１を参照）１００μＬ中に用意し、そこに同じく反応液Ａ中で調整した１０ｍＭ  ｐＮＰ−ＴＭＰ、２０μＬを添加しよく混合したあと、３７℃で５分間加温する。一方で６ｎｇのオートタキシン（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ、Ｒ＆Ｄ社製）を溶液Ａで希釈したものを８０μＬ用意し、３７℃で５分間加温する。加温後両者を混合し酵素反応を開始させる。反応溶液中の最終オートタキシン濃度は０．３ｎＭ、最終基質濃度は１ｍＭである。反応液を含むプレートを３７℃で２４時間加温後、マイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０（モレキュラーデバイス社製）にセットし波長４０５ｎｍで吸光度を求める。核酸をいれていないときの吸光度を１００％（Ａ０）とし、各被験物質の吸光度（Ａ）から酵素活性率を次式から求める。
【００１８】
【数１】
0006586669.tif 000002
【００１９】
酵素活性を５０％阻害するのに要する阻害剤の濃度（ＩＣ５０）を求める。ＩＣ５０値が０．１０μＭ以下であるアプタマーを優れた阻害活性を持つアプタマーであると判定する。
【００２０】
本発明のアプタマーは、オートタキシンの任意の部分に結合するアプタマーである限り特に限定されない。また本発明のアプタマーは、オートタキシンの任意の部分に結合し、その活性を阻害し得るものである限り特に限定されない。
【００２１】
本発明のアプタマーの長さは特に限定されず、通常、約２００ヌクレオチド以下であり得るが、例えば約１００ヌクレオチド以下であり、好ましくは約５０ヌクレオチド以下であり、より好ましくは約４０ヌクレオチド以下であり、最も好ましくは約３０ヌクレオチド以下であり得る。総ヌクレオチド数が少なければ、化学合成及び大量生産がより容易であり、かつコスト面でのメリットも大きい。また、化学修飾も容易であり、生体内安定性も高く、毒性も低いと考えられる。本発明のアプタマー長の下限は、配列番号５３で表わされる共通配列（ＧＷＡＡＣＡＧＧＵＹＹＹＧＣＵ；ＷはＡ又はＵ、ＹはＵ又はＣを示す。但し、ウラシルはチミンであってもよい）を含み、該共通配列が所望の二次構造（後述の式（Ｉ’）又は（ＩＩ）で表わされる二次構造）をとり得る限り特に制限はないが、該アプタマー長は、例えば１５ヌクレオチド以上、好ましくは２０ヌクレオチド以上、より好ましくは２３ヌクレオチド以上であり得る。特に好ましい実施態様において、本発明のアプタマーの長さは２３〜５０ヌクレオチド、あるいは２３〜４０ヌクレオチドである。
【００２２】
好ましい一実施態様において、本発明のアプタマーは、下式：
ＧＷＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵ（配列番号４２）
（式中、ＷはＡ又はＵである）
で表わされるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）を含む（以下、本発明のアプタマー（Ｉ）ともいう）。
【００２３】
本発明のアプタマー（Ｉ）に含まれる各ヌクレオチドは、以下の（ａ）又は（ｂ）:
（ａ）（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位がフッ素原子であり、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位がヒドロキシ基である；
（ｂ）（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のフッ素原子が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、ヒドロキシ基、アルコキシ基（例、メトキシ基）、アシルオキシ基（例、アセチルオキシ基）及びアミノ基（例、−ＮＨ２基）からなる群より選ばれる原子又は基、好ましくは、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシ基が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、フッ素原子又はアルコキシ基（例、メトキシ基）、アシルオキシ基（例、アセチルオキシ基）及びアミノ基（例、−ＮＨ２基）からなる群より選ばれる原子又は基、好ましくは、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている;
のいずれかである。
【００２４】
式：ＧＷＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵ（配列番号４２）において、Ｗは、好ましくはＡである。
【００２５】
式：ＧＷＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵ（配列番号４２）で表わされる配列は、式（Ｉ）：
【００２６】
【化１】
0006586669.tif 000003
【００２７】
又は式（ＩＩ）：
【００２８】
【化２】
0006586669.tif 000004
【００２９】
で表わされる潜在的２次構造を形成することができる。
本発明のアプタマーは、ＧＷＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵ（配列番号４２）（式中、ＷはＡ又はＵである）で表わされる配列部分において上記構造をとることができる。この構造をとることで、オートタキシンに対する種々の活性（オートタキシンへの結合活性、オートタキシンの阻害活性等）を有すると考えられる。
【００３０】
また上記構造において、５’末端と３’末端それぞれに続く配列間の相互作用によって、好ましくはステム構造が形成され得る。本発明のアプタマーが種々の活性（オートタキシンへの結合活性、オートタキシンの阻害活性等）を有するためには、上記潜在的２次構造に加えて、それに続くステム構造を有することが望ましい。ステム構造を持つことによってアプタマーが安定化し、強い活性を持つようになる。ステム構造は相補的な塩基対（ワトソン−クリック塩基対の他、Ｇ＝Ｕ塩基対も含む）によって形成されるが、塩基対の数（ステム長）は特に限定されない。好ましくは、ステム長は４塩基対以上である。上限は特に制限はないが、例えば１８塩基対以下、好ましくは１１塩基対以下である。またステム構造においては、全体としてステム構造を構成する限りにおいて、その一部において塩基対を形成しなくてもアプタマー活性は維持される。従って、ステム構造部分は、その構造を持つ限りにおいてヌクレオチドの置換、欠失、挿入、付加等が可能である。ステム構造の具体的な例は、例えば図１に示される。
【００３１】
式：ＧＷＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵ（配列番号４２）（式中、ＷはＡ又はＵである）で表わされる配列の５’末端と３’末端それぞれに続く配列間の相互作用によって、ステム構造が形成される好ましいヌクレオチド配列の例として、配列番号１６で表わされるヌクレオチド配列を挙げることができる。配列番号１６で表わされるヌクレオチド配列がとり得る潜在的２次構造を図１右に示す。
【００３２】
本発明のアプタマー（Ｉ）は、オートタキシンへの結合活性及びオートタキシン活性（オートタキシンの酵素活性等）の阻害活性を保持する限り、配列番号４２で表わされるヌクレオチド配列において、１〜数個（例えば、１〜４個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、特に好ましくは１個）のヌクレオチドが置換、挿入又は付加されてもよい。ヌクレオチドが置換又は挿入される位置は特に制限されないが、例えばヌクレオチドが置換される場合、配列番号１０で表わされるヌクレオチド配列の５’末端から１０〜１２番目のＵＵＵの少なくとも１個のＵが、他のヌクレオチド、好ましくはＡ以外のヌクレオチド、より好ましくはＣで置換されることが好ましい。
したがって、好ましくは、本発明のアプタマー（Ｉ）は、式：ＧＷＡＡＣＡＧＧＵＹＹＹＧＣＵ（式中、ＷはＡ又はＵであり、ＹはＵ又はＣである）（配列番号４９）で表わされるヌクレオチド配列を含み得る。式中、Ｗは、好ましくはＡであり、ＹＹＹは、好ましくはＵＵＵ、ＵＵＣ、ＵＣＵ又はＣＵＵである。また、配列番号４２で表わされるヌクレオチド配列中、５’末端から６番目のＡが置換される場合、Ｕ以外のヌクレオチドで置換されることが好ましく、より好ましくは５’末端から６番目のＡは置換されない。
【００３３】
上記において、置換、挿入又は付加されるヌクレオチドは、以下の（ａ）又は（ｂ）:
（ａ）（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位がフッ素原子であり、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位がヒドロキシ基である；
（ｂ）（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のフッ素原子が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、ヒドロキシ基、アルコキシ基（例、メトキシ基）、アシルオキシ基（例、アセチルオキシ基）及びアミノ基（例、−ＮＨ２基）からなる群より選ばれる原子又は基、好ましくは、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシ基が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、フッ素原子又はアルコキシ基（例、メトキシ基）、アシルオキシ基（例、アセチルオキシ基）及びアミノ基（例、−ＮＨ２基）からなる群より選ばれる原子又は基、好ましくは、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている;
のいずれかである。
【００３４】
あるいは、別の好ましい実施態様において、本発明のアプタマーは、下記（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）配列番号４、８、１４〜２０、２４、２９、３０、３２、４０、４１、４４〜４８及び５０〜５３から選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマー（但し、ウラシルはチミンであってもよい）；
（Ｂ）配列番号４、８、１４〜２０、２４、２９、３０、４０、４４、４５、４７、４８及び５０〜５３から選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において、１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を含むアプタマー；又は
（Ｃ）配列番号４、８、１４〜２０、２４、２９、３０、４０、４４、４５、４７、４８及び５０〜５３から選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、いっそう好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）の同一性を有するヌクレオチド配列を含むアプタマー；
（但し、上記（Ｂ）または（Ｃ）のアプタマーは、オートタキシンに結合し、オートタキシンの活性（オートタキシンの酵素活性等）を阻害し得るものである。）
のいずれかのアプタマーである（以下、本発明のアプタマー（ＩＩ）ともいう）。
【００３５】
上記（Ｂ）及び（Ｃ）の配列番号４、８、１４〜２０、２４、２９、３０、４０、４４、４５、４７、４８及び５０〜５３で表わされる各ヌクレオチド配列は、式：ＧＷＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵ（配列番号４２）（式中、ＷはＡ又はＵである）で表わされる配列を共通配列として含む。
【００３６】
上記（Ｂ）において、置換、欠失、挿入又は付加されるヌクレオチド数は、アプタマーがオートタキシンに結合し、オートタキシンの活性（オートタキシンの酵素活性等）を阻害し得る限り特に限定されないが、例えば約３０個以下、好ましくは約２０個以下、より好ましくは約１０個以下、さらにより好ましくは５個以下、最も好ましくは４個、３個、２個又は１個であり得る。配列番号１０で表わされる共通配列中にヌクレオチドの置換、挿入又は付加を有する場合、上記本発明のアプタマー（Ｉ）と同様の変異を含むことが好ましい。より好ましくは、該共通配列中にヌクレオチドの置換を有する場合、上記（Ｂ）のアプタマーは、式：ＧＷＡＡＣＡＧＧＵＹＹＹＧＣＵ（式中、ＷはＡ又はＵであり、ＹはＵ又はＣである）（配列番号４９）で表わされるヌクレオチド配列を含む。式中、Ｗは、好ましくはＡであり、ＹＹＹは、好ましくはＵＵＣ、ＵＣＵ又はＣＵＵである。また、配列番号１０で表わされるヌクレオチド配列中、５’末端から６番目のＡが置換される場合、Ｕ以外のヌクレオチドで置換されることが好ましく、より好ましくは５’末端から６番目のＡは置換されない。
【００３７】
上記（Ｃ）において、「同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのヌクレオチド配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全ヌクレオチド残基に対する、同一ヌクレオチド残基の割合（％）を意味する。
【００３８】
本明細書において、ヌクレオチド配列における同一性は、例えば相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ−２（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（ギャップオープン＝５ペナルティ；ギャップエクステンション＝２ペナルティ；ｘ＿ドロップオフ＝５０；期待値＝１０；フィルタリング＝ＯＮ）にて２つのヌクレオチド配列をアラインすることにより、計算することができる。
【００３９】
上記（Ｃ）のアプタマーにおいて、配列番号４２で表わされる共通配列部分に対する同一性は、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上であり、特に好ましくは、該アプタマーは、式：ＧＷＡＡＣＡＧＧＵＹＹＹＧＣＵ（式中、ＷはＡ又はＵであり、ＹはＵ又はＣである）（配列番号４９）で表わされるヌクレオチド配列を含む。式中、Ｗは、好ましくはＡであり、ＹＹＹは、好ましくはＵＵＣ、ＵＣＵ又はＣＵＵである。また、配列番号１０で表わされるヌクレオチド配列中、５’末端から６番目のＡが置換される場合、Ｕ以外のヌクレオチドで置換されることが好ましく、より好ましくは５’末端から６番目のＡは置換されない。
【００４０】
特に好ましい実施態様において、本発明のアプタマー（ＩＩ）は、下記（Ａ’）、（Ｂ’）又は（Ｃ’）：
（Ａ’）配列番号１６で表わされるヌクレオチド配列を含むアプタマー（但し、ウラシルはチミンであってもよい）；
（Ｂ’）配列番号１６で表わされるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）（ＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵ（配列番号１０）で表わされる配列を除く）において、１〜７個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を含むアプタマー；又は
（Ｃ’）配列番号１６で表わされるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と７０％以上（好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）の同一性を有する（但し、ＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵ（配列番号１０）で表わされる配列は同一である）ヌクレオチド配列を含むアプタマー（但し、上記（Ｂ’）または（Ｃ’）のアプタマーは、オートタキシンに結合し、オートタキシンの活性（オートタキシンの酵素活性等）を阻害し得るものである。）
のいずれかである。
【００４１】
上記（Ｂ’）において、置換、欠失、挿入又は付加されるヌクレオチド数は、好ましくは５個以下、より好ましくは４個、さらに好ましくは３個、特に好ましくは２個又は１個であり得る。
【００４２】
上記（Ｃ’）において、「同一性」とは、上記（Ｃ）と同義である。
【００４３】
本発明のアプタマー（ＩＩ）はまた、
（Ｄ）１以上の上記（Ａ）および／または１以上の上記（Ｂ）および／または１以上の上記（Ｃ）の複数の連結物、好ましくは、
（Ｄ’）１以上の上記（Ａ’）および／または１以上の上記（Ｂ’）および／または１以上の上記（Ｃ’）の複数の連結物
であり得る。上記（Ｄ）、（Ｄ’）において連結はタンデム結合にて行われ得る。また、連結に際し、リンカーを利用してもよい。リンカーとしては、ヌクレオチド鎖（例、１〜約２０ヌクレオチド）、非ヌクレオチド鎖（例、−（ＣＨ２）ｎ−リンカー、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−リンカー、ヘキサエチレングリコールリンカー、ＴＥＧリンカー、ペプチドを含むリンカー、−Ｓ−Ｓ−結合を含むリンカー、−ＣＯＮＨ−結合を含むリンカー、−ＯＰＯ３−結合を含むリンカー）が挙げられる。上記複数の連結物における複数とは、２以上であれば特に限定されないが、例えば２個、３個又は４個であり得る。
【００４４】
上記（Ａ）〜（Ｄ）、（Ａ’）〜（Ｄ’）における各ヌクレオチドは、以下の（ａ）又は（ｂ）:
（ａ）（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位がフッ素原子であり、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位がヒドロキシ基である；
（ｂ）（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のフッ素原子が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシ基が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている;
のいずれかである。
【００４５】
また、本発明のアプタマー（ＩＩ）は、上記（Ｂ）又は（Ｃ）において、式：ＧＷＡＡＣＡＧＧＵＹＹＹＧＣＵ（式中、ＷはＡ又はＵであり、ＹはＵ又はＣである）（配列番号４９）で表わされるヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列は、式（Ｉ’）：
【００４６】
【化３】
0006586669.tif 000005
【００４７】
又は式（ＩＩ）：
【００４８】
【化４】
0006586669.tif 000006
【００４９】
で表わされる潜在的二次構造を形成することができる。
式（Ｉ’）中、Ｗは、好ましくはＡであり、ＹＹＹは、好ましくはＵＵＵ、ＵＵＣ、ＵＣＵ又はＣＵＵである。
【００５０】
また、本発明のアプタマー（ＩＩ）は、上記（Ｂ）又は（Ｃ）において、式：ＧＷＡＡＣＡＧＧＵＹＹＹＧＣＵ（式中、ＷはＡ又はＵであり、ＹはＵ又はＣである）（配列番号４９）で表わされるヌクレオチド配列の５’末端と３’末端それぞれに続く配列間の相互作用によって、ステム構造を形成し得る。ステム長は特に限定されないが、好ましくは４塩基対以上である。ステム長の上限も特に制限はないが、例えば１８塩基対以下、好ましくは１１塩基対以下である。またステム構造においては、全体としてステム構造を構成する限りにおいて、その一部において塩基対を形成しなくてもアプタマー活性は維持される。従って、ステム構造部分は、その構造を持つ限りにおいてヌクレオチドの置換、欠失、挿入、付加等が可能である。
【００５１】
また、本発明のアプタマー（ＩＩ）は、上記（Ｂ’）又は（Ｃ’）において、式：ＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵ（配列番号１０）で表わされるヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列は、式（Ｉ”）：
【００５２】
【化５】
0006586669.tif 000007
【００５３】
で表わされる潜在的二次構造を形成することができる。
【００５４】
また、本発明のアプタマー（ＩＩ）は、上記（Ｂ）又は（Ｃ）において、式：ＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵ（配列番号１０）で表わされるヌクレオチド配列の５’末端と３’末端それぞれに続く配列間の相互作用によって、ステム構造を形成し得る。ステム長は特に限定されないが、好ましくは４塩基対以上である。ステム長の上限も特に制限はないが、好ましくは１０塩基対以下である。またステム構造においては、全体としてステム構造を構成する限りにおいて、その一部において塩基対を形成しなくてもアプタマー活性は維持される。従って、ステム構造部分は、その構造を持つ限りにおいてヌクレオチドの置換、欠失、挿入、付加等が可能である。
【００５５】
上述のように、本発明のアプタマー（本発明のアプタマー（Ｉ）及び（ＩＩ）を包括する）は、少なくとも１種（例、１、２、３又は４種）のヌクレオチドが、リボースの２’位において、ヒドロキシル基、又は上述した任意の原子又は基、例えば、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基及びメトキシ基からなる群より選ばれる少なくとも２種（例、２、３又は４種）の基を含むヌクレオチドであり得る。
【００５６】
本発明のアプタマーにおいてはまた、全てのピリミジンヌクレオチドが、リボースの２’位において、フッ素原子であるか、又は上述した任意の原子又は基、好ましくは、水素原子、ヒドロキシル基及びメトキシ基からなる群より選ばれる同一の原子又は基で置換されているヌクレオチドであり得る。
【００５７】
本発明のアプタマーにおいてはまた、全てのプリンヌクレオチドが、リボースの２’位において、ヒドロキシル基であるか、又は上述した任意の原子又は基、好ましくは、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる同一の原子又は基で置換されるヌクレオチドであり得る。
【００５８】
本発明のアプタマーはまた、全てのヌクレオチドが、リボースの２’位において、上述した任意の原子又は基、例えば、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基及びメトキシ基からなる群より選ばれる同一の原子又は基を含むヌクレオチドであり得る。
【００５９】
尚、本明細書においては、アプタマーを構成するヌクレオチドをＲＮＡと仮定して（すなわち糖基をリボースと仮定して）、ヌクレオチド中の糖基への修飾の態様を説明するが、これは、アプタマーを構成するヌクレオチドからＤＮＡが除外されることを意味するものではなく、適宜ＤＮＡへの修飾として読み替えられる。例えば、アプタマーを構成するヌクレオチドがＤＮＡである場合、リボースの２’位のヒドロキシル基のＸへの置換は、デオキシリボースの２’位の一方の水素原子のＸへの置換として読み替えられる。
【００６０】
本発明のアプタマーは、オートタキシンに対する結合性、安定性、薬物送達性等を高めるため、各ヌクレオチドの糖残基（例、リボース）が修飾されたものであってもよい。糖残基において修飾される部位としては、例えば、糖残基の２’位、３’位及び／又は４’位のヒドロキシル基を他の原子に置き換えたものなどが挙げられる。修飾の種類としては、例えば、フルオロ化、アルコキシ化（例、メトキシ化、エトキシ化）、Ｏ−アリル化、Ｓ−アルキル化（例、Ｓ−メチル化、Ｓ−エチル化）、Ｓ−アリル化、アミノ化（例、−ＮＨ２）が挙げられる。このような糖残基の改変は、自体公知の方法により行うことができる（例えば、Ｓｐｒｏａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌｅ．Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．１９，７３３−７３８；Ｃｏｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９，２６２９−２６３５；Ｈｏｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２，５１３８−５１４５参照）。
また糖残基については、２’位及び４’位で架橋構造を形成したＢＮＡ：Ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＬＮＡ：Ｌｉｎｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）とすることもできる。このような糖残基の改変も、自体公知の方法により行うことができる（例えば、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３８，  ８７３５−８７３８  （１９９７）；  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  ５９，  ５１２３−５１２８  （２００３）、Ｒａｈｍａｎ  Ｓ．Ｍ．Ａ．，  Ｓｅｋｉ  Ｓ．，  Ｏｂｉｋａ  Ｓ．，  Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  Ｈ．，  Ｍｉｙａｓｈｉｔａ  Ｋ．，  Ｉｍａｎｉｓｈｉ  Ｔ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １３０，  ４８８６−４８９６  （２００８）など参照）。
【００６１】
本発明のアプタマーはまた、オートタキシンに対する結合活性等を高めるため、核酸塩基（例、プリン、ピリミジン）が改変（例、化学的置換）されたものであってもよい。このような改変としては、例えば、５位ピリミジン改変、６及び／又は８位プリン改変、環外アミンでの改変、４−チオウリジンでの置換、５−ブロモ又は５−ヨード−ウラシルでの置換が挙げられる。
また、ヌクレアーゼ及び加水分解に対して耐性であるように、あるいはオートタキシンに対する結合活性等を高める目的で、本発明のアプタマーに含まれるリン酸基が改変されていてもよい。例えば、リン酸基たるＰ（Ｏ）Ｏ基が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（チオエート）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（ジチオエート）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（アミデート）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｒ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ２（ホルムアセタール）又は３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）で置換されていてもよい〔ここで各々のＲ又はＲ’は独立して、Ｈであるか、あるいは置換されているか、又は置換されていないアルキル（例、メチル、エチル）である〕。なかでもリン酸基たるＰ（Ｏ）Ｏ基の少なくとも一つが、Ｐ（Ｏ）Ｓ（チオエート）又はＰ（Ｓ）Ｓ（ジチオエート）で置換されている、いわゆるホスホロチオエート化又はホスホロジチオエート化したものが好ましい。アプタマーに含まれるリン酸基の少なくとも一つがホスホロチオエート化又はホスホロジチオエート化されることによって、本発明のアプタマーの活性が向上する。ホスホロチオエート化又はホスホロジチオエート化されるリン酸基は特に制限されないが、例えば、本発明のアプタマー（Ｉ）又は（ＩＩ）における共通配列（配列番号１０、４２又は４９）中の任意のヌクレオチドであってよく、好ましくは、該共通配列の５’末端から３番目のＡのリン酸基であり得る。
連結基としては、−Ｏ−、−Ｎ−又は−Ｓ−が例示され、これらの連結基を通じて隣接するヌクレオチドに結合し得る。
改変はまた、キャッピングのような３’及び５’の改変を含んでもよい。
【００６２】
本発明のアプタマーはさらに、ポリエチレングリコール、アミノ酸、ペプチド、ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ、核酸、ヌクレオシド、Ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ、Ｌｉｔｈｏｃｏｌｉｃ−ｏｌｅｙｌ、Ｄｏｃｏｓａｎｙｌ、Ｌａｕｒｏｙｌ、Ｓｔｅａｒｏｙｌ、Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ、Ｏｌｅｏｙｌ、Ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ、その他脂質、ステロイド、コレステロール、カフェイン、ビタミン、色素、蛍光物質、抗癌剤、毒素、酵素、放射性物質、ビオチンなどをアプタマーの５’末端及び／又は３’末端に付加することにより、末端修飾が行われ得る。このような末端修飾については、例えば、米国特許第５，６６０，９８５号、同第５，７５６，７０３号を参照して行うことができる。
【００６３】
特に好ましい実施態様において、本発明は、オートタキシンに結合するアプタマーであって、
（１）配列番号１６で表わされるヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列中、ＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵ（配列番号１０）で表わされる配列におけるリン酸基の少なくとも一つ（例えば、５’末端から３番目のＡのリン酸基等）がホスホロチオエート化又はホスホロジチオエート化されたものであり、
（２）アプタマーの５’末端もしくは３’末端がそれぞれinverted dT又はポリエチレングリコールで修飾されたものであり、かつ以下の（ａ）又は（ｂ）：
（ａ）該アプタマーに含まれるヌクレオチドにおいて、
（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位がフッ素原子であり、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位がヒドロキシ基である、アプタマー；
（ｂ）該（ａ）のアプタマーにおいて、
（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のフッ素原子が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシ基が、それぞれ独立して、無置換であるか、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー；
のいずれかであるアプタマーを提供する。
上述のように、本発明のアプタマーの長さは、好ましくは２３〜５０ヌクレオチド、あるいは２３〜４０ヌクレオチドであるから、配列番号１６で表わされるヌクレオチド配列（２９ヌクレオチド）を含む上記アプタマーの長さは、好ましくは２９〜５０ヌクレオチド、あるいは２９〜４０ヌクレオチドである。配列番号１６で表わされるヌクレオチド配列の５’末端及び３’末端のそれぞれに続くヌクレオチド配列は、少なくとも図１右に示される、配列番号１６で表わされるヌクレオチド配列がとり得る二次構造を維持し得るものであれば、特に制限はないが、図１右のステム構造を延長することにより（ミスマッチやバルジの形成を許容する）、図１右のステム−ループ構造をさらに安定化し得るものであることが望ましい。
【００６４】
本発明のアプタマーは、本明細書中の開示及び当該技術分野における自体公知の方法により合成することができる。合成方法の一つはＲＮＡポリメラーゼを用いる方法である。目的の配列とＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を持つＤＮＡを化学合成し、これをテンプレートにして既に公知の方法により転写することで目的のＲＮＡを得ることができる。また、ＤＮＡポリメラーゼを用いることでも合成することができる。目的の配列を有したＤＮＡを化学合成し、これをテンプレートにして、既に公知の方法であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する。これを既に公知の方法であるポリアクリルアミド電気泳動法や酵素処理法により一本鎖とする。修飾の入ったアプタマーを合成する場合は、特定の位置に変異を導入したポリメラーゼを用いることで伸長反応の効率を上げることができる。このようにして得られたアプタマーは公知の方法により容易に精製することができる。
アプタマーはアミダイト法もしくはホスホアミダイト法などの化学合成法によって大量合成することができる。合成方法はよく知られている方法であり、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（Ｖｏｌ．２）［１］Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（Ｅｄｉｔｏｒ：Ｙｕｋｉｏ  Ｓｕｇｉｕｒａ，Ｈｉｒｏｋａｗａ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）などに記載のとおりである。実際にはＧＥヘルスケアーバイオサイエンス社製のＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ１００やＯｌｉｇｏＰｒｏｃｅｓｓなどの合成機を使用する。精製はクロマトグラフィー等の自体公知の方法により行われる。
アプタマーはホスホアミダイト法などの化学合成時にアミノ基などの活性基を導入することで、合成後に機能性物質を付加することができる。例えば、アプタマーの末端にアミノ基を導入することで、カルボキシル基を導入したポリエチレングリコール鎖を縮合させることができる。
アプタマーは、リン酸基の負電荷を利用したイオン結合、リボースを利用した疎水結合及び水素結合、核酸塩基を利用した水素結合やスタッキング結合など多様な結合様式により標的物質と結合する。特に、構成ヌクレオチドの数だけ存在するリン酸基の負電荷を利用したイオン結合は強く、タンパク質の表面に存在するリジンやアルギニンの正電荷と結合する。このため、標的物質との直接的な結合に関わっていない核酸塩基は置換することができる。特に、ステム構造の部分は既に塩基対が作られており、また、二重らせん構造の内側を向いているので、核酸塩基は、標的物質と直接結合し難い。従って、塩基対を他の塩基対に置換してもアプタマーの活性は減少しない場合が多い。ループ構造など塩基対を作っていない構造においても、核酸塩基が標的分子との直接的な結合に関与していない場合に、塩基の置換が可能である。リボースの２’位の修飾に関しては、まれにリボースの２’位の官能基が標的分子と直接的に相互作用していることがあるが、多くの場合無関係であり、他の修飾分子に置換可能である。このようにアプタマーは、標的分子との直接的な結合に関与している官能基を置換又は削除しない限り、その活性を保持していることが多い。また、全体の立体構造が大きく変わらないことも重要である。
【００６５】
アプタマーは、ＳＥＬＥＸ法及びその改良法（例えば、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）  Ｎａｔｕｒｅ，３４６，８１８−８２２；Ｔｕｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，５０５−５１０）を利用することで作製することができる。ＳＥＬＥＸ法ではラウンド数を増やしたり、競合物質を使用したりして、選別条件を厳しくすることで、標的物質に対してより結合力の強いアプタマーが濃縮され、選別されてくる。よって、ＳＥＬＥＸのラウンド数を調節したり、及び／又は競合状態を変化させたりすることで、結合力が異なるアプタマー、結合形態が異なるアプタマー、結合力や結合形態は同じであるが塩基配列が異なるアプタマーを得ることができる場合がある。また、ＳＥＬＥＸ法にはＰＣＲによる増幅過程が含まれるが、その過程でマンガンイオンを使用するなどして変異を入れることで、より多様性に富んだＳＥＬＥＸを行うことが可能となる。
【００６６】
ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは標的物質に対して親和性が高い核酸であるが、そのことは標的物質の生理活性を阻害することを意味しない。オートタキシンは塩基性タンパク質であり、核酸が非特異的に結合しやすいと考えられるが、特定の部位に強く結合するアプタマー以外はその標的物質の活性に影響を及ぼさない。実際、ネガティブコントロールとして用いたランダム配列を含むＲＮＡはオートタキシンとの結合や阻害は認められなかった。
【００６７】
このようにして選ばれた活性のあるアプタマーに基づき、より高い活性を有するアプタマーを獲得するために更にプライマーを変えてＳＥＬＥＸを行うことが出来る。具体的な方法とは、ある配列が決まっているアプタマーの一部をランダム配列にしたテンプレートや１０〜３０％程度のランダム配列をドープしたテンプレートを作製して、再度ＳＥＬＥＸを行うものである。
【００６８】
ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは８０ヌクレオチド程度の長さがあり、これをそのまま医薬にすることは難しい。そこで、試行錯誤を繰り返し、容易に化学合成ができる５０ヌクレオチド程度以下の長さまで短くする必要がある。ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーはそのプライマー設計に依存して、その後の最小化作業のしやすさが変わる。うまくプライマーを設計しないと、ＳＥＬＥＸによって活性のあるアプタマーが選別できたとしても、その後の開発が不可能となる。本発明では２３ヌクレオチドでも阻害活性を保持しているアプタマーを得ることができた。
【００６９】
アプタマーは化学合成が可能であるので改変が容易である。アプタマーはＭＦＯＬＤプログラムを用いて二次構造を予測したり、Ｘ線解析やＮＭＲ解析によって立体構造を予測したりすることで、どのヌクレオチドを置換又は欠損することが可能か、また、どこに新たなヌクレオチドを挿入可能かなどを、ある程度予測することができる。予測された新しい配列のアプタマーは容易に化学合成することができ、そのアプタマーが活性を保持しているかどうかは、既存のアッセイ系により確認することができる。
【００７０】
得られたアプタマーの標的物質との結合に重要な部分が、上記のような試行錯誤を繰り返すことにより特定できた場合、その配列の両端に新しい配列を付加しても、多くの場合活性は変化しない。新しい配列の長さは特に限定されるものではない。
【００７１】
修飾に関しても、配列と同様に当業者であれば自由に設計又は改変可能である。
【００７２】
以上のように、アプタマーは高度に設計又は改変可能である。本発明はまた、所定の配列（例、ステム部分、インターナルループ部分、バルジ部分、ヘアピンループ部分及び一本鎖部分から選ばれる部分に対応する配列：以下、必要に応じて固定配列と省略する）を含むアプタマーを高度に設計又は改変可能であるアプタマーの製造方法を提供する。
【００７３】
例えば、このようなアプタマーの製造方法は、下記：
【００７４】
【化６】
0006586669.tif 000008
【００７５】
〔上記において、（Ｎ）ａはａ個のＮからなるヌクレオチド鎖を示し、（Ｎ）ｂは、ｂ個のＮからなるヌクレオチド鎖を示し、Ｎはそれぞれ、同一又は異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴ（好ましくは、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）からなる群より選ばれるヌクレオチドである。ａ、ｂはそれぞれ、同一又は異なって、任意の数であり得るが、例えば１〜約１００個、好ましくは１〜約５０個、より好ましくは１〜約３０個、さらにより好ましくは１〜約２０個又は１〜約１０個であり得る。〕で表わされるヌクレオチド配列からなる単一種の核酸分子又は複数種の核酸分子（例、ａ、ｂの数等が異なる核酸分子のライブラリ）、及びプライマー用配列（ｉ）、（ｉｉ）にそれぞれ対応するプライマー対を用いて、固定配列を含むアプタマーを製造することを含む。
【００７６】
本発明はまた、本発明のアプタマー及びそれに結合した機能性物質を含む複合体を提供する。本発明の複合体におけるアプタマーと機能性物質との間の結合は共有結合、又は非共有結合であり得る。本発明の複合体は、本発明のアプタマーと１以上（例、２又は３個）の同種又は異種の機能性物質とが結合したものであり得る。機能性物質としては、本発明のアプタマーに何らかの機能を新たに付加するもの、あるいは本発明のアプタマーが保持し得る何らかの特性を変化（例、向上）させ得るものである限り特に限定されない。機能性物質としては、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、単糖、ポリヌクレオチド、ヌクレオチドが挙げられる。機能性物質としてはまた、例えば、親和性物質（例、ビオチン、ストレプトアビジン、標的相補配列に対して親和性を有するポリヌクレオチド、抗体、グルタチオンセファロース、ヒスチジン）、標識用物質（例、蛍光物質、発光物質、放射性同位体）、酵素（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、薬物送達媒体（例、リポソーム、ミクロスフェア、ペプチド、ポリエチレングリコール類）、薬物（例、カリケアマイシンやデュオカルマイシンなどミサイル療法に使用されているもの、シクロフォスファミド、メルファラン、イホスファミド又はトロホスファミドなどのナイトロジェンマスタード類似体、チオテパなどのエチレンイミン類、カルムスチンなどのニトロソ尿素、テモゾロミド又はダカルバジンなどのアルキル化剤、メトトレキセート又はラルチトレキセドなどの葉酸類似代謝拮抗剤、チオグアニン、クラドリビン又はフルダラビンなどのプリン類似体、フルオロウラシル、テガフール又はゲムシタビンなどのピリミジン類似体、ビンブラスチン、ビンクリスチン又はビンオレルビンなどのビンカアルカロイド及びその類似体、エトポシド、タキサン、ドセタキセル又はパクリタキセルなどのポドフィロトキシン誘導体、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びミトキサントロンなどのアントラサイクリン類及び類似体、ブレオマイシン及びミトマイシンなどの他の細胞毒性抗生物質、シスプラチン、カルボプラチン及びオキザリプラチンなどの白金化合物、ペントスタチン、ミルテフォシン、エストラムスチン、トポテカン、イリノテカン及びビカルタミド）、毒素（例、リシン毒素、リア毒素及びベロ毒素）が挙げられる。これらの機能性分子は最終的に取り除かれる場合がある。更に、トロンビンやマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＦａｃｔｏｒＸなどの酵素が認識して切断することができるペプチド、ヌクレアーゼや制限酵素が切断できるポリヌクレオチドであってもよい。
【００７７】
本発明のアプタマー及び複合体は、例えば、医薬又は診断薬、検査薬、試薬として使用され得る。
【００７８】
本発明のアプタマー及び複合体は、オートタキシンの機能を阻害する活性を有し得る。上述のように、オートタキシンは臓器または組織の線維化と深く関わっている。従って、本発明のアプタマー及び複合体は、臓器又は組織の線維化が関与する疾患、特に種々の組織における線維症を伴う疾患を治療又は予防するための医薬として有用である。
【００７９】
ここで臓器又は組織の線維化が関与する疾患としては、肺線維症、前立腺肥大、心筋線維化、心筋線維症、筋骨格線維症、骨髄線維症、子宮筋腫、強皮症、外科手術後の癒着、手術後の瘢痕、熱傷性瘢痕、肥厚性瘢痕、ケロイド、アトピー性皮膚炎、腹膜硬化症、喘息、肝硬変、慢性膵炎、スキルス胃癌、肝線維症、腎線維症、線維性血管病、糖尿病の合併症である線維性微小血管炎による網膜症、神経症、腎症、糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎、遺伝性腎疾患、動脈硬化末梢動脈炎などが挙げられる。
【００８０】
オートタキシンは酵素活性を有し、その基質となる生理活性物質を切断する。主にＬＰＣからＬＰＡが産生されるが、ＬＰＡは細胞表面に発現しているその受容体と結合し、細胞内Ｇタンパク質や、さらにその下流のＰＬＣ、ＥＲＫやＲｈｏを活性化させ、細胞増殖や生存、遊走といった生理的作用を発揮する。従って、本発明のアプタマー及び複合体は、これらの経路の活性化に関係した疾患の医薬又は診断薬、検査薬、試薬として使用され得る。当該疾患としては、上記した臓器又は組織の線維化が関与する疾患が挙げられる。
【００８１】
本発明の医薬は、医薬上許容される担体が配合されたものであり得る。医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００８２】
本発明の医薬の投与経路としては特に限定されるものではないが、例えば経口投与、非経口投与が挙げられる。経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のリガンドを溶解させた液剤、有効量のリガンドを固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の有効成分を懸濁させた懸濁液剤、有効量の有効成分を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
【００８３】
また、本発明の医薬は必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性などの目的のため、自体公知の方法でコーティングすることができる。コーティングに用いられるコーティング剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、ツイーン８０、プルロニックＦ６８、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート、オイドラギット（ローム社製、ドイツ，メタアクリル酸・アクリル酸共重合体）及び色素（例、ベンガラ、二酸化チタンなど）などが用いられる。当該医薬は、速放性製剤、徐放性製剤のいずれであってもよい。徐放の基材としては、例えば、リポソーム、アテロコラーゲン、ゼラチン、ヒドロキシアパタイト、PLGAなどが挙げられる。
【００８４】
非経口的な投与（例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、腹腔内投与、経鼻投与、経肺投与など）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌の溶媒に溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。また、徐放製剤も好適な製剤として挙げることができる。徐放製剤としては、人工骨や生体分解性もしくは非分解性スポンジ、バッグ、薬剤ポンプ、浸透圧ポンプなど、体内に埋め込まれた担体もしくは容器からの徐放形態、あるいは体外から継続的もしくは断続的に体内もしくは局所に送達されるデバイス等が挙げられる。生体分解性の基材としては、リポソーム、カチオニックリポソーム、Poly(lactic-co-glycolic)acid (PLGA)、アテロコラーゲン、ゼラチン、ヒドロキシアパタイト、多糖シゾフィランなどが挙げられる。更に注射液剤や徐放製剤以外にも、吸入剤、軟膏剤も可能である。吸入剤の場合、凍結乾燥状態の有効成分を微細化し適当な吸入デバイスを用いて吸入投与する。吸入剤には、更に必要に応じて従来より使用されている界面活性剤、油、調味料、シクロデキストリン又はその誘導体等を適宜配合することができる。
【００８５】
ここで界面活性剤としては、例えばオレイン酸、レシチン、ジエチレングリコールジオレエート、テトラヒドロフルフリルオレエート、エチルオレエート、イソプロピルミリステート、グリセリルトリオレエート、グリセリルモノラウレート、グリセリルモノオレエート、グリセリルモノステアレート、グリセリルモノリシノエート、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ポリエチレングリコール400、セチルピリジニウムクロリド、ソルビタントリオレエート(商品名スパン８５)、ソルビタンモノオレエート(商品名スパン８０)、ソルビタンモノラウエート(商品名スパン２０)、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油(商品名ＨＣＯ−６０)、ポリオキシエチレン(２０)ソルビタンモノラウレート(商品名ツイーン２０)、ポリオキシエチレン(２０)ソルビタンモノオレエート(商品名ツイーン８０)、天然資源由来のレシチン(商品名エピクロン)、オレイルポリオキシエチレン(２)エーテル(商品名ブリジ９２)、ステアリルポリオキシエチレン(２)エーテル(商品名ブリジ７２)、ラウリルポリオキシエチレン(４)エーテル(商品名ブリジ３０)、オレイルポリオキシエチレン(２)エーテル(商品名ゲナポル０−０２０)、オキシエチレンとオキシプロピレンとのブロック共重合体(商品名シンペロニック)等が挙げられる。油としては、例えばトウモロコシ油、オリーブ油、綿実油、ヒマワリ油等が挙げられる。また、軟膏剤の場合、適当な医薬上許容される基剤（黄色ワセリン、白色ワセリン、パラフィン、プラスチベース、シリコーン、白色軟膏、ミツロウ、豚油、植物油、親水軟膏、親水ワセリン、精製ラノリン、加水ラノリン、吸水軟膏、親水プラスチベース、マクロゴール軟膏等）を用い、有効成分と混合し製剤化し使用する。
【００８６】
吸入剤は常法に従って製造することができる。すなわち、上記本発明のアプタマー及び複合体を粉末又は液状にして、吸入噴射剤及び／又は担体中に配合し、適当な吸入容器に充填することにより製造することができる。また上記本発明のアプタマー及び複合体が粉末の場合は通常の機械的粉末吸入器を、液状の場合はネブライザー等の吸入器をそれぞれ使用することもできる。ここで噴射剤としては従来公知のものを広く使用でき、フロン−１１、フロン−１２、フロン−２１、フロン−２２、フロン−１１３、フロン−１１４、フロン−１２３、フロン−１４２ｃ、フロン−１３４ａ、フロン−２２７、フロン−Ｃ３１８、１,１,１,２−テトラフルオロエタン等のフロン系化合物、プロパン、イソブタン、ｎ−ブタン等の炭化水素類、ジエチルエーテル等のエーテル類、窒素ガス、炭酸ガス等の圧縮ガス等を例示できる。
【００８７】
界面活性剤としては、例えばオレイン酸、レシチン、ジエチレングリコールジオレエート、テトラヒドロフルフリルオレエート、エチルオレエート、イソプロピルミリステート、グリセリルトリオレエート、グリセリルモノラウレート、グリセリルモノオレエート、グリセリルモノステアレート、グリセリルモノリシノエート、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ポリエチレングリコール４００、セチルピリジニウムクロリド、ソルビタントリオレエート（商品名スパン８５）、ソルビタンモノオレエート（商品名スパン８０）、ソルビタンモノラウエート（商品名スパン２０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（商品名ＨＣＯ−６０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（商品名ツイーン２０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（商品名ツイーン８０）、天然資源由来のレシチン（商品名エピクロン）、オレイルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ブリジ９２）、ステアリルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ブリジ７２）、ラウリルポリオキシエチレン（４）エーテル（商品名ブリジ３０）、オレイルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ゲナポル０−０２０）、オキシエチレンとオキシプロピレンとのブロック共重合体（商品名シンペロニック）等が挙げられる。油としては、例えばトウモロコシ油、オリーブ油、綿実油、ヒマワリ油等が挙げられる。また、軟膏剤の場合、適当な医薬上許容される基剤（黄色ワセリン、白色ワセリン、パラフィン、プラスチベース、シリコーン、白色軟膏、ミツロウ、豚油、植物油、親水軟膏、親水ワセリン、精製ラノリン、加水ラノリン、吸水軟膏、親水プラスチベース、マクロゴール軟膏等）を用い、有効成分である本発明のアプタマーと混合し製剤化し使用する。
【００８８】
本発明の医薬の投与量は、有効成分の種類・活性、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．０００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００５〜約１ｍｇ／ｋｇであり得る。
【００８９】
本発明のアプタマー及び複合体は、オートタキシンに特異的に結合し得る。従って、本発明のアプタマー及び複合体は、オートタキシン検出用プローブとして有用である。該プローブは、オートタキシンのインビボイメージング、血中濃度測定、組織染色、ＥＬＩＳＡ等に有用である。また、該プローブは、オートタキシンが関与する疾患（線維症や悪性腫瘍を伴う疾患等）の診断薬、検査薬、試薬等として有用である。
【００９０】
また、そのオートタキシンへの特異的結合に基づき、本発明のアプタマー及び複合体はオートタキシンの分離精製用リガンドとして使用され得る。
【００９１】
また、本発明のアプタマー及び複合体は、生体内のオートタキシンが局在する部位への薬物送達剤として使用され得る。
【００９２】
本発明はまた、本発明のアプタマー及び複合体が固定化された固相担体を提供する。固相担体としては、例えば、基板、樹脂、プレート（例、マルチウェルプレート）、フィルター、カートリッジ、カラム、多孔質材が挙げられる。基板は、ＤＮＡチップやプロテインチップなどに使われているものなどであり得、例えば、ニッケル−ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）基板やガラス基板、アパタイト基板、シリコン基板、アルミナ基板などで、これらの基板にポリマーなどのコーティングを施したものが挙げられる。樹脂としては、例えば、アガロース粒子、シリカ粒子、アクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの共重合体、ポリスチレン架橋ジビニルベンゼン粒子、デキストランをエピクロロヒドリンで架橋した粒子、セルロースファイバー、アリルデキストランとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの架橋ポリマー、単分散系合成ポリマー、単分散系親水性ポリマー、セファロース、トヨパールなどが挙げられ、また、これらの樹脂に各種官能基を結合させた樹脂も含まれる。本発明の固相担体は、例えば、オートタキシンの精製、及びオートタキシンの検出、定量に有用であり得る。
【００９３】
本発明のアプタマー及び複合体は、自体公知の方法により固相担体に固定できる。例えば、親和性物質（例、上述したもの）や所定の官能基を本発明のアプタマー及び複合体に導入し、次いで当該親和性物質や所定の官能基を利用して固相担体に固定化する方法が挙げられる。本発明はまた、このような方法を提供する。所定の官能基は、カップリング反応に供することが可能な官能基であり得、例えば、アミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、カルボキシル基が挙げられる。本発明はまた、このような官能基が導入されたアプタマーを提供する。
【００９４】
本発明はまた、オートタキシンの精製及び濃縮方法を提供する。特に本発明はオートタキシンを他のファミリータンパク質から分離することが可能である。本発明の精製及び濃縮方法は、本発明の固相担体にオートタキシンを吸着させ、吸着したオートタキシンを溶出液により溶出させることを含み得る。本発明の固相担体へのオートタキシンの吸着は自体公知の方法により行うことができる。例えば、オートタキシンを含有する試料（例、細菌又は細胞の培養物又は培養上清、血液）を、本発明の固相担体又はその含有物に導入する。オートタキシンの溶出は、中性溶液等の溶出液を用いて行うことができる。中性溶出液は特に限定されるものではないが、例えばｐＨ約６〜約９、好ましくは約６．５〜約８．５、より好ましくは約７〜約８であり得る。中性溶液はまた、例えば、尿素、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）、ナトリウム塩（例、ＮａＣｌ）、カリウム塩（例、ＫＣｌ）、マグネシウム塩（例、ＭｇＣｌ２）、界面活性剤（例、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ、ＮＰ４０）、グリセリンを含むものであり得る。本発明の精製及び濃縮方法はさらに、オートタキシンの吸着後、洗浄液を用いて固相担体を洗浄することを含み得る。洗浄液としては、例えば、尿素、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）、Ｔｒｉｓ、酸、アルカリ、Ｔｒａｎｆｅｒ  ＲＮＡ、ＤＮＡ、Ｔｗｅｅｎ  ２０などの表面活性剤、ＮａＣｌなどの塩を含むものなどが挙げられる。本発明の精製及び濃縮方法はさらに、固相担体を加熱処理することを含み得る。かかる工程により、固相担体の再生、滅菌が可能である。
【００９５】
本発明はまた、オートタキシンの検出及び定量方法を提供する。特に本発明はオートタキシンと他のファミリータンパク質と区別して検出及び定量することができる。本発明の検出及び定量方法は、本発明のアプタマーを利用して（例、本発明の複合体及び固相担体の使用により）オートタキシンを測定することを含み得る。オートタキシンの検出及び定量方法は、抗体の代わりに本発明のアプタマーを用いること以外は、免疫学的方法と同様の方法により行われ得る。従って、抗体の代わりに本発明のアプタマーをプローブとして用いることにより、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ウエスタンブロット法、免疫組織化学的染色法、セルソーティング法等の方法と同様の方法により、検出及び定量を行うことができる。また、ＰＥＴ等の分子プローブとしても、使用することができる。このような方法は、例えば、生体又は生物学的サンプルにおけるオートタキシン量の測定、オートタキシンが関連する疾患の診断に有用であり得る。
【００９６】
本発明はまた、本発明のアプタマーを含む、オートタキシンの阻害剤を提供する。本発明のアプタマーはオートタキシンに結合しその機能を阻害することができるので、当該アプタマーを含む剤を用いることによってオートタキシンの機能を阻害することが可能となる。
当該剤に含まれるアプタマーは、本明細書中に記載される本発明のアプタマーであれば特に限定されない。
【００９７】
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【００９８】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。
【実施例】
【００９９】
実施例１  オートタキシンに特異的に結合するＲＮＡアプタマーの作製１
オートタキシンに特異的に結合するＲＮＡアプタマーはＳＥＬＥＸ法を用いて作製した。ＳＥＬＥＸはＥｌｌｉｎｇｔｏｎらの方法（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４６，８１８−８２２，１９９０）及びＴｕｅｒｋらの方法（Ｔｕｅｒｋ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９，５０５−５１０，１９９０）を参考にして行った。標的物質としてＴＡＬＯＮ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）の担体に固相化したＨｉｓタグ付きβオートタキシン（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ、Ｒ＆Ｄ社製、以下、オートタキシンと記す）を用いた。オートタキシンが固相化された担体は、担体中に存在するコバルトのヒスチジンへの要求性を利用し、両者を混ぜ、1時間程度室温で反応させることで得た。固相化量は、固相化前のオートタキシン溶液と固相化直後の上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べることで確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、上清からはオートタキシンのバンドは検出されず、使用したオートタキシンのほぼ全てがカップリングされたことが確認された。約５０ｐｍｏｌのオートタキシンが約５μＬの樹脂に固相化されたことになる。
最初のラウンドで用いたランダム配列のＲＮＡ（３０Ｎ）は、化学合成したＤＮＡをＤｕｒａＳｃｒｉｂｅＴＭＴ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を用いて転写することで得た。この方法によって得られたＲＮＡはピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位がフルオロ化されたものである。ＤＮＡ鋳型として、以下に示す３０ヌクレオチドのランダム配列の両端にプライマー配列を持った長さ７３ヌクレオチドのＤＮＡを用いた。ＤＮＡ鋳型とプライマーは化学合成によって作製した。【０１００】
ＤＮＡ鋳型配列：５’−ＣＧＧＡＴＡＣＧＴＣＴＣＡＣＴＴＣＧＴＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＡＧＡＧＣＧＴＴＴＡＧＡＧＴＧＣＧＧＴＣＣＣ−３’（配列番号１）
プライマーＦｗｄ：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＣＧＣＡＣＴＣＴＡＡＡＣＧＣＴＣＴＧ−３’（配列番号２）
プライマーＲｅｖ：５’−ＣＧＧＡＴＡＣＧＴＣＴＣＡＣＴＴＣＧＴＣ−３’（配列番号３）【０１０１】
ＤＮＡ鋳型（配列番号１）中のＮは、ヌクレオチド（Ａ，Ｇ，Ｃ又はＴ）の任意の組み合わせである。またプライマーＦｗｄはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいる。【０１０２】
オートタキシンが固相化された担体にＲＮＡプールを加え、３０分室温で保持した後、オートタキシンに結合しないＲＮＡを取り除くために、溶液Ａで樹脂を洗浄した。ここで溶液Ａは１４５ｍＭ  塩化ナトリウム、５．４ｍＭ  塩化カリウム、１．８ｍＭ  塩化カルシウム、０．８ｍＭ  塩化マグネシウム、２０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．６）、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０の混合溶液である。オートタキシンに結合したＲＮＡは、溶出液として溶液Ｂを加えて９５℃で１０分間熱処理を行い、その上清から回収した。ここで溶液Ｂは６Ｍ  グアニジン塩酸塩と溶液Ａの混合液である。回収されたＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲで増幅し、ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅＴＭ  Ｔ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔで転写して次のラウンドのプールとして用いた。以上を１ラウンドとし、同様の作業を複数回繰り返し行った。３ラウンド以降は溶出液として溶液Ｃを使用した。ここで溶液Ｃは２５０ｍＭ  イミダゾールと溶液Ａの混合溶液である。ＳＥＬＥＸ終了後、ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にクローニングし、大腸菌株ＤＨ５α（Ｔｏｙｏｂｏ社製）をトランスフォーメーションした。シングルコロニーからプラスミドを抽出後、ＤＮＡシーケンサー（３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＡＢＩ社製）でクローンの塩基配列を調べた。
ＳＥＬＥＸを８ラウンド行った後に４６クローンの配列を調べたところ、配列に収束が見られた。その中から、配列番号４で表わされるヌクレオチド配列からなるクローンが６つ得られた。MFOLDプログラム（Ｍ．Ｚｕｋｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（１３），３４０６−３４１５，２００３）を用いて予測した、このアプタマーの二次構造を図１に示す。【０１０３】
以下に配列番号４のヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、実施例中に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表し、各ヌクレオチドは、プリン（Ａ及びＧ）が２’−ＯＨ（天然ＲＮＡ型）であり、ピリミジン（Ｕ及びＣ）が２’−フルオロ修飾体であることを意味している。
配列番号４：ＧＧＧＡＣＣＧＣＡＣＵＣＵＡＡＡＣＧＣＵＣＵＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵＣＣＵＣＧＧＡＧＣＧＵＧＧＡＣＧＡＡＧＵＧＡＧＡＣＧＵＡＵＣＣＧ【０１０４】
配列番号４で表わされるヌクレオチド配列からなる核酸（以下、「配列番号Ｘで表わされるヌクレオチド配列からなる核酸（アプタマー）」を「配列番号Ｘの核酸（アプタマー）」と略記する場合がある）のオートタキシンに対する結合活性を表面プラズモン共鳴法により評価した。測定にはＧＥヘルスケア社製のＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００を用いた。センサーチップにはストレプトアビジンが固定化されているＳＡチップを用いた。これに、５’末端にビオチンが結合している１６ヌクレオチドのＰｏｌｙ  ｄＴを１５００ＲＵ程度結合させた。リガンドとなる核酸は、３’末端に１６ヌクレオチドのＰｏｌｙ  Ａを付加し、ＴとＡのアニーリングによりＳＡチップに固定化した。流速２０μＬ／ｍｉｎで核酸を２０μＬインジェクトし、約１５００ＲＵの核酸を固定化した。アナライト用のオートタキシンは０．０２μＭに調製し、２０μＬインジェクトした。ランニングバッファーには溶液Ａを用いた。
測定結果を図２及び表１に示した。測定の結果、配列番号４の核酸はオートタキシンに結合することがわかった。また、ネガティブコントロールとして使用した、３０ヌクレオチドのランダム配列を含む１ラウンド目に使用した核酸プール（３０Ｎ）は、結合量が配列番号４の核酸の１０％以下であり、結合しない（“−”とした）ことがわかった。ここで結合量とは、最大のレゾナンスユニット（ＲＵ）値を示す。【０１０５】
実施例２  オートタキシンに特異的に結合するＲＮＡアプタマーの作製２
ランダム配列が４０ヌクレオチドで、プライマー配列が実施例１で用いたものと異なる鋳型を用いて、実施例１と同様のＳＥＬＥＸをおこなった。ＳＥＬＥＸの標的物質としてＴＡＬＯＮ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）の担体に固相化したＨｉｓタグ付きオートタキシン（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ、Ｒ＆Ｄ社製）を用いた。使用した鋳型とプライマーの配列を以下に示す。ＤＮＡ鋳型とプライマーは化学合成により作製した。【０１０６】
ＤＮＡ鋳型配列：５’−ＧＴＡＣＧＡＡＧＡＣＧＣＡＴＣＴＣＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＴＣＣＡＴＧＴＣＣＴＧＴＴＧＣＣＡＣＣＣ−３’（配列番号５）
プライマーＦｗｄ：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＧＧＣＡＡＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＡＡＣ−３’（配列番号６）
プライマーＲｅｖ：５’−ＧＴＡＣＧＡＡＧＡＣＧＣＡＴＣＴＣＡＣ−３’（配列番号７）
ＤＮＡ鋳型（配列番号５）中のＮは、ヌクレオチド（Ａ，Ｇ，Ｃ又はＴ）の任意の組み合わせである。またプライマーＦｗｄはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいる。【０１０７】
ＳＥＬＥＸを８ラウンド行った後に４８クローンの配列を調べたところ、配列に収束が見られた。その中から、配列番号４で表わされるヌクレオチド配列中に含まれる、配列番号１０で表わされる共通配列を含むクローン（その配列を配列番号８に示す）が５つ得られた。また、該共通配列において一塩基違いの配列を含む、配列番号９の核酸が１クローン得られた。【０１０８】
以下に、上記それぞれのヌクレオチド配列を示す。下線は共通配列（配列番号１０）部分を示し、［Ｕ］は該共通配列と異なるヌクレオチドを示す。また個々の配列は、５’から３’の方向で表し、各ヌクレオチドは、プリン（Ａ及びＧ）が２’−ＯＨ（天然ＲＮＡ型）であり、ピリミジン（Ｕ及びＣ）が２’−フルオロ修飾体であることを意味している。
配列番号８：
ＧＧＧＵＧＧＣＡＡＣＡＧＧＡＣＡＵＧＧＡＡＣＧＣＧＣＣＣＣＡＡＣＵＧＣＵＵＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵＧＡＧＣＡＧＵＧＡＵＧＵＧＡＧＡＵＧＣＧＵＣＵＵＣＧＵＡＣ
配列番号９：
ＧＧＧＵＧＧＣＡＡＣＡＧＧＡＣＡＵＧＧＡＡＣＧＣＧＣＣＣＣＡＡＣＵＧＣＵＵＧＡＡＡＣ［Ｕ］ＧＧＵＵＵＵＧＣＵＧＡＧＣＡＧＵＧＡＵＧＵＧＡＧＡＵＧＣＧＵＣＵＵＣＧＵＡＣ
配列番号１０：
ＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵ【０１０９】
配列番号８及び９の核酸がオートタキシンと結合するかどうかを、表面プラズモン共鳴法により評価した。測定には、ＧＥヘルスケア社製のＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００を用い、以下に示す方法で測定を行った。ＣＭ４チップのセンサーチップ表面に、アミンカップリングキットを使用し、約２７００ＲＵのオートタキシンを固定化した。流速２０μＬ／ｍｉｎで、アナライトとして０．３μＭに調整した核酸を２０μＬインジェクトした。ランニングバッファーには溶液Ａを用いた。結果を表１に示した。表１では、結合量が配列番号４のアプタマーの１０％以下であるものを結合しない（−）とし、それ以上のものは結合する（＋）とした（ここで結合量とは、最大のレゾナンスユニット（ＲＵ）値を意味する）。測定の結果、配列番号８の核酸はオートタキシンに結合することがわかった。また、ネガティブコントロールとして使用した、４０ヌクレオチドのランダム配列を含む１ラウンド目に使用した核酸プール（４０Ｎ）は、結合しないことがわかった。さらに、１塩基違いの配列番号９の核酸は結合しないことがわかった。【０１１０】
実施例３  オートタキシンに特異的に結合するＲＮＡアプタマーの作製３
ランダム配列が３０ヌクレオチドで、プライマー配列が実施例１で用いたものと異なる鋳型を用いて、実施例１と同様のＳＥＬＥＸをおこなった。ＳＥＬＥＸの標的物質としてＴＡＬＯＮ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）の担体に固相化したＨｉｓタグ付きオートタキシン（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ、Ｒ＆Ｄ社製）を用いた。使用した鋳型とプライマーの配列を以下に示す。ＤＮＡ鋳型とプライマーは化学合成により作製した。また、転写用のヌクレオチドは、リボヌクレオチド（Ａ及びＧ及びＣ）とデオキシリボヌクレオチド（Ｔ）を使用した。【０１１１】
ＤＮＡ鋳型配列：５’−ＡＡＧＣＴＴＣＧＴＡＡＧＴＣＧＣＡＧＴＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＡＧＣＧＴＡＧＴＡＧＴＧＧＴＣＣＴＡＡＣＣＣ−３’（配列番号１１）
プライマーＦｗｄ：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＡＣＣＡＣＴＡＣＴＡＣＧＣＴＧ−３’（配列番号１２）
プライマーＲｅｖ：５’−ＡＡＧＣＴＴＣＧＴＡＡＧＴＣＧＣＡＧＴＣ−３’（配列番号１３）
ＤＮＡ鋳型（配列番号１１）中のＮは、ヌクレオチド（Ａ，Ｇ，Ｃ又はＴ）の任意の組み合わせである。またプライマーＦｗｄはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいる。【０１１２】
ＳＥＬＥＸを８ラウンド行った後に５２クローンの配列を調べたところ、配列に収束が見られたが、配列番号１０で表わされる共通配列をもつ配列は含まれていなかった。【０１１３】
実施例４  オートタキシン阻害活性の測定１
配列番号４、８、９の核酸がオートタキシンの活性を阻害するかどうかを、下記の方法により評価した。オートタキシンの基質として、ホスホジエステル結合含有合成基質ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ５’−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＮＰ−ＴＭＰ）（ＳＩＧＭＡ）を選択した（以下、ＮＰＰ２阻害アッセイと称する）。加水分解によりホスホジエステル結合が切断され、ｐ−ニトロフェノールが遊離する。このｐ−ニトロフェノールは黄色く発色し、それを検出する。アッセイには９６ウェルプレート（９６−Ｗｅｌｌ  ＥＩＡ／ＲＩＡ  Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  Ｐｌａｔｅｓ、  Ｃｏｓｔａｒ社）を使用し、反応液量２００μＬで行った。なお、反応液として溶液Ａを用いた。核酸を溶液Ａ１００μＬ中に用意し、そこに同じく反応液Ａ中で１０ｍＭに調整したｐＮＰ−ＴＭＰ２０μＬを添加してよく混合したあと、３７℃で５分間加温した。一方で６ｎｇのオートタキシンを溶液Ａで希釈したものを８０μＬ用意し、３７℃で５分間加温した。加温後両者を混合し、酵素反応を開始させた。反応溶液中の最終オートタキシン濃度は０．３ｎＭ、最終基質濃度は１ｍＭである。反応液を含むプレートを３７℃で２４時間加温後、マイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０（モレキュラーデバイス社製）にセットし、波長４０５ｎｍで吸光度を求めた。核酸をいれていないときの吸光度（Ａ０）を１００％とし、各被験物質の吸光度（Ａ）から阻害率を次式により求めた。【０１１４】
【数２】
0006586669.tif 000009
【０１１５】
酵素活性を５０％阻害するのに要する阻害剤の濃度（ＩＣ５０）を求めた。コントロールとして、３０Ｎ又は４０Ｎの核酸プールを用いた場合（ネガティブコントロール）、及び既知のオートタキシン阻害剤Ｓ３２８３６（ＳＩＧＭＡ社）（ポジティブコントロール）を用いた場合も同様に処理し、測定を行った。その結果を表１に示す。【０１１６】
【表１】
0006586669.tif 000010
【０１１７】
表中、“−”は結合量が配列番号４のアプタマーの１０％以下であるもの、“＋”はそれ以上のものを示す。ここで結合量とは、最大のレゾナンスユニット（ＲＵ）値を意味する（以下のＢｉａｃｏｒｅ結合試験についても同様）。
また、ＩＣ５０値は２〜３回測定の平均値±標準偏差を示す。“＞１．０”は、１．０μＭまでの濃度範囲で阻害活性が見られなかったことを示す（以下のＮＰＰ２阻害アッセイについても同様）。【０１１８】
測定の結果、配列番号４及び８のアプタマーは、オートタキシンのホスホジエステラーゼ活性に対して阻害活性を有していることが示された。一方、配列番号９のアプタマーについては、Ｂｉａｃｏｒｅでの結合活性、阻害活性の両方とも認められなかったことから、配列番号１０で表わされる共通配列の５’末端から６番目のＡはＵには置換できないことが示された。また尚、ネガティブコントロールである３０Ｎもしくは４０Ｎは阻害活性を示さなかった（ＩＣ５０＞１．０μＭ）。ポジティブコントロールであるＳ３２８３６のＩＣ５０値は０．０１５μＭの値を示した。【０１１９】
実施例５  アプタマーの短鎖化
配列番号４、８のアプタマーの短鎖化を行った。改変体の配列を配列番号１４〜２４に示す。得られたアプタマーのうち、配列番号１６で表わされるアプタマーの二次構造予測を図１右に示す。【０１２０】
以下にそれぞれのヌクレオチド配列を示す。下線は共通配列（配列番号１０）部分を示し、［  ］は置換されたヌクレオチドを示す。また個々の配列は、５’から３’の方向で表し、各ヌクレオチドは、プリン（Ａ及びＧ）が２’−ＯＨ（天然ＲＮＡ型）であり、ピリミジン（Ｕ及びＣ）が２’−フルオロ修飾体であることを意味している。
配列番号１４：（配列番号４で表わされるアプタマーを、共通配列を含む４６ヌクレオチドの長さに短鎖化し、５’末端にＧＧＧを、３’末端にＣＣＣを付加した配列）
ＧＧＧＣＵＡＡＡＣＧＣＵＣＵＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵＣＣＵＣＧＧＡＧＣＧＵＧＧＡＣＧＣＣＣ
配列番号１５：（配列番号４で表わされるアプタマーを、共通配列を含む３７ヌクレオチドの長さに短鎖化し、５’末端のＡをＣに，３’末端のＵをＧに置換した配列）
［Ｃ］ＣＧＣＵＣＵＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵＣＣＵＣＧＧＡＧＣＧ［Ｇ］
配列番号１６：（配列番号４で表わされるアプタマーを、共通配列を含む２９ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＵＣＵＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵＣＣＵＣＧＧＡ
配列番号１７：（配列番号４で表わされるアプタマーを、共通配列を含む２５ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＵＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵＣＣＵＣＧ
配列番号１８：（配列番号４で表わされるアプタマーを、共通配列を含む２７ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＣＵＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵＣＣＵＣＧＧ
配列番号１９：（配列番号４で表わされるアプタマーを、共通配列を含む２５ヌクレオチドの長さに短鎖化し、ヌクレオチドを１つ置換した配列）
［Ｃ］ＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵＣＣＵＣＧ
配列番号２０：（配列番号４で表わされるアプタマーを、共通配列を含む２３ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵＣＣＵＣ
配列番号２１：（配列番号４で表わされるアプタマーを、共通配列を含む２１ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵＣＣＵ
配列番号２２：（配列番号４で表わされるアプタマーを、共通配列を含む１９ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵＣＣ
配列番号２３：（配列番号４で表わされるアプタマーを、共通配列を含む１７ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＧＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵＣ
配列番号２４：（配列番号８で表わされるアプタマーを、共通配列を含む２９ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＡＣＵＧＣＵＵＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵＧＡＧＣＡＧＵ【０１２１】
配列番号１４は以下に示す化学合成したＤＮＡ配列を鋳型とし、ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅＴＭＴ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて転写することで得た。
ＤＮＡ鋳型配列：５’−ＧＧＧＣＧＴＣＣＡＣＧＣＴＣＣＧＡＧＧＡＧＣＡＡＡＡＣＣＴＧＴＴＴＣＣＣＴＣＡＧＡＧＣＧＴＴＴＡＧＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ−３’（配列番号２５）
配列番号１５〜２４の核酸は全て化学合成により作製した。これらの核酸がオートタキシンと結合するかどうかを、実施例２と同様な表面プラズモン共鳴法により評価した。測定結果を表２に示す。表２では、結合量が配列番号４のアプタマーの１０％以下であるものを結合しない（−）とし、それ以上のものは結合する（＋）とした。ここで結合量とは、最大のレゾナンスユニット（ＲＵ）値を示す。【０１２２】
また、オートタキシン阻害活性を、実施例４と同様にＮＰＰ２阻害アッセイで測定した。そのＩＣ５０値を表２に示す。【０１２３】
ＮＰＰ２阻害アッセイの結果、配列番号１４〜２０及び２４で表わされるアプタマーは、ＩＣ５０値が１００ｎＭ以下の強い阻害活性を有していることがわかった。これらのアプタマーは全て配列番号１０で表わされる共通配列を含んでいる。配列番号１４〜２０のアプタマーの二次構造は、該共通配列部分が式（Ｉ”）：【０１２４】
【化７】
0006586669.tif 000011
【０１２５】
で表わされ、その５’末端及び３’末端のそれぞれに続く配列が種々の長さのステムを形成する、ステム−ループ構造である。また、配列番号２４のアプタマーは、共通配列の一部がステム構造となっているが、式（ＩＩ）：【０１２６】
【化８】
0006586669.tif 000012
【０１２７】
で表わされる共通配列部分と、その５’末端及び３’末端のそれぞれに続く配列により形成されるステム構造とからできており、配列番号１４〜２０のアプタマーの二次構造に近い構造となっている。
以上より、配列番号１０で表わされる配列はオートタキシンを阻害するのに重要な配列であることがわかった。また、配列番号２０のアプタマーの結果から、２３ヌクレオチドまで短鎖化しても高い阻害活性を有していることがわかった。【０１２８】
【表２】
0006586669.tif 000013
【０１２９】
実施例６  短鎖化したアプタマーの塩基置換、欠失の効果
配列番号１６で表わされる配列をもとに、ヌクレオチドの置換、欠失を導入し、アプタマーのオートタキシン阻害活性に対する影響を調べた。作製した変異アプタマーの配列を配列番号２６〜３７に示す。下線は共通配列（配列番号１０）部分を示し、［  ］は置換されたヌクレオチドを示し、“−”は欠失を示す。また個々の配列は、５’から３’の方向で表し、各ヌクレオチドは、プリン（Ａ及びＧ）が２’−ＯＨ（天然ＲＮＡ型）であり、ピリミジン（Ｕ及びＣ）が２’−フルオロ修飾体であることを意味している。【０１３０】
配列番号２６：（配列番号１０で表わされる共通配列の５’末端から２番目のＡをＵに、１１番目のＵをＡに置換した配列）
ＵＣＵＧＡＧＧＧ［Ｕ］ＡＡＣＡＧＧＵＵ［Ａ］ＵＧＣＵＣＣＵＣＧＧＡ
配列番号２７：（配列番号１０で表わされる共通配列の５’末端から３番目のＡをＵに、１０番目のＵをＡに置換した配列）
ＵＣＵＧＡＧＧＧＡ［Ｕ］ＡＣＡＧＧＵ［Ａ］ＵＵＧＣＵＣＣＵＣＧＧＡ
配列番号２８：（配列番号１０で表わされる共通配列の５’末端側から４番目のＡをＵに、９番目のＵをＡに置換した配列）
ＵＣＵＧＡＧＧＧＡＡ［Ｕ］ＣＡＧＧ［Ａ］ＵＵＵＧＣＵＣＣＵＣＧＧＡ
配列番号２９：（配列番号１６で表わされる配列の５’末端側から３番目のＵをＣに置換した配列）
ＵＣ［Ｃ］ＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵＣＣＵＣＧＧＡ
配列番号３０：（配列番号１６で表わされる配列の３’末端側から３番目のＧをＡに置換した配列）
ＵＣＵＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵＣＣＵＣ［Ａ］ＧＡ
配列番号３１：（配列番号１０で表わされる共通配列の５’末端側から９番目のＵをＣに置換した配列）
ＵＣＵＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧ［Ｃ］ＵＵＵＧＣＵＣＣＵＣＧＧＡ
配列番号３２：（配列番号１０で表わされる共通配列の５’末端から１２番目のＵをＣに置換した配列）
ＵＣＵＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵ［Ｃ］ＧＣＵＣＣＵＣＧＧＡ
配列番号３３：（配列番号１０で表わされる共通配列の５’末端から２番目のＡをＧに置換した配列）
ＵＣＵＧＡＧＧＧ［Ｇ］ＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵＣＣＵＣＧＧＡ
配列番号３４：（配列番号１０で表わされる共通配列の５’末端側から３番目のＡをＧに置換した配列）
ＵＣＵＧＡＧＧＧＡ［Ｇ］ＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵＣＣＵＣＧＧＡ
配列番号３５：（配列番号１０で表わされる共通配列の５’末端側から４番目のＡをＧに置換した配列）
ＵＣＵＧＡＧＧＧＡＡ［Ｇ］ＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵＣＣＵＣＧＧＡ
配列番号３６：（配列番号１０で表わされる共通配列の５’末端から１０番目〜１２番目のＵＵＵのうち１塩基を欠損させた配列）
ＵＣＵＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵ−ＧＣＵＣＣＵＣＧＧＡ
配列番号３７：（配列番号１０で表わされる共通配列の５’末端側から２〜４番目のＡＡＡのうち１塩基を欠損させた配列）
ＵＣＵＧＡＧＧＧＡＡ−ＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵＣＣＵＣＧＧＡ【０１３１】
配列番号２６〜３７の核酸は全て化学合成により作製した。これらの核酸がオートタキシンと結合するかどうかを、実施例２と同様な表面プラズモン共鳴法により評価した。測定結果を表３に示した。その結果、配列番号２６、２９〜３４で表わされるアプタマーはオートタキシンに結合することが分かった。
また、これらの核酸がオートタキシン阻害活性を示すかどうかを、実施例４と同様にＮＰＰ２阻害アッセイで測定した。そのＩＣ５０値を表３に示す。その結果、配列番号２９、３０、３２のアプタマーはＩＣ５０値が１００ｎＭ以下の高い阻害活性を示した。【０１３２】
表３に含まれる配列のうち配列番号２６〜２８の結果から、配列番号１０で表わされる共通配列の５’末端から２番目のＡ及び１１番目のＵに同時に変異を導入すると、阻害活性が減少し、該共通配列の５’末端から３番目のＡ及び１０番目のＵ、又は５’末端から４番目のＡ及び９番目のＵに同時に変異を導入すると、阻害活性がより著しく減少することが分かった。配列番号２９と３０が表３中で高い阻害活性を示したが、ＭＦＯＬＤプログラムから予測されるその二次構造は、配列番号１６と同じであることが分かった。これらは、共通配列部分以外のステム部分に変異が入ったものであり、ステム部分はいくつか変異が入っても構造が保てれば、活性に影響しないことが示唆された。一方で、配列番号３２の結果から、共通配列に含まれる５’末端から１２番目のＵはやや阻害活性が落ちるものの、Ｃに置換が可能であることが分かった。しかし、配列番号３３〜３４の結果から、配列番号１０で表わされる共通配列の５’末端から２番目のＡはＧに変換できず、５’末端から３番目のＡをＧに置換すると、阻害活性が減少することがわかった。また、配列番号３５の結果から、配列番号１０で表わされる共通配列の５’末端側から４番目のＡをＧに置換すると、結合活性、阻害活性がともに著しく減少することが分かり、結合と阻害活性に重要な部分であることが示唆された。また配列番号３６と３７の結果から、共通配列の塩基が１つでも欠損すると、結合・阻害活性がともに著しく減少することもわかった。【０１３３】
【表３】
0006586669.tif 000014
【０１３４】
実施例７  より高い活性のオートタキシンアプタマーの作製１
配列番号１６で表わされる配列のうち、配列番号１０で表わされる共通配列を９％のランダム配列にドープしたＲＮＡプールを用いてＳＥＬＥＸをおこなった。ＳＥＬＥＸは実施例１とほぼ同様におこなった。そのＤＮＡ鋳型と５’末端側のプライマー配列を以下に示す。また、プライマーＲｅｖは配列番号３の核酸を使用した。ＤＮＡ鋳型とプライマーは化学合成により作製した。【０１３５】
鋳型
５’−ＣＧＧＡＴＡＣＧＴＣＴＣＡＣＴＴＣＧＴＣＣＡＣＧＣＴＣＣＧＡＧＧａｇｃａａａａｃｃｔｇｔｔｔｃＣＣＴＣＡＧＡＧＣＧＴＴＴＡＧＡＧＴＧＣＧＧＴＣＣＣ−３’（配列番号３８）
ａ：ａ（９１％），  ｇ（３％），  ｃ（３％），  ｔ（３％）
ｇ：ｇ（９１％），  ａ（３％），  ｃ（３％），  ｔ（３％）
ｃ：ｃ（９１％），  ａ（３％），  ｇ（３％），  ｔ（３％）
ｔ：ｔ（９１％），  ａ（３％），  ｃ（３％），  ｇ（３％）
プライマーＦｗｄ：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＣＧＣＡＣＴＣＴＡＡＡＣＧＣ−３’（配列番号３９）【０１３６】
２ラウンドと５ラウンド終了後にそれぞれ４８クローンの合計９８クローンの配列を調べたところ、ほとんどの配列が配列番号４で表わされる配列であった。その中で、配列番号１０で表わされる共通配列中のヌクレオチドが置換されたものが２つ確認された。それらについて該共通配列部分を含む長さ２９ヌクレオチドに短鎖化したものの（配列番号４０及び４１）配列を以下に示す。下線は共通配列（配列番号１０）部分を示し、［  ］は置換されたヌクレオチドを示す。また個々の配列は、５’から３’の方向で表し、各ヌクレオチドは、プリン（Ａ及びＧ）が２’−ＯＨ（天然ＲＮＡ型）であり、ピリミジン（Ｕ及びＣ）が２’−フルオロ修飾体であることを意味している。【０１３７】
配列番号４０：（配列番号１０で表わされる共通配列の５’末端から２番目のＡがＵに置換された配列）
ＵＣＵＧＡＧＧＧ［Ｕ］ＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵＣＣＵＣＧＧＡ
配列番号４１：（配列番号１０で表わされる共通配列の５‘末端から１０番目のＵがＣに置換された配列）
ＵＣＵＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＵ［Ｃ］ＵＵＧＣＵＣＣＵＣＧＧＡ【０１３８】
配列番号４０と４１の核酸は全て化学合成により作製した。これらの核酸がオートタキシン阻害活性を示すかどうかを、実施例４と同様にＮＰＰ２阻害アッセイで測定した。そのＩＣ５０値を表４に示す。その結果、いずれもオートタキシンに対してＩＣ５０値が１００ｎＭ以下の高い阻害活性を示した。配列番号４０の結果から、配列番号１０で表わされる共通配列の５’末端から２番目のＡはＵとすることもできることが示された。従って、オートタキシンに結合し、その活性を阻害し得るアプタマーの共通配列として、ＧＷＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵ（ＷはＡ又はＵを示す）（配列番号４２）が抽出された。また、配列番号４１の結果から、配列番号１０で表わされる共通配列の５’末端から１０番目のＵはＣに置換可能であることが示された。
配列番号４０と４１のアプタマーは、いずれも共通配列（上記式（Ｉ））とステム構造から成る構造であった。特に配列番号４１は配列番号１６と同じ構造をとっていた。【０１３９】
実施例８  より高い活性のオートタキシンアプタマーの作製２
さらに、配列番号１６で表わされる配列のうち、配列番号１０で表わされる共通配列以外の配列部分を９％のランダム配列にドープしたＲＮＡプールを用いてＳＥＬＥＸをおこなった。ＳＥＬＥＸは実施例１とほぼ同様におこなった。その鋳型配列を以下に示す。またプライマーは配列番号３９の核酸と配列番号３の核酸とを使用した。ＤＮＡ鋳型とプライマーは化学合成により作製した。
ＤＮＡ鋳型
５’−ＣＧＧＡＴＡＣＧＴＣＴＣＡＣＴＴＣＧＴＣＣＡＣＧＣｔｃｃｇａｇｇＡＧＣＡＡＡＡＣＣＴＧＴＴＴＣｃｃｔｃａｇａＧＣＧＴＴＴＡＧＡＧＴＧＣＧＧＴＣＣＣ−３’  （配列番号４３）
ａ：ａ（９１％），  ｇ（３％），  ｃ（３％），  ｔ（３％）
ｇ：ｇ（９１％），  ａ（３％），  ｃ（３％），  ｔ（３％）
ｃ：ｃ（９１％），  ａ（３％），  ｇ（３％），  ｔ（３％）
ｔ：ｔ（９１％），  ａ（３％），  ｃ（３％），  ｇ（３％）【０１４０】
５ラウンド終了後に、１、３、５ラウンドからそれぞれ４８クローン、合計１４４クローンについて配列を調べた。ほとんどの配列が配列番号４で表わされる配列であったが、その中に配列番号１６で表わされる配列部分の塩基が置換された配列があった。それらについて共通配列（配列番号１０）部分を含む長さ２９ヌクレオチドに短鎖化したもの（配列番号４４〜４８）の配列を以下に示す。下線は共通配列（配列番号１０）部分を示し、［  ］は置換されたヌクレオチドを示す。また個々の配列は、５’から３’の方向で表し、各ヌクレオチドは、プリン（Ａ及びＧ）が２’−ＯＨ（天然ＲＮＡ型）であり、ピリミジン（Ｕ及びＣ）が２’−フルオロ修飾体であることを意味している。【０１４１】
配列番号４４：（配列番号１０で表わされる共通配列以外の２カ所が置換された配列）
ＵＣＵＧ［Ｇ］ＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵＣＣ［Ｃ］ＣＧＧＡ
配列番号４５：（配列番号１０で表わされる共通配列以外の１カ所が置換された配列）
ＵＣＵＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵＣＣＵＣＧ［Ａ］Ａ
配列番号４６：（配列番号１０で表わされる共通配列の５’末端から１１番目のＵがＣに置換された配列）
ＵＣＵＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵ［Ｃ］ＵＧＣＵＣＣＵＣＧＧＡ
配列番号４７：（配列番号１０で表わされる共通配列以外の２カ所が置換された配列）
ＵＣ［Ｃ］ＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵＣＣＵＣＧ［Ｃ］Ａ
配列番号４８：（配列番号１０で表わされる共通配列以外の２カ所が置換された配列）
ＵＣＵＧＡＧ［Ｕ］ＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵ［Ｇ］ＣＵＣＧＧＡ【０１４２】
配列番号４４〜４８の核酸は全て化学合成により作製した。これらの核酸がオートタキシン阻害活性を示すかどうかを、実施例４と同様な方法で測定した。そのＩＣ５０値を表４に示す。その結果、これらのアプタマーはＩＣ５０値が１００ｎＭ以下の高い阻害活性を示すことがわかった。配列番号４６の結果から、共通配列（配列番号１０又は４２）の５’末端から１１番目のＵはＣに置換できることが示された。上述の配列番号３２及び４１の結果と合わせると、共通配列の５’末端から１０〜１２番目のＵＵＵのうち、少なくとも１つのＵはＣに置換可能であることが示唆された。従って、オートタキシンに結合し、その活性を阻害し得るアプタマーの共通配列として、ＧＷＡＡＣＡＧＧＵＹＹＹＧＣＵ（ＷはＡ又はＵ、ＹはＵ又はＣを示す）（配列番号４９）が抽出された。
また、共通配列以外の部分では、共通配列（上記式（Ｉ’））とステム構造とから成る二次構造をとり得る限り、ステム部分に数個の変異が導入されても活性に影響が出ないことが示された。更に、配列番号４５と４７（ＭＦＯＬＤによる二次構造予測では末端の２ヌクレオチドはステム構造をとらない）の結果から、ステム構造の長さは７である必要はなく、より短いものでもよいことがわかった。これは配列番号１７のアプタマーに活性があることと一致する。【０１４３】
実施例９  より高い活性のオートタキシンアプタマーの作製３
さらに、配列番号１６で表わされる配列のうち、配列番号１０で表わされる共通配列以外の配列部分を４５％のランダム配列にドープしたＲＮＡプールを用いてＳＥＬＥＸをおこなった。ＳＥＬＥＸは実施例１とほぼ同様におこなった。そのＤＮＡ鋳型として配列番号４３を使用した。またプライマーは配列番号３９と配列番号３を使用した。
ａ：ａ（５５％），  ｇ（１５％），  ｃ（１５％），  ｔ（１５％）
ｇ：ｇ（５５％），  ａ（１５％），  ｃ（１５％），  ｔ（１５％）
ｃ：ｃ（５５％），  ａ（１５％），  ｇ（１５％），  ｔ（１５％）
ｔ：ｔ（５５％），  ａ（１５％），  ｃ（１５％），  ｇ（１５％）【０１４４】
ＳＥＬＥＸを６ラウンド行った後に４８クローンの配列を調べたところ、収束は見られなかったが、ドープを入れた部分が様々な塩基に置換された配列が得られた。それらについて共通配列を含む長さ２９又は３０ヌクレオチドに短鎖化したもの（配列番号５０〜５３）の配列を以下に示す。下線は共通配列（配列番号１０）部分を示し、［  ］は置換されたヌクレオチドを示す。また個々の配列は、５’から３’の方向で表し、各ヌクレオチドは、プリン（Ａ及びＧ）が２’−ＯＨ（天然ＲＮＡ型）であり、ピリミジン（Ｕ及びＣ）が２’−フルオロ修飾体であることを意味している。【０１４５】
配列番号５０：（配列番号１０で表わされる共通配列以外の７カ所が置換された長さが３０ヌクレオチドの配列）
Ｕ[Ａ][Ｇ][Ａ]ＧＡ[Ｕ]ＧＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵＣ[Ａ]ＵＣ[Ｕ][Ｃ]Ａ
配列番号５１：（配列番号１０で表わされる共通配列以外の５カ所が置換された配列）
Ｕ[Ｕ]ＵＧＡ[Ａ]ＧＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵＣ[Ｕ]ＵＣＧ[Ａ][Ｇ]
配列番号５２：（配列番号１０で表わされる共通配列以外の４カ所が置換された配列）
Ｕ[Ｕ][Ｃ]ＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵＣＣＵＣ[Ａ][Ａ]Ａ
配列番号５３：（配列番号１０で表わされる共通配列以外の７カ所が置換された配列）
Ｕ[Ｇ][Ｇ]ＧＡ[Ａ]ＧＧＡＡＡＣＡＧＧＵＵＵＵＧＣＵＣ[Ｕ]ＵＣ[Ａ][Ｃ][Ｃ]【０１４６】
配列番号５０〜５３の核酸は全て化学合成により作製した。これらの核酸がオートタキシン阻害活性を示すかどうかを、実施例４と同様な方法で測定した。そのＩＣ５０値を表４に示す。その結果、いずれもオートタキシンに対する阻害活性を示した。配列番号５０〜５３の結果から、配列番号１０で表わされる共通配列以外の部分は４、５、又は７カ所の塩基置換が可能であることが示唆された。【０１４７】
【表４】
0006586669.tif 000015
【０１４８】
以上、実施例６〜９の結果から、配列番号１０で表わされる共通配列の５’末端から２番目のＡはＵで置換することができ、該共通配列の５’末端から１０〜１２番目のＵＵＵのうち、少なくとも１つのＵはＣに置換できることが分かった。即ち、オートタキシンに結合し、その活性を阻害し得るアプタマーの共通配列として、ＧＷＡＡＣＡＧＧＵＹＹＹＧＣＵ（ＷはＡ又はＵ、ＹはＵ又はＣを示す）（配列番号４９）が抽出された。また、配列番号１０で表わされる共通配列以外の部分は１〜７個の置換が可能であることが示された。【０１４９】
実施例１０  短鎖化したアプタマーの修飾
配列番号１６で表わされるアプタマーの末端を修飾した改変体や、配列中のプリンヌクレオチドのリボースの２’位に修飾を導入した改変体、デオキシリボヌクレオチドに置換した改変体を作製した。それらの配列を配列番号１６（１）〜１６（６８）に示す。核酸は全て化学合成により作製した。【０１５０】
以下にそれぞれのヌクレオチド配列を示す。各配列中、各ヌクレオチドの右の括弧はその２’位における修飾を示し、Ｆはフッ素原子を、Ｍはメトキシ基をそれぞれ示す。また、各ヌクレオチドの右の小文字のｓは、そのヌクレオチドのリン酸基のホスホロチオエート化、ｓｓはホスホロジチオエート化をそれぞれ示す。その他の小文字はデオキシリボヌクレオチドを示す。また、末端修飾において、ｉｄＴはｉｎｖｅｒｔｅｄ−ｄＴを、ＹはｓｓＨリンカーを、４０ＰはＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＧＳ２を、８０ＰはＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−８００ＧＳ２を、４０ＰＰはＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＴＳを、８０ＰＰはＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−８００ＴＳ、８０ＰＰＰはＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ４−８００ＧＳ２のポリエチレングリコールを、それぞれ示す。下線は共通配列（配列番号１０）部分を示す。【０１５１】
配列番号１６（１）：（配列番号１６で表わされるアプタマーにメトキシ修飾を導入した配列）
Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＡＡＣ（Ｆ）ＡＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ)Ｕ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）
配列番号１６（２）：（配列番号１６で表わされるアプタマーに修飾を導入した配列）
Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）
配列番号１６（３）：（配列番号１６（１）で表わされるアプタマーの両末端にｉｄＴ修飾を導入した配列）
ｉｄＴ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＡＡＡＣ（Ｆ）ＡＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（４）：（配列番号１６（２）で表わされるアプタマーの両末端にｉｄＴ修飾を導入した配列）
ｉｄＴ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（５）：（配列番号１６（４）で表わされるアプタマーの配列のうち１か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列）
ｉｄＴ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（６）：（配列番号１６（４）で表わされるアプタマーの配列のうち２か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列）
ｉｄＴ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（７）：（配列番号１６（４）で表わされるアプタマーの配列にホスホロチオエートを導入した配列）
ｉｄＴ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＡｓＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（８）：（配列番号１６（４）で表わされるアプタマーの配列の５’末端に４０ｋＤａポリエチレングリコールを導入した配列）
４０ＰＰ−Ｙ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（９）：（配列番号１６（４）で表わされるアプタマーの配列の５’末端に８０ｋＤａポリエチレングリコールを導入した配列）
８０ＰＰ−Ｙ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（１０）：（配列番号１６（４）で表わされるアプタマーの配列のうち３か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列）
ｉｄＴ−ｔｃｔＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（１１）：（配列番号１６（４）で表わされるアプタマーの配列のうち２か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列）
ｉｄＴ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ｔｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（１２）：（配列番号１６（４）で表わされるアプタマーの配列のうち２か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列）
ｉｄＴ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃｃＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（１３）：（配列番号１６（４）で表わされるアプタマーの配列のうち１か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列）
ｉｄＴ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）ｔＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（１４）：（配列番号１６（４）で表わされるアプタマーの配列のうち１か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列）
ｉｄＴ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（１５）：（配列番号１６（４）で表わされるアプタマーの配列のうち１か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列）
ｉｄＴ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ｃＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（１６）：（配列番号１６（４）で表わされるアプタマーの配列のうち１か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列）
ｉｄＴ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｔＧ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（１７）：（配列番号１６（４）で表わされるアプタマーの配列のうち１か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列）
ｉｄＴ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｔＵ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（１８）：（配列番号１６（４）で表わされるアプタマーの配列のうち１か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列）
ｉｄＴ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧＵ（Ｆ）ｔＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（１９）：（配列番号１６（４）で表わされるアプタマーの配列のうち１か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列）
ｉｄＴ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＧＧｔＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（２０）：（配列番号１６（４）で表わされるアプタマーの配列のうち１か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列）
ｉｄＴ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）ｃＡ（Ｍ）ＧＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（２１）：（配列番号１６（６）で表わされるアプタマーの配列のうち１か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列）
ｉｄＴ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（２２）：（配列番号１６（２１）で表わされるアプタマーの配列にホスホロチオエートを導入した配列）
ｉｄＴ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡｓＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（２３）：（配列番号１６（２２）で表わされるアプタマーの配列の５’末端ｉｄＴの代わりに４０ｋＤａのポリエチレングリコールを導入したもの。）
４０Ｐ−Ｙ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡｓＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（２４）：（配列番号１６（２１）で表わされるアプタマーの配列の５’末端ｉｄＴの代わりに４０ｋＤａのポリエチレングリコールを導入したもの。）
４０Ｐ−Ｙ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（M）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ)Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（２５）：（配列番号１６（６）で表わされるアプタマーの配列のうち４か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列）
ｉｄＴ−ｔｃｔＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ)Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（２６）：（配列番号１６（６）で表わされるアプタマーの配列のうち２か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列）
ｉｄＴ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ)Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（２７）：（配列番号１６（６）で表わされるアプタマーの配列のうち２か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列）
ｉｄＴ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ｔＣ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（２８）：（配列番号１６（６）で表わされるアプタマーの配列のうち２か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列）
ｉｄＴ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ｃＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（２９）：（配列番号１６（６）で表わされるアプタマーの配列のうち２か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列）
ｉｄＴ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（３０）：（配列番号１６（２１）で表わされるクローンの配列の５’末端ｉｄＴの代わりにｓｓＨリンカーを導入した配列）
Ｙ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（３１）：（配列番号１６（２２）で表わされるアプタマーの配列の５’末端ｉｄＴの代わりにｓｓＨリンカーを導入した配列）
Ｙ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡｓＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（３２）：（配列番号１６（２１）で表わされるアプタマーの配列のうち６か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列）
ｉｄＴ−ｔｃｔＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃｃＵ（Ｆ）ｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（３３）（配列番号１６（２１）で表わされるアプタマーの配列のうち３か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列）
ｉｄＴ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃｃＵ（Ｆ）ｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（３４）配列番号１６（３２）で表わされるアプタマーの配列の５’末端ｉｄＴの代わりに４０ｋＤａのポリエチレングリコールを導入したもの）
４０Ｐ−Ｙ−ｔｃｔＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃｃＵ（Ｆ）ｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（３５）（配列番号１６（３３）で表わされるアプタマーの配列の５’末端ｉｄＴの代わりに４０ｋＤａのポリエチレングリコールを導入したもの）
４０Ｐ−Ｙ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃｃＵ（Ｆ）ｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（３６）：（配列番号１６（３２）で表わされるアプタマーの配列にホスホロチオエートを導入した配列）
ｉｄＴ−ｔｃｔＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡｓＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃｃＵ（Ｆ）ｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（３７）：（配列番号１６（３３）で表わされるアプタマーの配列にホスホロチオエートを導入した配列）
ｉｄＴ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡｓＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃｃＵ（Ｆ）ｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（３８）：（配列番号１６（２１）で表わされるアプタマーの配列のうち２か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列）
ｉｄＴ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）gｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（３９）：（配列番号１６（３８）で表わされるアプタマーの配列の５’末端ｉｄＴの代わりに４０ｋＤａのポリエチレングリコールを導入したもの）
４０Ｐ−Ｙ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（M）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（４０）：（配列番号１６（２１）で表わされるアプタマーの配列のうち１か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列）
ｉｄＴ−ｔＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（４１）：（配列番号１６（２１）で表わされるアプタマーの配列のうち１か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列）
ｉｄＴ−Ｕ（Ｆ）ｃＵ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（４２）：（配列番号１６（２１）で表わされるアプタマーの配列のうち１か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列）
ｉｄＴ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ｔＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（４３）（配列番号１６（２１）で表わされるアプタマーの配列の５’末端ｉｄＴの代わりに８０ｋＤａのポリエチレングリコールを導入したもの）
８０Ｐ−Ｙ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（４４）（配列番号１６（４３）で表わされるアプタマーにホスホロチオエートを導入した配列）
８０Ｐ−Ｙ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡｓＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（４５）（配列番号１６（２１）で表わされるアプタマーの配列の５’末端ｉｄＴの代わりに８０ｋＤａのポリエチレングリコールを導入したもの）
８０ＰＰＰ−Ｙ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（４６）（配列番号１６（４５）で表わされるアプタマーにホスホロチオエートを導入した配列）
８０ＰＰＰ−Ｙ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡｓＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（４７）：（配列番号１６（２１）で表わされるアプタマーの配列のうち３か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列）
ｉｄＴ−ｔＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（４８）：（配列番号１６（４７）で表わされるアプタマーの配列の５’末端ｉｄＴの代わりに８０ｋＤａのポリエチレングリコールを導入したもの）
８０Ｐ−Ｙ−ｔＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（４９）：（配列番号１６（４８）で表わされるアプタマーにホスホロチオエートを導入した配列）
８０Ｐ−Ｙ−ｔＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡｓＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（５０）：（配列番号１６（３８）で表わされるアプタマーの配列の５’末端ｉｄＴの代わりに８０ｋＤａのポリエチレングリコールを導入したもの）
８０Ｐ−Ｙ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（５１）：（配列番号１６（５０）で表わされるアプタマーにホスホロチオエートを導入した配列）
８０Ｐ−Ｙ−Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡｓＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（５２）：（配列番号１６（４０）で表わされるアプタマーの配列の５’末端ｉｄＴの代わりに８０ｋＤａのポリエチレングリコールを導入したもの）
８０Ｐ−Ｙ−ｔＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（５３）：（配列番号１６（５２）で表わされるアプタマーにホスホロチオエートを導入した配列）
８０Ｐ−Ｙ−ｔＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡｓＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（５４）：（配列番号１６（３６）で表わされるアプタマーの配列の５’末端ｉｄＴの代わりに８０ｋＤａのポリエチレングリコールを導入したもの）
８０Ｐ−Ｙ−ｔｃｔＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡｓＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃｃＵ（Ｆ）ｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（５５）：（配列番号１６（４７）で表わされるアプタマーの配列にホスホロチオエートを導入し、さらに２か所にメトキシ修飾を導入した配列）
ｉｄＴ−ｔＣ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡｓＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（５６）：（配列番号１６（４７）で表わされるアプタマーの配列にホスホロチオエートを導入し、さらに２か所にメトキシ修飾を導入した配列）
ｉｄＴ−ｔＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡｓＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＣ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（５７）：（配列番号１６（４７）で表わされるアプタマーの配列にホスホロチオエートを導入し、さら１か所にメトキシ修飾を導入した配列）
ｉｄＴ−ｔＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡｓＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）ｃＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（５８）：（配列番号１６（４７）で表わされるアプタマーの配列にホスホロチオエートを導入し、さらに１か所にメトキシ修飾を導入した配列）
ｉｄＴ−ｔＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡｓＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ｃＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（５９）：（配列番号１６（４７）で表わされるアプタマーの配列にホスホロチオエートを導入し、さらに１か所にメトキシ修飾を導入した配列）
ｉｄＴ−ｔＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡｓＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（６０）：（配列番号１６（４７）で表わされるアプタマーの配列にホスホロチオエートを導入し、さらに１か所にメトキシ修飾を導入した配列）
ｉｄＴ−ｔＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡｓＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（６１）：（配列番号１６（４７）で表わされるアプタマーの配列にホスホロチオエートを導入し、さらに１か所にメトキシ修飾を導入した配列）
ｉｄＴ−ｔＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡｓＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（６２）：（配列番号１６（４７）で表わされるアプタマーの配列にホスホロチオエートを導入し、さらに１か所にメトキシ修飾を導入した配列）
ｉｄＴ−ｔＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡｓＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（６３）：（配列番号１６（４９）で表わされるアプタマーの配列の５’末端のポリエチレングリコールを８０ｋＤａから４０ｋＤａに変更した配列）
４０Ｐ−Ｙ−ｔＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡｓＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（６４）：（配列番号１６（４９）で表わされるアプタマーの配列の５’末端のポリエチレングリコールの種類を変更した配列）
８０ＰＰＰ−Ｙ−ｔＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡｓＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（６５）：（配列番号１６（４９）で表わされるアプタマーの配列の５カ所にメトキシ修飾を導入した配列）
８０Ｐ−Ｙ−ｔＣ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡｓＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）ｃＣ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（６６）：（配列番号１６（６５）で表わされるアプタマーの配列の５’末端のポリエチレングリコールを８０ｋＤａから４０ｋＤａに変更した配列）
４０Ｐ−Ｙ−ｔＣ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡｓＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）ｃＣ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（６７）：（配列番号１６（４９）で表わされるアプタマーの配列の６カ所にメトキシ修飾を導入した配列）
８０Ｐ−Ｙ−ｔＣ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ＡｓＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ｃＣ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ
配列番号１６（６８）：（配列番号１６（４７）で表わされるアプタマーの配列にホスホロジチオエートを導入し、さらに１か所をデオキシリボヌクレオチドに置換した配列）
ｉｄＴ−ｔＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｇＡ（Ｍ）ａｓｓＡ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ｇｇＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０１５２】
配列番号１６（１）〜１６（６８）の核酸は全て化学合成により作製した。これらの核酸がオートタキシン阻害活性を示すかどうかを、実施例４と同様なＮＰＰ２阻害アッセイで測定した。そのＩＣ５０値を表５に示す。配列番号１６（１）〜１６（６８）で表わされるアプタマーは、ＮＰＰ２阻害アッセイにおいてＩＣ５０値が１００ｎＭ以下の高い阻害活性を示した。
配列番号１６（１）〜１６（６８）で表わされるアプタマーは、配列番号１０で表わされる共通配列の部分及びステム部分の修飾を変えたものであるが、どれもオートタキシンに対して阻害活性を示した。これはリボースの２’位の修飾が各種変更可能であることを示している。
また、ホスホロチオエート及びホスホロジチオエート修飾を施すことで活性が向上することがわかった。【０１５３】
【表５−１】
0006586669.tif 000016
【０１５４】
【表５−２】
0006586669.tif 000017
【０１５５】
実施例１１  オートタキシンアプタマーの特異性の確認
配列番号１６（２３）で表わされるアプタマーがＦＧＦ２（ぺプロテック社）に対して結合活性を有しているかどうか表面プラズモン共鳴法で確認した。オートタキシンをフローセル２に、ＦＧＦ２をフローセル３に固定化し（約１１００ＲＵ）、アプタマーをインジェクションした。他は実施例２と同様に行った。測定の結果、配列番号１６（２３）で表わされるアプタマーはＦＧＦ２には結合しないことがわかった（図３）。これは、本発明のアプタマーがオートタキシンに特異的に結合することを示している。【０１５６】
実施例１２  オートタキシンアプタマーの肺線維症への効果
実施例１０で作製した配列番号１６（４９）で表わされるアプタマーを、ブレオマイシン誘導型肺線維症モデルマウスに腹腔内投与し、その効果を検証した。
ＩＣＲ系ＳＰＦマウス（１０週齢、雄、日本チャールズリバー）に対し、ＰＢＳで７７０μｇ／ｍＬに調整したブレオマイシン５０μＬを、麻酔下、気管内投与した。ブレオマイシンを投与した翌日から毎日１回、１ｍＭ塩化マグネシウム入りＰＢＳに溶かしたオートタキシンアプタマー溶液、又は１ｍＭ塩化マグネシウム入りＰＢＳのみ（ビークル群）を、１回の投与量１００μＬで腹腔内投与した。アプタマー投与量は１及び３ｍｇ／ｋｇ／日の２用量とした。また、無処置のコントロール群も同じ試験期間飼育した。ブレオマイシン投与開始から２１日目に試験を終了し、肺を摘出、左肺をヒドロキシプロリン測定用に凍結保存した。さらに右肺は１０％ホルマリン溶液で固定し、組織切片を作製してマッソン・トリクローム染色を行った。ヒドロキシプロリンの測定はバイオビジョン社のＨｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  キットを用いて測定した。また線維化のクリニカルスコアとして評価する方法は以下のように行った。すなわち、全観察面の領域においてコラーゲン線維の増生がないものを０、約２５％まで見られるものを１、約２５％〜５０％まで見られるものを２、約５０％〜７５％まで見られるものを３、７５％以上の場合を４とした。なお、統計学的有意差の評価はコントロール群とビークル群との検定はT検定、ビークル群と薬剤投与群の検定で等分散のものはＤｕｎｎｅｔｔ検定、不等分散のものはＳｔｅｅｌ検定で行った。【０１５７】
図４、５に結果を示した。全ての結果はマウス６〜７匹の平均値±Ｓ．Ｅで表した。また、図中の＊＊はｐ＜０．０１を表す。図４に左肺重量当たりのヒドロキシプロリン量を示した。アプタマー投与群３ｍｇ／ｋｇにおいて、ビークル群に対し抑制が認められた。また、図５の線維化スコアでは、アプタマー投与群３ｍｇ／ｋｇにおいてビークル群に対し有意に（ｐ＜０．０１）抑制が認められた。
以上より、配列番号１６（４９）で表わされるアプタマーは肺線維症治療薬として使用可能であることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１５８】
本発明のアプタマー及び複合体は、線維症などの疾患に対する医薬、あるいは診断薬、試薬として有用であり得る。本発明のアプタマー及び複合体はまた、オートタキシンの精製及び濃縮、並びにオートタキシンの検出及び定量に有用であり得る。
本出願は、日本で出願された特願２０１４−０９０７５５（出願日：平成２６年４月２４日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
【図１】
0006586669.tif 000018
【図２】
0006586669.tif 000019
【図３】
0006586669.tif 000020
【図４】
0006586669.tif 000021
【図５】
0006586669.tif 000022
【配列表】
0006586669000001.app