(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍｉＲ−３６７０、ｍｉＲ−４４７７ａおよびｍｉＲ−８０７８で構成された群から選択される一つ以上のｍｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ誘導体を有効成分として含み、前記ｍｉＲＮＡ誘導体が、ＲＮＡリン酸骨格構造（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を硫黄で置き換えた形態であるホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）構造を部分的に含む形態；ＲＮＡの代わりにＤＮＡ、ＰＮＡ（ｐｅｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）またはＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）分子への全体または部分的に置き換えた形態；およびＲＮＡ糖の２’ヒドロキシ基をメチル化、メトキシ化、フルオロ化で構成された群から選択される機能性構造で置き換えた形態で構成された群から選択される、ｍｉＲＮＡ誘導体である、肺癌の原発性癌、又はこれからその他臓器に転移されて誘発される転移癌の治療用医薬組成物。
【請求項２】
前記ｍｉＲ−３６７０は、配列番号３５と配列番号３６、または配列番号３５と配列番号６７の塩基配列からなる二本鎖ＲＮＡで構成される二本鎖を有効成分として含むことを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ｍｉＲ−４４７７ａは、配列番号４３と配列番号４４、または配列番号４３と配列番号６８の塩基配列からなる二本鎖ＲＮＡで構成される二本鎖を有効成分として含むことを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ｍｉＲ−８０７８は、配列番号６５と配列番号６６、または配列番号６５と配列番号６９の塩基配列からなる二本鎖ＲＮＡで構成される二本鎖を有効成分として含むことを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ｍｉＲＮＡは、癌細胞の自殺メカニズム（ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導して癌を治療することを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ｍｉＲＮＡ誘導体は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ前駆体形態；またはプラスミド形態のｍｉＲＮＡ前駆体で構成され、前記ｍｉＲＮＡ誘導体は、ＲＮＡリン酸骨格構造（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を硫黄で置き換えた形態であるホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）構造を部分的に含む形態；ＲＮＡの代わりにＤＮＡ、ＰＮＡ（ｐｅｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）またはＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）分子への全体または部分的に置き換えた形態；およびＲＮＡ糖の２’ヒドロキシ基をメチル化、メトキシ化、フルオロ化で構成された群から選択される機能性構造で置き換えた形態で構成された群から選択されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二本鎖ｍｉＲＮＡを有効成分として含み、抗癌剤として使用される医薬組成物に関する。より具体的に、本発明は、癌細胞の増殖を効果的に抑制するか、癌細胞の自発的死滅を誘導する方式を特徴とするｍｉＲ−３６７０、ｍｉＲ−４４７７ａおよびｍｉＲ−８０７８を薬剤的有効成分として、薬学的に許容される担体を含む坑癌医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の正常制御が行われないため発生する疾病、代表的に癌と通称される疾患に対する効果的で伝統的な治療法は、外科的に腫瘍を切除して除去する方法が使用されたが、原発性癌が他の器官に転移される場合は、外科的手術が不可であり坑癌薬物治療法が使用された。薬物治療で使用される抗癌剤は、主に単分子物質を有機的または無機的方法で合成して使用したが、これは癌疾患が主に信号伝達体系に含まれたリン酸活性因子タンパク質の過発現などによって信号体系をかく乱させるタンパク質に効果的に結合してタンパク質の活性を抑制する用途で開発されて使用された。このような方式の伝統的薬物治療法は、多くの副作用を伴うが、その中の一つは薬物で使用される物質が人為的に合成された生体外部由来物質であることと、坑癌物質の作用点がすでに過多発現したタンパク質を目的とする点である。
【０００３】
前記伝統的な薬物治療法を代替するための薬物治療剤の開発が、様々な方面で行われたが、その中の一つが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ、以下ｓｉＲＮＡで表記）の利用である（Iorns, E., Lord, C.J., Turner, N. & Ashworth, A. Utilizing RNA interference to enhance cancer drug discovery. Nat Rev Drug Discov 6, 556-68. 2007.）。ｓｉＲＮＡは、１６〜２７の間のヌクレオチドで構成された一本鎖ＲＮＡであり、細胞内でリスク（ＲＮＡ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ、ＲＩＳＣ）と知られたリボ核酸タンパク質結合体（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）の構成成分として活動をする（Tomari, Y. & Zamore, P.D. Perspective: machines for RNAi. Genes Dev 19, 517-29, 2005, Chu, C.Y. & Rana, T.M. Potent RNAi by short RNA triggers. Rna 14, 1714-9, 2008, Mittal, V. Improving the efficiency of RNA interference in mammals. Nat Rev Genet 5, 355-65, 2004, Reynolds, A. et al. Rational siRNA design for RNA interference. Nat Biotechnol 22, 326-30. 2004）。ＲＩＳＣは、ＲＮＡ酵素はさみとして機能をするが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ、以下ｍＲＮＡと表記）を切断してｍＲＮＡからタンパク質が生成されるのを阻害する。ＲＩＳＣに含まれたｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ配列と相補的な配列を有するｍＲＮＡと結合して二本鎖ＲＮＡを形成して、ＲＩＳＣは、ＲＮＡ酵素はさみとして作用して目標となるｍＲＮＡを切断してｍＲＮＡがそれ以上タンパク質を反復生成する型板（ｔｅｍｐｌａｔｅ）としての機能を行うことができないようにする。
【０００４】
このようにｓｉＲＮＡ基盤の坑癌治療剤は、タンパク質生成段階以前のｍＲＮＡを遮断する点、そしてＲＮＡと細胞内在的なＲＩＳＣシステムを活用する点において、前記単分子物質の抗癌剤よりも進んだ技術として評価されるが、ｓｉＲＮＡ基盤の技術でも解決できない副作用があり、それは非標的効果（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｅｆｆｅｃｔ）と呼ばれる現象である（Jackson, A.L. et al. Widespread siRNA "off-target" transcript silencing mediated by seed region sequence complementarity. Rna 12, 1179-87, 2006., Jackson, A.L. et al. Position-specific chemical modification of siRNAs reduces "off-target" transcript silencing. Rna 12, 1197-205, 2006., Jackson, A.L. et al. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol 21, 635-7, 2003., Nielsen, C.B. et al. Determinants of targeting by endogenous and exogenous microRNAs and siRNAs. Rna 13, 1894-910, 2007., Peek, A.S. & Behlke, M.A. Design of active small interfering RNAs. Curr Opin Mol Ther 9, 110-8, 2007.）。前述した通りｓｉＲＮＡ配列と相補的に結合するｍＲＮＡを分解するが、ｓｉＲＮＡ配列全体と相補的でなく一部分だけ相補的なｍＲＮＡとも結合して分解を誘発するが、これを標的でないｍＲＮＡの分解を誘発するということで非標的効果と呼ばれる。
【０００５】
前述されたｓｉＲＮＡ基盤の坑癌治療剤の技術的難点を克服するために、マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ、以下ｍｉＲＮＡと表記）を治療剤で使用しようとする研究が進行中である（Agostini, M. & Knight, R.A. miR-34: from bench to bedside. Oncotarget 5, 872-81, 2014., van Rooij, E., Purcell, A.L. & Levin, A.A. Developing MicroRNA Therapeutics. Circulation Research 110, 496-507, 2012., Burnett, J.C. & Rossi, J.J. RNA-based therapeutics: current progress and future prospects. Chem Biol 19, 60-71, 2012., Dangwal, S. & Thum, T. microRNA therapeutics in cardiovascular disease models. Annu Rev Pharmacol Toxicol 54, 185-203, 2014.）。ｍｉＲＮＡは、１６〜２７の間のヌクレオチドで構成されたＲＮＡであり、タンパク質で翻訳されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に対比してタンパク質非生成ＲＮＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ）に分類される（Carthew, R.W. & Sontheimer, E.J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell 136, 642-55, 2009., MacFarlane, L.-A. & Murphy, P.R. MicroRNA: Biogenesis, Function and Role in Cancer. Current Genomics 11, 537-561, 2010., Bartel, D.P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell 136, 215-33, 2009.）。ｍｉＲＮＡは、高等動植物細胞の遺伝体に記録されていて、細胞の生成、成長、分化、死滅を含む細胞の代謝および機能を調節するのに核心的な役割をすると知られている。現在までヒトの遺伝体では約２０００種のｍｉＲＮＡが知られていてこの中相当な数のｍｉＲＮＡの機能はまだ知られていない。
【０００６】
ｍｉＲＮＡは、遺伝体からＰｏｌＩＩと呼ばれるＲＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）によりＲＮＡに転写されるが、初期の長さは特定できないほど多様である（Carthew, R.W. & Sontheimer, E.J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell 136, 642-55, 2009., Brodersen, P. & Voinnet, O. Revisiting the principles of microRNA target recognition and mode of action. Nat Rev Mol Cell Biol 10, 141-148, 2009.）。これは、ｍｉＲＮＡが遺伝体に含まれた位置の多様性に起因するが、ｍＲＮＡのタンパク質生成非関与の部分であるイントロン（ｉｎｔｒｏｎ）に位置して、ｍＲＮＡ生成同一時点に転写される場合、および遺伝体上で遺伝子間空いている空間（ｉｎｔｅｒ−ｇｅｎｉｃ  ｒｅｇｉｏｎ）に位置して独自に転写される場合など多様な方式で生成されるためである（Malone, C.D. & Hannon, G.J. Small RNAs as guardians of the genome. Cell 136, 656-68, 2009.）。このように初期に生成されたｍｉＲＮＡ母体を一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ）というが、一次ｍｉＲＮＡは、核の中のドローシャ（Ｄｒｏｓｈａ）と呼ばれるＲＮＡ切断酵素（ＲＮＡｓｅ）等によって前駆体ｍｉＲ（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲ）に編集される（Bartel, D.P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell 136, 215-33, 2009.）。Ｐｒｅ−ｍｉＲはＲＮＡヘアピン構造（ＲＮＡ  ｈａｉｒ−ｐｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を成して約７０−８０個のヌクレオチドで構成される。細胞核内部のＰｒｅ−ｍｉＲは、ｅｘｐｏｒｔｉｎタンパク質などによって核から細胞質に移動して、細胞質内でダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれる別のＲＮＡ切断酵素（ＲＮＡｓｅ）によって二次加工されて１６−２７個のヌクレオチドで構成される二本鎖の成熟ｍｉＲ（ｍａｔｕｒｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ、以下他の修飾語なしにｍｉＲと記述する場合は成熟ｍｉＲを意味する）を生成する。二本鎖ｍｉＲ中一本鎖のＲＮＡが選択的に選ばれて前記リボ核酸タンパク質結合体（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅ）のＲＩＳＣと結合して活性を有するようになり、ｍｉＲの配列を利用して目標ｍＲＮＡと結合する。
【０００７】
一般にｍＲＮＡは、タンパク質生成関与の有無を基準に大きく三つの部分に分けられるが、タンパク質翻訳情報を含んでいるコード部分（ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）とコード部分のそれぞれ５’と３’部分としてタンパク質翻訳情報を持たない５’−ＵＴＲ（Ｕｎ−Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  Ｒｅｇｉｏｎ）と３’−ＵＴＲに区分することができる。ｍＲＮＡとの相補的配列を利用、目標ｍＲＮＡの分解を誘発するｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの５’−、３’−ＵＴＲおよびコード部分に関係なく作用するのに対して、ｍｉＲは主に３’−ＵＴＲと結合をする（Carthew, R.W. & Sontheimer, E.J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell 136, 642-55, 2009., Bartel, D.P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell 136, 215-33, 2009.）。
【０００８】
ｍＲＮＡとの結合位置の違いと共にｓｉＲＮＡと異なるｍｉＲＮＡの独特の特徴は、ｓｉＲＮＡはｓｉＲＮＡ全配列と相補的な配列を含むｍＲＮＡと主に結合するのに対して、ｍｉＲＮＡはｍｉＲＮＡの５’終端から２−８ヌクレオチド位に位置した、限定された大きさの種の部分（ｓｅｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）配列が主に目標ｍＲＮＡ認識に使用される点が異なり、したがって全ｍｉＲＮＡの配列が目標遺伝子と完ぺきな相補的な配列を持たず一定部分非相補的配列が含まれてもｍｉＲＮＡ活性に影響を与えない（Bartel, D.P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell 136, 215-33, 2009.）。種の部分の配列の大きさが６−８ヌクレオチドであるだけこれと相補的な配列を３’−ＵＴＲに有するｍＲＮＡ種類は多様で、このような理由から一つの種類のｍｉＲＮＡで多種類のｍＲＮＡを同時に制御することができる。このようなｍｉＲＮＡの性質は、ｍｉＲＮＡが細胞の分裂、成長、分化、死滅に至るまで多くの細胞生理学的側面の制御に関与する効率的な調節因子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）としての機能を果たす。また、調節因子としてのｍｉＲＮＡの機能は効果的な坑癌効果を実現するのに長所として働くが、ｓｉＲＮＡの場合、単一遺伝子発現の抑制を目標とするのに対して、ｍｉＲＮＡは癌誘発遺伝子多数の発現を同時に阻害することができるためである。
【０００９】
多くのｍＲＮＡが３’−ＵＴＲに一種以上のｍｉＲＮＡが結合する可能性がある部分を含んでいて、ある生物情報学的な計算によると、全ｍＲＮＡの約３０％がｍｉＲＮＡによってタンパク質生成が調節されていると知られている。
【００１０】
ｍｉＲＮＡのこのような信号伝達体系内の主な調節因子として働くことは、癌を含む主な疾患でも重要な役割をする点から分かる（MacFarlane, L.-A. & Murphy, P.R. MicroRNA: Biogenesis, Function and Role in Cancer. Current Genomics 11, 537-561. 2010., Malone, C.D. & Hannon, G.J. Small RNAs as guardians of the genome. Cell 136, 656-68. 2009., Nicoloso, M.S., Spizzo, R., Shimizu, M., Rossi, S. & Calin, G.A. MicroRNAs--the micro steering wheel of tumour metastases. Nat Rev Cancer 9, 293-302. 2009., Landi, D., Gemignani, F. & Landi, S. Role of variations within microRNA-binding sites in cancer. Mutagenesis 27, 205-10. 2012.）。実際に様々な研究から癌細胞でのｍｉＲＮＡの発現様式は、正常細胞での発現様式と大きな差を示すことが明らかになった。それだけでなく、癌が発生した原発臓器に応じてもｍｉＲＮＡ発現様式が大きな差があって、肺癌、肝臓癌、皮膚癌、血液癌など様々な癌が原発臓器に応じた独特のｍｉＲＮＡ発現様式を示し、これによりｍｉＲＮＡが癌生物学において主要な役割をすることが知られている。特に、癌種で発現するｍｉＲＮＡがそれらの正常細胞での発現量に対して通常低いことが知られている。
【００１１】
前記癌におけるｍｉＲＮＡの深い関連性を基に、ｍｉＲＮＡを坑癌治療剤で利用しようとする試みが近年始まり、その一例としてｍｉＲ−３４ａと命名されたｍｉＲＮＡの癌細胞増殖抑制および死滅誘導能力を検証するための臨床実験中にある（Wiggins, J.F. et al. Development of a lung cancer therapeutic based on the tumor suppressor microRNA-34. Cancer Res 70, 5923-30. 2010., Bader, A.G. et al. miR-34 Regulated Genes and Pathways as Targets for Therapeutic Intervention. Google Patents, 2009., Hermeking, H. The miR-34 family in cancer and apoptosis. Cell Death Differ 17, 193-9. 2010., Chang, T.C. et al. Transactivation of miR-34a by p53 broadly influences gene expression and promotes apoptosis. Mol Cell 26, 745-52. 2007.）。
【００１２】
そこで、本発明者等は、臨床実験中であるｍｉＲ−３４ａの癌細胞増殖抑制および癌細胞死滅誘導能力よりも効能が優れたｍｉＲＮＡを発見しようと努力した結果、坑癌効能が優れたｍｉＲ−３６７０、ｍｉＲ−４４７７ａおよびｍｉＲ−８０７８を発見して、これらのｍｉＲＮＡが癌誘発遺伝子として知られた多数の遺伝子発現を効果的遮断することによって坑癌効果を達成することを確認することによって本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、癌細胞増殖抑制および癌細胞死滅誘導能力が優れたｍｉＲＮＡをして、これを有効性分として含む癌治療用医薬組成物を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記目的を達成するために、本発明は、ｍｉＲ−３６７０、ｍｉＲ−４４７７ａおよびｍｉＲ−８０７８で構成された群から選択される一つ以上のｍｉＲＮＡを有効成分として含む癌治療用医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】スクリーニングライブラリー製作に含まれたｍｉＲＮＡの活性の有無を測定するために全スクリーニングライブラリーで代表的にｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１００およびｍｉＲ−１２５ｂを選定してこれらによって発現が阻害されると知られている各ｍＲＮＡ３’ＵＴＲをルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）発現ベクターの３’ＵＴＲに挿入してｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１００およびｍｉＲ−１２５ｂによるタンパク質発現阻害能を確認したものである。
【図２】約１７００種のｍｉＲＮＡで構成されたスクリーニングライブラリーをＮＣＩ−Ｈ４６０肺癌細胞株に処理して細胞成長をレサズリン（Ｒｅｓａｚｕｒｉｎ）試薬を使用して定量して、これを相対的な成長値に換算して示したものである。
【図３】ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞株で優れた効能を示した約５０種のｍｉＲＮＡを選別してこれを使用して相対的癌細胞成長阻害能力をＷＳＴ−１試薬で測定して示したものである。
【図４】肺癌細胞株における細胞死滅効果を測定するために、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３６７０、ｍｉＲ−８０７８、ｍｉＲ−４４７７ａをトランスフェクション方式で細胞内に注入した後、細胞の死滅程度をＦＩＴＣ染料で標識されたアネキシンＶで染色してフローサイトメトリーで分析した結果である。
【図５】肺癌細胞株に各ｍｉＲＮＡをトランスフェクション方式で注入してソフトアガー上で２週間培養してｍｉＲＮＡの影響による肺癌細胞株の群集形成能力を測定したものである。
【図６】ｍｉＲＮＡターゲット予測ソフトであるターゲットスキャンを使用してターゲット候補群を選定して、これらをターゲットとするｓｉＲＮＡを使用して細胞内の含量を阻害させる場合の細胞死滅能力をＺ−ｓｃｏｒｅで表示したものである。
【図７】図６で確認された遺伝子の発現量がｍｉＲＮＡによって阻害される程度をｑＰＣＲ分析で示したものである。
【図８】図６で確認された遺伝子の３’−ＵＴＲをルシフェラーゼの３’−ＵＴＲにクローニングしてｍｉＲＮＡによるルシフェラーゼタンパク質の発現阻害程度を表示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する實驗方法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００１７】
本発明では、坑癌効果があると知られているｍｉＲ−３４ａよりも効能が優れたｍｉＲＮＡを発見して、これの坑癌効果を確認しようとした。
本発明では、約１７００種のｍｉＲＮＡスクリーニングライブラリーを合成して（表１）、これをＮＣＩ−Ｈ４６０（肺癌細胞株）に処理して、癌細胞成長抑制能を測定して、ｍｉＲ−３４ａより効能が優れた、下記の塩基配列を有するｍｉＲ−３６７０、ｍｉＲ−４４７７ａおよびｍｉＲ−８０７８を発見して（表３）、これらの坑癌効能が優れていることを確認した（図４〜図８）。
【００１８】
従って、本発明は、ｍｉＲ−３６７０、ｍｉＲ−４４７７ａおよびｍｉＲ−８０７８で構成された群から選択される一つ以上のｍｉＲＮＡを有効成分として含む癌治療用医薬組成物に関する。
【００１９】
本発明において、前記ｍｉＲ−３６７０は、配列番号３５と配列番号３６または配列番号３５と配列番号６７の塩基配列からなる二本鎖ＲＮＡを有効成分として含んでもよい。
【００２０】
本発明において、前記ｍｉＲ−４４７７ａは、配列番号４３と配列番号４４または配列番号４３と配列番号６８の塩基配列からなる二本鎖ＲＮＡを有効成分として含んでもよい。
【００２１】
本発明において、前記ｍｉＲ−８０７８は、配列番号６５と配列番号６６または配列番号６５と配列番号６９の塩基配列からなる二本鎖ＲＮＡを有効成分として含んでもよい。
【００２２】
すなわち、本発明のｍｉＲ−３６７０鋳型鎖は、配列番号３５で表されてもよい。
5’-AGAGCUCACAGCUGUCCUUCUCUA-3’（MIMAT0018093. 配列番号３５）
【００２３】
生体内で究極的に活性を示すｍｉＲＮＡは、一本鎖であるが、ＲＩＳＣに結合するためには類似の塩基の大きさを有する塩基配列と共に二本鎖形態で細胞内に供給されなければならない。この時、前記配列と結合する反対配列（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）は、活性配列と相補的な配列を有する。相補的な配列は完全相補配列（ｐｅｒｆｅｃｔ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有するか、または生体内在的配列（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を使用することができる。二本鎖で構成された各配列全部、あるいは一方の鎖の３’に位置した塩基は、相手配列との塩基結合を有しないことがあるが、これを３’オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）といいこれを含むことができる。
【００２４】
すなわち、ｍｉＲ−３６７０の完全相補配列（ｐｅｒｆｅｃｔ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、配列番号３５で表されてもよい。
5’-GAGAAGGACAGCUGUGAGCUCUUU-3’（配列番号３６）
【００２５】
また、ｍｉＲ−３６７０の内在的相補配列（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、配列番号６７で表されてもよい。
5’-GACUGGUAUAGCUGCUUUUGGAGCCUCA-3’（配列番号６７）
【００２６】
前記背景技術で記述した通り、ｍｉＲＮＡ活性配列の二番目の塩基から８〜９番目の塩基まで該当する種配列（ｓｅｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）が活性の主要な因子であるが、二本鎖ＲＮＡを製造する時これを含む長い二本鎖を製造して使用してもよい。
【００２７】
ｍｉＲ−３６７０と同様にｍｉＲ−４４７７ａおよびｍｉＲ−８０７８の活性配列およびこれらと二本鎖をなすための相補配列は、下記の通り表示されることを特徴とする。これら二本鎖も前述した通り３’オーバーハングを含んで二本鎖を構成することができ、また種の領域（ｓｅｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）を含む長い配列の二本鎖を構成して使用することができる。
ｍｉＲ−４４７７ａ
5’-CUAUUAAGGACAUUUGUGAUUC-3’（MIMAT0019004 配列番号４３）
ｍｉＲ−４４７７ａの完全相補配列（ｐｅｒｆｅｃｔ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
5’-AUCACAAAUGUCCUUAAUAGUU-3’（配列番号４４）
ｍｉＲ−４４７７ａの内在的相補配列（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
5’-AUCACAAAUGUCCUUAAUGGCA-3’（配列番号６８）
ｍｉＲ−８０７８
5’-GGUCUAGGCCCGGUGAGAGACUC（MIMAT0031005, 配列番号６５）
ｍｉＲ−８０７８の完全相補配列（ｐｅｒｆｅｃｔ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
5’-GUCUCUCACCGGGCCUAGACCUU（配列番号６６）
ｍｉＲ−８０７８の内在的相補配列（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
5’-CUCCACCGGGCUGACCGGCCUG-3’（配列番号６９）
【００２８】
本発明でライブラリースクリーンを介して発見された前記ｍｉＲＮＡは、癌の誘発、生成および成長に主要な役割をするもので、通常知られた遺伝子を制御することによって坑癌効能を発生させることを確認した。一つの種類のｍｉＲＮＡが多数のｍＲＮＡ発現を同時に制御できることがｍｉＲＮＡの特徴であり、このような性質は本発明でも確認され、オリゴ基盤の坑癌新薬開発に有用な性質である。
【００２９】
本発明のｍｉＲ−３６７０はＣＢＸ４、ＮＲＡＳ、ＣＡＳＲ、ＴＸＬＮＡ、ＳＮＩＰ１、ＨＮＦ１Ａ、ＦＺＤ４、ＴＲＩＢ１、ＡＤＭＡ１９およびＣＫＡＰ５の発現を同時に抑制して、ｍｉＲ−８０７８はＧＲＥＢ１、ＨＥＣＴＤ３およびＲＩＰＫ４の発現を抑制して、ｍｉＲ−４４７７ａはＳＴＩＬ、ＫＩＦ１１、ＡＫＡＰ１１およびＦＡＭ１２０Ａの発現を同時に抑制することを確認した（図６）。
【００３０】
本発明のｍｉＲＮＡが抑制するターゲット遺伝子は下記のような機能をすると知られている。
ＣＢＸ４（ｐｏｌｙｃｏｍｂ  ｃｈｒｏｍｏｂｏｘ  ４）は、腫瘍の血管生成および腫瘍の転移促進に関与して、ＮＲＡＳは、腫瘍の成長および細胞分裂に主要な役割を果たすと知られている（Orouji, E. et al. MAP Kinase pathway gene copy alterations in NRAS/BRAF wild-type advanced melanoma. Int J Cancer (2015); Zheng, C. et al. MicroRNA-195 functions as a tumor suppressor by inhibiting CBX4 in hepatocellular carcinoma. Oncol Rep 33, 1115-22 (2015); Jiao, H.K. et al. Prognostic significance of Cbx4 expression and its beneficial effect for transarterial chemoembolization in hepatocellular carcinoma. Cell Death Dis 6, e1689 (2015); Ohashi, K. et al. Characteristics of lung cancers harboring NRAS mutations. Clin Cancer Res 19, 2584-91 (2013)）。
ＣＡＳＲは腫瘍で過多発現するものが発見され、腫瘍の転移に必要であり、ＴＸＬＮＡは腫瘍の成長および転移に関連すると知られているが発現率が高い患者群の生存率が低いとの臨床結果が発表された（Mashidori, T., Shirataki, H., Kamai, T., Nakamura, F. & Yoshida, K. Increased alpha-taxilin protein expression is associated with the metastatic and invasive potential of renal cell cancer. Biomed Res 32, 103-10 (2011); Tennakoon, S., Aggarwal, A. & Kallay, E. The calcium-sensing receptor and the hallmarks of cancer. Biochim Biophys Acta (2015); Ohtomo, N. et al. Expression of alpha-taxilin in hepatocellular carcinoma correlates with growth activity and malignant potential of the tumor. Int J Oncol 37, 1417-23 (2010)）。
【００３１】
転写共同活性因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ）で知られているＳＮＩＰ１は、細胞の成長および分裂に必須のｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１の発現を促進させるが、ＳＮＩＰ１の発現量が高い患者群の坑癌予後が良くないことが知られている。また、細胞増殖の主な調節子としての役割をするｃ−Ｍｙｃと結合して腫瘍成長を促進する役割をすると知られている（Li, Q. et al. SNIP1: a new activator of HSE signaling pathway. Mol Cell Biochem 362, 1-6 (2012); Fujii, M. et al. SNIP1 is a candidate modifier of the transcriptional activity of c-Myc on E box-dependent target genes. Mol Cell 24, 771-83 (2006); Roche, K.C., Rocha, S., Bracken, C.P. & Perkins, N.D. Regulation of ATR-dependent pathways by the FHA domain containing protein SNIP1. Oncogene 26, 4523-30 (2007); Jeon, H.S. et al. High expression of SNIP1 correlates with poor prognosis in non-small cell lung cancer and SNIP1 interferes with the recruitment of HDAC1 to RB in vitro. Lung Cancer 82, 24-30 (2013); Liang, X. et al. Hypoxia-inducible factor-1 alpha, in association with TWIST2 and SNIP1, is a critical prognostic factor in patients with tongue squamous cell carcinoma. Oral Oncol 47, 92-7 (2011)）。
【００３２】
ＨＮＦ１ＡとＦＺＤ４は、腫瘍の成長および生存に深く関与するＷｎｔ信号伝達体系の構成因子であり、Ｗｎｔ信号伝達体系は、腫瘍生物学で集中的に研究されてその重要性が広く知られている。ＴＲＩＢ１は、腫瘍細胞の成長、転移および細胞の自殺抑制の役割が知られていて、これは腫瘍成長の主な信号伝達体系の一つであるＭＡＰＫ信号伝達体系を調節する因子として知られている（Pecina-Slaus, N. et al. Wnt signaling transcription factors TCF-1 and LEF-1 are upregulated in malignant astrocytic brain tumors. Histol Histopathol 29, 1557-64 (2014); Ueno, K. et al. Tumor suppressor microRNA-493 decreases cell motility and migration ability in human bladder cancer cells by downregulating RhoC and FZD4. Mol Cancer Ther 11, 244-53 (2012); Lin, Z.Y. et al. MicroRNA-224 inhibits progression of human prostate cancer by downregulating TRIB1. Int J Cancer 135, 541-50 (2014); Soubeyrand, S., Naing, T., Martinuk, A. & McPherson, R. ERK1/2 regulates hepatocyte Trib1 in response to mitochondrial dysfunction. Biochim Biophys Acta 1833, 3405-14 (2013)）。
【００３３】
ＡＤＡＭ１９は、細胞膜に分布しているタンパク質であり、細胞−細胞間接触と細胞-細胞外マトリックスとの接触を含む生物学的多様な役割をすると知られているが、腫瘍生物学では腫瘍の成長および転移と深い関連があると知られている。遺伝子機能的スクリーンを介して腫瘍の生存に重要な役割をすると知られているＣＫＡＰ５遺伝子も前記ｍｉＲＮＡによって制御されることが本発明により明らかになり、ＧＲＥＢ１はホルモンに反応する組織または腫瘍の信号伝達体系と関連がある遺伝子として種々の腫瘍で過多発現して細胞の成長を促進させると知られている（Zhang, Q. et al. Role of microRNA-30c targeting ADAM19 in colorectal cancer. PLoS One 10, e0120698 (2015); Shan, N., Shen, L., Wang, J., He, D. & Duan, C. MiR-153 inhibits migration and invasion of human non-small-cell lung cancer by targetin;g ADAM19. Biochem Biophys Res Commun 456, 385-91 (2015); Martens-de Kemp, S.R. et al. Functional genetic screens identify genes essential for tumor cell survival in head and neck and lung cancer. Clin Cancer Res 19, 1994-2003 (2013); Rae, J.M. et al. GREB1 is a novel androgen-regulated gene required for prostate cancer growth. Prostate 66, 886-94 (2006); Zhang, L. et al. Development of transcriptomic biomarker signature in human saliva to detect lung cancer. Cell Mol Life Sci 69, 3341-50 (2012); Laviolette, L.A., Hodgkinson, K.M., Minhas, N., Perez-Iratxeta, C. & Vanderhyden, B.C. 17beta-estradiol upregulates GREB1 and accelerates ovarian tumor progression in vivo. Int J Cancer 135, 1072-84 (2014)）。
【００３４】
ＨＥＣＴＤ３は、Ｅ３ユビキチンリガーゼ（Ｅ３  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｌｉｇａｓｅ）として細胞の自殺を引き起こすカスパーゼ−８（ｃａｓｐａｓｅ−８）にポリユビキチンを付着してカスパーゼ−８の分解を誘導することによって腫瘍の死滅を抑制する一方、ＭＡＬＴ１タンパク質を安定化させてシスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）抗癌剤に対する薬物抵抗性を増大させると知られている。ＲＩＰＫ４は、受容体反応タンパク質キナーゼ４（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ４）であって、細胞成長信号因子であるベータ−カテニン（β−ｃａｔｅｎｎｉｎ）の蓄積を誘発すると同時にＷｎｔ信号伝達体系を活性化すると報告されている。ＲＩＰＫ４の人為的除去を介して腫瘍動物モデルにおける腫瘍の成長を抑制できることが明らかになっている（Li, Y. et al. The HECTD3 E3 ubiquitin ligase facilitates cancer cell survival by promoting K63-linked polyubiquitination of caspase-8. Cell Death Dis 4, e935 (2013); Li, Y. et al. The HECTD3 E3 ubiquitin ligase suppresses cisplatin-induced apoptosis via stabilizing MALT1. Neoplasia 15, 39-48 (2013); Huang, X. et al. Phosphorylation of Dishevelled by protein kinase RIPK4 regulates Wnt signaling. Science 339, 1441-5 (2013)）。
【００３５】
細胞周期循環中Ｇ２相（ｐｈａｓｅ）からＭ相（ｐｈａｓｅ）への転移過程中、必須的な要素としてのＳＴＩＬ遺伝子は、種々の癌種で発現率が高いと観測されて、腫瘍増殖と生存に必要であると知られている。ＫＩＦ１１も、腫瘍細胞の成長および転移に必要な要素の中の一つと報告されていて、ＫＩＦ１１の活動を阻害することによって腫瘍の成長を抑制することができると知られている（Erez, A. et al. Sil overexpression in lung cancer characterizes tumors with increased mitotic activity. Oncogene 23, 5371-7 (2004); Erez, A. et al. The SIL gene is essential for mitotic entry and survival of cancer cells. Cancer Res 67, 4022-7 (2007); Tang, Y., Orth, J.D., Xie, T. & Mitchison, T.J. Rapid induction of apoptosis during Kinesin-5 inhibitor-induced mitotic arrest in HL60 cells. Cancer Lett 310, 15-24 (2011); Venere, M. et al. The mitotic kinesin KIF11 is a driver of invasion, proliferation, and self-renewal in glioblastoma. Sci Transl Med 7, 304ra143 (2015)）。
【００３６】
タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）と結合してＰＫＡの活性を増加させるＡＫＡＰ１１は、ＧＳＫ−３ｂｅｔａとも同時に結合して、ＰＫＡによるＧＳＫ−３ｂｅｔａのリン酸化作用を促進させる。リン酸化ＧＳＫ−３ｂｅｔａは、活性を失うようになるが、これは細胞で成長を促進させる信号と認識されて、腫瘍の成長を誘発する主な機序の中の一つである。腫瘍細胞は、酸性条件、酸素欠乏条件などの様々なストレス条件に曝されるが、このような厳しい条件中でも腫瘍細胞の死滅を抑制する機序を維持している。その一つとして、ＲＮＡ結合タンパク質であるＦＡＭ１２０Ａは、Ｓｒｃなどのキナーゼ（Ｋｉｎａｓｅ）を活性化させて細胞の死滅抑制および薬物に対する抵抗性を増加させると知られている（Logue, J.S. et al. AKAP220 protein organizes signaling elements that impact cell migration. J Biol Chem 286, 39269-81 (2011); Whiting, J.L. et al. Protein Kinase A Opposes the Phosphorylation-dependent Recruitment of Glycogen Synthase Kinase 3beta to A-kinase Anchoring Protein 220. J Biol Chem 290, 19445-57 (2015); Tanji, C. et al. A-kinase anchoring protein AKAP220 binds to glycogen synthase kinase-3beta (GSK-3beta) and mediates protein kinase A-dependent inhibition of GSK-3beta. J Biol Chem 277, 36955-61 (2002); Tanaka, M. et al. A novel RNA-binding protein, Ossa/C9orf10, regulates activity of Src kinases to protect cells from oxidative stress-induced apoptosis. Mol Cell Biol 29, 402-13 (2009); Bartolome, R.A. et al. IL13 Receptor alpha2 Signaling Requires a Scaffold Protein, FAM120A, to Activate the FAK and PI3K Pathways in Colon Cancer Metastasis. Cancer Res 75, 2434-44 (2015)）。
【００３７】
本発明では前記遺伝子をｓｉＲＮＡを使用して細胞内含量を低下させると、ｍｉＲ−３６７０、ｍｉＲ４４７７ａ、ｍｉＲ−８０７８を使用する場合と同様に細胞の成長が低下することを確認して（図６）、ｍｉＲ−３６７０、ｍｉＲ−４４７７ａおよびｍｉＲ−８０７８を肺癌細胞内に伝達する場合、前記遺伝子のｍＲＮＡ発現が低下することをいずれもｑＰＣＲ結果として確認した（図７）。また、前記遺伝子が、ｍｉＲ−３６７０、ｍｉＲ−４４７７ａおよびｍｉＲ−８０７８の直接的なターゲットであることをルシフェラーゼ結果として確認した（図８）。このような事実は、ｍｉＲ−３６７０、ｍｉＲ−４４７７ａおよびｍｉＲ−８０７８が腫瘍細胞の成長および生存に重要な様々な遺伝子を直接的な方式で発現を同時に抑制することによって腫瘍細胞の死滅を誘導することを意味する。
【００３８】
本発明において、前記癌は、肺癌、肝臓癌、胃癌、大腸癌、膵臓癌、胆嚢および胆管癌、乳癌、白血病、食道癌、非ホジキンリンパ腫、甲状腺癌、子宮頸部癌、皮膚癌などの原發性癌と、これからその他臓器に転移されて誘発される転移癌、および異常な過細胞分裂を促進することによって生成される腫瘍性細胞疾患で構成される群から選択された１種以上の癌であることを特徴とするが、これに限定されない。
【００３９】
本発明で提供する癌治療用医薬組成物の有効性分として使用可能なｍｉＲＮＡ配列は、ヒトゲノム由来の配列であるが、ｍｉＲＮＡ由来のゲノムをヒトゲノムに限定せず、他の動物由来ゲノムから得たｍｉＲＮＡ配列も使用することができる。
【００４０】
本発明でｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの生物学的等価効能を発生させる様々なｍｉＲＮＡ誘導体（ｍｉＲＮＡ  ｍｉｍｉｃ）の形態で使用できるが、同じ種の領域（ｓｅｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）を含むｍｉＲＮＡ配列を含む変形されたｍｉＲＮＡを使用することができる。この時、配列１または配列２の長さを減らすことができるが、長さが１５個のヌクレオチドで構成された短い誘導体使用も可能である。
【００４１】
本発明で前記ｍｉＲＮＡに対するｍｉＲＮＡ誘導体としては、ＲＮＡリン酸骨格構造（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を硫黄などの他の元素で置き換えた形態であるホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）構造を部分的に含むことができ、ＲＮＡの代わりにＤＮＡ、ＰＮＡ（ｐｅｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）またはＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）分子への全体または部分的に置き換えた形態で使用可能で、さらに、ＲＮＡ糖の２’ヒドロキシ基を多様な機能性構造で置き換えた形態で使用が可能であるが、これはメチル化、メトキシ化、フルオロ化などを含むが、このような変形に限定されない。
【００４２】
本発明でｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲＮＡ（ｍａｔｕｒｅ  ｍｉＲＮＡ）とこれから誘導された前記ｍｉＲＮＡ誘導体の二本鎖ＲＮＡに限定せず、ｍｉＲＮＡ前駆体の形態で使用可能で、ｍｉＲＮＡ前駆体も前述したＲＮＡリン酸骨格構造、ＲＮＡ核酸のＤＮＡ、ＰＮＡまたはＬＮＡ分子への全体または部分的置き換、ＲＮＡ糖の２’ヒドロキシ基の変が可能である。
【００４３】
本発明でｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ前駆体または一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）形態で使用が可能であるが、これを化学的方法で合成したりまたはプラスミド形態で細胞に伝達して発現することが可能である。
【００４４】
本発明において、ｍｉＲＮＡを培養皿で培養した細胞に伝達する方法は、カチオン性脂質との混合物を使用する方法、電気的刺激で伝達する方法、およびウイルスを利用する方法などを使用することができるが、これに限定しない。
【００４５】
本発明の前記ｍｉＲＮＡを有効成分として含む癌治療用医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含んでもよく、担体と共に適切な形態で剤形化されることができる。
【００４６】
前記医薬的組成物は、薬学的に許容可能な担体を含んで製剤化されることができる。前記「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を刺激せずに投与化合物の生物学的活性および特性を阻害しない担体または希釈剤をいう。液状溶液に製剤化される組成物において許容される薬学的担体としては、滅菌および生体に適したものであって、生理食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、およびこれらの成分のうち１成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、及び潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。
【００４７】
本発明の前記ｍｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体を含む癌予防または治療用医薬組成物は、これを有効成分として含むいかなる剤形でも適用可能であり、経口用または非経口用剤形に製剤化することができる。本発明の医薬的剤形は、口腔（ｏｒａｌ）、直膓（ｒｅｃｔａｌ）、鼻腔（ｎａｓａｌ）、局所（ｔｏｐｉｃａｌ：頬部および舌下含む）、皮下、膣（ｖａｇｉｎａｌ）または非経口（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ：筋肉内、皮下および静脈内含む）投与に適した形態、または吸入（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）または注入（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）による投与に適した形態を含む。
【００４８】
本発明の組成物を有効成分として含む経口投与用剤形は、例えば錠剤、トローチ剤、薬用キャンデー、水溶性または油性懸濁液、調剤粉末または顆粒、エマルジョン、ハードまたはソフトカプセル、シロップまたはエリキシル剤などを含む。錠剤およびカプセルなどの剤形に製剤化するために、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アミロペクチン、セルロースまたはゼラチンなどの結合剤、第二リン酸カルシウムなどの賦形剤、トウモロコシ澱粉またはサツマイモ澱粉などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリルフマル酸ナトリウム、またはポリエチレングリコールワックスなどの湿潤油を含むことができ、カプセル剤形の場合には、前述した物質以外にも脂肪油などの流体担体をさらに含むことができる。
【００４９】
本発明の組成物を有効成分として含む非経口投与用剤形は、皮下注射、静脈注射または筋肉内注射などの注射用剤形、坐剤注入方式または呼吸器を介して吸入可能にするエアゾール剤などのスプレー用剤形に製剤化することができる。注射用剤形に製剤化するためには、本発明の組成物を安定化剤または緩衝剤と共に水で混合して溶液または懸濁液に製造し、これをアンプルまたはバイアルの単位投与用に製剤化することができる。坐剤として注入するためには、通常の坐薬ベース、例えばカカオバターまたは他のグリセリドなどを含む坐薬または治療浣腸剤などの直腸投与用組成物に製剤化することができる。エアロゾル剤などのスプレー用に剤形化する場合、水分散した濃縮物または湿潤粉末が分散するように推進剤などが添加剤と共に配合できる。
【実施例】
【００５０】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００５１】
実施例１：ｍｉＲＮＡスクリーニングライブラリー製作
ｍｉＲＮＡデータベースであるｍｉＲＢａｓｅ（ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）で提供する２１バージョンのヒトｍｉＲＮＡ配列として、ステムループ構造（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）基準に約１７００種のｍｉＲＮＡスクリーニングライブラリーを通常のオリゴ合成に使用される固体合成法で２本の鎖配列のｍｉＲＮＡ合成した。合成されたｍｉＲＮＡ各鎖はＣ１８樹脂を使用して逆相分離方式（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｈａｓｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）で精製した。合成されたすべてのｍｉＲＮＡ鎖は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ方式の質量分析器を使用して意図した配列の合成の有無を判別および確認した。二本鎖のｍｉＲＮＡを製造するために相応する相補鎖を塩存在下で９５℃、２分間加熱後、徐々に冷却して二本鎖を結合させた。
【００５２】
【表１】
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【００５３】
実施例２：ｍｉＲＮＡライブラリー標本の活性測定
実施例１で合成したｍｉＲＮＡ二本鎖の活性の有無を測定するために、約１７００種のｍｉＲＮＡスクリーニングライブラリーから選別的にｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１２５ｂを選択した。選別されたｍｉＲＮＡは既に行われた多くの研究から機能および発現を制御する目標ｍＲＮＡ種類および各ｍＲＮＡ  ３’ＵＴＲに結合する結合領域などに関する研究が多く進行されている関係から選択した。ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１２５ｂそれぞれによって発現が制御されると広く知られているＢｃｌ２、ｍＴＯＲ、Ｌｉｎ２８ｂ  ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ部分をファイアフライルシフェラーゼベクター（ｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｖｅｃｔｏｒ）の３’−ＵＴＲで置き換えて、各ｍｉＲＮＡに相応するベクターを製作した。各ベクターとｍｉＲ対照群、または各ベクターに相応するｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１２５ｂをオリゴの細胞内伝達試薬であるリポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＨＥＫ−２９３Ｔ細胞株にｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎして（３回繰り返し試料製作）、３７℃、５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素条件で２４時間培養した。ルシフェラーゼの活性は、Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定して、合成されたｍｉＲＮＡの活性を確認した（図１）。
【００５４】
実施例３：肺癌細胞株の増殖抑制誘発マイクロＲＮＡ発見のためのスクリーニング
９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに３，０００〜１０，０００個のＮＣＩ−Ｈ４６０細胞株を分注して２４時間３７℃、５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素条件で培養した後、ｍｉＲＮＡライブラリーの各ｍｉＲＮＡをＲＮＡｉＭＡＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して終濃度が１００ｎＭになるようにｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎを行った。各ｍｉＲＮＡは３回繰り返してｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎを行ったため、９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに保管されたｍｉＲＮＡライブラリー一つのｐｌａｔｅ当たり３つの実験９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅを準備した。これを前記細胞培養条件と同じ条件で２４時間さらに培養した後、レサズリン（Ｒｅｓａｚｕｒｉｎ）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加して発生する蛍光値を蛍光光度計（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ，Ｔｅｃａｎ）を使用して測定した。各ｍｉＲＮＡによる細胞増殖抑制能力を相対的に比較評価するために、９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅで測定された９６個の値の平均値と標準偏差を求めて、平均値から各ｍｉＲＮＡが含まれたｗｅｌｌにおける測定値が何標準偏差倍数だけ離れているかを（Ｚ−ｓｃｏｒｅ）下記の公式に代入して計算した。
ｚｉ＝（ｘｉ−μ）／σ
【００５５】
この時、ｘｉは各ｗｅｌｌの測定値で、μはｐｌａｔｅの全ｗｅｌｌ測定値の平均値で、σは標準偏差である。各ｗｅｌｌの標準偏差倍数ｚｉは３回繰り返しｐｌａｔｅで得られた平均値でこれによりｚ値が−２より小さい値を示す約５０個の一次候補ｍｉＲＮＡを選定した（図２、表２）。
【００５６】
【表２】
0006538183.tif 000044
0006538183.tif 000045
【００５７】
実施例４：肺癌細胞株の増殖抑制効能のｍｉＲＮＡ発見のための二次スクリーニング
一次スクリーニングで得られた約５０個のｍｉＲＮＡ候補群を使用して測定精度を向上させて二次スクリーニングを行った。実験条件は一次スクリーニング条件と同様に行って、異なる点は細胞の増殖能力を測定するための試薬としてレサズリンの代わりにＷＳＴ−１試薬（Ｒｏｃｈｅ）を利用した。ＷＳＴ−１がレサズリンに比べて信号の強度がより定量的に測定できる長所があって使用した。各ｍｉＲＮＡによる細胞抑制能力の測定値を対照群対比相対的な値は図３に開示して、陽性対照群としてｍｉＲ−３４ａも含む。
【００５８】
実施例５：細胞自殺誘導能力分析
スクリーニングで使用された方法は、定量的意味で細胞の個数を測定することによって相対的な細胞増殖の抑制程度を測定する方法である。細胞の増殖を抑制する機序は、細胞の分裂周期速度を減速させる方法と細胞の自殺を誘導する方法がある。本発明で発見したｍｉＲＮＡの細胞増殖抑制力の作用機序を分析するために、細胞自殺程度をフローサイトメトリー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ，ＦＡＣＳ）を使用して分析した。これのために細胞を６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに分注してＲＮＡｉＭＡＸ試薬で該当ｍｉＲＮＡを細胞に注入した後、４８時間前述した条件で細胞を培養した。この後細胞をＦＩＴ−Ｃ蛍光染料が標識されたアネキシンＶ（ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ）で処理した後、フローサイトメトリーで分析した（図４）。分析結果、ｍｉＲ−３６７０、ｍｉＲ−４４７７ａおよびｍｉＲ−８０７８で処理された多くの細胞が死滅したことを確認することができる。これは、スクリーニングで確認されたｍｉＲＮＡの腫瘍成長抑制効果が細胞の死滅を誘発することによるものであることが分かる（表３）。
【００５９】
【表３】
0006538183.tif 000046
【００６０】
実施例６：ｍｉＲＮＡによるソフトアガー（ｓｏｆｔ  ａｇａｒ）における腫瘍成長抑制
ソフトアガーを利用して腫瘍細胞を培養することによって腫瘍細胞としての特質を測定することができる。正常細胞の場合、成長するためにシャーレのような支持台が必要であるのに対して、腫瘍細胞はソフトアガーのような物理的に頑固な支持台がない環境でも成長する特徴を有している。このような腫瘍特異的性質を使用してソフトアガーでの細胞群集能力を把握した。ＮＣＩ−Ｈ４６０肺癌細胞株をｃｏｎｔｒｏｌ  ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−８０７８、ｍｉＲ−３６７０、ｍｉＲ−４４７７ａ、ｍｉＲ−４７６５でそれぞれ処理して２４時間培養した後、これをソフトアガーと混合して６ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅで２週間培養した。細胞をクリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔ）染料で染色して各群集の個数を測定した（図５）。その結果、ｍｉＲ−８０７８およびｍｉＲ−３６７０で処理した細胞は、ほとんど群集を形成できず、ｍｉＲ−４４７７ａで処理した細胞群の場合は対照群対比約３０％程度の群集形成能力を示すことを確認することができた。
【００６１】
実施例７：ｍｉＲＮＡのターゲットｍＲＮＡの細胞増殖抑制効果測定
ｍｉＲＮＡによってタンパク質発現が制御されるターゲットｍＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの配列と部分的に相補的な配列を有する。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの発現を抑制するために特に種の領域（ｓｅｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）の配列が重要であるが、これは種領域配列と相補的な配列を有するｍＲＮＡと結合して遺伝子の発現を阻害するためである。しかし、種領域配列が８〜９個の塩基で比較的短いので、ｍｉＲＮＡのターゲットになるｍＲＮＡはソフトを使用して予測する。しかし、ソフトを使用する場合でも予測されたターゲット中一部だけが実質的ターゲットであることが知られている。このような難点を解決するために、ソフトを介して予測されたターゲット遺伝子に対してｓｉＲＮＡを使用して細胞内の含量を低下させた後、細胞の成長が抑制されるか否かを判断することによってターゲット遺伝子を選定した。ｍｉＲＮＡのターゲットｍＲＮＡを予測するために、この分野で汎用されるターゲット予測ソフトとしてターゲットスキャン（ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ）を使用して、ｍｉＲ−３６７０、ｍｉＲ−４４７７ａおよびｍｉＲ−８０７８の予想ターゲットで計約６００種の遺伝子を選定した。選ばれた各遺伝子に対して３種のｓｉＲＮＡを合成して、これを使用して実施例３で行った方法と同様に実験を行った。細胞を９６ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅに分注して、各ｓｉＲＮＡで処理した後４８時間培養した後、レサズリン試薬を使用して細胞増殖能力を測定した。実施例３で処理した方法と同様の方式で計約１８００個（約６００遺伝子×３種のｓｉＲＮＡ）の測定値の平均から各遺伝子のＺ−ｓｃｏｒｅを計算して図６に開示した。
【００６２】
実施例８：ｍｉＲＮＡのターゲットｍＲＮＡ分析
ｍｉＲＮＡの作用方式は、ｍＲＮＡからタンパク質を生成することを低下させて、これと同時にターゲットとなる多くのｍＲＮＡの分解を誘発させる。したがって、細胞内にｍｉＲＮＡを注入してｍｉＲＮＡのターゲットとなるｍＲＮＡの含量をｑＰＣＲを使用して分析、含量低下を測定することによってｍｉＲＮＡのターゲットｍＲＮＡの有無を判別できる一つの基準として使用することができる。実施例７で確認されたｍｉＲＮＡのターゲット遺伝子を対象にして、ｍｉＲＮＡを細胞内に伝達した場合、実質的にターゲットｍＲＮＡが低下するか否かを測定するために、ｍｉＲ−３６７０、ｍｉＲ−４４７７ａおよびｍｉＲ−８０７８を肺癌細胞株にそれぞれ注入して４８時間培養した後、各細胞でＲＮＡを抽出してＲＮＡ含量を定量的に測定した（図７）。その結果、ｍｉＲ−３６７０、ｍｉＲ−４４７７ａおよびｍｉＲ−８０７８の予想ターゲットｍＲＮＡの含量が顕著に低下することを確認することができた。
【００６３】
実施例９：ルシフェラーゼ測定法によるターゲットｍＲＮＡの確認
ｍｉＲＮＡは、ターゲットｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）に結合することによってターゲットｍＲＮＡにおけるタンパク質生成を阻害するので、ｍｉＲＮＡとターゲットｍＲＮＡとの関係を直接的に測定する方法としてルシフェラーゼ測定法を通常使用する。ターゲットスキャン（ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ）ソフトでｍｉＲＮＡ結合配列が含まれた３’−ＵＴＲ配列を提供するが、これを前記実施例２で記述した通りファイアフライルシフェラーゼ（ｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）の３’−ＵＴＲに遺伝子クローニング（ｇｅｎｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ）手法で挿入して、このような方式で製作されたベクターを該当ｍｉＲＮＡと同時にＨｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ（ＨＥＫ）細胞にトランスフェクションしてベクターのルシフェラーゼ発現量を測定した。この時、トランスフェクション効率を補正するために、レニラルシフェラーゼ（ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）も同時にトランスフェクションして測定値を補正した。ｍｉＲＮＡ、ファイアフライルシフェラーゼ、レニラルシフェラーゼを同時に注入して４８時間培養した後、ルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）で測定した（図９）。その結果、各ターゲットｍＲＮＡが該当ｍｉＲＮＡによって直接的に制御されることを確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明に係る癌治療用医薬組成物は、ｍｉＲ−３６７０、ｍｉＲ−４４７７ａおよびｍｉＲ−８０７８で構成された群から選択される一つ以上のｍｉＲＮＡを有効成分として含み、既存の抗癌剤としての適合性を測定するために臨床実験進行中のｍｉＲ−３４ａおよびその他別のｍｉＲＮＡを有効成分とする癌治療用医薬組成物対比改善された坑癌効果を示しており、坑癌治療組成物として広く活用できる。
【００６５】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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