(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
0006556765.tif 000003
（式中，ＲはＨ＋又はＮａ＋であり，Ｒ１はＨ又はＣ（＝Ｏ）ＣｘＨｙ又は−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨ−ｈｅｔであり，ｘは５〜１７の範囲内の整数であり，ｙは１１〜３５の範囲内の整数であり，ＣｘＨｙは直鎖又は分岐鎖のＣ５−Ｃ１７の飽和鎖又は不飽和鎖であり，そしてｈｅｔは所望によりＮ，Ｓ又はＯ原子を有する複素環式基又は複素環芳香族基であり，少なくとも一つの繰り返し単位において一つ以上のＲ１は，−Ｃ（＝Ｏ）ＣｘＨｙ又は−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨ−ｈｅｔであり，ｎは１２〜４０００の範囲内にある）で表されるヒアルロン酸のＣ６−Ｃ１８−アシル化誘導体をベースとする抗腫瘍組成物であって，安定化するオレイン酸を有する無機ナノ粒子をさらに含み，該無機ナノ粒子が超常磁性ナノ粒子及びアップコンバージョンナノ粒子又は酸化亜鉛ナノ粒子から成る群から選ばれることを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記アシル化ヒアルロナンが，飽和及び不飽和結合を有するヒアルロン酸のＣ６−Ｃ１８アシル化誘導体，特にヒアルロン酸のＣ１８：１アシル化誘導体であることを特徴とする請求項１記載の抗腫瘍組成物。
【請求項３】
前記アシル化ヒアルロナンが無機ナノ粒子のキャリヤーとして寄与することを特徴とする請求項１又は２記載の抗腫瘍組成物。
【請求項４】
前記無機ナノ粒子が超常磁性ナノ粒子であることを特徴とする請求項１〜３いずれか１項記載の抗腫瘍組成物。
【請求項５】
前記組成物中のＦｅの量が０．３〜３重量%，好ましくは１．０重量%である酸化鉄をベースとする超常磁性ナノ粒子を含むことを特徴とする請求項４記載の抗腫瘍組成物。
【請求項６】
５〜２０nmのサイズを有する超常磁性ナノ粒子を含むことを特徴とする請求項４又は５記載の抗腫瘍組成物。
【請求項７】
５〜７nmのサイズを有する超常磁性ナノ粒子を含むことを特徴とする請求項４又は５記載の抗腫瘍組成物。
【請求項８】
５nmのサイズを有する超常磁性ナノ粒子を含むことを特徴とする請求項４又は５記載の抗腫瘍組成物。
【請求項９】
酸化亜鉛ナノ粒子を０．３〜３重量%含むことを特徴とする請求項１〜３いずれか１項記載の抗腫瘍組成物。
【請求項１０】
前記組成物中の希土類元素の合計含有量が０．３〜３重量%である量でアップコンバージョンナノ粒子を含むことを特徴とする請求項１〜３いずれか１項記載の抗腫瘍組成物。
【請求項１１】
Ｅｒ，Ｙｂ及びＹを含むアップコンバージョンナノ粒子を含むことを特徴とする請求項１０記載の抗腫瘍組成物。
【請求項１２】
付着及び懸濁の両方の腫瘍細胞の増殖抑制に使用される請求項１〜１１いずれか１項記載の抗腫瘍組成物。
【請求項１３】
大腸の癌及び腺癌，肺癌，肝細胞癌，乳腺癌，好ましくは大腸の癌及び腺癌に由来した腫瘍細胞の増殖の抑制に使用される請求項１〜１２いずれか１項記載の抗腫瘍組成物。
【請求項１４】
体内，特に腫瘍及び肝臓中における前記組成物の蓄積のインビボ検出に使用される請求項４〜８いずれか１項記載の抗腫瘍組成物。
【請求項１５】
体内の病的形成物，特に腫瘍のインビボ検出に使用される請求項４〜８いずれか１項記載の抗腫瘍組成物。
【請求項１６】
非経口又は局所投与のための処方において適用可能であることを特徴とする請求項１〜１５いずれか１項記載の抗腫瘍組成物。
【請求項１７】
医薬品組成物に使用される他の添加剤，好ましくは塩化ナトリウム，デキストロース又は緩衝塩をさらに含むことを特徴とする請求項１〜１６いずれか１項記載の抗腫瘍組成物。
【請求項１８】
さらに薬物，好ましくは細胞増殖抑制剤を含むことを特徴とする請求項１〜１７いずれか１項記載の抗腫瘍組成物。
【請求項１９】
最終包装内でオートクレーブにより滅菌可能であることを特徴とする請求項１〜１８いずれか１項記載の抗腫瘍組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１９いずれか１項記載の組成物の調製方法であって，ヒアルロン酸のアシル化誘導体の水溶液を調製し，次に有機ハロゲン化物溶媒に分散されオレイン酸によって安定化されかつ超常磁性ナノ粒子，アップコンバージョンナノ粒子又は酸化亜鉛ナノ粒子からなる群より選択される無機ナノ粒子を添加し，得られた懸濁液を均質の混合物が形成されるまでソニケーションし，その後，遊離の無機ナノ粒子をナノミセルに充填された無機ナノ粒子から遠心分離及びその後の濾過により分離することを特徴とする方法。
【請求項２１】
続いて濾液を凍結乾燥することを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
続いて濾液を最終包装内でオートクレーブにより滅菌することを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
続いて凍結乾燥体を水溶液に溶解し，最終包装内でオートクレーブにより滅菌することを特徴とする請求項２１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，腫瘍疾病の治療に使用され得るヒアルロン酸をベースとする組成物に関する。該組成物は，ヒアルロン酸の疎水化誘導体又はその薬学的に許容される塩を含むポリマーナノミセル，オレイン酸によって安定化されたナノ粒子，好ましくは鉄の超常磁性ナノ粒子，亜鉛のナノ粒子又はアップコンバージョンナノ粒子を含む。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍疾病の治療においては，全身に分布される薬物を患者に静脈内又は経口投与する化学療法が最も頻繁に使用される。しかしながら，抗癌物質は，腫瘍細胞だけでなく正常細胞にも非常に有毒である。従って，全身への分布の結果，腫瘍疾病のある領域だけでなく健康な組織及び細胞の領域で抗腫瘍治療の毒性がもたらされる。さらに，医薬の選択的でない分配は，最終的に腫瘍細胞に到達する薬物の量を減少させ，それによって，治療の有効性を低下させる。
【０００３】
上記の事実により，腫瘍細胞への化学療法の有効性を増強し，同時に治療による望ましくない全身毒性を抑えることを可能にする適切な方法を見つけることに非常に大きな利益がある。医薬がキャリヤーシステムのマトリックス中に取り込まれると，薬物の望ましくない副作用がかなりの程度抑えられ，消失することさえあることが見出された。この目的のために，そのような腫瘍細胞へのキャリヤーシステムのターゲッティングに研究が向けられることが多くなっている。
【０００４】
最近，ターゲッティングに最もよく使用される二つの方法がある。一つは，腫瘍組織における透過性及び貯留の増加（いわゆるＥＰＲ効果）を利用するいわゆる受動的ターゲッティングに基づくものである（Maeda,2001）。健康な組織とは対照的に，腫瘍組織はナノメートルサイズの分子を血流から腫瘍まで到達させる穿孔のある血管の分布を特徴とする。しかしながら，他の要因に加えて，受動的ターゲッティングは，低い有効性と，腫瘍細胞が薬物を伴うキャリヤーシステムを非特異的に捕捉することにより制限される。しかしながら，キャリヤーシステムが受動的ターゲッティングに適した大きさを有する場合，そのようなターゲッティング法は，該キャリヤーの他の特性により腫瘍細胞に対する特定の治療の増強された抗腫瘍効果と関連し得る。例えば，特許出願ＷＯ２００８／１３０１２１は，水溶液中で高分子ミセルを形成する腫瘍選択性・生分解性のシクロトリホスファゼン−白金（II）複合体の特許を請求しており，そしてこれは，ＵＳ２００１／６３３３４２２の同様の複合体と比較して，受動的ターゲッティングにおいて腫瘍組織に増強された選択性を示す。受動的ターゲッティングにおける腫瘍細胞に関しての増強された選択性は，特許出願ＷＯ２０１３／１８８７２７にも言及されており，ここでは迅速に開裂するエステルフェノール結合（esteric phenolic bond）によって結合したレチノエート（retinoate）又はその異性体と薬物（ＳＮ−３８，ＰＩ−１０３，エトポシド，フェンレチニド）との複合体を含む，生分解性のＰＥＧ化ナノ粒子が開示されている。いずれの場合も，同様のシステムと比較した実験データに基づいて増強された選択性が確認された。
【０００５】
ターゲッティング及びそれによる医薬の作用の選択性をより有効にするための別の方法，治療剤（therapeutics）が腫瘍細胞の表面にある受容体に対して高親和性を有するリガンドにより修飾されている場合の可能性である。この第２の方法は，能動的ターゲッティングとして知られており，治療剤（therapeutic）の腫瘍細胞への選択的分布を保証するものである。一例として，例えばチアゾリジノン・アミド及びチアゾリジニン（thiazolidinine）アミドのカルボン酸誘導体が特許請求されているＵＳ２００７／０１５５８０７に開示されている解決法があり，ここでは，増加したＬＰＬ受容体発現を示すメラノーマ細胞への選択的挙動が確認された。この解決法及び類似の解決法の欠点は，ＬＰＬ受容体が正常細胞，例えば心筋細胞でも同様に発現するという事実であり，それらは健康な組織におけるそれらの選択作用をも導き得る。この解決法及び類似の解決法（例えばＷＯ２０１２／１７３６７７，ＵＳ２０１３／０２７４２２００）の別の欠点は，腫瘍細胞受容体の発現が時期だけでなく患者によっても変動するという事実である（Duncan & Gaspar, 2011）。従って，能動的ターゲッティングのために選択した結合リガンドは，腫瘍疾患の特定の病期の細胞にのみ，あるいは患者のうちの数人にのみ効果があるかもしれない。
【０００６】
能動的ターゲッティングの別の可能性は，システムが共有結合で又は非共有結合で結合した磁気ナノ粒子を含む場合に外部磁界によりキャリヤーシステムをターゲッティングすることにある。この場合，好ましくは超常磁性ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）が使用され得る。最も頻繁には，これらは，意図された薬学的機能のない不活性なコントラストＭＲＩ手段として評価されているＦｅ３Ｏ４ナノ粒子である（Huang et al.,2013）。細胞におけるそのインターナリゼーションの後のＳＰＩＯＮに関する限り，短期毒性も長期毒性もこれまで報告されていない（Huang et al.,2013）。ＭＲＩコントラスト及び磁気ターゲッティングに加えて，ＳＰＩＯＮは細胞増殖抑制剤あるいは他の薬物と結合してキャリヤーとして使用され得る。別の好ましい用途は，ＳＰＩＯＮが交番磁界エネルギーを吸収してそれを熱に転換する磁性流体ハイパーサーミアである。したがって，ＳＰＩＯＮが位置する領域の温度を選択的に上昇させることが可能である。ＳＰＩＯＮが腫瘍の領域に位置する場合，それらは正常細胞より温度感受性が高いので，高温により腫瘍細胞を破壊することが可能である（Laurent, Dutz, Hafeli & Mahmoudi, 2011）。
【０００７】
受動的又は能動的ターゲッティングと組み合わせて，正常細胞と比較して特徴的な腫瘍細胞のいくつかの性質が，治療の選択性を強化するために使用される（Fleige, Quadir & Haag, 2012）。これらの性質は，例えばより酸性度の高いｐＨ，高レベルの活性酸素（ＲＯＳ）である。特許出願ＵＳ２０１３／０２３０５４２は，ＲＯＳが存在する環境で活性化される治療成分（フェノール誘導体）を開示しており，これらは高レベルのＲＯＳを有する腫瘍細胞中で選択的に作用する。この解決法の欠点は，高いＲＯＳレベルはある種の正常細胞でも同様に存在するという事実である。例としては高レベルのＲＯＳがファゴゾーム中の病原体を消失させるマクロファージが挙げられる。高いＲＯＳレベルは，他の細胞においても低酸素に対する自然な生体防御機構として，また多くの生理機能に影響するシグナル分子として寄与する。
【０００８】
文献では，インビトロで，いくつかのタイプの腫瘍細胞についての抗腫瘍方法で作用するという点で有望な抗腫瘍組成物もある。一例として，次の群から選ばれる１〜３の成分を含むＵＳ２００５／０２５５１７３の組成物が挙げられる：クエン酸，亜鉛及びアルブミン。この組成物は腺癌ＮＩＨ：ＯＶ−ＣＡＲ−３及びＳＫＯＶ−３に由来したヒト細胞株に対してコントロール細胞ＷＩ３８（正常ヒト肺線維芽細胞）と比較してインビトロでより高い細胞毒性を有する。この組成物の欠点は，その抗腫瘍効果が個々の成分の濃度含量に依存するという事実である（ＵＳ２００５／０２５５１７３）。成分が身体に固有のものであるので，特許請求された組成物の効果は，投与された特定の箇所での個々の物質の局所濃度（例えば血液中の高濃度のアルブミン）によって影響を受けるかもしれない。
【０００９】
引用した文献は，抗腫瘍治療学の研究が国際的に行われていることを示す。しかしながら，提案されている解決法の臨床用途での成功については，特にそれらの解決法のほとんどが生物分解性でない有機ポリマーを含んでいること，それらに腫瘍細胞への十分な選択性がないことから，まだ課題がある。そのため，腫瘍細胞に選択性を有する新しい組成物を見出すことはなお重要である。
【００１０】
発明の内容
本発明の主題は，選択的な抗腫瘍治療剤（therapeutics）としての無機ナノ粒子と組み合わせたヒアルロナンのナノミセルにある。より具体的には，本発明は，大腸癌又は腺癌，肺癌，肝細胞癌及び乳癌に由来する細胞に選択的に作用する疎水化ヒアルロン酸及び無機ナノ粒子をベースとする組成物に関する。この組成物はインビボの造影剤としても使用され得る。さらに，本発明は該組成物の調製法に関する。
【００１１】
該組成物は疎水化ヒアルロナンのナノミセルに，オレイン酸によって安定化された無機ナノ粒子を充填することに基づく。充填は，有機溶媒中のナノ粒子の溶液を水中の疎水化ヒアルロナンの溶液と共にソニケーションすることによって行ない得る。その後，得られた無機ナノ粒子を含むナノミセルを遠心分離にかけ，それによって遊離の無機ナノ粒子から分離し，腫瘍細胞への選択的効果のために使用し得る。本発明の組成物の主要かつ特徴的な利点は，腫瘍細胞とコントロール細胞の混合物を処理する場合でさえインビトロでの腫瘍細胞への選択的活性があることである。この組成物はオレイン酸によって安定化された無機ナノ粒子を含んでおり，無機ナノ粒子の本来の目的は，身体に投与した後に該組成物のインビボでの検出を可能にすることであった。しかしながら，驚くべきことに，疎水化ヒアルロン酸，特にヒアルロン酸オレイル誘導体と組み合わせると，たとえ細胞増殖抑制剤又は他の治療剤がなくても該組成物がインビトロで腫瘍細胞に選択的な細胞毒性を有することが見出された。この予期されず，今のところ説明もできない効果は，オレイン酸によって安定化されている限り，ＳＰＩＯＮナノ粒子，酸化亜鉛ナノ粒子及びアップコンバージョンナノ粒子に見られた。予期されていなかった効果は受容体媒介の効果，すなわちヒアルロナンに特有のＣＤ４４受容体に媒介される効果として明確に説明することもできず，増加したＲＯＳ産生の影響に関連して今まで集められたデータにより観測される選択性でもあり得ない。しかしながら，選択性はナノ粒子イオンの細胞内遊離の別の機構によって起きるかもしれない。多糖類あるいは別のポリマーマトリクスをベースとするキャリヤーに組み入れられたＳＰＩＯＮは，非細胞毒性であると解釈されてきたため腫瘍細胞上の選択効果はなおさら驚くべきことである（El-Dakdouki et al., 2012;Li, Kim, Tian, Yu, Jon & Moon, 2012）。
【００１２】
前述の組成物の他の利点は，生理的溶液との適合性，インビボでの静脈内投与の可能性及び生理的ｐＨにおけるナノミセルの経時安定性を含む。該組成物の別の利点は，ナノミセル・システムのまわりの外被を形成するキャリアポリマーとしてのヒアルロナンの使用によって，インビボで投与するための組成物の適合性を確保することである。好ましくは，ヒアルロナンは，ＣＤ４４受容体の発現増加を特徴とする腫瘍細胞への該組成物の結合形成をサポートしてもよい。組成物中のＳＰＩＯＮの存在は，磁界による体内の希望の位置へのキャリヤーのターゲッティングに好ましく使用され得る。交番磁界は，腫瘍組織の破壊に結びつく高熱を引き起こすのに寄与し得る。別の利点は，所定の組成物を細胞増殖抑制剤のような他の活性物質と組み合わせてもよいということである。ＳＰＩＯＮ及び酸化亜鉛のナノ粒子と同様に，アップコンバージョンナノ粒子の存在は，組織内での組成物のインビボでの検出に好ましく使用され得る。さらに，特定組成を有するアップコンバージョンナノ粒子は，光線力学療法又は組成物からの薬物の制御された放出に使用され得る。酸化亜鉛ナノ粒子の存在は，ＺｎＯナノ粒子が溶解しＺｎ２＋イオンが放出されてより高濃度で局所的に細胞毒性となる，酸性度がより高いｐＨを有する腫瘍組織で好ましく使用され得る。
【００１３】
したがって，本発明は，アシル化ヒアルロナンと，オレイン酸によって安定させた超常磁性ナノ粒子，アップコンバージョンナノ粒子又は酸化亜鉛ナノ粒子を含む群から選ばれ，特に超常磁性ナノ粒子である無機ナノ粒子をベースとする抗腫瘍組成物に関する。アシル化ヒアルロナンは，特に飽和及び不飽和結合を有するヒアルロン酸のＣ６−Ｃ１８アシル化誘導体，特にヒアルロン酸のＣ１８：１アシル化誘導体であってよく，該アシル化ヒアルロナンは無機ナノ粒子のキャリヤーとして寄与する。本発明による組成物が超常磁性ナノ粒子を含んでいる場合，これらは好ましくは組成物中のＦｅの量が０．３〜３重量%，好ましくは１．０重量%である酸化鉄をベースとするナノ粒子である。超常磁性ナノ粒子のサイズは５〜２０nm，好ましくは５〜７nm，より好ましくは５nmである。抗腫瘍組成物が酸化亜鉛ナノ粒子を含む場合，これらは好ましくは０．３〜３重量%のＺｎ量で存在する。該抗腫瘍組成物がアップコンバージョンナノ粒子を含む場合，これらは好ましくは組成物中の希土類元素の総量が，０．３〜３重量%である量で存在する。アップコンバージョンナノ粒子は，例えばＥｒ，Ｙｂ及びＹを含み得る。本発明の組成による組成物の利点は，オートクレーブにより最終包装の中で滅菌することが可能であるという事実でもある。
【００１４】
本発明による抗腫瘍組成物は，特に大腸の癌及び腺癌，肺癌，肝細胞癌，乳癌，好ましくは大腸の癌及び腺癌由来の付着及び懸濁の両方のヒト腫瘍細胞株の増殖抑制に使用され得る。さらに，超常磁性ナノ粒子を含む抗腫瘍組成物は，インビボの造影剤（contrast substance）として，即ち体内，特に肝臓及び病的形成物，例えば腫瘍における組成物の蓄積の検出のために使用され得る。本発明による組成物が，腫瘍細胞と非腫瘍細胞とで，特にヒトの大腸腺癌（＝腫瘍）に由来する細胞とヒトの皮膚線維芽細胞（＝非腫瘍）に由来する細胞とで，インビトロで異なる方法による金属イオンの放出を示すことが見出された。
【００１５】
本発明による抗腫瘍組成物は非経口又は局所投与，例えば，静脈内投与のための処方に適用され得る。それはさらに，医薬品組成物に使用される他の添加物，好ましくは塩化ナトリウム，デキストロース又は緩衝塩を含み得る。
【００１６】
本発明による組成物は下記の方法で調製することができる：ヒアルロン酸のアシル化誘導体の水溶液を調製し，次にハロゲン化物溶媒，例えばクロロホルムに分散した無機粒子を添加し，該無機粒子はオレイン酸によって安定化されておりかつ超常磁性ナノ粒子，アップコンバージョンナノ粒子又は酸化亜鉛ナノ粒子からなる群より選択されるものであり，得られた懸濁液を均質の混合物が形成されるまでソニケーションし，その後，遊離の無機ナノ粒子をナノミセルに充填した無機ナノ粒子から遠心分離及びその後の濾過により分離する。その後，濾液を凍結乾燥してもよく，長期貯蔵の目的でオートクレーブにより滅菌してもよい。その後，凍結乾燥体を水溶液に溶解し，オートクレーブにより滅菌してもよい。
【００１７】
本発明の目的のためには，市販のＳＰＩＯＮを使用し，オレイン酸によって安定化し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】疎水化ヒアルロナンに内包されたナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）のＴＥＭ写真。
【図２Ａ】コントロールのＮＨＤＦ線維芽細胞及びマウス非腫瘍３Ｔ３株のポジティブ／ニュートラル効果と比較した，腫瘍ＨＴ−２９株における，ＳＰＩＯＮを有するアシル化ヒアルロナンの組成物による生存率の抑制。
【図２Ｂ】コントロールのＮＨＤＦ線維芽細胞及びマウス非腫瘍３Ｔ３株のポジティブ／ニュートラル効果と比較した，腫瘍ＨＴ−２９株における，ＳＰＩＯＮを有するアシル化ヒアルロナンの組成物による生存率の抑制。
【図２Ｃ】コントロールのＮＨＤＦ線維芽細胞及びマウス非腫瘍３Ｔ３株のポジティブ／ニュートラル効果と比較した，腫瘍ＨＴ−２９株における，ＳＰＩＯＮを有するアシル化ヒアルロナンの組成物による生存率の抑制。
【図３】コントロールのＮＨＤＦ線維芽細胞及びマウス非腫瘍３Ｔ３株のポジティブ効果と比較した，様々な腫瘍細胞株の生存率の抑制に対するＳＰＩＯＮを有するアシル化ヒアルロナンの組成物の影響。
【図４Ａ】内包された５nmのＳＰＩＯＮを有するアシル化ヒアルロナンの組成物の腫瘍細胞ＨＴ−２９と正常ＮＨＤＦ及び３Ｔ３株の生存率に対する影響の比較。
【図４Ｂ】内包された１０nmのＳＰＩＯＮを有するアシル化ヒアルロナンの組成物の腫瘍細胞ＨＴ−２９と正常ＮＨＤＦ及び３Ｔ３株の生存率に対する影響の比較。
【図４Ｃ】内包された２０nmのＳＰＩＯＮを有するアシル化ヒアルロナンの組成物の腫瘍細胞ＨＴ−２９と正常ＮＨＤＦ及び３Ｔ３株の生存率に対する影響の比較。
【図５Ａ】コントロールのＮＨＤＦ線維芽細胞及びマウス非腫瘍３Ｔ３株のポジティブ／ニュートラル効果と比較した，腫瘍ＨＴ−２９株における，亜鉛ナノ粒子を有するアシル化ヒアルロナンの組成物による生存率の抑制。
【図５Ｂ】コントロールのＮＨＤＦ線維芽細胞及びマウス非腫瘍３Ｔ３株のポジティブ／ニュートラル効果と比較した，腫瘍ＨＴ−２９株における，亜鉛ナノ粒子を有するアシル化ヒアルロナンの組成物による生存率の抑制。
【図５Ｃ】コントロールのＮＨＤＦ線維芽細胞及びマウス非腫瘍３Ｔ３株のポジティブ／ニュートラル効果と比較した，腫瘍ＨＴ−２９株における，亜鉛ナノ粒子を有するアシル化ヒアルロナンの組成物による生存率の抑制。
【図６Ａ】コントロールのＮＨＤＦ線維芽細胞及びマウス非腫瘍３Ｔ３株のポジティブ／ニュートラル効果と比較した，腫瘍ＨＴ−２９株における，アップコンバージョンナノ粒子を有するアシル化ヒアルロナンの組成物による生存率の抑制。
【図６Ｂ】コントロールのＮＨＤＦ線維芽細胞及びマウス非腫瘍３Ｔ３株のポジティブ／ニュートラル効果と比較した，腫瘍ＨＴ−２９株における，アップコンバージョンナノ粒子を有するアシル化ヒアルロナンの組成物による生存率の抑制。
【図６Ｃ】コントロールのＮＨＤＦ線維芽細胞及びマウス非腫瘍３Ｔ３株のポジティブ／ニュートラル効果と比較した，腫瘍ＨＴ−２９株における，アップコンバージョンナノ粒子を有するアシル化ヒアルロナンの組成物による生存率の抑制。
【図７】ＳＰＩＯＮを有するアシル化ヒアルロナンの組成物を用いた，正常ＮＨＤＦ線維芽細胞及びコントロールのＨＴ−２９細胞の共培養。
【図８】フローサイトメトリーによって測定した，細胞ＮＨＤＦ，ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１の表面のＣＤ４４受容体の発現。
【図９】ＮＨＤＦ及びＨＴ−２９におけるＳＰＩＯＮを有するアシル化ヒアルロナンの組成物によるＲＯＳ生成の誘導。
【図１０】ＳＰＩＯＮ（スケール（scale）：１０μm）を有するアシル化ヒアルロナンの組成物と共にインキュベーションした後の腫瘍ＨＴ−２９及びコントロールのＮＨＤＦ細胞における細胞内Ｆｅ染色
【図１１】静脈内投与後の腫瘍細胞におけるアシル化ヒアルロナンに充填されたＳＰＩＯＮの時間蓄積（time accumulation）のＭＲＩ検出（膠芽腫，１．１mgＦｅ／kg）。
【図１２】アシル化ヒアルロナンに充填されたＳＰＩＯＮ組成物の静脈内投与（１．１mgＦｅ／kg）の後の肝臓のＭＲＩコントラスト。
【図１３】プルシアンブルーによる染色後の腫瘍の組織切片におけるＦｅ検出（ＳＰＩＯＮ組成物の投与後２及び２４時間）。
【図１４】プルシアンブルーによる染色後の肝臓の組織切片におけるＦｅ検出（ＳＰＩＯＮ組成物の投与後２及び２４時間）
【図１５】疎水化ヒアルロナン中に内包させたナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）の滅菌後のＴＥＭ写真。
【図１６】オートクレーブによる滅菌前後のＳＰＩＯＮ組成物の選択的な細胞毒性。
【図１７Ａ】マウスリンパ腫株ＥＬ４におけるＳＰＩＯＮ組成物によるアポプトーシスの誘導。
【図１７Ｂ】マウスリンパ腫株ＥＬ４におけるＳＰＩＯＮ組成物によるアポプトーシスの誘導。
【図１７Ｃ】マウスリンパ腫株ＥＬ４におけるＳＰＩＯＮ組成物によるアポプトーシスの誘導。
【００１９】
実施例
ＳＳ＝置換度＝１００%＊結合した置換基のモル量／多糖二量体の全モル量
ここに使用される当量（eq）という用語は，そうでないとことが示されていない限り，ヒアルロン酸二量体について使用される。パーセンテージは，そうでないとことが示されていない限り，重量パーセントである。
【００２０】
ヒアルロン酸：（Contipro Pharma,a.s., Dolni Dobrouc,CZから入手）の分子量は，ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳにより決定した。無機ナノ粒子という用語は，診断機能を有し，該診断機能が本発明による組成物中で使用される無機ナノ粒子の本質的な一般的性質である無機ナノ粒子を意味する。該診断機能は，医学において利用可能な方法によって該粒子を検知する可能性を意味することが意図されている。ＳＰＩＯＮは磁気共鳴によって，ＺｎＯ及びアップコンバージョンナノ粒子は発光（luminiscence）画像形成により検知することができ，これらのすべての粒子状物質は，検出のために適正に最適化されており，それが，それらが使用される理由である。したがって，１セットの無機ナノ粒子から，インビボであるいはインビトロでの検出（ミセルの）を可能にするものを選択した。
【００２１】
アップコンバージョンナノ粒子という用語は，エネルギーを有効にアップコンバージョンできる無機ナノ粒子が他に知られていないので，アップコンバージョンランタノイドナノ粒子，即ち希土類の群からの元素を含むナノ粒子を意味する。
【００２２】
実施例１：疎水化ヒアルロン酸，より具体的には安息香酸とオレイン酸の混合酸無水物によるヒアルロン酸のオレイル誘導体（Ｃ１８：１）の調製
１００gのヒアルロン酸ナトリウム（２５０mmol，１５kDa）を脱イオン水（demi water）２０００mlに溶解した。その後，１０００mlのイソプロパノールを徐々に添加した。その後，ＴＥＡ（７０ml，３当量）及びＤＭＡＰ（１．５２g，０．０５当量）を該溶液に添加した。同時に，オレイン酸（３５．３g，０．５当量）をイソプロパノール１０００mlに溶解し，その後ＴＥＡ（７０ml，３当量）及び塩化ベンゾイル（１４．４ml，０．５当量）を，該溶液に添加した。この酸の活性化の後，沈殿物を濾取して前記調製したＨＡ溶液に入れた。この反応は室温で３時間行った。その後，この反応混合物を９５gのＮａＣｌを添加した１０００mlの脱イオン水によって希釈した。アシル化した誘導体を４倍の無水イソプロパノールを用いて沈殿させることにより反応混合物から分離した。デカンテーションの後，沈殿をイソプロパノール水溶液（８５容量%）で繰り返し洗浄した。
ＳＳ  １３%（ＮＭＲで決定）。
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ０．８８（ｔ，３Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ３），δ１．２２−１．３５（ｍ，２０Ｈ（−ＣＨ２−）１０），
δ１．６０（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−），δ２．０（４Ｈ（−ＣＨ２−）２），δ２．４１（ｔ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＯ−），δ５．４１（ｄ，２Ｈ，ＣＨ＝ＣＨ）
この実施例は，ヒアルロナンの疎水化誘導体の一般的な合成法を記載している。しかしながら，その方法はオレイル誘導体のみに限定されない。疎水化誘導体の合成の詳細な開示は，特許出願ＣＺ  ＰＶ２０１２−８４２に記載されている。
【００２３】
実施例２：平均サイズ５nmのＳＰＩＯＮの調製
１．８０gのオレイン酸第二鉄，０．３５mlのオレイン酸及び１３．３５mlの１−オクタデケンを，容量５０mlの三口フラスコへ添加した。その混合物を真空下でゆっくり１００℃まで加熱し，揮発成分を取り出す（draw away）ために３０分間維持した。その後，その混合物を穏やかなアルゴン流下で２８０℃まで加熱し，６０分間この温度で維持した。この混合物を２８０℃で反応させる間にアルゴンでバブリングした。室温に冷却した後，アセトンをその反応混合物に添加し，ナノ粒子を遠心分離によって分離した。その後，沈殿したＳＰＩＯＮをヘキサン／アセトン（１：４〜１：１の連続する比率）の混合物で４回洗浄し，最後に，それらをトルエン中に分散し，暗所で４℃で貯蔵した。
収率：７８%
ナノ粒子のサイズ：５．２±０．８nm（電子顕微鏡写真による）
【００２４】
実施例３：１０nmの平均サイズを有するＳＰＩＯＮの調製
１．８０gのオレイン酸第二鉄，０．３５mlのオレイン酸及び１３．３５mlの１−オクタデケンを，５０ml容量の三口フラスコへ加えた。その混合物を真空下でゆっくり１００℃まで加熱し，揮発成分を取り出すために３０分間維持した。その後，その混合物を穏やかなアルゴン流下で沸点（〜３１７℃）まで加熱し，６０分間この温度で維持した。室温に冷却した後，ＳＰＩＯＮを実施例２と同じ方法で分離した。
収率：７４%
ナノ粒子のサイズ：９．８±０．５nm（電子顕微鏡からの写真による）
【００２５】
実施例４：平均サイズ２０nmのＳＰＩＯＮの調製
１．８０gのオレイン酸第二鉄，０．３５mlのオレイン酸及び５．３４mlの１−オクタデケン，及び６gのｎ−ドコサンを，５０ml容量の三口フラスコへ加えた。その混合物を真空下でゆっくり１００℃まで加熱し，揮発成分を取り出すために３０分間維持した。その後，その混合物を穏やかなアルゴン流の下で３１５℃まで加熱し，６０分間この温度で維持した。室温に冷却した後，ＳＰＩＯＮを実施例２と同じ方法で分離した。
収率：５６%
ナノ粒子のサイズ：２１．１±３．１nm（電子顕微鏡写真による）
【００２６】
実施例５：ＺｎＯナノ粒子の調製
酢酸亜鉛二水和物（１１８５．３０mg；５．４mmol）を，室温で，容量２５０mlの三口フラスコへ導入し，メタノール（９０ml）に溶解した。その間にメタノール（２２．３９ml）中の水酸化テトラメチルアンモニウム（１６２２．９１mg；８．９６mmol）の溶液を２口フラスコ中で調製した。上記溶液の両方を，アルゴンでバブリングしながら超音波洗浄浴（水浴温度５０℃，出力１２０W）中で１５分間脱気した。酢酸亜鉛のメタノール溶液を，油浴（浴温６０℃）中，還流下で加熱した。オレイン酸（３１０μｌ；０．９９mmol）を添加した後，この混合物を沸点にした（浴温８５℃）。前記メタノール中の水酸化テトラメチルアンモニウムの溶液を還流下で加熱し（浴温７５℃），酢酸亜鉛とオレイン酸を入れた三口フラスコへ素早く添加した。この反応混合物を絶えず撹拌しながら（６００rpm）還流し，２分間アルゴンでバブリングした（浴温８５℃）。その後，その混合物をメタノール（９０ml）によって希釈し，氷浴中で１５分間冷却した。この冷却した混合物を１５分間遠心分離機にかけた（４０００×g，４℃）。この粒子をエタノール（３×２５ml）で洗浄し，各洗浄工程の後には遠心分離（４０００×g，２５℃）を１０分間行った。その粒子をクロロホルム（４５ml）中に分散し，４℃で暗所で貯蔵した。
螢光の量子収率：３４%（平均法，標準＝ノルハルマンによって決定した）
ナノ粒子のサイズ：３．４±０．３nm（電子顕微鏡写真による）
【００２７】
実施例６：アップコンバージョンナノ粒子の調製
１．６０mmolのイットリウム（III）酢酸塩，０．３６mmolのイッテルビウム（III）酢酸塩及び０．０４mmolのエルビウム（III）酢酸塩に対応するモル量を，１００ml容量の三口フラスコへ導入し，１−オクタデケン（３４ml）及びオレイン酸（１２．０ml）を添加した。その混合物を激しく撹拌しながら（６００rpm）脱気し，８０℃まで油浴でゆっくり加熱した。この温度で，該混合物を完全な清澄化まで真空下で攪拌し，そしてその時点からさらに９０分間真空下で撹拌した。この混合物の入ったフラスコにアルゴンを充填し，アルゴン雰囲気下，室温まで冷却した後，メタノール（２０ml）中のＮａＯＨ（２００mg）及びＮＨ４Ｆ（２９６．３mg）の溶液を添加したところ，混合物には直ちに曇りが生じた。その混合物を，室温で一晩撹拌し，その後メタノールをゆっくり６５℃（油浴）で蒸発させた。その後，混合物の入ったフラスコをＰＩＤコントローラーによってコントロールされたマントルヒーターに移した。その混合物を徐々に真空とし，真空下で１１２℃にゆっくり加熱し，これをその温度で３０分間脱気した。その後，この混合物の入ったフラスコに，アルゴンを充填し，空気還流下（under air reflux）で，穏やかなアルゴン流中で３０５℃まで２℃／分の速度で加熱した。この混合物を３０５℃で１１０分間放置し，加熱をやめ，室温に自然冷却した。
アップコンバージョンナノ粒子をエタノール（反応混合物の体積の二倍の体積）によって反応混合物から沈殿させ，次に，遠心分離（ＲＣＦ  ３０００×g；１０分）によって分離した。該ナノ粒子（沈殿）をヘキサン５mlに分散し，エタノール（１０ml）によって沈殿させ，遠心分離（ＲＣＦ  ３０００×g；７分）によって分離した。該ナノ粒子をヘキサン／エタノール系で３回及びヘキサン／アセトン系で３回という方法で精製した。最後に，該ナノ粒子をクロロホルム（１０ml）に分散し，室温で貯蔵した。
ナノ粒子組成（ＩＣＰ−ＯＥＳ）：ＮａＹＦ４：Ｙｂ／Ｅｒ（８0mol.%Ｙ，１８mol.%Ｙｂ，2mol.%Ｅｒ）
有機成分フラクション（ＴＧＡ）：７%
ナノ粒子のサイズ（電子顕微鏡）：３４±２nm
【００２８】
実施例７：ＳＰＩＯＮを有するヒアルロン酸のカプロニル（capronyl）誘導体（ＨＡＣ６）の組成物の調製
実施例１によって調製したヒアルロナンのアシル化誘導体（ＨＡＣ６，ＤＳ＝６０%，Ｍｗ＝３８kDa）１５０mgを，マグネチックスターラーで常に撹拌しながら１５mlの脱イオン水中に２時間で溶解させた。実施例２により調製したＳＰＩＯＮ（オレイン酸によって安定化，ナノ粒子のサイズ：５nm）を，トルエン溶媒からクロロホルム溶媒に移した。
アシル化ヒアルロナンの溶液を，ロゼットソニケーション容器（ＲＺ１，容量：２５ml）へ移し，氷浴に浸漬した。まず，その溶液を６０秒間ソニケーションした（ソニケーションパラメーター：２００W，振幅６５%，サイクル０．５秒及びソノトロードＳ２）。さらに，３mlのＣＨＣｌ３中に分散した５mgのＳＰＩＯＮを，徐々に該溶液に添加した（ソニケーションパラメーター：２００W，振幅８５%，サイクル０．８秒及びソノトロードＳ２）。均質化した懸濁液をさらに１５分間ソニケーションした（ソニケーションパラメーター：振幅６５%，サイクル０．５秒及びソノトロードＳ２）。遊離のナノ粒子を遠心分離を繰り返すこと（３×４５００RPM，１０分間）によって分離し，得られたナノ粒子が充填されたヒアルロナンのナノミセルを含む上澄みを取り出し，１．０μmガラス濾過器によってろ過し，凍結乾燥した。
充填されたＦｅの量（ＩＣＰ測定）：１．１重量%
【００２９】
実施例８：ＳＰＩＯＮを有するヒアルロン酸のカプリリル誘導体（ＨＡＣ８）の組成物の調製
実施例１によって調製したヒアルロナンのアシル化誘導体（ＨＡＣ８，ＤＳ＝２２%，Ｍｗ＝２０kDa）１５０mgを，マグネチックスターラーで常に撹拌しながら１５mlの脱イオン水中に２時間で溶解させた。実施例２により調製したＳＰＩＯＮ（オレイン酸によって安定化，ナノ粒子のサイズ：５nm）を，トルエン溶媒からクロロホルム溶媒に移した。
アシル化ヒアルロナンの溶液を，ロゼットソニケーション容器（ＲＺ１，容量：２５ml）へ移し，氷浴に浸漬した。まず，その溶液を６０秒間ソニケーションした（ソニケーションパラメーター：２００W，振幅６５%，サイクル０．５秒及びソノトロードＳ２）。さらに，３mlのＣＨＣｌ３中に分散した５mgのＳＰＩＯＮを，徐々に該溶液に添加した（ソニケーションパラメーター：２００W，振幅８５%，サイクル０．８秒及びソノトロードＳ２）。均質化した懸濁液をさらに１５分間ソニケーションした（ソニケーションパラメーター：振幅６５%，サイクル０．５秒及びソノトロードＳ２）。遊離のナノ粒子を遠心分離を繰り返すこと（３×４５００RPM，１０分間）によって分離し，得られたナノ粒子が充填されたヒアルロナンのナノミセルを含む上澄みを取り出し，１．０μmガラス濾過器によってろ過し，凍結乾燥した。
充填されたＦｅの量（ＩＣＰ測定）：１．１重量%
【００３０】
実施例９：ＳＰＩＯＮを有するヒアルロン酸のカプリニル（caprinyl）誘導体（ＨＡＣ１０）の組成物の調製
実施例１によって調製したヒアルロナンのアシル化誘導体（ＨＡＣ１０，ＤＳ＝１５%，Ｍｗ＝１５kDa）１５０mgを，マグネチックスターラー上で常時撹拌しながら１５mlの脱イオン水に２時間で溶解した。実施例２で調製したＳＰＩＯＮ（オレイン酸によって安定化，ナノ粒子のサイズ：５nm）を，トルエン溶媒からクロロホルム溶媒に移した。
アシル化ヒアルロナンの溶液を，ロゼットソニケーション容器（ＲＺ１，容量：２５ml）へ移し，氷浴に浸漬した。まず，その溶液を６０秒間ソニケーションした（ソニケーションパラメーター：２００W，振幅６５%，サイクル０．５秒及びソノトロードＳ２）。さらに，３mlのＣＨＣｌ３中に分散した５mgのＳＰＩＯＮを，徐々に前述の溶液に添加した（ソニケーションパラメーター：２００W，振幅８５%，サイクル０．８秒及びソノトロードＳ２）。均質化した懸濁液をさらに１５分間ソニケーションした（ソニケーションパラメーター：振幅６５%，サイクル０．５秒及びソノトロードＳ２）。遊離のナノ粒子を遠心分離を繰り返すこと（３×４５００RPM，１０分間）によって分離し，得られたナノ粒子が充填されたヒアルロナンのナノミセルを含む上澄みを取り出し，１．０μmガラス濾過器によってろ過し，凍結乾燥した。
充填されたＦｅの量（ＩＣＰ測定）：１．２重量%
【００３１】
実施例１０：ＳＰＩＯＮを有するヒアルロン酸のパルミトイル誘導体（ＨＡＣ１６）の組成物の調製
実施例１によって調製したヒアルロナンのアシル化誘導体（ＨＡＣ１６，ＤＳ＝９%，Ｍｗ＝１５kDa）１５０mgを，マグネチックスターラーで常に撹拌しながら１５mlの脱イオン水中に２時間で溶解させた。実施例２により調製したＳＰＩＯＮ（オレイン酸によって安定化，ナノ粒子のサイズ：５nm）を，トルエン溶媒からクロロホルム溶媒に移した。
アシル化ヒアルロナンの溶液を，ロゼットソニケーション容器（ＲＺ１，容量：２５ml）へ移し，氷浴に浸漬した。まず，その溶液を６０秒間ソニケーションした（ソニケーションパラメーター：２００W，振幅６５%，サイクル０．５秒及びソノトロードＳ２）。さらに，３mlのＣＨＣｌ３中に分散した５mgのＳＰＩＯＮを，徐々に該溶液に添加した（ソニケーションパラメーター：２００W，振幅８５%，サイクル０．８秒及びソノトロードＳ２）。均質化した懸濁液をさらに１５分間ソニケーションした（ソニケーションパラメーター：振幅６５%，サイクル０．５秒及びソノトロードＳ２）。遊離のナノ粒子を遠心分離を繰り返すこと（３×４５００RPM，１０分間）によって分離し，得られたナノ粒子が充填されたヒアルロナンのナノミセルを含む上澄みを取り出し，１．０μmガラス濾過器によってろ過し，凍結乾燥した。
充填されたＦｅの量（ＩＣＰ測定）：１．２重量%
【００３２】
実施例１１：ＳＰＩＯＮを有するヒアルロン酸のステアリル誘導体（ＨＡＣ１８）の組成物の調製
実施例１によって調製したヒアルロナンのアシル化誘導体（ＨＡＣ１８：０，ＤＳ  ＝９%，Ｍｗ＝１５kDa）１５０mgを，マグネチックスターラーで常に撹拌しながら１５mlの脱イオン水中に２時間で溶解させた。実施例２により調製したＳＰＩＯＮ（オレイン酸によって安定化，ナノ粒子のサイズ：５nm）を，トルエン溶媒からクロロホルム溶媒に移した。
アシル化ヒアルロナンの溶液を，ロゼットソニケーション容器（ＲＺ１，容量：２５ml）へ移し，氷浴に浸漬した。まず，その溶液を６０秒間ソニケーションした（ソニケーションパラメーター：２００W，振幅６５%，サイクル０．５秒及びソノトロードＳ２）。さらに，３mlのＣＨＣｌ３中に分散した５mgのＳＰＩＯＮを，徐々に該溶液に添加した（ソニケーションパラメーター：２００W，振幅８５%，サイクル０．８秒及びソノトロードＳ２）。均質化した懸濁液をさらに１５分間ソニケーションした（ソニケーションパラメーター：振幅６５%，サイクル０．５秒及びソノトロードＳ２）。遊離のナノ粒子を遠心分離を繰り返すこと（３×４５００RPM，１０分間）によって分離し，得られたナノ粒子が充填されたヒアルロナンのナノミセルを含む上澄みを取り出し，１．０μmガラス濾過器によってろ過し，凍結乾燥した。
充填されたＦｅの量（ＩＣＰ測定）：１．０重量%
【００３３】
実施例１２：ＳＰＩＯＮを有するヒアルロン酸のオレイル誘導体（ＨＡＣ１８：１）の組成物の調製
実施例１によって調製したヒアルロナン（ＨＡＣ１８：１，ＤＳ＝１２%，Ｍｗ＝１５kDa）のアシル化誘導体１５０mgを，マグネチックスターラー上で常時撹拌しながら１５mlの脱イオン水に２時間で溶解した。実施例２で調製したＳＰＩＯＮ（オレイン酸によって安定化，ナノ粒子のサイズ：５nm）を，トルエン溶媒からクロロホルム溶媒に移した。
アシル化ヒアルロナンの溶液を，ロゼットソニケーション容器（ＲＺ１，容量：２５ml）へ移し，氷浴に浸漬した。まず，その溶液を６０秒間ソニケーションした（ソニケーションパラメーター：２００W，振幅６５%，０．５秒及びソノトロードＳ２）。さらに，３mlのＣＨＣｌ３中に分散した５mgのＳＰＩＯＮを，徐々に前述の溶液に添加した（ソニケーションパラメーター：２００W，振幅８５%，サイクル０．８秒及びソノトロードＳ２）。均質化した懸濁液をさらに１５分間ソニケーションした（ソニケーションパラメーター：振幅６５%，サイクル０．５秒及びソノトロードＳ２）。遊離のナノ粒子を遠心分離を繰り返すこと（３×４５００RPM，１０分間）によって分離し，得られたナノ粒子が充填されたヒアルロナンのナノミセルを含む上澄みを取り出し，１．０μmガラス濾過器によってろ過し，凍結乾燥した。
充填されたＦｅの量（ＩＣＰ測定）：１．０重量%
高分子ミセルに包まれたナノ粒子の形態を図１に示す。
【００３４】
実施例１３：ＳＰＩＯＮを有するヒアルロン酸（ＨＡＣ１８：１）のオレイル誘導体の組成物の調製
実施例１によって調製したヒアルロナンのアシル化誘導体（ＨＡＣ１８：１，ＤＳ＝１２%，Ｍｗ＝１５kDa）１２０mgを，マグネチックスターラーで常に撹拌しながら１２mlの脱イオン水中に２時間で溶解させた。実施例２により調製したＳＰＩＯＮ（オレイン酸によって安定化，ナノ粒子のサイズ：５nm）を，トルエン溶媒からクロロホルム溶媒に移した。
アシル化ヒアルロナンの溶液を，ロゼットソニケーション容器（ＲＺ１，容量：２５ml）へ移し，氷浴に浸漬した。まず，その溶液を６０秒間ソニケーションした（ソニケーションパラメーター：２００W，振幅６５%，サイクル０．５秒及びソノトロードＳ２）。さらに，４mlのＣＨＣｌ３中に分散した７．２５mgのＳＰＩＯＮを，徐々に該溶液に添加した（ソニケーションパラメーター：２００W，振幅８５%，サイクル０．８秒及びソノトロードＳ２）。均質化した懸濁液をさらに１５分間ソニケーションした（ソニケーションパラメーター：振幅６５%，サイクル０．５秒及びソノトロードＳ２）。遊離のナノ粒子を遠心分離を繰り返すこと（３×４５００RPM，１０分間）によって分離し，得られたナノ粒子が充填されたヒアルロナンのナノミセルを含む上澄みを取り出し，１．０μmガラス濾過器によってろ過し，凍結乾燥した。
充填されたＦｅの量（ＩＣＰ測定）：１．８重量%
【００３５】
実施例１４：ＳＰＩＯＮを有するヒアルロン酸のリノレイル（linoleyl）誘導体（ＨＡＣ１８：２）の組成物の調製
実施例１によって調製したヒアルロナンのアシル化誘導体（ＨＡＣ１８：２，ＤＳ＝１２%，Ｍｗ＝１５kDa）１５０mgを，マグネチックスターラーで常に撹拌しながら１５mlの脱イオン水中に４時間で溶解させた。実施例２により調製したＳＰＩＯＮ（オレイン酸によって安定化，ナノ粒子のサイズ：５nm）を，トルエン溶媒からクロロホルム溶媒に移した。
アシル化ヒアルロナンの溶液を，ロゼットソニケーション容器（ＲＺ１，容量：２５ml）へ移し，氷浴に浸漬した。まず，その溶液を６０秒間ソニケーションした（ソニケーションパラメーター：２００W，振幅６５%，サイクル０．５秒及びソノトロードＳ２）。さらに，３mlのＣＨＣｌ３中に分散した５mgのＳＰＩＯＮを，徐々に該溶液に添加した（ソニケーションパラメーター：２００W，振幅８５%，サイクル０．８秒及びソノトロードＳ２）。均質化した懸濁液をさらに１５分間ソニケーションした（ソニケーションパラメーター：振幅６５%，サイクル０．５秒及びソノトロードＳ２）。遊離のナノ粒子を遠心分離を繰り返すこと（３×４５００RPM，１０分間）によって分離し，得られたナノ粒子が充填されたヒアルロナンのナノミセルを含む上澄みを取り出し，１．０μmガラス濾過器によってろ過し，凍結乾燥した。
充填されたＦｅの量（ＩＣＰ測定）：０．９８重量%
【００３６】
実施例１５：ＳＰＩＯＮを有するヒアルロン酸（ＨＡＣ１８：３）のリノレニル（linolenyl）誘導体の組成物の調製
実施例１によって調製したヒアルロナンのアシル化誘導体（ＨＡＣ１８：３，ＤＳ＝３%，Ｍｗ＝１５kDa）１５０mgを，マグネチックスターラーで常に撹拌しながら１５mlの脱イオン水中に４時間で溶解させた。実施例２により調製したＳＰＩＯＮ（オレイン酸によって安定化，ナノ粒子のサイズ：５nm）を，トルエン溶媒からクロロホルム溶媒に移した。
アシル化ヒアルロナンの溶液を，ロゼットソニケーション容器（ＲＺ１，容量：２５ml）へ移し，氷浴に浸漬した。まず，その溶液を６０秒間ソニケーションした（ソニケーションパラメーター：２００W，振幅６５%，サイクル０．５秒及びソノトロードＳ２）。さらに，３mlのＣＨＣｌ３中に分散した５mgのＳＰＩＯＮを，徐々に該溶液に添加した（ソニケーションパラメーター：２００W，振幅８５%，サイクル０．８秒及びソノトロードＳ２）。均質化した懸濁液をさらに１５分間ソニケーションした（ソニケーションパラメーター：振幅６５%，サイクル０．５秒及びソノトロードＳ２）。遊離のナノ粒子を遠心分離を繰り返すこと（３×４５００RPM，１０分間）によって分離し，得られたナノ粒子が充填されたヒアルロナンのナノミセルを含む上澄みを取り出し，１．０μmガラス濾過器によってろ過し，凍結乾燥した。
充填されたＦｅの量（ＩＣＰ測定）：１．０重量%
【００３７】
実施例１６：ＳＰＩＯＮを有するヒアルロン酸のオレイル誘導体（ＨＡＣ１８：１）の組成物の調製
実施例１によって調製したヒアルロナンのアシル化誘導体（ＨＡＣ１８：１，ＤＳ＝１２%，Ｍｗ＝１５kDa）１５０mgを，マグネチックスターラーで常に撹拌しながら１５mlの脱イオン水中に２時間で溶解させた。実施例３により調製したＳＰＩＯＮ（オレイン酸によって安定化，ナノ粒子のサイズ：１０nm）を，トルエン溶媒からクロロホルム溶媒に移した。
アシル化ヒアルロナンの溶液を，ロゼットソニケーション容器（ＲＺ１，容量：２５ml）へ移し，氷浴に浸漬した。まず，その溶液を６０秒間ソニケーションした（ソニケーションパラメーター：２００W，振幅６５%，サイクル０．５秒及びソノトロードＳ２）。さらに，３mlのＣＨＣｌ３中に分散した５mgのＳＰＩＯＮを，徐々に該溶液に添加した（ソニケーションパラメーター：２００W，振幅８５%，サイクル０．８秒及びソノトロードＳ２）。均質化した懸濁液をさらに１５分間ソニケーションした（ソニケーションパラメーター：振幅６５%，サイクル０．５秒及びソノトロードＳ２）。遊離のナノ粒子を遠心分離を繰り返すこと（３×４５００RPM，１０分間）によって分離し，得られたナノ粒子が充填されたヒアルロナンのナノミセルを含む上澄みを取り出し，１．０μmガラス濾過器によってろ過し，凍結乾燥した。
充填されたＦｅの量（ＩＣＰ測定）：０．４重量%
【００３８】
実施例１７：ＳＰＩＯＮを有するヒアルロン酸のオレイル誘導体（ＨＡＣ１８：１）の組成物の調製
実施例１によって調製したヒアルロナンのアシル化誘導体（ＨＡＣ１８：１，ＤＳ＝１２%，Ｍｗ＝１５kDa）１５０mgを，マグネチックスターラーで常に撹拌しながら１５mlの脱イオン水中に２時間で溶解させた。実施例４により調製したＳＰＩＯＮ（オレイン酸によって安定化，ナノ粒子のサイズ：２０nm）を，トルエン溶媒からクロロホルム溶媒に移した。
アシル化ヒアルロナンの溶液を，ロゼットソニケーション容器（ＲＺ１，容量：２５ml）へ移し，氷浴に浸漬した。まず，その溶液を６０秒間ソニケーションした（ソニケーションパラメーター：２００W，振幅６５%，サイクル０．５秒及びソノトロードＳ２）。さらに，３mlのＣＨＣｌ３中に分散した５mgのＳＰＩＯＮを，徐々に該溶液に添加した（ソニケーションパラメーター：２００W，振幅８５%，サイクル０．８秒及びソノトロードＳ２）。均質化した懸濁液をさらに１５分間ソニケーションした（ソニケーションパラメーター：振幅６５%，サイクル０．５秒及びソノトロードＳ２）。遊離のナノ粒子を遠心分離を繰り返すこと（３×４５００RPM，１０分間）によって分離し，得られたナノ粒子が充填されたヒアルロナンのナノミセルを含む上澄みを取り出し，１．０μmガラス濾過器によってろ過し，凍結乾燥した。
充填されたＦｅの量（ＩＣＰ測定）：１．７重量%
【００３９】
実施例１８：ＳＰＩＯＮ及びパクリタキセルを有するヒアルロン酸のオレイル誘導体（ＨＡＣ１８：１）の組成物の調製
実施例１によって調製したヒアルロナンのアシル化誘導体（ＨＡＣ１８：１，ＤＳ＝１２%，Ｍｗ＝１５kDa）１５０mgを，マグネチックスターラーで常に撹拌しながら１５mlの脱イオン水中に２時間で溶解させた。実施例２により調製したＳＰＩＯＮ（オレイン酸によって安定化，ナノ粒子のサイズ：５nm）５mgを，トルエン溶媒からクロロホルム溶媒に移した。このように調製されたナノ粒子をクロロホルム３ml中のパクリタキセル６mgと混合した。
アシル化ヒアルロナンの溶液を，ロゼットソニケーション容器（ＲＺ１，容量：２５ml）へ移し，氷浴に浸漬した。まず，その溶液を６０秒間ソニケーションした（ソニケーションパラメーター：２００W，振幅６５%，サイクル０．５秒及びソノトロードＳ２）。さらに，ＣＨＣｌ３中に分散した５mgのＳＰＩＯＮ及び６mgのパクリタキセルを，徐々に該溶液に添加した（ソニケーションパラメーター：２００W，振幅８５%，サイクル０．８秒及びソノトロードＳ２）。均質化した懸濁液をさらに１５分間ソニケーションした（ソニケーションパラメーター：振幅６５%，サイクル０．５秒及びソノトロードＳ２）。遊離のナノ粒子及びパクリタキセルを遠心分離を繰り返すこと（３×４５００RPM，１０分間）によって分離し，得られたナノ粒子及びパクリタキセルが充填されたヒアルロナンのナノミセルを含む上澄みを取り出し，１．０μmガラス濾過器によってろ過し，凍結乾燥した。
充填されたＦｅの量（ＩＣＰ測定）：１．５重量%
充填されたＰＴＸの量（ＨＰＬＣ測定）：０．３重量%
【００４０】
実施例１９：ＺｎＯナノ粒子を有するヒアルロン酸のオレイル誘導体（ＨＡＣ１８：１）の組成物の調製
実施例１によって調製したヒアルロナンのアシル化誘導体（ＨＡＣ１８：１，ＤＳ＝１２%，Ｍｗ＝１５kDa）１５０mgを，マグネチックスターラー上で常時撹拌しながら１５mlの脱イオン水に２時間で溶解した。
アシル化ヒアルロナンの溶液を，ロゼットソニケーション容器（ＲＺ１，容量：２５ml）へ移し，氷浴に浸漬した。まず，その溶液を６０秒間ソニケーションした（ソニケーションパラメーター：２００W，振幅６５%，サイクル０．５秒及びソノトロードＳ２）。さらに，３mlのＣＨＣｌ３中に分散した５mgの酸化亜鉛（実施例５より）を，徐々に前述の溶液に添加した（ソニケーションパラメーター：２００W，振幅８５%，サイクル０．８秒及びソノトロードＳ２）。均質化した懸濁液をさらに１５分間ソニケーションした（ソニケーションパラメーター：振幅６５%，サイクル０．５秒及びソノトロードＳ２）。遊離のナノ粒子を遠心分離を繰り返すこと（３×４５００RPM，１０分間）によって分離し，得られたナノ粒子が充填されたヒアルロナンのナノミセルを含む上澄みを取り出し，１．０μmガラス濾過器によってろ過し，凍結乾燥した。
充填されたＺｎ（ＩＣＰ測定）の量：１．６重量%
【００４１】
実施例２０：アップコンバージョンナノ粒子を有するヒアルロン酸のオレイル誘導体（ＨＡＣ１８：１）の組成物の調製
実施例１によって調製したヒアルロナンのアシル化誘導体（ＨＡＣ１８：１，ＤＳ＝１２%，Ｍｗ＝１５kDa）１５０mgを，マグネチックスターラーで常に撹拌しながら１５mlの脱イオン水中に２時間で溶解させた。
アシル化ヒアルロナンの溶液を，ロゼットソニケーション容器（ＲＺ１，容量：２５ml）へ移し，氷浴に浸漬した。まず，その溶液を６０秒間ソニケーションした（ソニケーションパラメーター：２００W，振幅６５%，サイクル０．５秒及びソノトロードＳ２）。さらに，３mlのＣＨＣｌ３中に分散した５mgのアップコンバージョンナノ粒子（実施例６より）を，徐々に該溶液に添加した（ソニケーションパラメーター：２００W，振幅８５%，サイクル０．８秒及びソノトロードＳ２）。均質化した懸濁液をさらに１５分間ソニケーションした（ソニケーションパラメーター：振幅６５%，サイクル０．５秒及びソノトロードＳ２）。遊離のナノ粒子を遠心分離を繰り返すこと（３×４５００RPM，１０分間）によって分離し，得られたナノ粒子が充填されたヒアルロナンのナノミセルを含む上澄みを取り出し，１．０μmガラス濾過器によってろ過し，凍結乾燥した。
充填されたＥｒ；Ｙ；Ｙｂの量（ＩＣＰ測定）：０．０２；０．５０；０．１９重量%
【００４２】
実施例２１：ＳＰＩＯＮを有するアシル化ヒアルロナンの組成物のインビトロの細胞毒性
９６ウェルパネルに初代培養細胞及び非腫瘍及び腫瘍細胞株（表１）を播種し，３７℃／５%ＣＯ２で２４時間培養した。その後，細胞を，濃度１０，１００，２００及び５００μｇ／ml（培地中の高分子ミセルの濃度）の，実施例７〜１２，１４及び１５のＳＰＩＯＮを有するアシル化ヒアルロナンの組成物の溶液で処理した。同時に，アシル化ヒアルロナン単独及びＳＰＩＯＮ単独の生存率を測定した（各濃度で）。細胞の生存率はＭＴＴ法によって時間０，２４，４８及び７２時間でモニターし，最終的な値は各時点での細胞の生存率の抑制又は活性化を示す。ＳＰＩＯＮを有するアシル化ＨＡ誘導体の種々の組成物で処理した細胞の細胞生存率の抑制（図２Ａ〜図２Ｃ），及び様々な腫瘍細胞株に対する組成物ＨＡＣ１８：１＋ＳＰＩＯＮ（実施例１２からの）の影響（図３）をモニターした。図（４Ａ〜４Ｃ）は，５，１０及び２０nmのＳＰＩＯＮを有する組成物（実施例１２，１６，１７による）の細胞毒性作用の比較を示す。細胞株は表１に記載する。
【００４３】
【表１】
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【００４４】
図２Ａ〜図２Ｃの結果は，コントロールの細胞株（ＮＨＤＦと３Ｔ３）とは異なり，腫瘍細胞株ＨＴ２９の場合には，細胞増殖の著しい抑制があることを示す。最も高い抑制はＣ１８及びＣ１８：１アシル化誘導体をベースとする組成物で記録された。ＳＰＩＯＮを有するＣ１８：１誘導体をベースとする組成物は，ＮＨＤＦと３Ｔ３細胞の生存率をより高く維持した。アシル化ヒアルロナン単独及びＳＰＩＯＮ単独の場合は，試験細胞のいずれの生存率にも影響を及ぼさなかった（データは示されていない）。
【００４５】
ＳＰＩＯＮを有するＨＡＣ１８：１の組成物を，さらに他の腫瘍株の処理に使用した（図３）。実験データは，腫瘍系統Ａ５４９，ＨＣＴ１１６，Ｃ３Ａ，ＭＣＦ７及びＭＤＡ−ＭＢ２３１及びＣａｃｏ２の増殖の減速を示した。例外は黒色腫Ａ２０５８株のみであり，これにおいては最も高い濃度（５００μｇ／ml）の組成物で処理された場合にのみ抑制が示された。逆に，コントロールの線維芽細胞（ＮＨＤＦと３Ｔ３の両方）は該組成物により有意に刺激され，最も高い濃度（５００μｇ／ml）で処理した場合でさえいかなる細胞毒性作用も示さなかった。
【００４６】
図４Ａ〜図４Ｃは，５nmのＳＰＩＯＮを有する組成物の選択的な抗腫瘍活性を確認する。この効果は，１０及び２０nmのＳＰＩＯＮを有する組成物になるとそのような程度までは見られない。
【００４７】
実施例２２：酸化亜鉛のナノ粒子を有するアシル化ヒアルロナンの組成物のインビトロの細胞毒性
初代ヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ），大腸癌ＨＴ−２９細胞及びマウス線維芽細胞３Ｔ３株を９６ウェルパネルに播種し，３７℃／５%ＣＯ２で２４時間培養した。その後，濃度１０，１００，２００及び５００μｇ／ml（高分子ミセルの濃度）の実施例１９からの酸化亜鉛ナノ粒子を有するアシル化ヒアルロナンの組成物の溶液で該細胞を処理した。細胞の生存率がＭＴＴ法によって時間０，２４，４８及び７２時間でモニターされ，結果としての値は各時点における細胞の生存率の抑制又は活性化を示す（図５Ａ〜図５Ｃ）。
図５Ａ〜図５Ｃの結果は，コントロール株（ＮＨＤＦと３Ｔ３）とは異なり，インキュベーション時間の増加と共に，高分子ミセルのより高い濃度で癌細胞増殖の抑制が生じることを示す。しかしながら，５００μｇ／mlの高分子ミセル濃度の場合には３Ｔ３細胞でも増殖の抑制が観察された。より低い濃度の組成物，及びコントロールのＮＨＤＦ細胞株では，抑制は観察されていない。
【００４８】
実施例２３：アップコンバージョンナノ粒子を有するアシル化ヒアルロナンの組成物のインビトロ細胞毒性
初代ヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ），腸の腫瘍ＨＴ−２９細胞及びマウス線維芽細胞３Ｔ３株を９６ウェルパネルに播種し，３７℃／５%ＣＯ２で２４時間培養した。その後，濃度１０，１００，２００及び５００μｇ／ml（高分子ミセルの濃度）の実施例２０からのアップコンバージョンナノ粒子を有する高分子ミセルの溶液で該細胞を処理した。細胞の生存率がＭＴＴ法によって時間０，２４，４８及び７２時間でモニターされ，結果としての値は各時点における細胞の生存率の抑制又は活性化を示す（図６Ａ〜図６Ｃ）。
図６Ａ〜図６Ｃの結果は，生存率が著しく増加するコントロールのＮＨＤＦ系とは異なり，インキュベーション時間の増加と共に，癌細胞増殖の抑制が生じることを示す。しかしながら，非腫瘍細胞３Ｔ３株にも僅かな抑制が見られる。
【００４９】
実施例２４：ＳＰＩＯＮを有するアシル化ヒアルロナンの組成物のインビトロの選択的な細胞毒性
ＤｉＯ（緑）で標識した初代ヒト線維芽細胞及びＤｉＩ（赤）で標識した腫瘍ＨＴ−２９細胞を３：１の比率で５０，０００細胞／ウェルの総濃度で２４ウェルパネルのＲＰＭＩ  １６４０（ロズウェルパークメモリアルインスティチュート）培地１ml中に播種した。細胞単層のｍｉｎ８０%コンフルエンスの達成後に，該細胞を実施例１２のＳＰＩＯＮを有する組成物の２００μｇ／ml溶液で処理した。７２時間のインキュベーションの後，細胞の写真を，蛍光顕微鏡Nikon Ti-Eclipseで撮影した（図７）。
コントロールの細胞と腫瘍細胞で活性が異なることの可能なメカニズムを説明するために，ヒアルロナンに対するＣＤ４４受容体の発現を，ＮＨＤＦ，ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞についてフローサイトメトリーによって分析した。８０%コンフルエンスを達成した後に，細胞をＰＢＳで洗浄し，抗ＣＤ４４−ＦＩＴＣ抗体と共に室温で１５分間インキュベートし，インキュベーションの後，それらを再びＰＢＳで二回洗浄し，フローサイトメーターMACSQuant Analyzer（Miltenyi Biotec）で分析した。結果を蛍光強度（ＲＦＵ）として示す（図８）。
さらに，ＮＨＤＦ及びＨＴ−２９細胞について，実施例１２のＳＰＩＯＮを有するアシル化ヒアルロナンの組成物で処理した後の酸化ストレスを測定した。細胞を６ウェルパネル上で培養し，８０%コンフルエンスを達成した後にそれらをＳＰＩＯＮを有する組成物の２００μｇ／ml溶液で２４時間処理した。コントロールの細胞については，培地だけを試験組成物を含まない新しいものに交換した。インキュベーションの後，細胞を洗浄し，ＤＣＦ−ＤＡ（細胞内のＲＯＳによって酸化され蛍光性のＤＣＦとなる非蛍光物質，最終濃度：１ｕＭ）により暗所で３７℃で２０分間処理した。続いてＰＢＳで洗浄した後，細胞をフローサイトメーターMACSQuant Analyzer（Miltenyi Biotec）で分析した。結果を細胞内のＤＣＦの相対的な蛍光強度（未処理のコントロールに対する%）として示す（図９）。
図７の結果により，腫瘍ＨＴ−２９株の選択的増殖抑制が確認され，一方コントロールの線維芽細胞ＮＨＤＦは悪影響を受けず，それらはコンフルエンスに達する。この効果は，ＲＯＳ形成の異なる誘導によって引き起こされるのではなく，誘導は両タイプの細胞の中で増加するが同じレベルまで増加される（図９）。このことの説明はＮＨＤＦ，及びＨＴ−２９細胞におけるＲＯＳ生産のそのような増加に対する反応の程度が異なるということであり得る。
コントロールの細胞及び腫瘍細胞に関する活性の違いと，ヒアルロナンに対する主な表面受容体ＣＤ４４の発現との相関関係はない。図８から，コントロールＮＨＤＦ線維芽細胞においては組成物によるＣＤ４４の高い発現と生存率の増加が確認され，腫瘍ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１株では低い発現と生存率の著しい抑制が見られる（図３）。
細胞染色（プルシアンブルーによるＦｅの存在の検出）の後，実施例１２のＳＰＩＯＮを有するアシル化ヒアルロナンの組成物と共にインキュベートすると，異なるＦｅイオン分布が観察される。即ち，腫瘍細胞では溶解したＦｅが検出されたが，コントロール細胞では鉄凝集物が検出された（図１０）。この現象は，腫瘍細胞における組成物の選択的活性の原因であり得る。
【００５０】
実施例２５：静脈内投与用組成物の調製
無菌の０．９%のＮａＣｌ６５０μｌを，無菌様式で調製した実施例１２のＳＰＩＯＮを有するアシル化ヒアルロナン２０〜３０mgに添加し，該溶液を，凍結乾燥体が全て溶解するまで時々激しく撹拌する。該溶液は，問題なくインビボで注射可能である。
このように調製した溶液は粒子の流体力学的サイズに関する限り少なくとも２日間安定である。
【００５１】
実施例２６：静脈内投与用組成物の調製
無菌の５%デキストロース６５０μlを，無菌様式で調製した実施例１２からのＳＰＩＯＮを有するアシル化ヒアルロナン２０〜３０mgに添加し，該溶液を，凍結乾燥体が全て溶解するまで時々激しく攪拌する。該溶液は，問題なくインビボに注射可能である。
このように調製した溶液は粒子の流体力学的サイズに関する限り少なくとも２日間安定である。
【００５２】
実施例２７：ＳＰＩＯＮを有するアシル化ヒアルロナンの組成物のインビボでの検出
膠芽腫のあるLewis Brown Norwayラットをインビボ実験に使用した。この腫瘍は，脚の筋肉に３ｘ１０６膠芽腫細胞の懸濁液を注射することにより接種され，９日後にこのラットに，ＳＰＩＯＮを有するアシル化ヒアルロナン（ＨＡＣ１８：１）（０．９%ＮａＣｌ中の溶液７５０μl，Ｆｅ含有量が１．１mg／kg）の組成物を静脈内投与した。その後，ラットをBruker Biospec（４．７Ｔ）によって分析した。
組成物の静脈内投与の後の腫瘍中のＳＰＩＯＮの蓄積は図１１に確認され，腫瘍の端縁を特に暗くすることが検出された。ＳＰＩＯＮの視認可能な蓄積は肝臓でも検出された（図１２）。従って，該組成物は造影剤として肝臓に使用することができる。
Ｆｅの存在をプルシアンブルー着色（図中の青い染色）によって検知した場合，動物を屠殺した後に腫瘍上（図１３）及び肝臓（図１４）の組織切片でＳＰＩＯＮの蓄積をさらに確認した。青い着色はコントロールの試料のいずれにも検知されなかった。
【００５３】
実施例２８：ＳＰＩＯＮを有するアシル化ヒアルロナンの組成物のオートクレーブによる滅菌
実施例１２により調製した組成物（０．９%ＮａＣｌ中，濃度３０mg／ml）の滅菌を，オートクレーブ中１２１℃で１５分間行った。
該溶液は滅菌後安定であり，ＳＰＩＯＮはヒアルロナンのナノミセル中に覆われたままであり（図１５），腫瘍細胞に対する選択的な細胞毒性効果が保持された。
腫瘍ＨＴ−２９株及びコントロールの初代ＮＨＤＦ線維芽細胞について，細胞毒性を実施例２１において示した方法により測定した。図１６は，オートクレーブによる滅菌前後の実施例１２の組成物の比較を示し，腫瘍細胞への選択的な細胞毒性はオートクレーブによる滅菌の後でも保持された。
【００５４】
実施例２９：マウス腫瘍懸濁液リンパ腫ＥＬ４株におけるアポプトーシスの誘導
マウスリンパ腫ＥＬ４株（マウス発癌実験モデルにおいて腫瘍の誘導に使用される）を，ＲＰＭＩ  １６４０（Roswell Park Memorial Institut）培地中で培養した。指数増殖相で，アリコートをＲＰＭＩ培地中の５×１０５細胞／mlの濃度の細胞培養液から調製し，これらを実施例９のＳＰＩＯＮを有する組成物の１００，２００，及び５００μｇ／ml溶液で処理した。７２時間インキュベートした後，細胞を洗浄し，細胞死の蛍光マーカー（ヨウ化プロピジウム，Annexin V-FITC）で特異的に染色し，続いてこれをフローサイトメーターMACSQuant（Miltenyi Biotec）で検出した。
図１７Ａ〜図１７Ｃにおいて，実施例１２のＳＰＩＯＮを有する組成物の１００μｇ／ml溶液で処理した後に，アポプトーシスの明瞭な誘導（図１７Ｂ中の右下象限の細胞集団）及びネクローシスのわずかに増加した誘導（図１７Ｂの左／右上象限）がある。個々の濃度での組成物による処理の後の生存，アポプトーシス及びネクローシス細胞の表示を，グラフにプロットする（図１７Ｃ）。
【図１】
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【図２Ａ】
0006556765.tif 000005
【図２Ｂ】
0006556765.tif 000006
【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
0006556765.tif 000026
【図１６】
0006556765.tif 000027
【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
0006556765.tif 000029
【図１７Ｃ】
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