(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管内皮細胞増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）受容体の可溶性細胞外ドメインとヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃドメインが融合された、１０〜１００ｍｇ／ｍＬのタンパク質と；
ヒスチジン塩を含み、５．７〜６．２のｐＨ範囲を有する緩衝液と；
２．５％〜１０％のスクロース、トレハロース、マンニトールおよびグルコースからなる群から選ばれる糖と；
０％〜０．１％のポリソルベート２０およびポリソルベート８０からなる群から選ばれる界面活性剤と；
を含み、前記ＶＥＧＦ受容体の可溶性細胞外ドメインは、第１のＶＥＧＦ受容体の免疫グロブリン様ドメイン２と、第２のＶＥＧＦ受容体の免疫グロブリン様ドメイン３とを含み、前記ヒスチジン塩は、１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン−ＨＣｌまたはヒスチジン−アセテートであることを特徴とする、液状製剤。
【請求項２】
前記糖は、５％〜１０％のスクロースであることを特徴とする、請求項１に記載の液状製剤。
【請求項３】
ヒスチジン塩を含み、５．７〜６．２のｐＨ範囲を有する緩衝液と；
糖および界面活性剤からなる群から選ばれた一つまたはそれ以上の安定化剤と；を含み、
前記ヒスチジン塩は、１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン−ＨＣｌまたはヒスチジン−アセテートであり、前記糖は、２．５％〜１０％のスクロース、トレハロース、マンニトールおよびグルコースからなる群から選ばれたいずれか一つであり、前記界面活性剤は、０％〜０．１％のポリソルベート２０またはポリソルベート８０である、ＶＥＧＦ受容体の可溶性細胞外ドメインとＩｇＧのＦｃドメインが融合されたタンパク質を含む液状製剤の安定化用組成物であって、前記ＶＥＧＦ受容体の可溶性細胞外ドメインは、第１のＶＥＧＦ受容体の免疫グロブリン様ドメイン２と、第２のＶＥＧＦ受容体の免疫グロブリン様ドメイン３とを含む、組成物。
【請求項４】
前記界面活性剤は、０％〜０．０３％のポリソルベート２０またはポリソルベート８０であることを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
請求項３または４に記載のＶＥＧＦ受容体の可溶性細胞外ドメインとＩｇＧのＦｃドメインが融合されたタンパク質を含む液状製剤の安定化用組成物と；
アフリベルセプト（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）と；を含む液状製剤。
【請求項６】
硝子体内注射（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）に適合したものであることを特徴とする、請求項５に記載の液状製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃドメインを有する融合タンパク質の安定な液状製剤に関する。より具体的に、本発明は、血管内皮細胞増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）受容体の可溶性細胞外ドメインとヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃドメインが融合されたタンパク質、例えば、アフリベルセプト（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）が安定化した液状製剤、ＶＥＧＦ受容体の可溶性細胞外ドメインとＩｇＧのＦｃドメインが融合されたタンパク質の安定化用組成物およびＶＥＧＦ受容体の可溶性細胞外ドメインとＩｇＧのＦｃドメインが融合されたタンパク質を安定化させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管内皮細胞に対する選択性を有する細胞誘導二量体マイトジェンの類型が確認され、これを血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）と命名する。ＶＥＧＦは、血管新生と血管透過性を増加させる重要な因子である。
【０００３】
ＶＥＧＦは、膜貫通チロシンキナーゼ受容体（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）であるＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦＲ−３）を活性化させるものと知られている。 ＶＥＧＦ受容体のうちＶＥＧＦＲ−１とＶＥＧＦＲ−２は、ＶＥＧＦ結合のために細胞外領域に７個のＩｇ−類似配列を持ち、かつ単一膜横断領域、コンセンサス（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）チロシンキナーゼ領域を持つ。 このような特性は、ＶＥＧＦ拮抗剤（ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ  ａｇｅｎｔ）のための配列として使用され、眼科的治療剤であるアフリベルセプトは、ＶＥＧＦＲ−１の２番目の結合ドメインとＶＥＧＦＲ−２の３番目の結合ドメインがヒトＩｇＧ１のＦｃ領域と結合している構造であって、約１１５ｋＤａ（グリコシル化を含む）の可溶性デコイ受容体（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｄｅｃｏｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）である（文献［Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１３），３（７），７１１−７２２］）参照）。
【０００４】
ＶＥＧＦを介したメカニズムにおいて異常な血管新生は、眼科的疾患である滲出型加齢黄斑変性（ｗｅｔ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、糖尿病性黄斑浮腫（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｍａｃｕｌａｒ  ｅｄｅｍａ）、網膜静脈閉塞症での黄斑浮腫（ｍａｃｕｌａｒ  ｅｄｅｍａ  ｉｎ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｖｅｉｎ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）などと関連している（文献［Ｊ．Ｋｏｒｅａｎ  Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．（２０１４），５７（７），６１４−６２３］参照）。
【０００５】
このような眼科的疾患に対する治療剤としては、ペガプタニブ（Ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ）（Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標））、ラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、アフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標））があるが、アフリベルセプトは、２０１１年に滲出型加齢黄斑変性の治療剤として承認された（文献［Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２０１２），２（３）１−２２］、文献［Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１３），３（７），７１１−７２２］など参照）。前記治療剤のうちアフリベルセプトが、視力低下がかなり進行した糖尿病性黄斑浮腫患者に対して治療効果が最も優れているものと報告されたことがある（文献［ＮＥＪＭ（２０１５）、３７２（１３）１１９３−１２０３］参照）。アフリベルセプトは、転移性大腸癌（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ）などの治療剤［ザルトラップ（Ｚａｌｔｒａｐ）（登録商標）］と、網膜静脈閉塞症、糖尿病性黄斑浮腫、脈絡膜血管新生（ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、滲出型加齢黄斑変性などの治療剤［アイリーア（Ｅｙｌｅａ）（登録商標）］として市販されている。
【０００６】
抗体医薬品を含むタンパク質医薬品は、最適の条件でない条件で物理化学的に変性が起こる。特に、温度、ｐＨ、塩の濃度、空気との接触、タンパク質の濃度、緩衝液（ｂｕｆｆｅｒ）の種類などの要因は、タンパク質の酸化（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）、脱アミド化（ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）、異性化（ｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、重合化（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）などに相当な影響を及ぼす。このような変性は、タンパク質の凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）、断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）および異性体（ｉｓｏｍｅｒ）を生成させて、生理活性を減少させ得る。このような特性は、タンパク質によって異なり、特にＦｃ融合タンパク質の場合には、フォールディング（ｆｏｌｄｉｎｇ）の問題があるため、疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析において３個のピーク（ｐｅａｋ）に分離して分析される（文献［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（２０１３），２，４５２−５００］参照）。
【０００７】
なお、下記先行特許文献１（国際公開公報ＷＯ２００７／１４９３３４号）には、「１〜１００ｍｇ／ｍＬのアフリベルセプト、０．０１〜５％の有機共溶媒（例えば、ポリソルベート、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）、３０〜１５０ｍＭの等張化剤（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌなど）、５〜４０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液および１．０〜７．５％の安定化剤（例えば、スクロース、ソルビトール、グリセロール、トレハロース、マンニトールなど）を含む眼科用製剤（ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」と「５〜５０ｍｇ／ｍＬのアフリベルセプト、５〜２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、０．０１〜０．１５％の有機共溶媒、１〜１０％の安定化剤、２０〜１５０ｍＭの等張化剤を含む凍結乾燥製剤（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｂｌｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」が開示されている。下記先行特許文献１に記載された製剤は、硝子体内注射に適当なプレフィルドシリンジ（ｐｒｅｆｉｌｌｅｄ  ｓｙｒｉｎｇｅ）に適用することができる。
【０００８】
下記先行特許文献１に記載された眼科用製剤および凍結乾燥製剤の場合、アフリベルセプトの凝集、断片化および異性化などによる不純物ないしは副産物の生成を抑制する効果があると報告されたことがあるが、先行特許文献１の製剤は、苛酷条件、例えば４０℃以上の高温条件または撹拌条件などが与えられる場合、アフリベルセプトの安定化効果が顕著に減少する問題が発生する。
【０００９】
これより、本発明者らは、アフリベルセプトのようなＩｇＧＦｃドメインを有する融合タンパク質が貯蔵条件で長期間安定に維持されると共に、苛酷条件でも安定性が向上した液状製剤を開発することによって本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００７／１４９３３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、前述した問題点を解決するためになされたものであって、その目的は、血管内皮細胞増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）受容体の可溶性細胞外ドメインとヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃドメインが融合されたタンパク質が安定化された製剤を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、ＶＥＧＦ受容体の可溶性細胞外ドメインとＩｇＧのＦｃドメインが融合されたタンパク質の安定化用組成物を提供することにある。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、前記ＶＥＧＦ受容体の可溶性細胞外ドメインとＩｇＧのＦｃドメインが融合されたタンパク質の安定化用組成物と；アフリベルセプトと；を含む液状製剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、血管内皮細胞増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）受容体の可溶性細胞外ドメインとヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃドメインが融合されたタンパク質と；ヒスチジン塩を含み、５．７〜６．２のｐＨ範囲を有する緩衝液と；を含む液状製剤を提供する。
【００１５】
本発明の好適な一実施形態によると、前記ＶＥＧＦ受容体の可溶性細胞外ドメインは、第１のＶＥＧＦ受容体の免疫グロブリン様ドメイン２と、第２のＶＥＧＦ受容体の免疫グロブリン様ドメイン３とを含んでもよい。
【００１６】
本発明の好適な他の一実施形態によると、前記融合タンパク質は、１０〜４０ｍｇ／ｍＬの量で存在してもよい。
【００１７】
本発明の好適なさらに他の一実施形態によると、前記ヒスチジン塩は、ヒスチジン−ＨＣｌまたはヒスチジン−アセテートであってもよい。
【００１８】
本発明の好適な他の一実施形態によると、前記ヒスチジン塩の濃度は、１０ｍＭ〜５０ｍＭであってもよい。
【００１９】
本発明の好適なさらに他の一実施形態によると、前述した液状製剤は、糖および界面活性剤からなる群から選ばれた一つまたはそれ以上の安定化剤をさらに含んでもよい。
【００２０】
本発明の好適な他の一実施形態によると、前記糖は、２．５％〜１０％のスクロース、トレハロース、マンニトールおよびグルコースからなる群から選ばれたいずれか一つであってもよい。
【００２１】
本発明の好適なさらに他の一実施形態によると、前記糖は、５％〜１０％のスクロースであってもよい。
【００２２】
本発明の好適な他の一実施形態によると、前記界面活性剤は、０％〜０．０３％、例えば、０％または０．０１％〜０．０３％のポリソルベート２０またはポリソルベート８０であってもよい。
【００２３】
また、本発明は、ヒスチジン塩を含み、５．７〜６．２のｐＨ範囲を有する緩衝液と；糖および界面活性剤からなる群から選ばれた一つまたはそれ以上の安定化剤と；を含み、前記ヒスチジン塩は、１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン−ＨＣｌまたはヒスチジン−アセテートであり、前記糖は、２．５％〜１０％のスクロース、トレハロース、マンニトールおよびグルコースからなる群から選ばれたいずれか一つであり、前記界面活性剤は、０％〜０．０３％、例えば、０％または０．０１％〜０．０３％のポリソルベート２０またはポリソルベート８０である、ＶＥＧＦ受容体の可溶性細胞外ドメインとＩｇＧのＦｃドメインが融合されたタンパク質の安定化用組成物を提供する。
【００２４】
また、本発明は、ヒスチジン塩を含み、５．７〜６．２のｐＨ範囲を有する緩衝液を利用して血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体の可溶性細胞外ドメインとヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃドメインが融合されたタンパク質を安定化させる方法を提供する。
【００２５】
本発明の好適な一実施形態によると、前記緩衝液に糖および界面活性剤からなる群から選ばれた一つまたはそれ以上の安定化剤をさらに添加してもよい。
【００２６】
また、本発明は、ヒスチジン塩を含み、５．７〜６．２のｐＨ範囲を有する緩衝液と；糖および界面活性剤からなる群から選ばれた一つまたはそれ以上の安定化剤と；アフリベルセプトと；を含み、前記ヒスチジン塩は、１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン−ＨＣｌまたはヒスチジン−アセテートであり、前記糖は、２．５％〜１０％のスクロース、トレハロース、マンニトールおよびグルコースからなる群から選ばれたいずれか一つであり、前記界面活性剤は、０％〜０．０３％、例えば、０％または０．０１％〜０．０３％のポリソルベート２０またはポリソルベート８０である、液状製剤を提供する。
【００２７】
本発明の好適な一実施形態によると、前記液状製剤は、硝子体内注射（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）に適合し得る。
【発明の効果】
【００２８】
本発明において提供される液状製剤は、一般的な貯蔵条件だけでなく、苛酷条件、例えば、４０℃以上の高温条件または撹拌条件でヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃドメインを有する融合タンパク質（［特に、血管内皮細胞増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）受容体の可溶性細胞外ドメインとヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃドメインが融合されたタンパク質（例えば、アフリベルセプト）］の凝集、断片化および異性化などによる不純物ないしは副産物の生成が顕著に抑制され、長期保管時に安定性を向上させることができる。
【００２９】
また、本発明は、アフリベルセプトを含む抗−ＶＥＧＦ−Ｆｃ融合タンパク質の硝子体内注射に適当な安定な液状製剤を用いて生理活性の安定化を図ることができると共に、異常な血管生成による各種眼科疾患（例えば、網膜静脈閉塞症、糖尿病性黄斑浮腫、脈絡膜血管新生、滲出型加齢黄斑変性など）の治療効果を改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、アフリベルセプトを含むヒスチジン塩緩衝液のｐＨを異にして４０℃で７日間保管した試料の凝集物（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）および断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）の含量（％）の変化を測定したグラフである。
【図２】図２は、アフリベルセプトを含むヒスチジン塩緩衝液のｐＨを異にして４０℃で７日間保管した試料のＨＩ−ＨＰＬＣ（疎水性相互作用高性能液体クロマトグラフィー）分析においてピーク１、２、および３の含量（％）の変化を測定したグラフである。
【図３】図３は、アフリベルセプトを含む多様な種類の緩衝液（リン酸ナトリウム、サクシネート、ヒスチジン−ＨＣｌ、ヒスチジン−アセテートおよび酢酸ナトリウム）で４０℃で２１日間保管した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した結果である。
【図４】図４は、アフリベルセプトを含むヒスチジン塩緩衝液にいろいろな種類の糖（トレハロース、スクロース、マンニトール、およびグルコース）を含む製剤において５０℃で８日間保管した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した結果である。
【図５】図５は、アフリベルセプトを含むヒスチジン塩緩衝液にスクロース濃度を異にして４５℃で７日間保管した試料の凝集物および断片の含量（％）の変化を測定したグラフである。
【図６】図６は、アフリベルセプトを含むヒスチジン塩緩衝液にいろいろな種類の塩（塩化ナトリウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムおよび塩化カリウム）を含む製剤において４５℃で７日間保管した試料の凝集物および断片の含量（％）の変化を測定したグラフである。
【図７】図７は、アフリベルセプトを含むヒスチジン塩緩衝液にポリソルベートの有無による製剤を２５℃で２００ｒｐｍで撹拌（ｓｈａｋｉｎｇ）しながら７日間保管した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した結果である。
【図８】図８は、アフリベルセプトを含むヒスチジン塩緩衝液にポリソルベート２０をいろいろな濃度（０％、０．０１％、０．０３％、０．０５％、および０．１％）で含む製剤において４５℃で７日間保管した試料の凝集物および断片の含量（％）の変化を測定した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明をより詳細に説明する。
前述したように、既に提供されたアフリベルセプトのようなＩｇＧＦｃドメインを有する融合タンパク質が安定化した製剤は、苛酷条件で安定性が顕著に減少する問題が発生するため、一般的な貯蔵条件だけでなく、苛酷条件でも前記融合タンパク質が安定に維持され得る製剤の開発が要求されている。
【００３２】
これより、本発明では、血管内皮細胞増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）受容体の可溶性細胞外ドメインとヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃドメインが融合されたタンパク質と；ヒスチジン塩を含み、５．７〜６．２のｐＨ範囲を有する緩衝液と；を含む液状製剤を提供することによって、前述した問題の解決方法を見出した。本発明の液状製剤は、前記融合タンパク質を一般的な貯蔵条件で長期間安定に保管できると共に、苛酷条件でも不純物ないしは副産物の生成が顕著に抑制されるので、最適の貯蔵条件が提供され得ない不可避な環境でも公知の前記融合タンパク質の製剤と比較して安定性が顕著に向上した製剤を提供することが可能である。
【００３３】
本発明は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体の可溶性細胞外ドメインとヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃドメインが融合されたタンパク質と；ヒスチジン塩を含み、５．７〜６．２のｐＨ範囲を有する緩衝液と；を含む液状製剤を提供する。
前記液状製剤の有効成分である融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）において、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の可溶性細胞外ドメインは、第１のＶＥＧＦ受容体の免疫グロブリン様ドメイン２と、第２のＶＥＧＦ受容体の免疫グロブリン様ドメイン３とを含むことができ、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃドメインであってもよく、好ましくは、ＩｇＧ１のＦｃドメインであってもよい。ここで、Ｆｃ領域（Ｆｃ  ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒンジ（ｈｉｎｇｅ）−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３で構成されており、ＣＨ１が欠失された形態であってもよい。
【００３４】
本発明の液状製剤において、前記融合タンパク質は、約１０〜１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、約１０〜８０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは、約１０〜４０ｍｇ／ｍＬの量で含むことができる。
【００３５】
本発明による液状製剤において、前記「緩衝液」は、その酸−塩基コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）成分の作用によるｐＨの変化に耐える緩衝された溶液を指す。本発明の一実施形態では、ヒスチジン塩を含み、５．７〜６．２のｐＨ範囲を有する緩衝液を使用し、ここで、前記ヒスチジン塩は、ヒスチジン−ＨＣｌまたはヒスチジン−アセテートであることが好ましく、ヒスチジン塩の濃度は、１０ｍＭ〜５０ｍＭであってもよい。
【００３６】
図１および図２に示されたように、ｐＨ５．７〜６．２のヒスチジン塩緩衝液を使用した製剤の条件で対照群製剤（２）より凝集物および断片生成抑制効果が顕著に向上した。特に、ｐＨ６．０で製剤の安定性が最も優れている。
【００３７】
緩衝液のｐＨが５．７未満と低くなる場合、図１および図２に示されたように、製剤の安定性が顕著に低下した。ｐＨが６．５を超過する場合、標的タンパク質が破損または凝集して発生する不純物の増加問題が発生し得る。
【００３８】
また、図３に示されたように、多様な種類の緩衝液の条件でヒスチジン−ＨＣｌまたはヒスチジン−アセテート緩衝液を使用した場合、凝集物および不純物の生成抑制効果が最も優れていることを確認した。
【００３９】
さらに、図５の製剤（３）条件は、ｐＨ６．０、１０ｍＭのヒスチジン塩緩衝液においてアフリベルセプトの安定性を評価したものであり、前記緩衝液の条件だけでも対照群製剤（２）と類似した水準のアフリベルセプトの安定性が維持されることを確認した。
【００４０】
本発明の液状製剤は、液状製剤の有効成分である前記融合タンパク質とヒスチジン塩緩衝液の他にも、糖および界面活性剤からなる群から選ばれた一つまたはそれ以上の安定化剤をさらに含んでもよい。
【００４１】
本発明の液状製剤において、前記糖は、トレハロース（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、マンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）、ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、キシリトール（ｘｙｌｉｔｏｌ）、イノシトール（ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）およびヒドロキシプロピルシクロデキストリン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ  ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）からなる群から選択されたある一つであってもよく、好ましくは、トレハロース、スクロース、マンニトールおよびグルコースからなる群から選ばれたいずれか一つであってもよく、糖の濃度は、２．５〜１０％（ｗ／ｖ）であってもよい。
【００４２】
図４に示されたように、ヒスチジン塩緩衝液にトレハロース、スクロース、マンニトールおよびグルコースをそれぞれ含む製剤（３）〜（６）は、いずれも、対照群製剤（２）よりアフリベルセプトの安定性が向上し、特に糖がスクロースである場合、アフリベルセプトの安定性が最も優れていた。
【００４３】
また、図５に示されたように、スクロースが含まれていない製剤（３）は、対照群製剤（２）と比較して類似した程度の製剤安定性を示し、スクロースの濃度が増加するほど、対照群（２）に比べて凝集物および不純物の生成抑制効果が増加した。
【００４４】
本発明の液状製剤において、前記界面活性剤は、眼科用ドラッグデリバリー（ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）のために使用され得、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤などその種類に限定はない。界面活性剤の濃度は、約０％〜０．３％（ｗ／ｖ）であってもよく、例えば、０％または０．０１％〜０．０３％であってもよい。
【００４５】
前記アニオン性界面活性剤（ａｎｉｏｎｉｃ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）の例としては、サルフェート、スルホネート、ホスフェート、カルボキシレートなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４６】
前記カチオン界面活性剤（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）の例としては、オクテニジンジヒドロクロライド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、セチルトリメチル塩化アンモニウム（ＣＴＡＣ）、セチルピリジニウムクロライド（ＣＰＣ）、ベンザルコニウムクロライド（ＢＡＣ）、ベンゼトニウムクロライド、５−ブロモ−５−ニトロ−１、３−ジオキサン、ジメチルジオクタデシル塩化アンモニウム、セトリモニウムブロミド、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＯＤＡＢ）などが挙げられる。
【００４７】
前記ノニオン性界面活性剤（ｎｏｎ−ｉｏｎｉｃ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）の例としては、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル類、ポリオキシプロピレングリコールアルキルエーテル類、ポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテル類（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００など）、ポリオキシエチレングリコールアルキルフェノールエーテル類、グリセロールアルキルエステル類、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル類（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０など）、コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、ドデシルジメチルアミンオキシド、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体、ポリエトキシ化タローアミン（ＰＯＥＡ）などが挙げられる。
【００４８】
前記両イオン性界面活性剤 （Ｚｗｉｔｔｅｒ−ｉｏｎｉｃ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）の例としては、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンサルフェート）、コカミドプロピルヒドロキシスルタインなどが挙げられる。
【００４９】
また、界面活性剤として、ラウリル硫酸アンモニウム、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、ミレス硫酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｍｙｒｅｔｈ  Ｓｕｌｆａｔｅ）などのようなアルキル硫酸類；ジオクチルソディウムスルホサクシネート、パーフルオロオクタンスルホン酸（ＰＦＯＳ）、パーフルオロブタンスルホン酸、直鎖状アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＢ）類などのようなドクセート（ｄｏｃｕｓａｔｅ）類；ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリンなどのようなリン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）類；スフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎｅ）類などが使用できる。
【００５０】
本発明の一実施形態では、前述した液状製剤に含まれる構成成分の他に、さらなる塩成分の添加の有無による製剤の安定性を評価するために、塩を含まないか、または多様な種類の塩をそれぞれ含む製剤を製造した。その結果、図６に示されたように、さらなる塩成分をも含まない製剤において凝集物および不純物の生成抑制効果が最も優れているのが観察された。
【００５１】
本発明による液状製剤は、一般的な貯蔵条件で長期間融合タンパク質の安定性が維持され、且つ、苛酷条件でも融合タンパク質の不純物ないしは副産物の生成抑制効果に優れていて、融合タンパク質の安定性が従来の液状製剤より向上する。本発明において「苛酷条件」は、融合タンパク質に対して化学的および物理的に好ましくない環境を示し、容認できないタンパク質安定性を有するようにすることができる。前記苛酷条件は、例えば、高温または撹拌条件などがある。
【００５２】
本発明において用語「安定な」は、タンパク質が保管中にその物理的および／または化学的安定性および／または生物学的活性を本質的に維持することをいう。タンパク質安定性を測定するための多様な分析的技術が当業界において利用可能であり、安定性は、選択された温度で、選択された期間に対して測定され得る。
【００５３】
タンパク質は、色および／または透明度を目視検査で観察する際、またはＵＶ光散乱（目に見える凝集体を測定する）またはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で測定する際、凝集、沈殿および／または変性においてほとんど変化を示さないか、全く変化を示さない場合、製剤において「その物理的安定性を維持する」と言える。
【００５４】
図１〜図６および図８に示されたように、本発明の多様な条件の液状製剤は、４０〜５０℃の温度範囲で７〜２１日間対照群製剤（２）より凝集物および不純物の生成が顕著に抑制され、相対的に安定に維持された。
【００５５】
本発明の多様な条件の液状製剤を７日間２００ｒｐｍで撹拌（ｓｈａｋｉｎｇ）しながら２５℃で保管した後、それぞれの製剤をＳＥ−ＨＰＬＣおよびＨＩ−ＨＰＬＣにて分析した結果、ポリソルベート２０の有無に関係なく、凝集物および変形体の生成が抑制された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元；Ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ）（図７）およびＳＥ−ＨＰＬＣ結果においても同様に、２５℃に７日間撹拌する条件で、ポリソルベートの有無に関係なく、対照群（１）より凝集物およびタンパク質断片の生成が抑制されることが観察され、特にポリソルベートが含まれていない製剤の凝集物およびタンパク質断片の生成抑制効果が若干さらに良好であった。
【００５６】
本発明は、ヒスチジン塩を含み、５．７〜６．２ｐＨ範囲を有する緩衝液を利用して血管内皮細胞増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）受容体の可溶性細胞外ドメインとヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃドメインが融合されたタンパク質を安定化させる方法を提供する。
【００５７】
前記緩衝液および融合タンパク質に関する説明は、上記と同様であるため、重複した内容は、明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
【００５８】
本発明の融合タンパク質を安定化させる方法において、前記緩衝溶液に糖および界面活性剤からなる群から選ばれた一つまたはそれ以上の安定化剤をさらに添加することができる。
【００５９】
また、さらに添加される糖および界面活性剤に関する説明も、上記と同様であるため、その記載を省略する。
【００６０】
また、本発明は、ヒスチジン塩を含み、５．７〜６．２のｐＨ範囲を有する緩衝液と；糖および界面活性剤からなる群から選ばれた一つまたはそれ以上の安定化剤と；を含み、前記ヒスチジン塩は、１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン−ＨＣｌまたはヒスチジン−アセテートであり、前記糖は、２．５％〜１０％のスクロース、トレハロース、マンニトールおよびグルコースからなる群から選ばれたいずれか一つであり、前記界面活性剤は、０％〜０．０３％、例えば、０％または０．０１％〜０．０３％のポリソルベート２０またはポリソルベート８０である、ＶＥＧＦ受容体の可溶性細胞外ドメインとＩｇＧのＦｃドメインが融合されたタンパク質の安定化用組成物を提供する。
【００６１】
前記安定化用組成物の構成に関する説明は、上記と同様であるため、重複した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
【００６２】
また、本発明は、ＶＥＧＦ受容体の可溶性細胞外ドメインとＩｇＧのＦｃドメインが融合されたタンパク質の安定化用組成物と；アフリベルセプトと；を含む液状製剤を提供する。
【００６３】
前記液状製剤は、アフリベルセプト治療により治療され得る疾患であれば、特に限定されず、多様な疾患の予防または治療のための医薬用途に使用され得、好ましくは、網膜静脈閉塞症、糖尿病性黄斑浮腫、脈絡膜血管新生、滲出型加齢黄斑変性などの各種眼科疾患を予防または治療するのに使用され得る。
【００６４】
本発明による液状製剤は、薬剤学的に許容可能な担体（ｃａｒｒｉｅｒ）、希釈剤（ｄｉｌｕｅｎｔ）、賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）などをさらに含むことができる。
【００６５】
薬剤学的に許容可能な担体は、製剤に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルなどを含むことができるが、これに限らない。
【００６６】
本発明の液状製剤は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適当な薬剤学的に許容される担体および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳しく記載されている。
【００６７】
本発明の液状製剤は、目的に応じて多様な経路で投与され得、好ましくは、眼科疾患の治療のために硝子体内注射（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）で投与されることが良く、硝子体内注射に適当なプレフィルドシリンジ（ｐｒｅ−ｆｉｌｌｅｄ  ｓｙｒｉｎｇｅ）に適用することができる。
【００６８】
本発明の液状製剤の適当な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感度のような要因に応じて多様であり、当該分野における専門的な知識を有する医師は、所望の治療または予防に効果的な投与量を容易に決定および処方することができる。
【００６９】
本発明の範囲は、下記実施例に限定されると解すべきではなく、本明細書に使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者（「当業者」）により通常的に理解されるものと同じ意味を有する。
【実施例】
【００７０】
［実施例１］
製剤における最適のｐＨ条件の評価
本実施例１および以下の実施例２〜５では、先行技術文献である国際公開公報ＷＯ２００７／１４９３３４号に開示された液状製剤を５±３℃で保管したものを対照群（１）にし、対照群（１）に苛酷条件（４０℃以上の温度）を加えたものを対照群（２）にして、製剤安定性を本発明の多様な形態の液状製剤安定性と比較した。
【００７１】
本実施例では、抗−ＶＥＧＦ−Ｆｃ融合タンパク質であるアフリベルセプトを有効成分として含有する液状製剤の最適のｐＨを確認するために、次のように、ヒスチジン塩緩衝液をベースにしてｐＨ別に試料を製造した。
【００７２】
具体的に、アフリベルセプトの最終濃度を４０ｍｇ／ｍＬになるようにし、（１）１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ｐＨ６．２、５％のスクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０３％のポリソルベート２０を含む製剤（５±３℃保管製剤）；（２）１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、５％のスクロース、４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０３％のポリソルベート２０を含む製剤（４０℃保管製剤）、並びに１０％のトレハロース、０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０および１０ｍＭのヒスチジン−ＨＣｌ緩衝液の条件でｐＨをそれぞれ（３）５．５；（４）５．７；（５）６．０；（６）６．２；（７）６．５を含む各製剤を４０℃で７日間保管して、時間の経過に伴って生成された不純物に対してＳＥ−ＨＰＬＣ（サイズ排除高性能液体クロマトグラフィー）およびＨＩ−ＨＰＬＣ分析を行った。
【００７３】
ＳＥ−ＨＰＬＣ分析において、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ）カラム（日本国ＴＯＳＯＨ社）を使用して０．２Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ６．２）、０．２５ＭのＫＣｌおよび０．０５％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３緩衝液を０．５ｍＬ／分の速度で流し、吸光度２８０ｎｍで抗−ＶＥＧＦ−Ｆｃ融合タンパク質のピークを確認した。
【００７４】
４０℃で７日間保管した試料に対するＳＥ−ＨＰＬＣ分析において、単量体の含量を計算し、高分子量不純物である凝集物（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）と低分子量不純物である断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）を合わせて計算した。図１は、７日目のＳＥ−ＨＰＬＣ結果を示す図である。対照群（２）と比較して、本発明の製剤は、ｐＨ５．７、６．０、６．２および６．５で凝集物と断片の生成が顕著に減少して、安定していることを示す。また、いろいろなｐＨ条件のうちｐＨ６．０で製剤の安定性が最も高いと分析された。
【００７５】
ＨＩ−ＨＰＬＣ分析においてＴＳＫ  Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ（７．５×３００ｍｍ）カラムを使用し、移動相としては、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を使用し、２ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）および３０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル緩衝液を使用して０％〜９０％の濃度勾配で流して、吸光度２２０ｎｍで抗−ＶＥＧＦ−Ｆｃ融合タンパク質のピークを確認した。ＨＩ−ＨＰＬＣの分析時に、ピーク１、ピーク２およびピーク３など３個の主なピークがあるが、各ピークの変化が少ないものを安定なものと判断した。
【００７６】
４０℃で保管した試料を時間の経過に伴ってＨＩ−ＨＰＬＣ分析した結果を図２に示した。図２は、各条件においてのピーク１、ピーク２およびピーク３の変化を示し、対照群（２）と比較して、本発明のｐＨ５．７、６．０、６．２および６．５条件の製剤においてピークの変化が顕著に少ないことが確認された。また、他のいろいろなｐＨ条件に比べて、ｐＨ６．０の条件で相対的に最も安定していることが分かった。
【００７７】
［実施例２］
製剤における最適の緩衝液条件の評価
本実施例では、抗−ＶＥＧＦ−Ｆｃ融合タンパク質であるアフリベルセプトを有効成分として含有する液状製剤の最適の緩衝液条件を確認するために次のように試料を製造した。
【００７８】
具体的に、アフリベルセプトの最終濃度を４０ｍｇ／ｍＬになるようにし、（１）１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、５％のスクロース、４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０３％のポリソルベート２０を含む製剤（５±３℃保管製剤）；（２）１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、５％のスクロース、４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０３％のポリソルベート２０を含む製剤（４０℃保管製剤）；並びに（３）１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０；（４）１０ｍＭのヒスチジン−ＨＣｌ、ｐＨ６．０；（５）１０ｍＭのヒスチジン−アセテート、ｐＨ６．０；（６）１０ｍＭのサクシネート、ｐＨ６．０；および（７）１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．６の緩衝液それぞれに０．０１％のポリソルベート２０と２．５％のスクロースを含む各種製剤を４０℃で２１日間保管しつつ、時間の経過に伴って単量体、凝集体、および変形体を前記実施例１と同一にＳＥ−ＨＰＬＣ、ＨＩ−ＨＰＬＣにて分析した。
【００７９】
そして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。１ｍｇ／ｍＬで希釈された分析試料２０．０μＬに５ｘ試料緩衝液（還元（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）または非還元（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ））５．０μＬを添加した後、１００℃で５分反応した試料を分析に使用した。最終分析試料は、ウェル当たり１２．５μＬをローディングした。マーカー（Ｍ）は、ＤｏｋＤｏ−Ｍａｒｋ（登録商標）タンパク質マーカーを使用し、ウェル当たり３μＬをローディングした。１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元；Ｒｅｄｕｃｉｎｇ）、６％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元；Ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ）ゲルに電気泳動した後、クマシブルーで染色し、鮮明なバンドが現れるまで脱色した。
【００８０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元；Ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ）（図３）、ＳＥ−ＨＰＬＣおよびＨＩ−ＨＰＬＣで分析した結果、対照群（２）と比較して、本発明の１０ｍＭのヒスチジン−ＨＣｌおよび１０ｍＭのヒスチジン−アセテート製剤は、凝集物および不純物の生成を顕著に抑制するものと確認された。
【００８１】
［実施例３］
製剤における最適の糖種類条件の評価
本実施例では、抗−ＶＥＧＦ−Ｆｃ融合タンパク質であるアフリベルセプトを有効成分として含有する液状製剤の最適の糖を確認するために、次のように試料を製造した。
【００８２】
具体的に、アフリベルセプトの最終濃度を４０ｍｇ／ｍＬになるようにし、（１）１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、５％のスクロース、４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０３％のポリソルベート２０を含む製剤（５±３℃保管製剤）；（２）１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、５％のスクロース、４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０３％のポリソルベート２０を含む製剤（５０℃保管製剤）、並びに０．０１％のポリソルベート２０を含む１０ｍＭのヒスチジン−アセテート緩衝液（ｐＨ６．０）に（３）２．５％のトレハロース；（４）２．５％のスクロース；（５）２．５％のマンニトール；および（６）２．５％のグルコースをそれぞれ含む各製剤を５０℃で８日間保管し、時間の経過に伴って生成される単量体、凝集物、および変形体を前記実施例１および２と同一にＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元、非還元）、ＳＥ−ＨＰＬＣ、およびＨＩ−ＨＰＬＣにて分析した。
【００８３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元、非還元）分析（図４）およびＳＥ−ＨＰＬＣおよびＨＩ−ＨＰＬＣ分析結果、対照群（２）と比較して、本発明のトレハロース、スクロース、マンニトールおよびグルコースをそれぞれ含むすべての製剤は、凝集物および不純物の生成を顕著に抑制し、特にスクロースを含む製剤においての凝集物および不純物の生成抑制効果が最も優れていた。
【００８４】
［実施例４］
製剤における最適の糖濃度条件の評価
本実施例は、抗−ＶＥＧＦ−Ｆｃ融合タンパク質であるアフリベルセプトを有効成分として含有する液状製剤の最適の糖濃度を確認するために、次のように試料を製造した。
【００８５】
具体的に、アフリベルセプトの最終濃度を４０ｍｇ／ｍＬになるようにし、（１）１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、５％のスクロース、４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０３％のポリソルベート２０を含む製剤（５±３℃保管製剤）；（２）１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、５％のスクロース、４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０３％のポリソルベート２０を含む製剤（４５℃保管製剤）、並びに０．０１％のポリソルベート２０を含む１０ｍＭのヒスチジン−アセテート緩衝液（ｐＨ６．０）にそれぞれ（３）０％；（４）２．５％；（５）５％；および（６）１０％のように濃度の異なるスクロースを含む各製剤を、４５℃条件で７日間保管しつつ、時間の経過に伴って生成される単量体、凝集体、および変形体を前記実施例１および２と同一にＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元、非還元）、ＳＥ−ＨＰＬＣ、およびＨＩ−ＨＰＬＣにて分析した。
【００８６】
ＳＥ−ＨＰＬＣ分析結果、本発明のスクロースを含まない製剤（３）は、対照群（２）と類似した程度の製剤安定性を示し、本発明の各製剤においてスクロースの濃度が増加するほど、対照群（２）に比べて凝集物および不純物の生成抑制効果が増加することを確認した（図５）。
【００８７】
［実施例５］
さらなる塩条件の評価
本実施例では、抗−ＶＥＧＦ−Ｆｃ融合タンパク質であるアフリベルセプトを有効成分として含有する液状製剤の最適のさらなる塩成分を確認するために、次のように試料を製造した。
【００８８】
具体的に、アフリベルセプトの最終濃度を４０ｍｇ／ｍＬになるようにし、（１）１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、５％のスクロース、４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０３％のポリソルベート２０を含む製剤（５±３℃保管製剤）；（２）１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、５％のスクロース、４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０３％のポリソルベート２０を含む製剤（４５℃保管製剤）、そして０．０１％のポリソルベート２０を含む１０ｍＭのヒスチジン−アセテート緩衝液（ｐＨ６．０）に（３）塩を含まない製剤；（４）４０ｍＭの塩化ナトリウム；（５）４０ｍＭの塩化アンモニウム；（６）４０ｍＭの硫酸アンモニウム；および（７）４０ｍＭの塩化カリウムをそれぞれ含む各製剤を４５℃条件で７日間保管しつつ、時間の経過に伴って生成される単量体、凝集物、および変形体を前記実施例１および２と同一にＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元、非還元）、ＳＥ−ＨＰＬＣ、およびＨＩ−ＨＰＬＣにて分析した。
【００８９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥ−ＨＰＬＣ（図６）の分析結果、対照群（２）と比較して、本発明のさらなる塩成分を含まない製剤（３）の凝集物および不純物の生成抑制効果が最も優れているものと観察された。
【００９０】
［実施例６］
撹拌条件で界面活性剤の有無による安定性の評価
本実施例では、抗−ＶＥＧＦ−Ｆｃ融合タンパク質であるアフリベルセプトを有効成分として含有するヒスチジン−ＨＣｌ緩衝液ベースの液状製剤で撹拌をする間に、スクロース濃度およびポリソルベート２０の有無による製剤安定性を評価するために、次のように試料を製造した。
【００９１】
具体的に、アフリベルセプトの最終濃度を４０ｍｇ／ｍＬになるようにし、（１）１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、５％のスクロース、４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０３％のポリソルベート２０；（２）１０ｍＭのヒスチジン−アセテート、ｐＨ６．０、１０％のスクロース；（３）１０ｍＭのヒスチジン−ＨＣｌ、ｐＨ６．０、７．５％のスクロース；（４）１０ｍＭのヒスチジン−ＨＣｌ、ｐＨ６．０、５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート２０；（５）１０ｍＭのヒスチジン−ＨＣｌ、ｐＨ６．０、７．５％のスクロース、０．０１％のポリソルベート２０；および（６）１０ｍＭのヒスチジン−ＨＣｌ、ｐＨ６．０、１０％のスクロース、０．０１％のポリソルベート２０をそれぞれ含む各製剤を、それぞれオービタルシェーカー（ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｅｒ）を用いて２００ｒｐｍで撹拌しながら、５±３℃または２５℃に７日間保管した。
【００９２】
この際、前記（１）に記載された条件は、先行特許文献１である国際公開公報ＷＯ２００７／１４９３３４号の製剤に該当し、前記（２）に記載された条件は、ヒスチジン塩緩衝液の変化に対する対照群として使用された。
【００９３】
ＳＥ−ＨＰＬＣおよびＨＩ−ＨＰＬＣの分析結果、２５℃に７日間撹拌しながら保管した製剤の条件で、ポリソルベートの有無に関係なく、対照群（１）より凝集物および変形体の生成が抑制されることを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元）（図７）およびＳＥ−ＨＰＬＣ結果においても、同様に、２５℃に７日間撹拌する条件で、ポリソルベートの有無に関係なく、対照群（１）より凝集物および変形体の生成が抑制されることが観察され、特にポリソルベートが含まれていない製剤の凝集物およびタンパク質断片の生成抑制効果が若干さらに良好であった。
【００９４】
［実施例７］
製剤における最適のポリソルベート２０濃度条件の評価
本実施例では、抗−ＶＥＧＦ−Ｆｃ融合タンパク質であるアフリベルセプトを有効成分として含有する液状製剤の最適のポリソルベート２０の濃度を確認するために、次のように試料を製造した。
【００９５】
具体的に、アフリベルセプトの最終濃度を４０ｍｇ／ｍＬになるようにし、（１）１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、５％のスクロース、４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０３％のポリソルベート２０を含む製剤（５±３℃保管製剤）；（２）１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、５％のスクロース、４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０３％のポリソルベート２０を含む製剤（４５℃保管製剤）、並びに１０ｍＭのヒスチジン−アセテート緩衝液（ｐＨ６．０）、１０％のスクロースの組成にそれぞれ（３）０％；（４）０．０１％；（５）０．０３％；（６）０．０５；および（７）０．１％濃度のポリソルベート２０を含む各製剤を４５℃条件で７日間保管しつつ、時間が経つにつれて生成される単量体、凝集物、および変形体を前記実施例１および２と同一にＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元、非還元）、ＳＥ−ＨＰＬＣ、およびＨＩ−ＨＰＬＣにて分析した。
【００９６】
ＳＥ−ＨＰＬＣ（図８）の分析結果、本発明のポリソルベート２０を含まない製剤（３）と含む製剤（４）、（５）、（６）および（７）は、いずれも、凝集物および不純物の生成抑制効果が対照群（２）と比較して優れているものと観察された。
【００９７】
結果的に、前記実施例１〜７を通じて、本発明の多様な条件の液状製剤は、先行特許文献の製剤に比べて凝集および断片化が顕著に抑制されることを確認した。
【００９８】
このような製剤安定性の評価によって、本発明の液状製剤は、ＩｇＧＦｃドメインを有する融合タンパク質の凝集、断片化および異性化などによる不純物ないしは副産物の生成抑制効果に優れていて、前記融合タンパク質を長期間安定に保管できると共に、苛酷条件でも向上した安定性を提供できることを確認した。
【００９９】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界においての通常の知識を有する者にとって、このような具体的技術は、単に好ましい実施様態に過ぎず、これにより本発明の範囲が限定されるものではない点は明白であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲とそれらの均等物によって定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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