(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽鎖（ＬＣ）と重鎖（ＨＣ）とを含む、ヒトＰＤ−Ｌ１（配列番号１）と結合する抗体
であって、前記軽鎖は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、前記重鎖は、重鎖可変領域（
ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲは、それぞれアミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＴＶＮ
（配列番号５）、ＹＧＮＳＮＲＰＳ（配列番号６）、及びＱＳＹＤＳＳＬＳＧＳＶ（配列
番号７）からなる軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
前記ＨＣＶＲは、それぞれアミノ酸配列ＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳ（配列番号２）、Ｇ
ＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号３）、及びＡＲＳＰＤＹＳＰＹＹＹＹＧＭ
ＤＶ（配列番号４）からなる重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ
３を含む、抗体。
【請求項２】
軽鎖（ＬＣ）と重鎖（ＨＣ）とを含む抗体であって、前記軽鎖は、軽鎖可変領域（ＬＣ
ＶＲ）を含み、前記重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲは、配列番
号９に示されるアミノ酸配列を有し、前記ＨＣＶＲは、配列番号８に示されるアミノ酸配
列を有する、抗体。
【請求項３】
前記ＬＣは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有し、前記ＨＣは、配列番号１０
に示されるアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
２つの軽鎖及び２つの重鎖を含み、各軽鎖は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を
有し、各重鎖は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の抗体
。
【請求項５】
前記重鎖の一方は、前記軽鎖の一方と鎖間ジスルフィド結合を形成しており、前記重鎖
の他方は、前記軽鎖の他方と鎖間ジスルフィド結合を形成しており、前記重鎖の一方は、
前記重鎖の他方と２つの鎖間ジスルフィド結合を形成している、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体は、グリコシル化されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
配列番号１１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
と、配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配
列とを含むＤＮＡ分子を含む哺乳類細胞であって、前記細胞は、配列番号１１のアミノ酸
配列を有する軽鎖と、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖とを含む抗体を発現する
ことが可能である、哺乳類細胞。
【請求項８】
配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重
鎖とを含む抗体の産生方法であって、前記抗体が発現する条件下で請求項７に記載の哺乳
類細胞を培養することと、前記発現した抗体を回収することとを含む、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法によって産生された抗体。
【請求項１０】
請求項１〜６または９のいずれか１項に記載の抗体、及び許容される担体、希釈剤、ま
たは賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
癌を治療する方法であって、請求項１〜６または９のいずれか１項に記載の抗体の有効
量を、それを必要としている患者に投与することを含む、方法に用いるための医薬組成物。
【請求項１２】
前記癌は、黒色腫、肺癌、頭頸部癌、大腸癌、膵臓癌、胃癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺
癌、乳癌、卵巣癌、食道癌、軟部組織肉腫、または肝細胞癌である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記方法が、１つ以上の抗腫瘍薬を同時、別々、または逐次に組み合わせて投与することをさらに含む、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
療法において使用するための、請求項１〜６または９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１５】
癌の治療において使用するための、請求項１〜６または９のいずれか１項に記載の抗体
。
【請求項１６】
前記癌は、黒色腫、肺癌、頭頸部癌、大腸癌、膵臓癌、胃癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺
癌、乳癌、卵巣癌、食道癌、軟部組織肉腫、または肝細胞癌である、請求項１５に記載の
使用のための抗体。
【請求項１７】
癌の治療において、１つ以上の抗腫瘍薬を同時、別々、または逐次に組み合わせて使用
するための、請求項１〜６または９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１８】
前記癌は、黒色腫、肺癌、頭頸部癌、大腸癌、膵臓癌、胃癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺
癌、乳癌、卵巣癌、食道癌、軟部組織肉腫、または肝細胞癌である、請求項１７に記載の
使用のための抗体。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
本発明は、医薬の分野に関する。より具体的には、本発明は、ヒトプログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）と結合し、単独で、かつ化学療法及び他の癌治療法と組み合わせて、固形及び血液系腫瘍を治療するのに有用であり得る、抗体に関する。
【０００２】
腫瘍細胞は、複数の機構を通じた免疫系による検出及び除去を逃れる。免疫チェックポイント経路は、自己寛容の維持及びＴ細胞活性化の制御で使用されるが、癌細胞は、経路を使用して、抗腫瘍応答を抑制し、癌細胞の破壊を防止することができる。
【０００３】
ＰＤ−Ｌ１／ヒトプログラム細胞死１（ＰＤ−１）経路は、１つのそのような免疫チェックポイントである。ヒトＰＤ−１は、Ｔ細胞上で見られ、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合は、Ｔ細胞増殖及びサイトカイン産生を阻害する。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抑制性軸は、抗腫瘍免疫応答に関連して腫瘍進展を形作る自然選択過程の一部として、腫瘍によって抑えられている。ＰＤ−Ｌ１はまた、Ｂ７−１（ＣＤ８０）と結合する。Ｂ７−１は、Ｔ細胞活性化の別の負の調節因子である。したがって、ＰＤ−Ｌ１は、様々な腫瘍のタイプによって異常発現し、腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１の発現の増加は、多くの癌におけるより不良な予後と関連していることがわかっている。ＰＤ−Ｌ１発現はまた、免疫活性化及び炎症性サイトカインの産生の結果として、免疫細胞及び他の細胞内の腫瘍微小環境において浄法制御され、Ｔ細胞免疫抑制環境の確立にさらに寄与する。ＰＤ−Ｌ１の遮断は、腫瘍反応性Ｔ細胞の再活性化を促進し、腫瘍細胞を効果的に検出及び殺滅するそれらの能力を回復させ得る。
【０００４】
ヒトＰＤ−Ｌ１に対するヒトＩｇＧ１抗体、ＭＰＤＬ３２８０Ａは、ＰＤ−１及びＢ７−１への結合を遮断することが示されており、ヒト臨床試験において試験されている（Ｈｅｒｂｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１４）５１５：５６３、Ｃｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２０１５）４２（３）：４８４、及び米国特許出願第２０１０／０２０３０５６号）。ヒトＰＤ−Ｌ１に対するヒトＩｇＧ１抗体、ＭＥＤＩ４７３６は、ＰＤ−１及びＢ７−１への結合を遮断することが示されており、ヒト臨床試験において試験されている（Ｉｂｒａｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２０１５）４２（３）：４７４、及び米国特許出願第２０１３／００３４５５９号）。
【０００５】
ヒトＰＤ−Ｌ１と結合し、ＰＤ−１及びＢ７−１とのＰＤ−Ｌ１の相互作用を中和させる、代替の抗体を提供する必要性が残る。具体的には、より良好な会合速度などのより好ましい特性と結合するＰＤ−Ｌ１抗体を提供する必要性が残る。標的へのより迅速な会合は、治療用抗体のためのより良好なインビボ活性につながり得る。また、腫瘍サイズへの影響によって、ＣＤ３陽性Ｔ細胞の浸潤レベルによって、かつインビボモデルにおいてＣＤ８陽性であるＴ細胞の割合によって測定されるように、腫瘍に対するＴ細胞応答をより良好に強化するＰＤ−Ｌ１抗体を提供する必要性が残る。
【０００６】
本発明のある特定の抗体は、確立された腫瘍モデル及び確立されていない腫瘍モデルにおけるある特定の従来技術の抗体と比較して、腫瘍サイズによって測定されるように、腫瘍に対して強化されたＴ細胞応答を仲介する。本発明のある特定の抗体は、モデルにおけるある特定の従来技術の抗体と比較して、ＣＤ３陽性Ｔ細胞浸潤によって測定されるように、腫瘍に対して強化されたＴ細胞応答を仲介する。
【０００７】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、軽鎖（ＬＣ）と重鎖（ＨＣ）とを含む、ヒトＰＤ−Ｌ１（配列番号１）と結合する抗体を提供し、軽鎖は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、ＬＣＶＲは、それぞれアミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＴＶＮ（配列番号５）、ＹＧＮＳＮＲＰＳ（配列番号６）、及びＱＳＹＤＳＳＬＳＧＳＶ（配列番号７）からなる軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＶＲは、それぞれアミノ酸配列ＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳ（配列番号２）、ＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号３）、及びＡＲＳＰＤＹＳＰＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号４）からなる重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本発明は、軽鎖（ＬＣ）と重鎖（ＨＣ）とを含む抗体を提供し、軽鎖は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、ＬＣＶＲは、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＶＲは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する。
【０００９】
いくつかの実施形態において、本発明は、抗体を提供し、ＬＣは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有し、ＨＣは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する。
【００１０】
一実施形態において、本発明は、２つの軽鎖と２つの重鎖とを含む抗体を提供し、各軽鎖は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有し、各重鎖は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する。
【００１１】
さらなる実施形態において、本発明は、抗体を提供し、重鎖の一方は、軽鎖の一方と鎖間ジスルフィド結合を形成しており、重鎖の他方は、軽鎖の他方と鎖間ジスルフィド結合を形成しており、重鎖の一方は、重鎖の他方と２つの鎖間ジスルフィド結合を形成している。
【００１２】
さらなる実施形態において、本発明は、抗体を提供し、抗体は、グリコシル化されている。
【００１３】
一実施形態において、本発明は、配列番号１１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列とを含む、ＤＮＡ分子を含む、哺乳類細胞を提供し、細胞は、配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖とを含む抗体を発現することが可能である。
【００１４】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖とを含む抗体の産生方法を提供し、抗体が発現する条件下で本発明の哺乳類細胞を培養することと、発現した抗体を回収することとを含む。
【００１５】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明の方法によって産生された抗体を提供する。
【００１６】
一実施形態において、本発明は、本発明の抗体、及び許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。
【００１７】
一実施形態において、本発明は、癌を治療する方法を提供し、有効量の本発明の抗体を、それを必要としている患者に投与することを含む。さらなる実施形態において、本発明は、癌を治療する方法を提供し、有効量の本発明の抗体を、それを必要としている患者に投与することを含み、癌は、黒色腫、肺癌、頭頸部癌、大腸癌、膵臓癌、胃癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、食道癌、軟部組織肉腫、または肝細胞癌である。
【００１８】
さらなる実施形態において、本発明は、癌を治療する方法を提供し、癌は、黒色腫である。さらなる実施形態において、本発明は、癌を治療する方法を提供し、癌は、肺癌である。さらなる実施形態において、本発明は、癌を治療する方法を提供し、癌は、頭頸部癌である。さらなる実施形態において、本発明は、癌を治療する方法を提供し、癌は、大腸癌である。さらなる実施形態において、本発明は、癌を治療する方法を提供し、癌は、膵臓癌である。さらなる実施形態において、本発明は、癌を治療する方法を提供し、癌は、胃癌である。さらなる実施形態において、本発明は、癌を治療する方法を提供し、癌は、腎臓癌である。さらなる実施形態において、本発明は、癌を治療する方法を提供し、癌は、膀胱癌である。さらなる実施形態において、本発明は、癌を治療する方法を提供し、癌は、前立腺癌である。さらなる実施形態において、本発明は、癌を治療する方法を提供し、癌は、乳癌である。さらなる実施形態において、本発明は、癌を治療する方法を提供し、癌は、卵巣癌である。さらなる実施形態において、本発明は、癌を治療する方法を提供し、癌は、食道癌である。さらなる実施形態において、本発明は、癌を治療する方法を提供し、癌は、軟部組織肉腫である。さらなる実施形態において、本発明は、癌を治療する方法を提供し、癌は、肝細胞癌である。
【００１９】
さらなる実施形態において、これらの方法は、１つ以上の抗腫瘍薬を同時、別々、または逐次に組み合わせて有効量の本発明の抗体を投与することを含む。抗腫瘍薬の非限定的な例としては、ラムシルマブ、ネシツムマブ、オララツマブ、ガルニセルチブ、アベマシクリブ、シスプラチン、カルボプラチン、ダカルバジン、リポソーマルドキソルビシン、ドセタキセル、シクロホスファミド及びドキソルビシン、ナベルビン、エリブリン、パクリタキセル、注射可能懸濁液のためのパクリタキセルタンパク質結合粒子、イキサベピロン、カペシタビン、ＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン、フルオロウラシル、及びオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、フルオロウラシル、及びイリノテカン）、ならびにセツキシマブが挙げられる。
【００２０】
さらなる実施形態において、これらの方法は、１つ以上の腫瘍免疫療法薬を同時、別々、または逐次に組み合わせて有効量の本発明の化合物を投与することを含む。腫瘍免疫療法薬の非限定的な例としては、ニボルマブ、イピリムマブ、ピジリズマブ、ペムブロリズマブ、トレメリムマブ、ウレルマブ、リリルマブ、アテゾリズマブ、及びデュルバルマブが挙げられる。
【００２１】
一実施形態において、本発明は、療法において使用するための本発明の抗体を提供する。一実施形態において、本発明は、癌の治療において使用するための本発明の抗体を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、癌の治療において使用するための本発明の抗体を提供し、癌は、黒色腫、肺癌、頭頸部癌、大腸癌、膵臓癌、胃癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、食道癌、軟部組織肉腫、または肝細胞癌である。
【００２２】
さらなる実施形態において、本発明は、癌の治療において使用するための本発明の抗体を提供し、癌は、黒色腫である。さらなる実施形態において、本発明は、癌の治療において使用するための本発明の抗体を提供し、癌は、肺癌である。さらなる実施形態において、本発明は、癌の治療において使用するための本発明の抗体を提供し、癌は、頭頸部癌である。さらなる実施形態において、本発明は、癌の治療において使用するための本発明の抗体を提供し、癌は、大腸癌である。さらなる実施形態において、本発明は、癌の治療において使用するための本発明の抗体を提供し、癌は、膵臓癌である。さらなる実施形態において、本発明は、癌の治療において使用するための本発明の抗体を提供し、癌は、胃癌である。さらなる実施形態において、本発明は、癌の治療において使用するための本発明の抗体を提供し、癌は、腎臓癌である。さらなる実施形態において、本発明は、癌の治療において使用するための本発明の抗体を提供し、癌は、膀胱癌である。さらなる実施形態において、本発明は、癌の治療において使用するための本発明の抗体を提供し、癌は、前立腺癌である。さらなる実施形態において、本発明は、癌の治療において使用するための本発明の抗体を提供し、癌は乳癌である。さらなる実施形態において、本発明は、癌の治療において使用するための本発明の抗体を提供し、癌は、卵巣癌である。さらなる実施形態において、本発明は、癌の治療において使用するための本発明の抗体を提供し、癌は、食道癌である。さらなる実施形態において、本発明は、癌の治療において使用するための本発明の抗体を提供し、癌は、軟部組織肉腫である。さらなる実施形態において、本発明は、癌の治療において使用するための本発明の抗体を提供し、癌は、肝細胞癌である。
【００２３】
さらなる実施形態において、本発明は、１つ以上の抗腫瘍薬と同時、別々、または逐次に組み合わせて使用するための本発明の抗体を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、癌の治療において、ラムシルマブ、ネシツムマブ、オララツマブ、ガルニセルチブ、アベマシクリブ、シスプラチン、カルボプラチン、ダカルバジン、リポソーマルドキソルビシン、ドセタキセル、シクロホスファミド及びドキソルビシン、ナベルビン、エリブリン、パクリタキセル、注射可能懸濁液のためのパクリタキセルタンパク質結合粒子、イキサベピロン、カペシタビン、ＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン、フルオロウラシル、及びオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、フルオロウラシル、及びイリノテカン）、ならびにセツキシマブからなる群から選択される１つ以上の抗腫瘍薬と同時、別々、または逐次に組み合わせて使用するための本発明の抗体を提供する。
【００２４】
さらなる実施形態において、本発明は、１つ以上の腫瘍免疫療法薬を同時、別々、または逐次に組み合わせて使用するための本発明の抗体を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、癌の治療において、ニボルマブ、イピリムマブ、ピジリズマブ、ペムブロリズマブ、トレメリムマブ、ウレルマブ、リリルマブ、アテゾリズマブ、及びデュルバルマブからなる群から選択される１つ以上の腫瘍免疫療法薬を同時、別々、または逐次に組み合わせて使用するための本発明の抗体を提供する。
【００２５】
さらなる実施形態において、本発明は、癌の治療のための薬剤の製造のための本発明の抗体の使用を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、癌の治療のための薬剤の製造のための本発明の抗体の使用を提供し、癌は、黒色腫、肺癌、頭頸部癌、大腸癌、膵臓癌、胃癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、食道癌、軟部組織肉腫、または肝細胞癌である。
【００２６】
さらなる実施形態において、本発明は、癌の治療のための薬剤の製造における本発明の抗体の使用を提供し、該薬剤は、１つ以上の抗腫瘍薬と同時に、別々に、または逐次に投与されるものである。さらなる実施形態において、本発明は、癌の治療のための薬剤の製造における本発明の抗体の使用を提供し、該薬剤は、ラムシルマブ、ネシツムマブ、オララツマブ、ガルニセルチブ、アベマシクリブ、シスプラチン、カルボプラチン、ダカルバジン、リポソーマルドキソルビシン、ドセタキセル、シクロホスファミド及びドキソルビシン、ナベルビン、エリブリン、パクリタキセル、注射可能懸濁液のためのパクリタキセルタンパク質結合粒子、イキサベピロン、カペシタビン、ＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン、フルオロウラシル、及びオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、フルオロウラシル、及びイリノテカン）、ならびにセツキシマブからなる群から選択される１つ以上の抗腫瘍薬と同時に、別々に、または逐次に投与されるものである。
【００２７】
さらなる実施形態において、本発明は、癌の治療のための薬剤の製造における本発明の抗体の使用を提供し、該薬剤は、１つ以上の腫瘍免疫療法薬と同時に、別々に、または逐次に投与されるものである。さらなる実施形態において、本発明は、癌の治療のための薬剤の製造における本発明の抗体の使用を提供し、該薬剤は、癌の治療において、ニボルマブ、イピリムマブ、ピジリズマブ、ペムブロリズマブ、トレメリムマブ、ウレルマブ、リリルマブ、アテゾリズマブ、及びデュルバルマブからなる群から選択される１つ以上の腫瘍免疫療法薬と同時に、別々に、または逐次に投与されるものである。
【００２８】
本発明の抗体は、改変された非自然発生的なポリペプチド複合体である。本発明のＤＮＡ分子は、本発明の抗体中のポリペプチドのうちの１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、非自然発生的なＤＮＡ分子である。
【００２９】
本発明の抗体は、ＩｇＧ型抗体であり、鎖内及び鎖間ジスルフィド結合を介して架橋される「重」鎖と「軽」鎖とを有する。各重鎖は、Ｎ末端ＨＣＶＲ及び重鎖定常領域（「ＨＣＣＲ」）からなる。各軽鎖は、ＬＣＶＲ及び軽鎖定常領域（「ＬＣＣＲ」）からなる。ある特定の生物系において発現したとき、天然ヒトＦｃ配列を有する抗体は、Ｆｃ領域内でグリコシル化されている。典型的には、グリコシル化は、高度に保存されたＮ−グリコシル化部位における抗体のＦｃ領域内で生じる。Ｎ−グリカンは、典型的には、アスパラギンに付着する。抗体は、他の位置においても同様にグリコシル化され得る。
【００３０】
任意に、ある特定の本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ１由来であるＦｃ部分を含有する。ＩｇＧ１は、Ｆｃ−γ受容体ファミリー（ＦｃγＲ）ならびにＣ１ｑのタンパク質に結合することが周知である。これらの受容体との相互作用は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘発し得る。したがって、任意に、ある特定の本発明の抗体は、Ｆｃエフェクター機能を欠いた完全ヒトモノクローナル抗体である（ＩｇＧ１、λ、Ｆｃヌル）。ＦｃヌルＩｇＧ１抗体を実現するために、残基の選択的突然変異誘発がそのＩｇＧ１  Ｆｃ領域のＣＨ２領域内で必要である。アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、及びＧ２３７Ａは、ＩｇＧ１  Ｆｃに導入されて、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、及びＦｃγＲＩＩＩへの結合を低減し、置換Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓは、導入されて、Ｃ１ｑ媒介性補体結合を低減する。
【００３１】
ヒトに投与されたときに免疫応答の潜在的な誘発を低減するために、ある特定のアミノ酸は、抗体生殖系列配列と一致するための復帰突然変異を必要とし得る。ある特定の本発明の抗体は、可変重鎖においてＥ１Ｑ及びＳ９４Ｒ突然変異を含有し、可変軽鎖においてＴ７６Ｓ及びＡ８０Ｓ突然変異を含有する。
【００３２】
ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ領域は、フレームワーク領域（「ＦＲ」）と呼ばれるより保存された領域が点在する、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超変異性の領域にさらに細分され得る。各ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端まで配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。本明細書において、重鎖の３つのＣＤＲは、「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３」と称され、軽鎖の３つのＣＤＲは、「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３」と称される。ＣＤＲは、抗原との特定の相互作用を形成する残基のうちの大部分を含有する。配列描写のために使用される抗体のためのＣＤＲ割り当ての体系が現在３つある。ＫａｂａｔのＣＤＲ定義（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））は、抗体配列変異性に基づく。ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ定義（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９６，９０１−９１７（１９８７）、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２７３，９２７−９４８（１９９７））は、抗体の３次元構造及びＣＤＲループのトポロジーに基づく。ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ定義は、ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２を除いて、ＫａｂａｔのＣＤＲ定義と同一である。ＮｏｒｔｈのＣＤＲ定義（Ｎｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  Ｎｅｗ  Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＣＤＲ  Ｌｏｏｐ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４０６，２２８−２５６（２０１１））は、多数の結晶構造での親和性伝播クラスタリングに基づく。本発明の目的で、ＮｏｒｔｈのＣＤＲ定義が使用される。
【００３３】
ＨＣＶＲ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＨＣＶＲをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒトならびに他の哺乳動物の重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において既知である。これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、例えば、標準的なＰＣＲ増幅によって取得され得る。
【００３４】
ＬＣＶＲ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＬＣＶＲをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子に変換され得る。ヒトならびに他の哺乳動物の軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において既知である。これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって取得され得る。軽鎖定常領域は、κまたはλ定常領域であってもよい。好ましくは、本発明の抗体に対して、軽鎖定常領域は、λ定常領域である。
【００３５】
本発明のポリヌクレオチドは、その配列が発現制御配列に作動可能に連結された後に、宿主細胞内で発現する。発現ベクターは、典型的には、エピソーム、または宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分のいずれかとして、宿主生物中で複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で変換される細胞の検出を可能にするために、選択マーカー、例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、及びジヒドロ葉酸レダクターゼを含有する。
【００３６】
本発明の抗体は、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＨＥＫ２９３、またはＣＯＳ細胞などの哺乳類細胞内で容易に産生され得る。宿主細胞は、当該技術分野において周知の技術を使用して培養される。
【００３７】
対象となるポリヌクレオチド配列（例えば、抗体のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び発現制御配列）を含有するベクターは、細胞宿主の型に応じて異なる周知の方法によって、宿主細胞に導入され得る。
【００３８】
タンパク質精製の様々な方法が用いられ得、そのような方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８２：８３−８９（１９９０）、及びＳｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ＮＹ（１９９４）に記載される。
【００３９】
本発明の別の実施形態において、抗体またはそれをコードする核酸が、単離形態で提供される。本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、細胞環境において見られる任意の他の高分子種を含まない、または実質的に含まない、タンパク質、ペプチド、または核酸を指す。本明細書で使用される場合、「実質的に含まない」は、対象となるタンパク質、ペプチド、または核酸が、８０％超（モル基準で）、好ましくは９０％超、及びより好ましくは９５％超で存在する高分子種を含むことを意味する。
【００４０】
本発明の抗体またはそれを含む医薬組成物は、非経口経路（例えば、皮下及び静脈内）によって投与されてもよい。本発明の抗体は、単回または複数回投与で、薬学的に許容された担体、希釈剤、または賦形剤とだけで、患者に投与されてもよい。本発明の意訳組成物は、当該技術分野において周知の方法によって調製され得（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ  ｅｄ．（２０１２），Ａ．Ｌｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ）、本明細書に開示される抗体、及び１つ以上の薬学的に許容された担体、希釈剤、または賦形剤を含む。
【００４１】
「治療すること」（または「治療する」もしくは「治療」という用語は、既存の症状、疾患、状態、または疾病の進行または重症度を遅らせること、妨げること、阻止すること、軽減すること、停止すること、低減すること、または回復させることを指す。
【００４２】
ヒトＰＤ−Ｌ１に対する抗体の親和性に関連して本明細書で使用される場合、「結合する」は、特に指示がない限り、本質的に本明細書に記載されるように、３７℃で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサを使用することを含む、当該技術分野において既知の一般的な方法によって決定されるように、約１×１０−６Ｍ未満、好ましくは約１×１０−９Ｍ未満のＫＤを意味することを目的とする。
【００４３】
「有効量」は、研究者、医者、または他の臨床医によって探究されている組織、体系、動物、哺乳動物、またはヒトの生物学的もしくは医学的応答、またはそれに対する所望の治療効果を引き出す、本発明の抗体または本発明の抗体を含む医薬組成物の量を意味する。有効量の抗体は、個人の病状、年齢、性別、及び体重、ならびに個人における所望の応答を引き出す抗体の能力などの要因に応じて異なり得る。有効量はまた、抗体の任意の毒作用または有害作用よりも治療的に有益な効果が上回る量である。
【００４４】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに例示される。
【００４５】
実施例１：抗体発現及び精製
重鎖及び軽鎖の可変領域のポリペプチド、抗体Ａの完全重鎖及び軽鎖アミノ酸配列、ならびにそれをコードするヌクレオチド配列が、以下の「アミノ酸及びヌクレオチド配列」と題する節に列挙される。加えて、抗体Ａの軽鎖、重鎖、軽鎖可変領域、及び重鎖可変領域に対する配列番号は、表１に示される。
【００４６】
抗体Ａを含むがこれに限定されない本発明の抗体は、本質的に以下の通り作製及び精製され得る。ＨＥＫ２９３またはＣＨＯなどの適切な宿主細胞は、最適な所定のＨＣ：ＬＣベクター比、またはＨＣ及びＬＣの両方をコードする単一のベクター系を使用して、抗体を分泌するために、一時的または安定的のいずれかで、発現系でトランスフェクトされ得る。抗体が分泌された浄化培地は、多くの一般的に使用される技術のうちのいずれかを使用して精製されてもよい。例えば、培地は、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）などの適合緩衝液で平衡化された、ＭａｂＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、またはＦａｂフラグメントのためのＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に便利に適用され得る。カラムは、非特異的結合成分を除去するために洗浄され得る。結合した抗体は、例えば、ｐＨ勾配（２０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７から１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．０、またはリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４から１００ｍＭグリシン緩衝液ｐＨ３．０など）によって溶出され得る。抗体画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどによって検出され得、次いで、混合され得る。さらなる精製は、使用目的に応じて任意である。抗体は、一般的な技術を使用して濃縮及び／または滅菌濾過され得る。可溶性凝集体及び多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、マルチモーダル、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィを含む一般的な技術によって効果的に除去され得る。これらのクロマトグラフィステップ後の抗体の純度は、９５％を超える。生成物は、−７０℃ですぐに冷凍されてもよく、または凍結乾燥されてもよい。
【表１】
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【００４７】
アッセイ
インビボ活性−ＷＩＮＮアッセイ
本発明の抗体は、Ｗｉｎｎアッセイを用いて、インビボ免疫調節活性に関して試験され得る。Ｗｉｎｎアッセイにおいて、ヒト腫瘍細胞及びヒト免疫細胞（同種）は、免疫不全マウスに一緒に同時に注射され、次いで、免疫調節薬との投与が続く。モデルにおける腫瘍成長を遅らせるか、または遮る免疫調節薬の能力が評価され得る。腫瘍体積は、アッセイにおいて免疫調節薬の効果、及び腫瘍に対する免疫応答の強化があるかどうかを決定するために測定される。
【００４８】
本明細書で使用される場合、２．１４Ｈ９ＯＰＴは、米国特許出願第２０１３／００３４５５９号からの重鎖及び軽鎖配列を利用する、ヒトＩｇＧ１  ＰＤ−Ｌ１抗体である。本明細書で使用される場合、Ｓ７０は、米国特許出願第２０１０／０２０３０５６号からの重鎖及び軽鎖配列を利用する、ヒトＩｇＧ１  ＰＤ−Ｌ１抗体である。２．１４Ｈ９ＯＰＴ及びＳ７０の両方に関して、Ｆｃ  γ受容体及び補体カスケードに関するエフェクター機能を抑制するために、重鎖を、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓにおける残基変化を含有するヒトＩｇＧ１定常領域の可変領域に融合した。２．１４Ｈ９ＯＰＴ及びＳ７０の両方に関して、組み換えタンパク質を哺乳類細胞において発現させ、標準的なＰｒｏＡ精製方法によって精製した。
【００４９】
本発明の抗体による同種抗原への免疫応答の強化は、ＮＣＩ−Ｈ２９２ヒトＮＳＣＬＣ異種移植モデルにおいて試験され得る。０日目、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのＮＳＧマウス（７週齢、雌、８〜１０匹のマウスの群における）の脇腹に、２×１０６個のＨ２９２細胞、またはＨＢＳＳ中２×１０６個のＨ２９２細胞及び１×１０６個のヒトＰＢＭＣの混合物（０．２ｍＬの総体積）のいずれかを皮下移植する。１日目に開始し、マウスを、１週間に１回、１０ｍｇ／ｋｇの抗体の腹腔内注射で処理する。毛繕い及び歩行を含む動物の健康及び挙動を、１週間に少なくとも２回監視する。
【００５０】
体重及び腫瘍体積を、１週間に２回測定する。腫瘍検体を、全ての群から３６日目に収集する。免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色を、ウサギ抗マウスＣＤ３抗体（ヒトと交差反応性、Ａｂｃａｍ）を使用して腫瘍試料に実施し、続いて、二次ＨＲＰ共役抗ウサギＩｇＧ（Ｄａｋｏ）で染色する。
【００５１】
腫瘍体積を、細胞移植後４日目に開始して１週間に２回、電子キャリパーを使用して測定する。腫瘍体積（ｍｍ３）＝π／６＊長さ＊幅２。抗腫瘍有効性を、パーセントでのＴ／Ｃ比として表し、以下に要約されるように計算する。
【００５２】
％Ｔ／Ｃを、ΔＴが幾何平均値の０を超える場合、式１００  ΔＴ／ΔＣによって計算する。ΔＴ＝研究の最終日の薬物処理された群の平均腫瘍体積−最初の投与日の薬物処理された群の平均腫瘍体積。ΔＣ＝研究の最終日の対照群の平均腫瘍体積−最初の投与日の対照群の平均腫瘍体積。加えて、％回帰を、ΔＴが０を下回る場合、式＝１００×ΔＴ／Ｔ初期を使用して計算する。測定可能な腫瘍を有しない動物を、完全応答者（ＣＲ）と見なし、５０％を超える回帰を有する腫瘍は、部分応答者（ＰＲ）であった。
【００５３】
腫瘍体積データを、ＳＡＳソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ９．２）でＭＩＸＥＤ手順を使用して、時間及び処理による二元配置反復測定分散分析を用いて、３５日を通して分析する。分析した応答は、腫瘍体積の対数変換である。対数変換は、時間及び処理群にわたる分散を均等化するために必要である。反復測定モデルのための相関構造は、空間電力である。各時点に対して対照群（複数可）に対する処理群（複数可）の所定の一対比較を実施する。
【００５４】
モデルからの腫瘍片はまた、ＣＤ３のための染色及びＡｐｅｒｉｏ  Ｓｃａｎ  Ｓｃｏｐｅを用いた分析を使用して、ＣＤ３陽性Ｔ細胞の存在を測定することによって、ＣＤ３陽性Ｔ細胞浸潤に関して分析され得る。ＩＨＣ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓマクロは、使用者によって選択される領域内の個々の細胞に対する標的色原体のための核染色を検出し、それらの強度を定量化する。アルゴリズム結果が一貫した細胞の同定を生成するまで、３〜５つの注釈を生存腫瘍範囲から作製し、パラメータの調節で使用する。次いで、マクロを保存し、スライドを分析のためにログインする。細胞の総数のパーセントとしての％ＣＤ３陽性細胞を、Ａｐｅｒｉｏソフトウェアによって計算する。
【００５５】
腫瘍体積
本質的に本アッセイに記載されるように実施される実験において、週１回１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与された抗体Ａは、体重及び臨床的観察によって監視されるように、良好な耐容性を示す。免疫細胞が実験の対照群として免疫不全動物（ＰＢＭＣではなく、肺癌細胞株Ｈ２９２を移植されたマウス）に添加されない場合、１週間に１回、１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与される抗体Ａまたは２．１４Ｈ９ＯＰＴでの処理は、ヒトＩｇＧでの処理と比較して、Ｈ−２９２腫瘍成長に対する効果を有しない。
【００５６】
免疫細胞及び試験抗体が免疫不全動物に添加される場合、抗体Ａは、対照ＩｇＧよりも有意に優れた結果をもたらすが、一方で、２．１４Ｈ９ＯＰＴはもたらさない。ＮＣＩ−Ｈ２９２腫瘍及びＰＢＭＣを共移植され、１週間に１回、１０ｍｇ／ｋｇで抗体Ａを投与されたマウスは、対照のＩｇＧで処理されたマウスとは有意に異なる３５％のＴ／Ｃをもたらす（ｐ＝０．００６）。ＮＣＩ−Ｈ２９２腫瘍及びＰＢＭＣを共移植され、１週間に１回、１０ｍｇ／ｋｇで２．１４Ｈ９ＯＰＴを腹腔内投与されたマウスは、ヒトＩｇＧでの処理と比較して有意には異ならない５４％のＴ／Ｃをもたらす（ｐ＝０．１０２）。
【００５７】
ＣＤ３陽性Ｔ細胞浸潤
ＩＨＣ分析によって、本質的に本アッセイに記載されるように実施される実験において、対象群としての肺腫瘍株Ｈ２９２及びヒトＰＢＭＣのマウスの共移植は、移植後３６日目に測定されるように、腫瘍中に存在するヒトＣＤ３  Ｔ細胞の１０％の増加をもたらし、一方で、Ｈ２９２細胞のみを移植された動物は、ＣＤ３  Ｔ細胞の３％の増加を有する。ＰＢＭＣ及び抗体Ａでの処理（１週間に１回、１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与）は、ヒトＣＤ３  Ｔ細胞の１３％の増加をもたらし、ＰＢＭＣ＋ＩｇＧ対照群と比較したＰＢＭＣ＋抗体Ａで処理された群の統計的有意性は、０．０２１のｐ値を有する。ＰＢＭＣ及び２．１４Ｈ９ＯＰＴでの処理（１週間に１回、１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与）は、Ｈ２９２細胞及びヒトＰＢＭＣを共移植された、ＩｇＧで処理された対照と比較して、％ヒトＣＤ３  Ｔ細胞浸潤を増加させない（２．１４Ｈ９ＯＰＴについて９％のＣＤ３  Ｔ細胞に対して、対照について１０％のＣＤ３  Ｔ細胞）。
【００５８】
ＰＢＭＣでヒト化されたＮＳＧマウスにおける確立されたヒト腫瘍異種移植モデル
モデルにおいて確立された腫瘍を遅らせるか、または破壊する能力を評価するために、本発明の抗体の有効性がＮＣＩ−Ｈ８２７ヒトＮＳＣＬＣ異種移植モデルにおいて試験され得る。０日目、ＮＳＧマウス（７週齢、雌、１群当たり１０匹のマウス）の脇腹に、１×１０７個のＨ８２７細胞を皮下移植する。ヒト異種移植腫瘍が確立されると、３４日目、マウスに５×１０６個のヒトＰＢＭＣを注入（点滴）する。３５日目に開始し、マウスに、ヒトＩｇＧまたはＰＤ−Ｌ１抗体のいずれかを、週１回、１０ｍｇ／ｋｇ（合計３回の投与）で腹腔内投与する。毛繕い及び歩行を含む動物の健康及び挙動を、１週間に少なくとも２回監視する。体重及び腫瘍体積を、１週間に２回測定する。
【００５９】
本質的に本アッセイに記載されるように実施される実験において、抗体Ａでの処理は、ヒトＩｇＧでの処理と比較して、ヒト化ＮＳＧマウスにおける腫瘍成長を有意に阻害する（表２）。
【表２】
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【００６０】
本発明の抗体の有効性はまた、ＮＣＩ−Ｈ２９２ヒトＮＳＣＬＣ異種移植モデルにおける同種抗原に対する免疫応答を測定することによって試験され得る。
【００６１】
０日目、ＮＳＧマウス（７週齢、雌、１群当たり１０匹のマウス）の脇腹に、２×１０６個のＨ２９２細胞を皮下移植する。腫瘍が確立された後、１７日目、マウスに１０×１０６個のヒトＰＢＭＣを注入（点滴）する。１８日目に開始し、マウスに抗体を、週１回、１０ｍｇ／ｋｇ×３（合計３回の投与）で腹腔内投与する。毛繕い及び歩行を含む動物の健康及び挙動を、１週間に少なくとも２回監視する。体重及び腫瘍体積を、１週間に２回測定する。３２〜３６日目、マウスを屠殺し、ＴｒｕＣｏｕｎｔ（商標）チューブを使用して、末梢Ｔ細胞生着に関して血液を分析して、ヒトＴ細胞コンパートメントの末梢生着、ならびにＴ細胞サブセットの枯渇表現型に対する影響を評価する。
【００６２】
１群当たり２匹のマウスに対する、本質的に本アッセイに記載されるように実施される実験において、抗体Ａで処理された担腫瘍マウスは、ヒトＩｇＧで処理された群と比較して、ＣＤ８コンパートメントに有利に働く変化したＣＤ４：ＣＤ８比を示す（表３。ＩｇＧ対照に対する４７％と比較して、Ｔ細胞の６３％が抗体Ａに対してＣＤ８であった）。抗体Ａで処理された群は、末梢Ｔ細胞絶対数（ＣＤ４数＋ＣＤ８数）の観点から、ＩｇＧで処理された群とは有意には異ならないが、２．１４Ｈ９ＯＰＴで処理された群よりも高い末梢Ｔ細胞数を示す（ｈＩｇＧに対して、４３×１０３個の細胞／μＬの血液、抗体Ａに対して４５×１０３個の細胞／μＬの血液、及び２．１４Ｈ９ＯＰＴに対して１０×１０３個の細胞／μＬの血液）。
【００６３】
Ｔ細胞活性化を監視するとき、Ｔ細胞上のＰＤ−１レベルは、枯渇Ｔ細胞の顕著な特徴と見なされ得る。対照と比較してより少数のＰＤ−１＋Ｔ細胞が、ＰＤ−Ｌ１抗体でのより大きいＴ細胞活性化を示唆する。１群当たり２匹のマウスを用いた本研究において、ＩｇＧで処理された群（５３％のＰＤ−１＋）と比較して、抗体Ａで処理された群（１５％のＰＤ−１＋）及び２．１４Ｈ９ＯＰＴで処理された群（３２％のＰＤ−１＋）におけるＴ細胞上のＰＤ−１発現の減少が見られる。
【表３】
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【００６４】
混合リンパ球反応
本発明の抗体によるＰＤ−Ｌ１シグナルの遮断機能は、Ｔ細胞活性化中のサイトカインの放出を測定することによって評価され得る。ＩＦＮ−γなどのある特定のサイトカインのレベルは、Ｔ細胞活性化が本発明の抗体での処理によって促進された場合に増加すると予測される。
【００６５】
ＭＡＣＳビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｎｙｉ）を用いて健常ドナー（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）から得られた新鮮なヒトＰＢＭＣから、ＣＤ１４＋単球を単離する。４日間、１０００ＩＵ／ｍＬのｈＧＭ−ＣＳＦ及び５００ＩＵ／ｍＬのｈＩＬ−４の存在下で、１２ｍＬの完全ＲＰＭＩ−１６４０培地においてこれらの単球を培養することによって、未成熟樹状細胞（ＤＣ）を生成する。ネガティブ選択（Ｍｉｌｔｅｎｙ）によって、異なる健常ドナー（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）の新鮮なヒトＰＢＭＣから、ＣＤ４＋Ｔ細胞を精製する。次いで、１ウェル当たり１×１０５個のＣＤ４＋  Ｔ細胞及び４×１０３個の未成熟ＤＣを含有する１００μＬの完全ＡＩＭ−Ｖ培地を有する９６ウェルプレートの個々のウェル内で、２つの細胞型を混合する（Ｅ：Ｔ＝２５：１）。６個の複製で２ｎＭのヒトＩｇＧ１またはヒトＰＤ−Ｌ１抗体を含有する、１００μＬの完全ＡＩＭ−Ｖ培地を添加する。５％  ＣＯ２で３７℃における２日間のインキュベーション後、上清を採取し、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてヒトＩＦＮ−γに関して測定する。
【００６６】
本質的に本アッセイに記載されるように実施される実験において、抗体Ａ、Ｓ７０、または２．１４Ｈ９ＯＰＴの添加のそれぞれは、用量依存的にＴリンパ球によるＩＦＮ−γ産生を強化する。試験された最高濃度（３３．３ｎＭ）において、抗体Ａは、３．０５倍（Ｓ７０）及び４．５１倍（２．１４Ｈ９ＯＰＴ）と比較して、５．７１倍の増加を有する。
【表４】
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【００６７】
抗体の重鎖優位
抗体Ａ／ｈＰＤ−Ｌ１共複合体の構造を、３．７Å及び３．２Å分解能における２つの別々の結晶に関して解く。分析されたとき、それぞれは、ｈＰＤ−Ｌ１と直接接触している抗体ＡのＨＣＤＲ３領域を示す一方で、抗体ＡのＬＣＤＲ３は、エピトープから離れた方向を向く。抗体Ａの軽鎖のＣＤＲは、ｈＰＤ−Ｌ１ドメインのうちのいずれかとの有意な接触を有しない。６Åカットオフ内で、抗体Ａのパラトープは、１８個の重鎖残基及びわずか７個の軽鎖残基からなる。ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１結合部位アミノ酸は、Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）ＰＮＡＳ１０５（８）：３０１１−３０１６で報告されている。ＰＤ−Ｌ１上の抗体Ａの可変軽鎖によって行われる接触は、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用に関与するアミノ酸ではない。
【００６８】
結晶構造において見られる抗体Ａの重鎖優位を確認するために、抗体Ａの重鎖が、抗体Ａの軽鎖に取って代わる無関係の軽鎖と対になる抗体に関して、結合に対する効果を測定する。１つの対合は、抗体ＡとしてＥＬＩＳＡによってＰＤ−Ｌ１に同程度に結合した抗体を産生した。この抗体は、抗体Ａパラトープアミノ酸のうちのどれも可変軽鎖ＣＤＲ内で保存されていない軽鎖を含有した。この結果は、抗体ＡによるＰＤ−Ｌ１への結合が、ほぼ完全に重鎖によって仲介されることを示唆する。抗体Ａの熱力学的特徴は、重鎖優位がＰＤ−Ｌ１の結合に良い影響をもたらすかを評価するために分析され得る。
【００６９】
抗体Ａの熱力学的特徴のデコンボリューション
標的に対する抗体による優れた会合は、治療用抗体の開発において重要であり得る。標的を迅速に認識し結合する抗体は、治療用抗体にとって所望の特性である。抗体の重鎖による結合の優位は、結合前により少ない立体構造変化が生じる必要があることを意味し得る。
【００７０】
抗体Ａの重鎖優位が所望の結合特性をもたらす可能性を評価するために、ＰＤ−Ｌ１遮断の熱力学的特徴をデコンボリューションする。抗体Ａ、Ｓ７０、及び２．１４Ｈ９ＯＰＴのＦａｂに対して、熱力学的研究を完了する。
【００７１】
抗体Ａ  Ｆａｂ、Ｓ７０Ｆａｂ、及び２．１４Ｈ９ＯＰＴ  Ｆａｂの重鎖及び軽鎖を、ＧＳベクターにクローン化する。懸濁撹拌フラスコ培養物中で、製造業者の仕様書に従って、ヒト２９３−Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を培養し、ＧＳベクターでトランスフェクトする。簡潔に、未切断プラスミドＤＮＡ及び２９３フェクチンを２５分間複合化させる。ＨＥＫ２９３細胞を、新鮮な培地中で再懸濁し（塊を除去するためにボルテックスする）、続いてＤＮＡ／フェクチン複合体と組み合わせ、その後に３７℃でインキュベートする。馴化上清を、６日後に採取し、タンパク質発現に関して分析する。ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＧ−ＣＨ１  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｒｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）キットを利用して、ＨＥＫ２９３発現上清から全てのＦａｂを精製する。
【００７２】
Ｆａｂの結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって実施する。センサチップ表面上へのリガンドとしてのヒトＰＤ−Ｌ１モノマーのアミン結合固定化を、２５℃で実施する。抗体Ａ−Ｆａｂ、Ｓ７０−Ｆａｂ、及び２．１４Ｈ９ＯＰＴ−Ｆａｂをそれぞれ被分析物として使用し、ヒトＰＤＬ−１モノマー固定化センサチップ表面にわたって注射する。全ての試料被分析物を、３倍段階希釈（抗体Ａに対して３ｎＭ、ならびにＳ７０及び２．１４Ｈ９ＯＰＴの両方に対して９ｎＭの開始濃度）、中濃度及びゼロにおいて１つの複製を用いて合計６回の希釈で処理する。試料勾配を、ランニング緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０）中で調製する。結合実験を、４つの異なる温度：２０℃、２５℃、３７℃、及び４２℃で繰り返す。反応速度論実験全体を通じて、流量を３０μＬ／分で維持し、会合／接触時間を３つ全てのＦａｂに対して１８０秒で維持する。解離時間は、Ｓ７０−Ｆａｂに対して６００秒であり、抗体Ａ−Ｆａｂ及び２．１４Ｈ９ＯＰＴ−Ｆａｂに対して４２０秒である。解離後、０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＮａＯＨ溶液は、固定化ｈＰＤ−Ｌ１を再生し、次いで、表面をランニング緩衝液で３０秒間固定化する。再生接触時間は、２．１４Ｈ９ＯＰＴ−Ｆａｂ、Ｓ７０−Ｆａｂ、及び抗体Ａ−Ｆａｂに対して連続して、１８秒、２４秒、及び３０秒である。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ３．０）を使用して、結合反応速度を分析する。データは、ブランクフローセルを参照し、データを１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに適合させる。
【００７３】
抗体Ａ、Ｓ７０、及び２．１４Ｈ９ＯＰＴのＦａｂとのｈＰＤ−Ｌ１モノマーの相互作用に関するＶａｎ’ｔ  Ｈｏｆｆプロットを使用する。定常状態、会合、及び解離は、分析された３つの結合段階である。線形回帰分析のためにＭＡＴＬＡＢを利用する。線形回帰の適合性のＲ２基準は、３つ全ての結合段階において３つ全てのＦａｂに対して０．９７以上であった。
【００７４】
本質的に本アッセイに記載されるように実施される実験において、ＬＳＭｅａｎｓスチューデントのＴは、全ての線形プロットの傾斜が、２．１４Ｈ９ＯＰＴ−Ｆａｂ及び抗体Ａ−Ｆａｂの解離段階線形プロットを除いて、互いとは統計的に異なることを実証する。
【００７５】
会合に関して、抗体Ａ−Ｆａｂ／ｈＰＤ−Ｌ１相互作用は、全ての複合体の間で最も好ましい会合段階を有する。ΔＳｏｎは、会合の測定値であり、ΔＳｏｎ値がより負であるほど、相互作用は好ましい。抗体Ａは、−２６．０のΔＳｏｎ値を有し、一方で、Ｓ７０及び２．１４Ｈ９ＯＰＴはそれぞれ、−１１．７及び−１９．４のΔＳｏｎ値を有する。このデータは、これらの条件下で、Ｓ７０及び２．１４Ｈ９ＯＰＴよりも抗体Ａに対して、ＰＤ−Ｌ１とのより好ましい会合相互作用を実証する。
【００７６】
結合反応速度論及び親和性
ヒトＰＤ−Ｌ１に対する反応速度論及び平衡解離定数（ＫＤ）を、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して、本発明の抗体に関して決定する。
【００７７】
センサチップ表面上へのリガンドとしての本発明の抗体の固定化を、２５℃で実施する。可溶性ヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ融合タンパク質（及び場合によっては、カニクイザルＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ融合タンパク質）を、０．０１２３ｎＭ〜９ｎＭに及ぶ濃度で、被分析物として注射する。分析を、３７℃で実施する。各試料に対する接触時間は、３０μＬ／分で１８０秒である。解離時間は、２４０〜１５００秒であった。固定化表面を、３０μＬ／分で、０．９５Ｍ  ＮａＣｌ／２５ｍＭ  ＮａＯＨを用いて１８秒間再生し、次いで、３０秒間安定化する。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ３．０）を使用して、結合反応速度論を分析する。データは、ブランクフローセルを参照し、データを１：１結合モデルに適合させる。
【００７８】
本質的に本アッセイに記載されるように実施される実験において、抗体Ａは、８２ｐＭのＫＤでヒトＰＤ−Ｌ１に結合する。
【表５】
0006518005.tif 000006
【００７９】
ＥＬＩＳＡ分析：抗体Ａは、組み換えＰＤ−Ｌ１に結合する
ヒトＰＤ−Ｌ１に結合する本発明の抗体の能力は、ＥＬＩＳＡアッセイで測定され得る。ＰＤ−Ｌ１結合アッセイに対して、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を、４℃で一晩、ヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングする。ウェルを、ブロッキング緩衝液（５％の脱脂粉乳を含有するＰＢＳ）で２時間遮断する。ウェルを、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで３回洗浄する。次いで、抗ＰＤ−Ｌ１抗体または対照ＩｇＧ（１００μＬ）を添加し、室温で１時間インキュベートする。洗浄後、プレートを、室温で１時間、１００μＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰ共役体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）でインキュベートする。プレートを洗浄し、次いで、１００μＬの３，３’，５，５’−テトラ−メチルベンジジンでインキュベートする。４５０ｎｍにおける吸光度を、マイクロプレートリーダ上で読み取る。５０％効果濃度（ＥＣ５０）を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェアを使用して計算する。
【００８０】
本質的に本アッセイに記載されるように実施される実験において、抗体Ａは、０．１１ｎＭのＥＣ５０でヒトＰＤ−Ｌ１に結合する。抗体Ａは、３つ全ての温度条件、４℃、２５℃、及び４０℃の下で４週間後、その結合活性を保持する。抗体Ａは、ＰＤ−Ｌ１に対して、Ｓ７０及び２．１４Ｈ９ＯＰＴと同様の結合活性を示した。
【００８１】
フローサイトメトリ分析：抗体Ａは、細胞表面ＰＤ−Ｌ１に結合する
細胞表面発現ヒトＰＤ−Ｌ１に結合する本発明の抗体の能力は、フローサイトメトリアッセイで測定され得る。ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞（ＰＤ−Ｌ１陽性ヒト乳腺癌細胞株）を、２００μＬの染色緩衝液中、１ウェル当たり１．５×１０５個の細胞で、９６ウェルＵ底プレートに添加し、４℃で３０分間インキュベートする。プレートを１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去する。１００μＬの抗体ビオチン（１０μｇ／ｍＬから開始し、１：４によって段階希釈される）を添加する。合計６回の段階希釈を評価する。４℃で３０分間のインキュベーション後、細胞をＤＰＢＳで２回洗浄する。５μＬのストレプトアビジン−ＰＥを含有する１００μＬの検出緩衝液を添加する。４℃でさらに３０分間のインキュベーション後、プレートを遠心分離し、ＤＰＢＳで２回洗浄する。ＦＡＣＳ分析のために、細胞を２００μＬのＤＰＢＳ中で再懸濁する。
【００８２】
本質的に本アッセイに記載されるように実施される実験において、抗体Ａは、０．１４ｎＭのＥＣ５０で、用量依存的にＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞上の細胞表面ＰＤ−Ｌ１に結合する。
【００８３】
ＥＬＩＳＡ分析：抗体Ａは、ＰＤ−１とのＰＤ−Ｌ１の相互作用を遮断する
ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１結合を遮断する本発明の抗体の能力は、ＥＬＩＳＡアッセイで測定され得る。受容体−リガンド遮断アッセイに対して、異なる量（の抗ＰＤ−Ｌ１抗体または対照ＩｇＧを、固定量のビオチン化ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ融合タンパク質（１００ｎｇ／ウェル）と混合し、室温で１時間インキュベートする。混合物を、ＰＤ−１−Ｆｃ（１μｇ／ｍＬ）で予めコーティングされた９６ウェルプレートに移し、次いで、室温でさらに１時間インキュベートする。洗浄後、ストレプトアビジンＨＲＰ共役体を添加し、４５０ｎｍでの吸光度を読み取る。ＩＣ５０は、ＰＤ−１に結合するＰＤ−Ｌ１の５０％の阻害のために必要とされる抗体濃度を表す。
【００８４】
本質的に本アッセイに記載されるように実施される実験において、抗体Ａは、０．９５ｎＭのＩＣ５０で、ＰＤ−１とのＰＤ−Ｌ１の相互作用を遮断する。抗体Ａは、３つ全ての温度条件、４℃、２５℃、及び４０℃の下で４週間後、その遮断活性を保持する。抗体Ａは、ＰＤ−１とのＰＤ−Ｌ１相互作用を遮断する、Ｓ７０及び２．１４Ｈ９ＯＰＴと同様の能力を実証する。
【００８５】
ＥＬＩＳＡ分析：抗体Ａは、Ｂ７−１とのＰＤ−Ｌ１の相互作用を遮断する
ヒトＰＤ−Ｌ１はまた、Ｂ７−１に結合する。Ｂ７−１へのＰＤ−Ｌ１結合を遮断する本発明の抗体の能力は、ＥＬＩＳＡアッセイで測定され得る。ＰＤ−Ｌ１／Ｂ７−１遮断アッセイのための手順は、プレートが１μｇ／ｍＬのＢ７−１−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングされることを除いて、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１遮断アッセイと同様である。ＰＤ−１に結合するＰＤ−Ｌ１の５０％の阻害のために必要とされる抗体濃度（ＩＣ５０）を、ＧｒａｐｈＰａｄプリズム６ソフトウェアを使用して計算する。
【００８６】
本質的に本アッセイに記載されるように実施される実験において、抗体Ａは、２．４ｎＭのＩＣ５０で、Ｂ７−１とのＰＤ−Ｌ１の相互作用を遮断する。抗体Ａは、Ｂ７−１とのＰＤ−Ｌ１相互作用を遮断する、Ｓ７０及び２．１４Ｈ９ＯＰＴと同様の能力を示す。
【００８７】
アミノ酸及びヌクレオチド配列
配列番号１（ヒトＰＤ−Ｌ１）
ＭＲＩＦＡＶＦＩＦＭＴＹＷＨＬＬＮＡＦＴＶＴＶＰＫＤＬＹＶＶＥＹＧＳＮＭＴＩＥＣＫＦＰＶＥＫＱＬＤＬＡＡＬＩＶＹＷＥＭＥＤＫＮＩＩＱＦＶＨＧＥＥＤＬＫＶＱＨＳＳＹＲＱＲＡＲＬＬＫＤＱＬＳＬＧＮＡＡＬＱＩＴＤＶＫＬＱＤＡＧＶＹＲＣＭＩＳＹＧＧＡＤＹＫＲＩＴＶＫＶＮＡＰＹＮＫＩＮＱＲＩＬＶＶＤＰＶＴＳＥＨＥＬＴＣＱＡＥＧＹＰＫＡＥＶＩＷＴＳＳＤＨＱＶＬＳＧＫＴＴＴＴＮＳＫＲＥＥＫＬＦＮＶＴＳＴＬＲＩＮＴＴＴＮＥＩＦＹＣＴＦＲＲＬＤＰＥＥＮＨＴＡＥＬＶＩＰＥＬＰＬＡＨＰＰＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤＶＫＫＣＧＩＱＤＴＮＳＫＫＱＳＤＴＨＬＥＥＴ
配列番号２（抗体ＡのＨＣＤＲ１）
ＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳ
配列番号３（抗体ＡのＨＣＤＲ２）
ＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ
配列番号４（抗体ＡのＨＣＤＲ３）
ＡＲＳＰＤＹＳＰＹＹＹＹＧＭＤＶ
配列番号５（抗体ＡのＬＣＤＲ１）
ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＴＶＮ
配列番号６（抗体ＡのＬＣＤＲ２）
ＹＧＮＳＮＲＰＳ
配列番号７（抗体ＡのＬＣＤＲ３）
ＱＳＹＤＳＳＬＳＧＳＶ
配列番号８（抗体ＡのＨＣＶＲ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＰＤＹＳＰＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号９（抗体ＡのＬＣＶＲ）
ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＡＳＧＴＰＧＱＲＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＴＶＮＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＧＮＳＮＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＳＧＬＱＳＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＳＳＬＳＧＳＶＦＧＧＧＩＫＬＴＶＬＧ
配列番号１０（抗体ＡのＨＣ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＰＤＹＳＰＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＥＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１１（抗体ＡのＬＣ）
ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＡＳＧＴＰＧＱＲＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＴＶＮＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＧＮＳＮＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＳＧＬＱＳＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＳＳＬＳＧＳＶＦＧＧＧＩＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＡＥＣＳ
配列番号１２（抗体ＡのＨＣのＤＮＡ）
ＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＣＣＡＧＴＣＡＧＧＧＧＣＣＧＡＧＧＴＣＡＡＡＡＡＧＣＣＡＧＧＧＴＣＡＴＣＴＧＴＣＡＡＡＧＴＧＴＣＴＴＧＴＡＡＧＧＣＡＴＣＣＧＧＧＧＧＣＡＣＡＴＴＴＴＣＣＡＧＣＴＡＣＧＣＴＡＴＣＴＣＣＴＧＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＧＣＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＧＧＡＡＴＣＡＴＴＣＣＣＡＴＣＴＴＣＧＧＧＡＣＣＧＣＣＡＡＣＴＡＣＧＣＴＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＡＣＴＡＴＴＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＡＡＧＣＡＣＡＴＣＴＡＣＴＧＣＴＴＡＴＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＣＴＡＧＴＣＴＧＡＧＧＴＣＴＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＣＡＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＣＣＧＧＡＧＴＣＣＣＧＡＣＴＡＴＡＧＣＣＣＴＴＡＣＴＡＴＴＡＣＴＡＴＧＧＣＡＴＧＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＡＣＡＧＴＧＡＣＡＧＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＧＣＣＧＡＧＧＧＧＧＣＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＴＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＴＴＣＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＣＡＡＡ
配列番号１３（抗体ＡのＬＣのＤＮＡ）
ＣＡＧＴＣＣＧＴＣＣＴＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＣＣＴＧＧＧＣＡＧＣＧＡＧＴＧＡＣＡＡＴＣＴＣＴＴＧＴＴＣＴＧＧＧＡＧＴＴＣＣＴＣＡＡＡＴＡＴＴＧＧＴＡＧＴＡＡＣＡＣＣＧＴＧＡＡＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＧＡＡＡＣＴＣＡＡＡＴＡＧＧＣＣＡＴＣＣＧＧＡＧＴＣＣＣＣＧＡＣＣＧＧＴＴＣＴＣＴＧＧＴＡＧＴＡＡＡＴＣＡＧＧＣＡＣＴＴＣＣＧＣＣＡＧＣＣＴＧＧＣＴＡＴＴＡＧＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＧＣＣＧＡＴＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＴＣＴＴＡＣＧＡＴＴＣＣＡＧＣＣＴＧＴＣＴＧＧＡＡＧＴＧＴＧＴＴＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＴＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＡＡＧＧＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＧＴＣＡＣＴＣＴＧＴＴＣＣＣＧＣＣＣＴＣＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＴＴＣＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＣＡＴＡＡＧＴＧＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＧＧＧＡＧＣＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＧＣＡＧＡＴＡＧＣＡＧＣＣＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣＣＴＣＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＡＣＡＡＣＡＡＧＴＡＣＧＣＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴＣＣＣＡＣＡＧＡＡＧＣＴＡＣＡＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＣＡＣＧＣＡＴＧＡＡＧＧＧＡＧＣＡＣＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＣＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＣＴＣＴ
【配列表】
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