(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの第１のポリペプチド鎖と、２つの第２のポリペプチド鎖とを含む二重特異性抗体であって、それぞれ
ａ．）前記第１のポリペプチド鎖は、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）及びｍＡｂ  ＩｇＧ重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＨＣは重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１〜３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ１）を有し、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号９であり、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１０であり、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号１１であり、前記ｓｃＦｖは重鎖可変領域（ＨＣＶＲ２）及び軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ２）を有し、ＨＣＶＲ２はＨＣＤＲ４〜６を含み、ＬＣＶＲ２はＬＣＤＲ４〜６を含み、ＨＣＤＲ４のアミノ酸配列は配列番号１２であり、ＨＣＤＲ５のアミノ酸配列は配列番号１３であり、ＨＣＤＲ６のアミノ酸配列は配列番号１４であり、ＬＣＤＲ４のアミノ酸配列は配列番号１８であり、ＬＣＤＲ５のアミノ酸配列は配列番号１９であり、ＬＣＤＲ６のアミノ酸配列は配列番号２０であり、
ｂ．）前記第２のポリペプチドは、軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１〜３を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ１）を含むｍＡｂ軽鎖（ＬＣ）を含み、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１５であり、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１６であり、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号１７であり、
各ｓｃＦｖは、独立して、ＨＣのＮ末端及びＬＣＶＲ２のＣ末端に共有結合しているポリペプチドリンカー（Ｌ１）を介して前記ＨＣに連結され、ＬＣＶＲ２は、ＬＣＶＲ２のＮ末端及びＨＣＶＲ２のＣ末端に共有結合している第２のポリペプチドリンカー（Ｌ２）を介して同じｓｃＦｖのＨＣＶＲ２に連結され、
前記ｍＡｂの可変領域がヒトＣＤ２０に特異的に結合し、かつ、前記ｓｃＦｖの可変領域がヒトＢＡＦＦに特異的に結合する、二重特異性抗体。
【請求項２】
ＨＣＶＲ１のアミノ酸配列が配列番号５であり、ＬＣＶＲ１のアミノ酸配列が配列番号７であり、ＨＣＶＲ２のアミノ酸配列が配列番号６であり、ＬＣＶＲ２のアミノ酸配列が配列番号８である、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項３】
Ｌ１のアミノ酸配列が配列番号２１であり、Ｌ２のアミノ酸配列が配列番号２２である、請求項１及び２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項４】
２つの第１のポリペプチド鎖及び２つの第２のポリペプチド鎖を含む二重特異性抗体であって、前記第１のポリペプチドのそれぞれのアミノ酸配列が配列番号１であり、前記第２のポリペプチドのそれぞれのアミノ酸配列が配列番号２である、二重特異性抗体。
【請求項５】
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列、及び配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を発現することができる、哺乳動物細胞。
【請求項６】
二重特異性抗体が発現されるような条件下で請求項５に記載の哺乳動物細胞を培養することと、前記発現された二重特異性抗体を回収することとによって産生される二重特異性抗体であって、アミノ酸配列が配列番号１であるポリペプチドを含み、かつアミノ酸配列が配列番号２であるポリペプチドを含む、二重特異性抗体。
【請求項７】
治療に使用するための、請求項１〜４及び６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項８】
全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、または原発性シェーグレン症候群の治療に使用するための、請求項１〜４及び６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項９】
請求項１〜４及び６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体及び１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む薬学的組成物。
【請求項１０】
全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、または原発性シェーグレン症候群の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜４及び６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学の分野にあり、特にＣＤ２０及びＴＮＦファミリーのＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）に対する二重特異性抗体の新規分野にある。本発明の二重特異性抗体は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎（ＬＮ）、原発性シェーグレン症候群（ｐＳＳ）、及び／またはグレーブス病（ＧＤ）などのＢ細胞調節不全を有する、１つ以上の自己免疫疾患の治療に有用であることが期待されている。
【０００２】
ＳＬＥ、ＬＮ、及びｐＳＳは、自己抗体の発生を特徴とする全身性自己免疫疾患である。ＳＬＥ患者の推定３０〜６０％は、病気の経過中のある段階で腎障害（ＬＮへの進行を示す組織学的基準）を発症する。ＬＮは、抑制されなければ、腎不全につながり得る複雑で多因子の自己免疫疾患である。ｐＳＳは外分泌腺（例えば、唾液及び涙腺）の慢性炎症を特徴とし、呼吸器系、血管系、神経系、肝臓、及び／または腎機能に影響を及ぼし得る。現在、ｐＳＳに承認された病態修飾治療はない。同様に、現在利用可能なＳＬＥ及びＬＮの治療に対する応答は遅く、しばしば不完全である（患者の約２５〜５０％のみが寛解に達する）。
【０００３】
ＣＤ２０は、初期のプレＢ細胞発生の間にＢ細胞によって発現されるＢリンパ球限定分化抗原である。複数の研究により、ＣＤ２０がＢ細胞活性化の調節因子として、Ｂ細胞の形質細胞への分化に必要な段階として働くことが示されている。分化したＢ細胞は適応免疫に重要であるため、Ｂ細胞枯渇療法（ＢＣＤＴ）は、ＳＬＥ及びＬＮを含む多くの自己免疫疾患の治療として研究されてきた。Ｂ細胞の分化にＣＤ２０が果たす役割は、ＢＣＤＴの標的であるＣＤ２０のアピールに役立つ。しかしながら、これまでのところ、多くの努力にもかかわらず、ＣＤ２０を標的とするＢＣＤＴは、ＳＬＥ、ＬＮ、またはＰＳＳの治療のために承認されていない。
【０００４】
ＢＡＦＦは、Ｂ細胞の生存、増殖及び分化を刺激するサイトカインである。ＢＡＦＦの過剰発現は、ＳＬＥ、ＬＮ及びｐＳＳを模倣する自己免疫疾患のマウスモデルにおいて報告されている。多くの研究は、自己免疫疾患に関連するＢＡＦＦの過剰発現が、自己反応性Ｂ細胞を欠失経路から「救出する」ように働くことを示唆している。しかし、抗ＢＡＦＦ抗体療法は中程度にしか有効でないことが証明されている。
【０００５】
したがって、ＳＬＥ、ＬＮ及びｐＳＳの治療のための代替療法が依然として必要とされている。好ましくは、そのような治療は、現在利用可能な選択肢に対して非応答性であるか、または不十分に恩恵を受けている多数の患者において有効性を示すことができる。１つのそのような代替療法は、２つの異なる生物製剤（例えば、抗体）の同時投与を含み得る。同時投与には、２つの別個の製品の注射または２つの異なる抗体の合剤（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の単回注射のいずれかが必要である。２回の注射は投与量及びタイミングの柔軟性を可能にするが、コンプライアンス、疼痛及び費用に関して患者にとって不便ある。さらに、２つの異なる抗体の化学的及び物理的安定性を可能にする合剤条件を見出すことは、しばしば非常に困難であるかまたは不可能である。したがって、ＳＬＥ、ＬＮ及びｐＳＳの治療のための代替療法が依然として必要であり、好ましくはそのような代替療法は二重特異性抗体を含むであろう。
【０００６】
ＷＯ１９９５０９９１７は、異なる特異性を有する完全抗体（Ａｂ）に融合した一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）ポリペプチドを産生することにより二重特異性を有する二重特異性、４価抗体を組換え的に産生する方法を開示する。米国特許第８，１５３，１２５号は、ヒトＣＤ２０に対する抗体を開示している。米国特許第７，３１７，０８９号は、ヒトＢＡＦＦの可溶性形態及び膜結合形態の両方に対する抗体を開示している。しかし、米国特許第８，１５３，１２５号のＣＤ２０抗体及び米国特許第７，３１７，０８９号のＢＡＦＦ抗体を含む出発二重特異性抗体を作製するＷＯ１９９５０９９１７の教示に従う場合、本発明者らは化学的及び物理的安定性に関連する重大な問題を発見した。これらの問題を十分に克服するために、出発二重特異性抗体に多くの改変が必要であった。変更の必要性も実際の変更も当技術分野で示唆されていない。さらに、いくつかの変更は常用の手順ではなく、共通の一般的な知識から導き出される。同様に、単一抗体そのものはこれらの問題を有しておらず、これらのアミノ酸領域周辺の局所環境は二重特異性抗体という面において異なっていることを示唆している。したがって、ＣＤ２０及びＢＡＦＦの両方を中和する二重特異性抗体による薬理学的介入が必要である。
【０００７】
本発明は、４つのポリペプチド鎖、２つの第１のポリペプチド鎖及び２つの第２のポリペプチド鎖を有する二重特異性抗体を提供し、各第１のポリペプチド鎖は、ポリペプチドリンカー（Ｌ１）を介してｍＡｂ  ＩｇＧ重鎖（ＨＣ）のＮ末端に独立して連結された一本鎖可変フラグメントを含み、各第２のポリペプチド鎖はｍＡｂ軽鎖（ＬＣ）を含む。本発明の二重特異性抗体によれば、各ＨＣは、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１〜３を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ１）を含み、各ＬＣは、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１〜３を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ１）を含む。さらに、本発明の二重特異性抗体によれば、各ｓｃＦｖは、ＬＣＤＲ４〜６を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ２）及びＨＣＤＲ４〜６を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ２）を含む。また、本発明の二重特異性抗体によれば、ＬＣＶＲ２はそのＣ末端がＬ１に連結され、そのＮ末端がＨＣＶＲ２のＣ末端に連結されたポリペプチドリンカー（Ｌ２）に連結される。
【０００８】
本発明の二重特異性抗体の特定の実施形態によれば、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号９で与えられ、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１０で与えられ、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号１１で与えられ、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１５で与えられ、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１６で与えられ、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号１７で与えられ、ＨＣＤＲ４のアミノ酸配列は配列番号１２で与えられ、ＨＣＤＲ５のアミノ酸配列は配列番号１３で与えられ、ＨＣＤＲ６のアミノ酸配列は配列番号１４で与えられ、ＬＣＤＲ４のアミノ酸配列は配列番号１８で与えられ、ＬＣＤＲ５のアミノ酸配列は配列番号１９で与えられ、及びＬＣＤＲ６のアミノ酸配列は配列番号２０で与えられる。
【０００９】
特定の実施形態によれば、ＨＣはｍＡｂ  ＩｇＧ１アイソタイプを含む。いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、エフェクター機能を増強する各ＨＣの定常領域に１つ以上の修飾を含む。さらに特定の実施形態は、アミノ酸、残基６０１のグルタミン酸及び残基６０８のグルタミンを含む（残基は表１の例示的な二重特異性抗体の第１のポリペプチドに基づき番号付けされる）。
【００１０】
さらなる特定の実施形態によれば、各ＬＣは、ｍＡｂ  ｋａｐｐａ軽鎖を含む。そのようないくつかの実施形態では、ＬＣＶＲ１のアミノ酸配列は配列番号７で与えられ、ＬＣＶＲ２のアミノ酸配列は配列番号８で与えられる。さらなる特定の実施形態によれば、ＨＣＶＲ１のアミノ酸配列は配列番号５で与えられ、ＨＣＶＲ２のアミノ酸配列は配列番号６で与えられる。なおさらなる実施形態によれば、Ｌ１のアミノ酸配列は配列番号２１によって与えられ、Ｌ２のアミノ酸配列は配列番号２２によって与えられる。本発明の二重特異性抗体のなおさらに特定の実施形態では、各第１のポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１で与えられ、各第２のポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２で与えられる。
【００１１】
本発明はまた、本発明の二重特異性抗体をコードする核酸分子及び発現ベクターに関する。一実施形態では、本発明は、第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供し、第１のポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１である。一実施形態では、本発明はまた、第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供し、第２のポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２である。さらなる実施形態では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、かつ配列番号２のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供する。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号３で与えられ、配列番号２のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号４で与えられる。
【００１２】
本発明はまた、細胞が、本発明の第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む二重特異性抗体を発現することができる、ＤＮＡ分子で形質転換された哺乳動物細胞を提供する。また、本発明は、本発明の二重特異性抗体が発現される条件下で哺乳動物細胞を培養することを含む、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む二重特異性抗体を産生するためのプロセスを提供する。本発明はまた、該プロセスによって産生される二重特異性抗体を提供する。
【００１３】
本発明はまた、Ｂ細胞調節不全を有する自己免疫疾患、例えばＳＬＥ、ＬＮ、ｐＳＳ、またはＧＤを治療する方法であって、それを必要とする患者に本発明の二重特異性抗体の有効量を投与することを含む方法を提供する。
【００１４】
本発明はまた、治療に使用するための本発明の二重特異性抗体を提供する。より特別には、本発明は、ＳＬＥ、ＬＮ、ｐＳＳ、またはＧＤの治療に使用するための本発明の二重特異性抗体を提供する。
【００１５】
本発明はまた、本発明の二重特異性抗体及び１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は、ＳＬＥ、ＬＮ、ｐＳＳ、またはＧＤの治療に使用することができ、そのような治療は、それを必要とする患者に本発明の薬学的組成物を投与することを含む。
【００１６】
一実施形態では、本発明はまた、ＳＬＥ、ＬＮ、ｐＳＳ、またはＧＤの治療のための薬剤の製造における本発明の二重特異性抗体の使用を提供する。
【００１７】
本明細書で言及されるように、用語「二重特異性抗体」は、４つの抗原結合部位を含む操作されたポリペプチドを指す。４つの抗原結合部位のうち２つはＣＤ２０に結合し、他の２つの抗原結合部位はＢＡＦＦに結合する。本発明の二重特異性抗体は、ＣＤ２０及びＢＡＦＦに単独でまたは同時に結合することができ、インビトロ及び／またはインビボで少なくとも１つのヒトＣＤ２０生物活性及び少なくとも１つのヒトＢＡＦＦ生物活性を中和する。本発明の二重特異性抗体は、インビトロでＢＡＦＦの存在下または非存在下でのＣＤ２０の強力な阻害剤でもある。
【００１８】
また、本明細書で言及する二重特異性抗体は、４つのポリペプチド鎖、２つの第１のポリペプチド及び２つの第２のポリペプチドを含む。第１のポリペプチドのそれぞれは、ポリペプチドリンカー（Ｌ１）によってｍＡｂ重鎖（ＨＣ）のＮ末端に連結された一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含むように操作される。第２のポリペプチドの各々は、モノクローナル抗体軽鎖（ＬＣ）を含み、第１のポリペプチドの１つ、具体的には第１のポリペプチドのＨＣ内に鎖間ジスルフィド結合を形成するように操作される。各第１のポリペプチドは、第１のポリペプチドのそれぞれのＨＣ間に、他の第１のポリペプチドとの鎖間ジスルフィド結合を形成するように操作される。各第１のポリペプチドは、鎖内ジスルフィド結合を形成するようにさらに操作され、具体的にはそれぞれの第１のポリペプチドのｓｃＦｖ内にある。
【００１９】
本明細書で言及する第１のポリペプチドの「一本鎖可変フラグメント」（ｓｃＦｖ）は、ポリペプチドリンカー（Ｌ２）を介して連結された重鎖可変領域（ＨＣＶＲ２）及び軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ２））。さらに、本明細書において（及び以下の略図に示されるように）、各ｓｃＦｖのＬＣＶＲ２は、そのＣ−末端で、（第１のポリペプチドの）１つのＨＣのＮ末端にポリペプチドリンカー（Ｌ１）、第２のポリペプチドリンカー（Ｌ２）を介して同じｓｃＦｖのＨＣＶＲ２のＣ末端にＮ末端で結合している。
【化１】
0006529602.tif 000002
【００２０】
本発明の二重特異性抗体によれば、各第１のポリペプチドのＨＣは、アイソタイプ（例えばＩｇＧとして）を規定するガンマとして分類される。アイソタイプは、さらにサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）に分けられ得る。特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗体はＩｇＧ１である。各ＨＣのＣ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域（ＣＨ）を規定する。特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、エフェクター機能を増強する各ＨＣのＣＨに１つ以上の修飾を有する。より特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗体はＩｇＧ１であり、エフェクター機能を増強する両方のＨＣのＣＨに修飾を有する。さらにより特定の実施形態では、そのような修飾には、両方のＨＣのＣＨの残基６０１のグルタミン酸及び残基６０８のグルタミン（残基は表１の例示的な二重特異性抗体の第１のポリペプチドに基づき番号付けされる）が含まれる。各第１のポリペプチドの各ＨＣのＮ末端部分は、可変領域（ＨＣＶＲ１）を含む。
【００２１】
さらに、本発明の二重特異性抗体によれば、第２のポリペプチドを含む各ｍＡｂ軽鎖（ＬＣ）は、カッパまたはラムダとして分類され、当該分野で公知の特定の定常領域によって特徴付けられる。特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗体はカッパＬＣを含む。各ＬＣのＣ末端部分は軽鎖定常領域を規定し、各第２のポリペプチドの各ＬＣのＮ末端部分は軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ１）を含む。
【００２２】
各ｓｃＦｖのそれぞれのＨＣ及びＬＣ及びＨＣＶＲ２及びＬＣＶＲ２のＨＣＶＲ１及びＬＣＶＲ１は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれ、より保存された領域が点在し、フレームワーク領域と呼ばれる超可変領域にさらに細分することができるＦＲ）。好ましくは、本発明の二重特異性抗体のフレームワーク領域は、ヒト由来であるか、または実質的にヒト由来である。本発明による二重特異性抗体の各ＨＣＶＲ１、ＨＣＶＲ２、ＬＣＶＲ１及びＬＣＶＲ２は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順にアミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。ここで、各ＨＣＶＲ１の３つのＣＤＲは「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３」と呼ばれ、各ＨＣＶＲ２の３つのＣＤＲは「ＨＣＤＲ４、ＨＣＤＲ５及びＨＣＤＲ６」と呼ばれ、各ＬＣＶＲ１の３つのＣＤＲは「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３」と呼ばれ、各ＬＣＶＲ２の３つのＣＤＲは、「ＬＣＤＲ４、ＬＣＤＲ５及びＬＣＤＲ６」と呼ばれる。ＣＤＲは、抗原と特異的な相互作用を形成する残基の大部分を含む。特定の抗原に結合する本発明の二重特異性抗体の機能的能力は、６つのＣＤＲによって大きく影響される。
【００２３】
本明細書において互換的に使用される場合、「抗原結合部分」、「抗原結合部位」及び「抗原結合領域」は、抗原と相互作用するアミノ酸残基を含む本発明の二重特異性抗体の部分を指し、それぞれの抗原に対する二重特異性抗体の特異性及び親和性を付与する。本発明の二重特異性抗体によれば、抗原結合部位はＨＣＶＲ１／ＬＣＶＲ１対（鎖間ジスルフィド結合によって結合されたＬＣ及びＨＣ）及びｓｃＦｖ  ＨＣＶＲ２／ＬＣＶＲ２対によって形成される。さらに、本発明の二重特異性抗体によれば、各ＨＣＶＲ１／ＬＣＶＲ１対によって形成される抗原結合部位は同じであり（例えば、同じ抗原に対する特異性及び親和性を含む）、各ｓｃＦｖ  ＨＣＶＲ２／ＬＣＶＲ２対によって形成される抗原結合部位は同じである（例えば、同じ抗原に対する特異性及び親和性を含む）。しかしながら、本発明の二重特異性抗体によれば、各ｓｃＦｖ  ＨＣＶＲ２／ＬＣＶＲ２対によって形成された抗原結合部位から、各ＨＣＶＲ１／ＬＣＶＲ１対によって形成される抗原結合部位は異なる（例えば異なる抗原に対する特異性及び親和性を含む）。
【００２４】
本明細書において互換的に使用される「親抗体」または「親抗体」は、ｍＡｂの１つ（例えば、ＨＣ及びＬＣの両方）及び二重特異性抗体のｓｃＦｖの調製に使用されるアミノ酸配列によってコードされる抗体であり、例えばアミノ酸置換及び構造改変を介して行われる。親抗体は、マウス、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体であってもよい。本発明による二重特異性抗体を構築する初期の試みは、親ＢＡＦＦ抗体（例えば、米国特許第７，３１７，０８９号に記載されている）を様々な配置及び配向でｓｃＦｖ部分を含むように操作し及び親ＣＤ２０抗体を（例えば、米国特許第８，１５３，１２５号に記載されている）、二重特異性抗体のｓｃＦＶ部分及びｍＡｂ部分の両方を含むように操作した構築物を含んでいた。
【００２５】
「Ｋａｂａｔ番号付け」または「Ｋａｂａｔラベリング」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。当技術分野で認識されているこれらの用語は、抗体の重鎖及び軽鎖可変領域における他のアミノ酸残基よりもより可変性（すなわち超可変性）であるアミノ酸残基を番号付けするシステムを指す（Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２−９３（１９７１）、Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１））。
【００２６】
用語「Ｎｏｒｔｈ番号付け」または「Ｎｏｒｔｈラベリング」は、本明細書では交換可能に使用される。当技術分野で認識されているこれらの用語は、抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の他のアミノ酸残基よりもより可変性（すなわち超可変性）であるアミノ酸残基を番号付けするシステムを指し、（Ｎｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＣＤＲ  Ｌｏｏｐ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４０６：２２８−２５６（２０１１）に記載されているように、少なくとも部分的に多数の結晶構造を有する親和性伝播クラスタリングをベースにする。
【００２７】
様々な領域及びリンカーの関係が、本発明の例示的な二重特異性抗体において、表１に例示されている（アミノ酸の番号付けは直線的番号付けを適用し、アミノ酸の可変ドメインへの割り当ては、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇで入手可能なＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）に基づき、アミノ酸のＣＤＲドメインへの割り当ては、周知のＫａｂａｔ及びＮｏｒｔｈ番号付け協定に基づき及び表１の最後に反映される）。
【表１】
0006529602.tif 000003
【００２８】
表１中の本発明の例示的な二重特異性抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する２つの第１のポリペプチド及び配列番号２のアミノ酸配列を有する２つの第２のポリペプチドを含む。表１に示される本発明の例示的二重特異性抗体によれば、第１のポリペプチドの各々は、配列番号１のシステイン残基４８９と配列番号２のシステイン残基２１３との間の第２のポリペプチドの各々と鎖間ジスルフィド結合；他の第１のポリペプチドとの少なくとも２つの鎖間ジスルフィド結合、第１のポリペプチドのシステイン残基４９５（配列番号１のもの）と他の第１のポリペプチドのシステイン残基４９５（配列番号１のもの）との間に形成される第１の鎖間ジスルフィド結合、第１のポリペプチドのシステイン残基４９８（配列番号１の）と他の第１のポリペプチドのシステイン残基４９８（配列番号１の）との間に形成される第２の鎖間ジスルフィド結合；各第１のポリペプチドのシステイン残基４４（配列番号１の）とシステイン残基２４３（配列番号１の）との間の各第１のポリペプチドのｓｃＦｖ中に形成された鎖内ジスルフィド結合を形成する。さらに、表１の例示的な二重特異性抗体は、両方の第１のポリペプチドの配列番号１のアスパラギン残基５６６でグリコシル化されている。
【００２９】
二重特異性抗体工学
本発明の二重特異性抗体を構築する場合、化学的及び物理的安定性に関連する重大な問題に遭遇した。遭遇する問題には、発現不良、スプライス変異体形成、貧弱な精製回収、低い熱安定性、発現した二重特異性抗体の凝集、ｓｃＦｖのミスフォールディング、ＬＣクリッピング、低結合親和性及び低標的中和活性、不十分な溶解性及びインビボでの迅速なクリアランスを含む。
【００３０】
例えば、本発明による二重特異性抗体を構築する初期の試みは、親ＣＤ２０抗体（例えば米国特許第８１５３１２５号に記載されている）がｍＡｂ抗体部分を含み、親ＢＡＦＦ抗体（例えば、米国特許第７，３１７，０８９号に記載されている）が二重特異性抗体のｓｃＦｖ部分を含む構築物を含んでいた。初期の構築物は、ｓｃＦｖ部分が、ＨＣ及びＬＣのそれぞれのアミノ末端またはカルボキシル末端を含む様々な配置でｍＡｂ部分に結合されていることを含んでいた。さらに、最初の構築物は、ＨＣＶＲ２及びＬＣＶＲ２の配置が異なるｓｃＦｖ部分を含んでいた（例えば、ｍＡｂ部分（ＣまたはＮ末端）−リンカー１−ＬＣＶＲ２またはＨＣＶＲ２−リンカー２−ＬＣＶＲ２またはＨＣＶＲ２の他方）。さらに、親ＢＡＦＦ抗体構築物は、重鎖生殖細胞系フレームワークＶＨ４−５９及びＶＨ４−３４、及び軽鎖生殖細胞系フレームワークＬ６の組み合わせを含んでいた。親ＣＤ２０抗体構築物はまた、重鎖生殖細胞系フレームワークＶＨ５−５１及び軽鎖生殖細胞系フレームワークＡ２７の組み合わせを含んでいた。親ＣＤ２０抗体構築物はまた、例えば、米国特許第８１５３１２５号に記載されているように、ＩｇＧ１サブクラスを有するＨＣ、ならびに（ＩｇＧ１サブクラスの）各ＨＣの定常領域（ＣＨ）内の改変を含む。初期の構築物はヒトＩｇＧ１−Ｆｃ哺乳動物発現ベクターにクローニングし、そしてＨＥＫ２９３Ｆ細胞で発現させた。しかしながら、（上記のように）最初に産生された二重特異性構築物は、上記の化学的及び／または物理的問題の１つ以上を示した。
【００３１】
したがって、本発明の二重特異性抗体を構築しようとすることに伴う重要な化学的及び物理的安定性の問題に対処するための構造改変がなされた。例えば、親ＢＡＦＦ抗体と比較して、ＨＣＤＲ４、ＨＣＤＲ５、ＬＣＤＲ４、ＬＣＤＲ５、及びＬＣＤＲ６において改変が行われた。さらに、構築されたＨＣＶＲ２及びＬＣＶＲ２を、以下の式に従ってＢＡＦＦ  ｓｃＦｖフォーマットに操作した：
【化２】
0006529602.tif 000004
ＢＡＦＦ  ｓｃＦｖを安定化するためのジスルフィド結合は、ＨＣＶＲ２（Ｇ４４Ｃ）とＬＣＶＲ２（Ｇ２４３Ｃ）との間で操作された（アミノ酸残基は表１の例示的な二重特異性抗体に基づき番号付けされる）。さらに、重鎖生殖細胞系フレームワークは、親ＢＡＦＦ抗体と比較して、ＨＣ４−５９からＨＣ４−３４に変更した。本発明の二重特異性抗体のｍＡｂ部分はまた、ＣＤ２０の結合親和性及び中和を含む化学的及び物理的安定性の問題（上記）に対処するように操作された。例えば、親ＣＤ２０抗体に対する改変は、ＬＣＤＲ３及びＨＣのＣＨ（具体的には、ＨＣ  ＩｇＧ１骨格のＣＨ２領域）において操作された。
【００３２】
さらに、二重特異性抗体の静電表面電荷を計算し、帯電パッチを同定し、破壊した。広範な安定性研究を行い、構築された二重特異性抗体を熱安定性及び物理的及び化学的安定性ならびにＢＡＦＦ及びＣＤ２０の結合特性及び中和特性についてそれぞれの親抗体と比較してスクリーニングした。
【００３３】
操作されたＢＡＦＦ  ｓｃＦｖ構築物及びＣＤ２０  ｍＡｂ構築物（広範な化学的改変及び物理的改変を含み、本明細書に記載の方法で配向される）をコードする核酸配列を、ＣＨＯ及びＨＥＫ２９３などの哺乳動物細胞による発現のためにＩｇＧ１発現ベクターに操作した。本発明の二重特異性抗体の初期発現の後、スプライス変異体部位が同定された。スプライス変異体の問題は、ＣＨＯ及びＨＥＫ２９３のような哺乳動物細胞による発現のためにＩｇＧ１発現ベクターに再操作された核酸配列への設計されたサイレント改変の導入によって排除された。本発明の発現された二重特異性抗体は、化学的及び物理的安定性ならびにＢＡＦＦ及びＣＤ２０結合親和性及び中和特性を含む機能的特性について広範にスクリーニングされた。
【００３４】
本明細書に記載されるように配向された場合、改変されたＩｇＧ１サブクラス（天然のＩｇＧ１：Ｉ６０１Ｅ、Ａ６０８Ｑと比較して）及びＣＤＲ改変（親ＣＤ２０抗体：Ｎ９３ＨのＬＣＤＲ３と比較して）ならびに７つのＣＤＲ改変（親ＢＡＦＦ抗体：Ｙ３２Ｈ、Ｙ９９Ａ、Ｙ１００Ｒ、Ｙ１０７Ｌ、Ｆ１１０Ｙ及びＹ１１２ＨのＨＣＶＲ、Ｗ２３７ＨのＬＣＶＲと比較して）及び改変ＨＣフレームワーク（親ＢＡＦＦ抗体：ＶＨ４−３４→ＶＨ４−３９と比較して）を有するＢＡＦＦ  ｓｃＦｖを含む、ＣＤ２０ｍＡｂを含むように操作された二重特異性抗体は、初期構造物において示された発現、物理的安定性、化学的安定性、熱安定性、ならびに親和性及び中和の問題（上記）の改善として識別された（アミノ酸残基は表１の例示的な二重特異性抗体に基づき番号付けされる）。さらに、これらの改変された改変は、カニクイザルにおけるクリアランスの改善された速度をもたらした。上記の改変のいずれも、当技術分野で示唆されたルーチンまたは一般的な一般知識ではなく、これらの改変の必要性は、個々の親抗体の最初の特徴付けにおいて同定されなかった。
【００３５】
二重特異性抗体発現
これらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を導くことができる発現ベクターは、当技術分野で周知である。発現ベクターは、宿主細胞からのポリペプチドの分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチドであり得る。第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖は、それらが１つのベクター中で作動可能に連結されている異なるプロモーターから独立して発現されてもよく、あるいは、第１及び第２のポリペプチド鎖は、それらが第１のポリペプチド鎖を発現するものと第２のポリペプチド鎖を発現するものである、２つのベクターに作動可能に連結されている異なるプロモーターから独立して発現することができる。
【００３６】
宿主細胞は、本発明の第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、または第１及び第２のポリペプチド鎖の両方を発現する１つまたは複数の発現ベクターで安定にまたは一時的にトランスフェクト、形質転換、形質導入、または感染された細胞を含む。本発明の二重特異性抗体を産生する宿主細胞株の作製及び単離は、当該分野で公知の標準技術を用いて達成することができる。哺乳動物細胞は、二重特異性抗体の発現に好ましい宿主細胞である。特定の哺乳動物細胞は、ＣＨＯ及びＨＥＫ２９３である。好ましくは、二重特異性抗体は宿主細胞が培養される培地中に分泌され、そこから二重特異性抗体は従来技術により回収または精製され得る。例えば、培地は、従来の方法を用いてプロテインＡまたはプロテインＡカラムに適用し、溶離することができる。さらに、可溶性凝集体及び多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む一般的な技術によって効果的に除去することができる。生成物は直ちに、例えば−７０℃で凍結してもよく、または凍結乾燥してもよい。
【００３７】
抗体の哺乳類発現がグリコシル化をもたらすことは、当技術分野において周知である。典型的には、高度に保存されたＮ−グリコシル化部位で抗体のＦｃ領域にグリコシル化が起こる。Ｎ−グリカンは、典型的にはアスパラギンに結合する。例として、表１に示される例示的な二重特異性抗体の各ＨＣは、配列番号１のアスパラギン残基５６６でグリコシル化されている。
【００３８】
治療的使用
本明細書中で使用される場合、「治療」及び／または「治療する」は、すべてのプロセスを指すものとし、本明細書に記載の障害の進行の遅延、中断、阻止、制御、または停止があり得るが、必ずしもすべての障害症状の完全な排除を示すわけではない。治療は、患者における疾患または状態の治療のための本発明の二重特異性抗体の投与を含み、それは、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞及び／またはＢＡＦＦのレベルの低下、またはＣＤ２０陽性Ｂ細胞及び／またはＢＡＦＦの生物活性の低下により利益を得るものであり、ならびに、（ａ）疾患のさらなる進行を阻害すること、すなわちその進行を阻止すること、及び（ｂ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患または障害の退行を引き起こすこと、またはその症状または合併症を緩和することを含む。本発明の二重特異性抗体は、ＳＬＥ、ＬＮ、ｐＳＳ及び／またはＧＤを含むＢ細胞調節不全を有する自己免疫疾患を治療することが期待される。
【００３９】
本明細書において交換可能に使用される「患者」、「被験者」及び「個体」という用語は、ヒトを指す。特定の実施形態では、患者は、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞及びＢＡＦＦの両方のレベルの低下または生物活性の低下から利益を得る疾患、障害または状態（例えば、自己免疫障害）をさらに特徴とする。別の実施形態では、患者は、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞及びＢＡＦＦの両方のレベルの低下または生物活性の低下から恩恵を受ける障害、疾患または状態を発症する危険性があるとさらに特徴付けられる。
【００４０】
薬学的組成物
本発明の二重特異性抗体は、患者への投与に適した薬学的組成物に組み込むことができる。本発明の二重特異性抗体は、患者に単独で、または薬学的に許容される担体及び／または希釈剤と共に単回または複数回投与することができる。そのような薬学的組成物は、選択された投与様式に適切であるように設計されており、薬学的に許容される希釈剤、担体及び／または分散剤のような賦形剤、緩衝剤、界面活性剤、保存剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などが適宜使用される。前記組成物は、例えば、開業医には一般的に知られている配合技術の概要を提供するＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９９５に開示されている従来の技術に従って設計することができる。薬学的組成物に適した担体には、本発明の二重特異性抗体と組み合わせた場合、分子の活性を保持し、患者の免疫系と非反応性である任意の物質が含まれる。本発明の薬学的組成物は、二重特異性抗体及び１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む。
【００４１】
本発明の二重特異性抗体を含む薬学的組成物は、標準的な投与技術を用いて、本明細書に記載の疾患または障害の危険性があるかまたは存在する患者に投与することができる。
【００４２】
本発明の薬学的組成物は、有効量の本発明の二重特異性抗体を含有する。有効量とは、所望の治療結果を達成するのに必要な量（投薬量及び時間及び投薬手段で）を意味する。二重特異性抗体の有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する抗体または抗体部分の能力などの因子に従って変化し得る。有効量はまた、二重特異性抗体の毒性または有害な効果が治療上有益な効果よりも大きいものである。
【実施例】
【００４３】
他に記載されている場合を除いて、実施例を通して参照される例示的に操作された二重特異性抗体は、上記の表１に提示された本発明の例示的な二重特異性抗体を指す。
【００４４】
二重特異性抗体の発現及び精製
例示的な二重特異性抗体は本質的に以下のように発現され及び精製される。配列番号３（例示的な、配列番号１の第１のポリペプチド鎖をコードする）及び配列番号４（例示的な、配列番号２の第２のポリペプチド鎖をコードする）に関するＤＮＡを含むグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）発現ベクターを用いて、チャイニーズハムスター細胞株（ＣＨＯ、ＧＳノックアウトクローン１Ｄ３）をエレクトロポレーションによりトランスフェクトする。発現ベクターはＳＶアーリー（シミアンウイルス４０Ｅ）プロモーター及びＧＳ遺伝子をコードする。ＧＳの発現は、ＣＨＯ細胞によって必要とされるアミノ酸であるグルタミンの生化学的合成を可能にする。トランスフェクション後、細胞を５０μＭ  Ｌ−メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）でバルク選択にかける。ＭＳＸによるＧＳの阻害は、選択のストリンジェンシーを高めるために利用される。宿主細胞ゲノムの転写活性領域への発現ベクターｃＤＮＡの組み込みを有する細胞は、ＧＳの内因性レベルを発現するＣＨＯ野生型細胞に対して選択することができる。トランスフェクションされたプールは、安定した発現細胞のクローン伸長に近づけるようにするために、低密度でプレーティングされる。マスターウエル（ｍａｓｔｅｒｗｅｌｌ）を二重特異性抗体発現についてスクリーニングし、次いで無血清懸濁培養においてスケールアップして、生産に使用する。例示的な二重特異性抗体が分泌された清澄化された培地を、リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）などの適合性緩衝液で平衡化されたプロテインＡアフィニティーカラムに適用する。カラムを洗浄して非特異的結合成分を除去する。結合された二重特異性抗体は、例えばｐＨ勾配（０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．８〜０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ２．５など）によって溶出され、トリス、ｐＨ８緩衝液で中和される。二重特異性抗体画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは分析的サイズ排除などによって検出され、その後プールされる。可溶性凝集体及び多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む一般的な技術によって効果的に除去することができる。二重特異性抗体は、一般的な技術を用いて濃縮及び／または滅菌濾過される。これらのクロマトグラフィー工程後の例示的な二重特異性抗体の純度は９８％より大きい（モノマー）。二重特異性抗体は、直ちに−７０℃で凍結するか、または４℃で数ヶ月保存することができる。
【００４５】
ＣＤ２０に対する二重特異性抗体結合親和性
ＭＳＤ  ＳＩ６０００装置（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いて、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙに基づく溶液平衡滴定法（ＭＳＤ−ＳＥＴ）により、ヒトＣＤ２０に対する例示的な二重特異性抗体の結合親和性及び化学量論を測定する。マルチアレイ９６ウェルアッセイプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、品番Ｌ１５ＸＡ−３）をＰＢＳ中の０．５μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＦｃ捕捉抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、品番１０９−００５−０９８）でコーティングして、４℃で一晩インキュベートする。インキュベーション後、プレートをＰＢＳで洗浄し、次いで３％ブロッカーＡ溶液（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、品番Ｒ９３ＡＡ−１）を用いて室温で６０分間ブロックする。次いで、プレートを再びＰＢＳで洗浄する。
【００４６】
例示的な二重特異性抗体試料は、５００ｐＭまたは２５ｐＭのいずれかで二連で調製される。固定化したＷＩＬ２−Ｓ細胞（ＣＤ２０、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８８８５を発現するヒトＢリンパ腫細胞）を遠心分離（５００×Ｇ、１０℃で、４分間）によって沈殿させ、上清を捨てて、沈殿物を４億個の細胞／ｍＬの濃度の３％ブロッカーＡ溶液に再懸濁する。細胞を７０００細胞／ｍＬまで３％ブロッカーＡ溶液を含むＶ底９６ウェルプレート内で連続希釈（３倍希釈を使用）する（各二重特異性抗体濃度の複製のための合計１１の細胞濃度を作成する。）。ブランク（無細胞／ｍＬ）試料も、滴定曲線に含めるために作成する（各複製物について１２番目の濃度を作成する）。
【００４７】
例示的な二重特異性抗体（３％ブロッカーＡ溶液で１ｎＭまたは５０ｐＭに希釈）は、１：１の比で、１１の異なる細胞濃度及び各複製のブランクのそれぞれと混合される（例示的な二重特異性抗体の最終濃度は５００ｎＭまたは２５ｐＭであり；ＷＩＬ２−Ｓ細胞の最終濃度は約２億細胞／ｍＬ〜約３５００細胞／ｍＬである）。混合物をプレートシェーカー上で、３７℃で一晩インキュベートし、次いで遠心分離（５００×Ｇ、１０℃で４分間）により沈殿させる。遠心分離後、５０μＬを、予めヤギ抗ヒトＦｃ捕捉抗体でコーティングしたＭＳＤマルチアレイ９６ウェルアッセイプレートのウェルに加え、プレートシェーカー上で、室温で６０分間インキュベートする。次いで、プレートをＰＢＳで洗浄する。その後、１％ブロッカーＡ溶液中の１μｇ／ｍＬ  ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧコンジュゲート抗ヒト／ＮＨＰカッパ軽鎖二次抗体（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、品番Ｄ２０ＴＦ−６）２５μＬを各ウェルに添加する。その後、プレートをプレートシェーカー上で室温で６０分間インキュベートし、次いでＰＢＳで３回洗浄する。１Ｘ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、品番Ｒ９２ＴＣ−１）を各ウェルに加え、プレートをＭＳＤＳＩ６０００プレートリーダー（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ）で読み取る。データはＫｉｎＥｘＡ  Ｐｒｏソフトウェア（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｉｓｅ  ＩＤ）にエクスポートされ、結果を「Ａｆｆｉｎｉｔｙ，Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｐａｒｔｎｅｒ（ＴＣＭを計算する）」モデルに適合させＫＤを決定する。
【００４８】
上記アッセイはまた、ヒトＢＡＦＦの飽和量の存在下で行われ、その際、例示的な二重特異性抗体の濃度が（１１の異なる細胞濃度と混合した後）１００ｐＭまたは２ｎＭのいずれかで保持され、及びヒトＢＡＦＦが１０倍モル過剰で添加される（それぞれ１ｎＭ及び２０ｎＭトリマー濃度）。
【００４９】
実質的に本明細書に記載されるように決定された、（飽和ヒトＢＡＦＦの存在しない）ヒトＣＤ２０（Ｎ＝３）に対する例示的な二重特異性抗体の結合親和性は、ＫＤ＝２３９±６８ｐＭ（平均±標準偏差）である。実質的に本明細書に記載されるように決定された、（飽和ヒトＢＡＦＦの存在下）ヒトＣＤ２０（Ｎ＝３）に対する例示的な二重特異性抗体の結合親和性は、ＫＤ＝３０５±１３３ｐＭ（平均±標準偏差）である。これらの結果は、本発明の例示的な二重特異性抗体が、飽和濃度の組換えヒトＢＡＦＦの存在下または非存在下で、ヒトＣＤ２０との結合応答（二重特異性抗体の濃度に依存する）を生じることを示す。
【００５０】
ＢＡＦＦに対する二重特異性抗体結合親和性
ヒトＢＡＦＦに対する例示的な二重特異性抗体の結合親和性及び化学量論は、精製された組換えヒト可溶性ＢＡＦＦ（ＨＥＫ２９３細胞から発現される）を使用するＭＳＤ−ＳＥＴによって測定される。精製した組換えＢＡＦＦをＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣビオチン試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、品番２１３３５）を用いてビオチン化する。インビトロでのＢｉａｃｏｒｅアッセイ（データは示されていない）は、天然及びビオチン化組み換えＢＡＦＦが同様の結合特性を示すことを示す。
【００５１】
マルチアレイ９６ウェルアッセイプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、品番Ｌ１５ＸＡ−３）を３．５μｇ／ｍＬの二重特異性抗体でコーティングし、４℃で一晩インキュベートする。インキュベーション後、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、次いで室温で４５分間３％ブロッカーＡ溶液を用いてブロックする。次いで、プレートを再びＰＢＳで洗浄する。
【００５２】
例示的な二重特異性抗体を、２２４ｐＭの濃度で開始して、Ｖ底９６ウェルプレート中で連続的に希釈し（２倍希釈を使用）、１２の異なる二重特異性抗体濃度を作成する。７ｐＭのビオチン化組換え体ＢＡＦＦを、例示的な二重特異性抗体の各希釈液と混合し、３７℃で３６〜４８時間インキュベートする（平衡に到達させる）。平衡化した試料を、例示的な二重特異性抗体で予めコーティングしたＭＳＤマルチアレイ９６ウェルアッセイプレートのウェルに添加し、試料を２．５分間混合し、次いでＰＢＳで３回洗浄する。その後、１％ブロッカーＡ溶液中の１μｇ／ｍＬ  ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識ストレプトアビジン検出試薬（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、品番Ｒ３２ＡＤ−５）２５μＬを各ウェルに添加する。次いで、プレートをプレートシェーカー上で室温で３分間インキュベートし、次いでＰＢＳで洗浄する。１Ｘ読み取りバッファーＴ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、品番Ｒ９２ＴＣ−１）を各ウェルに加え、プレートをＭＳＤＳＩ６０００プレートリーダー（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ）で読み取る。得られた結合シグナルは、溶液中の遊離抗原の量を反映する。データはＫｉｎＥｘＡ  Ｐｒｏソフトウェアにエクスポートされ、結果を「標準、親和性」結合モデルに適合してＫＤを決定する。
【００５３】
実質的に本明細書に記載されるように決定された組換えヒトＢＡＦＦ（Ｎ＝３）に対する例示的な二重特異性抗体の結合親和性は、ＫＤ＝０．３±０．４ｐＭ（平均±標準偏差）である。これらの結果は、本発明の例示的な二重特異性抗体がヒトＢＡＦＦとの結合応答（二重特異性抗体の濃度に依存する）を生じることを示す。
【００５４】
ＣＤ２０とＢＡＦＦの同時結合
フローサイトメトリーを用いて、例示的な二重特異性抗体がＣＤ２０及びＢＡＦＦに同時に結合するかどうかを決定する。例示的な二重特異性抗体及び対照ヒトＩｇＧ１抗体を、それぞれ、製造業者の使用説明書に従ってＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４８８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、品番Ａ１０４６８）で蛍光標識する。組換えヒトＢＡＦＦをビオチン化し、５０００ｎｇから０．３２ｎｇまで連続希釈（５倍希釈を使用）する。
【００５５】
ＪＹ細胞株は、細胞表面上にＣＤ２０を発現するＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス不死化ヒトＢ細胞リンパ芽球系統（ＡＴＣＣ７７４４２）である。ＪＹ細胞を、ビオチン化ＢＡＦＦと、ａ）１μｇの標識化例示的な二重特異性抗体、またはｂ）１μｇの標識化対照ＩｇＧ１抗体のいずれかとの各希釈物と共に４℃で３０分間インキュベートする。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中２％ウシ胎仔血清）で２回洗浄し、分析のためにＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁する。フローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＦＣ５００）によってＣＤ２０とＢＡＦＦの両方の結合を同時に検出する。ＣＤ２０結合はＦＬ−１（ＦＩＴＣ）チャネルで検出され、ＢＡＦＦ結合はＦＬ−２（ＰＥ）チャネルで検出される。ＦＡＣＳデータは、ＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ４（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）によって解析される。結果を表２に示す。
【表２】
0006529602.tif 000005
【００５６】
表２の結果は、本発明の例示的な二重特異性抗体が、飽和濃度のＢＡＦＦにおいてさえも、細胞表面上のヒトＣＤ２０及び可溶性ＢＡＦＦに結合することができることを示す。
【００５７】
インビトロでのＴ１１６５．１７細胞の可溶性及び膜結合性ＢＡＦＦ誘発増殖の中和
Ｔ１１６５．１７細胞は、Ｔ１１６５マウス形質細胞腫（ＢＡＬＢ／ｃ  ＡｎＰｔマウスの腹水腫瘍に由来する）からサブクローニングされたＢＡＦＦ応答性マウス細胞株である。Ｔ１１６５．１７細胞は低レベルのＩＬ−１βを必要とすることが研究によって示されているが、短期間の増殖アッセイでは他のサイトカインがＩＬ−１βの代わりになり得ることが示されている。
【００５８】
可溶性ヒトＢＡＦＦ（５ｎｇ／ｍＬ）または膜結合性ヒトＢＡＦＦ（１８．１ｎｇ／ｍＬ）を９６ウェルプレートのウェルに３連で添加する。ａ．）例示的な二重特異性抗体、ｂ．）親ＢＡＦＦ抗体（例えば、米国特許第７，３１７，０８９号に記載されているもの）、及びｃ．）陰性対照抗体（ＩｇＧ１アイソタイプ抗体）の１つを、以下の濃度：１．６６７，０．５５６，０．１８５，０．０６２，０．０２１，０．００７及び０．００２（ｎＭ）のそれぞれで可溶性ＢＡＦＦまたは膜結合性ＢＡＦＦのいずれかを含むウェルに添加する。Ｔ１１６５．１７細胞を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、次いでＲＰＭＩ  １６４０、１０％ＦＢＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５×１０−５Ｍ  ２−メルカプトエタノール及び抗生物質／抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ、品番１５２４０）を含有するアッセイ培地に再懸濁する。Ｔ１１６５．１７細胞を５０００細胞／ウェルの濃度で各ウェルに添加し、プレートを３７℃で５％ＣＯ２で４４時間インキュベートする。インキュベーション後、ＭＴＳ生存基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、品番Ｇ３５８０）を各ウェルに添加し、プレートをさらに１時間インキュベートした後、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｓｅｓ）により４９０ｎｍでの吸光度測定を行う。試験は三連で実施する。
【表３】
0006529602.tif 000006
【表４】
0006529602.tif 000007
【００５９】
表３ａ及び３ｂに提示された結果は、本発明の例示的な二重特異性抗体が（可溶性及び膜結合性）ＢＡＦＦ誘導性Ｔ１１６５．１７細胞の増殖を完全に中和することができることを示す。この中和は、陽性対照抗体（親ＢＡＦＦ抗体）よりも改善される。陰性対照ＩｇＧ１抗体は、Ｔ１１６５．１７細胞の可溶性または膜結合性ＢＡＦＦ誘導性増殖の阻害を示さない。
【００６０】
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性のインビトロ解析
例示的な二重特異性抗体及び親ＣＤ２０抗体（例えば、米国特許第８，１５３，１２５号に記載されているもの）を各々、１０μｇ／ｍＬから０．０１μｇ／ｍＬまでそれぞれ連続希釈（２倍希釈を使用）する。例示的な二重特異性抗体のｓｃＦｖ部分に結合したＢＡＦＦの飽和量が、例示的な二重特異性抗体のＣＤＣ活性に影響を及ぼすかどうかを評価するために、各希釈液は、飽和量（１００ｎｇ／ｍＬ）の可溶性ヒトＢＡＦＦトリマーの存在下及び非存在下で複製される。例示的な二重特異性抗体及び親ＣＤ２０抗体の両方の各希釈液（可溶性ヒトＢＡＦＦトリマーを伴うまたは伴わない）を、９６ウェルプレート上に４０，０００細胞／ウェルの濃度で播種した（膜貫通型ＣＤ２０を発現する）ＷＩＬＳ−２Ｂリンパ腫細胞に添加し、プレートを３７℃で３０分間インキュベートする。その後、精製されたヒト血清補体（Ｑｕｉｄｅｌ、品番Ａ１３３）を１：１５希釈で各ウェルに加え、プレートを３７℃で２時間インキュベートする。インキュベーション後、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、品番ＤＡＬ１１００）を各ウェルに加え、プレートを３７℃で一晩インキュベートする。相対蛍光単位（１ウェルあたりの生存細胞の量を反映する）を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＥＭ  Ｒｅａｄｅｒを用いて、５４０ｎｍ励起及び５９０ｎｍ発光で記録する。収集されたデータを、４パラメーター適合Ｓ字状用量応答曲線にモデル化しＥＣ５０値を計算する。得られたＥＣ５０値を表４に示す。
【表５】
0006529602.tif 000008
【００６１】
表４に示す結果は、本発明の例示的な二重特異性抗体が、飽和量の可溶性ヒトＢＡＦＦの存在下または不在下でＣＤＣ活性を有し、濃度依存的にウェル当たりの生存可能なＷＩＬ２−Ｓ細胞の集団を減少させることを示す。例示的な二重特異性抗体の観察されたＣＤＣ活性は親ＣＤ２０抗体に匹敵する。本発明の二重特異性抗体は、ＢＡＦＦが同時に関与していても効果的なＣＤＣ活性を示す。
【００６２】
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性のインビトロ解析
ＷＩＬ２−Ｓ  Ｂリンパ腫細胞（これはヒトＣＤ２０を発現する）、及びレトロウイルスベクターを形質導入して、ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼレポート遺伝子、ガンマ鎖を同時発現するヒトＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−１５２）、ならびにＦｃγＩＩＩａ（Ｆ１５８）受容体またはＦｃγＩＩＩａ（Ｖ１５８）受容体のいずれかを、本発明の二重特異性抗体のＡＤＣＣ活性を分析するために使用する。４０，０００細胞／ウェルの濃度のＷＩＬ２−Ｓ細胞を、例示的な二重特異性抗体または親ＣＤ２０抗体（例えば米国特許第８１５３１２５号に記載されているもの）のいずれかと共に３７℃で１時間インキュベートし、両方とも１５０ｎｇ／ｍＬから０．０７ｎｇ／ｍＬまで連続希釈（３倍希釈を使用）した。インキュベーション（３７℃で１時間）後、トランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞をウェルに２００，０００細胞／ウェルの濃度で添加し、プレートを３７℃で３時間インキュベートする。
【００６３】
ルシフェラーゼレポーターシグナルは、１００μｌのＳｔｅａｄｙ  Ｇｌｏルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、品番Ｅ２５２０）を各ウェルに加え、１５分間混合することによって生成される。増加したＦｃγＩＩＩａ受容体結合（増加したＡＤＣＣ活性に変換する）を示すレポーター発光シグナルは、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  ＬＭａｘＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定され、４パラメーター適合Ｓ字状用量応答曲線にモデル化しＥＣ５０値を計算する。得られたＥＣ５０値を以下の表５に示す。
【表６】
0006529602.tif 000009
【００６４】
表５に示す結果は、本発明の例示的な二重特異性抗体が濃度依存的にＦｃγＩＩＩａ受容体と結合することを示す。例示的な二重特異性抗体の観察されたＡＤＣＣ活性は親のＣＤ２０抗体に匹敵する。本発明の例示的な二重特異性抗体は、有効なＡＤＣＣ活性を示す。
【００６５】
ＢＡＦＦが、本発明の二重特異性抗体のｓｃＦｖ部分に結合した場合、本発明の二重特異性抗体のＦｃγＩＩＩａ受容体結合（及びＡＤＣＣ）活性に影響を及ぼすかどうかを評価するために、（１００ｎｇ／ｍＬの開始濃度から）１／３連続希釈濃度の可溶性ヒトＢＡＦＦトリマーの存在下及び不在下で上記実験を（二連で）再現する。親ＣＤ２０抗体は、可溶性ヒトＢＡＦＦの不在下、かつ可溶性ヒトＢＡＦＦのこの最も高い開始濃度（１００ｎｇ／ｍＬ）で試験する。（上記のように）ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子及びＦｃγＩＩＩａ（Ｖ１５８）受容体を同時発現するように形質導入されたＪｕｒｋａｔＴ細胞が使用される。得られたＥＣ５０データを以下の表６に示す。
【表７】
0006529602.tif 000010
【００６６】
表６に示す結果は、ＢＡＦＦの存在下でさえ、本発明の例示的な二重特異性抗体がＦｃγＩＩＩａ受容体と結合することを示す。表６に示すように、本発明の例示的な二重特異性抗体は、ＢＡＦＦの飽和条件下でＦｃγＩＩＩａレセプターの結合をわずかに減少させる。例示的な二重特異性抗体の観察されたＡＤＣＣ活性は、ＢＡＦＦの飽和条件の存在下で親のＣＤ２０抗体と比較してわずかに減少する。本発明の例示的な二重特異性抗体は、ＢＡＦＦの同時結合中に有効なＡＤＣＣ活性を示す。
【００６７】
ＢＡＦＦ中和のインビボ分析
インビボでのヒトＢＡＦＦの中和を、ヒト可溶性ＢＡＦＦを発現するトランスジェニックＦＶＢマウスＦＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（ＬＰ４０）１６９８９）を使用して評価する。ヒトＢＡＦＦトランスジェニック（Ｔｇ）マウスに、３．３ｎｍｏｌｅのａ．）例示的な二重特異性抗体（Ｎ＝５）、ｂ．）親ＢＡＦＦ抗体（Ｎ＝５）、ｃ．）ヒトＩｇＧ４陰性対照抗体（Ｎ＝５）、ｄ．）親ＣＤ２０抗体（Ｎ＝５）を皮下注射し、またはｅ．）未処理にした（ナイーブマウス、Ｎ＝５）。８日後、マウスをと殺し、血漿及び脾臓を収集する。各抗体の暴露は、ヒトＩｇＧに特異的な血漿のＥＬＩＳＡによって確認される。
【００６８】
脾臓細胞の単一細胞懸濁液を調製し、赤血球溶解後に総白血球数を測定する。Ｂリンパ球の相対百分率は、細胞表面マーカーＢ２２０及びフローサイトメトリーを用いて決定され、それによりＢ２２０陽性細胞の百分率に脾臓中の白血球の総数を掛けることによって、脾臓あたりのＢ細胞の総数を計算することができる。結果を以下の表７に示す。
【表８】
0006529602.tif 000011
【００６９】
表７に提示する結果は、ナイーブ陰性対照及び親ＣＤ２０抗体処置トランスジェニックマウスと比較して、例示的な二重特異性抗体の単回皮下注射で処置したヒトＢＡＦＦ  Ｔｇマウスの脾臓におけるＢ細胞の総数の減少を反映する。このＢ細胞の減少は、親ＢＡＦＦ抗体で観察されたものと同等である。本発明の例示的な二重特異性抗体は、ＢＡＦＦの効果的なインビボ中和を示す。
【００７０】
インビボ有効性モデル
本発明の例示的な二重特異性抗体は、マウスＣＤ２０に結合せず、マウスＢＡＦＦへの結合が大幅に低下する（ヒトＢＡＦＦと比較してマウスＢＡＦＦへの結合が約２５０倍減少する）。さらに、代用マウス二重特異性抗体を産生することができなかった。したがって、齧歯類モデルにおける二重標的ＣＤ２０及びＢＡＦＦの治療可能性を試験するために、別々のマウス抗体（１つはマウスＣＤ２０に向けられ、もう１つはマウスＢＡＦＦに向けられた）が使用される。
【００７１】
ループス様自己免疫は、ドナーマウス（７〜８週齢のメスＤＢＡ／２マウス、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からの１４×１０６個のＣＤ４＋脾臓細胞の移入を介して宿主マウス（メスＣ５７ＢＬ／６ｘＤＢＡ／２  Ｆ１マウス、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において誘導される。Ｖｉａ  ＣＳ及びＳｈｅａｒｅｒ  ＧＭ，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，５３２：４４−５０（１９８８）により記載されているように、ドナーマウス由来のＣＤ４＋脾臓細胞を宿主マウスの尾静脈に移す。移入時に、ドナーＣＤ４＋脾臓細胞は、宿主Ｂ細胞に同種の助けを提供し、自己反応性宿主Ｂ細胞を含む宿主Ｂ細胞の増殖／増大をもたらす。
【００７２】
進行中の免疫応答の状況におけるＢ細胞枯渇を探索するために、ＣＤ４＋脾臓細胞をドナーマウスから宿主マウスに移す。移入後７日の宿主マウスを、抗ｄｓＤＮＡ自己抗体（以下に記載）についてＥＬＩＳＡにより試験して、疾患の開始を確認する。移植後７日目に、宿主マウスもまた、４つの処置群の１つに従って皮下的に処置する：
（ａ）６５μｇのマウスＣＤ２０抗体＋６５μｇのｍＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（Ｎ＝４）、
（ｂ）６５μｇのマウスＢＡＦＦ抗体＋６５μｇのｍＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（Ｎ＝４）、
（ｃ）６５μｇのマウスＣＤ２０抗体＋６５μｇのＢＡＦＦ抗体（Ｎ＝４）、または
（ｄ）１３０μｇのｍＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（Ｎ＝４）。
【００７３】
抗体処置の７日後に宿主マウスをと殺し、血液、リンパ節及び脾臓におけるＢ２２０＋細胞値を（処理されたトランスジェニックＢＡＦＦマウスの脾臓Ｂ細胞レベルに関して）上記のフローサイトメトリーによって測定する。結果を以下の表８に示す。
【表９】
0006529602.tif 000012
【００７４】
表８に提示する結果は、マウスＣＤ２０抗体及びマウスＢＡＦＦ抗体の単回皮下注射で処置した宿主マウスの血液、リンパ節及び脾臓におけるＢ細胞の総数は、陰性対照処置マウスよりも有意に減少していることを示す。マウスＣＤ２０抗体及びマウスＢＡＦＦ抗体で処置した宿主マウスにおけるＢ細胞のレベルは、ナイーブマウス、及びマウスＣＤ２０抗体もしくはマウスＢＡＦＦ抗体の単独の１つのみで処置したマウスのレベルよりも低いレベルまで低下させる。
【００７５】
７週間の研究では、ＣＤ４＋脾臓細胞をドナーマウスから宿主マウスに移し、脾細胞移入の日に宿主マウスを４つの処置群の１つに従って皮下的に処置する：
（ａ）６５μｇのマウスＣＤ２０抗体＋６５μｇのｍＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（Ｎ＝１０）、
（ｂ）６５μｇのマウスＢＡＦＦ抗体＋６５μｇのｍＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（Ｎ＝１０）、
（ｃ）６５μｇのマウスＣＤ２０抗体＋６５μｇのマウスＢＡＦＦ抗体（Ｎ＝１０）、または
（ｄ）１３０μｇのｍＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（Ｎ＝１０）。
処置の７週間後に宿主マウスをと殺し、抗ｄｓＤＮＡ自己抗体存在及び尿アルブミン／クレアチニン値を以下に詳細に記載するように測定する。
【００７６】
宿主マウスの血漿サンプル中の抗ｄｓＤＮＡ自己抗体の存在をＥＬＩＳＡにより決定する。Ｇｒｅｉｎｅｒ  ９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｂｅｌｌｃｏ  Ｇｌａｓｓ、品番６５５  ０６１）を、ダルベッコのリン酸緩衝食塩水（Ｄ−ＰＢＳ、Ｍｇなし、Ｃａなし）中のＴｒｅｖｉｇｅｎ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、品番９６００−５Ｄ）子牛胸腺ＤＮＡ１０μｇ／ｍＬで被覆し、４℃で一晩インキュベートする。インキュベーション後、プレートを２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＤ−ＰＢＳで室温（ＲＴ）で１時間ブロックし、次いでＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄する。
【００７７】
宿主マウスからの血漿をと殺の日に採取し、血漿試料をＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０プラス２％ＢＳＡで１：１００の開始希釈まで希釈する。収集された各血漿試料について、開始１：１００血漿希釈からの６つの４倍連続希釈液を調製する。希釈した血漿サンプルをプレートの個々のウェルに加え、プレートを室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、次いで、ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０＋２％ＢＳＡで１：２０００まで希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ及びＬ）−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、品番１１５−０３５−１６６）と共に９０分間インキュベートするその後、ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、品番３４０２１）を各ウェルに添加する。発色現像を０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止する。比色シグナルをＡ４５０での分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて読み取り、及び収集したデータを抗ＤＮＡ力価（ＥＣ５０）値を決定するためにＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて分析する。抗ｄｓＤＮＡ力価を表９に示す。
【表１０】
0006529602.tif 000013
【００７８】
表９に示す結果は、マウスＣＤ２０抗体及びマウスＢＡＦＦ抗体の両方での処置で、抗ＤＮＡ力価がＣＤ２０抗体単独またはＢＡＦＦ抗体単独による処置よりも有意に低いことを示す。
【００７９】
アルブミン／クレアチニン比は、ＳＬＥの進行に関連する腎の関与を評価するための有用な基準である。アルブミン／クレアチニン比の値は、宿主マウス尿中の、アルブミン（μｇ／ｍＬ）及びクレアチニン（ｍｇ／ｄＬ）値の両方を個々に測定することによって以下の式に従って、決定される：
【数１】
0006529602.tif 000014
尿のクレアチニンレベルは、Ｃｏｂａｓ  ＣＲＥＡ  Ｐｌｕｓアッセイ（Ｒｏｃｈｅ、品番１１７７５６８５）を用いて製造業者の使用説明書に従って測定する。
【００８０】
尿アルブミンレベルは、サンドイッチＥＬＩＳＡによって決定される。マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、品番６５５０６１）を、０．７５μｇ／ｍＬの濃度（ＰＢＳで希釈）のウサギ、抗マウスアルブミン抗体（Ａｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、品番ＡＰ０９２２１ＰＵ−Ｎ）６０μｌでコーティングし、次いで洗浄緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ  ７．４）で洗浄し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中のカゼイン、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、品番３７５２８）を用いてブロックする。尿サンプルは、ブロッキング緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ、品番３７５２８）を用いて１：２０００希釈及び１：８０，０００希釈によって調製する。ブロッキング緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ、品番３７５２８）の１：２希釈液を用いて２００ｎｇ／ｍＬの濃度のマウスアルブミン（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、品番ＩＭＳＡ）を０．７８ｎｇ／ｍＬまで連続希釈することにより標準曲線を作成する。標準曲線連続希釈液（５０μＬ）及び試料希釈液（５０μＬ）をプレートの個々のウェルに２連で加え、室温で１．５時間インキュベートする。その後、プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、次いで１：３０００希釈のヤギ抗マウスアルブミン−ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ、品番Ａ９０−２３４Ｐ）５０μＬと共に室温で１時間インキュベートする。プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、次いで５０μｌのＯＰＤ基質（Ｓｉｇｍａ、品番Ｐ−６９１２）を各ウェルに添加することによって発色させる。１００μＬの１Ｎ  ＨＣｌの添加により比色反応を停止させる。比色シグナルをプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて４９０ｎｍで測定し、収集したデータをＳｏｆｔＭａｘ  ３．１．２ソフトウェア及びサンプル濃度を逆算するために適合させた４パラメーターを用いて分析する。アルブミンクレアチニン比の値を表１０に示す。
【表１１】
0006529602.tif 000015
【００８１】
表１０に示す結果は、マウスＣＤ２０抗体単独またはマウスＢＡＦＦ抗体単独で処置したマウスとは対照的に、マウスＣＤ２０抗体及びマウスＢＡＦＦ抗体の両方で処置したマウスのアルブミンクレアチニン比の有意な減少を示す。
【００８２】
カニクイザルにおける薬物動態評価
カニクイザルのアミノ酸配列は、ヒトＣＤ２０のアミノ酸配列と９６．６％の同一性を共有する。カニクイザル全血のフローサイトメトリーを用いて、例示的な抗体とカニクイザルＣＤ２０との結合を確認する。
【００８３】
カニクイザルから採取した全血（５０μＬ）を、（ａ）例示的な二重特異性抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７で標識されている）（１．５μｇ）及び陽性対照抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、品番３３４３０６のカニクイザルと反応するＦＩＴＣ標識ＣＤ４０抗体）（１．５μｇ）、または（ｂ）ヒトＩｇＧ１アイソタイプ陰性対照抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７で標識されている）（１．５μｇ）及び陽性対照抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、品番３３４３０６のカニクイザルと反応するＦＩＴＣ標識ＣＤ４０抗体）（１．５μｇ）のいずれかと共に室温で３０分間、インキュベートする。インキュベーション後、赤血球を、製造業者の使用説明書に従ってＦＡＣＳ溶解溶液（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ．、品番３４９２０２）を添加することによって溶解させる。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（２％ウシ胎仔血清を含むＰＢＳ）で３回洗浄し、その後、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＦＣ５００を用いてフローサイトメトリーの前にＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁する。ＣＤ２０結合はＦＬ−４（６４７）チャネルで検出され、ＣＤ４０結合はＦＬ−１（ＦＩＴＣ）チャネルで検出される。結果を以下の表１１に示す。
【表１２】
0006529602.tif 000016
【００８４】
表１１に示す結果は、本発明の例示的な二重特異性抗体が、Ｂ細胞のカニクイザルＣＤ２０に結合するが、ヒトＩｇＧ１陰性対照抗体は、カニクイザルＢ細胞に結合しないことを示す。これらの結果は、本発明の二重特異性抗体のインビボ試験のためのカニクイザルの使用を支持する。
【００８５】
例示的な二重特異性抗体の血清薬物動態を評価するために、オスのカニクイザルに、例示的な二重特異性抗体１３．３ｍｇ／ｋｇを静脈内（Ｎ＝２）または皮下（Ｎ＝２）のいずれかで投与する。例示的な二重特異性抗体は、ＰＢＳ、ｐＨ７．４の溶液中で調製される。親ＣＤ２０抗体及び親ＢＡＦＦを含む二重特異性抗体による薬物動態学的研究は、発現及び回復を妨げる物理的及び化学的不安定性（本明細書に記載）のため不可能であった。
【００８６】
投与前に、各カニクイザルから約１．５ｍＬの血液が採取される。投与後、血液試料（約１．５ｍＬ）は投与後１、６、１２、２４、４８、７２、９６、１６８、２４０、３３６、４３２、５０４、６００及び６７２時間で、チューブ血清セパレーターチューブ（例えば抗凝血剤を含まない）に大腿静脈から静脈内に収集される。それぞれの時点で収集すると、試料は血清に処理される。
【００８７】
例示的な二重特異性抗体のクリアランスは、ＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｉｍｍｕｌｏｎ（登録商標）４ＨＢＸ）に特異的にコートされたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ‘）２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、品番１０９−００６−０９７）を利用する全ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡによる血清サンプルの分析によって決定される。それぞれの時点からの血清試料（１００μＬ）をＥＬＩＳＡプレートの個々のウェルに加え、２５℃で６０分間インキュベートする。インキュベーション後、例示的な二重特異性抗体の検出のために、ＥＬＩＳＡプレートのウェルに１００μＬ（５０，０００倍希釈）のマウス抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、品番９０４０−０５）を添加する。未結合の酵素を洗浄によって除去し、１００μＬのＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＫＰＬ、品番５０−７６−００）をＥＬＩＳＡプレートの個々のウェルに加える。１００μＬのＴＭＢストップ溶液（ＫＰＬ、品番５０−８５−０５）を添加することにより発色を停止させ、波長補正を６３０ｎｍに設定して４５０ｎｍでウェルの光学濃度を測定する。
【００８８】
クリアランス値の決定に用いるため、１００％カニクイザル血清（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ、品番ＣＹＮＳＲＭ）中の例示的な二重特異性抗体の既知量の標準曲線もまた生成される。例示的な二重特異性抗体（１００％カニクイザル血清中）を２０倍連続希釈でＰＢＳ中のブロッカーカゼイン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）Ｂｌｏｃｋｅｒ（商標）、品番３７５２８）中に希釈する。例示的な二重特異性抗体の標準曲線範囲は７８．１〜５０００ｎｇ／ｍＬである（それぞれ、１９００ｎｇ／ｍＬ及び１２０ｎｇ／ｍＬの定量の上限及び下限を有する）。
【００８９】
例示的な二重特異性抗体のクリアランス値は、投与後０時間（抗体の投与時）から１９２時間までの免疫反応性対時間プロファイルを用いて計算され、及びＰｈｏｅｎｉｘソフトウェア（ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ６．３、Ｃｏｎｎｅｃｔ１．３）を用いた非コンパートメント分析によって決定される。静脈内に投与された例示的な二重特異性抗体は、０．８３ｍＬ／時間／ｋｇの平均クリアランス及び５８時間の平均半減期を示す。例示的な二重特異性抗体は、皮下投与された場合、１．２２ｍＬ／時間／ｋｇの平均クリアランス、７２時間の平均半減期及び６９％のバイオアベイラビリティを示す。結果は、例示的な二重特異性抗体が、皮下投薬を支持するのに十分な半減期、クリアランス、及びバイオアベイラビリティを有することを示す。
【００９０】
カニクイザル血行における例示的な二重特異性抗体の安定性は、（上記のように計算された）全ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ値に対する（上記の時点で採取した血清試料のうちの）ＢＡＦＦ抗原捕捉値の比に基づいて決定される。ＢＡＦＦ抗原捕捉は、ＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｉｍｍｕｌｏｎ（登録商標）４ＨＢＸ）上にコーティングされたＢＡＦＦ抗原（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を利用する。上記の各時点からの血清試料（１００μＬ）をＥＬＩＳＡプレートの個々のウェルに加え、２５℃で６０分間インキュベートする。インキュベーション後、例示的な二重特異性抗体の検出のために、１００μＬ（１０，０００倍希釈）のマウス抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ品番９０４０−０５）をＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加する。未結合の酵素を洗浄により除去し、１００μＬのＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＫＰＬ、品番５０−７６−００）をＥＬＩＳＡプレートの個々のウェルに加える。１００μＬのＴＭＢ停止溶液（ＫＰＬ、品番５０−８５−０５）の添加により発色を停止させ、波長補正を６３０ｎｍに設定してウェルの光学濃度を４５０ｎｍで測定する。
【００９１】
ＢＡＦＦ抗原捕捉及び全ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡの両方についての曲線下面積（ＡＵＣ）を、Ｐｈｏｅｎｉｘ（ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ６．３、Ｃｏｎｎｅｃｔ１．３）を用いた非コンパートメント分析により決定する。平均曲線下面積百分率（％ＡＵＣ）は、（ＡＵＣ０−ｔｌａｓｔ、ＢＡＦＦ抗原捕捉アッセイ／ＡＵＣ０−ｔｌａｓｔ、全ヒトＩｇＧアッセイ）×１００％として計算される。例示的な二重特異性抗体は、約９５％〜１０１％のＢＡＦＦ結合に基づく％ＡＵＣを示す。この結果は、例示的な二重特異性抗体がリンカーＬ１及びＬ２の両方で十分な安定性を有することを反映する。
【００９２】
二重特異性抗体の物理的及び化学的特性分析
（親抗体と比較して）乏しい二重特異性抗体の発現、ＬＣクリッピング、ｓｃＦｖの誤った折り畳み、乏しい精製回収、二重特異性抗体の分解／クリッピング、熱安定性の低下、及び低親和性のために、親ＣＤ２０抗体及び親ＢＡＦＦを含む二重特異性抗体による予備研究は不可能であった。しかしながら、本発明の例示的な二重特異性抗体を用いた予備研究は、二重特異性抗体の発現を含む予想外の有益な特性及び予想外の有益な化学的及び物理的安定性及び溶解特性を示す。本明細書で提供されるデータによって示されるように、本発明の二重特異性抗体は、低いＨＭＷ凝集、良好な溶解性、溶液中の良好な粘度、低い分解レベル及び高い光安定性を含む物理的安定性の増加、低いペプチド結合開裂、及び高及び低濃度凍結解凍安定性は、ＣＤ２０（本明細書に記載のＦＡＣＳ分析によって測定した場合）及びＢＡＦＦ（本明細書に記載のＥＬＩＳＡ分析によって測定した場合）の両方に対して良好な親和性を維持し、ＢＡＦＦの中和活性ならびにＡＤＣＣ活性を維持する（両方は本明細書に記載のように分析した）。
【００９３】
物理的及び化学的安定性分析
物理的及び化学的安定性分析のために、表１の例示的な二重特異性抗体を、１０ｍＭ酢酸塩ｐＨ５．０、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０中に配合する。例示される二重特異性抗体試料は、１ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ及び１００ｍｇ／ｍＬに濃縮される（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕ．Ｃ．フィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、品番ＵＦＣ９０３０２４を使用）。
【００９４】
１ｍｇ／ｍＬに濃縮した試料の試料安定性を、４、２５及び４０℃のうちの１つで４週間にわたってインキュベートすることによって評価する。５０及び１００ｍｇ／ｍＬに濃縮したサンプルを、４及び２５℃のうちの１つで１５０ｍＭ  ＮａＣｌの存在下及び非存在下で４週間にわたってインキュベートする。
【００９５】
それぞれのインキュベーション時間の後、サンプルをＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、品番０８５４１）カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で高分子量％（％ＨＭＷ）について分析する。５０ｍＭリン酸ナトリウム＋３５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を０．５ｍＬ／分で３５分間移動する移動相として使用する。１ｍｇ／ｍＬ抗体サンプルの１０μＬ（１０μｇ）の容量をカラムに注入し、検出を２１４ｎｍで測定する。高濃度サンプルの場合、１μＬ（５０μｇまたは１００μｇ）の容量をカラムに注入し、２８０ｎｍで検出を測定する。ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎを使用してクロマトグラムを分析し、全ＡＵＣに対するモノマーピーク前に溶出したピークのＡＵＣの比を用いて％高分子量（ＨＭＷ）を計算する。結果を表１２に要約する。
【表１３】
0006529602.tif 000017
【００９６】
表１２に示す結果は、本明細書に記載のように配合された本発明の例示的な二重特異性抗体が高タンパク質濃度を達成し、２５℃の４週間の分解試験後に高分子量含量が１．４％未満の変化を示すことを示す。
【００９７】
１ｍｇ／ｍＬに濃縮された試料の試料分解もまた、Ｂｅｃｋｍａｎ−ＰＡ８００  ｐｌｕｓシステムを使用して製造者の使用説明書に従って毛管等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）分析により分析する。４℃でインキュベートした試料では、試料分解パーセントは０％として測定され、２５℃でインキュベートした試料では、試料の分解率は１．３％と測定された。
【００９８】
１ｍｇ／ｍＬに濃縮され、４０℃で保存された試料も、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｏｎ  Ｔｒａｐ  ＬＣ−ＭＳシステムを使用して製造者の使用説明書に従って液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）分析によりペプチド結合切断の同定について分析する。二重特異性抗体の領域は、２％を超えるペプチド結合切断を示さず、（第１のポリペプチド鎖である、例示的な二重特異性抗体の配列番号１の）ヒンジ領域は、わずか約１％のペプチド結合切断を示した。
【００９９】
溶解度分析
例示的な二重特異性抗体の溶解度を、各温度で１週間のインキュベーション期間の後、４℃、−５℃及び１０℃で分析する。溶解度は、１００〜１５０ｍｇ／ｍＬに濃縮された（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕ．Ｃ．フィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＵＦＣ９０３０２４を使用）二重特異性抗体試料を用いて評価し、ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸塩中に配合する。例示的な二重特異性抗体は、治療的二重特異性抗体の許容値内で少なくとも１４８ｍｇ／ｍＬの溶解度を示した。例示的な二重特異性抗体はまた、高濃度でのＨＭＷ含量のレベルのわずか０．４９％の変化を示し、インキュベーション期間後の相分離がなかった。
【０１００】
例示的な二重特異性抗体の粘度を室温で分析する。粘度を、１００ｍｇ／ｍＬに濃縮された二重特異性抗体で評価し、ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸塩中に配合する。例示的な二重特異性抗体は、治療用二重特異性抗体の許容値である１００ｍｇ／ｍＬで４．９ｃｐの粘度を示した。
【０１０１】
光安定性分析
例示的な二重特異性抗体の光安定性分析を、５０ｍｇ／ｍＬで濃縮された二重特異性抗体で評価し、（ａ）１０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ５．０、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０または（ｂ）１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６．０、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌのいずれかに配合する。２４０，０００ルクス時間の可視光と４０ワット−ｈｒ／ｍ２のＵＶ光に試料を暴露する。対照（「暗」）試料は光に曝されない。次いで、サンプルをＴＳＫｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  Ｇ３０００ＳＷカラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析する。結果を表１３に要約する。
【表１４】
0006529602.tif 000018
【０１０２】
表１３に示す結果は、高濃度で１０ｍＭの酢酸塩、ｐＨ５．０、０．０２％のＴｗｅｅｎ−８０中に配合された本発明の例示的な二重特異性抗体が、他の治療的二重特異性抗体に匹敵する光安定性を有することを示す。
【０１０３】
高濃度及び低濃度凍結／解凍分析
本発明の例示的な二重特異性抗体の凍結解凍分析を、表１４に従って行った３回の凍結／解凍サイクルの後に評価する。
【表１５】
0006529602.tif 000019
【０１０４】
例示的な二重特異性抗体の低濃度凍結／解凍分析を、１ｍｇ／ｍＬで濃縮された二重特異性抗体で評価し、０．０２％のＴｗｅｅｎ−８０を含む及び含まない１０ｍＭの酢酸塩、ｐＨ５．０中に配合する。３回の凍結／解凍サイクル（表Ｘに示す単一サイクル）を行い、各試料の粒子成長をＨＩＡＣ粒子計数器（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、品番９７０３）を用いて評価する。両方の配合物の粒子数は（０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０の有無にかかわらず）１００以下であった。０．０２％のＴｗｅｅｎ−８０を含む配合物は、低濃度条件下で本発明の例示的な二重特異性抗体が、凍結／解凍サイクルに供されない対照試料と比較して、粒子数の差異を示さず、複数の凍結／解凍サイクル後に安定していることを示す。
【０１０５】
例示的な二重特異性抗体の高濃度凍結／解凍分析を、５０ｍｇ／ｍＬで濃縮された二重特異性抗体で評価し、（ａ）１０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ５．０、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０または（ｂ）１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む及び含まない１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６．０、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０のいずれかに配合する。３回の凍結／解凍サイクル（表Ｘに表される単一サイクル）を行い及びＨＩＡＣ粒子計数器を用いて各試料の粒子成長を評価する。結果を表１５に示す。
【表１６】
0006529602.tif 000020
【０１０６】
表１５に示す結果は、高濃度で、及び１０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ５．０、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０に配合された、本発明の例示的二重特異性抗体が、複数回の凍結／解凍サイクル後に安定であることを示す。
【０１０７】
配列
表１の例示的な二重特異性抗体の第１のポリペプチド（配列番号１）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＦＳＧＨＹＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＣＬＥＷＩＧＥＩＮＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＡＲＤＩＬＴＧＹＬＹＹＹＤＨＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＲＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＳＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＨＰＲＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＲＴＦＴＳＹＮＭＨＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＡＩＹＰＬＴＧＤＴＳＹＮＱＫＳＫＬＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＳＴＹＶＧＧＤＷＱＦＤＶＷＧＫＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＥＥＫＴＩＳＫＱＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
表１の例示的な二重特異性抗体の第２のポリペプチド（配列番号２）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＳＳＶＰＹＩＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＡＴＳＡＬＡＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＷＬＳＨＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
表１の例示的な二重特異性抗体の第１のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号３）
ｃａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｃａｇｇａｇｔｃｇｇｇｃｃｃａｇｇａｃｔｇｇｔｇａａｇｃｃｔｔｃｇｇａｇａｃｃｃｔｇｔｃｃｃｔｃａｃｃｔｇｃａｃｔｇｔｃｔｃｔｇｇａｇｇｃｔｃｃｔｔｃａｇｔｇｇｔｃａｔｔａｃｔｇｇａｇｃｔｇｇａｔｔｃｇｃｃａｇｃｃｃｃｃａｇｇｇａａｇｔｇｔｃｔｇｇａｇｔｇｇａｔｔｇｇｇｇａａａｔｃａａｔｃａｔａｇｔｇｇａａｇｃａｃｃａａｃｔａｃａａｃｃｃｇｔｃｃｃｔｃａａｇａｇｔｃｇａｇｔｃａｃｃａｔａｔｃａｇｔａｇａｃａｃｇｔｃｃａａｇａａｃｃａｇｔｔｃｔｃｃｃｔｇａａａｃｔｇａｇｃｔｃｔｇｔｇａｃｃｇｃｃｇｃｇｇａｃａｃｇｇｃｔｇｔｇｔａｔｔａｃｔｇｔｇｃｇａｇａｇｇｇｇｃｔａｇａｇａｔａｔｔｔｔｇａｃｔｇｇｔｔａｔｃｔａｔａｃｔａｃｔａｔｇａｃｃａｔｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇａａｃｃｃｔｇｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｃｔｃａｇｇｇｇｇａｇｇｇｇｇｃａｇｃｇｇａｇｇａｇｇｃｇｇａｔｃｇｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇａａｇｔｇｇａｇｇｃｇｇａｇｇｃａｇｃｇａａａｔｔｇｔｇｔｔｇａｃｇｃａｇｔｃｔｃｃａｇｃｃａｃｃｃｔｇｔｃｔｔｔｇｔｃｔｃｃｔｇｇｇｇａａａｇａｇｃｃａｃｃｃｔｃｔｃｃｔｇｃａｇｇｇｃｃａｇｔｃａｇａｇｔｇｔｔａｇｃｃｇｃｔａｃｔｔａｇｃｃｔｇｇｔａｃｃａｇｃａｇａａａｃｃｔｇｇｃｃａｇｇｃｔｃｃｃａｇｇｃｔｃｃｔｃａｔｃｔａｔｇａｔｇｃａｔｃｃａａｃａｇｇｇｃｃａｃｔｇｇｃａｔｃｃｃａｇｃｃａｇｇｔｔｃａｇｔｇｇｃａｇｔｇｇｇｔｃｔｇｇｇａｃａｇａｃｔｃｃａｃｔｃｔｃａｃｃａｔｃａｇｃａｇｃｃｔａｇａｇｃｃｔｇａａｇａｔｔｔｔｇｃａｇｔｔｔａｔｔａｃｔｇｔｃａｇｃａｇｃｇｔａｇｃａａｃｃａｃｃｃｔｃｇｇａｃｇｔｔｃｇｇｃｔｇｔｇｇｇａｃｃａａｇｇｔｇｇａａａｔｃａａａｇｇｃｇｇｔｇｇｔｇｇｃａｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃｇｇａｔｃｃｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇａａｇｃｇａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇｃａｇｔｃｔｇｇａｇｃａｇａｇｇｔｇａａａａａｇｃｃｃｇｇｇｇａｇｔｃｔｃｔｇａａｇａｔｃｔｃｃｔｇｔａａｇｇｇｔｔｃｔｇｇｃｃｇｔａｃａｔｔｔａｃｃａｇｔｔａｃａａｔａｔｇｃａｃｔｇｇｇｔｇｃｇｃｃａｇａｔｇｃｃｃｇｇｇａａａｇｇｃｃｔｇｇａｇｔｇｇａｔｇｇｇｇｇｃｔａｔｔｔａｔｃｃｃｔｔｇａｃｇｇｇｔｇａｔａｃｔｔｃｃｔａｃａａｔｃａｇａａｇｔｃｇａａａｃｔｃｃａｇｇｔｃａｃｃａｔｃｔｃａｇｃｃｇａｃａａｇｔｃｃａｔｃａｇｃａｃｃｇｃｃｔａｃｃｔｇｃａｇｔｇｇａｇｃａｇｃｃｔｇａａｇｇｃｃｔｃｇｇａｃａｃｃｇｃｃａｔｇｔａｔｔａｃｔｇｔｇｃｇａｇａｔｃｇａｃｔｔａｃｇｔｇｇｇｃｇｇｔｇａｃｔｇｇｃａｇｔｔｃｇａｔｇｔｃｔｇｇｇｇｃａａｇｇｇｇａｃｃａｃｇｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｃｔｃａｇｃｃｔｃｃａｃｃａａｇｇｇｃｃｃａｔｃｇｇｔｃｔｔｃｃｃｇｃｔａｇｃａｃｃｃｔｃｃｔｃｃａａｇａｇｃａｃｃｔｃｔｇｇｇｇｇｃａｃａｇｃｇｇｃｃｃｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａｇｇａｃｔａｃｔｔｃｃｃｃｇａａｃｃｇｇｔｇａｃｇｇｔｇｔｃｇｔｇｇａａｃｔｃａｇｇｃｇｃｃｃｔｇａｃｃａｇｃｇｇｃｇｔｇｃａｃａｃｃｔｔｃｃｃｇｇｃｔｇｔｃｃｔａｃａｇｔｃｃｔｃａｇｇａｃｔｃｔａｃｔｃｃｃｔｃａｇｃａｇｃｇｔｇｇｔｇａｃｃｇｔｇｃｃｃｔｃｃａｇｃａｇｃｔｔｇｇｇｃａｃｃｃａｇａｃｃｔａｃａｔｃｔｇｃａａｃｇｔｇａａｔｃａｃａａｇｃｃｃａｇｃａａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇａｃａａｇａａａｇｔｔｇａｇｃｃｃａａａｔｃｔｔｇｔｇａｃａａａａｃｔｃａｃａｃａｔｇｃｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｔａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔａｃａａｃａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｔｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｃｃｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｃｇａｇｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｃａｇａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａａｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃｇｇｇａｃｇａｇｃｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｃｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｔａｇｃａａｇｃｔｃａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｃｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃａｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃｇｇｇｔ
表１の例示的な二重特異性抗体の第２のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号４）
ｇａａａｔｔｇｔｇｔｔｇａｃｇｃａｇｔｃｔｃｃａｇｇｃａｃｃｃｔｇｔｃｔｔｔｇｔｃｔｃｃａｇｇｇｇａａａｇｇｇｃｃａｃｃｃｔｃｔｃｃｔｇｃａｇｇｇｃｃａｇｃｔｃａａｇｔｇｔａｃｃｇｔａｃａｔｃｃａｃｔｇｇｔａｃｃａｇｃａｇａａａｃｃｔｇｇｃｃａｇｇｃｔｃｃｃａｇｇｃｔｃｃｔｃａｔｃｔａｔｇｃｃａｃａｔｃｃｇｃｃｃｔｇｇｃｔｔｃｔｇｇｃａｔｃｃｃａｇａｃａｇｇｔｔｃａｇｔｇｇｃａｇｔｇｇｇｔｃｔｇｇｇａｃａｇａｃｔｔｃａｃｔｃｔｃａｃｃａｔｃａｇｃａｇａｃｔｇｇａｇｃｃｔｇａａｇａｔｔｔｔｇｃａｇｔｇｔａｔｔａｃｔｇｔｃａｇｃａｇｔｇｇｃｔｇａｇｔｃａｔｃｃａｃｃｃａｃｔｔｔｔｇｇｃｃａｇｇｇｇａｃｃａａｇｃｔｇｇａｇａｔｃａａａｃｇａａｃｔｇｔｇｇｃｔｇｃａｃｃａｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｔｃｔｇａｔｇａｇｃａｇｔｔｇａａａｔｃｔｇｇａａｃｔｇｃｃｔｃｔｇｔｔｇｔｇｔｇｃｃｔｇｃｔｇａａｔａａｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇａｇａｇｇｃｃａａａｇｔａｃａｇｔｇｇａａｇｇｔｇｇａｔａａｃｇｃｃｃｔｃｃａａｔｃｇｇｇｔａａｃｔｃｃｃａｇｇａｇａｇｔｇｔｃａｃａｇａｇｃａｇｇａｃａｇｃａａｇｇａｃａｇｃａｃｃｔａｃａｇｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｃｃｔｇａｃｇｃｔｇａｇｃａａａｇｃａｇａｃｔａｃｇａｇａａａｃａｃａａａｇｔｃｔａｃｇｃｃｔｇｃｇａａｇｔｃａｃｃｃａｔｃａｇｇｇｃｃｔｇａｇｃｔｃｇｃｃｃｇｔｃａｃａａａｇａｇｃｔｔｃａａｃａｇｇｇｇａｇａｇｔｇｃ
表１の例示的な二重特異性抗体のＨＣＶＲ１（配列番号５）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＦＳＧＨＹＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＣＬＥＷＩＧＥＩＮＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＡＲＤＩＬＴＧＹＬＹＹＹＤＨＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
表１の例示的な二重特異性抗体のＨＣＶＲ２（配列番号６）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＲＴＦＴＳＹＮＭＨＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＡＩＹＰＬＴＧＤＴＳＹＮＱＫＳＫＬＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＳＴＹＶＧＧＤＷＱＦＤＶＷＧＫＧＴＴＶＴＶＳＳ
表１の例示的な二重特異性抗体のＬＣＶＲ１（配列番号７）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＳＳＶＰＹＩＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＡＴＳＡＬＡＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＷＬＳＨＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
表１の例示的な二重特異性抗体のＬＣＶＲ２（配列番号８）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＲＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＳＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＨＰＲＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
表１の例示的な二重特異性抗体のＨＣＤＲ１（配列番号９）
ＫＧＳＧＲＴＦＴＳＹＮＭＨ
表１の例示的な二重特異性抗体のＨＣＤＲ２（配列番号１０）
ＡＩＹＰＬＴＧＤＴＳＹＮＱＫＳＫＬ
表１の例示的な二重特異性抗体のＨＣＤＲ３（配列番号１１）
ＡＲＳＴＹＶＧＧＤＷＱＦＤＶ
表１の例示的な二重特異性抗体のＨＣＤＲ４（配列番号１２）
ＴＶＳＧＧＳＦＳＧＨＹＷＳ
表１の例示的な二重特異性抗体のＨＣＤＲ５（配列番号１３）
ＥＩＮＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ
表１の例示的な二重特異性抗体のＨＣＤＲ６（配列番号１４）
ＡＲＧＡＲＤＩＬＴＧＹＬＹＹＹＤＨ
表１の例示的な二重特異性抗体のＬＣＤＲ１（配列番号１５）
ＲＡＳＳＳＶＰＹＩＨ
表１の例示的な二重特異性抗体のＬＣＤＲ２（配列番号１６）
ＹＡＴＳＡＬＡＳ
表１の例示的な二重特異性抗体のＬＣＤＲ３（配列番号１７）
ＱＱＷＬＳＨＰＰＴ
表１の例示的な二重特異性抗体のＬＣＤＲ４（配列番号１８）
ＲＡＳＱＳＶＳＲＹＬＡ
表１の例示的な二重特異性抗体のＬＣＤＲ５（配列番号１９）
ＹＤＡＳＮＲＡＴ
表１の例示的な二重特異性抗体のＬＣＤＲ６（配列番号２０）
ＱＱＲＳＮＨＰＲＴ
表１の例示的な二重特異性抗体のポリペプチドリンカー１（配列番号２１）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
表１の例示的な二重特異性抗体のポリペプチドリンカー２（配列番号２２）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
本発明は、以下の態様を含む。
［１］
２つの第１のポリペプチド鎖と、２つの第２のポリペプチド鎖とを含む二重特異性抗体であって、それぞれ
ａ．）前記第１のポリペプチド鎖は、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）及びｍＡｂ  ＩｇＧ重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＨＣは重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１〜３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ１）を有し、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号９であり、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１０であり、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号１１であり、前記ｓｃＦｖは重鎖可変領域（ＨＣＶＲ２）及び軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ２）を有し、ＨＣＶＲ２はＨＣＤＲ４〜６を含み、ＬＣＶＲ２はＬＣＤＲ４〜６を含み、ＨＣＤＲ４のアミノ酸配列は配列番号１２であり、ＨＣＤＲ５のアミノ酸配列は配列番号１３であり、ＨＣＤＲ６のアミノ酸配列は配列番号１４であり、ＬＣＤＲ４のアミノ酸配列は配列番号１８であり、ＬＣＤＲ５のアミノ酸配列は配列番号１９であり、ＬＣＤＲ６のアミノ酸配列は配列番号２０であり、
ｂ．）前記第２のポリペプチドは、軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１〜３を含むｍＡｂ軽鎖（ＬＣ）を含み、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１５であり、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１６であり、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号１７であり、
各ｓｃＦｖは、独立して、ＨＣのＮ末端及びＬＣＶＲ２のＣ末端に共有結合しているポリペプチドリンカー（Ｌ１）を介して前記ＨＣに連結され、ＬＣＶＲ２は、ＬＣＶＲ２のＮ末端及びＨＣＶＲ２のＣ末端に共有結合している第２のポリペプチドリンカー（Ｌ２）を介して同じｓｃＦｖのＨＣＶＲ２に連結される、二重特異性抗体。
［２］
ＨＣＶＲ１のアミノ酸配列が配列番号５であり、ＬＣＶＲ１のアミノ酸配列が配列番号７であり、ＨＣＶＲ２のアミノ酸配列が配列番号６であり、ＬＣＶＲ２のアミノ酸配列が配列番号８である、［１］に記載の二重特異性抗体。
［３］
Ｌ１のアミノ酸配列が配列番号２１であり、Ｌ２のアミノ酸配列が配列番号２２である、［１］及び［２］のいずれかに記載の二重特異性抗体。
［４］
２つの第１のポリペプチド鎖及び２つの第２のポリペプチド鎖を含む二重特異性抗体であって、前記第１のポリペプチドのそれぞれのアミノ酸配列が配列番号１であり、前記第２のポリペプチドのそれぞれのアミノ酸配列が配列番号２である、二重特異性抗体。
［５］
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子。
［６］
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子。
［７］
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含み、かつ配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子。
［８］
［５］に記載のＤＮＡ分子及び［６］に記載のＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を発現することができる、哺乳動物細胞。
［９］
前記哺乳動物細胞がＣＨＯである、［８］に記載の哺乳動物細胞。
［１０］
［７］に記載のＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を発現することができる、哺乳動物細胞。
［１１］
前記哺乳動物細胞がＣＨＯである、［１０］に記載の哺乳動物細胞。
［１２］
アミノ酸配列が配列番号１であるポリペプチド及びアミノ酸配列が配列番号２であるポリペプチドを含む二重特異性抗体を産生するためのプロセスであって、前記二重特異性抗体が発現されるような条件下で［８］または［１０］に記載の哺乳動物細胞を培養することと、前記発現された二重特異性抗体を回収することとを含む、プロセス。
［１３］
［１２］に記載のプロセスによって産生される二重特異性抗体。
［１４］
全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、または原発性シェーグレン症候群を治療する方法であって、それを必要とする患者に、［１］〜［４］及び［１３］のいずれかに記載の治療有効量の二重特異性抗体を投与することを含む、方法。
［１５］
治療に使用するための、［１］〜［４］及び［１３］のいずれかに記載の二重特異性抗体。
［１６］
全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、または原発性シェーグレン症候群の治療に使用するための、［１］〜［４］及び［１３］のいずれかに記載の二重特異性抗体。
［１７］
［１］〜［４］及び［１３］のいずれかに記載の二重特異性抗体及び１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む薬学的組成物。
［１８］
全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、または原発性シェーグレン症候群の治療のための薬剤の製造における、［１］〜［４］及び［１３］のいずれかに記載の二重特異性抗体の使用。
【配列表】
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