(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異物反応を誘発することによって組織構造体を提供するように構成された、直径２〜１００ｍｍの少なくとも部分的にロッドの形のデバイスであって、前記デバイスは、異物反応を誘発できる材料を含み、前記材料は、ヒトまたは動物の体の皮下スペースに６週間の期間にわたり存在するときに、その１０重量％未満が分解する材料であり、前記デバイスの表面は、二乗平均平方根粗さ（Ｒｑ）が原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ；Ａｔｏｍｉｃ  Ｆｏｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）により、前記デバイスの表面の１００μｍ２あたり測定されたときに、１００ｎｍ〜５０００ｎｍである、デバイス。
【請求項２】
異物反応を誘発できる前記材料は、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ（オルトエステル）、ポリホスホエステル、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリビニルアルコール、ポリプロピレンフマレート、ポリテレフタレートからなる群もしくは前記群の１つ以上のコポリマー、または式Ａ／Ｂ／Ｃによって表されるのが好ましいポリ（エチレンオキシドテレフタレート）−ポリ（ブチレンテレフタレート）コポリマーより選択され、式中、
Ａは、コポリマー反応において使用される最初のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の分子量を指し、２００〜４００の間であり、２７５〜３２５の間であるのが好ましく；
Ｂは、コポリマー中のポリ（エチレンオキシドテレフタレート）の重量％を指し、４０〜７０であり、５０〜６０であるのが好ましく；
Ｃは、コポリマー中のポリ（ブチレンテレフタレート）の重量％を指し、３０〜６０であり、４０〜５０であるのが好ましい、
請求項１記載のデバイス。
【請求項３】
前記デバイスの外側表面は孔を有し、
孔密度は、１００μｍ２あたりの孔が１０〜１００であり；および／または
平均孔直径は、０．３〜２．０μｍであるのが好ましい、
請求項１〜２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項４】
前記デバイスの外側表面は、捕捉気泡法により測定して少なくとも７５°の接触角によって特徴づけられる濡れ性をもつ、請求項１〜３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項５】
前記デバイスは、一方もしくは両方の長手方向端から３０ｍｍ以内、好ましくは１０ｍｍ以内に凹部を含み、および／または、前記デバイスの一方もしくは両方の長手方向端の縁に丸みがつけられる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項６】
前記デバイスは、一方または両方の長手方向端から５０ｍｍ以内、または好ましくは３０ｍｍ以内で曲げられ、前記デバイスはＳ形状を有するのが好ましい、請求項１〜５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項７】
前記デバイスは、細胞外マトリックスタンパク質および／または成長因子で少なくとも部分的に被覆される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８】
前記デバイスは、長さ３０〜８００ｍｍおよび／または直径３〜２０もしくは４〜１５ｍｍであり、長さ５０〜１５０ｍｍおよび／または直径６〜１０ｍｍであるのが好ましい、請求項１〜７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９】
前記デバイスは、皮下移植に適し、および／または前記デバイスは、ヒトまたは動物の体に皮下挿入されたときに異物反応を誘発することができる、請求項１〜８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１０】
請求項１に記載の異物反応を誘発することによって組織構造体を提供するように構成されたデバイスを生産する方法であって、
ａ）直径３〜２０ｍｍの少なくとも部分的に少なくとも１つのロッドの形であるモールドキャビティであって、前記ロッドの形は、少なくとも２つのモールド部分のＵ形状の内側表面によって画成される、モールドキャビティ
を含む装置を提供するステップと；
ｂ）任意にプレス手段を用いて、流体ポリ（エチレンオキシドテレフタレート）−ポリ（ブチレンテレフタレート）コポリマーを前記モールドキャビティの前記少なくとも１つのロッドの形の少なくとも一部に満たすステップと；
ｃ）前記コポリマーを固化させるステップと；
ｄ）前記少なくとも２つのモールド部分を前記固化したコポリマーから分離して、直径３〜２０ｍｍのロッドの形の少なくとも１つのデバイスを得る、ステップと；
ｅ）前記少なくとも１つの得られたデバイスをクロロホルムおよび／またはジクロロメタンに５〜１５秒さらして、直径３〜２０ｍｍのロッドの形の少なくとも１つのデバイスを得る、ステップであって、前記デバイスは、ポリ（エチレンオキシドテレフタレート）−ポリ（ブチレンテレフタレート）コポリマーを含み、前記デバイスの表面は、二乗平均平方根粗さ（Ｒｑ）が原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ；Ａｔｏｍｉｃ  Ｆｏｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）により、前記デバイスの表面の１００μｍ２あたり測定されたときに、１００ｎｍ〜５０００ｎｍである、ステップと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ｉｎ  ｓｉｔｕティッシュ・エンジニアリング、特に、例えば血管、尿管として、および／または血液透析手技におけるカニュレーション部位として用いることができる組織構造体を提供することを目的とするｉｎ  ｓｉｔｕティッシュ・エンジニアリングの分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
動脈バイパス手技および血液透析の血管アクセスにおいては、血管グラフトが必要である。しかし、自己血管は過去の採取または先在的な血管疾患により必ずしも利用できず、人工血管は感染、狭窄および血栓症により開存率が低いことが多い。
【０００３】
したがって、最近のアプローチは、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を介して、次第に宿主細胞およびマトリックスによって置き換えられる足場を用いて、またはｉｎ  ｓｉｔｕ血管ティッシュ・エンジニアリングによって、完全に生物学的な血管を提供することを目的とする。
【０００４】
ｉｎ  ｓｉｔｕ血管ティッシュ・エンジニアリングは２０世紀の７０年代に最初に提唱され、いわゆるスパークスマンドリルを用いて多孔質ダクロンメッシュのまわりに形成される組織カプセルが生成された（非特許文献１；非特許文献２）。このマンドリルは、数カ月間筋肉内に移植された。しかし、このグラフトは主に血栓症および動脈瘤形成により失敗した（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。
【０００５】
他のグループもｉｎ  ｓｉｔｕティッシュ・エンジニアリングアプローチを研究しているが、腹膜（非特許文献６）または皮下ポーチ（非特許文献７；非特許文献８）をバイオリアクタとして用いている。しかし、腹膜内移植およびその後の採取はかなり侵襲性があり、癒着形成のリスクを招き、臨床実施の成功を妨げる可能性がある。さらに、すべてのインプラントが被包化されることはなく（非特許文献６）、いくつかのデバイスを移植する必要が生じる。ＳａｋａｉおよびＷａｔａｎａｂｅのアプローチも、例えばインプラントおよび生成される組織の特性の最適化の余地がある。本開示は、以前のアプローチに伴う問題のいくつかを迂回および／または解決し、ｉｎ  ｓｉｔｕティッシュ・エンジニアリング、特にｉｎ  ｓｉｔｕ血管ティッシュ・エンジニアリングのための改良された方法を目的とする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｐａｒｋｓ著  １９６９年  Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ  ８月；８（２）：１０４−１３
【非特許文献２】Ｓｐａｒｋｓ著  １９７０年  Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  １１月；１７２（５）：７８７−９４
【非特許文献３】Ｈａｌｌｉｎ著  １９７５年  Ａｍ  Ｓｕｒｇ  ９月；４１（９）：５５０−４
【非特許文献４】ＨａｌｌｉｎおよびＳｗｅｅｔｍａｎ著  １９７６年  Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  ８月；１３２（２）：２２１−３
【非特許文献５】ＲｏｂｅｒｔｓおよびＨｏｐｋｉｎｓｏｎ著  １９７７年１１月５日；２（６０９６）： １１９０−１
【非特許文献６】Ｃａｍｐｂｅｌｌ他著  １９９９年  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  １２月３日；８５（１２）：１１７３−８
【非特許文献７】Ｓａｋａｉ他著  ２００９年  Ｊ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｔ  Ｂ：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ：Ｖｏｌ９０Ｂ（１）：４１２−４１０
【非特許文献８】Ｗａｔａｎａｂｅ他著  ２０１１年  Ｊ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂ：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｖｏｌ９０Ｂ（１）：１２０−１２６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、ヒトまたは動物の体の皮下スペースをバイオリアクタとして用いて完全に生物学的なティッシュ・エンジニアリング血管がｉｎ  ｓｉｔｕで迅速に生成される、異なるアプローチに関する。皮下スペースのバイオリアクタとしての使用は、容易にアクセス可能であり、コラーゲン、エラスチン、繊維芽細胞および大きな血管網等のティッシュ・エンジニアリング血管に望ましいほとんどの構成要素が存在するという利点がある。さらに、血液透析血管アクセス等のいくつかの臨床場面において血管グラフトが必要とされる場所である。
【０００８】
この構想は、人工モールド、例えば円筒形状のポリマーロッドに対する異物反応を利用し、ポリマーロッドが炎症反応を引き起こし、組織構造体によるこのロッドの被包化が生じる。この管形状の組織構造体が、ティッシュ・エンジニアリング血管の基礎を形成することができる。
【０００９】
本発明者らは、皮下移植された人工ロッドのまわりの組織構造体の形成を、インプラント材料の特性、すなわち材料のタイプ、表面改質および生物活性被覆を調節することによって改良できることに気付いた。組織反応の誘発をできるだけ小さくしようとするほとんどの研究とは対照的に、本発明のｉｎ  ｓｉｔｕティッシュ・エンジニアリングのアプローチは、生成される組織の細胞型、マトリックス形成、並び方および分布について特定の要件を伴って顕著な組織反応を意図的に引き起こそうとする。
【００１０】
加えて、本発明者らは、ヒトまたはより大きな動物（５０ｋｇ超）に用いるための、ポリ（エチレンオキシドテレフタレート）−ポリ（ブチレンテレフタレート）コポリマーで作られた適切な特性をもつ大きな直径のロッド（例えば３０〜１００ｍｍ）の製作に関する問題を克服した。ロッドを損傷しない除去を可能にするために分離できる両半分からなるモールドキャビティを用いて、新しい圧縮モールドの原理を設計した。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】パンチ（１）と、チャンバ（２）と、直径８ｍｍのロッドの形の１０個のモールドキャビティ（３）とを含み、ロッドが２つのモールド半体（４）の内側表面によって画成される、トランスファー成形装置。Ａがパンチ（１）の側面図、Ｂがパンチを含まない上面図であり、真ん中の点線が２つのモールド半体の間の境界を表す。
【図２】Ａ：長手方向端に丸みがつけられたリム（縁）を有する本開示によるロッドの図である。Ｂ：ロッドの長手方向端の表面に凹部を有するロッドの図である。
【図３】異なる表面処理および暴露時間の前および後のＰＡ３００、ＰＡ１０００およびＰＣＬの３Ｄ  ＡＦＭ画像である（走査サイズ１μｍ２、但しＣＨＣｌ３は２５μｍ２）。
【図４】クロロホルムでエッチングしたロッドの、異なるインキュベーション時間（１ｓ、５ｓ、１０ｓ）後のＳＥＭ画像である。スケール：２０μｍ（左上のみ２μｍ）。
【図５】様々な表面処理を行ったＰＡ３００ロッドに付着したラット皮膚繊維芽細胞（ＲＤＦ、左）およびマクロファージ（右）のＤＮＡアッセイ分析の図である。
【図６】（ａ）異なる処理をしたロッドのＡＦＭ粗さ定量化（走査サイズ１μｍでのＲｑ）の図である。処理時間は、Ｘ＝非改質；Ａｒ＝アルゴン３０分；Ｏｘ＝酸素５分；ＣＨＦ３＝トリフルオロメタン２．５分＋ＮａＯＨ＝水酸化ナトリウム１０分；ＣＨＣｌ３＝クロロホルム１０秒である。各処理されたロッドの粗さの倍増数がバーの上に示される。（ｂ）Ａｒ、Ｏ２およびＮａＯＨからなる親水処理（７０〜４０℃）と、ＣＨＦ３およびＣＨＣｌ３からなる疎水処理（８５〜１１０℃）の図である。（ｃ）非改質ロッド対予め選択された改質ロッドのタンパク質吸収アッセイの図である。
【図７】非改質Ｐａ３００ロッドと比較した、改質（Ａｒ３０分；Ｏｘ５分；ＣＨＦ３２．５分；ＮａＯＨ１０分；ＣＨＣｌ３１０秒）および被覆ロッドのまわりに形成された組織カプセルにおけるＡ：コラーゲンの絶対量、Ｂ：α−ＳＭＡすなわち筋繊維芽細胞の絶対量、およびＣ：α−ＳＭＡすなわち筋繊維芽細胞の割合の定量化の図である。
【図８】ブタでのクロロホルムで処理したロッドの皮下移植で見られた、コラーゲン、筋繊維芽細胞および残余炎症細胞から主になる厚い組織カプセルの図である。
【図９】図８の組織カプセルを頸動脈挿入グラフトとしてブタに移植した。血管移植の４週間後に、８７％のグラフトが開存していた。組織学的レベルでは、α−ＳＭＡ陽性細胞の量が図９に示すように実質的に増加した。
【図１０】動脈（左、Ａ）と静脈（右、Ｂ）とを接続するＳ形状の組織構造体の図である。矢印は血流の方向を示す。カニューレ型透析針を組織構造体に挿入することができる。好ましい実施形態では、（Ｓ形状の）組織構造体の外周が、例えばＰＣＬで作られた生分解性シートによって覆われうる。
【図１１】皮下に配置されたロッドの形のデバイスを示した図である。番号は、１．橈側皮静脈、２．ロッドの形のデバイス、３．橈骨動脈、４．尺骨、５．橈骨を表す。異物反応の過程は、ａ．デバイス上のタンパク質堆積、ｂ．デバイス上の顆粒球およびマクロファージの付着、ｃ．繊維芽細胞の流入、ｄ．繊維芽細胞によるコラーゲン合成および炎症細胞の消退である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本開示は、直径３〜２０ｍｍの（少なくとも一部または全体が）ロッドの形のデバイスを提供し、デバイスの表面は、デバイスの重量と比較して少なくとも０．５、５、１０または２０重量％等の、異物反応を誘発できる遅延型生分解性または非生分解性の材料を含む。外側層の表面、すなわちデバイスの（外側）表面は、二乗平均平方根粗さ（Ｒｑ）が少なくとも１００ｎｍであり、少なくとも１２５ｎｍであるのが好ましく、少なくとも１５０ｎｍであるのがより好ましい。Ｒｑは最大３００、５００、１０００、２０００、５０００ｎｍまたはそれより大きくてもよい。
【００１３】
明らかになるように、表面材料は、ヒトまたは動物の体の皮下に挿入されたときに急速に分解されてはならず、異物反応を誘発できなければならない、すなわちデバイスは、デバイスのヒトまたは動物の体への皮下挿入後例えば６週間以内に組織構造体によって被包化される。本開示において、遅延型生分解性または非生分解性とは、ヒトまたは動物の体の皮下スペースにあるときに例えば６週間の期間にわたり時間とともに分解するのが材料の１０重量％未満であることを意味する。さらに、デバイスは全体がこの材料からなってもよいし、またはデバイスの外側層だけがこの遅延型生分解性もしくは非生分解性材料を含んでもよい。例えば外側層は、遅延型生分解性または非生分解性材料を、当該外側層の総重量の少なくとも５０、７０、８０、９０、９５重量％含みうる。本開示において、「層」という用語は、必ずしもデバイスの内側部分と組成が異なるかまたはその他の点で目にみえて識別可能であるセクションを意味することを意図しない。この用語は、例えば厚さ１〜２０ｍｍのデバイスの外側（外周）セクションを指すにすぎない。例えば、外側層がデバイス全体を形成してもよいが、デバイスのコアが中空であるかまたは異なる組成であり、当該コアが外側層によって囲まれることも予想される。特定の実施形態では、デバイスは、デバイスが使用中に破損する可能性を減らすために、（本明細書に後述する）ＰＥＯＴ／ＰＢＴ３００／５５／４５より剛性の（可撓性が低い）（例えば直径１〜２０ｍｍの）内側コアを含む。
【００１４】
二乗平均平方根粗さ（Ｒｑ）は、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ；Ａｔｏｍｉｃ  Ｆｏｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）により、例えばＰｉｃｏＳｃａｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ  ２５００−Ｑｕａｄｒｅｘｅｄ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ、米国）を用いて、走査サイズを（約）１００μｍ２（１０×１０μｍ）として、Ｔａｐｐｉｎｇ（登録商標）Ｍｏｄｅを用いて決定することができる。Ｎａｎｏｓｃｏｐｅソフトウェア（バージョン：６１２ｒ１（登録商標）、２００２  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｖｅｅｃｏ）を通じて、様々なパラメータ、すなわち積分ゲインおよび比例ゲインを調節して表面の走査を最適化することにより画像が処理されるのが好ましい。
【００１５】
粗さ分析はＲａ、ＲｑおよびＲｍａｘの測定を含みうることは技術者に明らかである（Ｇａｄｅｌｍａｗｌａ他  ２００２年；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２３：１３３−１４５）。Ｒａが最も普遍的に使用される。これは、算術平均高さパラメータまたは中心線平均であり、「１つのサンプリング長さにわたる平均線からの粗さ凹凸の絶対偏差の平均」と定義される。Ｒａは、評価長さに沿ったすべての山および谷（孔）を平均し、表面の全体的描写を与え、外れ点を中和する。Ｒｑは、Ｒａに対応する二乗平均平方根粗さパラメータである。これは、「表面高さの分布の標準偏差」を表し、Ｒａよりも平均線からの大きな偏差に高感度である。
【数１】
0006529090.tif 000002
【００１６】
Ｒｑは、Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ，ＳＰＩＰ（商標）、バージョン４．２．２．０（またはそれ以降の）ソフトウェアを用いて決定することができ、例えば「Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｒｏｕｇｈｎｅｓｓ」をクリックすることによって、画像の表面粗さを分析すなわち測定することができる。上述のように、粗さ測定は１００μｍ２の表面積により行うことができる。Ｒｑ測定のさらなる詳細については、Ｇａｄｅｌｍａｗｌａ他  ２００２年；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２３：１３３−１４５を参照。
【００１７】
さらに、本開示の範囲内では、ロッド（形）は、（ほぼ）円筒（形）を意味し、外周は円形状であるのが好ましいが、外周が楕円形状であってもまたは別の湾曲した形状を有していてもよい。さらに、外周の形状は必ずしも対称形である必要はないが、対称形であるのが好ましい。ロッド（形）はさらに、その長手方向に沿ってどこででも曲げられてもよいし（例えばＳ形状である）、および／または長手方向端の一方もしくは両方の縁に、縁（リム）の少なくとも一部はより角ばらないように丸みがつけられうる。加えて、ロッド形は、一方または両方の端表面に凹部（またはノッチ）を含んでもよい。デバイスの一部がロッド形を有する限り、デバイスが必ずしも全体としてロッド形を有する必要はないことも明らかとなるであろう。所望の用途のための形（すなわち長さおよび直径）をもつ、各患者に合わせたロッドを作ることができる。ロッドの直径によって、得られる組織構造体の内径が決定される。このようにして、組織構造体を患者の天然の血管（単数または複数）に吻合することができる。
【００１８】
好ましくは、異物反応を誘発できる（表面）材料は、ポリマー、例えばポリエステル、ポリカーボネート、ポリ（オルトエステル）、ポリホスホエステル、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリビニルアルコール、ポリプロピレンフマレート、ポリテレフタレートもしくはこれらの１つ以上のコポリマー；またはポリアルキレンオキシドおよびテレフタレートに基づくコポリマー、もしくはより好ましくはポリ（エチレンオキシドテレフタレート）−ポリ（ブチレンテレフタレート）コポリマーである（またはこれらのうちの１つ以上を含む）のが好ましく、後者は式Ａ／Ｂ／Ｃによって表されるのが好ましく、式中、
−  Ａは、コポリマー反応において使用される最初のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の（平均）分子量を指し、２００〜４００の間であり、２７５〜３２５の間であるのが好ましく、２９０〜３１０であるのがより好ましく；
−  Ｂは、コポリマー中のポリ（エチレンオキシドテレフタレート）の重量％を指し、４０〜７０であり、５０〜６０であるのが好ましく、５３〜５７であるのがより好ましく；
−  Ｃは、コポリマー中のポリ（ブチレンテレフタレート）の重量％を指し、３０〜６０であり、４０〜５０であるのが好ましく、４３〜４７であるのがより好ましい。
最も好ましいＰＥＯＴ／ＰＢＴブロックコポリマーは、３００／５５／４５である（フローニンゲン、オランダのＰｏｌｙＶａｔｉｏｎ  Ｂ．Ｖ．から得られる）。さらに、材料がシリコーンおよび／または（ポリ）アクリレートを含まないのが好ましい。
【００１９】
デバイスは、長さ３０〜８００ｍｍおよび／または直径２〜１００もしくは３〜２０ｍｍであり、長さ４０〜３００もしくは５０〜１５０ｍｍおよび／または直径６〜１０ｍｍであるのが好ましい。これらの寸法は、生じる組織構造体がヒトの自然の血管の寸法に類似する寸法を有する利点がある。
【００２０】
前述のように、生成される組織の特定の細胞型組成、マトリックス形成、並び方および分布を伴って所望の異物反応を誘発するために粗さが決定的要因であることから、デバイスの外側表面はその粗さ（Ｒｑ）に関して適切に描写されうる。しかし、粗さ（Ｒｑ）に加えて、デバイスの（外側層の）表面は、その多孔質構造によってさらに特徴づけることができる。当該表面は、以下のように定義できる多孔質構造を有しうる：
−  孔密度は、１００μｍ２あたりの孔が１０〜８０であり、２０〜６０であるのが好ましく、２５〜５０であるのがより好ましく、１００μｍ２あたりの孔が３５〜４５であるのがさらに好ましく；
−  平均孔直径は、０．４〜１．８μｍであり、０．６〜１．３μｍであるのが好ましく、０．８〜１．０μｍであるのがより好ましく、０．８５〜０．９５μｍであるのがさらに好ましい。
【００２１】
孔密度は、（例えばＰｈｉｌｉｐｓ  ＸＬ３０  ＥＳＥＭ−ＦＥＧ  ＳＥＭを用いた）走査型電子顕微鏡画像に基づいて決定される、各表面の２５０００μｍ２（５００×拡大）の（少なくとも）９つのランダムに選択されたセクションの孔（表面の小さな谷／穴）の平均数をとることによって決定することができる。直径が少なくとも０．０２５μｍ２の孔が計数されるのが好ましい。
【００２２】
同様に、平均孔直径は、（例えばＳＥＭによって）各表面の２５０００μｍ２（５００×拡大）の（少なくとも）９つのランダムに選択されたセクションに見つけられるすべての孔の直径の平均をとることによって決定することができる。孔の密度および直径のいずれに関しても、ＩｍａｇｅＪ１．４６ｒ（またはそれ以降）を用いて、好ましくは閾値を適用し、さらに画像を反転させて孔だけを測定できるようにすることにより画像を解析して孔径測定値を提供することができ、スケールバーラインが参照として用いられる。直径が少なくとも０．０２５μｍの孔の平均直径がとられるのが好ましい。
【００２３】
加えて、本開示によるデバイスは、捕捉気泡法（ｃａｐｔｉｖｅ  ｂｕｂｂｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ）により少なくとも７５°、好ましくは少なくとも８０°、最も好ましくは少なくとも９０°の接触角によって特徴づけられる濡れ性をもつ（外側層の）表面を有しうる。捕捉気泡法は技術者に周知であり、液滴形状分析を用いて２μＬの水滴と表面との間の接触角を測定することを含む（実施例２を参照）。
【００２４】
本開示から明らかになるように、デバイスの（外側層の）表面の所望の二乗平均平方根粗さ（Ｒｑ）、濡れ性および／または孔は、化学エッチングによって、好ましくはデバイスの表面をハロゲン化炭素溶剤またはクロロホルムおよび／もしくはジクロロメタン等の有機溶剤に所望の特性が得られるようなやり方でさらすことによって、例えばデバイスを当該溶剤に浸すことによって得られる。デバイスの外側表面の少なくとも一部は記載したＲｑ、濡れ性および／または孔構造を有しなければならないが、必ずしも表面全体が有しなければならないわけではないことが技術者には明らかであろう。
【００２５】
本開示による特に好ましい実施形態は、一方または両方の長手方向端から３０ｍｍ以内、好ましくは１０ｍｍ以内に凹部を含むデバイスに関する。デバイスの一方または両方の端表面が凹部を含むのが好ましい（例えば図２Ｂを参照）。このような凹部は、当初は製造エラーとして発生したものであるが、デバイスの移動を回避するためにデバイスが挿入される皮下スペースの（周囲の）組織にデバイスを縫合するために都合よく使用できることが分かった。実施例１から分かるように、デバイスを縫合しないとデバイスが移動し、採取時にもはやｉｎ  ｓｉｔｕにないこと、すなわち挿入した皮下スペース内にないことが起こりうる。
【００２６】
換言すれば、凹部は、デバイスが意図した場所に意図した期間とどまるようにデバイスを縫うために用いることができる。例えば、針を凹部に挿入し、容易にデバイスの直径の一部だけに通すことができるが、凹部がない場合には当該針を直径全体に通すかまたはデバイスのリムの近くのセクションに通さなければならないため、デバイスが不必要に損傷されうる。
【００２７】
加えてまたは代わりに、デバイスの一方または両方の長手方向端の縁（リム）に、例えば縁（リム）の少なくとも一部が角ばらないかまたはより角ばらないように、丸みがつけられてもよい（例えば図２Ａを参照）。言うまでもなく、この点での丸みがつけられるとは、縁の円形または楕円形状の外周形状を指すのではなく、デバイスの一方または両方の端表面（底部）からその長手方向表面へのなだらかな移行を指す。これは、デバイスを生産する方法で使用するモールドキャビティのロッドの形を適宜適応させることによって達成できる。このようにして、患者の褥瘡性潰瘍の発生を防止または減少でき、患者の体からのデバイスの自然押出の可能性を減少できることが分かった。
【００２８】
任意に前述の実施形態と組み合わせることができる別の好ましい実施形態では、デバイスが（その長手方向にしたがって）一方または両方の長手方向端から５０ｍｍ以内、または好ましくは４０、３０もしくはより好ましくは２０もしくは１０ｍｍ以内で曲げられ、デバイスが（その長手方向にしたがって）Ｓ形状を有する、つまり湾曲部が（ほぼ）対向方向にあるのが好ましい。言うまでもなくこれは、デバイスを生産する方法で使用するモールドキャビティのロッドの形を適応させることによって達成できる。湾曲部（単数または複数）および／またはＳ形状により、類似の形状の組織構造体が生じ、組織構造体を血液透析手技における血管アクセスに用いる際に患者の動脈および／または静脈により容易かつ確実に取り付けられるという利点がある。
【００２９】
血管アクセスを準備することは、血液透析を始める前の重要なステップである。血管アクセスは、透析の間に血液が除去され戻される体の部位、すなわちカニュレーション部位である。血液透析処置の間に洗浄される血液の量を最大化するために、血管アクセスは時間単位あたり大量の血流を可能にしなければならない。これは、動脈を静脈に接続するために本開示による組織構造体を用いて達成できる。Ｓ形状の組織構造体は、図１０に見られるように組織構造体の両長手方向端のリムを動脈および静脈により容易かつ確実に取り付けられるために有利である。これにより、組織構造体が動脈および／または静脈に対して緩むのが防止される。
【００３０】
本開示によるデバイスは、デバイスがヒトまたは動物の体の皮下に挿入されたときの組織応答をさらに調整するために、コラーゲン等の細胞外マトリックスタンパク質および／またはＴＧＦ−β等の成長因子（単数または複数）でさらに任意に少なくとも部分的に被覆されてもよい。
【００３１】
本開示によるデバイスが皮下移植に適することは、技術者に明らかとなるであろう。デバイスは、毒性の物質、すなわち急性もしくは遅発性疾患をもたらす物質、またはそのような疾患の可能性の少なくとも１０％の上昇を招くことが知られている物質を含まないのが好ましい。同時にまたは代わりに、デバイスは、ヒトまたは動物の体に皮下挿入されたときに異物反応を誘発することができる、すなわちデバイスはヒトまたは動物の体に例えば１〜６週間皮下挿入されたときに組織構造体によって被包化される。
【００３２】
本開示は、（少なくとも部分的に）ロッドの形であるデバイスに特に焦点を当てるが、シートの形（例えば厚さ１、２、３、４、または５ｍｍ）、球体の形、または、デバイスの皮下スペース移植の結果所望の形の組織構造体、例えば患者の交換予定の（病気の）中空器官、例えば血管、尿管、膀胱などに類似しうる中空組織構造体が生じるようなその他の形等の他の形も可能である。
【００３３】
本開示は、デバイス、特に特定の表面粗さ（Ｒｑ）のロッドの形のデバイスを生産する方法も提供する。この方法は、
ａ）直径３〜２０ｍｍの少なくとも部分的に少なくとも１つのロッドの形であるモールドキャビティであって、ロッドの形は、少なくとも２つのモールド部分（のＵ形状の内側表面）によって画成される、モールドキャビティ
を含む成形装置を提供するステップと；
ｂ）任意にプレス手段を用いて、流体（例えば溶融、液体）ポリ（エチレンオキシドテレフタレート）−ポリ（ブチレンテレフタレート）コポリマー（単数または複数）をモールドキャビティの少なくとも１つのロッドの形の少なくとも一部に満たすステップと；
ｃ）コポリマーを固化させるステップと；
ｄ）少なくとも２つのモールド部分を固化したコポリマーから分離して、直径３〜２０ｍｍのロッドの形の少なくとも１つのデバイスを得る、ステップと；
ｅ）少なくとも１つの得られたデバイスをクロロホルムおよび／またはジクロロメタンに５〜１５秒さらして、直径３〜２０ｍｍのロッドの形の少なくとも１つのデバイスを得る、ステップであって、デバイスは、ポリ（エチレンオキシドテレフタレート）−ポリ（ブチレンテレフタレート）コポリマーを含み、デバイスの外側表面は、二乗平均平方根粗さ（Ｒｑ）が少なくとも１００ｎｍであり、少なくとも１５０ｎｍであるのが好ましく、少なくとも１７５ｎｍであるのがさらに好ましく、少なくとも１８０ｎｍであるのが最も好ましい、ステップと
を含む。
【００３４】
ステップａ）では成形装置が提供され、これは例えば実施例３および図１のような圧縮成形装置とすることができる。成形は、モールドと呼ばれる剛性フレームを用いて液体または柔軟な原材料を成形することとみなしうる。それとともに、本成形装置は、本方法の製品の形、すなわち直径が３〜２０ｍｍであり、４〜１５ｍｍであるのが好ましく、６〜１０ｍｍであるのがより好ましい少なくとも１つのロッドの形を少なくとも部分的に有するモールドキャビティを有する。
【００３５】
図１に見られるように、モールドキャビティは、１〜１０本、１〜２０本もしくは１０〜１００本、または図１の実施例のちょうど１０本等の複数のロッド型のサブキャビティを含むことができる。これらのロッド型のサブキャビティは、成形材料を提供または格納するために用いることができるチャンバに接続されていてもよく、その後チャンバ内に嵌合するパンチ等のプレス手段を任意に用いてチャンバから成形材料がロッド型のサブキャビティ内に流されまたは押し込まれる。液体または成形可能成形材料が供給されたチャンバ内でパンチをロッド型のキャビティの方向に動かすことによって、当該キャビティが成形材料で満たされる。
【００３６】
モールドキャビティの少なくとも１つのロッドの形は、少なくとも２つ、好ましくはちょうど２つのモールド部分のＵ形状の内側表面によって画成される。換言すれば、当該モールド部分のこれらの内側表面は、ロッド形（単数または複数）の円周を少なくとも部分的にたどり、２つのモールド部分がそれぞれ円周の４０〜６０％をカバーするのが好ましく、約５０％をカバーするのがより好ましい。ロッドの長手方向端は、モールド部分の内側表面によって画成される必要はない、すなわちロッド形の長手方向端（単数または複数）は、（別の）サブキャビティで終端してもよいし、または開いていてもよい。
【００３７】
ステップｂ）では、流体ポリ（エチレンオキシドテレフタレート）−ポリ（ブチレンテレフタレート）コポリマー（ＰＥＯＴ／ＰＢＴ（フローニンゲン、オランダのＰｏｌｙＶａｔｉｏｎ  Ｂ．Ｖ．から得られる）が、モールドキャビティの少なくとも１つのロッドの形の少なくとも一部に満たされる。これは例えば、コポリマーを少なくともその融解温度より高温に加熱して流体の成形可能なコポリマーを得、これをモールドキャビティの少なくとも１つのロッドの形にパンチ等のプレス手段を任意に用いて満たすことによって行うことができる。プレス手段の使用は、最終製品における気泡の発生が減少する利点がある。
【００３８】
ポリ（エチレンオキシドテレフタレート）−ポリ（ブチレンテレフタレート）コポリマーは、式Ａ／Ｂ／Ｃによって表されるのが好ましく、式中、
−  Ａは、コポリマー反応において使用される最初のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の（平均）分子量を指し、２００〜４００の間であり、２７５〜３２５の間であるのが好ましく、２９０〜３１０であるのがより好ましく；
−  Ｂは、コポリマー中のポリ（エチレンオキシドテレフタレート）の重量％を指し、４０〜７０、５０〜６０であるのが好ましく、５３〜５７であるのがより好ましく；
−  Ｃは、コポリマー中のポリ（ブチレンテレフタレート）の重量％を指し、３０〜６０であり、４０〜５０であるのが好ましく、４３〜４７であるのがより好ましい。
最も好ましいＰＥＯＴ／ＰＢＴブロックコポリマーは、３００／５５／４５である（フローニンゲン、オランダのＰｏｌｙＶａｔｉｏｎ  Ｂ．Ｖ．から得られる）。
【００３９】
ステップｃ）では、コポリマーをモールドキャビティ内で固化させる。これは、コポリマーをその融解温度より低温に冷却させることで行うことができる。
【００４０】
ステップｄ）では、少なくとも２つのモールド部分を固化したコポリマーから分離して、ロッドの形の少なくとも１つのデバイスを得る。パンチを用いて成形材料をモールドキャビティに圧入できるため、少なくとも２つのモールド部分を、成形材料をモールドキャビティに圧入するために使用しないこと、および／または少なくとも２つのモールド部分をステップｄ）の前に分離しないことがさらに好ましい。デバイスは、必ずしもロッドの形状ではない追加の固化したコポリマーに接続されてもよい。
【００４１】
少なくとも１つのロッドの形を形成するＵ形状の内側表面をそれぞれ有する少なくとも２つのモールド部分を使用する具体的利点は、少なくとも１つのデバイスを損傷せずに除去できることである。ロッド型のキャビティが固定され、その結果デバイスを一方の端から引っ張るかまたは押すことによってしか除去できなければ、当該デバイスを損傷する可能性がより大きくなるだろう。
【００４２】
ステップｅ）では、少なくとも１つの得られたデバイスを、ハロゲン化炭素溶剤または有機溶剤、好ましくはクロロホルムおよび／またはジクロロメタンに（例えばＲｑなどの）所望の特性が得られるようなやり方で、および／または所望の特性が得られるような期間にわたりさらす。これは、デバイスをクロロホルムおよび／またはジクロロメタンに指定の期間浸すこと、浸漬することまたは沈めることによって実施することができる。このようにして、所望の表面特性と直径とを有するロッドの形の少なくとも１つのデバイスが得られ、このデバイスは皮下に挿入されたときに異物反応を誘発することができる。
【００４３】
好ましい実施形態では、デバイスは全体がＰＥＯＴ／ＰＢＴブロックコポリマーからなるか、またはデバイスの総重量に対して当該材料を少なくとも７０、８０、９０、９５重量％含み、もしくは９９重量％含んでもよい。デバイスの外側表面は、二乗平均平方根粗さ（Ｒｑ）が少なくとも１００ｎｍであり、少なくとも１２５ｎｍであるのが好ましく、少なくとも１５０ｎｍであるのがより好ましく、少なくとも１７５ｎｍであるのがさらに好ましく、少なくとも１８０ｎｍであるのが最も好ましく、および／または最大３００、１０００もしくは３０００ｎｍである。
【００４４】
本方法により、少なくとも１つのデバイス、例えばロッド形状の人工モールドを生産することができ、このデバイスは、ヒトまたは動物の体の皮下スペースに１〜６週間挿入すると異物（または炎症）反応を引き起こし、組織構造体によるモールドの被包化が生じる。この組織構造体が、ティッシュ・エンジニアリング血管の基礎を形成しうる。
【００４５】
本開示は、組織構造体を提供する方法をさらに提供し、この方法は、
ａ）本開示によるデバイスをヒトまたは動物の体の皮下スペースに１〜６週間、好ましくは２〜４週間の期間挿入して、デバイス上に組織構造体を形成させるステップと；
ｂ）好ましくはデバイスと、任意にその上に形成された組織構造体とを皮下スペースから除去するステップであって、デバイスと組織構造体とは、皮下スペースからの除去の前または後に分離されうる、ステップと；
ｃ）好ましくは、組織構造体を生分解性シートで覆うステップと；
ｄ）好ましくは、組織構造体を静脈、動脈および／または人工腎臓に接続するステップ（このステップは、ステップｃ）の前に行っても後に行ってもよい）と
を含む。
【００４６】
例えば、ステップａ）では、およそ１ｃｍの小さな切開の後に、例えば腕（上腕または前腕）に長手方向皮下ポケットを形成し、このポケットにデバイスを挿入することができる。感染を防ぐために切開部を閉じ、わずか１〜６週間または２〜４週間後に、例えば切開部を作製することによって、皮下ポケットにアクセスすることができる。それからデバイスと、任意にその上に形成された組織構造体とを除去することができる（ステップｂ）。したがって組織構造体を皮下スペース（ｉｎ  ｓｉｔｕ）に残し、その後一端を例えば動脈に、他端を例えば静脈に接続することが可能である。
【００４７】
この方法によって得られる組織構造体も提供される。
【００４８】
類似して、本開示は、手術または治療によるヒトまたは動物の体の処置に使用するための物質を提供し、この物質はＰＥＯＴ／ＰＢＴであり、ＰＥＯＴ／ＰＢＴは３００／５５／４５であるのが好ましく、この物質は本開示によるデバイス（の形）であるのがより好ましく、使用には、
ａ）物質をヒトまたは動物の体の皮下スペースに１〜６週間、好ましくは２〜４週間の期間挿入して、物質上に組織構造体を形成させるステップと；
ｂ）好ましくは物質と、任意にその上に形成された組織構造体とを皮下スペースから除去するステップであって、物質と組織構造体とは、皮下スペースからの除去の前または後に分離されうる、ステップと
を含む。さらに、上述のステップｃ）および／またはｄ）がここでも適用されてもよい。
【００４９】
上述の方法の結果、組織構造体の厚さ５μｍの横断面が以下の免疫組織化学的パラメータを有することを特徴とする、中空管の形の（単離された、すなわちヒトまたは動物の体外の）組織構造体が得られる：
−  α−ＳＭＡに対する抗体（Ｄａｋｏ、オランダから得られる；１：１０００）を視覚化することによって測定される、総面積に対して１５〜２５％のα平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）陽性面積；
−  ピクロシリウスレッド染色（例えばＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃキット）によって測定される、総面積に対して９０〜１００％のコラーゲン陽性面積；
ならびに、好ましくは：
−  ＣＤ４５に対する抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ、オランダ、１：５０、熱誘導０．１％トリプシン抗原回復）を視覚化することによって測定される、総面積に対して０〜１０％のＣＤ４５陽性面積；および／または
−  ＣＤ６８に対する抗体（例えばＡｂＤ、Ｓｅｒｏｔｅｃ、ｃｌｏｎｅ  ＭＡＣ３８７、１：１０）を視覚化することによって測定される、総面積に対して０〜５％のＣＤ６８陽性面積；および／または
−  ビメンチンに対する抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ、オランダ；１：３００、熱誘導プロテイナーゼＫ抗原回復）を視覚化することによって測定される、総面積に対して５０〜７０％のビメンチン陽性面積。
【００５０】
横断面は、組織構造体の中央からとるのが好ましく、ここで横断面は長手方向に対して直角である。ＩｍａｇｅＪ画像処理および解析ソフトウェアのバージョン１．３３またはそれ以降（アメリカ国立衛生研究所開発）を使用して定量化を行うことができ、特異的に染色された面積、例えば視覚化された抗体が特異的に結合した箇所の割合を、横断面の総面積に対して決定することができる。当該横断面の面積の少なくとも１０％を表す画像に基づいて定量化を行うのでも十分でありうる。
【００５１】
組織構造体は、円周方向に並んだα−ＳＭＡ陽性、デスミン陰性筋繊維芽細胞、および円周方向に並んだビメンチン陽性、α−ＳＭＡ陰性繊維芽細胞、ならびに円周方向に並んだＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンとグリコサミノグリカンとを含む細胞外マトリックスを含み、任意の白血球および／または異物巨細胞をさらに含む壁を含む組成を有しうる。壁厚は、組織構造体の長手方向長さの少なくとも８０％以上にわたり０．５〜５ｍｍまたは１〜４ｍｍでありうる。
【００５２】
上に定めたパラメータおよび／または組成を有する本開示による組織構造体は、ＩＳＯ７１９８ガイドライン（その第１方法が好ましい）にしたがって決定される平均破裂圧力が少なくとも１７００ｍｍＨｇであり、少なくとも２０００ｍｍＨｇであるのが好ましいことが分かり、これは動脈循環系への移植に十分なものである。さらに、ＩＳＯ７１９８ガイドラインにしたがって決定される縫合強度は、少なくとも２．５Ｎであり、少なくとも３Ｎであるのが好ましく、少なくとも３．５Ｎであるのがより好ましいことが分かり、ＩＳＯ７１９８にしたがったコンプライアンスは、少なくとも５％／１００ｍｍＨｇであり、６％／１００ｍｍＨｇであるのが好ましく、７．５％／１００ｍｍＨｇであるのがより好ましいことが分かった。理論に拘束されるものではないが、本発明者らは、高い平均破裂圧力および縫合強度を可能にするのは、組織構造体中のコラーゲンの架橋の（高い）レベルであると考える。
【００５３】
組織構造体は、おそらくは組織構造体を血流および血圧にさらすことに起因して、機能血管に分化転換することができる。このように、組織構造体を例えば機能血管としておよび／または血液透析手技のカニュレーション部位として用いることができる。
【００５４】
組織構造体を尿管（腎臓から膀胱へ尿を導く管）または尿道（膀胱から生殖器へ尿を導く管）として使用することも想定される。例えばＭｉｔｒｏｆａｎｏｆｆ法で目的とするような膀胱と皮膚表面との間の導管として組織構造体を使用できるとも予想される（ＭｉｎｇｉｎおよびＢａｓｋｉｎ  ２００３年，Ｉｎｔ  Ｂｒａｚ  Ｊ  Ｕｒｏｌ  ２９（１）：５３−６１）。
【００５５】
組織構造体は、一方または両方の長手方向端から５０ｍｍ以内、または好ましくは４０、３０もしくはより好ましくは２０ｍｍ以内で曲げられ、デバイスがＳ形状を有するのが好ましい。これは、本明細書に前述したように、一方または両方の長手方向端から５０ｍｍ以内、または好ましくは４０、３０もしくはより好ましくは２０ｍｍ以内で曲げられた、特に適応させたデバイスを用いて達成される。
【００５６】
本開示は、（手術または治療によるヒトまたは動物の体の処置において）血管として使用するための組織構造体も提供し、血管は、血液透析のためのカニュレーション部位（すなわち血管アクセス）として使用するためのものであるのが好ましい。（手術または治療によるヒトまたは動物の体の処置において）動静脈グラフトとしての移植に使用するための組織構造体も予想される。例えばこれには、組織構造体を好ましくは皮下に移植するステップを含む、必要な患者を処置する方法を含む。特別の利点は、組織構造体が患者の自己由来である（ドナーとレシピエントが同じである）ことであろう。組織構造体を育てる場所が使用を意図する場所の近く（例えば１０、８、５、２ｃｍ以内またはそれ未満）である場合には、組織構造体がすでにｉｎ  ｓｉｔｕにあってもよい。これは、動脈バイパス手技等において、病気の血管を置換するために、または血液透析のカニュレーション部位（すなわち血管アクセス）を作製するために行われてもよい。
【００５７】
組織構造体を生分解性シート（例えばＸｅｌｔｉｓから得られる厚さ３、２または１ｍｍ未満のポリカプロラクトンすなわちＰＣＬ等の弾性ポリマー）で（少なくとも部分的に）覆うことが有利でありうる。シートは、厚さを２００〜８００μｍとすることができ、３００〜５００μｍとするのが好ましい。図１１も参照。これは、患者内で使用されて圧力がかかったときに組織構造体にさらなる支持を与え、出血につながりうる構造体の引裂をさらに防ぐことができる。シートの使用は、エラスチン形成も刺激しうる。本開示においては、生分解性とは、ヒトまたは動物の体の皮下スペースにあるときに、シートが例えば１、２または３ヵ月の期間で消失するように時間とともに分解することを意味する。
【００５８】
さらに、組織構造体を、（人工またはポリマー）管等によって（装着型）人工腎臓に接続できることが想定される。これにより、病院外、例えば自宅での血液透析を可能にすることができる。加えて、組織構造体を、例えば末梢動脈の閉塞性疾患をもつ患者のために動脈バイパスグラフトを脚等に作製するために、末梢動脈に接続できることが想定される。
【００５９】
本開示によるアプローチによって、体が自らのティッシュ・エンジニアリング血管を生成することが可能になり、例えば血管細胞を播種した人工足場を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏアプローチからなる従来技術のティッシュ・エンジニアリングのアプローチと比較して、より容易で時間のかからない方法がもたらされる。
【００６０】
本開示の方法で使用する従来技術を行う方法は、技術者に明らかである。
【実施例】
【００６１】
実施例１−ｉｎ  ｓｉｔｕ血管ティッシュ・エンジニアリング
本実施例は、自己由来の、完全に生物学的なティッシュ・エンジニアリング血管（ＴＥＢＶ；ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌ）を生成するｉｎ  ｓｉｔｕ血管ティッシュ・エンジニアリングアプローチを説明する。移植時に管形状の線維細胞性組織カプセルによる被包化を生じる炎症反応を引き起こすポリマーロッドを開発し、これがＴＥＢＶの基礎を形成することができる。インプラント材料特性を調節することによって、組織カプセル形成を最適化するように組織反応を調整することができる。ポリ（エチレンオキシドテレフタレート）−ポリ（ブチレンテレフタレート）（ＰＥＯＴ／ＰＢＴ）とポリエチレングリコール（ＰＣＬ）とからなるロッド、およびガスプラズマ処理、化学エッチング、および成長因子被覆を施したロッドをラットに皮下移植し、組織反応を改変する能力をテストした。３週後に、組織カプセルがまわりに形成されたカプセルを採取して分析した。組織カプセルは、円周方向に並んだコラーゲンおよび筋繊維芽細胞から主になっていた。異なるインプラント材料は、組織カプセルの形成に実に明白な違いをもたらした。インプラント材料特性を変化させることによって、組織カプセル組成、細胞分布および組織配置を調整することができ、ＴＥＢＶに適切な基礎が生成された。
【００６２】
材料および方法
ロッドの製作
直径１．７５ｍｍおよび長さ最低２ｃｍの弾性コポリマー、ポリ（エチレンオキシドテレフタレート）−ポリ（ブチレンテレフタレート）（ＰＥＯＴ／ＰＢＴ、ＩｓｏＴｉｓ  Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ  Ｓ．Ａ．、オランダ）からなる固体の円筒形状のロッドを、溶融押出機として使用される高速プロトタイピングユニット（Ｍｏｒｏｎｉ他、２００６年  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｍａｒ；２７（７）：９７４−８５）（Ｅｎｖｉｓｉｏｎｔｅｃ，ＧｍｂＨ，ドイツ）により製作した。このコポリマーの製作の間に、ＰＥＯＴ／ＰＢＴ比および使用される最初のＰＥＧの分子量を変更して、濡れ性（Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ他、２００２年  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｊａｎ  １７；７８（１−３）：１７５−８６）およびタンパク質吸着（Ｍａｈｍｏｏｄ他  ２００４年  Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  Ｄｅｃ  １０；３０１（２）：１７９−８８）等の材料の性質を調節することができる。簡潔にいえば、シリンジに充填したＰＥＯＴ／ＰＢＴ顆粒を、１８０〜２００℃に加熱した。４〜５バールの窒素ガスを印加して溶融ポリマーを押出した。２つの異なるＰＥＯＴ／ＰＢＴの組成を用い、ＰＥＯＴ／ＰＢＴの重量％を５５／４５（Ｐｏｌｙａｃｔｉｖｅ  ３００（登録商標）／Ｐａ３００）、および７０／３０（Ｐｏｌｙａｃｔｉｖｅ（登録商標）１０００／Ｐａ１０００）とし、コポリマー反応のために使用する最初のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の分子量をそれぞれ３００ｇ／ｍｏｌおよび１０００ｇ／ｍｏｌとした。対照として、生体適合性で周知のポリ−ε−カプロラクトン（ＰＣＬ）を用いて、溶融押出（Ａｘｏｎ小型押出機、Ａｘｏｎ  ＡＢ  Ｐｌａｓｔｍａｓｋｉｎｅｒ、スウェーデン）を用いて類似の寸法のロッドを製作した。ＰＣＬペレット（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＣ  １２、Ｐｕｒａｃ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、オランダ）を１７０℃に加熱し、ＰＣＬが完全に溶融するまで撹拌した（０．６ｃｃ／回転）。その後これを、キャピラリを通じて２５バールの圧力下で押出して円筒状ロッドを製作した。
【００６３】
インプラント材料の改質
クロロホルムエッチングでは、非改質Ｐａ３００ロッドをクロロホルム（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、オランダ）に１０秒間浸漬し、激しく空気乾燥させて残留クロロホルムを蒸発させた。それからロッドを超純水で洗浄し、４２ｋＨｚで１５分間２回超音波処理してクロロホルムの完全な除去を確保し、その後空気乾燥させた。酸素ガスプラズマ処理では、非改質Ｐａ３００ロッドを、１００ｍＴｏｒｒの酸素ガスで、３０Ｗまたは１００Ｗで５分間処理した（反応性イオンエッチング、テスキ、トゥウェンテ大学、オランダ）。すべての改質および非改質ロッドを、ガンマ放射線（Ｉｓｏｔｒｏｎ、オランダ）により２５ｋＧｙを上回る線量で滅菌した。加えて、滅菌１００Ｗ酸素処理Ｐａ３００ロッドを、フローキャビネットにおいて滅菌状態でＴＧＦ−β溶液に１分間浸した。ＴＧＦ−β溶液は、滅菌Ｉ型ラットコラーゲン（５ｍｇ／ｍＬ、Ｃｕｌｔｕｒｅｘ、英国）に混合してコラーゲン１ｍＬあたり１０ｎｇのＴＧＦ−β濃度とした活性化ＴＧＦ−β３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、英国）からなった。対照として、類似の酸素処理Ｐａ３００ロッドを、ＴＧＦ−βを含まないＩ型ラット尾コラーゲンにおいて１分間ディップコートした。ロッドを空気乾燥させ、移植に直接使用した。
【００６４】
ラットモデル
１５匹の生後１３週間目の雄ウィスターラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ、フランス）を標準の研究用ケージに収容し、餌および水を自由に摂取させた。すべての手術を、イソフルラン吸入麻酔下で行った。ラットあたり４つのロッドを腹部の皮下スペースに移植した。対照として働く非改質ＰＣＬロッドを５回移植し、すべてのＰａ３００およびＰａ１０００非改質ロッド、ならびにすべてのＰＡ３００改質および被覆ロッドを、９回移植した。およそ１ｃｍの小さな水平切開後に縦方向皮下ポケットを形成し、このポケットにロッドを挿入した。その後、４−０ｖｉｃｒｙｌ縫合糸（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ、オランダ）を使用して切開部を閉じた。ラットに、手術毎のｐｅｒｆａｌｇａｎ（２００ｍｇ／ｋｇ）注入により術後鎮痛を直接与えた。加えて、手術１日後までｐｅｒｆａｌｇａｎ（２．７ｍｇ／ｍＬ）を飲料水に加えた。３週間後に、組織カプセルがまわりに形成されたロッドを採取し、動物を屠殺した。
【００６５】
組織カプセルの分析
組織カプセルを、４％パラホルムアルデヒドに固定し、処理し、パラフィンに包埋した。組織学的、免疫組織化学的および形態計測学的分析のために、各組織カプセルの２つの部分の５μｍの連続横断切片を作製した。すべてのサンプルを、ヘマトキシリン−フロキシン−サフラン（ＨＰＳ）を用いてルーチン的に染色した。細胞外マトリックスを特徴づけるために、各組織カプセルの連続切片を、コラーゲンにピクロシリウスレッド、グリコサミノグリカンにアルシアンブルー（ｐＨ  ２．５）で、エラスチンにｗｅｉｇｈｅｒｔ’ｓエラスチンを用いて染色した。潜在的石灰化を評価するために、切片をアリザリンレッドで染色した。自家蛍光を用い、青色光で励起し、スペクトル顕微鏡法（Ｎｕａｎｃｅ  Ｆｘ、米国）で分離してエラスチンを視覚化した。ピクロシリウスレッドで染色した切片を、明視野顕微鏡法と偏光を用いてＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンを区別して分析した。組織カプセルのすべての切片を、天然ラット大動脈の中間層の類似の切片と比較した。筋繊維芽細胞にα平滑筋アクチンに対する抗体（α−ＳＭＡ、Ｄａｋｏ、オランダ；１：１０００）、繊維芽細胞にビメンチンに対する抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ、オランダ；１：３００、熱誘導プロテイナーゼＫ抗原回復）、収縮平滑筋細胞にデスミンに対する抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ、オランダ；１：２５０、熱誘導０．１％トリプシン抗原回復）、白血球にＣＤ４５に対する抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ、オランダ、１：５０、熱誘導０．１％トリプシン抗原回復）、および血管内皮細胞にフォン・ヴィレブランド因子に対する抗体（Ｄａｋｏ、オランダ、１：３００、熱誘導０．１％トリプシン抗原回復）を用いて免疫組織化学法により組織カプセルの細胞構成を特徴づけ、３，３’−ジアミノベンザジン（ＤＡＢ）により視覚化した。他所に記載されているように、繊維芽細胞、筋繊維芽細胞および収縮平滑筋細胞を区別した（Ｒｏｙ−Ｃｈａｕｄｈｕｒｙ他  ２００７年  Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ  Ｎｏｖ；５０（５）：７８２−９０）。アイソタイプ抗体を用いて陰性対照を得た。加えて、組織カプセルからの押出後にロッドをメチレンブルーで染色して、組織がロッドに付着したか否かを判定した。
【００６６】
組織形態計測
パノラマスライドスキャナ（３Ｄ  Ｈｉｓｔｅｃ、ハンガリー）を用いて、染色した切片の明視野画像を得た。ＩｍａｇｅＪを用いて定量化を行った。ピクロシリウスレッドおよびα−ＳＭＡ染色切片を用いて、コラーゲンの総面積および筋繊維芽細胞の総面積をそれぞれμｍ２で定量化した。５μｍ２横断切片スライドの組織カプセルの総面積で割ったα−ＳＭＡ染色切片のμｍ２でのＤＡＢ発色面積を用いて、α−ＳＭＡ陽性面積の割合を測定した。
【００６７】
統計分析
データは、平均＋／−ＳＥＭとして表す。すべてのデータを、ＳＰＳＳを用いて一元配置ＡＮＯＶＡテストにより分析した。Ｔｕｋｅｙポストホック分析を行って、すべての異なるロッドの表面粗さグレイ値およびすべての非改質ロッドの組織形態計測結果を互いに比較した。Ｄｕｎｅｔｔポストホック分析を行って、すべての改質および被覆Ｐａ３００ロッドの組織形態計測結果を非改質Ｐａ３００ロッドと比較した。０．０５未満のｐ値を統計的に有意とみなした。
【００６８】
結果
インプラント材料
ＳＥＭ画像により、すべての非改質ロッドが完全に滑らかな表面を有する一方で、酸素ガスプラズマ処理およびクロロホルムエッチングによる表面改質が実際に表面トポグラフィの顕著な変化をもたらし、はっきりとした均質なパターンの表面が作製されたことが確認された。クロロホルムエッチングでは０．５〜５μｍの孔およびまれに１０〜２０μのいくつかの比較的大きな孔の形成が生じたのに対し、酸素処理では鋭い山が生じ、３０Ｗの酸素ガスプラズマ処理と比較して１００Ｗでは深さが大きかった。ガンマ放射線は、表面トポグラフィに影響しなかった（データは図示せず）。組織カプセルからの押出後のロッドのメチレンブルー染色から、非改質ロッド上に組織が全く残っておらず、表面改質および被覆ロッド上に組織がほとんど残っていないことが示された（データは図示せず）。
【００６９】
一般的組織カプセル形成
１つのＰａ１０００ロッドは、採取時にもはやｉｎ  ｓｉｔｕになかった。他の全てのケースでは、すべてのロッドを皮下移植から３週間後にうまく採取した。ロッドのリムのより顕著な組織反応については、ロッドは、血管に富んだ組織カプセルによって完全に被包化されており、ロッドのリム部の組織反応がより顕著だった。組織カプセルは、周囲の皮下組織に一体化していたが、容易に採取し、その後ロッドから円滑に押出することができた。組織学により、異なるタイプのロッドのまわりに形成された組織カプセルは、特にコラーゲンおよび筋繊維芽細胞含有量の相対的比率が目に見えて異なることが明らかになった。全体で、組織カプセルのマトリックスは、天然ラット動脈に匹敵する組成で、円周方向に並んだＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンならびにグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）から主になった。しかし、天然血管と比較して、エラスチンは局所的にごくわずかな量でしか存在しなかった。細胞構成に関しては、組織カプセルは、円周方向に並んだα−ＳＭＡ陽性、デスミン陰性筋繊維芽細胞が多数を占めた。残りの細胞は、主に円周方向に並んだビメンチン陽性、α−ＳＭＡ陰性繊維芽細胞であった。繊維芽細胞／筋繊維芽細胞の比率は、異なるタイプのロッド間で異なった。すべての組織カプセルにおいて、デスミン陽性平滑筋細胞はわずかしか存在しなかった。ＣＤ４５陽性白血球はほとんど存在せず（１％未満）、接触表面に異物巨細胞形成はなかった。アリザリンレッド染色で、組織カプセルのいずれにおいても石灰化の徴候はみられなかった（データは図示せず）。組織カプセルを囲む皮下スペースのコラーゲンは、部分的に組織カプセルと一緒に並び、疎に配置されたコラーゲン、いくつかの繊維芽細胞および小血管を含む外膜層のようなものを形成した。
【００７０】
非改質ロッドのまわりに形成された組織カプセル
最初に、３つのタイプの非改質ロッドを、移植時に組織反応に影響する能力につき評価し、組織カプセル組成の有意な差が得られた（ｐ＜０．０５）。生体適合性ＰＣＬロッドは、薄壁の、筋繊維芽細胞をほとんど含まない比較的無細胞の組織カプセルによって被包化されたのに対して、Ｐａ１０００およびＰａ３００ロッドはいずれもより厚い、筋繊維芽細胞から主になる細胞豊富な組織カプセルによって被包化された。筋繊維芽細胞の絶対面積も筋繊維芽細胞の割合も、ＰＣＬと比較してＰａ３００（それぞれｐ＝０．０４８およびｐ＝０．００６）およびＰａ１０００（それぞれｐ＝０．０１０およびｐ＝０．０１３）ロッドのまわりに形成された組織カプセルのほうが有意に大きかった。Ｐａ３００およびＰａ１０００のまわりに形成した組織カプセルには組織構造および組織形態計測において明らかな違いがなかった。しかし、Ｐａ３００ロッドは移植の間により壊れにくく、したがって組織カプセルを損傷しうる組織カプセルの採取の間に破損しにくいという利点があった（Ｐａ１０００ロッドと比較したＰａ３００）。したがってＰａ３００からなるロッドに表面改質を行った。
【００７１】
表面改質Ｐａ３００ロッドのまわりの組織カプセル形成
組織形態計測により、すべての改質ロッドのまわりに形成された組織カプセルが、非改質Ｐａ３００ロッドと比較して壁厚がより大きく、したがってコラーゲンおよび筋繊維芽細胞の含有量がより大きいことが明らかになった。図７に示すように、これらの量は、Ｐａ３００ロッドの改質のタイプごとに異なった。コラーゲン被覆ロッドは、組織カプセル中のコラーゲンの最も大きな増加を生成し（ｐ＜０．０５）、一方でＴＧＦ−β被覆ロッドは、コラーゲン量の増加に向かう傾向を示した（ｐ＝０．０７）。改質ロッドのまわりに形成された組織カプセルにおけるα−ＳＭＡすなわち筋繊維芽細胞の絶対量は増加したが、α−ＳＭＡすなわち筋繊維芽細胞の割合は、コラーゲン被覆ロッドおよびＴＧＦ−β被覆ロッドでも酸素処理ロッドでも、それらの非改質の対応物と比較してより低かった。対照的に、クロロホルムエッチングしたロッドは、α−ＳＭＡすなわち筋繊維芽細胞の割合が増加した組織カプセルを生成した（図７）。これらの定量化は組織カプセルの不均質性および形態を考慮しないため、組織カプセルをその全体的外観および含有量の分布についても評価した。異なるタイプのロッド間の形態の顕著な違いが観察された。酸素処理したロッドは、壁がかなり厚いが、より疎に配置された組織カプセルを生じた。非改質ロッドと比較して、コラーゲン被覆ロッドおよびＴＧＦ−β被覆ロッドはいずれも、厚く密集した組織カプセルを生じた。しかし、筋繊維芽細胞の相対的比率は非改質ロッドと比較して低く、筋繊維芽細胞が組織カプセル壁全体に相対的にランダムに分布していた。一方でクロロホルム処理したロッドは、かなり厚い組織カプセルを生じ、壁厚が均一に分布していた。加えて、組織カプセルは、密集し均質に分散した筋繊維芽細胞からほぼ完全になった。
【００７２】
異物反応を利用したティッシュ・エンジニアリング血管構築物の生成
生成された組織カプセルは、ＧＡＧ、円周方向に並んだコラーゲンおよび筋繊維芽細胞から主になった。引き起こされる反応は基本的に炎症反応であるが、組織カプセルに白血球または異物巨細胞はほとんど存在しなかった。これは移植期間の長さに依存する可能性が高い。異物反応は動的であり、好中球およびマクロファージが中心となる急性炎症の段階から始まり、数週間で（筋）繊維芽細胞の流入およびマトリックス形成を伴うより線維性の反応に収束する。やがて、かなり無細胞のコラーゲン性組織カプセルが残る。後者に基づき、本発明者らの結果に対応して、ラットでマトリックスおよび細胞豊富な非炎症性組織カプセルを得るためには３週間の移植期間が最適であると思われる。
【００７３】
インプラント材料特性を変えることによる異物反応の調節
本研究は、インプラントの性質が形態および組成に関して組織反応に好ましい影響を与えることができることを明らかに示す。従来のＰＣＬと比較して、Ｐａ３００およびＰａ１０００ロッドのまわりに形成された組織カプセルは、組成が有意に異なった。表面処理および生物活性被覆によって組織の組成および形態のさらに顕著な違いが得られた。本発明者らは、非改質の対応物と比較して、クロロホルムエッチングした表面および酸素プラズマ処理した表面から、組織カプセルの筋繊維芽細胞およびコラーゲンの含有量の増加が生じたことを示した。クロロホルム処理により、粗さが有意に増加したパターン化された表面が作製された。その後のインプラント表面特性およびトポグラフィの差は、インプラント材料のまわりに形成される組織の組成および形態を左右した。興味深いことに、クロロホルムエッチングした表面とプラズマ処理した表面との間のトポグラフィ構造および粗さのはっきりとした違いは、組織配置の顕著な相違を誘発した。酸素処理したロッドは厚い組織カプセルを生じたが、疎な配置は血管構築物に好ましくない。対照的に、クロロホルムエッチングしたロッドの移植は、最も均質に分布した、強い壁の、コラーゲンおよび筋繊維芽細胞の豊富な組織カプセルを生じた。したがって、本発明者らの見解では、これらのロッドがＴＥＢＶの適切な基礎を生成するために最も好ましい。
【００７４】
材料の生物活性被覆による異物反応の調節
ただの表面改質に加えて、改質ロッドをコラーゲンおよびコラーゲン／ＴＧＦ−βで被覆した。ＴＧＦ−βは、繊維芽細胞を筋繊維芽細胞分化に誘導する。コラーゲンのみとコラーゲン／ＴＧＦ−βとでのロッドの被覆はいずれも、非改質ロッドと比較してコラーゲン形成および壁厚の最大の増加をもたらした。しかし、コラーゲン／ＴＧＦ−β被覆はコラーゲン被覆のみと比較して有意に異なる組織カプセルを生じることはなく、結果がコラーゲンに起因するにすぎないことが示唆された。コラーゲン被覆ロッドおよびコラーゲン／ＴＧＦ−β被覆ロッドから最大の壁厚が生じた事実にもかかわらず、筋繊維芽細胞のより低い割合およびランダムな分布が、本発明者らの見解では、例えば筋繊維芽細胞豊富な、均質に分布した組織カプセルを生じたクロロホルム処理したＰａ３００ロッドと比較してこれらの被覆を血管ティッシュ・エンジニアリングのための生物活性モールドとしてより好ましくないものとする。
【００７５】
結論
本発明者らの生成した組織カプセルは、血管系内にグラフトされた後さらにリモデルしうるＴＥＢＶの基礎を形成する。実際に、組織カプセルに存在する主な細胞型である筋繊維芽細胞は、収縮機構を有し、刺激されると細胞外マトリックスを合成できる可塑性の細胞である。重要なことに、流れおよび周期的緊張は、マトリックス合成さらには筋繊維芽細胞の平滑筋細胞分化への強力な刺激でもある。したがって、血管系内にグラフトされ、大きな流れにさらされると、これらの組織カプセルはやがて分化し、より血管様の表現型に発達する可能性がある。
【００７６】
本研究は、円筒状ポリマーロッドに対する組織反応を利用することによって、ＴＥＢＶのための管形状の基礎を生成できることを示す。インプラント材料の特性を変更することによって、組織反応を調整でき、これによってＴＥＢＶに適切な基礎を生成することができる。
【００７７】
実施例２：異なる表面処理後のロッドの表面の特徴づけ
Ｐａ３００、Ｐａ１０００およびＰＣＬロッドを製作した。簡潔にいえば、ポリマー顆粒をステンレススチールシリンジに充填し、装置の移動Ｘ軸アーム上に固定したサーモセットカートリッジユニットにより温度Ｔ＝１８０〜２００℃で加熱した。溶融相で、加圧キャップを介して４〜５バールの窒素ガスをシリンジに印加した。繊維配列モデルを、Ｂｉｏｐｌｏｔｔｅｒコンピュータ援用製造ソフトウェア（ＣＡＭ、ＰｒｉｍＣＡＭ、スイス）にロードした。１．７５ｍｍのロッドを達成するために、２．２ｍｍの針外径（ＯＤ）を選択した。ロッドを、窒素ガスで洗浄した。ガスプラズマロッドを、真空チャンバでインキュベートした。アルゴンプラズマ処理には、Ｈａｒｒｉｃｋ  Ｐｌａｓｍａ  Ｃｌｅａｎｅｒ（ＰＤＣ−００２；Ｈａｒｒｉｃｋ  Ｐｌａｓｍａ  Ｉｔｈａｃａ、ニューヨーク州、米国）を、０．１３３ｍｂａｒおよび高設定（７４０Ｖ  ＤＣ、４０ｍＡ  ＤＣ、２９．６Ｗ）で３０、４５および６０分間それぞれ使用した。酸素およびトリフルオロメタン処理は、反応イオンエッチ（ＲＩＥ）システム（Ｅｔｃｈ  ＲＩＥ  Ｔｅｔｓｋｅ、Ｎａｎｏｌａｂ、トゥウェンテ大学）により、１００ｍＴｏｒｒおよび３０Ｗで５、１０および１５分間行った。水酸化ナトリウムエッチングは、１Ｍおよび４Ｍの濃度で５、１０および１５分間行った。ジクロロメタンまたはクロロホルムでエッチングしたロッドは、１、５または１０秒間さらした（ディッピング）。無機および有機エッチングの後、ロッドをＭｉｌｌｉＱ水で１回すすぎ、さらに２回それぞれ１５分間超音波処理して残留物を除去した。
【００７８】
原子力顕微鏡法（ＡＦＭ）−表面粗さおよび３Ｄ画像
ＡＦＭ分析を行うため、サンプルを両面接着テープによって磁気ディスク上に固定した。ＡＦＭを通して、超鋭利ＴＥＳＰカンチレバーによるタッピング１モード（ＰｉｃｏＳｃａｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ  ２５００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ、米国）を用いて、表面粗さ分析を行った：４２Ｎ／ｍ、３２０ｋＨｚ、２〜５ｎｍ  ＲＯＣ、Ｎｏ  Ｃｏａｔｉｎｇｓ（Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＦＭ  Ｐｒｏｂｅｓ）。Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、ＳＰＩＰＴＭ、バージョン４．２．２．０ソフトウェアを使用して、粗さ測定値（Ｒａ、ＲｑおよびＲｍａｘ）を決定した。ナノスケール構造体（Ｘ、Ａｒ、Ｏ２、ＣＦ３およびＮａＯＨ）につき１μｍ２およびマイクロスケール構造体（ＣＨＣｌ３）上では１０μｍ２の表面積によってＲｑ測定を行った。ポリマー表面の三次元（３Ｄ）の高品質画像を記録し、ランダムに異なる表面箇所で３回繰り返して観察された特性の再現性を確認し、平均値をとった。
【００７９】
接触角およびＸ線光電子分光
捕捉気泡法を用いた静的水接触角の測定によって濡れ性の測定を行った。ビデオベースの光学式接触角メータＯＣＡ１５（ＤａｔａＰｈｙｓｉｃｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＧｍｂＨ、フィルダーシュタット、ドイツ）を用いて測定を行った。電子的に制御されたＨａｍｉｌｔｏｎシリンジおよびニードルを用いてフィルム上に水滴（２μＬ）を適用することによって、水接触角を決定した。ＳＣＡ２０ソフトウェア（ＤａｔａＰｈｙｓｉｃｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＧｍｂＨ、フィルダーシュタット、ドイツ）を用いて接触角を計算した。その後、ロッドをＸＰＳチャンバへ移した。ＸＰＳチャンバ（Ｏｍｉｃｒｏｎ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＧｍｂＨ）は、ベース圧力が１×１０−１０ｍｂａｒ未満であった。モノクロＡｌ  Ｋα（ＸＭ１０００）Ｘ線源およびＥＡ１２５電子エネルギーアナライザを用いて測定を行った。すべてのスペクトルを、Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｅｎｅｒｇｙ（ＣＡＥ）モードで得た。電子が放出された殻によってＸＰＳスペクトル線が特定される（１ｓ、２ｓ、２ｐなど）。
【００８０】
細胞培養および増殖
Ｔｅｂｕ−ｂｉｏ（Ｒ１０６−０５ｎ、Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．）から購入した新生仔ラット皮膚繊維芽細胞（ＲＤＦ）を、α−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ウシ胎仔血清（Ｌｏｎｚａ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含む基礎培地で培養した。基礎培地に３０００細胞／ｃｍ２の初期播種密度でＲＤＦを増幅し、２〜３日毎にリフレッシュした。細胞を、細胞播種のためにトリプシン処理する前に８０〜９０％のコンフルエンシーで採取した。ラット肺胞マクロファージ細胞株ＮＲ８３８３を米国菌培養収集所（ＡＴＣＣ）から得、フェノールレッドを含まないＬ−グルタミンを加えたα−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、１５％ウシ胎仔血清（Ｌｏｎｚａ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むマクロファージ培地で、２００，０００生存細胞／ｍｌの最適細胞播種密度で維持した。培地を別のフラスコに移して継代培養を行った。Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）細胞スクレーパ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ）でこすることによって細胞の収集を行った。すべての細胞実験を、５％ＣＯ２多湿雰囲気において３７℃で実施した。
【００８１】
繊維芽細胞およびマクロファージの単培養細胞播種
改質および非改質ロッドを、サンプルごとに１ｃｍのロッドに切り、７０％エタノールで滅菌した。フェノールレッドを含まないＬ−グルタミンを加えたα−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ウシ胎仔血清（Ｌｏｎｚａ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含む培地でロッドを４時間プレインキュベートした。４８ウェルプレートへの細胞付着を防ぐため、および最適な静的細胞播種のために、アガロースモールド（３％ｗｔ／ｖ）をロッドの下に配置した。５００μｌの体積にＲＤＦは５０，０００細胞、マクロファージは１００，０００細胞の細胞播種密度を播種した。ＤＮＡアッセイ、およびメチレンブルー（ＭＢ）と走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）による画像化のため、１日目および３日目にサンプルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ですすぎ収集した。
【００８２】
細胞増殖アッセイ
細胞接着および増殖にアクセスするために、ＣｙＱｕａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）で全ＤＮＡを測定した。簡潔にいえば、培地を吸引し、サンプルをＰＢＳで穏やかに洗浄した。それからサンプルを５００μｌのエッペンドルフ管に収集し、−８０℃で凍結した。３回の凍結融解後、２５０μｌの溶解バッファ（１：２０溶解バッファ２０×）をサンプルに室温（ＲＴ）で少なくとも１時間、および溶解バッファＲＮａｓｅを用いてさらに１時間加えた。その後、細胞溶解物およびＣｙＱｕａｎｔ  ＧＲダイ（１×）を１：１で白色９６ウェルプレートにおいて混合し、暗所で１５分間インキュベートした。分光光度計（Ｔｈｅ  ＶＩＣＴＯＲ３  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、蛍光を４８０および５２０ｎｍの励起波長および発光波長でそれぞれ測定した。
【００８３】
メチレンブルー染色、免疫染色および走査型電子顕微鏡法
細胞培養サンプル（ｎ＝４）から培地を吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄し、新たに調製したＰＢＳ中１０％のホルムアルデヒドによりＲＴで３０分間固定した。ＰＢＳですすいだ後、サンプル（ｎ＝２）を、ＰＢＳ中１％のメチレンブルー溶液で１〜２分間インキュベートし、ＰＢＳでさらにすすいで非特異的染色を除去した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＳＺ−ＩＩＩ−Ｓｔｅｒｅｏ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｓでサンプルを観察してサンプルの細胞分布を見た。他の固定サンプル（ｎ＝２）については、ＰＢＳですすいだ後、細胞をＰＢＳ中０．１％のトリトンＸ−１００により４℃で１５分間透過処理し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）により室温で１時間ブロックした。細胞を、Ｖｉｎｃｕｌｌｉｎ−ＦＩＴＣ（１：４００）、Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（１：１００）およびＤａｐｉ（１：１００）で、合間に３回の洗浄ステップを入れて染色した。蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ６００）で画像を得た。その後、すべての染色サンプル（ｎ＝４）に、ステップあたりのインキュベーション時間を３０分として、７０−８０−９０−１００％の脱水ステップを行った。１００％の後、サンプルを、１００％エタノールに沈めた組織バッグに保存し、臨界点乾燥機チャンバ（ＣＰＤ  ０３０  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｐｏｉｎｔ  Ｄｒｙｅｒ、Ｌｅｉｃａ）へ移した。４℃で１００％メタノールを液体二酸化炭素と交換し、液体二酸化炭素を４０℃で気体状態に変えた。二酸化炭素ガスを１ｍｂａｒで外へ排出した。すべてのガスを除去したあと、サンプルは、４０ｍＡの電流および１００ｍＴｏｒｒの分圧での３０秒間の金スパッタリングの用意ができた。Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＸＬ３０  ＥＳＥＭ−ＦＥＧ走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を１０ｋＶおよび１０ｍｍの作動距離で用いて細胞の形態を研究した。
【００８４】
ＴＧＦ−β１、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−１０の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
異なるポイントで細胞培地を集め、ＴＧＦ−β１、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−１０のサイトカイン分泌を、ＥＬＩＳＡアッセイを用い、製造者の指示にしたがって定量化した（ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｋｉｔ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．）。簡潔にいうと、９６ウェルマイクロプレートを、ウェルあたり１００μＬの捕捉抗体で被覆し、室温で一晩インキュベートした。各ウェルを、洗浄バッファで３回洗浄し、ブロッキングバッファで最低１時間ブロックした。１００μＬサンプルの標準または対照を、室温で２時間インキュベートした。標準曲線を、製造標準にしたがって準備した。それからプレートを洗浄し、１００μＬの検出抗体を加え、室温で２時間インキュベートした。すすいだ後、１００μＬのストレプトアビジン−ＨＲＰを加え、室温で２０分間インキュベートした。プレートをさらに洗浄し、１００μＬの基質溶液を室温で２０分間加えた。最後に、５０μＬの停止溶液を各ウェルに加えた。マイクロプレートリーダにより４５０ｎｍおよび５４０ｎｍの波長で測定を行った。
【００８５】
コラーゲンおよびエラスチン発現のＳｉｒｃｏｌおよびＦａｓｔｉｎアッセイ
培養から４日後および７日後に合成されロッドに堆積したエラスチンおよびコラーゲンの量を、コラーゲンおよびエラスチン染色アッセイで測定した。サンプル（ｎ＝４）を、冷酸ペプシン（０．１ｍｇ／０．５Ｍ酢酸１ｍｌ）を用いてコラーゲン抽出し、一晩４℃で置いた。Ｓｉｒｃｏｌ  Ｄｙｅ  Ｒｅａｇｅｎｔを加える前にさらなるコラーゲン単離および濃縮を行った。ピクロシリウス（ｐｉｃｏｓｉｒｉｕｓ）レッドベースの比色ＳｉｒＣｏｌ（商標）コラーゲン染料結合アッセイキット（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ  Ｌｔｄ．）にしたがってアッセイを行い、マイクロプレートリーダにより５４０ｎｍで測定した。エラスチン定量化のためのロッド（ｎ＝４）は、まず０．２５Ｍシュウ酸で、１００℃で１時間加熱してα−エラスチンを抽出した。さらに、Ｆａｓｔｉｎエラスチンアッセイキット（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ  Ｌｔｄ．）を用いてエラスチン定量化を行い、マイクロプレートリーダにより５１３ｎｍで測定した。
【００８６】
統計分析
すべての生化学アッセイを、トリプリケートの生物サンプルで行った。図の説明に別段の指示がない限り、Ｔｕｋｅｙの多重比較試験を用いた二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって統計分析を行った（ｐ＜０．０５）。エラーバーは標準偏差を示す。すべての図に以下が当てはまる：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【００８７】
結果
見て取れるように、図３は、異なる表面処理および暴露時間の前および後のＰＡ３００、ＰＡ１０００およびＰＣＬの３Ｄ  ＡＦＭ画像である（走査サイズ１μｍ２、但しＨＣｌ３は２５μｍ２）。図５は、ＰＡ３００上に付着したラット皮膚繊維芽細胞（ＲＤＦ、左）およびマクロファージ（右）のＤＮＡアッセイ分析である。非改質（Ｘ）ロッドに、アルゴンプラズマ処理を３０、４５および６０分間（左から右のバーに向かってＡｒ３０−４５−６０）、酸素またはトリフルオロメタンプラズマ処理を２．５、５、１０分間（左から右のバーに向かってＯ２２．５−５−１０、ＣＨＦ３２．５−５−１０）のいずれかを行った。他の非改質ロッドは、水酸化ナトリウムを１Ｍまたは４Ｍの濃度で５〜１０分間（左から右のバーに向かってＮａＯＨ１Ｍ：５−１０、ＮａＯＨ４Ｍ：５−１０）、クロロホルムまたはジクロロメタンを１、５または１０秒間（左から右のバーに向かってＣＨＣｌ３：１−５−１０秒、ＣＨ２Ｃｌ２−１０秒）のいずれかで用いてウェットエッチングで処理した。３日目の倍増数が各バーの上に見られる。ＲＤＦ付着は、ＣＨＦ３５−１０サンプルを除くすべての処理で統計的に増加した。マクロファージ付着は、Ａｒ、ＯｘおよびＣＨＣｌ３処理の後に統計的に増加した。星印（＊、Ｐ＜０．０５）は、処理タイプごとの最善のパラメータを示す。このように、すべての表面改質ロッドで細胞接着の増加が観察され、Ｐａ３００が他のポリマータイプと比較して最も有意な増加を示した。
【００８８】
見て取れるように、図６において、（ａ）はＡＦＭ粗さ定量化（走査サイズ１μｍでのＲｑ）である。処理時間は以下の通りである：Ｘ＝非改質；Ａｒ＝アルゴン３０分；Ｏｘ＝酸素５分；ＣＨＦ３＝トリフルオロメタン２．５分＋ＮａＯＨ＝水酸化ナトリウム１０分；ＣＨＣｌ３＝クロロホルム１０秒。処理したロッドのそれぞれの粗さの倍増数が、そのバーの上に示される。（ｂ）親水処理（７０〜４０°）は、Ａｒ、Ｏ２およびＮａＯＨからなり、疎水処理（８５〜１１０°）は、ＣＨＦ３およびＣＨＣｌ３からなった。（ｃ）は、非改質ロッド対予め選択された改質ロッドのタンパク質吸収アッセイである。改質ロッドのタンパク質吸収を、非改質ロッドのタンパク質吸収によって正規化し、異なる処理間の倍加数の違いを示した。青い星印（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）は、非改質（Ｘ）と比較して統計的に有意な値を示し、黒い星印は各処理を互いに比較する。
【００８９】
結果から、ＣＨＣＬ３処理したロッド（１０秒）が、組織生成および機能性の運命を決定する、強化されたコラーゲンおよびエラスチン分泌を送達する理想的なバランスで最大量のＴＧＦ−β１、ＩＬ−β１、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０を提供することがさらに示された。非改質ロッド対予め選択された改質ロッドのＸＰＳ測定は、酸素含量の２倍増加（Ａｒ、Ｏｘ、ＮａＯＨおよびＣＨＣｌ３）５倍減少（ＣＨＦ３）の群が見られることを明らかにした。
【００９０】
実施例３−ブタにおける概念実証研究
ブタモデルには、大きな直径のＰＥＯＴ／ＰＢＴ  ３００ロッド（４．２ｍｍ）が必要である。残念ながら、これらの大きな直径のロッドの生産は、（Ｂｉｏｐｌｏｔｔｅｒデバイス、Ｅｎｖｉｓｉｏｎｔｅｃ  ＧｍｂＨ等による）ラピッドプロトタイピングを用いては不可能である。溶融押出も、望ましくない巨視的な表面粗さが生じるため好ましくない。ポリマーのペレットをモールドキャビティ内に置き、その後キャビティを上型によって閉じ、モールドをポリマーの融点より高温に加熱する圧縮成形が、最善の製造方法であるように思われた。それからモールドの冷却後に製品を除去することができる。
【００９１】
パイロット実験には、２つの加熱クランプ、熱電対、および温度設定値と読取値とを備えた制御デバイスを用いた直接加熱で、単一キャビティ圧縮モールドを使用した。短い時間フレーム内でポリマーが溶融し、キャビティ内を流れた。しかし、ＰＥＯＴ／ＰＢＴ材料の高い粘着性によりロッドを損傷せずにロッドを除去することは不可能だった。したがって、ロッドを損傷しない除去を可能にするために互いに分離できる両半分からなるモールドキャビティを用いて新たな圧縮モールド原理を設計した（実施例３を参照）。
【００９２】
直径４．２ｍｍのＰＡ３００ロッドを上述のように製作した。その後、これらのロッドを、ラットに移植したより小さいロッドと同じ方法を用いて、クロロホルムで１０秒間処理した。これらのロッドのブタへの皮下移植では、コラーゲン、筋繊維芽細胞および残余炎症細胞から主になるはるかに厚い組織カプセルが見られた（図８）。これらの組織カプセルの力学的評価により、２０００ｍｍＨｇを上回る平均破裂圧力が示され、これは動脈循環系への移植に十分なものである。次に、これらの組織カプセルを、頸動脈インターポジショングラフトとしてブタに移植した。血管グラフトの４週間後に、８７％のグラフトが開存していた。組織学的レベルでは、α−ＳＭＡ陽性細胞の量が実質的に増加した（図９）。驚くべきことに、血管グラフトの４週間後に、組織カプセル壁はデスミン陽性平滑筋細胞で大部分満たされた。カニュレーション研究で、透析針の除去後の止血までの平均時間が２分未満であることが分かった。
【００９３】
実施例４−支持シート
ポリ−ε−カプロラクトンからなる外部電界紡糸シート（ＰＣＬ、Ｐｕｒａｃ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、オランダ）を、１０±２μｍの繊維厚、９０±３％の多孔率、および約４００μｍの全厚で製作した。４４０μｍ厚のガンマ滅菌シート（ｎ＝３）の引張強度を、５０Ｎロードセルを備えた一軸引張ステージ（Ｍｅｃｍｅｓｉｎ、ＭｕｌｔｉＴｅｓｔ  １−ｉ）を用いて測定した。サンプルを１０ｍｍ／分で伸長し、時間、変位および力を記録した。応力−ひずみ曲線の線形部分からヤング係数を決定した。参照として、羊肺動脈のサンプルを測定した（ｎ＝１８）。２５ｋＧｙを上回るガンマ放射線を用いてロッドおよびシートを滅菌した（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈｅａｌｔｈ、オランダ）。クロロホルムエッチングしたロッドおよびＰＣＬシートの表面に対するガンマ放射線の効果を、ＳＥＭを用いて評価した。ＰＣＬシート（ｎ＝３）の引張強度は、肺動脈の１ＭＰａと比較して、９ＭＰａであると分かった。組織構造体をシートで覆うこと、すなわちシートを組織構造体のまわりに固定することにより、本開示による組織構造体を支持するためにシートを用いることができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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