(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
９８％超の純度を有するレバウディオサイドＭを調製する方法であって、
（ｉ）組換え細胞の存在下で、反応溶液中のレバウディオサイドＤをグルコシルドナーと反応させる工程であって、前記反応溶液は、２０〜６０℃の温度及びｐＨ５．０〜９．０で、可溶化剤を含む水相系であり、前記組換え細胞の各々が、
ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチド；及び
ｂ）スクロースシンテターゼをコードする外因性ポリヌクレオチド
を含む、工程；
（ｉｉ）粗レバウディオサイドＭを単離する工程；及び
（ｉｉｉ）前記粗レバウディオサイドＭを結晶化して９８％超の純度を有するレバウディオサイドＭを得る工程；
を含む方法。
【請求項２】
前記レバウディオシドＤが、前記組換え細胞の存在下で、反応溶液中のレバウディオシドＡをグルコシルドナーと反応させることによりその場で調製され、前記組換え細胞の各々が、配列番号４のアミノ酸配列を有するＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記グルコシルドナーが、スクロースシンテターゼの存在下でＵＤＰ及びスクロースからその場で生成されるＵＤＰ−グルコースである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記組換え細胞が、大腸菌（Escherichia coli）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、及びピチア・パストリス（Pichia pastoris）から成る群より選択される微生物細胞である、請求項１から３いずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記反応溶液が、３５℃〜４５℃の温度及び６．５〜８．５のｐＨで、リン酸緩衝液を含む、請求項１から４いずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記反応溶液が、１〜３体積％の濃度でトルエン又は他の細胞浸透剤を更に含有する、請求項１から５いずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記反応溶液中のレバウディオサイドＤが２ｇ／Ｌの濃度を有する、請求項１から６いずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記反応溶液が、前記可溶化剤として３〜５体積％の濃度でジメチルスルホキシドを含有する、請求項１から７いずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レバウディオサイドＭを調製する方法に関し、具体的には、レバウディオサイドＭを調製するための生物学的方法に関する。
【技術背景】
【０００２】
糖代替物は、ヒトの健康への様々な影響により４つのクラスに分けることができる。第１のクラスには、カロリー及び炭水化物含量の点で糖と類似している天然甘味料、例えば、果汁、蜂蜜、及びメープルシロップが含まれる。第２のクラスには、カロリーを提供せず、それ故に非栄養甘味料と見なされる人工甘味料、例えば、アスパルテーム及びサッカリンが含まれる。第３のクラスには、主に植物及び果実由来の糖アルコール、例えば、キシリトール及びソルビトールが含まれる。第４のクラスには、天然植物から抽出された甘味物質、例えば、ステビア・レバウディアナ（Stevia rebaudiana）から抽出されたステビオサイドが含まれる。人工甘味料、糖アルコール、及び抽出甘味料は全て、糖より何倍〜何百倍も甘いため、同じレベルの甘味を生成するのに必要な添加量は、スクロースよりも著しく低い。
【０００３】
ステビア・レバウディアナは、重要な経済価値を有する作物であり、その葉に非常に高い含量のステビオサイドを含む。現在のところ、ステビア・レバウディアナにおいて１００個を超える化合物が特定されており、最もよく知られている１つがステビオサイド、具体的には、ステビオールグリコシド及びレバウディオサイドＡである（非特許文献１）。近年、新規のステビオサイドが、ステビア・レバウディアナハイブリッド植物で発見されている（非特許文献２）。
【０００４】
特許文献１は、レバウディオサイドＭを調製するための生物学的方法を開示しており、ここで、レバウディオサイドＡ又はレバウディオサイドＤが基質として使用され、グルコシルドナーの存在下で、レバウディオサイドＭが、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ及び／又はＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼを含有する組み換え細胞の触媒作用下での基質の反応により生成される。しかしながら、当該特許のプロセスは、十分に最適化されておらず、変換率は最大でもわずか約８０％であり、純度はわずか９５％であり、基質濃度はより低く、生産コストはより高い。したがって、このプロセスは工業化生産には好適ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】中国特許出願第２０１３１０３５３５００．９号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２０１２，６０，８８６〜８９５
【非特許文献２】Ｍｏｒｉｔａ（２０１０，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，５７，１９９〜２０９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明において解決されるべき技術的問題は、先行技術の欠点を克服するために、酵素法によりレバウディオサイドＭを調製する方法を提供することである。この方法は、より低いコストで、より純度の高いレバウディオサイドＭ生成物を生成することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の技術的問題を解決するために、本発明は、以下の技術的解決策を用いる。
【０００９】
酵素法を使用することによりレバウディオサイドＭを調製する方法であって、レバウディオサイドＡ又はレバウディオサイドＤが基質として使用され、スクロース及びＵＤＰの存在下で、レバウディオサイドＭが、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ及びスクロースシンテターゼの混合物、又はＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ及びスクロースシンテターゼを含有する組み換え細胞の触媒作用下での基質の反応により生成される、方法。この反応は、水相系で２０〜６０℃の温度及びｐＨ５．０〜９．０で行われる。この反応系は、基質の可溶化を促進するために、体積比で３％〜５％の濃度のジメチルスルホキシドを更に含有する。初期反応系で、レバウディオサイドＡは１０ｇ／Ｌ以上の濃度を有し、レバウディオサイドＤは１５ｇ／Ｌ以上の濃度を有する。反応後、反応溶液が遠心分離され、次いで上清が取られ、マクロ多孔性吸着性樹脂で分離されて、レバウディオサイドＭの粗生成物の溶液が得られ、これがエタノール水溶液中で結晶化されて、レバウディオサイドＭ生成物が９８％を超える純度で得られる。
【００１０】
このましくは、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａ及び／又はイネ（Oryza sativa）由来のＵＧＴ−Ｂである。
【００１１】
好ましくは、反応は、水相系で３５℃〜４５℃の温度及びｐＨ６．５〜８．５で行われる。
【００１２】
好ましくは、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ及びスクロースシンテターゼを含有する組み換え細胞が、触媒作用を行うために使用され、初期反応系は、体積比で１％〜３％の濃度のトルエンを更に含有する。
【００１３】
好ましくは、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼとスクロースシンテターゼの重量比は、１：０．２〜０．４である。
【００１４】
好ましくは、本方法は、本反応で用いられる全ての原材料が反応ケトルに添加され、水相系で最終体積にされ、均一に混合され、次いで設定温度で定置され、撹拌されて反応する、というように実施される。
【００１５】
好ましくは、組み換え細胞は、微生物細胞である。
【００１６】
より好ましくは、微生物は、大腸菌（Escherichia coli）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、又はピチア・パストリス（Pichia pastoris）である。
【００１７】
好ましくは、基質はレバウディオサイドＡであり、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼはステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａ及びイネ由来のＵＧＴ−Ｂの混合物であり、ステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は配列番号２と少なくとも８０％一致し、イネ由来のＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列は配列番号４と少なくとも８０％一致する。より好ましくは、ステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａ及びイネ由来のＵＧＴ−Ｂの混合物中で、ステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａとイネ由来のＵＧＴ−Ｂの重量比は、３〜５：１である。
【００１８】
好ましくは、基質はレバウディオサイドＤであり、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼはステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａであり、ステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列は配列番号２と少なくとも８０％一致する。
【００１９】
好ましくは、反応溶液は、反応後かつ遠心分離前に、最初に５０〜６０℃で加熱され、超音波処理に５０〜７０分間供される。
【００２０】
好ましくは、レバウディオサイドＭの粗生成物の溶液は、レバウディオサイドＭの粗生成物の溶液が減圧下での蒸留により濃縮され、次いで遠心分離され、上清が捨てられる工程、沈殿物が追加の水で洗浄され、次いで遠心分離され、上清が捨てられる工程、沈殿物が体積比で４０％〜７０％の濃度のエタノール水溶液で懸濁され、６０〜７０℃まで加熱されて可溶化され、エタノール水溶液が体積比で２０〜３０％の濃度を有するまで水がその中に添加される工程、混合物が室温まで徐々に冷却され、結晶化及び固体の沈殿に供され、続いて吸引濾過及び真空乾燥に供される工程のような特定の工程によりエタノール水溶液中で結晶化される。
【００２１】
上記の技術的解決策の実施の結果として、本発明は、先行技術と比較して以下の利点を有する。
【００２２】
本発明で提供される酵素法によるレバウディオサイドＭを調製する方法は、重要な適用価値を有する。可溶化剤、反応温度、ならびにｐＨの最適化及び制御により、変換率及び純度が共に改善され、生産コストが低減される。したがって、この方法は、工業化生産に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の実施例７で得られる生成物のプロトン磁気スペクトル図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、レバウディオサイドＡ又はレバウディオサイドＤを原材料とした、酵素法を使用することによりレバウディオサイドＭを合成するためのプロセスを提供する。
【００２５】
【化１】
0006541159.tif 000002
【００２６】
レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＤ、及びレバウディオサイドＭは、それぞれ、４、５、及び６デキストロース単位のステビオサイドを含有し、構造式は、それぞれ、式Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩに示される。
【００２７】
本発明は、レバウディオサイドＭを合成するための２つの経路を提供する。
【００２８】
【化２】
0006541159.tif 000003
【００２９】
本発明では、原材料は精製される。
【００３０】
本発明の特定の一態様に従って、原材料は、ステビオールグリコシド基質レバウディオサイドＡを含む。
【００３１】
本発明の別の特定の態様に従って、原材料は、ステビオールグリコシド基質レバウディオサイドＤを含む。
【００３２】
本発明に従って、ＵＤＰグルコシルトランスフェラーゼは、精製されていても精製されていなくてもよい凍結乾燥酵素粉末の形態であってよく、又は組み換え細胞中に存在してもよい。
【００３３】
ＵＧＴ−Ａ、ＵＧＴ−Ｂ、及びＡｔＳＵＳ１（スクロースシンテターゼ）を含有する組み換え細胞は、以下の方法により得られる。
【００３４】
ＵＧＴ−Ａ、ＵＧＴ−Ｂ、及びＡｔＳＵＳ１の組み換え大腸菌（又は他の微生物細菌）発現株は、分子クローニング技術及び遺伝子工学技術を利用することにより得られる。次いで、組み換え大腸菌が発酵し、後処理及び組み換え細胞の回収に供される。
【００３５】
本発明に記載の分子クローニング技術及び遺伝子工学技術は全て既知のものである。分子クローニング技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第３版（Ｊ．Ｓｈａｍｂｒｏｏｋ、２００５）で見ることができる。
【００３６】
遺伝子工学技術を用いることによる本発明の組み換え株を構築するための発現工程は、以下のとおりである。
【００３７】
（１）ＵＧＴ−Ａ及びＡｔＳＵＳ１の遺伝子断片を、それぞれ、ｐＡＣＹＣ−Ｄｕｅｔ−１の２つのマルチクローナルサイトＭＣＳ２（ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ）及びＭＣＳ１（ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）にサブクローニングして、プラスミドｐＡ−ＵＧＴＡ−ＳＵＳ１を得る。
【００３８】
（２）ＵＧＴ−Ｂ遺伝子をｐＥＴ３０ａのＮｄｅＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間の部位にサブクローニングして、組み換えプラスミドｐＥ−ＵＧＩＴ−Ｂを得る。
【００３９】
（３）ＰＡ−ＵＧＴ−Ａ−ＳＬＴＳ１及びｐＥ−ＵＧＴ−Ｂを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に連続して形質転換して、株ＧＱ−ＡＢＳを得る。
【００４０】
以下の工程により、ＵＧＴを含有する組み換え大腸菌発現株を利用することにより、ＵＧＴを含有する組み換え細胞、又は凍結乾燥ＵＧＴ粉末を調製する。
【００４１】
組み換え大腸菌発現株ＧＱ−ＡＢＳを１％の割合に従って４ｍＬの液体ＬＢ培地に接種し、３７℃で振盪（２００ｒｐｍ）しながら一晩培養する。一晩培養した培養物を１％の接種サイズで５０ｍＬの液体ＬＢ培地に移す。培養培地を３７℃で振盪（２００ｒｐｍ）しながら、ＯＤ６００値が最大０．６〜０．８になるまで培養する。ＩＰＴＧを０．４ｍＭの最終濃度でその中に添加し、混合物を２０℃で振盪しながら一晩培養する。誘導完了後、細胞を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間）により回収する。細胞を５ｍＬの２ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を使用して再懸濁して、組み換え細胞を得るか、又は更に氷浴中で超音波により破裂させて、破裂した液体を遠心分離し（８，０００ｒｐｍ、１０分間）、上清を回収し、２４時間凍結乾燥させることにより凍結乾燥粉末を得る。
【００４２】
本発明は、特定の実施例と共により詳細に以下に記載される。
【実施例】
【００４３】
実施例１：ＵＧＴ−Ａを含有する組み換え大腸菌細胞の調製
配列番号１及び配列番号２に従って、ＵＧＴ−Ａ遺伝子断片を遺伝子合成し、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ酵素切断部位を、それぞれ、両方の末端に付加し、ｐＵＣ５７ベクター（Ｓｕｚｈｏｕ  Ｇｅｎｅｗｉｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）をその中でライゲーションした。ＵＧＴ遺伝子断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩでの酵素消化に供した。精製断片を回収した。Ｔ４リガーゼをその中に添加し、断片をｐＥＴ３０ａの対応する酵素切断部位にライゲーションして、ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、組み換え株ＧＱ−Ａを得た。
【００４４】
ＵＧＴ株を１％の割合に従って４ｍＬの液体ＬＢ培地に接種し、３７℃で振盪（２００ｒｐｍ）しながら一晩培養した。一晩培養した培養物を１％の接種サイズで５０ｍＬの液体ＬＢ培地に移した。培養培地を３７℃で振盪（２００ｒｐｍ）しながら、ＯＤ６００値が最大０．６〜０．８になるまで培養した。ＩＰＴＧを０．４ｍＭの最終濃度でその中に添加し、混合物を２０℃で振盪しながら一晩培養した。誘導完了後、細胞を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間）により回収した。細胞を５ｍＬの２ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を使用して再懸濁して、触媒作用で使用するためにＵＧＴ−Ａを含有する組み換え細胞を得た。
【００４５】
実施例２：凍結乾燥ＵＧＴ−Ａ粉末の調製
実施例１で調製したＵＧＴ−Ａの組み換え細胞を氷浴中で超音波により破裂させて、破裂した液体を遠心分離し（８，０００ｒｐｍ、１０分間）、上清を回収し、２４時間凍結乾燥させることによりＵＧＴ−Ａの凍結乾燥粉末を得た。
【００４６】
実施例３：ＵＧＴ−Ｂを含有する組み換え大腸菌細胞の調製
配列番号３及び配列番号４に従って、ＵＧＴ−Ｂ遺伝子断片を遺伝子合成し、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ酵素切断部位を、それぞれ、両方の末端に付加し、ｐＵＣ５７ベクター（Ｓｕｚｈｏｕ  Ｇｅｎｅｗｉｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）をその中でライゲーションした。ＵＧＴ遺伝子断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩでの酵素消化に供した。精製断片を回収した。Ｔ４リガーゼをその中に添加し、断片をｐＥＴ３０ａの対応する酵素切断部位にライゲーションして、ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、組み換え株ＧＱ−Ｂを得た。
【００４７】
ＵＧＴ株を１％の割合に従って４ｍＬの液体ＬＢ培地に接種し、３７℃で振盪（２００ｒｐｍ）しながら一晩培養した。一晩培養した培養物を１％の接種サイズで５０ｍＬの液体ＬＢ培地に移した。培養培地を３７℃で振盪（２００ｒｐｍ）しながら、ＯＤ６００値が最大０．６〜０．８になるまで培養した。最終濃度で０．４ｍＭのＩＰＴＧをその中に添加し、混合物を２０℃で振盪しながら一晩培養した。誘導完了後、細胞を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間）により回収した。細胞を５ｍＬの２ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を使用して再懸濁して、触媒作用で使用するためにＵＧＴ−Ｂを含有する組み換え細胞を得た。
【００４８】
実施例４：凍結乾燥ＵＧＴ−Ｂ粉末の調製
実施例３で調製したＵＧＴ−Ｂの組み換え細胞を氷浴中で超音波により破裂させて、破裂した液体を遠心分離し（８，０００ｒｐｍ、１０分間）、上清を回収し、２４時間凍結乾燥させることによりＵＧＴ−Ｂの凍結乾燥粉末を得た。
【００４９】
実施例５：ＵＧＴ−Ａ及びＡｔＳＵＳ１を含有する組み換え大腸菌細胞の調製
ＵＧＴ−Ａ及びＡｔＳＵＳ１の遺伝子断片を、それぞれ、ｐＡＣＹＣ−Ｄｕｅｔ−１プラスミドのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入して、プラスミドｐＡ−ＵＧＴ−Ａ−ＳＵＳ１を得る。このプラスミドでＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換して、組み換え株ＧＱ−ＡＳを得た。
【００５０】
ＵＧＴ株を１％の割合に従って４ｍＬの液体ＬＢ培地に接種し、３７℃で振盪（２００ｒｐｍ）しながら一晩培養した。一晩培養した培養物を１％の接種サイズで５０ｍＬの液体ＬＢ培地に移した。培養培地を３７℃で振盪（２００ｒｐｍ）しながら、ＯＤ６００値が最大０．６〜０．８になるまで培養した。ＩＰＴＧを０．４ｍＭの最終濃度でその中に添加し、混合物を２０℃で振盪しながら一晩培養した。誘導完了後、細胞を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間）により回収した。細胞を５ｍＬの２ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を使用して再懸濁して、触媒作用で使用するためにＵＧＴ−Ａ及びＡｔＳＵＳ１を含有する組み換え細胞を得た。
【００５１】
実施例６：ＵＧＴ−Ａ、ＵＧＴ−Ｂ、及びＡｔＳＵＳ１を含有する組み換え大腸菌細胞の調製
配列番号３及び配列番号４に従って、ＵＧＴ−Ｂ遺伝子断片を遺伝子合成し、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ酵素切断部位を、それぞれ、両方の末端に付加し、ｐＵＣ５７ベクター（Ｓｕｚｈｏｕ  Ｇｅｎｅｗｉｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）をその中でライゲーションした。ＵＧＴ遺伝子断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩでの酵素消化に供した。精製断片を回収した。Ｔ４リガーゼをその中に添加し、断片をｐＥＴ３０ａの対応する酵素切断部位にライゲーションして、ＧＱ−ＡＳ株を形質転換し、組み換え株ＧＱ−ＡＢＳを得た。
【００５２】
ＵＧＴ株を１％の割合に従って４ｍＬの液体ＬＢ培地に接種し、３７℃で振盪（２００ｒｐｍ）しながら一晩培養した。一晩培養した培養物を１％の接種サイズで５０ｍＬの液体ＬＢ培地に移した。培養培地を３７℃で振盪（２００ｒｐｍ）しながら、ＯＤ６００値が最大０．６〜０．８になるまで培養した。ＩＰＴＧを０．４ｍＭの最終濃度でその中に添加し、混合物を２０℃で振盪しながら一晩培養した。誘導完了後、細胞を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間）により回収した。細胞を５ｍＬの２ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を使用して再懸濁して、触媒作用で使用するためにＵＧＴ−Ａ、ＵＧＴ−Ｂ、及びＡｔＳＵＳ１を含有する組み換え細胞を得た。
【００５３】
実施例７：レバウディオサイドＤを基質とした酵素法によるレバウディオサイドＭの合成
０．２２４ｇのＵＤＰ、３４．２ｇのスクロース、１．６ｇのレバウディオサイドＤ、１ｇの凍結乾燥ＵＧＴ−Ａ粉末、０．４ｇの凍結乾燥ＡｔＳＵＳ１粉末、４ｍＬのジメチルスルホキシド、及び０．０５ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を反応系に連続して添加して、最終体積１００ｍＬにし、均一に混合し、次いで３７℃の水浴中に置き、２００ｒｐｍで撹拌して、反応を１８時間行った。反応完了後、２００μｌの反応溶液を取り、８００μｌの無水メタノールに添加し、均一に混合した。この混合物を１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を取り、フィルター膜を通し、続いて高速液体クロマトグラフィー（クロマトグラフィー条件：クロマトグラフィーカラム：Ａｇｉｌｅｎｔエクリプスｓｂ−Ｃ１８  ４．６×１５０ｍｍ；検出波長：２１０ｎｍ；移動相：メタノール：水＝６８％：３２％；流速：１．０ｍＬ／分；カラム温度：３０℃）を用いて検出した。レバウディオサイドＤの変換率は９０％を超えた。反応完了後、３００ｍＬの脱イオン水を１００ｍＬの反応溶液に添加し、混合物を５５℃で１時間加熱し、超音波処理に供し、６，７００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。この上清をサンプルＡとした。遠心分離後、１００ｍＬの水を沈殿物に添加し、混合物を５５℃で０．５時間加熱し、超音波処理に供し、６，７００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。この上清をサンプルＢとした。サンプルＡ及びサンプルＢを混合して、その結果サンプルＣを得て、これをマクロ多孔性吸着性樹脂（ＡＢ−８）で分離した。結果として得られたものを最初にカラム体積の４倍量の水で洗い流し、次いでカラム体積の３．５倍量の７０％エタノールで溶離して、レバウディオサイドＭの粗生成物の溶液を得た。粗生成物の上記溶液を、残りの溶液が約１０ｍＬになるまで、減圧（４０〜５０℃）で蒸留し、９，９００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨てた。沈殿物を４ｍＬの追加の水で洗浄し、９，９００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨てた。沈殿物を５０％エタノール水溶液で懸濁し、６５℃まで加熱して可溶化した。等体積の水をその中に添加し、２５％のエタノール濃度にした。混合物を室温まで徐々に冷却し、固体の沈殿後、吸引濾過及び真空乾燥に供して、１．１２ｇのレバウディオサイドＭを、９９％を超える純度で得た。
【００５４】
実施例８：レバウディオサイドＡを基質とした酵素法によるレバウディオサイドＭの合成
０．１８ｇのＵＤＰ、４１．０４ｇのスクロース、１ｇのレバウディオサイドＡ、２ｇの凍結乾燥ＵＧＴ−Ａ粉末、０．５ｇの凍結乾燥ＵＧＴ−Ｂ粉末、０．５ｇの凍結乾燥ＡｔＳＵＳ１粉末、４ｍＬのジメチルスルホキシド、及び０．０５ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を反応系に連続して添加して、最終体積１００ｍＬにし、均一に混合し、次いで３７℃の水浴中に置き、２００ｒｐｍで撹拌して、反応を１８時間行った。反応完了後、２００μｌの反応溶液を取り、８００μｌの無水メタノールに添加し、均一に混合した。この混合物を１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を取り、フィルター膜を通し、続いて高速液体クロマトグラフィー（クロマトグラフィー条件：クロマトグラフィーカラム：Ａｇｉｌｅｎｔエクリプスｓｂ−Ｃ１８  ４．６×１５０ｍｍ；検出波長：２１０ｎｍ；移動相：メタノール：水＝６８％：３２％；流速：１．０ｍＬ／分；カラム温度：３０℃）を用いて検出した。レバウディオサイドＡの変換率は９０％を超えた。反応完了後、３００ｍＬの脱イオン水を１００ｍＬの反応溶液に添加し、混合物を５５℃で１時間加熱し、超音波処理に供し、６，７００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。この上清をサンプルＡとした。遠心分離後、１００ｍＬの水を沈殿物に添加し、混合物を５５℃で０．５時間加熱し、超音波処理に供し、６，７００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。この上清をサンプルＢとした。サンプルＡ及びサンプルＢを混合して、その結果サンプルＣを得て、これをマクロ多孔性吸着性樹脂（ＡＢ−８）で分離した。結果として得られたものを最初にカラム体積の４倍量の水で洗い流し、次いでカラム体積の３．５倍量の７０％エタノールで溶離して、レバウディオサイドＭの粗生成物の溶液を得た。粗生成物の上記溶液を、残りの溶液が約１０ｍＬになるまで、減圧（４０〜５０℃）で蒸留し、９，９００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨てた。沈殿物を４ｍＬの追加の水で洗浄し、９，９００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨てた。沈殿物を５０％エタノール水溶液で懸濁し、６５℃まで加熱して可溶化した。等体積の水をその中に添加し、２５％のエタノール濃度にした。混合物を室温まで徐々に冷却し、固体の沈殿後、吸引濾過及び真空乾燥に供して、０．６９ｇのレバウディオサイドＭを、９９％を超える純度で得た。
【００５５】
実施例９：レバウディオサイドＤを基質とした全細胞合成によるレバウディオサイドＭの合成
本実施例で使用されるＧＱ−ＡＳ組み換え細胞は、ＵＧＴ−Ａ及びＡｔＳＵＳ１の両方を含有する組み換え株であった。
【００５６】
０．０４５ｇのＵＤＰ、１０．２６ｇのスクロース、２ｍＬのトルエン、０．２ｇのレバウディオサイドＤ、１０ｇのＧＱ−ＡＳ含有組み換え細胞、４ｍＬのジメチルスルホキシド、及び０．０５ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を反応系に連続して添加して、最終体積１００ｍＬにし、均一に混合し、次いで３７℃の水浴中に置き、２００ｒｐｍで撹拌して、反応を７時間行った。反応完了後、２００μｌの反応溶液を取り、８００μｌの無水メタノールに添加し、均一に混合した。この混合物を１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を取り、フィルター膜を通し、続いて高速液体クロマトグラフィー（クロマトグラフィー条件：クロマトグラフィーカラム：Ａｇｉｌｅｎｔエクリプスｓｂ−Ｃ１８  ４．６×１５０ｍｍ；検出波長：２１０ｎｍ；移動相：メタノール：水＝６８％：３２％；流速：１．０ｍＬ／分；カラム温度：３０℃）を用いて検出した。レバウディオサイドＤの変換率は９０％を超えた。反応完了後、３００ｍＬの脱イオン水を１００ｍＬの反応溶液に添加し、混合物を５５℃で１時間加熱し、超音波処理に供し、６，７００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。この上清をサンプルＡとした。遠心分離後、１００ｍＬの水を沈殿物に添加し、混合物を５５℃で０．５時間加熱し、超音波処理に供し、６，７００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。この上清をサンプルＢとした。サンプルＡ及びサンプルＢを混合して、その結果サンプルＣを得て、これをマクロ多孔性吸着性樹脂（ＡＢ−８）で分離した。結果として得られたものを最初にカラム体積の４倍量の水で洗い流し、次いでカラム体積の３．５倍量の７０％エタノールで溶離して、レバウディオサイドＭの粗生成物の溶液を得た。粗生成物の上記溶液を、残りの溶液が約１０ｍＬになるまで、減圧（４０〜５０℃）で蒸留し、９，９００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨てた。沈殿物を４ｍＬの追加の水で洗浄し、９，９００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨てた。沈殿物を５０％エタノール水溶液で懸濁し、６５℃まで加熱して可溶化した。等体積の水をその中に添加し、２５％のエタノール濃度にした。混合物を室温まで徐々に冷却し、固体の沈殿後、吸引濾過及び真空乾燥に供して、０．１４ｇのレバウディオサイドＭを、９９％を超える純度で得た。
【００５７】
実施例１０：レバウディオサイドＡを基質とした全細胞合成によるレバウディオサイドＭの合成
本実施例で使用されるＧＱ−ＡＢＳ組み換え細胞は、ＵＧＴ−Ａ、ＵＧＴ−Ｂ、及びＡｔＳＵＳ１を同時に含有する組み換え株であった。
【００５８】
０．０４５ｇのＵＤＰ、１０．２６ｇのスクロース、２ｍＬのトルエン、０．２ｇのレバウディオサイドＡ、１０ｇのＧＱ−ＡＢＳも含有する組み換え細胞、４ｍＬのジメチルスルホキシド、及び０．０５ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を反応系に連続して添加して、最終体積１００ｍＬにし、均一に混合し、次いで３７℃の水浴中に置き、２００ｒｐｍで撹拌して、反応を７時間行った。反応完了後、２００μｌの反応溶液を取り、８００μｌの無水メタノールに添加し、均一に混合した。この混合物を１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を取り、フィルター膜を通し、続いて高速液体クロマトグラフィー（クロマトグラフィー条件：クロマトグラフィーカラム：Ａｇｉｌｅｎｔエクリプスｓｂ−Ｃ１８  ４．６×１５０ｍｍ；検出波長：２１０ｎｍ；移動相：メタノール：水＝６８％：３２％；流速：１．０ｍＬ／分；カラム温度：３０℃）を用いて検出した。レバウディオサイドＡの変換率は４０％を超えた。反応完了後、３００ｍＬの脱イオン水を１００ｍＬの反応溶液に添加し、混合物を５５℃で１時間加熱し、超音波処理に供し、６，７００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。この上清をサンプルＡとした。遠心分離後、１００ｍＬの水を沈殿物に添加し、混合物を５５℃で０．５時間加熱し、超音波処理に供し、６，７００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。この上清をサンプルＢとした。サンプルＡ及びサンプルＢを混合して、その結果サンプルＣを得て、これをマクロ多孔性吸着性樹脂（ＡＢ−８）で分離した。結果として得られたものを最初にカラム体積の４倍量の水で洗い流し、次いでカラム体積の３．５倍量の７０％エタノールで溶離して、レバウディオサイドＭの粗生成物の溶液を得た。粗生成物の上記溶液を、残りの溶液が約１０ｍＬになるまで、減圧（４０〜５０℃）で蒸留し、９，９００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨てた。沈殿物を４ｍＬの追加の水で洗浄し、９，９００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨てた。沈殿物を５０％エタノール水溶液で懸濁し、６５℃まで加熱して可溶化した。等体積の水をその中に添加し、２５％のエタノール濃度にした。混合物を室温まで徐々に冷却し、固体の沈殿後、吸引濾過及び真空乾燥に供して、０．０５ｇのレバウディオサイドＭを、９９％を超える純度で得た。
【００５９】
上記実施例は、当業者が本発明の内容を理解し、それによりそれを実施することを可能にする目的のために、本発明の技術的概念及び特徴を説明するためだけのものであり、本発明の内容により本発明の保護範囲を限定するものではない。本発明の趣旨及び本質に従ってなされるいかなる同等の変更又は修正も、本発明の保護範囲内に包含されるものとする。
他の実施形態
１．酵素法を使用することによりレバウディオサイドＭを調製する方法であって、レバウディオサイドＡ又はレバウディオサイドＤが基質として使用され、スクロース及びＵＤＰの存在下で、レバウディオサイドＭが、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ及びスクロースシンテターゼの混合物、又は前記ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ及びスクロースシンテターゼを含有する組み換え細胞の触媒作用下での前記基質の反応により生成され、前記反応が水相系で２０〜６０℃の温度及びｐＨ５．０〜９．０で行われ、初期反応系で、前記レバウディオサイドＡが１０ｇ／Ｌ以上の濃度を有し、前記レバウディオサイドＤが１５ｇ／Ｌ以上の濃度を有し、前記反応後、反応溶液が遠心分離され、次いで上清がマクロ多孔性吸着性樹脂で分離されて、レバウディオサイドＭの粗生成物の溶液が得られ、これがエタノール水溶液中で結晶化されて、レバウディオサイドＭ生成物が９８％を超える純度で得られる、方法。
２．前記初期反応系で、前記レバウディオサイドＡが１０〜３０ｇ／Ｌの濃度を有し、前記レバウディオサイドＤが１５〜５０ｇ／Ｌの濃度を有する、実施形態１に記載の方法。
３．前記ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼが、ステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａ及び／又はイネ由来のＵＧＴ−Ｂである、実施形態１に記載の方法。
４．前記反応が、水相系で３５℃〜４５℃の温度及びｐＨ６．５〜８．５で行われる、実施形態１に記載の方法。
５．前記ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ及びスクロースシンテターゼを含有する前記組み換え細胞が、前記触媒作用を行うために前記反応で用いられ、前記初期反応系が、体積比で１％〜３％の濃度のトルエン又は他の細胞浸透剤を更に含有する、実施形態１に記載の方法。
６．前記ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼと前記スクロースシンテターゼの重量比が、１：０．２〜０．４である、実施形態１に記載の方法。
７．前記方法が、前記反応で用いられる全ての原材料が反応ケトルに添加され、水相系で最終体積にされ、均一に混合され、次いで設定温度で定置され、撹拌されて反応する、というように実施される、実施形態１に記載の方法。
８．前記組み換え細胞が微生物細胞である、実施形態１に記載の方法。
９．前記微生物が、大腸菌、出芽酵母、又はピチア・パストリスである、実施形態８に記載の方法。
１０．前記基質が、レバウディオサイドＡであり、前記ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼが、ステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａ及びイネ由来のＵＧＴ−Ｂの混合物であり、ステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列が、配列番号２と少なくとも８０％一致し、イネ由来のＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列が、配列番号４と少なくとも８０％一致する、実施形態１〜９のいずれか一項に記載の方法。
１１．ステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａ及びイネ由来のＵＧＴ−Ｂの前記混合物中で、ステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａとイネ由来のＵＧＴ−Ｂの重量比が３〜５：１である、実施形態１０に記載の方法。
１２．前記基質がレバウディオサイドＤであり、前記ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼがステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａであり、ステビア・レバウディアナ由来のＵＧＴ−Ａのアミノ酸配列が、配列番号２と少なくとも８０％一致する、実施形態１〜９のいずれかに記載の方法。
１３．前記反応溶液が、前記反応後かつ前記遠心分離前に、最初に５０〜６０℃で加熱され、超音波処理に５０〜７０分間供される、実施形態１に記載の方法。
１４．レバウディオサイドＭの前記粗生成物の前記溶液が、レバウディオサイドＭの前記粗生成物の前記溶液が減圧での蒸留により濃縮され、次いで遠心分離され、上清が捨てられる工程、沈殿物が追加の水で洗浄され、次いで遠心分離され、上清が捨てられる工程、沈殿物が体積比で４０％〜７０％の濃度のエタノール水溶液で懸濁され、６０〜７０℃まで加熱されて可溶化され、前記エタノール水溶液が体積比で２０〜３０％の濃度を有するまで水がその中に添加される工程、混合物が室温まで徐々に冷却され、結晶化及び固体の沈殿に供され、続いて吸引濾過及び真空乾燥に供される工程の特定の工程により前記エタノール水溶液中で結晶化される、実施形態１に記載の方法。
【図１】
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【配列表】
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