(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
損傷した心臓組織付近の領域にその機能を妨害することなく適用するよう構成された脱水された改変胎盤組織または脱水された改変胎盤組織抽出物を、損傷を軽減し治癒を誘導するのに十分な量で含む、損傷または罹患した心臓組織を治療するための組成物であって、
前記改変胎盤組織が線維芽細胞層を有する羊膜を含み、ここで前記羊膜は、絨毛膜上に直接積層されており、
前記改変胎盤組織が、造血幹細胞または間葉系幹細胞を動員する有効量の幹細胞動員因子を保持している、組成物。
【請求項２】
前記改変胎盤組織が、有効量の成長因子および／または血管新生誘導因子を保持している、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記改変胎盤組織が、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＴＧＦａ、ＴＧＦβ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＰｌＧＦ、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−４のうちの１つまたは複数を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
パッチである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記改変胎盤組織が微粒化されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
注射可能な形態である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記損傷または罹患した心臓組織が、虚血、急性心筋梗塞、心筋梗塞、心筋症、不安定狭心症、難治性狭心症、心臓発作、心不全、肺性心、静脈移植片疾患、冠動脈心疾患、閉塞性冠動脈血栓、心臓弁膜症、炎症性心肥大、アテローム性動脈硬化症、急性心外膜炎およびドレスラー症候群、炎症性心病態または壊死性心病態を原因とするものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記脱水された改変胎盤組織または脱水された前記改変胎盤組織抽出物が、前記領域と接触して貼付されたときに前記領域への幹細胞動員を促進する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が有効量の成長因子を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が有効量の血管新生誘導因子を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物によって多能性幹細胞が動員される、請求項３に記載の組成物。
【請求項１２】
胎盤組織が、治療する領域に幹細胞を動員するのに十分な質量を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記損傷または罹患した心臓組織が、炎症性心病態または壊死性心病態を原因とするものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
血管新生を誘導するために用いられる、請求項１３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は部分的には、十分な量の改変胎盤組織または胎盤組織抽出物の使用によって心病態を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（最新技術）
心血管疾患は、患者の管理および治療に進歩がみられるものの、依然として世界で最も大きな死因となっている。
【０００３】
約６００万人のアメリカ人が心不全（ＨＦ）を抱えながら生活しており、毎年新たに６７０，０００例のＨＦが認められている。ＨＦは、毎年１，２００万〜１，５００万件にのぼる外来診療および６５０万日にのぼる在院日数の主な原因となっている。ＨＦによる経済的負担および医療全般への影響は膨大なものである。実際、毎年米国でＨＦにかかる費用は直接的、間接的なものを併せて合計３００億ドルを超えると推定されている。特に注目されるのがアテローム性冠動脈疾患（ＣＡＤ）であり、この疾患は症候性ＨＦ全体の６０〜７５％を占め、ＭＩの病歴があるとＨＦの相対リスクが６．０に増大する。
【０００４】
したがって、心不全などの心血管疾患にさらなる治療選択肢が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
心病態には概略的には、心臓組織の損傷、例えば虚血性イベントに起因する心筋損傷、うっ血性心不全などに起因する左心室の損傷、冠動脈疾患などの疾患に起因する心臓弁の損傷などが含まれる。あらゆる面で、心臓組織の損傷部分の機能を改善することが患者の利益になると考えられる。従来の治療法では、ステント、体外ポンプなどの機械装置を導入して疾患または病態を治療する。その他の治療条件として、吻合によって動脈と接続した下肢静脈などの自己血管を導入することにより冠動脈閉塞部位を迂回する冠動脈バイパス法が挙げられる。
【０００６】
本発明は、改変胎盤組織が患者の損傷した臓器または組織の治癒を誘導する多数の生物学的因子を有するという発見に関する。このような因子としては、幹細胞動員因子、成長因子および血管新生誘導因子が挙げられ、これらはいずれも単独で、または組み合わさって相互作用して、損傷を最小限に抑え、既に損傷した心臓組織を治癒する。
【０００７】
したがって、一態様では、治療を必要とする患者の心病態を治療する方法が提供され、この方法は、前記患者に改変胎盤組織または胎盤組織抽出物を含む十分な量の組成物を投与することを含む。
【０００８】
一態様では、損傷した心臓組織付近の領域に非閉塞性に貼付するよう構成された改変胎盤組織を、損傷を最小限に抑え治癒を誘導するのに十分な量で含む、組成物が提供される。例えば、胎盤組織を損傷部分またはその付近に導入し、血管新生を含めた生物学的過程によって組織の治癒を誘導する。いくつかの実施形態では、改変胎盤組織は有効量の幹細胞動員因子、成長因子および／または血管新生誘導因子を保持している。
【０００９】
別の態様では、損傷または罹患した心臓組織を治療する方法が提供され、この方法は、有効量の改変胎盤組織または胎盤組織抽出物を損傷した心臓組織付近にその機能を妨害することなく貼付することを含み、改変胎盤組織または抽出物を、疾患の治療または損傷組織の治癒を促進する条件下で貼付する。
【００１０】
別の態様では、治療を必要とする患者の心病態を治療する方法が提供され、この方法は、患者の心臓に近接した領域に有効量の幹細胞動員因子を含む改変胎盤組織または胎盤組織抽出物を含む組成物を提供することを含み、前記改変胎盤組織または抽出物は、前記領域と接触して貼付されたときに前記領域への幹細胞動員を促進する。一実施形態では、動員される幹細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。別の実施形態では、動員される幹細胞は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。一実施形態では、動員される幹細胞は骨髄由来幹細胞である。
【００１１】
上に挙げたものをはじめとする本発明の態様について本明細書でさらに説明する。
【００１２】
本明細書に組み込まれその一部を構成する添付図面は、以下に記載されるいくつかの態様を説明するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例３に記載される幹細胞遊走アッセイのための細胞培養インサートの模式図である。
【図２】各種の量のＥｐｉＦｉｘ（登録商標）の存在下で培養したヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）のパーセント細胞遊走の棒グラフを示す図である。詳細については実施例３に記載されている。
【図３Ａ】移植の３日後、７日後、１４日後および２８日後における正常皮膚、偽移植、無細胞皮膚マトリックスおよびＥｐｉＦｉｘ（登録商標）の生存／Ｌｉｎ−マウス造血幹細胞の百分率の棒グラフを示す図である。示される数値は平均±標準偏差であり、標本数はｎ＝４である。＊＊は、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）または対照ＡＤＭと正常皮膚および偽移植とを一元配置ＡＮＯＶＡにより比較したときのｐ＜０．０５であることを表す。††は、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）と対照ＡＤＭとを両側ｔ検定により比較したときｐ＜０．０５であることを表す。
【図３Ｂ】移植の３日後、７日後、１４日後および２８日後における正常皮膚、偽移植、無細胞皮膚マトリックスおよびＥｐｉＦｉｘ（登録商標）の生存／Ｌｉｎ−マウス間葉細胞の百分率の棒グラフを示す図である。示される数値は平均±標準偏差であり、標本数はｎ＝４である。＊＊は、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）または対照ＡＤＭと正常皮膚および偽移植とを一元配置ＡＮＯＶＡにより比較したときのｐ＜０．０５であることを表す。詳細については実施例４に記載されている。
【図４Ａ−４Ｂ】ＡｍｎｉｏＦｉｘ（登録商標）膜およびＥｐｉＦｉｘ（登録商標）膜が実験的に誘発した心筋梗塞（ＭＩ）後の損傷からマウスを保護したことを示す図である。マウスをＡｍｎｉｏＦｉｘ（登録商標）膜またはＥｐｉＦｉｘ（登録商標）膜で処置することにより、ＭＩ後のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスおよび野生型マウスの梗塞の大きさが有意に減少した。それぞれの種類の膜にほぼ同じレベルの保護がみられた。図４Ａは、膜処置マウスおよび対照処置マウスの心臓の全領域に対する梗塞の大きさを定量化したものを示している。各心臓から切片３枚を取り、梗塞部位に近接する切片２枚について梗塞の大きさを定量化した。切片はマッソン・トリクロームで染色した。図４Ｂは、膜処置を実施した野生型マウスおよびＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスならびに対照処置を実施した野生型マウスおよびＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの代表的な画像を示している。ＡｍｎｉｏＦｉｘ（登録商標）膜＝膜２、３、４および６；ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）膜＝膜１、５および７。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１。詳細については実施例６に記載されている。
【図５Ａ−５Ｃ】ＡｍｎｉｏＦｉｘ（登録商標）膜およびＥｐｉＦｉｘ（登録商標）膜による処置がｃ−ｋｉｔ＋細胞数を増加させたことを示す図である。図５Ａは、ＡｍｎｉｏＦｉｘ（登録商標）膜またはＥｐｉＦｉｘ（登録商標）膜の貼付の模式図を示している。図５Ｂは、心臓のＡｍｎｉｏＦｉｘ（登録商標）膜もしくはＥｐｉＦｉｘ（登録商標）膜に覆われた領域または膜周辺の領域に実施したｃ−ｋｉｔの免疫組織化学染色の代表的な結果を示している。図５Ｃは、組織切片中のｃ−ｋｉｔ＋細胞を定量化したものを示している。詳細については実施例６に記載されている。
【図６Ａ−６Ｂ】膜処置心臓組織では膜に覆われた領域および膜処置領域の外側ともにＫｉ６７レベルが上昇したことを示す図である。図６Ａは、膜処置心臓および対照処置心臓の代表的な免疫細胞化学染色を示している。処置心臓をＫｉ−６７（緑色）および心筋細胞マーカーのトロポニン、トロポニンＣ（赤色）に対して染色した。ＤＡＰＩは青色で示されている。図６Ｂは、膜処置心臓のＫｉ−６７＋細胞を定量化したものを対照処置心臓と比較して示している。詳細については実施例６に記載されている。
【図７Ａ−７Ｂ】膜処置心臓の血管数が対照処置組織に比して有意に増加したことを示す図である。図７Ａは、膜処置心臓および対照処置心臓のＣＤ３１染色（緑色）により血管数の有意な増加が示されたことを示している。切片はトロポニン（赤色）とＤＡＰＩ（青色）で共染色した。図７Ｂは、膜（ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）およびＡｍｎｉｏＦｉｘ（登録商標））処置心臓の平均血管数を定量化したものを生理食塩水処置（対照）と比較して示している。詳細については実施例６に記載されている。
【図８Ａ−８Ｂ】膜処置によりＭＩ後のアポトーシスが有意に減少したことを示す図である。図８Ａは、ＴＵＮＥＬ染色を用いて膜処置心臓組織および対照処置心臓組織のアポトーシス細胞が確認されたことを示している。図８Ｂは、膜処置細胞および対照処置細胞中のＴＵＮＥＬ陽性細胞を定量化したものを示している。詳細については実施例６に記載されている。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
定義
本開示を開示し説明する前に、以下に記載する態様は特定の組成物、合成方法または使用に限定されるわけではなく、したがって、当然のことながら多様なものになり得ることを理解するべきである。このほか、本明細書で使用される用語は単に特定の態様を説明するのが目的であって、限定することを意図するものではないことを理解するべきである。
【００１５】
本明細書およびのちの特許請求の範囲では、次に挙げるような意味を有すると定義される多数の用語に言及する。
【００１６】
本明細書および添付の「特許請求の範囲」で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き複数形の指示対象を包含することに留意しなければならない。したがって、例えば、「生物活性剤」に言及する場合、２つ以上のこのような薬剤の混合物などがこれに包含される。
【００１７】
「任意選択の」または「任意選択で」は、のちに記載される事象または状況が起こっても起こらなくてもよく、またその記載にはその事象または状況がおこる場合およびそれが起こらない場合が包含されることを意味する。例えば、「任意選択で洗浄する段階」という語句は、その洗浄段階を実施しても実施しなくてもよいことを意味する。
【００１８】
本明細書で使用される「対象」または「患者」という用語は、特に限定されないが、ヒト、家畜、飼い馴らされたペットなどの哺乳動物対象を含めた任意の脊椎動物を指す。
【００１９】
本明細書で使用される「羊膜」という用語は、中間組織層がインタクトであるか、実質的に除去された羊膜を包含する。
【００２０】
「外面」という用語は、胎盤組織を適用する患者の罹患または損傷した心臓組織と接触する改変胎盤組織の一方または両方の面を指す。
【００２１】
本明細書で使用される「心臓組織」という用語は、心膜、心内膜、心筋および心外膜のほかにも、心臓に存在するか、これと接続している血管および神経などを含めた心臓の任意の部分を指す。
【００２２】
本明細書で使用される「罹患（した）」という用語は、病的状態にあるか病的状態になりやすいことを特徴とする、心臓組織などの臓器および／または身体部位指す。
【００２３】
本明細書で使用される「損傷（した）」という用語は、当該技術分野での通常の意味を有するように使用され、心臓組織などの臓器および／または身体部位に対するあらゆる種類の損傷を包含する。
【００２４】
本明細書で使用される「生体適合性」という用語は、対象への移植または注射に適した材料を指す。各種の態様では、生体適合材料を対象に移植したとき、これが毒性作用も有害作用も引き起こすことはない。
【００２５】
「改変胎盤組織」という用語は、組織を洗浄、消毒および／または分割することによって改変された胎盤組織全体を含めたあらゆる構成要素のほかにも、胎盤組織から分離された羊膜、絨毛膜、臍帯などの構成要素を指す。改変組織は上皮層および／または線維芽細胞層などの細胞層を保持し得る。改変胎盤組織は、胎盤組織の１つまたは複数の層の積層、胎盤組織の微粒化、小分子、タンパク質（例えば、成長因子、抗体）、核酸（例えば、アプタマー）、ポリマーをはじめとする物質の化学吸着または物理吸着などのさらなる改変を含み得る。
【００２６】
「胎盤組織抽出物」という用語は、胎盤組織または改変胎盤組織中に存在する１つまたは複数の生物学的因子を含み、胎盤組織も細胞材料も実質的に含まない溶液または凍結乾燥固体などの組成物を指す。
【００２７】
「十分な量」または「有効量」という用語は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかで心損傷を抑制するか、軽減するか、最小限に抑える、または罹患もしくは損傷した心臓組織の治癒を経時的に誘導するのに十分な改変胎盤組織または胎盤組織抽出物の量を指す。「十分な量」は、様々な因子、例えば、特に限定されないが、使用する胎盤組織または胎盤組織抽出物の種類および／または量、治療する罹患または損傷した心臓組織の種類および／または大きさ、治療する罹患または損傷した心臓組織に対する疾患または損傷の重症度ならびに投与経路などによって異なる。「十分な量」の決定は、本明細書に提供される開示に基づいて当業者によってなされ得る。
【００２８】
「胎盤成長因子」という用語は、改変胎盤組織から入手可能な各種成長因子を指す。このような成長因子の入手方法は本発明には重要なものではないが、単なる例として、胎盤からの水性抽出、このような成長因子を発現する胎盤細胞の培養などが挙げられる。成長因子の抽出に用いた水、生理食塩水または緩衝液の体積を減少させること、胎盤細胞培養物で産生された成長因子を加えることなどによって、抽出された成長因子の濃度を増大させることができる。
【００２９】
「幹細胞動員因子」という用語は、幹細胞の動員を誘導し、このような因子の発生源に遊走させることが可能なあらゆる因子を指す。幹細胞動員因子の非限定的な例は、１つまたは複数のＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、ＣケモカインまたはＣＸ３Ｃケモカインであり得る。
【００３０】
「幹細胞動員」という用語は、幹細胞の改変胎盤組織または胎盤組織抽出物に対する直接的または間接的な走化性を指す。一態様では、動員は直接的なものであり得、改変胎盤組織中の幹細胞動員因子（例えば、細胞走化性を誘導するケモカイン）が、このような因子を含む胎盤組織または抽出物から放出されて治療する部位に導入されることにより、幹細胞がその部位に遊走する。別の態様では、動員は間接的なものであり得、単独で存在するか改変胎盤組織中に存在する幹細胞動員因子が、周囲の細胞に因子（例えば、ケモカイン）の放出を誘導し、これにより幹細胞の胎盤組織への遊走が誘導される。さらには、幹細胞動員は直接的な因子と間接的な因子の両方を包含し得る。
【００３１】
本明細書で使用される「〜に近接した」という用語は、組成物が所望の効果を発揮する程度に罹患または損傷した心臓組織などの身体部位に隣接するか接触していることを意味する。一般に、「〜に近接した」は、一般に当業者の技能範囲内の距離を意味するが、好ましくは臓器または身体部位から３ｃｍ、２ｃｍまたは１ｃｍ以内の距離を意味する。「接触」または「接触している」という用語は、組成物が身体部位上または身体部位内に存在することを意味する。
【００３２】
「外因性」という用語は、改変胎盤組織などの同種移植組織を含めた、治療する身体部位に本来存在しない物質を指す。
【００３３】
「内因性」という用語は、対象に由来する自己の生物学的物質を指す。
【００３４】
本明細書で使用される「生体内分解性」という用語は、本明細書では「生分解性」という用語と互換的に使用され、ｉｎ  ｓｉｔｕで徐々に分解する、溶解する、加水分解される、および／または侵食される生体適合材料あるいは生存している生物体内で長時間かけて、例えば、数日または数か月かけてより小さい成分または分子に分解されやすいため、通常の生存条件下では生存している生物体に無害な生体適合材料を指す。一般に、本明細書の「生体内分解性」ポリマーは、加水分解性で、主として加水分解によりｉｎ  ｓｉｔｕで生分解されるポリマーのことである。より小さい成分または分子は患者に対して生体適合性であるのが好ましい。
【００３５】
当業者には理解されることであろうが、材料の分解により、材料中に組み込まれた治療量の胎盤成長因子が長時間にわたって、例えば約３日間、約５日間、約１０日間、約１５日間、約２０日間、約２５日間、約３０日間、約２か月間、約３か月間、約４か月間、約５か月間または約６か月間などにわたって継続的に放出される。生体内分解性または生分解性の塊の中に組み込む成長因子の初期濃度および塊の分解速度を調節することによって、所望の放出速度を決定および／または達成することができる。
【００３６】
本明細書では読者の利便性を考え、表題または副題が用いられることがあるが、これは本発明の範囲に影響を及ぼすことを意図するものではない。さらに、本明細書で使用される一部の用語については以下でさらに具体的に定義される。
【００３７】
組成物および方法
心筋などの心臓組織が、例えば心臓発作で損傷した場合、幹細胞を動員して修復することができる。しかし、心臓には修復が完了する前に幹細胞へのシグナル伝達を停止する傾向があると考えられている。その結果、損傷組織の修復が部分的なものにとどまり、これが心臓への負担となって心臓をさらに激しく非効率的に働かせることになり、ひいては心臓になおも有害な作用をもたらす可能性がある。さらに、現在用いられている損傷組織に幹細胞を注射する治療法は、注射した幹細胞の生存率が低いことにより複雑なものとなっている。
【００３８】
本発明は部分的には、羊膜などの改変胎盤組織または胎盤組織抽出物を含む十分な量の組成物を患者の罹患または損傷した心臓組織に近接させて適用することにより、外因性の治療法がもたらされることに加えて、驚くべきことに、罹患または損傷した身体部位に直接的または間接的な幹細胞動員を誘発することにより内因性の治療効果ももたらされ、これにより二元的な治療効果が得られるという発見に基づくものである。胎盤組織の場合、改変胎盤組織を罹患または損傷した心臓組織に投与することが、物理的治療および／または望ましくない組織癒着を防止する障壁をもたらすことに加えて、幹細胞動員の効率を向上させることによって内因性の効果を誘導し、かつ／または心臓自体が幹細胞を動員できない場合にこれを動員することが考えられる。さらに、改変胎盤組織または抽出物が幹細胞動員の誘導とは別に、またはこれと組み合わさって、罹患または損傷した組織に成長因子および／または血管新生誘導因子をもたらすことにより、罹患または損傷した組織の増殖および治癒を刺激することが考えられる。
【００３９】
したがって、一態様では、胎盤組織または胎盤組織から抽出された因子を含み、罹患または損傷した心臓組織付近の領域に損傷を軽減し治癒を誘導するのに十分な量で非閉塞性貼付のために送達される組成物が提供される。いくつかの実施形態では、改変胎盤組織または胎盤組織抽出物は、有効量の幹細胞動員因子、成長因子および／または血管新生誘導因子を含む。いくつかの実施形態では、胎盤組織または胎盤組織抽出物は、血管新生を含めた生物学的過程によって組織の治癒を誘導する。
【００４０】
別の態様では、治療を必要とする患者の心病態を治療する方法が提供され、この方法は、前記患者に改変胎盤組織または胎盤組織抽出物を含む十分な量の組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、心病態を有するか、それを引き起こしている心臓組織の付近に貼付することによって、組成物を投与する。
【００４１】
別の態様では、罹患または損傷した心臓組織を治療する方法が提供され、この方法は、損傷した心臓組織付近にその機能を妨害することなく貼付するよう構成された有効量の改変胎盤組織または胎盤組織抽出物を貼付することを含み、改変胎盤組織または胎盤組織抽出物は疾患の治療または損傷組織の治癒を促進する条件下で貼付される。
【００４２】
別の態様では、治療を必要とする患者の心病態を治療する方法が提供され、この方法は、患者の心臓に近接した領域に有効量の幹細胞動員因子、成長因子および血管新生誘導因子を含む改変胎盤組織または胎盤組織抽出物を含む組成物を提供することを含み、前記改変胎盤組織または抽出物は、前記領域と接触または近接して貼付されたときに前記領域への幹細胞員および／または心臓組織の治癒を促進する。一実施形態では、動員される幹細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。別の実施形態では、動員される幹細胞は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。別の実施形態では、動員される幹細胞は骨髄由来幹細胞である。
【００４３】
別の態様では、治療を必要とする患者の罹患または損傷した心臓組織を含む心病態を治療する方法が提供され、この方法は、前記心臓組織を、有効量の幹細胞動員因子、成長因子および血管新生誘導因子を含む改変胎盤組織または胎盤組織抽出物を含む十分な量の組成物と接触させることを含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、心病態は、心筋炎、心外膜炎および心内膜炎などの炎症性心病態ならびに壊死性病態から選択される。
【００４５】
いくつかの実施形態では、心病態は、急性心筋梗塞、心筋梗塞、心筋症（例えば、虚血性心筋症、心筋炎または炎症性心筋症、拡張型心筋症および肥大型心筋症）、不安定狭心症、難治性狭心症、心臓発作、心不全、肺性心、伏在静脈グラフトの変性および閉塞などの静脈グラフト疾患、冠動脈心疾患、閉塞性冠動脈血栓（例えば、血栓溶解療法後または冠動脈形成術後に生じる血栓）から選択される。いくつかの実施形態では、心病態は心臓弁の炎症である。いくつかの実施形態では、心病態は、心臓弁膜症、炎症性心肥大およびアテローム性動脈硬化症から選択される。
【００４６】
狭心症は、一般的には冠動脈（心臓の血管）の閉塞または攣縮による心筋の虚血（血流不足により酸素供給量が不足した状態）に起因する重度の胸痛である。狭心症の主な原因である冠動脈疾患は、心動脈のアテローム性動脈硬化症に起因する。アテローム性動脈硬化症の血餅を除去する各種の心臓血管開放外科手術には、血管の修復、再構築および閉鎖ならびに手術による欠損部分を閉じて継ぎ合わせるための再生組織パッチの支持が必要である。このほか、心臓バイパスグラフト術および心臓欠損部分の再構築（開胸外科手術の一部として）では、軟部組織の脆弱性を補強し、適切な組織がない場合に組織置換を可能にするほか、心臓自体の癒着を軽減する能力を与えるパッチまたはグラフトにより便益が得られる。改変胎盤組織は、手術および合併症、例えば頸動脈修復、冠動脈バイパスグラフト術、先天性心疾患、心臓弁修復および血管修復（すなわち、末梢血管）などによって生じる血管および心臓の欠損部分の修復を補助するパッチとして使用することができる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、この方法は、心臓の外科手術部位の治癒および／または瘢痕の軽減を促進するためのものである。いくつかの実施形態では、この方法は、弁修復または吻合などの心臓外科手術後の組織再生を促進するためのものである。
【００４８】
いくつかの実施形態では、この方法は、急性心外膜炎などの心膜疾患を治療するためのものである。いくつかの実施形態では、この方法を心膜の置換時および／または置換後に用いる。いくつかの実施形態では、この方法は、ドレスラー症候群を治療する、またはドレスラー症候群の炎症を軽減するためのものである。
【００４９】
いくつかの実施形態では、胎盤組織は内因性幹細胞を誘引し、幹細胞生存のための微小環境をもたらす。
【００５０】
いくつかの実施形態では、外因性幹細胞の増殖および同細胞の任意選択の心筋原細胞系列への分化を促進するように、胎盤組織をｉｎ  ｖｉｔｒｏで前処理する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、胎盤組織は、幹細胞に対して生体適合性で無毒性の支持体材料である。
【００５２】
いくつかの実施形態では、胎盤組織材料はパッチであり、罹患または損傷した領域の包帯としての役割を果たす構造的に耐久性のある要素となる。より具体的には、胎盤組織材料は分子的かつ機械的な包帯として機能するものであり、内因性幹細胞（例えば、心幹細胞および／または骨髄幹細胞）を損傷部位まで遊走させる化学誘引物質としての役割を果たし、同細胞の増殖を刺激して治癒を促進し、したがって瘢痕組織形成を軽減し、炎症を抑制する。
【００５３】
いくつかの実施形態では、胎盤組織材料を宿主組織内に組み込み、任意選択で宿主細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に置換する。
【００５４】
一実施形態では、胎盤組織を、洗浄、羊膜および絨毛膜の分離、上皮細胞層の除去または維持、汚染除去および脱水を含め、米国特許出願第６１／６８３，６９８号に記載されている通りに改変し得る。脱水は、例えば２０１２年１１月３０日に出願された米国特許出願第１３／６９１，５０９号に記載されている通りに、乾燥装置または化学的脱水を用いて実施し得る。上記出願はともにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。その工程の各態様では、単独で使用するか組み合わせて使用するかに関係なく、本発明の目的のための改変胎盤組織が作製される。しかし、改変胎盤組織は少なくとも洗浄段階と汚染除去段階を含むのが好ましい。したがって、改変胎盤組織は好ましくは、洗浄および汚染除去された胎盤組織を含み、ほかにも、羊膜および絨毛膜の分離、上皮細胞層の除去および脱水のうちの１つまたは複数を実施した胎盤組織を含む。このほか、改変胎盤組織を複数の層に形成することができ、この層は別個に乾燥させてから積層したものであっても、多層積層物を形成するよう一緒に乾燥させたものであってもよい。
【００５５】
ほかにも、改変胎盤組織を様々な大きさ、例えば、約３００ミクロン以下、例えば約２５０ミクロン未満、約２００ミクロン未満、約１５０ミクロン未満、約１００ミクロン未満または約５０ミクロン未満の大きさの粒子に微粒化し得る。微粒化した胎盤組織を多層積層物の１つまたは複数の層の間に挟むか、積層物の最上部に置き得る。このほか、微粒化した胎盤組織を改変胎盤組織の単一の層に加えてもよい。例えば、２０１２年２月１３日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２４７９８号および２０１２年８月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／６８３，７００号（ともにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。ほかにも、微粒化した改変胎盤組織により特定の身体部位における幹細胞動員速度を増大させ得ることが考えられる。いくつかの実施形態では、微粒化した改変胎盤組織を改変胎盤組織の単一の層または胎盤組織の多層積層物の間に加える。
【００５６】
いくつかの実施形態では、改変胎盤組織は、羊膜、絨毛膜または羊膜と絨毛膜の両方から選択される。いくつかの実施形態では、改変胎盤組織は臍帯を含まない。
【００５７】
羊膜は、ＩＶ型、Ｖ型およびＶＩＩ型が存在することにより水と結合して膨張することが可能な独特のＥＣＭである。羊膜の中間組織層は主として糖タンパク質とプロテオグリカンで構成され、これにより中間組織層も水と結合することが可能である。したがって、改変胎盤組織を罹患または損傷した心臓組織に適用すれば、その部位に水が保持され、心臓組織の修復および／または再生が促進される。例えば、親水性環境では治癒カスケード内の幹細胞動員を含めた細胞遊走が促進される。中間層はこのほか、Ｉ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型コラーゲンで構成されている。Ｉ型コラーゲンは、細胞接着および高分子固着のための主要な生体力学的足場となることによって皮膚に機械的強度を持たせる。ＩＩＩ型コラーゲンは弾性をもたらす。
【００５８】
他の実施形態では、羊膜の上皮細胞層を除去しない。このような実施形態では、改変胎盤組織が腹膜、より大きな血管および腹部の筋肉からの分離を維持することによって、さらなる保護をもたらす。改変胎盤組織は、癒着および瘢痕に対する摩擦の少ない解剖学的障壁としての役割を果たし得る。一実施形態では、上皮層が破壊されている場合に本明細書に記載の改変胎盤組織を適用することによって、成長因子を損傷部位に直接送達して治癒および／または幹細胞動員を促進する効果を得ることができる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、羊膜の上皮を実質的に除去する。上皮細胞層を除去すると、羊膜の基底膜層が露出して細胞シグナル伝達特性が増大する。このアップレギュレーション応答は細胞の遊走および抗炎症タンパク質の発現を増強し、これにより線維症が抑制される。
【００６０】
いくつかの実施形態では、改変胎盤組織または胎盤組織抽出物を含む組成物を、微粒化した改変胎盤組織もしくは抽出物を含む組成物の注射、組成物の外科的移植または組成物のパッチ送達により、罹患または損傷した心臓組織に隣接する領域に提供する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、改変胎盤組織または抽出物を含む組成物は、微粒化した改変胎盤組織または抽出物と薬学的に許容される担体とを含む、注射可能な形態である。適切な薬学的に許容される担体としては、特に限定されないが、水、緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、クエン酸緩衝液など）、水溶性有機溶媒（例えば、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルアセトアミドおよびジメチルスルホキシド）、有機液体／半固体（ミツロウ、ｄ−トコフェロール、オレイン酸、中鎖モノグリセリドおよびジグリセリド）、非イオン性界面活性剤（ポリエトキシル化ヒマシ油（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＲＨ４０、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＲＨ６０）、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、ｄ−トコフェロールポリエチレングリコール１０００スクシナート、ポリエチレングリコール（１５）−ヒドロキシステアラート、ソルビタンモノオレアート、オレオイルポリオキシル−６グリセリド、リノレオイルポリオキシル−６グリセリド、カプリロカプロイルポリオキシル−８グリセリド、Ｇｅｌｌｕｃｉｒｅ（登録商標）４４／１４、Ｓｏｆｔｉｇｅｎ（登録商標）７６７ならびにＰＥＧ３００、４００または１７５０のモノ脂肪酸エステルおよびジ脂肪酸エステルなど）、脂質（例えば、ヒマシ油、トウモロコシ油、綿実油、オリーブ油、ラッカセイ油、ハッカ油、ベニバナ油、ゴマ油、ダイズ油、水素化植物油、水素化ダイズ油ならびにヤシ油およびパーム核油の中鎖トリグリセリド）、シクロデキストリン（例えばα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンおよびγ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよびスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンなど）ならびにリン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、１−ジミリストイルホスファチジルコリン、１−ジミリストイルホスファチジルグリセロールなど）またはその混合物などが挙げられる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、組成物は、任意選択で組成物中の生物学的因子の長時間にわたる放出および／または持続的な放出のために、送達部位における溶液または懸濁液の局所的保持を可能にする薬剤とともに前記罹患および／または損傷した心臓組織に対して、あるいはこれに近接して適用した場合、局在する塊を形成する。このような薬剤としては、揺変剤、相転移剤などが挙げられる。このような組成物は、周囲条件下では注射可能な形態であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでは粘稠性またはゲル様の生体内分解性または生分解性の塊を形成して、送達部位から離れた場所への輸送を抑制し、形成された塊から長時間にわたって生物学的因子が拡散するのを可能にする。
【００６３】
いくつかの実施形態では、揺変剤、相転移剤などの局在化剤としては、特に限定されないが、ヒドロゲル、生体内分解性、生体適合性ポリマーおよびコラーゲンゲルを挙げ得る。本発明の組成物中に１つまたは複数の局在化剤を存在させることによって、組成物に投与後または注射後一定時間にわたって局所に保持される程度の粘度を持たせることが可能になる。適切な組成物の粘度の決定は当業者の専門範囲内にある。いくつかの態様では、組成物は、２５℃で粘度が約５ｃＰ（５×１０−３Ｐａ・ｓ）〜約１×１０８ｃＰ（１×１０５Ｐａ・ｓ）、約５ｃＰ（５×１０−３Ｐａ・ｓ）〜約１×１０６ｃＰ（１×１０３Ｐａ・ｓ）、約５ｃＰ（５×１０−３Ｐａ・ｓ）〜約１×１０５ｃＰ（１×１０２Ｐａ・ｓ）、約５ｃＰ（５×１０−３Ｐａ・ｓ）〜約１×１０４ｃＰ（１０Ｐａ・ｓ）、約５ｃＰ（５×１０−３Ｐａ・ｓ）〜約１×１０３ｃＰ（１Ｐａ・ｓ）または約６ｃＰ（６×１０−３Ｐａ・ｓ）〜約９５００ｃＰ（９．５Ｐａ・ｓ）である。
【００６４】
本発明の組成物に有用なヒドロゲルは、化学架橋および／または物理架橋ヒドロゲルであり得る。例えば、好ましくは共有結合の形成が起こる光重合、酸化還元重合またはマイケル型付加重合によりｉｎ  ｓｉｔｕ化学架橋が達成される。物理架橋ヒドロゲルは外部刺激を受けて自己集合し、共有結合の形成に依存しない。温度、ｐＨ、イオン濃度および疎水性相互作用がこのような自己集合およびこのようなヒドロゲルの固定化に有用ないくつかの外部刺激である。
【００６５】
本発明の組成物に使用するのに適した例示的なポリマーとしては、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（カプロラクトン）、ポリ酸無水物、ポリアミン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリジオキサノン、ポリアセタール、ポリケタール、ポリカルボナート、ポリリン酸エステル、ポリオルトカルボナート、ポリホスファゼン、コハク酸エステル、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（アミノ酸）、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシセルロース、ポリリン酸エステル、多糖類、キチン、キトサン、ヒアルロン酸およびコポリマー、ターポリマーならびにその混合物が挙げられる。
【００６６】
コラーゲンは、例えば、各種動物から抽出した不溶性コラーゲンをアルカリ処理して、あるいはペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パピン（ｐａｐｉｎ）またはプロナーゼなどの酵素で処理することによって使用することができる。コラーゲンの入手源に特に制限はないが、通常、鳥類または哺乳類の皮膚、骨、軟骨、腱または臓器などから得られるコラーゲンを使用することができる。コラーゲンでは加熱せずに適切な一貫性が得られることから、ゲル化する場合に調製を容易に実施することができる。さらに、コラーゲンは分子量が大きいため、生体組織により類似しており、生理活性が高く、したがって創傷に使用する場合に治癒を促進し、改変胎盤組織とともにさらなる治療効果をもたらす。コラーゲンは硬化後も弾力性を保つことができ、架橋にわずかな時間しか必要としない、言い換えれば、ゲル化にわずかな時間しか必要としない。ほかにも、生体に対して無毒な溶媒に溶かすことによってコラーゲン溶液を作製することが可能であり、このような溶媒の例としては、水、生理食塩水、ホウ酸緩衝液などの緩衝液あるいは塩化ナトリウム、臭化ナトリウムおよび臭化カリウムなどの塩またはタンパク質、糖もしくは脂質を含有する水溶液などが挙げられる。
【００６７】
コラーゲンはほかにも、血液中または体液中のような水分の存在下でもゲルを形成することができ、生体組織に対して極めて高い接着性を示し得る。本発明で使用するコラーゲン溶液を様々な濃度で作製し、中和し、注射用に調製することができる。各種の態様において、溶液中０．２ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．７５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬおよび５０ｍｇ／ｍＬのコラーゲンを注射に使用することができる。冷え固まったコラーゲンゲルを臓器に注射すると、ゲルが体温または約３７℃に達したときに熱ゲル化し（ｔｈｅｒｍｏｇｅｌ）得る。
【００６８】
いくつかの実施形態では、組成物は、調製時に相転移剤および揺変剤を含むことによって、保持時間の長い局在する塊を形成し得る。
【００６９】
いくつかの実施形態では、注射用組成物を治療する心臓組織に針による注射またはカテーテルで送達し、任意選択で、送達を内視鏡または蛍光透視法などの方法によってモニターする。
【００７０】
改変胎盤組織を含む組成物の作製に使用する成分の選択に加えて、グラフト中に存在する微粒化粒子の大きさもその用途によって異なり得る。ある特定の態様では、いくつかの適用に粒子径が比較的大きい微粒化粒子を使用し得る。例えば、瘢痕形成を軽減または予防し軟部組織の治癒を増強するのが望ましい創傷治癒には、粒子径が１５０μｍ〜３５０μｍの微粒化粒子（例えば、微粒化した羊膜／絨毛膜組織グラフト）が効果的であり得る。
【００７１】
いくつかの実施形態では、組成物は、構造的コラーゲンおよびＥＣＭタンパク質、再生分子ならびに／または成長因子を含む改変胎盤組織を含む。いくつかの実施形態では、組成物は十分な量の成長因子を含む。いくつかの実施形態では、任意選択で改変胎盤組織粒子で懸濁液を形成する必要のない成長因子を含む水性組成物を得るのに十分な量の胎盤成長因子を改変胎盤組織から抽出する。別の実施形態では、組成物は幹細胞または幹細胞動員因子を含まない。このような組成物はほかにも、ｉｎ  ｖｉｖｏでの保持時間が長い局在する塊を形成するように調製することができる。
【００７２】
いくつかの実施形態では、組成物は、血小板由来成長因子ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ）、血小板由来成長因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ヘパリン結合上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、アンジオゲニン、アンジオポエチン−２（ＡＮＧ−２）、レプチン、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−４のうちの１つまたは複数を含む改変胎盤組織を含む。組成物の一例として、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）は（多数の成長因子を介して）細胞遊走／増殖を刺激し、（ＴＩＭＰを介して）瘢痕組織を減少させ、（ＩＬ−１０およびＩＬ−４を介して）炎症を抑制することが示されている。組成物が梗塞域の包帯としての役割を果たし得ることが考えられる。より具体的には、胎盤組織材料は分子的かつ機械的な包帯として機能するものであり、内因性幹細胞（例えば、心幹細胞および／または骨髄幹細胞）を損傷部位まで遊走させる化学誘引物質としての役割を果たし、同細胞の増殖を刺激して治癒を促進し、したがって瘢痕組織形成を軽減し、炎症を抑制する。組成物は生分解性であり、したがって非炎症性で無毒性である。
【００７３】
いくつかの実施形態では、組成物を単独で使用した場合、内因性幹細胞を動員し、ＭＩ治癒を促進する。いくつかの実施形態では、組成物を骨髄幹細胞とともに使用した場合、細胞生存率を増大させ、これらの細胞の効果を改善する。いくつかの実施形態では、組成物はＭＩの治療に有用である。
【００７４】
別の態様では、本明細書に記載の改変胎盤組織を含む組成物を、幹細胞を誘引し内因性の治癒を促進するのに十分な量で、罹患および／または損傷した心臓組織の近接部位または内部に移植する。各種の態様では、損傷した心臓組織に幹細胞を誘引するのに、幹細胞が標的心臓組織に遊走するまで十分な量の胎盤組織を必要する。例えば、実施例３に記載するように、幹細胞遊走は、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）に応答して濃度依存性にみられた。直径１．５ｍｍの円盤状ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）改変胎盤組織ではｉｎ  ｖｉｔｒｏで有意な幹細胞遊走が起こらないことがわかった。しかし、直径４ｍｍの円盤状ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）改変胎盤組織および１２×１３ｍｍの四角形のＥｐｉＦｉｘ（登録商標）パッチでは、対照細胞に比して幹細胞遊走の統計的に有意な増加がみられた。１平方センチメートルのＥｐｉＦｉｘ（登録商標）の重量は４ｍｇである。驚くべきことに、幹細胞遊走にはｉｎ  ｖｉｔｒｏでも、遊走を誘導するのに最小量の改変胎盤組織、すなわち、１．５ｍｍの円盤状ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）改変胎盤組織を上回る量の改変胎盤組織を必要する。言い方を変えれば、十分な量の改変胎盤組織の存在と、幹細胞動員をもたらすのに十分な濃度の幹細胞動員因子との間には相関がみられる。幹細胞動員因子の量または濃度を増大させれば（幹細胞動員因子を含む抽出物を使用すること、または改変胎盤組織に幹細胞動員因子を加えることなどによって）、幹細胞動員が促進されると考えられる。
【００７５】
さらに、実施例４には、５×５ｍｍの四角形のＥｐｉＦｉｘ（登録商標）改変胎盤組織パッチをｉｎ  ｖｉｖｏ移植したところ、移植後約２週間からマウスに幹細胞動員の統計的に有意な増加がみられたことが記載されている。これの点に関して、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）改変胎盤組織の量を増やして使用すれば、幹細胞動員がさらに増強されて、幹細胞動員にかかる時間が短縮され、かつ／または所与の時間で動員される幹細胞の数が増加すると考えられる。各種の実施形態では、幹細胞動員の増強は、改変胎盤組織グラフト術を施行していない対象に比して少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、９０％、１００％またはそれ以上となる。それでも少なくともこの実施例では、データから、幹細胞動員をもたらすのに最小量を上回るＥｐｉＦｉｘ（登録商標）改変胎盤組織が必要であることがわかる。
【００７６】
具体的な事例で投与する胎盤組織または胎盤組織抽出物の実際の量は、治療する具体的な心臓組織、調製する特定の組成物、適用方法および治療する特定の対象の疾患または損傷の程度によって異なることが理解されよう。所与の宿主に対する投与量は、従来の検討方法を用いて、例えば、対象化合物と既知の薬剤の特異活性を、例えばしかるべき従来の薬理学的プロトコルにより慣例的に比較することによって決定することができる。医薬化合物の投与量の決定に精通した医師および製剤師であれば、標準的な推奨（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｂａｒｎｈａｒｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９９９））に従って全く問題なく投与量を決定できるであろう。
【００７７】
いくつかの態様では、現行技術の改変胎盤組織に幹細胞の走化性および／または動員を増強する１つまたは複数の幹細胞動員因子を加え得る。他の態様では、微粒化した胎盤組織に幹細胞動員因子を加えることができる。あるいは、積層組織グラフトの層に幹細胞動員因子を加えてもよい。したがって、例えば、改変胎盤組織にサイトカイン、ケモカイン、成長因子、細胞外マトリックス成分をはじめとする生物活性物質を加えて本来の幹細胞動員を増強することができる。
【００７８】
幹細胞動員因子の非限定的な具体例としては、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、ＣケモカインまたはＣＸ３Ｃケモカインのうちの１つまたは複数を挙げ得る。その他の幹細胞動員因子としてはさらに、ｃｃ−線維芽細胞成長因子（αＦＧＦまたはαＦＧＦ−１）、β−線維芽細胞成長因子（βＦＧＦ−１またはβＦＧＦ−２）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ−Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥ）、アンジオポエチン−１および−２、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２および−７）、トランスフォーミング成長因子−αおよび−β（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１α）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などの成長因子をはじめとする当該技術分野で公知の因子を挙げ得る。
【００７９】
別の態様では、改変胎盤組織を、特に限定されないが冠動脈バイパス術を含めた従来の治療法とともに使用し、このほか、コラーゲン、ヒアルロン酸、ゼラチンまたはその組合せなどの生体適合材料からなるマトリックスまたは足場と組み合わせて使用してもよい。
【実施例】
【００８０】
以下の実施例は、本明細書に記載および特許請求される組成物および方法を作製し評価する方法を当業者に十全に開示し説明するために記載され、単に例示を意図するものであり、本発明者らが自身の発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものではない。数値（例えば、量、温度など）に関しては正確を期するよう努めたが、いくらかの誤差および偏差があることは明らかにしておかなければならない。特に明示されない限り、一部とは重量部のことであり、温度は℃または周囲温度であり、圧力は大気圧またはその付近の圧力である。反応条件、例えば、記載される工程から得られる生成物の純度および収率を最適にするために用い得る成分濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力をはじめとする反応の範囲および条件には、多数の変動および組合せが存在する。このような工程条件の最適化には、妥当で日常的な実験しか必要としない。
【００８１】
実施例１−微粒化した胎盤組織の調製
この実施例で微粒化粒子の作製に使用する羊膜／絨毛膜組織グラフトを、米国特許出願公開第２００８／００４６０９５号（その全体が参照により組み込まれる）に記載されている工程により作製した。５０ｍＬバイアルに組織グラフト（４ｃｍ×３ｃｍ）と９．５ｍｍの粉砕鋼球２個を入れた後、バイアルを密閉した。バイアルを凍結ブロックに入れ、凍結ブロックを凍結棚に入れた。凍結棚を液体窒素の入ったジュワー瓶に入れた。組織試料を３０〜６０分以内で気相冷却した。ジュワー瓶から凍結棚を取り出し、凍結棚から凍結ブロックを取り出した。凍結ブロックを粉砕機（ＳＰＥＸ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  ＧｅｎｏＧｒｉｎｄｅｒ  ２０１０）の中に入れ、１，５００ｒｐｍ、２０分に設定した。２０分経過した後、組織を検査して微粒化を確認した。必要であれば、組織をさらに３０〜６０分間、再びジュワー瓶に入れ、粉砕機に移してさらに２０分間、十分に微粒化した。組織が十分に微粒化された後、一連の米国標準ＡＳＴＭふるいを用いて分級した。ふるいは次のような順序で設置した：３５５μｍ、３００μｍ、２５０μｍ、１５０μｍおよび１２５μｍ。微粒化した材料を５０ｍＬバイアルから３５５μｍのふるいに移した。微粒化粒子を十分に分離するため、各ふるいを個別に振動させた。ふるいを用いて微粒化粒子を効率的に分離した後、粒子径が３５５μｍ、３００μｍ、２５０μｍ、１５０μｍおよび１２５μｍの微粒化粒子を別々のバイアルに収集した。
【００８２】
実施例２−微粒化した胎盤組織を用いた組織グラフトの調製
本明細書に記載される改変胎盤組織、組成物および方法に様々な修正を施すことができる。本明細書を検討し、本明細書に開示される改変胎盤組織、組成物および方法を実践すれば、本明細書に記載される改変胎盤組織、組成物および方法のその他の態様が明らかになるであろう。本明細書および実施例は例示的なものとして見なされることが意図される。
【００８３】
２０１２年８月１５日に同時出願された「ＰＬＡＣＥＮＴＡＬ  ＴＩＳＳＵＥ  ＧＲＡＦＴＳ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＷＩＴＨ  Ａ  ＣＲＯＳＳ−ＬＩＮＫＩＮＧ  ＡＧＥＮＴ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＭＡＫＩＮＧ  ＡＮＤ  ＵＳＩＮＧ  ＴＨＥ  ＳＡＭＥ」と題する米国特許出願第Ｎｏ．６１／６８３，６９７号には適切な架橋剤および架橋方法の詳細な説明が記載されており、同出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８４】
２０１２年８月１５日に同時出願された「ＲＥＩＮＦＯＲＣＥＤ  ＰＬＡＣＥＮＴＡＬ  ＴＩＳＳＵＥ  ＧＲＡＦＴＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＭＡＫＩＮＧ  ＡＮＤ  ＵＳＩＮＧ  ＴＨＥ  ＳＡＭＥ」と題する米国特許出願第６１／６８３，６９９号には強化された胎盤組織グラフトの詳細な説明が記載されており、同出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８５】
２０１２年８月１５日に同時出願された「ＭＩＣＲＯＮＩＺＥＤ  ＰＬＡＣＥＮＴＡＬ  ＴＩＳＳＵＥ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＭＡＫＩＮＧ  ＡＮＤ  ＵＳＩＮＧ  ＴＨＥ  ＳＡＭＥ」と題する米国特許出願第６１／６８３，７００号には微粒化した胎盤組織およびその抽出物の作製および使用の詳細な説明が記載されており、同出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８６】
実施例３−ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）の存在下での細胞遊走
ヒト間葉系幹細胞（ヒトＭＳＣ）をＥｐｉＦｉｘ（登録商標）試料の存在下で細胞培養して評価し、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）がヒトＭＳＣの遊走を誘導するかどうかを明らかにした。ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）はインタクトの上皮層を有する羊膜と絨毛膜の層である。
【００８７】
材料および方法
底部に８μｍ孔膜フィルターを備えた２４ウェル細胞培養インサートで標準的な遊走アッセイを実施した（図１を参照されたい；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。実験開始２４時間前、ヒトＭＳＣ（ドナー１例、３代目）を無血清培地で培養し、フィブロネクチンをＰＢＳに溶かした５μｇ／ｍＬの溶液３００μＬを各細胞培養インサートに入れて、一晩、フィブロネクチンを細胞培養インサートの表面に吸着させた。
【００８８】
実験当日、プレートの底部のウェルに無血清培地７００μＬを加え、次いで、異なる大きさ部分に分けた滅菌ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）（低：直径１．５ｍｍの円盤状；中：直径４ｍｍの円盤状；高：１２×１３ｍｍの四角形を３〜４ｍｍの四角形に切り分けたもの；試験したＥｐｉＦｉｘ（登録商標）組織ドナー、ｎ＝６）を加えた（図２）。１平方センチメートルのＥｐｉＦｉｘ（登録商標）の重量は４ｍｇである。無血清培地および１０％ウシ胎仔血清を含む培地（ｎ＝６）をそれぞれ陰性対照および陽性対照とした。次いで、ヒトＭＳＣ（３００μＬ中４０，０００個の細胞）を細胞培養インサートに加え、２４時間培養した。次いで、細胞培養インサートの両側をＰＢＳで洗浄し、インサート上部の非遊走細胞を綿棒で取り除いた。インサートの下側および膜フィルターにある細胞を１０％ホルマリンで２０分間固定した後、洗浄し、ヘマトキシリンで５分間染色した。倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ２０００；ＳＰＯＴソフトウェア４．６）を用いて、膜を通過して遊走した細胞の数を膜の下面でカウントした。
【００８９】
データを１０％ＦＢＳ陽性対照に対して正規化し、各試料ウェルの１００倍視野の顕微鏡像当たりの遊走細胞カウント数の平均±標準偏差として表す。ボックス・コックス変換を用いてデータの分散を正規化し、次いで一因子分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびチューキーのＨＳＤ（ｈｏｎｅｓｔｌｙ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）事後検定を実施して、統計比較を行った。
【００９０】
結果
最小量のＥｐｉＦｉｘ（登録商標）試料を含有する「低」群（直径１．５ｍｍの円盤状）と無血清陰性対照との間に有意差はみられなかった（図２の棒グラフを参照されたい）。「中」群（直径４ｍｍの円盤状）および「高」群（１２×１３ｍｍの四角形を３〜４ｍｍの四角形に切り分けたもの）はともに無血清対照よりも統計学的に有意に高く（対照に比して約６０％および７５％の遊走；図２を参照されたい）、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）が細胞遊走を刺激することを示していた。「高」群と「中」群との間に統計学的有意差はみられなかった。以上の結果は、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）製品がヒト間葉系幹細胞を誘引する１つまたは複数の因子を含有することを示している。
【００９１】
実施例４−ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）移植を実施したマウスにおける幹細胞動員
正常マウスに移植したＥｐｉＦｉｘ（登録商標）が幹細胞／前駆細胞の動員を引き起こすかどうかを明らかにするため、マウス造血幹細胞（ＨＳＣ）およびマウス間葉系幹細胞（マウスＭＳＣ）に焦点を絞って試験を実施した。
【００９２】
材料および方法
正常マウスにおける移植にドナー６例のＥｐｉＦｉｘ（登録商標）製品を用いた。５ｍｍ四方のＥｐｉＦｉｘ（登録商標）を４か月齢のＦＶＢ／ＮＪマウス（体重約２３．５０ｇ〜約３０ｇ）の皮下に外科的に移植した。１つの試料につき１時点当たり４匹のマウスに移植を実施した。時点は３日後、７日後、１４日後および２８日後とした。陰性対照は皮膚が正常で偽手術を実施する（外科的切開は実施するが、移植は実施しない）マウスとした。細胞を除去した皮膚マトリックス（無細胞皮膚マトリックス；ＡＤＭ）を比較移植物（Ｉ型コラーゲンを含むが、サイトカインは含まない）として用いた。蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）に移植物およびそれを覆う皮膚を回収した。
【００９３】
移植物およびそれを覆う皮膚を回収し、１ｍｍ２の切片に薄切して、０．１５％ディスパーゼ／０．０７５％コラゲナーゼ溶液中、３７℃で１時間インキュベートした。遠心分離後、以下に記載する通りに試料を細胞系列の抗体カクテルで染色した。ＣＤ３１抗体を加え、次いでＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７抗ラット二次抗体を加えた。最後にフィコエリトリン−Ｃｙ７コンジュゲート抗ＣＤ４５抗体をインキュベートした。以下に記載する通りに試料を調製し分析した。
【００９４】
試料を細胞系列陰性（ｌｉｎ−）抗体カクテル（Ｔｅｒ１１９／ＣＤ４／ＣＤ８ａ／Ｇｒ−１／ＣＤ４５Ｒ／ＣＤ１１ｂ）とインキュベートし、次いでフィコエリトリン−Ｃｙ５抗ラット二次抗体とインキュベートした。間葉系幹細胞の分析には、ＣＤ４５（フィコエリトリン−Ｃｙ７）およびＳｃａ−１（フルオレセインイソチオシアナート）に対するコンジュゲート抗体を加えた。造血幹細胞の分析には、ＣＤ４５（フィコエリトリン−Ｃｙ７）、ｃ−Ｋｉｔ（フィコエリトリン）およびＳｃａ−１（フルオレセインイソチオシアナート）に対するコンジュゲート抗体を加えた。試料を抗体と３０分間インキュベートした後、ウシ胎仔血清をリン酸緩衝生理食塩水に溶かし２ｍＭエチレンジアミン四酢酸を加えた２％溶液を５体積加えて洗浄した。細胞を遠心分離した後、４℃で１分間、ヨウ化プロピジウムに再懸濁させた。ＬＳＲフローサイトメータを用いて試料を分析した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いて、試料に間葉系幹細胞を明らかにするｌｉｎ−／Ｓｃａ−１＋／ＣＤ４５−および造血幹細胞を明らかにするｌｉｎ−／Ｓｃａ−１＋／ｃ−Ｋｉｔ＋／ＣＤ４５＋のゲートをかけた。
【００９５】
結果
ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）移植後第７日、第１４日および第２８日、陰性対照に比してマウスＨＳＣの有意な増加がみられた（図３Ａを参照されたい）。第２８日、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）試料に依然としてＡＤＭに比してマウスＨＳＣの有意な増加がみられた。
【００９６】
ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）移植後第７日、陰性対照に比してマウスＭＳＣの有意な増加がみられた（図３Ｂを参照されたい）。全時点でマウスＭＳＣの平均百分率が陰性対照に比して増加していた。
【００９７】
したがって、上記データは、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）移植物が正常マウスにｉｎ  ｖｉｖｏでＨＳＣおよびＭＳＣの両方を効率的に動員することを示している。このデータはほかにも、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）が無細胞皮膚マトリックス（ＡＤＭ）よりも長い期間にわたってＨＳＣを動員することを示しており、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）がサイトカインを介した効果を有するとする仮説を裏付けている。
【００９８】
実施例５−ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）移植物を移植したマウスにおける幹細胞の特徴付け
マウスのＥｐｉＦｉｘ（登録商標）移植部位に動員される幹細胞を特徴付けるため、フローサイトメトリーおよび免疫組織化学を用いて試験を実施した。
【００９９】
材料および方法
４か月齢のＦＶＢ／ＮＪマウス１６匹の背中に皮膚切開を実施して、Ｐｕｒｉｏｎ（登録商標）処理した無菌ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）（ＭｉＭｅｄｘ社から入手）の５ｍｍ四方のパッチを皮下に移植した。また別のマウス１６匹に同じ皮膚切開を実施して対照治療（偽手術）とした。コラーゲン足場と比較するため、細胞を除去したヒト真皮（無細胞皮膚マトリックス；ＡＤＭ）の５ｍｍ四方のパッチをマウス１６匹の皮下に移植した。分析には未手術マウスを「正常な」背中の皮膚の入手源として用いた。
【０１００】
移植の３日後、７日後、１４日後および２８日後、幹細胞の分析に外科手術部位を摘出した。各時点で１グループ当たり４個体を用いた。幹細胞を蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）および免疫組織化学（ＩＨＣ）の２つの異なる方法で同定した。ＦＡＣＳ解析には、羊膜とそれに付随する再生組織から全細胞を単離した。細胞を特異的幹細胞マーカーに対する抗体で蛍光標識した。各細胞型のアイデンティティおよび数をフローサイトメータにより明らかにした。
【０１０１】
免疫組織化学分析には、膜とそれに付随する再生組織を固定し、薄切してスライドに載せ、幹細胞に対する特異的抗体で染色した。免疫組織化学には２種類の抗体、すなわち、造血前駆細胞（ＨＰＣ）を特異的に検出し皮膚前駆細胞、内皮細胞、樹状細胞と反応する抗ＣＤ３４および内皮細胞を検出する抗ＣＤ３１を用いた。染色した組織切片を顕微鏡で観察して、特異的な幹細胞型の有無および数を測定した。実験の分析には各細胞型の相対数をカウントした。結果は各細胞型の百分率として計算した（免疫染色細胞数／総細胞数）。２つの領域、すなわち、移植物周囲の組織および移植物自体を細胞動員について免疫組織化学的に分析した。
【０１０２】
結果
陰性対照との比較では、第１４日および第２８日にＥｐｉＦｉｘ（登録商標）移植物周囲の組織に造血前駆細胞（ＨＰＣ）レベルの有意な上昇がみられた。コラーゲン足場ＡＤＭ対照との比較では、第１４日および第２８日にＥｐｉＦｉｘ（登録商標）移植物周囲の組織に造血前駆細胞の有意な増加がみられた。
【０１０３】
ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）移植物内に前駆細胞が動員された。ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）移植物では第１４日に移植物内の造血前駆細胞数が最大になり、第２８日にも依然として高い値を示した。ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）移植物では、第１４日および第２８日に移植物内の平均造血前駆細胞数が対照ＡＤＭに比して増加していた。ＡＤＭ対照移植物内には前駆細胞は動員されなかった。
【０１０４】
第１４日から第２８日までの間、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）移植物の血管新生が着実に増大した。ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）移植物における新たな血管形成の量は、第２８日にＡＤＭ対照よりも有意に高い値を示した。
【０１０５】
以上のデータから、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）が損傷部位に造血幹細胞および間葉系幹細胞の両方を動員する１つまたは複数の因子を含有することが確認される。偽手術よりもＥｐｉＦｉｘ（登録商標）膜とそれに付随する再生組織の方がこれらの幹細胞の数が多かった。ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）の方が対照の細胞除去コラーゲン足場よりも移植部位に前駆細胞を動員して定着させる効果が有意に高かった。対照コラーゲン足場よりもＥｐｉＦｉｘ（登録商標）膜の方が前駆細胞の数が多かった。
【０１０６】
ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）はこのほか、付随する再生組織およびＥｐｉＦｉｘ（登録商標）膜自体に新たな血管形成を誘導した。ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）膜の方がコラーゲン足場対照よりも血管新生が高い値を示した。
【０１０７】
実施例６−ＡｍｎｉｏＦｉｘ（登録商標）およびＥｐｉＦｉｘ（登録商標）の心臓修復に及ぼす効果
ＡｍｎｉｏＦｉｘ（登録商標）膜およびＥｐｉＦｉｘ（登録商標）膜が急性心筋梗塞（ＭＩ）後の梗塞の大きさおよび心リモデリングを含めた心臓修復に及ぼす効果を検討するため試験を実施した。ＡｍｎｉｏＦｉｘ（登録商標）およびＥｐｉＦｉｘ（登録商標）（ＭｉＭｅｄｘ社から入手）はともに羊膜に由来し、構造的コラーゲンおよび細胞外マトリックスタンパク質のほか、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＰｌＧＦ、ＴＩＭＰ−１，ＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−４を含めた多数の成長因子およびサイトカインを含有する。
【０１０８】
材料および方法
この実験は、異種移植片のＡｍｎｉｏＦｉｘ（登録商標）膜またはＥｐｉＦｉｘ（登録商標）膜に応答して免疫系が関与するあらゆる可能性を排除するべく、免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを用いて実施したものである。野生型マウスを比較に用いた。
【０１０９】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスまたは野生型マウスの左下行冠動脈（ＬＡＤ）を結紮してＭＩを誘発した。ＭＩマウスをＡｍｎｉｏＦｉｘ（登録商標）膜、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）膜または対照の生理食塩水で処置した。処置から８週間後、マウスの梗塞の大きさ、心リモデリング、細胞のアポトーシスおよび増殖ならびに幹細胞動員を分析した。
【０１１０】
結果
ＡｍｎｉｏＦｉｘ（登録商標）膜で処置したマウスおよびＥｐｉＦｉｘ（登録商標）膜で処置したマウスではともに、対照（生理食塩水）処置マウスに比して冠動脈結紮後の梗塞領域が減少していた（図４Ａおよび４Ｂ）。ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）処置マウスとＡｍｎｉｏＦｉｘ（登録商標）処置マウスの間に梗塞の大きさの統計学的有意差はみられなかった。数匹のマウスが冠動脈結紮から回復しなかったが、これは術後の膜による処置ではなく外科手術による死亡が原因であった。
【０１１１】
梗塞の大きさの減少が骨髄からまたは局所的に心臓からのｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞の動員によるものであるかどうかを明らかにするため、心臓組織の切片をｃ−ｋｉｔで染色し分析した。膜と直接接触していた領域、膜周辺の心臓領域ともにｃ−ｋｉｔ陽性幹細胞の有意な増加がみられた（図５Ａ〜５Ｃ）。このことは、膜（ＡｍｎｉｏＦｉｘ（登録商標）膜またはＥｐｉＦｉｘ（登録商標）膜）と直接接触していた領域の外側に認められる心臓修復が幹細胞によって仲介され得ることを示している。このことは、観察された心臓の線維領域の全体的な減少の一因であり得る。
【０１１２】
さらに、対照群に比して膜処置心臓に細胞増殖マーカーＫｉ−６７のレベルの有意な増加がみられた（図６Ａおよび６Ｂ）。Ｋｉ−６７の発現は膜と直接接触していた領域を越えて遠位の心臓組織に及んでいた。このことから、羊膜製品が細胞増殖および組織修復の刺激にパラクリン効果を示すことがさらに裏付けされる。
【０１１３】
さらに、ＣＤ３１染色からわかるように、対照処置マウスに比して膜処置心臓に血管数の増加がみられた（図７Ａおよび７Ｂ）。このことは、膜処置が血管新生を増大させることにより血液供給が改善され、心臓修復が促進されることを示している。
【０１１４】
これとは逆に、ＴＵＮＥＬ染色による測定では生理食塩水処置に比して膜処置心臓にアポトーシスの有意な減少がみられた（図８Ａおよび８Ｂ）。以上の結果は、ＡｍｎｉｏＦｉｘ（登録商標）およびＥｐｉＦｉｘ（登録商標）が、おそらくは血液供給の改善をはじめとするパラクリン機序を介して、細胞アポトーシスを阻害し細胞の生存を促進することを示している。
【０１１５】
以上をまとめると、実施例６は、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）膜またはＡｍｎｉｏＦｉｘ（登録商標）膜で処置することにより、冠動脈結紮によるＭＩ誘発後にマウスの心臓が保護されたことを示している。２種類の膜はそれぞれ、梗塞領域を同程度減少させた。この梗塞の大きさの減少は、処置したマウスの種類（ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス対野生型マウス）に関係なくみられた。修復促進効果により、ｃ−Ｋｉｔ＋幹細胞レベルが上昇し、細胞増殖の増大し、細胞アポトーシスが減少した。さらに、処置心臓に平均血管数の増加がみられた。以上の結果から、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）またはＡｍｎｉｏＦｉｘ（登録商標）による処置が複数のパラクリン効果を介してＭＩ後の心臓修復を改善することがわかる。以上の実験では、ＥｐｉＦｉｘ（登録商標）とＡｍｎｉｏＦｉｘ（登録商標）の効果に有意差はみられなかった。
【０１１６】
本願全体を通して、様々な刊行物が参照されている。これらの刊行物の開示は、本明細書に記載される化合物、組成物および方法をより十全に説明するため、その全体が参照により本願に組み込まれる。
【０１１７】
本明細書に記載される化合物、組成物および方法には様々な修正および変形を施すことができる。本明細書を検討し、本明細書に開示される化合物、組成物および方法を実践すれば、本明細書に記載される化合物、組成物および方法のその他の態様が明らかになるであろう。本明細書および実施例は例示的なものとして見なされることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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