(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内のグリコーゲンの含有量に基づいて細胞種を判定する細胞判定方法であって、
細胞の光路長を測定し、光路長データを取得する取得ステップと、
得られた光路長データから、細胞の光路長と相関する光路長指標を算出する算出ステップと、
算出された光路長指標を閾値と比較する比較ステップと、
比較した結果に基づき、細胞が細胞内のグリコーゲン含有量の多い細胞種である、又は細胞内のグリコーゲン含有量の少ない細胞種である、と判定する判定ステップと、
を備える、細胞判定方法。
【請求項２】
前記取得ステップは、細胞の定量位相顕微鏡像から光路長を測定し、光路長データを取得するステップである、請求項１に記載の細胞判定方法。
【請求項３】
細胞の干渉反射顕微鏡像を撮像し、当該干渉反射顕微鏡像からコロニーの面積を測定する測定ステップを更に備え、
前記算出ステップでは、コロニーに含まれる細胞の光路長データの合計値を当該コロニーの面積で除した値を光路長指標として算出する、請求項１又は２に記載の細胞判定方法。
【請求項４】
前記細胞内のグリコーゲン含有量の多い細胞種が、多能性幹細胞であり、前記細胞内のグリコーゲン含有量の少ない細胞種が、分化した多能性幹細胞であり、
培養された多能性幹細胞の細胞集団から未分化の多能性幹細胞を判別する、又は分化した多能性幹細胞を判別するために用いられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞判定方法。
【請求項５】
前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞である、請求項４に記載の細胞判定方法。
【請求項６】
細胞の光路長データを取得する取得手段と、
取得した光路長データから、細胞の光路長と相関する光路長指標を算出する算出手段と、
算出した光路長指標を閾値と比較する比較手段と、
比較した結果に基づき、細胞が細胞内のグリコーゲン含有量の多い細胞種である、又は細胞内のグリコーゲン含有量の少ない細胞種である、と判定する判定手段と、
を備える、細胞判定装置。
【請求項７】
細胞の干渉反射顕微鏡像又はこれを二値化したデータを取得する第２の取得手段を更に備える、請求項６に記載の細胞判定装置。
【請求項８】
コンピュータを、
細胞の光路長データを取得する取得手段、
取得した光路長データから、細胞の光路長と相関する光路長指標を算出する算出手段、
算出した光路長指標を閾値と比較する比較手段、
比較した結果に基づき、細胞が細胞内のグリコーゲン含有量の多い細胞種である、又は細胞内のグリコーゲン含有量の少ない細胞種である、と判定する判定手段、
として機能させるための細胞判定プログラム。
【請求項９】
前記コンピュータを、細胞の干渉反射顕微鏡像又はこれを二値化したデータを取得する第２の取得手段として更に機能させることを含む、請求項８に記載の細胞判定プログラム。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の細胞判定プログラムが記録されたコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞判定方法、細胞判定装置及び細胞判定プログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト由来の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の幹細胞は、多種類の細胞に分化する能力（多能性）を有しており、創薬分野、医療分野への応用が期待されている。幹細胞から目的の細胞に分化誘導を行う際の分化効率は、出発材料である幹細胞の状態に大きく依存する。つまり幹細胞が多能性を維持し、未分化な状態を保持していないと、分化誘導の効率が低下する。そのためこれらの幹細胞を産業応用するためには、幹細胞の品質を管理することが極めて重要であり、幹細胞をモニタリングし、状態を非侵襲で判定する必要がある。
【０００３】
ＥＳ細胞は、未分化状態では嫌気的に解糖系を使ってアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を産生することが知られている。また、分化するとクエン酸回路（ＴＣＡ回路）を使った酸化的リン酸化によるＡＴＰ供給が主になる（非特許文献１）。ＥＳ細胞は、分化した細胞に比べてグルコース要求性が高く、細胞質にグリコーゲンを含んでいることが知られている（非特許文献２）。
【０００４】
グリコーゲンの検出方法として、古典的な組織化学染色（ＰＡＳ染色：Ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ａｃｉｄ  Ｓｃｈｉｆｆ  ｓｔａｉｎ）が知られている（例えば、非特許文献２）。また、非特許文献３では、ラマン分光イメージングによりＥＳ細胞の細胞質中のグリコーゲンを定量したことが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，２０１３年，１２巻，ｐｐ．１２７−１３７．
【非特許文献２】Ｊ．Ａｎａｔ．，２００４年，２０５巻，ｐｐ．２４７−２５５．
【非特許文献３】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１１年，８３巻，ｐｐ．６２５４−６２５８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＰＡＳ染色法は、細胞の染色が必要となるため、非侵襲での観察はできない。非特許文献３に記載されたラマン分光イメージングでは、細胞を染色することなく観察が可能である。しかしながら、ラマン散乱光の光強度が極めて弱いため、観察に必要な照明光強度も強く、細胞に損傷を与えるおそれがある。また、ラマン分光イメージングでは、培地中の様々な成分に由来するラマン散乱光から細胞に特異的なラマン散乱光を分光するのは難しく、培地中の細胞をそのまま観察することはできない。
【０００７】
本発明は、これらの問題点に鑑みてなされたものであり、細胞内のグリコーゲンの含有量に基づいて、非侵襲で、かつ簡便に細胞種を判定することのできる細胞判定方法、細胞判定装置及び細胞判定プログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、細胞内のグリコーゲンの含有量に基づいて細胞種を判定する細胞判定方法であって、細胞の光路長を測定し、光路長データを取得する取得ステップと、得られた光路長データから、細胞の光路長と相関する光路長指標を算出する算出ステップと、算出された光路長指標を閾値と比較する比較ステップと、比較した結果に基づき、細胞が細胞内のグリコーゲン含有量の多い細胞種である、又は細胞内のグリコーゲン含有量の少ない細胞種である、と判定する判定ステップと、を備える、細胞判定方法を提供する。
【０００９】
本発明の細胞判定方法は、細胞内のグリコーゲン含有量が多いほど光路長が長くなるという関係を見出したことに基づいている。ここで、「光路長」は、「位相差」又は「光学厚さ」と同じ意味である。
【００１０】
本発明の細胞判定方法によれば、細胞内のグリコーゲンの含有量に基づいて、非侵襲で、かつ簡便に細胞種を判定することができる。また、光路長を指標としているため、培地中の細胞をそのまま判定することもできる。
【００１１】
上記取得ステップは、細胞の定量位相顕微鏡像から光路長を測定し、光路長データを取得するステップであってもよい。
【００１２】
本発明の細胞判定方法は、細胞の干渉反射顕微鏡像を撮像し、当該干渉反射顕微鏡像からコロニーの面積を測定する測定ステップを更に備え、上記算出ステップでは、コロニーに含まれる細胞の光路長データの合計値を当該コロニーの面積で除した値を光路長指標として算出するものであってもよい。これにより、より簡便にコロニー単位で細胞を判定することができる。
【００１３】
上記細胞判定方法は、上記細胞内のグリコーゲン含有量の多い細胞種が、多能性幹細胞であり、上記細胞内のグリコーゲン含有量の少ない細胞種が、分化した多能性幹細胞であり、培養された多能性幹細胞の細胞集団から未分化の多能性幹細胞を判別する、又は分化した多能性幹細胞を判別するために用いられるものであってもよい。
【００１４】
未分化の多能性幹細胞は、細胞内にグリコーゲンを蓄積することが分かっている。一方、多能性幹細胞が分化するに従い、細胞内のグリコーゲン含有量は減少する。したがって、本発明の細胞判定方法は、例えば、多能性幹細胞の継代培養において、培養された多能性幹細胞の細胞集団から未分化の多能性幹細胞を判別する、又は分化した多能性幹細胞を判別するために用いることができる。
【００１５】
本発明者らは、未分化の人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は細胞内にグリコーゲンを蓄積する一方、分化したｉＰＳ細胞はそのような蓄積がないことを見出した。したがって、本発明の細胞判定方法により未分化のｉＰＳ細胞と、分化したｉＰＳ細胞を判定することができる。
【００１６】
したがって、上記多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞であってもよい。
【００１７】
また、本発明は、細胞の光路長データを取得する取得手段と、取得した光路長データから、細胞の光路長と相関する光路長指標を算出する算出手段と、算出した光路長指標を閾値と比較する比較手段と、比較した結果に基づき、細胞が細胞内のグリコーゲン含有量の多い細胞種である、又は細胞内のグリコーゲン含有量の少ない細胞種である、と判定する判定手段と、を備える、細胞判定装置を提供する。当該細胞判定装置は、細胞の干渉反射顕微鏡像又はこれを二値化したデータを取得する第２の取得手段を更に備えるものであってもよい。第２の取得手段を更に備えることにより、コロニー単位での判定をより簡便に行うことができる。
【００１８】
さらに、本発明は、コンピュータを、細胞の光路長データを取得する取得手段、取得した光路長データから、細胞の光路長と相関する光路長指標を算出する算出手段、算出した光路長指標を閾値と比較する比較手段、比較した結果に基づき、細胞が細胞内のグリコーゲン含有量の多い細胞種である、又は細胞内のグリコーゲン含有量の少ない細胞種である、と判定する判定手段、として機能させるための細胞判定プログラムを提供する。当該細胞判定プログラムは、コンピュータを、細胞の干渉反射顕微鏡像又はこれを二値化したデータを取得する第２の取得手段として更に機能させることを含むものであってもよい。
【００１９】
上記細胞判定プログラムは、当該細胞判定プログラムが記録されたコンピュータ読み取り可能な記録媒体として提供されてもよい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、細胞内のグリコーゲンの含有量に基づいて、非侵襲で、かつ簡便に細胞種を判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】（Ａ）ｉＰＳ細胞が細胞分裂する様子を定量位相顕微鏡で経時観察した結果を示す写真である。（Ｂ）（Ａ）中、輝度の高い領域（高光路長領域）を強調表示した図である。
【図２】（Ａ）ｉＰＳ細胞のコロニーをＰＡＳ染色した結果を示す写真である。（Ｂ）ｉＰＳ細胞のコロニーを定量位相顕微鏡で観察した結果を示す写真である。
【図３】（Ａ）ｉＰＳ細胞のコロニーをＰＡＳ染色した結果を示す写真である。（Ｂ）（Ａ）と同様のコロニーをアルカリフォスファターゼ染色（ＡＰ染色）した結果を示す写真である。
【図４】一実施形態に係るサイトメーターの構成図である。
【図５】一実施形態に係る細胞判定装置のハードウェア的構成を示す概要図である。
【図６】一実施形態に係る細胞判定装置の機能的構成を示す概要図である。
【図７】一実施形態に係る細胞判定方法のフローチャートである。
【図８】ｉＰＳ細胞の継代培養において、分化が進んだ細胞と未分化のｉＰＳ細胞を判定した例を示す写真である。（Ａ）コロニーの定量位相顕微鏡像である。（Ｂ）抗Ｎａｎｏｇ抗体で蛍光染色したコロニーの蛍光顕微鏡像である。
【図９】（Ａ）図８に示す各コロニーの面積を示すグラフである。（Ｂ）図８に示す各コロニーの単位面積あたりの光路長（コロニーの平均光学厚さ）を示すグラフである。
【図１０】未分化のｉＰＳ細胞と分化誘導したｉＰＳ細胞の光路長を示すグラフである。
【図１１】ｉＰＳ細胞由来の肝臓細胞（分化初期）と成熟した肝臓細胞の光路長を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の好適な実施形態について詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。なお、図面中、同一又は相当部分には同一符号を付し、重複する説明は適宜省略する。
【００２３】
本発明は、定量位相顕微鏡により観察した細胞の光路長（輝度）と細胞内のグリコーゲンの含有量との間に相関関係があるとの新規な知見を得たことに基づいている。まず、この新規な知見について説明する。
【００２４】
図１（Ａ）は、ｉＰＳ細胞が細胞分裂する様子を定量位相顕微鏡で経時観察した結果を示す写真である。写真は２０分毎に撮影した。図１（Ｂ）は、図１（Ａ）の写真中、輝度の高い領域（高光路長領域）を強調表示したものである。図１に示すとおり、細胞分裂に伴い核小体が消失して（００：２０）、細胞質に存在する高光路長領域が凝集し（００：４０）、二つにちぎれて（０４：００）、二つの細胞に分配されている（０５：００）。本発明者らの観察によると、この高光路長領域は細胞分裂時にかならず出現する。細胞分裂中の染色糸に注目すると染色糸に随伴するように１〜２個の高光路長領域が小胞体様の構造として細胞内に出現する。
【００２５】
図２（Ａ）は、ｉＰＳ細胞のコロニーをＰＡＳ染色した結果を示す写真である。図２（Ｂ）は、ｉＰＳ細胞のコロニーを定量位相顕微鏡で観察した結果を示す写真である。図２（Ａ）及び（Ｂ）では、分裂期の細胞を丸で囲んでいる。図２（Ａ）及び図２（Ｂ）に示すように、上述の高光路長領域と同様の位置が、ＰＡＳ染色で染色される。また、高光路長領域は、アミラーゼ処理によって消失することから（図示せず）、高光路長領域にはグリコーゲンが蓄積していることが推定される。
【００２６】
図３（Ａ）は、ｉＰＳ細胞のコロニーをＰＡＳ染色した結果を示す写真である。図３（Ｂ）は、図３（Ａ）と同様のコロニーをアルカリフォスファターゼ染色（ＡＰ染色）した結果を示す写真である。ＡＰ染色では、未分化のｉＰＳ細胞が染色される。図３（Ａ）及び（Ｂ）から、ＡＰ染色されない分化した細胞（中央部）は、同様にＰＡＳ染色で染色されず、ＡＰ染色される未分化のｉＰＳ細胞は、ＰＡＳ染色で染色される。
【００２７】
以上の結果より、グリコーゲンの含有量が多い細胞は、少ない細胞よりも光路長が長くなる（定量位相顕微鏡像において輝度が高くなる）ことが分かる。
【００２８】
本発明者は、上述の新規な知見に関して、以下のように推察している。すなわち、定量位相顕微鏡で観察している光路長（輝度）は、「細胞の実厚さ」に「細胞−培地間の屈折率差」を乗じたものである。細胞の実厚さ、及び培地と細胞の屈折率は大きく異ならないと考えられるため、わずかな屈折率差が生じた場合に大きな光路長の変化として観察されると考えられる。グリコーゲンの屈折率は１．６９と一般的な生体高分子の屈折率（１〜１．５）よりも高いことから、その蓄積量（含有量）が多いと光路長の長さ（輝度の高さ）に大きな変化が観察されると考えられる。
【００２９】
〔細胞判定方法〕
本発明の細胞判定方法は、細胞内のグリコーゲンの含有量に基づいて細胞種を判定するものである。
【００３０】
（判定対象となる細胞種）
本実施形態の細胞判定方法は、グリコーゲン含有量に基づく判定を行うものであるため、グリコーゲン含有量の多い細胞種とグリコーゲン含有量の少ない細胞種とが混在している、又は混在している可能性がある細胞系（まとめて「混在細胞系」という。）において、グリコーゲン含有量の多い細胞種、及び／又はグリコーゲン含有量の少ない細胞種を判定するために用いることができる。
【００３１】
グリコーゲン含有量の多い細胞種、及びグリコーゲン含有量の少ない細胞種としては、例えば、細胞のエネルギー源であるＡＴＰを主に嫌気的解凍系を利用して産生する細胞種等のグリコーゲン含有量の多い細胞種、細胞のエネルギー源であるＡＴＰを主にＴＣＡ回路における酸化的リン酸化を利用して産生する細胞種等のグリコーゲン含有量の少ない細胞種を挙げることができる。
【００３２】
混在細胞系の具体例としては、これに限られるものではないが、多能性幹細胞培養系（多能性を維持することを目的とする培養系）、多能性幹細胞を肝臓、腎臓、心臓、すい臓及び神経等の体細胞に分化させる際の細胞培養系、心筋組織、肝臓組織及び神経組織等由来の細胞の培養系、神経細胞／アストログリア細胞の混合培養系、並びに白血病患者のリンパ球細胞培養系を挙げることができる。
【００３３】
多能性幹細胞培養系では、未分化の多能性幹細胞（グリコーゲン含有量が多い細胞種）と分化した多能性幹細胞（グリコーゲン含有量が少ない）とが混在している可能性がある。本実施形態の細胞判定方法は、培養された多能性幹細胞の細胞集団から未分化の多能性幹細胞を判別する、又は分化した多能性幹細胞を判別するために用いられてもよい。これにより、継代培養している細胞の品質管理（未分化状態の維持）を非侵襲で簡便に行うことができる。また、再生医療等において、多能性幹細胞を体細胞に分化させる際、分化した多能性幹細胞を非侵襲で簡便に判別することができる。
【００３４】
心筋細胞培養系では、胎児心筋細胞（グリコーゲン含有量が多い細胞種）と成体心筋細胞（グリコーゲン含有量が少ない）とが混在している可能性がある。本実施形態の細胞判定方法は、培養された心筋細胞の細胞集団から胎児心筋細胞を判別する、又は成体心筋細胞を判別するために用いられてもよい。これにより、再生医療等における心筋シート等、成熟した心筋細胞の品質評価に有効である。
【００３５】
神経細胞はグルコースを直接消費し、アストログリア細胞は余剰のグルコースをグリコーゲンとして細胞内に蓄積することが知られている（Ｃｅｌｌ，２０１１年，１４４巻，５号，ｐｐ．８１０−８２３）。したがって、本実施形態の細胞判定方法は、培養された神経細胞及びアストログリア細胞の細胞集団から神経細胞を判別する、又はアストログリア細胞を判別するために用いられてもよい。
【００３６】
白血病の分類及び進行度の判定には、ＰＡＳ染色が用いられている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，１９７９年，３２巻，ｐｐ．１５８−１６１）。したがって、本実施形態の細胞判定方法は、白血病の分類又は進行度の判定のために用いられてもよい。
【００３７】
（光路長データ）
取得ステップは、細胞の光路長を測定し、光路長データを取得するステップである。細胞の光路長データは、例えば、定量位相顕微鏡、位相差顕微鏡により細胞を撮像することで、「位相差」又は「光学厚さ」として得ることができる。光路長データは、単一細胞について取得してもよいし、複数の細胞（例えば、細胞コロニー単位、顕微鏡の視野単位）について取得してもよい。
【００３８】
本実施形態の細胞判定方法では、対象となる細胞は、通常、培養細胞である。培地成分による判定結果への影響を受けにくいことから、取得ステップでは、培養培地中の細胞の光路長を測定し、光路長データを取得してもよい。培養培地中の細胞を測定対象にできることから、操作が極めて簡便になる。
【００３９】
（光路長指標）
算出ステップは、取得ステップで得られた光路長データから、細胞の光路長と相関する光路長指標を算出するステップである。光路長指標は、細胞の光路長と相関するものである。すなわち、細胞の光路長と細胞内のグリコーゲンの含有量との間の相関関係を判定に利用できる限りにおいて、光路長指標は、例えば、取得した光路長データそのままであってもよいし、複数の細胞について取得した光路長データに基づいて算出した指標（例えば、平均値）であってもよい。
【００４０】
光路長指標は、例えば、あるコロニーに含まれる細胞集団について取得した光路長データの合計値を当該コロニーの面積で割った値としてもよい（あるコロニーの単位面積あたりの光路長となる）。コロニーの面積は、例えば、干渉反射顕微鏡（ＩＲＭ）像を撮像し、ＩＲＭ像を二値化して細胞が接着した培養基材と細胞が接着していない培養基材とを見分けることで測定することができる。
【００４１】
光路長指標はまた、顕微鏡の一視野に含まれる細胞集団について取得した光路長データの合計値を当該視野に含まれる細胞集団の面積で割った値としてもよい（ある視野中の単位細胞面積あたりの光路長となる）。
【００４２】
（閾値）
比較ステップは、算出ステップで算出された光路長指標を閾値と比較するステップである。閾値は、判定対象とする細胞種、培養条件等に応じて適宜設定することができる。例えば、多能性幹細胞培養系で、未分化の多能性幹細胞、又は分化した多能性幹細胞を判定対象とする場合、多能性幹細胞培養系において、上述した取得ステップ、及び算出ステップを実施し、光路長指標を算出する。同じ多能性幹細胞培養系で、常法に従い（例えば、ＡＰ染色、抗Ｎａｎｏｇ抗体染色）、未分化の多能性幹細胞、及び分化した多能性幹細胞を判別する。これらの結果に基づき、未分化の多能性幹細胞、及び分化した多能性幹細胞を判別可能な閾値を予め設定する。
【００４３】
（判定ステップ）
判定ステップは、比較ステップで比較した結果に基づき、細胞が細胞内のグリコーゲン含有量の多い細胞種である、又は細胞内のグリコーゲン含有量の少ない細胞種である、と判定するステップである。
【００４４】
光路長指標が、細胞の光路長と正に相関する指標である場合（細胞の光路長が長くなると光路長指標が大きくなる場合）、以下のように判定する。
（ｉ）光路長指標が閾値以上である場合、細胞は細胞内のグリコーゲン含有量の多い細胞種であると判定する、又は
（ｉｉ）光路長指標が閾値未満である場合、細胞は細胞内のグリコーゲン含有量の少ない細胞種であると判定する。
【００４５】
光路長指標が、細胞の光路長と負に相関する指標である場合（細胞の光路長が長くなると光路長指標が小さくなる場合）、以下のように判定する。
（ｉｉｉ）光路長指標が閾値を超える場合、細胞は細胞内のグリコーゲン含有量の少ない細胞種であると判定する、又は
（ｉｖ）光路長指標が閾値以下である場合、細胞は細胞内のグリコーゲン含有量の多い細胞種であると判定する。
【００４６】
〔細胞判定装置〕
一実施形態において、細胞判定装置は、光路長測定装置と組み合わせてサイトメーターとして使用される。光路長測定装置としては、例えば、定量位相顕微鏡、位相差顕微鏡を使用できる。
【００４７】
図４は、一実施形態に係るサイトメーターの構成図である。図４に示すサイトメーター１は、主に、干渉反射顕微鏡の光学系及び定量位相顕微鏡の光学系を組み合わせた顕微鏡システムＡ及び細胞判定装置Ｄにより構成される。顕微鏡システムＡは、定量位相顕微鏡の光学系のみで構成されていてもよい。なお、顕微鏡システムＡが干渉反射顕微鏡の光学系を更に備えることで、単一細胞の面積、コロニーの面積、視野中の細胞の面積を併せて測定できる。
【００４８】
（定量位相顕微鏡）
定量位相顕微鏡の光学系は、光の入射側に、図示しない光出射部からの照射光Ｈ０（レーザ光）を導く光ファイバＢの出射側端面Ｂ１に臨ませたレンズＡ２と、このレンズＡ２を透過する照射光Ｈ０を反射する反射部Ａ３を具備する。一方、定量位相顕微鏡の光学系の光の出射側には、光干渉部Ａ７で生成される干渉縞（図示せず、以下同様）を撮像して画像とするＣＣＤカメラ等の撮像装置Ｃが設けられる。
【００４９】
顕微鏡Ａは、測定試料Ｓを支持する試料台Ａ４、対物レンズＡ５、反射部Ａ６、光干渉部Ａ７を少なくとも備える顕微鏡本体Ａ１を具備する。図４に示すように、顕微鏡本体Ａ１は、干渉反射顕微鏡の光学系Ａ８を更に備えていてもよい。
【００５０】
試料台Ａ４は、例えば、中央に光を透過可能な光透過部Ａ４１を備えるとともに、上向き面に測定試料Ｓを載置可能な載置面Ａ４２を有する略板状のものである。載置面Ａ４２に測定試料Ｓを載置した状態で上方から光を照射することにより、測定試料Ｓを透過した光（被測定光Ｈ１）が光透過部Ａ４１を透過して対物レンズＡ５に向かうようにしている。なお、光透過部Ａ４１は、例えばガラス等の光を透過可能な部材より形成したものであってもよいし、単なる孔であってもよい。対物レンズＡ５は、例えば、操作部（図示しない）の操作に基づいて、入射してくる被測定光Ｈ１をその操作に係る所定の倍率で拡大させて平行光として出射するものである。反射部Ａ６は、例えば全反射型のミラーであって、対物レンズＡ５からの被測定光Ｈ１を全反射させて光干渉部Ａ７に導入できるようにしている。光干渉部Ａ７は、被測定光Ｈ１を、２つの光Ｈ１ａ、Ｈ１ｂに分離する光分離素子Ａ７１と、この光分離素子Ａ７１が出射する被測定光Ｈ１（Ｈ１ａ、Ｈ１ｂ）を収束光Ｈ２（Ｈ２ａ、Ｈ２ｂ）に変換する集光レンズＡ７２と、収束光Ｈ２の収束位置に配した空間フィルタＡ７３と、空間フィルタＡ７３を透過した物体光Ｈ３と参照光Ｈ４とを重ね合わせて干渉縞を生成する合成レンズＡ７５とを具備するものである。ここで、光分離素子Ａ７１は、回折格子を用いて構成したものである。さらには、光分離素子Ａ７１は、偏光方向が互いに異なる２つの光に分離する偏光分離素子であってもよい。その場合、光干渉部Ａ７は、被測定光Ｈ１を、偏光方向が互いに異なる２つの光Ｈ１ａ、Ｈ１ｂに分離する光分離素子Ａ７１と、収束光Ｈ２（Ｈ２ａ、Ｈ２ｂ）に変換する集光レンズＡ７２と収束光Ｈ２の収束位置に配した空間フィルタＡ７３と、空間フィルタＡ７３を透過した物体光Ｈ３と参照光Ｈ４と、この空間フィルタＡ７３の出射側に配した半波長板Ａ７４と、この半波長板Ａ７４により偏光方向を揃えられた物体光Ｈ３と参照光Ｈ４とを重ね合わせて干渉縞を生成する合成レンズＡ７５と、を具備するものである。もしくは、空間フィルタＡ７３の出射側に配した半波長板Ａ７４に代えて偏光子を配して物体光Ｈ３と参照光Ｈ４の偏光方向を揃えてもよい。
【００５１】
（干渉反射顕微鏡）
干渉反射顕微鏡の光学系Ａ８は、載置面Ａ４２に測定試料Ｓを載置した状態で下方から光を照射することにより、測定試料Ｓで反射した光（被測定光Ｈ１）を測定する。干渉反射顕微鏡の光学系は、光の入射側に、光源（図示せず）からの照射光（レーザ光）を導く光ファイバＢ２の出射側端面Ｂ３に臨ませたバンドパスフィルタＡ８４及び開口スリットＡ８３と、このバンドパスフィルタＡ８４及び開口スリットＡ８３を透過する照射光を反射する反射部Ａ８１（例えば、ビームスプリッタ）を具備する。光源は、白色ＬＥＤ等で構成される。一方、干渉反射顕微鏡の光学系の光の出射側には、対物レンズ５及び反射部Ａ８１からの被測定光Ｈ１を反射させて集光レンズＡ８５に導く、反射部Ａ８２（例えば、ダイクロイックミラー）と、集光レンズＡ８５で収束された被測定光を撮像して画像とするＣＣＤカメラ等の撮像装置Ｃ１が設けられる。
【００５２】
（細胞判定装置）
細胞判定装置Ｄの構成について説明する。図５は、一実施形態に係る細胞判定装置Ｄのハードウェア的構成を示す概要図であり、図６は、一実施形態に係る細胞判定装置Ｄの機能的構成を示す概要図である。
【００５３】
図５に示すように、細胞判定装置Ｄは、物理的には、ＣＰＵ  Ｄ１１、ＲＯＭ  Ｄ１２及びＲＡＭ  Ｄ１３等の主記憶装置、キーボード及びマウス等の入力デバイスＤ１４、ディスプレイ等の出力デバイスＤ１５、例えば撮像装置Ｃ等の他の装置との間でデータの送受信を行うためのネットワークカード等の通信モジュールＤ１６、ハードディスク等の補助記憶装置Ｄ１７などを含む通常のコンピュータとして構成される。後述する細胞判定装置Ｄの各機能は、ＣＰＵ  Ｄ１１、ＲＯＭ  Ｄ１２、ＲＡＭ  Ｄ１３等のハードウェア上に所定のコンピュータソフトウェアを読み込ませることにより、ＣＰＵ  Ｄ１１の制御の下で入力デバイスＤ１４、出力デバイスＤ１５、通信モジュールＤ１６を動作させるとともに、主記憶装置Ｄ１２、Ｄ１３や補助記憶装置Ｄ１７におけるデータの読み出し及び書き込みを行うことで実現される。
【００５４】
図６に示すように、細胞判定装置Ｄは、機能的構成要素として、取得手段Ｄ１、算出手段Ｄ２、比較手段Ｄ３、判定手段Ｄ４、及び表示手段Ｄ５を備える。
【００５５】
取得手段Ｄ１は、撮像装置Ｃで撮影した定量位相顕微鏡像から光路長データを取得するものである。取得手段Ｄ１はまた、撮像装置Ｃ１で撮影した干渉反射顕微鏡像データ又はこれを二値化したデータを取得するものとしても機能する。算出手段Ｄ２は、取得した光路長データから、上述の光路長指標を算出するものである。比較手段Ｄ３は、算出した光路長指標を閾値と比較するものである。閾値は、細胞判定装置Ｄの補助記憶装置Ｄ１７等に予め格納されているものを読み出してもよい。判定手段Ｄ４は、比較した結果に基づき、細胞種を判定するものである。表示手段Ｄ５は、判定した結果を表示するものである。
【００５６】
〔細胞判定プログラム〕
細胞判定プログラムは、コンピュータを、上述した取得手段Ｄ１、算出手段Ｄ２、比較手段Ｄ３、判定手段Ｄ４、及び表示手段Ｄ５として機能させるものである。コンピュータに細胞判定プログラムを読み込ませることにより、コンピュータは細胞判定装置Ｄとして動作する。細胞判定プログラムは、例えば、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されて提供される。記録媒体は、非一時的記録媒体であってもよい。記録媒体としては、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ等の記録媒体、ＲＯＭ等の記録媒体、半導体メモリ等が例示される。
【００５７】
（細胞判定方法）
細胞判定装置Ｄにより行われる細胞判定方法について説明する。図７は細胞判定方法のフローチャートである。細胞判定装置Ｄにより行われる細胞判定方法により、対象となる細胞が、細胞内のグリコーゲン含有量の多い細胞種であるか、又は細胞内のグリコーゲン含有量の少ない細胞種であるかの判定を定量的且つ自動的に精度高く行うことができる。
【００５８】
［取得ステップＳ１］
最初に、取得手段Ｄ１が撮像装置Ｃから細胞の光路長データを取得する。光路長指標が、例えば、あるコロニーの単位面積あたりの光路長である場合、又はある視野中の単位細胞面積あたりの光路長である場合、光路長データを取得したコロニー又は視野のＩＲＭ像は、取得手段Ｄ１により取得してもよい。
【００５９】
［算出ステップＳ２］
次に、算出手段Ｄ２が取得した光路長データから光路長指標を算出する。光路長指標が、例えば、あるコロニーの単位面積あたりの光路長である場合、又はある視野中の単位細胞面積あたりの光路長である場合、光路長データを取得したコロニー又は視野のＩＲＭ像から細胞面積（例えば、コロニー面積）を算出することを含んでもよい。
【００６０】
［比較ステップＳ３］
次に、比較手段Ｄ３が、算出ステップＳ２にて算出した光路長指標と閾値を比較し、その結果を抽出する。比較手段Ｄ３は、補助記憶装置Ｄ１７等に予め格納されている閾値を読み出すことを含んでもよい。
【００６１】
［判定ステップＳ４］
次に、判定手段Ｄ４が、比較ステップＳ３にて抽出した比較の結果に基づき、細胞が、細胞内のグリコーゲン含有量の多い細胞種であるか、又は細胞内のグリコーゲン含有量の少ない細胞種であるかを判定する。判定手段Ｄ４は、比較ステップＳ３の比較の結果に基づいて、以下のように判定する。
光路長指標が、細胞の光路長と正に相関する指標である場合（細胞の光路長が長くなると光路長指標が大きくなる場合）；
（ｉ）光路長指標が閾値以上である場合、細胞は細胞内のグリコーゲン含有量の多い細胞種であると判定する、又は
（ｉｉ）光路長指標が閾値未満である場合、細胞は細胞内のグリコーゲン含有量の少ない細胞種であると判定する。
光路長指標が、細胞の光路長と負に相関する指標である場合（細胞の光路長が長くなると光路長指標が小さくなる場合）；
（ｉｉｉ）光路長指標が閾値を超える場合、細胞は細胞内のグリコーゲン含有量の少ない細胞種であると判定する、又は
（ｉｖ）光路長指標が閾値以下である場合、細胞は細胞内のグリコーゲン含有量の多い細胞種であると判定する。
【００６２】
［表示ステップＳ５］
次に、表示手段Ｄ５が、判定ステップＳ４にて判定した結果を表示する。例えば、細胞が、細胞内のグリコーゲン含有量の多い細胞種であるか、又は細胞内のグリコーゲン含有量の少ない細胞種であるかが表示手段Ｄ５によって表示される。
【実施例】
【００６３】
本発明の細胞判定方法により、ｉＰＳ細胞の継代培養において、分化が進んだ細胞と未分化のｉＰＳ細胞を判定した例を示す。なお、本発明は以下に示す例に限定されるものではない。
【００６４】
図８は、ｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１株）の継代培養において、分化が進んだ細胞と未分化のｉＰＳ細胞を判定した例を示す写真である。図８（Ａ）は、継代後３日培養して形成されたコロニーの定量位相顕微鏡像である。一視野中に複数のコロニーが含まれている。輝度が高い（光路長が長い）程、白く表示されている。図８（Ｂ）は、図８（Ａ）と同じコロニーを抗Ｎａｎｏｇ抗体で免疫染色した蛍光顕微鏡像である。当該免疫染色で染色される（蛍光が観察される）コロニーが未分化のｉＰＳ細胞である。免疫染色には定量性がないため、図８（Ａ）の輝度と一致するものではないが、図８（Ａ）で輝度が高い（光路長が長い）コロニーは、抗Ｎａｎｏｇ抗体で免疫染色されていることが分かる。図８から明らかなとおり、定量位相顕微鏡で観察される光路長（輝度）が所定値を超える場合に、未分化のｉＰＳ細胞又はコロニーであると判定することができる。
【００６５】
図９（Ａ）は、図８に示す各コロニーの面積を示すグラフである。各コロニーの面積は、干渉反射顕微鏡で別途撮像したＩＲＭ像を画像処理により二値化して細胞が接着している培養基材と接着していない培養基材を見分けることにより算出した。横軸は、培養時間である。培養時間が長くなるに連れてコロニー面積が増加していることが分かる。図９（Ｂ）は、図８に示す各コロニーの単位面積あたりの光路長（コロニーの平均光学厚さ：ｎｍ／ｍｍ２）を示すグラフである。細胞の接着状態が安定する培養１日目（ｄａｙ１）以降、未分化のｉＰＳ細胞のコロニー（Ｎａｎｏｇ陽性のコロニー）と分化したｉＰＳ細胞のコロニー（Ｎａｎｏｇ陰性のコロニー）とで、コロニーの平均光学厚さに明らかな差があった。具体的には、図８のコロニーＡ、Ｄ及びＪ（Ｎａｎｏｇ陰性のコロニー）では、平均光学厚さが９０〜１２０ｎｍ／ｍｍ２であり、図８のコロニーＢ、Ｃ、Ｆ、Ｈ及びＬ（Ｎａｎｏｇ陽性コロニー）では、平均光学厚さが２００〜２５０ｎｍ／ｍｍ２であった。したがって、例えば、閾値を１５５〜１６５ｎｍ／ｍｍ２の間で設定することにより、未分化のｉＰＳ細胞のコロニーと分化したｉＰＳ細胞のコロニーを判定することができる。
【００６６】
図１０は、未分化のｉＰＳ細胞と分化誘導したｉＰＳ細胞の光路長を示すグラフである。図１１は、ｉＰＳ細胞由来の幼若な肝臓細胞と成熟した肝臓細胞の光路長を示すグラフである。図１０及び図１１に示す光路長は、定量位相顕微鏡像から抽出した輝度（光路長）を示している。
【００６７】
図１０に示した「ｉＰＳ細胞」及び「ｉＰＳ細胞（レチノイン酸誘導）」、並びに図１１に示した「ｉＰＳ由来肝臓細胞」及び「初代肝臓細胞」は、以下のようにして培養した。
【００６８】
「ｉＰＳ細胞」は、反射防止コーティングされた直径３５ｍｍのプラスチックボトムディッシュをマトリゲル（登録商標）基底膜マトリクス（ベクトンディッキンソン社製、以下「基質」ともいう。）でコーティングしたものにヒト生体繊維芽細胞由来のｉＰＳ細胞株（２５３Ｇ１株）を１０〜２０コロニー／ディッシュとなるよう播種し、多能性幹細胞培養用合成培地（ｍＴｅＳＲ（登録商標）１，ＳｔｅｍＣｅｌｌ社製、以下「合成培地」ともいう。）を用いてフィーダーレスで培養した。１つのコロニーの大きさは２００μｍ程度であった。細胞は播種後３日目まで培養した。合成培地は１日１回交換した。播種後３日目に定量位相顕微鏡像を撮像し、光路長を測定した。
【００６９】
「ｉＰＳ細胞（レチノイン酸誘導）」は、「ｉＰＳ細胞」を播種後２日目に１２．５μＭのレチノイン酸を添加した合成培地に交換し、さらに４日間培養した。レチノイン酸は、一般的に分化を誘導する試薬として使用されている。レチノイン酸添加後４日目に定量位相顕微鏡像を撮像し、光路長を測定した。
【００７０】
「ｉＰＳ由来肝臓細胞」は、「ｉＰＳ細胞」から非特許文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１１年，１９巻２号，ｐｐ．４００〜４０７）に記載された手順に従い誘導した肝臓細胞である。誘導開始後１８日目及び２５日目に定量位相顕微鏡像を撮像し、光路長を測定した。
【００７１】
「初代肝臓細胞」は、べクトンディッキンソン社から入手したＢＤ  Ｇｅｎｔｅｓｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ（カタログ番号４５４５５０，ロット番号２９９）株を使用し、Ｈｅｐａｔｏ−ＳＴＩＭ培地（べクトンディッキンソン社製）を用いて培養した。播種後１日目に定量位相顕微鏡像を撮像し、光路長を測定した。
【００７２】
図１０に示すように、未分化の多能性幹細胞である「ｉＰＳ細胞」に比べて、分化を誘導する試薬として知られているレチノイン酸の添加によって、光路長（輝度）が減少する。また、図１１に示すように、ｉＰＳ細胞から肝臓細胞への分化を誘導した初期の状態における幼若な肝臓細胞（ｄａｙ１８及びｄａｙ２５）では、分化誘導に伴い光路長が減少するが、肝臓細胞として成熟することによって、グリコーゲンの蓄積により光路長が増加する。
【符号の説明】
【００７３】
１…サイトメーター、Ａ…顕微鏡システム、Ａ１…顕微鏡本体、Ｂ…光ファイバ、Ｃ…撮像装置、Ｄ…細胞判定装置、Ｄ１…取得手段、Ｄ２…算出手段、Ｄ３…比較手段、Ｄ４…判定手段、Ｄ５…表示手段。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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