(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾性の搾汁特性を有する植物において、該植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質であって、以下の（a）〜（c）：
（a）SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（b）SEQ ID NO: 2において、1または複数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質、または
（c）SEQ ID NO: 2に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質、
のいずれかのタンパク質、
の機能を阻害することを特徴とする、汁性の搾汁特性を有する形質転換植物を作製する方法。
【請求項２】
下記の（a）から（g）；
（a）SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、
（b）SEQ ID NO: 2において1または複数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（c）SEQ ID NO: 2に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（d）SEQ ID NO: 1の塩基配列からなる核酸、
（e）SEQ ID NO: 1において1または複数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（f）SEQ ID NO: 1に示される塩基配列と少なくとも90％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（g）SEQ ID NO: 1に示される塩基配列と相補的な塩基配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
からなる群より選択される核酸において、ストップコドン変異、フレームシフト変異、およびヌル変異からなる群より選択された変異を導入することにより、前記タンパク質の植物に乾性の搾汁特性を付与する機能を阻害することを特徴とする、請求項1に記載の汁性の搾汁特性を有する形質転換植物を作製する方法。
【請求項３】
乾性の搾汁特性を有する植物において、該植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質であって、請求項1の（a）〜（c）に記載したタンパク質、の機能を阻害することを特徴とする、植物に汁性の搾汁特性を付与する方法。
【請求項４】
請求項2の（a）〜（g）に記載した核酸において、ストップコドン変異、フレームシフト変異、およびヌル変異からなる群より選択された変異を導入することにより、前記タンパク質の機能を阻害することを特徴とする、請求項3記載の方法。
【請求項５】
植物が、イネ科植物である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
SEQ ID NO: １において変異を導入される部位が、SEQ ID NO: 1の塩基番号115の塩基欠失または塩基置換、塩基番号3690〜3701の塩基欠失、塩基番号3783の塩基置換、塩基番号3869と3870の間の塩基付加、塩基番号3979の塩基置換、塩基番号4012〜4015の塩基欠失、塩基番号4069の塩基置換、塩基番号4076の塩基置換、塩基番号4079と4080の間の塩基付加、塩基番号4086〜4088の塩基欠失、又は、塩基番号4093の塩基置換である、請求項2または請求項4に記載の方法。
【請求項７】
SEQ ID NO: 2において変異を導入される部位が、SEQ ID NO: 2のアミノ酸番号39のアミノ酸置換、アミノ酸番号149〜152のアミノ酸欠失、アミノ酸番号180のアミノ酸置換、アミノ酸番号208と209の間のアミノ酸付加、アミノ酸番号256と257の間のアミノ酸欠失、アミノ酸番号278のアミノ酸置換、アミノ酸番号278と279の間のアミノ酸付加、又は、アミノ酸番号281と282の間のアミノ酸欠失である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
請求項2の（a）〜（g）記載の核酸において、ストップコドン変異、フレームシフト変異、およびヌル変異からなる群より選択された変異が導入され、乾性の搾汁特性を付与する機能が喪失された、汁性の搾汁特性を有する形質転換植物。
【請求項９】
乾性の搾汁特性を有する植物において、該植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質であって、以下の（a）〜（c）：
（a）SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（b）SEQ ID NO: 2において、1または複数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質、または
（c）SEQ ID NO: 2に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性に搾汁特性を付与するタンパク質、
のいずれかのタンパク質。
【請求項１０】
下記の（a）から（g）；
（a）SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、
（b）SEQ ID NO: 2において1または複数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（c）SEQ ID NO: 2に示されるアミノ酸配列と少なくとも90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（d）SEQ ID NO: 1の塩基配列からなる核酸、
（e）SEQ ID NO: 1において1または複数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（f）SEQ ID NO: 1に示される塩基配列と少なくとも90％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（g）SEQ ID NO: 1に示される塩基配列と相補的な塩基配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
からなる群より選択される核酸。
【請求項１１】
請求項2の（a）〜（g）記載の核酸が導入され、乾性の搾汁特性を有する形質転換植物。
【請求項１２】
請求項2の（a）〜（g）記載の核酸を植物に導入する工程を含む、乾性の搾汁特性を有する形質転換植物を作製する方法。
【請求項１３】
請求項10記載の核酸を植物に導入することを特徴とする、植物に乾性の搾汁特性を付与する方法。
【請求項１４】
SEQ ID NO: 1の塩基番号115の塩基欠失または塩基置換、塩基番号3690〜3701の塩基欠失、塩基番号3783の塩基置換、塩基番号3869と3870の間の塩基付加、塩基番号3979の塩基置換、塩基番号4012〜4015の塩基欠失、塩基番号4069の塩基置換、塩基番号4076の塩基置換、塩基番号4079と4080の間の塩基付加、塩基番号4086〜4088の塩基欠失、又は、塩基番号4093の塩基置換で示される塩基配列を含む核酸を含む、ソルガムの乾汁性を判定するための組成物。
【請求項１５】
植物においてSEQ ID NO: 1の塩基番号115の塩基欠失または塩基置換、塩基番号3690〜3701の塩基欠失、塩基番号3783の塩基置換、塩基番号3869と3870の間の塩基付加、塩基番号3979の塩基置換、塩基番号4012〜4015の塩基欠失、塩基番号4069の塩基置換、塩基番号4076の塩基置換、塩基番号4079と4080の間の塩基付加、塩基番号4086〜4088の塩基欠失、又は、塩基番号4093の塩基置換で示される塩基配列を含むマーカーの有無を調べることを含む、植物の乾汁性を判定するためのマーカーを検出し、検出されたマーカーが、変異を含むことにより上記の塩基配列の一部分がタンパク質に翻訳されない場合には該植物は汁性の搾汁特性を有すると判定し、上記変異を含まない場合には乾性の搾汁特性を有すると判定する工程を含む、植物の乾汁性を判定する方法であって、該植物はソルガムである、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はソルガム乾汁性制御遺伝子とその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオ燃料はバイオマスの持つエネルギーを利用した燃料であり、石油のような枯渇性資源を代替し得る非枯渇性資源として注目されている。
【０００３】
そのようなバイオ燃料の資源となる候補作物としてソルガムが注目されている。ソルガムは大型のイネ科の植物であり、サトウキビと同じように葉肋と茎に糖を蓄積する性質があり、サトウキビに比べてはるかに生育が早い。よってソルガムを生長させ、その茎を搾汁し、その汁に含まれる糖を発酵させることにより、効率良くバイオエタノールを生産することが期待されている。
【０００４】
ソルガムからバイオエタノールの原料を効率よく得るためには、ソルガムが、茎の髄が高糖度液で満たされた汁性の形質を有することが必要である。ソルガムは同一種内に汁性品質と乾性品質の両方の形質を持つ非常にまれな作物である。ソルガムの乾汁性という形質は100年近く前に報告され、この形質が単一遺伝子により決定される対立遺伝子であることが知られていた。さらにソルガムの乾汁性は単一の遺伝子により支配されており、汁性が劣性であることも知られていた（非特許文献1：Hilson, 1916）。しかしソルガムの乾汁性を支配する遺伝子はこれまで同定されていなかった。かつ、全ゲノム配列の中でどの部分が該品種の汁性に関与しているかについては全く判っていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Hilson, G. R. (1916) On the inheritance of Certain stem characters in sorghum. Agriculture Journal of India 11 : 150-155
【非特許文献２】Yonemaru J-i, Ando T, Mizubayashi T, Kasuga S, Matsumoto T, Yano M (2009) Development of Genome-wide Simple Sequence Repeat Markers Using Whole-genome Shotgun Sequences of Sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench). DNA Res 16:187-193
【非特許文献３】Hamajima N, Saito T, Matsuo K, Kozaki K, Takahashi T, Tajima K (2000) Polymerase chain reaction with confronting two-pair primers for polymorphism genotyping. Japanese journal of cancer research : Gann 91:865-868
【非特許文献４】Kikuchi R, Kawahigashi H, Ando T, Tonooka T, Handa H (2009) Molecular and functional characterization of PEBP genes in barley reveal the diversification of their roles in flowering. Plant physiology 149:1341-1353
【非特許文献５】Murray MG, Thompson WF: Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Res 1980, 8(19):4321-4325.
【非特許文献６】Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG (2007) Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics 23:2947-2948
【非特許文献７】Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S (2011) MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol 28:2731-2739
【非特許文献８】Wang Z, Gerstein M, Snyder M (2009) RNA-Seq : a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews 10 : 57-63
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の解決すべき課題はバイオエタノール生産に資するために、その原料となるソルガムの乾汁性を支配する遺伝子を提供すること、更にその遺伝子を利用して汁性の搾汁特性を有する植物を作出することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題の解決のために、鋭意研究に努めた結果、優性形質であるD遺伝子がソルガムの茎の乾汁性制御に不可欠な遺伝子であることを見出した。野生型D遺伝子はソルガム品種に乾性の搾汁特性を付与する。一方、本発明者らは汁性を有するソルガム品種はD遺伝子に劣性の変異を有していることを見出した。そのような劣性遺伝子（以下でd遺伝子と称する）はソルガム品種に汁性の搾汁特性を付与する。ソルガムのd遺伝子は変異を有することにより正常なタンパク質の発現が阻害され、よって汁性の形質を示すと考えられる。
【０００８】
本発明の好ましい態様
本発明は好ましくは以下の態様を含む。
［態様1］
乾性の搾汁特性を有する植物において、該植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質であって、以下の（a）〜（c）：
（a）SEQ ID NO: 2（のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（b）SEQ ID NO: 2において、1または複数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質、または
（c）SEQ ID NO: 2に示されるアミノ酸配列と少なくとも75％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質、
のいずれかのタンパク質、
の機能を阻害することを特徴とする、汁性の搾汁特性を有する形質転換植物を作製する方法。
［態様2］
下記の（a）から（g）；
（a）SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、
（b）SEQ ID NO: 2において1または複数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列をからなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（c）SEQ ID NO: 2に示されるアミノ酸配列と少なくとも75％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（d）SEQ ID NO: 1の塩基配列からなる核酸、
（e）SEQ ID NO: 1において1または複数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（f）SEQ ID NO: 1に示される塩基配列と少なくとも83％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（g）SEQ ID NO: 1に示される塩基配列と相補的な塩基配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
からなる群より選択される核酸において、ストップコドン変異、フレームシフト変異、およびヌル変異からなる群より選択された変異を導入することにより、前記タンパク質の植物に乾性の搾汁特性を付与する機能を阻害することを特徴とする、態様1に記載の汁性の搾汁特性を有する形質転換植物を作製する方法。
［態様3］
乾性の搾汁特性を有する植物において、該植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質であって、態様1の（a）〜（c）に記載したタンパク質、の機能を阻害することを特徴とする、植物に汁性の搾汁特性を付与する方法。
［態様4］
態様2の（a）〜（g）に記載した核酸において、ストップコドン変異、フレームシフト変異、およびヌル変異からなる群より選択された変異を導入することにより、前記タンパク質の機能を阻害することを特徴とする、態様3記載の方法。
［態様5］
植物が、イネ科植物（好ましくは、ソルガム、トウモロコシ、スイッチグラス、アワ、ブラキポディウム、イネからなる群から選択される植物、さらに好ましくはソルガム）である、態様1〜4のいずれか1に記載の方法。
［態様6］
SEQ ID NO: 1において変異を導入される部位が、SEQ ID NO: 1の塩基番号115の塩基欠失または塩基置換、塩基番号3690〜3701の塩基欠失、塩基番号3783の塩基置換、塩基番号3869と3870の間の塩基付加、塩基番号3979の塩基置換、塩基番号4012〜4015の塩基欠失、塩基番号4069の塩基置換、塩基番号4076の塩基置換、塩基番号4079と4080の間の塩基付加、塩基番号4086〜4088の塩基欠失、塩基番号4093の塩基置換である、態様2または態様4に記載の方法。
［態様7］
SEQ ID NO: 2において変異を導入される部位が、SEQ ID NO: 2のアミノ酸番号39のアミノ酸置換、アミノ酸番号149〜152のアミノ酸欠失、アミノ酸番号180のアミノ酸置換、アミノ酸番号208と209の間のアミノ酸付加、アミノ酸番号256と257の間のアミノ酸欠失、アミノ酸番号278のアミノ酸置換、アミノ酸番号278と279の間のアミノ酸付加、アミノ酸番号281と282の間のアミノ酸欠失である、態様1〜4のいずれかに記載の方法。
［態様8］
態様2の（a）〜（g）記載の核酸において、ストップコドン変異、フレームシフト変異、およびヌル変異からなる群より選択された変異が導入され、乾性の搾汁特性を付与する機能が喪失された、汁性の搾汁特性を有する形質転換植物。
［態様9］
乾性の搾汁特性を有する植物において、該植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質であって、以下の（a）〜（c）：
（a）SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（b）SEQ ID NO: 2において、1または複数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質、または
（c）SEQ ID NO: 2に示されるアミノ酸配列と少なくとも75％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性に搾汁特性を付与するタンパク質、
のいずれかのタンパク質。
［態様10］
下記の（a）から（g）；
（a）SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、
（b）SEQ ID NO: 2において1または複数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列をからなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（c）SEQ ID NO: 2に示されるアミノ酸配列と少なくとも75％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（d）SEQ ID NO: 1の塩基配列からなる核酸、
（e）SEQ ID NO: 1において1または複数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（f）SEQ ID NO: 1に示される塩基配列と少なくとも83％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（g）SEQ ID NO: 1に示される塩基配列と相補的な塩基配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
からなる群より選択される核酸。
［態様11］
態様2の（a）〜（g）記載の核酸が導入され、乾性の搾汁特性を有する形質転換植物。
［態様12］
態様2の（a）〜（g）記載の核酸を植物に導入する工程を含む、乾性の搾汁特性を有する形質転換植物を作製する方法。
［態様13］
態様10記載の核酸を植物に導入することを特徴とする、植物に乾性の搾汁特性を付与する方法。
［態様14］
植物においてSEQ ID NO: 1の塩基番号塩基番号115の塩基欠失または塩基置換、塩基番号3690〜3701の塩基欠失、塩基番号3783の塩基置換、塩基番号3869と3870の間の塩基付加、塩基番号3979の塩基置換、塩基番号4012〜4015の塩基欠失、塩基番号4069の塩基置換、塩基番号4076の塩基置換、塩基番号4079と4080の間の塩基付加、塩基番号4086〜4088の塩基欠失、塩基番号4093の塩基置換で示される塩基配列を含む、植物の乾汁性を判定するためのマーカー。
［態様15］
植物においてSEQ ID NO: 1の塩基番号塩基番号115の塩基欠失または塩基置換、塩基番号3690〜3701の塩基欠失、塩基番号3783の塩基置換、塩基番号3869と3870の間の塩基付加、塩基番号3979の塩基置換、塩基番号4012〜4015の塩基欠失、塩基番号4069の塩基置換、塩基番号4076の塩基置換、塩基番号4079と4080の間の塩基付加、塩基番号4086〜4088の塩基欠失、塩基番号4093の塩基置換で示される塩基配列を含むマーカーの有無を調べることを含む、植物の乾汁性を判定するためのマーカーを検出し、検出されたマーカーが、変異を含むことにより上記の塩基配列の一部分がタンパク質に翻訳されない場合には該植物は汁性の搾汁特性を有すると判定し、上記変異を含まない場合には乾性の搾汁特性を有すると判定する工程を含む、植物の乾汁性を判定する方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、ソルガム、トウモロコシ、スイッチグラス、アワ、ブラキポディウム、イネなどのイネ科植物の乾汁性に関与するD遺伝子が提供された。D遺伝子を操作することにより、バイオマス特性に優れたイネ科植物（例えば、ソルガムなど）の品種を作製することが可能である。更にイネ科植物に対して組み換え技術を用いて本遺伝子の機能を制御することによって、バイオエタノール生産効率に重要な形質である搾汁特性を飛躍的に増大させることができる可能性もある。即ち野生型D遺伝子にD遺伝子により規定されるタンパク質を欠失させるような変異を導入することにより、植物に乾性の搾汁特性を付与する機能を喪失させ、結果として植物に汁性の形質特性を付与すること、並びに、汁性の形質転換植物を作製することができる。更にソルガムの乾汁性に関与するD遺伝子の部分配列を、植物の乾汁性を判定するためのマーカーとして使用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図1は、ソルガム乾性個体およびソルガム汁性個体の葉の中肋（a：乾性個体、b：汁性個体）と茎縦断面（c：乾性個体、d：汁性個体）を示す図である。
【図２】図2は、バルクマッピングおよびラフマッピングによるD遺伝子が含まれるゲノム領域のBACクローン選抜を示す図である。
【図３】図3は、BACクローンの比較より作出したマーカーを用いた精密マッピングによる遺伝子領域の特定を示す図である。マーカーCTPP-053およびInDel-120117に挟まれた18.99 Kb（18990塩基対）の範囲において、データベースで予測された遺伝子はSobic.006G147400のみであり、本遺伝子がD遺伝子であると推測された。
【図４】図4は、D遺伝子の予測構造と他のイネ科作物であるイネおよびトウモロコシのオルソログ遺伝子の予測構造の比較を示す図である。乾性であるイネおよびトウモロコシのD遺伝子のオルソログでは第1エキソンと予測される領域に、ソルガムのゲノム解読に利用された汁性品種BTX623の対応領域では欠損が生じており、データベースではイントロンが存在すると推定されていた。最下段のソルガムにおけるRNA-Seqの結果からも、本来この領域に欠損やイントロンはないことを示す。このため、汁性品種BTX623のSobic.006G147400はD遺伝子としての機能を失っている。
【図５】図5は、D遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を各種の植物で比較した図である。横の矢印は変異型d遺伝子でイントロンとなっている部分を示す。中抜けの太い線は、NAMスーパーファミリーと呼ばれる一群の転写調節因子に保存されているモチーフに相当する領域を示す。Sbは汁性ソルガム（品種：BTX623）、Sb-funcは乾性ソルガム（品種：千斤白(Senkinshiro)）、Zmはトウモロコシ、Siはアワ、Pvはスイッチグラス、Osはイネ、Bdはブラキポディウム、Atはアラビドプシス、Ptはポプラをそれぞれ示す。
【図６】図6は、野生型D遺伝子および変異型d遺伝子の葉身における発現量を、乾性品種個体（千斤白）と汁性品種個体（那系MS-3B）で比較した図である。
【図７】図7は、生殖成長期における野生型D遺伝子および変異型d遺伝子の乾性品種個体（千斤白）と汁性品種個体（那系MS-3B）のそれぞれの発現を示す図である。Rootは根を、Clumは茎を、F.Leafは止葉葉身を、Panicleは穂を示す。Sは千斤白を、Nは那系MS-3Bを示す。
【図８】図8は、栄養成長期における野生型D遺伝子および変異型d遺伝子の乾性品種個体（千斤白）と汁性品種個体（那系MS-3B）における発現時期を示す図である。2wは発芽2週間後を、4wは発芽４週間後を示す。Clumは茎を、Leaf bladeは葉身を示す。Sは千斤白を、Nは那系MS-3Bを示す。
【図９】図9は、野生型D遺伝子および変異型d遺伝子のアリル解析のためのプライマー等の位置を示す図である。箱は推定エキソンを示す。箱の上部にある数字はエキソンの長さを示す。下部にある数字はイントロンの長さを示す。図中のエキソンおよびプライマーの位置情報は、ソルガムゲノム（Sorghum bicolor v2.1 genome（那系MS3B）の第6染色体の塩基対数で示す。矢印の下の数字は、プライマーの名称を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（1）野生型D遺伝子およびDタンパク質について
本発明において、D遺伝子によりコードされるタンパク質（Dタンパク質という）は、ソルガムの乾汁性を制御する因子である。ソルガム品種千斤白は、野生型のD遺伝子のゲノムDNA配列を有しており、この塩基配列をSEQ ID NO: 1として示し、そしてSEQ ID NO: 1のコーディング領域によりコードされるアミノ酸配列を、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列として示す。そして、本発明において、前記野生型D遺伝子は、ソルガムに乾性の形質を付与するタンパク質をコードする遺伝子であり、この形質は優性形質であることが明らかになった。
【００１２】
一方、D遺伝子に変異が生じ、D遺伝子により規定されたタンパク質（すなわち、Dタンパク質）が、ソルガムを初めとしたイネ科植物に対して乾性の搾汁特性を付与することができなくなった場合に、その変異型の遺伝子のことをd遺伝子と呼ぶ。この場合、d遺伝子となった結果として、植物に対して汁性の搾汁特性を付与することとなるという特徴を有する。
【００１３】
本発明のD遺伝子により特定されるタンパク質（Dタンパク質）は、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列からなるタンパク質（野生型Dタンパク質）だけではなく、植物に乾性の搾汁特性を付与することができるその変異体タンパク質もまた含む概念である。
【００１４】
本発明において、植物に対して乾性の搾汁特性を付与する特徴を有するタンパク質（以下において、Dタンパク質という）という場合、以下の（a）〜（c）のタンパク質：
（a）SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（b）SEQ ID NO: 2において、1または複数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質、または
（c）SEQ ID NO: 2に示されるアミノ酸配列と少なくとも75％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性に搾汁特性を付与するタンパク質、
からなる群より選択されるタンパク質、
のいずれかのタンパク質として定義される。
【００１５】
本明細書において乾性とはソルガムまたは他の植物において茎と中肋が水浸状の表現型を示さないことを意味し、汁性とはソルガムまたは他の植物において茎と中肋が水浸状の表現型を示すことを意味する。図1に、ソルガム乾性個体の葉の中肋（a：乾性、b：汁性）と茎縦断面（c：乾性、d：汁性）を示す。
【００１６】
本発明のD遺伝子によりコードされるアミノ酸配列からなるDタンパク質は、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列で示されるもの（前述のタンパク質（a））に限定されるものではなく、植物に乾性の搾汁特性を付与する限りにおいてその変異体（前述のタンパク質（b）またはタンパク質（c））もまた包含する。以下にSEQ ID NO: ２のアミノ酸配列の変異体タンパク質（前述のタンパク質（b）またはタンパク質（c））について詳細に説明をする。
【００１７】
本発明において、SEQ ID NO: 2で示されるアミノ酸配列において、1または複数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を含むアミノ酸配列からなるタンパク質であって、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列と同様に、植物に対して乾性の搾汁特性を付与する性質を有するタンパク質が、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列の変異体タンパク質として包含される（タンパク質（b））。ここで複数個とは2〜10個、好ましくは2〜9個、2〜7個、2〜5個、2〜3個を意味する。
【００１８】
本発明において、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列と少なくとも80％以上、好ましくは85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、または99％以上、より好ましくは99.3％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列と同様に、植物に対して乾性特性を付与する性質を有するタンパク質もまた、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列の変異体タンパク質として包含される（タンパク質（c））。
【００１９】
タンパク質（c）の態様において、2つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査および数学的計算によって決定することができる。あるいは、2つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Needleman, S. B. およびWunsch, C. D. （J. Mol. Biol., 48: 443-453, 1970）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（UWGCG）より入手可能なGAPコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定することができる。GAPプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（1）Henikoff, S. およびHenikoff, J. G. （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、blosum62；（2）12のギャップ加重；（3）4のギャップ長加重；および（4）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
【００２０】
当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いることができる。同一性のパーセントは、例えばAltschulら（Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997）に記載されているBLASTプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でNational Center for Biotechnology Information（NCBI）、あるいはDNA Data Bank of Japan（DDBJ）のウェブサイトから利用することが可能である。BLASTプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。または、2つのアミノ酸配列の同一性％は、遺伝情報処理ソフトウエアGENETYX Ver.7（ゼネティックス製）などのプログラム、または、FASTAアルゴリズムなどを用いて決定することができる。その際、検索はデフォルト値を用いることができる。
【００２１】
また、本発明のD遺伝子は、SEQ ID NO: １の塩基配列（核酸（d））またはSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列（核酸（a））で示されるものに限定されるものではなく、植物に乾性の搾汁特性を付与するその変異体タンパク質をコードするその他の塩基配列も包含する概念である。以下にSEQ ID NO: １の塩基配列の変異体について詳細に説明をする。
【００２２】
前述した通り、本発明のDタンパク質は、タンパク質（a）〜（c）として定義することができる。これらのタンパク質に基づいて、本発明のD遺伝子には、タンパク質（a）〜（c）に対応するものとして、以下の（a）〜（c）の核酸：
（a）SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、
（b）SEQ ID NO: 2において1または複数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列をからなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（c）SEQ ID NO: 2に示されるアミノ酸配列と少なくとも75％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
のいずれかの核酸が含まれる。
【００２３】
タンパク質をコードする核酸において、核酸上に記録されている塩基配列情報は、周知のコドン規則に基づいてアミノ酸の配列情報に変換されるが、その際に、64種類のコドン情報に対して20種類のアミノ酸情報または終止コドン情報のいずれかを割り当てることになるため、縮重コドンが生じる。したがって、核酸の塩基配列中に縮重コドン間での変更が含まれていても、本発明の核酸（a）〜（c）の態様に含まれると理解される。例えば、核酸（a）の場合、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列をコードする核酸としてSEQ ID NO: 1の塩基配列からなる核酸が存在するが、このSEQ ID NO: 1の塩基配列に対して、上述した縮重のコドン変化に基づく塩基置換が含まれていたとしても、結果としてSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列をコードすることになる場合には、その様な核酸もまた核酸（a）に含まれる。
【００２４】
核酸（b）および（c）において、核酸が規定するタンパク質（b）および（c）に関して、それぞれの態様における「1または複数個のアミノ酸」の定義、そして「配列同一性」の定義、に付いては、前述した通りである。
【００２５】
本発明においてはまた、前述した通り、本発明のD遺伝子という場合、その一態様として、SEQ ID NO: 1の塩基配列（核酸（d））が含まれ、そしてこの核酸（d）に基づいて得られるD遺伝子の変異体もまた、含まれる。したがって、本発明のD遺伝子には、以下の（d）〜（g）の核酸：
（d）SEQ ID NO: 1の塩基配列からなる核酸、
（e）SEQ ID NO: 1において1または複数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（f）SEQ ID NO: 1に示される塩基配列と少なくとも83％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
（g）SEQ ID NO: 1に示される塩基配列の相補鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつ、植物に乾性の搾汁特性を付与するタンパク質をコードする核酸、
のいずれかの核酸もまた含まれる。以下にSEQ ID NO: 1の塩基配列の変異体（核酸（e）〜（g））について詳細に説明をする。
【００２６】
SEQ ID NO: 1で示される塩基配列において、1または複数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなる核酸であって、SEQ ID NO: １の塩基配列と同様に、植物に乾性の搾汁特性を付与する性質を有するタンパク質をコードする核酸も、本発明のD遺伝子の変異体に包含される（核酸（e））。ここで複数個とは2〜10個、好ましくは2〜9個、2〜7個、2〜5個、2〜3個を意味する。
【００２７】
またSEQ ID NO: 1の塩基配列と少なくとも80％以上、好ましくは85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、または99％以上、より好ましくは99.3％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる核酸であって、SEQ ID NO: １の塩基配列と同様に、植物に乾性特性を付与する性質を有するタンパク質をコードする核酸もまた、本発明のD遺伝子の変異体に包含される（核酸（f））。
【００２８】
2つの核酸配列の同一性％は、視覚的検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（GCG；ウィスコンシン州マディソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン10.0プログラム「GAP」である（Devereux, et al., 1984, Nucl. Acids Res., 12: 387）。この「GAP」プログラムの使用により、2つの核酸配列の比較の他に、2つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「GAP」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（1）ヌクレオチドについての（同一物について1、および非同一物について0の値を含む）一元（unary）比較マトリックスのGCG実行と、SchwartzおよびDayhoff監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Atlas of Polypeptide Sequence and Structure）」国立バイオ医学研究財団、353-358頁、1979により記載されるような、GribskovおよびBurgess, Nucl. Acids Res., 14: 6745, 1986の加重アミノ酸比較マトリックス；または他の比較可能な比較マトリックス；（2）アミノ酸の各ギャップについて30のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の1のペナルティ；またはヌクレオチド配列の各ギャップについて50のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の3のペナルティ；（3）エンドギャップへのノーペナルティ：および（4）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlにより使用が利用可能なBLASTNプログラム、バージョン2.2.7、またはUW-BLAST2.0アルゴリズムが使用可能である。UW-BLAST2.0についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されている。さらに、BLASTアルゴリズムは、BLOSUM62アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（A）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（WoottonおよびFederhenのSEGプログラム（Computers and Chemistry, 1993）により決定される；WoottonおよびFederhen, 1996「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Analysis of compositionally biased regions in sequence databases）」Methods Enzymol., 266: 544-71も参照されたい）、または、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ClaverieおよびStates（Computers and Chemistry, 1993）のXNUプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、および（B）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはE-スコア（KarlinおよびAltschul, 1990）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいE-スコア閾値の数値は0.5であるか、または好ましさが増える順に、0.25、0.1、0.05、0.01、0.001、0.0001、10-5、10-10、10-15、10-20、10-25、10-30、10-40、10-50、10-75、または10-100である。
【００２９】
また、SEQ ID NO: 1で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる核酸であって、SEQ ID NO: 1の塩基配列と同様に、植物に乾性の搾汁特性を付与する性質を有するタンパク質をコードする核酸もまた、本発明のD遺伝子の変異体に包含される（核酸（g））。
【００３０】
ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。
【００３２】
この節において説明をした本発明のD遺伝子は、植物に乾性の搾汁特性を付与する性質を有するタンパク質（すなわち、Dタンパク質）をコードするものであることが明らかになった。その一方で、植物に乾性の搾汁特性を付与するDタンパク質の機能を阻害することにより、植物に乾性の搾汁特性を付与する機能を阻害し、結果として植物に対して汁性の搾汁特性を付与することができることを示した。この様なDタンパク質の機能を阻害する手段の詳細に付いては後述するが、その一例として、本発明のD遺伝子をコードする核酸において、ストップコドン変異、フレームシフト変異、およびヌル変異からなる群から選択された変異を導入することにより、乾性の搾汁特性を付与する機能を喪失させ、結果として植物に汁性の搾重特性を付与することができる。この様な、Dタンパク質が本来有している機能を喪失させるようなD遺伝子の変異体を、以下においてd遺伝子と呼ぶこととした。このd遺伝子は、解析の結果、劣性の形質を示すものであることが明らかになった。植物の汁性、ストップコドン変異、フレームシフト変異、およびヌル変異については、下記（2）の「d遺伝子について」の項で定義を記載する。
【００３３】
（2）d遺伝子について
d遺伝子は上記（1）で述べたD遺伝子に変異が導入され、その結果として植物が汁性の搾汁特性の形質を有することとなる遺伝子である。このd遺伝子は、植物細胞中でヘテロで存在する場合には、乾性の汁性特性を示し、一方、ホモで存在する場合にのみ汁性の搾汁特性を示すことが明らかになった。このことから、d遺伝子は、劣性形質の遺伝子であり、D遺伝子の機能欠失変異体であることが明らかになった。
【００３４】
上記のような機能欠失変異は、例えば、D遺伝子のオープンリーディングフレーム内において生じた、ストップコドン変異、フレームシフト変異、およびヌル変異からなる群から選択された変異を例として挙げることができるが、それらに限定されるものではなく、その変異の結果として植物が汁性の搾汁特性の形質を有することとなる限り種々の変異を包含するものである。配列表のSEQ ID NO: 1の塩基配列で示されるD遺伝子にこのような変異が導入されたd遺伝子を有する植物では、d遺伝子が発現されることにより、D遺伝子に基づくタンパク質の機能が阻害されていることを特徴とする。そしてd遺伝子によって作製されたD遺伝子に基づくタンパク質の機能が阻害された植物は、汁性の搾汁特性を有する。よって下記（3）と（4）にも記載するように、D遺伝子にこのような変異を導入することにより、その結果として植物が汁性の搾汁特性を有することとなる。
【００３５】
本明細書において「D遺伝子に基づくタンパク質の機能が阻害された」とは、D遺伝子に変異が導入されることにより、D遺伝子がコードするタンパク質が機能欠失を生じるか、または正常に発現することができないことを意味する。
【００３６】
本明細書において「ストップコドン変異」とは、遺伝子を規定するDNAに対して1または数個の塩基が挿入されることにより、挿入された部位のアミノ酸のコドンを終止コドンにするような塩基配列の変異を意味する。
【００３７】
本明細書において「フレームシフト」とは、DNAに1個または数個（3の倍数ではない）の塩基の挿入や欠失が起こった結果、トリプレットのリーディングフレーム（読み枠）がずれてしまい、結果としてその挿入または欠失が生じた場所以降で野生型とは異なるアミノ酸配列を規定したり停止コドンが挿入されたりするような塩基配列の変異を意味する。
【００３８】
本明細書において「ヌル変異」とは、欠失や塩基置換などにより、全アミノ酸配列が発現されなくなるなど、機能を持つ遺伝子発現産物が作れなくなるような塩基配列の変異を意味する。
【００３９】
（3）D遺伝子およびd遺伝子の配列解析
下記の実施例で詳細に述べるが、乾性品種である千斤白のD遺伝子オルソログと、汁性品種である那系MS3BのD遺伝子オルソログにつきマッピングを行い、D遺伝子の候補領域を絞り込んだ。候補領域を18.99 kbに絞り込み、当該領域の塩基配列を公開されているソルガムのデータベース（汁性品種：BTX623の全塩基配列）から検索したところ、BTX623の全塩基配列中のこの領域にはSorbic.006G147400遺伝子のみが存在していた。よってSorbic.006G147400遺伝子が、汁性品種BTX623の乾汁性制御遺伝子であると判明した。
【００４０】
Sorbic.006G147400遺伝子のゲノムDNA配列をSEQ ID NO: 3に示す。BTX623は汁性品種であるために、Sorbic.006G147400遺伝子は変異を有する変異型遺伝子である。SEQ ID NO: 3のコーディング領域によりコードされるアミノ酸配列を、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列に示す（この変異型遺伝子のことをd遺伝子と呼ぶ）。
【００４１】
SEQ ID NO: 3の塩基配列は、4つのエキソンを含む。SEQ ID NO: 3において、塩基番号1から塩基番号93が第1エキソンであり、塩基番号133から塩基番号169が第2エキソンであり、塩基番号1547から塩基番号1812が第3エキソンであり、塩基番号1960から塩基番号2436が第4エキソンである。
【００４２】
これらの変異型遺伝子に対して、野生型遺伝子の解析を行ったところ、乾性品種である千斤白において対応する遺伝子が見出され、これの配列解析の結果、SEQ ID NO: 1のヌクレオチド配列と、そのヌクレオチド配列によりコードされるSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列により特定される野生型遺伝子（これをD遺伝子と呼ぶ）が得られた。
【００４３】
SEQ ID NO: 1の塩基配列は、3つのエキソンを含む。SEQ ID NO: 1において、塩基番号1から塩基番号169が第1エキソンであり、塩基番号1573から塩基番号1838が第2エキソンであり、塩基番号3680から塩基番号4156が第3エキソンである。
【００４４】
本発明者らは既存のソルガム品種において、乾汁性表現型と遺伝子型の間の関連性について解析を行った。その他の汁性品種においてもオルソログ遺伝子の解析を行ったところ、同じ遺伝子に変異が生じていた。上記で述べたSorbic.006G147400遺伝子の4つのエキソンに基づいて、それらの変異は以下の（A）から（F）に分類される。即ちそれらの変異は、（A）第1、2、3エキソンが増幅できない第1、2、3エキソン欠損型、（B）第1、2エキソンが増幅できない第1、2エキソン欠損型、（C）第3エキソンが増幅できない第3エキソン欠損型、（D）第4エキソンの12 bpが欠損している第4エキソン12 bp欠損型、（E）第1、2エキソンにストップコドン変異が生じている第1、2エキソンストップコドン型、（F）汁性形質を示すがエキソンに変異が見られない型、である（表1を参照）。
【００４５】
それらは既存または天然の品種において見られるD遺伝子の変異の例であり、本発明の好適な態様である。しかし本発明のD遺伝子はそれらの既存または天然の品種に存在するものに限定されるものではなく、そのような変異を模倣するように育種した形質転換植物に由来するものも本発明のD遺伝子に含まれる。
【００４６】
（4）汁性の搾汁特性を有する形質転換植物を作製する方法
本発明は、乾性の搾汁特性を有する植物において、乾性の搾汁特性を付与する核酸がコードする野生型タンパク質（即ちD遺伝子がコードするタンパク質）の機能を阻害することを特徴とする、汁性の搾汁特性を有する形質転換植物を作製する方法である。
【００４７】
ソルガムの形質転換にはパーティクルガン法（萩尾、農業生物資源研究所研究報告、1999、第13号、p68-70）およびアグロバクテリウム法 (Gurel et al. 2009, Plant Cell Reports, 28, 429) を用いることが出来る。ソルガム、トウモロコシ、イネの形質転換については、当業者は公知の方法を用いて形質転換体を得ることができる（田部井豊編、形質転換プロトコール（植物編）化学同人発行）。
【００４８】
より具体的には、配列表のSEQ ID NO: 1の塩基配列で示されるD遺伝子に変異を導入して変異型遺伝子であるd遺伝子として、D遺伝子がコードする野生型タンパク質の機能を阻害することにより、汁性の搾汁特性を有する形質転換植物を作製する方法である。
【００４９】
上記変異は、限定されるものではないが、好ましくはストップコドン変異、フレームシフト変異、およびヌル変異からなる群から選択される変異である。
【００５０】
上記変異は更に好ましくは、野生型D遺伝子の3つのエキソンと比較して、変異型d遺伝子の4つのエキソンに基づいて、（A）第1、2、3エキソンが増幅できない第1、2、3エキソン欠損型、（B）第1、2エキソンが増幅できなない第1、2エキソン欠損型、（C）第3エキソンが増幅できない第3エキソン欠損型、（D）第4エキソンの12 bpが欠損している第4エキソン12 bp欠損型、（E）第1、2エキソンにストップコドン変異が生じている第1、2エキソンストップコドン型、（F）汁性形質を示すがエキソンに変異が見られない型、なる群から選択された変異である。
【００５１】
ここで使用される植物は好ましくはソルガム、トウモロコシ、スイッチグラス、アワ、ブラキポディウム、イネからなる群から選択されるが、それらに限定されるものではない。
【００５２】
D遺伝子に上記の変異を導入する方法の一例として、部位特異的変異導入法を挙げることができる。部位特異的変異導入法は、本技術分野において一般的に使用されている遺伝子変異の導入手段であり、それに使用するためのキットなども市販されている。更に植物の細胞に放射線を照射することにより突然変異を誘発し、目的とする変異が生じたものを選択することも考えられる。しかし本発明で変異を導入する方法は、それらの方法に限定されるものではない。
【００５３】
（5）植物に汁性の搾汁特性を付与する方法
本発明は、乾性の搾汁特性を有する植物において、乾性の搾汁特性を付与する核酸がコードするタンパク質（即ちD遺伝子がコードするタンパク質）の機能を阻害することを特徴とする、植物に汁性の搾汁特性を付与する方法である。より具体的には、配列表のSEQ ID NO: １に示されるD遺伝子に変異を導入することによりD遺伝子がコードするタンパク質の機能を阻害することにより、植物に汁性の搾汁特性を付与する方法である。
【００５４】
上記変異は好ましくは、それらに限定されるものではないが、ストップコドン変異、フレームシフト変異、およびヌル変異からなる群から選択された変異である。
【００５５】
上記変異は更に好ましくは、野生型D遺伝子の3つのエキソンと比較して、変異型d遺伝子の4つのエキソンに基づいて、（A）第1、2、3エキソンが増幅できない第1、2、3エキソン欠損型、（B）第1、2エキソンが増幅できない第1、2エキソン欠損型、（C）第3エキソンが増幅できない第3エキソン欠損型、（D）第4エキソンの12 bpが欠損している第4エキソン12 bp欠損型、（E）第1、2エキソンにストップコドン変異が生じている第1、2エキソンストップコドン型、（F）汁性形質を示すがエキソンに変異が見られない型、なる群から選択された変異である。
【００５６】
ここで使用される植物はそれらに限定されるものではないが、好ましくはソルガム、トウモロコシ、スイッチグラス、アワ、ブラキポディウム、イネからなる群から選択される。変異を導入する手段は、上記（4）で述べたものを使用することができる。
【００５７】
（6）植物の乾汁性を判定するためのマーカー
SEQ ID NO: 1の塩基番号115の塩基欠失または塩基置換、塩基番号3690〜3701の塩基欠失、塩基番号3783の塩基置換、塩基番号3869と3870の間の塩基付加、塩基番号3979の塩基置換、塩基番号4012〜4015の塩基欠失、塩基番号4069の塩基置換、塩基番号4076の塩基置換、塩基番号4079と4080の間の塩基付加、塩基番号4086〜4088の塩基欠失、塩基番号4093の塩基置換の塩基配列からなる、本発明のD遺伝子の塩基配列の一部分は、植物の乾汁性を判定するためのマーカーとして有用である。即ち本発明は、SEQ ID NO: 1の塩基番号115の塩基欠失または塩基置換、塩基番号3690〜3701の塩基欠失、塩基番号3783の塩基置換、塩基番号3869と3870の間の塩基付加、塩基番号3979の塩基置換、塩基番号4012〜4015の塩基欠失、塩基番号4069の塩基置換、塩基番号4076の塩基置換、塩基番号4079と4080の間の塩基付加、塩基番号4086〜4088の塩基欠失、塩基番号4093の塩基置換の塩基配列を含む、植物の乾汁性を判定するためのマーカーである。
【００５８】
そのような目的で使用される本発明のDNAマーカーは、好ましくは配列表のSEQ ID NO: 1で示される塩基配列の15から100塩基を含むものであり、更に好ましくはその塩基配列の20〜80塩基を含むものであり、更に好ましくはその塩基配列の30〜50塩基を含むものである。またそれらのDNAマーカーがコードするアミノ酸配列を、ペプチドマーカーとして使用することもできる。しかし本発明の乾汁性のマーカーは、それらに限定されるものではない。
【００５９】
具体的な遺伝子マーカーとして、それらに限定されるものではないが、塩基配列の長さの差を利用したIndelマーカーとSNPを利用したマーカーを使用することができる。Indelマーカーには、リピート配列の長さの差を利用したSSRマーカーや、3 bp欠失の検出を利用したマーカーなどが含まれる。一方SNPを利用したマーカーには、CAPSマーカー、dCAPSマーカー、イントロン内の変異を検出するアリルスペシフィックマーカーなどが含まれる。
【００６０】
更に具体的な遺伝子マーカーとして、下記の実施例においてSorbic.006G147400遺伝子のマッピングに使用した遺伝子マーカーである領域を増幅するためのプライマー（SEQ ID NO: 5〜22）、または下記の実施例において作成したSNPマーカーまたはIndelマーカーである領域を増幅するためのプライマー（SEQ ID NO: 23〜38）を使用することにより、これらの領域を好適なマーカーとして使用することができる。上記に掲げた以外のマーカーも、Sorbic.006G147400遺伝子前後の配列における乾性および汁性品種間に検出された多型を利用することで作出は可能であるが、育種上の利用であればSorbic.006G147400遺伝子前後数Mb以内にマーカーを設定することが望ましい。PCRをベースとしたマーカーの場合は、各プライマーあたり18-27 bpが一般的である(参考文献中のPrimer3の初期設定値)。また、Sorbic.006G147400遺伝子の極近傍に農業形質に関わる遺伝子が明らかとなった場合は、その遺伝子との連鎖を断ち切る必要があることから、上記に掲げたマーカーの中でSorbic.006G147400遺伝子に比較的近い領域にあるものを選択することが有効である。
【００６１】
（7）植物の乾汁性を判定する方法
上記（6）で述べたマーカーを用いて、植物の乾汁性を判定することができる。即ち本発明は、植物において上記（6）で述べた核酸マーカーまたはペプチドマーカーの有無を調べることを含み、該マーカーを検出し、検出されたマーカーが、変異を含みことにより上記の塩基配列の一部分がタンパク質に翻訳されない場合には該植物は汁性の搾汁特性を有すると判定し、上記変異を含まない場合には乾性の搾汁特性を有すると判定する工程を含む、植物の乾汁性を判定する方法である。かかる方法は搾汁特性に優れた品種の選抜および育種において多いに役立つと思われる。
【実施例】
【００６２】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００６３】
実施例1：高精度連鎖解析によるソルガム乾汁性制御遺伝子Dのマッピング
本実施例においては、ソルガムゲノム上における乾汁性を支配する遺伝子Dの座乗位置を決定するために、汁性品種「那系MS3B」と乾性品種「千斤白」を用いたバルクマッピングおよびラフマッピングを行った。
【００６４】
具体的には、那系MS3Bと千斤白を交配しF2集団を得た。約200個体のF2集団から汁性形質を示す54個体を、上述のソルガム茎切断による判定方法により選抜した。ソルガムの汁性形質は、葉の中肋の色によって判別することもある程度は可能であり、簡便な選抜方法として育種現場で利用されているが、実際に茎を切断し茎断面が水浸状になっていることを確認する本判定法を用いることにより、より正確に汁性形質か乾性形質かを判別することができる。この切断による判定方法を採用したことにより、後述するように100年近く同定されることのなかったD遺伝子およびｄ遺伝子を同定することにつながった。
【００６５】
上記判別方法により汁性形質を示すことが明確になった54個体について、複数のマーカー（非特許文献2）を用いたバルクマッピングを行った。ソルガムの染色体10組について、F2集団のうち汁性形質を示した各個体について、各マーカー（非特許文献2）において汁性ソルガム那系MS3Bの遺伝子型と、乾性ソルガム千斤白の遺伝子型のどちらであるかを判定した。そのうえで共通して那系MS3Bの遺伝子型を示す領域を絞り込んだ。この方法により、おおまかな汁性形質遺伝子座の領域を絞り込んだ。
【００６６】
続いて、約1000個体のF2集団を用いたラフマッピングを行った。各染色体に6〜7個となるようにマーカーを作製および選択し、F2集団全ての個体を用いて、乾汁性形質と那系MS3B遺伝子型に共通する領域を調査することにより、目的遺伝子候補領域をさらに狭めた。具体的には、那系MS3Bと千斤白の遺伝子型と乾汁性の表現型が一致するゲノム領域を調査するため、ソルガムのSimple Sequence Repeat（SSR）マーカーおよび遺伝子内の多型情報を利用した遺伝子マーカー（非特許文献2）を作成した。それらの配列をSEQ ID NO: 5〜22に示す。その結果、これらのマーカーを用いてマッピングを行った結果、SB25453_re1およびSB25460に挟まれた185 kbにD遺伝子の候補領域を絞り込んだ（図２）。
【００６７】
マッピングにあたって利用した手法を以下に示す。汁性品種那系MS3Bと乾性品種千斤白、またはこれらのF2集団からそれぞれDNAを抽出した。DNA抽出は葉片を用いたCTAB法（Murray et al. 1980）を用いて行った。SSRマーカーおよび遺伝子マーカーは、KAPA Taq（日本ジェネティクス社）およびGo-Taq（プロメガ株式会社）を用いて表1のPCR条件に従って増幅を行い、3％のアガロ−スゲルを用いた電気泳動により多型を検出した。
【００６８】
【表１】
0006534138.tif 000002
【００６９】
乾性品種千斤白と汁性品種那系MS3BのBACライブラリーを作製した。具体的には、ソルガムの成葉および幼植物から核を抽出して制限酵素HindIIIで消化後、BACベクター（pIndigo BAC5）に結合して大腸菌DH10Bに導入する方法を用いた。その結果、千斤白では平均インサート長175 kb（全47311クローン）、那系MS3Bでは平均インサート長191 kb （全45095クローン）からなるライブラリーを構築できた。このライブラリーは、ソルガムのゲノムサイズを800 Mbと想定したときに、それぞれ10.3倍および10.8倍を示した。
【００７０】
それぞれのBACライブラリーから候補遺伝子領域を含むBACクローンを、前述した185 kb内に絞り込まれた領域に図2の各マーカー（SB24653、Sb6g022620、Sb06g022670、Sb06g022730、SB25460）を作製した。これらのマーカーの配列を検出するためのプライマー配列を、SEQ ID NO: 5〜22に示す。これらのマーカーを用いて、千斤白のBACライブラリーから2クローン（Senkinnshiro_0085105、Senkinshiro_0113N08）、那系MS3BのBACライブラリーから1クローン（Nakei-MS3B_0049G23）を選抜し（図2）、3クローン全ての全塩基配列を決定した。それらの塩基配列情報からSNP（CTPP法、非特許文献3）マーカーおよびIndelマーカーを作製した。これらのマーカー配列を検出するためのプライマー配列を、SEQ ID NO: 23〜38に示す。それによってさらに、アガロース電気泳動ならびにフラグメント解析（非特許文献２）を用いて多型を検出し、F2集団1925個体からなる精密マッピングによって候補領域をCTPP-053とIndel-120117-1に挟まれた18.99 kbの領域に絞りこんだ（図3）。当該領域の塩基配列を、公開されているソルガムのゲノムデータベース（汁性品種：BTX623の全塩基配列）（Phytozome：Joint Genome Institute、University of California Regents： Sbicolor_v2.1, http://www.phytozome.net/sorghum.php）のBLASTによる検索（http://www.phytozome.net/search.php?show=blast）をしたところ、この領域には、Sobic.006G147400遺伝子のみが存在すると推定されていた（図3）。この結果から、Sobic.006G147400が乾汁性を支配する遺伝子であると予想された。Sobic.006G147400遺伝子は汁性品種であるBTX623由来であるので、劣性であるd遺伝子である。以下においてd遺伝子の野生型遺伝子をD遺伝子と呼ぶ。
【００７１】
実施例2：D遺伝子候補遺伝子に対応する他の植物種遺伝子について
全ゲノム配列解読済植物（アラビドプシス、アワ、イネ、スイッチグラス、ソルガム、トウモロコシ、ブラキポディウム、ポプラ）の配列情報を含む配列データベース（Joint Genome Institute、University of California Regents：  http://www.phytozome.net/search.php?show=blast）から、ソルガムD遺伝子のアミノ酸配列と相同性の高い遺伝子（e-value 50以下）をBLASTにより抽出した。抽出した遺伝子群のアミノ酸配列情報をもとにClustalw（非特許文献6）を用いてアライメントを行い、得られた情報に基づきMega5（非特許文献7）によって分子系統樹を作成した。その結果、ソルガムのD遺伝子は、ゲノム上に多数存在するNAC superfamilyに分類される転写因子をコードする遺伝子であることが推定された（図5）。D遺伝子が存在する系統樹上のクレード（分岐群）には、アラビドプシスやポプラといった双子葉植物でみられる類似遺伝子がほとんどみられず、D遺伝子に相当する機能を持つ遺伝子は単子葉植物に特異的に存在する遺伝子である可能性が示唆された。ソルガムのD遺伝子と類似度が高くオルソログ（相同分子種）と考えられる各植物種の相当遺伝子の類似度の順は、1．トウモロコシ、2．アワ、3．スイッチグラス、4．イネおよびブラキポディウム、5．アラビドプシスおよびポプラとなった。これは、各植物の近縁度と一致する傾向にあった。NAC superfamilyモチーフは、ソルガムD遺伝子のアミノ酸配列で1〜180番目のアミノ酸に相当していた（図5）。
【００７２】
（D遺伝子と対応する他植物の遺伝子の遺伝子構造）
公開されているソルガムゲノム配列情報（汁性品種：BTX623）では、Sobic.006G147400は、4つのエキソンを持つ遺伝子構造であると推定されている（Sbicolor_v2.1, http://www.phytozome.net/sorghum.php）。一方、同じイネ科作物であるイネのオルソログ（LOC_Os04g43560.1）およびトウモロコシのオルソログ（GRMZM2G081930_T01）は3つのエキソンからなる構造を示していた（図4）。ここで、Sobic.006G147400の第1エキソンと第2エキソンの間にもソルガムのゲノムデータベースによるRNA-Seq法（非特許文献8）解析結果よりRNA断片が観察された。ここでいうRNA-Seqは、ソルガムデータベースに掲載されている、転写産物の推定情報である。
【００７３】
汁性ソルガム品種BTX623のSobic.006G147400遺伝子のアミノ酸配列、汁性ソルガム品種那系MS3BのSobic.006G147400遺伝子および乾性ソルガム品種千斤白のD遺伝子のアミノ酸配列と、他の植物の類似遺伝子であるアラビドプシス、アワ、イネ、スイッチグラス、ソルガム、トウモロコシ、ブラキポディウム、ポプラのアミノ酸配列との比較を行った結果、汁性形質を有さないいずれの植物においても、この汁性ソルガム品種BTX623の推定イントロン領域は、本来転写されアミノ酸に翻訳されている領域と考えられた（図4）。また、BTX623の推定イントロン領域を含む1〜180番目の約180個のアミノ酸残基はNAM superfamilyモチーフと予想される領域であり、植物間でアミノ酸配列が保存されている領域と考えられた。汁性品種である那系MS3BとBTX623は、開始コドンから115番目のシトシンがチミンに置き換わることでstopコドンが生じている（図5、下記の表2）ことから、機能を失ったタンパク質が生じている可能性が高い。
【００７４】
実施例3：遺伝子発現
ソルガムゲノム情報からSobic.006G147400の配列情報を取得し、3’-UTR側の497 bpを増幅するプライマーセット（SEQ ID NO: 47（TCCCACAGGGATGGACTGGCTGA）（Sobic.006G147400-3’endF）およびSEQ ID NO:48（TGGATTGGAGAGGTGCACTCTTA）（Sobic.006G147400-3’UTRR））を作成し、RT-PCRにより遺伝子発現を解析した。RT-PCRは、非特許文献4の方法に準じて行った。具体的には、サンプルについては、千斤白の3個体からサンプリングした植物片を混ぜて1サンプルとし、別途那系MS3Bの3個体からサンプリングした植物片を混ぜて1サンプルとして、それぞれからRNAを抽出した。RNAの定量は、機械誤差を排除するために同一サンプルを三回測定した値の平均値を利用した。その結果、乾性品種千斤白および汁性品種那系MS3BのいずれともD遺伝子候補遺伝子の転写産物は発芽から2週後には観察され、その後発芽から4週後にも変わらず発現していることが明らかとなった（図6）。
【００７５】
また、植物の器官ごとの発現を調査した結果、調べた器官全て（葉身、茎、穂および根）で遺伝子発現が検出された（図7）。これらのことから、候補遺伝子は配列の変異に関わらず遺伝子発現レベルでは変化が無く、植物体の多くの部位で発現していることが明らかとなった。
【００７６】
一方で、葉身内の発現部位を中肋とそれ以外の部位に分けて候補遺伝子の発現を調査した結果、候補遺伝子の中肋部位における発現量はそれ以外の部位の10倍以上であることが明らかとなった（図8）。この結果は、中肋部位で乾汁性形質が強く観察される結果と一致している。
【００７７】
更にレーザーマイクロダイセクションなどによるイネ根における遺伝子の発現時期および領域データベースを用いて、D遺伝子のイネオルソログの発現を調べた結果、D遺伝子のイネオルソログは生育盛期および皮層で強く発現していることが明らかとなった（RiceXproデータベース；http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/RXP_4001/index.php）。これは、ソルガムにおける乾汁性の表現型が現れる時期や領域と一致していた。D遺伝子は、配列からNAM superfamilyのドメインを持つNAC転写因子遺伝子であると予想されたことから、維管束における細胞分化に関わると推察された（図5）。
【００７８】
実施例4：推定D遺伝子のアリル解析
候補遺伝子の配列と表現型の関係を明らかにするために、世界から収集した乾性品種57品種および汁性38品種の候補遺伝子の配列調査を行った（表2）。
【００７９】
ソルガムの乾性品種である千斤白の推定D遺伝子ゲノム領域は、3つのエキソンから構成されている（SEQ ID NO: 1）。一方、汁性品種であるBTX623に由来する推定d遺伝子（Sorbic.006G147400遺伝子）のゲノム領域は、4つのエキソンから構成されている（SEQ ID NO: 3）。
【００８０】
この変異遺伝子である推定d遺伝子のゲノム領域のそれぞれのエキソンを、以下の配列を有するプライマーを使用して解析することができる：
・Exon1およびExon2の配列解析用プライマー：
SEQ ID NO:39（GCCCGCCTCTCCTGCAGGCTTCC）（79_sorchr6_250-s）；および
SEQ ID NO:40（TGGGAGATG(G)GAGATAAGAAAC）（107_sorchr6_232-as）；
・Exon3の配列解析用プライマー：
SEQ ID NO:41（GCATGTCAGACGCGGCGAAGCTG）（269_sorchr6_1564-s）；および
SEQ ID NO:42（GGTACGGTACCTTTGGTGGCGT）（270_sorchr6_1827-as）；
・Exon4の配列解析用プライマー
SEQ ID NO:43（GTTCCAGAAGCGGAAAGACAGCGA）（83_sorchr6_2560-s）；および
SEQ ID NO:44（GTAATCTAACCTCACGCTAAGTACC）（28_sorchr6_3180-as）；
・Exon4の配列解析用プライマー
SEQ ID NO:45（GCGTGCAGGAGGACTGGGTGCT 271_sorchr6_3671-s 
SEQ ID NO:46（AGTCCATCCCTGTGGGAACCC）272_sorchr6_4130-as；
【００８１】
さらに、エキソン1＋2の塩基配列における115番目塩基の塩基置換（C/T）を識別するためのマーカーとして、
（i）那系MS3B型アリル（T）を増幅するプライマーセット（SEQ ID NO:49（CCAACGAGCGCGCCGAGT）とSEQ ID NO:50（TGCACACAACAACCATGAGCAGGA））を用いてPCRを行うことにより、那系MS3B型アリル（T）を含む領域の増幅が可能となり、198 bpの長さのPCR産物が増幅される；
（ii）一方、千斤白型アリル（C）を増幅するプライマーセット（SEQ ID NO: 51（CAACGAGCGCGCCGAGCA）とSEQ ID NO: 52（ACCGGCCGAGCTAGTACTAATGA））を用いてPCRを行うことにより、千斤白型アリル（C）を含む領域の増幅が可能となり、394 bpの長さのPCR産物が増幅される。
【００８２】
実際には、調査を行うサンプルに対して、上記の2種類のプライマーセットで個別にPCRを行う。サンプルの遺伝子型がT/Tの場合は（i）の198 bpの長さのPCR産物のみのバンドが、C/Cの場合は（ii）の394 bpの長さのPCR産物のみのバンドが、C/T（ヘテロ）の場合は（i）の198 bpの長さのPCR産物と（ii）の394 bpの長さのPCR産物との両者のバンドが、それぞれ検出される。PCR条件は表1に示す通りであるが、アニーリング温度55℃以外の条件を変えても比較的頑健に検出が可能である。
【００８３】
その結果、乾性品種57品種ではいずれも乾性品種千斤白と同一の配列を示していた（代表として千斤白の情報のみ表2に記載する）。汁性品種は、第1、第2、第3エキソン欠損型が18品種（アリルタイプA）、第1、第2エキソン欠損型が１品種（アリルタイプB）、第3エキソン欠損型が1品種（アリルタイプC）、第4エキソン12 bp欠損型が3品種（アリルタイプD）、那系MS3B、BTX623でみられる第1、第2エキソンストップコドン型が12品種 （アリルタイプE）に分類された。また、汁性形質を示すもののエキソンに変異が見られない乾性型エキソン型品種が3品種（アリルタイプF）見られた。アリルタイプAからEまでは、D遺伝子が機能欠損していることが推定された。アリルタイプＦについては不明であるが、何らかの理由で遺伝子発現していないことが推定された。よってアリルタイプAからEの配列であることが検出できれば、汁性の表現型となることが言える。
【００８４】
【表２】
0006534138.tif 000003
【００８５】
配列表フリーテキスト：
SEQ ID NO: 1：千斤白のD遺伝子のゲノムDNAの塩基配列
SEQ ID NO: 2：千斤白のD遺伝子がコードするアミノ酸配列
SEQ ID NO: 3：Sobic.006G147400のゲノムDNAの塩基配列
SEQ ID NO: 4：Sobic.006G147400のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 5：Forward Primer for amplifying SB25430 region.
SEQ ID NO: 6：Reverse Primer for amplifying SB25430 region.
SEQ ID NO: 7：Forward Primer for amplifying SB25434 region.
SEQ ID NO: 8：Reverse Primer for amplifying SB25434 region.
SEQ ID NO: 9：Forward Primer for amplifying SB25442 region.
SEQ ID NO: 10：Reverse Primer for amplifying SB25442 region.
SEQ ID NO: 11：Forward Primer for amplifying SB25446 region.
SEQ ID NO: 12：Reverse Primer for amplifying SB25446 region.
SEQ ID NO: 13：Forward Primer for amplifying SB25453_re1 region.
SEQ ID NO: 14：Reverse Primer for amplifying SB25453_re1 region.
SEQ ID NO: 15：Forward Primer for amplifying Sb06g022620 region.
SEQ ID NO: 16：Reverse Primer for amplifying Sb06g022620 region.
SEQ ID NO: 17：Forward Primer for amplifying Sb062022670 region.
SEQ ID NO: 18：Reverse Primer for amplifying Sb062022670 region.
SEQ ID NO: 19：Forward Primer for amplifying Sb06g022730 region.
SEQ ID NO: 20：Reverse Primer for amplifying Sb06g022730 region.
SEQ ID NO: 21：Forward Primer for amplifying SB25460 region.
SEQ ID NO: 22：Reverse Primer for amplifying SB25460 region.
SEQ ID NO: 23：Forward Primer for amplifying InDel-053 region.
SEQ ID NO: 24：Reverse Primer for amplifying InDel-053 region.
SEQ ID NO: 25：Forward Primer for amplifying CTPP-053 (Nakei MS3B)region.
SEQ ID NO: 26：Reverse Primer for amplifying CTPP-053 (Nakei MS3B)region.
SEQ ID NO: 27：Forward Primer for amplifying CTPP-053 (Senkinshiro)region.
SEQ ID NO: 28：Reverse Primer for amplifying CTPP-053 (Senkinshiro)region.
SEQ ID NO: 29：Forward Primer for amplifying InDel-120117-2 region.
SEQ ID NO: 30：Reverse Primer for amplifying InDel-120117-2 region.
SEQ ID NO: 31：Forward Primer for amplifying CTPP-007 (Nakei MS3B)region.
SEQ ID NO: 32：Reverse Primer for amplifying CTPP-007 (Nakei MS3B)region.
SEQ ID NO: 33：Forward Primer for amplifying CTPP-007 (Senkinshiro)region.
SEQ ID NO: 34：Reverse Primer for amplifying CTPP-007 (Senkinshiro)region.
SEQ ID NO: 35：Forward Primer for amplifying InDel-120117-1 region.
SEQ ID NO: 36：Reverse Primer for amplifying InDel-120117-1 region.
SEQ ID NO: 37：Forward Primer for amplifying InDel-089 region.
SEQ ID NO: 38：Reverse Primer for amplifying InDel-089 region.
SEQ ID NO: 39：Primer for analyzing Exon1 and Exon 2 (79_sorchr6_250-s). 
SEQ ID NO: 40：Primer for analyzing Exon1 and Exon 2 (107_sorchr6_232-as). 
SEQ ID NO: 41：Primer for analyzing Exon3 (269_sorchr6_1564-s). 
SEQ ID NO: 42：Primer for analyzing Exon3 (270_sorchr6_1827-as). 
SEQ ID NO: 43：Primer for analyzing Exon4 (83_sorchr6_2560-s). 
SEQ ID NO: 44：Primer for analyzing Exon4 (28_sorchr6_3180-as). 
SEQ ID NO: 45：Primer for analyzing Exon4 (271_sorchr6_3671-s). 
SEQ ID NO: 46：Primer for analyzing Exon4 (272_sorchr6_4130-as). 
SEQ ID NO: 47：Primer for RT-PCR (Sobic.006G147400-3’endF)
SEQ ID NO: 48：Primer for RT-PCR (Sobic.006G147400-3’UTRR)
SEQ ID NO: 49：Forward Primer for identifying MS3B Exon1+2_115SNP (MS3B_Exon1&2_115-F). 
SEQ ID NO: 50：Reverse Primer for identifying MS3B Exon1+2_115SNP (MS3B_Exon1&2_115-R).
SEQ ID NO: 51：Forward Primer for identifying Senkin Exon1+2_115SNP (Senkin_Exon1&2_115-F). 
SEQ ID NO: 52：Reverse Primer for identifying Senkin Exon1+2_115SNP (Senkin_Exon1&2_115-R). 
【図１】
0006534138.tif 000004
【図２】
0006534138.tif 000005
【図３】
0006534138.tif 000006
【図４】
0006534138.tif 000007
【図５】
0006534138.tif 000008
【図６】
0006534138.tif 000009
【図７】
0006534138.tif 000010
【図８】
0006534138.tif 000011
【図９】
0006534138.tif 000012
【配列表】
0006534138000001.app