(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣細胞において標的ポリペプチドを発現させるための発現ベクターを発現させるステップであって、発現ベクターがチャイニーズハムスターフィブロネクチン分泌リーダー配列に作動可能に連結された組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含むステップと；
（ｂ）標的ポリペプチドを回収するステップと
を含む、標的ポリペプチドを生産する方法。
【請求項２】
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣細胞において標的ポリペプチドを発現させるための発現ベクターでチャイニーズハムスター卵巣細胞をトランスフェクションまたは形質転換するステップであって、発現ベクターがチャイニーズハムスターフィブロネクチン分泌リーダー配列に作動可能に連結された標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含むステップと；
（ｂ）チャイニーズハムスター卵巣細胞の増殖ならびにチャイニーズハムスター卵巣細胞からの標的ポリペプチドの発現および分泌が可能な条件下でチャイニーズハムスター卵巣細胞を培養するステップと、
（ｃ）標的ポリペプチドを回収するステップと
を含む、標的ポリペプチドを生産する方法。
【請求項３】
チャイニーズハムスター卵巣細胞が、ＣＨＯＫ１、ＤＧ４４、ＤＵＸＫＢ１１またはＣＨＯ  ｐｒｏ３−細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
チャイニーズハムスター卵巣細胞が、ＤＧ４４細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
発現カセットがｈＥＦ１ａプロモーターを含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
発現カセットがポリＡ配列を含む、請求項３から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ポリＡ配列が、ヒトβグロビンポリＡ、ウシ成長ホルモンポリＡ、ＳＶ４０初期または後期ポリＡ配列から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
フィブロネクチン分泌リーダーが、配列ＭＬＲＧＰＧＰＧＬＬＬＡＶＬＣＬＧＴＡＶＲＣＴＥＡを有する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
２つの発現カセットが利用され、一方の発現カセットがモノクローナル抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、第２の発現カセットがモノクローナル抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
２つの発現カセットが、同じプロモーター、分泌リーダーおよびポリＡ配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
プロモーターがｈＥＦ１ａプロモーターであり、フィブロネクチン分泌リーダーがチャイニーズハムスターフィブロネクチン分泌リーダーであり、ポリＡ配列がウシβグロビンポリＡ配列である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
チャイニーズハムスターフィブロネクチン分泌リーダー配列に作動可能に連結された標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む発現ベクターでトランスフェクトされた、チャイニーズハムスター卵巣細胞。
【請求項１３】
標的ポリペプチドが、モノクローナル抗体を含む、請求項１２に記載のチャイニーズハムスター卵巣細胞。
【請求項１４】
重鎖および軽鎖を含む別々の発現カセットが利用される、請求項１３に記載のチャイニーズハムスター卵巣細胞。
【請求項１５】
発現カセットが、同じベクターに位置する、請求項１４に記載のチャイニーズハムスター卵巣細胞。
【請求項１６】
各発現カセットが、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたハウスキーピング遺伝子プロモーターを含む、請求項１２から１５のいずれか一項に記載のチャイニーズハムスター卵巣細胞。
【請求項１７】
各発現カセットが、ウシ成長ホルモンポリＡ配列を含む、請求項１２から１６のいずれか一項に記載のチャイニーズハムスター卵巣細胞。
【請求項１８】
ジヒドロ葉酸レダクターゼマーカーシステムをさらに含む、請求項１２から１７のいずれか一項に記載のチャイニーズハムスター卵巣細胞。
【請求項１９】
ジヒドロ葉酸レダクターゼマーカーシステムが、マウスホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターを含む、請求項１８に記載のチャイニーズハムスター卵巣細胞。
【請求項２０】
フィブロネクチン分泌リーダーが、配列ＭＬＲＧＰＧＰＧＬＬＬＡＶＬＣＬＧＴＡＶＲＣＴＥＡを有する、請求項１２から１９のいずれか一項に記載のチャイニーズハムスター卵巣細胞。
【請求項２１】
請求項１２から２０のいずれか一項に記載のチャイニーズハムスター卵巣細胞を培養するステップを含む、ポリペプチドを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えポリペプチドの発現、特に組換えポリペプチドの分泌方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
目的のポリペプチドを、それが発現される細胞から輸送できれば、組換えポリペプチドの生産に著しく有益である。したがって発現システムは、そのような輸送または分泌を可能にするように有利に設計される。宿主細胞からの組換えポリペプチドの分泌には、シグナルペプチドの使用が一般に必要であり、そのシグナルペプチドは細胞質から輸送されることになる真核性および原核性タンパク質の大多数に見出される。そのような発現システムに利用される分泌リーダーは、一般に発現宿主に固有であり、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のＰｈｏＡ、ＭａｌＢおよびＯｍｐＡシグナルペプチドは、その生物のペリプラズムにポリペプチドを分泌するために広く使用されてきた。
【０００３】
米国特許第７，０７１，１７２号は、遺伝子治療における使用のためのＡＡＶに基づく送達ベクターのフィブロネクチン分泌リーダーの使用について記載している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の第１の態様によると、
ａ）宿主細胞において標的ポリペプチドを発現させるための発現ベクターを発現させるステップであって、発現ベクターがフィブロネクチン分泌リーダー配列またはその機能的同等物に作動可能に連結された組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含むステップと；
ｂ）標的ポリペプチドを回収するステップとを含む、標的ポリペプチドを生産する方法が提供される。
【０００５】
本発明に利用できるフィブロネクチン分泌リーダーには、哺乳動物および爬虫類のフィブロネクチン分泌リーダーがある。爬虫類のフィブロネクチン分泌リーダーの例としては、アフリカツメガエルフィブロネクチン分泌リーダーがある。哺乳動物のフィブロネクチン分泌リーダーの例としては、ヒト、ラット、マウス、ウシ、ブタ、イヌ、ネコおよびチャイニーズハムスターフィブロネクチン分泌リーダー、ならびにその機能的同等物、例えば配列ＭＬＲＧＰＧＰＧＬＬＬＬＡＶＱＣＬＧＴＡＶＰＳＴＧＡ（配列番号１）を有するヒトフィブロネクチン分泌リーダーがある。特定の実施形態において、アミノ酸配列ＭＬＲＧＰＧＰＧＬＬＬＡＶＬＣＬＧＴＡＶＲＣＴＥＡ（配列番号２）を有するチャイニーズハムスターフィブロネクチン分泌リーダーおよびその機能的同等物が好ましい。
【０００６】
分泌リーダーの機能的同等物とは、アミノ酸配列で７０％以上の同一性、好ましくは７５％以上の同一性、より好ましくは８０％以上の同一性、最も好ましくは９５％以上の同一性など９０％以上の同一性を共有するものであり、組換えポリペプチドを分泌する能力を保持する。一部の実施形態において、機能的に同等な分泌リーダーは、付加、欠失または置き換えのいずれかにより、単一アミノ酸で異なる。
【０００７】
多くの実施形態において、作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列は連続しており、分泌リーダーの場合、連続し、かつ同じ読み枠にある。
好ましくは、フィブロネクチン分泌リーダー配列をコードするポリヌクレオチドと標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとの結合は、分泌リーダーが組換えポリペプチドのＮ末端に結合するようなものである。特定の実施形態において、組換えポリペプチドは、Ｎ末端タグを含み、分泌リーダー配列と組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとの結合は、分泌リーダーがタグに、好ましくはタグのＮ末端に結合するようなものである。
【０００８】
好ましくは、フィブロネクチン分泌リーダー配列をコードするポリヌクレオチドは、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’末端で結合し、好ましくは配列ＡＴＧＣＴＧＡＧＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧＴＧＴＣＴＧＧＧＡＡＣＣＧＣＣＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＣＣＧＧＣＧＣＣ（配列番号３）またはＡＴＧＣＴＣＡＧＧＧＧＴＣＣＧＧＧＡＣＣＣＧＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＧＴＣＣＴＧＴＧＣＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣＧＧＴＧＣＧＣＴＧＴＡＣＣＧＡＡＧＣＣ（配列番号４）を有する。
【０００９】
本発明のベクターは、分泌リーダーおよび組換えポリペプチドの発現カセットに作動可能に連結されたプロモーターを含む。
本発明によるベクターに利用できるプロモーターは、発現カセットが発現されることになる宿主細胞にしたがって選択される。
【００１０】
原核性宿主細胞に利用できるプロモーターには、ＳｔｕｄｉｅｒおよびＭｏｆｆａｔ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．１８９：１１３〜１３０頁（１９８６）（参照により本明細書に組み込む）に開示されるプロモーターを含めた単一Ｔ７プロモーター領域などのファージポリメラーゼプロモーター、特にＴ７遺伝子１０プロモーター領域ならびに宿主ポリメラーゼプロモーター、特にＴ７Ａ１、Ｔ７Ａ２、Ｔ７Ａ３、λｐＬ、λｐＲ、ｌａｃ、ｌａｃＵＶ５、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｐｈｏＡおよびｒｒｎＢなどの大腸菌ポリメラーゼプロモーターがある。
【００１１】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーター領域が利用される場合、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの供給源が必要になると認識され、その供給源は当技術分野において公知の方法によって提供され、一般に、必要なファージポリメラーゼを発現するλＤＥ３プロファージを宿主株に挿入して溶原性宿主株を形成することによって提供される。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子を持つ特殊な形質導入λファージの感染によって細胞に送達することもできる。
【００１２】
酵母宿主細胞に利用できるプロモーターには、ｇａｌプロモーターならびにＡＯＸ１およびＡＯＸ２などのＡＯＸプロモーター、ＧＡＰ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ＦＬＰ（ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ）ならびにＧＡＬ１およびＧＡＬ１０がある。
【００１３】
哺乳動物宿主細胞に利用できるプロモーターは、宿主細胞に内在性でもまたは外来性でもよい。適切なプロモーターには、ＣＭＶ、ＳＶ４０プロモーターおよびＲＳＲ−ＬＴＲなどのウイルスプロモーターがある。ｈＥＦ１ａおよびマウスホスホグリセリン酸キナーゼ（ｍＰＧＫ）などハウスキーピング遺伝子由来プロモーターも利用できる。一部の実施形態において、好ましいプロモーターは、ヒトＣＭＶおよびラットＣＭＶである。複数のポリペプチド（例えばＭＡｂ  ＨＣおよびＬＣポリペプチド）を発現させる場合、プロモーターは同一でもまたは異なってもよい。プロモーターは、サイトメガロウイルスの主要前初期エンハンサー、特にヒトサイトメガロウイルスなどのエンハンサー配列と組み合わせて利用することができる。
【００１４】
発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに組み込まれてもまたはプラスミドなどの染色体外因子に含まれてもよい。
一般に発現ベクターは、ベクターが発現される宿主細胞に適当な選択可能なマーカーも含む。原核性宿主細胞に使用する選択可能なマーカーには、テトラサイクリンまたはカナマイシン耐性マーカーなどの抗生物質耐性マーカーがある。酵母宿主に使用する選択可能なマーカーには、ゼオシン、ピューロマイシン、ネオシン（ｎｅｏｃｉｎ）およびハイグロマイシン耐性などの抗生物質耐性マーカーがある。哺乳動物細胞用、特にチャイニーズハムスター卵巣細胞用の選択可能なマーカーには、グルタミンシンセターゼおよびジヒドロ葉酸レダクターゼマーカーシステムがある。
【００１５】
利用されるベクターは、適当な宿主細胞における発現に適当な、当技術分野で通常の特徴を含む。原核性発現ベクターは、複製起点、制限酵素部位、転写ターミネータ、およびｃｅｒ安定化配列（ｃｅｒ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）などのプラスミド安定化座（ｐｌａｓｍｉｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｌｏｃｕｓ）を一般に含む。酵母発現ベクターは、プロモーター、転写ターミネータ、選択マーカー、複製する場合には、複製起点を一般に含む。哺乳動物発現ベクターは、ヒトβグロビンポリＡ配列、ウシ成長ホルモンポリＡ配列およびＳＶ４０初期または後期ポリＡ配列などのポリアデニル化配列を一般に含む。
【００１６】
本発明の発現ベクターを利用して、宿主細胞において組換えポリペプチド、特にタンパク質を発現することができる。原核生物および特に真核生物宿主細胞を利用することができる。原核生物細胞の例としては、細菌細胞、例えば、大腸菌、サルモネラチフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチアマルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｓｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を含めたグラム陰性細菌細胞、ならびにバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）を含めたグラム陽性細菌細胞がある。好ましい原核生物宿主細胞は、細菌、特に腸内細菌科（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃａｅ）であり、好ましくは大腸菌、特にそのＢまたはＫ１２株である。
【００１７】
利用できる真核生物宿主細胞の例としては、酵母、哺乳動物および昆虫細胞がある。酵母宿主細胞には、特に酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）およびハンセヌラポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）がある。
【００１８】
好ましい宿主細胞は、ベビーハムスター腎臓細胞、ヒト胎生腎細胞株、例えばＨＥＫ２９３細胞、ヒト網膜由来細胞株、例えばＰＥＲ．Ｃ６細胞、ならびにマウスリンパ細胞株、例えばＮＳ０およびＳＰ２細胞、最も好ましくはチャイニーズハムスター卵巣細胞、特にＣＨＯＫ１、ＤＧ４４、ＤＵＸＫＢ１１およびＣＨＯ  ｐｒｏ３−細胞などの哺乳動物細胞である。
【００１９】
本発明の発現ベクターは、プラスミドの形態で一般に利用される。プラスミドは、自己複製プラスミドまたは組み込みプラスミドであることができる。
本発明の特定の非常に好ましい実施形態において、フィブロネクチン分泌リーダーは、利用する宿主細胞に対応するように選択される。例えば、ヒトフィブロネクチンはヒト由来細胞に利用され、ラットフィブロネクチンはラット細胞に利用され、特にチャイニーズハムスターフィブロネクチンはチャイニーズハムスター卵巣細胞に利用される。
【００２０】
本発明の方法によって発現できるポリペプチドには、サイトカイン、増殖因子、抗体、抗体断片、免疫グロブリン様ポリペプチド、酵素、ワクチン、ペプチドホルモン、ケモカイン、受容体、受容体断片、キナーゼ、ホスファターゼ、イソメラーゼ、ヒドロリアーゼ、転写因子ならびに融合ポリペプチドを含めた治療用タンパク質およびペプチドがある。
【００２１】
発現できる抗体には、多価および／または多重特異的な前述のいずれかの形態を含めた生物活性を有するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体ならびに抗体断片がある。
一般に天然に存在する抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続されたポリペプチド鎖を４つ、即ち同一の重鎖（Ｈ）を２つおよび同一の軽鎖（Ｌ）を２つ含む。各重鎖は、可変領域（ＶＨ）と定常領域（ＣＨ）を含み、ＣＨ領域はその天然の形態に３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、可変領域（ＶＬ）およびドメインを１つ含む定常領域、ＣＬを含む。
【００２２】
ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域に組み入れられている相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに区分けできる。各ＶＨならびにＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される。
【００２３】
発現できる抗体断片は、完全抗体の一部を含み、前記部分は所望の生物活性を有する。抗体断片は、少なくとも１つの抗原結合部位を一般に含む。抗体断片の例には、以下がある：（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦａｂ断片；（ｉｉ）ＣＨ１ドメインのＣ末端にシステイン残基を１つ以上有し、そのシステイン残基が２つのＦａｂ誘導体間のジスルフィド架橋により二価断片を形成することができる、Ｆａｂ’断片などのＦａｂ誘導体；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片；（ｉｖ）ＣＨ１ドメインのＣ末端にシステイン残基を１つ以上有するＦｄ誘導体などのＦｄ誘導体；（ｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインを有するＦｖ断片；（ｖｉ）ＶＬおよびＶＨドメインが共有結合している一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体などの一本鎖抗体分子；（ｖｉｉ）定常領域ドメインを持つかまたは持たない別の可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬドメインポリペプチド）に連結された定常領域ドメインを持たないＶＨまたはＶＬドメインポリペプチド（例えば、ＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＬ）、（ｖｉｉｉ）ＶＨドメインまたはＶＬドメインからなる断片などのドメイン抗体断片、および単離されたＣＤＲ領域など、ＶＨまたはＶＬドメインのいずれかの抗原結合断片；（ｉｘ）抗原結合部位を２つ含むいわゆる「ダイアボディ」、例えば、同じポリペプチド鎖内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；ならびに（ｘ）相補軽鎖ポリペプチドと一緒に一対の抗原結合領域を形成する、一対の直列Ｆｄセグメントを含むいわゆる線状抗体。
【００２４】
調製できる好ましい抗体断片は、哺乳動物の単一可変ドメイン抗体であり、免疫グロブリン可変ドメインに特徴的な配列を含み、抗原を特異的に結合する（すなわち、４００ｎＭ以下、好ましくは２５０ｎＭ以下、最も好ましくは１００ｎＭ以下など５００ｎＭ以下の解離定数）折り畳まれたポリペプチドドメインを含む抗体断片であり、その抗体断片は単一可変ドメインとして抗原を結合し；すなわち、どんな相補的可変ドメインも持たない。単一可変ドメイン抗体には、完全抗体可変ドメイン、ならびに例えば１つ以上のループが抗体可変ドメインに特徴的でない配列によって置き換えられた修飾可変ドメイン、または切り詰められたまたはＮ末端もしくはＣ末端伸張を含む抗体可変ドメイン、および可変ドメインが折り畳まれた断片がある。調製できる好ましい単一可変ドメインは、ＶＨならびにＶκおよびＶλを含めたＶＬの群から選択される。最も好ましくは、単一可変ドメインは、ヒト化ラクダ科動物ドメインを含めた、ヒトまたはラクダ科動物のドメインである。
【００２５】
標的ポリペプチドが、分泌される鎖を２つ以上含む場合、特に標的ポリペプチドが、鎖を２つ以上含む抗体または断片抗体である場合、鎖の少なくとも１つ、好ましくはそれぞれが、フィブロネクチン分泌リーダーに結合され、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがそれに応じて設計される。利用されるフィブロネクチン分泌リーダーは、同一でもまたは異なってもよい。鎖を２つ以上コードするポリヌクレオチドは、同じ発現カセットに含まれてもよいが、好ましくは異なる発現カセットに含まれる。異なる発現カセットが利用される場合、発現カセットは異なるベクターに位置してもよいが、好ましくは同じベクターに位置する。利用されるプロモーターは、同一でもまたは異なってもよい。
【００２６】
発現システムは、利用される細胞に対して当技術分野において周知の方法によって発現される。好ましい発現方法は、増殖培地で宿主細胞を培養するステップと、次いで発現したポリペプチドを回収するステップとを含む。用語「増殖培地」とは、宿主細胞を増殖させるために使用される栄養培地のことを指す。多くの実施形態において、栄養液が利用される。所与の宿主細胞に対して適切な増殖培地およびポリペプチドを回収する方法が、当技術分野で周知である。
【００２７】
多くの実施形態において、ポリペプチドの回収は、濾過、遠心分離、透析濾過、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーなどのアフィニティークロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ゲル濾過およびＨＰＬＣのうち１つ以上を含む。
【００２８】
本発明の好ましい態様によると、
（ａ）宿主細胞において標的ポリペプチドを発現させるための発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクションまたは形質転換するステップであって、発現ベクターがフィブロネクチン分泌リーダー配列またはその機能的同等物に作動可能に連結された標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含むステップと；
（ｂ）宿主細胞の増殖ならびに宿主細胞からの標的ポリペプチドの発現および分泌が可能な条件下で宿主細胞を培養するステップと、
（ｃ）標的ポリペプチドを回収するステップと
を含む、標的ポリペプチドを生産する方法が提供される。
【００２９】
本発明のさらなる態様によると、フィブロネクチン分泌リーダー配列またはその機能的同等物に作動可能に連結された標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む発現ベクターでトランスフェクトされた、チャイニーズハムスター卵巣細胞、好ましくはＣＨＯＫ１、ＤＧ４４、ＤＵＸＫＢ１１またはＣＨＯ  ｐｒｏ３−細胞が提供される。
【００３０】
本発明のさらなる態様においてコードされる標的ポリペプチドは、好ましくはモノクローナル抗体を含む。モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードするポリヌクレオチドを含み、好ましくはそれぞれがフィブロネクチン分泌リーダーに作動可能に連結された発現カセットを利用できる。一部の実施形態において、重鎖および軽鎖を含む別々の発現カセットが利用され、それら発現カセットは、別々のベクターに位置してもよいが、しばしば同じベクターに位置する。利用されるフィブロネクチン分泌リーダーは、同一でもまたは異なってもよいが、好ましくは同一である。
【００３１】
多くの好ましい実施形態において、発現カセットは、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたハウスキーピング遺伝子プロモーター、特にｈＥＦ１ａプロモーターを含み、発現カセットが２つ以上利用される場合、各発現カセットは、ハウスキーピング遺伝子プロモーター、好ましくは同じプロモーター、最も好ましくはｈＥＦ１ａプロモーターを含む。
【００３２】
その、または各、標的ポリペプチドの発現カセットは、好ましくはウシ成長ホルモンポリＡ配列を含む。
発現ベクターは、好ましくは選択マーカー、最も好ましくはジヒドロ葉酸レダクターゼマーカーシステムを含む。特定の例において、ジヒドロ葉酸レダクターゼマーカーシステムは、マウスホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターをさらに含む発現カセットを含む。
【００３３】
哺乳動物細胞において有効なプロモーターおよびフィブロネクチン分泌リーダー配列に作動可能に連結された標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含むＤＮＡ構築物は、本発明の別の態様を形成する。
【００３４】
ＤＮＡ構築物は、好ましくはモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖について別々の発現カセットを含む。最も好ましくは、各発現カセットは、同じプロモーター、特にハウスキーピング遺伝子プロモーター、とりわけｈＥＦ１ａプロモーターを含む。特に好ましくは、各発現カセットは、ウシ成長ホルモンポリＡ配列をさらに含む。ＤＮＡ構築物は、選択マーカー、最も好ましくはジヒドロ葉酸レダクターゼマーカーシステムをしばしば有利に含む。特定の例において、ジヒドロ葉酸レダクターゼマーカーシステムは、マウスホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターをさらに含む発現カセットを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】発現カセットの構造を、図１に例示する。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明は、以下の実施例により限定されずに例示される。
【実施例】
【００３７】
［実施例１］
評価される各分泌リーダー（ＳＬ）について、抗ＭＵＣ−１  ＭＡｂのｈγ１  ＦＬ重鎖（ＨＣ）または抗ＭＵＣ−１  ＭＡｂのλ軽鎖（ＬＣ）のいずれかを含有する２つの単一遺伝子ベクターを構築した。各発現カセットは、ＨＣまたはＬＣ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列にフレームを合わせて連結された分泌リーダーをコードするポリヌクレオチド配列およびヒトβグロビンポリＡ配列、に機能的に連結されたラットＣＭＶプロモーターからなった。発現カセットの構造を、図１に例示する。
【００３８】
利用した分泌リーダーは次の通りである。
分泌リーダーＡ：ヒトコラーゲン、配列ＭＬＳＦＶＤＴＲＴＬＬＬＬＡＶＴＬＣＬＡＴＣＱＳ（配列番号５）
分泌リーダーＢ：ヒトフィブロネクチン、配列ＭＬＲＧＰＧＰＧＬＬＬＬＡＶＱＣＬＧＴＡＶＰＳＴＧＡ（配列番号１）
分泌リーダーＣ：チャイニーズハムスターフィブロネクチン、配列ＭＬＲＧＰＧＰＧＬＬＬＡＶＬＣＬＧＴＡＶＲＣＴＥＡ（配列番号２）
分泌リーダーＤ：チャイニーズハムスターアルブミン、配列ＭＫＷＶＴＦＬＬＬＬＦＶＳＤＳＡＦＳ（配列番号６）
ＣＨＯ  ＤＧ４４宿主細胞を計数し、１０％血清、２ｍＭグルタミンおよび０．４５％グルコースで補充したＭＥＭ−α培地に１．２×１０６個細胞／ウェルで６穴プレートのウェルに播種し、７．５％  ＣＯ２、３６．５℃で、終夜インキュベートした。
【００３９】
各トランスフェクションについて、ＨＣおよびＬＣ単一遺伝子ベクター（２μｇ）４μｇを一緒に混合し、無血清ＭＥＭ−α培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）２５０μＬに希釈した。模擬トランスフェクション（ＰＢＳのみ）も含めた。各トランスフェクションについて、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１２．５μＬを無血清ＭＥＭ−α培地２５０μＬに希釈し、混合した。混合物を、室温（１５〜２５℃）で５分間インキュベートした。希釈したＤＮＡとリポフェクタミン２０００（商標）試薬を合わせ、混合し、室温で２０分間インキュベートした。さらなるＭＥＭ−α培地５００μＬを各トランスフェクション混合物に添加し、増殖培地をウェルから除去し、次いで複合体を、細胞を含有する６ウェルプレートのウェルに添加した。５時間後に培地を除去し、新しい増殖培地を添加した。細胞を７．５％  ＣＯ２、３６．５℃で５日間インキュベートした。上清を採取し、遠心分離によって清澄化した。抗体価を、Ｏｃｔｅｔ（Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ）プロテインＡアッセイを使用して決定した。
【００４０】
結果を以下の表１に示す。
【００４１】
【表１】
0006545153.tif 000002
【００４２】
作製した抗体を、プロテインＡ捕捉し、低ｐＨで溶出することによって上清から回収し、陽イオン交換クロマトグラフィー後の陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製する。陰イオン交換クロマトグラフィーからの溶離液をウイルスナノ濾過に供し、その後緩衝液交換し、濃縮する。
【００４３】
［実施例２］
ベクター構築
抗ＭＵＣ−１  ＭＡｂのｈγ１  ＦＬ重鎖と抗ＭＵＣ−１  ＭＡｂのヒトλ軽鎖の両方の発現を駆動するｈＥＦ１ａプロモーターを含有する二重遺伝子ベクターを構築した。
【００４４】
ｈＥＦ１αプロモーターをｈＣＭＶ  ＭＩＥプロモーターまたはラットＣＭＶプロモーターのいずれかに交換した場合、二重遺伝子ベクターをさらに構築した。
二重遺伝子ベクター中にある各発現カセットは、実施例１のＣＨＯフィブロネクチンシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターからなり、そのシグナルペプチドは、ＨＣまたはＬＣ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列にフレームを合わせて連結された。ウシ成長ホルモンポリＡ配列の存在により正しいｍＲＮＡプロセッシングを確実にした。
【００４５】
安定な細胞株の選択を可能にするために、ベクターは、マウスホスホグリセリン酸（ｍＰＧＫ）プロモーターの制御下にあるマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子およびチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターの制御下にあるハイグロマイシン耐性遺伝子のコピーも含有した。
【００４６】
ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞の通常の継代培養：
ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞を、８ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１ｘＨＴ補助剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で補充したＥＸ−ＣＥＬＬ  ＡＣＦ  ＣＨＯ培地（シグマ）中で懸濁振とうフラスコで常法通り培養した。細胞を２×１０５個細胞／ｍｌの濃度で播種し、細胞を３日毎に分けた。フラスコを７．５％  ＣＯ２、３７℃で、１４０ｒｐｍのオービタル振盪培養器で培養した。
【００４７】
安定な細胞株を生成するためのトランスフェクション
上で詳述したように、トランスフェクションに使用する細胞を細胞懸濁培養で増殖させた。増殖培養からの細胞を遠心分離し、２ｘ１０７個細胞／ｍＬの濃度に再懸濁した。細胞懸濁液０．１ｍＬ容積および線状化プラスミドＤＮＡ  ４μｇを、エレクトロポレーションキュベットに添加した。次いでキュベットを、Ａｍａｘａ  ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）の中に置き、ヌクレオフェクト（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）した。トランスフェクション後に、細胞をＴ７５フラスコ中の、８ｍＭグルタミンおよび１ｘＨＴ補助剤で補充された予め温めたＥＸ−ＣＥＬＬ  ＡＣＦ  ＣＨＯ培地（シグマ）２０ｍＬに添加した。トランスフェクトした細胞を７．５％  ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。培地からヒポキサンチンおよびチミジン（ＨＴ）を除去し（トランスフェクション４８時間後）、４００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２５ｎＭ  ＭＴＸを添加した（トランスフェクション１４４時間後）後に、細胞を５０００個細胞／ウェル（２．５×１０４／ｍＬ）で９６ウェルプレートに播いた。プレートを空気中７．５％ＣＯ２雰囲気中で、３７℃でインキュベートした。トランスフェクション後およそ３週間まで、コロニー増殖についてプレートを観察した。細胞増殖を含有する最大１００ウェルから上清を採取し、Ｏｃｔｅｔ（Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ）プロテインＡアッセイを使用して抗体について分析した。コロニーを発現している上位２４個を、２４ウェルプレートに展開し、１０日間培養した。次いで上清を、Ｏｃｔｅｔ（Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ）プロテインＡアッセイを使用して抗体についてアッセイした。結果を以下の表２に示す。
【００４８】
【表２】
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【００４９】
［実施例３］
ＣＨＯ上清からの抗体の精製
実施例２に記述したｈＥＦ１αプロモーター二重遺伝子ベクターを使用して生成した組換えＣＨＯ  ＤＧ４４細胞株からの上清を、プロテインＡ樹脂を使用して精製した。清澄化した採収物３５０ｍＬを、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含有する予め充填されたカラムにロードした。樹脂を、最初に２０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で、次いで２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で洗浄した。次いで抗体を１００ｍＭ酢酸で溶出した。回収した産物をＯｃｔｅｔ（Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ）プロテインＡアッセイを使用して定量化し、表３に示す。
【００５０】
【表３】
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発明の態様
［態様１］（ａ）宿主細胞において標的ポリペプチドを発現させるための発現ベクターを発現させるステップであって、発現ベクターがフィブロネクチン分泌リーダー配列またはその機能的同等物に作動可能に連結された組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含むステップと；
ｂ）標的ポリペプチドを回収するステップと
を含む、標的ポリペプチドを生産する方法。
［態様２］（ａ）宿主細胞において標的ポリペプチドを発現させるための発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクションまたは形質転換するステップであって、発現ベクターがフィブロネクチン分泌リーダー配列またはその機能的同等物に作動可能に連結された標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含むステップと；
（ｂ）宿主細胞の増殖ならびに宿主細胞からの標的ポリペプチドの発現および分泌が可能な条件下で宿主細胞を培養するステップと、
（ｃ）標的ポリペプチドを回収するステップと
を含む、標的ポリペプチドを生産する方法。
［態様３］フィブロネクチン分泌リーダーが、宿主細胞に対応するように選択される、態様１または２に記載の方法。
［態様４］宿主細胞が哺乳動物細胞である、態様１から３のいずれかに記載の方法。
［態様５］宿主細胞が、ＣＨＯ細胞である態様４に記載の方法。
［態様６］発現カセットがｈＥＦ１ａプロモーターを含む、態様４または５に記載の方法。
［態様７］発現カセットがポリＡ配列を含む、態様４から７のいずれかに記載の方法。
［態様８］ポリＡ配列が、ヒトβグロビンポリＡ、ウシ成長ホルモンポリＡ、ＳＶ４０初期または後期ポリＡ配列から選択される、態様７に記載の方法。
［態様９］フィブロネクチン分泌リーダーが、配列ＭＬＲＧＰＧＰＧＬＬＬＬＡＶＱＣＬＧＴＡＶＰＳＴＧＡまたはＭＬＲＧＰＧＰＧＬＬＬＡＶＬＣＬＧＴＡＶＲＣＴＥＡを有する、態様１から８のいずれかに記載の方法。
［態様１０］２つの発現カセットが利用され、一方の発現カセットがモノクローナル抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、第２の発現カセットがモノクローナル抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む、態様１から９のいずれかに記載の方法。
［態様１１］２つの発現カセットが、同じプロモーター、分泌リーダーおよびポリＡ配列を含む、態様１０に記載の方法。
［態様１２］宿主細胞がＣＨＯ細胞であり、プロモーターがｈＥＦ１ａプロモーターであり、フィブロネクチン分泌リーダーがチャイニーズハムスターフィブロネクチン分泌リーダーであり、ポリＡ配列がウシβグロビンポリＡ配列である、態様１１に記載の方法。
［態様１３］フィブロネクチン分泌リーダー配列またはその機能的同等物に作動可能に連結された標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む発現ベクターでトランスフェクトされた、チャイニーズハムスター卵巣細胞、好ましくはＣＨＯＫ１、ＤＧ４４、ＤＵＸＫＢ１１またはＣＨＯ  ｐｒｏ３−細胞。
［態様１４］標的ポリペプチドが、モノクローナル抗体を含む、態様１３に記載のチャイニーズハムスター卵巣細胞。
［態様１５］重鎖および軽鎖を含む別々の発現カセットが利用される、態様１４に記載のチャイニーズハムスター卵巣細胞。
［態様１６］発現カセットが、同じベクターに位置する、態様１５に記載のチャイニーズハムスター卵巣細胞。
［態様１７］各発現カセットが、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたハウスキーピング遺伝子プロモーター、特にｈＥＦ１ａプロモーターを含む、態様１３から１６のいずれかに記載のチャイニーズハムスター卵巣細胞。
［態様１８］各発現カセットが、ウシ成長ホルモンポリＡ配列を含む、態様１３から１７のいずれかに記載のチャイニーズハムスター卵巣細胞。
［態様１９］ジヒドロ葉酸レダクターゼマーカーシステムをさらに含む、態様１３から１８のいずれかに記載のチャイニーズハムスター卵巣細胞。
［態様２０］ジヒドロ葉酸レダクターゼマーカーシステムが、マウスホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターを含む、態様１９に記載のチャイニーズハムスター卵巣細胞。
［態様２１］フィブロネクチン分泌リーダーがＣＨＯフィブロネクチンである、態様１３から２０のいずれかに記載のチャイニーズハムスター卵巣細胞。
［態様２２］フィブロネクチン分泌リーダーが、配列ＭＬＲＧＰＧＰＧＬＬＬＡＶＬＣＬＧＴＡＶＲＣＴＥＡを有する、態様１３から２１のいずれかに記載のチャイニーズハムスター卵巣細胞。
［態様２３］態様１３から２２のいずれかに記載のチャイニーズハムスター卵巣細胞を培養するステップを含む、ポリペプチドを生産する方法。
［態様２４］哺乳動物細胞中で有効なプロモーターおよびフィブロネクチン分泌リーダー配列に作動可能に連結された標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含むＤＮＡ構築物。
［態様２５］プロモーターが、ハウスキーピングプロモーター、好ましくはｈＥＦ１ａプロモーターであり、発現カセットが、ウシ成長ホルモンポリＡ配列をさらに含む、態様２４に記載のＤＮＡ構築物。
【図１】
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【配列表】
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