(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャピラリーからエレクトロスプレーを製造するためのシースフローインターフェースであって、
（ａ）検体液に含有された検体を分離するように構成され、前記検体液を受け取るように構成された噴射端と検体流出液を排出するように構成された被覆のない遠位端とを有するシリカ製のキャピラリーであって、前記遠位端のセグメントの外径が低減された外径までテーパが付けられており、前記低減された外径は約２０μｍ〜約２００μｍの範囲内であり、前記遠位端の内側部分は、前記キャピラリーの長さに対して実質的に一様なままである、シリカ製のキャピラリーと、
（ｂ）少なくとも前記キャピラリーの前記遠位端を囲繞して共軸性に配置されたエレクトロスプレー放出体であって、前記キャピラリーの前記遠位端に関連して共軸性に配置された開口で終わるようにテーパが付けられた遠位端を有するエレクトロスプレー放出体と、
（ｃ）前記キャピラリーの周辺の接続フィクスチャを介して前記エレクトロスプレー放出体の内部と液体連通するシース液リザーバであって、電導性のシース液が前記シース液リザーバから、前記エレクトロスプレー放出体の前記内部を通過し、前記シース液が前記検体流出液を鞘状に覆うことができる前記キャピラリーの前記遠位端に流れ、且つ前記エレクトロスプレー放出体の前記遠位端にある前記開口を通過して流れることが可能であるように、前記接続フィクスチャは前記シース液のフローを前記シース液リザーバから前記エレクトロスプレー放出体の前記内部まで導くことが可能である、シース液リザーバと、を備え、
前記シース液は前記キャピラリーと前記エレクトロスプレー放出体の間の電気的接触を実現し、前記シースフローインターフェースは前記検体流出液を鞘状に覆う前記シース液の動電学的フローによってナノスプレーを製造することが可能であり、且つ前記動電学的フローは前記エレクトロスプレー放出体と前記エレクトロスプレー放出体の前記開口に隣接するが物理的に接触しないように配置された標的面との間の電位によって生成されることが可能である、シースフローインターフェース。
【請求項２】
前記キャピラリーの前記遠位端が、放出体オリフィスの遠位端から約７５０μｍから放出体オリフィス開口の先の約１００μｍまでにある、請求項１に記載のシースフローインターフェース。
【請求項３】
前記キャピラリーの前記遠位端が、前記放出体オリフィスの前記遠位端から約１００ｎｍ〜約７５０μｍにある、請求項２に記載のシースフローインターフェース。
【請求項４】
前記キャピラリーの前記遠位端が、前記放出体オリフィスの前記遠位端の終端点と前記放出体オリフィスの前記遠位端の約１００μｍ先との間まで延びている、請求項２に記載のシースフローインターフェース。
【請求項５】
前記キャピラリーの前記遠位端の前記外径が約２０μｍ〜約７５μｍである、請求項１に記載のシースフローインターフェース。
【請求項６】
低減された外径までテーパが付けられた前記遠位端の前記セグメントが約０．１ｍｍ〜約１０ｍｍのセグメント長を備える、請求項１に記載のシースフローインターフェース。
【請求項７】
キャピラリーゾーン電気泳動計器のために構成された請求項１に記載のシースフローインターフェース。
【請求項８】
分析のための質量分析装置によって構成されている、請求項７に記載のシースフローインターフェース。
【請求項９】
質量分析装置検出限界が約１〜１０ゼプトモルである、請求項８に記載のシースフローインターフェース。
【請求項１０】
質量分析装置検出限界が概ね１ゼプトモルである、請求項８に記載のシースフローインターフェース。
【請求項１１】
請求項８に記載のシースフローインターフェースを用いてキャピラリーから検体流出液のナノスプレーを製造するための方法であって、前記シース液の電気浸透性フローを、前記シース液リザーバから、接続用フィクスチャを通過し、前記エレクトロスプレー放出体の前記内部を通過し、前記シース液が前記検体流出液を鞘状に覆うことができる前記キャピラリーの前記遠位端に至り、且つ前記エレクトロスプレー放出体の前記遠位端にある前記開口を通過するように駆出するのに十分な電圧を前記シース液リザーバとキャピラリーの前記噴射端との間に印加するステップであって、前記検体流出液内の検体がキャピラリーゾーン電気泳動によって前記キャピラリー内で分離される、ステップを含む、方法。
【請求項１２】
前記シースフローインターフェースをタンデム質量分析法のために構成するステップを含んでおり、前記シースフローインターフェースが質量分析装置に対して分析のためにナノスプレーを提供するように構成されており、前記標的面が前記質量分析装置の入力オリフィスであり、且つタンパク質サンプルの下側検出限界が約３フェムトグラムから約５フェムトグラムである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ペプチドがＥ．ｃｏｌｉトリプシン消化物、又はヒト細胞株消化物を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
分析されるペプチドの質量検出限界が約１ゼプトモルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
分析されるペプチドの信号対雑音比が約２６０：１〜約３００：１である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質消化物の分離及び分析が約６０分以内で完了する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
ペプチド分離について２５０，０００理論段〜約３５０，０００理論段の平均値が得られる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記シースフローインターフェースの前記キャピラリーの内径が約５μｍ〜約７５μｍである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
スプレーの総流量が約２０〜２００ｎＬ／分である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記キャピラリーの前記遠位端が、放出体オリフィスの遠位端から約２００μｍにあり、前記キャピラリーの前記遠位端の前記低減された外径は５０μｍ〜１００μｍであり、前記放出体オリフィスの内径が約２μｍ〜約５０μｍであり、前記エレクトロスプレー放出体は非導電性である、請求項１に記載のシースフローインターフェース。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、参照により本明細書に組み込むものとする２０１３年８月２９日に出願された米国特許仮出願第６１／８７１，５６２号に対する米国特許法第１１９（ｅ）条に基づく優先権を主張するものである。
【政府支援】
【０００２】
本発明は、米国国立衛生研究所の助成による認可番号第Ｒ０１ＧＭ０９６７６７号に基づいた政府支援によりなされたものである。政府は本発明について一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ボトムアッププロテオミクスは、質量分析法による分析の前にタンパク質のタンパク分解消化によってタンパク質を同定すると共に、そのアミノ酸配列及び翻訳後修飾を特徴付けするために有用な方法である。ボトムアッププロテオミクスは、複雑な生体サンプルに対する定性的及び定量的な特徴付けのために広く使用されている。数マイクログラムの材料が得られれば、哺乳類細胞溶解液からは１０，０００を超えるタンパク質を、また原核生物溶解液からは２，５００を超えるタンパク質を同定することが可能である。ボトムアッププロテオミクスの性能は、レーザ捕獲顕微解剖された組織、循環腫瘍細胞、単一胚及び単一体細胞などの質量制限のあるサンプルでは急速に劣化する。
【０００４】
キャピラリー液体クロマトグラフィ（ＬＣ）−エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）−タンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）を用いたナノグラムサンプルのボトムアッププロテオミクスに関しては、一群の報告が存在している。Ｍａｎｎのグループは、タンパク質含有量が数百ｎｇの単一の膵島から２，０００のタンパク質を同定した（Ｗａａｎｄｅｒｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ２００９、１０６、１８９０２）。Ｋａｒｇｅｒのグループは、５０ｎｇのメタノサルシナアセチボランスの消化物から５６６のタンパク質を同定し（Ｙｕｅら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．２００７、７９、９３８）、また子宮頸がん細胞株の約２．５ｎｇのトリプシン消化物から１６３のタンパク質を同定した（Ｌｕｏら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．２００７、７９、６１７４）。Ｓｍｉｔｈのグループは、デイノコッカスラジオデュランスの低ナノグラム量の消化物から精密質量保持時間タグ（ＡＭＴ）［８］方針によって８７０のタンパク質を検出した（Ｓｍｉｔｈら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００２、２、５１３）。Ｓｍｉｔｈのグループはまた、０．５ｐｇのサンプルにおけるＡＭＴ法による３つの最も豊富なタンパク質の検出を報告しており、またウシ血清アルブミン消化物中のあるペプチドについて約１０ｚｍｏｌｅの検出限界を報告している（Ｓｈｅｎら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．２００４、７６、１４４）。Ｄｏｖｉｃｈｉと同僚研究者らは、Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析装置をより高いエネルギーの衝突解離で使用し（Ｏｌｓｅｎら、Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００７、４、７０９）、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞株の１ｎｇの消化物から約１００のタンパク質群を同定した（Ｓｕｎら、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．  ２０１３、２７、１５７）。これらの分析ではすべて、少なくとも１時間の計器時間を必要とした。したがって、フェムトグラム量のタンパク質消化物をボトムアップ分析するより迅速な方法があれば、プロテオミクスコミュニティに大きな恩恵となろう。
【０００５】
キャピラリーゾーン電気泳動−エレクトロスプレーイオン化−タンデム質量分析法（ＣＺＥ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）は、ボトムアッププロテオミクスについて注目を集めており、またこの方式は、低ナノグラムサンプルについて性能がＬＣ−ＭＳ／ＭＳを一貫して凌駕している。小さいサンプル量に関するＣＺＥの性能の向上は、これが非常に単純な設計であり、このためインジェクタやフィッチングでのサンプル損失が排除されることに由来すると思われる。Ｓｍｉｔｈのグループ（Ｓｍｉｔｈら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．１９８８、６０、１９４８）の先駆的な研究に始まり、キャピラリー電気泳動に関してエレクトロスプレーインターフェースが開発されてきた（Ｍａｘｗｅｌｌら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ  ２００８、６２７、２５）。しかし、シース流量が低いことによるサンプル希釈の低減のため、機械式ポンプを排除するため、広範な分離バッファを許容するため、及びナノスプレーレジームでの動作の安定化のために、新たなインターフェースが必要である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、改良型の動電学的ポンピング式シースフローインターフェースに基づいた超高感度且つ高速のキャピラリーゾーン電気泳動−エレクトロスプレーイオン化−タンデム質量分析法（ＣＺＥ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）システムを実現する。改良型の動電学的ポンピング式インターフェースは、シース流量が非常に低いことによるサンプル希釈の低減、機械式ポンプの排除、広範な分離バッファの許容、市販のキャピラリー電気泳動計器との適合性、及びナノスプレーレジームにおける安定な動作を含む幾つかの利点を有する。本システムは、フェムトグラム量のタンパク質消化物に関する迅速なボトムアップ分析のために有用であり、且つ極めて高い感度を実現する。
【０００７】
したがって、本発明は、キャピラリーからエレクトロスプレーを製造するためのシースフローインターフェースであって、
（ａ）検体液を含有するように構成され、検体液を受け取るように構成された噴射端と検体流出液を排出するように構成された遠位端とを有するキャピラリーであって、遠位端のセグメントの外径が約２０μｍ〜約２００μｍの範囲の低減された外径までテーパが付けられている、キャピラリーと、
（ｂ）少なくともキャピラリーの遠位端を囲繞して共軸性に配置されたエレクトロスプレー放出体であって、キャピラリーの遠位端に関連して共軸性に配置された開口で終わるようにテーパが付けられた遠位端を有するエレクトロスプレー放出体と、
（ｃ）エレクトロスプレー放出体の内部と液体連通するシース液リザーバであって、電導性のシース液がシース液リザーバから、キャピラリーとエレクトロスプレー放出体の中間の接続用フィクスチャを通過し、キャピラリーの遠位端を横断し、且つエレクトロスプレー放出体の遠位端にある開口を通過して流れることが可能である、シース液リザーバと、
を含むインターフェースを実現する。
【０００８】
本シースフローインターフェースは、キャピラリーの遠位端とエレクトロスプレー放出体オリフィスとがエレクトロスプレー放出体内で約７５０μｍ〜約１００ｎｍの距離だけ離間されるように構成することが可能である。キャピラリーの外径が放出体オリフィスの直径より小さい実施形態では、キャピラリーの遠位端を放出体オリフィス開口内に存在させるように構成することが可能である。さらに、キャピラリーの遠位端は、放出体オリフィス開口より先に約１００μｍまで延びることが可能である。
【０００９】
シース液は、キャピラリーとエレクトロスプレー放出体の間に電気的接触を実現することが可能である。本シースフローインターフェースは、検体流出液と混合されたシース液の動電学的フローによって生成されたナノスプレーを製造するように構成することが可能である。さらに、動電学的フローは、エレクトロスプレー放出体とエレクトロスプレー放出体の開口に隣接するが物理的に接触しないように配置された標的面との間の電位によって生成することが可能である。
【００１０】
様々な実施形態では、キャピラリーの遠位端の外径を、約２０μｍ〜約７５μｍ、又は約４５μｍ〜約６５μｍとすることが可能である。低減された外径までテーパが付けられた遠位端のセグメントは、約０．１ｍｍ〜約１０ｍｍ（典型的には、約５ｍｍ）のセグメント長とすることが可能である。
【００１１】
本シースフローインターフェースは、キャピラリーゾーン電気泳動及びタンデム質量分析装置によって構成されたときに４００フェムトグラムのペプチドサンプルから複数のペプチドを、１２分未満又は１０分未満の質量分析法計器時間で検出することが可能である。複数のペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉトリプシン消化物などのペプチド消化物を含む。
【００１２】
本シースフローインターフェースは、キャピラリーゾーン電気泳動計器及び質量分析装置によって構成することが可能であり、この際に１５０を超えるペプチドを精密質量保持時間タグによってピコグラム未満量の複雑なタンパク質消化物から１２分未満の質量分析装置時間で（多くの場合に、１０分未満の質量分析装置時間で）同定することが可能である。
【００１３】
質量分析装置検出限界は、約１〜１０ゼプトモルにすること（例えば、概ね１ゼプトモル程度に小さくすること）が可能である。
【００１４】
本発明はまた、請求項１のシースフローインターフェースをキャピラリーゾーン電気泳動計器によって構成するステップを含むタンパク質消化物を分析するための方法を提供しており、ここで検体液は分離キャピラリー内でキャピラリーゾーン電気泳動によって分離され且つ約３００Ｖ／ｃｍの電界を提供するように約１０ｋＶの電位が印加されて、広い検体分離ウィンドウが生じ、その間に検体はキャピラリーからインターフェース内まで約６０分以内で移動する。ペプチド分離について、２５０，０００理論段〜約３５０，０００理論段の平均値が得られる。
【００１５】
幾つかの実施形態では、シースフローインターフェースの分離キャピラリーの内径は約５μｍ〜約７５μｍである。様々な実施形態では、スプレーに関する総流量は、約１５〜約２００ｎＬ／分、約２０〜約２００ｎＬ／分、約１５〜約２５ｎＬ／分、又は約２０ｎＬ／分である。本方法は、本明細書に記載したシースフローインターフェースをタンデム質量分析法によって構成するステップを含むことが可能であり、シースフローインターフェースは質量分析装置に対して分析のためにナノスプレーを提供するように構成され、標的面は質量分析装置の入力オリフィスであり、且つタンパク質サンプルの下側検出限界が約３フェムトグラム約５フェムトグラムである。分析されるペプチドの質量検出限界は、特に内径が小さい分離キャピラリー（例えば、直径が約１５マイクロメートル未満、典型的には約１０マイクロメートル）の場合に約１ゼプトモルとすることが可能である。非常に低い質量検出限界を達成するためには、高感度の質量分析装置を利用すべきである。高感度の質量分析装置の一例は、Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ四重極オービトラップ型質量分析装置（Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）である。分析されるペプチドの信号対雑音比は、約２６０：１〜約３００：１とすることが可能である。
【００１６】
本発明はさらに、本明細書に記載したシースフローインターフェースを用いてキャピラリーから検体流出液のナノスプレーを製造するための方法であって、シース液の電気浸透性フローを、シース液リザーバから、キャピラリーとエレクトロスプレー放出体の中間の接続用フィクスチャを通過し、キャピラリーの遠位端を横断し、且つエレクトロスプレー放出体の遠位端にある開口を通過するように駆出するのに十分な電圧をシース液リザーバに印加するステップを含み、キャピラリーの噴射端に電圧を印加することによって、検体流出液がキャピラリーゾーン電気泳動によってキャピラリー内で分離されている、方法を実現する。
【００１７】
様々な実施形態では、検体液は動電学的な力又は機械式ポンピング力によってキャピラリーを通るように移動させることが可能である。検体液は、キャピラリーゾーン電気泳動、ミセル動電クロマトグラフィ、キャピラリー電気クロマトグラフィ、キャピラリー等電点電気泳動、キャピラリー液体クロマトグラフィ、又はこれらの組み合わせによってキャピラリー内で分離することが可能である。ナノスプレーは、例えば電気浸透性フローによって製造することが可能である。検体液は、キャピラリー内で電気泳動によって分離することが可能であり、この際ナノスプレーが電気浸透性フローによって製造されると共に、電気泳動と電気浸透性フローの両方がキャピラリーの噴射端、シース液リザーバ及び標的面の間に電位を印加することによって駆出される。検体液は、クロマトグラフィによって分離することが可能であり、ここでフローは従来の液体クロマトグラフィの機械式ポンプによるか電気クロマトグラフィの動電学的フローによるかのいずれかで駆出される（このケースでは、エレクトロスプレーをエレクトロスプレー放出体内の電気浸透性フローによって駆出することが可能である）。
【００１８】
シースフローインターフェースは、質量分析装置に対して分析のためにナノスプレーを提供するように構成することが可能であり、またこの際に標的面は質量分析装置の入力オリフィスとなる。標的面を接地に保持することが可能であり、又は標的面をある電位に保持することが可能である。シース液は、検体流出液の質量分析装置との適合性を高めるように構成することが可能である。エレクトロスプレー放出体の遠位端にある開口は、約０．５μｍ〜約５０μｍ直径とする、又は約０．５μｍ〜約３０μｍ直径とすることが可能である。
【００１９】
本発明はまた、タンパク質消化物などの生体分子を分析するための方法を実現する。本方法は、タンパク質消化物から検体流出液を形成するステップと、上に記載したシースフローインターフェースの実施形態を使用してキャピラリーから検体流出液のナノスプレーを製造するステップと、を含むことが可能である。検体流出液のナノスプレーを製造する方法は、シース液の電気浸透性フローがシース液リザーバから、キャピラリーとエレクトロスプレー放出体の中間の接続用フィクスチャを通過し、キャピラリーの遠位端を横断し、且つエレクトロスプレー放出体の遠位端にある開口を通過して駆出されるのに十分な電圧をシース液リザーバに印加するステップを含むことが可能である。検体流出液は、キャピラリーの噴射端に電圧を印加することによってキャピラリー内でキャピラリーゾーン電気泳動によって分離されることが可能である。
【００２０】
以下の図面は、本明細書の一部を成すものであり、また本発明のある種の実施形態又は様々な態様をさらに論証するために含めたものである。幾つかの事例において、本発明の実施形態は本明細書に提示した詳細な説明と併せて添付の図面を参照することによって最良に理解することが可能である。この説明及び添付の図面は、本発明に関するある具体的な例又はある種の態様を強調していることがある。しかし当業者であれば、こうした例や態様の一部を本発明の他の例や態様と組み合わせて使用し得ることを理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】開示した実施形態に従った代表的なインターフェースの概要図である。シース液は、ポンプ動電学的フローにより、ＨＶ２と質量分析装置の入口の間の電位差によって駆出することが可能である。分離は、キャピラリーの入口（ＨＶ１）と出口（ＨＶ２）の間の電位差によって駆動することが可能である。
【図１Ｂ】（Ｂ）質量分析装置を伴った代表的なインターフェースの概要図である。シース液は、ポンプ動電学的フローにより、ＨＶ２と質量分析装置の入口の間の電位差によって駆出することが可能である。分離は、キャピラリーの入口（ＨＶ１）と出口（ＨＶ２）の間の電位差によって駆動することが可能である。
【図２】一実施形態によるインターフェースの構成要素の図である。
【図３】ＣＺＥ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳシステムの図である。システムのスケッチ（Ａ）、エレクトロスプレー放出体内のエッチングされたキャピラリーのスケッチ（Ｂ）、及び放出体内のエッチングされたキャピラリーの顕微鏡写真（Ｃ）である。
【図４】ＣＺＥ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによって三重式に分析された１６ｐｇ量のＥ．ｃｏｌｉ消化物からのタンデムスペクトルに基づいて同定された５０の高強度ペプチドに関する抽出イオン電気泳動図である。抽出に関する質量許容値は２ｐｐｍであった。
【図５】１６ｐｇのＥ．ｃｏｌｉ消化物の三重ランに関するペプチド移動時間の相対標準偏差（ＲＳＤ）分布の図である。選択したイオン電気泳動図は、１５４の高強度ペプチドから作成した。ペプチドピーク抽出に使用した質量許容値は３ｐｐｍとした。教師なし式非線形最小二乗当て嵌め：Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ｔ）＝ａ×ｅｘｐ（−０．５＊（ｔ−ｔ０）２）／ｗｉｄｔｈ２＋ｏｆｆｓｅｔ（ここで、ｔは時間、ｔ０はピーク移動時間、ａはピーク振幅、ｗｉｄｔｈはガウス型の標準偏差でのピークの幅、またｏｆｆｓｅｔはｄｃオフセットである）を用いて電気泳動図に対してガウス関数を当て嵌めた。計算にはＭＡＴＬＡＢの当て嵌めルーチンを使用した。ａとｔ０の初期推定値には、各電気泳動図の最大点に関する振幅及び移動時間を使用した。ｗｉｄｔｈの初期推定値は３秒とした。ｏｆｆｓｅｔの初期推定値は電気泳動図の中央値とした。移動時間の相対標準偏差は、三重電気泳動図の各組ごとにｓｔｄ（ｔ０）／ｍｅａｎ（ｔ０）×１００％で計算した。
【図６】１６ｐｇ量のＥ．ｃｏｌｉ消化物からＣＺＥ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより三重式に同定したペプチドのピーク幅分布の図である。ピーク幅は、上の図５の説明に記載した非線形回帰分析から決定した。ガウス関数の半値全幅＝２．３５×ｗｉｄｔｈであり、また基準線の全幅は４×ｗｉｄｔｈである。
【図７】１６ｐｇ量のＥ．ｃｏｌｉ消化物からＣＺＥ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより三重式に同定したペプチドの理論段の数（Ｎ）の分布の図である。理論段の数は、Ｎ＝（ｔ０／ｗｉｄｔｈ）２（ｔ０及びｗｉｄｔｈは上の図５の説明に記載した非線形回帰分析で決定したもの）により計算した。
【図８Ａ】分析した１６ｐｇ量のＥ．ｃｏｌｉ消化物からのランの間のペプチド強度の相関関係（１６ｐｇ量のＥ．ｃｏｌｉ＿第１ランからのペプチド強度対１６ｐｇ量のＥ．ｃｏｌｉ＿第２ランからのペプチド強度）の図である。ペプチド強度は、ＭａｘＱｕａｎｔソフトウェア（ｖ．１．３．０．５）によるデータベース検索結果から取得しており、同定したペプチド配列に関連付けされたすべての同位体クラスターに関する抽出イオン電流（ｅＸｔｒａｃｔｅｄ  Ｉｏｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ；ＸＩＣ）の総和である。
【図８Ｂ】分析した１６ｐｇ量のＥ．ｃｏｌｉ消化物からのランの間のペプチド強度の相関関係（１６ｐｇ量のＥ．ｃｏｌｉ＿第１ランからのペプチド強度対１６ｐｇ量のＥ．ｃｏｌｉ＿第３ランからのペプチド強度）の図である。ペプチド強度は、ＭａｘＱｕａｎｔソフトウェア（ｖ．１．３．０．５）によるデータベース検索結果から取得しており、同定したペプチド配列に関連付けされたすべての同位体クラスターに関する抽出イオン電流（ｅＸｔｒａｃｔｅｄ  Ｉｏｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ；ＸＩＣ）の総和である。
【図８Ｃ】分析した１６ｐｇ量のＥ．ｃｏｌｉ消化物からのランの間のペプチド強度の相関関係（１６ｐｇ量のＥ．ｃｏｌｉ＿第２ランからのペプチド強度対１６ｐｇ量のＥ．ｃｏｌｉ＿第３ランからのペプチド強度）の図である。ペプチド強度は、ＭａｘＱｕａｎｔソフトウェア（ｖ．１．３．０．５）によるデータベース検索結果から取得しており、同定したペプチド配列に関連付けされたすべての同位体クラスターに関する抽出イオン電流（ｅＸｔｒａｃｔｅｄ  Ｉｏｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ；ＸＩＣ）の総和である。
【図９Ａ】Ｅ．ｃｏｌｉ消化物の装填量とタンデムスペクトル（線で繋いだ点）及び精密質量保持時間タグ（星印＝ＡＭＴ）に基づいた同定との間の関係の図である。タンパク質同定である。各サンプルは二重又は三重式で分析した。４００ｆｇ量のＥ．ｃｏｌｉ消化物からのＡＭＴに基づいた同定には星印で標識を付けた。エラーバーは平均値の標準偏差である。
【図９Ｂ】Ｅ．ｃｏｌｉ消化物の装填量とタンデムスペクトル（線で繋いだ点）及び精密質量保持時間タグ（星印＝ＡＭＴ）に基づいた同定との間の関係の図である。ペプチド同定である。各サンプルは二重又は三重式で分析した。４００ｆｇ量のＥ．ｃｏｌｉ消化物からのＡＭＴに基づいた同定には星印で標識を付けた。エラーバーは平均値の標準偏差である。
【図１０】精密質量保持時間タグ（ＡＭＴ）法に基づいた、４００ｆｇ量のＥ．ｃｏｌｉ消化物からの同定ペプチドの抽出イオン電気泳動図（上側）、及び１６ｐｇ量のＥ．ｃｏｌｉ消化物からの対応する電気泳動図（下側）である（電気泳動図の１５３の追加対は図示せず）。ピーク抽出に使用した質量許容値は３ｐｐｍとした。
【図１１Ａ】ペプチド検出限界の計算のために４００ｆｇ量のＥ．ｃｏｌｉ消化物からＭＳ／ＭＳにより同定した３つの伸長因子Ｔｕペプチドの一つの抽出イオン電気泳動図である。
【図１１Ｂ】ペプチド検出限界の計算のために４００ｆｇ量のＥ．ｃｏｌｉ消化物からＭＳ／ＭＳにより同定した３つの伸長因子Ｔｕペプチドの一つの抽出イオン電気泳動図である。
【図１１Ｃ】ペプチド検出限界の計算のために４００ｆｇ量のＥ．ｃｏｌｉ消化物からＭＳ／ＭＳにより同定した３つの伸長因子Ｔｕペプチドの一つの抽出イオン電気泳動図である。
【図１２】ＣＺＥ−ＰＲＭ分析後におけるアンジオテンシンＩＩの装填量及びフラグメントイオン（ｙ２＋及びｂ６＋）強度に関する広ダイナミックレンジ較正曲線の図である。これらの線はｌｏｇ−ｌｏｇデータに対する非重み付け線形当て嵌めの結果である。
【図１３】三重式ＣＺＥ−ＰＲＭ分析からの異なる装填量（２ａｍｏｌｅ〜１５０ｆｍｏｌｅ）に関する移動時間とアンジオテンシンＩＩフラグメントイオンの強度（ｙ２＋）との相対標準偏差（ＲＳＤ）の図である。
【図１４】ＣＺＥ−ＥＳＩ−ＭＳ分析後におけるＭＣＦ７消化物の基準ピーク電気泳動図である。（Ａ）分離全体、（Ｂ）１２〜１８分の分離に関する詳細である。データは、ガウス型カーネル及びスパンを１０点としたＬｏｗｅｓｓフィルタによって処理した。サンプル装填量は約６０ｎｇとし、キャピラリーは内径２０μｍ及び長さ１００ｃｍとし、分離バッファは０．５％（ｖ／ｖ）ＦＡとし、また分離には電界強度２８０Ｖ／ｃｍを使用した。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書では、動電学的ポンピング式シースフローエレクトロスプレーインターフェース及びキャピラリー電気泳動と結合させたときのその使用の論証について説明している。有用なキャピラリー電気泳動システムについては、ＷｏｊｃｉｋらのＲａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．  ２０１０；２４：２５５４〜６０を参照されたい。以前のインターフェースに対する有意な修正について本明細書で説明しており、この修正によって概ね２桁の感度改良が得られる。この改良型のインターフェースは、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解液の４００フェムトグラムのトリプシン消化物を含む多種多様な消化物の分析について使用されている。当該消化物においては、６０を超えるタンパク質から１５４のペプチドが１０分の分析で同定される。同じタンパク質からの３つのペプチドについての質量検出限界は概ね１ゼプトモル（６００分子）である。この改良型インターフェースによって、ボトムアップタンパク質同定に関する技術水準においては２桁の改良、またＭＳベースのペプチド検出限界に関する技術水準においては１桁の改良がもたらされる。
【００２３】
テーパ付きのキャピラリーの重要性は、市販の電気泳動計器で使用されるキャピラリーの寸法からその一部が生じている。当該計器（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎの計器）は典型的には、３７５マイクロメートル外径の溶融シリカ製キャピラリーを使用している。当該キャピラリーは、あまりに大きすぎるため本明細書に記載した改良型のインターフェースで使用することができない、その理由はキャピラリー先端から放出体オリフィスまでの距離を短縮しようと試みるとき標準キャピラリー先端が放出体に突き当たってしまうからである。キャピラリーの遠位端を修正する（例えば、その外径を低減する）ことによって、これらは本明細書に記載したインターフェースと適合するようになる。
【００２４】
定義
以下の定義は、本明細書及び特許請求の範囲に関する明瞭であり且つ一貫した理解を実現するために含めたものである。本明細書で使用する場合に、記載した用語は以下の意味をもつものとする。本明細書で使用している他の用語及び言い回しはすべて、当業者により理解される通常の意味を有するものとする。このような通常の意味は、Ｈａｗｌｅｙ’ｓ  Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  第１４版（Ｒ．Ｊ．Ｌｅｗｉｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、２００１）などの技術辞典を参照することにより得ることができる。
【００２５】
明細書における「一実施形態」、「ある実施形態」、その他に対する言及は、記載した実施形態がある特定の態様、特徴、構造、部分又は特性を含み得るが、必ずしもすべての実施形態が当該の態様、特徴、構造、部分又は特性を含むとは限らないことを示している。さらに、このような言い回しは、明細書の他の部分において言及された同じ実施形態を示すことがある（ただし、必ずそうなるものではない）。さらに、ある実施形態に関連してある特定の態様、特徴、構造、部分又は特性を説明している場合、明示的に記載しているかどうかによらず、このような態様、特徴、構造、部分又は特性が他の実施形態により影響を受けること又は他の実施形態と関連することは当業者の知見の域内にあろう。
【００２６】
単数形の「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、コンテキストによって明瞭に否定の規定をしない限り複数言及を含むものとする。したがって例えば、「ある化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」に対する言及には、複数のこのような化合物を含み、したがってある化合物Ｘ（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｘ）は複数の化合物Ｘを含む。さらに本特許請求の範囲が任意選択の要素を全く排除するように記載され得ることに留意されたい。このため、この表明は、本明細書に記載した任意の要素との連携した「ただ単に（ｓｏｌｅｌｙ）」、「のみ（ｏｎｌｙ）」、その他などの排除的用語法の使用、及び／又は特許請求要素の記載や「否定的（ｎｅｇａｔｉｖｅ）」限定の使用のための先行基準の役割をするように意図したものである。
【００２７】
「及び／又は」という用語は、その用語が関連付けされる項目のうちの任意の１つ、これらの項目の任意の組み合わせ、又はこれらの項目のすべてを意味する。「１つ又は複数の」及び「少なくとも１つの」という言い回しは、特にその使用されるコンテキストで読めば当業者は容易に理解されよう。例えばこの言い回しは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、１０個、１００個、又は記載した下側限界より概ね１０倍、１００倍又は１０００倍大きな任意の上側限界を意味することが可能である。例えば、１つ又は複数の検体とは、１つ、１つ又は２つ、１つから３つ、１つから４つ、１つから５つ、１〜１０個、１〜１００個、又は１〜５００個の異なる検体や異なる種類の検体を示すことが可能である。
【００２８】
「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、指定された値に関する±５％、±１０％、±２０％又は±２５％の変動を示すことが可能である。例えば「約５０」パーセントとは幾つかの実施形態では、４５〜５５パーセントまでの変動を帯びることが可能である。整数の範囲の場合に「約」という用語は、その範囲の両端において記載された整数を超える及び／又は記載された整数未満の１つ又は２つの整数を含むことが可能である。本明細書で特に否定の記述をしない限り、「約」という用語は、個別の成分、組成又は実施形態の機能に関した等価である記載の範囲に近い値（例えば、重量パーセント）を含むように意図している。「約」という用語はまた、この段落の上の検討のように、記載した範囲の端の点の変更が可能である。
【００２９】
当業者であれば理解されるように、成分の量や、分子量、反応条件などの特質、その他を表現するものを含む数値のすべては近似値であり、またすべての事例について「約」という用語によって任意選択で修飾されるものと理解される。これらの値は、当業者が本明細書の説明の教示を利用して得ようとする所望の特質に応じて様々となる可能性がある。さらに、このような値は、当該の試験計測値から得られる標準偏差に由来するのが必然的である変動性を本来的に包含することを理解されたい。
【００３０】
ありとあらゆる目的（特に、記載の説明の提供に関する目的）について、本明細書に示したすべての範囲がまた、ありとあらゆる可能な下位範囲並びにその下位範囲の組み合わせ、さらにまたこの範囲を形成する個々の値（特に、整数値）を包含することは当業者であれば理解されよう。記載した範囲（例えば、重量パーセントや炭素基）は、当該範囲内にある具体的な各値、整数、小数、又は恒等を含む。リストした任意の範囲は、同じ範囲が少なくとも２等分、３等分、４等分、５等分、又は１０等分に細分割されることを十分に示し且つ当該細分割が可能であると容易に認識することが可能であろう。非限定の例として、本明細書で検討している各範囲は、下側３分の１、中間３分の１及び上側３分の１、その他に容易に細分割可能である。さらに、「〜までの（ｕｐ  ｔｏ）」、「少なくとも」、「を超える（ｇｒｅａｔｅｒ  ｔｈａｎ）」、「〜未満の（ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ）」、「〜より多くの（ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ）」、「〜以上の（ｏｒ  ｍｏｒｅ）」、その他のすべての言語表現は記載した数値を含むと共に、このような用語は上で検討したように下位範囲まで引き続き細分割することが可能な範囲を指すものであることは当業者であれば理解されよう。同様の方式で、本明細書に示したすべての比率もまた、より広い比率の域内にあるすべての下位比率を含む。したがって、ラジカル、置換成分について示した具体的な値及び範囲は、単に例証を目的としており、これによってラジカル及び置換成分に関する規定された範囲にある別の規定された値又はその他の値が排除されるものではない。
【００３１】
当業者であればまた、構成対象が、マーカッシュグループの形など通常の方式で一体にグループ分けされている場合に、本発明が全体としてリストされたグループ全体を包含するだけではなく、グループの各構成対象を個別にまた主グループの可能なすべての下位グループも包含することを容易に認識されよう。さらにすべての目的において、本発明は主グループを包含するだけではなく、グループ構成対象のうちの１つ又は複数を欠いた主グループも包含する。本発明ではしたがって、示したグループの構成対象のうちの任意の１つ又は複数に関する明示的な排除が想定される。したがって、但し書きは開示した範疇又は実施形態のいずれにも適用し得るものであり、記載した元素、化学種又は実施形態のうちの任意の１つ又は複数が、例えば明示的な否定的限定で使用するために、こうした範疇又は実施形態から排除されることがあり得る。
【００３２】
「接触して（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」という用語は、接触するという動作、接触させるという動作、或いは細胞又は分子レベルでの近接を含め密接又は近接近状態にするという動作であり、これにより例えば、溶液中、反応混合物中、インビトロ又はインビボで生理学的反応、化学的反応、又は物理的変化が引き起こされるものを示している。
【００３３】
「有効量」とは、反応混合物内での生成物の形成に必要な量など記載した効果をもたらすために有効となる量を示している。有効量の決定は、特に本明細書で提示した開示の詳細に照らした際に当業者の能力域内にあるのが典型的である。「有効量」という用語は、例えば反応混合物における生成物の形成に有効である、本明細書に記載したある化合物や試薬の量、又は本明細書に記載したある化合物や試薬の合成体の量を含むように意図している。したがって、「有効量」とは一般に、質量分析図を取得するためのタンパク質の最小量など所望の効果をもたらす量のことを意味する。
【００３４】
「ナノスプレー」という用語は、大きさがマイクロメートル未満の液滴からなるエアロゾルを生成する方法、又はこのようなプロセスの生成物のことを示している。ナノスプレーは、静電界が液体の表面張力に打ち克って液体のジェットを形成するエレクトロスプレーイオン化の一形態である。ナノスプレーは、マイクロメートルサイズの出口及びｎＬ／分範囲の流量を有するガラス製キャピラリーを利用することが可能である。
【００３５】
「電気浸透性フロー」という用語は、キャピラリーチューブ、マイクロチャンネル又は他の流体コンジットにかけられた印加電位によって誘導される液体の移動を示している。
【００３６】
シースフローエレクトロスプレーインターフェース
キャピラリー電気泳動（ＣＥ）とエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＭＳ）とをハイフンで繋げることは１９８０年代後半に開発されたものであり、この時以降、本技法の組み合わせ使用が着実に進展してきた。キャピラリー電気泳動−エレクトロスプレーイオン化インターフェースは一般に、シースレス、コアキシャルシースフロー、及び液体接合インターフェースという３つのカテゴリーに分類される。
【００３７】
シースフローインターフェースは、分離キャピラリーから移動したものに従って検体と混合するコアキシャルシース液を使用する。シース液は、電気泳動分離とエレクトロスプレーイオン化源の間に電気的接触をもたらす。シース液はまた、分離バッファがＭＳ検出とより高い適合性となるように分離バッファを修飾することが可能である。現在市販されているシースフローインターフェースでは、分離キャピラリーの遠位端を、キャピラリーの端部がチューブより先まで延びるようにして同心性のチューブに挿入している。電気的接触は、チューブから突き出たキャピラリーを越えて流れるシース液によってなされており、またスプレー形成を支援するように噴霧器ガスが供給される。シース液は安定したスプレーが維持される速度でポンピングされており、またインターフェースは比較的高いシース流量（典型的には、毎分２、３マイクロリットルから数マイクロリットルの範囲）で動作しており、これによりかなりのサンプル希釈を生じる可能性がある。
【００３８】
液体接合インターフェースでは、分離キャピラリーとエレクトロスプレー放出体オリフィスをわずかなギャップだけ離間させている。エレクトロスプレーを駆出するようにこのギャップによって電気的接触がなされている。しかしながら、このギャップは分離効率の低下を及ぼす可能性がある。
【００３９】
シースレスインターフェースによれば、シース液に関連するサンプル希釈が排除され、より高い感度を生じさせる傾向がある。シースレスインターフェースでは、分離キャピラリーがエレクトロスプレー放出体の役割をすることが多い。シースレスインターフェースの設計に関する進行中の研究は、分離キャピラリーの遠位端での電気的接触の確立に重点を置いている。変形形態には、キャピラリーの外側先端を金属でコーティングすること、キャピラリー出口内部に電極を挿入すること、多孔性のエッチング済みキャピラリー壁を使用すること、及びマイクロダイアリシス接合を使用することが含まれる。シースレスインターフェースの大きな欠点は、分離条件から生じる非常に小さい流量に由来するスプレーの不安定性、さらにまたポストカラムケミストリーがないことによる分離バッファ選択の制限がある。
【００４０】
シースフローとシースレスインターフェースの両方の最初の設計に関連する問題のうちの幾つかを克服するために、低フローバージョンのシースフローインターフェースが導入された。この設計では、分離キャピラリーがテーパ付きのガラス製放出体の内部に挿入されている。放出体内には第２のキャピラリーが挿入されており、１μＬ／分の流量のポンピングでシース液を供給する。エレクトロスプレー電圧は、放出体内に挿入されたステンレス鋼製ワイヤによって供給される。
【００４１】
テーパ付きの放出体を備えるシースフローインターフェースは、より低流量への対応に関連するのみならず、脱溶媒の改善、感度の向上及び耐塩性の上昇にも関連するナノスプレーレジームで動作可能である。しかし、ＣＥ流出液からナノスプレーを製造しようとする試みでは、キャピラリー電気泳動質量分析法（ＣＥ−ＭＳ）の分野を前進させるために克服しなければならない多くの技術的問題が提起される。本明細書では、これらの問題を克服するためのシステム及び方法について記載することにする。
【００４２】
したがって一実施形態では、本発明は、キャピラリーからエレクトロスプレーを製造するためのシースフローインターフェースを実現する。本インターフェースは、（ａ）検体液を含有するように構成された、検体液を受け取るように構成された噴射端と検体流出液を排出するように構成された遠位端とを有するキャピラリーであって、当該遠位端のセグメントの外径は約２０μｍ〜約２００μｍ、約２０μｍ〜約１００μｍ、又は約４０μｍ〜約１００μｍの範囲内で低減された外径までテーパが付けられている、キャピラリーと、（ｂ）少なくともキャピラリーの遠位端を囲繞して共軸性に配置されたエレクトロスプレー放出体であって、キャピラリーの遠位端に関連して共軸性に配置された開口で終わるようにテーパが付けられた遠位端を有するエレクトロスプレー放出体と、（ｃ）エレクトロスプレー放出体の内部と液体連通するシース液リザーバであって、電導性のシース液がシース液リザーバから、キャピラリーとエレクトロスプレー放出体の中間の接続用フィクスチャを通過し、キャピラリーの遠位端を横断し、且つエレクトロスプレー放出体の遠位端にある開口を通過して流れることを許容するシース液リザーバと、を含むことが可能である。
【００４３】
シース液は、キャピラリーとエレクトロスプレー放出体の間に電気的接触を実現することが可能である。本シースフローインターフェースは、検体流出液と混合されたシース液の動電学的フローによって生成されたナノスプレーを製造するように構成することが可能である。動電学的フローは、エレクトロスプレー放出体とエレクトロスプレー放出体の開口に隣接するが物理的に接触しないように配置された標的面との間の電位によって生成することが可能である。本インターフェースはしたがって、キャピラリーからエレクトロスプレーを製造するために使用することが可能であり、このエレクトロスプレーは、蒸発光散乱検出、誘導結合型プラズマ検出、及び後続の分析のための表面上への標的分子エレクトロスプレー析出などエレクトロスプレーを利用可能な質量分析法の分析や他の分析技法のためのイオン源として使用することが可能である。
【００４４】
本シースフローインターフェースについて、図１Ａを参照しながらさらに説明することが可能である。インターフェース１００はキャピラリー１０２を含む。キャピラリー１０２は、検体液を受け取るように構成された噴射端１０４を含む。検体液は、当業者に知られた様々な手段によって噴射端１０４のところでキャピラリー１０２に導入することが可能である。例えば噴射端１０４は、クロマトグラフィカラムとインターフェースすることが可能であり、これによりクロマトグラフィカラムからの流出液がキャピラリー１０２に噴射するようにしている。キャピラリー１０２に検体を提供するための他の方法には、噴射端１０４を検体のリザーバと接触させるステップと、動電学的、流体静力学的又は流体力学的な噴射を実行するステップと、を含む。
【００４５】
キャピラリー１０２は、検体流出液を放出するように構成された遠位端１０６を有する。遠位端１０６の外側面直径は、キャピラリー１０２の残りの部分の外径と比較して低減させている。遠位端１０６の遠位セグメント（例えば、キャピラリー１０２の最終の０．１〜１０ｍｍ）は、約３０％〜約９０％だけ、又は約４０％〜約７５％だけ（多くの場合に、約６０％だけ）低減させた外径を有することが可能であり、一方内径は概ね同じのままである。したがって、キャピラリー１０２の外径が約１５０μｍである実施形態では、遠位端１０６の外径は、約２０μｍ〜約２００μｍ、約２０μｍ〜約１００μｍ、約４０μｍ〜約１００μｍ、約６０μｍ又は約５０μｍの外径まで低減することが可能である。
【００４６】
キャピラリーの遠位端の外径は、内径に影響を及ぼすことなく化学的に低減させるのが典型的である。他の実施形態では、例えば加熱及び引張り技法によって、外径が低減されたときに内径もまた低減する可能性がある。キャピラリーの遠位端の外径を低減するための他の技法には、機械的研削及びサンドブラスティングが含まれる。
【００４７】
本明細書で使用する場合に検体流出液とは、キャピラリー１０２の長さ方向に通過した遠位端１０６から放出される検体のことを指す。検体流出液は、動電学的力（例えば、電気浸透性及び／又は電気泳動フロー）を用いることによるなど様々な手段によってキャピラリー１０２を通るように移動させることが可能である。
【００４８】
キャピラリー１０２の周りにはエレクトロスプレー放出体１１０が配置される。エレクトロスプレー放出体は、少なくともキャピラリー１０２の遠位端１０６の周りに共軸性に配置させ、これによりキャピラリー１０２とエレクトロスプレー放出体１１０の開口１１４とが図１Ａに示したような軸Ａに沿って共軸性に配列されるようにしている。エレクトロスプレー放出体１１０の遠位端１１２は、開口１１４を形成するために放出体１１０のチューブ状円筒体部からテーパ付きとなっている。
【００４９】
エレクトロスプレーは、キャピラリー１０２を通り且つ放出体１１０の開口１１４を通る検体流出液から生成することが可能である。エレクトロスプレーを製造するために、放出体１１０の内部１１６を通って流れるシース液を提供することが可能である。シース液は、シース液リザーバ１２０から内部１１６に送達することが可能である。接続フィクスチャ１２４によって、シース液リザーバ１２０と内部１１６の間に液体連通を設けることが可能である。
【００５０】
エレクトロスプレーを製造するために、シース液は放出体１１０の内部１１６を通過し且つキャピラリー１０２の遠位端１０６を越えて流れることが可能である。シース液は、キャピラリー１０２の遠位端１０６を越えて流れる際に、キャピラリー１０２から放出された検体流出液と相互作用し、検体流出液を開口１１４の方向に押す。生成されるエレクトロスプレーはしたがって、検体流出液とシース液の混合液を含む。
【００５１】
エレクトロスプレーは、シース液リザーバ１２０と標的面１３０の間に少なくとも電圧ＨＶ２を印加することによって生成することが可能である。電圧ＨＶ２は、放出体１１０の内部表面のゼータ電位を使用してシース液の電気浸透性フローを駆出する。ＨＶ２電圧は、開口１１４からエレクトロスプレーを生成するのに十分な動電学的フローをもたらすことが可能である。このエレクトロスプレーをナノスプレーとすることが可能である。標的面１３０は、接地に又はある電圧に保持することが可能である。
【００５２】
幾つかの実施形態では、キャピラリー１０２に電圧ＨＶ１を印加することが可能である。エレクトロスプレーは次いで、電圧ＨＶ１とＨＶ２の組み合わせによって生成される放出体開口１１４の電界、又は標的面１３０の表面電位によって維持される。このような構成では、ＨＶ１とＨＶ２の両方の電位が放出体のところの電界に寄与する。放出体のところの電位がＨＶ２によってだけ制御されるのが理想的である。キャピラリーの抵抗は、ＨＶ１がエレクトロスプレーに対してほとんど影響を及ぼさないように十分に大きくするのが典型的である。一方で電気泳動は、ＨＶ１とＨＶ２の電位の差によって駆動される。ＨＶ２電圧又は標的面１３０の表面電位は、放出体において所望の電界を維持するように調節可能な追加の電位源である。
【００５３】
キャピラリー１０２はキャピラリー電気泳動（ＣＥ）のために使用することが可能である。インターフェースがＣＥ向けに構成されている場合、ＨＶ１からＨＶ２まで降下させた電圧によって、キャピラリー１０２を通過する１つ又は複数の検体に対する動電学的分離の形態の動電学的フローがもたらされる。
【００５４】
シース液は、キャピラリー１０２の遠位端１０６と放出体１１０の遠位端１１２の間にエレクトロスプレー生成プロセスを駆動させるのに十分な電気的接続がもたらされる導電率特性を有することが可能である。エレクトロスプレーが発生させる電流は、液体の伝導率と比例する可能性がある。代表的なシース液には例えば、５０％メタノール／アセトニトリル又はイソプロパノール中の１０ｍＭギ酸又は酢酸が含まれる。有機溶剤の百分率は関心対象の検体に応じて様々とすることが可能であることは当業者であれば理解されよう。シース液には、ギ酸アンモニウムや酢酸アンモニウムなどの揮発性塩を添加することが可能である。
【００５５】
検体は、キャピラリー１０２を通過する検体液によって運ばれる多種多様な組成の物質とすることが可能である。検体は検体液自体とすることがあり、或いは検体を検体液内に溶解させることがある。別法として、検体を検体液と不均一に混合させることがある。代表的な検体には、極性の小分子やその塩、及び大きな生体分子（例えば、代謝産物、ペプチド、タンパク質、脂質、グリカン、及び核酸）が含まれる。他の検体には、農薬、環境汚染物、薬剤やその混入物、代謝産物、その他が含まれる。
【００５６】
インターフェース１００の個々の構成要素に関するさらなる詳細について以下に含めている。
【００５７】
キャピラリー１０２は、検体流出液を提供するのに適当且つ有効な任意のキャピラリーとすることが可能である。代表的なキャピラリーは、ガラス（例えば、溶融シリカ）又はプラスチックから形成することが可能であり、またチューブ形態を有する円筒状の体部とすることが可能であり、この際にキャピラリーの内径は概ね約０．５マイクロメートル〜約５００マイクロメートルである。一実施形態では、その内径は、約５マイクロメートル〜約７５マイクロメートル、５マイクロメートル〜約２５マイクロメートル、５マイクロメートル〜約１５マイクロメートル、又は約１０マイクロメートルである。
【００５８】
放出体１１０は、ガラス、溶融シリカ、及び放出体について適当且つ有効な他の任意の材料から形成することが可能である。ＴＥＦＬＯＮなどのポリマーも使用可能であり、これは本明細書に記載したような放出体１１０に適した構造を形成するように成形が可能なセラミックや任意の非導体材料が可能であるのと同様である。放出体１１０は、遠位端１１２に向けたテーパ付けの手前では均一な円筒であるのが典型的である。しかし放出体１１０は、全体を通じてテーパ付きとすることや、非円形の断面を有することも可能である。
【００５９】
放出体１１０の内径は、キャピラリーの放出体１１０の内部への嵌め込みを可能にするためにキャピラリー１０２の外径より大きくなければならない。放出体１１０の内部１１６は、キャピラリー１０２の外側面と放出体１１０の内側面との間の空間によって規定される。
【００６０】
放出体１１０の開口１１４によって、生成されるエレクトロスプレーの形状及び大きさが部分的に規定される。一実施形態では、エレクトロスプレー放出体の遠位端の開口１１４は、直径が約０．５マイクロメートル〜約３０マイクロメートルである。開口１１４は円形であるのが典型的であるが、ある種の実施形態では開口が非円形である。
【００６１】
一実施形態では、キャピラリーの遠位端１０６とエレクトロスプレー放出体の遠位端１１２（すなわち、開口１１４、エレクトロスプレー放出体オリフィス）とが、約７５０マイクロメートル未満の距離だけ離間されている。別の実施形態では、キャピラリーの遠位端１０６とエレクトロスプレー放出体の遠位端１１２とが、約７００マイクロメートル未満、約５００マイクロメートル未満、約２５０マイクロメートル未満、約１００マイクロメートル未満、約５０マイクロメートル未満、約１０マイクロメートル未満、約５マイクロメートル未満、約１マイクロメートル未満、又は約０．５マイクロメートル未満の距離だけ離間されている。キャピラリーの遠位端と放出体の間の距離は、約１００ｎｍ程度に小さくすることが可能である。一実施形態では、キャピラリーの遠位端と放出体の間の距離が、約１５０マイクロメートル〜約２５０マイクロメートル、又は約２００マイクロメートルである。
【００６２】
別の実施形態では、キャピラリーの遠位端１０６をエレクトロスプレー放出体の遠位端１１２内に収めるように構成することが可能である。さらに、キャピラリーの遠位端１０６は、放出体オリフィス開口１１４より先に約１００μｍまで延ばすこと（ただし、外径キャピラリー１０６が放出体オリフィス開口１１４の直径より小さい場合）が可能である。幾つかの実施形態では、キャピラリーの遠位端１０６を、放出体オリフィス開口１１４より先に約５μｍだけ、約２５μｍだけ、約５０μｍだけ、約７５μｍだけ又は約１００μｍだけ、或いは前出の値のうちの任意の２つの間の範囲だけ延ばすことが可能である。この構成によれば、キャピラリーの遠位端１０６とエレクトロスプレー放出体の遠位端１１２とが約７５０マイクロメートル未満の距離だけ離間させたときと同様の結果が得られる。
【００６３】
バルブ、配管及び他の流体制御構成要素を接続フィクスチャ１２４として使用することが可能である。代表的な接続フィクスチャ１２４の一例を図２に示している。接続フィクスチャ１２４は、ＴＥＦＬＯＮや他のポリマー配管、ガラス、又は溶融シリカによって製作することが可能である。複数のシース流体の間（すなわち、複数のシース液リザーバ１２０の間）での切替えのために、所望であれば切替え用バルブを組み込むことが可能である。接続フィクスチャ１２４の寸法は、キャピラリー１０２及び放出体１１０の寸法に関連する。代表的な内径は約１０μｍ〜約５ｍｍであり、また長さは約１ｍｍ〜約３０ｃｍである。
【００６４】
インターフェース１００の動作は電位によって駆動するのが典型的である。一実施形態は、標的面１３０を接地又はカウンタ電位としてシース液リザーバ１２０への電位ＨＶ２の印加を実現する。ＨＶ２は、シース液リザーバ１２０に配置された電極に対する電気的接触によるなど幾つかの方法でシース液リザーバ１２０に印加することが可能である。例えば、シース液リザーバ１２０内にワイヤ電極を浸漬させることが可能であり、又はシース液リザーバ１２０の壁に電極を配置することが可能である。
【００６５】
一実施形態では、検体液は、動電学的力や機械的なポンピング力などの力によってキャピラリーを通るように移動させている。動電学的力は当業者によく知られており、誘電泳動及び電気浸透性又は電気泳動フロー（ただし、これらに限らない）を含む。
【００６６】
動電学的フローが使用される場合、任意選択の電圧ＨＶ１を使用することが可能である。ＨＶ１は、検体液に電気的に接触させることによって印加することが可能である。例えば、キャピラリー１０２の噴射端１０４に電極を配置させることがあり、又は噴射端１０４の近くで検体液に接触させるためにワイヤ電極を使用することが可能である。
【００６７】
検体液は、キャピラリーゾーン電気泳動、キャピラリー電気クロマトグラフィ、誘電泳動、又はこれらの組み合わせなどの技法によってキャピラリー内で分離させることが可能である。検体液は、キャピラリーの噴射端に入る前に液体クロマトグラフィによって分離させることが可能である。検体液は、必ずしも常にキャピラリーを通過するときに分離させる必要はない。その代わりにキャピラリーは、事前分離された流出液を受け取ると共に、エレクトロスプレーを生成するために検体を単に搬送するだけのことがある。検体液をキャピラリーに提供するためには、クロマトグラフィプロセスの流出液が提供されてキャピラリーの噴射端とインターフェースさせることが可能であれば、様々なクロマトグラフィ技法を使用することが可能である。
【００６８】
一実施形態では、検体液をキャピラリー内で電気泳動によって分離させており、この際にナノスプレーが電気浸透性フローによって生成されると共に、電気泳動と電気浸透性フローの両者は、キャピラリーの噴射端、シース液リザーバ及び標的面の間への電位の印加によって駆動されている。
【００６９】
幾つかの実施形態では、シースフローインターフェース１００は質量分析装置に対して分析のためにナノスプレーを提供するように構成されている（図１Ｂ参照）。この実施形態では、標的面１３０は質量分析装置の入力オリフィスである。このような構成を、以下の例でより詳細に説明することにする。
【００７０】
インターフェース１００が質量分析法に使用される場合、シース液は質量分析装置との検体流出液の適合性を高めるように構成することが可能である。検体流出液それ自体がＭＳに適合しない場合、有効なＭＳを容易にするようにシース液を選択することが可能である。例えば、検体流出液を提供するためにＣＥが使用される場合、幾つかの共通バッファがＭＳと適合しないことがある。しかし、適正なシース液を使用すれば、バッファとその中に含有された検体をＭＳによって分析することが可能である。
【００７１】
本発明はまた、本明細書に記載したようなシースフローインターフェースを用いてキャピラリーから検体流出液のナノスプレーを製造するための方法を実現する。一実施形態では本方法は、シース液の電気浸透性フローを、シース液リザーバから、キャピラリーとエレクトロスプレー放出体の中間の接続用フィクスチャを通過し、キャピラリーの遠位端を横断し、且つエレクトロスプレー放出体の遠位端にある開口を通過して駆出させるのに十分な電圧をシース液リザーバに印加するステップを含む。検体流出液は、キャピラリーの噴射端に電圧を印加することによってキャピラリー内でキャピラリー電気泳動により分離することが可能である。しかし他の実施形態では、検体流出液は、液体クロマトグラフィ（又は、他の分離方法）によってキャピラリーに入る前に分離させている。さらに他の実施形態では、検体流出液は、キャピラリーを通って入る前にもキャピラリーを通過する間にも分離させていない。上に記載したように、このシースフローインターフェースは、エレクトロスプレーがイオン化され、分析のために質量分析装置の入力オリフィスに導き入れられている質量分析法向けのイオン化源として使用することが可能である。
【００７２】
ＣＥ−ＭＳナノスプレーインターフェースの設計及び試験
本開示は、非常に低いシース流量によって（任意選択では、ポンプや噴霧器ガスを伴うことなく）安定したスプレーが達成されているナノスプレーシースフローインターフェースを実現する。分離キャピラリーはテーパ付きガラス製ＥＳ放出体などの放出体の内部に配置することが可能である。シース液は、放出体表面のゼータ電位によって生成される電気浸透によって駆出することが可能である。シース液は分離キャピラリーの端部を越えて流れて、回路が閉じられると共に先端の内部のキャピラリー流出液と混合される。キャピラリー、エレクトロスプレー放出体及びシース液配管は、例えばＰＥＥＫクロスによって接続することが可能である。放出体先端サイズが小さい（２〜１０μｍ内径）ため、ナノスプレーレジームでの動作が可能となる。
【００７３】
以前のインターフェース設計では、エレクトロスプレー電圧はエレクトロスプレー先端に直接印加されており、このため放出体の内部に金属製や金属被覆の放出体やワイヤ電極を使用する必要があることが多い。これらの金属被覆の放出体の寿命は有限であり、また交換しなければならないことも多い。金属放出体はガラスと比べてより堅牢ではあるが、金属表面上のレドックス反応がバブル形成やコロナ放電につながることが多く、これによりエレクトロスプレーの感度及び安定性が制限される。ワイヤ電極もまた制限を有する。例えば、乱流や分離効率の損失を生じる可能性がある。先端に電流を供給するためには炭素被覆及び導電性ポリマー被覆のキャピラリーが使用されてきた。しかし、炭素被覆は寿命に限界があり、また定期的に交換しなければならない。さらに、導電性ポリマーは、放出体の外部に付着させなければならず、この付着によって放出体先端が詰まることがある。これらの問題は、先端への電圧を間接的に印加することによって（例えば、シースバッファリザーバに配置した白金電極によって）回避することが可能である。
【００７４】
［インターフェース］インターフェースの概要を図１Ｂに示す。分離キャピラリーは、クロスフィッチング（例えば、０．５ｍｍ内径の５ｍｍ長のクロスチャンネル）を用いてガラス製エレクトロスプレー放出体内に挿通することが可能である。クロスの一方のアームには、シース液リザーバの役割をするマイクロ遠心チューブに突き入れられたＨＰＦＡ配管（０．５ｍｍ内径）を据え付けることが可能である。リザーバ内の液体の高さは、流体力学的なフローを回避するために放出体先端と同じ高さに保持することが可能である。高電圧を、キャピラリーの噴射端に対して（ＨＶ１）、またシース液リザーバに対して（ＨＶ２）印加することが可能である。分離は、この電位の差によって駆動することが可能である。ＨＶ２は放出体内で電気浸透性のフローを駆動する電位をもたらすことが可能である。質量分析装置入口は、接地電位に保持することが可能である。クロスのもう一方のアームは、実験の開始時点でインターフェースをシース流体でフラッシュするために使用することが可能である。
【００７５】
様々な実施形態では、エレクトロスプレー放出体を、１０ｃｍ長のホウケイ酸ガラス製のキャピラリー（１ｍｍ外径、０．７５ｍｍ内径）から引き出すこと（例えば、Ｐ−１０００  Ｓｕｔｔｅｒ  Ｐｕｌｌｅｒによる）が可能である。使用する先端サイズは、テーパ付け長さを約３ｍｍとして約２μｍ〜約５０μｍ内径、又は約２μｍ〜約１０μｍ内径の範囲とすることが可能である。先端直径は、先端の顕微鏡下での検査によって決定することが可能である。先端の外径を書き留めておくことが可能であり、また内径は、最初のガラス製キャピラリーの内径対外径の比に基づいて決定することが可能である。
【００７６】
インターフェースの一例に関する詳細図を図２に示す。溶融シリカ分離キャピラリー（５０μｍ内径、１５０μｍ外径、４５ｃｍ長）をＰＥＥＫコーンポートクロス（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ）に挿通させることが可能である。キャピラリーは次いで、エレクトロスプレー放出体に挿通される。キャピラリー及び放出体先端は、スリーブ、フェルール及びマッチングナットによって適所に保持させることが可能である。キャピラリー先端から放出体先端までの距離は、フィッチングが締め付ける際にシステムを顕微鏡下で観察しながら調整することが可能である。シース液は、クロスに接続したＨＰＦＡ配管によってエレクトロスプレー先端に導入される。クロスの第４のポートは、シリンジに接続されると共に、実験の開始時点でインターフェースをシース液でフラッシュするために使用することが可能である。
【００７７】
電圧は、流れるバッファと接触した白金電極によって電源（例えば、Ｓｐｅｌｌｍａｎ  ＣＺＥ  １０００Ｒ）から、シース液リザーバまで伝達することが可能である。クロスは、Ｔｈｅｒｍｏ  ＬＣＱイオントラップ計器のソースに配置された並進段に取り付けることが可能である。
【００７８】
［ＣＥ−ＭＳ］ＣＥ−ＭＳ実験は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱイオントラップ計器などの計器によって実施することが可能である。サンプルは、酵素やペプチドなどの生体分子とすることが可能である。キャピラリーは、０．１ＭのＨＣｌでコンディショニングした後、１ＭのＮａＯＨで、また次いで分離バッファでコンディショニングすることが可能であり、これらすべては使用前に５分間にわたり１０ｐｓｉ圧力下で噴射させている。
【００７９】
連続注入実験では、サンプルを分離キャピラリーに動電学的に導入することが可能である。連続注入は、最適なペプチド信号を得るように計器をチューニングするために使用することが可能である。キャピラリー電気泳動分析では、サンプルを動電学的に噴射することが可能である。様々な実験において、放出体先端はイオン源から約２ｍｍ離して配置させることが可能である。有効なチューニングパラメータ組の１つには、−３８Ｖのレンズ電圧及び１６５℃のキャピラリー温度が含まれる。
【００８０】
正イオンモード実験では、分離バッファを例えば、約１０ｍＭの酢酸アンモニウム、ｐＨ７．８とすることが可能であり、且つシース液を約１０ｍＭの酢酸水溶液とメタノールの等体積混合物とすることが可能である。
【００８１】
負イオンモード実験では、電気浸透性フローを最小限にするためにキャピラリーにＵｌｔｒａｔｒｏｌ  ＬＮ（Ｔａｒｇｅｔ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、ＴＭ）被覆を施すことが可能である。分離バッファは、１０ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ８）からなることが可能であり、またシース液は１０ｍＭの酢酸アンモニウム水溶液とメタノールの等体積混合物とすることが可能である。
【００８２】
等電気浸透性フローでは、分離バッファとシース液の電位の比を、分離バッファとシース液の流量の比と比例させることが可能である。
【００８３】
［キャピラリー出口と放出体先端の間の距離］キャピラリー出口から放出体出口までの距離は、ＥＳＩ放出体の性能に大きな影響を及ぼす。米国特許出願公開第２０１３／０１４０１８０号（Ｄｏｖｉｃｈｉら）はシースフローインターフェースについて記載していると共に、分離キャピラリーの遠位端と放出体の先端の間の距離が２ｍｍから１ｍｍまで低減される（低減されたカラム外バンド拡大の結果としてピーク振幅が狭くなり且つ上昇する）ような実験が実施されている。しかし、米国特許出願公開第２０１３／０１４０１８０号（Ｄｏｖｉｃｈｉら）の装置及び技法を使用する際には、放出体の先端の内径及びキャピラリーの外径が物理的障壁となり、キャピラリーの遠位端が放出体の先端から８００μｍを超えて近づくことができなかった。キャピラリーの遠位端の外径エッジと放出体の先端の内径とがこのような非常な接近すると、信号振幅が低下すること、クロマトグラフィ性能でピークが幅広になること、及びプレートカウントが低下することを含むシステム性能の劣化が生じていた。
【００８４】
キャピラリーの遠位端を放出体先端により近づけようとする試みは放出体壁との接触によって物理的に妨げられる。この問題は、市販の多くの電気泳動計器に見られる大きな外径（例えば、３７５マイクロメートル）のキャピラリーを使用する場合に特に重大である。こうしたキャピラリーでは、キャピラリー出口と放出体オリフィスの間の分離距離を数ミリメートルとする必要があり、これにより感度が大幅に低下することになる。このような大外径のキャピラリーの遠位端を放出体先端の近くにもって来ると、キャピラリー先端の破損が生じ、計器の分解及び再組み上げを要する可能性がある。
【００８５】
本明細書には、ガラス製キャピラリーの外径をエッチングするなどによってキャピラリーの外径を低減することによって、キャピラリーの遠位端を放出体オリフィスのより近くにもって来ることを可能にしたこの問題に対する解決法を記載している。キャピラリーの外側面に対する慎重なエッチングによって、キャピラリーを（すなわち、図３の（Ｂ）に示した実施形態のさらなるエッチングによって）放出体の先端から１００ｎｍ程度の近さにもって来ることが可能である。キャピラリーの遠位端をその外側直径が放出体オリフィスの直径と比べてより小さくなるように修正すると、放出体の先端もまた放出体オリフィス内に収まると共に、放出体オリフィスを最大１００マイクロメートルまで越えるように構成することが可能である。分離キャピラリーの先端と放出体の先端の間のこの短くした間隔、又は放出体オリフィスを通過するその延長によって、カラム外バンド拡大が大幅に小さくなる。
【００８６】
意外なことに、この修正によって、ボトムアップタンパク質同定に関する技術水準においては２桁の改良が、またＭＳベースのペプチド検出限界に関する技術水準においては１桁の改良が得られた。感度の上昇によって、非常に小さい量のサンプルからのペプチド検出が可能となった。さらに、同じ量の材料が与えられたときに、このシースフローインターフェースは従来設計と比べてより多くのペプチド及びタンパク質の検出が可能となる。さらに意外なことは、質量分析装置検出からのバックグラウンドがより清浄となったこと及びスプレー放出体寿命がより長くなったことである。インターフェースに対する修正によって、非常に小さいサンプルサイズ（例えば、４〜４００ｆｇのペプチド）を１２分未満の質量分析装置計器時間で分析可能とするインターフェースが得られた。約１ゼプトモル（約６００分子）程度の低い質量分析装置検出限界を得ることが可能であり、したがって概ね１アトグラム程度の少ない質量を検出することが可能である。したがって、感度が高くなったことで、本明細書に記載したようにより少ないサンプルの分析が可能となり、且つ以前のインターフェース設計で使用した同サイズサンプルからより多くのペプチドを同定することが可能である。
【００８７】
以下の実施例は、上の発明の例証を目的としており、その範囲を狭めるためのものと見なすべきではない。当業者であれば、これらの実施例が本発明を実施することを可能とさせる他の多くの方法を示唆することを容易に理解されよう。本発明の範囲の域内に留まりながらも多くの変形形態及び修正形態を実施し得ることを理解すべきである。
【００８８】
（実施例１）
実施例１  フェムトグラム量の複雑なプロテオーム消化物に対する超高感度且つ高速のボトムアップ分析
【００８９】
キャピラリーゾーン電気泳動を改良型のシースフローエレクトロスプレーインターフェースと結合させ、ボトムアップタンパク質分析で必要な材料の量について２桁の改良をもたらした。この実施例では、改良型のナノスプレーインターフェースに基づいた超高感度キャピラリーゾーン電気泳動−質量分析法システムについて説明することにする。本システムは、ピコグラムからフェムトグラム量のＥ．ｃｏｌｉ消化物などの消化物の分析に使用することが可能である。１６ｐｇの消化物からタンデム質量スペクトルに基づいて１００を超えるタンパク質を同定し、また４００ｆｇの消化物から精密質量保持時間タグに基づいて１０分間で６０を超えるタンパク質を同定した。
【００９０】
キャピラリー液体クロマトグラフィ（ＬＣ）−エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）−タンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）分析を用いたナノグラムサンプルに対するボトムアッププロテオミクスには、少なくとも１時間の計器時間が必要である。この実施例において発明者らは、改良型の動電学的ポンピング式シースフローインターフェースに基づいた超高感度且つ高速のキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳシステムを報告する。発明者らは、フェムトグラム量のＥ．ｃｏｌｉタンパク質消化物に対する迅速なボトムアップ分析のためのシステムについて例証する。
【００９１】
ＣＺＥ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳは、一部で改良型のインターフェースのために、低ナノグラムサンプルについてＬＣ−ＭＳ／ＭＳを一貫して性能で凌駕している。この実施例では、動電学的ポンピング式シースフローインターフェース（図３の（Ａ））に基づいた別のインターフェース（以前のシースフローインターフェースの一例については、Ｗｏｊｃｉｋら、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．  ２０１０、２４、２５５４を参照されたい）の開発について説明している。新たなインターフェースは、非常に低いシース流量に由来するサンプル希釈の低減、機械式ポンプの排除、広範な分離バッファ使用の許容、及びナノスプレーレジームでの安定した動作を含む幾つかの利点を有する。発明者らはまた、多重反応モニタリングを使用した複雑な混合物中におけるロイシンエンケファリン（Ｌｅｕ−ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）の定量化のためのインターフェースによってＣＺＥを三連四重極質量分析装置に対して結合しており、また発明者らはこのシステムの高感度分析の能力を示す３３５ｚｍｏｌｅのペプチド検出限界を得た（Ｌｉら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．２０１２、８４、６１１６）。
【００９２】
動電学的ポンピング式シースフローインターフェースのＣＯＭＳＯＬモデルの予測及び実験による検証によると、キャピラリーの遠位端を放出体オリフィスのより近くにもって来るに連れて感度は上昇する。キャピラリー先端とオリフィスの間の典型的な最小距離は、１５０マイクロメートル外径のキャピラリーを用いた場合に約１ｍｍであり、また３７５マイクロメートル外径のキャピラリーを用いた場合に２．５ｍｍである。距離しきい値のこの低減は、円錐状の放出体壁の内部に最終的に押し当てられる分離キャピラリーの外径によって制限されている。
【００９３】
本明細書に記載したように、発明者らは分離キャピラリー先端の外部を数ミリメートルだけフッ化水素酸によってエッチングし、外径を約１５０μｍから約６０μｍ又は約５０μｍまで低減した。この単純なステップによって発明者らは、キャピラリー端を放出体オリフィスにさらにより近づけて（例えば、約２００μｍ）（図３の（Ｂ）及び図３の（Ｃ））配置することが可能となり、これによりシステムの感度の劇的な改良が得られる。発明者らは、電気泳動については被覆のない溶融シリカ製キャピラリー（３２ｃｍ及び４０ｃｍ、１０μｍ内径／１５０μｍ外径）を、またペプチド同定についてはＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析装置を使用した。実験の詳細については、この実施例の以下の実験セクションに示している。
【００９４】
シリカ製キャピラリーの作成については、Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｐｉｐｅｔｔｅ  Ｃｏｏｋｂｏｏｋ（２０１１、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｕｔｔｅｒ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔａｃｔ／ｆａｑｓ／ｐｉｐｅｔｔｅ＿ｃｏｏｋｂｏｏｋ．ｐｄｆ）に説明されている。これらのキャピラリーは次いで、本明細書に記載したインターフェース向けのキャピラリーが得られるようにエッチングすることが可能である。一実施形態に従った有用なキャピラリーの一例は、寸法が２５〜３０ｃｍ長、１０μｍ内径／１５０μｍ外径を備えた、エッチングされた端部（約５ｍｍ長、約５０〜６０μｍ外径）を有するキャピラリーである。より大きな外径（例えば、２５０〜３００μｍ外径）を有するキャピラリーでは、エッチングされた端部の外径を約２００μｍ外径まで低減することが可能であり、この際に例えば、キャピラリー放出体は、キャピラリーの遠位端を放出体オリフィスから約７５０μｍ未満に存在することを許容するように構成される。キャピラリーの遠位端もまた、外径が約２０μｍ〜約１００μｍ、約２０μｍ〜約８０μｍ、約４０μｍ〜約８０μｍ、約６０μｍ〜約８０μｍ、約４０μｍ〜約６０μｍ、又は約５０μｍ〜約６０μｍまで低減されるようにエッチングすることが可能である。
【００９５】
発明者らは、２８ｐｇ量のＥ．ｃｏｌｉ消化物の分析に関する分離電圧の効果を先ず評価した。分離は、３２ｃｍ長のキャピラリーで１５ｋＶ（５００Ｖ／ｃｍ）及び１０ｋＶ（３００Ｖ／ｃｍ）で実施した。電気泳動図は、ＭａｘＱｕａｎｔソフトウェア（ｖ．１．３．０．５）（Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６、１３６７〜１３７２（２００８））によって作成した。１０ｋＶ電位によってより広い分離ウィンドウが生成され、これにより１５ｋＶと比較してかなり多くのタンパク質（１２９±１８対８８±１４）とペプチド（３７５±２７対２４６±１９）の同定が得られた。以下の研究では、３００Ｖ／ｃｍの電界を使用した。
【００９６】
発明者らは次いで、１６ｐｇのＥ．ｃｏｌｉタンパク質消化物の４０ｃｍキャピラリーによる分析に関する発明者らのＣＺＥ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳシステムの再現性について評価した。発明者らは、タンデム質量スペクトルの三重ボトムアップ分析に基づいて、１０５±１７のタンパク質及び２５６±９のペプチドを同定した。複雑なタンパク質消化物のタンデム質量スペクトル分析に関する技術水準は、１ｎｇレベルにおいて約１００のタンパク質同定である。発明者らのシステムは２桁少ないサンプルから同様の数のタンパク質同定を得た。
【００９７】
分離は再現性があり且つ高効率であった。５０のペプチドからの信号を足し合わせて、抽出イオン電気泳動図を作成した（図４）。１５４のペプチドの移動時間の平均相対標準偏差は０．７％であった（図５）。電気泳動ピークはかなりシャープであり、ピークの当て嵌めに使用されるガウス関数の標準偏差として定義される平均値幅は０．７ｓ（半値全幅１．６ｓ）であった（図６）。発明者らは、ペプチド分離に関して３００，０００を超える理論段という平均値を一貫して得た（図７）。ピーク強度もまたランの間で一貫していた（図８Ａ〜図８Ｃ）。分離は、１０分未満で完了しており、これは複雑なプロテオームの高感度ボトムアッププロテオミクスの技術水準と比べて分析時間の１桁の改良である。
【００９８】
発明者らは次に、タンデム質量スペクトルに基づいた同定数とＥ．ｃｏｌｉ消化物の装填量との間の関係を決定した（図９Ａ及び図９Ｂ）。二重４００ｆｇ装填では、タンデム質量スペクトルの手動評価後において、４±１のタンパク質に対応する９つのペプチドが高信頼に同定された。Ｅ．ｃｏｌｉにおける最も豊富なタンパク質（伸長因子Ｔｕ）は、総タンパク質質量の約１％を占めている。４００ｆｇのＥ．ｃｏｌｉ消化物の分析はしたがって、このタンパク質を約４ｆｇ含有することになる。タンデム質量分析法による同定に関するタンパク質最小量は、４ｆｇ未満（したがって、技術水準において２桁の改良を示す）である（Ｓｈｅｎら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．２００４、７６、１４４）。サンプル装填量を８４ｐｇまで増加させたとき、タンパク質とペプチドの同定数はそれぞれ１６２±８と５７０±１１まで増加した（図９Ａ及び図９Ｂ）。
【００９９】
発明者らはまた、１６ｐｇのＥ．ｃｏｌｉデータをデータベースとして用いてＳｍｉｔｈの精密質量保持時間タグ方式を適用した。４００ｆｇのＥ．ｃｏｌｉ消化物から、質量許容値を３ｐｐｍとし、移動時間許容値を０．３分（アラインメントなし）とし、且つ各ペプチドごとに少なくとも２つの検出同位体ピークとして、６０のタンパク質及び１５０のペプチドを超えるものが同定された（図９Ａ及び図９Ｂ）。代表的な抽出イオン電気泳動図を図１０に示す。この結果は、ＡＭＴベースのピコグラム未満プロテオーム分析に関する技術水準について、タンパク質同定の数で２０倍の改良である。
【０１００】
発明者らは最後に、４００ｆｇのＥ．ｃｏｌｉデータからのペプチド検出限界を評価した。発明者らは、１ｐｐｍの質量許容値によるＭＳ／ＭＳスペクトルに基づいて同定された伸長因子Ｔｕからの３つのペプチドについて電気泳動図を手作業で抽出した。信号対雑音比は、ピーク後０．３分〜２．３分のノイズ領域を用いてＸｃａｌｉｂｕｒソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって取得した（図１１Ａ〜図１１Ｃ）。サンプル（４ｆｇ）に存在する伸長因子Ｔｕの量とその分子量（約４３ｋＤａ）に基づいて、これらのペプチドの約１００ｚｍｏｌｅを分析のために取り出した。これらのペプチドは２７０〜２９０の信号対雑音比（Ｓ／Ｎ）を生成した、質量検出限界（Ｓ／Ｎ＝３）は約１ｚｍｏｌｅ（約６００分子）であり、これはＭＳベースのペプチド検出に関する技術水準において１桁の改良である。
【０１０１】
ＣＺＥ−ＭＳシステムから得られる高感度に関する説明を以下に含めるものとする。第１に、ペプチドがキャピラリー端からスプレー放出体端まで移動するのにかかる時間はわずか約０．２ｓ以下（発明者らの研究に基づく概算による）であり、これによりスプレー放出体内でのサンプル拡散が劇的に減少すると共により大きなペプチド信号が生成され、ペプチド検出限界の改善が得られる。第２に、分離キャピラリー中とスプレー放出体中での電気浸透性流量はバッファ及び印加電圧（約３００Ｖ／ｃｍ）が同様であるために概ね同じであり、また総スプレー流量は約２０ｎＬ／分であり、これにより高いイオン化効率が生じ、高い感度が得られる。第３に、発明者らはサンプル流量を低減し且つ非常に効率が高い分離をもたらすような内径がかなり狭いキャピラリーを利用している。
【０１０２】
発明者らはまた、この研究で得られたタンパク質同定数がペプチド分離ウィンドウが比較的短いために約２００のタンパク質であり、取得されるタンデムスペクトルの数が制限され、これにより生体サンプル中の比較的低い存在量のタンパク質の検出が制限されることを指摘しておく。ＣＺＥ−ＭＳシステムに基づいてタンパク質同定を改善するための方法は、ＣＺＥ−ＭＳ分析の前にオンライン／オフラインのペプチド事前分別を実行し、より長い分離キャピラリーを使用して分離を遅くすること、又は被覆のキャピラリーを用いて電気浸透を低下させると共に分離ウィンドウを大きくすることである。
【０１０３】
要約するとこの実施例は、フェムトグラムプロテオミクス分析のための超高感度で高スループットのＣＺＥ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳシステムについて説明している。このＣＺＥ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳシステムを用いて得られた結果は、タンデム質量分析法によるタンパク質同定に必要な材料の量に関して、ピコグラム未満量の複雑なタンパク質消化物から精密質量保持時間タグによって同定されるタンパク質の数に関して、ペプチド質量検出限界に関して、及び分析時間に関しての１桁〜２桁の改良である。このＣＺＥ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳシステムは、単一細胞分析に使用することが可能である。今日まで、単一細胞タンパク質分析に利用可能な最高感度のツールは、レーザ誘導式蛍光検出を利用している。高感度ではあるが、蛍光が発生させるのは本来的に、タンパク質同定に関する原始的な情報しか提供できない低情報コンテンツの信号である。１ｚｍｏｌ検出限界を有するＣＺＥ−質量分析法システムの開発は、比較的高い存在量のタンパク質に関する高信頼の同定による単一細胞タンパク質分析への扉を開いた。
【０１０４】
［材料］ウシの膵臓ＴＰＣＫ処理済みトリプシン、尿素、重炭酸アンモニウム（ＮＨ４ＨＣＯ３）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びヨードアセトアミド（ＩＡＡ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。アセトニトリル（ＡＣＮ）、ギ酸（ＦＡ）及びフッ化水素酸（ＨＦ）は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＵＳＡ）から購入した。メタノール及び水は、Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ  Ｂｕｒｄｉｃｋ  ＆  Ｊａｃｋｓｏｎ（Ｗｉｃｋｌｏｗ、Ｉｒｅｌａｎｄ）から購入した。溶融シリカ製キャピラリー（１０μｍ内径／１５０μｍ外径）は、Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐｈｏｅｎｉｘ、ＵＳＡ）から購入した。コンプリート、ミニプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＥＡＳＹｐａｃｋの形で提供される）は、Ｒｏｃｈｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）から購入した。ＰＥＥＫクロス、ナット、フェルール、スリーブ及びＰＨＦＡ配管などの器具類は、Ｉｄｅｘ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｏａｋ  Ｈａｒｂｏｒ、ＷＡ、ＵＳＡ）などの供給元から購入することが可能である。
【０１０５】
［Ｅ．ｃｏｌｉサンプルの作成］Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｄｈ５−Ａｌｐｈａ）をＦａｓｅｒｌらによって記載されたプロトコル（Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．２０１１、８３、７２９７）によって培養した。培養後、Ｅ．ｃｏｌｉペレットを先ず、ＰＢＳで（３回）洗った。次いで、ペレットをプロテアーゼ阻害剤を含有する８Ｍの尿素と１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）のバッファに懸濁させると共に、細胞溶解（ｌｙｓｉｓ）のために氷の上で１５分にわたり超音波処理した。溶解液は、１５分にわたり１８，０００ｇで遠心分離した後、ＢＣＡ法（Ｃｏｈｅｎら、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．２００８、１、１６５）によりタンパク質濃度計測をした。分取したタンパク質（９００μｇ）を低温のアセトンによって−２０℃で一晩沈殿させた。遠心分離後、タンパク質ペレットを再度低温のアセトンで洗い混入物を除去した。乾燥させるために室温（約２２℃）で数分間インキュベーションした後に、タンパク質を３００μＬの８Ｍ尿素を入れた１００ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８．５）で溶解させ、その後に、３７℃で６０分間にわたりタンパク質変性させ、６０℃で１時間にわたりＤＴＴ（８ｍＭ）で還元させ、且つ暗所で室温で３０分間にわたりＩＡＡ（２０ｍＭ）でアルキル化させた。
【０１０６】
次いで、１．２ｍＬの１００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８．５）を添加して尿素濃度を２Ｍ未満まで希釈した。最後に、分取した６０μＬの処理済みタンパク質溶液（３６μｇ）を３７℃において１／３０（ｗ／ｗ）のトリプシン／タンパク質比でトリプシンによって一晩消化させた。消化物は、反応を終了させるためにギ酸（ＦＡ）（０．５％最終濃度）で酸性化した。トリプシン消化物は、ＺｉｐＴｉｐＣ１８（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＵＳＡ）によって脱塩させた後、減圧濃縮装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍａｒｉｅｔｔａ、ＵＳＡ）によって凍結乾燥させた。乾燥済みのタンパク質消化物は、２０％（ｖ／ｖ）ＡＣＮを含有する０．０５％（ｖ／ｖ）ＦＡバッファ水溶液に溶解させ、０．１ｍｇ／ｍＬ及び０．０１ｍｇ／ｍＬ濃度の溶液を得て、次いでこれを分析に使用した。
【０１０７】
［分離キャピラリーの作成］弱い炎を用いて、溶融シリカ製キャピラリー（１０μｍ内径／１５０μｍ外径、約５０ｃｍ長さ）の一端から約３〜４ｃｍでポリアミド被覆を長さ１ｃｍだけ除去した。キャピラリー外径と比べて若干大きなドリル刃先によって２００μＬエッペンドルフチューブの底部に小さい穴を錐もみすることによって反応チェンバを作成した。キャピラリーは、キャピラリーの炎を当てた部分がエッペンドルフチューブの内部に保持されるようにして穴に挿通させた。
【０１０８】
最後に、約１５０μＬのフッ化水素酸（ＨＦ、約５０％ｗ／ｗ）をエッペンドルフチューブに加えると共に、室温においてフード中で約２０分間インキュベーションさせた。エッチング後にエッチングされた部分の外径は約６０μｍとなったが、キャピラリーの内径はＨＦと接触状態になかったため変化しなかった。キャピラリーの外部を脱イオン水で洗って残留ＨＦを除去し、次いでキャピラリーを約５ｍｍのエッチング領域が遠位端に来るようにして約４０ｃｍ長さに切断した。ＨＦ溶液を扱う間には、注意及び適正安全手順を用いるべきである。エッチングしたキャピラリーは、水酸化ナトリウム（１Ｍ）、脱イオン水、塩酸（１Ｍ）、脱イオン水、及び０．５％（ｖ／ｖ）ＦＡによって順次フラッシュした。
【０１０９】
［ＣＺＥ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析］キャピラリー電気泳動システムは以前に報告した構成要素から組み上げた（Ｍｏｉｎｉ、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．２００７、７９、４２４１；Ｌｉら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．８４、１６１７〜１６２２（２０１２）；Ｓｕｎら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．８５、４１８７〜４１９４（２０１３）を参照されたい）。図３の（Ａ）も参照されたい。２つのＳｐｅｌｌｍａｎ  ＣＺＥ  １０００Ｒ高電圧電源によって分離及びエレクトロスプレー向けの高電圧を実現した。電圧プログラミングはＬａｂＶｉｅｗソフトウェアによって制御した。
【０１１０】
分離キャピラリーの全長は、４０ｃｍ（４００ｆｇ、４ｐｇ及び１６ｐｇ量のＥ．ｃｏｌｉ消化物向け）又は３２ｃｍ（２８ｐｇ及び８４ｐｇ量のＥ．ｃｏｌｉ消化物向け）とした。分離バッファは、０．５％（ｖ／ｖ）ＦＡを脱イオン水に入れたものとし、またシース液は１０％（ｖ／ｖ）メタノールを含有した０．１％（ｖ／ｖ）ＦＡとした。サンプルは、０．０５％（ｖ／ｖ）ＦＡ及び２０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを含有するバッファ水溶液で溶解させた。サンプルは、空気圧（１０〜２０ｐｓｉ及び１〜９ｓ）によって分離キャピラリー内に噴射し、またサンプル噴射体積はポアズイユの法則に基づいて計算した。
【０１１１】
キャピラリーを質量分析装置に結合するためには動電学的ポンピング式シースフローインターフェースを使用した。エレクトロスプレー放出体は、ホウケイ酸ガラス製のキャピラリー（１．０ｍｍ外径、０．７５ｍｍ内径、及び１０ｃｍ長）からＳｕｔｔｅｒ  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔのＰ−１０００  ｆｌａｍｉｎｇ／ｂｒｏｗｎ型マイクロピペットプラーで引っ張って引き出した。放出体先端は、３ｍｍテーパが付いた外径約８μｍ及び内径６μｍとした。分離キャピラリーのエッチングした端部はＰＥＥＫコーンポートクロス（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ、Ｏａｋ  Ｈａｒｂｏｒ、ＵＳＡ）を介してスプレー放出体に挿通した。キャピラリー先端と放出体端の間の距離は約２００μｍとした（図３の（Ｂ）及び図３の（Ｃ）参照）。シース液は、クロスに接続されたＨＰＦＡ配管によってエレクトロスプレー先端に導入した。クロスの第４のポートは、シリンジに接続し実験の開始時点での放出体のフラッシュに使用した。
【０１１２】
スプレー電圧（ＨＶＩＩ、図３の（Ａ））は各実験について１．２ｋＶとした。高電圧Ｉ（ＨＶＩ、図３の（Ａ））は、３２ｃｍキャピラリーでは１１．２ｋＶ（また、４０ｃｍキャピラリーでは１３．２ｋＶ）とし、分離キャピラリーに約３００Ｖ／ｃｍの電界が生成されるようにした。分離条件を最適化しながら２８ｐｇ量のＥ．ｃｏｌｉ消化物を分析するためにＨＶＩとして１６．２ｋＶの電位も印加した。
【０１１３】
異なるサンプル装填量を得るために、４００ｆｇ実験用のサンプルとしては２０％（ｖ／ｖ）ＡＣＮを含有する０．０５％（ｖ／ｖ）ＦＡバッファ水溶液に０．０１ｍｇ／ｍＬのＥ．ｃｏｌｉ消化物を入れたものを使用し、また４ｐｇ実験及び８４ｐｇ実験用のサンプルとしては０．１ｍｇ／ｍＬＥ．ｃｏｌｉ消化物を使用した。各サンプルは二重又は三重式で分析した。
【０１１４】
データ依存収集モードでの実験には、Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。オービトラップ質量分析計においてｍ／ｚ３８０〜１，８００（２８及び８４ｐｇのＥ．ｃｏｌｉサンプル向け）及びｍ／ｚ４００〜１，０００（４００ｆｇ、４ｐｇ及び１６ｐｇのＥ．ｃｏｌｉサンプル向け）に対して分解能７０，０００（ｍ／ｚ２００）によりフルＭＳスキャンを収集した。標的値及び最大噴射時間は、１．００Ｅ＋０６及び２５０ｍｓ（１６、２８及び８４ｐｇのＥ．ｃｏｌｉサンプルの場合）；３．００Ｅ＋０６及び５００ｍｓ（４００ｆｇ及び４ｐｇのＥ．ｃｏｌｉサンプルの場合）とした。
【０１１５】
４００ｆｇのＥ．ｃｏｌｉ消化物分析では、チャージ状態が２又は３であり且つ強度が２．００Ｅ＋０３より高い２つの最高強度ピーク（Ｔｏｐ２法）を単離ウィンドウが２ｍ／ｚの四重極で順次単離させると共に、２８％の正規化衝突エネルギーでより高いエネルギーの衝突解離衝突細胞中でフラグメント化した、またタンデム質量スペクトルは分解能３５，０００（ｍ／ｚ２００）、標的値１．００Ｅ＋０６、及び最大噴射時間５００ｍｓによってオービトラップ質量分析計で収集した。
【０１１６】
４ｐｇのＥ．ｃｏｌｉ消化物分析については、Ｔｏｐ４法を適用し、タンデムスペクトルの最大噴射時間を２５０ｍｓとした。１６ｐｇのＥ．ｃｏｌｉ消化物分析については、Ｔｏｐ６法を使用した。タンデムスペクトルの最大噴射時間は１２０ｍｓとし、強度しきい値は４．００Ｅ＋０３とし、またチャージエクスクルージョンは１及び５以上とした。２８及び８４ｐｇのＥ．ｃｏｌｉ消化物分析については、Ｔｏｐ６法を使用した。タンデムスペクトルの最大噴射時間は１２０ｍｓとし、強度しきい値は８．００Ｅ＋０３とし、またチャージエクスクルージョンは１及び７以上とした。各実験について、動的エクスクルージョンは６．０ｓとし、マイクロスキャンは１とし、ペプチドマッチをオンとし、また同位体エクスクルードをオンにした。
【０１１７】
［データ分析］ＭａｘＱｕａｎｔソフトウェアバージョン１．３．０．５によって未加工ＭＳファイルを分析した。ＭＳ／ＭＳスペクトルは、フォワード及びリバースシーケンスを包含したＮＣＢＩ−Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＨ１）データベース（フォワード及びリバースシーケンスを含む８，３２０のエントリ）に対してＡｎｄｒｏｍｅｄａ検索エンジン（Ｃｏｘら、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．１０、１７９４）によって検索した。このＮＣＢＩ−Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＨ１）データベースにはまた共通混入物も含んでいた。ＭａｘＱｕａｎｔ分析には、プリカーサ質量許容値が１０ｐｐｍの初期検索、主検索（プリカーサ質量許容値５ｐｐｍ）、及びフラグメント質量許容値２０ｐｐｍを含めた。検索には、トリプシンとした酵素、メチオニン酸化の可変修飾、Ｎ末端アセチル化及び脱アミド化（ＮＱ）、並びにカルバミドメチルシステインの固定修飾を含めた。最小ペプチド長さは、アミノ酸７個に設定し、またミスドクリベージ（ｍｉｓｓｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ）の最大数は２に設定した。過誤発見率（ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ）は、ペプチドとタンパク質の両同定について０．０１に設定した。同じ組のペプチドによって同定されたタンパク質は１つのタンパク質群として報告した。タンパク質及びペプチドのテーブルは、リバースデータベース及び共通混入物からのペプチドとタンパク質の同定を除去するようにフィルタリングした。
【０１１８】
実施例２  定量的並列反応モニタリングに関するＣＺＥ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ
この実施例では、ペプチド存在量の定量的並列反応モニタリング及びヒト細胞株の単一ショットプロテオミクス分析に対するキャピラリーゾーン電気泳動−エレクトロスプレーイオン化−タンデム質量分析法（ＣＺＥ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）の使用について説明することにする。
【０１１９】
発明者らは、複雑なプロテオームのタンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）分析のためにキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を超高感度動電学的ポンピングのナノスプレーイオン化源と結合させた。発明者らは先ず、０．４５ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）消化物にスパイクしたアンジオテンシンＩＩの並列反応モニタリング（ＰＲＭ）分析のためにシステムを使用した。アンジオテンシンＩＩの装填量とアンジオテンシンＩＩフラグメントイオンの強度の間で較正曲線を作成した。ＣＺＥ−ＰＲＭにより、２ａｍｏｌｅ〜１５０ｆｍｏｌｅのアンジオテンシンＩＩ装填量に対応する４．５桁を超えるダイナミックレンジにわたって線形較正曲線を作成した。移動時間の相対標準偏差（ＲＳＤ）は＜４％とし、また１５０ｆｍｏｌｅのアンジオテンシンＩＩ装填量データ（約３６％ＲＳＤ）を除きフラグメントイオン強度のＲＳＤは約２０％以下とした。
【０１２０】
発明者らはさらに、ＣＺＥ−ＭＳ／ＭＳを用いたヒト細胞株の第１のボトムアッププロテオミクス分析のためにシステムを利用した。発明者らは、概ね８０ｎｇ装填量に対応するＭＣＦ７乳がん細胞株消化物の１時間の単一ショットＣＺＥ  ＭＳ／ＭＳ分析から２８３のタンパク質同定を生成した。ＭＣＦ７消化物は、Ｃ１８固相抽出カラムを使用して分取した。単一留分の単一ショット分析によって４６８のタンパク質同定が得られ、これはＣＺＥを用いた哺乳類プロテオミクスサンプルに関して報告されたタンパク質同定数において断然の最大数である。
【０１２１】
キャピラリー電気泳動（ＣＥ）−エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）−質量分析法（ＭＳ）は、インタクトタンパク質、ペプチド及び代謝産物を含む広範な検体を特徴付けるために使用されている。有用なＣＥ−ナノスプレーインターフェースの１つは、発明者らが開発した約５μｍオリフィスを有するガラス製放出体を利用したシースフローインターフェースである（Ｗｏｊｃｉｋら、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．  ２４（２０１０）２５５４）。ガラス表面での電気浸透によってシース流体が非常に低速で駆出される。このシースフローインターフェースは、非常に低いシース流量に由来する最小サンプル希釈、機械式ポンプ及びネブライジングガスの排除、広範な分離バッファの使用、並びにナノスプレーレジームでの安定した動作を含む幾つかの利点を有する。発明者らは、マイコバクテリウムマリナムのセクレトーム（Ｌｉら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．８４（２０１２）１６１７）、イースト溶解液の留分（Ｗｏｊｃｉｋら、Ｔａｌａｎｔａ  ８８（２０１２）３２４）、Ｅ．ｃｏｌｉプロテオーム（Ｚｈｕら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ．  ８１０（２０１４）９４）、ピコグラム量のＲＡＷ２６４．７細胞溶解液（Ｓｕｎら、Ａｎａｌｙｓｔ１３８（２０１３）３１８１）、及びＰＣ１２細胞溶解液（Ｚｈｕら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．８５（２０１３）７２２１）に対するショットガンプロテオミクス分析に関して動電学的ポンピング式シースフローナノスプレーインターフェースＣＥ−ＭＳ／ＭＳシステムを利用してきた。さらにこの動電学的ポンピング式シースフローナノスプレーインターフェースＣＥ−ＭＳ／ＭＳシステムをまた、トップダウンのインタクトタンパク質特徴付け（Ｓｕｎら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．８５（２０１３）５９８９）、ペプチド存在量の定量的多重反応モニタリング（ＭＲＭ）（Ｌｉら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．８４（２０１２）６１１６）、及びリン酸化ペプチド特徴付け（Ｍｏｕら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．８５（２０１３）１０６９２）にも利用した。
【０１２２】
上の実施例１において発明者らは、超高感度性能が得られる発明者らのインターフェースに対する簡単な修正について説明した。発明者らは、分離キャピラリー先端の外部を数ミリメートルだけフッ化水素酸によってエッチングし、外径を約１５０μｍ〜約６０μｍまで低減した。このステップによってキャピラリー先端を放出体オリフィスから２００μｍの域内に配置することが可能となり、システムの感度の大幅な改良が得られる（Ｓｕｎら、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．５２（２０１３）１３６６１）。１０μｍ内径の分離キャピラリー、Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析装置、及び改良型のＣＥ−ＭＳインターフェースを利用することによって、発明者らは、１ｚｍｏｌｅ（１ｚｍｏｌ＝１０−２１ｍｏｌ＝約６００分子）のペプチド検出限界（Ｓ／Ｎ＝３）を得た。１６ｐｇのＥ．ｃｏｌｉ消化物からタンデム質量スペクトルに基づいて１００を超えるタンパク質を同定し、また４００ｆｇのサンプル装填から６０のタンパク質からの１５４のペプチドを同定した。
【０１２３】
発明者らのグループは、２０１２年にＭ．ｍａｒｉｎｕｍのセクレトームのキャピラリーゾーン電気泳動分析に関して動電学的ポンピング式シースフローインターフェースを使用する一方、１４０のタンパク質群を同定した（Ｌｉら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．８４（２０１２）１６１７）。発明者らは、線形ポリアクリルアミド被覆キャピラリー及びスタッキング噴射を用いることによってペプチド分離を改良した。１００ｎｇのＥ．ｃｏｌｉ消化物から単一ショット分析によって１ｈ未満で概ね３００のタンパク質群を同定した（Ｚｈｕら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．８５（２０１３）２５６９）。タンパク質ＩＤの数は、オフラインＣ１８−ＳＰＥ分別から７つのＥ．ｃｏｌｉ消化物留分を分析することによって８７１まで増加した（Ｙａｎら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ１３（２０１３）２５４６）。発明者らはまた、分化するＰＣ１２細胞の８−ｐｌｅｘ  ｉＴＲＡＱベースの定量的プロテオミクス分析に関して動電学的ポンピング式シースフローインターフェースを有するキャピラリー等電点ＭＳ／ＭＳシステムを利用する一方、８３５のタンパク質群を同定した（Ｚｈｕら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．８５（２０１３）７２２１）。発明者らの知る限りでは、ヒト細胞株の分析に関してＣＺＥ−ＭＳ／ＭＳを利用する公開は存在しない。
【０１２４】
標的プロテオミクスリサーチでは、多重／選択反応モニタリング（ＭＲＭ／ＳＲＭ）が三連四重極（ＱｑＱ）質量分析装置と共に利用されるのが典型的である。要するに、標的ペプチドの親イオンが第１の四重極（Ｑ１）で単離され、次いで第２の四重極（Ｑ２）でフラグメント化される。標的ペプチドからの１つ又は幾つかのフラグメントイオンが第３の四重極（Ｑ３）によって検出のためにさらに単離される。最近では、新たな標的プロテオミクス技法が導入されており、いわゆるベンチトップ四重極オービトラップ型質量分析装置によって実行される並列反応モニタリング（ＰＲＭ）である（Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ１１（２０１２）１４７５）。ＰＲＭでは、標的ペプチドが四重極で選択され、次いで衝突細胞でフラグメント化される。得られたフラグメントイオンは、オービトラップで分析され、１つのフル高分解能ＭＳ／ＭＳスペクトルが作成される。フラグメントイオンのｍ／ｚ比は方法の開発段階では必要がないため、このプロセスはＳＲＭ／ＭＲＭと比べてかなり容易である。さらに、ＰＲＭは、オービトラップ分析計が高分解能であることによりＳＲＭ／ＭＲＭと比べてバックグラウンドマトリックスに対してかなり良好な許容性を有する。
【０１２５】
この実施例では、発明者らはＣＺＥ−ＰＲＭの第１の例について説明する。発明者らは、実施例１においてペプチド分析向けに上に記載した発明者による改良型の動電学的ポンピング式シースフローナノスプレーインターフェースを利用する。標準ペプチド（アンジオテンシンＩＩ）は、ＣＺＥ−ＰＲＭシステム性能を評価するために０．４５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン消化物にスパイクした。発明者らは、２〜１５０，０００ａｍｏｌｅの装填量に対応するアンジオテンシンＩＩに関して４．５桁を超える線形ダイナミックレンジを観測した。発明者らはまた、ヒト細胞株のボトムアップ分析に関してＣＺＥ−ＭＳ／ＭＳの第１の例を提示している。約８０ｎｇ装填量での１時間の単一ショットＣＺＥ−ＭＳ／ＭＳ分析でＭＣＦ７全細胞溶解液消化物から概ね３００のタンパク質が同定された。
【０１２６】
［実験］
１．材料及び試薬。ウシの膵臓ＴＰＣＫ処理済みトリプシン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、尿素、重炭酸アンモニウム（ＮＨ４ＨＣＯ３）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）、及びアンジオテンシンＩＩ（ヒト、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。アセトニトリル（ＡＣＮ）、ギ酸（ＦＡ）、及びフッ化水素酸（ＨＦ）は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）から購入した。メタノール及び水は、Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ  Ｂｕｒｄｉｃｋ  ＆  Ｊａｃｋｓｏｎ（Ｗｉｃｋｌｏｗ、Ｉｒｅｌａｎｄ）から購入した。溶融シリカ製キャピラリー（１０及び２０μｍ内径／１５０μｍ外径）並びに線形ポリアクリルアミド（ＬＰＡ）被覆キャピラリー（５０μｍ内径／１５０μｍ外径）は、Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐｈｏｅｎｉｘ、ＡＺ）から購入した。
【０１２７】
Ｅａｇｌｅの最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（１００×）、インシュリン、及び抗生物質−抗真菌剤（Ａｎｔｉ−Ａｎｔｉ、１００×）は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ  ＮＹ）から購入した。細胞溶解用の哺乳類細胞−ＰＥ  ＬＢ（商標）バッファは、Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。コンプリート、ミニプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＥＡＳＹｐａｃｋの形で提供される）は、Ｒｏｃｈｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入した。
【０１２８】
２．サンプル作成。８Ｍ尿素を含有する１００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８．０）中でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、０．５ｍｇ／ｍＬ）を３７℃で３０分間変性させた後、ＤＴＴ及びＩＡＡによって標準還元及びアルキル化を行った。尿素濃度を２Ｍ未満に低下させるように１００ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８．０）で希釈した後に、１２時間にわたり３７℃においてトリプシン／タンパク質比が１／３０（ｗ／ｗ）のトリプシンでタンパク質消化を実施した。酸性化後に、タンパク質消化物をＣ１８−ＳｅｐＰａｋカラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）で脱塩させた後、減圧濃縮装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍａｒｉｅｔｔａ、ＯＨ）で凍結乾燥した。乾燥させたサンプルは、０．５ｍｇ／ｍＬ溶液を作成するように０．０５％（ｖ／ｖ）ＦＡに溶解させ、また使用前は−２０℃で保存した。
【０１２９】
アンジオテンシンＩＩ溶液は、ＢＳＡ消化物内にスパイクし、０．４５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ消化物且つ異なる濃度（１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ及び１００μＭ）のアンジオテンシンＩＩを含有する０．０５％（ｖ／ｖ）ＦＡで５つのサンプルを生成した。各サンプルは、ＣＺＥ−ＰＲＭによって三重式に分析した。
【０１３０】
使用したＭＣＦ７細胞培養、細胞溶解、タンパク質アセトン沈殿、変性、還元及びアルキル化に関する手順は、Ｓｕｎら（Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ａ．  １３３７（２０１４）４０）によって記載されている。要するに、細胞培養後に、ＭＣＦ７細胞をソニケーションによって溶解させた後、ＢＣＡタンパク質濃度計測及びアセトン沈殿を行った。次いで、６９０μｇのタンパク質分取を８Ｍ尿素及び１００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ約８．０）に溶解させ、３７℃において１時間変性させ、且つ約４０ｍＭ  ＤＴＴで３７℃において１．５時間還元させた後、１００ｍＭ  ＩＡＡにより室温において３０分間アルキル化した。尿素濃度を２Ｍ未満に低下させるように１００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ約８．０）で希釈した後に、３７℃において一晩トリプシン／タンパク質比が１／３０（ｗ／ｗ）のトリプシンでタンパク質を消化させた。タンパク質消化物は、ＦＡ（１％最終濃度）で酸性化させると共に、Ｃ１８−ＳｅｐＰａｋカラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）で脱塩させた後に、凍結乾燥させた。ペプチド混合物は、２０％（ｖ／ｖ）ＡＣＮを含有する０．０４％（ｖ／ｖ）ＦＡに溶解させて３．５ｍｇ／ｍＬのサンプルを得た後に、ＣＺＥ−ＥＳＩ−ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ分析を行った。約３００μｇの消化物を再度凍結乾燥させると共に、０．１％（ｖ／ｖ）ＦＡで再溶解させた。消化物は、Ｃ１８−ＳｅｐＰａｋ  ＳＰＥカラム（Ｗａｔｅｒｓ）上に装填すると共に、０．１％（ｖ／ｖ）ＦＡを含有する１ｍＬの１２％（ｖ／ｖ）ＡＣＮによって溶離させた。溶離液は凍結乾燥させ、またＣＺＥ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析のために２８μＬの０．０４％（ｖ／ｖ）ＦＡ及び３０％（ｖ／ｖ）ＡＣＮでさらに溶解させた。
【０１３１】
３．ＣＺＥ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析。キャピラリー電気泳動システムは、上の実施例１の構成要素から組み上げた。２つのＳｐｅｌｌｍａｎ  ＣＺＥ  １０００Ｒ高電圧電源によって分離及びエレクトロスプレー向けの電圧を実現した。ＣＺＥをＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に結合させるために、超高感度動電学的ポンピング式シースフローインターフェースを使用した。エレクトロスプレー放出体は、Ｓｕｔｔｅｒ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔのＰ−１０００  ｆｌａｍｉｎｇ／ｂｒｏｗｎ型マイクロピペットプラーで引き出したホウケイ酸ガラス製のキャピラリー（１．０ｍｍ外径、０．７５ｍｍ内径）とし、また放出体オリフィスのサイズは８〜１０μｍとした。電圧プログラムは、ＬａｂＶｉｅｗソフトウェアによって制御した。
【０１３２】
ＣＺＥ−ＰＲＭ実験では、エッチングされた先端（約６０μｍ外径、約５ｍｍ長さ）を有する３２ｃｍ長キャピラリー（１０及び２０μｍ内径／１５０μｍ外径）を分離に使用した。分離バッファは、０．５％（ｖ／ｖ）ＦＡとした。噴射端の電圧は１６．２ｋＶとし、スプレー電圧としては１．２ｋＶを印加した。全ＭＣＦ７細胞溶解液消化物分析のためには、約５ｍｍ長のエッチングした端部（約６０μｍ外径）を有する１００ｃｍ長キャピラリー（２０μｍ内径／１５０μｍ外径）を利用し、また分離バッファは０．５％（ｖ／ｖ）ＦＡとした。ＭＳ１のみの実験では噴射端に２９．２ｋＶを印加し、またデータ依存収集（ＤＤＡ）モードのＭＳ／ＭＳ実験では噴射端に２１．２ｋＶを印加した。この両ケースとも、エレクトロスプレー向けには１．２ｋＶを印加した。
【０１３３】
Ｃ１８−ＳＰＥカラムからのＭＣＦ７細胞溶解液消化物の１２％（ｖ／ｖ）ＡＣＮ溶離液に対する分析では、約５ｍｍ長のエッチングした端部（約７０μｍ外径）を有するＬＰＡ被覆のキャピラリー（６２ｃｍ、５０μｍ内径／１５０μｍ外径）を使用した、また分離バッファは０．１２％（ｖ／ｖ）ＦＡとした。噴射端に印加した電圧は１６．２ｋＶであり、また１．２ｋＶをスプレー電圧として印加した。
【０１３４】
この実験のすべてについて、シースバッファは１０％（ｖ／ｖ）メタノール及び０．１％（ｖ／ｖ）ＦＡとした。分離キャピラリー端とスプレー放出体先端の間の距離は約２００μｍとした。サンプルは、窒素圧によって分離キャピラリー内に噴射した、また噴射体積はポアズイユの法則に基づいて計算した。分離キャピラリーに対するすべてのＨＦエッチング動作は、上の実施例１に示したのと同じプロトコルで実行した。エッチングされた１０及び２０μｍ内径の分離キャピラリーは、使用前に水酸化ナトリウム（１Ｍ）、脱イオン水、塩酸（１Ｍ）、脱イオン水、及び０．５％（ｖ／ｖ）ＦＡで順次フラッシュした。エッチングしたＬＰＡ被覆の分離キャピラリー（５０μｍ内径）は、使用前に脱イオン水及び０．１２％（ｖ／ｖ）ＦＡで順次フラッシュした。
【０１３５】
ＣＺＥ−ＰＲＭ実験では、Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅをインクルージョンリストをオンとして標的−ＭＳ２モードでプログラミングした。インクルージョンリストにおいて、標的ｍ／ｚとチャージとして５２３．７７３４と＋２をそれぞれ設定した。正規化衝突エネルギー（ＮＣＥ）は２５％であった。これ以外のパラメータは以下のとおりとした：ＭＳ／ＭＳの分解能は１７，５００、ＡＧＣ標的は５Ｅ５、最大噴射時間は５００ｍｓ、単離ウィンドウは１ｍ／ｚ、またマイクロスキャンは１である。
【０１３６】
ヒト細胞株消化物の分析では、ＭＳ１のみ実験及び通常ＤＤＡモードの実験の両方を実施した。ＭＳ１のみ実験では、３８０〜１８００ｍ／ｚのレンジ、７０，０００の分解能（ｍ／ｚ２００）、１Ｅ６のＡＧＣ標的、２５０ｍｓの最大噴射時間、マイクロスキャン１としてＭＳスペクトルを収集した。ＤＤＡモード実験では、ｔｏｐ１２法を利用した。ＭＳ１全スキャンでは、パラメータをＭＳ１のみ実験と同じとした。ＭＳ／ＭＳでは、ＭＳスペクトルからの最も高強度の１２のピークを四重極（単離ウィンドウは２．０ｍ／ｚ）で順次単離させ、さらにより高いエネルギーの衝突解離（ＨＣＤ）細胞（ＮＣＥは２８％）でフラグメント化した後に、オービトラップ分析を行った。３５，０００の分解能（ｍ／ｚ２００）、１Ｅ６のＡＧＣ標的、１２０ｍｓの最大噴射時間、及びマイクロスキャン１を適用した。チャージ状態が＋１より大きく且つ強度が８．３Ｅ３より大きい親イオンをフラグメント化のために選択した。動的エクスクルージョンは、２０μｍ内径キャピラリーについては１０ｓまた５０μｍ内径キャピラリーでは１５ｓと設定した。ペプチドマッチ及び同位体エクスクルードをオンにした。
【０１３７】
４．データ分析。ＣＺＥ−ＰＲＭ実験では、データはＴｈｅｒｍｏ  Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェアによって手作業で分析した。アンジオテンシンＩＩからのフラグメントイオンのピークを１０ｐｐｍの質量許容値によって手作業で抽出し、またこのフラグメントイオンのピークに対してガウス型スムージング（５点）を実施した。
【０１３８】
ヒト細胞溶解液消化物データでは、タンデムスペクトルを包含した未加工ファイルをＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ１．３ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって分析した。Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースに対するデータベース検索のためには、タキソノミーをヒトとして（２０，３３５シーケンス）Ｍａｓｃｏｔ２．２を使用した。消化酵素としてトリプシンを選択し、またミスドクリベージの最大数は２に設定した。親イオンとフラグメントイオンの質量許容値は、それぞれ１０ｐｐｍと０．０５Ｄａに設定した。動的な修飾には、酸化（Ｍ）、脱アミド（ＮＱ）、及びアセチル化（Ｋ及びタンパク質Ｎ−末端）を含めた。カルバミドメチル化（Ｃ）を固定修飾として設定した。過誤発見率（ＦＤＲ）（Ｅｌｉａｓ及びＧｙｇｉ、Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４（２００７）２０７）を評価するために、対応するリバースデータベースに対するデータベース検索も実行した。
【０１３９】
Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ  １．３に組み込まれたパーコレータソフトウェア（バージョン１．１７）をデータベース検索結果の評価のために使用した。ペプチドレベル分析では、ペプチド同定のフィルタリングのためにペプチド信頼値のｈｉｇｈを使用した、これは１％未満のペプチドレベルＦＤＲに対応する。１タンパク質あたりペプチド数（ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｐｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の設定では、ペプチドの最小数１、ランク１ペプチドのみカウント、及びトップスコアのタンパク質でのみペプチドをカウントを含むパラメータを適用した。さらに、タンパク質群化を有効にした。
【０１４０】
［結果及び検討］
１．ペプチド検出に関するＣＺＥ−ＰＲＭ。ＣＺＥ−ＰＲＭ実験では、Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅを標的−ＭＳ２モードにプログラミングした。インクルージョンリストにおいて、アンジオテンシンＩＩに対応するｍ／ｚ５２３．７７３４（＋２）（ヒト、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ）を使用した。アンジオテンシンＩＩ標準ペプチドは、ＢＳＡ消化物の一定のバックグラウンドの存在下で分離キャピラリー（２０μｍ内径）に装填された１５ａｍｏｌｅ〜１５０ｆｍｏｌｅのアンジオテンシンＩＩに対応する１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ及び１００μＭのアンジオテンシンＩＩを含有する一連のサンプルを生成するために０．４５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ消化物にスパイクした。
【０１４１】
発明者らはまた、１０μｍ内径の分離キャピラリーを利用して、０．４５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ消化物にスパイクした１０ｎＭのアンジオテンシンＩＩから作成されたサンプルを分析した。この実験では、約２ａｍｏｌｅのアンジオテンシンＩＩをキャピラリーに装填した。三重ＣＺＥ−ＰＲＭ分析の後に、アンジオテンシンＩＩの最も高強度の２つのフラグメントイオン（ｂ６＋及びｙ２＋）を、１０ｐｐｍ質量許容値の収集データから抽出し較正曲線を作図した（図１２）。発明者らは、ｌｏｇ−ｌｏｇデータに対して非重み付け重み線形当て嵌めを実施した。フラグメントイオン信号は、アンジオテンシン装填量に従って直線的に４．５桁（ｌｏｇ−ｌｏｇ  ｂ６＋ｓｌｏｐｅ＝０．９０、ｒ＝０．９９；ｙ２＋ｓｌｏｐｅ＝０．８９、ｒ＝０．９９）を超える増大があった。発明者らは、アンジオテンシンＩＩの２つのフラグメントイオンが各ＣＺＥ−ＰＲＭランにおいて共に移動しており、標準ペプチドの検出が確認されたことを指摘しておく。
【０１４２】
０．４５ｍｇ／ｍＬ（約７μＭ）ＢＳＡ消化物バックグラウンドの存在下での２ａｍｏｌｅのアンジオテンシンＩＩの使用によって、アンジオテンシンＩＩの最も豊富なフラグメントイオン（ｙ２＋）に関して約２．０Ｅ＋０３信号が生成された。この約２．０Ｅ＋０３信号は、６６ｎＭのＢＳＡ消化物をバックグラウンドとして存在させ且つＣＺＥ−ＭＲＭ分析を使用して同じく約２ａｍｏｌｅのロイシンエンケファリンを噴射させた発明者らの以前の研究からのものと比べて約２０倍大きい（Ｌｉら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．８４（２０１２）６１１６）。
【０１４３】
信号振幅の劇的な改善は、幾つかの要因に起因するものである。第１に、以前の研究では発明者らの第１世代の動電学的ポンピング式シースフローインターフェースを利用したが、本研究では改良バージョンのインターフェース（上記の実施例１）を使用した。改良型のインターフェースにおける分離キャピラリー先端とスプレー放出体先端の間の距離が当初バージョンのものと比べて５分の１であるため、スプレー放出体におけるペプチドの拡散が減少し、ペプチドピークが非常にシャープになり、且つペプチド信号が相応してより高強度となる。第２に、発明者らは、内径をかなり小さくした（１０〜２０μｍ対５０μｍ）分離キャピラリーと、ｐＨ値をかなり低くした（３未満対６〜８）分離バッファを使用しており、これにより分離キャピラリー内の流量が低下し、より良好な感度が生成された。第３に、この研究ではオンラインスタッキングを使用した、これによってもピークがシャープとなる。キャピラリーに高電圧が印加されたときにペプチドが集中するように、サンプルマトリックス（０．０５％（ｖ／ｖ）ＦＡ）の伝導率を分離バッファ（０．５％ＦＡ）よりかなり低くしている。さらに、この研究ではかなり高分解能の質量分析計（オービトラップ対四重極）を利用した、これがバックグラウンドマトリックスに対する格段に優れた許容度を生成している。
【０１４４】
発明者らはまた、アンジオテンシンＩＩフラグメントイオン（ｙ２＋）の移動時間及び強度に関するＣＺＥ−ＰＲＭシステムの再現性について評価した（図１３）。三重式分析での移動時間の相対標準偏差（ＲＳＤ）は４％未満であった。三重式分析でのフラグメントイオン強度のＲＳＤは、１５０ｆｍｏｌｅの装填量では約３６％、１５０ａｍｏｌｅ〜１５ｆｍｏｌｅの装填量では約１０％以下、また２及び１５ａｍｏｌｅの装填量では２０％に近かった。
【０１４５】
２及び１５ａｍｏｌｅ装填量データのＲＳＤが若干高いのは次の２つの理由による可能性が高い。第１に、共単離したＢＳＡペプチドの強度がアンジオテンシンＩＩよりかなり高くなり、これが非常に低い装填量ではより大きな検出変動につながる。第２に、２及び１５ａｍｏｌｅ装填量データのフラグメントイオンは非常にシャープなピーク（ピークの半値全幅が≦２ｓ）であるため、より高い装填量データと比べてピークの間のデータ点が少なくなる。１５０ｆｍｏｌｅ装填量データでは、ＲＳＤは大幅に高くなる、その理由はＣＥ−ＭＳシステムが若干過負荷となり、これにより非ガウス型ピーク形状が生成されるからである。さらに、アンジオテンシンＩＩフラグメントイオンｂ６＋の移動時間及びフラグメントイオン強度のＲＳＤデータは、ｙ２＋に関するものとよく一致する。
【０１４６】
２．ヒト細胞溶解液消化物分析に関するＣＺＥ−ＥＳＩ−ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ。上の実施例１は、高フェムトグラムから中間的ピコグラム量のＥ．ｃｏｌｉ細胞溶解液消化物の分析のために使用した、エッチング先端の動電学的ポンピング式シースフローナノスプレーインターフェースベースのＣＺＥ−ＭＳ／ＭＳシステムの使用について説明した。当該研究によって、原核生物プロテオーム消化物の分離及び検出に関して、改良型のシステムが極めて高効率であり且つ定量的再現性があることが立証された。今日まで、ＣＺＥ−ＭＳ／ＭＳを用いたヒトプロテオームのボトムアップ分析で公表されたものは存在しない。
【０１４７】
ここで発明者らは、ヒトプロテオーム（ＭＣＦ−７ヒト乳がん細胞株のプロテオーム）のボトムアップ分析に関するＣＺＥ−ＭＳ／ＭＳの第１の適用について報告する。発明者らは、約６０ｎｇの全細胞消化物の分析に関して超高感度インターフェースを使用することによって開始した（図１４）。分離は、２８０Ｖ／ｃｍ電界によって駆動した。ペプチドは、キャピラリーから１１分で移動を開始し、また分離は概ね２６分までに完了した（図１４の（Ａ））、ただし後の時点で幾つかの強いピークが観測された。分離は、極めて高効率であり、またピークは非常にシャープである（図１４の（Ｂ））。
【０１４８】
概ね１０〜２０のピークが、１３〜１４分の１分の分離ウィンドウにおよぶ基準ピーク電気泳動図から分解された。発明者らは、５２５，０００理論段を生成した２ｐｐｍ質量許容値のデータから１つのペプチド（ｍ／ｚ４００．７７１６１、ｚ＝＋２）を抽出した、これによりこの計器によって極めて高い分離効率が得られることが立証される。
【０１４９】
発明者らは次に、ＭＣＦ７全細胞溶解液消化物のボトムアップ分析に関して単一ショットＣＺＥ−ＭＳ／ＭＳを適用した。約８０ｎｇのペプチドを１００ｃｍ長の２０μｍ内径分離キャピラリーに装填した。分離は、２００Ｖ／ｃｍ電界で実施した。タンデムスペクトルのデータベース検索後に、１，１５９のペプチド及び２８３のタンパク質が高信頼に同定され、また少なくとも２つのペプチドに基づいて１７６のタンパク質が同定された。分離は概ね４０分間で完了した。
【０１５０】
単一ショットＣＺＥ−ＭＳ／ＭＳでＭＣＦ７プロテオームからどれだけ多くのペプチド及びタンパク質が同定可能であるかを試験するために、発明者らはプロテオームを分取することによってＭＣＦ７細胞溶解液消化物を単純化した。ペプチドは先ずＣ１８  ＳＰＥカラム上にトラップし、次いで分析のために留分を１２％（ｖ／ｖ）ＡＣＮで溶離させた。電気浸透を低下させためにＬＰＡ被覆の分離キャピラリーを使用した、これにより分離容量が大きくなる。サンプル噴射体積を増加させるために、発明者らは５０μｍＩＤキャピラリーを使用し、約１３０ｎＬのサンプルを噴射した。データベース検索後に、単一ショット分析により１，１９９のペプチド及び４６８のタンパク質が同定された。少なくとも２つのペプチドに基づいて２１９のタンパク質が同定された。分離は６０分以内に完了した。合成データ組は、２，００５のペプチドと５３７のタンパク質ＩＤとを包含している。
【０１５１】
具体的な実施形態について開示した実施形態及び実施例を参照しながら上で説明してきたが、このような実施形態は単に例証であり且つ本発明の範囲を限定するものではない。当業者によれば、添付の特許請求の範囲の規定に従ったそのより広い態様において本発明を逸脱することなく変更や修正が可能である。
【０１５２】
すべての公開、特許及び特許文書は、参照によりそれぞれが個々に組み込まれたのと同様にして参照により本明細書に組み込まれるものとする。本開示と矛盾するいかなる限定もこれらから理解すべきでない。本発明について、様々な具体的且つ好ましい実施形態及び技法を参照しながら説明してきた。しかし、本発明の精神及び範囲の域内に留まりながら多くの変形形態及び修正形態が実施され得ることを理解すべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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