(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞に対する作用物質の効果を特徴付けるための方法であって、
a）種々の濃度系列の作用物質を細胞の集団のサンプルと接触させるステップ、
b）各サンプルについて及び各暴露濃度について集団の個々の細胞において2以上の表現型パラメータの各々を測定するステップ、
c）各パラメータについて及び各暴露濃度について細胞の測定値の分布を得るステップ、
d）各パラメータについて化合物に暴露していない細胞の測定値の分布を得るステップ、
e）ステップd）で得られた分布とステップc）で得られた各分布との間の非類似度を算出するステップ、
f）算出された非類似度を組み合わせて、マルチパラメトリック応答テンソルを形成するステップ
を含み、
ここで、マルチパラメトリック応答テンソルが、同じ方法で作成された他のフィンガープリントと直接比較することができる、細胞に対する作用物質の効果に特徴的なフィンガープリントである、方法。
【請求項２】
フィンガープリントを作成し記憶するために使用される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
フィンガープリントの比較を行うために使用される、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
比較が、in vivo効果を予測するために用いられる、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
サイトメトリーによって個々の細胞において表現型パラメータを測定する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
表現型パラメータが、細胞生存力、細胞周期段階、ミトコンドリア膜完全性、ミトコンドリア毒性、グルタチオン濃度、活性酸素種、還元種、細胞膜透過性、DNA損傷、ストレス応答マーカー、炎症応答マーカー、アポトーシスマーカー及び脂質ペルオキシダーゼのうちの2種以上を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
表現型パラメータが、NF-kB、カスパーゼ、ERK、SAPK、PI3K、AKT、Bcl-ファミリータンパク質、p38、ATM、GSk3B、及びリボソームS6キナーゼのうちの1種以上を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
表現型パラメータの1種が、細胞周期である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
細胞の各集団が、複数の蛍光色素を用いて機能的に標識され、表現型パラメータが、前記標識された細胞の集団がサイトメトリー分析にかけられたときに生じるスペクトル発光シグナルの点で検出され、定量化される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
表現型パラメータが細胞周期であり、HOECHST 33342、DRAQ5、YO-PRO-1 IODIDE、DAPI、CYTRAK ORANGE、サイクリン又はリン酸化ヒストンタンパク質の1種以上の点で定量化される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
細胞に対する作用物質の効果に特徴的なフィンガープリントのバンクを作成するための方法であって、
請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法により複数の作用物質の各々についてマルチパラメトリック応答テンソルを形成するステップであって、各マルチパラメトリック応答テンソルが、細胞に対する作用物質の効果に特徴的なフィンガープリントである、ステップ、
互いに比較し、同じ方法で作成された他の作用物質のフィンガープリントと比較することができるように、コンピュータ可読媒体にフィンガープリントを記憶するステップ
を含み、これにより、細胞に対する作用物質の効果に特徴的なフィンガープリントのデータベースを作成する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
実施形態は、細胞アッセイ、生理学及び薬物開発の分野に関する。実施形態は、サイトメトリー並びにサイトメトリーデータなどのマルチパラメトリックデータの半自動化及び自動化分析にさらに関する。
【０００２】
政府の資金提供
本明細書に開示され、特許請求の範囲に記載される発明を行うのに政府資金は使用されなかった。
【０００３】
関連出願
本願は、米国仮出願番号第61/927,247号の優先権を主張し、その全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
表現型化合物スクリーニングは、医薬化合物の迅速評価のための新たな技術であり、近年、小分子又は生物製剤などの撹乱物（摂動物）に対する細胞の表現型応答を特徴付けるためにいくつかの技術が開発された。報告された研究の大部分は、伝統的なバルク生化学的アッセイ又は高含量スクリーニングに基づいた単一細胞技術(自動化顕微鏡)を使用している。例えば、関連ある部分に関して本明細書に参照により組み込まれる、Abrahamら(「High content screening applied to large-scale cell biology.」Trends Biotechnol.第22巻、15〜22頁、2004)及びGiulianoら(「Advances in High content Screening for Drug Discovery.」ASSAY Drug Dev. Technol.第1巻、565〜577頁, 2003)を参照のこと。
【０００５】
より最近は、複雑なスクリーニングデータセットの分析では、新規統計的手法が実装されている。これらの方法は、データセット間の相関を決定する手段を提供し得る。スクリーニングするための簡単な経路によるモデルが、関連ある部分に関して本明細書に参照により組み込まれる、Congら(「Method for using division arrested cells in screening assays」、EP1 581645)に記載されている。Congは、増殖を停止した細胞においてシグナル変換を研究すること及びこのようなシステムを使用して、β2アドレナリン受容体(β2AR)、Gタンパク質共役受容体の1種などの細胞表面受容体の活性を調節する作用物質についてスクリーニングすることを提案する。Congは、このような増殖が停止した細胞においても、イソプロテレノール(100μM)を用いる処理が、分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)活性を増大し、それが、順に、増殖を停止した細胞が、転写応答に至るまで無傷のシグナル伝達経路を依然として有し、このようなシステムを使用して酵素リポーターアッセイを実施し得ることを実証した。
【０００６】
同様の技術が、関連ある部分に関して本明細書に参照により組み込まれる、Hytopoulosら(「Methods for analysis of biological dataset profiles.」米国特許出願公開第2007-0,135,997号)によって提供されている。Hytopoulosは、生物学的データセットプロファイルを評価する方法を開示している。複数の細胞パラメータの情報を含むデータセットが比較され、同定される。通常のデータセットは、候補作用物質の存在下又は不在下での生物学的因子に対する細胞の曝露に起因する複数の細胞パラメータからの読み出し情報を含む。複数の状況によって定義されるシステムの分析のために、複数のシステムから得た出力データが連結される。しかし、Hytopoulosは、応答プロファイルを作成及び形成するための正確な方法ステップを概説していない。さらに、Hytopoulosは、生物学的試料を用いる方法論を実行するための作業実施形態を全く提供していない。
【０００７】
関連ある部分に関して本明細書に参照により組み込まれる、Bergら(「Function homology screening.」米国特許第8,467,970号)には、薬物間の機能的相同性を評価するための方法が開示されている。方法は、細胞を薬物に曝露すること及び複数の出力パラメータをモニタリングすることによって細胞環境を改変する効果を評価することを含む。環境中に存在する異なる化合物を有するものなどの2つの異なる環境を直接比較して、類似度及び相違を決定できる。これらの比較に基づいて、化合物を、機能レベルで特徴付けることができ、化合物の副作用の経路の同定及び予測が可能となる。Bergはまた、すべての測定された細胞パラメータを図示する極めて単純化されたヒートマップである、「バイオマップ」の形態での測定データの表現も開示している。Bergは、ストレスに対する生理学的応答というよりも、生物学的シグナル伝達経路を測定することと関連している。
【０００８】
関連ある部分に関して本明細書に参照により組み込まれる、Friendら(「Methods of characterizing drug activities using consensus profiles.」米国特許第6,801,859号)には、種々の薬物処理に応じた、遺伝子発現パターンなどの生物学的応答パターンを測定するための方法が開示されている。生物系を種々の濃度の薬物に曝露することによって作成される応答プロファイル(曲線)は、特定の群又はクラスの薬物に対する細胞の生物学的応答を説明し得る。応答曲線は、モデルを使用して近似される。曲線若しくはプロファイルを形成する得られたデータベクトル又はそれらのパラメトリカルモデルを、類似度の種々の測度を使用して比較できる。この比較は、距離行列を形成し、これを、続いて、階層的クラスタリングアルゴリズムにおいて使用し、プロファイルの類似度を表す階層を構築できる。しかし、Friendらによって開発されたプロファイルは、簡単なベクトル型及びパラメトリック数理モデルに制限される。
【０００９】
さらに、Bergら及びFriendらの刊行物の前述の適用のプロファイリング法は、制限され、特に、未知候補薬物のプロファイルを開発するために分配（distribution）を使用することを提供しない。
【００１０】
この領域では比較的少ない研究が、フローサイトメトリーを使用して実施されており、これによって、細胞の大集団での細胞状態の単一細胞分析が可能となる。例えば、関連ある部分に関して本明細書に参照により組み込まれる、Edwardsら(「Flow cytometry for high-throughput, high-content screening.」Curr. Opin. Chem. Biol.第8巻、392〜398頁、2004、2004)、Opreaら(「Associating Drugs, Targets and Clinical Outcomes into an Integrated Network Affords a New Platform for Computer-Aided Drug Repurposing.」Mol. Inform.第30巻、100〜111頁、2011)、Robinsonら(「High-throughput secondary screening at the single-cell level.」J. Lab. Autom.第18巻、85〜98頁、2013)及びSklarら(「Flow cytometry for drug discovery, receptor pharmacolog and high throughput screening.」Curr. Opin. Pharmacol.第7巻、527〜534頁、2007)を参照のこと。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかし、サイトメトリーのためにハイスループット流体処理システムが最近利用可能になったことが、数分内に全96又は384ウェルプレートを処理し、ウェルあたり数千個細胞をサンプリングすることを実現可能にし、ハイスループット細胞アッセイにとってサイトメトリーをますます魅力的なものにした。ハイスループットフローサイトメトリーの使用を記載する報告は、通常、分析された細胞の細胞生理学を説明する1〜5種の異なる変数を獲得する比較的単純なアッセイに焦点を当てている。数学的観点から、これらのアッセイにおいて集められたデータは、行が個々の細胞についての情報を保存し、列が測定された量(例えば、光散乱特徴、蛍光強度シグナルなど)を説明するアレイとして記載され得る。測定された特徴は、種々の統計値によってまとめられ得る。最も一般的には、対照の領域における平均蛍光強度が使用される。データ整理後、実験の結果は、要素が選択された要約統計値の値であるベクトルによって表される。実験が、いくつかの異なる濃度の薬物を試験することを含む場合には、最終結果は、2-Dアレイであり、個々の列は、応答曲線を説明する。アレイにさらなる次元を加えるために、さらなるパラメータ(例えば、種々の時間の薬物インキュベーション)が使用され得る。
【００１２】
伝統的に、薬物応答曲線は、推測的数学的モデル(S字型対数正規曲線、対数ロジスティック曲線、ゴンペルツ曲線、Weibullなどといった)によって近似され、測定された薬物応答情報は、曲線を説明する数種のパラメータ(又はさらには単一のパラメータ)に低減される。プロセス全体は、大きく簡略化された化合物応答要約:通常、いくつかのEC50値、すなわち、指定の曝露時間後にベースラインと最大との間の中間の反応を誘導する化合物の濃度を表す値を含む「シグネチャー」をもたらす。
【００１３】
このようなアプローチは、できたとしても容易には軽減され得ない重要な固有の限界を受ける。第1に、それらは、試験された化合物すべての応答を説明する、適当なパラメータ化を用いる既知適切数学的モデルが事前に存在することを仮定する。第2に、それらは、S字型曲線から導かれた単一パラメータ(EC50)が、化合物応答パターンについての必要な情報すべてを保持することを仮定する。第3に、それらは、測定されたパラメータによって示される応答を別々に、すなわち、1次元的に分析する。応答曲線の形成につながるデータ分析及び特徴抽出もまた、問題になる。
【００１４】
さらに、伝統的な十分に確立されたサイトメトリーデータ処理は、いわゆるゲーティングプロセスに頼るものであり、これは、これらの集団の単純な統計学的特徴(分散の平均、中央値、係数など)を計算するための、対象の集団の手作業による分離を含む。このゲーティングは、高度に主観的なものであり得、自動化設定において再現することが困難である。さらに、計算された特徴は、あり得る生物学的応答の範囲又はサイトメトリーの測定値の精度を反映するようスケーリング又は標準化されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
記載される本明細書における実施形態は、いくつかの実施形態では、化合物応答を定量化するための新規方法論を使用することによって現在の表現型スクリーニング法の相当な欠点を克服するための方法を提供する。本明細書に記載される実施形態は、情報の質を損なうことなく、応答についての推測的仮定を伴うことなく、多次元化合物フィンガープリントの意味のある比較を可能にする、いくつかの革新的データ獲得及びデータ処理技術を提供する。
【００１６】
本記載によって包含される多数の実施形態のうち数種のものは、以下の番号を付けた段落に要約されている。番号付けされた段落は、自己を反映するものである。特に、これらの段落において使用される語句「前述のもの又は以下のもののいずれかに従って」とは、他の段落を指す。この語句は、以下の段落において、本明細書に開示される実施形態は、単独でとられる個々の段落に記載される対象及び組み合わせてとられる段落によって記載される対象の両方を含むことを意味する。この関連で、以下の段落を示すことにおける出願人の目的は明確に、特に、単独で、又は任意の組合せでとられる段落によって種々の態様及び実施形態を説明することである。すなわち、段落は、個別に、及び互いの任意の組合せで、それらによって包含されるすべての実施形態の明確な文書による説明を設定及び提供するコンパクトな方法である。出願人は、単独で、又はそれに示される任意の他の値との任意の組合せでとられる、それに示される任意の値の任意の組合せを含めた、単独で、又は任意の1以上の他の段落の任意の他の主題と一緒に、以下の段落のいずれかにおいて設定される任意の主題を主張するときはいつでも権利を具体的に留保する。出願人は、本願において又は本願の利益を有する任意の後継出願において、全体が示される本明細書において組合せのすべてを示す権利を具体的に留保する必要があるはずである。
【００１７】
方法及び分析
A1.細胞集団を複数の濃度cの作用物質に曝露すること、
サイトメトリーによって、各濃度で集団中の細胞の複数の生理学的パラメータpを測定すること、
各濃度で細胞集団の各パラメータについて集団と対照の間の一連の距離を算出すること、並びに
算出された距離から各化合物について1以上のテンソルをコンパイルすること、並びに
テンソル分解によってテンソルを圧縮して、ベクトルの形態の簡略化された化合物フィンガープリントを得ること
を含む、作用物質に対する1以上の細胞応答を特徴付けるための方法。
【００１８】
A2.(A)第1の細胞集団を複数の濃度の第1の作用物質に曝露すること、
サイトメトリーによって、前記第1の作用物質の各濃度で集団中の細胞の複数の生理学的パラメータpを測定すること、
測定値から1以上のテンソルをコンパイルし、それによって、前記第1の作用物質を説明すること、
分解によってテンソル(複数可)を圧縮して、ベクトルの形態の簡略化された化合物フィンガープリントを得ること、
(B)第2の細胞の集団を第2の複数の濃度の第2の作用物質に曝露すること、
サイトメトリーによって、前記第2の作用物質の各濃度で、集団中の細胞の複数の生理学的パラメータを測定すること、
測定値から1以上のテンソルをコンパイルし、それによって、前記第2の作用物質を説明すること、
分解によってテンソル(複数可)を圧縮して、ベクトルの形態の簡略化された化合物フィンガープリント(複数可)を得ること、並びに
(C)第1及び第2の簡略化されたフィンガープリント間の非類似度を算出して、第1及び第2の作用物質に対する細胞の応答間の相違を決定すること
を含む、作用物質に対する1以上の細胞応答を比較するための方法。
【００１９】
A3.1以上の陰性、1以上の陽性対照について、及び1以上の濃度の化合物について、2種以上の細胞生理学的応答を測定すること、
数学的制限によって対照及び濃度系列について細胞の亜集団を選択し、それによって、特定の細胞周期区画及び特定の形態学的クラスにある細胞をゲーティングすること、
陽性及び陰性対照各々の、及び各濃度の細胞測定値の分布間の非類似度を算出すること、
算出された非類似度によって化合物に対する細胞の応答を特徴付けること
を含む、作用物質に対する細胞の1以上の応答を決定する方法。
【００２０】
A4.応答が分布に作用する数学的計量を使用して算出される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００２１】
A5.測定値が多次元データ点クラウド(point cloud)を形成する、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００２２】
A6.多次元データ点クラウドにおける変化が、Wasserstein計量、Kantorovich-Rubinstein輸送問題の解として定義される計量、二次形式距離、二次カイ距離、Kullback-Leiblerダイバージェンス、Jensen-Shannonダイバージェンス、Kolmogorov計量、Csiszar φ-ダイバージェンス、Burbea及びRaoダイバージェンス並びにBregmanダイバージェンスのうち任意の1つ以上によって距離として算出される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００２３】
A7.対照の群内のペアワイズ距離の95パーセンタイルの値が、測定値精度の限界(統計学的有意性の限界)として選択される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００２４】
A8.陽性対照の群と陰性対照の群の間の非類似度の頑強な測度が、応答間の非類似度の単位を定義する、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００２５】
A9.化合物の複数の異なる濃度で測定された多次元データ点クラウドの分布の変化を定量化することを含む、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００２６】
A10.どの応答ベクトルも、前記化合物の濃度の数より小さいいくつかの導かれた量によってまとめられる、複数の応答表から特徴をまとめることによる次元縮小をさらに使用する、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００２７】
A11.特徴をまとめることを含む、多元(multiway)テンソルによって作用物質に対する応答をさらに表す、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００２８】
A12.異なる作用物質に対して算出されたテンソルが、非類似度の測度を計算することによって互いに比較される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００２９】
A13.Tucker分解、CANDECOMP、PARAFAC、PARAFAC2、INDSCAL、CANDELINC、DEDICOM又はPARATUCK2分解のうち1以上を使用してテンソルが分解される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００３０】
テンソル及び状態テンソル
TSt1.応答テンソルが、2種以上の細胞生理学パラメータのうち複数の測定値のデータセットから作成され、応答テンソルが、マルチパラメトリック及び多因子細胞表現型を定量化する、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う細胞応答テンソル。
【００３１】
TSt2.有形の形式でコードされ、その結果、ユーザーによって全体で又は部分的に、アクセスされ、コピーされ、使用され、及び/又は読み出される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う細胞応答テンソル。
【００３２】
TSt3.対照データセットの応答テンソルが、試験データセットが、対照又はプロファイルデータセットと異なるかどうかを判定するための根拠を提供する、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う細胞応答テンソル。
【００３３】
対照
Ctr1.陽性対照細胞が、1以上の測定された細胞生理学的応答に対して最大の測定可能な効果を誘発する1種以上の既知化合物で処理される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００３４】
Ctr2.陰性対照が、処理されていない細胞、バッファーで処理された細胞、培地で処理された細胞又は偽化合物で処理された細胞である、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００３５】
細胞周期
Ccy1.細胞状態が、細胞の増殖期の測定値、好ましくは、細胞分裂の測定値である、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００３６】
Ccy2.細胞状態又は細胞周期段階が、単一細胞レベルでフローサイトメトリーによって検出される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００３７】
Ccy3.生理学的パラメータの1種が、細胞周期である、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００３８】
Ccy4.生理学的パラメータの1種が、細胞周期区画G1、S、G2及びMである、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００３９】
Ccy5.細胞周期区画の1つが、G1、S及びG2/Mである、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００４０】
Ccy6.生理学的応答のすべてが、細胞周期区画の関数として測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００４１】
Ccy7.細胞周期の期が、蛍光標識を使用して測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００４２】
Ccy8.細胞周期の期が、1以上の蛍光DNA挿入色素を使用して測定される前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００４３】
Ccy9.細胞周期の期が、蛍光挿入色素HOECHST 33342(2'-(4-エトキシフェニル)-6-(4-メチル-1-ピペラジニル)-1H,3'H-2,5'-ビベンズイミダゾール)、DRAQ5(商標)(1,5-ビス{[2-(ジ-メチルアミノ)エチル]アミノ}-4,8-ジヒドロキシアントラセン-9,10-ジオン)、YO-PRO-1ヨウ化物(キノリニウム、4-((3-メチル-2(3H)-ベンゾキサゾリリデン)メチル)-1-(3-(トリメチルアンモニオ)プロピル)-、二ヨウ化物)、DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)及びCYTRAK ORANGE(1,5-ビス{[2-(ジ-メチルアミノ)エチル]アミノ}-4,8-ジヒドロキシアントラセン-9,10-ジオンの誘導体)のうち1種以上を使用して測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００４４】
Ccy10.細胞周期の期が、細胞周期依存性タンパク質の免疫標識によって測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００４５】
Ccy11.細胞周期の期が、サイクリンA、サイクリンB及びサイクリンEのうち1種以上の免疫標識によって測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００４６】
Ccy12.細胞周期の期が、1種以上のリン酸化ヒストンタンパク質の免疫標識によって測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００４７】
Ccy13.細胞周期の期が、遺伝的にコードされた細胞周期依存性蛍光色素、例えば、過リン酸化Rbタンパク質を使用しており、細胞周期がフローサイトメトリーによって測定され得(関連ある部分に関して本明細書に参照により組み込まれる、Juanら「Phosphorylation of retinoblastoma susceptibility gene protein assayed in individual lymphocytes during their mitogenic stimulation」Experimental Cell Res第239巻: 104〜110頁、1998を参照のこと)、サイクリンタンパク質発現(又はそれらのリン酸化状態)が、フローサイトメトリーを使用してモニタリングされ得る(関連ある部分に関して本明細書に参照により組み込まれる、Darzynkiewiczら、Progress in Cell Cycle Research第5巻;533〜542頁、2003中の章「Cytometry of cell cycle regulatory proteins.」を参照のこと)、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００４８】
Ccy14.細胞周期の期が、蛍光タンパク質部分と連結している天然に発現される変動タンパク質を含む遺伝的にコードされた融合タンパク質の発現、例えば、G2/Mでの細胞周期停止(Chengら、「Cell-cycle arrest at G2/M and proliferation inhibition by adenovirus-expressed mitofusin-2 gene in human colorectal cancer cell lines」Neoplasma第60巻;620〜626頁、2013);S期開始の調節(McGowanら、「Plateelet-derived growth factor-A regulates lung fibroblast S-phase entry through p27kip1 and FoxO3a」Respiratory Research、第14巻;68〜81頁、2013)又はサイクリンB1-GFP融合リポーターを使用する生存増殖細胞の同定(Klochendlerら、「A transgenic mouse marking live replicating cells reveals in vivo transcriptional program of proliferation」、Developmental Cell、第16巻;681〜690頁、2012を参照のこと)によって測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。これらの刊行物における開示は、関連ある部分に関して本明細書に参照により組み込まれる。
【００４９】
Ccy15.細胞周期が作用物質によって改変される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００５０】
Ccy16.細胞周期が、細胞培養法の変動によって改変される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００５１】
Ccy17.細胞周期が、培養培地中の以下のもの:グルコース、必須及び非必須アミノ酸、O2濃度、pH、ガラクトース及び/又はグルタミン/グルタミン酸のうち1種以上のレベルの変化によって改変される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００５２】
Ccy18.細胞周期の状態を撹乱させることがわかっている複数の化学物質又は作用物質に対して曝露された細胞の対照集団における細胞状態又は細胞周期段階を検出することをさらに含む、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００５３】
細胞
Cls1.細胞が、in vitro培養された細胞である、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００５４】
細胞が生検細胞である、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００５５】
Cls2.細胞が生存細胞である、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００５６】
Cls3.細胞が固定細胞である、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００５７】
Cls4.細胞が、細胞株である、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００５８】
Cls5.細胞が、天然に存在する健常な細胞型に特徴的である、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００５９】
Cls6.細胞が、疾患に特徴的である、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００６０】
Cls7.細胞が、先天的な遺伝的障害に特徴的である、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００６１】
Cls8.細胞が、癌に特徴的である、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００６２】
Cls9.細胞が、代謝障害に特徴的である、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００６３】
Cls10.細胞が、動物細胞である、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００６４】
Cls11.細胞が、哺乳動物細胞である、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００６５】
Cls12.細胞が、ヒト細胞である、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００６６】
Cls13.細胞が、生殖細胞又は多能性幹細胞を含めた幹細胞である、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００６７】
Cls14.細胞が、体細胞である、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００６８】
Cls15.細胞が、幹細胞である、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００６９】
Cls16.細胞が、胚幹細胞である、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００７０】
Cls17.細胞が、多能性幹細胞である、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００７１】
Cls18.細胞が、誘導性多能性幹細胞である、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００７２】
Cls19.細胞が、芽細胞である、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００７３】
Cls20.細胞が、分化した細胞である、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００７４】
Cls21.細胞が、最終分化した体細胞である、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００７５】
Cls22.細胞が、心筋細胞、肝細胞、ニューロン又はそれらの組合せである、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００７６】
Cls23.細胞が、以下の細胞:一次細胞、形質転換された細胞、幹細胞、昆虫細胞、酵母細胞、好ましくは、足場非依存性細胞、例えば、ヒト造血細胞株など(限定されるものではないが、HL-60、K562、CCRF-CEM、Jurkat, THP-1などを含む)又は足場依存性細胞株(限定されるものではないが、HT-29(結腸)、T-24(膀胱)、SKBR(乳房)、PC-3(前立腺)などを含む)のうち1種以上である、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００７７】
期間
Dur1.細胞が、複数の期間又は種々の時間にわたり作用物質に曝露される、例えば、細胞におけるシグナル伝達経路の活性化について時間経過(速度論)を測定する(例えば、関連ある部分に関して本明細書に参照により組み込まれる、Woostら、「High-resolution kinetics of cytokine signaling in humna CD34/CD117-posiive cells in unfractionated bone marrow」Blood、第117巻;131〜141頁、2011を参照のこと)、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。速度論の分析を含む実施形態は、このような分析を必要としない実施形態よりも好ましい(速度論分析を教示しない、Kornblauら「Dynamic single-cell network profiles in acute myelogenous leukemia are associated with patient response to standard induction therapy」Clin Cancer Res、第16巻;3721〜3733頁、2010を参照のこと)。
【００７８】
Dur2.細胞が、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、44、48、52、56、60、66、72、78時間以上の時間又はそれらのいずれかの組合せの間、作用物質に対して曝露される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００７９】
濃度
Cnc1.作用物質の複数の2種以上の濃度系列、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００８０】
複数のサンプル(サンプルの数)
Plr1.複数のサンプルが測定されることを含む、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００８１】
Plr2.マルチウェルプレートのウェル中に分注された複数のサンプルを測定することを含む、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００８２】
Plr3. 96、384又は1536ウェルプレートのウェル中に分注された複数のサンプルを測定することを含む、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００８３】
基本的な機器の使用/方法
Ins1.応答が、サイトメトリーによって測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００８４】
Ins2.応答が、フローサイトメトリーによって測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００８５】
Ins3.応答が、生存細胞のフローサイトメトリーによって測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００８６】
Ins4.応答が、固定（fixed）細胞のフローサイトメトリーによって測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００８７】
Ins5.応答が、固定化された（immobilized）細胞のイメージングによって測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００８８】
Ins6.応答が蛍光定量によって測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００８９】
Ins7.複数の2以上の応答パラメータが、マルチチャネルセンサーアレイによって測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００９０】
シグナル処理
Sig1.測定値のベクトルに、その列中に、使用される蛍光種のスペクトルを含有する行列の逆行列を乗じることによって、獲得されたシグナルの線形分離によって蛍光シグナルを脱相関することを含み、前記行列が対列ごと（per column）に1に正規化される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００９１】
Sig2.測定値のベクトルに、その列中に、使用される蛍光種のスペクトルを含有する行列の逆行列を乗じることによって、獲得されたシグナルの線形分離によって蛍光シグナルを脱相関することを含み、前記行列が対角ごと（per diagonal）に1に正規化される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００９２】
作用物質
Agt1.細胞が、単一化合物に曝露される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００９３】
Agt2.細胞が、2種以上の化合物に曝露される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００９４】
Agt3.1種以上の化合物が、生理学的応答を刺激する、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００９５】
Agt4. 作用物質が、遺伝的作用物質、例えば、発現されたコード配列、又は化学的作用物質、例えば、薬物候補であり得る、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００９６】
生理学的パラメータ
MMP
MMP1.ミトコンドリア毒性が測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００９７】
MMP2.ミトコンドリア膜電位又は完全性の喪失が測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００９８】
MMP3.ミトコンドリア膜電位又は完全性の喪失が、蛍光色素を使用して測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【００９９】
MMP4.ミトコンドリア膜電位又は完全性の喪失が、JC-1(5,5',6,6'-テトラクロロ-1,1',3,3'-テトラエチルベンズイミ-ダゾリルカルボシアニンヨウ化物)、JC-9((3,3'-ジメチル-β-ナフトキサゾリウムヨウ化物、MITOPROBE(商標)、Molecular Probes)、JC-10(例えば、JC-1の誘導体)、DiOC2(3)((3,3'-ジエチルオキサカルボシアニンヨウ化物;MITOPROBE(商標)、Molecular Probes)、DiIC1(5)((1,1',3,3,3',3'-ヘキサメチルインドジカルボ-シアニンヨウ化物;MITOPROBE(商標)、Molecular Probes)、MITOTRACKER(商標)(Molecular Probes)、ORANGE CMTMROS(クロロメチル-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、MITOTRACKER(商標)ORANGE、Molecular Probes)及びCMXROS(1H,5H,11H,15H-キサンテノ[2,3,4-ij:5,6,7-i'j']ジキノリジン-18-イウム、9-[4-(クロロメチル)フェニル]-2,3,6,7,12,13,16,17-オクタヒドロ-、クロリド、MITOTRACKER(商標)RED、Molecular Probes)のうち1種以上を使用して測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１００】
光散乱
LSg1.細胞状態の生理学的パラメータが、光散乱によって測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１０１】
LSg2.細胞状態の生理学的パラメータが、レーザー光散乱によって測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１０２】
LSg3.細胞状態の生理学的パラメータが、2以上の角度での個々の細胞からのレーザー光散乱された量を定量することによって測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１０３】
LSg4.細胞状態の生理学的パラメータが、レーザー光散乱によって測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１０４】
LSg5.細胞状態の生理学的パラメータが、レーザー光散乱によって測定され、レーザーによって発せられる光の波長が、403〜408nm、483〜493nm、525〜535nm、635〜635nm及び640〜650nmのうちいずれか1以上の範囲にある、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１０５】
細胞生存力
Via1.細胞生存力が測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１０６】
Via2.細胞膜完全性が測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１０７】
Via3.細胞生存力が、膜完全性を測定することによって決定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１０８】
Via4.膜完全性の喪失が、色素を使用して検出される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１０９】
Via5.膜完全性の喪失が、死にかけている細胞又は死細胞に特徴的な膜が損傷している細胞に侵入するが、生存細胞に特徴的な無傷の膜を有する細胞には侵入しない色素を使用して検出される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１１０】
Via6.膜完全性の喪失が、死にかけている細胞又は死細胞に特徴的な膜が損傷している細胞に侵入するが、生存細胞に特徴的な無傷の膜を有する細胞には侵入しない色素を使用して検出され、色素がDNAと結合すると蛍光を発する、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１１１】
Via7.膜完全性の喪失が、以下の色素:プロピジウムヨージド、DAPI及び7-アミノアクチノマイシンDのうち1種以上を使用して検出される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１１２】
Via8.膜完全性が、無傷の細胞膜を横断し、細胞内酵素との相互作用の際に蛍光を発し、生存細胞の細胞質中に留まるが、無傷の細胞質膜を欠くものからは拡散する1種以上の色素を使用して測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１１３】
Via9.膜完全性が、無傷の細胞膜を横断し、細胞内酵素との相互作用時に蛍光を発し、生存細胞の細胞質中に留まるが、無傷の細胞質膜を欠く細胞からは拡散する1種以上の色素を使用して測定され、色素が、フルオレセインジアセテート、カルセインAM、BCECF AM、カルボキシエオシンジアセテート、CELLTRACKER(商標)GREEN CMFDA、クロロメチルSNARF-1アセテート及びOREGON GREEEN 488カルボン酸二酢酸)のうち1種以上である、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１１４】
Via10.生存力が、アネキシンV、リン酸化及び/又は核ラミン分解を含めた、切断されたカスパーゼ/カスパーゼ活性化のうち任意の1以上によって測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１１５】
GLU、ROS、MMP、CMP及び生存力
GRC1.以下の生理学的パラメータ:グルタチオン濃度(「GLU」)、フリーラジカル及び/又は活性酸素種(「ROS」)、ミトコンドリア膜電位/透過性(「MMP」)、細胞質膜透過性及び細胞生存力のうち1以上が測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１１６】
DNA損傷、ストレス、炎症、代謝、アポトーシス
DSI1.以下の生理学的パラメータ:DNA損傷、ストレス応答シグナル伝達経路成分、炎症反応経路成分、代謝経路調節成分又はアポトーシス経路成分のうち1以上が測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１１７】
DSI2.ストレス応答シグナル伝達経路成分SAPKが測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１１８】
DSI3.炎症反応シグナル伝達経路成分NF-kBが測定される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１１９】
DSI4.測定される代謝経路調節成分が、脂質ペルオキシダーゼ、GSk3B及び/又はリボソームS6キナーゼである、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１２０】
DSI5.測定されるアポトーシス経路成分が、PI3K、AKT及び/又はBcl-ファミリータンパク質である、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１２１】
参照バンク
Rbk1.既知撹乱化学物質又は外因性分子作用物質が、その既知効果に基づいてさらに細分される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１２２】
Rbk2.細胞生存力、ミトコンドリア毒性及び細胞周期依存性マーカーによって定義される、細胞周期の段階ごとに計算される前記化合物の使用される濃度ごとの少なくとも1つのさらなる生理学的又は表現型記述子の変化についての情報を含む応答表を作成することをさらに含む、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１２３】
Rbk3.特定の疾患を治療するために使用される既知化合物を説明するテンソルが、単一の定義されるクラス又は複数の定義されるクラスにグループ分けされ、化合物テンソルが、未知又はこれまでに特徴付けられていない化合物を前記の定義されたクラスに分類する教師あり学習（管理された学習）の訓練セットとして使用される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１２４】
Rbk4.既知化合物を説明するテンソルが、副作用などのそれらのオフターゲット応答に基づいてクラスにグループ分けされる、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１２５】
Rbk5.教師なし学習（管理されない学習）を使用して同様の化合物のクラスターを発見するために特徴テンソルが使用される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１２６】
Rbk6.特徴テンソルが、ベクトル化される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１２７】
作用物質作用の分類
Cls1.化合物に曝露された細胞の集団から得た複数の細胞特徴を検出することを含み、前記特徴が、2以上の角度で測定された光散乱強度の割合によって同時に定量化される形態学的特性に関連付けられる、いずれかに従う生物学的に活性な化合物を分類するための方法。
【０１２８】
Cls2.前記細胞集団の培養物を、複数の化合物に曝露すること及び前記化合物の存在下及び不在下で、前記細胞集団の生理学的応答を検出することを含む、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１２９】
Cls3.前記培養物からサンプリングされた個々の細胞の生理学的応答を検出することを含む、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１３０】
Cls4.生理学的応答が、ミトコンドリア毒性であり、JC-1、JC-9、JC-10、DiOC2(3)、DiIC1(5)、MITO TRACKER(登録商標)ORANGE CMTMROS、MITO TRACKER(登録商標)RED CMXROSからなる群から選択される1種以上の蛍光標識を使用してミトコンドリア膜電位の喪失又はミトコンドリア膜完全性の喪失の点で定量化される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１３１】
Cls5.生理学的応答が、全体的な細胞生存力であり、1種以上の蛍光標識を使用して細胞膜完全性の喪失の点で定量化される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１３２】
Cls6.蛍光標識が、極めて明るい蛍光をもたらす細胞内部に入る色素(例えば、プロピジウムヨージド及び7-アミノアクチノマイシンD)、
無傷の細胞膜の膜を横断し、細胞内酵素との相互作用時に蛍光分子を生成する色素(例えば、フルオレセインジアセテート、カルセインAM、BCECF AM、カルボキシエオシンジアセテート、CELLTRACKER(商標)GREEN CMFDA、クロロメチルSNARF-1アセテート、OREGON GREEN 488カルボン酸二酢酸)
からなる群から選択される、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１３３】
Cls7.グルタチオンの濃度、活性酸素種又はフリーラジカルの存在からなる群から、少なくとも1つのさらなる生理学的又は表現型記述子を検出することをさらに含む、前述のもの又は以下のもののいずれかに従う方法。
【０１３４】
システム
Sys1.コンピュータで実行されると、前述又は以下の方法のいずれかをコンピュータに実施させる、コンピュータプログラムを記憶する非一過性のコンピュータ可読記憶媒体を含む、生物学的データセットを評価する/比較するためのシステム。
【０１３５】
Sys2.コンピュータで実行されると、作用物質に対する1以上の細胞応答を特徴付けるための前述又は以下の方法のいずれかをコンピュータに実施させ、前記方法が
前記作用物質の濃度cに曝露される集団中の細胞の複数の生理学的パラメータpをサイトメトリーによって測定すること、
各濃度で細胞集団の各パラメータについて集団と対照の間の一連の距離を算出すること、及び
各化合物のテンソル又は一連のテンソルをコンパイルすること(テンソルは、化合物フィンガープリントを含有する)、及び
テンソル分解によってテンソルを圧縮して、ベクトルの形態の簡略化された化合物フィンガープリントを得ること
を含む、コンピュータプログラムを記憶する非一過性のコンピュータ可読記憶媒体を含む、生物学的データセットを評価/比較するためのシステム。
【０１３６】
Sys3.コンピュータで実行されると、作用物質に対する1種以上の細胞応答を特徴付けるための方法をコンピュータに実施させ、前記方法が
(A)第1の細胞集団を第1の作用物質の複数の濃度cに曝露し、
前記第1の作用物質の各濃度で集団中の細胞の複数の生理学的パラメータpをサイトメトリーによって測定し、
前記第1の作用物質を説明することから1以上のテンソルをコンパイルし、
分解によってフィンガープリントテンソル(複数可)を圧縮して、ベクトルの形態の簡略化された化合物フィンガープリントを得ること、
(B)第2の細胞集団を第2の作用物質の第2の複数の濃度c2に曝露し、
前記第2の作用物質の各濃度で集団中の細胞の複数の生理学的パラメータpをサイトメトリーによって測定し、
前記第2の作用物質を説明することから1以上のテンソルをコンパイルし、
分解によってフィンガープリントテンソル(複数可)を圧縮して、ベクトルの形態の簡略化された化合物フィンガープリントを得ること、並びに
(C)第1及び第2の簡略化されたフィンガープリント間の非類似度を算出して、第1及び第2の作用物質に対する細胞の応答間の相違を決定すること
を含む、コンピュータプログラムを記憶する非一過性のコンピュータ可読記憶媒体を含む、生物学的データセットを評価/比較するためのコンピュータシステム。
【０１３７】
Sys4.コンピュータで実行されると、作用物質に対する1以上の細胞応答を特徴付けるための方法をコンピュータに実施させ、前記方法が、
1以上の陰性、1以上の陽性対照に対する、及び化合物の1以上の濃度に対する2以上の細胞生理学応答を測定すること、
特定の細胞周期区画及び特定の形態学的クラスにある細胞をゲーティングすることによって、対照及び濃度系列について細胞の亜集団を選択すること、
陽性及び陰性対照各々の、及び各濃度の細胞測定値の分布間の非類似度を算出し、
それによって化合物に対する細胞の応答を決定すること
を含む、
コンピュータプログラムを記憶する非一過性のコンピュータ可読記憶媒体を含む、生物学的データセットを評価/比較するためのコンピュータシステム。
【０１３８】
データセット及びデータベース
Dbs1.2種以上の細胞パラメータの値を含むデータセット。
【０１３９】
Dbs2.候補作用物質の不在下又は存在下で生物学的因子に対して曝露された細胞の複数の細胞パラメータの測定値を含むデータセット。
【０１４０】
Dbs3.化合物応答テンソルの形態の化合物フィンガープリントデータセットを含むデータベース。
【０１４１】
Dbs4.信頼されるプロファイルが推測的に知られる及び十分に特徴付けられた化合物の応答テンソルである、試験プロファイルの同定のための信頼されるプロファイルのデータベース。
【０１４２】
Dbs5.データセットは、対照データセット又は試験データセット又は既知作用物質のパラメータ変化を反映するプロファイルデータセットであり得る。複数の状況により定義されるシステムの分析のために、複数の系から得た出力データを連結してもよい。
【０１４３】
フィンガープリント
Fpt1.複数の細胞応答パラメータの値を含む薬物フィンガープリント。
【０１４４】
Fpt2.状態テンソルの反復測定値の平均を含む、化合物の類の薬物フィンガープリント。
【０１４５】
Fpt2.テンソルが、複数の化合物の測定値を含有していた場合には、前記テンソル分解によって生じたベクトル又は行列を含む、化合物の類の薬物フィンガープリント。
【０１４６】
本明細書に記載される実施形態の種々の特徴及び利点は、添付の図面を踏まえて検討される、より良好に理解されるようになるので十分に理解され得る:
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１Ａ】実施例1に記載されるような正常細胞のサイトメトリープロファイルを示す図である。細胞を、モノブロモビマン(MBBR)を用いて測定した場合に、細胞/核チオールレベル、主にグルタチオン(GSH)レベルを測定するために特異的に標識した。細胞を、実施例1に記載されるような種々の蛍光色素を使用して染色した。細胞質膜透過性は、カルセインAMを用いて測定され、活性酸素種(ROS;ミトコンドリア機能と関連している)は、MITOSOX RED(商標)を用いて測定され、細胞質膜及び核膜透過性(生存/死滅)は、SYTOXRED(商標)を用いて測定される。
【図１Ｂ】「レーダー」プロットの形態で図1Aのデータを示す図である。
【図２】前方散乱(FS)、グルタチオン、カルセインAM、ROS及び細胞生存力について実施例2に記載されるように分析された、100μMのミキソチアゾール(ミトコンドリアシトクロムbc1複合体の阻害剤)を用いて処理された細胞の一連のプロットである。図1Aと図2を比較することで、100μMのミキソチアゾールを用いる処理が、細胞質膜及び核膜透過性(生存力)を撹乱させることが示される。
【図３】前方散乱、グルタチオン、カルセインAM、ROS及び生存力について実施例2に記載されるように分析された33μMのカルボニルシアニド-4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン「FCCP」、ミトコンドリアにおいて脱共役剤として作用するイオノフォアモバイルイオンキャリヤー)を用いて処理された細胞の散乱プロットを示す図である。矢印は、図1Aに示される対照集団と比較した細胞パラメータのシフトを示す。
【図４Ａ】前方散乱、グルタチオン、カルセインAM、ROS及び生存力について実施例2に記載されるように分析された100μMフルオキセチン(選択的セロトニン再取り込み阻害剤)を用いて処理された細胞の散乱プロットである。
【図４Ｂ】4つの軸に沿ってプロットされた図2、図3及び図4Aの一連の多次元プロファイルである:100μMのミキソチアゾール(上左)、33μMのFCCP(上右)又は100μMのフルオキセチン(下中央)を用いて処理された細胞のもの。
【図５】実施例3に記載されるような、VYBRANVIOLET(商標)色素を使用する生存HL-60細胞における細胞周期段階の対照分析の結果を示す図である。縦軸に細胞数が示されている。横軸にDNA含量が示されている。左側の紫色のスパイクは、G1期の細胞を示す。幅広い桃色の領域は、S期の細胞を示す。右側の交差して陰影が付いた紫色のピークは、G2/M期の細胞を示す。
【図６Ａ】図6Aは、実施例4Aに記載されたように、迅速なMMP脱分極を引き起こすバリノマイシンに曝露されたHL-60細胞のミトコンドリア膜電位(MMP)を示すグラフである。脱分極は、色素JC-9の緑色及び赤色蛍光シグナルを増大する。細胞がバリノマイシンに曝露された場合には、赤色及び緑色蛍光の両方が有意により高く、およそ約0.045μMにピークがある。
【図６Ｂ】実施例4Bに記載されたように、アントラサイクリン  抗白血病薬イダルビシン、ダウノルビシンの類似体を用いて処理されたHL60細胞におけるJC-9蛍光を示すグラフである。イダルビシンは、DNA中に挿入し、DNA複製の際に巻き戻しを防ぐ。JC-9色素の赤色蛍光は、1.23μMのイダルビシンで有意に増加し始め、それを上回って増加し続ける。緑色蛍光は増加しない。
【図７】図7は、実施例5Aに記載されるように、固定された透過処理された細胞の細胞周期分析の結果を示す図である。  上左側のパネルは、DNA染色による周期のG1、S及びG/2M段階の細胞の明確な描写を示す(図5について上記で説明されるように)。  上部右側のパネルは、細胞周期の関数として、ALEXA FLUOR(登録商標)647にコンジュゲートされたP-H3抗体を使用して測定されたリン酸化ヒストンH3(「P-H3」)の結果を示す。DNA含量は、上左側のパネルに関して測定された。結果は、P-H3がG2/Mにおいてのみ発現されることを示す。  下の2つのパネルは、細胞周期の関数として、PEにコンジュゲートされた抗A2抗体を使用して測定されたサイクリンA2の結果を示す。DNA含量は、上左側のパネルに関して測定された。サイクリンA2は、Sを通る細胞の進行を増大し、G2/Mにおける異なるサイクリンA2発現の2つの集団を形成する。  下右側パネルは、後期Sを通りG2からMへの細胞進行の間のP-H3のものに対するサイクリンA2の結果を示す。  これらの細胞周期集団のみでのその後の分析(DNA含量を使用する)の「ゲーティング」によって、P-H3は、最高のサイクリンA2レベルを有する細胞(G2集団)において最初に発現されること、P-H3は、高レベルで維持されるが、サイクリンA2は低下すること及びP-H3は、次いで、有糸分裂(M)からG1に戻る細胞進行につれて「失われる」(G2へ入った際にリン酸化された特定のセリン残基の脱リン酸化によって)ことが明らかである。伝統的なフローサイトメトリー分析では、異なる細胞集団(DNA含量に基づいて)を注意深く手作業で「ゲーティング」する(選択する)こと及びタンパク質(又は異なる抗体コンジュゲートによって定義される他の標的)の発現を続いて分析することによって、タンパク質発現におけるこれらの一連の変化が確立されている。
【図８】末梢血単球で見られるToll様受容体4(TLR4)の下流のシグナル伝達経路の例を示す図である。PI3キナーゼ(PI3K)及びマイトジェン関連タンパク質キナーゼキナーゼ(MAPKK)経路の代表的な阻害剤が矢印によって示されている。
【図９】実施例6に記載されるような、PI3キナーゼ阻害剤GDC0941の不在下(左パネル)及び存在下における、LPSに対するヒト末梢血単球におけるシグナル伝達反応の速度論(分で)を示す図である。  緑色-IκBα、赤色-P-ERK、橙色-P-Akt、青色-P-S6。  左側のパネルに見られるように、LPS処理は、Iκキナーゼを活性化しIκBαのプロテアソーム分解-緑色/ALEXA FLUOR(登録商標)488蛍光シグナルの喪失)、ERK、Akt及びS6(それぞれ、ALEXA FLUOR(登録商標)647、PE及びPacific BlueとコンジュゲートしているP-ERK、P-Akt及びP-S6に対する抗体を使用してフローサイトメトリーによって検出される個々のリン酸化タンパク質)を活性化(リン酸化)する。  右側パネルは、PI3キナーゼ阻害剤GDC0941の存在下では、P-Aktはリン酸化されず、LPS単独を用いて処理された対照細胞(左側パネル)と比較して、ERK及びS6リン酸化の速度論が遅延することを示す。PI3K阻害が、IκBαのプロテアソーム分解に影響を及ぼさないことがさらに示される。
【図１０】GLEEVEC(商標)(イマチニブ又はSTI571)に対して細胞を曝露する効果を示す図である。その詳細は、実施例7に提供される。図からわかるように、2μMを用いる30分間のK562細胞の処理は、STAT5標的の下流のリン酸化の>95%の阻害をもたらす。リン酸化されたSTAT5は、サイクリンDを含めたいくつかの標的タンパク質の転写アクチベーターとして作用し、サイクリンDの構成的発現は、細胞周期におけるK562細胞を維持する。  図において見られるように、STAT5のリン酸化は、30分のイマチニブ曝露後に阻害されるが(GLEEVEC処理細胞における閾値ラインを上回るものから閾値ラインを下回るものまでの、P-Stat5陽性である細胞の総集団におけるシフトによって実証されるように)、DNA含量によって測定されるように(挿入図を参照のこと)、細胞周期において同時に起こる変化はない。
【図１１】二次元で一緒にあるように思われる化合物が、3以上の次元でマッピングされると、実際には互いに距離があることを示す、応答データのマルチウェイ（多元）MDS可視化の二次元及び三次元での例を提供する図である。
【図１２】抗糖尿病薬トログリタゾンの薬物フィンガープリントを示す図である。その詳細は、実施例8に概説されている。
【図１３】分析される細胞表現型(例えば、細胞及び核膜完全性又はROSの存在)に基づいて、種々の薬物間の生理学的類似度を可視化するための代表的な樹形図を示す図である。
【図１４】薬物応答フィンガープリントを表す多元テンソルの例を示す図である。
【図１５】代表的なクラウドの進化を示す図である。複雑な点クラウド間の非類似度によって定義される空間においての変化が込み入った軌跡を形成し、その軌跡は、それらの変化を引き出す化合物特性を一意的に記述している。
【図１６】細胞生理学アッセイを実施するための一般的なプロセスステップを示すフローチャートである。
【図１７】本明細書に記載されるテンソル法を使用するデータ分析におけるステップを示すフローチャートである。
【図１８】化合物に曝露された(A)及び曝露されなかった(B)細胞のシミュレートされたフローサイトメトリー分析の結果の2-D散乱プロットを示す図である。(A)及び(B)は、それぞれ、作用物質の陽性及び陰性対照を表す。FL1及びFL2は、蛍光シグナル1及び2である。
【図１９】実施例9に記載されるような、漸増濃度の生物学的作用物質に曝露されたサンプルのシミュレートされたフローサイトメトリー分析の結果の2-D散乱プロットを示す図である。各サンプルは、5,000個細胞を含有する。濃度はAからJに増大させた。陽性対照様クラスター中の細胞数は、Aにおける4,909から、Jにおける29まで減少した。FL1及びFL2は、蛍光シグナルである。
【図２０】実施例9及び図18に記載されるシミュレートされたフローサイトメトリー分析の応答曲線の2つのグラフを提供する。(A)は、陽性様対照クラスター中の細胞数の関数としての各サンプルの結果を示す。(B)は、陽性様対照クラスター中の細胞のパーセントの関数として各サンプルの同結果を示す。
【図２１】実施例9に記載されるような、非類似度の測度を提供するための各サンプルについて算出された4つの距離を示す。(1)パラメータ1のサンプルと陰性対照との間の距離。(2)パラメータ1のサンプルと陽性対照との間の距離。(3)パラメータ2のサンプルと陰性対照との間の距離。(4)パラメータ2のサンプルと陽性対照との間の距離。
【図２２】ポリアディック(polyadic)テンソル分解によって導かれた実施例9に記載されたシミュレーションの応答曲線を示す図である。結果は、ベクトルの平均を差し引くこと及び標準偏差で除することによってセンタリングした。結果は、z-因子として表されており、左側のグラフに示されている。右側のグラフは、陰性対照と陽性対照との間の相違に対して正規化された、すなわち、陰性対照と陽性対照との間の相違が、単位(1)として定義され、この相違に対してスケーリングされた結果を示す。
【図２３】縦軸に沿って陰性対照様クラスター中の細胞のパーセンテージで従来的に表され、横軸に沿って距離/非類似度の点で表された実施例9に記載されたシミュレーションの結果のグラフである。距離/非類似度は、実施例9に記載されるような図18に例示されるような陽性及び陰性対照を使用して同一結果について算出した。
【図２４】実施例9Bに記載されるような漸増濃度のバリノマイシンに対して曝露されたサンプルのフローサイトメトリー分析の結果の2-D散乱プロットを示す図である。JC9の赤色(縦軸)及び緑色(横軸)蛍光の割合を測定して、ミトコンドリア膜電位を決定した。バリノマイシン濃度は、A(最低濃度)からJ(最高濃度)に増大した。
【図２５】図25は、実施例9Bに記載され、図24に例示されるバリノマイシン分析の(丸)、同様に得られたイダルビシン(菱形)及びアセトアミノフェン(三角)データの非類似度の応答曲線を示す図である。非類似度は、実施例に記載され、また図21に例示されるように算出した。左のグラフは、サンプル数の関数として非類似度を示す。右のグラフは、濃度の関数として非類似度を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１４８】
本発明の例示的実施形態は、例えば、薬物などの化学化合物に対して曝露された細胞の生理学的応答を定量化し、比較することに関して、情報、特に、例えば、サイトメトリーベースの情報に基づいて、複雑な集団を収集し、コンパイルし、表し、利用するための自動化された、観察者独立性の、頑強な、再現性のある及び遺伝的な方法を提供する。種々の実施形態は、応答テンソルによって応答を特徴付けるための方法を提供する。例示的実施形態は、1以上の次元における分布間の距離の種々の統計学的尺度及び多元テンソルにグループ分けされた応答ベクトル間の非類似度の測度の使用を提供する。種々の実施形態では、2種(又はそれ以上)の化学化合物に対する細胞応答の相違は、前記化合物を表す2つの応答テンソル(「フィンガープリント」)間の相違として特徴付けられる。実施形態は、前記フィンガープリントを作成するための方法及びそれを操作し、処理し、保存し、分類し、使用する方法を提供する。
【０１４９】
本明細書に記載される種々の実施形態では、例えば、それらの間、多くは、試験データセット及び対照の間又は試験データセット及びプロファイルデータセットの間の対応を決定するために生物学的データセットが分析される。比較は、通常のデータセットが、候補作用物質の不在下又は存在下で生物学的因子に対する細胞の曝露に起因するものなどの複数の細胞パラメータから得た読み出し情報を含み、作用物質が、例えば、遺伝的作用物質、例えば、発現されたコード配列、又は化学的作用物質、例えば、薬物候補又は環境毒素であり得る2種以上のデータセット間で行われ得る。種々の実施形態では、測定は、サイトメトリー、例えば、フローサイトメトリーを使用して実施される。
【０１５０】
サイトメトリー
本明細書に記載された種々の実施形態の方法は、サイトメトリーによって決定されるような、細胞集団中の個々の細胞での複雑なマルチパラメトリックデータの分析に適している。本明細書にまとめられたサイトメトリー機器及び技術(例えば、フローサイトメトリー及びイメージングサイトメトリー)によって、個々の細胞の複数の固有の特徴(例えば、光散乱、細胞容量など)又は派生特徴(例えば、蛍光、吸収など)の同時測定が可能となる。光散乱及び蛍光は、現在のサイトメトリー適用の最も一般的に利用される測定値に相当する。蛍光測定は、細胞中に天然に存在する「固有の」フルオロフォア(例えば、ポルフィリン、フラビン、リポフスチン、NADPHなど)、特異的発現のために遺伝子操作されたフルオロフォア(例えば、GFP、RFPなど)又は種々の細胞型中の若しくは細胞型上の特異的エピトープ若しくは構造を標的とする蛍光リポーター(例えば、フルオロフォアがコンジュゲートしている抗体、アプタマー、ファージディスプレイ若しくはペプチド又は細胞中若しくは細胞上で特異的酵素によって非蛍光から蛍光状態へ変換されるリポーター)のいずれかを使用して実施され得る。
【０１５１】
本明細書に記載される実施形態において有用なサイトメトリー技術は、生存細胞を利用する(例えば、例えば、ミトコンドリア膜電位、ROS、グルタチオン含量又はそれらの組合せなどの細胞「生理学」の態様に関して細胞を報告するプローブを使用して)。いくつかの実施形態において有用なサイトメトリー技術は、フルオロフォアがコンジュゲートしているリポーターの細胞質及び/又は核への輸送を可能にするよう固定され、透過処理される細胞をさらに使用する。
【０１５２】
フローサイトメトリーを使用する細胞アッセイの一般的な方法
本明細書に記載される種々の態様及び実施形態と一致するサイトメトリーにとって有用な一般的な方法は、以下に記載されており、図16において一般化されたフローチャートに示されている。
【０１５３】
足場独立性細胞の培養
当技術分野で周知であり、日常的に使用される、活性アッセイ及びフローサイトメトリーによる分析にとって適した細胞及び方法が、本明細書に記載される本発明の実施形態の実施において使用され得る。
【０１５４】
アッセイのための細胞は、市販の又は他の供給源から得ることができる。培養容器に付着せずに増殖する白血病に由来するものなどのヒト癌由来の細胞(例えば、細胞生理学アッセイにおいて現在使用されるHL-60細胞)が使用され得る。細胞は、一般的に、標準細胞法に従って液体窒素中で保存され得る。凍結細胞は、37℃の水浴中で迅速に解凍され、37℃の組織培養インキュベーター中、予め加温された新鮮な組織培養培地中、静置フラスコ中で培養される。組織培養培地は、通常、細胞が凍結されているDMSOを希釈するために、培養の最初の2〜4日間毎日置換される。
【０１５５】
ひと度、静置フラスコ中で増殖が確立すると(Vi-cell(商標)細胞カウンターを使用して細胞数及び生存力がモニタリングされる)、フリーザー貯蔵のために細胞のアリコートを取り出し得る(これらの初期継代細胞は、バックアップのためにのみ使用される)。さらに、これらの細胞は、プレートアッセイのために十分な細胞数を有するために必要とされるローラーボトル培養を確立するために使用し得る。フラスコ中で増殖する細胞が、比較的高細胞濃度(200mlの新鮮組織培養培地中、1mlあたり約106個細胞)でローラーボトル中に入れられ、組織培養インキュベーター中で培養される。ローラーボトル培養は最初に、通常、新鮮な組織培養培地の添加によって供給される。ひと度、増殖が確立すると、0.5〜1.5x106個の生存細胞/mlの濃度の細胞を維持するために必要に応じて細胞を取り出す。多数の細胞型がローラーボトル培養にゆっくりと適応し、これらの種類の培養に成功裏に適応するために数週間を必要とする。ローラーボトル適応の成功は、連続的な高い生存力(約95%)及び連続的な増殖速度(倍加時間を使用して測定される)によって証明される。成功裏に適応されると、同様に少ない継代数でアッセイに使用される細胞を維持するために細胞のストックが凍結される(1つの新規ローラーボトル培養を開始するのに十分な細胞を含有する50mlの滅菌チューブ中に)(以下に詳述される)。ローラーボトル中で維持された細胞は、アッセイプレートのために回収され、遠心分離され、実施されるべきアッセイに適当な細胞濃度で、新鮮な組織培養培地中に再懸濁される(各回収について細胞数及び生存力が測定され、記録される)。
【０１５６】
上記に示されるように、ローラーボトルに適応した細胞は、すべてのプレートアッセイについて同様に少ない継代数の細胞を維持するためにさらなる使用のために凍結され得る。ローラーボトル細胞培養は、1ヶ月間維持され、その後、少ない継代の凍結細胞の新規ロットに切り替えられ得る。日常的な使用の月の間、通常、凍結細胞の1つのチューブが解凍され、ローラーボトル培養に再確立される。ひと度、ローラーボトル培養への適応が成功すると(上記のように)、最も新しいロットの細胞が、普通、アッセイ実施のためにまず評価され(以下の「クロスオーバー」研究を参照のこと)、その後、このロットの細胞はプレートアッセイにおいて使用される。凍結細胞をローラーボトル培養に確立すること及び日常的に試験することは、10から21日かかる。
【０１５７】
細胞は、一般的に、マイコプラズマ混入について培養プロセスにおいて複数のステップで日常的に試験される。これらは、最初のフラスコ培養、ローラーボトルに適応された細胞、凍結細胞の各チューブ(各「クロスオーバー」研究の前に試験される)を含む。マイコプラズマ試験は、外部の認定された試験企業によって、通常、PCRベースのアッセイを使用して提供され得る。
【０１５８】
化合物貯蔵及び化合物アッセイ準備
試験化合物は、一般的に、96ウェルプレート中に蓄積されたDMSO中の10mMストックとして得られる。化合物プレートは、室温、暗所で密閉されて保存される。化合物アッセイのために、保存溶液は希釈され(DMSOでの5から10ステップの化合物希釈)、液体処理システムを使用してアッセイプレート中に入れられる。すべての希釈及びアッセイプレート中への化合物蓄積は、アッセイが実施される同日に実施される。各ウェル中に入れられた化合物の最終容量は、2μlであり、細胞の添加後に1%のDMSOの最終濃度をもたらす。
【０１５９】
アッセイの再現性は、試験化合物を使用して評価されなければならない。特定の細胞生理学的測定値に対して十分に実証された影響を有する一連の16種の化合物を使用して、細胞生理学アッセイの再現性を試験した。これらの化合物は、上記のように、96ウェルプレート中にDMSO中の10mMアッセイ溶液として保存される。「クロスオーバー」研究のために、新規に解凍された細胞及びローラーボトルに適当した細胞の生理学的応答を、製造細胞の現在のロットと比較するために16種の化合物のセットが使用される。
【０１６０】
細胞生理学アッセイ
細胞生理学アッセイのために、2セットの384ウェルプレートを使用して、10種以上の細胞応答パラメータに対する化合物の影響を測定することが好都合であり得る。両セットのプレートのために、化合物希釈物をまず、ウェル中に分注し、次いで、ステップ2602に示されるように、各ウェルに1X106個のアッセイ細胞を添加する。化合物を慣用的に、個々のクライアントのための研究の開始時に、同一プレートで2連の化合物希釈セットを用いて実行し、応答の再現性を測定するために最初の16から32種の化合物について2連のプレートを実行する。ステップ2604に示されるように、完全に混合した後、プレートを密閉し(O2/CO2透過性シールを使用して)、37℃の組織培養インキュベーター中に種々の期間(通常、4時間)入れる。次いで、ステップ2606においてプレートを遠心分離し、上清流体の半量を除去し、同一容量の適当な色素混合物(プレートAについては、色素混合物は、モノブロモビマン、カルセインAM、MitoSox(商標)及びSytox Red(商標)を含み得、プレートBについては、色素混合物は、Vybrant Violet(商標)(生存細胞周期)、JC-9(ミトコンドリア膜電位)及びSytox Red(商標)を含み得る)によって置換し、ステップ2608に示されるように、続いて、混合する。ステップ2610において、プレートを組織培養インキュベーターに約15分間(プレートA)又は30分間(プレートB)戻し、ステップ2612におけるフローサイトメーターでの混合した、即時の実施を続ける。
【０１６１】
各行で陽性及び陰性対照ウェルから得たデータを使用して、本明細書においてより詳細に記載されるような応答を算出する。プレートA及びBのために使用される陽性対照化合物は異なっており、開示された実施形態を使用するプレートA又はBにおいて測定される細胞応答において、独特の「シグネチャー」(「フィンガープリント」)を提供するよう設計される。
【０１６２】
ハイスループットフローサイトメトリー
種々のアッセイでは、フローサイトメーターは、プレートがアッセイされる各日に標準手順を使用して設定される。設定は、標準化された標的に対して各検出器(PMT)を設置するために使用される、蛍光ビーズを使用するフロー機器QA/QCを含む。次いで、384ウェルプレートの各ウェルが、6秒のシップ時間とそれに続くサンプル間で1秒の気泡を使用して連続的にサンプリングされる。サンプル流は、フローサイトメーターを通って連続的に流れ、完全なプレート(それぞれ、プレートA及びB)を20〜30分でサンプリングする。
【０１６３】
フローサイトメトリーデータファイル(1つのプレートの)は、開示された実施形態によってその後処理され、個々のウェルデータが同定され(いくつかの相互作用及びヒトの介入を使用して)、次いで、単一プレートからの各ウェルのリストモードデータ(LMD)としてサーバーに保存される。
【０１６４】
各プレートのQA/QC分析
プレート(A及びB)の両方が、陰性対照(未処理サンプル)及び陽性対照(プレートAに対しては50μM FCCP及び50μMミキソチアゾールの混合物又はプレートBに対しては25μM FCCPを用いて処理されたサンプル)を含有する。陽性対照と陰性対照との間の非類似度は、このアッセイにおいて応答のあり得る範囲を定義しない。しかし、応答の単位を定義する。全プレートの分析の時間の間に、陽性対照と陰性対照との間の非類似度がプレートにおける悪化する生理学的条件のために変化し得る(温度、O2の変化など)。これは、対照の対ごとの特定の最小レベルの非類似度が予想される理由である。単一行内の各陽性及び陰性対照について、開示された実施形態は、各色素応答の陽性及び陰性集団間のQF距離を個別に決定する。次いで、開示された実施形態は、プレートのはじめ(列A)から最後(列P)から得たQF距離の変化をプロットする。
【０１６５】
本明細書に記載される実験は、一般的に、以下の手順に従って実施されている。
【０１６６】
サイトメーター機器使用
現在のフローサイトメトリー機器は、個々の細胞を起源とする多数の蛍光シグナル及び固有の光学的特徴を同時に定量化できる複数のレーザー及び複数の別個の蛍光検出器を備えている。したがって、以下に例示的に記載されるものなどのサイトメトリー技術及び機器は、サンプル中の数千から数百万個の細胞の測定を可能にする。得られた極めて大きなデータセットは、現在使用されるサイトメトリーデータ処理及び可視化法に相当な課題を提示する。これらの課題は、本明細書に記載される方法によって効果的に取り扱われる。
【０１６７】
現代のサイトメーターは、通常、サンプルからのいくつかの異なるシグナルの同時検出のために設計されている。本明細書に記載される方法に従って使用され得る種々のサイトメーターが市販されている。通常の機器は、フローセル、集束レンズを通してフローセルを照射する1以上のレーザー、フローセルを通る光の検出器、前方散乱光の検出器、特定の波長の光を測定するための、通常、蛍光を検出するためのいくつかの二色性ミラー-検出器配置を含む。市販の機器には、様々な他の機器使用が組み込まれていることが多い。
【０１６８】
通常の操作では、レーザー(複数可)は、フローセル及びそれを通って流れる細胞(又は他のサンプル)を照射する。レーザーによって照射される容量は、照射点と呼ばれる。フローセルは、ガラス、石英及びプラスチック並びに他の材料製である。レーザーは、サイトメーターにおける最も一般的な光の供給源であるが、他の光供給源も使用され得る。ほとんどすべてのサイトメーターが、前方散乱及び後方散乱光の種々のパラメータ並びに同様に蛍光発光のいくつかの波長を検出し、測定できる。これらの機器中の検出器は、かなり感度が高く、個々の細胞からの光散乱及び蛍光を極めて短期間で容易に定量化する。検出器からのシグナルは、通常、幅広い様々なサンプル特性を決定するために、デジタル化され、コンピュータによる方法によって分析される。本明細書に記載される本発明の種々の態様及び実施形態と一致して使用され得るフローサイトメトリー法に関して利用可能な多数の教本がある。この関連で1つの有用な参考文献として、本明細書に記載される方法に従って使用され得るような、特に、サイトメトリー及び細胞分析に関連ある部分に関して参照により組み込まれるPractical Flow Cytometry、第4版、Howard M. Shapiro、Wiley、New York (2003) ISBN: 978-0-471-41125-3がある。
【０１６９】
フローサイトメトリーシグナルのスペクトル非混合
機能的蛍光標識によって発せられるシグナルは、サイトメトリーシステム(フロー又はイメージベースの)中の一連の検出器によって測定されるので、検出システムは、スペクトルクロストークしやすい。結果として、個々の蛍光色素の強度は、他の蛍光色素の排除のために直接測定され得ない。スペクトルクロストークによるノイズを最小にする又は排除するために、集められたシグナルのすべてが、線形混合物としてモデル化されるか、又は処理され得る。各測定された細胞のシグナル混合物は、測定された結果及び非混合シグナルの推定量を混合行列を乗じることによって形成される近似された組成の間の最小逸脱を見出すことによって、個々のシグナル強度の近似に分解される。混合行列(「スピルオーバー行列」とも呼ばれる)は、個々の標識の蛍光スペクトルのn-バンド近似を説明する(ここで、nは、システム中で使用される検出器の数である)。最小化アルゴリズムの適用によって、シグナル組成の最良の推定を見出すことが可能になる。この推定は、種々の標識の存在量についての情報を提供する。最も単純な場合には、測定値誤差がガウスであると推定されるなら、通常の最小二乗法(OLS)最小化を使用して非混合プロセスが実施されてもよい。
【０１７０】
分散安定化
分散安定化(VS)は、探索的データ解析を単純化するように、又は、より複雑で、しばしば雑音があり、不等分散なデータのセット(つまり、列内の確率変数が異なる有限な分散を有する)に対して、データ等分散性を仮定するデータ解析技術の使用を可能にするように設計された処理である。VSは、蛍光に基づく様々な生物学的測定システムに慣用的に広く応用されてきている。これは、マイクロアレイの解析には重要なツールである。
【０１７１】
フローサイトメトリーの状況及びマクロアレイ解析において、対数変換は伝統的に使用されてきた。しかし、現代的な手法が、例えば、マイクロアレイ解析の状況において知られている。例えば、Rockeら(「Approximate variance-stabilizing transformations for gene-expression microarray data.」 Bioinformatics、19、966〜972頁2003)及びHuberら(「Variance stabilization applied to microarray data calibration and to the quantification of differential expression.」 Bioinformatics、18、S96〜S104, 2002)を参照のこと。Huberには、分散安定化に逆双曲正弦関数(hyperbolic arcsine function)の使用が記載されている。フローサイトメトリーのデータ解析の状況では、Mooreら(「Automatic clustering of flow cytometry data with density-based merging」, Adv Bioinformatics、2009)は、論理変換(logical transformation)を使用している。Bagwell(「Hyperlog-a flexible log-like transform for negative, zero, and positive valued data.」 Cytometry A. 64(1):34〜42、2005)には、フローサイトメーターからの出力の分析において、hyperlog変換の使用が記載されている。
【０１７２】
本発明の実施形態において、対照的に、経験的に発見されたパラメータを有する逆双曲正弦技術(一般化された対数)が、分散安定化において使用される。
【数１】
0006606100.tif 000002
【０１７３】
比較
本明細書に記載のある実施形態では、比較ステップに関わる方法を提供し、非混合シグナルの強度の分布が、対照又は他の試験データを起源とする、非混合シグナルの分布と比較される。適用される比較方法に応じて、分布をその積分で割ることで、それぞれの分布は最初に正規化されてもよい。
【０１７４】
比較ステップは、細胞集団の処理前後間での非類似度の情報を含む応答テンソルのコンパイルに関わってもよい。非類似度は、細胞の処理済集団、未処理集団(「陰性」又は「効果なし」対照)及び観測可能な生理学的反応を最大化するように設計された撹乱剤の混合物で処理された集団(「陽性」又は「最大効果」対照)のシグナル分布間での距離として計算される。
【０１７５】
結果を標準化して実験変数による影響を受けないようにするために、測定された非類似度は、陽性対照と陰性対照との間の平均非類似度に等しい単位で表示されることが可能である。
【０１７６】
非類似度又は距離の様々な測度が適用され得、(限定されないが)Wasserstein計量、二次形式距離(QFD)、二次カイ距離、Kolmogorov計量、(対称化)Kullback-Leiblerダイバージェンスなどがある。好ましい実装形態において、本発明の方法及びアルゴリズムはWasserstein計量又は二次カイ距離を使用する。
【０１７７】
以下の例示的な方法において、存在量分布が、通常、1次元において比較される。しかし、いくつかの標識が2つの関連するシグナル(例えば、JC-1、2つの異なるチャネルにおける蛍光を放出するミトコンドリア膜電位標識)によりコードされる。この場合、分布間の2D非類似度測度が計算される。最終的に、2D又は3D非類似度測度は、(光散乱を通して得られる)形態関連測定値及び(蛍光シグナルから計算される)存在量に基づいて多次元分布を利用することで計算されることが好ましい。高次元へ容易に一般化可能であるという仮定では、様々な距離又は非類似度測度が使用されてもよい。例えば、Wasserstein計量又はQFDに基づく決まった方法はこの状況で使用してもよいが、Kolmogorov計量はそうではない。
【０１７８】
集団の比較のための代表的な式は以下に与えられる(Peleら、「The Quadratic-Chi Histogram Distance Family.」 Computer Vision -ECCV 2010、Lecture Notes in Computer Science. Springer Berlin Heidelberg、749〜762頁; Daniilidis, K.、 Maragos, P.、 Paragios, N. (編)を参照)。
【数２】
0006606100.tif 000003
ここでxとyは対象の分布であり、Aは半正定値非類似度行列である。
【０１７９】
テンソルを使用するサイトメトリーデータの解析
サイトメトリーのマルチパラメトリックデータはテンソルとして表示可能であり、対照サンプルと試験サンプルの間の比較は化合物フィンガープリントテンソルによって記載されることが可能である。テンソルは多次元アレイであり、行列の一般化と考えることが可能である。1階(すなわち1元)テンソルはベクトルであり、2階(2元)テンソルは行列である。3階(3元)以上のテンソルは、高階テンソルと呼ばれる。
【０１８０】
集団におけるあらゆる細胞に対して単一細胞システムで個々に実施される生物学的測定値は分布を形成する。化合物の存在に曝露された細胞について実施された測定値の分布と化合物に曝露されない細胞について実施された測定値の分布との間の距離は、1つの数(スカラー値)で表示されることが可能である。細胞は多数の異なる薬物濃度に曝露されてもよく、生物学的測定は、これらの曝露レベルのそれぞれに対して実施されることが可能である。そのような実験では、ベクトルとして表示可能な値の列(例えば、1元テンソル)が生成される。多数の生物学的パラメータが測定されると、結果は2元テンソル(すなわち行列)に配置されることが可能であり、各列は異なる測定されたパラメータを含み、各行は化合物の異なる濃度を記載する。
【０１８１】
データのこの配置は、さらに拡張されることが可能である。処理済細胞から得られる測定値の分布と、別の化合物に曝露された細胞の集団から収集された測定値の分布との間の距離を測定しようとするならば、結果を別の行列にグループ化することが可能である。例えば、1つの化合物で処理された細胞と、陽性対照として働く効果を観測することを容易にする別のよく特徴付けられた化合物で処理された細胞の別のグループとの間の非類似度を測定することが有益となり得る。
【０１８２】
ともに置かれた2つの行列(2元テンソル)は3元テンソルを生成する。この3元テンソルの大きさは、I1×I2×I3であり、ここで、I1は濃度の数であり、I2は測定された生物学的パラメータの数であり、I3は測定された非類似度/距離の数(通常は2つであり、陽性対照の距離測定及び陰性対照の距離測定)である。したがって、生物学的測定値を表すテンソルAに対して、要素(i,j,k)(ai,j,kと表記される)によって、濃度iで化合物に曝露される細胞集団から得られたパラメータjの測定値と対照細胞集団kから得られた測定値との間の距離を記載する。
【０１８３】
テンソルAの列ファイバー(a:jkと表記される)は、一連の試験サンプルに対して実施されたパラメータjの測定値と対照kの測定値との間の距離全部を含む。化合物の10種の濃度が試験されるならば、列ファイバーa:jkは10個の要素のベクトルとなる。テンソルAの前方のスライス(A::kと表記される)は、k対照に対して測定された距離を記載する行列を形成する。側方スライスA:j:は、パラメータjに対する距離の測定値を示す行列である。
【０１８４】
テンソルAはさらに、複数の環境、細胞培養又は細胞周期の期を説明するために拡張されることが可能である。したがって、測定の複数の繰返し（反復）、測定が実施される細胞周期の複数の期などは、化合物フィンガープリントテンソルに記憶されることが可能である。事実、任意の多次元スクリーニング実験は、p階テンソル
【数３】
0006606100.tif 000004
として表現されることが可能である。例えば、データを複数の実験から次元I1×I2×I3×I4を有する4元テンソルにグループ化してもよく、ここでI4は独自に測定された化合物の数である。この設定において、スライスA:jklは、パラメータjに対して計算された、化合物lを含む試験サンプルと対照kを含む試験サンプルとの間の非類似度を含む。化合物lが4回繰り返して測定されたならば、結果として得られたA:jklスライスは、10行(濃度)と4列(繰返し)の行列である。
【０１８５】
化合物測定値のテンソル表現は、化合物類似度/非類似度、化合物フィンガープリント、圧縮化合物フィンガープリント、化合物正規化など多数の化合物関連の計量及びオペレータを定義するために使用され得る。テンソル形式における表現型スクリーニングデータの配置は、化合物反応の類似度の解析を通して、化合物特性に関する独自の洞察の定式化を可能にする。これは、化合物に関する情報がデータベクトルとして単純に表現されるときは不可能である。具体的には、化合物がスカラー値(伝統的に利用されるIC50値など)だけを使用して記載されるならば、以下に記載される技術を実装するのは不可能であろう。
【０１８６】
上述の解析は、「集団データの一般的テンソル解析、一般的な方法及び式-I」として本明細書で参照される以下の式及び操作の形式で、一般的な用語で述べられることが可能である。
【０１８７】
第1のステップにおいて、陽性対照(Cp)と陰性対照(Cn)との間の距離の対が、あらゆる周辺ヒストグラムψに対して計算される。これらの距離はさらなる使用及び再スケーリングに対して基準として保たれる。
【数４】
0006606100.tif 000005
ここでψ∈{1,...,p}である。
【０１８８】
距離関数Dは、二次形式距離、Wasserstein距離、二次カイ二乗距離、又はヒストグラムを表すベクトルに作用する他の任意の距離であり得る。
【０１８９】
【数５】
0006606100.tif 000006
この操作に続き、生物学的サンプルの一連の距離は同様のやり方で計算される。距離は、対照kと一連の濃度（濃度系列）(S1, S2, …, Si)における生物学的サンプルとからなる対のそれぞれについて計算される。ここで、iは試験化合物の濃度を表記する。
【数６】
0006606100.tif 000007
【０１９０】
結果として得られた値は、多次元アレイ又はp階テンソル
【数７】
0006606100.tif 000008
を形成する。テンソルのサイズ及び次元は、対照の数、利用された1次元ヒストグラムの数、及び測定が実行されたときの生物学的条件の数に依存する。
【０１９１】
テンソルAの列ファイバー(a[κ,ψ]と表記される)は、一連の試験されたサンプルと対照kとに対して実施された周辺ヒストグラムψにより要約された生物学的パラメータの測定値の間の一連の距離を含むベクトルである。
【数８】
0006606100.tif 000009
【０１９２】
テンソルAの前方のスライス(a[κ,ψ]と表記される)は、生物学的パラメータψのための距離を記載する行列を形成し、ここで測定はすべての対照に関わる。
【数９】
0006606100.tif 000010
【０１９３】
側方スライスA[ψ]は、複数の生物学的パラメータのための距離の測定を示す行列であり、ここで測定は、ただ1つだけの対照kを使用して実施される。
【数１０】
0006606100.tif 000011
【０１９４】
したがって、テンソルAは、
【数１１】
0006606100.tif 000012
として表示されることが可能である。
【０１９５】
生物学的測定値は、それぞれの
【数１２】
0006606100.tif 000013
を、対応する
【数１３】
0006606100.tif 000014
によって割ることでさらに正規化されてもよく、正規化された距離のテンソルとなる。
【数１４】
0006606100.tif 000015
【０１９６】
同じ解析が様々な条件に対して実施されることが可能であり、一連の正規化された距離のテンソルとなる。
【０１９７】
圧縮
一連の測定値から得られたテンソルAは、試験化合物のすべての表現型特性を含むので、テンソルAは、特有の化合物フィンガープリントを形成する。このテンソルAは、ポリアディックテンソル分解又は他の方法などの低ランクテンソル近似技術を使用して「圧縮」されることが可能である。関連ある部分に関して参照により組み込まれるKolda及びBader、(「Tensor decompositions and applications」, SIAM Rev. 51、455、2009)を参照のこと。
【０１９８】
テンソル分解は、テンソルをランク1テンソル成分の和に因子分解する。テンソル
【数１５】
0006606100.tif 000016
が、p個のベクトルの外積
【数１６】
0006606100.tif 000017
として表示されることが可能であれば、定義によりこのテンソルはランク1である。
【０１９９】
正準ポリアディック(canonical polyadic)(CP)分解の目標は、以下の判定基準を満たすテンソルAの近似(
【数１７】
0006606100.tif 000018
と表記される)を見つけることである。
【数１８】
0006606100.tif 000019
【０２００】
テンソルは同様に他の技術を使用して分解されることが可能である。例えば、Tucker分解は、テンソルを、各モードに沿って行列によってかけ算したコアテンソルに分解する。
【数１９】
0006606100.tif 000020
【０２０１】
テンソル分解のための様々な方法により、複雑な多次元化合物フィンガープリントを「圧縮された」短縮版で近似することが可能である。この目標は、テンソル再構築の精度に大した貢献をしない分解部分を除くことによって達成されることが可能である。
【０２０２】
以下の例は、この点を例示している。Aが、化合物の情報を含んでいる3元テンソルと仮定する。テンソルAの前方のスライスはA::1 及び A::2と表記され、
【数２０】
0006606100.tif 000021
である。
【０２０３】
CP分解を実施した後、以下のベクトルを得る。
【数２１】
0006606100.tif 000022
【０２０４】
元のテンソルは、CPモデルに従うこの結果から再構築されてもよい。
【数２２】
0006606100.tif 000023
【０２０５】
再構築後には、近似テンソル
【数２３】
0006606100.tif 000024
は、以下の値を含む。
【数２４】
0006606100.tif 000025
【０２０６】
しかし、テンソルAはa1及びa2を使用するよりも、ベクトルa1だけを使用して再構築されることが可能である。結果として得られた近似は、高次のエラーを有しているが、なおAによって表されるほとんどの情報を捕捉している。
【数２５】
0006606100.tif 000026
【数２６】
0006606100.tif 000027
【０２０７】
上述のように、テンソルAはa1ベクトルだけを使用して近似されることが可能である。結果として得られた精度が十分であれば、分解はテンソルAをおよそ6倍で効率良く圧縮する。元のテンソルをコードするには60個要するが、圧縮されたテンソル
【数２７】
0006606100.tif 000028
(ベクトルa(1)、a(2)、a(3)及び値λ)をコードするには11個で済む。テンソルの分解された形式は、さらに、テンソル対テンソルの比較に使用されることができ、同様に、例えばサポートベクターマシーン学習へといった教師あり機械学習方法の入力にも使用されることができる。
【０２０８】
単純なCP分解とより複雑なTucker分解は、より単純でよりわかりやすい形式でテンソル配置の情報の内容を表示するためにほとんどいつも使用されるが、テンソルを分解するために有用な方法はこれらだけではないことに留意されたい。データセットの構成が容認できる約束に従っている限りは、他のテンソル分解方法もまた、スクリーニングデータで使用されることが可能である。
【０２０９】
さらに上述の通り、テンソル分解は、高階テンソルにも適用されることが可能である。この場合、複数の化合物に対して実施された複数の測定値がテンソルのモードに沿って分解され、化合物間の決定的な相違を明らかにする。また、同じ試験化合物の複数の繰返しが使用されることが可能であり、合成した「平均」化合物フィンガープリントの計算へと効率良くつながり、次いで、他のフィンガープリントと比較されることが可能である。
【０２１０】
形態に基づいた自動ゲーティング
実施形態により、自動ゲーティングにより駆動されるモデルの使用が提供される(ただしゲーティングアルゴリズムの使用は任意選択である)。ここで、独自開発の追加の有無によらない混合物モデリングの最新技術がアルゴリズムに追加されてもよい。このシステムは、アッセイの効率性を改良するために反復的手法に頼ってもよい。
【０２１１】
実施形態において、ゲーティング技術は、「生細胞」、「死にかけている細胞」、及び「死細胞」(デブリ)を表す3つの非対称正規確率分布を含む。データに依存して、既存の(例えば古くに確認された)モデルが使用されてもよいし、対照に基づいて新たなモデルが生成されてもよい。例えば、それぞれの混合物モデルに対して全対数尤度(LL)を算出することで進めることが可能である。次いで、LLがより大きい特定のモデルは、将来の使用のために維持される。
【０２１２】
化合物非類似度
化合物非類似度測定は、すべての化合物(及びすべての測定の繰返し)が記憶されている結果テンソルの分解に続いて、個々の化合物フィンガープリントの分解の後で実施されることが可能であり、又は、フィンガープリントの完全な「非圧縮」版を直接使用することで実施されることが可能である。比較が分解されたテンソルを含む場合には、問題は、本質的に、ベクトルの比較に帰着される。
【０２１３】
しかし、上述の通り、化合物フィンガープリントテンソルはまた、直接比較されることが可能である。この場合、化合物テンソル間の非類似度は、化合物テンソルAのモード1ファイバーa:jk間の非類似度(距離)を記憶しているベクトルとして表示される。ファイバーa:jkは、試験化合物の濃度上昇に曝露されている細胞培養の反応についての情報を記憶しているので、値は列を形成し、それらは多角形曲線として見ることが可能である。結果として、データのテンソル配向された配置は、離散的な曲線(ベクトル)間の距離を利用することを可能にする。
【０２１４】
そのような距離の1つに離散フレシェ距離があり、これは、経路の書かれた2つの曲線の始点から終点まで犬と飼い主が動くのに必要な鎖の最小の長さとして定義され、ただし犬と飼い主の両方は、進むスピードは調節可能だが、進む方向にのみ移動可能としている。ファイバーは多角形曲線として見ることが可能なので、この設定では、犬と飼い主のどちらも曲線の頂点でのみ止まることが可能であり、犬と飼い主のそれぞれは、歩行中、現在の頂点で留まるか又は次の頂点へジャンプするかのいずれかが可能である。関連ある部分に関して参照により組み込まれるAronovら(「Frechet Distance for Curves,」 Revisited、in: Azar, Y.、 Erlebach, T. (編)、 Algorithms - ESA 2006, Lecture Notes in Computer Science. Springer Berlin Heidelberg、52〜63頁、2006)を参照のこと。
【０２１５】
概念的に類似している距離測度は、動的時間伸縮距離(dynamic time warping distance)であり、これは、最善なアラインメントを見つけるために2つの多角形曲線を非線形なやり方で伸縮することによって2つの曲線間の距離を測定する。アラインメントを実施するためのコストは距離の値として定義される。関連ある部分に関して参照により組み込まれるBerndt及びClifford、(「Using dynamic time warping to find patterns in time series,」 AAAI94 Workshop on Knowledge Discovery in Databases、359〜370頁、1994)を参照のこと。
【０２１６】
したがって、一般的な場合において、2つの化合物フィンガープリント(テンソル)A及びBの間の非類似度を
wA,B = D(A,B) = d(a:jk, b:jk)
として表示することが可能であり、ここで、Dは化合物テンソルA及びBの間の非類似度であり、dはそれぞれのテンソルのモード1ファイバーを比較する距離関数(フレシェ距離又は動的時間伸縮距離など)であり、wは距離ベクトルである。10用量応答曲線、4つのパラメータ並びに陽性対照及び陰性対照を含む実験により生成された3元テンソルに対して、ベクトルwは8の長さを有する。ベクトルの各要素は、テンソルA及びBの対応するファイバー間の曲線距離として計算される。
【０２１７】
化合物非類似度のグラフ表現
化合物間の類似度/非類似度は、非類似度を評価するのに使用される関数に依存して様々な方法を使用して視覚的に実証することが可能である。例として図11に示される。短縮版化合物フィンガープリントが分解後にベクトルとして表示されることが可能であれば(複数のベクトルの連結によって形成されていれば)、ベクトル間の事前に選んだ距離を適用してもよいし、又は、計量学習法を使用して距離関数を訓練してもよい。関連ある部分に関して参照により組み込まれるWeinberger及びSaul、(「Distance metric learning for large margin nearest neighbor classification,」 J. Mach. Learn. Res. 10、207〜244、2009)を参照のこと。最終結果は、多次元尺度法(MDS)、階層的クラスタリング、又は多様体学習法(manifold learning methods)を使用して視覚化されることが可能である。
【０２１８】
分解/圧縮が使用されないならば、化合物間の類似度の視覚化は、非類似度のスカラー測度よりも、非類似度のベクトルを利用した手法を要求する。そのような方法の1つは、ストレスマジョリゼーション(stress majorization)を利用するマルチモードMDSアルゴリズムである。関連ある部分に関して参照により組み込まれるLeeuw及びMair、(「Multidimensional Scaling Using Majorization: SMACOF,」 R. J. Stat. Softw. 31、1〜30頁、2009)を参照のこと。
【０２１９】
形成された非類似度行列を多元多次元尺度（スケーリング）技術により利用することは、測定された化合物シグネチャーを化合物内部の類似度を定義する空間に置くことである。関連ある部分に関して参照により組み込まれるGroenenら(「The majorization approach to multidimensional scaling for Minkowski distances.」 J. Classif. 12、3〜19頁、1995)を参照のこと。結果として得られた空間において、近く位置する化合物は、説明されたプロセスの意味で「類似している」と考えられ、離れて位置する化合物は「非類似である」と考えられる。
【０２２０】
複数の細胞のサブセットを使用した分布の比較
対照サンプル対試験サンプルの非類似度は、測定されたすべての例(細胞)を使用して計算されることが可能であり、又は、機能的に定義された細胞集団のサブセットのそれぞれに対して別々に計算されることが可能である。例えば、測定された光散乱に基づいて形態として異なる2つの細胞のサブセットを定義してもよい。この設定において、2つの細胞のサブセットは、別々に対照と比較されてもよい。わかることは、比較の回数は、形成されたサブセットの個数に依存することである。例えば、5つの機能的な標識が、細胞生理学の5つの異なる態様を実証するように指定されていれば、形態として異なる細胞集団のそれぞれに対して処理済出力と未処理出力を比較するように選択し、最大で20個の異なる距離(5つの標識×2つの対照×2つの細胞サブセット)を生成する可能性がある。
【０２２１】
望ましい生理学的効果となる撹乱剤の濃度は事前には確かめることはできないので、撹乱剤の濃度に伴って徐々に増加する効果を説明する関数を使用して撹乱剤の性質を示すことが可能であり、測定は薬物のいくつかの濃度で実施される。したがって、10通りの濃度での使用を仮定して上述の概略のシナリオに対して、設定される最終データは200個の値(5つの標識×2つの対照×2つの部分集団×10通りの濃度)を含むことになる。測定された値は独立ではない、したがって、それらは多元テンソルとしてさらなる処理に対して扱われる。例えば、対照の1つのタイプのみが使用される(例えば「陽性」対照)のであれば、データセットは5×10×2の次元を有する3元テンソルを形成する。図14は、薬物反応フィンガープリントを表す多元テンソルの例を示す。
【０２２２】
多次元特徴空間の使用
本発明の実施形態において、多次元特徴空間における点クラウドの進化は、分布間の距離を直接計算することにより計算されることが可能である。多次元特徴空間において進化する点クラウドの例として、それらに限定されないが、例えば、薬物の濃度などの変数、インキュベーション時間などが含まれる。複雑な点クラウド間の非類似度によって定義される空間においてクラウドの進化の変化は、込み入った軌跡を形成し、その軌跡は、それらの変化を引き出す化合物特性を一意的に記述している。
【０２２３】
代表的なクラウド進化が図15に示されている。
【０２２４】
細胞周期情報を使用した分布の比較
実施形態において、フィンガープリントテンソルが、細胞周期依存の標識によって定義されるクラスター又は細胞サブセットのそれぞれに対して生成される。この設定において、DNAに挿入された蛍光標識(HOECHST 33342、DRAQ5、YO-PRO-1 IODIDE、DAPI、CYTRAK ORANGEなど)の強度を定量化すること、細胞周期に関連する免疫標識タンパク質(例えば、サイクリン、リン酸化ヒストンタンパク質など)の存在を定量化すること、又は細胞周期の期と結びついた遺伝的にコードされた蛍光色素のシグナルを測定することなどによって、細胞周期の期の評価は、他の測定と同時に実施される。最も簡単な場合は、これらの技術によって細胞周期の3つの区画を決定することが可能であり、5×10×3結果テンソル(又は追加の標識の数に依存してより複雑なテンソル)を形成することになる。これは実施例5Aに例示されている。
【０２２５】
教師なし分類と教師あり分類
実施形態は分類方法を提供し、ここでは、後に続く解析は複数の手法を使用して実施される。これらの解析技術は、結果の好ましい最終表現又は視覚化に応じて実装されてもよい。例えば、教師なしの設定において、距離テンソルは、マルチモード多次元SMACOF(Scaling by MAjorizing a COmplicated Function)アルゴリズム又はスケーリングに適切な他の数学的技術によって処理されることが可能である。MDS法の適用後、薬物フィンガープリントは2D平面上又は研究者によって定義された他の任意のn次元曲面(例えば球面)上に置かれる。これはデータセットの容易な解釈及び視覚化を可能にし、MSD射影上に「マップ」を形成する。
【０２２６】
教師ありの枠組みにおいては、機能、反応タイプ、化学構造などによって定義される様々なグループに属する化合物を表すフィンガープリントが使用されて、複数のクラスを有する訓練ライブラリーを生成する。この訓練ライブラリーは後に使用して、以前には未知のフィンガープリントを既知の化合物によって定義されたクラスに分類する分類器(ニューラルネットワーク分類器、サポートベクターマシーン又は別のタイプの機械学習システムなど)を訓練することが可能である。
【０２２７】
拡張により、本発明の関連する実施形態は、異なる細胞周期の期において、未知の撹乱剤(事前にはMMPへの影響が未知)が、MMPに示差的な影響(及び他の細胞生理学的測定値、例えばSYTOX(商標)RED低細胞対高細胞)を有するかどうかを決定するための、未知の撹乱剤の効果を評価する方法を提供する。したがって、それぞれの試験化合物に対して、細胞状態を評価する次元の1つとして細胞周期関連状態テンソルを含む多元測定値テンソル(化合物シグネチャー)を提供する。
【０２２８】
以下は、本発明のシステム及びアルゴリズムを使用して様々な撹乱剤を比較する代表的な方法である。
【０２２９】
最初に、各蛍光チャネルに対して(例えば、生細胞及び死にかけている細胞のそれぞれに対して)、すべての化合物間の距離行列が、上記の技術を使用して生成される。例えば、距離は、応答曲線間で動的時間伸縮距離(dtw)であることが可能である。続いて、多元多次元尺度法(MDS)を使用して、いくつかの行列を組み合わせてユークリッド空間にする。次いで、MMPデータ(カルセイン、SYTOX(商標))のみを含む行列の1つのグループに対するMDS及び透過性データ(MBBR、MITOSOX(商標))のみを有する別のグループに対するMDSが算出されてもよい。化合物間の様々な生理学的類似度が、既知のマッピング及びクラスタリング技術の助けを借りて視覚化されてもよい。例えば、樹形図又はグラフ視覚化(例えば、中間ノードを生成してデータを様々な外部視覚化ソフトウェアパッケージの任意の1つにエクスポートすること)である。さらに、1つ以上の分類器を使用する教師あり手法も使用してもよい。
【０２３０】
細胞周期
本明細書で説明される実施形態は、細胞の集団において配位したタンパク質(又は他のマーカー)の発現の測定を細胞周期の機能（function）(例えば、G1、S、G2M)として可能にし、試験化合物の細胞周期依存効果を決定することを可能にする。したがって、マルチパラメトリック解析が、異なる濃度及び/又は時点で各撹乱剤の効果を解析することによって実行されて、様々な細胞パラメータに対する前記化合物の効果(例えば、ミトコンドリア膜電位、核又は細胞質膜透過性、ROS、細胞死又はアポトーシス)を調べてもよい。
【０２３１】
細胞周期依存解析の例は、正常な(撹乱されていない)細胞において、サイクリンA2発現の測定に基づいている。本明細書において、可能な「状態」とは、サイクリンA2陰性、サイクリンA2低及びサイクリンA2高を含む。同様に、細胞周期解析における第2のマーカーであるホスホ-ヒストン3(P-H3)に対して、可能な「状態」は、「陰性」及び「陽性」を含む。これら2つの細胞周期マーカーはまた、組み合わせて解析されてもよく、したがって9通りの異なる可能な組合せ(「状態」)が生じる。これらの状態は正常な生理学空間においてすべて存在するわけでないので(スパース行列)、すべての可能な「状態」を調べる必要は必ずしもない。
【０２３２】
したがって、特定の細胞の細胞周期状態に依存して、関心のある薬物又は化合物によって引き起こされる示差的な撹乱は、細胞を個別な(正常な)行列要素に集めることで調べることが可能である。例として、有糸分裂からG1に戻る正常な進行をブロックする薬物(これによって「正常な」行列集団において量的な変化(すなわち、「後の」(正常な)細胞周期区画(例えばG2及びM)への細胞の蓄積)を引き起こす)及び/又はG1期において細胞を使い果たす薬物は、サイクリンA2及び/又はP-H3染色を使用して一斉に解析されることが可能である。同様に、娘核の分離を妨げる薬物は、S期に細胞を停止する薬物(例えば、新たなDNA合成を阻害する薬物)と比較して異なる量的フィンガープリントパターンを示すことが期待される。したがって、細胞が異なる行列要素に出現するように引き起こす化合物は、独自のシグネチャーを生成するだけではなく、占有される特異的な行列要素は、薬物作用の機序に関する情報を提供する。例えば、G1及び又はMにおけるサイクリンA2の発現は、正常なサイクリンA2分解を妨げるプロテアソーム阻害剤の結果である可能性がある。
【０２３３】
複数細胞型アッセイシステム
一実施形態では、本発明は、単一アッセイにおいて、複数の細胞型、例えば、2種以上の細胞株(組織培養由来の)を使用して細胞状態をアッセイするための方法を提供する。このアプローチの1つの利点は、DNA損傷/応答の分析を可能にすることである。さらなる利点は、同一アッセイ(構成的発現を有する1種の細胞株及び適当なアゴニストを使用して同一経路を活性化し得る別のものを使用する)において構成的及び誘導性シグナル伝達経路両方の研究を可能にすることである。同時に2種(又はそれ以上)の細胞株を使用することで、1アッセイにおいて複数のシグナル伝達経路を対象とすることが可能となる。
【０２３４】
例えば、ヒト骨髄細胞株(骨髄性白血病の患者に由来する)を使用することで、LPSに応答性の1種の細胞株がNF-κB及びPI3キナーゼ経路を活性化し、TNF-αに応答性の別のものが複数のMAPキナーゼ経路を活性化し、両方の場合において、上流(NF-κBのIκキナーゼ)及び下流(ERKのP-S6及びPI3KのmTOR)が評価され得る。さらに、これらのアッセイは、上記で示されるようにDNA損傷/応答マーカーを含み得る。細胞混合物中の応答性細胞株は、DNA含量(いくつかの細胞株は、2倍体であり、他のものは、異なる異常なDNA含量を有する異性体である)若しくは生物学的特徴(細胞表面マーカー)のいずれかを使用して同定され得るか、又は細胞は、「バーコードが付けられ」得る(G. Nolanら)。最後に、シグナル伝達アッセイは、シグナル伝達経路応答の、同一薬物に応じた細胞生理学との相関を可能にするための細胞周期分析(例えば、DNA含量)を含み得る。
【０２３５】
[実施例]
以下の実施例は、種々の特定の実施形態によって単に例示として提供され、決して、徹底的なものではなく、排他的なものでもない。
【０２３６】
以下の実施例の一般的な方法論
組織培養
ヒト組織培養細胞は、Sigma-Aldrich (St Louis、MO、USA)から凍結ストックとして入手した。細胞株を解凍し、最初に静置培養中に入れ、続いて、RPMI 1640/10%FBS/Glut(+/- 0.5〜2mM)/Penn/Strep中、1Lのローラーボトル中で連続培養した。in vitroスクリーニングアッセイのための細胞は、高度に標準化された条件(投与及び回収細胞密度、生存力など)下で対数期増殖で維持した。
【０２３７】
細胞生理学アッセイプレート1a及び1bの調製
細胞を384ウェルプレート(40μlの組織培養培地中、1X106個細胞)中に入れ、標準ロボット技術を使用して個々のウェル中に試験化合物の段階希釈(又は対象の場合には媒体)を入れた。化合物蓄積及び希釈は、BIOMEK FX(100から0.005μMへの5又は10ステップ希釈)によって実施した。希釈物は、100% DMSO中に最初に溶解した化合物の保存溶液から調製した。各ウェル中に入れた最終容量は、2μlの各化合物希釈物である(化合物は、1% DMSOの最終濃度である)。組織培養インキュベーター(37℃で5% CO2)中で種々の期間(通常、4時間)インキュベートした後に、プレートを室温で遠心分離し、続いて、20μlの上清流体を除去する。プレートを振動させて細胞を再懸濁した後、色素混合物(プレート1aモノブロモビマン、カルセインAM、MITOSOX(商標)及びSYTOSOX(商標)RED;プレート1b VYBRANVIOLET(商標)生存細胞周期色素、JC-9及びSYTOSOX(商標)RED)を20μlの総容量中に添加し、さらなる混合ステップを続けた。プレートを組織培養インキュベーター(37℃の5% CO2)中にさらに15分間(プレート1a)又は30分間(プレート1b)戻し、続いて、HYPERCYT-CYAN(商標)を使用して直ちに分析した。
【０２３８】
細胞周期又は細胞シグナル伝達アッセイプレート2及び3の調製
上記に示されたように、細胞を96ウェルプレートの個々のウェル中に入れた試験化合物の希釈物上に入れた。30分から12時間組織培養インキュベーター(37℃で5% CO2)中でインキュベートした後、細胞を遠心分離によってペレットにし、上清を除去し、残存する上清流体中で細胞を振動によって再懸濁し、50μlの固定液(PBS中、1.2%ホルムアルデヒド)を添加した。15分インキュベート(37℃で？)した後、細胞を遠心分離によってペレットにし、上清を除去し、プレートを振動させることによって細胞を懸濁した。
【０２３９】
150μlの冷無水メタノールを添加し、続いて、4℃で15分間インキュベートすることによって細胞を透過処理した。透過処理された細胞を遠心分離し、上清を除去し、細胞を4% FBSを含有する冷(4℃)PBSで3回洗浄した。最終洗浄した後、細胞を遠心分離し、上清を除去し、細胞をその実験に適当な抗体カクテル(総容量20μl)に再懸濁した。
【０２４０】
DNA含量/細胞周期分析のために、細胞をDAPI(1μg/ml)を含有するPBS/FBSに再懸濁し(未結合の抗体コンジュゲートを除去するための洗浄後)、続いて、HYPERCYT-CYAN(商標)を使用して分析した。
【０２４１】
HYPERCYT-CYANハイスループットフローサイトメトリー
384ウェルプレートの各ウェルを、6秒のシップ時間及びウェル間で1秒の遅延を用いてサンプリングし、その結果、およそ45分の各プレートの総読み取り時間となった。CYAN(商標)フローサイトメーターを使用してデータを獲得し、FCS形式を使用して個々のプレートで各ウェルのファイルをコンパイルするためにHYPERCYT(商標)ソフトウェアを使用した。各プレートのデータを、以下に記載されるようにいくつかの品質保証パラメータ(ウェルあたりの事象の総数、形態学的に正常な事象と関連する事象数、死細胞数)についてその後分析した。
【０２４２】
[実施例1]
正常細胞
表1に列挙された色素に由来する固有の細胞特性(前方光散乱及びレーザービームに対して直交して散乱された光)及び蛍光シグナルのフローサイトメトリー分析を、プレート1a及び1bについて実施した。
【０２４３】
【表１】
0006606100.tif 000029
【０２４４】
結果は、図1Aにおいて散乱プロットで示されている。プロットで見られるように、光散乱単独で、「正常な」形態を有する細胞の同定を可能にする。この図における細胞は、任意の薬物で処理されず、細胞の大部分(ここでは、すべての事象の95%超)は、「正常な」形態を示す。
【０２４５】
この図に示される細胞はまた、以下の通りに表1の色素混合物を用いて処理された:
(1)Cossarizzaら(「Simultaneous analysis of reactive oxygen species and reduced glutathione content in living cells by polychromatic flow cytometry.」Nat. Protoc.第4巻、1790〜1797頁、2009)、 Kosowerら(「Bimane fluorescent labels: labeling of normal human red cells under physiological conditions.」Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.第76巻、3382〜3386頁、1979)、Radkowskyら(「Bimanes. 17. (Haloalkyl)-1,5-diazabicyclo[3.3.O]octadienediones(halo-9,10-dioxabimanes): reactivity toward the tripeptide thiol, glutathione.」J. Am. Chem. Soc.第108巻、4527〜4531頁、1986)に先に記載されたように、細胞内グルタチオン(GSH)含量を測定するためのモノブロモビマン(MBBR)、
(2)Ivnitski-Steeleら(「High-throughput flow cytometry to detect selective inhibitors of ABCB1, ABCC1, and ABCG2 transporters.」Assay Drug Dev. Technol.第6巻、263〜276頁、2008)に記載されるように、細胞質膜完全性を測定するためのカルセインAM。カルセインAMは、細胞質膜を通過し、生存細胞中にある非蛍光化合物であり、化合物は、細胞質膜を通過できない強力な緑色蛍光化合物に変換され、細胞が、その後、細胞質膜完全性を失うと、蛍光化合物が受動拡散によって細胞を離れる、
(3)Zielonkaら(「Detection of 2-hydroxyethidium in cellular systems: a unique marker product of superoxide and hydroethidine.」Nat. Protoc.第3巻、8〜21頁、2008)に記載されるように、細胞内活性酸素種を測定するためのMITOSOX(商標)RED。MITOSOX(商標)REDは、生存細胞中に拡散し、スーパーオキシドアニオン種、特に、ミトコンドリア呼吸の生成物と反応し得る化合物であり、細胞ストレスなどの状態が、ミトコンドリアを呼吸の増大によって応答させ(特には、迅速に)及び/又はスーパーオキシドアニオンを放出させ得、並びに
(3)細胞生存力(核膜完全性の喪失)を測定するためのSYTOXRED(商標)。SYTOXRED(商標)は、両方の膜の完全性を失った細胞の細胞質膜及び核膜のみを通過できる高親和性DNA株であり、したがって、明るい蛍光細胞は死滅している。
【０２４６】
特定の撹乱に基づいて、細胞は、細胞内GSHを失い(いくつかの場合には、獲得し)、蛍光シグナルの喪失(又は獲得)をもたらし得る。
【０２４７】
正常細胞のクラウドプロット集団のパラメータテンソルが算出され、図1Bに表されるか、又は図的に記載される。
【０２４８】
[実施例2]
ミキソチアゾール、FCCP及びフルオキセチンを用いて処理された細胞
細胞を、撹乱物(例えば、ミキソチアゾール、FCCP及びフルオキセチン)を用いて処理し、実施例1に記載されるように分析した。
【０２４９】
100μMのミキソチアゾールに細胞を曝露する効果が、図2に示されている。ミキソチアゾールを用いる細胞の処理は、細胞の大部分(すべてのパネル中の暗青)における細胞形態に大幅な変化(上左側パネル)、GSH及びカルセインAMの低減(上中央及び右側パネル)並びにROS及びSYTOXRED(商標)の増大(下のパネル)をもたらした。これらの応答の各々は、図1Aに示されるように、「正常な」細胞における各色素のパターンとは視覚的に異なっている。
【０２５０】
33μMのFCCPに対して細胞を曝露することによって、種々の応答曲線が誘発され、これは図3に示されている。結果は、「正常な」パターンとは、及び100μMのミキソチアゾールのパターンとは異なるさらに別のパターンを実証する。「正常な形態」を有する細胞の別個の集団は、FCCPを用いる処理後に存在し(上左側パネルにおける緑色細胞)、これらの同一細胞は、すべてのパネルにおいて緑色に着色されており、示されるように、正常なGSH及びカルセインAMレベル(上中央及び右側パネル)、SYTOX(商標)Red取り込みの欠如によって実証されるような無傷の核膜及び細胞質膜(下右側パネル)を有する。しかし、FCCPを用いて処理された細胞は、ROS(ミトコンドリアストレスの指標;下左側パネル)を増大した。さらに、「正常な形態」を有する細胞と比較して、形態の変更、GSHの低減、カルセインの増大、ROSの増大及びより高いSYTOXRED(商標)(淡い青色に着色された細胞として図3中のすべてのパネルに示される)を示す細胞の別個の集団がある。
【０２５１】
100μMのフルオキセチンに対して曝露された細胞について、図4には、さらに別の応答パターンが示されている。およそ30%の細胞が、「正常な形態」を失い、GSHの低減、カルセインAMの低減、ROSの増大及び有意により高いレベルのSYTOXRED(商標)(図4Aにおけるすべてのパネルにおいて暗青色細胞)を示す。この応答の別個の「シグネチャー」は、SYTOXRED(商標)ヒストグラム(下右側)に見られるパターンであり-高いSYTOXRED(商標)含量を有する細胞のすべては、親HL-60細胞株のDNA含量(細胞周期)を読み出している色素取り込みを示し、これは、この処理期間内に、細胞が細胞周期を通じて死にかけており、そのDNAをまだ分解していない(アポトーシス細胞の正常な特徴)ことを示す。
【０２５２】
図2、図3及び図4Aの一連の多次元プロファイルは、図4Bにおいて4軸に沿ってプロットされている:100μMのミキソチアゾール(上左側)、33μMのFCCP(上右側)又は100μMのフルオキセチン(下中央)を用いて処理された細胞のもの。
【０２５３】
[実施例3]
細胞周期
上記の実施例2に記載されるものと同一の測定を、色素の第2の組合せを使用して行った:
(1)生存細胞における細胞周期を測定するためのVYBRANVIOLET(商標)、
(2)ミトコンドリア膜電位(MMP)を測定するためのJC-9、及び
(3)SYTOXRED(商標)(上記で本明細書において記載のもの)。
【０２５４】
細胞周期のG1、S及びG2M期の細胞の別個の集団を示す、未処理の細胞の細胞周期測定値が、図5においてグラフで表されている。グラフの左側に鋭い高いピークを構成する第1の集団は、G1の細胞である。グラフの平坦な中央部分は、S期の細胞から生じている。グラフの右側のピークは、G2/Mの細胞によって作られている。
【０２５５】
本明細書に示される細胞周期区画は、固定されたHL-60細胞において測定されるものと同一であり、以下に記載されるように、DNA結合色素が核DNAに接近することを可能にする細胞固定を使用する「従来の」アプローチを用いて染色する生存細胞の同等性を実証する。
【０２５６】
[実施例4A]
バリノマイシンの効果
JC-9を用いるミトコンドリア膜電位(MMP)の測定を実施し、MMPの変化は、色素の凝集を引き起こし、凝集した色素分子対非凝集色素分子によって異なる蛍光発光を有するので、2つの独立した蛍光チャネル(緑色及び赤色蛍光シグナル)を使用した。図6Aに示されるように、赤色及び緑色蛍光の両方とも、バリノマイシン濃度の増大に応じて最初に増大し、約0.05μMバリノマイシンでピークの緑色蛍光を有していた。バリノマイシン濃度が高いほど、赤色蛍光は増大し、赤色/緑色蛍光比が増大した。このアッセイの独特の態様は、MMP(JC-9)の変化及び細胞死(SYTOXRED(商標))は、細胞周期の期(G1、S及びG2M)と相関しているということである。
【０２５７】
[実施例4B]
イダルビシンの効果
1.23μMの、DNA中に挿入し、DNA複製の際に巻き戻しを防ぎ、細胞分裂を停止するイダルビシン（ダウノルビシンの類似体）に対してHL60細胞を曝露することを用いて、先に記載されたものと同一の研究を実施した。図6Bに示されるように、JC-9色素の赤色蛍光が、未処理の対照細胞よりもイダルビシンを用いて処理された細胞において有意により高い(左側の最初の2つのデータ点は、対照細胞を示す)。
【０２５８】
[実施例5]
固定された細胞の分析
研究によって、ミトコンドリアは、正常な細胞周期の異なる期の間に大幅な構造的変化を受けることが確立されている。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるBarniら(「Static cytofluorometry and fluorescence morphology of mitochondrias and DNA in proliferating fibroblasts.」Biotech. Histochem. Off. Publ. Biol. Stain Comm.第71巻、66〜70頁、1996)、Margineantuら(「Cell cycle dependent morphology changes and associated mitochondria DNA.」Mitochondrion  第1巻、425〜435頁、2002)、chiekeら(「Coodination of mitochondrial bioenergetics with G1 phase cell cycle  progression.」Cell Cycle第7巻、1782〜1787頁、2008)及びSweetら(「Changes in mitochondrial mass、membrane potential、and cellular adenosine triphosphate content during the cell cycle of human leukemic (HL-60) cells.」  J. Cell. Physiol.第180巻、91〜96頁、1999)を参照のこと。制限されたデータにより、G1対S+G2M集団におけるミトコンドリア電位の差(ΔΨm)が示唆されている(Schiekeら、Cell Cycle第7巻、1782〜1787頁、2008)が、単一細胞レベルでMMPの変化及び細胞周期の期を関連付ける公開された報告はない。さらに、細胞周期の異なる期での、異なる化学化合物、例えば、MMPを変更することが知られている化合物の示差的な効果を調べる研究もない。以下に記載される2つの例示的実施形態では、固定された細胞を使用して、細胞周期(実施例5A)及びシグナル伝達(実施例5B)の分析を実施した。
【０２５９】
[実施例5A]
固定された細胞を使用する細胞周期の分析
細胞周期の期は、細胞質膜及び核膜を通過できるDNA結合色素(例えば、図5に示されるようなVYBRANVIOLET(商標))を使用して生存細胞において測定され得る。しかし、このアプローチは、問題になる場合がある。いくつかのDNA結合色素は、毒性である可能性がある化合物(例えば、癌細胞及び幹様細胞上によく見られるP-糖タンパク質輸送体)を除去する細胞質膜「ポンプ」によって生存細胞から輸送される。さらなる問題は、無傷の細胞質膜及び核膜が、蛍光フローサイトメトリーのための抗体コンジュゲートによる内部タンパク質への接近を遮断することである。これらの制限を克服するために、細胞タンパク質、脂質、炭水化物並びに細胞構造の分解を妨げる化学固定液の組合せを使用して細胞を固定して、透過処理した。固定化後、細胞質膜及び核膜を日常的な界面活性剤を使用して透過処理し、このプロセスが、プローブ分子(例えば、抗体コンジュゲート)が細胞内区画と接近することを可能にする。
【０２６０】
ヒト慢性骨髄性白血病K-562細胞(CML株に由来する)を固定し、既知技術(例えば、ホルムアルデヒド固定と、それに続く、-20℃でメタノールを使用する透過処理)を使用して透過処理した。これらの固定された細胞は、DNA含量(細胞周期)並びに細胞内及び核内タンパク質の同時測定に適している。例えば、関連ある部分に関して参照により組み込まれる、Polliceら(「Sequential paraformaldehyde and methanol fixation for simultaneous flow cytometric analysis of DNA, cell surface proteins, and intracellular proteins.」Cytometry  第13巻、432〜444頁、1992)を参照のこと。洗浄後、固定された、透過処理された細胞を、1種以上のフルオロフォア-抗体コンジュゲートとともにインキュベートし、次いで、洗浄して未結合の抗体を除去し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０２６１】
図7に示されるように、DNA含量によって示される細胞周期分析は、図5において生存細胞周期染色のために示されるような、G1、S及びG2M集団の同様のパターン(上左側パネル)を示した。
【０２６２】
同細胞はまた、ALEXA FLUOR(登録商標)647にコンジュゲートされた、サイクリンA2に対する抗体(PEにコンジュゲートされた)を用いて、またヒストンH3タンパク質のリン酸化形態(P-H3)に対する抗体を用いて染色した。細胞周期対P-H3(上右側のヒストグラム)の分析は、ヒストンH3タンパク質のリン酸化形態は、G2M集団においてのみ発現されることを示し、細胞周期対サイクリンA2タンパク質発現の分析(下左側ヒストグラム)は、Sを通る進行の間にサイクリンA2のより複雑なパターンの増大するレベル及びG2MにおけるサイクリンA2発現の2つの集団を示す。
【０２６３】
撹乱されなかった細胞におけるサイクリンA2の発現の生物学は、十分に特徴付けられており、G2の間に発現のピークレベルに達した後、サイクリンA2は、有糸分裂(M)に入ると迅速に分解される。下右側パネルに示されるように、サイクリンA2対P-H3の発現の分析は、後期Sを通りG2まで、Mまでの進行の間のこれら2種のタンパク質のより複雑なパターンの発現を明らかにする。これらの細胞周期集団のみでのその後の分析(DNA含量を使用する)の「ゲーティング」によって、P-H3は、最高サイクリンA2レベルを有する細胞(G2集団)において最初に発現されること、P-H3は、高いレベルで維持されるが、サイクリンA2が分解されること、及び細胞が進行して、有糸分裂(M)からG1に戻るにつれ、P-H3は、次いで、「失われる」(G2に入るとリン酸化された特定のセリン残基の脱リン酸化によって)ことが明らかである。伝統的なフローサイトメトリー分析では、異なる細胞集団(DNA含量に基づいて)を注意深く手作業で「ゲーティング」する(選択する)こと及びタンパク質(又は異なる抗体コンジュゲートによって規定される他の標的)の発現を続いて分析することによって、タンパク質発現におけるこれらの一連の変化が確立されている。
【０２６４】
[実施例6]
シグナル伝達
シグナル伝達経路は、細胞分裂 (増殖)、細胞死(アポトーシス、アノイキス)及び細胞分化を含めた複数の細胞の運命の経路を調節する。一般に、シグナル伝達は、受容体によって認識される特異的リガンドの結合後に下流経路を活性化する細胞質受容体を介して作用する。シグナル伝達経路の特徴は、タンパク質修飾のカスケードである(シグナル伝達は、メチル化、アセチル化、ユビキチン化、SUMO化を含めた他のタンパク質修飾を含み得るが、頻繁には、セリン又はトレオニン又はチロシン残基のリン酸化)。
【０２６５】
リン酸化、現在最もよく研究されているシグナル伝達事象では、同族リガンドによる細胞表面受容体の活性化が、受容体においてキナーゼ活性を作り出す。この活性キナーゼは、次いで、その下流パートナーで特定のアミノ酸残基をリン酸化し、普通、キナーゼ活性を作り出す。このカスケードは、一般に、末端キナーゼが核に移行するまで継続し、ここで、DNA上の特異的転写活性化部位と結合する。さらに、多数のシグナル伝達経路は、「側方に」作用して、他のシグナル伝達経路を活性化又は阻害する(例えば、活性化されたPI3キナーゼは、下流Akt>mTOR>リボソームS6キナーゼ>S6>タンパク質合成経路に加えてMAPキナーゼ経路を活性化できる)。
【０２６６】
末梢血単球で見られるToll様受容体4(TLR4)の下流のシグナル伝達経路の一例が、図8に示されている。ほとんどの表面受容体-リガンド相互作用とは対照的に、この高度に普通ではない応答では、TLR4への同族リガンド、リポ多糖類(LPS)の結合は、3種すべてのMAP(マイトジェン活性化タンパク質)キナーゼ(ERK、p38及びSAP/JNK MAPキナーゼ)、PI3キナーゼ及びNF-κB経路を含めた複数のシグナル伝達経路を活性化する。
【０２６７】
これらの経路のすべてが、末梢血単球でのフローサイトメトリーを使用してモニタリングされた。上記のように(細胞周期と関連するタンパク質のモニタリングについて)、フルオロフォア-抗体コンジュゲートの細胞内(及び核)接近を可能にするために、細胞は、固定及び透過処理され得る。
【０２６８】
本明細書において、細胞膜透過性(細胞死のマーカー)、核膜透過性(細胞死のマーカー)、DNA損傷に関わるシグナル伝達経路(ホスホ-ヒストンH2A、ホスホ-ATM/ATR、ホスホ-p53)、炎症に関わるシグナル伝達経路(例えば、NF-kB)、MAPキナーゼ経路(ERK、SAP/JNK、p38)によるシグナル伝達、PI3キナーゼ経路(Akt、GSK3B、RS6K、S6)によるシグナル伝達、初期アポトーシス経路(例えば、アネキシンV)、中期アポトーシス経路(例えば、切断型カスパーゼ)、後期アポトーシス経路(例えば、PARP/DNAフラグメンテーション)などをモニタリングする特異的色素が使用され得る。
【０２６９】
4つのシグナル伝達経路の速度論をフローサイトメトリーを使用して同時に測定する代表的な実験の結果が、図9に示されている。本明細書において、ヒト全血を、PI3キナーゼ阻害剤GDC0941の存在下(実験サンプル)又は不在下(対照サンプル)でLPSを用いて処理した。Shankeyら(「Whole blood fixation and permeabilization protocol with red blood cell lysis for flow cytometry of intracellular phosphorylated epitopes in leukocyte subpopulations.」Cytometry 67A;4〜17頁、2005)においてこれまでに公開された方法に従って、細胞を固定化し、透過処理し、CD14-PECy7(正常白血球細胞中の細胞混合物中の単球を同定するために)及びIκBα(ALEXAFLUOR(商標)488にコンジュゲートされた)、P-ERK(ALEXAFLUOR(商標)647にコンジュゲートされた)、P-Akt(PEにコンジュゲートされた)及びP-S6(Pacific Blueにコンジュゲートされた)に対する抗体を用いて染色した。
【０２７０】
図9に示されるように、LPS処理は、Iκキナーゼを活性化し、IκBαのプロテアソーム分解及び緑色/ALEXA FLUOR(登録商標)488蛍光シグナルの喪失をもたらす。LPS処理はまたERK、Akt及びS6を活性化した(下流エフェクターのリン酸化によってアッセイされたように)。PI3キナーゼ阻害剤GDC0941(右側パネル)の存在下で、P-Aktは、リン酸化されず、ERK及びS6リン酸化の速度論が遅延された(LPS単独を用いて処理された細胞と比較して)。PI3K阻害はまた、IκBαのプロテアソーム分解に対して影響がなかった。本明細書において示される結果は、以下を実証する:
(1)正常細胞集団における応答の再現性のある速度論
(2)(水平)経路内の相互作用(単球においてP-ERKは、P-S6を活性化し、(3)他の非造血細胞において見られるように、S6は、Aktによって活性化されない)
(4)経路を研究するための十分に「マッピング」された阻害剤の使用。
【０２７１】
[実施例7]
組織培養サンプル
より容易に入手可能な、再現性のある細胞系を提供するために(また、既存の方法を用いた場合に見られる問題を避けるために)、組織培養細胞株に基づいた実験系が、シグナル伝達経路に対する薬物の影響をモニタリングするために利用され得る。
【０２７２】
組織培養細胞を使用するフローサイトメトリー法は、薬物、例えば、慢性骨髄性白血病(CML)の治療において有用であるBcr/Ablキナーゼの阻害剤の効果を調べるために日常的に使用されてきた。CMLは、フィラデルフィア染色体、染色体9上のAbl1遺伝子を染色体22上のBCR遺伝子の部分と融合する遺伝子転座と関連している。得られた融合タンパク質は、P-STAT5、P-Crkl、P-mTOR及びP-HSFを含めたいくつかの下流シグナル伝達経路を構成的に活性化する受容体チロシンキナーゼを含有する。Ablキナーゼは、イマチニブ(GLEEVEC(商標))、ニロチニブ及びダサチニブを含めた臨床的に現在使用されるいくつかの治療薬の標的である。これらの化合物は、受容体レベルでチロシンキナーゼ活性を阻害することによって作用し、また、すべての下流シグナル伝達経路を付随して阻害する。
【０２７３】
CMLの代表的なモデルとして、Bcr/Abl融合タンパク質を発現し、下流STAT5標的を構成的にリン酸化するヒトK562細胞株 (Cytometry 54A;75〜88頁、2003)を、以下の実験において使用した。図10に示されるように、2μM GLEEVEC(商標)(イマチニブ又はSTI571)を用いるK562細胞の30分間の処理は、下流STAT5標的のリン酸化の>95%阻害をもたらす。また、図10に示されるように、30分のイマチニブ曝露後にSTAT5のリン酸化が阻害されるが、DNA含量によって測定されるような細胞周期の変化はない。
【０２７４】
リン酸化されたSTAT5(P-STAT5)は、サイクリンDを含めたいくつかの標的タンパク質の転写アクチベーターとして作用する。サイクリンDの構成的発現(P-STAT5によって誘導される)は、K562細胞を細胞周期中に維持する。イマチニブに対する24時間の曝露が、S期(細胞増殖のマーカーとして)を約50%低減し、イマチニブに対するさらに24時間のさらなる曝露がS期をさらに50〜70%低減することがわかった(データは示されず)。
【０２７５】
[実施例8]
トログリタゾンの効果
細胞をトログリタゾンを用いて処理し、続いて、種々の蛍光色素(カルセインAM、MBBR、MITOSOX(商標)及びCYTOSOX(商標))とともにインキュベートした。各非対照ウェルについては、陽性及び陰性対照鋳型に対する二次のカイ距離(各蛍光チャネルについて)を算出し、倍率を用いて正規化した。正規化されたデータをテンソルに再構成し、陽性及び陰性対照鋳型からの距離を算出する。別の化合物テンソルに対するトログリタゾンテンソルの類似度は、動的時間伸縮距離を使用してテンソルのファイバー列を比較することによって、公知の技術を使用して計算され得る(Giorginoら「Computing and Visualizing Dynamic Time Warping Alignments in R: The dtw Package.」Journal of Statistical Software、第31巻(7)、 1〜24頁、2009を参照のこと)。すべての他の化合物に対する非類似度又は距離は、このように算出され得る。
【０２７６】
結果は、図12に示されている。
【０２７７】
[実施例9]
ゲーティングを用いない細胞性MMP応答の自動化された誘導
ミトコンドリア膜電位の測定は、JC-1及びJC-9などのミトコンドリアセンサーを使用してフローサイトメトリーにおいて実施されることが多い。これらの化学種は、可視光スペクトルの緑色部分(JC-1について約525nm)から赤色(JC-1について約590nm)への蛍光発光シフトによって示される、ミトコンドリアにおける電位依存性蓄積を示す色素である。したがって、ミトコンドリアにおける生理学的変化は、2つの観察された蛍光のバンド間の強度比のシフトによって示される。
【０２７８】
サイトメトリーでは、MMPの全体的な(集団全体)変化の検出は、通常、最も低い及び最も高いレベルのMMPを特徴とする細胞の亜集団のゲーティング(選択)によって測定される。これは、細胞の関連亜集団を同定しようと試みる、手作業でのデータ処理又は種々のクラスタリングアルゴリズムの使用を必要とする。亜集団が同定される場合には、化合物濃度の増大とMMPの対応する変化を関連付ける関数を示すMMP応答曲線を作成することが可能である。
【０２７９】
これらの関数(曲線)は、通常、特定のゲート(例えば、「高MMP」集団を描写するゲート)中の細胞のパーセンテージを化合物曝露に対する細胞集団の応答に関する情報を提供するプロキシとして使用して作成される。したがって、応答曲線は、対象の生化学的化合物を特徴付け、化学化合物のデータベースから化合物の特徴を利用するために、又は化合物の機能性を予測するために、化合物をクラスターにさらにグループ分けするために使用され得る。
【０２８０】
記載される適用では、通常、ゲーティングが使用されるが、Bernasらは、これらの集団を説明する分布間の頑強な非類似度計量(距離)を計算することによってそれを用いずにフローサイトメトリーサンプル中のサンプルの集団間の相違を決定することが実現可能であることを実証した(Bernasら(2008): Quadratic form: A robust metric for quantitative comparison of flow cytometric histograms; Cytometry A 73A、715〜726頁。doi:10.1002/cyto.a.20586)。Bernasによって提案された計量(二次形式距離)は、1次元で又はより高次元で操作することができる。Rajwaらは、これらの距離を計算し、フローサイトメトリーにおける生物学的サンプル間の相違を定量化することに関連してそれらを使用する方法を教示する(Rajwaら(2011): Quantification of differences between measured values and statistical validation based on the differences、米国特許出願公開番号US20110,066,385 A1)。Robinsonらは、距離関数を利用することによって、応答曲線を計算し、IC50、漸近線などといったこれらの曲線の付随するパラメータを導く方法を教示する(Robinsonら (2013):  Gate-free flow cytometry data analysis、米国特許出願公開番号US20130,226,469 A1)。この開示では、Robinsonは、一連のサンプルと対照との間の距離を計算する。使用される対照は、陽性対照又は陰性対照であり得る。開示は、蛍光の個々のチャネルの非類似度を計算することを実証する。
【０２８１】
上記の参考文献によって開示される方法の適用は、4つの相補的応答曲線をもたらす:蛍光の第1の測定されたバンドの一連のサンプルと陽性対照との間の非類似度をコードするもの、同一バンドにおけるサンプルと陰性対照との間の非類似度をコードする第2のもの、及び第2の測定されたバンドについて類似して構築された2つのさらなる曲線。一緒にされた4つの応答曲線が、同定されたクラスター中の細胞のパーセンテージを利用する伝統的なアプローチを使用して導かれた情報と同様の情報を含有することは自明であるが、導かれた曲線が、生物学的化合物分析及び医薬品化学において十分に確立された有用性を有する単一応答曲線の代わりに使用され得る方法は明確ではない。
【０２８２】
したがって、上記で引用された開示は、それらが多数の他のフローサイトメトリー測定に実際的な解決策を提供するとしてもMMPの場合には適用され得ない。
【０２８３】
一般に、先行技術は、生物学的応答についての情報が、2以上の次元でコードされるサンプルの単一応答曲線を計算する方法を含まない、また陽性対照及び陰性対照両方の使用が必要であるということができる。Bernasetらは、提案された距離関数が、多パラメータ(多次元)サイトメトリーにスケール調整可能であるという事実に言及するが、著者は、多次元の場合の実際に適用可能な実装又は実証を開示していない。Robinsonらは、一連のサンプルと対照との間の多重比較は、手作業でのデータのゲーティングから抽出された応答曲線と同様の応答曲線につながるシリーズに配置できると教示している。しかし、Robinsonらは、JC-、JC-9、JC-10及び他のレシオメトリック色素の測定値などの2次元の場合における開示された方法の使用に関しては沈黙している。この開示は、2以上の種類の対照が使用され、生物学的サンプルが2以上の測定値によって特徴付けられる、MMP測定値及び他の測定値の距離関数を使用する応答曲線の誘導を教示する。
【０２８４】
以下に記載される方法は、細胞の集団に対して作用する場合に、対象の生物学的化合物によって示される応答の特徴を決定するのに必要な情報のすべてを含有する単一応答曲線を誘導可能である。
【０２８５】
この方法は、フローサイトメトリー測定値によって形成される周辺ヒストグラム(1次元ヒストグラム)への距離関数の適用を含む。
【０２８６】
(A)in silicoシミュレーション
本明細書において開示される実施形態に係る、フローサイトメトリー測定値によって形成される周辺ヒストグラム(1次元ヒストグラム)への距離関数の適用を使用する方法を、以下のin silico実施例において説明する。
【０２８７】
図19は、ミトコンドリア膜電位に影響を及ぼす増大する濃度の作用物質に曝露された10種のフローサイトメトリーサンプルのコンピュータシミュレーションを例示する。図18は、陰性及び陽性対照を示す。陰性対照によって定義される細胞のクラスターに属する細胞の数及びパーセンテージの変化は、図20に例示される。パネルAは、細胞の数の関数として応答曲線を示す。Bは、細胞のパーセントの関数として応答曲線を示す。
【０２８８】
第1に、陽性対照(Cp)と陰性対照(Cn)の間の距離の対が計算される。FL1周辺ヒストグラム(Cl)及びFL2周辺ヒストグラム(Cll)について、2つの距離が定義される。これらの距離は、さらなる使用及び再スケーリングのための参照である:
f1=D(Clp,C11)
f2=D(Cllp,Clll)
式中、iは、希釈系列中のサンプルを示す数であり、ローマ数字(I、II)は、チャネル数を示す。式は、2次元の場合(2つの周辺ヒストグラム)を示し、したがって、2つのローマ数字のみが使用される。距離関数Dは、二次形式距離、Wasserstein距離、二次カイ二乗距離、又はヒストグラムを表すベクトルに作用する他の任意の距離であり得る。
【０２８９】
この操作後に、生物学的サンプルの一連の距離を類似のやり方で算出する。距離は、陽性対照と一連の生物学的サンプル(S1、S2、…、Si)並びに陰性対照サンプルの対ごとに計算される(図21を参照のこと):
dln,I=D(Cln,Sli)
dlp,I=D(Clp,Sli)
dlln,I=D(Clln,Slli)
dllp,I=D(Cllp,Slli)
【０２９０】
得られた値はアレイを形成する。アレイの大きさ及び次元は、さらに説明されるように対照の数及び利用される1次元ヒストグラムの数に左右される。MMPの場合には、2つの対照が使用され、2つの蛍光チャネルが測定される。
【０２９１】
【数２８】
0006606100.tif 000030
【０２９２】
測定値のアレイ(上記で示される2つの行列)はまた、3元（three-way）テンソルと見なされ得る。この3元テンソルの大きさは、I1xI2xI3であり、ここで、I1は、試験された濃度の数(通常、10)であり、I2は、測定された応答の数(JC様標識の場合には2つ)であり、I3は、測定された非類似度/距離の数(通常は2つであり陽性対照の距離測定値及び陰性対照の距離測定値)である。したがって、生物学的測定値を表すテンソルAについては、αi,j,kによって示される要素(i、j、k)は、濃度iの化合物に曝露された細胞集団及び対照細胞集団kから得られたパラメータjの測定値間の距離を説明する。
【０２９３】
この第3のステップでは、テンソルA中のデータの配置後に、テンソル分解が実施される。テンソル分解の目的は、高次のテンソルのすべて又はほとんどの情報を含有する低ランクテンソルの形成である。実証された実施例では、利用される分解は、ポリアディックテンソル分解(CP)である。テンソルAは、2つのテンソルに分解される2つに分解される。
【０２９４】
CP分解の目的は、以下の判定基準を満たす、
【数２９】
0006606100.tif 000031
と示されるテンソルAの近似を見出すことである:
【数３０】
0006606100.tif 000032
式中、○は、外積を示す。
【０２９５】
第1のテンソル
【数３１】
0006606100.tif 000033
(本明細書において以下、単純化のためにA1と示される)a1(1)(本明細書において以下、a1と示される)を組み立てる第1のベクトルは、静止濃度の化合物を上回る一連の生物学的サンプルによって示される、応答の全体的な変化を説明する(図22A))。a1ベクトルは、応答の予め考えられたモデル(対数ロジスティックなど、Gompertz、Weibull、Cedergreen-Ritz-Streibig、Brain-Cousens etc)(Cedergreenら、2005;Meddingsら、1989)をフィッティングすることによってさらに特徴付けられ得る。このようなフィッティングの例は、図22Bに示されている。
【０２９６】
図19に示されるin silicoシミュレートされたサンプルのすべてにおいて、細胞の総数は5000である。図19Aから図19Jにおいて図中に示される「陽性対照」様クラスター中の細胞数は、それぞれ、4909、4753、4409、3650、2478、1370、581、234、87及び29である。先に記載したように、変化についての情報はまた、クラスター中の細胞のパーセンテージとして、又はクラスター中の細胞のパーセンテージと陰性対照中のクラスターに属する細胞のパーセンテージの間の相違として可視化され得る。実証された実施例では、それらのパーセンテージは、AからJのサンプルについて、それぞれ、98.18、95.06、88.18、73、49.56、27.4、11.62、4.68、1.74及び0.58である(図19)。すべての場合において、s字形状はプロットされた関数（plotted function）を特徴付ける。
【０２９７】
ポリアディックテンソル分解によって計算された応答曲線(ベクトルa1によって記載された曲線)は、図22Aにおいて実証される。曲線は、濃度(サンプル数によってコードされる)と応答の相対レベルの間の機能的依存についての同一情報を提供するs字型特徴を保持する。曲線は、対照間の距離を使用して再スケーリングされ得る。再スケーリング後、1の非類似度は、陰性対照と陽性対照との間の非類似度に等しい。伝統的な方法論を使用して導かれた応答曲線間の対応関係を示すプロット及び記載された方法が、図23に提供されている。
【０２９８】
(B)バリノマイシン及び2種の他の作用物質に対する細胞応答の分析
上記の手順を、本当のフローサイトメトリーデータで実施した。結果は、図24及び25に示されている。データは、上記で本明細書に記載された方法を使用して得た。
【０２９９】
図24は、バリノマイシンに対して曝露された細胞集団の変化を実証する一連のフローサイトメトリープロットを示す。図25Aは、フローサイトメトリーデータから導いた応答曲線を提供する。図24では、バリノマイシンに加えて、イダルビシン及びアセトミフェンに曝露されたさらなるサンプルが使用された。図25Aにおける非類似度の単位は、陽性対照と陰性対照との間の相違であり、これでは、陽性対照は、25μmの濃度のFCCPを用いて処理されたサンプルである。
【０３００】
計算された応答データはまた、定義されたs字型曲線モデルをフィッティングするために使用され得る。例えば、提供された実施例にフィッティングされる対数ロジスティック4パラメータモデルは、図25Bにおいて濃度とサンプル応答の間の近似された機能依存を表す。
【０３０１】
本発明は、例えば以下の実施形態を包含する：
［実施形態１］細胞に対する作用物質の効果を特徴付けるための方法であって、
作用物質を細胞の集団と接触させるステップ、
集団の個々の細胞において2以上の表現型パラメータの各々を測定するステップ、
各パラメータについて細胞の測定値の分布を得るステップ、
対照と各分布との間の非類似度を算出するステップ、
算出された非類似度を組み合わせて、マルチパラメトリック応答テンソルを形成するステップ
を含み、
ここで、マルチパラメトリック応答テンソルが細胞に対する作用物質の効果に特徴的である、方法。
［実施形態２］作用物質に対する細胞の応答曲線を特徴付けるための方法であって、
細胞の集団のアリコートを、濃度系列の作用物質、陰性対照及び陽性対照と接触させるステップ、
サイトメトリーによって各アリコートの細胞、陽性対照アリコートの細胞及び陰性対照アリコートの細胞の2以上の表現型パラメータを測定するステップ、
各パラメータについて1つの直交軸を有するn-次元座標系に各アリコートの結果をマッピングするステップ、
陽性対照及び陰性対照の各パラメータ軸に沿った測定値の周辺分布を決定するステップ、
陽性対照と陰性対照の周辺分布間の距離を算出するステップ、
濃度系列中の各アリコートの測定値の各パラメータ軸に沿った周辺分布を決定するステップ、
(a)前記周辺分布の各々と、陽性対照について決定された対応する周辺分布間、(b)前記周辺分布の各々と、陽性対照について決定された対応する周辺分布間の距離を、各アリコートの各パラメータについて算出するステップ、
陽性及び陰性対照間で算出された距離に対して各アリコートの算出された距離を正規化するステップ、
このように算出された距離から、作用物質に対する細胞の応答曲線を決定するステップを含む、方法。
［実施形態３］試験作用物質のin vivo効果を予測するための方法であって、
試験作用物質を細胞の集団と接触させるステップ、
集団の個々の細胞において2以上の表現型パラメータの各々を測定するステップ、
各パラメータについて細胞の測定値の分布を得るステップ、
対照と各分布との間の非類似度を算出するステップ、
非類似度を組み合わせて、マルチパラメトリック応答テンソル
【数３２】
0006606100.tif 000034
を形成するステップであって、
ここで、pは、テンソルの階数であり、要素が算出された非類似度であるマルチパラメトリック状態テンソルAは、細胞に対する作用物質の効果に特徴的である、ステップ、
低損失圧縮法によってマルチパラメトリック応答テンソルを圧縮して、その複雑性を低減するステップ、
圧縮されたマルチパラメトリック応答テンソルAと、in vivo効果が知られている化合物のバンクについて同等に算出されたテンソルとの間の相違を算出するステップ、
相違の値から、作用物質のin vivo効果を予測するステップ
を含む、方法。
［実施形態４］作用物質のin vivo効果を予測する方法であって、
作用物質を細胞の集団と、及び/又は複数の参照作用物質を1以上の細胞の参照集団と接触させるステップであって、各参照作用物質が既知in vivo効果を有するステップ、
前記細胞の複数の表現型パラメータを検出(及び定量化)するステップ、
対照と表現型測定値の各分布との間の非類似度を算出するステップ、
非類似度を応答テンソルに組み合わせるステップ、
応答テンソルと1以上の参照テンソルとの間の相違を算出するステップ、並びに
相違から、試験作用物質のin vivo効果を予測するステップ
を含む、方法。
［実施形態５］データが、一般的な方法及び式-1に従って分析される、実施形態1に記載の方法。
［実施形態６］データが、一般的な方法及び式-3に従って分析される、実施形態2に記載の方法。
［実施形態７］データが、一般的な方法及び式-1に従って分析される、実施形態3に記載の方法。
［実施形態８］データが、一般的な方法及び式-1に従って分析される、実施形態4に記載の方法。
［実施形態９］表現型パラメータの1種が、細胞周期である、実施形態5に記載の方法。
［実施形態１０］表現型パラメータが、細胞周期、ミトコンドリア膜完全性、活性酸素種、還元種及び細胞生存力のうちの2種以上である、実施形態5に記載の方法。
［実施形態１１］細胞の各集団が、複数の蛍光色素を用いて機能的に標識され、表現型パラメータが、前記標識された細胞の集団がサイトメトリー分析にかけられたときに生じるスペクトル発光シグナルの点で検出され、定量化される、実施形態5に記載の方法。
［実施形態１２］各表現型パラメータが、表現型パラメータについて特異的にアッセイ可能である1種以上の蛍光化合物によって生じたスペクトル発光シグナルの点で算出される、実施形態5に記載の方法。
［実施形態１３］複数のスペクトル発光シグナルが検出され、定量化され、発光シグナル間のクロストークが、シグナルを線形混合物として処理することによって低減される、実施形態5に記載の方法。
［実施形態１４］シグナルが、線形混合物として処理され、線形混合物が、検出された発光シグナル間の最小逸脱を決定することによって個々のシグナル強度の近似に分解され、各シグナルの近似された組成が、非混合シグナルの推定量を混合行列と混合することによって作成される、実施形態5に記載の方法。
［実施形態１５］近似シグナル組成の組成が、組成中の異なる発光シグナルの存在量についての情報を含有するアルゴリズムを使用することによって決定される、実施形態5に記載の方法。
［実施形態１６］処理されていない細胞の集団を含む陰性対照、細胞応答を誘発することが知られている1種以上の撹乱物を用いて処理されている細胞の集団を含む陽性対照が決定される、実施形態5に記載の方法。
［実施形態１７］シグナル分布を、各分布を積分で割ることによって、細胞の試験集団、陰性対照及び陽性対照に対して正規化するステップをさらに含む、実施形態5に記載の方法。
［実施形態１８］細胞の試験集団を起源とする正規化された非混合シグナル分布を、陰性対照、陽性対照又は陰性及び陽性対照の両方を起源とする正規化された非混合シグナル分布と比較するステップをさらに含む、実施形態17に記載の方法。
［実施形態１９］陽性対照及び陰性対照を起源とする発光シグナルの分布における平均非類似度を計算するステップをさらに含む、実施形態5に記載の方法。
［実施形態２０］発光シグナルの分布における平均非類似度が、一次元、二次元、三次元又は複数次元で比較される、実施形態19に記載の方法。
［実施形態２１］多次元非類似度比較が、蛍光シグナル分布、存在量測定値及び非蛍光シグナル分布、光散乱測定値の比較を含む、実施形態20に記載の方法。
［実施形態２２］多次元非類似度分布が、Wasserstein計量又は二次形式距離(QFD)計量を使用して計算される、実施形態20に記載の方法。
［実施形態２３］一次元非類似度分布が、Wasserstein計量、二次形式距離(QFD)計量、Kolmogorov計量又は対称化Kullback-Leiblerダイバージェンス計量を使用して計算される、実施形態20に記載の方法。
［実施形態２４］非類似度分布が、各細胞集団のすべての測定されたシグナル強度を使用することによって計算されるか、又は細胞集団の機能的に定義されたサブセット各々について別々に計算される、実施形態19に記載の方法。
［実施形態２５］細胞の複数の集団が、種々の濃度の作用物質と接触され、細胞の複数の参照集団が、種々の濃度の参照化合物と接触され、表現型パラメータが、作用物質及び参照化合物の各濃度の各集団について測定され、測定値から状態テンソルのデータセットが作成される、実施形態5に記載の方法。
［実施形態２６］集団を、細胞形態に基づいて2以上の細胞サブセットのうち複数にグループ分けするステップをさらに含む、実施形態5に記載の方法。
［実施形態２７］データセットが、細胞集団の総数、測定された表現型パラメータの総数、各パラメータの測定に使用された蛍光マーカーの総数、研究された試験又は参照化合物の濃度の総数及び使用された細胞サブセットの数の積に等しい、すべての測定値の総計を含む、実施形態25に記載の方法。
［実施形態２８］データセットが、n6個の異なる細胞の集団のn5個の異なる細胞サブセットにおけるn4種の異なる化合物のn3種の異なる濃度のn2種の蛍光マーカーを使用するn1個の異なる細胞パラメータの分析から作成された値を含む、実施形態25に記載の方法。
［実施形態２９］n1=5、n2=1、n3=5、n4=2、n5=2及びn6=2であり、その結果、データセットが、200個の値を含む、実施形態28に記載の方法。
［実施形態３０］パラメータが、DNAインターカレーションに特異的である5種の蛍光シグナル(HOECHST 33342、DRAQ5、YO-PRO-1 IODIDE、DAPI、CYTRAK ORANGE)及び細胞周期と関連する2種のタンパク質(サイクリン及びリン酸化ヒストンタンパク質)の点で検出され、定量化される細胞周期であり、試験集団及び参照集団が、各々、5種の異なる濃度の試験化合物及び細胞周期撹乱物質である参照化合物と接触される、実施形態25に記載の方法。
［実施形態３１］コンピュータで実行されると、プロセスをコンピュータに実施させる、コンピュータプログラムを記憶する非一過性のコンピュータ可読記憶媒体であって、プロセスが、
細胞の試験集団及び細胞の参照集団の各々中の複数の表現型パラメータを検出(及び定量化)するステップであって、前記表現型パラメータが、各々、互いに独立して、状態テンソルとして表される(又はグループ化される)、ステップ、
細胞の試験集団及び細胞の参照集団の状態テンソル間の相違を測定する(ことで試験化合物のフィンガープリントを計算する)ステップ、並びに
参照作用物質の既知in vivo効果から試験作用物質のin vivo効果を予測するステップ
を含む、非一過性のコンピュータ可読記憶媒体。
［実施形態３２］p=3であり、I1が、作用物質濃度のセットであり、I2が、測定される生物学的応答のセットであり、I3が、使用される対照のセットである、実施形態3に記載の方法。
［実施形態３３］p=4であり、I1が、作用物質濃度のセットであり、I2が、測定される生物学的応答のセットであり、I3が、使用される対照のセットであり、I4が、使用される培養環境のセットである、実施形態3に記載の方法。
［実施形態３４］p=5であり、I1が、作用物質濃度のセットであり、I2が、測定される生物学的応答のセットであり、I3が、使用される対照のセットであり、I4が、使用される培養環境のセットであり、I5が、使用される作用物質曝露の期間のセットである、実施形態3に記載の方法。
［実施形態３５］p≧3である、実施形態3に記載の方法。
［実施形態３６］テンソルAがランク1テンソルA(iのセットに分解され、A≒[[λ;A(1),A(2),…,A(n)]]、(CP分解)である、実施形態3に記載の方法。
［実施形態３７］テンソルAが、各モード:A≒[[G;M(1),M(2),…,M(p)]](Tucker分解)に沿って行列M(j)によってかけ算されたコアテンソルGに分解される、実施形態3に記載の方法。
［実施形態３８］生物学的に活性な作用物質間の非類似度が、分解によって生じたランク1テンソルを形成するベクトル間の非類似度として表される、実施形態36に記載の方法。
［実施形態３９］生物学的に活性な作用物質間の非類似度が、分解に起因するコアテンソル間の非類似度として表される、実施形態37に記載の方法。
本明細書に引用される参考文献を考慮した前述の説明の注意深い検討から、当業者ならば、本明細書に記載される本発明及び実施形態の特徴を確定でき、それによって、その趣旨及び範囲から逸脱することなく、その幅広い様々な変化及び修飾を取り込むことが可能になる。
【０３０２】
上記で引用されるすべての刊行物及び特許は、特に、その前述の考察に関連する部分として参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
0006606100.tif 000035
【図１Ｂ】
0006606100.tif 000036
【図２】
0006606100.tif 000037
【図３】
0006606100.tif 000038
【図４Ａ】
0006606100.tif 000039
【図４Ｂ】
0006606100.tif 000040
【図５】
0006606100.tif 000041
【図６Ａ】
0006606100.tif 000042
【図６Ｂ】
0006606100.tif 000043
【図７】
0006606100.tif 000044
【図８】
0006606100.tif 000045
【図９】
0006606100.tif 000046
【図１０】
0006606100.tif 000047
【図１１】
0006606100.tif 000048
【図１２】
0006606100.tif 000049
【図１３】
0006606100.tif 000050
【図１４】
0006606100.tif 000051
【図１５】
0006606100.tif 000052
【図１６】
0006606100.tif 000053
【図１７】
0006606100.tif 000054
【図１８】
0006606100.tif 000055
【図１９】
0006606100.tif 000056
【図２０】
0006606100.tif 000057
【図２１】
0006606100.tif 000058
【図２２】
0006606100.tif 000059
【図２３】
0006606100.tif 000060
【図２４】
0006606100.tif 000061
【図２５】
0006606100.tif 000062