(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫測定法における試料中の生体粘膜由来の体液に由来する抗原抗体反応における偽陽性及び／又は偽陰性を抑制する免疫反応阻害抑制剤であって、以下の（１）及び（２）のいずれかの化合物を含むことを特徴とする免疫反応阻害抑制剤；
（１）「Ｒ１−ＳＯ３Ｈ」で表されるスルホン酸化合物又はその塩
（式中、Ｒ１は、直鎖状のＣ５〜Ｃ３０アルキル基、直鎖状のＣ５〜Ｃ３０アルキル基を少なくとも１つ有する炭素環式芳香族基で置換された直鎖状のＣ１〜Ｃ３０アルキル基、又は直鎖状のＣ５〜Ｃ３０アルキル基を少なくとも１つ有する炭素環式芳香族基を表し、これらの基は置換基を有していてもよい。）、
（２）「Ｎ＋−Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｒ５」で表される第四級アンモニウムイオン又はその塩
（式中、Ｒ２〜Ｒ５は、それぞれ独立して直鎖状のＣ１〜Ｃ３０アルキル基、又は少なくとも１つの直鎖状のＣ５〜Ｃ３０アルキル基により置換されている炭素環式芳香族基を表し、これらの基は置換基を有していてもよい。）。
【請求項２】
（１）の式中、Ｒ１は、未置換の直鎖状のＣ５〜Ｃ２０のアルキル基であるか、直鎖状のＣ５〜Ｃ２０のアルキル基を有するフェニル基で置換された直鎖状のＣ１〜Ｃ２０アルキル基であるか、又は直鎖状のＣ５〜Ｃ２０のアルキル基で置換されたフェニル基である、請求項１に記載の免疫反応阻害抑制剤。
【請求項３】
（２）の式中、Ｒ２〜Ｒ５は、それぞれ独立して、炭素環式芳香族基で置換されていてもよい直鎖状のＣ１〜Ｃ２０アルキル基、又は少なくとも１つの直鎖状のＣ５〜Ｃ２０アルキル基で置換されている炭素環式芳香族基である、請求項１に記載の免疫反応阻害抑制剤。
【請求項４】
（２）の式中、Ｒ２〜Ｒ５は、それぞれ独立して、未置換もしくはフェニル基で置換されている直鎖状のＣ１〜Ｃ２０アルキル基、又は直鎖状のＣ５〜Ｃ２０アルキル基で置換されているフェニル基である、請求項１に記載の免疫反応阻害抑制剤。
【請求項５】
（２）の式中、Ｒ２〜Ｒ５が下記の（ａ）〜（ｅ）のいずれかの場合である、請求項４に記載の免疫反応阻害抑制剤；
（ａ）Ｒ２〜Ｒ５のいずれか１つが、フェニル基で置換されていてもよい直鎖状のＣ３〜Ｃ２０アルキル基であって、他の３つがメチル基もしくはエチル基である場合、
（ｂ）Ｒ２〜Ｒ５のいずれか１つが、メチル基もしくはエチル基であって、他の３つがフェニル基で置換されていてもよい直鎖状のＣ３〜Ｃ２０アルキル基である場合、
（ｃ）Ｒ２〜Ｒ５のすべてが、フェニル基で置換されていてもよい直鎖状のＣ３〜Ｃ２０アルキル基である場合、
（ｄ）Ｒ２〜Ｒ５のいずれか１つがベンジル基であって、他の３つがフェニル基で置換されていてもよい直鎖状のＣ３〜Ｃ２０アルキル基である場合、又は
（ｅ）Ｒ２〜Ｒ５のいずれか２つがメチル基もしくはエチル基であって、他の２つがフェニル基で置換されていてもよい直鎖状のＣ６〜Ｃ２０アルキル基である場合。
【請求項６】
（２）の式中、Ｒ２〜Ｒ５が下記の（ａ）〜（ｅ）のいずれかの場合である、請求項５に記載の免疫反応阻害抑制剤；
（ａ）Ｒ２〜Ｒ５のいずれか１つが直鎖のＣ３〜Ｃ１６アルキル基であって、他の３つがメチル基である場合、
（ｂ）Ｒ２〜Ｒ５のいずれか１つがメチル基であって、他の３つが直鎖のＣ３〜Ｃ１２アルキル基である場合、
（ｃ）Ｒ２〜Ｒ５のすべてが直鎖のＣ３〜Ｃ１２アルキル基である場合、
（ｄ）Ｒ２〜Ｒ５のいずれか１つがベンジル基であって、他の３つが直鎖のＣ３〜Ｃ１２アルキル基である場合、又は
（ｅ）Ｒ２〜Ｒ５のいずれか２つがメチル基であって、他の２つが直鎖のＣ３〜Ｃ１２アルキル基である場合。
【請求項７】
（２）がアンモニウムイオンの塩であって、ハロゲン化水素、硝酸、ヘキサフルオロリン酸、三フッ化二水素、及び過塩素酸なる群から選択された化合物との塩である、請求項１、３〜６のいずれか一項に記載の免疫反応阻害抑制剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫反応阻害抑制剤を使用することを特徴とする、免疫測定方法。
【請求項９】
被験体の生体粘膜由来の体液を含有する試料中の被検物質を測定するＥＬＩＳＡ、イムノクロマト法、ウエスタンブロット法、イムノブロット法、免疫沈降法、及びラテックス凝集法から選択されたいずれかの免疫測定法において、請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫反応阻害抑制剤を使用することを含む、抗原抗体反応における偽陽性及び／又は偽陰性が抑制された免疫測定方法。
【請求項１０】
被験体の生体粘膜由来の体液を含有する試料が、唾液、喀痰、喉拭い液、鼻拭い液、鼻腔吸引液、及び角結膜拭い液から選択された生体粘膜由来の体液を少なくとも１種含有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
被検物質が、病原体、病原微生物、ホルモン、炎症関連物質、プロスタグランジン、及びメタボリックシンドローム関連物質からなる群から選択された物質である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記病原体又は病原微生物が、口蹄疫ウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、コロナウイルス、狂犬病ウイルス、百日咳菌、溶血性連鎖球菌、大腸菌、食中毒細菌、クラミジア・トラコマテス及びマイコプラズマから選択された病原体又は病原微生物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫反応阻害抑制剤を含むことを特徴とする免疫測定用キット。
【請求項１４】
免疫測定用キットが、ＥＬＩＳＡ、イムノクロマト法、ウエスタンブロット法、イムノブロット法、免疫沈降法、及びラテックス凝集法から選択されたいずれかの免疫測定法のためのキットである、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
被験体が病原性疾患に罹患しているか否かを、被験体の生体粘膜由来の体液を用いて免疫反応により診断するためのキットであって、
被検体液試料の希釈剤、展開液、ブロッキング液の少なくとも１つに請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫反応阻害抑制剤が添加されていることを特徴とする、キット。
【請求項１６】
病原性疾患が、口蹄疫ウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、コロナウイルス、狂犬病ウイルス、百日咳菌、溶血性連鎖球菌、大腸菌、食中毒細菌、クラミジア・トラコマテス及びマイコプラズマから選択された病原体又は病原性微生物により引き起こされる疾患であることを特徴とする、請求項１５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫測定法における体液成分、特に唾液など生体粘膜由来成分による抗原抗体反応阻害を抑制する阻害抑制物質の提供、及び当該阻害抑制物質を用いた迅速、簡便かつ正確な免疫測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト、動物の疾病等の診断には現在様々な簡易検査法が開発されている。簡易診断法は、検出したい対象物質（病原体等）に対する特異的抗体の結合反応（抗原抗体反応）を用いて診断する方法が主流であり、ＥＬＩＳＡ、イムノクロマト法、ラテックス凝集法などが広く知られている。患者、患畜より検体を採取後、迅速かつ簡便に結果を得ることができるため、症状が早期のうちに治療を開始できることから、簡易検査試薬およびキットの重要性は、医療、畜産の現場において年々高まっている。
現在ヒトや家畜の疾病の診断では、一部の病原体で患者から採取した咽頭拭い液などを検体として迅速診断をする方法など簡易診断法の実用化が進んでいる。しかし、これはインフルエンザの迅速診断など一部場面に限られており、未だ診断できる対象が限られている。
その要因の一つとして、検体に混入するヒト・動物由来の唾液などの体液成分が抗原抗体反応に悪影響（偽陽性化、偽陰性化）を及ぼし、診断結果が正確に得られない現象が生じる場合があることがあげられる。例えば、家畜生産に重大な被害をもたらす口蹄疫においては、現場での迅速な診断が重要であるため大きな機器を必要としないイムノクロマトが必要とされているが、ウシ唾液など生体粘膜由来成分が検体に混入することによりイムノクロマトの反応異常が起こり正確な診断ができないという問題点があった。
体液検体のうちでも特に唾液などの生体粘膜由来検体の場合、粘膜免疫系に由来する生体防御成分を多く含んでおり、イムノアッセイによる被検出物質の検出において、偽陰性や偽陽性の原因となることが知られていた（特許文献１、２）。【０００３】
このような、唾液など体液成分による抗原抗体反応の阻害を抑制するための阻害抑制物質の研究開発も活発化してきており、主として、各種界面活性剤など界面活性作用を有する物質、又はスルホン酸基、カルボキシル基もしくは硫酸基などイオン性官能基を分子中に多数有する分子量の大きなポリマーを用いる技術が注目されている。例えば、非イオン性又は両性界面活性剤により唾液中のムチンによるミュータンス連鎖球菌の凝集を可溶化する技術（特許文献３）、スルホン酸基及び／又はカルボキシル基を有する陽イオン交換樹脂を用いて咽頭由来検体を前処理する技術（特許文献４）スルホン酸基、カルボン酸基などを有する疎水性環式モノマーの重合ポリマーからなるイオン性界面活性剤により血清中の妨害物質の作用を抑制する技術（特許文献５）、スルホン酸基又はその塩を含有する共役ジエン系共重合体により血液中の妨害物質作用を抑制する技術（特許文献６）、硫酸基を２個以上有する平均分子量５，０００〜５００，０００のデキストラン硫酸塩を用いて生体粘膜由来成分中のＩｇＡ等の妨害作用を抑制する技術（特許文献１）などが提案されている。また、低分子化合物を用いた例では、便、唾液などの検体中のヘモグロビンの免疫学的測定における妨害物質を、ＳＨ基を有する化学物質により抑制する技術（特許文献７）や、う蝕原因細菌の測定、同定検査時の唾液など口腔内検体をドデシル硫酸ナトリウム等陰イオン界面活性剤で処理する方法（特許文献２）が提案されている。そして、ＨＣＶなどウイルス含有血液由来検体中のウイルス抗原の測定に際し、検体を陰イオン性、両イオン性又は非イオン性界面活性剤含有処理液を用いることで、ウイルス粒子からの抗原抽出の効率化と共に血清中成分の測定阻害が抑制できることが記載されている（特許文献８）。
しかし、いずれも、特定の病原体など限られた対象抗原に対しては一定の効果を上げているものの、唾液など体液成分による広範な抗原抗体反応の阻害に対しての強力な抑制剤を提供するには至っておらず、広くタンパク質抗原、及び当該抗原を含む各種病原体全般に適用できる強力な反応阻害抑制剤の提供が強く望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１４−１４９１８９号公報
【特許文献２】特開２００９−５２９４５号公報
【特許文献３】特開２００２−３５７５９９号公報
【特許文献４】特許第４９６９２４５号公報
【特許文献５】特開２００５−２４１４１５号公報
【特許文献６】特開平９−３０４３８４号公報
【特許文献７】特開２０１０−１１７２４４号公報
【特許文献８】特許第３１７１８２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、体液試料、特に唾液などの生体粘膜由来試料を用いて、特定の病原体のみならず、広く一般的なタンパク質抗原の簡便で正確な免疫測定法を提供するものであり、また、その際に用いる唾液など体液成分による抗原抗体反応阻害に対する抑制剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明では、この問題の解決のため、体液成分のうちでも免疫反応阻害作用の強い唾液に着目し、唾液成分由来の広範なタンパク質抗原に対する強い免疫反応阻害作用を抑制できる物質であれば、広範な病原体、アレルゲンの検出、測定技術に適用できる反応阻害抑制剤となり得るのでは、と考えた。
そこで、大量に分泌されるウシ唾液を多数の個体から集めて各々の免疫反応阻害活性を調べ、最も阻害活性の高い唾液試料を用い、簡便に効果が確認できるイムノクロマトを用いてスクリーニング実験を行うこととした。その際の検出対象抗原としてはカンピロバクター抗原を選択し、市販のカンピロバクター検出キットを用いた。
まず、以前に、唾液など体液試料で特定の病原体などの免疫反応において一定の効果が確認されている各種の界面活性剤を試したが、いずれの界面活性剤の効果も十分ではなかった。次いで、各種カラム樹脂を試したところ、特にスルホン酸基を有する強酸性陽イオン交換樹脂の効果が高かったが、乾燥により性能が劣化するなど、効果が安定しない欠点があった。
次にスルホン酸基を有する強酸性陽イオン交換樹脂の効果安定化を検討するため、樹脂の不純物をイムノクロマト用展開液で洗浄し、口蹄疫抗原検出イムノクロマトを用いて唾液検体に対するコントロールラインの反応性を計測した。同時に、比較のために洗浄後の洗浄液についても同様の計測を行った。その結果、驚くべきことに、洗浄液の方が洗浄後の樹脂の10倍近い強い反応性を示した。すなわち、スルホン酸基を有する強酸性陽イオン交換樹脂において観察された高い免疫阻害抑制効果は、強酸性陽イオン交換樹脂製造過程で生成され不純物として混在していたスルホン酸基を有する低分子化合物であったと解される。【０００７】
そこで、不純物として混在している可能性の高い種々の低分子のスルホン酸塩について、唾液検体に対するコントロールラインの反応性及び口蹄疫ウイルス検出感度を測定してその反応阻害抑制効果を評価したところ、少なくとも１つの炭素数５以上の直鎖アルキル基を有する脂肪族又は芳香族のスルホン酸塩が、各種のタンパク質抗原の免疫測定法において、高い反応阻害抑制効果を示し、偽陽性、偽陰性を防止できることを見いだした。
また、スルホン酸塩と同様に強いイオン性官能基を有する低分子化合物を検索し、各種第四級アンモニウム塩についても同様の反応阻害抑制効果を確認した。
以上のことから、少なくとも１つの直鎖状のＣ５〜Ｃ３０アルキル基を有する脂肪族又は芳香族スルホン酸もしくはその塩、及び第四級アンモニウムイオンもしくはその塩は、免疫測定法における唾液など体液の混入による免疫反応阻害の抑制剤として使用できることがわかった。
以上の知見を得たことで、本発明を完成することができた。【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕  免疫測定法における試料中の体液、特に生体粘膜由来の体液に由来する免疫反応阻害作用を抑制する免疫反応阻害抑制剤であって、以下の（１）及び（２）のいずれかの化合物を含むことを特徴とする免疫反応阻害抑制剤；
（１）「Ｒ１−ＳＯ３Ｈ」で表されるスルホン酸化合物又はその塩
（式中、Ｒ１は、直鎖状のＣ５〜Ｃ３０アルキル基、直鎖状のＣ５〜Ｃ３０アルキル基を少なくとも１つ有する炭素環式芳香族基で置換された直鎖状のＣ１〜Ｃ３０アルキル基、又は直鎖状のＣ５〜Ｃ３０アルキル基を少なくとも１つ有する炭素環式芳香族基を表し、これらの基は置換基を有していてもよい。）、
（２）「Ｎ＋−Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｒ５」で表される第四級アンモニウムイオン又はその塩
（式中、Ｒ２〜Ｒ５は、それぞれ独立して直鎖状のＣ１〜Ｃ３０アルキル基、又は少なくとも１つの直鎖状のＣ５〜Ｃ３０アルキル基により置換されている炭素環式芳香族基を表し、これらの基は置換基を有していてもよい。）。
ここで、本発明の「免疫反応阻害抑制剤」とは、被検試料中に存在する可能性がある標的抗原を検出又は測定するための抗原抗体反応を利用した免疫測定法において、被検試料中に含まれるか又は含まれる可能性がある体液に由来する免疫反応阻害作用を有意に抑制する化合物又は当該化合物を有効成分として含む組成物を指す。
〔２〕  （１）の式中、Ｒ１は、未置換の直鎖状のＣ５〜Ｃ２０のアルキル基であるか、直鎖状のＣ５〜Ｃ２０のアルキル基を有するフェニル基で置換された直鎖状のＣ１〜Ｃ２０アルキル基であるか、又は直鎖状のＣ５〜Ｃ２０のアルキル基で置換されたフェニル基である、前記〔１〕に記載の免疫反応阻害抑制剤。
〔３〕  （２）の式中、Ｒ２〜Ｒ５は、それぞれ独立して、炭素環式芳香族基で置換されていてもよい直鎖状のＣ１〜Ｃ２０アルキル基、又は少なくとも１つの直鎖状のＣ５〜Ｃ２０アルキル基で置換されている炭素環式芳香族基である、前記〔１〕に記載の免疫反応阻害抑制剤。
〔４〕  （２）の式中、Ｒ２〜Ｒ５は、それぞれ独立して、未置換もしくはフェニル基で置換されている直鎖状のＣ１〜Ｃ２０アルキル基、又は直鎖状のＣ５〜Ｃ２０アルキル基で置換されているフェニル基である、前記〔１〕に記載の免疫反応阻害抑制剤。
〔５〕  （２）の式中、Ｒ２〜Ｒ５が下記の（ａ）〜（ｅ）のいずれかの場合である、前記〔４〕に記載の免疫反応阻害抑制剤；
（ａ）Ｒ２〜Ｒ５のいずれか１つが、フェニル基で置換されていてもよい直鎖状のＣ３〜Ｃ２０アルキル基であって、他の３つがメチル基もしくはエチル基である場合、
（ｂ）Ｒ２〜Ｒ５のいずれか１つが、メチル基もしくはエチル基であって、他の３つがフェニル基で置換されていてもよい直鎖状のＣ３〜Ｃ２０アルキル基である場合、
（ｃ）Ｒ２〜Ｒ５のすべてが、フェニル基で置換されていてもよい直鎖状のＣ３〜Ｃ２０アルキル基である場合、
（ｄ）Ｒ２〜Ｒ５のいずれか１つがベンジル基であって、他の３つがフェニル基で置換されていてもよい直鎖状のＣ３〜Ｃ２０アルキル基である場合、又は
（ｅ）Ｒ２〜Ｒ５のいずれか２つがメチル基もしくはエチル基であって、他の２つがフェニル基で置換されていてもよい直鎖状のＣ６〜Ｃ２０アルキル基である場合。
〔６〕  （２）の式中、Ｒ２〜Ｒ５が下記の（ａ）〜（ｅ）のいずれかの場合である、前記〔５〕に記載の免疫反応阻害抑制剤；
（ａ）Ｒ２〜Ｒ５のいずれか１つが直鎖のＣ３〜Ｃ１６アルキル基であって、他の３つがメチル基である場合、
（ｂ）Ｒ２〜Ｒ５のいずれか１つがメチル基であって、他の３つが直鎖のＣ３〜Ｃ１２アルキル基である場合、
（ｃ）Ｒ２〜Ｒ５のすべてが直鎖のＣ３〜Ｃ１２アルキル基である場合、
（ｄ）Ｒ２〜Ｒ５のいずれか１つがベンジル基であって、他の３つが直鎖のＣ３〜Ｃ１２アルキル基である場合、又は
（ｅ）Ｒ２〜Ｒ５のいずれか２つがメチル基であって、他の２つが直鎖のＣ３〜Ｃ１２アルキル基である場合。
〔７〕  （２）がアンモニウムイオンの塩であって、ハロゲン化水素、硝酸、ヘキサフルオロリン酸、三フッ化二水素、及び過塩素酸なる群から選択された化合物との塩である、前記〔１〕、〔３〕〜〔６〕のいずれかに記載の免疫反応阻害抑制剤。
〔８〕  前記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の免疫反応阻害抑制剤を使用することを特徴とする、免疫測定方法。
より具体的には、標的抗原特異的抗体を用いて被検試料中に存在するか又は存在する可能性がある標的抗原を検出又は測定する方法であって、
（ａ）前記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の免疫反応阻害抑制剤を添加する工程、及び（ｂ）被検試料と標的抗原特異的抗体とを接触させる工程
を含み、
ここで前記工程（ａ）は前記工程（ｂ）と同時、またはそれに先だって行われるものであり、前記工程（ａ）が前記工程（ｂ）に先だって行われる場合は、前記添加する工程は、被検試料希釈液、抗体希釈液、ブロッキング液、及び反応バッファー溶液からなる群から選択される少なくとも１つに対して行われるものである、方法ということができる。
〔９〕  被験体由来の体液、特に生体粘膜由来の体液を含有する試料中の被検物質を測定するＥＬＩＳＡ、イムノクロマト法、ウエスタンブロット法、イムノブロット法、免疫沈降法、及びラテックス凝集法から選択されたいずれかの免疫測定法において、前記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の免疫反応阻害抑制剤を使用することを含む、偽陽性及び／又は偽陰性が抑制された免疫測定方法。
より具体的には、下記の〔９ａ〕、〔９ｂ〕又は〔９ｃ〕の方法ということができる。
〔９ａ〕  イムノクロマト法を用いた標的抗原の検出又は測定方法であって、
（ａ）前記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の免疫反応阻害抑制剤を添加する工程、及び（ｂ）メンブレン上で被検試料と標的抗原検出用抗体とを接触させる工程、
を含み、
ここで前記工程（ａ）は前記工程（ｂ）と同時、またはそれに先だって行われるものであり、前記工程（ａ）が前記工程（ｂ）に先だって行われる場合は、前記添加する工程は、被検試料希釈液、イムノクロマト展開液、抗体希釈液、ブロッキング液、イムノクロマト用メンブレンの前処理液、コンジュゲートパッド固定用溶液、及びサンプルパッド固定用溶液からなる群から選択される少なくとも１つに対して行われるものである、方法。
〔９ｂ〕  ＥＬＩＳＡを用いた標的抗原の検出又は測定方法であって、
（ａ）前記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の免疫反応阻害抑制剤を添加する工程、及び（ｂ）被検試料と標的抗原検出用抗体とを接触させる工程、
を含み、
ここで前記工程（ａ）は前記工程（ｂ）と同時、または異時に行われるものであり、前記工程（ａ）が前記工程（ｂ）と異時に行われる場合は、前記添加する工程は、被検試料希釈液、ブロッキング液、一次抗体希釈液、二次抗体希釈液、及び洗浄用緩衝液からなる群から選択される少なくとも１つに対して行われるものである、方法。
〔９ｃ〕  ウエスタンブロット法、イムノブロット法、免疫沈降法、及びラテックス凝集法から選択されたいずれかの方法を用いた標的抗原の検出又は測定方法であって、
（ａ）前記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の免疫反応阻害抑制剤を添加する工程、及び（ｂ）被検試料と標的抗原検出用抗体とを接触させる工程、
を含み、
ここで前記工程（ａ）は前記工程（ｂ）と同時、またはそれに先だって行われるものであり、前記工程（ａ）が前記工程（ｂ）に先だって行われる場合は、前記添加する工程は、被検試料希釈液、ブロッキング液、抗体希釈液、及び反応バッファーからなる群から選択される少なくとも１つに対して行われるものである、方法。
〔１０〕  被験体由来の体液を含有する試料が、唾液、喀痰、喉拭い液、鼻拭い液、鼻腔吸引液、及び角結膜拭い液から選択された生体粘膜由来の体液を少なくとも１種含有する、前記〔９〕に記載の方法。
〔１１〕  被検物質が、病原体、病原微生物、ホルモン、炎症関連物質、プロスタグランジン、及びメタボリックシンドローム関連物質からなる群から選択された物質である、前記〔８〕〜〔１０〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕  前記病原体又は病原微生物が、口蹄疫ウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、コロナウイルス、狂犬病ウイルス、百日咳菌、溶血性連鎖球菌、大腸菌、食中毒細菌、クラミジア・トラコマテス及びマイコプラズマから選択された病原体又は病原微生物である、前記〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕  前記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の免疫反応阻害抑制剤を含むことを特徴とする免疫測定用キット。
〔１４〕  免疫測定用キットが、ＥＬＩＳＡ、イムノクロマト法、ウエスタンブロット法、イムノブロット法、免疫沈降法、及びラテックス凝集法から選択されたいずれかの免疫測定法のためのキットである、前記〔１３〕に記載のキット。
〔１５〕  被験体が病原性疾患に罹患しているか否かを、被験体由来の体液、特に生体粘膜由来の体液を用いて免疫反応により診断するためのキットであって、
被検体液試料の希釈剤、展開液、ブロッキング液の少なくとも１つに前記〔１〕〜〔７〕のいずれか項に記載の免疫反応阻害抑制剤が添加されていることを特徴とする、キット。
〔１６〕  病原性疾患が、口蹄疫ウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、コロナウイルス、狂犬病ウイルス、百日咳菌、溶血性連鎖球菌、大腸菌、食中毒細菌、クラミジア・トラコマテス及びマイコプラズマから選択された病原体又は病原性微生物により引き起こされる疾患であることを特徴とする、前記〔１５〕に記載のキット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の免疫反応阻害抑制剤を、各種免疫測定方法において前処理液又は展開液に用いることにより、唾液などの体液試料又は唾液などが混入する可能性のある被検試料に対しても、抗原抗体反応の低下を効率的に抑制できる。従来、唾液などの体液の影響を除くために前処理等が必要であったが、本発明により前処理等がなく唾液などの体液が混入する可能性がある検体を測定することができるようになったため、医療や畜産の現場での迅速で的確な対応が可能となり、検査品質の向上、生産性の向上に貢献することが期待される。
特に、ウシ、ブタなどの家畜の疾病診断において口蹄疫、インフルエンザウイルスなどの重要疾病の診断を、唾液や鼻喉拭い液などの免疫反応阻害活性の強い被検試料であっても迅速かつ簡便なイムノクロマトキットを用いて、正確に診断を行うことが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】イムノクロマトに対するウシ唾液での阻害活性の検証。カンピロバクター検出イムノクロマトであるＮＨイムノクロマトカンピロバクターにおいてカンピロバクター陽性検体を試験した際のテストラインへの影響（抗カンピロバクター抗体でカンピロバクター菌検出の際の反応阻害）とコントロールラインへの影響（抗ＩｇＧ抗体で抗口蹄疫抗体を検出する際の反応阻害）
【図２】カンピロバクター検出用イムノクロマト（ＮＨイムノクロマトカンピロバクター）においてウシ唾液検体を希釈することにより反応性の回復可能性の検証。
【図３】口蹄疫抗原検出用イムノクロマトを用いた直鎖アルキルスルホン酸塩の免疫反応阻害の抑制効果の検証。直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを０．３（ｗ／ｖ）％添加したウシ唾液４９検体での口蹄疫ウイルス検出試験結果。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．本発明の免疫反応阻害抑制剤
（１−１）本発明の免疫反応阻害抑制剤として用いられる化合物
本発明で「免疫反応阻害抑制剤」というとき、被検試料中に存在する可能性がある標的抗原を検出又は測定するための抗原抗体反応を利用した免疫測定法において、被検試料中に含まれる（又は含まれる可能性がある）体液、特に生体粘膜由来の体液に由来する免疫反応阻害作用を抑制する化合物又は当該化合物を有効成分として含む組成物を指す。
本発明の免疫反応阻害抑制剤の１つは、分子中に置換されていてもよいＣ５以上の直鎖アルキル基を有する脂肪族又は芳香族スルホン酸又はそれらの塩である。
他の１つは分子中に置換されていてもよいＣ３以上の直鎖アルキル基を有する第四級アンモニウムイオンもしくはその塩であって、いずれも分子内に大きな電荷の偏りがある低分子化合物であることを特徴としている。
【００１２】
（１−２）直鎖アルキル基含有スルホン酸化合物又はその塩
本発明の免疫反応阻害抑制剤のうち、直鎖アルキル基含有スルホン酸化合物は、分子中に置換されていてもよいＣ５〜Ｃ３０直鎖状アルキル基を少なくとも１つ有しており、下記（式１）で表されるスルホン酸化合物もしくはその塩である。
（式１）
「Ｒ１−ＳＯ３Ｈ」
（式中、Ｒ１は、直鎖状のＣ５〜Ｃ３０アルキル基、直鎖状のＣ５〜Ｃ３０アルキル基を少なくとも１つ有する炭素環式芳香族基で置換された直鎖状のＣ１〜Ｃ３０アルキル基、又は直鎖状のＣ５〜Ｃ３０アルキル基を少なくとも１つ有する炭素環式芳香族基を表し、これらの基は置換基を有していてもよい。）
【００１３】
すなわち、
（ａ）置換されていてもよい直鎖状のＣ５〜Ｃ３０、好ましくはＣ７〜Ｃ２０、より好ましくはＣ８〜Ｃ１５、特に好ましくはＣ１０〜Ｃ１２アルキルスルホン酸又はその塩、
（ｂ）置換されていてもよい直鎖状のＣ５〜Ｃ３０、好ましくはＣ７〜Ｃ２０、より好ましくはＣ８〜Ｃ１５、特に好ましくはＣ１０〜Ｃ１２アルキル基を有する炭素環式芳香族（アリール）スルホン酸又はその塩、
（ｃ）置換されていてもよい直鎖状のＣ５〜Ｃ３０、好ましくはＣ７〜Ｃ２０、より好ましくはＣ８〜Ｃ１５、特に好ましくはＣ１０〜Ｃ１２アルキル基を有する炭素環式芳香族（アリール）基を有する直鎖状のＣ１〜Ｃ３０、好ましくはＣ１〜Ｃ２０、より好ましくはＣ１〜Ｃ１５、特に好ましくはＣ１〜Ｃ１２アルキルスルホン酸又はその塩である。
直鎖状のＣ５〜Ｃ３０アルキル基としては、炭素数が大きいほど反応阻害抑制効果が高い傾向が見られるが、製造のしやすさ、測定用試料への溶解のしやすさから炭素数の長さが制限される。
炭素環式芳香族基（アリール基）としては、フェニル基又はナフチル基が好ましく、フェニル基が特に好ましい。
【００１４】
これらの直鎖アルキル基含有スルホン酸化合物は、直鎖アルキル基以外の置換基を有していてよく、例えば、ハロゲン分子、ヒドロキシ基、アルケニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルコキシル基、アシル基、アセチル基、ホルミル基、カルボニル基、カルボキシル基、アミノ基、イミノ基、シアノ基、アゾ基、ニトロ基、チオール基、ケトン基、などアルキル基を置換し得る官能基であればどのような置換基でもよいが、直鎖アルキル基含有スルホン酸化合物全体の分子内の電荷の偏りを損なわない官能基が好ましい。具体的には正の電荷を有するか、又は電荷を有さない官能基が好ましい。
【００１５】
これらの直鎖アルキル基含有スルホン酸化合物の代表的な例として、１-ペンタンスルホン酸、１-ヘキサンスルホン酸、１-へプタンスルホン酸、１-オクタンスルホン酸、１-ノナンスルホン酸、１-デカンスルホン酸、１-ウンデカンスルホン酸及び１-ドデシルスルホン酸などの直鎖アルキルスルホン酸；並びに１-ドデシルベンゼンスルホン酸、ｐ-オクチルベンゼンスルホン酸、及びｐ-トルエンスルホン酸などの直鎖アルキルベンゼンスルホン酸；が例示できるが、これら化合物には限定されない。
【００１６】
また、直鎖アルキル基含有スルホン酸の塩としては、スルホ基（スルホン酸基）をアルカリ金属化合物、アルカリ土類化合物、アンモニアなどの塩基化合物で中和した塩を指す。好ましくは、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩などがあり、特にナトリウム塩が好ましい。
【００１７】
（２）第四級アンモニウムイオン又はその塩
本発明の免疫反応阻害抑制剤のうち、第四級アンモニウムイオン又はその塩は、分子中に置換されていてもよい直鎖アルキル基又は置換されていてもよいアリール基のいずれか１つの基を少なくとも１つ有している、下記（式２）で表される常に正電荷を有する第四級アンモニウムカチオン、又はハロゲンなどアニオンとの塩である第四級アンモニウム塩である。
（式２）
「Ｎ＋−Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｒ５」で表される第四級アンモニウムイオン又はその塩
（式中、Ｒ２〜Ｒ５は、それぞれ独立して直鎖状のＣ１〜Ｃ３０アルキル基、又は少なくとも１つの直鎖状のＣ５〜Ｃ３０アルキル基により置換されている炭素環式芳香族基を表し、これらの基は置換基を有していてもよい。）。
【００１８】
ここで、独立したＲ２〜Ｒ５のうち少なくとも１つの基は、
（i）直鎖状のＣ３〜Ｃ３０、好ましくはＣ３〜Ｃ２０、より好ましくはＣ５〜Ｃ１５の直鎖アルキル基であるか、又は
（ii）直鎖状のＣ３〜Ｃ３０、好ましくはＣ３〜Ｃ２０、より好ましくはＣ５〜Ｃ１５のアルキル基で置換された炭素環式芳香族基（アリール基）を置換基として有しているＣ１〜Ｃ３０、好ましくはＣ３〜Ｃ２０、より好ましくはＣ５〜Ｃ１５の直鎖アルキル基であることが好ましい。
また、炭素環式芳香族基（アリール基）としては、フェニル基又はナフチル基が好ましく、フェニル基が特に好ましい。
【００１９】
本発明の望ましい態様では、Ｒ２〜Ｒ５が下記の（ａ）〜（ｅ）のいずれかの場合として表記することができる。
（ａ）Ｒ２〜Ｒ５のいずれか１つが、フェニル基で置換されていてもよい直鎖状のＣ３〜Ｃ２０、好ましくはＣ３〜Ｃ１６アルキル基であって、他の３つがメチル基もしくはエチル基、好ましくはメチル基である場合、
（ｂ）Ｒ２〜Ｒ５のいずれか１つが、メチル基もしくはエチル基、好ましくはメチル基であって、他の３つがフェニル基で置換されていてもよい直鎖状のＣ３〜Ｃ２０、好ましくはＣ３〜Ｃ１２アルキル基である場合、
（ｃ）Ｒ２〜Ｒ５のすべてが、フェニル基で置換されていてもよい直鎖状のＣ３〜Ｃ２０アルキル基、好ましくは未置換の直鎖のＣ３〜Ｃ１２アルキル基である場合、
（ｄ）Ｒ２〜Ｒ５のいずれか１つがベンジル基であって、他の３つがフェニル基で置換されていてもよい直鎖状のＣ３〜Ｃ２０アルキル基、好ましくは未置換の直鎖のＣ３〜Ｃ１２アルキル基である場合、又は
（ｅ）Ｒ２〜Ｒ５のいずれか２つがメチル基もしくはエチル基、好ましくはメチル基であって、他の２つがフェニル基で置換されていてもよい直鎖状のＣ６〜Ｃ２０アルキル基、好ましくは未置換の直鎖のＣ３〜Ｃ１２アルキル基である場合。
【００２０】
本発明の免疫反応阻害抑制剤として用いられる第四級アンモニウムイオン又はその塩は、直鎖アルキル基以外の置換基を有していてよく、例えば、ハロゲン分子、ヒドロキシ基、アルケニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルコキシル基、アシル基、アセチル基、ホルミル基、カルボニル基、カルボキシル基、アミノ基、イミノ基、シアノ基、アゾ基、ニトロ基、チオール基、ケトン基、などアルキル基を置換し得る官能基であればどのような置換基でもよいが、第四級アンモニウムイオン全体の分子内の電荷の偏りを損なわない官能基が好ましい。具体的には負の電荷を有するか、又は電荷を有さない官能基が好ましい。
【００２１】
これらの第四級アンモニウムイオンの代表的な例として、ｎ−オクチルトリメチルアンモニウム、ラウリルトリメチルアンモニウム、ミリスチルトリメチルアンモニウム、ステアリルトリメチルアンモニウム、ドデシルトリメチルアンモニウム；メチルトリオクチルアンモニウム、メチルトリブチルアンモニウム；テトラブチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム；及びベンジルトリブチルアンモニウム；を例示することができるが、これらアンモニウムイオンには限定されない。
【００２２】
本発明の免疫反応阻害抑制剤として用いられる第四級アンモニウムイオンは、常に正電荷を有し反応性が高いため、安定なアンモニウム塩として用いることが好ましい。安定なアンモニウム塩を形成するアニオンは、ハロゲン、硝酸、ヘキサフルオロリン酸、三フッ化二水素、もしくは過塩素酸などであり、好ましくはＣｌ，Ｂｒ，又はＩ等のハロゲン化物である。
【００２３】
２．本発明の免疫測定法における検出、測定対象
（２−１）検出、測定対象
本発明における検出物質は、イムノアッセイなど抗原抗体反応を利用した免疫測定法で測定し得る抗原又は抗体である。抗原としては抗体を作製し得るものなら如何なる抗原でもよいが、タンパク質、糖タンパク質又はペプチドが好ましく、これらの物質を含む原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア、ウイルス等も検出し得る。特に、口蹄疫ウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、コロナウイルス、狂犬病ウイルス、百日咳菌、溶血性連鎖球菌、又はカンピロバクター、サルモネラ、病原性大腸菌等の食中毒細菌のような病原性のウイルスや細菌を迅速かつ正確に検出又は定量する際に適用することが好ましい。
さらに、唾液試料からのプロスタグランジンなどのエイコサノイド、コルチゾール等ストレスホルモン、テストステロン、エストラジオールなどの性ホルモン、メラトニン、インシュリンなどの各種ホルモン、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β等炎症関連物質、α−アミラーゼなど消化酵素、アディポネクチンなどのメタボリックシンドローム関連物質のＥＬＩＳＡ，イムノアッセイ（ＥＩＡ）などによる検出、測定（高知県大学紀要  看護学部編第64巻、第73〜83頁、2014）の際にも有用である。
また、飲食品、飼料などの品質管理において、保存時にヒトや動物の体液が混入するおそれがある場合、飲食品、飼料中のアレルゲンタンパク質抗原の検出又は定量にも適用することができる。
【００２４】
前記抗原を検出するための抗体は、測定対象とする抗原と特異的に反応して結合する抗体であれば、モノクローナル抗体でなくても、ポリクローナル抗体、抗血清を用いることもできる。
【００２５】
（２−２）被検試料
本発明の免疫測定法に付される被検試料は、標的抗原もしくは標的抗体を有しているか、又は有している可能性がある試料であり、特に限定されないが、妨害物質の影響を抑制するという本発明の効果を大いに発揮できる生体試料、特に唾液などの生体粘膜由来試料が好ましく、典型的には、ヒトや動物（ブタ、ウシ、鶏、ヤギ、ヒツジ などの家畜、イヌ、ネコなどの愛玩動物など）から採取する生体粘膜由来の体液、例えば、唾液、口腔拭い液、喀痰、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、及び角結膜拭い液などから選択される検体又はその希釈液などが挙げられる。その他、これら体液が混入するおそれのある飲食品、飼料なども被検試料となり得る。特に、唾液試料は、最も非侵襲的な採取方法であるため好ましい。
【００２６】
３．本発明の免疫測定法及び本発明の免疫反応阻害抑制剤の使用方法
（３−１）本発明抗原抗体反応を用いた検出系、測定系
本発明の免疫反応阻害抑制剤は、抗原抗体反応を用いた検出系、測定系であれば全て適用できる。具体的には、イムノクロマト、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、イムノブロット、免疫沈降、ラテックス凝集法などに適用すると、偽陰性及び偽陽性が抑えられ好ましい。とりわけ、唾液など粘膜由来物質の影響を受けやすいイムノクロマト法に適用すると効果が高い。
以下、各免疫測定法について本発明の典型的な使用方法を例示して簡単に説明するが、本発明の使用方法はこれらの方法には限定されない。
【００２７】
（ａ）イムノクロマト法における使用方法
イムノクロマト法においては、ニトロセルロース膜等の適当なメンブレン上にあらかじめ被検試料中の標的抗原特異的な抗体（キャプチャー抗体）を固定化しておき、検体滴下部に準備した金属コロイドなどで標識した抗体と、検体中の抗原と形成した免疫複合体を、該メンブレンの毛細管現象を利用して移動展開させる。キャプチャー抗体上に免疫複合体がトラップされた場合の標識量（テストライン）を目視で定性判定できる。読み取り装置としてイムノクロマトリーダー（以下、ＩＣリーダーともいう。）を用いれば、反応性を数値化することもできる。固定化したキャプチャー抗体の下流には金属コロイドで標識した抗体を認識する抗ＩｇＧ抗体等が固定化されており、余剰の金属コロイド標識抗体が結合する位置がコントロールラインとして目視あるいはイムノクロマトリーダーで確認される。
【００２８】
イムノクロマト法では、被検試料を緩衝液などで希釈して用いるが、本発明の免疫反応阻害抑制剤をあらかじめ希釈液中に添加しておくか、又は被検試料と同時に希釈液中に添加することができる。
その際、希釈液として、一般的なイムノクロマト法の展開液として用いられているトリス緩衝液やリン酸緩衝液等（必要に応じて界面活性剤やアルブミン等のタンパク質を添加してもよい）を用いれば、そのままイムノクロマト法の展開液として使用できる。
また、金属コロイド標識抗体、ラテックス粒子標識抗体などの希釈液中に添加しておくこともできる。ラテックス粒子のブロッキングに用いてもよい。
さらに、イムノクロマト法で用いるニトロセルロース膜等のメンブレンをブロッキングするためのメンブレン前処理液や、コンジュゲートパッド、サンプルパッドへの固定のための溶液中にも用いることができる。
すなわち、本発明の免疫測定法のうちイムノクロマト法を用いた標的抗原の検出又は測定方法は、
（ａ）本発明の免疫反応阻害抑制剤を添加する工程、及び
（ｂ）メンブレン上で被検試料と標的抗原検出用抗体とを接触させる工程、
を含み、
ここで前記工程（ａ）は前記工程（ｂ）と同時、またはそれに先だって行われるものであり、前記工程（ａ）が前記工程（ｂ）に先だって行われる場合は、前記添加する工程は、被検試料希釈液、イムノクロマト展開液、抗体希釈液、ブロッキング液、イムノクロマト用メンブレンの前処理液、コンジュゲートパッド固定用溶液、及びサンプルパッド固定用溶液からなる群から選択される少なくとも１つに対して行われるものである、方法ということができる。
【００２９】
イムノクロマト法などの免疫測定法において、希釈液、前処理液など中に添加する本発明の免疫反応阻害抑制剤の最適な濃度範囲は、免疫反応阻害抑制剤の種類によっても、被検対象生物の種類、年齢、混入する体液の種類、検出対象となる標的抗原の種類などによっても異なるが、一般的に０．０１〜１０（ｗ／ｖ）％であり、好ましくは０．０２〜５．０（ｗ／ｖ）％、さらに好ましくは０．０５〜３．０（ｗ／ｖ）％、特に好ましくは０．１〜１．０（ｗ／ｖ）％である。
【００３０】
（ｂ）ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡは、直接吸着法であれば、被検試料溶液をマイクロプレート、ガラスビーズなど固相に吸着させ、抗原抗体反応及び酵素反応に関与しないタンパク質（スキムミルク、アルブミンなど）で固相をブロッキングした後、標的抗原特異的抗体を反応させて、抗原抗体反応を起こさせ、余分な抗体を洗い流す。（抗体が標識されていない場合は、酵素標識二次抗体を反応させて二次抗体の洗浄工程が付加される。）次いで標識した酵素の基質を加えて酵素反応生成物を検出する。
サンドイッチ法であれば、標的抗原に特異的な捕獲抗体を固相に吸着させ、ブロッキング工程後、被検試料溶液及び捕獲抗体とは別のエピトープを認識する抗原特異的抗体（一次抗体）を反応させ、一次抗体が標識されていない場合はさらに標識二次抗体を反応させる。
【００３１】
直接吸着法であってもサンドイッチ法であっても、ＥＬＩＳＡにおける被検試料希釈液、ブロッキング用のスキムミルクなど溶解液、及び／又は標的抗原特異的抗体、二次抗体等の抗体用希釈液中に添加して使用することができる。
すなわち、本発明の免疫測定法のうちＥＬＩＳＡを用いた標的抗原の検出又は測定方法は、
（ａ）本発明の免疫反応阻害抑制剤を添加する工程、及び
（ｂ）被検試料と標的抗原検出用抗体とを接触させる工程
を含み、
ここで前記工程（ａ）は前記工程（ｂ）と同時、または異時に行われるものであり、前記工程（ａ）が前記工程（ｂ）と異時に行われる場合は、前記添加する工程は、被検試料希釈液、ブロッキング液、一次抗体希釈液、二次抗体希釈液、及び洗浄用緩衝液からなる群から選択される少なくとも１つに対して行われるものである、方法ということができる。
【００３２】
（ｃ）その他の免疫測定法での使用方法
他に、本発明の免疫反応阻害抑制剤が好ましく用いられる免疫測定法に免疫凝集法がある。免疫凝集法は、抗原抗体反応により生じる、反応液の濁度や吸光度のような光学的性質の変化に基づいて、被検試料中の抗原又は抗体を検出又は定量する方法であり、免疫比濁法及びラテックス粒子を用いるラテックス凝集法も包含される。標識した抗血清を含む反応液、又は標的抗原に特異的な抗体をコーティングしたラテックス粒子を懸濁した反応液中に被検試料を添加し、免疫複合体の形成により抗血清又はラテックス粒子が凝集することで、濁度や吸光度が変化するのを観察、測定する。
その際の被検試料希釈液等に添加する他、ラテックス粒子のブロッキング用溶液や反応液中にも用いることができる。
その他、ウエスタンブロット法では、被検試料希釈液の他、抗体希釈液、ブロッキング液に添加でき、免疫沈降法でも、被検試料希釈液の他、抗体希釈液、反応バッファー溶液中に添加する。
すなわち、他の免疫測定法においても、被検試料希釈液、抗体希釈液、ブロッキング液及び反応バッファー溶液を調製する工程の少なくともいずれか１つの工程、及び／又は被検試料と標的抗原特異的抗体とを反応させる工程で、本発明の免疫反応阻害抑制剤を添加する工程を含むことを特徴とする。
より具体的には、
ウエスタンブロット法、イムノブロット法、免疫沈降法、及びラテックス凝集法から選択されたいずれかの方法を用いた標的抗原の検出又は測定方法であって、
（ａ）本発明の免疫反応阻害抑制剤を添加する工程、及び
（ｂ）被検試料と標的抗原検出用抗体とを接触させる工程
を含み、
ここで前記工程（ａ）は前記工程（ｂ）と同時、またはそれに先だって行われるものであり、前記工程（ａ）が前記工程（ｂ）に先だって行われる場合は、前記添加する工程は、被検試料希釈液、ブロッキング液、抗体希釈液、及び反応バッファーからなる群から選択される少なくとも１つに対して行われるものである、方法ということができる。
【００３３】
（３−２）免疫測定用キット
本発明の免疫反応阻害抑制剤は、通常の各種免疫測定法用のキットと組み合わせて、本発明の免疫反応阻害抑制剤キットとすることが可能である。また、これら各種免疫測定法用キットにおいて用いる希釈用緩衝液、展開液、反応液、ブロッキング液などの少なくとも１つの溶液中に、あらかじめ本発明の免疫反応阻害抑制剤を所定の濃度に溶解して容器詰めしたものを、キットに含めることでより利便性を高めることができる。
【実施例】
【００３４】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した先行技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。【００３５】
（実施例１）唾液による免疫反応阻害
（１−１）唾液によるカンピロバクター抗原の検出阻害
本実施例では、カンピロバクター検出イムノクロマトにおける抗原抗体反応阻害を見るために、ウシ唾液を展開液で希釈した検体に対してカンピロバクター（Campylobacter jejuni; ATCC29428）死菌液を８×１０６ｃｆｕ／ｍＬとなるように添加して攪拌した検体を、カンピロバクター検出イムノクロマト（ＮＨイムノクロマトカンピロバクター（日本ハム（株）製））に滴下し、テストラインおよびコントロールラインをイムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス製  C10066）により測定した（図１）。テストラインは抗カンピロバクター抗体が、コントロールラインは抗マウスIgG抗体がそれぞれ塗布してあり、それぞれカンピロバクター菌体、抗カンピロバクター抗体に反応する。
【００３６】
その結果、検討したウシ唾液のうち由来する個体ごとに各検体の阻害度合いは異なるものの、ウシ唾液を検体とした場合コントロールのＰＢＳを検体とした場合と比較して反応が下がることが確認された。さらに、全く異なる組合せの抗原抗体反応に対しても発揮する阻害度合いはほとんど変わらないことが観察された。
したがって、本検体にて強い阻害作用を示した唾液を、阻害活性抑制物質検索のための検討試料として選択した。【００３７】
（１−２）カンピロバクター抗原に対するウシ・ブタ唾液による阻害状況
この実施例では、（１−１）と同様のカンピロバクター抗原タンパクの免疫測定に対する唾液による阻害状況が、ウシ唾液のみならず、ブタの唾液でもあることを確認する。
具体的には、ウシ・ブタ唾液をＰＢＳで１０倍希釈して、ＮＨイムノクロマトカンピロバクター（日本ハム（株）社製）に供試した。ウシ唾液では、２０検体中、コントロールラインが阻害された偽陰性検体が２例、偽陽性が１例であったのに対し、ブタ唾液では、５４検体中偽陰性は０例であったが、偽陽性となる唾液検体が１２例も存在した（表１）。
なお、口腔内に高濃度でカンピロバクターが存在する可能性は低いため、テストラインで高い測定値を示した場合は偽陽性とカウントした。また、コントロールラインが阻害された唾液についてはテストラインも偽陰性となる可能性が高いと考えた。
結果の詳細の一部を（表２）として示す。【００３８】
【表１】
0006601932.tif 000002
【００３９】
【表２】
0006601932.tif 000003
【００４０】
（１−３）各種イムノクロマトに対する唾液による反応阻害
本実施例では、実施例（１−１）で得られた最も阻害活性が高い唾液試料（Ｇ）を用い、検出対象の抗原タンパク質が異なる各種イムノクロマトに対する唾液成分の混入による免疫反応阻害の程度を観察した。
具体的には、異なる抗原タンパク質検出用イムノクロマトのモデルとして、食品のアレルゲンタンパク質である卵、牛乳、小麦タンパク質、また病原菌の検出モデルとして腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、病原ウイルスの検出モデルとして口蹄疫ウイルスを選択し、それぞれ「ＦＡＳＴＫＩＴスリム卵」、「ＦＡＳＴＫＩＴスリム小麦」（日本ハム（株）製）、並びに「ＮＨイムノクロマトＯ１５７」（日本ハム（株）製）、「口蹄疫抗原検出イムノクロマト」（開発品）を用いて実験を行った。
食品のアレルゲンタンパク質の検出実験には、唾液試料（Ｇ）を１０倍希釈した希釈唾液試料を作製し、これに対して、アレルゲンタンパク質の卵タンパク質、及び小麦タンパク質をそれぞれ約２５ｎｇ／ｍＬとなるよう混和した試料１００  μＬをイムノクロマトに供試した。
一方、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７検出実験には、唾液試料（Ｇ）を１０倍希釈した希釈唾液試料を作製し、「Ｏ１５７」（野外株）（１×１０６ｃｆｕ／ｍＬ）を希釈唾液試料で２６倍希釈した試料１００μＬをイムノクロマトに供試した。口蹄疫ウイルス検出試験には、実施例（１−１）とは別の検討で得られた阻害活性の高い唾液試料（Ｒ）を使用した。唾液試料（Ｒ）を１０倍希釈した希釈唾液試料を作製し、これに対して口蹄疫ウイルス（O/JPN/2010株）を１０４．７５ＴＣＩＤ５０／ｍＬとなるように混和した試料６０μＬをイムノクロマトに供試した。
さらに各試験においてウシ唾液の代わりにＰＢＳを添加した対照試験を設け、ウシ唾液を添加した試験との反応性の違いを比較した。【００４１】
その結果、特に卵、小麦、口蹄疫の検出用イムノクロマトでは、唾液によりほぼ１００％近い反応性の低下が観察された。また、「Ｏ１５７」の検出用イムノクロマトでは、約４０％近い反応性の低下となった。このことから実施例（１−１）で検討したウシ唾液はＩｇＧ、細菌、アレルゲンタンパク、ウイルス等幅広い抗原に対して反応阻害を示すことが分かった（表３）。【００４２】
【表３】
0006601932.tif 000004
【００４３】
（１−４）唾液成分による反応阻害への希釈による影響
ヒトの診断キット等では検体への唾液の混入による反応阻害を回避するために検体を希釈することが推奨されている例がある。
そこで実施例（１−３）で用いたものと同じ唾液試料を用い、カンピロバクター検出イムノクロマト（ＮＨイムノクロマトカンピロバクター）でのテストライン及びコントロールラインの消失が、希釈により回復するか否か、また何倍希釈で回復するかを検討するために、希釈率を変えて複数回行った。
その結果、テストライン、コントロールラインとも５倍希釈で若干回復したものの、５０倍まで希釈しても反応は完全には回復しなかった。テストラインについては、５０倍希釈によっても５６％程度しか回復しなかった（図２）。【００４４】
（実施例２）免疫反応阻害抑制剤のスクリーニング
（２−１）界面活性剤からのスクリーニング
まず、免疫反応阻害抑制剤の候補として、従来、唾液など体液中の免疫反応阻害物質の抑制に効果があるとされた各種の界面活性剤を試した。
界面活性剤として、特許文献１で唾液中のムチンの可溶化効果が確認された各種非イオン性界面活性剤及び両性界面活性剤を用いて、陰性試験及び陽性試験を行った。
陰性試験及び陽性試験は、実施例（１−２）等と同様、唾液試料（Ｇ）を用い、実施例（１−１）と同様の条件でＮＨイムノクロマトカンピロバクター及びカンピロバクター希釈液を用いて行った。【００４５】
その結果、ほとんどの界面活性剤で十分な効果が確認できなかった（data not shown）。比較的効果の高かったものを下記（表４）として示す。
陰イオン界面活性剤のタウロコール酸ナトリウム水和物（濃度２％）の場合、コントロールラインは回復したが、テストラインが回復しなかった。同じく陰イオン界面活性剤である、デオキシコール酸（濃度１〜５％）、及びラウロイルサルコシン（濃度１〜５％）の場合も同様に、コントロールラインは回復したが、テストラインの回復が十分でなかった（表４）。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の場合は、テストラインもわずかに回復したが、検体に添加しているカンピロバクター菌体量から考えればライン強度は十分でなく反応は回復していないと判断した。
結局、コントロールラインと共にテストラインも回復し、かつ偽陽性反応も示さない十分な界面活性剤を見出すことはできなかった。【００４６】
【表４】
0006601932.tif 000005
【００４７】
（２−２）カラム樹脂からのスクリーニング
次いで、特許文献２で咽頭由来検体の前処理に用いてインフルエンザウイルス検出に効果のあったスルホン酸基又はカルボキシル基を有する陽イオン交換樹脂など各種カラム樹脂からのスクリーニングを行った。
６種の強酸性陽イオン交換樹脂、２種の弱酸性陽イオン交換樹脂、８種の強塩基性陰イオン交換樹脂、４種の弱塩基性陰イオン交換樹脂の他、２種のキレート樹脂及び４種の合成吸着剤のカラム、あわせて２６種類について、それぞれの回復率を測定した。その際、陽性コントロールとしては、ＰＢＳに懸濁したカンピロバクター菌液の反応性を１００％とし、その回復率を測定した。
詳細には、ウシ唾液２．３６ｍＬに１％ＢＳＡ含有ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）２１．２４ｍＬを加えた唾液希釈液にカンピロバクター死菌７５０μＬを加えた試料を用意し、上記の各樹脂を約０．５ｍＬずつ充填したカラムに対して試験用試料５００μＬを通液した。
得られた各カラム通過液を、カンピロバクター検出イムノクロマト（ＮＨイムノクロマトカンピロバクター（日本ハム（株）社製）に供して、テストライン及びコントロールラインでの反応性を測定した（表５）。
その際、阻害除去の陽性コントロールとしてＰＢＳ ２３．６ｍＬに上記カンピロバクター死菌７５０μＬを懸濁した液をＮＨイムノクロマトカンピロバクターに供した際の反応性を１００％とし、その他のカラムを通液させたときのテストラインの値から回復率を算出した。【００４８】
【表５】
0006601932.tif 000006
【００４９】
これらのカラムによる一回目の結果（表５）では、強酸性陽イオン交換樹脂及び強塩基性陰イオン交換樹脂の中に、回復効果の高い結果を示す樹脂が複数見いだされたものの、再度追試を行うと実験の再現性が乏しく、安定した効果が得られなかった。(Data not shown)
イオン交換樹脂などをカラムに詰めた後、静置状態での時間の経過と共に樹脂の乾燥が進んでしまうが、その進み方はカラムへの詰め方、そのときの室内環境など種々の要因により一定しない。そのようなカラム内の樹脂の乾燥状態のばらつきが、結果が安定しない原因であると考えられた。【００５０】
（２−３）強酸性陽イオン交換樹脂の安定性
以下の実験では、（２−２）の実験中で最も効果が高かったスルホン酸基を有する強酸性陽イオン交換樹脂Ｎｏ．５（三菱化学製ＰＫ２２０）を一応の免疫阻害抑制剤候補として選択し、その安定性を試験する。
強酸性陽イオン交換樹脂の場合、カラムに詰めた後放置しておくと、時間の経過と共に樹脂が乾燥してしまう。そのようなカラム内の樹脂の乾燥状態のばらつきにより、結果が安定しない傾向があった。そこで、強酸性陽イオン交換樹脂ＰＫ２２０（三菱化学社製）を０．１％ＢＳＡ含有ホウ酸緩衝液に懸濁し、内径約０．８ｃｍ、長さ約１．０ｃｍの円錐状のカラムに０．３ｇ詰め、密封あるいは封をせずに１週間通常の実験室環境に放置し、その安定性を試験した。具体的には唾液試料（Ｒ）を１０倍希釈した希釈唾液試料を作製し、これに対して口蹄疫ウイルス（O/JPN/2010株）を１０４ＴＣＩＤ５０／ｍＬとなるように混和した試料６０μＬを口蹄疫抗原検出イムノクロマトに供試した。その結果、（表６）に示すように、樹脂の乾燥により唾液中の口蹄疫ウイルスへの反応性が低下することが判明した。【００５１】
【表６】
0006601932.tif 000007
【００５２】
（２−４）強酸性陽イオン交換樹脂の洗浄液での阻害抑制効果
樹脂の乾燥状態のばらつきを均一化することを当初の目的として、強酸性陽イオン交換樹脂ＰＫ２２０(三菱化学社製)６ｇを、イムノクロマト用０．１％ＢＳＡ含有ホウ酸緩衝液１８ｍＬに懸濁して４℃で一晩静置した後の樹脂を洗浄後の樹脂としてその性能を確認した。さらに洗浄後の上澄みを回収した。洗浄後の樹脂と共に、比較例として洗浄後の上澄み液での唾液検体に対する口蹄疫抗原検出イムノクロマトのコントロールラインの反応性を計測した。
その結果、驚くべきことに、洗浄後の上澄み液の方が洗浄後の樹脂の１０倍近い強い反応性を示した（表７）。
洗浄後の上澄み液の方が高い阻害除去活性を示した原因としては阻害除去物質が樹脂カラムに含まれる０．１％ＢＳＡ含有ホウ酸緩衝液に可溶なものであったことが推察され、このことからスルホン酸基を有する強酸性陽イオン交換樹脂による免疫阻害の高い抑制効果は、強酸性陽イオン交換樹脂製造過程で生成され不純物として混在していたスルホン酸基を有する低分子化合物によるものであった可能性が高い。【００５３】
【表７】
0006601932.tif 000008
【００５４】
（実施例３）スルホン酸基を有する化合物の免疫反応阻害の抑制効果の検討
（３−１）唾液検体による反応性阻害の回復効果
実施例（２−４）の結果から免疫反応阻害の抑制効果が高いことが期待される直鎖アルキル基を有する各種のスルホン酸基含有低分子化合物について、実施例１（１−１）で用いた口蹄疫抗原検出イムノクロマトでのウシ唾液検体によるコントロールラインの反応性への阻害が回復するかどうかを観察した。
その結果、最も低濃度でコントロールラインの反応阻害を回復させたものが、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸塩であった。このため、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸が最も阻害除去効果が高いと推測した（表８）。
さらに、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸塩以外の各種アルキルスルホン酸塩では、直鎖アルキル基の炭素数が大きいほど低濃度で効果を示し、その効果が高いことが確認できた。直鎖アルキルスルホン酸ナトリウムでは炭素数５以上でコントロールラインが回復した。直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムでは、炭素数８及び１１のアルキル基を有する場合にコントロールラインが回復することを確認した（表８）。【００５５】
【表８】
0006601932.tif 000009
【００５６】
（３−２）最適な添加濃度の検討
そこで、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸塩を含有するイムノクロマト用展開液に対し、口蹄疫ウイルス（O/JPN/2010株）を１０６ＴＣＩＤ５０／ｍＬとなるように添加した唾液を添加して、攪拌した。この試験液を口蹄抗原検出用イムノクロマトに供した。
直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸塩の添加濃度を変化させて検討したところ、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸塩の添加濃度は０．０５〜１．０（ｗ／ｖ）％の範囲であればウシ唾液中の口蹄疫ウイルスの検出が可能であり、０．１〜０．８（ｗ／ｖ）％の範囲が好ましいことがわかった（表９）。【００５７】
【表９】
0006601932.tif 000010
【００５８】
（実施例４）脂肪族又は芳香族アルキルスルホン酸塩による免疫反応阻害抑制効果
（４−１）口蹄疫ウイルスの検出効果−１
阻害活性の強いウシ唾液を用い、本発明のスルホン酸ナトリウム化合物による阻害の抑制効果を調べた。
詳細には、ウシ唾液検体１０μＬに口蹄疫ウイルス（O/JPN/2010株）を１０６ＴＣＩＤ５０／ｍＬとなるように添加後、通常組成（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有）の展開液、又は直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．３（ｗ／ｖ）％もしくはオクタンスルホン酸ナトリウム２．５ｗ／ｖ％を添加した展開液に１０倍希釈となるように懸濁し、実施例１（１−１）で用いた口蹄疫抗原検出イムノクロマトにより測定した。
その結果、展開液のみの場合、口蹄疫ウイルスは、唾液による阻害のため目視で検出できず、テストラインのリーダー測定値でも０．０を示したのに対し、本発明のスルホン酸ナトリウム化合物を唾液検体中に添加しておくことで阻害作用が抑制され、目視でもリーダー測定値でも検出可能となった（表１０）。
さらに、あわせて、口蹄疫ウイルス含有唾液検体を含まない場合に、偽陽性とならないことも確認した（表１０）。
この結果は、同時に、展開液中の非イオン性界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎＸ−１００には、免疫活性阻害が強い場合には抑制効果がほとんど期待できないことを示している。【００５９】
【表１０】
0006601932.tif 000011
【００６０】
（４−２）口蹄疫ウイルスの検出効果−２
この実験では、実施例１（１−１）と同様の唾液の検体数を増やし、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加して行い、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムの免疫阻害抑制効果を確認する。
具体的には、口蹄疫陰性のウシ４９頭から採取した唾液を（株）ジャパン・バイオシーラムより購入し、０．１％ＢＳＡ含有ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）で１０倍希釈した展開液を作成し、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを０．３（ｗ／ｖ）％添加した。次いで、口蹄疫ウイルス（O/JPN/2010株）を１０４ＴＣＩＤ５０／ｍＬとなるように添加して、攪拌した。各１４０μＬを、口蹄疫抗原検出イムノクロマトに滴下し、目視及びリーダーにより測定した（図３）。なお、検体番号は、（図１）とは一致していない。
その結果、４７／４９検体で正しく陽性と判定でき、（実施例１−１）で正しく判定できたのは４／１７検体のみであることからみて、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムの免疫阻害抑制効果が確認できた。【００６１】
（４−３）アルキルベンゼンスルホン酸塩による偽陽性の改善
本実施例では、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムの偽陽性抑制効果を確認する。
具体的には、（４−２）で採取したウシ唾液のうち口蹄疫陰性にも関わらず口蹄疫抗原検出イムノクロマトで陽性となる偽陽性を示す唾液を、通常展開液で１０倍に希釈したもの、及び当該希釈液に直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを０．３（ｗ／ｖ）％添加したものにそれぞれ加え、実施例１（１−１）と同様の口蹄疫抗原検出イムノクロマトで測定した。
その結果、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムの使用で、反応阻害のみならず偽陽性も抑制されることを確認した（表１１）。【００６２】
【表１１】
0006601932.tif 000012
【００６３】
（実施例５）アレルゲンタンパク抗原の検出効果
本実施例では、実施例１（１−３）で唾液検体によりほぼ１００％の阻害活性が観察された小麦タンパク質検出イムノクロマト（ＦＡＳＴＫＩＴスリム  小麦、日本ハム製）を用い、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムにより、反応性が回復するかどうかを確認する。
その結果、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを使用することで、目視でも、ＩＣリ−ダー結果でも、検出可能な程度に回復した（表１２）。【００６４】
【表１２】
0006601932.tif 000013
【００６５】
（実施例６）食中毒細菌Ｏ１５７の検出
本実施例では、実施例１（１−２）で唾液検体により４０％近い阻害活性が観察された腸管出血性大腸菌Ｏ１５７の検出イムノクロマト（ＮＨイムノクロマトＯ１５７、日本ハム製）を用い、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムにより、反応性が回復するかどうかを確認する。
その結果、食中毒細菌Ｏ１５７検出用イムノクロマトについても、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムの使用により、反応が回復し、反応阻害抑制効果が確認できた（表１３）。【００６６】
【表１３】
0006601932.tif 000014
【００６７】
（実施例７）第四級アンモニウム塩のスクリーニング
スルホン酸ナトリウムが唾液による阻害や偽陽性を防止することが明らかとなったため、本実施例ではスルホン酸ナトリウム塩と電荷や構造の点で類似することから着目した第四級アンモニウム塩について唾液による阻害や偽陽性防止効果がないか検討した。
具体的には、下記（表１４）の(1)〜(14)で示された第四級アンモニウム塩について、実施例（３−１）と同様に、実施例（１−１）で選択した最も阻害作用が高いウシ唾液を用い、１％ＢＳＡ含有ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）で１０倍希釈した展開液に各化合物を添加し、カンピロバクター検出用イムノクロマト（ＮＨイムノクロマトカンピロバクター）により陰性試験及び陽性試験を行った。【００６８】
【表１４】
0006601932.tif 000015
【００６９】
その結果、(5)のラウリルトリメチルアンモニウム＝クロリド、(8)のテトラブチルアンモニウム＝フルオリド、(11)の三フッ化二水素テトラブチルアンモニウム、(13)のドデシルトリメチルアンモニウム＝ブロミド、及び(14)のメチルトリオクチルアンモニウム＝クロリドが、テストライン及びコントロールラインのいずれも回復させているので、本発明の免疫阻害抑制剤の候補とした。【００７０】
次いで、最も回復効果の高かった(14)のメチルトリオクチルアンモニウム＝クロリドについての濃度条件の検討を行った。
その結果、メチルトリオクチルアンモニウム＝クロリドの場合、２．５〜５．０（ｖ／ｗ）％でカンピロバクター菌を検出可能となることが判明した（Data not shown）。【００７１】
（実施例８）第四級アンモニウム塩の免疫反応阻害効果
（８−１）ウシ・ブタ唾液の偽陰性解消についての効果
実施例（１−２）においてコントロールラインが阻害され、偽陰性になると考えられたウシ唾液ＢＳ−Ｋ１６にカンピロバクター菌液を１０８ＣＦＵ／ｍＬとなるように添加（カンピロバクター添加唾液）した。
カンピロバクター添加唾液を、第四級アンモニウム塩をＰＢＳで溶解した溶液、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩をＰＢＳで溶解した溶液で１０倍希釈して、ＮＨイムノクロマト  カンピロバクターに供試した。
なお、各試薬をＰＢＳに溶解する濃度は、カンピロバクターに対する反応性を阻害しない範囲で一番濃い濃度を選択した。
その結果、ラウリルトリメチルアンモニウム＝クロリド、ドデシルトリメチルアンモニウム＝ブロミド、ミリスチルトリメチルアンモニウム＝ブロミドなどＣ１２〜Ｃ１４のアルキル鎖を持つ第四級アンモニウム塩が唾液による偽陰性の解消に対して高い効果を示した（表１５）。【００７２】
【表１５】
0006601932.tif 000016
【００７３】
（８−２）ウシ・ブタ唾液の偽陽性解消についての効果
（８−１）において偽陽性を示したウシ・ブタ唾液検体を、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩をＰＢＳで溶解した溶液、又は直鎖アルキル第四級アンモニウム塩をＰＢＳで溶解した溶液で１０倍希釈して、ＮＨイムノクロマト  カンピロバクターに供試した。
その結果、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムと同様に、ラウリルトリメチルアンモニウムクロリド及びドデシルトリメチルアンモニウム＝ブロミドのいずれもが唾液由来の偽陽性を抑制することが確認された（表１６）。【００７４】
以上のことから、第四級アンモニウム塩についても、各種病原菌抗原の測定時に問題となる免疫阻害に対し、直鎖アルキル基を有するスルホン酸化合物と同様の抑制効果が期待できることがわかった。【００７５】
【表１６】
0006601932.tif 000017
【００７６】
（実施例９）Ｏ１５７検出用イムノクロマトにおける唾液の阻害抑制効果
（９−１）ウシ・ブタ唾液の偽陰性解消についての効果
まず、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩及び複数の第四級アンモニウム塩に対し、それぞれＰＢＳで溶解した１（ｗ／ｖ）％溶液をＮＨイムノクロマトＯ１５７に供試したところ、（表１７）に示すように、検討したすべての化合物で陰性であったので、以下の実験に用いた。【００７７】
【表１７】
0006601932.tif 000018
【００７８】
実施例（１−２）のＮＨイムノクロマトカンピロバクターでの検討の結果、偽陰性になると考えられたウシ唾液ＢＳ−Ｋ１６を用い、Ｏ１５７菌液を１０７ＣＦＵ／ｍＬとなるように添加（Ｏ１５７添加唾液）した。
次いでＯ１５７添加唾液を、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩又は各第四級アンモニウム塩をＰＢＳで溶解した溶液で１０倍希釈して、ＮＨイムノクロマトＯ１５７に供試した。
その結果、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、並びにラウリルトリメチルアンモニウムクロリド、ドデシルトリメチルアンモニウム＝ブロミド及びミリスチルトリメチルアンモニウム=ブロミドのいずれもが唾液由来の偽陰性の解消に有効であることを確認した（表１８）。【００７９】
【表１８】
0006601932.tif 000019
【００８０】
（９−２）ウシ・ブタ唾液の偽陽性解消についての効果
実施例（１−２）のＮＨイムノクロマトカンピロバクターでの検討の結果、偽陽性を示した唾液（ＳＳ−Ｋ４４）を、（９−１）と同様に、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩又は第四級アンモニウム塩をＰＢＳで溶解した溶液で１０倍希釈して、ＮＨイムノクロマトＯ１５７に供試した。
その結果、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、並びにラウリルトリメチルアンモニウムクロリド、ドデシルトリメチルアンモニウム＝ブロミド及びミリスチルトリメチルアンモニウム=ブロミドのいずれもが唾液由来の偽陽性の解消に有効であることを確認した（表１９）。【００８１】
【表１９】
0006601932.tif 000020
【００８２】
（実施例１０）落花生アレルゲン検出用イムノクロマトにおける偽陰性の解消効果
（１０−１）ウシ・ブタ唾液の偽陰性解消についての効果
実施例（１−２）のＮＨイムノクロマトカンピロバクターでの検討の結果、偽陰性になると考えられたウシ唾液ＢＳ−Ｋ１６に落花生タンパクを１μｇ／ｍＬとなるように添加し、落花生タンパク添加唾液検体を作成した。
まず、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩又は第四級アンモニウム塩をＰＢＳで溶解した溶液が供試濃度にて偽陽性を示さないことをあらかじめ確認した（表２０）。【００８３】
【表２０】
0006601932.tif 000021
【００８４】
次いで、落花生タンパク添加唾液検体を、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩又は第四級アンモニウム塩をＰＢＳで溶解した溶液で１０倍希釈して、ＦＡＳＴＫＩＴスリム落花生に供試した。
その結果、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ラウリルトリメチルアンモニウムクロリド及びミリスチルトリメチルアンモニウム＝ブロミドにより反応性が回復でき、唾液由来の偽陰性の解消に有効であることを確認した（表２１）。【００８５】
【表２１】
0006601932.tif 000022
【００８６】
（実施例１１）各種アレルゲン検出用イムノクロマトにおける偽陰性の解消効果
実施例１０などで第四級アンモニウム塩が唾液による偽陰性の解消に有効であることが示されたため、各種アレルゲンキットについてこれらの物質が有効であるかを確認した。
具体的には、阻害活性の強いウシ唾液に対して各種アレルゲンタンパクを添加して、その唾液を第四級アンモニウム塩を添加した展開液に１０倍希釈をすることで試料液を作製し、この試料液を各種アレルゲン検出用イムノクロマトに供試した。アレルゲン検出用イムノクロマトとしては、卵、小麦、落花生、甲殻類を使用した。
その結果、複数の第四級アンモニウム塩で、免疫反応阻害抑制効果を確認できた（表２２）。【００８７】
【表２２】
0006601932.tif 000023
【００８８】
（実施例１２）カンピロバクター検出用ＥＬＩＳＡ
本実施例では、ＥＬＩＳＡにおいても唾液による偽陽性があるか、また当該偽陽性が、イムノクロマトと同様に本発明の第四級アンモニウム塩化合物で解消されるかを確認する。
具体的には、大阪公衆衛生研究所より分与された抗カンピロバクターモノクローナル抗体（４Ｂ４：特開２００９−７７６５８号公報参照）を５μｇ／ｍＬの濃度でプレートに固定化し、固相プレートを作成した。
次いで、固相プレートにカンピロバクターを１０７ＣＦＵ／ｍＬ含むようにＰＢＳ又は各種第四級アンモニウム塩化合物含有ＰＢＳを用いて１０倍希釈した唾液を添加し、１時間インキュベートし、洗浄した。次に、ビオチン標識４Ｂ４を２次抗体として１．６μｇ／ｍＬの濃度で添加し、１時間インキュベートし、洗浄した。
続いて、ストレプトアビジン-ＨＲＰを添加して、３０分間インキュベートし、洗浄後、ＨＲＰ基質を添加して２０分間インキュベートし、希硫酸液を添加して、反応を停止させた。
その後、４５０ｎｍ吸光度を測定（レファレンス波長６２０ｎｍ）した。
その結果、（表２３）に示すように、ＥＬＩＳＡでも第四級アンモニウム塩の添加により唾液による免疫反応阻害が回復することが確認できた。【００８９】
【表２３】
0006601932.tif 000024
【００９０】
（実施例１３）アレルゲン検出ＥＬＩＳＡキットでの唾液による阻害抑制効果の検証
各種アレルゲン検出用ＥＬＩＳＡにおいて唾液による阻害での偽陰性が観察されるか、また、イムノクロマトの場合と同様に本発明の直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩又は第四級アンモニウム塩により回復できるかを確認する。
具体的には、落花生アレルゲン検出用ＥＬＩＳＡキットとして「ＦＡＳＴＫＩＴエライザ落花生（日本ハム（株）製）」を用い、ウシ唾液ＢＳ−Ｋ１６又はＰＢＳを５μＬ添加した落花生アレルゲンタンパク５０ｎｇ／ｍＬ又は２５ｎｇ／ｍＬを５０μＬを、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩又は第四級アンモニウム塩のＰＢＳ溶解溶液４５μＬで希釈して、ＥＬＩＳＡキットに供試した。
その結果、唾液を添加すると反応性低下が見られ、ＥＬＩＳＡにおいても唾液による阻害が確認された。そして、反応溶液中に第四級アンモニウム塩のラウリルトリメチルアンモニウム＝クロリド、ドデシルトリメチルアンモニウム＝ブロミド又はミリスチルトリメチルアンモニウム＝ブロミドを添加することで反応性が回復することを確認した（表２４）。【００９１】
【表２４】
0006601932.tif 000025
【００９２】
他のアレルゲンタンパク質、具体的には小麦、ごま、大豆アレルゲンタンパク質について、それぞれのアレルゲン検出用ＥＬＩＳＡキットである「ＦＡＳＴＫＩＴエライザ小麦（日本ハム（株）製）」、「ＦＡＳＴＫＩＴエライザごま（日本ハム（株）製）」、「ＦＡＳＴＫＩＴエライザ大豆（日本ハム（株）製）」を用いて落花生アレルゲンの場合と同様の検査を行った。
その結果、他のアレルゲンタンパク質においても、落花生アレルゲンタンパク質の場合と同様に、複数の第四級アンモニウム塩又は直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩が唾液による免疫反応阻害を抑制できることが確認できた(data not shown：表２５)。【００９３】
【表２５】
0006601932.tif 000026
【図１】
0006601932.tif 000027
【図２】
0006601932.tif 000028
【図３】
0006601932.tif 000029