(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
システアミンを含む組成物の純度を分析する方法であって、該方法が
（ｉ）システアミンを含む試料溶液を逆相ＨＰＬＣカラム上に注入すること；
（ｉｉ）アルキルスルホン酸、緩衝液、アセトニトリル及びメタノールを含む移動相を使用して前記カラムから前記試料を溶離すること；ならびに
（ｉｉｉ）ＵＶ検出器を使用して、約１７０ｎｍ〜約２５０ｎｍの波長で、溶離した前記試料を測定すること、
を含み、
前記試料が、勾配溶離を用いて溶離され、前記溶離が、第１及び第２移動相を使用して前記試料を勾配溶離することを含み、
前記第１移動相が、
約２．０〜３．０のｐＨを有する約７５体積％〜約９５体積％の水溶液であって、アルキルスルホン酸及びリン酸緩衝液を含む水溶液、
約１体積％〜約８体積％のアセトニトリル、及び
約５体積％〜約２０体積％のメタノール、を含み、
前記第２移動相が、
約２．０〜３．０のｐＨを有する約５体積％〜約３０体積％の水溶液であって、アルキルスルホン酸及びリン酸緩衝液を含む水溶液、
約８体積％〜約３０体積％のアセトニトリル、及び
約５０体積％〜約８５体積％のメタノール
を含む、
方法。
【請求項２】
酸性のｐＨを有する溶媒中にシステアミン試料を溶解して、システアミンを含む前記試料溶液を形成することをさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
腸溶コーティングしたシステアミンビーズの純度を分析する方法であって、該方法が
（ｉ）腸溶コーティングしたシステアミンビーズを粉砕すること；
（ｉｉ）粉砕した該ビーズを、酸性のｐＨを有する溶媒中に溶解して、システアミンを含む試料溶液を形成すること；
（ｉｉｉ）該試料溶液を逆相ＨＰＬＣカラム上に注入すること；
（ｉｖ）アルキルスルホン酸、緩衝液、アセトニトリル及びメタノールを含む移動相を使用して前記カラムから前記試料を溶離すること；ならびに
（ｖ）ＵＶ検出器を使用して、約１７０ｎｍ〜約２５０ｎｍの波長で、溶離した前記試料を測定すること
を含み、
前記試料が、勾配溶離を用いて溶離され、前記溶離が、第１及び第２移動相を使用して試料を勾配溶離することを含み、
前記第１移動相が、
約２．０〜３．０のｐＨを有する約７５体積％〜約９５体積％の水溶液であって、アルキルスルホン酸及びリン酸緩衝液を含む水溶液、
約１体積％〜約８体積％のアセトニトリル、及び
約５体積％〜約２０体積％のメタノール、を含み、
前記第２移動相が、
約２．０〜３．０のｐＨを有する約５体積％〜約３０体積％の水溶液であって、アルキルスルホン酸及びリン酸緩衝液を含む水溶液、
約８体積％〜約３０体積％のアセトニトリル、及び
約５０体積％〜約８５体積％のメタノール
を含む、
方法。
【請求項４】
前記溶媒がアルキルスルホン酸、緩衝液、アセトニトリル及びメタノールを含む請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＨＰＬＣカラムが、直径約１μｍ〜約１０μｍの充填材料粒子サイズを有する請求項１又は３に記載の方法。
【請求項６】
前記ＨＰＬＣカラムが、約０．１ｍｍ〜約１０ｍｍの内径を有する請求項１又は３に記載の方法。
【請求項７】
前記溶離した試料を、ＵＶ検出器を使用して、約１８０ｎｍ〜約２３０ｎｍの波長で測定する請求項１又は３に記載の方法。
【請求項８】
前記第１移動相の前記水溶液が
約１５ｍＭ〜約５０ｍＭのアルキルスルホン酸、及び
約１５ｍＭ〜約１００ｍＭのリン酸緩衝液
を含む請求項１又は３記載の方法。
【請求項９】
前記第２移動相の前記水溶液が
約１００ｍＭ〜約３００ｍＭのアルキルスルホン酸、及び
約１００ｍＭ〜約２００ｍＭのリン酸緩衝液
を含む請求項１又は３記載の方法。
【請求項１０】
約０．００１ｍＬ／分〜約２ｍＬ／分の流速を使用して前記試料を溶離する請求項１又は３記載の方法。
【請求項１１】
前記試料溶液がシステアミン酒石酸水素塩を含む請求項１又は３記載の方法。
【請求項１２】
前記ビーズを粉砕して粉末を形成する請求項３記載の方法。
【請求項１３】
前記ビーズを粉砕してペーストを形成する請求項３記載の方法。
【請求項１４】
システアミンを含む組成物の純度を分析する方法であって、該方法が
（ｉ）酸性のｐＨを有する溶媒中にシステアミン試料を溶解して、システアミンを含む試料溶液を形成すること；
（ｉｉ）Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム上に前記試料溶液を注入すること；
（ｉｉｉ）第１移動相及び第２移動相を使用して前記カラムから前記試料を勾配溶離すること；ならびに
（ｉｖ）ＵＶ検出器を使用して、約２１０ｎｍ以下の波長で、溶離した前記試料を測定すること
を含む方法であって、
前記第１移動相が、約２．６のｐＨを有する約８５体積％の水溶液であって、該水溶液が約２３．６ｍＭの１‐オクタンスルホン酸ナトリウム及び約２９ｍＭのリン酸ナトリウムを含む水溶液；約３体積％のアセトニトリル；ならびに約１２体積％のメタノールを含み、ならびに
前記第２移動相が、約２．６のｐＨを有する約１０体積％の水溶液であって、該水溶液が約０．２Ｍの１‐オクタンスルホン酸ナトリウム及び約０．１Ｍのリン酸ナトリウムを含む水溶液；約１８体積％のアセトニトリル；ならびに約７２体積％のメタノールを含む方法。
【請求項１５】
以下のプロファイル：
【表１】
0006518658.tif 000004
に従って、約１．０ｍＬ／分の流速で勾配溶離することを含む請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記ＨＰＬＣカラムが、直径約３．５μｍの充填材料粒子サイズを有する請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＨＰＬＣカラムが、約１５０ｍｍの長さ、及び約４．６ｍｍの内径を有する請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
３０μｇ以上のシステアミンを前記カラム上に注入することを含む請求項１、３又は４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２０１３年６月１７日に出願した米国仮特許出願第６１／８３５，９８７号に基づく優先権を主張する。該仮特許出願は、参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
本発明は概して、システアミンを含む組成物の純度を分析し、システアミン組成物中の不純物を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
システアミン（ＨＳ‐ＣＨ2‐ＣＨ2‐ＮＨ2）はサイズが小さいため細胞膜を容易に通過することができる。現在システアミンは、リソソーム内のシスチン蓄積障害であるシスチン症の治療に対しＦＤＡで承認されている。シスチン症においてシステアミンは、システイン及びシステイン‐システアミン混合二硫化物へシスチンを変換することにより作用する。システイン及びシステイン‐システアミン混合二硫化物は両方とも、それぞれシステイン輸送体及びリジン輸送体によってリソソームから出され得る(Gahlら、N Engl J Med 2002;347(2):111-21)。システアミンを用いた治療の結果、循環している白血球で細胞内シスチンレベルが下がることが示されている(Dohilら、J. Pediatr 148(6):764-9, 2006)。
【０００４】
製造工程中の副生成物の形成により、且つ／または保管中の薬物製品の変性（例えば、分解）により、システアミン配合物中には不純物が存在し得る。システアミン含有配合物の純度を精度良く且つ完全に測定することは、医薬製品の市販承認を獲得するのに重要であり、且つ医薬製品の放出時の不純物レベルがヒトへの投与に対し許容であること、及び医薬製品の保管安定性が許容であることを示すのに重要である。電気化学検出システムを備えたＨＰＬＣ法を使用したシステアミン含有配合物の純度の分析は、システアミン配合物中に見られる特定の不純物を検出するのに必要な感度を有しないことが示されている。
【０００５】
本発明は、システアミンを含む組成物の純度を分析し、システアミン組成物中の不純物を検出する改良された方法を提供する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、システアミンを含む組成物の純度を分析する方法に関する。この方法は、システアミンを含む試料溶液を逆相ＨＰＬＣカラム上に注入すること；アルキルスルホン酸（例えば、１‐ヘキサンスルホン酸及び／または１‐オクタンスルホン酸）、緩衝液、アセトニトリルならびにメタノールを含む移動相を使用してカラムから試料を溶離すること；ならびにＵＶ検出器を使用して、溶離した試料を測定することを含む。溶離した試料は、約１７０ｎｍ〜約２５０ｎｍの波長で測定する。
【０００７】
関連方法においては、本発明は、腸溶コーティングしたシステアミンビーズ等の遅延放出性システアミン配合物の純度を分析する方法を提供する。このようなビーズには、患者への経口投与用に製剤された単投与量カプセルに入れられたビーズが含まれる。この方法は、腸溶コーティングしたシステアミンビーズを粉砕すること；粉砕したこのビーズを、酸性のｐＨを有する溶媒中に溶解して、システアミンを含む試料溶液を形成すること；この試料溶液を逆相ＨＰＬＣカラム上に注入すること；アルキルスルホン酸（例えば、１‐ヘキサンスルホン酸及び／または１‐オクタンスルホン酸）、緩衝液、アセトニトリルならびにメタノールを含む移動相を使用してカラムから試料を溶離すること；ならびにＵＶ検出器を使用して、約１７０ｎｍ〜約２５０ｎｍの波長で、溶離した試料を測定することを含む。
【０００８】
さらに、本発明は（ｉ）酸性のｐＨを有する溶媒中にシステアミン試料を溶解して、システアミンを含む試料溶液を形成すること；（ｉｉ）この試料溶液をＣ１８逆相ＨＰＬＣカラム上に注入すること；（ｉｉｉ）第１移動相及び第２移動相を使用してカラムから試料を勾配溶離すること；ならびに（ｉｖ）ＵＶ検出器を使用して、約２１０ｎｍ以下の波長で、溶離した試料を測定することを含む、システアミンを含む組成物の純度を分析する方法を提供し、上記の第１移動相は、約２．６のｐＨを有する約８５体積％の水溶液；約３体積％のアセトニトリル；及び約１２体積％のメタノールを含み、上記の水溶液は約２３．６ｍＭの１‐オクタンスルホン酸ナトリウム及び約２９ｍＭのリン酸ナトリウムを含み、上記の第２移動相は、約２．６のｐＨを有する約１０体積％の水溶液；約１８体積％のアセトニトリル；及び約７２体積％のメタノールを含み、上記の水溶液は約０．２Ｍの１‐オクタンスルホン酸ナトリウム及び約０．１Ｍのリン酸ナトリウムを含む。
【０００９】
本発明のさらなる態様は、以下の詳細な記載と、付属の特許請求の範囲を組み合わせて精査することにより当業者に明らかとなってもよい。本発明は、様々な形態の実施形態が可能であるが、本開示は説明するものであって本明細書において記載される特定の実施形態に本発明を制限することを意図するものではないという理解のもと、本発明の特定の実施形態を以下に記載する。本文書全体が、統合された開示として関連することを意図するものであり、明細書において記載される特徴の全ての組合せが意図され、たとえ特徴の組合せが同一文章もしくは同一段落、または本書類の同一節に共に見られなかったとしても、全ての組合せが意図されることが理解される必要がある。例えば、システアミンを含む組成物の純度を分析する方法に関する実施形態が記載される場合、同一の特性及び特徴を有する、腸溶コーティングしたシステアミン等の遅延放出性システアミン配合物を分析する方法に関する実施形態が明確に意図され、且つその逆も当てはまる。
【００１０】
前述のものに加えて、本発明は、上で詳細に言及した変形物よりも何らかの点で範囲が狭い本発明の全実施形態を、さらなる態様として含む。１つの種類として記載された本発明の態様に関して、個々の種類の全てが、本発明の別の態様として個別にみなされる。範囲内での選択として記載される要素に関しては、その範囲内にある別個の副単位の全てが、本発明の実施形態として意図されることが理解される必要がある。本明細書において範囲は、「約（about）」もしくは「およそ（approximately）」のある特定値からとして表わされてもよく、且つ／または「約（about）」もしくは「およそ（approximately）」の別の特定値までとして表わされてもよい。このような範囲が表わされる際、本発明の別の実施形態は、ある特定値から、且つ／または他の特定値までを含む。同様に、「約」、「約〜以上」、「約〜未満」等の先行詞を使用する以外で特定値が近似値として表わされる場合、その特定値が別の実施形態を形成することが理解されるであろう。
【００１１】
「１つの（a）」または「１つの（an）」を用いて記載または請求される本発明の態様に関しては、文脈上明らかにより制限された意味を必要としない限り、これらの用語が「１つ以上」を意味することが理解される必要がある。「または」という用語は、文脈上明らかに別の方法を必要としない限り、どれか一方の項目を包含するか、または項目を共に包含することが理解される必要がある。本発明の態様がある特徴を「含む（comprising）」として記載される場合、実施形態はその特徴「からなる（consisting of）」か、またはその特徴「から本質的になる（consisting essentially of）」ことも意図される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１では、本明細書に記載の方法に従って得られたシステアミンのＨＰＬＣクロマトグラムを提供する。
【図２Ａ】図２Ａでは、ＵＶ検出器（左パネル）及び電気化学検出器（右パネル）を使用して得られたシステアミンのＨＰＬＣクロマトグラムを提供する。
【図２Ｂ】図２Ｂでは、ＵＶ検出器（左パネル）及び電気化学検出器（右パネル）を使用して得られたシステアミンのＨＰＬＣクロマトグラムを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、システアミンを含む組成物の純度を分析し、システアミン組成物中の不純物を検出する改良された方法を提供する。このような方法は、本発明に基づかない方法と比較して、より高い感度及びより少ない選択性を提供することが好ましい。より少ない選択性を提供することにより、より選択的な方法による検出と比較して、本発明の方法はさらなる不純物の検出を可能にする。したがって本発明の方法は、システアミン配合物中に存在する不純物及び／または関連物質の数及び量の、より完全且つより高精度な検出を提供することができる。本明細書において使用される場合、「システアミン配合物」、「システアミン組成物」または「システアミンを含む組成物」という用語はシステアミンを含む任意の配合物を指し、この配合物にはシステアミン塩を含む配合物が含まれる。本明細書において使用される場合、「関連物質」という用語は、調製時及び／または保管後に最初はシステアミン配合物中に存在するシステアミンから誘導される化合物を指す。システアミン関連物質には、システアミン２量体（すなわち、シスタミン）、ならびにシステアミンの修飾によって得られる他の生成物、及び／または配合物中に存在する他の成分とシステアミンの反応によって得られる、塩等の他の生成物が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１４】
以下、本発明がより詳細に記載される。節の見出しは読む際の利便性目的であり、それ自体で限定することを意図するものではない。
ＨＰＬＣ法
【００１５】
一態様においては、本発明は、システアミンを含む組成物の純度を分析し、システアミン組成物中の不純物を検出する方法を提供する。この方法は、システアミンを含む試料溶液を逆相ＨＰＬＣカラム上に注入すること；アルキルスルホン酸、緩衝液、アセトニトリル及びメタノールを含む移動相を使用してカラムから試料を溶離すること；ならびにＵＶ検出器を使用して、約１７０ｎｍ〜約２５０ｎｍの波長で、溶離した試料を測定することを含む。この方法は任意に、酸性のｐＨを有する溶媒中にシステアミン試料を溶解して、システアミンを含む試料溶液を形成することを含む。
【００１６】
関連する一態様においては、本発明は、腸溶コーティングしたシステアミンビーズの純度を分析し、腸溶コーティングしたシステアミンビーズ中の不純物を検出する方法を提供する。この方法は、腸溶コーティングしたシステアミンビーズを粉砕すること；粉砕したこのビーズを、酸性のｐＨを有する溶媒中に溶解して、システアミンを含む試料溶液を形成すること；この試料溶液を逆相ＨＰＬＣカラム上に注入すること；１‐オクタンスルホン酸、緩衝液、アセトニトリル及びメタノールを含む移動相を使用してカラムから試料を溶離すること；ならびにＵＶ検出器を使用して、溶離した試料を測定することを含む。
【００１７】
種々の実施形態においては、システアミン試料を溶解する溶媒は、アルキルスルホン酸、緩衝液、アセトニトリル及びメタノールを含む。溶媒の例としては、ＨＰＬＣ移動相が挙げられる。第１移動相及び第２移動相を使用して試料を勾配溶離する場合、溶媒は通常、より高い体積パーセントの水性成分、及びより低い体積パーセントの有機成分を有する移動相である（一般に、第１移動相または移動相Ａと呼ばれる）。
【００１８】
試料溶液は、逆相ＨＰＬＣカラム上に注入する。通常、試料溶液は、１０μＬまたは１００μＬの容量で注入するが、他の注入容量（例えば、５μＬ、２０μＬ、３０μＬ、４０μＬ、５０μＬ、６０μＬ、７０μＬ、８０μＬまたは９０μＬの試料溶液）を使用することができ、複数回の注入（例えば、１０μＬの試料溶液を２、３、４または５回注入）を使用してもよい。システアミン関連物質が検出され得るように、十分な量の試料をカラム上に注入する。一般に、カラム上に注入するシステアミンの量は、３０μｇ以上、４０μｇ以上、５０μｇ以上、及び／または６０μｇ以上である。
【００１９】
ＨＰＬＣカラムは、充填材料（すなわち、固定相）を含む。逆相ＨＰＬＣでは、カラムは疎水性充填材料を含有する。逆相ＨＰＬＣカラムの例としては、Ｃ１８カラム、Ｃ８カラム、シリカカラム、シアノ基が結合したシリカカラム、及びフェニル基が結合したシリカカラムが挙げられるがこれらに限定されるものではない。一般にＨＰＬＣカラムは、直径約１μｍ〜約１０μｍ、直径約１μｍ〜約７μｍ、直径約２μｍ〜約５μｍ、直径約３μｍ〜約４μｍ、及び／または直径約３．５μｍの充填材料粒子サイズを有する。典型的なＨＰＬＣカラムは、約０．１ｍｍ〜約１０ｍｍ、約０．１ｍｍ〜約７ｍｍ、約０．１５ｍｍ〜約５ｍｍ、約０．３ｍｍ〜約５ｍｍ、約０．５ｍｍ〜約５ｍｍ、約０．７ｍｍ〜約５ｍｍ、約１ｍｍ〜約５ｍｍ、約１．５ｍｍ〜約５ｍｍ、約２ｍｍ〜約５ｍｍ、約３ｍｍ〜約５ｍｍ、約４ｍｍ〜約５ｍｍ、及び／または約４．６ｍｍの内径を有する。一般にＨＰＬＣカラムは、約５ｍｍ〜約５００ｍｍ、約１０ｍｍ〜約２５０ｍｍ、約２０ｍｍ〜約２５０ｍｍ、約３０ｍｍ〜約２５０ｍｍ、約５０ｍｍ〜約２５０ｍｍ、約７５ｍｍ〜約２００ｍｍ、及び／または約１００ｍｍ〜約１５０ｍｍの長さを有する。
【００２０】
市販のＨＰＬＣカラムには、XBRIDGE分析カラム（Waters、Milford、Massachusetts）が含まれ、例えば内径及び長さがそれぞれ１．０×５０ｍｍ、１．０×１００ｍｍ、１．０×１５０ｍｍ、２．１×１０ｍｍ、２．１×１０ｍｍ、２．１×２０ｍｍ、２．１×３０ｍｍ、２．１×５０ｍｍ、２．１×７５ｍｍ、２．１×１００ｍｍ、２．１×１５０ｍｍ、３．０×２０ｍｍ、３．０×３０ｍｍ、３．０×５０ｍｍ、３．０×７５ｍｍ、３．０×１００ｍｍ、３．０×１５０ｍｍ、４．６×２０ｍｍ、４．６×３０ｍｍ、４．６×５０ｍｍ、４．６×７５ｍｍ、４．６×１００ｍｍ、４．６×１００ｍｍ、４．６×１５０ｍｍ、及び４．６×２５０ｍｍであるXBRIDGE分析カラムが含まれる。XBRIDGE分析カラムは、例えば直径約２．５μｍ、直径約３．５μｍ及び直径約５μｍの粒子サイズを有する充填材料を含有する。
【００２１】
アルキルスルホン酸、緩衝液、アセトニトリル及びメタノールを含む移動相を使用して、カラムから試料を溶離する。通常、溶離は勾配溶離である。勾配溶離中、異なる組成を有する第１移動相及び第２移動相を使用する。溶離の過程にわたり移動相の組成が変化するように、第１移動相及び第２移動相を、溶離の間ずっと割合を変えて混合する。勾配溶離は任意に、移動相の割合の段階変化を１つ以上含む。
【００２２】
アルキルスルホン酸及び緩衝液を含む水溶液は通常、移動相の約５体積％〜約９５体積％の量で移動相中に含まれ、例えば約１０体積％〜約９０体積％、約１５体積％〜約８５体積％、約２０体積％〜約８０体積％、約２５体積％〜約７５体積％、約３０体積％〜約７０体積％、約３５体積％〜約６５体積％、約４０体積％〜約６０体積％、及び／または約４５体積％〜約５５体積％の量で含まれる。他の量の水溶液も使用してよい。例えば試料を勾配溶離する場合、１つの移動相がより低い濃度で水溶液を含んでもよく、第２移動相がより高い濃度で水溶液を含んでもよい。したがって、水溶液の量の他の例としては、約７５体積％〜約９５体積％、約８０体積％〜約９０体積％、約８５体積％、約５体積％〜約３０体積％、約５体積％〜約２５体積％、約５体積％〜約２０体積％、及び／または約５体積％〜約１０体積％が挙げられる。水溶液は通常、酸性のｐＨを有し、例えば約１．５〜約６．５、約２〜約６、約２〜約５、約２〜約４、約２〜約３、及び／または約２．４〜約２．８のｐＨを有する。
【００２３】
好適なアルキルスルホン酸には、エタンスルホン酸、プロパンスルホン酸、ブタンスルホン酸、ペンタンスルホン酸、ヘキサンスルホン酸、ヘプタンスルホン酸、オクタンスルホン酸、ノナンスルホン酸及びデカンスルホン酸が含まれるがこれらに限定されるものではない。アルキルスルホン酸（例えば、１‐ヘキサンスルホン酸または１‐オクタンスルホン酸）は、ナトリウム塩形態等の任意のその塩形態で、移動相の水溶液中に含まれてもよく、例えば１‐ヘキサンスルホン酸ナトリウムまたは１‐オクタンスルホン酸ナトリウムの形態で含まれてもよい。アルキルスルホン酸（またはその塩）は通常、約１５ｍＭ〜約３００ｍＭ、約２０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約３０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約４０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ、及び／または約６０ｍＭ〜約９０ｍＭの濃度で水溶液中に含まれる。他の濃度のアルキルスルホン酸（またはその塩）も使用してよい。例えば試料を勾配溶離する場合、１つの移動相がより低い濃度でアルキルスルホン酸（またはその塩）を含んでもよく、第２移動相がより高い濃度でアルキルスルホン酸（またはその塩）を含んでもよい。したがって、水溶液中のアルキルスルホン酸（またはその塩）の濃度の他の例としては、約１５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約４０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ、約１００ｍＭ〜約３００ｍＭ、約１２０ｍＭ〜約２８０ｍＭ、及び／または約１５０ｍＭ〜約２５０ｍＭが挙げられる。
【００２４】
緩衝液は通常、約１５ｍＭ〜約２００ｍＭ、２０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、及び／または３０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度で水溶液中に含まれる。他の濃度の緩衝液も使用してよい。例えば試料を勾配溶離する場合、１つの移動相がより低い濃度で緩衝液を含んでもよく、第２移動相がより高い濃度で緩衝液を含んでもよい。したがって、水溶液中の緩衝液の濃度の他の例としては、約１５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２０ｍＭ〜約７５ｍＭ、約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約７５ｍＭ〜約１２５ｍＭ、約８５ｍＭ〜約１１５ｍＭ、約１００ｍＭ〜約２００ｍＭ、及び／または約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭが挙げられる。緩衝液の例としては、酸性のｐＨ、例えば１．５〜約６、約２〜約５、約２〜約４、約２〜約３、及び／または約２〜約２．５のｐＨでｐＫａを有する任意の緩衝液が挙げられる。緩衝液の例としては、リン酸、クエン酸／クエン酸塩、酢酸／酢酸塩、グリシン、ギ酸／ギ酸塩、及びコハク酸／コハク酸塩が挙げられるがこれらに限定されるものではない。種々の実施形態においては、緩衝液にはリン酸ナトリウムが含まれる。
【００２５】
アセトニトリルは通常、移動相の約５体積％〜約９５体積％の量で移動相中に含まれ、例えば約１体積％〜約３０体積％、約２体積％〜約２５体積％、約３体積％〜約２０体積％、約５体積％〜約１５体積％、約８体積％〜約１２体積％、及び／または約１０体積％の量で含まれる。他の量のアセトニトリルも使用してよい。例えば試料を勾配溶離する場合、１つの移動相がより低い濃度でアセトニトリルを含んでもよく、第２移動相がより高い濃度でアセトニトリルを含んでもよい。したがって、アセトニトリルの量の他の例としては、約１体積％〜約８体積％、約１体積％〜約６体積％、約１体積％〜約５体積％、約２体積％〜約４体積％、約３体積％、約８体積％〜約３０体積％、約１０体積％〜約２５体積％、約１５体積％〜約２０体積％、及び／または約１８体積％が挙げられる。
【００２６】
メタノールは通常、移動相の約５体積％〜約８５体積％の量で移動相中に含まれ、例えば約１０体積％〜約８０体積％、約１５体積％〜約７５体積％、約２０体積％〜約７０体積％、約２５体積％〜約６５体積％、約３０体積％〜約６０体積％、及び／または約３５体積％〜約５５体積％の量で含まれる。他の量のメタノールも使用してよい。例えば試料を勾配溶離する場合、１つの移動相がより低い濃度でメタノールを含んでもよく、第２移動相がより高い濃度でメタノールを含んでもよい。したがって、メタノールの量の他の例としては、約５体積％〜約２０体積％、約８体積％〜約１５体積％、約１２体積％、約５０体積％〜約８５体積％、約６０体積％〜約８０体積％、及び／または約７２体積％が挙げられる。
【００２７】
例示的な移動相は、約２．０〜３．０のｐＨを有する約５体積％〜約９５体積％の水溶液、約１体積％〜約３０体積％のアセトニトリル、及び約５体積％〜約８５体積％のメタノールを含み、上記の水溶液はアルキルスルホン酸（例えば、１‐ヘキサンスルホン酸及び／または１‐オクタンスルホン酸）ならびにリン酸緩衝液を含む。種々の実施形態においては、水溶液は、約１５ｍＭ〜約３００ｍＭのアルキルスルホン酸（例えば、１‐ヘキサンスルホン酸及び／または１‐オクタンスルホン酸）、ならびに約１５ｍＭ〜約２００ｍＭのリン酸緩衝液を含む。
【００２８】
溶離の間中、異なる割合で混合される第１移動相及び第２移動相を使用して、試料を勾配溶離することができる。例示的な第１移動相は、約２．０〜３．０のｐＨを有する約７５体積％〜約９５体積％の水溶液、約１体積％〜約８体積％のアセトニトリル、及び約５体積％〜約２０体積％のメタノールを含み、上記の水溶液はアルキルスルホン酸（例えば、１‐ヘキサンスルホン酸及び／または１‐オクタンスルホン酸）ならびにリン酸緩衝液を含む。種々の実施形態においては、第１移動相の水溶液は、約１５ｍＭ〜約５０ｍＭのアルキルスルホン酸（例えば、１‐ヘキサンスルホン酸及び／または１‐オクタンスルホン酸）、ならびに約１５ｍＭ〜約１００ｍＭのリン酸緩衝液を含む。例示的な第２移動相は、約２．０〜３．０のｐＨを有する約５体積％〜約３０体積％の水溶液、約８体積％〜約３０体積％のアセトニトリル、及び約５０体積％〜約８５体積％のメタノールを含み、上記の水溶液はアルキルスルホン酸（例えば、１‐ヘキサンスルホン酸及び／または１‐オクタンスルホン酸）ならびにリン酸緩衝液を含む。種々の実施形態においては、第２移動相の水溶液は、約１００ｍＭ〜約３００ｍＭのアルキルスルホン酸（例えば、１‐ヘキサンスルホン酸及び／または１‐オクタンスルホン酸）、ならびに約１００ｍＭ〜約２００ｍＭのリン酸緩衝液を含む。
【００２９】
勾配溶離においては、勾配は通常、高い割合の第１移動相を用いて開始し、例えば約１００％の第１移動相及び０％の第２移動相、約９０％の第１移動相及び約１０％の第２移動相、ならびに／または約８０％の第１移動相及び約２０％の第２移動相を用いて開始する。例えば５分以上の間、１０分以上の間、１５分以上の間、２０分以上の間、２５分以上の間、及び／または３０分以上の間等の期間、第２移動相に対する第１移動相の割合を連続的に減少させる。その期間の終了時では、第１移動相の割合は勾配開始時よりも低く、例えば約３０％の第１移動相及び約７０％の第２移動相、約４０％の第１移動相及び約６０％の第２移動相、約５０％の第１移動相及び約５０％の第２移動相、約６０％の第１移動相及び約４０％の第２移動相、及び／または約７０％の第１移動相及び約３０％の第２移動相である。流速１ｍＬ／分での例示的な溶離においては、溶離プロファイルは、１００％の第１移動相を２分間与え、次に１８分間かけて第１移動相の量を一次関数的に６０％まで減少させ、第２移動相の量を一次関数的に４０％まで増加させ、次に６０％の第１移動相及び４０％の第２移動相を５分間与え、その後１００％の第１移動相を１５分間与える。
【００３０】
好適な流速を使用してカラムから試料を溶離し、例えば約０．００１ｍＬ／分〜約２ｍＬ／分、約０．０１ｍＬ／分〜約２ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約２ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２ｍＬ／分、及び／または約１ｍＬ／分の流速を使用する。さらに、好適なカラム温度で試料を溶離し、例えば約２０℃〜約８０℃、約２５℃〜約６０℃、約３０℃〜約５０℃、及び／または約４０℃のカラム温度である。
【００３１】
溶離した試料は、ＵＶ検出器を使用して測定し、その信号は、好適な記録装置を使用して記録する。通常、溶離した試料は、約１７０ｎｍ〜約２５０ｎｍ、約１７０ｎｍ〜約２４０ｎｍ、約１７０ｎｍ〜約２３０ｎｍ、約１７０ｎｍ〜約２２０ｎｍ、約１７０ｎｍ〜約２１０ｎｍ、１８０ｎｍ〜約２５０ｎｍ、約１８０ｎｍ〜約２４０ｎｍ、約１８０ｎｍ〜約２３０ｎｍ、約１８０ｎｍ〜約２２０ｎｍ、約１８０ｎｍ〜約２１０ｎｍ、約１９０ｎｍ〜約２５０ｎｍ、約１９０ｎｍ〜約２４０ｎｍ、約１９０ｎｍ〜約２３０ｎｍ、約１９０ｎｍ〜約２２０ｎｍ、約１９０ｎｍ〜約２１０ｎｍ、約２００ｎｍ〜約２５０ｎｍ、約２００ｎｍ〜約２４０ｎｍ、約２００ｎｍ〜約２３０ｎｍ、約２００ｎｍ〜約２２０ｎｍ、約２００ｎｍ〜約２１０ｎｍ、約２５０ｎｍ以下、約２４０ｎｍ以下、約２３０ｎｍ以下、約２２０ｎｍ以下、及び／または約２１０ｎｍ以下の波長で測定する。
システアミンの処理
【００３２】
本発明の方法の分析用システアミン配合物には、薬学的に許容できる塩を含む全形態のシステアミンが含まれる。「薬学的に許容できる塩」とは、医薬品用途の化合物へ配合され得る塩であり、これには金属塩（例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等）及びアンモニア塩または有機アミン塩が含まれるが、これらに限定されるものではない。システアミン誘導体の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ‐トルエンスルホン酸塩、酒石酸水素塩及びホスホシステアミン誘導体が挙げられる。システアミンの例示的形態はシステアミン酒石酸水素塩である。
【００３３】
システアミン配合物は即時放出性配合物であることができる。即時放出性配合物は一般に、好適な溶媒に溶解して試料溶液を形成することによって分析用に調製することができる。必要であれば、即時放出性システアミン配合物を溶解前に粉砕するか、またはそれ以外の場合は脱凝集させることができる。システアミン配合物が、カプセルまたは他の単投与量単位中に存在する場合、溶解前にそのカプセルまたは他の単位を開け、その内容物を好適な容器に移すことができる。
【００３４】
システアミン配合物は、腸溶コーティングしたシステアミン配合物等の遅延放出性配合物であることもできる。腸溶コーティングしたシステアミンビーズ等の遅延放出性システアミン配合物を調製するには、一般にビーズを粉砕して粉末を形成するか、または幾量かの好適な溶媒と共に粉砕してペーストを形成する。次に、得られた粉末またはペーストを溶解して分析用試料溶液を形成する。
【００３５】
腸溶コーティングは、システアミン製品が腸管、通常は小腸に到達するまで放出を延ばす。腸溶コーティングにより小腸への到達が改善され、それにより胃の副作用を減らしながら活性成分の吸収を改善する。腸溶コーティングしたシステアミン製品の例は、２００７年８月９日に公開された国際公開第ＷＯ２００７／０８９６７０号において記載されており、これはその全体が本明細書に取り込まれる。
【００３６】
一般に、腸溶コーティングはポリマー材料を含み、このポリマー材料は、低ｐＨ環境の胃においてシステアミン製品が放出するのを防ぐが、通常４または５のｐＨであるわずかに高いｐＨでイオン化し、したがって小腸で十分に溶解して活性剤を徐々に放出する。したがって、最も効果的な腸溶コーティング材料の１つは、約３〜５のｐＫａを有する多価酸である。好適な腸溶コーティング材料には、重合ゼラチン、セラック、メタクリル酸コポリマー体型ＣＮＦ、酪酸フタル酸セルロース、フタル酸水素セルロース、プロピオン酸フタル酸セルロース、酢酸フタル酸ポリビニル（ＰＶＡＰ）、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、酢酸トリメリット酸セルロース（ＣＡＴ）、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、コハク酸ジオキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース（ＣＭＥＣ）、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＡＳ）、ならびに、通常アクリル酸エステル及びメタクリル酸エステルのコポリマーを用いて、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、メタクリル酸メチル及び／またはメタクリル酸エチルから形成されるアクリル酸ポリマー及びアクリル酸コポリマー（Ｅｕｄｒａｇｉｔ  ＮＥ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  ＲＬ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  ＲＳ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
実施例１
XBRIDGE C18カラム（寸法：１５０ｍｍ×４．６ｍｍ；充填粒子サイズ：３．５μｍ）（Waters、Milford、Massachusetts）を使用し、勾配溶離ＨＰＬＣによってシステアミン酒石酸水素塩試料を評価した。オートサンプラーの温度は４℃であった。約１０μＬまたは約１００μＬの試料をカラム上に注入した。カラム温度は４０℃であり、以下のプロファイルに従って、流速１．０ｍＬ／分で試料を溶離した。
【表１】
0006518658.tif 000002
【００３８】
移動相Ａは、８５／３／１２（ｖ／ｖ／ｖ）で、１‐オクタンスルホン酸ナトリウム２３．６ｍＭ及びリン酸ナトリウム２９．０ｍＭ／アセトニトリル／メタノールを含有した。移動相Ｂは、１０／１８／７２（ｖ／ｖ／ｖ）で、１‐オクタンスルホン酸ナトリウム０．２０Ｍ及びリン酸ナトリウム０．１０Ｍ（ｐＨ２．６）／アセトニトリル／メタノールを含有した。１‐オクタンスルホン酸の純度は９８％以上であった。検出は、ＵＶ検出器を使用して２１０ｎｍで行った。
【００３９】
標準溶液の調製
システアミン酒石酸水素塩分析参照標準の標準溶液は以下のとおり調製した。低光化学作用性ガラス器具を使用し、移動相Ａ中に基準濃度０．５４ｍｇ／ｍＬのシステアミン酒石酸水素塩分析参照標準を有する実用標準溶液及び実用チェック標準（Working Check Standard）溶液を調製した。低光化学作用性ガラス器具を使用し、移動相Ａ中に基準濃度０．３０ｍｇ／ｍＬのシステアミン酒石酸水素塩分析参照標準を有する実用感受性（Working Sensitivity）溶液を調製した。この濃度はシステアミンの定量下限（ＬＯＱ）に一致する。システアミン酒石酸水素塩分析参照標準の水含有量は、Karl Fischer滴定または熱重量分析（ＴＧＡ）で使用する日の７日以下前に測定した。参照標準は、窒素雰囲気下、冷蔵して保管した。
【００４０】
ビーズ調製分析試料の調製
以下の手順に従って、腸溶コーティングしたシステアミン（RP103）ミクロビーズを分析用に調製した。腸溶コーティングしたシステアミン配合物RP103は、共有の出願番号＿＿＿（代理人明細書番号３１０７５／４７７２２）（参照により本明細書に取り込まれる）において記載されている。ボールミルを使用し、約１分、２７ＨｚでRP103ビーズ約３．７ｇを粉砕し、微粉末にした。粉砕物は、保管用に琥珀色容器へ移した。ビーズ調製分析試料貯蔵液は、３７０．４ｍｇ±５ｍｇの粉砕物を２５０ｍＬの低光化学作用性メスフラスコに加え、移動相Ａで希釈することにより２連で調製した。この混合物を、撹拌子を用いて１５分間以上撹拌した。得られた溶液の約１５ｍＬを、０．４５μｍナイロンフィルターを通して濾過し、始めの５ｍＬを廃棄した。得られたビーズ調製分析試料貯蔵液のシステアミン濃度は約０．３００ｍｇ／ｍＬであった。ビーズ調製試料実用溶液は、４．０ｍＬのビーズ調製分析試料貯蔵液を２５ｍＬの低光化学作用性メスフラスコに入れ、その体積まで移動相Ａで希釈することにより調製した。得られたビーズ調製試料実用溶液のシステアミン濃度は約０．０４８ｍｇ／ｍＬであった。
【００４１】
分析試料の調製
以下の手順に従って、腸溶コーティングしたシステアミン（RP103）ミクロビーズを含有するカプセルを分析用に調製した。光及び酸素への曝露を減らすため、試料調製（始めのカプセル全体の秤量から、ＨＰＬＣに試料バイアルを装填するまで）は１日で完了した。１０個のカプセルを秤量した。カプセルの内容物を空け、空の殻を秤量して平均のカプセル充填重量を決定した。ボールミルを使用し、約１分、２７Ｈｚでカプセルの内容物を粉砕し、微粉末にした。粉砕物は、保管用に琥珀色容器へ移した。試料貯蔵液は、１カプセルに対する適量（平均のカプセル充填重量によって決定されたとおり）の粉砕物を２５ｍＬの低光化学作用性メスフラスコに加え、移動相Ａで希釈することにより２連で調製した。この混合物を、撹拌子を用いて１５分間以上撹拌した。得られた溶液を、約３４００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心分離した溶液の約１５ｍＬを、０．４５μｍナイロンフィルター（Acrodisc、直径２５ｍｍ）を通して濾過し、始めの５ｍＬを廃棄し、試料貯蔵液を得た。試料実用溶液は、６．０ｍＬの試料貯蔵液（２５ｍｇカプセル用）、または２．０ｍＬの試料貯蔵液（７５ｍｇカプセル用）を１０ｍＬの低光化学作用性メスフラスコに入れ、その体積まで移動相Ａで希釈することにより調製した。
【００４２】
含量均一性試料の調製
以下の手順に従って、腸溶コーティングしたシステアミン（RP103）ミクロビーズを含有するカプセルを分析用に調製した。光及び酸素への曝露を減らすため、試料調製（始めのカプセル全体の秤量から、ＨＰＬＣに試料バイアルを装填するまで）は１日で完了した。１０個のカプセルを秤量した。各カプセルの内容物を別々の乳鉢に空け、空の殻を秤量してそれぞれのカプセルの充填重量を決定した。約１〜２ｍＬの移動相Ａを乳鉢に加えた。ただちにビーズを粉砕してペーストにした。必要である場合は、合計５ｍＬ以下まで、さらなる移動相Ａをペーストに加えた。２５０ｍＬの低光化学作用性メスフラスコにペーストを移した。乳鉢及び乳棒を、移動相Ａを用いて十分洗い流し、この洗液を同じフラスコに回収した。このフラスコを、全量の約４分の３まで移動相Ａで満たし、１５分間以上撹拌した。このフラスコを、その体積まで移動相Ａで満たした。得られた溶液の約２０ｍＬを、０．４５μｍナイロンフィルター（Acrodisc、直径２５ｍｍ）を通して濾過し、始めの５ｍＬを廃棄し、ＣＵ試料貯蔵液を得た。ＣＵ試料実用溶液は、１２．０ｍＬのＣＵ試料貯蔵液（２５ｍｇカプセル用）、または４．０ｍＬのＣＵ試料貯蔵液（７５ｍｇカプセル用）を２５ｍＬの低光化学作用性メスフラスコに入れ、その体積まで移動相Ａで希釈することにより調製した。得られたＣＵ試料実用溶液のシステアミン濃度は、約０．０４８ｍｇ／ｍＬであった。
【００４３】
データ解析
以下の式に従って、システアミン実用標準溶液濃度を計算した。システアミン濃度（Ｃstd）＝システアミン酒石酸水素塩分析参照標準のｍｇ×Ｐf／２５．０ｍＬ
【００４４】
Ｐfは標準材料の純度係数を表わす。以下の式に従って、Ｐfを計算した。Ｐf＝Ｂ×（１００−水）×Ｃ／１００
式中、Ｂ＝システアミン酒石酸水素塩分析参照標準中の無水システアミン遊離塩基（標準容器のラベル上に小数値として表わされる）、
水＝使用する日の７日以下前に、Karl FischerまたはＴＧＡによって測定される水含有量（百分率として表わされる）、及び
Ｃ＝シスタミン補正（標準容器のラベル上に小数値として表わされる）である。
【００４５】
以下の式に従って、１カプセルあたりのシステアミンの量を計算した。１カプセルあたりのシステアミンのｍｇ＝（ＡSam／ＡStd）×ＣStd×ＤＦ×（平均Ｗｔ／試料Ｗｔ）
式中、ＡSam＝１０μＬを注入して行った試料のクロマトグラムにおけるシステアミンのピーク面積、
ＡStd＝１０μＬを注入して行った全実用標準溶液のクロマトグラムにおけるシステアミンの平均ピーク面積、
ＣStd＝実用標準溶液中のシステアミンの濃度（ｍｇ／ｍＬ）、
ＤＦ＝希釈係数（７５ｍｇカプセルでは１２５；２５ｍｇカプセルでは４１．６６６７）、
平均Ｗｔ＝平均カプセル充填重量（ｍｇ）、及び
試料Ｗｔ＝試料重量（ｍｇ）である。
【００４６】
含量均一性では、以下の式に従って、１カプセルあたりのシステアミンの量を計算した。１カプセルあたりのシステアミンのｍｇ＝（ＡSam／ＡStd）×ＣStd×ＤＦ
式中、ＡSam＝１０μＬを注入して行った試料のクロマトグラムにおけるシステアミンのピーク面積、
ＡStd＝１０μＬを注入して行った全実用標準溶液のクロマトグラムにおけるシステアミンの平均ピーク面積、
ＣStd＝実用標準溶液中のシステアミンの濃度（ｍｇ／ｍＬ）、及び
ＤＦ＝希釈係数（７５ｍｇカプセルでは１５６２．５；２５ｍｇカプセルでは５２０．８）である。
【００４７】
ビーズ調製分析では、以下の式に従って、１カプセルあたりのシステアミンの量を計算した。１カプセルあたりのシステアミンのｍｇ＝（ＡSam／ＡStd）×ＣStd×ＤＦ×（平均Ｗｔ／試料Ｗｔ）
式中、ＡSam＝１０μＬを注入して行った試料のクロマトグラムにおけるシステアミンのピーク面積、
ＡStd＝１０μＬを注入して行った全実用標準溶液のクロマトグラムにおけるシステアミンの平均ピーク面積、
ＣStd＝実用標準溶液中のシステアミンの濃度（ｍｇ／ｍＬ）、
ＤＦ＝希釈係数（７５ｍｇの希釈係数、１５６２．５を使用）、
平均Ｗｔ＝平均カプセル充填重量（ｍｇ）（目標充填重量、３７０．４ｍｇを使用）、及び
試料Ｗｔ＝試料重量（ｍｇ）（試料の調製で使用した実際の重量を使用）である。
【００４８】
以下の式に従って、分析試料溶液、含量均一性試料溶液及びビーズ調製分析試料溶液について、表示値の百分率（％ＬＣ）を計算した。
％ＬＣ＝（システアミンのｍｇ）／ＬＣ×１００％
式中、システアミンのｍｇ＝適用可能な上記の式によって計算される量、及び
ＬＣ＝表示量（７５ｍｇまたは２５ｍｇ）（ビーズ調製分析では７５ｍｇを使用）である。
【００４９】
以下の式に従って、シスタミン等のシステアミン酒石酸水素塩に関連する物質の量（システアミン不純物を含む）を計算した。
関連物質のｍｇ＝（ＡRS／ＡStd）×ＣStd×ＲＲＦ×ＤＦ×（平均Ｗｔ／試料Ｗｔ）
式中、ＡRS＝１００μＬを注入して行った試料実用溶液のクロマトグラムにおける任意の関連物質のピーク面積（ＲＲＴ０．４８より前のピークは無視した；２度目の移動相Ａ／ブランクの注入（１００μＬ注入）のクロマトグラムで観測されたピークも無視した）、
ＡStd＝１０μＬを注入して行った全実用標準溶液のクロマトグラムにおけるシステアミンの平均ピーク面積、
ＣStd＝実用標準溶液中のシステアミンの濃度（ｍｇ／ｍＬ）、
ＲＲＦ＝比応答係数（シスタミンでは０．９８；他の関連物質では１．００）、
ＤＦ＝希釈係数（７５ｍｇカプセルでは１２．５；２５ｍｇカプセルでは４．１６６６７）、
平均Ｗｔ＝平均カプセル充填重量（ｍｇ）、及び
試料Ｗｔ＝試料実用溶液の調製で粉砕した試料の重量（ｍｇ）である。
【００５０】
以下の式に従って、シスタミン、及び他の各関連物質の重量パーセントを計算した。
各関連物質の％＝関連物質のｍｇ／システアミンのｍｇ×１００％
式中、関連物質のｍｇ＝上記で計算された関連物質の量、及び
システアミンのｍｇ＝分析試料のシステアミンの量である。
【００５１】
０．０５％以上の全関連物質を足し合わせることにより、関連物質合計の百分率を決定した。２８分以降のピークは無視した。純度計算に無関係であるとして、早く溶離するピークを無視した先行の電気化学検出法とは対照的に、前述の方法では早いピークは不純物であることが明らかとなり、上記のとおり早く溶離するピークを合わせた。
【００５２】
上記の手順に従って、５ロットの腸溶コーティングしたシステアミン（RP103）（遅延放出性、７５ｍｇ強度）、及び２ロットの腸溶コーティングしていないシステアミン（Cystagon（登録商標））（即時放出性）を試験し、関連物質の重量パーセントを決定した。ロット放出の時間（「時間０」）、及びロット放出後１２月または１８月後に、５個のRP103バッチを試験した。各関連物質の百分率は、システアミンの重量パーセントとして計算した。ＲＲＦを決定するのに十分な量の関連物質が単離されなかったため、各関連物質（シスタミンを除く）のＲＲＦには１．００を割りあてた。シスタミンでは、ＲＲＦは０．９８であると決定した。試験の結果を表１に示し、代表的なクロマトグラムを図１に示す。
【表２】
0006518658.tif 000003
【００５３】
これらの結果、腸溶コーティングしていないシステアミンと比較して、腸溶コーティングしたシステアミンでは、ロット放出時及びロット放出後１２月において、関連物質の合計が低いことが示された。例えば、即時放出性製品は５％未満のシスタミン不純物を含むことが電気化学検出法によって以前に示されているのに対し、本発明の方法は、多くの即時放出性システアミン配合物は、５％超のシスタミン不純物を含むことを示している。対照的に、遅延放出性組成物RP103は５％未満のシスタミン不純物を含むことを本方法は示している。さらに、ＵＶ検出法を使用してさらなるピーク、例えばピーク１、ピーク５及びピーク６（表１及び図１を参照のこと）が検出可能であり、これらは電気化学検出法によって検出されなかった。これらの結果は、本発明の方法が、システアミン配合物中に存在する関連物質の高感度且つ高精度の検出を提供することも示している。
実施例２
【００５４】
システアミンの即時放出性配合物中にある不純物の検出に従来使用されてきた電気化学検出と、システアミン酒石酸水素塩不純物のＵＶ検出を比較した。２つのシステアミン酒石酸水素塩試料（腸溶コーティングなし）をＨＰＬＣによって評価した。１番目の試料（試料Ａ）は、１ｍｇ／ｍＬの濃度でシステアミン酒石酸水素塩（ＣＢＴ）を含有し、チオモルホリン（ＴＭＰ）、チオモルホリン‐１‐オキシド（ＯＴＭＰ）、ピーク１（表１及び図１を参照のこと）（ＲＲＴ０．８５）、及びピーク４（表１及び図１を参照のこと）（Ｒ４）をこの試料に添加した。２番目の試料（試料Ｂ）は、１ｍｇ／ｍＬの濃度でシステアミン酒石酸水素塩（ＣＢＴ）を含有し、ランチオナミン（lanthionamine）（ＴＢＥＡ）、ピーク５（表１及び図１を参照のこと）（Ｒ５）、ピーク６（表１及び図１を参照のこと）（Ｒ６）、及びピークＤ（表１を参照のこと）（ＲＲＴ０．８９）をこの試料に添加した。両方の試料は、ＨＰＬＣ分析前に２〜３日間、５℃で保管した。
【００５５】
ATLANTIS T3 C18カラム（寸法：１５０ｍｍ×４．６ｍｍ；充填粒子サイズ：３μｍ）（Waters、Milford、Massachusetts）を使用し、定組成溶離ＨＰＬＣによって試料Ａ及びＢを評価した。オートサンプラーの温度は５℃であった。約１０μＬの試料をカラム上に注入した。カラム温度は４０℃であり、流速１．０ｍＬ／分で１５分間試料を溶離した。移動相は、８８／１２の水／アセトニトリル（ｖ／ｖ）中、８．８ｍＭのヘキサンスルホン酸ナトリウム一水和物、０．１％のＨ3ＰＯ4を含有した。針は水で洗浄した。
【００５６】
ＵＶ検出は、ＵＶ検出器を使用して２００ｎｍで行った。電気化学検出は、コンディションセル（２５０ｍＶ、５μＡ）及び分析セル（６５０ｍＶ、１００μＡ）を備えた電気化学検出器を使用して行った。
【００５７】
電気化学検出は、ＵＶ検出と比較してより高感度な検出法であると当初は思われていた。しかしながら図２に示すように、電気化学検出法（右パネルを参照のこと）と比較して、本明細書に記載されるＵＶ検出法（左パネルを参照のこと）によってさらなるピークが検出され、より良いピーク解像度が示された。図２においては、上部のパネルが試料Ａに対応し、下部のパネルが試料Ｂに対応する。
【００５８】
理論によって限定されることを意図するわけではないが、本明細書において同定され、ＵＶ検出器を使用して低波長で検出された不純物の多くは、電気化学検出器を使用して不純物が検出されるのに不可欠である酸化還元反応に耐えないと思われる。したがって以下に示すとおり、ＵＶ検出法は、電気化学検出法よりも多くの不純物ピークを同定する。
【００５９】
例えばＵＶ検出法は、電気化学検出によって同定されないチオモルホリン（ＴＭＰ）、チオモルホリン‐１‐オキシド（ＯＴＭＰ）、ピークＤ、ピーク４、ランチオナミン（ＴＢＥＡ）、ピーク５及びピーク６等のさらなる不純物ピークを同定した。
【００６０】
したがって本明細書において記載されるＵＶ検出法は、電気化学検出と比較して、感度がより高く、選択性はより少ないことを示した。
【図１】
0006518658.tif 000005
【図２Ａ】
0006518658.tif 000006
【図２Ｂ】
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