(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネにおけるイネ白葉枯病菌に対する防御応答を誘導するプラントアクティベーターであって、
β−アミリン、またはルペオールを有効成分として含み、
前記β−アミリンの場合には10μM、
前記ルペオールの場合には20μM含むプラントアクティベーター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐病性を向上させるプラントアクティベーターに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
プラントアクティベーターと呼ばれる一群の化合物は、植物の持つ免疫力を高め、その耐病性を向上させる薬剤である（例えば、特許文献１参照。）。なお、プラントディフェンスアクティベーターや抵抗性誘導剤と呼ばれることもある。
【０００３】
プラントアクティベーターは、複数の病害に対する広範な防除効果を持ち、薬剤耐性菌による効果の減衰もない。また、プラントアクティベーターの利用によって従来の殺菌性農薬の使用回数や量を低減できることから、持続的で環境負荷の少ない農業の実現に向けた利用拡大が期待されている。
【０００４】
特に、プラントアクティベーターは、病原体の感染に関係なく単に細胞死を引き起こす薬剤である「植物免疫誘導型プラントアクティベーター」と、感染時に発動される免疫応答を強める、もしくは早める薬剤である「植物免疫プライミング型プラントアクティベーター」とに区別できる。植物免疫プライミング型プラントアクティベーターの場合は生長阻害などの副作用はなく、実用性の高いプラントアクティベーターとして期待されている。
【０００５】
プラントアクティベーターは、これまでイネ栽培に特化した開発が進められてきた。これまでにプロペナゾール、アシベンゾラルＳメチル、チアジニル、イソチアニル、バリダマイシンＡなどがプラントアクティベーターとして販売されている。またつい最近もアラドプシスに対して有効なインプリマチンというプラントアクティベーターも開発されている。
【０００６】
これらのプラントアクティベーターは、植物の防御応答シグナル伝達経路、いわゆるサリチル酸経路に作用し、特にプロペナゾールやインプリマチンは病原体感染時における迅速な抵抗性発現への準備効果、すなわちプライミング効果により病害抵抗性を高めることが知られている。
【０００７】
一方、現在までのところ、ジャスモン酸やエチレンを介した防御応答シグナル伝達経路を活性化させるプラントアクティベーターは見いだされていない。
【０００８】
イネ白葉枯病菌などに対する抵抗性は通常、植物の防御応答シグナル伝達経路、いわゆるサリチル酸経路によって制御されている。このサリチル酸経路は一般的には植物ホルモンであるジャスモン酸と拮抗的相互作用を示すことが分かっている。
【０００９】
イネにおいてはいくつかの研究で、ジャスモン酸シグナル伝達がイネ白葉枯病菌に対する抵抗性をネガティブに制御することが明らかにされ、ジャスモン酸シグナル伝達の抑制が、サリチル酸を介した防御応答シグナル伝達経路を活性化させ、イネ白葉枯病菌に対する抵抗性を高める結果が報告されている。実際、現在よく使われているプラントアクティベーターであるオリザメート（登録商標）はプロペナゾールを主成分とし、サリチル酸経路の上流に作用してイネの抵抗性を活性化させる。
【００１０】
一方で、ジャスモン酸処理をしたイネではイネ白葉枯病菌に対する抵抗性を高める結果が報告されている。ジャスモン酸シグナル伝達自体が、防御応答を活性化させ、イネ白葉枯病菌に対する抵抗性を高める事例も幾つか明らかになってきている。
【００１１】
しかし、ジャスモン酸をプラントアクティベーターとして使用するには、その副作用が問題となる。すなわち、ジャスモン酸は、葉の老化（黄化）や細胞死を促進し、活性酸素生成によるミトコンドリアの死（白斑形成）、根の伸長抑制、花成の遅延、イネ種子の発芽抑制などに関与する。さらにジャスモン酸シグナル伝達とサリチル酸シグナル伝達の両方を抑制したときにもイネ白葉枯病菌に対する抵抗性を高める結果が報告されている。
【００１２】
これらの相反する事例に対する解釈は、イネにおいてはジャスモン酸シグナル伝達とサリチル酸シグナル伝達との間の拮抗作用機構が明らかになっていないため、現時点ではよく分かっていない。
【００１３】
また、植物の主要な二次代謝産物として知られているトリテルペンは、イソプレノイド生合成上のMVA経路を介して生産されている。トリテルペンの構造は、環状化様式や修飾様式の違いにより多岐にわたっているが、その構造の多様化から多くの有益な生理活性をもたらすため、植物から抽出されるトリテルペンの構造の同定、及びその骨格の形成に関与するOxidosqualene cyclase (OSC)の酵素学的な機能同定が、近年急速に進められている。例えば、トリテルペンは一般的に植物の環状トリテルペンは葉や果実の表面に蓄積するワックスの構成物質であると認識されている。
【００１４】
特に、トリテルペンは、抗炎症作用、抗酸化作用など、動物に対し様々な生理活性を示すことが分かっている一方で、環状トリテルペン類の植物に対する生理学的機能は、ほとんど明らかとなっていない。
【００１５】
本発明者は、イネにおいてトリテルペン合成やステロール合成に関与する１２個のOSC(OxidoSqualene Cyclase)遺伝子の存在を確認した（例えば、非特許文献１参照。）。
【００１６】
なお、エンバク（燕麦）では、配糖化トリテルペンの一種であるサポニンが生産され、このサポニンは抗菌活性を有しており、サポニンの前駆体としてβ−アミリンが生産されていることが知られているが、新潟大学と中国のグループによって、これらのイネのOSC遺伝子群中にβ−アミリン合成酵素遺伝子が存在しないことも確認されている（例えば、非特許文献２及び非特許文献３参照。）。すなわち、通常、イネにおいてトリテルペンやサポニンが生産されることはない。
【００１７】
そこで、本発明者はサポニンに着目し、その前駆体であるβ−アミリンの合成酵素遺伝子（AsbAS1）を導入した組換え体イネを作出して、遺伝子組換えによりイネにサポニンの生産能力を付与することで、イネの発芽／幼苗時における病原菌に対する耐病性の獲得を目指した研究を行っている。
【００１８】
まず、本発明者は、β−アミリン合成酵素（AsbAS1）遺伝子を導入したイネにおいて、GC-MSによる代謝物の解析から、この組換え体イネにβ−アミリンが蓄積されていることを確認した（例えば、非特許文献４参照。)。
【００１９】
さらに、日本晴イネ(WT)と組換え体イネ(#22)に対してマイクロアレイ解析を行って、組換え体イネ(#22)において、日本晴イネ（WT）を基準として発現量が数倍〜数十倍に増加している遺伝子を以下のように特定した。
ジャスモン酸合成系遺伝子群に対して相同遺伝子群のOsLOX4、OsAOS3、OsOPR3、OsOPR4、
ジテルペン合成酵素遺伝子群のOsCPS2、OsCPS4、OsKSL4、OsKSL7、OsKSL8、OsKSL10、
防御関連遺伝子群のPR1a、PR5、PR8、PBZ1、WRKY69、LRR。
ここで、PR1a、PR5、PR8は抗菌性タンパク質、PBZはプロベナゾールで特異的に誘導される防御関連遺伝子、WRKYは転写因子、LRRはロイシンリッチリピート型受容体類縁遺伝子を示す。
【００２０】
また、日本晴イネ(WT)と組換え体イネ(#22)に対して半定量的PCRによる発現遺伝子の解析を行って、組換え体イネ(#22)において、日本晴イネ（WT）を基準として発現量が明らかに増加している遺伝子を以下のように特定した。
ジテルペン合成酵素遺伝子群のOsCPS2、OsCPS4、OsKSL4、OsKSL7、OsKSL8、OsKSL10、
防御関連遺伝子群のPR1a、PR8、PBZ1、LRR。
【００２１】
すなわち、β−アミリンの蓄積により、
ジテルペン合成酵素遺伝子群のOsCPS2、OsCPS4、OsKSL4、OsKSL7、OsKSL8、OsKSL10、
防御関連遺伝子群のPR1a、PR8、PBZ1、
ジャスモン酸合成系相同遺伝子群のOsLOX4、OsAOS3、OsOPR3、OsOPR4、
の発現が高まることが確認できた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】特開２０１３−０８２６６１号公報
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】Inagaki et al., New Phytologist (2011) 191, 432_448.
【非特許文献２】Ito et al., Org. Lett. 2011, 13(10):2678-2681.
【非特許文献３】Xue et al., New Phytologist, 2012, 193:1022-1038.
【非特許文献４】Inagaki et al., New Phytologist (2011) 191, 432_448.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
このように、β−アミリンによって活性化される遺伝子があることから、β−アミリンが新規なプラントアクティベーターと成り得ることを知見し、今まで知られていなかった新規なプラントアクティベーターを提供するものである。さらに、類縁のトリテルペンであるルペオールもまた新規なプラントアクティベーターと成り得ることを知見している。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明のプラントアクティベーターは、イネにおけるイネ白葉枯病菌に対する防御応答を誘導するプラントアクティベーターであって、β−アミリン、またはルペオールを有効成分として含み、β−アミリンの場合には10μM、ルペオールの場合には20μM含むプラントアクティベーターである。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のプラントアクティベーターであるβ−アミリンでは、既知のサリチル酸経路やジャスモン酸経路とは異なる抵抗性シグナル伝達経路が活性化されることで病害抵抗性が亢進されており、既存のプラントアクティベーターでは対応が困難な病気に対する耐性を向上させることができるプラントアクティベーターを提供できる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】日本晴イネ（WT）に対するβ-アミリン噴霧処理時（10μM及び100μM）及びプロペナゾール噴霧処理時（100μM及び200μM）のジテルペン合成系遺伝子群に関する発現解析の結果である。
【図２】日本晴イネ（WT）に対するβ-アミリン噴霧処理時（10μM及び100μM）及びプロペナゾール噴霧処理時（100μM及び200μM）の防御関連遺伝子群に関する発現解析の結果である。
【図３】日本晴イネ（WT）の土栽培に対するβ-アミリン水溶液（10μM+100ppmデタージェント（NUC-Silicone, L-77））を根に与えた時及びプロペナゾール水溶液を根に与えた時（10μM+100ppmデタージェント及び20μM+100ppmデタージェント）のイネ白葉枯病菌（Xanthomonas oryzea pv. oryzae, T7174R株）に対する病害抵抗性亢進の結果である。
【図４】日本晴イネ（WT）の土栽培に対するルペオール水溶液（20μM+50ppmデタージェント（NUC-Silicone, L-77））、ベツリン水溶液（20μM+50ppmデタージェント（NUC-Silicone, L-77））を根に与えた時及びプロペナゾール水溶液を根に与えた時（20μM+50ppmデタージェント）のイネ白葉枯病菌（Xanthomonas oryzea pv. oryzae, T7174R株）に対する病害抵抗性亢進の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明のプラントアクティベーターは、β−アミリンまたはルペオールを有効成分として含むものである。
【００２９】
特に、β−アミリンまたはルペオールを含有する液体から成るプラントアクティベーターとして、植物に前記液体を水溶液の形で与えることで病害抵抗性誘導活性を生じさせることができ、取り扱い性も良好なプラントアクティベーターを提供できる。
【実施例１】
【００３０】
10日齢の日本晴イネ（WT）に外部からβ-アミリンを噴霧し、その２日後（12日齢）におけるジテルペン合成系遺伝子群及び防御関連遺伝子群の発現を半定量的RT-PCRにより解析した。ここで、日本晴イネ（WT）に、β-アミリンを10μＭ噴霧した場合（B10）と、β-アミリンを100μＭ噴霧した場合（B100）と、プロペナゾールを100μＭで噴霧した場合（P100）と、プロペナゾールを200μＭで噴霧した場合（P200）と、コントロールとして0.5%のEtOHと250ppmのシリコン系界面活性剤（Nuc-Sikicone L-77）との混合液を噴霧した場合（Ｃ）の５種類の試験を行った。
【００３１】
図１に示すように、β-アミリン処理を行ったイネでは10μM噴霧（B10）及び100μM噴霧（B100）のどちらにおいても、ジテルペン合成経路遺伝子群のCPS2, CPS4, KSL4, KSL7, KSL8, KSL10がそれぞれ活性化していることが確認された。Actinはイネのアクチン遺伝子である。
【００３２】
また、図２に示すように、β-アミリン処理を行ったイネでは10μM噴霧（B10）及び100μM噴霧（B100）のどちらにおいても、防御応答関連遺伝子群のPR1, PR8, PBZがそれぞれ活性化していることが確認された。また、データとしては示していないがジャスモン酸合成経路相同遺伝子のOsLOX4、OsAOS3、OsOPR3、OsOPR4も活性化していることを確認した。
【００３３】
このことは、β-アミリン本体が、これらイネにおける防御応答を誘導した可能性を示しており、β-アミリンはトリテルペンの中でも特にプラントアクティベーターとして病害抵抗性誘導活性があると考えられる。
【００３４】
しかも、β-アミリンは所定濃度とした液体として植物に水溶液の形で根に与えるだけでよく、極めて取り扱いやすいプラントアクティベーターとして利用できる。
【実施例２】
【００３５】
日本晴イネ（WT）をβ-アミリン10μＭ+シリコン系界面活性剤（Nuc-Sikicone L-77）100ppm濃度の水溶液として14日齢まで育苗し、14日齢時の日本晴イネ（WT）にイネ白葉枯病菌（Xanthomonas oryzea pv. oryzae, T7174R株）を鋏切接種した。その後、14日後（28日齢時）に病徴の伸展長を計測した。ここで、日本晴イネ（WT）の根に水溶液の形で、β-アミリン0μＭ+シリコン系界面活性剤（Nuc-Sikicone L-77）100ppm濃度の水溶液（C+）と、β-アミリンを10μＭで与えた場合（BA10）と、プロペナゾールを10μＭで与えた場合（PBZ10）と、プロペナゾールを20μＭで与えた場合（PBZ20）（全ての場合において、シリコン系界面活性剤（Nuc-Sikicone L-77）が100ppm含まれる）の４処理区に対して病原菌感染試験を行った。
【００３６】
図３に示すように、β-アミリン10μMの水溶液を与えたイネ（BA10）では、（PBZ10）と（PBZ20）同様、イネ白葉枯病菌（Xanthomonas oryzea pv. oryzae, T7174R株）に対する病害抵抗性が有意に亢進していることが確認された。＊印はT検定で有意（P<0.05）であったことを示す。なお、図3において、コントロール（C+）の病徴の伸展度合を1とした時の他の処理区の度合をDisease Indexとしている。
【００３７】
日本晴イネ（WT）をベツリン20μＭ+シリコン系界面活性剤（Nuc-Sikicone L-77）50ppm濃度の水溶液（BT20）、及びルペオール20μＭ+シリコン系界面活性剤（Nuc-Sikicone L-77）50ppm濃度の水溶液（LP20）として14日齢まで育苗し、14日齢時の日本晴イネ（WT）にイネ白葉枯病菌（Xanthomonas oryzea pv. oryzae, T7174R株）を鋏切接種した。その後、14日後（28日齢時）に病徴の伸展長を計測した。ここで、日本晴イネ（WT）の根に水溶液の形で、シリコン系界面活性剤（Nuc-Sikicone L-77）50ppm濃度の水溶液（コントロール：C）と、ベツリンを20μＭで与えた場合（BT20）と、ルペオールを20μＭで与えた場合（LP20）と、プロペナゾールを20μＭで与えた場合（PBZ20）（全ての場合において、シリコン系界面活性剤（Nuc-Sikicone L-77）が50ppm含まれる）の４処理区に対して病原菌感染試験を行った。
【００３８】
図４に示すように、ルペオール20μＭの水溶液を与えたイネ（LP20）では、イネ白葉枯病菌（Xanthomonas oryzea pv. oryzae, T7174R株）に対する病害抵抗性が有意に亢進していることが確認された。＊印はT検定で有意（P<0.05）であったことを示す。なお図４において、コントロール（C）の病徴の伸展度合を1とした時の他の処理区の度合をDisease Indexとしている。
【図１】
0006455833.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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