(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
聴覚機能が低下している耳の蝸牛の少なくとも一部分と組成物を接触させることによって、対象者における難聴を予防するための、又は治療前は聴覚機能が低下していた治療対象者の聴覚の少なくとも部分的な修復を得るための前記組成物において、
前記組成物は、薬学的に許容されるビヒクル内に、下記式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物を含み、
【化１】
0006601882.tif 000004
式中、Ｒ１はＨ又はＲ−ＣＯであって、ＲはＨ、ＣＨ３又はＣ２Ｈ５であり、Ｒ２はＨ又はＯＨであり、Ｒ３は−ＮＲ５Ｒ６であり［ここで、Ｒ５はＨ又は−（ＣＨ２）３ＮＨ２であり、Ｒ６は−（ＣＨ２）４ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨ２、−（ＣＨ２）２−イミダゾール−４−イル及び−（ＣＨ２）２−インドール−３−イルからなる群から選択される］、Ｒ４は、Ｒ又はＳの立体配置の不斉中心を得るように配置された２０、２２、２４、２５、２６又は２７位のＨ又はＯＨであり、Ｚ１及びＺ２の各々は、それぞれ炭素原子Ｃ７とＣ８及びＣ２２とＣ２３の間の二重結合数を表し（０又は１）、Ｔ１、Ｔ２及びＴ３は互いに独立してＨ又はＣＨ３であり、Ｔ４は、２４位でＲ又はＳの立体配置の不斉中心を得るように配置されたＨ、ＣＨ３、又はＣ２Ｈ５であり、
及び／又は式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物の薬学的に許容される少なくとも１つの塩を含んでいることを特徴とする組成物。
【請求項２】
式（Ｉ）の化合物が、Ｚ１は０、Ｒ１はＨ、Ｒ２はＯＨ、Ｒ３はＮＨＲ６であり［ここでＲ６は−（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ２又は−（ＣＨ２）２−イミダゾール−４イルである］、Ｔ１＝Ｔ２＝Ｔ３＝Ｈであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
式（Ｉ）の化合物が、Ｚ１は０又は１、Ｒ１はＨ、Ｒ２はＯＨ、Ｒ３は−ＮＨＲ６であり［ここでＲ６は−（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ２又は−（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ２である］、Ｔ１＝Ｔ２＝Ｔ３＝Ｈ、Ｒ４は２２又は２７位のＨ又はＯＨであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
式（Ｉ）の化合物が、Ｚ１は０、Ｒ１はアセチル、Ｒ２はＯＨ、Ｒ４はＨ、Ｒ３はＮＨ−（ＣＨ２）２−イミダゾール−４−イル及びＴ１＝Ｔ２＝Ｔ３＝Ｈであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
信号変換器（有毛細胞又は電極）から脳に向かっての聴覚信号の伝達を改善するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
治療対象者に予め設置された蝸牛インプラントの有効性を改善するための、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
治療対象者に対し、螺旋神経節のニューロン又は内有毛細胞及び外有毛細胞の
数及び／又は機能性を刺激するための少なくとも１つの療法を実施する前に、前記対象者における前記ニューロンの機能性を改善するための、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
外傷又は疾病に起因する難聴を理由として蝸牛インプラントの設置を必要とする対象者における前記蝸牛インプラントの移植前に螺旋神経節のニューロンの機能性を維持するための、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
内耳全体又はその一部分を修復することを目指す療法からの効果をその後に対象者が、より多く享受できるようにすることを目的とし、前記療法が、内耳全体又はその一部分の中での、幹細胞の移植、支持細胞の分化転換による有毛細胞の再生、遺伝子導入及び遺伝子ブロックからなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
耳毒性レベルの騒音、耳毒性作用物質、放射線、抗生物質、抗炎症薬、化学療法剤、重金属、又は対象者の加齢により発症した外傷を有する対象者に対し、修復が恩恵を与えることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
耳炎、ペンドレッド症候群、ニーマンピック症候群、スミス−レムリーオピッツ症候群、スティックラー症候群、チャージ症候群、ジャーベル・ランゲニールセン症候群、ノリエ症候群、アッシャー症候群、ワールデンブルグ症候群、ペロー症候群、神経線維腫症２型、鰓弓耳腎症候群からなる群の中から選択される疾病により発症した難聴を有する対象者に対し、修復が恩恵を与えることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
一方では螺旋神経節のニューロンと、他方では有毛細胞又は蝸牛電極との間の結合の質を維持及び／又は改善するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、難聴の対処に関する。より厳密には、本発明は、式Ｉの分子又はこの化合物の薬学的に許容できる塩の使用に関する。本発明に係る組成物は、対象者に対して、対象者の難聴を回避するか又はその聴覚を修復するために投与される。
【背景技術】
【０００２】
難聴は世界保健機構によると（２０１２年）、世界中で３億６０００万人以上の人が患っている一般的疾患である。世界保健機構が考慮に入れた難聴は、２５ｄＢを超える喪失である。この病気は、これを患う者及び社会にとって、経済的にも感情的にも重大な有害な影響をもたらす（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。加齢（６５才超のヒトの５０％、７５才超のヒトの８０％が罹患している）、騒音、身体的又は心的外傷、さらには遺伝的因子などの多くの因子が、有毛細胞の機能不全又は喪失、それに続いて難聴を導く聴神経の変性の原因となり得る。
【０００３】
損傷を受けていない聴覚器官の中で、音は鼓膜の振動により脳の専門化した細胞に伝達され、鼓膜は内耳に対して機械的に情報を伝達することが知られている。内耳内には、前記機械的信号を電気信号に変換する有毛細胞（以下ＨＣと呼ぶ）があり、螺旋神経節のニューロン（以下ＳＧＮと呼ぶ）により脳に伝達される電気情報を生成する。有毛細胞は、「蝸牛」と呼ばれる螺旋状の器官により担持され、蝸牛は、並んで配置され一方は外リンパ、他方は内リンパという液体が満たされた２つの螺旋状のチャンバを有し、これら２つのチャンバの間に有毛細胞が配置されている。
【０００４】
中度又は重度の感音性難聴は、少なくとも３つのタイプの機能不全に起因しうる。第１には、感覚細胞ＨＣの機能不全又は部分的喪失、第２には、細胞ＨＣの信号を脳に伝達する、螺旋神経節のニューロン（以下略してＳＧＮと呼ぶ）の軸索変性（聴覚神経疾患）、そして第３には、細胞ＨＣとニューロンＳＧＮの間のシナプス結合の構造破壊（聴覚シナプス変性症）である。難聴を引き起こすこれらの異なる機序は、図１に図式化されており、この図については、本明細書の中で詳しく後述される。
【０００５】
有毛細胞が喪失した場合、信号は、蝸牛インプラントによって伝達されうる。それは、細胞ＨＣに代わる電極を有する。ヒトにおいては、このような場合、ＳＧＮは変性し、特に細胞ＨＣの方を指すその軸索を失うが、死滅するわけではない。したがって、聴覚の維持又は回復の鍵は、細胞ＨＣ又は蝸牛インプラントのいずれであれ、ＳＧＮと音響信号を受け取る変換器との間の結合を再構築することのできる軸索の再生にある。
【０００６】
細胞ＨＣの喪失に結びつけられる難聴については、蝸牛インプラントだけが唯一聴覚を改善するが、その有効性は、ＳＧＮの完全性によって直接影響され、このインプラントは、ＳＧＮの変性を妨げるわけではない。したがって、神経終端と電極の間の距離を減少させることのできる軸索の再成長は、蝸牛インプラントの有効性を改善するために有利なアプローチである（非特許文献５）。他の全ての形態については、今日までのところ、満足のいく対症的解決法も治癒的解決法も存在しない。ニューロンの存続及び軸索再成長に対して有益な効果を示した唯一の分子である神経栄養因子は、体重減少（非特許文献６）、制御不能の細胞移動（非特許文献７）及びショワン細胞の異常増殖に結びつけられるガンのリスク（非特許文献８）などの副作用を理由として使用不可能である。徹底的な研究にも関わらず、これまでのところ、以上の問題点を解決するための満足できる解決法はなく、したがって、新しいアプローチが必要である。
【０００７】
多能性胚腫瘍細胞のニューロン分化、培養中の運動ニューロンの存続、成人ニューロン前駆細胞の増殖及び分化を誘発する化合物である、新規のステロール誘導体がすでに記述されている。（非特許文献９及び非特許文献１０）。当業者であっても、当然ここから、これらの化合物が、以上で指摘したように、治療対象ゾーン内のニューロンの数の問題ではなく、ニューロンの結合の問題に結びつけられる病状について有利であることを演繹することはできない。したがって、当業者は、一方ではニューロンＳＧＮと、他方では少なくとも部分的に機能的である有毛細胞又は蝸牛インプラントの電極で構成される信号エミッタとの間の結合を再形成するために、前記ステロール誘導体を利用しようとは絶対にしないと思われる。
【０００８】
ところが、今日、本発明によると、ストレスにより難聴にされた実験室動物に対しこれらの化合物を使用した場合、（有毛細胞に代わる蝸牛インプラントの電極により）電気パルスの形に翻訳された音情報の伝達の維持が得られ、ここで該情報は、ＳＧＮを通して脳へ向かって、しかも前記動物のＳＧＮ数を増大させることなく伝達されることが確認されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ｄｅ  Ｇｒａａｆら、Ｐｓｙｃｈｏｓｏｍ  Ｍｅｄ  ６４、６１〜７０
【非特許文献２】Ｆｅｌｌｉｎｇｅｒら、Ａｃｔａ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ  Ｓｃａｎｄ  １１５、２４３〜５
【非特許文献３】Ｆｅｌｌｉｎｇｅｒら、Ｓｏｃ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  ４０、７３７−４２
【非特許文献４】Ｍｏｈｒら、Ｐｏｌｉｃｙ  Ａｎａｌ  Ｂｒｉｅｆ  Ｈ  Ｓｅｒ２、１〜４
【非特許文献５】Ｓｈｉｂａｔａら、Ｈｅａｒ  Ｒｅｓ  ２８１、５６〜６４
【非特許文献６】Ｗｉｎｋｌｅｒら、Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ４１、８２〜９３
【非特許文献７】Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  １１３、３１〜７
【非特許文献８】Ｅｒｉｋｓｄｏｔｔｅｒ  Ｊｏｎｈａｇｅｎら、Ｄｅｍｅｎｔ  Ｇｅｒｉａｔｒ  Ｃｏｇｎ  Ｄｉｓｏｒｄ  ９、２４６〜５７
【非特許文献９】ｄｅ  Ｍｅｄｉｎａら、２００９、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５２、７７６５〜７７
【非特許文献１０】Ｋｈａｌｉｆａら、２００３、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ４４６、６８１〜６
【発明の概要】
【００１０】
したがって、本発明の目的は、聴覚機能が低下している耳の蝸牛の少なくとも一部分と医薬組成物を接触させることによって、対象者における難聴を予防するための、又は治療前は聴覚機能が低下していた治療対象者の聴覚の少なくとも部分的な治療的修復を得るための前記医薬組成物において、
該組成物は、薬学的に許容されるビヒクル内に、有意な用量の下記式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物を含み、
【化１】
0006601882.tif 000002
式中、Ｒ１はＨ又はＲ−ＣＯであって、ＲはＨ、ＣＨ３又はＣ２Ｈ５であり、
Ｒ２はＨ又はＯＨであり、
Ｒ３は−ＮＲ５Ｒ６であって、Ｒ５はＨ又は−（ＣＨ２）３ＮＨ２であり、Ｒ６は−（ＣＨ２）４ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨ２、−（ＣＨ２）２−イミダゾール−４−イル及び−（ＣＨ２）２−インドール−３−イルからなる群から選択され、
Ｒ４は、Ｒ又はＳの立体配置の不斉中心を得るように配置された２０、２２、２４、２５、２６又は２７位のＨ又はＯＨであり、
Ｚ１及びＺ２は、それぞれ原子Ｃ７とＣ８及びＣ２２とＣ２３の間の二重結合数（０又は１）であり、
Ｔ１、Ｔ２及びＴ３は互いに独立してＨ又はＣＨ３であり、
Ｔ４は、２４位でＲ又はＳの立体配置の不斉中心を得るように配置されたＨ、ＣＨ３、又はＣ２Ｈ５であり、
及び／又は式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物の薬学的に許容される少なくとも１つの塩を含んでいることを特徴とする組成物にある。
【００１１】
上で規定された組成物の中で、以下の特徴を有する下位群の化合物について得られた結果が特に有利であったことが確認された。すなわち、
ａ）式（Ｉ）において、Ｚ１は０、Ｒ１はＨ、Ｒ２はＯＨ、Ｒ３は−ＮＨＲ６であり［ここでＲ６は−（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ２又は−（ＣＨ２）２−イミダゾール−４イルである］、Ｔ１＝Ｔ２＝Ｔ３＝Ｈである化合物、
ｂ）式（Ｉ）において、Ｚ１は０又は１、Ｒ１はＨ、Ｒ２はＯＨ、Ｒ３は−ＮＨＲ６であり［ここでＲ６は−（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ２又は−（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ２である］、Ｔ１＝Ｔ２＝Ｔ３＝Ｈ、Ｒ４は２２又は２７位のＨ又はＯＨである化合物、
ｃ）式（Ｉ）において、Ｚ１は０、Ｒ１はアセチル、Ｒ２はＯＨ、Ｒ４はＨ、Ｒ３はＮＨ−（ＣＨ２）２−イミダゾール−４−イル及びＴ１＝Ｔ２＝Ｔ３＝Ｈである化合物である。
【００１２】
本発明の第１の態様によると、本発明に係る組成物によってもたらされる修復は、治療対象者に予め設置された蝸牛インプラントの有効性の改善である。
【００１３】
本発明の別の態様によると、本発明に係る組成物を用いて得られる修復は、治療対象者に対し、螺旋神経節のニューロン又は内有毛細胞及び外有毛細胞を刺激するための少なくとも１つの療法を実施する前に、該治療対象者における前記ニューロンの機能性を改善する。
【００１４】
本発明の別の態様によると、本発明に係る組成物によってもたらされる修復は、外傷又は疾病に起因する難聴を理由として蝸牛インプラントの設置を必要とする対象者に対して恩恵を与え、前記修復は、前記蝸牛インプラントの移植の前に螺旋神経節のニューロンの機能性を維持する。
【００１５】
本発明の別の態様によると、本発明に係る組成物は、内耳全体又はその一部分を修復することを目指す療法からの効果をその後に対象者が、より多く享受できるようにするために使用され、前記療法は、内耳全体又はその一部分の中での、幹細胞の移植、支持細胞の分化転換、遺伝子導入及び遺伝子ブロックからなる群の中から選択される。
【００１６】
本発明の別の態様によると、本発明に係る組成物は、経口投与、静脈内投与、鼓室内投与、蝸牛内投与、頭蓋内投与、鼻腔内投与、蝸牛の正円窓又は卵円窓上投与、又は鼓膜上投与される。
【００１７】
本発明の別の態様によると、本発明に係る組成物は、前記組成物が含侵された又は塗布された電極、前記組成物が装填されたカニューレを含む電極、又は式（Ｉ）の１つ以上の化合物で部分的に構成された電極によって内耳内に配置される。
【００１８】
本発明の別の態様によると、本発明に係る組成物によって得られる修復は、耳毒性レベルの騒音、耳毒性作用物質、例えば、放射線、抗生物質、抗炎症薬、化学療法剤、重金属、又は対象者の加齢により発症した外傷を有する対象者に対し恩恵を与える。
【００１９】
本発明の別の態様によると、本発明に係る組成物は、耳炎、ペンドレッド（Pendred）症候群、ニーマンピック（Niemann-Pick）症候群、スミス−レムリーオピッツ（Smith-Lemli-Opitz）症候群、スティックラー（Stickler）症候群、アルポート（Alport）症候群、チャージ（CHARGE）症候群、ジャーベル・ランゲーニールセン（Jervell and Lange-Nielsen）症候群、ノリエ（Norrie）症候群、アッシャー（Usher）症候群、ワールデンブルグ（Waardenburg）症候群、ペロー（Perrault）症候群、神経線維腫症２型、及び鰓弓耳腎症候群からなる群の中から選択された疾病により発症した難聴を有する対象者に恩恵を与える修復を可能にする。
【００２０】
また、本発明は、一方ではＳＧＮと、他方では有毛細胞又は蝸牛インプラント電極との間の結合の質を維持及び／又は改善するための、以上で規定した組成物の使用である。
【００２１】
本発明の実施は、３つの例によって例示されており、５つの図を含む図面はこれらに対応している。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明が改善できる感音性難聴をもたらす内耳の異なる疾患並びにそれに関係する細胞作用に関する図式である。                                           この図は、３つの枠組を含んでいる。すなわち、左の枠組は、内耳疾患のない対象者の場合におけるＳＧＮと細胞ＨＣのシナプス結合Ｓを提示する。中央の枠組は、３つの機能不全の症例Ａ、Ｂ、ＣにおけるＳＧＮ／ＨＣ結合の状態を提示する。すなわち、機能不全Ａにおいて、ニューロンＳＧＮはもはや、以前にＳに接続されていた細胞ＨＣ（破線）の無機能を理由としてそのシナプスＳの情報を受けとらない。機能不全Ｂにおいては、ＳＧＮは、そのシナプスがもはやその結合の役目を果たさないこと（左欄）、及びＳＧＮが変性すること（右欄）から、そのシナプスの情報を受けとらない。機能不全Ｃにおいては、ＳＧＮはもはや作動可能な受容シナプスを有さず（左欄）、したがって、細胞ＨＣ由来の放射はもはやＳＧＮに供給されず、その時からＳＧＮは変性する（右欄）。右欄は、機能不全Ａ（ＨＣ喪失）、Ｂ（シナプス変性症）及びＣ（神経障害）が関与する要素に対して製品ＤＡ又はＤＢを作用させた時の結果を提示し、右欄の表現は、治療及び聴覚の部分的回復後の状態を示す（矩形Ｄは、ＳＧＮの電気刺激を図式化している）。
【図２】本発明に係る組成物を用いた治療が、ネオマイシンによる聴神経障害の誘発開始から２日後に始まった場合の、電気聴性脳幹反応（ｅＡＢＲ）の経時的推移曲線を示すグラフである。
【図３】前記組成物での治療が、ネオマイシンによる聴神経障害の誘発開始から１６日後に始まった場合の、電気聴性脳幹反応（ｅＡＢＲ）の経時的推移曲線を示すグラフである。
【図４】ネオマイシンに曝露されなかった耳について得られるもの（図４の左側の最初の棒）に比べた、図１及び２に関連する実験における螺旋神経節のニューロン数を示す、棒グラフである。
【図５】図４に報告した螺旋神経節のニューロン数の定量化並びに治療によってもたらされた軸索再成長を例示する、蝸牛軸の中央レベルで取った蝸牛の小薄片の３枚の一連の写真である。各写真には、治療のために使用された製品の内容（ＡＰ、ＤＢ及びＧＤＥＦ）を表示している。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
図中、以下の略語が使用されている。
ＡＰ：人工外リンパ液（リンゲル・アセテート）
ＤＡ：６β−［２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−エチルアミノ］−コレスタン−３β，５α−ジオール
ＤＢ：６β−［３−（４−アミノブチルアミノ）プロピルアミノ］−コレスタン−３β，５α−ジオール
ｅＡＢＲ：電気聴性脳幹反応
Ｎｅｏ：ネオマイシン
ＧＤＮＦ：グリア細胞由来神経栄養因子
ＳＧＣ：螺旋神経節の細胞
【００２４】
表１は、ＳＧＮ密度及び電気聴性脳幹反応（ｅＡＢＲ）に対する実施例１ないし３の中で使用された分子の効果をまとめている。
【００２５】
【表１】
0006601882.tif 000003
【００２６】
以下では、「結合」及び「シナプス結合」なる用語は、螺旋神経節のニューロンの適切な刺激を可能にする蝸牛インプラントの電極又は有毛細胞と螺旋神経節のニューロンとの間の機能的相互作用を意味する。
【００２７】
「ストレス」なる用語は、機能的シナプス結合の喪失の原因及び／又は螺旋神経節のニューロン投射の喪失の原因を意味する。
【００２８】
実施例１ないし３の研究をモルモット（体重２５０〜５００ｇ）について行った。蝸牛インプラントをまねるために、蝸牛内に挿入される白金−イリジウム電極を、全ての動物に装備させた。Ｒａｐｈａｅｌ及びその共同研究者によって記述されたプロトコルにしたがって、実験を行った（Ｓｈｉｎｏｈａｒａら、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９、１６５７〜６０））。
【実施例】
【００２９】
実施例１：螺旋神経節のニューロンＳＧＮの興奮性に対する、式（Ｉ）の誘導体を用いた早期治療効果
【００３０】
動物に麻酔を施し（体重１ｋｇあたり１０ｍｇのキシラジン及び体重１ｋｇあたり４０ｍｇのケタミンを筋肉注射）、耳介後部で内耳を切開した。１０％の硫酸ネオマイシン２４μｌの入った予め充填したカニューレを、毎時０．５μｌの流量を有する浸透圧ミニポンプ（ＡＬＺＥＴ  ２００２、ＤＵＲＥＣＴ  Ｃｏｒｐ、ＣＡ、ＵＳＡ）に連結した。カニューレは、鼓室階に到達するように正円窓の近傍で蝸牛内に進入した。４８時間後に、カニューレに６β−［２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−エチルアミノ］−コレスタン−３β，５α−ジオール溶液（１μＭ）か、６β−［３−（４−アミノブチルアミノ）プロピルアミノ］−コレスタン−３β，５α−ジオール溶液（１μＭ）か、ＧＤＮＦ（１μｇ／ｍｌ）か、あるいは対照として人工外リンパ液を充填した。２週間後に、ポンプを取外し、同様に予め充填された同一の新しいポンプと取替えた。さらに２週間後に、ポンプを取外し、カニューレをさらに２週間埋込んだ。この技術は、以上で特定したＳｈｉｎｏｈａｒａの刊行物の１６５８頁目に詳述されている。
【００３１】
ポンプの設置時点で正円窓を介して蝸牛（鼓室階）内に１．５ｍｍ挿入されたイリジウム−白金電極（Ｐｔ−Ｉｒ９０％〜１０％、直径２５０μｍ）を用いて、電気聴性脳幹反応（ｅＡＢＲ）の閾値測定を行い、対極板（Ｐｔ−Ｉｒ、直径１２５μｍ）を首筋の筋肉下で、後頭骨に接して設置した。実験全体を通したｅＡＢＲ閾値測定は、第２週までは、グループ間での有意な差異を示さなかった。それ以降は、図２に示されるように、治療対象グループと対照グループの間には、ｅＡＢＲ閾値の有意な減少が存在した（第２週でＰ＜０．０５、４週間を超えるとＰ＜０．００１）。第６週以降は、対照グループの動物では、いかなるｅＡＢＲも得ることができなかった。以上で規定したものと同じ条件下に置かれたものの、製品ＤＡ又はＤＢによる治療を受けていない動物に対して、起こりうるｅＡＢＲ刺激はなかった。
【００３２】
実施例２：螺旋神経節のニューロンの興奮性に対する、実施例１で使用された誘導体ＤＡ又はＤＢを用いて実施された遅延治療の効果
【００３３】
使用される手順は、硫酸ネオマイシンの注入後、ポンプには２週間、人工外リンパ液が充填されるという点以外、実施例１の場合と同じである。取替えの際に、ポンプを、６β−［２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−エチルアミノ］−コレスタン−３β，５α−ジオール溶液（１μＭ）か、６β−［３−（４−アミノブチルアミノ）プロピルアミノ］−コレスタン−３β，５α−ジオール溶液（１μＭ）か、ＧＤＮＦ（１μｇ／ｍｌ）か、あるいは対照として人工外リンパ液の入った同一のポンプと取替えた。これらのポンプを、２週間後に、同じ溶液が予め充填されたさらに２週間のための同一のポンプと取替えた。
【００３４】
実験全体を通しての電気聴性脳幹反応（ｅＡＢＲ）の閾値測定は、第４週までは、治療対象グループと対照グループの間で有意な差異を示した。第５週以降は、図３に示されているように、６β−［２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−エチルアミノ］−コレスタン−３β，５α−ジオール溶液で治療したグループと対照グループの間にはもはや有意な差異はなく、一方、６β−［３−（４−アミノブチルアミノ）プロピルアミノ］−コレスタン−３β，５α−ジオールで治療したグループと対照グループの間に有意な差異（Ｐ＜０．００１）が存在していた。以上で規定したものと同じ条件下に置かれたものの、製品ＤＡ又はＤＢによる治療を受けていない動物に対して、起こりうるｅＡＢＲ刺激はなかった。
【００３５】
実施例３：ローゼンタール流路内でのＳＧＮ密度の定量化
【００３６】
ｅＡＢＲ閾値の最終測定の後、ペントバルビタール・ナトリウム（２５ｍｇ／ｋｇ）を用いて腹腔内で動物に深麻酔を施し、食塩溶液により心臓内潅流を行って（３７℃）血液を除去し、次に低温グルタルアルデヒド溶液（０．１Ｍのリン酸塩衝液中２．５％）により心臓内潅流して組織を固定する。側頭骨を取り出し、次に水疱を開いて蝸牛をさらけ出した。蝸牛の頂端及び正円窓の膜の中に小窓を開けて、グルタルアルデヒド溶液で蝸牛を軽く洗浄できるようにした。その後、蝸牛をＥＤＴＡ溶液（リン酸援衝液中０．１Ｍ）の中で脱灰して、切断を行うことができるようにした。脱灰の後、蝸牛を脱水し、「プラスチックＪＢ−４」（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）内に封入した。蝸牛を、厚み４μｍの小薄片に切りわけた。ローゼンタール流路の６つの断面を内部に識別できる１つの小薄片によって特徴づけされる蝸牛軸の中央で、３つのうちの１つの小薄片を分析のために保存した（こうして螺旋神経節の同じニューロンを複数回計数するのを回避できる）。小薄片を、「Ｐａｒａｇｏｎ」を用いてスライドグラス上に取付け、トルイジン・ブルーで染色し、顕微鏡検査のために準備した。６つの小薄片のローゼンタール流路の６つの断面を各動物グループ（Ｓｉｇｍａ  Ｐｒｏ  Ｓｃａｎ）について分析して、螺旋神経節のニューロンを１つずつ数えた。ＳＧＮについて選択された基準は、１４〜２０μｍの細胞直径であり、核の直径は７〜１０μｍであった。こうして、ＳＧＮの平均密度を計算し、図４にそれを提示する。ローゼンタール流路の断面図は、図５に示されている。
【００３７】
実施例１については、ＧＤＮＦでの治療のみが、人工外リンパ液（Ｐ＜０．００１）で治療された対照グループと比べてＳＧＮ数の有意な差異を誘発した。実施例２については、いかなる遅延治療も対照グループと比べて有意な差異を誘発していない。
【００３８】
しかしながら、組織学的分析は（図５を参照）、ＳＧＮの軸索がＡＰで治療した動物については識別できなかったにも関わらず、ＤＢで治療した動物については、厚く長いものであることを明らかにしている。このことは、軸索のサイズが大きくなる（信号変換器とニューロンの間の距離が減少する）につれてニューロンの電気抵抗が小さくなることから、ＤＢの有効性を説明している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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