(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）コイルドコイルドメインを有するタンパク質と、（ｉｉ）前記コイルドコイルドメインに連結された少なくとも１つの正電荷ペプチドとを含んでなる、改変タンパク質であって、該正電荷ペプチドが、配列番号２（ＳＰＲＲＲＲＳ）、配列番号３６（ＧＲＲＲＲＲＳ）または配列番号３７（ＳＰＲＲＲＲＲＲＲＲＲＳ）で示される配列からなる群から選択される配列を有するものであり、前記改変タンパク質が、配列番号７、配列番号４２、配列番号６１または配列番号６７で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる、改変タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載の改変タンパク質と１以上の抗原とを含んでなる、融合タンパク質。
【請求項３】
前記抗原が、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡ、マイコバクテリア抗原８５Ａおよびインフルエンザ核タンパク質抗原からなる群から選択される、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
請求項１に定義される改変タンパク質に融合された、１以上のブドウ球菌抗原を含んでなる、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記１以上のブドウ球菌抗原が、ＳｐＡ、Ｈｌａ、ＣｌｆＢおよびソルターゼＡからなる群から選択されるものである、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
請求項１に定義される改変タンパク質に融合された、インフルエンザ核タンパク質などの１以上のインフルエンザ抗原を含んでなる、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
請求項１に定義される改変タンパク質に融合された、ＧｎＲＨなどの１以上の自己抗原を含んでなる、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
請求項１に定義される改変タンパク質に融合された抗原を含んでなる、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１に記載の改変タンパク質、または請求項２〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、細胞内ＴＬＲの核酸リガンドとを含んでなる、免疫原性組成物。
【請求項１０】
コイルドコイルドメインを含んでなる抗原またはコイルドコイルドメインを含んでなる担体タンパク質の免疫原性を増強するための方法であって、少なくとも１つの正電荷ペプチドを前記コイルドコイルドメインに連結することを含んでなり、前記正電荷ペプチドが配列番号２（ＳＰＲＲＲＲＳ）、配列番号３６（ＧＲＲＲＲＲＳ）または配列番号３７（ＳＰＲＲＲＲＲＲＲＲＲＳ）で示される配列からなる群から選択される配列を有するものであり、および、得られた改変担体タンパク質が配列番号７、配列番号４２または配列番号６７で示されるアミノ酸配列を有するものであり、かつ、得られた改変抗原が配列番号６１で示されるアミノ酸配列を有するものである、方法。
【請求項１１】
抗原の免疫原性、特にＴｈ１免疫原性を増強するための方法であって、
・請求項１０に記載の方法に従って前記改変担体タンパク質を作製すること、および
・前記抗原を、前記改変担体タンパク質、および細胞内ＴＬＲの核酸リガンドまたはヘパリンなどの負電荷ポリマーに会合させること
を含んでなる、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の改変タンパク質、または請求項２〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項９に記載の免疫原性組成物を含んでなる、ワクチン組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の改変タンパク質をコードする、または請求項２〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、核酸分子。
【請求項１４】
請求項１３に記載の少なくとも１つの核酸分子を含んでなる、ワクチン組成物。
【請求項１５】
請求項１に定義される改変タンパク質に融合された、１以上のブドウ球菌抗原を含んでなる、請求項２に記載の融合タンパク質を含んでなる、ブドウ球菌感染症の治療および予防のための医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１に定義される改変タンパク質に融合された、インフルエンザ核タンパク質などの１以上のインフルエンザ抗原を含んでなる、請求項２に記載の融合タンパク質を含んでなる、インフルエンザの治療および予防のための医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１に定義される改変タンパク質に融合された抗原を含んでなる、請求項２に記載の融合タンパク質を含んでなる、家禽の免疫感作のための組成物。
【請求項１８】
前記１以上のブドウ球菌抗原が、ＳｐＡ、Ｈｌａ、ＣｌｆＢおよびソルターゼＡからなる群から選択されるものである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コイルドコイルドメインを含有する組換え抗原、またはコイルドコイルを含有するタンパクと融合された抗原に関し、ここで、前記コイルドコイルは改変されているこの改変は前記抗原の免疫原性を改善する。同時に、この改変は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸などの負電荷ポリマーに対する、またヘパリンに対するそれらの結合能も改善する。
【背景技術】
【０００２】
コイルドコイルは、ロープの各ストランドのようにα−ヘリックスが互いにコイル状に巻かれたタンパク質の構造モチーフである。コイルドコイルドメインは、天然タンパク質に豊富に存在し（１、２）、それらは自然界のタンパク質のオリゴマー化の最も一般的な方法であり得る。コイルドコイルは、単純でしかも融通の効くタンパク質折りたたみであるスーパーコイル状に互いに巻き付いている２本以上のα−ヘリックスからなる（３）。典型的なコイルドコイル一次配列は、「ヘプタッド(heptad)」と呼ばれる７残基のリピートからなる反復である。
【０００３】
多くのコイルドコイル型タンパク質は、重要な生物学的機能に関与している。特に本明細書で注目するのは、抗原または担体タンパク質に見られるものである。
【０００４】
抗原に見られるコイルドコイルの例としては、限定されるものではないが、次のものが挙げられる。
ｉ）ＯＣＡファミリー（ここで、ＯＣＡは、オリゴマーコイルドコイル接着(oligomeric coiled coil adhesion)を意味する）に見られる二本鎖コイルドコイル：例として、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)防御抗原ＮａｄＡ（４）；エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)由来ＹａｄＡ（５）；モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)由来ＵｓｐＡ２（６）；バルトネラ・ヘンセラ(Bartonella henselae)由来ＢａｄＡ（７）、およびインフルエンザ菌(Haemophilus influenza)由来ＨａｄＡ（８）がある。
ｉｉ）中でも、インフルエンザ血球凝集素ＨＡ２タンパク質（９）、呼吸器合胞体ウイルスＦ糖タンパク質（１０）、ＨＩＶ−１（１１）およびＨＩＶ−２（１２）のｇｐ４１糖タンパク質、ならびにエボラウイルスのｇｐ１、２（１３）に見られるトリマーコイルドコイル。
ｉｉｉ）ニューカッスル病ＨＮ（血球凝集素−ノイラミダーゼ）糖タンパク質および他のパラミクソウイルス（１４、およびその中の参照文献）に見られるテトラマーコイルドコイル。
【０００５】
担体タンパク質は、特に抗原の免疫原性を改善するために使用される。コイルドコイルを含有する担体タンパク質は、特に、ＣＯＭＰ（１５）およびペンタマーも形成する人工配列（３４）に由来するペンタマー、および哺乳動物Ｃ４ｂｐオリゴマー化ドメインに由来するヘプタマー。例えば、マウスドメインＩＭＸ１０８（１６）、または鳥類Ｃ４ｂｐオリゴマー化ドメイン（１６、ＷＯ２００５／０７７９７６およびＷＯ２００７／０６２８１９）など、これまでに記載されている。ＩＭＸ３１３（ＷＯ２００７／０６２８１９）と呼ばれるハイブリッド鳥類オリゴマー化ドメインを本明細書で例として用いる。
【０００６】
従来技術では、コイルドコイルは、何がそれらのオリゴマー化状態およびそれらのヘリックスの適正な配向（平行または逆平行）を決定するのか理解するために鋭意検討の対象となってきた（３５）。しかし、それらのコイルドコイルを改変することにより抗原の免疫原性を改善するための研究はなかった。従来技術において２つの注目すべき例は、ワクチン接種の目的でコイルドコイルを含有する２つの別の抗原を精製することを必要としたワクチン産業界に関連するグループに関連し（１０、３６、３７）、抗原におけるコイルドコイルを改変したグループはない。
【０００７】
従来技術では、いくつかの特異的ペプチドが、モノマータンパク質の結合特性を改善することが示されており、これらはコイルドコイルを欠いている。組換えタンパク質にポリアルギニンテールが融合されると、それらはイオン交換クロマトグラフィーによる精製が容易となることが示されている（１７、１８）。これまでの使用では、これらの付加的アルギニンは酵素的手段による精製の後に除去される（１７、１８）か、あるいはそのまま残って酵素の固定化および／または再折りたたみに使用された（１９、２０）。ヘパリン−セファロースカラムにモノマー酵素を固定化して、基質結合によるモノマーの凝集を防ぎ、酵素の再使用を可能とするために、連続する６個のアルギニンという短いペプチドが使用された（１９、２０）。ＦｕｃｈｓおよびＲａｉｎｅｓは、モノマー酵素（ＲＮアーゼＡ）をガラスおよびシリカ樹脂などの様々な支持体に固定化するために、アミノ酸９個のポリアルギニンタグを使用できることを示した（２２）。
【０００８】
１９８０年代にＤＮＡ結合モチーフとして同定されたＳＰＫＫモチーフなどの他の核酸結合ペプチドも開示されており、ＳＰＫＫモチーフを含有するペプチドは二本鎖ＤＮＡと結合することができる（２１）。しかしながら、ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡとの結合は示されておらず、鈴木のデータは、副溝は二重らせん分子にのみ存在することから、一本鎖ＤＮＡへの結合は生じないことを強く示唆する。
【０００９】
ＤＮＡと結合することが示されている他のペプチドとしては、本明細書においていくつかの例で使用されるペプチド配列ＳＰＲＲＲＲＳを含有するＢ型肝炎コア抗原（３８）のプロタミン様ドメインが含まれる。
【００１０】
しかしながら、ポリアルギニンテールは、プロテアーゼ、特にセリンプロテアーゼによる切断に極めて感受性が高く、慣例の使用において、精製および固定化の両目的でそれらはポリヒスチジンタグに置き換えられてきた（４５）。
【００１１】
また別に、従来技術では、ペプチドは、それらの免疫原性を高めるためにモノマータンパク質と融合されてきた。Ｓｈｉｂａｇａｋｉおよび共同研究者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて樹状細胞（ＤＣ）の形質導入を高めるためにタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）が使用可能であること、および形質導入されたＤＣを動物に再注入すると、抗原の免疫原性の向上が得られることを示している（４３）。さらに、Ｓｈｉｍａｄａおよび共同研究者らは、ポリアルギニンペプチドが、それに融合されたタンパク質オボアルブミン（４２）の免疫原性を、そのタンパク質を発現する腫瘍に直接注射した場合または皮内に注射した場合に（４１）向上させ得ることを示した。
【００１２】
ほとんどの精製抗原は免疫原性が弱い。それらの免疫原性を増強するためにアジュバントが使用されてきた。抗原の免疫原性を増強するためのＣ４ｂｐタンパク質の、コイルドコイルを含有する小ドメインの使用がこれまでに示されている：
・ＷＯ２００７／０６２８１９は、第１成分としての鳥類Ｃ４ｂｐドメインと第２成分としての抗原を含んでなる複合体を記載し、前記成分は融合タンパク質の形態であるか、または非共有結合的に会合されている。この複合体は、生物に投与された際に抗原の免疫原性の増強を示す。
・ＷＯ２０１１／０４５６１２は、ニワトリ由来のＣ４ｂｐタンパク質フラグメントとマイコバクテリア抗原８５Ａを含有する融合タンパク質を記載している。前記ハイブリッドタンパク質は、齧歯類などの動物だけでなく霊長類でも８５Ａの免疫原性を高める。
【００１３】
加えて、免疫誘導法を改善するためには、ＴＬＲ受容体を介したシグナル伝達を誘導することも極めて重要であるが、このシグナル伝達を制限できることも少なくとも同程度に重要である。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、自然免疫系において重要な役割を果たすタンパク質種である。微生物がひと度、生物の物理的バリアを破ると、それらはＴＬＲにより認識される。認識される微生物由来の特徴としては、ウイルスの二本鎖ＲＮＡ、細菌およびウイルスＤＮＡの非メチル化ＣｐＧ部位、および特定の他のＲＮＡおよびＤＮＡ分子が含まれる。
【００１４】
このような核酸においては、それらがＴｏｌｌ様受容体（以下、ＴＬＲ）種、特に、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９およびＴＬＲ１３のリガンドであることから実質的な関心が寄せられている（２３およびその中の参照文献）。これらは「細胞内Ｔｏｌｌ様受容体」として分類される場合があるが、少なくともＴＬＲ３は一部の細胞表面にも存在する（２４）。ＴＬＲ７およびＴＬＲ９は、細胞内区画（特に、小胞体およびエンドソーム）に局在し、ＴＬＲ９およびＴＬＲ７については、この受容体の切断が、それを介して受容体のリガンドがシグナルを伝達するＭｙＤ８８の活性化に不可欠であることが明らかに示されている（２５、２６）。この切断はエンドリソソーム内でのみ起こるので、それはおそらく自己の核酸からの不適切なシグナル伝達を防ぐための進化適応であると思われる。
【００１５】
ＴＬＲ３は、気道、子宮、角膜、膣、子宮頸部、胆管および腸管上皮細胞を含む様々な上皮細胞により発現され、これらの細胞は、それらの細胞表面にＴＬＲ３を発現すると思われる（２４）。従って、ポリＩ：Ｃの投与がいくつかの有害作用に関連付けられていることはおそらく驚くことではない（２６）。その研究では、３ミリグラム／グラムの用量での反復投与が用いられた。平均マウス体重が３５ｇ近くであれば、１００ｍｇ用量の反復投与がこれらの作用を誘発し得る。本発明者らは、本明細書に記載の免疫誘導で一用量当たり２．５μｇのポリＩ：Ｃを必要としたに過ぎない。
【００１６】
これらの受容体、特にＴＬＲ３受容体を介したシグナル伝達を制限することの重要性は、用量依存性である。従って、核酸リガンドを抗原に強固に結合させる利点は不可欠である。よって、強固に結合した細胞内ＴＬＲリガンドは、結合が強固でない製剤よりも極めて好ましい。従って、当業者はＴＬＲリガンドと効率的に結合することができる抗原性組成物を探しており、これにより、この抗原性組成物は、他所においてはＴＬＲ受容体に対するリガンドの結合により媒介される潜在的有害作用を無くすという目的で、抗原が免疫応答を惹起する細胞にそれが到達するまで抗原から分離されない。
【発明の概要】
【００１７】
本発明は、コイルドコイルドメインに正電荷ペプチドを連結することにより改変されたコイルドコイルドメインを含んでなるタンパク質に関する。この改変コイルドコイル型タンパク質は、改善された免疫原性と同時にヘパリンおよび核酸などの負電荷ポリマーに対して改善された結合特性を有する。これらのコイルドコイルタンパク質は総て組換え型であり、改変は、コイルドコイルの末端に短いペプチド配列を融合させることにより得られる。本明細書の例において、改変は遺伝子工学技術により行われるが、ペプチド合成などの、改変コイルドコイルを得る他の方法も存在する。
【００１８】
この正電荷ペプチドは、優先的にはアルギニンを含んでなるが、代わりにリジン、または両方の組合せを含んでなることもできる。このペプチドは短く、アミノ酸７個以下、特に、アミノ酸５個、６個または７個を含んでなる。コイルドコイルの各鎖に１以上のペプチドを使用してもよい。
【００１９】
連結はコイルドコイルドメインに直接行われるか、またはコイルドコイルドメイン、正電荷ペプチドおよびそれらの組合せの技術的効果に影響を及ぼさない１個以上のアミノ酸を含んでなるリンカーペプチドを介して行われる。リンカーはいずれのアミノ酸を含有してもよいが、好ましいリンカーは、グリシン、セリンまたはプロリン、またはそれらの組合せを含有する。
【００２０】
ある例のセットでは、改変タンパク質は、ニワトリのＣ４ｂｐタンパク質に由来する担体タンパク質ＩＭＸ３１３である。
【００２１】
本発明はまた、抗原に融合された改変コイルドコイル担体タンパク質を含んでなる融合タンパク質に関する。
【００２２】
本発明はまた、改変コイルドコイルドメインを含んでなる改変抗原に関する。
【００２３】
本発明はまた、改変融合タンパク質または改変抗原、および細胞内ＴＬＲに対する核酸リガンドを含んでなる免疫原性組成物に関する。
【００２４】
本発明はまた、本発明の改変タンパク質を担持する支持体に関し、この支持体への連結は、コイルドコイルドメインに連結されたペプチドを介して形成される。支持体ヘパリンはｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで使用することができる。正電荷タンパク質の免疫原性を高めるためにヘパリンを使用する方法は周知である（４７、およびその中の参照文献）。
【００２５】
本出願はまた、患者において免疫応答を誘導するための、上記のような改変抗原または改変融合タンパク質または免疫原性組成物の使用に関する。
【００２６】
改変タンパク質のコイルドコイルドメインに正電荷ペプチドが連結された本出願による改変コイルドコイル型タンパク質は、対応する非改変タンパク質に比べて、特に下記の利点を提供する：
・陽イオン交換カラムＳＰ  ＦＦなどの負電荷クロマトグラフィーカラム、特に、ヘパリン−セファロースカラムへの良好な結合；
・核酸への良好な結合；
・担体タンパク質および抗原の場合、これらの改変コイルドコイル型タンパク質である抗原、または前記改変担体タンパク質と会合している抗原の免疫原性の増強。
【発明の具体的説明】
【００２７】
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特に例示される方法に限定されず、当然のことながら変更可能であると理解されるべきである。特に、本発明は、コイルドコイルドメインを有する改変抗原に関するものであり、コイルドコイルを含有する特定の担体タンパク質または特定の抗原に限定されない。
【００２８】
本明細書に引用されている刊行物、特許および特許出願は前掲または後掲を問わず、総て、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる。しかしながら、本明細書に記載される刊行物は、その刊行物で報告され、かつ、本発明に関連して使用され得るプロトコール、試薬およびベクターを記述および開示する目的で引用される。
【００２９】
さらに、本発明の実施では、特に断りのない限り、当業者の範囲内の従来のタンパク質精製および分子生物学的技術を使用する。このような技術は当業者に周知であり、文献で十分に説明されている。以下の特許請求の範囲および本発明の引き続いての記載では、言語表現または必要な含意により文脈がそうではないことを必要とする場合を除き、用語「含んでなる(comprise)」、「含有する(contain)」、「包含する(involve)」または「含む(include)」または「含んでなる(comprises)」、「含んでなる(comprising)」、「含有する(containing)」、「包含する(involved)」、「含む(includes）」、「含む(including)」などの変形は、包含の意味で、すなわち、本発明の種々の実施態様において、記載の特徴の存在を明示するが、さらなる特徴の存在または付加を排除せずに使用される。
【００３０】
以下の用語を本発明のより良い理解のために定義する。
「コイルドコイル型タンパク質」は、「コイルドコイル含有タンパク質」または「コイルドコイルドメインを有するタンパク質」とも称され、コイルドコイルモチーフ、すなわち、スーパーコイル状に互いに巻き付いている少なくとも２本のα−ヘリックスストランド、を含んでなるタンパク質を表す。このようなコイルドコイルを含有するいくつかのタンパク質は文献で報告されている。本発明によれば、好ましいコイルドコイル型タンパク質は抗原および担体タンパク質である。
【００３１】
「担体タンパク質」は、一般に、抗原がコンジュゲートまたは融合され、それにより抗原がより高い免疫原性とされるタンパク質を表す。ここで、この用語は、特に、抗原を担持するタンパク質の意味で使用される。このタンパク質の機能は、それがコンジュゲートまたは融合された前記抗原の免疫原性を高めることである。融合は、均質な生成物を作出するという利点を有する。より形式的に、「コンジュゲーション」は、免疫原性誘発タグまたは担体タンパク質をコードするＤＮＡがスプライシングされて、抗原をコードするＤＮＡとなる遺伝学として記載することができる。従来の化学コンジュゲーション法では、抗原がタンパク質に連結される位置を常に厳密に制御できるわけではない。この形態では、このサブクラスの担体タンパク質はまた、「免疫原性誘発タグ」またはさらには「アジュバント」（１６）もしくは「遺伝学的アジュバント」とも呼ばれる。
【００３２】
本発明によれば、「改変タンパク質」は、本発明による正電荷ペプチドの付加または部分的置換を伴う、野生型配列に対して改変された配列を有するタンパク質を表す。非改変タンパク質と本発明の改変タンパク質の間の差異は、付加または部分的に置換されたコイルドコイルドメインに連結された正電荷ペプチドにある。当業者には、本発明の改変タンパク質が組換えタンパク質、または自然界には見られないキメラであることが理解される。コイルドコイルドメインと電荷ペプチドドメインを含んでなるが、電荷ペプチドドメイン以外の他所で改変された天然タンパク質は本発明の一部ではない。
【００３３】
本発明は、（ｉ）コイルドコイルドメインを有するタンパク質と、（ｉｉ）前記コイルドコイルドメインに連結された少なくとも１つの正電荷ペプチドとを含んでなる、改変タンパク質であって、該正電荷ペプチドが、ＺＸＢＢＢＢＺ（配列番号１）
〔配列中、
・Ｚは任意のアミノ酸であるか、または存在せず；
・Ｘは任意のアミノ酸であり；
・Ｂはアルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）である〕
で示される配列を有するものである改変タンパク質に関する。
【００３４】
前記ペプチドの最後のアミノ酸は、カルボキシペプチダーゼＢなどのエキソプロテアーゼによる分解からペプチドを保護することが望まれる場合には、アルギニンまたはリジン残基でなくてもよい。
【００３５】
本発明の改変タンパク質が配列番号１の正電荷ペプチドを２つ以上含んでなる場合、それらのペプチドは好ましくは互いに融合させて、式（ＺＸＢＢＢＢＺ）ｎ（式中、ｎは１以上、少なくとも６までの整数であり、特に、１、２、３、４、５または６、好ましくは、２である）の配列番号１の反復となる単一の正電荷ペプチドを形成させる。
【００３６】
別の実施態様では、２、３、４、５または６つのペプチドを、下記に定義される２つ以上(one of more)のリンカーによって分離されてよい。
【００３７】
本発明の好ましい実施態様では、ペプチドは、特にヘプタマーコイルドコイルでは、ＳＰＲＲＲＲＳ（配列番号２）、ＧＲＲＲＲ（配列番号３）、ＳＰＫＫＫＫ（配列番号４）、ＧＫＫＫＫ（配列番号５）およびＧＲＲＲＲＲＳ（配列番号３６）の配列からなる群から選択される配列を有する。特に、トリマーコイルドコイルでは、２つの正電荷ペプチドの融合が好ましく、第１のペプチドＳＰＲＲＲＲ（配列番号３８）と第２のペプチドＲＲＲＲＲＳ（配列番号３９）の組合せであるＳＰＲＲＲＲＲＲＲＲＲＳ（配列番号３７）、および第１のペプチドＧＲＲＲＲＲ（配列番号４１）とペプチドＲＲＲＲＲＳ（配列番号３９）の組合せであるＧＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＳ（配列番号４０）の配列からなる群から選択される配列を有するのがより好ましい。
【００３８】
前記ペプチドはコイルドコイルのＣ末端に融合してもＮ末端に融合してもよい。ペプチドとタンパク質の融合は、ペプチドとタンパク質を連結する短いペプチド配列であるリンカーを用いて行うこともできるし、または用いずに行うこともできる。リンカーはいずれのアミノ酸を含んでもよいが、好ましいリンカーは、グリシン、セリンもしくはプロリン、またはそれらの組合せを含む。
【００３９】
特定の実施態様では、前記タンパク質のＣ末端の数個のアミノ酸を欠失させ、１コピー以上のペプチドＺＸＢＢＢＢＺで置き換えることができる。
【００４０】
本発明の好ましい態様において、ペプチドは、コイルドコイルのＣ末端に連結する。
【００４１】
本発明の一態様において、改変タンパク質は担体タンパク質の機能を有し、特に、抗原の担体として働く。
【００４２】
本発明の好ましい一態様では、改変タンパク質は、特許出願ＷＯ２００７／０６２８１９に記載されているヘプタマーコイルドコイルを含んでなる、ＩＭＸ３１３と呼ばれるニワトリ由来担体Ｃ４結合タンパク質である。
【００４３】
本発明による特定の改変タンパク質は、ペプチドＧＲＲＲＲ（配列番号３）がＩＭＸ３１３のコイルドコイルドメインに連結されたタンパク質ＩＭＸ３１３である。
【００４４】
本発明による別の特定の改変タンパク質は、ペプチドＳＰＫＫＫＫ（配列番号４）がＩＭＸ３１３のコイルドコイルドメインに連結されたタンパク質ＩＭＸ３１３である。
【００４５】
本発明による別の特定の改変タンパク質は、ペプチドＧＫＫＫＫ（配列番号５）がＩＭＸ３１３のコイルドコイルドメインに連結されたタンパク質ＩＭＸ３１３である。
【００４６】
本発明による好ましい特定の改変タンパク質は、ペプチドＳＰＲＲＲＲＳ（配列番号２）がＩＭＸ３１３のコイルドコイルドメインに連結されたタンパク質ＩＭＸ３１３である。
【００４７】
ＩＭＸ３１３、ＩＭＸ３１３ＴおよびＩＭＸ３１３Ｐのアミノ酸配列を以下に示す（＊は終止コドンを表す）。
【化１】
0006518193.tif 000002
【００４８】
好ましい実施態様では、担体タンパク質の機能を有するタンパク質は、ＩＭＸ３１３Ｐ（配列番号４２）である。ＩＭＸ３１３Ｐ（配列番号４２）の配列を含んでなるタンパク質はまた、単独、または１以上の正電荷ペプチドおよび抗原または別のタンパク質と融合されたものがそれ自体、本発明の目的である。
【００４９】
最も好ましい実施態様では、ＩＭＸ３１３Ｐ（配列番号４２）のコイルドコイルドメインは、配列番号１の２つの正電荷ペプチド、より好ましくは、ＳＰＲＲＲＲＲＲＲＲＲＳ（配列番号３７）の配列のペプチド、またはＧＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＳ（配列番号４０）の配列のペプチドの融合物に連結される。
【００５０】
本発明の別の態様では、改変タンパク質は担体タンパク質ではなく、抗原である。前記オリゴマー抗原は、特に、
・インフルエンザ血球凝集素ＨＡタンパク質、
・呼吸器合胞体ウイルスのＦ糖タンパク質、
・ＨＩＶ−１のｇｐ４１糖タンパク質、
・ＨＩＶ−２のｇｐ４１糖タンパク質、
・エボラウイルスのｇｐ１，２、
・髄膜炎菌由来のＮａｄＡ、
・エルシニア・エンテロコリチカ由来のＹａｄＡ、
・モラクセラ・カタラーリス由来のＵｓｐＡ２、
・バルトネラ・ヘンセラ由来のＢａｄＡ、および
・インフルエンザ菌由来のＨａｄＡ
からなる群から選択される。
【００５１】
本発明はまた、改変担体タンパク質と抗原の間の会合に関する。担体タンパク質（ＩＭＸ３１３）と抗原のこのような会合は、前記抗原の免疫原性を増強することがすでに示されている（特許出願ＷＯ２００７／０６２８１９参照）。改変担体タンパク質を用いれば、非改変ＩＭＸ３１３タンパク質を用いるよりも免疫原性の増強はいっそう良好となる。
【００５２】
特に、抗原と会合された改変担体タンパク質は、配列番号４２の配列を有するＩＭＸ３１３Ｐである。
【００５３】
ある別法では、これら２つの会合成分は互いに非共有結合的に会合される。好ましい別法では、これら２つの会合成分は化学的にカップリングされ、融合タンパク質の形態である。当業者ならば、融合タンパク質を生産する目的で、２つのペプチド成分をどのように接続すればよいかを知っている。
【００５４】
本発明は特に、担体タンパク質を改変コイルドコイルおよび１以上の抗原とともに含んでなる融合タンパク質に関する。
【００５５】
本発明の好ましい一態様では、下記の抗原の１つがＩＭＸ３１３ＴまたはＩＭＸ３１３Ｐ改変タンパク質と融合される：
ｉ）記載のように（２７、４４）変異された黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)プロテインＡタンパク質、または黄色ブドウ球菌タンパク質アルファ溶血素、または黄色ブドウ球菌タンパク質ＣｌｆＢまたは黄色ブドウ球菌タンパク質ソルターゼＡ；
ｉｉ）結核菌(Mycobacterium tuberculosis)により分泌されるタンパク質８５Ａ（２８）；
ｉｉｉ）自己抗原ＧｎＲＨ；
ｉｖ）クリプトスポリジウム抗原Ｃｐ１５；
ｖ）インフルエンザ核タンパク質。
【００５６】
本発明による特定の融合タンパク質は、ペプチドＧＲＲＲＲＲＳ（配列番号３６）がＩＭＸ３１３のコイルドコイルドメインに連結されたタンパク質ＩＭＸ３１３Ｐ（配列番号４２）であり、前記改変タンパク質が黄色ブドウ球菌プロテインＡタンパク質と融合される。
【００５７】
本発明による別の特定の融合タンパク質は、ペプチドＧＲＲＲＲＲＳ（配列番号３６）がＩＭＸ３１３のコイルドコイルドメインに連結されたタンパク質ＩＭＸ３１３Ｐ（配列番号４２）であり、前記改変タンパク質がタンパク質８５Ａと融合される。
【００５８】
本発明による別の特定の融合タンパク質は、ペプチドＳＰＫＫＫＫ（配列番号４）がＩＭＸ３１３のコイルドコイルドメインに連結されたタンパク質ＩＭＸ３１３（配列番号６）であり、前記改変タンパク質が黄色ブドウ球菌プロテインＡタンパク質と融合される。
【００５９】
本発明による別の特定の融合タンパク質は、ペプチドＳＰＫＫＫＫ（配列番号４）がＩＭＸ３１３のコイルドコイルドメインに連結されたタンパク質ＩＭＸ３１３（配列番号６）であり、前記改変タンパク質がタンパク質８５Ａと融合される。
【００６０】
本発明による別の特定の融合タンパク質は、ペプチドＧＫＫＫＫ（配列番号５）がＩＭＸ３１３のコイルドコイルドメインに連結されたタンパク質ＩＭＸ３１３（配列番号６）であり、前記改変タンパク質が黄色ブドウ球菌プロテインＡタンパク質と融合される。
【００６１】
本発明による別の特定の融合タンパク質は、ペプチドＧＫＫＫＫ（配列番号５）がＩＭＸ３１３のコイルドコイルドメインに連結されたタンパク質ＩＭＸ３１３（配列番号６）であり、前記改変タンパク質がタンパク質８５Ａと融合される。
【００６２】
本発明による別の特定の融合タンパク質は、ペプチドＳＰＲＲＲＲＳ（配列番号２）がタンパク質ＩＭＸ１０８（配列番号６３）のコイルドコイルドメインに融合されたタンパク質ＩＭＸ１０８Ｔ（配列番号６４）である。
【００６３】
本発明による好ましい特定の改変タンパク質は、ペプチドＳＰＲＲＲＲＳ（配列番号２）がＩＭＸ３１３のコイルドコイルドメインに連結されたタンパク質ＩＭＸ３１３（配列番号６）であり、前記改変タンパク質が黄色ブドウ球菌プロテインＡタンパク質と融合される。
【００６４】
本発明による別の好ましい特定の改変タンパク質は、ペプチドＳＰＲＲＲＲＳ（配列番号２）がＩＭＸ３１３のコイルドコイルドメインに連結されたタンパク質ＩＭＸ３１３（配列番号６）であり、前記改変タンパク質がタンパク質８５Ａと融合される。
【００６５】
例に示されるように、コイルドコイルの改変がそれらの免疫原性を高めたことを証明するためにこれら２つのモデル抗原を使用した。Ｂ細胞応答およびＴ細胞応答の両方が改善された。さらに、改変コイルドコイルは、タンパク質または核酸のいずれかとして投与した場合、より免疫原性が高かった。
【００６６】
本発明はまた、上記のものなどの改変コイルドコイル型タンパク質、または上記のものなどの融合タンパク質とおよび細胞内ＴＬＲの核酸リガンドとを含んでなる免疫原性組成物に関する。これらのＴＬＲの核酸リガンドは改変担体タンパク質と優先的に複合体を形成する。有利には、核酸リガンドは改変タンパク質に結合されるが、対応する非改変担体タンパク質は、これらのＴＬＲの核酸リガンドと有意に結合することができなった。
【００６７】
本発明はまた、上記のものなどの改変コイルドコイル型タンパク質、または上記のものなどの融合タンパク質とヘパリンとを含んでなる免疫原性組成物に関する。ヘパリンは改変担体タンパク質と優先的に複合体を形成する。有利には、ヘパリンは改変タンパク質に結合されるが、対応する非改変担体タンパク質は、ヘパリンと有意に結合することができなかった。
【００６８】
本発明はまた、改変タンパク質を担持する固相支持体に関し、ここで、前記タンパク質は、ペプチドＺＸＢＢＢＢＺで支持体に結合される。実際に、ペプチドにおける電荷の存在量は、改変タンパク質を表面に強く結合させるのに十分なものである。
【００６９】
本発明はまた、コイルドコイルドメインを含んでなるタンパク質の支持体への結合能を増強するための方法であって、少なくとも１つのペプチドＺＸＢＢＢＢＺ
〔配列中、
・Ｚは任意のアミノ酸であるか、または存在せず；
・Ｘは任意のアミノ酸であり；
・Ｂはアルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）である〕
をコイルドコイルドメインに連結することを含んでなる方法に関する。
【００７０】
特に、前記支持体はクロマトグラフィーカラムである。総ての可溶性改変コイルドコイルタンパク質を、親和性タグとして正電荷ペプチドを用いてこのようなカラムに結合させることができる。作業者は、結合を強くするまたは弱くするために一般配列ＺＸＢＢＢＢＺのペプチドにおけるアルギニン残基の数を変えることができる。あるいは、作業者は、結合を強くするために一般配列ＺＸＢＢＢＢＺのペプチドの数を変えることもできる。オリゴマーのタンパク質鎖の数が少ないほど、使用されるべきペプチドまたはペプチド中のアルギニンの数は多くなる。従って、例えば、トリマーコイルドコイルを用いる場合、ヘパリン−セファロース上での同様の精製を保証するためには、好ましくは、鎖当たり９以上のアルギニンが使用されるべきである。
【００７１】
本発明はまた、コイルドコイルドメインを含んでなる担体タンパク質または抗原の免疫原性を増強するための方法であって、少なくとも１つのペプチドＺＸＢＢＢＢＺ
〔配列中、
・Ｚは任意のアミノ酸であるか、または存在せず；
・Ｘは任意のアミノ酸であり；
・Ｂはアルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）である〕
を前記タンパク質のコイルドコイルドメインに連結することを含んでなる方法に関する。
【００７２】
本発明はまた、抗原の免疫原性を増強するための方法であって、
・上記のものなどの改変担体タンパク質を作製すること、および
・前記抗原を前記改変担体タンパク質および細胞内ＴＬＲの核酸リガンドまたはヘパリンに会合させること
を含んでなる方法に関する。
【００７３】
本発明は特に、抗原のＴｈ１免疫原性を増強するための方法であって、
・上記のものなどの改変担体タンパク質を作製すること、および
・前記抗原を前記改変担体タンパク質および細胞内ＴＬＲの核酸リガンドまたはヘパリンに会合させること
を含んでなる方法に関する。
【００７４】
本発明はまた、ワクチンとして使用するための、本発明による改変抗原、または本発明による融合タンパク質に関する。
【００７５】
本出願はまた、必要な患者において免疫応答を誘導するための方法であって、改変担体タンパク質と抗原とを含んでなる融合タンパク質を含んでなるワクチン組成物の患者への投与を含んでなる方法に関する。
【００７６】
本出願はまた、必要な患者において免疫応答を誘導するための方法であって、改変タンパク質と細胞内ＴＬＲの核酸リガンドまたはヘパリンとを含んでなる免疫原性組成物を含んでなるワクチン組成物の患者への投与を含んでなる方法に関する。
【００７７】
本発明はまた、上記のものなどの改変タンパク質および融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。
【００７８】
さらに、本発明は、上記のものなどの少なくとも１つの核酸分子を含んでなるワクチン組成物に関する。核酸分子を含んでなるワクチン組成物は当業者に周知であり、特に、引用することにより本明細書の一部とされる特許出願ＷＯ２００８／１２２８１７に記載されている。
【００７９】
このような核酸はそれ自体で使用可能であり、またはそれらは、これもまた特許出願ＷＯ２００８／１２２８１７に記載されているウイルスベクターで投与することもできる。いくつかのウイルスベクターは、その後、ウイルスベクターにコードされている改変抗原に結合することができる核酸を産生するように改変されている。核酸を生産するためのウイルスベクターの改変は、引用することにより本明細書の一部とされるＷＯ２００７／１００９０８に開示されている。
【００８０】
本発明はまた、上記のものなどの改変コイルドコイル型タンパク質を精製するための方法であって、
・ヘパリン−セファロースクロマトグラフィーカラムに前記改変タンパク質をロードすること、および
・前記タンパク質を、５００ｍＭを超える塩濃度で溶出させること
を含んでなる方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】Ｈｉ  ＴｒａｐヘパリンＨＰカラムで精製されたＩＭＸ３１３Ｔのクロマトグラム。ヘパリン−セファロースカラムは、ほぼ純粋なＩＭＸ３１３Ｔタンパク質（ピークＣ）から夾雑物（ピークＡおよびＢ）を明瞭に分離する。点線は、改変タンパク質を溶出させるために用いた塩勾配を示す。
【図２】ＴＬＲ９リガンドおよびＩＭＸ４９７タンパク質（ＰＡｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ）−アガロースゲル電気泳動（ＴＡＥバッファー中０．８％）。オリゴヌクレオチドが移動したゲルにおける位置は、ゲルを臭化エチジウムで染色すると紫外線下で観察できる。
【図３】ＴＬＲ７およびＴＬＲ３リガンドおよびＩＭＸ４９７タンパク質（ＰＡｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ）−アガロースゲル電気泳動（ＴＡＥバッファー中０．８％）。
【図４】ＴＬＲ７リガンドおよびＩＭＸ４９５（ＰＡｍ）、ＩＭＸ４９４（ＰＡｍ−ＩＭＸ３１３）およびＩＭＸ４９７（ＰＡｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ）タンパク質−アガロースゲル電気泳動（ＴＡＥバッファー中０．８％）。
【図５】雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスの群（ｎ＝５）を、初回はＣＦＡ中に、次回はＩＦＡ中に処方したＰＡｍ、ＰＡｍ−ＩＭＸ３１３、ＰＡｍ−ＩＭＸ３１３ＴまたはＰＡｍで、１４日間隔で２回、皮下免疫した。初回免疫の２８日後に、血清中のＰＡｍ特異的ＩｇＧ力価を、プレートをＰＡｍでコーティングしたＥＬＩＳＡを用いて測定した。結果を４０５ｎｍで測定されたサンプルのＯＤ＋ＳＥＭとして表す。異なる群の平均値間の有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡとその後のＴｕｋｅｙの多重比較検定により判定した。ｐ値＜０．０５を統計学的に有意と見なして異なる＊として表し、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊はｐ＜０．０１を表す。
【図６】全Ｔ細胞集団におけるＩＦＮ−γの発現レベル。筋肉内に免疫したマウスにおける８５Ａ特異的細胞性免疫応答。雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの群（ｎ＝５）を、８５Ａ、８５Ａ−ＩＲ１４、８５Ａ−ＴＬ１８、８５Ａ−ＩＭＸ３１３または８５Ａ−ＩＭＸ３１３Ｔを発現するプラスミドで、１４日間隔で２回免疫した。最後の免疫の２週間後に、マウスを屠殺し、脾臓Ｔ細胞を精製した。細胞を組換え８５Ａタンパク質と共培養した。異なる群の平均値間の有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡとその後のＴｕｋｅｙの多重比較検定により判定した。ｐ値＜０．０５を統計学的に有意と見なした。共培養上清中のＩＦＮ−γ応答を、細胞１００万個当たりのＩＦＮ−γ分泌細胞として表す。
【図７】ＣＤ８＋Ｔ細胞集団におけるＩＦＮ−γ発現レベル。筋肉内に免疫したマウスにおける８５Ａ特異的細胞性免疫応答。雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの群（ｎ＝５）を、８５Ａ、８５Ａ−ＩＲ１４、８５Ａ−ＴＬ１８、８５Ａ−ＩＭＸ３１３、または８５Ａ−ＩＭＸ３１３Ｔを発現するプラスミドで、１４日間隔で２回免疫した。最後の免疫の２週間後に、マウスを屠殺し、脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞を精製した。細胞を８５Ａペプチドｐ１１と共培養した。異なる群の平均値間の有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡとその後のＴｕｋｅｙの多重比較検定により判定した。ｐ値＜０．０５を統計学的に有意と見なした。共培養上清中のＩＦＮ−γ応答を、細胞１００万個当たりのＩＦＮ−γ分泌細胞として表した。
【図８】ＣＤ４＋Ｔ細胞集団におけるＩＦＮ−γ発現レベル。筋肉内に免疫したマウスにおける８５Ａ特異的細胞性免疫応答。雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの群（ｎ＝５）を、８５Ａ、８５Ａ−ＩＲ１４、８５Ａ−ＴＬ１８、８５Ａ−ＩＭＸ３１３または８５Ａ−ＩＭＸ３１３Ｔを発現するプラスミドで、１４日間隔で２回免疫した。最後の免疫の２週間後に、マウスを屠殺し、脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞を精製した。細胞を８５Ａペプチドｐ１５と共培養した。異なる群の平均値間の有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡとその後のＴｕｋｅｙの多重比較検定により判定した。ｐ値＜０．０５を統計学的に有意と見なした。共培養上清中のＩＦＮ−γ応答を、細胞１００万個当たりのＩＦＮ−γ分泌細胞として表した。
【図９】雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスの群（ｎ＝５）を、８５Ａ−ＩＭＸ３１３プラスミド、８５Ａ−ＩＭＸ３１３Ｔプラスミドならびにより短い配列８５Ａ−ＩＲ１４および８５Ａ−ＴＬ１８で、１４日間隔で２回、筋肉内免疫した。初回免疫の２８日後に、血清中の８５Ａ特異的ＩｇＧレベルを、８５Ａ特異的ＥＬＩＳＡを用いて測定した。結果を４０５ｎｍで測定されたサンプルのＯＤ＋ＳＥＭとして表す。異なる群の平均値間の有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡとその後のＴｕｋｅｙの多重比較検定により判定した。ｐ値＜０．０５を統計学的に有意と見なした。ＮＳは有意でないことを意味し、有意性値はアスタリスクにより示す：＊＊＊（ｐ＜０．００１）、＊＊（ｐ＜０．０１）、＊（ｐ＜０．０５）。
【図１０】親プラスミドｐｃＤＮＡ３  ＮＰのマップ−実施例に記載の通りに構築したこのプラスミドおよびその誘導体をＤＮＡワクチン接種に用いた。
【図１１】ＩＭＸ３１３に融合されたＮＰに対して、ＮＰをコードするプラスミドによる免疫に応答してＩＦＮ−γを分泌する全Ｔ細胞の比較。
【図１２】ＮＰをコードするプラスミドまたはＩＭＸ３１３に融合されたＮＰをコードするプラスミドによる免疫に応答してＩＦＮ−γを分泌するＣＤ８およびＣＤ４  Ｔ細胞の比較。
【図１３】ＮＰまたはＩＭＸ３１３に融合されたＮＰのいずれかをコードするＤＮＡプラスミドにより誘導された組換えＮＰに対するＩｇＧ抗体応答の比較。
【図１４】ＮＰまたはＩＭＸ３１３に融合されたＮＰのいずれかをコードするＤＮＡプラスミドにより誘導された組換えＮＰに対するＩｇＧ抗体サブクラス応答の比較。
【図１５】ＮＰ、モノマーＮＰ（ＮＰ−Ｍ）、ＩＭＸ３１３に融合されたモノマーＮＰ（ＮＰ−Ｍ−ＩＭＸ３１３）およびＩＭＸ３１３Ｔに融合されたモノマーＮＰ（ＮＰ−Ｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ）をコードするプラスミドに対する全Ｔ細胞応答の比較。
【図１６】ＮＰ、モノマーＮＰ（ＮＰ−Ｍ）、ＩＭＸ３１３に融合されたモノマーＮＰ（ＮＰ−Ｍ−ＩＭＸ３１３）およびＩＭＸ３１３Ｔに融合されたモノマーＮＰ（ＮＰ−Ｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ）をコードするプラスミドに対するＣＤ８＋およびＣＤ４＋  Ｔ細胞応答の比較。
【図１７】ＮＰ、モノマーＮＰ（ＮＰ−Ｍ）、ＩＭＸ３１３に融合されたモノマーＮＰおよびＩＭＸ３１３Ｔに融合されたモノマーＮＰをコードするプラスミドに対する、組換えＮＰを用いたＥＬＩＳＡにより測定されたＩｇＧ抗体応答の比較。
【図１８】ＮＰ、モノマーＮＰ（ＮＰ−Ｍ）、ＩＭＸ３１３に融合されたモノマーＮＰおよびＩＭＸ３１３Ｔに融合されたモノマーＮＰをコードするプラスミドに対する、組換えＮＰを用いて測定されたＩｇＧ抗体サブクラス応答の比較。
【図１９】種々のＮＰ融合タンパク質の、ｔＰＡシグナルペプチドによる分泌の効果。全Ｔ細胞をＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔにより測定し、ＮＰ、分泌型ＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰ）、分泌型モノマーＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰ−Ｍ）、分泌型ＩＭＸ３１３融合ＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰ−ＩＭＸ３１３）、分泌型ＩＭＸ３１３融合モノマーＮＰ、およびＩＭＸ３１３Ｔ融合分泌型モノマーＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰ−Ｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ）を比較した。
【図２０】ＮＰ、分泌型ＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰ）、分泌型モノマーＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰ−Ｍ）、分泌型ＩＭＸ３１３融合ＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰ−ＩＭＸ３１３）、分泌型ＩＭＸ３１３融合モノマーＮＰ、および分泌型ＩＭＸ３１３Ｔ融合モノマーＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰ−Ｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ）を比較する、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔにより測定された、種々のＮＰ融合タンパク質に対するＣＤ８＋およびＣＤ４＋応答に及ぼす、ｔＰＡシグナルペプチドによる分泌の効果。
【図２１】ＮＰ、分泌型ＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰ）、分泌型モノマーＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰ−Ｍ）、分泌型ＩＭＸ３１３融合ＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰ−ＩＭＸ３１３）、分泌型ＩＭＸ３１３融合モノマーＮＰ、および分泌型ＩＭＸ３１３Ｔ融合モノマーＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰ−Ｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ）を比較する、ＥＬＩＳＡにより測定された、種々のＮＰ融合タンパク質に対するＩｇＧ応答の、ｔＰＡシグナルペプチドによる分泌の効果。
【図２２】ＮＰ、分泌型ＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰ）、分泌型モノマーＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰ−Ｍ）、分泌型ＩＭＸ３１３融合ＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰ−ＩＭＸ３１３）、分泌型ＩＭＸ３１３融合モノマーＮＰ、および分泌型ＩＭＸ３１３Ｔ融合モノマーＮＰ（ｔＰＡ−ＮＰ−Ｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ）を比較する、ＥＬＩＳＡにより測定された、種々のＮＰ融合タンパク質に対するＩｇＧサブクラス応答に及ぼす、ｔＰＡシグナルペプチドによる分泌の効果。
【図２３】この図は、ＩＭＸ７４３タンパク質はＤＮＡオリゴヌクレオチドＯＤＮ１８２６と強く結合するが、ＩＭＸ７４４は同じオリゴヌクレオチドと弱くしか結合しないことを示す。アガロースゲル電気泳動は、ＴＡＥバッファー中０．８％で行った。オリゴヌクレオチドが移動したゲル中の位置は、ゲルを臭化エチジウムで染色すると紫外線下で観察できる。ゲルの上の表に記載の通りに、ＴＬＲ９リガンドＯＤＮ１８２６とＩＭＸ７４４およびＩＭＸ７４３タンパク質の種々の組合せを調製し、複合体形成をアガロースゲル電気泳動により分析した。複合体は複合体を形成していないリガンドよりもずっとゆっくり移動したので、複合体形成は明瞭に検出可能であった。タンパク質の濃度が低下するにつれ、観察される複合体は発散性が高くなり、非結合ＴＬＲリガンドのバンドが見えるようになった。このゲルは、ゲルシフトはＩＭＸ７４３では再現性があるが（レーン６と１２を比較）、ＩＭＸ７４４（レーン３〜５）は、ゲルにほとんど認識できないようなシフトをもたらすに過ぎないことを示す。
【実施例】
【００８２】
１．ＩＭＸ３１３、ＩＭＸ３１３ＴおよびＩＭＸ３１３Ｐタンパク質の生産
ＩＭＸ３１３は、標準的な方法によりこのオリゴマー化ドメインをＴ７に基づく発現ベクターにクローニングすることにより生産した。ＰＣＲ産物は、Ｎ末端のＮｄｅＩ部位および第２の終止コドンとオーバーラップするＨｉｎｄＩＩＩ部位を含んでいた。ヌクレオチド配列は、
配列番号８：
【化２】
0006518193.tif 000003
である。
【００８３】
この遺伝子は、下記のタンパク質配列（配列番号９）：
【化３】
0006518193.tif 000004
をコードする。
【００８４】
アスタリスクは、終止コドンを表す。質量分析により判定したところ、２番目のセリンは、開始メチオニンの完全な除去を可能とした。
【００８５】
ＩＭＸ３１３を大腸菌(Escherichia coli)株Ｃ４３（ＤＥ３）で発現させた。形質転換細胞を３７℃にてＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ培地でＯＤ６００がおよそ０．６となるまで増殖させた後、１ｍＭ濃度のＩＰＴＧで発現を誘導し、この培養物を３７℃で一晩増殖させた。回収した細菌を、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４を含有するバッファー中で音波処理により溶解させ、４℃にて１８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。ＩＭＸ３１３タンパク質は可溶性画分に見られた。
【００８６】
ＩＭＸ３１３Ｔは、ＩＭＸ３１３の最後の５つのＣ末端アミノ酸（ＧＬＳＫＥ）を次のように正電荷ペプチド（ＳＰＲＲＲＲＳ）で置換することにより作出した：ＰｓｔＩ制限部位（ＣＴＧＣＡＧ：アミノ酸ロイシンおよびグルタミンをコードする）を、置換されるアミノ酸（ＧＬＳＫＥ）のすぐ前に部位特異的突然変異誘発により作出した。これにより、ＩＭＸ３１３の最後の５つのアミノ酸の、アニーリングして終止コドンのすぐ下流にあるＰｓｔＩ部位およびＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位にライゲート可能な２つの相補的オリゴヌクレオチドによりコードされる任意のアミノ酸による置換が可能となる。
【００８７】
アニーリングされＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位：
【化４】
0006518193.tif 000005
の間にクローニングされた際、下記のリン酸化オリゴヌクレオチドは、ＬＱＧＬＳＫＥ＊＊（配列番号１０）をコードする配列をＬＱＳＰＲＲＲＲＳ＊＊（配列番号１１、ここで、＊は終止コドンを表す）に置換した。
【００８８】
ＩＭＸ３１３Ｔをコードするヌクレオチド配列は下記の通りである。（配列番号１４）：
【化５】
0006518193.tif 000006
【００８９】
また、ＩＭＸ３１３Ｔも大腸菌株Ｃ４３（ＤＥ３）で発現させた。形質転換細胞を３７℃にてＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ培地でＯＤ６００がおよそ０．６となるまで増殖させた後、ＩＰＴＧを１ｍＭまで加えることにより発現を誘導し、この培養物を３７℃で一晩増殖させた。これらの細菌を、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４を含有するバッファー中で音波処理により溶解させ、４℃にて１８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。ＩＭＸ３１３Ｔタンパク質も可溶性画分に見られた。
【００９０】
ＩＭＸ３１３Ｐは、ＩＭＸ３１３Ｔを発現するプラスミドをオリゴヌクレオチド：
【化６】
0006518193.tif 000007
で変異させることにより構築した。
【００９１】
このＰＣＲ産物を、Ｇｅｉｓｅｒ（２９）の方法により、ＩＭＸ３１３Ｔタンパク質を発現するＴ７ベクターに挿入した。
【００９２】
ＩＭＸ３１３Ｐをコードするヌクレオチド配列は下記の通りである。（配列番号４５）：
【化７】
0006518193.tif 000008
【００９３】
溶解バッファーも１Ｍ  ＮａＣｌを含有したこと以外は、ＩＭＸ３１３Ｔタンパク質と同じ方法でＩＭＸ３１３Ｐタンパク質を精製した。清澄化した細菌溶解液を８０℃で２０分間加熱し、４℃にて(are 4℃) １８，０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離により再び清澄化した。
【００９４】
２．ＩＭＸ３１３と同様にＩＭＸ３１３ＰおよびＩＭＸ３１３Ｔはヘプタマーである
タンパク質ＩＭＸ３１３Ｔを、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４で平衡化したＨｉ  Ｔｒａｐ  ＳＰ  ＦＦ  ５ｍｌカラムで精製した。このタンパク質を０Ｍから１ＭのＮａＣｌ勾配で溶出させた。タンパク質ＩＭＸ３１３Ｔを含有する画分をプールし、１倍ＰＢＳに対して透析し、１倍ＰＢＳで平衡化したＨｉ  Ｌｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ｐｇカラムに適用した。ＩＭＸ３１３Ｔの溶出容量（Ｖｅ  １７０ｍｌ）は、ＩＭＸ３１３（Ｖｅ  １６２ｍｌ）の溶出容量と酷似していた。
【００９５】
タンパク質ＩＭＸ３１３Ｐは、ヘパリンセファロースカラムで精製した。このタンパク質は、このカラムにロードする前に、まず、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０および１５０ｍＭ  ＮａＣｌの溶液に対して透析した。次に、このカラムをＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０および２Ｍ  ＮａＣｌで展開した。溶出したＩＭＸ３１３Ｐタンパク質画分をプールし、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するＰＢＳに対して透析し、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１倍ＰＢＳで平衡化したＨｉ  Ｌｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ｐｇカラムに適用した。溶出容量は、ＩＭＸ３１３Ｔの溶出用量と識別可能であった。
【００９６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でヘプタマー形成を実証するために、精製したＩＭＸ３１３ＴおよびＩＭＸ３１３Ｐタンパク質を非変性条件、変性条件および還元条件下で分析した。還元剤の不在下で、ＩＭＸ３１３ＴおよびＩＭＸ３１３ＰはＩＭＸ３１３と同様にオリゴマー化し、総て、それらのモノマーよりもはるかに高い分子量で移動した。
【００９７】
３．短い正電荷ペプチドのＩＭＸ３１３への融合はタンパク質精製を容易にする
上記のように精製したＩＭＸ３１３Ｔタンパク質を次に、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファーｐＨ７．５にて、ＨｉＴｒａｐヘパリンＨＰ  ５ｍｌカラムにロードした。結合したタンパク質の溶出は、塩勾配：同じバッファー中２ＭのＮａＣｌ  １５カラム容量で行った。正電荷ＩＭＸ３１３Ｔタンパク質はヘパリンカラムに結合し、およそ１Ｍ  ＮａＣｌで溶出した。別のカラム実施で、ＩＭＸ３１３はヘパリン−セファロースカラムに結合せず、その代わりにフロースルー画分に見られたことが示された。
【００９８】
ヘパリンセファロースは、アフィニティークロマトグラフィーカラムである。ヘパリンセファロースは、凝固因子、リパーゼ、リポタンパク質およびホルモン受容体を含む血清タンパク質を精製するために広く使用され、また、増殖因子を精製するためにも首尾良く使用されている。ＤＮＡおよびＲＮＡの類似体として働くヘパリンのポリ陰イオン構造は、ポリメラーゼ、リガーゼ、キナーゼ、およびリボゾームタンパク質を含む、ＤＮＡまたはＲＮＡと相互作用する多種類のタンパク質の精製を可能にしてきた。
【００９９】
本発明者らは、本明細書で、正電荷ペプチド（ポリアルギニンテールなど）の融合によるコイルドコイルの改変が、負電荷ヘパリンセファロースカラムへの有用な結合能を付与し、精製を大幅に簡単にすることを示した。
【０１００】
このことは、Ｓｔｅｍｐｆｅｒら（１９，２０）が、ヘパリン−セファロース上に酵素を固定化するためにその酵素に融合させた６つのアルギニン残基を用いた際には予期されず、この酵素は０．３５Ｍ  ＮａＣｌを用いた場合にのみカラムから溶出可能であった。この塩濃度では、実施例４に示されるように、細胞抽出液中の他のタンパク質も溶出し、５００ｍＭ  ＮａＣｌ未満などの塩濃度で、カラムに結合する大部分のタンパク質を溶出させ、次いで、さらに高い塩濃度で改変コイルドコイル融合タンパク質を実質的に純粋な形態で溶出させることができるという大きな利点がある。これによりステップグラジェントまたはバッチ精製の実施が可能となる。従って、ヘパリン−セファロースカラムは、ＩＭＸ３１３Ｔ、および本明細書に記載の様式で改変された他のコイルドコイルに融合されたタンパク質のアフィニティーカラムとして使用することができる。
【０１０１】
Ｈｉ  Ｔｒａｐ  ＳＰ  ＦＦなどの陽イオン交換カラムに比べ、ヘパリン−セファロースカラムは、改変コイルドコイルにより特異的であるためにより有用である。本発明者らの研究では、陽イオン交換カラム（Ｈｉ  Ｔｒａｐ  ＳＰ  ＦＦ；ｐＨ７．４）から溶出されたタンパク質ＩＭＸ３１３Ｔは、完全に純粋ではなかった。このＳＰ  ＦＦおよびＳ７５で精製したタンパク質をヘパリン−セファロースカラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰ）にロードすると、夾雑物の痕跡がフロースルー中に除去され、ＩＭＸ３１３Ｔタンパク質は純度＞９８％で溶出され、このことは、同等濃度のＮａＣｌでどちらのカラムからも当該タンパク質が溶出されたが、ヘパリンカラムは、ペプチドＳＰＲＲＲＲＳの付加により改変されたコイルドコイルに対してＳＰ  ＦＦよりも特異性が高いことを示す。
【０１０２】
４．ヘパリンセファロースは改変コイルドコイルのアフィニティーカラムとして機能する
ＩＭＸ３１３を実施例１に記載の通り作製した。細菌溶解液を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファーｐＨ７．５中で音波処理し、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＳＳ３４ローターにて４℃、１８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後に、可溶性画分を得た。
【０１０３】
融合タンパク質を含有する上清を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５で平衡化したＨｉ  Ｔｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰカラムにロードした。溶出は、塩勾配：同じバッファー中２ＭのＮａＣｌで行った。ほとんど総ての夾雑物がフロースルー中、または低い塩濃度で除去され、ＩＭＸ３１３Ｔタンパク質は、後におよそ１Ｍ  ＮａＣｌで、ただ１回のクロマトグラフィー工程だけで極めて高純度（およそ９５％）で溶出された。さらにゲル濾過により精製すると、実質的に純粋なタンパク質が得られる。結果を図１に示す。
【０１０４】
５．ＩＭＸ３１３に融合された他の短い正電荷ペプチド
異なるリンカー（グリシン対セリンおよびプロリン）を比較するため、またはアルギニンとリジンを比較するために、ＩＭＸ３１３Ｔの他の３つの改変を行った。ＩＭＸ３１３Ｔを発現するプラスミドを、オリゴヌクレオチド：
【化８】
0006518193.tif 000009
を用いて増幅することにより変異させ、そのＰＣＲ産物をＧｅｉｓｅｒ（２９）の方法により、ＩＭＸ３１３Ｔタンパク質を発現するＴ７ベクターに挿入した。
【０１０５】
ｐＩＭＸ４２７、ｐＩＭＸ４２８およびｐＩＭＸ４２９と呼称する得られたプラスミドは、タンパク質：
【化９】
0006518193.tif 000010
をコードする。
【０１０６】
これらをＩＭＸ３１３Ｐと同様に精製し、次いで、それらの５ｍｌヘパリン−セファロースカラム上での挙動を、ＩＭＸ３１３ＴおよびＩＭＸ３１３Ｐと比較して調べた。
【０１０７】
【表１】
0006518193.tif 000011
【０１０８】
条件は次の通りであった：ローディングバッファー２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ。次いで、第２バッファーを用いて勾配溶出を行った。第２バッファーは、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５および２Ｍ  ＮａＣｌであった。
【０１０９】
これらの結果は、アルギニン７個のペプチドがＮａＣｌ濃度８２０ｍＭでヘパリンセファロースから溶出し、リジン７個のペプチドが６４０ｍＭ  ＮａＣｌ濃度で溶出したことを示したＦｒｏｍｍおよび共同研究者ら（４７）の実験と比較することができる。明らかに、正電荷ペプチドのコイルドコイルとの融合は、それらのヘパリンへの結合を改善する。
【０１１０】
６．抗原ＰＡｍ、ならびに融合タンパク質ＰＡｍ−ＩＭＸ３１３およびＰＡｍ−ＩＭＸ３１３Ｔの生産および精製
抗原ＰＡｍのＩＭＸ３１３との融合物を生産するために、黄色ブドウ球菌オープンリーディングフレーム由来のプロテインＡを、オリゴヌクレオチド：
【化１０】
0006518193.tif 000012
を用いてプラスミドｐＥＺＺ１８（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から増幅させ、その約２３３ｂｐ塩基対のＰＣＲ産物を、Ｇｅｉｓｅｒ（２９）の方法により、ＩＭＸ３１３タンパク質を発現するＴ７ベクターに挿入した。次に、プロテインＡリーディングフレームを、Ｋｉｍら（２７）により記載されている突然変異を導入するために、オリゴヌクレオチド：
【化１１】
0006518193.tif 000013
を用いて変異させ、発現ベクターｐＩＭＸ４９４を作出し、これは下記の発現カセット（配列番号１９）：
【化１２】
0006518193.tif 000014
を有する。
【０１１１】
これは下記のタンパク質（配列番号２０）：
【化１３】
0006518193.tif 000015
をコードする。
【０１１２】
このバージョンのＩＭＸ３１３は、計画された免疫誘導の解釈を容易にするために、５５アミノ酸バージョンに見られる最後の５つのアミノ酸（ＧＬＳＫＥ）を欠いていることに留意されたい。ＩＭＸ４９４融合タンパク質（ＰＡｍ−ＩＭＸ３１３）は、Ｃ４３（ＤＥ３）株でＩＰＴＧによる誘導時に発現された。この細胞ペレットを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７中での音波処理により溶解させ、４℃にて１８，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。融合タンパク質はペレット中に見られ、次にこれを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３Ｍ尿素から構成されるバッファーｐＨ７．４中で音波処理し、再び１８０００ｒｐｍで遠心分離した。この時、融合タンパク質は上清中に存在し、これをＨｉ  Ｔｒａｐ  Ｑ  ＦＦ  ５ｍｌカラムにロードし、カラムを１Ｍ  ＮａＣｌ勾配で展開した。
【０１１３】
ＩＭＸ４９４タンパク質を含有する画分をプールし、ＰＢＳに対して透析し、Ｈｉ  Ｌｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５カラムでのゲル濾過によりさらに精製した。
【０１１４】
担体タンパク質に融合されていない抗原ＰＡｍを生産するために、ベクターｐＩＭＸ４９４からＩＭＸ３１３コード配列を、オリゴヌクレオチド：
【化１４】
0006518193.tif 000016
を用いて欠失させた。このＰＣＲ産物を親ベクターに挿入し（２７）、プラスミドｐＩＭＸ４９５を作出した。
【０１１５】
Ｃ４３（ＤＥ３）株中ｐＩＭＸ４９５の５００ｍｌ培養物(A 500ml culture of pIMX495 in the strain C43(DE3)を１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、一晩増殖させた。回収した細菌をバッファー：５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４中での音波処理により溶解させ、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＳＳ３４ローターにて、４℃、１８，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。タンパク質ＩＭＸ４９５（そのＮ末端メチオニンを欠くＰＡｍ）は上清中に見られ、その上清を７６℃で１５分間加熱した後に１８ｋで１５分間の２回目の遠心分離を行うことにより精製した。この時にも、ＩＭＸ４９５は上清中に見られ、これを５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６バッファーに対して透析した。上清をＨｉ  Ｔｒａｐ  ＳＰ  ＦＦ  ５ｍｌカラムにロードし、ＮａＣｌ勾配で溶出させた。最後に、ＩＭＸ４９５タンパク質をＰＢＳ中、Ｈｉ  ｐｒｅｐ  ２６／６０  ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００  ＨＲカラムでのゲル濾過により精製した。
【０１１６】
融合タンパク質ＰＡｍ−ＩＭＸ３１３ＴをコードするベクターｐＩＭＸ４９７を生産するために、ベクターｐＩＭＸ４９４を、最後の２つのアミノ酸ロイシンおよびグルタミンをコードする配列をＴＴＧＣＡＡからＣＴＧＣＡＧに同義的に変異させることによって改変し、次いで、新たに作出されたＰｓｔ  Ｉ部位と、第２の終止コドンとオーバーラップするＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位との間に、オリゴヌクレオチド：
【化１５】
0006518193.tif 000017
を用いてクローニングし、ＩＭＸ３１３のＣ末端をＬＱ＊＊からＬＱＳＰＲＲＲＲＳ＊＊（配列番号１１）に変更した。
【０１１７】
次に、コードされているタンパク質ＩＭＸ４９７をＣ４３（ＤＥ３）株で発現させ、細菌ペレットを５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４に溶解させて１８ｋ  ｒｐｍで遠心分離することにより精製した。融合タンパク質はペレット中に見られ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、８Ｍ尿素、ｐＨ７．４中での音波処理により再懸濁させた。さらなる遠心分離の後、上清を５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４に対して透析し、この透析物を遠心分離した。上清を１５分間７５℃に加熱した後、再び遠心分離した。上清を２ＭへのＮａＣｌ勾配で展開させるＨｉ  Ｔｒａｐ  ＳＰ  ＦＦカラムで精製し、ＩＭＸ４９７融合タンパク質を含有する画分をプールし、ＰＢＳに対して透析し、Ｈｉ  Ｌｏａｄ  ２６／６０  ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５カラムでのゲル濾過により精製した。
【０１１８】
７．細胞内ＴＬＲリガンドの結合
これらのタンパク質が細胞内ＴＬＲリガンドと結合できたかどうかを判定するために、電気泳動移動度シフトアッセイ(electrophoretic mobility shift assay)（ＥＭＳＡ）を行った。
【０１１９】
細胞内ＴＬＲリガンドとＩＭＸ４９７タンパク質（ＰＡｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ）の種々の組合せを調製し、複合体形成をアガロースゲル電気泳動により分析した。
【０１２０】
用いたＴＬＲリガンドは次の通りであった。
・ＴＬＲ３の場合：二本鎖ＲＮＡの類似体としてのポリシチジル酸にハイブリダイズされるポリイノシン酸ポリヌクレオチドの二重鎖であるポリＩ：Ｃ。鎖長は各鎖２０ヌクレオチドであった。
・ＴＬＲ７の場合：配列5’ GsCsCsCsGsUsCsUsGsUsUsGsUsGsUsGsAsCsUsC 3’ （ここで、「ｓ」はホスホチオエート結合(phosphothioate linkage)を表す）（配列番号２５）を有する、ｓｓＲＮＡ４０と呼ばれるオリゴヌクレオチド。
・ＴＬＲ９の場合：配列：5’ tccatgacgttcctgacgtt 3’(配列番号26)を有する、ＯＤＮ１８２６と呼ばれるオリゴヌクレオチド。
【０１２１】
ＴＬＲ９リガンドに関して、結果を図２に示す。左から右へ：
レーン１：低分子量ラダー（ＮＥＢ）；
レーン２：タンパク質ＩＭＸ４９７（１ｍｇ／ｍｌ）；
レーン３：ＦＩＴＣ  ＣｐＧ  ＯＤＮ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）１０μＭ；
レーン４：タンパク質ＩＭＸ４９７（１ｍｇ／ｍｌ）とＦＩＴＣ  ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０μＭ；
レーン５：タンパク質ＩＭＸ４９７（０．５ｍｇ／ｍｌ）とＦＩＴＣ  ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０μＭ；
レーン６：タンパク質ＩＭＸ４９７（０．２５ｍｇ／ｍｌ）とＦＩＴＣ  ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０μＭ；
レーン７：タンパク質ＩＭＸ４９７（０．１２５ｍｇ／ｍｌ）とＦＩＴＣ  ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０μＭ。
【０１２２】
複合体は複合体を形成していないリガンドよりもずっとゆっくり移動し、従って、ゲル上でリガンドが「シフトする」ので、複合体形成は明瞭に検出可能であった。タンパク質の濃度が低下するにつれ、観察される複合体は発散性が高くなり、非結合ＴＬＲリガンドのバンドが見えるようになった（それは、対照として用いたＴＬＲリガンドのみを含有するサンプルと同じ距離の移動であった）。
【０１２３】
タンパク質ＩＭＸ４９７とＴＬＲ７およびＴＬＲ３リガンドの組合せを図３に示すが、これらの核酸もまた複合体を形成し、ＥＭＳＡにより容易に検出された。
【０１２４】
図３の凡例（ＴＬＲ７リガンドまたはＴＬＲ３リガンド＋ＩＭＸ４９７）：
レーン１：低分子量ラダー（ＮＥＢ）；
レーン２：タンパク質ＩＭＸ４９７（１ｍｇ／ｍｌ）；
レーン３：ＦＩＴＣ  ｓｓＲＮＡ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）１０μＭ；
レーン４：タンパク質ＩＭＸ４９７（１．５ｍｇ／ｍｌ）／ＦＩＴＣ  ｓｓＲＮＡ  １０μＭ；
レーン５：タンパク質ＩＭＸ４９７（１ｍｇ／ｍｌ）／ＦＩＴＣ  ｓｓＲＮＡ  １０μＭ；
レーン６：タンパク質ＩＭＸ４９７（０．５ｍｇ／ｍｌ）／ＦＩＴＣ  ｓｓＲＮＡ  １０μＭ；
レーン７：タンパク質ＩＭＸ４９７（０．２５ｍｇ／ｍｌ）／ＦＩＴＣ  ｓｓＲＮＡ  １０μＭ；
レーン８：タンパク質ＩＭＸ４９７（０．１２５ｍｇ／ｍｌ）／ＦＩＴＣ  ｓｓＲＮＡ  １０μＭ；
レーン９：ＦＩＴＣ  ｓｓＲＮＡ  １０μＭ；
レーン１０：陰性対照；
レーン１１：ポリ（Ｉ：Ｃ）（Ｒ＆Ｄ  ＴＯＣＲＩＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）０．５ｍｇ／ｍｌ；
レーン１２：タンパク質ＩＭＸ４９７（１．５ｍｇ／ｍｌ）／ポリ（Ｉ：Ｃ）０．５ｍｇ／ｍｌ；
レーン１３：タンパク質ＩＭＸ４９７（１ｍｇ／ｍｌ）／ポリ（Ｉ：Ｃ）０．５ｍｇ／ｍｌ；
レーン１４：タンパク質ＩＭＸ４９７（１ｍｇ／ｍｌ）／ポリ（Ｉ：Ｃ）０．２５ｍｇ／ｍｌ；
レーン１５：タンパク質ＩＭＸ４９７（０．５ｍｇ／ｍｌ）／ポリ（Ｉ：Ｃ）０．５ｍｇ／ｍｌ；
レーン１６：タンパク質ＩＭＸ４９７（０．５ｍｇ／ｍｌ）／ポリ（Ｉ：Ｃ）０．２５ｍｇ／ｍｌ；
レーン１７：タンパク質ＩＭＸ４９７（０．２５ｍｇ／ｍｌ）／ポリ（Ｉ：Ｃ）０．５ｍｇ／ｍｌ。
【０１２５】
本発明者らはまた、ＩＭＸ４９４（ＰＡｍ−ＩＭＸ３１３）およびＩＭＸ４９５（ＰＡｍ）もまたＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＴＬＲ９リガンド）とともにこのようなゲルシフトをもたらすことができたかどうかも検討した。結果を図４に示す。
【０１２６】
図４の凡例：
レーン１：低分子量ラダー（ＮＥＢ）；
レーン２：タンパク質ＩＭＸ４９７（１ｍｇ／ｍｌ）；
レーン３：タンパク質ＩＭＸ４９４（１ｍｇ／ｍｌ）；
レーン４：タンパク質ＩＭＸ４９５（１ｍｇ／ｍｌ）；
レーン５：ＦＩＴＣ  ＣｐＧ  ＯＤＮ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）１０μＭ；
レーン６：タンパク質ＩＭＸ４９７（１，５ｍｇ／ｍｌ）とＦＩＴＣ  ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０μＭ；
レーン７：タンパク質ＩＭＸ４９７（１ｍｇ／ｍｌ）とＦＩＴＣ  ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０μＭ；
レーン８：タンパク質ＩＭＸ４９７（０．５ｍｇ／ｍｌ）とＦＩＴＣ  ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０μＭ；
レーン９：タンパク質ＩＭＸ４９７（０．２５ｍｇ／ｍｌ）とＦＩＴＣ  ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０μＭ；
レーン１０：タンパク質ＩＭＸ４９４（１ｍｇ／ｍｌ）とＦＩＴＣ  ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０μＭ；
レーン１１：タンパク質ＩＭＸ４９４（０．５ｍｇ／ｍｌ）とＦＩＴＣ  ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０μＭ；
レーン１２：タンパク質ＩＭＸ４９４（０．２５ｍｇ／ｍｌ）とＦＩＴＣ  ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０μＭ；
レーン１３：タンパク質ＩＭＸ４９５（１ｍｇ／ｍｌ）とＦＩＴＣ  ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０μＭ；
レーン１４：タンパク質ＩＭＸ４９５（０．５ｍｇ／ｍｌ）とＦＩＴＣ  ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０μＭ；
レーン１５：タンパク質ＩＭＸ４９５（０．２５ｍｇ／ｍｌ）とＦＩＴＣ  ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０μＭ。
【０１２７】
図４のゲルは、ゲルシフトはＩＭＸ４９７では再現性があるが、ＩＭＸ４９５（レーン１３〜１５）は検出可能なゲルシフトはもたらさず、また、ＩＭＸ４９４（レーン１０〜１２）で見られるゲルシフトはかろうじて検出可能であって、ＩＭＸ４９７で見られるものよりもはるかに著しさを欠くことを示す。
【０１２８】
ＩＭＸ４９４とＩＭＸ４９７の間の違いは、ＩＭＸ４９７にはタンパク質のコイルドコイルのＣ末端に融合された配列ＳＰＲＲＲＲＳが存在することである。
【０１２９】
結論：
前記ペプチドが無ければ、ＩＭＸ３１３と抗原ＰＡＭの融合タンパク質は、ＴＬＲ受容体の核酸リガンドと結合することができない。
【０１３０】
８．ＩＭＸ３１３Ｔに会合された抗原の免疫原性
次に、単独であれＩＭＸ３１３またはＩＭＸ３１３Ｔに融合された場合であれ、また、細胞内ＴＬＲリガンドを伴う処方を用いる場合であれ用いない場合であれ、ＰＡｍの免疫原性を判定するために、マウスに免疫を行った。フロイントの完全または不完全アジュバント（ＣＦＡ／ＩＦＡ）とともに処方したＰＡｍを対照として用いた。
【０１３１】
この目的で、雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、初回はＣＦＡ中に、次回はＩＦＡ中に処方したＰＡｍ、ＰＡｍ−ＩＭＸ３１３、ＰＡｍ−ＩＭＸ３１３ＴまたはＰＡｍで、１４日間隔で２回、１回の注射につき各タンパク質２ナノグラムを用いて皮下免疫した。初回免疫の２８日後に、血清中のＰＡｍ特異的ＩｇＧ力価を、プレートをＰＡｍでコーティングしたＥＬＩＳＡを用いて測定した。結果を４０５ｎｍで測定されたサンプルのＯＤ＋ＳＥＭとして表す。異なる群の平均値間の有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡとその後のＴｕｋｅｙの多重比較検定により判定した。ｐ値＜０．０５を統計学的に有意と見なして異なる＊として表し、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊はｐ＜０．０１を表す。
【０１３２】
結果を図５に示す。ＰＡｍ単独で免疫したマウスの血清中には抗ＰＡＭ  ＩｇＧ抗体は存在しないかまたは極めて低いレベルであった。他方、ＰＡｍ−ＩＭＸ３１３またはＰＡｍ−ＩＭＸ３１３Ｔで免疫したマウスは、高レベルの全身性ＰＡｍ特異的ＩｇＧ抗体応答を示したが、ＰＡｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ免疫マウスは、ＰＡｍ−ＩＭＸ３１３免疫マウスに比べて有意に高い（ｐ＜０．００１）ＩｇＧ抗体応答を示し、ＰＡｍ−ＩＭＸ３１３Ｔと同等の応答がＰＡｍ＋ＣＦＡ／ＩＦＡをアジュバントとして用いた場合に得られた。
【０１３３】
このことは、ペプチドＳＰＲＲＲＲＳの付加は、親配列ＩＭＸ３１３に比べ、抗原に対して有意に向上した免疫原性を付与することを示す。
【０１３４】
抗原ＰＡｍを細胞内ＴＬＲリガンド（一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであれ二本鎖ＲＮＡであれ）とともに処方した場合、その免疫原性は実質的に改善し、同等の改善が、処方前に抗原がＩＭＸ３１３に融合された場合にも見られた。しかしながら、明らかに最良の結果は、ＴＬＲリガンドとともに処方する前に抗原がＩＭＸ３１３Ｔに融合された場合に見られた。
【０１３５】
ここで結果を表にまとめ、以下に概略を示す。
【０１３６】
【表２】
0006518193.tif 000018
【０１３７】
着目される問題は、これらの改善が、抗原、この場合ＰＡｍに対して得られた免疫応答のタイプを改変するかどうかということである。Ｔｈ１またはＴｈ２応答は選択的に改善されるのか。これに答えるために、本発明者らは、ＩｇＧ１力価がＴｈ２型応答の典型であり、一方、ＩｇＧ２ａはＴｈ１型応答に相当することから、ＩｇＧ１応答とＩｇＧ２ａ応答を比較した。結果を表２に示す。
【０１３８】
ＰＡｍはそれ自体でほとんど等しいＴｈ１応答とＴｈ２応答を誘導するが、それをフロイントのアジュバントとともに処方した場合には、これを劇的に変化させ、この場合にはＴｈ２応答（ＩｇＧ１）が優勢となることが明らかである。ＰＡｍとＩＭＸ３１３の融合は、Ｔｈ１応答とＴｈ２応答の両方が増強されること、およびこの応答のタイプに有意なシフトがないことを示す。ＩＭＸ３１３Ｔを用いた場合には、Ｔｈ１応答（ＩｇＧ２ａ）が優勢化し始めるが、この効果はフロイントのアジュバントを用いた場合よりもはるかに小さく、逆方向である。免疫学者の共通認識は、Ｔｈ１応答の方がＴｈ２応答よりも好ましいということである。
【０１３９】
この分析をさらに考慮して、本発明者らは、細胞内ＴＬＲリガンドを用いた処方が、Ｔｈ１応答またはＴｈ２応答のいずれかを生成するように免疫系を再指向するために使用可能であるかどうかを検討した。Ｔｈ応答のタイプを評価するためにＩｇＧ抗体アイソタイプデータを用い、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ１抗体の優勢性は、それぞれＴｈ１様応答またはＴｈ２様応答を示す。Ｔｈ１様応答は極めて高いＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比を有し、従って、群平均値も高かった。ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比は、Ｔｈ１優勢（ＩｇＧ２ａ＞ＩｇＧ１）、Ｔｈ２優勢（ＩｇＧ１＞ＩｇＧ２ａ）、または混合型Ｔｈ１／Ｔｈ２（Ｔｈ０、ＩｇＧ１＝ＩｇＧ２ａ）応答のいずれかの指標として用いた。
【０１４０】
結果を下記の表２に示す。
【表３】
0006518193.tif 000019
【０１４１】
ＰＡｍ−ＩＭＸ３１３ＴをＴＬＲリガンドとともに処方すると、３種類のリガンドのそれぞれでＴｈ１応答が優勢となる傾向を強めることが即明らかであり、この効果はＴＬＲ３リガンドポリＩ：Ｃで最も顕著であり、ＴＬＲ９リガンドを用いる場合とほとんど同じ顕著さである。
【０１４２】
９．Ｔ細胞応答
正電荷ペプチドによるＩＭＸ３１３コイルドコイルの改変はＴ細胞応答も改善できたかどうかを判定するために、本発明者らはマイコバクテリア抗原８５Ａをモデルとして用いたが、これはＩＭＸ３１３がマウスおよびサルにおいてこの抗原に対するＴ細胞応答を改善することが示されていたためである（２８）。抗原８５Ａ単独またはＩＭＸ３１３Ｔとの融合物もしくはその１４もしくは１８個のアミノ酸だけを含有するＩＭＸ３１３の２つの末端切断型との融合物を発現する一連の組換えプラスミドを、まず、Ｓｐｅｎｃｅｒら（２８）により記載されているｐＳＧ２−８５Ａ−ＩＭＸ３１３ベクターから８５Ａ−ＩＭＸ３１３コード配列をＧａｔｅｗａｙプラスミドｐＥＮＴＲ４−ＬＰにサブクローニングすることにより作製した。このｐＥＮＴＲ４骨格において、ＩＭＸ３１３を欠失させるか改変するような誘導体を作製した。
【０１４３】
これらのＩＭＸ３１３変異体のアミノ酸配列を以下に示す。
【化１６】
0006518193.tif 000020
【０１４４】
ＩＭＸ３１３の１４マーおよび１８マーフラグメントは３７℃（および４２℃でさえも）ヘプタマーを維持しており、従って、ＤＮＡワクチン接種後に発現させた際にヘプタマー融合タンパク質を形成するはずであることから、それらを選択した。ＩＭＸ３１３の改変は次のように行った。
【０１４５】
フォワードプライマーＩＭＸ０４３およびＩＭＸ０４４とリバースプライマーＩＭＸ０４５を用いてＩＭＸ３１３のフラグメントを増幅し、このＰＣＲ産物を用いて（２９）親プラスミドのＩＭＸ３１３と置換した。
【０１４６】
【化１７】
0006518193.tif 000021
【０１４７】
ＩＭＸ３１３コード配列を、プライマーＩＭＸ０３７およびＩＭＸ０４７と、鋳型としての親プラスミドを用いて欠失させ、次に、得られたＰＣＲ産物を用いて（２９）ＩＭＸ３１３配列と置換した。
【０１４８】
【化１８】
0006518193.tif 000022
【０１４９】
８５Ａ−ＩＭＸ３１３Ｔを作製するために、下記のオリゴを用いて、プラスミドｐＩＭＸ４９７からＩＭＸ３１３Ｔを増幅し、次に、そのＰＣＲ産物を親プラスミド：
【化１９】
0006518193.tif 000023
に挿入した（２９）。
【０１５０】
次に、これらの５つのプラスミド（８５Ａ、８５Ａ−ＩＲ１４、８５Ａ−ＴＬ１８、８５Ａ−ＩＭＸ３１３および８５Ａ−ＩＭＸ３１３Ｔをコードする）をＤＮＡ免疫に用いた。
【０１５１】
５群のＢＡＬＢ／ｃマウスを、これら５つのプラスミドのそれぞれで、０日目と１４日目に１回の注射当たり２５μｇを用いて筋肉内免疫した。抗原特異的Ｔ細胞応答の誘導は、２８日目に脾細胞を用い、ＥＬＩＳＰＯＴにより測定した。免疫マウスから単離した精製脾臓ＣＤ４＋、ＣＤ８＋および全Ｔ細胞を組換え８５Ａタンパク質（Ｃｌｉｎｉｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃから購入したペプチドｐ１１もしくはｐ１５（２６）のいずれかと共培養した。
【０１５２】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ：
平底９６ウェルニトロセルロースプレート（Ｍｉｌｌｉｔｉｔｅｒ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をＩＦＮ−γ  ｍＡｂ（１５μｇ／ｍｌ；ＭＡＢＴＥＣＨ、ストックホルム）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、プレートを３７℃にて１時間、１０％ウシ胎仔血清でブロッキングした。２×１０６細胞／ウェルを、１５μｇ／ｍｌの抗ヒトＩＦＮ−□でコーティングしたＩＰＶＨ膜上にて、終濃度２μｇ／ｍｌの関連ペプチド（ＣＤ８エピトープｐ１１、ＣＤ４エピトープｐ１５または８５Ａタンパク質）で刺激し、２０時間インキュベートした。インキュベーション後、これらのプレートをＰＢＳで十分に洗浄して細胞を除去し、ＩＦＮ−γ  ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌのビオチン、ＭＡＢＴＥＣＨ）を各ウェルに加えた。３７℃で２時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、室温で１時間、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（１μｇ／ｍｌ；ＭＡＢＴＥＣＨ）で現像した。洗浄した後、基質（３−アミノ−９−エチルカルバゾール(3-amino-9-ethycarbazol)（Ｓｉｇｍａ））を加え、１５分間インキュベートした。さらに洗浄した後に、赤色スポットを顕微鏡下で計数した。
【０１５３】
８５Ａ−ＩＭＸ３１３、８５Ａ−ＩＲ１４または８５Ａ−ＴＬ１８または８５Ａ−ＩＭＸ３１３Ｔ免疫マウスから単離された精製脾臓ＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔおよび全Ｔ細胞は、８５Ａ免疫マウスに比べて有意に高いＩＦＮγ応答を示し、ＩＭＸ３１３および他の改変配列のＴ細胞応答増強能が確認された。さらに、８５Ａ−ＩＭＸ３１３Ｔ接種マウス由来の脾臓ＣＤ４＋、ＣＤ８＋および全Ｔ細胞は、他のいずれの免疫群よりも有意に多いＩＦＮγを産生した（ｐ＜０．００１）（図６、７、８）。
【０１５４】
ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞とは異なるサイトカインプロファイルを示し、見られた優勢なサイトカイン産生集団は、ＩＦＮ−γを産生するＣＤ８＋Ｔ細胞であった（図７および８）。
【０１５５】
ＩＭＸ３１３がＩＭＸ３１３Ｔで置換されるとＣＤ４＋およびＣＤ８＋両方の抗原特異的Ｔ細胞応答が増強されるということは注目すべきことである。
【０１５６】
結論として、ＩＭＸ３１３により改善される抗原８５Ａに対するＴ細胞応答は、代わりにＩＭＸ３１３Ｔを使用することによりさらに改善される。
【０１５７】
１０．ＤＮＡワクチン接種により誘導されるＢ細胞応答
ＤＮＡワクチンで免疫したマウスの血清において、抗原８５Ａに対する抗体力価をＥＬＩＳＡにより測定した（図９）。
【０１５８】
８５Ａ−ＩＭＸ３１３プラスミド、８５Ａ−ＩＭＸ３１３Ｔプラスミドおよび短鎖型のＩＭＸ３１３（ＩＲ１４およびＴＬ１８）で免疫したマウスは、８５Ａを発現するプラスミドで免疫したマウスよりも有意に高い抗原特異的な総ＩｇＧ力価を生じた（図９）。８５Ａ−ＩＭＸ３１３Ｔで免疫した群は、最高のＩｇＧ応答を示した（ｐ＜０．００１）。８５Ａ単独で免疫したマウスでは、それらの血清中の抗８５Ａ  ＩｇＧ抗体は極めて低レベルであった。
【０１５９】
短い正電荷ペプチドＳＰＲＲＲＲＳが付加された場合の免疫応答のＴｈ１への再指向は、
ＤＮＡがワクチン接種に使用される場合にも見られた。本発明者らは、８５Ａタンパク質に特異的なＩｇＧアイソタイプをＥＬＩＳＡにおいて評価した（表３）。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ＩｇＧ２ａアイソタイプはＴｈ１型免疫応答に関連付けられ、ＩｇＧ１アイソタイプはＴｈ２型免疫応答に関連付けられる。
【０１６０】
注目すべきは、ＩＭＸ３１３またはＩＭＸ３１３Ｔのいずれかの使用は、Ｔヘルパータイプ１（Ｔｈ１）関連抗原特異的ＩｇＧへのシフトをもたらし、抗原８５Ａ単独に比べて有意に高いレベルのＩｇＧ２ａと低いレベルのＩｇＧ１を伴い（表３）、これらの結果はＴｈ１分極の直接的エビデンスを成し、これらの結果は細胞性免疫応答で見られた結果と一致する。
【０１６１】
表３．雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスの群（ｎ＝５）を、８５Ａ−ＩＭＸ３１３、８５Ａ−ＩＭＸ３１３Ｔ、短いＩＭＸ３１３配列８５Ａ−ＩＲ１４および８５Ａ−ＴＬ１８、および８５Ａ単独を発現するプラスミドで、１４日間隔で２回、筋肉内免疫した。初回免疫の２８日後に、血清中の８５Ａ特異的ＩｇＧ1およびＩｇＧ２ａレベルを、８５Ａ特異的ＥＬＩＳＡを用いて測定した。結果を４０５ｎｍで測定されたサンプルのＯＤ＋ＳＥＭとして表す。本発明者らが上記のように分析すると、これらのアイソタイプデータを分類する同様のデータが得られた。
【０１６２】
【表４】
0006518193.tif 000024
【０１６３】
明らかに、総てのバージョンのＩＭＸ３１３には優先的にＴｈ１応答を増強する傾向があり、コイルドコイルに融合された短い正電荷ペプチドを有するＩＭＸ３１３Ｔのバージョンで効果が最も顕著であった。
【０１６４】
１１．特定の融合タンパク質ＩＭＸ３１３Ｔ＋インフルエンザ由来核タンパク質（ＮＰ）抗原の使用
ＤＮＡワクチン接種のため、図１０に示されるような親プラスミドｐｃＤＮＡ３−ＮＰを下記の例に記載するように改変した。
【０１６５】
１１．１−ＮＰコードプラスミドへのＩＭＸ３１３の挿入
ＩＭＸ３１３コード配列をプラスミドｐＩＭＸ４９４から、オリゴヌクレオチドプライマー：
【化２０】
0006518193.tif 000025
を用いて増幅し、Ｇｅｉｓｅｒ（２９）に記載されているようにプラスミドｐｃＤＮＡ３−ＮＰに挿入した。
【０１６６】
１１．２−ｔＰＡシグナルペプチドの挿入
ｔＰＡシグナルペプチドをベクターｐＳＧ２−８５Ａ（２８）から、オリゴヌクレオチド：
【化２１】
0006518193.tif 000026
を用いて増幅し、Ｇｅｉｓｅｒ（２９）により記載されているようないくつかのプラスミドに、ＮＰコード配列のＮ末端とインフレームで挿入した。
【０１６７】
１１．３−そのモノマー化のためのＮＰの２つの点突然変異の作出
オリゴヌクレオチドプライマー：
【化２２】
0006518193.tif 000027
を用いてＮＰ遺伝子の内部フラグメントを増幅し、得られたＰＣＲ産物をＧｅｉｓｅｒに記載されているようにＮＰコードプラスミドに挿入した。両オリゴヌクレオチドともＮＰ遺伝子との一致は不完全であったので、このＰＣＲ産物の挿入は２つの点突然変異を作り出した。ＩＭＸ１２８７プライマーはＮＰ遺伝子に突然変異Ｅ３３９Ａ（ＧＡＡからＧＣＡへ）を生成し、ＩＭＸ１２８８プライマーは突然変異Ｒ４１６Ａ（ＡＧＡからＧＣＡへ）を生成した。
【０１６８】
１１．４−ＩＭＸ３１３Ｔの挿入
ＩＭＸ３１３Ｔコード配列をプラスミドｐＩＭＸ４９７から、オリゴヌクレオチドプライマー：
【化２３】
0006518193.tif 000028
を増幅し、Ｇｅｉｓｅｒに記載されているように種々のｐｃＤＮＡ３−ＮＰ由来プラスミドに挿入した。
【０１６９】
１１．５−本発明による核酸を用いたＤＮＡ免疫
１１．５．１．プロトコール
５個体の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスの群を、種々のプラスミドＤＮＡで、１４日間隔で２回、１回の注射につき各プラスミド２０μｇを用いて筋肉内免疫した。２８日目に免疫応答を測定し、種々の改変：＋／−ＩＭＸ３１３またはＩＭＸ３１３Ｔ；＋／−ｔＰＡシグナルペプチド；＋／−モノマー化突然変異の影響を判定した。
【０１７０】
抗原特異的Ｔ細胞応答は、２８日目に脾細胞を用いてＥＬＩＳＰＯＴにより測定した。免疫マウスから単離した精製脾臓ＣＤ４＋、ＣＤ８＋および全Ｔ細胞を、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃから購入したＮＰ  Ａインフルエンザペプチド（アミノ酸３６６〜３７４）と共培養した。
【０１７１】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ：
平底９６ウェルニトロセルロースプレート（Ｍｉｌｌｉｔｉｔｅｒ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をＩＦＮ−γ  ｍＡｂ（１５μｇ／ｍｌ；ＭＡＢＴＥＣＨ、ストックホルム）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、プレートを３７℃にて１時間、１０％ウシ胎仔血清でブロッキングした。２×１０６細胞／ウェルを、１５μｇ／ｍｌの抗ヒトＩＦＮ−γでコーティングしたＩＰＶＨ膜上にて、終濃度２μｇ／ｍｌの関連ペプチド（ＮＰ  Ａインフルエンザペプチド）で刺激し、２０時間インキュベートした。インキュベーション後、これらのプレートをＰＢＳで十分に洗浄して細胞を除去し、ＩＦＮ−γ  ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌのビオチン、ＭＡＢＴＥＣＨ）を各ウェルに加えた。３７℃で２時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、室温で１時間、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（１μｇ／ｍｌ；ＭＡＢＴＥＣＨ）で現像した。洗浄した後、基質（３−アミノ−９−エチルカルバゾール(3-amino-9-ethycarbazol)（Ｓｉｇｍａ））を加え、１５分間インキュベートした。さらに洗浄した後に、赤色スポットを顕微鏡下で計数した。
【０１７２】
体液性免疫応答を検討するため、本発明者らは、Ｔｈ１とＴｈ２の総体的割合を評価するために、全ＩｇＧに特異的なＥＬＩＳＡ、ならびにＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの個々に特異的なＥＬＩＳＡにより抗体レベルを評価した。ＢＡＬＢ／ｃマウスは一般に、インフルエンザワクチンにはＴｈ２型免疫応答で応答し、これはＩｇＧ１抗体の刺激に関連する。しかしながら、ウイルス感染から生き残ったマウスの血清中に存在する主要な抗体アイソタイプはＩｇＧ２ａであり、これはＴｈ１型免疫応答の際に刺激される（３２）。ＩｇＧ２ａ抗体の刺激は、インフルエンザワクチン接種の有効性の増強に関連付けられている。
【０１７３】
ＥＬＩＳＡについては、抗原を０．１Ｍ炭酸ナトリウム／重炭酸（ｐＨ９．６）中で５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した後、ＭａｘｉＳｏｒｂプレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｌｏｎ、デンマーク）のウェルのコーティングに用いた。これらのウェルに試験血清の２倍連続希釈液を加え、洗浄後、結合した抗体を、セイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされた抗マウスＩｇＧ、または抗マウスＩｇＧ１または抗マウスＩｇＧ２ａ（Ｓｉｇｍａ）で検出した。ｏ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ）およびＨ２Ｏ２を加え、反応を１Ｍ硫酸で停止させた後に４９０ｎｍでの吸光度を測定した。
【０１７４】
結果を図１１〜１４に示す。
【０１７５】
１１．５．２．
予備実験で、本発明者らは、ＮＰまたはＩＭＸ３１３に融合されたＮＰのいずれかをコードするＤＮＡワクチンにより誘導されたＮＰに対する全Ｔ細胞応答を調べた。ＮＰ−ＩＭＸ３１３免疫マウスから単離された全Ｔ細胞は、ＮＰ免疫マウスの場合に比べて有意に高いＩＦＮγ応答を示し、ＩＭＸ３１３のＴ細胞応答増強能が確認された。
【０１７６】
図１１は、親ＮＰ抗原遺伝子とＩＭＸ３１３遺伝子の融合がＮＰに対するＴ細胞応答を改善することを示す。
【０１７７】
１１．５．３．
ＥＬＩＳＰＯＴで検出されたＩＦＮ−γがＣＤ４  Ｔ細胞により産生されたかＣＤ８  Ｔ細胞により産生されたかを判定するために、本発明者らは免疫マウス由来の脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を精製し、これらをインフルエンザＡ  ＮＰペプチドと共培養した。ＮＰ−ＩＭＸ３１３で免疫した群で、ＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ産生の有意な増加が検出された。ＩＦＮ−γを産生する抗原特異的ＣＤ８＋細胞のパーセンテージは、対応するＣＤ４＋Ｔ集団よりも高かった（図１２）。
【０１７８】
図１２は、ＮＰ抗原遺伝子とＩＭＸ３１３遺伝子の融合がＮＰ抗原に対するＣＤ４＋応答およびＣＤ８＋応答を改善することを示す。
【０１７９】
１１．５．４．
本発明者らは、次に、免疫後および最後の免疫から１４日後のＮＰに対する抗体応答を検討し、血清においてＮＰ特異的ＩｇＧ  Ａｂ応答を測定した。ＮＰ対照マウスとＮＰ−ＩＭＸ３１３を与えたマウスは中等度のＮＰ特異的ＩｇＧ  Ａｂを示し（図１３）、ＮＰ−ＩＭＸ３１３で免疫した群の方が高かった。
【０１８０】
図１３は、ＮＰ遺伝子とＩＭＸ３１３遺伝子の融合がＮＰ抗原に対するＩｇＧ抗体応答を改善することを示す。
【０１８１】
１１．５．５．
ＮＰ特異的ＩｇＧ１抗体およびＩｇＧ２ａ抗体（Ｂａｌｂ／ＣマウスにおいてそれぞれＴｈ２型およびＴｈ１型の応答を表す）の存在に関しても血清を調べた。ＮＰ−ＩＭＸ３１３免疫マウスの血清ではＮＰ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体アイソタイプが検出されたが、ＮＰだけを与えたマウス由来の血清サンプルは、低レベルのＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ  Ａｂを示したに過ぎなかった（図１４）。
【０１８２】
図１４は、ＮＰ抗原に対して誘導された抗体のサブクラス分布を示す。ＩＭＸ３１３遺伝子との融合はＩｇＧ１応答よりもＩｇＧ２Ａ応答を高め、ＮＰに対するＴｈ２に傾いた応答をＮＰ−ＩＭＸ３１３に対するＴｈ１に傾いた応答に転換する。
【０１８３】
１１．６−組換えＮＰ−Ｍ−ＩＭＸ３１３Ｔタンパク質の生産
タンパク質ＮＰ−Ｍ−ＩＭＸ３１３Ｔをコードする合成遺伝子を大腸菌での発現のためにコドンを最適化して合成した。この合成遺伝子をＴ７に基づく発現ベクターｐＩＭＸ０４（これは、ｆ１オリジンがプラスミドｐＳＣ１０１のｐａｒ遺伝子座により置換されているＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのベクターｐＲｓｅｔＣである）にクローニングした。発現を数種の標準培地（ＬＢ、Ｓｔｕｄｉｅｒの自己誘導培地）で誘導し、過剰発現されたタンパク質を、最初は、清澄化およびイオン交換工程に関してＹｅ（３０）およびＴａｒｕｓ（３１）により記載されているように精製したが、最終工程では、融合タンパク質を上記のようにヘパリンセファロースに対する親和性により精製した。
【０１８４】
１１．７．組換えタンパク質ＮＰ−Ｍ−ＩＭＸ３１３Ｔは次のように免疫に使用される：
５個体の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスの群を、種々のタンパク質調製物（ＴＬＲリガンドを含む処方を用い、または用いずに）で、１４日間隔で２回、１回の注射につき２ナノグラムのタンパク質を用いて筋肉内免疫した。２８日目に脾細胞を用いて免疫応答を測定し、抗原特異的Ｔ細胞応答（ＥＬＩＳＰＯＴにより測定）を判定した。免疫前と２８日目の抗体応答を、抗原としてＮＰを用いたＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１８５】
結果：
図１５は、ＮＰのモノマー化がその免疫原性を若干改善すること、これはＩＭＸ３１３遺伝子との融合によりさらに改善されるが、最大の改善はモノマーＮＰとＩＭＸ３１３Ｔ遺伝子を融合させることにより得られることを示す。
【０１８６】
図１６は、ＣＤ４＋応答およびＣＤ８＋応答の分析において、図６の場合と同様の順位付けが見られ、ＮＰのモノマー化がＮＰの免疫原性を若干改善すること、これはＩＭＸ３１３遺伝子との融合によりさらに改善されるが、最大の改善は、モノマーＮＰとＩＭＸ３１３Ｔ遺伝子を融合させることにより得られることを示す。
【０１８７】
図１７は、Ｂ細胞応答に関しても、図６および７でＴ細胞応答（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方）に関して見られたものと同様の順位付けが見られることを示す。ＮＰに対する全ＩｇＧ応答は、ＩＭＸ３１３を用いる場合よりもＩＭＸ３１３Ｔを用いる場合に高かった。
【０１８８】
図１８は、モノマーＮＰ抗原に対して誘導される抗体のサブクラス分布を示す。ＮＰの場合と同様に、ＩＭＸ３１３遺伝子との融合はＩｇＧ１応答よりもＩｇＧ２Ａ応答を増強し、ＮＰに対するＴｈ２に傾いた応答をＮＰ−ＩＭＸ３１３に対するＴｈ１に傾いた応答に転換する。特に注目されるのは、このＴｈ１バイアスに対するＴｈ２バイアスの除去は、ＩＭＸ３１３との融合よりもＩＭＸ３１３Ｔとの融合によって増幅された。インフルエンザワクチンにおけるＩｇＧ２ａ抗体の発現はウイルスのクリアランスと相関し、致死的なインフルエンザチャレンジに対する保護を増強した。ＥＬＩＳＡにより測定された両抗体アイソタイプの誘導の増強は、中和単独よりもワクチンの有効性により良い相関があった（３２）。
【０１８９】
１１．８−ＮＰ抗原の分泌はその免疫原性を改善した
組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）分泌シグナル配列を含有する一連のＮＰ  ＤＮＡワクチン構築物：ｔＰＡ−ＮＰ、ｔＰＡ−ＮＰ−Ｍ、ｔＰＡ−ＮＰ−Ｍ−ＩＭＸ３１３、およびｔＰＡ−ＮＰ−Ｍ−ＩＭＸ３１３Ｔを作製した。免疫動物由来の体液性免疫応答および細胞性免疫応答に対するｔＰＡとＮＰの融合の効果を分析した。
【０１９０】
ｔＰＡ含有構築物で免疫したマウスは、ＮＰ免疫マウスに比べて有意に高いＩＦＮγ応答を示し、ＩＭＸ３１３Ｔおよびモノマー化突然変異のＴ細胞応答増強能が確認された。
【０１９１】
図１９は、ＮＰ抗原の分泌の強制は、それがモノマーであってもなくても（ｔＰＡ−ＮＰ対ｔＰＡ−ＮＰ−Ｍ）、その免疫原性を改善する（ＮＰ対ｔＰＡ−ＮＰ）ことを示す。しかしながら、ＩＭＸ３１３との融合は、モノマー型のＮＰの使用が非改変抗原の使用よりも免疫原性が高かった（ｔＰＡ−ＮＰ−ＩＭＸ３１３対ｔＰＡ−ＮＰ−Ｍ−ＩＭＸ３１３）ことを示した。そして、ＩＭＸ３１３のＩＭＸ３１３Ｔによる置換はＮＰの免疫原性をさらに改善した（ｔＰＡ−ＮＰ−Ｍ−ＩＭＸ３１３対ｔＰＡ−ＮＰ−Ｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ）。
【０１９２】
図２０は、ＮＰの種々の分泌型に対するＣＤ８＋応答およびＣＤ４＋応答を示す。図１９と同じ順位付けが見られ、ＩＭＸ３１３が付加される場合にもまた抗原をモノマー化する有用性が明らかである。上記の図面と同様に、ＩＭＸ３１３よりもむしろＩＭＸ３１３Ｔが使用される場合に最大の免疫応答が見られる。
【０１９３】
図２１は、抗原ＮＰに対する全ＩｇＧ応答を示し、Ｔ細胞応答に関する図２０と同様の結論を導き、ＩＭＸ３１３Ｔが使用される場合に最大応答が見られるが、分泌（ＮＰ対ｔＰＡ−ＮＰ）およびモノマー化（ｔＰＡ−ＮＰ−ＩＭＸ３１３  ｖｅｒｓｕｓ  ｔＰＡ−ＮＰ−Ｍ−ＩＭＸ３１３）も重要な寄与となる。
【０１９４】
ＮＰ単独で免疫したマウスの血清中には抗ＮＰ  ＩｇＧ抗体は存在しないかまたは極めて低いレベルであった（図２１）。他方、ＮＰ−Ｍ−ＩＭＸ３１３、ｔＰＡ−ＮＰ−Ｍ−ＩＭＸ３１３、ＮＰ−Ｍ−ＩＭＸ３１３ＴまたはｔＰＡ−ＮＰ−Ｍ−ＩＭＸ３１３Ｔで免疫したマウスは、高レベルの全身性ＮＰ特異的ＩｇＧ抗体応答を示したが、ｔＰＡ−ＮＰ−Ｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ免疫マウスは、総ての免疫マウス群に比べて有意に高い（ｐ＜０．００１）ＩｇＧ抗体応答を有した。このことは、これらの改変の総ての組合せ（モノマー化突然変異、ｔＰＡおよびＩＭＸ３１３Ｔ）が、親配列または他の組合せに比べて、抗原に対して有意に高い免疫原性を付与することを示す。
【０１９５】
図２２は、ＮＰに対するＢ細胞応答のサブクラス分析を示し、ＮＰ単独を用いた場合の最初のＴｈ２バイアスはＩＭＸ３１３により、およびＩＭＸ３１３Ｔにより逆転されることを示す。分泌はそれ自体での効果はほとんどないが（ＮＰ対ｔＰＡ−ＮＰ）、モノマー化（ｔＰＡ−ＮＰ−ＩＭＸ３１３対ｔＰＡ−ＮＰ−Ｍ−ＩＭＸ３１３）およびその後のＩＭＸ３１３のＩＭＸ３１３Ｔによる置換（ｔＰＡ−ＮＰ−Ｍ−ＩＭＸ３１３対ｔＰＡ−ＮＰ−Ｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ）は総て、Ｔｈ２（ＩｇＧ１）応答に対するＴｈ１（ＩｇＧ２ａ）応答の改善に寄与する。
【０１９６】
ｔＰＡ−ＮＰ−Ｍ−ＩＭＸ３１３Ｔがそれ自体でＴｈ１応答とＴｈ２応答をほぼ等しく高めることは極めて重要である。ＮＰとＩＭＸ３１３の融合は、Ｔｈ１応答とＴｈ２応答の両方が増強され、応答のタイプに有意なシフトが無いことを示す。しかし、ＩＭＸ３１３Ｔとモノマー化突然変異を用いると、Ｔｈ１応答（ＩｇＧ２ａ）が優勢化し始める。免疫学者の共通認識は、Ｔｈ１応答の方がＴｈ２応答よりも好ましいということである（図２２）。
【０１９７】
１１．９−ＩＭＸ３１３Ｔは分泌経路通過時にプロテアーゼにより分解されない
ＩＭＸ３１３Ｔを含有するプラスミドを用いたＤＮＡ免疫により得られた結果は、分子のテールが、プロテアーゼが豊富な分泌経路を通過する際にプロテアーゼにより切断されないことを強く示唆する。この疑問をより直接的に検討するために、ｉｎ  ｖｉｖｏでＮＰ−Ｍ−ＩＭＸ３１３Ｔを発現させるために使用されるプラスミドを用いてＣＨＯ  Ｋ１細胞のトランスフェクションを行った。トランスフェクションは記載のように行った（３３）。
【０１９８】
１８〜２４時間後、トランスフェクト細胞の上清を遠心分離により回収し、濾過した後に、上記のようにヘパリンセファロースカラムにロードした。
【０１９９】
小さな「ピークＣ」が見られ、これはＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法で、タンパク質ＮＰ−Ｍ−ＩＭＸ３１３Ｔを含有することが判明した。
【０２００】
１２．トリマーコイルドコイルの改変
トリマーコイルドコイルの改変が抗原の免疫原性を改善するかどうかを判定するために、インフルエンザ血球凝集素のトリマーコイルドコイルをコードする合成ＨＡ２遺伝子を用いて２つのプラスミドを構築した。
【０２０１】
第１のプラスミドは、ＨＡ２コイルドコイルがペプチド：SPRRRRRRRRRS（配列番号３７）の融合により改変されたｐＩＭＸ７４３であった。
【０２０２】
下記のＮｄｅ  Ｉ〜ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントをＴ７発現ベクターにクローニングした。
【化２４】
0006518193.tif 000029
【０２０３】
コードされるタンパク質配列は、
【化２５】
0006518193.tif 000030
であった。
【０２０４】
対照プラスミドｐＩＭＸ７４４は、オリゴヌクレオチドプライマー：
【化２６】
0006518193.tif 000031
およびＴ７Ｆを用いてペプチドを欠失させてＨＡ２インサートを増幅することにより作出し、次にこれを親プラスミドに挿入した。
【０２０５】
ヌクレオチド配列は、
【化２７】
0006518193.tif 000032
であった。
【０２０６】
また、コードされるタンパク質配列は、
【化２８】
0006518193.tif 000033
であった。
【０２０７】
次に、両タンパク質を、まずＩＭＡＣアフィニティーカラムで、その後ヘパリンセファロースカラムで精製した。ＩＭＸ７４３タンパク質は、ＩＭＸ７４４タンパク質よりも高い塩（ＮａＣｌ）濃度で溶出し、ＩＭＸ７４３タンパク質は１．４Ｍ（原文のまま）の塩濃度で溶出し、一方、ＩＭＸ７４４タンパク質は６００ｍＭの塩濃度で溶出した。
【０２０８】
次に、両タンパク質を用い、４群の５〜６週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０日目と１４日目に１回の注射につき２０μｇで免疫した。２１日目にＥＬＩＳＡおよびＥＬＩＳＰＯＴのために血清および脾臓を採取した。２群はアジュバントＡｄｄａｖａｘ中のタンパク質を受容し、他の２群はアジュバント無しで免疫した。タンパク質ＩＭＸ７４４をＥＬＩＳＡ抗原として、また脾細胞を刺激するためにも使用した。
【０２０９】
結果を下記の表４に示す。
【０２１０】
【表５】
0006518193.tif 000034
【０２１１】
これらの結果は、アジュバントが使用されても使用されなくても、ＩＭＸ７４３タンパク質にのみ存在する正電荷ペプチド（配列番号３７）が、ＩＭＸ７４３タンパク質を、他の点では同一のタンパク質ＩＭＸ７４４よりもはるかに高い免疫原性とすることを明らかに示す。さらに、アジュバントの使用が、コイルドコイル含有抗原の免疫原性をさらに改善する。
【０２１２】
１３．マウスＣ４ｂｐオリゴマー化ドメインＩＭＸ１０８改変
参照１６に記載されている融合タンパク質ＤｓｂＡ−ＩＭＸ１０８のコイルドコイルを、それがまたＩＭＸ３１３上に付与される改善された特性も獲得したかどうかを判定するために改変した。それを改変するために、ＤｓｂＡ−ＩＭＸ１０８遺伝子を、オリゴヌクレオチド：
【化２９】
0006518193.tif 000035
およびＴ７Ｆを用いて増幅し、ＩＭＸ３１３の代わりにＩＭＸ３１３Ｔを発現するプラスミドに挿入した（２９）。このタンパク質をイオン交換クロマトグラフィー、次いで、ヘパリン−セファロースカラム（これに該タンパク質は結合したが、親構築物ＤｓｂＡ−ＩＭＸ１０８は結合しなかった）により精製した。
【０２１３】
以下に親ＩＭＸ１０８配列（配列番号６６）をＩＭＸ１０８Ｔ配列（配列番号６７）に対してアラインする。
【化３０】
0006518193.tif 000036
【０２１４】
改変ＩＭＸ１０８タンパク質は家禽の免疫に有用であり、改変ＩＭＸ３１３融合タンパク質を使用することの潜在的自己免疫作用が回避されるはずである（１６）。他の哺乳動物Ｃ４ｂｐオリゴマー化ドメイン（参照１６およびＷＯ２００７／０６２８１９に挙げられている）も、この目的で本明細書に記載されているように改変することができる。
【０２１５】
１４．ブドウ球菌アルファ溶血素のＮ末端および改変ＩＭＸ３１３タンパク質を含んでなる融合タンパク質
改変ＩＭＸ３１３タンパク質との融合がブドウ球菌毒素アルファ溶血素（Ｈｌａ）のＮ末端ドメインの免疫原性を改善することができたかどうかを判定するために、末端切断型溶血素遺伝子をＮｅｗｍａｎ株のゲノムＤＮＡから増幅し、Ｔ７発現ベクターにクローニングした。オリゴヌクレオチド：
【化３１】
0006518193.tif 000037
を用いた。
【０２１６】
成熟毒素のＮ末端の６３のアミノ酸を改変ＩＭＸ３１３タンパク質に融合させるため、ＩＭＸ３１３Ｔをプライマー：
【化３２】
0006518193.tif 000038
を用い、ＩＭＸ３１３Ｔ発現プラスミドから増幅し、このＰＣＲ産物を用いて、Ｈｌａ毒素遺伝子をさらに末端切断すると同時にアミノ酸６３個を改変ＩＭＸ３１３遺伝子に融合させた。得られたプラスミドは、Ｈｌａ６３−ＩＭＸ３１３Ｔと呼ばれる融合タンパク質を発現し、それは下記のタンパク質配列：
【化３３】
0006518193.tif 000039
を有し、下記のヌクレオチド配列：
【化３４】
0006518193.tif 000040
によりコードされている。
【０２１７】
このタンパク質を生産するために、Ｃ４３（ＤＥ３）株の５００ｍｌ培養物を１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、一晩増殖させた。回収した細菌を音波処理により溶解させ、不溶性タンパク質を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび６Ｍ尿素（バッファーＡ）に再懸濁させた。これをＨｉ−Ｔｒａｐ  ＳＰ  ＦＦカラムにロードし、１Ｍ  ＮａＣｌを含有するバッファーＡで溶出させた。部分的に精製したタンパク質をバッファー５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析し、ヘパリンセファロースカラムにロードし、そこからＮａＣｌ勾配（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１Ｍ  ＮａＣｌ）で溶出させた。溶出したタンパク質をＰＢＳに対して透析し、ゲル濾過によりさらに精製した。
【０２１８】
Ｎ末端フラグメント（ＩＭＸ３１３Ｔを欠く）を、Ｃ末端６Ｈｉｓタグをクローニングすることにより改変し、ＩＭＡＣニッケルアフィニティークロマトグラフィーおよびゲル濾過により精製した。
【０２１９】
両方の精製タンパク質を次に、アジュバントの存在下および不在下でマウスの免疫に用いた。
【０２２０】
５個体の５〜６週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウス４群を、Ｈｌａ６３タンパク質またはＩＭＸ３１３Ｔに融合された同抗原のいずれか５ミリモルで、０日目と１４日目に免疫した。２８日目に、ＥＬＩＳＡおよびＥＬＩＳＰＯＴのために血清および脾臓を採取した。タンパク質６３Ｈｌａ  ６ＨｉｓをＥＬＩＳＡ抗原として、また脾細胞を刺激するためにも使用した。
【０２２１】
結果を表５に示す。
【表６】
0006518193.tif 000041
【０２２２】
これらの結果は、アジュバントが使用されても使用されなくても、アルファ溶血素（ＨＬＡ）のＮ末端は、ＩＭＸ３１３Ｔタンパク質に融合された場合に免疫原性がより高いことを明らかに示す。
【０２２３】
１５．改変ＩＭＸ３１３タンパク質に融合された全長ブドウ球菌プロテインＡ
ＩＭＸ３１３ＴおよびＩＭＸ３１３Ｐが全長ブドウ球菌プロテインＡ抗原（ＳｐＡ）の免疫原性を改善することができたかどうかを判定するために、５つの相同ドメイン（参照４４に記載の通りに変異させた）をコードする合成遺伝子をＴ７発現ベクターにＮｄｅ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩフラグメントとしてクローニングした。ヌクレオチド配列は、
【化３５】
0006518193.tif 000042
であり、コードされるタンパク質配列は、
【化３６】
0006518193.tif 000043
であった。
【０２２４】
抗原をＩＭＸ３１３ＴおよびＩＭＸ３１３Ｐタンパク質に融合させるため、Ｃ末端ＨｉｓタグをコードするＢａｍＨ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩフラグメントを、３１３タンパク質をコードするＢａｍＨ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩフラグメントで置換した。
【０２２５】
タンパク質を次のように精製した：  細菌株ＢＬＲでＳｐＡ−６Ｈｉｓを産生させ、細菌ペレットをバッファーＡ（１×ＰＢＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）に溶解し、細菌溶解液を１５分間７５℃に加熱し、次いで、遠心分離により清澄化した後、ＩＭＡＣニッケルアフィニティーカラムにロードした。タンパク質をバッファーＢ（１×ＰＢＳ、５００ｍＭイミダゾール）中のイミダゾール勾配で溶出させた。このタンパク質をゲル濾過によりさらに精製した。
【０２２６】
また、ＳｐＡ−ＩＭＸ３１３ＴおよびＳｐＡ−ＩＭＸ３１３ＰもＢＬＲ株で発現させ、細菌溶解液を１５分間７５℃に加熱し、遠心分離により清澄化した。次に、両タンパク質をＳＰイオン交換カラム、次いでヘパリンセファロースカラムで精製した。
【０２２７】
これら３つのタンパク質を用い、６群の５〜６週齢Ｂａｌｂ／ｃ雌マウスを、０日目と１４日目に免疫した。１回の免疫につき５ミリモルの各タンパク質を、アジュバントＡｄｄａＶａｘとともにまたは伴わずに用いた。２８日目に、ＥＬＩＳＡおよびＥＬＩＳＰＯＴのために血清および脾臓を採取した。ＳｐＡ−６Ｈｉｓタンパク質をＥＬＩＳＡ抗原として、また脾細胞を刺激するためにも使用した。
【０２２８】
結果を下記の表６に示す。ＩＭＸ３１３ＴまたはＰに融合された抗原ＳｐＡは、融合されていない抗原よりも明らかに免疫原性が高く、ＩＭＸ３１３Ｐ型は、ＩＭＸ３１３Ｔ型よりもやや免疫原性が高い。
【０２２９】
【表７】
0006518193.tif 000044
【０２３０】
１６．ＣｌｆＢと改変ＩＭＸ３１３タンパク質の融合タンパク質
ブドウ球菌抗原ＣｌｆＢの免疫原性を改善するために、Ｎ２Ｎ３ドメインを、下記のオリゴ：
【化３７】
0006518193.tif 000045
を用いて増幅し、このＰＣＲ産物をＴ７発現ベクターにＮ末端Ｈｉｓタグとともにクローニングした（２７）。
【０２３１】
Ｎ２Ｎ３フラグメントのヌクレオチド配列は、
【化３８】
0006518193.tif 000046
であり、タンパク質配列は、
【化３９】
0006518193.tif 000047
である。
【０２３２】
次に、ＩＭＸ３１３ＴおよびＩＭＸ３１３Ｐドメインを、オリゴヌクレオチド：
【化４０】
0006518193.tif 000048
およびＩＭＸ１３９を用いて増幅し、Ｎ３ドメインのＣ末端にクローニングした。非改変Ｎ２Ｎ３ドメイン、および融合タンパク質Ｎ２Ｎ３−ＩＭＸ３１３ＴおよびＩＭＸ３１３Ｐは次のように発現させる。
【０２３３】
Ｃ４３（ＤＥ３）株の５００ｍｌ培養物を１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、一晩誘導後、細菌ペレットをバッファーＡ（１×ＰＢＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）に溶解し、次いで、遠心分離により清澄化した後、ＩＭＡＣニッケルアフィニティーカラムにロードした。タンパク質をバッファーＢ（１×ＰＢＳ、５００ｍＭイミダゾール）中イミダゾールの勾配で溶出させた。融合タンパク質をヘパリン−セファロースでのアフィニティークロマトグラフィー、次いで、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００  ＨＲゲル濾過によりさらに精製し、一方、非融合タンパク質はＳ−７５ゲル濾過カラムでのゲル濾過によりさらに精製する。
【０２３４】
１７．ソルターゼＡと改変ＩＭＸ３１３タンパク質の融合タンパク質
ソルターゼＡ、またはＳｒｔＡとして知られるブドウ球菌プロテアーゼの免疫原性を改善するため、次のように、不活性型をＩＭＸ３１３、ＩＭＸ３１３ＴおよびＩＭＸ３１３Ｐにインフレームでクローニングした。野生型ソルターゼＡ遺伝子をＮｅｗｍａｎ株ゲノムＤＮＡからオリゴヌクレオチド：
【化４１】
0006518193.tif 000049
を用いて増幅し、Ｔ７発現ベクターにクローニングした。次に、活性部位のシステイン残基を、オリゴヌクレオチド：
【化４２】
0006518193.tif 000050
を用いてセリンに変異させた。
【０２３５】
次に、ＩＭＸ３１３、３１３Ｔおよび３１３Ｐ遺伝子を、オリゴヌクレオチド：
【化４３】
0006518193.tif 000051
を用いて、それらの各発現ベクターから増幅し、不活性化プロテアーゼ遺伝子とインフレームで挿入した（２９）。
【０２３６】
ＩＭＸ３１３ＴおよびＩＭＸ３１３Ｐ融合タンパク質をＳＰカラムでのイオン交換、次いでヘパリンセファロースカラムで精製した。
【０２３７】
１８．ＣＰ１５  ＤＮＡ免疫
改変ＩＭＸ３１３タンパク質が、ＩＭＸ３１３自体の使用によって得られる改善以上に、クリプトストリジウム抗原ＣＰ１５の免疫原性をさらに改善できたかどうかを判定するために、大腸菌でＣｐ１５、Ｃｐ１５−ＩＭＸ３１３およびＩＭＸ３１３Ｔを発現するように設計された３つのプラスミドを用いて、ＤＮＡワクチンとしてのｐｃＤＮＡ３ベクターを作製した。ｐｃＤＮＡ３のｔＰＡシグナルペプチドの下流に挿入するための、Ｔ７発現ベクター由来の３つの遺伝子を増幅するために使用したプライマーは、
【化４４】
0006518193.tif 000052
であった。
【０２３８】
これら３つのＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｎ末端ｔＰＡシグナルペプチドを含有していた）に別々に挿入した。
【０２３９】
これらの３つのコード配列は次の通りであった。
【化４５】
0006518193.tif 000053
【０２４０】
インサートを持たないｐｃＤＮＡ３ベクターを対照プラスミドとして使用した。これら４つのプラスミドを用いて、４群の５〜６週齢Ｂａｌｂ／ｃ雌マウスを０日目と１４日目に免疫した。各免疫につき２５マイクログラムの各プラスミドを筋肉内注射した。２８日目に、ＥＬＩＳＡおよびＥＬＩＳＰＯＴのために血清および脾臓を採取した。大腸菌から精製したＣｐ１５−６Ｈｉｓタンパク質をＥＬＩＳＡ抗原として、また脾細胞を刺激するためにも使用した。
【０２４１】
ＥＬＩＳＡおよびＥＬＩＳＰＯＴの結果を下記の表７に示す。
【０２４２】
【表８】
0006518193.tif 000054
【０２４３】
これらの結果は、ＩＭＸ３１３はＣｐ１５抗原に対する抗体力価とインターフェロンγ応答の両方を改善するが、これらの応答はＩＭＸ３１３の代わりにＩＭＸ３１３Ｔを使用することによりさらに改善されることを示す。
【０２４４】
１９．自己抗原と改変ＩＭＸ３１３タンパク質の融合物：ＧｎＲＨ−ＩＭＸ３１３Ｔによる免疫
ＩＭＸ３１３に融合された際の自己抗原ＧｎＲＨにより誘導される抗体応答をさらに改善するために、タンパク質ＧｎＲＨ−ＩＭＸ３１３Ｔを作製した。このタンパク質コード配列は
【化４６】
0006518193.tif 000055
であり、タンパク質配列は、
【化４７】
0006518193.tif 000056
である。
【０２４５】
２０．アジュバントと改変ＩＭＸ３１３タンパク質および抗原との相乗作用
改変ＩＭＸ３１３タンパク質の使用により得られた免疫原性の改善が古典的アジュバントの使用によりさらに改善できるかどうか、また、２つのアジュバントの使用により誘導できるかどうかを判定するために、下表の「アジュバント」の欄に示されているように下記のタンパク質：ＰＡｍ、ＰＡｍ−ＩＭＸ３１３およびＰＡｍ−ＩＭＸ３１３Ｔ（上記の実施例６に記載の通りに作製）を作製した。次に、処方したタンパク質を用いて、７群の５〜６週齢Ｂａｌｂ／ｃ雌マウスを、０日目と１４日目に免疫した。１回の免疫につき５ミリモルの各タンパク質を、アジュバントＡｄｄａＶａｘとともにまたは伴わずに、また、ＴＬＲリガンドポリＩ：Ｃとともにまたは伴わずに用いた。７番目の群には、ＴＬＲリガンドポリＩ：Ｃをまずタンパク質ＰＡｍ−ＩＭＸ３１３Ｔとともに処方した後に、アジュバントＡｄｄａＶａｘとともに処方した。
【０２４６】
２８日目に、ＥＬＩＳＡおよびＥＬＩＳＰＯＴのために血清および脾臓を採取した。ＰＡｍタンパク質をＥＬＩＳＡ抗原として、また脾細胞を刺激するためにも使用した。
【０２４７】
これらの結果を下記の表に示す（表８）。
【０２４８】
【表９】
0006518193.tif 000057
【０２４９】
明らかに、改変ＩＭＸ３１３タンパク質とともにアジュバントを使用することに利点があり、免疫原性は第２のアジュバントであるポリＩ：Ｃを使用することによりさらに改善できる。
【０２５０】
参照文献
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0006518193.tif 000059
0006518193.tif 000060
0006518193.tif 000061
【図１】
0006518193.tif 000062
【図２】
0006518193.tif 000063
【図３】
0006518193.tif 000064
【図４】
0006518193.tif 000065
【図５】
0006518193.tif 000066
【図６】
0006518193.tif 000067
【図７】
0006518193.tif 000068
【図８】
0006518193.tif 000069
【図９】
0006518193.tif 000070
【図１０】
0006518193.tif 000071
【図１１】
0006518193.tif 000072
【図１２】
0006518193.tif 000073
【図１３】
0006518193.tif 000074
【図１４】
0006518193.tif 000075
【図１５】
0006518193.tif 000076
【図１６】
0006518193.tif 000077
【図１７】
0006518193.tif 000078
【図１８】
0006518193.tif 000079
【図１９】
0006518193.tif 000080
【図２０】
0006518193.tif 000081
【図２１】
0006518193.tif 000082
【図２２】
0006518193.tif 000083
【図２３】
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【配列表】
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