(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮脂腺を観察する方法であって、
（Ｉ）皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体を培地中に浮遊させた状態で培養するステップ、および
（ＩＩ）ステップ（Ｉ）で得られた培養後の皮脂腺構造体を観察するステップ
を含む皮脂腺の観察方法。
【請求項２】
前記ステップ（Ｉ）を行なう前に、単離された皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部を除去して前記皮脂腺構造体を得るステップをさらに含む請求項１に記載の皮脂腺の観察方法。
【請求項３】
被験物質が有する皮脂産生調節作用を評価する方法であって、
（Ａ）皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体を被験物質の非存在下で培地中に浮遊させた状態で培養するステップ、
（Ｂ）皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体を被験物質の存在下で培地中に浮遊させた状態で培養するステップ、および
（Ｃ）前記ステップ（Ａ）で得られた培養後の皮脂腺構造体（Ａ）と前記ステップ（Ｂ）で得られた培養後の皮脂腺構造体（Ｂ）とを観察し、前記皮脂腺構造体（Ａ）における皮脂腺の動態と前記皮脂腺構造体（Ｂ）における皮脂腺の動態との違いに基づき、前記被験物質が有する皮脂産生調節作用を評価するステップ
を含み、前記皮脂腺構造体（Ａ）における皮脂腺の動態と前記皮脂腺構造体（Ｂ）における皮脂腺の動態との違いが被験物質の有無による皮脂腺の最外層における皮脂を内包する細胞の数の違い、被験物質の有無による皮脂腺における未分化の皮脂腺基底細胞から成熟皮脂腺細胞への分化の速度の違い、被験物質の有無による皮脂腺の中心部付近に存在する崩壊した成熟皮脂腺細胞の数の違い、被験物質の有無による皮脂腺の中心部付近に存在する皮脂量の違い、被験物質の有無による分化マーカーの発現位置の違いまたは被験物質の有無による分化マーカーの発現量の違いであることを特徴とする被験物質の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮脂腺の観察方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、化粧料などの外用剤の開発などに有用な皮脂腺の観察方法および被験物質の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮脂は、皮脂腺から皮膚の表面に分泌され、体外からの刺激から皮膚を保護する作用を有する。しかし、皮膚に存在する皮脂が過少である場合、皮膚を十分に保護することができないことがある。一方、皮膚に存在する皮脂が過剰である場合、ざ瘡、脂漏性皮膚炎、皮脂腺増殖症などが引き起こされることがある。したがって、皮脂の産生を適度に調節する化粧料などの外用剤が望まれている。【０００３】
一方、皮脂の産生に与える物質の影響は、皮脂腺細胞を用いる培養試験によって解析されている（例えば、特許文献１参照）。しかし、皮脂腺細胞を用いる培養試験には、生体における皮脂腺からの皮脂の産生を十分に再現することができないことから、生体における皮脂腺の動態を的確に観察し難いという欠点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１３−３２３３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、生体における皮脂腺の動態を的確に観察することができる皮脂腺の観察方法および被験物質が皮脂の産生を調節する物質であるかどうかを的確に評価することができる被験物質の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、
（１）皮脂腺を観察する方法であって、
（Ｉ）皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体を培地中に浮遊させた状態で培養するステップ、および
（ＩＩ）ステップ（Ｉ）で得られた培養後の皮脂腺構造体を観察するステップ
を含む皮脂腺の観察方法、
（２）前記ステップ（Ｉ）を行なう前に、単離された皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部を除去して前記皮脂腺構造体を得るステップをさらに含む前記（１）に記載の皮脂腺の観察方法、ならびに
（３）被験物質が有する皮脂産生調節作用を評価する方法であって、
（Ａ）皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体を被験物質の非存在下で培地中に浮遊させた状態で培養するステップ、
（Ｂ）皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体を被験物質の存在下で培地中に浮遊させた状態で培養するステップ、および
（Ｃ）前記ステップ（Ａ）で得られた培養後の皮脂腺構造体（Ａ）と前記ステップ（Ｂ）で得られた培養後の皮脂腺構造体（Ｂ）とを観察し、前記皮脂腺構造体（Ａ）における皮脂腺の動態と前記皮脂腺構造体（Ｂ）における皮脂腺の動態との違いに基づき、前記被験物質が有する皮脂産生調節作用を評価するステップ
を含み、前記皮脂腺構造体（Ａ）における皮脂腺の動態と前記皮脂腺構造体（Ｂ）における皮脂腺の動態との違いが被験物質の有無による皮脂腺の最外層における皮脂を内包する細胞の数の違い、被験物質の有無による皮脂腺における未分化の皮脂腺基底細胞から成熟皮脂腺細胞への分化の速度の違い、被験物質の有無による皮脂腺の中心部付近に存在する崩壊した成熟皮脂腺細胞の数の違い、被験物質の有無による皮脂腺の中心部付近に存在する皮脂量の違い、被験物質の有無による分化マーカーの発現位置の違いまたは被験物質の有無による分化マーカーの発現量の違いであることを特徴とする被験物質の評価方法
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の皮脂腺の観察方法によれば、生体における皮脂腺の動態を的確に観察することができるという優れた効果が奏される。また、本発明の被験物質の評価方法によれば、被験物質が皮脂の産生を調節する物質であるかどうかを的確に評価することができるという優れた効果が奏される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】皮脂腺構造体の皮脂腺を含む要部の構造を示す概略説明図である。
【図２】試験例１（１）において、調製例７で得られた観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの外観を観察した結果を示す図面代用写真である。
【図３】試験例１（１）において、調製例７で得られた観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの外観を観察した結果を示す図面代用写真である。
【図４】試験例１（２）において、調製例７で得られた観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの内部を観察した結果を示す図面代用写真である。
【図５】試験例１（２）において、調製例７で得られた観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの内部における皮脂の油滴を観察した結果を示す図面代用写真である。
【図６】実施例１（５）において、実験番号１〜６それぞれの観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの皮脂腺の最外層に含まれる細胞内の油滴の状態を分類して観察した結果を示す図面代用写真である。
【図７】（Ａ）は実施例２（３）において、実験番号７の観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの内部を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は（Ａ）における枠囲み部分を拡大して観察した結果を示す図面代用写真である。
【図８】（Ａ）は実施例２（３）において、実験番号８の観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの内部を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は（Ａ）における枠囲み部分を拡大して観察した結果を示す図面代用写真である。
【図９】（Ａ）は実施例２（３）において、実験番号９の観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの内部を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は（Ａ）における枠囲み部分を拡大して観察した結果を示す図面代用者写真である。
【図１０】実施例２（３）において、試料の種類と皮脂産生進行度との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１１】実施例４（４）において、試料の種類と皮脂生成度との関係を調べた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、１つの側面では、皮脂腺を観察する方法であって、
（Ｉ）皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体を培地中に浮遊させた状態で培養するステップ、および
（ＩＩ）ステップ（Ｉ）で得られた培養後の皮脂腺構造体を観察するステップ
を含む皮脂腺の観察方法に関する。
【００１０】
本発明の皮脂腺の観察方法によれば、前記皮脂腺構造体を培地中に浮遊させた状態で培養するという操作が採られているので、前記皮脂腺構造体が真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去されていても、当該皮脂腺構造体において、生体における皮脂腺からの皮脂の産生などに代表される生体における皮脂腺の動態が観察しやすい状態で、的確に再現される。したがって、本発明の皮脂腺の観察方法によれば、生体内により近い環境下で皮脂腺の動態を観察することができる。
【００１１】
前記皮脂腺構造体は、皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された構造体である。具体的には、前記皮脂腺構造体は、図１に示されるように、皮脂腺１と、毛２と、毛２を取り囲む毛包３と、表皮４とを含有する。皮脂腺１は、皮脂腺１の最外層に局在する未分化の皮脂腺基底細胞１１と、未分化の皮脂腺基底細胞１１の局在位置よりも内側に局在し、脂肪滴を生成する細胞（以下、「成熟皮脂腺細胞」ともいう）１２と、皮脂腺１の中心部に局在し、成熟皮脂腺細胞１２が死滅して崩壊した細胞残さ１３とを含有している。皮脂腺１で生成された皮脂Ｓは、毛包３を介して皮膚の外に放出される。前記皮脂腺構造体における皮脂腺１と毛２と毛包３と表皮４とから構成される部分は、皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去されている点を除き、生体中の皮膚組織における皮脂腺と毛と毛包と表皮とから構成される部分と同じ構造を有する。
【００１２】
なお、本明細書において、「皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの一部が除去された」とは、皮膚組織から真皮および皮下組織が除去され、皮脂腺を観察することができる程度に皮脂腺が露出していることを意味する。
【００１３】
前記ステップ（Ｉ）では、前記皮脂腺構造体を培地中に浮遊させた状態で培養する。前記皮脂腺構造体は、例えば、単離した皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部を除去することなどによって製造することができる。したがって、本発明の皮脂腺の観察方法は、前記ステップ（Ｉ）を行なう前に、単離された皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部を除去して前記皮脂腺構造体を得るステップをさらに含むことができる。
【００１４】
前記皮脂腺構造体の製造方法としては、例えば、
（ａ１）単離された皮膚組織から皮下組織の全部または一部を切除するステップ、および
（ａ２）前記ステップ（ａ１）で得られた組織から膠原繊維などの繊維を除去して皮脂腺を露出させて前記皮脂腺構造体を得るステップ
を含む方法（以下、「製法Ａ」ともいう）；
（ｂ１）単離された皮膚組織から皮下組織の全部または一部を切除するステップ、
（ｂ２）前記ステップ（ｂ１）で得られた組織をディスパーゼ、コラゲナーゼ、プロナーゼなどの表皮付属器官を真皮から解離させるための酵素と接触させるステップ、および
（ｂ３）前記ステップ（ｂ２）で得られた組織から真皮を分離するステップ
を含む方法（以下、「製法Ｂ」ともいう）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの皮脂腺構造体の製法のなかでは、皮脂腺構造体を容易に製造することができ、しかも生体における皮脂腺の動態を的確に観察することができることから、製法Ａおよび製法Ｂが好ましく、製法Ａがより好ましい。
【００１５】
前記単離された皮膚組織としては、例えば、外科手術の際に生じた余剰皮膚などから取得され、生きている状態の皮膚組織などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。なお、本明細書において、「生きている状態の皮膚組織」とは、生体内における本来の生物学的活性および本来の動きと同様の生物学的活性および動きを示す状態の皮膚組織をいう。
【００１６】
前記皮膚組織の供給源としては、例えば、ヒトなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。本発明の皮脂腺の観察方法をヒトにおける皮脂の産生時の皮脂腺の観察などに用いる場合、前記皮膚組織の供給源は、ヒトであることが好ましい。従来、ヒトの皮脂腺の動態を的確に観察することが困難であったことから、本発明の皮脂腺の観察方法は、ヒトの皮脂腺の観察に好適である。
【００１７】
皮脂腺の動態としては、例えば、皮脂の産生の際の少なくとも２つの時点における皮脂腺を構成する細胞の形状を対比したときの細胞の形状の変化、皮脂の産生の際の少なくとも２つの時点における皮脂腺を構成する細胞の分化状態を対比したときの細胞の分化状態の変化、皮脂の産生の際の少なくとも２つの時点における分化した細胞の形状を対比したときの分化した細胞の形状の変化、皮脂の産生の際の少なくとも２つの時点における分化した細胞の局在部位の位置を対比したときの分化した細胞の局在部位の位置の変化などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００１８】
皮脂腺構造体の培養は、皮脂腺構造体を培地中に浮遊させた状態で行なわれる。「皮脂腺構造体を培地中に浮遊させた状態」は、前記皮脂腺構造体の培養に用いられる培養容器の壁面に当該皮脂腺構造体が接触していない状態であればよく、特に限定されるものではない。したがって、「皮脂腺構造体を培地中に浮遊させた状態」は、前記皮脂腺構造体の培養に用いられる培養容器の壁面に当該皮脂腺構造体が接触していない状態であれば、前記皮脂腺構造体の全体が培地中に浸漬している状態であってもよく、前記皮脂腺構造体の一部が培地外に露出し、その残部が培地中に浸漬している状態であってもよい。
【００１９】
前記培地は、皮脂腺構造体に含まれる未分化の皮脂腺基底細胞を成熟皮脂腺細胞に分化させるのに適した分化促進成分および細胞を増殖させる増殖成分を含む培地であればよく、特に限定されるものではない。前記培地は、慣用の基本培地に、前記分化促進成分および増殖成分を補った培地であってもよく、市販されている培地であってもよい。前記分化促進成分としては、例えば、ウシ胎児血清、脂肪酸、ペプチド、ホルモンなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの分化促進成分は、単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。前記培地における前記分化促進成分の含有率は、前記培地の種類、前記分化促進成分の種類などによって異なるので一概に決定されるものではないことから、前記培地の種類、前記分化促進成分の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。前記増殖成分としては、例えば、アミノ酸、ビタミン、無機塩、糖類、細胞増殖促進因子などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記培地における前記増殖成分の含有率は、前記培地の種類、前記増殖成分の種類などによって異なるので一概に決定されるものではないことから、前記培地の種類、前記増殖成分の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。これらの増殖成分は、単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。前記基本培地としては、例えば、ダルベッコ改変培地とＦ−１２培地との混合培地などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００２０】
前記皮脂腺構造体の培養を行なう際の培養条件は、前記皮脂腺構造体の製造に用いられる皮膚組織の供給源の種類、観察対象の皮脂腺の動態の種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、前記皮脂腺構造体の製造に用いられる皮膚組織の供給源の種類、観察対象の皮脂腺の動態の種類などに応じて決定することが望ましい。前記培養条件は、例えば、培養温度、培養時間、培地のｐＨ、培養雰囲気における二酸化炭素濃度などを含む。
【００２１】
前記皮膚組織の供給源がヒトである場合、培養温度は、生体における皮脂腺の状態を的確に再現する観点から、通常、好ましくは３５℃〜３８℃、より好ましくは３６．５℃〜３７．５℃である。また、前記皮膚組織の供給源がヒトである場合、培養時間は、培地中において、前記皮脂腺構造体における生理機能を良好な状態で維持する観点から、通常、好ましくは６〜１６８時間、より好ましくは２４〜４８時間である。さらに、前記皮膚組織の供給源がヒトである場合、培地のｐＨは、生体における皮脂腺の状態を的確に再現する観点から、通常、好ましくは６．８〜７．６、より好ましくは７．０〜７．４である。培養雰囲気における二酸化炭素濃度は、生体における皮脂腺の状態を的確に再現する観点から、通常、好ましくは４〜１０体積％、より好ましくは５〜７体積％である。
【００２２】
つぎに、前記ステップ（ＩＩ）では、培養後の皮脂腺構造体を観察する。培養後の皮脂腺構造体の観察は、例えば、培養後の皮脂腺構造体を染色試薬によって染色された皮脂腺構造体を観察試料として用いることなどによって行なうことができる。
【００２３】
前記皮脂腺構造体の染色は、例えば、前記皮脂腺構造体と前記染色試薬とを接触させることなどによって行なうことができる。前記染色に用いられる前記培養後の皮脂腺構造体は、固定液によって固定された固定試料であってもよい。前記固定試料は、前記皮脂腺構造体に含まれる各細胞の細胞膜が前記染色試薬を透過させるのに十分な透過性を有する状態にされた試料であればよい。皮脂腺構造体の固定は、例えば、皮脂腺構造体が入っている培養容器中に、固定液を添加して、皮脂腺構造体と固定液とを接触させることなどによって行なわれる。
【００２４】
前記固定液としては、例えば、アセトン、メタノール、アセトンとメタノールとの混合溶液、ホルムアルデヒド水溶液、ホルムアルデヒドのリン酸緩衝液溶液、パラホルムアルデヒド水溶液、パラホルムアルデヒドのリン酸緩衝液溶液などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記固定試料は、染色に先立ち、必要に応じて、適切な洗浄液で洗浄してもよく、洗浄しなくてもよい。前記洗浄液としては、例えば、リン酸緩衝化生理的食塩水、トリス緩衝化生理的食塩水などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００２５】
前記染色試薬としては、例えば、マーカーに結合する結合物質と検出可能な物質との複合体を含む試薬、前記結合物質を含有し、前記検出可能な物質を含まない試薬などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。なお、本明細書において、「マーカー」とは、皮脂腺構造体に含まれる組織、細胞などの存在の指標、細胞の分化度などの指標となる物質をいう。
【００２６】
前記結合物質は、本発明の皮脂腺の観察方法の用途などによって異なるので一概には決定することができないことから、発明の皮脂腺の観察方法の用途などに応じて適宜決定することが好ましい。前記結合物質としては、例えば、前記マーカーに結合する抗体（以下、単に、「抗体」という）またはその断片（以下、単に、「抗体断片」という）、前記マーカーに結合する化合物などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。前記抗体のなかでは、前記マーカーに対する特異性が高いことから、モノクローナル抗体が好ましい。前記抗体断片としては、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、単鎖抗体などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記ポリクローナル抗体、前記モノクローナル抗体および前記抗体断片は、前記マーカーを抗原として用い、慣用の手法によって製造することができる。また、前記ポリクローナル抗体、前記モノクローナル抗体および前記抗体断片として、商業的に容易に入手可能なポリクローナル抗体、商業的に容易に入手可能なモノクローナル抗体および商業的に容易に入手可能な抗体断片を用いることができる。前記結合物質は、検出可能なシグナルを生じる物質であってもよく、当該シグナルを生じない物質であってもよい。
【００２７】
前記検出可能な物質としては、例えば、蛍光物質、酵素などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記蛍光物質としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒシリーズの蛍光物質〔例えば、インビトロジェン製、商品名：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７など〕などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。また、前記酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスフォターゼなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの検出可能な物質のなかでは、検出操作が容易であり、高い精度で検出対象物を検出することができることから、蛍光物質が好ましく、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒシリーズの蛍光物質〔例えば、インビトロジェン製、商品名：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７など〕がより好ましい。
【００２８】
なお、前記結合物質が抗体またはその抗体断片である場合、前記染色試薬は、必要に応じ、前記抗体またはその抗体断片に結合する標識結合物質をさらに含んでいてもよい。前記標識結合物質としては、例えば、前記結合物質に結合する第２の結合物質と標識物質との複合体などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記第２の結合物質としては、例えば、前記抗体を製造する際に免疫した動物が有する免疫グロブリンに対する抗体、当該免疫グロブリンの断片に対する抗体などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記標識物質としては、例えば、前記検出可能な物質などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００２９】
前記染色試薬の種類は、発明の皮脂腺の観察方法の用途などによって異なるので一概には決定することができないことから、発明の皮脂腺の観察方法の用途などに応じて適宜決定することが好ましい。前記染色試薬としては、例えば、前記未分化の皮脂腺基底細胞に対する染色試薬（以下、「未分化細胞染色試薬」ともいう）、皮脂に対する染色試薬（以下、「皮脂染色試薬」ともいう）、細胞核に対する染色試薬（以下、「核染色試薬」ともいう）、分化細胞染色試薬などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３０】
前記未分化細胞染色試薬は、未分化の皮脂腺基底細胞に特異的なマーカー（以下、「未分化マーカー」ともいう）に結合する物質（以下、「未分化細胞結合物質」ともいう）を含む。前記未分化細胞染色試薬は、未分化細胞結合物質と検出可能な物質との複合体を含む試薬であってもよく、前記未分化細胞結合物質自体が検出可能なシグナルを生じる物質である場合には、前記未分化細胞結合物質を含有し、前記検出可能な物質を含まない試薬であってもよい。前記未分化細胞マーカーとしては、例えば、ケラチン−５、ケラチン―７、ケラチン―１４、Ｂリンパ球誘導成熟タンパク質１（Ｂｌｉｍｐ１）、ロイシン−リッチリピート・イムノグロブリン様ドメインタンパク質１（Ｌｒｉｇ１）などが挙げられるが、本発明は、特に限定されるものではない。
【００３１】
前記核染色試薬は、核を構成する物質に結合する結合物質（以下、「核結合物質」ともいう）を含む。前記核染色試薬は、核結合物質と検出可能な物質との複合体を含む試薬であってもよく、前記核結合物質自体が検出可能なシグナルを生じる物質である場合には、前記核結合物質を含有し、前記検出可能な物質を含まない試薬であってもよい。前記核を構成する物質としては、例えば、ＤＮＡなどの核酸などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記核結合物質は、細胞膜を透過する物質であればよい。前記核結合物質としては、例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。なお、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２は、検出可能な蛍光を生じる物質であることから、前記核染色試薬は、前記検出可能な物質を含有しない試薬であってもよい。
【００３２】
前記皮脂染色試薬としては、例えば、皮脂に溶解する脂溶性色素などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記脂溶性色素としては、例えば、ナイルレッド、ナイルブルー、オイルレッドＯ、ズダンＩＩＩ、ズダンＩＶ、ズダンブラックＢなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。なお、前記脂溶性色素は、皮脂に溶解して皮脂を染色することから、前記脂溶性色素を含む皮脂染色試薬は、前記検出可能な物質を含有しない試薬であってもよい。
【００３３】
前記分化細胞染色試薬としては、例えば、未分化の皮脂腺基底細胞から分化した皮脂腺細胞に特異的なマーカー（以下、「分化マーカー」ともいう）に結合する物質（以下、「分化細胞結合物質」ともいう）を含む。前記分化細胞染色試薬は、分化細胞結合物質と検出可能な物質との複合体を含む試薬であってもよく、前記分化細胞結合物質自体が検出可能なシグナルを生じる物質である場合には、前記分化細胞結合物質を含有し、前記検出可能な物質を含まない試薬であってもよい。前記分化細胞マーカーとしては、例えば、ステアリル−ＣｏＡ不飽和化酵素１（Ｓｃｄ−１）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）などが挙げられるが、本発明は、特に限定されるものではない。
【００３４】
前記染色試薬中における前記結合物質の含有率は、前記結合物質の種類、発明の皮脂腺の観察方法の用途などによって異なるので一概に決定されるものではないことから、前記結合物質の種類、発明の皮脂腺の観察方法の用途などに応じて適宜決定することが好ましい。
【００３５】
前記未分化細胞染色試薬に含まれる検出可能な物質、前記皮脂染色試薬に含まれる検出可能な物質および前記核染色試薬に含まれる検出可能な物質は、互いに識別可能な物質であることが好ましい。
【００３６】
前記皮脂腺構造体と前記染色試薬との混合比および接触時間は、前記染色試薬の種類などによって異なるので一概に決定されるものではないことから、前記染色試薬の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。
【００３７】
前記皮脂腺構造体と前記染色試薬との接触後、皮脂腺の動態をより的確に観察する観点から、染色された皮脂腺構造体を適切な洗浄液で洗浄することが好ましい。前記洗浄液としては、例えば、リン酸緩衝生理的食塩水、リン酸緩衝液などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３８】
なお、前記染色試薬が抗体またはその抗体断片を含む場合、皮脂腺の動態をより的確に観察する観点から、前記染色された皮脂腺構造体に対し、ブロッキング剤を用いてブロッキング処理を施すことが好ましい。前記ブロッキング剤としては、例えば、アルブミンを含有するリン酸緩衝生理的食塩水溶液などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３９】
前記染色された皮脂腺構造体を用いて皮脂腺の動態を観察する。皮脂腺の観察は、例えば、蛍光顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡などの光学顕微鏡などを用いて行なうことができる。具体的には、皮脂腺の観察は、例えば、染色された皮脂腺構造体をそのまま観察すること、染色された皮脂腺構造体における染色試薬に由来するシグナルを検出することによって行なうことができる。
【００４０】
以上説明したように、本発明の皮脂腺の観察方法によれば、皮脂腺からの皮脂の産生を的確に観察することができることから、皮脂産生調節物質のスクリーニング、皮脂産生調節物質の有効性の評価などに用いられることが期待される。
【００４１】
２．被験物質の評価方法
本発明は、他の側面では、被験物質が有する皮脂産生調節作用を評価する方法であって、
（Ａ）皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体を被験物質の非存在下で培地中に浮遊させた状態で培養するステップ、
（Ｂ）皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体を被験物質の存在下で培地中に浮遊させた状態で培養するステップ、および
（Ｃ）前記ステップ（Ａ）で得られた培養後の皮脂腺構造体（Ａ）と前記ステップ（Ｂ）で得られた培養後の皮脂腺構造体（Ｂ）とを観察し、前記皮脂腺構造体（Ａ）における皮脂腺の動態と前記皮脂腺構造体（Ｂ）における皮脂腺の動態との違いに基づき、前記被験物質が有する皮脂産生調節作用を評価するステップ
を含む被験物質の評価方法に関する。
【００４２】
本発明の被験物質の評価方法は、前記ステップ（Ａ）およびステップ（Ｂ）を行ない、前記ステップ（Ａ）で得られた培養後の皮脂腺構造体（Ａ）と前記ステップ（Ｂ）で得られた培養後の皮脂腺構造体（Ｂ）とを観察するという操作が行なわれるので、前記被験物質が有する皮脂産生調節作用を的確に評価することができる。したがって、本発明の被験物質の評価方法によれば、被験物質が皮脂の産生を調節する物質であるかどうかを的確に評価することができる。前記皮脂産生調節作用には、皮脂産生を増加させる皮脂産生促進作用および皮脂産生を減少させる皮脂産生抑制作用が含まれる。なお、前記ステップ（Ａ）およびステップ（Ｂ）を行なう順は、ステップ（Ａ）を行なった後にステップ（Ｂ）を行なう順であってもよく、ステップ（Ｂ）を行なった後にステップ（Ａ）を行なう順であってもよい。また、ステップ（Ａ）およびステップ（Ｂ）を同時に行なってもよい。
【００４３】
まず、前記ステップ（Ａ）では、皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体を被験物質の非存在下で培地中に浮遊させた状態で培養する。前記ステップ（Ａ）に用いられる皮脂腺構造体および培地は、前述の皮脂腺の観察方法に用いられる皮脂腺構造体および培地と同様である。前記ステップ（Ａ）における前記皮脂腺構造体の培養は、前述の皮脂腺の観察方法における前記皮脂腺構造体の培養の手法と同様の手法で行なうことができる。前記皮脂腺構造体の培養条件は、評価内容、評価対象の被験物質の種類、被験物質と前記皮脂腺構造体の製造に用いられる皮膚組織の供給源の種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、評価内容、評価対象の被験物質の種類、前記皮脂腺構造体の製造に用いられる皮膚組織の供給源の種類などに応じて決定することが望ましい。
【００４４】
前記ステップ（Ｂ）では、皮膚組織から真皮および皮下組織が除去された皮脂腺構造体を被験物質の存在下で培地中に浮遊させた状態で培養する。前記ステップ（Ｂ）に用いられる皮脂腺構造体は、前記ステップ（Ａ）で用いられる皮脂腺構造体と同じ供給源の皮膚組織から得られる同じ種類の皮脂腺構造体であるが、前記ステップ（Ａ）で用いられた皮脂腺構造体とは別の皮脂腺構造体である。前記ステップ（Ｂ）で用いられる培地は、前記ステップ（Ａ）で用いられる培地と同じ種類の培地である。前記ステップ（Ｂ）において、被験物質の存在下での前記皮脂腺構造体の培養は、例えば、前記ステップ（Ａ）で用いられる培地と同じ種類の培地に被験物質を添加して得られた被験物質含有培地を用いることを除き、前述の皮脂腺の観察方法における前記皮脂腺構造体の培養の手法と同様の手法で行なうことができる。被験物質含有培地における被験物質の濃度は、評価内容、評価対象の被験物質の種類、前記皮脂腺構造体の製造に用いられる皮膚組織の供給源の種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、評価内容、評価対象の被験物質の種類、前記皮脂腺構造体の製造に用いられる皮膚組織の供給源の種類などに応じて決定することが望ましい。前記ステップ（Ｂ）における皮脂腺構造体の培養条件は、被験物質を用いないことを除き、前記ステップ（Ａ）における皮脂腺構造体の培養条件と同じである。
【００４５】
前記ステップ（Ｃ）では、前記ステップ（Ａ）で得られた培養後の皮脂腺構造体（Ａ）と前記ステップ（Ｂ）で得られた培養後の皮脂腺構造体（Ｂ）とを観察し、前記皮脂腺構造体（Ａ）における皮脂腺の動態と前記皮脂腺構造体（Ｂ）における皮脂腺の動態との違いに基づき、前記被験物質が有する皮脂産生調節作用を評価する。前記ステップ（Ｃ）における皮脂腺構造体の観察の手法は、前述の皮脂腺の観察方法における皮脂腺構造体の観察の手法と同様である。
【００４６】
前記皮脂腺構造体（Ａ）における皮脂腺の動態と前記皮脂腺構造体（Ｂ）における皮脂腺の動態との違いとしては、被験物質の有無による皮脂腺の最外層における皮脂を内包する細胞の数の違い、被験物質の有無による皮脂腺における未分化の皮脂腺基底細胞から成熟皮脂腺細胞への分化の速度の違い、被験物質の有無による皮脂腺の中心部付近に存在する崩壊した成熟皮脂腺細胞の数の違い、被験物質の有無による皮脂腺の中心部付近に存在する皮脂量の違い、被験物質の有無による分化マーカーの発現位置の違い、被験物質の有無による分化マーカーの発現量の違いなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００４７】
前記被験物質が皮脂産生促進作用を有することの指標としては、例えば、以下の（１ａ）〜（３ａ）の指標などが挙げられる。これらの指標は、単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。
（１ａ）前記皮脂腺構造体（Ａ）の皮脂腺の最外層における皮脂を内包する細胞の数に比べて前記皮脂腺構造体（Ｂ）の皮脂腺の最外層における皮脂を内包する細胞の数が多いこと、
（２ａ）前記皮脂腺構造体（Ａ）の皮脂腺における未分化の皮脂腺基底細胞から成熟皮脂腺細胞への分化の速度に比べて前記皮脂腺構造体（Ｂ）の皮脂腺における未分化の皮脂腺基底細胞から成熟皮脂腺細胞への分化の速度が大きいこと、および
（３ａ）前記皮脂腺構造体（Ａ）の皮脂腺の中心部付近に存在する崩壊した成熟皮脂腺細胞の数に比べて前記皮脂腺構造体（Ｂ）の皮脂腺の中心部付近に存在する崩壊した成熟皮脂腺細胞の数が多いこと。
【００４８】
また、前記被験物質が皮脂産生抑制作用を有することの指標としては、例えば、以下の（１ｂ）〜（３ｂ）の指標などが挙げられる。これらの指標は、単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。
（１ｂ）前記皮脂腺構造体（Ａ）の皮脂腺の最外層における皮脂を内包する細胞の数に比べて前記皮脂腺構造体（Ｂ）の皮脂腺の最外層における皮脂を内包する細胞の数が少ないこと、
（２ｂ）前記皮脂腺構造体（Ａ）の皮脂腺における未分化の皮脂腺基底細胞から成熟皮脂腺細胞への分化の速度に比べて前記皮脂腺構造体（Ｂ）の皮脂腺における未分化の皮脂腺基底細胞から成熟皮脂腺細胞への分化の速度が小さいこと、および
（３ｂ）前記皮脂腺構造体（Ａ）の皮脂腺の中心部付近に存在する崩壊した成熟皮脂腺細胞の数に比べて前記皮脂腺構造体（Ｂ）の皮脂腺の中心部付近に存在する崩壊した成熟皮脂腺細胞の数が少ないこと。
【００４９】
以上説明したように、本発明の被験物質の評価方法によれば、前記被験物質が有する皮脂産生調節作用を的確に評価することができることから、皮脂産生調節物質のスクリーニング、皮脂産生調節物質の有効性の評価などに用いられることが期待される。前記皮脂産生調節物質は、例えば、顔、腋、頭皮などの皮膚用の化粧料に配合される皮脂産生抑制剤、皮脂産生促進剤などに用いられることが期待されるものである。
【実施例】
【００５０】
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。以下において、各略語の意味は、以下のとおりである。
＜略語の説明＞
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＤＭＥＭ：ダルベッコ改変培地
ＦＢＳ：ウシ胎児血清
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＰＢＳＴＴ：ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ２０）とポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）とを含有するＰＢＳ溶液〔組成：０．１体積％Ｔｗｅｅｎ２０、０．５体積％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および残部ＰＢＳ〕
ＰＦＡ：パラホルムアルデヒド【００５１】
調製例１
ＤＭＥＭとＦ−１２培地との混合培地〔ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（体積比）が１／１〕に、ＦＢＳおよび細胞外基質〔コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）社製、商品名：マトリゲル〕をＦＢＳの濃度が１０体積％および細胞外基質の濃度が２体積％となるように添加して混合培地を得た。【００５２】
調製例２
抗Ｋ５抗体〔アブカム（ａｂｃａｍ）（株）製、商品名：αＫ５  ａｎｔｉｂｏｄｙ〕をその濃度が０．３３μｇ／ｍＬとなるように２質量％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴＴ溶液に添加して一次抗体含有溶液を得た。なお、Ｋ５は、皮脂腺の最外層に存在する未分化の皮脂腺基底細胞のマーカーである。【００５３】
調製例３
標識抗ＩｇＧ抗体〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（株）製、商品名：α  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６４７〕および核染色剤〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（株）製、商品名：ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２〕を標識抗ＩｇＧ抗体の濃度が２μｇ／ｍＬおよび核染色剤の濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように２質量％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴＴ溶液に添加して染色試薬Ａを得た。なお、前記標識抗ＩｇＧ抗体は、調製例２で用いられた抗Ｋ５抗体に対する二次抗体である。【００５４】
調製例４
脂肪染色試薬〔和光純薬（株）製、商品名：ナイルレッド（Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ）〕をその濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように２質量％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴＴ溶液に添加して染色試薬Ｂを得た。【００５５】
調製例５
カバーグラス（２４ｍｍ×５５ｍｍ）上にスペーサー（直径９ｍｍおよび厚さ０．１２ｍｍ）を貼り、スペーサー付カバーグラスを得た。【００５６】
調製例６
実体顕微鏡下に、ハサミを用い、皮膚組織から皮下組織を除去した。つぎに、ハサミおよびピンセットを用い皮下組織除去後の皮膚組織中の真皮から膠原繊維を除去することにより、皮脂腺が露出した皮脂腺構造体（以下、「皮脂腺構造体Ａ」という）を得た。なお、皮脂腺構造体Ａは、皮膚組織における皮脂腺と毛と毛包と表皮とを含有しているが、真皮および皮下組織を実質的に含有しておらず、皮脂腺が露出していた。【００５７】
調製例７
調製例６で得られた皮脂腺構造体Ａを４質量％ＰＦＡ含有ＰＢＳ溶液中に４℃で３０分間浸漬させることにより、皮脂腺構造体Ａを固定して固定試料を得た。得られた固定試料を２質量％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴＴ溶液中において、４℃で１時間インキュベーションすることにより、洗浄を行なった。洗浄は、３回行なった。【００５８】
洗浄後の固定試料を、調製例２で得られた一次抗体含有溶液中において、４℃で２４時間インキュベーションした。インキュベーション後の固定試料を２質量％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴＴ溶液中において、４℃で１時間インキュベーションすることにより、洗浄を行なった。洗浄は、３回行なった。【００５９】
洗浄後の固定試料を、調製例３で得られた染色試薬Ａ中において、４℃で１２時間インキュベーションすることにより、皮脂腺の最外層に存在する皮脂腺基底細胞および核を染色した。染色後の固定試料を２質量％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴＴ溶液中において、４℃で１時間インキュベーションすることにより、洗浄を行なった。洗浄は、３回行なった。【００６０】
洗浄後の固定試料を、調製例４で得られた染色試薬Ｂ中において、室温（２５℃）で３０分間インキュベーションすることにより、皮脂腺構造体Ａに含まれる皮脂を染色した。染色後の固定試料を２質量％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴＴ溶液中において、４℃で１時間インキュベーションすることにより、洗浄を行なった。洗浄は、３回行なった。【００６１】
洗浄後の固定試料を２０質量％グリセロール含有ＰＢＳ溶液中における４℃で１時間のインキュベーション、５０質量％グリセロール含有ＰＢＳ溶液中における４℃で１時間のインキュベーションおよび８０質量％グリセロール含有ＰＢＳ溶液中における室温４℃で１時間のインキュベーションに供して固定試料に含まれる水分をグリセロールに置換した。【００６２】
調製例５で得られたスペーサー付カバーグラスのスペーサーに囲まれた部分に８０質量％グリセロール水溶液適量（例えば５０μＬ）を添加した。つぎに、グリセロール置換後の皮脂腺構造体Ａを前記スペーサー付カバーグラスのスペーサーに囲まれた部分に皮脂腺側が下向きになるように載置した。その後、前記スペーサー付カバーグラスのスペーサーに囲まれた部分に円形のカバーガラス（直径１２ｍｍ）をかぶせることにより、観察用試料を得た。【００６３】
試験例１
（１）皮脂腺構造体の外観の観察
調製例７で得られた観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの外観を共焦点顕微鏡下で観察した。試験例１（１）において、調製例７で得られた観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの外観を観察した結果を図２および図３に示す。図２中のスケールバーの長さは、５０μｍである。また、図３中のスケールバーの長さは、５０μｍである。図３中、１は皮脂腺、３は毛包を示す。【００６４】
図２に示された結果から、皮脂腺構造体Ａは、未分化の皮脂腺基底細胞で覆われた滑らかな表面を有する皮脂腺を有していることがわかる。また、図３に示された結果から、皮脂腺構造体Ａには、毛包３および毛包３に包まれた毛が除去されずに残存していることがわかる。したがって、皮脂腺構造体Ａは、生体における皮脂腺本来の構造を保持していることがわかる。このように、皮脂腺構造体Ａは、生体における皮脂腺の構造を保持していることから、皮脂腺構造体Ａを用いることにより、生体における皮脂腺の動態を的確に観察することができることがわかる。【００６５】
（２）皮脂腺構造体の内部の観察
調製例７で得られた観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの内部を共焦点顕微鏡下で観察した。試験例１（２）において、調製例７で得られた観察用試料に含まれる皮脂腺構造体の内部を観察した結果を図４、調製例７で得られた観察用試料に含まれる皮脂腺構造体の内部における皮脂の油滴を観察した結果を図５に示す。図４中のスケールバーの長さは７０μｍ、図５中のスケールバーの長さは、５０μｍである。図４中、１１は未分化の皮脂腺基底細胞、Ｎは核、Ｓは皮脂を示す。また、図５中、Ａは皮脂腺の最外層に存在する皮脂の油滴、Ｂは皮脂腺の中間層に存在する皮脂の油滴、Ｃは皮脂腺の中心付近に存在する皮脂の油滴を示す。【００６６】
図４に示された結果から、皮脂腺の表面は、未分化の皮脂腺基底細胞で覆われた滑らかな表面であることから、皮脂腺構造体Ａは、生体における皮脂腺本来の構造を保持していることがわかる。また、図５に示された結果から、皮脂腺の最外層（図５中、Ａ）から中心付近（図５中、Ｃ）に向かうにしたがって細胞内の油滴の大きさが大きくなっていることがわかる。これらの結果から、皮脂腺構造体Ａは、培地中に浮遊させた状態で培養した場合、培養時間の経過に伴い、図１に示されるように、未分化の皮脂腺基底細胞１１が、皮脂腺１の最外層から皮脂腺１の中心部に向けて移動しながら成熟皮脂腺細胞１２に分化すること、および成熟皮脂腺細胞１２によって生成された油滴が成熟皮脂腺細胞１２が死滅して崩壊した細胞残さ１３から毛２を取り囲む毛包３を介して皮脂Ｓとして皮膚の外に放出されることが推定される。このように、皮脂腺構造体Ａは、生体における皮脂腺の構造を保持するとともに、生体における皮脂産生過程を再現することができることがわかる。したがって、皮脂腺構造体Ａによれば、生体における皮脂腺の動態を的確に観察することができることがわかる。【００６７】
実施例１
（１）被験試料の調製
調製例１で得られた混合培地（以下、「被験試料Ａ」ともいう）に、リノール酸をその濃度が１×１０-4Ｍとなるように添加して被験試料Ｂを得た。また、調製例１で得られた混合培地に、リノール酸の濃度が１×１０-3Ｍとなるように添加して被験試料Ｃを得た。【００６８】
（２）皮脂腺構造体の培養および皮脂腺構造体と被験試料との接触
被験試料Ａ１ｍＬを２４ウェルプレートの各ウェルに添加した。つぎに、調製例６で得られた皮脂腺構造体Ａを、前記２４ウェルプレートの各ウェル内の被験試料Ａ中に浮かべた状態で、５体積％二酸化炭素下に３７℃で２４時間培養することにより、皮脂腺構造体Ａと被験試料Ａとを接触させた（実験番号１）。また、実験番号１において、２４時間の培養を行なう代わりに４８時間の培養を行なうことを除き、実験番号１と同様の操作を行ない、皮脂腺構造体Ａと被験試料Ａとを接触させた（実験番号２）。【００６９】
調製例６で得られた皮脂腺構造体Ａを、前記２４ウェルプレートの各ウェル内の被験試料Ｂ中に浮かべた状態で、５体積％二酸化炭素下に３７℃で２４時間培養することにより、皮脂腺構造体Ａと被験試料Ｂとを接触させた（実験番号３）。また、実験番号３において、２４時間の培養を行なう代わりに４８時間の培養を行なうことを除き、実験番号３と同様の操作を行ない、皮脂腺構造体Ａと被験試料Ｂとを接触させた（実験番号４）。【００７０】
調製例６で得られた皮脂腺構造体Ａを、前記２４ウェルプレートの各ウェル内の被験試料Ｂ中に浮かべた状態で、５体積％二酸化炭素下に３７℃で２４時間培養することにより、皮脂腺構造体Ａと被験試料Ｃとを接触させた（実験番号５）。また、実験番号５において、２４時間の培養を行なう代わりに４８時間の培養を行なうことを除き、実験番号５と同様の操作を行ない、皮脂腺構造体Ａと被験試料Ｃとを接触させた（実験番号６）。【００７１】
（３）観察用試料の調製
調製例７において、調製例６で得られた皮脂腺構造体Ａを用いる代わりに実施例１（２）で得られた培養後の皮脂腺構造体Ａ（実験番号１〜６）を用いたことを除き、調製例７と同様の操作を行ない、実験番号１〜６の観察用試料を得た。【００７２】
（４）皮脂腺構造体の内部の観察
試験例１（１）において、調製例６で得られた観察用試料を用いる代わりに実施例１（３）で得られた実験番号１〜６の観察用試料を用いたことを除き、試験例１（１）と同様の操作を行ない、実験番号１〜６それぞれの観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの内部を共焦点顕微鏡下で観察した。【００７３】
（５）皮脂産生過程の観察
試験例１（１）において、調製例６で得られた観察用試料を用いる代わりに実施例１（３）で得られた実験番号１〜６の観察用試料を用いたことを除き、試験例１（１）と同様の操作を行ない、実験番号１〜６それぞれの観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの皮脂腺の最外層に含まれる細胞内の油滴の状態を観察した。つぎに、観察された皮脂腺の細胞内の油滴の状態を表１の（Ａ）〜（Ｇ）に基づいて分類して観察した。なお、分類は、観察された細胞内の油滴の状態に基づき、一見して表１の（Ａ）〜（Ｇ）に最も近いものを選択することによって行なった。実施例１（５）において、実験番号１〜６それぞれの観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの皮脂腺の最外層に含まれる細胞内の油滴の状態を分類して観察した結果を図６に示す。図中、（Ａ）〜（Ｇ）それぞれのスケールバーの長さは、１０μｍである。また、図中、（Ａ）から（Ｇ）の順に分化が進んだ細胞を含む部分を示す。（Ａ）〜（Ｇ）それぞれの上段と下段とは、皮脂腺構造体Ａの皮脂腺中の同一の部分を示す。さらに、図中、（Ａ）〜（Ｇ）の下段において、実線は細胞の輪郭、破線は油滴の輪郭を示す。なお、図６（Ａ）〜（Ｇ）に示される皮脂腺の最外層に含まれる細胞内の油滴の状態は、それぞれ、表１中の（Ａ）〜（Ｇ）の状態に対応する。【００７４】
【表１】
0006529691.tif 000002
【００７５】
また、実験番号１〜６それぞれの観察用試料の皮脂腺の最外層で見られる細胞内の油滴の状態と、図６に示される皮脂腺の最外層に含まれる細胞内の油滴の状態との対応関係を表２に示す。表２中、「〇（白丸）」は図６に示される所定の状態が観察されること、「−」は図６に示される所定の状態が観察されないことを示す。【００７６】
【表２】
0006529691.tif 000003
【００７７】
図６に示された結果から、（Ａ）から（Ｆ）の順に分化が進むにつれて、細胞内に占める油滴の割合が増えていることがわかる。また、（Ｇ）では、皮脂が放出され、細胞が消失していることがわかる。また、表２に示された結果から、皮脂腺構造体Ａにおける皮脂産生には、生体における皮脂産生と同様に、被験試料におけるリノール酸濃度が低く、培養時間が短いほど、皮脂産生が進んでいない細胞が多く、被験試料におけるリノール酸濃度が高く、培養時間が長いほど、皮脂産生が進んでいる細胞が多くなる傾向が見られることがわかる。これらの結果から、皮脂腺構造体Ａは、生体における皮脂産生過程を再現することができることがわかる。したがって、皮脂腺構造体Ａによれば、生体における皮脂腺の動態を的確に観察することができることがわかる。【００７８】
調製例８
調製例１で得られた混合培地に、リノール酸および被験物質としてのリノール酸受容体アンタゴニスト〔アブカム（株）製、商品名：ＧＳＫ−３７８７〕をリノール酸の濃度が１×１０-4Ｍおよび被験物質の濃度が１μＭとなるように添加して被験試料Ｄを得た。【００７９】
実施例２
（１）皮脂腺構造体の培養および皮脂腺構造体と被験試料との接触
被験試料Ａ１ｍＬを２４ウェルプレートの各ウェルに添加した。つぎに、調製例６で得られた皮脂腺構造体Ａを、前記２４ウェルプレートの各ウェル内の被験試料Ａ中に浮かべた状態で、５体積％二酸化炭素下に３７℃で２４時間培養することにより、皮脂腺構造体Ａと被験試料Ａとを接触させた（実験番号７）。【００８０】
また、実験番号７において、被験試料Ａを用いる代わりに実施例１（１）で得られた被験試料Ｂ（実験番号８）または調製例８で得られた被験試料Ｄ（実験番号９）を用いたことを除き、実験番号７と同様の操作を行ない、皮脂腺構造体Ａと、被験試料Ｂ（実験番号８）または被験試料Ｄ（実験番号９）とを接触させた。【００８１】
（２）観察用試料の調製
調製例７において、調製例６で得られた培養後の皮脂腺構造体Ａを用いる代わりに実施例２（１）で得られた実験番号７〜９の皮脂腺構造体Ａを用いたことを除き、調製例７と同様の操作を行ない、実験番号７〜９の観察用試料を得た。【００８２】
（３）皮脂腺構造体の内部の観察
試験例１（１）において、調製例７で得られた観察用試料を用いる代わりに実施例２（２）で得られた実験番号７〜９の観察用試料を用いたことを除き、試験例１（１）と同様の操作を行ない、実験番号７〜９それぞれの観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの内部を共焦点顕微鏡下で観察した。【００８３】
実施例２（３）において、実験番号７の観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの内部を観察した結果を図７（Ａ）、図７（Ａ）における枠囲み部分を拡大して観察した結果を図７（Ｂ）に示す。図７（Ａ）におけるスケールバーの長さは２０μｍ、図７（Ｂ）におけるスケールバーの長さは１０μｍである。また、図７中、破線で囲まれた部分は皮脂腺の最外層を示す。また、実施例２（３）において、実験番号８の観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの内部を観察した結果を図８（Ａ）、図８（Ａ）における枠囲み部分を拡大して観察した結果を図８（Ｂ）に示す。図８（Ａ）におけるスケールバーの長さは４０μｍ、図８（Ｂ）におけるスケールバーの長さは１０μｍである。また、図８中、破線で囲まれた部分は皮脂腺の最外層、矢頭は皮脂の油滴を示す。さらに、実施例２（３）において、実験番号９の観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの内部を観察した結果を図９（Ａ）、図９（Ａ）における枠囲み部分を拡大して観察した結果を図９（Ｂ）に示す。図９（Ａ）におけるスケールバーの長さは４０μｍ、図９（Ｂ）におけるスケールバーの長さは１０μｍである。また、図９中、破線で囲まれた部分は皮脂腺の最外層を示す。【００８４】
さらに、図７〜９に示された結果を用い、以下の評価基準に基づいて各図に示された最外層の細胞４０個の各細胞の状態を評価した。
＜評価基準＞
０点：細胞内に油滴がまったく見られない〔図６（Ａ）参照〕。
１点：細胞内にわずかに油滴が見られる〔図６（Ｂ）参照〕。
２点：細胞内に油滴のスペースができている〔図６（Ｃ）参照〕。
３点：細胞内の油滴が細胞の核を侵食しはじめている〔図６（Ｄ）参照〕。
４点：細胞内の油滴同士がつながりはじめている〔図６（Ｅ）参照〕。
５点：細胞内のすべてが油滴によって占められている〔図６（Ｆ）参照〕。
６点：細胞が消失している〔図６（Ｇ）参照〕。【００８５】
つぎに、図７〜９のそれぞれにおいて、最外層の細胞４０個における点数の平均値を求めることにより、皮脂腺構造体Ａに含まれる皮脂腺の細胞における皮脂産生進行度を評価した。実施例２（３）において、試料の種類と皮脂産生進行度との関係を調べた結果を図１０に示す。図中、レーン１はリノール酸を含まない被験試料Ａと接触させた皮脂腺構造体Ａ（実験番号７）における皮脂産生進行度、レーン２はリノール酸を含む被験試料Ｂと接触させた皮脂腺構造体Ａ（実験番号８）における皮脂産生進行度、レーン３はリノール酸とリノール酸受容体アンタゴニストとを含む被験試料Ｄと接触させた皮脂腺構造体Ａ（実験番号９）における皮脂産生進行度を示す。【００８６】
図７および図１０に示された結果から、リノール酸を含まない被験試料Ａと接触させた皮脂腺構造体Ａ（実験番号７）の最外層には、皮脂の油滴が見られないことがわかる。ところが、図８および図１０に示された結果から、リノール酸を含む被験試料Ｂと接触させた皮脂腺構造体Ａ（実験番号８）の最外層には、皮脂の油滴が見られることがわかる。一方、図９および図１０に示された結果から、リノール酸とリノール酸受容体アンタゴニストとを含む被験試料Ｄと接触させた皮脂腺構造体Ａ（実験番号９）の最外層には、皮脂の油滴が見られないことがわかる。【００８７】
調製例９
実体顕微鏡下に、ハサミを用い、皮膚組織から皮下組織を除去した。つぎに、皮下組織除去後の皮膚組織を、前記６０ｍｍ径ディッシュ内のディスパーゼ含有ＰＢＳ溶液に浮かべた状態で、４℃で１６時間インキュベーションした。インキュベーション後の皮膚組織から真皮を除去して表皮と毛と毛包と皮脂腺とを含む構造体を得た。【００８８】
前記構造体から皮脂腺が付属している毛包の根元の周囲をピンセットの先で傷つけた後、皮脂腺が付属している毛包を引っ張ることにより、皮脂腺と毛包とを含有する皮脂腺構造体（以下、「皮脂腺構造体Ｂ」という）を得た。なお、皮脂腺構造体Ｂは、皮膚組織における皮脂腺と毛と毛包と表皮とを含有しているが、真皮および皮下組織を実質的に含有していなかった。【００８９】
実施例３
（１）皮脂腺構造体の培養
実施例２（１）において、調製例６で得られた皮脂腺構造体Ａを用いる代わりに調製例９で得られた皮脂腺構造体Ｂを用いたことを除き、実施例２（１）と同様の操作を行ない、皮脂腺構造体と被験試料との接触を行なう。【００９０】
（２）観察用試料の調製
調製例７において、調製例６で得られた皮脂腺構造体Ａを用いる代わりに実施例３（１）で得られた培養後の皮脂腺構造体Ｂを用いたことを除き、調製例７と同様の操作を行ない、観察用試料を得る。【００９１】
（３）皮脂腺構造体の観察
試験例１（１）において、調製例７で得られた観察用試料を用いる代わりに実施例３（２）で得られた観察用試料を用いたことを除き、試験例１（１）と同様の操作を行ない、皮脂腺構造体Ｂの観察を行なう。その結果、皮脂腺構造体Ｂが有する皮脂腺が小さい場合には、当該皮脂腺の動態を的確に観察することができることがわかる。一方、皮脂腺構造体Ｂが有する皮脂腺が大きい場合には、調製例６で得られた皮脂腺構造体Ａを用いたときと比べ、当該皮脂腺の動態を的確に観察しにくいことがあることがわかる。【００９２】
実施例４
（１）被験試料の調製
調製例１で得られた混合培地（被験試料Ａ）に、リノール酸および被験物質としてのフィチン酸をリノール酸の濃度が１×１０-4Ｍおよび被験物質の濃度が１００μＭとなるように添加して被験試料Ｅを得た。【００９３】
（２）皮脂腺構造体の培養および皮脂腺構造体と被験試料との接触
被験試料Ａ１ｍＬを２４ウェルプレートの各ウェルに添加した。つぎに、調製例６で得られた皮脂腺構造体Ａを、前記２４ウェルプレートの各ウェル内の被験試料Ａ中に浮かべた状態で、５体積％二酸化炭素下に３７℃で２４時間培養することにより、皮脂腺構造体Ａと被験試料Ａとを接触させた（実験番号１０）。【００９４】
また、実験番号１０において、被験試料Ａを用いる代わりに実施例１（１）で得られた被験試料Ｂ（実験番号１１）または実施例４（１）で得られた被験試料Ｅ（実験番号１２）を用いたことを除き、実験番号１０と同様の操作を行ない、皮脂腺構造体Ａと、被験試料Ｂ（実験番号１１）または被験試料Ｅ（実験番号１２）とを接触させた。【００９５】
（３）観察用試料の調製
調製例７において、調製例６で得られた培養後の皮脂腺構造体Ａを用いる代わりに実施例４（２）で得られた培養後の皮脂腺構造体Ａ（実験番号１０〜１２）を用いたことを除き、調製例７と同様の操作を行ない、実験番号１０〜１２の観察用試料を得た。【００９６】
（４）皮脂腺構造体の観察
画像解析ソフトウェア〔ビットプレーン（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）社製、商品名：Ｉｍａｒｉｓ〕を用い、実施例４（３）で得られた実験番号１０〜１２それぞれの観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの外観を共焦点顕微鏡下で観察することにより、皮脂腺構造体Ａの３次元画像のデータを得た。つぎに、画像解析ソフトウェア〔ビットプレーン（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）社製、商品名：Ｉｍａｒｉｓ〕を用い、得られた３次元画像のデータから皮脂腺構造体Ａの最外層の情報を抽出した。その後、抽出された情報から最外層に存在する細胞の全体積を算出するとともに、最外層に含まれる皮脂滴を計数した。最外層に存在する細胞の全体積および皮脂の油滴数を用い、式（Ｉ）：
［皮脂生成度］
＝［皮脂の油滴数］／［最外層に存在する細胞の全体積］      （Ｉ）
にしたがい、皮脂生成度を求めた。【００９７】
試料の種類と皮脂生成度との関係を調べた結果を図１１に示す。図中、レーン１はリノール酸を含まない被験試料Ａと接触させた皮脂腺構造体Ａにおける皮脂生成度、レーン２はリノール酸を含む被験試料Ｂと接触させた皮脂腺構造体Ａにおける皮脂生成度、レーン３はリノール酸とフィチン酸とを含む被験試料Ｅと接触させた皮脂腺構造体Ａにおける皮脂産生進行度を示す。【００９８】
図１１に示された結果から、リノール酸を含む被験試料Ｂと接触させた皮脂腺構造体Ａにおける皮脂生成度は、リノール酸を含まない被験試料Ａと接触させた皮脂腺構造体Ａにおける皮脂生成度と比べて高いことがわかる。したがって、リノール酸は、皮脂産生促進作用を有することがわかる。一方、リノール酸とフィチン酸とを含む被験試料Ｃと接触させた皮脂腺構造体Ａにおける皮脂生成度は、リノール酸を含む被験試料Ｂと接触させた皮脂腺構造体Ａにおける皮脂生成度と比べて低いことがわかる。したがって、フィチン酸は、皮脂産生抑制作用を有することがわかる。これらの結果から、皮脂腺構造体Ａによれば、被験物質が有する皮脂産生調節作用を的確に評価することができることがわかる。【００９９】
以上説明したように、皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体を用いることにより、皮脂腺の動態を的確に観察することができるとともに、被験物質が皮脂産生調節作用を有する物質であるかどうかを的確に評価することができることがわかる。したがって、本発明の皮脂腺の観察方法および被験物質の評価方法、皮脂産生の調節が必要なヒトに適した化粧料などの外用剤の開発に用いられることが期待されるものである。
【符号の説明】
【０１００】
１  皮脂腺
２  毛
３  毛包
４  表皮
１１  未分化の皮脂腺基底細胞
１２  成熟皮脂腺細胞
１３  細胞残さ
Ｓ  皮脂
Ｎ  核
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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