(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）結合タンパク質と封入体に発現された結合タンパク質固有の活性を維持しつつ前記結合タンパク質のディスプレイを可能にする特性を有するＣＢＤ（cellulose-binding domain）タンパク質とから構成された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む構築物を含む細胞を提供するステップと、
（ｂ）前記細胞で融合タンパク質を発現させることにより結合タンパク質が封入体にディスプレイされた相互作用捕獲細胞（Interaction Trapper cells; ITcells）を形成するステップと、
（ｃ）蛍光が融合した標的物質を前記ステップ（ｂ）における細胞であって前記総合タンパク質の活性及び遺伝情報を維持する細胞の透過性を増加することによって当該細胞内に導入するステップと、
（ｄ）結合タンパク質と標的物質間の相互作用を外部から導入された標的物質に融合した蛍光物質の蛍光強度により測定するステップとを含む、結合タンパク質と標的物質間との相互作用を分析する方法。
【請求項２】
前記細胞の透過度を増加させるステップは、細胞膜又は細胞壁にクラックを生成するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記クラックを生成するステップは、
（ｉ）ステップ（ｂ）における細胞を凍結するステップと、
（ｉｉ）前記凍結した細胞を解凍するステップと、
（ｉｉｉ）前記解凍された細胞を酸性溶液又はキレート剤で処理するステップとを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記標的物質はタンパク質、核酸又は化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記融合タンパク質は、蛍光タンパク質をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記蛍光タンパク質と標的物質を構成する蛍光物質とは互いに異なる波長の蛍光であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記蛍光タンパク質は、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）、ＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescent Protein）、ｍＧＦＰ（modified green fluorescent protein）、Ｒ
ＦＰ（Red Fluorescent Protein）、ｍＲＦＰ（Monomeric Red Fluorescent Protein）、ＥＲＦＰ（Enhanced Red Fluorescent Protein）、ＤｓＲｅｄ（Discosoma sp. red fluorescent protein）、ＢＦＰ（Blue Fluorescent Protein）、ＥＢＦＰ（Enhanced Blue Fluorescent Protein）、ＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）、ＣＧＦＰ（Cyan Green Fluorescent Protein）、ＥＣＦＰ（Enhanced Cyan Fluorescent Protein）、ＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）、ＥＹＦＰ（Enhanced Yellow Fluorescent Protein）、ＡｚＧ（Azami Green）、ＨｃＲ（HcRed, Heteractis crispa red fluorescent protein）及
びＢＦＰ（Blue Fluorescent Protein）からなる群から選択される請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞内の蛍光信号の測定は、蛍光顕微鏡又はフローサイトメーターにより行う、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
請求項１のいずれかの方法により、結合タンパク質と標的物質間の相互作用を分析して、個々の細胞単位で細胞を回収するステップとを含む、標的物質に特異的なスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記細胞は細胞ライブラリーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項９の方法により、回収した細胞に存在する標的物質に特異的な結合タンパク質をコードする遺伝子を分離するステップを含む、標的物質に特異的なスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項９の方法に従って、 回収した細胞に存在する標的物質に特異的な結合タンパク
質をコードする遺伝子を分離するステップを含む、標的物質に特異的な 結合タンパク質
の製造方法 。
【請求項１３】
前記遺伝子を分離するステップは、分離された遺伝子を増幅するステップをさらに含む、請求項１１又は請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
結合タンパク質と封入体に発現された結合タンパク質固有の活性を維持しつつ前記結合タンパク質のディスプレイを可能にする特性を有するＣＢＤ（cellulose-binding domain）タンパク質とから構成された融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチドを含む構築物を含み、
前記細胞は、前記総合タンパク質の活性及び遺伝情報を維持しつつ、透過性が増加した細胞膜または細胞壁を有する細胞。
【請求項１５】
結合タンパク質と封入体に発現された結合タンパク質固有の活性を維持しつつ前記結合タンパク質のディスプレイを可能にする特性を有するＣＢＤ（cellulose-binding domain）タンパク質とから構成された融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチドを含む構築物を含み、
前記細胞は、前記総合タンパク質の活性及び遺伝情報を維持しつつ、透過性が増加した細胞膜または細胞壁を有する細胞ライブラリー。
【請求項１６】
前記ライブラリーは、ＤＮＡライブラリー又はそれを形質転換した細胞ライブラリーである、請求項１５に記載のライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結合タンパク質を含む活性型タンパク質粒子、すなわち不溶性凝集体（封入体；inclusion bodies）を形成しながらも結合タンパク質固有の相互作用及び活性を示す融合タンパク質を発現させ、結合タンパク質が細胞内の封入体表面にディスプレイされた相互作用捕獲細胞（ＩＴｃｅｌｌｓ; Interaction Trapper cells）を用いて、前記細胞にディスプレイされた結合タンパク質の活性及び遺伝情報には影響を与えない最適な透過処理ステップにより結合タンパク質と外部標的物質間の相互作用を測定するステップを含む、結合タンパク質と標的物質間の相互作用を分析する方法、及びそれに個々の細胞単位で回収するステップをさらに含むライブラリースクリーニング方法に関する。また、本発明は、細胞内の封入体表面にディスプレイされた結合タンパク質の活性及び遺伝情報を保存しつつ外部標的物質を細胞内に導入できることを特徴とし、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む構築物を含むか、融合タンパク質が発現されることにより、結合タンパク質が封入体にディスプレイされた細胞及び細胞ライブラリーに関する。
【背景技術】
【０００２】
生命体が行う全てのプロセスは、細胞内のタンパク質を媒介とした相互作用ネットワーク複合体（interactome）により行われ、このような相互作用の調節に問題が生じるとネットワーク全体に影響を及ぼし、これは疾病発生の原因となる。よって、相互作用に関するタンパク質を理解してそれを調節することは、ネットワーク複合体を理解する基盤となり、さらに疾病治療研究及び治療剤開発においても非常に重要である。
【０００３】
よって、既にその機能及び特性が知られている細胞内のタンパク質をターゲットとし、それに対する相互作用パートナーであるタンパク質ライブラリーを作製し、ライブラリーからターゲットと相互作用するタンパク質のみを選択してその特性を確認することにより、生体内タンパク質間相互作用を理解する様々なスクリーニング方法が研究されている（非特許文献１）。
【０００４】
現在、ライブラリーをスクリーニングする多くの方法は、無細胞システム（cell-free system）と細胞表面ディスプレイシステム（surface display）に大別され、代表的な無細胞システムとしては、リボソームディスプレイとインビトロ区画化（in vitro compartmentalization; ＩＶＣ）法、表面ディスプレイシステムとしては、ファージディスプレイ、バクテリア／酵母ディスプレイ法が知られており、これらは通常のライブラリースクリーニング法である。
【０００５】
まず、リボソームディスプレイは、ｍＲＮＡ−リボソーム−ペプチドが３重複合体を形成し、ターゲットに結合したペプチドのｍＲＮＡを複合体から解離してＲＴ−ＰＣＲにより増幅する方法であり、全ての過程が生体外で行われるので形質転換が必要なく、ライブラリーサイズが大きい（最大１０１３個）という利点を有するが、約２７％のみが複合体で存在し、ｍＲＮＡ−リボソームにディスプレイされるタンパク質のサイズに限界があり、リボソーム複合体の安定性、技術的感度などに限界がある（非特許文献２）。
【０００６】
インビトロ区画化（ＩＶＣ）は、細胞内部ではなく、オイル中に分散している水溶液エマルジョンにより遺伝子を区画化する方法であり、区画された遺伝子はエマルジョン中で転写、翻訳されてタンパク質ライブラリーを形成する。１ミリリットル（ｍＬ）の体積中に１０９個以上の液滴を形成することができ、これらの液滴は様々な外部環境（温度，ｐＨ，塩濃度）に対して安定しており、独立したマイクロリアクター（microreactor）の役割を果たす。しかし、タンパク質回収の際にエマルジョンを有機溶媒で破壊するが、そのとき用いる有機溶媒によりタンパク質の活性が減少することがあり、このように回収されたタンパク質は細胞内で活性を示さないことがある（非特許文献３）。
【０００７】
現在、ライブラリースクリーニングにおいて最も常用される方法であるファージディスプレイは、ファージ末端のｐＩＩＩタンパク質にライブラリータンパク質が融合されてディスプレイされ、これを用いて固定された標的ターゲットに対する結合親和性によりスクリーニングする方法であり、ライブラリーから多数のクローンを容易にスクリーニングできるという利点を有する。しかし、ファージのｐＩＩＩタンパク質に１〜５個の結合タンパク質がディスプレイされており、ターゲットをビーズ、プレートの底に固定して用いるので、ターゲットに複数が同時に結合することにより、個々のタンパク質とターゲットとの実際の親和力とは異なるという問題（avidity effect）が生じることがある。また、この方法の特性上、溶離（elution）ステップを必要とするが、ディスプレイされたタンパク質がターゲットとの高い結合力を有する場合は、ディスプレイされたタンパク質が固定相から溶離し難くなるなどの限界がある。さらに、ファージディスプレイにおいてライブラリースクリーニング時に用いられるパンニング（panning）法は、シグナル対ノイズ比が低いので、ターゲットに対する結合親和性を有するタンパク質を得るためには少なくとも３〜５回のパンニング過程を経なければならず、偽陽性（false positive）が多いという限界もある（非特許文献４）。
【０００８】
ファージディスプレイの限界を克服するために開発された細胞表面ディスプレイは、バクテリア、酵母などの微生物の細胞膜タンパク質を表面アンカリングモチーフ（surface anchoring motif）として用いて、タンパク質を微生物表面に安定して発現させる方法であり、蛍光プローブ（fluorescence probe）が融合されたターゲットを用い、ライブラリースクリーニング時にフローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を用いるので、ハイスループットスクリーニング（high throughput screening）が可能であり（１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｈ）、ファージディスプレイのパンニング方法より非特異的バックグラウンド（nonspecific background）が低いという利点を有する。しかし、このような表面ディスプレイシステムは、タンパク質ライブラリーを細胞壁の外に正常に突出させなければならないと共に、正常に細胞内の膜を通過したタンパク質を細胞表面に安定して付着させなければならず、細胞表面に融合したタンパク質の３次元構造に変化があってはならない（タンパク質の活性維持）。このためには、細胞表面に到達させるために、細胞内の膜を通過できるように助ける非常に効率的なシグナル配列がタンパク質に融合されていなければならず、細胞外部にタンパク質が正常に突出しなければならないので、表面にディスプレイされるタンパク質のサイズの制限や数の制限などの限界がある（非特許文献５）。
【０００９】
よって、従来のスクリーニングシステムの限界を克服するためには、スクリーニングの感度を向上させ、様々な結合親和性（ｍＭ〜ｎＭ）を有するターゲットに対してスクリーニングすることができ、シグナル対ノイズ比が高く、細胞内の多くのタンパク質中の所望のタンパク質と特異的結合を有する結合タンパク質をライブラリーから容易にスクリーニングできる、効果的かつ効率的なスクリーニングシステムの開発が必要である。
【００１０】
上記問題を解決する方法として、複数の結合タンパク質を１つの担体に固定化してターゲットに結合する際に探知シグナルを増幅し、ターゲットとの相互作用分析は蛍光を用いた探知方法によりシグナル対ノイズ比を高くする方法があり、このような特徴を有する分析方法としては、自己組織化特性を有するタンパク質であるフェリチン（ferritin）を用いて、ナノ単位複合体により物質間の相互作用を検出する方法（非特許文献６）、ナノ粒子を固定化マトリックス（immobilized matrix）として用いて、生物学的分子との相互作用及び触媒作用に用いる方法（非特許文献７）が開発されている。
【００１１】
一方、近年、細胞内のタンパク質の不溶性沈殿物であるタンパク質封入体（inclusion bodies; ＩＢｓ ）に細胞内のタンパク質を固定して生体触媒として用いる研究が報告されている（非特許文献８）。
【００１２】
一般に、細胞内のタンパク質封入体（inclusion bodies; ＩＢｓ）とは、不活性凝集体を意味するが、近年、一部の封入体はタンパク質固有の生化学的特性をかなり維持する活性型タンパク質粒子（active particles）であることが報告されている（非特許文献９）。前記活性型タンパク質粒子を固定化担体として用いて、酵素及び蛍光タンパク質を固定化してその活性を測定した結果、固定化していない酵素及び蛍光タンパク質の活性と比較して約３０〜１００％の活性が維持され、固定化された酵素の安定性が増加し、再利用などの有用性があることが報告されており、活性型タンパク質粒子を酵素産業に用いる研究が盛んに行われている。
【００１３】
本発明者らは、セルロモナス・フィミ（Cellulomonas fimi）由来のファミリーＩＩ ＣＢＤ（cellulose-binding domain）が大腸菌（Escherichia coli, Ｅ．ｃｏｌｉ）内で自己凝集して封入体（inclusion bodies, ＩＢｓ）を形成することを確認し、バクテリア細胞だけでなく、真核細胞内で同時に発現されたタンパク質が前記封入体粒子に同時に集積される現象を用いて、細胞における生体物質間相互作用を観察する方法を開発した（特許文献１）。しかし、上記方法は、細胞内で同時に発現する細胞内の生体分子間の相互作用のみ観察することができ、シグナル対ノイズ比が低く、標的物質に結合された結合物質を効果的に個々の細胞単位で分画、回収することは難しいという限界がある。また、標的物質はタンパク質、又はペプチド、核酸などの細胞内で合成される物質に制限され、蛍光シグナルとしては蛍光タンパク質を用いなければならないという制限がある。すなわち、外部から挿入される様々な形態の標的物質を用いることができないだけでなく、蛍光シグナルとして様々な蛍光化学物質を用いることもできないという欠点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】韓国公開特許第１０−２０１３−００２３０５７号公報
【特許文献２】韓国登録特許第１０−１２５５６８２号公報
【特許文献３】韓国公開特許第１０−２０１０−００８６０５５号公報
【特許文献４】韓国登録特許第１０−１３５６０７５号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Hening Lin and VirginiaW. Cornish., 2002. Screening and Selection Methods for Large-Scale Analysis of Protein Function. Angew. Chem. Int. Ed 41;4402〜25
【非特許文献２】Hanes, J and Pluckthun, A., 1997. In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display. Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 4937〜42
【非特許文献３】Dan S. Tawfik and Andrew D. Griffiths., 1998. Man-made cell-like compartments for molecular evolution. Nat. Biotechnol. 16; 652-56
【非特許文献４】George P. Smith and Valery A. Petrenko., 1997. Phage Display. Chem. Rev. 97: 391〜410
【非特許文献５】Eric T. Boder and K. Dane Wittrup., 1997. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat. Biotech. 15;553〜57
【非特許文献６】Sangkyu Lee et al., 2011. Small-Molecule-Based Nanoassemblies as Inducible Nanoprobes for Monitoring Dynamic Molecular Interactions Inside Live Cells. Angew Chem Int Ed Engl 50;8709〜13
【非特許文献７】Wenwan Zhong., 2009. Nanomaterials in fluorescence-based biosensing. 394;47〜59
【非特許文献８】Jozef Nahalka, Bernd Nidetzky., 2007. Fusion to a pull-down domain: a novel approach of producing trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase as insoluble enzyme aggregates. Biotechnology and Bioengineering. 97;454〜61
【非特許文献９】Antonio Villaverd et al., 2005. Aggregation as bacterial inclusion bodies does not imply inactivation of enzymes and fluorescent proteins. Microbial Cell Factories 4;1〜6
【非特許文献１０】Hansruedi Felix., 1982. Permeabilized cells. Analytical Biochemistry 120; 211〜34
【非特許文献１１】Ursula Rinas and James E. Bailey., 1992. Protein compositional analysis of inclusion bodies produced in recombinant Escherichia coil. Applied Microbiology and Biotechnology 37; 609〜14
【非特許文献１２】polyhydroxybutyrate synthase from Cupriavidus necator; Bjorn Steinmann, Andreas Christmann, Tim Heiseler, Janine Fritz, Harald Kolmar., 2010. In Vivo Enzyme Immobilization by Inclusion Body Display. Appl. Environ. Microbiol. 76;5563?69
【非特許文献１３】Antonio Villaverd et al., 2005. Aggregation as bacterial inclusion bodies does not imply inactivation of enzymes and fluorescent proteins. Microbial Cell Factories 4;1-6
【非特許文献１４】HANSRUEDIFELIX., 1982. Permeabilized Cells. Anal. Biochem. 120;211-34
【非特許文献１５】J Microbiol Biotechnol. 2008 Mar;18(3):443-8
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明者らは、封入体にディスプレイされた結合タンパク質の活性及び遺伝情報には影響を与えないように、細胞壁を透過処理して外部標的物質を細胞内に導入し、細胞内に存在するタンパク質封入体にディスプレイされた結合タンパク質に結合させることにより、生体分子と外部物質間に起こる相互作用を直接観察できるシステムを開発した結果、シグナル対ノイズ比が４５０倍以上のレベルに改善され、単一細胞レベルで物質間の相互作用を直接観察できることを確認した。また、実際にライブラリーを作製してスクリーニングを行った結果、単一細胞レベルで分子間の相互作用を高速で探索することにより標的物質と相互作用する結合タンパク質を選択的に回収できることを確認し、最大で２回の繰り返しスクリーニングで高親和性結合体（high-affinity binder；〜ｎＭレベル）を発見できることを確認し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、結合タンパク質と活性型封入体（intracellular particle）タンパク質とから構成された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む構築物を含む細胞ライブラリーを提供するステップと、前記細胞ライブラリーから融合タンパク質を発現させることにより結合タンパク質が封入体にディスプレイされた相互作用捕獲細胞（Interaction Trapper cells; ＩＴｃｅｌｌｓ）を形成するステップと、蛍光が融合した標的物質を前記ステップにおける細胞に透過処理（membrane disintegration）により導入するステップと、結合タンパク質と標的物質間の相互作用を標的物質に融合した蛍光物質の蛍光強度により測定して個々の細胞単位で回収するステップとを含む、ライブラリースクリーニング方法を提供することを目的とする。
【００１８】
また、本発明は、結合タンパク質と活性型封入体タンパク質とから構成された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む構築物を含む細胞を提供するステップと、前記細胞から融合タンパク質を発現させることにより結合タンパク質が封入体にディスプレイされた相互作用捕獲細胞を形成するステップと、蛍光が融合した標的物質を透過処理（membrane disintegration）により前記ステップにおける細胞内に導入するステップと、結合タンパク質と標的物質間の相互作用を外部から導入された標的物質に融合した蛍光物質の蛍光強度により測定するステップとを含む、結合タンパク質と標的物質間の相互作用を分析する方法を提供することを目的とする。
【００１９】
さらに、本発明は、結合タンパク質と活性型封入体タンパク質とから構成された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む構築物を含む細胞を提供することを目的とする。
【００２０】
さらに、本発明は、結合タンパク質と活性型封入体タンパク質とから構成された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む構築物を含む細胞ライブラリーを提供することを目的とする。
【００２１】
さらに、本発明は、結合タンパク質と活性型封入体タンパク質とから構成された融合タンパク質が発現され、結合タンパク質が封入体にディスプレイされた相互作用捕獲細胞及び細胞ライブラリーを提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の方法を用いると、結合タンパク質の過剰発現により相互作用する標的物質を高感度に標識することにより、シグナル対ノイズ比が４５０倍のレベルになって従来のスクリーニング方法に比べてはるかに高く、スクリーニング効率が高く、単一細胞単位で容易に分離することができ、蛍光顕微鏡及びフローサイトメーターを用いて大量のライブラリーから相互作用タンパク質を超高速で探索及び分離できる高速探索技術（high-throughput screening; ＨＴＳ）を提供することができる。また、細胞内で発現が難しい外来物質も、細胞外で発現させた後に細胞内へ導入することにより、生体物質間の相互作用を容易に高速で分析することができる。本発明は、抗体／人工抗体の開発、新たな相互作用タンパク質の製造、標的タンパク質と医薬候補物質間の相互作用の分析及び最適化など様々な分野に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の代表図であり、物質間相互作用を高速分析できるタンパク質融合ディスプレイの模式図及びそれを用いて物質間相互作用を分析した結果である。
【図２】タンパク質融合ディスプレイ技術の方法を示す全体模式図である。
【図３】大腸菌内で活性型封入体を形成するＣＢＤタンパク質を用いて結合タンパク質であるＶＬＲと蛍光タンパク質であるｍＲＦＰがディスプレイされた封入体細胞と、封入体細胞に対する超音波粉砕により細胞から封入体のみ分離したものとを蛍光顕微鏡により観察した結果である。
【図４】本発明において開発した２ステップの細胞透過処理（membrane disintegration）過程のうち細胞凍結／解凍過程が細胞透過に及ぼす影響を確認するために、結合タンパク質の活性型封入体ディスプレイの有無により分析した結果である。
【図５】本発明において開発した細胞透過処理過程のうち細胞凍結過程により、活性型封入体にディスプレイされた結合タンパク質の活性及び発現は維持されるものの、外部標的物質が導入されるには細胞透過の程度が十分でないことを標的物質の導入により確認したフローサイトメトリーの結果である。
【図６】本発明において開発した細胞透過処理過程のうち細胞凍結過程を経た封入体細胞に対して、酸性溶液処理によって外部標的物質の導入を確認したフローサイトメトリーの結果であり、Ａ、Ｂは酸性溶液の各種類及び各ｐＨにおける外部標的物質の導入を確認した結果であり、Ｃは細胞外膜透過効果を有するキレート剤であるＥＤＴＡと酸性溶液の透過効果を比較分析した結果である。
【図７】図６で最適化された透過により、外部標的物質を細胞内に導入して結合タンパク質との相互作用を確認した結果であり、Ａは活性型封入体にディスプレイされた結合タンパク質と標的物質との相互作用を確認した蛍光画像の結果であり、Ｂは相互作用捕獲細胞に対する細胞透過処理後の標的物質との各インキュベーション時間における標的物質の細胞内導入の程度を結合タンパク質との相互作用による標的物質の蛍光強度を用いて確認した結果である。
【図８】最適化された細胞透過方法による結合タンパク質と標的物質間の相互作用が活性型封入体によって固有の活性を維持している結合タンパク質との特異的結合であることが確認されたフローサイトメトリーの結果である。
【図９】活性型封入体細胞の透過化による細胞内外の変化を観察した結果であり、Ａは細胞透過処理ステップにおける細胞内のタンパク質の変化をタンパク質分析システムであるＥｘｐｅｒｉｏｎＴＭ Ｐｒｏ２６０（Ｂｉｏ−ｒａｄ）により分析した結果であり、Ｂは細胞透過処理前後の活性型封入体細胞の変化を電子顕微鏡により確認した結果である。
【図１０】本発明において開発した細胞透過処理過程にもかかわらず、活性型封入体により細胞内の結合タンパク質の遺伝情報のほとんどが維持されることをポリメラーゼ連鎖反応定量検査（ＲＴ−ＰＣＲ）により確認した結果である。
【図１１ａ】本発明において開発した細胞透過処理によるタンパク質融合ディスプレイをモデルタンパク質とモデル標的物質を用いて確認した結果であり、細胞透過による外部標的物質の細胞内導入による結合タンパク質と標的物質との相互作用を確認したフローサイトメトリー及び蛍光画像の結果である。
【図１１ｂ】本発明において開発した細胞透過処理によるタンパク質融合ディスプレイをモデルタンパク質とモデル標的物質を用いて確認した結果であり、細胞透過処理過程にもかかわらず、相互作用捕獲細胞内の結合タンパク質の遺伝情報のほとんどが維持されることをポリメラーゼ連鎖反応定量検査（ＲＴ−ＰＣＲ）及びアガロースゲル電気泳動により分析した結果である。
【図１１ｃ】本発明において開発した細胞透過処理によるタンパク質融合ディスプレイをモデルタンパク質とモデル標的物質を用いて確認した結果であり、細胞透過処理前後の活性型封入体細胞の変化をフローサイトメーターと電子顕微鏡により確認した結果である。
【図１２】タンパク質融合ディスプレイ技術により得たデキストラン（dextran）−ＦＩＣＴ結合体であるＣ２０を用いて様々な分子量を有するデキストラン−ＦＴＩＣ処理により、本発明において開発した細胞透過処理による細胞透過の程度を分析した結果である。
【図１３】本発明において開発した最適化された細胞透過処理により標的物質を細胞内に導入して結合タンパク質との親和性の有無によるタンパク質間相互作用を蛍光画像（Ａ）及びフローサイトメーター（Ｂ）により分析した結果である。Ｃは最適化された細胞透過処理により標的物質を細胞内に導入して結合タンパク質の標的物質との親和性の差による相互作用をフローサイトメーターにより分析した結果である。
【図１４】タンパク質融合ディスプレイを用いてライブラリースクリーニングが可能であることを確認した結果である。結合タンパク質と標的物質間の相互作用が存在する封入体細胞（ＰＰＩ＋）と相互作用が存在しない封入体細胞（ＰＰＩ−）を混合してライブラリー類似環境を形成し、その後フローサイトメーターにより標的物質と相互作用する結合タンパク質が発現された細胞を標的物質に融合したＧＦＰ蛍光により分析し、次いでＧＦＰ蛍光が高いＥ．ｃｏｌｉ細胞（ＰＰＩ＋）を１０，０００個回収し、ＰＣＲ増幅によりスクリーニング効率を分析した結果である。
【図１５ａ】タンパク質融合ディスプレイにより実際にライブラリーを用いてスクリーニングを行った結果であり、各種ターゲットについてタンパク質結合体を探索するスクリーニング過程を示す結果である。
【図１５ｂ】タンパク質融合ディスプレイにより実際にライブラリーを用いてスクリーニングを行った結果であり、モデル結合タンパク質として用いたｒｅｐｅｂｏｄｙのランダムライブラリー構築のためのアミノ酸残基の全体構造を示す図である。
【図１５ｃ】タンパク質融合ディスプレイにより実際にライブラリーを用いてスクリーニングを行った結果であり、各ターゲットを用いてライブラリースクリーニングによりそれぞれ選択されたタンパク質結合体のターゲットとの相互作用をフローサイトメーターにより確認した結果である。
【図１６】実際のライブラリースクリーニングの結果得たｓｆＧＦＰ結合体であるＨ２の結合親和性を等温滴定熱量計（isothermal titration calorimetry; ＩＴＣ）により測定した結果である。
【図１７】ＣＢＤ活性型タンパク質封入体を電子顕微鏡により確認した結果である。
【図１８】本発明のライブラリースクリーニングシステムと従来のライブラリースクリーニングシステムを比較した結果である
【発明を実施するための形態】
【００２４】
上記目的を達成するために、本発明の一態様は、（ａ）結合タンパク質と活性型封入体（intracellular particle）タンパク質とから構成された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む構築物を含む細胞ライブラリーを提供するステップと、（ｂ）前記細胞ライブラリーに融合タンパク質を発現させることにより結合タンパク質が封入体にディスプレイされた相互作用捕獲細胞（Interaction Trapper cells; ＩＴｃｅｌｌｓ）を形成するステップと、（ｃ）蛍光が融合した標的物質を透過処理（membrane disintegration）により前記ステップ（ｂ）における細胞内に導入するステップと、（ｄ）結合タンパク質と標的物質間の相互作用を標的物質に融合した蛍光物質の蛍光強度により測定して個々の細胞単位で回収するステップとを含む、標的物質に特異的なライブラリースクリーニング方法を提供する。
【００２５】
ステップ（ｃ）の透過処理ステップは、細胞内部の封入体にディスプレイされた結合タンパク質の活性及び遺伝情報には影響を与えず、透過膜を介して標的物質を細胞内に導入できるようにするものであれば、当業界で通常用いる方法を制限なく用いることができる。特に、細胞を凍結するステップ、解凍するステップ、及び酸性溶液で処理するステップを含んでもよく、例えば（ｉ）細胞を−８０℃〜−１０℃で凍結するステップと、（ｉｉ）前記凍結した細胞を常温〜３７℃で解凍するステップと、（ｉｉｉ）酸性溶液で処理するステップとを含むものであってもよい。前記酸性溶液は、種類やｐＨが限定されるものではなく、例えばｐＨ４〜ｐＨ６であってもよい。これによって、前記細胞内部の封入体にディスプレイされた結合タンパク質の活性及び遺伝情報には影響を与えず、透過膜を介して標的物質を細胞内に導入できるようにすることにより、外部標的物質が細胞内に導入されて結合タンパク質と標的物質間の相互作用を可能にする最適化された細胞透過処理であってもよい。
【００２６】
本発明の一実施例によれば、透過処理は、結合タンパク質が発現されたステップ（ｂ）の細胞を遠心分離することにより凝集体（pellet）を形成し、−２０℃で凍結するステップと、３７℃で解凍するステップと、酸性溶液、好ましくは０．１Ｍのクエン酸（ｐＨ．４）で処理するステップとからなる。
【００２７】
本発明のライブラリースクリーニング方法は、個々の細胞単位で回収した細胞に存在する融合タンパク質を得るか、融合タンパク質をコードする遺伝子を分離して増幅するステップをさらに含んでもよい。前記タンパク質を回収するか、遺伝子を分離して増幅するステップは、当業界で周知の方法により行うことができる。
【００２８】
本発明の上記方法は、従来のライブラリースクリーニング方法において、通常用いられるリボソームディスプレイ（ribosome display）、ファージディスプレイ（phage display）、細胞表面ディスプレイ（cell surface display）などを代替できる方法であり、結合タンパク質を含む活性型タンパク質粒子、すなわちＣＢＤタンパク質タグを細胞内で封入体により形成して相互作用捕獲細胞として用いて、細胞を透過して外部標的物質が封入体にディスプレイされた結合タンパク質と相互作用できるようにすることにより、結合タンパク質と共に活性型封入体に凝集（co-localization）する現象を直接観察することで簡便に相互作用を検出できる相互作用分析方法である。特に、本発明は、細胞内の結合タンパク質を過剰発現（overexpression）させて封入体に高密度（high density）でディスプレイすることにより（≒３×１０５個タンパク質／ｃｅｌｌ，ｃｆ．酵母表面ディスプレイシステム ３×１０４個タンパク質／ｃｅｌｌ）、結合タンパク質に相互作用する標的物質を高感度で標識するので、シグナル対ノイズ比が従来のスクリーニング方法に比べてはるかに高く、スクリーニング効率が高く、様々な結合親和性に適用できるという利点を有する。また、微量の標的物質であっても高いシグナル強度により発現率が低い標的物質の相互作用が確認できるという利点を有し、大腸菌ベースのシステムであるので実験が容易で方法が簡単であり、標的物質に融合した蛍光を用いて標的物質と結合タンパク質間に相互作用が起こった細胞をフローサイトメーターにより分析及びライブラリースクリーニングできるハイスループットスクリーニングシステムである。
【００２９】
本発明者らは、セルロモナス・フィミ（Cellulomonas fimi）由来のファミリーＩＩ ＣＢＤ（cellulose-binding domain）が大腸菌（Escherichia coli; Ｅ．ｃｏｌｉ）内で自己凝集して封入体を形成することを確認し、バクテリア細胞だけでなく、真核細胞内で同時に発現されたタンパク質が前記封入体粒子に同時に集積される現象を用いて、細胞内の生体物質間相互作用を観察する方法を開発した（特許文献１）。
【００３０】
よって、本発明者らは、上記特許で活性型封入体として相互作用を捕獲できるＣＢＤタンパク質を用いて、固有の活性を有する結合タンパク質（抗体、類似抗体、相互作用タンパク質、リガンド結合タンパク質、医薬標的タンパク質など）がディスプレイされた封入体細胞を形成させた。前記細胞に、本発明において開発した最適化された細胞透過処理により蛍光が結合された標的物質（タンパク質、核酸又は低分子物質）を外部から細胞内部に導入することにより、封入体にディスプレイされた結合タンパク質との相互作用を直接観察することができ、単一細胞レベルで分子間の相互作用を高速で探索することにより、標的物質と相互作用する結合タンパク質を選択的に回収できるタンパク質ライブラリースクリーニングシステムを開発した（図１）。
【００３１】
特に、本発明は、本発明において開発した細胞透過処理方法により、活性型封入体にディスプレイされた結合タンパク質の活性及び発現を細胞内に安定して維持すると共に、結合タンパク質の遺伝情報もほとんど消失させずに細胞内に安定して維持することを特徴とする。
【００３２】
一般に、細胞透過とは、物理的、化学的方法を用いて、細胞壁／膜の透過性を向上させるか又は細胞壁／膜を完璧に除去することにより細胞内の生体内分子を細胞外部に分泌させる方法であり、浸透圧、超音波粉砕機などを用いて細胞を完璧に破壊する方法、又はトルエンなどを用いて細胞形態は維持するものの、細胞内のタンパク質だけでなく、遺伝情報も細胞外部に放出させる方法である（非特許文献１０）。
【００３３】
本発明において開発した最適化された細胞透過方法は、細胞内外のタンパク質は自由に移動できる程度の透過処理にもかかわらず、活性型封入体にディスプレイされた結合タンパク質及び遺伝情報は細胞外に消失せず、細胞形態を安定して維持する本発明の特徴的な方法である。
【００３４】
また、本発明の実施例によれば、活性型封入体の有無が結合タンパク質の遺伝情報の細胞内の有無に影響を及ぼすことが確認されたが、これは封入体内にリボソームＲＮＡ（ribosomal RNA）、ＲＮＡポリメラーゼ（RNA polymerase）などが発見されるという従来の報告に一致する結果である（非特許文献１１）。
【００３５】
すなわち、本発明者らは、細胞内で結合タンパク質を過剰発現させて封入体に高密度でディスプレイさせることにより、従来の表面ディスプレイシステムが有する限界（ディスプレイできるタンパク質のサイズ及び数、細胞表面分泌の問題）を克服し、封入体に高密度でディスプレイされた結合タンパク質が相互作用する標的物質を高感度で標識することにより、従来の細胞表面ディスプレイにより得られる蛍光シグナルに比べて数百〜数万倍以上高いレベルのシグナル強度を示し、シグナル対ノイズ比が従来のスクリーニング方法に比べてはるかに高く、生体物質間の相互作用を容易に分析できるという利点を見出した（図１８）。
【００３６】
また、本発明は、結合タンパク質が活性型封入体にディスプレイされることにより、本発明において開発した最適化された細胞透過処理後も結合タンパク質固有の活性を維持するだけでなく、結合タンパク質の遺伝情報がほとんど消失しないことを特徴とする。
【００３７】
本発明における「融合タンパク質」とは、少なくとも２つのタンパク質融合により生成されたタンパク質を意味し、特に本発明においては、結合タンパク質及びＣＢＤタンパク質が含まれる。また、本発明の融合タンパク質は、遺伝子組換え方法により生産でき、構築物を宿主細胞に形質転換する方法により結合タンパク質の発現を確認できるものであることが好ましい。さらに、前記融合タンパク質は、蛍光タンパク質をさらに含むものであってもよい。
【００３８】
本発明の構築物は、本発明の融合タンパク質の構成要素をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された組換えベクターである。前記「作動可能に連結された」とは、発現調節配列が融合タンパク質の構成要素をコードするポリヌクレオチド配列の転写及び翻訳を調節するように連結されたことを意味し、発現調節配列（プロモーターが含まれる）の調節下でポリヌクレオチド配列が発現され、ポリヌクレオチド配列によりコードされる融合タンパク質の構成要素が生成されるように正確な翻訳フレームを維持することが含まれる。
【００３９】
本発明における「結合タンパク質」とは、標的物質と相互作用するタンパク質を意味する。結合タンパク質は、商業的用途で大量生産される必要のあるタンパク質が含まれてもよく、これらに限定されるものではないが、抗体、類似抗体、相互作用タンパク質、リガンド結合タンパク質、医薬標的タンパク質などから選択される結合タンパク質であり、標的物質との相互作用の対象となるタンパク質を意味する。また、前記結合タンパク質は、これらに限定されるものではないが、標的物質と相互作用する天然タンパク質だけでなく、結合機能を果たすドメイン、ポリペプチドの一部であってもよい。
【００４０】
前記結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、様々なタンパク質をコードする遺伝子を含むライブラリーに由来するものであることが好ましい。これは、全ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡライブラリーなどの生物体の全ゲノムから得ることができる。また、前記結合タンパク質及び標的物質をコードするポリヌクレオチドは、サブトラクションライブラリー（subtracted library）やサイズドライブラリー（sized library）などの全ゲノムのサブセットから得ることができる。例えば、結合タンパク質は、インターナリンＢ（internalin B, ＩｎＢ）タンパク質のＮ末端、ＶＬＲ（Variable Lymphocyte Receptor）タンパク質の変形した反復モジュール、及びＶＬＲタンパク質のＣ末端が融合された、人工抗体タンパク質であるＩｎ−ＶＬＲ５−ｃ又はＩｎ−ＶＬＲ５ｃ−Ｄ３Ｅ８であってもよい（特許文献２）。
【００４１】
本発明における「活性型封入体タンパク質」とは、封入体に発現された結合タンパク質固有の活性を維持しつつディスプレイさせることのできる特徴を有するタンパク質を意味し、例えばＣＢＤ（cellulose-binding domain）タンパク質、ＰｈａＣタンパク質（非特許文献１２）、ＦＭＤＶ（foot-and-mouth disease virus）ＶＰ１ ｃａｐｓｉｄタンパク質（非特許文献１３）などがこれに該当する。
【００４２】
本発明における「ＣＢＤ（cellulose-binding domain）タンパク質」とは、セルロモナス・フィミ（Cellulomonas fimi）由来のファミリーＩＩタンパク質であり、セルロース結合ドメインタンパク質を意味する。本発明の一実施例によれば、ＣＢＤタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて封入体を形成し、それに融合したタンパク質固有の活性及び特性には影響を与えない活性型粒子（intracellular particle）を形成するが、ＣＢＤタンパク質に限定されるものではなく、あらゆる活性型封入体を形成するタンパク質を用いることができる。
【００４３】
本発明の一実施例によれば、結合タンパク質としてはＬＲＲ（Leucine-rich-repeat）タンパク質であるＩｎＢ−ＶＬＲ（特許文献２）の変異体の一つであるＤ３Ｅ８を用いたが、これは標的物質であるＩＬ−６と２ｎＭの結合親和性を有するタンパク質であり、次のように結合タンパク質が融合されたタンパク質を設計した。ＩＬ−６に結合親和性のない結合タンパク質であるＩｎＶＬＲ５ｃ、蛍光タンパク質であるｍＲＦＰ、及びファミリーＩＩ ＣＢＤタンパク質のみで構成された融合タンパク質を生産するために、遺伝子組換え方法によりｐＩｎＶＬＲ５ｃ−ｍＲＦＰ−ＣＢＤプラスミドベクターを生成し、ＩＬ−６に親和性のある結合タンパク質であるＩｎＶＬＲ５ｃ−Ｄ３Ｅ８、蛍光タンパク質であるｍＲＦＰ、及びファミリーＩＩ ＣＢＤタンパク質のみで構成された融合タンパク質を生産するために、遺伝子組換え方法によりｐＤ３Ｅ８−ｍＲＦＰ−ＣＢＤプラスミドベクターを生成した。上記プラスミドベクターは、宿主細胞である大腸菌に形質転換して融合タンパク質を生産する要素として用いられた（実施例２）。
【００４４】
本発明における「細胞」とは、全ての生物の機能的、構造的基本単位を意味する。前記細胞は、動物、植物、酵母及びバクテリアの細胞であってもよく、これらに限定されるものではないが、Ｅ．ｃｏｌｉ、ストレプトマイセス、サルモネラ・ティフィムリウムなどのバクテリア細胞、酵母細胞、ピキアパストリスなどの菌類細胞、ドロソフィラ、スポドプテラＳｆ９細胞などの昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳＯ、２９３、ボウメラノーマ細胞などの動物細胞、又は植物細胞であってもよい。バクテリア細胞であることが好ましく、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であることがより好ましい。本発明の細胞は、ＣＢＤタンパク質の過剰発現により活性型封入体が形成され、これを相互作用捕獲細胞として用いることができるバクテリア細胞であることが好ましい。
【００４５】
本発明における「相互作用捕獲細胞（Interaction Trapper cells; ＩＴｃｅｌｌｓ）」とは、結合タンパク質とＣＢＤタンパク質を発現するプラスミドが形質転換した細胞で過剰発現されることによりＣＢＤタンパク質が封入体を形成するようにし、この封入体に発現された結合タンパク質が固有の活性を維持しつつ高密度でディスプレイされた細胞を意味する。前記相互作用捕獲細胞内に外部標的物質が導入されると、封入体にディスプレイされた結合タンパク質と相互作用が起こる細胞が好ましい。
【００４６】
本発明における「標的物質」とは、結合タンパク質と相互作用する物質を意味する。また、前記標的物質は、これらに限定されるものではないが、結合タンパク質と相互作用する天然タンパク質だけでなく、機能を担うドメイン、ポリペプチドの一部であってもよく、生体内に存在しない化合物であってもよい。特に、生命工学、医学、薬学などに有用な候補物質や、生体内作用を起こす物質などであってもよく、特に、タンパク質、核酸又は化合物であってもよく、例えばＩＬ−６であってもよい。本発明の目的上、前記標的物質は、細胞内で結合タンパク質と同時に発現させず、外部から導入することを特徴とする。すなわち、前記封入体が結合タンパク質をディスプレイする相互作用捕獲細胞として用いられ、標的物質が外部から導入される。
【００４７】
本発明における「細胞内に導入」するとは、細胞外部の物質を物理的又は化学的方法により細胞内に移動させることを意味する。外部物質を細胞内に移動させる過程において、前記物質は標的物質であり、前記標的物質を細胞内に移動させるために、細胞膜又は細胞壁の透過性を増大させる過程を含む。細胞壁又は細胞膜の透過性を一時的に増大させる方法としては、様々な物理的、化学的方法が存在し（非特許文献１４）、例えば超音波処理、浸透圧処理、熱処理、凍結処理、解凍処理、酸性溶液処理、それらの組み合わせなどが挙げられる。本発明の一実施例によれば、大腸菌細胞を−２０℃で凍結処理し、その後３７℃で解凍し、酸性溶液処理により細胞壁又は細胞膜の透過性を増大させることにより、細胞内の封入体にディスプレイされた結合タンパク質の活性及び遺伝情報を維持しつつ、透過膜を介して外部標的物質を細胞内に導入した（実施例５）。
【００４８】
本発明における「蛍光物質」とは、特定エネルギーに反応するか、自発的に蛍光を発することのできる物質を意味し、本発明においては蛍光タンパク質、蛍光化合物を含む意味で用いられる。本発明における「蛍光タンパク質」とは、特定エネルギーに反応するか、自発的に蛍光を発することのできるポリペプチドを意味し、これらに限定されるものではないが、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）、ＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescent Protein）、ｍＧＦＰ（modified green fluorescent protein）、ＲＦＰ（Red Fluorescent Protein）、ｍＲＦＰ（Monomeric Red Fluorescent Protein）、ＥＲＦＰ（Enhanced Red Fluorescent Protein）、ＤｓＲｅｄ（Discosoma sp. red fluorescent protein）、ＢＦＰ（Blue Fluorescent Protein）、ＥＢＦＰ（Enhanced Blue Fluorescent Protein）、ＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）、ＣＧＦＰ（Cyan Green Fluorescent Protein）、ＥＣＦＰ（Enhanced Cyan Fluorescent Protein）、ＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）、ＥＹＦＰ（Enhanced Yellow Fluorescent Protein）、ＡｚＧ（Azami Green）、ＨｃＲ（HcRed, Heteractis crispa red fluorescent protein）及びＢＦＰ（Blue Fluorescent Protein）からなる群から選択されるものであってもよい。また、蛍光化合物とは、標的物質を修飾することのできる蛍光団を意味し、これらに限定されるものではないが、前記蛍光タンパク質、及びＸａｎｔｈｅｎｅ誘導体であるｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ ｇｒｅｅｎ、ｅｏｓｉｎ、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ、及びＣｙａｎｉｎｅ誘導体であるｃｙａｎｉｎｅ、ｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ、ｏｘａｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ、ｔｈｉａｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ、及びｍｅｒｏｃｙａｎｉｎｅ、Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ誘導体（ｄａｎｓｙｌ及びｐｒｏｄａｎ誘導体）、Ｃｏｕｍａｒｉｎ誘導体、ｏｘａｄｉａｚｏｌｅ誘導体であるｐｙｒｉｄｙｌｏｘａｚｏｌｅ、ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ、及びｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ、Ｐｙｒｅｎｅ誘導体であるｃａｓｃａｄｅ ｂｌｕｅ、Ｏｘａｚｉｎｅ誘導体であるＮｉｌｅ ｒｅｄ、Ｎｉｌｅ ｂｌｕｅ、ｃｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ、ｏｘａｚｉｎｅ １７０、Ａｃｒｉｄｉｎｅ誘導体であるｐｒｏｆｌａｖｉｎ、ａｃｒｉｄｉｎｅ ｏｒａｎｇｅ、ａｃｒｉｄｉｎｅ ｙｅｌｌｏｗ、Ａｒｙｌｍｅｔｈｉｎｅ誘導体であるａｕｒａｍｉｎｅ、ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ、ｍａｌａｃｈｉｔｅ ｇｒｅｅｎ、Ｔｅｔｒａｐｙｒｒｏｌｅ誘導体であるｐｏｒｐｈｉｎ、ｐｈｔａｌｏｃｙａｎｉｎｅ、ｂｉｌｉｒｕｂｉｎからなる群から選択されるものであってもよい。
【００４９】
本発明において、結合タンパク質と融合タンパク質を形成する蛍光タンパク質と標的物質を修飾する蛍光物質とは、互いに異なる波長の蛍光であってもよく、具体的には、それぞれから放出される蛍光シグナルの波長が異なるために蛍光シグナル検出器が各シグナルを区分して検出できるものであってもよい。
【００５０】
本発明において、結合タンパク質には蛍光タンパク質が含まれても含まれなくてもよいが、標的物質には前記蛍光タンパク質又は蛍光物質が含まれなければならない。
【００５１】
本発明の一実施例によれば、結合タンパク質をコードするプラスミドｐＩｎＶＬＲ５ｃ−ｍＲＦＰ−ＣＢＤ及びｐＤ３Ｅ８−ｍＲＦＰ−ＣＢＤは蛍光タンパク質としてＲＦＰを含み、標的タンパク質ＩＬ−６は蛍光物質としてＧＦＰを含む。
【００５２】
本発明における「蛍光シグナル」とは、蛍光タンパク質又は蛍光物質から起こるエネルギーの波長を意味し、これは蛍光シグナル検出器により値として表される。
【００５３】
前記細胞内の蛍光シグナルの測定は、蛍光顕微鏡又はフローサイトメーターにより行う方法を用いる。本発明の一実施例によれば、フローサイトメーターＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（BD Biosciences, CA）によりＧＦＰ及びＲＦＰ蛍光をそれぞれＦＬ１（５３０／３０ｎｍ）及びＦＬ２（５８５／４２ｎｍ）ＰＭＴで検出して分析し、標的物質であるＩＬ６に結合親和性のあるｐＤ３Ｅ８−ｍＲＦＰ−ＣＢＤが発現された封入体細胞（ＰＰＩ＋）と、親和性のないｐＩｎＶＬＲ５ｃ−ｍＲＦＰ−ＣＢＤが発現された封入体細胞（ＰＰＩ−）に最適化された細胞透過により、ＧＦＰが結合したＩＬ６タンパク質を細胞内に導入し、その後ＩＬ６に対する結合親和性の差をＧＦＰ蛍光により確認した（図１１）。おとりタンパク質と結合物質を細胞内で同時に発現させる従来の方法（特許文献１）による結果と比較すると、従来の方法がおとりタンパク質と結合物質との相互作用の有無により細胞内の封入体上で結合物質に融合した蛍光シグナルの密集及び分散の差を用いてタンパク質間の相互作用を分析する方法であるのに対して、本発明の方法は最適化された細胞透過により外部から標的物質が細胞内に導入され、結合タンパク質との相互作用により結合した標的物質の蛍光シグナルの強度を測定するものであり、従来の方法においてはシグナル対ノイズ比が約２倍の僅かな差を示すのに対して、本発明においてはシグナル対ノイズ比が４５０倍以上の差を示すという明確な結果が得られた（図１３）。
【００５４】
本発明の実施例においては、結合タンパク質としてＤ３Ｅ８及びＩｎＶＬＲ５ｃを用い、活性型封入体としてセルロモナス・フィミ由来のファミリーＩＩのＣＢＤタンパク質を用い、標的物質としてＩＬ−６を用いたが、本発明はこれらに限定されるものではなく、結合タンパク質と標的物質間の相互作用を分析するためであれば、いかなる種類の結合タンパク質、標的物質及び活性型封入体に対しても適用できることは当業者にとって明らかである。
【００５５】
本発明の方法は、前記ステップ（ｄ）の後に、（ｅ）前記測定された蛍光強度に基づいて個々の細胞単位で細胞を回収するステップ、をさらに含んでもよく、個々の細胞単位で回収された細胞に存在する融合タンパク質を得るか、融合タンパク質をコードする遺伝子を分離して増幅するステップをさらに含んでもよい。前記タンパク質を得るか、遺伝子を分離して増幅するステップは、当業界で周知の方法により行うことができる。
【００５６】
本発明における「回収」とは、結合タンパク質を含む細胞ライブラリーから標的物質に融合した蛍光物質の蛍光シグナルを測定して結合タンパク質と標的物質の相互作用が確認された細胞のみをフローサイトメーターで選別することを意味する。前記フローサイトメーターとは、細胞のサイズ、細胞内部の組成、蛍光の強度を測定できる装置を意味し、実験者が所望の細胞のサイズ、細胞内部の組成、蛍光の強度により単一細胞を分離、回収できる装置であることが好ましい。
【００５７】
本発明における「分離」とは、結合タンパク質を含む細胞ライブラリーから結合タンパク質と標的物質の相互作用が確認された細胞を回収する際に、結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞から分離することを意味する。前記分離とは、細胞からＤＮＡを分離することを意味する。前記ＤＮＡの分離は、結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを分離する目的に反しない限り、当業界で公知のいかなる方法であってもよい。
【００５８】
本発明における「増幅」とは、前記分離された結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを当業界で公知の一般的なポリヌクレオチド増幅方法により大量に増幅することを意味する。増幅の方法は、増幅されるポリヌクレオチドの用途に応じて選択されるものであり、当業者が容易に選択することができる。
【００５９】
本発明の一実施例によれば、封入体にディスプレイされた結合タンパク質と標的物質との相互作用により標的物質に融合したＧＦＰの蛍光強度の差を用いて、ハイスループットフローサイトメーターにより結合親和性の有無による差を分析できるか調査し、ＩＬ−６との結合親和性が約２ｎＭのＬＲＲタンパク質であるＤ３Ｅ８（ＰＰＩ＋）、１１７ｎＭのＦ１１（ＰＰＩ＋）、親和性がないＬＲＲタンパク質であるＩｎＶＬＲ５ｃ（ＰＰＩ−）が封入体にディスプレイされた細胞（ＩＴｃｅｌｌｓ）をそれぞれ１：１０：１００００の割合で混合してライブラリー類似環境を形成し、その後細胞透過処理及びタンパク質相互作用を誘導したサンプルをフローサイトメーター（ＦＡＣＳａｒｉａ）により分析してＩＬ−６との結合親和力が高いＥ．ｃｏｌｉ細胞を１０，０００個回収した。回収した細胞からプラスミドを純粋分離してＤＨ５αＥ．ｃｏｌｉ細胞を再び形質転換させ、形成されたコロニーを対象にＰＣＲ増幅反応を行って、表現型（Ｄ３Ｅ８−ｍＲＦＰ−ＣＢＤタンパク質）により回収した細胞の遺伝子回収の結果を確認した（図１４）。
【００６０】
本発明の方法は、細胞内で過剰発現させて封入体に集束させた結合タンパク質を用いるので、従来の細胞表面ディスプレイにより得られる蛍光シグナルに比べて数百〜数万倍以上高いレベルのシグナル強度を示し、これに基づいて個々の細胞単位で分画するステップを含むタンパク質ライブラリースクリーニングステップを含む様々なタンパク質工学に用いることができる。
【００６１】
本発明の他の態様は、（ａ）結合タンパク質と活性型封入体タンパク質とから構成された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む構築物を含む細胞を提供するステップと、（ｂ）前記細胞に融合タンパク質を発現させることにより結合タンパク質が封入体にディスプレイされた相互作用捕獲細胞を形成するステップと、（ｃ）蛍光が融合した標的物質を透過処理（membrane disintegration）により前記ステップ（ｂ）における細胞内に導入するステップと、（ｄ）結合タンパク質と標的物質の相互作用を外部から導入された標的物質に融合した蛍光物質の蛍光強度により測定するステップとを含む、結合タンパク質と標的物質間の相互作用を分析する方法を提供する。
【００６２】
前記ステップ（ｃ）の透過処理ステップは、細胞内部の封入体にディスプレイされた結合タンパク質の活性及び遺伝情報には影響を与えず、透過膜を介して標的物質を細胞内に導入できるようにするものであれば、当業界で通常用いる方法を制限なく用いることができる。特に、細胞を凍結するステップ、解凍するステップ、及び酸性溶液で処理するステップを含んでもよく、例えば（ｉ）細胞を−８０℃〜−１０℃で凍結するステップと、（ｉｉ）前記凍結した細胞を常温〜３７℃で解凍するステップと、（ｉｉｉ）酸性溶液で処理するステップとを含むものであってもよい。前記酸性溶液は、種類やｐＨに限定されるものではなく、例えばｐＨ４〜ｐＨ６であってもよい。よって、前記結合タンパク質とその遺伝情報が細胞内で安定して維持され、外部標的物質が細胞内に導入されて結合タンパク質と標的物質間の相互作用を可能にする最適化された細胞透過処理であってもよい。
【００６３】
本発明の一実施例によれば、透過処理は、結合タンパク質が発現された前記ステップ（ｂ）の細胞を遠心分離することにより凝集体を形成し、−２０℃で凍結するステップと、３７℃で解凍するステップと、酸性溶液、好ましくは０．１Ｍのクエン酸（ｐＨ．４）で処理するステップとからなる。
【００６４】
本発明における「微生物」とは、本発明の結合タンパク質と活性型封入体タンパク質とから構成された融合タンパク質を発現し、細胞内の封入体にディスプレイさせることができるあらゆる種類の細胞を意味し、真核細胞又は原核細胞であってもよいが、これらに限定されるものではない。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であってもよい。
【００６５】
従来の透過処理技術は、細胞内のタンパク質及び遺伝情報を細胞外に流出させてタンパク質及び遺伝情報を得るための透過処理自体を目的としたものであり、透過により細胞内のタンパク質及び遺伝情報を完璧に流出させることが目的であったが、本発明者らは細胞内の活性型封入体にディスプレイされた結合タンパク質の活性及び遺伝情報には影響を与えず、標的物質を細胞内に円滑に導入できるようにする透過処理方法を確立すべく努力した結果、本発明の透過処理方法を確立するに至った。
【００６６】
よって、本発明の微生物細胞透過処理方法は、微生物内部の活性型封入体にディスプレイされた結合タンパク質の活性及びその遺伝情報が細胞内で安定して維持され、外部標的物質を細胞内に導入することができ、細胞形態を維持するという新たな効果を有する。
【００６７】
本発明の一実施例によれば、透過処理は微生物（大腸菌）を遠心分離することにより凝集体（pellet）を形成し、−２０℃で凍結するステップと、３７℃で解凍するステップと、酸性溶液、好ましくは０．１Ｍのクエン酸（ｐＨ．４）で処理するステップとからなる。よって、外部標的物質を細胞に自由に導入できる透過処理された相互作用捕獲細胞が形成され、これを用いるとタンパク質間の相互作用を高感度で測定できることが確認され、これにより遺伝情報も得られることが確認された。
【００６８】
本発明のさらに他の態様は、結合タンパク質と活性型封入体タンパク質とから構成された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む構築物を含む細胞を提供する。
【００６９】
前記結合タンパク質、活性型封入体タンパク質、融合タンパク質及び細胞については前述した通りである。
【００７０】
本発明の一実施例によれば、結合タンパク質としてＬＲＲタンパク質を用い、活性型封入体タンパク質としてＣＢＤタンパク質を用い、標的物質としてＩＬ−６タンパク質を用いて、結合タンパク質とＣＢＤタンパク質が融合されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドを大腸菌細胞に形質導入することにより相互作用捕獲細胞を形成した。
【００７１】
本発明のさらに他の態様は、結合タンパク質と活性型封入体タンパク質とから構成された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む構築物を含む細胞ライブラリーを提供する。前記ライブラリーは、ＤＮＡライブラリー又はそれを形質転換した細胞ライブラリーであってもよい。
【００７２】
前記結合タンパク質、活性型封入体タンパク質、融合タンパク質及び細胞については前述した通りである。
【００７３】
本発明における「細胞ライブラリー」とは、標的物質と相互作用する結合タンパク質がコードされたプラスミドを含む細胞からなるライブラリーを意味し、結合タンパク質が安定して封入体にディスプレイされ、細胞透過化により標的物質を細胞内に導入できる細胞からなることを特徴とするライブラリーであることが好ましい。前記細胞ライブラリーは、これに限定されるものではないが、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞からなるライブラリーであることが好ましい。
【００７４】
本発明の一実施例によれば、標的物質であるＩＬ−６との親和性が約２ｎＭのＬＲＲタンパク質であるＤ３Ｅ８（ＰＰＩ＋）、１１７ｎＭのＦ１１（ＰＰＩ＋）、親和性がないＬＲＲタンパク質であるＩｎＶＬＲ５ｃ（ＰＰＩ−）が封入体にディスプレイされた細胞をそれぞれ１：１０：１００００の割合で混合した類似ライブラリーを用いた。また、本発明の一実施例によれば、タンパク質融合ディスプレイシステムを用いたスクリーニングのために、モデル結合タンパク質であるｒｅｐｅｂｏｄｙ（ＬＲＲタンパク質）にランダムライブラリーを構築して実際のライブラリーとして用いた。
【００７５】
本発明のさらに他の態様は、結合タンパク質と活性型封入体タンパク質とから構成された融合タンパク質が発現され、結合タンパク質が封入体にディスプレイされた相互作用捕獲細胞及び細胞ライブラリーを提供する。
【００７６】
前記結合タンパク質、活性型封入体タンパク質、融合タンパク質、細胞及び細胞ライブラリーについては前述した通りである。
【実施例】
【００７７】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７８】
実施例１：遺伝子及び酵素の確保
ファミリーＩＩのＣＢＤ（cellulose-binding domain）遺伝子は、韓国生命工学研究院生物資源センター（Korean Collection of Type Cultures, KCTC）のセルロモナス・フィミ（Cellulomonas fimi）ＫＣＴＣ９１４３菌株のエキソグルカナーゼ（exoglucanase）遺伝子からクローニングした。改善されたＧＦＰ（modified green fluorescent protein）遺伝子は商用プラスミドベクターであるｐＥＧＦＰ（Clontech, CA）から得て、ｍＲＦＰ１（monomeric red fluorescent protein 1）遺伝子を有するプラスミドベクターｐＲＦＰは韓国大田所在の韓国科学技術院から提供された。ＶＬＲ（Variable Lymphocyte Receptor）タンパク質は、インターナリンＢ（internalin B, InB）タンパク質のＮ末端、ＶＬＲタンパク質の改変された反復モジュール、及びＶＬＲタンパク質のＣ末端が融合された、人工抗体タンパク質であるＲｅｐｅｂｏｄｙ（ＩｎＢ−ＶＬＲ）ファミリーのうち、ＩＬ−６に結合親和性がないＩｎ−ＶＬＲ５−ｃ（特許文献３）、及びＩＬ−６に結合親和性があるＩｎ−ＶＬＲ５ｃ−Ｄ３Ｅ８（ＫＤ＝２ｎＭ）、Ｉｎ−ＶＬＲ５ｃ−Ｆ１１（ＫＤ＝１１７ｎＭ）が用いられ、ｈＩＬ−６（human interlukin-6）はｈＩＬ−６遺伝子がクローニングされたベクターである。前記遺伝子は、全て韓国大田所在の韓国科学技術院から提供された。本発明に用いられる全ての酵素はＮＥＢ（New England Biolabs）から購入した。
【００７９】
実施例２：組換えベクターの作製
本発明の全てのプライマーは、韓国大田のバイオニアにおいて合成した。前記プライマーは下記表１に示す。表１において制限酵素ＮｄｅＩやＫｐｎＩなどの制限部位は太字で示した。Ｉｎ−ＶＬＲ、ＧＦＰ遺伝子をはじめとして本発明に用いられる全ての遺伝子は、表１に示す各プライマーで増幅し、その後オーバーラップ伸長ＰＣＲ（overlap extension PCR）を用いて融合し、ｐＥＴ２１ａベクターのＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限部位に挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞を用いて組み換えた。上記方法により作製されたプラスミドベクターをそれぞれｐＩｎＶＬＲ５ｃ−ｍＲＦＰ−ＣＢＤ、ｐＤ３Ｅ８−ｍＲＦＰ−ＣＢＤ、ｐＦ１１−ｍＲＦＰ−ＣＢＤ、ｐＧＦＰ−ＩＬ６と命名した。また、ｐＩｎＶＬＲ５ｃ−ｍＲＦＰ−ＣＢＤプラスミドをＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素で処理することにより、ＩｎＶＬＲ５ｃ−ｍＲＦＰ遺伝子をＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素で処理されたｐＥＴ２１ａベクターに挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞を用いて組み換えた。上記方法により作製されたプラスミドベクターをｐＩｎＶＬＲ５ｃ−ｍＲＦＰと命名した。
【００８０】
【表１】
0006526029.tif 000002
【００８１】
Ｉｎ−ＶＬＲ５ｃ−Ｄ３Ｅ８、Ｉｎ−ＶＬＲ５ｃ−Ｆ１１遺伝子はプライマー１（配列番号１）及びプライマー２（配列番号２）を用いて、Ｉｎ−ＶＬＲ５ｃ遺伝子はプライマー１（配列番号１）及びプライマー７（配列番号７）を用いて、Ｉｎ−ＶＬＲ５ｃ−Ｄ３Ｅ８、Ｉｎ−ＶＬＲ５ｃ−Ｆ１１、Ｉｎ−ＶＬＲ５ｃ遺伝子がクローニングされたベクターから増幅した。ｍＲＦＰ１遺伝子はプライマー３（配列番号３）及びプライマー４（配列番号４）を用いて、ｍＲＦＰ１遺伝子がクローニングされたベクターから増幅し、ＧＦＰ遺伝子はプライマー８（配列番号８）及びプライマー９（配列番号９）を用いて、ｐＥＧＦＰ遺伝子から増幅した。ＣＢＤ遺伝子はプライマー５（配列番号５）及びプライマー６（配列番号６）を用いて、ＣＢＤから増幅し（非特許文献１５参照）、ｈＩＬ−６遺伝子はプライマー１０（配列番号１０）及びプライマー(１１)（配列番号１１）を用いて、ｈＩＬ−６遺伝子がクローニングされたベクターから増幅した。
【００８２】
実施例３：プラスミドの分離
実施例２で作製したｐＩｎＶＬＲ５ｃ−ｍＲＦＰ−ＣＢＤ、ｐＤ３Ｅ８−ｍＲＦＰ−ＣＢＤ、ｐＦ１１−ｍＲＦＰ−ＣＢＤ及びｐＩｎＶＬＲ５ｃ−ｍＲＦＰプラスミドでＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換し、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地（１％ ｂａｃｔｏ−トリプトン，０．５％ 酵母エキス，１％ ＮａＣｌ）に接種して３７℃で２４時間振盪培養した。培養した細胞懸濁液は遠心分離機（universal 320R, Hettich）を用いて４，４７０×ｇの速度で５分間遠心分離し、その後上清を除去したペレットを用いてＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔでプラスミドを分離し、分離したプラスミドは１％アガロースゲルを用いて電気泳動により確認した。
【００８３】
また、実施例２で作製したｐＧＦＰ−ＩＬ６プラスミドでＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換し、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地（１％ ｂａｃｔｏ−トリプトン，０．５％ 酵母エキス，１％ ＮａＣｌ）に接種して３７℃で２４時間振盪培養した。培養した細胞懸濁液は遠心分離機（universal 320R, Hettich）を用いて４，４７０×ｇの速度で５分間遠心分離し、その後上清を除去したペレットからＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔでプラスミドを分離し、分離したプラスミドは１％アガロースゲルを用いて電気泳動及びシークエンシングによりサイズ及び塩基配列を確認した。
【００８４】
実施例４：タンパク質の発現及び精製
実施例２で作製したｐＤ３Ｅ８−ｍＲＦＰ−ＣＢＤ、ｐＩｎＶＬＲ５ｃ−ｍＲＦＰ−ＣＢＤ及びｐＩｎＶＬＲ５ｃ−ｍＲＦＰプラスミドでＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地（１％ ｂａｃｔｏ−トリプトン，０．５％ 酵母エキス，１％ ＮａＣｌ）に接種して３７℃で振盪培養した。６００ｎｍにおけるＯＤ値が０．５のとき、ＣＢＤ封入体を誘導するために、ＩＰＴＧ（イソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシド, ２００μＭ）を添加し、細胞を３０℃で５時間培養し、培養した細胞がタンパク質及びタンパク質封入体を形成したか否かを蛍光顕微鏡（ZEISS）で確認した（図３）。
【００８５】
ｐＧＦＰ−ＩＬ６プラスミドでＥ．ｃｏｌｉ ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）を形質転換し、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地（１％ ｂａｃｔｏ−トリプトン，０．５％ 酵母エキス，１％ ＮａＣｌ）に接種して３７℃で振盪培養した。６００ｎｍにおけるＯＤ値が０．５のとき、ｈＩＬ−６タンパク質を発現するために、ＩＰＴＧ（イソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシド, ２００μＭ）を添加し、細胞を３０℃で５時間培養し、培養した細胞がＧＦＰ−ｈＩＬ６タンパク質を発現したか否かを蛍光顕微鏡で確認した。融合タンパク質が発現された細胞培養液を氷上で超音波粉砕して細胞膜を破砕し、その後溶解した菌株を再び２０，０００×ｇで２０分間遠心分離して沈殿物を除去し、上清のみ０．２μｍのフィルターで濾過して後続の精製過程に用いた。タンパク質の精製は、ＧＦＰ−ｈＩＬ６のＮ末端に発現された６×Ｈｉｓ−ｔａｇを用いてＦＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）に連結されたアフィニティークロマトグラフィーカラムＨｉＴｒａｐＴＭ Ｑ ＨＰ（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）により精製し、その後ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で脱塩し、遠心濾過器（centrifugal filteration; Sartorius stedim）を用いてタンパク質を４０ｍｇ／ｍｌの濃度に濃縮し、−２０℃で保管して下記実施例に用いた。精製されたＧＦＰ−ｈＩＬ６タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により確認した。
【００８６】
実施例５：タンパク質相互作用捕獲細胞の透過処理
実施例４で培養したｐＤ３Ｅ８−ｍＲＦＰ−ＣＢＤ又はｐＩｎＶＬＲ５ｃ−ｍＲＦＰ−ＣＢＤ細胞に、外部標的物質であるＧＦＰ−ＩＬ６タンパク質を細胞内導入するために、本発明において開発した最適化された細胞透過処理を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞培養液を２，４８０×ｇで５分間遠心分離し、その後凝集体（pellet）を−２０℃で凍結した。凍結したＥ．ｃｏｌｉ細胞をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に再懸濁し、その後３７℃で解凍し、２，４８０×ｇで５分間遠心分離して上清を除去した。０．１Ｍのクエン酸（ｐＨ４）でＥ．ｃｏｌｉ細胞を処理し、その後遠心分離して上清を除去し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に再懸濁した。
【００８７】
実施例６：封入体ディスプレイの有無による透過細胞における遺伝子分析
実施例４で培養したｐＩｎＶＬＲ５ｃ−ｍＲＦＰ−ＣＢＤ細胞に実施例５の方法で細胞透過処理をし、その後遠心分離機（universal 320R, Hettich）を用いて４，４７０×ｇの速度で５分間遠心分離して細胞上清と凝集体（pellet）に分け、次いで凝集体は細胞上清と同一量のＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に再懸濁した。細胞上清と凝集体再懸濁液をそれぞれｉＱＴＭ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）と１：１の割合で混合し、プライマー１３（配列番号１３）とプライマー１４（配列番号１４）を１０ｐｍｏｌずつ添加してポリメラーゼ連鎖反応定量検査装置であるＣＦＸ９６（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を用いてＤＮＡ量を分析した。
【００８８】
実施例７：タンパク質構造ベースの結合タンパク質ライブラリーの構築
モデル結合タンパク質として用いられたＬＲＲタンパク質であるｒｅｐｅｂｏｄｙのライブラリー構築方法は、特許文献４に用いられた方法と同様である。Ｒｅｐｅｂｏｄｙを用いて、連続的な２つの変異モジュール（LRRV module 1と2）の凹部に位置する６つのアミノ酸残基、９１、９３、９４、１１５、１１７及び１１８位を選択した。その後、前記選択したアミノ酸をＮＮＫ縮重コドン（Degenerate codon）で置換することにより、ライブラリー構築のための突然変異誘発プライマー（Mutagenic primer）を合成した。次に、前記プライマーを用いて２つのモジュールに対するオーバーラップポリメラーゼ連鎖反応（Overlap PCR）を行うことによりライブラリーＤＮＡを得て、前記組み換えたベクターｐＩｎＶＬＲ５ｃ−ｍＲＦＰ−ＣＢＤのＩｎＶＬＲ５ｃ遺伝子位置にライブラリー遺伝子を置換、挿入することによりｍＲＦＰ−ＣＢＤ遺伝子に結合したライブラリープラスミドを確保した。確保されたライブラリーを電気穿孔法（electroporation）で大腸菌ＤＨ５αに導入して形質転換体を得ることにより、１×１０７のレベルの多様性を有するライブラリーを構築した。
実施例８：
【００８９】
活性型封入体にディスプレイされた発現ライブラリーの作製及び発現
実施例７で作製したライブラリーコロニーを保存バッファ（storage buffer）（２ｘＴＹ 培地，５０％ グリセロール，２０％ グルコース）で回収し、その後４，４７０×gの速度で５分間遠心分離し、上清を除去したペレットからＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔでプラスミドを分離した。分離したライブラリープラスミド１μｇで電気穿孔法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換することにより、１×１０７のレベルの多様性を有する発現ライブラリーを構築した。発現ライブラリーコロニーを 保存バッファで回収し、その後ＯＤ６００ ０．０５で細胞を採取し、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地（１％ ｂａｃｔｏ−トリプトン，０．５％ 酵母エキス，１％ ＮａＣｌ）に接種して３７℃で振盪培養した。６００ｎｍにおけるＯＤ値が０．５のとき、ＣＢＤ封入体を誘導するために、２００μＭのＩＰＴＧを添加し、細胞を３０℃で３時間培養し、培養した細胞を遠心分離して上清を除去し、その後凝集体（pellet）を−２０℃で凍結した。
【００９０】
実施例９：フローサイトメーターによるタンパク質間相互作用の分析
実施例５で細胞透過処理によるｐＤ３Ｅ８−ｍＲＦＰ−ＣＢＤ（ＰＰＩ＋）又はｐＩｎＶＬＲ５ｃ−ｍＲＦＰ−ＣＢＤ（ＰＰＩ−）が発現された相互作用捕獲細胞（ＩＴｃｅｌｌｓ）懸濁液に、実施例４で精製及び分離したＧＦＰ−ＩＬ６タンパク質１０μＭをそれぞれ添加し、３０分間の攪拌反応により外部標的物質を細胞内部に導入してタンパク質間相互作用を誘導した。３０分後にＰＢＳＴ、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄し、その後結合タンパク質と標的物質の相互作用を蛍光顕微鏡（図１３のＡ）又はフローサイトメーター（図１３のＢ）により分析した。
【００９１】
フローサイトメトリーはＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（BD Biosciences, CA）により行い、分析ゲートはＳＳＣ及びＦＳＣパラメータに基づいてセッティングした。ＧＦＰ及びＲＦＰ蛍光をそれぞれＦＬ１（５３０／３０ｎｍ）及びＦＬ２（５８５／４２ｎｍ）ＰＭＴで検出し、コンペンセーションは（ＦＬ１−ＦＬ２：ＦＬ２−ＦＬ１＝１６％：１６％）に設定し、１０，０００回のイベントを各試料においてカウントした。データはＢＤ ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏ（version 4.0.2, 145 BD Biosciences）ソフトウェアを用いて収集し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（version 10）を用いて分析した。
【００９２】
実施例１０：タンパク質融合ディスプレイを用いたライブラリースクリーニング
実施例８で凍結した凝集体（pellet）に実施例５の方法で細胞透過処理を行い、その後ＧＦＰが融合した各種ターゲット（ｍＧＦＰ−ＩＬ６，ｓｆＧＦＰ．フルオレセイン，デキストラン−ＦＩＴＣ）に対してそれぞれ結合タンパク質ライブラリーがディスプレイされた封入体細胞との相互作用を誘導し、次いでフローサイトメーターにより相互作用細胞を回収した。相互作用細胞の回収はＦＡＣＳａｒｉａＴＭ ＩＩＩ（BD Biosciences, CA）により行い、分析ゲートはＳＳＣ及びＦＳＣパラメータに基づいてセッティングした。ＧＦＰ及びＲＦＰ蛍光をそれぞれＦＬ１（５３０／３０ｎｍ）及びＦＬ２（５８５／４２ｎｍ）ＰＭＴで検出し、コンペンセーションは（ＰＥ−ＦＩＴＣ：ＦＩＴＣ−ＰＥ＝２８．６２：４．２９）に設定し、１０，０００回のイベントを各試料においてカウントした。データはＢＤ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ（version 7.0 BD Biosciences）ソフトウェアを用いて収集し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（version 10）を用いて分析した。
【００９３】
実施例１１：電子顕微鏡分析（ＳＥＭ，ＴＥＭ）
実施例５の処理を経たＥ．ｃｏｌｉ細胞を２．５％パラホルムアルデヒド−グルタルアルデヒド（paraformaldehyde-glutaraldehyde；４℃，リン酸緩衝液，ｐＨ７．２）固定液で２時間前固定し、リン酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ７．２）で１０分間ずつ３回洗浄し、その後１％ＯｓＯ４（２５℃，０．１Ｍのリン酸緩衝液，ｐＨ７．２）で２時間後固定した。固定が終了した材料は、同一の緩衝液で数回洗浄し、その後エタノール濃度の昇順に脱水し、酢酸イソアミル（isoamyl acetate）で置換し、超臨界点乾燥装置（critical point dryer）により乾燥させ、その後ＳＣ５０２スパッタコーター（sputter coater）を用いて２０ｎｍの厚さでめっきし、次いで韓国生命工学研究院内に設置されているＦＥＩ Ｑｕａｎｔａ ２５０ ＦＥＧ（ＦＥＩ，ＵＳＡ）走査型電子顕微鏡（scanning electron microscope, ＳＥＭ）により１０ｋＶで観察した。
【００９４】
透過型電子顕微鏡による観察のために、採取した部位を２．５％パラホルムアルデヒド−グルタルアルデヒド（４℃，リン酸緩衝液，ｐＨ７．２）固定液で２時間前固定し、リン酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ７．２）で１０分間ずつ３回洗浄し、その後１％ＯｓＯ４（２５℃，０．１Ｍのリン酸緩衝液，ｐＨ７．２）で２時間後固定した。固定が終了した材料は、同一緩衝液で数回洗浄し、その後エタノール濃度の昇順に脱水し、酸化プロピレン（propylene oxide）で置換し、Ｅｐｏｎ−８１２に包埋し、次いで６０℃のオーブンで３６時間重合反応させた。包埋した組織は、ウルトラミクロトーム（ultramicrotome, ULTRACUT E, Leica）により超薄切片を作製し、酢酸ウラニル（uranyl acetate）とクエン酸鉛（lead citrate）で二重染色して透過型電子顕微鏡（transmission electron microscope, TEM, CM 20, Philips）により１００ｋＶで観察した。
【００９５】
実施例１２：結合タンパク質の封入体ディスプレイ
ＣＢＤ封入体がディスプレイされた結合タンパク質の活性及び発現を安定して維持する活性型封入体であることを確認するために、結合タンパク質であるＶＬＲ（ＩｎＶＬＲ５ｃ）と蛍光タンパク質であるｍＲＦＰをＣＢＤタグに融合し、大腸菌内で過剰発現させて封入体細胞を形成し、超音波粉砕により封入体のみ分離して蛍光顕微鏡で確認した。蛍光タンパク質であるｍＲＦＰの蛍光が封入体の位置に観察されることにより、結合タンパク質であるＶＬＲとｍＲＦＰがＣＢＤ封入体にディスプレイされたことが確認され、超音波粉砕により分離された封入体にもｍＲＦＰ蛍光が観察されることにより、ＣＢＤ封入体が結合タンパク質の活性を維持し、安定してディスプレイされたことが確認された（図３）。
【００９６】
実施例１３：細胞透過が細胞内外に及ぼす影響
本発明において開発した細胞透過方法（membrane disintegration）が細胞に及ぼす影響を確認するために、結合タンパク質及びＲＦＰタンパク質が封入体にディスプレイされた細胞（ＶＬＲ−ｍＲＦＰ−ＣＢＤ）と封入体にディスプレイされていない細胞（ＶＬＲ−ｍＲＦＰ）を用いて実験を行った。結合タンパク質が活性型封入体にディスプレイされた細胞（ＶＬＲ−ｍＲＦＰ−ＣＢＤ）と封入体のない細胞（ＶＬＲ−ｍＲＦＰ）を用いて、本発明において開発した２ステップの細胞透過処理（凍結／解凍及び酸性溶液処理）を行い、その後透過ステップによる両細胞の相違点をフローサイトメーターと蛍光顕微鏡により観察した。
【００９７】
実施例５における細胞透過処理過程のうち凍結及び解凍処理過程後の封入体の有無による細胞内の変化をフローサイトメーターと蛍光画像により分析した（図４）。その結果、活性型封入体にディスプレイされた結合タンパク質は凍結及び解凍処理過程後も細胞内で安定して発現を維持するのに対して、封入体にディスプレイされていない結合タンパク質のほとんどは細胞内で消失することが確認された。これは、凍結／解凍処理過程が細胞壁を透過処理することにより細胞内の分子（intracellular molecules）を細胞外部に流出させるが、封入体に結合された結合タンパク質は封入体に安定してディスプレイされているので、細胞外部に消失しないで細胞内に存在することを示すものである。
【００９８】
また、外部標的物質は、凍結及び解凍処理過程だけでは細胞内に導入されないが（図５）、凍結及び解凍処理された封入体細胞に酸性溶液又はキレート剤であるＥＤＴＡ処理を行うことより導入できることがフローサイトメーターにより確認された（図６）。図６の結果から、外部標的物質の細胞内導入を最も効果的に行える方法は０．１Ｍのクエン酸（ｐＨ４）であることを確認し、本発明の最適化された透過処理過程を完成した。
【００９９】
前記最適化された透過処理過程により外部標的物質が細胞内に移動して封入体にディスプレイされた結合タンパク質との相互作用を蛍光画像により観察した（図７のＡ）。標的物質が短時間（１分）で細胞内部に移動して結合タンパク質と相互作用するフローサイトメトリーの結果から（図７のＢ）、透過処理された細胞膜により標的物質が容易に移動可能な状態であることが確認された。
【０１００】
図８は、前記最適化された透過処理過程により細胞内部に導入された外部標的物質と封入体にディスプレイされた結合タンパク質との相互作用が、非特異的相互作用ではなく、結合タンパク質固有の活性を維持する状態において標的物質との親和性により相互作用する特異的相互作用であることが確認された結果である。
【０１０１】
結合タンパク質の活性型封入体ディスプレイの有無による結合タンパク質の遺伝情報維持を確認するために、結合タンパク質が活性型封入体にディスプレイされた細胞（ＶＬＲ−ｍＲＦＰ−ＣＢＤ ｃｅｌｌ）と封入体のない細胞（ＶＬＲ−ｍＲＦＰ）を用いて、本発明において開発した最適化された細胞透過処理により凝集体と上清にそれぞれ分離し、その後透過過程を経た両細胞内の結合タンパク質の遺伝情報を有するプラスミドの有無をリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応定量検査（定量ＰＣＲ；Ｑ−ＰＣＲ）により確認した。その結果、活性型封入体にディスプレイされた結合タンパク質の遺伝情報は、細胞透過処理にもかかわらず、細胞内にほとんど安定して維持されるのに対して、封入体にディスプレイされていない結合タンパク質の遺伝情報は、ほとんどが細胞外部に流出することが確認された（図１０）。
【０１０２】
実施例１４：タンパク質融合ディスプレイシステムの証明
前記本発明において開発した最適化された細胞透過処理を用いたタンパク質融合ディスプレイ技術の証明のために、モデル結合タンパク質とモデル標的物質を用いて実験を行った。図１１ａは、本発明において開発した２ステップの透過処理過程後に外部標的物質を細胞内部に導入することができ、導入された標的物質が細胞内の封入体にディスプレイされた結合タンパク質との相互作用により封入体に共局在（co-localization）することを示すデータである。
【０１０３】
図１１ｂは、前記細胞透過処理過程後の細胞内の遺伝情報維持の有無を確認するための実験である。結合タンパク質が活性型封入体にディスプレイされた細胞（Ｒｅｐｅｂｏｄｙ−ｍＲＦＰ−ＣＢＤ ｃｅｌｌ）を本発明において開発した細胞透過処理により凝集体（pellet）と上清にそれぞれ分離し、その後凝集体は上清と同一量のＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に再懸濁した。凝集体懸濁液と上清を用いて、結合タンパク質の遺伝情報を有するプラスミドの有無をリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応定量検査（定量ＰＣＲ；Ｑ−ＰＣＲ）により確認した。また、透過処理前の細胞と透過処理後の細胞内のプラスミドを分離し、電気泳動により確認した。その結果、活性型封入体にディスプレイされた結合タンパク質の遺伝情報のほとんどは、細胞透過処理にもかかわらず、細胞内に安定して維持されることが確認された。
【０１０４】
これは、本発明の最適化された透過処理により細胞内の活性型封入体にディスプレイされた結合タンパク質とその遺伝情報が維持される特徴により、結合タンパク質と標的物質の相互作用を用いて、個々の細胞単位で分画でき、個々の細胞単位で遺伝情報を回収できるようにするステップを含む、タンパク質ライブラリースクリーニングが可能なシステムであることを示す結果である。
【０１０５】
図１１ｃは前記細胞透過処理前後の細胞形態をフローサイトメーターと電子顕微鏡により確認した結果であり、細胞透過処理後も細胞形態を安定して維持することが確認された。
【０１０６】
これは、本発明において開発した細胞透過処理方法は、細胞を破壊せずに細胞壁及び膜の透過化を向上させることにより、外部標的物質を細胞内に安定して導入すると共に、活性型封入体にディスプレイされた結合タンパク質及びその遺伝情報は細胞内に安定して維持する、従来の他の細胞透過処理方法とは明らかに異なる本発明固有の方法であることを裏付けるものである。
【０１０７】
図１２は前記最適化された細胞透過処理により導入可能な標的物質のサイズを確認した実験であり、タンパク質融合ディスプレイシステムを用いたスクリーニングにより得たｄｅｘｔｒａｎ−ＦＩＴＣ結合タンパク質であるＣ２０（ＰＰＩ＋）と、結合していない結合タンパク質（negative control）が封入体にディスプレイされた相互作用捕獲細胞を実験に用いた。各細胞（ＰＰＩ＋，ＰＰＩ−）の透過処理後に様々なサイズのｄｅｘｔｒａｎ−ＦＩＴＣ（分子量３，０００〜５，０００、７０，０００及び２５０，０００）を細胞内に導入して相互作用を誘導した。その結果、分子量２５０，０００のｄｅｘｔｒａｎ−ＦＩＴＣも細胞内に導入されて細胞内の封入体にディスプレイされた結合タンパク質と相互作用することが確認された。これは、本発明の透過処理方法を用いた場合、高分子物質（macromolecules）も容易に細胞内に導入することができ、これをターゲットに相互作用を誘導すると、ライブラリースクリーニングによりタンパク質結合体が得られることを示す結果である。
【０１０８】
実施例１５：タンパク質融合ディスプレイ技術を用いたタンパク質間相互作用の分析
上記実施例の最適化された細胞透過を用いたタンパク質融合ディスプレイによるタンパク質間相互作用を確認するために、標的物質であるＩＬ−６に親和性を有するＤ３Ｅ８（Ｋｄ＝２ｎＭ）と、親和性がないＩｎＶＬＲ５ｃタンパク質をモデル結合タンパク質として用いて、封入体にそれぞれディスプレイした。ｐＤ３Ｅ８−ｍＲＦＰ−ＣＢＤ又はｐＩｎＶＬＲ５ｃ−ｍＲＦＰ−ＣＢＤプラスミドでそれぞれＥ．ｃｏｌｉを形質転換して融合タンパク質を発現させ、実施例５の最適化された細胞透過処理により標的物質であるＧＦＰ−ＩＬ６タンパク質を細胞内に導入し、その後蛍光顕微鏡及びフローサイトメーターにより細胞を観察した。
【０１０９】
その結果、ＩＬ６に結合親和性を有するｐＤ３Ｅ８−ｍＲＦＰ−ＣＢＤが発現された封入体細胞（ＰＰＩ＋）においては、ＧＦＰ−ＩＬ６蛍光が細胞内の封入体に結合タンパク質と共にディスプレイされたＲＦＰ蛍光と同じ位置（co-localization）で観察されるのに対して、親和性がないＬＲＲタンパク質が発現された細胞であるｐＩｎＶＬＲ５ｃ−ｍＲＦＰ−ＣＢＤ（ＰＰＩ−）においては、細胞内の封入体にディスプレイされた結合タンパク質のＲＦＰ蛍光のみ観察され、ＧＦＰ蛍光は全く観察されなかった（図１３のＡ）。すなわち、結合タンパク質と相互作用により結合した標的物質の蛍光強度により、タンパク質間相互作用の有無を明らかに確認することができた。要するに、これらの結果は、活性型封入体がそれにディスプレイされたタンパク質の適切なフォールディング（folding）や自然な形態の形成を妨害せず、ディスプレイされたタンパク質を活性型の形態に固定化する役割を果たすことを裏付けるものである。すなわち、本発明の方法が結合タンパク質の実際の構造及び固有の活性には影響を及ぼさない状態でタンパク質間の相互作用を分析できることを証明するものである。
【０１１０】
また、フローサイトメトリーの結果、標的物質（ＩＬ−６）と相互作用が存在する結合タンパク質であるＤ３Ｅ８がディスプレイされた封入体細胞（ＰＰＩ＋）は、細胞透過により細胞内に導入された標的物質ＩＬ−６タンパク質との相互作用によりＧＦＰ蛍光が大きく増加し（赤色の実線）、ＩＬ−６に親和性がない結合タンパク質であるＩｎＶＬＲ５ｃ（灰色の実線）と比較すると（ＰＰＩ−）、タンパク質間相互作用が存在するか否かによる蛍光の差（シグナル対ノイズ比）が４５０倍のレベルであり、明らかに異なることが確認されることにより（ＰＰＩ−：ＰＰＩ＋＝１×１０１：５．５×１０３）、タンパク質間相互作用の有無を明らかに判別できることが確認された（図１３のＢ）。また、結合タンパク質の親和性によるタンパク質間相互作用を分析した結果、結合タンパク質の親和性が増加するにつれて標的物質に融合した蛍光の強度も共に増加したので、本発明は定量的分析が可能なタンパク質間相互作用分析方法であることが確認された（図１３のＣ）。
【０１１１】
これらの結果は、本発明の方法において、封入体にディスプレイされた結合タンパク質と標的物質の親和性及び相互作用により個々の細胞単位の封入体細胞を蛍光顕微鏡だけでなく、フローサイトメーターによっても標的物質の蛍光強度で分離及び回収できることを裏付けるものである。さらに、本発明は、外部から導入された標的物質に融合した蛍光の強度により相互作用の有無を区別するので、シグナル対ノイズ比の差が非常に明瞭であるという利点がある。
【０１１２】
実施例１６：タンパク質融合ディスプレイ技術を用いたライブラリースクリーニング
本発明において開発したタンパク質融合ディスプレイ技術を用いると、ライブラリースクリーニングが可能であることが確認された。標的物質であるＩＬ−６に親和性がある結合タンパク質であるＤ３Ｅ８（Ｋｄ＝２ｎＭ）、Ｆ１１（Ｋｄ＝１１７ｎＭ）と、親和性がないＬＲＲタンパク質であるＩｎＶＬＲ５ｃ（ＰＰＩ−）がディスプレイされた封入体細胞をそれぞれ１：１０：１００００の割合で混合してライブラリー類似環境を形成し、その後実施例５の方法で最適化された細胞透過化処理及びタンパク質相互作用を誘導したサンプルから、フローサイトメーター（FACSaria）によりＩＬ−６との結合親和力が高いＥ．ｃｏｌｉ細胞を１０，０００個回収した。回収した細胞からプラスミドを純粋分離してＤＨ５αＥ．ｃｏｌｉ細胞を再び形質転換させ、形成されたコロニーを対象にＰＣＲ増幅反応を行って表現型（Ｄ３Ｅ８（Ｆ１１）−ｍＲＦＰ−ＣＢＤタンパク質）により回収した細胞の遺伝子回収の結果を確認した。ＰＣＲ増幅反応は、表１のプライマー１２（配列番号１２）、プライマー１３（配列番号１３）及びプライマー１４（配列番号１４）を混合して用いた。増幅された遺伝子のサイズにより相互作用が存在する細胞が回収されたか否かを確認した。
【０１１３】
その結果、１回のスクリーニングで初期混合比率（１／１０００）を考慮すると約３０，０００倍のスクリーニング効率を示すことが確認された（図１４）。これらの結果は、活性型封入体を相互作用捕獲細胞として用いて、結合タンパク質をディスプレイした相互作用捕獲細胞ライブラリーからタンパク質間相互作用により相互作用が存在する封入体細胞のみを超高速分析装置であるフローサイトメーター（ＦＡＣＳ）により選択的に分類することができ、選択的に分類した細胞から相互作用タンパク質コード遺伝子を効果的に回収できるライブラリースクリーニングシステムであるという事実を裏付けるものである。
【０１１４】
上記結果に基づいて、モデル結合タンパク質として用いられるｒｅｐｅｂｏｄｙにより実際にライブラリーを作製し、それを用いて各種ターゲットに対するタンパク質結合体（binder）を探索するスクリーニング作業を行った（図１５ａ〜図１５ｃ）。実施例８で作製した発現ライブラリーに細胞透過処理を行い、その後ＧＦＰが結合した各種ターゲット（ｍＧＦＰ−ＩＬ６，ｓｆＧＦＰ，ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，ｄｅｘｔｒａｎ−ＦＩＴＣ）を相互作用捕獲細胞ライブラリーで処理して相互作用を誘導し、次いでＦＡＣＳにおいてＧＦＰシグナルが増加した部分（相互作用存在）の細胞を回収した（図１５ａ）。回収した細胞のＲｅｐｅｂｏｄｙ遺伝子部分のみＰＣＲし、ｐＩｎＶＬＲ５ｃ−ｍＲＦＰ−ＣＢＤのＩｎＶＬＲ５ｃ遺伝子位置にライブラリー遺伝子を置換、挿入することにより、ｍＲＦＰ−ＣＢＤ遺伝子に結合したプラスミドを確保した。このプラスミドを電気穿孔法で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入して形質転換体を得て、その後ランダムにそれぞれのコロニーを選択してシークエンシングにより得たＲｅｐｅｂｏｄｙ遺伝子配列を確認した。最大で２回の繰り返しスクリーニングでそれぞれのターゲットに結合する各種タンパク質結合体（binder）を容易に得ることができた。特にｓｆＧＦＰをターゲットにしたライブラリースクリーニングの場合、ＦＡＣＳ分析においてターゲットと所望の結合力を有する結合タンパク質細胞のみ選択的に回収することができた。これらの結果から、タンパク質融合ディスプレイ技術を用いると、タンパク質間相互作用によるタンパク質結合体が迅速かつ容易に得られるライブラリースクリーニングシステムであるという事実が証明された。
【０１１５】
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、明細書ではなく特許請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態を含むものであると解釈すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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