(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｘ−（Ｂ２−［Ｙ２］ｓ−Ｄ１）２−Ｂ１−Ｚ
（式中、Ｘは
（Ｄ２）４、
（Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、
（Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、
（Ｄ５）３２−（Ｂ５−［Ｙ５］ｐ−Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、又は
（Ｄ６）６４−（Ｂ６−［Ｙ６］ｏ−Ｄ５）３２−（Ｂ５−［Ｙ５］ｐ−Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４であり、かつ、
それぞれのＹ（Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５及びＹ６）はその他のＹから独立して、下記の式
【化１】
0006553706.tif 000042
に例示されるチオエーテル部分によって、Ｃ末端に隣接するＤのアミノ酸のＮ末端と結合する、結合部分のジペプチド又はトリペプチドのＨ−Ｃｙｓ又はＣＨ−Ｃｙｓ（式中、Ｈは疎水性側鎖を含む任意のアミノ酸であり、かつ、Ｃはカチオン性側鎖を含む任意のアミノ酸である。）であり、
ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは０又は１であり、
Ｚは中心部分であり、
それぞれのＢ（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５及びＢ６）はその他のＢから独立して分岐部分であり、一般式ＣｎＨ２ｎ−１（ＮＨ）２ＣＯ−で表されるジアミノアルキルカルボン酸部分を表し（式中、Ｈは水素原子であり、かつ、Ｃは炭素原子である。）、ｎは２〜１０の間の数であり、
それぞれのＤ（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６）はその他のＤから独立して、
ｉ．ジペプチドＣＨ、ＨＣ、ＣＣ若しくはＨＨ、又は
ｉｉ．トリペプチドＨＣＨ、ＨＨＣ、ＣＨＨ、ＣＣＨ、ＣＨＣ、ＨＣＣ、ＨＨＨ若しくはＣＣＣ
（式中、Ｈは疎水性側鎖を含む任意のアミノ酸であり、かつ、Ｃはカチオン性側鎖を含む任意のアミノ酸である。）
である。）
で表される、薬剤として使用するためのペプチドデンドリマー。
【請求項２】
ａ．Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５及びＢ６は独立して、リジン、オルニチン、（Ｌ）−２、３−ジアミノプロピオン酸及び（Ｌ）−２、３−ジアミノ酪酸から選択され、
ｂ．前記疎水性側鎖を含む任意のアミノ酸であるＨはロイシン、フェニルアラニン、アラニン、チロシン又はトリプトファンから選択され、及び／又は
ｃ．前記カチオン性側鎖を含む任意のアミノ酸であるＣはリジン、アルギニン又は（Ｌ）−２、３−ジアミノ酪酸から選択される、請求項１に記載の、薬剤として使用するためのペプチドデンドリマー。
【請求項３】
Ｚは、Ｚのアミノ官能基とＢ１のカルボン酸炭素との間のアミド結合によってＢと結合し、かつ、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６はそれぞれ、それらの各々の結合パートナーであるＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５及びＢ６と、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５及びＢ６のアミノ窒素とＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６のカルボン酸炭素との間のアミド結合によって結合することを特徴とする、請求項１又は２に記載の、薬剤として使用するためのペプチドデンドリマー。
【請求項４】
ＺはジペプチドＣＨ若しくはトリペプチドＨＣＨであり（式中、Ｈは疎水性側鎖を含む任意のアミノ酸であり、かつ、Ｃはカチオン性側鎖を含む任意のアミノ酸である。）、又はＺはＬｙｓ−Ｌｅｕ、Ａｒｇ−Ｌｅｕ、Ｄａｂ−Ｔｒｐ、Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ若しくはＬｅｕから選択され、かつ、ＤはＬｙｓ−Ｌｅｕ、Ａｒｇ−Ｌｅｕ及びＤａｂ−Ｔｒｐから選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の、薬剤として使用するためのペプチドデンドリマー。
【請求項５】
下記の式：
ａ．（ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｂ．（ＫＬ）４−（Ｂ−ＫＬ）２−Ｂ−ＫＬ
ｃ．（ＲＬ）４−（Ｂ−ＲＬ）２−Ｂ−ＲＬ
ｄ．（ＫＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２Ｋ−ＫＬ
ｅ．（ＤａｂＷ）４−（Ｋ−ＤａｂＷ）２−Ｋ−ＤａｂＷ
ｆ．（ＤａｂＬ）４−（Ｋ−ＤａｂＬ）２−Ｋ−ＤａｂＬ
ｇ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｈ．（ＲＬ）８−（Ｋ−ＲＬ）４−（Ｋ−ＲＬ）２−Ｋ−ＲＬ
ｉ．（ＬＫ）８−（Ｋ−ＬＫ）４−（Ｋ−ＬＫ）２−Ｋ−ＬＫ
ｊ．（ＫＹ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｋ．（ＬＡ）８−（Ｋ−ＬＫ）４−（Ｋ−ＬＡ）２−Ｋ−ＫＬ
ｌ．（ＫＷ）８−（Ｋ−ＫＷ）４−（Ｋ−ＫＷ）２−Ｋ−ＫＷ
ｍ．（ＫＦ）８−（Ｋ−ＫＦ）４−（Ｋ−ＫＦ）２−Ｋ−ＫＦ
ｎ．（ＫＬ）８−（Ｂ−ＫＬ）４−（Ｂ−ＫＬ）２−Ｂ−ＫＬ
ｏ．（ＲＬ）８−（Ｂ−ＲＬ）４−（Ｂ−ＲＬ）２−Ｂ−ＲＬ
ｐ．（ＬＬ）８−（Ｋ−ＫＫ）４−（Ｋ−ＬＬ）２−Ｋ−ＫＫ
ｑ．（ＤａｂＬ）８−（Ｋ−ＤａｂＬ）４−（Ｋ−ＤａｂＬ）２−Ｋ−ＤａｂＬ
ｒ．（ＤａｂＬ）８−（Ｋ−ＤａｂＷ）４−（Ｋ−ＤａｂＬ）２−Ｋ−ＤａｂＷ
ｓ．（ＤａｂＬ）８−（Ｋ−ＤａｂＬ）４−（Ｋ−ＤａｂＷ）２−Ｋ−ＤａｂＷ
ｔ．（ＤａｂＬ）８−（Ｋ−ＤａｂＷ）４−（Ｋ−ＤａｂＷ）２−Ｋ−ＤａｂＬ
ｕ．（ＤａｂＬ）８−（Ｋ−ＤａｂＷ）４−（Ｋ−ＤａｂＷ）２−Ｋ−ＤａｂＡ
ｖ．（ＤａｂＬ）８−（Ｋ−ＤａｂＷ）４−（Ｋ−ＤａｂＡ）２−Ｋ−ＤａｂＷ
ｗ．（ＤａｂＬ）８−（Ｋ−ＤａｂＡ）４−（Ｋ−ＤａｂＷ）２−Ｋ−ＤａｂＷ
ｘ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬＣＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｙ．（ＫＬ）１６−（Ｋ−ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬＣＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｚ．（ＫＬ）１６−（Ｋ−ＫＬＣＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ａａ．（ＲＬ）８−（Ｋ−ＲＬＣＲＬ）４−（Ｋ−ＲＬ）２−Ｋ−ＲＬ
ｂｂ．（ＫＫＬ）４−（Ｋ−ＫＫＬ）２−Ｋ−ＫＫＬ
ｃｃ．（ＫＬＬ）４−（Ｋ−ＫＬＬ）２−Ｋ−ＫＬＬ
ｄｄ．（ＬＫＬ）４−（Ｋ−ＬＫＬ）２−Ｋ−ＬＫＬ
ｅｅ．（ＫＬＬ）８−（Ｋ−ＫＬＬ）４−（Ｋ−ＫＬＬ）２−Ｋ−ＫＬＬ
ｆｆ．（ＬＫＬ）８−（Ｋ−ＬＫＬ）４−（Ｋ−ＬＫＬ）２−Ｋ−ＬＫＬ
ｇｇ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＬＫＬ）２−Ｋ−ＫＫＬ
ｈｈ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＬＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＬ
ｉｉ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＬＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ
ｊｊ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＬＫＬ）２−Ｋ−ＬＫＬ
ｋｋ．（ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）４ＣＨ３
ｌｌ．（ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）６ＣＨ３
ｍｍ．（ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）８ＣＨ３
ｎｎ．（ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）１０ＣＨ３
ｏｏ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）４ＣＨ３
ｐｐ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）６ＣＨ３
ｑｑ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）８ＣＨ３
ｒｒ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）１０ＣＨ３
ｓｓ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）１４ＣＨ３
ｔｔ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）１６ＣＨ３
ｕｕ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）２２ＣＨ３
ｖｖ．（ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）１６ＣＨ３
ｗｗ．（ＣＨ３（ＣＨ２）４ＣＯ−ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｘｘ．（ＣＨ３（ＣＨ２）４ＣＯ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｙｙ．（ＫＫ）８−（Ｋ−ＫＫ）４−（Ｋ−ＬＬ）２−Ｋ−ＬＬ
ｚｚ．（ＫＫ）８−（Ｋ−ＬＬ）４−（Ｋ−ＫＫ）２−Ｋ−ＬＬ
ａａａ．（ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）１４ＣＨ３
ｂｂｂ．（ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）２２ＣＨ３
ｃｃｃ．（ＫＫ）８−（Ｋ−ＬＬ）４−（Ｋ−ＬＬ）２−Ｋ−ＧＳＣ
ｄｄｄ．（ＫＫ）８−（Ｋ−ＫＫ）４−（Ｋ−ＬＬ）２−Ｋ−ＧＳＣ
ｅｅｅ．（ＫＫ）８−（Ｋ−ＫＫ）４−（Ｋ−ＫＫ）２−Ｋ−ＧＳＣ
ｆｆｆ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＬＬ）４−（Ｋ−ＬＬ）２−Ｋ−ＧＳＣ
ｇｇｇ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＬＬ）２−Ｋ−ＧＳＣ
ｈｈｈ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＧＳＣ
ｉｉｉ．（ＫＡ）８−（Ｋ−ＫＡ）４−（Ｋ−ＫＡ）２−Ｋ−ＧＳＣ
ｊｊｊ．（ＫＨ）８−（Ｋ−ＫＨ）４−（Ｋ−ＫＨ）２−Ｋ−ＧＳＣ
ｋｋｋ．（ＲＬ）８−（Ｋ−ＬＬ）４−（Ｋ−ＬＬ）２−Ｋ−ＧＳＣ
ｌｌｌ．（ＲＬ）８−（Ｋ−ＲＬ）４−（Ｋ−ＬＬ）２−Ｋ−ＧＳＣ
ｍｍｍ．（ＲＬ）８−（Ｋ−ＲＬ）４−（Ｋ−ＲＬ）２−Ｋ−ＧＳＣ
ｎｎｎ．（ＯｒｎＬ）４−（Ｋ−ＤａｂＦ）２−Ｋ−ＫＬ
ｏｏｏ．（ＯｒｎＦ）４−（Ｋ−ＤａｂＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｐｐｐ．（ＲＦ）４−（Ｋ−ＤａｂＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｑｑｑ．（ＯｒｎＦ）４−（Ｋ−ＤａｂＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）８ＣＨ３
ｒｒｒ．（ＯｒｎＬ）４−（Ｋ−ＤａｂＦ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）８ＣＨ３
ｓｓｓ．（ＲＦ）４−（Ｋ−ＤａｂＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）８ＣＨ３
（式中、Ｄａｂは（Ｌ）−２、３−ジアミノ酪酸であり、Ｂは（Ｌ）−２、３−ジアミノプロピオン酸であり、−（ＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３又はＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯ−で表される部分（式中、ｎは４，６，８、１０，１４，１６又は２２であり、Ｈは水素原子であり、かつ、Ｃは炭素原子である。）はアルキルカルボン酸部分であり、１文字表記はアミノ酸に用いられ及び大文字はＬ−エナンチオマーを示し、並びに分岐するジアミノ酸は下線で示している。）
のいずれかによって特徴付けられる、薬剤として使用するためのペプチドデンドリマー。
【請求項６】
デンドリマーのＺ及び／又はＮ末端のＤがアルキルカルボン酸部分と結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の、薬剤として使用するためのペプチドデンドリマー。
【請求項７】
細菌感染症の予防又は治療において使用するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の、薬剤として使用するためのペプチドデンドリマー。
【請求項８】
一般式Ｘ−（Ｂ２−［Ｙ２］ｓ−Ｄ１）２−Ｂ１−Ｚ
（式中、Ｘは
（Ｄ２）４、
（Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、
（Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、
（Ｄ５）３２−（Ｂ５−［Ｙ５］ｐ−Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、又は
（Ｄ６）６４−（Ｂ６−［Ｙ６］ｏ−Ｄ５）３２−（Ｂ５−［Ｙ５］ｐ−Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４であり、かつ、
それぞれのＹ（Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５及びＹ６）はその他のＹから独立して、下記の式
【化２】
0006553706.tif 000043
に例示されるチオエーテル部分によって、Ｃ末端に隣接するＤのアミノ酸のＮ末端と結合する、結合部分のジペプチド又はトリペプチドのＨ−Ｃｙｓ又はＣＨ−Ｃｙｓ（式中、Ｈは疎水性側鎖を含む任意のアミノ酸であり、かつ、Ｃはカチオン性側鎖を含む任意のアミノ酸である。）であり、
ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは０又は１でありえ、
Ｚは中心部分であり、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５及びＢ６はその他のＢからそれぞれ独立して分岐部分であり、一般式ＣｎＨ２ｎ−１（ＮＨ）２ＣＯ−で表されるジアミノアルキルカルボン酸部分を表し（式中、Ｈは水素原子であり、かつ、Ｃは炭素原子である。）、ｎは２〜１０の間の数であり、
Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６はその他のＤからそれぞれ独立して、
ｉ．ジペプチドＣＨ、ＨＣ、ＣＣ若しくはＨＨ、又は
ｉｉ．トリペプチドＨＣＨ、ＨＨＣ、ＣＨＨ、ＣＣＨ、ＣＨＣ、ＨＣＣ、ＨＨＨ若しくはＣＣＣ
（式中、Ｈは疎水性側鎖を含む任意のアミノ酸であり、かつ、Ｃは（Ｌ）−２、３−ジアミノ酪酸であることを特徴とする。）
である。）
で表される、ペプチドデンドリマー。
【請求項９】
Ｚは、Ｚのアミノ官能基とＢ１のカルボン酸炭素との間のアミド結合によってＢと結合し、かつ、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６はそれぞれ、それらの各々の結合であるパートナーＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５及びＢ６と、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５及びＢ６のアミノ窒素とＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６のカルボン酸炭素との間のアミド結合によって結合することを特徴とする、請求項８に記載のペプチドデンドリマー。
【請求項１０】
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５及びＢ６は独立して、リジン、オルニチン、（Ｌ）−２、３−ジアミノプロピオン酸及び（Ｌ）−２、３−ジアミノ酪酸から選択される、請求項８又は９に記載のペプチドデンドリマー。
【請求項１１】
一般式Ｘ−（Ｂ２−［Ｙ２］ｓ−Ｄ１）２−Ｂ１−Ｚ
（式中、Ｘは
（Ｄ２）４、
（Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、
（Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、
（Ｄ５）３２−（Ｂ５−［Ｙ５］ｐ−Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、又は
（Ｄ６）６４−（Ｂ６−［Ｙ６］ｏ−Ｄ５）３２−（Ｂ５−［Ｙ５］ｐ−Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４であり、かつ、
それぞれのＹ（Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５及びＹ６）はその他のＹから独立して、下記の式
【化３】
0006553706.tif 000044
に例示されるチオエーテル部分によって、Ｃ末端に隣接するＤのアミノ酸のＮ末端と結合する、結合部分のジペプチド又はトリペプチドのＨ−Ｃｙｓ又はＣＨ−Ｃｙｓ（式中、Ｈは疎水性側鎖を含む任意のアミノ酸であり、かつ、Ｃはカチオン性側鎖を含む任意のアミノ酸である。）であり、
ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは０又は１であり、
Ｚは中心部分であり、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５及びＢ６はその他のＢからそれぞれ独立して分岐部分であり、一般式ＣｎＨ２ｎ−１（ＮＨ２）２ＣＯ−で表されるジアミノアルキルカルボン酸部分を表し（式中、Ｈは水素原子であり、かつ、Ｃは炭素原子である。）、ｎは２〜１０の間の数であり、
Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６はその他のＤからそれぞれ独立して、
ｉｖ．アミノ酸Ｃ又はＨ
ｖ．ジペプチドＣＨ、ＨＣ、ＣＣ又はＨＨ
ｖｉ．トリペプチドＨＣＨ、ＨＨＣ、ＣＨＨ、ＣＣＨ、ＣＨＣ、ＨＣＣ、ＨＨＨ又はＣＣＣ
（式中、Ｈは疎水性側鎖を含む任意のアミノ酸であり、かつ、Ｃはカチオン性側鎖を含む任意のアミノ酸であることを特徴とする。）
であり、Ｚ及び／又はＮ末端のＤがアルキルカルボン酸と結合することを特徴とする。）
で表される、ペプチドデンドリマー。
【請求項１２】
前記アルキルカルボン酸部分が一般式ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯ−によって表される（式中、Ｈは水素原子であり、かつ、Ｃは炭素原子である。）、請求項１１に記載のペプチドデンドリマー。
【請求項１３】
ａ．ＺはジペプチドＣＨ若しくはトリペプチドＨＣＨであり（式中、Ｈは疎水性側鎖を含む任意のアミノ酸であり、かつ、Ｃはカチオン性側鎖を含む任意のアミノ酸である。）、又はＺはＬｙｓ−Ｌｅｕ、Ａｒｇ−Ｌｅｕ、Ｄａｂ−Ｔｒｐ及びＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓから選択され、
ｂ．Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５及びＢ６は独立して、リジン、オルニチン、（Ｌ）−２、３−ジアミノプロピオン酸及び（Ｌ）−２、３−ジアミノ酪酸から選択され、
ｃ．前記疎水性側鎖を含む任意のアミノ酸であるＨはロイシン、フェニルアラニン、アラニン、チロシン又はトリプトファンから選択され、及び／又は
ｄ．前記カチオン性側鎖を含む任意のアミノ酸であるＣはリジン、アルギニン又は（Ｌ）−２、３−ジアミノ酪酸から選択される、請求項１１又は１２に記載のペプチドデンドリマー。
【請求項１４】
Ｚは、Ｚのアミノ官能基とＢ１のカルボン酸炭素との間のアミド結合によってＢと結合し、かつ、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６はそれぞれ、それらの各々の結合パートナーであるＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５及びＢ６と、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５及びＢ６のアミノ窒素とＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６のカルボン酸炭素との間のアミド結合によって結合することを特徴とする、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のペプチドデンドリマー。
【請求項１５】
下記の式：
ａ．（ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｂ．（ＫＬ）４−（Ｂ−ＫＬ）２−Ｂ−ＫＬ
ｃ．（ＲＬ）４−（Ｂ−ＲＬ）２−Ｂ−ＲＬ
ｄ．（ＫＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｅ．（ＤａｂＷ）４−（Ｋ−ＤａｂＷ）２−Ｋ−ＤａｂＷ
ｆ．（ＤａｂＬ）４−（Ｋ−ＤａｂＬ）２−Ｋ−ＤａｂＬ
ｇ．（ＬＫ）８−（Ｋ−ＬＫ）４−（Ｋ−ＬＫ）２−Ｋ−ＬＫ
ｈ．（ＫＹ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｉ．（ＬＡ）８−（Ｋ−ＬＫ）４−（Ｋ−ＬＡ）２−Ｋ−ＫＬ
ｊ．（ＫＷ）８−（Ｋ−ＫＷ）４−（Ｋ−ＫＷ）２−Ｋ−ＫＷ
ｋ．（ＫＦ）８−（Ｋ−ＫＦ）４−（Ｋ−ＫＦ）２−Ｋ−ＫＦ
ｌ．（ＫＬ）８−（Ｂ−ＫＬ）４−（Ｂ−ＫＬ）２−Ｂ−ＫＬ
ｍ．（ＲＬ）８−（Ｂ−ＲＬ）４−（Ｂ−ＲＬ）２−Ｂ−ＲＬ
ｎ．（ＬＬ）８−（Ｋ−ＫＫ）４−（Ｋ−ＬＬ）２−Ｋ−ＫＫ
ｏ．（ＤａｂＬ）８−（Ｋ−ＤａｂＬ）４−（Ｋ−ＤａｂＬ）２−Ｋ−ＤａｂＬ
ｐ．（ＤａｂＬ）８−（Ｋ−ＤａｂＷ）４−（Ｋ−ＤａｂＬ）２−Ｋ−ＤａｂＷ
ｑ．（ＤａｂＬ）８−（Ｋ−ＤａｂＬ）４−（Ｋ−ＤａｂＷ）２−Ｋ−ＤａｂＷ
ｒ．（ＤａｂＬ）８−（Ｋ−ＤａｂＷ）４−（Ｋ−ＤａｂＷ）２−Ｋ−ＤａｂＬ
ｓ．（ＤａｂＬ）８−（Ｋ−ＤａｂＷ）４−（Ｋ−ＤａｂＷ）２−Ｋ−ＤａｂＡ
ｔ．（ＤａｂＬ）８−（Ｋ−ＤａｂＷ）４−（Ｋ−ＤａｂＡ）２−Ｋ−ＤａｂＷ
ｕ．（ＤａｂＬ）８−（Ｋ−ＤａｂＡ）４−（Ｋ−ＤａｂＷ）２−Ｋ−ＤａｂＷ
ｖ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬＣＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｗ．（ＫＬ）１６−（Ｋ−ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬＣＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｘ．（ＫＬ）１６−（Ｋ−ＫＬＣＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｙ．（ＲＬ）８−（Ｋ−ＲＬＣＲＬ）４−（Ｋ−ＲＬ）２−Ｋ−ＲＬ
ｚ．（ＫＫＬ）４−（Ｋ−ＫＫＬ）２−Ｋ−ＫＫＬ
ａａ．（ＫＬＬ）４−（Ｋ−ＫＬＬ）２−Ｋ−ＫＬＬ
ｂｂ．（ＬＫＬ）４−（Ｋ−ＬＫＬ）２−Ｋ−ＬＫＬ
ｃｃ．（ＫＬＬ）８−（Ｋ−ＫＬＬ）４−（Ｋ−ＫＬＬ）２−Ｋ−ＫＬＬ
ｄｄ．（ＬＫＬ）８−（Ｋ−ＬＫＬ）４−（Ｋ−ＬＫＬ）２−Ｋ−ＬＫＬ
ｅｅ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＬＫＬ）２−Ｋ−ＫＫＬ
ｆｆ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＬＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＬ
ｇｇ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＬＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ
ｈｈ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＬＫＬ）２−Ｋ−ＬＫＬ
ｉｉ．（ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）４ＣＨ３
ｊｊ．（ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）６ＣＨ３
ｋｋ．（ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）８ＣＨ３
ｌｌ．（ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）１０ＣＨ３
ｍｍ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）４ＣＨ３
ｎｎ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）６ＣＨ３
ｏｏ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）８ＣＨ３
ｐｐ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）１０ＣＨ３
ｑｑ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）１４ＣＨ３
ｒｒ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）１６ＣＨ３
ｓｓ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）２２ＣＨ３
ｔｔ．（ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）１６ＣＨ３
ｕｕ．（ＣＨ３（ＣＨ２）４ＣＯ−ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｖｖ．（ＣＨ３（ＣＨ２）４ＣＯ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｗｗ．（ＫＫ）８−（Ｋ−ＫＫ）４−（Ｋ−ＬＬ）２−Ｋ−ＬＬ
ｘｘ．（ＫＫ）８−（Ｋ−ＬＬ）４−（Ｋ−ＫＫ）２−Ｋ−ＬＬ
ｙｙ．（ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）１４ＣＨ３
ｚｚ．（ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）２２ＣＨ３
ａａａ．（ＯｒｎＬ）４−（Ｋ−ＤａｂＦ）２−Ｋ−ＫＬ
ｂｂｂ．（ＯｒｎＦ）４−（Ｋ−ＤａｂＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｃｃｃ．（ＲＦ）４−（Ｋ−ＤａｂＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｄｄｄ．（ＯｒｎＦ）４−（Ｋ−ＤａｂＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）８ＣＨ３
ｅｅｅ．（ＯｒｎＬ）４−（Ｋ−ＤａｂＦ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）８ＣＨ３
ｆｆｆ．（ＲＦ）４−（Ｋ−ＤａｂＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）８ＣＨ３
（式中、Ｄａｂは（Ｌ）−２、３−ジアミノ酪酸であり、Ｂは（Ｌ）−２、３−ジアミノプロピオン酸であり、−（ＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３又はＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯ−で表される部分（式中、ｎは４，６，８、１０，１４，１６又は２２であり、Ｈは水素原子であり、かつ、Ｃは炭素原子である。）はアルキルカルボン酸部分であり、１文字表記はアミノ酸に用いられ及び大文字はＬ−エナンチオマーを示し、並びに分岐するジアミノ酸は下線で示している。）によって特徴付けられる、ペプチドデンドリマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
グラム陰性緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は環境中に広く分布する一般的な日和見病原体である。緑膿菌は尿路、呼吸器系、血流の感染症並びに重度の火傷及び嚢胞性線維症の患者の感染症と頻繁に関連する。広範囲の火傷を負った患者には全身感染症さえも引き起こしうる。緑膿菌は、院内感染症における倫理の主要因の１つである。それは、抗生物質への高レベルの獲得耐性及び抗生物質への感受性を減少させるバイオフィルムの形成が原因である。それ故に、グラム陰性細菌、及び具体的には緑膿菌をターゲットとする新規の治療薬を開発する必要がある。
【背景技術】
【０００２】
抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）は競合する病原微生物に対する防御機構として、あらゆる種類の生命の体内で生成される。直鎖のＡＭＰが多数であるが、単環及び複環のＡＭＰもまた自然界で発見されうる。全てのＡＭＰの一般的な特徴は６〜５０残基であり、塩基性アミノ酸のリジン又はアルギニン及び相当な割合（少なくとも３０％）の疎水性残基を含むことである。それ故にＡＭＰは負の電荷を帯びた細菌で覆われた双性イオン性の哺乳類の膜に優先的に作用し、かつ、疎水残基が膜の疎水性部分への拡散を促進させる。ＡＭＰにおいても、耐性を誘発する可能性があるが、その進行は古典的な抗生物質よりもずっと遅い。ほとんどの直鎖のＡＭＰは、新規の優れた抗生物質源となりうる、病原性細菌、菌類、ウイルス、寄生虫及びさらにがん細胞に対する広範囲の活性を有する。直鎖のＡＭＰの主要な欠点は、潜在毒性、プロテアーゼによる急速な分解、ｐＨ変化に対する感受性及び高い生産コストである。
【０００３】
別の種類は、多量体／樹脂状抗微生物ペプチドから成る。これらのペプチドデンドリマーは、鋳型又はコアマトリクスと結合したペプチドモノマーの数個の複製物を含む分岐ポリマーと定義された。それらの多価ペプチドデンドリマーの多数の種類は過去３０年内に開発された。改良は主にコアに対して行われた一方、結合したペプチドは効率的な天然に存在するペプチド又はそれらの類似体のままであった。１９８０年代に分岐単位としてのリジンから成るコアを含み、かつ最大で第３世代のデンドリマーを生み出す多重抗原ペプチド（ＭＡＰｓ）が免疫源として導入された（Ｔａｍ、Ｊ．Ｐ．ら；２００２、Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２６９、９２３−３２）。
【０００４】
新規のトポロジーを備えるペプチドデンドリマーは、本発明者の研究グループによって開発された。これらのペプチドデンドリマーは、分岐点として用いられるリジンなどのジアミノ酸、及び分岐単位の間の１つ、２つ又は３つのアミノ酸（ＡＡ）を含む分岐ペプチドである。これらは固相ペプチド合成によって容易に調製され、かつ、直鎖状配列によく見られる凝集傾向がなく、水媒体への良好な溶解性を持つ。それらのペプチドデンドリマーは触媒活性及び生物活性を示し、かつ、直鎖の類似体と比較してタンパク質分解及び加水分解に非常に安定である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔａｍ、Ｊ．Ｐ．ら；２００２、Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２６９、９２３−３２
【非特許文献２】Ｓｔａｃｈ、Ｍ．ら、２０１２．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、３（１）、８６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
抗菌剤としてのペプチドデンドリマーの研究は最初に、（分岐リジン間に１つのアミノ酸を有する）１１１１個のペプチドデンドリマーのビーズのコンビナトリアルライブラリー合成、及びビーズ拡散分析による活性のスクリーニングが試みられた（Ｓｔａｃｈ、Ｍ．ら、２０１２．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、３（１）、８６）。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）がスクリーニング細菌として用いられ、そして複数のヒット配列が明らかになった。ヒット物及び類似体の再合成は、グラム陽性枯草菌に対して非常に高い活性を持つ化合物を生成した。しかし、調製された化合物は全て緑膿菌に対する活性を示さないか、又はＭＩＣ（最小発育阻止濃度）が約２０μｇ／ｍＬのわずかな活性があるかのいずれかであった。緑膿菌に対する同じライブラリーのスクリーニングは、１つの化学構造もヒットしなかったことが示された。
【０００７】
本発明の目的は、生体外及び生体内で使用するための、新規のペプチド抗生物質を提供することである。本目的は、独立請求項の主題により達成される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、分岐単位間に２つ又は３つのアミノ酸を有する、新種の抗微生物ペプチドデンドリマー（ＡＭＰＤｓ）に関する（図１）。ペプチドデンドリマーは第２、第３、第４及び第５世代になり得、分岐単位はリジン、ジアミノプロピオン酸、オルニチン又はジアミノ酪酸であり得、かつ、分岐単位間のアミノ酸は任意の天然又は非天然のアミノ酸である。疎水性尾部のような活性を高める基はデンドリマーのコア又はＮ末端に結合しうる。当該ペプチドデンドリマーは、臨床単離株を含むグラム陰性緑膿菌、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）及びアシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）を含む他のグラム陰性細菌、並びにいくつかのグラム陽性細菌（黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ））に対し、非常に効果が高い。
【０００９】
用語及び定義
アミノ酸配列はＮ末端からＣ末端までである。本明細書中で言及されるペプチドデンドリマーの末端のカルボキシ基は、カルボン酸、カルボキシレート基（ＣＯＯ−）又はアミド基（ＣＯＮＨ２）である可能性がある。
【００１０】
本明細書中の文脈におけるアルキルカルボン酸は、一般式ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨで表され、式中、ｎは６〜２２の値である。特定の実施態様では、ｎは６、７、８、９、１０、１１、１２、１４又は１６から選択される。
【００１１】
３文字のコードで表わされる配列位置（ストライヤー、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、ｐ．２１）は、別段の指示がない限り、天然に存在する（タンパク質を構成する）Ｌ−アミノ酸のエナンチオマー又はジアステレオマーを指す。
【００１２】
本明細書中の文脈における疎水性アミノ酸は、水素結合供与体又は受容体のない側鎖を有する、任意のαアミノカルボン酸である。疎水性アミノ酸は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンを含むが、これらに限定されない。
【００１３】
本明細書中の文脈におけるカチオン性側鎖を含むアミノ酸は、生理的なｐＨ下でカチオンとして存在する化学官能基を含む、側鎖を有するαアミノカルボン酸である。カチオン性アミノ酸はアルギニン、ヒスチジン、リジン、オルニチン、ジアミノプロピオン酸及びジアミノ酪酸を含むが、これらに限定されない。
【００１４】
Ｄａｂは（Ｌ）−２、３−ジアミノ酪酸（ＣＡＳ番号２６４３−６６−５）である。
【００１５】
（Ｂ）は（Ｌ）−２、３−ジアミノプロピオン酸（ＣＡＳ番号４０３３−３９−０）である。
【００１６】
発明の第１の側面によれば、薬剤として使用するためのペプチドデンドリマーが提供される。該デンドリマーは一般式Ｘ−（Ｂ２−［Ｙ２］ｓ−Ｄ１）２−Ｂ１−Ｚ
（式中、Ｘは
（Ｄ２）４、
（Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、
（Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、
（Ｄ５）３２−（Ｂ５−［Ｙ５］ｐ−Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、又は
（Ｄ６）６４−（Ｂ６−［Ｙ６］ｏ−Ｄ５）３２−（Ｂ５−［Ｙ５］ｐ−Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４であり、
それぞれのＹ（Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５及びＹ６）はその他のＹから独立して、下記の式
【化１】
0006553706.tif 000002
に例示されるチオエーテル部分によって、Ｃ末端に隣接するアミノ酸のＮ末端と結合する、結合部分のジペプチド又はトリペプチドのＨ−Ｃｙｓ又はＣＨ−Ｃｙｓであり、
ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは０又は１であり、
Ｚは中心部分であり、
それぞれのＢ（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５及びＢ６）はその他のＢから独立して分岐部分であり、
それぞれのＤ（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６）はその他のＤから独立して、
ｉ．ジペプチドＣＨ、ＨＣ、ＣＣ若しくはＨＨ、又は
ｉｉ．トリペプチドＨＣＨ、ＨＨＣ、ＣＨＨ、ＣＣＨ、ＣＨＣ、ＨＣＣ、ＨＨＨ若しくはＣＣＣ
（式中、Ｈは疎水性側鎖を含む任意のアミノ酸であり、かつ、Ｃはカチオン性側鎖を含む任意のアミノ酸である。）
である。）
で表される。
【００１７】
言い換えれば、本発明の主題であるデンドリマーは、簡略化した一般式（（［（［（［（［Ｄ６２Ｂ６［Ｙ６］ｏ］ｄＤ５）２Ｂ５［Ｙ５］ｐ］ｃＤ４）２Ｂ４［Ｙ４］ｑ］ｂＤ３）２Ｂ３［Ｙ３］ｒ］ａＤ２）２Ｂ２［Ｙ２］ｓＤ１）２Ｂ１−Ｚ
（式中、ａ、ｂ、ｃ及びｄは０又は１であり得る（ただし、ａが１の場合ｂは１のみであり得、ｂが１の場合ｃは１のみであり得、かつ、ｃが１の場合ｄは１のみであり得る）。上記の式で示されるように、結合部分Ｙは、存在する場所で、アミド結合によってＤと結合する酢酸部分を含むシステイン側鎖のチオエーテル結合によって、隣接するＤと結合する。当該例示的な結合において、チオエーテル基の硫黄はＹのシステイン側鎖が起源であり、かつ、アミド結合中のアミノ基は（システイン残基から見れば）Ｃ末端でＤに隣接する、Ｎ末端のアミノ酸が起源である。）
で表される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】分岐点間に２つのＡＡを有する第３世代（Ｇ３）のペプチドデンドリマーのトポロジー。
【図２】樹上ペプチドの固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）。ａ．カップリング：３当量／Ｇ  Ｆｍｏｃ−アミノ酸、３当量／Ｇ  ヘキサフルオロリン酸（ベンゾトリアゾ−ル−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム（ＰｙＢＯＰ）又は１−ヒドロキシベンゾトリアゾ−ル（ＨＯＢｔ）、及び５当量／Ｇ  Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）又はＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中のＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＰＡ）又はＮ、Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）。ｂ．アセチル化：無水酢酸（Ａｃ２Ｏ）／ジクロロメタン（ＤＣＭ）（１：１、ｖ／ｖ）、１×１５分。ｃ．Ｆｍｏｃの脱保護：ピペリジン／ＤＭＦ（１：４、ｖ／ｖ）、２０分。ｄ．開裂：トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（９４％）、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）（５％）、水（１％）（システイン及びメチオニンの遊離ペプチド）又はＴＦＡ（９４％）、ＴＩＳ（１％）、水（２．５％）、１、２−エタンジオール（ＥＤＴ）（２．５％）（システイン及び／又はメチオニンを含むペプチド）。
【図３】低位の世代のペプチドデンドリマーのチオ連結反応によるペプチドデンドリマーの組立。
【図４】Ａ：第３世代のＡＭＰＤのＭＳｔ−１１２、及びＢ：コアリジンに結合するＣ１２疎水性尾部を有する第２世代ＡＭＰＤのＭＳｔ−２６３。荷電したＡＡは黒色であり、疎水性のＡＡは明灰色であり、かつ、分岐点は暗灰色である。
【図５】黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマニ及び緑膿菌の臨床分離株に対するＡＭＰＤのＭＩＣ値（μｇ／ｍＬ）（２つの独立したデュプリケートで測定され、ＭＳｔ−２６１及びＭＳｔ−２６５は１回だけ試験された）。最大測定濃度は６４μｇ／ｍＬである。
【図６】ホスファチジルグリセロールの脂肪小胞からの５（６）−カルボキシフルオレセインの漏出。５０秒でペプチドデンドリマーをバッファー（１０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１０７ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４）中の脂質小胞溶液に添加し、かつ、３００秒で１．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を添加する。蛍光強度はＩ（ｔ）＝（Ｉｔ−Ｉ０）／（Ｉ∞−Ｉ０）（式中、Ｉ０＝Ｉｔでペプチドデンドリマーを添加し、Ｉ∞＝Ｉｔで溶菌が飽和する）を用いて、部分発光強度Ｉ（ｔ）に正規化された。Ａは活性のあるＡＭＰＤのＭＳｔ−１１２であり、Ｂは異なるペプチド濃度の、不活性なペプチドデンドリマーのＭＳｔ−１１３である。
【図７】ホスファチジルコリンの脂肪小胞からの５（６）−カルボキシフルオレセインの漏出。５０秒でペプチドデンドリマーをバッファー（１０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１０７ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４）中の脂質小胞溶液に添加し、かつ、３００秒で１．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を添加する。蛍光強度はＩ（ｔ）＝（Ｉｔ−Ｉ０）／（Ｉ∞−Ｉ０）（式中、Ｉ０＝Ｉｔでペプチドデンドリマーを添加し、Ｉ∞＝Ｉｔで溶菌が飽和する）を用いて、部分発光強度Ｉ（ｔ）に正規化された。Ａは活性のあるＡＭＰＤのＭＳｔ−１１２であり、Ｂは異なるペプチド濃度の、不活性なペプチドデンドリマーのＭＳｔ−１１３である。
【図８】異なる濃度のＭＳｔ−２６０によって誘発される５（６）−カルボキシフルオレセインの漏出。５０秒でペプチドデンドリマーをバッファー（１０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１０７ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４）中の脂質小胞溶液に添加し、かつ、３００秒で１．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を添加する。蛍光強度はＩ（ｔ）＝（Ｉｔ−Ｉ０）／（Ｉ∞−Ｉ０）（式中、Ｉ０＝Ｉｔでペプチドデンドリマーを添加し、Ｉ∞＝Ｉｔで溶菌が飽和する）を用いて、部分発光強度Ｉ（ｔ）に正規化された。Ａはホスファチジルグリセロールの大規模単層ベシクル（ＬＵＶｓ）であり、ＢはホスファチジルコリンのＬＵＶｓである。
【図９】２つの独立したデュプリケートで測定された、活性及び不活性のペプチドデンドリマー細胞生存性。緑膿菌はペプチドデンドリマー（２５μｇ／ｍＬ）を加えて培養され、かつ、３７℃で０、１、３、６、８、２４時間培養された。ＷＳＴ−８の添加及び培養の後、吸光度を４５０ｎｍで測定した。
【図１０】チオエーテル結合した例示的なデンドリマーの構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明のすべての側面において、分岐部分Ｂは任意の二官能性のアミノ酸であり得、具体的には任意のジアミノ酸であり得、具体的には一般式ＣｎＨ２ｎ−１（ＮＨ２）２ＣＯ−（式中、ｎは２〜１０の間の数であり、より具体的にはｎは２、３、４又は５である）で表されるジアミノ置換アルキルカルボン酸部分であり得る。
【００２０】
いくつかの実施態様では、薬剤として使用するためのペプチドデンドリマーは、一般式Ｘ−（Ｂ２−［Ｙ２］ｓ−Ｄ１）２−Ｂ１−Ｚ
（式中、Ｘは
（Ｄ２）４、
（Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、
（Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、
（Ｄ５）３２−（Ｂ５−［Ｙ５］ｐ−Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、又は
（Ｄ６）６４−（Ｂ６−［Ｙ６］ｏ−Ｄ５）３２−（Ｂ５−［Ｙ５］ｐ−Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４であり、かつ、
それぞれのＹ（Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５及びＹ６）はその他のＹから独立して、下記の式
【化２】
0006553706.tif 000003
に例示されるチオエーテル部分によって、Ｃ末端に隣接するＤのアミノ酸のＮ末端と結合する、結合部分のジペプチド又はトリペプチドのＨ−Ｃｙｓ又はＣＨ−Ｃｙｓであり、
ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは０又は１であり、
Ｚは中心部分であり、
それぞれのＢ（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５及びＢ６）はその他のＢから独立して、一般式ＣｎＨ２ｎ−１（ＮＨ）２ＣＯ−で表されるジアミノアルキルカルボン酸部分を表し、ｎは２〜１０の間の数であり、より具体的にはｎは２、３、４又は５であり、
それぞれのＤ（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６）はその他のＤから独立して、
ｉ．ジペプチドＣＨ、ＨＣ、ＣＣ若しくはＨＨ、又は
ｉｉ．トリペプチドＨＣＨ、ＨＨＣ、ＣＨＨ、ＣＣＨ、ＣＨＣ、ＨＣＣ、ＨＨＨ若しくはＣＣＣ
（式中、Ｈは疎水性側鎖を含む任意のアミノ酸であり、かつ、Ｃはカチオン性側鎖を含む任意のアミノ酸である。）
である。）
で表される。
【００２１】
いくつかの実施態様では、薬剤として使用するためのペプチドデンドリマーは、一般式Ｘ−（Ｂ２−［Ｙ２］ｓ−Ｄ１）２−Ｂ１−Ｚ
（式中、Ｘは
（Ｄ２）４、
（Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、
（Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、
（Ｄ５）３２−（Ｂ５−［Ｙ５］ｐ−Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、又は
（Ｄ６）６４−（Ｂ６−［Ｙ６］ｏ−Ｄ５）３２−（Ｂ５−［Ｙ５］ｐ−Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４であり、かつ、
それぞれのＹ（Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５及びＹ６）はその他のＹから独立して、下記の式
【化３】
0006553706.tif 000004
に例示されるチオエーテル部分によって、Ｃ末端に隣接するＤのアミノ酸のＮ末端と結合する、結合部分のジペプチド又はトリペプチドのＨ−Ｃｙｓ又はＣＨ−Ｃｙｓであり、
ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは０又は１であり、少なくともｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは１であり、
Ｚは中心部分であり、
それぞれのＢ（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５及びＢ６）はその他のＢから独立して、一般式ＣｎＨ２ｎ−１（ＮＨ）２ＣＯ−で表されるジアミノアルキルカルボン酸部分を表し、ｎは２〜１０の間の数であり、より具体的にはｎは２、３、４又は５であり、
それぞれのＤ（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６）はその他のＤから独立して、
ｉ．ジペプチドＣＨ、ＨＣ、ＣＣ若しくはＨＨ、又は
ｉｉ．トリペプチドＨＣＨ、ＨＨＣ、ＣＨＨ、ＣＣＨ、ＣＨＣ、ＨＣＣ、ＨＨＨ若しくはＣＣＣ
（式中、Ｈは疎水性側鎖を含む任意のアミノ酸であり、かつ、Ｃはカチオン性側鎖を含む任意のアミノ酸である。）
である。）
で表される。
【００２２】
いくつかの実施態様では、薬剤として使用するためのペプチドデンドリマーは、一般式Ｘ−（Ｂ２−［Ｙ２］ｓ−Ｄ１）２−Ｂ１−Ｚ
（式中、Ｘは
（Ｄ２）４、
（Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、
（Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、
（Ｄ５）３２−（Ｂ５−［Ｙ５］ｐ−Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、又は
（Ｄ６）６４−（Ｂ６−［Ｙ６］ｏ−Ｄ５）３２−（Ｂ５−［Ｙ５］ｐ−Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４であり、かつ、
それぞれのＹ（Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５及びＹ６）はその他のＹから独立して、下記の式
【化４】
0006553706.tif 000005
に例示されるチオエーテル部分によって、Ｃ末端に隣接するＤのアミノ酸のＮ末端と結合する、結合部分のジペプチド又はトリペプチドのＨ−Ｃｙｓ又はＣＨ−Ｃｙｓであり、
ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは０又は１であり、
Ｚは中心部分であり、
それぞれのＢ（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５及びＢ６）はその他のＢから独立して、一般式ＣｎＨ２ｎ−１（ＮＨ）２ＣＯ−で表されるジアミノアルキルカルボン酸部分を表し、ｎは２〜１０の間の数であり、より具体的にはｎは２、３、４又は５であり、
それぞれのＤ（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６）はその他のＤから独立して、
ｉ．ジペプチドＣＨ、ＨＣ、ＣＣ若しくはＨＨ、又は
ｉｉ．トリペプチドＨＣＨ、ＨＨＣ、ＣＨＨ、ＣＣＨ、ＣＨＣ、ＨＣＣ、ＨＨＨ若しくはＣＣＣ
（式中、Ｈは疎水性側鎖を含む任意のアミノ酸であり、かつ、Ｃはカチオン性側鎖を含む任意のアミノ酸である。）
であり、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６のうちの少なくとも１つが上記のトリペプチドから選択されるトリペプチドである。）
で表される。
【００２３】
Ｂにおける以下の実施態様は本発明の全ての側面に適用する。いくつかの実施態様では、Ｂはリジン、オルニチン、２、３−ジアミノ酪酸及び２、３−ジアミノプロピオン酸などの、アミノ官能化されたαアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｂは天然に存在するアミノ酸から選択されるアミノ酸である。天然に存在するアミノ酸は非毒性の代謝産物に容易に代謝され、それ故に、デンドリマーの人への使用に対する規制当局の承認を容易にする。
【００２４】
本発明の任意の側面の特定の実施態様では、ペプチドデンドリマーは、固相合成担体上で成長するデンドリマーのアミノ基と活性カルボン酸基をペプチド結合することによってデンドリマーを伸長する、メリーフィールドによる固相ペプチド合成によって合成される。本発明の任意の側面のこれらのいくつかの実施態様では、第１位置のＺはＺのアミノ官能基とＢ１のカルボン酸炭素との間のアミド結合によってＢと結合し、かつ、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ６はそれぞれ、それらの各々の結合パートナーであるＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６と、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６のアミノ窒素とＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ６のカルボキシル末端アミノ酸のカルボン酸炭素との間のアミド結合によって、それぞれ結合する。
【００２５】
（）内にチオエーテル結合が１つもない実施態様において、式はＸ−（Ｂ２−Ｄ１）２−Ｂ１−Ｚ
（式中、Ｘは
（Ｄ２）４、
（Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、
（Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、
（Ｄ５）３２−（Ｂ５−［Ｙ５］ｐ−Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、又は
（Ｄ６）６４−（Ｂ６−［Ｙ６］ｏ−Ｄ５）３２−（Ｂ５−［Ｙ５］ｐ−Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４
である。）
という簡略化された形で表されうる。
【００２６】
特定の実施態様では、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６はその他のＤからそれぞれ独立して、ジペプチド（ＣＨ、ＨＣ、ＣＣ若しくはＨＨ）又はトリペプチド（ＨＣＨ、ＨＨＣ、ＣＨＨ、ＣＣＨ、ＣＨＣ、ＨＣＣ、ＨＨＨ若しくはＣＣＣ）である。
【００２７】
Ｚは中心部分であり、かつ、本発明のデンドリマーを作成するための固相化学的手法では、Ｚは合成の出発点である。多数の異なる短ペプチドが、実験的に用いられ、全面的に高い成功率を収めている。
【００２８】
いくつかの実施態様では、ＺはＬｙｓ−Ｌｅｕ、Ａｒｇ−Ｌｅｕ、Ｄａｂ−Ｔｒｐ、Ｄａｂ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｔｒｐ、Ｌｙｓ−Ｐｈｅ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、ＤａｂＡ−Ａｌａ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ、Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ、Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ｏｒｎ−Ｌｅｕ、Ｏｒｎ−Ｐｈｅ、Ａｒｇ−Ｐｈｅ又はＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓである。
【００２９】
いくつかの実施態様では、ＺはＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ＣＯＮＨ２）である。いくつかの実施態様では、ＺはＬｙｓ−Ｌｅｕ、Ａｒｇ−Ｌｅｕ、Ｄａｂ−Ｌｅｕ又はＤａｂ−Ｔｒｐである。いくつかの実施態様では、ＺはＬｙｓ又はＬｅｕである。いくつかの実施態様では、ＺはＺのアミノ官能基とアルキルカルボン酸のカルボキシ基との間のアミド結合によって、アルキルカルボン酸と結合する。特定の実施態様では、アルキルカルボン酸はＺに含まれるリジン部分のωアミノ側鎖と結合する。他の実施態様では、アルキルカルボン酸はＮ末端のＤと結合する。
【００３０】
いくつかの実施態様では、Ｈはロイシン、フェニルアラニン、アラニン、チロシン又はトリプトファンから選択される。いくつかの実施態様では、Ｃはリジン、アルギニン又は（Ｌ）−２−３−ジアミノ酪酸から選択される。
【００３１】
いくつかの実施態様では、ＺはトリペプチドＨＣＨ、ＨＨＣ、ＣＨＨ、ＣＣＨ、ＣＨＣ、ＨＣＣ、ＨＨＨ又はＣＣＣであり、Ｈ及びＣは上記の意味を持つ。
【００３２】
いくつかの実施態様では、ＺはＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓである。
【００３３】
いくつかの実施態様では、ＺはトリペプチドＨＣＨ、ＨＨＣ、ＣＨＨ、ＣＣＨ、ＣＨＣ、ＨＣＣ、ＨＨＨ又はＣＣＣであり、Ｈ及びＣは上記の意味を持ち、かつ、ＺはＺのアミノ官能基とアルキルカルボン酸のカルボキシ基との間のアミド結合によって、一般式ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯ−によって表されるアルキルカルボン酸部分と結合する。
【００３４】
いくつかの実施態様では、ｎは４〜２２の間の数であり、具体的には４〜１０の間の数であり、より具体的には４〜８の間の数である。
【００３５】
いくつかの実施態様では、ＺはＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓであり、ＺはＺのアミノ官能基とアルキルカルボン酸のカルボキシ基との間のアミド結合によって、アルキルカルボン酸と結合する。
【００３６】
いくつかの実施態様では、ペプチドデンドリマーは表１ａの式によって特徴付けられる：
【表１ａ】
0006553706.tif 000006
【００３７】
いくつかの実施態様では、化合物ｇ及びｈはリストより除外される。
【００３８】
いくつかの実施態様では、表１ａのリストはさらに以下の化合物を含む：
ｃｃｃ．（ＫＫ）８−（Ｋ−ＬＬ）４−（Ｋ−ＬＬ）２−Ｋ−ＧＳＣ
ｄｄｄ．（ＫＫ）８−（Ｋ−ＫＫ）４−（Ｋ−ＬＬ）２−Ｋ−ＧＳＣ
ｅｅｅ．（ＫＫ）８−（Ｋ−ＫＫ）４−（Ｋ−ＫＫ）２−Ｋ−ＧＳＣ
ｆｆｆ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＬＬ）４−（Ｋ−ＬＬ）２−Ｋ−ＧＳＣ
ｇｇｇ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＬＬ）２−Ｋ−ＧＳＣ
ｈｈｈ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＧＳＣ
ｉｉｉ．（ＫＡ）８−（Ｋ−ＫＡ）４−（Ｋ−ＫＡ）２−Ｋ−ＧＳＣ
ｊｊｊ．（ＫＨ）８−（Ｋ−ＫＨ）４−（Ｋ−ＫＨ）２−Ｋ−ＧＳＣ
ｋｋｋ．（ＲＬ）８−（Ｋ−ＬＬ）４−（Ｋ−ＬＬ）２−Ｋ−ＧＳＣ
ｌｌｌ．（ＲＬ）８−（Ｋ−ＲＬ）４−（Ｋ−ＬＬ）２−Ｋ−ＧＳＣ
ｍｍｍ．（ＲＬ）８−（Ｋ−ＲＬ）４−（Ｋ−ＲＬ）２−Ｋ−ＧＳＣ。
【００３９】
いくつかの実施態様では、表１ａのリストはさらに以下の化合物を含む：
ｎｎｎ．（ＯｒｎＬ）４−（Ｋ−ＤａｂＦ）２−Ｋ−ＫＬ
ｏｏｏ．（ＯｒｎＦ）４−（Ｋ−ＤａｂＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｐｐｐ．（ＲＦ）４−（Ｋ−ＤａｂＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｑｑｑ．（ＯｒｎＦ）４−（Ｋ−ＤａｂＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）８ＣＨ３
ｒｒｒ．（ＯｒｎＬ）４−（Ｋ−ＤａｂＦ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）８ＣＨ３
ｓｓｓ．（ＲＦ）４−（Ｋ−ＤａｂＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）８ＣＨ３。
【００４０】
各括弧において、一番左の（Ｎ末端の）アミノ酸は、最後の１つを除いて分岐部分である。挙げられた例では、括弧部分の間の単一のアミノ酸及びＺ部分は分岐部分である。
【００４１】
特定の実施態様では、本発明の該第１の側面による薬剤として使用されるペプチドデンドリマーは、デンドリマーのＺ及び／又はＮ末端のＤがアルキルカルボン酸部分と結合し、具体的には一般式ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯ−によって表されるアルキルカルボン酸部分と結合し、より具体的にはｎは４〜２２の間の数であり、よりいっそう具体的には、ｎは４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４又は１６であることで特徴付けられる。
【００４２】
特定の実施態様では、デンドリマーは（ホモ）ダイマーとして存在する。二量化は、例えば、Ｚ中心部分のシステイン残基を通じた２つのデンドリマーの結合によって達成される。
【００４３】
特定の実施態様では、ペプチドデンドリマーは細菌感染症の予防又は治療において使用される。特定の実施態様では、前記細菌感染症は、緑膿菌、アシネトバクター・バウマニ又は大腸菌、又は黄色ブドウ球菌、具体的にはメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ株）を含むが、これに限定されないグラム陰性又は陽性の細菌によって引き起こされる。
【００４４】
本発明の第２の側面によれば、一般式Ｘ−（Ｂ２−［Ｙ２］ｓ−Ｄ１）２−Ｂ１−Ｚ
（式中、Ｘは
（Ｄ２）４、
（Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、
（Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、
（Ｄ５）３２−（Ｂ５−［Ｙ５］ｐ−Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、又は
（Ｄ６）６４−（Ｂ６−［Ｙ６］ｏ−Ｄ５）３２−（Ｂ５−［Ｙ５］ｐ−Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４であり、
それぞれのＹ（Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５及びＹ６）はその他のＹから独立して、下記の式
【化５】
0006553706.tif 000007
に例示されるチオエーテル部分によって、Ｃ末端に隣接するアミノ酸のＮ末端と結合する、結合部分のジペプチド又はトリペプチドのＨ−Ｃｙｓ又はＣＨ−Ｃｙｓであり、
ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは０又は１でありえ、
Ｚは中心部分であり、
それぞれのＢ（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５及びＢ６）はその他のＢから独立して分岐部分であり、
それぞれのＤ（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６）はその他のＤから独立して、
ｉ．ジペプチドＣＨ、ＨＣ、ＣＣ若しくはＨＨ、又は
ｉｉ．トリペプチドＨＣＨ、ＨＨＣ、ＣＨＨ、ＣＣＨ、ＣＨＣ、ＨＣＣ、ＨＨＨ若しくはＣＣＣ
（式中、Ｈは疎水性側鎖を含む任意のアミノ酸であり、かつ、Ｃ（Ｌ）−２、３−ジアミノ酪酸である。）
である。）
で表されるペプチドデンドリマーが提供される。
【００４５】
いくつかの実施態様では、一般式Ｘ−（Ｂ２−［Ｙ２］ｓ−Ｄ１）２−Ｂ１−Ｚ
（式中、Ｘは
（Ｄ２）４、
（Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、
（Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、
（Ｄ５）３２−（Ｂ５−［Ｙ５］ｐ−Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、又は
（Ｄ６）６４−（Ｂ６−［Ｙ６］ｏ−Ｄ５）３２−（Ｂ５−［Ｙ５］ｐ−Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４であり、かつ、
それぞれのＹ（Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５及びＹ６）はその他のＹから独立して、下記の式
【化６】
0006553706.tif 000008
に例示されるチオエーテル部分によって、Ｃ末端に隣接するＤのアミノ酸のＮ末端と結合する、結合部分のジペプチド又はトリペプチドのＨ−Ｃｙｓ又はＣＨ−Ｃｙｓであり、
ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは０又は１でありえ、
Ｚは中心部分であり、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５及びＢ６はその他のＢからそれぞれ独立して、一般式ＣｎＨ２ｎ−１（ＮＨ）２ＣＯ−で表されるジアミノアルキルカルボン酸部分を表し、ｎは２〜１０の間の数であり、より具体的にはｎは２、３、４又は５であり、
Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６はその他のＤからそれぞれ独立して、
ｉ．ジペプチドＣＨ、ＨＣ、ＣＣ若しくはＨＨ、又は
ｉｉ．トリペプチドＨＣＨ、ＨＨＣ、ＣＨＨ、ＣＣＨ、ＣＨＣ、ＨＣＣ、ＨＨＨ若しくはＣＣＣ
（式中、Ｈは疎水性側鎖を含む任意のアミノ酸であり、かつ、Ｃは（Ｌ）−２、３−ジアミノ酪酸であることを特徴とする。）
である。）
で表される、ペプチドデンドリマーが提供される。
【００４６】
いくつかの実施態様では、一般式Ｘ−（Ｂ２−［Ｙ２］ｓ−Ｄ１）２−Ｂ１−Ｚ
（式中、Ｘは
（Ｄ２）４、
（Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、
（Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、
（Ｄ５）３２−（Ｂ５−［Ｙ５］ｐ−Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、又は
（Ｄ６）６４−（Ｂ６−［Ｙ６］ｏ−Ｄ５）３２−（Ｂ５−［Ｙ５］ｐ−Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４であり、かつ、
それぞれのＹ（Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５及びＹ６）はその他のＹから独立して、下記の式
【化７】
0006553706.tif 000009
に例示されるチオエーテル部分によって、Ｃ末端に隣接するＤのアミノ酸のＮ末端と結合する、結合部分のジペプチド又はトリペプチドのＨ−Ｃｙｓ又はＣＨ−Ｃｙｓであり、
ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは０又は１でありえ、
Ｚは中心部分であり、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５及びＢ６はその他のＢからそれぞれ独立して、一般式ＣｎＨ２ｎ−１（ＮＨ）２ＣＯ−で表されるジアミノアルキルカルボン酸部分を表し、ｎは２〜１０の間の数であり、より具体的にはｎは２、３、４又は５であり、
Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６はその他のＤからそれぞれ独立して、
ｉ．ジペプチドＣＨ、ＨＣ、ＣＣ若しくはＨＨ、又は
ｉｉ．トリペプチドＨＣＨ、ＨＨＣ、ＣＨＨ、ＣＣＨ、ＣＨＣ、ＨＣＣ、ＨＨＨ若しくはＣＣＣ
（式中、Ｈは疎水性側鎖を含む任意のアミノ酸であり、かつ、Ｃは（Ｌ）−２、３−ジアミノ酪酸であり、かつ、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６のうちの少なくとも１つがＣＨ、ＨＣ、ＣＣ、ＨＣＨ、ＨＨＣ、ＣＨＨ、ＣＣＨ、ＣＨＣ、ＨＣＣ又はＣＣＣから選択されることを特徴とする。）
である。）
で表される、ペプチドデンドリマーが提供される。
【００４７】
いくつかの実施態様では、ＺはＬｙｓ−Ｌｅｕ、Ａｒｇ−Ｌｅｕ、Ｄａｂ−Ｔｒｐ、Ｄａｂ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｔｒｐ、Ｌｙｓ−Ｐｈｅ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、ＤａｂＡ−Ａｌａ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ、Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ、Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ｏｒｎ−Ｌｅｕ、Ｏｒｎ−Ｐｈｅ、Ａｒｇ−Ｐｈｅ又はＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓである。
【００４８】
Ｚは中心部分であり、かつ、本発明のデンドリマーを作成するための固相化学的手法では、Ｚは合成の出発点である。多数の異なる短ペプチドが、実験的に用いられ、全面的に高い成功率を収めている。いくつかの実施態様では、ＺはＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ＣＯＮＨ２）である。いくつかの実施態様では、ＺはＬｙｓ−Ｌｅｕ、Ａｒｇ−Ｌｅｕ、Ｄａｂ−Ｌｅｕ又はＤａｂ−Ｔｒｐである。いくつかの実施態様では、ＺはＬｙｓ又はＬｅｕである。
【００４９】
いくつかの実施態様では、Ｈはトリプトファン、ロイシン又はアラニンから選択される。いくつかの実施態様では、Ｃは（Ｌ）−２−３−ジアミノ酪酸である。
【００５０】
いくつかの実施態様では、ＺはトリペプチドＨＣＨ、ＨＨＣ、ＣＨＨ、ＣＣＨ、ＣＨＣ、ＨＣＣ、ＨＨＨ又はＣＣＣであり、Ｈ及びＣは上記の意味を持つ。
【００５１】
いくつかの実施態様では、ＺはＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓである。
【００５２】
いくつかの実施態様では、ＺはトリペプチドＨＣＨ、ＨＨＣ、ＣＨＨ、ＣＣＨ、ＣＨＣ、ＨＣＣ、ＨＨＨ又はＣＣＣであり、Ｈ及びＣは上記の意味を持ち、かつ、ＺはＺのアミノ官能基とアルキルカルボン酸のカルボキシ基との間のアミド結合によって、一般式ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯ−によって表されるアルキルカルボン酸部分と結合する。
【００５３】
いくつかの実施態様では、ｎは４〜２２の間の数であり、具体的には４〜１０の間の数であり、より具体的には４〜８の間の数である。
【００５４】
いくつかの実施態様では、ＺはＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓであり、ＺはＺのアミノ官能基とアルキルカルボン酸のカルボキシ基との間のアミド結合によって、アルキルカルボン酸と結合する。
【００５５】
本発明の第３の側面によれば、一般式Ｘ−（Ｂ２−［Ｙ２］ｓ−Ｄ１）２−Ｂ１−Ｚ
（式中、Ｘは
（Ｄ２）４、
（Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、
（Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、
（Ｄ５）３２−（Ｂ５−［Ｙ５］ｐ−Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、又は
（Ｄ６）６４−（Ｂ６−［Ｙ６］ｏ−Ｄ５）３２−（Ｂ５−［Ｙ５］ｐ−Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４であり、
それぞれのＹ（Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５及びＹ６）はその他のＹから独立して、下記の式
【化８】
0006553706.tif 000010
に例示されるチオエーテル部分によって、Ｃ末端に隣接するアミノ酸のＮ末端と結合する、結合部分のジペプチド又はトリペプチドのＨ−Ｃｙｓ又はＣＨ−Ｃｙｓであり、
ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは０又は１でありえ、
Ｚは中心部分であり、
それぞれのＢ（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５及びＢ６）はその他のＢから独立して分岐部分であり、
それぞれのＤ（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６）はその他のＤから独立して、
ｉ．アミノ酸Ｃ又はＨ
ｉｉ．ジペプチドＣＨ、ＨＣ、ＣＣ若しくはＨＨ、又は
ｉｉｉ．トリペプチドＨＣＨ、ＨＨＣ、ＣＨＨ、ＣＣＨ、ＣＨＣ、ＨＣＣ、ＨＨＨ若しくはＣＣＣ
（式中、Ｈは疎水性側鎖を含む任意のアミノ酸であり、かつ、Ｃはカチオン性側鎖を含む任意のアミノ酸である。）
であり、かつ、Ｚ及び／又はＮ末端のＤが一般式ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯ−によって表されるアルキルカルボン酸部分と結合し、具体的にはｎは４〜２２の間の数であり、より具体的にはｎは６、７、８、９、１０、１１、１２、１４又は１６であることを特徴とする。）
で表される、ペプチドデンドリマーが提供される。。
【００５６】
いくつかの実施態様では、一般式Ｘ−（Ｂ２−［Ｙ２］ｓ−Ｄ１）２−Ｂ１−Ｚ
（式中、Ｘは
（Ｄ２）４、
（Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、
（Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、
（Ｄ５）３２−（Ｂ５−［Ｙ５］ｐ−Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４、又は
（Ｄ６）６４−（Ｂ６−［Ｙ６］ｏ−Ｄ５）３２−（Ｂ５−［Ｙ５］ｐ−Ｄ４）１６−（Ｂ４−［Ｙ４］ｑ−Ｄ３）８−（Ｂ３−［Ｙ３］ｒ−Ｄ２）４であり、かつ、
それぞれのＹ（Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５及びＹ６）はその他のＹから独立して、下記の式
【化９】
0006553706.tif 000011
に例示されるチオエーテル部分によって、Ｃ末端に隣接するアミノ酸のＮ末端と結合する、結合部分のジペプチド又はトリペプチドのＨ−Ｃｙｓ又はＣＨ−Ｃｙｓであり、
ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは０又は１であり、
Ｚは中心部分であり、
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５及びＢ６はその他のＢからそれぞれ独立して、一般式ＣｎＨ２ｎ−１（ＮＨ２）２ＣＯ−で表されるジアミノアルキルカルボン酸部分を表し、ｎは２〜１０の間の数であり、より具体的にはｎは２、３、４又は５であり、
Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６はその他のＤからそれぞれ独立して、
ｉ．アミノ酸Ｃ又はＨ
ｉｉ．ジペプチドＣＨ、ＨＣ、ＣＣ又はＨＨ
ｉｉｉ．トリペプチドＨＣＨ、ＨＨＣ、ＣＨＨ、ＣＣＨ、ＣＨＣ、ＨＣＣ、ＨＨＨ又はＣＣＣ
（式中、Ｈは疎水性側鎖を含む任意のアミノ酸であり、かつ、Ｃはカチオン性側鎖を含む任意のアミノ酸である。）
であり、Ｚ及び／又はＮ末端のＤがアルキルカルボン酸部分と結合することを特徴とする。）
で表される、ペプチドデンドリマーが提供される。。
【００５７】
いくつかの実施態様では、Ｚ及び／又はＮ末端のＤが一般式ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯ−によって表されるアルキルカルボン酸部分と結合し、具体的にはｎは６〜２２の間の数であり、より具体的には、ｎは６、７、８、９、１０、１１、１２、１４又は１６である。
【００５８】
いくつかの実施態様では、ｎは４〜２２の間の数であり、具体的には４〜１０の間の数であり、より具体的には４〜８の間の数である。
【００５９】
いくつかの実施態様では、ＺはＬｙｓ−Ｌｅｕ、Ａｒｇ−Ｌｅｕ、Ｄａｂ−Ｔｒｐ、Ｄａｂ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｔｒｐ、Ｌｙｓ−Ｐｈｅ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、ＤａｂＡ−Ａｌａ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ、Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ、Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ｏｒｎ−Ｌｅｕ、Ｏｒｎ−Ｐｈｅ、Ａｒｇ−Ｐｈｅ又はＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓである。
【００６０】
いくつかの実施態様では、ＺはトリペプチドＨＣＨ、ＨＨＣ、ＣＨＨ、ＣＣＨ、ＣＨＣ、ＨＣＣ、ＨＨＨ又はＣＣＣであり、Ｈ及びＣは上記の意味を持つ。
【００６１】
いくつかの実施態様では、ＺはＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓである。
【００６２】
いくつかの実施態様では、ＺはトリペプチドＨＣＨ、ＨＨＣ、ＣＨＨ、ＣＣＨ、ＣＨＣ、ＨＣＣ、ＨＨＨ又はＣＣＣであり、Ｈ及びＣは上記の意味を持ち、かつ、ＺはＺのアミノ官能基とアルキルカルボン酸のカルボキシ基との間のアミド結合によって、一般式ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯ−によって表されるアルキルカルボン酸部分と結合する。
【００６３】
いくつかの実施態様では、ｎは４〜２２の間の数であり、具体的には４〜１０の間の数であり、より具体的には４〜８の間の数である。
【００６４】
いくつかの実施態様では、ＺはＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓであり、ＺはＺのアミノ官能基とアルキルカルボン酸のカルボキシ基との間のアミド結合によって、アルキルカルボン酸と結合する。
【００６５】
Ｚは中心部分であり、かつ、本発明のデンドリマーを作成するための固相化学的手法では、Ｚは合成の出発点である。多数の異なる短ペプチドが、実験的に用いられ、全面的に高い成功率を収めている。いくつかの実施態様では、ＺはＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ＣＯＮＨ２）である。
【００６６】
いくつかの実施態様では、Ｈはロイシン、フェニルアラニン、アラニン、チロシン又はトリプトファンから選択される。いくつかの実施態様では、Ｃはリジン、アルギニン又は（Ｌ）−２−３−ジアミノ酪酸から選択される。
【００６７】
いくつかの実施態様では、ペプチドデンドリマーは式ｇ及びｈを除く表１に示す式によって特徴付けられる。
【００６８】
本明細書中に開示される、本発明の任意の側面の特定の実施態様では、デンドリマーは全体が、又は部分的に上記で特定されるアミノ酸のＤ体のエナンチオマーからなる。
【００６９】
例えば、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５又はＤ６、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５又はＢ６、又はＺ又はＨ、又はＣのような、単一の分離可能な特徴の代替案が明細書で「実施態様」と説明されるいずれの場所も、そのような代替が自由に結びついて、本明細書中に開示される本発明の個別の実施態様を形成する可能性があることは当然である。
【００７０】
いくつかの実施態様では、ペプチドデンドリマーは表１ｂの式によって特徴付けられる：
【表１ｂ】
0006553706.tif 000012
【００７１】
いくつかの実施態様では、ペプチドデンドリマーは下記の式：
ａ．（ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｂ．（ＫＬ）４−（Ｂ−ＫＬ）２−Ｂ−ＫＬ
ｃ．（ＲＬ）４−（Ｂ−ＲＬ）２−Ｂ−ＲＬ
ｄ．（ＫＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２Ｋ−ＫＬ
ｅ．（ＤａｂＷ）４−（Ｋ−ＤａｂＷ）２−Ｋ−ＤａｂＷ
ｆ．（ＤａｂＬ）４−（Ｋ−ＤａｂＬ）２−Ｋ−ＤａｂＬ
ｇ．（ＬＫ）８−（Ｋ−ＬＫ）４−（Ｋ−ＬＫ）２−Ｋ−ＬＫ
ｈ．（ＫＹ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｉ．（ＬＡ）８−（Ｋ−ＬＫ）４−（Ｋ−ＬＡ）２−Ｋ−ＫＬ
ｊ．（ＫＷ）８−（Ｋ−ＫＷ）４−（Ｋ−ＫＷ）２−Ｋ−ＫＷ
ｋ．（ＫＦ）８−（Ｋ−ＫＦ）４−（Ｋ−ＫＦ）２−Ｋ−ＫＦ
ｌ．（ＫＬ）８−（Ｂ−ＫＬ）４−（Ｂ−ＫＬ）２−Ｂ−ＫＬ
ｍ．（ＲＬ）８−（Ｂ−ＲＬ）４−（Ｂ−ＲＬ）２−Ｂ−ＲＬ
ｎ．（ＬＬ）８−（Ｋ−ＫＫ）４−（Ｋ−ＬＬ）２−Ｋ−ＫＫ
ｏ．（ＤａｂＬ）８−（Ｋ−ＤａｂＬ）４−（Ｋ−ＤａｂＬ）２−Ｋ−ＤａｂＬ
ｐ．（ＤａｂＬ）８−（Ｋ−ＤａｂＷ）４−（Ｋ−ＤａｂＬ）２−Ｋ−ＤａｂＷ
ｑ．（ＤａｂＬ）８−（Ｋ−ＤａｂＬ）４−（Ｋ−ＤａｂＷ）２−Ｋ−ＤａｂＷ
ｒ．（ＤａｂＬ）８−（Ｋ−ＤａｂＷ）４−（Ｋ−ＤａｂＷ）２−Ｋ−ＤａｂＬ
ｓ．（ＤａｂＬ）８−（Ｋ−ＤａｂＷ）４−（Ｋ−ＤａｂＷ）２−Ｋ−ＤａｂＡ
ｔ．（ＤａｂＬ）８−（Ｋ−ＤａｂＷ）４−（Ｋ−ＤａｂＡ）２−Ｋ−ＤａｂＷ
ｕ．（ＤａｂＬ）８−（Ｋ−ＤａｂＡ）４−（Ｋ−ＤａｂＷ）２−Ｋ−ＤａｂＷ
ｖ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬＣＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｗ．（ＫＬ）１６−（Ｋ−ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬＣＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｘ．（ＫＬ）１６−（Ｋ−ＫＬＣＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｙ．（ＲＬ）８−（Ｋ−ＲＬＣＲＬ）４−（Ｋ−ＲＬ）２−Ｋ−ＲＬ
ｚ．（ＫＫＬ）４−（Ｋ−ＫＫＬ）２−Ｋ−ＫＫＬ
ａａ．（ＫＬＬ）４−（Ｋ−ＫＬＬ）２−Ｋ−ＫＬＬ
ｂｂ．（ＬＫＬ）４−（Ｋ−ＬＫＬ）２−Ｋ−ＬＫＬ
ｃｃ．（ＫＬＬ）８−（Ｋ−ＫＬＬ）４−（Ｋ−ＫＬＬ）２−Ｋ−ＫＬＬ
ｄｄ．（ＬＫＬ）８−（Ｋ−ＬＫＬ）４−（Ｋ−ＬＫＬ）２−Ｋ−ＬＫＬ
ｅｅ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＬＫＬ）２−Ｋ−ＫＫＬ
ｆｆ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＬＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＬ
ｇｇ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＬＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ
ｈｈ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＬＫＬ）２−Ｋ−ＬＫＬ
ｉｉ．（ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）４ＣＨ３
ｊｊ．（ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）６ＣＨ３
ｋｋ．（ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）８ＣＨ３
ｌｌ．（ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）１０ＣＨ３
ｍｍ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）４ＣＨ３
ｎｎ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）６ＣＨ３
ｏｏ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）８ＣＨ３
ｐｐ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）１０ＣＨ３
ｑｑ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）１４ＣＨ３
ｒｒ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）１６ＣＨ３
ｓｓ．（ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）２２ＣＨ３
ｔｔ．（ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）１６ＣＨ３
ｕｕ．（ＣＨ３（ＣＨ２）４ＣＯ−ＫＬ）８−（Ｋ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｖｖ．（ＣＨ３（ＣＨ２）４ＣＯ−ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｗｗ．（ＫＫ）８−（Ｋ−ＫＫ）４−（Ｋ−ＬＬ）２−Ｋ−ＬＬ
ｘｘ．（ＫＫ）８−（Ｋ−ＬＬ）４−（Ｋ−ＫＫ）２−Ｋ−ＬＬ
ｙｙ．（ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）１４ＣＨ３
ｚｚ．（ＫＬ）４−（Ｋ−ＫＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）２２ＣＨ３
ａａａ．（ＯｒｎＬ）４−（Ｋ−ＤａｂＦ）２−Ｋ−ＫＬ
ｂｂｂ．（ＯｒｎＦ）４−（Ｋ−ＤａｂＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｃｃｃ．（ＲＦ）４−（Ｋ−ＤａｂＬ）２−Ｋ−ＫＬ
ｄｄｄ．（ＯｒｎＦ）４−（Ｋ−ＤａｂＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）８ＣＨ３
ｅｅｅ．（ＯｒｎＬ）４−（Ｋ−ＤａｂＦ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）８ＣＨ３
ｆｆｆ．（ＲＦ）４−（Ｋ−ＤａｂＬ）２−Ｋ−ＫＬＫ−（ＣＯ（ＣＨ２）８ＣＨ３
によって特徴付けられる。
【００７２】
本発明は、さらなる実施態様及び利点が引き出されうる、以下の実施例及び図面によってさらに説明される。これらの実施例は本発明を説明することを意図するが、その範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００７３】
異なる世代、分岐部分及び電荷疎水比を含む様々な化合物の第１ライブラリーは構造活性相関（ＳＡＲ）に関する識見を得るために合成された。ペプチドのＣ末端から第２位置の荷電したアミノ酸を含むことによる、各世代に荷電し、かつ疎水性のアミノ酸を有することで高い活性のために効果があることが分かった。
【００７４】
疎水性側鎖を含むＡＭＰＤのライブラリーが合成され、かつ、試験された。鎖の長さがＣ６〜Ｃ２４のカルボン酸は、分岐部分間のＫＬモチーフ（ｍｏｔｉｖｅ）を含む第２又は第３世代ＡＭＰＤのコアに導入されたリジンに結合する（図４）。疎水性側鎖を含む第２又は第３世代のＡＭＰＤ（ＭＳｔ−２６０〜ＭＳｔ−２６７）は、一般的な抗生物質に対する耐性を持つ臨床分離株を含む緑膿菌に対して試験された、最も強力な構造であると考えられた。第３世代のＡＭＰＤへの疎水性側鎖の付加は結果として溶血作用の増加をもたらすが、ＡＭＰＤは溶血発生前の低濃度中で格段に活性が強い。
【００７５】
１次又は２次構造のペプチドデンドリマーの活性に関する試験は活性又は不活性の化合物の２次構造は類似であり、かつかなりランダムコイルであることを示した。しかし、活性化合物は疎水性環境と接触するときは広がる傾向にある。中性の脂質小胞ではなく、負に帯電した脂質小胞からの５（６）−カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）の漏出は活性変化の役割を示す。疎水性側鎖を有する、及び有しないＡＭＰＤの反応速度論は、脂質がペプチドデンドリマーに結合する場合のより早い殺菌を示した。
【００７６】
材料及び試薬
全ての試薬、塩及びバッファーはＡｌｄｒｉｃｈ、Ｆｌｕｋａ、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、ＴＣＩ  Ｅｕｒｏｐｅ又はＤｒ．Ｇｒｏｇｇ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＡＧのいずれかから購入した。ＰｙＢＯＰ、アミノ酸及びそれらの誘導体はＡｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ（アメリカ合衆国）、ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ（スイス国）、ＩＲＩＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ドイツ国）、ＰｏｌｙＰｅｐｔｉｄｅ（フランス国）、ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（上海）から購入した。アミノ酸は以下の誘導体として使用された：Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｄａｐ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｂ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、４−Ｆｍｏｃ−アミノメチル安息香酸（ＡＭＢＡ）、Ｆｍｏｃ−γ−Ａｂｕ−ＯＨ（ＧＡＢＡ）。ＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｓ  ＮＨ２（荷重：０．３２ｍｍｏｌ／ｇ）及びＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｓ  ＲＡＭ（荷重：０．２２〜０．２６ｍｍｏｌ・ｇ−１）レジンはＲａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ（ドイツ国）から購入した。５（６）−カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）はＳｉｇｍａから購入した。ベシクル調製に利用される卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、卵ホスファチジルグリセロール（ＥＰＧ）及びＭｉｎｉ−ＥｘｔｒｕｄｅｒはＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから購入した。ペプチドデンドリマーの合成は、ポリエチレンのフリット、テフロン（登録商標）の栓及びストッパーが取り付けられたポリプロピレンシリンジ内で、手動で行われた。分析ＲＰ−ＵＨＰＬＣは、Ｄｉｏｎｅｘ  Ａｃｃｌａｉｍ  ＲＳＬＣ  １２０  Ｃ１８カラム（２．２μｍ、１２０Å、３．０×５０ｍｍ、流速１．２ｍｌ・ｍｉｎ−１）を用いたＤｉｏｎｅｘ  ＵＬＴＩＭＡＴＥ  ３０００  Ｒａｐｉｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＵＬＴＩＭＡＴＥ−３０００ＲＳ  ｄｉｏｄｅ  ａｒｒａｙ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ）で実行した。化合物は２１４ｎｍの紫外線吸収により検出した。データの記録及び処理はＤｉｏｎｅｘ  Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．８０（分析ＲＰ−ＨＰＬＣ）で行った。予備のＲＰ−ＨＰＬＣはＤｒ．Ｍａｉｓｃｈ  Ｇｍｂｈ  Ｒｅｐｒｏｓｐｈｅｒカラム（Ｃ１８−ＤＥ、１００×３０ｍｍ、５μｍ、孔経１００Å、流速４０ｍＬ・ｍｉｎ−１）を用いたＷａｔｅｒｓ  Ｐｒｅｐ  ＬＣ２４８９クロマトグラフィーシステムで実行した。化合物は２１４ｎｍの紫外線吸収により検出した。ＲＰ−ＨＰＬＣはＨＰＬＣ級のアセトニトリル及びｍＱ脱イオン水を用いて実行した。溶出溶液は：Ａ  ０．１％ＴＦＡを含む水；Ｂ  水／アセトニトリル（５０：５０）；Ｃ  ０．１％ＴＦＡを含む水／アセトニトリル（１０：９０）；Ｄ  ０．１％ＴＦＡを含む水／アセトニトリル（４０：６０）とした。ＭＳスペクトル、アミノ酸分析及びＤＯＳＹ−ＮＭＲ測定は、ベルン大学の化学科及び生化学科の質量分析、タンパク質分析及びＮＭＲの設備によってそれぞれ提供された。収率は、他に記載がない限り、定量的なアミノ酸分析（ＡＡＡ）で決定した。蛍光測定は、攪拌機及び温度制御器（他に記載がない限り２５℃での測定）を備えた蛍光分光光度計（Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ、Ｖａｒｉａｎ）で実行された。
【００７７】
デンドリマーの合成
修飾のないペプチドデンドリマー
レジン（ＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｓ  ＲＡＭ）は８ｍＬのジクロロメタンで膨潤させ、そしてＤＭＦ中の２０％ピペリジン溶液（２×１０分）でレジンのＦｍｏｃ保護基を除去した。さらなる結合として、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウム）（３当量／Ｇ、Ｇ＝世代）及び約８ｍＬのＮＭＰ中のＤＩＰＥＡ（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）（５当量／Ｇ）の存在下で、レジンを保護されたアミノ酸（３当量／Ｇ）の１つでアシル化した。アミノ酸、誘導体又はジアミノ酸は１時間（Ｇ０）、２時間（Ｇ１）、３時間（Ｇ２）、４時間（Ｇ３）で結合した。反応の終了は２、４、６−トリニトロベンゼンスルホン酸溶液（ＴＮＢＳ）又は（プロリン用の）クロラニルテストを用いて確認した。ビーズが赤の場合（プロリンは茶色）、いくつかの遊離アミノ基があり、かつレジンテストは陽性であった。それらが無色の場合、遊離アミノ基がなく、かつレジンテストは陰性であった。結合は陽性のテスト後に繰り返された。未反応のペプチド鎖のキャッピングは無水酢酸及びジクロロメタン（１：１ｖ／ｖ）で１５分間行われた。各結合後、各シリンジ内のレジンは脱保護され（ＤＭＦ中の２０％ピペリジン、２×１０分）、続いてＴＮＢＳ又はクロラニルテストが行われ（テストは陽性でなければならない）、そして次に保護されたアミノ酸が添加された。合成の終わりに、末端のアミノ基は無水酢酸／ジクロロメタン（１：１）で２０分間アセチル化するか、又はアセチル化しないかのいずれかであった。レジンはメタノールで２回洗浄し、真空下で乾燥後、ＴＦＡ／ＴＩＳ／水（９４：５：１  ｖ／ｖ／ｖ）を用いて４．５時間開裂を行った。システイン又はメチオニンを含むペプチドにおいては、開裂条件はＴＦＡ／ＴＩＳ／水／ＥＤＴ（９４／１／２．５／２．５  ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）である。濾過後、ペプチドを５０ｍＬの氷冷したｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）を用いて沈殿させ、４４００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、そしてＴＢＭＥで２回洗浄した。粗製ペプチドの精製のために、粗製ペプチドをＡ（１００％ｍＱ水、０．１％ＴＦＡ）に溶解し、予備ＲＰ−ＨＰＬＣに供し、そして凍結乾燥後にＴＦＡ塩として得た。記載のない限り、分析ＨＰＬＣに用いられた勾配は２．２分でＡ／Ｄ＝１００／０〜０／１００、１．２ｍＬ・ｍｉｎ−１である。
【００７８】
リジン側鎖に結合したカルボン酸を含むペプチドデンドリマー
合成は「修飾のないペプチドデンドリマー」に従って行った。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨが最初にレジンに結合した。最後のＦｍｏｃ基の脱保護の前にアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）保護基を、５ｍＬの無水ＤＣＭ及び２５当量のフェニルシラン（ＰｈＳｉＨ３）に溶解した０．２５当量のテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（Ｐｄ（ＰＰｈ３）４を触媒として、乾燥条件下で除去した。該工程は２回繰り返し、間に無水ＤＣＭで２回レジンを洗浄した。第２サイクル後、レジンをＤＣＭで１時間洗浄し、そしてＴＮＢＳテストで遊離アミン基の検査を行うことによって脱保護を確認した。テストが赤であった場合、最初にＨＯＢｔ（５当量）、ＤＩＣ（５当量）及びＮＭＰ／ＤＣＭ（１／１  ｖ／ｖ）中のＤＩＰＥＡ（３当量）を添加したカルボン酸（５当量）をレジンに溶解させ、そして３〜４時間撹拌した。ＮＭＰ、メタノール、ＤＣＭで３回洗浄後、ＨＡＴＵ（５当量）及びＤＭＦ／ＤＣＭ（１／１  ｖ／ｖ）中のＤＩＰＥＡ（３当量）を溶解させたカルボン酸（５当量）を用いて結合を一晩繰り返した。最後のＦｍｏｃ基の脱保護はＮＭＰ、メタノール、ＤＣＭで３回洗浄後に行い、そしてＴＮＢＳテスト（無色）による遊離アミン基の検査の後に行い、続いて「修飾のないペプチドデンドリマー」に記載した開裂及び精製を行った。
【００７９】
チオエーテル連結戦略を用いたペプチドデンドリマー合成
チオエーテル連結
コア及び鎖部分のペプチドは上記の手順に従って合成した。固相からのコアペプチドの開裂及び精製の前に、Ｎ末端を５ｍＬのＤＣＭ中のクロロ酢酸無水物溶液（Ｎ末端ごとに１０．０当量）で２回、１５分間クロロアセチル化した。レジンはＮＭＰ、メタノール及びＤＣＭで（それぞれ３回）洗浄した。
【００８０】
典型的な実験では、コアペプチド（クロロアセチル基を含む配列、１．０当量）、及びＤＭＦ／水（１／１、ｖ／ｖ）中のＫＩ（２０．０当量）の溶液（３００μＬ）を５ｍＬ線のガラスフラスコに調製した。混合物は１０分間アルゴンで脱ガスした。第２の５ｍＬ線ガラスフラスコに鎖ペプチド（システイン含有配列、コア配列中のクロロアセチル基ごとに１．５当量）を（溶媒なしに）調製し、そしてフラスコをアルゴン／真空で３回脱ガスした。コアペプチド溶液を気密性シリンジで鎖ペプチドを含むガラスフラスコに移した。ＤＩＰＥＡ（５５．０当量）を添加し、そして溶液を室温で撹拌した。反応物を続いて分析ＲＰ−ＨＰＬＣに供した（気密性１０μＬガラスシリンジで採取した１．０μＬ反応混合物＋１００μＬの溶媒Ａ）。終了後（通常は一晩）、反応物は５ｍＬの溶媒Ａを加えてクエンチし、濾過しそして予備ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。収率はアミノ酸分析で補正した。
【００８１】
上記の一般的な手順を用いて、出発物質ＣＣＳ−２：（ＣｌＡｃＫＬ）４（ＫＫＬ）２ＫＫＬＮＨ２及びＣＣＳ−５：（ＫＬ）２ＫＫＬＣＮＨ２からＣＣＳ−２０：（ＫＬ）８（ＫＫＬＣｘＫＬ）４（ＫＫＬ）２ＫＫＬＮＨ２が予備ＲＰ−ＨＰＬＣ精製後に白色の泡状固体として得た（１１．２ｍｇ、１．８２μｍｏｌ、７３％）。分析ＲＰ−ＨＰＬＣ：ｔＲ＝１．５１分（２．２分でＡ／Ｄ＝１００／０〜０／１００、λ＝２１４ｎｍ）。ＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ２９０Ｈ５５６Ｎ８０Ｏ５３Ｓ４  ｃａｌｃ．／ｆｏｕｎｄ．６１４０．２８／６１４０．３  ［Ｍ］＋、６２４０．４６／６２３９  ［Ｍ＋２Ｋ＋Ｎａ］＋。「ｘ」はＣ末端に隣接するアミノ酸のＮ末端とアミド結合によって結合する酢酸部分を含むシステイン側鎖のチオエーテル結合を示す。
【００８２】
アミノ酸分析
サンプルを、０．１％フェノール（ｖ／ｖ）含有６Ｍ塩酸を用いて、窒素真空下で、１１５℃で２２時間加水分解した（チャン、Ｊ．−Ｙ．及びクネヒト、Ｒ．、１９９２、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９７、５２−５８）。遊離したアミノ酸はフェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）と結合し、そして結果として生じるフェニルチオカルバミル（ＰＴＣ）アミノ酸は自動注入装置（Ｂｉｄｌｉｎｇｍｅｙｅｒ、Ｂ．Ａ．ら、１９８４、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ、３３６、９３−１０４）と共にＤｉｏｎｅｘ  Ｓｕｍｍｉｔ  ＨＰＬＣ装置を用いて、Ｎｏｖａ  Ｐａｃｋ  Ｃ１８カラム（４μｍ、３．９ｍｍ×１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）によってＲＰ−ＨＰＬＣによって分析された。対応する酢酸アンモニウムバッファーがｐＨ６．３、０．１４Ｍの酢酸ナトリウムバッファーと置き換わった。チオエーテルの橋にシステインが含まれた場合、カルボメチルシステイン（ＣＭＣｙｓ）として検出した。そうでない場合はシステインは加水分解中に崩壊した。加水分解が原因でトリプトファンは該方法では検出し得ず、かつアスパラギン／グルタミンはアスパラギン酸／グルタミン酸とそれぞれ同じ保持時間であった。フェニルアラニン及びＤａｐ溶出は同様に同じ保持時間であった。本分析ではセリンの検出量は通常、理論上の期待量より著しく低い。全ての収率、ＭＩＣ（最小発育阻止濃度）ＭＢＣ（最小殺菌濃度）及びＭＨＣ（最小溶血濃度）は該方法から結果として生じたペプチド含有量に従って補正した。
【００８３】
生物学的アッセイ
抗微生物ペプチドＩの微量液体希釈法
抗微生物活性は枯草菌（ＢＲ１５１株）、大腸菌（ＤＨ５α株）、及び緑膿菌（ＰＡＯ１株）に対して評価した。微量液体希釈法は最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定するために用いた。細菌のコロニーはＬＢ培地中で、３７℃で一晩培養した。濃度は６００ｎｍでの吸光度を測定することで定量化し、そしてＯＤ６００＝０．１（１×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）まで希釈した。サンプルは１ｍｇ・ｍＬ−１水溶液を原液として調製し、そして９６ウェルのマイクロプレート（Ｃｏｒｎｓｔａｒ、ポリプロピレン、未処理）中の栄養素ＬＢ培地中で２／３ずつ連続的に希釈した。サンプル溶液（５０μＬ）はＯＤ６００ｎｍが０．００１の希釈細菌懸濁液（５０μＬ）と混合した。これにより５×１０５ＣＦＵ／ｍＬの最終希望植菌が生じた。プレートを３７℃で十分な増殖まで（１８−２４時間）培養した。各テストに対し、プレートの２つのカラムが無菌のコントロール（ＳＣ、培養液のみ）及び増殖コントロール（ＧＣ、培養液及び細菌種菌、抗体なし）として保持した。ＭＴＴの０．１％水溶液を１０μＬずつ各ウェルに加えた。最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は肉眼で試験細菌（黄色）の目に見える増殖を阻害した抗菌物質（ペプチドデンドリマー）の最低濃度として定義した。微生物学的な研究のために、直鎖ペプチドＬｙｓＴｙｒＬｙｓＬｙｓＡｌａＬｅｕＬｙｓＬｙｓＬｅｕＡｌａＬｙｓＬｅｕＬｅｕ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）をリファレンスとして用いた。
【００８４】
抗微生物ペプチドＩＩの微量液体希釈法
抗微生物活性は緑膿菌（ＰＡＯ１株）、緑膿菌ＰＴ１４８２（Ａ−）、ＰＴ１４８５（Ａ−Ｂ−）、ＰＴ１１４９（Ａ−Ｂ−Ｃ−ａｌｇＣ）、ＰＴ３３１（Ｚ６１）（ＬＰＳ変異株）、緑膿菌ＰＥＪ２．６、ＰＥＪ９．１、ＺＥＭ１．Ａ、ＺＥＭ９．Ａ（ジュネーヴ大学／大学医療センターからの臨床分離株）、バークホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ），黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ株）及びアシネトバクター・バウマニ（ジュネーヴ大学／大学医療センターからの臨床分離株）に対して評価した。最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定するために、微量液体希釈法を用いた。細菌のコロニーをＭＨ培地で３７℃、一晩培養した。サンプルは８ｍｇ・ｍＬ−１水溶液の原液として調製し、開始濃度を３００μＬのＭＨ培地中で３２、６４、１２８又は２５６μｇ／ｍＬまで希釈し、９６ウェルのマイクロプレート（トリフェニルホスフェート（ＴＰＰ）、未処理）の第１ウェルに添加し、そして１／２ずつ連続的に希釈した。細菌の濃度は６００ｎｍでの吸光度を測定することで定量化し、そしてＭＨ培地中でＯＤ６００＝０．０２２まで希釈した。サンプル溶液（１５０μＬ）をおよそ５×１０５ＣＦＵの最終植菌の４μＬ希釈バクテリア懸濁液と混合した。プレートを３７℃で十分な増殖まで（〜１８時間）培養した。各テストに対し、プレートの２つのカラムが無菌のコントロール（ＳＣ、培養液のみ）及び増殖コントロール（ＧＣ、培養液及び細菌種菌、抗生物質なし）として保持した。最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は肉眼で試験細菌の目に見える増殖を阻害した抗菌物質（ペプチドデンドリマー）の最低濃度として定義した。微生物学的な研究のために、ポリミキシンをリファレンスとして用いた。
【００８５】
溶血アッセイ
最小溶血濃度（ＭＨＣ）を決定するために、ペプチドデンドリマー水溶液を８ｍｇ／ｍＬ原液として調製し、そして５０μＬを９６ウェルのプレート（Ｃｏｒｎｓｔａｒ又はＮｕｎｃ、ポリスチレン、未処理）中で、５０μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１／２ずつ連続的に希釈した。ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）を、信頼できる被験者からの全血１．５ｍＬを３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することで得た。血漿を捨て、そしてペレットを１５ｍＬのファルコンチューブ内で、最大５ｍＬのＰＢＳで再懸濁した。洗浄を三回繰り返し、そして残余のペレットを１０ｍＬのＰＢＳで、最終ｈＲＢＣ濃度が５％となるように再懸濁した。ｈＲＢＣ懸濁液（５０μＬ）を各ウェルに加え、そしてプレートを室温で４時間培養した。最小溶血濃度（ＭＨＣ）のエンドポイントは溶媒期間後にウェルの目視検査によって決定した。各プレートのコントロールにはブランクの培地のコントロール（５０μｌＰＢＳ＋５０μｌｈＲＢＣ懸濁液）及び溶血活性コントロール（ｍＱ脱イオン水５０μＬ＋５０μＬｈＲＢＣ懸濁液）を含んだ。
【００８６】
予備の耐性発現アッセイ
枯草菌ＢＲ１５１への化合物のＭＩＣは、化合物濃度がＭＩＣの値の半分であるウェル（１／２ＭＩＣウェル）からの細胞を用いて１５日間毎日決定した。各化合物において、従前のアッセイプレートからの１／２ＭＩＣウェルからの細菌はＬＢ培養液で再懸濁され、３７℃で２〜４時間培養し、そしてＯＤ６００を決定した。再懸濁液をその後ＬＢ培養液で５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌまで希釈し（ＯＤ６００＝０．１であり、その後１：１００倍に希釈してＯＤ６００＝０．００１となる）、そして以前これらの細胞を曝したものと同一の化合物のＭＩＣを再度決定するために用いた。全てのＭＩＣの決定はデュプリケートで行った。
【００８７】
生体内研究
動物：生後４〜６週間のオスのウィスター系ラット（体重範囲２００〜５００ｇ）を毒性実験に用いた。ラットはベルンティアスタール本部（ベルン大学臨床研究部）から得て、そしてケージ毎に４匹収容した。各実験グループは２匹のラットを含む。動物の全ての処置、世話及び取扱いはスイス国、ベルン州の獣医療サービスによって再検討及び承認され、そしてベルン大学の臨床研究部の、ユーグ・アブリエル教授のグループの協力のもと行った。
【００８８】
処置：ラットは誘導室内で４％イソフルラン及び１Ｌ／ｍｉｎ酸素で麻痺させた。ラットが眠っているときにラットを臨床用のドレープの上に移し、そしてマスクによって１〜２％イソフルラン及び０．８ｌ／ｍｉｎの酸素で麻痺させた。尾を温水で温め、そして７０％エタノールで消毒した。尾静脈への静脈（ｉ．ｖ．）注射は５００μＬＰＢＳ中の２ｍｇ／ｋｇラットのＡＭＰＤの単回投与を含んだ。注射前に各ラットを個別に体重を測り、そして正確な投与量を決定した。注射無し及び５００μＬＰＢＳの静脈注射のコントロールのグループを含む全てのラットについて、２日間の生存及び挙動を観察した。
【００８９】
ＷＳＴ−８細胞生存性アッセイ
細胞生存性は緑膿菌（ＰＡＯ１株）に対して試験した。細菌のコロニーをＬＢ培地で３７℃、一晩培養した。濃度は６００ｎｍでの吸光度を測定することで定量化し、そしてＯＤ６００＝０．１（１×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）まで希釈した。サンプルは１ｍｇ・ｍＬ−１水溶液を原液として調製し、そして９６ウェルのマイクロプレート（ＴＰＰ、未処理）中で、５０μｇ／ｍＬの濃度までＬＢで希釈した。サンプル溶液（５０μＬ）はＯＤ６００ｎｍが０．００１の希釈細菌懸濁液（５０μＬ）と混合した。これにより５×１０５ＣＦＵ／ｍＬの最終希望植菌が生じた。プレートを３７℃で１、３、６、８及び２４時間培養した。各時点で別個のプレートを分析した。各テストに対し、プレートの２つのカラムを無菌のコントロール（ＳＣ、培養液のみ）及び増殖コントロール（ＧＣ、培養液及び細菌種菌、抗体なし）として保持した。培養後、１５μＬのＷＳＴ−８希釈標準溶液（３．３１ｍｇ／ｍＬのＷＳＴ−８（Ｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、０．０７４ｍｇ／ｍＬのＰＥＳ（フェナジンエトスルファート））を各ウェルに加え、そして細胞を３７℃でＧＣが希望値になるまで培養した。反応が起こった後、最終吸光度は４５０ｎｍを示した。計算において、ＧＣの値は細胞生存率１００％に設定し、かつネガティブコントロール（細菌なし、ＳＣ）の値は細胞生存率０％に設定した。これらの２つの値を用いて較正曲線を作成した。
【００９０】
ヒト血清によるペプチド及びペプチドデンドリマーのタンパク質分解安定性
ペプチド及びペプチドデンドリマーを２００μＭのＰＢＳ溶液を原液として調製した。２５％ヒト血清（ＤＭＥＭ希釈）を１４０００ｒｐｍで１５分遠心分離して脂質を除去し、そして上澄みを回収して、３７℃で１５分間培養した。タンパク質分解は５０μＬの試験ペプチド又はペプチドデンドリマーの５０μＬの血清への添加及び３７℃での振とうによって開始した。最終ペプチド濃度は１００μＭである。反応混合物は０、１、６、２４時間後に氷冷した１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を添加して血清タンパクを沈殿させることで分析した。１４０００ｒｐｍで１５分遠心分離後に、上澄みをサンプルごとに回収し、そしてＳｐｅｅｄＶａｃで蒸発させた。個体を１００μＬのｍＱ水に溶解後、それらをＲＰ−ＨＰＬＣで分析した（流速：１．２ｍＬ／ｍｉｎ、勾配：７．５分でＡ／Ｄ＝１００／０〜０／１００）。残余のペプチド及びペプチドデンドリマーの転換は、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェアを用いることによる、２１４ｎｍでの吸光度の積分によって算出した。
【００９１】
細菌存在下のペプチドの検出
ペプチド及びペプチドデンドリマーは２００μＭ水溶液の原液として調製した。細菌のコロニーはＬＢ培地中で、３７℃で一晩培養した。濃度は６００ｎｍでの吸光度を測定することで定量化し、そしてＯＤ６００＝０．２まで希釈した。分解は５０μＬの試験ペプチド又はペプチドデンドリマーの５０μＬの細菌懸濁液への添加及び３７℃での振とうによって開始した。最終ペプチド濃度は１００μＭであり、かつ細菌の最終濃度ＯＤ６００＝０．１（１×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）であった。反応化合物は０、１、６、９、２４時間後に９５℃で５分間加熱し、続いて１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後に分析した。５０μＬの上澄みをサンプルごとに回収し、そして５０μＬのＡを加えて濃度を５０μＭとした。５μＬの４−ヒドロキシ安息香酸（標準）を添加した後、ＲＰ−ＨＰＬＣで分析した（流速：１．２ｍＬ／ｍｉｎ、勾配：７．５分でＡ／Ｄ＝１００／０〜０／１００）。残余のペプチド及びペプチドデンドリマーの転換は、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェアを用いることによる、２１４ｎｍでの吸光度の積分によって算出した。
【００９２】
脂質小胞実験
調製
２５ｍｇＥｇｇＰＣ又はＥｇｇＰＧの１ｍＬメタノール／トリクロロメタン溶液１／１を、ロータリーエバポレーター（ｒｔ）及びその後の一晩真空下で、溶液を蒸発させることで脂質薄膜を調製した。結果物である膜を１ｍＬのバッファー（５０ｍＭ  ＣＦ、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で３０分水和し、凍結融解サイクル（７回）及びポリカーボネート膜（孔経１００ｎｍ）を通した押出（１５回）に供した。小胞外の成分を１０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１０７ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４によるゲル濾過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０）によって除去した。最終条件：〜２．５ｍＭ  Ｅｇｇ  ＰＣ又はＥｇｇ  ＰＧ；内部：５０ｍＭ  ＣＦ、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ,、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４；外部：１０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１０７ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４。
【００９３】
実験
Ｅｇｇ  ＰＣ又はＥｇｇ  ＰＧの原液（３７．５μＬ）をバッファー（１０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１０７ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で希釈し、恒温蛍光キュベット（２５℃）内に入れ、そして緩やかに撹拌した（キュベット内の全容積〜３０００μＬ；最終脂質濃度〜３１．２５μＭ）。ＣＦ流出は、λｅｍ５１７ｎｍ（λｅｘ４９２ｎｍ）で、ｔ＝５０秒での最終濃度が１、５、７．５、１０、１５、２０、２５、３０μｇ／ｍＬとなる２０μＬのペプチドデンドリマーのバッファー（１０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１０７ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）溶液の添加、及びｔ＝３００秒でのｔｒｉｔｏｎＸ−１００（３０μＬ、０．０１２％最終濃度）の添加後の時間関数として測定した。蛍光強度はＩ（ｔ）＝（Ｉｔ−Ｉ０）／（Ｉ∞−Ｉ０）（式中、Ｉ０＝Ｉｔでペプチドデンドリマーを添加し、Ｉ∞＝Ｉｔで溶菌が飽和する）を用いて、部分発光強度Ｉ（ｔ）に正規化された。
【００９４】
結果論及び考察
分岐部分間に１つ、２つ又は３つのアミノ酸を含む抗微生物ペプチドデンドリマー（ＡＭＰＤ）の設計及び合成
抗微生物作用を有するデンドリマーを特定するために、直鎖抗微生物ペプチドの一般的な特徴を樹状骨格内に組み込んだ（図１）。リシン及びアルギニンのようなカチオン性アミノ酸はペプチドデンドリマーに変化を起こすために選択し、かつ、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン及びアラニンは両親媒性を持たせるための疎水性対応物として選択した。
【００９５】
７８個のペプチドデンドリマーのライブラリー（５３個の標準、１８個のアルキル鎖を含むもの、７個のＧ４及びＧ５、さらに２個の直鎖ペプチド、６個の二量体）を標準のＦｍｏｃ−ＳＰＰＳ（メリーフィールド、Ｒ．ら、１９６３、Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５、２１４９−２１５４；ケント、Ｓ．Ｂ．ら、２００９、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．、３８、３３８−５１）を用いて、Ｒｉｎｋ−ａｍｉｄｅレジン上で合成した（図２）。コア内に疎水性尾部を含むＡＭＰＤにおいて、側鎖の直交保護基としてＡｌｌｏｃを含む追加のリジンを合成の第１アミノ酸として配置した。０．２５当量のＰｄ（ＰＰｈ３）４及び２５当量のＰｈＳｉＨ３によるＡｌｌｏｃ脱保護（グリエコ、Ｐ．ら、２００１、Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．、５７、２５０−２５６）の後、６〜２４個の範囲の炭素原子である、異なる炭素側鎖をカルボン酸として、ＤＭＦ中のＨＡＴＵ／ＤＩＰＥＡ又はＮＭＰ中のＨＯＢｔ／ＤＩＣ／ＤＩＰＥＡという古典的なカップリング条件下で結合させた。ペプチドデンドリマーの側鎖の脱保護及び付随する酸分解は最後のＦｍｏｃ脱保護の後に行われ、続いてＲＰ−ＨＰＬＣ精製を行った。表２〜表７は全ての世代及び分岐部分間のアミノ酸の数が異なる、極めて良好（４４〜１０％）から良好（１０〜１％）な収率である全ての合成されたＡＭＰＤを示す。ＨＰＬＣからの精製留分、合成及び精製に対応する収率は最適化しなかった。第３世代のペプチドデンドリマー及びアルキル鎖が結合した第２世代の構造式は図４に示す。
【００９６】
以下の全ての表において、ペプチドデンドリマーの配列はＮ末端からＣ末端までである。１文字表記はアミノ酸に用いられ、大文字はＬ−エナンチオマーを示し、かつ、小文字はＤ−エナンチオマーを示す。ＤａｂはＬ−２、３−ジアミノ酪酸であり、かつ、ＢはＬ−２、３−ジアミノプロピオン酸である。分岐するジアミノ酸は斜字体で示す。他に記載のない限り、全てのペプチドはＣ末端でカルボアミド（ＣＯＮＨ２）である。収率を示す所では、これらはＴＦＡ塩としてのＲＰ−ＨＰＬＣ精製産物と関係する。
【００９７】
ＭＩＣ（最小発育阻害濃度）及びＭＨＣ（最小溶血濃度、ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）で決定した）の値はμｇ／ｍＬの単位である。検出可能な溶血活性が何ら観察されなかった場合、最終測定濃度は治療指数（ＴＩ）の算出に用いた。ＴＩ（治療指数）＝ＭＨＣ（μｇ／ｍｌ）／ＭＩＣ（μｇ／ｍｌ）の幾何平均。より大きな値はより強い抗微生物特異性を示す。
【００９８】
表２：第３世代ＡＭＰＤのアミノ酸配列、収率及びＭＳ分析
【表２】
0006553706.tif 000013
【００９９】
ＡＭＰＤの第１系列は第３世代のペプチドデンドリマーから成った。最初は一般的に天然抗微生物ペプチドとして存在するアミノ酸を樹状構造に組み込んだ。第１段階ではリジン分岐間でロイシン、アラニン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシンの疎水性アミノ酸がリジン又はアルギニンと交代する。より強固に作成するために、より小さな分岐部分のＢ（Ｌ−２、３−ジアミノプロピオン酸）部分が用いられた。第２設計では、荷電及び疎水性を中心又は外圏のいずれかに集中させた。ペプチドデンドリマーは明確に定義された二次構造なしに、非常に柔軟な分子である。機構的な研究及び生理学的条件についてのより高い安定性のために、４つの有望な配列を全てＤ−エナンチオマーとして合成した。異なるアミノ酸によって正電荷に変化するだけでなく、側鎖の長さが活性に影響を与えるかどうかを確かめるために、側鎖に４つのメチレン基を含むリジンのうち２つのメチレンのみをＤａｂ（Ｌ−２、３−ジアミノ酪酸）に置換した。
【０１００】
表３：第２世代のＡＭＰＤのアミノ酸配列、収率及びＭＳ分析を示す。
【表３】
0006553706.tif 000014
【０１０１】
広範囲の構造をカバーするため、第２世代のペプチドデンドリマーを調製した。これらの合成は容易かつ迅速であり、かつ、それにより高い収率につながる。第２世代ＡＭＰＤのＭＳｔ−１４６、ＭＳｔ−１３８、ＭＳｔ−１３９、ＭＳｔ−１１９、ＭＳｔ−１７６及びＭＳｔ−２０１は第３世代の類似体と同じ特徴を有するが、分子量は半分に過ぎない。他の構造的可能性を調査するため、第４及び第５世代のペプチドデンドリマー並びに第２世代のペプチド二量体を同様に生成した（表４及び５）。
【０１０２】
ペプチドデンドリマーのＳＰＰＳは最大で第３世代のビーズに限られるため、第４世代及び第５世代のＡＭＰＤは公開された手順（ウーリヒ、Ｎ．Ａ．ら；Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１１、９、７０８４）を用いた収斂接近（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ）によって合成した。従って第２及び第３世代ペプチドデンドリマーはＮ末端をクロロアセチル基として調製した。チオエーテル連結ではこれらのペプチドデンドリマー及びＣ末端に追加のシステインを含む第１又は第２世代のペプチドデンドリマーを結合して、第４及び第５世代のＡＭＰＤを良好な収率で形成した（表４）。
【０１０３】
表４：チオエーテル連結戦略によって調製した第４及び第５世代のＡＭＰＤ。
【表４】
0006553706.tif 000015
【０１０４】
表５：システイン（Ｃ）によるホモ二量体化によって調製した、分岐部分間に２つのアミノ酸を含むペプチドデンドリマー二量体。
【表５】
0006553706.tif 000016
【０１０５】
表６：分岐間に１つのアミノ酸を含む第３世代ＡＭＰＤ。
【表６】
0006553706.tif 000017
【０１０６】
表７：分岐間に２つ又は３つのアミノ酸を含む第２及び第３世代ＡＭＰＤ。
【表７】
0006553706.tif 000018
【０１０７】
表８：直鎖ＡＭＰのアミノ酸配列、収率、及びＭＳ分析
【表８】
0006553706.tif 000019
【０１０８】
その上、システイン残基を組み込んだ第１又は第２世代のペプチドデンドリマーはジスルフィド結合の形成によって二量化し、ホモ二量体を良好な収率で得る（表５）。
【０１０９】
最後の方法では、分岐間のアミノ酸の数の影響をよりよく理解し、かつ、より強固、又はより柔軟のいずれかのＡＭＰＤを作成するために、１１１１（ＭＳｔ−１４７、ＭＳｔ−１４８、ＭＳｔ−１４９）、３３３３（ＭＩＳ−０２、ＭＩＳ−０３、ＭＩＳ−０４、ＭＩＳ−０６、ＭＩＳ−０８）、２２３３（ＹＧＯ−００８、ＹＧＯ−００９、ＹＧＯ−０１０、ＹＧＯ−１１）ＡＭＰＤを作成した。１１１１系列は、グラム陰性緑膿菌に対する活性ではなくグラム陽性枯草菌に対する活性がある前述の１１１１ＡＭＰＤと比べて、同じトポロジーを有するが、異なるアミノ酸組成を有する。電荷／疎水性モチーフを入れ替え、かつ、ＭＳｔ−１１２と同じアミノ酸分布を有するＭＳｔ−１１７、及び緑膿菌に対する活性があると文献に記載されるＲＨｅ−９の、２つの直鎖配列を参考として調製した。
【０１１０】
表９：疎水性側鎖を含む第３世代ＡＭＰＤのアミノ酸配列、収率、ＭＳ分析
【表９】
0006553706.tif 000020
【０１１１】
ＡＭＰＤの構造を、天然抗微生物ペプチドの反復性成分である疎水性アルキル鎖を結合させることで、第２及び第３世代のペプチドデンドリマーへとさらに変更した。固相ペプチド合成はコアのアルキル鎖の１つのコピー又は複数のコピーをＮ末端に結合しうるように容易に拡張しうる。６個、８個、１０個、１２個、１６個、１８個及び２４個の炭素の鎖を有するカルボン酸を用いた。合計で１８個の疎水性アルキル鎖を含むＡＭＰＤを調製した（表９）。
【０１１２】
ヒト病原体の緑膿菌に対するＡＭＰＤの活性及びヒト赤血球（ｈＲＢＣ）に対するＡＭＰＤの毒性
ＭＩＣ（最小発育阻害濃度）の値を決定するために、液体希釈アッセイ（ウィーガンド、Ｉら、２００８、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．、３、１６３−７５；臨床・検査標準委員会資料Ｍ７−Ａ７、第７版）で、全てのペプチドの緑膿菌ＰＡＯ１に対する活性を試験した。ペプチドデンドリマーの原液は９６ウェルのマイクロタイタープレート内で、栄養素ＬＢで２／３ずつ連続希釈した。細菌を栄養素ＬＢ中で一晩、３７℃で培養した。希釈後に細菌にペプチドを添加し、そして一晩（１８〜２４時間）３７℃で培養した。全ての合成した第３世代のＡＭＰＤのＭＩＣ値は、ポリミキシン（２μｇ／ｍＬ）及びトブラマイシン（０．５μｇ／ｍＬ）と同様の範囲の極めて高い活性（２μｇ／ｍＬ）から活性がある（１４μｇ／ｍＬ）範囲まで及んだ（表１０）。最も効力のある配列は、各世代で交互に並ぶ、荷電した（リジン、アルギニン、Ｌ−２、３−ジアミノ酪酸）及び疎水性の（ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン）のアミノ酸を含む。疎水性アミノ酸がＣ末端から１番目に数えられ、かつ荷電したアミノ酸が２番目の位置にある場合、分岐部分間のアミノ酸の位置は最適であると考えられる。追加の疎水性アミノ酸としてアラニンを導入すると活性が減少する（ＭＳｔ−１２０）。荷電したアミノ酸の性質は活性に大きな影響を与えないが、活性の変化を疎水性アミノ酸の変化と比較すると、結果としてロイシンが最善であり、トリプトファン及びフェニルアラニンが続き、一方でチロシンは活性が大幅に減少する傾向となる。分岐部分をリジンからより強固なＤａｐ（２、３−ジアミノプロピオン酸）に変更すると活性は著しく減少はしなかった。デンドリマー上の電荷が疎水性アミノ酸と離れ、その結果外圏又はコア部分のいずれかが荷電する場合、活性は大幅に減少する。同様に、分岐部分間で荷電した又は疎水性の領域が集合すると活性の減少に至る一方で、Ｌ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に変更すると活性が維持され、活性機構は受容体媒介ではないという仮説に繋がる。非常に効果的なＡＭＰＤは天然、非天然及びＤ−アミノ酸で調製し、そしてそれら全てが非常に高い活性を示した。
【０１１３】
表１０：第３世代ＡＭＰＤのＭＩＣ、ＭＨＣ及びＴＩの値
【表１０】
0006553706.tif 000021
【０１１４】
第３世代のＡＭＰＤが新規の抗生物質として有用であり得るかどうかを試験するために、第３世代のＡＭＰＤについて、それらのヒト赤血球（ｈＲＢＣ）への溶血活性を試験した（表１０）。最小溶血濃度（ＭＨＣ）の値は１μｇ／ｍＬから非常に高い９００μｇ／ｍＬまで及ぶ。ＭＨＣの値への最も大きい影響は荷電したアミノ酸の性質であると思われる。明らかにリジン又はＬ−２、３−ジアミノプロピオン酸を含むペプチドはアルギニンを含むペプチドよりも溶血性が低い。疎水性アミノ酸のロイシン、トリプトファン、チロシン又はアラニンは互いに比較してＭＨＣに大きな影響を与えず、かつ、ＭＨＣの値はそれらのＭＩＣの値より依然としてはるかに高い。
【０１１５】
ＴＩ（治療指数＝ＭＨＣ（μｇ／ｍＬ）／ＭＩＣ（μｇ／ｍＬ））は異なるＡＭＰＤを互いに比較するために有用な手段である。より高いＴＩはより活性が高く、かつより毒性の低いＡＭＰＤである。それ故にＴＩはさらなる開発、機構の研究において、及び潜在的な抗菌性として非常に興味深い。最も高いＴＩを有するＡＭＰＤひいては最も潜在力の高いペプチドは、ＭＳｔ−１１２、ＭＳｔ−１１４、ＭＳｔ−１３６、ＭＳｔ−２００、ＭＳｔ−２０３であり、かつ、さらに評価され、かつ議論されることになる。ここでの焦点は、天然のアミノ酸を含むペプチドデンドリマーは全体的に毒性作用が低いことから、天然のアミノ酸を含むペプチドデンドリマーに当てるべきである。
【０１１６】
第３世代のＡＭＰＤで発見し、かつそれらのＭＩＣ及びＭＨＣを評価した、最良のモチーフに従って第２世代のＡＭＰＤを合成した（表１１）。前述の通り、荷電したアミノ酸をリジンからＬ−２、３−ジアミノ酪酸又はアルギニンに変更することでの活性の著しい差異は発見し得なかったが、ＭＨＣは一般的にリジンからアルギニン、Ｌ−２、３−ジアミノ酪酸へと減少した。同様に分岐部分をリジンからＬ−２、３−ジアミノプロピオン酸へと変更することによる関連する変化は見られなかった。ロイシン又はトリプトファンのチロシン又はアラニンへの置換により結果として活性の喪失が起こった。興味深いことに、第２世代のＡＭＰＤのＭＨＣの値は、分子内の正電荷残基の数が少ないことが原因である可能性がある、第３世代の類似体と比較して、非常に高く、より高いＴＩの値をもたらす。従って第２世代のＡＭＰＤは、特にそれらのＳＰＰＳからの容易な入手可能性が結果としてもたらすより高い収率のため、さらなる開発及び調査の有望な候補である。
【０１１７】
一般的な効果を完全に理解するために、ＭＳｔ−１１２及びＭＳｔ−１４６のＫ分岐間にＫＬモチーフを有する、効果のある配列を含む第１世代及び０世代（ジペプチド）のＡＭＰＤ類似体のＭＩＣ及びＭＨＣもまた試験した。これらの２つのペプチドは溶血活性が低いが、緑膿菌に対する活性がない（表１１）。
【０１１８】
表１１：第２世代のＡＭＰＤのＭＩＣ、ＭＨＣ及びＴＩの値
【表１１】
0006553706.tif 000022
【０１１９】
チオエーテル連結によって合成した第４及び第５世代のＡＭＰＤは、それらの第２及び第３世代の類似体と比較してわずかに低い、緑膿菌に対する活性を有する（表１２）。それらのより大きいサイズのため、ｈＲＢＣを溶解する効力は極めて高く、故にＴＩは相対的に低い。興味深いことにアルギニンの変化は活性が低くなり、かつ、溶血性が高くなり、第３世代のＡＭＰＤと同様の効果であることが明らかである。
【０１２０】
表１２：チオエーテル連結によって調製された分岐間に２つのアミノ酸を含む第４及び第５世代のＡＭＰＤのＭＩＣ、ＭＨＣ及びＴＩの値
【表１２】
0006553706.tif 000023
【０１２１】
容易に入手可能な第１及び第２世代の二量体もまた緑膿菌に対して検査した（表１３）。分岐間に２つのアミノ酸を含む第１及び第２世代の二量体は、第２及び第３世代のＡＭＰＤと同じくらいの活性（ＣＣＳ−３）であるか、少し低い活性（ＣＣＳ−５、ＣＣＳ−１９、ＣＣＳ−１８）である。
【０１２２】
表１３：（システインＣによるホモ二量体化によって調製した）分岐間に２つのアミノ酸を含むペプチドデンドリマー二量体のアミノ酸配列、収率及びＭＳ分析
【表１３】
0006553706.tif 000024
【０１２３】
前述の通り、１１１１の第３世代のＡＭＰＤは枯草菌、グラム陽性細菌に対して活性があったが、緑膿菌に対しては活性がなかった。２２２２の第３世代のＡＭＰＤの成功したモチーフに倣い、新規の１１１１の第３世代のＡＭＰＤを設計し、そしてそれらの溶血活性を液体希釈アッセイで試験した。ＭＳｔ−１４７（配列：（Ｌ）８（ＫＫ）４（ＫＬ）２（ＫＫ））のみが、非常に低い溶血性（１９３７μｇ／ｍＬ；ＴＩ＞１６０）及び１２μｇ／ｍＬのＭＩＣの活性を示した。
【０１２４】
分岐部分間のアミノ酸の数の減少はＡＭＰＤのより高い活性をもたらさず、より高い活性のＡＭＰＤを求めて、アミノ酸の数を２から３に増加させることを次に試験した。４つの３３３３の第２世代のＡＭＰＤ、２つの３３３３の第３世代のＡＭＰＤ及び交互に位置するＫＬモチーフを含む４つの２２３３の第３世代のＡＭＰＤを緑膿菌に対して試験した。分岐間に非常に高いリジン含有量を含むＭＩＳ−０３及び分岐点間で離れている高いリジン含有量を含むＭＩＳ−０５を除いて、全ての配列は２２２２の第２及び第３世代のＡＭＰＤと同等の活性を示した。それらのＡＭＰＤは、ＴＩと同等に至る極めて高い溶血値を有する。ＭＩＳ−０６及びＭＩＳ−０８の、３３３３の第３世代のＡＭＰＤは高い疎水性のため極めて高い溶血性である。
【０１２５】
表１４：分岐間に２つ又は３つのアミノ酸を含む第３世代のＡＭＰＤのＭＩＣ、ＭＨＣ及びＴＩの値
【表１４】
0006553706.tif 000025
【０１２６】
Ｋ分岐間にＫＬモチーフを含む第２（ＭＳｔ−２６０：Ｃ６、ＭＳｔ−２６１：Ｃ８、ＭＳｔ−２６２：Ｃ１０、ＭＳｔ−２６３：Ｃ１２、ＭＳｔ−２８６：Ｃ１８、ＭＳｔ−２８７：Ｃ２４）及び第３（ＭＳｔ−２６３：Ｃ６、ＭＳｔ−２６５：Ｃ８、ＭＳｔ−２６６：Ｃ１０、ＭＳｔ−２６７：Ｃ１２、ＭＳｔ−３０１：Ｃ１６、ＭＳｔ−２８４：Ｃ１８、ＭＳｔ−２８５：Ｃ２４）世代のＡＭＰＤのコアへの疎水性炭素側鎖の結合は，結果としてＣ６−Ｃ１２側鎖において非常に高い活性の配列、及びＣ１６−Ｃ２４側鎖において低い活性をもたらす（表１５）。第２世代のＡＭＰＤであるＭＳｔ−２６０〜ＭＳｔ−２６３は、溶血性が、炭素側鎖がより長くなるにつれて増加するにもかかわらず、高いＭＨＣ値をもたらす。ＭＳｔ−２６４〜ＭＳｔ−２６７への異なるカルボン酸の結合は、溶血性が、炭素側鎖がより長くなるにつれて増加することと同じ効果である非常に低いＭＨＣの値をもたらす。ＭＳｔ−３０２、ＭＳｔ−２８６、ＭＳｔ−２８７、ＭＳｔ−３０１、ＭＳｔ−２８４、ＭＳｔ−２８５は全て低濃度で溶血性を示し、それ故に低いＴＩである。第２及び第３世代のＡＭＰＤ（ＭＳｔ−２８８、ＭＳｔ−２９０）のＮ末端へのＣ６又はＣ１２カルボン酸の固定、従って炭素鎖の４つ又は８つのコピーのいずれかの導入は、Ｃ６の炭素鎖ではＡＭＰＤの活性を維持したが、Ｃ１２の類似体では活性を喪失した。
【０１２７】
コアにおいてＣ６〜Ｃ１２の炭素鎖を持つ第３世代のＡＭＰＤ及び特に第２世代の類似体であり、類似したＴＩ値を有するデンドリマーは、臨床的単離株及び機構的な研究といった、変異株を用いるさらなる試験にとてもよく適する。
【０１２８】
表１５：疎水性側鎖を含む第３世代のＡＭＰＤのＭＩＣ、ＭＨＣ及びＴＩの値
【表１５】
0006553706.tif 000026
【０１２９】
枯草菌及び大腸菌に対するＡＭＰＤの活性
広い範囲の異なる細菌をカバーするため、グラム陽性細菌である枯草菌ＢＲ１５１、及び別のグラム陰性細菌である大腸菌ＤＨ５αに対するＡＭＰＤの抗微生物活性をＡＭＰＤライブラリーで試験した。枯草菌に対する第３世代のＡＭＰＤのＭＩＣはすべて１〜１０μｇ／ｍＬの範囲のむしろ良い活性であり、ＭＳｔ−１７９はより低い効果である（表１６）。従って明確な構造活性相関は全く証明され得なかったが、明らかに疎水性アミノ酸のアラニン及びチロシンは活性の減少に重要な影響を及ぼすと考えられる。第３世代のＡＭＰＤを大腸菌に対して用いる場合、それらは緑膿菌と同じ効果の傾向を示す（表１０）が、いくつかのペプチド、ＭＳｔ−１９９、ＭＳｔ−１１４、ＭＳｔ−１２０は大幅に活性が低い。
【０１３０】
表１６：第３世代のＡＭＰＤのＭＩＣ、ＭＨＣ及びＴＩの値
【表１６】
0006553706.tif 000027
【０１３１】
第２世代のＡＭＰＤは枯草菌及び大腸菌のどちらにも活性がない一方、第２世代のＡＭＰＤは緑膿菌に非常に効果がある（表１１）。１つの配列である、アミノ酸としてＬ−２、３−ジアミノ酪酸及びトリプトファンを含むＭＳｔ−１７６は例外であると考えられる。トリプトファンを含む第２世代のＡＭＰＤは枯草菌に対しても同様に活性があり、グラム陽性細菌に対する活性に関する、非常に疎水的なアミノ酸の考えられる作用を示唆する。さらにＭＳｔ−１３９及びＭＳｔ−１１９は１６μｇ／ｍＬ及び２０μｇ／ｍＬでわずかに効果的であると考えられる。
【０１３２】
表１７：第２世代のＡＭＰＤのＭＩＣ、ＭＨＣ及びＴＩの値
【表１７】
0006553706.tif 000028
【０１３３】
より大きい第４及び第５世代のペプチドデンドリマーは、第２世代より枯草菌及び大腸菌に対する活性がずっと高いが、第３世代の類似体は同様の範囲である（表１８）。低いＭＨＣの値のため、第４及び第５世代のペプチドデンドリマーのＴＩは第３世代のＡＭＰＤのＴＩより低い。二量体のＭＩＣデータは表１９に示す。
【０１３４】
表１８：チオエーテル連結によって調製された、分岐間に２つのアミノ酸を含む第４及び第５世代のＡＭＰＤのＭＩＣ、ＭＨＣ及びＴＩの値。
【表１８】
0006553706.tif 000029
【０１３５】
表１９：（システインＣによるホモ二量体化によって調製した）分岐間に２つのアミノ酸を含むペプチドデンドリマー二量体のアミノ酸配列、収率及びＭＳ分析
【表１９】
0006553706.tif 000030
【０１３６】
既報の通り、１１１１の第３世代のＡＭＰＤは２〜５μｇ／ｍＬの濃度で枯草菌に対する活性がある。同じトポロジーであるがリジン及びロイシンのみが異なる位置にある、ＭＳｔ−１４８及びＭＳｔ−１４９は依然として活性があるが、効果は小さい（表２０）。ＭＳｔ−１４８及びＭＳｔ−１４９は、それらをアップスケールのための理想的なペプチドにさせるように、よい収率を伴って容易かつ迅速な合成されるにもかかわらず、今までのところＭＳｔ−１４８及びＭＳｔ−１４９は、グラム陰性及びグラム陽性細菌へは他のペプチドデンドリマーと同等の効果は示さなかった。
【０１３７】
表２０：（分岐間に１つのアミノ酸を含む）１１１１の第３世代のＡＭＰＤのＭＩＣ及びＴＩの値
【表２０】
0006553706.tif 000031
【０１３８】
３３３３の第２及び第３世代のＡＭＰＤであるＭＩＳ−０２、ＭＩＳ−０３、ＭＩＳ−０４、ＭＩＳ−０６及びＭＩＳ−０８（表２１）は全て枯草菌に対する活性が、０．５〜６μｇ／ｍＬと非常に効果が高く、ＭＩＳ−０５を除いて緑膿菌よりもずっと良好であった。これらは全て非常に溶血性が高く、故にこれらのＴＩはＭＩＳ−０４を除いて非常に低い。ＭＩＳ−０４は一般的なグラム陽性細菌のための、さらなる開発及び調査の有望な候補になるであろう。２２３３の第３世代のＡＭＰＤ（ＹＧＯ−００８、ＹＧＯ−００９、ＹＧＯ−０１０、ＹＧＯ−０１１）は大腸菌についてのみ試験したが、緑膿菌と同等の範囲である、２〜３μｇ／ｍＬという（表２１）優れた活性を示した（表１４）。
【０１３９】
表２１：分岐間に２つ又は３つのアミノ酸を含む第３世代のＡＭＰＤのＭＩＣ、ＭＨＣ及びＴＩの値
【表２１】
0006553706.tif 000032
【０１４０】
比較判断のため選択された２つの直鎖のペプチドであるＭＳｔ−１１７及びＲＨｅ−９は、緑膿菌（表１２）と比較して、枯草菌及び大腸菌（表２２）への活性において同じ傾向を示す。ＭＳｔ−１１７は第３世代のＡＭＰＤより非常に低い効能であり、かつ非常に溶血性がある。ＲＨｅ−９はグラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の両方に非常に効果があり、かつ、溶血性がなく、結果として第３世代のＡＭＰＤと同等のＴＩである。
【０１４１】
表２２：直鎖のＡＭＰのＭＩＣ、ＭＨＣ及びＴＩの値
【表２２】
0006553706.tif 000033
【０１４２】
表２３は、ペプチドデンドリマーのＣ末端に疎水性炭素側鎖を含む、第２及び第３世代のＡＭＰＤを枯草菌及び大腸菌に対してリストする。全ての配列はＭＩＣが１〜６μｇ／ｍＬで、両方の細菌に非常に高い効果がある。Ｎ末端にＣ２４の炭素鎖を含むＭＳｔ−２８５及びＭＳｔ−２８７、Ｃ１６の炭素鎖を含むＭＳｔ−３０２及びＭＳｔ−３０１、Ｃ６の炭素鎖を含むＭＳｔ−２６０のようなほんの数個の例外があり、全て非常に疎水的であり、かつ緑膿菌に全く活性がない（表１５）。それにもかかわらず、より溶血性が高くなると、より疎水的となり、結果としてより低いＴＩである（表２３）が、依然として強力な場合は１００より高い、ＭＳｔ−２６１、ＭＳｔ−２６２、ＭＳｔ−２６３、ＭＳｔ−２６４、ＭＳｔ−２６５、ＭＳｔ−２６６、ＭＳｔ−２６７、ＭＳｔ−２８４、ＭＳｔ−２８６、ＭＳｔ−２８８、ＭＳｔ−２９０のような、依然として非常に効果の高いＡＭＰＤがある。従って、ＭＳｔ−２６１、ＭＳｔ−２６２、ＭＳｔ−２６３、ＭＳｔ−２６４、ＭＳｔ−２６５、ＭＳｔ−２６６、ＭＳｔ−２６７は３種の試験細菌全てに対して非常に効果が高く、かつ大きな可能性がある。
【０１４３】
表２３：１つ、４つ又は８つの疎水性側鎖を含む第２及び第３世代のＡＭＰＤのＭＩＣ及びＴＩの値
【表２３】
0006553706.tif 000034
【０１４４】
表２４：Ｃ１０アルキルカルボン酸側鎖を含む／含まないＧ２  ＡＭＰＤのＭＨ培地中で、ヒト血清存在下でのＰＡＯ１に対しての結果−アルキルカルボン酸側鎖のないＧ２はＬＢ中では活性を示すが、ＭＨ中では活性がない；
【表２４】
0006553706.tif 000035
【０１４５】
表２５：ＭＨ培地中のＤａｂを含む化合物、及びＤＡＢを含まない化合物の、ＰＡＯ１に対するＭＩＣの値。結果はトリプリケートで行った２つの独立した実験（ＭＨ培地、１２〜１８時間）に対してである
【表２５】
0006553706.tif 000036
【０１４６】
表２６：ＭＨ培地中のＤａｂを含む化合物、及びＤＡＢを含まない化合物の、緑膿菌ＭＤＲ臨床分離株、黄色ブドウ球菌及びアシネトバクター・バウマニに対するＭＩＣの値。結果はトリプリケートで行った２つの独立した実験（ＭＨ培地、１２〜１８時間）に対してである
【表２６】
0006553706.tif 000037
【０１４７】
表２７：緑膿菌及びアシネトバクター・バウマニにの薬剤耐性株に対するＧ３ＫＬのＭＩＣの値
【表２７】
0006553706.tif 000038
0006553706.tif 000039
【０１４８】
表２８：数個の薬剤耐性病原体に対するＧ３ＫＬのＭＩＣの値
【表２８】
0006553706.tif 000040
0006553706.tif 000041
【０１４９】
臨床的な緑膿菌、黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマニ単離株に対するＡＭＰＤの最小発育阻止濃度及び耐性分析
最も有望な１０個の化合物（図５）について、緑膿菌の４つの単離株（ＺＥＭ９．Ａ，ＺＥＭ１．Ａ，ＰＥＪ２．６，ＰＥＪ９．１）、黄色ブドウ球菌の１つの単離株（ＣＯＬ，ＭＲＳＡ参考株）及び１つのアシネトバクター・バウマニ菌株に対する効率（ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を試験した。ジュネーブにおける実験では、ペプチドデンドリマー及び参照化合物（ポリミキシン）はＰＢＳに溶解され、２倍希釈のミューラー・ヒントン（ＭＨ）培養液によって分析された。
【０１５０】
４つの緑膿菌臨床単離株に対して試験をした全てのＡＭＰＤは２０μｇ／ｍｌより低い活性を示し、リシン（ＭＳｔ−２４２）の代わりにアルギニンと結合した第３世代のデンドリマーのみが、緑膿菌ＥＺＭ９．Ａに対してわずかに高い活性を示した。これらの単離株は、イミペネム、メロペネム、トリメトプリム及びスルホンアミドのような汎用的に使われる抗生物質に対して耐性があり、それ故に代替物として高い可能性を有する。これらのＡＭＰＤは、もう１つの病原グラム陰性菌であるアシネトバクター・バウマニに対して６−１９μｇ／ｍＬの範囲の活性を示す。一度耐性を発現すると問題となり得る、グラム陰性菌である黄色ブドウ球菌はまた分析に含められ、第２世代ＡＭＰＤのＭｓｔ−１７６、Ｍｓｔ−２６３及び第３世代ＡＭＰＤのＭｓｔ−２４２は２０μｇ／ｍＬよりも低い活性を示した。
【０１５１】
ヒト血清中のＡＭＰＤの安定性
ペプチドデンドリマーは、前述のとおり、その直線の類似体と比較してタンパク質分解に非常に安定である。それらの分岐点である開裂部位は、プロテアーゼが作用し難いからである。分岐単位の間のアミノ酸の数もまた、より高い安定性にとって重要である。
【０１５２】
ペプチドは、プロテアーゼに対するＡＭＰＤの安定性を測定するために、最終的なペプチド濃度が１００μｍになるようにヒト血清（事前にＤＭＥＭにより希釈した）と混合され、かつ３７℃において０、１、６又は２４時間培養された。ＴＣＡによってタンパク質を沈殿させた後、溶液を分析的ＲＰ−ＵＰＬＣにより分析した。２４時間にわたって、ＡＭＰＤのＭＳｔ−１１２及びＭＳｔ−１８１のシグナルは一定を維持し、それ故にタンパク質分解は起こらないか、又は少しだけ起こった。ところが、直線状のペプチドＲＨｅ−９（ＳＥＱ  ＩＤ  １）は完全に消滅する。これは、このペプチドが２４時間にわたり完全にタンパク質分解を起こすことを示唆している。興味深いことに、Ｄ−エナンチオマーのＭＳｔ−１８１に比べて、全てのＬ−エナンチオマーのＭｓｔ−１１２は同じ挙動を示す。これは、Ｌ−エナンチオマーＡＭＰＤは既に十分に安定であり、かつＤ−エナンチオマーはその可能性としてある毒性は避けることができることを示す。ＡＭＰＤのＭｓｔ−１１４、Ｍｓｔ−１３６、Ｍｓｔ−１３８、Ｍｓｔ−１３９、Ｍｓｔ−１４０及びＭｓｔ−１７６の安定性がまた調べられた。Ｍｓｔ−１３６、Ｍｓｔ−１３８及びＭｓｔ−１３９は２４時間安定であり、しかしながらペプチドデンドリマーＭｓｔ−１１４及びＭｓｔ−１３９は完全には分解しなかったが、少しの分解を示した。ヒト血清中の、天然Ｌ−アミノ酸のみが結合したペプチドデンドリマーの安定性は、天然でない物質が結合したペプチドと比較して、治療薬の開発において著しい優位点を示す。
【０１５３】
ＡＭＰＤの安定性を示すもう１つの実験は、緑膿菌ＰＡＯ１の細菌懸濁液とペプチドとの培養である。細菌をＬＢ中で一晩培養し、ＯＤ６００＝０．２まで希釈した。１００μＭの濃度になるようにペプチドを加えた後、サンプルを３７℃で０、１、６、９、２４時間培養した。懸濁液を９５℃で５分加熱し、遠心分離した後、溶液はＵＰＬＣに供し、残ったペプチドはＣｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェアを用いて分析した。分析は、２４時間経った後でさえ、細菌懸濁液はＡＭＰＤのＭｓｔ−１１２、Ｍｓｔ−１１４、Ｍｓｔ−１３６、Ｍｓｔ−１３８、Ｍｓｔ−１３９、Ｍｓｔ−１４０、Ｍｓｔ−１７６、及びＭｓｔ−１８１を減成させないこと、一方で、ＲＨｅ−９（ＳＥＱ  ＩＤ  １）は９時間後において検出されないことを示した。
【０１５４】
真核生物及び原核生物の細胞膜にとってのモデル系としての、大規模単層ベシクル（ＬＵＶｓ）とＡＭＰＤとの相互作用
細菌膜は、曝されたアニオン性脂質の比較的多くを含む。一方で植物及び動物の膜の外側は、主に正味荷電のない脂質によって構成されている。そのような膜の荷電の構成はリン脂質小胞によって模倣され得る。負の電荷を帯びたＰＧ（ホスファチジルグリセロール）又はＰＣ（ホスファチジルコリン）を含む中性のリン脂質により構成された大規模単層ベシクル（ＬＵＶｓ）が調製され、５（６）−カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）をカプセル化した。これらのＬＵＶｓはＡＭＰＤのＭｓｔ−１１２、Ｍｓｔ−１１４、Ｍｓｔ−１７６、及びＭｓｔ−１８１、並びに不活性なペプチドデンドリマーであるＭｓｔ−１３８、Ｍｓｔ−１３９により、それぞれ異なる濃度で処理された。ホスファチジルグリセロールからのＬＵＶｓ溶液に、５０秒で活性のある第３世代のＡＭＰＤであるＭｓｔ−１１２を加えたところ、蛍光の増加が起こった。Ｍｓｔ−１１２の濃度が高いほど、ＣＦの漏出が多くなった（図６Ａ）。ホスファチジルグリセロールＬＵＶｓにおける（on）不活性なＭｓｔ−１１３は１００μｍ／ｍＬにおいてさえも即座に増加を示すことはなく、時間が経過しても無視できる程度の漏出を示すのみであった（図６Ｂ）。既知の膜攪乱物質であるポリミキシン並びに、全ての活性なＡＭＰＤ（Ｍｓｔ−１１４、Ｍｓｔ−１７６、及びＭｓｔ−１８１）は、ペプチドの添加に伴い、同様のＣＦの即座の漏出を示す。細菌中でのタンパク質の生合成を妨害する抗生物質であるＭｓｔ−１３８及びトブラマイシンは、Ｍｓｔ−１１３のようにＣＦの漏出を示さない。一方で、同じ濃度における活性なＡＭＰＤとは異なって、Ｍｓｔ−１３９はＣＦを漏出する。全ての活性なＡＭＰＤは負の電荷を帯びた膜と相互作用を起こし、ＣＦを漏出する。それ故に、膜の透過処理及び攪乱は起こりそうに思われるが、一方で、不活性なペプチドはＬＵＶｓの脂質と部分的に相互作用するか又は相互作用しない。
【０１５５】
Ｍｓｔ−１１２がホスファチジルコリン由来のＬＵＶｓ溶液に供された場合、ＭＩＣ値と比較して非常に高い濃度でさえ、ＣＦは漏出しない（図７Ａ）。他の全ての活性なＡＭＰＤ及びポリミキシンは同様にふるまう。一方で、高い疎水性の第２世代ペプチドであり、他に比べてより高い溶血性を示す（表１１）Ｍｓｔ−１７６は、ＣＦの漏出を誘発する。Ｍｓｔ−１１３（図７Ｂ）、Ｍｓｔ−１３８及びＭｓｔ−１３９並びにトブラマイシンはＣＦを漏出しないという同じ挙動を示す。
【０１５６】
第２世代（Ｍｓｔ−２６０、Ｍｓｔ−２６１、Ｍｓｔ−２６２、Ｍｓｔ−２６３）及び第３世代（Ｍｓｔ−２６４、Ｍｓｔ−２６５、Ｍｓｔ−２６６、Ｍｓｔ−２６７）ＡＭＰＤに炭素の側鎖を導入した場合は、ホスファチジルグリセロールＬＵＶｓ溶液に、Ｍｓｔ−１１２と同様の方法で、５０秒でさまざまな濃度でペプチドデンドリマーを添加した後に、ＣＦは即座に漏出する（図８ＡのＭｓｔ−２６０に示されている）。唯一の違いは、様々な濃度における第２世代及び第３世代ＡＭＰＤの強度である。１つの追加の世代では、同一の濃度で増加する蛍光はより高い。従って、これらの全てのＡＭＰＤは負の電荷を帯びたモデル膜と相互作用し、完全な状態の膜を妨害して、ＣＦを漏出させる。正味荷電が無いモデル膜であるホスファチジルコリンが使用された場合は、ＣＦ漏出は高いペプチドデンドリマー濃度においてのみ観察される（図８ＢのＭｓｔ−２６０）。疎水性側鎖中の炭素原子数の増加に伴って、ＣＦ漏出の強度は強くなる。これはｈＲＢＣの溶解に一致し、ここでより長い炭素鎖はより低い濃度における溶血を誘発する。
【０１５７】
殺菌の反応速度論
ＡＭＰＤの殺菌反応速度論を明らかにするために、ＡＭＰＤと培養した後の時間関数としての生菌量を測定した。生菌を検知するためのＷＳＴ−８を用いた分析を使用した（Ｒｏｅｈｍ，Ｎ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４２，２５７−２６５；Ｃｈａｎｇ，Ｊ．−Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９７，５２−５８）。それ故緑膿菌は、生菌に比例する、ホルマザンの４５０ｎｍの吸光度を測定する前に、ＡＭＰＤ又は不活性なペプチドデンドリマーにより、２５μｍ／ｍＬの濃度で、０、１、３、６、８、２４時間培養した。図９は２４時間に渡る細菌生存を示す。全てのＡＭＰＤ（Ｍｓｔ−１１２、Ｍｓｔ−１７６、Ｍｓｔ−１８１）は、ペプチドデンドリマーの添加直後に、細菌の少なくとも６０％がまだ生きているという、同じ挙動を示した。ほとんどのＡＭＰＤは、完全な殺菌に３時間を要する。参照化合物であり、緑膿菌を即座に殺菌するポリミキシン及びトブラマイシンと比較して、ＡＭＰＤはより遅く作用するようである。予期されるとおり、不活性なペプチドデンドリマーＭｓｔ−１３８及びＭｓｔ−１３９は、２４時間後に細菌量を減少させることはできなかった。ＡＭＰＤのＭｓｔ−１１４の性能として、それは非常に強いものであるが、他のＡＭＰＤとは異なる。２４時間後においてのみ、ほぼ全ての細菌が殺菌された。
【０１５８】
コアにおいてＣ８（Ｍｓｔ−２６１及びＭｓｔ−２６３）又はＣ１２（Ｍｓｔ−２６５及びＭｓｔ−２６７）の炭素側鎖と結合する第２世代及び第３世代ＡＭＰＤと、Ｍｓｔ−１１２とを比較すると、異なる挙動が現れた。すなわち添加のすぐ後に６０％の細菌が殺菌され、１時間後にその数は既にゼロになった。それ故、炭素側鎖の結合は殺菌の反応速度論を変化させると思われる。この分析は、ＡＭＰＤの殺菌の反応速度論の第１の示唆を与えるが、生体外での殺菌に要する時間を決定するためには、さらなる実験が必要である。
【０１５９】
耐性分析
ＡＭＰＤがどのぐらい早く耐性を発現し得るかの初期の見積りのために、ＭＩＣを１５日連続して繰り返し測定し、測定日毎に決定した。通常の培養液希釈分析法においてＭＩＣ値を得た後、１／２ＭＩＣウェルからの細菌（枯草菌）を２〜５時間培養し、希釈分析を繰り返した。この手順は１５日実行され、測定日毎のＭＩＣが比較された。ＭＩＣが増加する場合には、ＡＭＰＤに対する耐性が示唆される。この実験においては、とても効力の強いＭｓｔ−１１２、Ｍｓｔ−１７６、Ｍｓｔ−１８１は１５日に渡ってそのＭＩＣ値は著しく変化することはなかった。これに対して、効力がより弱いＭｓｔ−１１４、Ｍｓｔ−１３９、Ｍｓｔ−１４０は、５〜１０日後において、既に活性の喪失を示した。
【０１６０】
ＡＭＰＤの毒性−ラットを用いた予備の生体内試験
ＫＬモチーフ（ｍｏｔｉｖｅ）を含む第３世代のＡＭＰＤであるＭｓｔ−１１２化合物、Ｍｓｔ−１８１のＤ−エナンチオマー類似体、ＲＬモチーフ（motive）を含む第３世代のＡＭＰＤであるＭｓｔ−２４２、及びリシンの代わりにチロシンを含む第３世代のＭｓｔ−１１４が、毒性を査定するための、雄のウィスター系ラットを用いた生体内試験に使用された。これらの化合物は、それらの活性に比べて少なくとも１０倍の高さである、高いＭＨＣ値及びその効力の強さのために選ばれた。それぞれの化合物（２ｍｇ／ｋｇの濃度である）は、ＡＭＰＤの耐性が十分に発現しているか、又は副作用を引き起こし得るかを観察するために、２匹のラットに対し、尾の静脈注射に適用された。ＭＩＣより約５〜１０倍高い濃度を使用した。ＡＭＰＤのＭｓｔ−１１２及びＭｓｔ−２４２を注入した後、ラットは標準的な振る舞いをし、かつ目に見える効果は観察されなかった。ＡＭＰＤのＭｓｔ−１１４及びＭｓｔ−１８１の注入により、四肢がわずかに青みを帯びたが、これは約５分の後に治まった。ラットは標準的な振る舞いをした。ラットを２日間観察した結果、ラットの振る舞いに異常は見られず、また生存率は１００％であった。５００μＬのＰＢＳを注入したか、又は注入をしていないコントロールのラットはまた、２日の間に標準的な振る舞いを示し、かつ１００％の生存率を示した。それ故、ラットはＡＭＰＤによく耐え、目に見えるサイト効果又は傷さえもないように思われた。
【０１６１】
結論
病原性のグラム陰性菌である緑膿菌に対する、７８の化合物のペプチドデンドリマーライブラリーのスクリーニングの後、赤血球の、低い溶血性及び高い活性を持つのいくつかのデンドリマーが発見された。いくつかは第２世代のペプチドデンドリマー（Ｍｓｔ−１３８、Ｍｓｔ−１３９、Ｍｓｔ−１７６）であり、他は第３世代のペプチドデンドリマー（Ｍｓｔ−１１２、Ｍｓｔ−１８１、Ｍｓｔ−２４２）である。グラム陰性菌である大腸菌及びグラム陰性菌である枯草菌に対する追加のスクリーニングによって、Ｍｓｔ−１７６、Ｍｓｔ−１１２、Ｍｓｔ−１１８及びＭｓｔ−２４２の幅広い効果が明らかとなった。緑膿菌は一般的な抗生物質に対する耐性を示すが、この臨床単離株によるさらなる研究において、第２世代のＡＭＰＤであるＭｓｔ−１７６及び第３世代のＡＭＰＤであるＭｓｔ−１１２、Ｍｓｔ−１１８及びＭｓｔ−２４２は同様に有効であった。グラム陰性菌でアシネトバクター・バウマニに対して、それらはいくらかの活性を示した。
【０１６２】
Ｃ６からＣ１２の範囲のアルキル鎖を、第２世代のＡＭＰＤのコアに結合させることで、より広い殺菌スペクトルを持つ抗菌剤が生成された。これらの配列はまたアシネトバクター・バウマニ及び院内耐性菌に対して有効である。最良の化合物の活性は、クリニックで最後の手段として使用される、効力がとても強いポリミキシンの活性と同じ範囲にある。他のペプチド性化合物と比較した際のＡＭＰＤの優位点は、それらのヒト赤血球への低毒性、プロテアーゼによる分解が遅いこと、及び天然のアミノ酸のみが存在することである。集められた証拠は同様に、細胞膜が崩壊し、細胞が溶解し、かつ細菌が死滅する作用機構を指し示す。緑膿菌変異株、ＬＵＶｓ及び殺菌反応速度論の実験は細胞膜崩壊に向けられる。ここで、ＬＰＳ構造はペプチドデンドリマーを妨害しない。それ故、ＡＭＰＤを用いた治療は耐性を急速に発現させることはなさそうである。
【０１６３】
我々の、新種の抗菌剤である、分岐単位の間の２又は３のアミノ酸を含むＡＭＰＤは、非毒性であり安定な系である。これは、好収率で容易に合成され、生体外で、ヒト病原体に対して高い効果を示す。活性な配列はアルキル鎖を含む又は含まない（with or without）第３世代、第２世代である可能性がある。ペプチドデンドリマーは、１つの精製工程のみを伴って固相担体上で調製され、より低位の世代の２つのデンドリマー（ｃｃｓ−２０を見よ）から溶液中に集められ、好収率で第３世代のデンドリマーを提供する。構造の柔軟さは、直線又は環状の対応物では見られない、我々のペプチドデンドリマーの比類のない特徴であり、かつ、希望の薬物動態を持つ化合物を得るための更なる適正化に関する優位点を与える。記載された生体外の試験は、今、生体内の試験の枠組みを示し、これはペプチドデンドリマーに基づいた治療薬の開発の目標に向かう工程となるだろう。
【０１６４】
ヒト血清（ＭＨ培地中の３０％血清）の存在下での抗菌活性が調べられ、ＭＨ培地中で観察された低いＭＩＣを維持するためにＧ３ＫＬが示された。タンパク質分解安定性を測定し、ＭＨ培地中で非常に高い活性を示すが、血清中ではタンパク質分解のために効力を失う直線の配列と対照的に、Ｇ３ＫＬは血清中で極めて安定であった。
【０１６５】
他剤耐性病原体の大形のパネル（pannel）を、Ｇ３ＫＬにより調べた。デンドリマーは、耐性のメカニズムから独立して試験された緑膿菌及びアシネトバクター・バウマニのほぼ全ての株に対して、非常に高い活性を示した。Ｇ３ＫＬのＭＢＣがまた調べられ、これは、デンドリマーがＭＩＣと同一又は非常に近いＭＢＣの値で殺菌力を示した。デンドリマーは、延長して暴露した後で、ヒトの細胞に対して非毒性であった。
【０１６６】
コアＧ２ＫＬＣ１０において、脂質側鎖Ｃ１０（ＣＯ（ＣＨ２）８ＣＨ３）を含む第２世代ペプチドデンドリマー及び類似体はまた、緑膿菌（ＰＡ）に対して非常に高い活性を示すことが発見された。とりわけ、臨床単離株を含むＰＡに対して非常に高い活性を示す３つの新しい化合物が特定される可能性がある。加えて、１つのＧ２Ｃ１０であるＡＭＰＤがＭＲＳＡに対して良好な活性を示した。第２世代のデンドリマーは第３世代のデンドリマー（Ｇ２ＫＬ  １７アミノ酸残基及びＧ２ＫＬ  ３７アミノ酸残基）よりも小さいが、脂質鎖を含むＧ２デンドリマーは血清の存在下で活性を示し、かつ血清中で良好な安定性を示す（Ｇ２ＫＬＣ１０及びＴＮＳ−１２２を見よ）。
【図１】
0006553706.tif 000045
【図２】
0006553706.tif 000046
【図３】
0006553706.tif 000047
【図４】
0006553706.tif 000048
【図５】
0006553706.tif 000049
【図６】
0006553706.tif 000050
【図７】
0006553706.tif 000051
【図８】
0006553706.tif 000052
【図９】
0006553706.tif 000053
【図１０】
0006553706.tif 000054
【配列表】
0006553706000001.app