(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から得た大腸がん（但し、乳児型線維肉腫を除く）由来試料中の、ＮＴＲＫ３融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法。
【請求項２】
前記検出方法が、ＮＴＲＫ３タンパク質の切断、又は、ＮＴＲＫ３タンパク質をコードする遺伝子の切断、を検出する工程を含む、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記検出方法が、ＮＴＲＫ３タンパク質とそれ以外の他のタンパク質とから構築される融合タンパク質の存在、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子の存在、を検出する工程を含む、請求項１に記載の検出方法。
【請求項４】
前記融合タンパク質が、ＥＴＶ６タンパク質とＮＴＲＫ３タンパク質との融合タンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項５】
前記融合タンパク質が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の検出方法：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び  
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
【請求項６】
前記ＮＴＲＫ３融合遺伝子が、請求項５に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項７】
前記融合遺伝子が、ＤＮＡ又はｍＲＮＡである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項８】
ＮＴＲＫ３遺伝子５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＮＴＲＫ３遺伝子３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとを含む、大腸がん（但し、乳児型線維肉腫を除く）由来試料中のＮＴＲＫ３融合遺伝子の検出用キット。
【請求項９】
ＮＴＲＫ３遺伝子と共にＮＴＲＫ３融合遺伝子を構成する他の遺伝子の５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＮＴＲＫ３遺伝子３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとを含む、大腸がん（但し、乳児型線維肉腫を除く）由来試料中のＮＴＲＫ３融合遺伝子の検出用キット。
【請求項１０】
ＮＴＲＫ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドの、５’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、前記ポリヌクレオチドの３’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、大腸がん（但し、乳児型線維肉腫を除く）由来試料中のＮＴＲＫ３融合遺伝子の検出用キット。
【請求項１１】
ＥＴＶ６タンパク質とＮＴＲＫ３タンパク質との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、大腸がん（但し、乳児型線維肉腫を除く）由来試料中のＮＴＲＫ３融合遺伝子の検出用キット。
【請求項１２】
以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、大腸がん（但し、乳児型線維肉腫を除く）由来試料中のＮＴＲＫ３融合遺伝子の検出用キット：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
【請求項１３】
ＮＴＲＫ３タンパク質のＮ末端側領域を特異的に認識できる抗ＮＴＲＫ３抗体、及び、ＮＴＲＫ３タンパク質のＣ末端側領域を特異的に認識できる抗ＮＴＲＫ３抗体を含む、大腸がん（但し、乳児型線維肉腫を除く）由来試料中のＮＴＲＫ３融合タンパク質の検出用キット。
【請求項１４】
ＮＴＲＫ３タンパク質と共にＮＴＲＫ３融合タンパク質を構成する他のタンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、ＮＴＲＫ３タンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む、大腸がん（但し、乳児型線維肉腫を除く）由来試料中のＮＴＲＫ３融合タンパク質の検出用キット。
【請求項１５】
前記他のタンパク質が、ＥＴＶ６タンパク質である、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
ＥＴＶ６タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるセンスプライマー及びＮＴＲＫ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、大腸がん（但し、乳児型線維肉腫を除く）由来試料中のＥＴＶ６遺伝子とＮＴＲＫ３遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは請求項１２に記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなり、センスプライマーは請求項１２に記載のポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でアニールする核酸分子からなるプライマーセット。
【請求項１７】
大腸がん（但し、乳児型線維肉腫を除く）由来試料中のＥＴＶ６遺伝子とＮＴＲＫ３遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。
【請求項１８】
配列番号１の塩基番号１から１００９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号１０１０から１９０２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーを含む、大腸がん（但し、乳児型線維肉腫を除く）由来試料中のＥＴＶ６遺伝子とＮＴＲＫ３遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＴＲＫ３キナーゼ領域を含む融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法に関する。
本発明は、ＥＴＶ６タンパク質の少なくとも一部を含む融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
染色体転座の結果、本来は別々の遺伝子が融合して融合遺伝子が作られる。これまで慢性骨髄性白血病におけるＢＣＲ−ＡＢＬ１融合体や、肺がんにおけるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合体、肺がんを含む種々のがんにおけるＲＯＳ１融合体のように、キナーゼ遺伝子の一部を構成要素に含む融合遺伝子はしばしば発がんに本質的な役割を担い、その機能を抑制する薬剤は極めて有効な抗がん剤となることが知られている（非特許文献１、特許文献１及び特許文献２）。
例えば、チロシンキナーゼ阻害剤のイレッサやタルセバの登場により、分子診断とがん治療効果の関係について、臨床で示されつつあり、分子診断による適応患者の選別により、患者を層別化した上での治療薬投与というコンセプトが広がりつつある。【０００３】
ＥＴＶ６（Ｅｔｓ  Ｖａｒｉａｎｔ６）−ＮＴＲＫ３（Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｃ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ，Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｔｙｐｅ３）融合体は、肉腫（非特許文献２）及び乳がん（非特許文献３）において、その存在が報告されていたが、消化器がんではこれまで報告がなかった。また、ＮＴＲＫ３のキナーゼ領域が融合体の一部に成り得ること（すなわち、ＮＴＲＫ３のキナーゼ領域を含む融合体の存在）も、消化器がんではこれまで報告がなかった（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４３０３３０３号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１１／１６２２９５号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Lugo TG, Pendergast AM, Muller AJ, Witte ON. Tyrosine kinase activity and transformation potency of bcr-abl oncogene products. Science. 1990 Mar 2;247(4946):1079-1082
【非特許文献２】Knezevich SR, McFadden DE, Tao W, Lim JF, Sorensen PH.  A novel ETV6-NTRK3 gene fusion in congenital fibrosarcoma.  Nat Genet. 1998 Feb;18(2):184-7
【非特許文献３】Tognon C, Knezevich SR, Huntsman D, Roskelley CD, Melnyk N, Mathers JA, Becker L, Carneiro F, MacPherson N, Horsman D, Poremba C, Sorensen PH.  Expression of the ETV6-NTRK3 gene fusion as a primary event in human secretory breast carcinoma.  Cancer Cell. 2002 Nov;2(5):367-76
【非特許文献４】Hisaoka M, Sheng WQ, Tanaka A, Hashimoto H.  Gene expression of TrkC (NTRK3) in human soft tissue tumours.  J Pathol. 2002 Aug;197(5):661-67
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、がんの新たな原因遺伝子であるポリヌクレオチドを解明し、この知見に基づき、当該ポリヌクレオチド又はそれがコードするポリペプチドの検出方法、前記検出のためのキット及びプライマーセット、前記ポリペプチドの阻害物質のスクリーニング方法、並びに前記阻害物質を含有するがん治療用医薬組成物及び前記がん治療用医薬組成物を投与するがん治療方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、大腸がん患者から得た検体から、ＥＴＶ６遺伝子の一部と、キナーゼであるＮＴＲＫ３遺伝子の一部との融合を確認し（実施例２）、これらの融合遺伝子が大腸がん患者検体に存在すること（実施例３及び実施例４）を見出した。
本発明者は、これらの知見から、ＮＴＲＫ３融合遺伝子又は該融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の検出方法を構築し（実施例３〜５）、そのためのキット及びプライマーセットを提供し、この融合遺伝子又は該融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質を検出することにより、ＮＴＲＫ３阻害剤を用いた薬物治療の対象となるがん患者を選別することを可能とした。
本発明者は、これらの知見から、ＥＴＶ６融合遺伝子又は該融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の検出方法を構築し（実施例３〜５）、そのためのキット及びプライマーセットを提供し、この融合遺伝子又は該融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質を検出することにより、ＥＴＶ６阻害剤を用いた薬物治療の対象となるがん患者を選別することを可能とした。【０００８】
本発明は、以下の発明に関する：
［１］被験者から得た消化器由来試料中の、ＮＴＲＫ３融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法。
［２］前記検出方法が、ＮＴＲＫ３タンパク質の切断、又は、ＮＴＲＫ３タンパク質をコードする遺伝子の切断、を検出する工程を含む、［１］に記載の検出方法。
［３］前記検出方法が、ＮＴＲＫ３タンパク質とそれ以外の他のタンパク質とから構築される融合タンパク質の存在、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子の存在、を検出する工程を含む、［１］に記載の検出方法。
［４］前記融合タンパク質が、ＥＴＶ６タンパク質とＮＴＲＫ３タンパク質との融合タンパク質である、［１］〜［３］のいずれかに記載の検出方法。
［５］前記融合タンパク質が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドである、［１］〜［４］のいずれかに記載の検出方法：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
［６］前記ＮＴＲＫ３融合遺伝子が、［５］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、［１］〜［５］のいずれかに記載の検出方法。
［７］前記融合遺伝子が、ＤＮＡ又はｍＲＮＡである、［１］〜［６］のいずれかに記載の検出方法。
［８］前記消化器が、消化管である、［１］〜［７］のいずれかに記載の検出方法。
［９］前記消化器が、下部消化管である、［１］〜［７］のいずれかに記載の検出方法。
［１０］前記消化器が、大腸である、［１］〜［７］のいずれかに記載の検出方法。
［１１］ＮＴＲＫ３遺伝子５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＮＴＲＫ３遺伝子３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとを含む、ＮＴＲＫ３融合遺伝子の検出用キット。
［１２］ＮＴＲＫ３遺伝子と共にＮＴＲＫ３融合遺伝子を構成する他の遺伝子の５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＮＴＲＫ３遺伝子３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとを含む、ＮＴＲＫ３融合遺伝子の検出用キット。
［１３］ＮＴＲＫ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドの、５’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、前記ポリヌクレオチドの３’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＮＴＲＫ３融合遺伝子の検出用キット。
［１４］ＥＴＶ６タンパク質とＮＴＲＫ３タンパク質との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＮＴＲＫ３融合遺伝子の検出用キット。
［１５］以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＮＴＲＫ３融合遺伝子の検出用キット：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
［１６］ＮＴＲＫ３タンパク質のＮ末端側領域を特異的に認識できる抗ＮＴＲＫ３抗体、及び、ＮＴＲＫ３タンパク質のＣ末端側領域を特異的に認識できる抗ＮＴＲＫ３抗体を含む、ＮＴＲＫ３融合タンパク質の検出用キット。
［１７］ＮＴＲＫ３タンパク質と共にＮＴＲＫ３融合タンパク質を構成する他のタンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、ＮＴＲＫ３タンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む、ＮＴＲＫ３融合タンパク質の検出用キット。
［１８］前記他のタンパク質が、ＥＴＶ６タンパク質である、［１７］に記載のキット。
［１９］ＥＴＶ６タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるセンスプライマー及びＮＴＲＫ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ＥＴＶ６遺伝子とＮＴＲＫ３遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは［１５］に記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなり、センスプライマーは［１５］に記載のポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でアニールする核酸分子からなるプライマーセット。
［２０］ＥＴＶ６遺伝子とＮＴＲＫ３遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。
［２１］配列番号１の塩基番号１から１００９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号１０１０から１９０２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーを含む、プライマーセット。
［２２］（１）［５］に記載のポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
（２）前記ポリペプチドの活性及び／又は発現が阻害されるか否かを分析する工程、及び（３）前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質を選択する工程
を含む、前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質をスクリーニングする方法。
［２３］前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質が、ＮＴＲＫ３融合体陽性のがんの治療剤である、［２２］に記載のスクリーニング方法。
［２４］前記がんが消化器がんである、［２２］又は［２３］に記載のスクリーニング方法。
［２５］前記がんが消化管がんである、［２２］又は［２３］に記載のスクリーニング方法。
［２６］前記がんが下部消化管がんである、［２２］又は［２３］に記載のスクリーニング方法。
［２７］前記がんが大腸がんである、［２２］又は［２３］に記載のスクリーニング方法。
［２８］ＮＴＲＫ３融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質を含有する、ＮＴＲＫ３融合体陽性のがんの治療用医薬組成物。
［２９］前記ＮＴＲＫ３融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、［２８］に記載の医薬組成物。
［３０］前記ＮＴＲＫ３融合タンパク質が、［５］に記載のポリペプチドである、［２８］又は［２９］に記載の医薬組成物。
［３１］前記がんが消化器がんである、［２８］〜［３０］のいずれかに記載の医薬組成物。
［３２］前記がんが消化管がんである、［２８］〜［３０］のいずれかに記載の医薬組成物。
［３３］前記がんが下部消化管がんである、［２８］〜［３０］のいずれかに記載の医薬組成物。
［３４］前記がんが大腸がんである、［２８］〜［３０］のいずれかに記載の医薬組成物。
［３５］がんを有する患者の治療方法であって、以下の工程を含む、治療方法：
（１）［１］〜［１０］のいずれかに記載の検出方法により、ＮＴＲＫ３融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の存在を決定する工程、
（２）ＮＴＲＫ３融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の存在に基づき、ＮＴＲＫ３融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質を含む医薬組成物を前記患者に投与し、前記患者の治療を行う工程。
［３６］前記がんが消化器がんである、［３５］に記載の治療方法。
［３７］前記がんが消化管がんである、［３５］に記載の治療方法。
［３８］前記がんが下部消化管がんである、［３５］に記載の治療方法。
［３９］前記がんが大腸がんである、［３５］に記載の治療方法。
［４０］前記ＮＴＲＫ３融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、［３５］〜［３９］のいずれかに記載の治療方法。
［４１］ＮＴＲＫ３融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質の、ＮＴＲＫ３融合体陽性のがんの治療用医薬組成物の製造への使用。
［４２］ＮＴＲＫ３融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
［４３］［４２］に記載のＤＮＡが、ベクターＤＮＡに挿入されている、組換えベクター。
［４４］［４３］に記載の組換えベクターが導入されている、形質転換細胞。
［４５］前記ＮＴＲＫ３融合タンパク質が、ＥＴＶ６タンパク質とＮＴＲＫ３タンパク質との融合タンパク質である、［４２］に記載のＤＮＡ。
［４６］前記ＮＴＲＫ３融合タンパク質が、［５］に記載の融合タンパク質である、［４２］に記載のＤＮＡ。
［４７］前記ポリペプチドを発現している細胞が、［４４］に記載の形質転換細胞である、［２２］〜［２７］のいずれかに記載のスクリーニング方法。
［４８］被験者から得た消化器由来試料中の、ＥＴＶ６融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法。
［４９］前記検出方法が、ＥＴＶ６タンパク質の切断、又は、ＥＴＶ６タンパク質をコードする遺伝子の切断、を検出する工程を含む、［４８］に記載の検出方法。
［５０］前記検出方法が、ＥＴＶ６タンパク質とそれ以外の他のタンパク質とから構築される融合タンパク質の存在、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子の存在、を検出する工程を含む、［４８］に記載の検出方法。
［５１］前記融合タンパク質が、ＥＴＶ６タンパク質とＮＴＲＫ３タンパク質との融合タンパク質である、［４８］〜［５０］のいずれかに記載の検出方法。
［５２］前記融合タンパク質が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドである、［４８］〜［５１］のいずれかに記載の検出方法：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
［５３］前記ＥＴＶ６融合遺伝子が、［５２］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、［４８］〜［５２］のいずれかに記載の検出方法。
［５４］前記融合遺伝子が、ＤＮＡ又はｍＲＮＡである、［４８］〜［５３］のいずれかに記載の検出方法。
［５５］前記消化器が、消化管である、［４８］〜［５３］のいずれかに記載の検出方法。
［５６］前記消化器が、下部消化管である、［４８］〜［５３］のいずれかに記載の検出方法。
［５７］前記消化器が、大腸である、［４８］〜［５３］のいずれかに記載の検出方法。
［５８］ＥＴＶ６遺伝子５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＥＴＶ６遺伝子３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとを含む、ＥＴＶ６融合遺伝子の検出用キット。
［５９］ＥＴＶ６遺伝子と共にＥＴＶ６融合遺伝子を構成する他の遺伝子の３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＥＴＶ６遺伝子５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとを含む、ＥＴＶ６融合遺伝子の検出用キット。
［６０］ＥＴＶ６タンパク質をコードするポリヌクレオチドの、５’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、前記ポリヌクレオチドの３’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＥＴＶ６融合遺伝子の検出用キット。
［６１］ＥＴＶ６タンパク質とＮＴＲＫ３タンパク質との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＥＴＶ６融合遺伝子の検出用キット。
［６２］以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＥＴＶ６融合遺伝子の検出用キット：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
［６３］ＥＴＶ６タンパク質のＮ末端側領域を特異的に認識できる抗ＥＴＶ６抗体、及び、ＥＴＶ６タンパク質のＣ末端側領域を特異的に認識できる抗ＥＴＶ６抗体を含む、ＥＴＶ６融合タンパク質の検出用キット。
［６４］ＥＴＶ６タンパク質と共にＥＴＶ６融合タンパク質を構成する他のタンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、ＥＴＶ６タンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む、ＥＴＶ６融合タンパク質の検出用キット。
［６５］前記他のタンパク質が、ＮＴＲＫ３タンパク質である、［６４］に記載のキット。
［６６］ＥＴＶ６タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるセンスプライマー及びＮＴＲＫ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ＥＴＶ６遺伝子とＮＴＲＫ３遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは［６２］に記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなり、センスプライマーは［６２］に記載のポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でアニールする核酸分子からなるプライマーセット。
［６７］ＥＴＶ６遺伝子とＮＴＲＫ３遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。
［６８］配列番号１の塩基番号１から１００９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号１０１０から１９０２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーを含む、プライマーセット。
［６９］（１）［５］に記載のポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
（２）前記ポリペプチドの活性及び／又は発現が阻害されるか否かを分析する工程、及び（３）前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質を選択する工程
を含む、前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質をスクリーニングする方法。
［７０］前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質が、ＥＴＶ６融合体陽性のがんの治療剤である、［６９］に記載のスクリーニング方法。
［７１］前記がんが消化器がんである、［６９］又は［７０］に記載のスクリーニング方法。
［７２］前記がんが消化管がんである、［６９］又は［７０］に記載のスクリーニング方法。
［７３］前記がんが下部消化管がんである、［６９］又は［７０］に記載のスクリーニング方法。
［７４］前記がんが大腸がんである、［６９］又は［７０］に記載のスクリーニング方法。
［７５］ＥＴＶ６融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質を含有する、ＥＴＶ６融合体陽性のがんの治療用医薬組成物。
［７６］前記ＥＴＶ６融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、［７５］に記載の医薬組成物。
［７７］前記ＥＴＶ６融合タンパク質が、［５］に記載のポリペプチドである、［７５］又は［７６］に記載の医薬組成物。
［７８］前記がんが消化器がんである、［７５］〜［７７］のいずれかに記載の医薬組成物。
［７９］前記がんが消化管がんである、［７５］〜［７７］のいずれかに記載の医薬組成物。
［８０］前記がんが下部消化管がんである、［７５］〜［７７］のいずれかに記載の医薬組成物。
［８１］前記がんが大腸がんである、［７５］〜［７７］のいずれかに記載の医薬組成物。
［８２］がんを有する患者の治療方法であって、以下の工程を含む、治療方法：
（１）［４８］〜［５７］のいずれかに記載の検出方法により、ＥＴＶ６融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の存在を決定する工程、
（２）ＥＴＶ６融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の存在に基づき、ＥＴＶ６融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質を含む医薬組成物を前記患者に投与し、前記患者の治療を行う工程。
［８３］前記がんが消化器がんである、［８２］に記載の治療方法。
［８４］前記がんが消化管がんである、［８２］に記載の治療方法。
［８５］前記がんが下部消化管がんである、［８２］に記載の治療方法。
［８６］前記がんが大腸がんである、［８２］に記載の治療方法。
［８７］前記ＥＴＶ６融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、［８２］〜［８６］のいずれかに記載の治療方法。
［８８］ＥＴＶ６融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質の、ＥＴＶ６融合体陽性のがんの治療用医薬組成物の製造への使用。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の検出方法は、ＮＴＲＫ３融合体陽性のがん（特に消化器がん）を検出する方法として利用できる。また、本発明の検出方法によれば、ＮＴＲＫ３阻害物質の適用対象者であるか否かを判定することができる。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、本発明の検出方法に用いることができる。更に、本発明の阻害物質スクリーニング方法によれば、当該融合体陽性のがん患者の治療に有効な薬剤をスクリーニングすることができる。前記スクリーニングにより得られた薬剤は、ＮＴＲＫ３融合体陽性のがんの治療用医薬組成物の有効成分として使用することができ、また、ＮＴＲＫ３融合体陽性のがんの治療に用いることができる。本発明によりがんの診断を行うことができる。
本発明の検出方法は、ＥＴＶ６融合体陽性のがん（特に消化器がん）を検出する方法として利用できる。また、本発明の検出方法によれば、ＥＴＶ６阻害物質の適用対象者であるか否かを判定することができる。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、本発明の検出方法に用いることができる。更に、本発明の阻害物質スクリーニング方法によれば、当該融合体陽性のがん患者の治療に有効な薬剤をスクリーニングすることができる。前記スクリーニングにより得られた薬剤は、ＥＴＶ６融合体陽性のがんの治療用医薬組成物の有効成分として使用することができ、また、ＥＴＶ６融合体陽性のがんの治療に用いることができる。本発明によりがんの診断を行うことができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
≪定義等≫
＜融合点＞
本明細書における「ＮＴＲＫ３融合遺伝子における融合点」とは、ＮＴＲＫ３融合遺伝子におけるＮＴＲＫ３遺伝子由来のポリヌクレオチドと、ＮＴＲＫ３遺伝子と共に融合遺伝子を構築する他の遺伝子由来のポリヌクレオチドとが結合した箇所を意味する。例えば、配列番号１で表される融合遺伝子の場合、塩基配列の第１００９番塩基と第１０１０番の塩基の結合した箇所である。
本明細書における「ＮＴＲＫ３融合タンパク質における融合点」とは、ＮＴＲＫ３融合タンパク質における、ＮＴＲＫ３遺伝子由来のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドと、ＮＴＲＫ３遺伝子と共に融合遺伝子を構築するもう一方の遺伝子由来のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドとが結合した箇所を意味する。
【００１１】
本明細書における「ＥＴＶ６融合遺伝子における融合点」とは、ＥＴＶ６融合遺伝子におけるＥＴＶ６遺伝子由来のポリヌクレオチドと、ＥＴＶ６遺伝子と共に融合遺伝子を構築する他の遺伝子由来のポリヌクレオチドとが結合した箇所を意味する。例えば、配列番号１で表される融合遺伝子の場合、塩基配列の第１００９番塩基と第１０１０番の塩基の結合した箇所である。
本明細書における「ＥＴＶ６融合タンパク質における融合点」とは、ＥＴＶ６融合タンパク質における、ＥＴＶ６遺伝子由来のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドと、ＥＴＶ６遺伝子と共に融合遺伝子を構築するもう一方の遺伝子由来のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドとが結合した箇所を意味する。
【００１２】
＜ＮＴＲＫ３遺伝子又はＮＴＲＫ３タンパク質の切断＞
さらに、本明細書において、「ＮＴＲＫ３遺伝子の切断」又は「ＮＴＲＫ３遺伝子が切断されている」とは、遺伝子の転座又は逆位等によりＮＴＲＫ３遺伝子の連続性が失われている状態、すなわち、ＮＴＲＫ３遺伝子がＮＴＲＫ３キナーゼ領域を含むポリヌクレオチドと、それ以外のポリヌクレオチドと、の少なくとも２つのポリヌクレオチドとに分かれている状態を指す。なお、ＮＴＲＫ３遺伝子の切断点（break point）は、ＮＴＲＫ３遺伝子が切断されてできたポリヌクレオチドの少なくとも一つがコードするタンパク質がＮＴＲＫ３キナーゼ活性を保持する範囲で限定されない。
また、「ＮＴＲＫ３以外の他の遺伝子の切断」又は「ＮＴＲＫ３以外の他の遺伝子が切断されている」とは、遺伝子の転座又は逆位等により他の遺伝子の連続性が失われている状態、すなわち、他の遺伝子が少なくとも２つのポリヌクレオチドに分かれている状態を指す。
【００１３】
また、本明細書において、「ＮＴＲＫ３タンパク質の切断」又は「ＮＴＲＫ３タンパク質が切断されている」とは、ＮＴＲＫ３遺伝子が、前述のように切断されている状態であることに基づき、ＮＴＲＫ３タンパク質の連続性が失われている状態、すなわち、ＮＴＲＫ３タンパク質がＮＴＲＫ３キナーゼ領域を含むポリペプチドと、それ以外のポリペプチドと、の少なくとも２つのポリペプチドに分かれている状態を指す。なお、ＮＴＲＫ３タンパク質の切断点は、ＮＴＲＫ３タンパク質が切断されてできたポリペプチドの少なくとも一つがＮＴＲＫ３キナーゼ活性を保持する範囲で限定されない。
また、「ＮＴＲＫ３以外の他のタンパク質の切断」又は「ＮＴＲＫ３以外の他のタンパク質が切断されている」とは、他の遺伝子が、前述のように切断されている状態であることに基づき、他のタンパク質の連続性が失われている状態、すなわち、他のタンパク質が少なくとも２つのポリペプチドに分かれている状態を指す。
【００１４】
＜ＥＴＶ６遺伝子又はＥＴＶ６タンパク質の切断＞
更に、本明細書において、「ＥＴＶ６遺伝子の切断」又は「ＥＴＶ６遺伝子が切断されている」とは、遺伝子の転座又は逆位等によりＥＴＶ６遺伝子の連続性が失われている状態を指す。なお、ＥＴＶ６遺伝子の切断点（break point）は、ＥＴＶ６遺伝子と共にＥＴＶ６融合遺伝子を構築する他の遺伝子がコードするタンパク質の機能（例えば、当該タンパク質がキナーゼドメインを有する場合、キナーゼ活性）を保持する範囲で限定されない。
また、「ＥＴＶ６遺伝子以外の他の遺伝子の切断」又は「ＥＴＶ６遺伝子以外の他の遺伝子が切断されている」とは、遺伝子の転座又は逆位等により他の遺伝子の連続性が失われている状態、すなわち、他の遺伝子が少なくとも２つのポリヌクレオチドに分かれている状態を指す。
【００１５】
また、本明細書において、「ＥＴＶ６タンパク質の切断」又は「ＥＴＶ６タンパク質が切断されている」とは、ＥＴＶ６遺伝子が、前述のように切断されている状態であることに基づき、ＥＴＶ６タンパク質の連続性が失われている状態、すなわち、ＥＴＶ６タンパク質が少なくとも２つのポリペプチドに分かれている状態を指す。なお、ＥＴＶ６タンパク質の切断点は、ＥＴＶ６タンパク質と共にＥＴＶ６融合タンパク質を構築する他のタンパク質の機能（例えば、当該他のタンパク質がキナーゼドメインを有する場合、キナーゼ活性）を保持する範囲で限定されない。
また、「ＥＴＶ６タンパク質以外の他のタンパク質の切断」又は「ＥＴＶ６タンパク質以外の他のタンパク質が切断されている」とは、他の遺伝子が、前述のように切断されている状態であることに基づき、他のタンパク質の連続性が失われている状態、すなわち、他のタンパク質が少なくとも２つのポリペプチドに分かれている状態を指す。
【００１６】
＜５’末端側領域／３’末端側領域、Ｎ末端側領域／Ｃ末端側領域＞
５’末端側領域とは、融合遺伝子の場合は、融合点より５’末端側のポリヌクレオチド、野生型遺伝子（融合遺伝子でない遺伝子）の場合は、当該野生型遺伝子が融合遺伝子を構築した場合の、切断点より５’末端側のポリヌクレオチドを示す。なお、５’末端側領域は、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｃＤＮＡのいずれにおける領域であってもよく、例えば、ゲノムＤＮＡの場合は、５’末端側ゲノム領域ともいう。
３’末端側領域とは、融合遺伝子の場合は、融合点より３’末端側のポリヌクレオチド、野生型遺伝子（融合遺伝子でない遺伝子）の場合は、当該野生型遺伝子が融合遺伝子を構築した場合の、切断点より３’末端側のポリヌクレオチドを示す。なお、３’末端側領域は、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｃＤＮＡのいずれにおける領域であってもよく、例えば、ゲノムＤＮＡの場合は、３’末端側ゲノム領域ともいう。
Ｎ末端側領域とは、融合タンパク質の場合は、融合点よりＮ末端側のポリペプチド、野生型タンパク質（融合タンパク質でないタンパク質）の場合は、当該野生型タンパク質が融合遺伝子を構築した場合の、切断点よりＮ末端側のポリヌクレオチドを示す。
Ｃ末端側領域とは、融合タンパク質の場合は、融合点よりＣ末端側のポリペプチド、野生型タンパク質（融合タンパク質でないタンパク質）の場合は、当該野生型タンパク質が融合遺伝子を構築した場合の、切断点よりＣ末端側のポリヌクレオチドを示す。
例えば、配列番号１で表されるＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合遺伝子の場合、５’末端側領域は、第１番〜第１００９番、３’末端側領域は、第１０１０番〜１６５３番の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合タンパク質の場合、Ｎ末端側領域は、前記５’末端側領域にコードされるポリペプチドであり、Ｃ末端側領域は、前記３’末端側領域にコードされるポリペプチドである。
【００１７】
＜ｃＤＮＡリファレンス配列＞
また、本明細書において、各由来遺伝子のｃＤＮＡリファレンス配列として、ＮＴＲＫ３はENST00000394480、ＥＴＶ６はENST00000396373を、タンパク質のアミノ酸リファレンス配列としては、ＮＴＲＫ３はENSP00000377990、ＥＴＶ６はENSP00000379658を用いた。
【００１８】
＜ストリンジェントな条件＞
本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」の条件である。「よりストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」の条件である。
【００１９】
＜腫瘍形成能＞
あるポリペプチドが「腫瘍形成能を有する」ことは、公知の方法、例えば、ＷＯ２０１１／１６２２９５の実施例４の方法で確認することができる。具体的には、当該ポリペプチドを発現するプラスミドを導入した宿主（３Ｔ３繊維芽細胞）をヌードマウスの皮下に接種し、腫瘍形成の有無で判断する方法で確認する。なお、ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合遺伝子については、導入細胞における形質転換及び導入細胞移植マウスにおける腫瘍形成能が示されており、本融合遺伝子又はその転写産物の存在は、発現部位におけるがんの原因であることが示唆されている（Wai DHら、Oncogene. 2000 Feb 17;19(7):906-915）。
【００２０】
≪本発明の検出方法に係る試料≫
＜対象臓器＞
本発明に係る検出方法は、対象臓器に生じるがんの検出に好適に用いることができる。被験者の被験部位（対象臓器）としては、消化器が好ましく、消化管がより好ましく、胃腸が更に好ましく、下部消化管が更に好ましく、大腸が更に好ましい。
より具体的には、本発明に係る検出方法は、消化器がんの検出に好適に、消化管がんの検出により好適に、胃腸がんの検出に更に好適に、下部消化管がんの検出に更に好適に、大腸がんの検出に更に好適に用いることができる。
【００２１】
＜被験者からの採取物＞
本発明に係る検出方法における、被験者から得た試料としては、被験者からの採取物（生体から分離した試料）、具体的には、任意の採取された体液（好ましくは血液）、被験者患部からの摘出検体、生検試料又は擦過検体、糞便、尿、消化管洗浄液等を用いることができる。前記消化管洗浄液は、消化管全体の洗浄液であっても、あるいは、少なくとも被験部位を含む消化管の洗浄液、例えば、下部消化管の洗浄液、大腸の洗浄液であってもよい。検出感度を考慮すると、前記対象臓器における被験部位の細胞が含まれる試料が好ましく、被験者の被験部位からの摘出検体又は生検試料が更に好ましい。
【００２２】
＜採取物の調製＞
本発明に係るＮＴＲＫ３融合遺伝子、又は、ＮＴＲＫ３融合タンパク質の検出方法は、被験者から得た試料の組織切片、又は、細胞懸濁液等を作成し、組織切片又は細胞懸濁液に含まれる細胞に対し、当業者に周知の技法により、ＮＴＲＫ３融合遺伝子、又は、ＮＴＲＫ３融合タンパク質を検出することにより実施できる。あるいは、前述の被験者から得た試料から、可溶化液を調製し、ここに含まれる遺伝子、又は、タンパク質を抽出し、この抽出試料において、当業者に周知の技法により、ＮＴＲＫ３融合遺伝子、又は、ＮＴＲＫ３融合タンパク質を検出してもよい。なお、ＮＴＲＫ３融合遺伝子の検出とは、ＮＴＲＫ３融合遺伝子のゲノムＤＮＡの検出、当該ゲノムＤＮＡの転写産物であるｍＲＮＡ、又は、ｍＲＮＡを鋳型として得られるｃＤＮＡの検出のいずれであってもよい。
【００２３】
本発明に係るＥＴＶ６融合遺伝子、又は、ＥＴＶ６融合タンパク質の検出方法は、被験者から得た試料の組織切片、又は、細胞懸濁液等を作成し、組織切片又は細胞懸濁液に含まれる細胞に対し、当業者に周知の技法により、ＥＴＶ６融合遺伝子、又は、ＥＴＶ６融合タンパク質を検出することにより実施できる。あるいは、前述の被験者から得た試料から、可溶化液を調製し、ここに含まれる遺伝子、又は、タンパク質を抽出し、この抽出試料において、当業者に周知の技法により、ＥＴＶ６融合遺伝子、又は、ＥＴＶ６融合タンパク質を検出してもよい。なお、ＥＴＶ６融合遺伝子の検出とは、ＥＴＶ６融合遺伝子のゲノムＤＮＡの検出、当該ゲノムＤＮＡの転写産物であるｍＲＮＡ、又は、ｍＲＮＡを鋳型として得られるｃＤＮＡの検出のいずれであってもよい。
【００２４】
≪本発明の検出方法に係る検出対象≫
本発明の検出方法には、被験者から得た試料中の、ＮＴＲＫ３融合体の検出方法、すなわち、ＮＴＲＫ３キナーゼ領域を含む融合タンパク質（「ＮＴＲＫ３融合タンパク質」ともいう）の検出方法、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子（「ＮＴＲＫ３融合遺伝子」ともいう）の検出方法が含まれる。
本発明の検出方法には、被験者から得た試料中の、ＥＴＶ６融合体の検出方法、すなわち、ＥＴＶ６融合タンパク質の検出方法、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子（「ＥＴＶ６融合遺伝子」ともいう）の検出方法が含まれる。
【００２５】
＜ＮＴＲＫ３融合体：ＮＴＲＫ３融合タンパク質とＮＴＲＫ３融合遺伝子＞
本発明に係るＮＴＲＫ３融合体は、ＮＴＲＫ３融合タンパク質とＮＴＲＫ３融合遺伝子を含む。
本発明に係るＮＴＲＫ３融合遺伝子は、ＮＴＲＫ３融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
本発明に係るＮＴＲＫ３融合タンパク質は、ＮＴＲＫ３タンパク質由来のポリペプチドと、ＮＴＲＫ３以外の他のタンパク質由来のポリペプチドと、から構築される融合ポリペプチドであって、前記ＮＴＲＫ３タンパク質由来のポリペプチドは、ＮＴＲＫ３タンパク質における少なくともＮＴＲＫ３キナーゼ領域のポリペプチドを含み、ＮＴＲＫ３以外の他のタンパク質由来のポリペプチドは、他のタンパク質における少なくとも一部のポリペプチドを含む範囲で特に制限されない。
【００２６】
前記他のタンパク質としては、ＮＴＲＫ３キナーゼドメインを含むＮＴＲＫ３タンパク質の一部と融合することにより、構築されたＮＴＲＫ３融合タンパク質が腫瘍形成能を有するものであれば特に制限されない。構築されたＮＴＲＫ３融合タンパク質において、ＮＴＲＫ３キナーゼ活性化が恒常的に維持されることにより、ＮＴＲＫ３融合タンパク質が腫瘍形成能を有することが好ましい。
【００２７】
また、ＮＴＲＫ３融合タンパク質は、ＮＴＲＫ３キナーゼ活性化が恒常的に維持され、構築されたＮＴＲＫ３融合タンパク質が腫瘍形成能を有する範囲で、ＮＴＲＫ３タンパク質由来のポリペプチド、及び、ＮＴＲＫ３タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドのいずれでもない、第３のポリペプチドを含んでいてもよい。第３のポリペプチドは、ＮＴＲＫ３融合タンパク質のＮ末端に位置していても、Ｃ末端に位置していても、或いは、ＮＴＲＫ３タンパク質由来のポリペプチドとＮＴＲＫ３タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとの間に位置していてもよい。
【００２８】
ＮＴＲＫ３融合タンパク質としては、前記他のタンパク質が、ＥＴＶ６タンパク質である融合タンパク質が特に好ましい。すなわち、少なくともＮＴＲＫ３キナーゼ領域のポリペプチドを含む、ＮＴＲＫ３タンパク質由来のポリペプチドと、ＥＴＶ６タンパク質の少なくとも一部のポリペプチドとを含む、ＥＴＶ６遺伝子由来のポリペプチドと、から構築された、ＮＴＲＫ３タンパク質とＥＴＶ６タンパク質の融合タンパク質（以下、ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合タンパク質ともいう）であることが好ましい。
【００２９】
＜ＥＴＶ６融合体：ＥＴＶ６融合タンパク質とＥＴＶ６融合遺伝子＞
本発明に係るＥＴＶ６融合体は、ＥＴＶ６融合タンパク質とＥＴＶ６融合遺伝子を含む。
本発明に係るＥＴＶ６融合遺伝子は、ＥＴＶ６融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
本発明に係るＥＴＶ６融合タンパク質は、ＥＴＶ６タンパク質由来のポリペプチドと、ＥＴＶ６タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドと、から構築される融合ポリペプチドであって、前記ＥＴＶ６タンパク質由来のポリペプチドは、ＥＴＶ６タンパク質における少なくとも一部のポリペプチドを含み、ＥＴＶ６タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドは、他のタンパク質における少なくとも一部のポリペプチドを含む範囲で特に制限されない。
【００３０】
前記他のタンパク質としては、ＥＴＶ６タンパク質の一部と融合することにより、構築されたＥＴＶ６融合タンパク質が腫瘍形成能を有するものであれば特に制限されない。当該他のタンパク質の有する機能性ドメイン（好ましくは、キナーゼドメイン）の活性化が恒常的に維持されることにより、ＥＴＶ６融合タンパク質が腫瘍形成能を有することが好ましい。
【００３１】
また、ＥＴＶ６融合タンパク質は、ＥＴＶ６タンパク質の一部と融合することによりＥＴＶ６タンパク質以外の他のタンパク質の機能性ドメインの活性化が恒常的に維持され、構築されたＥＴＶ６融合タンパク質が腫瘍形成能を有する範囲で、ＥＴＶ６タンパク質由来のポリペプチド、及び、ＥＴＶ６タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドのいずれでもない、第３のポリペプチドを含んでいてもよい。第３のポリペプチドは、ＥＴＶ６融合タンパク質のＮ末端に位置していても、Ｃ末端に位置していても、或いは、ＥＴＶ６タンパク質由来のポリペプチドとＥＴＶ６タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとの間に位置していてもよい。
【００３２】
ＥＴＶ６融合タンパク質としては、前記他のタンパク質が、ＮＴＲＫ３タンパク質である融合タンパク質が特に好ましい。すなわち、ＥＴＶ６タンパク質の少なくとも一部のポリペプチドを含む、ＥＴＶ６タンパク質由来のポリペプチドと、少なくともＮＴＲＫ３キナーゼ領域のポリペプチドを含む、ＮＴＲＫ３タンパク質の少なくとも一部のポリペプチドと、から構築された、ＥＴＶ６タンパク質とＮＴＲＫ３タンパク質との融合タンパク質（以下、ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合タンパク質ともいう）であることが好ましい。
【００３３】
「ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合タンパク質」としては、下記（ａ）〜（ｄ）に記載のポリペプチドが特に好ましい：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）、及び
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）。
【００３４】
配列番号２で表されるアミノ酸配列は、配列番号１で表される塩基配列によりコードされる配列である。また、配列番号１で表される塩基配列は、ＥＴＶ６遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン５までとＮＴＲＫ３遺伝子のエクソン１５からエクソン１９の停止コドンまでの塩基配列からなる。配列番号１で表される塩基配列の内、塩基番号１〜１００９の配列はＥＴＶ６遺伝子に由来し、塩基番号１０１０〜１６５３の配列はＮＴＲＫ３遺伝子に由来する。以下、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドをＥＴＶ６ｅｘ５−ＮＴＲＫ３ｅｘ１５と称する。
【００３５】
「機能的等価改変体」において置換、欠失、及び／又は挿入可能なアミノ酸数は、１〜数個であるが、好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜７個、最も好ましくは１〜５個である。
【００３６】
「相同ポリペプチド」は、「配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、腫瘍形成能を有するポリペプチド」であるが、該同一性が、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチドが好ましい。
【００３７】
なお、本明細書における前記「同一性」とは、ＮＥＥＤＬＥ ｐｒｏｇｒａｍ（J Mol Biol 1970; 48: 443-453）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｙを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ １０
Ｅｘｔｅｎｄ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ０．５
Ｍａｔｒｉｘ ＝ ＥＢＬＯＳＵＭ６２
【００３８】
≪本発明の検出方法の態様（融合遺伝子及び融合タンパク質の検出方法）≫
本発明の検出方法には、被験者から得た消化器由来試料中の、ＮＴＲＫ３遺伝子の切断、又は、ＮＴＲＫ３遺伝子にコードされるポリペプチドの切断、を検出する工程を含む検出方法と、被験者から得た消化器由来試料中の、ＮＴＲＫ３遺伝子とそれ以外の他の遺伝子とから構築される融合遺伝子の存在、又は、前記融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の存在、を検出する工程を含む検出方法が含まれる。
本発明の検出方法には、被験者から得た消化器由来試料中の、ＥＴＶ６遺伝子の切断、又は、ＥＴＶ６遺伝子にコードされるポリペプチドの切断、を検出する工程を含む検出方法と、被験者から得た消化器由来試料中の、ＥＴＶ６遺伝子とそれ以外の他の遺伝子とから構築される融合遺伝子の存在、又は、前記融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の存在、を検出する工程を含む検出方法が含まれる。
【００３９】
＜ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出する態様＞
以下、ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出する態様について述べるが、これらに限定されるものではない。
なお、以下の各態様における遺伝子の特定の領域の検出は、その例示に関わらず、あらかじめ解析した塩基配列に基づいて設計されたプローブ又はプライマーを用いて行っても、あるいは、シーケンシングによって行ってもよい。
【００４０】
〔ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出する態様（１）〕
〈ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出する態様（１−ａ）〉
ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出する一態様として、ＮＴＲＫ３融合遺伝子が構築されているとき、ＮＴＲＫ３遺伝子が２つ以上のポリヌクレオチドに切断されていることに基づき、ＮＴＲＫ３遺伝子が切断されている状態、すなわち、ＮＴＲＫ３遺伝子の５’末端側領域とＮＴＲＫ３遺伝子の３’末端側領域との連続性が失われていることを検出することにより、ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ＮＴＲＫ３遺伝子の５’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第１のプローブと、ＮＴＲＫ３遺伝子の３’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第２のプローブを用い、当該２つの遺伝子領域が染色体上で離れていることを検出することにより、ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出することができる。
なお、ＮＴＲＫ３遺伝子由来のポリヌクレオチドと融合して融合遺伝子を構築している他の遺伝子が切断されている状態を前記方法で確認することにより、ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出してもよい。
【００４１】
〈ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出する態様（１−ｂ）〉
他の一態様として、ＮＴＲＫ３遺伝子の、５’末端側領域と、３’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることにより、ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出することができる。具体的には、例えば、ＮＴＲＫ３遺伝子の５’末端側領域の発現量と、ＮＴＲＫ３遺伝子３’末端側領域の発現量とが異なる場合、ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出することができる。
あるいは、ＮＴＲＫ３遺伝子と共にＮＴＲＫ３融合遺伝子を構築しているＮＴＲＫ３遺伝子以外の他の遺伝子について、前記方法で確認することにより、ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出してもよい。
【００４２】
〈ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出する態様（１−ｃ）〉
他の一態様として、ＮＴＲＫ３融合遺伝子の形成過程において、ＮＴＲＫ３遺伝子又はＮＴＲＫ３遺伝子以外の他の遺伝子の少なくとも一部の複製（duplication）を伴う場合、すなわち、ＮＴＲＫ３遺伝子由来の重複したポリヌクレオチドと、ＮＴＲＫ３と共にＮＴＲＫ３融合遺伝子を構築しているＮＴＲＫ３遺伝子以外の他の遺伝子由来の重複したポリヌクレオチドとからＮＴＲＫ３融合遺伝子が構築されている場合、ＮＴＲＫ３遺伝子由来のポリヌクレオチド又は前記他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの重複を検出することにより、ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出することができる。
【００４３】
〔ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出する態様（２）〕
ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出する一態様として、ＮＴＲＫ３融合遺伝子が、ＮＴＲＫ３遺伝子由来ポリヌクレオチドと、ＮＴＲＫ３以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドと融合して構築されていることに基づき、ＮＴＲＫ３融合遺伝子における、ＮＴＲＫ３遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部と、ＮＴＲＫ３以外の遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部とが連続して含まれる融合ポリヌクレオチドを検出することにより、ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ＮＴＲＫ３以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの５’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第１のプローブと、ＮＴＲＫ３遺伝子３’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第２のプローブを用い、当該２つの遺伝子領域が染色体上で近接していることを検出することにより、ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出することができる。ＮＴＲＫ３以外の他の遺伝子が、ＥＴＶ６の場合、すなわちＮＴＲＫ３融合遺伝子がＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合遺伝子である場合、第１のプローブはＥＴＶ６遺伝子由来のポリヌクレオチドの５’末端側領域に特異的にハイブリダイズするプローブを用いればよい。
【００４４】
〔ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出する態様（３）〕
ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出する一態様として、ＮＴＲＫ３融合遺伝子が、ＮＴＲＫ３遺伝子由来ポリヌクレオチドと、ＮＴＲＫ３以外の他の遺伝子由来ポリヌクレオチドとが、融合点において融合して構築されていることに基づき、ＮＴＲＫ３融合遺伝子における、ＮＴＲＫ３遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部と、ＮＴＲＫ３以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部とが、融合点を含んで連続して含まれる融合ポリヌクレオチドを検出することにより、ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ＮＴＲＫ３遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの５’末端側領域に特異的にアニールする第１のプライマーと、ＮＴＲＫ３遺伝子３’末端側領域に特異的にアニールする第２のプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行い、融合点の存在を示す所定のＰＣＲ産物が得られることを確認することにより、ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出することができる。
【００４５】
＜ＮＴＲＫ３融合タンパク質を検出する態様＞
以下、ＮＴＲＫ３タンパク質を検出する態様について述べるが、これらに限定されるものではない。
【００４６】
〔ＮＴＲＫ３融合タンパク質を検出する態様（１）〕
〈ＮＴＲＫ３融合タンパク質を検出する態様（１−ａ）〉
ＮＴＲＫ３融合タンパク質を検出する態様として、ＮＴＲＫ３融合遺伝子が構築されているとき、ＮＴＲＫ３遺伝子にコードされるＮＴＲＫ３タンパク質も切断されることに基づき、ＮＴＲＫ３タンパク質が切断されている状態、すなわち、ＮＴＲＫ３タンパク質のＮ末端側領域とＣ末端側領域とが連続せずに切断されていることを検出することにより、ＮＴＲＫ３融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ＮＴＲＫ３タンパク質のＮ末端側領域に特異的に結合する第１の抗体と、ＮＴＲＫ３タンパク質のＣ末端側領域に特異的に結合する第２の抗体を用い、当該２つの領域が、同一のタンパク質に存在しない（すなわち、異なるタンパク質に存在する）ことを確認することにより、ＮＴＲＫ３融合タンパク質を検出することができる。
あるいは、ＮＴＲＫ３タンパク質と共に融合タンパク質を構築しているＮＴＲＫ３タンパク質以外の他のタンパク質が切断されている状態を前記方法により確認することで、ＮＴＲＫ３融合タンパク質を検出してもよい。
【００４７】
〈ＮＴＲＫ３融合タンパク質を検出する態様（１−ｂ）〉
他の一態様として、ＮＴＲＫ３タンパク質の、Ｎ末端側領域と、Ｃ末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることにより、ＮＴＲＫ３融合タンパク質を検出することができる。具体的には、例えば、ＮＴＲＫ３タンパク質のＮ末端側領域の発現量と、ＮＴＲＫ３タンパク質のＣ末端側領域の発現量とが異なることを指標として、ＮＴＲＫ３融合タンパク質を検出することができる。
あるいは、ＮＴＲＫ３タンパク質と共にＮＴＲＫ３融合タンパク質を構築しているＮＴＲＫ３タンパク質以外の他のタンパク質について、前記方法で確認することにより、ＮＴＲＫ３融合タンパク質を検出してもよい。
【００４８】
〔ＮＴＲＫ３融合タンパク質を検出する態様（２）〕
ＮＴＲＫ３融合タンパク質を検出する一態様では、ＮＴＲＫ３融合タンパク質が、ＮＴＲＫ３タンパク質由来ポリペプチドと、ＮＴＲＫ３以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとが融合して構築されていることに基づき、ＮＴＲＫ３融合タンパク質における、ＮＴＲＫ３タンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部と、前記他のタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部が連続して含まれる融合ポリペプチドを検出することにより、ＮＴＲＫ３融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ＮＴＲＫ３以外の他のタンパク質のＮ末端側領域に特異的に結合する第１の抗体と、ＮＴＲＫ３タンパク質のＣ末端側領域に特異的に結合する第２の抗体を用い、当該２つの領域が、同一のタンパク質に存在することを確認することにより、ＮＴＲＫ３融合タンパク質を検出することができる。
【００４９】
〔ＮＴＲＫ３融合タンパク質を検出する態様（３）〕
ＮＴＲＫ３融合タンパク質を検出する一態様では、ＮＴＲＫ３融合タンパク質が、ＮＴＲＫ３タンパク質由来ポリペプチドと、ＮＴＲＫ３以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとが融合点で融合して構築されていることに基づき、ＮＴＲＫ３融合タンパク質における、前記融合点を含むＮＴＲＫ３タンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部と、前記他のタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部が連続して含まれる融合ポリペプチドを検出することにより、ＮＴＲＫ３融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ＮＴＲＫ３融合タンパク質の融合点を含むポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法により、ＮＴＲＫ３融合タンパク質を検出することができる。
【００５０】
〔ＮＴＲＫ３融合タンパク質を検出する態様（４）〕
ＮＴＲＫ３融合タンパク質を検出する一態様では、ＮＴＲＫ３融合タンパク質の活性を指標にＮＴＲＫ３融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、野生型ＮＴＲＫ３タンパク質に対して阻害活性のある物質を用いて野生型ＮＴＲＫ３タンパク質の活性を阻害した上で、ＮＴＲＫ３タンパク質のキナーゼ活性を測定し、ＮＴＲＫ３融合タンパク質を含まない（野生型ＮＴＲＫ３タンパク質のみを含む）場合に比較して、活性が高いことを指標にＮＴＲＫ３融合タンパク質を検出することができる。なお、ＮＴＲＫ３タンパク質のキナーゼ活性の測定には当業者に周知の方法を適宜選択することができ、例えば、ＮＴＲＫ３によりリン酸化を受ける分子のリン酸化状態を検出してもよい。
【００５１】
なお、ＮＴＲＫ３融合タンパク質の検出は、ＮＴＲＫ３融合タンパク質を構成する全長ポリペプチドの存在、あるいは、ＮＴＲＫ３融合タンパク質の一部を構成するポリペプチドの存在を指標として行ってもよく、ＮＴＲＫ３融合タンパク質の存在が確認できる範囲で制限されない。
【００５２】
＜ＥＴＶ６融合遺伝子を検出する態様＞
以下、ＥＴＶ６融合遺伝子を検出する態様について述べるが、これらに限定されるものではない。
なお、以下の各態様における遺伝子の特定の領域の検出は、その例示に関わらず、あらかじめ解析した塩基配列に基づいて設計されたプローブ又はプライマーを用いて行っても、あるいは、シーケンシングによって行ってもよい。
【００５３】
〔ＥＴＶ６融合遺伝子を検出する態様（１）〕
〈ＥＴＶ６融合遺伝子を検出する態様（１−ａ）〉
ＥＴＶ６融合遺伝子を検出する一態様として、ＥＴＶ６融合遺伝子が構築されているとき、ＥＴＶ６遺伝子が２つ以上のポリヌクレオチドに切断されていることに基づき、ＥＴＶ６遺伝子が切断されている状態、すなわち、ＥＴＶ６遺伝子の５’末端側領域とＥＴＶ６遺伝子の３’末端側領域との連続性が失われていることを検出することにより、ＥＴＶ６融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ＥＴＶ６遺伝子の５’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第１のプローブと、ＥＴＶ６遺伝子の３’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第２のプローブを用い、当該２つの遺伝子領域が染色体上で離れていることを検出することにより、ＥＴＶ６融合遺伝子を検出することができる。
なお、ＥＴＶ６遺伝子由来のポリヌクレオチドと融合して融合遺伝子を構築している他の遺伝子が切断されている状態を前記方法で確認することにより、ＥＴＶ６融合遺伝子を検出してもよい。
【００５４】
〈ＥＴＶ６融合遺伝子を検出する態様（１−ｂ）〉
他の一態様として、ＥＴＶ６遺伝子の、５’末端側領域と、３’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることにより、ＥＴＶ６融合遺伝子を検出することができる。具体的には、例えば、ＥＴＶ６遺伝子の５’末端側領域の発現量と、ＥＴＶ６遺伝子３’末端側領域の発現量とが異なる場合、ＥＴＶ６融合遺伝子を検出することができる。
あるいは、ＥＴＶ６遺伝子と共にＥＴＶ６融合遺伝子を構築しているＥＴＶ６遺伝子以外の他の遺伝子について、前記方法で確認することにより、ＥＴＶ６融合遺伝子を検出してもよい。
【００５５】
〈ＥＴＶ６融合遺伝子を検出する態様（１−ｃ）〉
他の一態様として、ＥＴＶ６融合遺伝子の形成過程において、ＥＴＶ６遺伝子、あるいは、ＥＴＶ６遺伝子以外の他の遺伝子の少なくとも一部の複製（duplication）を伴う場合、すなわち、ＥＴＶ６遺伝子由来の重複したポリヌクレオチドと、ＥＴＶ６と共にＥＴＶ６融合遺伝子を構築しているＥＴＶ６遺伝子以外の他の遺伝子由来の重複したポリヌクレオチドとからＥＴＶ６融合遺伝子が構築されている場合、ＥＴＶ６遺伝子由来のポリヌクレオチド又は前記他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの重複を検出することにより、ＥＴＶ６融合遺伝子を検出することができる。
【００５６】
〔ＥＴＶ６融合遺伝子を検出する態様（２）〕
ＥＴＶ６融合遺伝子を検出する一態様として、ＥＴＶ６融合遺伝子が、ＥＴＶ６遺伝子由来ポリヌクレオチドと、ＥＴＶ６遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドと融合して構築されていることに基づき、ＥＴＶ６融合遺伝子における、ＥＴＶ６遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部と、ＥＴＶ６遺伝子以外の遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部とが連続して含まれる融合ポリヌクレオチドを検出することにより、ＥＴＶ６融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ＥＴＶ６遺伝子由来のポリヌクレオチドの５’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第１のプローブと、ＥＴＶ６遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの３’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第２のプローブを用い、当該２つの遺伝子領域が染色体上で近接していることを検出することにより、ＥＴＶ６融合遺伝子を検出することができる。ＥＴＶ６遺伝子以外の他の遺伝子が、ＮＴＲＫ３遺伝子の場合、すなわちＥＴＶ６融合遺伝子がＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合遺伝子である場合、第２のプローブはＮＴＲＫ３遺伝子由来のポリヌクレオチドの３’末端側領域に特異的にハイブリダイズするプローブを用いればよい。
【００５７】
〔ＥＴＶ６融合遺伝子を検出する態様（３）〕
ＥＴＶ６融合遺伝子を検出する一態様として、ＥＴＶ６融合遺伝子が、ＥＴＶ６遺伝子由来ポリヌクレオチドと、ＥＴＶ６遺伝子以外の他の遺伝子由来ポリヌクレオチドとが、融合点において融合して構築されていることに基づき、ＥＴＶ６融合遺伝子における、ＥＴＶ６遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部と、ＥＴＶ６遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部とが、融合点を含んで連続して含まれる融合ポリヌクレオチドを検出することにより、ＥＴＶ６融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ＥＴＶ６遺伝子由来のポリヌクレオチドの５’末端側領域に特異的にアニールする第１のプライマーと、ＥＴＶ６遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの３’末端側領域に特異的にアニールする第２のプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行い、融合点の存在を示す所定のＰＣＲ産物が得られることを確認することにより、ＥＴＶ６融合遺伝子を検出することができる。
【００５８】
＜ＥＴＶ６融合タンパク質を検出する態様＞
以下、ＥＴＶ６融合タンパク質を検出する態様について述べるが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
〔ＥＴＶ６融合タンパク質を検出する態様（１）〕
〈ＥＴＶ６融合タンパク質を検出する態様（１−ａ）〉
ＥＴＶ６融合タンパク質を検出する態様として、ＥＴＶ６融合遺伝子が構築されているとき、ＥＴＶ６遺伝子にコードされるＥＴＶ６タンパク質も切断されていることに基づき、ＥＴＶ６タンパク質が切断されている状態、すなわち、ＥＴＶ６タンパク質のＮ末端側領域とＣ末端側領域との連続性が失われていることを検出することにより、ＥＴＶ６融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ＥＴＶ６タンパク質のＮ末端側領域に特異的に結合する第１の抗体と、ＥＴＶ６タンパク質のＣ末端側領域に特異的に結合する第２の抗体を用い、当該２つの領域が、同一のタンパク質に存在しないことを確認することにより、ＥＴＶ６融合タンパク質を検出することができる。
あるいは、ＥＴＶ６タンパク質と共に融合タンパク質を構築しているＥＴＶ６タンパク質以外の他のタンパク質が切断されている状態を前記方法により確認することで、ＥＴＶ６融合タンパク質を検出してもよい。
【００６０】
〈ＥＴＶ６融合タンパク質を検出する態様（１−ｂ）〉
他の一態様として、ＥＴＶ６タンパク質の、Ｎ末端側領域と、Ｃ末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることにより、ＥＴＶ６融合タンパク質を検出することができる。具体的には、例えば、ＥＴＶ６タンパク質のＮ末端側領域の発現量と、ＥＴＶ６タンパク質Ｃ末端側領域の発現量とが異なることを指標として、ＥＴＶ６融合タンパク質を検出することができる。
あるいは、ＥＴＶ６タンパク質と共にＥＴＶ６融合タンパク質を構築しているＥＴＶ６タンパク質以外の他のタンパク質について、前記方法で確認することにより、ＥＴＶ６融合タンパク質を検出してもよい。
【００６１】
〔ＥＴＶ６融合タンパク質を検出する態様（２）〕
ＥＴＶ６融合タンパク質を検出する一態様では、ＥＴＶ６融合タンパク質が、ＥＴＶ６タンパク質由来ポリペプチドと、ＥＴＶ６タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとが融合して構築されていることに基づき、ＥＴＶ６融合タンパク質における、ＥＴＶ６タンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部と、前記他のタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部が連続して含まれる融合ポリペプチドを検出することにより、ＥＴＶ６融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ＥＴＶ６タンパク質のＮ末端側領域に特異的に結合する第１の抗体と、ＥＴＶ６タンパク質以外の他のタンパク質のＣ末端側領域に特異的に結合する第２の抗体を用い、当該２つの領域が、同一のタンパク質に存在することを確認することにより、ＥＴＶ６融合タンパク質を検出することができる。
【００６２】
〔ＥＴＶ６融合タンパク質を検出する態様（３）〕
ＥＴＶ６融合タンパク質を検出する一態様では、ＥＴＶ６融合タンパク質が、ＥＴＶ６タンパク質由来ポリペプチドと、ＥＴＶ６タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとが融合点で融合して構築されていることに基づき、ＥＴＶ６融合タンパク質における、前記融合点を含むＥＴＶ６タンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部と、前記他のタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部が連続して含まれる融合ポリペプチドを検出することにより、ＥＴＶ６融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ＥＴＶ６融合タンパク質の融合点を含むポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法により、ＥＴＶ６融合タンパク質を検出することができる。
【００６３】
〔ＥＴＶ６融合タンパク質を検出する態様（４）〕
ＥＴＶ６融合タンパク質を検出する一態様では、ＥＴＶ６融合タンパク質の活性を指標にＥＴＶ６融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ＥＴＶ６タンパク質と共に融合タンパク質を構築するＥＴＶ６タンパク質以外の他のタンパク質が酵素活性を有するタンパク質である場合、ＥＴＶ６融合タンパク質を含まない（野生型ＥＴＶ６タンパク質のみを含む）場合に比較して、当該酵素活性が高いことを指標に、ＥＴＶ６融合タンパク質を検出することができる。なお、酵素活性の測定には当業者に周知の方法を適宜選択することができ、例えば、前記他のタンパク質がキナーゼ活性を有するタンパク質（好ましくはＮＴＲＫ３タンパク質）である場合、ＥＴＶ６融合タンパク質によりリン酸化を受ける分子のリン酸化状態を検出してもよい。
【００６４】
なお、ＥＴＶ６融合タンパク質の検出は、ＥＴＶ６融合タンパク質を構成する全長ポリペプチドの存在、あるいは、ＥＴＶ６融合タンパク質の一部を構成するポリペプチドの存在を指標として行ってもよく、ＥＴＶ６融合タンパク質の存在が確認できる範囲で制限されない。
【００６５】
≪検出方法に用いる技法≫
以下、ＮＴＲＫ３融合遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡ）の検出、ＥＴＶ６融合遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡ）の検出、ＮＴＲＫ３融合タンパク質の検出、ＥＴＶ６融合タンパク質の検出の工程及び検出技法について、より詳細に説明するが、これらに制限されるものではない。
なお、被験者から得た試料から、遺伝子（ゲノムＤＮＡ、又は、ｍＲＮＡ）又は、タンパク質を抽出した場合、あるいは、組織切片、又は、細胞懸濁液等を作成した場合において、調製された試料においてＮＴＲＫ３融合遺伝子又はＥＴＶ６融合遺伝子、又は、ＮＴＲＫ３融合タンパク質又はＥＴＶ６融合タンパク質を検出するために好適な技法は、当業者が適宜選択することができる。
【００６６】
＜融合遺伝子の検出＞
ＮＴＲＫ３融合遺伝子又はＥＴＶ６融合遺伝子の検出は、ＮＴＲＫ３融合遺伝子又はＥＴＶ６融合遺伝子のゲノムＤＮＡの検出、当該ゲノムＤＮＡの転写産物であるｍＲＮＡの検出、又は、ｍＲＮＡを鋳型として得られるｃＤＮＡの検出のいずれであってもよい。
被験者から得た試料中の、ＮＴＲＫ３融合遺伝子（ゲノムＤＮＡ、又は、ｍＲＮＡ）又はＥＴＶ６融合遺伝子（ゲノムＤＮＡ、又は、ｍＲＮＡ）を検出する技法としては、ＮＴＲＫ３融合遺伝子又はＥＴＶ６融合遺伝子の少なくとも一部にハイブリダイズするプローブ（核酸プローブ等）を使用したハイブリダイゼーション技術、又は、ＮＴＲＫ３融合遺伝子又はＥＴＶ６融合遺伝子の少なくとも一部にアニールするプライマーを用いた遺伝子増幅技術等、遺伝子の検出に用いられる当業者に周知のいかなる技法、及び、これらの技法を応用した技法を用いることができる。
すなわち、ＰＣＲ、ＬＣＲ（Ligase chain reaction）、ＳＤＡ（Strand displacement amplification）、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-based amplification）、ＩＣＡＮ（Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids）、ＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）法、ＴＭＡ法（Gen-Probe’s TMA system）、インサイチュハイブリダイゼーション法、マイクロアレイ法、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、ドットブロット法、ＲＮＡプロテクション法、ＤＮＡシーケンス、ＲＮＡシーケンス等のいかなる技法を用いてもよい。
【００６７】
〔ゲノムＤＮＡの検出〕
ゲノムＤＮＡの検出には、インサイチュハイブリダイゼーション技術を好適に用いることができる。インサイチュハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、例えば、公知のＦＩＳＨ法に従って実施することができる。又は、クロモジェニックインサイチュハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）法とシルバーインサイチュハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）法を組み合わせたフュージョンアッセイ（fusion assay）で実施することができる。好適には、実施例４又は５に記載のＦＩＳＨ法スプリットアッセイ、又は、ＦＩＳＨ法フュージョンアッセイで検出することができる。
【００６８】
あるいは、ゲノムＤＮＡの検出には、ＤＮＡシーケンス技術を好適に用いることができる。シーケンシングには、従来のサンガー法に基づくシーケンサーを使用してもよいが、解析の効率を考慮すると、次世代シーケンサーを使用することが好ましい（例えば、Metzker ML、Nat Rev Genet. 2010 Jan;11(1):31-46参照）。次世代シーケンサーとしては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＭｉＳｅｑ／ＨｉＳｅｑ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｇｉｅｓ社のＳＯＬｉＤシステム、Ｒｏｃｈｅ社の４５４シーケンスシステム（ＧＳ ＦＬＸ＋／ＧＳ Ｊｕｎｉｏｒ）等が例示できる。シーケンシングにおいては、シーケンスキャプチャ技術等を用いて、融合遺伝子が存在している可能性がある領域を濃縮（enrich）することで、解析の効率を向上させることができる。シーケンスキャプチャ技術としては、Ｒｏｃｈｅ社のＲｏｃｈｅ ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＳｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ等が例示できる。
以下に、ゲノムＤＮＡの検出のための代表的な方法を例示するが、これらに限定されるものではない。
【００６９】
〈ＦＩＳＨ法スプリットアッセイ〉
ＮＴＲＫ３融合遺伝子のＦＩＳＨ法スプリットアッセイでは、検出用プローブとして、後述の実施例５で詳細に説明するように、ＮＴＲＫ３遺伝子の５’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、同遺伝子の３’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせを使用する。正常な場合には、２つの遺伝子領域（各遺伝子ごとの５’末端側領域と３’末端側領域）が近接しているため、２つのシグナルが重なった色（例えば、赤色蛍光色素と緑色蛍光色素を使用する場合には、黄色）として検出されるのに対して、転座又は逆位により２つの遺伝子領域が切断されている場合は、２種類の蛍光色素に由来するシグナル（例えば、赤色と緑色）が別々に離れて検出される。従って、ＦＩＳＨ法スプリットアッセイでは、ＮＴＲＫ３遺伝子の５’末端側ゲノム領域とＮＴＲＫ３遺伝子３’末端側ゲノム領域とが染色体上で離れていることを検出することにより、ＮＴＲＫ３融合遺伝子の存在を検出している。
【００７０】
ＥＴＶ６融合遺伝子融合遺伝子のＦＩＳＨ法スプリットアッセイでは、検出用プローブとして、後述の実施例５で詳細に説明するように、ＥＴＶ６遺伝子の５’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、同遺伝子の３’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせを使用する。正常な場合には、２つの遺伝子領域（各遺伝子ごとの５’末端側領域と３’末端側領域）が近接しているため、２つのシグナルが重なった色（例えば、赤色蛍光色素と緑色蛍光色素を使用する場合には、黄色）として検出されるのに対して、転座又は逆位により２つの遺伝子領域が切断されている場合は、２種類の蛍光色素に由来するシグナル（例えば、赤色と緑色）が別々に離れて検出される。従って、ＦＩＳＨ法スプリットアッセイでは、ＥＴＶ６遺伝子の５’末端側ゲノム領域とＥＴＶ６遺伝子３’末端側ゲノム領域とが染色体上で離れていることを検出することにより、ＥＴＶ６融合遺伝子の存在を検出している。
【００７１】
ＮＴＲＫ３融合遺伝子がＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合遺伝子の場合、検出用プローブとして、後述の実施例５に示すように、ＥＴＶ６遺伝子の５’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、同遺伝子の３’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせたもの、あるいは、ＥＴＶ６遺伝子の５’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、同遺伝子の３’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせたものを使用することにより、ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出することができる。
【００７２】
〈ＦＩＳＨ法フュージョンアッセイ〉
ＦＩＳＨ法フュージョンアッセイでは、例えば、ＮＴＲＫ３融合遺伝子がＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合遺伝子の場合、検出用プローブとして、後述の実施例４で詳細に説明するように、ＥＴＶ６遺伝子の５’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、ＮＴＲＫ３遺伝子の３’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせを使用することができる。正常な場合には、２種類の蛍光色素に由来するシグナル（例えば、赤色と緑色）が別々に離れて検出されるのに対して、転座又は逆位により２つの遺伝子領域が近接している場合は、２つのシグナルが重なった色（例えば、黄色）として検出される。
【００７３】
〈ＦＩＳＨ法を用いた遺伝子重複の検出〉
ＮＴＲＫ３融合遺伝子構築に伴う遺伝子重複は、例えば、ＮＴＲＫ３融合遺伝子が、ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合遺伝子の場合、検出用プローブとして、ＮＴＲＫ３遺伝子の３’末端側ゲノム領域の少なくとも一部をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものを使用することができる。そして、野生型ＮＴＲＫ３遺伝子のみを含む場合に比較して強いシグナル、例えば、２倍以上のシグナルが得られることを検出することで、ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出することができる。
なお、ＮＴＲＫ３遺伝子由来のポリヌクレオチドと融合して融合遺伝子を構築している他の遺伝子（例えば、ＮＴＲＫ３融合遺伝子がＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合遺伝子の場合、ＥＴＶ６遺伝子）の５’側ゲノム領域の検出用プローブを使用し、前記方法で、ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出してもよい。
【００７４】
ＥＴＶ６融合遺伝子構築に伴う遺伝子重複は、例えば、ＥＴＶ６融合遺伝子が、ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合遺伝子の場合、検出用プローブとして、ＥＴＶ６遺伝子の５’末端側ゲノム領域の少なくとも一部をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものを使用することができる。そして、野生型ＥＴＶ６遺伝子のみを含む場合に比較して強いシグナル、例えば、２倍以上のシグナルが得られることを検出することで、ＥＴＶ６融合遺伝子を検出することができる。
なお、ＥＴＶ６遺伝子由来のポリヌクレオチドと融合して融合遺伝子を構築している他の遺伝子（例えば、ＥＴＶ６融合遺伝子がＮＴＲＫ３−ＥＴＶ６融合遺伝子の場合、ＮＴＲＫ３遺伝子）の３’側ゲノム領域の検出用プローブを使用し、前記方法で、ＥＴＶ６融合遺伝子を検出してもよい。
【００７５】
〈ＣＧＨアレイ解析を用いた遺伝子重複の検出〉
ＮＴＲＫ３融合遺伝子構築又はＥＴＶ６融合遺伝子構築に伴う遺伝子重複は、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）アレイ解析（例えば、Agilent CGH/CNV Array解析；アジレントテクノロジー社）により、検出することができる。
【００７６】
〈次世代シーケンサーを用いた遺伝子重複の検出〉
ＮＴＲＫ３融合遺伝子構築又はＥＴＶ６融合遺伝子構築に伴う遺伝子重複は、次世代シーケンサーにより、検出することができる。具体的には、次世代シーケンサーを用いた解析において、遺伝子重複部分のカバレッジが高い（解析対象としたＤＮＡ断片のシーケンスをリファレンス配列にアノテーションした際の該当部分の冗長度が高い）ことを検出することで、ＮＴＲＫ３融合遺伝子又はＥＴＶ６融合遺伝子を検出することができる。
【００７７】
〈検出に用いるプローブ（ゲノム用）〉
ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出するための、ハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、ＮＴＲＫ３融合遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド又はそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下で（好ましくはよりストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズするプローブが好ましい。
【００７８】
例えば、融合点を含むＮＴＲＫ３融合遺伝子のゲノムＤＮＡを検出する場合、ＮＴＲＫ３融合遺伝子の融合点をはさんでその上流及び下流のそれぞれ１６塩基からなる、連続した少なくとも３２塩基の核酸分子（具体的には、配列番号１で表される塩基配列の第９９４番〜第１０２５番）、又はそれらの相補鎖を含むプローブを用いてもよい。
【００７９】
ＥＴＶ６融合遺伝子を検出するための、ハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、ＥＴＶ６融合遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド又はそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下で（好ましくはよりストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズするプローブが好ましい。
【００８０】
例えば、融合点を含むＥＴＶ６融合遺伝子のゲノムＤＮＡを検出する場合、ＥＴＶ６融合遺伝子の融合点をはさんでその上流及び下流のそれぞれ１６塩基からなる、連続した少なくとも３２塩基の核酸分子（具体的には、配列番号１で表される塩基配列の第９９４番〜第１０２５番）、又はそれらの相補鎖を含むプローブを用いてもよい。
【００８１】
例えば、ＮＴＲＫ３融合遺伝子又はＥＴＶ６融合遺伝子がＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合遺伝子の場合、ＦＩＳＨ法フュージョンアッセイに用いることのできるプローブとしては、ＥＴＶ６遺伝子又はＮＴＲＫ３遺伝子のいずれか一方の遺伝子の５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、残る一方の遺伝子の３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとの組み合わせ（好ましくは、ＥＴＶ６遺伝子の５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＮＴＲＫ３遺伝子の３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとの組み合わせ）を用いることができ、より具体的には、後述の実施例４で使用したＢＡＣクローンの各組み合わせを挙げることができる。
一方、例えば、ＮＴＲＫ３融合遺伝子又はＥＴＶ６融合遺伝子がＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合遺伝子の場合、ＦＩＳＨ法スプリットアッセイに用いることのできるプローブとしては、ＮＴＲＫ３遺伝子５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＮＴＲＫ３遺伝子の３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとの組み合わせ、あるいは、ＥＴＶ６遺伝子５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＥＴＶ６遺伝子３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとの組み合わせ（好ましくは、ＮＴＲＫ３遺伝子の５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＮＴＲＫ３遺伝子の３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとの組み合わせ）を用いることができ、より具体的には、後述の実施例５で使用したＢＡＣクローンの各組み合わせを挙げることができる。
【００８２】
〔ｍＲＮＡの検出〕
ｍＲＮＡの検出は、ノーザンハイブリダイゼーション法等によりｍＲＮＡ自体を解析することにより行っても、又は、当業者に周知の方法によりｍＲＮＡを鋳型として合成した、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を解析することにより行ってもよい。
上記ＲＮＡの検出には、シーケンス技術を好適に用いることができる。シーケンシングには、解析の効率を考慮すると、次世代シーケンサーを使用することが好ましい（例えば、Metzker ML、Nat Rev Genet. 2010 Jan;11(1):31-46参照）。次世代シーケンサーとしては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＭｉＳｅｑ／ＨｉＳｅｑ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｇｉｅｓ社のＳＯＬｉＤシステム、Ｒｏｃｈｅ社の４５４シーケンスシステム（ＧＳ ＦＬＸ＋／ＧＳ Ｊｕｎｉｏｒ）等が例示できる。シーケンシングにおいては、後述の遺伝子増幅反応方法、シーケンスキャプチャ技術等を用いて、融合遺伝子が存在している可能性がある領域を濃縮（enrich）することで、解析の効率を向上させることができる。シーケンスキャプチャ技術としては、Ｒｏｃｈｅ社のＲｏｃｈｅ ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＳｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ等が例示できる。
【００８３】
〈遺伝子増幅反応方法による検出〉
ｍＲＮＡは、検出対象であるＮＴＲＫ３融合遺伝子又はＥＴＶ６融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したプライマーを用いた、遺伝子増幅反応方法にて検出することができる。以下に、ｍＲＮＡの検出のための代表的な方法を例示するが、これらに限定されるものではない。
【００８４】
==ＰＣＲ法==
例えば、ＰＣＲ法では、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイド染色等によって目的とするサイズの増幅断片が得られたか否かを確認できる。目的とするサイズの増幅断片が得られた場合は、被験者から得た試料において、ＮＴＲＫ３融合遺伝子又はＥＴＶ６融合遺伝子が存在していたことになる。このように、ＮＴＲＫ３融合遺伝子又はＥＴＶ６融合遺伝子を検出することができる。
本発明のＮＴＲＫ３融合遺伝子又はＥＴＶ６融合遺伝子の検出方法としては、被験者から得た試料中の、特定のポリヌクレオチドを遺伝子増幅反応により増幅する工程に加え、更に目的とするサイズの増幅断片が得られたか否かを検出する工程を含むことが好ましい。
【００８５】
ＰＣＲ法は、ＮＴＲＫ３融合遺伝子又はＥＴＶ６融合遺伝子を定量的に検出することに適している。
従って、前述の<ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出する態様（１−ｂ）>に記載のように、ＮＴＲＫ３遺伝子の５’末端側領域と３’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることによってＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出する方法に好適に用いることができる。或いは、ＮＴＲＫ３遺伝子と共にＮＴＲＫ３融合遺伝子を構築しているＮＴＲＫ３遺伝子以外の他の遺伝子の５’末端側領域と３’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることによって、ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出することができる。
また、前述の<ＥＴＶ６融合遺伝子を検出する態様（１−ｂ）>に記載のように、ＥＴＶ６遺伝子の５’末端側領域と３’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることによってＥＴＶ６融合遺伝子を検出する方法に好適に用いることができる。あるいは、ＥＴＶ６遺伝子と共にＥＴＶ６融合遺伝子を構築しているＥＴＶ６遺伝子以外の他の遺伝子の５’末端側領域と３’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることによって、ＥＴＶ６融合遺伝子を検出することができる。
【００８６】
なお、ＰＣＲ法、及び、これに用いるプライマー設計法は、公知の方法に従って当業者が行うことができる。
例えば、ＮＴＲＫ３遺伝子の５’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、ＮＴＲＫ３遺伝子の３’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いることができる。
例えば、ＥＴＶ６遺伝子の５’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、ＥＴＶ６遺伝子の３’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いることができる。
【００８７】
==リアルタイムＰＣＲ法==
更には、ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター（リアルタイムＰＣＲ）法（Genome Res., 6(10), 986, 1996）を用いることにより、ＮＴＲＫ３融合遺伝子又はＥＴＶ６融合遺伝子の検出において、より定量的な解析を行うことが可能である。ＰＣＲ増幅モニター法としては、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７９００（ＰＥバイオシステムズ社）を用いることが出来る。リアルタイムＰＣＲは公知の方法であり、そのための装置及びキットは市販されており、これらを利用して簡便に行える。
【００８８】
より具体的には、例えばＮＴＲＫ３融合遺伝子がＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合遺伝子であって、ｍＲＮＡを指標にしてＮＴＲＫ融合遺伝子を検出する場合、センスプライマー（５’−プライマー）を、ＥＴＶ６遺伝子由来の任意の部分から、アンチセンスプライマー（３’−プライマー）を、ＮＴＲＫ３遺伝子由来の任意の部分から設計する。
また、例えばＥＴＶ６融合遺伝子がＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合遺伝子であって、ｍＲＮＡを指標にしてＥＴＶ６融合遺伝子を検出する場合、センスプライマー（５’−プライマー）を、ＥＴＶ６遺伝子由来の任意の部分から、アンチセンスプライマー（３’−プライマー）を、ＮＴＲＫ３遺伝子由来の任意の部分から設計する。
【００８９】
==マルチプレックスＰＣＲ==
ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出するためのＰＣＲ法では、ＮＴＲＫ３遺伝子と融合してＮＴＲＫ３融合遺伝子を構成する他の各遺伝子、及び、複数の融合点に対応した上記センスプライマーを混ぜることにより、１反応液により全ての融合ポリヌクレオチドを検出するマルチプレックスＰＣＲ（Multiplex PCR）を設計することもできる。
ＥＴＶ６融合遺伝子を検出するためのＰＣＲ法では、ＥＴＶ６遺伝子と融合してＥＴＶ６融合遺伝子を構成する他の各遺伝子、及び、複数の融合点に対応した上記センスプライマーを混ぜることにより、１反応液により全ての融合ポリヌクレオチドを検出するマルチプレックスＰＣＲ（Multiplex PCR）を設計することもできる。
【００９０】
==質量分析による検出==
上記遺伝子増幅反応方法を用いた検出方法において、増幅断片の解析のために、特開2012-100628記載の質量分析法を用いることができる。
【００９１】
==検出に用いるプライマーセット==
本発明のＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出するための検出方法に用いられるプライマーセットは、検出対象であるＮＴＲＫ３融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅でき、ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出できるものであれば、特には限定されず、当業者が、検出対象ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計することができる。
本発明のＥＴＶ６融合遺伝子を検出するための検出方法に用いられるプライマーセットは、検出対象であるＥＴＶ６融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅でき、ＥＴＶ６融合遺伝子を検出できるものであれば、特には限定されず、当業者が、検出対象ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計することができる。
ＰＣＲ増幅モニター法におけるプライマー設計は、プライマー設計ソフトウェア（例えば、Primer Express; PE Biosystems）などを利用してできる。また、ＰＣＲ産物のサイズが大きくなると増幅効率が悪くなるため、センスプライマーとアンチセンスプライマーは、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを対象に増幅したときの増幅産物の大きさが１ｋｂ以下になるように設定するのが適切である。
【００９２】
〈ハイブリダイゼーション法による検出〉
ｍＲＮＡは、検出対象であるＮＴＲＫ３融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブを用いた、ハイブリダイゼーション法にて検出することができる。
ハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＲＮＡプロテクション法などが挙げられる。
【００９３】
==プローブ（ｍＲＮＡ用）==
ハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、ＮＴＲＫ３融合遺伝子又はＥＴＶ６融合遺伝子の少なくとも一部又はそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下で（好ましくはよりストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズするプローブが好ましい。
【００９４】
＜融合タンパク質の検出＞
被験者から得た試料中の、ＮＴＲＫ３融合タンパク質又はＥＴＶ６融合タンパク質を検出する技法としては、タンパク質を解析するために用いられる当業者に周知いかなる技法、又は、これらの技法を応用したいかなる技法を用いてもよい。
【００９５】
例えば、ＮＴＲＫ３融合タンパク質の検出に用いる方法としては、ＮＴＲＫ３タンパク質、又は、ＮＴＲＫ３タンパク質と共にＮＴＲＫ３融合タンパク質を構築するＮＴＲＫ３以外の他のタンパク質を特異的に認識する抗体、あるいは、ＮＴＲＫ３融合タンパクを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法（イムノアッセイ法）、酵素活性測定法（ＥＬＩＳＡ法）、２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、ウェスタンブロッティング法、免疫組織化学法、免疫沈降法、ｉＡＥＰ（intercalated antibody-enhanced polymer）法、ＦＲＥＴ法を例示することができる。あるいは、これらと組み合わせて、または単独で、質量分析法、アミノ酸シーケンス法を用いることができる。
【００９６】
例えば、ＥＴＶ６融合タンパク質の検出に用いる方法としては、ＥＴＶ６タンパク質、又は、ＥＴＶ６タンパク質と共にＥＴＶ６融合タンパク質を構築するＥＴＶ６タンパク質以外の他のタンパク質を特異的に認識する抗体、あるいは、ＥＴＶ６融合タンパクを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法（イムノアッセイ法）、酵素活性測定法（ＥＬＩＳＡ法）、２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、ウェスタンブロッティング法、免疫組織化学法、免疫沈降法、ｉＡＥＰ（intercalated antibody-enhanced polymer）法、ＦＲＥＴ法を例示することができる。あるいは、これらと組み合わせて、または単独で、質量分析法、アミノ酸シーケンス法を用いることができる。
以下に、タンパク質の検出のための代表的な方法を例示するが、これらに限定されるものではない。
【００９７】
〔検出に用いる代表的な手法〕
抗体を用いる検出方法としては、上記公知の方法によればよいが、例えば以下の方法を用いることができる。
【００９８】
〈免疫組織化学法〉
例えば、検出対象のＮＴＲＫ３融合タンパク質又はＥＴＶ６融合タンパク質が、ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合タンパク質の場合、検出対象の融合タンパク質が存在している可能性のある組織切片に対し、ＮＴＲＫ３タンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに結合する抗ＮＴＲＫ３抗体及びＥＴＶ６タンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに結合する抗ＥＴＶ６抗体を用いた免疫染色を行い、それらの抗体が近接していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。また、ＮＴＲＫ３タンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、ＮＴＲＫ３タンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いた免疫染色を行い、それらの抗体が離れて局在していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。また、ＥＴＶ６タンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、ＥＴＶ６タンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いた免疫染色を行い、それらの抗体が離れて局在していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。また、融合点を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いた免疫染色を行い、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。
【００９９】
〈ウェスタンブロッティング法〉
例えば、検出対象のＮＴＲＫ３融合タンパク質又はＥＴＶ６融合タンパク質がＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合タンパク質の場合、検出対象の融合タンパク質が存在している可能性のある細胞抽出液を、当業者に周知の方法により電気泳動して細胞抽出液中のタンパク質を分離した後、メンブレンにブロッティングする。
そして、タンパク質がブロッティングされたメンブレンに対し、ＮＴＲＫ３タンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに結合する抗ＮＴＲＫ３抗体及びＥＴＶ６タンパク質のＮ末端側領域に結合する抗ＥＴＶ６抗体を用いた免疫染色を行い、メンブレン上の所望の位置に、抗ＮＴＲＫ３抗体と抗ＥＴＶ６抗体が結合していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。
また、融合点を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体を用い、当該抗体がメンブレン上の所望の位置に結合していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。
あるいは、抗ＮＴＲＫ３抗体を用い、当該抗体が、メンブレン上のＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合タンパク質に結合していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。この際、メンブレン上で野生型ＮＴＲＫ３タンパク質が予測される位置とは異なる位置に抗ＮＴＲＫ３抗体が結合することを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出してもよい。
抗ＥＴＶ６抗体を用い、抗ＮＴＲＫ３抗体を用いた場合と同じ原理で、ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合タンパク質を検出してもよい。
【０１００】
〈免疫沈降法〉
例えば、検出対象タンパク質のＮＴＲＫ３融合タンパク質又はＥＴＶ６融合が、ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合タンパク質の場合、検出対象の融合タンパク質が存在している可能性のある細胞抽出液に対し、ＮＴＲＫ３タンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに結合する抗ＮＴＲＫ３抗体又はＥＴＶ６タンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに結合する抗ＥＴＶ６抗体のいずれか一方の抗体で免疫沈降を行い、その沈降物に対して残るもう一方の抗体で検出することで、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。上記の通り、免疫沈降と検出をした後、更には、検出抗体により、検出したポリペプチドが目的の検出対象ポリペプチドの大きさであることを確認することが好ましい。
あるいは、検出対象のＮＴＲＫ３融合タンパク質が存在している可能性のある細胞抽出液に対し、ＮＴＲＫ３タンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに結合する抗ＮＴＲＫ３抗体で免疫沈降を行い、さらにその沈降物の質量分析を行うことにより、野生型ＮＴＲＫ３と異なる質量の抗ＮＴＲＫ３抗体と結合するタンパク質の存在を確認することで、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。
検出対象のＥＴＶ６融合タンパク質が存在している可能性のある細胞抽出液に対し、ＥＴＶ６タンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに結合する抗ＥＴＶ６抗体で免疫沈降を行い、さらにその沈降物の質量分析を行うことにより、野生型ＥＴＶ６と異なる質量の抗ＥＴＶ６抗体と結合するタンパク質の存在を確認することで、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。
【０１０１】
〔検出に用いる抗体〕
なお、本発明に係る検出方法に用いる抗体は、ＮＴＲＫ３融合タンパク質又はＥＴＶ６融合タンパク質の所望の部位に特異的に結合する範囲で特に制限されず、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を組みあわせて用いることもできる。前記抗体としては、免疫グロブリンそれ自体であっても、抗原結合能を保持した抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖでもよい。また、抗体の結合を検出するため、当業者に周知のいかなる標識やシグナル増幅法が用いられてもよい。
【０１０２】
＜標識手法＞
上記遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等）及びタンパク質の検出方法において、プローブ、増幅産物、抗体等の標識は公知の技術を用いればよい。例えば、蛍光標識、放射性標識、酵素標識等を挙げることができる。
プローブを用いた検出方法において、プローブを標識する場合、その標識方法は上記のとおり、公知の方法によればよく、例えば、BACクローンから、標識された核酸プローブを作製する場合、ニックトランスレーション、ランダムプライム法等の公知手法を用いることができる。またその際、ビオチン−ｄＵＴＰ（例えば、Roche Applied Science社製）を用いてプローブをビオチン標識し、アビジンと結合させた、蛍光体、放射性同位体、酵素等、をさらに処理することでプローブを標識することができる。
抗体を用いた検出方法において、抗体を標識する場合、その標識方法は上記のとおり、公知の方法によればよいが、例えば、下記の標識方法が挙げられる。
【０１０３】
〔ｉＡＥＰ（intercalated antibody-enhanced polymer）法〕
検出対象となるタンパク質に結合する第一抗体と、ポリマー試薬の間に介在抗体を入れることにより、染色感度を上げることが可能である（Takeuchiら、Clin Cancer Res, 2009 May 1; 15(9):3143-3149）。
【０１０４】
〔蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）〕
２つの抗体の近接を検出する手法として、例えば、ＦＲＥＴ現象を利用したプローブ（ＦＲＥＴプローブ）を用いることができる。抗体の一つをドナー蛍光物質（ＣＦＰ等）で標識し、他の抗体をアクセプター蛍光物質（ＹＦＰ等）で標識した場合、両者が十分に近い距離にあると、ＦＲＥＴ現象により、ＹＦＰが励起状態となり、基底状態に戻る際に蛍光を発する。この蛍光を検出することで、２つの抗体が近接していることを検出することができる。
【０１０５】
≪ＮＴＲＫ３阻害物質による治療の適用対象の判定≫
本発明の検出方法における検出対象のＮＴＲＫ３融合遺伝子又は検出対象のＮＴＲＫ３融合タンパク質が、被験者から得た試料から検出された場合は、当該被験者は、ＮＴＲＫ３融合体陽性のがんを有する対象（患者）であり、ＮＴＲＫ３阻害物質による治療の適用対象となる。
【０１０６】
≪ＥＴＶ６阻害物質による治療の適用対象の判定≫
本発明の検出方法における検出対象のＥＴＶ６融合遺伝子又は検出対象のＥＴＶ６融合タンパク質が、被験者から得た試料から検出された場合は、当該被験者は、ＥＴＶ６融合体陽性のがんを有する対象（患者）であり、ＥＴＶ６阻害物質による治療の適用対象となる。
【０１０７】
≪検出用キット≫
本発明の検出用キットには、検出対象のＮＴＲＫ３融合遺伝子の検出用キット、又は、検出対象のＮＴＲＫ３融合タンパク質の検出用キットが含まれる。
本発明の検出用キットには、検出対象のＥＴＶ６融合遺伝子の検出用キット、又は、検出対象のＥＴＶ６融合タンパク質の検出用キットが含まれる。
本発明の検出対象のＮＴＲＫ３融合遺伝子の検出用キット、又は、ＥＴＶ６融合遺伝子の検出用キットには、本発明の検出方法においてＦＩＳＨ法フュージョンアッセイ又はＦＩＳＨ法スプリットアッセイに用いることのできるプローブ、あるいは、本発明の検出方法における検出対象のＮＴＲＫ３融合遺伝子又はＥＴＶ６融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅できるように設計したセンス及びアンチセンスプライマーが含まれる。センス及びアンチセンスプライマーセットは、ＮＴＲＫ３融合遺伝子又はＥＴＶ６融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチドであり、かつ、増幅対象であるポリヌクレオチドの増幅用のプライマーとして機能するポリヌクレオチドのセットである。
【０１０８】
また、本発明の検出対象のＮＴＲＫ３融合タンパク質の検出用キット、又は、ＥＴＶ６融合タンパク質の検出用キットには、本発明の検出方法において用いることができる抗体が含まれる。
【０１０９】
＜プローブ＞
本発明のＮＴＲＫ３融合遺伝子の検出用キットは、ＮＴＲＫ３融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチド、又は、その相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出できるプローブを１種類、あるいは、２種類以上の組み合わせで含むことができる。
本発明のＥＴＶ６融合遺伝子の検出用キットは、ＥＴＶ６融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチド、又は、その相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記ＥＴＶ６融合遺伝子を検出できるプローブを１種類、あるいは、２種類以上の組み合わせで含むことができる。
【０１１０】
プローブとして、前述の≪検出方法に用いる技法≫に記載したいずれか１種類以上のプローブが例示できる。
例えば、ＮＴＲＫ３融合遺伝子又はＥＴＶ６融合遺伝子がＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合遺伝子の場合、ＮＴＲＫ３遺伝子由来ポリヌクレオチドにハイブリダイズする１種類以上の（好ましくは２種類以上の）プローブ、又は、ＥＴＶ６遺伝子由来ポリヌクレオチドにハイブリダイズする１種類以上の（好ましくは２種類以上の）プローブ、のいずれかのみを含んでも、ＮＴＲＫ３遺伝子由来ポリヌクレオチドにハイブリダイズする１種類以上のプローブ、及び、ＥＴＶ６遺伝子由来ポリヌクレオチドにハイブリダイズする１種類以上のプローブ、の両方を含んでも、あるいは、ＮＴＲＫ３融合遺伝子の融合点を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズする１種類以上のプローブを含んでもよい。
【０１１１】
＜プライマーセット＞
本発明のＮＴＲＫ３融合遺伝子の検出用キットは、ＮＴＲＫ３融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅でき、ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出できるプライマーセットを１セット、あるいは、２セット以上の組み合わせで含むことができる。
本発明のＥＴＶ６融合遺伝子の検出用キットは、ＥＴＶ６融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅でき、ＥＴＶ６融合遺伝子を検出できるプライマーセットを１セット、あるいは、２セット以上の組み合わせで含むことができる。
プライマーセットとして、前述の≪本発明の検出方法の態様≫又は≪検出方法に用いる技法≫に記載したいずれか１種類以上のプライマーセットが例示できる。
【０１１２】
本発明のプライマーセットには、好ましくは、
（１）ＥＴＶ６をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＮＴＲＫ３をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ＥＴＶ６遺伝子とＮＴＲＫ３遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」にストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でアニールする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなり、センスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」の相補鎖にストリンジェントな条件（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でアニールする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなるプライマーセット、が含まれる。
【０１１３】
また、前記プライマーセット（１）のより具体的な態様として、本発明のプライマーセットには、以下の（２）のプライマーセットが含まれる。
【０１１４】
（２）配列番号１（ＥＴＶ６ｅｘ５−ＮＴＲＫ３ｅｘ１５）の塩基番号１から１００９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー（好ましくは配列番号４）及び配列番号１の塩基番号１０１０から１９０２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー（好ましくは配列番号５）のプライマーセット。
【０１１５】
これらのプライマーセット（１）、（２）においては、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーの選択位置の間隔が１ｋｂ以下であるか、あるいは、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが１ｋｂ以下であることが好ましい。
また、本発明のプライマーは、通常、１５〜４０塩基、好ましくは１６〜２４塩基、更に好ましくは１８〜２４塩基、特に好ましくは２０〜２４塩基の鎖長を有する。
【０１１６】
本発明のプライマーセットは、本発明の検出方法において、検出対象ポリヌクレオチドを増幅及び検出するために用いることができる。また、本発明のプライマーセットに含まれる各プライマーは、特に限定されるものではないが、例えば、化学合成法によって製造することができる。
【０１１７】
＜抗体＞
本発明のＮＴＲＫ３融合タンパク質の検出用キットには、ＮＴＲＫ３融合タンパク質の任意の部位に特異的に結合する抗体を１種類、あるいは、２種類以上の組み合わせで含むことができる。具体的には、前述の＜融合タンパク質の検出＞に記載した抗体が例示できる。
本発明のＥＴＶ６融合タンパク質の検出用キットには、ＥＴＶ６融合タンパク質の任意の部位に特異的に結合する抗体を１種類、あるいは、２種類以上の組み合わせで含むことができる。具体的には、前述の＜融合タンパク質の検出＞に記載した抗体が例示できる。
例えば、ＮＴＲＫ３融合タンパク質又はＴＶ６融合タンパク質がＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合タンパク質の場合、ＮＴＲＫ３タンパク質由来ポリペプチドに結合する１種類以上の（好ましくは２種類以上の）抗体、又は、ＥＴＶ６タンパク質由来ポリペプチドに結合する１種類以上の（好ましくは２種類以上の）抗体、のいずれかのみを含んでも、ＮＴＲＫ３タンパク質由来ポリペプチドに結合する１種類以上の抗体、及び、ＥＴＶ６タンパク質由来ポリペプチドに結合する１種類以上の抗体、の両方を含んでも、あるいは、ＮＴＲＫ３融合タンパク質の融合点を含むポリペプチドに結合する１種類以上の抗体を含んでもよい。
【０１１８】
≪阻害物質のスクリーニング方法≫
＜ポリペプチドを阻害する物質をスクリーニングする工程＞
本発明の、阻害物質のスクリーニング方法は、前記検出対象ポリペプチドを阻害する物質をスクリーニングすることができ、
（１）検出対象ポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
（２）前記ポリペプチドが阻害されるか否かを分析する工程、及び
（３）前記ポリペプチドを阻害する物質を選択する工程
を含む。
【０１１９】
本明細書において、「ポリペプチドの阻害」には、ポリペプチドの活性の阻害と、ポリペプチドの発現の阻害とが含まれる。また、「阻害」は、少なくとも一部の阻害を意味する。
【０１２０】
＜阻害物質スクリーニング工程とその指標＞
本発明のスクリーニング方法には、
（Ａ）精製又は粗製のポリペプチドを用いて、インビトロでポリペプチドの活性阻害を指標とする方法、
（Ｂ）ポリペプチドを発現している細胞を用いて、ポリペプチドの活性阻害を指標とする方法、
（Ｃ）ポリペプチドを発現している細胞を用いて、ポリペプチドの発現阻害を指標とする方法
が含まれる。
【０１２１】
〔（Ａ）精製又は粗製ポリペプチドを用い、活性阻害を指標とする方法〕
前記方法（Ａ）には、インビトロでポリペプチドに試験物質を添加して接触させる工程、前記試験物質により前記ポリペプチドの活性が阻害されたか否かを、対照（試験物質を接触させなかったポリペプチド）と比較して分析する工程、ポリペプチドの活性を阻害した物質を選択する工程を含む方法が含まれる。
インビトロにおけるポリペプチド活性の測定は、公知のキナーゼ活性測定法を用いることができ、例えば、キナーゼ反応により生成するＡＤＰ量を指標としても、あるいは、ポリペプチドのチロシンリン酸化レベルを指標としてもよく、市販のキナーゼ活性測定キットを用いることもできる。
【０１２２】
〔（Ｂ）ポリペプチド発現細胞を用い、活性阻害を指標とする方法〕
前記方法（Ｂ）には、ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を添加して接触させる工程、前記試験物質により前記ポリペプチドの活性が阻害されたか否かを、対照（試験物質を接触させなかった細胞）と比較して分析する工程、ポリペプチドの活性を阻害した物質を選択する工程を含む方法が含まれる。
前記細胞におけるポリペプチド活性の測定は、公知のキナーゼ活性測定法を用いることができ、例えば、キナーゼ反応により生成するＡＤＰ量を指標としても、あるいは、ポリペプチドのチロシンリン酸化レベルを指標としてもよく、市販のキナーゼ活性測定キットを用いることもできる。
【０１２３】
〔（Ｃ）ポリペプチド発現細胞を用い、発現阻害を指標とする方法〕
前記方法（Ｃ）には、ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を添加して接触させる工程、前記試験物質により前記ポリペプチドの発現が阻害されたか否かを、対照（試験物質を接触させなかった細胞）と比較して分析する工程、ポリペプチドの発現を阻害した物質を選択する工程を含む方法が含まれる。
前記細胞におけるポリペプチドの発現は、タンパク質又はｍＲＮＡの量を測定することにより分析することができる。タンパク質量の測定には、例えば、ＥＬＩＳＡ法、イムノブロット法を用いることができ、ｍＲＮＡ量の測定には、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロット法を用いることができる。
【０１２４】
ここで、ＮＴＲＫ３融合遺伝子は、腫瘍形成能を有する遺伝子である。従って、本発明の阻害物質スクリーニング方法で選択したポリペプチド阻害物質は、ＮＴＲＫ３融合体陽性のがんの治療薬又はその候補物質として有用であり、本発明方法は、所望により、前記阻害物質がＮＴＲＫ３融合体陽性のがんに対する治療活性を有することを確認する工程を更に含むことができる。
また、ＥＴＶ６融合遺伝子は、腫瘍形成能を有する遺伝子である。従って、本発明の阻害物質スクリーニング方法で選択したポリペプチド阻害物質は、ＥＴＶ６融合体陽性のがんの治療薬又はその候補物質として有用であり、本発明方法は、所望により、前記阻害物質がＥＴＶ６融合体陽性のがんに対する治療活性を有することを確認する工程を更に含むことができる。
前記確認工程は、公知の評価系を用いて実施することができ、例えば、培養細胞を用いるインビトロ評価系、腫瘍細胞を移植した担がんモデル動物を用いる評価系などを挙げることができる。
【０１２５】
前記ポリペプチド発現細胞は、本発明のポリヌクレオチドを、常法にしたがって、所望の細胞に導入することで得ることもできる（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th Edition（2012）、Cold Spring Harbor Laboratory Press参照）。具体的には、例えば、本発明のＮＴＲＫ３融合遺伝子又はＥＴＶ６融合遺伝子であるｃＤＮＡを、組換えベクターに導入し、これをさらに細胞に導入することで、前記ポリペプチド発現細胞（形質転換細胞）を得ることができる。
【０１２６】
≪阻害物質を含有するがん治療用医薬組成物≫
本発明の、ＮＴＲＫ３融合体陽性のがん（例えば、消化器がん）の治療用医薬組成物は、ＮＴＲＫ３融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質を含む。例えば、本発明の阻害物質スクリーニング方法で得られる阻害物質（例えば、低分子化合物、二重鎖核酸（ｓｉＲＮＡを含む）、タンパク質（抗体又は抗体断片を含む）、ペプチド、又はそれ以外の化合物）を有効成分として含有し、所望により、製剤学的に許容される担体を含有することができる。
本発明の、ＥＴＶ６融合体陽性のがん（例えば、消化器がん）の治療用医薬組成物は、ＥＴＶ６融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質を含む。例えば、本発明の阻害物質スクリーニング方法で得られる阻害物質（例えば、低分子化合物、二重鎖核酸（ｓｉＲＮＡを含む）、タンパク質（抗体又は抗体断片を含む）、ペプチド、又はそれ以外の化合物）を有効成分として含有し、所望により、製剤学的に許容される担体を含有することができる。
【０１２７】
＜ＮＴＲＫ３融合遺伝子又は転写産物、あるいは、ＥＴＶ６融合遺伝子又は転写産物に対する阻害物質＞
ＮＴＲＫ３融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質としては、キナーゼ阻害剤、例えば、ＮＴＲＫ３阻害物質、又は、ＮＴＲＫ３遺伝子と共に融合遺伝子を構築するもう一方の遺伝子又はその転写物質に対する阻害物質を挙げることができる。
ＥＴＶ６融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質としては、キナーゼ阻害剤、例えば、ＥＴＶ６阻害物質、又は、ＥＴＶ６遺伝子と共に融合遺伝子を構築するもう一方の遺伝子又はその転写物質に対する阻害物質を挙げることができる。
【０１２８】
〔低分子化合物〕
前記阻害物質のうち、低分子化合物の具体例としては、AG879（CAS148741-30-4）、国際公開公報WO2008/045627、WO2008/073480に記載の化合物等を挙げることができる。
【０１２９】
また、ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質としては、例えば、ＰＫＣ４１２（別称としてミドスタウリン（midostaurin）；Chi HT, Ly BT, Kano Y, Tojo A, Watanabe T, Sato Y. ETV6-NTRK3 as a therapeutic target of small molecule inhibitor PKC412. Biochem Biophys Res Commun. 2012 Dec 7;429(1-2):87-92.）を挙げることができる。
【０１３０】
〔二重鎖核酸〕
二重鎖核酸は、二重鎖の核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）部分と、好ましくはセンス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端のオーバーハングとからなり、ＲＮＡｉを誘導する。ＲＮＡｉは進化的に保存された現象で、ＲＮａｓｅIIIエンドヌクレアーゼによって生じる２１〜２３塩基の二重鎖核酸を介して起こる（Genes Dev. 15, 485-490, 2001）。３’側のオーバーハングはそれぞれ１又は２塩基の任意の核酸であるが、２塩基が好ましい。なお、前記塩基数（２１〜２３塩基）は、オーバーハングを含むセンス鎖又はアンチセンス鎖の各々の塩基数である。また、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ塩基数であることもできるし、異なる塩基数であることもできるが、同じ塩基数であることが好ましい。
【０１３１】
二重鎖核酸の３’側オーバーハングを構成するリボ核酸としては、例えば、Ｕ（ウリジン）、Ａ（アデノシン）、Ｇ（グアノシン）、又はＣ（シチジン）を用いることができ、３’側のオーバーハングを構成するデオキシリボ核酸としては、例えば、ｄＴ（デオキシチミジン）、ｄＡ（デオキシアデノシン）、ｄＧ（デオキシグアノシン）、又はｄＣ（デオキシシチジン）を用いることができる。
【０１３２】
本発明の医薬組成物の有効成分として用いることのできる二重鎖核酸は、ＮＴＲＫ３融合遺伝子に対する阻害作用又はＥＴＶ６融合遺伝子に対する阻害作用を有するものであれば、特に限定されない。例えば、二重鎖部分が融合点を含むポリヌクレオチドの塩基配列、例えば、配列番号１の第１００９番〜第１０１０番を含む塩基配列に基づいて設計することができる。あるいは、二重鎖部分が、キナーゼ部分をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計することができる。本発明の二重鎖核酸は、常法（例えば、J. Am. Chem. Soc., 120, 11820-11821, 1998; 及びMethods, 23, 206-217, 2001）により製造することができる。また、二重鎖核酸を委託製造する会社（例えば、ＲＮＡｉ社）は、当業者によく知られており、二重鎖核酸の製造に利用できる。また、ｓｉＲＮＡ配列設計システム（商用ｓｉＤｉｒｅｃｔ（登録商標）、ＲＮＡｉ社）により、二重鎖核酸を設計することができる。
【０１３３】
〔タンパク質・抗体〕
本発明の医薬組成物の有効成分として用いることのできる抗体は、ＮＴＲＫ３融合遺伝子の転写産物又はＥＴＶ６融合遺伝子の転写産物、好ましくは、ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３遺伝子の転写産物を阻害するものであれば、限定されない。例えば、ＮＴＲＫ３融合タンパク質又はＥＴＶ６融合タンパク質の活性、好ましくはキナーゼ活性を阻害するものが挙げられる。
【実施例】
【０１３４】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【０１３５】
［実施例１］臨床検体でのＥＴＶ６遺伝子異常のＦＩＳＨ法による検出
目的遺伝子の５’末端側領域及び３’末端側領域を異なる色素で染め、遺伝子の転座を観察する方法が知られている。ＦＩＳＨ法の一種であるこの方法はスプリットアッセイ（split assay）と呼ばれている。スプリットアッセイでは、染色体転座を調べたい目的遺伝子の５’末端側領域及び３’末端側領域のそれぞれを異なる蛍光色素で標識したプローブで染める。例えば、テキサスレッド（TexasRed）（赤）標識及びＦＩＴＣ（緑）標識した２種類のプローブにて蛍光標識することにより、正常な場合は２つの黄色のシグナル（緑色と赤色のシグナルが近傍に存在している状態）として検出され、転座又は逆位が起きている場合は、離れた緑色と赤色のシグナルとして検出される。【０１３６】
臨床検体でのＥＴＶ６遺伝子異常をＦＩＳＨ法スプリットアッセイで検出した。手術により摘出され、２０％ホルマリンで固定化されパラフィンに包埋された大腸がん組織を４μｍの厚さで切り、スライドガラス上に乗せ病理切片を作製した。ＦＩＳＨ法は文献（Takeuchi K, Choi YL, Soda M, Inamura K, Togashi Y, Hatano S, Enomoto M, Takada S, Yamashita Y, Satoh Y, Okumura S, Nakagawa K, Ishikawa Y, Mano H. Multiplex reverse transcription-PCR screening for EML4-ALK fusion transcripts. Clin Cancer Res. 2008;14:6618-6624.）の方法に従い行った。作製した未染色の切片は、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ＦＩＳＨアクセサリーキット（Dako社）で処理し、続いて、緑（ＦＩＴＣ）の蛍光標識したＥＴＶ６遺伝子５’末端側領域をカバーするＢＡＣ（bacterial artificial chromosome）クローン（クローン番号  RP11-639O1、RP11-1077I5）と、赤（TexasRed）の蛍光標識したＥＴＶ６遺伝子３’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号  RP11-297N18）とを用いてハイブリダイゼーションした。更に続いて４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（4,6-diamino-2-phenylindole）で染色を行った。蛍光観察は蛍光顕微鏡ＢＸ５１（Olympus社）を使用した。緑と赤のシグナルが離れて観察されるゲノム構造異常が示唆される切片を見出した。約１５００例の病理検体での検討から１例のＥＴＶ６遺伝子領域のゲノム構造異常を示唆する検体（結腸がん患者由来）を見出した。【０１３７】
［実施例２］臨床検体でのＥＴＶ６融合ポリヌクレオチド遺伝子の同定
ＦＩＳＨ法解析によりＥＴＶ６ゲノム構造異常が示唆された組織由来のＲＮＡをテンプレートに市販のＲＡＣＥキット（SMARTer(登録商標) RACE cDNA Amplification Kit; Clonetech社）のプロトコールに従い、ＥＴＶ６遺伝子５’末端側領域の３’末端側に存在する遺伝子を調べた。具体的には、ファーストストランドｃＤＮＡ（1st strand cDNA）合成は、臨床検体由来のＲＮＡ０．５μｇを用いて行った。３’−ＲＡＣＥ（rapid amplification of cDNA ends）ＰＣＲは、キットに含まれるユニバーサルプライマー（UPM）及びフォワードプライマー（配列番号３）を用いてＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold(登録商標)；ライフテクノロジーズジャパン株式会社）によるＰＣＲ反応を行った。
本ＲＡＣＥ産物を電気泳動し、１−２ｋｂｐ付近のＤＮＡ断片を精製し、常法に従いＴＡクローニング後にシーケンス解析した。その結果、ＮＴＲＫ３遺伝子キナーゼ領域の一部が、ＥＴＶ６遺伝子の３’側に融合していることが明らかとなった。また、その融合は、ＥＴＶ６遺伝子のエクソン５と、ＮＴＲＫ３遺伝子のエクソン１５との間で生じていることが判明した。【０１３８】
消化器がんにおいて、これらの遺伝子の融合遺伝子及びその転写産物の存在は報告されておらず、初めて示されたものであった（Knezevich SRら、Nat Genet. 1998 Feb;18(2):184-187。Tognon C,ら、Cancer Cell. 2002 Nov;2(5):367-76）。また、消化器がんにおけるＮＴＲＫ３の存在もこれまで報告はなく、初めて示されたものであった（Hisaoka Mら、J Pathol. 2002 Aug;197(5):661-67）。
当該融合遺伝子については、導入細胞における形質転換及び導入細胞移植マウスにおける腫瘍形成能が示されており、本融合遺伝子又はその転写産物の存在は、発現部位におけるがんの原因であることが示唆されている（Wai DHら、Oncogene. 2000 Feb 17;19(7):906-15）。【０１３９】
【表１】
0006534930.tif 000002
【０１４０】
［実施例３］ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合遺伝子の検出
表１に示すプライマーを用いて、融合点を含む領域を直接増幅するＲＴ−ＰＣＲで融合遺伝子の検出を行い、融合遺伝子ｃＤＮＡががん組織に存在していることを示した。具体的には、検体由来ＲＮＡテンプレートに対して、ＥＴＶ６遺伝子上に設計したフォワードプライマーＥＴＶ６-428F（配列番号４）とＮＴＲＫ３遺伝子上に設計したリバースプライマーＮＴＲＫ３-1632R（配列番号５）とを使用してＰＣＲを行った。増幅産物を電気泳動したところ、プライマー設定位置から予想されるサイズのバンド（１０３７ｂｐ）が観察され、臨床検体を用いて融合遺伝子の検出がこれらの遺伝子上にプライマーを設計することによって可能であることが示された。【０１４１】
［実施例４］臨床検体でのＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合遺伝子のＦＩＳＨ法フュージョンアッセイによる検出
融合遺伝子がゲノム上で融合していることを確認するため、表２に示す各ＢＡＣクローンを適宜組み合わせて、ＦＩＳＨ法フュージョンアッセイにて検出を行った。【０１４２】
【表２】
0006534930.tif 000003
【０１４３】
ＦＩＳＨ法フュージョンアッセイでは染色体転座によって近接する二つの目的遺伝子領域を異なる蛍光色素で標識したプローブで染める。例えば、ＴｅｘａｓＲｅｄ（赤）標識及びＦＩＴＣ（緑）標識した２種類のプローブにて蛍光標識することにより、正常な場合は赤と緑はそれぞれのシグナル（緑色と赤色のシグナルが離れて存在している状態）として検出され、転座又は逆位が起きることにより２つの遺伝子領域が近接している場合は、緑色と赤色のシグナルが重なり黄色として検出される。具体的には、緑（ＦＩＴＣ）の蛍光標識したＥＴＶ６遺伝子５’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号  RP11-639O1、RP11-1077I5）と、赤（TexasRed）の蛍光標識したＮＴＲＫ３遺伝子３’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号RP11-624F1、RP11-948I15）との組み合わせを使用した。蛍光観察は蛍光顕微鏡ＢＸ５１（Olympus社）を使用した。実施例３において融合遺伝子が陽性であった病理切片上でのフュージョンアッセイの結果、ＥＴＶ６遺伝子５’末端側領域とＮＴＲＫ３遺伝子３’末端側領域との近接したシグナル（黄色）が観察され、融合遺伝子が染色体転座により生成されたことが確かめられた。
この方法が当該融合遺伝子の存在を検出する方法として使えることがわかった。【０１４４】
［実施例５］臨床検体でのＥＴＶ６遺伝子又はＮＴＲＫ３遺伝子のＦＩＳＨ法スプリットアッセイによる検出
実施例１に記載の方法にしたがい、ＥＴＶ６遺伝子又はＮＴＲＫ３遺伝子のＦＩＳＨ法スプリットアッセイを実施した。病理切片の作製は、実施例１と同様に実施した。作製した未染色の切片は、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ＦＩＳＨアクセサリーキット（Dako社）で処理した。
ＥＴＶ６を対象としたスプリットアッセイの場合、続いて、緑（ＦＩＴＣ）の蛍光標識したＥＴＶ６遺伝子５’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号  RP11-639O1、RP11-1077I5）と、赤（TexasRed）の蛍光標識したＥＴＶ６遺伝子３’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号  RP11-297N18）とを用いてハイブリダイゼーションした。更に続いて４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（4,6-diamino-2-phenylindole）で染色を行った。
ＮＴＲＫ３を対象としたスプリットアッセイの場合、続いて、緑（ＦＩＴＣ）の蛍光標識したＮＴＲＫ３遺伝子５’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号CTD-3188J15、CTD-2573H21、RP11-285I14）と、赤（TexasRed）の蛍光標識したＮＴＲＫ３遺伝子３’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号RP11-624F1、RP11-948I15）とを用いてハイブリダイゼーションした。更に続いて４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（4,6-diamino-2-phenylindole）で染色を行った。
蛍光観察は蛍光顕微鏡ＢＸ５１（Olympus社）を使用した。実施例３において融合遺伝子が陽性であった病理切片上で、緑と赤のシグナルが離れて観察されるゲノム構造異常が示唆される切片を見出した。
この方法が当該融合遺伝子の存在を検出する方法として使えることがわかった。【０１４５】
以上より、本発明において、一部の消化器がん患者においてＮＴＲＫ３遺伝子の融合遺伝子が存在し、その遺伝子ががんの原因となっていることが明らかとなった。即ち、ＮＴＲＫ３阻害薬物治療の対象となるがん患者を、ＮＴＲＫ３融合遺伝子を検出することで、好ましくは、ＥＴＶ６ｅｘ５−ＮＴＲＫ３ｅｘ１５を検出することで、選別できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１４６】
本発明の検出方法は、ＮＴＲＫ３融合体陽性のがん患者の判定に有用である。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、前記検出方法に用いることができる。本発明の阻害物質スクリーニング方法は、当該融合体陽性のがん患者の治療に有効な薬剤をスクリーニングするのに用いることができる。前記スクリーニングにより得られる薬剤は、当該融合体陽性のがんの治療用医薬組成物の有効成分として使用することができる。前記検出方法により、当該融合体陽性のがん患者と判定された患者に、前記薬剤を投与することにより、がんを治療することができる。
本発明の検出方法は、ＥＴＶ６融合体陽性のがん患者の判定に有用である。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、前記検出方法に用いることができる。本発明の阻害物質スクリーニング方法は、当該融合体陽性のがん患者の治療に有効な薬剤をスクリーニングするのに用いることができる。前記スクリーニングにより得られる薬剤は、当該融合体陽性のがんの治療用医薬組成物の有効成分として使用することができる。前記検出方法により、当該融合体陽性のがん患者と判定された患者に、前記薬剤を投与することにより、がんを治療することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表フリーテキスト】
【０１４７】
配列表の配列番号３〜５の配列で表される塩基配列は、合成プライマー配列である。
【配列表】
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