(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体可変重鎖ドメイン及び抗体可変軽鎖ドメインを含む、少なくとも１つのＥＧＦＲｖＩＩＩ結合部位を備えるＥＧＦＲｖＩＩＩ結合タンパク質であって、
ここで、
（ａ）
（ａ１）配列認識番号２７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列認識番号２８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列認識番号２９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む抗体可変重鎖ドメイン、並びに、配列認識番号３０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列認識番号３１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列認識番号３２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む抗体可変軽鎖ドメイン、
（ａ２）配列認識番号３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列認識番号２８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列認識番号２９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む抗体可変重鎖ドメイン、並びに、配列認識番号３４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列認識番号３１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列認識番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む抗体可変軽鎖ドメイン、
（ａ３）配列認識番号３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列認識番号２８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列認識番号２９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む抗体可変重鎖ドメイン、並びに、配列認識番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列認識番号３１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列認識番号３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む抗体可変軽鎖ドメイン、
（ａ４）配列認識番号３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列認識番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列認識番号２９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む抗体可変重鎖ドメイン、並びに、配列認識番号３９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列認識番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列認識番号４１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む抗体可変軽鎖ドメイン、
（ａ５）配列認識番号４２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列認識番号４３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列認識番号２９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む抗体可変重鎖ドメイン、並びに、配列認識番号４４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列認識番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列認識番号４５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む抗体可変軽鎖ドメイン、
（ａ６）配列認識番号４６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列認識番号２８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列認識番号２９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む抗体可変重鎖ドメイン、並びに、配列認識番号４７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列認識番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列認識番号４８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む抗体可変軽鎖ドメイン、
（ａ７）配列認識番号４９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列認識番号５０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列認識番号２９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む抗体可変重鎖ドメイン、並びに、配列認識番号５１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列認識番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列認識番号５２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む抗体可変軽鎖ドメイン、
（ａ８）配列認識番号５３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列認識番号５４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列認識番号２９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む抗体可変重鎖ドメイン、並びに、配列認識番号４４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列認識番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列認識番号５５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む抗体可変軽鎖ドメイン、
（ａ９）配列認識番号５３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列認識番号２８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列認識番号２９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む抗体可変重鎖ドメイン、並びに、配列認識番号５６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列認識番号５７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列認識番号５８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む抗体可変軽鎖ドメイン、
（ａ１０）配列認識番号４６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列認識番号２８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列認識番号２９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む抗体可変重鎖ドメイン、並びに、配列認識番号５９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列認識番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列認識番号６０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む抗体可変軽鎖ドメイン、
（ａ１１）配列認識番号３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列認識番号６１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列認識番号２９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む抗体可変重鎖ドメイン、並びに、配列認識番号４４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列認識番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列認識番号６２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む抗体可変軽鎖ドメイン、又は、
（ａ１２）アミノ酸配列ＹＤＦＳＳＹＷＩＧを有するＣＤＲ１、配列認識番号６３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列認識番号２９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む抗体可変重鎖ドメイン、並びに、配列認識番号６４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列認識番号３１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び、配列認識番号６５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む抗体可変軽鎖ドメイン、を含むＥＧＦＲｖＩＩＩ結合タンパク質。
【請求項２】
前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合部位は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）アッセイでは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性細胞に結合するが、ＥＧＦＲ陽性細胞に結合しない、請求項１に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ結合タンパク質。
【請求項３】
配列識別番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、及び、２５から成るグループから選択される抗体可変重鎖ドメイン、及び、配列識別番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、及び、２６から成るグループから選択される抗体可変軽鎖ドメイン、とを含む請求項１又は２に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ結合タンパク質。
【請求項４】
配列認識番号５、７、及び２５からなるグループから選択される抗体可変重鎖ドメイン、又は、配列認識番号６、８、及び、２６からなるグループから選択される抗体可変軽鎖ドメインを含む請求項１〜３のいずれか一項に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ結合タンパク質。
【請求項５】
可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインの前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合部位は、以下の（ｉ）〜（ｘｉｉ）のグループから選択される請求項３に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ結合タンパク質。
（ｉ）配列認識番号１及び配列認識番号２
（ｉｉ）配列認識番号３及び配列認識番号４
（ｉｉｉ）配列認識番号５及び配列認識番号６
（ｉｖ）配列認識番号７及び配列認識番号８
（ｖ）配列認識番号９及び配列認識番号１０
（ｖｉ）配列認識番号１１及び配列認識番号１２
（ｖｉｉ）配列認識番号１３及び配列認識番号１４
（ｖｉｉｉ）配列認識番号１５及び配列認識番号１６
（ｉｘ）配列認識番号１７及び配列認識番号１８
（ｘ）配列認識番号１９及び配列認識番号２０
（ｘｉ）配列認識番号２１及び配列認識番号２２
（ｘｉｉ）配列認識番号２５及び配列認識番号２６
【請求項６】
３７℃で２４時間の、結合タンパク質の飽和条件における前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合タンパク質に対する細胞の露出後、前記細胞の表面上で、未処理細胞上のＥＧＦＲｖＩＩＩレセプタ分子の少なくとも８０％がまだ使用可能である請求項１〜５のいずれか一項に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ結合タンパク質。
【請求項７】
少なくとも１つの別の機能的ドメインを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ結合タンパク質。
【請求項８】
前記少なくとも１つの別の機能的ドメインは、エフェクタドメインである請求項７に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ結合タンパク質。
【請求項９】
前記エフェクタドメインは、Ｔ細胞、又は、ＮＫ細胞に対して特異的である請求項８に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ結合タンパク質。
【請求項１０】
前記エフェクタドメインは、ＣＤ３に対する抗原結合部位を形成する、少なくとも１つの抗体可変重鎖ドメインと少なくとも１つの可変軽鎖ドメインとを含むＣＤ３結合部位である請求項８又は９に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ結合タンパク質。
【請求項１１】
前記ＣＤ３結合部位は、配列識別番号２３のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインと配列識別番号２４のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインとを含む請求項１０に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ結合タンパク質。
【請求項１２】
多重特異性である請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ結合タンパク質。
【請求項１３】
三重特異性である請求項１２に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ結合タンパク質。
【請求項１４】
二量体タンパク質である請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ結合タンパク質。
【請求項１５】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ及びＣＤ３（ＥＧＦＲｖＩＩＩ/ＣＤ３）に対して特異的であるタンデムダイアボディ（tandem diabody）、又は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ及びＣＤ１６Ａ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ/ＣＤ１６Ａ）に対して特異的であるタンデムダイアボディ（tandem diabody）である請求項１４に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ結合タンパク質。
【請求項１６】
タンデムダイアボディ（tandem diabody）であって、各ポリペプチドにおいて、４つの可変鎖ドメインは、ペプチドリンカーＬ１、Ｌ２、及びＬ３によって以下の順序で互いに融合されている請求項１５に記載の二量体ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合タンパク質。
（ｉ）ＶＬ（ＣＤ３）―Ｌ１−ＶＨ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）−Ｌ２−ＶＬ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）−Ｌ３−ＶＨ（ＣＤ３）、又は、
（ｉｉ）ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ１−ＶＬ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）−Ｌ２−ＶＨ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）−Ｌ３−ＶＬ（ＣＤ３）、又は、
（ｉｉｉ）ＶＬ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ３−ＶＨ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、又は、
（ｉｖ）ＶＨ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ３−ＶＬ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）
【請求項１７】
前記ペプチドリンカーＬ１、Ｌ２及びＬ３は、１２以下のアミノ酸残基からなる請求項１６に記載のタンデムダイアボディ。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ結合タンパク質、又は、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のタンデムダイアボディをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載のベクターでトランスフォーム、又はトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項２１】
（ｉ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ結合タンパク質、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の二重特異性タンデムダイアボディ、請求項１９に記載のベクター、又は、請求項２０に記載の宿主細胞、及び、
（ｉｉ）薬用的許容可能キャリア、を含む薬用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、EGFRvIIIに特異的に結合する結合タンパク質と、EGFRvIIIとCD3とに特異的に結合する多重特異性結合タンパク質とに関する。本発明は、更に、EGFRvIIIとCD3とに特異的に結合する多重特異性タンデムダイアボディ（tandem diabody）にも関する。特に、本発明は、複数種の固形腫瘍ガンを特異的かつ強力に死滅させるためにT細胞をリクルート（recruit）するための高度細胞傷害性EGFRvIII/CD3二重特異性タンデムダイアボディ（TandAb（登録商標））に関する。
【背景技術】
【０００２】
EGFR異常調節は、これまで様々なガンに関連付けられており、小分子及びEGFR標的抗体との両方がこれまで臨床まで成功裏に到達している。しかしながら、臨床使用に認可されている抗体及び開発中の抗体には、すべて、EGFRの広範囲な正常組織発現により、重篤な副作用プロファイルがある。短縮型（truncated）細胞外ドメインとその後のリガンド独立的構成活性を有するEGFRの欠失バリアントIII（EGFRvIII）は、発がん性形質転換に関連する最も一般的な突然突然変異体形態である。EGFRvIIIは、もっぱらガン組織中に発現され、様々な固形腫瘍に関連している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
EGFRvIIIがガン細胞上でその発現が限定されることは、正常な組織はそのままにした状態にガンを排他的標的化し、EGFR療法に関連する副作用を大幅に低減する可能性を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の第1態様において、完全ヒト高特異性高親和性EGFRvIII結合タンパク質がここに記載される。ここに記載のEGFRvIII結合タンパク質は以下の利点を有する。
【０００５】
それらは標的陽性細胞の細胞表面からのEGFRvIIIの内在化（インターナリゼーション（internalization）を促進しないか、若しくは、非常に僅かな内在化しか促進せず、このことは細胞傷害性T又はNK細胞をリクルートするために有利である。図９に提供される結果は、すべてのテスト条件下において、未処理の細胞に対して、本発明による前記EGFRvIII結合タンパク質に対する細胞の露出後において、EGFRvIIIレセプタ分子が細胞表面上に残っていることを示している。これらの結果は、本発明による前記EGFRvIII/CD3結合タンパク質が驚くべきことになんら内在化傾向を示さないということを示唆している（図９）。内在化を誘発する代わりに、本発明による前記EGFRvIII特異性結合タンパク質の結合は、EGFRvIIIの内在化を抑制するか、又はEGFRvIIIの発現の増加を促進し、それによってその細胞表面密度を高めるのであるかもしれない。
【０００６】
これらの高親和性結合タンパク質は、それらの親和性を、KDが100pMの範囲以下のEGFRvIIIに対して特異的な結合タンパク質を得るために親和性成熟技法を利用して更に大幅に改善させることができるであろう。驚くべき事実は、これらの結合タンパク質は、ネイティブEGFR（野生型EGFR又はEGFRwt）に対する交叉反応性無く、EGFRvIIIに対する結合の精巧な特異性を示すことにある。EGFRwtに対するEGFRvIII中のネオ・エピトープが、EGFRの細胞外ドメイン（エキソン2〜7）からの269のアミノ酸のインフレーム欠失によって形成され、これはかなり小さなものであると予想され、それは、その欠失部位におけるアミノ酸の新規な隣接（アミノ酸5がアミノ酸274に融合される）と単一の新規なGLYアミノ酸とから成る。
【０００７】
前記親和性成熟スクリーニング処理は、低下した会合率（kOFF）での結合タンパク質の選択を容易にすることによって結合親和性を改善することを目的とするものであった。しかしながら、驚くべきことに、親和性成熟結合タンパク質は会合率（kON）の大幅な増加を示したのに対して、KOFFの低下は、結合タンパク質の結合の100倍以下の改善に対して何種類かの抗体ドメインでは100pM未満のKDの僅かな貢献しか提供しなかった。
【０００８】
これらのユニークな性質により、ここに記載されるEGFRvIIIに対して特異的なこれらの可変抗体ドメインは、多重特異性、例えば、二重特異性の、多価、免疫エフェクタ細胞係合、腫瘍標的化抗体療法、例えば、前記EGFRvIII/CD3二重特異性タンデムダイアボディ（Tand Ab（登録商標））の開発に適したものとなる。
【０００９】
本発明の別の態様において、EGFRvIIIに対する二つの結合部位を有する、又は多価二重特異性抗体の場合には、EGFRvIIIに対する二つの結合部位に加えて、T細胞抗原CD3又はナチュラルキラー（NK）細胞上に特異的に発現されたCD16A、に対する結合部位、を有する多価EGFRvIII結合抗体が提供される。
【００１０】
一例において、EGFRvIIIに対する二つの結合部位と、更に、CD3に対する二つの結合部位を有するEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディが使用され、それらの組み換えEGFRvIII又はEGFR-Fc融合抗原に対する結合がテストされた。前記EGFRvIII又はEGFR-Fc融合抗原は、非還元条件下（ジスルフィド結合がそのままであるため、分子構造は部分的に不変）、又は、還元条件下（タンパク質構造は完全に変質する）でのSDS-PAGEによって分離され、ウェスタンブロッティングによってPVDF膜に移され、ブロットを修飾するために異なるEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディ抗体又はEGFR-結合IgGセツキシマブ（Cetuximab）を使用して結合を評価した（図４）。前記例は、親と親和性成熟EGFRvIII結合ドメインとの両方が、EGFRvIIIのための二つの結合部位を含む、多価抗体形態においても、EGFRvIIIに対する選択的特異性を維持することを示している。すべてのEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディは還元条件下と非還元条件下との両方においてEGFRvIIIを認識するが、全長野生型EGFRはこれらの条件下にいずれにおいても認識しない。この例は、更に、ここに記載の前記EGFRvIII特異性結合ドメインはリニアエピトープを認識するが、それらの反応性のために3-次元構造が不変であることは要件としない。これは、野生型EGFRvIIIと変異EGFRvIIIとの両方を認識するが、配座エピトープ（conformational epitope）とのその反応性のためにジスルフィド結合が不変であることを明確に要件とする、EGFRvIII結合IgG 抗体セツキシマブ（アービタックス（Erbitux））と対照的である（図４）。
【００１１】
別の例において、EGFRvIII/CD3タンデムダイアボディは、種々のCD3結合ドメインと組み合わされた親又は親和性成熟EGFRvIII特異性ドメインを含んで、及び／又は、タンデムダイアボディ中の個々の結合ドメインの異なる順序を有するものが使用された。ドメイン順序VLCD3-VHEGFRvIII-VLEGFRvIII-VHCD3を有するタンデムダイアボディはタンデムタンデムダイアボディ分子の中間に二価EGFRvIII結合部位を含み、これに対して、ドメイン順序VHEGFRvIII- VLCD3- VHCD3-VLEGFRvIIIを有するタンデムタンデムダイアボディは、外側位置に二つのEGFRvIII結合部位と中間に二つのCD3結合部位を有する。前記異なるEGFRvIIIドメインを含み、そしてタンデムダイアボディのドメイン順序バリアントの、EGFRvIII抗原、野生型EGFR抗原、に対する濃度依存結合、更に、CD3に対する結合をELISAで分析した（図６）。親和性成熟EGFRvIII結合ドメインを含有するすべてのタンデムダイアボディは、EGFRvIIIに対する大幅に改善された結合を示し、これは、対応の結合曲線の、二倍以上の低濃度へのシフトとして明確に見える（図６）。これらタンデムダイアボディのいずれについても野生型EGFR抗原に対する結合は観察されなかった。
【００１２】
抗EGFRvIII抗体、例えば、変異したEGFRには選択的に結合するが、ネイティブ（自然）形態のEGFRに対しては結合しない抗原結合タンパク質を、ファージディスプレイライブラリーによって選択し同定することができる。T細胞は、自然抗体によってはリクルートすることのできない強力な腫瘍死滅化エフェクタ細胞である。従って、本発明の別の態様において、T細胞リクルート能力を有し、広範囲の結合及び細胞傷害性を有する、多重特異性EGFRvIII/CD3抗原結合タンパク質、特に、タンデムダイアボディ、のパネルが本発明によって提供される。本発明による前記抗原結合タンパク質の、結合特性、T細胞媒介細胞傷害活性及び標的介在T細胞活性化がイン・ヴィトロアッセイのパネルで特徴付けられる。本発明による前記抗原結合タンパク質は、Biacore、ELISAにおけるEGFRvIII抗原、及びFACSアッセイにおけるEGFRvIII陽性細胞に対する鋭敏な特異性を示す。テストされた全濃度範囲に渡ってEGFR抗原又はEGFRwt発現細胞に対しては前記結合タンパク質のいずれも検出可能な結合は観察されなかった。最も強力な高親和性タンデムダイアボディは、EC50が1pM〜10pMの範囲でEGFRvIII発現F98グリオーマ及びCHO細胞に対して細胞傷害性を示し、残りのタンデムダイアボディは、EC50が最高で約10000pMの細胞傷害性を示す。自然型に対する残余の結合（residual binding）のより感度の高いプローブとしての、これらのタンデムダイアボディのEGFRwt+細胞に対する細胞傷害性もアッセイされる。EGFRwt+細胞又はその他のEGFRvIII陰性細胞に対しては、0.5μMの最大評価タンデムダイアボディ濃度まで、細胞傷害性は観察されない。CD3に対する高い親和性結合は、効果的なT細胞リクルートのために必須であるが、イン・ヴィトロでEGFRwt+標的細胞不在下で、本発明によるタンデムダイアボディは、それらの増殖の欠如による測定で、T細胞活性化を示さず、良好な臨床前安全性プロファイルに寄与する（図１０）。要約すると、抗腫瘍細胞傷害性の厳密な特異性と高い効力が前記EGFRvIII/CD3タンデムダイアボディによって媒介される。
【００１３】
CD3結合KDの範囲が1.1nM〜約500nMであるが、比較的に一定のEGFRvIII結合KD（2.0mM〜6.7nM）であるタンデムダイアボディを生成したところ、それらのCD結合強度と、EC50の値の範囲が25pM〜約10000pMでのEGFRvIII発現細胞に対するそれらの細胞傷害性効力との間に良好な相関を示した（図１１）。
【００１４】
本発明による前記抗原結合タンパク質のEGFRvIIIに対する親和性は大幅に改善されたが、特異性の損失は無かった。
【００１５】
Tand Ab（登録商標）は、タンデムダイアボディを表すために使用されるAffirmed Therapeuticsの商標である（Kipriyanov et al., 1999,J. Mol. Biol, 293: 41-56; Cochlovius et al., 2000, Cancer Res., 60: 4336-4341; Reusch et al., 2004, Int. J. Cancer, 112: 509-518, Kipriyanov, 2009, Methods Mol Biol. 562; 177-93; McAleese and Eser, 2012, Future Oncol. 8:687-95）。本発明のコンテクストにおいて、Tand Abとタンデムダイアボディとは同義的に使用される。
【００１６】
野生型EGFR遺伝子とタンパク質の配列は知られている。EGFRvIIIは、野生型EGFR遺伝子のエキソン2〜7（801bp）のインフレーム欠失の結果であり、それによって、前記レセプタの外部ドメインの267のアミノ酸の欠失と、エキソン1と8とのジャンクションでの新規なグリシン残基の生成が生じる。EGFRの細胞外ドメイン内でのアミノ酸のこの新規な並列によって腫瘍特異性及び免疫原性エピトープが作り出される。
【００１７】
本発明の第1の態様に依れば、少なくともEGFRvIIIに対する特異性を有し、野生型EGFRに対しては交叉反応性を持たない結合タンパク質が記載される。前記結合タンパク質は、好ましくは、下記の表１Ａに記載されるCDRから選択される、抗体可変重鎖のCDR1、CDR2、CDR3と、抗体可変軽鎖のCDR1、CDR2、CDR3とを含む。
【００１８】
【表１Ａ】
0006529498.tif 000002
【００２０】
本発明の１の態様に依れば、前記結合タンパク質は、表１Ｂに示めされている配列識別番号１、３、５、７、 ９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、及び２５から成るグループから選択される抗体可変重鎖ドメイン、及び／又は、図１Ｂに示めされている配列識別番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、及び２６から成るグループから選択される抗体可変軽鎖ドメインとを有する少なくとも1つのEGFRvIII結合部位を含む。前記三つの可変軽鎖CDRと前記可変重鎖CDRのアミノ酸配列は、表１において太字で下線とともに示されている。これらの結合部位は、特異性の損失無く改善された親和性を示す。これらの抗原結合タンパク質は、野生型EGFR抗原と交叉反応性を有さない。
【００２１】
更に、本発明によるこれらの抗原結合タンパク質は、それらに対する結合時に、EGFRvIIIの内在化（インターナリゼーション（internalization））を促進しないか、若しくは、非常に僅かな内在化しか促進しない。本発明に依れば、例９によってテストされた条件下において、前記EGFRvIII結合抗体に対する細胞の露出後、EGFRvIIIレセプタ分子の80%以上、好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上が細胞表面上にまだ残っている。内在化を誘導する代わりに、本発明による前記EGFRvIII特異性結合タンパク質の結合は、EGFRvIIIの内在化を抑制するか、又はEGFRvIIIの発現の増加を促進し、それによってその細胞表面密度を高めるのであるかもしれない。
【００２２】
前記用語「結合タンパク質」とは、抗原結合性を有する免疫グロブリン誘導体、即ち、抗原結合部位を含む、免疫グロブリンペプチド又はそのフラグメントを意味する。前記結合タンパク質は、抗体又はそのフラグメントの可変ドメインを有する。各抗原結合ドメインは、抗体、即ち、免疫グロブリン、可変重鎖ドメイン（VH）と抗体可変軽鎖ドメイン（VL）、同じエピトープに結合する、によって形成される。本発明による可変軽鎖ドメイン又は可変重鎖ドメインは、CDR1, CDR2及びCDR3を含むポリペプチドである。好ましくは、本発明による前記結合タンパク質は、免疫グロブリン定常ドメインを有さない。前記用語「結合タンパク質」は、更に、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fvフラグメント、一本鎖Fv、ダイアボディ、タンデムダイアボディ（TandAb（登録商標））、フレキシボディ（flexibody）（WO03/025018）、タンデム一本鎖Fv（(scFv)2）を含む抗体フラグメント又は誘導体も意味する。
【００２３】
【表１Ｂ−１】
0006529498.tif 000003
【表１Ｂ−２】
0006529498.tif 000004
【００２４】
一好適実施例において、EGFRvIIIに対して特異性を与える前記結合タンパク質は、表１に示す可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインとの下記の組み合わせのいずれかからの抗原結合部位を有する。
（i）配列識別番号１と配列識別番号２
（ii）配列識別番号３と配列識別番号４
（iii）配列識別番号５と配列識別番号６
（iv）配列識別番号７と配列識別番号８
（v）配列識別番号９と配列識別番号１０
（vi）配列識別番号１１と配列識別番号１２
（vii）配列識別番号１３と配列識別番号１４
（viii）配列識別番号１５と配列識別番号１６
（ix）配列識別番号１７と配列識別番号１８
（x）配列識別番号１９と配列識別番号２０
（xi）配列識別番号２１と配列識別番号２２、又は、
（xii）配列識別番号２５と配列識別番号２６。
【００２５】
本発明は、更に、EGFRvIIIに対する特異性を有するだけでなく、少なくとも1つの更に別の機能ドメインも有する結合タンパク質も提供する。別の実施例において、少なくとも1つの別の機能ドメインはエフェクタドメインである。「エフェクタドメイン」とは、エフェクタ細胞に対して特異的な結合部位であって、細胞傷害性、食作用、抗原提示、サイトカイン放出を刺激又はトリガできるものをいう。そのようなエフェクタ細胞は、例えば、T細胞又はNK細胞であるがこれらに限定されるものではない。特に、前記別のエフェクタドメインは、CD3、好ましくはヒトCD3に対する抗原結合部位を形成する、少なくとも1つの抗体可変重鎖ドメインと少なくとも1つの可変軽鎖ドメインとを有する。
【００２６】
従って、本発明による前記EGFRvIII結合タンパク質は、多重特異性であることができる。ここで使用される「多重特異性」という用語は、本発明の結合タンパク質が異なるエピトープに対する少なくとも二つの抗原結合部位を有し、そのうちの少なくとも一つがEGFRvIIIに対するものである、ことを意味する。例えば、前記結合タンパク質は、三重特異性であり、そして、腫瘍細胞上の二種類のエピトープ及び／又は抗原に対する結合部位と、エフェクタ細胞、例えばCD3等、上のエピトープ又は抗原に対する少なくとも1つの結合部位を有することができる。前記結合タンパク質は、同じ抗原上の異なるエピトープ及び／又は異なる抗原上のエピトープに対する結合部位を有するものとして構成することができる。そのような多重特異性結合タンパク質は、一本鎖ダイアボディ、（scFv）2、タンデムダイアボディ（TandAb（登録商標））、フレキシボディ（Le Gall et al. 1999 FEBS Letts 453:164-168及びWO 03/025018を参照）を含む。本発明の一実施例において、前記結合タンパク質は、EGFRvIIIとCD3とに対する二重特異性を有する。
【００２７】
本発明の前記多重特異性結合タンパク質の前記CD3結合部位は、表２に示す前記可変重鎖ドメイン（配列識別番号２３）と可変軽鎖ドメイン（配列識別番号２４）、又は、前記CDR配列の2つのアミノ酸のみにおいて異なるこの配列の近接ホモローグ、又はCD3に対して特異的な任意の他の完全ヒト、ヒト化、又は、非ヒト可変抗体ドメイン（CD3と称する）、例えば、CD3、特にはCD3ε、に対して特異的な任意の他の完全ヒ例えばト、ヒト化、又は非ヒト可変抗体ドメイン、例えば、UCHT1やOKT3の可変抗体ドメイン等のような、から構成することができる。
【００２８】
【表２】
0006529498.tif 000005
【００２９】
更に、本発明による前記EGFRvIII結合タンパク質は、多価性であることができる。ここで使用される「多価性」とは、本発明による結合タンパク質が少なくとも二つの抗原結合部位を含むことを意味する。前記抗原結合部位は、同じ特異性を有するものであっても、異なる特異性を有するものであってもよい。本発明の一実施例において、前記結合タンパク質は、同じエピトープに対する少なくとも二つの結合部位と結合する、即ち、二価性、を有する。二価結合タンパク質の一例は、ダイアボディであり、少なくとも四価の結合タンパク質の一例はタンデムダイアボディである。
【００３０】
本発明の更に別の態様において、前記EGFRvIII結合タンパク質、及び、前記二重特異性EGFRvIII及びCD3結合部位は、ヒト化、又は完全ヒト型、即ちヒト由来のものである。本発明の更に別の態様において、前記EGFRvIII結合タンパク質又は前記多重特異性EGFRvIII及びCD3結合タンパク質は、二量体、即ちEGFRvIIIとCD3とに対する抗原結合部位を備える二つのポリペプチドを含む。
【００３１】
本発明に依れば、二量体型で二重特異性EGFRvIII及びCD3結合タンパク質は、タンデムダイアボディ（TandAb（登録商標））として提供される。そのようなタンデムダイアボディは、4つの抗体可変結合ドメイン（重鎖可変ドメイン（VH）と軽鎖可変ドメイン（VL））をホモ二量体化を可能にする単一の遺伝子構造物中に連結させることによって構築される（McAleese and Eser, 2012, Future Oncol, 8:687-95を参照）。それらのタンデムダイアボディにおいて、リンカー長は、それによって可変ドメインの分子間対合が防止されて、分子が折りたたまれて一本鎖ダイアボディを形成することができなくなって、別の鎖の相補ドメインと対合を形成することを強いられるように構成される。前記ドメインは、更に、対応するVHとVLとがこの二量体化中に対合するようにも構成される。単一の遺伝子構造物からの発現に続いて、二つの同一のポリペプチド鎖が頭部-尾部に折りたたまれて約110kDaの機能的非共有結合ホモダイマを形成する（McAleese and Eser, 2012, Future Oncol, 8:687-95を参照）。分子間共有結合が欠如しているにも拘らず、前記ホモ二量体は、一旦形成されると非常に安定的であり、そのままの状態に留まって単量体形態に戻ることがない。
【００３２】
多重特異性タンデムダイアボディの一実施例において、膠芽腫（glioblastoma、GB）、前立腺、頭部及び頚部、並びにその他の上皮成長因子レセプタ変異vIII陽性（EGFRvIII+）ガンの治療のためのT細胞の細胞傷害性能力を活用する（harness）べく、それぞれCD3とEGFRvIIIとに対する二つの結合部位を備える（EGFRvIII/CD3 RECRUIT- TandAb（登録商標））、ヒト化二重特異性三価抗体（TandAb（登録商標））が提供される。
【００３３】
タンデムダイアボディは、伝統的なモノクローナル抗体と、更に、もっと小さな多重特異性分子とに対して利点を提供する多くの性質を有する。タンデムダイアボディは、グリコシル化不在下において完全に機能する。タンデムダイアボディは、抗体可変ドメインしか持たず、従って、Fc成分に関連する可能性のある副作用が全く無い。二重特異性タンデムダイアボディは、EGFRvIIIとCD3とのそれぞれに対する二価結合を可能にするので、その結合活性はIgGのそれと同じである。約110kDaのタンデムダイアボディのサイズは、IgGよりも小さく、このことによって、より高度な腫瘍に対する浸透が可能となるかもしれない。但し、このサイズは、腎臓の初回通過クリアランスのための閾値よりも遥かに大きく、抗体結合ドメイン又は非抗体スキャフォールドに基づくより小さな二重特異性形態と比較して薬物動態的利点を提供する。そのようなタンデムダイアボディの形成と産生は、例えば、Kipriyanov SM: Methods Mol. Biol. 2009; 562:177-93, Kipriyanov SM: Methods Mol Biol 2003; 207:323-33又はMcAleese及びEser, 2012, Future Oncol. 8:687-95に記載されている。
【００３４】
タンデムダイアボディは、CHO細胞中において良好に発現する。しっかりとした上流側及び下流側製造処理を行うことが可能である。
【００３５】
本発明による前記EGFRvIII及びCD3二重特異性タンデムダイアボディは、細胞傷害性T細胞をリクルートすることによるEGFRvIII+腫瘍細胞の特異的標的化を可能にするように設計される。抗体は、直接には細胞傷害性T細胞をリクルートすることができない。これに対して、これらの細胞上において特異的に発現されるCD分子に係合することによって、前記タンデムダイアボディは、細胞傷害性T細胞をEGFRvIII+腫瘍細胞と、高度に特異的にクロスリンクし、それによってそのような分子の細胞傷害能力を大幅に増大させることができる。前記タンデムダイアボディは、強力で、特異的で効率的な細胞傷害性を示す。T細胞は腫瘍成長の制御において役割を演じることができるという有意な証拠がある。例えば、大腸腫瘍とNHL患者からのリンパ節とにおける細胞傷害性T細胞の存在が、より良好な臨床結果に相関することが示された。更に、T細胞応答を誘導するように設計された治療法の能力が、メラノーマワクチン、更に、CTLA-4に対する抗体、T細胞活性化のネガティブレギュレータに関して示されている。本発明による前記タンデダイアボディは、表面発現されたCD3、好ましくはCD3ε、T細胞レセプタの一部を形成する、に対する結合によって細胞傷害性T細胞に係合する。特定の腫瘍細胞の表面上に発現されたCD3とEGFRvIIIとに対するこのタンデムダイアボディの同時結合によってT細胞活性化が起こり、前記腫瘍細胞のその後の溶解（lysis）が媒介される。
【００３６】
「二量体」とは、二つのポリペプチドの複合体を指す。好ましくは、前記二つのポリペプチドは、特に、これら二つのポリペプチド間に共有結合が存在しないという条件で、互いに対して非共有的に会合している。好ましくは、前記二重特異性二量体は、ホモ二量体、即ち、二つの同じポリペプチドを有する。但し、三重又はその他の多重特異性二量体は、ヘテロ二量体であってもよく、二つの異なるポリペプチドを備えることができ、例えば、そこで、少なくとも1つの結合部位の、可変軽鎖ドメインが一つのポリペプチド上に位置し、可変重鎖ドメインが他方のドメイン上に位置する。前記用語「ポリペプチド」とは、アミド結合によって連結されたアミノ酸残基のポリマーを意味する。前記ポリペプチドは、好ましくは、分岐していない一本鎖融合タンパク質である。前記ポリペプチドにおいて、前記可変抗体ドメインは、互いに前後に連結されている。前記ポリペプチドは、前記可変ドメインN末端及び／又はC-末端に加えて、隣接するアミノ酸残基を備えることができる。例えば、そのような隣接アミノ酸残基は、Tag配列、好ましくは、前記ポリペプチドの精製に有用かもしれないC末端でTag配列、を備えることができる。
【００３７】
前記二重特異性タンデムダイアボディの各ポリペプチドは、少なくとも4つの可変ドメイン、即ち、CD3結合タンパク質の可変軽鎖（VL）及び可変重鎖（VH）、EGFRvIII結合タンパク質の可変軽鎖（VL）及び可変重鎖（VH）を有する。これら4つの可変ドメインは、ペプチドリンカーL1、L2及びL3によつて連結され、以下のようなにN末端からC末端まで配列されたものとすることができる。
（i）VL(CD3)-L1-VH(EGFRvIII)-L2-VL(EGFRvIII)-L3-VH(CD3);又は
（ii）VH(CD3)-L1-VL(EGFRvIII)-L2-VH(EGFRvIII)-L3-VL(CD3);又は
（iii）VL(EGFRvIII)-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3)-L3-VH(EGFRvIII);又は
（iv）VH(EGFRvIII)-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)-L3-VL(EGFRvII)。
【００３８】
本発明の一実施例において、前記4つの可変ドメインは、VL(CD3)-L1-VH(EGFRvIII)-L2-VL(EGFRvIII)-L3-VH(CD3)として配列される。ドメイン順序VLCD3-VHEGFRvIII-VLEGFRvIII-VHCD3を有し、EGFRvIIIに対する親和性が異なるにも拘らず異なるEGFRvIII結合配列を含むタンデムダイアボディは、すべて、CD3γε抗原上でELISAによって示されるように、第2の特異性、CD3、に対して非常に類似した結合を示した（図５Ａ)。外側位置においてEGFRvIII結合ドメインを含み、中間位置において2つのCD3結合部位を有するその他のタンデムダイアボディ順序（VHEGFRvIII-VLCD3- VHCD3-VLEGFRvIII）では、親和性成熟EGFRvIII結合ドメインとのEGFRvIII結合の十分な改善が同様に明白であるのに対して、前記タンデムダイアボディの中間のドメインのCD3に対する結合は、第1のドメイン順序よりも、僅かに弱く、個々のタンデムダイアボディ間でより可変的である（図５Ｂ）。別のCD3ドメイン（配列識別番号２３と２４）を使用して前記異なるEGFRvIII結合ドメインを含むタンデダイアボディを構築した時にも類似の観察結果が得られた（図５Ｃ）。
【００３９】
リンカーの長さは、前記抗原結合タンデムダイアボディのフレキシビリティに影響する。二量体抗原結合タンパク質の形成に対するリンカー長の影響は、例えば、Todorovska et al., 2001 Journal of Immunological Methods 248: 47-66, Perisic et al., 1994 Structure 2: 1217-1226; Le Gall et al., 2004, Protein Engineering 17: 357-366及びWO 94/13804に記載されている。
【００４０】
本発明に依れば、前記ペプチドリンカーL1、L2及びL3の長さは、一つのポリペプチドのドメインが別のポリペプチドのドメインと分子間的に会合して、二量体抗原結合タンデムダイアボディを形成することが可能となるように構成することが好ましい。そのようなリンカーは、「短い」、即ち、それは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12のアミノ酸残基である。従って、前記リンカーは、約12以下のアミノ酸残基から成る。0アミノ酸残基の場合、前記リンカーはペプチド結合である。そのような短いリンカーが、異なるポリペプチドの抗体可変軽鎖ドメインと抗体可変重鎖ドメインとの間で正しい抗原結合部位に結合し形成することによる、二つのポリペプチド間の分子間二量体化に有利である。約12以下のアミノ酸残基の短いリンカーによって、同じポリペプチドの隣接するドメインが、互いに対する分子間相互作用することが防止される。本発明の一実施例において、これらのリンカーは、約3〜約10、例えば、4、5又は6の隣接アミノ酸残基から成る。
【００４１】
前記リンカーのアミノ酸組成に関して、前記二つのポリペプチドの二量体化に干渉しないペプチドが選択される。例えば、グリシンとセリン残基を含むリンカーが一般的にプロテアーゼ耐性を提供する。前記リンカーのアミノ酸配列は、前記抗原結合ポリペプチド二量体の抗原結合と産生収率とを改善するべく、例えば、ファージディスプレイ法によって最適化することができる。本発明によるタンデムダイアボディのために好適なペプチドリンカーの具体例は、GGSGGS（配列識別番号６６）、GGSG（配列識別番号６７）又はGGSGG（配列識別番号６８）である。
【００４２】
ここに記載される前記EGFRvIII結合タンパク質と多重特異性タンデムダイアボディは、もう一つの同じポリペプチドと会合して前記抗原結合タンデムダイアボディを形成する前記タンデムダイアボディのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することによって作製することができる。従って、本発明の別実施例は、ここに記載の前記抗原結合タンデムダイアボディのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、DNA又はRNAである。
【００４３】
前記ポリヌクレオチドは、例えば、ペプチドリンカーをコードする配列によって分離された、又は、ペプチド結合によって直接連結された少なくとも4つの抗体可変ドメインをコードする遺伝子を、適当なプロモータ、オプションとして検出と精製のためのタンパク質-タグ及び適当な転写ターミネータ、によって操作可能に連結された単一の遺伝子構築物へと組み合わせ、それを、バクテリア、又は、例えばCHO細胞等のその他の適当な発現システム中において発現させること等の、当業者に知られている方法によって構築することができる。利用されるベクターシステムと宿主とに応じて、構成及び誘導プロモータを含む、任意の数の適当な転写及び翻訳要素を使用することができる。前記プロモータは、それによって前記各宿主細胞中における前記ポリヌクレオチドの発現が引き起こされるように選択される。
【００４４】
前記ポリヌクレオチドは、本発明の別の実施例であるところの、ベクター、好ましくは、発現ベクターに挿入可能である。この組み換えベクターは、当業者に周知の方法によって構築することができる。
【００４５】
本発明の前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、そして、発現させるために様々な発現ベクター／宿主システムを利用することができる。E.coli内での発現のための発現ベクターの具体例は、pSKK（Le Gall et al., J. Immunol Methods. (2004)285(1); 111-27）又は哺乳動物細胞中での発現のためのpcDNA5（Introgen）である。
【００４６】
従って、ここに記載される前記抗原結合タンデムダイアボディは、上述したポリペプチドをコードするベクターを、宿主細胞に導入して、それによって前記ポリペプチド鎖が発現され、培養培地から単離し、またオプションとしてその後、精製することができる条件下で前記細胞を培養することによって作製できる。
【００４７】
別の実施例において、本発明は、前記EGFRvIII結合タンパク質、前記抗原結合タンデムダイアボディ、前記抗原結合タンデムダイアボディの前記ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドを有する前記ベクター、又は、このベクターによってトランスフォームされた宿主細胞、そして、少なくとも1つの薬用的許容可能キャリア、を含む薬用組成物を提供する。ここで用語「薬用的許容キャリア」は、前記成分の生物活性の有効性に干渉せず、それが投与される患者に対して毒性を有さない任意のキャリアを含むものをいう。適当な薬用キャリアの具体例は当該技術において周知であり、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、水、油／水エマルジョン等のエマルジョン、種々のタイプの湿潤剤、無菌液等がある。そのようなキャリアは、従来の方法によって調製することができ、適当な投与量で対象体に対して投与することができる。好ましくは、前記組成物は殺菌されている。これらの組成物は、更に、保存剤、エマルジョン化剤、分散剤、等のアジュバントも含むことができる。種々の抗菌剤及び抗真菌剤を含ませることによって微生物の活動の防止を確実なものとすることができる。
【００４８】
当業者は、既に確立されている技術、及び当該分野で知られている標準法、例えば、Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.; The Protein Protocols Handbook, John M. Walker編集、Humana Press Inc. (2002); 又はAntibody engineering; methods and protocols/Benny K.C. Lo編集、Benny K.C. II Series: Methods in molecular biology (Totowa, N.J.))を利用することによって、ここに記載のタンデムダイアボディ等の抗原結合タンパク質を容易に無理なく構築し入手することができるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１Ａ】親和性成熟後に誘導されたEGFRvIII特異性高親和性結合ドメインにおける可変配列位置を示している。親配列とは異なる重鎖及び軽鎖可変領域のCDR位置がアステリスクで示され、各アミノ酸はグレーでハイライト表示されている。有用な変異を有する位置は、濃いグレーでハイライト表示されている。
【図１Ｂ】親和性成熟後に誘導されたEGFRvIII特異性高親和性結合ドメインにおける可変配列位置を示している。親配列とは異なる重鎖及び軽鎖可変領域のCDR位置がアステリスクで示され、各アミノ酸はグレーでハイライト表示されている。有用な変異を有する位置は、濃いグレーでハイライト表示されている。
【図２Ａ】Biacore T200中における組み換えEGFRvIII-Fc抗原又は野生型EGFRvIII-Fc抗原に対する異なるscFv抗体の結合の多重サイクルカイネティクス測定から得られた結果を図示している。センサーグラムは、4種類の濃度レベル（86nM、17.2nM、3.4nM、0.69nM）のscFv抗体の時間経過測定された表面プラズモン共鳴（SPR）レスポンスユニット（RU）のカイネティクスを図示している。会合を180秒間測定し、その後に解離を測定する。データは1:1結合モデルを使用して分析される。
【図２Ｂ】Biacore T200中における組み換えEGFRvIII-Fc抗原又は野生型EGFRvIII-Fc抗原に対する異なるscFv抗体の結合の多重サイクルカイネティクス測定から得られた結果を図示している。センサーグラムは、4種類の濃度レベル（86nM、17.2nM、3.4nM、0.69nM）のscFv抗体の時間経過測定された表面プラズモン共鳴（SPR）レスポンスユニット（RU）のカイネティクスを図示している。会合を180秒間測定し、その後に解離を測定する。データは1:1結合モデルを使用して分析される。
【図２Ｃ】Biacore T200中における組み換えEGFRvIII-Fc抗原又は野生型EGFRvIII-Fc抗原に対する異なるscFv抗体の結合の多重サイクルカイネティクス測定から得られた結果を図示している。センサーグラムは、4種類の濃度レベル（86nM、17.2nM、3.4nM、0.69nM）のscFv抗体の時間経過測定された表面プラズモン共鳴（SPR）レスポンスユニット（RU）のカイネティクスを図示している。会合を180秒間測定し、その後に解離を測定する。データは1:1結合モデルを使用して分析される。
【図２Ｄ】Biacore T200中における組み換えEGFRvIII-Fc抗原又は野生型EGFRvIII-Fc抗原に対する異なるscFv抗体の結合の多重サイクルカイネティクス測定から得られた結果を図示している。センサーグラムは、4種類の濃度レベル（86nM、17.2nM、3.4nM、0.69nM）のscFv抗体の時間経過測定された表面プラズモン共鳴（SPR）レスポンスユニット（RU）のカイネティクスを図示している。会合を180秒間測定し、その後に解離を測定する。データは1:1結合モデルを使用して分析される。
【図２Ｅ】Biacore T200中における組み換えEGFRvIII-Fc抗原又は野生型EGFRvIII-Fc抗原に対する異なるscFv抗体の結合の多重サイクルカイネティクス測定から得られた結果を図示している。センサーグラムは、4種類の濃度レベル（86nM、17.2nM、3.4nM、0.69nM）のscFv抗体の時間経過測定された表面プラズモン共鳴（SPR）レスポンスユニット（RU）のカイネティクスを図示している。会合を180秒間測定し、その後に解離を測定する。データは1:1結合モデルを使用して分析される。
【図２Ｆ】Biacore T200中における組み換えEGFRvIII-Fc抗原又は野生型EGFRvIII-Fc抗原に対する異なるscFv抗体の結合の多重サイクルカイネティクス測定から得られた結果を図示している。センサーグラムは、4種類の濃度レベル（86nM、17.2nM、3.4nM、0.69nM）のscFv抗体の時間経過測定された表面プラズモン共鳴（SPR）レスポンスユニット（RU）のカイネティクスを図示している。会合を180秒間測定し、その後に解離を測定する。データは1:1結合モデルを使用して分析される。
【図２Ｇ】Biacore T200中における組み換えEGFRvIII-Fc抗原又は野生型EGFRvIII-Fc抗原に対する異なるscFv抗体の結合の多重サイクルカイネティクス測定から得られた結果を図示している。センサーグラムは、4種類の濃度レベル（86nM、17.2nM、3.4nM、0.69nM）のscFv抗体の時間経過測定された表面プラズモン共鳴（SPR）レスポンスユニット（RU）のカイネティクスを図示している。会合を180秒間測定し、その後に解離を測定する。データは1:1結合モデルを使用して分析される。
【図２Ｈ】Biacore T200中における組み換えEGFRvIII-Fc抗原又は野生型EGFRvIII-Fc抗原に対する異なるscFv抗体の結合の多重サイクルカイネティクス測定から得られた結果を図示している。センサーグラムは、4種類の濃度レベル（86nM、17.2nM、3.4nM、0.69nM）のscFv抗体の時間経過測定された表面プラズモン共鳴（SPR）レスポンスユニット（RU）のカイネティクスを図示している。会合を180秒間測定し、その後に解離を測定する。データは1:1結合モデルを使用して分析される。
【図２Ｉ】Biacore T200中における組み換えEGFRvIII-Fc抗原又は野生型EGFRvIII-Fc抗原に対する異なるscFv抗体の結合の多重サイクルカイネティクス測定から得られた結果を図示している。センサーグラムは、4種類の濃度レベル（86nM、17.2nM、3.4nM、0.69nM）のscFv抗体の時間経過測定された表面プラズモン共鳴（SPR）レスポンスユニット（RU）のカイネティクスを図示している。会合を180秒間測定し、その後に解離を測定する。データは1:1結合モデルを使用して分析される。
【図２Ｊ】Biacore T200中における組み換えEGFRvIII-Fc抗原又は野生型EGFRvIII-Fc抗原に対する異なるscFv抗体の結合の多重サイクルカイネティクス測定から得られた結果を図示している。センサーグラムは、4種類の濃度レベル（86nM、17.2nM、3.4nM、0.69nM）のscFv抗体の時間経過測定された表面プラズモン共鳴（SPR）レスポンスユニット（RU）のカイネティクスを図示している。会合を180秒間測定し、その後に解離を測定する。データは1:1結合モデルを使用して分析される。
【図２Ｋ】Biacore T200中における組み換えEGFRvIII-Fc抗原又は野生型EGFRvIII-Fc抗原に対する異なるscFv抗体の結合の多重サイクルカイネティクス測定から得られた結果を図示している。センサーグラムは、4種類の濃度レベル（86nM、17.2nM、3.4nM、0.69nM）のscFv抗体の時間経過測定された表面プラズモン共鳴（SPR）レスポンスユニット（RU）のカイネティクスを図示している。会合を180秒間測定し、その後に解離を測定する。データは1:1結合モデルを使用して分析される。
【図２Ｌ】Biacore T200中における組み換えEGFRvIII-Fc抗原又は野生型EGFRvIII-Fc抗原に対する異なるscFv抗体の結合の多重サイクルカイネティクス測定から得られた結果を図示している。センサーグラムは、4種類の濃度レベル（86nM、17.2nM、3.4nM、0.69nM）のscFv抗体の時間経過測定された表面プラズモン共鳴（SPR）レスポンスユニット（RU）のカイネティクスを図示している。会合を180秒間測定し、その後に解離を測定する。データは1:1結合モデルを使用して分析される。
【図３Ａ】図３は、（Ａ）EGFRvIIIを過剰発現するF98ラット神経膠腫（glioma）細胞（F98EGFRvIII）、（Ｂ）天然EGFRを過剰発現するF98細胞（F98EGFR）、（Ｃ）非トランスフェクションF98細胞（F98）に対するscFv抗体の結合と、（Ｄ）EGFRvIIIを過剰発現するCHO細胞（CHOEGFRvIII）、（Ｅ）天然EGFRを過剰発現するCHO細胞（CHOEDFR）及び（Ｆ）非トランスフェクションCHO細胞（CHO）に対するこれら同じscFv抗体の結合のフローサイトメトリー測定の結果を図示している。
【図３Ｂ】図３は、（Ａ）EGFRvIIIを過剰発現するF98ラット神経膠腫（glioma）細胞（F98EGFRvIII）、（Ｂ）天然EGFRを過剰発現するF98細胞（F98EGFR）、（Ｃ）非トランスフェクションF98細胞（F98）に対するscFv抗体の結合と、（Ｄ）EGFRvIIIを過剰発現するCHO細胞（CHOEGFRvIII）、（Ｅ）天然EGFRを過剰発現するCHO細胞（CHOEDFR）及び（Ｆ）非トランスフェクションCHO細胞（CHO）に対するこれら同じscFv抗体の結合のフローサイトメトリー測定の結果を図示している。
【図３Ｃ】図３は、（Ａ）EGFRvIIIを過剰発現するF98ラット神経膠腫（glioma）細胞（F98EGFRvIII）、（Ｂ）天然EGFRを過剰発現するF98細胞（F98EGFR）、（Ｃ）非トランスフェクションF98細胞（F98）に対するscFv抗体の結合と、（Ｄ）EGFRvIIIを過剰発現するCHO細胞（CHOEGFRvIII）、（Ｅ）天然EGFRを過剰発現するCHO細胞（CHOEDFR）及び（Ｆ）非トランスフェクションCHO細胞（CHO）に対するこれら同じscFv抗体の結合のフローサイトメトリー測定の結果を図示している。
【図３Ｄ】図３は、（Ａ）EGFRvIIIを過剰発現するF98ラット神経膠腫（glioma）細胞（F98EGFRvIII）、（Ｂ）天然EGFRを過剰発現するF98細胞（F98EGFR）、（Ｃ）非トランスフェクションF98細胞（F98）に対するscFv抗体の結合と、（Ｄ）EGFRvIIIを過剰発現するCHO細胞（CHOEGFRvIII）、（Ｅ）天然EGFRを過剰発現するCHO細胞（CHOEDFR）及び（Ｆ）非トランスフェクションCHO細胞（CHO）に対するこれら同じscFv抗体の結合のフローサイトメトリー測定の結果を図示している。
【図３Ｅ】図３は、（Ａ）EGFRvIIIを過剰発現するF98ラット神経膠腫（glioma）細胞（F98EGFRvIII）、（Ｂ）天然EGFRを過剰発現するF98細胞（F98EGFR）、（Ｃ）非トランスフェクションF98細胞（F98）に対するscFv抗体の結合と、（Ｄ）EGFRvIIIを過剰発現するCHO細胞（CHOEGFRvIII）、（Ｅ）天然EGFRを過剰発現するCHO細胞（CHOEDFR）及び（Ｆ）非トランスフェクションCHO細胞（CHO）に対するこれら同じscFv抗体の結合のフローサイトメトリー測定の結果を図示している。
【図３Ｆ】図３は、（Ａ）EGFRvIIIを過剰発現するF98ラット神経膠腫（glioma）細胞（F98EGFRvIII）、（Ｂ）天然EGFRを過剰発現するF98細胞（F98EGFR）、（Ｃ）非トランスフェクションF98細胞（F98）に対するscFv抗体の結合と、（Ｄ）EGFRvIIIを過剰発現するCHO細胞（CHOEGFRvIII）、（Ｅ）天然EGFRを過剰発現するCHO細胞（CHOEDFR）及び（Ｆ）非トランスフェクションCHO細胞（CHO）に対するこれら同じscFv抗体の結合のフローサイトメトリー測定の結果を図示している。
【図４Ａ】異なるEGFRvIII結合ドメインを含むタンデムダイアボディの、SDS-PAGEによって分離されウェスタンブロッティングによってPVDF膜に移された、精製EGFRvIII-又は天然EGFR-Fc融合抗原（非還元タンパク質又はDTTによって還元されたタンパク質）に対する結合を示している。前記Fc融合タンパク質は、Fc部分においてジスルフィド結合を介して二量体化するが、DTTでの還元後は単量体である。EGFRvIII特異性抗体は前記EGFRvIII融合抗原に対しては還元及び非還元形態で結合するが、天然EGFRに対しては結合しない。前記抗EGFR抗体セツキシマブを対照として使用したが、これは前記非還元EGFRvIII-Fcと前記非還元EGFR-Fc抗原との両方を認識するが、前記DTT処理抗原は認識しない。
【図４Ｂ】異なるEGFRvIII結合ドメインを含むタンデムダイアボディの、SDS-PAGEによって分離されウェスタンブロッティングによってPVDF膜に移された、精製EGFRvIII-又は天然EGFR-Fc融合抗原（非還元タンパク質又はDTTによって還元されたタンパク質）に対する結合を示している。前記Fc融合タンパク質は、Fc部分においてジスルフィド結合を介して二量体化するが、DTTでの還元後は単量体である。EGFRvIII特異性抗体は前記EGFRvIII融合抗原に対しては還元及び非還元形態で結合するが、天然EGFRに対しては結合しない。前記抗EGFR抗体セツキシマブを対照として使用したが、これは前記非還元EGFRvIII-Fcと前記非還元EGFR-Fc抗原との両方を認識するが、前記DTT処理抗原は認識しない。
【図５Ａ】図５は、ELISAにおいて分析されたEGFRvIII-Fc, EGFR-Fc及びCD3γε組み換え抗原に対する異なるEGFRvIII/CD3特異性タンデム二重抗原の濃度依存結合を図示している。結合シグナルは（Ａ）ドメイン順序（VLCD3-VHEGFRvIII-VLEGFRvIII-VHCD3）を有するEGFRvIII/CD3特異性タンデムダイアボディ、（Ｂ）ドメイン順序（VHEGFRvIII-VLCD3- VHCD3-VLEGFRvIII-） を有するEGFRvIII/CD3特異性タンデムダイアボディ、及び（Ｃ） 配列識別番号２３、２４のCD3ドメインとドメイン順序（VLCD3-VHEGFRvIII-VLEGFRvIII-VHCD3）を有するEGFRvIII/CD3特異性タンデムダイアボディについて図示されている。親和性成熟EGFRvIII結合ドメインを含むタンデムダイアボディについてEGFRvIIIに対する結合の改善が、すべてのフォーマット/ドメイン順序での各結合曲線のより低い濃度へのシフトとして明確に検出可能である。
【図５Ｂ】図５は、ELISAにおいて分析されたEGFRvIII-Fc, EGFR-Fc及びCD3γε組み換え抗原に対する異なるEGFRvIII/CD3特異性タンデム二重抗原の濃度依存結合を図示している。結合シグナルは（Ａ）ドメイン順序（VLCD3-VHEGFRvIII-VLEGFRvIII-VHCD3）を有するEGFRvIII/CD3特異性タンデムダイアボディ、（Ｂ）ドメイン順序（VHEGFRvIII-VLCD3- VHCD3-VLEGFRvIII-） を有するEGFRvIII/CD3特異性タンデムダイアボディ、及び（Ｃ） 配列識別番号２３、２４のCD3ドメインとドメイン順序（VLCD3-VHEGFRvIII-VLEGFRvIII-VHCD3）を有するEGFRvIII/CD3特異性タンデムダイアボディについて図示されている。親和性成熟EGFRvIII結合ドメインを含むタンデムダイアボディについてEGFRvIIIに対する結合の改善が、すべてのフォーマット/ドメイン順序での各結合曲線のより低い濃度へのシフトとして明確に検出可能である。
【図５Ｃ】図５は、ELISAにおいて分析されたEGFRvIII-Fc, EGFR-Fc及びCD3γε組み換え抗原に対する異なるEGFRvIII/CD3特異性タンデム二重抗原の濃度依存結合を図示している。結合シグナルは（Ａ）ドメイン順序（VLCD3-VHEGFRvIII-VLEGFRvIII-VHCD3）を有するEGFRvIII/CD3特異性タンデムダイアボディ、（Ｂ）ドメイン順序（VHEGFRvIII-VLCD3- VHCD3-VLEGFRvIII-） を有するEGFRvIII/CD3特異性タンデムダイアボディ、及び（Ｃ） 配列識別番号２３、２４のCD3ドメインとドメイン順序（VLCD3-VHEGFRvIII-VLEGFRvIII-VHCD3）を有するEGFRvIII/CD3特異性タンデムダイアボディについて図示されている。親和性成熟EGFRvIII結合ドメインを含むタンデムダイアボディについてEGFRvIIIに対する結合の改善が、すべてのフォーマット/ドメイン順序での各結合曲線のより低い濃度へのシフトとして明確に検出可能である。
【図６Ａ】Biacore X100中において組み換えEGFRvIII-Fc抗原に対するドメイン順序VLCD3-VHEGFRvIII-VLEGFRvIII-VHCD3における異なる二価EGFRvIII結合ドメインを含むEGFRvIII/CD3特異性タンデムダイアボディのマルチサイクルキネティクス測定の結果を図示している。センサーグラムは、異なる濃度レベルの前記タンデムダイアボディの経時測定された表面プラズモン共鳴（SPR）レスポンスユニット（RU）のキネティクスを図示している。会合を180秒間測定し、その後に解離を測定する。データを1:1結合モデルを使用して分析する。
【図６Ｂ】Biacore X100中において組み換えEGFRvIII-Fc抗原に対するドメイン順序VLCD3-VHEGFRvIII-VLEGFRvIII-VHCD3における異なる二価EGFRvIII結合ドメインを含むEGFRvIII/CD3特異性タンデムダイアボディのマルチサイクルキネティクス測定の結果を図示している。センサーグラムは、異なる濃度レベルの前記タンデムダイアボディの経時測定された表面プラズモン共鳴（SPR）レスポンスユニット（RU）のキネティクスを図示している。会合を180秒間測定し、その後に解離を測定する。データを1:1結合モデルを使用して分析する。
【図６Ｃ】Biacore X100中において組み換えEGFRvIII-Fc抗原に対するドメイン順序VLCD3-VHEGFRvIII-VLEGFRvIII-VHCD3における異なる二価EGFRvIII結合ドメインを含むEGFRvIII/CD3特異性タンデムダイアボディのマルチサイクルキネティクス測定の結果を図示している。センサーグラムは、異なる濃度レベルの前記タンデムダイアボディの経時測定された表面プラズモン共鳴（SPR）レスポンスユニット（RU）のキネティクスを図示している。会合を180秒間測定し、その後に解離を測定する。データを1:1結合モデルを使用して分析する。
【図６Ｄ】Biacore X100中において組み換えEGFRvIII-Fc抗原に対するドメイン順序VLCD3-VHEGFRvIII-VLEGFRvIII-VHCD3における異なる二価EGFRvIII結合ドメインを含むEGFRvIII/CD3特異性タンデムダイアボディのマルチサイクルキネティクス測定の結果を図示している。センサーグラムは、異なる濃度レベルの前記タンデムダイアボディの経時測定された表面プラズモン共鳴（SPR）レスポンスユニット（RU）のキネティクスを図示している。会合を180秒間測定し、その後に解離を測定する。データを1:1結合モデルを使用して分析する。
【図６Ｅ】Biacore X100中において組み換えEGFRvIII-Fc抗原に対するドメイン順序VLCD3-VHEGFRvIII-VLEGFRvIII-VHCD3における異なる二価EGFRvIII結合ドメインを含むEGFRvIII/CD3特異性タンデムダイアボディのマルチサイクルキネティクス測定の結果を図示している。センサーグラムは、異なる濃度レベルの前記タンデムダイアボディの経時測定された表面プラズモン共鳴（SPR）レスポンスユニット（RU）のキネティクスを図示している。会合を180秒間測定し、その後に解離を測定する。データを1:1結合モデルを使用して分析する。
【図６Ｆ】Biacore X100中において組み換えEGFRvIII-Fc抗原に対するドメイン順序VLCD3-VHEGFRvIII-VLEGFRvIII-VHCD3における異なる二価EGFRvIII結合ドメインを含むEGFRvIII/CD3特異性タンデムダイアボディのマルチサイクルキネティクス測定の結果を図示している。センサーグラムは、異なる濃度レベルの前記タンデムダイアボディの経時測定された表面プラズモン共鳴（SPR）レスポンスユニット（RU）のキネティクスを図示している。会合を180秒間測定し、その後に解離を測定する。データを1:1結合モデルを使用して分析する。
【図６Ｇ】Biacore X100中において組み換えEGFRvIII-Fc抗原に対するドメイン順序VLCD3-VHEGFRvIII-VLEGFRvIII-VHCD3における異なる二価EGFRvIII結合ドメインを含むEGFRvIII/CD3特異性タンデムダイアボディのマルチサイクルキネティクス測定の結果を図示している。センサーグラムは、異なる濃度レベルの前記タンデムダイアボディの経時測定された表面プラズモン共鳴（SPR）レスポンスユニット（RU）のキネティクスを図示している。会合を180秒間測定し、その後に解離を測定する。データを1:1結合モデルを使用して分析する。
【図７Ａ】図７は、（Ａ）3人の個人の頭頚部（H&N）がん患者、（Ｂ）3人の個人の膠芽腫患者からの組織切片の免疫組織化学的染色の結果、（Ｃ）は前立腺がん、乳がん（Her2 neg）及び非小細胞肺がん（NSCLC）からの結果を示している。切片を、EGFRvIII標的タンデムダイアボディ（例えば(VLCD3-)VHEGFRvIII-VLEGFRvIII-(VHCD3)）における構成に類似するが、CD3結合部分を持たない、二価形態においてEGFRvIII特異性結合ドメインLi3G30を含む二種類の濃度のEGFRvIII-特異性ダイアボディで染色した。対照として、切片を、EGFR（健全な組織とがん組織との両方に存在する）、並びに、EGFRvIIIを認識する前記EGFR-特異性IgG抗体セツキシマブによって染色した。染色の特異性を、EGFR-又はEGFRvIII-特異性一次抗体の不在下で二次試薬と共にインキュベートした対照切片によって確認した。
【図７Ｂ】図７は、（Ａ）3人の個人の頭頚部（H&N）がん患者、（Ｂ）3人の個人の膠芽腫患者からの組織切片の免疫組織化学的染色の結果、（Ｃ）は前立腺がん、乳がん（Her2 neg）及び非小細胞肺がん（NSCLC）からの結果を示している。切片を、EGFRvIII標的タンデムダイアボディ（例えば(VLCD3-)VHEGFRvIII-VLEGFRvIII-(VHCD3)）における構成に類似するが、CD3結合部分を持たない、二価形態においてEGFRvIII特異性結合ドメインLi3G30を含む二種類の濃度のEGFRvIII-特異性ダイアボディで染色した。対照として、切片を、EGFR（健全な組織とがん組織との両方に存在する）、並びに、EGFRvIIIを認識する前記EGFR-特異性IgG抗体セツキシマブによって染色した。染色の特異性を、EGFR-又はEGFRvIII-特異性一次抗体の不在下で二次試薬と共にインキュベートした対照切片によって確認した。
【図７Ｃ】図７は、（Ａ）3人の個人の頭頚部（H&N）がん患者、（Ｂ）3人の個人の膠芽腫患者からの組織切片の免疫組織化学的染色の結果、（Ｃ）は前立腺がん、乳がん（Her2 neg）及び非小細胞肺がん（NSCLC）からの結果を示している。切片を、EGFRvIII標的タンデムダイアボディ（例えば(VLCD3-)VHEGFRvIII-VLEGFRvIII-(VHCD3)）における構成に類似するが、CD3結合部分を持たない、二価形態においてEGFRvIII特異性結合ドメインLi3G30を含む二種類の濃度のEGFRvIII-特異性ダイアボディで染色した。対照として、切片を、EGFR（健全な組織とがん組織との両方に存在する）、並びに、EGFRvIIIを認識する前記EGFR-特異性IgG抗体セツキシマブによって染色した。染色の特異性を、EGFR-又はEGFRvIII-特異性一次抗体の不在下で二次試薬と共にインキュベートした対照切片によって確認した。
【図８Ａ】EGFRvIII陽性細胞上での親和性成熟の前の親EGFRvIII結合ドメイン（Li3G30）を含む各タンデムダイアボディとの比較における、種々の親和性成熟EGFRvIII特異性結合ドメインを含むEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディの、細胞傷害性能力と標的依存特異性における改善を図示している。即ち（Ａ）EGFRvIII/CD3タンデムダイアボディを含むABC470、（Ｂ）EGFRvIII/CD3タンデムダイアボディを含むABC471、（Ｃ）EGFRvIII/CD3タンデムダイアボディを含むABC472。抗体濃度依存細胞傷害性を、EGFRvIII発現CHO細胞（CHOEGFRvIII）、EGFRvIII陰性EGFR発現CHO細胞（CHOEGFR）、又は、非トランスフェクションCHO細胞を標的細胞として使用し、ヒトPBMCをエフェクタ細胞として使用するフローサイトメトリーによって測定した。各パネル（Ａ〜Ｃ）において、個々のEGFRvIII結合ドメインとCD3ドメインv64を順序VLCD3-VHEGFRvIII-VLEGFRvIII-VHCD3を含むタンデムダイアボディが左側に示され、順序VHEGFRvIII-VLCD3- VHCD3-VLEGFRvIIIにおける異なるCD3ドメインと組み合わせされた個々のEGFRvIII結合ドメインを含むタンデムダイアボディが右側に示されている。
【図８Ｂ】EGFRvIII陽性細胞上での親和性成熟の前の親EGFRvIII結合ドメイン（Li3G30）を含む各タンデムダイアボディとの比較における、種々の親和性成熟EGFRvIII特異性結合ドメインを含むEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディの、細胞傷害性能力と標的依存特異性における改善を図示している。即ち（Ａ）EGFRvIII/CD3タンデムダイアボディを含むABC470、（Ｂ）EGFRvIII/CD3タンデムダイアボディを含むABC471、（Ｃ）EGFRvIII/CD3タンデムダイアボディを含むABC472。抗体濃度依存細胞傷害性を、EGFRvIII発現CHO細胞（CHOEGFRvIII）、EGFRvIII陰性EGFR発現CHO細胞（CHOEGFR）、又は、非トランスフェクションCHO細胞を標的細胞として使用し、ヒトPBMCをエフェクタ細胞として使用するフローサイトメトリーによって測定した。各パネル（Ａ〜Ｃ）において、個々のEGFRvIII結合ドメインとCD3ドメインv64を順序VLCD3-VHEGFRvIII-VLEGFRvIII-VHCD3を含むタンデムダイアボディが左側に示され、順序VHEGFRvIII-VLCD3- VHCD3-VLEGFRvIIIにおける異なるCD3ドメインと組み合わせされた個々のEGFRvIII結合ドメインを含むタンデムダイアボディが右側に示されている。
【図８Ｃ】EGFRvIII陽性細胞上での親和性成熟の前の親EGFRvIII結合ドメイン（Li3G30）を含む各タンデムダイアボディとの比較における、種々の親和性成熟EGFRvIII特異性結合ドメインを含むEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディの、細胞傷害性能力と標的依存特異性における改善を図示している。即ち（Ａ）EGFRvIII/CD3タンデムダイアボディを含むABC470、（Ｂ）EGFRvIII/CD3タンデムダイアボディを含むABC471、（Ｃ）EGFRvIII/CD3タンデムダイアボディを含むABC472。抗体濃度依存細胞傷害性を、EGFRvIII発現CHO細胞（CHOEGFRvIII）、EGFRvIII陰性EGFR発現CHO細胞（CHOEGFR）、又は、非トランスフェクションCHO細胞を標的細胞として使用し、ヒトPBMCをエフェクタ細胞として使用するフローサイトメトリーによって測定した。各パネル（Ａ〜Ｃ）において、個々のEGFRvIII結合ドメインとCD3ドメインv64を順序VLCD3-VHEGFRvIII-VLEGFRvIII-VHCD3を含むタンデムダイアボディが左側に示され、順序VHEGFRvIII-VLCD3- VHCD3-VLEGFRvIIIにおける異なるCD3ドメインと組み合わせされた個々のEGFRvIII結合ドメインを含むタンデムダイアボディが右側に示されている。
【図９】EGFRvIII特異性抗体の結合時の、細胞表面からのEGFRvIIIレセプタ内在化の評価の結果を示している。EGFRvIII発現細胞を、様々な濃度のドメイン順序VLCD3-VHEGFRvIII-VLEGFRvIII-VHCD3（i）、又はVHEGFRvIII-VLCD3- VHCD3-VLEGFRvIII（iv）、及び／又は、異なるCD3結合ドメインを含む、三種類のEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディと共に、37℃で24時間インキュベートした。調節後、各タンデムダイアボディを、10μg/mLの飽和濃度で使用して、細胞表面上においてすべての残りのEGFRvIIIレセプタ分子を染色した。
【図１０】EGFRvIII/CD3（又はEGFRvIII/CD16A）タンデムダイアボディの存在下でのヒトPBMC培養における細胞増殖（BrdU取り込み）の評価の結果を図示している。PBMCは、CD3結合抗体OKT3、又は植物レクチン植物凝集素（PHA）、陽性対照として使用される、の存在下で増殖する。EGFRvIII陽性標的細胞の不在下での異なるEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディでのPBMCのインキュベーションによっては、PBMCの活性化と増幅は誘導されない。
【図１１】EGFRvIII/CD3タンデムダイアボディのCD3結合親和性と、それらの細胞傷害性能力との相関を示している。CD3に対する異なる親和性を有する種々のCD3結合ドメインとドメイン順序VLCD3-VHEGFRvIII-VLEGFRvIII-VHCD3と組み合わされた同じEGFRvIII結合ドメイン(Li3G30）をすべて含む20以上のEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディを、CD3+-Jurkat細胞上でのCD3の結合、CHOEGFRvIII上でのEGFRvIIIの結合、更に、細胞傷害性能力とに関して分析した。CD3結合KD値は1nM〜約500nMの範囲である。分析されたタンデムダイアボディのそれぞれに関して、EGFRvIII結合KD値と細胞傷害性EC50値をCD3結合KD値上にプロットした。TandAbsは、EGFRvIII結合KD値において非常に僅かな変化しか示めさないが、細胞傷害性EC50は、タンデムダイアボディの増大するCD3結合KD値でほとんどリニアな増加を示す。
【図１２Ａ】イン・ヴィヴォでの概念実証研究の結果を示している。皮下F98EGFRvIII異種移植片腫瘍の成長に対する投与量依存抑制作用を、同じEGFRvIII結合ドメイン（Li3G30）を含むが、異なるCD3結合ドメイン又はドメイン順序を含む、2つのEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディに関して分析し、それらを、遥かに高い濃度レベルで投与されたセツキシマブの作用と比較した。（Ａ）ドメイン順序VLCD3-VHEGFRvIII-VLEGFRvIII-VHCD3を有するEGFRvIII/CD3v6タンデムダイアボディによる投与量依存腫瘍成長抑制、（Ｂ）異なる高親和性CD3結合ドメインを含み、ドメイン順序VHEGFRvIII-VLCD3- VHCD3-VLEGFRvIIIを有するEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディによる投与量依存腫瘍成長抑制。
【図１２Ｂ】イン・ヴィヴォでの概念実証研究の結果を示している。皮下F98EGFRvIII異種移植片腫瘍の成長に対する投与量依存抑制作用を、同じEGFRvIII結合ドメイン（Li3G30）を含むが、異なるCD3結合ドメイン又はドメイン順序を含む、2つのEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディに関して分析し、それらを、遥かに高い濃度レベルで投与されたセツキシマブの作用と比較した。（Ａ）ドメイン順序VLCD3-VHEGFRvIII-VLEGFRvIII-VHCD3を有するEGFRvIII/CD3v6タンデムダイアボディによる投与量依存腫瘍成長抑制、（Ｂ）異なる高親和性CD3結合ドメインを含み、ドメイン順序VHEGFRvIII-VLCD3- VHCD3-VLEGFRvIIIを有するEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディによる投与量依存腫瘍成長抑制。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明の実施形態を、以下の例によって更に例示するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００５１】
例１: EGFRvIII特異性結合タンパク質の開示と親和性成熟
Li3G30の開示:
EGFRvIIIに対して特異的なバインダをエンリッチするために、IgMに基づく起源のヒトscFv配列のファージディスプレイライブラリーを2〜3のパニングラウンドにかけた。バインダをEGFRの野生型又は融合タンパク質のFc部分まで枯渇させるために、各パニングラウンドの前に、前記ライブラリーをEGFR-Fc上でプレインキュベートした。EGFRvIII被覆固相上と溶液中とにおいて選択を平行して行った。2及び3パニングラウンド後、単一コロニーを取り出し、溶解性scFvの発現を誘導し、抽出物のEGFRvIII-FcとEGFR-Fcに対する結合をスクリーニングした。
【００５２】
本発明に依れば、変異形態では排他的に腫瘍に発現するが健全な組織には発現しない、EGFRの欠失突然変異体である、EGFRvIIIに結合する完全ヒト、高特異性可変抗体ドメインが記載される。ここに記載の完全ヒトEGFRvIII特異性ドメインは、最初、IgMベース起源の完全ヒトscFvライブラリーを使用したファージディスプレイスクリーニングで発見された。驚くべきことに、EGFRvIIIに対して特異的なバインダをエンリッチするはずである、2又は3のパニングラウンドの野生型EGFR抗原に対する欠失処置を使用したにも拘らず、得られたscFvの大半はELISAにおいて両方のタンパク質（EGFRvIIIと野生型EGFR）に結合した。Li3G30と呼ぶ一つの高度なEGFRvIII特異性配列が同定された。VHとVLのN末端での僅かな偏差の他に、前記フレームワーク領域と、重鎖と軽鎖のCDR1と2はそれぞれ生殖系コード化配列VH5-51とVL3-25と完全に同じである。Li3G30は、第3回目の液相パニングラウンドから同定された。
【００５３】
親和性成熟:
抗体フレームワーク対VH5-51/VL3-25のためのライブラリーを、DistributedBioから注文したアルゴリズムによって設計した。Li3G30からの特異性決定残基が同定され、前記ライブラリー設計に含められた。前記設計は、そのそれぞれがアミノ酸の個別に定義された分布を有する、52のランダム化されたCDR位置を含んでいた。3種類のループ長がVL-CDR3に組み込まれた。VHとVLの前記ランダム化位置をコードする遺伝子フラグメントを、Geneart/Lifetechnologiesからオーダーし、TRIM技術を介して合成した。これらフラグメントを、前記ファージディスプレイベクターpEXHAM（Schwarz et al. 2004）にクローニングし、3.7E+8トランスフォームE.coli細胞の最終ライブラリーサイズとした。前記ライブラリーをファージ粒子にパッケージ化し、パニング及びスクリーニング処理にかけて、改善された親和性と保持された特異性、EGFRvIIIに対する、を備えるバリアントを単離した。前記パニングは、タンパク質結合プラスチック表面上に固定されたEGFRvIII-Fc抗原によって行われた。前記パニング手順は、以下の工程を実行することによって、遅い解離速度（KOFF）のEGFRvIII結合scFvに対して有利なものとすることを目的とするものであった。洗浄手順は、ゆっくりと解離するscFvの選択に有利とするために30分間以内の複数の洗浄緩衝液インキュベーション工程を含むものであった。もう一つの手順は、溶解性EGFRvIIIとの一晩での競合に基づくものであった。第1回目のパニング工程の前の親和性成熟の処理においてEGFR-EGFRvIII交叉反応性抗体又はFcに対して結合する抗体が選択されることのないように、野生型EGFR-Fcに対するプレインキュベーションによって前記ライブラリーから可能な野生型EGFRバインダを枯渇させた。更に、前記スクリーニングプロトコルによって、固定EGFRvIII上での前記パニング手順中に溶解性EGFRの存在による交叉反応性バインダにとって不利になるようにした。
【００５４】
ユニークなEGFRvIII特異性scFvを、更に、フローサイトメトリーにおいてEGFRvIII発現トランスフェクションCHO及びF98細胞に対する結合についてもテストした。野生型EGFR発現及び／又は非トランスフェクション細胞に対する結合を示したscFvを、その後の分析から除外した。Biacore X100での初期KDランキングを使用して、出発クローンLi3G30との比較でEGFRvIIIに対する親和性が改善されたscFvを同定した。最善のバリアントを、詳細なSPR測定と蛍光ベースの安定性アッセイとにおいて特徴付けた。
【００５５】
親和性成熟のための初期ライブラリーは、VL CDR3に対する3種類のループ長を含んでいたが、これらのすべてはVH5-51/VL3-25フレームワークに匹敵するものであるであることが知られていた。驚くべきことに、中間のループ長が、選択中において明らかに有利であった。その結果、前記VL-CDR3は、すべての親和性成熟バリアントに関して、親抗EGFRvIII抗体と比較して1つのアミノ酸だけ短い（表１、図１）。選択されたscFvの配列を、前記インプットライブラリーと比較したところ、分析によってVL CDR3中において3つの有利な変異が示唆される。前記親抗EGFRvIII抗体の重鎖及び軽鎖のCDR1と2は、各生殖系配列VH5-51とVL3-25によってコードされる配列と同じである。前記各生殖系コード残基が、前記位置の75%において再構築されるか、もしくは明白に有利とされた。一つの有益な変異がVH CDR1中に示唆され、一つがVL CDR1中に示唆される（図１）。残りのランダム化位置におけるアミノ酸分布は、選択前のライブラリーにおける分布と非常に類似していた。
【００５６】
例２：BiacoreにおけるEGFRvIIIと野生型EGFRとに対するscFv結合の測定
抗ヒト（anti-hu）FcIgG CM5-チップの調製:
抗ヒトFcIgG CM5-チップを製造業者の指示に従って、Amine-Coupling-Kit（GE）を使用して共有アミンカップリングによって調製した。前記IgGを提供された固定緩衝液（10mM 酢酸ナトリウム、pH 5.0）中で2.5μg/mLで希釈した。前記カップリング手順のために、Biacore T200制御ソフトウエアの所定の方法”Amine”を使用した。すべての4つのフローセルにおいて5000〜10000RUの標的レベルが到達された。前記組み換えタンパク質溶液を注入する前に、前記チップの表面をEDC/NHSによって活性化させた。表面上のフリー結合部位をエタノールアミンによってブロッキングした。1×HBS-P+を前記カップリング手順全体のためのランニング緩衝液として選択した。
【００５７】
SPR測定に使用された一本鎖Fv´s（scFvs）の濃度範囲：
Nandropを使用したA280測定によってSPR測定前にScFv濃度をチェックした。ストック溶液の濃度（ｃ）を下記の式によって計算した。
c[mg/mL]=(A280)/(2.25[cm2/mg]×1[cm]) 
【００５８】
“Expasy Protparam”予想ツール（http:/ /web.expasy.org/protparam/）によって異なる減衰係数を計算した。HisタグscFv抗体のモル濃度の計算のために、約28kDの分子量を想定した。前記scFvsを、1×HBS-P+緩衝液中での段階希釈によって下記の最終濃度に調節した。以下の濃度が調製された。430nM、86nM、17.2nM、3.44nM、0.688nM及び0nM。
【００５９】
scFvsの測定条件： 
EGFRvIII-Fcと野生型EGFR-Fc融合タンパク質を、1×HBS-P+中で6.25nMの濃度にまで希釈した。両方の抗原を、10μL/分の流速でEGFRvIII-Fc については75秒間、野生型EGFR-Fcについては90秒間、注入した。EGFRvIII-Fcは、フローセル2上に注入され、野生型EGFR-Fcはフローセル4上に注入された。フローセル1と3はブランクとされた。
【００６０】
1×HBS-P+を処理全体のためのランニング緩衝液として使用した。前記scFv抗体を、4つ全部のフローセル上に30μL/分の流速で180秒間注入した。捕捉抗原無しでフローセル1中において測定されたシグナルを、フローセル2のシグナルから除算して、バックグランド結合のために結合曲線を補正した。捕捉抗原無しでフローセル3中において測定されたシグナルを、フローセル4のシグナルから除算して、バックグランド結合に関して結合曲線を補正した。540秒間の分離時間後、前記チップを下記のように再生させた。
【００６１】
前記抗ヒト Fc IgGチップを高塩緩衝液3.0 M MgCl2（30秒、10μL/分）の注入によって再生した。各測定の前に、4つの「スタートアップサイクル」をscFv無しで行った。scFv溶液は最低濃度から最高濃度まで測定された。ニート（neat）なランニング緩衝液（0μM）での1サイクルを含ませた。
【００６２】
scFv抗体のキネティクスを、MCK（Multi Cycle Kinetic）測定で測定した。見かけ上の結合親和性の推定のために、前記結合曲線を前記Biacore評価ソフトウエアに含まれている“Kinetic”法を使用して計算した。この方法によって、前記結合曲線は、“Langmuir 1:1相互作用モデル”を使用するソフトウエアによってグローバルにフィットされた。その結果を表３に示す。
【００６３】
適用した親和性成熟スクリーニング手順は、低下した解離速度（kOFF）でのバインダの選択を促進することによって前記EGFRvIII特異性結合ドメインのEGFRvIII結合親和性を改善することを目的としたものであった。しかしながら、驚くべきことに、得られた親和性成熟バインダ（表３）は、大幅に増加した解離速度（kON）を示したのに対して、kOFF低下は、scFvsの結合の100倍以下の改善に対してわずかな貢献しかなく、いくつかのバインダは100pM以下のKD示した（表３）。特に驚くべきことは、スクリーニング手順が、低下したkOFFでのscFvcの選択に有利なものであったにも拘らず、KDの低下が、主として、kONの増加によって成し遂げられるものであったということである。このことは、抗体の親和性成熟が通常はkOFFの低下と関連付けられている（Schier et al., 1996, Pini et al., 1998, Boder et al., 2000）ことからも驚くべきことである。
【００６４】
【表３】
0006529498.tif 000006
【００６５】
11の親和性成熟scFvの内8つが、親scFvに対してkONの少なくとも5倍の改善を示し、それらの内の3つは20倍高いkONを有していた。kONの改善と比較して、kOFFに対する親和性成熟の影響は比較的少なかった。3つの親和性成熟scFvのみがkOFFの4〜5倍の改善を示した。興味深いことに、それらの内の2つは、洗浄緩衝液中での延長されたインキュベーションと比較した低下したkOFFでのscFvの選択のより効率的な方法であるかもしれない、競合による選択アプローチによって単離された。
【００６６】
選択された親和性成熟候補の溶解温度は、53℃〜67.2℃の範囲で、示差走査蛍光法（SDF）による測定で、62.2℃の平均値を有している。
【００６７】
親和性成熟中の野生型EGFRに対するEGFRvIIIの高特異性の維持
親和性成熟には、一般に、結合エピトープの小さな変化がしばしば伴い、これらによって特異性/交叉反応性が影響される可能性がある（Barbas et al, 1994, Parsons et al., 1996, Winkler et al., 2000）。野生型EGFRの細胞外ドメイン（エクソン2〜7）の269のアミノ酸のインフレーム欠失によって、野生型EGFRに対するEGFRvIIIネオ-エピトープが形成されるが、これはかなり小さなものであると予想され、それはアミノ酸の新規な近接配置（juataposition）（アミノ酸5がアミノ酸274に融合する）と、前記欠失部位での単一の新規なGLYアミノ酸とから成る。このケースにおける結合エピトープのたとえ小さな変化であってもEGFRvIIIに対する精巧な特異性がすぐに破壊されてしまうと予想され、それによって天然EGFRも認識する交叉反応性バインダが生じる可能性がある。
【００６８】
驚くべきことに、ここに記載の親和性成熟によってEGFRvIIIに対する排他的特異性のそのような損失無く、抗EGFRvIII抗体の100倍の結合の改善が得られた（表３、図２）。
【００６９】
親和性成熟バインダの選択中に、ユニークなEGFRvIII特異性scFvにつき、EGFRvIII発現CHO（CHOEGFRvIII）とF98細胞（F98EGFRvIII）とに対する結合をフローサイトメトリーで、又、ヒト野生型EGFR発現CHO（CHOEGFR）とF98（F98EGFR）細胞と、非トランスフェクションCHOとF98細胞とに対する結合とをテストした。
【００７０】
野生型EGFR陽性細胞（CHOEGFR）と非トランスフェクションCHO細胞上で測定可能なバックグランド結合の無い11の高特異性抗EGFRvIIIscFvをより詳細に特徴付けた。最善のケースにおいて、親scFvとの比較で100倍の改善度に対応するEGFRvIII抗原に対する80pMの親和性が測定された。同時に、テストされた抗EGFRvIII scFvsのいずれも、野生型EGFR抗原との交叉反応性を示したものはなかった（図２）。
【００７１】
我々の知る限り、EGFRvIIIに対する排他的親和性を組みわせられ、かつ、野生型EGFRに対しては測定可能な交叉反応性を持たない、ヒトの抗体ドメインのEGFRvIIIに対するそのように高い親和性はこれまで観察されたことがない。Safdariと同僚は、最近、マウス、EGFRvIII結合抗体ドメイン、MR1（Safdari et al., 2014）のヒト化の結果について記載しているが、そのマウス型は、最初、Lorimerと同僚とによって記載されたものである（Lorimer et al., 1996, Beers et al., 2000, Kuan et al., 2000）。そのヒト化アプローチ中、彼らは、ここに報告されるものと類似のピコモルのKD値に達するhumMR1に関する親和性の改善を達成したが、我々の発明と違って、彼らは、抗体ドメインの野生型EGFRとの交叉反応性を完全に無くすることには失敗しており、このことは、彼らの刊行物の図４中にはっきり見て取れる（Safdari et al., 2014）。それゆえに、humMR1は、EGFRvIII（145kD）に対して完全に特異的ではなく、SDS PAGE及びウエスタンブロッティングの後、EGFR（170kD）をも認識する。我々は、我々のEGFRvIII結合ドメインの特異性と交叉反応性との両方について親和性成熟の前と後とに、広範囲にテストし、驚くべきことに、Biacore（図２）中で、SDS PAGE及びウェスタンブロッティング（図４）中で、或いはELISA（図５）中で分析された精製組み換え野生型EGFR抗原（図２）との何れにおいても、野生型EGFRとの交叉反応性のいかなる徴候も見出さなかった。また、我々のEGFRvIII結合ドメインは、トランスフェクションCHO細胞（CHOEGFR）又はF98神経膠腫細胞（F98EGFR）の細胞表面上で過剰発現された野生型EGFRとの交叉反応性も示さなかった（図３）。
【００７２】
例３: 高特異性及び高親和性EGFRvIII特異性scFv抗体のEGFRvIIIを過剰発現するF98ラット神経膠腫細胞（F98EGFRvIII）、又はEGFRvIIIを過剰発現する安定トランスフェクションCHO細胞（CHOEGFRvIII）に対するフローサイトメトリーによる評価、天然EGFRを過剰発現するF98細胞（F98EGFR）、又は非トランスフェクションF98細胞（F98）に対する結合の欠如、更に、天然EGFRを過剰発現するCHO細胞（CHOEGFR）又は非トランスフェクションCHO細胞（CHO）に対する結合の欠如
材料（培地、緩衝液、及び試薬）:
抗His IgG 13/45/31（Dianova）、FCS（Invitrogen）、Ficoll Paque PLUS（GE Healthcare）、FITCコンジュゲート（conj.）  ヤギ抗ヒトIgG（Dianova）、FITCコンジュケート ヤギ抗マウスIgG、mix X （Dianova）、L-グルタミン（Invitrogen）、NaN3 （Carl Roth）、PBS（Invitrogen）、ペニシリン/ストレプトマイシン（Invitrogen）、ヨウ化プロピジウム（Sigma）、RPMI-1640（Invitrogen）
【００７３】
細胞及び細胞ライン：
F98ラット神経膠腫細胞、EGFRを過剰発現するF98細胞（F98EGFR）、EGFRvIIIを過剰発現するF98細胞（F98EGFRvIII）をAmerican Type Culture Collection（ATCC）から購入し、推奨されているプロトコルに従って培養した。
F98  （ATCC CRL-2397） 
F98EGFR  （ATCC CRL-2948）
F98npEGFRvIII  （ATCC CRL-2949） 
【００７４】
組み換えEGFR又はEGFRvIIIを発現する安定トランスフェクションCHO細胞を、下記のプロトコルに従ってAffirmedで生成した。
【００７５】
野生型EGFR又は欠失変異EGFRvIIIをコードする遺伝子を、Life Technologies/Gene Art（Regensburg, Germany）によって合成し、哺乳動物発現ベクターpcDNA5/FRTへサブクローニングした。組み換え野生型EGFR又はEGFRvIIIを発現する安定CHO細胞ラインを、予め懸濁成長に適合させておいた宿主細胞ラインFlp-In CHO（Life Technologies）をベースに生成した。トランスフェクションの1日前、Flp-In CHO細胞を、L-グルタミン、HT Supplement,及びペニシリン/ストレプトマイシン（ゼオシン無し）を添加したHyClone CDM4 CHOにサブ培養した。安定した発現細胞ラインを、前記Flp-In CHO細胞ラインのpcDNA5/FRT-ベースの産物発現及び組み込みプラスミドとFlpリコンビナーゼ発現プラスミドpOG44（Life Technologies）とのポリエチレンイミン（PEI）トランスフェクション試薬を使用したコトランスフェクションによって生成した。2.5μg全DNAを50μLのOptiMEMI培地中で希釈し、50μL Opti MEMI培地中で希釈された7.5μgのPEIと組み合わせた。混合物を10分間インキュベーションし、その後、1mL  CHO-S-SFMII培地中に懸濁された2×106 Flp-In CHO細胞に添加した。トランスフェクションの一日後、細胞を500μg/mLのハイグロマイシン（Hygromycin）Bを添加したCHO-S-SFML培地中で1×105の生存細胞/mLの密度にまで希釈し、T75培養フラスコに播種した。Flpリコンビナーゼは、Flp-In発現構造物の、部位特異的DNA組み換えを通して組み込まれたFRT部位におけるゲノムへの挿入を媒介する。選択フェーズ中、前記生存細胞密度を週に1〜2回測定し、細胞を遠心分離し、新しい選択培地中にて1×105生存細胞/mLの最高密度で再懸濁した。500μg/mLのハイグロマイシンBを使用した約2〜3週間の選択後に、EGFR又はEGFRvIIIを発現する安定細胞が回収され、次に、これらをHyClone CDM4 CHO懸濁培養培地に移した。安定野生型EGFR又はEGFRvIII発現細胞を、50%のProFreeze （Lonza）と7.5%のDMSOを含む培地中で凍結保存した。
【００７６】
前記安定トランスフェクション細胞ライン上の野生型EGFR又はEGFRvIII細胞表面抗原の密度を測定するために、製造業者のインストラクションに従ってフローサイトメトリー間接免疫蛍光アッセイ（QIFIKIT、Dako）を使用したところ、CHOEGFR安定トランスフェクション細胞上での野生型EGFRと、CHOEGFRvIII安定トランスフェクション細胞上でのEGFRvIIIのほぼ同一の密度が示されたのに対して、非トランスフェクションCHO細胞上では野生型EGFR又はEGFRvIII結合部位は検出することができなかった。
【００７７】
フローサイトメトリーによる抗体結合及び親和性の測定：
氷上で45分間のFACS緩衝液中での100μg/mL（〜3300nM）から開始して表示のscFv抗体の100μLの段階希釈で細胞をインキュベートした。FACS緩衝液での3回の洗浄後、細胞を0.1mLの10μg/mLマウスモノクローナル抗His抗体クローン13/45/31と、同じ緩衝液中で氷上で45分間インキュベートした。第2の洗浄サイクル後、前記細胞を、上述したのと同じ条件下で、0.1mLの15μg/mL FITCコンジュゲート  ヤギ抗マウスIgG抗体とインキュベートした。対照として、細胞を、前記抗His IgG 13/45/31とインキュベートし、その後、scFvs無しのFITCコンジュゲート  ヤギ抗マウスIgG抗体によってインキュベートした。次に、前記細胞を、再び洗浄し、死滅細胞を除外するために、2μg/mLのヨウ化プロピジウムを含有する0.2mLのFACS緩衝液中に再懸濁させた。1×104生細胞の蛍光を、MXPソフトウエア（Beckman-Coulter、Krefeld、Germany）を利用するBeckman-Coulter FC500 MPLフローサイトメータ又は、Incyteソフトウエア（Merck Millipore、Schwalbach、Germany）を利用するMilipore Guava EasyCyteフローサイトメータを使用して測定した。前記細胞サンプルの平均蛍光強度を、CXPソフトウエア（Beckman-Coulter、Krefeld、Germany）又はIncyteソフトウエア（Merck Millipore、Schwalbach、Germany）を使用して計算した。
【００７８】
Beckman-Coulter FC500 MPLフローサイトメータでの分析の場合は0.5×106細胞/染色、そしてMilipore Guava EAsyCyteフローサイトメータの場合は0.25×106細胞/染色だけが使用された。
【００７９】
二次及び三次試薬のみによって染色された細胞の蛍光強度値を除算した後、KD値を、GraphPad Prism ソフトウエア（Windows 用GraphPad Prismバージョン6.00、GraphPad Software、La Jolla California US）の1サイト結合（双曲線:hyperbola）の等式を使用して計算した。
【００８０】
その結果を図３に示す。
【００８１】
例４：EGFRvIII結合抗体の結合特異性を分析するためのSPD PAGEとウェスタンブロッティング分析
EGFRvIII抗原に対する異なる結合ドメインを含むEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディの結合特異性をテストするとともに、野生型EGFR抗原に対する結合の欠如を示すために、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）とウェスタンブロッティング分析を行う。
【００８２】
野生型EGFR又は短縮型（truncated）EGFRvIIIの細胞外ドメインをコードする配列を、組み換えDNA技術によって、ヒトIgG抗体のFc部分に融合させる。DNA構造物を、細胞培養上清中に溶解性タンパク質として組み換え野生型EGFR-Fc又はEGFRvIII-Fcを分泌するCHO細胞にトランスフェクションし、そこから、それをプロテインAクロマトグラフィを使用して精製する。Fc部分の細胞間ジスルフィド結合形成により、前記野生型EGFR-Fc（又はEGFRvIII-Fc）融合タンパク質は、2つの同一鎖の二量体を形成する。EGFRvIII特異性の267アミノ酸欠失によるEGFRvIII-Fcは、EGFR-Fcよりも約25kD小さく、それによって、前記Fc融合タンパク質の二量体形態において約50kDのサイズ差が生じる。
【００８３】
同量の精製した野生型EGFR-Fc（及びEGFRvIII-Fc）を、非還元2×SDS PAGEサンプル緩衝液、又は還元剤としてジチオトレイトール（DTT）を含む還元2×SDS PAGEサンプル緩衝液と混合する。DTTを含むサンプルを、4〜20% Criterion TGX Precast SDS PAGE Gels（Biorad）上へのローディングの前に、95℃で5分間加熱する。1レーン当たり1μgのタンパク質サンプルを使用する。ゲル中でタンパク質を分離するために、SDS-PAGEを300Vで約25分間、1×Tris/グリシン/SDS緩衝液（Biorad）中でランする。Criterion Stain-free Molecular Imaging System（Biorad）を使用してゲル中で総タンパク質を可視化する。分子量マーカとして、Page Ruler Unstained Protein Ladder（Thermo Scientific）を使用する。次に、ゲルをBioRadのSemi-dry blotting Fastblotシステムを使用してPVDF膜上にブロットする。前記膜を、室温で30分間、1×TBS中の3%（w/v）スキムミルクパウダー中でブロッキングする。前記膜を、そのそれぞれが類似のブロットされたタンパク質サンプルを含む複数の切片に切断する。異なるタンデムダイアボディを、1×TBS中の3%（w/v）スキムミルクパウダー中の2μg/mLの濃度にまで希釈し、個々の膜切片と振とうプラットフォーム上で1時間インキュベートする。前記抗EGFR抗体セツキシマブを10μg/mLの濃度で対照として使用する。膜を、TBST（TBS+0.1%(v/v)Tween 20）でそれぞれ3回10分間洗浄し、二次HRPコンジュゲート検出抗体、タンデムダイアボディ検出用のPenta HIS-HRP（QIAGEN）、又はセツキシマブ検出用のProtein L-HRP（Thermo Scientific）とのインキュベーションの前に、TBSで1回洗浄し、振とうプラットフォーム上で1時間TBS中の3%スキムミルクパウダー中で1:5000に希釈する。膜をそれぞれ3回10分間TBST（TBS+0.1%（v/v）Tween20）で洗浄し、TBSで1回洗浄する。膜上でのHRP媒介発色をTBS中で0.06%のDAB+0.02% CoCl2+0.015% H2O2の添加によって開始させる。水を加えることによって反応を停止させる。膜を乾燥させスキャニングする。
【００８４】
結果を図４に示す。
【００８５】
例５: EGFRvIII抗原へ結合及びCD3へ結合する異なるEGFRvIII結合ドメインを含むEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディの酵素結合免疫吸着法（ELISA）による結合、並びに前記野生型EGFR抗原に対する結合の無いEGFRvIIIに対する結合の特異性の分析
ELISA手順：
96ウェルELISAプレート（Immuno MaxiSorp; Nunc）を100mMの炭酸水素塩緩衝液中でEGFRvIII-Fc、野生型EGFR-Fc又はCD3γε組み換え抗原によって一晩4℃でコーティングする。およそ同じモル量の抗原のコーティング密度を得るために、EGFRvIII-Fcを4μg/mLの濃度で、EGFR-Fcは6μg/mLの濃度で、又は、CD3γε抗原は1.5μg/mLの濃度で、それぞれコーティングする。PBS中に溶解された3% （w/v）のスキムミルクパウダー（Merck）によるブロッキング工程の後、0.3% （w/v）のスキムミルクパウダー（Merck）を含むPBS中で200ng/μL〜6.5×10-6 ng/μLの範囲の前記種々のEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディの11の段階希釈物を、25℃で1.5時間、プレート上でインキュベートする。インキュベーションに続いて、プレートを0.1%（v/v）Tween 20（Serva）を含むPBSの各ウェル300μLで3回洗浄する。50ng/mLのProtein L-HRPを添加し25℃で1時間プレート上でインキュベートした。0.1%（v/v）Tween 20を含むPBSの各ウェル300μLで3回洗浄した後、検出のためにテトリラメチルベンジジン（TMB）基質（Seramum）を添加する。各ウェル当たり100μLの0.5 M H2SO4の添加によって約2分後に反応を停止させる。前記ウェルの吸光度を、マルチウェルプレートリーダー（Victor、Perkin Elmer）によって450nmで測定する。 
【００８６】
吸光度を、GraphPad Prism ソフトウエア（GraphPad Software, San Diego CA）を使用してダイヤグラムにプロットする。
【００８７】
結果を図５に示す。
【００８８】
例６：SPRによるタンデムダイアボディのEGFRvIIIへの結合の測定
抗ヒト（anti-hu）Fc IgG CM5-チップの作成
抗ヒトFc IgG CM5-チップを上述したように作成した（例２）。
【００８９】
SPR測定に使用されたタンデムダイアボディの濃度範囲：
タンデムダイアボディ濃度を、SPR測定の前に、Nandropを使用したA280測定によってチェックした。ストック溶液の濃度（ｃ）は、下記の等式によって計算した。
c[mg/mL]=(A280)/(2.25[cm2/mg]×1 [cm])
【００９０】
異なる消光係数を、”Expasy Protparam”予測ツール（http://web.expasy.org/protparam/）によって計算した。モル濃度の計算のために、すべてのタンデムダイアボディに関し、105kDのモル量を推定した。前記タンデムダイアボディ濃度を、1×HBS-P+緩衝液中での段階希釈によって下記の最終希釈へと調節した。以下の濃度が調製された。150nM、30 nM、6nM、1.2 nM、0.24nM、0.048nM、及び0nM又は90nM、30nM、10nM、3.33nM、1.11nM、0.37nM、0.123nM、0.041nM、及び0nM、又は以下の通り。
【００９１】
タンデムダイアボディのKD測定のための結合アッセイ条件：
EGFRvIII-Fc融合タンパク質を、1×HBS-P+中で6.25nMの濃度にまで希釈した。前記抗原溶液を、EGFRvIII-Fcについては、10μL/分の流速で40秒間注入した。前記抗原はフローセル2に注入された。フローセル1は参照セルであった。
【００９２】
全処理のために1×HBS-P+をランニングバッファとして使用した。前記タンデムダイアボディ希釈物を、すべてのフローセル上に30μL/分の流速で180秒間注入した。捕捉された抗原の無いフローセル1において測定されたシグナルを、フローセル2のシグナルから減算してバックグランド結合に対して結合曲線を補正した。540秒間の解離時間の後、前記チップを下記のようにして再生した。
【００９３】
前記抗ヒトFc IgG-チップを高塩緩衝液3.0M MgCl2（3×15秒、10μL/分）の注入によって再生した。各測定前に、3 つの「スタートアップサイクル」をタンデムダイアボディ無しで行った。タンデムダイアボディ溶液を、最低濃度から最高濃度まで測定した。ニート（neat）なランニング緩衝液（0μM）での一つのサイクルを含めた。
【００９４】
前記タンデムダイアボディの結合パラメータを、MCK（Multi Cycle Kinetic）測定で測定した。見かけ上の結合親和性の推定のために、結合曲線を、Biacore X100評価ソフトウエアに含まれる”Kinetic”法を使用して評価した。この方法によって、結合曲線は、”Langmuir 1:1相互作用モデル」を使用する前記ソフトウエアによってグローバルかつローカルに適合される。
【００９５】
タンデムダイアボディの結合パラメータ
二つのEGFRvIII結合ドメインを、前記EGFRvIII/CD3タンデムダイアボディのような二価又は多価又は多重特異性分子と組み合わせることの影響を分析するために、EGFRvIII抗原に対するEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディの見かけ上の親和性をBiacore X100を使用するSPRによって測定した（図６）。
【００９６】
テストしたすべての分子において、EGFRvIII/タンデムダイアボディ中のEGFRvIII特異性結合ドメインの見かけ上の親和性が改善され、最善の結合タンデムダイアボディについてKDは11pMに達した。親EGFRvIII結合ドメインを含む対応タンデムダイアボディに対する親和性成熟度面を含むタンデムダイアボディのKDの低下は、最大で25倍であった。一価結合scFvsに関して測定されたKDに対するKDの改善も最大25倍であった。興味深いことに、主としてkONの改善によって引き起こされた親和性成熟によって達成された改善と異なり、二価タンデムダイアボディ形態における結合親和性の更なる改善は、主に、kOFF（kofOFF）が遅いことによるものである（表４）。
【００９７】
それにより前記タンデムダイアボディ形態は、抗体結合ドメインの特異性を維持しながら、結合親和性を更に高めるための手段を提供する。
【００９８】
【表４】
0006529498.tif 000007
【００９９】
例７: 抗EGFRvIII二重特異性ダイアボディ又はセツキシマブによる固形腫瘍組織切片の免疫組織化学的染色（IHC）
健全な組織上に広く発現される野生型EGFRと対照的に、変異レセプタEGFRvIIIの発現は高度に腫瘍特異的である。膠芽腫においてEGFRvIIIが高頻度で発現されることについては文献において常に記載されているが、他の腫瘍におけるEGFRvIIIの発現有病率（expression prevalence）とその発現の均質性はいまだに論争の的となっている。
【０１００】
小免疫組織化学的染色（IHC）研究が開始され、膠芽腫（GB）、頭頸部（H&N）癌、前立腺がん、Her2-陰性乳がん、更に、非小細胞肺がん（NSCLC）を患う最大で3名の個人がん患者からの組織切片を、二価ダイアボディ形態で本発明の前記EGFRvIII特異性結合ドメインとの反応性について分析した（図７）。
【０１０１】
種々の腫瘍におけるEGFRvIIIの発現と、EGFRvIII結合抗体の腫瘍特異性とを評価するために免疫組織化学的研究を行った。EGFRvIII特異性可変ドメインのEGFRvIII結合を、構成VHEGFRvIII-VLEGFRvIIIで前記EGFRvIII結合ドメインLi3G30を含む二価ダイアボディ形態でテストした。前記ダイアボディタンパク質上でのHis-tagによって二次検出を行った。対照として、天然EGFR特異性IgG抗体セツキシマブ（アービタックス）を使用した。
【０１０２】
全てのヒト組織切片はBioChain Institute, Inc.から購入し、切片は供給業者の指示に従って取り扱われた。組織切片を室温に適合させ、そして、DAKOペルオキシダーゼでインキュベートし、その後、10%ヤギ血清によってブロッキングした。前記EGFRvIII特異性ダイアボディを、0.5μg/mLと0.1μg/mLとの二種類の濃度レベルで1時間インキュベートし、その後、抗His抗体（Dinova）でインキュベートし、マウス抗体（DAKO）に対してEnvision+HRP-DABシステムによって検出した。前記対照品アービタックス（Merck KGaA）による組織切片の染色を、製造業者の指示に従ってKlear Human HRP-Polymer DAB Detection System（GBI Labs）を使用して10μg/mLの濃度で行った。
【０１０３】
最後に、切片をヘマトキシリンで染色し、マウンタントメディウム（Shandon Consul Mount（商標）、Thermo Scientific）でマウンティングした。
【０１０４】
結果を図７に示す。
【０１０５】
前記３つの膠芽腫サンプルの内の2つがEGFRvIII特異性ダイアボディに対する明確で特異的な反応性を示した。驚くべきことに、３つの頭頸部（H&N）がんサンプルのすべてがEGFRvIIIに対する強力で明確な陽性を示し、更に、前立腺がん、乳がんとNSCLCとについても、ここに記載のEGFRvIII特異性抗体により、腫瘍組織の特異的な染色が得られた（図７）。
【０１０６】
これらの特性に基づき、ここに記載されるEGFRvIII結合ドメインは、例えばEGFRvIII/CD3二重特異性タンデムダイアボディ等の、多重特異性、多価、免疫エフェクタ細胞係合、腫瘍標的抗体療法の開発に極めて優れて適したものである。
【０１０７】
例８：EGFRvIII/CD3タンデムダイアボディによって媒介される細胞傷害性活性のFACSに基づく細胞傷害性アッセイでの評価
前記親又は親和性成熟EGFRvIII特異性ドメインと、種々のCD3結合ドメインとが組み合わされて含まれ、及び／又は、タンデムダイアボディ分子において異なる順序の個々の結合ドメインを有するEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディ抗体を、細胞ベース細胞傷害性アッセイで分析した（図８）。タンデムダイアボディの標的媒介性依存、特異性と、T細胞媒介性死滅を、CHO細胞（CHOEGFRvIII）、野生型EGFR発現CHO細胞（CHOEGFR）、及び非トランスフェクションCHO細胞を標的細胞として使用することによって分析した。       
【０１０８】
材料（培地、緩衝液及び試薬）:
DMSO（Sigma）、EasySep（商標） Human T Cell Enrichment Kit（Stem Cell Technologies）、EasySep（商標）HumanCD4+T Cell Enrichment Kit （Stem Cell Technologies）、EasySep（商標） Human CD8+T Cell Enrichment Kit（Stem Cell Technologies）、The Big Easy EasySep（商標） Magnet（Stem Cell Technologies）、FCS（Invitrogen）、Lymphoprep（Stem Cell）、L-グルタミン（Invitrogen）、mIgG1 FITC（ADG）、CD16-FITC（MEM-154）（Thermo Fisher Scientific）、mIgG1-FITC/mIgG1-PE/mIG1-ECD（Bechman Coulter）、mIgG1-PE （Beckman Coulter）、mIgG1-PC5（Beckman Coulter）、mIgG1-PC7（Beckman Coulter）、CD8-FITC/CD4-PE/CD3-ECD（Beckman Coulter）、CD16-PC5（Beckman Coulter）、CD19-PC7（Beckman Coulter）、CD16-FITC/CD56-PE/CD3-ECD（Beckman Coulter）、CD14-PC7（Beckman Coulter）、CD33-PE（MACS Milteny Botech）、NaN3 （Roth）、PBS（Invitrogen）、ペニシリン/ストレプトマイシン（Invitrogen）、PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Midi Kit（Sigma）、GammanormヒトIgG（Octapharma）、プロピジウムイオダイド（Sigma）、RPM1-1640 （Invitrogen）。    
【０１０９】
バッフィーコートからのPBMCの単離とT細胞のエンリッチメント：
バッフィーコートを、採血の当日にDeutsches Rotes Kreuz, DRK-Blutspendedienst Baden-Wurtemberg-Hessen（Mannheim、Germany）から購入した。PBMCを密度勾配遠心分離によって単離する前に、バッフィーコート調製物を一晩室温で保存した。前記バッフィーコートサンプルを、2〜3倍量のPBSで希釈し、Lymphoprepのクッション上に重ね、800×gで、25分間、室温w/o brakeで遠心分離にかけた。界面に位置するPBMCを収集し、それらをT細胞エンリッチメント又はフロサイトメトリー分析に使用する前にPBSで3回洗浄した。T細胞を、非接触のヒトT細胞の免疫磁気分離用のEasySep（商標） Human T Cell Enrichment KitとBig Easy EasySep（商標） Magnetを製造業者の指示に従って使用して、前記PBMC集団からエンリッチした。
【０１１０】
フローサイトメトリー分析によるエフェクタ細胞の特徴づけ：
PBMCのサブポピュレーションの分布とエンリッチされたPBMC又はT細胞サブセットの純度を評価するためにPBMCの染色を行った。
【０１１１】
フローサイトメトリー分析のために、単離されたPBMC又はエンリッチされたPBMCのサブポピュレーションを、2%の熱不活性化FCSと0.1%アジ化ナトリウム（FACS緩衝液と称する）と1mg/mLポリクローナルヒトIgGを添加したPBS中で、0.5〜2×106/mLの密度にまで再懸濁した。次に、0.5mL細胞懸濁物のアリコートを暗所で15分間、製造業者によって推奨されているように下記のスキームに従って、抗体とインキュベートした。
【０１１２】
【表５】
0006529498.tif 000008
【０１１３】
インキュベーション後、前記サンプルを、MXP取得ソフトウエア（Beckman-Coulter）でPBMCと多色染色（FITC PE ECD PC5 PC7、FITC PE ECD、FITC PE PC5 PC7）に関して設定されたプロトコルを使用してBeckman-Coulter FC500 MPLフローサイトメータ（Beckman-Coulter、Krefeld、Germany）上で3．4．5．6．1. 2の順序で測定した。前記分析とデータプロットのために、前記CXP分析ソフトウエア（Beckman-Coulter）を使用した。
【０１１４】
細胞傷害性アッセイ：
エフェクタ細胞として使用されたT細胞を、上述したようにフローサイトメトリーによって特徴付けた。細胞傷害性アッセイに使用された標的細胞は、EGFRvIIIを過剰発現するように安定的にトランスフェクションされたCHO細胞（CHOEGFRvIII）、野生型EGFRを発現するように安定的にトランスフェクションされたCHO細胞（CHOEGFR）又は非トランスフェクションCHO細胞（CHO）であった。前記細胞ラインは、前述したように生成され、前述したように標準条件下で培養された。前記細胞傷害性アッセイのために、標的細胞を収集し、FCS無しのRPMI1640培地で2回洗浄し、PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Midi Kit内に提供された希釈物C中で2×107/mLの密度に再懸濁した。次に、前記細胞懸濁液を、同量の2倍濃度PKH67-標識溶液（例えば、250μL希釈物C中1μLのPKH67）と混合し、製造業者の指示に従って、周期的混合により2〜5分間RTでインキュベートした。染色反応を、同量のFCSの添加と1分間のインキュベーションによって停止させた。標識された標的細胞を完全RPMI培地で洗浄後、細胞を計数し、完全RPMI培地中で2×105/mLの密度に再懸濁させた。
【０１１５】
次に、2×104の標的細胞を、総量200μL/ウェルの丸底96ウェルマイクロプレートの個々のウェルに、T細胞、E:T比5:1及び表示の抗体と一緒に播種した。通常、30μg/mLからの9回の段階的1:5希釈物をテストした。抗体不在下でのエフェクタによる自発的細胞死と標的の死滅を、各プレートにおいて少なくとも3回の再現で測定した。タンデムダイアボディ媒介死滅は通常、重複測定された。
【０１１６】
200gのRT、2分間の遠心分離後、前記アッセイプレートを、5%CO2の加湿雰囲気中で、37℃にて40〜48時間インキュベートした。インキュベーション後、培養物を、FACS緩衝液で1回洗浄し、その後、2μg/mLのPIを添加した150μLのFACS緩衝液中で再懸濁させた。陽性グリーンPKH67染色によって特徴付けられるが、PI染色に関しては陰性である生存標的細胞の絶対量を、Milipore Guava EasyCyte flow cytometer（Merck Milipore）を使用して測定した。
【０１１７】
測定された残存の生存標的細胞に基づいて、特異的細胞溶解（lysis）の百分率を、下記の式に従って計算した。
［1-（生存標的の数（サンプル）/（生存標的（自然発生））×100%。
シグモイド用量反応曲線とEC50値をGraphPad Prismソフトウエア（Windows 用GraphPad Prismバージョン6.00、GraphPad Software、La Jolla California US）を使用して非線型回帰/4パラメータロジスティックフィットによって計算した。
【０１１８】
統計分析：
所与の抗体濃度について得られる溶解値は反復測定され、そしてGraphPad Prismソフトウエア（Windows 用GraphPad Prismバージョン6.00、GraphPad Software、La Jolla California US）を使用してシグモイド用量反応/4-パラメータロジスティックフィットによって分析され、そしてEC50値平均及び溶解率の反復のSDの算出のために使用された。
【０１１９】
結果を図８と表６に示す。
【０１２０】
テストしたすべてのタンデムダイアボディは、EGFRvIII発現細胞に対して、濃度依存、高特異性、細胞傷害性、及び高い有効性を示したのに対して、EGFRvIII陰性細胞は、それらの生存が損なわれなかった。EGFRwt発現細胞又は非トランスフェクション細胞に対してテストされたタンデムダイアボディにおいてはいずれも全濃度範囲においても検出可能な細胞傷害性は観察されなかった。従って、EGFRvIII/CD3タンデムダイアボディによって媒介される細胞傷害性は、厳密に標的依存性である。親和性成熟の前に親EGFRvIII結合ドメインを含み、そしてドメイン順序VLCD3-VHEGFRvIII-VLEGFRvIII-VHCD3を有するタンデムダイアボディ、前記細胞傷害性アッセイにおいて25pMのEC50（図８）。同じドメイン順序（VLCD3-VHEGFRvIII-VLEGFRvIII-VHCD3）における親和性改善EGFRvIII結合ドメインを含む対応のタンデムダイアボディは、常に、高い細胞傷害性能力を示し、最善のケースにおいてEC50は1.5pMに達した（表６）。細胞傷害性活性における相対的改善は、外側位置（ドメイン順序VHEGFRvIII-VLCD3-VHCD3-VLEGFRvIII）においてEGFRvIII特異性結合ドメインを有するタンデムダイアボディにおいてより顕著であった（表６）。低親和性EGFRvIII結合ドメインLi3G30を親和性改善ドメインと置き換えることによってこれらのタンデムダイアボディにおいて最大で70倍の細胞傷害性能力の改善を達成することができた（図８、表６）。
【０１２１】
【表６】
0006529498.tif 000009
【０１２２】
Choi et al.（Proc Natl Acad Sci USA. 2013 Jan 2; 110(1): 270-5; WO2013/7185010）は、EGFRvIIIに対する単一の結合部位（マウスMR1ドメインに基づく）とCD3に対する単一の結合部位（抗CD3抗体OKT3に基づく）とを有するEGFRvIII/CD3（t EGFRvIII/CD3 a EGFRvIII/CD3）二重特異性T細胞係合体（engager）（BiTE）に対する比較を記載している。細胞ベース細胞傷害性アッセイにおいて、この抗体は、52kD BiTEについて約200 pMのモルEC50濃度に対応する約10-2μg/mLの濃度で50%の最大達成特異性溶解に達した（Choi et al. 2013の図４Ｃ）。前記比較は、ここに記載の親の親和性成熟ではないEGFRvIII結合ドメインを含むタンデムダイアボディでさえも、EGFRvIII/CD3 BiTEよりも約10倍高い細胞傷害性を有することを示している。更に、前記親和性成熟EGFRvIII結合ドメインを含む本発明による前記タンデムダイアボディは、EGFRvIII/CD3 BiTEのそれに対して100倍も高い細胞傷害性を示す。
【０１２３】
例９：組み換えEGFRvIIIを発現するCHO細胞（CHOEGFRvIII）又は組み換えEGFRvIIIを発現するF98細胞（F98EGFRvIII）上でのEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディによるEGFRvIIIレセプタ内在化
EGFRvIII/CD3タンデムダイアボディによるEGFRvIII調節の評価のために、組み換えEGFRvIIIを発現するCHO（CHOEGFRvIII）、又は組み換えEGFRvIIIを発現するF98細胞（F98EGFRvIII）を、10% FCS、2mM L-グルタミン、100IU/mLペニシリンGナトリウム、100μg/mL硫酸ストレプトマイシン、100μg/mLピルビン酸ナトリウムを添加したRPMI 1640培地（ここでは完全RPMI培地と称する、すべての成分はInvitrogenから得た）中で、増加する濃度のEGFRvIII/CD3ダイアボディ抗体と共に、37℃、5%CO2の加湿されたインキュベータ内で24時間、丸底98ウェルマイクロプレートの個々のウェルに2.5×105細胞のアリコート内でインキュベートした。細胞の複数のアリコートを、抗体不在で培養し、これは最大EGFRvIII細胞表面レベルの検出のための対照サンプルとして、そして、第2試薬のみでの染色のための陰性対照として使用された。インキュベーション後、細胞を、2%熱不活性化FCS（Invitrogen）と0.1%アジ化ナトリウム（Roth、Karlsruhe、Germany）とを添加した氷冷リン酸緩衝食塩水（PBS、Invitrogen）（ここではFACS緩衝液と称する）で2回洗浄し、その後、細胞表面上の残存のEGFRvIII抗原に対応する最大抗体結合を評価するために調節培養中にそれらとともにインキュベーションされた同じ抗体の飽和濃度（10μg/mL）で染色した。細胞表面上での最大測定可能EGFRvIIIレベルに対応する最大抗体結合能力を測定するために飽和濃度の同じ抗体で、抗体不在で培養された細胞のアリコートを染色した。FACS緩衝液での3回の洗浄後、細胞をタンデムダイアボディで処理し、10μg/mL、抗His mAb（Dia910、Dianova）で染色し、その後、15μg/mL FITCコンジュゲート  ヤギ抗マウスIgG（Dianova）で染色した。FACS緩衝液による反復洗浄後、細胞を、2μg/mLのヨウ化プロピジウム（Sigma）を含有するFACS緩衝液中に再懸濁させて死滅細胞を除去した。各サンプルから〜5×103ヨウ化プロピジウム陰性細胞を、MXPソフトウエアを使用してFC500MPLフローサイトメータ（Beckman-Coulter、Krefeld、Germany）で分析し、測定されたサンプルの平均蛍光強度（MFI）を、前記CXPソフトウエア（Beckman-Coulter）で測定するか、或いは、細胞を、Incyteソフトウエア（Merck MIlipore、Schwalbach、Germany）を使用したMilipore Guava EasyCyteフローサイトメータで分析した。
【０１２４】
前記二次試薬のみでの細胞の染色から得られたシグナルの除算後、測定されたサンプルの平均蛍光強度をGraphPad Prismソフトウエア（GraphPad Software、San Diego CA）を使用してダイアグラムにプロットし、細胞表面上の残存のEGFRvIIIの相対量を、細胞表面EGFRvIIIの100%を占めるように設定された、未処理細胞サンプルのEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディの不在下で37℃での染色によって得られた蛍光シグナルを使用して計算した。
【０１２５】
その結果を図９に示す。
【０１２６】
複数の文献報告は、前記欠失突然変異体EGFRvIIIが、天然EGFRとの比較で内在化の損傷を示すことを記載している（Fenstermaker et al. 2000, Han et al. 2006, Grandal et al. 2007, Gan et al. 2009）。それにも拘らず、EGFRvIII特異性抗体又はEGFRvIII（例えば、セツキシマブ）にも結合する野生型EGFRに対する抗体についてのいくつかの刊行されいる報告は、各抗体の結合後のEGFRvIII発現細胞におけるEGFRvIIIの急速な内在化と低下について記載している（Reist et al. 1995, Foulon et al. 2000, Kuan et al. 2000, Patel et al. 2007, Jutten et al. 2009, Dreier et al. 2012）。
【０１２７】
内在化アッセイのために、EGFRvIIIを過剰発現するトランスフェクションCHOEGFRvIII細胞が使用された。これらのEGFRvIII発現細胞を、様々な濃度のEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディと37℃で24時間、他のEGFRvIII結合抗体との関連では強力な内在化を引き起こすことが記載されている条件下、でインキュベートした。その間に抗体-レセプタ複合体が内在化しうるか又は内在化しない、この調節後、各抗体を、10μg/mLの飽和濃度で使用してすべての残存のEGFRvIIIレセプタ分子を細胞表面上で染色した（図９）。図９に示す結果は、テストされた全ての条件下において、未処理細胞上に存在するEGFRvIIIレセプタ分子の80%以上、最大で140%が、EGFRvIII結合タンデムダイアボディへの細胞の暴露（exposition）後においてもまだ利用可能であることを示している（140%以上の一般値>100%は、前記EGFRvIII結合タンデムダイアボディによって処理された細胞は、細胞表面上のレセプタの数の減少（内在化によって）を有するのに対して、細胞上のレセプタの増加を示すということを意味する。100%への正規化は、処理されなかった細胞との比較からのものである）。これらの結果は、本発明によるEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディが驚くべきことに、なんら内在化の傾向を示さないということを示唆している（図９）。内在化を誘導する代わりに、本発明によるEGFRvIII特異性ドメインの結合は、内在化を抑制し、細胞表面上のEGFRvIIIレセプタレベルの増大さえ導くものであるかもしれない。図９に示す結果は、未処理の細胞に対して、少なくとも80%以上の細胞が、テストされた全ての条件下においてEGFRvIII結合ドメインに対する細胞の露出後において細胞表面上に残存するということを示している。これらの結果は、本発明による前記EGFRvIII/CD3抗体、特に、EGFRvIII/CD3タンデムダイアボディは、内在化傾向を示さない。内在化の誘導に代わって、本発明によるEGFRvIII特異性ドメインは、内在化を抑制するかもしれないが、EGFRvIIIの発現の増加を促進し、それによってその細胞表面密度の増大をもたらすものであるかもしれない、ということを示している。
【０１２８】
例１０：EGFRvIII/CD3（又は、EGFRvIII/CD16A）タンデムダイアボディの存在下でのPBMC培養における細胞増殖の評価
EGFRvIII/CD3（又は、EGFRvIII/CD16A）タンデムダイアボディが、EGFRvIII+標的細胞の不在下においてT細胞の活性化と、その後の増殖を誘導するか否かを評価するために、ヒトPBMCを増大する濃度のEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディの存在下で培養した。増殖は、５日間のインキュベーションの後のBrdU取り込みアッセイで評価された。
【０１２９】
材料（培地、緩衝液及び試薬）：
FCS（Invitrogen）、ヒト血清（Sigma）、Lymphoprep（Stemcell Technologies）、L-グルタミン（Invitrogen）、OKT3（Biolegend）、PBS （Invitrogen）、β-メルカプトエタノール（Invitrogen）、ペニシリン/ストレプトマイシン（Invitrogen）、RPMI-1640（Invitrogen）、ピルビン酸ナトリウム（Invitrogen）、BrdU Cell Proliferation ELISA （Roche）。
【０１３０】
細胞：
バッフィーコートを、採血の当日にDeutsches Rotes Kreuz、DRK-Blutspendedienst Baden-Wurtemberg-Hessen （Mannheim、 Germany）から購入した。PBMCを単離する前に、バッフィーコート調合物を一晩室温で保存した。
【０１３１】
バッフィーコートからのPBMCの単離とT細胞のエンリッチメント：
PBMCを密度勾配遠心分離によってバッフィーコートから単離した。前記バッフィーコートサンプルを、2〜3倍の量のPBSで希釈し、Lymphoprepのクッション上に重ね、800×gで、25分間、室温w/o brakeで遠心分離にかけた。界面に位置するPBMCを収集し、それらを増殖アッセイに使用する前に、PBSで3回洗浄した。  
【０１３２】
増殖アッセイ：
全てのアッセイプレートを、10%熱不活性化ヒト血清、4mM  L-グルタミン、100U/mLペニシリンGナトリウム、100μg/mL硫酸ストレプトマイシン、1mMピルビン酸ナトリウム、0.05mMのベータ-メルカプエタノールを添加したRPMI培地（ここでは完全RPMI培地と称する）で、2時間RTでブロックし、抗体の前記プラスチック表面に対する非特異的結合を防止した。前記ブロッキング培地の除去後、4×105 のPBMCを、示される濃度のテスト及び対照品と共に200μL/ウェルの総量で、平底96ウェルマイクロプレートの個々のウェルに、完全RPMI培地中に3重に播種した。IgG抗CD3クローンOKT3を陽性対照として使用した。自発的増殖を評価するために、増殖細胞を6重で抗体の不在下で培養した。次に、プレートを、加湿雰囲気中で37℃、5%CO2で4日間インキュベートした。インキュベーションの終わりの18時間前に、細胞培養に、100μM BrdUをパルシングした。取り込まれたBrdUを、製造業者の指示に従ってBrdU Proliferation ELISA kitを使用して定量した。100mM H2SO4を添加することによって発色現象を停止させた後、マルチラベルプレートリーダ（Victor 3、Perkin Elmer）によって450nmで吸光度を測定した。吸光度値を分析し、平均値をSDと共に、GraphPad Prismソフトウエア（Windows 用GraphPad Prismバージョン6.00、GraphPad Software、La Jolla California US）を使用してプロットした。
【０１３３】
結果を図１０に示す。
【０１３４】
例１１：EGFRvIII/CD3タンデムダイアボディのCD3結合親和性と細胞傷害能力の相関
CD3 T細胞抗原に対する親和性の範囲を有する異なるCD3結合ドメインと組み合わされた同じEGFRvIII結合ドメイン（Li3G30）を含むEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディを構築し、発現させ、CD3+Jurkat細胞とEGFRvIII+CHOEGFRvIII細胞への結合を測定し、更に、標的細胞としてCHOEGFRvIII細胞、そしてエフェクタ細胞としてPBMCを使用した細胞傷害性アッセイを行った。この例でテストされた全てのテストタンデムダイアボディは、個々のVH及びVL（重鎖と軽鎖）ドメインの同じ順序VLCD3-VHEGFRvIII-VLEGFRvIII-VHCD3を有している。
【０１３５】
EGFRvIII/CD3タンデムダイアボディによって媒介されるEGFRvIII+CHOEGFRvIII細胞への抗体結合と細胞傷害活性との両方のフローサイトメリー評価を前の例に記載したようにして行った。  
【０１３６】
CD3+細胞に対するEGFRvIII/CD3タンデムダイアボディの見かけ上の親和性を、増大する濃度のタンデムダイアボディでのCD3+Jurkat細胞の染色後にフローサイトメトリーによって測定した。KD値を、個々のタンデムダイアボディ濃度に対してフローサイトメトリーによって測定された平均蛍光値を使用する非線型回帰/双曲線によって計算した。
【０１３７】
材料（培地、緩衝液及び試薬）：
抗His IgG 13/45/31 （Dianova）、FCS（Invitrogen）、FITCコンジュゲート ヤギ抗マウスIgG min X （Dianova）、L-グルタミン（Invitrogen）、NaN3（Carl Roth）、PBS（Invitrogen）、ペニシリン/ストレプトマイシン（Invitrogen）、ヨウ化プロピジウム（Sigma）、RPMI-1640 （Invitrogen）
【０１３８】
細胞：
Jurkat細胞（Dr. G. Moldenhauer、DKFZ、Heidelberg、Germanyのご厚意によって提供された）を2mM L-グルタミンと100 IU/mLペニシリンGナトリウムと100μg/mL硫酸ストレプトマイシンとを添加したRPMI 1640培地中（すべての成分はInvitrogenから、ここで完全RPMI 1640培地と称する）で培養した。
【０１３９】
フローサイトメトリーによるCD3+細胞に対する抗体親和性の測定：
細胞を、2%熱不活性化FCSと0.1%アジ化ナトリウムとを添加した氷冷PBS（ここではFACS緩衝液と称する）中で100μg/mL（〜1000nM）からの示された抗体の100μLの段階希釈物で45分間、氷上でインキュベートした。FACS緩衝液での3回の洗浄後、前記細胞を、同じ緩衝液中で45分間、氷上で、0.1mLの10μg/mLマウスモノクローナル抗His抗体クローン13/45/31とインキュベートした。第2回目の洗浄サイクル後、前と同じ条件下で0.1mLの15μg/mL FITC Cコンジュゲート ヤギ抗マウスIgG抗体とインキュベートした。対照として、細胞を、前記抗His IgG 13/45/31と、その後、FTTCコンジュゲート ヤギ抗マウスIgG抗体と、一次抗体無しでインキュベートした。その後、前記細胞を、再び洗浄し、死滅細胞を除去するために、2μg/mLヨウ化プロピジウムを含む0.2mLのFACS緩衝液中に再懸濁させた。1×104の生存細胞の蛍光を、MXPソフトウエアを使用するBeckman-Coulter  FC500 MPLフローサイトメータ（Beckman-Coulter、Krefeld、Germany）、又は、Incyteソフトウエアを使用するMilipore Guava EasyCyteフローサイトメータ（Merck MIlipore、Schwalbah、Germany）で測定した。前記細胞サンプルの平均蛍光強度を、前記CXPソフトウエア（Beckman-Coulter、Krefeld、Germany）又は前記Incyteソフトウエア（Merck MIlipore、Schwalbah、Germany）を使用して計算した。Beckman-Coulter FC500 MPLフローサイトメータによる分析の場合には0.5×106細胞/染色、Milipore Guava EasyCyteフローサイトメータの場合には、0.25×106細胞/染色のみが使用された。二次試薬及び三次試薬のみで染色された細胞の蛍光強度値を減算した後、それらの値を、GraphPad Prism ソフトウエア（Windows 用GraphPad Prismバージョン6.00、GraphPad Software、La Jolla California US）の１サイト結合（双曲線:hyperbola）の等式でのKD値の計算に使用した。
【０１４０】
EGFRvIII結合KD値と細胞傷害性のEC50値とを、分析されたタンデムダイアボディのそれぞれに関してCD3結合KD値の関数としてプロットした。前記タンデムダイアボディは、EGFRvIII結合KD値においては非常に僅かな相違しか示さないが、EC50細胞傷害性値は、タンデムダイアボディのCD3結合KD値の増加とともにほとんどリニアな増加を示している。
【０１４１】
例１２：EGFRvIII/CD3タンデムダイアボディによるF98EGFRvIII異種移植腫瘍抑制（イン・ヴィヴォ概念実証）
9の実験群の免疫不全NOD/scidマウス（NOD/MrbBom Tac-Prkdcscid, Taconic Denmark）を、第0日目（d0）に健全なドナーからの1×107精製ヒトPBMCと混合した4×106のF98npEGFRvIII細胞の懸濁液を皮下（s.c.）注射によって異種移植した。PBMCの潜在的ドナー可変性（variability）を説明するために、前記実験群のそれぞれを、1の個人のみのドナーのPBMCをそれぞれ受ける二つのコホートに分割した。動物に、腫瘍細胞接種2時間後に尻尾の静脈（i.v.）に注入し、その後、各タンデムダイアボディテスト品100μg、10μg、1μgを24時間、48時間、72時間、及び96時間に、注入した。対照群はビヒクルのみを受けた。別の対照には、1mgのセツキシマブ（アービタックス）をi.p.で、d0からはじめて週2回投与した。表６に投与群とドナー割り当てを要約する。腫瘍の大径と小径とをキャリパで測定することによって、腫瘍の体積（volume）を毎週3回、第3日目から第52日目までモニタした。腫瘍体積は、下記の式によって直径から計算された。
Vol. =(小径)2×大径×0.5
【０１４２】
【表７】
0006529498.tif 000010
【０１４３】
参照文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図２Ｌ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【配列表】
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