(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２人の異なる同種異系ドナーから得られた同種異系白血球の混合物を供給する工程と、
単球が豊富な同種異系白血球を供給するために前記同種異系白血球の混合物から同種異系単球を分離する工程と、
前記単球が豊富な同種異系白血球から非消耗未成熟樹状細胞（ＤＣ）を生成する工程と、
を含む非消耗未成熟ＤＣの生成方法であって、
前記非消耗未成熟樹状細胞（ＤＣ）の生成は、前記単球が豊富な同種異系白血球を、非ヒト血清を含まない水性細胞培養培地で、２〜７日間共培養することによって行われ、前記培地に、インターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が添加される、非消耗未成熟樹状細胞（ＤＣ）の生成方法。
【請求項２】
前記細胞培養培地が少なくともヒトポリペプチドを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ヒトポリペプチドが、トランスフェリン、アルブミン、およびインシュリンからなる群から選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記単球が豊富な同種異系白血球が同種異系好中球を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記同種異系白血球の混合物が、白血球を含む少なくとも２つの軟膜を貯留することによって供給され、前記貯留される軟膜が、少なくとも２人の異なる同種異系ドナーから得られる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記貯留される軟膜が、血小板を含むか、血小板が除去されている、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記同種異系白血球の混合物が、
少なくとも２つの白血球除去フィルターから白血球を溶出する工程であって、前記フィルターのそれぞれは、全血から白血球を除去するために使用済みの白血球除去フィルターであり、前記全血は少なくとも２人の異なる同種異系ドナーから得られる、工程；および
前記同種異系白血球の混合物を得るために、得られた白血球を貯留する工程；または
１つの白血球除去フィルターから白血球を溶出する工程であって、前記フィルターは貯留された軟膜から白血球を除去するのに使用され、前記貯留された軟膜は少なくとも２人の異なる同種異系ドナーから得られる、工程、
によって供給される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記同種異系単球がエルトリエーション、または抗体／ビーズ分離によって分離される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記共培養が５日間行われる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
非消耗未成熟ＤＣに抗原を負荷する工程をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法によって非消耗未成熟ＤＣを供給する工程と、
炎症誘発性ＤＣを得るために非消耗未成熟ＤＣを活性化する工程と、
を含む、炎症誘発性ＤＣの生成方法。
【請求項１２】
前記活性化が、活性化を誘導するＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）リガンドポリ−Ｉ：Ｃ、ＴＬＲ７／８リガンドおよびインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）を添加することによって行われる、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記活性化が、活性化を誘導するＴＬＲ２−リガンド、ＴＬＲ４−リガンド、ＴＬＲ９−リガンド、インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）からなる群から選択される少なくとも１つの物質の添加をさらに含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記活性化がプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の添加を含まない、請求項１２または１３記載の方法。
【請求項１５】
前記未成熟ＤＣが活性化因子に８〜２４時間さらされ、その後全ての前記活性化因子が実質的に洗い流される、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
同種異系炎症誘発性樹状細胞が請求項１１〜１５のいずれか１項による方法によって得られた、少なくとも２人の異なる同種異系ドナーから得られる、同種異系炎症誘発性樹状細胞の混合物。
【請求項１７】
請求項１６による同種異系炎症誘発性樹状細胞の混合物および少なくとも１つの医薬上許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項１８】
癌治療で使用するための請求項１６による同種異系炎症誘発性樹状細胞の混合物、または請求項１７による医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非消耗未成熟単球由来ヒト樹状細胞（ＤＣ）の生成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
手術、放射線、および化学療法などの従来の癌療法は、患者を治療するのにしばしば不十分で、通常、重度の副作用を引き起こす。免疫療法は、より有害でない副作用を有する代わりの治療法として有望であることが示されている。
【０００３】
免疫系は細胞、特にＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を有することが現在周知であり、それは腫瘍細胞を認識することができ、殺す可能性がある。それにもかかわらず、大きな問題は、これらのＴ細胞の殺す能力が、癌患者において誘導されないかまたは弱くしか誘導されないということである。１つの可能性は、樹状細胞（ＤＣ）による腫瘍抗原の不十分な提示および同時刺激、つまり癌患者に機能的および腫瘍特異的Ｔ細胞免疫を生じさせるための「生理的アジュバント」が不十分であることである。
【０００４】
既存の癌免疫療法戦略は、抗原負荷した自己患者由来ＤＣに主に重点を置いている。これらのＤＣは生体外で分化され、抗原負荷されたものである。この方法の基本的な前提は、ＤＣの生体外の操作により提供される効果的な働きおよび制御が、強い抗原発現および同時刺激能力を有するＤＣを生成するということである。Ｔ細胞応答の性質は、流入領域リンパ節において、ＭＨＣを制限して、Ｔ細胞に腫瘍抗原を提示する、これらの自己ＤＣの能力に依存し（ＤＣおよびＴ細胞は同じ個人のものでなければならない）、その結果、腫瘍特異的Ｔ細胞応答を生む。
【０００５】
単球由来の自己ＤＣは、白血球細胞が循環血液から分離される、労力を要する時間のかかる手順の、白血球分離によって集められる末梢血白血球から何十億もの単球を得ることができるため、試験的研究において最もよく使用されるＤＣである。その後に単球を豊富にするためにいくつかの方法が利用でき、これらの方法のうちの２つの方法、エルトリエーションおよび抗体／ビーズ分離を、医薬品最適製造基準（ＧＭＰ）のガイドラインに従って実施することもできる。
【０００６】
次に、単球は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ―４を添加した培地で４〜７日間、培養され、それらを分化して未熟なＤＣをもたらす。未熟なＤＣは、その後の特定の種類の活性化因子による刺激時に、大量の炎症誘発性のケモカインおよびサイトカインを生成する優れた能力で特徴づけられる（非特許文献１；非特許文献２）。刺激されたＤＣは通常、関連する腫瘍抗原で前置刺激され、ワクチン投与の前に１〜２日間活性化される。しかしながら、そのようなＤＣベースのワクチンに対する免疫応答はしばしば弱く、臨床反応はまれにしか完結しないし長続きしない。
【０００７】
ＤＣが注入された後の生体外で生成された自己ＤＣの結果および機能に関してはほとんど知られていない。ヒト環境において、注入ワクチンＤＣの移動パターンは、最近、生体内で追跡され、特に注入ＤＣの５％未満が流入領域リンパ節に到達し、大多数のＤＣが注入部位にとどまる。これらの局所的に捕捉されたワクチンＤＣは生存能力を急速に失い、その後、補充された抗原提示細胞によって除去された。
【０００８】
限られた時間（すなわち６〜１８時間）、生体外で活性化された注入ワクチンＤＣは炎症誘発（ＰＩ）ＤＣになり、純粋な局所的免疫アジュバントとして作用することによって、生体内で天然ＣＤ８＋Ｔ細胞を間接的に刺激することができる。注入されたＰＩ−ＤＣのこのアジュバント機能は、（活性化因子の除去後の）投与時の特定のＤＣおよびＮＫ細胞補充ケモカインの進行中の分泌に厳密に依存する。そのようなＰＩ−ＤＣはまた、ワクチン投与部位での補充された内在性のＮＫ細胞およびＤＣの活性化を誘導する因子を発現／分泌する。ＰＩ−ＤＣとは対照的に、臨床試験で一般的に使用されている、長時間（すなわち２４時間超）活性化させられたＤＣは、「消耗した」状態（Ｌａｎｇｅｎｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ  ２０００）の特徴があり、よって投与時に望ましいケモカインおよびＤＣ活性化因子を分泌することができない。
【０００９】
結論として、ＰＩ−ＤＣは、ＭＨＣ適合の自己Ｔ細胞の直接的な刺激物質として作用できるだけでなく、投与時に大量の炎症誘発性ケモカインおよびサイトカインを生成するアジュバントとしても作用する。ＰＩ−ＤＣの局所的注入は、循環するＮＫ細胞およびＤＣ前駆物質を含む他の免疫細胞の補充および活性化をもたらす。注入されたＰＩ−ＤＣは、関連する腫瘍抗原を前負荷されたか、または既存の腫瘍性病変に直接注入される場合、補充された内因性のＤＣは、関連する腫瘍抗原または死にかけた抗原発現腫瘍細胞をそれぞれ発現する死にかけたワクチン細胞を取り込む。活性化の後、これらの補充されて、その後に抗原負荷された内因性のＤＣが流入領域リンパ節に移動し、ＭＨＣを制限して、腫瘍特異的Ｔ細胞を刺激する（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ，２００８）。この結論は、腫瘍の成長が、非消耗ＭＨＣ不適合の同種異系ＰＩ−ＤＣによる治療的ワクチン投与によって著しく低減されたという、いくつかの最近の前臨床研究からのデータによって支持されている（Ａｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２００８，Ｓｉｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ  ２００９，Ｅｄｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０）。
【００１０】
ＰＩ−ＤＣによる強いアジュバント機能は、ＰＩ−ＤＣと患者のＴ細胞との間のＭＨＣ適合性を大きく必要とせず、よって、最新の特別注文の患者特有ＤＣワクチンの実行可能な実用的な代替を表す「既製のワクチン」として、あらかじめ製造された凍結保存のＭＨＣ不適合同種異系ＰＩ−ＤＣを使用する可能性をもたらす。そのようなＭＨＣ不適合同種異系ＰＩ−ＤＣの使用は特許文献１および特許文献２に開示されている。
【００１１】
道義上、臨床用途で商業用の大規模なワクチン製造のみを目的として、白血球除去による通常の血液ドナーから単球を大規模に調達することは実行可能ではない。実際には、ＰＩ−ＤＣ生成の利用可能な原材料、すなわち、単球は、望ましくない白血球を、異なる全血成分から分離する間の廃棄物（軟膜および／または使用済みの白血球除去フィルター）から得られる単球、または血液バンクにおいて軟膜から得られる単球に限定される。
【００１２】
しかしながら、それぞれの軟膜からまたはそれぞれの血液バッグ白血球除去フィルターから分離することができる単球の総数は通常２億未満であり（非特許文献３）、当技術に係る医薬品最適製造基準（ＧＭＰ）のガイドラインに従う方法による個々のバッチの単球を豊富にすることとその後のＤＣ分化（各バッチは１人のドナーから得られたものである）の許容できない高いコストをもたらす。
【００１３】
したがって、当技術分野において、血液バンクから得られる単球を含む廃棄物からの非消耗未成熟樹状細胞の大規模でコスト効率の良い臨床グレードの生成方法のニーズがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】欧州特許第１５０９２４４号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１１／０９８５１６号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｓａｌｌｕｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９９．２９：１６１７
【非特許文献２】Ｎａｐｏｌｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００５．６：７６９
【非特許文献３】Ｅｂｎｅｒ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ  ｐａｓｓａｇｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｆｉｌｔｅｒｓ：ａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｂｕｆｆｙ  ｃｏａｔｓ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５２（２００１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
その結果、本発明は、少なくとも２人の異なる同種異系ドナー由来の非消耗未成熟樹状細胞（ＤＣ）を生成する方法を提供することによって、当技術分野における上記の潜在的な不足および欠点の１つまたは２つ以上を、個々にまたは任意の組み合わせで、軽減、緩和、除去、または回避しようとするものである。この方法において、少なくとも２人の異なる同種異系ドナーから得られた同種異系白血球の混合物が供給される。次に、単球が豊富な同種異系白血球を供給するために、同種異系白血球の混合物から同種異系単球が分離される。その後、単球が豊富な同種異系白血球を２〜７日間、非ヒト血清を含まない水性細胞培養培地で共培養することによって、単球が豊富な同種異系白血球から非消耗未成熟ＤＣが生成される。水性細胞培養培地は、インターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が添加される。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
一般に広まっている先入観とは異なり、炎症誘発性ＤＣに活性化した後、生成される単球由来の未成熟樹状細胞は、非消耗のため、炎症誘発性ケモカインおよび炎症誘発性サイトカインの相当量を持続的に生成することができる。したがって、この方法は、非消耗未成熟樹状細胞の大規模なコスト効率の良い臨床グレードの生成方法を示す。
【００１８】
本発明のさらなる態様は、少なくとも２人の異なる同種異系ドナー由来の同種異系非消耗未成熟樹状細胞（ＤＣ）の混合物に関する。そのような混合物は、上述の方法によって得ることが可能である。
【００１９】
本発明のさらなる態様は、炎症誘発性ＤＣの生成方法に関する。非消耗未成熟ＤＣを活性化することによって、炎症誘発性ＤＣが得られる。そうした方法によって、少なくとも２人の異なる同種異系ドナー由来の同種異系炎症誘発性樹状細胞の混合物を得ることが可能である。混合物は、少なくとも１つの医薬上許容可能な担体をさらに含む医薬組成物に処方されてもよい。この混合物および医薬組成物はそれぞれ、癌治療に用いることができる。
【００２０】
本発明のさらなる有利な特徴は、従属クレームで定義される。さらに、本発明の有利な特徴は、本明細書で開示の実施形態で詳細に述べる。
【００２１】
本発明者らは、軟膜に存在する、または白血球を全血から除去するのに使用される白血球除去フィルター（赤血球を豊富にするために使用）もしくは白血球を貯留された軟膜から除去するのに使用される白血球除去フィルター（血小板を豊富にするために使用）に捕捉される、単球を含有する白血球集団が、非消耗未成熟樹状細胞の大規模でコスト効率の良い生成に使用できる可能性があると考えた。
【００２２】
前述したように、異なる種類の白血球除去フィルターによって保持された白血球は、適切な培地でバックフラッシュさせる（ｂａｃｋ−ｆｌｕｓｈｉｎｇ）ことによって回収でき、その後、単球が豊富にされる（非特許文献３、９３〜１０４；Ｍｅｙｅｒ  Ｔ  Ｐ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｆｉｌｔｅｒ  Ｂｕｆｆｙ  Ｃｏａｔｓ（ＦＢＣ）：Ａ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ  ｆｒｏｍ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３０７（２００５）１５０〜１６６）。
【００２３】
軟膜は、全血の密度勾配遠心分離の後に、好中球、好塩基球、好酸球、単球、およびリンパ球を含むほとんどの白血球、ならびに血小板を含有する抗凝固処置された血液試料の画分である。軟膜は通常、血小板生成の原材料として用いられる。このプロセスの間、４〜８の軟膜の貯留後に、白血球除去フィルターによる白血球の低減が行われる。一般的には、ＴＡＣＳＩ装置またはＯｒｂｉＳａｃシステムが、血小板を軟膜から分離するのに用いられる。
【００２４】
貯留された軟膜から血小板を調製するためのＴＡＣＳＩ装置は、システムボックス（ローターに固定）およびＴＡＣＳＩキットの据付のために取り外せるインサートを含む。各システムボックスは、個別のマイクロプロセッサによって制御および監視されるプレスシステムを備える。最初に、貯留容器内の貯留された軟膜が、遠心分離によって垂直位置に沈殿させられる。次の工程で、貯留された軟膜の上清の血小板が豊富な層（単球およびリンパ球を含む相当量の白血球もまた含有する）が、各ボックス内のプレスシステムの起動によって貯蔵容器に移される。さらに、白血球除去フィルターが、処理バッグと最終貯蔵容器との間のＴＡＣＳＩキット内に組み込まれる。その後、相当量の単球を含有する、白血球除去フィルターおよび軟膜貯留容器内の軟膜の残部の両方が放出される。
【００２５】
自動化された血小板を豊富にするための代替的なＯｒｂｉＳａｃシステムでは、軟膜貯留容器は環状である。遠心分離後、上清の血小板が豊富な中心部分が、遠心分離機の中央に置かれた容器に移され、その移動は、組み込まれた白血球除去フィルターを介して行われる。その後、相当量の単球を含有する、白血球除去フィルターおよび軟膜貯留容器内の軟膜の残部の両方が放出される。
【００２６】
要するに、軟膜から血小板を豊富にするための当技術分野における方法は、２つの可能な単球のソース、すなわち、血小板が除去された軟膜をも意味する、血小板を除去した軟膜の残部および白血球除去フィルターを供給する。血小板が除去された軟膜および白血球除去フィルターのそれぞれは、最大１０億個の単球を含む白血球の混合物を含有する。しかしながら、これらの単球は、血小板除去の前に軟膜が貯留されているため、異なる同種異系ドナー由来のものであるので、互いに対して同種異系である。
【００２７】
血小板を含有する貯留されていない軟膜または全血の白血球除去後に得られたフィルターは、１つの軟膜またはフィルター当たり最大で約１億〜２億個の単球をもたらす。したがって、非消耗未成熟ＤＣのコスト効率の良いＧＭＰ生成に十分な数を与えるために貯留されなければならない。
【００２８】
血小板生成から得られた白血球に類似して、血小板を含む軟膜からの貯留された白血球、または白血球を全血から除去するのに使用されたフィルターからの貯留された白血球はまた、異なる同種異系ドナー由来の混合細胞集団からなる。
【００２９】
少なくとも５〜１０の軟膜の白血球の貯留または少なくとも５〜１０の全血白血球フィルターからの溶出された白血球の貯留は、少なくとも理論上、非消耗未成熟ＤＣの大規模でコスト効率の良い臨床グレード生成に十分な数の白血球を供給するという問題を解決する。
【００３０】
同様に、貯留された血小板が除去された軟膜および／または軟膜から血小板を豊富にするために使用される白血球除去フィルターは、非消耗未成熟ＤＣの大規模でコスト効率の良い臨床グレードの生成に十分な数の白血球を供給するのに使用できる可能性がある。
【００３１】
上述したように、白血球除去フィルターによって保持された白血球は、適切な培地でバックフラッシュさせることによって回収でき、その後、単球が豊富にされる（非特許文献３、９３〜１０４；Ｍｅｙｅｒ  Ｔ  Ｐ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｆｉｌｔｅｒ  Ｂｕｆｆｙ  Ｃｏａｔｓ（ＦＢＣ）：Ａ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ  ｆｒｏｍ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３０７（２００５）１５０〜１６６）。
【００３２】
しかしながら、異なる同種異系ドナーから得られる、後続の単球が豊富な白血球の共培養に伴う想定される問題は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびクラスＩＩ抗原に関する不適合が、一方のドナーのアロ反応性Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー細胞を混入することによって他方のドナーの単球／未成熟ＤＣの早期の活性化を引き起こすことが考えられることである。
【００３３】
標準細胞培養培地、例えばＲＰＭＩ−１６４０（ＲＰＭＩはＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで、そこでその培地の原型がＭｏｏｒｅらによって開発された）での、ウシ胎仔血清との共培養、または２人の同種異系ドナーからの単球、リンパ球、およびＮＫ細胞を含む単核細胞のＸ−ＶＩＶＯ  １５などの血清を含まない細胞培養培地における共培養が、ＴＮＦ−αを含む有名なＤＣ活性化因子の生成を誘導することが知られている（Ｌａｕｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２００４；７７：２６７；Ｗａｌｌｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００５；６２：２３４）。さらに、ウシ胎仔血清との標準ＲＰＭＩ−１６４０培地における、または標準的な血清を含まない同種異系単核細胞の培地における、そのような共培養からの培養上清の添加が、単球由来の未成熟ＤＣの活性化／成熟を誘導することが繰り返し示されている（Ｌａｕｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２００４；７７：２６７；Ｗａｌｌｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００５；６２：２３４）。
【００３４】
さらに単球を未成熟ＤＣに分化するのに使用されるＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を添加した標準的なＲＰＭＩ−１６４０培地にＴＮＦ−αを添加することは、分化されたＤＣの早発活性化およびその後の消耗（免疫寛容性）を誘導することが明らかになっている（Ｒｉｅｓｅｒ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｄｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ：Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ−ａ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２．Ｂｌｏｏｄ  ９１（１９９８）３１１２−３１１７）。
【００３５】
Ｔ細胞およびＮＫ細胞の混入に関する問題は、基本的にＴ細胞およびＮＫ細胞の混入のない単球細胞集団を調製することは困難なため、貯留された軟膜または白血球除去フィルターからの単球をＧＭＰで豊富にした（エルトリエーションおよび抗体／ビーズ分離）（Ｓｃｈｗａｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  ２１：１５３−１５７（２００６）；Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３０７（２００５）１５０−１６６）後でさえ関係がある。
【００３６】
さらに、そして重要なことに、Ｍｅｇｇｉｏｖａｎｎｉらが示すように（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００６；７９；９７７−９８８を参照）、標準的な培地における同種異系リンパ球との共培養だけでなくウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地における同種異系好中球との単球の共培養は、ＤＣ上の膜ＣＤ４０、ＣＤ８６、およびヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−ＤＲの上方調節、すなわち早発活性化につながる。貯留された軟膜内の単球またはエルトリエーションを用いて溶出されたフィルター白血球から好中球を大量に除去すること（Ｓｃｈｗａｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  ２１：  １５３−１５７  （２００６））または抗体／ビーズ分離（Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３０７  （２００５）  １５０−１６６）は、非常に難しいことが明らかにされている。通常、そのような単球が豊富な生成物はかなりの量の（すなわち存在する細胞の総数に対して２５〜４０％）好中球を含有する。しかしながら、安全の点では、この好中球の混入は問題ではない。
【００３７】
さらに、たとえ１００％純粋単球細胞集団を作製することが可能であっても、これは異なる同種異系ドナーの単球間での能動的相互作用による早発活性化のリスクを排除しない。著名な名高い免疫学者Ｆａｄｉ  Ｇ．ＬａｋｋｉｓおよびＲｏｂｅｒｔ  Ｉ．Ｌｅｃｈｌｅｒの最近の総説「Ｏｒｉｇｉｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｖｏｌ．  ３，  Ｎｏ．  ８，  ２０１３を参照）において、先天性非自己認識メカニズムは実際に存在すると結論づけられている。著者は、「同種移植片拒絶は、適応免疫系がある脊椎動物に限定されず、適応免疫の進化に先立つ多くの無脊椎動物にもよく起こると述べている（ＴおよびＢリンパ球、ＮＫ細胞、体細胞遺伝子再配列酵素、およびＭＨＣが不足している動物）」。
【００３８】
さらに、そしておそらくより直接的な同種免疫反応がリンパ系細胞を欠いているマウスにも見られる。単球の活性化は、レシピエントの単球と、同種異系単球を含む注入される同種異系ドナーの白血球との間の非ＭＨＣ抗原の違いによる（（Ｚｅｃｈｅｒ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎ  Ｉｎｎａｔｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  Ｎｏｎｓｅｌｆ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８３  （２００９）  ７８１０−７８１６）。Ｚｅｃｈｅｒらは、同種異系白血球を、ＴおよびＢリンパ球を欠いているＲＡＧ２／２マウスの耳介に注入することは、同系白血球を注入することより、宿主骨髄細胞を有する皮膚のより大きな腫れと浸潤を著しく引き起こすことを示した。同種異系白血球に対する応答はＮＫ細胞とは無関係に起こり、単球によって媒介された。さらに、単球の応答は、ＭＨＣにつながらないアロ決定基に対してであった。
【００３９】
さらにより最近の論文（Ｚｅｎｇ  Ｑ，ｅｔ  ａｌ．「Ｉｎｎａｔｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｎｏｎ−ｓｅｌｆ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｍａｔｕｒｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．」、Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １２：  １４８−１４８，  ２０１２）において、著者は、Ｔ、Ｂ、およびＮＫ細胞を欠いたｇｃ２／２ＲＡＧ２／２マウスに移植された心臓同種移植片が、成熟したＩＬ−１２を発現した樹状細胞（ＤＣ）に分化する宿主の単球によって急速に浸潤されることを示した。しかしながら、宿主の単球の成熟を引き起こす同種異系細胞の決定基およびそれらを認識する推定単球レセプターはまだわかっていない。
【００４０】
したがって、哺乳類の単球が、Ｔ、Ｂ、およびＮＫ細胞とは無関係に、同種異系細胞の非ＭＨＣ決定基に直接応答する明白な証拠がある。ゆえに、一般的に広まっている認識によれば、アロ反応性は単球の一般的性質と見なされている。
【００４１】
まとめると、これは、異なる同種異系ドナー由来の単球が豊富な細胞集団の共培養は、それらの単球由来ＤＣへの分化の間に、単球の事前活性化とその後の消耗を引き起こすことが予想されることを意味する。それによってＤＣは、関連する活性化因子と再刺激されるときに、必要なアジュバント因子を持続的に生成するＰＩ−ＤＣになることができない。
【００４２】
この予想される活性化が誘導される消耗が、ＴＮＦ−αのような炎症性物質（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１２；  １２：  ６０７−６１５）または微生物リポ多糖（ＬＰＳ）（Ｒｉｅｓｅｒ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｄｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ：Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ−α  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２．  Ｂｌｏｏｄ  ９１（１９９８）３１１２−３１１７；Ｌａｎｇｅｎｋａｍｐ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ＴＨ１，ＴＨ２  ａｎｄ  ｎｏｎｐｏｌａｒｉｚｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１（２０００）３１１−３１６）との早発活性化によって誘導される単球、マクロファージ、およびＤＣの周知の消耗に類似している。
【００４３】
しかしながら、本発明者らは、驚くべきことに、１人のドナーから得られる豊富にされた単球からの非消耗未成熟ＤＣを増殖させるのに用いられる方法（特許文献２を参照）と類似した方法で、すなわち、非ヒト血清を含まず、インターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を添加した水性細胞培養培地を使用することによって、非消耗未成熟ＤＣが、異なる同種異系ドナーからの同種異系単球が豊富な白血球の混合物からなる始原細胞集団から実際に増殖され得ることを発見した。
【００４４】
一般的な先入観とは異なり、特定の条件下での異なる同種異系ドナーからの豊富にされた単球の混合物の未成熟ＤＣへの増殖は、驚くべきことにＤＣの早発活性化およびその後の消耗につながらないことが示された。これらの条件は、非ヒト血清を含まずＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を添加した水性細胞培養培地での共培養を含む。
【００４５】
しかしながら、非ヒト血清を含まず、インターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を添加していない水性細胞培養培地における共培養と、例えば仔ウシ血清などの非ヒト血清を含み、インターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球マクロファージコロニーを添加した水性細胞培養培地での共培養は、当技術分野で予想され認識されるように、ＤＣの早発活性化とその後の消耗をもたらす。
【００４６】
したがって、単球は異なる同種異系ドナーからの貯留された白血球集団から分離されてもよく、例えばエルトリエーション（Ｅｌｕｔｒａ）または抗体／ビーズ分離（ＣｌｉｎｉＭａｃｓ）などの大規模でコスト効率の良いＧＭＰでの単球を豊富にすることを可能にする。その後、非消耗未成熟ＤＣは、早発活性化しないで、分離した単球が豊富な同種異系白血球から生成することができる。
【００４７】
そのような非消耗未成熟ＤＣは、腫瘍内に注入されるときに抗腫瘍ワクチンとして機能することを目的とした炎症誘発性ＤＣを増殖させるのに用いられてもよい（特許文献２を参照）。さらに、異なる同種異系ドナーからの非消耗未成熟ＤＣは、腫瘍内、皮下、皮膚上、筋肉内、および／または静脈内の部位を含む、異なる部位に注入することができる「完全な」細胞同種異系抗癌ワクチン（特許文献１を参照）を生成するために、活性化の前に腫瘍抗原で負荷されてもよい。
【００４８】
したがって、一実施形態は、単球が豊富な同種異系白血球の混合物から非消耗未成熟ＤＣを生成する方法に関する。このような方法では、少なくとも２人の異なる同種異系ドナーから得られる同種異系白血球の混合物が供給される。一実施形態によれば、２人の異なる異種同系ドナーは、白血球を提供する２人の個人が同じ種であるが、異なる遺伝子構成、すなわち抗原的に異なることを意味することが意図される。上述したように、同種異系白血球は、貯留された軟膜から得られてもよいし、または使用済み白血球除去フィルターから白血球を溶出することによって得られてもよい。次に、同種異系単球が、供給された同種異系白血球の混合物から分離される。その後、非消耗未成熟ＤＣが、分離された単球が豊富な同種異系白血球から生成される。
【００４９】
大規模でコスト効率の良いＧＭＰでの単球を豊富にすることが行える以外に、少なくとも２人の異なる同種異系ドナーから得られる同種異系単球の混合物から得られる非消耗未成熟ＤＣのさらなる利点は、異なるドナーからのＰＩ−ＤＣ間に存在することが知られている、活性化の際に異なる炎症誘発性因子の生成に関する通常の生物学的変化が低減されることである。
【００５０】
好ましい実施形態において、同種異系白血球は、白血球を含む少なくとも２つの軟膜を貯留することによって供給される。貯留される軟膜は、少なくとも２人の異なる同種異系ドナーから得られる。貯留される軟膜は血小板を含有しても、または血小板が除去されていてもよい。
【００５１】
同種異系白血球はまた、少なくとも２つ白血球除去フィルターから白血球を溶出することによって供給されてもよく、そのフィルターは、先に少なくとも２人の異なる同種異系ドナーの全血から白血球を除去するのに使用したものである。溶出の後、得られた白血球は同種異系白血球の混合物を得るために貯留される。明らかに、しかしより好ましくなく、全血はまた白血球の除去の前に貯留されてもよい。白血球を除去フィルターから溶出する手順は、Ｅｂｎｅｒら（非特許文献３、９３〜１０４を参照）によって記載されている。
【００５２】
同様に、同種異系白血球はまた、１つの白血球除去フィルターから白血球を溶出することによって供給されてもよく、そのフィルターは、貯留された軟膜から白血球を除去するのに使用したもので、貯留された軟膜は、少なくとも２人の異なる同種異系ドナーから得たものである。白血球を除去フィルター（フィルターは先に軟膜から白血球を除去するために使用されたものである）から溶出する手順は、Ｍｅｙｅｒら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３０７（２００５）  １５０−１６６を参照）によって記載されている。
【００５３】
白血球除去フィルターから得られた同種異系白血球もまた、非消耗未成熟ＤＣを生成するために使用されるが、少なくとも２人の異なる同種異系ドナーから得られた少なくとも２つの軟膜を貯留することによって供給された同種異系白血球を使用することが好ましいように思われる。白血球除去フィルターから溶出された同種異系白血球は、貯留された末梢血試料または貯留された軟膜から直接得られた同種異系単球と比較して、成熟の後に、ＭＩＧ、サイトカインを除いて、若干少ない量のケモカインを生成する可能性がある。
【００５４】
異なる白血球の混合物から単球を分離することは、当技術分野で周知である。一実施形態によれば、単球は、確立されたＧＭＰ生成方法によって、供給された同種異系白血球の混合物から分離される。したがって、単球は、エルトリエーションまたは抗体／ビーズ分離によって、供給された同種異系白血球の混合物から分離されてもよい。
【００５５】
エルトリエーションは、持続的な逆流のエルトリエーションが、細胞を複数の画分に分割する技術である。要するに、密度によって細胞を分割する一定の遠心力は、大きさごとに細胞を分散させる沈殿物によって持続的に増している培地の流れに逆らう。ゆえに、最も小さい／軽いものが最初に、そして最も大きく／重いものが最後に、培地の流れは細胞をいくつかの生成物に流す。
【００５６】
単球の抗体／ビーズ分離は、（免疫）磁性活性化細胞分類（ＭＡＣＳ）によって行われる。ＭＡＣＳは、細胞を全血、軟膜、またはＷＢＣアフェレセート（ａｐｈｅｒｅｓａｔｅ）から選択的に分離するための広く利用される技術である。要するにＦｃ末端でＣＤ特異的の抗体保持強磁性ビーズが、望ましい（陽性選択）または望ましくない（陰性選択）細胞に結合される。そのように処理された細胞が、強い磁場にさらされるとき、多孔質の金属被覆のカラム内に保持されてもよい。
【００５７】
分離の後に、単球は未成熟ＤＣに分化される、すなわち未成熟ＤＣが生成される。未成熟ＤＣは、２〜７日間、例えば約５日間、非ヒト血清を含まず、インターロイキン４（ＩＬ−４）と組み合わせた顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を添加した水性細胞培養培地で同種異系単球を共培養し、それによって単球を未成熟ＤＣに分化することによって生成される。
【００５８】
ウシ胎仔血清を含む細胞培養培地は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４が添加されるにもかかわらず、早発活性化を誘導することがわかったので、使用される培地が非ヒト血清を含まないことが重要である。
【００５９】
未成熟ＤＣはまた、２〜７日間、例えば５日間、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）またはインターフェロンアルファと組み合わせたＧＭ−ＣＳＦを含む水性培地で同種異系単球を培養し、それによって単球を未成熟ＤＣに分化しすることによって生成されてもよい。しかしながら、ＩＬ−４と組み合わせてＧＭ−ＣＳＦを使用することは、非ヒト血清を含まない培地と組み合わせて使用する際に、アロ反応性および早発活性化を防ぐことがわかっているので好ましい。
【００６０】
当業者は細胞培養培地およびそれらの成分に精通している。通常、使用される細胞培養培地は以下を含む：
ＮａＣｌ、ＫＣ１、ＭｇＳＯ４、および／またはＣａ（ＮＯ３）２などの少なくとも１つの塩；
グルコースなどの少なくとも１つの糖類；
Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよび／またはＬ−リジンなどの１つまたは複数のアミノ酸；
グルタチオン、ビオチン、ビタミンＢ１２、Ｄ−Ｃａ−パントテナート、塩化コリン、葉酸、ミオイノシトール、ニコチンアミド、パラアミノ安息香酸、ピリドキシン、リボフラビンおよび／またはチアミンなどの１つまたは複数のビタミンおよび他の必要不可欠な栄養素；および
リン酸塩（例えばＮａ２ＨＰＯ４）および／または炭酸塩（例えばＮａＨＣＯ３）などの少なくとも１つの緩衝液。
【００６１】
一実施形態によれば、培養培地は、少なくとも１つのＮａＣｌなどの塩、少なくとも１つのグルコースなどの糖類、１つまたは複数のアミノ酸、１つまたは複数のビタミン、およびリン酸塩（例えばＮａ２ＨＰＯ４）および／または炭酸塩（例えばＮａＨＣＯ３）などの緩衝剤を含む。
【００６２】
さらに、細胞培養培地は非ヒト血清を含まないが、通常、少なくともヒトポリペプチドを含む。一実施形態によれば、細胞培養培地は、トランスフェリン、アルブミン、およびインシュリンからなる群から選択される少なくとも１つのヒトポリペプチドを含む；好ましくは、細胞培養培地はこれらの全ての３つを含む。ヒトポリペプチドは、ヒト血漿から得られてもよい。さらに、それらは組み換えで生成されてもよい。一例として、インシュリンは酵母細胞内で組み換えで生成されてもよい。
【００６３】
一例として、非ヒト血清を含まない細胞培養培地はＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）であってもよく、それはＣｅｌｌＧｅｎｉｘ  ＧｍｂＨによって提供されるＧＭＰ無血清樹状細胞培地（ＤＣ）である。米国において、この培地はＣｅｌｌＧｅｎｉｘ（商標）で販売されている。
【００６４】
当業者によって認識されているように、また本明細書で説明されているように、「分離された」とは、必ずしも１００％純粋を意味せず、単球の選択を示す分離プロセスによって得られた単球を意味する。そのようなプロセスによって得られた単球は、単球に加えて他の白血球が存在するので、単球が豊富な同種異系白血球と見なされてもよい。
【００６５】
一実施形態によれば、同種異系単球は同種異系白血球の混合物から豊富にされてもよい。単球が豊富な同種異系白血球は通常、単球に加えて同種異系好中球も含む。さらにそれらは他の顆粒球を含んでもよい。
【００６６】
一般に広まっている先入観とは異なり、未成熟ＤＣが同種異系白血球の混合物から得られたという事実にもかかわらず、同種異系単球が、非ヒト血清を含まずＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４が添加された水性細胞培養培地で共培養されたとき、早発活性化の徴候は見られなかった。それに基づいて、そのような未成熟ＤＣは非消耗であるため、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−ｌβ、ＲＡＮＴＥＳ、およびＭＩＧを含む、例えば２０００、５０００、または７５００ｐｇ／ｍＬより多い相当量の炎症誘発性ケモカイン、およびＩＬ−１２ｐ７０およびＴＮＦ−αを含む、例えば５００、１５００、または３０００ｐｇ／ｍＬより多い相当量の炎症誘発性サイトカインを、活性化因子の除去の後、持続的に生成することができる。
【００６７】
一実施形態によれば、未成熟は、ＤＣ成熟マーカーＣＤ８３およびＣＤ８６の低いレベルのみを発現させるＤＣを意味することが意図され、そのＤＣは活性化時に大量の炎症誘発性ケモカインおよびサイトカインを生成できる。実施形態によれば、低レベルは、ＣＤ８３の発現の少なくとも３倍、例えば少なくとも５倍の増加が活性化時に見られ、ＣＤ８６の発現の少なくとも５倍、例えば少なくとも８倍の増加が活性化時に見られるように解釈される。
【００６８】
早発活性化が見られることが予想されたので、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）媒介の活性化されたＤＣの消耗を妨害することが知られている因子のシクロキシゲナーゼ−２阻害剤ＮＳ−３９８がいくつかの実験で加えられた。しかしながらＤＣ内での単球の増殖の間、ＮＳ−３９８の存在は、ＭＩＧおよびＩＬ−１２ｐ７０の活性化により誘導された生成物を増やさず、むしろ減少させた。したがって、混合された同種異系単球の共培養から分化された未成熟ＤＣのＰＧＥ２媒介の消耗の徴候はない。
【００６９】
当業者によって認識されるように（特許文献１および２を参照）、非消耗未成熟樹状細胞（ＤＣ）は癌治療のための医薬組成物の生成に役立つ。したがって、一実施形態は、少なくとも２人の異なる同種異系ドナー由来の同種異系非消耗未成熟樹状細胞（ＤＣ）の混合物に関する。そのような樹状細胞（ＤＣ）は、本明細書に開示の方法によって得ることが可能である。未成熟ＤＣに分化の後、未成熟ＤＣは炎症誘発性ＤＣになるように活性化されてもよい。活性化はいくつかの方法で誘導することができる。多くのシグナルがＤＣ活性化の少なくともいくつかの態様を誘導するために示された。これらのうちで最も強力なものが、微生物およびウイルス産物（病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ））であり、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）ファミリーのメンバーを含むパターン認識受容体（ＰＲＲ）によって直接認識される。ＰＲＲは多くの先天性応答遺伝子の発現を制御し、ＤＣ活性化のために直接シグナルを送ることができる。さらに免疫細胞および非免疫細胞の両方におけるＰＲＲのシグナルは、しばしば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインターロイキン１（ＩＬ−１）などの炎症性サイトカインの合成をもたらし、それはまたＤＣの活性化を促すことができる。したがって、炎症性サイトカインの添加はまた未成熟ＤＣの活性化にも役立つことができる。
【００７０】
一実施形態によれば、未成熟ＤＣは、細胞同種異系抗癌ワクチンを供給するために、活性化の前に、または活性化と同時に、抗原を負荷させられる。抗原負荷は当技術分野で周知で（例えば、特許文献１を参照）、振動、トランスフェクション、感染、または融合などの方法で行うことができる。一例として、抗原は通常、腫瘍から得ることができ、通常はワクチンが対象にする腫瘍タイプから得ることができる。抗原を得る際に、目的の癌タイプの代表的な検体が通常使用される。
【００７１】
好ましい実施形態によれば、未成熟ＤＣの活性化は、特許文献２に開示の方法に従って行われる。したがって、成熟は、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）リガンドポリ−Ｉ：Ｃ、ＴＬＲ７／８リガンド、例えばＲ８４８（レジキモド）およびサイトカインインターフェロンγ（ＩＦＮ―γ）を加えることによって誘導されてもよい。Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）リガンドポリ−Ｉ：Ｃは、ポリ（Ｃ）鎖にアニールされたポリ（Ｉ）鎖を含むｄｓＲＮＡの合成類似体である。鎖の大きさは異なってもよい。その大きさは、２００〜８０００塩基対であってもよく、例えば２００〜１５００または１５００〜８０００塩基対であってもよい。ＴＬＲ７／８リガンドＲ８４８は、当技術分野でレジキモドとも表される。レジキモドの代わりに、ガーディキモドまたはイミキモドがＴＬＲ７／８リガンドとして用いられてもよい。通常、未成熟ＤＣは、８〜２４時間、例えば１８時間、活性化因子にさらされる。
【００７２】
活性化は、ＴＬＲ２リガンド、細菌性リポ多糖およびモノホスホリルリピドＡなどのＴＬＲ４リガンド、微生物ＤＮＡと哺乳類ＤＮＡを区別するＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）シーケンスなどのＴＬＲ９リガンド、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）、インターロイキン１β（ＩＬ―Ιβ）、および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）からなる群から選択される少なくとも１つの物質の添加をさらに含んでもよい。さらに活性化は、本発明において不利であろう、成熟ＤＣが、注入部位（腫瘍）から急速に離れる移動性ＤＣとなることを防ぐために、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の添加を含まないことが好ましい。
【００７３】
活性化の後で、結果として生じる炎症誘発性ＤＣは全ての活性化因子を基本的に除去するために洗われてもよい。したがって、活性化因子は通常、炎症誘発性ＤＣをワクチンとして使用する前に洗い流される。活性化因子の除去は、活性化因子の同時投与（生体外で炎症誘発性ＤＣを誘導することを目的とした）を防ぐ。活性化因子の同時投与は、腫瘍内で補充される未成熟ＤＣの強くて持続的な活性化ももたらす可能性が高く、移動性成熟ＤＣへの望ましい分化よりむしろ炎症誘発性成熟ＤＣへの分化をもたらす。
【００７４】
前述したように（特許文献２を参照）、炎症誘発性樹状細胞は、腫瘍負荷された移動性ＤＣを作るために患者固有のＤＣを活性化することができるので、癌治療に役立つ。したがって、一実施形態は、少なくとも２人の異なる同種異系ドナー由来の同種異系炎症誘発性樹状細胞の混合物に関する。そのような同種異系炎症誘発性樹状細胞は、本明細書で開示された方法によって得ることが可能である。活性化の後で炎症誘発性樹状細胞を凍結することによって、保存することができる。通常、炎症誘発性樹状細胞は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および血清または血漿を含有する培地で凍結される。使用前に凍結された細胞は解凍され、ＤＭＳＯは洗い流される。
【００７５】
癌治療で使用するために、そのような同種異系炎症誘発性樹状細胞は、医薬組成物に処方されてもよい。この医薬組成物は、少なくとも１つの医薬上許容可能な担体、例えばリン酸緩衝食塩水溶液、水、および油／水または水／油エマルションなどのエマルション、ならびにさまざまな種類の湿潤剤を含んでもよい。さらに、医薬組成物は、医薬上許容可能なアジュバント、賦形剤、安定剤、防腐剤、および／または当技術分野で知られている他の成分を含んでもよい。一例として、担体はヒト血清アルブミンを含む生理食塩水であってもよい。
【００７６】
さらなる実施形態は、癌治療で使用のために、同種異系炎症誘発性樹状細胞のそのような混合物またはそのような同種異系炎症誘発性樹状細胞を含むそのような組成物に関する。同様に、一実施形態は、癌治療の薬剤の製造に使用されるそのような同種異系炎症誘発性樹状細胞の混合物の使用に関する。さらなる実施形態は、癌の治療方法に関し、同種異系炎症誘発性樹状細胞の混合物は、そのような治療が必要な患者に、腫瘍負荷された移動性ＤＣを作るために患者固有のＤＣを活性化するのに十分な投与量で投与される。
【００７７】
さらなる詳細の説明がなくても、前述の説明および以下の実験部分を用いて、当業者は本発明を最大限活用することができると考えられる。したがって、本明細書に記載の好ましい特定の実施形態は、単なる例示として解釈され、どのようにしても本明細書の残りの部分を限定するものではない。さらに、本発明を特定の実施形態に関して上述してきたが、本明細書に記載の特定の形態に限定することを意図していない。むしろ、本発明は、添付の請求項によって限定され、上述の特定の実施形態以外の実施形態は、例えば上述の実施形態とは異なる、これらの添付の請求項の範囲内で同様に可能である。
【００７８】
請求項において、「含む」の語は、他の要素または工程の存在を排除しない。さらに、個々の特徴が異なる請求項に含まれ得るが、これらは有利に組み合わされ得る。異なる請求項に含まれることは、特徴の組み合わせが実現可能でないおよび／または有利でないことを意味しない。
【００７９】
さらに、単数形の言及は複数を排除しない。「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、「第１の」「第２の」等は、複数を除外しない。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１Ａ】単一または混合末梢血単球培養物から得られた未成熟ＤＣ上の活性化／成熟マーカーＣＤ８３の発現を示している。
【図１Ｂ】単一または混合末梢血単球培養物から得られた未成熟ＤＣ上の活性化／成熟マーカーＣＤ８６の発現を示している。
【図１Ｃ】単一または混合末梢血単球培養物から得られたＰＩ−ＤＣ上の活性化／成熟マーカーＣＤ８３の発現を示している。
【図１Ｄ】単一または混合末梢血単球培養物から得られたＰＩ−ＤＣ上の活性化／成熟マーカーＣＤ８６の発現を示している。
【図２Ａ】１８時間の持続的な活性化因子による刺激の間の、未成熟ＤＣ（単一または混合末梢血単球培養物から得られた）による炎症誘発性ケモカインの生成を示している（「能動的生成」）。
【図２Ｂ】１８時間の持続的な活性化因子による刺激の間の、未成熟ＤＣ（単一または混合末梢血単球培養物から得られた）による炎症誘発性ケモカインの生成を示している（「能動的生成」）。
【図２Ｃ】１８時間の持続的な活性化因子による刺激の間の、未成熟ＤＣ（単一または混合末梢血単球培養物から得られた）による炎症誘発性ケモカインの生成を示している（「能動的生成」）。
【図２Ｄ】１８時間の持続的な活性化因子による刺激の間の、未成熟ＤＣ（単一または混合末梢血単球培養物から得られた）による炎症誘発性ケモカインの生成を示している（「能動的生成」）。
【図３Ａ】１８時間の持続的な活性化因子による刺激の間の、未成熟ＤＣ（単一または混合末梢血単球培養物から得られた）による炎症誘発性サイトカインの生成を示している（「能動的生成」）。
【図３Ｂ】１８時間の持続的な活性化因子による刺激の間の、未成熟ＤＣ（単一または混合末梢血単球培養物から得られた）による炎症誘発性サイトカインの生成を示している（「能動的生成」）。
【図４Ａ】シクロオキシゲナーゼ−２（Ｃｏｘ―２）阻害剤ＮＳ−３９８の添加をして／しないで、活性化因子による１８時間の持続的な刺激の間の、未成熟ＤＣ（単一または混合末梢血単球培養物から得られた）による炎症誘発性サイトカインの生成を示している。
【図４Ｂ】シクロオキシゲナーゼ−２（Ｃｏｘ―２）阻害剤ＮＳ−３９８の添加をして／しないで活性化因子による１８時間の持続的な刺激の間の、未成熟ＤＣ（単一または混合末梢血単球培養物から得られた）による炎症誘発性サイトカインの生成を示している。
【図５Ａ】１８時間の持続的な活性化因子による刺激（「能動的生成」）の間の、未成熟ＤＣ（単一または混合軟膜単球培養物から得られた）による炎症誘発性ケモカインの生成を示している。
【図５Ｂ】１８時間の持続的な活性化因子による刺激の間の、未成熟ＤＣ（単一または混合軟膜単球培養物から得られた）による炎症誘発性ケモカインの生成を示している（「能動的生成」）。
【図５Ｃ】１８時間の持続的な活性化因子による刺激の間の、未成熟ＤＣ（単一または混合軟膜単球培養物から得られた）による炎症誘発性ケモカインの生成を示している（「能動的生成」）。
【図５Ｄ】１８時間の持続的な活性化因子による刺激の間の、未成熟ＤＣ（単一または混合軟膜単球培養物から得られた）による炎症誘発性ケモカインの生成を示している（「能動的生成」）。
【図６Ａ】１８時間の持続的な活性化因子による刺激の間の、未成熟ＤＣ（単一または混合軟膜単球培養物から得られた）による炎症誘発性サイトカインの生成を示している（「能動的生成」）。
【図６Ｂ】１８時間の持続的な活性化因子による刺激の間の、未成熟ＤＣ（単一または混合軟膜単球培養物から得られた）による炎症誘発性サイトカインの生成を示している（「能動的生成」）。
【図７Ａ】ＰＩ−ＤＣ（単一または混合末梢血単球培養物から得られた）による炎症誘発性ケモカインの生成を示している。これらのＰＩ−ＤＣは、１８時間の活性化因子による刺激の後洗われ、その後、活性化因子を添加しないで２４時間再培養された（「受動的生成」）。
【図７Ｂ】ＰＩ−ＤＣ（単一または混合末梢血単球培養物から得られた）による炎症誘発性ケモカインの生成を示している。これらのＰＩ−ＤＣは、１８時間の活性化因子による刺激の後洗われ、その後、活性化因子を添加しないで２４時間再培養された（「受動的生成」）。
【図７Ｃ】ＰＩ−ＤＣ（単一または混合末梢血単球培養物から得られた）による炎症誘発性ケモカインの生成を示している。これらのＰＩ−ＤＣは、１８時間の活性化因子による刺激の後洗われ、その後、活性化因子を添加しないで２４時間再培養された（「受動的生成」）。
【図７Ｄ】ＰＩ−ＤＣ（単一または混合末梢血単球培養物から得られた）による炎症誘発性ケモカインの生成を示している。これらのＰＩ−ＤＣは、１８時間の活性化因子による刺激の後洗われ、その後、活性化因子を添加しないで２４時間再培養された（「受動的生成」）。
【図８Ａ】ＰＩ−ＤＣ（単一または混合末梢血単球培養物から得られた）による炎症誘発性サイトカインの生成を示している。これらのＰＩ−ＤＣは、１８時間の活性化因子による刺激の後洗われ、その後、活性化因子を添加しないで２４時間再培養された（「受動的生成」）。
【図８Ｂ】ＰＩ−ＤＣ（単一または混合末梢血単球培養物から得られた）による炎症誘発性サイトカインの生成を示している。これらのＰＩ−ＤＣは、１８時間の活性化因子による刺激の後洗われ、その後、活性化因子を添加しないで２４時間再培養された（「受動的生成」）。
【図９Ａ】ＰＩ−ＤＣ（単一または混合軟膜単球培養物から得られた）による炎症誘発性ケモカインの生成を示している。これらのＰＩ−ＤＣは、１８時間の活性化因子による刺激の後洗われ、その後、活性化因子を添加しないで２４時間再培養された（「受動的生成」）。
【図９Ｂ】ＰＩ−ＤＣ（単一または混合軟膜単球培養物から得られた）による炎症誘発性ケモカインの生成を示している。これらのＰＩ−ＤＣは、１８時間の活性化因子による刺激の後洗われ、その後、活性化因子を添加しないで２４時間再培養された（「受動的生成」）。
【図９Ｃ】ＰＩ−ＤＣ（単一または混合軟膜単球培養物から得られた）による炎症誘発性ケモカインの生成を示している。これらのＰＩ−ＤＣは、１８時間の活性化因子による刺激の後洗われ、その後、活性化因子を添加しないで２４時間再培養された（「受動的生成」）。
【図９Ｄ】ＰＩ−ＤＣ（単一または混合軟膜単球培養物から得られた）による炎症誘発性ケモカインの生成を示している。これらのＰＩ−ＤＣは、１８時間の活性化因子による刺激の後洗われ、その後、活性化因子を添加しないで２４時間再培養された（「受動的生成」）。
【図１０Ａ】ＰＩ−ＤＣ（単一または混合軟膜単球培養物から得られた）による炎症誘発性サイトカインの生成を示している。これらのＰＩ−ＤＣは、１８時間の活性化因子による刺激の後洗われ、その後、活性化因子を添加しないで２４時間再培養された（「受動的生成」）。
【図１０Ｂ】ＰＩ−ＤＣ（単一または混合軟膜単球培養物から得られた）による炎症誘発性サイトカインの生成を示している。これらのＰＩ−ＤＣは、１８時間の活性化因子による刺激の後洗われ、その後、活性化因子を添加しないで２４時間再培養された（「受動的生成」）。
【図１１Ａ】フィルター単球由来の混合未成熟ＤＣが、１８時間の持続的な活性化因子による刺激の間に、相当量の炎症誘発性ケモカインを生成することを示している（「能動的生成」）。
【図１１Ｂ】フィルター単球由来の混合未成熟ＤＣが、１８時間の持続的な活性化因子による刺激の間に、相当量の炎症誘発性ケモカインを生成することを示している（「能動的生成」）。
【図１１Ｃ】フィルター単球由来の混合未成熟ＤＣが、１８時間の持続的な活性化因子による刺激の間に、相当量の炎症誘発性ケモカインを生成することを示している（「能動的生成」）。
【図１１Ｄ】フィルター単球由来の混合未成熟ＤＣが、１８時間の持続的な活性化因子による刺激の間に、相当量の炎症誘発性ケモカインを生成することを示している（「能動的生成」）。
【図１２Ａ】フィルター単球由来の混合未成熟ＤＣが、１８時間の持続的な活性化因子による刺激の間に、相当量の炎症誘発性サイトカインを生成することを示している（「能動的生成」）。
【図１２Ｂ】フィルター単球由来の混合未成熟ＤＣが、１８時間の持続的な活性化因子による刺激の間に、相当量の炎症誘発性サイトカインを生成することを示している（「能動的生成」）。
【図１３Ａ】フィルター単球由来の混合ＰＩ−ＤＣによる、活性化因子を除去した後の、相当量の炎症誘発性ケモカインの生成を示している。これらのＰＩ−ＤＣは、１８時間の活性化因子による刺激の後洗われ、その後、活性化因子を添加しないで２４時間再培養された（「受動的生成」）。
【図１３Ｂ】フィルター単球由来の混合ＰＩ−ＤＣによる、活性化因子を除去した後の、相当量の炎症誘発性ケモカインの生成を示している。これらのＰＩ−ＤＣは、１８時間の活性化因子による刺激の後洗われ、その後、活性化因子を添加しないで２４時間再培養された（「受動的生成」）。
【図１３Ｃ】フィルター単球由来の混合ＰＩ−ＤＣによる、活性化因子を除去した後の、相当量の炎症誘発性ケモカインの生成を示している。これらのＰＩ−ＤＣは、１８時間の活性化因子による刺激の後洗われ、その後、活性化因子を添加しないで２４時間再培養された（「受動的生成」）。
【図１３Ｄ】フィルター単球由来の混合ＰＩ−ＤＣによる、活性化因子を除去した後の、相当量の炎症誘発性ケモカインの生成を示している。これらのＰＩ−ＤＣは、１８時間の活性化因子による刺激の後洗われ、その後、活性化因子を添加しないで２４時間再培養された（「受動的生成」）。
【図１４Ａ】フィルター単球由来の混合ＰＩ−ＤＣによる、活性化因子を除去した後の、相当量の炎症誘発性サイトカインの生成を示している。これらのＰＩ−ＤＣは、１８時間の活性化因子による刺激の後洗われ、その後、活性化因子を添加しないで２４時間再培養された（「受動的生成」）。
【図１４Ｂ】フィルター単球由来の混合ＰＩ−ＤＣによる、活性化因子を除去した後の、相当量の炎症誘発性サイトカインの生成を示している。これらのＰＩ−ＤＣは、１８時間の活性化因子による刺激の後洗われ、その後、活性化因子を添加しないで２４時間再培養された（「受動的生成」）。
【発明を実施するための形態】
【００８１】
実験
以下の実施例は単なる例であり、本発明の範囲を限定するように解釈されるべきでない。むしろ、本発明は、添付の請求項によってのみ限定される。
【００８２】
さまざまな起源の白血球
白血球除去フィルター（ＴＡＣＳＩフィルター）から白血球を分離
白血球フィルター（血小板生成の間に４つの貯留された軟膜の通常の白血球除去のために使用されるＴＡＣＳＩ白血球除去フィルター）を、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｓａｈｌｇｒｅｎｓｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＨｏｓｐｉｔａｌのＣｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで回収し、冷やして実験室（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｈｌｇｒｅｎｓｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）に運んだ。
【００８３】
実験室において、シリンジ（テルモ）を５０ｍｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液（ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ）で満たし、ルアーロック取付具によってＴＡＣＳＩフィルターに接続した。フィルターを滅菌ガラスフラスコ内へ３回バックフラッシュさせた（合計１５０ｍｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液）。溶出された細胞懸濁液を、最後にＦａｌｃｏｎ管内で１：２の濃度で、ＰＢＳ（ＰＡＡ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で希釈した。
【００８４】
軟膜
健康な血液ドナーからの軟膜を輸血部で採取し、室温で実験室に運んだ。
【００８５】
末梢血
健康なドナーの末梢血を輸血部で採取し、室温で実験室に運んだ。実験室において、血液を１：２の濃度で、Ｆａｌｃｏｎ管内で室温ＰＢＳと混合した。
【００８６】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の分離
健康なドナーの末梢血を輸血部で採取し、室温で実験室に運んだ。実験室において、血液を１：２の濃度で、Ｆａｌｃｏｎ管内で室温ＰＢＳと混合した。細胞懸濁液を、３ｍｌのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ）を含有する１０ｍｌ遠心分離管（Ｎｕｎｃ）に静かに移した。各管に５〜６ｍｌを移し、その後、室温で２０分間、制動しないで２０００ｒｐｍで遠心分離した。分離したＰＢＭＣを予め冷やした１０ｍｌ管に移した。その管に冷ＰＢＳを満たすことにより細胞を２回洗い、その後、１４５０ｒｐｍ、４℃で１０分間、遠心分離した。上清を捨て、沈殿物を１ｍｌの冷ＰＢＳ内で再懸濁した。さらに９ｍｌを各管に加えた。
【００８７】
単球分離
５ｍｌの溶出されたフィルター白血球／軟膜白血球または１０〜２０ｍｌの全末梢血から分離されたＰＢＭＣを、１４５０ｒｐｍ、４℃で１０分間、管内で遠心分離した。上清を完全に除去し、細胞沈殿物を１０７細胞につき８０μｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）内で再懸濁した。１０７細胞につき、２０μｌのＣＤ１４ミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を加えた。細胞を混合し、４℃で１５分間培養し、その後、１〜２ｍｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡを加えることによって洗い、次に３００ｘｇで１０分間、遠心分離した。上清を完全に除去し、残りの細胞を５００μｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡ内で再懸濁した。
【００８８】
ＭｉｄｉＭＡＣＳセパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を磁性マルチスタンド（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に配置し、３ｍｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡですすいだ。細胞懸濁液が、ＭｉｄｉＭＡＣＳセパレーター上に配置され、細胞が通れるようにする。ＭｉｄｉＭＡＣＳセパレーターは、３ｍｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡで３回洗った。非標識細胞を有する廃液部分は捨てた。ＭｉｄｉＭＡＣＳセパレーターを磁性マルチスタンドから取り外し、Ｆａｌｃｏｎ管上に配置した。５ｍｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液をカラム上にピペットで移し、ただちに細胞をプランジャーで押し出す。
【００８９】
細胞の濃度をＢｕｒｋｅｒチャンバで測定した。単球を含有する細胞懸濁液を１４５０ｒｐｍ、４℃で１０分間、遠心分離した。上清を捨て、細胞をＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）で再懸濁した。全ての単球が分離した細胞培養物内のＣＤ１４＋単球の純度は、下記のＦＡＣＳ分析によって測定され、８０％未満であった。
【００９０】
未成熟ＤＣの生成
ＴＡＣＳＩフィルターで得られた白血球を、非ヒト血清を含まない培地のＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地内で３０００００細胞／ｍｌの濃度に再懸濁し、２４ウェルプレート（１ウェルにつき１ｍＬ）に固定した（ｐｌａｔｅ）。軟膜からの単球が豊富な白血球および末梢血をまず、ＣｅｌｌＧｒｏ培地において５ｘ１０５単球／ｍＬの濃度に再懸濁した。４００μｌのＣｅｌｌＧｒｏ培地（細胞なし）をまず、２４ウェルプレート内の１２ウェル（Ａｌ−６、Ｂｌ−３、Ｃｌ−３）に加えた。ドナーＡからの６００μｌの単球が豊富な細胞懸濁液（軟膜または末梢血のそれぞれ）をウェルＡｌ−３に移した。ドナーＢからの６００μｌの単球が豊富な細胞懸濁液をウェルＣｌ−３（軟膜または末梢血）に移した。ドナーＣからの６００μｌの単球が豊富な細胞懸濁液をウェルＢｌ−３（軟膜または末梢血）に移した。ウェルＡ４−６において、２００μｌの単球が豊富な細胞懸濁液を全ての３人のドナーから移した（軟膜または末梢血）。全てのウェル内の最終細胞数は３０００００細胞であった（１ウェルにつき１ｍｌのＣｅｌｌＧｒｏ培地の容積につき）。
【００９１】
単球を未成熟ＤＣに分化するために、培養培地に１０００Ｕ／ｍＬ組換え型のヒトＩＬ−４および１０００Ｕ／ｍＬ組換え型のヒトＧＭ−ＣＳＦ（全てドイツ、フライブルグのＣｅｌｌＧｅｎｉｘ製）を添加し、その後、細胞を５日間培養した。
【００９２】
未成熟ＤＣの活性化／成熟
ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを添加したＣｅｌｌＧｒｏ培地で５日間培養した後、未成熟ＤＣの活性化／成熟は、２０μｇ／ｍＬのｐｏｌｙＩ：Ｃ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸またはポリイノシン酸−ポリシチジル酸ナトリウムとしても知られるＴＬＲ−３受容体に特有の免疫賦活薬、２．５μｇ／ｍＬのＲ８４８（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、レジキモドとしても知られるｔｏｌｌ様受容体７／８リガンド、および１０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）を加えることによって誘導した。１８時間の培養後、細胞を３回洗い、さらに２４時間、新鮮なＡＩＭ−Ｖ培地で培養した（外因性活性化因子を添加しないで）。培養物の培養上清は、当業者が周知のプロトコルに従って回収した。
【００９３】
炎症誘発性ケモカインおよび炎症誘発性サイトカインの濃度を分析するために、ＥＬＩＳＡ分析を下記のとおり上清に関して行った。
【００９４】
ＥＬＩＳＡによる炎症誘発性ケモカインおよび炎症誘発性サイトカインの濃度の評価
炎症誘発性ケモカインＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳおよびＣＸＣＬ９／ＭＩＧならびに炎症誘発性サイトカインＩＬ−１２ｐ７０およびＴＮＦ−αを、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）で、米国ミネアポリスのＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓのＤｕｏ  Ｓｅｔ  ＥＬＩＳＡ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、その製造者説明書にしたがって測定した。
【００９５】
フローサイトメトリーによる表現型試験
単球および単球由来ＤＣを上述のとおり生成した。単球分離の後、ＣＤ１４＋単球の発生頻度を、細胞をＦＩＴＣ−抗ヒトＣＤ１４で染色することによって評価した。ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを添加したＣｅｌｌＧｒｏ内で５日間培養した後、未成熟ＤＣを洗い、その後、ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ８３と組み合わせたＰＥ抗ヒトＣＤ８６で染色した。その後、活性化因子を用いて１８時間活性化した未成熟ＤＣをまた、ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ８３と組み合わせたＰＥ抗ヒトＣＤ８６で染色した。ＦＩＴＣおよびＰＥで染色したマウスＩｇＧ１およびＩｇＧ２をアイソタイプ対照群として用いた（全て米国カリフォルニアのＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）。その試料をＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  （ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  ＵＳＡ）を用いて、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で分析した。
【００９６】
結果
以下に実験部分の結果をコメントする。
【００９７】
非ヒト血清を含まずＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を添加した水性細胞培養培地内で共培養する際に、単球が豊富な同種異系白血球の共培養由来のＤＣは、表現型的に活性化／成熟していない。
【００９８】
非ヒト血清を含まずＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を添加した細胞培養培地で４〜７日間、単一血液ドナーからの単球を増殖させることは、成熟マーカーＣＤ８３の低い発現および同時刺激分子ＣＤ８６の低い発現を含む、典型的な「未成熟」表現型を有する非消耗ＤＣを生じさせる。図１ａおよびｂに見られるように、３つの異なる「単一」ＤＣのＣＤ８３とＣＤ８６の両方の平均の発現は、３人の全てのドナーの混合物から得られたＤＣのＣＤ８３（図１ａ）およびＣＤ８６（図１ｂ）の発現と比較して類似していた。図１ｃおよび１ｄで見られるように、非ヒト血清を含まずＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を添加した水性細胞培養培地中で４日間増殖させ、その後１８時間刺激因子で持続的に活性化した後、「単一」のＤＣ（分析された３人の異なる末梢血ドナーのＤＣ）の活性化／成熟マーカーＣＤ８３およびＣＤ８６の強く高められた平均発現は、３人の全てのドナーの同種異系単球が豊富な白血球の混合物由来の活性化されたＤＣ上のＣＤ８３（図１ｃ）およびＣＤ８６（図１ｄ）の発現と比較して類似していた。
【００９９】
まとめると、これらの実験結果は、混合同種異系単球集団が、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４での５日間の培養の後、未成熟であり、よって単球から未成熟ＤＣに分化する間、活性化／成熟シグナルを経験しなかったことを示している。さらに、混合同種異系単球集団からの未成熟ＤＣは、活性化因子で刺激されるときに表現型成熟に強く反応するので、少なくとも表現型の上では非消耗である。
【０１００】
フローサイトメトリーによって得られたデータ。それぞれのＹ軸は、１８時間の活性化因子による持続的な刺激の前と後のＣＤ８３およびＣＤ８６の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示している。Ｘ軸は異なる測定された組み合わせを示している。
【０１０１】
混合同種異系末梢血単球の共培養から得られた未成熟ＤＣは機能上消耗していない。
【０１０２】
ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を添加した培養培地で４〜７日間、単球（１人の単一血液ドナーの）を増殖させることは、特定の活性化因子による刺激時に、炎症誘発性ケモカイン（ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β，ＲＡＮＴＥＳ、およびＭＩＧ）ならびに炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ−１２ｐ７０およびＴＮＦ−α）の活発な生成に反応する非消耗ＤＣを生じさせることがわかっている。
【０１０３】
図２に見られるように、１８時間の持続的な刺激因子による活性化の間に「単一」ＤＣ（分析された３人の異なる末梢血ドナーのＤＣ）によって生成されたＭＩＰ−１α（図２ａ）、ＭＩＰ−１β（図２ｂ）、ＲＡＮＴＥＳ（図２ｃ）、ＭＩＧ（図２ｄ）の高い平均濃度が、３人の全てのドナーからの単球の混合物から得られたＤＣと比較して類似していた。特に、異なる単一ドナーＤＣ間で、活性化が誘導されたケモカイン生成においてかなりの差異がある。図４に見られるように、活性化された「単一」ＤＣによって生成されたＩＬ−１２ｐ７０（図３ａ）およびＴＮＦ−α（図３ｂ）の高い平均濃度が、３人の全てのドナーからの単球の混合物から得られたＤＣと比較して類似していた。特に異なる単一ドナーＤＣ間で、ＩＬ−１２ｐ７０およびＴＮＦ−αの生成においてかなりの差異がある。
【０１０４】
データはＥＬＩＳＡ分析から得た。示された結果は、３人の個人からの平均値±ＳＤであり、３人の全てのドナーの混合物から得られた値である。それぞれのＹ軸は、１８時間の持続的な刺激／活性化の間、ｐｇ／ｍＬ／１ｘ１０６細胞で生成されたそれぞれの物質の量を示している。Ｘ軸は測定された異なる組み合わせを示している。
【０１０５】
プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）は、未成熟ＤＣの活性化が誘導される消耗に中心的役割を果たすことが示唆された（Ｒｉｅｓｅｒ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｄｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ：Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ−α  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２．Ｂｌｏｏｄ  ９１（１９９８）３１１２−３１１７）。したがって、我々は、同種異系単球の共培養の間のＣｏｘ−２阻害剤ＮＳ−３９８の添加（ＰＧＥ２の生成の可能性を妨げることを目的とした）は、その後の活性化の際の、炎症誘発性ケモカインの生成（ＭＩＧ生成と表される）または炎症誘発性サイトカインの生成（ＩＬ−１２ｐ７０生成と表される）を高めるかどうかを調査した。図４に見られるように、単球をＤＣに増殖させる間のＣｏｘ−２阻害剤ＮＳ−３９８の存在は、ＭＩＧおよびＩＬ−１２ｐ７０の活性化が誘導された生成を増加させるよりもむしろ減少させた。したがって、混合異種同系単球の共培養からの分化された未成熟ＤＣのＰＧＥ２媒介の消耗の徴候はない。
【０１０６】
データはＥＬＩＳＡ分析から得た。示された結果は、３人の全てのドナーの混合物からの１つの実験のものである。それぞれのＹ軸は、１８時間の持続的な刺激／活性化の間、ｐｇ／ｍＬ／１ｘ１０６細胞で生成されたそれぞれの物質の量を示している。Ｘ軸は測定された異なる組み合わせを示している。
【０１０７】
混合同種異系単球が豊富な軟膜白血球の共培養から得られた未成熟ＤＣは、機能上消耗していない。
【０１０８】
図５に見られるように、１８時間の刺激因子による持続的な活性化の間、「単一」ＤＣ（分析された３つの異なる軟膜ドナーからのＤＣ）によって生成された、活性化が誘導された炎症誘発性ケモカインＭＩＰ−１α（図５ａ）、ＭＩＰ−１β（図５ｂ）、ＲＡＮＴＥＳ（図５ｃ）、ＭＩＧ（図５ｄ）の高い平均濃度は、３人の全てのドナーからの単球の混合物から得られたＤＣと比較して類似していた。特に、異なる単一ドナーＤＣ間でケモカインの生成においてかなりの差異がある。
【０１０９】
図６に見られるように、「単一」ＤＣによって生成されるＩＬ−１２ｐ７０（図６ａ）およびＴＮＦ−α（図６ｂ）の平均濃度は、３人の全てのドナーの単球が豊富な白血球の混合物から得られたＤＣと比較して類似していた。特に、異なる単一ドナーＤＣ間でＩＬ−１２ｐ７０およびＴＮＦ−αの生成においてかなりの差異がある。
【０１１０】
データはＥＬＩＳＡ分析から得た。示された結果は、３人の個人からの平均値±ＳＤであり、３人の全てのドナーの混合物から得られた値である。それぞれのＹ軸は、１８時間の持続的な刺激／活性化の間、ｐｇ／ｍＬ／１ｘ１０６細胞で生成されたそれぞれの物質の量を示している。Ｘ軸は測定された異なる組み合わせを示している。
【０１１１】
混合同種異系末梢血単球の共培養から得られたＰＩ−ＤＣは、炎症誘発性ケモカインおよびサイトカインの持続的な生成を示す。
【０１１２】
活性化された炎症誘発性ＤＣ（ＰＩ−ＤＣ）を患者に注入するために、ＰＩ−ＤＣは通常、投与前に、洗浄しなければならない。洗浄しない場合、刺激剤の同時投与（生体外でＰＩ−ＤＣを誘導することを目的とする）によって誘発される望ましくない副作用が起こる可能性がある。したがって、未成熟ＤＣは、活性化誘導因子の停止の後もまた、望ましい因子の持続的な生成によってＰＩ−ＤＣに活性化されなければならない。図７に見られるように、活性化因子を除去した後の「単一」ＰＩ−ＤＣ（分析される３人の異なるドナーからの末梢血単球からのＰＩ−ＤＣ）によって生成されたＭＩＰ−１α（図７ａ）、ＭＩＰ−１β（図７ｂ）、ＲＡＮＴＥＳ（図７ｃ）、ＭＩＧ（図７ｄ）の平均濃度は、３人の全ての末梢血ドナーからの単球の混合物から得られたＰＩ−ＤＣと比較して類似していた。特に、活性化因子を除去した後、異なる単一ドナーＰＩ−ＤＣ間でケモカインの生成においてかなりの差異がある。活性化因子を除去した後の「単一」ＰＩ−ＤＣによって生成されたＩＬ−１２ｐ７０（図８ａ）およびＴＮＦ−α（図８ｂ）の平均生成はまた、３人の全てのドナーからの単球の混合物から得られた洗浄されたＰＩ−ＤＣと比較して類似していた。特に、活性化因子を除去した後、異なる単一ドナーＰＩ−ＤＣ間で、サイトカインの生成においてかなりの差異がある。
【０１１３】
データはＥＬＩＳＡ分析から得た。示された結果は、３人の個人からの平均値±ＳＤであり、３人の全てのドナーの混合物から得られた値である。それぞれのＹ軸は、活性化因子を除去した後の２４時間の間に、ｐｇ／ｍＬ／１ｘ１０６細胞で生成されたそれぞれの物質の量を示している。Ｘ軸は測定された異なる組み合わせを示している。
【０１１４】
混合同種異系単球が豊富な末梢軟膜白血球の共培養から得られたＰＩ−ＤＣは、炎症誘発性ケモカインおよびサイトカインの持続的な強い生成を示す。
【０１１５】
図９に見られるように、活性化因子を除去した後の「単一」ＰＩ−ＤＣ（分析される３人の異なるドナーからの軟膜単球からのＰＩ−ＤＣ）によって生成されたＭＩＰ−１α（図９ａ）、ＭＩＰ−１β（図９ｂ）、ＲＡＮＴＥＳ（図９ｃ）、ＭＩＧ（図９ｄ）の平均濃度は、３人の全ての軟膜ドナーからの単球の混合物から得られたＰＩ−ＤＣと比較して類似していた。特に、異なる単一ドナーＰＩ−ＤＣ間でケモカインの生成においてかなりの差異がある。活性化因子を除去した後の「単一」ＰＩ−ＤＣによって生成されたＩＬ−１２ｐ７０（図１０ａ）およびＴＮＦ−α（図１０ｂ）の平均生成はまた、３人の全ての軟膜ドナーからの単球の混合物から得られた洗浄されたＰＩ−ＤＣと比較して類似していた。特に、異なる単一ドナーＰＩ−ＤＣ間で、サイトカインの生成においてかなりの差異がある。
【０１１６】
データはＥＬＩＳＡ分析から得た。示された結果は、３人の個人からの平均値±ＳＤであり、３人の全てのドナーの混合物から得られた値である。それぞれのＹ軸は、活性化因子を除去した後の２４時間の間に、ｐｇ／ｍＬ／１ｘ１０６細胞で生成されたそれぞれの物質の量を示している。Ｘ軸は測定された異なる組み合わせを示している。
【０１１７】
単球が豊富なフィルター白血球から得られた混合未成熟ＤＣは、活性化時に相当量の炎症誘発性ケモカインおよびサイトカインを生成する。
【０１１８】
図１１に見られるように、単球が豊富なフィルター白血球から得られた活性化された混合ＤＣ（最初の白血球集団は４−軟膜白血球除去フィルターから溶出された）は、相当量のＭＩＰ−１α（図１１ａ）、ＭＩＰ−１β（図１１ｂ）、ＲＡＮＴＥＳ（図１１ｃ）、ＭＩＧ（図１１ｄ）を生成した。図１２に見られるように、相当量のＩＬ−１２ｐ７０（図１２ａ）およびＴＮＦ−α（図１２ｂ）も生成された。
【０１１９】
データはＥＬＩＳＡ分析から得た。示された結果は、１つの実験からの値である。それぞれのＹ軸は、１８時間の持続的な刺激／活性化の間にｐｇ／ｍＬ／１ｘ１０６細胞で生成されたそれぞれの物質の量を示している。
【０１２０】
単球が豊富なフィルター白血球から得られた混合ＰＩ−ＤＣは、活性化因子を除去した後、相当量の炎症誘発性ケモカインおよびサイトカインの生成を示す。
【０１２１】
図１３に見られるように、フィルター単球から得られた活性化された混合ＤＣ（最初の白血球集団は４−軟膜白血球除去フィルターから溶出された）は、活性化因子を除去した後、相当量のＭＩＰ−１α（図１３ａ）、ＭＩＰ−１β（図１３ｂ）、ＲＡＮＴＥＳ（図１３ｃ）、ＭＩＧ  （図１３ｄ）を生成した。図１４に見られるように、相当量のＩＬ−１２ｐ７０（図１４ａ）およびＴＮＦ−α（図１４ｂ）も生成された。データはＥＬＩＳＡ分析から得た。示された結果は、１つの実験からの値である。それぞれのＹ軸は、活性化因子を除去した後の２４時間の間に、ｐｇ／ｍＬ／１ｘ１０６細胞で生成されたそれぞれの物質の量を示している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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