(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つ以上の試料のプール内に含まれる２つ以上の化学化合物を一斉同定および定量する方法であって、
試料は、プールする前に、化学化合物の包括的濃度がプールされた当該試料内で等しくなるように試料の均等化にかけ、試料のプールを分析測定にかけて、化学化合物の組成を表す信号、および各試料中に含まれる化学化合物の存在量を表す信号強度データを得、
前記信号強度はｍ列ｎ行の行列ａｉｊとして編成され、
ここで、ｎは２以上であり、かつプール内の化学化合物数に相当し、ｍは２以上であり、かつプール内の試料数に相当し、ａｉｊは、試料ｊ中に存在する化合物ｉに関して測定された信号強度に相当し、ａは特定の化学化合物に関して測定された信号強度を示し、ｉは１からｎであってプール内の特定の化学化合物を示し、かつｊは１からｍであってプール内の特定の試料を示し、
【数１】
0006518269.tif 000035
前記行列Ａの列は、プール内の特定の化学化合物を示し、前記行列Ａの行は、各行の平均が１／ｍとなるような第一のスケーリング制約
【数２】
0006518269.tif 000036
および前記行列Ａの列の平均が１／ｍとなるような第二の正規化制約
【数３】
0006518269.tif 000037
を受け、前記行列Ａに関する制約付き最適化問題：ｇ（ｘ）＝０の条件を満たすｍｉｎｘｆ（ｘ）を解き、試料中に含まれる各化学化合物の存在量を、プール内の対応する試料の相対含有量に基づいて決定する、方法。
【請求項２】
前記行列Ａ中の欠測値またはゼロ値は、下記のように、欠測値またはゼロ値を欠測またはゼロを含まない値の平均に一般化することによって計算される、請求項１に記載の方法。
【数４】
0006518269.tif 000038
および
【数５】
0006518269.tif 000039
【請求項３】
前記信号強度は、ポリマー化合物の１つまたは複数の断片の信号強度に相当する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
１つまたは複数の化学化合物は、１つまたは複数の生体分子および１つまたは複数の生体分子の１つまたは複数の断片もしくは代謝産物もしくは前駆体の群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
生体分子は、遺伝子、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物、ならびに前述の生体分子の前駆体、代謝産物、および断片、ならびに前述の生体分子２つ以上の混合物の群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
代謝産物は、生体試料、特に生命体から生じる代謝中間体、ホルモン、もしくは他のシグナル伝達分子、または二次代謝産物の群から選択される、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
代謝産物は、内因性、外因性、もしくは生体異物代謝産物、またはそれら２つ以上の混合物である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
内因性代謝産物は、アミノ酸、有機酸、核酸、脂肪酸、アミン、糖類、ビタミン、補因子、色素、抗生物質の群から選択される１つまたは複数の化合物を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
外因性代謝産物は、生来生命体が産生しない薬物、環境汚染物質、食品添加物、毒素、および他の生体異物の群から選択される１つまたは複数の化合物を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
生体分子は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、および他のノンコーディングＲＮＡの群から選択される、請求項４または５に記載の方法。
【請求項１１】
試料は、器官、組織、もしくは生体液、またはそれらの一部である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
生体液は、尿または血漿から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
１つまたは複数の化学化合物は、分析測定を行う前に標識化される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
生体分子は、タンパク質であり、かつタンパク質の１つまたは複数のペプチドは、前駆体標識化または同重体標識化されている、請求項４、５または１０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
請求項１の前文によると、本発明は、２つ以上の試料のプールの分析測定から、試料中に含まれる１つまたは複数の化学化合物を一斉同定および定量する方法であって、試料は、プールする前に、化学化合物の包括的濃度がプールされた当該試料内で等しくなるように試料の均等化にかけ、試料のプールを分析測定にかけて、化学化合物の組成を表す信号、および各試料中に含まれる化学化合物の存在量を表す信号強度データを得る、方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、とりわけオミクス、すなわちプールまたは２つ以上の生体試料の混合物中に存在する個々の生体分子の一斉特性評価および定量の分野に関する。オミクスは、とりわけメタボロミクス、リピドミクス、ゲノミクス、およびプロテオミクスを含む。そのようなオミクスの結果は、生体試料の構造、機能、および動態を反映する。
【０００３】
例えば、プール内に存在する生体分子の同定および定量を目的として、種々の分析技術が存在し、ＮＭＲ分光法、質量分析法、マイクロアレイ、および次世代シーケンシングが最も頻繁に用いられている。化合物の分離、同定、および定量を容易にするため、質量分析法を、例えば液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、またはキャピラリー電気泳動（ＣＥ）と合わせることができる。それぞれの方法は概して、多く異なる生体分子または生体分子の特徴を同定できる。
【０００４】
とりわけメタボロミクス、プロテオミクス、リピドミクス、ゲノミクスで生成したデータは、通常、デジタル化されたスペクトルであっても、または生体分子のレベルのリストであってもよい。最も単純な形式において、行が対象（同定される生体分子）に対応し、列が生体分子のレベルに対応する、行列が生成される。これらのデータを解析するために、例えば主成分分析および最小二乗回帰などの統計プログラムを利用できる。ひとたび分子組成が決定されると、パターンおよび関連性を明らかにするためにデータ整理技術を使用できる。
【０００５】
前述の分析技術、とりわけ質量分析法およびＮＭＲにおいて、数個の試料をプールし、１回の実験で測定できること、および異なる試料の生体化合物の一斉同定および／または定量を実施できることは、プールの全ての試料、言い換えると全ての測定が、同等に機器によるばらつきの影響を受けるため、直接的な統計学的評価に利益をもたらす。
【０００６】
ここで、例えば生体分子の相対定量を想定すると、試料の多重化、すなわち複数の生体試料をプールすることが標識化により可能となり、ひいては複数の生体試料の生体分子を一斉に定量できるため、分析測定前の分子の標識化が普及した。このため、前駆体標識化と同重体標識化にさらに分類可能な、各種の標識化法が開発されている。前駆体標識化の例として、代謝的標識化戦略、酵素的標識化戦略、および化学的標識化戦略が挙げられる（Ｌｉら、２０１２）。アミノ酸による安定同位体標識化（ＳＩＬＡＣ：Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｂｙ  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）といった代謝的標識化戦略が有望であるが、現時点ではまだ培養細胞または小動物に限られている。代替として、同位体コードされたアフィニティタグ（Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈら参照、ＩＣＡＴ：ｉｓｏｔｏｐｅ  ｃｏｄｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔａｇ）といった、Ｏ１６／Ｏ１８酵素交換および化学同位体標識化アプローチが開発されている。例えば、同重体標識化戦略は、化学的標識化の下位分類に属し、異なる標識がインタクトな状態で等しい質量を有する（よって「同重体」と称される）ため特殊である。同重体標識化は、これらのタグが１回のＬＣ−ＭＳで最大で１０個までの試料の多重化を可能とし、測定時間を減らし、かつ実験内直接比較を可能とするため、とりわけプロテオミクス研究において普及している。タンデム質量タグ（ＴＭＴ：Ｔａｎｄｅｍ  Ｍａｓｓ  Ｔａｇ）（６重または１０重）、ならびに相対および絶対定量用同重体タグ（ｉＴＲＡＱ：ｉｓｏｂａｒｉｃ  Ｔａｇ  ｆｏｒ  Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（４重または８重）の２つは市販されているキットである。ＴＭＴおよびｉＴＲＡＱ同重体タグは、何れもバランサー基によって隔たれるレポーター基およびアミノ反応基を含有し、全てのタグに同重体質量シフトをもたらす（Ｒｏｓｓ、２００４；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ２００３）。ほぼ全ての消化されたペプチドが少なくとも１回標識されるように、タグの反応基は、Ｎ末端およびリシンの遊離アミノ基を標的とする。標識され、プールされたペプチドの相対定量は、ペプチド前駆体のフラグメンテーションに際し固有のレポーターイオンが生成することによって達成される。この逆多重化によって、タンデム質量スペクトルにおけるこれらのレポーターイオンの信号強度を、多重化された試料中のペプチドの相対的発現差異を決定するために使用できる（Ｄａｙｏｎ  ２００８、Ｚｈａｎｇ  ２０１０、Ｐｉｃｈｌｅｒ  ２０１１、ＤｅｐｈｏｕｒｅおよびＧｙｇｉ  ２０１２）。この多重化は、ＬＣ−ＭＳ測定時間を大幅に減らすだけでなく、定量結果のばらつきも実質的に低減する（Ｇｙｇｉ）。
【０００７】
しかし、この標識化プロトコールは付加的な試料操作を伴い、そのため、この同重体標識化戦略、および標識化一般は、ウェット・ラボ段階での系統的影響が生じやすくなる。最も一般的な操作における誤差は、例えば、試料をプールする際に発生するピペッティングによる誤差（ＯｂｅｒｇおよびＭａｈｏｎｅｙ、２００２）、または消化前のタンパク質濃度の決定における誤差である。この種の誤りは、データの正規化によって修正できる。
【０００８】
このような系統誤差を補正するため、マイクロアレイ、ＬＣ−ＭＳ、またはＮＭＲのデータ解析から取り入れることができる極めて多くのデータ正規化法が開発されている（Ｅｊｉｇｕら  ２０１３、ＯｂｅｒｇおよびＭａｈｏｎｅｙ  ２０１２、ｂｏｌｓｔａｄ  ２００３）。同重体標識化プロテオミクス研究において、多く場合、クオンタイル正規化（Ｋｅｓｈａｍｏｕｎｉ  ２００５；Ｊａｇｔａｐ  ２００６）のようなアルゴリズムが適用される。Ｑｕａｎｔ（Ｂｏｅｈｍ  ２００７）、ＩｓｏｂａｒｉＱ（Ａｒｔｎｚｅｎ  ２０１０）、Ｉｓｏｂａｒ（ｂｒｅｉｔｗｅｉｓｅｒ  ２０１１）を含む、同重体標識化データに適するいくつかのソフトウェア・パッケージは、包括的正規化法を使用する。ここで、定量チャネル内の測定結果の強度分布は、分布の平均または中央値が定量チャネル全域で等しくなるよう、一定量シフトする。他のソフトウェア・パッケージ、ｉ−ｔｒａｃｋｅｒは、定量的情報とペプチド同定の統合を容易に確立し、かつ４重ｉＴＲＡＱのレポーターイオン比を与えるよう開発された（Ｓｈａｄｆｏｒｄら  ２００５）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、既存の正規化方法は、試料操作および測定プロトコールによって生じる系統的影響を完全に補正できないため、不十分であることが判明した。したがって、本発明は、既存の正規化技術が実際に達成するよりも効果的な方法で、試料操作および測定プロトコールによって生じる系統的影響を除去し得る、正規化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この目的は、本発明に従い、請求項１の特徴部分に記載の技術的特徴を示す方法によって達成される。
【００１１】
加えて本発明の方法は、２つ以上の試料のプール内に含まれる２つ以上の化学化合物を一斉同定および定量する方法であって、試料は、プールする前に、化学化合物の包括的濃度がプールされた当該試料内で等しくなるように試料の均等化にかけ、試料のプールを分析測定にかけて、化学化合物の組成を表す信号、および各試料中に含まれる化学化合物の存在量を表す信号強度データを得、前記信号強度はｍ列ｎ行の行列ａｉｊとして編成され、ここで、ｎは２以上であり、かつプール内の化学化合物数に相当し、ｍは２以上であり、かつプール内の試料数に相当し、ａｉｊは、試料ｊ中に存在する化合物ｉに関して測定された信号強度に相当し、ａは特定の化学化合物に関して測定された信号強度を示し、ｉは１からｎであってプール内の特定の化学化合物を示し、かつｊは１からｍであってプール内の特定の試料を示し、
【数１】
0006518269.tif 000002
である、方法を提供する。
ここで前記行列Ａの列は、プール内の特定の化学化合物を示し、前記行列Ａの行は、
【数２】
0006518269.tif 000003
となるような第一のスケーリング制約、および前記行列Ａの列の平均が１／ｍとなる
【数３】
0006518269.tif 000004
と等しくなるような第二の正規化制約を受け、前記行列Ａに関する制約付き最適化問題：ｇ（ｘ）＝０の条件を満たすｍｉｎｘｆ（ｘ）を解き、試料中に含まれる各化学化合物の存在量を、プール内の対応する試料の相対含有量に基づいて決定する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】本発明に係る正規化前（Ａ）の６個のＴＭＴレポーターイオンの対数強度分布を示す。
【図１Ｂ】本発明に係る正規化後（Ｂ）の６個のＴＭＴレポーターイオンの対数強度分布を示す。
【図２Ａ】クオンタイル正規化（Ａ）に伴う階層クラスタリングを示す。
【図２Ｂ】本発明に係る正規化（Ｂ）に伴う階層クラスタリングを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
つまり、本発明は、試料のプール内に含まれる化合物の定量データの、より精度の高い正規化を達成可能とする、データ駆動型正規化方法を提供する。本発明は、とりわけ、データ依存的な正規化を提供し、プール内に含まれる化合物の定量に使用される分析技術に適切な測定プロトコールによって生じる系統誤差を、当分野で知られている現在の正規化技術によって達成され得るよりも効果的に補正または除去することを可能とする。その結果、データ内に存在する生物学的情報が不明瞭となる危険性を最小限に抑えることができる。
【００１４】
つまり、本発明の方法は、測定結果中に存在する全ての信号の平均が１／ｍ（ここで、ｍは、プール内の異なる試料の数である）となるよう、試料のプールの分析測定結果中の各信号の強度を正規化する。
【００１５】
これらの制約は、制限された自由度を与えることによって、実測強度を均整に制御しつつ、実測強度を等量に変更することを目的とする。
【００１６】
本発明の方法において、
−  化学化合物の大部分は、試料間で変化せず、正規化のための参照セットとして使用され得ること
−  または上方もしくは下方調節された信号または化合物の分布は、おおよそ対称であること
−  系統誤差が生じると、全ての化合物の強度分布に影響が及ぶよう、当該系統誤差はプールされた試料中の全ての測定強度に影響を与えること
−  特定の信号が優先して生成することがない、すなわち全ての化合物は同様に良好なフラグメンテーション特性を有すること
も仮定される。これにより、特定の化合物の信号強度の合計が、ある信号が全ての試料で観測される場合と等しくなるよう、全ての信号強度の縮尺を変更することが可能となる。言い換えると、今や化学化合物は、プールされた試料中の当該化学化合物の存在量を反映する百分率分布によって定量される。
【００１７】
これらの仮定は、信号強度分布のシフトは生物学的作用によって生じるものではなく、系統的バイアスによって生じるという効果を有する。それと共に本発明は、数個の試料の混合物について、精度の高い正規化をデータ依存的に行うことを可能とする。その結果、定量された成分は割合として、例えば試料中に存在する６個の化合物の６重プールの１／６、または試料中に存在する１０個の化合物の１０重プールの１／１０として表される。
【００１８】
したがって、本発明は、前述した実験条件によって課せられる一連の等式制約を受けつつ、Ｘにおける元データから最小限逸脱する、「新しい」行列Ｙを提供する。
【数４】
0006518269.tif 000005
【００１９】
つまり、本発明では、欠測している観測を含み得るデータを操作し、かつ正確な形態に書き換えて、質の高い数学的対称性を反映するために、上記の数２および数３を一般化して、
【数５】
0006518269.tif 000006
【数６】
0006518269.tif 000007
と、前述の制約の最終的な形態を提供できる。
【００２０】
この表現の有用な利点は、２つ以上の試料の混合物またはプール内の対応する試料の相対的寄与によって試料中に含まれる各化合物が定量されるため、化合物に関する下流の統計解析を条件付きで行う必要がないことである。したがって、さらなるデータ処理を必要とすることなく、１つの試料中の化合物の存在量を互いの間で比較し、かつ１つの試料内の化合物強度にまとめることができる。この表現を用いないと、試料の定量を可能とするために条件付き統計解析が必要となるであろう。すなわち、先行技術において、個々の成分の定量は、実際の試料と対照との間の成分比のレベルで行われる。先行技術において行われるような外部標準の使用は、実験計画の柔軟性に重大な制限を課すが、今や本発明によって回避され得る。
【００２１】
個々の成分は、公知の正規化方法で行われるように各測定に関して正規化されるだけでなく、むしろ実験全体を通して正規化され、数個の試料からなる１または数個の後に続くプールの後に続くいくつかの測定が関与し得る。したがって、本発明は、別々の操作にわたって異なる試料の比較を可能とし、本発明の方法と従来の正規化アプローチとを差別化する。言い換えると、本発明の方法は、系統誤差を補正しつつ、実験条件との関係を維持できるという利点を示す。その結果、本発明の方法は、相次いで実施されたか、または異なる時点で実施された異なる分析測定を比較するために使用され得る。したがって、本発明の実験内正規化は、いくつかの分析単位の実験間比較を可能とする。
【００２２】
上記では、第一と第三の化合物および第二と第四の化合物は、同一であっても、または異なっていてもよく、かつ第一と第三の信号および第二と第四の信号は、同一であっても、または異なっていてもよい。さらに、上記ではｍは２以上であり、かつプール内の化学化合物数に相当し、かつ／または行列に使用される信号の数に相当する。
【００２３】
当分野で公知のクオンタイル正規化において、各実験は個々に正規化される。この公知の個々の正規化は、実験条件ではなく分析測定のクラスタリングをもたらす。一方、本発明は、同一でも、または異なっていてもよい数種の化学化合物を各試料が含み得る、数個の試料のプールを取り扱うことができ、かつ、全ての分析データを分析単位の共通部分により１つの正規化手順で比較できる。この共通部分は、実験群に基づくデータ・クラスタリングをもたらす。その結果、正規化信号強度について、さらなる統計解析を直接行うことができ、実験群の厳密な比較を容易にする。
【００２４】
要するに、本発明の正規化手順は、２つ以上の試料について一回の分析測定内で正規化を行うことを可能とするだけでなく、複数の分析操作の相互比較を行うことも可能とする。それと共に本発明は、分析測定の定量データから系統的影響を除去することを可能とする方法を提供する。
【００２５】
本発明は、分析測定で欠測しているデータの計算も可能とする。欠測値またはゼロ値の場合、制約は単に欠測またはゼロを含まない値の平均に一般化する。第ｉ行の欠測値ｋｉ、および第ｊ列の欠測値ｋｊの場合、制約は、
【数７】
0006518269.tif 000008
および
【数８】
0006518269.tif 000009
と変換できる。
【００２６】
前述の制約付き最適化問題を解くために、当業者はいくつかの方法を利用できる。制約内の対称性によって、計量経済学分野由来の簡単な方法が使用可能となる。
【００２７】
当業者に周知の適切な方法として、ＲＡＳ法（Ｓｔｏｎｅら、１９４２；Ｂａｃｈａｒａｃｈ、１９７０）、またはより一般的な反復比例あてはめ手順（ＩＰＦＰ：Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  Ｆｉｔｔｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）（ＤｅｍｉｎｇおよびＳｔｅｐｈａｎ、１９４０；Ｆｉｅｎｂｅｒｇ、１９７０）が挙げられる。本発明の方法は、当該手順の要件に適合し、一意的な解に収束する。
【００２８】
コンピュータ・サイエンスにおいてレーキングとしても公知のＲＡＳ手順は、元のデータ行列を変換するために用いられる、スケーリング・パラメーターおよび正規化パラメーターを表す２つの対角行列
【数９】
0006518269.tif 000010
および
【数１０】
0006518269.tif 000011
を推定する。対角行列
【数１１】
0006518269.tif 000012
は、同定される各ペプチドｉのスケーリング・パラメーターを含むｎ行ｎ列行列であり、対角行列
【数１２】
0006518269.tif 000013
は、各定量チャネルｊの正規化パラメーターを含むｍ行ｍ列の行列である。したがって、自由度ｍ＋ｎは、任意の取り決めで、提示された制約に適合するよう、元のデータを最適に変換する。行列記法において、
【数１３】
0006518269.tif 000014
である。当該手順は、収束が得られるまで２．スケーリング工程と３．正規化工程の間を反復する。
【００２９】
％  正規化開始
１．初期化手順
【数１４】
0006518269.tif 000015
【００３０】
％  ｔ＝０でループ開始、ｔ＝０、１、２、・・・、Ｔ、ここでｔ＝Ｔは収束に達した最後の反復である。
２．スケーリング工程
スケーリング・パラメーターを演算：
【数１５】
0006518269.tif 000016
データをスケーリング：
【数１６】
0006518269.tif 000017
【００３１】
３．正規化工程
正規化パラメーターを演算：
【数１７】
0006518269.tif 000018
データを正規化：
【数１８】
0006518269.tif 000019
【００３２】
４．もし
【数１９】
0006518269.tif 000020
（εは小さな誤差）である場合、ｔ＝Ｔとしてループを停止し、そうでない場合はｔ＝ｔ＋１とする。
【００３３】
％  ループ終了
５．最終結果を代入：
【数２０】
0006518269.tif 000021
【００３４】
ＲＡＳ手順は制約付き標準化データを戻すが、スケール行列および正規化行列の対角線は、
【数２１】
0006518269.tif 000022
のように容易に計算できる。最新の行和が事前に指定された行周辺度数からどれだけ逸脱するか、および列和が列周辺度数からどれだけ逸脱するかにより、ＲＡＳアルゴリズムの段階的な進行は測定される。この目的のため、Ｌ１誤差関数：
【数２２】
0006518269.tif 000023
が導入される。奇数工程ｔに関し、行はその事前に指定された周辺度数と一致し、行誤差和は消滅する。偶数工程ｔに関し、そのとき列がその周辺度数に達するため、行誤差和はゼロである。
【００３５】
アルゴリズムを実行する際、次の停止基準：ｅｒｒ（ｔ）＜Δａｂｓ（ここでΔａｂｓは、桁が通常１Ｅ−４の、ユーザー定義の閾値である）を使用する。データセットから、アルゴリズムは２０回の反復の後に収束に達する。この反復回数は、データの量、データ内の誤差、およびユーザーが指定した閾値Δａｂｓに基づき変動し得る。
【００３６】
本発明の方法は、信号強度が試料中の化学化合物の存在量を表わす、例えば赤外分光法、ＮＭＲ分光法、および質量分析法、ならびにＳＩＭＳ、ＥＳＲおよび他の任意の公知の分析技術などの、各種の分析技術での使用に適する。本発明は、質量分析法を用いる、試料プール内の化学化合物の定量に使用され、好ましくは、プールされた試料中に含まれる化合物を分離可能な、例えば液体クロマトグラフ（ＬＣ）、ガスクロマトグラフ（ＧＣ）、またはキャピラリー電気泳動（ＣＥ）などの技術が質量分析法に先行する。
【００３７】
１つまたは複数の生体分子化合物がポリマー化合物の１つまたは複数の断片に対応することは、本発明の好ましい実施形態の範囲内である。ポリマー化合物は、最も一般的な考え方では、すなわち２つ以上の構成単位を含む任意の分子であると理解すべきである。例として、有機および無機化合物、例えば、エステル、エーテル、ポリエステル、エーテル、ポリエーテル、脂肪酸、モノ、ジ、もしくはトリグリセリド、ポリアルキレン、ポリオキシアルキレン、ケイ酸塩、シロキサン、ポリシロキサン、鉱物、アルミナケイ酸塩、ケイ酸マグネシウム、アルミン酸マグネシウム、有機もしくは無機炭酸塩、クレームミネラル、ゼオライト、または前述した化合物の２つ以上の混合物が挙げられる。本発明は、化学化合物またはその断片の定量を目的として分析測定に供され得る任意の化学化合物への使用に適すると理解すべきである。
【００３８】
１つまたは複数の化学化合物が、１つまたは複数の生体分子および１つまたは複数の生体分子の１つまたは複数の断片もしくは代謝産物もしくは前駆体の群から選択されることは、本発明の特に好ましい実施形態の範囲内である。
【００３９】
本発明は、とりわけオミクス、すなわち２つ以上の生体試料のプールまたは混合物中に存在する個々の生体分子の一斉特性評価および定量への使用に適する。そのようなオミクスの結果は、生体試料の構造、機能、および動態を反映する。本発明は、とりわけタンパク質およびペプチドの大規模研究であるプロテオミクス、脂質の大規模研究であるリピドミクス、すなわち脂質の経路およびネットワークの研究、遺伝子および遺伝子転写物の大規模研究であるゲノミクスへ、ならびに代謝産物の大規模研究であるメタボロミクス、すなわち細胞過程の化学的フィンガープリントの研究への使用に適する。メタボロームは、細胞過程によって生じ、その生理に関する情報、具体的には前述の化合物の化学構造を提供する、生体細胞、組織、器官、または生命体内の代謝産物の一群を表す。
【００４０】
本発明の方法において、生体分子は、メタボローム、すなわち、例えば、生体試料、特には生命体から生じる代謝中間体、ホルモン、もしくは他のシグナル伝達分子、または二次代謝産物などの低分子代謝産物であってもよい。
【００４１】
本発明の方法によると、２つ以上の異なる生命体の２つ以上のメタボロームをプールし、１回の測定または実験で分析できる。メタボロームは、例えばアミノ酸、有機酸、核酸、脂肪酸、アミン、糖類、ビタミン、補因子、色素、抗生物質であり、ここで外因性代謝産物として、生来生命体が産生しない薬物、環境汚染物質、食品添加物、毒素、および他の生体異物の群から選択される１つまたは複数の化合物が挙げられる。
【００４２】
本発明での使用に適する生体分子の例として、遺伝子またはその断片、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、および他のノンコーディングＲＮＡまたはその断片；タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸；脂質、リン脂質、トリグリセリド、脂肪、脂肪酸；炭水化物、前述の生体分子の代謝産物および断片、ならびに前述の生体分子２つ以上の混合物が挙げられる。
【００４３】
生体分子は、様々な発生源から生じ得、例えば組織または生体液から生じ得る。生体分子は、内因性であっても、または外因性であってもよい。
【００４４】
本発明の範囲内において、化学化合物はそれ自体が分析されてもよく、または想定される分析測定を行う前に化学化合物は標識化されてもよい。標識化技術は当業者に周知であり、当業者は、分析する化学化合物、具体的には分析する生体分子の特性を考慮して適切な標識化技術を選択できる。標識化を利用する場合、分析測定は、より正確には結合する標識の測定に焦点を合わせるであろう。
【００４５】
本発明の方法は、とりわけタンパク質の分析に適し、タンパク質は、ＬＣ−ＭＳ分析前に前駆体標識化または同重体標識化され得る。本発明は、一連のスケーリング・パラメーターと正規化パラメーターを推定する制約付き充足問題を含意する。プロテオミクス研究で使用される同重体標識は、１回のＬＣ−ＭＳ操作で、最大１０個の試料までの多重化を可能とし、測定時間を減らし、かつ実験内直接比較を可能とする。これは、８個を超えるか、または１０個の生体試料（ｉＴＲＡＱ／ＴＭＴ）を定量実験、例えば異なるペプチドを十分な統計的検出力で検出するための定量的プロテオミクス実験で測定する場合、特に有益である。
【００４６】
正規化因子として用いることができる、標識化されたデザインの参照試料としてプールを追加することは、当分野で公知である（参考文献１６、１７）。上記で説明したように、この正規化手順は、検体特異的な操作誤差といったパラメーターを考慮しない（参考文献４）。クオンタイル正規化および循環Ｌｏｅｓｓ正規化を含む、存在量比の代わりにペプチドレベルの存在量値を取り扱う、より高度な技術は、１つの多重ＴＭＴ、例えば１つの６重ＴＰＴ実験（参考文献１８）に用いられる、良好な正規化方法を提供する。しかし、２つ以上の多重実験を比較する必要がある場合、これらの方法には欠点がある。本発明は、異なるいくつかの分析単位（例えばＬＣ−ＭＳ運転）の実験間比較を容易にする、本発明の実験内正規化によってこの制限を回避できる。
【００４７】
当分野で公知のクオンタイル正規化において、各ＴＭＴ実験は個々に正規化され、実験条件のクラスタリングでななく、ＴＭＴ実験のクラスタリングをもたらす。一方、本発明は、測定する必要のある、結果として全ての成分を異なる測定の共通部分で比較する必要のある全ての試料を１つの正規化手順にまとめることを可能とし、実験群に基づくクラスタリングをもたらす。したがって、さらなる統計解析を、特定の化合物の、例えば特定のタンパク質の正規化成分強度、例えばペプチド強度に直接行うことができる。これは、ペプチド比に対し統計解析を行わず、これらの実験群の厳密な比較を容易にすることを意味する。
【００４８】
したがって、本発明は、定量情報を得るために同重体標識を使用する、２Ｄおよび１Ｄ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験の解析を目的として現在のところ存在しない、生体試料の組成を決定する新規の方法を提供する。本発明は、多重測定方法を行うことができるが、さらに複数の同重体測定、とりわけＬＣ−ＭＳ／ＭＳ操作間の比較を行うことも可能とする方法を提供する。
【実施例】
【００４９】
本発明をさらに下記の実施例で説明する。
【００５０】
（試料調製）
それぞれ６つの生物学的に独立する試料に由来する、異なる３種類の免疫細胞を使用した。
【００５１】
３つの異なる実験条件に対応する、異なる３種類の免疫細胞に関して、１×ＨＡＬＴプロテアーゼ阻害剤および１×ＨＡＬＴホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に２００μｌのＲＩＰＡ緩衝液（１×）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、氷上で１０秒間３回の試料の超音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ＳＬＰｅ超音波ホモジナイザー、Ｌａｂｅｑｕｉｐ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）と組み合わせて細胞ペレットを溶解させた。試料を１４，０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離した後、細胞ペレットを廃棄した。次いで、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてタンパク質濃度を測定した。
【００５２】
次に、ＴＭＴ標識化キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能）に同梱される５０ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン２μｌを用いて、体積１００μｌの１００ｍＭ炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）中で各タンパク質試料１５μｇを還元し、５５℃で１時間インキュベートした。試料を３７５ｍＭのヨードアセトアミドでアルキル化し、暗所内で３０分間インキュベートした後、各試料に６倍の体積の氷冷アセトンを添加した。その後、試料を−２０℃で終夜インキュベートした。翌日、試料を６０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、次いでアセトンを除去した。次に、タンパク質ペレットを１５μｌの１００ｍＭＴＥＡＢ溶液中に再懸濁した。タンパク質の可溶化をさらに促進し、効率の良い消化を確実にするため、試料に０．１％Ｒａｐｉｇｅｓｔ  ＳＦ界面活性剤（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を添加し、次いで１００℃で５分間インキュベートした。タンパク質を消化するため、Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｇｏｌｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を酵素：タンパク質比＝１：２０で添加し、試料を３７℃で終夜インキュベートした。翌日、Ｒａｐｉｇｅｓｔを不活化し、かつ試料に２００ｍＭのＨＣｌを添加してトリプシン消化を停止させ、次いで周囲温度で３０分間インキュベートした。１４，０００ｇで５分間の遠心分離工程の後、上清を集め、さらに使用するまで−８０℃で保管した。
【００５３】
（ＴＭＴ標識化）
タグの再構成のため、製造者のプロトコールに従って、ＴＭＴ標識を４１μｌのアセトニトリル中に溶解させた。アセトニトリル中に溶解した４．１μｇのＴＭＴタグによって、全ての試料からそれぞれ１０μｇのタンパク質が標識され、全ての試料は周囲温度で１時間インキュベートされた。１μｌの５ｍＭヒドロキシルアミンの添加によって標識化反応を停止した。１５分後、タンパク質濃度比１：１：１：１：１：１で、標識化された試料を元にプールされた試料を調製した。次に、標識化された消化物を、製造者の指示に従ってＰｉｅｒｃｅ  Ｃ１８スピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて脱塩した。実験の設定の概要を表１に示す。なお、３つの実験条件（Ａ、Ｂ、およびＣと称された異なる３種類の細胞）に属する１８試料は、ＬＣ−ＭＳ分析用にプールされた試料内で各条件のバイオロジカル・レプリケートが２つ存在するよう、利用可能なＴＭＴ標識に対しブロックランダム化される。
【００５４】
表1：実験の構成の概要。６つの対象からの３つの異なる実験条件(Ａ、Ｂ、およびＣ)。各シンプレックスは各実験群でバイオロジカル・レプリケートを２回行った。
【表１】
0006518269.tif 000024
【００５５】
（逆相液体クロマトグラフィーおよび質量分析）
複雑さを低減するため、標識化試料を、Ａｃｑｕｉｔｙ超高速高分離液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）システム（Ｗａｔｅｒｓ）を用いてオフラインで分画した。ＴＭＴ標識化ペプチド混合物を、３０μｌの移動相Ａ（２％ＡＣＮ、１％ＮＨ４ＯＨ、０．２５％ＦＡ、ｐＨ＝９）で再構成した。寸法５０ｍｍ×２．１ｍｍおよび粒子径５μｍのＸＢｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ１３０  Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）に試料を負荷した。２％の移動相Ｂ（９５％ＡＣＮ、１％ＮＨ４ＯＨ、０．５％ＦＡ、ｐＨ＝９）から６０％の移動相Ｂの直線勾配にて、１０分間かけて流速１．５ｍｌ／分でペプチドを溶出した。フォトダイオードアレイを用いてλ＝２１４ｎｍにおける吸光度を測定し、画分を１分間隔で集めることにより、ペプチドの溶出をモニタリングした。結果として得られた画分を真空濃縮機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）内で乾燥させた。
【００５６】
Ａｃｃｌａｉｍ  Ｃ１８  ＰｅｐＭａｐ１００  Ｎａｎｏ−Ｔｒａｐカラム（２００μｍ×２ｃｍ）をＡｃｃｌａｉｍ  Ｃ１８分析カラム（７５μｍ×１５ｃｍ、粒子径３μｍ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｈｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）に接続して用いるＥｋｓｉｇｅｎｔのナノＵＰＬＣシステムにて、逆相クロマトグラフィーにより各画分をさらに分離した。負荷前に試料を１５μｌの移動相Ａ（２％アセトニトリル中０．１％ギ酸）に溶解し、２０ｆｍｏｌのＧｌｕ−１−フィブリノペプチドＢ（Ｇｌｕ−ｆｉｂ、Ｐｒｏｔｅａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｏｒｇａｎｔｏｗｎ、ＷＶ）をスパイクした。流速３５０ｎｌ／分で、２％から３５％の直線勾配で移動相Ｂ（９８％アセトニトリル中０．１％ギ酸）を１１０分間、次いで移動相Ｂを９５％まで急増させて２分間用いた。ナノスプレーイオンソース（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に接続されたＰｉｃｏＴｉｐエミッター（Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を用い、質量分析計にナノＬＣをオンラインで接続した。
【００５７】
フルスキャンスペクトル（３５０〜２０００ｍ／ｚ、分解能６０，０００）に最大で５つのデュアルＣＩＤ／ＨＣＤタンデム質量スペクトル（１００〜２０００ｍ／ｚ）が続く、ＭＳ／ＭＳモードに、ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｈｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を設定した。フルスキャン質量スペクトルの、最も強い５つのピークのペプチドイオンを、タンデムＭＳによるさらなる照合のために選択した。７５００の分解能で、ＣＩＤスキャンは質量分析計のリニアイオントラップ内で、ＨＣＤスキャンはＯｒｂｉｔｒａｐ内で取得された。使用した正規化コリジョンエネルギーは、ＣＩＤで４０％、ＨＣＤで５５％であった。データ依存的収集に関し、９０秒のダイナミック・エクスクルージョン・リスト（Ｄｙｎａｍｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｌｉｓｔ）を適用した。ウェット・ラボおよびＬＣ−ＭＳ手順は、全体を通して交絡因子が制御された。
【００５８】
（データ解析）
Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（１．３）ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｈｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用し、ＳｅｑｕｅｓｔアルゴリズムおよびＭａｓｃｏｔアルゴリズムの両方を用いて、ＩＰＩ  Ｈｕｍａｎ３．８７データベースに対しデータベース検索を行った。前駆体質量許容範囲は１０ｐｐｍ、断片質量許容範囲は０．８Ｄａという設定を適用した。トリプシンを消化酵素として指定し、許容するミスクリベージを２とした。システインのカルバミドメチル化およびＴＭＴ修飾（Ｎ末端およびリシン残渣）を固定修飾とし、かつメチオニンの酸化、ならびにセリン残渣、トレオニン残渣、およびチロシン残渣におけるリン酸化反応を可変修飾と定義した。包括的ＦＤＲが５％未満の中信頼度および高信頼度のペプチド、および１位に順位付けされたペプチドのみを結果に含めるという設定を用いて、結果をフィルタにかけた。ＴＭＴ定量のワークフローにおいて、最も信頼のある重心方法は２０ｐｐｍの積分ウィンドウで使用された。同位体のコンタミネーションに関し、一次方程式系を解き、かつデータシートから既知の標識純度を用いることにより［参考文献１２］、レポーターイオン強度を補正した。本研究において、前述の要件と一致する、固有のペプチドのすべてのシーケンスおよびレポーターイオン強度は、さらなるデータ解析のためにカンマ区切り形式（ＣＳＶ）へデータ転送された。
【００５９】
（正規化原理）
同重体標識化手順において、データ中に存在する生物学的情報が不明瞭とならないよう、正規化方法は系統的バイアスを除去する必要がある。したがって、同重体標識化方法の原理を利用するデータ駆動型正規化アプローチを示す。
【００６０】
この系統的影響を正規化できるアルゴリズムを開発するため、下記が仮定された。
１）大部分を占めるタンパク質は、試料間で変化せず、正規化のための参照セットとして使用される。結果として、例えば異なるプルダウンといった極端な実験条件からの発現プロファイルは回避されるはずである。
２）上方もしくは下方調節されたタンパク質の分布は、おおよそ対称である。
３）系統誤差が生じると、全てのペプチドの強度分布に影響が及ぶよう、当該系統誤差はプールされた試料中の全てのペプチド強度に影響を与える。
【００６１】
これらの仮定により、必然的にレポーター強度分布中に観察されるシフトは、生物学的作用によって生じるものではなく、系統的バイアスによって生じる可能性が最も高い。
【００６２】
さらに、レポーターフラグメントイオンの発生に優先性はない、すなわち全ての同重体標識は同様に良好なフラグメンテーション特性を有すると仮定された。したがって、レポーター強度は、プールされた試料中のペプチドの相対的存在量を反映すると仮定された。これらの仮定により、レポーターイオン強度は、相対的な尺度で示され得る。このため、特定のペプチドに関する強度の合計が１となるよう、強度の縮尺を変更した。言い換えると、ここでペプチドは、プールされた試料中の当該ペプチドの存在量を反映する寄与率によって定量される。
【００６３】
理想的な状況において、プールされた試料中のペプチド濃度は、プール内でビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク濃度アッセイによって消化前に均等化されるため、等しいはずである。言い換えると、包括的タンパク質濃度がレポーターチャネル全域で等しくなるよう、すなわち割合が１：１：１：１：１：１となるよう、試料はプールされる。このプールする前の試料の均等化は、均等なレポーター強度分布をもたらすはずであり、したがって、ｍ個の標識を含む同重体標識化実験について、定量チャネルにおけるペプチド強度の平均値は１／ｍに設定される。包括的正規化といった、一般に適用される正規化方法は、強度分布の上方または下方へのシフトに相当するユーザー定義値に強度を集中させる。しかし、そのように分布を１／ｍにシフトさせるような正規化を適用することは、プール内の試料の寄与率に対する解釈を無効にするであろう。したがって、データの正規化中に制約を適用すべきである。
【００６４】
レポーター強度の合計が１となるような制約を適用し、観測される強度分布の平均が１／ｍとなるよう正規化した。ペプチド毎に１つの係数、かつレポーターチャネル毎に１つの係数という制限された自由度のみを与えることよって、観測される強度を均整に制御しつつ、等量に変更することを目指した。
【００６５】
ｍ重同重体標識化実験で生じるデータは、矩形データ形式で表すことができる。この形式は、タンデム質量スペクトルからレポーターイオン強度に関する情報を収集する、数２６で表されるｍ列ｎ行のデータ行列
【数２３】
0006518269.tif 000025
である。この行列の列は、多重化された試料に対応するｍ個の定量チャネルを示し、行は、ＬＣ−ＭＳ実験で同定されるｎ個のペプチドを表す。より正式には、行列
【数２４】
0006518269.tif 000026
内の各要素
【数２５】
0006518269.tif 000027
は、レポーターチャネルｊ内のペプチドｉの絶対強度を表す。
【数２６】
0006518269.tif 000028
ここで、インデックスは、ｉ＝１、２、・・・、ｎであり、かつｊ＝１、２、・・・、ｍである。正式には、元のデータ行列
【数２７】
0006518269.tif 000029
が与えられ、新しい正規化行列Ａを生成する正規化工程
【数２８】
0006518269.tif 000030
を検討する。先の段落で説明された実験条件が課され、結果として生じる行列Ａは、完全データ行列である（欠測値がない）場合、次の制約
【数２９】
0006518269.tif 000031
および
【数３０】
0006518269.tif 000032
（ここでａｉｊは正規化データ行列Ａの要素である）を満たすはずである。これらの２つの制約は、
【数３１】
0006518269.tif 000033
および
【数３２】
0006518269.tif 000034
に相当する。欠測値の場合、単に欠測のない値の平均に一般化する。
【００６６】
数２９および数３０は、それぞれスケーリング制約および正規化制約として示される。数２９における制約が、特定のペプチドｉに関するプール内の試料ｊの寄与率として正規化強度を解釈できることを確実にすることを想起されたい。数３０における制約は、多重化された各試料のレポーター強度が、プール内のタンパク質／ペプチド濃度における等しい寄与を反映するよう、正規化強度の分布を平均値１／ｍに向けてスケーリングする。
【００６７】
本発明のアルゴリズムの長所を示すため、３×６個の試料（３つの実験群が提供する１８個の生物学的に独立する試料を表す）をランダム化し、３つのＴＭＴシンプレックスＬＣ−ＭＳ実験で測定する、標準的なＴＭＴシンプレックス定量実験に前述の正規化方法を適用した。実験の構成の概要は、表１に与えられる。図１は、正規化前および後のデータの比較を表す。ここで、６個のレポーターチャネル（レポーターチャネルＴＭＴ１２６からＴＭＴ１３１を表す、１から６に番号付けされる）の対数強度分布は、ボックスプロットを用いて視覚化される。
【００６８】
図１は、正規化前および後のデータの比較を表す。図１Ａより、小さい系統誤差、例えばピペッティングによる誤差が、試料中の全ペプチドの強度分布に影響を与えることが明らかとなる。試料は１：１：１：１：１：１の割合でプールされるため、その強度分布は、レポーターチャネル全域で等しいはずである。６重実験に存在する、ウェット・ラボの各系統誤差は、レポーターチャネルにおける変換された強度分布のシフト（上方または下方）として検出できる。
【００６９】
このため、本発明の正規化は、それらのレポーター強度の合計が１となるよう、強度の尺度を変更する。ＴＭＴシンプレックスの場合、プールされた試料中のペプチド含有量は、レポーター強度の平均が総試料の１／６となるように正規化される。この尺度の変更は、図１Ｂに示される。図１Ｂにより、強度分布が１／６％に集中することが認められる。この百分率表示は、すでにＳｈａｄｆｏｒｔｈら［参考文献１２］によって提案されていたが、正規化は数３０の制約によって制限されていなかった。この表示法の有用な結果は、各ペプチドがプールされた試料中の試料の相対的寄与によって定量されるため、もはや下流の統計解析を条件付きでペプチドに行う必要がないことである。したがって、さらに処理することなく、ペプチドを比較でき、またはタンパク質強度にまとめることができる。この表示法を用いずにタンパク質含有量を定量するためには、条件付き統計解析が必要であり、すなわち、タンパク質の定量は、事例と対照の間のペプチド比レベルで行われる。この後者の構想は、実験計画の柔軟性に重大な制約を課すが、今や本発明の表示法によって回避される。
【００７０】
本発明に係るデータの制約標準化は、ＲＡＳアルゴリズムと呼ばれる経済学分野由来のアルゴリズム手順［参考文献１３］、または反復比例あてはめ手順としてより一般的に知られるアルゴリズム手順［参考文献」１４、１５］によって実行される。
【００７１】
次に、本発明の方法を、マイクロアレイデータの標準化によく用いられる一般的なクオンタイル正規化技術と比較する。本研究の３つのＴＭＴシンプレックス実験に関し、測定されたペプチド強度をまとめるクラスター分析によって、正規化の信頼性を評価する。なお、クラスタリングは、３つのシンプレックスＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験（共通部分）において同定および定量されたペプチドのサブセットについて行われる。クオンタイル正規化された強度の場合（図２Ａ）、クラスタリングは、同じ実験群に結びつく対象をグループ化できない。代わりに、クラスタリングアルゴリズムは、同じ多重化ＬＣ−ＭＳ実験にプールされた対象をグループ化する。同じＬＣ−ＭＳ実験による対象のグループ化は、クラスタリングが、データ内に依然として存在する系統誤差によって決定されること、および生物学的情報は、それらの誤差によって不明瞭となることを明らかにする。しかし、プールされた試料のＬＣ−ＭＳ実験をみると、クラスタリングは、互いに関連する対象をグループ化することがわかる。したがって、同重体標識化実験内で試料を比較するために、クオンタイル正規化は十分であると思われる。
【００７２】
一方で、本発明に従って正規化された強度のクラスタリングは、生物学的サブセットに対応するようデータをまとめる（図２Ｂ）。この正確なグループ化は、生物学的に関連する情報が維持されつつＬＣ−ＭＳ測定から生じる系統ニューサンスが除去されることを明らかにし、結果として、さらなる統計解析をペプチド強度に対し行うことができる。
【００７３】
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【００８０】
８．Ｊａｇｔａｐ  Ｐ．、Ｍｉｃｈａｉｌｉｄｉｓ  Ｇ．、Ｚｉｅｌｋｅ  Ｒ．、Ｗａｌｋｅｒ  Ａ．  Ｋ．ら、Ｅａｒｌｙ  ｅｖｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｔｉｍｅ−ｃｏｕｒｓｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００６、６（１９）、５１９９−５２１１
【００８１】
９．Ｂｏｅｈｍ  Ａ．  Ｍ．、Ｐｕｔｚ  Ｓ．、Ａｌｔｅｎｈｏｆｅｒ  Ｄ．、Ｓｉｃｋｍａｎｎ  Ａ．、Ｆａｌｋ  Ｍ．、Ｐｒｅｃｉｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｉＴＲＡＱ、ＢＭＣ．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．、２００７、８、２１４
【００８２】
１０．Ａｒｎｔｚｅｎ  Ｍ．  Ｏ．、Ｋｏｅｈｌｅｒ  Ｃ．  Ｊ．、Ｂａｒｓｎｅｓ  Ｈ．、Ｂｅｒｖｅｎ  Ｆ．  Ｓ．ら、ＩｓｏｂａｒｉＱ：  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  ｉｓｏｂａｒｉｃ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｕｓｉｎｇ  ＩＰＴＬ，  ｉＴＲＡＱ，  ａｎｄ  ＴＭＴ、Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．、２０１１、１０（２）、９１３−９２０
【００８３】
１１．Ｂｒｅｉｔｗｉｅｓｅｒ  Ｆ．  Ｐ．、Ｍｕｌｌｅｒ  Ａ．、Ｄａｙｏｎ  Ｌ．、Ｋｏｃｈｅｒ  Ｔ．ら、Ｇｅｎｅｒａｌ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｄａｔａ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓｏｂａｒｉｃ  ｔａｇｓ、Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．、２０１１、１０（６）、２７５８−２７６６
【００８４】
１２．Ｓｈａｄｆｏｒｔｈ  Ｉ．  Ｐ．、Ｄｕｎｋｌｅｙ  Ｔ．  Ｐ．、Ｌｉｌｌｅｙ  Ｋ．  Ｓ．、Ｂｅｓｓａｎｔ  Ｃ．、ｉ−Ｔｒａｃｋｅｒ：  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｕｓｉｎｇ  ｉＴＲＡＱ、ＢＭＣ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２００５、６、１４５
【００８５】
１３．Ｌａｈｒ  Ｍ．、ｄｅ  Ｍｅｓｎａｒｄ  Ｌ．、Ｂｉｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｉｎｐｕｔ−Ｏｕｔｐｕｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ｔａｂｌｅ  Ｕｐｄａｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４、１６（２）、１１５−１３４
【００８６】
１４．Ｄｅｍｉｎｇ  Ｗ．  Ｅ．、Ｓｔｅｐｈａｎ  Ｆ．  Ｆ．、Ｏｎ  ａ  Ｌｅａｓｔ  Ｓｑｕａｒｅｓ  Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｓａｍｐｌｅｄ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｔａｂｌｅ  Ｗｈｅｎ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｃｔｅｄ  Ｍａｒｇｉｎａｌ  Ｔｏｔａｌｓ  ａｒｅ  Ｋｎｏｗｎ、Ａｎｎ．  Ｍａｔｈ．  Ｓｔａｔｉｓｔ．、１９４０、４２７−４４４
【００８７】
１５．Ｆｉｅｎｂｅｒｇ  Ｓ．  Ｅ．、Ａｎ  Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｎｔｉｎｇｅｎｃｙ  Ｔａｂｌｅｓ、Ａｎｎ．  Ｍａｔｈ．  Ｓｔａｔｉｓｔ．、１９７０、９０７−９１７
【００８８】
１６．Ｂｏｒｔｎｅｒ  Ｊ．  Ｄ．  Ｊｒ．、Ｒｉｃｈｉｅ  Ｊ．  Ｐ．  Ｊｒ．、Ｄａｓ  Ａ．、Ｌｉａｏ  Ｊ．ら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ  ｂｙ  ｉＴＲＡＱ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＴＩ−ＨＣ３  ａｎｄ  ＶＤＢＰ  ｂｙ  ｃｉｇａｒｅｔｔｅ  ｓｍｏｋｉｎｇ、Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．、２０１１、１０（３）、１１５１−１１５９
【００８９】
１７．Ａｍｅｌｉｎａ  Ｈ．、Ｓｊｏｄｉｎ  Ｍ．  Ｏ．、Ｂｅｒｇｑｕｉｓｔ  Ｊ．、Ｃｒｉｓｔｏｂａｌ  Ｓ．、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｓｕｂｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｌｉｖｅｒ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｓ  ｂｙ  ｉＴＲＡＱ  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．、２０１１、８７９（３０）、３３９３−３４００
【００９０】
１８．Ｋａｌｌ  Ｌ．、Ｖｉｔｅｋ  Ｏ．、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、ＰＬｏＳ．  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｂｉｏｌ．、２０１１、７（１２）、ｅ１００２２７７
【００９１】
１９．Ｔｉｎｇ  Ｌ．、Ｒａｄ  Ｒ．、Ｇｙｇｉ  Ｓ．  Ｐ．、Ｈａａｓ  Ｗ．、ＭＳ３  ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ  ｒａｔｉｏ  ｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｓｏｂａｒｉｃ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１１、８（１１）、９３７−９４０
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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