(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０よりなる群から選択される配列を含む、組換えＤＮＡ分子。
【請求項２】
前記ＤＮＡ分子がトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシ植物または種子に由来し、種子の代表的な試料がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２０８６０として寄託されている前記事象を含む、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項３】
前記ＤＮＡ分子がトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象由来のＤＮＡの存在に特徴的であるアンプリコンである、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項４】
前記ＤＮＡ分子がトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシ由来のトウモロコシ植物、細胞、種子、後代植物または植物部分中にあり、種子の代表的な試料がＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２０８６０として寄託されている前記事象を含む、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項５】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０よりなる群から選択されるＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡプローブとして機能するのに十分な長さの、配列番号１０の連続的なＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子であって、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０よりなる群から選択される配列を含まないＤＮＡ配列とハイブリダイズせず、配列番号１または配列番号２を含む、前記ＤＮＡ分子。
【請求項６】
第１のＤＮＡ分子および第２のＤＮＡ分子を含む１対のＤＮＡ分子であって、前記第１のＤＮＡ分子が配列番号９の断片であって、前記第２のＤＮＡ分子がトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象のトウモロコシゲノムＤＮＡの断片であって、前記第１および第２のＤＮＡ分子が、増幅反応においてトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むＤＮＡと一緒に使用して試料中のトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象に特徴的であるアンプリコンを生成する場合に、ＤＮＡプライマーとして機能するのに十分な長さの、連続的なヌクレオチドのＤＮＡ配列をそれぞれ含み、前記アンプリコンが配列番号１または配列番号２を含む、前記ＤＮＡ分子。
【請求項７】
ＤＮＡ試料中のトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の存在の検出方法であって、
ａ）前記試料を請求項５に記載のＤＮＡ分子と接触させること、
ｂ）前記試料および前記ＤＮＡ分子をストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供すること、ならびに
ｃ）試料中の標的ＤＮＡ分子に対する前記ＤＮＡ分子のハイブリダイゼーションを検出することを含み、
前記標的ＤＮＡ分子に対する前記ＤＮＡ分子の前記ハイブリダイゼーションが、前記ＤＮＡ試料中のトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の存在を示す、前記方法。
【請求項８】
ＤＮＡ試料中のトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の存在の検出方法であって、
ａ）前記試料を請求項６に記載のＤＮＡ分子対と接触させること、
ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８よりなる群から選択される配列を含むＤＮＡアンプリコンを生成するのに十分である増幅反応を行うこと、ならびに
ｃ）反応物中のＤＮＡアンプリコンの存在を検出することを含み、
前記反応物中の前記ＤＮＡアンプリコンの存在が、前記ＤＮＡ試料中のトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の存在を示す、前記方法。
【請求項９】
ａ）配列番号１もしくは配列番号２を含むＤＮＡ分子、または
ｂ）第１のＤＮＡ分子および第２のＤＮＡ分子を含む１対のＤＮＡ分子であって、前記第１のＤＮＡ分子は配列番号９の断片であり、前記第２のＤＮＡ分子はトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の前記トウモロコシゲノムＤＮＡの断片であり、前記第１および第２のＤＮＡ分子は、増幅反応において前記ＭＯＮ８７４１９事象トウモロコシを含む前記ＤＮＡと一緒に使用して、試料中のトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象に特徴的であるアンプリコンを生成する場合に、ＤＮＡプライマーとして機能するのに十分な長さの、連続的なヌクレオチドのＤＮＡ配列をそれぞれ含み、前記アンプリコンが配列番号１または配列番号２を含む、１対のＤＮＡ分子
を含む、ＤＮＡ検出キット。
【請求項１０】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０よりなる群から選択されるＤＮＡ配列を有するＤＮＡ分子を含む、トランスジェニックトウモロコシ植物、種子、細胞、植物部分または商品生産物。
【請求項１１】
グルホシネートもしくはジカンバまたはグルホシネート除草剤およびジカンバ除草剤に耐性である、請求項１０に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物、種子または細胞。
【請求項１２】
トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含み、種子の代表的な試料がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２０８６０として寄託されているトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含む、トランスジェニックトウモロコシ植物、種子、細胞、植物部分または商品生産物。
【請求項１３】
トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含む少なくとも１つの親植物を有するハイブリッドである、請求項１２に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物または種子。
【請求項１４】
トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシをある区域に播種すること、ならびに前記トランスジェニックトウモロコシを害すること無しに前記区域において雑草を管理するために、有効量のジカンバもしくはグルホシネートまたはジカンバ除草剤およびグルホシネート除草剤を施用することを含む、ある区域における雑草の管理方法。
【請求項１５】
前記有効量のグルホシネート除草剤が、生育期にわたって、合計で１エーカーあたり約０．１ポンド酸当量から１エーカーあたり約１６ポンド酸当量のグルホシネート除草剤である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記有効量のグルホシネート除草剤が、生育期にわたって、合計で１エーカーあたり約０．４ポンド酸当量から１エーカーあたり約１．５９ポンド酸当量のグルホシネート除草剤である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記有効量のジカンバ除草剤が、生育期にわたって、合計で１エーカーあたり約０．１ポンド酸当量から１エーカーあたり約１６ポンド酸当量のジカンバ除草剤である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記有効量のジカンバ除草剤が、生育期にわたって、合計で１エーカーあたり約０．５ポンド酸当量から１エーカーあたり約２ポンド酸当量のジカンバ除草剤である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
グルホシネート除草剤およびジカンバ除草剤に耐性であるトランスジェニックトウモロコシ植物の作製方法であって、
ａ）トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシ植物をそれ自体とまたは第２のトウモロコシ植物と性的に交配すること、
ｂ）作られた種子を採取すること、
ｃ）前記種子を生育させて後代植物を作製すること、
ｄ）グルホシネートもしくはジカンバまたはグルホシネート除草剤およびジカンバ除草剤で前記後代植物を処理すること、ならびに
ｅ）グルホシネート除草剤およびジカンバ除草剤に耐性である後代植物を選抜すること
含む、前記方法。
【請求項２０】
グルホシネート除草剤およびジカンバ除草剤に耐性であるトランスジェニックトウモロコシ植物の生育方法であって、
ａ）事象ＭＯＮ８７４１９を含むトウモロコシ種子を播種すること、
ｂ）前記種子から植物を生育させること、ならびに
ｃ）グルホシネートもしくはジカンバまたはグルホシネート除草剤およびジカンバ除草剤で前記植物を処理すること
を含む、前記方法。
【請求項２１】
グルホシネート除草剤およびジカンバ除草剤の施用に耐性を示す植物の作製方法であって、
ａ）図１に示す導入遺伝子インサートを含むＤＮＡコンストラクトを提供すること、
ｂ）前記ＤＮＡコンストラクトをトウモロコシ植物細胞に導入すること、ならびに
ｃ）前記トウモロコシ植物細胞を再生してトウモロコシ植物を作製し、その結果、前記植物がグルホシネート除草剤およびジカンバ除草剤の施用に耐性を示すこと
を含む、前記方法。
【請求項２２】
前記導入遺伝子インサートが配列番号９を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記トウモロコシ植物細胞への前記ＤＮＡコンストラクトの導入が、前記トウモロコシ細胞のゲノムの一部として、配列番号１〜８および１０から選択される配列をもたらす、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
請求項２１に記載の方法によって作製されるトウモロコシ植物。
【請求項２５】
請求項２４に記載のトウモロコシ植物の後代植物、種子または一部であって、前記トウモロコシ植物の後代植物、種子または一部は、配列番号１〜８および１０からなる群から選択される配列を含むＤＮＡ分子を含む、トウモロコシ植物の後代植物、種子または一部。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年３月２０日に出願された米国特許仮出願第６１／９６８，３４２号に対する優先権の利益を主張する。
【０００２】
配列表の組み込み
２９．４ＫＢ（ＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓで測定）であり、２０１５年３月９日に作成された「ＭＯＮＳ３６２ＷＯ．ｔｘｔ」と題するファイルに含まれる配列表を電子的な提出によって本明細書とともに出願し、参照により本明細書に組み込む。
【０００３】
発明の分野
本発明は、トランスジェニックトウモロコシ事象ＭＯＮ８７４１９に固有の組換えＤＮＡ分子に関する。本発明は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシ植物、部分、種子、細胞および農産物ならびにそれらの使用方法にも関する。トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシ植物は、ジカンバ除草剤およびグルホシネート除草剤に対して耐性を示す。
【背景技術】
【０００４】
トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）は、世界の多くの地域において重要な作物である。望ましい形質を有するトウモロコシを生産するために、バイオテクノロジー方法がこの作物に適用されている。そのような望ましい形質の１つは除草剤耐性である。植物における除草剤耐性のための異種遺伝子（導入遺伝子としても知られる）の発現は、植物に除草剤耐性を与えることができる。しかし、導入遺伝子の発現、したがってその有効性は、植物の染色体に導入された個々の導入遺伝子の発現を駆動するカセットの向きおよび組成ならびに導入遺伝子挿入の染色体位置およびゲノム結果を含めた、多くの異なる因子の影響を受ける可能性がある。これは、分子的に連結された複数の導入遺伝子（それぞれが別々の形質を与える）を有するトランスジェニック植物において、さらに複雑である。そのような状況では、植物における、分子的に連結された導入遺伝子のそれぞれの適切な発現は、同じ導入遺伝子挿入から生じる必要がある（多重遺伝子事象とも呼ばれる）。そのような場合では、導入遺伝子および発現要素の構成が異なる複数の発現カセットを設計および試験すること、次いで、商業目的に適したものにするために必要な望ましい形質および最適な表現型的および農業的特徴のそれぞれに対して優れた特性を有するトランスジェニック事象を選抜するために、複数の植物世代を通して、多数の個々の植物形質転換事象を産生および解析することが必要である。そのような選抜は、有意量の農学的データ、表現型データおよび分子データを採取することができるように、広範な分子特性評価ならびに、複数の場所において様々な条件下で複数年にわたって行われる温室試験および圃場試験を必要とする。次いで、商業的な農業用途に適した事象を選抜することを目的に、幅広い生殖質にわたって、および様々な圃場条件において、得られたデータおよび観察結果を科学者と農学者のチームが解析する必要がある。一旦選抜したら、望ましい形質を与える商業的事象を、植物育種法を使用して他の遺伝的背景に遺伝子移入することができ、そのようにして、望ましい形質を含み、且つ特定の場所の生育条件に適切に適合した、多くの異なる作物品種を作製することができる。
【０００５】
単一の形質転換事象を含むトランスジェニック植物を作るために、植物形質転換法を使用して、組換えＤＮＡコンストラクトの一部をトウモロコシ細胞のゲノム中に移す。続いて、このトウモロコシ細胞を使用して固有のＲ０植物を産生し、次いで、これを使用してトランスジェニック後代植物を産生することができる。後代植物のゲノムはこの固有の事象を含み、所望の形質（複数可）について、および農学的性能について、これらの植物を試験することができる。ある事象の有効性は、形質転換事象の組み込み部位に対するシスおよび／またはトランスの因子によって強い影響を受ける可能性がある。事象によって与えられる表現型は、ＤＮＡコンストラクトの大きさおよび設計によって、強い影響を受ける可能性もあり、これは、発現カセットにおける遺伝要素の組み合わせ、導入遺伝子の数、発現カセットの数ならびにそのような要素およびそのようなカセットの構成によって変動し得る。所与の事象の性能は、導入遺伝子の発現の植物発達的、日周的、時間的もしくは空間的パターンなどの因子によって、または外因子、例えば、環境的な植物生育条件、水利用能、窒素利用能、熱もしくはストレスによって、さらに複雑であり得る。したがって、望ましいセットの表現型形質を与える事象を作出する能力は、容易には予測することができない。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、配列番号１〜１０よりなる群から選択される配列を含む組換えＤＮＡ分子を提供する。本発明は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２０８６０として寄託されたトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含む種子の代表的な試料である、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシ植物または種子に由来する、組換えＤＮＡも提供する。本発明は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象に由来するＤＮＡの存在に特徴的であるアンプリコンである組換えＤＮＡ分子も提供する。本発明は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシに由来するトウモロコシ植物、細胞、種子、後代植物または植物部分中にあるＤＮＡ分子も提供する。
【０００７】
本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１〜１０よりなる群から選択されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子とハイブリダイズし、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１〜１０よりなる群から選択されるＤＮＡ配列を含まないＤＮＡ分子とハイブリダイズしないＤＮＡプローブとして機能するのに十分な長さの、配列番号１０の連続的なＤＮＡ配列を有するＤＮＡ分子を提供する。本発明は、第１のＤＮＡ分子および第２のＤＮＡ分子を含む１対のＤＮＡ分子も提供し、ここでは第１のＤＮＡ分子は配列番号９の断片であり、第２のＤＮＡ分子はトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象のトウモロコシゲノムＤＮＡの断片であり、第１および第２のＤＮＡ分子はそれぞれ、増幅反応においてトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むＤＮＡと一緒に使用して試料中のトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象に特徴的であるアンプリコンを生成する場合に、ＤＮＡプライマーとして機能するのに十分な長さの、連続的なヌクレオチドのＤＮＡ配列を含む。
【０００８】
本発明は、試料をＤＮＡプローブと接触させ、試料およびＤＮＡプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供し、試料中のＤＮＡ分子へのＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションを検出することによって、ＤＮＡ試料中のトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の存在を検出する方法であって、ＤＮＡ分子へのＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションがＤＮＡ試料中のトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の存在を示す方法を提供する。
【０００９】
本発明は、試料を１対のＤＮＡプライマーと接触させ、配列番号１〜８および配列番号１０よりなる群から選択される配列を含むＤＮＡアンプリコンを生成するのに十分である増幅反応を行い、反応物中のＤＮＡアンプリコンの存在を検出することによって、ＤＮＡ試料中のトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の存在を検出する方法であって、反応物中のＤＮＡアンプリコンの存在がＤＮＡ試料中のトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の存在を示す方法を提供する。
【００１０】
本発明は、ＤＮＡ試料中のトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の存在の検出に対して特異的なプライマーまたはプローブとして機能するのに十分な長さの、配列番号１０の連続的なヌクレオチドのＤＮＡ配列を含む少なくとも１つのＤＮＡ分子を含む、ＤＮＡ検出キットを提供する。
【００１１】
本発明は、配列番号１〜１０よりなる群から選択されるＤＮＡ配列を有するＤＮＡ分子を含む、組換えトウモロコシ植物、種子、細胞、植物部分または商品生産物を提供する。本発明は、グルホシネートもしくはジカンバまたはグルホシネート除草剤およびジカンバ除草剤に耐性である、トランスジェニックトウモロコシ植物、種子または細胞も提供する。本発明は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含む、トランスジェニックトウモロコシ植物、種子、細胞、植物部分または商品生産物も提供する。本発明は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含んでいた少なくとも１つの親植物を有するハイブリッドである、トランスジェニックトウモロコシ植物または種子も提供する。
【００１２】
本発明は、ある区域で雑草を管理する方法であって、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシをある区域に播種すること、ならびにトランスジェニックトウモロコシを害すること無しにその区域において雑草を管理するために、有効量のジカンバもしくはグルホシネートまたはジカンバ除草剤およびグルホシネート除草剤を施用することを含む方法を提供する。本発明は、エーカーあたり約０．１ポンド酸当量からエーカーあたり約１６ポンド酸当量のグルホシネート除草剤という有効量のグルホシネート除草剤を生育期にわたって施用することによって雑草を管理する方法も提供する。本発明は、エーカーあたり約０．４ポンド酸当量からエーカーあたり約１．５９ポンド酸当量のグルホシネート除草剤という有効量のグルホシネート除草剤を生育期にわたって施用することによって雑草を管理する方法も提供する。本発明は、エーカーあたり約０．１ポンド酸当量からエーカーあたり約１６ポンド酸当量のジカンバ除草剤という有効量のジカンバ除草剤を生育期にわたって施用することによって雑草を管理する方法も提供する。本発明は、有効量のジカンバ除草剤を施用することによって雑草を管理する方法も提供し、生育期にわたってエーカーあたり約０．５ポンド酸当量からエーカーあたり約２ポンド酸当量のジカンバ除草剤である。
【００１３】
本発明は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシ植物と第２のトウモロコシ植物とを性的に交配し、作られた種子を採取し、その種子を生育させて後代植物を作製し、グルホシネートもしくはジカンバまたはグルホシネート除草剤およびジカンバ除草剤でその後代植物を処理し、グルホシネート除草剤およびジカンバ除草剤に耐性である後代植物を選抜することによる、グルホシネート除草剤およびジカンバ除草剤に耐性であるトランスジェニックトウモロコシ植物の作製方法を提供する。本発明は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシ植物を自殖させ、作られた種子を採取し、その種子を生育させて後代植物を作製し、グルホシネートもしくはジカンバまたはジカンバ除草剤およびグルホシネート除草剤でその後代植物を処理し、グルホシネート除草剤およびジカンバ除草剤に耐性である後代植物を選抜することによる、グルホシネート除草剤およびジカンバ除草剤に耐性であるトランスジェニックトウモロコシ植物の作製方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】トウモロコシ事象ＭＯＮ８７４１９を含むトウモロコシ植物のゲノムにおける導入遺伝子インサートの構成を示す図である。横線は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０の相対位置に対応する。ＳＱ２６６４４およびＳＱ２６６４５と表示される太矢印は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシを特定するのに使用される１対のプライマーのおおよその位置を表す。１４から２２までの番号が付けられた太くて短い線は、ＤＮＡインサート（配列番号９）内の固有の組換えコンストラクト配列の相対位置を表し、番号は、それぞれ、各々の対応する配列番号を指す。細い横矢印は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の異種導入遺伝子挿入ＤＮＡの２つの別々の発現カセットの相対構成を表し、ボックスは、２つの発現カセットの別々の要素を示す。先頭の「Ｐ」はプロモーター要素を表し、先頭の「Ｌ」はリーダー要素を表し、先頭の「Ｉ」はイントロンを表し、先頭の「ＴＳ」は葉緑体トランジットペプチドを表し、先頭の「Ｔ」は３’転写終結およびポリアデニル化要素（３’ＵＴＲ）を表し、ｐａｔはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）タンパク質のコード領域を表し、ｄｍｏはジカンバモノオキシゲナーゼ（ＤＭＯ）タンパク質のコード領域を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
配列の簡単な説明
配列番号１は、トウモロコシゲノムＤＮＡと導入遺伝子インサートの５’接合部を表す、３０ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。配列番号１は、配列番号１０のヌクレオチド位置１２３２〜１２６１に対応する。
【００１６】
配列番号２は、トウモロコシゲノムＤＮＡと導入遺伝子インサートの３’接合部を表す、３０ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。配列番号２は、配列番号１０のヌクレオチド位置７９９４〜８０２３に対応する。
【００１７】
配列番号３は、トウモロコシゲノムＤＮＡと導入遺伝子インサートの５’接合部を表す、６０ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。配列番号３は、配列番号１０のヌクレオチド位置１２１７〜１２７６に対応する。
【００１８】
配列番号４は、トウモロコシゲノムＤＮＡと導入遺伝子インサートの３’接合部を表す、６０ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。配列番号４は、配列番号１０のヌクレオチド位置７９７９〜８０３８に対応する。
【００１９】
配列番号５は、トウモロコシゲノムＤＮＡと導入遺伝子インサートの５’接合部を表す、１００ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。配列番号５は、配列番号１０のヌクレオチド位置１１９７〜１２９６に対応する。
【００２０】
配列番号６は、トウモロコシゲノムＤＮＡと導入遺伝子インサートの３’接合部を表す、１００ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。配列番号６は、配列番号１０のヌクレオチド位置７９５９〜８０５８に対応する。
【００２１】
配列番号７は、１２４６ヌクレオチドの５’隣接トウモロコシゲノムＤＮＡおよび５２５ヌクレオチドの導入遺伝子インサート５’末端を表す、１７７１ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。
【００２２】
配列番号８は、５１６ヌクレオチドの導入遺伝子インサート３’末端および１２５１ヌクレオチドの３’隣接トウモロコシゲノムＤＮＡを表す、１７６７ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。
【００２３】
配列番号９は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の導入遺伝子インサートに対応する、６７６２ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。
【００２４】
配列番号１０は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象に対応する９２５９ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、この配列は、位置１〜１２４６の５’隣接ゲノムＤＮＡ配列、位置１２４７〜８００８のトランスジェニックＤＮＡインサートおよび位置８００９〜９２５９の３’隣接ゲノムＤＮＡ配列を含む。
【００２５】
配列番号１１は、ＳＱ２６６４４と称されるプライマーに対応する３３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＤＮＡ試料中のトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を特定するのに使用され、配列番号１０の位置７９６６〜７９９８に対応する。
【００２６】
配列番号１２は、ＳＱ２６６４５と称されるプライマーに対応する２４ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＤＮＡ試料中のトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を特定するのに使用され、配列番号１０の位置８０２２〜８０４５に対応する。
【００２７】
配列番号１３は、ＰＢ１１２０７と称されるプローブに対応する１９ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＤＮＡ試料中のトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を特定するのに使用され、配列番号１０の位置８００２〜８０２０に対応する。
【００２８】
配列番号１４〜２２は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の導入遺伝子インサート内の固有の配列に対応するＤＮＡ配列である。
【００２９】
本発明の詳細説明
以下の定義および方法は、本発明をよりよく定義するため、および本発明の実施において当業者を手引きするために提供される。別様に記さない限り、用語は、関連分野の当業者による従来の用法にしたがって理解されるものとする。
【００３０】
現代の植物形質転換法を使用して、遺伝子組換え植物を作出する。「トランスジェニック」という用語も、遺伝子組換え植物を指すのに使用することができる。トランスジェニック植物を作出する過程で、外来ＤＮＡが植物細胞のゲノム中にランダムに挿入される。形質転換手順の間に、多くの個々の細胞が形質転換される。ランダムな組み込みが原因で、別々且つ固有のＤＮＡ組換え事象が、それぞれの個々の形質転換植物細胞のゲノム内で起こる。次いで、完全なトランスジェニック植物が、単一の個々のトランスジェニック細胞から作出され、これは、必然的に、トランスジェニック植物のすべての細胞が、そのゲノムの安定的な部分として固有に挿入されたＤＮＡを含むことをもたらす。トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニック除草剤耐性トウモロコシは、トウモロコシ生殖質の染色体／ゲノム中へのトランスジェニックＤＮＡの単一の挿入を含む。トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象は以下によって作製された：（ｉ）目的の導入遺伝子を含む核酸コンストラクトによる、何千ものトウモロコシ植物細胞の形質転換、（ｉｉ）それぞれ固有のトランスジェニック事象を含むトウモロコシ植物集団の再生、および（ｉｉｉ）望ましい農学的特性を有する事象、すなわちトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を選抜するための、複数年の試験、スクリーニングおよび選抜。トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象は、トウモロコシ植物のゲノムの特定位置への導入遺伝子の挿入による固有のＤＮＡ配列を特徴とする。
【００３１】
トウモロコシ植物のゲノム中にトランスジェニックＤＮＡを挿入する行為は、植物形質転換の行為によって達成され、「事象」として知られる、新しいトランスジェニックゲノム分子配列の作出をもたらす。この配列は、事象に固有且つ特異的であり、元のトウモロコシゲノム配列または他のトランスジェニックトウモロコシ事象と比較すると、容易に特定することができる。トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の分子解析によって、挿入ＤＮＡゲノムの挿入部位（配列番号９）ならびに挿入ＤＮＡの両側に直接隣接する隣接トウモロコシゲノムＤＮＡ配列（配列番号７および配列番号８）が特定された。したがって、周囲のトウモロコシ植物ゲノムＤＮＡに対する挿入ＤＮＡのこの配置は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニック除草剤耐性トウモロコシに特異的且つ固有である。この新しいゲノム分子配列（配列番号１０）はまた、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニック除草剤耐性トウモロコシ植物の染色体の必須部分であり、したがって植物中で静的であり、植物の後代に伝えられ得る。
【００３２】
本発明はまた、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含む元の形質転換体の後代を提供する。トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトウモロコシ植物の自殖によって、またはトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトウモロコシ植物とトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むもしくは含まない別の植物との間の性的な異系交配によって、そのような後代を作製することができる。そのような他の植物は、同じまたは異なる事象（複数可）を含むトランスジェニック植物でもよいし、非トランスジェニック植物、例えば異なる品種由来のものでもよい。反復親への反復戻し交配の後でさえも、形質転換された親からのトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象は、同じゲノム位置で交配の後代に存在する。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「トウモロコシ」という用語は、Ｚｅａ  ｍａｙｓ（コーンとも称される）を意味し、トウモロコシと掛け合わせることができるすべての植物品種を含む。
【００３４】
本発明は、ジカンバ（３，６−ジクロロ−２−メトキシ安息香酸）除草剤およびグルホシネート（２−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）ブタン酸）除草剤に耐性である、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニック除草剤耐性トウモロコシ植物を提供する。ジカンバは、広葉の雑草を管理するのに有用な合成オーキシン除草剤である。グルホシネートは、幅広い１年性および多年性草本および広葉の雑草を管理するのに有用な有機リン系除草剤である。トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象は、ジカンバ除草剤に耐性を与えるためのジカンバモノオキシゲナーゼ（ＤＭＯ）タンパク質を発現する、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ由来のデメチラーゼ（ｄｍｏ）遺伝子、およびグルホシネート除草剤に耐性を与えるためのホスフィノトリシンＮ‐アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）タンパク質を発現する、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ由来のビアラホス抵抗性（ｐａｔ）遺伝子を含む。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「組換え」という用語は、通常は天然に見られないであろう、ヒトの介在によって作出された、非天然のＤＮＡ、タンパク質または生物を指す。本明細書で使用する場合、「組換えＤＮＡ分子」は、天然には一緒に存在しないであろう、ヒトの介在の結果であるＤＮＡ分子の組み合わせを含むＤＮＡ分子であり、例えば、互いに異種である少なくとも２つのＤＮＡ分子の組み合わせから構成されるＤＮＡ分子、例えば、導入遺伝子およびその導入遺伝子に隣接する植物ゲノムＤＮＡを含むＤＮＡ分子である。組換えＤＮＡ分子の１例は、配列番号１〜１０から選択される少なくとも１つの配列を含むＤＮＡ分子である。本明細書で使用する場合、「組換え植物」は、通常は天然には存在しないであろう、ヒトの介在の結果である、トランスジェニックＤＮＡ分子を含む植物である。そのようなゲノム変化の結果として、組換え植物は新しいものであり、関連する野生型植物と明確に異なる。組換え植物の例は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトウモロコシ植物である。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「導入遺伝子」という用語は、植物形質転換法によるなどのヒトの介在の結果として、生物のゲノムに人為的に組み込まれたＤＮＡ分子を指す。導入遺伝子は、その生物に対して異種でもよい。本明細書で使用する場合、「導入遺伝子インサート」という用語は、トウモロコシ事象ＭＯＮ８７４１９を作製するために植物形質転換法によってトウモロコシゲノム中に挿入される導入遺伝子を指す。この導入遺伝子インサートに関する配列は、配列番号９として提供される。「トランスジェニック」という用語は導入遺伝子を含むことを指し、例えば、「トランスジェニック植物」は導入遺伝子を含む植物を指す。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「異種」という用語は、天然において、第２の分子または生物と通常は関係がない第１の分子を指す。例えば、ＤＮＡ分子は第１の種に由来し、第２の種のゲノム中に挿入され得る。したがって、このＤＮＡ分子は、このゲノムおよび生物に対して異種となるであろう。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「キメラ」という用語は、第１のＤＮＡ分子を第２のＤＮＡ分子に融合することによって生成される単一ＤＮＡ分子（ここでは、第１のＤＮＡ分子も第２のＤＮＡ分子も、他方と融合した構成で通常は見られないであろう）を指す。したがって、キメラＤＮＡ分子は、通常は天然に見られない新しいＤＮＡ分子である。キメラＤＮＡ分子の１例は、配列番号１〜１０から選択される少なくとも１つの配列を含むＤＮＡ分子である。
【００３９】
本発明は、ＤＮＡ分子およびその対応するＤＮＡ配列を提供する。本明細書で使用する場合、「ＤＮＡ」および「ＤＮＡ分子」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を指す。ＤＮＡ分子はゲノム起源でもよいし合成起源でもよく、慣例により、５’（上流）末端から３’（下流の）末端である。本明細書で使用する場合、「ＤＮＡ配列」という用語はＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を指す。使用される命名法は、合衆国法典第３７編連邦規則集第１．８２２条によって要求され、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５（１９９８）、補遺２の表の表１および３に記載されるものである。慣例により、本発明のＤＮＡ配列およびその断片は、２つの相補ＤＮＡ配列鎖の１つの鎖のみに関して開示される。暗におよび意図的に、当技術分野で逆相補配列としても言及される本明細書で提供される配列の相補配列（相補鎖の配列）は本発明の範囲内であり、特許請求される主題の範囲内にあることが、明確に意図される。したがって、本明細書で使用する場合、配列番号１〜１０および配列番号１４〜２２ならびにそれらの断片への言及は、相補鎖の配列およびその断片を含み、これらを指す。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「断片」という用語は、全体のうちのより小さな部分を指す。例えば、配列番号１０の断片は、配列番号１０の完全な配列のうちの少なくとも約２０個の連続したヌクレオチド、少なくとも約２５個の連続したヌクレオチド、少なくとも約３０個の連続したヌクレオチド、少なくとも約３５個の連続したヌクレオチド、少なくとも約４０個の連続したヌクレオチド、少なくとも約４５個の連続したヌクレオチド、少なくとも約５０個の連続したヌクレオチド、少なくとも約６０個の連続したヌクレオチド、少なくとも約７０個の連続したヌクレオチド、少なくとも約８０個の連続したヌクレオチド、少なくとも約９０個の連続したヌクレオチドまたは少なくとも約１００個の連続したヌクレオチドである配列を含むであろう。
【００４１】
導入遺伝子インサートの完全なＤＮＡ配列および導入遺伝子インサートのいずれかの末端に隣接するトウモロコシゲノムＤＮＡの実質的なセグメントに対応するＤＮＡ配列は、配列番号１０として提供される。ホスホジエステル結合によって導入遺伝子インサートの５’末端に物理的に連結する、したがって導入遺伝子インサートの５’末端に隣接するトウモロコシゲノムＤＮＡのＤＮＡ配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７として提供される。ホスホジエステル結合によって導入遺伝子インサートの３’末端に物理的に連結した、したがって導入遺伝子インサートの３’末端に隣接するトウモロコシゲノムＤＮＡのＤＮＡ配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８として提供される。
【００４２】
トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシは、接合部と称される２つの領域を含む。「接合部」は、導入遺伝子インサートの１つの末端がゲノムＤＮＡに結合している場所である。接合部は、導入遺伝子インサートの一部および隣接する隣接ゲノムＤＮＡにわたって広がるか延び、したがって、１つの連続的な分子としてのこれら２つの結合点である。１つの接合部は導入遺伝子インサートの５’末端にあり、１つは導入遺伝子インサートの３’末端にあり、それぞれ、５’接合部および３’接合部と本明細書で言及される。「接合部配列」は、ある事象の５’または３’接合部に広がる任意の長さのＤＮＡ配列を指す。配列番号１０を使用すれば、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の接合部配列は当業者に容易に明らかになる。トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の接合部配列の例は、配列番号１〜８として提供される。図１は、５’から３’に配置された配列番号１〜１０の物理的配置を図示する。したがって、本発明は、配列番号１〜８に記載のＤＮＡ配列の少なくとも１つを含むＤＮＡ分子を提供する。
【００４３】
トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の接合部配列は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシ植物、種子または細胞のゲノムの一部として存在してもよい。トランスジェニックトウモロコシ植物、植物部分、種子または細胞に由来する試料における配列番号１〜８のいずれか１つまたは複数の特定は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシからＤＮＡが得られたことを示し、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の存在に特徴的である。
【００４４】
トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象は、導入遺伝子インサートに固有の配列、具体的には配列番号１４〜２２を含む。これらの配列は、この事象の導入遺伝子インサート内の様々なプロモーター、イントロン、葉緑体ターゲティングペプチド（ＣＴＰ）、３’終結シグナル、ｐａｔおよびｄｍｏ遺伝子に関する特定のキメラ構成に固有である。図１は、配列番号９に対するこれらの固有の導入遺伝子インサート配列のそれぞれの相対位置を図示する。
【００４５】
トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象に由来するＤＮＡの試料中の存在を判定するためのプライマーまたはプローブのいずれかとして使用することができる例示的ＤＮＡ分子が提供される。そのようなプライマーまたはプローブは標的核酸配列に対して特異的であり、したがって、本明細書に記載する方法によるトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の特定に有用である。
【００４６】
「プライマー」は、増幅反応をともなうアニーリングまたはハイブリダイゼーション法で使用するために設計されるＤＮＡ分子である。増幅反応は、アンプリコンを生成するために鋳型ＤＮＡを増幅するインビトロ反応である。本明細書で使用する場合、「アンプリコン」は、増幅法を使用して合成されたＤＮＡ分子である。本発明のアンプリコンは、配列番号１〜１０の１つもしくは複数またはそれらの断片を含むＤＮＡ配列を有する。アンプリコンを生成するために、増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、１対のプライマーを鋳型ＤＮＡ、例えばトウモロコシゲノムＤＮＡの試料とともに使用することができ、この場合、生成されたアンプリコンは、プライマーが鋳型にハイブリダイズした２つの部位間に位置する鋳型ＤＮＡの配列に対応するＤＮＡ配列を有することとなる。プライマーは、一般的には、相補的な標的ＤＮＡ鎖にハイブリダイズして、プライマーと標的ＤＮＡ鎖の間でハイブリッドを形成するように設計されている。プライマーの存在は、鋳型として標的ＤＮＡ鎖を使用してプライマーの伸長を開始するためのポリメラーゼによる認識点である。プライマー対は、それらの間のヌクレオチドセグメントを増幅する目的で、二本鎖ヌクレオチドセグメントの反対の鎖に結合する２つのプライマーの使用を指す。プライマー配列の例は、配列番号１１および配列番号１２として提供される。配列番号１１および配列番号１２として提供されるプライマー対は、第１のＤＮＡ分子および第２のＤＮＡ分子として有用であり、この場合、第１のＤＮＡ分子は配列番号９の断片であり、第２のＤＮＡ分子は配列番号１０のトウモロコシゲノムＤＮＡ配列の断片であり、増幅反応においてトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むＤＮＡと一緒に使用して試料中のトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象に特徴的であるアンプリコンを生成する場合に、それぞれが、ＤＮＡプライマーとして機能するのに十分な長さのものである。トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象のトウモロコシゲノムＤＮＡ配列は、配列番号１０の位置１〜１２４６および８００９〜９２５９として提供される。
【００４７】
「プローブ」は、標的核酸の鎖に相補的であり、ハイブリダイゼーション検出方法に有用である核酸分子である。本発明によるプローブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけでなく、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合するポリアミドおよび他のプローブ材料も含み、そのような結合の検出は、標的ＤＮＡ配列の存在または非存在の検出に有用であり得る。プローブは、従来の検出可能な標識またはレポーター分子、例えば、放射性同位体、リガンド、化学発光剤または酵素と結合していてもよい。トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を検出するためのプローブとして有用な例示的ＤＮＡ配列は、配列番号１３として提供される。
【００４８】
プライマーおよびプローブを設計および使用するための方法は当技術分野で周知であり、配列番号１〜１０の断片を含み、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を検出するためのプライマーおよびプローブとして有用なＤＮＡ分子は、当業者によって容易に設計され得る。
【００４９】
したがって、本明細書で提供されるＤＮＡ分子および対応するＤＮＡ配列は、トランスジェニックトウモロコシ植物、細胞、種子、部分においてトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を特定するのに、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトウモロコシ品種またはハイブリッドを選抜するのに、および試料中のトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の存在または非存在を検出するのに有用である。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「単離された」という用語は、その本来のまたは天然の状態において通常はそれに付随する他の分子から分子を分離することを指す。したがって、「単離された」という用語は、その本来のまたは天然の状態において通常はそれに付随する他のＤＮＡ分子（複数可）から分離されたＤＮＡ分子を指すことができる。そのようなＤＮＡ分子は、例えば組換えＤＮＡ分子などの組換えられた状態で存在してもよい。したがって、例えば組換え技法の結果として、通常は付随しない調節配列またはコード配列に融合したＤＮＡ分子は、細胞の染色体中に導入遺伝子として組み込まれている、または他のＤＮＡ分子とともに存在している場合でさえも、単離されているとみなされる。
【００５１】
本発明は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトウモロコシ植物、後代、種子、植物細胞および植物部分ならびにこれらを使用して生産された商品生産物を提供する。ＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニック除草剤耐性トウモロコシの種子の代表的な試料は、ブダペスト条約にしたがってアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ（登録商標））に寄託されている。ＡＴＣＣ保管所によって、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニック除草剤耐性トウモロコシ植物の種子に対して特許寄託指定ＰＴＡ−１２０８６０が割り当てられている。本発明の植物、後代、種子、植物細胞、植物部分および商品生産物は、配列番号１〜１０および配列番号１４〜２２として提供される配列の少なくとも１つを有する検出可能な量のＤＮＡを含む。本発明の植物、後代、種子、植物細胞および植物部分は、１種または複数のさらなるトランスジェニック形質、特に、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトウモロコシ植物をさらなるトランスジェニック形質（複数可）を含む別の植物と交配することによって導入されたものを含むこともできる。そのような形質としては、増大した昆虫抵抗性、増大した水利用効率、増大した収量性、増大した耐干性、向上した種子品質、改善された栄養品質、ハイブリッド種子の生産および／または除草剤耐性の増大が挙げられるが、これらに限定されず、ここでは、形質は、このようなトランスジェニック形質を欠くトウモロコシ植物に対して測定される。
【００５２】
本発明の植物を、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含む後代を作製するのに使用することができる。本明細書で使用する場合、「後代」は、祖先植物から遺伝したトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含む、任意の植物、種子および植物細胞を含み、これは、配列番号１〜１０から選択される少なくとも１つの配列を有するＤＮＡ分子を含む植物によって示される。植物、後代および種子は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象に関してホモ接合でもよいしヘテロ接合でもよい。後代植物は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトウモロコシ植物によって作られた種子から、またはトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含む花粉と受精したトウモロコシ植物によって作られた種子から生育させることができる。
【００５３】
本明細書で使用する場合、本発明の「植物部分」は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシ植物に由来する任意の部分である。植物部分としては、花粉、胚珠、さや、花、根、茎、繊維および葉が挙げられるが、これらに限定されない。植物部分は、生育できてもよいし生育できなくてもよい。
【００５４】
本発明は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシから生産される商品生産物を提供する。本発明の商品生産物は、配列番号１〜１０よりなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む検出可能な量のＤＮＡを含む。本明細書で使用する場合、「商品生産物」は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシ植物、トウモロコシ種子、トウモロコシ植物細胞またはトウモロコシ植物部分に由来する材料から構成される、任意の組成物または生産物を指す。商品生産物としては、加工された種子、穀粒、植物部分およびミールが挙げられるが、これらに限定されない。トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシは、一般的にトウモロコシから得られる任意の商品生産物を製造するのに使用することができる。本発明の商品生産物は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象に対応する検出可能な量のＤＮＡを含む。試料におけるこのＤＮＡの１つまたは複数の検出は、商品生産物の内容または源を決定するのに使用することができる。本明細書に開示される検出方法を含めて、ＤＮＡ分子の検出についての任意の標準的な方法を使用することができる。
【００５５】
本発明は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシとともにグルホシネートもしくはジカンバまたはグルホシネート除草剤およびジカンバ除草剤を使用して、雑草を管理する方法を提供する。トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシ植物をある区域に播種すること、およびトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシ植物を害することなく、その区域において雑草を管理する目的で、除草有効量のグルホシネートもしくはジカンバまたはグルホシネート除草剤およびジカンバ除草剤をその区域に施用することから成る、ある区域、例えば圃場で雑草を管理する方法を提供する。グルホシネートもしくはジカンバまたはグルホシネート除草剤およびジカンバ除草剤のそのような施用は、発芽前（トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシ種子を播種してから、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシ植物が発芽する前の任意の時期）でもよいし、発芽後（トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシ植物が発芽した後の任意の時期）でもよい。雑草を管理するための区域で使用するための除草有効量のグルホシネートは、生育期にわたって、エーカーあたり約０．１ポンド酸当量（ａｅ／ａｃ）から約１６ポンドａｅ／ａｃという量の範囲にわたるグルホシネートから成るべきである。雑草を管理するための区域で使用するための除草有効量のジカンバは、生育期にわたって、約０．１ポンドａｅ／ａｃから約１６ポンドａｅ／ａｃという量までの範囲にわたるジカンバから成るべきである。グルホシネートもしくはジカンバまたはグルホシネート除草剤およびジカンバ除草剤の複数の施用を生育期にわたって使用することができ、例えば２回の施用（例えば、播種前の施用および発芽後の施用もしくは発芽前の施用および発芽後の施用）または３回の施用（例えば、播種前の施用、発芽前の施用および発芽後の施用）である。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「活性成分」または「ａｉ」は、除草活性に関与する除草剤製剤の成分であり、これは、ガロンあたりのポンドで測定されるか、エーカーあたりのポンドとして適用されることが多い。酸（例えば、その構造の一部としてカルボキシル基を有する分子）である除草剤については、製剤化過程の間に、酸性基が、塩（所望のイオンに置き換えられて塩を形成し得る）またはエステル（アルコールと反応してエステルを形成する）に変換されることが多い。これは、特定の除草剤分子の化学的特徴だけでなく、質量も変化させ得る。しかし、対応する酸は製剤の除草活性部分であり、異なる活性成分間の除草活性の同等性は、測定値の標準単位としての酸当量を使用して計算することができる。「酸当量」という用語または「ａｅ」は、対応する酸に理論的に再変換され得る、製剤中の活性成分部分を意味する。除草剤の施用割合は、「エーカーあたりの酸当量」（「ａｅ／ａｃ」と略される）または「エーカーあたりの活性成分」（「ａｉ／ａｃ」と略される）として表すことができる。
【００５７】
トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含む除草剤耐性トランスジェニックトウモロコシ植物を作製する方法が提供される。これらの方法によって作製された後代は、変種でもハイブリッド植物でもよく、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシ植物によって作られた種子から生育してもよいし、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシ植物の花粉と受精したトウモロコシ植物によって作られた種子から生育してもよく、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象に関してホモ接合でもよいしヘテロ接合でもよい。植物を自家受粉（自殖」としても知られる）させてもよいし、他家受粉（「交配」としても知られる）させてもよい。トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシ植物を自家受粉させて、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象についてホモ接合である、植物の純粋な育種系統を作出することができる。自殖は「インブレッド」として知られる後代をもたらし、遺伝的に均一なインブレッド系統を作製するのに使用される。あるいは、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシ植物を異系交配して（トランスジェニックまたは非トランスジェニックの別の植物と掛け合わせて）、変種またはハイブリッド種子を作製することができる。本発明の方法によって作られた種子および後代植物はトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むこととなり、次いで、グルホシネートもしくはジカンバまたはグルホシネート除草剤およびジカンバ除草剤で処理することができる。グルホシネートもしくはジカンバまたはグルホシネート除草剤およびジカンバ除草剤による処理を使用して、耐性な後代を選抜することができる。あるいは、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含む植物または種子を選抜するための判定法を使用して、これらの後代植物を解析することができる。
【００５８】
本発明の植物、後代、種子、植物細胞および植物部分は、１種または複数のさらなるトウモロコシトランスジェニック形質、特に、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトウモロコシ植物をさらなるトランスジェニック形質（複数可）を含む別のトウモロコシ植物と交配することによって導入されたものを含むこともできる。そのようなトウモロコシトランスジェニック形質としては、増大した昆虫抵抗性、増大した水利用効率、増大した収量性、増大した耐干性、向上した種子品質、改善した栄養品質、ハイブリッド種子の生産および除草剤耐性が挙げられるが、これらに限定されず、ここでは、形質は、このようなトランスジェニック形質を欠くトウモロコシ植物に対して測定される。そのようなトウモロコシトランスジェニック形質は当業者に知られており、例えばそのような形質のリストは、米国農務省（ＵＳＤＡ）の動植物検疫局（ＡＰＨＩＳ）によって提供され、そのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｐｈｉｓ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ）に見出すことができる。したがって、２種のトランスジェニック植物を交配して、２つ以上の独立に分離するトランスジェニック形質を含む後代を作製することができる。親植物への戻し交配および非トランスジェニック植物との異系交配も企図され、同様に、栄養繁殖も企図される。異なる形質および作物に対して一般に使用される育種方法の説明は、いくつかの参考文献のうちの１つ、例えば、Ｆｅｈｒ，ｉｎ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｗｉｌｃｏｘ  Ｊ．編，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ（１９８７）に見出すことができる。
【００５９】
本発明の植物、種子、細胞、植物部分および商品生産物は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の存在を示すＤＮＡおよびタンパク質分子の検出に使用することができる。そのような検出は、本明細書で提供されるＤＮＡ配列ならびに配列番号９として提供される導入遺伝子インサートにコードされるそれぞれのＤＭＯおよびＰＡＴのタンパク質配列を使用して行われるであろう。トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の存在の検出は、当技術分野で既知の方法、例えば、核酸の熱増幅、核酸ハイブリダイゼーション法（ノーザンブロッティングおよびサザン解析など）、タンパク質検出法（ウエスタンブロッティング、免疫沈降および酵素結合免疫吸着測定法ベース（ＥＬＩＳＡ）の技法など）または本明細書で提供される検出方法および／もしくは検出キットを使用して行うことができる。ある方法は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシのＤＮＡからアンプリコンを生成することができるプライマー対とＤＮＡ試料を接触させること、増幅反応を行い、それによって配列番号１〜１０および配列番号１４〜２２として提供されるＤＮＡ配列の少なくとも１つを含むＤＮＡアンプリコンを生成すること、次いでアンプリコン分子の存在または非存在を検出すること、および場合により、アンプリコン配列内で、配列番号１〜１０および配列番号１４〜２２として提供される配列の少なくとも１つを含む配列を確認することを提供する。そのようなアンプリコンの存在は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシに対して特異的なＤＮＡの存在、したがって、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシに由来する、試料中の生物的物質の存在に特徴的である。別の方法は、ＤＮＡ試料をＤＮＡプローブと接触させること、プローブおよびＤＮＡ試料をストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供すること、次いで、プローブと標的ＤＮＡ試料の間のハイブリダイゼーションを検出することを提供する。ハイブリダイゼーションの検出は、ＤＮＡ試料における、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシに対して特異的なＤＮＡの存在に特徴的である。
【００６０】
トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象用のＤＮＡ検出キットを提供する。本明細書に開示される組成物および方法ならびにＤＮＡ検出の分野で周知の方法を使用して、そのようなキットの変形形態も開発することができる。トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシ植物を用いる育種のための方法にＤＮＡ検出キットを適用することができる。そのようなキットは、配列番号１〜１０の断片を含むＤＮＡプライマーまたはプローブを含む。そのようなキットの１例は、試料においてトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニック除草剤耐性トウモロコシ植物に由来するＤＮＡの存在および／または非存在を検出するのに有用なＤＮＡプローブとして機能するのに十分な長さの、配列番号１０の連続的なヌクレオチドの少なくとも１つのＤＮＡ分子を含む。試料中においてトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象ＤＮＡを含むトランスジェニック除草剤耐性トウモロコシの存在および／または非存在を決定、検出または判定するのに有用な、ＤＮＡプローブとして使用するのに十分なＤＮＡ分子が提供され、配列番号１３として提供される。他のプローブは、当業者によって容易に設計され得、配列番号１０の少なくとも約１５ヌクレオチドを含むべきであり、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象に由来するＤＮＡを特定するために、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象ＤＮＡを含むトランスジェニック除草剤耐性トウモロコシに十分に固有であるべきである。別の種類のキットは、試料においてトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の存在または非存在を検出するのに有用なアンプリコンを生成するのに有用なプライマー対を含む。そのようなキットは、標的ＤＮＡ試料をプライマー対と接触させること、次いで、配列番号１〜１０から選択される少なくとも１つの配列を有するＤＮＡ分子を含むアンプリコンを生成するのに十分な核酸増幅反応を行うこと、次いで、アンプリコンの存在または非存在を検出することを含む方法を用いることとなる。そうした方法は、アンプリコンまたはその断片の配列決定をすることを含むこともできる。他のプライマー対は、当業者によって容易に設計され得、配列番号１０の少なくとも２０ヌクレオチドを含むべきであり、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を検出するために、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象ＤＮＡを含むトランスジェニック除草剤耐性トウモロコシに十分にユニークであるべきである。本発明のキットは、任意で、本明細書に記載の検出もしくは判定反応を行うための試薬、またはキットおよびその内容物の使用のための説明書も含むことができる。
【００６１】
本明細書で使用する場合、用語「含む」は「含むが限定されない」を意味する。
【００６２】
寄託情報
ブダペスト条約にしたがって、所在地が１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ＵＳＡ，Ｚｉｐ  Ｃｏｄｅ  ２０１１０であるアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシ種子の代表的な試料の寄託を行った。トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含む種子に対するＡＴＣＣ特許寄託指定（受託番号）はＰＴＡ−１２０８６０であり、寄託の日付は２０１４年１月１７日であった。この寄託は、３０年間もしくは最後の依頼から５年間または本特許の有効期間のいずれか長い期間、保管所に維持される。
【実施例】
【００６３】
以下の実施例は、本発明をより十分に説明するために含まれる。開示される特定例において多くの修正を行うことができ、それにもかかわらず同様の結果を得ることができることを当業者は理解されたい。同じまたは同様の結果を得る限り、化学的および生理学的の両方に関連したある特定の薬剤で本明細書に記載の薬剤を置き換えることができる。当業者に明らかなすべてのそのような置換および修正は、本発明の範囲内にあるとみなされる。
【００６４】
実施例１：ＭＯＮ８７４１９事象の作製および選抜
本実施例は、ジカンバ除草剤およびグルホシネート除草剤の両方に耐性を与える事象である事象ＭＯＮ８７４１９を含むトランスジェニックトウモロコシの作製、解析および選抜を説明する。トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の究極的な選抜に必要とされる厳密な分子試験、表現型試験および圃場試験による、複数年にわたる何万もの個々の植物の作製および解析の概要を述べる。
【００６５】
様々な異なる発現カセットを含む形質転換ベクターを設計し、試験して、ｄｍｏおよびｐａｔ遺伝子を発現させることについてのそれらの有用性を確認した。このデータを使用して、発現要素の組み合わせを選択し、８つの異なる形質転換ベクターを構築し、トウモロコシに形質転換した。これらのベクターは、ｐａｔ遺伝子およびｄｍｏ遺伝子に対する２つのコード領域を用いて、様々な組み合わせでプロモーターおよびターミネーターを試験した（表１）。得られた植物をタンパク質発現について解析し、２つのベクター（表１にＡおよびＢとして示す）を商業的なトウモロコシ形質転換用に選択した。
【表１】
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【００６６】
選択した２つのベクター（ＡおよびＢ）を使用して、１３０００を超える固有の形質転換トウモロコシ植物を作製した。植物において、それぞれの事象間で、導入した遺伝子の発現レベルの幅広い変動があることが多く、遺伝子発現は、事象を含む植物の表現型と正または負に直接的に相関し得る。植物における外来遺伝子の発現は、特に、その染色体位置に影響されることが知られている。このような理由で、最適な事象を特定するために、複数年および複数の場所を通して、ランダムな挿入事象を含む多数の個々の植物をスクリーニングすることが必要であった。トランスジェニックトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象は、ＬＨ２４４トウモロコシの未熟胚のアグロバクテリウム媒介性形質転換によって作出した。トウモロコシを形質転換する方法は当技術分野で既知である。トウモロコシ細胞を形質転換し、インタクトなトウモロコシ植物に再生した。正常な表現型特徴を有する発根植物を選抜した。次いで、何千もの個々の独立の事象を土に移植して、生育させ、さらに評価した。
【表２】
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【００６７】
事象選抜過程の全体を通して、分子解析ならびに事象の表現型、農学性および有効性を評価するための圃場試験を行い、しばしば同時に行った（表２）。１３，０００個の個々の固有の形質転換トウモロコシのＲ０植物を、最初にＰＣＲによって解析して、単一コピーの導入遺伝子インサートを有する事象を選抜した（初回通過単一コピー）。これによって、２，９９８事象を先に進めた。次の選抜は、温室で行うＲ０の除草剤噴霧耐性であった。Ｖ１／Ｖ２生育段階で噴霧するグルホシネート（０．９ｌｂ  ａｉ／ａｃ）およびジカンバ（２．０ｌｂ  ａｅ／ａｃ）のタンク混合物を使用して、グルホシネート（Ｉｇｎｉｔｅ（登録商標）２８０除草剤）およびジカンバ（Ｃｌａｒｉｔｙ（登録商標）除草剤）の両方に対する耐性について植物を試験した。１５％超の損傷を示す植物を捨て、さらなる解析のために１，４４０事象を選抜した。最初の詳細な分子解析を行い、これは、配列の特定および確認ならびにコピー数およびバックボーンの非存在に関する第２の検査を含んでいた。この解析によって、先に進めるために選抜される、単一コピーのみの導入遺伝子インサートを含む１８４事象がもたらされた。Ｒ０事象から抽出したＤＮＡに対するサザン解析を行って、導入遺伝子インサートのコピー数をさらに確認し、形質転換バックボーンの非存在を確認した。これに基づいて、１１２事象を選抜して、さらなる解析のためにＲ１に進めた。Ｒ０植物を自家受粉させ、Ｒ１試験のための種子を採取した。
【００６８】
すべての圃場試験と同時に、さらなる分子解析が進行中であった。ノーザン解析を行って、ｐａｔおよびｄｍｏ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物を検出および測定した。選抜した事象を含むトランスジェニック植物から精製したＰＡＴおよびＤＭＯタンパク質のＮ末端プロテインの配列決定を行って、組換えタンパク質配列を確認した。ＰＡＴおよびＤＭＯタンパク質を検出するためのウエスタン解析を、トランスジェニック植物試料を用いて行った。導入遺伝子全体およびインサートの５’と３’末端の両方の配列決定を行い、続いて、これをそれぞれの事象を検出する方法を開発するのに使用した。Ｒ１植物に対して詳細なサザン解析を実施して、コピー数およびバックボーンの非存在を確認した。
【００６９】
Ｒ１圃場試験初期スクリーニングのために、Ｒ０スクリーニングから選抜した１１２事象のうち、種子の収穫量（ｓｅｅｄ  ｒｅｔｕｒｎ）および苗床の大きさの考慮に基づいて８２事象を選抜した。Ｒ１植物は分離し、それによりＲ１植物は、ある事象についてヌル、ヘミ接合またはホモ接合になった。高い除草剤施用割合を用いる圃場有効性スクリーニングにおいて、Ｒ１植物中の８２事象を評価した。グルホシネート（Ｉｇｎｉｔｅ  ２８０）とジカンバ（Ｃｌａｒｉｔｙ）の様々な組み合わせ（ラベルに表記される圃場施用量の最大２０倍のグルホシネートおよび最大１６倍のジカンバ）で、Ｖ１／Ｖ２からＶ８／Ｖ１０の様々な生育段階での施用タイミングで処理した後に、植物の損傷を評価した。損傷評定は、除草剤を施用してから１０〜１４日後に行った。標準的な損傷評定は、白化、奇形および繁殖のパーセントについてのスコアリングを含む。同じ事象を含む複数の植物についての全体の平均を使用して、先に進めるための事象を選抜した。２倍量での除草剤施用は、概して１０％未満の損傷をもたらし、１６倍量および２０倍量での除草剤施用は、１０％を超える損傷評価をもたらした。有効性試験に加えて、各植物について農学的スコアリングを収集し、これを、それが含む事象と相関させた。評価される農学的スコアリングの判断基準は、草高、穂の高さ、水分パーセント、試験重量、５０％花粉までの日数および５０％トウモロコシ毛までの日数を含んでいた。Ｒ１圃場試験および分子解析から集めたデータの解析に基づいて、さらなる解析のためのＲ２に進めるために４４事象を選抜した。Ｒ１植物を自家受粉させ、Ｒ２試験のための種子を採取した。
【００７０】
Ｒ２圃場試験の初期スクリーニングでは、Ｒ２およびＦ１事象（Ｒ１の異系交配由来）を、３か所（２つの州およびプエルトリコ）での圃場有効性スクリーニングにおいて評価した。グルホシネートとジカンバの施用量および施用タイミングの様々な組み合わせで処理した後に、植物の損傷を評価した。Ｒ２植物は事象に対してホモ接合であり、除草剤を施用した後の除草剤耐性失敗率は低く、これは、Ｒ１の結果を確証するものである。農学的データを集め、Ｒ１圃場試験と同様にスコア化した。遺伝子発現解析を含めたさらなる分子解析も使用して、最良の事象を含む植物を選抜した。Ｒ２およびＦ１圃場試験ならびに分子解析から集めたデータの解析に基づいて、さらなる解析のためのＲ３に進めるために４２事象を選抜した。Ｒ２植物を自家受粉させ、Ｒ３試験のための種子を採取した。
【００７１】
進んだ圃場試験のために、ハイブリッドおよびインブレッドの有効性圃場試験とハイブリッドおよびインブレッドの農学的圃場試験の両方を行った。農学的圃場試験は、有効性圃場試験と同じシーズン中に実施した。すべての圃場試験は無作為化完備ブロック計画を使用し、複数の場所で行った。有効性圃場試験と農学的圃場試験の両方について、圃場試験のシーズン全体を通して農学的スコアリングを集め、そのシーズンの終わりに収量を決定した（有効性収量または農学的収量）。有効性圃場試験を行って、除草剤施用の後１０〜１４目の作物の損傷、作物の損傷評定および収量を評価した。事象を先に進めるための標的作物損傷評定は、１０％未満のスコアであった。農学的圃場試験については、小区画の土地を雑草無しに維持し、生育期の間、グルホシネートもジカンバ除草剤も施用しなかった。ハイブリッドの農学的圃場試験は、トランスジェニックハイブリッド交配種を作るのに使用された同じ親のトウモロコシ系統を使用して作製された、比較可能なハイブリッドの対照（ハイブリッド対照）を含んでいたが、トランスジェニック事象は含んでいなかった。インブレッド対照は、トランスジェニックインブレッド系統と比較可能なインブレッドであった。
【００７２】
複数のシーズン、複数の場所の圃場試験のデータの集合を使用して、メタ解析を実施した。表３は、ある観察結果が、事象のうちのいずれか１つを含む植物に対する特定の圃場試験タイプで反復された反復数を示す。２つの事象のそれぞれについて、ハイブリッドの農学的性能について記録された１３５個のデータ点、ハイブリッドの有効性について９３３個のデータ点、インブレッドの農学的について１７９個のデータ点、インブレッドの有効性について３０個のデータ点、および事象を含むトウモロコシに対する除草剤施用割合の事象ベースの圧力テストについて１６個のデータ点があった。
【表３】
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【００７３】
選抜した２３事象（Ｒ２圃場試験からの４２事象のサブセット）のうちの１つをそれぞれ含むハイブリッド植物を、南米（ＳＡ）１年目の逆シーズンの有効性圃場試験および農学的圃場試験で評価した。６か所において、処理あたり４処理および２反復での無作為化完備ブロック計画で試験を行った。有効性圃場試験では、ジカンバ製剤はＢａｎｖｅｌ（登録商標）４ＳＬ除草剤であり、グルホシネート製剤はＬｉｂｅｒｔｙ（登録商標）１．６７ＳＬであった。除草剤処理は以下から成っていた：（１）未処理の対照；（２）２ポンドａｅ／エーカー（ａｃ）ＰＲＥのジカンバ（ＰＲＥは、播種または作物が発芽する前の時点として定義される）、それに続いて、ＶＥ〜Ｖ２、続いてＶ４、続いてＶ８のそれぞれで施用される１ポンドａｅ／ａｃのジカンバ；（３）ＶＥ〜Ｖ２、続いてＶ４、続いてＶ８において０．８ポンドａｉ／ａｃで施用されるグルホシネート；および（４）ＶＥ〜Ｖ２、続いてＶ４、続いてＶ８において０．８ポンドａｉ／ａｃで施用されるグルホシネート＋１ポンドａｅ／ａｃで施用されるジカンバ。損傷評定は、除草剤を施用してから１０〜１４日後に行った。同じ事象を含む複数の植物についての全体の平均を使用して、先に進めるための事象を選抜した。標的作物の損傷評定は１０％未満のスコアであり、観察された損傷評定は１％未満であった。ハイブリッドの損傷スコアリング、農学的スコアリング、有効性収量、農学的収量、およびさらなる分子解析に基づいて、先に進めるための１７事象を選抜した。
【００７４】
次いで、ＳＡ１年目の逆シーズンの圃場試験から進められた１７事象由来のインブレッドおよびハイブリッド植物を、米国（ＵＳ）１年目の有効性圃場試験および農学的圃場試験でさらに評価した。これらの試験は、米国では激しい干ばつ期であった２０１２年に行った。ハイブリッドの有効性圃場試験を、２つの州の１２か所で、処理あたり６処理および３反復での無作為化完備ブロック計画で行った。トランスジェニック事象を含むハイブリッド植物は、交配で雄親からグリホサート耐性を得た。これらの有効性圃場試験では、グリホサート製剤はＲｏｕｎｄｕｐ  ＰｏｗｅｒＭＡＸ（登録商標）４．５ＳＬであり、ジカンバ製剤はＣｌａｒｉｔｙ  ４ＳＬであり、グルホシネート製剤はＩｇｎｉｔｅ  ２８０  ２．３４ＳＬであった。除草剤処理は以下から成っていた：（１）未処理の対照；（２）Ｖ４、続いてＶ８で施用される３ポンドａｅ／ａｃのグリホサート；（３）Ｖ２、続いてＶ４、続いてＶ８で施用される０．８ポンドａｉ／ａｃのグルホシネート；（４）ＰＲＥで施用され、次いで再びＶ４、続いてＶ８で施用される２ポンドａｅ／ａｃのジカンバ；（５）Ｖ２、続いてＶ４、続いてＶ８で施用される３ポンドａｅ／ａｃのグリホサート＋１．５ポンドａｅ／ａｃのジカンバ；（６）Ｖ２で施用される２ポンドａｅ／ａｃのジカンバ、続いて、生育段階Ｖ４で施用される０．８ポンドａｉ／ａｃのグルホシネート＋１ポンドａｅ／ａｃのジカンバ、続いて、生育段階Ｖ８で施用される３ポンドａｅ／ａｃのグリホサート＋１．５ポンドａｅ／ａｃのジカンバ。損傷評定は、除草剤を施用してから１０〜１４日後に行った。同じ事象を含む複数の植物についての全体の平均を使用して、先に進めるための事象を選抜した。標的作物の損傷評定は１０％未満のスコアであり、観察された損傷評定は１％未満であった。ハイブリッドの損傷スコアリング、農学的スコアリング、有効性収量、農学的収量およびさらなる分子解析に基づいて、先に進めるための１１事象を選抜した。
【００７５】
次いで、これらの１１事象を含む植物を用いて、ハイブリッドの有効性およびインブレッドの農学的収量を評価するための南米（ＳＡ）２年目の逆シーズンの圃場試験を行った。トランスジェニック事象を含むハイブリッド植物は、交配で雄親からグリホサート耐性を得た。ハイブリッドの有効性圃場試験を、基本的に、南米（ＳＡ）１年目の逆シーズンの圃場試験に記載されているように行ったが、以下の除草剤処理を用いた：（１）未処理の対照；（２）Ｖ４、続いてＶ８で施用される３ポンドａｅ／ａｃのグリホサート；（３）Ｖ４、続いてＶ８で施用される０．８ポンドａｉ／ａｃのグルホシネート；（４）ＰＲＥで施用され、次いで再びＶ４、続いてＶ８で施用される２ポンドａｅ／ａｃのジカンバ；（５）Ｖ４、続いてＶ８で施用される３ポンドａｅ／ａｃのグリホサート＋１．５ポンドａｅ／ａｃのジカンバ；（６）Ｖ４で施用される０．８ポンドａｉ／ａｃのグルホシネート＋１ポンドａｅ／ａｃのジカンバ、続いてＶ８で施用される３ポンドａｅ／ａｃのグリホサート＋１．５ポンドａｅ／ａｃのジカンバ。損傷評定は、除草剤を施用してから１０〜１４日後に行った。同じ事象を含む複数の植物についての全体の平均を使用して、先に進めるための事象を選抜した。ハイブリッドの損傷スコアリング、農学的スコアリング、ハイブリッドの有効性収量、インブレッドの農学的収量、およびさらなる分子解析に基づいて、先に進めるための５事象を選抜した。
【００７６】
次いで、これらの５事象についてさらなる分子解析を完了した。次いで、ハイブリッド形質の有効性圃場試験、ハイブリッドおよびインブレッドの収量測定、農学的スコアリングならびに分子情報を含めた、５事象のそれぞれに対する複数年の圃場および分子データを精査し、さらなる解析のために２事象を選抜した。これらの事象の両方は、同じ形質転換ベクターを使用して作製されており、したがって、同じ導入遺伝子インサートを有するが、同じゲノム位置も隣接配列も有さない。
【００７７】
米国（ＵＳ）２年目のハイブリッドおよびインブレッドの有効性圃場試験ならびにハイブリッドおよびインブレッドの農学的圃場試験を行って、これら２つの事象を評価した。ハイブリッドの有効性試験は、１年目のＵＳ圃場試験と同様に行ったが、異なる噴霧レジメンを含んでいた。有効性は、損傷評定およびハイブリッドの有効性収量によって測定した。事象に対するさらなる分子解析も行った。トランスジェニック事象を含むハイブリッド植物は、交配で雄親からグリホサート耐性を得た。ハイブリッドの有効性１および２の圃場試験は２つの州にわたって１２箇所で行い、ハイブリッドの有効性３の圃場試験は４つの州にわたって３３か所で行った。これらの圃場試験では、グリホサート製剤はＲｏｕｎｄｕｐ  ＰｏｗｅｒＭＡＸ  ４．５ＳＬであり、ジカンバ製剤はＣｌａｒｉｔｙ  ４ＳＬであり、グルホシネート製剤はＩｇｎｉｔｅ  ２８０  ２．３４ＳＬであった。有効性１および有効性２の試験（２つの別々のインブレッド系統との交配種を用いる）についての除草剤施用は：（１）未処理の対照；（２）ＶＥ〜Ｖ２、続いてＶ６で施用される０．４ポンドａｉ／ａｃのグルホシネート；（３）ＶＥ〜Ｖ２、続いてＶ６で施用される０．８ポンドａｉ／ａｃのグルホシネート；（４）Ｖ４、続いてＶ８で施用される０．５ポンドａｅ／ａｃのジカンバ；（５）Ｖ４、続いてＶ８で施用される１．０ポンドａｅ／ａｃのジカンバ；および（６）Ｖ４、続いてＶ８で施用される２．２５ポンドａｅ／ａｃのグリホサート＋１．０ポンドａｅ／ａｃのジカンバであった。有効性３試験（第３のインブレッド系統との交配由来のハイブリッドに相当する）についての除草剤施用は：（１）未処理の対照；（２）ＶＥ〜Ｖ２で施用される０．５ポンドａｅ／ａｃのジカンバ、続いてＶ６で施用される０．４ポンドａｉ／ａｃのグルホシネート；および（３）ＶＥ〜Ｖ２で施用される１．０ポンドａｅ／ａｃのジカンバ、続いてＶ６で施用される０．８ポンドａｉ／ａｃのグルホシネートであった。損傷評定は、除草剤を施用してから１０〜１４日後に行い、同じ事象を含む複数の植物について、損傷評定を使用して、先に進めるための事象を選抜した。収量および農学的データを集めた。
【００７８】
２つの事象についてハイブリッドの損傷評定を比較するために、複数のハイブリッドの有効性圃場試験に関するメタ解析を完了した（表４）。損傷評定をＶ８において統計学的な最小有意差（ｐ＜０．０５でのＬＳＤ）でスコア化した（Ｖ８の解析は、Ｖ２、Ｖ４、Ｖ６およびＶ８での除草剤施用由来の累積損傷を包含する）。テスター１、テスター２およびテスター３は、指定の圃場試験用のハイブリッドを作出するのに使用した３つの独立したインブレッドトウモロコシ親系統との交配種を表す。各試験について、２つの事象のいずれかを含むトランスジェニックトウモロコシ親を使用して作出されたハイブリッド間で、損傷評定における統計的差異は見られなかった。
【表４】
0006606164.tif 000005
【００７９】
複数の有効性圃場試験由来のハイブリッドの有効性収量（ブッシェル／エーカー）のメタ解析を完了し、２つの事象のそれぞれを含むハイブリッドからの収量を比較した（表５）。各試験について、２つの事象のいずれかを含むトランスジェニックトウモロコシ親を使用して作出されたハイブリッド間で、ハイブリッドの有効性収量の統計的差異は見られなかった。
【表５】
0006606164.tif 000006
【００８０】
２つの事象のうちのいずれか１つを含むハイブリッドトランスジェニックトウモロコシを用いて、圧力試験の圃場試験も行った。圧力試験では、グルホシネート（Ｉｇｎｉｔｅ  ２８０、２．３４ＳＬ）またはジカンバ（Ｃｌａｒｉｔｙ  ４ＳＬ）除草剤のいずれかを非商業的な高い割合で施用した。典型的な圃場試験については、グルホシネートに対する１倍量は０．４ポンドａｉ／ａｃであり、ジカンバに対する１倍量は０．５ポンドａｅ／ａｃであった。グルホシネート圧力試験の圃場試験については、グルホシネートをＶＥ〜Ｖ２、続いてＶ４、続いてＶ８において、以下の割合で施用した：（１）１ポンドａｉ／ａｃ（２．５倍）；（２）２ポンドａｉ／ａｃ（５倍）；（３）４ポンドａｉ／ａｃ（１０倍）；および（４）８ポンドａｉ／ａｃ（２０倍）。ジカンバ圧力試験の圃場試験については、ジカンバをＶＥ〜Ｖ２、続いてＶ４、続いてＶ８において、以下の割合で施用した：（１）２ポンドａｅ／ａｃ（４倍）；（２）４ポンドａｅ／ａｃ（８倍）；（３）８ポンドａｅ／ａｃ（１６倍）；および（４）１６ポンドａｅ／ａｃ（３２倍）。シーズンの終わりに、ハイブリッドの圧力試験の圃場試験を収穫し、収量（ブッシェル／エーカーまたはｂｕ／ａｃ）を決定した。収量データの解析は、２つの事象のいずれかを含むハイブリッドを比較した。各試験について、除草剤施用割合のいずれかにおける収量の統計的差異は、２つの事象のいずれかを含むトランスジェニックトウモロコシ親を使用して作出されたハイブリッド間で見られなかった。
【表６】
0006606164.tif 000007
【００８１】
ハイブリッドの農学的圃場試験を、３つの州にわたる２１か所での、セットあたり１５か所で３セットにおいて行い、ハイブリッドの有効性圃場試験と同じシーズン中に実施した。圃場試験のシーズンを通じて農学的測定値を得、そのシーズンの終わりに農学的収量を決定した。複数のシーズン、複数の場所のハイブリッドの農学的圃場試験の全体にわたるメタ解析を使用して、ハイブリッド対照の収量と２つの事象のうちのいずれか１つを含むハイブリッドの収量とを比較した。ハイブリッドの農学的収量の統計的差異はトランスジェニックハイブリッドの間またはハイブリッド対照と比較した場合のどちらでも見られなかった（表７）。
【表７】
0006606164.tif 000008
【００８２】
インブレッドの有効性圃場試験を、１つの州の６か所で、無作為化完備ブロック計画を使用して行った。これらの圃場試験では、ジカンバ製剤はＣｌａｒｉｔｙ  ４ＳＬであり、グルホシネート製剤はＩｇｎｉｔｅ  ２８０  ２．３４ＳＬであった。インブレッドの有効性圃場試験についての除草剤施用は、ＶＥ〜Ｖ２で施用される０．８ポンドａｉ／ａｃのグルホシネートおよび２．０ポンドａｅ／ａｃのジカンバ、続いてＶ８で施用される０．８ポンドａｉ／ａｃのグルホシネートおよび２．０ポンドａｅ／ａｃのジカンバであった。シーズンの終わりに、収量を測定した。各試験について、２つの事象のいずれかを含むトランスジェニックトウモロコシのこれらの試験から収穫されたインブレッドの収量を比較した場合、インブレッドの有効性収量において統計的差異が見られた（表８）。これらのデータは、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシの優れた性能を示す。
【表８】
0006606164.tif 000009
【００８３】
ＵＳ１年目有効性圃場試験、ＳＡ１年目有効性圃場試験およびＵＳ２年目有効性圃場試験（１１か所、１つの州）を用いて、インブレッドの農学的圃場試験を同じシーズン中に実施した。複数の場所で行われる無作為化完備ブロック計画において、小区画の土地を準備し、試験は、トランスジェニックインブレッド系統と比較可能なインブレッドという対照を含んでいた。複数のシーズン、複数の場所のインブレッドの農学的圃場試験の全体にわたるメタ解析を行って、対をなす対照および２つの事象のいずれかを使用して作出されたトランスジェニックインブレッドに関して収量を比較した。インブレッドの農学的収量の統計的差異は、対照とＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシとの間に見られなかった（表９）。その一方、対照またはＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシのいずれかと比較した場合、トランスジェニック事象２を含むトウモロコシにおいて収量の統計学的に有意な低下があった。これらのデータによって、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシの優れた性能がさらに示された。
【表９】
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【００８４】
実施例２：トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象のＤＮＡ配列の特性評価
本実施例は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象について行われた広範な分子特性評価を説明する。トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の導入遺伝子インサートは、５’から３’の向きに、以下を含む：（ｉ）プロモーター（Ｐ−ＡＮＤｇｅ．Ｕｂｑｌ）、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ  ｇｅｒａｒｄｉｉ由来のユビキチン遺伝子（Ｕｂｑ）のリーダーおよびイントロン（Ｌ−Ｉ−ＡＮＤｇｅ．Ｕｂｑ１）（これらは、グルホシネート除草剤に対する耐性を与えるホスフィノトリシンＮ‐アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）をコードするＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ由来の  ｐａｔ遺伝子（ＣＲ−ＳＴＲｖｉ．ｐａｔ）に作動可能に連結され、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａのＲＡ５Ｂ前駆体遺伝子由来のポリアデニル化シグナル（ｍＲＮＡのポリアデニル化を導くターミネーターとしても知られる）（Ｔ−Ｏｓ．Ａｒａ５）に作動可能に連結される）、ならびに（ｉｉ）２重エンハンサー領域を含むピーナッツクロロティックストリークウイルスの完全長転写産物に対するプロモーター（ＰＣｌＳＶ）（これは、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ由来の集光性複合体ｂ１遺伝子のリーダー（Ｌ−Ｔａ．Ｌｈｃｂｌ）に作動可能に連結され、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ由来のアクチン１遺伝子の第１イントロン（Ｉ−Ｏｓ．Ａｃｔ１）に作動可能に連結され、Ｐｅｔｕｎｉａ  ｘ  ｈｙｂｒｉｄａの５−エノイルピルビニルシキミ酸−３−リン酸合成酵素遺伝子由来のＮ末端葉緑体トランジットペプチド（ＴＳ−Ｐｈ．ＳｈｋＧ−ＣＴＰ４）に作動可能に連結され、ジカンバ除草剤に対する耐性を与えるジカンバモノオキシゲナーゼ（ＤＭＯ）をコードし、単子葉植物での発現に最適化された、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａのｄｍｏ遺伝子（ＣＲ−ＳＴＥｍａ．ＤＭＯ）に作動可能に連結され、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ由来の熱ショックタンパク質１７のポリアデニル化シグナル（Ｔ−Ｔａ．Ｈｓｐ１７）に作動可能に連結される）。導入遺伝子インサートの５’末端はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓの右境界配列に隣接し、導入遺伝子インサートの３’末端はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓの左境界配列に隣接していた。
【００８５】
サザンブロット解析を行って、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシが、いかなるベクターバックボーンも有さずに、完全な導入遺伝子インサートの単一でインタクトなコピーを含むことを確認した。隣接配列をインサートの５’と３’末端の両方から単離し、インバースＰＣＲおよび／またはゲノムウォーキング法を使用して、それぞれの接合部を決定した。トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象のインサートの染色体位置を、インバースＰＣＲを使用して決定して、目的部位の外側のゲノムＤＮＡを増幅した。トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象に対する隣接配列を、既知のトウモロコシゲノム物理アセンブリに対して位置付けし、いかなる既知遺伝子の中にもトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象が存在しないことを確認した。この配列情報を使用して、試料中のトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の存在を特定するための、事象特異的なエンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイを設計した。挿入部位の配列情報も、事象の染色体位置に関するバイオインフォマティクス解析に使用した。挿入部位の完全性を、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の隣接領域に特異的なプライマーを使用して、野生型アレル全体にわたって、ＰＣＲにより決定した。野生型の挿入部位を使用して、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象に関する導入遺伝子組み込みの固有部位をトウモロコシ参照ゲノムに位置付けした。導入遺伝子のいかなる領域にも変化または変異が形質転換の中に導入されていないということを確実にするために、トウモロコシＭＯＮ８７４１９の導入遺伝子インサート全体さえも植物から単離し、配列決定した。
【００８６】
トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシの穀粒から免疫精製されたタンパク質抽出物を使用して、発現したＰＡＴおよびＤＭＯタンパク質のＮ末端プロテイン配列決定を実施した。次いで、この配列を使用して、真正のＮ末端アミノ酸配列を確認した。トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシの穀粒からのタンパク質抽出物に対してウエスタン解析を行った。これによって、それぞれＰＡＴおよびＤＭＯに関して、単一の予期される大きさのタンパク質が産生されていることが確認された。ＥＬＩＳＡを開発して、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象から発現したＰＡＴまたはＤＭＯタンパク質について、トランスジェニックトウモロコシの様々な組織タイプ（葉、種子、根および花粉）におけるタンパク質レベル決定した。トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシの穀粒から単離されたポリＡ  ＲＮＡに対して、ノーザン解析を行った。これによって、ｐａｔおよびｄｍｏ  ｍＲＮＡ生成物に関して、転写産物の大きさおよび数が確認された。トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシ由来の試料を使用して、リアルタイムＰＣＲによってＲＮＡ発現レベルも測定した。
【００８７】
実施例３：事象特異的なエンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイ
本実施例は、試料中にトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含むトランスジェニックトウモロコシを特定するために開発された、事象特異的なエンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）熱増幅法を説明する。エンドポイントアッセイで使用されるＤＮＡプライマーは、プライマーＳＱ２６６４４（配列番号１１）、ＳＱ２６６４５（配列番号１２）および６−ＦＡＭ（商標）標識されたプローブＰＢ１１２０７（配列番号１３）であった。６−ＦＡＭ（商標）は、ＤＮＡプローブに結合された、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）の蛍光色素製品である。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＭＧＢ（商標）プローブについては、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性が、フルオロフォアとクエンチャーの間で、５’末端からプローブを切断する。標的ＤＮＡ鎖にハイブリダイズすると、クエンチャーおよびフルオロフォアが、蛍光シグナルを生成するのに十分な程度に分離されるので、蛍光が放出される。こうした反応方法およびＰＢ１１２０７と使用される場合のＳＱ２６６４４およびＳＱ２６６４５は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象に特徴的であるＤＮＡアンプリコンを生成する。この解析の対照は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含む陽性対照、非トランスジェニックトウモロコシ由来の陰性対照および鋳型ＤＮＡを含まない陰性対照を含むべきである。さらに、ＰＣＲ反応に対する対照は、トウモロコシゲノム中の単一コピー遺伝子に特異的な内部対照プライマーおよび内部対照プローブを最適に含むべきである。これらのアッセイは、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（最大スピードで実施）またはＭＪ  ＲｅｓｅａｒｃｈのＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  ＰＴＣ−２２５サーマルサイクラーのいずれかを用いる使用に最適化されているが、他の機器を使用してもよい。
【００８８】
トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の検出に有用なエンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイ法とともに有用な条件の例は、以下の通りである。ステップ１：１８メグオームの水を１０μｌの最終量に調整する。ステップ２：５．０μｌの２×ユニバーサルマスターミックス（ｄＮＴＰｓ、酵素、緩衝液）を１×終濃度にする。ステップ３：０．５μｌの事象プライマー１（ＳＱ２６６４４）および事象プライマー２（ＳＱ２６６４５）。混合（各プライマーについて、１８メグオームの水に再懸濁して２０ｕＭの濃度にする）して１．０μＭの終濃度にする（例えば微量遠心機チューブ中で、２０ｕＭの終濃度で５００μｌになるように以下のものを加えるべきである：１００μＭの濃度の１００μｌのプライマーＳＱ２６６４；１００μＭの濃度の１００μｌのプライマーＳＱ２６６４５；３００μｌの１８メグオームの水）。ステップ４：０．２μｌの事象６−ＦＡＭ（商標）ＭＧＢプローブＰＢ１１２０７（１０ｕＭ）（１８メグオームの水に再懸濁して、１０μＭ〜０．２μＭの濃度の終濃度にする。ステップ５：０．５μｌの内部対照プライマー１および内部対照プライマー２の混合物（１８メグオームの水に再懸濁して、各プライマーについて２０μＭの濃度にする）を１．０μＭの終濃度にする。ステップ６：０．２μｌの内部対照ＶＩＣ（商標）プローブ（１０ｕＭ）を０．２μＭの終濃度にする（１８メグオームの水に再懸濁して、１０μＭの濃度にする）。ステップ７：以下のものを含む各々を用いた各試料についての３．０μｌの抽出ＤＮＡ（鋳型）。１．解析すべき葉試料；２．陰性対照（非トランスジェニックＤＮＡ）；３．陰性水対照（鋳型無し）；４．トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象のＤＮＡを含む陽性対照トランスジェニックトウモロコシ。ステップ８：以下のサーモサイクラー条件：５０℃で２分間の１サイクル；９５℃で１０分間の１サイクル；９５℃で１５秒間、次いで６４℃で１分間の１０サイクル（（−１℃／サイクル）をともなう）；９５℃で１５秒間、次いで５４℃で１分間の３０サイクル、随意の付加的な１０〜２０サイクル（９５℃で１５秒、次いで６４℃で１分間（−１℃／サイクル）は、エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）解析中に、より明確な集団分離を提供し得る）；１０℃の最終サイクル。
【００８９】
実施例４：接合状態アッセイ
接合状態アッセイは、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象を含む植物が事象または野生型アレルについてヘテロ接合であるかホモ接合であるかを決定するのに使用することができる。増幅反応アッセイは、本明細書で提供される配列情報を使用して設計することができる。例えば、そのようなＰＣＲアッセイは、少なくとも３つのプライマー、すなわちプライマー１、プライマー２およびプライマー３の設計を含むことになり、この場合、プライマー１はトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の３’隣接部でトウモロコシゲノムＤＮＡに特異的であり、プライマー２はトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象の導入遺伝子インサートに特異的であり、プライマー３は野生型アレルに特異的である。増幅反応でプライマー対として使用する場合、プライマー１はプライマー２とともにトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象に対して特異的なＰＣＲアンプリコンを生成する。増幅反応でプライマー対として使用する場合、プライマー１はプライマー３とともに野生型アレルに対して特異的なＰＣＲアンプリコンを生成する。トウモロコシゲノムＤＮＡに対して実施するＰＣＲ反応では、（プライマー１＋プライマー２）および（プライマー１＋プライマー３）から作出されたそれぞれのＰＣＲアンプリコンは、アンプリコンの配列および大きさが異なる。３つのプライマーが、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象についてホモ接合の植物から抽出されたＤＮＡを用いるＰＣＲ反応に含まれる場合は、プライマー１＋プライマー２のアンプリコンのみが作出される。３つのプライマーが、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象についてヘテロ接合の植物から抽出されたＤＮＡを用いるＰＣＲ反応に含まれる場合は、プライマー１＋プライマー２のアンプリコンおよびプライマー１＋プライマー３のアンプリコンの両方が作出される。３つのプライマーが、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象についてヌルである（野生型である）植物から抽出されたＤＮＡを用いるＰＣＲ反応に一緒に混合される場合は、プライマー１＋プライマー３のアンプリコンのみが作出される。
【００９０】
トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象について、トウモロコシ植物の接合状態を決定する別の方法は、エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）熱増幅反応である。このタイプのアッセイについては、上記のプライマーに加えて、アッセイは、２つの蛍光標識プローブを含むことになる。プローブ１はトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象に対して特異的であり、プローブ２はトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象についてヌルである（野生型）トウモロコシ植物に対して特異的であることとなり、この場合、２つのプローブは、異なる蛍光標識、例えば６−ＦＡＭ（商標）標識またはＶＩＣ（商標）標識を含む。エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）熱増幅反応で使用される場合、プライマー１＋プライマー２＋プローブ１は、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象に対して特異的な第１の蛍光シグナルを生成する。エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）熱増幅反応で使用される場合、プライマー１＋プライマー３＋プローブ２は、野生型トウモロコシに対して特異的な第２の蛍光シグナルを生成する。３つのプライマーおよび２つのプローブが、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象についてホモ接合の植物から抽出されたＤＮＡを用いるエンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）熱増幅反応に含まれる場合、（プライマー１＋プライマー２＋プローブ１に特異的な）第１の蛍光シグナルのみが発生する。３つのプライマーが、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象についてヘテロ接合の植物から抽出されたＤＮＡを用いるエンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）熱増幅反応に含まれる場合、（プライマー１＋プライマー２＋プローブ１に特異的な）第１の蛍光シグナルおよび（プライマー１＋プライマー３＋プローブ２に特異的な）第２の蛍光シグナルの両方が発生する。３つのプライマーが、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象に対してヌル（野生型）である植物から抽出されたＤＮＡを用いるエンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）熱増幅反応に一緒に混合される場合、（プライマー１＋プライマー３＋プローブ２に特異的な）第２の蛍光シグナルのみが発生する。
【００９１】
トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象について植物の接合状態を決定する別の方法はサザン解析であろう。トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象に対して特異的なサザンハイブリダイゼイションプローブ（複数可）およびトウモロコシＭＯＮ８７４１９事象についてヌル（野生型）であるトウモロコシ植物に対して特異的な第２のサザンハイブリダイゼイションプローブを設計する方法を、当業者なら知っているであろう。サザン解析を用いて、第１のサザンハイブリダイゼイションプローブからのみ検出されるシグナルは、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象についてホモ接合である植物を示し、第１のサザンハイブリダイゼイションプローブと第２のサザンハイブリダイゼイションプローブの両方から検出されるシグナルは、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象についてヘテロ接合である植物を示し、第２のサザンハイブリダイゼイションプローブからのみ検出されるシグナルは、トウモロコシＭＯＮ８７４１９事象についてヌル（野生型）である植物からＤＮＡが抽出されたことを示す。
【図１】
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【配列表】
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