(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
弱毒ＲＮＡウイルスを生成するための方法であって、以下のステップ：
ステップＩ）感染性ＲＮＡウイルスの全ウイルスゲノムのヌクレオチドコドンの一部分を、同じアミノ酸をコードする別のヌクレオチドコドンによってランダムに置換することによって、前記感染性ＲＮＡウイルスのウイルスゲノムを再コードするステップであって、ただし、
ｉ）前記ウイルスゲノムに存在する希少ヌクレオチドコドンの数および位置は変更せず、前記希少ヌクレオチドコドンとはＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＵＣＧ、ＣＣＧ、ＧＣＧおよびＡＣＧであり、
ｉｉ）ＲＮＡ二次構造に関与する前記ウイルスゲノムの領域は変更しないという条件である、ステップと、
ステップＩＩ）
サブステップＩＩ．ａ）ステップＩ）で得られた再コードウイルスゲノムの５’位にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを導入し、任意には３’位にターミネーターおよびＲＮＡポリアデニル化配列を導入するステップ、
サブステップＩＩ．ｂ）前記プロモーターならびに任意には前記ターミネーターおよびＲＮＡポリアデニル化配列を含む、サブステップａ）で調製された前記再コードウイルスゲノムを、少なくとも２、好ましくは少なくとも３、４、５または６の重複するｃＤＮＡフラグメントに増幅するステップ、
サブステップＩＩ．ｃ）前記ｃＤＮＡフラグメントを宿主細胞にトランスフェクトするステップ、
サブステップＩＩ．ｄ）サブステップｃ）の前記宿主細胞をインキュベートするステップ、および
サブステップＩＩ．ｅ）前記インキュベートした宿主細胞から前記感染性ＲＮＡウイルスを回収するステップ
によって弱毒ＲＮＡウイルスを生成するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
ステップＩ）において、前記感染性ＲＮＡウイルスの前記全ウイルスゲノムの前記ヌクレオチドコドンの約１％から約２０％が、同じアミノ酸をコードする別のヌクレオチドコドンによって置換される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップＩ）は、
前記感染性ＲＮＡウイルスの前記全ウイルスゲノムによってコードされるアミノ酸配列を定め、各アミノ酸をコードする各ヌクレオチドコドンを定めるステップと、
表１のアミノ酸をコードする前記ウイルスゲノムの前記ヌクレオチドコドンの１％から２０％を、次の表で指定されるとおりの同じアミノ酸をコードする異なるヌクレオチドコドンによって置換するステップと
【表１】
0006541695.tif 000007
によって行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ウイルスはプラス一本鎖ＲＮＡウイルスであり、好ましくはフラビウイルス、アルファウイルス、およびエンテロウイルスからなる群より選択されるウイルスである、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ステップＩＩ．ａ）において、
５’位におけるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの前記プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ｐＣＭＶ）であり、および／または
前記任意のターミネーターおよびＲＮＡポリアデニル化配列はそれぞれ、肝炎デルタリボザイムおよびサルウイルス４０ポリアデニル化シグナル（ＨＤＲ／ＳＶ４０ｐＡ）である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
サブステップＩＩ．ｃ）は、サブステップｂ）で得られた前記ｃＤＮＡフラグメント自体の直接トランスフェクションのステップであり、
前記サブステップＩＩ．ｃ）はサブステップＩＩ．ｂ）の直後に起こる、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
サブステップＩＩ．ｃ）は、サブステップＩＩ．ｂ）で得られたｃＤＮＡフラグメントを含むプラスミドまたはベクターのトランスフェクションのステップであり、各ｃＤＮＡフラグメントは個々の分離したプラスミドまたはベクター内にある、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
サブステップＩＩ．ｃ）のトランスフェクトされたｃＤＮＡフラグメントは、インキュベーションのサブステップＩＩ．ｄ）の間に前記宿主細胞中で自発的に組み換えを行う、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルスはチクングニアウイルスであり、再コードする前記ステップＩ）は、
非構造タンパク質ｎｓＰ１をコードする領域において、配列番号６３に示される再コードカセットによって行われ、
非構造タンパク質ｎｓＰ４をコードする領域において、配列番号６４に示される再コードによって行われ、ならびに
構造タンパク質Ｅ２およびＥ１と重複する領域をコードする領域において、配列番号６５に示される再コードカセットによって行われる、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルスはダニ媒介脳炎ウイルスであり、再コードする前記ステップＩ）は、ＮＳ５ゲノム領域において、配列番号６６に示される再コードカセットによって行われる、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ウイルスは日本脳炎ウイルスであり、再コードする前記ステップＩ）は、ＰｒＭの最初からＮＳ５ゲノム領域の最後までの完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）において、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、および配列番号７２からなる群より選択される少なくとも１つの再コードカセットによって行われる、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
生弱毒ワクチンを開発するための、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項１３】
ワクチンとして使用するためのｃＤＮＡフラグメントであって、前記ｃＤＮＡフラグメントは、
再コードウイルスゲノムの５’位にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを導入し、任意には３’位にターミネーターおよびＲＮＡポリアデニル化配列を導入することと、
前記再コードウイルスゲノムを、少なくとも２、好ましくは少なくとも３、４、５または６の重複するｃＤＮＡフラグメントに増幅することとによって得られる、重複するｃＤＮＡフラグメントであり、
前記再コードウイルスゲノムは、感染性ＲＮＡウイルスの全ウイルスゲノムのヌクレオチドコドンの一部分を、同じアミノ酸をコードする別のヌクレオチドコドンによってランダムに置換することによって、前記感染性ＲＮＡウイルスの前記ウイルスゲノムを再コードすることによって得られ、
ただし、
前記ウイルスゲノムに存在する希少ヌクレオチドコドンの数および位置は変更せず、前記希少ヌクレオチドコドンとはＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＵＣＧ、ＣＣＧ、ＧＣＧおよびＡＣＧであり、
ＲＮＡ二次構造に関与する前記ウイルスゲノムの領域は変更しないという条件である、ｃＤＮＡフラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス性の感染症および疾患に対する保護のためのワクチンとして使用され得る弱毒ＲＮＡウイルスの迅速な生成のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの新興感染症は、一本鎖ＲＮＡウイルスによって引き起こされる。各々がヒトの健康に対してかなりの衝撃を有するデング熱、西ナイル脳炎、チクングニア熱、およびリフトバレー熱の近年起こった大流行は、これらのウイルスが新たなテリトリーに侵入することまたは新たな宿主もしくはベクター種に順応することを可能にする因子を理解することが緊急に必要であることを強調している。
【０００３】
これらの事象はしばしば、パンデミックの可能性に対する警告サインであると考えられる。パンデミックの場合には、これらの急速に発展する感染性病原体の順応性を形作る因子を理解することと、ワクチンを迅速に開発する我々の能力とが、疾患の蔓延を制御するための決定的なステップとなる。
【０００４】
実際に今日まで、ワクチン接種はなおもこうしたウイルスによって引き起こされるヒトの死亡率および罹患率を低減させるための最良のアプローチであり続けている。特に生弱毒ワクチンは、宿主免疫応答の種々の防御手段を刺激するために成功率が高い。これらの生弱毒ワクチンは、異常な宿主においてウイルスを継代することによって得られる天然ウイルスの変異体である。しかし、特に生弱毒ワクチンの調製は経験的な時間のかかる方法に頼るものであるため、その調製は多くの欠点を有する。したがって、現在ヒトに投与できる有用なワクチンを開発するためには、長い時間がかかる。
【０００５】
よって、復帰変異の可能性を有さず、かつワクチン候補を製造する高速で、効率的で、対費用効果が高くて、安全な方法を提供する、弱毒ウイルスを生成するアプローチに対する未対処の要求が存在する。
【０００６】
本発明は、本質的に復帰変異の可能性を有さない、将来のワクチン候補を設計するための体系的アプローチを提供することによって、この要求を満たすものである。この方法は広範囲のウイルスに広く適用可能であり、多様な抗ウイルスワクチンを生産するための有効なアプローチを提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、非常に短期間で、すなわち標的ウイルスの完全な配列が分かって感染性ゲノムを生成できてからすぐに弱毒ＲＮＡウイルスを生成するために、突然変異誘発の力を利用するものである。
【０００８】
アミノ酸よりも多くのコドンが存在するため、遺伝子コードは必然的に冗長である。同じアミノ酸をコードする異なるコドンは、同義コドンとして公知である。タンパク質のＤＮＡ配列が２つの同義コドン間で変わることは、しばしば影響がないものと想定され、よって同義突然変異と呼ばれる。しかし、たとえ同義コドンが同じアミノ酸をコードするものであっても、ウイルスゲノムの大きい領域にわたる同義置換は、ウイルスの有効な弱毒化をもたらすことを発明者らは示した（Ｎｏｕｇａｉｒｅｄｅら、「Ｒａｎｄｏｍ  Ｃｏｄｏｎ  Ｒｅ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ  Ｆｉｔｎｅｓｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ  Ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｔｅ  ａｎｄ  Ｍｏｓｑｕｉｔｏ  Ｃｅｌｌｓ」、ＰＬＯＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、２０１３）。より正確には、ＲＮＡウイルスのゲノムの天然ヌクレオチドコドンを同義ヌクレオチドコドンで置換することが、ウイルスの複製適応度を減少させることによって前記ウイルスを弱毒化することを発明者らは見出した。
【０００９】
加えて発明者らは、全長ｃＤＮＡのバクテリアにおけるクローニングおよび増殖を必要としない、ＲＮＡウイルスを生成するための新規のアプローチを開発した。この技術は、各々がウイルスゲノムの一部分をカバーする重複する二本鎖ＤＮＡフラグメントが、トランスフェクション後に完全なウイルスゲノムのＤＮＡコピーの組み換えおよび合成を自発的に可能にするという観察に基づくものである。
【００１０】
これら２つのアプローチを組み合わせることによって、発明者らは弱毒ウイルスを直接生成するための方法を開発し、この方法は、標的病原体の完全な配列が分かって感染性ゲノムを生成できてからすぐに、非常に短期間でワクチン候補を得る可能性を含む、ワクチン候補開発に対するいくつかの利点を有する。よって本発明の方法は、それに対する処置またはワクチンが利用できないような新規の病原体に向けられた生弱毒ワクチンを数日以内に生成するために非常に役立つ。
【００１１】
したがって第１の局面において、本発明は以下のステップを含む、弱毒ＲＮＡウイルスを生成するための方法に関する。
【００１２】
ステップＩ）感染性ＲＮＡウイルスの全ウイルスゲノムのヌクレオチドコドンの一部分を、同じアミノ酸をコードする別のヌクレオチドコドンによってランダムに置換することによって、前記感染性ＲＮＡウイルスのウイルスゲノムを再コードするステップであり、ただし、
ｉ）前記ウイルスゲノムに存在する希少ヌクレオチドコドンの数および位置は変更せず、前記希少ヌクレオチドコドンとはＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＵＣＧ、ＣＣＧ、ＧＣＧおよびＡＣＧであり、
ｉｉ）ＲＮＡ二次構造に関与する前記ウイルスゲノムの領域は変更しないという条件である。
【００１３】
ステップＩＩ）
サブステップＩＩ．ａ）ステップＩ）で得られた再コードウイルスゲノムの５’位にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを導入し、任意には３’位にターミネーターおよびＲＮＡポリアデニル化配列を導入すること、
サブステップＩＩ．ｂ）前記プロモーターおよび任意には前記ターミネーターおよびＲＮＡポリアデニル化配列を含む、サブステップａ）で調製された再コードウイルスゲノムを、少なくとも２、好ましくは少なくとも３、４、５または６の重複するｃＤＮＡフラグメントに増幅すること、
サブステップＩＩ．ｃ）前記ｃＤＮＡフラグメントを宿主細胞にトランスフェクトすること、
サブステップＩＩ．ｄ）サブステップｃ）の前記宿主細胞をインキュベートすること、および
サブステップＩＩ．ｅ）前記インキュベートした宿主細胞から感染性ＲＮＡウイルスを回収すること
によって弱毒ＲＮＡウイルスを生成するステップである。
【００１４】
第２の局面において、本発明は、本明細書に開示される方法に従って得られた弱毒ＲＮＡウイルスを含む医薬組成物に関する。
【００１５】
第３の局面において、本発明は、生弱毒ワクチンを開発するための本明細書に開示される方法の使用、または本明細書に開示される方法に従って得られた弱毒ＲＮＡウイルスの生弱毒ワクチンとしての使用に関する。
【００１６】
第４の局面において、本発明は、ワクチンとして使用するための、本発明の方法において開示されるとおりに得られた重複するｃＤＮＡフラグメントに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】プラス一本鎖ＲＮＡウイルスを救出するための一般的戦略を示す図である。図面に概略的に表される全ウイルスゲノム（フラビウイルスゲノム）は、５’および３’においてそれぞれヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ｐＣＭＶ）および肝炎デルタリボザイムに続くサルウイルス４０ポリアデニル化シグナル（ＨＤＲ／ＳＶ４０ｐＡ）に隣接しており、ＰＣＲによって増幅されて３つの重複するｃＤＮＡフラグメントになった。ＰＣＲ産物を許容細胞にトランスフェクトすることによって、３日から９日後にウイルスの回収が可能になった。水平方向の青色の矢印は、３つの重複するｃＤＮＡフラグメントを生成するために用いられたプライマーを表す。
【図２】ＣＨＩＫＶ再コードウイルスを概略的に表す図である。上から下に、ヌクレオチドスケールバー；コード領域（灰色の矩形）、非コード（黒色の矩形）、およびポリＡ末端を有するＣＨＩＫＶ完全ゲノムの概略的表示。再コード領域は暗灰色で表される。
【図３】ＩＳＡ法によって得られた９つの異なる再コードＪＥＶを概略的に表す図である。各矩形はフラグメントを表す。突然変異が導入されなかったときには、紫色の矩形が用いられる（ＷＴ）。再コードフラグメントに対しては、青色（低レベルの再コード）および緑色（高レベルの再コード）の矩形が用いられる（値は同義突然変異の数を表す）。
【図４】ＷＴおよび再コードＪＥＶの複製適応度を示す図である。ヒト細胞を用いて、再コードＪＥＶのインセルロ（Ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏ）複製適応度を測定した。結果は、再コードのレベル、再コード領域のサイズ、および再コードフラグメントのゲノム位置に従う複製適応度の減少を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
第１の局面において、本発明は以下のステップを含む、弱毒ＲＮＡウイルスを生成するための方法に関する。
【００１９】
ステップＩ）感染性ＲＮＡウイルスの全ウイルスゲノムのヌクレオチドコドンの一部分を、同じアミノ酸をコードする別のヌクレオチドコドンによってランダムに置換することによって、前記感染性ＲＮＡウイルスのウイルスゲノムを再コードするステップであり、ただし、
ｉ）前記ウイルスゲノムに存在する希少ヌクレオチドコドンの数および位置は変更せず、前記希少ヌクレオチドコドンとはＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＵＣＧ、ＣＣＧ、ＧＣＧおよびＡＣＧであり、
ｉｉ）ＲＮＡ二次構造に関与する前記ウイルスゲノムの領域は変更しないという条件である。
【００２０】
ステップＩＩ）
サブステップＩＩ．ａ）ステップＩ）で得られた再コードウイルスゲノムの５’位にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを導入し、任意には３’位にターミネーターおよびＲＮＡポリアデニル化配列を導入すること、
サブステップＩＩ．ｂ）前記プロモーターおよび任意には前記ターミネーターおよびＲＮＡポリアデニル化配列を含む、サブステップａ）で調製された再コードウイルスゲノムを、少なくとも２、好ましくは少なくとも３、４、５または６の重複するｃＤＮＡフラグメントに増幅すること、
サブステップＩＩ．ｃ）前記ｃＤＮＡフラグメントを宿主細胞にトランスフェクトすること、
サブステップＩＩ．ｄ）サブステップｃ）の前記宿主細胞をインキュベートすること、および
サブステップＩＩ．ｅ）前記インキュベートした宿主細胞から感染性ＲＮＡウイルスを回収すること
によって弱毒ＲＮＡウイルスを生成するステップである。
【００２１】
発明者らは自身の徹底的な研究に基づいて、大規模な再コードによって弱毒ウイルスを直接生成するための非常に有望な戦略を開発した。
【００２２】
したがって本発明は弱毒ウイルスを提供するものであり、この弱毒ウイルスはゲノム中の複数の場所で操作されたヌクレオチド置換を含む変更されたウイルスゲノムを含み、この置換はゲノムに複数の同義コドンを導入する。本明細書において用いられる「弱毒ウイルス」という用語は、たとえばヒトまたは動物レシピエントなどの意図されるレシピエントにおける病原性が損なわれたウイルスを示す。より特定的には、弱毒ウイルスは疾患を生じる能力が減少されるかまたは弱められている一方で、野生型ウイルスと類似の免疫応答を刺激する能力を保持している。
【００２３】
この新規戦略は、ワクチン開発に対する顕著に改善された経路を表す。実際に、アミノ酸配列の変更に関連しない部位特異的再コードは、新規の表現型特性の可能性を軽減することにより、生弱毒ワクチンの一般的開発に対して、コスト低減および長期免疫の単一用量誘導を含む利益を提供する。
【００２４】
大規模再コードステップ
本発明の方法は、以下「大規模再コード」とも呼ばれる突然変異誘発の第１のステップＩ）を含む。本明細書において用いられる「再コード法」または「大規模再コード法」という表現は、次の条件によって、感染性ＲＮＡウイルスの全ウイルスゲノムのヌクレオチドコドンの一部分を、同じアミノ酸をコードする別のヌクレオチドコドンによってランダムに置換することによって、前記ＲＮＡウイルスのウイルスゲノム、好ましくは前記ウイルスゲノムの領域を再コードするステップを示しており、その条件とはすなわち、
ｉ）前記ウイルスゲノムに存在する希少ヌクレオチドコドンの数および位置は変更せず、前記希少ヌクレオチドコドンとはＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＵＣＧ、ＣＣＧ、ＧＣＧおよびＡＣＧであること、ならびに
ｉｉ）ＲＮＡ二次構造に関与する前記ウイルスゲノムの領域は変更しないことである。
【００２５】
好ましくは、ステップＩ）は次の条件によって、感染性ＲＮＡウイルスの全ウイルスゲノムのヌクレオチドコドンの約１％から約２０％、好ましくは約１％から約１７％、好ましくは約１％から約１５％、好ましくは約１％から約１０％、好ましくは約３％から約８％、好ましくは約３％から約５％を、同じアミノ酸をコードする別のヌクレオチドコドンによってランダムに置換することによって、前記感染性ＲＮＡウイルスのウイルスゲノムを再コードするステップであり、その条件とはすなわち、
ｉ）前記ウイルスゲノムに存在する希少ヌクレオチドコドンの数および位置は変更せず、前記希少ヌクレオチドコドンとはＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＵＣＧ、ＣＣＧ、ＧＣＧおよびＡＣＧであること、ならびに
ｉｉ）ＲＮＡ二次構造に関与する前記ウイルスゲノムの領域は変更しないことである。
【００２６】
よって再コード法は、多数の同義突然変異を導入することによって、コードされるタンパク質を変えることなく、ＲＮＡウイルスのウイルスゲノムの大きいコード領域の核酸組成を変更する。
【００２７】
ステップＩ）の出発材料は、好ましくは感染性ＲＮＡウイルスである。好ましくは、ヌクレオチドコドンの約１％から約２０％が同じアミノ酸をコードする異なるヌクレオチドコドンによって置換されるように、ウイルスのゲノムが再コードされる。これはコドン使用頻度バイアスのおかげで可能である。
【００２８】
本明細書において用いられる「同義ヌクレオチドコドン」または「同義コドン」という表現は、同じアミノ酸をコードする２つまたはそれ以上のヌクレオチドコドンを示す。実際のところ、ほとんどのアミノ酸は２つ以上のコドンによってコードされる。同義コドンとは、同じアミノ酸をコードする複数のコドンである。
【００２９】
本明細書において用いられる「同義突然変異」または「同義置換」という表現は、同じアミノ酸をコードする別のヌクレオチドコドン、すなわち同義コドンによるヌクレオチドコドンの置換を示す。同義置換はウイルスの複製適応度を低減させることを発明者らは示した。加えて、ウイルスゲノムへの同義コドンの導入は、ウイルスゲノムが病原性になるように変異するか、または組み換えを用いる能力を制限する。生弱毒ワクチンとしてなおも使用可能な弱毒ＲＮＡウイルスを得るために、ウイルスゲノムのヌクレオチドコドンのわずか１％から２０％、好ましくは１％から１０％がランダムに再コードされることは注目に値する。本発明の状況において、同義突然変異は部位特異的突然変異誘発によって導入される。好ましくは、前記突然変異はカセット突然変異誘発によって挿入される。
【００３０】
ほとんどのアミノ酸がいくつかの異なるコドンによってコードされ得る一方で、すべてのコドンが等しい頻度で使用されるわけではなく、いくつかのコドンは「希少」コドンである。本明細書において用いられる「希少」コドンとは、特定のアミノ酸をコードする少なくとも２つの同義コドンのうちの１つであって、そのアミノ酸に対して最も頻繁に使用されるコドンよりも有意に低い頻度でｍＲＮＡ中に存在するコドンである。典型的に、前記希少コドンはＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＵＣＧ、ＣＣＧ、ＧＣＧおよびＡＣＧである。
【００３１】
発明者らによって設計される方法は、ウイルス弱毒化を効率的に制御するためには前記希少コドンを変更せずにおくべきであるという観察に基づいている。
【００３２】
加えて発明者らは、ウイルス弱毒化を効率的に制御するためには、ＲＮＡ二次構造に関与するウイルスゲノムの領域を変更すべきでないという結論に達した。したがって、前記領域は再コードされるべきではない。
【００３３】
本明細書において用いられる「ＲＮＡ二次構造に関与するウイルスゲノムの領域」という表現は、「ＲＮＡ二次構造」としても公知である、機能的に活性なＲＮＡ構造を含むウイルスのゲノムの保存領域を示す。前記ＲＮＡ構造は、ウイルスの生活環のさまざまな段階において重要であることが判明している。通常は進化的系統発生においてよく保存されている顕著なＲＮＡ二次構造に関与する領域を、当業者は容易に定めるであろう。
【００３４】
基本的に、感染性ＲＮＡウイルスのゲノムを再コードするステップＩ）は、次のステップを含む。
−  ウイルスゲノムの非調節部分内の複数の場所においてコドンを識別するステップであって、そのコドンは同義コドンによって置換可能であり、前記コドンはＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＵＣＧ、ＣＣＧ、ＧＣＧおよびＡＣＧではない、ステップ、
−  識別されたヌクレオチドコドンの約１％から約２０％に対して、置換されるべき同義コドンを選択するステップ、および
−  好ましくは下の表１に基づいて、識別されたコドンの各々に対する同義コドンを置換するステップ。
【００３５】
好ましくは、ステップＩ）は次のステップによって行われる。
−  感染性ＲＮＡウイルスの全ウイルスゲノムによってコードされるアミノ酸配列を定め、各アミノ酸をコードする各ヌクレオチドコドンを定めるステップ、および
−  表１のアミノ酸をコードするウイルスゲノムのヌクレオチドコドンの約１％から約２０％、好ましくは約１％から約１７％、好ましくは約１％から約１５％、好ましくは約１％から約１０％、好ましくは約３％から約８％、好ましくは約３％から約５％を、表１で指定されるとおりの同じアミノ酸をコードする異なるヌクレオチドコドンによって置換するステップ。
【００３６】
【表１】
0006541695.tif 000002
【００３７】
本発明に従って得られる弱毒ウイルスは、タンパク質レベルでは変更されないという顕著な特性を有する。実際のところ、前記弱毒ウイルスは、核レベルのみの同義置換によって遺伝子改変されたウイルスに対応する。
【００３８】
ウイルスの弱毒化は、通常の当業者に周知のやり方で確認できる。非限定的な例は、プラークアッセイ、増殖測定、および実験動物における罹患率または死亡率の低減を含む。
【００３９】
より特定的には、大規模再コードは標的ＲＮＡウイルスの複製適応度に対する影響を有することによって、前記ウイルスを弱毒化することを発明者らは示した。「複製適応度」とは、所与の環境における生物の複製能力／順応性であると定義される。ウイルスまたは本明細書に開示される方法に従って得られた弱毒ウイルスの複製適応度は、たとえば組織培養における２つまたはそれ以上のウイルス株の拮抗を含む手段などによって、インセルロで測定され得る。典型的に、複製適応度は、たとえばヒト以外の霊長類の細胞またはアルボウイルスの場合にはカの細胞などのさまざまなタイプの細胞において、ウイルスが回収されるときに定められ得る。典型的に、評価すべき再コードウイルスと野生型ウイルスとが、たとえばヒト以外の霊長類の細胞（Ｖｅｒｏ）またはカ（Ｃ６／３６）などのさまざまなタイプの細胞において継代される。たとえばＴＣＩＤ５０値の分析に基づくウイルス増殖速度の分析などの公知の技術を用いて、各継代ウイルスの複製動力学が定められる。
【００４０】
ランダムな再コードステップは、両方の霊長類（およびアルボウイルスの場合には節足動物細胞）におけるウイルスの複製適応度を減少させることを発明者らは示した。複製適応度の減少は、再コードの程度と直接相関した。これらの結果は、コドン再コードが放出ウイルスの感染力価を大きく低減させる一方で、ウイルス粒子の数は安定なままであることを実証するものである。
【００４１】
好ましくは、この方法が生成することを目的とする弱毒ＲＮＡウイルス（本明細書において「標的ウイルス」とも呼ばれる）は、プラス一本鎖ＲＮＡウイルスの弱毒バージョンである。より好ましくは、前記ウイルスはフラビウイルス、アルファウイルス、およびエンテロウイルスからなる群より選択される。
【００４２】
フラビウイルスの非限定的なリストは、デングウイルス（ＤＥＮＶ：Ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ）、黄熱ウイルス（ＹＦＶ：Ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、セントルイス脳炎（ＳＬＥＶ：Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ：Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ）、マレー峡谷脳炎（ＭＶＥＶ：Ｍｕｒｒａｙ  Ｖａｌｌｅｙ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ：Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、ロシオ（ＲＯＣＶ：Ｒｏｃｉｏ）、ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ：Ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、オムスク出血熱（ＯＭＳＫＶ：Ｏｍｓｋ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ）、キャサヌール森林病（ＫＦＤＶ：Ｋｙａｓａｎｒ  Ｆｏｒｒｅｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ポワッサン（ＰＯＷＶ：Ｐｏｗａｓｓａｎ）を含む。好ましくは、前記フラビウイルスは、以下からなる群より選択される。
−  日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、たとえば遺伝子型Ｉ株（ＪＥＶ  Ｉ）または遺伝子型ＩＩＩ株（ＪＥＶ  ＩＩＩ）など、
−  西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、たとえば遺伝子型２株など、
−  デングウイルス（ＤＥＮＶ）、たとえば血清型４株など、
−  黄熱ウイルス（ＹＦＶ）、たとえば南アメリカ野生型株など、および
−  ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、たとえば極東サブタイプ株など。
より好ましくは、前記フラビウイルスはダニ媒介脳炎ウイルスである。
【００４３】
アルファウイルスの非限定的なリストは、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫ：Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ  ｖｉｒｕｓ）、東部ウマ脳炎（ＥＥＥ：Ｅａｓｔｅｒｎ（Ｅａｓｔｅｒｍ）  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、西部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ：Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、マヤロウイルス（ＭＡＹ：Ｍａｙａｒｏ  ｖｉｒｕｓ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮ：Ｏ’ｎｙｏｎｇ’ｎｙｏｎｇ  ｖｉｒｕｓ）、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、バーマ森林ウイルス、ロスリバーウイルス、ウナウイルス、トナテウイルスを含む。好ましくは、前記アルファウイルスはチクングニアウイルスである。
【００４４】
エンテロウイルスの非限定的なリストは、コクサッキー、エコーウイルス、ポリオウイルス、およびライノウイルスを含む。好ましくは、前記エンテロウイルスはコクサッキー、より好ましくはコクサッキーＢウイルスである。
【００４５】
好ましい実施形態の１つにおいて、標的ウイルスはチクングニアウイルスである。この特定の実施形態において、再コードステップはウイルスゲノムの３つの領域で行われる。すなわち、
−  非構造タンパク質（ｎｏｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）ｎｓＰ１をコードする領域、
−  非構造タンパク質ｎｓＰ４をコードする領域、ならびに
−  構造タンパク質Ｅ２およびＥ１と重複する領域である。
【００４６】
典型的に、突然変異は「再コードカセット」とも呼ばれるカセット突然変異誘発によって導入される。典型的に、各領域に対して約１３００ｐｂから約１５００ｐｂの再コードカセットが用いられる。
【００４７】
この実施形態において、チクングニアのウイルスゲノムは次のとおりに変更される。
−  完全なゲノムの位置２４２〜１５４３（ｎｔ）における、非構造タンパク質ｎｓＰ１をコードする領域は、配列番号６３に示される１３０２ｎｔの再コードカセットによって変異され、
−  完全なゲノムの位置６０２６〜７４３５（ｎｔ）における、非構造タンパク質ｎｓＰ４をコードする領域は、配列番号６４に示される１４１０ｎｔの再コードカセットによって変異され、
−  完全なゲノムの位置９５２６〜１１０２２（ｎｔ）における、構造タンパク質Ｅ２およびＥ１と重複する領域は、配列番号６５に示される１５００ｎｔの再コードカセットによって変異される。
【００４８】
典型的に、再コードカセットの各々は２００から４００の同義突然変異、好ましくは約２５０から約３２０、好ましくは約２６６から約３２０を導入する。好ましくは、配列番号６３、配列番号６４および配列番号６５に示される再コードカセットは、それぞれ２６４、２９８および３２０の同義突然変異を導入する。
【００４９】
別の実施形態において、標的ウイルスはダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）である。この特定の実施形態において、再コードステップは、非構造タンパク質ＮＳ５をコードするウイルスのＮＳ５ゲノム領域において行われる。典型的には、約１４００ｐｂの再コードカセットが用いられる。この実施形態において、ＴＢＥＶのウイルスゲノムは、約２００から約３５０の同義突然変異、好ましくは約２００から約３００、好ましくは約２２５から約３００、好ましくは約２２５から約２７５、好ましくは約２２５を導入するように変更される。
【００５０】
好ましくは、ダニ媒介脳炎ウイルスのウイルスゲノムは、配列番号６６に示される１４１２ｎｔの再コードカセットによって変異される。前記再コードカセットは、２７３の突然変異を導入する。
【００５１】
さらに別の実施形態において、標的ウイルスは日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、好ましくは遺伝子型１株である。この特定の実施形態において、再コードステップは、ウイルスゲノムの大きい領域、典型的には完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ：ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）のほぼすべてである、ＰｒＭの最初からＮＳ５ゲノム領域の最後までにおいて行われる。
【００５２】
好ましくは、ＪＥＶのウイルスゲノムは、約１６３から約６５８、好ましくは約１６３から約６５８の突然変異を導入するように変更される。
【００５３】
好ましくは、日本脳炎ウイルスのウイルスゲノムは、以下からなる群より選択される少なくとも１つの再コードカセットによって変異される。
−  配列番号６７に示される再コードカセットＩａ、
−  配列番号６８に示される再コードカセットＩｂ、
−  配列番号６９に示される再コードカセットＩＩａ、
−  配列番号７０に示される再コードカセットＩＩｂ、
−  配列番号７１に示される再コードカセットＩＩＩａ、および
−  配列番号７２に示される再コードカセットＩＩＩｂ。
【００５４】
より好ましくは、日本脳炎ウイルスのウイルスゲノムは、以下のとおりの再コードカセットの組み合わせによって変異される。
−  再コードカセットＩａおよびＩＩａの組み合わせ、または
−  再コードカセットＩａおよびＩＩＩａの組み合わせ、または
−  再コードカセットＩＩａおよびＩＩＩａの組み合わせ。
【００５５】
代替的に、前記ウイルスは一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルスである。より好ましくは、前記ウイルスはパラミクソウイルス、アレナウイルス、フィロウイルス、ラブドウイルス、ブニヤウイルス、またはインフルエンザウイルスである。
【００５６】
弱毒ＲＮＡウイルスの直接生成
本発明の方法は、弱毒ＲＮＡウイルスの直接生成の第２のステップＩＩ）を含む。
【００５７】
発明者らは、前記ウイルスのランダムに再コードされたウイルスゲノムから出発して、弱毒ＲＮＡウイルスを直接生成するための新規のアプローチを開発した。ＲＮＡウイルスのゲノムの一部分を各々がカバーする重複するｃＤＮＡフラグメントによって、全長ｃＤＮＡまたはこうした全長ｃＤＮＡを含むプラスミドもしくはベクターを使用せずにウイルスを生じさせ得ることを発明者らは証明した。したがって、弱毒ウイルスゲノムの一部分を各々がカバーする重複する二本鎖ＤＮＡフラグメントは、インセルロで完全なウイルスゲノムのＤＮＡコピーの組み換えおよび合成を自発的に可能にすることを発明者らは明らかにした。
【００５８】
前記方法は、特に以下のことが免除されるために非常に有利である。
−  再コードウイルスゲノム全体をカバーする全長ｃＤＮＡを構築すること、および／または
−  こうした全長ｃＤＮＡを含むプラスミドもしくはベクターの使用、および／または
−  宿主細胞へのトランスフェクションの前に全長ｃＤＮＡもしくは弱毒ウイルスゲノム全体を再構築する必要性、および／または
−  たとえば自然発生しない組み換えもしくは制限酵素部位を組み込むことなど、弱毒ウイルスゲノムを変更すること、および／または
−  ヘルパーウイルスもしくはその他のウイルスタンパク質を使用すること。
【００５９】
よって「感染性サブゲノムアンプリコン（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｍｐｌｉｃｏｎｓ）」または「ＩＳＡ」とも呼ばれる本発明のこの特定のステップＩＩ）は、数日以内に弱毒ＲＮＡウイルスの生成を促進でき、ウイルス配列の完全な制御を有し、かつ再コードウイルスゲノムから出発する非常に簡単な手順である。
【００６０】
この戦略は、各々が再コードウイルスゲノムのフラグメントをカバーするいくつかのｃＤＮＡフラグメントの生成に依拠するものである。構築物のアセンブリは、トランスフェクションの前にギブソンアセンブリまたは環状ポリメラーゼ伸長クローニングによってインビトロで行われるのではなく、インセルロで直接行われる組み換えプロセスによって行われる。
【００６１】
本明細書において用いられる「弱毒ＲＮＡウイルスの生成」という表現は、遺伝子改変された形、すなわち本発明の方法に従って再コードされた形のＲＮＡウイルスの生成を示す。
【００６２】
本明細書において用いられる「自然発生しない組み換え部位」という表現は、Ｃｒｅ−ＬｏｘまたはＦＬＰ−ＦＲＴ組み換え系によって例示され得る部位特異的組み換えを可能にする配列を示す。制限酵素部位とは、ＮｏｔＩまたはＡｌｕＩエンドヌクレアーゼによって例示され得る制限酵素による二本鎖ＤＮＡの部位特異的切断を可能にする配列を示す。
【００６３】
本発明の方法のステップＩＩ）は、ＲＮＡウイルスの全ゲノムの５’位にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを導入するサブステップＩＩ．ａ）を含む。任意には、前記サブステップＩＩ．ａ）はさらに、ＲＮＡウイルスの全ゲノムの３’位にターミネーターおよびＲＮＡポリアデニル化配列を導入することを含む。
【００６４】
標的ウイルスがたとえばフラビウイルスなどのポリアデニル化ウイルスであるとき、サブステップＩＩ．ａ）は、ＲＮＡウイルスの全ゲノムの５’位にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを導入し、かつ３’位にターミネーターおよびＲＮＡポリアデニル化配列を導入するステップであることに注目すべきである。
【００６５】
第１のｃＤＮＡフラグメントの５’末端にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含み、最終ｃＤＮＡフラグメントの３’末端にリボザイム配列およびＲＮＡポリアデニル化に対するシグナル配列を含むことによって、このｃＤＮＡフラグメントは真正の５’および３’末端を有する全長ＲＮＡ弱毒ゲノムとして転写される。
【００６６】
好ましくは、５’位におけるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの前記プロモーターは、配列番号１に示されるヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ｐＣＭＶ）である。好ましくは、前記ターミネーターおよびＲＮＡポリアデニル化配列はそれぞれ、肝炎デルタリボザイムおよびサルウイルス４０ポリアデニル化シグナル（ＨＤＲ／ＳＶ４０ｐＡ）である。ＨＤＲ／ＳＶ４０ｐＡの配列は、配列番号２に示される。
【００６７】
したがってサブステップａ）は、５’および３’においてそれぞれヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ｐＣＭＶ）（配列番号１）および肝炎デルタリボザイムに続くサルウイルス４０ポリアデニル化シグナル（ＨＤＲ／ＳＶ４０ｐＡ）（配列番号２）に隣接する、ＲＮＡウイルスの完全な再コードウイルスゲノムを提供する。
【００６８】
本発明の方法のステップＩＩ）は、再コードウイルスゲノム全体をいくつかの重複するｃＤＮＡフラグメントに増幅するサブステップＩＩ．ｂ）を含む。サブステップＩＩ．ｂ）において、全ウイルスゲノムとはステップａ）で調製された全ウイルスゲノムに対応し、すなわちそれは前記プロモーターならびに任意には前記ターミネーターおよびＲＮＡポリアデニル化配列を含む。
【００６９】
本明細書において用いられる、「アンプリコン」または「ＤＮＡサブゲノムフラグメント」または「サブゲノムアンプリコン」とも示される「重複するｃＤＮＡフラグメント」、「ｃＤＮＡフラグメント」という表現は、ＲＮＡウイルスの再コードウイルスゲノムの一部分のみをカバーする二本鎖ＤＮＡフラグメントである。こうしたフラグメントは「サブゲノムフラグメント」に対応する。
【００７０】
こうしたフラグメントが細胞内でトランスフェクトされるとき、驚くべきことにそれらはインセルロで自発的に組み換えを行って再コードウイルスゲノム全体を再構成することを発明者らは教示した。たとえウイルスゲノムが付加的な自然発生しない組み換え部位を組み込むように遺伝子改変されなくても、前記組み換えは起こる。
【００７１】
本発明に従うｃＤＮＡフラグメントは、以下を包含する。
−  たとえばＰＣＲなどによる増幅によって得られるＤＮＡフラグメント、および
−  デノボ（新規）で得られたＤＮＡフラグメント。
好ましくは、前記ｃＤＮＡフラグメントは非感染性である。
【００７２】
本明細書において用いられる「全長ｃＤＮＡ」という表現は、単一断片においてウイルスの全ウイルスゲノム、好ましくは再コードウイルスゲノム全体を含むＤＮＡを示す。
【００７３】
本明細書において用いられる「再コードウイルスゲノム全体の一部分をカバーするｃＤＮＡフラグメント」という表現は、再コードウイルスゲノム全体の一部分を含むＤＮＡフラグメントを示す。典型的に、本発明に従うｃＤＮＡフラグメントは、細胞へのトランスフェクションの際に自発的に組み換えを行って、５’末端においてＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターと隣接し、３’末端において終止配列およびＲＮＡポリアデニル化に対するシグナル配列と隣接する再コードウイルスゲノム全体のＤＮＡコピーを構成する。この構築物は、細胞機構によって真正の５’および３’末端を有する全長ＲＮＡ再コードゲノムとして転写される。これとは反対に、「全ウイルスゲノムをカバーする全長ｃＤＮＡ」とは、ウイルスゲノムの全体性、好ましくは再コードウイルスゲノムの全体性をコードする単一ｃＤＮＡである。
【００７４】
好ましくは、本発明の方法のステップＩＩ．ｂ）は２から１５の重複するｃＤＮＡフラグメント、好ましくは３、４、５、または６の重複するｃＤＮＡフラグメントの生成を可能にする。典型的に、前記ｃＤＮＡフラグメントは約２ｋｂから約６ｋｂ、好ましくは約４ｋｂであり、各ｃＤＮＡフラグメントは約７０ｂｐから約１００ｂｐの重複領域を有する。
【００７５】
好ましくは、ステップＩＩ．ｂ）の前記重複するｃＤＮＡフラグメントは次のものである。
−  ＰＣＲによって増幅されていない感染性クローンのフラグメント、
−  ＰＣＲによって増幅された感染性クローンのフラグメント、
−  ＰＣＲによって増幅されていない非感染性クローンのフラグメント、
−  ＰＣＲによって増幅された非感染性クローンのフラグメント、
−  ＰＣＲによって増幅されていないデノボで合成されたフラグメント、
−  ＰＣＲによって増幅されたデノボで合成されたフラグメント、および
−  ウイルスゲノムから逆転写ＰＣＲによって得られたフラグメント。
【００７６】
本発明の方法のステップＩＩ）は、前記ｃＤＮＡフラグメントの宿主細胞へのトランスフェクションのサブステップＩＩ．ｃ）を含む。
【００７７】
本明細書において用いられる「トランスフェクション」という用語は、真核細胞もしくは原核細胞または生物への核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）の導入を示す。外来性の核酸を受け入れた細胞は「宿主細胞」または「トランスフェクトされた細胞」と呼ばれる。トランスフェクションは、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、ポリブレン介在トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、および微粒子銃を含む、当該技術分野において公知のさまざまな手段によって達成されてもよい。
【００７８】
好ましくは、サブステップｃ）の宿主細胞は、感染性ウイルスの回収を可能にする許容細胞である。典型的に、本発明の方法において使用される許容細胞は、ｃＤＮＡフラグメントによるトランスフェクションの際に、ウイルス粒子の生成を含むウイルスの完全な複製サイクルを実現できる細胞である。好ましくは、前記宿主細胞はＳＷ１３、ＢＨＫ−２１、ＨＥＫ２９３、およびベロ細胞系からなる群より選択される。
【００７９】
好ましい実施形態において、サブステップＩＩ．ｃ）は、サブステップＩＩ．ｂ）で得られたｃＤＮＡフラグメント自体の直接トランスフェクションのステップであり、サブステップＩＩ．ｃ）はサブステップＩＩ．ｂ）の直後に起こる。この特定の実施形態において、ｃＤＮＡフラグメント自体が宿主細胞にトランスフェクトされる。前記フラグメントはインセルロで自発的に組み換えを行って、５’末端においてＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターと隣接し、３’末端において終止配列およびＲＮＡポリアデニル化に対するシグナル配列と隣接する再コードウイルスゲノム全体のＤＮＡコピーとなる。前述のとおり、本発明の方法はこのように全ウイルスゲノムをカバーする全長ｃＤＮＡをトランスフェクトすることが免除されるために、技術的不利益を克服する。加えてこの方法は、こうした前記全長ｃＤＮＡを含むプラスミドもしくはベクターを用いること、および／または宿主細胞へのトランスフェクションの前に全ｃＤＮＡもしくは全ウイルスゲノムを再構築する必要性がない。
【００８０】
これとは反対に、この方法は、各々が再コードウイルスゲノムの一部分を含む、重複するｃＤＮＡフラグメントのトランスフェクションに依拠している。ＲＮＡウイルスの全ゲノムをカバーする重複する二本鎖ＤＮＡフラグメントを許容細胞にトランスフェクトすることによって、インセルロで完全なウイルスゲノムのＤＮＡコピーの組み換えおよび合成が可能になる。
【００８１】
代替的な実施形態において、サブステップＩＩ．ｃ）は、サブステップＩＩ．ｂ）で得られたｃＤＮＡフラグメントを各々含むプラスミドのトランスフェクションのステップであり、ここで各ｃＤＮＡフラグメントは個々の分離したプラスミドまたはベクターに組み込まれている。
【００８２】
この実施形態において、各ｃＤＮＡフラグメントは、個々の分離したプラスミドまたはベクターに組み込まれている。各プラスミドまたはベクターは、ｃＤＮＡの単一フラグメントを含む。この実施形態において、トランスフェクション後に再コードウイルスゲノム全体が再構成される。
【００８３】
一実施形態において、本発明の方法はサブステップｂ）の後、サブステップｃ）の前に、重複するｃＤＮＡフラグメントの精製のさらなるステップＩＩ．ｂ’）を含む。前記精製は任意の公知の技術、好ましくはクロマトグラフィーカラムによって行われてもよい。
【００８４】
本発明の方法のステップＩＩ）は、好ましくは３日から９日間続く宿主細胞のインキュベーションのサブステップＩＩ．ｄ）を含む。前記インキュベーションステップの間に、トランスフェクトされたｃＤＮＡフラグメントが宿主細胞中で自発的に組み換えを行って、５’末端においてＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターと隣接し、３’末端において終止配列およびＲＮＡポリアデニル化に対するシグナル配列と隣接する再コードウイルスゲノム全体のＤＮＡコピーを構成する。この構築物は、細胞機構によって真正の５’および３’末端を有する全長ＲＮＡゲノムとして転写される。
したがって、サブステップＩＩ．ｄ）において救出された生成物は弱毒ＲＮＡウイルスである。
【００８５】
医薬組成物
第２の局面において、本発明は、本明細書に開示される方法に従って得られた弱毒ＲＮＡウイルスを含む医薬組成物に関する。
前に開示した技術データはすべてここで適用可能である。
【００８６】
弱毒ウイルスを含む前記医薬組成物は、免疫化のために好適である。
【００８７】
好ましくは、本発明のこうした医薬組成物の投与は、たとえば皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、経口、または経皮的経路などのさまざまな非経口経路によるものであってもよい。非経口投与は、ボーラス注入または経時的な徐々の灌流によって達成され得る。
【００８８】
非経口投与のための調製物は、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁物、および／またはエマルションを含み、それは当該技術分野において公知の補助的な薬剤または賦形剤を含んでもよい。非水性溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、たとえばオリーブ油などの植物油、およびたとえばオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。皮膚浸透性を高め、抗原吸収を促進するために、担体または密封包帯を使用してもよい。経口投与のための液体剤形は、液体剤形を含有するリポソーム溶液を含んでもよい。リポソームを懸濁するための好適な形は、たとえば精製水などの当該技術分野において一般的に使用される不活性希釈剤を含有するエマルション、懸濁物、溶液、シロップ、およびエリキシル剤を含む。こうした組成物は、不活性希釈剤に加えてアジュバント、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、または甘味料、調味料、もしくは香料をも含んでもよい。
【００８９】
本発明の組成物が個体への投与のために用いられるとき、それはさらに塩、緩衝剤、アジュバント、または組成物の有効性を改善するために望ましいその他の物質を含んでもよい。ワクチンに対しては、特定の免疫応答を増強できる物質であるアジュバントが用いられてもよい。通常、アジュバントと組成物とは免疫系への提示の前に混合されるか、または別々だが、免疫化される生物の同じ部位に提示される。
【００９０】
組成物の投与は、「予防」または「治療」のいずれの目的のためであってもよい。予防的に提供されるとき、ワクチンである本発明の組成物は、病原体感染症の何らかの症状または臨床徴候が顕在化する前に提供される。組成物の予防的投与は、あらゆるその後の感染症を防止または減弱させる働きをする。この実施形態において、本発明は、対象におけるＲＮＡウイルス感染症を防止するための使用のための、本明細書に開示される医薬組成物に関する。
【００９１】
治療的に提供されるとき、弱毒ウイルスワクチンは、実際の感染症の症状または臨床徴候の検出の際に提供される。治療的投与は、あらゆる実際の感染症を減弱させる働きをする。この実施形態において、本発明は、対象におけるＲＮＡウイルス感染症を処置するための使用のための、本明細書に開示される医薬組成物に関する。
【００９２】
よって、本発明の弱毒ワクチン組成物は、（予測される感染症を防止または減弱するように）感染症の発症前に提供されても、実際の感染症の開始後に提供されてもよい。
【００９３】
将来のワクチン候補の設計
第３の局面において、本発明は、生弱毒ワクチンを開発するための本明細書に開示される方法の使用、または本明細書に開示される方法に従って得られた弱毒ＲＮＡウイルスの生弱毒ワクチンとしての使用に関する。
前に開示した技術データはすべてここで適用可能である。
【００９４】
本発明の大規模コドン再コードステップは、標的病原体の完全な配列が分かって感染性ゲノムを生成できてからすぐに、非常に短期間で有望なワクチン株を得る可能性を含む、ワクチン開発に対するいくつかの利点を有する弱毒化の強力な方法であることが示された。よって本発明の方法は、それに対する処置またはワクチンが利用できないような新規の病原体に向けられた生弱毒ワクチンを数日以内に生成するために非常に役立つ。
【００９５】
加えて本発明の方法は、将来のワクチン候補を設計するときにいくつかの局面において有利であることを発明者らは示した。すなわち、
（ｉ）多数の突然変異が生成されるため、野生型への復帰変異は本質的に困難になる。
（ｉｉ）複製適応度の低減は再コードの程度とともに減少するため、この方法は、再コード領域の長さおよび導入する同義突然変異の数を調節することによって適応度低減を微調整することの門戸を開く。
（ｉｉｉ）ウイルスゲノム全体にわたって位置するいくつかの再コード領域の組み合わせを使用することによって、ＷＴと再コードウイルスとの組み換えによる完全な表現型復帰変異が防がれる。すなわち、大規模な配列変更は組み換えを本質的に困難にし、組み換えの場合にも再コード株を表すゲノムの部分はなおも適応度低減に関連するいくつかの突然変異を有すると考えられる。
【００９６】
ｃＤＮＡフラグメントの使用
発明者らは、本発明の方法を直接インビボに適用するという重責に面した。そうすることによって、発明者らはワクチンを必要とする患者の体内で生弱毒ワクチンを直接作製するための方法を開発する。前記方法は、本明細書に開示される方法に従う、再コードされた感染性ＲＮＡウイルスから得られた重複するｃＤＮＡフラグメントの投与に基づくものである。
【００９７】
したがって第４の局面において、本発明はさらに、ワクチン、好ましくは生弱毒ワクチンとして使用するためのｃＤＮＡフラグメントに関し、
前記ｃＤＮＡフラグメントは、
−  再コードウイルスゲノムの５’位にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを導入し、任意には３’位にターミネーターおよびＲＮＡポリアデニル化配列を導入することと、
−  前記再コードウイルスゲノムを、少なくとも２、好ましくは少なくとも３、４、５または６の重複するｃＤＮＡフラグメントに増幅することとによって得られる、重複するｃＤＮＡフラグメントであり、
前記再コードウイルスゲノムは、次の条件によって、感染性ＲＮＡウイルスの全ウイルスゲノムのヌクレオチドコドンの一部分を、同じアミノ酸をコードする別のヌクレオチドコドンによってランダムに置換することによって、前記感染性ＲＮＡウイルスのウイルスゲノムを再コードすることによって得られ、
その条件とは、
ｉ）前記ウイルスゲノムに存在する希少ヌクレオチドコドンの数および位置は変更せず、前記希少ヌクレオチドコドンとはＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＵＣＧ、ＣＣＧ、ＧＣＧおよびＡＣＧであること、ならびに
ｉｉ）ＲＮＡ二次構造に関与する前記ウイルスゲノムの領域は変更しないことである。
【００９８】
前に開示した技術データはすべてここで適用可能である。
【００９９】
以下の実施例は、本発明のさまざまな実施形態を例示する目的で与えられるものであり、本発明をいかなる態様で制限することも意味しない。
【実施例】
【０１００】
実施例１：数日以内にＲＮＡウイルスを生成すること
実施例１は、数日以内にＲＮＡウイルスの生成を可能にする方法ＩＳＡを例示するものである。
【０１０１】
以下のＩＳＡの例示は、過去に変更されていないウイルスゲノム、すなわち再コードステップを受けていないウイルスゲノムに基づくものである。
【０１０２】
方法
細胞、ウイルス、感染性クローンおよび抗体
仔ハムスター腎（Ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）（ＢＨＫ−２１）細胞を、７％の熱不活性化ウシ胎児血清（ｆｏｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）（ＦＢＳ；ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））および１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）（ＰＳ；５０００Ｕ／ｍＬおよび５０００μｇ／ｍｌ；ライフ・テクノロジーズ）を伴う最小必須培地（ライフ・テクノロジーズ）中で５％ＣＯ２によって３７℃にて増殖させた。ヒト胚腎２９３（ＨＥＫ−２９３：Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ２９３）細胞およびアフリカミドリザル腎（ＶｅｒｏＥ６）細胞を、１％の非必須アミノ酸（ライフ・テクノロジーズ）を補った、ＢＨＫ−２１細胞と同じ培地中で、５％ＣＯ２によって３７℃にて増殖させた。ヒト副腎癌（ＳＷ１３）細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ＰＳを伴うＲＰＭＩ１６４０培地（ライフ・テクノロジーズ）中で、５％ＣＯ２によって３７℃にて増殖させた。
【０１０３】
ＪＥＶ遺伝子型Ｉ株ＪＥＶ＿ＣＮＳ７６９＿Ｌａｏｓ＿２００９（ＫＣ１９６１１５）は、ラオス（Ｌａｏｓ）１６における患者の脳脊髄液から２００９年６月に単離した。ヒト血清から２００９年に単離したＹＦＶ株ＢＯＬ８８／１９９９（ＫＦ９０７５０４）は、国立熱帯病センター（ＣＥＮＥＴＲＯＰ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）、サンタクルス（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ）、ボリビア（Ｂｏｌｉｖｉａ）よりご提供頂いた。ヒト血清から単離したＤＥＮＶ−４株Ｄａｋ  ＨＤ３４  ４６０（ＫＦ９０７５０３）は、バイオディフェンスおよび新興感染症センター−ワクチン開発のシーリーセンター（ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｄｅｆｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ−Ｓｅａｌｙ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）（テキサス大学医学部（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｒａｎｃｈ）、ガルベストン（Ｇａｌｖｅｓｔｏｎ）、テキサス（Ｔｅｘａｓ）、ＵＳＡ）のロバート（Ｒｏｂｅｒｔ）Ｂ  テシュ（Ｔｅｓｈ）よりご提供頂いた。ｒｐ９（ＤＱ６４８５９７）株に由来するＪＥＶ遺伝子型ＩＩＩの感染性クローンは、生物医学科学研究所（ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、中央研究院（Ａｃａｄｅｍｉａ  Ｓｉｎｉｃａ）、台北（Ｔａｉｐｅｉ）、台湾（Ｔａｉｗａｎ）のイリン・リン（Ｙｉ−Ｌｉｎｇ  Ｌｉｎ）よりご提供頂いた。ＷＮＶの感染性クローンは、Ｏｕｇａｎｄａ１９３７（Ｍ１２２９４）株から得た。ＴＢＥＶの感染性クローンは、Ｏｓｈｉｍａ５．１０（ＡＢ０６２０６３）株から得た。ＣＶ−Ｂ３の感染性クローンは、２６７９（ＫＪ４８９４１４）株から得た。直接免疫蛍光アッセイを行うために、ＪＥＶ特異的免疫血清（ＪＥＶに対するワクチン接種後に得る）およびモノクローナルＤＥＮＶ特異的抗体１７を使用した。
【０１０４】
ｃＤＮＡフラグメントの調製
５’および３’においてそれぞれヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ｐＣＭＶ）（配列番号１）および肝炎デルタリボザイムに続くサルウイルス４０ポリアデニル化シグナル（ＨＤＲ／ＳＶ４０ｐＡ）（配列番号２）に隣接する完全なゲノムをＰＣＲによって増幅して、約４．８ｋｂ、３．０ｋｂおよび４．３ｋｂ（ＣＨＩＫＶに対しては４．８ｋｂ、２．９ｋｂおよび５．２ｋｂ、ＴＢＥＶに対しては４．８ｋｂ、４．１ｋｂおよび３．４ｋｂ、ＣＶ−Ｂ３に対しては２．９ｋｂ、２．８ｋｂおよび２．７ｋｂ）の３つの重複するＤＮＡフラグメントにした（下の表１を参照）。
【０１０５】
ＷＮＶ、ＴＢＥＶ、ＪＥＶ  ＩＩＩおよびＣＨＩＫＶに対しては、感染性クローンを用いたＰＣＲによってＤＮＡフラグメントを得た（ＪＥＶ  ＩＩＩに対しては、フュージョンＰＣＲを用いて突然変異を修正した）。
【０１０６】
ＪＥＶ  Ｉ（全ＤＮＡフラグメント）、ＤＥＮＶ−４（第１および第３のフラグメント）、およびＹＦＶ（第１および第３のフラグメント）に対しては、ＤＮＡフラグメントをデノボ合成（ジェンスクリプト（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ））してＰＣＲで増幅した。Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）ＰＣＲスーパーミックス・ハイ・フィデリティ（ＳｕｐｅｒＭｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）キット（ライフ・テクノロジーズ）を用いて、アンプリコンを生成した。
【０１０７】
混合物（最終体積５０μＬ）は、４５μＬのスーパーミックス、２μＬの１ｎｇ／μＬのＤＮＡテンプレート（感染性クローンまたは合成ＤＮＡフラグメント）、および２００ｎＭの各プライマーからなるものであった。ＤＥＮＶ−４およびＹＦＶに対しては、清澄化した細胞上清からのＲＴ−ＰＣＲによって第２のＤＮＡフラグメントを得た。ＥＺ１バイオロボット（Ｂｉｏｒｏｂｏｔ）においてＥＺ１ウイルス・ミニ・キット（Ｖｉｒｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ）ｖ２（どちらもキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）より）を用いて、製造者の指示に従って核酸を抽出し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩワンステップ（Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ）ＲＴ−ＰＣＲ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑハイファイ（Ｈｉｆｉ）キット（ライフ・テクノロジーズ）によって増幅した。混合物（最終体積５０μＬ）は、２５μＬの反応混合物（Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ）、２μＬの核酸抽出物、１００ｎＭの各プライマー、１μＬの酵素混合物（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ）、および２０μＬのヌクレアーゼフリー水（Ｎｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ）を含んだ。バイオメトラ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）Ｔ−プロフェッショナル・スタンダード・グラジエント（Ｔ−ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ）サーモサイクラーにおいて、次の条件によってアッセイを行った。すなわち、９４℃で２分、その後に続いて９４℃で１５秒、６４℃で３０秒、６８℃で５分の４０サイクル、およびＲＴ−ＰＣＲに対する５０℃で３０分の予備ステップである。ゲル電気泳動によってＰＣＲ産物のサイズを確認し、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ウルトラ（Ｕｌｔｒａ）−０．５ｍＬキット（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を用いて製造者の指示に従って精製した。テンプレートとしてプラスミドＤＮＡを用いたときは、トランスフェクションの前に制限酵素Ｄｐｎ１（ニュー・イングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））による分解ステップによって、テンプレートの完全な除去を確実にした。この付加的なステップの効率を制御するために、発明者らは対照として２つのｃＤＮＡフラグメント（第１および第２、最終１μｇ）のみをトランスフェクトした（以下を参照）。これらの対照は感染性ウイルスを何ら生成しなかった。
【０１０８】
【表２】
0006541695.tif 000003
【０１０９】
細胞トランスフェクション
最終１μｇのＰＣＲで増幅したすべてのｃＤＮＡフラグメントの等モル混合物、または１μｇのＣＶ−Ｂ３の感染性クローンを、１２μｌのリポフェクタミン２０００（ライフ・テクノロジーズ）とともに６００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ライフ・テクノロジーズ）中でインキュベートした。製造者の指示に従って、抗生剤を有さない１ｍＬの培地を含有するサブコンフルエント細胞の１２．５ｃｍ２培養フラスコに、この混合物を加えた。４時間のインキュベーション後、細胞上清を取り除き、細胞を２回洗浄し（ＨＢＳＳ；ライフ・テクノロジーズ）、３ｍＬの新鮮な培地を加えた。全体の細胞変性効果（ＣＰＥ：ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）が観察されたとき（細胞型およびウイルス増殖速度に依存して３〜９日）、または非細胞変性ウイルスに対してはトランスフェクションの９日後に細胞上清を採取し、遠心分離によって清澄にし、アリコートして−８０℃にて保存した。次いで、ＤＥＮＶ−４およびＹＦＶ以外の各ウイルスについては、同じ細胞型を用いて４回継代した。ＤＥＮＶ−４およびＹＦＶに対しては、それぞれＶｅｒｏＥ６およびＨＥＫ−２９３を用いた。継代は、６６６μＬの培地を含有する１２．５ｃｍ２培養フラスコ内の細胞に３３３μＬの清澄細胞上清を接種することによって行い、２時間のインキュベーション後に細胞を２回洗浄し（ＨＢＳＳ）、３ｍＬの新鮮な培地を加えた。２〜６日後に細胞上清を採取し、遠心分離によって清澄にし、アリコートして−８０℃にて保存した。清澄細胞上清（ウイルスストック）を用いて、ウイルスＲＮＡの定量化、ＴＣＩＤ５０アッセイ、直接免疫蛍光アッセイ、および全ゲノム配列決定を行った。
【０１１０】
リアルタイムＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲアッセイ
感染性ウイルスの生成を評価し、陽性の検出がｃＤＮＡ混入の結果ではなかったことを確認するために、逆転写酵素を伴うかまたは伴わないアクセス（Ａｃｃｅｓｓ）ＲＴ−ＰＣＲコア試薬（Ｃｏｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ）キット（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて、ウイルスＲＮＡを定量化し、検出されたｃＤＮＡの量と比較した。ＥＺ１ミニ・ウイルス２．０キットおよびＥＺ１バイオロボット（どちらもキアゲンより）を用いて、製造者の指示に従ってＲＮＡを抽出した。混合物（最終体積２５μＬ）は、標準量のＡＭＶ／Ｔｆｌ  ５Ｘ反応緩衝剤（Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ）、０．５μＭの各プライマー、０．５μＬのｄＮＴＰ混合物、０．５ｍＭのＭｇＳＯ４、０．５μＬのＡＭＶ逆転写酵素（ＲＴ−ＰＣＲに対してのみ）、０．５μＬのＴｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ、１５．５μＬのヌクレアーゼフリー水、および２μＬの抽出核酸を含んだ。ＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）（バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ））を用いて、次の条件によってアッセイを行った。すなわち、５０℃で１５分、９５℃で２分、その後に続いて９５℃で１５秒、６０℃で４０秒の４５サイクルである。６０℃のステップの際にデータ回収を行った。リアルタイムＰＣＲおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイによって得られたサイクル閾値（ｃｔ：Ｃｙｃｌｅ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｖａｌｕｅｓ）の差を用いて、ウイルスＲＮＡ生成を評価した。加えて、検量線から用量検出限界（任意単位（ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｕｎｉｔ）；ＡＵ）として表されるウイルスＲＮＡの量を算出した（培養ウイルスの細胞上清からの核酸を基準として用いた。５つの核酸抽出物をプールし、１０μｌアリコートを−８０℃にて保存した）。
【０１１１】
５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０：Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｏｓｅ  ５０）アッセイ
測定ごとに、ウェル当り１００μＬの培地に２０，０００ＢＨＫ−２１細胞を含有する９６ウェルプレート培養（接種の直前に加えた）に、５０μＬの清澄細胞培養上清の１０倍段階希釈物を接種した。各行は、６ウェルの同じ希釈物および２つのネガティブコントロールを含んだ。プレートを７日間インキュベートし、各ウェル中のＣＰＥがないかあるかを判断した。リード（Ｒｅｅｄ）およびミュンヒ（Ｍｕｅｎｃｈ）１８の方法を用いて、ＴＣＩＤ５０／ｍＬの決定を行った。
【０１１２】
直接免疫蛍光アッセイ（ｄＩＦＡ：Ｄｉｒｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｓｓａｙ）
清澄細胞上清を用いてそれぞれ２日および６日前に感染させた、ＪＥＶ  ＩおよびＪＥＶ  ＩＩＩに対するＳＷ１３細胞およびＶｅｒｏＥ６細胞の１２．５ｃｍ２培養フラスコを用いて、直接ＩＦＡを行った（上記ウイルスの継代を参照）。上清を除去し、細胞を２回洗浄し（ＨＢＳＳ；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、トリプシン処理し、採取し、新鮮な培地で希釈（１／５）した。この細胞懸濁物１５０μＬの細胞遠心分離（３分間、９００ｒｐｍ；サイトスピン（Ｃｙｔｏｓｐｉｎ）、サーモ・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））の後に、スライドを乾燥し、固定のために冷アセトンに２０分間沈め、乾燥し、適切に希釈したＪＥＶ特異的免疫血清（上を参照）またはモノクローナルＤＥＮＶ特異的抗体とともに３７℃にて３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、蒸留水で１回洗浄し、乾燥し、適切に希釈したＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体およびエバンスブルー対比染色剤とともに３７℃にて３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、蒸留水で１回洗浄し、乾燥し、装着し、蛍光顕微鏡を用いて読取った。
【０１１３】
全長ゲノムの配列分析
イオンＰＧＭシーケンサー１９（Ｉｏｎ  ＰＧＭ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ１９）（ライフ・テクノロジーズ）を用いて完全なゲノム配列決定を行い、ＣＬＣゲノミクス・ワークベンチ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ）６ソフトウェアによって分析を行った。最初にウイルス上清を清澄化し、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼＨＣ＞９９％（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））によって３７℃にて一晩処理した。ＥＺ１ミニ・ウイルス２．０キットおよびＥＺ１バイオロボット（どちらもキアゲンより）を用いたＲＮＡ抽出（ＲＮＡ担体は用いなかった；上を参照）の後、前述２０のとおりに核酸のランダム増幅を行った。イオンＰＧＭシーケンサーを用いて、製造者の指示に従って増幅ＤＮＡを分析した。得られた読取りを整えた。すなわち、最初に品質スコアを用い、次いでランダム増幅の際に用いたプライマーを除去し、最後に５’および３’末端において体系的に６ヌクレオチドを除去することによって整えた。２９ヌクレオチドよりも大きい長さを有する読取りのみを用い、参照として用いた元のゲノム配列に対してマップした。各位置に対する突然変異頻度（突然変異を有するウイルスゲノムの割合）は、その部位における参照と比べて突然変異を有する読取りの数を、読取りの総数で割った数として単純に算出した。
【０１１４】
結果
発明者らは、クローニング、ｃＤＮＡのバクテリアにおける増殖、またはインビトロＲＮＡ転写を必要とすることなく、ゲノムＤＮＡ材料からの感染性ＲＮＡウイルスの回収を容易にする簡単で多用途の逆遺伝学を開発した。発明者らの作業仮説は、ＲＮＡウイルスの全ゲノムをカバーする重複した二本鎖ＤＮＡフラグメントを感受性細胞にトランスフェクトすることによって、完全なウイルスゲノムのＤＮＡコピーの組み換えおよび合成を自発的に可能にするというものであった。第１の（５’）ＤＮＡフラグメントの５’末端にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含み、最終（３’）ＤＮＡフラグメントの３’末端にリボザイム配列およびＲＮＡポリアデニル化に対するシグナル配列を含むことによって、このゲノムＤＮＡコピーが（細胞質区画で複製するウイルスの場合）核外に効率的に排出される、真正の５’および３’末端を有する全長ＲＮＡゲノムとして転写されるであろうことを発明者らは予測した。
【０１１５】
最初に発明者らは、主要なフラビウイルスの進化系統を表す６つのフラビウイルス（すなわち、感染細胞の細胞質で複製するプラス極性の一本鎖ＲＮＡゲノムを有する節足動物媒介エンベロープウイルス）によって、この仮説をテストした。それらのウイルスとはすなわち、２つの日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ；遺伝子型Ｉ（ＪＥＶ  Ｉ）および遺伝子型ＩＩＩ（ＪＥＶ  ＩＩＩ））、１つの遺伝子型２の西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、１つの血清型４のデングウイルス（ＤＥＮＶ−４）、１つの黄熱ウイルス（ＹＦＶ）の野生型株、および１つの極東サブタイプのダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）である（表２）。
【０１１６】
全ゲノムをＰＣＲによって増幅して、各々が７０〜１００ｂｐの重複領域を有する約４ｋｂの３つのＤＮＡフラグメントにした。第１および最終のフラグメントは、それぞれ５’および３’においてヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ｐＣＭＶ）および肝炎デルタリボザイムに続くサルウイルス４０ポリアデニル化シグナル（ＨＤＲ／ＳＶ４０ｐＡ）に隣接した（図１）。ＰＣＲ産物をカラム精製し、１μｇのすべてのフラグメントの等モル混合物をＳＷ１３および／またはＢＨＫ−２１細胞系にトランスフェクトし、これはフラビウイルス感染性ゲノムの効率的な回収を確実にする。これらの感染性培養物からの細胞上清培地を同じ細胞型を用いて４回連続継代し、ＪＥＶ  Ｉ、ＪＥＶ  ＩＩＩ、ＴＢＥＶおよびＷＮＶの単離を可能にした。より要求の厳しいウイルスに対しては、付加的な許容細胞（例、ＤＥＮＶ−４：ＶｅｒｏＥ６細胞；ＹＦＶ：ＨＥＫ−２９３細胞）において継代することによって、単離を達成してもよい。次の基準の組み合わせを用いて、各ウイルスに対して４連続継代後のウイルス複製を示した。
（ｉ）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を用いた、細胞上清培地におけるウイルスゲノムの生成、
（ｉｉ）ＴＣＩＤ５０アッセイを用いた、細胞上清培地における感染性粒子の生成、
（ｉｉｉ）細胞変性効果（ＣＰＥ）の検出、
（ｉｖ）直接免疫蛍光アッセイによるウイルス抗原の検出、および
（ｖ）次世代配列決定（ＮＧＳ：ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）法を用いた、完全なウイルスゲノム配列決定。
【０１１７】
以下のとおり、この方法の頑強性、柔軟性および多用途性をさらに検証した。第１に発明者らは、トランスフェクションのために組み合わされる重複するフラグメントのサイズを減少し、数を増加させた。ＪＥＶ  Ｉの場合においてこれを例証したところ、約２ｋｂの最大６つの重複するアンプリコンを用いたとき、これに対するＩＳＡ法は感染性ウイルスを生成した。第２に発明者らは、異なるファミリーに属するプラス極性の一本鎖ＲＮＡゲノムを有するウイルスに対して、ＩＳＡ法を適用した。それらのウイルスとはすなわち、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ、エンベロープウイルス、トガウイルス科ファミリー）、およびコクサッキーウイルスＢ３（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ  Ｂ３）（ＣＶ−Ｂ３、非エンベロープウイルス、ピコルナウイルス科ファミリー）である。ここでも、ＨＥＫ−２９３細胞（ＣＨＩＫＶ）またはＢＧＭ細胞（ＣＶ−Ｂ３）におけるトランスフェクションおよび４継代の後に、感染性ウイルスを単離できた（下の表２）。さらに発明者らは、プラスミドを有する感染性ゲノムのトランスフェクション後に得られたＣＶ−Ｂ３を対照として使用し、発明者らは感染力および配列データにおいて類似の結果を得た（表３）。
【０１１８】
【表３】
0006541695.tif 000004
【０１１９】
第３に発明者らは、ＩＳＡ法が数日以内に遺伝子改変されたウイルスを生成する能力を示した。欠損ＪＥＶ  ＩＩＩ感染性クローンのフラグメント１におけるフレームシフト変異（１９１５ｄｅｌ）のＰＣＲに基づく修正、およびその後の対応ウイルスの回収（補足方法）によってこれを例証した。加えて発明者らは、遺伝子型ＩおよびＩＩＩのＪＥＶの（構造タンパク質をコードする）第１のＤＮＡフラグメントを交換することによって、キメラウイルスを生成できた。最初の２フラグメントの重複領域には１１のミスマッチがあるにもかかわらず、トランスフェクションの結果、遺伝子型間のＪＥＶ  Ｉ／ＪＥＶ  ＩＩＩおよびＪＥＶ  ＩＩＩ／ＪＥＶ  Ｉキメラの生成がもたらされた。ＮＧＳを用いた第４の継代で確立された完全ゲノム配列の分析は、遺伝的浮動（配列変更の比率）が中程度であったことを示した（固定された突然変異を考慮するとき、部位当り１，４５Ｅ−０３から９，００Ｅ−０５にわたる置換）。非同義突然変異の大部分、異なるＪＥＶ株の間で共有される突然変異の存在（７／８５）、および（ホットスポットおよび高度に保存された領域の両方による）ゲノムにわたる（１０％を超える頻度での）突然変異の非ランダムな分布は、細胞培養条件に対する順応を示した。
【０１２０】
変異率は単離に用いた細胞によって変動し、予想どおり、培養に順応した株に由来するものよりも、低継代株に由来するウイルスの方が高かった。結論として、ＩＳＡ法とは、ウイルス配列の完璧な制御を伴い、かつ既存の感染性クローン、ウイルスＲＮＡ、またはデノボ合成されたＤＮＡゲノム配列を含むさまざまな初期供給源から出発する、数日以内での感染性の遺伝子改変ＲＮＡウイルスの生成を促進する非常に簡単な手順である。この技術は、過去には考えられなかった規模でのＲＮＡウイルスに対する大きな逆遺伝学実験の設計を生成するという、将来的な可能性を有する。加えてこの技術は特定的に、実験的手順から回収されたウイルスの特徴を調節する能力を有する。付加的には、ＤＮＡサブゲノムフラグメントをＰＣＲによって簡便に得ることができるので、この方法は、ウイルスＲＮＡから出発するときにウイルス母集団１３の遺伝的多様性を保存する可能性を有する。たとえばさまざまな実験的選択条件下での順応ウイルス１５の選択を容易にするなどのために、人工的なウイルス異種性を作成するために、誤りを起こしやすいＰＣＲが使用されてもよく、反対に、生成されるウイルスのクローン性の程度を制御するために、忠実度の高いポリメラーゼおよびクローン増幅テンプレートが使用されてもよい。
【０１２１】
最後に、本発明の方法は、単純な感染性ＤＮＡサブゲノムフラグメントを室温にて別々に発送し、受領した機関が次いでそれらを組み合わせてトランスフェクトできることで、感染性ウイルス株の迅速、簡単かつ安全な回収を可能にすることによる、科学機関の間でのＲＮＡウイルスの将来的交換の安全性およびセキュリティを改革する可能性を有する。
【０１２２】
実施例２：チクングニアの弱毒化
材料および方法
細胞および抗体
アフリカミドリザル腎（Ｖｅｒｏ）細胞を、７％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；インビトロジェン）および１％のペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＳ；５０００Ｕ／ｍＬおよび５０００μｇ／ｍｌ；インビトロジェン）を伴う最小必須培地（インビトロジェン）中で５％ＣＯ２によって３７℃にて増殖させた。ヒト胚腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ＰＳを伴うダルベッコ変法イーグル培地（インビトロジェン）中で５％ＣＯ２によって３７℃にて増殖させた。ヒトスジシマカ（Ａ．ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）Ｃ６／３６細胞を、１０％の熱不活性化ＦＢＳ、１％ＰＳ、および５％のトリプトースリン酸ブロス（２９．５ｇ／Ｌ；シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を伴うＬ−１５培地（インビトロジェン）中で３０℃にて増殖させた。
【０１２３】
ＣＨＩＫＶ特異的免疫ヒト血清を用いて、ＥＬＩＳＡアッセイ（以下を参照）を行った。ＨＥＫ２９３細胞化合物と反応する非特異的分子の濃度を下げるために、４０μｌの血清を、最終体積４００μｌ（希釈剤：１％ＢＳＡ；ＫＰＬ）において、抽出されたＨＥＫ２９３細胞（１つの１５０ｃｍ２フラスコ培養から得られた細胞、アセトンを用いて抽出）と１６時間接触させた。ＡＦＭＢ研究室（生物高分子構造機能（Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｅｔ  Ｆｏｎｃｔｉｏｎ  ｄｅｓ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｑｕｅｓ）、ＵＭＲ  ６０９８、マルセイユ（Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ）、フランス（Ｆｒａｎｃｅ））よりご提供頂いた組み換えタンパク質（ｎｓＰ２のＣ末端領域とｎｓＰ３のＮ末端領域との融合；テキストＳ２）を用いて、標準的な方法（ラビット・スピーディー（Ｒａｂｂｉｔ  Ｓｐｅｅｄｙ）２８日間免疫化プロトコル、ユーロジェンテック（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ））を用いて２羽のウサギを免疫化した。精製したポリクローナル抗体（セファロースマトリックスを用いたアフィニティ精製；ユーロジェンテック）を用いて、ウエスタンブロット分析を行った。
【０１２４】
インシリコ再コード法
ヌクレオチドコドンをそれらが対応するアミノ酸配列に基づいてランダムに帰属させるコンピュータプログラムを用いて、ＣＨＩＫＶゲノムの３つの領域を再コードした。たとえば、アミノ酸バリンをＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡまたはＧＴＧでランダムに置換した。霊長類細胞系における希少コドンの影響を最小化するために、霊長類ゲノムにおけるこうした希少コドン（すなわちＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＵＣＧ、ＣＣＧ、ＧＣＧ、ＡＣＧ）の数および位置は変更しなかった。加えて、いくつかの部位における同義突然変異を修正することによって、一意の制限部位を保存した。最初に一意制限部位の利用可能性に基づいて、既知のＲＮＡ二次構造との重複を避けるように、再コードカセットの場所を調整した。最後に、この方法を用いてそれぞれ１３０２、１４１０および１５００塩基のｎｓＰ１、ｎｓＰ４およびＥ２／Ｅ１領域に位置する３つのカセットを設計した（カセットの配列はそれぞれ配列番号６３、配列番号６４、および配列番号６５に示す）。
【０１２５】
ＣＨＩＫＶ感染性クローン（ＩＣ：ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃｌｏｎｅｓ）の構築
我々は前述のＬＲ２００６株（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受入れＥＵ２２４２６８）のＩＣを、複製開始点および原核生物プロモーターをそれぞれ改変ｐＢＲ３２２開始点およびプロモーターＣＭＶ（ｐＣＭＶ）で置換することによって変更した。ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩの一意の制限部位を用いて、新たな複製開始点（改変ｐＢＲ３２２）と、原核生物プロモーターＣＭＶ（ｐＣＭＶ）と、部分的ウイルスゲノム（第１の塩基からＸｈｏＩまで）とを含む中間プラスミドを、標準的な分子技術を用いて得た。部分的ウイルスゲノム（ＸｈｏＩから最後まで）、ポリＡ末端、および肝炎Ｄリボザイム（ＨＤＲ：ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｄ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ）に続くサルウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化を合成し（ジェンスクリプト）、ＸｈｏＩおよびＡｖｒＩＩ一意制限部位を用いて中間構築物に導入した。最後に、一意制限部位ＢａｍＨＩ、ＡｇｅＩおよびＸｈｏＩを用いて、ゲノムに同義突然変異を導入した（突然変異カセットは、ＰＣＲ産物の融合によって得た）。必要とされる制限部位を生成するため、または望ましくない制限部位を除去するために、合計８つの同義突然変異を導入した。得られた野生型（ＷＴ：ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）と考えられる感染性クローンは、４つの新たな一意制限部位を組み込んでいた。
【０１２６】
すべての再コード領域を合成し（ジェンスクリプト）、次いで消化（Фｎｓｐ１に対してＢａｍＨＩ／ＸｍａＩ、Фｎｓｐ４に対してＡｇｅＩ／ＡｐａＩ、およびФｅｎｖに対してＸｈｏＩ／ＡｖｒＩＩ；ニュー・イングランド・バイオラボ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））、消化産物のゲル精製（キアゲン）、ライゲーション（Ｔ４ＤＮＡリガーゼ；インビトロジェン）、およびエレクトロコンピテントＳＴＢＬ４細胞（インビトロジェン）への形質転換によって、ＩＣに挿入した。トランスフェクションの前に、すべての感染性クローンを精製し（０．２２μｍろ過）、制限地図および特定のプライマー対の組を用いた完全配列決定によって、それらの完全性を確認した。
【０１２７】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイ
ｎｓＰ２領域に位置する１７９ｎｔのフラグメント（ヌクレオチド位置２６３１から２８０９）を用いて、再コードしたかまたはしていないすべてのＣＨＩＫＶ（ユニバーサルアッセイ）のゲノムＲＮＡ（プラス鎖）を検出した。ｎｓＰ４領域に位置する１６８ｎｔの別のフラグメント（ヌクレオチド位置６８０４から６９７１）を用いて、拮抗実験からの細胞上清を分析した。すなわち、２組のプライマーおよびプローブによって、我々はｎｓＰ４領域において再コードされたウイルスまたは同じ領域内に変更を有さないウイルスを特異的に検出できた。
【０１２８】
複製動力学
Ｖｅｒｏ、ＨＥＫ２９３またはＣ６／３６細胞において３つ組で行った複製動力学研究の結果を用いて、各ウイルスの複製適応度を定めた。７つのＩＣからの７つのウイルス（ＷＴウイルスおよび６つの再コードウイルス）の比較のために、すべてのウイルスによって１つの実験を行った。ウイルスストックまたはＩＣを用いて、それぞれ細胞を感染またはトランスフェクトした。継代ウイルスの複製適応度を評価するために、発明者らはＶｅｒｏにおける第１の継代および各継代レジメンに対する第１２、第２５、第３７および第５０の継代によって、各ウイルス（ＷＴ、Φｎｓｐ４およびΦｎｓｐ１  Φｎｓｐ４  Φｅｎｖウイルス）に対して１つの実験を行った（１３の上清を３つ組でテストした）。単一サイクル複製動力学に対して、コンフルエントなＶｅｒｏ、Ｃ６／３６またはＨＥＫ２９３細胞の７５ｃｍ２培養フラスコを感染させるために、推定ＭＯＩ５を用いた。感染の３０分後に細胞を２回洗浄し（ＨＢＳＳ）、２０ｍｌの培地を加えた。洗浄の直前ならびに２、８、１４、２０および２８時間ｐｉに１ｍｌの細胞上清をサンプリングした。低い推定ＭＯＩによる複製動力学および継代ウイルスの複製適応度の評価に対して、コンフルエントなＶｅｒｏまたはＣ６／３６細胞の２５ｃｍ２培養フラスコを感染させるために、推定ＭＯＩ０．０１を用いた。感染の２時間後に細胞を２回洗浄し（ＨＢＳＳ）、８ｍｌの培地を加えた。洗浄後（Ｔ０）ならびに２４、４８および７２時間ｐｉに１ｍｌの細胞上清をサンプリングした。感染性ＤＮＡクローンを用いた複製動力学に対して、サブコンフルエントＨＥＫ２９３細胞の７５ｃｍ２培養フラスコを、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン）を用いて製造者の指示に従ってＩＣでトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後に細胞を２回洗浄し（ＨＢＳＳ）、２０ｍｌの培地を加えた。洗浄後（Ｔ０）ならびに１６、２４および４８時間ｐｉに１ｍｌの細胞上清をサンプリングした。
【０１２９】
すべてのサンプリングした細胞上清を遠心分離によって清澄にし、アリコートして−８０℃にて保存した。次いで、ＴＣＩＤ５０アッセイおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイ（体系的に行っていない、図面の説明文を参照）を用いてそれらを分析した。ＥＺ１バイオロボットにおいてＥＺ１ウイルス・ミニ・キットｖ２（どちらもキアゲンより）を用いて、清澄細胞上清から核酸を抽出した。
【０１３０】
ウイルス拮抗実験
５つの異なるＰＦＵ比率（ＷＴ／再コードウイルス１／９９、２０／８０、５０／５０、８０／２０、９９／１）を用いて、ＷＴウイルスと４つの再コードウイルス（Φｎｓｐ４、Φｎｓｐ１  Φｎｓｐ４、Φｎｓｐ１  Φｅｎｖ、またはΦｎｓｐ１  Φｎｓｐ４  Φｅｎｖ）のうちの１つとを拮抗して増殖させた。全体的推定ＭＯＩ０．５を第１の接種に用いた。各実験に対して、コンフルエント細胞の２５ｃｍ２フラスコ培養を２時間感染させ、洗浄し（ＨＢＳＳ）、次いで７ｍｌの培地を加えた後に４８ｈインキュベートした。次いで、各実験からのウイルスを次のとおりに９回継代した。すなわち、コンフルエント細胞の２５ｃｍ２フラスコ培養を精製培養上清（遠心分離）によって２時間感染させ、洗浄し（ＨＢＳＳ）、次いで７ｍｌの培地を加えた後に４８ｈインキュベートした。各継代において、推定ＭＯＩは約０．５にて妨げられた。各感染の後、ＥＺ１バイオロボットにおけるＥＺ１ウイルス・ミニ・キットｖ２（どちらもキアゲンより）を用いて、清澄培養上清から核酸を抽出した。Φｎｓｐ４領域（上を参照）を標的とする２つの特定のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いて、各ウイルスの量を評価し、２つの値の比率（ＷＴ／再コード）を算出した。
【０１３１】
細胞内ＲＮＡおよびウイルスタンパク質の定量化
ウイルスストックによってＨＥＫ２９３細胞のコンフルエント１２ウェルプレートを感染させるために、全体的推定ＭＯＩ５を用いた。感染の３０分後に細胞を１回洗浄し（ＨＢＳＳ）、２ｍｌの培地を加えた。８時間ｐｉにおいて、細胞変性効果がないことをチェックし、培養上清を捨て、細胞を１回洗浄した（ＨＢＳＳ）。すべての実験は３つ組で行った。ウエスタンブロット分析および細胞内ウイルスＲＮＡ定量化に対して、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ／タンパク質キットによって製造者の指示（マッハライ・ナーゲル（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ））に従って、同じウェルを用いて総ＲＮＡおよびタンパク質の単離を行った。ＳＤＳを含有する１０％ポリアクリルアミドゲルにおいてタンパク質抽出物を分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。抗Ｎｓｐ１／２ウサギｐＡｂ、抗アクチンＣ−２  ｍＡｂ（サンタ・クルス・バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））および対応するＨＲＰコンジュゲート二次抗体を用いた。イモビロン（ミリポア）を使用した後にブロットをＸ線フィルムに露出することによって、タンパク質バンドを明らかにした。ウイルス細胞内ＲＮＡを評価するために、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイ（上を参照）を行った（前述のとおり、細胞数および／または抽出ＲＮＡの品質の相違を説明するために、正規化群としてｍＲＮＡアクチンを用いた）。ＥＬＩＳＡによるウイルスタンパク質の定量化のために、細胞スクレーパーを用いて細胞を機械的に採取し、８００μＬのＰＢＳに再懸濁し、ボルテックスし、超音波処理によって破壊した（２０ＫＨｚにて３０秒間、ミソニックス・ソニケーター（Ｍｉｓｏｎｉｘ  Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）ＸＬ）。前処理したＣＨＩＫＶ特異的免疫ヒト血清を用いて、ウイルスタンパク質を検出した。
【０１３２】
インセルロでのウイルスの実験的継代
３つのレジメンに従って、ＷＴおよび２つの再コードウイルス（Φｎｓｐ４およびΦｎｓｐ１  Φｎｓｐ４  Φｅｎｖ）を５０回継代した。すなわち、ＶｅｒｏまたはＣ６／３６細胞における連続継代、およびＶｅｒｏとＣ６／３６との交互継代である。各継代に対して、コンフルエント細胞の２５ｃｍ２培養フラスコを希釈清澄細胞上清によって２時間感染させ、洗浄し（ＨＢＳＳ）、７ｍｌの培地を加えた後に４８時間インキュベートした。次いで細胞上清を採取し、遠心分離によって清澄にし、アリコートして−８０℃にて保存した。各継代に対して、推定ＭＯＩは約０．１にて妨げられた。混入を避けるために、ウイルス継代を３つのフェーズで行った。すなわち、ＷＴおよびΦｎｓｐ４ウイルスの連続継代、同じウイルスの交互継代、ならびにΦｎｓｐ１  Φｎｓｐ４  Φｅｎｖウイルスの継代である。同時に継代されるすべてのウイルスを、異なる層流キャビネット内で逐次操作した。
【０１３３】
プラークアッセイ
１ｍｌのウイルスストックによって、１２ウェル培養プレート内のＶｅｒｏ細胞の単層を感染させた（上を参照）。２時間後に細胞を洗浄し（ＨＢＳＳ）、２ｍｌの０．９％アガロースを含む培養培地を加えた。７２時間のインキュベーション後、１０％ホルムアルデヒドによって細胞を４時間固定し、０．１％ナフタレンブラック溶液によって３０分間染色した。
【０１３４】
５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）アッセイ
各決定に対して、コンフルエントＶｅｒｏ細胞の９６ウェルプレート培養に、１５０μｌ／ウェルの遠心分離清澄細胞培養上清の１０倍段階希釈物を接種した。各行は、６ウェルの希釈物および２つのネガティブコントロールを含んだ。プレートを７日間インキュベートし、各ウェル中のＣＰＥがないかあるかを読取った。リードおよびミュンヒの方法を用いて、ＴＣＩＤ５０／ｍｌの決定を行った。あるサンプルによって得られた値がこの方法の検出閾値（１０１．８２ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）よりも低かったとき、発明者らは２倍、２０倍および２００倍希釈物による別のアッセイを行った（検出閾値：１０１．１３ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）。この閾値よりも低い値はグラフィック提示において１０１．１３ＴＣＩＤ５０／ｍｌに等しいものと考え、統計分析には加えなかった。再コードおよび／または実験的継代がＣＰＥの出現を有意に変更し得ることを想定して、発明者らは感染性ウイルスの存在の感受性指標としてｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ（下を参照）を用いた。各ウイルス（第１の継代ならびに利用可能なときには第２５および第５０の継代）に対して、このアッセイを行った。すべてのウイルスに対して、ＣＰＥ陽性のウェルは１６よりも低い閾値サイクルによるｑＲＴ−ＰＣＲにおいて陽性であったが、ＣＰＥを生成しなかったものは陰性または閾値サイクル＞３５による陽性であり、この値は初期ＲＮＡ収率の希釈後に予期されるものであった。
【０１３５】
赤血球凝集アッセイ
コンフルエントなＶｅｒｏまたはＣ６／３６細胞の２５ｃｍ２培養フラスコにウイルスストック（上を参照）を感染させるために、推定ＭＯＩ５を用いた。感染の３０分後に細胞を２回洗浄し（ＨＢＳＳ）、ＦＢＳなしの培地８ｍｌを加えた。１６時間ｐｉにおいて２ｍｌの細胞上清をサンプリングした。サンプリングした上清を遠心分離によって清澄にし、アリコートして−８０℃にて保存した。次いで、それらをＴＣＩＤ５０アッセイ（上を参照）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いて分析し、さらに標準的な方法を用いて赤血球凝集滴定アッセイを行った。すなわち、０．４％ウシアルブミン／ホウ酸食塩水ｐＨ９．０溶液（最終体積：ウェル当り３５μｌ）で、Ｕ底マイクロプレート上に細胞上清の２倍段階希釈物を調製した。３５マイクロリットルの予め希釈したガチョウ赤血球（最終ｐＨ６．０調整希釈剤を用いて１／１５０）を加え、混合物をホモジナイズし、室温にて４５分間インキュベートし、次いで次の４つのスコア付け記号を用いて読取った。すなわち、＋＋は完全な赤血球凝集、＋は部分的な赤血球凝集、＋／−は微量の赤血球凝集、−は負の赤血球凝集であった。赤血球凝集力価は、＋を観察した最高希釈の逆数であった。
【０１３６】
結果
発明者らは、再興している旧世界病原性アルボウイルスであるＣＨＩＫＶの大規模再コードの、複製適応度および細胞変性に対する影響を評価した。大規模再コードによる弱毒ウイルスの生成は、ワクチン開発およびウイルス病原性の進化の基礎の理解に対する興奮するような、かつおそらく重要な経路を表すものである。アミノ酸配列の変更が付随しない部位特異的再コードは、新規の表現型特性の可能性を軽減し、我々がコドン置換間隔の長さを変えることによって適応度を調節することを可能にするが、それに加えて生弱毒ワクチンの一般的開発に対して、コスト低減および長期免疫の単一用量誘導を含む利益を提供する。
【０１３７】
主要な結果は、本明細書に開示されるランダム再コード法が、霊長類および節足動物細胞の両方におけるＣＨＩＫＶの複製適応度を減少させるという観察であった。ＣＨＩＫＶ複製適応度の減少は、再コードの程度と直接相関した。カ細胞の１複製サイクルの間に、コドン再コードは放出ウイルスの感染力価を著しく低減させる一方で、ウイルス粒子の数は安定なままであることを発明者らは見出した。これは、ウイルスが再コードされるときに成熟プロセス（すなわち、リボ核タンパク質の形成およびＨＡを含有する形質膜へのそれらの挿入）に欠陥が生じ得ることを暗示している。
【０１３８】
これに対し、霊長類細胞において、このウイルス粒子の感染性の減少は、おそらくは複製複合体が損なわれたことによるウイルスＲＮＡおよびタンパク質の生成の低減に関連していた。
【０１３９】
これらの結果は、ウイルスゲノムにおける同義突然変異は主要な適応度への影響を有し、それは過去に記載された少数のシス作用領域（ジェラルディン（Ｇｅｒａｒｄｉｎ）ら、２００８）だけではないことを示す。
【０１４０】
実際、この実験の際に、６つの再コードウイルスを生成し、そのうちで最も再コードされたウイルスは、異なるタンパク質をコードする３つの領域が変更された（合わせて、４，２１２ｎｔにわたって８８２の同義突然変異を導入した）。再コードしたポリオウイルスおよびインフルエンザＡウイルスが弱毒化されることを示した過去の研究を支持して、複製適応度の低減の観察は、ＲＮＡウイルスにおける同義突然変異の割合は中立ではないことを強く示唆する。実際に、いくつかの同義突然変異は継代プロセスの際に積極的に選択されたようであり、同義部位はウイルス適応度の中心であるという考えを強化する。結論として、非同義突然変異の場合と同様に、同義突然変異は中立、有益、または有害のいずれでもあり得ると考えられる。
【０１４１】
同義部位における進化パターンは、たとえばＧ＋Ｃ％、コドン使用頻度バイアス、およびジヌクレオチド頻度などのゲノム全体の突然変異プロセスによって形作られ得る。理論上生存可能なゲノムの部分集合を生成するこれらの全体的な制約は、ポリオウイルス、インフルエンザＡウイルスおよびバクテリアウイルスＴ７におけるコドン再コードの過去の研究によって評価されており、この研究はコドン使用頻度バイアス、コドン対バイアス、またはＣｐＧ／ＵｐＡ頻度の特定的変更を適用した。
【０１４２】
これらの全体的特性をわずかに変更しただけの大規模ランダム再コード法を用いて、発明者らは霊長類および節足動物細胞の両方における複製適応度の低減をなおも観察した。これらの結果は、局所的な制約も、たとえばＲＮＡ二次構造を破壊することなどによってＲＮＡウイルスにおける同義部位に顕著な淘汰圧を提供し得ることを示す。ＲＮＡウイルスのコード領域には多数の機能性二次構造が存在し、したがって同義部位を含む（ポリオウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、アルファウイルスおよびＨＩＶ−１における注目すべき例を有する）ため、類似の構造はＣＨＩＫＶにおいて共通であると考えられる。
【０１４３】
最近、ポリオウイルスの非カプシド領域に適用された類似の再コード戦略が、２つの新規の機能性ＲＮＡエレメントの同定をもたらしたことが示された。本明細書に記載される大規模ランダム再コードの概念は、ウイルス複製適応度に対するランダム単一同義突然変異（ゲノムの遺伝的特徴は変更していない）の負の影響の報告によっても支持される。
【０１４４】
最後に、これらの結果は、ウイルス複製適応度の低減はさまざまな因子によって駆動されることを示す。
【０１４５】
第１に、研究されるウイルスの性質は重要なパラメータである。すなわち、最大８８２のランダム同義突然変異を導入することは、ＣＨＩＫＶの複製適応度に明らかに影響したことを発明者らは見出したが、２つの過去の研究は、ポリオウイルスのカプシド前駆体（Ｐ１）領域に適用された同等のランダム再コード法が、複製適応度に顕著に影響しなかったことを示した（それぞれ９３４および１５３の同義置換が導入された）。
【０１４６】
再コード領域の場所は、重要な第２の因子を構成する。すなわち、Ｅ２／Ｅ１領域における再コードは、他の遺伝領域よりも大きい適応度の損失をもたらした。完全な野生型ＣＨＩＫＶゲノムの分析は、この再コード領域における同義多様性が本来低レベルであることを明らかにし、この領域が特定の局所的な進化の制約を受けていることを示し、これはこの領域における再コードの顕著な影響を部分的に説明している。
【０１４７】
１つの突然変異の平均の影響は、明らかにランダム再コードにおいては特異的アプローチよりも重要でないだろう。これは、ランダム大規模再コードが将来のワクチン候補を設計するときにいくつかの局面において有利であり得ることを示唆する。すなわち、
（ｉ）多数の突然変異が生成されるため、野生型への復帰変異は本質的に困難になるはずである。
（ｉｉ）本実験において、複製適応度の低減は再コードの程度とともに減少するため、この方法は、再コード領域の長さおよび導入する同義突然変異の数を調節することによって適応度低減を微調整することの門戸を開く。
（ｉｉｉ）ウイルスゲノム全体にわたって位置するいくつかの再コード領域の組み合わせを使用することによって、ＷＴと再コードウイルスとの組み換えによる完全な表現型復帰変異が防がれ得る。すなわち、大規模な配列変更は組み換えを本質的に困難にしてもよく、組み換えの場合にも再コード株を表すゲノムの部分はなおも適応度低減に関連するいくつかの突然変異を有すると考えられる。
【０１４８】
したがって、これらの再コードウイルスは非常に安定である。実証のために、発明者らはインセルロで野生型および２つの再コードＣＨＩＫＶを継代した。発明者らは再コードウイルスの連続継代の際に、コドン再コードに対する応答と、培養条件に対する順応とが同時に起こることを観察した。しかし、ＷＴウイルスと再コードウイルスとに観察された高レベルの収束進化は、コドン再コードから起こる選択は培養条件に対する順応のための選択よりも弱いと考えられること、および／または再コードの損失を回復させるための有益な突然変異は起こりにくかったことを示す。したがって、再コードの影響を逆戻りさせることの困難さに対するこの間接的洞察は、これらの再コードウイルスの安定性をさらに強調する。
【０１４９】
加えてこれらの実験は、１つの宿主で得られた突然変異が、異なる宿主型においては有害であり得る（霊長類細胞における連続継代は霊長類細胞におけるウイルス複製適応度を増加させたのに対し、カ細胞における連続継代は霊長類細胞におけるウイルス適応度を減少させた）ことおよび、最も再コードされたウイルスを除き、交互継代は深刻に（ｉ）複製適応度の向上を制限し、かつ（ｉｉ）突然変異の出現を遅らせることを確証するものである。
【０１５０】
結論として、これらの実験は、ランダムコドン再コードがＣＨＩＫＶの複製適応度を有意に減少させることを示す。これらの結果はすべて重要かつ励まされるものであるが、慢性感染症を生じるＲＮＡウイルスにそれらを容易に拡張することはできない。よって、ワクチン候補の生成のためのこれらの新世代弱毒化法の可能性を評価するために、動物モデルにおける研究が明らかに必要である。しかし、このアプローチは、アルボウイルスに対するものを含む将来のＲＮＡウイルスワクチンの開発を助け得る。多数のわずかに有害な同義突然変異を導入することは、霊長類および節足動物細胞の両方においてＣＨＩＫＶの複製適応度を数桁低減させた。この戦略は、ウイルスの集中的な連続継代培養後の復帰変異および適応度の回復の制限をもたらしており、野生型ウイルスとの組み換えが起こったときの完全な表現型復帰変異の危険性を低減させると考えられる。我々の結果は、こうした改変ウイルスが実世界の天然のアルボウイルスサイクルに戻ることは困難であろうとして我々を励ますものである。さらに、複製適応度の減少は再コードの程度と相関しており、この観察はウイルス弱毒化を調節するための将来の戦略の開発において有利であり得る。
【０１５１】
実施例３：さらなるＲＮＡウイルスの弱毒化
本発明の大規模コドン再コードステップは、標的病原体の完全な配列が分かって感染性ゲノムを生成できてからすぐの非常に短期間で有望なワクチン株を得る可能性を含む、ワクチン開発に対するいくつかの利点を有する弱毒化の強力な方法であることが示された。この大規模コドン再コードステップはさらに、対費用効果の高い態様で、複製適応度損失の程度を正確に調節すること、および長期保護を与える安全な生弱毒ワクチンを生成することに対する可能性を有する。
【０１５２】
発明者らは、本明細書に開示されて実施例２に例示された弱毒化の方法を、他の２つのアルボウイルス（どちらもフラビウイルス；エンベロープ一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルス）に適用した。すなわち、ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）および日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）である。
【０１５３】
Ａ）ＴＢＥＶ
前にチクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）に適用した大規模コドン再コードの方法に従って、発明者らはＴＢＥＶ（Ｏｓｈｉｍａ５−１０株）のＮＳ５ゲノム領域（配列番号６６に示される１４１２ｐｂのカセット）を変更し、２７３のサイレント突然変異（ランダムコドン再コード）を挿入した。
【０１５４】
日本で１９９５年に単離されたＴＢＥＶ株Ｏｓｈｉｍａ５−１０は、極東サブタイプに属し、マウスにおいて重要な病原性を示す（ヒトと同様に脳炎を誘発する）。ＩＳＡ法および古典的な方法を用いて、野生型（ＷＴ）およびＮＳ５＿ｒａｎｄｏｍ＿ｒｅ−ｅｎｃｏｄｅｄウイルスを得る（感染性クローンを得た）。対応するウイルスの複製適応度をインセルロで測定したところ、ほぼ同一であった。
【０１５５】
【表４】
0006541695.tif 000005
【０１５６】
次いで、インビボモデルを用いて、この再コードＴＢＥＶの弱毒表現型を測定した。腹腔内接種（２．１０４、２．１０５および２．１０６ＴＣＩＤ５０のウイルスを用いた）の後、２０日間にわたってマウスの症状出現をモニタし、毎日体重測定を行った。
【０１５７】
結果は、ＷＴウイルスに感染させたマウスに比べて、ＮＳ５＿ｒａｎｄｏｍ＿ｒｅ−ｅｎｃｏｄｅｄウイルスに感染させたマウスに対する体重減少および症状出現の遅延を示す。さらに、少なくとも１つの症状、体重減少（≦９４％）、および脳内のウイルス（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるウイルスＲＮＡの検出）を示すマウスの数は、ＮＳ５＿ｒａｎｄｏｍ＿ｒｅ−ｅｎｃｏｄｅｄ感染マウスよりもＷＴ感染マウスの方が有意に高い。最初の接種の３０日後に、ＮＳ５＿ｒａｎｄｏｍ＿ｒｅ−ｅｎｃｏｄｅｄウイルスに感染させたマウスにおいて、高レベルの血清中和ＩｇＧ抗体を観察した。最後に、ＷＴウイルスによる投与実験（最初の接種の３０日後にマウスに投与した）は、再コードウイルスに予め感染したマウスがすべて保護された（症状の出現および体重減少に基づく）ことを示す。
【０１５８】
【表５】
0006541695.tif 000006
【０１５９】
逆遺伝学の方法ＩＳＡならびにこれらのＷＴおよび再コードフラグメントの組み合わせを用いて、発明者らはゲノムの異なる部分に漸進的レベルの再コードを含む多数の組み換えウイルスを生成した。
【０１６０】
Ｂ）ＪＥＶ
発明者らは、大規模ランダムコドン再コード法を用いて、ＪＥＶ株「ＪＥＶ＿ＣＮＳ７６９＿Ｌａｏｓ＿２００９」（遺伝子型１）を変更した。
【０１６１】
ここでは異なるアプローチを用いる。すなわち発明者らは、２つの異なるレベルの再コード、すなわちオープンリーディングフレーム全体にわたる５８５または１７１７の同義突然変異の挿入を伴う高レベルおよび低レベルの再コードを用いて、ＰｒＭの最初からＮＳ５ゲノム領域の最後までのほぼすべての完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をインシリコで再コードした（図３）。
【０１６２】
この目的のために、発明者らは配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、および配列番号７２に示される少なくとも１つの再コードカセットを用いた。
【０１６３】
ヒト細胞を用いて、これらの再コードＪＥＶのインセルロ複製適応度を測定した。予備的結果は、再コードのレベル、再コード領域のサイズ、および再コードフラグメントのゲノム位置に従う複製適応度の減少を示す（図４）。
【０１６４】
実施例４：インビボ生成
本発明の方法を用いて、ＲＮＡウイルスの全ゲノムをカバーし、かつ５および３’においてそれぞれＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターおよびターミネーター／ＲＮＡポリアデニル化シグナルに隣接する、重複するフラグメントを調製した。
【０１６５】
これらのＤＮＡフラグメントを生きた動物に直接接種し、いくつかの動物サンプルから感染性ウイルスを回収した。加えて、感染症の典型的な徴候を観察するために、動物の臨床的調査（症状の出現および有意な体重減少）を行った。
【０１６６】
ａ）実験１：ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ；フラビウイルス）
発明者らは、野生型株のダニ媒介脳炎ウイルス（Ｏｓｈｉｍａ５．１０株（ジェンバンク受入れ番号ＡＢ０６２０６３））を用いた。発明者らは、ＤＮＡ重複フラグメントに本発明の方法を適用した。
【０１６７】
５週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｊのメスのマウスに、３つのＤＮＡ重複フラグメントを接種した。
【０１６８】
ウイルス感染症の臨床的経過を、以下によってモニタした。
（ｉ）疾患の臨床的徴候（ふるえ、脊柱後弯、眼の汚れ、不全片麻痺または不全四肢麻痺、片麻痺または四肢麻痺）、および
（ｉｉ）Ｆａｂｒｉｔｕｓ  Ｌら、２０１５、「大規模ランダムコドン再コードを用いたダニ媒介脳炎ウイルスの弱毒化（Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｉｃｋ−Ｂｏｒｎｅ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｃｏｄｏｎ  Ｒｅ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  １１（３）にまさに記載されるとおりのマウスの体重。
【０１６９】
接種の１４日後に屠殺したマウスから脳および脾臓を採取した。
【０１７０】
脳および脾臓を粉砕して遠心分離した。結果として得られた上清を用いて、感染性ウイルスの存在を評価した。
【０１７１】
分子（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）および古典的細胞培養の方法（感染性ウイルスの単離）を用いて、感染性ウイルスの存在を評価した。
【０１７２】
２μｇから５μｇの範囲の初期量のＤＮＡ、および２つの異なる接種経路（腹腔内および皮内注射）を用いて、脳および脾臓の両方から感染性ウイルスを検出した。疾患の臨床的徴候（有意な体重減少および症状）も観察した。
【０１７３】
ｂ）実験２：授乳期マウスの脳内接種
発明者らは、野生型株のダニ媒介脳炎ウイルス（Ｏｓｈｉｍａ５．１０株（ジェンバンク受入れ番号ＡＢ０６２０６３））および日本脳炎（ＪＥＶ＿ＣＮＳ７６９＿Ｌａｏｓ＿２００９（ジェンバンク受入れ番号ＫＣ１９６１１５））を用いた。発明者らは、本発明の方法を用いてＤＮＡ重複フラグメントを生成した。
【０１７４】
ＤＮＡ重複フラグメントをＰＢＳで希釈して用いるか、またはトランスフェクション試薬と混合した。
【０１７５】
ＤＮＡ重複フラグメントの脳内注射によって、授乳期ＯＦ１マウスに接種した。疾患の臨床的徴候（ふるえ、嗜眠）を追跡することによって、ウイルス感染症の臨床的経過をモニタした。接種の６〜１２日後に屠殺したマウスから脳を採取した。脳を粉砕して遠心分離した。結果として得られた上清を用いて、感染性ウイルスの存在を評価した。
【０１７６】
分子（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）および古典的細胞培養の方法（感染性ウイルスの単離）を用いて、感染性ウイルスの存在を評価した。
【０１７７】
２μｇのＤＮＡを用いて、トランスフェクション試薬の添加を伴っても伴わなくても、両方のウイルス（ＴＢＥＶおよびＪＥＶ）に対して脳内に感染性ウイルスを検出した。疾患の臨床的徴候も観察した。
【０１７８】
結論
よって発明者らは、インビボでウイルスを生成することによって本明細書に開示される方法の力を利用した。よって前記方法は、インビボで、すなわち直接対象の体内で生弱毒ワクチンを開発するために非常に効率的である。
【図１】
0006541695.tif 000008
【図２】
0006541695.tif 000009
【図３】
0006541695.tif 000010
【図４】
0006541695.tif 000011
【配列表】
0006541695000001.app