(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
低級有機酸を基質としてスクアレンを生成する、Bacillus sp. SS-1株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０４４）、Bacillus sp. SS-2株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０４５）、又はBacillus sp. SS-3株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０４６）であるBacillus属の微生物。
【請求項２】
請求項１に記載の微生物であって、
前記低級有機酸に加え、糖類、アルコール類、タンパク質、アミノ酸及び脂質のうちから選ばれた少なくとも１つを基質として利用できることを特徴とする微生物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の微生物であって、
前記低級有機酸がプロピオン酸及び酢酸の少なくとも一方であることを特徴とする微生物。
【請求項４】
請求項２に記載の微生物であって、
グルコースを基質として生育可能であることを特徴とする微生物。
【請求項５】
低級有機酸資化性を有する、Bacillus sp. SS-1株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０４４）、Bacillus sp. SS-2株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０４５）、又はBacillus sp. SS-3株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０４６）であるBacillus属の微生物を用いて炭素源からスクアレンを生産する方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、
前記炭素源がプロピオン酸及び酢酸の少なくとも一方であることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法において、
前記炭素源がプロピオン酸を含み、
プロピオン酸の濃度が１０ｍＭ以上１００ｍＭ以下の液中で前記微生物を培養する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項５〜７のうちいずれか１つに記載の方法において、
前記炭素源は、低級有機酸と、糖類、アルコール類、タンパク質、アミノ酸、脂質のうちから選ばれた少なくとも１つとを含み、
前記炭素源を含む液中で前記微生物を培養する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項５〜８のうちいずれか１つに記載の方法において、
グルコースを含む液中で前記微生物を培養する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項５〜９のうちいずれか１つに記載の方法において、
５０℃以上の液中での培養により前記微生物の芽胞を形成させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項５〜１０のうちいずれか１つに記載の方法において、
前記微生物により、脂質がさらに生産されることを特徴とする方法。
【請求項１２】
低級有機酸資化性を有する、Bacillus sp. SS-1株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０４４）、Bacillus sp. SS-2株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０４５）、又はBacillus sp. SS-3株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０４６）であるBacillus属の微生物を用いて、炭素源を含む廃液の処理を行う方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、
前記廃液には低級有機酸と、糖類、アルコール類、タンパク質、アミノ酸、脂質のうちから選ばれた少なくとも１つとが含まれることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に開示された技術は、微生物を用いてスクアレン等の炭化水素を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有機性の産業排水は、微生物を含む活性汚泥により処理されているが、その際に発生する余剰汚泥は法律上施設内で処理しなければならないとされている。活性汚泥が嫌気発酵するとプロピオン酸等の有機酸が生成され、これにより他の菌が死滅する。このような有機酸を含有する汚泥は脱水焼却されなければならず、その処理には大きなコストがかかる。このため、焼却される汚泥の量の低減や、汚泥の再利用が望まれている。
【０００３】
特許文献１には、プロピオン酸等の低級脂肪酸を炭素源として利用し、炭化水素を生産できる微生物が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−２２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に記載された微生物は、燃料として使用される炭化水素を生産できる。しかしながら、実際の廃液には低級有機酸だけでなく多様な炭素源が含まれているところ、低級有機酸以外の炭素源や複数種類の炭素源が含まれる液中では炭化水素の合成が阻害される可能性がある。
【０００６】
上記課題に鑑み、本発明は、低級有機酸等種々の炭素源を基質として炭化水素を生成でき、且つスクアレンの生成が阻害されにくい微生物を用いて炭化水素を生産することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書には、低級有機酸を基質として少なくとも一種の炭化水素を生成するBacillus属の微生物が開示されている。炭化水素は、例えばスクアレンであってもよい。
【０００８】
この微生物は、例えば、Bacillus sp. SS-1株、Bacillus sp. SS-2株、Bacillus sp. SS-3株又はこれらと同一の微生物学的性質を有するBacillus属の微生物である。
【０００９】
また、本明細書に開示された方法は、Bacillus属の微生物を用いて低級有機酸からスクアレンを生産する方法である。
【００１０】
また、本明細書に開示された微生物のスクリーニング方法は、環境中から採取した試料に含まれる微生物を低級有機酸を含む培地中で培養する工程と、前記低級有機酸を含む培地を加熱して芽胞を形成する微生物を取得する工程と、前記微生物に含まれるスクアレンの量を確認する工程とを含む。
【発明の効果】
【００１１】
本明細書に開示された微生物及びこれを用いた方法によれば、低級有機酸からスクアレン等の炭化水素を生産することが可能になる。その結果、例えば活性汚泥中の低級有機酸の量を低減させることで廃液処理等のコストを大幅に低減すると同時に、従来は廃棄物となっていた使用済みの活性汚泥を燃料等として再利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、有機酸資化能を持つ細菌のスクリーニング手順を示すフローチャートである。
【図２】図２は、菌体中の全脂質の重量のうちスクアレンの重量が占める割合を１００分率で表した図である。
【図３】図３は、培養液の体積当たりのスクアレン量を示す図である。
【図４】図４は、乾燥菌体当たりのスクアレン収量を示す図である。
【図５】図５は、表３に示す「２０−煮−２０」の条件で培養したBacillus sp. SS-2についてのＧＣ分析結果を示す図である。
【図６】図６は、図５に結果を示す培養を行った際のBacillus sp. SS-2の生育と培地におけるプロピオン酸濃度の経時変化とを示す図である。
【図７】図７は、ＧＴＹ培地からＡＴＣＣ＃１４０９培地へと移した場合のBacillus sp. SS-1、Bacillus sp. SS-2及びBacillus sp. SS-3の増殖曲線を示す図である。
【図８】図８は、菌体中の全脂質の重量のうちスクアレンの重量が占める割合を１００分率で表した図である。
【図９】図９は、培養液の体積当たりのスクアレン量を示す図である。
【図１０】図１０は、乾燥菌体当たりのスクアレン収量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（実施形態）
−炭化水素産生菌のスクリーニング−
本願発明者らは、低級有機酸への耐性を有し、且つスクアレン等の炭化水素を産生できる菌の探索を行った。本願明細書で「低級有機酸」とは、炭素数が６以下の有機酸を指すものとする。
【００１４】
図１は、有機酸資化能を持つ細菌のスクリーニング手順を示すフローチャートである。
【００１５】
まず、広島県の大崎上島付近の海域において海水及び礫を試料として採取し、当該試料に含まれる菌を培養した（ステップＳ１）。本ステップでは、１０ｍＭのプロピオン酸が添加されたＡＴＣＣ＃１４０９培地（ｐＨ７．０）を用いて集積培養を行った。このＡＴＣＣ＃１４０９培地は、３０ｇ／ＬのＮａＣｌ、１ｍＬ／ＬのＳＬＡ  ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ、１ｍＬ／ＬのＶＡ  ｖｉｔａｍｉｎｓ、１．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ＬのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／ＬのＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ、１．０ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、３．０ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、０．７ｇ／ＬのＮａ２ＳＯ４、１．０ｇ／Ｌの酢酸ナトリウム（酢酸として１０ｍＭ相当の量）、０．５ｇ／Ｌのアスコルビン酸ナトリウム、０．１ｇ／ＬのＹｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、０．１５６ｇ／Ｌの硫酸ナトリウムを含む。
【００１６】
ＳＬＡ  ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓは、２５０ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、７０ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＺｎＣｌ２、５００ｍｇのＨ３ＢＯ３、３０ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＮａ２ＳｅＯ３・５Ｈ２Ｏ、１．８ｇＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏを１Ｌの蒸留水に溶解させることで作成された。
【００１７】
ＶＡ  ｖｉｔａｍｉｎｓは、１００ｍｇのビオチン、３５０ｍｇのニコチンアミド、３００ｍｇのチアミン−ＨＣＬ、２００ｍｇのパラアミノ安息香酸、１００ｍｇのピリドキシン−ＨＣＬ、１００ｍｇのＤ−パントテン酸カルシウム、５０ｍｇのシアノコバラミン（Ｂ１２）を蒸留水１Ｌに溶解させることで作成された。
【００１８】
本ステップでは、２８℃、暗所、好気条件（１００ｒｐｍで振盪）で１６８時間培養した。なお、培養温度は２０℃〜３７℃、好ましくは２５℃〜３２℃程度であればよい。この培養可能温度は以後の培養工程でも同様である。培養時間は温度等の条件に応じて適宜変更してもよい。
【００１９】
次に、それぞれ１０ｍＭの酢酸及びプロピオン酸を含有するＡＴＣＣ＃１４０９培地の寒天培地（アガロース濃度１．５％）に先の培養で得られた菌液を塗布し、暗所、好気条件で培養を行った（ステップＳ２）。
【００２０】
次いで、寒天培地に生じたコロニーを取り、それらの菌を９６穴プレートに植菌し、１０ｍＭのプロピオン酸を含有するＡＴＣＣ＃１４０９培地により培養した（ステップＳ３）。ＡＴＣＣ＃１４０９培地の量はウェルごとに６００μＬとした。培養は２８℃、１００ｒｐｍ、暗所、好気条件で行った。
【００２１】
次に、プレートリーダー（Spectra MAX M5、Molecular Devices社製）を用いて各ウェルでの吸光度を測定した。ここでは、培養された菌液の一部を９６穴プレートに移し、６６０ｎｍでの吸光度を測定した。本ステップにおいて、吸光度が大きいことは、菌が増殖していることを意味する。
【００２２】
本ステップでは、各培養液を遠心分離して集菌し、菌体をPhosphate Buffered Saline（ＰＢＳ）で洗浄後、５０μＬのＰＢＳと２μＬのナイルレッド（和光純薬製、濃度１ｍｇ／ｍＬ）とを加えて菌体を染色した。試料を９６穴プレートに移し、蛍光／発光マイクロプレートリーダー（Fluoroskan Ascent FL、Thermo社製）を用いて励起波長５４０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍの蛍光強度を測定した。各株の細胞密度当たりの蛍光強度を算出し、その値が比較的高かった株を、有機酸耐性菌の候補株として選択した。 
【００２３】
次に、先のステップで生育が良好な菌を選択し、酸性培地を用いて培養した（ステップＳ４）。本ステップでは２０ｍＭのプロピオン酸を含み、ｐＨが４程度に調整されたＡＴＣＣ＃１４０９培地を用いて２８℃、暗所、１００ｒｐｍ程度の好気条件で１６８時間培養を行った。培養は容量が２０ｍＬの試験管に３ｍＬの培地を投入して行った。
【００２４】
次に、培地の温度を９０℃に上げた状態で２０分〜４０分程度培養した（ステップＳ５）。これにより、形成された芽胞を採取して、酢酸及びプロピオン酸をそれぞれ１０ｍＭの濃度で含むＡＴＣＣ＃１４０９培地を３ｍＬずつ用いて暗所、好気条件、２８℃で７日間培養した（ステップＳ６）。
【００２５】
次いで、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）及びガスクロマトグラフィー質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）を用いてスクアレンの産生量を調べた（ステップＳ７）。その結果、後述する、スクアレンの産生量の多い３つの菌株が得られた。表１に、この３つの菌株により産生されたスクアレンの量を示す。なお、表１における全脂質量には、便宜的にスクアレン等の炭化水素の量が含まれている。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
得られた菌株を、酢酸及びプロピオン酸をそれぞれ１０ｍＭの濃度で含むＡＴＣＣ＃１４０９培地を３ｍＬずつ用いて２８℃、７日間、暗所にて回転数１００ｒｐｍで振盪培養した結果、表１に示すように、全脂質量当たりのスクアレン量は８．１３％〜１１．６６％、培養液当たりのスクアレン量は０．０３９３ｍｇ／Ｌ〜０．０９６６ｍｇ／Ｌ、乾燥菌体当たりのスクアレン量は０．６５８ｍｇ／ｇ〜２．７５ｍｇ／ｇとなった。
【００２８】
なお、この測定では、GC-17A、CBM-102（島津製作所製）を用いた。解析ソフトとしてGCSolutionバージョン２．４（島津製作所製）を用いた。カラムとしては内径０．２５ｍｍ、長さ３０ｍ、膜厚０．１μｍのDB-5HTキャピラリーGCカラム（Agilent Technologies社製）を用いた。分析条件は、カラムオーブンを１００℃から３８０℃まで１０℃／ｍｉｎで昇温させ、キャリアガスとしてＮ２を用い、試料気化室を３００℃とし、検出器を３８０℃とし、圧力を１０７ｋＰａとし、全流量を１６ｍＬ／ｍｉｎとし、カラム流量を１．１９ｍＬ／ｍｉｎとし、スプリット比を１：１０とした。スタンダートとしてスクアレン（純度≧98%, SIGMA-ALDRICH製）を用いて検量線を作成し、各試料でのスクアレンのピーク面積からスクアレン量を算出した。
【００２９】
また、ガスクロマトグラフィー質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）によりスクアレンの同定を行った。カラムとしては内径０．２５ｍｍ、長さ３０ｍ、膜厚０．２５μｍのZB-1HT（Zebron製）を用い、ＧＣ／ＭＳとしてはJMS-T100GCV"AccuTOF GCv 4G"（日本電子製）を用いた。分析条件は、カラムオーブンを１００℃から３８０℃まで１０℃／ｍｉｎで昇温させ、キャリアガスとしてＨｅを用い、試料気化室を３００℃とし、検出器を２７０℃とし、注入量を１．０μＬとし、カラム流量を１．２ｍＬ／ｍｉｎとし、スプリット比を１：１０とした。
【００３０】
−菌種の同定−
次に、得られた菌株の種を同定するために公知のＰＣＲ法によりこれらの菌株の１６ＳｒＤＮＡの全長配列を解析した。この結果、３つの菌株はいずれも単菌化されていることが確認できた。第１の菌株（後述するBacillus sp. SS-1株）ではBacillus aryabhattai strain B8W22の１６ＳｒＤＮＡ配列と９９．９％の相同性（１５２７／１５２９）を示し、第２の菌株（後述するBacillus sp. SS-2株）ではBacillus aryabhattai strain B8W22の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と９９．８％の相同性（１５２６／１５２９）を示し、第３の菌株（後述するBacillus sp. SS-3株）ではBacillus aryabhattai strain B8W22の１６ＳｒＤＮＡ配列と９９．７％の相同性（１５２４／１５２９）を示した。このように、得られた３つの菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列はいずれもBacillus aryabhattai strain B8W22の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と９９％以上の相同性を示したことから、Bacillus属の菌であることが判明した。
【００３１】
これらの細菌はグラム陽性で好気性の短桿菌であってヘテロ栄養性を有し、プロピオン酸他、表２に示される低級有機酸を資化できる。これらの細菌は、グルコース、マルトース等の多糖類、タンパク質、アミノ酸、脂質等を資化できることも確認できた。また、これらの細菌は高温条件や、ｐＨ４以下程度の酸性条件等の過酷な条件下で芽胞を形成できる。これら細菌のコロニーは白色であり、近縁種であるBacillus aryabhattai strain B8W22（International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2009), 59, 2977-2986参照）とは異なることから、新種であると言える 。
【００３２】
本願発明者らは、得られた菌株について、プロピオン酸以外の低級有機酸の資化性についても調べた。具体的には、酢酸ナトリウムを抜いたＡＴＣＣ＃１４０９培地に炭素源として炭素数が５以下の種々の低級有機酸を添加して２８℃で３日間、暗所、好気条件下で培養した。培地中の各低級有機酸の濃度は１０ｍＭとした。
【００３３】
この試験結果を表２に示す。表４では、１０ｍＭのプロピオン酸を添加したＡＴＣＣ＃１４０９培地を用いて７日間培養した場合の生育状態を基準として、当該基準を超える生育状態であれば判定Ａとし、当該基準と同等程度の生育状態であれば判定Ｂとし、生育可能であるが当該基準以下である場合を判定Ｃとした。
【００３４】
【表２】
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【００３５】
表２に示すように、単離された細菌は、少なくとも炭素数が５以下の低級有機酸を資化できることが確認できた。
【００３６】
なお、第１の菌株（後述するBacillus sp. SS-1株）と第２の菌株（後述するBacillus sp. SS-2株）ではBacillus sp. SS-1株がクエン酸存在下での生育がより良好であることを除いて両株が同等の低級有機酸資化性を示した。
【００３７】
上述のように、ここで得られた３つの菌株はBacillus属の新種であるので、上述の第１、第２及び第３の菌株は、それぞれBacillus sp. SS-1、Bacillus sp. SS-2、Bacillus sp. SS-3と命名された。
【００３８】
なお、Bacillus sp. SS-1は受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０４４として、Bacillus sp. SS-2は受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０４５として、Bacillus sp. SS-3は受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０４６として、それぞれ千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室所在の独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託されている。
【００３９】
−炭化水素の産生特性についての検討−
本願発明者らは、Bacillus sp. SS-1、Bacillus sp. SS-2、Bacillus sp. SS-3のそれぞれを、プロピオン酸濃度の異なる培地を用いて培養し、炭化水素の一例としてスクアレンの収量を調べた。Bacillus sp. SS-1、Bacillus sp. SS-2、Bacillus sp. SS-3のそれぞれを、プロピオン酸を添加したＡＴＣＣ＃１４０９培地を用いて２８℃、暗所、７日間の条件で培養した。ここでは容量が２０ｍＬの試験管に３ｍＬの培地を入れ、回転数１００ｒｐｍで振盪培養を行った。プロピオン酸の濃度は１０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭ、６０ｍＭ、８０ｍＭ及び１００ｍＭとした。培養後、遠心分離等により菌体を凍結乾燥させ、ＧＣにより菌体中の全脂質量と、スクアレン量とを測定した。
【００４０】
図２は、菌体中の全脂質の重量のうちスクアレンの重量が占める割合を１００分率で表した図であり、図３は、培養液の体積当たりのスクアレン量を示す図であり、図４は、乾燥菌体当たりのスクアレン収量を示す図である。
【００４１】
図２に示す結果から、Bacillus sp. SS-1、Bacillus sp. SS-2、Bacillus sp. SS-3のいずれの菌株でもプロピオン酸濃度が高くなるにつれて全脂質量に占めるスクアレン量の値が大きくなっていくことが分かった。全脂質量に占めるスクアレン量の割合は、プロピオン酸の濃度によらず、Bacillus sp. SS-1が最も高かった。
【００４２】
図３に示す結果から、培養液の体積当たりのスクアレン収量は、プロピオン酸濃度が８０ｍＭのときに最も大きくなることが分かった。培養液当たりのスクアレン収量はBacillus sp. SS-3が最も多く、次いでBacillus sp. SS-1が多く、Bacillus sp. SS-2が最も少なかった。
【００４３】
図４に示す結果から、乾燥菌体重量当たりのスクアレン収量はBacillus sp. SS-1が最も大きく、Bacillus sp. SS-2が次に大きく、Bacillus sp. SS-3が最も小さかった。ただし、乾燥菌体の重量当たりのスクアレン収量が最大となるプロピオン酸濃度は、Bacillus sp. SS-1で６０ｍＭ、Bacillus sp. SS-2で４０ｍＭ、Bacillus sp. SS-3で８０ｍＭであり、菌株間で若干の相違が見られた。
【００４４】
以上の結果から、Bacillus sp. SS-1、Bacillus sp. SS-2、Bacillus sp. SS-3は、少なくとも培地中のプロピオン酸濃度が１０ｍＭ以上１００ｍＭ以下の範囲で生育可能であり、プロピオン酸を基質としてスクアレンを生産できることが分かった。
【００４５】
次に、本願発明者らは、培養条件の変更がスクアレンの生産に影響するか否かを調べた。得られた菌株は芽胞を形成可能であり、高温で培養可能であるので、室温での培養と高温での培養とで得られるスクアレンの量を比較した。表３は、Bacillus sp. SS-1及びBacillus sp. SS-2について、温度条件等を変えて培養を行った場合のスクアレンの収量を示す。なお、表３に示す「全脂質量」には便宜上スクアレン等の炭化水素の量も含まれている。
【００４６】
【表３】
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【００４７】
まず、Bacillus sp. SS-1及びBacillus sp. SS-2について、２０ｍＭの濃度でプロピオン酸を添加した４ｍＬのＡＴＣＣ＃１４０９培地中で２８℃、１９０時間、暗所で振盪培養した。その後、２０ｍＭの濃度でプロピオン酸を添加した５ｍＬのＡＴＣＣ＃１４０９培地に先の培養で得られた菌液５０μＬを植え継いで２８℃、１６３時間、暗所で振盪培養した（表３における培養条件「２０−２０」）。次いで、遠心分離等により培養された菌体を集菌し、乾燥させてからＧＣを用いて全脂質量及びスクアレンの収量を算出した。なお、各条件での培養には、いずれも容量が２０ｍＬの試験管を用いた。
【００４８】
また、Bacillus sp. SS-1及びBacillus sp. SS-2について、４０ｍＭの濃度でプロピオン酸を添加した４ｍＬのＡＴＣＣ＃１４０９培地中で２８℃、２０６時間、暗所で振盪培養した。その後、２０ｍＭの濃度でプロピオン酸を添加した５ｍＬのＡＴＣＣ＃１４０９培地に先の培養で得られた菌液５０μＬを植え継いで２８℃、１６３時間、暗所で振盪培養した（表３における培養条件「４０−２０」）。次いで、遠心分離等により培養された菌体を集菌し、乾燥させてからＧＣを用いて全脂質量及びスクアレンの収量を算出した。
【００４９】
また、Bacillus sp. SS-1及びBacillus sp. SS-2について、２０ｍＭの濃度でプロピオン酸を添加した４ｍＬのＡＴＣＣ＃１４０９培地中で２８℃、１９０時間、暗所で振盪培養した後、培地の温度を９０℃まで上げて４０分間保持した。その後、２０ｍＭの濃度でプロピオン酸を添加した５ｍＬのＡＴＣＣ＃１４０９培地に加熱後の菌液５０μＬを植え継いで２８℃、１６３時間、暗所で振盪培養した（表３における培養条件「２０−煮−２０」）。次いで、遠心分離等により培養された菌体を集菌し、乾燥させてからＧＣを用いて全脂質量及びスクアレンの収量を算出した。
【００５０】
この結果、表３に示すように、培地の温度を９０℃にした場合でも、培地の温度を上げない場合と同等以上の量のスクアレンを得られることが分かった。なお、培養液の体積当たりの乾燥菌体の収量は、Bacillus sp. SS-1では高温処理した場合に少なくなっていたが、Bacillus sp. SS-2では高温処理した場合の方がプロピオン酸濃度を４０ｍＭから２０ｍＭに変更した場合よりも多かった。温度に対する感受性は菌株ごとに多少の違いがあると考えられる。
【００５１】
しかしながら、Bacillus sp. SS-1では高温処理した場合、高温処理をしない場合に比べて乾燥菌体当たりのスクアレン量、培養液当たりのスクアレン量が大きくなっていた。Bacillus sp. SS-2では高温処理した場合、乾燥菌体当たりの全脂質量は増えたが、乾燥菌体当たりのスクアレン量、培養液の体積当たりのスクアレン量は高温処理した場合と大きな差がなかった。
【００５２】
図５は、２０ｍＭの濃度でプロピオン酸を添加したＡＴＣＣ＃１４０９培地を用いて培養されたBacillus sp. SS-2についてのＧＣ分析結果を示す図である。培養温度は２８℃として培養時間は７日間とした。集菌後の試料の調整方法は、表３の場合と同様とした。
【００５３】
図５に示す結果から、Bacillus sp. SS-2の培養後の菌体内では、スクアレン（ピーク１２）等の炭化水素の他にパルミチン酸（ピーク５）、ステアリン酸（ピーク７）、ジアシルグリセロール及びトリアシルグリセロール等の脂質が合成されていることが分かった。
【００５４】
また、図６は、図５に結果を示す培養を行った際のBacillus sp. SS-2の生育と培地におけるプロピオン酸濃度の経時変化とを示す図である。プロピオン酸濃度は公知の方法により測定した。図６に示すように、菌の生育に伴って培地中のプロピオン酸は消費され、菌数が飽和した後はプロピオン酸の消費量は小さくなっていた。
【００５５】
図６に示す結果から、プロピオン酸がBacillus sp. SS-2によって炭素源として利用され、且つプロピオン酸がスクアレンや脂質の合成にも利用されることが確かめられた。なお、Bacillus sp. SS-1、Bacillus sp. SS-3についても菌の生育と培地におけるプロピオン酸濃度を測定したが、図６と同様に菌の生育に伴ってプロピオン酸が消費されていた。
【００５６】
また、表３の結果から、Bacillus sp. SS-1、Bacillus sp. SS-2とも乾菌当たりの全脂質量は３０ｍｇ／ｇ以上と高い値を示し、Bacillus sp. SS-1、Bacillus sp. SS-2ではスクアレン等の炭化水素以外に脂質等も多く合成されていることが分かった。なお、Bacillus sp. SS-2だけでなくBacillus sp. SS-1及びBacillus sp. SS-3においてもスクアレン等の炭化水素の他にパルミチン酸、ステアリン酸、ジアシルグリセロール等の脂質が合成されていた。
【００５７】
また、以上の結果から、Bacillus sp. SS-1、Bacillus sp. SS-2を用いてスクアレンを生産させる場合、高温処理を行ってもスクアレンの収量が落ちることはないことが分かった。一方、Bacillus sp. SS-3は９０℃以上の高温処理で死滅したが、９０℃未満の高温処理では芽胞を形成可能であり、且つスクアレンの収量もBacillus sp. SS-1、Bacillus sp. SS-2と同等であった。
【００５８】
従って、プロピオン酸等の低級有機酸からスクアレンを生産させる際に、高温処理を行って不要な雑菌が繁殖するのを防ぐことができると考えられる。Bacillus sp. SS-2では高温処理後の培養で乾菌当たりの全脂質量が大幅に増加しており、Bacillus sp. SS-1でも高温処理後の培養で全脂質量が高い値を示すことから、この高温処理は、脂質の生産を目的とする場合でも有効であることが分かる。なお、高温処理の際の液温は少なくとも５０℃以上であってもよい。高温処理の処理時間は処理温度によって適宜変更すればよいが、例えば処理温度を９０℃にした場合には４０分以下としてもよい。Bacillus sp. SS-3を用いる場合、９０℃未満で処理時間を２０分未満としてもよい。
【００５９】
また、Bacillus sp. SS-1、Bacillus sp. SS-2及びBacillus sp. SS-3は高温だけでなく低温下でも死滅しにくく、ｐＨの変化等の環境変化に強いので、野外等の温度調節を行いにくい場所であっても安定してスクアレンを生成させることができる。なお、本実施形態の微生物によれば、培地の温度が少なくとも２０℃以上３７℃以下、好ましくは２５℃以上３２℃以下程度の範囲であれば低級有機酸からスクアレンを生成させることができる。また、低級有機酸からスクアレンを生成させる際の培地のｐＨは少なくとも４以上８以下程度であってもよい。Bacillus sp. SS-1、Bacillus sp. SS-2及びBacillus sp. SS-3は、ｐＨが４未満になっても芽胞を形成できるので死滅することはない。従って、本実施形態の微生物によれば、スクアレンを生成させる際に温度や環境を調節するためのコストを削減することができる。
【００６０】
次に、本願発明者らは、培地中に含まれる基質がスクアレンの収量に与える影響を調べた。具体的には、１ｗｔ％でグルコースを含む３ｍＬのＧＴＹ培地でBacillus sp. SS-1、Bacillus sp. SS-2及びBacillus sp. SS-3のそれぞれを７２時間培養した後、１００００ｇで５分間、４℃の条件で遠心分離して集菌した。得られた菌体に、１０ｍＭのプロピオン酸を添加した３ｍＬのＡＴＣＣ＃１４０９培地を加え、さらに７２時間培養した。ＧＴＹ培地で培養後の菌体と、ＡＴＣＣ＃１４０９培地で培養後の菌体について、全脂質量とスクアレンの量とを測定した。
【００６１】
ＧＴＹ培地は、１ｗｔ％グルコースの他、０．６ｗｔ％トリプトン、０．２ｗｔ％酵母抽出物及び２ｗｔ％ＮａＣｌを含んでいる。培養は２８℃、暗条件で行った。
【００６２】
図７は、ＧＴＹ培地からＡＴＣＣ＃１４０９培地へと移した場合のBacillus sp. SS-1、Bacillus sp. SS-2及びBacillus sp. SS-3の増殖曲線を示す図である。図７の横軸は時間（hour）を示し、縦軸は６６０ｎｍでの吸光度、すなわち菌濃度を示す。なお、図７に示すSS-1'、SS-2'は、それぞれBacillus sp. SS-1株、Bacillus sp. SS-2株をＧＴＹ培地での培養開始前に９０℃で４０分間処理した菌を表す。
【００６３】
図７に示すように、高温処理後のBacillus sp. SS-1、Bacillus sp. SS-2はＧＴＹ培地中で７２時間まで右肩上がりで増殖を続けていた（図中のSS-1'とSS-2'）。これに対し、高温処理を受けていないBacillus sp. SS-1、Bacillus sp. SS-2及びBacillus sp. SS-3は、培養開始から２４時間後まで直線的に増殖した後一旦増殖が停止し、４８時間後から７２時間後までで再度増殖していた。
【００６４】
また、貧栄養培地であるＡＴＣＣ＃１４０９培地へと移すと、いずれの菌においても移植直後に菌濃度が大きく減少してからほぼ定常状態を保っていた。高温処理後のBacillus sp. SS-2（図７中のSS-2'）のみは移植直後から移植後７２時間経過時まで菌濃度が減少し続けていた。
【００６５】
図８は、菌体中の全脂質の重量のうちスクアレンの重量が占める割合を１００分率で表した図であり、図９は、培養液の体積当たりのスクアレン量を示す図であり、図１０は、乾燥菌体当たりのスクアレン収量を示す図である。
【００６６】
図８〜図１０に示すように、ＧＴＹ培地で培養した場合よりもＡＴＣＣ＃１４０９培地に移して培養した場合の方が、全脂質重量当たりのスクアレン重量、培養液体積当たりのスクアレン収量、乾燥菌体当たりのスクアレン収量ともほとんどの試料で増えていることが分かった。ＡＴＣＣ＃１４０９培地中ではＧＴＹ培地中よりも菌濃度が低くなっているにも関わらず培養液当たりのスクアレン収量は高温処理後のBacillus sp. SS-2（図中のSS-2'）を除いて増加していた。
【００６７】
この結果から、酢酸及びプロピオン酸が、より好ましいスクアレン合成の基質である可能性があると考えられる。また、酢酸やプロピオン酸に限らず、グルコースを基質としてもスクアレンが生成できることも確認できた。
【００６８】
廃糖蜜や酒造廃液には糖分が多量に残留しているが、このような糖分を含む物質を処理する場合であっても本実施形態の微生物を用いれば特別な前処理を行うことなくスクアレンの生産を行うことができる。
【００６９】
本実施形態の微生物であるBacillus sp. SS-1、Bacillus sp. SS-2、Bacillus sp. SS-3は上述のように、低級有機酸やグルコースの他にもマルトース等の糖類、グリセロール等のアルコール類、タンパク質、アミノ酸、脂質等を資化可能であり、これら種々の炭素源の存在下でスクアレンを合成可能であると考えられる。また、これらの菌株では、低級有機酸等の炭素源とそれ以外の種々の炭素源が液中に存在している場合であってもスクアレンの合成は阻害されにくいと考えられる。
【００７０】
このため、複数の炭素源を含む廃液であってもこれらの菌株を用いて高い収率でスクアレンを生産することが可能となっている。また、本実施形態の微生物では低級有機酸以外の他、種々の炭素源を利用できるので、単独で用いた場合でも種々の廃液を処理することができ、スクアレン等の炭化水素や脂質を生産することもできる。
【００７１】
また、本実施形態の微生物を用いれば、低級有機酸等の炭素源を含む活性汚泥等の物質に菌液を加えて培養条件を整えるだけでスクアレン等を生産させることができる。廃液等の処理を行う際には、活性汚泥に代えて本実施形態の微生物の菌液を用いることもできる。本実施形態の微生物の菌液と低級有機酸を含む処理対象物とを混合させて培養することで、良質な燃料となるペレットを得ることが可能となる。このため、本実施形態の微生物によれば、低コストで活性汚泥等の廃棄量を削減することができるだけでなく、燃料等として利用できるスクアレンを簡便に生産させることができる。
【００７２】
以上のように、本実施形態の微生物は、処理したい物質と直接混合して好気条件下、適切な範囲の温度で保持しておくことでスクアレン等の炭化水素を生成することが可能である。処理される対象物は低級有機酸等の炭素源を含む液状物質であれば特に限定されない。上述のように、処理される対象物は基質として酢酸及びプロピオン酸に代えてギ酸、フマル酸、クエン酸、酒石酸等他の低級有機酸の少なくとも１種以上を含んでいてもよく、酢酸及びプロピオン酸のいずれか一方と他の低級有機酸とを共に含んでいてもよい。また、処理対象物が、グルコース等の糖類、グリセロール等のアルコール類、脂質、タンパク質等の炭素源を含んでいてもよい。
【００７３】
処理される液体のｐＨは例えば４以上８以下の範囲であればよく、酸性であればより好ましい。処理される液体に含まれる低級有機酸の濃度は、少なくとも１０ｍＭ以上１００ｍＭ以下であればよいが、これに限定されない。
【００７４】
なお、微生物の培養条件は、処理される廃液等のスケールに応じて適宜変更すればよい。大量の廃液を処理する場合であっても、例えば液のｐＨを４以上８以下、温度を２０℃以上３７℃以下とし、好気条件で培養を行うことで、スクアレンを合成させることができる。
【００７５】
また、大量の廃液等を処理する場合であっても、小量の処理と同様に培養の途中で例えば廃液の温度を５０℃以上に上げて一旦芽胞を形成させてから再度微生物の培養を続けてもよい。高温処理の時間は特に限定されず、処理温度によっても異なるが、４０分以下であってもよい。菌株による耐熱性のばらつきを考慮し、処理時間を２０分未満としてもよい。
【００７６】
また、本実施形態の微生物は環境中から単離されたものであるが、遺伝子工学等の技術を用いてスクアレンの収率をさらに向上させたものを用いてスクアレンを生産させてもよい。
【００７７】
また、低級有機酸を含む培地を用いて高温処理をする方法により、上述の３株と同様に低級有機酸から高い収率でスクアレンを生成できるBacillus属の菌株を単離してもよい。これにより、スクアレンの生産効率をさらに向上させることができる。本実施形態の方法で得られた菌株は、Bacillus sp. SS-1、Bacillus sp. SS-2及びBacillus sp. SS-3と同一の微生物学的性質を有していればよい。ここで、Bacillus sp. SS-1等と「同一の微生物学的性質を有する」とは、液中で低級有機酸を炭素源としてスクアレンを生産できるBacillus属の細菌であることを意味する。
【００７８】
また、以上では主に本実施形態の微生物を用いてスクアレンを生産する方法について説明したが、生産される物質は必ずしもスクアレンに限定されない。本実施形態の微生物はスクアレン以外に例えばジアシルグリセロールやトリアシルグリセロール等の脂質を合成することもできる。従って、本実施形態の微生物を用いれば低級有機酸やその他の炭素源を含む液中で燃料の材料等として活用できる炭化水素や脂質を高い収量で得ることが可能である。
【００７９】
なお、本実施形態では低級有機酸からスクアレンを産生する菌のスクリーニング方法を説明したが、図１に示すステップＳ７においてスクアレン以外の炭化水素の収量を確認することで、所望の炭化水素を合成できる微生物を選抜することも可能である。
【００８０】
また、基質となる炭素源を含む被処理物質は必ずしも液体に限定されず、細かく砕いた被処理物質と本実施形態の菌株を含む菌液とを混合することでスクアレン等の炭化水素や脂質を生産させることが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
以上説明したように、本開示の一例に係るスクアレン等の生産方法は、活性汚泥や廃液等の処理に適用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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