(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物由来の多能性幹細胞から後腎ネフロン前駆細胞を分化誘導する方法であって、該方法が、以下の３つの工程：
（ａ）多能性幹細胞から誘導された胚様体を、高濃度（濃度Ａ）のＷｎｔアゴニストおよび場合によりさらにＢｍｐを含有する培地で培養する工程、
（ｂ）前記胚様体を、Ｂｍｐおよび中濃度（濃度Ｂ）のＷｎｔアゴニストを含有する培地で培養する工程、および
（ｃ）前記胚様体を、Ｆｇｆおよび低濃度（濃度Ｃ）のＷｎｔアゴニストを含有する培地で培養する工程、
をその順で含むことを特徴とする分化誘導方法、
ここで、Ｗｎｔアゴニストの濃度は、濃度Ａ＞濃度Ｂ＞濃度Ｃであって、濃度Ａは濃度Ｃの少なくとも５倍である。
【請求項２】
前記工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）におけるＷｎｔアゴニストの濃度は、濃度Ａは濃度Ｂの少なくとも３倍であり、かつ濃度Ｂは濃度Ｃの少なくとも３倍である、請求項１に記載の分化誘導方法。
【請求項３】
前記工程（ｂ）において、培地がさらにアクチビンを含む、請求項１または２に記載の分化誘導方法。
【請求項４】
前記工程（ｂ）において、培地がさらにレチノイン酸を含む、請求項３に記載の分化誘導方法。
【請求項５】
前記ＷｎｔアゴニストがＧＳＫ−３阻害剤である（ただし、各工程のＷｎｔアゴニストは同じであっても異なってもよい）、請求項１〜４のいずれかひとつに記載の分化誘導方法。
【請求項６】
前記Ｗｎｔアゴニストが、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、およびＳＢ４１５２８６からなる群より選ばれる（ただし、各工程のＷｎｔアゴニストは同じであっても異なってもよい）、請求項５に記載の分化誘導方法。
【請求項７】
前記Ｂｍｐが、Ｂｍｐ２、Ｂｍｐ４およびＢｍｐ７からなる群より選ばれる、かつ、前記Ｆｇｆが、Ｆｇｆ２、Ｆｇｆ９およびＦｇｆ２０からなる群より選ばれる、請求項１〜６のいずれかに記載の分化誘導方法。
【請求項８】
前記ＢｍｐがＢｍｐ４であり、かつ前記ＦｇｆがＦｇｆ９である、請求項１〜７のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
【請求項９】
前記工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）におけるＷｎｔアゴニストが、ＣＨＩＲ９９０２１であり、かつ、前記濃度Ａが７．５μＭ〜１５μＭ、前記濃度Ｃが０．５μＭ〜２．０μＭである、請求項１〜８のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
【請求項１０】
前記工程（ａ）および（ｂ）におけるＢｍｐがＢｍｐ４であり、工程（ａ）における濃度が０．１ｎｇ／ｍｌ〜３ｎｇ／ｍｌであり、工程（ｂ）における濃度が１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌである、請求項９に記載の分化誘導方法。
【請求項１１】
前記工程（ｂ）において、アクチビンを２．５〜４０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む請求項１０に記載の分化誘導方法。
【請求項１２】
前記工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）が、連続した工程である請求項１〜１１のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
【請求項１３】
前記工程（ｃ）において、培地が、Ｂｍｐ、アクチビンまたはレチノイン酸のいずれも含まない培地である、請求項１〜１２のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
【請求項１４】
前記多能性幹細胞がマウスＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞、またはヒトＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、請求項１〜１３のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
【請求項１５】
前記多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である、請求項１４に記載の分化誘導方法。
【請求項１６】
前記多能性幹細胞がマウスＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であり、かつ工程（ａ）が、少なくとも１日以上４日以内培養する工程である請求項１４に記載の分化誘導方法。
【請求項１７】
前記多能性幹細胞がヒトＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であり、かつ工程（ａ）が、少なくとも３日以上１１日以内培養する工程である請求項１４に記載の分化誘導方法。
【請求項１８】
多能性幹細胞からネフロン前駆細胞を誘導するための分化誘導培地キットであって、該キットは、（ｉ）分化誘導培地、および（ｉｉ）Ｗｎｔアゴニストを含み、使用時において、前記Ｗｎｔアゴニストを段階的濃度で含む少なくとも３つの分化誘導培地が調整される、ここで、前記段階的濃度は、少なくとも濃度Ａ、ＢおよびＣからなり、濃度Ａ＞濃度Ｂ＞濃度Ｃであって、濃度Ａは濃度Ｃの少なくとも５倍である、
ことを特徴とする、培地キット。
【請求項１９】
前記Ｗｎｔアゴニストの段階的濃度は、濃度Ａは濃度Ｂの少なくとも３倍であり、かつ濃度Ｂは濃度Ｃの少なくとも３倍であるように分化誘導培地が調整される、請求項１８に記載の培地キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞からの腎臓の誘導方法に関する。より詳細には、本発明は、多能性幹細胞、例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から、糸球体と尿細管の両方を含む腎臓の3次元構造物を誘導する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎臓は尿を産生することで老廃物を排出すると同時に体内の電解質、水分の恒常性の維持に重要な役割を果たしている。腎機能が失われると水分と様々な毒性成分が蓄積し、意識混濁、肺水腫による呼吸困難、高カリウム血症で死に至るため、人工透析を行う必要がある。日本で人工透析を受ける患者数は約３０万人に達しており、現在も増加の一途をたどっている。人工透析導入原因の第１位は糖尿病であり導入患者数の約４５％を占めている。加えて腎臓は内分泌器官としても重要な働きをしており、レニンを産生することで血圧の調節を行い、ビタミンＤの活性化やエリスロポエチンの産生によって骨代謝と赤血球の維持に関与している。そのため，腎不全においては血圧と骨の異常および重度の貧血が見られる。腎不全にともなう貧血に対して、現在では週に数回のエリスロポエチンの投与による治療が行われているが、一生にわたり投与を行う必要があり医療費の高騰を招いている。【０００３】
糖尿病性腎症、慢性糸球体腎炎、腎硬化症などといった腎疾患により末期腎不全に陥った場合、死体および生体からの腎移植、血液または腹膜を介しての人工透析、の二つの治療法が行われている。腎移植は損なわれた腎機能を完全に補うことができる根本的な治療であるが、慢性的なドナー不足によって一般的な治療法にはなり得ていない。一方、人工透析は患者に厳しい食事制限や定期的な通院を強いる一方、腎臓の濾過機能の代償にしかすぎないため長期合併症を引き起こす。これらに代わる新しい治療として再生療法が注目されている。【０００４】
多能性幹細胞から様々なタイプの組織をインビトロで構築することが成功しているにもかかわらず、インビトロでの腎臓の作成は依然成功例はなく、その方法論の確立が待ち望まれている。これは主に、インビボでの腎臓分化過程の発生学的複雑さにより、そのメカニズムの詳細が解明されていないことに起因する。すなわち、腎臓は他の主要臓器とは異なり、その発生過程において、前方に位置する２つの一時的な原基（前腎、中腎）、さらには後方に位置し、成体腎へと分化する後腎の３つの原基形成を伴う、複雑なプロセスを経て形成される。さらに、人工的に再構成された腎臓が機能するためには、その機能単位である「ネフロン」を構成する、「糸球体」と「尿細管」の両方を含む三次元構造の構築が必須であることが、さらにその技術的難易度を高めている。【０００５】
腎臓は、胎児体幹の最も後方で発達する後腎から発生する。後腎は、２つの前駆組織、すなわち、後腎間葉と尿管芽の間での相互作用によって形成される。これまでに、細胞系譜解析により、後腎間葉と尿管芽が共に、胎生（E）8.5日目頃あらわれる転写因子、Osr1を発現する中間中胚葉から発生することが示されている（非特許文献１：Mugfordら、Dev Biol 324, 88-98, 2008）。しかし、初期の中胚葉がどのような成長因子シグナルによって中間中胚葉に分化するかについての基礎となるメカニズムは明らかにされていない。また、中間中胚葉から後腎へと発生する過程においては、中間中胚葉後方における後方Hox遺伝子群の重要性が報告されている（非特許文献２：Mugfordら、Dev Biol 319, 396-405, 2008; 非特許文献３：Wellikら、Genes Dev 16, 1423-1432, 2002）。しかし、どのようにして中間中胚葉の中で前後軸が形成され後方Hox遺伝子が発現し、後腎間葉が形成されるのか（後方化）はまだ解明されていない。【０００６】
腎臓は、中胚葉由来である後腎間葉と尿管芽という２つの組織の相互作用によって形成されるが、その機能単位であるネフロンに含まれる「糸球体」や「尿細管」等の主な構造は前者（後腎間葉）に由来する。発明者らは以前に、マウス胎児期の後腎間葉にネフロンのもととなる前駆細胞（後腎ネフロン前駆細胞）が存在することを報告し、その検出法も開発した（非特許文献４：長船、西中村ら、Development 133, 151-161, 2006）。また、ｉＰＳ細胞をアクチビンＡおよびＷｎｔ存在下で培養し、次いで、ＢＭＰおよびＷｎｔ存在下で培養することによる、ｉＰＳ細胞からの中間中胚葉を誘導する方法が報告されている（特許文献１）。しかしながら、多能性幹細胞から、糸球体と尿細管の両方を再構築しうる「後腎ネフロン前駆細胞」の誘導に成功したという報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２０１２／０１１６１０公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Mugfordら、Dev Biol 324, 88-98, 2008
【非特許文献２】Mugfordら、Dev Biol 319, 396-405, 2008
【非特許文献３】Wellikら、Genes Dev 16, 1423-1432, 2002
【非特許文献４】長船、西中村ら、Development 133, 151-161, 2006
【非特許文献５】Takemotoら、Nature 470, 394-398, 2011
【非特許文献６】Tzouanacouら、Dev Cell 17, 365-376, 2009
【非特許文献７】Wilsonら、Development 136, 1591-1604, 2009
【非特許文献８】Kispertら、Development 125, 4225-4234, 1998
【非特許文献９】西中村ら、Development 128, 3105-3115, 2001
【非特許文献１０】Jamesら、Development 133, 2995-3004, 2006
【非特許文献１１】Barakら、Dev Cell 22, 1191-1207., 2012
【非特許文献１２】Poladiaら、Dev Biol 291, 325-339, 2006
【非特許文献１３】Atsutaら、Dev Growth Differ 55, 579-590, 2013
【非特許文献１４】Attiaら、Development 139, 4143-4151, 2012
【非特許文献１５】Obara-Ishiharaら、Development 126, 1103-1108, 1999
【非特許文献１６】Saxen, Cell 131, 861-872, 1987
【非特許文献１７】Herrmannら、Nature 343, 617-622, 1990
【非特許文献１８】Burridge、Cell Stem Cell 10, 16-28, 2012
【非特許文献１９】Bernardら、Cell Stem Cell 9, 144-155, 2011
【非特許文献２０】Kattmanら、Cell stem cell 8, 228-240, 2011
【非特許文献２１】Yuら、Cell Stem Cell 8, 326-334, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、多能性幹細胞、例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から、腎臓の三次元構造物を誘導する場合に用いることができる工程または方法を提供することを目的とする。本発明は特に、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞（例えば、マウス胚性幹細胞やヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞）から、まず中間中胚葉細胞を誘導し、さらに、中間中胚葉細胞から後腎間葉細胞（後腎ネフロン前駆細胞）を誘導する方法、ならびにそのような方法を用いた腎臓分化系統の新たなモデルを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、マウスおよびヒト多能性幹細胞から腎臓の三次元構造すなわち、尿細管及び糸球体を再構成することが可能な後腎ネフロン前駆細胞（後腎間葉）を誘導することに成功し、本発明を完成した。腎臓を構成する大部分の上皮系細胞は、体幹の後方端に位置する後腎に含まれる後腎間葉細胞から派生する。しかし、インビボにおいては後腎の発生に先立ち、前腎、中腎の形成を含む複雑な発生過程を経るため、インビトロでの腎再生の試みを困難なものとしてきた。本発明者らは、後腎間葉細胞の前駆体が、インビボで原腸形成終了時期まで、転写因子Brachyury（＝T）を発現する未分化中胚葉の状態に維持され、後方化されていることを確認した。そして、マウス胚からの分取したＴ陽性細胞は、高濃度のＷｎｔアゴニストを用いた後方化と、それに続く段階的なＷｎｔアゴニストの減量、ならびに各時期特異的な成長因子の添加によって、インビトロで後腎間葉に分化することを見いだした。マウスおよびヒトの多能性幹細胞を同様に処理すると、後腎間葉細胞が得られ、それは、糸球体上皮細胞をもつ糸球体とはっきりとした管腔をもつ尿細管、を含む腎臓の三次元構造を再構築できることを見出し、本発明を完成した。本発明により、インビトロでの腎臓の再構築が可能となった。【００１１】
本発明は以下を含むものである。
（１）  哺乳動物由来の多能性幹細胞から（後腎）ネフロン前駆細胞である後腎間葉を分化誘導する方法であって、該方法が、以下の３つの工程、
（ａ）多能性幹細胞から誘導された胚様体を、高濃度（濃度Ａ）のＷｎｔアゴニストおよび場合によりさらにＢｍｐを含有する培地で培養する工程、
（ｂ）前記胚様体を、Ｂｍｐおよび中濃度（濃度Ｂ）のＷｎｔアゴニストを含有する培地で培養する工程、および
（ｃ）前記胚様体を、Ｆｇｆおよび低濃度（濃度Ｃ）のＷｎｔアゴニストを含有する培地で培養する工程、
をその順で含むことを特徴とする分化誘導方法
（ここで、Ｗｎｔアゴニストの濃度は、濃度Ａ＞濃度Ｂ＞濃度Ｃであって、濃度Ａは濃度Ｃの少なくとも５倍である。）。
（２）前記工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）におけるＷｎｔアゴニストの濃度は、濃度Ａは濃度Ｂの少なくとも２倍（好ましくは少なくとも３倍）であり、かつ濃度Ｂは濃度Ｃの少なくとも２倍（好ましくは少なくとも３倍）である、前記（１）に記載の分化誘導方法。
（３）  前記工程（ｂ）において、培地がさらにアクチビンを含む、前記（１）または（２）に記載の分化誘導方法。
（４）  前記工程（ｂ）において、培地がさらにレチノイン酸を含む、前記（３）に記載の分化誘導方法。
【００１２】
（５）  前期ＷｎｔアゴニストがＧＳＫ−３阻害剤である（ただし、各工程のＷｎｔアゴニストは同じであっても異なってもよい）、前記（１）〜（４）のいずれかひとつに記載の分化誘導方法。
（６）  前記Ｗｎｔアゴニストが、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、およびＳＢ４１５２８６からなる群より選ばれる（ただし、各工程のＷｎｔアゴニストは同じであっても異なってもよい）、前記（５）に記載の分化誘導方法。
（７）  前記Ｂｍｐが、Ｂｍｐファミリーからなる群、好ましくはＢｍｐ２、Ｂｍｐ４およびＢｍｐ７からなる群より選ばれる、かつ、前記Ｆｇｆが、Ｆｇｆファミリーからなる群、好ましくはＦｇｆ２、Ｆｇｆ９およびＦｇｆ２０からなる群より選ばれる、前記（１）〜（６）のいずれかに記載の分化誘導方法。
（８）  前記ＢｍｐがＢｍｐ４であり、かつ前記ＦｇｆがＦｇｆ９である、前記（１）〜（７）のいずれかひとつに記載の分化誘導方法。
（９）  前記工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）におけるＷｎｔアゴニストが、ＣＨＩＲ９９０２１であり、かつ、前記濃度Ａが７．５μＭ〜１５μＭ、前記濃度Ｃが０．5μＭ〜2．０μＭである、前記（１）〜（８）のいずれか一つに記載の分化誘導方法
（１０）  前記工程（ａ）および（ｂ）におけるＢｍｐがＢｍｐ４であり、工程（ａ）における濃度が０．１ｎｇ／ｍｌ〜３ｎｇ／ｍｌであり、工程（ｂ）における濃度が１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌである、前記（９）に記載の分化誘導方法。
（１１）  前記工程（ｂ）において、アクチビンを２．５〜４０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む前記（１０）に記載の分化誘導方法。
（１２）  前記工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）が、連続した工程である前記（１）〜（１１）のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
（１３）  前記工程（ｃ）において、培地が、Ｂｍｐ、レチノイン酸またはアクチビンのいずれも含まない培地である、前記（１）〜（１２）のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
【００１３】
（１４）  前記多能性幹細胞がマウスＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞、またはヒトＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、前記（１）〜（１３）のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
（１５）  前記多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である、前記（１４）に記載の分化誘導方法。
（１６）  前記多能性幹細胞がマウスＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であり、かつ工程（ａ）が、少なくとも１日以上４日以内培養する工程（ここで、好ましくは、少なくとも１回新鮮な培地に交換を行う）である前記（１４）に記載の分化誘導方法。
（１７）  前記多能性幹細胞がヒトＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であり、かつ工程（ａ）が、少なくとも３日以上１１日以内培養する工程（ここで、好ましくは、少なくとも２回新鮮な培地に交換を行う）である前記（１４）に記載の分化誘導方法。
（１８）  転写因子である、Ｏｓｒ１、Ｗｔ１、Ｐａｘ２、Ｓｉｘ２、Ｈｏｘａ１０、Ｈｏｘａ１１の全てを発現する細胞集団であることを特徴とする哺乳動物由来の多能性幹細胞から分化誘導されたネフロン前駆細胞。
（１９）  前記多能性幹細胞が、マウスＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞、またはヒトＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、前記（１８）に記載のネフロン前駆細胞。
（２０）  前記（１）〜（１７）のいずれか一つに記載の分化誘導方法により誘導されたネフロン前駆細胞。
（２１）  前記（１８）〜（２０）のいずれか一つに記載のネフロン前駆細胞を用いて、糸球体および尿細管を有する三次元腎臓構造を作成する方法。
（２２）  前記方法が、ネフロン前駆細胞を気液界面にて胚脊髄またはＷｎｔ４発現細胞と共培養することを含む、前記（２１）に記載の三次元腎臓を作成する方法。
（２３）  前記（２１）または（２２）に記載の方法により形成された、糸球体および尿管を有する三次元腎臓構造。
（２４）  前記（１８）〜（２０）のいずれか一つに記載のネフロン前駆細胞から分化誘導されたＣａｄｈｅｒｉｎ６、Ｍｅｇａｌｉｎ、およびＬＴＬを発現する細胞集団であることを特徴とする近位尿細管細胞。
（２５）  前記分化誘導が、ネフロン前駆細胞を胎児脊髄またはＷｎｔ４発現細胞と共培養することにより行われる、前記（２４）に記載の近位尿細管細胞。
（２６）  前記（１８）〜（２０）のいずれか一つに記載のネフロン前駆細胞から分化誘導された、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｂｒｎ１、およびＮＣＣを発現する細胞集団であることを特徴とする遠位尿細管細胞。
（２７）  前記分化誘導が、ネフロン前駆細胞を胎児脊髄またはＷｎｔ４発現細胞と共培養することにより行われる、前記（２６）に記載の遠位尿細管細胞。
（２８）  前記（１８）〜（２０）のいずれか一つに記載のネフロン前駆細胞から分化誘導された、Ｗｔ１、Ｎｅｐｈｒｉｎ、およびＰｏｄｏｃｉｎを発現する細胞集団であることを特徴とする糸球体上皮細胞。
（２９）  前記分化誘導が、ネフロン前駆細胞を胎児脊髄またはＷｎｔ４発現細胞と共培養することにより行われる、前記（２８）に記載の糸球体上皮細胞。
（３０）  多能性幹細胞からネフロン前駆細胞を誘導するための分化誘導培地キットであって、該キットは、（ｉ）分化誘導培地、および（ｉｉ）Ｗｎｔアゴニストを含み、使用時において、前記Ｗｎｔアゴニストを段階的濃度で含む少なくとも３つの分化誘導培地が調整される、ここで、前記段階的濃度は、少なくとも濃度Ａ、ＢおよびＣからなり、濃度Ａ＞濃度Ｂ＞濃度Ｃであって、濃度Ａは濃度Ｃの少なくとも５倍である、
ことを特徴とする培地キット、培地キット。
（３１）  前記Ｗｎｔアゴニストの段階的濃度は、濃度Ａは濃度Ｂの少なくとも３倍であり、かつ濃度Ｂは濃度Ｃの少なくとも３倍であるように分化誘導培地が調整される、前記（３０）に記載の培地キット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、幹細胞（例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞）から後腎ネフロン前駆細胞を効率よく誘導することができ、さらには、糸球体および尿細管の両方を含む腎臓の三次元構造の再構築が可能となった。このことにより、種々の疾患の患者から樹立されたｉＰＳ細胞を用いて、疾患特異的な尿細管や糸球体上皮細胞を作成し、その病態解明や新規創薬に応用できる可能性が開かれた。さらには、この後腎ネフロン前駆細胞は免疫不全マウスに移植することにより血管浸潤を伴った糸球体を形成したことから、今後、尿産生能を有する機能的な腎臓の再生にもつながることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】マウスＥＳ細胞からの後腎ネフロン前駆細胞（後腎間葉）の誘導の工程の概要を示している。Ａはアクチビン、ＢはＢｍｐ４、ＣはＣＨＩＲ９９０２１、Ｒはレチノイン酸、ＦはＦｇｆ９を示す。Ｃ１０、Ｃ３、及びＣ１は、それぞれ、１０μＭ、３μＭ、及び１μＭのＣＨＩＲ９９０２１を表す。
【図２】ヒトｉＰＳ細胞からの後腎ネフロン前駆細胞（後腎間葉）の誘導の工程の概要を示している。Ａはアクチビン、ＢはＢｍｐ４、ＣはＣＨＩＲ９９０２１、Ｒはレチノイン酸、ＦはＦｇｆ９を示す。
【図３】Ｏｓｒ１−ＧＦＰノックインマウス作成の標的ストラテジーを示している。ＥＧＦＰは、Ｏｓｒ１遺伝子座に挿入して、ＥＧＦＰにＯｓｒ１のＮ末端アミノ酸が結合するようにした。ＢはＢａｍＨＩを表す。
【図４】Ｏｓｒ１−ＧＦＰノックインマウスのＥ８．５（Ａ）、Ｅ９．５（Ｂ）およびＥ１５．５（Ｃ）でのＥＧＦＰ発現を示している。スケールバーは５００μｍである。
【図５】Ｏｓｒ１−ＧＦＰ陽性集団により形成されたコロニーの、明視野像（左）、Ｐａｘ２発現（中央）、およびＬＴＬ発現（右）を示している。スケールバーは、１００μｍである。
【図６】Ｏｓｒ１−ＧＦＰ陽性集団により形成されたコロニーの腎臓関連遺伝子の発現を、β−アクチンに対する相対発現で示している。それぞれの最初のレーンは、コロニーを含まないＷｎｔ４フィーダー細胞のみを示している。マーカーはそれぞれ、腎臓系統マーカー：Ｐａｘ２とＳａｌｌ１；近位尿細管マーカー：Ｓｌｃ５ａ１；ヘンレループのマーカー：ＣｌｃｎｋａとＣｌｃｎｋｂ；遠位尿細管マーカー：Ｐｏｕ３ｆ３；接続細管マーカー：ｓ１００ｇである。
【図７】Ｏｓｒ１−ＧＦＰノックインマウスのＥ８．５、Ｅ９．５、Ｅ１１．５、およびＥ１５．５での、Ｉｔｇａ８およびＰｄｇｆｒａの発現を、胚切片の免疫染色により示したものである。矢頭は、Ｅ１５．５およびＥ１１．５でのキャッピング間葉、Ｅ９．５での凝集中間中胚葉、Ｅ８．５での中間中胚葉を示す。スケールバーは、１００μｍである。
【図８】各発生段階における胚の、Ｏｓｒ１−ＧＦＰ（左）およびＩｔｇａ８／Ｐｄｇｆｒａ（右）のＦＡＣＳ分析の結果を示している。
【図９】Ｏｓｒ１−ＧＦＰノックインマウスのＥ１１．５後腎における、Ｓａｌｌ１−ＧＦＰが高い集団（左）およびＳｉｘ２−ＧＦＰ陽性の集団（右）と、Ｉｔｇａ８／Ｐｄｇｆｒａ発現のＦＡＣＳ分析の結果を示している。
【図１０】胚の前部（体節レベル７〜２２）および後部（体節レベル２３から後方）を用手的に単離し、Ｏｓｒ１＋細胞の２０，０００細胞数をＷｎｔシグナルフィーダー細胞上に播種した。各部分のコロニー形成率は、平均±標準誤差として右側に示した（ｎ＝３）。
【図１１】Ｅ９．５の中間中胚葉におけるネフロン前駆細胞の各種マーカーを、免疫染色により確認した。中間中胚葉は破線で輪郭を描いた。スケールバーは５０μｍである。
【図１２】Ｓｉｘ２−ＧＦＰＣｒｅＥＲマウスとｔｄＴｏｍａｔｏレポーター遺伝子を持つマウスと交配し、そしてＥ８．７５でタモキシフェンを注射してＥ９．５前後でＣｒｅを一時的に活性化した。胚はＥ１１．５で採取し、Ｅ−カドヘリン（緑）またはＰａｘ２（緑）で免疫染色した。ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性の赤い細胞は中腎で検出されたが、後腎では検出されなかった。スケールバーは１００μｍである。
【図１３】Ｅ９．５およびＥ１０．５の中間中胚葉における各転写産物の発現を示している。Ｅ９．５前方およびＥ１０．５前方：中腎前駆細胞、Ｅ１０．５後方：後腎前駆細胞、Ｅ９．５後方：後方中間中胚葉である。β−アクチン発現に対する各転写産物の相対的な発現は、平均±標準誤差で示した（ｎ＝３）。
【図１４】選別した早期腎前駆細胞におけるネフロン前駆細胞マーカー遺伝子発現を比較した結果である。プローブ毎に標準化された中央値に対する相対的な発現レベルはｌｏｇ２比（log2 fold change）倍数変化として示している。Ｅ８．５：胚体幹からの選別されたＯｓｒ１−ＧＦＰ陽性または陰性細胞。Ｅ９．５：胚体幹からの選別されたＯｓｒ１−ＧＦＰ陽性または陰性細胞。ＧＦＰ＋集団は、Ｉｔｇａ８＋／Ｐｄｇｆｒａ−集団とその他に分けた。Ｅ１１．５ＭＭ：用手的に単離した後腎間葉由来のＯｓｒ１−ＧＦＰ陽性または陰性細胞。ＧＦＰ＋集団は、Ｉｔｇａ８＋／Ｐｄｇｆｒａ−集団とその他に分けた。後腎ネフロン前駆細胞マーカー遺伝子、例えば、Ｏｓｒ１、Ｗｔ１、Ｐａｘ２、Ｓｉｘ２、ＧｄｎｆとＣｒｙｍは、Ｅ９．５とＥ１１．５のＯｓｒ１＋／Ｉｔｇａ８＋／Ｐｄｇｆｒａ−集団の両方で発現していた。一方Ｈｏｘａ１０、ａ１１、ｃ１０、ｄ１０、ｄ１１とｄ１２のような尾部Ｈｏｘ遺伝子は、Ｅ１１．５後腎間葉で濃縮されていた。
【図１５】マウスの腎臓発生の模式図である。Ｅ８．５のＴ＋／Ｃｄｘ２＋／Ｔｂｘ６＋後部未分化中胚葉は、後部中間中胚葉を経て後腎間葉を生じさせる。Ｐａｘ２とＳｉｘ２を発現しＨｏｘ１１ｓを発現しないＥ９．５の前方に位置する中間中胚葉は、中腎を生じさせＷｎｔ４フィーダー細胞上のいくつかのコロニーを形成する。Ｐａｘ２とＳｉｘ２を発現しないまたはコロニーを形成しないＥ９．５の後方に位置する中間中胚葉は、尾部Ｈｏｘ遺伝子を発現している。Ｅ１０．５の後方に位置する後腎間葉は、尾部Ｈｏｘ遺伝子、Ｐａｘ２およびＳｉｘ２を発現し、Ｗｎｔ４フィーダー細胞上で多くのコロニーを形成する。
【図１６】Ｅ９．５胚の後方部分から選別したＯｓｒ１−ＧＦＰ＋細胞をＹ２７６３２の存在下で培養した際の、培養細胞凝集体のＧＦＰ蛍光および免疫染色の結果（左図）および培養開始時に対する各転写産物の相対的発現の結果（平均±標準誤差、ｎ＝３、右図）である。
【図１７】上記培養細胞凝集体のＯｓｒ１−ＧＦＰ発現（左図）およびＩｔｇａ８／Ｐｄｇｆｒａ発現（右図）のＦＡＣＳ分析の結果である。
【図１８】上記培養細胞凝集体のコロニー形成率を示した結果である（ｎ＝３）。Ｙ：Ｙ２７６３２（Ｒｏｃｋ阻害剤）；ＳＵ：ＳＵ５４０２（Ｆｇｆｒ１阻害剤）；Ｃ１：１μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１（カノニカル  Ｗｎｔアゴニスト）；Ｃ３：３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１，Ｃ１０：１０μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１；ＲＡ：レチノイン酸。
【図１９】選別した早期腎前駆細胞における、Ｆｇｆ、Ｂｍｐ、およびＷｎｔ関連遺伝子の発現を、マイクロアレイ分析により比較した結果である。各プローブの標準化した平均値に対する相対発現を、ｌｏｇ２比（log2 fold change）で示している。
【図２０】Ｆｇｆ９および低容量のＷｎｔアゴニストの添加によるコロニー形成への影響を示している。Ｙ：Ｙ２７６３２（Ｒｏｃｋ阻害剤）；Ｆ：Ｆｇｆ９；Ｃ１：１μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１。
【図２１】中胚葉からの尿管芽と後腎間葉の系統分離モデルを示している。
【図２２】Ｅ８．５のＴ陽性後部中胚葉からの後腎ネフロン前駆の誘導の結果である。Ａは、Ｅ８．５胚におけるＴ−ＧＦＰ発現を示しており、左パネルが明視野であり、右パネルが蛍光である（スケールバー：５００μｍ）。なお、体節形成前の未分化中胚葉領域を破線の輪郭で示している。Ｂは、Ｔ−ＧＦＰ陽性細胞集団のソーティングのためのゲートを示す。ＣおよびＤは、培養条件を示した。Ｂ：Ｂｍｐ４；Ｃ：ＣＨＩＲ９９０２１；Ａ：アクチビン；Ｒ：レチノイン酸；Ｆ：Ｆｇｆ９である。ＥおよびＦは、β−アクチンの発現に対する各転写産物の相対発現を平均±標準誤差で表示した（ｎ＝４）。Ｅ１０．５ＭＭはＥ１０．５後腎間葉を、Ｔ−ＧＦＰ＋は誘導開始時点の試料を示す。Ｇは、培養した細胞凝集体のコロニー形成率を、平均±標準誤差で示した（ｎ＝４）。
【図２３】Ｅ８．５後部未分化中胚葉からネフロン前駆細胞の誘導の結果である。Ａは、後方化期における増殖因子またはそれらの阻害剤の効果を、コロニー形成アッセイにより分析した結果である。各条件でのコロニー形成の比率は平均±標準誤差として示した（ｎ＝３）。最終的な採択条件は、左から２つ目のカラムである。Ｂは、腎カクテル期の成長因子またはそれらの阻害剤の効果を、コロニー形成アッセイにより分析した結果である。各条件でのコロニー形成の比率は平均±標準誤差として示した（ｎ＝３）。最終採択条件は、左から２つ目のカラムである。すべての条件で、Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）が含まれている。ＣＨＩＲ：ＣＨＩＲ９９０２１（カノニカル  Ｗｎｔアゴニスト）；Ａ１０：１０ｎｇ／ｍｌのアクチビン；ＳＢ：ＳＢ４３１５４２（Ｓｍａｄ２／３阻害剤）；ＬＤＮ：ＬＤＮ９３１８９（Ｓｍａｄ１／５／８アンタゴニスト）；ＸＡＶ：ＸＡＶ９３９（Ｗｎｔシグナルアンタゴニスト）、Ｒ：０．１μＭレチノイン酸；ＢＭＳ：ＢＭＳ４９３（ｐａｎ−ＲＡＲ拮抗薬）、Ｆ：５ｎｇ／ｍｌのＦｇｆ９；ＳＵ：ＳＵ５４０２（Ｆｇｆｒ１阻害剤）。
【図２４】Ｅ８．５のＴ陽性後部中胚葉からの後腎ネフロン前駆細胞の誘導におけるマーカー遺伝子の発現を確認した結果である。Ａは、マーカー遺伝子の時間的発現の動態を確認した結果である。Ｅ１０．５の胚後腎間葉の発現レベルを菱形印で表示した。β−アクチン発現に対する各転写物の相対的な発現は、平均±標準誤差で表示した（ｎ＝４）。Ｂは、誘導細胞凝集体の免疫染色の結果である。高倍率画像は右の２つのパネルに示した。スケールバーは、２００μｍ（左６パネル）、２０ミクロン（右端２パネル）である。Ｃは、誘導４日目（ｄａｙ４）でのＩｔｇａ８／Ｐｄｇｆｒａ発現のＦＡＣＳ解析の結果である。
【図２５】マウスＥＳ細胞からのネフロン前駆細胞の誘導の各段階における遺伝子発現の動態を示している。Ｅ１０．５胚後腎間葉における発現レベルを菱形印で示した。遺伝子発現は、β−アクチン発現に対する各転写産物の相対的な発現（平均±標準誤差）で表示した（ｎ＝４）。
【図２６】マウスＥＳ細胞からの後腎ネフロン前駆細胞の誘導におけるｄａｙ８．５での誘導胚様体におけるＯｓｒ１−ＧＦＰ／Ｗｔ１／Ｐａｘ２とＯｓｒ１−ＧＦＰ／Ｓａｌｌ１／Ｓｉｘ２陽性細胞の局在を示している。スケールバーは、２００μｍ（左６パネル）である。
【図２７】マウスＥＳ細胞からのネフロン前駆細胞の誘導におけるｄａｙ８．５での胚様体におけるＯｓｒ１−ＧＦＰおよびＩｔｇａ８／Ｐｄｇｆｒａ発現のＦＡＣＳ分析の結果を示している。
【図２８】マウスＥＳ細胞からの３次元構造の腎臓の誘導の結果を示す。Ａ〜Ｄは、ヘマトキシリンおよびエオシン染色の結果である（ＢおよびＤ：高倍率）。ＡおよびＢは、胚後腎間葉、ＣおよびＤは、脊髄と共培養した誘導した胚様体である。腎臓の尿細管は、破線で輪郭を示した。ＳＰ：脊髄、Ｇ：糸球体。スケールバーは、２００μｍおよび２０μｍである。Ｅ〜Ｐは、誘導した胚様体を、尿細管マーカー（Ｅ〜Ｈ、Ｌ〜Ｐ）（近位尿細管マーカー：ＬＴＬ、遠位尿細管マーカー：Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｂｒｎ１およびＮＣＣ）と糸球体マーカー（Ｉ〜Ｋ）で免疫染色した結果である。スケールバーは、１００μｍ（Ｅ、Ｉ）および２０μｍ（Ｆ〜Ｈ、Ｊ〜Ｌ）である。
【図２９】マウスＥＳ細胞からの３次元構造の腎臓の誘導の結果を示す。ＱおよびＲは、誘導した胚様体をヌードマウスの腎臓被膜下に移植し、１週間後に摘出したマウスの腎臓を示している。移植片を破線で輪郭を描いている。Ｑの黒矢印は、移植片の血管新生を示す。Ｒは、移植片の蛍光画像である。Ｒの白矢印は、移植片中のネフロン様構造を示している。スケールバーは、５００μｍである。Ｓ〜Ｕは、移植した腎臓切片のヘマトキシリンおよびエオシン染色の結果である。Ｓは低倍率画像である（ｇ：移植片；ｋ：ホストの腎臓、スケールバー：１００μｍ）。Ｔは中倍率画像である（腎臓の尿細管は、破線で輪郭を描いている、Ｇ：糸球体。スケールバー：２０μｍ）。Ｕは移植片における糸球体の高倍率画像である（矢印は、糸球体に侵入する脈管構造中の赤血球を示している、スケールバー：２０μｍ）。ＶおよびＷは、血管マーカーである、Ｐｅｃａｍ１による免疫染色の結果である（Ｖ：低倍率画像、Ｗ：移植片中における糸球体の高倍率画像、ｇ：移植片、ｋ：ホストの腎臓、スケールバー：２０μｍ）。ＸおよびＹは、糸球体上皮細胞における血管誘導因子（Ｘ：Ｖｅｇｆａ、Ｙ：Ｅｆｎｂ２）の発現を示している。
【図３０】ヒトｉＰＳ細胞からの後腎ネフロン前駆細胞の誘導における、分化したｉＰＳ細胞の遺伝子発現解析の結果である。未熟なｉＰＳ細胞（各左列）に対する各転写産物の相対的な発現を、平均±標準誤差で表示した（ｎ＝６）。
【図３１】ヒトｉＰＳ細胞からの後腎ネフロン前駆細胞の誘導における、ｄａｙ１４（１４日目）での誘導した胚様体中のＷｔ１／Ｐａｘ２およびＳａｌｌ１／Ｓｉｘ２陽性細胞の局在を示す。スケールバーは、７５μｍである。
【図３２】ＤおよびＥは、脊髄とともに共培養した誘導した胚様体のヘマトキシリンおよびエオシン染色の結果である（Ｅは高倍率のイメージである）。尿細管を破線で輪郭を描いた。ＳＰ：脊髄、Ｇ：糸球体、スケールバー：２００μｍ（Ｄ）および２０μｍ（Ｅ）。Ｆ〜Ｋは、誘導された胚様体の隣接切片の免疫染色の結果である。Ｋは、糸球体マーカー、ＨおよびＩは、尿細管マーカーであり、スケールバーは５０μｍである。
【図３３】多能性細胞から後腎間葉への分化誘導モデルである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は以下に記載の態様に限定されるものではない。
【００１７】
発明者らは、マウスおよびヒト多能性幹細胞から尿細管及び糸球体を含む三次元腎臓を再構成することが可能な後腎ネフロン前駆細胞を誘導することに成功した。尿細管及び糸球体は、腎機能のための重要な２つの主要なコンポーネントであるので、本発明の方法ならびにそれを用いて得られる知見は、ヒト腎臓疾患の根底にある分子機構を明らかにするために有用であるとともに、再生医療に利用することができる。本明細書に示されたデータはまた、腎臓の発達過程がヒトとマウスの間でよく保存されていることを実証しており、生理学的プロセスを忠実に再現する本発明の方法の堅牢性を示している。
【００１８】
従来の研究は、推定される「系統誘導因子」を用いて腎臓前駆細胞の誘導に挑戦してきたが、それらは、後腎つまり成人の腎臓の原基が、予定腎臓領域すなわち中間中胚葉の中でどのように後方化されるかという観点を欠いていた。これまでに、後腎を構成する二大要素の一つである尿管芽は、前方中間中胚葉から発生し後方へと伸長することが知られていた。今回我々は、もう一つの構成要素である後腎間葉の前駆体は、前方中間中胚葉からではなく、原腸形成終了期まで転写因子Brachyury（＝Ｔ）陽性の状態に維持され後方化（posteriorized）された後方未分化中胚葉に由来することを新たに明らかにした。原腸形成開始段階で発現し始める転写因子Ｔはこれまで、幹細胞からの分化誘導研究において”一時的な”未分化中胚葉マーカーとして認識されてきた。しかし最近、Ｔ陽性状態を維持した未分化な前駆細胞集団が、体幹の伸展が完了するまで胚の後端に存在し、そして体幹尾部のもととなる細胞すなわち「体軸幹細胞」として機能することが示されている（非特許文献５：Takemotoら、Nature 470, 394-398, 2011；非特許文献６：Tzouanacouら、Dev Cell 17, 365-376, 2009；非特許文献７：Wilsonら、Development 136, 1591-1604, 2009）。本明細書に示したデータは、この最近同定された後部未分化中胚葉（体軸幹細胞）が、後腎間葉、すなわちネフロン前駆細胞の起源であろうということを示唆しており、腎臓全体が前方中間中胚葉に由来するという従来の考えに対抗するものである。体軸幹細胞の誘導モデルの導入は、さらに他の尾側に位置する臓器の分化誘導に適用することができるかもしれない。
【００１９】
以下に記載の実施例で示すように、本発明者らは、通常マウスＥＳ細胞の未分化状態の維持等に使用される濃度を上回る濃度のＷｎｔアゴニストを利用することにより、細胞をＴ陽性の未分化状態で維持したまま後方化することに成功した。その後、Ｗｎｔアゴニストの濃度を段階的に漸次減少し、さらに分化段階特異的に成長因子を組み合わせて添加することによって、腎臓系統へと分化誘導させ、最終的に後腎ネフロン前駆細胞の形成を可能にした。誘導の初期段階における高濃度のＷｎｔアゴニストの必要性は、インビボにおいて尾部体幹の伸長および体軸幹駆細胞の維持にＷｎｔシグナルが重要であることを反映している。後方中間中胚葉に向けた次のステップでは、体幹の筋骨格を形成する沿軸中胚葉の分化過程と同様に、Ｗｎｔアゴニスト濃度の減少とレチノイン酸の添加が効果的であった。またこのステップにおいては腎臓の遺伝子誘導に対するアクチビンの相乗効果も確認された。続いて、後方中間中胚葉から後腎間葉へと分化させる工程においては、Ｆｇｆ９の添加とＷｎｔシグナルのさらなる低減が有効で、この際、Ｂｍｐ４、レチノイン酸およびアクチビンの添加は阻害的であり、この最終工程から除かれるべきである。このことは、各成長因子が段階特異的に添加されるべきであるということを示している。
【００２０】
これらの観察結果は、以前、Ｅ８．５でのＯｓｒ１＋前方中間中胚葉細胞からの後腎前駆細胞の誘導に何故失敗したかを部分的に説明することができるかもしれない。それは、Ｅ８．５で既に存在しているＯｓｒ１＋前方中間中胚葉細胞は後腎に貢献せず、Ｔ＋／Ｏｓｒ１−集団が後腎に分化する能力がある真正のＴ−／Ｏｓｒ１＋後方中間中胚葉細胞を生じさせる、ということが予想される。
【００２１】
本発明で用いる「多能性幹細胞」とは、自己複製能を有しインビトロにおいて培養することが可能で、かつ、個体を構成する細胞に分化しうる多分化能を有する細胞をいう。具体的には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、体細胞由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等をあげることができるが、本発明で特に好ましく用いられるのはｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であり、特に好ましくは、マウスｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞である。
【００２２】
本発明で用いるＥＳ細胞は、哺乳類動物由来のＥＳ細胞であればよく、その種類や取得方法などは特に限定されない。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル又はヒト等をあげることができ、好ましくは、マウス又はヒトである。
ＥＳ細胞は、一般的には、胚盤胞期の受精卵をフィーダー細胞と一緒に培養し、増殖した内部細胞塊由来の細胞をばらばらにして、さらに、植え継ぐ操作を繰り返し、最終的に細胞株として樹立することができる。
【００２３】
また、ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）とは、分化多能性を獲得した細胞のことで、体細胞（例えば、線維芽細胞など）へ分化多能性を付与する数種類の転写因子（分化多能性因子）遺伝子を導入することにより、ＥＳ細胞と同等の分化多能性を獲得した細胞のことである。「分化多能性因子」としては、多くの因子が報告されており、特に限定しないが、例えば、Ｏｃｔファミリー（例えば、Ｏｃｔ３／４）、Ｓｏｘファミリー（例えば、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５及びＳｏｘ１７など）、Ｋｌｆファミリー（例えば、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２など）、Ｍｙｃファミリー（例えば、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃなど）、Ｎａｎｏｇ、ＬＩＮ２８などを挙げることができる。ｉＰＳ細胞の樹立方法については、多くの報告が既になされており、それらを参考にすることができる。
【００２４】
哺乳動物由来のＥＳ細胞の培養方法は常法により行うことができる。例えば、フィーダー細胞としてマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ細胞）を用い、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ＫＳＲ（ノックアウト血清代替物）、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸、ペニシリン、ストレプトマイシン、β−メルカプトエタノールを加えた培地、例えばＤＭＥＭ培地を用いて維持することができる。
ｉＰＳ細胞の培養も定法により行うことができる。例えば、フィーダー細胞としてマウス繊維芽細胞を用いて、ｂＦＧＦ、ＫＳＲ（ノックアウト血清代替物）、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、β−メルカプトエタノールを加えた培地、例えばＤＭＥＭ/Ｆ１２培地やＰｒｉｍａｔｅ  ＥＳ培地（リプロセル）を用いて維持することができる。
【００２５】
本発明における多能性幹細胞、例えばＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞からネフロン前駆細胞の分化誘導は、フィーダー細胞を含む培養系、フィーダーフリーの培養系のいずれも含む。分化誘導に用いる培地は、一般に用いられている培地を用いることができ、本発明の目的を達成できる限り特に制限がなく、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧｊＢ培地、ＣＭＲＬ  １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地、改良ＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅｓ  ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ダルベッコ培地、改良ダルベッコ培地、およびこれらの混合培地等をあげることができる。例えば、好ましくは、ＥＳ細胞の分化誘導においては、イスコフ改良ダルベッコ培地とハムＦ１２の混合培地を用いることができ、ｉＰＳ細胞の分化誘導においては、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いることができるが、これに制限されない。
【００２６】
本発明の培養方法で用いられる培地は、血清含有培地、無血清培地であり得るが、異種成分の排除による細胞移植の安全性の確保という観点からは、無血清培地が好ましい。ここで、無血清培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）または、血清代替物が混入している培地は無血清培地に該当するものとする。かかる無血清培地としては、例えば、市販のＫＳＲを適量（例えば、１−２０％）添加した無血清培地、インスリンおよびトランスフェリンを添加した無血清培地、細胞由来の因子を添加した培地等をあげることができるが、これらに限定されない。
【００２７】
多能性幹細胞からのネフロン前駆細胞の分化誘導は、後に詳細に記載するように、本発明に従って、各工程において、上記の培地に各成分や因子を添加した培地を用いて行うことができる。培地に添加する成分や因子としては、これに限定されないが、例えば、Ｂ２７、Ｎ２、Insulin-transferrin-serenium、β-メルカプトエタノール、アスコルビン酸、Non-essential amino acidなどをあげることができる。
【００２８】
本発明で言う多能性幹細胞の「分化」又は「分化誘導」とは、多能性幹細胞が、中間中胚葉さらには後腎ネフロン前駆細胞まで分化誘導されることを含む意味で用いられ、更にはまた、それらが、尿細管及び糸球体を含む三次元腎臓へと分化誘導されることを含む意味でも用いられる。
【００２９】
本発明の一つの態様は、哺乳動物由来の多能性幹細胞からネフロン前駆細胞を分化誘導する方法である。本発明を用いて、ＥＳ細胞からネフロン前駆細胞を誘導する工程全体の概要を図１に、ｉＰＳ細胞からネフロン前駆細胞を誘導する工程全体の概要を図２に示す。
本発明を用いて哺乳動物由来の多能性幹細胞からネフロン前駆細胞を分化誘導する場合、以下の３つの工程（ａ）〜（ｃ）を、その順で含むことが必要である：工程（ａ）多能性幹細胞から誘導された胚様体を、高濃度（濃度Ａ）のＷｎｔアゴニストおよび場合によりさらにＢｍｐを含有する培地で培養する工程；工程（ｂ）前記胚様体を、Ｂｍｐおよび中濃度（濃度Ｂ）のＷｎｔアゴニストを含有する培地で培養する工程；および工程（ｃ）前記胚様体を、Ｆｇｆおよび低濃度（濃度Ｃ）のＷｎｔアゴニストを含有する培地で培養する工程。
工程（ａ）および（ｂ）で用いられるＢｍｐは、Ｂｍｐ１、Ｂｍｐ２、Ｂｍｐ４、Ｂｍｐ６、Ｂｍｐ７、Ｂｍｐ８a、Ｂｍｐ８ｂおよびＢｍｐ１０等のＢｍｐファミリーからなる群より選ばれ、好ましくは、Ｂｍｐ２、Ｂｍｐ４またはＢｍｐ７から選ばれ、さらに好ましくはＢｍｐ４である。
工程（ｃ）で用いられるＦｇｆは、Ｆｇｆ２，９，２０等のＦｇｆファミリーから選ばれ、好ましくはＦｇｆ２、Ｆｇｆ９またはＦｇｆ２０から選ばれ、より好ましくはＦｇｆ９である。
工程（ａ）〜（ｃ）で用いられるＷｎｔアゴニストの濃度は、濃度Ａ＞濃度Ｂ＞濃度Ｃであって、濃度Ａは濃度Ｃの少なくとも５倍である。
本発明の方法は、これらの工程を、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の順で含み、必要に応じて各工程の間に別の工程を含むこともできるが、好ましくは、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を連続で含む。これらの工程が連続することにより、多能性幹細胞からネフロン前駆細胞を効率よく分化誘導できる。
【００３０】
本発明の分化誘導方法においては、好ましくは、上記行程（ｂ）において、培地が、さらにアクチビンを含み、より好ましくは、アクチビンおよびレチノイン酸を含む。
本発明の分化誘導方法においては、特に好ましくは、上記工程（ｃ）において、培地がＢｍｐ、アクチビンまたはレチノイン酸のいずれも含まない培地である。
上記工程（ａ）により、後方中胚葉が誘導され、工程（ｂ）により後方中間中胚葉が誘導され、そして工程（ｃ）により後腎ネフロン前駆細胞（後腎間葉）が誘導される。
【００３１】
工程（ａ）に用いる胚様体は、多能性幹細胞（例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞）を、任意の培地、好ましくは無血清培地で培養することにより調整できる。例えば、マウス多能性幹細胞を用いる場合は、これに限定されないが、好ましくはマウスＥＳ細胞を用いて胚様体が調整され、さらに好ましくは、工程（ａ）の処理をする前にアクチビンで処理してＦｇｆ５の発現を一過性に誘導した胚様体が用いられる。培地中のアクチビンの濃度は、例えば、０．1〜３ｎｇ／ｍＬ、好ましくは０．５〜１ｎｇ／ｍＬをあげることができる。アクチビンでの処理は、例えば、１〜２日、好ましくは１日行うことができる。この際、細胞株によってはＢｍｐ４を０．１ｎｇ／ｍｌ〜０．３ｎｇ／ｍｌ程度で合せて用いると分化誘導効率が上がることがある。
一方、ヒト多能性幹細胞を用いる場合は、これに限定されないが、好ましくはヒトｉＰＳ細胞を、Ｂｍｐ４およびＲｏｃｋ阻害剤（Ｙ２７６３２）で（必要に応じてさらにＦｇｆを加えて）処理した細胞を用いて胚様体が調整され、さらに好ましくは、次いで、アクチビンおよびＦｇｆで処理された胚様体が用いられる。培地中のＢｍｐ４の濃度は、例えば、０．３〜５ｎｇ／ｍＬ、好ましくは０．５〜２ｎｇ／ｍＬをあげることができ、培地中のＲｏｃｋ阻害剤（Ｙ２７６３２）の濃度は、例えば、１〜１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５〜２０ｎｇ／ｍＬをあげることができ、培地中のＦｇｆの濃度は、例えば、０〜２０ｎｇ／ｍＬ、をあげることができ、培地中のアクチビンの濃度は、例えば、０．１〜５ｎｇ／ｍＬ、好ましくは０．５〜１ｎｇ／ｍＬをあげることができる。Ｂｍｐ４およびＲｏｃｋ阻害剤（Ｙ２７６３２）、Ｆｇｆでの処理は、例えば、１〜２日、好ましくは１日行い、アクチビンおよびＦｇｆの処理は、例えば、１〜４日、好ましくは２日行うことができる。
【００３２】
本発明の分化誘導方法においては、上記工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）において、それぞれの工程において用いられる培地が含有するＷｎｔアゴニストの濃度Ａ、ＢおよびＣが、特定の関係にあることが重要である。各工程で用いる培地のＷｎｔアゴニストの濃度は、濃度Ａ＞濃度Ｂ＞濃度Ｃでありかつ濃度Ａは濃度Ｃの少なくとも５倍であるが、好ましくは、濃度Ａは濃度Ｂの少なくとも２倍でありかつ濃度Ｂは濃度Ｃの少なくとも２倍であり、さらに好ましくは、濃度Ａは濃度Ｂの少なくとも３倍であり、かつ濃度Ｂは濃度Ｃの少なくとも３倍である。工程（ｃ）におけるＷｎｔアゴニストの濃度Ｃは、本発明の方法において、分化誘導が起こる限り特に制限がなく、また、用いるＷｎｔアゴニストによよって適宜選択されるが、例えばＣＨＩＲ９９０２１を用いた場合、０．１〜３．０μＭ、好ましくは、０．５〜２．０μＭをあげることができる。
例えばＣＨＩＲ９９０２１を用いた場合、これに限定されないが、工程（ａ）および（ｃ）におけるＷｎｔアゴニストの濃度ＡおよびＣの組み合わせとして、濃度Ａは、６〜２０μＭ、好ましくは７〜１５μＭ、より好ましくは１０μＭから選ばれ、濃度Ｃは、０．５〜２μＭ、好ましくは０．７〜１．５μＭ、より好ましくは１μＭから選ばれる組合せをあげることができる。また、例えばＣＨＩＲ９９０２１を用いた場合、これに限定されないが、工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）におけるＷｎｔアゴニストの濃度Ａ、ＢおよびＣの組み合わせとして、濃度Ａは、６〜２０μＭ、好ましくは７〜１５μＭ、より好ましくは１０μＭから選ばれ、濃度Ｂは、２〜６μＭ、好ましくは２〜４．５μＭ、より好ましくは３μＭから選ばれ、濃度Ｃは、０．５〜２μＭ、好ましくは０．７〜１．５μＭ、より好ましくは１μＭから選ばれる組合せをあげることができる。
【００３３】
本発明で用いることができるＷｎｔアゴニストは、Ｗｎｔアゴニスト活性を有する限り特に制限されない。Ｗｎｔアゴニストは、細胞中でＴＣＦ／ＬＥＦ介在性の転写を活性化する薬剤として定義される。従ってＷｎｔアゴニストは、Ｗｎｔファミリータンパク質のありとあらゆるものを含むＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体ファミリーメンバーに結合し、活性化する真のＷｎｔアゴニスト、細胞内β−カテニン分解の阻害剤およびＴＣＦ／ＬＥＦの活性化物質から選択される。本発明でいう、Ｗｎｔアゴニストは、この分子の非存在下でのＷｎｔ活性のレベルと比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、よりさらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％、細胞においてＷｎｔ活性を刺激するものを言う。当業者にとって公知のように、Ｗｎｔ活性は、例えばｐＴＯＰＦＬＡＳＨおよびｐＦＯＰＦＬＡＳＨ  Ｔｃｆルシフェラーゼレポーターコンストラクトによって、Ｗｎｔの転写活性を測定することにより調べることができる（Korinekら, Science 275:1784-1787, 1997）。
【００３４】
本発明で用いることができるＷｎｔアゴニストは、Ｗｎｔ−１／Ｉｎｔ−１；Ｗｎｔ−２／Ｉｒｐ（Ｉｎｔ−１関連タンパク質）；Ｗｎｔ−２ｂ／１３、Ｗｎｔ−３／Ｉｎｔ−４；Ｗｎｔ−３ａ；Ｗｎｔ−４；Ｗｎｔ−５ａ；Ｗｎｔ−５ｂ；Ｗｎｔ−６；Ｗｎｔ−７ａ；Ｗｎｔ−７ｂ、Ｗｎｔ−８ａ／８ｄ；Ｗｎｔ−８ｂ；Ｗｎｔ−９ａ／１４；Ｗｎｔ−９ｂ／１４ｂ／１５；Ｗｎｔ−１０ａ；Ｗｎｔ−１０ｂ／１２；Ｗｎｔ−１１およびＷｎｔ−１６を含む分泌糖タンパク質を含む。さらに、Ｗｎｔアゴニストは、分泌タンパク質のＲ−スポンジンファミリーおよび、高親和性でＦｒｉｚｚｌｅｄ−４受容体に結合し、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化を誘導するという点でＷｎｔタンパク質のように機能する分泌性制御タンパク質であるノリン（Ｎｏｒｒｉｎ）を含む。Ｗｎｔシグナル伝達経路の小分子アゴニスト、アミノピリミジン誘導体もまたＷｎｔアゴニストとして明確に含まれる。
【００３５】
上記定義に含まれるＷｎｔアゴニストはまた、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＧＳＫ−３阻害剤、Ｄｋｋ１アンタゴニスト等も含む。ＧＳＫ−３阻害剤とは、ＧＳＫ−αまたはβ阻害剤を含み、ＧＳＫ−３αまたはβ蛋白質のキナーゼ活性、例えばβカテニンに対するリン酸化能、を阻害する物質として定義され、多くの物質が知られている。その具体例としては、ＣＨＩＲ９９０２１（６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリル）、リチウムや、バルプロ酸、ベンズアゼピノン（ｂｅｎｚａｚｅｐｉｎｏｎｅ）ファミリーのケンパウロン（Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ；９−ブロモ−７，１２−ジヒドロインドロ［３，２−ｄ］［１］ベンズアセピン−６（５Ｈ）−オン）やアルスターパウロン（Ａｌｓｔｅｒｐａｕｌｌｏｎｅ；９−ニトロ−７，１２−ジヒドロインドロ［３，２−ｄ］［１］ベンズアセピン−６（５Ｈ）−オン）、インジルビン誘導体である５−クロロ−インジルビン、インジルビン−３’−モノオキシムやＢＩＯ（別名、ＧＳＫ−３βインヒビターＩＸ；６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）、マレイミド誘導体であるＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）やＳＢ４１５２８６（３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、チアジアゾリジノン（ＴＤＺＤ：ｔｈｉａｄｉａｚｏｌｉｄｉｎｏｎｅ）類似体であるＴＤＺＤ−８（別名、ＧＳＫ−３βインヒビターＩ；４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン）やＯＴＤＺＴ（別名、ＧＳＫ−３βインヒビターＩＩＩ；２，４−ジベンジル−５−オキソチアジアゾリジン−３−チオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるＧＳＫ−３βインヒビターＶＩＩ（４−ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるＬ８０３−ｍｔｓ（別名、ＧＳＫ−３βペプチドインヒビター；Ｍｙｒ−Ｎ−ＧＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ2）などが挙げられる。
【００３６】
本発明で用いることができるＷｎｔアゴニストはさらに、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を含み、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質として公知のまたは販売されている物質を用いることができる。
本発明で用いることができるＷｎｔアゴニストは、上記の定義に含まれる限り、天然物または合成物のいずれも含まれ、また、タンパク質、高分子、低分子のいずれであってもよい。本発明において用いることができるＷｎｔアゴニストの例としては、これに限定されないが、例えば、好ましくは、ＧＳＫ−３阻害剤、より好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、またはＳＢ４１５２８６をあげることができ、特に好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１をあげることができる。各Ｗｎｔアゴニストの使用濃度は使用目的に合わせて適宜選択できるが、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１を用いた場合に得られる効果と同様の効果を発揮できる濃度を選択することができる。
【００３７】
工程（ａ）において用いられるＢｍｐは、上記したＢｍｐのいずれを用いることもでき、各Ｂｍｐ化合物の使用濃度は使用目的に合わせて適宜選択できる。例えばＢｍｐ４を用いる場合は、いずれの起源のＢｍｐ４を用いることができるが好ましくはヒトＢｍｐ４であり、培地中の濃度は、分化誘導の効果が得られる限り特に制限がないが、例えば、０．１〜３ｎｇ／ｍＬ、好ましくは０．３〜１．５ｎｇ／ｍＬをあげることができる。また、他のＢｍｐ化合物を用いる場合は、Ｂｍｐ４を用いた場合に得られる効果を同様の効果を発揮できる濃度を適宜選択することができる。
【００３８】
工程（ｂ）において用いられるＢｍｐは、上記したＢｍｐのいずれを用いることもでき、各Ｂｍｐ化合物の使用濃度は使用目的に合わせて適宜選択できる。例えばＢｍｐ４を用いる場合は、いずれの起源のＢｍｐ４を用いることができるが好ましくはヒトＢｍｐ４であり、培地中の濃度は、分化誘導の効果が得られる限り特に制限がないが、例えば、０．１〜３０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１〜１０ｎｇ／ｍＬをあげることができる。また、他のＢｍｐ化合物を用いる場合は、Ｂｍｐ４を用いた場合に得られる効果を同様の効果を発揮できる濃度を適宜選択することができる
好ましい態様において、工程（ｂ）において用いられるアクチビンは、いずれの起源のアクチビンを用いることができるが好ましくはヒトアクチビンＡである。また、培地中の濃度は、分化誘導の効果が得られる限り特に制限がないが、例えば、２．５〜４０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは７．５〜１５ｎｇ／ｍＬをあげることができる。
また、別の好ましい態様において、工程（ｂ）において用いられるレチノイン酸の培地中の濃度は、分化誘導の効果が得られる限り特に制限がないが、例えば、０．００１〜１μＭ、好ましくは０．０１〜０．３μＭをあげることができる。
【００３９】
工程（ｃ）において用いられるＦｇｆは、上記したＦｇｆのいずれを用いることもでき、各Ｆｇｆ化合物の使用濃度は使用目的に合わせて適宜選択できる。例えばＦｇｆ９を用いる場合は、いずれの起源のＦｇｆ９を用いることができるが好ましくはヒトＦｇｆ９である。培地中の濃度は、分化誘導の効果が得られる限り特に制限がないが、例えば、１〜２５ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２．５〜１０ｎｇ／ｍＬをあげることができる。また、他のＦｇｆ化合物を用いる場合は、Ｆｇｆ９を用いた場合に得られる効果を同様の効果を発揮できる濃度を適宜選択することができる。
【００４０】
工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）で処理する日数は、ネフロン前駆細胞が誘導できる限り特に制限はないが、マウスおよびヒトにおいてそれぞれに以下のような好ましい日数がある。
マウスの多能性幹細胞を用いてネフロン前駆細胞を誘導する場合は、培養は、工程（ａ）は、例えば、１〜４日、好ましくは２日〜３日、特に好ましくは２．５日行い、工程（ｂ）は、好ましくは０．５日〜２日、特に好ましくは１日行い、工程（ｃ）は、例えば、０．５〜３日、好ましくは１日〜２．５日、特に好ましくは２日行うことができる。
一方、ヒトの多能性幹細胞を用いてネフロン前駆細胞を誘導する場合は、培養は、工程（ａ）は、例えば、３〜１１日、好ましくは４日〜１０日、特に好ましくは６日行い、工程（ｂ）は、好ましくは１日〜３日、特に好ましくは２日行い、工程（ｃ）は、例えば、１〜５日、好ましくは２日〜４日、特に好ましくは３日行う。
【００４１】
本発明の他の態様は、本発明の分化誘導方法により誘導された後腎ネフロン前駆細胞である。本発明の方法により誘導されたネフロン前駆細胞は、後腎間葉を規定する転写因子、Ｏｓｒ１、Ｗｔ１、Ｐａｘ２、Ｓｉｘ２、Ｈｏｘａ１０、Ｈｏｘａ１１全てを発現する細胞集団であることを特徴とし、それらの遺伝子が単一細胞レベルで高い確率で共発現している。本発明のネフロン前駆細胞は、尿細管だけではなく糸球体を含む三次元腎臓を再構成することが可能な後腎ネフロン前駆細胞である。
【００４２】
本発明の他の一つの態様は、本発明の後腎ネフロン前駆細胞から更に分化誘導された近位尿細管細胞、遠位尿細管細胞、および糸球体上皮細胞である。近位尿細管細胞の特徴は、Ｃａｄｈｅｒｉｎ６、Ｍｅｇａｌｉｎ、およびＬＴＬを発現する細胞の細胞集団である。遠位尿細管細胞の特徴は、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｂｒｎ１、およびＮＣＣを発現する細胞の細胞集団である。糸球体細胞の特徴は、Ｗｔ１、Ｎｅｐｈｒｉｎ、およびＰｏｄｏｃｉｎを発現する細胞の細胞集団である。近位尿細管細胞、遠位尿細管細胞、または糸球体上皮細胞は、ネフロン前駆細胞を、これに限定されないが、例えば、胎児脊髄またはＷｎｔ４発現細胞と共培養することにより得ることができる。
また、共培養後の各構成細胞の分取は、これに限定されないが、例えば、トリプシン等を用いた細胞解離処理後に各細胞特異的な膜たんぱく質（例えば、糸球体上皮細胞であればｐｏｄｏｃａｌｙｘｉｎ、近位尿細管であればＣａｄｈｅｒｉｎ６、遠位尿細管であればＥｃａｄｈｅｒｉｎ）を抗体染色し、ＦＡＣＳ（フローサイトメーター）を用いて分取することが可能である。
【００４３】
本発明の別の態様は、本発明の方法により得られたネフロン前駆細胞を用いて尿細管及び糸球体が再構成された三次元腎臓を作成する方法である。本発明の方法により得られたネフロン前駆細胞を用いて三次元腎臓を作成する方法は、例えば、ネフロン前駆細胞を、気液界面にて胚脊髄またはＷｎｔ４発現細胞と共培養することにより行うことができる。共培養の条件は、例えば、Kispertら、Development 125, 4225-4234, 1998（非特許文献８）に記載の方法を参考にして行うことができるが、それに限定されず、他の公知の知見をもとに、当業者が適宜変更または改良を加えたものも含まれる。このようにして作成した腎臓は、尿細管や糸球体を含む三次元腎臓の構造を形成している。
【００４４】
本発明の他の別の態様は、本発明の方法により得られたネフロン前駆細胞を用いて作成された尿細管及び糸球体が再構成された三次元腎臓である。三次元腎臓の作成方法は、上述の通りである。
【００４５】
本発明の別の一つの態様は、多能性幹細胞からネフロン前駆細胞を誘導するための培地および培地のキットである。本発明の培地の一つの特徴は、濃度を段階的に変更したＷｎｔアゴニストを含む培地の組合せであり、本発明はまたそのような培地の組合せを作成するための培地のキットである。例えば、多能性幹細胞からネフロン前駆細胞または腎臓を誘導するための誘導培地とＷｎｔアゴニストからなる培地キットをあげることができ、用時に、Ｗｎｔアゴニストを段階的濃度となるように培地に加えて使用される。本発明の培地のキットは、さらに、Ｂｍｐ４、アクチビン、レチノイン酸のいずれか１つ以上を含むこともできる。
【００４６】
上記のように、本発明により、多能性幹細胞より後腎ネフロン前駆細胞を誘導することが可能となった。本発明の方法により作成された後腎ネフロン前駆細胞は、さらに成熟したネフロンコンポーネントの構築に貢献でき、そして、それらを尿管芽由来の構造と結合して腎臓の生理的機能を付与することが可能となる。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００４８】
（Ａ）材料と方法
（１）変異マウスの作成
ＧＦＰはエクソン２のＡｇｅＩ部位に挿入し、Ｏｓｒ１のＮ末端１２アミノ酸がＧＦＰにインフレームで結合するようにした。５’Ｈｐａ１−ＡｇｅＩ  Ｏｓｒ１ゲノム断片（２．８ｋｂ）をＥＧＦＰに結合し、そしてTakasatoら（Mech Dev 121, 547-557, 2004）の方法に従い、３’ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片（５．５ｋｂ）を、ｌｏｘＰ部位に隣接したＮｅｏおよびタンデムなＤＴＡを含むベクターに挿入した。標的ベクターをＥ１４．１ＥＳ細胞にエレクトロポレーションし、次いで、３つの４８０Ｇ４１８耐性クローンを、ＢａｍＨＩで消化した後、５’プローブを用いたサザンブロット分析により、標的として決定した。正しく標的とされたＥＳクローンを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスと交配する生殖系列キメラを作成するために使用した。Ｎｅｏを、Ｏｓｒ１−ＧＦＰ変異マウスと遍在的にＣｒｅを発現するマウスとを交配させることにより取り除くと、表現型およびＥＧＦＰ発現パターンは、元の変異マウスのものと同一であった。子孫の遺伝子型分析は、フォワードプライマー、５’−ＴＡＴＧＴＴＧＡＧＧＧＧＧＣＡＧＴＡＧＧＴＴＣ−３’、２つのリバースプライマー、５’−ＧＴＴＧＧＧＣＡＧＧＴＧＧＴＣＣＧＡＧＧＧＣＡ−３’および５’−ＴＡＧＧＴＣＡＧＧＧＴＧＧＴＣＡＣＧＡＧＧＧＴ−３’を用いたＰＣＲによって行い、野性型アレルのための３２０塩基対の産物および変異アレルのための４２０ｂｐの産物を製造した。TnEGFP-CreERT2/+（Acc. No. CDB0604K: http:// www.cdb.riken.jp/arg/mutant%20mice%20list.html）、Wt1tm1(EGFP/cre)Wtpマウス、Six2tm3(EGFP/cre/ERT2)Amcマウス、およびGt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hzeマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（米国）から購入した。全ての動物実験は、施設のガイドラインおよび倫理委員会に従って行った。【００４９】
（２）インビトロコロニー形成アッセイ
インビトロコロニー形成アッセイは、Osafuneら（非特許文献４：Development 133, 151-161, 2006）の記載に従って行った。要約すれば、前駆細胞は、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて選別し、Ｗｎｔ４を安定に発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞上に低密度（１，２５０-１０，０００細胞／ウェル、６ウェルプレート）で播種した。次いで、細胞を、５％  ノックアウト血清代替物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０μｇ／ｍＬ  インスリン、６．７μｇ／Ｌ  亜セレン酸ナトリウム、５．５μｇ／ｍＬ  トランスフェリン、１×１０-7ｍｏｌ／Ｌ  デキサメタゾン、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ニコチンアミド、２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−グルタミン、５０μＭ／Ｌ  ２−メルカプトエタノール、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２で培養した。【００５０】
（３）免疫染色
検体は、１０％ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋して６μｍの切片にカットした。免疫染色は、ＢｌｕｅＭａｐまたはＤＡＢｍａｐキットおよび自動Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて自動的に行うか、または手動で免疫蛍光染色を行った。蛍光免疫組織化学のために、パラフィンで固定した切片を脱パラフィンした。クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で、５分間、１２１℃でオートクレーブして脱パラフィンした。室温で１時間、ブロッキング溶液中でインキュベートした後、切片を４℃で一次抗体と共に一晩インキュベートした。次いで、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、５６１、５９４、６３３または６４７と結合させた二次抗体とインキュベートした。核はＤＡＰＩ（Ｒｏｃｈｅ）でカウンター染色した。凍結切片については、サンプルを４％パラホルムアルデヒドで固定し、最適切削温度（ＯＣＴ）化合物（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ）に包埋し、１０μｍ厚の凍結切片とした。免疫染色のために、ＯＣＴ化合物をＰＢＳで３回洗浄することにより除去した後、切片をブロッキング溶液中でインキュベートした。以降の手順は、パラフィン切片を染色する場合と同じとした。【００５１】
（４）選別した胚細胞の培養 
Ｅ８．５における胚組織培養物については、６−１０体節期胚の前体節領域を採取し、Ｔ−ＧＦＰ＋細胞をＦＡＣＳで選別した。選別した細胞を９６ウェルの低細胞接着プレートに、凝集体あたり７，０００細胞で凝集させて、無血清既知組成培地で培養した。Ｅ９．５での胚組織培養では、２２から２６体節期胚の２３体節領域からの尾部領域を回収し、Ｏｓｒ１−ＧＦＰ＋またはＷｔ１−ＧＦＰ＋細胞をＦＡＣＳで選別した。選別された細胞を、９６ウェルの低細胞接着プレート内に凝集体当たり１０，０００細胞で凝集させて、無血清既知組成培地で培養した【００５２】
（５）マウスＥＳ細胞およびヒトｉＰＳ細胞培養
マウスＥＳ細胞（Ｏｓｒ１−ＧＦＰ）を、１５％ウシ胎児血清、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール（ナカライテスク）および１，０００Ｕ／ｍＬの白血病抑制因子（ＥＳＧＲＯ）を補充したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にてマウス胚性線維芽細胞上で維持した。ＥＢ３−ＤｓＲｅｄの細胞は、丹羽仁史博士（理化学研究所ＣＤＢ）から供与を受けた。ＥＢ３−ＤｓＲｅｄの細胞は、Ｕｓｕｉら（Am J Pathol 180, 2417-2426, 2012）らの報告に従って維持した。分化を開始する前に、ＥＳ細胞を、１５％ウシ胎児血清、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１，０００Ｕ／ｍＬ  白血病抑制因子、３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１（和光）および１μＭ  ＰＤ０３２５９０１（和光）を補充したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にて、フィーダー細胞を含まないゼラチンコートディッシュ上で１代継代した。ＥＳ細胞の分化は、以下のようにして無血清培地中で行った。ＥＳ細胞は、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＥＳＧＲＯ）で解離し、７５％のイスコフ改良ダルベッコ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２５％のハムＦ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、０．５×Ｎ２と０．５×Ｂ２７（レチノイン酸なし）サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．５×ペニシリン／ストレプトマイシン、０．０５％ウシ血清アルブミン、２ｍＭ  グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、０．５ｍＭ  アスコルビン酸（シグマ）および４．５×１０-4Ｍ  １−チオグリセロールを補充した無血清分化培地中で培養した。集めた細胞は、９６ウェルの低細胞結合プレートで、凝集体あたり１，０００細胞で凝集させ、胚様体（ＥＢｓ）を形成した。４８時間後（ｄａｙ２）、ＥＢｓをＡｃｃｕｔａｓｅで解離し、０．５ｎｇ／ｍＬ  ヒトアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を加えた無血清分化培地で再凝集させた。２４時間後（ｄａｙ３）、培地を、１ｎｇ／ｍＬ  ヒトＢｍｐ４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および１０μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１を含むＢＣ１０培地に切り替えた。３６時間後（ｄａｙ４．５）、培地を新しい培地（ＢＣ１０）に変えた。Ｄａｙ５．５で、培地を１０ｎｇ／ｍＬ  アクチビン、３ｎｇ／ｍＬ  Ｂｍｐ４、３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１および０．１μＭ  レチノイン酸を含むＡＢＣ３Ｒ培地に変更した。ｄａｙ６．５に、培地を、１μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１および５ｎｇ／ｍＬ  ヒトＦｇｆ９（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含むＣ１Ｆ培地に変更した。【００５３】
ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）は、５ｎｇ／ｍＬ  組換えヒト塩基性Ｆｇｆ（和光）を補充したＰｒｉｍａｔｅ  ＥＳ培地（リプロセル）中で、マウス胚性線維芽細胞上で維持した。培養３日目に、１ｍｇ／ｍｌのＴｙｐｅ4 ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ (ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社) 中でｉＰＳ細胞のコロニーを剥離させ回収した。さらにマウス胚繊維芽細胞を除くために、回収した細胞浮遊液を１０分間静置し、ｉＰＳ細胞のコロニーのみを回収した。ｉＰＳ細胞の分化は、以下のように無血清培地中で行った。ｉＰＳ細胞は、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＥＳＧＲＯ）で解離し、２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７（レチノイン酸なし）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％（ｖ／ｖ）ＩＴＳ、１％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸（レチノイン酸なし）、９０μＭ  β−メルカプトエタノールおよび０．５×ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）からなる無血清分化培地で培養した。集めた細胞を、１０μＭ  Ｙ２７６３２（和光）、および０．５ｎｇ／ｍＬ  ヒトＢｍｐ４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の存在下で、９６ウェルの低細胞接着プレート内で、凝集体当たり１０，０００細胞で凝集させて、胚様体（ＥＢｓ）を形成させた。２４時間後（ｄａｙ１）、培地を１ｎｇ／ｍＬ  ヒトアクチビンおよび２０ｎｇ／ｍＬ  ヒト塩基性Ｆｇｆ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む中胚葉誘導培地に変更した。４８時間後（ｄａｙ３）、培地を、１ｎｇ／ｍＬ  ヒトＢｍｐ４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および１０μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１を含むＢＣ１０培地に切り替えた。その後、一日おきに、培地量の半分を新しい培地（ＢＣ１０）に交換した。Ｄａｙ９に、培地を、１０ｎｇ／ｍＬ  アクチビン、３ｎｇ／ｍＬ  Ｂｍｐ４、３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１および０．１μＭ  レチノイン酸を含むＡＢＣ３Ｒ培地に変更した。Ｄａｙ１１に、培地を、１μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１および５ｎｇ／ｍＬ  ヒトＦｇｆ９（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含むＣ１Ｆ培地に変更した。特に断らない限り、示された全てのデータは、少なくとも３つの独立した実験の代表的な例である。【００５４】
（６）後腎間葉または誘導した後腎前駆細胞の器官培養
Kispertら（非特許文献８：Development 125, 4225-4234, 1998）とOsafuneら（非特許文献４：Development 133, 151-161, 2006）の報告に従い、マウス胚後腎間葉細胞または誘導したＥＳ細胞凝集体を、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭを用いて、ポリカーボネートフィルター（０．８μｍ、ワットマン）の上で、空気−液体界面で、Ｅ１１．５またはＥ１２．５胚から取った胚脊髄とともに、または３Ｔ３Ｗｎｔ４細胞上で培養した。【００５５】
（７）免疫染色によるフローサイトメトリー分析
胚組織またはＥＳ細胞から誘導された細胞凝集体を、５分間、０．２５％トリプシンと共にインキュベーションすることによって分離した。正常マウス血清（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でブロッキングした後、細胞表面マーカー染色を１％ウシ血清アルブミン、１×ＨＢＳＳおよび０．０３５％  ＮａＨＣＯ3を含む緩衝液中で行った。データは、ソフトウェアＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）で分析した。【００５６】
（８）抗体
用いた抗体は以下のものである：ウサギ抗Ｐａｘ２（Ｃｏｖａｎｃｅ；１：８００）；フルオレセイン抗ＬＴＬ（ＦＬ−１３２１；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；１：１００）；ニワトリ抗ＧＦＰ（Ａｂｃａｍ；１：１０００）；ウサギ抗ＧＦＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１：４００）；ウサギ抗Ｉｔｇａ８（Ｓｉｇｍａ；１：２００）；ウサギ抗Ｐｄｇｆｒａ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１：５００）；マウス抗Ｐｄｇｆｒａ（Takakuraら、J Histochem Cytochem 45, 883-893, 1997）（１：５００）；ウサギ抗Ｗｔ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１：２００）；マウス抗Ｗｔ１（Ｄａｋｏ；１：１００）；ウサギ抗Ｓｉｘ２（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ；１：５００）；マウス抗Ｓａｌｌ１（ＰＰＭＸ  Ｐｅｒｓｅｕｓ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ；１：２００）；マウス抗Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；１：８００）；ウサギ抗Ｃｄｈ６（Dr. Dressler（Choら、Development 125, 803-812, 1998）から供与；１：４００）；マウス抗Ａｑｐ１（Ａｂｃａｍ；１：１００）；ウサギ抗Ｐｏｄｏｃｉｎ（淺沼博士より供与（Lydiaら、 Am J Nephrol 35, 58-68., 2012）；１：４００）；モルモット抗Ｎｅｐｈｒｉｎ（Ｐｒｏｇｅｎ；１：２００）；ウサギ抗ＣＤ３１（Ａｂｃａｍ；１：２５）；ラット抗ＣＤ３４（Ａｂｃａｍ；１：１００）；ウサギ抗ＤｓＲｅｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；１：１００）。【００５７】
（９）定量的ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離し、次にランダムプライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写した。定量的ＰＣＲは、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＴｈｕｎｄｅｒｂｉｒｄ  ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いて行った。すべてのサンプルは、相対標準曲線法を用いてβ−アクチンの発現により標準化した。【００５８】
（１０）マイクロアレイ分析
標本は、以下の７種類を比較した：Ｅ８．５胚のＯｓｒ１−ＧＦＰ陽性および陰性細胞；Ｅ９．５胚の尾体幹のＯｓｒ１−ＧＦＰ＋／Ｉｔｇａ８＋／Ｐｄｇｆｒａ−集団、Ｏｓｒ１−ＧＦＰ＋（但しＩｔｇａ８＋／Ｐｄｇｆｒａ−を除く）集団、およびＯｓｒ１−ＧＦＰ陰性集団；Ｅ１１．５にて手動操作で分離した後腎間葉のＯｓｒ１−ＧＦＰ＋／Ｉｔｇａ８＋／Ｐｄｇｆｒａ−集団およびＯｓｒ１−ＧＦＰ＋（Ｉｔｇａ８＋／Ｐｄｇｆｒａ−を除く）集団。マイクロアレイ分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３マウス遺伝子発現（８×６０Ｋ）マイクロアレイを用いて行った。データは、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸソフトウェア（アジレント）によって標準化した。マイクロアレイデータは、Biotechnology Information Gene Expression Omnibus（ＧＳＥ）のためにナショナルセンターに寄託した。【００５９】
Ｂ．実施例
実施例１：コロニー形成前駆細胞を表すOsr1+/Integrina8+/Pdgfra-集団
後腎間葉は、転写因子Ｓｉｘ２を発現する間葉を標識する工程を含む細胞運命分析によって示されるように、糸球体の上皮（足細胞を含む）とネフロンの主要部分を構成する細管を生じさせる。発明者らは以前、新規のコロニー形成アッセイを確立することによってネフロン前駆細胞の存在を証明した。Ｓａｌｌ１を強発現する分離した後腎間葉系細胞を、Ｗｎｔ４を安定に発現するフィーダー細胞上に播いた場合、コロニーを形成した単一の細胞群は、糸球体及び腎臓の尿細管マーカーを発現した（非特許文献９：Nishinakamuraら、Development 128, 3105-3115, 2001；非特許文献４：Osafuneら、Development 133, 151-161, 2006）。したがって、Ｓａｌｌ１が高くＳｉｘ２陽性の後腎間葉は、胚腎臓でネフロン前駆体集団を表す。
Ｏｓｒ１は、別の後腎間葉マーカーであり、また、中間中胚葉の最も早いマーカーの１つである。したがって、Ｏｓｒ１は、腎臓発生を通じて腎前駆体集団で連続的に発現される（非特許文献１０：Jamesら、Development 133, 2995-3004, 2006；非特許文献１：Mugfordら、Dev Biol 324, 88-98, 2008）。そこで、Ｏｓｒ１−ＧＦＰノックインマウスを作成し（図３）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が、Ｅ８．５−Ｅ９．５の中間中胚葉で、そして、Ｅ１１．５−Ｅ１５．５の後腎間葉で発現することを確認した（図４Ａ〜Ｃ）。【００６０】
次いで、ＯＳＲ１−ＧＦＰ陽性集団が、コロニー形成ネフロン前駆細胞を含んでいるかを、以下のようにして確認した。Ｅ８．５胚（心臓レベルから尾部）とＥ９．５胚（前肢レベルから尾部）の尾の部分を採取した。Ｅ１１．５およびＥ１５．５については、胚の後腎を手動操作で解剖した。それぞれの採取した細胞を分離した後、ＯＳＲ１＋細胞をＦＡＣＳによってソートし、Ｗｎｔ４フィーダー細胞上に播種した。８日目において、コロニー数を計数した。結果を以下の表１に示す。下記のように、発明者らの以前の報告と同様、Ｅ１１．５およびＥ１５．５胚腎臓から選別されたＯＳＲ１−ＧＦＰ陽性集団は、コロニー形成ネフロン前駆細胞を含んでいた。【００６１】
【表１】
0006455729.tif 000002
【００６２】
コロニーが、腎臓転写因子ならびに分化した尿細管マーカーを発現しているかを確認した（図５および図６）。結果、コロニーは、腎臓転写因子、例えばＰａｘ２やＳａｌｌ１、ならびに分化した尿細管マーカーを発現した。したがって、ＯＳＲ１＋後腎間葉は、コロニー形成ネフロン前駆細胞を含んでいるとわかった。【００６３】
次に、ネフロン前駆細胞を濃縮することができる細胞表面マーカーを検索した。Ｅ１５．５およびＥ１１．５において、Ｉｎｔｅｇｒｉｎａ８（Ｉｔｇａ８）は、尿管芽の先端の周りのキャッピング間葉で強く発現していたが、一方、Ｐｄｇｆｒａは、集団から除かれていた（図７）。ＦＡＣＳ分析により、Ｅ１５．５およびＥ１１．５胚腎臓のＯｓｒ１−ＧＦＰ＋集団におけるＩｔｇａ８＋／Ｐｄｇｆｒａ−分画の存在を確認した（図８）。また、Ｏｓｒ１−ＧＦＰ＋／Ｉｎｔａ８＋／Ｐｄｇｆｒａ−細胞集団が、コロニー形成ネフロン前駆細胞を多く含んでいるかを以下のようにして確認した。Ｅ９．５またはＥ１１．５の切片を採取した。Ｅ１０．５では、中腎領域（前方前肢端から前方後肢端）または後腎領域（前方後肢端から後方後肢端）を手動操作で解剖した。採取した組織を分離し、抗Ｉｔｇａ８抗体と抗Ｐｄｇｆｒａ抗体で免疫染色した。ＯＳＲ１＋／Ｉｔｇａ８＋／Ｐｄｇｆｒａ−細胞をＦＡＣＳによってソートし、Ｗｎｔ４フィーダー細胞上に播種した。８日目において、コロニー数を計数した。結果を以下の表２に示す。下記のように、コロニー形成ネフロン前駆細胞は、Ｏｓｒ１＋／Ｉｔｇａ８＋／Ｐｄｇｆｒａ−分画で濃縮されていた。【００６４】
【表２】
0006455729.tif 000003
【００６５】
次いで、ＧＦＰノックインマウスを用いて、Ｓａｌｌ１およびＳｉｘ２について、これらの細胞表面マーカーの信頼性を確認した。結果を、図９に示す。Ｓａｌｌ１−ＧＦＰ高またはＳｉｘ２−ＧＦＰ＋細胞のほとんどは、Ｉｔｇａ８＋／Ｐｄｇｆｒａ−だった。したがって、Ｉｔｇａ８＋／Ｐｄｇｆｒａ−分画は、コロニー形成ネフロン前駆細胞を表すことがわかった。【００６６】
実施例２：Ｅ９．５での前方中間中胚葉は中腎に寄与するコロニー形成前駆細胞を含む
次に、ネフロン前駆細胞マーカーの発現、および初期段階のＯｓｒ１−ＧＦＰ陽性細胞のコロニー形成能力を検討した。図５および表１に示すように、Ｅ８．５では、Ｉｔｇａ８とＧＦＰの重複は検出されず、ＧＦＰ＋集団によるコロニー形成もなかったが、Ｅ９．５では、ＧＦＰ＋集団によるコロニー形成が検出された（０．０３７±０．０１３％）。
また、Ｉｔｇａ８＋／Ｐｄａｆｒａ−であるＧＦＰ＋領域を見つけ（図５）、そして、Ｏｓｒ１＋／Ｉｔｇａ８＋／Ｐｄｇｆｒａ−集団を選別することにより、コロニー形成細胞を濃縮した（１．１０±０．２６％、図６、表２）。しかし濃縮後でさえ、コロニー形成頻度は、Ｅ１０．５およびＥ１１．５の後腎領域からのＯｓｒ１＋／Ｉｔｇａ８／Ｐｄｇｆｒａ−集団のそれより有意に低かった（それぞれ、３０．９±１．５％及び５０．９±５．２％、表２）。これとは対照的に、Ｅ１０．５の中腎領域からのＯｓｒ１＋／Ｉｔｇａ８＋／Ｐｄｇｆｒａ−集団のコロニー形成頻度（１．４７±０．２０％、表２）は、Ｅ９．５のそれと同じくらい低かった。後腎の前方に位置している中腎は、後腎より早く発展し、はるかに少ないネフロンを形成するので、Ｅ９．５でのコロニー形成細胞は、中腎ネフロン前駆細胞を表すかもしれないという仮説を立てた。【００６７】
コロニー形成前駆細胞は、図１０に示すように、Ｅ９．５胚におけるＧＦＰ＋細胞の前部の中でのみ検出された。Ｗｔ１（別のネフロン前駆細胞マーカー）が、前部と尾部の両方の部分で発現されている一方、図１１に示すように、ネフロン前駆細胞のマーカーであるＰａｘ２とＳｉｘ２は、主に、中間中胚葉の前部で発現した。これらのデータは、Ｅ９．５での前部と尾部の中間中胚葉の間の分子の違いを示唆している。さらに、ｔｄＴｏｍａｔｏレポーター対立遺伝子をもつマウスとＳｉｘ２−ＧＦＰＣｒｅＥＲマウスを交差させ、Ｅ９．５にて一時的に活性化したＣｒｅにタモキシフェンを注入した。Ｅ１１．５で分析すると、図１２に示すように、標識された細胞は、中腎で検出されたが、後腎では検出されなかった。したがって、中間中胚葉前部に存在する中腎ネフロン前駆細胞は、後方に配置されている後腎ネフロン前駆細胞を生じないことがわかった。【００６８】
実施例３：Ｅ９．５の尾部中間中胚葉からの後腎ネフロン前駆細胞の誘導
Ｏｓｒ１＋／Ｉｔｇａ８＋／Ｐｄｇｆｒａ−であるコロニー形成が推定されるＥ９．５の中腎前駆細胞と、Ｅ１０．５〜１１．５の後腎ネフロン前駆細胞を用いて、マイクロアレイと定量ＰＣＲ解析を行った。結果を図１３と図１４に示す。両方のタイプの前駆細胞が、例えば、Ｏｓｒ１、Ｗｔ１、Ｐａｘ２およびＳｉｘ２のような共通の転写因子、ならびにＧｄｎｆ（腎臓発生に必須のサイトカイン）を発現している一方、後腎前駆細胞はＨｏｘａ１０、Ｈｏｘａ１１およびＨｏｘｄ１２を含む尾部Ｈｏｘ遺伝子をより多く発現していた。Ｅ９．０前後で胚の後端で発現され始めるＨｏｘ１１ファミリー遺伝子は、中間中胚葉の前後軸に沿った後腎領域を決定づけることによって後腎の発達に不可欠であると報告されている。さらに、細胞運命マッピング研究により、Ｅ９．５のＯｓｒ１＋中間中胚葉が後腎間葉に寄与していることが示されている。それゆえ、Ｅ９．５で後方に位置していた非コロニー形成Ｏｓｒ１＋／尾部Ｈｏｘ＋である中間中胚葉は、後腎ネフロン前駆細胞の前駆体集団となり得るという仮説を立てた（図１５、図１１および図１３）。特に、Ｅ９．５の尾部中間中胚葉におけるＰａｘ２、Ｓｉｘ２およびＧｄｎｆの発現レベルは、依然としてＥ１０．５での尾部後腎前駆細胞に比べてはるかに低く、このことは、それらが異なっていることを示している（図１３）。【００６９】
仮説をテストするために、Ｅ９．５胚の尾の部分からＯｓｒ１−ＧＦＰ＋細胞を選別し、細胞の生存をサポートするＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２の存在下で、低細胞接着プレートにそれらの細胞を播いた。結果を図１６に示す。細胞は、自発的に再凝集し、２４時間以内に球体を形成した。４８時間の培養時点で、凝集体は、強いＧＦＰ信号を持ち、培養開始時点に比べて１０倍以上高いＰａｘ２、Ｓｉｘ２およびＧｄｎｆ発現を示した。また、ＦＡＣＳ分析（図１７）に示すように、Ｏｓｒ１＋／Ｉｔｇａ８＋／Ｐｄｇｆｒａ−集団の出現を示した（全細胞の１０．０±０．０１％）。これらの凝集体を分離し、Ｗｎｔ４で刺激した場合には、図１８に示すように、コロニー形成が観察された。このことは、尾部中間中胚葉から後腎ネフロン前駆細胞のインビトロでの誘導を示唆している。【００７０】
このプロセスでの成長因子の影響に注目した。マイクロアレイと定量ＰＣＲ解析によると、Ｅ９．５およびＥ１１．５の両者で、コロニー形成集団において、Ｆｇｆリガンド（特にＦｇｆ９およびＦｇｆ２０）、受容体およびそれらの下流の標的遺伝子の蓄積された発現を示したが、一方、ＢｍｐおよびＷｎｔ標的はダウンレギュレートされていた（図１９）。図１８に示されるように、Ｆｇｆシグナリングの阻害、Ｂｍｐ４または高濃度のＷｎｔシグナル伝達アゴニスト（３または１０μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１；ＣＨＩＲ）の外部からの添加、ならびにレチノイン酸またはアクチビンの添加は、コロニー形成前駆細胞および腎臓遺伝子発現を阻害し、一方、ＦＧＦ９または低濃度のＷｎｔアゴニスト（１μＭのＣＨＩＲ）の添加は、コロニー形成を僅かに改善した。Ｏｓｒ１−ＧＦＰは、側板中胚葉を含むかなり広い集団で発現されているので、Ｗｔ１−ＧＦＰノックインマウスを用いてこれらの因子の効果を確認した。Ｗｔ１−ＧＦＰノックインマウスは、中間中胚葉の領域でのより制限された発現を示した（図１１）。図２０に示すように、Ｆｇｆ９および低容量のＷｎｔアゴニストの添加は、凝集体成長を相乗的に促進し、そして凝集体によるコロニー形成を増加させた。
したがって、１μＭ  ＣＨＩＲおよびＦｇｆ９の組み合わせ（Ｃ１Ｆ）は、尾部中間中胚葉から後腎ネフロン前駆細胞への誘導に最適であった。これらの観察結果は、後腎間葉の形成と維持のためのＦｇｆ受容体とＦｇｆ９／Ｆｇｆ２０がそれぞれ要求されることを示している先行文献と一致する（非特許文献１１：Barakら、Dev Cell 22, 1191-1207., 2012、および非特許文献１２：Poladiaら、Dev Biol 291, 325-339, 2006）。
【００７１】
実施例４：後腎間葉前駆体は、Ｅ８．５ポスト原腸形成期までＴ陽性尾集団で維持される
次に、Ｅ９．５尾部中間中胚葉を用いて、早い段階の中胚葉を後腎間葉に分化させるインビトロでの方法で調べた。一つの報告では、中間中胚葉由来の後腎間葉と尿管芽の両方が、胎生（Ｅ）８．５前後で現れ、転写因子Ｏｓｒ１を発現することが示されている（非特許文献１：Mugfordら、Dev Biol 324, 88-98, 2008）。他のいくつかの報告では、尿管芽は、前方中間中胚葉に由来し、そしてその原基であるウォルフ管は、前方から後方に向けて伸長することが、ニワトリ胚を直接標識することにより示されている（非特許文献１３：Atsutaら、Dev Growth Differ 55, 579-590, 2013、非特許文献１４：Attiaら、Development 139, 4143-4151, 2012、非特許文献１５：Obara-Ishiharaら、Development 126, 1103-1108, 1999、非特許文献１６：Saxen, Cell 131, 861-872, 1987）。マウス胚では、Ｅ８．５のＰａｘ２／８−陽性前中間中胚葉（前腎原基と呼ばれる）は、同等の集団と推定され、Ｏｓｒ１−陽性領域に含まれる。従って、最初に、選別されたＥ８．５のＯｓｒ１−ＧＦＰ＋細胞を用いて増殖因子の多くの組み合わせの効果を検討した。しかし、コロニー形成前駆細胞を誘導することができなかった。
【００７２】
したがって、別のアプローチを試した。原始線条と尾部未分化中胚葉の代表的マーカーであるＴ（Brachyury）の欠損は、後腎領域を含む尾の短縮化を引き起こす（非特許文献１７：Herrmannら、Nature 343, 617-622, 1990）。まず、ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターアレルを持つマウスとＴnEGFP-CreERT2/+マウスを交差させ、初期胚葉形成が起こるとき、原腸形成期（Ｅ６．５およびＥ７．５）にタモキシフェンを注入した。Ｅ１１．５で分析すると、心臓、手足や腎臓を含む中胚葉組織のほとんどが標識された。次に、Ｅ８．５でタモキシフェン注入したところ、標識された細胞が、後肢レベルに位置する後腎間葉を含むＥ１１．５胚の下部体幹にのみ検出されたことがわかった。一方、前方に位置する中胚葉組織である心臓や前肢は、もはや標識されていなかった。重要なことは、後腎レベルの切片を作成したとき、尿管芽ではなく、後腎間葉のみが標識されたことである。これらの知見は、尿管芽の起源はＥ８．５で既に分離されているということを示しており、尿管芽が、Ｅ８．５では、前方中間中胚葉から由来し、尾側へと伸張するという考えと一致する。しかし、Ｅ９．５でタモキシフェンを注入した場合は、尾領域のみが標識され、後腎間葉の領域では標識された細胞は観察されなかった。
以上をまとめると、図２１に示されるように、後腎間葉の前駆体は、Ｅ８．５後の原腸形成の段階まで、Ｔ陽性状態に維持され後方化される。おそらくこれは、部分的には、尾体幹の供給源として最近認識された”体軸幹細胞（ａｘｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）”に対応すると考えられる。これらのデータはまた、後方に位置する後腎間葉組織および前方に位置する中胚葉組織、例えば心臓、の間の発生過程の違いを明らかにする。なお、これらの前方に位置する中胚葉組織は、分化初期における短期間のＴ陽性状態を経て多能性幹細胞からの誘導に成功している（非特許文献１８：Burridge、Cell Stem Cell 10, 16-28, 2012）。【００７３】
実施例５：Ｅ８．５でのＴ陽性尾部中胚葉から後腎間葉誘導
系統トレース実験に基づき、原料として選別したＥ８．５のＴ＋尾部中胚葉を用いて、後腎ネフロン前駆細胞を誘導した。結果を図１８に示す。選別した細胞は、再凝集させて凝集体を形成させて種々の成長因子で処理し、次いで上記のようにＣ１Ｆで処理した（図２２Ｃ、工程３）。後方中間中胚葉は、Ｏｓｒ１、Ｗｔ１および尾部Ｈｏｘ遺伝子の発現によって識別されるので、まずこれらの遺伝子の発現に影響を与える可能性がある成長因子に注目した。ＢｍｐおよびＷｎｔシグナル伝達の相乗効果は、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞分化における尾部Ｈｏｘ遺伝子の発現で報告されており、レチノイン酸シグナル伝達は、ゼブラフィッシュ発達におけるＷｔ１同族の発現に重要であると報告されている。レチノイン酸、ＢｍｐおよびＷｎｔアゴニストの同時導入は、胚後腎間葉で観察されたレベルまで尾部Ｈｏｘ遺伝子を増加させなかった（図２２ＤとＥ）ので、”後方化期”を追加した。すなわち、カノニカルなＷｎｔシグナルが体幹の伸長に重要であると報告されているので、Ｂｍｐ４と組み合わせて、Ｗｎｔアゴニストを高濃度（１０μＭ  ＣＨＩＲ）で添加した。この処理（ＢＣ１０、ステップ１）は劇的に尾部Ｈｏｘ遺伝子の発現を増加させ、そして、腎臓遺伝子の発現レベルは胚後腎間葉に比べてまだ低かったが、誘導された細胞からのコロニー形成を検出することができた（図２２ＤとＧ）。次に、様々な条件を試み、アクチビンとレチノイン酸の組み合わせを、Ｂｍｐ４および３μＭ  ＣＨＩＲと一緒に用いること（ＡＢＣ３Ｒ、ステップ２）が、腎臓遺伝子の発現を実質的に増加させることを見いだした（図２２Ｆ）。この最適化された３段階の条件（ＢＣ１０とそれに続くＡＢＣ３ＲおよびＣ１Ｆ）で、細胞は、アクチビンまたはレチノイン酸のいずれかの単独での添加に比べて、多数のコロニー（２２．７±３．６６％、ｎ＝４）を形成した（図２２Ｇ）。最初の後方化工程において、標準的なＷｎｔアゴニストの濃度は極めて重要であり、レチノイン酸の添加は完全にコロニー形成前駆細胞誘導を阻害した（図２３Ａ）。第二工程において、アクチビン、レチノイン酸、Ｂｍｐ、ＷｎｔまたはＦｇｆシグナリングのいずれかの阻害は、コロニー形成を減少させ（図２３Ｂ）、このことは、これらのシグナルのすべてが必須であることを示唆している。【００７４】
さらに、誘導プロセスの各ステップでの遺伝子発現の時間的動態を検討した。結果を図２４に示す。図２４Ａに示されるように、最初の工程では、Ｔ、Ｃｄｘ２およびＴｂｘ６（これらは全て後部中胚葉マーカーである）が発現されて維持され、一方、尾部Ｈｏｘ遺伝子は増加し始めた。第二工程では、腎臓遺伝子が発現し始め、そして最終工程では、Ｐａｘ２、Ｓｉｘ２、Ｇｄｎｆおよび尾部Ｈｏｘ遺伝子の発現が、胚後腎間葉のレベルに増加した。さらに、複数の転写因子、例えば、Ｗｔ１／Ｐａｘ２およびＳａｌｌ１／Ｓｉｘ２の単一細胞での共在化（図２４Ｂ）と、誘導された球体でのＩｔｇａ８＋／Ｐｄｇｆｒａ−集団の存在（３０．８±２．４％、ｎ＝４）（図２４Ｃ）を確認した。つまり、尾部新生中胚葉から後腎ネフロン前駆細胞を誘導するプロトコルが確立できた。【００７５】
実施例６：マウスＥＳ細胞からの後腎ネフロン前駆細胞の誘導
ＥＳ細胞からの後腎ネフロン前駆細胞の誘導を行った。ＥＳ細胞からの後腎間充織の誘導の全体の工程の概要を図１に示し、各段階におけるシグネチャー遺伝子の発現を図２５に示す。中間中胚葉と後腎ネフロン前駆細胞の誘導を監視するために、上記したＯｓｒ１−ＧＦＰマウスから作成したＯｓｒ１−ＧＦＰ  ＥＳ細胞株を用いて、２日間、因子なしの無血清培地で培養して胚様体（ＥＢｓ）を作成した。ＥＢsを用いて、後腎ネフロン前駆細胞の作成を行った。次の２４時間、低濃度のアクチビンを添加して、胚性外胚葉マーカーＦｇｆ５の一過性の発現を誘導した。ＥＢｓはその後、Ｂｍｐ４と高濃度のＣＨＩＲで処理した（工程２）。４．５日では、尾部新生前駆体を表すＴ、ならびにＣｄｘ２およびＴｂｘ６の発現がアップレギュレートされた。その後、上記の胚後部中胚葉のためのプロトコルを完全に再現できた（図２２Ｃ、および図１の工程３〜５）。ｄａｙ８．５に収穫した誘導されたＥＢｓは、胚後腎間葉に匹敵するレベルで、後腎ネフロン前駆細胞に対する複数のシグネチャー遺伝子を発現していた（図２５）。免疫染色の結果は、多くの細胞が、Ｏｓｒ１、Ｗｔ１、Ｐａｘ２、Ｓａｌｌ１およびＳｉｘ２を含む典型的な腎性転写因子を共発現していることを示した（図２６）。さらに、ＦＡＣＳ分析の結果は、細胞の約９０％近くがＯｓｒ１−ＧＦＰ陽性であり、Ｏｓｒ１＋細胞の中でＩｔｇａ８＋／Ｐｄｇｆｒａ−前駆細胞は約６５％を構成することを示した（図２７）。これらの誘導された前駆細胞は、堅牢なコロニー形成を（２１．３±１．６９％、ｎ＝８）を示した。このことは、ＥＳ細胞から後腎ネフロン前駆細胞を生成することに成功したことを示している。【００７６】
実施例７：ＥＳ細胞を用いた三次元腎臓構造の形成
Ｅ１１．５胚からの後腎間葉は、気液界面にて胚脊髄またはＷｎｔ４発現細胞と共培養したとき、間葉上皮転換し、糸球体および尿細管を形成することが十分に確立されている（非特許文献８：Kispertら、Development 125, 4225-4234, 1998）。Ｅ１１．５胚を用いて作成した糸球体および尿細管を図２８Ａに示す。そこで、実施例６で誘導したＥＢｓを同様の方法で培養したところ、しっかりとした尿細管形成が確認された。結果を図２８ＣおよびＤに示す。特に、ｄａｙ６で収穫したＥＢｓの組織学的検査では、いずれの条件でも多くの管形成が認められ（図２８ＣとＤ）、これはＥ−カドヘリン染色によって確認された（図２８Ｅ）。管のほとんどは、Ｐａｘ２とＳａｌｌ１陽性であり、腎尿細管であることを示している（図２８Ｅ〜Ｈ、Ｌ〜Ｐ）。いくつかの尿細管は、近位尿細管のマーカーである、例えば、ＬＴＬまたはカドヘリン６、アクアポリン１、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｍｅｇａｌｉｎなどを発現していた（図２８Ｆ、Ｇ、Ｌ〜Ｎ）。他の尿細管は、遠位尿細管の形成を示すＥ−カドヘリン、Ｂｒｎ１，ＮＣＣを発現していた（図２８Ｈ、Ｏ、Ｐ）。さらに素晴らしいことに、多数の糸球体様構造が観察された（図２８Ｃおよび２８Ｉ〜２８Ｋ）。これらの構造は、核に典型的な糸球体上皮細胞マーカーであるＷｔ１を発現する細胞のクラスターで、ネフリンやポドシンなどの足突起タンパク質も発現していた。これらの構造は、胚後腎間葉のものと区別できなかった（図２８ＢおよびＤ、ｎ＝６）。【００７７】
さらに、ＤｓＲｅｄを恒常的に発現する別のＥＳ細胞株を使用し、免疫不全マウスの腎臓被膜下に、誘導したＥＢｓを胎児脊髄とともに移植した（図２９ＱおよびＲ）。１週間後に採取したところ、インビトロ培養と似た多数の尿細管形成を確認した（図２９ＳおよびＴ）。さらには、多くの血管が、移植組織中へと、最も顕著にはＥＳ細胞由来の糸球体へと侵入していた（図２９Ｑ、２９Ｕ〜２９Ｗ）。これらの糸球体は実際に血管誘導因子である、ＶｅｇｆａやＥｆｎｂ２を発現していることも確認された（図２９ＸおよびＹ）。それらはＤｓＲｅｄ陰性であるので一体化した血管は宿主動物から由来し、このことは、移植した糸球体が、濾過装置としての糸球体機能に必須の要件である宿主の血液循環に連結されていることを示している。
【００７８】
実施例８：ヒトｉＰＳ細胞からの後腎ネフロン前駆細胞の誘導
上記のマウスＥＳ細胞に用いたプロトコルをヒトｉＰＳ細胞に適用し、インビトロで、ｉＰＳ細胞を後腎ネフロン前駆細胞に向かって分化させた。ｉＰＳ細胞からの後腎間葉の誘導の全体の工程の概要を図２に示した。以前の報告では、ヒト多能性幹細胞において、中胚葉系譜の細胞の初期誘導のためには、Ｂｍｐ、Ｆｇｆおよびアクチビンのシグナルが重要であることが示されている（非特許文献１９：Bernardら、Cell Stem Cell 9, 144-155, 2011; 非特許文献２０：Kattmanら、Cell stem cell 8, 228-240, 2011; 非特許文献２１：Yuら、Cell Stem Cell 8, 326-334, 2011）。したがって、ヒトｉＰＳ細胞凝集体を、最初の２４時間Ｂｍｐで処理し、次いで、２日間アクチビンおよびＦｇｆで処理した。誘導された中胚葉細胞をさらに、マウスＥＳ細胞の誘導と同様に、高濃度のＷｎｔアゴニスト（ＣＨＩＲ  １０μＭ）およびＢｍｐの存在下で、後方化しつつ未熟な中胚葉状態に維持した。ヒト胚における体幹伸長のための生理的期間を考え、これらの培養条件下で６日間ＥＢｓを培養した。その後、単に培養期間を調整することにより、マウスＥＳ細胞の分化のためのプロトコルを完全に再現した。１４日目に採取した誘導ＥＢｓは、後腎ネフロン前駆細胞の複数のシグネチャー遺伝子を発現していた（図３０）。免疫染色の結果、多くの細胞が、Ｗｔ１、Ｐａｘ２、Ｓａｌｌ１およびＳｉｘ２を含む代表的な腎性転写因子を共発現していることが明らかなった（図３１）。これらの誘導前駆細胞は、マウス胚脊髄と共培養すると、堅牢な尿細管形成および糸球体上皮細胞の形成を示した（図３２ＤとＥ、ｎ＝６）。１０日目での免疫組織化学的検査の結果は、十分に特定されたネフロン成分の形成を明らかにした。これらの構造は、Ｗｔ１／ネフリン（Ｎｅｐｈｒｉｎ）陽性糸球体（図３２Ｋ、３２Ｊ）、カドヘリン６（ｃｄｈ６）陽性近位尿細管（図３２Ｈ）およびＥ−カドヘリン陽性遠位尿細管（図３２Ｉ）で構成され、それらの全てがその順で連結されており、それによってヒト胎児腎臓形成を再現していた。
以上のように、インビボでの発生過程を反復することにより、インビトロで、マウスおよびヒト多能性幹細胞の両方から真正な後腎ネフロン前駆体および三次元腎臓構造の誘導に成功した（図３３）。【００７９】
上記の記載は、本発明の目的及び対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明によれば、多能性幹細胞、例えばＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を後腎ネフロン前駆細胞に分化誘導できる。また、本発明を、多能性幹細胞よりの三次元腎臓構造の形成においてその一部の工程として用いることができる。従って、本発明は、多能性幹細胞から腎臓への分化誘導を利用する、研究および再生医療において有用なものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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