(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板、該基板上に形成されたマイクロ流路、該マイクロ流路内に形成されたナノワイヤを含み、前記ナノワイヤの一部が、前記マイクロ流路内に埋め込まれている生体分子抽出用チップ。
【請求項２】
前記ナノワイヤの表面が、プラスに帯電している請求項１に記載の生体分子抽出用チップ。
【請求項３】
前記ナノワイヤの表面が、核酸の等電点より低い等電点の材料で形成されている請求項１に記載の生体分子抽出用チップ。
【請求項４】
前記マイクロ流路の一端にサンプル投入部、他端に残渣又はサンプル回収部が形成され、前記サンプル投入部及び前記残渣又はサンプル回収部の間に前記ナノワイヤが形成されている請求項１〜３の何れか一項に記載の生体分子抽出用チップ。
【請求項５】
転写することでマイクロ流路を形成するための段差を基板上に形成する工程、
前記段差上にナノワイヤを成長させ、鋳型を作製する工程、
前記鋳型を生体分子抽出用チップの基板に転写する工程、
生体分子抽出用チップのマイクロ流路内に埋め込まれたナノワイヤを成長させる工程、
を含む、ナノワイヤの一部が、前記マイクロ流路内に埋め込まれている生体分子抽出用チップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子抽出用チップ、及び生体分子抽出用チップの製造方法に関する。特に、生体分子抽出用チップのマイクロ流路内に形成されたナノワイヤの一部が、前記マイクロ流路内に埋め込まれていることで、サンプルの流入速度を速くしても、ナノワイヤがマイクロ流路から剥離せず、効率的に生体分子を抽出することができる生体分子抽出用チップ、及び生体分子抽出用チップの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
エクソソームは早期がん・疾病診断の新規バイオマーカーであるｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ；以下、「ｍｉＲＮＡ」と記載することがある。）を内包しており、体液中や培養上清液中のエクソソームに内包されるｍｉＲＮＡ解析が盛んに行われている。エクソソーム由来ｍｉＲＮＡの解析による効果的な未知のバイオマーカー探索や低侵襲診断を行うためには、少ないサンプルから効率的なエクソソームの抽出、つまり、少ない溶液量から得られる情報量の多さが重要である。【０００３】
既存のエクソソーム分離手法には、超遠心分離法や、凝集試薬法などが知られている。最も一般的に用いられている超遠心分離法は、数１０ｍＬのサンプル量及び４〜５時間の分離時間が必要であり、また、回収率も５〜２５％程度で効率的にエクソソームを分離することが難しいという問題がある。【０００４】
一方、凝集試薬法では、対象サンプルに凝集試薬を滴下し静置する簡便な手法ではあるが、分離には長時間の静置（０．５時間〜１晩）が必要であり、また、遠心機の使用、粒径の変化や粒子数の減少、マーカータンパク量の減少が生じること等の問題点がある。【０００５】
上記問題点を解決するため、本発明者らは、チップのマイクロ流路内に形成したナノワイヤを用いて、少量の体液や培養上清液からエクソソームをナノワイヤに吸着させることで、エクソソーム由来ｍｉＲＮＡを高効率に抽出する方法を発表している（非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓ．  Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，“ＮＡＮＯＷＩＲＥ  ＤＥＶＩＣＥＳ  ＦＯＲ  ＥＸＯＳＯＭＡＬ  ＭＩＣＲＯＲＮＡ  ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ”，  １７ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２７−３１  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１３，  Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，ＧＥＲＭＡＮＹ，要旨集  ｐ１８８７−１８９９
【非特許文献２】Ｓｕ  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｄｅｒｅｄ  ＺｎＯ  ｎａｎｏｗｉｒｅ  ａｒｒａｙｓ  ｏｎ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ”，  Ｊ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｃｈｅｍ．，  ２０１０，  ２０，  １０６０６−１０６１０
【非特許文献３】Ｊｕｎｇ  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｎａｎｏｗｉｒｅ−ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｆａｃｉｌｅ  ａｎｄ  ｒｅａｇｅｎｔ−ｆｒｅｅ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ”，  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，２０１２，  １２，  ２９１４−２９２１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、非特許文献１に記載されているチップは、マイクロ流路内の表面からナノワイヤを成長させている。したがって、サンプル回収のスループットを向上させるためにサンプルの投入速度を速くすると、ナノワイヤがマイクロ流路表面から剥離してしまうという問題がある。【０００８】
ところで、太陽電池、ＬＥＤ（ｌｉｇｈｔ  ｅｍｉｔｔｉｎｇ  ｄｉｏｄｅ）、ＵＶ（ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ）レザー等のチップに用いられるＺｎＯナノワイヤを効率よく複製するため、図１に示すように、（１）基板表面から成長したナノワイヤを埋め込むように樹脂Ｉを充填し、（２）基板表面から樹脂を剥離することで、ナノワイヤが埋め込まれた樹脂層Ｉを作製し、（３）該樹脂層Ｉに埋め込まれたナノワイヤを成長させ、（４）樹脂層Ｉの表面から成長したナノワイヤを埋め込むように樹脂ＩＩを充填し、（５）樹脂層Ｉの表面からナノワイヤを破断するようにして樹脂ＩＩを剥離することで、ナノワイヤが埋め込まれた樹脂層Ｉ及び樹脂層ＩＩを作製し、（６）前記樹脂層Ｉ及び樹脂層ＩＩを用いて上記（３）〜（５）の手順を繰り返す、という工程により、ナノワイヤの一部が埋め込まれた樹脂を効率的に生産する方法が知られている（非特許文献２参照）。【０００９】
しかしながら、上記非特許文献２に記載されている方法は、ナノワイヤの一部が埋め込まれた樹脂を基に、倍々でナノワイヤの一部が埋め込まれた樹脂を生産するためのものである。したがって、上記工程「（５）樹脂層Ｉの表面からナノワイヤを破断するようにして樹脂ＩＩを剥離することで、ナノワイヤが埋め込まれた樹脂層Ｉ及び樹脂層ＩＩを作製し」の際には、得られた２つの「樹脂層Ｉ」及び「樹脂層ＩＩ」の表面は同じ形にすること、つまり、平面にする必要がある。そのため、非特許文献２に記載されている方法では、マイクロ流路等を設計し、且つマイクロ流路内にナノワイヤの一部を埋め込むことは難しいという問題がある。【００１０】
本発明は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、電子線リソグラフィとフォトリソグラフィの技術を駆使することで段差部分を含む基板を作製し、当該段差部分にナノワイヤが成長した基板を鋳型にして生体分子抽出用チップの基板に転写すると、段差部分がマイクロ流路となり、且つ、転写したナノワイヤの一部がマイクロ流路内に埋め込まれ、そして埋め込まれたナノワイヤを成長させることで、ナノワイヤの一部がマイクロ流路内に埋め込まれた生体分子抽出用チップを作製できることを新たに見出し、本発明を完成した。【００１１】
すなわち、本発明の目的は、マイクロ流路内に形成されたナノワイヤの一部が、前記マイクロ流路内に埋め込まれている生体分子抽出用チップ（以下、「チップ」と記載することがある。）、及び該チップの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、以下に示す、チップ、及び該チップの製造方法に関する。【００１３】
（１）基板、該基板上に形成されたマイクロ流路、該マイクロ流路内に形成されたナノワイヤを含み、前記ナノワイヤの一部が、前記マイクロ流路内に埋め込まれている生体分子抽出用チップ。
（２）前記ナノワイヤの表面が、プラスに帯電している上記（１）に記載の生体分子抽出用チップ。
（３）前記ナノワイヤの表面が、核酸の等電点より低い等電点の材料で形成されている上記（１）に記載の生体分子抽出用チップ。
（４）前記マイクロ流路の一端にサンプル投入部、他端に残渣又はサンプル回収部が形成され、前記サンプル投入部及び前記残渣又はサンプル回収部の間に前記ナノワイヤが形成されている上記（１）〜（３）の何れか一に記載の生体分子抽出用チップ。
（５）転写することでマイクロ流路を形成するための段差を基板上に形成する工程、
前記段差上にナノワイヤを成長させ、鋳型を作製する工程、
前記鋳型を生体分子抽出用チップの基板に転写する工程、
生体分子抽出用チップのマイクロ流路内に埋め込まれたナノワイヤを成長させる工程、
を含む、ナノワイヤの一部が、前記マイクロ流路内に埋め込まれている生体分子抽出用チップの製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のチップは、マイクロ流路内に形成されたナノワイヤの一部が、前記マイクロ流路内に埋め込まれているので、サンプルの流入速度を速くしても、ナノワイヤがマイクロ流路から剥離し難くなる。したがって、生体分子の抽出時間を短縮することができる。【００１５】
また、本発明のチップの製造には、電子線リソグラフィとフォトリソグラフィの技術を用いて作製した段差部分を含む基板を鋳型として用いている。したがって、段差部分、つまり、転写後のマイクロ流路の幅及び深さ等の形状、並びに本数等を任意に設計することができる。【００１６】
更に、本発明のチップの製造方法に用いる鋳型の段差部分には、繰り返しナノワイヤを成長させることができる。したがって、同一の鋳型を用いて、チップを繰り返し製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、従来技術であって、ナノワイヤの一部が埋め込まれた樹脂を効率的に生産する方法を示す図である。
【図２】図２は、本発明のチップ１の一例を示す図である。
【図３】図３は、本発明のチップ１の作製工程の一例を示す図である。
【図４】図４は、図面代用写真で、図４（１）は実施例１において鋳型である基板１１の段差１４上で成長したナノワイヤの電界放射型走査電子顕微鏡（Ｆｉｅｌｄ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＦＥＳＥＭ）写真、図４（２）は図４（１）を拡大した写真である。
【図５】図５は、図面代用写真で、図５（１）は実施例１においてポリジメチルシロキサン２を剥離した後の鋳型である基板１１の段差１４のＦＥＳＥＭ写真、図５（２）は図５（１）を拡大した写真である。
【図６】図６は、図面代用写真で、図６（１）は実施例１において鋳型を転写した後のポリジメチルシロキサン２のマイクロ流路３のＦＥＳＥＭ写真、図６（２）は図６（１）を拡大した写真である。
【図７】図７は、図面代用写真で、図７（１）は実施例１においてポリジメチルシロキサン２を剥離した後に、ナノワイヤ１７を３．５時間成長させた後のマイクロ流路３のＦＥＳＥＭ写真、図７（２）及び（３）は図７（１）を拡大した写真である。
【図８】図８は、図面代用写真で、図８（１）は実施例１においてポリジメチルシロキサン２を剥離した後に、ナノワイヤ１７を１０時間成長させた後のマイクロ流路３のＦＥＳＥＭ写真、図８（２）は図８（１）を拡大した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に、マイクロ流路内に形成されたナノワイヤの一部が、前記マイクロ流路内に埋め込まれている生体分子抽出用チップ、及び該チップの製造方法について詳しく説明する。なお、本発明において「ナノワイヤの一部が、マイクロ流路内に埋め込まれている」とは、少なくとも、ナノワイヤを成長させるための核となる粒子又は触媒が、マイクロ流路内の表面に載っているのではなく、マイクロ流路の内部の内壁に埋め込まれていることを意味する。
【００１９】
図２は、本発明のチップの一例を示している。図２に示すチップ１は、基板２、基板２上に形成されたマイクロ流路３、マイクロ流路３の一端に形成されたサンプル投入部４、マイクロ流路３の他端に形成された残渣又はサンプル回収部５を含んでいる。そして、サンプル投入部４及び残渣又はサンプル回収部５の間の流路内（図中の点線部分）に、一部が流路内に埋め込まれたナノワイヤが設けられている。なお、マイクロ流路３にサンプルを直接投入し、また、残渣又はサンプルをマイクロ流路３から直接回収する場合は、サンプル投入部４及び残渣又はサンプル回収部５を設けなくてもよい。
【００２０】
本発明のチップ１を用いて、例えば、エクソソームを分離する場合は、シリンジポンプ等を用いてエクソソームを含有するサンプル溶液（培養液、血清・尿等の体液など）をサンプル投入部４から送液し、残渣又はサンプル回収部５からサンプルを分離後の溶液を回収する。そして、サンプル溶液を流し終わった後は、ナノワイヤに吸着したエクソソームを分析すればよい。エクソソームはマイナスに帯電しているので、ナノワイヤの表面はプラスに帯電していることが望ましく、例えば、ＺｎＯナノワイヤ、酸化ニッケル等のプラスに帯電する材料で被覆層を形成したナノワイヤを用いればよい。また、表面がプラスに帯電しているナノワイヤを用いる場合、回収部がマイナスとなるように電場をかけることで、プラスに帯電するタンパク質等の生体分子を抽出することができる。
【００２１】
また、本発明のチップ１を用いて、例えば、細胞、ウイルス、菌から選ばれるサンプルから核酸を抽出する場合は、サンプルを懸濁した懸濁液をサンプル投入部４に投入する。なお、細胞、ウイルス、菌の具体例としては、細胞としては細胞膜構造を有するものが挙げられ、ブドウ球菌、枯草菌、大腸菌、サルモネラ菌、緑膿菌、コレラ菌、赤痢菌、炭疽菌、結核菌、ボツリヌス菌、破傷風菌、レンサ球菌等の細菌類、顆粒球、リンパ球、網赤血球、赤血球、白血球、血小板等の血球細胞、等が挙げられる。ウイルスとしては、ノロウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ等が挙げられる。菌としてはキノコ、カビ、酵母などが挙げられ、具体的には、白癬菌、カンジダ、アスペルギルス、出願酵母等が挙げられる。また、エクソソーム以外にも、ミトコンドリア、細胞外小嚢もサンプルとして挙げられる。
【００２２】
そして、サンプル投入部４をマイナス、残渣又はサンプル回収部５をプラスとなるように電場を印加することで、ナノワイヤでサンプルを破砕し、残渣又はサンプル回収部５から伸長した核酸を回収することができる。なお、本発明のチップ１を用いて核酸を回収する場合は、サンプル投入部４とマイクロ流路３のナノワイヤを設けた部分（図１中の点線部分）の間に、他端に残渣取出部を有するマイクロ流路を接続し、残渣又はサンプル回収部５からは核酸を取り出し、残渣取出部からは破砕した細胞の残渣を取り出せるようにしてもよい。核酸を抽出する場合、ナノワイヤの表面は細胞等の孔から漏出した核酸が静電的相互作用によりナノワイヤに吸着しない方が好ましいことから、ナノワイヤの表面は核酸の等電点より低い等電点の材料から形成されることが好ましい。後述するように、ナノワイヤを成長後、ナノワイヤ表面をＳｉＯ2、ＴｉＯ2等の材料で被覆すればよい。
【００２３】
本発明のチップ１は公知の分析装置に組み込むことで分析装置を構成することができる。また、公知の分析装置と併用することで、抽出した生体分子をそのまま分析することもできる。更に、チップ１に抽出した生体分子を分析する分析部を形成してもよい。例えば、本発明のチップ１を用いて核酸を抽出する場合、サンプルから抽出した核酸はナノワイヤ間を流れる際に伸長することから、
（１）チップ１を公知の核酸シークエンサーに組み込める形状とすることで、核酸の抽出と核酸配列の解析を一つの装置で実施することができる。
（２）伸長した核酸を、別途核酸シークエンサーに導入することで核酸配列を解析できる。
（３）チップ１に更に核酸の分析を行う電極等の分析部を形成することで、核酸の抽出と核酸配列の解析を一つの装置で実施できる新たな分析装置を作製することができる。
【００２４】
本発明のチップ１は、電子線リソグラフィ及びフォトリソグラフィ技術を用いて作製した鋳型を樹脂等に転写し、転写した樹脂等に埋め込まれたナノワイヤを更に成長させることで製造することができる。図３は、本発明のチップ１の作製工程の一例を示している。
【００２５】
（１）鋳型用の基板１１上にＣｒ層１２をスパッタで堆積する。
（２）ポジ型フォトレジスト１３をスピンコータで塗布する。次いで、転写した際にチップ１のマイクロ流路３に相当するパターンをフォトリソグラフィにより作製する。
（３）Ｃｒエッチャント液にてマイクロ流路３に相当するパターン以外のＣｒ層１２をエッチングする。
（４）基板１１のみを選択的にエッチングする手法によりにより、マイクロ流路３に相当するパターン以外の基板１１をエッチングして、マイクロ流路３に相当する段差１４を形成する。段差１４の深さを調整することで、マイクロ流路３の深さを調整することができる。
（５）Ｃｒエッチャント液にて、段差１４上のＣｒ層１２及びポジ型フォトレジスト１３をエッチングする。
（６）基板１１上に、ナノワイヤ作製用の粒子又は触媒１５をパルスレーザーデポジッション（ＰＬＤ）で塗布する。
（７）Ｏ2プラズマを実施後、電子線リソグラフィ用のレジスト１６を塗布し、段差１４上でナノワイヤを成長させる場所を電子線リソグラフィで描画する。電子線リソグラフィの描画は、ナノワイヤを成長させたいパターンで形成すればよく、所定間隔でナノワイヤを成長させる場合は所定間隔のドット、ナノワイヤをランダムに成長させたい場合は段差１４上の任意の箇所からナノワイヤが成長できるように段差１４上の全てを描画すればよい。電子線リソグラフィで描画した後は、レジストを現像・除去する。
（８）レジストが除去され、粒子又は触媒１５が露出した場所からナノワイヤ１７を成長させ、本発明のチップ１の製造に用いる鋳型を作製する。
（９）チップ１の基板２用の材料を、鋳型に塗布する。
（１０）基板２を鋳型から剥離することで、マイクロ流路３内にナノワイヤ１７の一部が埋め込まれたチップ１を形成する。
（１１）マイクロ流路３内に埋め込まれたナノワイヤ１７を更に成長させる。ナノワイヤ１７の成長後、サンプル投入部４、残渣又はサンプル回収部５、必要に応じて残渣取出部を形成する。なお、サンプル投入部４、残渣又はサンプル回収部５及び残渣取出部は、フォトリソグラフィでマイクロ流路３を設計する時に同時に設計し、転写により形成してもよい。
【００２６】
チップ１を複数製造する場合は、上記工程で作製した鋳型を用いて、上記の（８）〜（１１）の工程を繰り返せばよい。なお、上記の工程は単にチップ１の製造工程の一例を示したもので、基板１１上に段差１４を形成し、段差１４上に成長させたナノワイヤ１７をチップ１の基板２に転写することで、チップ１のマイクロ流路３内にナノワイヤ１７の一部を埋め込むことができれば特に制限は無い。
【００２７】
上記工程において、鋳型用の基板１１としては、エッチングにより段差１４が形成できるものであれば特に制限はない。例えば、ドライエッチングで段差１４を形成する場合は、シリコン、石英ガラス、パイレックス（登録商標）ガラス等が挙げられる。
【００２８】
また、ウェットエッチングにより段差１４を形成する場合も、ドライエッチングと同様、シリコン、石英ガラス、パイレックス（登録商標）ガラス等を用いればよい。
【００２９】
ポジ型フォトレジスト１３としては、ＴＳＭＲ  Ｖ５０、ＰＭＥＲ等、半導体製造分野で一般的に使用されているものであれば特に制限はない。また、ポジ型に代え、ネガティブ型のフォトレジストを用いてもよく、ＳＵ−８、ＫＭＰＲ等、半導体製造分野で一般的に使用されているものであれば特に制限はない。
【００３０】
Ｃｒ層１２のエッチャント液は、Ｈ2Ｏ：Ｃｅ（ＮＨ4）2（ＮＯ3）6：ＨＣｌＯ4等、Ｃｒをエッチングできるものであれば特に制限はない。また、本発明はＣｒに限定されるのではなく、Ｃｒ以外の材料を堆積し、該材料をエッチングできるエッチャント液と組み合わせて用いてもよい。
【００３１】
基板１１のみを選択的にエッチングする手法として、基板１１をドライエッチングする場合は、六フッ化硫黄（ＳＦ6）、四フッ化炭素（ＣＦ4）、トリフルオロメタン（ＣＨＦ3）等の公知のドライエッチング用のガスを用いればよい。また、基板１１をウェットエッチングする場合、基板１１がガラスの場合はフッ化水素（ＨＦ）、シリコンの場合は水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）等を用いればよい。
【００３２】
ナノワイヤ１７作製用の粒子１５としては、例えば、ＺｎＯが挙げられる。また、ナノワイヤ１７作製用の触媒１５としては、例えば、金、プラチナ、アルミニウム、銅、鉄、コバルト、銀、錫、インジウム、亜鉛、ガリウム等が挙げられる。
【００３３】
電子線リソグラフィ用のレジスト１６としては、ＺＥＰ５２０、ＰＭＭＡ等、半導体分野で一般的に用いられているものであれば特に制限はない。また、レジストの除去液としては、ジメチルホルムアミドとアセトン等、半導体分野で一般的な除去液であれば特に制限はない。
【００３４】
段差１４上において、ナノワイヤ１７は、粒子又は触媒１５から公知の方法で成長させればよい。例えば、粒子１５としてＺｎＯ微粒子を用いた場合は、非特許文献３に記載されている水熱合成方法を用いて作製することができる。具体的には、硝酸亜鉛六水和物（Ｚｎ（ＮＯ3）2・６Ｈ2Ｏ）、ヘキサメチレンテトラミン（Ｃ6Ｈ12Ｎ4）を脱イオン水に溶解した前駆体溶液に、加熱した基板１１を浸漬させることで、段差１４のＺｎＯ粒子１５が露出している部分から、ＺｎＯナノワイヤ１７を成長させることができる。
【００３５】
触媒１５を用いる場合は、次の工程でナノワイヤ１７を作製することができる。
（ａ）ＳｉＯ2、Ｌｉ2Ｏ、ＭｇＯ、Ａｌ2Ｏ3、ＣａＯ、ＴｉＯ2、Ｍｎ2Ｏ3、Ｆｅ2Ｏ3、ＣｏＯ、ＮｉＯ、ＣｕＯ、ＺｎＯ、Ｇａ2Ｏ3、ＳｒＯ、Ｉｎ2Ｏ3、ＳｎＯ2、Ｓｍ2Ｏ3、ＥｕＯ等の材料を用い、パルスレーザーデポジション、ＶＬＳ（Ｖａｐｏｒ−Ｌｉｑｕｉｄ−Ｓｏｌｉｄ）法等の物理蒸着法でコアナノワイヤを形成する。
（ｂ）ＳｉＯ2、ＴｉＯ2等を用い、スパッタリング、ＥＢ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｂｅａｍ）蒸着、ＰＶＤ（Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｖａｐｏｒ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）、ＡＬＤ（Ａｔｏｍｉｃ  Ｌａｙｅｒ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）等の一般的な蒸着法により、コアナノワイヤの周囲に被覆層を形成する。なお、段差１４上で触媒１５を用いてナノワイヤを成長する場合、上記（ｂ）の被覆層は必須ではなく、コアナノワイヤのみを成長させ転写させてもよい。
【００３６】
本発明では、段差１４上で成長させるナノワイヤ１７の長さに応じて、転写後のマイクロ流路３内に埋め込まれるナノワイヤの長さが決まる。したがって、サンプル流入速度を速くしたい場合は、埋め込まれるナノワイヤの長さが長くなるように、段差１４上でのナノワイヤ１７の成長を適宜調整すればよい。なお、例えば、段差１４上の電子線リソグラフィ用レジスト１６を全て描画した場合は、ナノワイヤ作製用の粒子又は触媒１５が段差１４上に露出した状態になる。この状態でチップ１を作製するための基板２に転写すると、段差１４上の粒子又は触媒１５の少なくとも１部がマイクロ流路３内に埋め込まれるように転写される。この埋め込まれた粒子又は触媒１５からナノワイヤ１７を成長させることで、一部がマイクロ流路３内に埋め込まれたナノワイヤ１７を作製することもできる。
【００３７】
本発明のチップ１を作製するための基板２としては、鋳型を転写できるものであれば特に制限はない。例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ＡＢＳ（アクリロニトリルブタジエンスチレン）樹脂、ＡＳ（アクリロニトリルスチレン）樹脂、アクリル樹脂（ＰＭＭＡ）等の熱可塑性樹脂；フェノール樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、尿素樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、アルキド樹脂、ポリウレタン、熱硬化性ポリイミド、シリコーンゴム等の熱硬化性樹脂が挙げられる。なお、チップ１をそのまま使用して目的とする生体分子を分析する場合は光透過性があり生体分子と非親和性の樹脂が望ましく、例えば、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、硬質ポリエチレン製等のプラスチック、シリコン等が挙げられる。
【００３８】
基板２を剥離後のマイクロ流路３に埋め込まれたナノワイヤ１７の成長は、上記と同様の手順で行えばよい。なお、触媒１５を用いてナノワイヤ１７を成長させる場合、ナノワイヤ１７は、分岐鎖を有していなくてもよいし、分岐鎖を有していてもよい。
【００３９】
マイクロ流路３内で成長させるナノワイヤ１７の直径は、目的に応じて適宜調整すればよい。例えば、エクソソームを吸着させる場合は、あまり細すぎるとエクソソームを破壊する恐れがあることから、エクソソームより大きくすればよく、例えば、１００ｎｍ以上とすればよい。また、細胞等を破砕する場合は、破砕する目的である細胞、ウイルス、菌等の大きさ、細胞膜又は細胞壁の強度等に応じて直径を変えればよく、例えば、原核細胞は１μｍ〜１０μｍ、真核細胞は５μｍ〜１０μｍ、ウイルスは数１０ｎｍ〜数１００ｎｍ、血球細胞は７μｍ〜１５μｍの大きさであることから、ナノワイヤの直径は、１０ｎｍ以上、１５ｎｍ以上、２０ｎｍ以上、又は２５ｎｍ以上であってもよい。また、ナノワイヤの直径は、破砕する目的である細胞等よりは小さい必要があり、例えば、２００ｎｍ以下、１５０ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、９０ｎｍ以下、８０ｎｍ以下、７０ｎｍ以下、６０ｎｍ以下、又は５０ｎｍ以下であってもよい。
【００４０】
ナノワイヤ１７の直径は、粒子１５を用いて形成する場合は、段差１４に塗布する粒子のサイズを変更する、または、作製したナノワイヤ１７に被覆層を形成することで適宜調整することができる。被覆層は、触媒１５を用いた場合の被覆層と同じ材料及び被覆方法で形成されてもよく、蒸着時間を適宜調整すればよい。また、触媒１５を用いて成長させる場合も、被覆層を形成する際の蒸着時間を変えることで直径を適宜調整することができる。
【００４１】
ナノワイヤ１７の長さは、マイクロ流路３の深さ等を考慮して、適宜調整すればよい。ナノワイヤ１７の長さは、粒子１５を用いて形成する場合は、前駆体溶液への浸漬時間を変えることで調整することができる。また、触媒１５を用いて形成する場合は、コアナノワイヤを形成した後のＶＬＳによる成長時間を変えることで適宜調整することができる。
【００４２】
チップ１に形成するマイクロ流路３の深さ及び幅は特に制限は無く、目的とする生体分子に併せて調整すればよいが、マイクロ流路３の空間体積を小さくし過ぎると圧力損失が大きくなるので、例えば、深さ及び幅を１μｍ以上としてもよい。また、チップ１に形成するマイクロ流路３の本数も特に制限は無く、チップ１上に複数のマイクロ流路３を設けてもよい。マイクロ流路３の幅、深さは、段差１４の幅及び高さで調整することができ、マイクロ流路３の本数は、段差１４の本数で調整することができる。
【００４３】
サンプル投入部４、残渣又はサンプル回収部５、残渣取出部をマイクロ流路３と一緒に設計しない場合は、鋳型を基板２に転写後に、生検トレパン、超音波ドリル等を用いて形成すればよい。
【００４４】
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
【実施例】
【００４５】
＜実施例１＞
〔チップの作製〕
本発明のチップは以下の手順により作製した。
（１）ＲＦ（ｒａｄｉｏ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）スパッタ装置（ＳＶＣ−７００ＬＲＦ、Ｓａｎｙｕ  Ｄｅｎｓｈｉ）を用いて、シリコン（１１１）基板１１上（株式会社エレクトロニクスエンドマテリアルズコーポレーション）に８００ｎｍの厚さのＣｒ層１２を堆積させた。【００４６】
（２）ポジ型フォトレジスト１３（ＴＳＭＲ  Ｖ５０、Ｔｏｋｙｏ  Ｏｈｋａ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．）をスピンコータにより塗布した。その後、フォトリソグラフィにより幅約１ｍｍ、両端部に直径約２ｍｍの円を有する長さ約１１ｍｍのマイクロ流路３に相当するパターンを作製した。パターン作製後は、ＳＭＲ−Ｖ５０  ＥＬ（Ｔｏｋｙｏ  Ｏｈｋａ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．）でレジストを現像した。【００４７】
（３）Ｃｒエッチャント液（Ｈ２Ｏ：Ｃｅ（ＮＨ4）2（ＮＯ3）6：ＨＣｌＯ4＝８５：１０：５（質量％比））にて、マイクロ流路３に相当するパターン以外のシリコン上のＣｒ層をエッチングした。【００４８】
（４）反応性イオンエッチング装置（ＲＩＥ−１０ＮＲ、Ｓａｍｃｏ  Ｃｏ．）を用いてＣＦ4ガスにより、マイクロ流路３に相当するパターン以外の基板１１を深さ約１μｍエッチングした。【００４９】
（５）上記（３）と同様のＣｒエッチャント液を用いて、マイクロ流路３に相当するパターン上のＣｒ層１２及びポジ型フォトレジスト１３を除去することで、深さ約１μｍの段差１４（転写後のマイクロ流路３に相当）を作製した。【００５０】
（６）ＺｎＯペレット（純度４Ｎ、株式会社高純度化学研究所製）を用いて、シリコン基板１１上に、パルスレーザーデポジション装置（ＰＬＤ−ＹＡ−８６７０、湘南工業株式会社製）を用いて約１００ｎｍの厚さとなるように塗布した。【００５１】
（７）ポジ型電子線レジスト１６（ＺＥＰ５２０Ａ、Ｚｅｏｎ  Ｃｏｒｐ．）をスピンコータにより約５００ｎｍとなるように塗布した。次に、電子線リソグラフィ（ＳＰＧ−７２４、Ｓａｎｙｕ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏ．）により、ナノワイヤ１７を成長させるスポットのパターン（直径約５００ｎｍの円、任意のスポットと隣接するスポットの端部との間隔は約１μｍの格子状）を描画した。描画後、ＺＥＰ  ５２０  Ａ７を用いてポジ型電子線レジスト１６を現像してスポット部分のポジ型電子線レジスト１６を除去することで、段差１４上にＺｎＯ粒子層まで到達するスポットパターンを作製した。【００５２】
（８）硝酸亜鉛六水和物（Ｚｎ（ＮＯ3）2・６Ｈ2Ｏ、９８％、シグマ・アドリッチ社製）を０．０４４６１ｇ、ヘキサメチレンテトラミン（（Ｃ6Ｈ12Ｎ4）、９９＋％、シグマ・アドリッチ社製）を０．０２１０３ｇ、脱イオン水５０ｍＬに加えて、硝酸亜鉛六水和物とヘキサメチレンテトラミンが３ｍＭの前駆体溶液を作成した。次に、基板１１を前駆体溶液に入れ、９５°Ｃのオーブンに１０時間浸漬させることで、ＺｎＯ粒子層からナノワイヤ１７を成長させることで鋳型を作製した。図４（１）は、基板１１の段差１４上で成長したナノワイヤのＦＥＳＥＭ写真で、図４（２）は、図４（１）の写真を更に拡大した写真である。図４（１）及び（２）の写真から明らかなように、段差１４上のスポットからナノワイヤが上方に向かって成長していることが確認された。なお、図４（２）に示すナノワイヤの長さは、段差１４上のポジ型電子線レジスト１６の層から約２μｍであった。【００５３】
（９）チップ１の基板２となるポリジメチルシロキサン２（ＰＤＭＳ、Ｓｉｌｐｏｔ  １８４，  Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｔｏｒａｙ）は、プレポリマー（Ｓｉｌｐｏｔ  １８４，  Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｔｏｒａｙ）と硬化剤（Ｃａｔａｌｙｓｔ  Ｓｏｌｐｏｔ  １８４，  Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｔｏｒａｙ）を重量比１０：１で混合し、５分間静置後、真空中にて３０分間脱泡した。その後、作製したＰＤＭＳを上記（８）で作製した鋳型に流し込み、真空中にて１時間脱泡、７５℃で２時間加熱した。【００５４】
（１０）鋳型から上記（９）で流し込んだポリジメチルシロキサン２を手で剥離した。図５（１）は、ポリジメチルシロキサン２を剥離した後の基板１１の段差１４のＦＥＳＥＭ写真で、図５（２）は、図５（１）の写真を更に拡大した写真である。図５（１）及び（２）の写真から明らかなように、ポリジメチルシロキサン２を剥離した後のナノワイヤ１７は根元部分から切断されていた。一方、図６（１）は、鋳型が転写されたポリジメチルシロキサン２のマイクロ流路３部分のＦＥＳＥＭ写真で、図６（２）は、図６（１）の写真を更に拡大した写真である。図６（１）及び（２）の写真から明らかなように、ナノワイヤ１７の一部がマイクロ流路３内に包み込まれるように埋設されていた。【００５５】
（１１）上記工程（８）と同様の手順で、ポリジメチルシロキサン２に埋め込まれているナノワイヤ１７の断面から、更にナノワイヤ１７を成長させた。図７（１）は、３．５時間後のマイクロ流路３のＦＥＳＥＭ写真で、図７（２）及び（３）は、図７（１）の写真を更に拡大した写真である。図８（１）は、１０時間後のマイクロ流路３のＦＥＳＥＭ写真で、図８（２）は、図８（１）の写真を更に拡大した写真である。図６〜図８に示す写真から明らかなように、ポリジメチルシロキサン２のマイクロ流路３内に転写したナノワイヤ１７が更に成長したことが確認できた。なお、図８（２）に示す、個々のナノワイヤ１７の直径は約１００ｎｍであった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の生体分子抽出用チップは、ナノワイヤの一部がマイクロ流路内に埋め込まれていることから、サンプルの流入速度を速くしても、ナノワイヤがマイクロ流路から剥離し難くなる。したがって、サンプルから生体分子を抽出する速度を向上することができるので、医療機関、大学、企業、研究機関等において、生体分子迅速な抽出に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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