(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状菌を宿主とする変異体であって、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列：
（ａ）配列番号１又は３のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１又は３のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１又は３のアミノ酸配列と同一性が９０％以上であるアミノ酸配列；
で表されるタンパク質をコードする遺伝子であり、且つ多糖又はタンパク質を分解する加水分解酵素活性を抑制する遺伝子であるか、
あるいは以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれかの塩基配列：
（ｄ）配列番号２又は４の塩基配列；
（ｅ）配列番号２又は４の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列；
（ｆ）配列番号２又は４の塩基配列と同一性が９０％以上である塩基配列；
（ｇ）配列番号２又は４の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列；
で表される遺伝子であり、且つ多糖又はタンパク質を分解する加水分解酵素活性を抑制する遺伝子の機能が低下又は欠損する変異が導入されており、当該変異が前記アミノ酸配列における１８４位に相当するロイシンの欠失又は他のアミノ酸への置換である、変異体。
【請求項２】
前記他のアミノ酸がセリンである、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
前記宿主がアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）又はアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）に属する、請求項１又は２に記載の変異体。
【請求項４】
前記宿主と比較して多糖又はタンパク質を分解する加水分解酵素の活性が増大している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項５】
前記加水分解酵素が分泌型である、請求項４に記載の変異体。
【請求項６】
前記加水分解酵素がアルカリプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ、α−アミラーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ、キシラナーゼ及びマンナナーゼから成る群から選択される一種以上の酵素である、請求項４又は５に記載の変異体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の変異体を含む、当該変異体の培養物又はその抽出物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の変異体の製造方法であって、糸状菌宿主の以下の遺伝子：
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列：
（ａ）配列番号１又は３のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１又は３のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１又は３のアミノ酸配列と同一性が９０％以上であるアミノ酸配列；
で表されるタンパク質をコードする遺伝子であり、且つ多糖又はタンパク質を分解する加水分解酵素活性を抑制する遺伝子であるか、
あるいは以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれかの塩基配列：
（ｄ）配列番号２又は４の塩基配列；
（ｅ）配列番号２又は４の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列；
（ｆ）配列番号２又は４の塩基配列と同一性が９０％以上である塩基配列；
（ｇ）配列番号２又は４の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列；
で表される遺伝子であり、且つ多糖又はタンパク質を分解する加水分解酵素活性を抑制する遺伝子の機能を低下又は欠損させる変異を導入する工程を含み、当該変異が前記アミノ酸配列における１８４位に相当するロイシンの欠失又は他のアミノ酸への置換である、製造方法。
【請求項９】
請求項７に記載の培養物又はその抽出物の製造方法であって、請求項１〜６のいずれか１項に記載の変異体と植物性及び／又は動物性原料とを接触させる工程を含む、製造方法。
【請求項１０】
前記原料が大豆及び小麦を含む、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記培養物が麹又は諸味である、請求項９又は１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
有機性材料の加水分解産物の製造方法であって、請求項１〜６のいずれか１項に記載の変異体又は請求項７に記載の培養物又はその抽出物と有機性材料とを接触させる工程を含む、製造方法。
【請求項１３】
前記有機性材料が多糖又はタンパク質を含む、請求項１２に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、加水分解酵素活性が向上した糸状菌変異体等に関する。
【背景技術】
【０００２】
アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）及びアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）等の麹菌は、醤油、酒、味噌などの伝統的な食品醸造、酵素生産、及びバイオマス利用等のために工業的に広く用いられている。
【０００３】
日本の伝統食品である醤油の製造では、麹菌を原料である大豆と小麦に生育させて麹を作製し、麹に食塩水を加えて諸味とする。麹や諸味中では麹菌の破精込みによる物理的な作用と、麹菌が分泌する様々な加水分解酵素による酵素的な作用によって、原料の大豆や小麦のタンパク質、糖質、脂質が分解されて呈味成分であるアミノ酸、糖、及びグリセロール等を遊離する。この過程での原料分解が向上すると、原料利用率や圧搾性が上がり、生産性を向上させることができる。
【０００４】
上記のように、原料利用率や圧搾性が向上する麹菌の育種は、産業上極めて重要であり、これを目的とした育種が現在までに精力的に行われている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、加水分解酵素活性が向上し、延いては発酵諸味の粘度を低下させ、圧搾性を向上させることができる麹菌の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
担子菌類であるクリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ   Ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）に存在するｃｐｓ１遺伝子はヒアルロン酸合成酵素をコードする遺伝子として知られている（Ambrose Jongら、"Identification and Characterization of CPS1 as a Hyaluronic Acid Synthase Contributing to the Pathogenesis of Cryptococcus neoformans Infection", Eukaryot Cell. Aug 2007; 6(8): 1486-1496）。本発明者らは、驚くべきことに、糸状菌においてｃｐｓ１遺伝子と高い相同性を有する遺伝子を変異させることにより、加水分解酵素活性が増大し、延いては発酵諸味の粘度が低下し且つ圧搾性が向上する糸状菌変異体を取得できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明は、以下の各態様に係る。
［態様１］
糸状菌を宿主とする変異体であって、ｃｐｓ１遺伝子に対応する遺伝子の機能が低下又は欠損する変異が導入されている、変異体。
［態様２］
ｃｐｓ１遺伝子に対応する遺伝子が以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列：
（ａ）配列番号１又は３のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１又は３のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１又は３のアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列；
で表されるタンパク質をコードする遺伝子であるか、
あるいは以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれかの塩基配列：
（ｄ）配列番号２又は４の塩基配列；
（ｅ）配列番号２又は４の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列；
（ｆ）配列番号２又は４の塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列；
（ｇ）配列番号２又は４の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列；
で表される遺伝子であり、且つ加水分解酵素活性に関与する遺伝子である、態様１に記載の変異体。
［態様３］
前記アミノ酸配列において、１８４位に相当するロイシンが欠失又は他のアミノ酸に置換されている、態様２に記載の変異体。
［態様４］
前記他のアミノ酸がセリンである、態様３に記載の変異体。
［態様５］
ｃｐｓ１遺伝子に対応する遺伝子の一部又は全部が欠失している、態様１又は２に記載の変異体。
［態様６］
前記宿主がアスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼに属する、態様１〜５のいずれかに記載の変異体。
［態様７］
前記宿主と比較して加水分解酵素をコードする遺伝子の発現が亢進しているか、加水分解酵素活性が増大している、態様１〜６のいずれかに記載の変異体。
［態様８］
前記加水分解酵素が分泌型である、態様７に記載の変異体。
［態様９］
前記加水分解酵素が多糖又はタンパク質を加水分解する、態様７又は８に記載の変異体。
［態様１０］
前記加水分解酵素がアルカリプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ、α−アミラーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ、キシラナーゼ及びマンナナーゼから成る群から選択される一種以上の酵素である、態様７〜９ｎおいずれかに記載の変異体。
［態様１１］
態様１〜１０のいずれかに記載の変異体の培養物又はその抽出物。
［態様１２］
態様１〜１０のいずれかに記載の変異体の製造方法であって、糸状菌宿主のｃｐｓ１遺伝子に対応する遺伝子の機能を低下又は欠損させる工程を含む、製造方法。
［態様１３］
態様１１に記載の培養物又はその抽出物の製造方法であって、態様１〜１０のいずれかに記載の変異体と植物性及び／又は動物性原料とを接触させる工程を含む、製造方法。
［態様１４］
前記原料が大豆及び小麦を含む、態様１３に記載の製造方法。
［態様１５］
前記培養物が麹又は諸味である、態様１３又は１４に記載の製造方法。
［態様１６］
有機性材料の加水分解産物の製造方法であって、態様１〜１０のいずれかに記載の変異体又は態様１１に記載の培養物又はその抽出物と有機性材料とを接触させる工程を含む、製造方法。
［態様１７］
前記有機性材料が多糖又はタンパク質を含む、態様１６に記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、糸状菌におけるｃｐｓ１遺伝子に対応する遺伝子を変異させることにより、糸状菌の加水分解酵素活性、特に、菌体外に存在する加水分解酵素活性を顕著に向上させることができる。糸状菌はヒアルロン酸を合成せず、また、糸状菌における上記遺伝子はｃｐｓ１遺伝子との同一性が低いため、本発明者らは、ｃｐｓ１遺伝子に対応する遺伝子をＲｓｅＡ（Regulator of Secretory Enzymes Ａ）遺伝子と命名した。糸状菌において、ＲｓｅＡは膜に局在し、菌体外多糖の生合成に関与していると考えられる。
【０００９】
加水分解酵素活性の向上は、原料の加水分解工程が必要とされる醸造・発酵産業における生産性や効率性の増大に資する。醤油醸造においては酵素の添加や加水分解遺伝子の高発現によって分解効率の向上や粕の低減が報告されていることからも、本発明の変異体を諸味等の原料の分解工程に用いると、原料の分解率が向上したり、諸味からの自然だれによる液汁回収量が増加し、また、粕重量も減少するため有効であることが期待される（板倉辰六郎ら、"醤油の科学と技術" ｐ171-194、  北本則行ら、"セルラーゼ遺伝子高発現麹菌を用いた醤油粕の低減化",醤研Vol.33, No.1, 2007; 35-39）。特に、醸造においては、諸味粘度が高いと圧搾性が低下し歩留まりが低下するが、本変異体を用いることにより、諸味粘度を低下させ、圧搾性が向上した醸造法を提供することができる。しかしながら、本発明の変異体又はその培養物、又は培養物からの抽出物は、広く有機性材料の加水分解産物の製造方法に使用することができるため、その用途は食品分野に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は実施例１で行ったＲｓｅＡ＿Ｌ１８４Ｓ変異導入ベクターを用いた遺伝子相同組換えを模式的に表したものである。
【図２】図２はアスペルギルス・ソーヤの対照株とＲｓｅＡ＿Ｌ１８４Ｓ変異株とで各種酵素活性を比較した結果を示している。対照株の活性を１とした場合のＲｓｅＡ＿Ｌ１８４Ｓ変異株の相対値を示している。
【図３】図３は実施例３で行ったｒｓｅＡ遺伝子破壊ベクターを用いた遺伝子相同組換えを模式的に表したものである。
【図４】図４はアスペルギルス・ソーヤの対照株とｒｓｅＡ遺伝子破壊株とで各種酵素活性を比較した結果を示している。対照株の活性を１とした場合のｒｓｅＡ遺伝子破壊株の相対値を示している。
【図５】図５は糸状菌におけるＲｓｅＡのオーソログの系統樹を示したものである。カッコ内はアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１株のＲｓｅＡとのアミノ酸配列での相同性を示している。
【図６】図６はアスペルギルス・オリゼの対照株とＲｓｅＡ＿Ｌ１８４Ｓ変異株とで各種酵素活性を比較した結果を示している。対照株の活性を１とした場合のＲｓｅＡ＿Ｌ１８４Ｓ変異株の相対値を示している。
【図７】図７はアスペルギルス・オリゼの対照株とｒｓｅＡ遺伝子破壊株とで各種酵素活性を比較した結果を示している。対照株の活性を１とした場合のｒｓｅＡ遺伝子破壊株の相対値を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．糸状菌を宿主とする変異体及びその製法
本発明は、糸状菌を宿主とする変異体であって、ｃｐｓ１遺伝子に対応する遺伝子の機能が低下又は欠損する変異が導入されている変異体を提供する。クリプトコッカス・ネオフォルマンスで同定されたＣｐｓ１は、計算上５１．５ｋＤａの分子量を有する、莢膜の生合成に関与するタンパク質をコードすること、そして、そのアミノ酸配列は、高度に保存された領域として、例えば、Ｄ１３５にはＤＸＤモチーフ、Ｑ２７８にはＱＸＸＸＲＷモチーフを含むことが報告されている（Y. C. Chang et al., "CPS1, a Homolog of the Streptococcus pneumoniae Type 3 Polysaccharide Synthase Gene, Is Important for the Pathobiology of Cryptococcus neoformans", Infect Immun. Jul 2006; 74(7): 3930-3938）。Ｃｐｓ１と高い相同性を有するＲｓｅＡもＣｐｓ１と同様の構造的特徴を有している。また、ＲｓｅＡの予測分子量もＣｐｓ１の分子量と略同程度の５０．８ｋＤａである。本発明者らは、ＲｓｅＡがＧｌｙｃｏ＿ｔｒａｎｆ＿２＿３ファミリーのドメインを有していることや、一つの膜貫通領域を有する膜局在型のタンパク質をコードすることを確認している。これらの特徴から、ＲｓｅＡは膜に局在し、菌体外多糖の生合成に関与するタンパク質であると考えられる。
【００１２】
本発明における宿主は、Ｃｐｓ１と高い相同性を有し、且つ加水分解酵素活性に関与する遺伝子を有する糸状菌であれば特に限定されない。より具体的には、Ｃｐｓ１と約４０％以上の同一性を有し、且つ加水分解酵素活性に関与する遺伝子を有する糸状菌は本発明の宿主となり得ると考えられる。
【００１３】
相同性解析の結果、ＲｓｅＡはアスペルギルス属糸状菌とペニシリウム属(Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ)糸状菌において広く保存されていることが確認されている。その他にも、本発明における糸状菌として、ネオサルトリア(Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ)属、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）等に属する菌株が意図される。ｒｓｅＡ遺伝子を有するアスペルギルス属糸状菌として、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１株やアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０（ＮＢＲＣ１００９５９）がある。これらの菌株が有するＲｓｅＡは約９０％以上の同一性を有する。
【００１４】
本明細書で使用する場合、「ｃｐｓ１遺伝子に対応する遺伝子」とは、糸状菌において、ｃｐｓ１遺伝子と高い相同性、例えば約４０％以上の同一性を有する遺伝子であって、加水分解酵素活性に関与する遺伝子（ｒｓｅＡ遺伝子）を意味する。換言すると、糸状菌におけるｃｐｓ１遺伝子に対応する遺伝子は、Ｇｌｙｃｏ＿ｔｒａｎｆ＿２＿３ファミリーのドメインを有しており、また、１回膜貫通領域を有する膜局在型のタンパク質をコードする遺伝子である。
【００１５】
より具体的な態様において、ｃｐｓ１遺伝子に対応する遺伝子、すなわちｒｓｅＡ遺伝子は以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列：
（ａ）アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１由来の配列番号１で表されるアミノ酸配列（ＡｓＲｓｅＡ＿ｐｅｐ）又はアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０の配列番号３で表されるアミノ酸配列（ＡｏＲｓｅＡ＿ｐｅｐ）；
（ｂ）配列番号１又は３のアミノ酸配列において、１若しくは数個、例えば２〜５個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１又は３のアミノ酸配列と同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上であるアミノ酸配列；
で表されるタンパク質をコードする遺伝子であるか、
あるいは以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれかの塩基配列：
（ｄ）配列番号２又は４の塩基配列；
（ｅ）配列番号２又は４の塩基配列において、１若しくは数個、例えば２〜５個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列；
（ｆ）配列番号２又は４の塩基配列と同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である塩基配列；
（ｇ）配列番号２又は４の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列；
で表される遺伝子であり、且つ加水分解酵素活性に関与する遺伝子、
から選択される。
【００１６】
アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１のｒｓｅＡ遺伝子（配列番号２）とアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０のｒｓｅＡ遺伝子（配列番号４）は互いに約９８％の同一性を有する。配列番号２及び４の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１及び３のアミノ酸配列である。ｒｓｅＡ遺伝子のオーソログは他の糸状菌菌種にも存在することが確認されている（実施例４）。アスペルギルス・ソーヤのＲｓｅＡを基準とした場合、他の糸状菌のＲｓｅＡは約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の同一性を有する。
【００１７】
ここで、ハイブリダイゼーションは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｎｇ  ｔｈｉｒｄ．ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）、又はカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
【００１８】
本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、温度６０℃〜６８℃において、ナトリウム濃度１５〜９００ｍＭ、好ましくは１５〜６００ｍＭ、さらに好ましくは１５〜１５０ｍＭ、ｐＨ６〜８であるような条件を挙げることができる。
【００１９】
したがって、配列番号２又は４の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列としては、例えば、全塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で、約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上である塩基配列で表される遺伝子であり、且つ加水分解酵素活性に関与する遺伝子を挙げることができる。かかる相同性の程度は、本発明に係るタンパク質と相同のタンパク質についても適用される。
【００２０】
２つの塩基配列又はアミノ酸配列における配列相同性を決定するために、配列は、比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行う。その後、各部位におけるアミノ酸残基又は塩基が比較される。第一の配列におけるある部位に、第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基又は塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。２つの配列における配列相同性は、配列間での同一である部位数の全部位（全アミノ酸又は全塩基）数に対する百分率で示される。
【００２１】
上記の原理に従い、２つの塩基配列又はアミノ酸配列における配列相同性は、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８、１９９０及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７、１９９３）により決定される。このようなアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムやＦＡＳＴＡプログラムは、主に与えられた配列に対し、高い配列相同性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。
【００２２】
上記のような塩基配列の配列相同性を示すような遺伝子は、上記のようにハイブリダイゼーションを指標に得ることもでき、ゲノム塩基配列解析等によって得られた機能未知のＤＮＡ群又は公共データベースの中から、当業者が通常用いている方法により、例えば、前述のＢＬＡＳＴソフトウェアを用いた検索により発見することも容易である。さらに、本発明遺伝子は、種々の公知の変異導入方法によって得ることもできる。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「相同性」は同一性を指す場合がある。「同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つの塩基配列又はアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメントにおける、オーバーラップする全塩基又は全アミノ酸残基に対する、同一塩基又はアミノ酸残基の割合（％）を意味する。好ましくは、当該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである。
【００２４】
「ｃｐｓ１遺伝子に対応する遺伝子の機能が低下又は欠損する変異」とは、宿主と比較した場合に加水分解酵素活性を増大させるようなｒｓｅＡ遺伝子の任意の変異を意味する。例えば、ｒｓｅＡ遺伝子の一部又は全部を破壊すること、例えば、ｒｓｅＡ遺伝子の一部又は全部を欠失させたり、ｒｓｅＡ遺伝子の途中に薬剤耐性遺伝子等、別の遺伝子を挿入するなどして正常に機能しないように遺伝子を修飾すること等により、糸状菌の加水分解酵素活性を増大させることができる。
【００２５】
ｃｐｓ１遺伝子の欠失変異体は、ｃｐｓ１遺伝子のうちの欠失させたい任意の領域の両端をつなぎ合わせたベクターを用いて遺伝子組換えを行うことで任意の領域を欠失させることにより調製できる。ベクターには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、ａｄｅＡ、ｐｙｒＧ、ａｒｇＢ、ｔｒｐＣ、ｎｉａＤ、ｓＣ、のような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子や、ピリチアミンやオーレオバシジンなどの薬剤に対する抵抗遺伝子などが挙げられる。
【００２６】
変異の種類や方法は特に限定されず、例えば、当業者にとって公知の部位特異的に変異を導入する方法、ランダムに変異を導入する方法、変異原となる薬剤を作用させる方法、紫外線照射法、タンパク質工学的手法等を広く用いることができる。部位特異的変異導入法により、対応するアミノ酸配列において、１８４位に相当するロイシンを欠失させるか、または他のアミノ酸、例えばセリンに置換する変異（Ｌ１８４Ｓ）を行うことでｒｓｅＡ遺伝子の機能を低下又は欠損させてもよい。Ｃｐｓ１ファミリーのアミノ酸配列には高度に保存された領域が複数存在しているが、触媒部位にあるＤＸＤモチーフはクリプトコッカス・ネオフォルマンスの場合１３５位に、そしてアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１やアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０の場合１３１位に位置する。糸状菌の上記１８４位に相当するロイシンはＤＸＤモチーフの最初のアスパラギン酸から数えて約５３塩基下流に存在する。
【００２７】
実施例３及び６では、ｒｓｅＡ遺伝子の破壊が加水分解酵素活性の向上をもたらすことが確認されている。よって、本発明は広く、ｃｐｓ１遺伝子に対応する遺伝子の機能、すなわちｒｓｅＡ遺伝子の機能を低下又は欠損させるあらゆる変異を有する菌株を包含する。したがって、部位特異的な変異は上述したＬ１８４Ｓのような特定の変異に限定されないことは明らかである。
【００２８】
本発明の変異体は、ｒｓｅＡ遺伝子が変異していることにより、糸状菌が産生する種々のタンパク質分解系加水分解酵素や多糖分解系加水分解酵素をコードする遺伝子の発現が有意に亢進しているか、このような加水分解酵素の活性が有意に増大している。限定することを意図するものではないが、本発明により活性が増大する加水分解酵素、特に菌体外に分泌される加水分解酵素として、例えばアルカリプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ、α−アミラーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼが挙げられる。
【００２９】
２．変異体の用途
本発明は更に、上記変異体を用いて得られる培養物を提供する。本発明の変異体を含む培養物は、タンパク質を多く含む原料、例えば、植物性タンパク質を含む穀物類、野菜類など（例えば、大豆、小麦など）、そして動物性タンパク質を含む肉類、魚類などの加水分解工程で使用することができる。本明細書で使用する場合、「培養物」は変異体を添加した麹や、更には変異体を利用して得られる諸味等の発酵物を意味する。
【００３０】
本発明の培養物は、上記変異体とタンパク質性の原料とを接触させる工程を含む方法により製造することができる変異体を添加するタイミングは特に限定されない。本発明の効果、例えば向上した加水分解酵素活性を損なわない限り、培養物の調製の途中又はその前後の工程で変異体以外の菌を添加して培養物を処理してもよい。その他の工程については、所望とする用途に応じて当業者が適宜決定することができる。
【００３１】
本発明の変異体又はその培養物は、向上した加水分解酵素活性により処理されることが必要な種々の分野、特に醸造・発酵産業での使用が想定される。例えば、糸状菌を利用して製造される種々の発酵食品、例えば醤油、味噌等の製造に本発明の変異体等を使用した場合、原料利用率や圧搾性の向上、延いては最終製品の生産性の向上に資する。食品分野に限らず、本発明の変異体又はその培養物は、広く有機性材料の加水分解産物の製造方法に使用することができる。本明細書で使用する場合、「有機性材料」とは、天然・非天然の由来を問わず、広く炭素を主要元素として、酸素、水素、窒素原子などで構成される物質であって、糸状菌によって分解可能な物質を意味する。例えば、本発明の変異体又はその培養物によれば、糸状菌によって分解されるタンパク質、多糖、脂質等を含む食物残渣やバイオマスを効率的にその構成単位であるペプチドや単糖にまで分解することができる。
【００３２】
以下、実施例に即して本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの記載によって、なんら制限されるものではない。
【実施例１】
【００３３】
（麹菌アスペルギスル・ソーヤＮＢＲＣ４２４１系統株におけるＲｓｅＡ＿Ｌ１８４Ｓ変異体の作製）
ＲｓｅＡ＿Ｌ１８４Ｓ変異体を作製するための親株として、ウリジンを含まない最少培地では生育することのできない栄養要求性株である麹菌アスペルギルス・ソーヤＫｕＵ１株（Δｋｕ７０、ΔｐｙｒＧ株；アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１株を親株とする変異株）を用いた。
【００３４】
ｋｕ７０遺伝子は非相同末端結合に働く遺伝子であり、ｋｕ７０遺伝子が欠失したＫｕＵ１株ではゲノムの相同組換えが高効率で起こる（Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７０（２００６）、１３５−１４３）。
【００３５】
アスペルギルス・ソーヤＫｕＵ１株にマーカー遺伝子であるｐｙｒＧ遺伝子が正常に導入された株では栄養要求性が回復するため、ウリジンを含まないＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地においても生育することが可能となる。このことから、ｐｙｒＧ遺伝子と共にｒｓｅＡ遺伝子変異を導入した株を容易に単離することができる。
【００３６】
使用培地
ＰＤ培地（ポリペプトン  １％、デキストリン  ２％、リン酸水素二カリウム  ０．５％、硝酸ナトリウム  ０．１％、硫酸マグネシウム  ０．０５％、カザミノ酸  ０．１％、ｐＨ  ６．０）、Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地（グルコース  ３．０％、塩化カリウム  ０．０５％、硝酸ナトリウム  ０．２％、リン酸水素二カリウム  ０．１％、硫酸マグネシウム  ０．０５％、硫酸第二鉄  ０．００１％、ｐＨ  ６．０）、マルツ寒天培地（麦芽エキス  ８％、寒天 １．５％、ｐＨ６．０）
栄養要求性株を培養する場合には、ウリジン要求性株では終濃度１０ｍＭのウリジンを培地添加し、変異体の再生には培地に１．２Ｍのソルビトールを添加した。
【００３７】
アスペルギルス・ソーヤＲｓｅＡ＿Ｌ１８４Ｓ変異導入ベクターの作製
図１にアスペルギルス・ソーヤのＲｓｅＡ＿Ｌ１８４Ｓ変異導入ベクター及び形質転換による相同組換えの概要を示す。アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１株から定法に従いゲノムＤＮＡを抽出し、これ鋳型として表１に示すプライマーＡｓＲｓｅＡＬＳ＿Ｆ１とＡｓＲｓｅＡＬＳ＿Ｒ１、ＡｓＲｓｅＡＬＳ＿Ｆ２とＡｓＲｓｅＡＬＳ＿Ｒ２＿ＰｙｒＧ、ＡｓＲｓｅＡＬＳ＿Ｆ３＿ＰｙｒＧとＡｓＲｓｅＡＬＳ＿Ｒ３、ＡｓＰｙｒＧ＿ＦとＡｓＰｙｒＧ＿Ｒを用いてＰＣＲ法により増幅し、それぞれ図１に示す変異断片１、変異断片２、変異断片３、マーカー断片を作製した。
【００３８】
ＰＣＲには、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いた。クローニングしたＤＮＡ断片はＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。４つのＤＮＡ断片を用いてＦｕｓｉｏｎ  ＰＣＲを行った。
【００３９】
最後に、Ｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ産物を鋳型として、ＡｓＲｓｅＡＬＳ＿ＦｎｅｓｔｅｄとＡｓＲｓｅＡＬＳ＿Ｒｎｅｓｔｅｄを用いてＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行い、図１に示すようなＲｓｅＡ＿Ｌ１８４Ｓ変異導入ベクターを構築した。
【表１】
0006529769.tif 000002
【００４０】
形質転換
５００ｍＬ三角フラスコ中の１０ｍＭのウリジンを含むＰＤ培地１００ｍＬに形質転換宿主株の分生子懸濁液を接種し、３０℃で１６時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体を０．７Ｍ塩化カリウム緩衝液で洗浄し、１．５％  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ（シグマ社製）及び０．３％  Ｙａｔａｌａｓｅ（大関社製）を含む０．７Ｍ塩化カリウム緩衝液で３０℃、３時間緩やかに振とうし、プロトプラストを調製した。得られたプロトプラストは１．２Ｍソルビトール緩衝液で洗浄した後、プロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行った。形質転換後のプロトプラストはＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少寒天培地に播種した。
【００４１】
相同組換えの確認
得られた形質転換体のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１記載のプライマーＡｓＲｓｅＡＬＳ＿ＦｃｈｅｃｋとＡｓＲｓｅＡＬＳ＿Ｒｃｈｅｃｋを用いてＰＣＲ法による増幅を行い、増幅断片をアガロースゲル電気泳動に供した。ＲｓｅＡ＿Ｌ１８４Ｓ変異導入ベクターが相同組換えによりゲノム中に導入された場合、ＰＣＲ増幅断片長が親株より長くなり、電気泳動のバンドが上部へシフトすることにより相同組換えの成功を確認した。
【００４２】
相同組換えが確認された株について、表１記載のプライマーＡｓＲｓｅＡＬＳ＿ｓｅｑを用いて形質転換体のゲノムシークエンシングを行い、目的の変異箇所の塩基配列を確認した。その結果、ＲｓｅＡのＣ末端側から１８４番目のロイシンがセリンに置き換わった、アスペルギルス・ソーヤＲｓｅＡ＿Ｌ１８４Ｓ株が取得されたことを確認した（図１）。
【実施例２】
【００４３】
（菌体外酵素活性の測定）
麹菌の培養方法及び酵素液の調製
脱脂大豆、小麦及び水を１：１．１：１．５の割合で混合したのち、１０ｇ秤量し、１５０ｍＬ容の三角フラスコにいれ、綿栓をしてオートクレーブにより滅菌した。これに、２．７  ｘ  １０7個のアスペルギルス・ソーヤＲｓｅＡ＿Ｌ１８４Ｓ株又はＲｓｅＡ＿Ｃｏｎｔｒｏｌ株の分生子をそれぞれ接種し、よくまぜた。これを３０℃で７２時間を静置培養した。
【００４４】
培養した麹に蒸留水１００ｍＬを加えよく攪拌し、更に１時間に１回攪拌しながら４時間置いた。この混濁液をＮｏ．２濾紙（アドバンテック社製）で濾過し濾液を得て、これを酵素液とした。
【００４５】
全プロテアーゼ活性測定
ミルクカゼイン溶液（２％ミルクカゼイン、０．０５Ｍリン酸緩衝液：ｐＨ７．０）５００μＬと蒸留水４５０μＬを試験管にとり混合し、恒温槽で３０℃に予熱した。ここへ蒸留水で３倍に希釈した酵素液を５０μＬ加え混合し、３０℃で２０分間反応させた後、反応停止液（５％トリクロロ酢酸）２ｍＬを加え、反応を停止した。これを３０℃で３０分間静置し、生じた沈殿をＮｏ．５濾紙（アドバンテック社製）で濾過した。得られた濾液５００μＬに０．４Ｍ  Ｎａ2ＣＯ3水溶液２．５ｍＬ、蒸留水で５倍希釈したフェノール試薬（ＦＯＬＩＮ＆ＣＩＯＣＡＬＴＥＵ‘Ｓ  ＰＨＥＮＯＬ  ＲＥＡＧＥＮＴ，ＭＰ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）５００μＬを加え混合し、３０℃で３０分間反応させた。反応液の吸光度（６６０ｎｍ）を測定した。ブランクは、酵素液添加前に反応停止液を加えて、同じ操作を行った。
【００４６】
ＲｓｅＡ変異株のプロテアーゼ活性は、以下の計算式で示されるように、対照株のプロテアーゼ活性を１としたときの比率で比較した。プロテアーゼ活性比率＝変異株（試料の吸光度−ブランクの吸光度）／対照株（試料の吸光度−ブランクの吸光度）。試験は３反復で行い、その平均値を算出して比較した。その結果、ＲｓｅＡ変異株では対照株より４４．０％高いプロテアーゼ活性を示すことが確認された（図２）。
【００４７】
アルカリプロテアーゼ活性測定
Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ（シグマアルドリッチ社製）を１ｍＭとなるように２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）へ溶解させた基質液１８０ｍＬに、蒸留水で４０倍に希釈した酵素液２０ｍＬを加え混合した。３０℃で２０分間反応させた後、０．１Ｎ  ＨＣｌを６００ｍＬ加えて反応を停止し、吸光度（４１０ｎｍ）を測定した。ブランクは、酵素液添加前に反応停止液を加えて、同じ操作を行った。プロテアーゼ活性測定と同様に、（ＲｓｅＡ変異株の吸光度）／（対照株の吸光度）で算出した活性比率で比較した。その結果、ＲｓｅＡ変異株では対照株より５７．２％高いアルカリプロテアーゼ活性を示した（図２）。
【００４８】
酸性カルボキシペプチダーゼ活性測定
酸性カルボキシペプチダーゼ測定キット（キッコーマンバイオケミファ社製）を用い、キットに付属の手順書に従ってカルボキシペプチダーゼの活性測定を行った。その結果、ＲｓｅＡ変異株では対照株より１５７％高いカルボキシペプチダーゼ活性を示した（図２）。
【００４９】
α−アミラーゼ活性測定
α−アミラーゼ活性測定キット（キッコーマンバイオケミファ社製）を用い、キットに付属の手順書に従ってα−アミラーゼの活性測定を行った。その結果、ＲｓｅＡ変異株では対照株より４３．８％高いカルボキシペプチダーゼ活性を示した（図２）。
【００５０】
ペクチンリアーゼ活性測定
ペクチン０．５ｇを４０ｍＬの蒸留水に溶解し、０．１Ｎ  水酸化ナトリウムでｐＨ５.５に調整後、クエン酸-リン酸緩衝液（ｐＨ５．５）５０ｍＬと蒸留水を加え、１００ｍＬとしたものを基質溶液とした。酵素液５０μＬに基質溶液２００μＬを加え、良く攪拌した後、３０℃で２時間インキュベートした。予め１．８ｍＬの蒸留水を入れておいた試験管にインキュベート後の反応物を２００μＬ添加してよく攪拌し、２３５ｎｍの吸光度を測定することでエリミネーション機構によって得られた二重結合を持つガラクツロナイドの増加を測定した。また、ブランク試験にはインキュベート時間０分のサンプルを用いて同様に操作した。プロテアーゼ活性測定と同様に、（ＲｓｅＡ変異株の吸光度）／（対照株の吸光度）で算出した活性比率で比較した。その結果、ＲｓｅＡ変異株では対照株より９０．２％高いペクチンリアーゼ活性を示した（図２）。
【００５１】
ポリガラクツロナーゼ活性測定
ペクチンリアーゼ活性測定と同様の方法にて調整した反応液を、銅試薬によるヘキスロン酸の定量法（Ｃａｒｂｏｈｙｄ．  Ｒｅｓ．，  ４（１９６７）３５９−３６１））により遊離のガラクツロン酸を定量し、ポリガラクツロナーゼ活性とした。プロテアーゼ活性測定と同様に、（ＲｓｅＡ変異株の吸光度）／（対照株の吸光度）で算出した活性比率で比較した。その結果、ＲｓｅＡ変異株では対照株より１５２．７％高いポリガラクツロナーゼ活性を示した（図２）。
【００５２】
カルボキシメチルセルラーゼ活性測定
カルボキシメチルセルロース（和光純薬社製）１．０ｇを０．１Ｍ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）１００ｍＬに溶解したものを基質溶液とした。酵素液５００μＬと等量の基質溶液を混合し、正確に４０℃で３０分インキュベートした。予め０．７５ｍＬのＤＮＳ試薬を入れておいた試験管に反応液０．７５ｍＬを加えてよく混合し、ガラス玉で栓をして沸騰浴中で７分間煮沸した。水道水にて冷却後、蒸留水を３ｍＬ加えて５３５ｎｍの吸光度を測定した。ブランクには加熱処理した酵素を使用して同様の操作を行った。プロテアーゼ活性測定と同様に、（ＲｓｅＡ変異株の吸光度）／（対照株の吸光度）で算出した活性比率で比較した。その結果、ＲｓｅＡ変異株では対照株より４４．９％高いキシラナーゼ活性を示した（図２）。
【００５３】
キシラナーゼ活性測定
ＲＥＭＡＺＯＬ  ＢＲＩＬＬＩＡＮＴ  ＢＬＵＥ  Ｒ−Ｄ  ＸＹＬＡＮ（シグマアルドリッチ社製）０．１２５ｇを１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）５０ｍＬに溶解したものを基質溶液とした。酵素液５０μＬと基質溶液２５０μＬを混合し、正確に３０℃、６０分間インキュベートした。この反応液にエタノール１ｍＬを添加し、３０分静置した後、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上澄を回収し、５９５ｎｍの吸光度を測定した。ブランクは、酵素液添加前にエタノールを加えて、同じ操作を行った。プロテアーゼ活性測定と同様に、（ＲｓｅＡ変異株の吸光度）／（対照株の吸光度）で算出した活性比率で比較した。その結果、ＲｓｅＡ変異株では対照株より９０．２％高いキシラナーゼ活性を示した（図２）。
【００５４】
マンナナーゼ活性測定
Ｌｏｃｕｓｔ  Ｂｅａｎ  Ｇｕｍ（和光純薬）１．０ｇを０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）１００ｍＬに溶解したものを基質溶液とした。酵素液５００μＬと等量の基質溶液を加え、混合した。正確に４０℃、３時間インキュベートし、反応液０．１ｍＬを予めＤＮＳ試薬１ｍＬと蒸留水０．９ｍＬを加えた試験間に良く混合した。ガラス球で栓をし、沸騰浴中で７分間煮沸した後、水道水で冷却し、蒸留水４ｍＬを加えて５３５ｎｍの吸光度を測定した。なお、ブランクには加熱処理した酵素を使用して同様の操作を行った。プロテアーゼ活性測定と同様に、（ＲｓｅＡ変異株の吸光度）／（対照株の吸光度）で算出した活性比率で比較した。その結果、ＲｓｅＡ変異株では対照株より１３８．６％高いキシラナーゼ活性を示した（図２）。
【００５５】
以上の結果より、アスペルギルス・ソーヤＲｓｅＡ＿Ｌ１８４Ｓ変異株では対照株と比べてタンパク質分解系、多糖分解系の酵素群が軒並み上昇しており、調味料製造や酵素剤製造に好適な、産業上の利用可能性が高い麹菌が得られた。
【実施例３】
【００５６】
（麹菌アスペルギスル・ソーヤＮＢＲＣ４２４１系統株におけるｒｓｅＡ遺伝子破壊株の作製と評価）
ｒｓｅＡ遺伝子破壊株を作製するための親株として、ウリジンを含まない最少培地では生育することのできない栄養要求性株である麹菌アスペルギルス・ソーヤＫｕＵ１株（Δｋｕ７０、ΔｐｙｒＧ株；アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１株を親株とする変異株）を用いた。
【００５７】
アスペルギルス・ソーヤｒｓｅＡ遺伝子破壊用ベクターの作製
図３にアスペルギルス・ソーヤのｒｓｅＡ遺伝子破壊用ベクター及び形質転換による相同組換えの概要を示す。アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２４１株から定法に従いゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型として表１に示すプライマーＡｓＲｓｅＡＤｅｌ＿Ｆ１とＡｓＲｓｅＡＤｅｌ＿Ｒ１＿ｐｙｒ、ＡｓＲｓｅＡＤｅｌ＿Ｆ２＿ｐｙｒとＡｓＲｓｅＡＤｅｌ＿Ｒ２、ＡｓＰｙｒＧ＿ＦとＡｓＰｙｒＧ＿Ｒを用いてＰＣＲ法により増幅し、それぞれ図３に示す変異断片１、変異断片２、マーカー断片を作製した。
【００５８】
ＰＣＲには、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いた。クローニングしたＤＮＡ断片はＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。３つのＤＮＡ断片を用いてＦｕｓｉｏｎ  ＰＣＲを行った。
【００５９】
最後に、Ｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ産物を鋳型として、ＡｓＲｓｅＡＤｅｌ＿ＦｎｅｓｔｅｄとＡｓＲｓｅＡＤｅｌ＿Ｒｎｅｓｔｅｄを用いてＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行い、図３に示すようなｒｓｅＡ遺伝子破壊用ベクターを構築した。
【表２】
0006529769.tif 000003
【００６０】
上記と同様の方法にて形質転換を実施後、表２記載のプライマーＡｓＲｓｅＡＤｅｌ＿Ｆｃｈｅｃｋ１とＡｓＲｓｅＡＤｅｌ＿Ｒｃｈｅｃｋ１を用いてＰＣＲ法による増幅を行い、増幅断片をアガロースゲル電気泳動に供した。ｒｓｅＡ遺伝子破壊ベクターが相同組換えによりゲノム中に導入された場合、ＡｓＲｓｅＡＤｅｌ＿Ｆｃｈｅｃｋ１とＡｓＲｓｅＡＤｅｌ＿Ｒｃｈｅｃｋ１による３．６ｋｂのＰＣＲ増幅断片長が得られる。
【００６１】
このようにして得られたｒｓｅＡ遺伝子破壊株を用いて麹を作製し、全プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、酸性カルボキシペプチダーゼ、α―アミラーゼの菌体外酵素活性を測定した。その結果、対照株と比べてプロテアーゼ活性が２９．２％、アルカリプロテアーゼ活性が２２．３％、酸性カルボキシペプチダーゼ活性が５７．９％、α―アミラーゼ活性が３２．４％高い活性を示した（図４）。
【００６２】
以上の結果より、アスペルギルス・ソーヤｒｓｅＡ遺伝子破壊株では、変異株と同様にタンパク質分解系、多糖分解系の酵素群が上昇することが確認され、調味料製造や酵素剤製造に好適な、産業上の利用可能性が高い麹菌が得られた。
【実施例４】
【００６３】
（ＲｓｅＡの機能予測と糸状菌におけるｒｓｅＡ遺伝子の分布）
ＲｓｅＡの機能を予測するためにＰｆａｍデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／）を用いて保存されたモチーフの検索を行った。その結果、ｒｓｅＡ遺伝子はＧｌｙｃｏ＿ｔｒａｎｆ＿２＿３ファミリーのドメインを有していることが分かった。更に局在を予測するためにＳＯＳＵＩ（ｈｔｔｐ：／／ｈａｒｒｉｅｒ．ｎａｇａｈａｍａ−ｉ−ｂｉｏ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉ／）のプログラムを用いて解析を行ったところ、ＲｓｅＡは１回膜貫通領域を有する膜局在型のタンパク質であることが示唆された。以上の結果より、ＲｓｅＡは膜に局在し、菌体外多糖の生合成に関与するタンパク質であることが示唆された。
【００６４】
糸状菌におけるＲｓｅＡのホモロジー解析
アスペルギルス・ソーヤのＲｓｅＡのアミノ酸配列を元に、ＢＬＡＳＴプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ・Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を用いて糸状菌におけるオーソログを検索した。その結果、アスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＲＩＢ４０のＸＰ＿００１８２５５２０、アスペルギルス・フラバス（Ａ．ｆｌａｖｕｓ）ＮＲＲＬ３３５７のＸＰ＿００２３８０７２２，アスペルギルス・カワチ（Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ）ＩＦＯ４３０８のＧＡＡ９１１０１、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ１３．８８のＸＰ＿００１３３９５０９９、アスペルギルス・テレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ）ＮＩＨ２６２４のＸＰ＿００１２０９２４３、アスペルギルス・フミガタス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）Ａｆ２９３のＸＰ＿７４６６８２、ネオサルトリア・フィッシェリ（Ｎ．ｆｉｓｈｅｒｉ）ＮＲＲＬ１８１のＸＰ＿００１２６２８８３、アスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ＦＧＳＣＡ４のＸＰ＿６８２３３８、ペニシリウム・エクスパンサム（Ｐ．ｅｘｐａｎｓｕｍ）のＫＧＯ４１９８９、ペニシリウム・イタリカム（Ｐ．ｉｔａｌｉｃｕｍ）のＫＧＯ７７１１８、ペニシリウム・オキサリカム（Ｐ．ｏｘａｌｉｃｕｍ）１１４−２のＥＰＳ７７１１８、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＱＭ６ａのＸＰ＿００６９６６５８０、フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のＥＷ２８７０８５、クリプトコッカス・ネオフォルマンスのＡＦＲ９７０５１遺伝子と相同性を示し、ＲｓｅＡは糸状菌界で保存されていることが確認された（図５）。更にこれら１５個のアミノ酸配列を用いてアラインメント比較を実施した結果、いずれもＧｌｙｃｏ＿ｔｒａｎｆ＿２＿３ファミリーに属するドメインを有していることが分かった。また、これら相同性を示すタンパク質のアミノ酸配列からＣｌｕｓｔａｌＷのプログラムを用いて系統樹を作製した結果、アスペルギルス属糸状菌とペニシリウム属糸状菌で特にアスペルギルス・ソーヤのＲｓｅＡと高い相同性を有していることが確認された。
【実施例５】
【００６５】
（麹菌アスペルギスル・オリゼＲＩＢ４０系統株におけるＲｓｅＡ＿Ｌ１８４Ｓ変異株の作製と評価）
糸状菌の中でｒｓｅＡ遺伝子は広く保存されていることが確認されたため、これまでに検討を進めたアスペルギルス・ソーヤとは種が異なる糸状菌であるアスペルギルス・オリゼにおいてもｒｓｅＡ遺伝子の変異において酵素分泌が活性化するか検討を行った。ｒｓｅＡ遺伝子破壊株を作製するための親株として、ウリジンを含まない最少培地では生育することのできない栄養要求性株である麹菌アスペルギルス・オリゼＲＫｕＮ１６ｐｒｔ１株（Δｋｕ７０、ΔｐｙｒＧ株；アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株を親株とする変異株）を用いた。
【００６６】
アスペルギルス・オリゼｒｓｅＡ遺伝子Ｌ１８４Ｓ変異導入株の作製
表１で示したアスペルギルス・ソーヤｒｓｅＡ遺伝子Ｌ１８４Ｓ変異導入用プライマーを用いてアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０ゲノムを鋳型にＰＣＲを行い、アスペルギルス・オリゼ用のｒｓｅＡ遺伝子Ｌ１８４Ｓ変異導入用ベクターを構築した。得られたベクターを用いてアスペルギルス・オリゼΔｋｕＲＣ７−２株に形質転換を実施した。実施例
１と同様の方法にて相同組換えの確認と変異点の塩基置換を確認した。
【００６７】
アスペルギルス・オリゼｒｓｅＡ遺伝子Ｌ１８４Ｓ変異導入株の評価
得られたアスペルギルス・オリゼｒｓｅＡ遺伝子Ｌ１８４Ｓ変異導入株を用いて麹を作製し、全プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、酸性カルボキシペプチダーゼ、α―アミラーゼの菌体外酵素活性を測定した。その結果、対照株と比べて全プロテアーゼ活性が３５．８％、アルカリプロテアーゼ活性が３０．７％、酸性カルボキシペプチダーゼ活性が３０．２％、α―アミラーゼ活性が１８．９％高い活性を示した（図６）。
【００６８】
以上の結果より、アスペルギルス・オリゼｒｓｅＡ遺伝子Ｌ１８４Ｓ変異導入株では、アスペルギルス・ソーヤと同様にタンパク質分解系、多糖分解系の酵素群が上昇することが確認された。
【実施例６】
【００６９】
（麹菌アスペルギスル・オリゼＲＩＢ４０系統株におけるｒｓｅＡ遺伝子破壊株の作製と評価）
【００７０】
アスペルギルス・オリゼｒｓｅＡ遺伝子破壊株の作製
表２で示したアスペルギルス・ソーヤｒｓｅＡ遺伝子破壊用プライマーを用いてアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０ゲノムを鋳型にＰＣＲを行い、アスペルギルス・オリゼ用のｒｓｅＡ遺伝子破壊用ベクターを構築した。得られたベクターを用いてアスペルギルス・オリゼΔｋｕＲＣ７−２株に形質転換を実施した。実施例３と同様の方法にて相同組換え
の確認と変異点の塩基置換を確認した。
【００７１】
アスペルギルス・オリゼｒｓｅＡ遺伝子破壊株の評価
得られたアスペルギルス・オリゼｒｓｅＡ遺伝子破壊株を用いて麹を作製し、プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、酸性カルボキシペプチダーゼ、α―アミラーゼの菌体外酵素活性を測定した。その結果、対照株と比べてプロテアーゼ活性が１２１．９％、アルカリプロテアーゼ活性が１１５．２％、酸性カルボキシペプチダーゼ活性が７６．５％、α―アミラーゼ活性が３１．９％高い活性を示した（図７）。
【００７２】
以上の結果より、アスペルギルス・オリゼｒｓｅＡ遺伝子破壊株では、変異株やアスペルギルス・ソーヤでの破壊株以上にタンパク質分解系、多糖分解系の酵素群が上昇することが確認された。これらの結果から、ｒｓｅＡ遺伝子の変異や破壊はアスペルギルス属糸状菌において菌体外酵素の活性を増大させる有効な方法であることが確認された。
【図１】
0006529769.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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