(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維化を判定するために、ヒト被験者から得られた試料中からCD45+C1q+CCR8+細胞を検出する方法。
【請求項２】
前記被験者から得られた試料中の細胞数が、健常者から得られた試料中の細胞数と比較して、高い場合には、線維化していると判定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記線維化は、以下の臓器の線維化である請求項１又は２に記載の方法。
（１）心臓
（２）腎臓
（３）肺
（４）肝臓
【請求項４】
以下の抗体を含むヒト線維化判定キット。
（１）抗CD45抗体
（２）抗C1q抗体
（３）抗CCR8抗体
【請求項５】
線維化を判定するために、マウスから得られた試料中からCD45+Scal+細胞、CD45+Scal+C1q+細胞又はCD45+Scal+C1q+CCR8+細胞を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者から得られた試料中からCD45+C1q+CCR8+細胞を検出することを特徴とする線維化判定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
（線維化）
線維化は、病因を問わず最終的に臓器不全に至るまでの経過中から共通に観られる現象である。したがって、臓器線維化の早期診断方法とその治療法の確立が、臓器不全への進展阻止を考える上で重要である。
具体例として、近年、疫学研究により慢性腎疾患(Chronic kidney disease, ＣＫＤ)患者の心疾患発症率はＣＫＤがない患者に比べて約3倍頻度が多いことが明らかになった。このような心疾患で、初期から出現する心臓の線維化は不可逆的な現象であり、組織再生が起こりにくい心臓にとっては特に重要な問題となりえる。
【０００３】
（線維化の検査方法）
心臓の線維化に代表されるように、臓器の線維化という状態は機能的な面においても臓器に生じている病態の最終終末像である。つまり、最終終末像に至る前に、事前に線維化が進行するのかどうかを予測し見極める手段・手法の開発が必要である。これまでには、組織生検を行って臓器・組織に現在、炎症や細胞浸潤がどこまで進行しているのか、線維化の状態がどのようになっているのかを判断するしかなかった。特に心臓などでそのような評価を行いたい場合、心筋生検は、得られる情報に比べて侵襲が大きすぎるというリスク面が大きかった。さらに、線維化がこれから進行する状態であるのかどうかや、今生じている線維化の活動性を予測可能にする有効な技術は全く存在していないという現状がある。
肝臓線維化においては、血中のIV 型コラーゲン（以下 IV.C）、プロコラーゲン III ペプチド（以下PIIIP）、ヒアルロン酸（以下HA）をはじめとする血中肝線維化マーカーを測定して線維化の病態を判断しようとすることもされているが病態進行の予測や、活動性の指標には十分になり得ていない。
【０００４】
一方で、臓器線維化に対して早期に介入し、積極的な予防処理あるいは治療を開始することで、以降の臓器不全進展に対して抑制可能であることが、腎臓病、心血管病をはじめとして明らかになってきた。しかしながら、各種臓器線維化を正確、迅速、および簡便に評価する技術はこれまで存在しなかった（非特許文献１、２）。
【０００５】
特許文献１では、「末梢血中のfibrocyteの濃度を測定することによる腎線維化検査方法」を開示している。しかし、本発明の線維化判定方法は、特許文献１に記載の腎線維化検査方法とは、使用するマーカーが明らかに異なる。さらに、特許文献１に記載の腎線維化検査方法では、血中fibrocyteの定量化により腎線維化との関連性を証明できるものではなかった。よって本発明では、さらに細胞表面マーカーを追加することで細胞種を絞り込んだ技術を含む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１２−１２７８７９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Proc Natl Acad SciUSA 103(38):14098-14103, 2006
【非特許文献２】Biochem Biophys Res Commun353(1):104-108, 2007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現段階において、線維化、特に心臓の線維化を判定する正確、迅速、および簡便な方法はない。そこで、本発明者らは、新規な線維化判定方法を開発することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、被験者から得られた試料中からCD45+C1q+CCR8+細胞が線維化のマーカーになることを確認して、本発明の線維化判定方法を完成した。
【００１０】
本発明は以下からなる。
１．被験者から得られた試料中から以下のいずれか１以上の細胞を検出することを特徴とする線維化判定方法。
（１）CD45+C1q+CCR8+細胞
（２）CD45+C1q+細胞
（３）C1q+CCR8+細胞
（４）CD45+CCR8+細胞
２．以下の細胞を検出することを特徴とする前項１の線維化判定方法。
（１）CD45+C1q+CCR8+Sca1+細胞
（２）CD45+C1q+Sca1+細胞
（３）C1q+CCR8+Sca1+細胞
（４）CD45+CCR8+Sca1+細胞
（５）CD45+Sca1+細胞
３．前記被験者から得られた試料中の細胞数が、健常者から得られた試料中の細胞数と比較して、高い場合には、線維化していると判定することを特徴とする前項１又は２に記載の線維化判定方法。
４．前記線維化は、以下の臓器の線維化である前項１〜３のいずれか１に記載の線維化判定方法。
（１）心臓
（２）腎臓
（３）肺
（４）肝臓
（５）膵臓
（６）皮膚
（７）動脈
（８）腹膜
（９）がん組織
５．以下のいずれから１以上の抗体を含む線維化判定キット。
（１）抗CD45抗体
（２）抗C1q抗体
（３）抗CCR8抗体
（４）抗Sca1抗体
【発明の効果】
【００１１】
本発明の線維化判定方法は、線維化を判定する正確、迅速、および簡便な方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】臓器線維化モデルの作成工程
【図２】収縮期血圧の測定結果
【図３】心臓のアザン染色像
【図４】線維化面積率および心体重比の測定結果
【図５】collagen type 1αおよびTGF-β1のmRNA発現測定結果
【図６】ハイドロキシプロリンの測定結果
【図７】心機能の評価結果｛左：M mode像を示す、右：左室駆出率（Ejection Fraction: EF）｝
【図８】parabiosisモデルの作成工程
【図９】心臓のアザン染色像
【図１０】線維化面積率の測定結果
【図１１】心臓内におけるGFP陽性細胞の確認
【図１２】GFP陽性細胞のキャラクタリゼーション結果
【図１３】GFP陽性細胞の分類結果
【図１４】細胞種を細胞表面マーカーを使用して定量評価した結果
【図１５】骨髄移植モデルの作成工程
【図１６】GFP陽性細胞の確認
【図１７】GFP陽性細胞の分類結果
【図１８】細胞種を細胞表面マーカーを使用して定量評価した結果
【図１９】CD45+Sca1+細胞と胚性線維芽細胞の共培養の工程の説明
【図２０】CD45+Sca1+細胞と胚性線維芽細胞の共培養の工程の説明
【図２１】CD45+Sca1+ 細胞の線維化誘導能の確認結果
【図２２】genetipによる遺伝子発現解析結果のサマリー
【図２３】CD45+Sca1+X+（又はX-）細胞と胚性線維芽細胞の共培養の工程の説明
【図２４】CD45+Sca1+X+（又はX-）細胞と胚性線維芽細胞の共培養の工程の説明
【図２５】CD45+Sca1+X+（又はX-）細胞の線維化誘導能の確認結果
【図２６】CD45+Sca1+細胞と胚性線維芽細胞の共培養（抗C1q抗体投与）の工程の説明
【図２７】CD45+Sca1+細胞と胚性線維芽細胞の共培養（抗C1q抗体投与）の工程の説明
【図２８】抗C1q抗体の投与されたCD45+Sca1+細胞の線維化誘導能の確認結果
【図２９】骨髄移植モデルの作成工程
【図３０】CD45+Sca1+X+細胞の分類確認結果
【図３１】CD45+Sca1+X+細胞の分類確認結果
【図３２】CD45+Sca1+X+細胞の分類確認結果
【図３３】骨髄移植モデルの作成工程
【図３４】腎臓・心臓の線維化モデルであるAII+UUOマウスモデルにおいて、CD45+Sca1+C1q+CCR8+細胞は血液中、心臓、腎臓においては検出されるのとは逆に骨髄、脾臓においては全く存在しない
【図３５】臓器線維化モデルの作成工程
【図３６】CD45+Sca1+C1q+CCR8+細胞の血中細胞数上昇
【図３７】ヒトにおけるCD45+C1q+CCR8+細胞の血中細胞数上昇
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（本発明の線維化判定方法）
本発明の線維化判定方法は、被験者から得られた試料中から以下のいずれか１以上の細胞（各陽性細胞）を検出することを特徴とする。なお、「+」は、陽性細胞であることを意味する。
（１）CD45+C1q+CCR8+細胞（細胞表面にCD45抗原、C1q抗原及びCCR8抗原が発現している細胞）
（２）CD45+C1q+細胞（細胞表面にCD45抗原及びC1q抗原が発現している細胞）
（３）C1q+CCR8+細胞（細胞表面にC1q抗原及びCCR8抗原が発現している細胞）
（４）CD45+CCR8+細胞（細胞表面にCD45抗原及びCCR8抗原が発現している細胞）
（５）CD45+C1q+CCR8+Sca1+細胞（細胞表面にCD45抗原、C1q抗原、CCR8抗原及びSca1抗原が発現している細胞）
（６）CD45+C1q+Sca1+細胞（細胞表面にCD45抗原、C1q抗原及びSca1抗原が発現している細胞）
（７）C1q+CCR8+Sca1+細胞（細胞表面にC1q抗原、CCR8抗原及びSca1抗原が発現している細胞）
（８）CD45+CCR8+Sca1+細胞（細胞表面にCD45抗原、CCR8抗原及びSca1抗原が発現している細胞）
（９）CD45+Sca1+細胞（細胞表面にCD45抗原及びSca1抗原が発現している細胞）
なお、CD45は、分子量約115kDの糖タンパク質である。Sca1は、グルコシルホスファチジールイノシトールに結合するLy（lymphocyteactivation protein）-6に属する細胞表面タンパク質である。C1qは、補体の一種である。CCR8は、ケモカイン(C-C)レセプター８タンパク質を意味する。
上記した各種細胞の表面に発現している抗原は、該抗原に対する抗体（ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体の何れでもよい）により、容易に検出することができる。なお、すべての抗原に対する抗体は、市販品の抗体が存在するので、当業者なら容易に入手可能である。
【００１４】
（被験者）
本発明の被験者は、臓器で線維化が生じる哺乳類であれば特に限定されないが、例えば、ヒト、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ラット、ウサギ、フェレット、スンクス、ヒツジ、ロバ、ブタ等を例示することができる。
【００１５】
（試料）
本発明の試料は、被験者から採取され、かつ、CD45+細胞陽性細胞、C1q+細胞陽性細胞、CCR8+細胞及びSca1+細胞が存在していれば特に限定されないが、血液、リンパ液、髄液、骨髄液、唾液、尿、関節液、胸水、腹水、涙液、眼房水、硝子体液、鼻腔液、母乳、精液、前立腺液、膣液、膵液、胆汁、汗、膿、気管支洗浄液、生検サンプル（胃粘膜、大腸粘膜、気管支粘膜、皮膚、筋肉、腫瘍、リンパ節、子宮粘膜）、解剖検体（病理組織、法医学的組織）等を例示することができ、好ましくは、血液、リンパ液、髄液、唾液、気管支洗浄液、骨髄液、及び生検サンプルである。
【００１６】
（各陽性細胞の検出方法）
本発明の線維化判定方法は、試料中の各陽性細胞を検出することができれば、特に限定されないが、好ましくはフローサイトメトリーで行うことができる。フローサイトメトリーを用いて各陽性細胞の蛍光発光を検出・測定する場合、各抗原を特異的に認識可能な各種抗体は、蛍光標識物質で標識した標識抗体として使用することが好ましい。本発明で用いる蛍光標識物質の種類は、フローサイトメトリーで検出できるものであれば特に限定されず、例えば、フィコエリスリン、ＦＩＴＣ等を例示することができる。
【００１７】
（指標）
本発明の「指標（Cut off（カットオフ）値）」とは、線維化を有する患者と健常者を区別するための試料中の各陽性細胞数を意味する。例えば、被験者の試料中の各陽性細胞が、予め設定した試料中の各陽性細胞数以上の場合には、臓器で線維化が発症している、進行している、重篤である、及び／又は今後の発症の可能性が高いと判定することができる。Cut off（カットオフ）値の設定方法としては、線維化を有しない被験者の試料中の各陽性細胞数の平均値から算出する。通常、予め決定した線維化を有しない被験者の試料中の各陽性細胞数の平均値の標準偏差の90％以下、好ましくは80%以下、より好ましくは70％以下、さらに好ましくは60％以下、最も好ましくは50％以下の範囲の細胞数を指標とする。
また、別の指標の設定方法として、被験者の試料中の各陽性細胞数が、線維化を有しない被験者の試料中の各陽性細胞数の平均値に対して、105％以上、110％以上、120％以上、130％以上、140％以上、150％以上、180％以上、200％以上、250％以上、300％以上、400％以上、500％以上、600％以上、700％以上、800％以上、900％以上又は1000％以上の場合には、臓器で線維化が発症している、進行している、重篤である、及び／又は今後の発症の可能性が高いと判定することができる。
さらに、別のcut off値の設定方法としては、予め線維化を有していることを確認している患者及び線維化を有しない被験者において、試料中の各陽性細胞数を測定して得られた値に基づき、市販の統計解析ソフトを使用してROC(Receiver Operating Characteristic)曲線を作成し、最適な感度及び特異度を求める。例えば、一次スクリーニング等の目的では感度が高い方を優先し、精査目的では特異度が高くなるようなカットオフ値を設定することが可能である。
【００１８】
本発明の線維化判定方法では、試料中の各陽性細胞を検出することにより、心臓、腎臓、肺、肝臓、膵臓、皮膚、動脈、がん組織（スキルス胃がん、乳がん、膵臓がん、肝がん、肺がんなど）及び／又は、腹膜の線維化を判定することができるが、特に線維化の検出感度が高いのは、下記の実施例の結果より、心臓及び腎臓である。
【００１９】
（試料中の各陽性細胞の検出方法）
本発明の線維化判定方法における試料中の各陽性細胞の検出方法の工程を下記に例示するが特に限定されない。
（１）被験者から血液（全血）を取得する。
（２）取得した血液を緩衝液で希釈する。
（３）希釈した血液を、市販の蛍光したCD45抗体（APC-Cy7）、C1q抗体（APC）、CCR8抗体（PE）及びSca1+抗体（V450）を用いてフローサイトメトリーにより各陽性細胞の蛍光発光を検出・測定する。APC-Cy7、APC、PE、V450などの蛍光色素は、解析方法としてその他のものと置き換えることができる。
（４）測定した各陽性細胞数を、カットオフ値と比較して、線維化を判定する。
【００２０】
（線維化判定キット）
本発明の線維化判定キットは、CD45+C1q+CCR8+細胞、CD45+C1q+細胞、C1q+CCR8+細胞、CD45+CCR8+細胞、CD45+C1q+CCR8+Sca1+細胞、CD45+C1q+Sca1+細胞、C1q+CCR8+Sca1+細胞、CD45+CCR8+Sca1+細胞、及び／又はCD45+Sca1+細胞を被験者から得られた試料中から検出するために必要な構成を含む。
例えば、本発明の線維化判定キットは、下記のようないずれか１以上の抗体を含む。
（１）抗CD45抗体
（２）抗C1q抗体
（３）抗CCR8抗体
（４）抗Sca1抗体
なお、上記すべての抗体は、自体公知の市販品でもよりが、各抗原を標的として作製したモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体でも良い。
【００２１】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。なお、本実施例は、金沢大学動物実験規程に従って行った。
【実施例１】
【００２２】
（心線維化モデルの作成と心線維化の評価）
心臓の線維化が予測可能なバイオマーカーを新たに同定するために、心線維化が進行する臓器線維化モデルを作成し、さらにparabiosisモデル、骨髄移植モデルを使用し実験を行った。バイオマーカーの中でも心線維化の進行によりその数が変化する細胞種（群）を、抗体を使用した細胞表面マーカーを使って調べた。詳細は、以下の通りである。
【００２３】
（臓器線維化モデルにおける心線維化の評価）
生後8週齢のC57BL/6Jマウス（B6 マウス）に、一側尿管結紮（Unilateral ureteralobstruction: UUO）および浸透圧ポンプを用いてアンジオテンシンII（AII）を2.8 mg/kg/dayにて持続静注したモデルを作成した（参照：図１）。対照群としてAII単独群、UUO単独群も作成した。第14日にと殺を行い、解析した。
tail-cuff法を用いて、各群の収縮期血圧を測定した。第14日において、AII+UUO群が最も血圧が高値であったが、AII群との間に差を認めなかった（参照：図２）。心臓のアザン染色像を示す（参照：図３）。線維化面積率および心体重比ともにAII+UUO群が最も大きく、線維化が進行していた（参照：図４）。
心組織よりRNAを抽出し、collagen type 1αおよびTGF-β1のmRNA発現を検討した（参照：図５）。
また、ハイドロキシプロリン法を行い、心線維化を半定量的に評価した。いずれにおいてもAII+UUO群にて最も上昇していた（参照：図６）。
経皮的心エコーを行い、心機能を評価した（参照：図７）。左にM mode像を示す。左室駆出率（Ejection Fraction: EF）はAII+UUO群にて有意に低下していた。
以上の結果により、心線維化モデルにおいて、AII+UUO群は、AII群と比較しても血圧非依存性に心線維化が進行した。これにより、心線維化が進行する臓器線維化モデルが作成できたことを確認した。以降はこのマウスを心線維化モデルとして使用した。
【００２４】
（parabiosisモデルにおける心線維化の評価）
B6マウスとC57BL/6-Tg (CAG-EGFP：全身のすべての細胞でenhanced GFPが発現する)マウスを用いてparabiosisモデルを作成した。麻酔導入後に、皮膚および腹膜を長軸方向に切開し、各々縫合した。キメラ完成後にB6マウス側にAII+UUOを作成した（参照：図８）。AII+UUO作成後、第7日及び第14日にと殺を行い、解析した。
心臓のアザン染色像を示す（参照：図９）。線維化面積率は、第７日においてAII+UUO群が最も大きく、線維化が進行しており、第１４日にさらに進行した（参照：図１０）。
以上により、parabiosisモデルにおいても、AII+UUOによって心線維化の進行を認めた。加えて、蛍光抗体法による免疫染色を行ったところ、心筋内にGFP陽性細胞が浸潤していた（参照：図１１）。次に、マルチカラーフローサイトメトリー法にて、GFP陽性細胞のキャラクタリゼーションを行った（参照：図１２）。GFP陽性細胞は、白血球のマーカーであるCD45とstem cellの代表的マーカーであるSca1の2つを用いて大きく3分類できた（参照：図１３）。さらに、線維化の進行に伴ってCD45+Sca1-細胞とともにCD45+Sca1+細胞が増加した（参照：図１４）。
【００２５】
（骨髄移植モデルにおける心線維化の評価）
C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)マウスの骨髄を、B6マウスに移植し、骨髄移植モデルを作成し、加えてAII+UUOを作成した（参照：図１５）。AII+UUO作成後、第７日にと殺を行い、解析した。
心浸潤GFP細胞のキャラクターをparabiosisモデル同様にフローサイトメトリー法にて解析した（参照：図１６）。骨髄移植モデルにおいてもGFP陽性細胞はCD45とSca1の2つを用いて3つに分類することできた（参照：図１７）。また線維化の進行に伴ってCD45+Sca1-細胞とともにCD45+Sca1+細胞が増加した（参照：図１８）。
以上により、本モデルでは、骨髄由来の細胞が流血を介して線維化部分に浸潤していくことを確認した。
【実施例２】
【００２６】
（CD45+Sca1+細胞の線維化誘導能の確認）
機能的にCD45+Sca1+細胞が線維化を誘導する細胞であるのかを解析するために、胚性線維芽細胞との共培養を行い、胚性線維芽細胞のコラーゲン1産生を定量評価することによる線維化誘導能を調べた。さらに、その後、CD45+Sca1+細胞はまだヘテロな集団からなる細胞群であり、線維化を誘導する細胞種をさらに絞り込むためにCD45+Sca1+細胞の遺伝子発現解析を行い線維化誘導に関与する候補遺伝子を調べた。その結果をもとに、フローサイトメトリー及び共培養にてCD45+Sca1+細胞に加え、さらに絞り込んだ細胞表面マーカーの同定と確認を行った。詳細は、以下の通りである。
【００２７】
（CD45+Sca1+細胞と胚性線維芽細胞の共培養を用いた線維化誘導能の評価）
COL/LUC-Tg (コラーゲン１α2のプロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を融合した遺伝子を過剰発現したマウス)マウスより、胚性線維芽細胞（mouse embryonic fibroblast: MEF）を採取し、フローサイトメトリーを用いたソーティングにて得られたCD45+Sca1+細胞と共培養を行った（参照：図１９、図２０）。４８時間後にルシフェラーゼアッセイにて線維化を引き起こすcollagen1α2の発現を評価した。
CD45+Sca1+細胞は、CD45-Sca1+細胞と比較して、線維化誘導能を有することを確認した（参照：図２１）。TGF-βは陽性コントロールとして使用した。
【００２８】
（CD45+Sca1+細胞と胚性線維芽細胞の共培養を用いた表面マーカーの検討）
CD45+Sca1+細胞よりRNAを抽出し、genetipによる発現解析をCD45-Sca1+細胞、CD45+Sca1-細胞と比較し、同細胞のキャラクターを評価した。約4万個の遺伝子の中から、31個の候補遺伝子を抽出した（参照：図２２）。
抽出した候補遺伝子の中から細胞表面に発現するもので、表面マーカーとして使用可能なものを選定し、CD45+Sca1+というカテゴリーに加え、さらなる表面マーカーの追加を行った。CD45+Sca1+X+ 細胞（Xは、図25中の13種類）およびCD45+Sca1+X-細胞をセルソーターを使用してソーティングした。上記と同様にMEFと共培養を行い、４８時間後のルシフェラーゼアッセイにて線維化誘導能を評価した（参照：図２３、図２４）。その結果、CD45+Sca1+X+細胞は、CD45+Sca1+X-細胞と比較して、強い線維化誘導能を有している細胞群は存在しなかった（参照：図２５）。しかしながら、C1q抗体陽性でソーティングした細胞は常に線維化誘導能がコントロールレベルまで完全に抑制されている事実が判明した。
【００２９】
（CD45+Sca1+細胞と胚性線維芽細胞の共培養を用いた抗C1q抗体投与の影響の検討）
上記の結果をさらに検証するために以下の実験を行った。
ソーティングして回収したCD45+Sca1+細胞とCOL/LUC-Tg 由来MEFを共培養し、そこに抗C1q抗体の濃度を振って添加し、48時間後のルシフェラーゼアッセイにて線維化誘導能を評価した（参照：図２６、図２７）。
抗C1q抗体の投与により、CD45+Sca1+細胞のcollagen1α2の発現誘導が濃度依存的に抑制された（参照：図２８）。TGF-βは陽性コントロールとして使用した。
【００３０】
（CD45+Sca1+C1q+細胞の表面マーカーの検討）
以上の結果から、骨髄由来のCD45+Sca1+C1q+細胞が線維化を誘導する細胞であると判断し、さらに、その性質について検討を行った。
野生型のC57BL/6JマウスにCAG-EGFPマウスの骨髄を移植した骨髄移植モデルを作成し、マルチカラーフローサイトメトリー法にて検討を行った（参照：図２９）。
CD45+Sca1+C1q+細胞には、さらに、CCR8が発現していることを確認した（参照：図３０、３１、３２）。
【００３１】
（CD45+Sca1+C1q+CCR8+細胞の表面マーカーの検討）
CD45+Sca1+C1q+CCR8+細胞に着目し、その発現を腎臓、脾臓、骨髄および血液で検討した。前記骨髄移植モデルを用いて、マルチカラーフローサイトメトリー法にて検討を行った（参照：図３３）。
同細胞は、腎臓および血液においても検出できた（参照：図３４）。
【００３２】
（CD45+Sca1+C1q+CCR8+細胞の臓器線維化のマーカーとしての評価）
前記臓器線維化モデル（参照：図３５）を使用して、血液中のCD45+Sca1+C1q+CCR8+細胞が、臓器線維化のバイオマーカーとなりうるかについて検討した。心臓より採血を行い、フローサイトメトリー法を用いて解析した。
CD45+Sca1+C1q+CCR8+細胞は、線維化の進行に伴い有意に増加しており、臓器線維化のマーカーとなることを確認した（参照：図３６）。
【実施例３】
【００３３】
（ヒトにおける線維化マーカーの確認）
ヒトにおいてもCD45+Sca1+C1q+CCR8+細胞が検出可能かを評価した。なお、Sca1は、ヒトには存在しないため、CD45+C1q+ CCR8 + 細胞で検討した。
【００３４】
（ヒトにおける線維化評価）
維持透析症例及び対照健常者より得た血液試料を用いて、フローサイトメトリー法にて検討を行った。
健常者においてもCD45+C1q+ CCR8 + 細胞は、検出可能であり、腎不全状態にて増加した（参照：図３７）。透析症例は、腎線維化および心線維化が進行した症例群であり、ヒトにおいてもCD45+C1q+CCR8+細胞が、臓器線維化のマーカーとなることを確認した（参照：図３７）。
【００３５】
（総論）
以上の実施例１〜３の結果により、以下の各陽性細胞を被験者の試料中から検出することにより、臓器の線維化を判定することができる。
（１）CD45+C1q+CCR8+細胞
（２）CD45+C1q+細胞
（３）C1q+CCR8+細胞
（４）CD45+CCR8+細胞
（５）CD45+C1q+CCR8+Sca1+細胞
（６）CD45+C1q+Sca1+細胞
（７）C1q+CCR8+Sca1+細胞
（８）CD45+CCR8+Sca1+細胞
（９）CD45+Sca1+細胞
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明では、新規な線維化判定方法を提供できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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