(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクチビンとアクチビンＡ受容体タイプＩ（ＡＣＶＲ１）との相互作用を阻害する結合阻害物質、又はアクチビンの発現を抑制する核酸を有効成分として含有し、
前記結合阻害物質が、下記（１）〜（５）からなる群から選ばれる、進行性骨化性線維異形成症の予防剤又は治療剤：
（１）アクチビン受容体の細胞外領域の全部又はリガンド結合ドメインを含む細胞外領域の一部からなるポリペプチド断片、
（２）アクチビン受容体の改変体の細胞外領域の全部又はリガンド結合ドメインを含む細胞外領域の一部からなるポリペプチド断片、
（３）（１）又は（２）のポリペプチド断片と、ヒト由来の抗体のＦｃ領域とが、直接又はリンカー配列を介して連結したポリペプチド断片、
（４）アクチビンに対する抗体、及び
（５）アクチビンに対する抗体の抗原結合部位を含む抗体断片。
【請求項２】
前記有効成分が前記結合阻害物質であり、
当該結合阻害物質が、（１）アクチビン受容体の細胞外領域の全部又はリガンド結合ドメインを含む細胞外領域の一部からなるポリペプチド断片、（２）アクチビン受容体の改変体の細胞外領域の全部又はリガンド結合ドメインを含む細胞外領域の一部からなるポリペプチド断片、及び（３）（１）又は（２）のポリペプチド断片と、ヒト由来の抗体のＦｃ領域とが、直接又はリンカー配列を介して連結したポリペプチド断片からなる群から選ばれる、請求項１に記載の予防剤又は治療剤。
【請求項３】
前記（１）及び（２）に記載のアクチビン受容体が、ＡＣＶＲ２Ａである、請求項１又は２に記載の予防剤又は治療剤。
【請求項４】
前記（１）及び（２）に記載のアクチビン受容体が、ＡＣＶＲ２Ｂである、請求項１又は２に記載の予防剤又は治療剤。
【請求項５】
前記有効成分が前記結合阻害物質であり、
当該結合阻害物質が、（４）アクチビンに対する抗体、及び（５）アクチビンに対する抗体の抗原結合部位を含む抗体断片からなる群から選ばれる、請求項１に記載の予防剤又は治療剤。
【請求項６】
前記（４）及び（５）に記載のアクチビンに対する抗体が、インヒビンβＡ鎖を抗原とする抗体である、請求項１又は５に記載の予防剤又は治療剤。
【請求項７】
前記（４）及び（５）に記載のアクチビンに対する抗体が、インヒビンβＢ鎖を抗原とする抗体である、請求項１又は５に記載の予防剤又は治療剤。
【請求項８】
前記有効成分が前記核酸であり、
当該核酸が、アクチビンの遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びリボザイムからなる群から選ばれる、請求項１に記載の予防剤又は治療剤。
【請求項９】
前記アクチビンの遺伝子が、インヒビンβＡ鎖又はインヒビンβＢ鎖をエンコードする遺伝子である、請求項８に記載の予防剤又は治療剤。
【請求項１０】
ＡＣＶＲ１にアミノ酸変異を有する患者用である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の予防剤又は治療剤。
【請求項１１】
前記アミノ酸変異が、前記ＡＣＶＲ１のＧＳドメイン又はキナーゼドメインにおけるアミノ酸変異を含む、請求項１０に記載の予防剤又は治療剤。
【請求項１２】
前記ＧＳドメイン又はキナーゼドメインにおけるアミノ酸変異が、配列番号１０に記載のアミノ酸配列における第１９６番目のアミノ酸残基がプロリンであるアミノ酸変異、第１９７番目のアミノ酸残基がロイシンであり第１９８番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸変異、第２０２番目のアミノ酸残基がイソロイシンであるアミノ酸変異、第２０６番目のアミノ酸残基がヒスチジンであるアミノ酸変異、第２０７番目のアミノ酸残基がグルタミン酸であるアミノ酸変異、第２５８番目のアミノ酸残基がグリシン又はセリンであるアミノ酸変異、第３２５番目のアミノ酸残基がアラニンであるアミノ酸変異、第３２８番目のアミノ酸残基がグルタミン酸、アルギニン又はトリプトファンであるアミノ酸変異、第３５６番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸であるアミノ酸変異、及び第３７５番目のアミノ酸残基がプロリンであるアミノ酸変異からなる群から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸変異を含む、請求項１１に記載の予防剤又は治療剤。
【請求項１３】
前記ＡＣＶＲ１のＧＳドメインにおけるアミノ酸変異を含み、前記ＧＳドメインにおけるアミノ酸変異が、配列番号１０に記載のアミノ酸配列における第２０６番目のアミノ酸残基がヒスチジンであるアミノ酸変異を含む、請求項１１に記載の予防剤又は治療剤。
【請求項１４】
異所性骨化の症状若しくは進行を抑制する薬剤、又は異所性骨化の発症を回避若しくは抑制する薬剤である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の予防剤又は治療剤。
【請求項１５】
進行性骨化性線維異形成症の予防剤若しくは治療剤、又はそれらの候補物質のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下、アクチビンとアクチビンＡ受容体タイプＩ（ＡＣＶＲ１）との相互作用を測定し、第１の結合力を求める工程と、
前記被験物質の非存在下において測定した前記相互作用から求められた第２の結合力と比較し、前記第１の結合力が前記第２の結合力より弱いとき、前記被験物質を候補物質として選択する工程と、を含むか、又は、
被験物質の存在下、アクチビンが結合することによる変異型ＡＣＶＲ１を介したシグナル伝達の強度を測定し、第１のシグナル強度を求める工程と、
前記被験物質の非存在下において測定した前記シグナル伝達の強度から求められた第２のシグナル強度と比較し、前記第１のシグナル強度が前記第２のシグナル強度より弱いとき、前記被験物質を候補物質として選択する工程と、を含む、スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、進行性骨化性線維異形成症の予防剤及び治療剤に関する。より詳細には、本発明は、アクチビンの活性を抑制することで進行性骨化性線維異形成症の主症状であるフレアアップ、並びに／又は、異常な軟骨若しくは骨の形成及び成長を抑制する、予防剤及び予防方法、並びに、治療剤及び治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）は、炎症又は痛みを伴う腫脹（「フレアップ」とも言う。）と異所性の骨化（「異所性骨化」とも言う。）とを主症状とする遺伝性の疾患である。典型的な進行性骨化性線維異形成症の患者（ＦＯＰ患者）では、小児期又は学童期からフレアアップが出現し、フレアアップの消失に伴って異所性の骨化が生じる。この頃から全身の骨格筋、筋膜、腱及び靭帯等の線維性組織が進行性かつ異所性に骨化し、関節の拘縮、変形又は可動性障害が生じる。【０００３】
ＦＯＰにおける異所性骨化の特徴は、筋等の軟部組織の破壊及び再生によって異所性骨化が急激に誘発される点にある（非特許文献１）。ＦＯＰ患者に見られる異所性骨化では、軟骨内骨化（内軟骨性骨化）とよばれる過程を経ることが報告されている（非特許文献２）。軟骨内骨化は、まず軟骨が形成され、その後骨に置き換わる現象である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，２００５，１１６，ｅ６５４−６６１．
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．Ａｍ．，１９９３，７５（２），２２０−２３０．
【非特許文献３】Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２００６，３８，５２５−５２７．
【非特許文献４】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２００９，２８４（１１），７１４９−７１５６．
【非特許文献５】Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．２０１０，２５（６），１２０８−１２１５．
【非特許文献６】Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９９３，８（１０），２８７９−２８８７．
【非特許文献７】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８，２７３（４０），２５６２８−２５６３６．
【非特許文献８】ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１３，８（６），１２９１−１３０２．
【非特許文献９】Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２０１３，２３（１１），３２４８−３２５２．
【非特許文献１０】Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，２０１２，１９（７），７８６−７９０．
【非特許文献１１】Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２０１１，１７（４），４５４−４６０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＦＯＰは常染色体優性遺伝形式をとる遺伝子疾患である。ＦＯＰは、アクチビンＡ受容体タイプＩ（ＡＣＶＲ１）の突然変異が原因であることが報告されている（非特許文献３）。ＡＣＶＲ１は、Ｉ型骨形成タンパク質受容体（ＢＭＰ受容体）のひとつである。ＡＣＶＲ１は、ＢＭＰの受容体として細胞内にシグナルを伝達するセリン／スレオニンキナーゼである。ＦＯＰ患者でみられる変異型ＡＣＶＲ１は、ＢＭＰ非依存的にシグナルが伝達されること（非特許文献４及び５）、及び正常なＡＣＶＲ１（野生型ＡＣＶＲ１）と比較してＢＭＰに対する反応性が亢進していること（非特許文献５）が報告されている。【０００６】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーは２０種類を超える多様なメンバーから構成され、ＢＭＰファミリーとＴＧＦ−βファミリーとに大別される。例えばＢＭＰ−７はＢＭＰファミリーに属するサイトカインの一種である。ＢＭＰは、膜貫通型セリン／スレオニンキナーゼであるＩ型及びＩＩ型の２種類の受容体と複合体を形成することで、細胞内にシグナルを伝達する。一方アクチビンは、ＴＧＦ−βファミリーに分類されるリガンドであり、インヒビンβ鎖からなる二量体である。ＢＭＰ同様にアクチビンもＩ型及びＩＩ型の受容体と複合体を形成することで細胞内にシグナルを伝達する。しかし、アクチビンとＢＭＰとでは、シグナルを伝達する受容体分子が異なることが知られている。【０００７】
Ｉ型ＢＭＰ受容体の一種であるＡＣＶＲ１の遺伝子は、ヒトＩＩ型アクチビン受容体及び線虫Ｄａｆ−１と配列相同性のある遺伝子を探索した結果、見出された遺伝子である。そのため、ＡＣＶＲ１はアクチビン受容体様キナーゼ２とも呼ばれている（非特許文献６）。しかしながら、その後の解析によって、ＡＣＶＲ１の生理的なリガンドは、ＢＭＰ−７等のＢＭＰファミリーのリガンドであることが示されている（非特許文献７）。さらに、アクチビンはＡＣＶＲ１を介してシグナルを伝達する活性がないことが示されている（非特許文献７）。【０００８】
現在、ＦＯＰの治療には、ステロイド、非ステロイド性消炎鎮痛剤、ビスフォスフォネート等が使用されている。しかしながら、異所性骨化の進行を抑制する、明らかな有効性が確認された治療薬は存在しない。【０００９】
ＦＯＰの治療法として、ＡＣＶＲ１のキナーゼ活性を阻害する化合物が研究されている（非特許文献８及び９）。これらの化合物には、ＦＯＰの病態の一面を模倣した動物モデルを用いた実験で、異所性骨化を抑制する作用が確認されているものがある。【００１０】
別の知見として、ＲＮＡ干渉技術を用いてＦＯＰ患者で見られる変異型ＡＣＶＲ１を選択的に発現抑制すると、ＦＯＰ患者由来の脱落乳歯歯髄幹細胞の骨分化が抑制されることが報告されている（非特許文献１０）。【００１１】
ＦＯＰの病態の一面を模倣した動物モデルを用いた実験で、レチノイン酸受容体γアゴニストが、異所性骨化を抑制することが示されている（非特許文献１１）。【００１２】
上記のように、これまでに報告されている治療法は、いずれもＡＣＶＲ１の発現若しくは酵素活性を抑制すること、又はＡＣＶＲ１の下流でシグナル伝達を阻害することに基づいた方法である。
一方、ＦＯＰの原因となる変異型ＡＣＶＲ１は、正常なＡＣＶＲ１と比較してＢＭＰシグナルの伝達能が亢進していること、及びＢＭＰ非依存的にシグナルを伝達することが報告されている。（非特許文献４及び５）、しかし、これらの現象とＦＯＰの病態との関係は明確ではない。【００１３】
以上のように、ＦＯＰの発症のメカニズムは未だ不明であり、ＦＯＰの発症の抑制又は治療に用いられる医薬品は見出されていない。【００１４】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）の予防剤及び／又は治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
アクチビンは、ＡＣＶＲ１にも結合するが、本来ＡＣＶＲ１ではなくアクチビンＡ受容体タイプＩＢ（ＡＣＶＲ１Ｂ）を介してシグナルを伝達するリガンドである。しかしながら、本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ＦＯＰ患者由来の細胞では、アクチビンが、変異型ＡＣＶＲ１を介しても細胞内にシグナルを伝達し、この異常なシグナル伝達がＦＯＰ患者で認められる異所性の軟骨誘導及び骨誘導の一因であることを見出した。尚、本明細書において、「アクチビンがＡＣＶＲ１に結合する」とは、アクチビンがＡＣＶＲ１を含む受容体複合体に結合することを含む。更に、上述の独自の知見に基づき、アクチビンのＡＣＶＲ１に対する結合活性を抑制する物質又はアクチビンの発現を抑制する物質が、ＦＯＰ患者から樹立したｉＰＳ細胞に由来する間葉系幹細胞様の細胞における軟骨細胞への分化誘導を抑制する効果、すなわち異所性骨化の発症若しくは進行を抑制する効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。【００１６】
すなわち、本発明は、以下に関する。
［１］アクチビンとアクチビンＡ受容体タイプＩ（ＡＣＶＲ１）との相互作用を阻害する結合阻害物質、又はアクチビンの発現を抑制する発現抑制物質を有効成分として含有する、進行性骨化性線維異形成症の予防剤又は治療剤。
［２］上記結合阻害物質が、アクチビン受容体、その改変体、及びそれらの部分配列を含むポリペプチド断片、
フォリスタチン、フォリスタチン様タンパク質、それらの改変体、及びそれらの部分配列を含むポリペプチド断片、
アクチビンに対する抗体及び抗原結合部位を含むその抗体断片、並びに、
インヒビン及びその改変体、
からなる群から選ばれる、上記［１］に記載の予防剤又は治療剤。
［３］上記発現抑制物質が、アクチビンの遺伝子発現を抑制する核酸である、上記［１］に記載の予防剤又は治療剤。
［４］上記アクチビンの遺伝子発現を抑制する核酸が、アクチビンの遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びリボザイムからなる群から選ばれる、上記［３］に記載の予防剤又は治療剤。
［５］ＡＣＶＲ１にアミノ酸変異を有する患者用である、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の予防剤又は治療剤。
［６］上記アミノ酸変異が、上記ＡＣＶＲ１のＧＳドメイン又はキナーゼドメインにおけるアミノ酸変異を含む、上記［５］に記載の予防剤又は治療剤。
［７］上記ＧＳドメイン又はキナーゼドメインにおけるアミノ酸変異が、配列番号１０に記載のアミノ酸配列における第１９６番目のアミノ酸残基がプロリンであるアミノ酸変異、第１９７番目のアミノ酸残基がロイシンであり第１９８番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸変異、第２０２番目のアミノ酸残基がイソロイシンであるアミノ酸変異、第２０６番目のアミノ酸残基がヒスチジンであるアミノ酸変異、第２０７番目のアミノ酸残基がグルタミン酸であるアミノ酸変異、第２５８番目のアミノ酸残基がグリシン又はセリンであるアミノ酸変異、第３２５番目のアミノ酸残基がアラニンであるアミノ酸変異、第３２８番目のアミノ酸残基がグルタミン酸、アルギニン又はトリプトファンであるアミノ酸変異、第３５６番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸であるアミノ酸変異、及び第３７５番目のアミノ酸残基がプロリンであるアミノ酸変異からなる群から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸変異を含む、上記［６］に記載の予防剤又は治療剤。
［８］上記ＡＣＶＲ１のＧＳドメインにおけるアミノ酸変異を含み、上記ＧＳドメインにおけるアミノ酸変異が、配列番号１０に記載のアミノ酸配列における第２０６番目のアミノ酸残基がヒスチジンであるアミノ酸変異を含む、上記［６］に記載の予防剤又は治療剤。
［９］進行性骨化性線維異形成症の予防剤若しくは治療剤、又はそれらの候補物質のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下、アクチビンとアクチビンＡ受容体タイプＩ（ＡＣＶＲ１）との相互作用を測定し、第１の結合力を求める工程と、
上記被験物質の非存在下において測定した上記相互作用から求められた第２の結合力と比較し、上記第１の結合力が上記第２の結合力より弱いとき、上記被験物質を候補物質として選択する工程と、を含むか、又は、
被験物質の存在下、アクチビンが結合することによる変異型ＡＣＶＲ１を介したシグナル伝達の強度を測定し、第１のシグナル強度を求める工程と、
上記被験物質の非存在下において測定した上記シグナル伝達の強度から求められた第２のシグナル強度と比較し、上記第１のシグナル強度が上記第２のシグナル強度より弱いとき、上記被験物質を候補物質として選択する工程と、を含む、スクリーニング方法。
［１０］上記［９］に記載のスクリーニング方法によって選択された被験物質を有効成分として含有する、進行性骨化性線維異形成症の予防剤又は治療剤。
［１１］異所性骨化の症状若しくは進行を抑制する薬剤、又は異所性骨化発症を回避若しくは抑制する薬剤である、上記〔１〕〜〔８〕及び〔１０〕のいずれかに記載の予防剤又は治療剤。【００１７】
さらに本発明は、以下に関する。
［１２］アクチビンとアクチビンＡ受容体タイプＩ（ＡＣＶＲ１）との相互作用を阻害する結合阻害物質、又はアクチビンの発現を抑制する発現抑制物質の有効量を、哺乳動物に投与することを含む、進行性骨化性線維異形成症の予防又は治療方法。
［１３］上記結合阻害物質が、アクチビン受容体、その改変体、及びそれらの部分配列を含むポリペプチド断片、
フォリスタチン、フォリスタチン様タンパク質、それらの改変体、及びそれらの部分配列を含むポリペプチド断片、
アクチビンに対する抗体及び抗原結合部位を含むその抗体断片、並びに、
インヒビン及びその改変体、
からなる群から選ばれる、上記［１２］に記載の方法。
［１４］上記発現抑制物質が、アクチビンの遺伝子発現を抑制する核酸である、上記［１２］に記載の方法。
［１５］上記アクチビンの遺伝子発現を抑制する核酸が、アクチビンの遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びリボザイムからなる群から選ばれる、上記［１４］に記載の方法。
［１６］上記哺乳動物がヒトである、上記［１２］〜［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］上記ヒトがＡＣＶＲ１にアミノ酸変異を有する、上記［１６］に記載の方法。
［１８］上記アミノ酸変異が、上記ＡＣＶＲ１のＧＳドメイン又はキナーゼドメインにおけるアミノ酸変異を含む、上記［１７］に記載の方法。
［１９］上記ＧＳドメイン又はキナーゼドメインにおけるアミノ酸変異が、配列番号１０に記載のアミノ酸配列における第１９６番目のアミノ酸残基がプロリンであるアミノ酸変異、第１９７番目のアミノ酸残基がロイシンであり第１９８番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸変異、第２０２番目のアミノ酸残基がイソロイシンであるアミノ酸変異、第２０６番目のアミノ酸残基がヒスチジンであるアミノ酸変異、第２０７番目のアミノ酸残基がグルタミン酸であるアミノ酸変異、第２５８番目のアミノ酸残基がグリシン又はセリンであるアミノ酸変異、第３２５番目のアミノ酸残基がアラニンであるアミノ酸変異、第３２８番目のアミノ酸残基がグルタミン酸、アルギニン又はトリプトファンであるアミノ酸変異、第３５６番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸であるアミノ酸変異、及び第３７５番目のアミノ酸残基がプロリンであるアミノ酸変異からなる群から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸変異を含む、上記［１８］に記載の方法。
［２０］上記ＡＣＶＲ１のＧＳドメインにおけるアミノ酸変異を含み、上記ＧＳドメインにおけるアミノ酸変異が、配列番号１０に記載のアミノ酸配列における第２０６番目のアミノ酸残基がヒスチジンであるアミノ酸変異を含む、上記［１８］に記載の方法。
［２１］進行性骨化性線維異形成症の予防又は治療に使用するための、アクチビンとアクチビンＡ受容体タイプＩ（ＡＣＶＲ１）との相互作用を阻害する結合阻害物質。
［２２］アクチビン受容体、その改変体、及びそれらの部分配列を含むポリペプチド断片、
フォリスタチン、フォリスタチン様タンパク質、それらの改変体、及びそれらの部分配列を含むポリペプチド断片、
アクチビンに対する抗体及び抗原結合部位を含むその抗体断片、並びに、
インヒビン及びその改変体、
からなる群から選ばれる、上記［２１］に記載の結合阻害物質。
［２３］進行性骨化性線維異形成症の予防又は治療に使用するための、アクチビンの発現を抑制する発現抑制物質。
［２４］アクチビンの遺伝子発現を抑制する核酸である、上記［２３］に記載の発現抑制物質。
［２５］上記アクチビンの遺伝子発現を抑制する核酸が、アクチビンの遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びリボザイムからなる群から選ばれる、上記［２４］に記載の発現抑制物質。
［２６］進行性骨化性線維異形成症の予防剤又は治療剤の製造における、アクチビンとアクチビンＡ受容体タイプＩ（ＡＣＶＲ１）との相互作用を阻害する結合阻害物質、又はアクチビンの発現を抑制する発現抑制物質の使用。
［２７］上記結合阻害物質が、アクチビン受容体、その改変体、及びそれらの部分配列を含むポリペプチド断片、
フォリスタチン、フォリスタチン様タンパク質、それらの改変体、及びそれらの部分配列を含むポリペプチド断片、
アクチビンに対する抗体及び抗原結合部位を含むその抗体断片、並びに、
インヒビン及びその改変体、
からなる群から選ばれる、上記［２６］に記載の使用。
［２８］上記発現抑制物質が、アクチビンの遺伝子発現を抑制する核酸である、上記［２６］に記載の使用。
［２９］上記アクチビンの遺伝子発現を抑制する核酸が、アクチビンの遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びリボザイムからなる群から選ばれる、上記［２８］に記載の使用。
［３０］以下の工程（１）及び工程（２）を含む方法によって調製される、進行性骨化性線維異形成症モデル動物：
（１）ＡＣＶＲ１にアミノ酸変異を有するｉＰＳ細胞から調製された間葉系幹細胞様の細胞を含む細胞集団を、アクチビンＡの共存下に培養し、三次元軟骨ペレットを得る工程、
（２）工程（１）で得られた三次元軟骨ペレットを、免疫不全非ヒト哺乳動物に皮下投与する工程。
［３１］以下の工程（１）〜（３）を含む、進行性骨化性線維異形成症の予防剤若しくは治療剤、又はそれらの候補物質の評価方法：
（１）上記［３０］に記載のモデル動物に被験物質を投与する工程、
（２）上記モデル動物において、異所性に形成された骨軟骨塊の量を評価する工程、及び、
（３）工程（２）で評価された上記骨軟骨塊の量が基準よりも小さい場合に、当該被験物質を進行性骨化性線維異形成症の予防剤若しくは治療剤、又はそれらの候補物質として同定する工程。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、進行性骨化性線維異形成症の予防剤及び／又は治療剤を提供することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＦＯＰ患者由来の細胞及び変異修復株由来の細胞における、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現に由来する相対発光強度を示すグラフである。
【図２】ＦＯＰ患者由来の細胞及び変異修復株由来の細胞における、リン酸化ＳＭＡＤ１／５／８及び総ＳＭＡＤ１／５／８の量を示すウエスタンブロットの写真である。
【図３】ＦＯＰ患者由来の細胞及び変異修復株由来の細胞から分化した軟骨細胞をアルシアンブルーで染色した写真である。
【図４】ＦＯＰ患者由来の細胞及び変異修復株由来の細胞から分化した軟骨細胞における、硫酸化グリコサミノグリカンの量を示すグラフである。
【図５】ＦＯＰ患者由来の細胞における、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現に由来する相対発光強度を示すグラフである。
【図６】ＦＯＰ患者由来の細胞から分化した軟骨細胞をアルシアンブルーで染色した写真（Ａ）及びＦＯＰ患者由来の細胞から分化した軟骨細胞における、硫酸化グリコサミノグリカンの量を示すグラフ（Ｂ）である。
【図７】ＦＯＰ患者由来の細胞から分化した軟骨細胞における、硫酸化グリコサミノグリカンの量を示すグラフである。
【図８】野生型ＡＣＶＲ１又は変異型ＡＣＶＲ１の遺伝子を発現させたＵ２ＯＳ細胞における、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現に由来する発光強度を示すグラフである。
【図９】ＦＯＰ患者由来の細胞及び変異修復株由来の細胞における、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現に由来する相対発光強度を示すグラフである。
【図１０】ＦＯＰ患者由来の軟骨ペレット又は変異修復株由来の軟骨ペレットのマウスへの移植実験の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００２１】
本実施形態における進行性骨化性線維異形成症の予防剤又は治療剤（以下、「ＦＯＰ予防剤／治療剤」という場合がある。）は、アクチビンとアクチビンＡ受容体タイプＩ（ＡＣＶＲ１）との相互作用を阻害する結合阻害物質、又はアクチビンの発現を抑制する発現抑制物質を有効成分として含有する。
【００２２】
進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）とは、典型的には小児期から全身の結合組織が進行性かつ異所性に骨化し（異所性骨化）、四肢及び体幹の可動性の低下若しくは変形を生じる遺伝子疾患を意味する。異所性骨化とは、本来は骨形成が起こらない組織において認められる骨化を意味する。ＦＯＰでは進行性に全身の結合組織の異所性骨化が起こることで運動機能が著しく障害される。本発明者らは、アクチビンが変異型ＡＣＶＲ１に結合することによって細胞内にシグナルが伝達されること及び、このシグナル伝達がＦＯＰ患者で認められる異所性の軟骨誘導及び骨誘導の一因であることを見出している。なお、アクチビンは、ＡＣＶＲ１と結合するが、野生型ＡＣＶＲ１と結合しても、ＡＣＶＲ１の下流にシグナルを伝達しないことが知られている。ＦＯＰ予防剤／治療剤は、アクチビンとＡＣＶＲ１との相互作用を阻害すること、又はアクチビンの発現を抑制することでＦＯＰの主症状であるフレアアップ、並びに／又は、異常な軟骨若しくは骨の形成及び成長を抑制する薬剤である。ＦＯＰ予防剤／治療剤は、例えば、アクチビンのＡＣＶＲ１に対する結合阻害剤、又は、アクチビンの発現抑制剤として把握することもできる。上記変異型ＡＣＶＲ１の詳細については後述する。
【００２３】
進行性骨化性線維異形成症の予防とは、フレアアップ又は異所性骨化が発症することを回避又は抑制することを意味する。例えば、以下の処置によって上記予防が達成される。
（１）フレアアップ又は異所性骨化を発症する前から日常的にＦＯＰ予防剤／治療剤を投薬する。
（２）外傷及び感染等のフレアアップを発症する要因が生じた際にＦＯＰ予防剤／治療剤を投薬し、フレアップの発症を回避又は抑制する。
（３）炎症、痛み、フレアアップ等が生じたときにＦＯＰ予防剤／治療剤を投薬し、異所性骨化の発症を回避又は抑制する。
【００２４】
進行性骨化性線維異形成症の治療とは、進行性骨化性線維異形成症の症状の治癒、症状の改善、症状の軽減、又は症状の進行の抑制を意味する。例えば、以下に示す事項が上記治療に含まれる。
（１）フレアアップの症状の抑制、フレアアップが発症している期間の短縮。
（２）フレアアップを発症した後の異所性骨化の症状の抑制。
（３）通常、進行性の経過をとる異所性骨化の症状又は進行の抑制。
【００２５】
アクチビンとは、インヒビンβ鎖のホモダイマー又はヘテロダイマーを意味する。インヒビンβ鎖としては、例えば、βＡ鎖（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００２１９２、配列番号１、２）、βＢ鎖（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００２１９３、配列番号３、４）、βＣ鎖（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００５５３８、配列番号５、６）、βＥ鎖（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０３１４７９、配列番号７、８）が挙げられる。上記アクチビンとしては、例えば、アクチビンＡ（βＡ鎖のホモダイマー）、アクチビンＢ（βＢ鎖のホモダイマー）、アクチビンＡＢ（βＡ鎖とβＢ鎖とのヘテロダイマー）が挙げられる。インヒビンβ鎖は、ｍＲＮＡからの翻訳後、まずＮ末端側の約１８〜３０アミノ酸残基のシグナルペプチドが切断されてｐｒｏ体となる。インヒビンβ鎖の上記ｐｒｏ体は、更にＮ末端側の約２００〜３００アミノ酸残基のポリペプチドが切断され除かれることで成熟したインヒビンβ鎖となる。
【００２６】
アクチビンＡ受容体タイプＩ（ＡＣＶＲ１）は、Ｉ型ＢＭＰ受容体の一種である。ＡＣＶＲ１は、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００１１０５（配列番号９）又はそのアイソフォームであるＮＭ＿００１１１１０６７（配列番号２１）に記載の核酸配列によってコードされる受容体である。ＡＣＶＲ１のアミノ酸配列は、例えば、配列番号１０又は２２に記載のアミノ酸配列が挙げられる。
【００２７】
アクチビンＡ受容体タイプＩＢ（ＡＣＶＲ１Ｂ）は、アクチビン受容体の一種である。アクチビンは生体内において、ＡＣＶＲ１Ｂを介してシグナルを伝達する。ＡＣＶＲ１Ｂとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００４３０２（ｖａｒｉａｎｔ  １，ｉｓｏｆｏｒｍ  ａ；配列番号２３）、ＮＭ＿０２０３２７（ｖａｒｉａｎｔ  ２，  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｂ；配列番号２５）、ＮＭ＿０２０３２８（ｖａｒｉａｎｔ  ３，  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｃ；配列番号２７）に記載の核酸配列によってコードされる受容体が挙げられる。ＡＣＶＲ１Ｂのアミノ酸配列としては、例えば、配列番号２４、配列番号２６及び配列番号２８に記載のアミノ酸配列が挙げられる。
【００２８】
アクチビンＡ受容体タイプＩＩは、アクチビンと結合して複合体を形成するタンパク質である。アクチビンＡ受容体タイプＩＩは、生体内において、当該複合体がＡＣＶＲ１Ｂを介してアクチビンのシグナルを伝達する。アクチビンＡ受容体タイプＩＩとしては、ＡＣＶＲ２Ａ（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００１６１６、配列番号１１、１２）及びＡＣＶＲ２Ｂ（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００１１０６、配列番号１３、１４）が挙げられる。
【００２９】
アクチビンとアクチビンＡ受容体タイプＩ（ＡＣＶＲ１）との相互作用を阻害する結合阻害物質（以下、「結合阻害物質」という場合がある。）は、アクチビンがリガンドとしてＡＣＶＲ１に結合することを阻害すること、又はアクチビンがリガンドとしてアクチビンＡ受容体タイプＩＩ（ＡＣＶＲ２Ａ若しくはＡＣＶＲ２Ｂ）と結合して複合体を形成し、当該複合体がＡＣＶＲ１に結合することを阻害することが可能であれば、特に制限されない。結合阻害物質としては、例えば、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのリガンドに対するＩ型又はＩＩ型受容体のリガンド結合部位を含む部分タンパク質（アクチビン受容体等）、フォリスタチン、フォリスタチン様タンパク質、アクチビンに対する抗体、インヒビン、及びこれらの部分配列を含むポリペプチド断片、並びに、後述するスクリーニング方法によってスクリーニングされうる物質（低分子化合物、ポリペプチド等）等が挙げられる。なお、「結合阻害物質」は、ＦＯＰ予防剤／治療剤の投与対象の内在性のタンパク質等とは区別される外来性のタンパク質等を意味する。「外来性のタンパク質等」としては例えば、遺伝子工学的方法に準じて製造されたタンパク質等、単離又は精製されたタンパク質等が挙げられる。
【００３０】
結合阻害物質は、アクチビン受容体、その改変体、及びそれらの部分配列を含むポリペプチド断片、
フォリスタチン、フォリスタチン様タンパク質、それらの改変体、及びそれらの部分配列を含むポリペプチド断片、
アクチビンに対する抗体及び抗原結合部位を含むその抗体断片、並びに、
インヒビン、及びその改変体
からなる群から選ばれることが好ましい。
【００３１】
アクチビン受容体としては、例えば、アクチビンＡ受容体タイプＩ（ＡＣＶＲ１）、アクチビンＡ受容体タイプＩＢ（ＡＣＶＲ１Ｂ）、アクチビンＡ受容体タイプＩＩ（ＡＣＶＲ２Ａ又はＡＣＶＲ２Ｂ）が挙げられる。結合阻害物質としてのアクチビン受容体はアクチビンと結合して、アクチビンと内在性のＡＣＶＲ１との結合を阻害する。そのため、アクチビンが変異型ＡＣＶＲ１に結合することによるシグナル伝達が抑制されて、異所性の軟骨誘導及び骨誘導が抑制される。
ＡＣＶＲ１としては、例えば、配列番号１０又は２２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。ＡＣＶＲ１Ｂとしては、例えば配列番号２４、２６又は２８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。ＡＣＶＲ２Ａとしては、例えば配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。ＡＣＶＲ２Ｂとしては、例えば配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。結合阻害物質としてのアクチビン受容体は、ＡＣＶＲ２Ａ又はＡＣＶＲ２Ｂであることが好ましく、更にＡＣＶＲ２Ａであることが好ましい。
【００３２】
アクチビン受容体の改変体とは、アクチビン受容体を構成するアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、及び、アクチビン受容体を構成するアミノ酸配列に対して８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、アクチビンに対する結合能力を有するタンパク質を意味する。
【００３３】
好ましくは、上記ＡＣＶＲ１の改変体としては、
（１）配列番号１０で表されるアミノ酸配列、又は、配列番号１０で表されるアミノ酸配列における第２１〜第１２３番目に対応するアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、及び、
（２）配列番号１０で表されるアミノ酸配列、又は、配列番号１０で表されるアミノ酸配列における第２１〜第１２３番目に対応するアミノ酸配列に対して８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ、アクチビンに対する結合能力を有するタンパク質が挙げられる。
【００３４】
好ましくは、上記ＡＣＶＲ１Ｂの改変体としては、
（１）配列番号２４で表されるアミノ酸配列、配列番号２４で表されるアミノ酸配列における第２４〜第１２６番目に対応するアミノ酸配列、配列番号２６で表されるアミノ酸配列、配列番号２６に記載のアミノ酸配列における第１〜第７４番目に対応するアミノ酸配列、配列番号２８で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２８で表されるアミノ酸配列における第２４〜第１２６番目に対応するアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、及び、
（２）配列番号２４で表されるアミノ酸配列、配列番号２４で表されるアミノ酸配列における第２４〜第１２６番目に対応するアミノ酸配列、配列番号２６で表されるアミノ酸配列、配列番号２６に記載のアミノ酸配列における第１〜第７４番目に対応するアミノ酸配列、配列番号２８で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２８で表されるアミノ酸配列における第２４〜第１２６番目に対応するアミノ酸配列に対して８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ、アクチビンに対する結合能力を有するタンパク質が挙げられる。
【００３５】
好ましくは、上記ＡＣＶＲ２Ａ又はＡＣＶＲ２Ｂの改変体としては、
（１）配列番号１２で表されるアミノ酸配列、配列番号１２で表されるアミノ酸配列における第２０〜第１３５番目に対応するアミノ酸配列、配列番号１４で表されるアミノ酸配列、又は配列番号１４で表されるアミノ酸配列における第１９〜第１３４番目に対応するアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、及び、
（２）配列番号１２で表されるアミノ酸配列、配列番号１２で表されるアミノ酸配列における第２０〜第１３５番目に対応するアミノ酸配列、配列番号１４で表されるアミノ酸配列、又は配列番号１４で表されるアミノ酸配列における第１９〜第１３４番目に対応するアミノ酸配列に対して８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ、アクチビンに対する結合能力を有するタンパク質が挙げられる。
【００３６】
本明細書において、置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸（変異されたアミノ酸）の数は、改変体がアクチビンに対する結合能力を有する範囲であればよい。アミノ酸の変異の数は、少なくとも１個、好ましくは、１若しくは数個である。「１若しくは数個」は好ましくは１個〜５個、より好ましくは、１個〜３個、更に好ましくは１又は２個である。変異されたアミノ酸配列は、天然に存在するアミノ酸配列、すなわち、自然発生による変異を有するアミノ酸配列であってもよい。変異されたアミノ酸配列は、人為的に所望の部位又はアミノ酸残基に変異を導入したアミノ酸配列であってもよい。人為的に所望の部位又はアミノ酸残基に変異を導入する場合、天然に存在する変異体に準じて人為的に変異を導入してもよい。人為的な変異（置換、欠失、挿入又は付加）の導入は、例えば、ＰＣＲ法を用いた部位特異的変異導入法、又は既知の部位特異的変異導入法（Ｓｉｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いた常法によって、アミノ酸配列をコードする塩基配列を部分的に改変することによって導入することができる（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃｓｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．，  １９８４  Ｖｏｌ．８１，  ５６６２−５６６６；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （１９８９）  Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。
【００３７】
配列同一性は、参照配列（例えば、配列番号１０、１２、１４、２４、２６又は２８に記載のアミノ酸配列）に対して、クエリー配列（評価対象のアミノ酸配列）を、適切にアラインメントし、算出された値である。配列同一性は、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムで算出された値等が挙げられる。
【００３８】
上記配列同一性は、高いほど好ましく、具体的には、８５％以上、９０％以上、９５％以上、又は９８％以上である。
結合阻害物質としてのアクチビン受容体の改変体は、ＡＣＶＲ２Ａ又はＡＣＶＲ２Ｂの改変体であることが好ましい。
【００３９】
結合阻害物質としてのアクチビン受容体又はその改変体の部分配列を含むポリペプチド断片は、ＡＣＶＲ１と、アクチビン又はアクチビン及びアクチビンＡ受容体タイプＩＩ（ＡＣＶＲ２Ａ若しくはＡＣＶＲ２Ｂ）の複合体と、の結合と競合し得るものであればよく、例えば、膜型の受容体、可溶型の受容体、好ましくは可溶型の受容体が挙げられる。ここで膜型の受容体としては、例えば細胞外のリガンド結合ドメイン及び膜貫通領域を有し、細胞内領域の全部又はＩ型受容体との結合に必要な領域を含む細胞内領域の一部を欠失したＡＣＶＲ２Ａ又はＡＣＶＲ２Ｂが挙げられる。可溶型の受容体としては、例えばＡＣＶＲ２Ａ、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＣＶＲ１及びＡＣＶＲ１Ｂからなる群より選択される受容体の細胞外領域の全部又はリガンド結合ドメインを含む細胞外領域の一部からなるタンパク質、及びそれらが例えばヒト由来の抗体のＦｃ領域と直接又はリンカー配列を介して連結されたタンパク質が挙げられる。
【００４０】
アクチビン受容体又はその改変体の部分配列を含むポリペプチド断片としては、好ましくは、アクチビン受容体又はその改変体の細胞外ドメインに対応するアミノ酸配列を有し、アクチビンに対する結合能力を有する、１００〜１４０アミノ酸残基のポリペプチド断片が挙げられる。当該ポリペプチド断片として、好ましくは１００〜１３５アミノ酸残基、より好ましくは１００〜１３０アミノ酸残基、更に好ましくは１００〜１２０アミノ酸残基のポリペプチド断片が挙げられる。
【００４１】
アクチビン受容体又はその改変体の細胞外ドメインに対応するアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１２に記載のアミノ酸配列における第２０〜第１３５番目に対応するアミノ酸配列、配列番号１４に記載のアミノ酸配列における第１９〜第１３４番目に対応するアミノ酸配列、配列番号１０に記載のアミノ酸配列における第２１〜第１２３番目に対応するアミノ酸配列、配列番号２４に記載のアミノ酸配列における第２４〜第１２６番目に対応するアミノ酸配列、配列番号２６に記載のアミノ酸配列における第１〜第７４番目に対応するアミノ酸配列、配列番号２８に記載のアミノ酸配列における第２４〜第１２６番目に対応するアミノ酸配列並びに、これらのアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列及びこれらのアミノ酸配列に対して８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
具体的には、Ｓｏｔａｔｅｒｃｅｐｔ（ＡＣＥ−０１１又は、ＡｃｔＲＩＩＡ−ＩｇＧ１−Ｆｃともいい、ＡＣＶＲ２Ａの部分ポリペプチドであり、配列番号１２に記載のアミノ酸配列の第２０番目〜第１３５番目のアミノ酸配列に相当する。；国際公開第２００６／０１２６２７号の配列番号１及びＢｏｎｅ  ４６  （２０１０）  １０８２−１０８８を参照）を例示することができる。
【００４２】
本実施形態において、上記ポリペプチド断片は、ポリペプチド断片単独の形態、上記ポリペプチド断片と担体タンパク質との融合タンパク質の形態も含むものとする。上記担体タンパク質としては、例えば、抗体のＦｃ断片、及び１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有する上記Ｆｃ断片の改変体等が挙げられる。このような融合タンパク質としては、例えば、配列番号１２に記載のアミノ酸配列における第２０〜第１３５番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド断片と、ヒト由来の抗体のＦｃ領域又は１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有する上記Ｆｃ領域の改変体等との融合タンパク質、配列番号１４に記載のアミノ酸配列における第１９〜第１３４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド断片と、ヒト由来の抗体のＦｃ領域又は１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有する上記Ｆｃ領域の改変体等との融合タンパク質、配列番号１０に記載のアミノ酸配列における第２１〜第１２３番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド断片と、ヒト由来の抗体のＦｃ領域又は１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有する上記Ｆｃ領域の改変体等との融合タンパク質、配列番号２４に記載のアミノ酸配列における第２４〜第１２６番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド断片と、ヒト由来の抗体のＦｃ領域又は１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有する上記Ｆｃ領域の改変体等との融合タンパク質、配列番号２６に記載のアミノ酸配列における第１〜第７４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド断片と、ヒト由来の抗体のＦｃ領域又は１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有する上記Ｆｃ領域の改変体等との融合タンパク質、配列番号２８に記載のアミノ酸配列における第２４〜第１２６番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド断片と、ヒト由来の抗体のＦｃ領域又は１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有する上記Ｆｃ領域の改変体等との融合タンパク質等が挙げられる。上記融合タンパク質は、上記ポリペプチド断片がＦｃ断片等の担体タンパク質とリンカーペプチドを介して連結された形態でもよい。リンカーペプチドとしては、比較的二次構造がとりにくい５、１５、２０、３０又は５０アミノ酸残基以上の人工の又は天然のアミノ酸配列を有するペプチドが考えられる。具体的には、例えばスレオニン若しくはセリンとグリシンとの単一配列、又は、スレオニン若しくはセリンとグリシンとの反復配列（例えば、ＴＧ４又はＳＧ４）を含むペプチドが挙げられる。
【００４３】
フォリスタチンとは、アクチビンに直接結合し、内在性のアンタゴニストとして機能するタンパク質である。すなわち、結合阻害物質としてのフォリスタチンはアクチビンと結合して、アクチビンとＡＣＶＲ１との結合を阻害する。そのため、アクチビンが変異型ＡＣＶＲ１に結合することによるシグナル伝達が抑制されて、異所性の軟骨誘導及び骨誘導が抑制される。フォリスタチンとしては、フォリスタチン３１７（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００６３５０、配列番号１５、１６）、及びフォリスタチン３４４（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０１３４０９、配列番号２９、３０）が挙げられる。上記配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるフォリスタチン３１７において第１番目〜第２９番目のアミノ酸配列に相当するシグナルペプチドが除去されたフォリスタチン２８８、配列番号３０で表されるアミノ酸配列からなるフォリスタチン３４４から第１番目〜第２９番目のアミノ酸配列に相当するシグナルペプチドが除去されたフォリスタチン３１５、上記フォリスタチン３１５のＣ末端の１２アミノ酸残基（配列番号３０で表されるアミノ酸配列の第３３３番目〜第３４４番目のアミノ酸配列）が除去されたフォリスタチン３０３も、本明細書におけるフォリスタチンの範疇である。
【００４４】
フォリスタチンの改変体とは、フォリスタチンを構成するアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、及び、フォリスタチンを構成するアミノ酸配列に対して８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、アクチビンに対する結合能力を有するタンパク質を意味する。
【００４５】
好ましくは、上記フォリスタチンの改変体としては、
（１）配列番号１６で表されるアミノ酸配列、配列番号１６で表されるアミノ酸配列において第１〜第２９番目のアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列、配列番号３０で表されるアミノ酸配列、配列番号３０で表されるアミノ酸配列において第１〜第２９番目のアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列、又は、配列番号３０で表されるアミノ酸配列において第１〜第２９番目のアミノ酸配列及び第３３３番目〜第３４４番目のアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、及び、
（２）配列番号１６で表されるアミノ酸配列、配列番号１６で表されるアミノ酸配列において第１〜第２９番目のアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列、配列番号３０で表されるアミノ酸配列、配列番号３０で表されるアミノ酸配列において第１〜第２９番目のアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列、又は、配列番号３０で表されるアミノ酸配列において第１〜第２９番目のアミノ酸配列及び第３３３番目〜第３４４番目のアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列に対して８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ、アクチビンに対する結合能力を有するタンパク質が挙げられる。
【００４６】
フォリスタチン様タンパク質とは、フォリスタチンに類似したアミノ酸配列を有し、アクチビンに結合し、内在性のアンタゴニストとして機能し得るタンパク質である。すなわち、結合阻害物質としてのフォリスタチン様タンパク質はアクチビンと結合して、アクチビンとＡＣＶＲ１との結合を阻害する。そのため、アクチビンが変異型ＡＣＶＲ１に結合することによるシグナル伝達が抑制されて、異所性の軟骨誘導及び骨誘導が抑制される。フォリスタチン様タンパク質としては、例えば、フォリスタチン様１（Ｆｏｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ  １又はＦＳＴＬ１ともいう；ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００７０８５  配列番号１７、１８）、フォリスタチン様３（Ｆｏｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ３、ＦＳＴＬ３又はＦＬＲＧともいう；ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００５８６０  配列番号１９、２０）が挙げられる。更に好ましくはフォリスタチン様３が挙げられる。
【００４７】
フォリスタチン様タンパク質の改変体とは、フォリスタチン様タンパク質を構成するアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、及び、フォリスタチン様タンパク質を構成するアミノ酸配列に対して８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、アクチビンに対する結合能力を有するタンパク質を意味する。
【００４８】
好ましくは、上記フォリスタチン様タンパク質の改変体としては、
（１）配列番号１８若しくは配列番号２０で表されるアミノ酸配列、配列番号１８で表されるアミノ酸配列において第１〜第２０番目のアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列、又は、配列番号２０で表されるアミノ酸配列において第１〜第２６番目のアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、及び、
（２）配列番号１８若しくは配列番号２０で表されるアミノ酸配列、配列番号１８で表されるアミノ酸配列において第１〜第２０番目のアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列、配列番号２０で表されるアミノ酸配列において第１〜第２６番目のアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列に対して８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ、アクチビンに対する結合能力を有するタンパク質が挙げられる。
【００４９】
フォリスタチン又はフォリスタチン様タンパク質の部分配列を含むポリペプチド断片は、フォリスタチン又はフォリスタチン様タンパク質のアクチビンに結合するアミノ酸領域に対応するアミノ酸配列を有し、アクチビンに対する結合能力を有する、５０〜２２０アミノ酸残基のポリペプチド断片であることが好ましい。具体的には、アクチビンに結合するアミノ酸領域に対応するアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１６に記載のアミノ酸配列における第３０〜第２４１番目に対応するアミノ酸配列が挙げられる。より好ましくは、上記ポリペプチド断片は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列における第３０〜第８８番目又は第９３〜第２４１番目に対応するアミノ酸配列を有し、アクチビンに対する結合能力を有する、５０〜１５０アミノ酸残基のポリペプチド断片である。
【００５０】
インヒビンとは、インヒビンα鎖とインヒビンβ鎖とのヘテロダイマーであって、アクチビンと類似のタンパク質である。結合阻害物質としてのインヒビンは、アクチビンＡ受容体タイプＩＩと結合して、アクチビン及びアクチビンＡ受容体タイプＩＩの複合体の形成を阻害する。そのため、当該複合体とＡＣＶＲ１との結合が阻害され、アクチビンが変異型ＡＣＶＲ１に結合することによって細胞内に伝達されるシグナルが抑制されて、異所性の軟骨誘導及び骨誘導が抑制される。インヒビンとしては、例えば、インヒビンＡ（α鎖とβＡ鎖とのヘテロダイマー）、インヒビンＢ（α鎖とβＢ鎖とのヘテロダイマー）が挙げられる。インヒビンα鎖としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００２１９１、配列番号３１、３２）が挙げられる。インヒビンα鎖は、ｍＲＮＡからの翻訳後、まずＮ末端側の約１８アミノ酸残基のシグナルペプチドが切断されてｐｒｏ体となる。インヒビンα鎖の上記ｐｒｏ体は、更にＮ末端側の約２００〜２３０アミノ酸残基のポリペプチドが切断され除かれることで成熟したインヒビンα鎖（例えば、配列番号３２で表されるアミノ酸配列における第２３３〜第３６６番目のアミノ酸配列に相当）となる。
【００５１】
インヒビンの改変体とは、インヒビンの各鎖を構成するアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、及び、インヒビンを構成するアミノ酸配列に対して８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＡＣＶＲ２Ａ又はＡＣＶＲ２Ｂとアクチビンとの結合を阻害する能力を有するタンパク質を意味する。
【００５２】
好ましくは、上記インヒビンの改変体としては、
（１）配列番号２、配列番号４若しくは配列番号３２で表されるアミノ酸配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列において第１〜第２８番目若しくは第１〜第３１０番目のアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列、配列番号４で表されるアミノ酸配列において第１〜第２８番目若しくは第１〜第２９２番目のアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列、又は、配列番号３２で表されるアミノ酸配列において第１〜第１８番目若しくは第１〜第２３２番目のアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、及び、
（２）配列番号２、配列番号４若しくは配列番号３２で表されるアミノ酸配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列において第１〜第２８番目若しくは第１〜第３１０番目のアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列、配列番号４で表されるアミノ酸配列において第１〜第２８番目若しくは第１〜第２９２番目のアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列、又は、配列番号３２で表されるアミノ酸配列において第１〜第１８番目若しくは第１〜第２３２番目のアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列に対して８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ、ＡＣＶＲ２Ａ又はＡＣＶＲ２Ｂとアクチビンとの結合を阻害する能力を有するタンパク質が挙げられる。
【００５３】
上記アクチビン受容体、フォリスタチン、フォリスタチン様タンパク質、それらの改変体、それらのポリペプチド断片、インヒビン、インヒビンの改変体（以下、「本タンパク質」と言う。）は、当業者に周知の以下の方法等で製造することができる。
【００５４】
まず、上述の本タンパク質をコードする遺伝子（本遺伝子）を、通常の遺伝子工学的方法［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，  Ｆｒｉｓｃｈ  Ｅ．  Ｆ．，  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ）等に記載されている方法等］に準じて取得する。次いで、得られた本遺伝子を用いることによって、通常の遺伝子工学的方法に準じて本タンパク質を製造及び取得することができる。
【００５５】
例えば、まず本遺伝子が宿主細胞中で発現できるようなプラスミドを作製し、このプラスミドを宿主細胞に導入して形質転換する。更に形質転換された宿主細胞（形質転換体）を培養することで得られる培養物から本タンパク質を取得すればよい。上記プラスミドとしては、例えば、宿主細胞中で機能可能なプロモーターを有し、必要に応じて検出可能なマーカーを導入した発現ベクターに、本タンパク質をコードする遺伝子が導入されたものを好ましく挙げることができる。発現ベクターとしては、各種のものが市販されている。例えば、本タンパク質をコードする遺伝子を導入するために用いられる制限酵素認識部位、及び哺乳動物細胞での発現に使用されるＳＶ４０ウイルスプロモーター、サイトメガロウィルスプロモーター（ＣＭＶプロモーター）、Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−１  ａｌｐｈａプロモーター（ＥＦ１αプロモーター）、サイトメガロウイルスエンハンサー、ニワトリβアクチン遺伝子プロモーター、ウサギβ−グロビン遺伝子３’非翻訳領域から構成される合成プロモーター（ＣＡＧプロモーター）、Ｒａｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａ  Ｖｉｒｕｓプロモーター（ＲＳＶプロモーター）、βアクチン遺伝子プロモーター、ａＰ２遺伝子プロモーター等のプロモーターを含む発現ベクター等が市販されている。
【００５６】
宿主細胞としては、原核生物若しくは真核生物である微生物細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞等を挙げることができる。例えば、生理活性を有する本タンパク質の大量調製が容易になるという観点では、哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞等）等を好ましく挙げることができる。上述のようにして得られたプラスミドは、通常の遺伝子工学的方法によって上記宿主細胞に導入することができる。形質転換体の培養は、微生物培養、昆虫細胞若しくは哺乳動物細胞の培養に使用される通常の方法によって行うことができる。例えば哺乳動物細胞の場合、適当な炭素源、窒素源及びビタミン等の微量栄養物を適宜含む培地中で培養を行う。
【００５７】
本タンパク質の取得は、一般のタンパク質の単離及び精製に通常使用される方法を組み合わせて実施すればよい。例えば、まず上述の培養によって得られた培養上清を回収し、遠心分離等で夾雑物を除去する。次に、上記培養上清をイオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、及びゲルろ過クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィーを用いた工程を単独で、又は組み合わせることによって精製すればよい。
【００５８】
アクチビンに対する抗体は、インヒビンβＡ鎖、インヒビンβＢ鎖、インヒビンβＣ鎖及びインヒビンβＥ鎖からなる群から選ばれる少なくとも１つのインヒビンβ鎖を抗原とする抗体であることが好ましく、インヒビンβＡ鎖又はインヒビンβＢ鎖を抗原とする抗体であることがより好ましい。結合阻害物質としてのアクチビンに対する抗体はアクチビンと結合して、アクチビンとＡＣＶＲ１との結合を阻害する。そのため、アクチビンが変異型ＡＣＶＲ１に結合することによって細胞内に伝達されるシグナルが抑制されて、異所性の軟骨誘導及び骨誘導が抑制される。
【００５９】
抗体は、公知のアイソタイプ及びサブタイプを含むことができる。抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。これらの抗体は、公知の抗体又は抗血清の製造法に従って製造することができる。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＡが挙げられる。抗体は、標的抗原を特異的に認識し結合するための相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）を少なくとも有するものであれば特に制限はない。抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体及び完全ヒト化抗体等の遺伝子工学的に改変された抗体であってもよい。
【００６０】
抗体の抗体断片は、上記抗体の抗原結合部位（可変領域）を含む抗体断片であればよい。上記抗体断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＶＨ、ＦｖのＨ鎖（ＶＨ）とＬ鎖（ＶＬ）を適当なリンカーで連結させた一本鎖抗体：ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ＶＨとＶＬを含むポリペプチドの二量体で分子間ＶＨ−ＶＬ相互作用によって会合したダイアボディ、ｓｃＦｖのＨ鎖に定常領域の一部（ＣＨ３）が結合したものの二量体であるミニボディ、その他の低分子化抗体等が挙げられる。
【００６１】
低分子化抗体は、全長抗体(ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、例えばｗｈｏｌｅ  ＩｇＧ等）の一部分が欠損している抗体断片を含む。低分子化抗体は、抗原への結合能を有していれば特に限定されない。抗体断片は、全長抗体の一部分であれば特に限定されないが、重鎖可変領域（ＶＨ）及び／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）を含んでいることが好ましい。
【００６２】
一本鎖抗体とは、「単鎖Ｆｖ」すなわち「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントとも呼ばれる。一本鎖抗体は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含有し、これらのドメインはポリペプチド単鎖に存在する。「Ｆｖ」断片は最小の抗体断片であり、完全な抗原認識部位と結合部位を含む。一般的に「Ｆｖ」断片は１つのＶＨ及びＶＬが非共有結合によって強く連結されたダイマー（ＶＨ−ＶＬダイマー）である。各可変領域の３つの相補鎖決定領域（ＣＤＲ）が相互作用し、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面に抗原結合部位を形成する。６つのＣＤＲが抗体に抗原結合部位を付与している。しかしながら、１つの可変領域（または、抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、全結合部位よりも親和性は低いが、抗原を認識し、結合する能力を有する。ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成できるように、ＶＨとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含んでいる［Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ｖｏｌ．  １１３，  Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．  ２６９−３１５（１９９４）］。
【００６３】
上記抗体の製造方法は、特に制限されず、当該分野で公知の種々の抗体製造方法を用いることができる。このような抗体製造方法としては、例えば、ハイブリドーマ法、遺伝子工学的に抗体の遺伝子を導入した微生物を用いて製造する方法、ファージディスプレイ法によって多数の分子からなる莫大なクローンライブラリーから最適抗体がスクリーニングされ、その抗体を哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）で大量生産する方法、及び免疫した動物の血清から直接得る方法が挙げられる。
【００６４】
例えば、ポリクローナル抗体は、以下のように製造することができる。抗原タンパク質、又はその部分ペプチドを、ウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。得られた血清を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡカラム、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、抗原タンパク質又は合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等によって精製することで調製する。
【００６５】
抗原の調製は、例えば、当業者に周知のバキュロウイルスを用いる方法等で行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。
【００６６】
モノクローナル抗体の製造方法としては、例えば以下の工程で行われる。まず、公知の方法にしたがって、感作抗原を動物に免疫する。一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射することによって行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）、生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁する。得られた希釈液又は懸濁液に所望によって通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化する。その後、乳化した感作抗原を哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。
【００６７】
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付す。このとき、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。上記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３Ｕ１（Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１）、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．  Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，  １５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，  １−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ，  Ｇ．  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｃ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，  ５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，  Ｄ．  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ（１９７６）８，  ４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，  ２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅ  Ｓｔ．  Ｇｒｏｔｈ，  Ｓ．  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，  １−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，  Ｉ．  Ｓ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，  ３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，  １３１−１３３）等が好適に使用される。
【００６８】
上記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、例えば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ，  Ｇ．  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｃ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，  ３−４６）等に準じて行うことができる。
【００６９】
より具体的には、上記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望によって融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
【００７０】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞の数に対して免疫細胞の数を１〜１０倍とするのが好ましい。上記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、上記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能である。さらに、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）等の血清補液を上記培養液と併用することもできる。
【００７１】
細胞融合は、次の方法で行う。まず、上記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を上記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００〜６０００程度）を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加する。得られた細胞懸濁液を、混合することによって目的とするハイブリドーマを形成する。続いて、適当な培養液を上記細胞懸濁液に逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによってハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
【００７２】
ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばＥＢウイルスに感染し不死化したヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗原タンパク質、抗原タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作することによって、ヒト抗体産生細胞株を作製することもできる。抗体分泌能を安定に持続させるために、感作リンパ球を上記と同様のマウスミエローマ細胞又はヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、所望の活性（抗原結合活性）を有するヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。
【００７３】
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養液）で培養することによって選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローニングを行う。
【００７４】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能である。上記ハイブリドーマは、液体窒素中で長期保存することが可能である。当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、又は、ハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、上記哺乳動物の腹水として得る方法などが採用される。上記培養上清として得る方法は、高純度の抗体を得るのに適している。一方、上記哺乳動物の腹水として得る方法は、抗体の大量生産に適している。
【００７５】
ヒト抗体は、ヒト由来の抗体遺伝子の発現産物である抗体を意味する。ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体遺伝子座を導入し、ヒト由来抗体を産生する能力を有するトランスジェニック動物に抗原を投与することによって得ることができる。該トランスジェニック動物としては、マウスが挙げられる。ヒト抗体を産生し得るマウスの作出方法は、例えば、国際公開第０２／４３４７８号に記載されている。
【００７６】
本実施形態におけるモノクローナル抗体には、抗体を構成する重鎖（Ｈ鎖）及び／又は軽鎖（Ｌ鎖）の各々のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有する重鎖及び／又は軽鎖からなるモノクローナル抗体も包含される。本実施形態では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体も使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
【００７７】
キメラ型抗体は、異なる動物種に由来する２以上の部分の結合によって特徴づけられる免疫グロブリン分子である。一般に、キメラ型抗体の可変領域は、ヒト以外の哺乳類抗体（例えばマウスモノクローナル抗体）に由来し、その免疫グロブリン定常領域は、ヒト免疫グロブリン分子に由来する。好ましくは、低免疫原性を持つ可変領域を選択し、それを、やはり低免疫原性を持つヒト定常領域と組み合わせる。そして、その組み合わせもまた、低い免疫原性を持つことが好ましい。キメラ型抗体には、一価、二価又は多価免疫グロブリンが含まれる。一価のキメラ型抗体は、ジスルフィド結合を介してキメラＬ鎖と結合したキメラＨ鎖によって形成される二量体（ＨＬ）である。二価のキメラ型抗体は、少なくとも１つのジスルフィド結合を介して結合した２つのＨＬ二量体によって形成される四量体（Ｈ２Ｌ２）である。
【００７８】
キメラ型抗体及びそれらの製造方法は、当該技術分野で既に記述されている［Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３−６４６（１９８４）；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３（１９８７）；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８４：２１４−２１８（１９８７）；Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）；及びＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ，  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］。
【００７９】
ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称される。ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものである。ヒト化抗体は、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ１２５０２３号明細書、国際公開第９２／１９７５９号参照）。ヒト化抗体の製造方法としては、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ；ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法によって合成する。得られたＤＮＡを、ヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込む。得られた発現ベクターを宿主に導入し産生させることによって、ヒト化抗体が得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ２３９４００号明細書、国際公開第９２−１９７５９号参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  （１９９３）  ５３，  ８５１−８５６）。
【００８０】
キメラ抗体、ヒト化抗体には、ヒト抗体のＣ領域が使用される。ヒト抗体の定常領域（Ｃ領域）としては、Ｃγが挙げられ、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３又はＣγ４を使用することができる。抗体の構造又はその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体のＣ領域を修飾してもよい。キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来のＣ領域からなる。ヒト化抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体由来のフレームワーク領域及びＣ領域からなる。キメラ抗体及びヒト化抗体は、ヒト体内における抗原性が低下しているため、本実施形態に使用される抗体として有用である。
【００８１】
低分子化抗体、一本鎖抗体は、例えば、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，  Ｍ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  （１９９４）  １５２，  ２９６８−２９７６、Ｂｅｔｔｅｒ，  Ｍ．  ＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ，  Ａ．  Ｈ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （１９８９）  １７８，  ４７６−４９６、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ａ．  ＆  Ｓｋｅｒｒａ，  Ａ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （１９８９）  １７８，  ４９７−５１５、Ｌａｍｏｙｉ，  Ｅ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （１９８９）  １２１，  ６５２−６６３、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （１９８９）  １２１，  ６６３−６６９、Ｂｉｒｄ，  Ｒ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＴＩＢＴＥＣＨ  （１９９１）  ９，  １３２−１３７参照）ことによって、製造することができる。
【００８２】
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域（可変領域）とＬ鎖Ｖ領域を連結することによって得られる。これらの領域は単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、ｓｃＦＶはさらにＶＨ及びＶＬの間にポリペプチドリンカーを含んでいる。ポリペプチドリンカーによってｓｃＦｖは、抗原結合のために必要な構造を形成することができる［ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ”Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”  Ｖｏｌ．１１３（Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄ  （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）  ｐｐ．２６９−３１５，  １９９４）を参照。］。
【００８３】
このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域はリンカー、好ましくは、ペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，  Ｊ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  （１９８８）  ８５，  ５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域は、上記抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、その両端に連結された抗体可変領域の発現を阻害するものでなければ特に限定されないが、例えばアミノ酸１２〜１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
【００８４】
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、例えば、以下の方法によって得られる。まず、上記抗体のＨ鎖又はＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、及びＬ鎖又はＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを鋳型とし、それらの配列のうちの所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法によって増幅する。次いで、増幅したＤＮＡ、並びに、ペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ及びその両端を各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せてＰＣＲ法で増幅することによって、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが得られる。一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されれば、それらを含有する発現ベクター、及び該発現ベクターによって形質転換された宿主を常法に従って得ることができる。さらに得られた宿主を用いて常法に従って、ｓｃＦｖを得ることができる。
【００８５】
ダイアボディは、遺伝子融合によって構築された二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）の抗体断片を指す（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）、欧州特許出願公開第４０４０９７号明細書、国際公開第９３／１１１６１号等）。ダイアボディは、２本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーである。通常、ダイアボディを構成するポリペプチド鎖は各々、同じ鎖中でＶＬおよびＶＨが、互いに結合できない程度に短いリンカー、例えば、５アミノ酸残基程度のリンカーによって結合されている。同一ポリペプチド鎖上にコードされるＶＬとＶＨとは、その間のリンカーが短いため単鎖可変領域フラグメントを形成することが出来ず二量体を形成する。そのため、ダイアボディは２つの抗原結合部位を有することとなる。
【００８６】
ｓｃ（Ｆｖ）２は、２つのＶＨ及び２つのＶＬをリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である（Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９９；２３１：１７７−１８９）。ｓｃ（Ｆｖ）２は、例えば、２つのｓｃＦｖをリンカーで結ぶことによって作製できる。
【００８７】
本実施形態において、抗体の可変領域を結合するリンカーとしては、遺伝子工学によって導入し得る任意のペプチドリンカー、または合成化合物リンカー（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ９（３），  ２９９−３０５，  １９９６参照）に開示されるリンカー等を用いることができる。ペプチドリンカーを用いる場合、その長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能である。通常、ペプチドリンカーの長さは、１〜１００アミノ酸残基、好ましくは３〜５０アミノ酸残基、更に好ましくは５〜３０アミノ酸残基、特に好ましくは１２〜１８アミノ酸残基（例えば、１５アミノ酸残基）である。合成化合物リンカー（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋剤、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−ＥＧＳ）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ−ＤＳＴ）、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、ビス［２−（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ）などである。これらの架橋剤は市販されている。
【００８８】
これら抗体の断片は、上記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主によって産生させることができる。
【００８９】
タンパク質と融合させた抗体は、抗体のＮ末端又はＣ末端に異種タンパク質が融合した抗体であり、その作製方法も公知である（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００４，  １０，  １２７４−１２８１）。抗体に異種タンパク質を結合させたキメラ分子であればよい。異種タンパク質としては、例えば、Ｆｃ受容体、サイトカイン等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
上述のように産生、発現された抗体は、細胞内外、又は宿主から分離し、均一になるまで精製することができる。本実施形態で使用される抗体の分離、精製はアフィニティークロマトグラフィーによって行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。プロテインＡカラムに用いる担体として、例えば、ＨｙｐｅｒＤ、ＰＯＲＯＳ、ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。
【００９１】
例えば、上記アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせれば、本実施形態で使用される抗体を分離、精製することができる。クロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）に適用し得る。逆相ＨＰＬＣを用いてもよい。
【００９２】
アクチビンの発現を抑制する発現抑制物質（以下、「発現抑制物質」という場合がある。）は、アクチビンの発現を抑制することが可能であればどのような物質であっても、特に制限されない。発現抑制物質は、アクチビンの遺伝子発現を抑制する核酸であることが好ましい。アクチビンの遺伝子発現が抑制されると、アクチビン分子の生成が抑制される。そのため、アクチビンが変異型ＡＣＶＲ１に結合することによるシグナル伝達が抑制されて、異所性の軟骨誘導及び骨誘導が抑制される。
【００９３】
アクチビンの遺伝子発現を抑制する核酸は、アクチビンの遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びリボザイムからなる群から選ばれることが好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びリボザイムの取得方法は当該分野において公知である。当業者は例えば上述のインヒビンβ鎖遺伝子の核酸配列（配列番号１、３、５又は７に記載の核酸配列等）に基づいてこれらを容易に得ることができる。
【００９４】
アクチビンの遺伝子発現を抑制する核酸は、配列番号１に記載の核酸配列における第５３８〜第５５６番目又は第１３５６〜第１３７４番目に対応する核酸配列、並びに、これらの核酸配列において１個若しくは数個の核酸が欠失、置換、挿入又は付加された核酸配列及びこれらの核酸配列に対して８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の配列同一性を有する核酸配列からなる群から選ばれる核酸配列の相補鎖を含み、アクチビンの遺伝子発現を抑制する核酸であることが好ましい。ここで遺伝子発現を抑制する核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれであってもよく、一本鎖の核酸配列及び二本鎖の核酸配列を共に含む概念である。本明細書において、配列番号１に示される核酸配列等は、便宜的にＤＮＡ配列であるが、ＲＮＡ配列を示す場合には、チミン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）として解する。
【００９５】
アクチビンの遺伝子発現を抑制する核酸は、配列番号１、３、５又は７に記載の核酸配列を含む核酸と、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸配列を含み、アクチビンの遺伝子発現を抑制する核酸であってもよい。
【００９６】
「ストリンジェントな条件」とは、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡと５０％(ｖ／ｖ)ホルムアミドとを含む溶液中、室温にて１２時間インキュベートし、更に０．５×ＳＳＣで５０℃以上の温度で洗浄する条件をいう。さらに、よりストリンジェントな条件、例えば、４５℃又は６０℃にて１２時間インキュベートすること、０．２×ＳＳＣ又は０．１×ＳＳＣで洗浄すること、洗浄に際し６０℃又は６５℃以上の温度条件で洗浄すること等の、より厳しい条件も含む。
【００９７】
アクチビンの遺伝子発現を抑制する核酸の塩基数は特に制限はない。上記核酸がアクチビンの遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである場合には、アクチビンをコードするｍＲＮＡの相補鎖の全配列であっても部分配列であってもよい。アクチビンの遺伝子発現を抑制する核酸の塩基数は、短いもので約１０塩基程度、長いものでｍＲＮＡ又は初期転写産物の全配列が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１５〜５０塩基であることが好ましく、２０〜３０塩基であることがより好ましい。
【００９８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、又はＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドがＤＮＡである場合、標的ＲＮＡとアンチセンスＤＮＡとによって形成されるＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドは、内在性ＲＮａｓｅ  Ｈに認識されて標的ＲＮＡの選択的な分解を引き起こすことができる。したがって、ＲＮａｓｅ  Ｈによる分解を指向するアンチセンスＤＮＡの場合、標的配列は、スプライシングを受け成熟したｍＲＮＡ中の配列だけでなく、アクチビン遺伝子の初期翻訳産物におけるイントロン領域の配列であってもよい。イントロン配列は、ゲノム配列と、アクチビン遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列とをＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等のホモロジー検索プログラムを用いて比較することによって決定することができる。さらに、本実施形態に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アクチビンのｍＲＮＡ又は初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するものであってもよい。さらに上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡであるアクチビンの遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ＲＮＡへの転写を阻害し得るもの（アンチジーン）であってもよい。
【００９９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチド分子は、天然型のＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。上記ヌクレオチド分子は、安定性（化学的安定性及び／又は酵素に対する安定性）又は比活性（ＲＮＡとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を含むことができる。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート及びホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。各ヌクレオチドの糖（リボース）の２’位の水酸基を、−ＯＲ（Ｒ＝ＣＨ３（２’−Ｏ−Ｍｅ）、ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ等）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよい。上記化学修飾としては、例えば、ピリミジン塩基の５位へのメチル基若しくはカチオン性官能基の導入、又は、２位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換等が挙げられる。
【０１００】
ＲＮＡの糖部のコンフォーメーションはＣ２’−ｅｎｄｏ（Ｓ型）とＣ３’−ｅｎｄｏ（Ｎ型）の２つが支配的であり、一本鎖ＲＮＡではこの両者の平衡として存在するが、二本鎖を形成するとＮ型に固定される。したがって、標的ＲＮＡに対して強い結合能を付与するために、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）が好ましく用いられ得る。ＢＮＡは、２’酸素と４’炭素とを架橋することによって、糖部のコンフォーメーションをＮ型に固定したＲＮＡ誘導体である。ＢＮＡの具体的な例としては、例えば２’酸素と４’炭素がメチレンによって架橋された２’，４’−ＢＮＡ（ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）とも言う。）（Ｉｍａｎｉｓｈｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  １６５３−９，  ２００２；  Ｊｅｐｓｅｎ，  Ｊ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  １４，  １３０−４６，  ２００４）及び、２’酸素と４’炭素がエチレンにより架橋されたＥＮＡ（Ｍｏｒｉｔａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，  ２２，  １６１９−２１，  ２００３）が挙げられる。
【０１０１】
本実施形態のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アクチビン遺伝子のｍＲＮＡ又は初期転写産物の標的配列を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することによって調製することができる。上述した各種修飾を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドも、いずれも公知の手法によって、化学的に合成することができる。
【０１０２】
上記アクチビンの遺伝子発現を抑制する核酸がｓｉＲＮＡである場合には１５〜５０塩基、更には１５〜３０塩基であることが好ましく、１８〜２６塩基、更には１９〜２３塩基であることがより好ましい。
【０１０３】
ｓｉＲＮＡは、５’末端又は３’末端に、付加的な塩基を有していてもよい。該付加的塩基の長さは、通常２〜４塩基程度であり、ｓｉＲＮＡの全長として１９塩基以上である。該付加的塩基は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡを用いると核酸の安定性を向上させることができる場合がある。このような付加的塩基の配列としては、例えばｕｇ−３’、ｕｕ−３’、ｔｇ−３’、ｔｔ−３’、ｇｇｇ−３’、ｇｕｕｕ−３’、ｇｔｔｔ−３’、ｔｔｔｔｔ−３’、ｕｕｕｕｕ−３’等の配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１０４】
２本鎖の相補的な配列の他に、各々の鎖の３’末端又は５’末端に、１〜４塩基、好ましくは１〜３塩基、更に好ましくは２塩基の突出部（オーバーハング）が存在していてもよい。具体的には、ｄＴｄＴ（「ｄＴ」は、デオキシリボ核酸を示す。）を付加したものが挙げられる。
３’末端又は５’末端は、末端付加がない平滑末端（ブラントエンド）であってもよい。
アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端に突出部配列（オーバーハング）を有しセンス鎖とアンチセンス鎖とが異なる塩基数であってもよい。
好ましくは、１９〜２１塩基からなり、ブラントエンド又は二本鎖それぞれの３’末端に１〜３塩基のオーバーハングが存在しているｓｉＲＮＡ等を例示することができる。具体的には、標的配列部分が１９塩基長で３’末端にｄＴｄＴを付加された合計２１塩基長のｓｉＲＮＡが挙げられる。
【０１０５】
上記アクチビンの遺伝子発現を抑制する核酸がｓｈＲＮＡである場合には５〜１５塩基のヘアピンループ部分に加えてアクチビン遺伝子に相補的な配列が１５〜３０塩基であることが好ましく、１５〜２６塩基、更には１５〜２３塩基、更には１８〜２３塩基であることがより好ましい。
【０１０６】
ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、標的遺伝子のｃＤＮＡ配列情報に基づいて、例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒら（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，  １５，  １８８−２００  （２００１））、Ｔｅｒａｍｏｔｏら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ５７９（１３）：ｐ２８７８−８２（２００５））の提唱する規則に従って設計することができる。
【０１０７】
標的配列の位置は特に制限されるわけではないが、５’−ＵＴＲ及び開始コドンから約５０塩基まで、並びに３’−ＵＴＲ以外の領域から標的配列を選択することが好ましい。上述の規則その他に基づいて選択された標的配列の候補群について、標的以外のｍＲＮＡにおいて１６〜１７塩基の連続した配列に相同性がないかどうかを、ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）等のホモロジー検索ソフトを用いて調べ、選択した標的配列の特異性を確認する。特異性の確認された標的配列について、ＡＡ（又はＮＡ）以降の１９〜２１塩基にＴＴ又はＵＵの３’末端オーバーハングを有するセンス鎖と、該１９〜２１塩基に相補的な配列及びＴＴ又はＵＵの３’末端オーバーハングを有するアンチセンス鎖とからなる２本鎖ＲＮＡをｓｉＲＮＡとして設計してもよい。ｓｉＲＮＡの前駆体であるショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ループ構造を形成しうる任意のリンカー配列（例えば、５〜２５塩基程度）を適宜選択し、上記センス鎖とアンチセンス鎖とを該リンカー配列を介して連結することによって設計することができる。
【０１０８】
ｓｉＲＮＡ及び／又はｓｈＲＮＡの配列は、種々のｗｅｂサイト上に無料で提供される検索ソフトを用いて検索が可能である。このようなサイトとしては、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈが提供するＲＮＡｉ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｅｌｅｃｔｏｒ及びｓｈＲＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｒｎａｉｄｅｓｉｇｎｅｒ／ｆｒｏｎｔｐａｇｅ．ｊｓｐ）があるが、これらに限定されない。
【０１０９】
ｓｉＲＮＡを構成するリボヌクレオチド分子も、安定性、比活性等を向上させるために、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドの場合と同様の修飾を受けていてもよい。但し、ｓｉＲＮＡの場合、天然型ＲＮＡ中のすべてのリボヌクレオチド分子を修飾型で置換すると、ＲＮＡｉ活性が失われる場合がある。したがって、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ複合体）が機能できる最小限の修飾ヌクレオチドの導入が必要である。
【０１１０】
修飾の例として具体的には、ｓｉＲＮＡを構成するヌクレオチド分子の一部を、天然型のＤＮＡ、又は、安定性（化学的安定性及び／又は酵素に対する安定性）若しくは比活性（ＲＮＡとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を施したＲＮＡ、に置換することができる（Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，ＴＩＢＳ  １７，３４；Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３を参照。）。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を防ぐために、ｓｉＲＮＡを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート及びホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。各ヌクレオチドの糖（リボース）の２’位の水酸基を、−ＯＲ（Ｒ＝ＣＨ３（２’−Ｏ−Ｍｅ）、ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ等）、フッ素原子（−Ｆ）に置換してもよい。ｓｉＲＮＡにおけるＲＮＡの一部をＤＮＡに置換する化学修飾（２’−デオキシ化、２’−Ｈ）を施してもよい。
【０１１１】
その他の修飾の例としては、２’位の修飾基が４’位の炭素原子に架橋した構造を有する架橋構造型人工核酸（ＢＮＡ）、より具体的には、２’位の酸素原子と４’位の炭素原子とがメチレンを介して架橋したロックト人工核酸（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ；ＬＮＡ）、及びエチレン架橋構造型人工核酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ＥＮＡ）等が挙げられる。
【０１１２】
塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の５位へのメチル基若しくはカチオン性官能基の導入、２位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。その他上述のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおける修飾方法を用いることができる。ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖は、リンカーを介し、細胞表層に存在する受容体を特異的に認識するリガンド、ペプチド、糖鎖、抗体、脂質、正電荷若しくは分子構造的に細胞膜表層に吸着し貫通するオリゴアルギニン、Ｔａｔペプチド、Ｒｅｖペプチド、Ａｎｔペプチド等と化学結合していてもよい。
【０１１３】
ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ上の標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることによって調製することができる。ｓｉＲＮＡの前駆体となるショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を合成し、得られたｓｈＲＮＡを、ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）を用いて切断することによって調製することもできる。
【０１１４】
ｓｈＲＮＡは、ｍＲＮＡ上の標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖を適当なループ構造を形成しうる長さ（例えば５〜２５塩基程度）のスペーサー配列を間に挿入して連結した塩基配列を含むオリゴＲＮＡをデザインし、これをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機で合成することによって調製することができる。上述のｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを発現するように構築された発現ベクターなどを用いることもできる。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡを発現するベクターには、タンデムタイプとステムループ（ヘアピン）タイプとがある。タンデムタイプのベクターはｓｉＲＮＡのセンス鎖の発現カセットとアンチセンス鎖の発現カセットをタンデムに連結したものである。タンデムタイプのベクターでは、細胞内で各鎖が発現してアニーリングすることによって２本鎖のｓｉＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成する。一方、ステムループタイプのベクターはｓｈＲＮＡの発現カセットをベクターに挿入したものである。ステムループタイプのベクターでは、細胞内でｓｈＲＮＡが発現しＤｉｃｅｒによるプロセシングを受けてｄｓＲＮＡを形成する。プロモーターとしては、ｐｏｌＩＩ系プロモーター（例えば、ＣＭＶ前初期プロモーター）を使用することもできるが、短いＲＮＡの転写を正確に行わせるために、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを使用するのが一般的である。ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターとしては、マウス及びヒトのＵ６−ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒトＨ１−ＲＮａｓｅ  Ｐ  ＲＮＡプロモーター、ヒトバリン−ｔＲＮＡプロモーター等が挙げられる。転写終結シグナルとして４個以上Ｔが連続した配列が用いられる。
【０１１５】
ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ発現ベクターとしては、例えばレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス及びセンダイウイルス等のウイルスベクター、動物細胞発現プラスミド等が挙げられる。
【０１１６】
上記ｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド配列の情報に基づいて、例えば３９４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機等のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用いて常法に従って化学的に合成することができる。具体的には、当業者に公知の核酸保護基（例えば５’末端にジメトキシトリチル基）及びカップリング基（例えば３’末端にホスホルアミダイト）を用いて合成できる。すなわち、５’末端の保護基を、ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）等の酸で脱保護し、カップリング反応を行う。ついでアセチル基でキャッピングを行った後、次の核酸の縮合反応を行う。修飾されたＲＮＡ又はＤＮＡを含むｓｉＲＮＡの場合には、原料として修飾されたＲＮＡ（例えば、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド）を用いればよく、カップリング反応の条件は適宜調整できる。リン酸結合部分が修飾されたホスホロチオエート結合を導入する場合には、ボーケージ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド）を用いることができる。
【０１１７】
オリゴヌクレオチドは、別々に合成し、合成後に例えばライゲーションによって一緒につなげてもよいし（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６，９９２３；Ｄｒａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９３／２３５６９号；Ｓｈａｂａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９，４２４７；Ｂｅｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１６，９５１；Ｂｅｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．８，２０４）、又は、合成及び／若しくは脱保護の後にハイブリダイゼーションによって、一緒につなげてもよい。ｓｉＲＮＡ分子はタンデム合成法によって合成することができる。すなわち、両方のｓｉＲＮＡ鎖を、切断可能なリンカーによって分離された単一の連続するオリゴヌクレオチドとして合成する。次に上記オリゴヌクレオチドを切断して別々のｓｉＲＮＡフラグメントを生成し、得られたｓｉＲＮＡフラグメントをハイブリダイズさせて精製する。リンカーはポリヌクレオチドリンカーであっても非ヌクレオチドリンカーであってもよい。
【０１１８】
合成したｓｉＲＮＡ分子は、当業者に公知の方法を用いて精製できる。例えばゲル電気泳動によって精製する方法、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製する方法が挙げられる。
【０１１９】
本実施形態において、アクチビンの遺伝子発現を抑制する核酸は、市販品を用いてもよく、例えば、インヒビンβＡ鎖の遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（アプライドバイオシステムズ社製、カタログ番号、Ｓ７４３４、Ｓ７４３５）が挙げられる。これらのｓｉＲＮＡの塩基配列は、Ｓ７４３４（配列番号１に記載の核酸配列における第１３５６〜第１３７４番目の塩基配列に対応）：センス鎖５’−ＣＡＡＣＡＧＵＣＡＵＣＡＡＣＣＡＣＵＡｔｔ−３’（配列番号３３）、アンチセンス鎖５’−ＵＡＧＵＧＧＵＵＧＡＵＧＡＣＵＧＵＵＧａｇ−３’（配列番号３４）、Ｓ７４３５（配列番号１に記載の核酸配列における第５３８〜第５５６番目の塩基配列に対応）：センス鎖５’−ＧＡＡＣＧＧＧＵＡＵＧＵＧＧＡＧＡＵＡｔｔ−３’（配列番号３５）、アンチセンス鎖５’−ＵＡＵＣＵＣＣＡＣＡＵＡＣＣＣＧＵＵＣｔｃ−３’（配列番号３６）である。小文字で表記した配列部分はオーバーハング部分を表し、リボース骨格がデオキシリボース骨格に置き換わっている部分である。
【０１２０】
上記アクチビンの遺伝子発現を抑制する核酸がリボザイムである場合には、２５〜６０塩基であることが好ましく、３０〜５５塩基であることがより好ましく、３５〜５０塩基であることが更に好ましい。
【０１２１】
リボザイム核酸としては、ウイロイド、ウイルソイド等の感染性ＲＮＡにみられるセルフスプライシングＲＮＡが挙げられ、ハンマーヘッド型、ヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることによって、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。アクチビン遺伝子のｍＲＮＡが自身で二本鎖構造をとる場合には、ＲＮＡヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のＲＮＡモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることによって、標的配列を一本鎖にすることができる［Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９８（１０）：  ５５７２−５５７７  （２００１）］。さらに、リボザイムを、上記リボザイムをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２９（１３）：  ２７８０−２７８８  （２００１）］。
【０１２２】
上記アクチビンの遺伝子発現を抑制する核酸がｍｉＲＮＡである場合には、２０〜１００塩基であることが好ましい。
ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳の阻害又はｍＲＮＡの分解を通して、遺伝子の発現調節に関与する。ｍｉＲＮＡは、細胞内に存在する短鎖（２０−２５塩基）のノンコーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、以下の過程を経て機能する。まず、ＤＮＡから、ｍｉＲＮＡとその相補鎖とを含みヘアピンループ構造を取ることが可能な一本鎖のｐｒｉ−ＲＮＡとして転写される。次にｐｒｉ−ＲＮＡは、核内にあるＤｒｏｓｈａと呼ばれる酵素によって一部が切断されｐｒｅ−ＲＮＡとなって核外に輸送される。その後、ｐｒｅ−ＲＮＡはさらにＤｉｃｅｒによって切断されて、ｍｉＲＮＡとして機能する。したがって、上記ｍｉＲＮＡは、ｐｒｉ−ＲＮＡ、又はｐｒｅ−ＲＮＡの形態であってもよい。
アクチビンの遺伝子発現を抑制するｍｉＲＮＡは、標的遺伝子のｃＤＮＡ配列情報に基づいて、例えば、miRDB（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｄｂ．ｏｒｇ／ｍｉＲＤＢ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）等のデータベースに従って得ることができる。アクチビンの遺伝子発現を抑制するｍｉＲＮＡは、例えば、has-miR-4482-3p、hsa-miR-4507、hsa-miR-147a、hsa-miR-3940-5p、hsa-miR-4252、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-452-3p、hsa-miR-3692-3p、hsa-miR-4699-3p、hsa-miR-513c-3p、hsa-miR-4287、hsa-miR-4685-3p、hsa-miR-513a-3p、hsa-miR-4302、hsa-miR-5094、hsa-miR-4677-5p、hsa-miR-548au-3p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-4465、hsa-miR-548ar-3p、hsa-miR-1297、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-630、hsa-miR-148b-3p、hsa-miR-152、hsa-miR-548e、hsa-miR-548f、hsa-miR-655、hsa-miR-374c-5p、hsa-miR-920、hsa-miR-548a-3p、hsa-miR-4742-3p、hsa-miR-568、hsa-miR-891b、hsa-miR-3666、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-3924、hsa-miR-5591-5p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-4668-5p、hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-3605-3p、hsa-miR-939、hsa-miR-132-5p、hsa-miR-301b、hsa-miR-302a-5p、hsa-miR-548l、hsa-miR-129-5p、hsa-miR-1298、hsa-miR-4300、hsa-miR-3163、hsa-miR-2682-3p、hsa-miR-362-3p、hsa-miR-541-5p、hsa-miR-4295、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-329、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-369-3p、hsa-miR-548g-3p、hsa-miR-4757-5p、hsa-miR-3943、hsa-miR-5685、hsa-miR-218-5p、hsa-miR-345-3p、hsa-miR-593-3p、hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-1228-3p、及びhsa-miR-1237が挙げられる。
【０１２３】
ＦＯＰ予防剤／治療剤は、経口的又は非経口的（例えば、静脈内、皮下若しくは筋肉内注射、局所的、経直腸的、経皮的、脊髄内的又は経鼻的）に投与することができる。経口投与のための剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、散剤、液剤、懸濁剤等が挙げられる。非経口投与のための剤型としては、例えば、注射用水性剤、注射用油性剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、エアロゾル剤、坐剤、貼付剤等が挙げられる。これらの製剤は、従来公知の技術を用いて調製され、医薬分野において通常使用される無毒性かつ不活性な担体又は添加剤を含有することができる。
【０１２４】
本実施形態において、「有効量」とは、組織、系、動物又はヒトにおいて、研究者又は医師によって要求される生物学的又は医薬的応答を誘発する薬物又は医薬の量を意味する。
【０１２５】
本実施形態において、予防剤又は治療剤とは、特定の量で特定の成分を含む医薬製品、並びに特定の量で特定の成分の組み合わせから直接的又は間接的に生じるあらゆる医薬製品を包含することを意図している。
【０１２６】
さらに本発明の目的を損なわない範囲で、ＦＯＰ予防剤／治療剤は、他の併用可能な薬剤と組み合わせて投与してもよい。ＦＯＰ予防剤／治療剤及び他の併用可能な薬剤は別々に投与してもよく、１つの医薬組成物として一緒に投与してもよい。ＦＯＰ予防剤／治療剤を、他の併用可能な薬剤に対して、先に、同時に、又は後に投与してもよい。ＦＯＰ予防剤／治療剤と併用可能な他の薬剤として、例えば、ステロイド性消炎鎮痛剤及び非ステロイド性消炎鎮痛剤等の消炎鎮痛剤、ビスフォスフォネート剤、並びにレチノイン酸受容体γアゴニスト等が挙げられる。
【０１２７】
対象となる哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒト等が挙げられる。本実施形態に係るＦＯＰ予防剤／治療剤は、ヒトに対して好適に用いられる。
【０１２８】
ＦＯＰ予防剤／治療剤は、投与の目的、投与方法、投与対象の状況（性別、年齢、体重、病状等）によって異なるが、ヒトに対して投与される場合、１日当り、好ましくは０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇの有効成分が、より好ましくは０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇの有効成分が、投与されるように用いられる。
【０１２９】
ＦＯＰ予防剤／治療剤は、ＡＣＶＲ１にアミノ酸変異（変異型ＡＣＶＲ１）を有する患者に好適に用いられる。「変異型ＡＣＶＲ１」とは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列において、１〜２個が欠失又は置換されたアミノ酸配列を含み、アクチビンと結合することによって下流にシグナルを伝達する、受容体タンパク質を意味する。
【０１３０】
上記アミノ酸変異としては、例えば、以下の表１に示すものが挙げられる。ここで、アミノ酸残基の番号（アミノ酸残基番号）は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の番号を意味する。
【０１３１】
【表１】
0006601687.tif 000002
【０１３２】
列挙された上記アミノ酸変異は、例えば、Ｋａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．３，３７９−３９０，２００９に記載されているＡＣＶＲ１の一次配列と機能ドメインとの相関図によれば、ＧＳドメイン又はキナーゼドメインに位置すると把握できる。「ＧＳドメイン」とは、アミノ酸配列中、グリシンとセリンに富んだ領域を意味する。「キナーゼドメイン」とは、アミノ酸配列中、キナーゼ活性を発現するために必要な領域を意味する。
【０１３３】
したがって、上記アミノ酸変異は、ＡＣＶＲ１のＧＳドメイン又はキナーゼドメインにおけるアミノ酸変異を含むことが好ましい。上記ＧＳドメイン又はキナーゼドメインにおけるアミノ酸変異は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列における第１９６番目のアミノ酸残基がプロリンであるアミノ酸変異、第１９７番目のアミノ酸残基がロイシンであり第１９８番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸変異、第２０２番目のアミノ酸残基がイソロイシンであるアミノ酸変異、第２０６番目のアミノ酸残基がヒスチジンであるアミノ酸変異、第２０７番目のアミノ酸残基がグルタミン酸であるアミノ酸変異、第２５８番目のアミノ酸残基がグリシン又はセリンであるアミノ酸変異、第３２５番目のアミノ酸残基がアラニンであるアミノ酸変異、第３２８番目のアミノ酸残基がグルタミン酸、アルギニン又はトリプトファンであるアミノ酸変異、第３５６番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸であるアミノ酸変異、及び第３７５番目のアミノ酸残基がプロリンであるアミノ酸変異からなる群から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸変異を含むことが好ましく、上記ＧＳドメインにおけるアミノ酸変異は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列における第２０６番目のアミノ酸残基がヒスチジンであるアミノ酸変異を含むことがより好ましい。すなわち、ＦＯＰ予防剤／治療剤は、ＧＳドメイン又はキナーゼドメインにおけるアミノ酸変異を含むＡＣＶＲ１を有する患者に好適に用いられ、具体的には、表１に記載されたアミノ酸変異を含むＡＣＶＲ１を有する患者が挙げられる。なかでも、配列番号１０に記載のアミノ酸配列における第２０６番目のアミノ酸残基がヒスチジンであるＡＣＶＲ１を有する患者により好適に用いられる。
【０１３４】
本実施形態に係る、進行性骨化性線維異形成症の予防剤若しくは治療剤、又はそれらの候補物質のスクリーニング方法は、
（１−１）被験物質の存在下、アクチビンとＡＣＶＲ１との相互作用を測定し、第１の結合力を求める工程と、
（１−２）上記被験物質の非存在下において測定した上記相互作用から求められた第２の結合力と比較し、上記第１の結合力が上記第２の結合力より弱いとき、上記被験物質を候補物質として選択する工程と、を含むか、又は、
（２−１）被験物質の存在下、アクチビンが結合することによる変異型ＡＣＶＲ１を介したシグナル伝達の強度を測定し、第１のシグナル強度を求める工程と、
（２−２）上記被験物質の非存在下において測定した上記シグナル伝達の強度から求められた第２のシグナル強度と比較し、上記第１のシグナル強度が上記第２のシグナル強度より弱いとき、上記被験物質を候補物質として選択する工程と、を含む。
工程（１−１）において用いられるＡＣＶＲ１には特に限定はなく、変異型ＡＣＶＲ１を用いてもよい。
【０１３５】
被験物質としては、特に制限はなく、低分子化合物、ポリペプチド、タンパク質、核酸等が挙げられる。
【０１３６】
工程（１−１）において、アクチビンとＡＣＶＲ１との相互作用を測定する方法は、当該技術分野において公知の手法であれば特に制限されず、例えば、ＥＬＩＳＡ法、表面プラズモン共鳴法、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を応用した方法、タンパク質断片コンプリメンテーション法等が挙げられる。
【０１３７】
上記結合力は、アクチビンとＡＣＶＲ１との相互作用の強さを示すものであればどの様な指標であってもよく、例えば、解離定数、発光強度、蛍光強度、酵素活性等が挙げられる。
【０１３８】
工程（１−２）における、第２の結合力は、第１の結合力を測定するときに同時に測定して求めてもよいし、事前に又は事後に測定して求めたものであってもよい。
【０１３９】
「第１の結合力が第２の結合力より弱い」との評価は、定性的な比較であってもよいし、定量的な比較であってもよい。定量的な比較を行う場合、第１の結合力が第２の結合力より５倍、１０倍又は１００倍弱いとき、上記被験物質を候補物質として好適に選択できる。
【０１４０】
工程（２−１）における、アクチビンが結合することによる変異型ＡＣＶＲ１を介したシグナル伝達の強度を測定する方法は、当該技術分野において公知の手法であれば特に制限されず、例えば、ウエスタンブロット法又はＥＬＩＳＡ法によって、変異型ＡＣＶＲ１の下流に存在するシグナル伝達分子（例えば、ＳＭＡＤ１／５／８）のリン酸化の度合いを測定する方法、レポーター遺伝子を用いて変異型ＡＣＶＲ１を介した転写活性を測定する方法、ＦＯＰ患者由来のｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞等を用いて軟骨細胞又は骨細胞への分化の割合を測定する方法等が挙げられる。すなわち、工程（２−１）は、被験物質及びアクチビンを接触させた変異型ＡＣＶＲ１を発現している細胞における、ＡＣＶＲ１を介したシグナル伝達の強度を測定し、第１のシグナル強度を求める工程とすることもできる。同様に、後述する工程（２−２）においては、上記被験物質の非存在下において、アクチビンを接触させた変異型ＡＣＶＲ１を発現している細胞における、ＡＣＶＲ１を介したシグナル伝達の強度を測定し、求められた第２のシグナル強度と比較する工程と言える。変異型ＡＣＶＲ１を発現している細胞とは、外来性及び内在性を問わず変異型ＡＣＶＲ１を発現していれば特に限定されない。変異型ＡＣＶＲ１を発現している細胞としては、例えば、ＦＯＰ患者由来の細胞が挙げられ、より好ましくは、ＦＯＰ患者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導された間葉系細胞、軟骨細胞又は骨細胞が挙げられる。
【０１４１】
上記シグナル強度は、アクチビンが結合することによる変異型ＡＣＶＲ１を介したシグナル伝達の強度を示すものであればどの様な指標であってもよい。上記シグナル強度としては、例えば、ＳＭＡＤ１／５／８分子の総量に対するリン酸化したＳＭＡＤ１／５／８分子の割合、レポーター遺伝子の発現量、分化した軟骨細胞に由来する硫酸化グリコサミノグリカンの生成量、軟骨細胞若しくは骨細胞への分化に伴って発現が変動する遺伝子の発現量又はそのプロモーター活性等が挙げられる。レポーター遺伝子を用いる場合、例えば、当該レポーター遺伝子がＡＣＶＲ１を介したシグナル伝達によって活性化されるプロモーターと機能的に連結された遺伝子を細胞に導入することによって行い得る。ＡＣＶＲ１を介したシグナル伝達によって活性化されるプロモーターとして、Ｒ−Ｓｍａｄが結合する配列を含有するＢＭＰ応答配列（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００２，２７７（７），４８８３−４８９１．）が例示される。レポーター遺伝子として、蛍光、発光、呈色、又は、蛍光、発光若しくは呈色を補助すること等によって、定量化することができる遺伝子であってもよい。レポーター遺伝子としては、例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、イクオリン、ガラクトシダーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、βラクタマーゼ及びルシフェラーゼが例示される。
【０１４２】
工程（２−２）における、第２のシグナル強度は、第１のシグナル強度を測定するときに同時に測定して求めてもよいし、事前に又は事後に測定して求めたものであってもよい。
【０１４３】
「第１のシグナル強度が第２のシグナル強度より弱い」との評価は、定性的な比較であってもよいし、定量的な比較であってもよい。定量的な比較を行う場合、第１のシグナル強度が第２のシグナル強度より５倍、１０倍又は１００倍弱いとき、上記被験物質を候補物質として好適に選択できる。
【０１４４】
本実施形態に係るスクリーニング方法によって選択された被験物質は、変異型ＡＣＶＲ１を発現する細胞にアクチビンを添加した際の、ＳＭＡＤ１／５／８等のシグナル伝達分子のリン酸化の上昇を抑制する分子、ＡＣＶＲ１の下流で働くプロモーターの活性化を抑制する分子、軟骨細胞又は骨細胞へ分化するときに発現が上昇する分子の発現を抑制する分子等でありうる。
【０１４５】
上記スクリーニング方法によって選択された被験物質は、進行性骨化性線維異形成症の予防剤又は治療剤の有効成分として好適に用いられる。すなわち、上記スクリーニングによって選択されたアクチビンとＡＣＶＲ１の相互作用、具体的には結合を阻害又は抑制する物質、及びアクチビンが結合することによる変異型ＡＣＶＲ１を介したシグナル伝達を抑制する物質を有効成分として含有する、進行性骨化性線維異形成症の予防剤又は治療剤もまた、本発明の範疇である。
【０１４６】
本実施形態に係る、進行性骨化性線維異形成症モデル動物は、以下の工程（３−１）及び（３−２）を含む方法によって調製される。
（３−１）ＡＣＶＲ１にアミノ酸変異を有するｉＰＳ細胞から調製された間葉系幹細胞様の細胞を含む細胞集団を、アクチビンＡの共存下に培養し、三次元軟骨ペレットを得る工程、
（３−２）工程（３−１）で得られた三次元軟骨ペレットを、免疫不全非ヒト哺乳動物に皮下移植する工程。
【０１４７】
工程（３−１）において、ＡＣＶＲ１にアミノ酸変異を有するｉＰＳ細胞は、例えば、ＦＯＰ患者の体細胞から作製することができる。ＦＯＰ患者の体細胞としては、ＦＯＰ患者由来の体細胞であれば特に限定は無く、皮膚由来細胞、血液由来細胞等が挙げられる。当該ｉＰＳ細胞の製造方法としては、例えば、山中らの方法（Ｃｅｌｌ，２００７，１３１  （５），８６１１−８６７２．）が挙げられる。ｉＰＳ細胞から間葉系幹細胞様の細胞を含む細胞集団を調製する方法については、本明細書の実施例１に準じて、ＴＧＦβ阻害剤及びＧＳＫ３β阻害剤を添加した培養液中で培養することによって調製することができる。ＴＧＦβ阻害剤としては、ＳＢ−４３１５４２が例示される。ＧＳＫ３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１が例示される。当該細胞団を培養し、軟骨細胞のペレットを形成させる。その後、得られた軟骨細胞のペレットを更にヒトアクチビンＡの存在下で１５〜２５日間培養することで、三次元軟骨ペレットを得ることができる。具体的な方法としては実施例３に記載の方法が挙げられる。ここでヒトアクチビンＡの添加濃度としては５０ｎｇ／ｍＬ〜１５０ｎｇ／ｍＬが挙げられる。
【０１４８】
工程（３−２）において用いられる免疫不全非ヒト哺乳動物としては特に限定はないが、好ましくはげっ歯類動物、具体的には、マウス（例えば、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス）、ラット等が挙げられる。三次元軟骨ペレットの移植部位としては特に限定はないが、動物の背側に皮下移植することができる。
【０１４９】
上記進行性骨化性線維異形成症モデル動物は、進行性骨化性線維異形成症の予防剤若しくは治療剤、又はそれらの候補物質を評価するために使用することができる。すなわち、当該モデル動物に被験物質を投与し、当該動物において、異所性に形成された骨軟骨塊の量を評価することによって、被験物質が進行性骨化性線維異形成症の予防剤若しくは治療剤、又はそれらの候補物質となり得るか否かを評価することができる。例えば、評価された上記骨軟骨塊の量が基準よりも小さい場合に、当該被験物質を進行性骨化性線維異形成症の予防剤若しくは治療剤、又はそれらの候補物質として同定してもよい。上記基準としては、例えば、当該モデル動物に上記被験物質を投与しなかったこと以外は、上述の方法と同様の方法によって評価された骨軟骨塊の量が挙げられる。ここで、骨軟骨塊の量を測定する方法に特に限定は無いが、具体的には、Ｘ線画像解析によって当該動物の移植部位を観察することができる。又は、当該動物において異所性に形成された骨軟骨塊を回収し当業者に周知の方法で定量することも可能である。
【実施例】
【０１５０】
以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。【０１５１】
実施例１：ＦＯＰ患者由来のＡＣＶＲ１を介した転写活性の評価
（方法）
山中らの方法（Ｃｅｌｌ，２００７，１３１  （５），８６１１−８６７２．）に従って、ＦＯＰ患者由来のｉＰＳ細胞（以下、「患者由来ｉＰＳ細胞株」という場合がある。）を樹立した。この患者の細胞は、ＡＣＶＲ１遺伝子にＦＯＰの原因となる典型的な変異を有する細胞であることを確認した。この変異は、ＡＣＶＲ１のアミノ酸配列（配列番号１０に記載のアミノ酸配列）における第２０６番目のアルギニン残基をヒスチジン残基へ置換する変異である。次に、コントロールとして使用する目的で、ＢＡＣノックインベクターによる遺伝子修復によって、上記ＡＣＶＲ１遺伝子の変異を正常型（野生型）に修復したｉＰＳ細胞株（以下、「変異修復ｉＰＳ細胞株」又は「変異回復ｉＰＳ細胞株」（gene-corrected  (rescued)  iPS  cell  clone)という場合がある。）を樹立した。【０１５２】
患者由来ｉＰＳ細胞株及び変異修復ｉＰＳ細胞株をマトリゲルコートプレート（ベクトンアンドディッキンソン社製、商品名Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  （ＧＦＲ）ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標））Ｍａｔｒｉｘ上で、ｍＴｅＳＲ１（ステムセルテクノロジーズ社製）を用いて２日間フィーダーフリーの条件下で培養した。その後、１０μＭ  ＳＢ−４３１５４２（セレックケミカルズ社製）及び１μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１（和光純薬工業株式会社製）を添加した無血清培地［Ｆ１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ギブコ社製）／Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）（シグマアルドリッチ社製）／０．５％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマアルドリッチ社製）／１％  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ（ＣＤ−Ｌｉｐｉｄ）（ギブコ社製、商品名Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）／１５μｇ／ｍＬ  アポトランスフェリン（シグマアルドリッチ社製、商品名ａｐｏ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｈｕｍａｎ）／７μｇ／ｍＬ  インシュリン（和光純薬工業株式会社製、商品名Ｉｎｓｕｌｉｎ，  Ｈｕｍａｎ，  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）／０．４５ｍＭ  １−Ｔｈｉｏｇｌｙｃｅｒｏｌ（シグマアルドリッチ社製）］を用いて、患者由来ｉＰＳ細胞株及び変異修復ｉＰＳ細胞株を、更に１週間フィーダーフリーの条件下で培養し、神経堤細胞へと分化誘導した。続いて、抗ＣＤ２７１−ＡＰＣ抗体（ベクトンアンドディッキンソン社製、商品名Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６４７  Ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＣＤ２７１）で細胞を標識し、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ（ベクトンアンドディッキンソン社製）を用いてＣＤ２７１陽性細胞をソーティングした。その後、ａｌｐｈａ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（αＭＥＭ）（ナカライテスク株式会社製）／１０％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（株式会社ニチレイバイオサイエンス製）／５ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−２（和光純薬工業株式会社製）で、ソーティングした細胞を数回継代することによって、間葉系幹細胞様の細胞へと分化誘導し、以下の実験に供した。患者由来ｉＰＳ細胞株から分化した間葉系幹細胞様の細胞を「ＦＯＰ患者由来の細胞」と、変異修復ｉＰＳ細胞株から分化した間葉系幹細胞様の細胞を「変異修復株由来の細胞」という場合がある。【０１５３】
プロモーター領域にＢＭＰ応答配列を有するＦｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼレポータープラスミド（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００２，２７７（７），４８８３−４８９１．）と、内部標準としてＣＭＶプロモーターの下流にＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードする核酸配列を有するプラスミド（プロメガ株式会社製、商品名ｐｈＲＬ―ＣＭＶ  Ｖｅｃｔｏｒ）とを混合し、上述した間葉系幹細胞様の細胞にＦｕＧｅｎｅ（登録商標）  ＨＤ  （プロメガ株式会社製）を用いてトランスフェクションを行った。トランスフェクションを行ってから６時間後に、ヒトアクチビンＡ（アールアンドディーシステムズ社製、商品名Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ  Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、最終濃度１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ）又はヒトＢＭＰ−７（アールアンドディーシステムズ社製、商品名Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＢＭＰ−７、最終濃度１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ）を加えて、上記トランスフェクションを行った細胞を１６時間培養した。その後、デュアルグロ・ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ株式会社製）に添付のプロトコールにしたがってルシフェラーゼ活性を測定した。発光検出は、ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチラベルカウンター（パーキンエルマー社製）を用いて行った。ＢＭＰ応答配列を介した転写活性は、Ｆｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼ活性の測定値をＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性の測定値で除した値を用いて評価した。結果を図１に示す。図１において、棒グラフは各処理群の平均値を示し、エラーバーは標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を表す。【０１５４】
（結果）
図１に示すとおり、１０ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬのヒトアクチビンＡで処理することで、ＦＯＰ患者由来の細胞においてＡＣＶＲ１を介した転写活性が有意に上昇した（１０ｎｇ／ｍＬ  Ｐ＜０．０１、１００ｎｇ／ｍＬ  Ｐ＜０．００１、Ｄｕｎｎｅｔｔ型多重比較）。一方、この現象は、変異修復株由来の細胞では認められなかった。これに対して、ＢＭＰ−７で処理した場合には、ＦＯＰ患者由来の細胞及び変異修復株由来の細胞のいずれにおいても濃度依存的に転写活性が上昇した（ＦＯＰ患者由来細胞：１０ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬ  Ｐ＜０．００１、変異修復株：  １００ｎｇ／ｍＬ  Ｐ＜０．００１、各細胞の無処理群に対するＤｕｎｎｅｔｔ型多重比較）。これらの結果から、アクチビンＡは、ＦＯＰ患者由来の細胞に特異的にＢＭＰ応答配列を活性化することが確認された。【０１５５】
実施例２：ＳＭＡＤ１／５／８のリン酸化の評価
（方法）
実施例１と同様の方法によって、患者ｉＰＳ細胞株由来及び変異修復ｉＰＳ細胞株由来の間葉系幹細胞様の細胞をそれぞれ作製した。これらの間葉系幹細胞様の細胞に、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬのヒトアクチビンＡ又は１００ｎｇ／ｍＬのヒトＢＭＰ−７を加えて６０分間培養した。その後、３００μＬの溶解液（７０ｍＭ  トリス塩酸緩衝溶液、ｐＨ６．８、１１．２％  グリセロール、３％  ドデシル硫酸ナトリウム）で、細胞を可溶化し、細胞抽出液を調製した。得られた細胞抽出液中に含まれるリン酸化ＳＭＡＤ１／５／８の量及び総ＳＭＡＤ１／５／８の量をウエスタンブロット法にて定量した。リン酸化ＳＭＡＤ１／５／８に対する一次抗体は、ウサギ抗リン酸化ＳＭＡＤ１／５／８抗体［セルシグナリング社製、商品名Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ１  （Ｓｅｒ４６３／４６５）／  Ｓｍａｄ５  （Ｓｅｒ４６３／４６５）／  Ｓｍａｄ８  （Ｓｅｒ４２６／４２８）  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  （Ｒａｂｂｉｔ）］を用いて、総ＳＭＡＤ１／５／８に対する一次抗体は、ウサギ抗総ＳＭＡＤ１／５／８抗体［サンタクルーズバイオテクノロジー社製、商品名Ｓｍａｄ１／５／８  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  （Ｎ−１８）−Ｒ  （Ｒａｂｂｉｔ）］を用いた。二次抗体は、西洋わさびペルオキシダーゼ共役抗ウサギ抗体（セルシグナリング社製、商品名Ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ，  ＨＲＰ−ｌｉｎｋｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ）を用いた。化学発光の基質としてＥＣＬプライム（ＧＥヘルスケア株式会社製）を用いて、検出にはＣｈｅｍｉＤｏｃＸＲＳＰｌｕｓ（バイオラッド社製）を用いた。結果を図２に示す。【０１５６】
（結果）
図２に示すように、ＦＯＰ患者由来の細胞において、ヒトアクチビンＡによる処理を行うことによって、ＳＭＡＤ１／５／８のリン酸化が誘導された。一方、変異修復株由来の細胞では、ヒトＢＭＰ−７による処理を行うことによってＳＭＡＤ１／５／８のリン酸化は起こるものの、ヒトアクチビンＡによる処理を行ってもＳＭＡＤ１／５／８のリン酸化の誘導は生じなかった。ヒトアクチビンＡ又はヒトＢＭＰ−７による処理で、総ＳＭＡＤ１／５／８の量に大きな変化はなかった。以上の結果から、変異修復株由来の細胞においてもＡＣＶＲ１は正常に機能しているが、ヒトアクチビンＡによるＳＭＡＤ１／５／８のリン酸化は、ＦＯＰ患者由来の細胞に特異的に起こる現象であることが確認された。【０１５７】
実施例３：軟骨細胞への分化誘導に及ぼす影響
（方法）
実施例１と同様の方法によって、患者ｉＰＳ細胞株由来及び変異修復ｉＰＳ細胞株由来の間葉系幹細胞様の細胞をそれぞれ作製した。これらの間葉系幹細胞様の細胞をＵｍｅｄａらの方法（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１２，２，４５５．）の培地条件下で６日間培養し、軟骨細胞へと分化誘導した。分化誘導の際、１００ｎｇ／ｍＬのヒトアクチビンＡ、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＢＭＰ−７、又は、１ｎｇ／ｍＬのヒトＴＧＦ−β３（アールアンドディーシステムズ社製、商品名Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ３）を共存させることで、軟骨細胞への分化誘導に及ぼす各因子の影響を検討した。軟骨細胞への分化誘導の程度は、アルシアンブルーの染色及び硫酸化グリコサミノグリカンの定量キット（バイオカラー社製、商品名Ｂｌｙｓｃａｎ  Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）によって測定した。結果を図３及び図４に示す。図４において、棒グラフは各処理群の平均値を示し、エラーバーはＳ．Ｄ．を表す。【０１５８】
（結果）
アルシアンブルー染色の結果、１００ｎｇ／ｍＬのヒトアクチビンＡがＦＯＰ患者由来の細胞から軟骨細胞への分化誘導を顕著に促進することが明らかになった（図３）。硫酸化グリコサミノグリカンの定量においても、ヒトアクチビンＡがＦＯＰ患者由来細胞で特に顕著に軟骨誘導を促進することが明らかになった（図４、ＦＯＰ患者由来細胞、変異修復細胞ともにＰ＜０．００１、各細胞の無処理群に対するＤｕｎｎｅｔｔ型多重比較；ＦＯＰ患者由来細胞では変異修復細胞の４倍程度の硫酸化グリコサミノグリカン産生が認められた。）。ＢＭＰ−７及びＴＧＦ−β３は、いずれの細胞においても有意に軟骨誘導を促進した（ＦＯＰ患者由来細胞：ＢＭＰ−７  Ｐ＜０．０５、ＴＧＦ−β３  Ｐ＜０．００１、変異修復細胞：ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β３ともにＰ＜０．００１、各細胞の無処理群に対するＤｕｎｎｅｔｔ型多重比較）。しかし、その作用はＦＯＰ患者由来細胞に対してアクチビンＡが示す作用と比較して弱く、ＴＧＦ−β３については、ＦＯＰ患者由来の細胞と変異修復株由来の細胞の間に有意な差が認められなかった。【０１５９】
実施例４：ＡＣＶＲ１又はＢＭＰＲ１Ａの発現を阻害することによる影響
（方法）
実施例１と同様の方法によって、患者ｉＰＳ細胞株由来の間葉系幹細胞様の細胞を作製した。この細胞に、プロモーター領域にＢＭＰ応答配列を有するＦｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼレポータープラスミド、内部標準としてＣＭＶプロモーターの下流にＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードする核酸配列を有するプラスミド、及びＡＣＶＲ１又はＢＭＰＲ１ＡのｓｉＲＮＡを、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社製）を用いてトランスフェクションすることで、ＡＣＶＲ１又はＢＭＰＲ１Ａの発現をノックダウンした。ＢＭＰＲ１Ａは、ＢＭＰのシグナルを伝達するＩ型受容体である。ｓｉＲＮＡはアプライドバイオシステムズ社から購入し、ノックダウンには、各遺伝子について２種類の異なる配列を有するｓｉＲＮＡを用いた（カタログ番号、ＡＣＶＲ１：Ｓ９７５、Ｓ９７６、ＢＭＰＲ１Ａ：Ｓ２８１、Ｓ２８２）。さらに、実施例１と同様にアクチビンＡを加えて、上記細胞を１６時間培養した。その後に、細胞を可溶化し、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図５に示す。図５において、棒グラフは各処理群の平均値を示し、エラーバーはＳ．Ｄ．を表す。ここで、試験に用いたｓｉＲＮＡの配列は、Ｓ９７５：センス鎖５’−ＧＧＡＵＣＡＵＵＣＧＵＧＵＡＣＡＵＣＡｔｔ−３’（配列番号３７）、アンチセンス鎖５’−ＵＧＡＵＧＵＡＣＡＣＧＡＡＵＧＡＵＣＣａａ−３’（配列番号３８）、Ｓ９７６：センス鎖５’−ＧＵＵＧＣＵＣＵＣＣＧＡＡＡＡＵＵＵＡｔｔ−３’（配列番号３９）、アンチセンス鎖５’−ＵＡＡＡＵＵＵＵＣＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣｔｃ−３’（配列番号４０）、Ｓ２８１：センス鎖５’−ＧＧＣＣＧＡＵＡＵＧＧＡＧＡＡＧＵＡＵｔｔ−３’（配列番号４１）、アンチセンス鎖５’−ＡＵＡＣＵＵＣＵＣＣＡＵＡＵＣＧＧＣＣｔｔ−３’（配列番号４２）、Ｓ２８２：センス鎖５’−ＧＡＡＵＣＵＧＧＡＵＡＧＵＡＵＧＣＵＵｔｔ−３’（配列番号４３）、アンチセンス鎖５’−ＡＡＧＣＡＵＡＣＵＡＵＣＣＡＧＡＵＵＣｔｇ−３’（配列番号４４）である。小文字で表記した配列部分はオーバーハング部分を表し、リボース骨格がデオキシリボース骨格に置き換わっている部分である。【０１６０】
（結果）
図５に示すように、２種類のＡＣＶＲ１  ｓｉＲＮＡ（ＡＣＶＲ１−１、ＡＣＶＲ１−２それぞれ、Ｓ９７５、Ｓ９７６に対応）のいずれを用いた場合にも、ＦＯＰ患者由来の細胞における、ヒトアクチビンＡによるＢＭＰ応答配列の転写活性化が消失した。一方、ＢＭＰＲ１ＡをｓｉＲＮＡ（ＢＭＰＲ１Ａ−１、ＢＭＰＲ１Ａ−２それぞれ、Ｓ２８１、Ｓ２８２に対応）によってノックダウンした場合には、ＦＯＰ患者由来の細胞における、ヒトアクチビンＡの作用は影響を受けなかった。したがって、ＦＯＰ患者由来の細胞においてアクチビンのシグナルは、ＦＯＰ患者に特有の変異型ＡＣＶＲ１を介して伝達されていることが確認された。【０１６１】
実施例５：結合阻害剤の評価
（方法）
実施例１と同様の方法によって、患者ｉＰＳ細胞株由来の間葉系幹細胞様の細胞を作製した。この間葉系幹細胞様の細胞を実施例３と同様の方法で６日間培養し、軟骨細胞へと分化誘導した。この際、ヒトアクチビンＡに対する中和抗体（アールアンドディーシステムズ社製、商品名Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ  Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ  βＡ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ）、フォリスタチン（アールアンドディーシステムズ社製、商品名Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ  ３１５  ａａ  ３０−３４４）、フォリスタチン様３（アールアンドディーシステムズ社製、商品名Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ／ＦＬＲＧ）、ＡＣＶＲ２Ａ−Ｆｃキメラタンパク質（アールアンドディーシステムズ社製、商品名Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ａｃｔｉｖｉｎ  ＲＩＩＡ  Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ  （ＣＨＯ））、又はＡＣＶＲ２Ｂ−Ｆｃキメラタンパク質（アールアンドディーシステムズ社製、商品名Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ａｃｔｉｖｉｎ  ＲＩＩＢ  Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ）と、３０ｎｇ／ｍＬのヒトアクチビンＡとを共存させることで、軟骨細胞への分化誘導に及ぼす各因子の影響を検討した。ここで、ＡＣＶＲ２Ａ−Ｆｃキメラタンパク質は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列における第２０〜第１３４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド断片と、ヒト由来の抗体のＦｃ領域とがリンカー配列（Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ）を介して結合した融合タンパク質である。ＡＣＶＲ２Ｂ−Ｆｃキメラタンパク質は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列における第１９〜第１３４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド断片と、ヒト由来の抗体のＦｃ領域とがリンカー配列（Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ）を介して結合した融合タンパク質である。軟骨細胞への分化誘導の程度は、実施例３と同様にアルシアンブルーの染色と硫酸化グリコサミノグリカンの定量とによって行った。結果を図６に示す。図６（Ｂ）において、棒グラフは各処理群の平均値を示し、エラーバーはＳ．Ｄ．を表す。【０１６２】
（結果）
図６に示すように、ヒトアクチビンＡに対する中和抗体（抗アクチビン抗体）、フォリスタチン、フォリスタチン様３、ＡＣＶＲ２Ａ−Ｆｃキメラタンパク質及びＡＣＶＲ２Ｂ−Ｆｃキメラタンパク質のいずれも、３０ｎｇ／ｍＬのヒトアクチビンＡによるＦＯＰ患者由来の細胞の軟骨細胞への分化誘導を阻害した（ＡＣＶＲ２Ｂ−Ｆｃ  １００ｎｇ／ｍＬ  Ｐ＜０．０５、抗アクチビン抗体  １００ｎｇ／ｍＬ  Ｐ＜０．０１、その他の処理はいずれもＰ＜０．００１、アクチビン処理群に対するＤｕｎｎｅｔｔ型多重比較）。【０１６３】
実施例６：アクチビンの発現を阻害することによる影響
（方法）
実施例１と同様の方法によって、患者ｉＰＳ細胞株由来の間葉系幹細胞様の細胞を作製した。アクチビンを構成するポリペプチド鎖であるインヒビンβＡ鎖の遺伝子に対するｓｉＲＮＡを、実施例４と同様の方法でＦＯＰ患者由来の細胞にトランスフェクションすることで、アクチビンの発現を抑制した。ｓｉＲＮＡはアプライドバイオシステムズ社から購入し、ノックダウンには２種類の異なる配列を有するｓｉＲＮＡ（ＩＮＨＢＡ−１、ＩＮＨＢＡ−２）を用いた（カタログ番号Ｓ７４３４、Ｓ７４３５）。その後、実施例３と同様に軟骨細胞へと分化誘導した。軟骨細胞への分化誘導の程度は、実施例３と同様に硫酸化グリコサミノグリカンの定量によって判定した。結果を図７に示す。図７において、「陰性対照」は、どの遺伝子に対しても発現を抑制しない陰性対照のｓｉＲＮＡ（ライフテクノロジーズ社製、カタログ番号４３９０８４３）をトランスフェクトしたＦＯＰ患者由来の細胞を示す。棒グラフは各処理群の平均値を示し、エラーバーはＳ．Ｄ．を表す。【０１６４】
（結果）
図７に示すように、インヒビンβＡ鎖の遺伝子発現をノックダウンすることによってアクチビンの発現を抑制すると、ＦＯＰ患者由来の細胞の軟骨細胞への分化誘導は阻害された（両ｓｉＲＮＡともにＰ＜０．００１、Ｄｕｎｎｅｔｔ型多重比較）。【０１６５】
実施例７：各変異型ＡＣＶＲ１を介した転写活性の評価
（方法）
ＢＭＰの代表的な下流遺伝子であるＩＤ１遺伝子のプロモーター領域を有するＦｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼレポータープラスミド（Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ．  ２００２  Ｓｅｐ；７（９）：９４９−６０．）と、ＦＯＰを惹き起こすことが報告されている種々の変異型ＡＣＶＲ１の遺伝子を含むプラスミドとを混合し、Ｕ２ＯＳ細胞にＦｕＧｅｎｅ  ＨＤを用いてトランスフェクションを行った。トランスフェクションを行ってから１時間後にヒトアクチビンＡ（最終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）を加えて上記トランスフェクションを行った細胞を２０時間培養した。その後、ブライトグロ・ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ株式会社製）に添付のプロトコールにしたがってルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図８に示す。図８において、各サンプル名は、ＡＣＶＲ１のアミノ酸変異に基づいて、上記表１に従って記載した。【０１６６】
（結果）
図８に示すように、ヒトアクチビンＡによる処理によって、ＦＯＰを惹き起こすことが報告されている変異型ＡＣＶＲ１を導入した細胞ではいずれもＡＣＶＲ１を介した転写活性が上昇した。一方、この現象は、野生型ＡＣＶＲ１を導入した細胞では認められなかった。このことから、アクチビンＡは、ＦＯＰを惹き起こすことが報告されている変異型ＡＣＶＲ１を導入した細胞においてのみ、ＩＤ１遺伝子のプロモーターを活性化することが確認された。【０１６７】
実施例８：その他のアクチビンを用いた場合の評価
（方法）
実施例１と同様の方法によって、患者ｉＰＳ細胞株由来及び変異修復ｉＰＳ細胞株由来の間葉系幹細胞様の細胞をそれぞれ作製した。これらの細胞に、プロモーター領域にＢＭＰ応答配列を有するＦｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼレポータープラスミド、及び内部標準としてＣＭＶプロモーターの下流にＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードする核酸配列を有するプラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクションを行ってから６時間後にヒトアクチビンＡ（アールアンドディーシステムズ社製、最終濃度１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ）、ヒトアクチビンＢ（アールアンドディーシステムズ社製、商品名Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ａｃｔｉｖｉｎ  Ｂ、最終濃度１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ）、又はヒトアクチビンＡＢ（アールアンドディーシステムズ社製、商品名Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ａｃｔｉｖｉｎ  ＡＢ、最終濃度１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ）を加えて、上記トランスフェクションを行った細胞を１６時間培養した。その後、デュアルグロ・ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ株式会社製）に添付のプロトコールにしたがってルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図９に示す。図９において、棒グラフは各処理群の平均値を示し、エラーバーはＳ．Ｄ．を表す。【０１６８】
（結果）
図９に示すとおり、ヒトアクチビンＡで処理した場合と同様に、ヒトアクチビンＢ又はヒトアクチビンＡＢで処理することで、ＦＯＰ患者由来の細胞においてＡＣＶＲ１の下流の転写活性が有意に上昇した（１０ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＢ及びアクチビンＡＢ処理  Ｐ＜０．００１、無処理群に対するＤｕｎｎｅｔｔ型多重比較）。この現象は、変異修復株由来の細胞では認められなかった。このことから、アクチビンＢ及びアクチビンＡＢは、ＦＯＰ患者由来の細胞に対してアクチビンＡと同様の活性を有することが示された。【０１６９】
実施例９：三次元軟骨ペレットの形成とマウスへの移植実験
（方法）
三次元軟骨ペレットの作製
実施例１と同様の方法によって、患者ｉＰＳ細胞株由来及び変異修復ｉＰＳ細胞株由来の間葉系幹細胞様の細胞をそれぞれ作製した。この間葉系幹細胞様の細胞を１５ｍＬチューブに移して、遠心分離（１２００ｒｐｍ×５分）することで軟骨細胞のペレットを形成させた。実施例３と同様の培地条件下で１００ｎｇ／ｍＬのヒトアクチビンＡを共存させ、ペレットの状態で２１日間培養して三次元軟骨ペレット（以下、「軟骨ペレット」という場合がある。）を作製した（図１０の写真（ａ））。【０１７０】
三次元軟骨ペレットのマウスへの移植実験
上述の方法で得られた三次元軟骨ペレットを、免疫不全マウス（ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス）の背側の皮下に移植した。その後、４週間経時的にＸ線画像解析によって移植したマウスを観察した（図１０の写真（ｂ））。移植には１０匹のマウスを用いた。それぞれのマウスの右側にＦＯＰ患者由来の細胞から作製した軟骨ペレット（ＦＯＰ患者由来軟骨ペレット）を、左側に変異修復株由来の細胞から作製した軟骨ペレット（変異修復株由来軟骨ペレット）を移植した。移植してから４週間後に、ｍｉｃｒｏ−ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｈｙ解析（μＣＴ解析）（図１０の写真（ｃ））を実施した。その後、異所性に形成された骨軟骨塊を回収して４％パラホルムアルデヒドで固定し、組織染色（ＨＥ染色、アルシアンブルー染色、ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色）による解析を行った（図１０の写真（ｄ））。【０１７１】
（結果）
作製した軟骨ペレットの写真（ａ）を図１０に示す。ＦＯＰ患者由来軟骨ペレットは、変異修復株由来軟骨ペレットよりもサイズが大きく、より成熟した軟骨細胞が観察された。【０１７２】
移植してから４週間後のマウスのＸ線撮影像の写真（ｂ）を図１０に示す。白い破線の矢印が、ＦＯＰ患者由来軟骨ペレットを移植した場所に発生した石灰化部位を示す。白い実線の矢印が、変異修復株由来軟骨ペレットを移植した場所に発生した石灰化部位を示す。ＦＯＰ患者由来軟骨ペレットを移植した部位には２週目に１０匹中７匹で、３週目以降は９匹で異所性の石灰化が観察された。一方、変異修復株由来軟骨ペレットを移植した部位には３週目以降、１匹だけ異所性の石灰化が観察された。【０１７３】
ＦＯＰ細胞由来軟骨ペレットの移植によって起こった異所性の石灰化部位の（白い破線の矢印）、μＣＴ解析による撮影像（写真（ｃ））を図１０に示す。さらに、ＦＯＰ患者由来軟骨ペレットを移植したマウスにおいて、異所性に形成された骨軟骨塊の組織染色の写真（ｄ）を図１０に示す。いずれの解析においても、ＦＯＰ患者由来軟骨ペレットをマウスに移植することで、移植した部位に、異所性の石灰化が確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１７４】
ＦＯＰは臨床において効果が確認された治療法が存在しない疾患である。本発明は、ＦＯＰに対して、その主症状であるフレアアップ及び／又は異常な軟骨若しくは骨の形成及び成長を抑制する、効果的な予防剤及び／又は治療剤を提供するものである。より詳細には、アクチビンとＡＣＶＲ１との相互作用を阻害する、アクチビンの発現を抑制することでＦＯＰの主症状であるフレアアップ及び／又は異常な軟骨若しくは骨の形成及び成長を抑制する、予防剤及び予防方法、並びに治療剤及び治療方法を提供するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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