(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経伸長を促進するペプチドであって、下記の配列のみからなり、
Ａｓｎ−Ｘ１−Ｘ２−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ  （配列番号３）
配列中、
Ｘ１は、非極性アミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、及びチロシンからなる群から選択されるアミノ酸であり、
前記ペプチドが神経伸長を促進することを特徴とする、
神経伸長を促進するペプチド。
【請求項２】
前記配列は、ＮＡＩＰＱ（配列番号１）、ＮＰＳＰＱ（配列番号２）、ＮＦＥＰＱ（配列番号４）、ＮＭＹＰＱ（配列番号５）、ＮＩＫＰＱ（配列番号６）、ＮＬＭＰＱ（配列番号７）、ＮＶＡＰＱ（配列番号８）、およびＮＷＬＰＱ（配列番号９）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチドおよび薬学上許容されるビヒクルを含む、組成物。
【請求項５】
神経細胞の伸長を促進するための薬剤の製造における、請求項１に記載のペプチドの使用。
【請求項６】
前記神経細胞は正常型、損傷型、または変性型であることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
対象において神経損傷または神経変性に関連する症状を改善するための薬剤の製造における、請求項１に記載のペプチドの使用。
【請求項８】
前記症状は記憶障害、精神的退化、協調障害、生存率の低下、中枢神経系病変、パーキンソン病、アルツハイマー病、感覚ニューロンに作用する疾患、大脳辺縁系皮質調節不全、発育遅滞および学習障害に関連する障害、ダウン症、酸化ストレス誘導性神経細胞死、加齢関連疾患、アルコールに関する慢性疾患および病態、薬物乱用に関連する障害、創傷組織における病変、ならびに治療薬および処置の負の副作用によって引き起こされる病態からなる群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
健康な対象において記憶または学習能を増強するための組成物の製造における、請求項１に記載のペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明の背景
本発明は、神経伸長を促進するペプチド、特に、神経突起伸長を促進するペプチド、およびそれらの適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．従来技術の説明
学習および記憶は、ヒトおよび他の哺乳動物にとって不可欠な能力である。これらの生物は、環境を探索して知識および／または経験を獲得し、そしてそれを脳に蓄積および統合し、思考と行動を変化させることを通して変化する環境に適応する。記憶の喪失は主としてニューロンの持続的変性または死滅によるものであり、神経シグナル伝達の不全をもたらす。神経突起伸長、シナプス伝達、および記憶の形成などの成体のシナプスの可塑性は、学習および豊富な環境刺激によって強化される。脳神経の可塑性を増強する物質は、理論上、記憶形成も同様に増強する。
脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）（ＧＤＮＦ）、インスリン様成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）（ＩＧＦ）をはじめとする多くの神経栄養因子は、神経の可塑性ならびに記憶の形成を増強することが示されている。しかしながら、このような大きなタンパク質は通常、構造的不安定性、より短い半減期に見舞われ、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて血液脳関門を通過できない。ペプチドは生理学的機能および生化学的機能において重要な役割を果たすので、ペプチド薬は今般、それらの潜在的治療用途に関して注目されている。小さな化学実体の薬物に比べ、ペプチド系薬物は、より高い効力、より高い選択性、およびより良い安全性を含む、特定の有利な特徴を有する。
【発明の概要】
【０００３】
本発明の第１の態様は、下記のアミノ酸配列：
（Ｒ１）ａ−Ａｓｎ−Ｘ１−Ｘ２−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−（Ｒ２）ｂ（配列番号３）
およびその保存的に修飾されたバリエーションを含む、神経伸長を促進できるペプチドを提供する。
上式において、Ｒ１は、１〜４０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列であり、ここで、各アミノ酸は、天然アミノ酸およびアミノ酸類似体からなる群から独立に選択される。Ｒ１と同様に、上式のＲ２は、１〜４０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列であり、ここで、各アミノ酸は、天然アミノ酸およびアミノ酸類似体からなる群から独立に選択される。上式のＸ１は、非極性アミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸である。上式のＸ２は、天然アミノ酸およびアミノ酸類似体からなる群から選択されるアミノ酸である。上式の指数「ａ」および「ｂ」は独立に選択され、０または１であり得る。
【０００４】
本発明の第２の態様は、上記ペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０００５】
本発明の第３の態様は、上記ペプチドのうち少なくとも１つおよび薬学上許容されるビヒクルを含む組成物を提供する。
【０００６】
本発明の第４の態様は、神経伸長を促進するための方法を提供する。その方法は、神経細胞を、神経伸長を促進するために十分な量の上記ペプチドのいずれかと接触させるステップを含む。
【０００７】
本発明の第５の態様は、対象において神経細胞の損傷または神経変性に関連する症状を改善するための薬剤の製造における上述のペプチドのうちいずれか１つの使用を提供する。
【０００８】
本発明のこれらおよびその他の態様は、下記の好ましい実施形態の説明を下記の図面とともに参照すれば明らかとなる。ただし、本開示の新規な概念の趣旨および範囲から逸脱することなくその中に変形および改変を行うことが可能である。
【０００９】
以上の概要、ならびに下記の発明の詳細な説明は、添付の図面とともに読めばより良く理解できる。本発明を例示するために、添付の図面では、全てではなく一部の選択的実施形態を挙げる。しかしながら、本発明は、示されている厳密な配置および手段に限定されないと理解されるべきである。本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を成すこれらの図面は、本発明の原理を説明する助けとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】初代海馬神経突起伸長に対するＣ５ペプチド（配列番号１）およびＣ６ペプチド（配列番号２）の効果を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３日目（ＤＩＶ３）の初代海馬ニューロン培養物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、陰性対照として）で３日間処理した後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ６日目（ＤＩＶ６）に抗タウ抗体（軸策マーカー、緑）、抗ＭＡＰ２抗体（樹状突起マーカー、赤）、および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、核色素、青）で免疫染色を行った。スケールバー：５０μｍ。
【図１Ｂ】初代海馬神経突起伸長に対するＣ５ペプチド（配列番号１）およびＣ６ペプチド（配列番号２）の効果を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３日目（ＤＩＶ３）の初代海馬ニューロン培養物をＣ５ペプチド（１０−９Ｍ）で３日間処理した後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ６日目（ＤＩＶ６）に抗タウ抗体（軸策マーカー、緑）、抗ＭＡＰ２抗体（樹状突起マーカー、赤）、および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、核色素、青）で免疫染色を行った。スケールバー：５０μｍ。
【図１Ｃ】初代海馬神経突起伸長に対するＣ５ペプチド（配列番号１）およびＣ６ペプチド（配列番号２）の効果を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３日目（ＤＩＶ３）の初代海馬ニューロン培養物をＣ５ペプチド（１０−１２Ｍ）で３日間処理した後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ６日目（ＤＩＶ６）に抗タウ抗体（軸策マーカー、緑）、抗ＭＡＰ２抗体（樹状突起マーカー、赤）、および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、核色素、青）で免疫染色を行った。スケールバー：５０μｍ。
【図１Ｄ】初代海馬神経突起伸長に対するＣ５ペプチド（配列番号１）およびＣ６ペプチド（配列番号２）の効果を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３日目（ＤＩＶ３）の初代海馬ニューロン培養物をＣ５ペプチド（１０−１５Ｍ）で３日間処理した後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ６日目（ＤＩＶ６）に抗タウ抗体（軸策マーカー、緑）、抗ＭＡＰ２抗体（樹状突起マーカー、赤）、および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、核色素、青）で免疫染色を行った。スケールバー：５０μｍ。
【図１Ｅ】初代海馬神経突起伸長に対するＣ５ペプチド（配列番号１）およびＣ６ペプチド（配列番号２）の効果を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３日目（ＤＩＶ３）の初代海馬ニューロン培養物をＤ型Ｃ５ペプチド（１０−９Ｍ）で３日間処理した後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ６日目（ＤＩＶ６）に抗タウ抗体（軸策マーカー、緑）、抗ＭＡＰ２抗体（樹状突起マーカー、赤）、および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、核色素、青）で免疫染色を行った。スケールバー：５０μｍ。
【図１Ｆ】初代海馬神経突起伸長に対するＣ５ペプチド（配列番号１）およびＣ６ペプチド（配列番号２）の効果を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３日目（ＤＩＶ３）の初代海馬ニューロン培養物をＣ６ペプチド（１０−９Ｍ）で３日間処理した後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ６日目（ＤＩＶ６）に抗タウ抗体（軸策マーカー、緑）、抗ＭＡＰ２抗体（樹状突起マーカー、赤）、および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、核色素、青）で免疫染色を行った。スケールバー：５０μｍ。
【図１Ｇ】初代海馬神経突起伸長に対するＣ５ペプチド（配列番号１）およびＣ６ペプチド（配列番号２）の効果を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３日目（ＤＩＶ３）の初代海馬ニューロン培養物をＣ６ペプチド（１０−１２Ｍ）で３日間処理した後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ６日目（ＤＩＶ６）に抗タウ抗体（軸策マーカー、緑）、抗ＭＡＰ２抗体（樹状突起マーカー、赤）、および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、核色素、青）で免疫染色を行った。スケールバー：５０μｍ。
【図１Ｈ】初代海馬神経突起伸長に対するＣ５ペプチド（配列番号１）およびＣ６ペプチド（配列番号２）の効果を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３日目（ＤＩＶ３）の初代海馬ニューロン培養物をＣ６ペプチド（１０−１５Ｍ）で３日間処理した後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ６日目（ＤＩＶ６）に抗タウ抗体（軸策マーカー、緑）、抗ＭＡＰ２抗体（樹状突起マーカー、赤）、および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、核色素、青）で免疫染色を行った。スケールバー：５０μｍ。
【図１Ｉ】初代海馬神経突起伸長に対するＣ５ペプチド（配列番号１）およびＣ６ペプチド（配列番号２）の効果を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３日目（ＤＩＶ３）の初代海馬ニューロン培養物をＤ型Ｃ６ペプチド（１０−１２Ｍ）で３日間処理した後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ６日目（ＤＩＶ６）に抗タウ抗体（軸策マーカー、緑）、抗ＭＡＰ２抗体（樹状突起マーカー、赤）、および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、核色素、青）で免疫染色を行った。スケールバー：５０μｍ。
【図２Ａ】初代海馬神経突起伸長に対するＰ１ペプチド（配列番号４）、Ｐ２ペプチド（配列番号５）、Ｐ３ペプチド（配列番号６）、Ｐ４ペプチド（配列番号７）、Ｐ５ペプチド（配列番号８）、およびＰ６ペプチド（配列番号９）の効果を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３日目（ＤＩＶ３）の初代海馬ニューロン培養物をＰＢＳ（陰性対照として）で３日間処理した後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ６日目（ＤＩＶ６）に抗タウ抗体（軸策マーカー、緑）、抗ＭＡＰ２抗体（樹状突起マーカー、赤）、および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、核色素、青）で免疫染色を行った。スケールバー：５０μｍ。
【図２Ｂ】初代海馬神経突起伸長に対するＰ１ペプチド（配列番号４）、Ｐ２ペプチド（配列番号５）、Ｐ３ペプチド（配列番号６）、Ｐ４ペプチド（配列番号７）、Ｐ５ペプチド（配列番号８）、およびＰ６ペプチド（配列番号９）の効果を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３日目（ＤＩＶ３）の初代海馬ニューロン培養物をＰ１ペプチド（１０−９Ｍ）で３日間処理した後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ６日目（ＤＩＶ６）に抗タウ抗体（軸策マーカー、緑）、抗ＭＡＰ２抗体（樹状突起マーカー、赤）、および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、核色素、青）で免疫染色を行った。スケールバー：５０μｍ。
【図２Ｃ】初代海馬神経突起伸長に対するＰ１ペプチド（配列番号４）、Ｐ２ペプチド（配列番号５）、Ｐ３ペプチド（配列番号６）、Ｐ４ペプチド（配列番号７）、Ｐ５ペプチド（配列番号８）、およびＰ６ペプチド（配列番号９）の効果を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３日目（ＤＩＶ３）の初代海馬ニューロン培養物をＰ２ペプチド（１０−９Ｍ）で３日間処理した後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ６日目（ＤＩＶ６）に抗タウ抗体（軸策マーカー、緑）、抗ＭＡＰ２抗体（樹状突起マーカー、赤）、および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、核色素、青）で免疫染色を行った。スケールバー：５０μｍ。
【図２Ｄ】初代海馬神経突起伸長に対するＰ１ペプチド（配列番号４）、Ｐ２ペプチド（配列番号５）、Ｐ３ペプチド（配列番号６）、Ｐ４ペプチド（配列番号７）、Ｐ５ペプチド（配列番号８）、およびＰ６ペプチド（配列番号９）の効果を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３日目（ＤＩＶ３）の初代海馬ニューロン培養物をＰ３ペプチド（１０−９Ｍ）で３日間処理した後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ６日目（ＤＩＶ６）に抗タウ抗体（軸策マーカー、緑）、抗ＭＡＰ２抗体（樹状突起マーカー、赤）、および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、核色素、青）で免疫染色を行った。スケールバー：５０μｍ。
【図２Ｅ】初代海馬神経突起伸長に対するＰ１ペプチド（配列番号４）、Ｐ２ペプチド（配列番号５）、Ｐ３ペプチド（配列番号６）、Ｐ４ペプチド（配列番号７）、Ｐ５ペプチド（配列番号８）、およびＰ６ペプチド（配列番号９）の効果を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３日目（ＤＩＶ３）の初代海馬ニューロン培養物をＰ４ペプチド（１０−９Ｍ）で３日間処理した後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ６日目（ＤＩＶ６）に抗タウ抗体（軸策マーカー、緑）、抗ＭＡＰ２抗体（樹状突起マーカー、赤）、および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、核色素、青）で免疫染色を行った。スケールバー：５０μｍ。
【図２Ｆ】初代海馬神経突起伸長に対するＰ１ペプチド（配列番号４）、Ｐ２ペプチド（配列番号５）、Ｐ３ペプチド（配列番号６）、Ｐ４ペプチド（配列番号７）、Ｐ５ペプチド（配列番号８）、およびＰ６ペプチド（配列番号９）の効果を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３日目（ＤＩＶ３）の初代海馬ニューロン培養物をＰ５ペプチド（１０−９Ｍ）で３日間処理した後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ６日目（ＤＩＶ６）に抗タウ抗体（軸策マーカー、緑）、抗ＭＡＰ２抗体（樹状突起マーカー、赤）、および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、核色素、青）で免疫染色を行った。スケールバー：５０μｍ。
【図２Ｇ】初代海馬神経突起伸長に対するＰ１ペプチド（配列番号４）、Ｐ２ペプチド（配列番号５）、Ｐ３ペプチド（配列番号６）、Ｐ４ペプチド（配列番号７）、Ｐ５ペプチド（配列番号８）、およびＰ６ペプチド（配列番号９）の効果を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３日目（ＤＩＶ３）の初代海馬ニューロン培養物をＰ６ペプチド（１０−９Ｍ）で３日間処理した後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ６日目（ＤＩＶ６）に抗タウ抗体（軸策マーカー、緑）、抗ＭＡＰ２抗体（樹状突起マーカー、赤）、および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、核色素、青）で免疫染色を行った。スケールバー：５０μｍ。
【図３Ａ】本発明のいくつかの例示ペプチドの処理後の初代海馬ニューロンの軸策分岐の数および長さの統計結果を示す。ニューロン分岐の図を図３Ａに示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３日目（ＤＩＶ３）の初代海馬ニューロン培養物をＣ５ペプチド（１０−１２Ｍ）またはＣ６ペプチド（１０−１２Ｍ）で３日間処理した後、抗タウ抗体（緑）、抗ＭＡＰ２抗体（赤）およびＤＡＰＩ（青）で免疫染色を行い、次いで、軸策分岐の数（図３Ｃ）および長さ（図３Ｂ）を計測した。加えて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３日目（ＤＩＶ３）の初代海馬ニューロン培養物をＰ１ペプチド（１０−９Ｍ）、Ｐ２ペプチド（１０−９Ｍ）、Ｐ３ペプチド（１０−９Ｍ）、Ｐ４ペプチド（１０−９Ｍ）、Ｐ５ペプチド（１０−９Ｍ）、またはＰ６ペプチド（１０−９Ｍ）で３日間処理した後、抗タウ抗体（緑）、抗ＭＡＰ２抗体（赤）およびＤＡＰＩ（青）で免疫染色を行い、次いで、軸策分岐の数（図３Ｅ）および長さ（図３Ｄ）を計測した。データをＩｍａｇｅ  Ｊソフトウエアおよび一元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、ニューマン−コイルス検定で分析した。データは平均±ＳＥＭとして表す。対照群と比較した場合、＊＊、ｐ＜０．０１。
【図３Ｂ】本発明のいくつかの例示ペプチドの処理後の初代海馬ニューロンの軸策分岐の数および長さの統計結果を示す。ニューロン分岐の図を図３Ａに示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３日目（ＤＩＶ３）の初代海馬ニューロン培養物をＣ５ペプチド（１０−１２Ｍ）またはＣ６ペプチド（１０−１２Ｍ）で３日間処理した後、抗タウ抗体（緑）、抗ＭＡＰ２抗体（赤）およびＤＡＰＩ（青）で免疫染色を行い、次いで、軸策分岐の数（図３Ｃ）および長さ（図３Ｂ）を計測した。加えて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３日目（ＤＩＶ３）の初代海馬ニューロン培養物をＰ１ペプチド（１０−９Ｍ）、Ｐ２ペプチド（１０−９Ｍ）、Ｐ３ペプチド（１０−９Ｍ）、Ｐ４ペプチド（１０−９Ｍ）、Ｐ５ペプチド（１０−９Ｍ）、またはＰ６ペプチド（１０−９Ｍ）で３日間処理した後、抗タウ抗体（緑）、抗ＭＡＰ２抗体（赤）およびＤＡＰＩ（青）で免疫染色を行い、次いで、軸策分岐の数（図３Ｅ）および長さ（図３Ｄ）を計測した。データをＩｍａｇｅ  Ｊソフトウエアおよび一元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、ニューマン−コイルス検定で分析した。データは平均±ＳＥＭとして表す。対照群と比較した場合、＊＊、ｐ＜０．０１。
【図３Ｃ】本発明のいくつかの例示ペプチドの処理後の初代海馬ニューロンの軸策分岐の数および長さの統計結果を示す。ニューロン分岐の図を図３Ａに示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３日目（ＤＩＶ３）の初代海馬ニューロン培養物をＣ５ペプチド（１０−１２Ｍ）またはＣ６ペプチド（１０−１２Ｍ）で３日間処理した後、抗タウ抗体（緑）、抗ＭＡＰ２抗体（赤）およびＤＡＰＩ（青）で免疫染色を行い、次いで、軸策分岐の数（図３Ｃ）および長さ（図３Ｂ）を計測した。加えて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３日目（ＤＩＶ３）の初代海馬ニューロン培養物をＰ１ペプチド（１０−９Ｍ）、Ｐ２ペプチド（１０−９Ｍ）、Ｐ３ペプチド（１０−９Ｍ）、Ｐ４ペプチド（１０−９Ｍ）、Ｐ５ペプチド（１０−９Ｍ）、またはＰ６ペプチド（１０−９Ｍ）で３日間処理した後、抗タウ抗体（緑）、抗ＭＡＰ２抗体（赤）およびＤＡＰＩ（青）で免疫染色を行い、次いで、軸策分岐の数（図３Ｅ）および長さ（図３Ｄ）を計測した。データをＩｍａｇｅ  Ｊソフトウエアおよび一元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、ニューマン−コイルス検定で分析した。データは平均±ＳＥＭとして表す。対照群と比較した場合、＊＊、ｐ＜０．０１。
【図３Ｄ】本発明のいくつかの例示ペプチドの処理後の初代海馬ニューロンの軸策分岐の数および長さの統計結果を示す。ニューロン分岐の図を図３Ａに示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３日目（ＤＩＶ３）の初代海馬ニューロン培養物をＣ５ペプチド（１０−１２Ｍ）またはＣ６ペプチド（１０−１２Ｍ）で３日間処理した後、抗タウ抗体（緑）、抗ＭＡＰ２抗体（赤）およびＤＡＰＩ（青）で免疫染色を行い、次いで、軸策分岐の数（図３Ｃ）および長さ（図３Ｂ）を計測した。加えて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３日目（ＤＩＶ３）の初代海馬ニューロン培養物をＰ１ペプチド（１０−９Ｍ）、Ｐ２ペプチド（１０−９Ｍ）、Ｐ３ペプチド（１０−９Ｍ）、Ｐ４ペプチド（１０−９Ｍ）、Ｐ５ペプチド（１０−９Ｍ）、またはＰ６ペプチド（１０−９Ｍ）で３日間処理した後、抗タウ抗体（緑）、抗ＭＡＰ２抗体（赤）およびＤＡＰＩ（青）で免疫染色を行い、次いで、軸策分岐の数（図３Ｅ）および長さ（図３Ｄ）を計測した。データをＩｍａｇｅ  Ｊソフトウエアおよび一元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、ニューマン−コイルス検定で分析した。データは平均±ＳＥＭとして表す。対照群と比較した場合、＊＊、ｐ＜０．０１。
【図３Ｅ】本発明のいくつかの例示ペプチドの処理後の初代海馬ニューロンの軸策分岐の数および長さの統計結果を示す。ニューロン分岐の図を図３Ａに示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３日目（ＤＩＶ３）の初代海馬ニューロン培養物をＣ５ペプチド（１０−１２Ｍ）またはＣ６ペプチド（１０−１２Ｍ）で３日間処理した後、抗タウ抗体（緑）、抗ＭＡＰ２抗体（赤）およびＤＡＰＩ（青）で免疫染色を行い、次いで、軸策分岐の数（図３Ｃ）および長さ（図３Ｂ）を計測した。加えて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３日目（ＤＩＶ３）の初代海馬ニューロン培養物をＰ１ペプチド（１０−９Ｍ）、Ｐ２ペプチド（１０−９Ｍ）、Ｐ３ペプチド（１０−９Ｍ）、Ｐ４ペプチド（１０−９Ｍ）、Ｐ５ペプチド（１０−９Ｍ）、またはＰ６ペプチド（１０−９Ｍ）で３日間処理した後、抗タウ抗体（緑）、抗ＭＡＰ２抗体（赤）およびＤＡＰＩ（青）で免疫染色を行い、次いで、軸策分岐の数（図３Ｅ）および長さ（図３Ｄ）を計測した。データをＩｍａｇｅ  Ｊソフトウエアおよび一元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、ニューマン−コイルス検定で分析した。データは平均±ＳＥＭとして表す。対照群と比較した場合、＊＊、ｐ＜０．０１。
【図４】ＭＴＴアッセイによる初代海馬ニューロンの生存率に対する種々の濃度のＣ５ペプチド（１０−１２Ｍ、１０−９Ｍ、１０−６Ｍ、１０−３Ｍ）およびＣ６ペプチド（１０−１２Ｍ、１０−９Ｍ、１０−６Ｍ、１０−３Ｍ）の効果を示す。データは、３サンプルの平均±ＳＥＭとして表す。
【図５Ａ】初代海馬ニューロンの再生に対するＣ５ペプチドおよびＣ６ペプチドの効果を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ５日目（ＤＩＶ５）に、胎児海馬初代ニューロンに機械的掻爬傷害を施した。次に、掻爬した胎児海馬初代ニューロンをＰＢＳで９６時間処理した後、抗タウ抗体（緑、軸策マーカー）およびＤＡＰＩ（青、核色素）で免疫染色を行った。スケールバー：１００μｍ。
【図５Ｂ】初代海馬ニューロンの再生に対するＣ５ペプチドおよびＣ６ペプチドの効果を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ５日目（ＤＩＶ５）に、胎児海馬初代ニューロンに機械的掻爬傷害を施した。次に、掻爬した胎児海馬初代ニューロンをＣ５ペプチド（１０−９Ｍ）で９６時間処理した後、抗タウ抗体（緑、軸策マーカー）およびＤＡＰＩ（青、核色素）で免疫染色を行った。スケールバー：１００μｍ。
【図５Ｃ】初代海馬ニューロンの再生に対するＣ５ペプチドおよびＣ６ペプチドの効果を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ５日目（ＤＩＶ５）に、胎児海馬初代ニューロンに機械的掻爬傷害を施した。次に、掻爬した胎児海馬初代ニューロンをＣ６ペプチド（１０−９Ｍ）で９６時間処理した後、抗タウ抗体（緑、軸策マーカー）およびＤＡＰＩ（青、核色素）で免疫染色を行った。スケールバー：１００μｍ。
【図６】水迷路課題による空間学習および記憶に対するＣ５ペプチドおよびＣ６ペプチドの効果の検討を示す。スプラーグ−ドーリー（Ｓｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）（ＳＤ）ラットを対照、Ｃ５低用量群（５４μｇ／ｋｇ）、Ｃ５高用量群（２７０μｇ／ｋｇ）、Ｃ６低用量群（５．４μｇ／ｋｇ）、およびＣ６高用量群（２７μｇ／ｋｇ）に無作為に分けた。各水迷路学習日の逃避潜時（秒）を記録した。データは二元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、ニューマン−コイルス多重比較事後検定で分析した。データは平均±ＳＥＭとして表す。対照群と比較した場合、＊＊、Ｐ＜０．０１。
【図７】ラットでの水迷路記憶形成におけるスコポラミン誘導性記憶障害に対するＣ５ペプチドおよびＣ６ペプチドの効果を示す。ラットを陰性対照、スコポラミン注射群（Ｓｃｏ）、Ｃ５ペプチドとスコポラミン注射群（Ｃ５＋Ｓｃｏ）、およびＣ６ペプチドとスコポラミン注射群（Ｃ６＋Ｓｃｏ）に無作為に分け、水迷路訓練を行った。各水迷路学習日の逃避潜時（秒）を記録した。データは二元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、ニューマン−コイルス多重比較事後検定で分析した。データは平均±ＳＥＭとして表す。対照群と比較した場合、＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。
【図８】ラットでの受動的一元配置抑制性回避学習におけるスコポラミン誘導性記憶障害に対するＣ５ペプチドおよびＣ６ペプチドの効果を示す。ラットを対照、スコポラミン注射群（Ｓｃｏ）、Ｃ５ペプチドとスコポラミン注射群（Ｃ５＋Ｓｃｏ）、およびＣ６ペプチドとスコポラミン注射群（Ｃ６＋Ｓｃｏ）に無作為に分け、受動的一元配置抑制性回避学習を行った。フットショック前の照明区画での保持時間は差異を示さなかった。フットショック１日後および７日後の照明区画での保持時間を記録した。データを一元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、ニューマン−コイルス多重比較事後検定で分析した。データは平均±ＳＥＭとして表す。対照群と比較した場合、＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。
【図９Ａ】ラットでのステップダウン受動回避記憶課題におけるスコポラミン誘導性記憶障害に対するＣ５ペプチドおよびＣ６ペプチドの効果を示す。ラットを対照、スコポラミン注射群（Ｓｃｏ）、Ｃ５ペプチドとスコポラミン注射群（Ｃ５＋Ｓｃｏ）、およびＣ６ペプチドとスコポラミン注射群（Ｃ６＋Ｓｃｏ）に無作為に分け、ステップダウン受動回避記憶課題を行った。図９Ａは、フットショック前に、各群のラットのステージ上での保持時間の有意な差は無かったことを示す。データを一元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、ニューマン−コイルス多重比較事後検定で分析した。データは平均±ＳＥＭとして表す。対照群と比較した場合、＊＊  ｐ＜０．０１。
【図９Ｂ】ラットでのステップダウン受動回避記憶課題におけるスコポラミン誘導性記憶障害に対するＣ５ペプチドおよびＣ６ペプチドの効果を示す。ラットを対照、スコポラミン注射群（Ｓｃｏ）、Ｃ５ペプチドとスコポラミン注射群（Ｃ５＋Ｓｃｏ）、およびＣ６ペプチドとスコポラミン注射群（Ｃ６＋Ｓｃｏ）に無作為に分け、ステップダウン受動回避記憶課題を行った。図９Ｂは、フットショック１日後のステージ上での保持時間を示す。データを一元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、ニューマン−コイルス多重比較事後検定で分析した。データは平均±ＳＥＭとして表す。対照群と比較した場合、＊＊  ｐ＜０．０１。
【図９Ｃ】ラットでのステップダウン受動回避記憶課題におけるスコポラミン誘導性記憶障害に対するＣ５ペプチドおよびＣ６ペプチドの効果を示す。ラットを対照、スコポラミン注射群（Ｓｃｏ）、Ｃ５ペプチドとスコポラミン注射群（Ｃ５＋Ｓｃｏ）、およびＣ６ペプチドとスコポラミン注射群（Ｃ６＋Ｓｃｏ）に無作為に分け、ステップダウン受動回避記憶課題を行った。図９Ｃは、フットショック１日後の飛び跳ねエラー数を示す。データを一元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、ニューマン−コイルス多重比較事後検定で分析した。データは平均±ＳＥＭとして表す。対照群と比較した場合、＊＊  ｐ＜０．０１。
【図１０】ラットでの新奇物体認識試験におけるスコポラミン誘導性記憶障害に対するＣ５ペプチドおよびＣ６ペプチドの効果を示す。ラットを対照、スコポラミン注射群（Ｓｃｏ）、Ｃ５ペプチドとスコポラミン注射群（Ｃ５＋Ｓｃｏ）、およびＣ６ペプチドとスコポラミン注射群（Ｃ６＋Ｓｃｏ）に無作為に分け、新奇物体認識試験を行った。右の物体が新奇物体に置き換えられる前と、置き換えられた３時間後、８時間後、および２４時間後の左の物体（ＬＯ）、右の物体（ＲＯ）、および新奇物体（ＮＯ）の探索に費やした保持時間（秒）を記録した。データを二元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、ニューマン−コイルス多重比較事後検定で分析した。データは平均±ＳＥＭとして表す。対照群と比較した場合、＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。
【図１１Ａ】ラットでの水迷路記憶形成における加齢誘導性記憶障害に対するＣ５ペプチドおよびＣ６ペプチドの効果を示す。加齢ラットを対照、Ｃ５ペプチド注射群、およびＣ６ペプチド注射群に無作為に分け、水迷路訓練を行った。図１１Ａは、薬物投与前の各学習日の平均逃避潜時（秒）を示す。データを二元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、ニューマン−コイルス多重比較事後検定で分析した。データは平均±ＳＥＭとして表す。対照群と比較した場合、＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。
【図１１Ｂ】ラットでの水迷路記憶形成における加齢誘導性記憶障害に対するＣ５ペプチドおよびＣ６ペプチドの効果を示す。加齢ラットを対照、Ｃ５ペプチド注射群、およびＣ６ペプチド注射群に無作為に分け、水迷路訓練を行った。図１１Ｂは、薬物投与後６か月の各学習日の平均逃避潜時を示す。データを二元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、ニューマン−コイルス多重比較事後検定で分析した。データは平均±ＳＥＭとして表す。対照群と比較した場合、＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。
【図１２】加齢ラットの生存監視に対するＣ５ペプチドおよびＣ６ペプチドの効果を示す。各群（対照、Ｃ５群、およびＣ６群）は、本試験の開始時に６個体のラット（１２か月齢）を含んでいた。各群のラット数を本試験の開始時と隔月（それぞれ１２、１４、１６、１８、２０、および２２か月齢）に記録した。データは、各群の生存監視数を示す。
【図１３】１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）−マウスパーキンソン病モデルに対するＣ６ペプチドの効果を示す。
【図１４】ラットでの水迷路記憶形成におけるＤ−ガラクトース誘導性加齢に対するＣ５ペプチドおよびＣ６ペプチドの効果を示す。ラットを対照、Ｄ−ガラクトース注射群、Ｃ５ペプチドとＤ−ガラクトース注射群、およびＣ６ペプチドとＤ−ガラクトース注射群に無作為に分け、水迷路訓練を行った。各水迷路学習日の逃避潜時（秒）を記録した。データを二元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、ニューマン−コイルス多重比較事後検定で分析した。データは平均±ＳＥＭとして表す。対照群と比較した場合、＊＊、ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以上の概要説明と下記の詳細な説明の両方は例示および説明であり、特許請求される本発明を制限するものではないと理解されるべきである。本発明の１以上の実施形態の特定の詳細は下記の説明に示される。本発明の他の特徴または利点は、以下に続く代表例の非網羅的リストから、また、添付の特許請求の範囲から明らかとなる。
【００１２】
本発明は、下記の配列：
（Ｒ１）ａ−Ａｓｎ−Ｘ１−Ｘ２−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−（Ｒ２）ｂ（配列番号３）
およびその保存的に修飾されたバリエーションを含む、神経伸長を促進するペプチドを提供し、配列中、Ｒ１は、１〜４０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列であり、ここで、各アミノ酸は、天然アミノ酸およびアミノ酸類似体からなる群から独立に選択され、Ｒ２は、１〜４０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列であり、ここで、各アミノ酸は、天然アミノ酸およびアミノ酸類似体からなる群から独立に選択され、Ｘ１は、非極性アミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２は、天然アミノ酸およびアミノ酸類似体からなる群から選択されるアミノ酸であり、かつ、ａおよびｂは独立に選択され、０および１に等しい。
【００１３】
一実施形態では、ａおよびｂは両方とも０である。一実施形態では、ペプチドは、ＮＡＩＰＱ（配列番号１）の配列を有する。一実施形態では、ペプチドは、ＮＰＳＰＱ（配列番号２）の配列を有する。一実施形態では、ペプチドは、ＮＦＥＰＱ（配列番号４）の配列を有する。一実施形態では、ペプチドは、ＮＭＹＰＱ（配列番号５）の配列を有する。一実施形態では、ペプチドは、ＮＩＫＰＱ（配列番号６）の配列を有する。一実施形態では、ペプチドは、ＮＬＭＰＱ（配列番号７）の配列を有する。一実施形態では、ペプチドは、ＮＶＡＰＱ（配列番号８）の配列を有する。一実施形態では、ペプチドは、ＮＷＬＰＱ（配列番号９）の配列を有する。
上記に挙げた配列は例示であり、本発明の神経伸長を促進するペプチドは、配列番号１、２、４〜９の配列に限定されない。例えば、限定されるものではないが、Ｘ１がアラニン（Ａｌａ、Ａ）である場合、Ｘ２は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、チロシンのうちいずれか１つであり得る。
【００１４】
本発明の神経伸長を促進するペプチドは、限定されるものではないが、ペプチド合成装置または分子クローニングにより生産できる。一実施形態では、本ペプチドは、ペプチド合成装置により合成され、Ｄ型またはＬ型に限定されない。本発明で提供されるペプチドのアミノ酸残基は、全Ｌもしくは全Ｄ、またはそれらの組合せの当技術分野で公知の天然アミノ酸または非天然アミノ酸から構成される可能性がある。
別の実施形態では、本ペプチドはまた、分子クローニングによっても生産できる。分子クローニングにより得られるペプチドは、限定されるものではないが、本ペプチドの１つをコードするポリヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入して、本ペプチドの１つをコードするポリヌクレオチド配列を含むプラスミドを形成し、該プラスミドを宿主細胞に形質転換し、該宿主細胞内でタンパク質発現を誘導して神経伸長を促進するペプチドを得ることによって生産できる。
【００１５】
従って、本発明はまた、上記ペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド、および／または上記ペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む組換え核酸発現ベクター、および／または上記ペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを有する組換え核酸発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１６】
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、各アミノ酸を遺伝暗号表に挙げられている全縮重コドンを含む３ヌクレオチドコドンで置換することにより、神経伸長を促進するペプチドのアミノ酸配列から誘導される。例えば、本ペプチドのアミノ酸配列の各プロリンは、コドンＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、またはＣＣＴにより独立にコードされ得る。
【００１７】
本発明はさらに、上記ペプチドのうち少なくとも１つおよび薬学上許容されるビヒクルを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本組成物は、上記ペプチドのうち少なくとも１つ、例えば、限定されるものではないが、ＮＡＩＰＱ（配列番号１）、ＮＰＳＰＱ（配列番号２）、ＮＦＥＰＱ（配列番号４）、ＮＭＹＰＱ（配列番号５）、ＮＩＫＰＱ（配列番号６）、ＮＬＭＰＱ（配列番号７）、ＮＶＡＰＱ（配列番号８）、およびＮＷＬＰＱ（配列番号９）のうち１つ、またはそれらの組合せを有する。いくつかの実施形態では、本組成物は、必ずしもそうではないが、薬学上有効な量の上記ペプチドを有する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、神経伸長を促進し、特に、軸策分岐の数および軸策の長さを増す。新たなシナプスは脳の活動（例えば、学習、記憶、修復、および再生）の際に形成される。シナプス形成のプロセスはシナプス前ニューロンにおける軸策終末ボタンの形成で始まり、これは次にシナプス後ニューロンにおける樹状突起の形成を誘発する。
シナプスは、ニューロン間のクロストークが存在するような軸策終末ボタンと樹状突起の接触、新たな接続の形成、ならびに活動を遂行するための脳の発達およびリモデリングにより形成される。従って、学習および記憶などの活動を遂行するためには、樹状分岐のための軸策伸長とシナプス形成を刺激することが必要である。脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は、軸策神経突起の伸長と続いての樹状分岐を刺激することによって神経伸長を促進する。ＢＤＮＦ受容体の阻害剤は、軸策伸長を阻害し、記憶喪失を引き起こす。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、軸策成長を有意に増強する。本ペプチドの役割はＢＤＮＦと同様であり、両方とも軸策成長を増強することにより神経伸長を促進する。
【００１９】
加えて、成体哺乳動物の脳では新生される新たなニューロンはほとんど形成されず、ニューロンの変性、死滅、および欠損が持続するために、成体および高齢個体はニューロン間のクロストークを維持または改善するために神経突起の分岐に頼る必要がある。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは軸策成長を増強することにより神経伸長を促進し、従って、加齢または他の因子により引き起こされる神経損傷または神経変性を軽減し、対象における神経損傷または神経変性に関連する症状を改善する。
【００２０】
従って、本発明は、神経細胞を、神経伸長を促進するために十分な量の上記ペプチドのうち少なくとも１つと接触させることを含む、神経伸長を促進するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、神経細胞は、正常機能を有する神経細胞である。いくつかの実施形態では、神経細胞は、変性した神経細胞である。いくつかの実施形態では、神経細胞は、損傷した神経細胞である。
神経細胞の損傷または変性の原因には、限定されるものではないが、物理的損傷（例えば、機械的損傷、挫傷、または切傷）、化学的損傷（例えば、アルコール、塩酸スコポラミン、１−メチル−４−フェニル−６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）、またはアンフェタミンにより引き起こされる損傷）、生物学的損傷（例えば、脳低酸素症によりにより引き起こされる損傷）、加齢またはそれらの組合せが含まれる。
【００２１】
加えて、本発明は、対象において記憶障害を改善するための方法を提供する。本発明はまた、対象において認知症を改善するための方法も提供する。いくつかの実施形態では、対象における記憶障害または認知症は、加齢により誘発される。いくつかの実施形態では、対象における記憶障害または認知症は、機械的傷害により誘発される。いくつかの実施形態では、対象における記憶障害または認知症は、化学試薬により誘発される。いくつかの実施形態では、対象における記憶障害または認知症は、塩酸スコポラミンにより誘発される。塩酸スコポラミン（Ｓｃｏ）は、動物およびヒトにおけるムスカリン性受容体拮抗剤であり、学習および記憶に障害を引き起こす。いくつかの実施形態では、本発明は、認知症に対する本発明に開示されるペプチドの効果を検討するためにＳｃｏ誘導性健忘症の動物モデルを使用する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、対象における記憶障害または認知症は、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）により誘発される。ＭＰＴＰは、１−メチル−４−フェニルピリジニウムの神経毒前駆体（ＭＰＰ＋）であり、脳の黒質でドーパミンニューロンを破壊することによりパーキンソン病の恒久的症状を引き起こす。いくつかの実施形態では、本発明は、本疾患に対する本発明に開示されるペプチドの効果を検討するためにＭＰＴＰ誘導性パーキンソン病の動物モデルを使用する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、対象における記憶障害または認知症は、自然加齢またはＤ−（＋）−ガラクトース（Ｄ−ガラクトース）により誘発される。Ｄ−ガラクトースは、通常の状況では栄養素である。しかしながら、Ｄ−ガラクトースの過剰な取り込みは非酵素的グリコシル化（糖化）を引き起こすことがあり、糖分子が酵素の作用を制御せずにタンパク質または脂質分子と結合する。一連の反応での糖とタンパク質の重合は不可逆的な物質を産生し、これが他のタンパク質と結合し、終末糖化産物（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ）（ＡＧＥ）を形成する。
細胞における終末糖化産物の蓄積は、反応性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）（ＲＯＳ）の生成をもたらし、酸化ストレス、神経炎症、記憶形成およびシナプス伝達の妨害、神経変性、最終的には記憶の欠損に至る。この非酵素的グリコシル化は、酸化傷害および加齢性疾患に寄与する。生理学的分析または病理学的分析のいずれかから、Ｄ−ガラクトースで処置したラットの加齢は、１６〜２４か月齢のラットに等しい。いくつかの実施形態では、本発明は、認知症に対する本発明に開示されるペプチドの効果を検討するために自然加齢の動物モデルを使用する。いくつかの実施形態では、本発明は、認知症に対する本発明に開示されるペプチドの効果を検討するためにＤ−ガラクトース誘導性加齢の動物モデルを使用する。
【００２４】
本発明はさらに、対象において神経損傷または神経変性に関連する症状を改善するための薬剤の製造における上記ペプチドのいずれかの使用を提供する。いくつかの実施形態では、該症状には、限定されるものではないが、記憶障害、精神的退化、協調障害、生存率の低下、中枢神経系病変、パーキンソン病、アルツハイマー病、感覚ニューロンに作用する疾患、大脳辺縁系皮質調節不全、発育遅滞および学習障害に関連する障害、ダウン症、酸化ストレス誘導性神経細胞死、加齢関連疾患、アルコールに関する慢性疾患および病態、薬物乱用に関連する障害、創傷組織における病変、ならびに治療薬および処置の負の副作用によって引き起こされる病態が含まれる。いくつかの実施形態では、該症状は、記憶障害、精神的退化、協調障害、生存率の低下、パーキンソン病、および／またはアルツハイマー病である。いくつかの実施形態では、陰性対照に比べて、これらの症状は対象に一定の期間、本発明のペプチドを投与した後に有意に改善される。
【００２５】
別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により共通に理解されているものと同じ意味を有する。
【００２６】
本明細書で使用する場合、冠詞「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「いずれかの（ａｎｙ）」は、１または複数（すなわち、少なくとも１つ）のその冠詞の文法的目的語を指す。例えば、「１つの要素」は、１つの要素または複数の要素を意味する。
【００２７】
本明細書で使用する場合、用語「ヌクレオチド」は、１以上のリン酸基に連結されたリボースまたは２’−デオキシリボースなどの糖を含む糖リン酸に連結された窒素塩基を含むモノマーを指す。「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、複数のヌクレオチドモノマーを含み、該モノマーは多くの場合、糖−リン酸骨格の糖−リン酸結合によって連結されているポリマーを指す。ポリヌクレオチドは、１タイプのみのヌクレオチドモノマーを含む必要はない。例えば、あるポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドのみであってもよいし、２’−デオキシリボヌクレオチドのみであってもよいし、またはリボヌクレオチドと２’−デオキシリボヌクレオチドの両方の組合せであってもよい。
ポリヌクレオチドには、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）およびリボ核酸（「ＲＮＡ」）などの天然核酸、ならびに１以上の非天然モノマーを含む核酸類似体が含まれる。ポリヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成装置を用いて合成できる。用語「核酸」は一般に、大きなポリヌクレオチドを指す。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）により表される場合、これには「Ｕ」が「Ｔ」に取って代わったＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も含むと理解される。用語「ｃＤＮＡ」は、一本鎖形態または二本鎖形態いずれかの、「Ｔ」が「Ｕ」に取って代わったこと以外はｍＲＮＡと相補的なまたは同一のＤＮＡを指す。用語「組換え核酸」は、自然状態で一緒にはない配列を有するポリヌクレオチドまたは核酸を指す。組換え核酸はベクターの形態で存在してもよい。
【００２８】
本明細書で使用する場合、用語「アミノ酸」は、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は、遺伝コードによりコードされるもの、ならびに後に修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。
本出願の目的では、用語「アミノ酸類似体」は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合された炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。本出願の目的では、用語「アミノ酸模倣体」は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。
【００２９】
本明細書で使用する場合、用語「非極性アミノ酸」は、α−炭素に結合された官能基（すなわち、ＲＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨのＲ）が疎水性を有するα−アミノ酸を指す。本発明の非極性アミノ酸には、天然および合成非極性アミノ酸、ならびに天然非極性アミノ酸と同様に機能する非極性アミノ酸類似体および非極性アミノ酸模倣体、例えば、限定されるものではないが、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、およびα−アミノ酪酸が含まれる。
【００３０】
本明細書で使用する場合、用語「ペプチド」は、アミノ酸残基のポリマーを意味する。この用語は、１以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の類似体または模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーに当てはまる。
【００３１】
本明細書で使用する場合、用語「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸配列と核酸配列の両方に当てはまる。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一の配列を指す。具体的には、縮重コドン置換は、１以上の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することにより達成され得る。
遺伝コードの縮重のために、多数の機能的に同一の核酸がある任意のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコードする。従って、コドンによりアラニンが指定されるどの位置でも、そのコドンは、コードされるポリペプチドを変更することなく記載の対応するコドンのいずれか変更することもできる。このような核酸バリエーションは、保存的に修飾されたバリエーションの一種としての「サイレントバリエーション」である。ペプチドをコードする本明細書の全ての核酸配列は、その核酸の存在し得る全てのサイレントバリエーションも表す。当業者であれば、核酸の各コドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧ以外）は、機能的に同一の分子を生じるように修飾可能であることを認識するであろう。よって、ペプチドをコードする核酸の各サイレントバリエーションは、記載される各配列に暗に示される。
【００３２】
本明細書で使用する場合、用語「ベクター」は、宿主細胞を形質転換して核酸の発現を促すように核酸が宿主細胞に導入できる手段を指す。ベクターは、対象とするあるヌクレオチド配列および調節配列を含み得る。ベクターは、そのあるヌクレオチド配列を発現するため、またはそのあるヌクレオチド配列を、それを複製する、それを操作する、それを変更する、それを末端切断する、それを拡大培養する、および／もしくはそれを異なる場所間（例えば、異なる生物間もしくは宿主細胞間もしくはその組合せ間）で移動させるために維持するために使用できる。
【００３３】
本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」は、限定されるものではないが、放線菌、古細菌、細菌、および酵母を含む、単細胞原核または真核生物を指す。宿主細胞はまた、限定されるものではないが、哺乳動物などの脊椎動物および昆虫などの無脊椎動物を含む、植物および動物などの高等生物由来の単細胞（限定されるものではないが、培養細胞を含む）であってもよい。
【００３４】
本明細書で使用する場合、用語「神経損傷または変性に関連する病態」は、例えば、下記の、
大脳基底核を侵す変性病態（例えば、ハンチントン病、ウィルソン病、線条体黒質変性症、大脳皮質神経節変性症）、トゥーレット症候群、パーキンソン病、進行性核上麻痺、進行性球麻痺、遺伝性痙性対麻痺、脊髄性筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、およびその変異形、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、オリーブ橋小脳萎縮症、傍腫瘍性小脳変性症、およびドーパミン毒性を含む中枢神経系疾患、
フリードライヒ運動失調症、糖尿病、末梢神経障害、網膜神経変性などの感覚ニューロンに作用する疾患、
脳アミロイドアンギオパチー、ピック萎縮、レット症候群などの大脳辺縁系の疾患、
アルツハイマー病、ＡＩＤＳ関連認知症、リー病、びまん性レビー小体病、癲癇、多系統萎縮症、ギラン−バレー症候群、リポフスチン沈着症などのリソソーム蓄積障害、ダウン症候群の後期変性期、アルパーズ病、ＣＮＳ変性の結果としての目眩を含む神経系および／または脳幹を含む神経変性病態、
発達遅滞および学習障害に関連する病態、ダウン症候群、および酸化ストレス誘導性神経細胞死、
例えば、アルコール依存症を伴う青斑核、小脳、コリン作動性前脳基底部におけるニューロンの変性、認知および運動障害に至る小脳ニューロンおよび大脳ニューロンの加齢変性を伴うもの、運動障害に至る大脳基底核ニューロンの慢性アンフェタミン乱用変性を伴うもの含む、加齢および慢性アルコールまたは薬物乱用に伴って起こる病態、
脳卒中、局所的虚血、血管不全、低酸素性虚血性脳症、高血糖症、低血糖症、閉鎖性頭部外傷、または直接的外傷などの局所的外傷から起こる病態変化、ならびに、
治療薬および処置の負の副作用として起こる病態（例えば、抗痙攣用量のＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸）種グルタミン酸受容体の拮抗剤に応答した帯状回および嗅内皮質ニューロンの変性）、
を含む、神経細胞死および／または亜致死神経病態に至る病態（疾患および傷害）を指す。
【００３５】
本明細書で使用する場合、用語「医薬組成物」は、本発明の融合タンパク質またはウイルス様粒子またはそれらの組合せが、調剤され、貯蔵され、保存され、変更され、投与され、またはそれらの組合せがなされ得るいずれの製剤も指す。以下に記載するように、本製剤は、任意の薬学上許容される希釈剤、アジュバント、バッファー、賦形剤、担体、またはそれらの組合せを含み得る。一般に、本製剤の成分は、投与様式および経路、ならびに標準的な製薬実務に基づいて選択される。本明細書で使用する場合、用語「医薬担体」は、本発明の医薬組成物を得るために本発明の融合タンパク質またはウイルス様粒子が物理的もしくは化学的に混合され、溶解され、懸濁され、またはそうでなければ組み合わせられるいずれの物質またはそれらの組合せも指す。
【００３６】
本明細書で使用する場合、用語「薬学上有効な量」は、限定されるものではないが、疾患、障害、またはそれらの組合せの治療、軽減、除去、実質的な予防を含む、所望の生理学的結果を維持もしくは生成可能な、または維持もしくは生成に十分な量を指す。薬学上有効な量は、逐次にまたは同時に投与される１以上の用量を含んでもよい。当業者ならば、限定されるものではないが、徐放性製剤を含む種々のタイプの製剤を考慮するために本発明の用量を調整することを知っている。
本明細書で使用する場合、用語「予防的」とは、疾患、障害、またはそれらの組合せの任意の側面を実質的に防止または予防し得る組成物を指す。本明細書で使用する場合、用語「治療的」とは、疾患、障害、またはそれらの組合せの任意の側面を治療する、軽減する、進行を停止させる、進行を緩徐化する、除去する、またはそれらの組合せをなし得る組成物を指す。
【００３７】
本明細書で使用する場合、用語「対象」は、本発明の投与が指示される任意の個体を指す。対象は例えば哺乳動物であり得る。対象は、性、齢、またはそれらの組合せに関わらず、胎児を含むヒトまたは獣医学的動物であり得る。対象は、所望により、特定の疾患、障害、またはそれらの組合せに罹患しているか、そのリスクがあるか、またはそれらの組合せであり得る。
【００３８】
本発明の投与に好適な製剤は、おそらく当業者に周知のものの中でも、水溶液および非水溶液、酸化防止剤、静菌剤、バッファー、等張性に影響を与える溶質、保存剤、可溶化剤、安定剤、沈殿防止剤、増粘剤、またはそれらの組合せを含み得る。
【００３９】
加えてまたは代わりに、本発明の投与に好適な製剤は、おそらく当業者に周知のものの中でも、ゲル、ＰＥＧ  ４００などのＰＥＧ、プロピレングリコール、生理食塩水、サシェ、水、当技術分野で公知の他の適当な液体、またはそれらの組合せを含み得る。
【００４０】
また、加えてまたは代わりに、本発明の投与に好適な製剤は、おそらく当業者に周知のものの中でも、結合剤、緩衝剤、リン酸カルシウム、セルロース、コロイド状二酸化ケイ素などのコロイド、着色剤、希釈剤、崩壊剤、色素、増量剤、香味剤、ゼラチン、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、微晶質ゼラチン、湿潤剤、パラフィン炭化水素、香錠、ポリエチレングリコール、保存剤、ソルビトール、コーンスターチ、ジャガイモデンプンもしくはそれらの組合せなどのデンプン、ステアリン酸、スクロース、タルク、トリグリセリド、またはそれらの組合せを含み得る。
【００４１】
また、加えてまたは代わりに、本発明の投与に好適な製剤は、おそらく当業者に周知のものの中でも、ベンジルアルコールもしくはエタノールなどのアルコール、塩化ベンザルコニウム、リン酸バッファー、酢酸バッファー、クエン酸バッファー、もしくはそれらの組合せなどのバッファー、カルボキシメチルセルロースまたは微晶質セルロース、コレステロール、デキストロース、グレープフルーツ果汁などの果汁、ミルク、レシチンなどのリン脂質、植物油、魚油もしくは鉱油もしくはそれらの組合せなどの油、当該技術分野で公知の他の薬学上適合する担体、またはそれらの組合せを含み得る。
【００４２】
また、加えてまたは代わりに、本発明の投与に好適な製剤は、おそらく当業者に周知のものの中でも、ポリ−乳酸−グリコール酸（ＰＬＧＡ）コポリマーなどの生分解性物質、その分解産物が生体系から速やかに排除され得る他の実体、またはそれらの組合せを含み得る。
【００４３】
本発明の製剤は、単位用量形、多用量形、またはそれらの組合せで投与可能である。本製剤は、単位用量容器、多用量容器、またはそれらの組合せに封入可能である。本発明は、アンプル、カシェ剤、カプセル剤、顆粒、トローチ剤、散剤、錠剤、バイアル、限定されるものではないがアラビアガムエマルションを含むエマルション、懸濁液、またはそれらの組合せで存在してよい。
【００４４】
本発明を下記の実施例によりさらに説明するが、これらの実施例は限定ではなく説明のために示される。当業者であれば、本開示を鑑みて、開示されている特定の実施形態に多くの変更をなすことができ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなくなお同様または類似の結果を取得できることを認識するはずである。
【実施例】
【００４５】
実施例１
神経伸長に対するＣ５ペプチド、Ｃ６ペプチド、Ｐ１ペプチド、Ｐ２ペプチド、Ｐ３ペプチド、Ｐ４ペプチド、Ｐ５ペプチド、およびＰ６ペプチドの効果
１．ペプチドの調製
Ｄ型およびＬ型両方のＣ５、Ｃ６、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、およびＰ６ペプチドをペプチド合成装置（Ｎｅｏｇｅｎｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐ．、台北、台湾）により合成した。合成されたＣ５ペプチド（配列番号１）、Ｃ６ペプチド（配列番号２）、Ｐ１ペプチド（配列番号４）、Ｐ２ペプチド（配列番号５）、Ｐ３ペプチド（配列番号６）、Ｐ４ペプチド（配列番号７）、Ｐ５ペプチド（配列番号８）、およびＰ６ペプチド（配列番号９）をそれぞれＤＭＳＯおよびＰＢＳに溶かした。
【００４６】
２．細胞培養
胎児海馬初代ニューロンを培養するために、妊娠スプラーグ−ドーリーラットを台湾国立研究センター（台北、台湾）から購入した。スプラーグ−ドーリーラットの胎児（１９日胎児、Ｅ１９）から海馬組織を酵素で解離させ、ポリ−Ｌ−リシンコーティングカバーガラス上に、５％ウシ血清、５％ウマ血清、および５０ｎｇ／ｍＬインスリン−トランスフェリン−亜セレン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）を含有する最小必須培地とともに播種した。播種後、培地を、０．５ｍＭグルタミンおよび１２．５ｍＭグルタミン酸を含有する２％Ｂ２７ニューロベーサルメディウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）に置き換えた。胎児海馬初代ニューロンをさらなる試験処理のために３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
【００４７】
３．神経伸長アッセイ
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ３日目（ＤＩＶ３）の初代海馬ニューロン培養物をそれぞれ１０−９Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１５ＭのＣ５ペプチド（Ｌ型）、１０−９Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１５ＭのＣ６ペプチド（Ｌ型）、１０−９ＭのＰ１ペプチド（Ｌ型）、１０−９ＭのＰ２ペプチド（Ｌ型）、１０−９ＭのＰ３ペプチド（Ｌ型）、１０−９ＭのＰ４ペプチド（Ｌ型）、１０−９ＭのＰ５ペプチド（Ｌ型）、１０−９ＭのＰ６ペプチド（Ｌ型）、１０−９ＭのＣ５ペプチド（Ｄ型）、および１０−１２のＣ６ペプチド（Ｄ型）で３日間処理した後、免疫細胞化学法を行った。陰性対照の胎児海馬初代ニューロンはＰＢＳで処理した。各処理条件は３反復で行った。
【００４８】
４．免疫細胞化学
培養した海馬ニューロンを４％パラホルムアルデヒドで固定し、室温（ＲＴ）にて０．１％トリトンＸ−１００で透過処理を施した。次に、培養物をウサギ抗タウ一次抗体（軸策の選択マーカー、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）およびマウス抗ＭＡＰ２一次抗体（樹状突起の選択マーカーである微小管結合タンパク質−２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄後、細胞をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗ウサギ二次抗体（緑色蛍光、Ａｂｃａｍ  Ｐｌｃ．、ＵＫ）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４ヤギ抗マウス二次抗体（赤色蛍光、Ａｂｃａｍ  Ｐｌｃ．）とともにＲＴで１時間インキュベートした。次に、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、青色蛍光、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）で核を染色した。その後、これらの細胞にカバーガラスを載せ、Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｄ１顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、イェーナ、ドイツ）を用いて画像を取得し、ＩｍａｇｅＪソフトウエア（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｊａｖａ、国立衛生研究所、ＵＳＡ）により解析した。１０μｍより長いニューロンの突起を神経突起と定義する。
【００４９】
５．統計分析
生化学的データを一元配置分散分析（一元配置ＡＮＯＶＡ）、次いで、ニューマン−コイルス多重比較事後検定で分析した。
【００５０】
６．結果
Ｃ５ペプチド、Ｃ６ペプチド、Ｐ１ペプチド、Ｐ２ペプチド、Ｐ３ペプチド、Ｐ４ペプチド、Ｐ５ペプチド、およびＰ６ペプチドは全て、神経伸長および分岐形成を促進する。免疫細胞化学の結果を図１および図２に示す。
図１Ａ〜１Ｉに示されるように、陰性対照群（図１Ａ）と比較して、３ＤＩＶにおけるＣ５ペプチド（１０−９Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１５Ｍ）（それぞれ図１Ｂ、１Ｃ、および１Ｄに示される通り）またはＣ６ペプチド（１０−９Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１５Ｍ）の３日間の処理（それぞれ図１Ｆ、１Ｇ、および１Ｈに示される通り）は、軸策伸長を促進した。天然Ｌ型Ｃ５およびＣ６ペプチドに加え、合成Ｄ型Ｃ５ペプチド（１０−９Ｍ）およびＤ型Ｃ６ペプチド（１０−１２Ｍ）もそれぞれ神経突起伸長に同様の効果を示した（図１Ｅおよび１Ｉに示される通り）。さらに、図２Ａ〜２Ｇに示されるように、陰性対照群（図２Ａ）と比較して、３ＤＩＶにおける１０−９ＭのＰ１ペプチド、Ｐ２ペプチド、Ｐ３ペプチド、Ｐ４ペプチド、Ｐ５ペプチド、またはＰ６ペプチドの３日間の処理（それぞれ図２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ、および２Ｇに示される通り）は、軸策伸長を促進した。
【００５１】
加えて、軸策分岐の数および長さも計測し、それらの統計結果を図３Ｂ〜３Ｅに示す。ニューロンの細胞体から伸びる軸策を一次軸策分岐と定義し、一次軸策分岐から伸びる軸策を二次軸策分岐と定義し、二次軸策分岐から伸びる軸策を三次軸策分岐と定義するなどである（図３Ａ）。１０μｍより長い軸策のみを計数する。
【００５２】
図３Ｂは、Ｃ５ペプチドまたはＣ６ペプチド処理後の軸策分岐の長さを示す。Ｃ５ペプチドまたはＣ６ペプチド処理無し（陰性対照）の海馬ニューロンの一次軸策分岐と比較して、Ｃ５ペプチド（１０−９Ｍ）またはＣ６ペプチド（１０−９Ｍ）で処理した海馬ニューロンの一次軸策分岐は長い。この結果は、Ｃ５ペプチドおよびＣ６ペプチドが海馬ニューロンの一次軸策分岐の長さを有意に増すことを示す（ｐ＜０．０１）。
さらに、図３Ｃは、Ｃ５ペプチドまたはＣ６ペプチド処理後の軸策分岐の数を示す。Ｃ５ペプチドまたはＣ６ペプチド処理無し（陰性対照）の海馬ニューロンの三次軸策分岐の平均数は０．７であるのに対し、Ｃ５ペプチド（１０−９Ｍ）またはＣ６ペプチド（１０−９Ｍ）で処理した海馬ニューロンの三次軸策分岐の平均数はそれぞれ３および４．９である。加えて、Ｃ５ペプチドまたはＣ６ペプチド処理無し（陰性対照）の海馬ニューロンの二次軸策分岐の平均数は４．３であるのに対し、Ｃ６ペプチド（１０−９Ｍ）で処理した海馬ニューロンの二次軸策分岐の平均数は６．５である。これらの結果は、Ｃ５ペプチドおよびＣ６ペプチドの両方が海馬ニューロンの軸策分岐の数を有意に増すことを示す（ｐ＜０．０１）。
【００５３】
図３Ｄは、Ｐ１ペプチド、Ｐ２ペプチド、Ｐ３ペプチド、Ｐ４ペプチド、Ｐ５ペプチド、またはＰ６ペプチド処理後の軸策分岐の長さを示す。陰性対照の海馬ニューロンの一次および二次軸策分岐と比較して、Ｐ１ペプチド、Ｐ２ペプチド、Ｐ３ペプチド、Ｐ４ペプチド、Ｐ５ペプチド、またはＰ６ペプチド（１０−９Ｍ）で処理した海馬ニューロンの一次および二次軸策分岐は長い。この結果は、Ｐ１ペプチド、Ｐ２ペプチド、Ｐ３ペプチド、Ｐ４ペプチド、Ｐ５ペプチド、およびＰ６ペプチドは全て、海馬ニューロンの一次および二次軸策分岐の長さを有意に増すことを示す（ｐ＜０．０１またはｐ＜０．０５）。加えて、陰性対照の海馬ニューロンの三次軸策分岐と比較して、Ｐ６ペプチド（１０−９Ｍ）で処理した海馬ニューロンの三次軸策分岐は有意により長い（ｐ＜０．０５）。
さらに、図３Ｅは、Ｐ１〜Ｐ６ペプチド処理後の軸策分岐の数を示す。陰性対照の海馬ニューロンの二次軸策分岐の平均数は２．５であるのに対し、Ｐ６ペプチド（１０−９Ｍ）で処理した海馬ニューロンの二次軸策分岐の平均数は４．２である。この結果は、Ｐ６ペプチドは有意に海馬ニューロンの軸策分岐の数を増すことを示す（ｐ＜０．０１）。
【００５４】
実施例２
初代ニューロン培養物に対するＣ５ペプチドおよびＣ６ペプチドの神経毒性の分析
１．材料
Ｃ５ペプチド、Ｃ６ペプチド、および胎児海馬初代ニューロンは、実施例１に記載の方法により調製した。
【００５５】
２．細胞処理
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ１日目（１ＤＩＶ）に、胎児海馬初代ニューロンをそれぞれ１０−３Ｍ、１０−６Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１２ＭのＣ５ペプチドまたはＣ６ペプチドで２４時間処理した後、細胞生存率アッセイを行った。
【００５６】
３．細胞生存率アッセイ
細胞生存率は、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイにより評価した。細胞をＭＴＴ試薬（０．５ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、ＵＳＡ）とともに３７℃で１時間インキュベートした。ＭＴＴ溶液を除去し、ＤＭＳＯをウェルに加え、室温で１時間振盪した。ＭＴＴホルマザン産物の量を、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ２マイクロプレートリーダー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、サニーヴェール、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて５７０および６３０ｎｍでその吸光度を測定することにより定量した。
【００５７】
４．統計分析
生化学的データを、一元配置分散分析（一元配置ＡＮＯＶＡ）、次いで、ニューマン−コイルス多重比較事後検査で分析した。
【００５８】
５．結果
Ｃ５ペプチドもＣ６ペプチドも初代ニューロン培養物に対して神経毒性を示さない。ＭＴＴアッセイの結果を図４に示す。胎児海馬初代ニューロンをそれぞれ１０−３Ｍ、１０−６Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１２ＭのＣ５ペプチドまたはＣ６ペプチドで２４時間処理した。Ｃ５ペプチドおよびＣ６ペプチドは、胎児海馬初代ニューロンに対して有意な神経毒性作用を示さなかった（ｐ＞０．０５）。
【００５９】
実施例３
初代海馬ニューロンの再生に対するＣ５ペプチドおよびＣ６ペプチドの効果
１．材料
Ｃ５ペプチド、Ｃ６ペプチド、および胎児海馬初代ニューロンは、実施例１に記載の方法により調製した。
【００６０】
２．掻爬試験
ニューロン再生におけるＣ５ペプチドおよびＣ６ペプチドの効果を評価するために掻爬試験を使用した。胎児海馬初代ニューロンを５日（ＤＩＶ５）までｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した。掻爬試験を行った。チップを用いてプレートのウェルに十字の印をつけた。そのプレートに１０−９ＭのＣ５ペプチドまたは１０−９ＭのＣ６ペプチドを含有する培養培地を加えた。ニューロンを７２時間インキュベートした後に免疫蛍光染色を行った。
【００６１】
３．免疫細胞化学
免疫細胞化学の方法は、実施例１に記載されている。培養海馬ニューロンをウサギ抗タウ一次抗体（軸策の選択マーカー、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中でインキュベートした後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギ二次抗体（緑色蛍光、Ａｂｃａｍ  Ｐｌｃ．、ＵＫ）とともにインキュベートした。その後、ＤＡＰＩ（青色蛍光、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で核を染色した。細胞の画像をＡｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｄ１顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、イェーナ、ドイツ）を用いて取得し、ＩｍａｇｅＪソフトウエア（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｊａｖａ、国立衛生研究所、ＵＳＡ）により分析した。
【００６２】
４．統計分析
生化学的データを一元配置分散分析（一元配置ＡＮＯＶＡ）、次いで、ニューマン−コイルス多重比較事後検定で分析した。
【００６３】
５．結果
Ｃ５ペプチドおよびＣ６ペプチドは両方とも軸策再生を促進する。掻爬アッセイの結果を図５に示す。ＰＢＳで処理した掻爬胎児海馬初代ニューロン（陰性対照）には掻爬境界をわたって成長する軸策がほとんどなかった（図５Ａ）のに対し、Ｃ５ペプチドまたはＣ６ペプチドで処理した掻爬胎児海馬初代ニューロンは、掻爬境界をわたって成長するより多くの、より長い軸策を有していた（図５Ｂおよび図５Ｃ）。これらの結果は、Ｃ５ペプチドおよびＣ６ペプチドが掻爬傷害後の神経突起の再生を改善することを示す。
【００６４】
実施例４
空間学習および記憶に対するＣ５ペプチドおよびＣ６ペプチドの効果−水迷路課題
１．動物
成体雄スプラーグ−ドーリーラット（３００〜４００ｇ）を台湾国立研究センターから購入した。ラットは宜蘭大学（台湾）の動物施設の温度（２２〜２４℃）および湿度（５０％〜６０％）制御室で飼育した（１ケージ当たり２個体）。動物は１２時間／１２時間  明／暗周期で維持した室内で、食物および水を自由に摂らせて飼育した。動物は試験手順を行う前に１週間、室内に馴化させた。試験手順は全て、国立衛生研究所による実験動物の管理と使用に関するガイドライン（ＮＩＨ刊行物第８０２３号、１９７８年改定）により承認されたものであり、台湾国立研究センターにより適当な訓練を受けた者によって実施された。試験は全て、宜蘭大学の動物実験倫理委員会によっても承認された。
【００６５】
２．材料
Ｃ５ペプチドおよびＣ６ペプチドは、実施例１に記載の方法により調製した。
【００６６】
３．薬物処置
２５個体の成体雄ナイーブスプラーグ−ドーリーラットを各５個体の５群に無作為に分けた。これらの５群のラットにそれぞれ低用量のＣ５ペプチド（５４μｇ／ｋｇ）、高用量のＣ５ペプチド（２７０μｇ／ｋｇ）、低用量のＣ６ペプチド（５．４μｇ／ｋｇ）、高用量のＣ６ペプチド（２７μｇ／ｋｇ）、および０．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ／ＰＢＳ（陰性対照）を腹膜内注射した。注射容量は１μＬ／ｇ体重とし、注射プログラムは行動試験の１４日前に開始し、試験中も継続した。
【００６７】
４．水迷路学習
１８３ｃｍ径のプラスチック円形プールに水（２５±２℃）を満たした。円形のプラットフォームをプールの端から特定の位置に配置し、水面下に沈めた。無毒な色素を添加することで水を濁らせた。壁面に明瞭な視覚的マークを付けた。空間学習のため、動物に朝早く１回、正午に１回、午後遅くにもう１回の３回の試験を行った。この訓練手順を４日継続し、合計１２回の試験を行った。
ラットをプール外周の等間隔の異なる開始点に無作為な順序で置いた。このプールでラットを６０秒泳がせた。ラットがプラットフォームを見つけることができなければ、プラットフォームに導き、そこに２０秒間留まらせた。各ラットがプラットフォームに到達するのにかかった時間を逃避潜時として記録した。５日目にラットの記憶保持を試験するために６０秒の探索試験を行った。プラットフォームを除去したプールにラットを入れ、ラットが各四分円（四分円、２、３、および４）で費やした時間を記録した。ラットが目的四分円（四分円４）に長く留まっているほど、そのラットは良好な記憶を有していた。
この試験の終了時に、ラットに可視プラットフォーム学習を受けさせた。可視プラットフォーム学習のため、プラットフォームにフラッグを付け、プラットフォームを水面の上に上昇させた。ラットがプラットフォームを見つける時間を記録した。加えて、ラットが水からプラットフォームの位置を見ることができるようにプールに色素を加えなかった。
【００６８】
５．統計分析
データを二元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、ニューマン−コイルス多重比較事後検定で分析した。
【００６９】
６．結果
Ｃ５ペプチドおよびＣ６ペプチドは両方とも、ラットの空間学習および記憶を増強する。図６は、各水迷路学習日の各ラット群の平均逃避潜時（秒）を示す。０．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ／ＰＢＳを受けたラット（陰性対照）と比較して、Ｃ５ペプチド（５４μｇ／ｋｇ、２７０μｇ／ｋｇ）およびＣ６ペプチド（５．４μｇ／ｋｇ、２７μｇ／ｋｇ）を受けたラットは、隠れたプラットフォームを見つけるのにかかる時間が有意に短い［Ｆ（４，２０）＝１５．１６８、ｐ＜０．０１］。これらの結果は、Ｃ５ペプチドおよびＣ６ペプチドはラットの空間学習および記憶を増強することを示す。
【００７０】
実施例５
スコポラミン誘導性空間学習および記憶障害に対するＣ５ペプチドおよびＣ６ペプチドの効果−水迷路課題
１．動物
ラットは実施例４に記載のように入手し、世話をした。
【００７１】
２．材料
Ｃ５ペプチドおよびＣ６ペプチドは実施例１に記載の方法により調製した。塩酸スコポラミン（Ｓｃｏ）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．（セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。Ｓｃｏは、さらなる使用のために終濃度１．５ｍｇ／ｍＬとなるように生理食塩水に溶かした。
【００７２】
３．薬物処置
スプラーグ−ドーリーラットを、陰性対照群、スコポラミン注射群（Ｓｃｏ）、Ｃ５ペプチドとスコポラミン注射群（Ｃ５＋Ｓｃｏ）、およびＣ６ペプチドとスコポラミン注射群（Ｃ６＋Ｓｃｏ）に無作為に分け、これら４群のラットにそれぞれビヒクル（陰性対照群およびスコポラミン単独群）、Ｃ５ペプチド（５４μｇ／ｋｇ／日、Ｃ５＋Ｓｃｏ群）、およびＣ６ペプチド（５．４μｇ／ｋｇ／日、Ｃ６＋Ｓｃｏ群）を連続１４日間腹膜内注射した。その後、４群のラットにそれぞれビヒクル（陰性対照群）、ビヒクルとスコポラミン（１．５ｍｇ／ｋｇ／日）（スコポラミン単独群）、Ｃ５ペプチド（５４μｇ／ｋｇ／日）とスコポラミン（１．５ｍｇ／ｋｇ／日）（Ｃ５＋Ｓｃｏ群）、およびＣ６ペプチド（５．４μｇ／ｋｇ／日）とスコポラミン（１．５ｍｇ／ｋｇ／日）（Ｃ６＋Ｓｃｏ群）を連続７日間腹膜内注射した。次に、行動試験を行い、試験中もスコポラミンの注射プログラムを継続した。注射容量は１μＬ／ｇ体重とした。スコポラミン注射は、毎朝、行動試験の３０分前に行い、Ｃ５ペプチドまたはＣ６ペプチド注射は、１日前のＰＭ５：００に１日１回行った。
【００７３】
４．水迷路学習
水迷路学習の方法は実施例４に記載されている。
【００７４】
５．統計分析
データを二元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、ニューマン−コイルス多重比較事後検定で分析した。
【００７５】
６．結果
Ｃ５ペプチドおよびＣ６ペプチドは両方とも、スコポラミン誘導性空間学習および記憶障害を改善する。本実施例では、加齢および認知症に対するＣ５ペプチドおよびＣ６ペプチドの効果を検討するためにＳｃｏ誘導性健忘症動物モデルを使用する。
図７は、各水迷路学習日における各群のラットの平均逃避潜時（秒）を示す。Ｓｃｏ注射を受けたラットは、隠れたプラットフォームを見つけるのにより長い逃避潜時を示した（Ｆ３，２０＝１０．３６、Ｐ＜０．０１）。Ｓｃｏ注射を受けたラットと比較して、（Ｃ５＋Ｓｃｏ）および（Ｃ６＋Ｓｃｏ）処置群（ｑ＝６．５８および６．７７、両方ともＰ＜０．０１）で逃避潜時における有意な改善が３日目から見られた。加えて、３日目から、（Ｃ５＋Ｓｃｏ）および（Ｃ６＋Ｓｃｏ）処置群のラットは、隠れたプラットフォームを陰性対照群のラットよりも早く見つけた。これらの結果は、Ｃ５ペプチドおよびＣ６ペプチドは空間学習におけるスコポラミン誘導性記憶障害を改善することを示す。
【００７６】
実施例６
スコポラミン誘導性記憶障害に対するＣ５ペプチドおよびＣ６ペプチドの効果−抑制性回避記憶試験
１．動物
ラットは実施例４に記載のように入手し、世話をした。
【００７７】
２．材料
Ｃ５ペプチドおよびＣ６ペプチドは、実施例１に記載の方法により調製した。塩酸スコポラミン（Ｓｃｏ）は、実施例５に記載の方法により調製した。
【００７８】
３．薬物処置
ラットに、実施例５に記載のように、それぞれＳｃｏ、Ｃ５ペプチドおよびＳｃｏ（Ｃ５＋Ｓｃｏ群）、Ｃ６ペプチドとＳｃｏ（Ｃ６＋Ｓｃｏ群）、およびＤＭＳＯ／ＰＢＳ（陰性対照群）を腹膜内注射した。
【００７９】
４．抑制性回避学習課題
装置は、照明された安全な区画と暗区画を仕切るスライドドアにより分かれた溝型小路からなった。電流を生じるショック発生装置は暗区画の床に接続した（ＵＧＯ  Ｂａｓｉｌｅ、コメリオ  ＶＡ、イタリア）。行動課題は、訓練および試験手順を含め、ＡＭ８：００〜ＰＭ６：００の間に記録した。試験前、ラットが環境に適合できるように薄暗い部屋で１時間馴化させた。訓練段階では、照明区画の、ドアとは反対側の遠位端に置いた。
ラットが判定した際にドアを閉め、１ｍＡ／秒のフットショックを２回与えた。その後、ラットをこの小路から取り出し、ケージに戻した。訓練後の種々の時点で（１日後および７日後）、保持試験を行った。１日後と７日後に、ショックを受けないこと以外は訓練と同様にラットを試験した。ラットが暗室に入るかまたは入らずに６００秒の後に試験を終了した。暗室に入らずに６００秒の最高限度スコアに達したラットを小路から取り出し、良好な記憶を有するラットとした。暗室に居てフットショック（１ｍＡ／秒、２秒間）を受けたラットをそのままフットショック単独対照群とした。
【００８０】
５．統計分析
データを一元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、ニューマン−コイルス多重比較事後検定で分析した。
【００８１】
６．結果
Ｃ５ペプチドおよびＣ６ペプチドは両方とも、スコポラミン誘導性記憶障害を改善する。ラットを陰性対照群、スコポラミン単独群、（Ｃ５＋Ｓｃｏ）群および（Ｃ６＋Ｓｃｏ）群に無作為に分け、これらの４群のラットにそれぞれビヒクル（陰性対照群およびスコポラミン単独群）、Ｃ５ペプチド（５４μｇ／ｋｇ／日）（Ｃ５＋Ｓｃｏ群）、およびＣ６ペプチド（５．４μｇ／ｋｇ／日）（Ｃ６＋Ｓｃｏ群）を連続１４日間腹膜内注射した。その後、４群のラットにそれぞれビヒクル（陰性対照群）、ビヒクルとスコポラミン（１．５ｍｇ／ｋｇ／日）（スコポラミン単独群）、Ｃ５ペプチド（５４μｇ／ｋｇ／日）とスコポラミン（１．５ｍｇ／ｋｇ／日）（Ｃ５＋Ｓｃｏ群）、およびＣ６ペプチド（５．４μｇ／ｋｇ／日）とスコポラミン（１．５ｍｇ／ｋｇ／日）（Ｃ６＋Ｓｃｏ群）を連続７日間腹膜内注射した。次に、行動試験を行い、試験中もスコポラミンの注射プログラムを継続した。注射容量は１μＬ／ｇ体重とした。スコポラミン注射は毎朝、行動試験の３０分前に行い、Ｃ５ペプチドまたはＣ６ペプチド注射は、１日前のＰＭ５：００に１日１回行った。
図８に示されるように、フットショックを受ける前は、全てのラット群が照明室から暗室に入るのにおよそ同じ時間を要した（Ｐ＞０．０５）。Ｓｃｏ処置ラットは、フットショック７日後に照明室でより短い保持時間を示した（ｑ＝４．１４、Ｐ＜０．０５）（７日目における対照とＳｃｏ処置群の比較）。（Ｃ５＋Ｓｃｏ）処置ラットは、フットショック７日後に照明室でより長い保持時間を示した（ｑ＝４．８４、Ｐ＜０．０５）（７日目におけるＳｃｏと（Ｃ５＋Ｓｃｏ）処置群の比較）。（Ｃ６＋Ｓｃｏ）処置ラットもそうであった（ｑ＝４．８４、Ｐ＜０．０５）（７日目におけるＳｃｏと（Ｃ６＋Ｓｃｏ）処置群の比較）。これらの結果は、Ｃ５ペプチドおよびＣ６ペプチドは受動的一元配置回避課題におけるスコポラミン誘導性記憶障害を改善することを示す。
【００８２】
実施例７
スコポラミン誘導性記憶障害に対するＣ５ペプチドおよびＣ６ペプチドの効果−ステップダウン受動回避試験
１．動物
ラットは実施例４に記載のように入手し、世話をした。
【００８３】
２．材料
Ｃ５ペプチドおよびＣ６ペプチドは、実施例１に記載の方法により調製した。塩酸スコポラミン（Ｓｃｏ）は、実施例５に記載の方法により調製した。
【００８４】
３．薬物処置
ラットに、実施例６に記載のように、それぞれＳｃｏ、Ｃ５ペプチドとＳｃｏ（Ｃ５＋Ｓｃｏ群）、Ｃ６ペプチドとＳｃｏ（Ｃ６＋Ｓｃｏ群）、およびＤＭＳＯ／ＰＢＳ（陰性対照群）を腹膜内注射した。
【００８５】
４．ステップダウン受動回避試験
ラットを訓練２４時間前に器具に馴化させた。翌日、ラットを、受動回避試験ボックスの床の中央に配置した高架プラットフォームに載せ、ステップダウンまでの潜時を記録した。試験３日目に、ステップダウン直後に格子床からラットに軽い電気ショック（３Ｖ、３秒間、Ｄ．Ｃ．）をかけ、その後、ホームケージに戻した。翌日（２４時間保持間隔として）、ラットを再びプラットフォームに載せたが、ラットに電気ショックは行わなかった。ステップダウンまでの潜時を記録した。ラットがプラットフォームに５分間留まれば、３００秒の最大スコアとした。
【００８６】
５．統計分析
データを一元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、ニューマン−コイルス多重比較事後検定で分析した。
【００８７】
６．結果
Ｃ５ペプチドおよびＣ６ペプチドは両方とも、スコポラミン誘導性記憶障害を改善する。ラットを陰性対照群、スコポラミン単独群、（Ｃ５＋Ｓｃｏ）群および（Ｃ６＋Ｓｃｏ）群に無作為に分け、これら４群のラットにそれぞれビヒクル（陰性対照群およびスコポラミン単独群）、Ｃ５ペプチド（５４μｇ／ｋｇ／日、Ｃ５＋Ｓｃｏ群）、およびＣ６ペプチド（５．４μｇ／ｋｇ／日、Ｃ６＋Ｓｃｏ群）を連続１４日間注射した。その後、４群のラットにそれぞれビヒクル（陰性対照群）、ビヒクルとスコポラミン（１．５ｍｇ／ｋｇ／日）（スコポラミン単独群）、Ｃ５ペプチド（５４μｇ／ｋｇ／日）とスコポラミン（１．５ｍｇ／ｋｇ／日）（Ｃ５＋Ｓｃｏ群）、およびＣ６ペプチド（５．４μｇ／ｋｇ／日）とスコポラミン（１．５ｍｇ／ｋｇ／日）（Ｃ６＋Ｓｃｏ群）を連続７日間腹膜内注射した。次に、行動試験を行い、試験中もスコポラミンの注射プログラムを継続した。注射容量は１μＬ／ｇ体重とした。スコポラミン注射は毎朝、行動試験の３０分前に行い、Ｃ５ペプチドまたはＣ６ペプチド注射は、１日前のＰＭ５：００に１日１回行った。
図９Ａに示されるように、フットショックを受ける前には、全てのラット群はステージを跳ね降りるのにおよそ同じ時間を要した（Ｐ＞０．０５）。図９Ｂおよび図９Ｃに示されるように、フットショック後、Ｓｃｏ処置ラットは、フットショック１日後にステージ上でのより短い保持時間  およびより多いステップダウンを示した（ｑ＝４．４、Ｐ＜０．０５）（１日目における対照とＳｃｏ処置群の比較）。（Ｃ５＋Ｓｃｏ）処置ラットは、フットショック１日後にステージ上でのより長い保持時間およびより少ないステップダウンを示した（ｑ＝４．４、Ｐ＜０．０５）（１日目における対Ｓｃｏと（Ｃ５＋Ｓｃｏ）処置群の比較）。（Ｃ６＋Ｓｃｏ）処置ラットは、フットショック１日後にステージ上でのより長い保持時間およびより少ないステップダウンを示した（ｑ＝４．４、Ｐ＜０．０５）（７日目におけるＳｃｏと（Ｃ６＋Ｓｃｏ）処置群の比較）。これらの結果は、Ｃ５ペプチドおよびＣ６ペプチドは、ステップダウン受動回避課題においてスコポラミン誘導性記憶障害を改善することを示す。
【００８８】
実施例８
物体認識におけるスコポラミン誘導性記憶障害に対するＣ５ペプチドおよびＣ６ペプチドの効果−新奇物体認識学習試験
１．動物
ラットは実施例４に記載のように入手し、世話をした。
【００８９】
２．材料
Ｃ５ペプチドおよびＣ６ペプチドは、実施例１に記載の方法により調製した。塩酸スコポラミン（Ｓｃｏ）は、実施例５に記載の方法により調製した。
【００９０】
３．薬物処置
ラットに、実施例５に記載のように、それぞれＳｃｏ、Ｃ５ペプチドとＳｃｏ（Ｃ５＋Ｓｃｏ群）、Ｃ６ペプチドとＳｃｏ（Ｃ６＋Ｓｃｏ群）、およびＤＭＳＯ／ＰＢＳ（陰性対照群）を腹膜内注射した。
【００９１】
４．新奇物体認識学習
馴化中、オープンフィールドボックス（９０×７０×６０ｃｍ）内でラットに２つの同一の物体を５分間探索させた。探索に関して使用した判定基準は、ラットと物体の間の距離が１．５ｃｍ未満または物体との直接接触であった。３時間後および２４時間後に行った保持試験では、既知物体のうちの１つほぼ同じサイズの新奇物体に置き換えたこと以外は同じボックスにラットを戻した。５分間のうちに各ラットが２つの物体を探索するのに対訳した時間を記録した。物体の無いオープンフィールドボックスに５分間入れたラットを非訓練群とした。
【００９２】
５．統計分析
データを二元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、ニューマン−コイルス多重比較事後検定で分析した。
【００９３】
６．結果
Ｃ５ペプチドおよびＣ６ペプチドは両方とも、スコポラミン誘導性記憶障害を改善する。新奇物体認識課題では、ラットを陰性対照群、スコポラミン単独群、（Ｃ５＋Ｓｃｏ）群および（Ｃ６＋Ｓｃｏ）群に無作為に分け、これら４群のラットにそれぞれビヒクル（陰性対照群およびスコポラミン単独群）、Ｃ５ペプチド（５４μｇ／ｋｇ／日、Ｃ５＋Ｓｃｏ群）、およびＣ６ペプチド（５．４μｇ／ｋｇ／日、Ｃ６＋Ｓｃｏ群）を連続１４日間注射した。その後、４群のラットにそれぞれビヒクル（陰性対照群）、ビヒクルとスコポラミン（１．５ｍｇ／ｋｇ／日）（スコポラミン単独群）、Ｃ５ペプチド（５４μｇ／ｋｇ／日）とスコポラミン（１．５ｍｇ／ｋｇ／日）（Ｃ５＋Ｓｃｏ群）、およびＣ６ペプチド（５．４μｇ／ｋｇ／日）とスコポラミン（１．５ｍｇ／ｋｇ／日）（Ｃ６＋Ｓｃｏ群）を連続７日間腹膜内注射した。次に、行動試験を行い、試験中もスコポラミンの注射プログラムを継続した。注射容量は１μＬ／ｇ体重とした。スコポラミン注射は毎朝、行動試験の３０分前に行い、Ｃ５ペプチドまたはＣ６ペプチド注射は、１日前のＰＭ５：００に１日１回行った。
図１０に示されるように、ラットは認識訓練中に左の物体（ＬＯ）にもまたは右の物体（ＲＯ）にも選好性を示さなかった（全てＰ＞０．０５）。３時間、８時間および２４時間後に、新奇物体（ＮＯ）がＲＯに取って代わった。対照、（Ｃ５＋Ｓｃｏ）および（Ｃ６＋Ｓｃｏ）処置ラットは、ＮＯに選好性を示した（ｑ＝３．８７、Ｐ＜０．０５；ｑ＝３．５７、Ｐ＜０．０５）。Ｓｃｏ注射を受けたラットは、ＬＯの探索に費やす時間に対してＮＯに関する探索選好性を全く示さなかった（Ｐ＞０．０５）（各Ｎ＝６）。これらの結果は、Ｃ５ペプチドおよびＣ６ペプチドは、新奇物体認識学習試験においてスコポラミン誘導性記憶障害を改善することを示す。
【００９４】
実施例９
加齢ラットにおける空間学習および記憶に対するＣ５ペプチドおよびＣ６ペプチドの効果−水迷路課題
１．動物
ラットは実施例４に記載のように入手し、世話をした。
【００９５】
２．材料
Ｃ５ペプチドおよびＣ６ペプチドは、実施例１に記載の方法により調製した。
【００９６】
３．薬物処置
薬物投与前に、１２か月齢のラットを４群に無作為に分け、水迷路訓練を行った。次に、ラットにそれぞれＰＢＳ（陰性対照）、Ｃ５ペプチド（５４μｇ／ｋｇ／日）、およびＣ６ペプチド（５．４μｇ／ｋｇ／日）を、行動試験前に６か月間注射し、試験中も継続的に注射した（各群Ｎ＝６）。注射容量は１μＬ／ｇ体重とした。注射は１日１回行った。
【００９７】
４．水迷路学習
水迷路学習の方法は実施例４に記載されている。
【００９８】
５．統計分析
データを二元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、ニューマン−コイルス多重比較事後検定で分析した。
【００９９】
６．結果
Ｃ５ペプチドおよびＣ６ペプチドは両方とも、加齢誘導性記憶障害を改善する。薬物投与前に、１２か月齢のラットを４群に無作為に分け、水迷路訓練を行った。訓練の結果を図１１Ａに示し、各群の平均逃避潜時（秒）は同等であり、４日の訓練期間で短縮された。６か月の薬物投与後、１８か月齢のラットに水迷路試験を行った結果を図１１Ｂに示す。
陰性対照のラットと比較して、Ｃ５ペプチド（５４μｇ／ｋｇ）またはＣ６ペプチド（５．４μｇ／ｋｇ）注射を受けたラットは、隠れたプラットフォームを見つけるのにより短い逃避潜時を示し、Ｃ５およびＣ６処置群では１日目から逃避潜時に顕著な改善が見られた（ｐ＜０．０１）。これらの結果は、Ｃ５ペプチドおよびＣ６ペプチドは空間学習において加齢誘導性記憶障害を改善することを示す。
【０１００】
加えて、各群の生存監視を本試験の開始時と隔月（それぞれ１２、１４、１６、１８、２０、および２２か月齢）に記録した。図１２は、加齢ラットの生存監視を示す。陰性対照のラットと比較して、Ｃ５ペプチド注射を受けたラットはより高い生存率を示し、Ｃ６ペプチド注射を受けたラットは２２か月齢で１００％の生存監視を示した。これらの結果は、Ｃ５ペプチドおよびＣ６ペプチドはラットの平均余命を延長することを示す。
【０１０１】
実施例１０
１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）マウスパーキンソン病モデルに対するＣ６ペプチドの効果
１．動物
ラットは実施例４に記載のように入手し、世話をした。
【０１０２】
２．材料
Ｃ６ペプチドは、実施例１に記載の方法により調製した。１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．（セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入し、さらなる使用のためにＤＭＳＯに溶かした。
【０１０３】
３．薬物処置
５週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウスを３群に無作為に分け、それぞれＰＢＳ（陰性対照）、ＭＰＴＰ（３０ｍｇ／ｋｇ）（ＭＰＴＰ群）、およびＣ６ペプチド（１０．７μｇ／ｋｇ）とＭＰＴＰ（３０ｍｇ／ｋｇ）（Ｃ６＋ＭＰＴＰ群）を腹膜内注射した。注射容量は毎日、各マウスの体重に基づいて計算した。Ｃ６＋ＭＰＴＰ群のマウスにＣ６ペプチドを３週間注射した後、Ｃ６ペプチドとＭＰＴＰを１週間注射し、次いで、ロータロッド性能試験を行った。
【０１０４】
４．ロータロッド性能試験
マウスの協調性を評価するためにロータロッド性能試験を行った。マウスをロッド上に載せ、ロッドに適応させるために２ｒｐｍの定速で２分間稼働させた。その後、ロッドの２０ｒｐｍへの加速化を開始し（５分以内）、１５分間保持した。各マウスがロッドから落下する時間（潜時）を記録した。
【０１０５】
５．統計分析
データを一元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、ニューマン−コイルス多重比較事後検定で分析した。
【０１０６】
６．結果
Ｃ６ペプチドは、ＭＰＴＰパーキンソン病マウスモデルにおいて協調性を改善する。本実施形態では、マウスにおいてパーキンソン病を誘発するためにＭＰＴＰを使用し、パーキンソン病に対するＣ６ペプチドの効果を試験するためにこのマウスモデルを使用した。
図１３は、ロッド上の各群のマウスの平均落下潜時（秒）を示す。マウスがロッド上に長く留まっているほど、それらの協調性は良好である。ＰＢＳを注射したマウス（陰性対照）の平均落下潜時は７７８．５秒であり、ＭＰＴＰマウスパーキンソン病モデル（ＭＰＴＰ群）の平均落下潜時は１５９．８秒であり、（ＭＰＴＰ＋Ｃ６）群の平均落下潜時は２６１秒であった。陰性対照と比較してＭＰＴＰ群および（ＭＰＴＰ＋Ｃ６）群の両方で落下潜時に有意な短縮が見られた（ｑ＝２４．１２、２３．４２、２０．１８、ｐ＜０．０１）。（ＭＰＴＰ＋Ｃ６）群のマウスは、ＭＰＴＰマウスパーキンソン病モデル（ＭＰＴＰ群）よりも有意に長い落下潜時を示した（ｑ＝４．１９、３．４５、ｐ＜０．０５）。これらの結果は、Ｃ６ペプチドはＭＰＴＰマウスパーキンソン病モデルにおける協調性を改善することを示す。
【０１０７】
実施例１１
Ｄ−ガラクトース誘導性加齢モデルラットにおける空間学習および記憶に対するＣ５ペプチドおよびＣ６ペプチドの効果−水迷路課題
１．動物
ラットは実施例４に記載のように入手し、世話をした。
【０１０８】
２．材料
Ｃ５ペプチドおよびＣ６ペプチドは、実施例１に記載の方法により調製した。Ｄ−ガラクトースは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．（セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入し、さらなる使用のために０．９％ＮａＣｌ溶液に溶かした。
【０１０９】
３．薬物処置
７週齢のスプラーグ−ドーリーラットを陰性対照群（０．９％ＮａＣｌ）、Ｄ−ガラクトース注射群（Ｄ−ガラクトース）、Ｃ５ペプチドとＤ−ガラクトース注射群（Ｃ５＋Ｄ−ガラクトース）、およびＣ６ペプチドとＤ−ガラクトース注射群（Ｃ６＋Ｄ−ガラクトース）  に無作為に分けた。これら４群のラットにそれぞれ０．９％ＮａＣｌ（陰性対照群およびＤ−ガラクトース群）、Ｃ５ペプチド（５４μｇ／ｋｇ／日、Ｃ５＋Ｄ−ガラクトース群）、およびＣ６ペプチド（５．４μｇ／ｋｇ／日、Ｃ６＋Ｄ−ガラクトース群）を連続７日間腹膜内注射した。その後、４群のラットにそれぞれ０．９％ＮａＣｌ（陰性対照群）、０．９％ＮａＣｌとＤ−ガラクトース（１５０ｍｇ／ｋｇ／日）（Ｄ−ガラクトース群）、Ｃ５ペプチド（５４μｇ／ｋｇ／日）とＤ−ガラクトース１５０ｍｇ／ｋｇ／日）（Ｃ５＋Ｄ−ガラクトース群）、およびＣ６ペプチド（５．４μｇ／ｋｇ／日）とＤ−ガラクトース（１５０ｍｇ／ｋｇ／日）（Ｃ６＋Ｄ−ガラクトース群）を連続９週間腹膜内注射し、次いで、水迷路課題を行った。注射容量は１μＬ／ｇ体重とした。
【０１１０】
４．水迷路学習
水迷路学習の方法は実施例４に記載されている。
【０１１１】
５．統計分析
データを二元配置ＡＮＯＶＡ、次いで、ニューマン−コイルス多重比較事後検定で分析した。
【０１１２】
６．結果
Ｃ５ペプチドおよびＣ６ペプチドは両方ともＤ−ガラクトース誘導性加齢モデルラットにおいて空間学習および記憶を増強する。
図１４は、各水迷路学習日における各群のラットの平均逃避潜時（秒）を示す。Ｄ−ガラクトース注射を受けたラットは、隠れたプラットフォームを見つけるのにより長い逃避潜時を示した（平均潜時は５３．０６秒であった）。Ｄ−ガラクトース注射を受けたラットと比較して、Ｃ５＋Ｄ−ガラクトースおよびＣ６＋Ｄ−ガラクトース群では２日目から逃避潜時に有意な改善が見られたが（ｑ＝５．３４、４．３７、ｐ＜０．０１）、陰性対照、Ｃ５＋Ｄ−ガラクトース、およびＣ６＋Ｄ−ガラクトース群の間には有意な差は見られなかった（ｐ＞０．０５）。これらの結果は、Ｃ５ペプチドおよびＣ６ペプチドはＤ−ガラクトース誘導性加齢モデルラットにおいて空間学習および記憶を増強することを示す。
【０１１３】
本発明の上記の実施形態には、当然のことながら、その範囲から逸脱することなく多くの変更および改変を行うことができる。よって、科学および有用な技術における進展を促進するために、本発明が開示され、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものとする。
【図１Ａ】
0006526807.tif 000002
【図１Ｂ】
0006526807.tif 000003
【図１Ｃ】
0006526807.tif 000004
【図１Ｄ】
0006526807.tif 000005
【図１Ｅ】
0006526807.tif 000006
【図１Ｆ】
0006526807.tif 000007
【図１Ｇ】
0006526807.tif 000008
【図１Ｈ】
0006526807.tif 000009
【図１Ｉ】
0006526807.tif 000010
【図２Ａ】
0006526807.tif 000011
【図２Ｂ】
0006526807.tif 000012
【図２Ｃ】
0006526807.tif 000013
【図２Ｄ】
0006526807.tif 000014
【図２Ｅ】
0006526807.tif 000015
【図２Ｆ】
0006526807.tif 000016
【図２Ｇ】
0006526807.tif 000017
【図３Ａ】
0006526807.tif 000018
【図３Ｂ】
0006526807.tif 000019
【図３Ｃ】
0006526807.tif 000020
【図３Ｄ】
0006526807.tif 000021
【図３Ｅ】
0006526807.tif 000022
【図４】
0006526807.tif 000023
【図５Ａ】
0006526807.tif 000024
【図５Ｂ】
0006526807.tif 000025
【図５Ｃ】
0006526807.tif 000026
【図６】
0006526807.tif 000027
【図７】
0006526807.tif 000028
【図８】
0006526807.tif 000029
【図９Ａ】
0006526807.tif 000030
【図９Ｂ】
0006526807.tif 000031
【図９Ｃ】
0006526807.tif 000032
【図１０】
0006526807.tif 000033
【図１１Ａ】
0006526807.tif 000034
【図１１Ｂ】
0006526807.tif 000035
【図１２】
0006526807.tif 000036
【図１３】
0006526807.tif 000037
【図１４】
0006526807.tif 000038
【配列表】
0006526807000001.app