(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍抗原タンパク質をコード化する核酸を含む、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘発することによって対象におけるワクチン接種に使用するための組成物であって、核酸が、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）タンパク質をコード化し、組成物が、皮内注射によって注入され、そして、
−まず、１２５０から１４００Ｖ／ｃｍの電界強度および１０μｓから１０００μｓの持続時間の単回の高電圧パルスを印加し；
−次いで、１００から２００Ｖ／ｃｍの電界強度および３００から８００ｍｓの持続時間の単回の低電圧パルスを印加して、
皮膚細胞内へ電気的に導入される、組成物。
【請求項２】
単回の低電圧パルスが、１８０Ｖ／ｃｍの電界強度を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
単回の高電圧パルスが、１２５０Ｖ／ｃｍの電界強度を有する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
単回の低電圧パルスが、３５０から６００ｍｓ、好ましくは４００ｍｓの持続時間を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
単回の高電圧パルスが、５０から１５０μｓ、好ましくは１００μｓの持続時間を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
使用される電極が、非侵襲的な平板電極である、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
高電圧パルスおよび低電圧パルスが、ラグタイムで分けられている、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
ラグタイムが、３００ｍｓから３０００ｍｓの間、好ましくは５００ｍｓから１２００ｍｓの間、さらに好ましくは１０００ｍｓである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
腫瘍を縮小、阻止または抑制するための、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入のための細胞の電気的透過性化（cell electropermeabilization）の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
電気パルス（ＥＰ）の局所送達による細胞の透過性化を意味する、細胞の電気的透過性化は、癌を含む、ヒトおよび動物の広範な疾病の管理および予防のために利用が増加しつつある。
【０００３】
細胞膜は、細胞質および細胞外液の２つの画分を区切り、イオン濃度の違いが存在するために膜電位の違いを生じる。電界が細胞に適用されるとき、静止膜電位に重畳する膜電位が誘発される結果となる（Mir et al., 2005）。閾値を超えると、一過性の膜透過が起こり、細胞質と細胞外液との間の分子交換がもたらされる。この現象は、細胞へのＥＰの適用と膜透過性の喪失がもたらされる結果として起こり、電気的透過性化と呼ばれる。この技術は、細胞による非透過性分子の取り込みを向上させるために、３０年に亘って使用されてきた。
【０００４】
電気的透過性化の正確な機序は未だ議論されているが、この技術は、多くの生物医学的用途のための、特に癌治療のための道を開いた（Breton ＆ Mir, 2011）。抗腫瘍電気化学療法と称される、それらの方法の１つは、細胞膜を通って自発的に拡散しない（または拡散が不十分である）ブレオマイシンまたはシスプラチンの投与と組み合わせて腫瘍部位に直接適用されるＥＰからなる（Mir et al., 1991; Mir, 2006）。一旦、電気的透過性化された細胞に入ると、これらの２つの薬剤は、ＤＮＡ損傷を生じ、細胞死をもたらす。非透過性分子である、薬剤のみでなく、核酸もまた（Satkauskas et al., 2002; Andre ＆ Mir, 2010）、電気的透過性化を用いて細胞内へ電気的に導入され得る。ＤＮＡは、皮膚、筋肉、肝臓、腫瘍、角膜、肺、腎臓、脳、膀胱および精巣を含む、生きている動物の種々の組織内へ成功裏に導入される（Andre et al., 2008; Gothelf ＆ Ghel, 2010を参照のこと）。
【０００５】
電気的遺伝子導入法の１つの有望な用途は、ＤＮＡワクチン接種の分野に関する。実際に、ＤＮＡワクチン接種は、９０年代初期から、大きな注目を集めている。ウォルフと共同研究者らは、動物の筋肉内へのＤＮＡ導入に初めて成功した。ＤＮＡ分子は、一旦トランスフェクトされると、標的細胞がコード化されたタンパク質を産生するのを可能にした（Wolff et al., 1990）。Ｔａｎｇらは、遺伝子銃法（biolistic method）によって皮膚細胞に導入されるＤＮＡにコード化されるタンパク質が、免疫応答を誘発できることを実証し（Tang et al., 1992）、Ｂａｒｒｙらは、病原体タンパク質をコード化するプラスミドによる遺伝子ワクチン接種が、対応する病原体による攻撃から動物を保護することを示した（Barry et al., 1995）。この技術は、実験室ツールから承認された動物用ワクチンまでの広範囲の用途に使用されており（Anderson et al., 1996）、癌、マラリア、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎のような種々の感染病原体の管理のため、またはインフルエンザもしくはヒト免疫不全ウイルスのようないくつかのウイルス感染の予防のために開発中である（clinicaltrials.gov) (Bergman et al., 2003）。
【０００６】
総じて、ＤＮＡワクチンは、他のワクチン技術と比較して、製造上、利用上および経済上の利点を有する（Liu, 2011）。ＤＮＡワクチンは、免疫細胞に抗原を送達し、特異的免疫応答を誘発するための正確かつ柔軟な戦略を提供するという事実にも関わらず、小さなげっ歯動物から大きな動物まで、そして最終的には患者へこの技術を変換するには当初問題があった（Rochard et al., 2011）。実際問題として、ＤＮＡワクチンは、ワクチン接種部位におけるＤＮＡ分子の低い細胞取り込みのために、免疫原性が低く、弱いことが見出された。この問題は、ＤＮＡワクチンの性能を劇的に向上させる電気的遺伝子導入法を用いることにより克服されている（Li et al., 2012; Gothelf ＆ Gehl, 2012）。
【０００７】
しかしながら、ワクチン接種戦略について予期される電気的透過法を使用するために、その手法は、特に特異的な方法を用いて実施されなければならない。電気的透過法は、２つの異なる種類のＥＰによる多段階の方法である（Andre ＆ Mir, 2010; Satkauskas et al., 2005; Favard et al., 2007）。まず初めに、ＤＮＡを、ワクチン接種の予期される部位（皮膚、筋肉）に注射することにより標的細胞周囲に近づけ、次いで、高電圧（ＨＶ）パルスと呼ばれる、単回または複数回の短く（約１００μ秒）、かつ強力な（１センチメートル当たり約千ボルト）パルスで細胞膜を可逆的に透過性とする。所定のラグタイム後に、低電圧（ＬＶ）パルスと呼ばれる、単回または複数回の長く（約数百マイクロ秒）、かつやや弱い（１センチメートル当たり約百ボルト）パルスを印加する。ＬＶパルスは、電気泳動的に、ＤＮＡ分子を、細胞外マトリックスを通過させて電気的透過性化した膜と接触させるまで誘導することを意図するものである。この時点では、如何にしてＤＮＡ分子が細胞質膜を通過し、核に取り込まれて、細胞の翻訳機構によって翻訳されるかについてのコンセンサスは存在しない（Escoffre et al., 2009）。
【０００８】
興味深いことに、動物またはヒトにおいて、ＤＮＡ投与、およびその後の電気的導入（electrotransfer）後の重大な副作用はこれまで検出されていない（Fioretti et al., 2013）。実験は、投与後に、ＤＮＡワクチンが主に注射部位の周辺に局在しており、その局在検出レベルが時間の経過と共に急速に減少し、生殖腺組織はそれを取り込むことなく（生殖細胞系伝達の顕著に低いリスク）、そして挿入確率はウイルスタンパク質を使用しないために顕著に低いことを報告した（Dolter et al., 2011）。さらに、ＤＮＡ分子が電気的遺伝子導入法と共にワクチン接種の目的に使用される場合、アデノウイルスベクターのようなウイルスベクターとは反対に処理前または処理後の免疫問題がないため、複数の投与が可能である（相同的なプライム−ブーストＤＮＡ／ＤＮＡまたは相同的なプライム−ブーストＤＮＡ／ベクターもしくはＤＮＡ／タンパク質）（Villemejane ＆ Mir, 2009）。その結果、電気的導入と組み合わせたＤＮＡワクチン接種は、ここ数年で関心を集めている。
【０００９】
癌病理に関係するものについて、ＤＮＡワクチンは、腫瘍特異的または腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘発することを意味する（Stevenson ＆ Palucka, 2010）。実際に、癌細胞は、自己寛容（Bei ＆ Scardino, 2010）、制御性Ｔ細胞または骨髄由来サプレッサー樹状細胞（ｍｏＤＣ）のいずれかを伴う多様な免疫抑制機序（Lindau et al., 2013）、ＣＴＬＡ−４のような免疫細胞の表面に発現する分子（Kolar et al, 2009; Shevach, 2009）ならびにＰＤ−１／ＰＤ−１Ｌ相互作用（Keir et al., 2008）のような複数の複雑な機構のために、免疫応答を常に効率的に開始することができないように免疫系を混乱させる。
【００１０】
電気的導入技術による効率的なＤＮＡワクチン送達の最終的な目標は、目的のプラスミドによってコード化される抗原に対する正しい種類の免疫応答を形成することでなければならない。筋肉内投与経路についてはよく説明されているが（特許出願 WO 2007/026236）（Mir et al., 2005; Andre ＆ Mir, 2010）、ワクチン接種の目的のための、皮膚への電気的導入パラメーターについては殆ど知られていない。免疫応答は、特定の病状の患者に良好な治療効果を生ずるのに十分に強く、かつ十分に長く持続しなければならない。注目すべきは、免疫応答の強さは、それ自体が遺伝子導入の効率と密接に相関する抗原発現のレベルに少なくとも部分的に依存して変わることである（Lee et al., 1997; Kirman ＆ Seder, 2003）。皮膚における電気的遺伝子導入効率に関して、それは、ＥＰの強度およびそれらを送達するために使用される電極の種類を含む幾つかのパラメーターによって変わる（Gothelf ＆ Gehl, 2010）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際特許出願 ＷＯ ２００７／０２６２３６号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Adotevi O, Mollier K, Neuveut C, Cardinaud S, Boulanger E, et al. (2006) Immunogenic HLA−B*0702−restricted epitopes derived from human telomerase reverse transcriptase that elicit antitumor cytotoxic T−cell responses. Clin Cancer Res 12: 3158−3167.
【非特許文献２】Anderson ED, Mourich DV, Fahrenkrug SC, LaPatra S, Shepherd J, et al. (1996) Genetic immunization of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) against infectious hematopoietic necrosis virus. Mol Mar Biol Biotechnol 5: 114−122.
【非特許文献３】Andre FM, Gehl J, Sersa G, Preat V, Hojman P, et al. (2008) Efficiency of high− and low−voltage pulse combinations for gene electrotransfer in muscle, liver, tumor, and skin. Hum Gene Ther 19: 1261−1271.
【非特許文献４】Andre FM, Mir LM (2010) Nucleic Acids electrotransfer In Vivo: Mechanisms and Practical Aspects. Current Gene Therapy 10: 267−280.
【非特許文献５】Barry MA, Lai WC, Johnston SA (1995) Protection against mycoplasma infection using expression−library immunization. Nature 377: 632−635.
【非特許文献６】Bei R, Scardino A (2010) TAA polyepitope DNA−based vaccines: a potential tool for cancer therapy. J Biomed Biotechnol 2010: 102758.
【非特許文献７】Bergman PJ, McKnight J, Novosad A, Charney S, Farrelly J, et al. (2003) Long−term survival of dogs with advanced malignant melanoma after DNA vaccination with xenogeneic human tyrosinase: a phase I trial. Clin Cancer Res 9: 1284−1290.
【非特許文献８】Breton M, Mir LM (2011) Microsecond and nanosecond electric pulses in cancer treatments. Bioelectromagnetics.
【非特許文献９】Cortez−Gonzalez X, Sidney J, Adotevi O, Sette A, Millard F, et al. (2006) Immunogenic HLA−B7−restricted peptides of hTRT. Int Immunol 18: 1707−1718.
【非特許文献１０】Dolter KE, Evans CF, Ellefsen B, Song J, Boente−Carrera M, et al. (2011) Immunogenicity, safety, biodistribution and persistence of ADVAX, a prophylactic DNA vaccine for HIV−1, delivered by in vivo electroporation. Vaccine 29: 795−803.
【非特許文献１１】Escoffre JM, Portet T, Wasungu L, Teissie J, Dean D, et al. (2009) What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues. Mol Biotechnol 41: 286−295.
【非特許文献１２】Favard C, Dean DS, Rols MP (2007) electrotransfer as a non viral method of gene delivery. Current Gene Therapy 7: 67−77.
【非特許文献１３】Fioretti D, Iurescia S, Fazio VM, Rinaldi M (2013) In vivo DNA electrotransfer for immunotherapy of cancer and neurodegenerative diseases. Curr Drug Metab 14: 279−290.
【非特許文献１４】Gothelf A, Gehl J (2010) Gene electrotransfer to skin; review of existing literature and clinical perspectives. Curr Gene Ther 10: 287−299.
【非特許文献１５】Gothelf A, Gehl J (2012) What you always needed to know about electroporation based DNA vaccines. Hum Vaccin Immunother 8: 1694−1702.
【非特許文献１６】Keir ME, Butte MJ, Freeman GJ, Sharpe AH (2008) PD−1 and its ligands in tolerance and immunity. Annu Rev Immunol 26: 677−704.
【非特許文献１７】Kirman JR, Seder RA (2003) DNA vaccination: the answer to stable, protective T−cell memory? Curr Opin Immunol 15: 471−476.
【非特許文献１８】Kolar P, Knieke K, Hegel JKE, Quandt D, Burmester GR, et al. (2009) CTLA−4 (CD152) Controls Homeostasis and Suppressive Capacity of Regulatory T Cells in Mice. Arthritis and Rheumatism 60: 123−132.
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【非特許文献２０】Li L, Saade F, Petrovsky N (2012) The future of human DNA vaccines. J Biotechnol 162: 171−182.
【非特許文献２１】Lindau D, Gielen P, Kroesen M, Wesseling P, Adema GJ (2013) The immunosuppressive tumour network: myeloid−derived suppressor cells, regulatory T cells and natural killer T cells. Immunology 138: 105−115.
【非特許文献２２】Liu MA (2011) DNA vaccines: an historical perspective and view to the future. Immunol Rev 239: 62−84.
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【非特許文献２８】Rohrlich PS, Cardinaud S, Firat H, Lamari M, Briand P, et al. (2003) HLA−B*0702 transgenic, H−2KbDb double−knockout mice: phenotypical and functional characterization in response to influenza virus. Int Immunol 15: 765−772.
【非特許文献２９】Satkauskas S, Bureau MF, Puc M, Mahfoudi A, Scherman D, et al. (2002) Mechanisms of in vivo DNA electrotransfer: Respective contributions of cell electropermeabilization and DNA electrophoresis. Molecular Therapy 5: 133−140.
【非特許文献３０】Satkauskas S, Andre F, Bureau MF, Scherman D, Miklavcic D, et al. (2005) Electrophoretic component of electric pulses determines the efficacy of In Vivo DNA electrotransfer. Human Gene Therapy 16: 1194−1201.
【非特許文献３１】Shevach EM (2009) Mechanisms of foxp3+ T regulatory cell−mediated suppression. Immunity 30: 636−645.
【非特許文献３２】Stevenson FK, Palucka K (2010) Understanding and activating immunity against human cancer. Curr Opin Immunol 22: 212−214.
【非特許文献３３】Tang DC, DeVit M, Johnston SA (1992) Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature 356: 152−154.
【非特許文献３４】Villemejane J, Mir LM (2009) Physical methods of nucleic acid transfer: general concepts and applications. British Journal of Pharmacology 157: 207−219.
【非特許文献３５】Vesely MD, Kershaw MH, Schreiber RD, Smyth MJ (2011) Natural innate and adaptive immunity to cancer. Annu Rev Immunol 29: 235−271.
【非特許文献３６】Wang Q, Lei C, Wan H, Liu Q (2012) Improved cellular immune response elicited by a ubiquitin−fused DNA vaccine against Mycobacterium tuberculosis. DNA Cell Biol 31: 489−495.
【非特許文献３７】Wolff JA, Malone RW, Williams P, Chong W, Acsadi G, et al. (1990) Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science 247: 1465−1468.
【発明の概要】
【００１３】
発明の簡単な説明：
本発明者らは、皮膚における電気的導入効率が、高電圧パルスおよび低電圧パルスの特定の組み合わせを使用することによって改善され得ることを見出した。
本発明は、インビボでの皮膚細胞への核酸の導入法に関し、ここで、該核酸は、皮内注射（ＩＤ）により注入され、単回の高電圧パルスを印加し、その後、単回の低電圧パルスを印加することにより皮膚細胞に電気的に導入される。
【００１４】
本発明は、皮膚細胞にインビボで導入されることを意図する医薬組成物または医薬の製造を目的とする核酸の使用に関し、ここで、該医薬組成物は、皮内注射によって注入され、そして、
−まず、１０００から１５００Ｖ／ｃｍの電界強度および１０μｓから１０００μｓの持続時間の単回の高電圧パルスを印加し；
−次いで、好ましくは所定のラグタイム後に、５０から２５０Ｖ／ｃｍの電界強度および３００から８００ｍｓの持続時間の単回の低電圧パルスを印加して、
皮膚細胞内へ電気的に導入される。
【００１５】
従って、本発明の目的はまた、治療的に有効なまたは免疫原性の分子をコード化する核酸を皮内注射し、そして
−まず、１０００から１５００Ｖ／ｃｍの電界強度および１０μｓから１０００μｓの持続時間の単回の高電圧パルスを印加し；
−次いで、好ましくは所定のラグタイム後に、５０から２５０Ｖ／ｃｍの電界強度および３００から８００ｍｓの持続時間の単回の低電圧パルスを印加して、
皮膚を電気的に透過性化し、
これらの電気パルス手段により組織細胞内に核酸を導入する
ことを含む、ヒトまたは動物の処置法でもある。
【００１６】
本発明は、ワクチン接種の分野において特に有用である。皮膚組織は、実際に、ｉ）ワクチン接種部位と抗原提示細胞（ＡＰＣ）の局在部位との間の完全な一致、およびｉｉ）抗原用量の低減を可能にする。
従って、好ましい態様において、核酸は、有利には、腫瘍抗原、またはウイルスもしくは細菌抗原などの抗原性または免疫原性タンパク質をコード化する。
好ましい態様において、本発明は、抗腫瘍ワクチン接種の分野で使用されている。核酸は、有利には、腫瘍を縮小、阻止または抑制するのに効果的な抗原性タンパク質、例えば腫瘍抗原をコード化する。
【００１７】
本発明は、対象におけるワクチン接種または遺伝子治療で使用するための、タンパク質をコード化する核酸を提供し、ここで、該核酸は、皮内注射され、そして、
−１０００から１５００Ｖ／ｃｍの電界強度および１０μｓから１０００μｓの持続時間の単回の高電圧パルスを印加し；
−次いで、好ましくは所定のラグタイム後に、５０から２５０Ｖ／ｃｍの電界強度および３００から８００ｍｓの持続時間の単回の低電圧パルスを印加して、
皮膚細胞内へ電気的に導入することにより投与される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ＩＮＶＡＣ−１プラスミドＤＮＡベクターの概略図である。塩基１−３４７８：ＮＴＣ８６８５−ｅＲＮＡ４１Ｈ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩベクター（ＮＴＣ）；塩基３４７９−３４８４：ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位（ＮＴＣ／Ｉｎｖｅｃｔｙｓ）；塩基３４８５−６９６７：Ｕｂｉ−テロメラーゼ導入遺伝子（Ｉｎｖｅｃｔｙｓ）；塩基６９６８−６９７３：ＸｂａＩクローニング部位（Ｉｎｖｅｃｔｙｓ／ＮＴＣ）；塩基６９７４−７１２０：ＮＴＣ８６８５−ｅＲＮＡ４１Ｈ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩベクター（ＮＴＣ）。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、電気的導入が遺伝子導入および免疫化のために有利であることを示すグラフである。（Ａ）ｐＣＭＶ−ｌｕｃ注入後、ＥＰ印加を適用し、または適用せず、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける生物発光強度の表示（ｐＣＭＶ−ｌｕｃ ＩＤ注入のみのマウス（ｎ＝５）、ｐＣＭＶ−ｌｕｃ ＩＤ注入＋ＥＰのマウス（ｎ＝１０）（そのうち５匹は、マウス当たり２処理））。（Ｂ）ＩＮＶＡＣ−１でワクチン接種し、その後ＥＰ印加を適用し、または適用せず、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて検出されるｈＴＥＲＴ特異的ＩＮＦγ＋ＣＤ８ Ｔ細胞数（ｎ＝６〜８マウス）。バーは中央値を示す。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、マン−ホイットニー−ウィルコクソン検定。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、最良の電極の選択を示すグラフである。（Ａ）３種類の電極を用いるｐＣＭＶ−ｌｕｃ電気的導入後のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける生物発光強度の表示（ｐＣＭＶ−ｌｕｃ ＩＤ注入のみのマウス（ｎ＝１４）、ｐＣＭＶ−ｌｕｃ  ＩＤ注入＋ＥＰのマウス（ｎ＝８〜１０）（そのうち４〜５匹マウスは、マウス当たり２処理））。（Ｂ）３種類の電極を用いてＩＮＶＡＣ−１をワクチン接種したＨＬＡ−Ｂ７マウスにおいて検出されるｈＴＥＲＴ特異的ＩＮＦγ＋ＣＤ８ Ｔ細胞の数（ＰＢＳ接種による対照マウス（ｎ＝３）およびＩＮＶＡＣ−１免疫接種マウス（ｎ＝４〜９））。バーは中央値を示す。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、ダンの多重比較検定とクラスカル−ワリス検定。
【図４】図４は、ＩＤ注入および平板電極を用いるｐＣＭＶ−ｌｕｃの電気的導入後の、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおけるルシフェラーゼ遺伝子発現の局在を示す写真である。
【図５】図５は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、平板電極を用いる、経皮注入されたｐＣＭＶ−ｌｕｃの電気的導入に最適なＨＶパルス強度の決定を示すグラフである（ｐＣＭＶ−ｌｕｃ ＩＤ注入のみのマウス（ｎ＝２４）、ｐＣＭＶ−ｌｕｃ ＩＤ注入＋ＥＰのマウス（ｎ＝８）（そのうち４匹のマウスは、マウス当たり２処理））。バーは中央値を示す。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、ダンの多重比較検定とクラスカル−ワリス検定。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける最適なＨＶ−ＬＶパルスの組み合わせの選択を示すグラフである。（Ａ）種々のＨＶ−ＬＶパルスの組み合わせによるｐＣＭＶ−ｌｕｃ ＩＤ注入後に得られる生物発光（ｐＣＭＶ−ｌｕｃ ＩＤ注入のみのマウス（ｎ＝３０）およびｐＣＭＶ−ｌｕｃ ＩＤ注入＋ＥＰ（ｎ＝６）（そのうち３匹のマウス、マウス当たり２処理））。（Ｂ）ＨＶ−ＬＶパルスの種々の組み合わせでＩＮＶＡＣ−１をワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて検出されたｈＴＥＲＴ特異的ＩＦＮγ＋ＣＤ８ Ｔ細胞数（ＰＢＳ接種による対照マウス（ｎ＝８）およびＩＮＶＡＣ−１免疫接種マウス（ｎ＝５）)。バーは中央値を示す。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、ダンの多重比較検定とクラスカル−ワリス検定。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
定義
用語ＨＶは高電圧を意味し、用語ＬＶは低電圧を意味する。
【００２０】
本明細書で用いる用語“皮膚”は、動物、例えばヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えばげっ歯動物（例えばマウス、ウサギまたはラット）、イヌ、ネコ、または霊長動物、ウマ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシなどの皮膚を意味する。好ましい態様において、核酸は、真皮の細胞に導入される。本発明の方法により核酸が導入される皮膚細胞は、好ましくは、樹状細胞であるが、ケラチノサイト、メラノサイト、線維芽細胞、または骨髄もしくはリンパ系細胞も含まれ得る。用語“核酸”は、目的の任意の核酸、特に、目的のタンパク質を発現することができる任意の核酸を意味する。核酸は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、アンチセンスまたはｉＲＮＡ）である。好ましくは、それは、ＤＮＡ、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。好ましい態様において、核酸は、当技術分野でよく知られている種類のＤＮＡ発現ベクターである。一般的に、発現ベクターは、目的のタンパク質をコード化するＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。
【００２１】
用語“ＴＥＲＴ”とは、テロメラーゼ活性の主要な決定因子である、野生型テロメラーゼまたはその変異体を含む“テロメラーゼ逆転写酵素”を意味する。
【００２２】
用語“免疫原性”とは、言及される組成物または構築物が投与時に免疫応答を誘導することが可能であることを意味する。対象における“免疫応答”は、抗原に対する、体液性免疫応答、細胞性免疫応答、または両方を含む、自然免疫および適応免疫応答の発生を意味する。“体液性免疫応答”は、抗体により仲介されるものを意味する。“細胞性免疫応答”は、Ｔ−リンパ球により仲介されるものを意味する。それは、活性化Ｔ細胞、白血球、または両方により産生される、サイトカイン、ケモカインおよび同様の分子の産生を含む。免疫応答は、当技術分野で公知の体液性免疫応答の検出のための標準的な免疫アッセイおよび中和アッセイを用いて決定され得る。抗癌ワクチン接種に関して、免疫応答は、好ましくは、細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞および／またはＣＤ４ Ｔ細胞の刺激または増殖を含み、免疫アッセイ、例えばＥＬＩＳｐｏｔアッセイ、インビボ細胞傷害性アッセイまたはサイトカイン分泌結合アッセイを用いて決定され得る。
【００２３】
本明細書で用いる用語“処置”または“治療”または“免疫療法”は、症状の緩和、改善および／または排除、低減および／または安定化（例えば、より進んだ段階へ進行しない）の何れか、ならびに疾患またはその症状の進行の遅延を意味する。従って、疾患が癌であるとき、この用語は、癌患者において観察される効果的な抗腫瘍免疫応答の達成を含む。
【００２４】
本明細書で用いる用語“予防”または“防止”は、前駆症状、すなわち特定の症状が生じる前に疾患の始まりを示唆し得る任意の変化または初期症状（または一連の症状）の緩和、改善および／または排除、低減および／または安定化（例えば、より進んだ段階へ進行しない）を意味する。
【００２５】
“患者”または“対象”は、一般的に、上記のような哺乳動物対象、好ましくは任意の年齢、性別、または病状の重症度のヒト対象である。
【００２６】
電気的導入パラメーター
核酸は、好ましくは、単回のＬＶパルスの印加前に、単回のＨＶパルスの印加前に、皮膚細胞と接触させることがさらにより好ましい。核酸の注入と電気パルスとの間の時間、とりわけ注入と単回のＨＶパルスとの間の時間は重要ではない。一般的には、医薬組成物を、数秒から１０分間、例えば３０秒から５分間、皮膚細胞と接触させた。ＨＶパルスの前の５から１０分の時間間隔もまた、許容される。核酸または該核酸を含む医薬組成物を、皮内注射によって皮膚細胞（すなわち、真皮細胞）と接触させる。
【００２７】
本発明の有利な面において、単回の高電圧パルスは、好ましくは、１１００から１４００Ｖ／ｃｍの間の電界強度、好ましくは１２５０Ｖ／ｃｍの電界強度を有する。
【００２８】
単回の高電圧パルスは、５０から１５０μｓの持続時間、好ましくは、１００μｓの持続時間を有し得る。
【００２９】
本発明の有利な態様では、単回の低電圧パルスは、好ましくは、１００から２００Ｖ／ｃｍの間の電界強度、好ましくは１８０Ｖ／ｃｍの電界強度を有する。
【００３０】
単回の低電圧パルスは、好ましくは、３５０から６００ｍｓの持続時間、さらに好ましくは４００ｍｓの持続時間を有し得る。
【００３１】
好ましい態様において、単回の高電圧パルスは、好ましくは、１１００から１４００Ｖ／ｃｍの間の電界強度、好ましくは１２５０Ｖ／ｃｍの電界強度、および５０から１５０μｓの持続時間、好ましくは１００μｓの持続時間を有し、そして単回の低電圧パルスは、１００から２００Ｖ／ｃｍの間の電界強度、好ましくは１８０Ｖ／ｃｍの電界強度、および３５０から６００ｍｓの持続時間、さらに好ましくは４００ｍｓの持続時間を有する。
【００３２】
特定の態様において、対象がヒト対象であるとき、単回の高電圧パルスは、１２５０Ｖ／ｃｍの電界強度、および好ましくは１００μｓの持続時間を有し、そして単回の低電圧パルスは、１８０Ｖ／ｃｍ電界強度、および好ましくは４００ｍｓの持続時間を有し得る。
【００３３】
ＬＶパルスは、ＨＶパルスと同じ極性または逆の極性であってよい。
好ましくは、単回のＬＶパルスは、二乗パルスである。また、台形パルスまたは不連続パルスであってもよい。単回のＨＶパルスは、有利には二乗パルスであり得る。
【００３４】
ＨＶおよびＬＶパルスは、ラグタイムで分けられ、このラグタイムは、有利には、３００から３０００ｍｓ、好ましくは５００から１２００ｍｓ、一般的には１０００ｍｓであり得る。
【００３５】
本発明の目的は、核酸を含む真皮細胞の近くに間隔を空けて電極を配置し、次いで、以下のように：
−まず、１０００から１５００Ｖ／ｃｍの電界強度および１０μｓから１０００μｓの持続時間の単回の高電圧パルスを印加し；
−次いで、好ましくは所定のラグタイム後に、５０から２５０Ｖ／ｃｍの電界強度および３００から８００ｍｓの持続時間の単回の低電圧パルスを印加して、
真皮細胞を電気的透過性化し、これらの電気パルスの結果、該核酸を真皮細胞に導入することを含む、エレクトロポレーション法そのものである。
【００３６】
プログラム可能な電圧発生器を使用してもよい。
【００３７】
使用される電極は、一般に４ｍｍ間隔の４本２列の長針からなる侵襲的な針電極（例えば、Ｎ−３０−４Ｂ、ＩＧＥＡ）、または一般に４ｍｍ間隔の３本２列の短針からなる侵襲性のフィンガー電極（例えば、Ｆ−０５−ＯＲ、ＩＧＥＡ）であるが、好ましいのは非侵襲的な平板電極（例えば、Ｐ３０−８Ｂ、ＩＧＥＡ）である。
【００３８】
電極は、電極間の電界が、注入された液体が注射時に拡散している注射部位または領域を通過するように、注射部位の近傍に配置される。当業者に公知の通り、導電性ゲルは、有利に使用され得る。
【００３９】
特定の態様において、電極は、注入と電気刺激の両方を行うデバイスによって実施され得る。
【００４０】
遺伝子構築物、免疫原性組成物
好ましくは、核酸は、目的のタンパク質をコード化するポリヌクレオチド配列、ならびに宿主細胞または宿主生物におけるタンパク質産物の発現例えば、転写および翻訳）を可能にする調節配列（例えば、適当なプロモーター（複数可）、エンハンサー（複数可）、ターミネーター（複数）等）を含む遺伝子構築物である。
【００４１】
本発明の遺伝子構築物は、一般的には、意図される宿主細胞または宿主生物の形質転換に適する形態、意図される宿主細胞のゲノムＤＮＡに挿入されるのに適する形態、または意図される細胞もしくは生物での独立した複製、維持および遺伝に適する形態であり得る。例えば、本発明の遺伝子構築物は、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクターまたはトランスポゾンのようなベクターの形態であり得る。特に、ベクターは、発現ベクター、すなわち、インビボでの、とりわけ真皮の細胞における、ＲＮＡの転写および／またはタンパク質の発現を提供し得るベクターあり得る。
【００４２】
好ましいが非限定的な面において、本発明の遺伝子構築物は、ｉ）目的のタンパク質をコード化する少なくとも１つの核酸；ｉｉ）１つまたはそれ以上の調節要素、例えばプロモーターおよび要すれば、好適なターミネーター（これにｉ）が作動可能に連結されている）；ならびに、要すれば、ｉｉｉ）１つまたはそれ以上の遺伝子構築物のさらなる要素、例えば３’−または５’−ＵＴＲ配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカー／レポーター遺伝子、および／または形質転換または組み込み（の効率）を促進または増加させ得る要素、を含む。
【００４３】
本発明の使用は、インビボで異なる活性分子を発現し得る２つまたはそれ以上の核酸が、医薬組成物を製造するのに使用される場合を包含することが理解され得る。核酸は、病状の処置において相補的および／または相乗的に作用するように選択される。その場合、別の分子をコード化するヌクレオチド配列は、同じプロモーターまたは異なるプロモーターの制御下にあってよい。該核酸（複数可）またはベクター（複数可）を含む組成物を製造することができる。一態様において、組成物は免疫原性である。これらは、ヒトまたは哺乳動物に投与するのに適する（すなわち、非毒性である）担体または添加剤を含んでいてよい。かかる添加剤には、医薬ビヒクル、等張化剤、安定化剤、もしくは任意のアジュバントとして作用する、液体、半固体、または固体希釈剤が含まれる。
【００４４】
ノンコーディング核酸
別の態様において、核酸は、任意の目的のタンパク質をコード化しないが、標的遺伝子の発現を阻害または減少させる。例えば、核酸は、アンチセンスまたは干渉ＲＮＡであってよい。核酸は、天然のＲＮＡ核酸分子またはＰＬＮＡなどの核酸類縁体であってよい。特に、核酸は、標的ｍＲＮＡを標的とする、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、例えば一本鎖または二本鎖ＲＮＡ、例えば約１７ヌクレオチド長から約２９ヌクレオチド長、好ましくは約１９ヌクレオチド長から約２５ヌクレオチド長の短い一本鎖または二本鎖ＲＮＡであってよい。二本鎖ＲＮＡである場合、かかるｓｉＲＮＡは、共にアニーリングしたセンスＲＮＡ鎖および相補的アンチセンスＲＮＡ鎖を含む。
【００４５】
ワクチン接種および／または遺伝子治療
特定の態様において、核酸は、目的のタンパク質の発現により、遺伝子治療および／またはワクチン接種に有用である。好ましい態様において、目的のタンパク質は、免疫刺激作用、さらに好ましくはワクチン効果を有する。有利には、体液性免疫応答が得られる。
【００４６】
好ましい面において、核酸は、トランスフェクトされた皮膚細胞において、１つまたはそれ以上の治療的に有効な分子（複数可）、好ましくは目的の１または複数のタンパク質をインビボで発現可能な核酸配列を含む。
【００４７】
この活性分子または目的のタンパク質は、身体内の別の場所で皮膚自体および/または皮膚の外側に作用し、例えば、該発現された分子が、抗腫瘍ワクチンとして有効である場合、体内のどこかに位置する腫瘍、または該発現された分子が、抗感染症ワクチンとして有効である場合、体内のどこかに位置する感染（infection）に作用し得る。
【００４８】
目的の治療用分子の例としては、抗腫瘍ワクチンとして有用なＴＥＲＴタンパク質が含まれる。本発明によって発現され得る分子の種類は特に限定されないため、当業者は、そのコーディング配列が知られている目的の分子および最良のコンストラクションまたは発現ベクターを選択するための常套の実験を用いて本発明を実施することができることが理解され得る。
【００４９】
興味深い面において、治療的に有効な分子として、核酸は、宿主に免疫応答を誘導し得る、１つまたは幾つかの免疫原（または、免疫原性ペプチド、ポリペプチドもしくは糖タンパク質を含むタンパク質）をコード化する。一態様において、免疫応答は、宿主の保護免疫応答(protective immune response)である。この態様において、本発明は、癌に対して、または微生物、例えばウイルスもしくは細菌に対して向けられている、免疫原性組成物または予防もしくは治療ワクチンの製造に関する。
【００５０】
一例として、核酸は、ＨＩＶ、ＨＢＶ、エプスタイン−バーウイルス、仮性狂犬病ウイルス、合胞体形成ウイルス、オンコウイルス、パピローマウイルスなどの１つまたは幾つかの免疫原をコード化する。当業者は、選択した適応についての最も興味深い分子をコード化する核酸を入手でき、例えば特定の疾患のための最も効率的な免疫原または免疫原の組み合わせを入手可能である。
【００５１】
別の態様において、免疫応答は、抗体、とりわけポリクローナル抗体の産生をもたらし、これらの抗体は、産生された血清から回収して、通常の方法で使用されることが意図される。
【００５２】
さらに別の態様において、核酸は、対象、例えばマウスに投与されることにより、特定の抗体の産生を誘発する、抗原ペプチドまたはタンパク質をコード化する。
【００５３】
腫瘍の処置
特定の態様において、患者における腫瘍または望ましくない細胞増殖（例えば、異形成）の予防法または処置法が記載され、該方法は、本発明のエレクトロポレーション法を用いて、それを必要とする患者に有効量の核酸または免疫原性組成物を投与することを含む。該核酸または免疫原性組成物は、患者において免疫応答を誘導するのに十分な量で投与される。
【００５４】
腫瘍は、良性腫瘍または悪性腫瘍、とりわけ癌の、望ましくない細胞増殖であり得る。
【００５５】
癌は、転移段階を含む、任意の段階のものであり得る。
【００５６】
従って、核酸は、好ましくは、医薬組成物が、腫瘍血管形成を低減、抑制もしくは退行させるのに有効であるか、または腫瘍増殖を低減もしくは抑制するか、または転移を阻害するように、選択される１つまたは複数の活性分子（複数可）を発現する。例として、腫瘍抗原（例えば、ＴＥＲＴ）をコード化する核酸を使用することができる。
【００５７】
特定の態様において、腫瘍は固形腫瘍、肉腫または癌腫である。特に、腫瘍は、黒色腫、神経膠芽腫、神経芽腫および星状細胞腫などの脳腫瘍、および膀胱癌、乳癌、頸部癌、結腸癌、肺の癌種、とりわけ非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膵臓癌、前立腺癌、頭頸部癌、または胃癌からなる群より選択できる。
【００５８】
別の態様において、腫瘍は、液性腫瘍(liquid tumor)、例えば、造血器腫瘍、リンパ腫または白血病、例えばリンパ性白血病、骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、悪性骨髄腫を含むリンパ腫であり得る。
【００５９】
必要とされる材料（material）の量は、個々の構築物の免疫原性によって変わることが理解され、事前に予測することはできないが、任意の所定の構築物のための適当な投与量を決定する方法は容易に実行できる。具体的には、約５から３０μｇ、または好ましくは２０から２５μｇから始めて、例えば約５００から１０００μｇまでの一連の増加投与量を、対応する種（species）に投与し、その結果の免疫応答を、例えば、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（実施例部分に記載）による細胞免疫応答を検出すること、インビボ溶解アッセイ、クロム放出アッセイを用いて細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を検出すること、またはサイトカイン放出アッセイを用いてＴＨ（ヘルパーＴ細胞）応答を検出することにより観察する。
【００６０】
好ましい態様において、ワクチン接種レジメンは、１から３回の接種を含み、好ましくは３から４週間後に繰り返される。特定の態様において、ワクチン接種スケジュールは、１回または２回の接種の３または４週間後に、３回から５回の接種の少なくとも１サイクルを行うことから構成され得る。別の態様において、初期用量（primer dose）は、毎年、または例えば２年毎の少なくともブースター用量に続く、１回から３回の接種からなる。これらは単なる例であり、他のワクチン接種レジメンは本明細書中に包含される。
【００６１】
本発明は、以下の非限定的な実験を示してさらに詳細に説明される。
【実施例】
【００６２】
実施例：抗腫瘍ワクチン接種のための電気的遺伝子導入法
本実験において、テロメラーゼ腫瘍抗原に対するワクチン接種目的のための真皮への電気的遺伝子導入法が最適化された。最初の評価において、ルシフェラーゼレポーター遺伝子は、使用されるパラメーターの関数として真皮への電気的遺伝子導入効率を評価した。次に、これらのパラメーターを、テロメラーゼエピトープに対する免疫化マウスにおけるそれらの効率について試験した。非侵襲的または侵襲的のいずれかの、ならびに種々の印加電界範囲の、異なる電極タイプを用いた。
【００６３】
２つの重要な結果、第一に、電気的導入部位でのルシフェラーゼ発現の強度、第二に、抗癌ワクチンについて予期される免疫応答の一種である、ワクチン特異的インターフェロンγ（ＩＦＮγ）陽性ＣＤ８ Ｔ細胞の強度の、２つの重要な結果を評価した（Vesely et al., 2011）。３つの主要な電気的導入因子を調べた：電極タイプならびにＨＶおよびＬＶパルスの影響。
【００６４】
材料および方法
マウス
ＨＬＡ−Ｂ７マウスは、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２クラスＩ分子を発現するトランスジェニックマウスである。それらは、クラスＩ Ｈ２ＤｂおよびＨ２Ｋｂ分子のノックアウトマウスである。それらは、Rohrlich et al. 2003に既報であり、パスツール研究所内部育種から入手した。メスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６−８週令）をJanvier研究所(Saint−Berthevin、France)またはHarlan研究所(Gannat、France)から購入した。
【００６５】
動物は、パスツール研究所またはジスターブルシイ研究所の特定の病原体が存在しない動物飼育施設で飼育した。全ての動物実験は、欧州委員会が発行した倫理ガイドライン（Directive 2010/63/EU）を厳格に遵守して行われ、動物は、動物実験実施基準に従って厳密に処理された。
【００６６】
プラスミド
ｐＣＭＶ−ｌｕｃ（ＰＦ４６１、Plasmid Factory、Bielefeld、Germany）は、サイトメガロウイルスプロモーター（ｐＣＭＶ）の制御下に配置されたホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子をコード化する６２３３ｂｐの二本鎖プラスミドＤＮＡである。
【００６７】
ＩＮＶＡＣ−１は、ユビキチンタンパク質配列に融合されたテロメラーゼタンパク質の修飾配列をコード化する７１２０ｂｐの二本鎖プラスミドＤＮＡである。コード化されたテロメラーゼタンパク質は、酵素的に不活性であるが、それでもインビボでテロメラーゼエピトープに対する免疫応答を誘導し得る。ユビキチン−テロメラーゼインサートは、Nature Technology Corporation （Lincoln, Nebraska）によって設計されたＮＴＣ８６８５−ＥＲＮＡ４１Ｈ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ発現ベクターにクローニングされる。ユビキチンの存在は、プロテアソームへのテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）タンパク質の集合を増加させ、ＴＥＲＴ由来ペプチドのＭＨＣクラスＩ提示経路を増大させる（Rodriguez et al., 1997; Wang et al., 2012）。ＴＥＲＴタンパク質をコード化するＤＮＡ配列は、核小体局在化シグナルを含む、Ｎ末端領域の４７アミノ酸を欠失させた。さらに、３個のアミノ酸を、タンパク質酵素活性をなくすためにＴＥＲＴ（ＶＤＤ）の触媒部位の内部から除いた。ＩＮＶＡＣ−１プラスミドを、使用前に、−２０℃にて、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、２ｍｇ／ｍＬの濃度で保存した。図１は、ＩＮＶＡＣ−１プラスミドマップを表す。
【００６８】
ＥＰ発生器および電極
電気的遺伝子導入を、Cliniporator（登録商標）（IGEA, Carpi, Italy）を用いて、ＨＶパルスおよびＬＶパルスを送出して行った。電圧は、２列の電極間の距離に応じて設定した。異なる種類の電極を使用した：（１）４ｍｍ間隔の４本２列の長針からなる侵襲性針電極（Ｎ−３０−４Ｂ、ＩＧＥＡ）、（２）４ｍｍ間隔の３本２列の短針からなる侵襲的なフィンガー電極（Ｆ−０５−ＯＲ、ＩＧＥＡ）、（３）厚さ１ｍｍおよび５ｍｍ間隔の２つの金属板からなる非侵襲的な平板電極（Ｐ３０−８Ｂ、ＩＧＥＡ）。
【００６９】
インビボ電気的遺伝子導入
マウスを、皮内注射（ＩＤ）の前に、２％イソフルラン／酸素混合ガス麻酔（Abbot, Suresnes, France）または２％キシラジン（Rompun, Bayer Sante, Loos, France）と８％ケタミン（Imalgen 1000, Merial, Lyon, France）の混合ＰＢＳ溶液（腹腔内経路）の何れかを個々の動物の重量に応じて用いて麻酔した。ＩＤ注入を、剃毛した後、２９Ｇのインスリンに特定の針を用いて脇腹の下部に行った（両側に注射）。ＨＬＡ−Ｂ７またはＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス系統の各動物は、１００μｇのＩＮＶＡＣ−１プラスミド（脇腹あたり２５μＬ ＰＢＳ中の５０μｇ）または１０μｇのｐＣＭＶ−ｌｕｃプラスミド（脇腹あたり２５μＬ ＰＢＳ中の５０μｇ）に相当する、ＤＮＡの単回投与を受けた。
【００７０】
ＩＤ注入直後に、電気的遺伝子導入を、１回のＨＶパルス（持続時間１００μｓ）、次いで１０００ｍｓ後に、１回のＬＶパルス（持続時間４００ｍｓ）を用いて行った。電極を、プラスミド注入により形成されたブレブ（bleb）を囲むように配置した。フィンガー電極または針電極の両方を、皮膚に約５ｍｍ押し込んだ。プレート電極には、導電性ゲル（Labo FH, gel de contact bleu, NM Medical, France）を金属板と皮膚との間の接触を確実にするために用いた。
【００７１】
インビボ生物発光イメージングおよび電気的導入局在
ｐＣＭＶ−ｌｕｃ電気的導入の２日後、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、１グラム重量あたり０．１５ｍｇの甲虫ルシフェリン（Promega, Lyon, France）を腹腔内注射した。注入の２０分後、動物を２％イソフルラン／酸素混合ガス麻酔を用いて麻酔し、ルシフェラーゼ駆動生物化学発光反応をインビボイメージングシステムＩＶＩＳ ５０（Xenogen, Waltham, USA）を用いて検出した。皮膚における電気的遺伝子導入を検証するために、３匹のマウスを、ルシフェリン注射の２０分後に頚椎脱臼により屠殺し、電気的に透過性にした皮膚領域を該動物から取り除いた。生物発光強度を、皮膚弁および下層の筋肉において評価した。
【００７２】
脾臓細胞調製
ＩＮＶＡＣ−１のＩＤ注入および電気的導入の１４日後、マウスを頚椎脱臼により屠殺し、脾臓を摘出した。滅菌条件下で、各脾臓を７０μｍナイロンメッシュ（cell strainer, BD Falcon Franklin Lakes, USA）に通し、完全ＲＰＭＩ培養培地（１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１％ピルビン酸ナトリウム、１％ペニシリン−ストレプトマイシンおよび０．１％β−メルカプトエタノールを添加した、Roswell Park Memorial Institute medium）で洗浄した。全ての試験材料をLife technologies SAS （Saint−Aubin, France）から購入した。脾臓細胞をフィコール勾配（リンパ球分離培地、Eurobio, Courtaboeuf, France）中で精製し、洗浄し、Cellometer（登録商標） Auto T4 Plus counter（Ozyme, Saint−Quentin−en−Yvelines, France）を用いて計数し、ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔアッセイで使用する前に、完全ＲＰＭＩ中２万個の細胞／ｍＬに調製した。
【００７３】
ＨＬＡ−Ｂ７およびＨ２制限ペプチド
ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２クラスＩ分子によって制限されるヒトＴＥＲＴ（ｈＴＥＲＴ）ペプチドは、既報である（Adotevi et al., 2006; Cortez−Gonzalez et al., 2006）。他のペプチドは、オンラインで利用可能な４つのアルゴリズム：Ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ（http://www.syfpeithi.de/）、Ｂｉｍａｓ（http://www−bimas.cit.nih.gov）、ＮｅｔＭＨＣｐａｎおよびＳＭＭ（http://tools.immuneepitope.org/main/）を使用して、マウスＭＨＣクラスＩ、Ｈ２Ｋｂ、Ｈ２Ｄｂを結合させるためにインシリコでのエピトープ予測により予測された。全ての合成ペプチドは、Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ（Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）から凍結乾燥物（＞９０％純度）で購入した。凍結乾燥されたペプチドを滅菌水に２ｍｇ／ｍＬで溶解し、使用前に、３５μＬアリコートで−２０℃にて保存した。Ｂ７またはＨ２制限によるペプチド配列の詳細は、以下に示す通りである：
Ｈ２制限ｈＴＥＲＴペプチド：
・Ｈ２Ｄｂ：ＲＰＩＶＮＭＤＹＶ（ｐ６６０）
・Ｈ２Ｋｂ：ＨＡＱＣＰＹＧＶＬ（ｐ４２９）
ＨＬＡ−Ｂ７制限ｈＴＥＲＴペプチド：
・ＨＬＡ−Ｂ７：ＲＰＳＬＴＧＡＲＲＬ（ｐ３５１）
・ＨＬＡ−Ｂ７：ＲＰＡＥＥＡＴＳＬ（ｐ２７７）
・ＨＬＡ−Ｂ７：ＬＰＳＤＦＫＴＩＬ（ｐ１１２３）。
【００７４】
ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
簡単には、ポリフッ化ビニリデンマイクロプレート（ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ ｋｉｔ、１０×９６試験、Diaclone、Eurobio）を、捕捉抗体（抗マウスＩＦＮγ）で一晩コーティングし、滅菌２％スキムミルクＰＢＳ溶液で２時間ブロッキングした。ＥＬＩＳｐｏｔプレートを洗浄し、脾臓細胞懸濁液を２×１０５細胞／ウェルで三重(triplicate)に播種した。その後、細胞を５μｇ／ｍＬ Ｈ２もしくはＢ７関連ペプチドまたは１０μｇ／ｍＬホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）−イオノマイシンもしくは無血清培地で刺激したモックで刺激した。プレートを、３７℃にて、５％ＣＯ２でインキュベートした。１９時間後、スポットを、ビオチン結合ＩＦＮγ検出抗体、次いでストレプトアビジン−アルカリホスファターゼおよび５−ブロモ−４−クロロ−３’−インドリルホスフェート ｐ−トルイジン塩／ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）基質溶液を用いて明らかにした。スポットを、Immunospot ELISpot 計数器およびソフトウェア（Cellular Technology Limited, Bonn, Germany）を用いて計数した。
【００７５】
統計分析とデータ処理
プリズム−５ソフトウェアを、データ処理、分析およびグラフ化のために使用した。生物発光およびＥＬＩＳｐｏｔアッセイの統計分析のために、ダンの多重比較検定と共にマン−ホイットニー−ウィルコクソン検定またはクラスカル・ウォリス検定のいずれかを、試験に応じて使用した。有意性は、ｐ値＜０．０５に設定した。
【００７６】
結果
電気的導入は、最適なインビボ導入遺伝子発現および抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の誘導を達成する。
ｐＣＭＶ−ｌｕｃまたはＩＮＶＡＣ−１プラスミドの何れかを、剃毛したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脇腹に皮内注射し、次いでＥＰ印加（１回のＨＶパルスを１０００Ｖ／ｃｍで１００μｓ間、その１０００ｍｓ後に、１回のＬＶパルスを１４０Ｖ／ｃｍで４００ｍｓ間）するか、またはしなかった。紅斑は、剃毛後も、電気的導入法中およびその後も観察されなかった。２つのパラメーターを電気的遺伝子導入後に測定した：ｐＣＭＶ−ｌｕｃのＩＤ電気的導入後のルシフェラーゼ発現およびＩＮＶＡＣ−１のＩＤ電気的導入後のＩＦＮγを分泌するｈＴＥＲＴ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数。ルシフェラーゼ発現（図２Ａ）およびＩＦＮγを分泌するｈＴＥＲＴ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞数（図２Ｂ）は、電気的導入なしにＤＮＡ注入のみを受容した動物と比較して、ＤＮＡ注入後にＥＰを直接適用したとき、有意に増加した（それぞれ、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．０５）。従って、電気的導入は、ＩＮＶＡＣ−１をＩＤワクチン接種後のｈＴＥＲＴ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答の有意なレベルおよびｐＣＭＶ−ｌｕｃのＩＤ注入後のルシフェラーゼ発現の有意なレベルを誘導する。
【００７７】
最適な遺伝子導入および強力な細胞性免疫応答の生成のための最良の電極の選択
異なる種の電極を、皮膚におけるインビボでの電気的導入に使用することができる（Gothelf ＆ Gehl, 2010）。従って、３種の異なる電極（平板電極、フィンガー電極および針電極、材料および方法の節に記載の通り）を、マウスにおける効率的な遺伝子導入および強い特異的細胞性免疫応答の生成に最適化どうかを決定するために試験した。その結果、該３種の電極は、ＥＰなしでプラスミドを受容した動物と比較して、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるｐＣＭＶ−ｌｕｃプラスミドの電気的導入を顕著に増強することが示された（図３Ａ）。しかしながら、平板電極で電気的導入したマウス群の応答に、より良好な均一性があった（ｐ＜０．００１）。より刺激を少なくするために、針電極で電気的導入した動物もまた、ルシフェラーゼ発現の顕著なレベルを示した（ｐ＜０．０５）。
【００７８】
同様の結果が、ＨＬＡ−Ｂ７マウスの免疫原性実験から得られた。マウスを、ＩＮＶＡＣ−１で皮内ワクチン接種し、その後、皮膚に電気的導入したとき、ＩＦＮγ＋特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の最も高い中央値が、平板電極を用いたときに検出され、この差は、ＰＢＳ対照群と比較して統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）（図３Ｂ）。
【００７９】
まとめると、平板電極は、ｐＣＭＶ−ｌｕｃの電気的導入およびｈＴＥＲＴ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の有意なレベルの生成の両方に最高の能力を示した。
【００８０】
ＩＤ注入、その後の電気的遺伝子導入後のルシフェラーゼの局在
電気的遺伝子導入は筋肉においてとても効率がよいことが知られている（Andre et al., 2008）。ルシフェラーゼ遺伝子が、ｐＣＭＶ−ｌｕｃのＩＤ注入後に皮膚に電気的にのみ導入されたことを確認するために、皮膚弁（flap skin）を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脇腹に処理部位で開き、該皮膚弁および下層の筋肉の両方の生物発光を、電気的遺伝子導入の４日後に測定した。平板電極を、この電気的遺伝子導入実験に使用した。本発明者らは、導入遺伝子の発現が皮膚のみで起こり、下層の筋肉では検出されなかった（図４）ことを確認した。
【００８１】
ＨＶパルスの選択
電気的パラメーターの第一の最適化は、以下の電界振幅のうちＨＶパルス（１００μｓの持続時間）の最も効率的な振幅を決定することにあった：６００、８００、１０００、１２００、１４００、１６００Ｖ／ｃｍ。ＬＶパルス（４００ｍｓの持続時間）の強度は、１４０Ｖ／ｃｍで一定に保たれ、ＨＶパルスとＬＶパルスとのラグタイムは１０００ｍｓに設定された。この評価は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子およびＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを用いて行った。
【００８２】
１２００Ｖ／ｃｍ、１４００Ｖ／ｃｍおよび１６００Ｖ／ｃｍで電気的導入したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、対照マウスと比較して、ルシフェラーゼ発現の最も顕著な増大を示した（ｐ＜０．００１）（図５）。特に、最高の中央値生物発光は、１４００Ｖ／ｃｍで処理した群で得られたものであり、他の群と比べて、この群の結果には優れた均質性があった。しかしながら、これらの３つの群、すなわち１２００、１４００および１６００Ｖ／ｃｍから得られた応答には統計的な差は認められなかった。
【００８３】
最良のＨＶ−ＬＶパルスの組み合わせの選択
ＨＶ−ＬＶの組み合わせの影響は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの皮膚にＩＤ注入後の、ｐＣＭＶ−ｌｕｃ電気的導入およびＩＮＶＡＣ−１により誘導された特異的細胞性免疫応答の両方で評価した。ＨＶパルスについて、１０００Ｖ／ｃｍまたは１４００Ｖ／ｃｍを、種々のＬＶパルスと組み合わせるために選択した。ｐＣＭＶ−ｌｕｃまたはＩＮＶＡＣ−１のＩＤ注入直後の、１０００Ｖ／ｃｍまたは１４００Ｖ／ｃｍでの１回のＨＶパルス（１００μｓの持続時間）を適用し、その後、６０Ｖ／ｃｍ、１００Ｖ／ｃｍ、１４０Ｖ／ｃｍ、１８０Ｖ／ｃｍまたは２２０Ｖ／ｃｍのいずれかでの１回のＬＶパルス（４００ｍｓの持続時間）を適用した。１０回のＨＶ−ＬＶパルスの組み合わせを“Ｐ１”から“Ｐ１０”と称した（表１）。
【００８４】
【表１】
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【００８５】
技術的な制限により、Cliniporator（登録商標）は、常に２２０Ｖ／ｃｍ、４００ｍｓの持続時間で送達することができなかった。従って、得られた結果は、Ｐ５およびＰ１０条件を用いるとき、信頼性のあるデータを生成せず、データ分析について除外された。
【００８６】
最高の中央値生物発光強度を生成したＨＶ−ＬＶパルスの３つの組み合わせは、Ｐ４、Ｐ８およびＰ９であった（図６Ａ）。これらの３つの組み合わせの全てが、ＥＰなしでｐＣＭＶ−ｌｕｃ注入単独と比較した場合、顕著に高い統計的な差を示した（ｐ＜０．００１）。特に、Ｐ９は、最高の中央値の生物発光強度を示し、最小の生物発光強度の最高値および最低の分散を示した。
【００８７】
Ｐ４、Ｐ８およびＰ９ ＨＶ−ＬＶパルスの組み合わせは、その後、ＩＮＶＡＣ−１のＩＤワクチン接種について試験した。これらの群のｈＴＥＲＴ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答の強度を、皮下組織へのＤＮＡの電気的導入について既報のＰ３組合せと比較した（Andre et al., 2008）。免疫原性アッセイからのデータを分析するとき、Ｐ８およびＰ９組合せが、対照マウスと比較して、ＩＦＮγ＋特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の有意な細胞数の生成を可能にする、最高の組合せであることが明らかであった（それぞれ、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１）（図６Ｂ）。Ｐ８群とＰ９群との間の差は統計的に有意ではなかったにもかかわらず、Ｐ９は、ｈＴＥＲＴ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞のより高い中央値を示した。
【００８８】
生物発光および免疫原性データ分析により、最良のＨＶ−ＬＶパルスの組み合わせは、Ｐ９、すなわち、１４００Ｖ／ｃｍでの１回のＨＶパルス（１００μｓの持続時間）、その後の１８０Ｖ／ｃｍでの１回のＬＶパルス（４００ｍｓの持続時間）であることが明らかであった。
【００８９】
結論
本試験において、インビボでの真皮へのルシフェラーゼ電気的遺伝子導入およびテロメラーゼベースのＩＤワクチン接種の両方法を最適化した。１００μｓの持続時間の１回の高電圧パルス、その後の４００ｍｓの持続時間の１回の低電圧パルスを送達する非侵襲性の平板電極は、最高レベルのルシフェラーゼ発現および最高のテロメラーゼ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞数の両方を示す。このテロメラーゼＤＮＡワクチンで生成された結果は、腫瘍抗原、またはウイルスもしくは細菌抗原であるべきである、抗原の電気的導入技術を独立して使用して、グローバルなＤＮＡワクチン接種法を設定することができる。
【００９０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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