(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸が幹細胞に導入され、その結果として該幹細胞がTBX3またはTBX18転写因子を発現するか、またはTBX3タンパク質またはTBX18タンパク質が幹細胞に導入される、幹細胞から洞房結節細胞を作製する方法であって、α-MHC（MYH6）プロモーターにより制御される抗生物質耐性遺伝子の発現のための構築物が追加的に導入され、かつ得られる幹細胞が抗生物質の存在下にて分化する、上記方法。
【請求項２】
洞房結節細胞が、得られる心筋細胞のサブタイプに基づいて、60％超の高い純度で取得される、請求項1に記載の幹細胞から洞房結節細胞を作製する方法。
【請求項３】
洞房結節細胞が、得られる心筋細胞のサブタイプに基づいて、70％超の高い純度で取得される、請求項2に記載の幹細胞から洞房結節細胞を作製する方法。
【請求項４】
洞房結節細胞が、得られる心筋細胞のサブタイプに基づいて、80％超の高い純度で取得される、請求項2または3に記載の幹細胞から洞房結節細胞を作製する方法。
【請求項５】
多分化性（multipotent）または多能性（pluripotent）幹細胞が用いられる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の幹細胞から洞房結節細胞を作製する方法。
【請求項６】
非ヒト胚性幹細胞または非ヒト誘導型多能性幹細胞もしくはヒト誘導型多能性幹細胞または単為生殖幹細胞もしくは精原幹細胞が用いられる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の幹細胞から洞房結節細胞を作製する方法。
【請求項７】
核酸が、TBX3 DNA、TBX18 DNA；TBX3 RNA、およびTBX18 RNAから選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の幹細胞から洞房結節細胞を作製する方法。
【請求項８】
TBX3 RNAまたはTBX18 RNAがそれぞれTBX3 mRNAまたはTBX18 mRNAである、請求項7に記載の幹細胞から洞房結節細胞を作製する方法。
【請求項９】
TBX3核酸またはTBX18核酸の導入が、発現ベクターまたは過剰発現ベクターを用いて達成される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の幹細胞から洞房結節細胞を作製する方法。
【請求項１０】
抗生物質耐性遺伝子が、アミノグリコシド系抗生物質耐性遺伝子から選択され；かつ抗生物質が、アミノグリコシド系抗生物質から対応して選択される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の幹細胞から洞房結節細胞を作製する方法。
【請求項１１】
抗生物質耐性遺伝子が、ネオマイシンおよびピューロマイシン耐性遺伝子から選択される、請求項10に記載の幹細胞から洞房結節細胞を作製する方法。
【請求項１２】
抗生物質耐性遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子である、請求項10または11に記載の幹細胞から洞房結節細胞を作製する方法。
【請求項１３】
抗生物質が、ネオマイシンおよびピューロマイシンから選択される、請求項10〜12のいずれか1項に記載の幹細胞から洞房結節細胞を作製する方法。
【請求項１４】
医薬品のin vitro評価のための、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法により幹細胞からin vitroで作製される洞房結節細胞の使用。
【請求項１５】
心筋組織構造体の構築および/または心臓組織の生長のための医薬の製造のための、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法により幹細胞からin vitroで作製される洞房結節細胞の使用。
【請求項１６】
細胞ベースの生物学的心臓ペースメーカーの製造のための、請求項15に記載の幹細胞からin vitroで作製される洞房結節細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
幹細胞からの洞房結節細胞（ペースメーカー細胞）の作製方法および作製された洞房結節細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
「洞不全症候群」との用語は、心臓のペースメーカーである洞房結節の機能破壊により引き起こされる一連の障害を説明するための総称として用いられる。構造に関して、これは、自律神経系により支配される特殊化した心筋細胞から形成される。この障害には、病的症候性洞性除脈、SAブロック（SA＝洞房）、洞停止および頻脈・徐脈症候群が含まれる。
【０００３】
洞不全症候群は、しばしば、虚血性心疾患、心筋症または心筋炎などの一般的な心臓障害に付随する。これらにより、洞房結節内での活動電位の形成障害または心房への洞房結節からの電気的パルスの伝達障害（後者は「洞房伝達障害」と称される）のいずれかが引き起こされる。現在では、「洞不全症候群」に対する治療的手段は、極めて高額かつホルモン刺激に対する感受性を有しない人工ペースメーカーの埋め込みに基づく。追加の因子は、感染および早すぎる電池放電により生じるリスクが重大な制限をもたらすことである。つまり、ペースメーカーを埋め込まれた患者は、一般的に、彼らの残りの人生での、重篤な合併症の高いリスクの対象となる。
【０００４】
これらの欠点は、移植片に対する機能的SA結節細胞（同義語：洞房結節細胞、結節細胞（node cell）、心臓ペースメーカー細胞）の利用可能性によるか、またはin vivoでのそれらの新規（de novo）生成により、回避することができるであろう。結節細胞は、それらの低い膜電位、拡張期脱分極および低い立ち上がり速度を特徴とする。数種類の異なるイオン電流が、拡張期脱分極およびSA結節での活動電位に関与し、それには、ペースメーカー電流Ifが含まれる。この電流は、環状ヌクレオチドにより調節されるHCNチャネルにより伝わる。HCNチャネル中のcAMP結合部位はカテコールアミンによる活性化の調節を可能にし、この特性は、ペースメーカー機構の自立的調節を制御できるであろう［1］。HCN1〜HCN4と称されるチャネルのアイソフォームは、4つの遺伝子によりコードされる。SA結節での圧倒的に優勢なアイソフォームは、HCN4である［2］［3］。
【０００５】
将来の治療のための生物学的ペースメーカー細胞を取得するために、2つのアプローチが進められている：
【０００６】
・一方では、目的は、心臓ペースメーカー細胞に対する遺伝学的操作によって、その場（in situ）で拍動する心筋細胞に変換することである（「直接的再プログラミング」）。これに関して、基本的初期転写因子であるTBX3が、不完全なペースメーカー特性を有する細胞をもたらした［4］。最近、同じ転写因子ファミリーのメンバーであるTbx18のウイルス過剰発現が、洞房結節細胞に対する心室筋の再プログラミングを可能にしたことが報告された［5］。しかしながら、この手法はウイルスベクターを必要とし、これは発生中の胚のin vivo状態のシミュレーションのための再プログラミング因子の空間的および時間的に調節可能な発現を妨げる。さらに、効率が非常に低かった［5］。また、Tbx18は発達中の洞房結節の頭部（head portion）で一時的にしか発現されない一方で、直接的再プログラミングと比較して、制御された分化のためにここで（すなわち、本発明のアプローチで）用いられるTbx3因子は、洞房結節全体でin vivoにて恒久的に発現される［6］。
【０００７】
・さらなるアプローチは、胚性幹細胞（ESCまたはES細胞）または誘導型多能性幹細胞（iPSC）などの多能性幹細胞（幹細胞＝S細胞またはSC）から取得された、in vitroで作製された「生物学的ペースメーカー」の移植に基づく［7］［8］。これに関して、低分子化合物EBIOが、ある程度までは、ネズミES細胞からの結節細胞の形成を強化することが主張されている［9］。しかしながら、刊行物は、心室筋細胞を刺激する該細胞の実際の能力は検討しておらず、該細胞の拍動頻度は同様に低かった（低すぎた）。また、電気生理学レベルでは、比較的成熟したペースメーカー細胞と、同様に自発的に収縮する初期/中期細胞タイプとの間に差異はなかった［9］［10］［11］。
【０００８】
洞房結節細胞が、Alcam発現（CD166）の検出によって精製された細胞集団から生じ得ることが、最近報告されている。しかしながら、生物種間で表面マーカーの特異性は保存されていないことがしばしばあるので、ヒト系への適用可能性はここでは明らかでない［12］。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、幹細胞からin vitroにて高収率で取得された、改善されたペースメーカー特性を有する心臓ペースメーカー細胞（洞房結節細胞）を提供することが、本発明の目的であった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この目的は、請求項1にて特許請求される通りの方法により達成された。さらなる好ましい実施形態が、従属項に開示される。言い換えれば、この目的は、幹細胞から洞房結節細胞（「心臓ペースメーカー細胞」）を作製する方法により達成され、該方法では、核酸が幹細胞に導入され、その結果として該幹細胞がTBX転写因子を発現するか、またはTBXタンパク質が幹細胞に導入され、このとき、該方法は、αMHC（MYH6）プロモーターにより制御される抗生物質耐性遺伝子の発現のための構築物が追加で導入され、結果として生じる幹細胞が抗生物質の存在下で分化することを特徴とする。「結果として生じる幹細胞」とは、TBX（核酸またはタンパク質）および構築物の両方を含む幹細胞を意味する。
【００１１】
これは、個々の転写因子によって特異的な心筋細胞サブタイプをもたらすために、本発明者らにより最近導入されたES細胞の制御された分化の、さらに発展した代替物のタイプを構成する［13］［14］［11］。これまでは、他のサブタイプに焦点が当たっていたので、これは「代替物のタイプ」である。
【００１２】
TBX、特にTBX3に対する、この手順、すなわち、個々の転写因子による制御された分化の適用により、これが既に、機能的ペースメーカー細胞の倍増をもたらすことが示されている。しかしながら、これらの細胞の純粋な集団を取得するためには、これは未だ不十分である。このことは、TBX3が単一因子として機能的再プログラミングを達成できないことと相関する［4］。
【００１３】
したがって、本発明では、方法が、Myh6プロモーターに基づく抗生物質選択と組み合わせられた［15］。これにより、自発的に拍動する心筋細胞（KM細胞）のみからなり、初めて、（ネズミ）心臓のものと近い拍動頻度を有する細胞凝集塊が提供された。
【００１４】
これらの細胞のうち、60％超、特に70％超、最も好ましくは80％超が、タンパク質発現、電気生理学的パラメータおよびCa2+トランジェント（Ca2+transient）、ならびにまた心筋培養物、特にネズミ心筋培養物の安定的ex vivo刺激に対するその効力のレベルでの完全な機能性を有する、所望のタイプのペースメーカー細胞（生成される心筋細胞サブタイプに基づく）を示した。一部の文献は既に60％の収率に言及しているが、初期/中期細胞と分化したペースメーカー細胞との間で差異がなかったことについては言及していない。前者もまた、心臓ペースメーカー細胞と同様に、自発的に拍動するが、それ以外では異なる性質を有し、この性質が、これらを心臓ペースメーカー細胞としては不適切にする（すなわち、それらは分化の開始時にあり、すべてのサブタイプに（すなわち、ペースメーカー細胞だけでなく、心房細胞および心室細胞にも）未だになることができる/なるであろう）。
【００１５】
「誘導型洞房体」（induced sinoatrial body；iSAB）とも称される、本発明に従って取得される細胞または細胞凝集塊は、さらに、RNA配列決定（RNA-seq）を用いてその全部のmRNA発現パターンに関して分析され、これにより結果が確認された。つまり、本発明は、幹細胞から誘導されたペースメーカー細胞の高度に富化された集団を生じ、これらはこの細胞タイプの特徴であるすべての特性を有し、将来の細胞療法および医薬品のin vitro評価に対して大きな意義を有するであろう。
【００１６】
TBX転写因子の発現のために幹細胞へと核酸が導入される場合、これは好ましくは、TBX DNA、特にTBX cDNA；またはTBX RNA、特にTBX mRNAから選択される。RNAの文脈では、安定的な遺伝子改変は生じないが、TBX mRNAを幹細胞にトランスフェクションすることができる。あるいは、内在性TBXの発現をもたらすマイクロRNAを導入することができる。核酸導入の好ましい実施形態では、TBX DNA、特にTBX cDNAは、ベクターを用いて、特に（過剰）発現ベクターを用いて導入される。TBXは好ましくは、TBX3またはTBX18から選択され、TBX3が特に好ましく、TBX3 cDNAが最も好ましい。言い換えれば、最も好ましい変法は、過剰発現ベクターを用いるTBX3 cDNAの導入である。同様に（安定的な）遺伝子改変を引き起こさないTBXタンパク質に関しては、TBX3が好ましい。
【００１７】
ヒトもしくは非ヒト核酸またはタンパク質が用いられ、ヒト起源のものが好ましい。
【００１８】
用いる幹細胞に関して、多分化性（multipotent）または多能性（pluripotent）幹細胞、好ましくは多能性（pluripotent）幹細胞が用いられる。幹細胞は、ヒトもしくは非ヒト胚性幹細胞またはヒトもしくは非ヒト誘導型幹細胞またはヒト誘導型幹細胞または単為生殖幹細胞もしくは精原幹細胞から選択することができる。これらは、好ましくは非ヒト胚性幹細胞または非ヒト誘導型幹細胞もしくはヒト誘導型幹細胞または単為生殖幹細胞もしくは精原幹細胞であり、より好ましくは非ヒト胚性幹細胞または非ヒト誘導型幹細胞もしくはヒト誘導型幹細胞である。ヒト胚性幹細胞は、好ましい変法および特に好ましい変法からは明確に除外される。
【００１９】
Myh6プロモーターに基づく本発明の抗生物質選択は、好ましくは、アミノグリコシド系抗生物質耐性遺伝子から、より好ましくはネオマイシンおよびピューロマイシン耐性遺伝子から選択され、最も好ましくはネオマイシン耐性遺伝子である抗生物質耐性遺伝子を利用する。選択のために用いられる抗生物質は、アミノグリコシド系抗生物質から、特にネオマイシンおよびピューロマイシンから、対応して選択される。「対応して選択される」とは、常に、用いられる耐性遺伝子に対応する抗生物質であること；例えば、ネオマイシン耐性遺伝子の場合には、ネオマイシンを用いたその後の選択がなされることを意味する。
【００２０】
それぞれの場合に生成されるものは心臓ペースメーカー細胞（ヒトまたは非ヒト）であり、ヒト心臓ペースメーカー細胞が好ましい。この目的のために、ヒト幹細胞は、好ましくはヒトタンパク質またはヒト核酸と組み合わせられる。交雑組み合わせ、例えば、非ヒト（例えば、ネズミ）幹細胞へのヒトタンパク質またはヒト核酸の導入は、非ヒト心臓ペースメーカー細胞の作製のための非ヒト代表物の純粋組み合わせと同様に可能である。
【００２１】
本明細書中、下記で詳細に明らかになるであろう通り、幹細胞からin vitroで作製された本発明の洞房結節細胞（短縮形でも同義：発明的洞房結節細胞または幹細胞から本発明に従って作製された洞房結節細胞）は、薬剤と接触した場合に、予測された挙動を示し、例えば、HCNチャネル遮断薬であるZD-7288およびムスカリン性受容体拮抗薬カルバコールは、拍動頻度の著明な減少を引き起こす。β-アドレナリン受容体作動薬であるイソプロテネロールの投与は、対照的に、拍動頻度の増大をもたらす。幹細胞から作製された本発明の洞房結節細胞は、in vivoでの洞房結節細胞とまったく同じ様式で、投与された薬剤に対して反応したので、それらは、正常洞房結節細胞に対するモデルとして好適である。したがって、幹細胞からin vitroで作製された洞房結節細胞、特に幹細胞から（in vitroで）本発明に従って作製された洞房結節細胞は、とりわけ医薬品のin vitro評価のためにも用いることができる。これは、そのような実際の好適性に関する活性成分（すなわち、潜在的な医薬品）の研究（「in vitro薬物試験」）と同義であることが理解される。新規医薬品のための潜在的な候補は、それらが医薬品当局により販売承認を受ける前に、その品質、安全性および有効性について義務的な前臨床試験および臨床試験で試験されなければならない。生化学的および化学情報学的前臨床試験は、これまで、in vivoで新規活性成分がどのような挙動を示すかに関していかなる最終的な確実性も与えていないので、新規活性成分は、大規模な動物実験を必須としてきた前臨床試験で試験されなければならない。幹細胞からin vitroで作製された洞房結節細胞、特に本発明の洞房結節細胞の使用は、少なくとも動物実験の程度の低減を助けることができる。細胞ベースのin vitroアッセイもまた、これらの本質的性状がin vivo薬物学および毒性学を反映し得るという事実を理由に、活性成分候補に対する探索および毒性の研究で用いることができるので、初期の前臨床段階で、幹細胞からin vitroで作製された洞房結節細胞、特に本発明の洞房結節細胞を用いることが同様に可能である。
【００２２】
幹細胞からin vitroで作製された洞房結節細胞、特に幹細胞から本発明に従って作製された洞房結節細胞は、心臓組織の構築、および/または心筋組織の生長のために、特に実行目的で、しかしまたin vivoでの新規（de novo）生成のためにも、用いることができる。より詳細には、ここでの焦点は、細胞ベースの生物学的心臓ペースメーカーの生成に当てられている。
【００２３】
本発明の元になる研究が、本明細書中、下記で詳細に提示される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】ES細胞でのTBX3過剰発現構築物の機能性を示す図である。(A) ヒトTBX3 cDNAを含む過剰発現構築物を用いて安定的にトランスフェクトされた20の個別の細胞クローンを示す。
【図１Ｂ】ES細胞でのTBX3過剰発現構築物の機能性を示す図である。(B) 4つの選択されたクローンでの過剰発現されたTBX3およびアクチンの免疫染色が、TBX3の過剰発現レベルを確認する。
【図１Ｃ】ES細胞でのTBX3過剰発現構築物の機能性を示す図である。(C) Oct-4/Pou5f1およびSox2のFACS分析は、LIFの添加による多能性に対するTBX3過剰発現のいかなる影響も示さなかった（データは平均値±SEMとして報告される；n＝5）。
【図２Ａ】Tbx3分化型ES細胞でのペースメーカー型心筋細胞の優位な出現を示す図である。(A) 個別のTBX3クローンおよびES対照細胞（GSES）での自発的拍動活性（spontaneous bead activity）の増大を示す図である（データは平均値±SEMとして報告される；n＞100）。
【図２Ｂ】Tbx3分化型ES細胞でのペースメーカー型心筋細胞の優位な出現を示す図である。(B) 対照およびTBX3過剰発現心筋細胞でのMyh6発現の共焦点分析。アクチンおよび細胞核の対比染色。スケール：10μm。
【図２Ｃ】Tbx3分化型ES細胞でのペースメーカー型心筋細胞の優位な出現を示す図である。(C) 心筋細胞サブタイプの分布であり、Ventr.：心室（23.1％）；Atr.：心房（8％）；Pace.：洞房結節様（38.5％）；Interm.：中期/初期型（38.8％）。水平バー：100ms；垂直バー：20mV。
【図２Ｄ】Tbx3分化型ES細胞でのペースメーカー型心筋細胞の優位な出現を示す図である。(D) HCN4発現細胞が、18日目にTBX3クローンで有意に増大していた（データは平均値±SDとして報告される；n＝5）。
【図３Ａ】Tbx3分化およびMyh6プロモーター選択の組み合わせにより取得されるペースメーカー型心筋細胞の生理学的パラメータを示す図である。(A) Myh6-ネオマイシン対照およびMyh6-TBX3細胞の異なる処理レジメン後の、時間に対する拍動頻度を示す。
【図３Ｂ】Tbx3分化およびMyh6プロモーター選択の組み合わせにより取得されるペースメーカー型心筋細胞の生理学的パラメータを示す図である。(B) iSABでのHCN4（左側領域）、Cx45（中央領域）およびCx30.2（右側領域）の発現。アクチンおよび細胞核の対比染色を示す。スケール：10μm。
【図３Ｃ】Tbx3分化およびMyh6プロモーター選択の組み合わせにより取得されるペースメーカー型心筋細胞の生理学的パラメータを示す図である。(C) iSABの播種により取得される同期細胞層中の洞房結節細胞の典型的な細長い細胞形状を示す。スケール：10μm。
【図３Ｄ】Tbx3分化およびMyh6プロモーター選択の組み合わせにより取得されるペースメーカー型心筋細胞の生理学的パラメータを示す図である。(D) 単一細胞パッチクランプおよびファニーチャネル測定から明らかであるペースメーカー細胞の分布：81％超のペースメーカー型細胞が取得された。そのうち、19％が未成熟ペースメーカー細胞であり、それ以外は成熟ペースメーカー細胞であった；n＝65。
【図３Ｅ】Tbx3分化およびMyh6プロモーター選択の組み合わせにより取得されるペースメーカー型心筋細胞の生理学的パラメータを示す図である。(E) Myh6-TBX3細胞での自発的Ca2+トランジェントの頻度は、ZD7288によるHCNチャネルの阻害後に有意に低下する（データは平均値±SEMとして報告される；n≧7）。
【図３Ｆ】Tbx3分化およびMyh6プロモーター選択の組み合わせにより取得されるペースメーカー型心筋細胞の生理学的パラメータを示す図である。(F) Myh6-TBX3細胞での自発的Ca2+トランジェントの頻度は、ミベフラジル（mibefradil）およびニフェジピンによるT型およびL型Ca2+チャネルの阻害後に低下する（データは平均値±SEMとして報告される；n＞12）。
【図３Ｇ】Tbx3分化およびMyh6プロモーター選択の組み合わせにより取得されるペースメーカー型心筋細胞の生理学的パラメータを示す図である。(G) iSABおよびaCaB由来細胞での添加前および10mMカフェインの存在下での自発的Ca2+トランジェント。前者の細胞でのカフェイン誘導性ピークの振幅は、自発的Ca2+トランジェントの最大値に匹敵する。n≧8。
【図３Ｈ】Tbx3分化およびMyh6プロモーター選択の組み合わせにより取得されるペースメーカー型心筋細胞の生理学的パラメータを示す図である。(H) タプシガルギンによるSRへのCa2+取り込みの遮断は、aCab由来細胞とは対照的に、iSAB由来細胞での拡張期Ca2+レベルの増加をもたらす。n≧11。
【図３Ｉ】Tbx3分化およびMyh6プロモーター選択の組み合わせにより取得されるペースメーカー型心筋細胞の生理学的パラメータを示す図である。(I) Na+/Ca2+交換体の遮断および筋線維鞘Ca2+チャネルの遮断の前後でのCa2+トランジェント：iSAB由来細胞では、EB由来の対照細胞とは対照的に、大きなカフェインピークが観察される。n＞16。
【図３Ｊ】Tbx3分化およびMyh6プロモーター選択の組み合わせにより取得されるペースメーカー型心筋細胞の生理学的パラメータを示す図である。(J) Ca2+取り込み阻害の前後でのCa2+トランジェント：Na+/Ca2+交換体の阻害＋SERCA阻害は、aCaB由来細胞とは対照的に、iSAB由来細胞での細胞内Ca2+の迅速な増加を引き起こす。
【図３Ｋ】Tbx3分化およびMyh6プロモーター選択の組み合わせにより取得されるペースメーカー型心筋細胞の生理学的パラメータを示す図である。(K) ペースメーカーとして活性である細胞の特徴であるSR Ca2+流出の分析により、aCaBと比較してiSAB由来細胞での細胞内Ca2+の蓄積速度の増加が示される。
【図４Ａ】培養ネズミ心室スライスのex vivoモデルでのiSABの機能性を示す図である。(A) 5日間培養された心室スライス（左側領域）および生存性をチェックするためのMTT染色（右側領域）。
【図４Ｂ】培養ネズミ心室スライスのex vivoモデルでのiSABの機能性を示す図である。(B) スライス上に播種されたDiI標識iSABの同定（右側領域：重ね合わせ）。
【図４Ｃ】培養ネズミ心室スライスのex vivoモデルでのiSABの機能性を示す図である。(C) 経時的な、少なくとも1箇所の収縮領域を含むiSAB播種、aCaB播種および未播種スライスの分布割合（％）。
【図４Ｄ】培養ネズミ心室スライスのex vivoモデルでのiSABの機能性を示す図である。(D) 経時的な、iSAB播種、aCaB播種および未播種スライス1枚当たりの活動性領域の平均数（データは平均値±SEM（MW SEM）として報告される；n≧15）。
【図４Ｅ】培養ネズミ心室スライスのex vivoモデルでのiSABの機能性を示す図である。(E) 1日目から4日目までのiSABを播種されたスライスの拍動頻度の増加（データは平均値±SEM（MW SEM）として報告される；n≧16）。
【図４Ｆ】培養ネズミ心室スライスのex vivoモデルでのiSABの機能性を示す図である。(F) 経時的な、レシピエントスライスへのiSABからのカルセイン色素の移動［スケール：200μm；「h」：時間；「d」：日］。
【図４Ｇ】培養ネズミ心室スライスのex vivoモデルでのiSABの機能性を示す図である。(G) iSAB（矢印）の即時環境でのスライス領域（矢印）の刺激は、高度に同期的なCa2+トランジェントにより達成される。
【図５Ａ】RNA配列決定（RNA-seq）により決定されるiSABのトランスクリプトーム状態を示す図である。(A) 対照と比較してiSABでは、生物学的プロセスを記述する82個の遺伝子オントロジーが、220種類のアップレギュレーションされた遺伝子を含む。
【図５Ｂ】RNA配列決定（RNA-seq）により決定されるiSABのトランスクリプトーム状態を示す図である。(B) 心臓/筋肉機能および心臓発生に関連するオントロジー群のクラスターが優勢である。
【図５Ｃ】RNA配列決定（RNA-seq）により決定されるiSABのトランスクリプトーム状態を示す図である。(C) 生物学的プロセスに関連する遺伝子オントロジーの統合ネットワーク。
【図５Ｄ】RNA配列決定（RNA-seq）により決定されるiSABのトランスクリプトーム状態を示す図である。(D) 対照と比較してiSABでは、細胞構成要素を記述する34種類の遺伝子オントロジーが、220種類のアップレギュレーションされた遺伝子を含む。
【図５Ｅ】RNA配列決定（RNA-seq）により決定されるiSABのトランスクリプトーム状態を示す図である。(E) 収縮性細胞に典型的な構造に関連するオントロジー群のものが優勢である。
【図５Ｆ】RNA配列決定（RNA-seq）により決定されるiSABのトランスクリプトーム状態を示す図である。(F) 細胞構成要素に関連する遺伝子オントロジーの統合ネットワーク。
【図６】Tbx3プログラム細胞から得られる代表的活動電位を示す図である。(A)(B) (A)心室型および(B)心房型活動電位を有する心筋タイプ。(C)(D) (C)成熟洞房結節型活動電位および(D) ネズミ胎児心臓の中期型細胞と称される若干未成熟なペースメーカー型細胞。水平時間軸：100ms。
【図７】iSAB心筋細胞から得られる代表的活動電位を示す図である。(A) 完全に生長したネズミ洞房結節細胞から生成される活動電位に類似するペースメーカー型活動電位。(B) 若干未成熟なペースメーカー型細胞により生成される活動電位。水平時間軸：100ms。
【図８】単離されたiSAB細胞由来のIfプロットを示す図である。(A) パッチクランププロトコール；過分極により活性化される電流を引き起こすために印加される電圧。(B) iSAB由来の単離細胞から記録されたIf電流の例。(C)(D) HCN4チャネルサブタイプおよび成熟洞房結節Ifに典型的な遅い活性化動態を有する堅牢なIf発現を示す、−130mVでの活性化の(C)電流密度および(D)時定数。n＝17；エラーバー：平均値±SD。
【図９】単離されたTbx3プログラム細胞およびiSAB由来細胞の活動電位(AP)速度の調節を示す図である。β-アドレナリン性（イソプロテネロール）およびムスカリン性（カルバコール）刺激に対する反応は、典型的な加速型vs.減速型AP速度をもたらす。iSAB由来細胞は、最大で560bpmまでの範囲の拍動頻度を有する、イソプロテネロールへのより明らかな応答を示す。iSAB/iso：n＝9；iSAB/carb：n＝5；エラーバー：平均値±SD。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
安定的にTBX3を過剰発現するES細胞株の作製
脊椎動物でのTBX3タンパク質の高度な保存に基づいて、ここでのその特異的検出可能性が高いので、ヒトTBX3をネズミES細胞へと挿入した。ES細胞での過剰発現のために、ヒトTBX3-cDNAをpEF-DEST51（Invitrogen社）へと挿入した。20の個別クローンから、TBX3 mRNA過剰発現の低い程度から高い程度までのすべてのスペクトルを代表する4つのクローンを、qRT-PCRからの結果に基づいて選択した（図1A）。この過剰発現レベルを、タンパク質レベルで確認した（図1B）。FACS分析では、多能性マーカーであるOct-4/Pou5f1陽性およびSox2陽性細胞の割合（％）に対するTBX3過剰発現の影響に関するいかなる示唆も見出されなかった（図1C）。このことは、LIF含有培地での正常な未分化型コロニー増殖に対応し（図1B）、MESP1およびNKX2-5過剰発現に対して以前に得られた結果と合致する［13］［14］［11］。このことから、これらの因子に類似して、TBX3単独では、ES細胞の分化を誘導する能力を有しないことが結論付けられた。
【００２６】
ES細胞由来の自発的に拍動する心筋細胞の収率およびサブタイプに対するTBX3過剰発現の影響
高度から中程度のTBX3過剰発現を有するES細胞クローンは、分化中の早期に収縮し始め、約5〜10倍の収縮領域の数を示した（図2A）。この心筋分化の増大は、本発明者らにより最近記載されたMESP1およびNKX2-5過剰発現の効果と似通っている［13］［14］［11］。それらの強化された拍動活性と一致して、TBX3過剰発現心筋細胞は、サルコメアマーカーであるMyh6の正常な発現パターンを示した（図2B）。
【００２７】
機能性のさらなる検証および心筋細胞のサブタイプの比率の決定のために、電気生理学的特性を、記載された通りに［13］［14］［16］、分化18日目での単一細胞パッチクランプ技術およびHCN（またはファニー（funny））チャネルの密度の測定により分析した。
【００２８】
一般的に言って、EB発達中に得られる単離された拍動性心筋細胞の記載されたすべてのサブタイプ、つまり心室、心房およびSA/AV（ペースメーカー型）細胞、ならびにまた初期/中期細胞が、TBX3細胞クローンの調製物中に存在する（図2C；追加表1）。異なる細胞タイプにより生成される活動電位は、それらの個々のパラメータ（例えば、MDP、DDR、立ち上がり速度およびAPプラトー相の持続時間）に関して、またはβ-アドレナリン性（イソプロテレノール）もしくはムスカリン性（カルバコール）刺激に対するその反応に関して、TBX3細胞と対照細胞との間では顕著には異ならず、このことは、心筋細胞の適正な発達の仮定を支持する（図2C；追加表1）。しかしながら、並外れて高い比率のペースメーカー型サブタイプがTBX3過剰発現細胞で見出され、これはすべての心筋細胞の38.5％を占めた。これらの細胞はプラトー相を有さず、高密度のファニーチャネル（If）および−60mV超の正のMDPを有し、通常は60mV/sを超える最高DDR値を示した。対照的に、それらは、最も遅い立ち上がり速度および最も速い脱分極速度（＜5V/s）および最大で＋10mVの最小の正のオーバーシュートを有した。また、SA/AV細胞は、イソプロテレノールに対して予測された通りに反応し、これがAP速度での加速をもたらした。TBX3により選択的に分化させられた心筋細胞でのペースメーカー細胞の高い割合に従って、「ファニーチャネル」に対応するHCN4チャネルを発現する細胞数が増大した（図2D）。
【００２９】
TBX3を用いた制御された分化によって得られたSA/AVサブタイプの収率をさらに増大させるために、この方法をMyh6プロモーターに基づく抗生物質選択と組み合わせる試みが行なわれ［15］、これは、40％以下の非常に不満足な収率ではあるが、後者の方法が特にペースメーカー細胞を富化することが最近報告されたからである［17］［18］。
【００３０】
この目的のために、Myh6-ネオマイシンカセット［15］を保持するプラスミドを、TBX3クローンに追加的に挿入した。分化中の抗生物質（ネオマイシン）の投与は、予測された通りに、Myh6プロモーター支援抗生物質選択（しかしTbx3は用いずに）により得られた対照細胞での拍動性組織の富化をもたらし、これは抗生物質選択心臓体（antibiotic-selected cardiac body）（「aCaB」）と称された。同様に、二重トランスジェニックMyh6-TBX3クローンは、自発的に収縮する領域に関して富化された。しかしながら、後者の場合には、対応する拍動性細胞の拍動数は、ほとんど二倍であった（図3A）。追加の解離ステップの導入後、拍動数のさらなる上昇が、抗生物質選択Myh6プロモーター対照細胞および二重トランスジェニックMyh6-TBX3細胞クローンの両方で得られた。後者の細胞の場合には、初めて、300〜400bpmで収縮する細胞凝集塊が得られ、これはネズミ心臓の拍動頻度（約500bpm）に近く、「誘導型洞房結節体」（iSAB）の形成を示唆する（図3A）。iSAB内の細胞は、HCN4に関して、ならびにコネキシンCx45およびCx30.2に関して陽性であり（図3B）、これはペースメーカー細胞に特徴的である［19、20］。
【００３１】
ゼラチンベースの細胞培養ディッシュを用いた3週間のiSABのさらなる培養により、蓄積された、350bpm超で拍動する非常に同期した細胞層が生じた。細胞は、洞房結節細胞の典型的な細長い形状を有した（図3C）。
【００３２】
iSAB由来の心筋細胞の電気生理学的パラメータを調べるために、単一細胞パッチクランプ技術を再び用いた。分析した65個の細胞のうち、53個の細胞（81.5％）が、ここでペースメーカー細胞の一定間隔で速く拍動するサブタイプに対応し、たった12個の細胞（18.5％）が、不規則かつ遅く拍動する心筋サブタイプに相当した。また、ペースメーカー細胞のサブタイプとして分類された53個の細胞のうち43個が成熟したペースメーカー細胞のパラメータを示し、これらの一定間隔で自発的に拍動する細胞のうちの10個が未だ未成熟であった（図3D、追加表2）。しかしながら、それらは短いプラトー相および比較的負のMDPを有する（このことはそれらを成熟したペースメーカー細胞と区別する）にもかかわらず、速いDDRを有する一定間隔の自発的な活動電位の生成などのペースメーカー細胞の典型的な特徴を既に示し、かつ典型的なペースメーカー電流（If）を有する（例えば、図3B中の導出を参照されたい）。
【００３３】
ペースメーカー細胞を含むそれらの正体についてのさらなる証拠に関して、細胞外空間からのCa2+電流および細胞内Ca2+貯蔵が特性決定され、これは筋線維鞘中のCa2+チャネルにより、または貯蔵からのCa2+の放出により与えられる。筋線維鞘内のチャネルの生理学的機能性はまた、Ca2+トランジェントの頻度も決定する。ペースメーカー細胞の特徴として、Ca2+トランジェントの頻度を調節するHCNチャネルに関して細胞を調べた。HCNチャネル遮断薬であるZD7288の投与は、時間の関数としてのiSABのCa2+トランジェントの頻度を低下させた（図3E）。また、同様に、Ca2+トランジェントの頻度は、電位依存性T型およびL型Ca2+チャネルの活性に基づく。対応して、iSAB由来細胞でのCa2+トランジェントの自発的頻度はニフェジピンを用いたL型Ca2+チャネルの阻害後に劇的に低下し、かつミベフラジル（mibefradil）を用いたT型Ca2+チャネルの阻害は中程度の低下を引き起こした（図3F）。
【００３４】
機能的筋小胞体（SR）は、心筋細胞の成熟段階を明らかにする。つまり、SRからのCa2+は、自発的活動に対して重要な役割を果たす。自発的Ca2+トランジェントに対するSR由来のCa2+のこの影響は、カフェインを用いて、またはタプシガルギンを用いたSERCAの阻害により、SRからのCa2+の完全放出が誘導される際に明らかになる。iSAB由来細胞では、カフェインにより誘導されるSRからのCa2+放出が、Ca2+ピークと同程度に拡張期Ca2+レベルを低下させたが、Ca2+ピークの経過中を通じた認識可能な自発的Ca2+トランジェントおよび変化しない収縮期Ca2+値を有した（図3G）。SR-Ca2+放出に対する同様なカフェインにより誘導される作用は、aCaB由来細胞では検出できない。タプシガルギンによるSRへのCa2+の再取り込みの遮断は、iSAB由来細胞のみでCa2+拡張期レベルの増大を生じさせた（図3H）。
【００３５】
Ca2+トランジェントの基礎となるCa2+のうちの主な部分は、細胞外空間に由来する。したがって、細胞外Ca2+の交換は、Ca2+トランジェントの除去をもたらす。筋線維鞘Ca2+流入がNa+/Ca2+交換体およびCa2+チャネルの遮断により除去される場合、細胞内Ca2+回路のみが検出できる。この場合、カフェインの添加がiSAB由来細胞でのCa2+ピークを誘導し、このピークは、aCaB由来細胞と比較して4倍大きかった（図3I、図3K）。これらの条件下でのSERCAの追加的阻害は、iSAB由来細胞でのSR中の漏出を明らかにした。細胞内Ca2+蓄積の速度は、SERCA阻害を含まない操作と比較して4倍の増大を受ける。タプシガルギンとのインキュベーションの5分後のカフェイン添加は、Ca2+ピークを4分の1に減少させた。対照的に、対照細胞では、Ca2+ピークはSERCA阻害ありまたはなしで同一のままであり（図3J、図3K）、ここでもまた細胞内Ca2+蓄積を検出できなかった。
【００３６】
最終的に機能的ペースメーカー活性についてiSABを調べるために、ネズミ心臓の培養心室スライスに基づくex vivoモデルの利点を利用した［21］（図4A）。これらは通常は調製後すぐに自発的拍動活性を有する一方で、そこでの安定的収縮を約60bpmまで低下させることが可能であり、そのようにして、それらは作製されたiSABの機能性に関する理想的な試験系を構成する。DiIを用いた標識化から明らかである通り、スライス上に播種されたiSABはスライスに接着し、かつその上で生存することが可能であった（図4B）。iSAB播種の影響を決定するために、まず、自発的スライス活動性を未処理スライスで慎重に定量した。最大で約70％のスライスがスライス調製後の2日目に自発的拍動活性を有する少なくとも1箇所の領域を含んだ後に、この割合（％）は、3日目および4日目に劇的に減少した（図4C）。iSABを播種されたスライスが、aCaBを播種されたものと比較して、1日目および2日目での拍動活性の約1.5倍の増大を既に示した一方で、その後も維持されたのはそれらの活性のみであった（図4C）。また、3日目および4日目のスライスは、未播種スライスおよびaCaB播種スライスと比較して、スライス1枚当たりの著明にさらに活性な領域を含んだ（図4D）。また、iSABを播種されたスライスの拍動頻度は、1日目から4日目までに4倍超、継続的かつ有意に増大し（図4E）；これは未播種スライスおよびaCaB播種スライスの場合には観察されなかった（dns）。時間に対する色素のプロットから明らかである通り、スライスに移す前にカルセインをiSABにロードすることにより、iSABと心室細胞との間の合胞体の形成が確認された（図4F）。また、機能的カップリングは、iSABとスライスの心筋細胞との間の同期したCa2+トランジェントから明らかである。結果として、スライス内のCa2+トランジェントのピークは比較的小さいが、自発的iSAB活動とは非常に同期的であり、約200μmの半径内で検出することができる（図4G）。
【００３７】
最後に、iSABのトランスクリプトームの全体的な状態を、ペースメーカー作製に対して重要な新規因子および/またはマーカーを特定する目的で、RNA配列分析により確認した。この分析によって、対照との比較により、220種類の顕著にアップレギュレーションされた遺伝子が、iSAB中で特定された。とりわけ、Myh6（33倍のアップレギュレーション）、SERCA2（20倍のアップレギュレーション）、Ryr2（39倍のアップレギュレーション）およびKcnj5（45倍のアップレギュレーション）であった。全体として、アップレギュレーションされた遺伝子を、生物学的プロセスを記述する82種類の遺伝子オントロジーへと割り当てることができた（図5A）。とりわけ、心臓および筋肉機能ならびに心臓発生に（極めて）密接な関連がある群へと多数を分類することが可能であった（図5B）。遺伝子オントロジーの基礎となるネットワークを、図5Cに示す。細胞構成要素のアドレス分けでは、220種類の遺伝子が34種類のオントロジーに分かれる（図5D）。同様に、これらは収縮性細胞に典型的な構造に高度に関連する群に分類することができた（図5E）。遺伝子オントロジーの基礎となるネットワークを、図5Fに示す。興味深いことに、iSAB中のほとんど12倍多くの遺伝子（2500種超）が顕著にダウンレギュレーションされ、これはおそらく転写抑制因子としてのTBX3の役割と相関する。しかしながら、これらの遺伝子は、ハウスキーピングプロセス、例えば、Gタンパク質共役型受容体のシグナルカスケードおよびミトコンドリア機能に対して重要であるオントロジーに、より関連があった。
【００３８】
4. 考察
そのすべてが成熟洞房結節細胞の機能的パラメータを取り込む、幹細胞から取得された心臓ペースメーカー細胞の非常に富化された集団のde novo作製に対する能力は、将来の細胞ベース療法に関して強い関心を持たれている。これは、「生物学的ペースメーカー」の様式での適正な心拍リズムの回復に寄与する要因であり得る。また、in vitro医薬品スクリーニングは、そのような生成された結節細胞の利用可能性から利益を得るであろう。多能性幹細胞（PSC）は、それらに関して、SA細胞/ペースメーカー細胞の特徴である分子的および機能的特性を有する自発的に拍動する心筋細胞をはじめとする、哺乳動物器官のあらゆる細胞タイプがそこから形成できることが実証されてきたので［10］［22］［23］［24］［25］［11］、これらの目的で注目されている。しかしながら、「胚様体」中の細胞集団は、典型的には極めて不均一であり、このことの不可避の影響は、信頼性のある選択および単離戦略が必要とされることであり、これは、特に、非常に稀なタイプである心臓洞房結節細胞には特に関連する。これに関して、自発的に拍動する領域でEGFP、HCN4および他の心臓マーカーを共発現する、HCN4遺伝子のプロモーターにより転写制御されるEGFPを組み込んだネズミES細胞由来細胞が記載されている［26］。しかしながら、フローサイトメトリーによる精製後に、自発的活動電位は、EGFP陽性画分では稀にしか観察されず、興味深いことに、大部分の細胞がニューロンのマーカーであるネスチンに関して陽性であった［26］。これは、HCN4が、自発的に活動する心筋細胞および神経細胞の両方に対するマーカーであるという知識に合致する［27］。結果として、これに対する代替法として、これらの強く求められる細胞の精製のための内因性表面マーカーの探索が早められた。これに関して、Alcam（CD166）に基づく精製が結節細胞の含有量を改善することが、最近報告されている。しかしながら、HCN4の染色から明らかである通り、所望の細胞タイプの富化は、ES細胞培養から取得される細胞中の10％さえも超えなかった。細胞に関して、それらがin vitroで培養された心室筋細胞での収縮を刺激することが可能であることが報告されたが、これらの重要な結果は刊行物中に提示されなかった［12］。
【００３９】
低分子量化合物の薬理学的投与によって、分化中のESCからの結節細胞の収率を増加させるために、他のアプローチが試みられた。ある程度の成功（3〜6倍の増加）が報告されているにもかかわらず、これは決して機能的洞房結節細胞集団の十分に高い富化を生じなかった［28］。同様に、結節細胞の比率の増大を記載する低分子量化合物EBIOの投与に関連する刊行物では、電気生理学的レベルおよび機能的レベルでの包括的分析は欠如している［9］。
【００４０】
この課題を解決するために、重要な転写因子として、TBX、特にTBX3を用いるES細胞の制御された分化のためのプログラミングをMyh6支援抗生物質選択と組み合わせるプロトコールが開発された［15］。これは、ネズミ心臓での拍動頻度に初めて近づいている、300〜400bmpの高度に同期した拍動頻度を有する自発的に収縮する心筋細胞を特徴とする洞房結節様ペースメーカー細胞凝集塊の非常に効果的な作製を、一貫してもたらした。これらの細胞クラスター中の大部分（80％超）の心筋細胞は、結節細胞の所望のタイプに明らかに相当し、これに近い精製度はこれまで達成されたことがない［9］［28］［12］。作製された細胞は、完全な機能性に関するすべての他の特性、すなわち、タンパク質発現パターン、電気生理学的パラメータおよびCa2+シグナルパラメータを有するので、遺伝学的操作により作製されたこれらのペースメーカー凝集塊は、「誘導型洞房体」（induced sinoatrial body；iSAB）と称されることが提案される。さらに、作製されたiSABは、ex vivoで心室筋を安定的に刺激するそれらの効力に関して機能的である。また、RNA配列決定支援分析は、ペースメーカー細胞のプログラミングおよび精製のためのツールとしての新規因子および/またはマーカーの組み合わせの研究に対する基礎として、幹細胞由来のペースメーカー細胞の最初の全体的なmRNA発現パターンを提供した。
【００４１】
TBX3に基づくプログラミングのみを用いる最初のパイロット実験が、顕著に低い拍動頻度を有する凝集塊中の機能的ペースメーカー細胞の数を二倍にしたことは、注目に値する。しかしながら、抗生物質選択の追加のMyh6プロモーター支援ステップの導入により、富化はさらに劇的に増大した。基本的なアイデアは、この方法が心筋細胞サブタイプの無制限の富化を元来意図していたとしても、Myh6支援選択による心室筋細胞および希少な心筋細胞の富化を記載する最近の刊行物に基づくものであった［15］［17］［18］。
【００４２】
他方で、TBX3単独ではESC由来結節細胞の純粋集団はもたらされないという事実は、それが、ペースメーカー細胞を形成するための心室筋の完全な直接的再プログラミングを達成することができないことと一致する［4］。最近、さらなるTボックス転写因子であるTbx18が洞房結節細胞への機能的（working）心筋の直接的変換を可能にすることが熱狂的に報告された（「iSAN」）。Tbx18は、この特殊な関係ではTbx3よりも有望であるように見えるが、例えば、非常に低い効率および比較的遅い拍動頻度などの懸念が存在する。さらに、このウイルスアプローチは、in vivoでは多大な困難を伴ってのみ制御可能であるであろう［5］。このグループからの新たな論文［5a］は、まさに以下のことを示している：ウイルスベクターは肺および脾臓でも見つかったこと、および心臓中でさえも、明らかに集中した領域はなかったこと。また、in vivoの大型動物モデルでは、たった2週間だけしかペースメーカー細胞機能を維持することができず、その後、再び失われた。さらに、現在までに、心臓でのアデノウイルス感染が炎症および/または不整脈を引き起こし得るか否かは明らかになっていない。
【００４３】
同様に、本発明のアプローチは、筋線維鞘電気生理の基礎を形成する末端エフェクター分子の操作のみを通じて生物学的ペースメーカーをシミュレーションする従前の刊行物とは異なり、むしろ、完全に機能的な結節細胞を新規に（de novo）生成する［29］［30］。対照的に、本発明のプロトコールは、電気的振動のみならず、微妙な電気生理学的特性およびCa2+シグナル特性ならびに生来型のペースメーカー細胞の目立った形態学的特徴も有する細胞をもたらす。したがって、本発明の方法は、電気的ペースメーカーに対する将来的な代替物に関する基礎に相当する。
【００４４】
ここで作製されるペースメーカー細胞は、同期しかつ速く拍動する合胞体を形成し、かつex vivoで心室スライス培養と電気的連絡を形成可能であり、その中での収縮を刺激することができるにもかかわらず、しかしながら、心臓内で固定され、かつ生理学的拍動数を有する収縮を刺激するその能力を分析する必要が未だにある。ヒト多能性幹細胞（すなわち、hESC、hiPSC）［31］［32］［33］［34］［35］［36］に対するプロトコールの応用可能性は、直接的に可能である。これは、最終的には、臨床応用およびin vitroでの医薬品スクリーニングに対して非常に重要である、細胞ベースの生物学的ペースメーカーの応用可能性への道を開くことができる。
【００４５】
材料および方法
qRT-PCR
定量的リアルタイムPCRを、Rneasyキット（QIAGEN社）を用いて単離されたRNAを使用して行なった。第一鎖cDNAを、AMV逆転写酵素（Amersham社）およびランダムヘキサマープライマーを37℃で用いて、2μgのRNAから作製した。リアルタイムPCRを、iCyclerおよびMyiQDetectionシステム（Biorad社）にて、IQ Syber Green Super Mix Kit（Biorad社）を用いて行なった。プライマーはDNA-Starソフトウェアを用いて構築し、各プライマーペアの特異性はアガロースゲル電気泳動を用いて確認した。すべてのプライマーペアに対してアニーリング温度は57℃であり、増幅されたネズミcDNA断片は、mGAPDHの塩基対812〜934およびヒトTBX3（hTbx3）の塩基対287〜429に対応する。すべてのサンプルを二重反復で分析し、未分化型および分化型ES細胞の組み合わせにより、およびネズミ心臓から形成されたトータルRNAを、対照として用い、かつ分析されるマーカーに対する標準曲線を描画するために用いた。逆転写酵素を含まない各サンプルのトータルRNAを、陰性対照として用いた。逆転写酵素の非存在下では、40回のPCRサイクル後にシグナルは得られず、このことは、すべてのサンプルが混入DNAを含まなかったことを示す。また、RNA鋳型なしで逆転写酵素を添加した場合にはシグナルは得られず、このことは、外来性RNAまたはDNAの混入はなかったことを示す。すべての遺伝子に対する標準曲線は、鋳型濃度のそれぞれ半分に対する閾値サイクルからの増大を示した。相対的遺伝子発現強度の評価を、ΔCT法に基づいて行なった。mRNA発現の相対的強度の変化係数を、対照細胞での発現値を1と定義して、参照遺伝子としてGAPDHを用いて算出した。
【００４６】
パッチクランプ技術
収縮性心筋細胞の自発的活動電位および電流を、MultiClamp 700B増幅器およびpClamp10ソフトウェア（Molecular Devices, Union City, USA）を用いた穿孔パッチ構成にて37℃で記録した。オフラインでのデータ解析は、Clampfitソフトウェア（Molecular Devices, Union City, USA）またはOrigin 6.0ソフトウェア（Microcal, Northampton, USA）を用いて行なった。パッチピペットは、ホウケイ酸ガラスから引いて熱研磨され、10mM NaCl、130mMアスパラギン酸カリウム、0.04mM CaCl2、3mM Mg-ATP、10mM HEPESおよび200μg/mLアムホテリシンB（pHはKOHを用いて7.2に調整）を含有する細胞内溶液を充填した際に2〜5MΩの抵抗を有した。細胞外（バス）溶液は、以下の成分を含有し：140mM NaCl、5.4mM KCl、1mM MgCl2、1.8mM CaCl2、5mM HEPES、5.5mMグルコース；pHはNaOHを用いて7.4に調整した。Ifのよりよい記録のために、一部のケースでは、2mM BaCl2および0.3mM CdCl2を、IKIおよびICaを遮断するためにバス溶液に加えた。−40mVの保持電位から始まり、−130mV〜＋20mVの試験電位までの段階的変化により、Ifを測定した。電流（If）密度を決定するために、−130mVパルス中の3秒後の電流振幅を、セル静電容量で除算した。If活性化動態を決定するために、活性化の時定数（τ）を、最初のディレイ後の−130mVステップの電流トレースを2種類の指数関数の合計y＝A1e(-x/τ1)＋A2e(-x/τ2)（式中、τ1およびτ2は活性化に対する速い時定数および遅い時定数であり；したがって、HCNチャネル活性化の遅い成分（A2）は一般的に電流振幅のうちの10％未満であるので、τ1はτと称される）を用いてフィッティングすることにより取得した。イソプロテレノールおよびカルバコール（Sigma, Taufkirchen, Germany）を実験日にバス溶液に直接溶解させ、迅速交換過融解システム（rapid exchange superfusion system）を用いて細胞に投与した。APを、10kHzのサンプリングレートで記録した。分析は、オリジナルのトレースを用いて行なった。MDPから電位閾値までの距離の線形フィッティングの傾斜/勾配がDDRであり；AP持続時間は閾値電位からMDPまでの時間である。
【００４７】
Ca2+イメージング
すべてのCa2+トランジェントは、蛍光イメージング顕微鏡（Visitron Systems社）を用いて測定し、VisiVIEW(登録商標)イメージングソフトウェアを用いて分析した。Ca2+シグナルは、4×4ビニングモードにて冷却CCDデジタルカメラを使用し、470/40nmの励起波長を用いて、525/50nmの発光波長で記録した（50ms）。iSABおよびaCaBに、37℃にて30分間、分化培地中の2.5μM Fluo-4/AMをロードした。2回目の培地交換後、28℃の温度で測定を行なった。蛍光強度（F）のピーク値としてのESC中でのCa2+トランジェントは、分析した時間中の最小の蛍光強度（Fo）に対して標準化する。
【００４８】
自発的Ca2+トランジェントは、5μM ZD7288（Sigma-Aldrich社）を用いたHCNチャネルの阻害、1μMミベフラジル（mibefradil）（Sigma-Aldrich社）を用いた電位依存性T型Ca2+チャネルの阻害および1μMニフェジピン（Sigma-Aldrich社）を用いた電位依存性L型Ca2+チャネルの阻害により影響を受けた。筋線維鞘Ca2+輸送の遮断に関する実験のために、培養培地を以下の組成のタイロード液（Tyrode's solution）に置き換えた（単位はmM）：LiCl 140、KCl 6、MgCl 1、グルコース10、EGTA 1、HEPES 5、pH7.4（KOHを用いて調製）。Ca2+トランジェントに対するCa2+貯蔵の影響を、リアノジン共役型SR-Ca2+チャネルを開くためのカフェイン（10mM、Sigma-Aldrich社）、およびSERCAを阻害するためのタプシガルギン（2μM、Sigma-Aldrich社)の添加により調べた。ZD7288、ニフェジピンおよびFluo-4/AMはDMSO中に溶解させ（最終濃度＜0.1％）、タプシガルギンはエタノール中に溶解させた（最終濃度0.2％）ミベフラジルおよびカフェインは、H2O中に溶解させた。
【００４９】
スライス作製および培養
動物実験のための実験プロトコールは、所轄のバイエルン政府機関により承認され、実験動物の管理および使用に関する基準（the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）（National Institutes of Health、公報第85-23号、1996年改訂）に従って実施された。両方の性別の生体マウスから心臓を迅速に取り出し、以下の組成の氷冷改変タイロード液に移した（単位はmM）：NaCl 136、KCl 5.4、MgCl2 1、CaCl2 0.9、NaH2PO4 0.33、グルコース10、2,3-ブタンジオンモノオキシム30、HEPES 5、pH7.4（NaOHを用いて調整）。心室から動脈、フラップ（flap）および血管を除去し、グルコースを含まない改変タイロード液に溶解させた4％低融点アガロースゲル中に包埋した。心臓を含むアガロースをVibratom（VT1200S、Leica社）の試料容器に貼り付け、直ちに氷冷タイロード液で覆った。心臓を、スチール製ブレード（Wilkinson社）を用いて300μm厚組織スライスへと、フラップ（flap）の面に平行にスライスし、これにより心室筋の環状スライスが得られた。
【００５０】
氷冷タイロード液中での30分間のインキュベーション中、スライスは、空気/培地界面にて培養のために組織培養インサート（Millicell、Millipore社）のBioporeTMメンブレンに載せた。組織培養インサートを、1％インスリン-トランスフェリン-セレン（Gibco社）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（Sigma社）を添加したM199培養培地を含有するペトリディッシュ中に置いた。スライスを、共培養段階までインキュベーター（37℃、5％CO2）にて培養した。日常的なスライスの生存率決定のために、スライスをチアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（MTT、0.5mg/mL、Sigma社）と共に37℃にて40分間インキュベートし、光学顕微鏡下で分析した。
【００５１】
心臓スライスとのiSABの共培養
生存細胞を観察するために、iSABを、CalceinRedTM（AAT Bioquest社）を用いて標識した。この目的のために、iSABを、分化培地中の10mg/mL CalceinRedTM/AMと共に37℃にて30分間インキュベートした。遠心分離（1000rpm、5分間）および分化培地中への再懸濁後、iSABを、ピペットを用いて顕微鏡下でネズミ心臓スライスに載せた。iSABおよび心臓スライスをインキュベーター（37℃、5％CO2）中で共培養した。iSABおよびスライス領域の拍動頻度は、Sony NEX-5Nカメラを用いて毎日記録した。iSABから切片の細胞へのCalceinRedTMの移動によるiSABとスライスとのカップリングを、蛍光イメージング（Ex/Em 646/659nm、Visitron Systems社）を用いて検出した。iSABとスライスとの接触領域を毎日記録し、CalceinRedTM蛍光の分布を目視で分析した。
【００５２】
iSABとスライスとの接触領域でのCa2+イメージング
iSABを含むスライスに、1％インスリン-トランスフェリン-セレン（Gibco社）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（Sigma社）を添加したM199中の5μM Fluo-4/AM（Invitrogen社）を、37℃にて30分間載せた。Ca2+シグナルを、4×4ビニングモードにて冷却CCDデジタルカメラを使用し、470/40nmの励起波長を用いて525/50nmの発光波長で（露光時間30ms）、蛍光イメージング顕微鏡（Visitron Systems社）により記録した。すべてのCa2+トランジェントを、VisiVIEW(登録商標)イメージングソフトウェアを用いて分析し、報告されたピーク値を蛍光強度（F）とし、対応する領域での分析時間（20s）中の最小蛍光強度（Fo）に対して標準化した。
【００５３】
細胞培養
ネズミ細胞株GSES株［37］由来のES細胞株を、10％FBS Superior（Biochrom社）、100μM非必須アミノ酸（GIBCO社）、1％ペニシリン/ストレプトマイシン（GIBCO社）および100μM β-メルカプトエタノール（Sigma社）を1000U/mL白血病阻害因子（LIF、Milllipore社）の存在下で含有し、高濃縮グルコースおよび安定グルタミン（GIBCO社）を含むDMEM培地中で増殖させた。分化は、10％FBS（Biochrom社）、100μM非必須アミノ酸（GIBCO社）、1％ペニシリン/ストレプトマイシン（GIBCO社）および450μM 1-チオグリセロールを含有するイスコフ基礎培地（Iscove’s basal medium）（Biochrom社）中で、標準的プロトコールに従って行なった［13］。細胞の継代は、通常は2〜3日後に到達する70％コンフルエンスにて、トリプシン/EDTA（GIBCO社）を用いて行なった。分化は、通常は細胞融解後3〜4継代目で行なった。細胞を、JetPEI（Peqlab社）を使用し、15μgプラスミドDNAを用いて形質転換し、続いて、10μg/mLブラスチシジン（blasticidin）（Invivogen社）または250μg/mLハイグロマイシン（Invitrogen社）を用いて、10cm組織培養ディッシュ中で選択した。安定なクローンを手動で選択し、続いて培養し、qRT-PCRおよび分化アッセイを用いて試験した［13］。aCaBおよびiSABの自発的形成を誘導するために、最近記載された通りに［15］、陽性クローンを、心筋細胞の富化のために抗生物質を用いて処理した。その後に続く生理学的分析に必要とされる単一細胞を、記載された通りに酵素的に単離した［14］［16］。aCaBおよびiSABが成功裏に作製されたことを確認するために、考えられるマイコプラズマの混入を、PCRベースの MycoSPYキットシステム（Biontex社）を用いて週2回、定期的にモニタリングした。
【００５４】
RNA配列決定
ライブラリー作製および配列決定のために、接着培養にて増殖した細胞の培養培地をデカントで除去し、細胞を洗浄し、溶解バッファーの添加により直接溶解させた。この溶解物のうち1μLを、製造業者の使用説明書に従ってSMARTerキット（Clontech, Mountain ViewCA, USA）によるcDNA合成および増殖のために用いた。cDNA合成は、polyA特異的プライマーのアニーリングおよびターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素の添加により開始した。続いて、新規に合成した第一鎖cDNAを、まずターミナルトランスフェラーゼによりホモポリマーストレッチを用いて伸長し、次に、鋳型スイッチングにより特異的アプリケーションタグを用いて伸長した。得られた二重標識cDNAを、PCRを用いて増幅し、超音波処理（Bioruptor, Diagenode, Liege, Belgium；30sオン/30sオフにて25サイクル）により断片化し、NEBnext Ultra DNA library preparation kit（New England Biolabs, Ipswich MA, USA）を用いて、バーコード化Illumina配列ライブラリーに変換した。PCR富化後、cDNAライブラリーを、AmpureXP磁気ビーズ（Beckman-Coulter, Brea CA, USA）を用いて精製し、Bioanalyzer 2100（Agilent, Santa Clara CA, USA）を用いて定量化した。cDNAライブラリーを等モル量で組み合わせ、IlluminaGenomeAnalyzerIIxを、単独読み取りモード（single-read mode）にて、78ヌクレオチドの読み取り長および複製物あたり2100万〜3200万の未処理読み取り結果の範囲で配列決定した。
【００５５】
引き続くマッピングおよび発現解析のために、Illumina配列決定からの読み取り結果を脱多重化し（de-multiplexed）、TOPHAT sliced-read（v1.4）［38］およびエキソン-エキソン境界の検出の補助のためにゲノム注釈（iGenomesから、http://cufflinks.cbcb.umd.edu/igenomes.html）と共にmm9マウスゲノムを用いてマッピングした。各遺伝子に対する読み取り結果の割り当てを、HTSeq（http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/）を用いて取得し、DESeq Rパッケージを用いて標準化した［39］。示差的発現を、3種類の生物学的複製物および0.05に設定された偽発見率（false discovery rate）を用いて、各群の対間比較（pair-by-pair comparison）により、DESeqにて検討した。すべての配列およびデータ解析ステップは、Galaxyプラットフォームのローカルサーバ上で行なった［40］。
本発明は、例えば以下の実施形態を包含する：
［１］核酸が幹細胞に導入され、その結果として該幹細胞がTBX転写因子を発現するか、またはTBXタンパク質が幹細胞に導入される、幹細胞、特に多能性幹細胞から洞房結節細胞を作製する方法であって、α-MHC（MYH6）プロモーターにより制御される抗生物質耐性遺伝子の発現のための構築物が追加的に導入され、かつ得られる幹細胞が抗生物質の存在下にて分化する、上記方法。
［２］洞房結節細胞が、得られる心筋細胞のサブタイプに基づいて、60％超、好ましくは70％超、最も好ましくは80％超の高い純度で取得される、［1］に記載の幹細胞から洞房結節細胞を作製する方法。
［３］多分化性（multipotent）または多能性（pluripotent）幹細胞、好ましくは多能性幹細胞が用いられる、［1］または［2］に記載の幹細胞から洞房結節細胞を作製する方法。
［４］非ヒト胚性幹細胞または非ヒト誘導型幹細胞もしくはヒト誘導型幹細胞または単為生殖幹細胞もしくは精原幹細胞が用いられ、好ましくは非ヒト胚性幹細胞または非ヒト誘導型幹細胞もしくはヒト誘導型幹細胞が用いられる、［1］〜［3］のいずれかに記載の幹細胞から洞房結節細胞を作製する方法。
［５］核酸が、TBX DNA、特にTBX cDNA；TBX RNA、特にTBX mRNAから選択される、［1］〜［4］のいずれかに記載の幹細胞から洞房結節細胞を作製する方法。
［６］TBXがTBX3またはTBX18から選択され、TBX3が特に好ましく、TBX3 cDNAが最高に好ましい、［1］〜［5］のいずれかに記載の幹細胞から洞房結節細胞を作製する方法。
［７］TBX核酸の導入が、ベクターを用いて、特に（過剰）発現ベクターを用いて達成される、［1］〜［6］のいずれかに記載の幹細胞から洞房結節細胞を作製する方法。
［８］抗生物質耐性遺伝子が、アミノグリコシド系抗生物質耐性遺伝子から、より好ましくはネオマイシンおよびピューロマイシン耐性遺伝子から選択され、最も好ましくはネオマイシン耐性遺伝子であり；かつ抗生物質が、アミノグリコシド系抗生物質から、特にネオマイシンおよびピューロマイシンから対応して選択される、［1］〜［7］のいずれかに記載の幹細胞から洞房結節細胞を作製する方法。
［９］医薬品のin vitro評価のための、幹細胞からin vitroで作製される洞房結節細胞の使用。
［１０］心筋組織構造体の構築および/または心臓組織の生長のための、幹細胞からin vitroで作製される洞房結節細胞の使用。
［１１］細胞ベースの生物学的心臓ペースメーカーの製造のための、［10］に記載の幹細胞からin vitroで作製される洞房結節細胞の使用。
［１２］［1］〜［8］のいずれかに記載の方法により幹細胞からin vitroで作製される洞房結節細胞が用いられる、［9］〜［11］のいずれかに記載の使用。
【００５６】
図面の説明
図1：ES細胞でのTBX3過剰発現構築物の機能性
(A) ヒトTBX3 cDNAを含む過剰発現構築物を用いて安定的にトランスフェクトされた20の個別の細胞クローン。過剰発現レベルは、qRT-PCRを用いて分析した。さらなる分析のために、4つの代表的クローンを選択した（データは平均値±SDとして報告される；n＝2）。(B) 4つの選択されたクローンでの過剰発現されたTBX3およびアクチンの免疫染色が、TBX3の過剰発現レベルを確認する。(C) Oct-4/Pou5f1およびSox2のFACS分析は、LIFの添加による多能性に対するTBX3過剰発現のいかなる影響も示さなかった（データは平均値±SEMとして報告される；n＝5）。
【００５７】
図2：Tbx3分化型ES細胞でのペースメーカー型心筋細胞の優位な出現
(A) 個別のTBX3クローンおよびES対照細胞（GSES）での自発的拍動活性（spontaneous bead activity）の増大（データは平均値±SEMとして報告される；n＞100）。対照クローンおよび4つのクローンであるクローン#3、クローン#7、クローン#15およびクローン#19が、この順で右から左へと、各ケースで白色で示される対照から始まって、それぞれ示される。(B) 対照およびTBX3過剰発現心筋細胞でのMyh6発現の共焦点分析。アクチンおよび細胞核の対比染色。スケール：10μm。(C) 心筋細胞サブタイプの分布であり、Ventr.：心室（23.1％）；Atr.：心房（8％）；Pace.：洞房結節様（38.5％）；Interm.：中期/初期型（38.8％）。水平バー：100ms；垂直バー：20mV。(D) HCN4発現細胞が、18日目にTBX3クローンで有意に増大していた（データは平均値±SDとして報告される；n＝5）。
【００５８】
図3：Tbx3分化およびMyh6プロモーター選択の組み合わせにより取得されるペースメーカー型心筋細胞の生理学的パラメータ
(A) Myh6-ネオマイシン対照およびMyh6-TBX3細胞の異なる処理レジメン後の、時間に対する拍動頻度。最高拍動頻度（300〜400bpm）は、選択的TBX3プログラミング、抗生物質選択および追加の解離ステップの組み合わせにより達成される（データは平均値±SDとして報告される；n≧5）。(B) iSABでのHCN4（左側領域）、Cx45（中央領域）およびCx30.2（右側領域）の発現。アクチンおよび細胞核の対比染色。スケール：10μm。(C) iSABの播種により取得される同期細胞層中の洞房結節細胞の典型的な細長い細胞形状。スケール：10μm。(D) 単一細胞パッチクランプおよびファニーチャネル測定から明らかであるペースメーカー細胞の分布：81％超のペースメーカー型細胞が取得された。そのうち、19％が未成熟ペースメーカー細胞であり、それ以外は成熟ペースメーカー細胞であった；n＝65。(E) Myh6-TBX3細胞での自発的Ca2+トランジェントの頻度は、ZD7288によるHCNチャネルの阻害後に有意に低下する（データは平均値±SEMとして報告される；n≧7）。(F) Myh6-TBX3細胞での自発的Ca2+トランジェントの頻度は、ミベフラジル（mibefradil）およびニフェジピンによるT型およびL型Ca2+チャネルの阻害後に低下する（データは平均値±SEMとして報告される；n＞12）。(G) iSABおよびaCaB由来細胞での添加前および10mMカフェインの存在下での自発的Ca2+トランジェント。前者の細胞でのカフェイン誘導性ピークの振幅は、自発的Ca2+トランジェントの最大値に匹敵する。n≧8。(H) タプシガルギンによるSRへのCa2+取り込みの遮断は、aCaB由来細胞とは対照的に、iSAB由来細胞での拡張期Ca2+レベルの増加をもたらす。n≧11。(I) Na+/Ca2+交換体の遮断および筋線維鞘Ca2+チャネルの遮断の前後でのCa2+トランジェント：iSAB由来細胞では、EB由来の対照細胞とは対照的に、大きなカフェインピークが観察される。n＞16。(J) Ca2+取り込み阻害の前後でのCa2+トランジェント：Na+/Ca2+交換体の阻害＋SERCA阻害は、aCaB由来細胞とは対照的に、iSAB由来細胞での細胞内Ca2+の迅速な上昇を引き起こす。n＞24。また、両方のケースで、小さなカフェインピークが観察された。(K) ペースメーカーとして活性である細胞の特徴であるSR Ca2+流出の分析により、aCaBと比較してiSAB由来細胞での細胞内Ca2+の蓄積速度の増加が示される。Na+/Ca2+交換体の遮断＋SERCA阻害は、iSAB由来細胞ではカフェインピークの減少と同等の細胞内Ca2+蓄積をもたらした。aCaB由来細胞では、収縮期Ca2+の蓄積速度およびカフェインピークの振幅には差異がなかった。平均値±SEM；#p＜0.05（SERCA阻害なしとの比較）；*p＜0.05（対照との比較）。
【００５９】
図4：培養ネズミ心室スライスのex vivoモデルでのiSABの機能性
(A) 5日間培養された心室スライス（左側領域）および生存性をチェックするためのMTT染色（右側領域）。(B) スライス上に播種されたDiI標識iSABの同定（右側領域：重ね合わせ）。(C) 経時的な、少なくとも1箇所の収縮領域を含むiSAB播種、aCaB播種および未播種スライスの分布割合（％）。自発的活動性は、2日目の後には減少するが、iSABを播種されたスライスでの活動性は高い程度で維持される（n≧15）。(D) 経時的な、iSAB播種、aCaB播種および未播種スライス1枚当たりの活動性領域の平均数（データは平均値±SEM（MW SEM）として報告される；n≧15）。(E) 1日目から4日目までのiSABを播種されたスライスの拍動頻度の増加（データは平均値±SEM（MW SEM）として報告される；n≧16）。(F) 経時的な、レシピエントスライスへのiSABからのカルセイン色素の移動［スケール：200μm；「h」：時間；「d」：日］。(G) iSAB（矢印）の即時環境でのスライス領域（矢印）の刺激は、高度に同期的なCa2+トランジェントにより達成される。
【００６０】
図5：RNA配列決定（RNA-seq）により決定されるiSABのトランスクリプトーム状態
英語でのみ当業者が精通しているオントロジー記述は、英語のままで残されている。
(A) 対照と比較してiSABでは、生物学的プロセスを記述する82個の遺伝子オントロジーが、220種類のアップレギュレーションされた遺伝子を含む。(B) 心臓/筋肉機能および心臓発生に関連するオントロジー群のクラスターが優勢である。(C) 生物学的プロセスに関連する遺伝子オントロジーの統合ネットワーク。(D) 対照と比較してiSABでは、細胞構成要素を記述する34種類の遺伝子オントロジーが、220種類のアップレギュレーションされた遺伝子を含む。(E) 収縮性細胞に典型的な構造に関連するオントロジー群のものが優勢である。(F) 細胞構成要素に関連する遺伝子オントロジーの統合ネットワーク。
【００６１】
7. 追加資料
表1：Tbx3プログラミング細胞の活動により得られる心筋細胞の活動電位パラメータ
データは、平均値±SD（標準偏差）である。
表中、数字の中のカンマ「,」は点「.」で表わされる。
【００６２】
図6：Tbx3プログラム細胞から得られる代表的活動電位
(A)(B) (A)心室型および(B)心房型活動電位を有する心筋タイプ。(C)(D) (C)成熟洞房結節型活動電位および(D) ネズミ胎児心臓の中期型細胞と称される若干未成熟なペースメーカー型細胞を含むペースメーカー型活動電位。水平時間軸：100ms。
【００６３】
表2：iSABから取得された心筋細胞の活動電位パラメータ
データは、平均値±SDである。
表中、数字の中のカンマ「,」は点「.」で表わされる。
【００６４】
図7：iSAB心筋細胞から得られる代表的活動電位
(A) 完全に生長したネズミ洞房結節細胞から生成される活動電位に類似するペースメーカー型活動電位。(B) 若干未成熟なペースメーカー型細胞により生成される活動電位。水平時間軸：100ms。
【００６５】
図8：単離されたiSAB細胞由来のIfプロット
(A) パッチクランププロトコール；過分極により活性化される電流を引き起こすために印加される電圧。(B) iSAB由来の単離細胞から記録されたIf電流の例。(C)(D) HCN4チャネルサブタイプおよび成熟洞房結節Ifに典型的な遅い活性化動態を有する堅牢なIf発現を示す、−130mVでの活性化の(C)電流密度および(D)時定数。n＝17；エラーバー：平均値±SD。
【００６６】
図9：単離されたTbx3プログラム細胞およびiSAB由来細胞の活動電位(AP)速度の調節
β-アドレナリン性（イソプロテネロール）およびムスカリン性（カルバコール）刺激に対する反応は、典型的な加速型vs.減速型AP速度をもたらす。iSAB由来細胞は、最大で560bpmまでの範囲の拍動頻度を有する、イソプロテネロールへのより明らかな応答を示す。iSAB/iso：n＝9；iSAB/carb：n＝5；エラーバー：平均値±SD。
【００６７】
文献
0006529976.tif 000002
0006529976.tif 000003
0006529976.tif 000004
0006529976.tif 000005
【００６８】
【表１】
0006529976.tif 000006
【００６９】
【表２】
0006529976.tif 000007
【図１Ａ】
0006529976.tif 000008
【図１Ｂ】
0006529976.tif 000009
【図１Ｃ】
0006529976.tif 000010
【図２Ａ】
0006529976.tif 000011
【図２Ｂ】
0006529976.tif 000012
【図２Ｃ】
0006529976.tif 000013
【図２Ｄ】
0006529976.tif 000014
【図３Ａ】
0006529976.tif 000015
【図３Ｂ】
0006529976.tif 000016
【図３Ｃ】
0006529976.tif 000017
【図３Ｄ】
0006529976.tif 000018
【図３Ｅ】
0006529976.tif 000019
【図３Ｆ】
0006529976.tif 000020
【図３Ｇ】
0006529976.tif 000021
【図３Ｈ】
0006529976.tif 000022
【図３Ｉ】
0006529976.tif 000023
【図３Ｊ】
0006529976.tif 000024
【図３Ｋ】
0006529976.tif 000025
【図４Ａ】
0006529976.tif 000026
【図４Ｂ】
0006529976.tif 000027
【図４Ｃ】
0006529976.tif 000028
【図４Ｄ】
0006529976.tif 000029
【図４Ｅ】
0006529976.tif 000030
【図４Ｆ】
0006529976.tif 000031
【図４Ｇ】
0006529976.tif 000032
【図５Ａ】
0006529976.tif 000033
【図５Ｂ】
0006529976.tif 000034
【図５Ｃ】
0006529976.tif 000035
【図５Ｄ】
0006529976.tif 000036
【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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