(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式、
（Ｍ）n（Ｘ）m（Ｙ）o
を有する、微量元素有機錯体化合物であって、
式中、
Ｍは、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ａｇであり、
Ｘは、ＮＨ3、Ｈ2Ｏであり、
Ｙは、アミノ酸、脂肪酸、ヒドロキシ酸、及び／またはポリアミノ−カルボン酸であり、
ｎは、１−６であり、
ｍは、１−６であり、
ｏは、１−８であり、
前記錯体は、
銅（Ｈ2Ｏ）ビスグリシネート、銅（Ｈ2Ｏ）2ビスグリシネート、銅（Ｈ2Ｏ）ビスマラート、銅（Ｈ2Ｏ）2エチレンジアミン四酢酸、亜鉛（Ｈ2Ｏ）ビスグリシネート、亜鉛（Ｈ2Ｏ）2エチレンジアミン四酢酸、亜鉛（Ｈ2Ｏ）2マラート、Ｚｎ（Ｈ2Ｏ）ビスアラニネート、Ｚｎ（Ｈ2Ｏ）ビスアスパルテート、Ｚｎ（Ｈ2Ｏ）ビスブチレート、Ｚｎ（Ｈ2Ｏ）ビスグルタメート、Ｚｎ（Ｈ2Ｏ）ビスプロピオネート、Ｚｎ（Ｈ2Ｏ）ビスバレリアネート、Ｚｎ（Ｈ2Ｏ）ビスマラート、銅（ＮＨ3）2ビスグリシネート、銅（ＮＨ3）2エチレンジアミン四酢酸、銅（ＮＨ3）2ビスマラート、銅（ＮＨ3）2アスパラギナート、銅（ＮＨ3）2ビスアスパラギナート、銅（ＮＨ3）2ビスグルタメート、銅（ＮＨ3）2グルタメート、亜鉛（ＮＨ3）2ビスマラート、亜鉛（ＮＨ3）2エチレンジアミン四酢酸、亜鉛（ＮＨ3）2マラート、亜鉛（ＮＨ3）2メチオネート、亜鉛（ＮＨ3）4ビスグリシネート、亜鉛（ＮＨ3）4マラート、Ｚｎ（ＮＨ3）2アスパラギナート、Ｚｎ（ＮＨ3）2アスパルテート、Ｚｎ（ＮＨ3）2ビスアスパラギナート、Ｚｎ（ＮＨ3）2ビスアスパルテート、Ｚｎ（ＮＨ3）2ビスグルタメート、Ｚｎ（ＮＨ3）2ビスグリシネート、Ｚｎ（ＮＨ3）2ビスヒスチジナート、Ｚｎ（ＮＨ3）2シトレート、Ｚｎ（ＮＨ3）2グルタメート、からなる群から選択される
ことを特徴とする化合物。
【請求項２】
次の一般式、
（Ｍ）n（Ｘ）m（Ｙ）o
を有する、病原菌により引き起こされる疾患の処置における使用のための微量元素有機錯体化合物を含有する病原菌阻害剤であって、
式中、
Ｍは、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ａｇであり、
Ｘは、ＮＨ3、Ｈ2Ｏであり、
Ｙは、アミノ酸、脂肪酸、ヒドロキシ酸、及び／またはポリアミノ−カルボン酸であり、
ｎは、１−６であり、
ｍは、１−６であり、
ｏは、１−８である
ことを特徴とする病原菌阻害剤。
【請求項３】
前記錯体は、
銅（Ｈ2Ｏ）ビスグリシネート、銅（Ｈ2Ｏ）2ビスグリシネート、銅（Ｈ2Ｏ）ビスマラート、銅（Ｈ2Ｏ）2エチレンジアミン四酢酸、亜鉛（Ｈ2Ｏ）ビスグリシネート、亜鉛（Ｈ2Ｏ）2エチレンジアミン四酢酸、亜鉛（Ｈ2Ｏ）2マラート、Ｚｎ（Ｈ2Ｏ）ビスアラニネート、Ｚｎ（Ｈ2Ｏ）ビスアスパルテート、Ｚｎ（Ｈ2Ｏ）ビスブチレート、Ｚｎ（Ｈ2Ｏ）ビスグルタメート、Ｚｎ（Ｈ2Ｏ）ビスプロピオネート、Ｚｎ（Ｈ2Ｏ）ビスバレリアネート、Ｚｎ（Ｈ2Ｏ）−ビスマラート、銅（ＮＨ3）2ビスグリシネート、銅（ＮＨ3）2エチレンジアミン四酢酸、銅（ＮＨ3）2ビスマラート、銅（ＮＨ3）2アスパラギナート、銅（ＮＨ3）2ビスアスパラギナート、銅（ＮＨ3）2ビスグルタメート、銅（ＮＨ3）2グルタメート、亜鉛（ＮＨ3）2ビスマラート、亜鉛（ＮＨ3）2エチレンジアミン四酢酸、亜鉛（ＮＨ3）2マラート、亜鉛（ＮＨ3）2メチオネート、亜鉛（ＮＨ3）4ビスグリシネート、亜鉛（ＮＨ3）4マラート、Ｚｎ（ＮＨ3）2アスパラギナート、Ｚｎ（ＮＨ3）2アスパルテート、Ｚｎ（ＮＨ3）2ビスアスパラギナート、Ｚｎ（ＮＨ3）2ビスアスパルテート、Ｚｎ（ＮＨ3）2ビスグルタメート、Ｚｎ（ＮＨ3）2ビスグリシネート、Ｚｎ（ＮＨ3）2ビスヒスチジナート、Ｚｎ（ＮＨ3）2シトレート、Ｚｎ（ＮＨ3）2グルタメートからなる群から選択される
請求項２に記載の病原菌阻害剤。
【請求項４】
前記病原菌は通性病原菌であり、サルモネラ、Ｅ．コリ、クロストリジウム種、ブラキスピラ種、アルカノバクテリウム種、スタフィロコッカス種、ストレプトコッカス種、ローソニア種、エイメレラ（Ｅｉｍｅｒｅｌｌａ）種から成る群より選択される
請求項２または３に記載の病原菌阻害剤。
【請求項５】
前記病原菌は、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・エンテリカ亜種、エンテリカ血清型エンテリティディス、サルモネラ・チフィムリウム、サルモネラ・インファンティス、サルモネラ・ガリナリウム、Ｓ．パラチフス、Ｓ．アボルタス−エクイ、Ｓ．ジャバ、Ｓ．コレラ、Ｓ．チフス−スイス、Ｓ．センダイ、エシェリキア・コリ、クロストリジウム・パーフリンジェンス、Ｃｌ．バラティ、Ｃｌ．ソルデリー、Ｃｌ．ボツリヌスＡ−Ｆ、Ｃｌ．，ノービイＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｃｌ．セプティカム、Ｃｌ．ショウベイ、Ｃｌ．ヒストリチカム、Ｃｌ．スポロゲネス、Ｃｌ．テタニ、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア、ブラキスピラ・ピロシコリ、アルカノバクテリウム・ピオゲネス、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・アガラクチア、ローソニア・イントラセルラリスから成る群より選択される
請求項２ないし４のいずれかに記載の病原菌阻害剤。
【請求項６】
家禽の腸疾患、豚の腸疾患、牛の腸疾患、並びに表面処置、家禽の壊死性皮膚炎を伴う潰瘍性足皮膚炎、乳牛の乳房炎、乳牛の子宮炎、有蹄動物の蹄病変、他の動物の腸内及び表在性の疾患から成る群より選択される疾患を処置または予防するためのものである
請求項２ないし５のいずれかに記載の病原菌阻害剤。
【請求項７】
消化管の小腸部分または皮膚の表面上で増殖し、かつ、そこで疾患を引き起こす細菌を阻害するため、及び／または、前記細菌によって引き起こされる疾患を予防または処置するためのものである
請求項２ないし６のいずれかに記載の病原菌阻害剤。
【請求項８】
飼料添加物を調製する方法であって、請求項１に記載の化合物に飼料添加物成分を混合する工程を含む、ことを特徴とする方法。
【請求項９】
飼料を調製する方法であって、請求項１に記載の化合物を標準飼料に混合する工程を含む、ことを特徴とする方法。
【請求項１０】
体重増加を増大させ、並びに／または飼料利用を増加させ、並びに／または卵の収量を増加させ、並びに／または家禽、ブロイラー若しくは産卵鶏若しくは七面鳥、並びに／若しくは豚、及び／若しくは乳牛の個体群における死亡率を減少させるための、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項１１】
Ｙは、
グリシン、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、メチオニン、ヒスチジン、ブチル酸、プロピオン酸、バレリアン酸(IUPAC名：ペンタン酸)、リンゴ酸(malic acid)、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸からなる群から選択される
請求項２ないし７のいずれかに記載の病原菌阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、通性病原菌を阻害するための微量元素有機キレート錯体化合物に関する。本発明はさらに、該化合物を含む組成物、飼料添加物または飼料、並びにそれらの調製方法及び動物畜産業におけるそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミネラルは生体での生理学的及び生化学的な作用において多様かつ重要な役割を果たしている。それらは、とりわけ、酵素（Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｍｇ、Ｆｅ）及びビタミン（Ｃｏ）の成分である。それらは種々の防御機構（Ｃｕ、Ｚｎ、Ｆｅ、Ｓｅ）において決定的な役割を有している。それらは造血（Ｃｕ、Ｆｅ）、再生（Ｐ、Ｃｕ、Ｋ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｍｇ）において役割を果たしている。それらは核酸及びタンパク質の合成を促進する。飼料作物のミネラル含有量は、植物の分類上の位置、土壌の組成及びｐＨ、年間の降水量分布、農学技術などのいくつかの要因に左右され、かつ非常に高い変動性を示す。乾期には、飼料作物のミネラル含有量は減少する。ミネラル含有量は、植物の生物季節相の開始時に増加し、次いで最大値に達した後に減少し始める。収穫時またはベキシラ（ｖｅｘｉｌｌａｒ）植物の葉の損失の場合に発生する溶出はまた、著しいミネラル含有量の損失を伴った。土壌を補充する際、家畜糞尿の使用の中止により土壌の再循環平衡が崩壊し、土壌は酸性化して弱体化し続ける。
【０００３】
家畜動物の中で、飼料を摂取する動物（豚、家禽）のミネラル需要の決定について、現在本発明者らは、粗飼料を摂取する動物の場合と比べて、給餌表に提供されるような飼料作物のミネラル含有量により良く頼ることができる。種子などの植物の胚部分では、ミネラル含有量の変動は、茎、葉などの生長部分と比べて深刻ではない。しかしながら、そうであっても、変動は種子の場合で２−３倍であり得る。しかしながら、高生産量で飼育される家畜は、増加かつ平衡化したミネラル（微量元素を含む）補給を必要とする。現在では、この要件は、主に種々のミネラル塩を用いて、提供する飼料に微量元素を混合することで飼料を介してのみ満たされる。
【０００４】
必要な補給のレベルは、基礎飼料の組成及び追加飼料の量を知ることなくして計画し得ない。要件は、種、年齢層、利用の種類に応じて異なる。飼料中のミネラルの供給不足は、２つの方法で判断可能である。第１の欠乏は、所定の元素が飼料中で十分でないときである。第２の欠乏は、体が飼料に添加された元素を利用できないとき、例えば、元素を吸収するのに必要な因子が不足しているとき、または拮抗要素が優位なために所定の元素の吸収が阻害されるときなどに発生する（非特許文献３）。
【０００５】
微量元素は、植物中または動物の体内で非常に微量に生じるミネラル化合物、金属または非金属の元素のグループに属する。微量元素の機能に基づいて、それらは、静的、恒常的、または酵素的（Ｆｅ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｉ、Ｎｉ、Ｓｅ、Ｃｒ）元素として作用し得る。微量元素が欠乏する場合には、それらは必須元素として分類され得るが、高濃度ではそれらは毒性を示し得る。したがって、特定の微量元素は、それが生物中に存在するときの濃度に応じて、必須であるかまたは毒性を示し得る（非特許文献３）。ミネラルは、陽イオンまたは陰イオンとしてイオン化された形態で、または担体タンパク質と結合して、または生物内の能動輸送によって（カリウムを除いて）吸収され得る。金属イオンは電子供与体配位子と可逆的に結合する金属錯体を形成し得、これらはいわゆるキレートである。このプロセスでは、かなりの量のＡＴＰが消費される（非特許文献３）。正に荷電した金属イオンは水性環境中でルイス酸として作用し、このため電子供与体（ルイス塩基）と反応可能であり、それと同時に、錯体、配位化合物または配位イオンが形成される。キレートの静電効果は、水相中でのみ観察できる（アクアキレート）。したがって、そうでない場合は、不溶性の化合物は、金属錯体の形態で可溶化した後に吸収性となる。藻類の加水分解物、またはアルギン酸塩を用いて生成されたフミン酸及びフモ（ｈｕｍｏ）−キレートによる以前の研究から、金属キレートは金属塩よりも良好に利用されることが証明された。それらは、あまり量が必要でなくても、製造コストが非常に高かったので、広く普及しなかった（非特許文献３）。
【０００６】
元素の生物学的効果は、主としてその化学形態に影響される。塩化物、硫酸塩などの金属塩は、酸化物または炭酸塩よりも良好に利用される（非特許文献３）。プレミックスを製造する工場では、これらの元素は植物中で主に有機化合物中に存在するという事実にもかかわらず、微量元素の無機形態を使用している。過去１０−１５年の科学調査により、有機結合中の微量元素を使用することは、無機形態と比較して有利であることが明確となった。金属含有有機錯体は、生体系における主要な化合物形態の１つである。金属イオンは、錯体、イオン、分子、天然有機化合物（アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物など）、すなわち、金属イオンに結合する配位子中で、中心位置を占める。金属イオンが２個以上の配位子の原子に結合すると、特定のイオンと有機化合物との間の化学反応によりキレートが生成される。金属−配位子の相互作用を有するキレート化合物は、イオン化形態における金属活性よりも１０5−１０7倍高いこれらの錯体における金属活性のために、生物にとって最も有益である。
【０００７】
キレートはそれらの機能に基づいて、転送、保存及び代謝キレートであり得る。代謝キレートは、とりわけ、それらの中心部内にＦｅ2+、Ｃｕ2+イオンを含む（ヘモグロビン、クロロフィルなどの）ポルフィリン骨格を有する化合物である。転送キレートは通常、アミノ酸（グリシン（ｇｙｉｃｉｎｅ）、シスチン、ヒスチジン）であり、またごく稀にペプチドであり得る（非特許文献３）。大部分の微量元素の場合、以下のキレート錯体が形成される：アミノ酸、タンパク質、有機酸などで形成される錯体。それらのうち、タンパク質（アミノ酸）の微量元素錯体は基本である。動物における十分なＦｅ2+、Ｍｎ2+、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+及びＣｒ3+のイオン要件を減少させるために、畜産分野で現在使用可能な飼料添加物よりも良好に利用される飼料添加物が必要である。有機形態で提供される微量元素はより良好に利用されるが、利用度は使用する化合物の化学構造に左右されることが文献から知られている。より良好な微量元素の利用の他に、飼料に混合される微量元素の場合には、元素の相互作用は有意に減少し得る（非特許文献２、１０、５）。
【０００８】
研究及び実践的な経験の結果によれば、有機結合中の微量元素の吸収及び生物学的効果はより有利であるが、要件を満たすのに適当な量は各微量元素及び動物種について決定されなければならない。これは、飼料内で投与可能な微量元素の最大濃度が、かなり当然のごとく、厳格な食品安全及び環境規制に起因して継続的に減少しているため、さらにより重要である。いくつかの場合では、減少は、動物における微量元素の必要性が、優れたまたはより良好な吸収微量元素の供給でのみ満たされ得ることを意味している。
【０００９】
同時に、いくつかの無機化合物（硫酸銅、酸化亜鉛など）は抗菌効果を有する。本発明者ら自身の経験において、本発明者らは、金属含有製品（Ｓｅ−酵母製品）において、有機結合の金属錯体も抗菌特性を有することを見出した。しかしながら、使用する微量元素の濃度が動物において毒性を示すため、この効果は実際には有用ではない。ＣｕＳＯ4及びＺｎＳＯ4の類似の効果はまた工業的発酵の際に使用されており、有毒な微量元素の濃度はより許容される。非特許文献１２は、彼らの実験において、キレート結合中に金属塩を含有する金属化合物が、例えばヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）に対して有益であることを見出した。同様の知見が、特許文献１に報告されている。ヘリコバクター・ピロリは、例えば、それが胃の強酸環境内に存在するなど、いくつかの理由のために特有の病原体であることに留意すべきである。したがって、腸内細菌叢中に一般的に存在する細菌が有機金属キレート化合物と反応するかどうか、及びどのように反応するか、並びに、たとえそうであるとしても、有機金属キレート化合物のどの種類を試行すべきかについて、確定的な結論は先行技術のキレートの抗ヘリコバクター・ピロリ特性（ｐｏｐｅｒｔｉｅｓ）からは引き出されていないであろう。
【００１０】
いくつかの特許出願は、畜産業での金属キレート錯体の使用を開示している。
【００１１】
特許文献２は、アミノ酸金属キレート錯体を含有する動物飼料を開示している。キレート錯体は、とりわけ、鉄、銅、マンガン及び亜鉛のアミノ酸キレートを含む。
【００１２】
特許文献３は、メチオニン金属キレートを調製する方法を開示している。メチオニン及び可溶性の金属塩（例えば、硫酸銅、塩化銅、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、三塩化クロム、硫酸鉄、塩化鉄）をアルコールの存在下で共に混合し、混合物を１−８時間の間４０−１５０℃で維持し、次いでそれを濾過して乾燥させる。メチオニン金属キレートは動物飼料に使用される。
【００１３】
特許文献４は、ＤＬ−トレオニン銅キレートを調製する方法を開示している。ＤＬ−トレオニン銅キレートは、グリシン（ｇｙｃｉｎｅ）銅キレート及びアセトアルデヒドから調製される。ＤＬ−トレオニン銅キレートもまた動物飼料に使用される。
【００１４】
特許文献５は、離乳していない子豚のために調製した微量元素飼料を開示している。飼料は、鉄ビス−グリシネートキレート、亜鉛グリシネート、銅グリシン、硫酸マグネシウム、ヨウ化カリウム及び酵母を含む。
【００１５】
特許文献６は、毛皮動物用の飼料に有用なプレミックスを開示している。プレミックスは、とりわけ、鉄、亜鉛、マンガン、銅、セレンのアミノ酸キレートを含み、好ましくは毛皮動物の妊娠及び授乳期間中に使用される。
【００１６】
上記文献の目的は、より良好な吸収特性を示す金属化合物を調製することである。
【００１７】
特許文献７は、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅａ）によって引き起こされる豚赤痢を処置するためのＥＤＴＡまたはその塩の使用を開示している。
【００１８】
特許文献８は、亜鉛及び銅の金属塩並びに無機酸及び有機酸の単純錯体、並びにマイクロカプセル化プロセスを用いて消化管の最初の部分内でそれらを非吸収性にすることによる、それらの抗菌特性を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】米国特許第６，４２９，２２５号
【特許文献２】中国特許第１４８４９７１Ａ号
【特許文献３】中国特許第１０１９４１９３１Ａ号
【特許文献４】中国特許第１０１８３８２１４Ａ号
【特許文献５】中国特許第１０１７４４１２０Ａ号
【特許文献６】中国特許第１０２１５０７５１Ａ号
【特許文献７】国際公開第２００９／０６６１１７号
【特許文献８】国際公開第２００４／０８０２１０号
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ｃｈｕ，Ｂ．Ｃ，Ｇａｒｃｉａ−Ｈｅｒｒｅｒｏ，Ａ．，Ｊｏｈａｎｓｏｎ，Ｔ．Ｈ．，Ｋｒｅｗｕｌａｋ，Ｋ．Ｄ．，Ｌａｕ．Ｃ．Ｋ．，Ｐｅａｃｏｃｋ，Ｒ．Ｓ．，Ｓｌａｖｉｎｓｋａｙａ，Ｚ，Ｖｏｇｅｌ，Ｈ．Ｊ．：Ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｂａｔｔｌｅｆｏｒ  ｉｒｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ；ａ  ｂｉｒｄ’ｅｙｅ  ｖｉｅｗ．Ｂｉｏｍｅｔａｌｓ（２０１０）２３（４），６０１−６１１．
【非特許文献２】Ｄｕ，Ｚ．（１９９４）：Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃｏｐｐｅｒ  ｉｎ  ｃｏｐｐｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎａｔｅ，ｃｏｐｐｅｒ  ｌｙｓｉｎｅ  ａｎｄ  ｃｕｐｒｉｃ  ｓｕｌｆａｔｅ，ａｎｄ  ｃｏｐｐｅｒ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｈｏｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｊｅｒｓｅｙ  ｃａｔｔｌｅ．Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｋｅｎｔｕｃｋｙ，  Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ
【非特許文献３】Ｋａｋｕｋｋ  Ｔｉｂｏｒ，ｄｒ．Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｊａｎｏｓ，１９８８．Ｔａｋａｒｍａｎｙｏｚａｓｔａｎ  ３．４．：１２２−１４５
【非特許文献４】Ｌｅｏｎｇ，Ｊ．（１９８６）Ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅｓ：ｔｈｅｉｒ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．，２４：１８７−２０９．
【非特許文献５】Ｍａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｅｅｄ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｐｒｏｃ．ｏｆ  Ａｌｌｔｅｃｈ’ｓ  Ｔｅｎｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ．ｐ．３２３−３３３
【非特許文献６】Ｍｉｅｔｈｋｅ  ａｎｄ  Ｍａｒａｈｉｅｌ，（２００７）ＳＩＤＥＲＯＰＨＯＲＥ−ＢＡＳＥＤ  ＩＲＯＮ  ＡＣＱＵＩＳＩＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＰＡＴＨＯＧＥＮ  ＣＯＮＴＲＯＬ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．７１（３），４１３−４５１
【非特許文献７】Ｎｅｉｌａｎｄｓ，Ｊ．Ｂ．（１９８１）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｉｒｏｎ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５０：７１５−７３１．
【非特許文献８】Ｎｅｉｌａｎｄｓ，Ｊ．Ｂ．，Ｋｏｎｏｐｋａ，Ｋ．，Ｓｃｈｗｙｎ，Ｂ．，Ｃｏｙ，Ｍ．，Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｒ．Ｔ．，Ｐａｗ，Ｈ．，Ｂａｇｇ，Ａ．（１９８７）Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｉｒｏｎ  ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｉｒｏｎ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ，Ｐｌａｎｔｓ  ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌｓ．（Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ，Ｇ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  ｅｌｍ，Ｄ．，Ｎｅｉｌａｎｄｓ，Ｊ．Ｂ．Ｅｄｓ．），（ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ｐｐ．３−３３．
【非特許文献９】Ｑｕｉｎｎ  Ｐ．Ｊ．，Ｃａｒｔｅｒ  Ｍ．Ｅ．，Ｍａｒｋｅｙ  Ｂ．Ｋ．，Ｃａｒｔｅｒ  Ｇ．Ｒ．，１９９４．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｏｌｆｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｎｄｏｎ
【非特許文献１０】Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）：Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅ，ｉｒｏｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ａｎｄ  ｉｒｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎａｔｅ  ｏｎ  Ｃｕ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕ  ｓｕｌｆａｔｅ  ａｎｄ  Ｃｕ  ｐｒｏｔｅｉｎａｔｅ．Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．７８：１８７（Ｓｕｐｐｌ．１）．
【非特許文献１１】Ｗｅｇｅｒ，Ｌ．Ａ．ｄｅ，Ｂｏｘｔｅｌ，Ｒ．ｖａｎ，Ｂｕｒｇ，Ｂ．ｖａｎ  ｄｅｒ，Ｇｒｕｔｅｒｓ，Ｒ．，Ｇｅｅｌｓ，Ｆ．Ｐ．，Ｓｃｈｉｐｐｅｒｓ，Ｂ．，Ｌｕｇｔｅｎｂｅｒｇ，Ｂ．（１９８６）Ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅｓ  ａｎｄ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ，ｐｌａｎｔ−ｇｒｏｗｔｈ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ，ｒｏｏｔ−ｃｏｌｏｎｉｚｉｎｇ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６５：５８５−５９４．
【非特許文献１２】Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｒｅｇｕｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１８（３），４１９−２７
【非特許文献１３】Ｃｈｕ，Ｂ．Ｃ，Ｇａｒｃｉａ−Ｈｅｒｒｅｒｏ，Ａ．，Ｊｏｈａｎｓｏｎ，Ｔ．Ｈ．，Ｋｒｅｗｕｌａｋ，Ｋ．Ｄ．，Ｌａｕ．Ｃ．Ｋ．，Ｐｅａｃｏｃｋ，Ｒ．Ｓ．，Ｓｌａｖｉｎｓｋａｙａ，Ｚ，Ｖｏｇｅｌ，Ｈ．Ｊ．：Ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｂａｔｔｌｅｆｏｒ  ｉｒｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ；ａ  ｂｉｒｄ’ｅｙｅ  ｖｉｅｗ．Ｂｉｏｍｅｔａｌｓ（２０１０）２３（４），６０１−６１１．
【非特許文献１４】Ｄｕ，Ｚ．（１９９４）：Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃｏｐｐｅｒ  ｉｎ  ｃｏｐｐｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎａｔｅ，ｃｏｐｐｅｒ  ｌｙｓｉｎｅ  ａｎｄ  ｃｕｐｒｉｃ  ｓｕｌｆａｔｅ，ａｎｄ  ｃｏｐｐｅｒ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｈｏｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｊｅｒｓｅｙ  ｃａｔｔｌｅ．Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｋｅｎｔｕｃｋｙ，  Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ
【非特許文献１５】Ｋａｋｕｋｋ  Ｔｉｂｏｒ，ｄｒ．Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｊａｎｏｓ，１９８８．Ｔａｋａｒｍａｎｙｏｚａｓｔａｎ  ３．４．：１２２−１４５
【非特許文献１６】Ｌｅｏｎｇ，Ｊ．（１９８６）Ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅｓ：ｔｈｅｉｒ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．，２４：１８７−２０９．
【非特許文献１７】Ｍａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｅｅｄ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｐｒｏｃ．ｏｆ  Ａｌｌｔｅｃｈ’ｓ  Ｔｅｎｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ．ｐ．３２３−３３３  Ｍｉｅｔｈｋｅ  ａｎｄ  Ｍａｒａｈｉｅｌ，（２００７）ＳＩＤＥＲＯＰＨＯＲＥ−ＢＡＳＥＤ  ＩＲＯＮ  ＡＣＱＵＩＳＩＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＰＡＴＨＯＧＥＮ  ＣＯＮＴＲＯＬ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．７１（３），４１３−４５１
【非特許文献１８】Ｎｅｉｌａｎｄｓ，Ｊ．Ｂ．（１９８１）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｉｒｏｎ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５０：７１５−７３１．
【非特許文献１９】Ｎｅｉｌａｎｄｓ，Ｊ．Ｂ．，Ｋｏｎｏｐｋａ，Ｋ．，Ｓｃｈｗｙｎ，Ｂ．，Ｃｏｙ，Ｍ．，Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｒ．Ｔ．，Ｐａｗ，Ｈ．，Ｂａｇｇ，Ａ．（１９８７）Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｉｒｏｎ  ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｉｒｏｎ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ，Ｐｌａｎｔｓ  ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌｓ．（Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ，Ｇ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  ｅｌｍ，Ｄ．，Ｎｅｉｌａｎｄｓ，Ｊ．Ｂ．Ｅｄｓ．），（ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ｐｐ．３−３３．
【非特許文献２０】Ｑｕｉｎｎ  Ｐ．Ｊ．，Ｃａｒｔｅｒ  Ｍ．Ｅ．，Ｍａｒｋｅｙ  Ｂ．Ｋ．，Ｃａｒｔｅｒ  Ｇ．Ｒ．，１９９４．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｏｌｆｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｎｄｏｎ  Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）：Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅ，ｉｒｏｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ａｎｄ  ｉｒｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎａｔｅ  ｏｎ  Ｃｕ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕ  ｓｕｌｆａｔｅ  ａｎｄ  Ｃｕ  ｐｒｏｔｅｉｎａｔｅ．Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．７８：１８７（Ｓｕｐｐｌ．１）．
【非特許文献２１】Ｗｅｇｅｒ，Ｌ．Ａ．ｄｅ，Ｂｏｘｔｅｌ，Ｒ．ｖａｎ，Ｂｕｒｇ，Ｂ．ｖａｎ  ｄｅｒ，Ｇｒｕｔｅｒｓ，Ｒ．，Ｇｅｅｌｓ，Ｆ．Ｐ．，Ｓｃｈｉｐｐｅｒｓ，Ｂ．，Ｌｕｇｔｅｎｂｅｒｇ，Ｂ．（１９８６）Ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅｓ  ａｎｄ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ，ｐｌａｎｔ−ｇｒｏｗｔｈ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ，ｒｏｏｔ−ｃｏｌｏｎｉｚｉｎｇ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６５：５８５−５９４．
【非特許文献２２】Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｒｅｇｕｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１８（３），４１９−２７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
有機キレートの作用機序における本発明者らの新たな知見は、特定の錯体化合物は、それ自体でまたは組み合わせて、腸管内での病原菌の増殖を阻害可能であるため、正常な腸内細菌叢（ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ））の有用なメンバーが優位（ｐｒｅｄｏｍｉｎｉｎｃｅ）であることを可能とするということである。なお、先行技術は、アミノ酸の微量元素キレート錯体の抗菌効果を示唆しなかった。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
したがって、本発明は、次の一般式、
（Ｍ）n（Ｘ）m（Ｙ）o
を有する、病原菌を阻害するための微量元素（ｍｉｃｏｒｌｅｍｅｎｔ）有機キレート錯体に関し、
式中、ＭはＺｎ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ａｇであり、
ＸはＮＨ4、Ｈ2Ｏであり、
Ｙはアミノ酸、脂肪酸、ヒドロキシ酸及び／またはポリアミノカルボン酸であり、
ｎは０−６であり、
ｍは１−６であり、
ｏは１−８である。
【００２３】
特許文献７は、ブラキスピラ・ヒオディセンテリアによって引き起こされる豚赤痢を処置するためのＥＤＴＡまたはその塩の使用を開示している。その中で使用されるＥＤＴＡまたはＥＤＴＡナトリウムの効率は、本発明による微量元素ＥＤＴＡ水キレート錯体または微量元素ＥＤＴＡアンモニウムキレート錯体の効率より劣る。水分子またはアンモニウム分子で形成されたキレート錯体は、シデロフォア類似体及び／または抗生物質（ａｎｉｂｉｏｔｉｃ）結合分子及び／またはＱＳシグナル分子結合分子として作用するような有利なキレート構造となり、そして約１０−５００ｍｇ／ｋｇの最小濃度で病原菌を阻害する。
【００２４】
化合物が、それらのマイクロカプセル化によって消化管の最初の部分で非吸収性であることによって、それらの抗菌効果を発揮する、特許文献８とは対照的に、本発明は、微量元素の錯体の他に、本発明者らがそのＯ−キレート及びＮ−キレートを調製した場合、次に、このように形成された特別な化合物の微生物学的活性は、これらの微量元素の単純錯体のそれよりもはるかに高いという知見に基づくものである。この新規な知見によれば、Ｏ−キレート及びＮ−キレートの錯体形成化合物に加えて、水分子若しくは別のＯ−キレート形成分子、またはアンモニウム若しくは別のＮ−キレート形成分子は、微生物に応じて配位結合で存在すべきである。
【００２５】
使用するアミノ酸は、好ましくは、２０個の天然型アミノ酸から成る群より選択される。
【００２６】
使用する脂肪酸は、好ましくは、ギ酸、酢酸、プロピオン酸及び酪酸から成る群より選択される。
【００２７】
使用するヒドロキシ酸は、好ましくは、マレイン酸または乳酸である。
【００２８】
ポリアミノカルボン酸は、好ましくは、ニトリロ三酢酸またはエチレンジアミン四酢酸である。
【００２９】
さらなる実施形態では、本発明は化合物に関し、病原菌は、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、サルモネラ・エンテリカ亜種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｐ．）、エンテリカ血清型エンテリティディス（Ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・インファンティス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、サルモネラ・ガリナリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ）、Ｓ．パラチフス（Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、Ｓ．アボルタス−エクイ（Ｓ．ａｂｏｒｔｕｓ−ｅｑｕｉ）、Ｓ．ジャバ（Ｓ．ｊａｖａ）、Ｓ．コレラ（Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）、Ｓ．チフス−スイス（Ｓ．ｔｙｐｈｉ−ｓｕｉｓ）、Ｓ．センダイ（Ｓ．ｓｅｎｄａｉ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・バラティ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂａｒａｔｉ）、Ｃｌ．ソルデリー（Ｃｌ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ）、Ｃｌ．ボツリヌスＡ−Ｆ（Ｃｌ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ａ−Ｆ）、Ｃ．ノービイＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ（Ｃ．ｎｏｖｙｙ  Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）、Ｃｌ．セプティカム（Ｃｌ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）、Ｃｌ．ショウベイ（Ｃｌ．ｃｈｕｖｏｅｉ）、Ｃｌ．ヒストリチカム（Ｃｌ．ｈｙｓｔｏｌｉｔｉｃｕｍ）、Ｃ．，スポロゲネス（Ｃ．，ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、Ｃｌ．テタニ（Ｃｌ．ｔｅｔａｎｉ）、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア、ブラキスピラ・ピロシコリ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ）、アルカノバクテリウム・ピオゲネス（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｉｏｇｅｎｅｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）から成る群より選択される。
【００３０】
好ましい実施形態では、本発明は、家禽の腸疾患、豚の腸疾患、牛の腸疾患、並びに表面処置、例えば家禽の壊死性皮膚炎を伴う潰瘍性足皮膚炎、乳牛の乳房炎、乳牛の子宮炎、有蹄動物の蹄病変、他の動物の腸内及び表在性の疾患から成る群より選択される疾患を処置または予防するための化合物に関する。
【００３１】
特に好ましい実施形態では、本発明は、亜鉛テトラアンモニウム（ｔｅｔｒａａｍｏｎｉｕｍ）ビス−グリシネートキレート、亜鉛マレイネート（ｍａｌｅｉｎａｔｅ）キレート、亜鉛ジアンモニウムマレイネートキレート、亜鉛テトラアンモニウムマレイネートキレート、亜鉛ジアンモニウムメチオネート（ｍｅｔｈｉｏｎａｔｅ）キレート、銅ジアンモニウムリシネート（ｌｙｓｉｎａｔｅ）キレート、亜鉛ジアンモニウムアミネート（ａｍｉｎａｔｅ）キレート、好ましくは、亜鉛モノ−グリシネートキレート、亜鉛ジグリシネートキレート、亜鉛ビス−グリシネートキレート、銅モノ−グリシネートキレート、銅ジ−グリシネートキレート、銅ビス−グリシネートキレート、亜鉛ジアンモニウムビス−マレイネートキレート、亜鉛ビス−マレイネートキレート、銅ビス−マレイネートキレート、銅ジアンモニウム（マレイネート）2キレート、より好ましくは、亜鉛モノ−グリシネートキレート、銅モノ−グリシネートキレート、亜鉛ジアンモニウムビス−マレイネートキレート、銅ジアンモニウム（マレイネート）2キレート、亜鉛ジアンモニウムエチレンジアミン四酢酸キレート、銅ジアンモニウムエチレンジアミン四酢酸キレート、最も好ましくは、銅ジアンモニウムビス−マレイネートキレート、亜鉛ジアンモニウムエチレンジアミン四酢酸キレート、銅エチレンジアミン四酢酸キレートから成る群より選択される化合物に関する。上記化合物の場合において、キレートの種類は、塩に加えて、例えばＨ2ＯなどのいわゆるＯ−キレート、または例えばアンモニウムなどのいわゆるＮ−キレートを含む。
【００３２】
さらなる実施形態では、本発明は、消化管の小腸部分において増殖して疾患を引き起こす細菌を阻害するため、及び／または前記細菌によって引き起こされる疾患を予防または処置するための化合物に関する。
【００３３】
別の態様では、本発明は、必要に応じて標準添加物と共に、本発明による化合物を含む組成物を提供する。
【００３４】
さらに好ましい実施形態では、本発明は、必要に応じて標準添加物と共に、本発明による少なくとも２つの相乗的に作用する化合物を含む組成物を提供する。
【００３５】
特に好ましい実施形態では、組成物は、必要に応じて標準添加物と共に、本発明による少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つまたはそれ以上の種々の相乗的に作用する化合物を含む。
【００３６】
別の態様では、本発明は、本発明による化合物または組成物を含む飼料添加物を提供する。
【００３７】
さらなる実施形態では、本発明は、好ましくは顆粒の放出可能な形態で適切な担体上に存在する飼料添加物に関する。
【００３８】
またさらなる実施形態では、本発明は、本発明による化合物、組成物または飼料添加物を含む飼料に関する。
【００３９】
さらなる実施形態では、本発明は飼料添加物を調製する方法に関し、前記方法は、本発明による化合物または組成物、及び必要に応じてさらなる標準飼料添加物成分を混合する工程を含む。
【００４０】
またさらなる実施形態では、本発明は飼料を調製する方法に関し、前記方法は、本発明による化合物、組成物または飼料添加物を標準飼料に混合する工程を含む。
【００４１】
別の実施形態では、本発明は、体重増加を増大させ、並びに／または飼料利用を増加させ、並びに／または卵の収量を増加させ、並びに／または家禽及び／若しくは豚及び／若しくは乳牛の個体群における死亡率を減少させるための、畜産業における本発明による化合物、組成物、飼料添加物または飼料の使用に関する。
【００４２】
有機金属キレートを使用することの利点は、良好な配位子を選択することによって、添加物もまた安価になるという事実によってさらに支持される。組成物の生産は非常に安価であるため、固定価格の利点を提供できる。有機金属キレートは、それらの静菌／殺菌特性により予防剤として経済的生産において大きな役割を果たしている。それらは、腸内細菌叢のバランスを回復するため、その産生のため、及び動物の健康にとって危険要因である通性病原微生物に対抗するために、有効であり得る。間違った飼料利用及び動物損失に起因した利益損失に加えて、感染した個体群を有する農場の抗生物質に対する年間費用はまた非常に高い。いくつかの場合では、例えば所定の製造所の豚農場における豚赤痢に効く組成物の費用は、使用される薬剤の費用の７０％を超えることがある。処置費用は平均で動物当たり約＄２−７．５である。この処置は、微量元素有機金属キレートプレミックスで置き換えられ得る。
【００４３】
同時に、有機形態で提供される銅及び亜鉛のグリシネートはより良好に利用されるだけでなく、驚くべきことに、微生物に対する阻害効果も有する。互いに組み合わせた有機結合微量要素キレート組成物は、腸内細菌叢のバランスを回復するため、その産生のため、及び動物の健康にとって危険要因である通性病原微生物に対抗するために、有効である。有機キレート錯体は、いくつかの通性病原菌によって引き起こされ得る豚大腸炎などの複雑な病因を有する疾患に有効であり得る。
【００４４】
【表１】
0006553510.tif 000002
【００４５】
有機キレートの作用機序における重要な因子は、それらが腸管内で病原菌の増殖を阻害可能であるため、正常な腸内細菌叢の有用なメンバーが優位であることを可能とすることである。本発明者らは、微量元素のモノ−、ジ−、ビス−グリシネート、メチオネート、リシネート、マレイネート、プロピオネート、ステアレート、バレリアネート（ｖａｌｅｒｉａｎａｔｅ）、ブチレートのＯ−キレート及び／またはＮ−キレートの化合物のいくつかの種類を研究し、細菌／菌類の増殖に対するそれらの効果を調査した。個々の微量元素キレートのＭＩＣ値を決定する過程で、本発明者らは経済的利益を有する非常に最適な組み合わせを選択し、そしてキレートの相互作用が細菌／菌類の生物学的特性にどのように影響するかに焦点を当てて研究を続けた。さらに、微量元素の投与における基本的な疑問は、どのように金属イオンと腸内細菌叢の他の成分との相互作用を吸収前に防止するかであり、これは、現在特許保護下の製剤を提供することによって達成され得る。
【００４６】
鉄、銅、亜鉛などの微量元素は、偏性及び通性の好気性微生物の代謝において中心的な役割を果たしているが、それらは環境中に微量で存在する。植物における鉄の利用可能度の低さは、主にオキシ水酸化第二鉄ポリマーの溶解度の低さに起因する。十分に酸化された植物部分内では、例えば鉄などの溶解性は主にＦｅ（ＯＨ）3に依存する。これらの化合物の溶解度定数は非常に低く（Ｋsol＝１０-38）、そのためｐＨ７でのＦｅ3+の濃度は１０-17であり、一方で、通常の植物の成長を可能とする最小濃度は１０-6Ｍである［Ｎｅｉｌａｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）（非特許文献８）］。これは、上記の矛盾を解決するのに重要な所定の微小環境の微生物叢における微量元素の獲得戦略である。このような環境では、大部分の微生物種は、良好に構築されかつ非常に効果的な鉄獲得機構及び／または微量元素獲得機構を有して、生存または「支配」し得る。植物はこれらの目的のために微生物の支援を使用する。
【００４７】
微生物は、不溶性の微量元素及び／または例えば、Ｆｅ（ＩＩＩ）酸化物を可溶化するために、３つの主要な機構：プロトン化、還元及びキレート形成を使用し得る。プロトン化は、例えば平衡定数をシフトさせることによって、Ｆｅ（ＯＨ）3錯体の解離の増加をもたらす（ｐＨにおける１単位の減少は、Ｆｅ（ＩＩＩ）イオンの溶解度において千倍の増加をもたらす）。これは自然界においていくらか制限されてのみ使用可能であることは明らかである。同じ（ｓｍｅ）ｐＨでＦｅ（ＩＩＩ）からＦｅ（ＩＩ）に変換することによって、溶解性が大幅に増加する。しかしながら、このプロセスは高エネルギーを必要とするステップを有する。
【００４８】
現実世界で普及しているキレート形成は、主に微生物によって産生される、いわゆるシデロフォアの助けを借りて行われている。微生物の環境において微量元素があまり利用できない場合には、多くの微生物は、低分子量代謝産物、シデロフォア及び部分的に外側の膜タンパク質を産生し始め、それらは種に特徴的であり、かつ例えば、Ｆｅ3+イオンに対して高い親和性を有し（外膜タンパク質は、Ｆｅ−シデロフォア錯体の認識及びイオンの吸収において役割を果たしている［Ｗｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）（非特許文献１１）］）、これらの成分はミネラル及び有機化合物（例えば、トランスフェリン、ラクトフェリン）から微量元素を溶解する。シデロフォアは低分子量で種特異的な二価配位子の分子であり、それは主に八面体（ｏｃｔａｅｄｅｒ）方向の６つの結合によって酸素原子を介してＦｅ（ＩＩＩ）イオンに結合し、かつキレートの形態で環境からＦｅ3+イオンを取り上げて、それらを微生物細胞に輸送する［Ｎｅｉｌａｎｄｓ，Ｊ．Ｂ．（１９８１）（非特許文献７）、Ｌｅｏｎｇ，Ｊ．（１９８６）（非特許文献４）］。微量元素の細胞サイトゾルへの輸送は、特異的な膜受容体及び鉄−シデロフォア錯体を認識する輸送系によって媒介される。したがって、わずかに酸性、中性またはアルカリ性の環境での小腸における微生物のシデロフォア産生は重要であり、かつそれらの増殖能に必要である一般的な現象である。
【００４９】
給餌の専門知識を持つ専門家は、微量元素（Ｚｎ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｍｎなど）が不足している飼料を与えられた動物は、より容易に胃腸疾患で病気になることを経験から知っている。疾患は微量元素の投与によっては消滅し得ないが、消化由来の疾患の発生は、バランスのとれた微量元素の供給によって少なくなる。
【００５０】
正常な（ｎｐｒｍａｌ）腸内細菌叢の構成要素は、小腸内に約１０9−１０10ＣＦＵ／ｍｌのかなりの量で存在する。これらは、ほとんどの場合、主に乳酸を産生してわずかに酸性のｐＨをもたらす有益なラクトバチルス、ビフィドバクテリウム種であり、そのため、それらはシデロフォアを産生する必要はない。いわゆる病原微生物、例えば、Ｅ．コリ、サルモネラ、クロストリジウム、ブラキスピラは、１０5ＣＦＵ／ｍｌの最大量よりも少ない量で、健康な腸内細菌叢に存在している。
【００５１】
最近の文献によれば、胃腸系内での病原微生物と非病原微生物との間の平衡は、ｐＨに起因するものであった。ラクトバチルスは酸性のｐＨ範囲で増殖し、かつ乳酸などの酸を産生するので、この仮説についての実際の根拠がある。病原微生物は中性またはわずかにアルカリ性の範囲で増殖し、そこでは正常な腸内細菌叢のメンバーは再生不可能である。ｐＨについてのこの知見は、畜産業でのプロバイオティクス、ラクトバチルスを含有する組成物の数十年の長期使用において基礎となっている。この処置の結果は様々であり、いくつかの場合では、それは驚くほど効果的であり、他の場合では、それは完全に効果がないことに留意しなければならない。
【００５２】
本発明者らは、消化管の問題を処置するための近年の技術状態と比較して、全く新たな驚くべき可能性を提供することを目的としている。微量元素キレートは、それらの特有の構造のために、より良好な吸収特性及び利用特性を有しており、かつ驚くべきことに、通性病原微生物の増殖を阻害可能である。処置に有用な化合物の範囲は広い。プロバイオティクスの場合には、いくつかの異なる微生物が使用され、使用される微生物の組成は予期する効果に応じて変化する。種々の微生物が鳥の場合において使用され、他の微生物が豚に使用される。本発明者らの現在の知見に基づいて、これは完全に保証される。なぜなら、鳥の場合において問題を引き起こしている病原微生物の組成は豚のものとは異なるからである。
【００５３】
本発明者らは、いわゆるシデロフォアキレート形成配位子は、正常な微生物叢と病原微生物との比の形成において主要な役割を果たし、それは金属イオンに対して「空腹」であるシデロフォア産生病原菌に対して、小腸のわずかにアルカリ性または中性の環境内で利点を提供することを理論化する。したがって、本発明による微量元素キレートが、意外にも細菌のシデロフォア結合膜受容体に結合するとき、病原菌はそれらの微量元素の取り込み、したがって増殖に利点を有さない。
【００５４】
大腸における腸内細菌叢の組成は、小腸のそれとは全く異なっている。例えばラクトバチルスによって支配されている腸内細菌叢の代わりに、大腸は例えばクロストリジウムによって支配されている腸内細菌叢を有し、すなわち、大腸は病原性支配の腸内細菌叢を有している。しかしながら、微量元素の吸収は小腸の後部で発生することが知られている。これに基づいて、本発明者らはまた、微量元素（ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｏｒ  ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ）を含有する錯体化合物であるシデロフォアキレート形成因子は、慢性的に炎症性の大腸内でこれらのシデロフォア配位子を産生する細菌に対して排他的な利点を提供することを理論化する。これは鳥において見出された頻繁に起こる臨床状態である。上記の知見からすると、微量元素化合物は、胃腸管に存在する病原性でシデロフォアを産生する微生物を阻害し得ることが見出され、かつ微量元素と有機化合物との組み合わせで構成されなければならないということになる。さらに、微量元素を含有するシデロフォアの受容体を飽和させる効果が本当であれば、次に小腸では、低濃度で病原微生物の増殖を阻害し、一方で高濃度でのみ正常な腸内細菌叢を形成する非病原性であるがシデロフォアを産生するエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）に作用し得る領域を化合物について調査しなければならない。
【００５５】
【化１】
0006553510.tif 000003
【００５６】
シデロフォアの構造：ＦｅシデロフォアのタイプＡ、Ｂ及びＣ並びに銅シデロフォアのタイプＤ、Ｅ及びＩ。
【００５７】
さらなる効果は、有機微量元素キレートのシデロフォア型配位子は、再生または細胞合成を阻害する抗生物質分子と結合するため、病原菌はそれを病原菌のシデロフォア受容体で吸収することである。したがって、より効果的な阻害剤及び／または致死効果は、抗生物質化合物単独よりも有機キレートに結合した抗生物質によって達成され得る。
【００５８】
さらなる効果は、細菌は高い数字で増殖するとき、細菌細胞間の伝達−クオラムセンシング（ＱＳ）−を介して、それらの遺伝子機能を同調させ、かつ特定の化合物を産生し得ることである。これは、細菌が、例えば腸の表面上または創傷領域上にいわゆるコロニーを作り、かつ層「バイオフィルム」を形成する量に細菌が達したときに発生する。これはまた、細菌が血中において十分な（ｓｕｆｆｉｃｕｅｎｔ）数であり、攻撃を受ける生物において最遠点に到達した場合に発生し得る。分泌されたＱＳシグナル分子の濃度の上昇は、細菌にとって集中的な増殖を開始するための信号である。ＱＳ分子は主として長鎖脂肪酸、キノール、脂肪酸のメチルエステル、Ｎ−アシルホモセリンの化合物であり、かつシデロフォアと同様に、細菌の特異的受容体に結合する。本発明者らの仮説によれば、これらの受容体は、シデロフォアと同様に、非特異的に微量元素有機キレート化合物によって飽和され得、そのためＱＳシグナル分子はそれらの効果を発揮することができない。これにより、細菌間の伝達、従ってそれらの増殖、コロニー形成及びバイオフィルム形成が防止される。
【００５９】
本発明者らの実験では、本発明者らは有機結合中の微量元素として主にＺｎ、Ｃｕ、Ｍｎ及びＦｅを含む化合物を研究した。本発明者らは、より効果的な微量元素供給源として既に飼料産業において使用されている既知の微量元素グリシネート、微量元素メチオネート、微量元素マロネート等は、特定の病原微生物に対して選択的阻害効果を有することを決定した。選択性及び生物学的活性は、微量元素キレートのＯ−キレート及びＮ−キレートを組み合わせることによって強化され得る。選択的な生物学的活性は、アミノ酸、例えばメチオニン、リシン、グリシンなど、一価の酸、例えば酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸など、ヒドロキシ酸、例えば乳酸など、ジカルボン酸、マレイン酸、ポリカルボン酸、並びに上記のＺｎ、Ｃｕ、Ｍｎ及びＦｅの塩を用いて達成された。驚くべきことに、微生物学的活性は、好ましくは水分子を用いたＯ−キレート、または好ましくはアンモニウムを用いたＮ−キレートを形成する場合に有意に増加する。
【００６０】
前述の微量元素はいわゆるキレート形成化合物であり、したがって、本発明者らは生物学的効果を保有する上記の微量元素のＮ−キレート及びＯ−キレートの化合物について本研究を拡張した。
【００６１】
さらに、本発明者らは、上記のＮ−キレート及びＯ−キレートの形成に加えて、中心金属イオンを有するキレート結合中に０−６個のアンモニアまたは０−６個の水分子を含むキレート化合物を調製した。
【００６２】
微量元素グリシネートキレートは、特にシデロフォアの構造に類似し得る。したがって、細胞のシデロフォア受容体に結合することによって、微生物の微量元素、例えば鉄の利用を防止し得るため、細胞は死滅する。したがって、鉄、亜鉛、銅、マンガン−グリシネートキレート錯体は、その構造のために、好ましくは、所定の細菌細胞の種特異的な膜受容体へのグリシネートキレート錯体の特異的な親和性によって、細菌細胞の膜受容体を被覆することが可能であり、微量元素の供給、その結果として生存率、再生、それ故好ましくは細胞死に直接影響を与える。効果は所定の菌種、菌株の受容体の感受性に依存し、そのため特定の菌種または菌株は感受性を有さない可能性があり、その結果として、微量元素キレートの効果は種特異的であると言える。適切に効果的なＭＩＣ及び／または好ましくはＣＩＤの効果を達成するために、全ての細菌群について別々の微生物学的測定が必要である。
【００６３】
いくつかの研究によれば、開発された微量元素キレート、例えばグリシネートは、血液の存在下であっても完全にグラム陽性菌の増殖を阻害した。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）株の増殖に対するその阻害効果は弱く、効果は他のグラム陰性菌及びいくつかの真菌に対してより強かった。種々の微量元素（ｍｏｃｒｏｅｌｅｍｅｎｔ）キレート抽出物を用いてこれまでに行われた研究から、最も多様な病原微生物及び食品を腐敗させる微生物に対するそれらの有効性が明確に実証された。これらの研究によれば、グラム陽性細菌に対するその活性はグラム陰性細菌に対するものよりも高く、一方で、本発明者らはまた、他の組成物において、インビトロ条件下でのグラム陰性細菌に対する顕著な効果を見出した。
【００６４】
鳥（ブロイラー鶏、産卵鶏、七面鳥）の壊死性腸炎及び急性豚赤痢の場合には、エンテロコッカス及びラクトバチルスの数が腸内細菌叢において大幅に減少し、同時に、フソバクテリア（ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属の細菌、Ｅ．コリ及び特定の大腸菌型細菌、及びクロストリジウムの数が増加する。長く持続する場合では、クロストリジウムの増加が明らかである。これらの全てに起因して、本研究はこの方向で行った：本発明者らの液体培養及び寒天拡散試験によれば、微量元素グリシネートキレートは、部分的にまたは完全にミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）、Ｅ．コリ、サルモネラ・エンテリティディス及びクロストリジウム・パーフリンジェンス株の成長を阻害する。最小阻害濃度または最小致死濃度（ＭＩＣ及びＣＩＤ）を生物学的アッセイにおいて測定し、各株について決定する。
【００６５】
微量元素グリシネートキレートを銅及び亜鉛のアミネートキレート化合物と組み合わせることで、本発明者らは細菌阻害能を向上させることができた。微量元素キレート混合物の最適比率は、寒天拡散及び液体培養の生物学的アッセイにおいて決定される。微生物学的観点から金属キレート錯体の効果を調査するとき、本発明者らは、特定の濃度で投与した場合、金属キレート錯体は病原微生物のいくつかの成長に有効であり、一方で、同じ濃度において、正常な腸内細菌叢を形成する微生物集団の再生は無傷であることを観察した。種々の金属キレート化合物を調製するために種々の金属イオンを使用すると、種々の抗菌効果が測定され得る。錯体を調製するために使用するＺｎ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｍｎイオンは、本発明者らが錯体形成時に同じ配位子を使用する時であっても、異なる濃度で微生物に対してそれらの効果を発揮する。実験の間、本発明者らは、インビトロにおいて微量元素キレートのＺｎ及びＣｕのグリシネートの組み合わせは、二重の相乗的な組み合わせで調査したＳ．エンテリカ、及び三重の相乗的な組み合わせで調査したＣ．パーフリンジェンスによって引き起こされる腸内疾患の予防に有用であり、一方で、正常な腸内細菌叢（例えば、ラクトバチルス、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ））に対する選択的な作用は、通性病原微生物の増殖を防止し、一方で、正常な腸内細菌叢を形成する乳酸菌及び酵母を阻害しないことを見出した。主に表在性疾患を引き起こす病原体であるクロストリジウム・バラティ、Ｃｌ．ソルデリー、Ｃｌ．ボツリヌスＡ−Ｆ、Ｃｌ．ノービイＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｃｌ．セプティカム、Ｃｌ．ショウベイ、Ｃｌ．ヒストリチカム、Ｃ．，スポロゲネス、Ｃｌ．テタニは、同様に、銅及び亜鉛の有機キレート、好ましくはキレートアミネート化合物に感受性を有する。
【００６６】
当然ならが、本発明による化合物は、各通性病原（ｐａｔｈｏｆｅｎｉｃ）菌の成長を阻害するため、腸内細菌叢の有益な要素を維持するため、及びこのような病原菌によって引き起こされる疾患を処置及び予防するために、ヒトへの適用においても同様に適している。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】亜鉛モノ−グリシネートキレートのＩＲスペクトル
【図２】銅モノ−グリシネートキレートのＩＲスペクトル
【図３】クロストリジウム・パーフリンジェンスは、ＴＳＡ寒天培地において阻害領域を形成していることを示す写真
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００６８】
亜鉛（Ｈ2Ｏ）ビス−グリシネートキレートの調製
１ｍｏｌのＺｎＯ（７９．５ｇ）に、２００ｍｌの蒸留水、２．１ｍｏｌのＮＨ4ＯＨ、及び４８．５ｇのＣＯ2を添加する。１２０℃かつ１０−１２ｂａｒの圧力で、４時間の反応時間後に、反応生成物はＺｎ（ＮＨ4）2ＣＯ3である。得られたキレート化合物のｐＨを、ＣＯ2を用いて８．０の値に設定する。この時点で、ＺｎＣＯ３の沈殿物が形成される。得られた沈殿物を濾過し、次いで、２ｍｏｌのグリシンと反応させる。このようにして、以下の構造（Ｉ）の化合物が形成される。
【００６９】
【化２】
0006553510.tif 000004
【００７０】
（Ｍ）（グリシン）2、式中、ＭはＺｎまたはＣｕである。式の化合物の好ましい例は、Ｚｎ（グリシン）2である。
【００７１】
好ましくは、化合物を調製するための乾燥工程を行って、適切な含水量を保つことで微量元素キレート化合物の含水量を維持する。生成物を１２−１４％の含水量まで乾燥させる場合、式（Ｉ）の化合物の粉末製剤が得られる。生成物をほぼゼロ〜約３％の含水量まで乾燥させる場合、次に、それは配位結合によって中心金属原子に結合しているその含水量を失う。この後者の生成物の生物学的活性は異なり、それは式（Ｉ）の化合物のそれよりも有意に低い。生成物は水中で高い溶解性を有する、厚く、吸湿性のある、粘性の化合物である。
【実施例２】
【００７２】
亜鉛ジアンモニウムビス−グリシネートキレートの調製
１ｍｏｌのＺｎＯ（７９．５ｇ）に、１５０ｍｌの蒸留水、２．２ｍｏｌのＮＨ4ＯＨ、及び４８．５ｇのＣＯ2を添加する。１２０℃かつ１０−１２ｂａｒの圧力で、４時間の反応時間後に、反応生成物はＺｎ（ＮＨ4）2ＣＯ3である。得られたキレート化合物を直接２ｍｏｌのグリシンと反応させる。以下の構造（ＩＩ）の化合物が得られる。
【００７３】
【化３】
0006553510.tif 000005
【００７４】
（Ｍ）（ＮＨ4）2（グリシン）2、式中、ＭはＺｎまたはＣｕである。グリシンは、例えば、メチオニン、リシン、アスパラギン酸などの任意のアミノ酸で置き換えられてもよい。式（ＩＩ）に従った好ましい化合物はＺｎ（ＮＨ4）2（グリシン）2である。
【実施例３】
【００７５】
亜鉛テトラアンモニウムビス−グリシネートキレートの調製
１ｍｏｌのＺｎＯ（７９．５ｇ）に、１００ｍｌの蒸留水、４．２ｍｏｌのＮＨ４ＯＨ、及び４８．５ｇのＣＯ2を添加する。１２０℃かつ１０−１２ｂａｒの圧力で、４時間の反応時間後に、反応生成物はＺｎ（ＮＨ4）4ＣＯ3である。得られたキレート化合物を直接２ｍｏｌのグリシンと反応させる。以下の構造（ＩＩＩ）の化合物が得られる。
【００７６】
【化４】
0006553510.tif 000006
【００７７】
（Ｍ）（ＮＨ4）4（グリシン）2、式中、ＭはＺｎ、ＣｕまたはＦｅである。グリシンは、例えば、メチオニン、リシン、アスパラギン酸などの任意のアミノ酸で置き換えられてもよい。式（ＩＩＩ）に従った好ましい化合物はＺｎ（ＮＨ4）4（グリシン）2である。
【実施例４】
【００７８】
亜鉛（Ｈ2Ｏ）2ビス−マラートキレートの調製
実施例１に記載の通りに調製したＺｎＣＯ3化合物に、２．０ｍｏｌのマレイン酸を水溶液中で添加する。以下の構造（ＩＶ）の化合物が得られる。
【００７９】
【化５】
0006553510.tif 000007
【００８０】
Ｚｎマレイネート。マレイン酸は、例えば、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸、クエン酸などの任意のヒドロキシ酸で置き換えられてもよい。亜鉛は、例えば銅などの別の微量元素で置き換えられてもよい。好ましくは、化合物を調製するための乾燥工程を行って、適切な含水量を保つことで微量元素キレート化合物の含水量を維持する。生成物を１０−１２％の含水量まで乾燥させる場合、式（ＩＶ）の化合物の粉末製剤が得られる。生成物をほぼゼロ〜約３％の含水量まで乾燥させる場合、次に、それは配位結合によって中心金属原子に結合しているその含水量を失う。この後者の生成物の生物学的活性は異なり、それは式（ＩＶ）の化合物のそれよりも有意に低い。
【実施例５】
【００８１】
亜鉛ジアンモニウムビス−マラートキレートの調製
実施例２に記載の通りに調製したＺｎ（ＮＨ4）2ＣＯ3化合物に、２．０ｍｏｌのマレイン酸を水溶液中で添加する。以下の化合物が得られる。
【００８２】
【化６】
0006553510.tif 000008
【００８３】
Ｚｎジアンモニウムマレイネート。マレイン酸は、例えば、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸、クエン酸などの任意のヒドロキシ酸で置き換えられてもよい。亜鉛は、例えば銅などの別の微量元素で置き換えられてもよい。
【実施例６】
【００８４】
亜鉛テトラアンモニウムビス−マラートキレートの調製
実施例３に記載の通りに調製したＺｎ（ＮＨ4）4ＣＯ3化合物に、２．０ｍｏｌのマレイン酸を水溶液中で添加する。以下の構造（ＶＩ）の化合物が得られる。
【００８５】
【化７】
0006553510.tif 000009
【００８６】
Ｚｎテトラアンモニウムマレイネート。マレイン酸は、例えば、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸、クエン酸などの任意のヒドロキシ酸で置き換えられてもよい。亜鉛は、例えば銅などの別の微量元素で置き換えられてもよい。
【実施例７】
【００８７】
亜鉛ジアンモニウムビス−メチオネートキレートの調製
実施例２に記載の通りに調製したＺｎ（ＮＨ4）2ＣＯ3化合物に、２ｍｏｌのメチオニンを水溶液中で添加する。
【００８８】
【化８】
0006553510.tif 000010
【００８９】
Ｚｎジアンモニウムメチオネート。
【実施例８】
【００９０】
亜鉛ジアンモニウムビス−リシネートキレートの調製
実施例２に記載の通りに調製した１ｍｏｌのＺｎ（ＮＨ4）2ＣＯ3化合物に、２ｍｏｌのリシンを添加する。
【００９１】
【化９】
0006553510.tif 000011
【００９２】
Ｚｎジアンモニウムリシネート。
【実施例９】
【００９３】
微量元素アミネートキレートの調製
実施例１に記載の通りに調製した１ｍｏｌのＺｎＣＯ3またはＣｕＣＯ3化合物に、２ｍｏｌの選択したアミノ酸を添加する。得られた化合物はＺｎ（アミネート）2キレートである。
【００９４】
生成物を１２−１４％の含水量まで乾燥させる場合、次にＺｎ（Ｈ2Ｏ）（アミネート）2が形成される。生成物をほぼゼロ〜約３％の含水量まで乾燥させる場合、次に、それは配位結合によって中心金属原子に結合しているその含水量を失う。この後者の生成物の生物学的活性は異なり、それはＺｎ（Ｈ2Ｏ）（アミネート）2化合物のそれよりも有意に低い。
【実施例１０】
【００９５】
微量元素ジアンモニウムキレートの調製
実施例２に記載の通りに調製した１ｍｏｌのＺｎ（ＮＨ4）2ＣＯ３化合物に、２ｍｏｌの選択したアミノ酸を添加する。得られた化合物はＺｎジアンモニウムアミネートキレートである。
【実施例１１】
【００９６】
微量元素ＥＤＴＡキレートの調製
実施例１に記載の通りに調製した１ｍｏｌのＺｎ（ＣＯ3）化合物に、１ｍｏｌのＥＤＴＡを水溶液中で添加する。反応完了後、好ましくは担体上に適用された最終生成物を１０％の含水量まで乾燥させて、以下のＯ−キレート化合物を得る。
【００９７】
【化１０】
0006553510.tif 000012
【実施例１２】
【００９８】
微量元素ジアンモニウムＥＤＴＡキレートの調製
実施例２に記載の通りに調整した１ｍｏｌのＺｎ（ＮＨ4）2ＣＯ3化合物を、１ｍｏｌのＥＤＴＡと反応させて、以下の化合物を得る。亜鉛はキレート形成微量元素としての銅、鉄またはマンガンで置き換えられてもよい。
【００９９】
【化１１】
0006553510.tif 000013
【実施例１３】
【０１００】
工場規模での亜鉛（Ｈ2Ｏ）モノ−グリシネートキレートの調製
本発明者らは８０００リットルの反応器中でキレートの調製を実施し、そして微量元素キレートを製造した。４０００リットルの水に、２８７５ｋｇの硫酸亜鉛七水和物及び７５０ｋｇのグリシンを添加した。９０℃で４時間反応させた後、亜鉛（Ｈ2Ｏ）モノ−グリシネート生成物が形成され、それを流動床乾燥機中でマイクロ顆粒に変換し、こうして生成物を得た。
【０１０１】
得られた生成物におけるキレート結合の形成は、構造決定技術（錯滴定金属イオン分析、加熱実験、酸塩基滴定、中央ＩＲスペクトルの記録）によって、かつ得られた生成物の遠赤外線スペクトルを記録することによって確認した。図１は、亜鉛（Ｈ2Ｏ）モノ−グリシネートキレートのＩＲスペクトルを示している。
ＩＲスペクトルの評価：
【０１０２】
２０００−４０００ｃｍ-1：
２つの明確なバンドが３１６０−３２１１ｃｍ-1及び３４５６−３３９０ｃｍ-1のそれぞれのバンド最大値で出現している。後者のバンドの場合には、より高い波数範囲においてショルダーが存在する。先のバンドは（グリシン、グリシンＨＣｌのスペクトルに基づいて）ＮＨ3+基のＮＨ原子価振動に割り当てられ得る。後者のバンドは、配位した水分子に割り当てられ得る。「ショルダー」の存在は、様々な強さの水分子結合（例えば、配位及び非配位、水素結合によってのみ結合）が存在していることを示唆するものである。
【０１０３】
１６００、１４００ｃｍ-1及びそれらの近傍でのバンド：
両方の場合において、１つの鋭くかつ強いバンド最大値が（１６４３、１６４３、１６４９、１６５２、１６５１ｃｍ-1）及び（１４１２、１４１１、１４１０、１４０９、１４１０ｃｍ-1）それぞれで観察され得る。これは、それぞれの場合において、グリシンのカルボキシレート基が配位していることを示唆している。各バンド最大値の差異（２３１、２２２、２３９、２４３、２４１ｃｍ-1）は二座配位を示唆しており、すなわち両方の酸素が配位している。Ｘ線回折データ［３］に基づいて、Ｃｕ（グリシン）ＳＯ4×２Ｈ2Ｏ、Ｚｎ（グリシン）ＳＯ4×２Ｈ2Ｏ錯体の場合において提案されたように、ブリッジ型の結合が推定され得る。
【０１０４】
１５００ｃｍ-1及びその近傍：
各サンプルにおいて、約１５００ｃｍ-1（１４９２、１４８０、１４７８、１４７８、１４７６ｃｍ-1）に最大値を有する中強度のバンドが観察され得、それは、２０００−４０００ｃｍ-1の範囲で観察されたものと一致して、明確にプロトン化グリシン（ＮＨ3+）の存在を示唆している。
【０１０５】
１１００及び６００ｃｍ-1、並びにそれらの近傍：
各サンプルにおいて、強いバンドは１１００及び６００ｃｍ-1（それぞれ１１００、１０８１、１１０８、１１１３、１１１３、１１１４及び６３１、６１７、６１８、６１８、６１７ｃｍ-1）の波数付近で観察され得る。同時に、ショルダーがより高い波数範囲で観察され得、それは硫酸イオンがイオンまたは／及び単座の様態で（１つの酸素で）金属イオンに配位していることを示唆している。
【０１０６】
グリシンの代わりに、任意の他のアミノ酸、例えば、メチオニン、リシン、アスパラギン酸などが存在してもよい。亜鉛は別の微量元素、例えば、銅、マンガンなどで置き換えられてもよい。
【実施例１４】
【０１０７】
工場規模での銅モノ−グリシネートキレートの調製
１．８立方メートルの水に、３７５ｋｇのグリシンを６０−７０℃で添加した。この溶液に、１２５０ｋｇの結晶性ＣｕＳＯ4を８０℃に加熱しながら添加し、次いで３０分間冷却する。反応生成物を流動床乾燥機中でマイクロ顆粒に乾燥する。
【０１０８】
工場生成物のＣｕ−キレート−グリシン配位は、ＩＲスペクトルで明確に視認できる。グリシン分子はカルボキシル基を介して配位しており、かつアミノ基はプロトン化されたままである。カルボキシレート基は二座架橋で配位している。２種類のグリシン分子が異なる環境で配位した状態で視認できる。グリシンは、二座架橋配位子として、カルボキシル基を介して配位する。グリシンのアミノ基はプロトン化されたままである。硫酸イオンは単座及び／または二座の様態で配位する。図２は、銅モノ−グリシネートキレートのＩＲスペクトルを示している。
【０１０９】
２０００−４０００ｃｍ-1：バンド最大値は波数３１３８及び３１９２ｃｍ-1それぞれにおいて、低波数範囲でのいくつかのより小さな最大値と共に視認できる。
【０１１０】
１６００、１４００ｃｍ-1及びそれらの近傍：２つの各バンドの最大値は、１６４７、１５８０（両方の場合）及び１４５８、１４１０及び１４６３、１４０９ｃｍ-1の波数値それぞれで視認できる。
【０１１１】
１５００ｃｍ-1及びその近傍：中強度のバンドが１５１２及び１５０２ｃｍ-1それぞれの値で視認できる。
【０１１２】
１１００及び６００ｃｍ-1並びにそれらの近傍：ショルダーを有する３つ及び２つのバンド最大値がそれぞれ視認できる。
【０１１３】
結論：グリシンのカルボキシル基は配位しており、アミノ基はプロトン化されている。硫酸イオンは二座の様態で銅イオンに結合している。
【実施例１５】
【０１１４】
亜鉛及び銅のモノ−グリシネートキレートの混合物の調製
実施例１３で調製した１０００リットルのＺｎモノ−グリシンキレートを、実施例１４で調製した２５０リットルのＣｕモノ−グリシンキレートと６０℃にてブレード型ミキサー反応器中で混合し、次いで、このようにして得られた混合物を流動床乾燥機中でマイクロ顆粒に乾燥する。
【実施例１６】
【０１１５】
通性病原微生物及び正常な腸内細菌叢の構成要素に対する微量元素キレート化合物のＭＩＣ及びＣＩＤの濃度の決定
実用的、治癒的な医療の観点から、抗菌剤の耐性スペクトルである、抗菌活性を調査するための従来の方法は、ディスク拡散、または寒天ウェル拡散アッセイ、及び液体培地で行われる希釈実験である。標準化された（ＮＣＣＬＳ、ＤＩＮなど）ディスク拡散または穴拡散アッセイでは、抗菌剤の効果は寒天培養皿の表面上に広がった試験微生物の成長において調査される。寒天拡散アッセイでは、例えば、菌叢を寒天皿上で調製し、次いで、研究室で開発された手順に従って、寒天ディスク切断装置を用いて接種したプレートの中央に穴を開ける。その後、１０−１００μｌのアッセイサンプルを穴に入れる。試験化合物は、菌叢上に配置された試験ディスクから、または寒天皿に開いた穴から培養培地に拡散し、こうして、ディスクまたは穴の周囲に成長−増殖阻害領域が形成される。寒天拡散試験に基づいて、調査する株の感受性は、明確に試験化合物に対して決定され得る。臨床実践に従って、（領域の直径が薬剤の濃度に比例する）抗生物質製剤の標準化されたアッセイと同様に、本発明者らは、ディスク穴の周囲に形成された感受性領域に照らして分類する。各薬剤の場合において、微生物は、領域の直径に基づいて、所定の薬剤に耐性または感受性を有すると見なされる。新たな抗菌剤の使用には高いレベルの注意が必要とされる。すなわち、例えば、培地のｐＨ、溶解Ｏ2またはＣＯ2の濃度、培地の成分との相互作用など、何が（寒天拡散アッセイにおいて）抗菌剤の拡散に影響を与えるかが知られていないため、所定の薬剤及び微生物の両方に適した適切な技術及び培地を複数の要因に基づいて選択しなければならない。培養希釈試験において液体培地中で微生物の適切な濃度を調製し、かつ成長及び増殖の進行は、顕微鏡及び／または光学技術により確認した。この試験により、所定の微生物に対する目的の薬剤の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を決定することが可能となる。さらに、薬剤が、静的（成長阻害剤）またはｃｉｄ（すなわち微生物致死作用を有する）効果のみを有するかどうかを決定するために、成長を示さないチューブ内の微生物の死も確認する場合、次に最小ｃｉｄ濃度（ＭＣＣ）もまた決定され得る。ＭＣＣ／ＭＩＣの比率は、インビボでの薬剤の有効性に関する重要な情報を与える。この値が高い場合には、インビボでの薬剤の有用性は恐らく低い。
【０１１６】
【表２】
0006553510.tif 000014
【０１１７】
アッセイで使用するまで、株は２５％の滅菌グリセロールを含むＴＳＢブロス（Ｓｃｈａｒｌａｕ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）中で懸濁形態にて、−８０℃で凍結させてまたは凍結乾燥させて保存した。
【０１１８】
Ｂ．ヒオディセンテリア株（Ｂ／０６）の単離
Ｂ．ヒオディセンテリア株は、ハンガリーの種々の地域で育てられた、ブタ赤痢の臨床症状を示す成長中の飼育豚から単離した。食肉処理場での屠殺後、臨床徴候を示す豚の結腸切除物を固定し、６時間以内に研究室に輸送した。結腸部を開いた後、サンプルを結腸粘膜から擦過物として得た。全ての場合において、ストリーカ上の粘膜擦過物を、１０％の脱繊維牛血液及び４００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｋｆｔ．）を補充した新たに調製したＴＳＡ（トリプトン−大豆）寒天（Ｓｃｈａｒｌａｕ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）の表面上に広げた。接種後、培養物を厳密な嫌気性条件下で４２℃にて９６時間インキュベートした。嫌気性条件は、嫌気性ガス発生パウチ（Ｏｘｏｉｄ、ガス発生キット、嫌気システムＢＲ００３８Ｂ）及び嫌気培養ジャー（Ｏｘｏｉｄ、嫌気ジャー）を用いて達成した。一次及び二次の生化学的特性の決定及び単離株の同定は、標準的な技術を用いて実施した（非特許文献９）。
【０１１９】
インビトロ阻害実験
所定量（ｐｐｍ、ｍｇ／ｋｇ、μｇ／ｍｌ）の微量元素を保存溶液からの微生物培養培地に添加する。種々の組成のサンプル溶液を、２４ウェルのグライナー組織培養プレートにおいて液体培養培地中で２倍に連続的に希釈し、その後、生理食塩水を用いて調製した０．５ＭａｃＦａｒｌａｎｄ密度の５μｌのサンプル細菌の懸濁液を、種々の濃度の液体培養培地中に量り入れた。活性成分の組合せをアッセイする場合、２つの異なる溶液を２方向からプレートの表面全体にわたって希釈したときに、クロス希釈技術が使用された。アッセイする細菌に必要な大気条件でプレートを２４時間インキュベートした。次いで、結果を読み取り、こうして試験化合物の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を決定した。最小致死濃度（ＣＩＤ）をアッセイする場合、次にインキュベーション期間後に混濁を示していないウェルから、１０μｌの溶液を血液寒天の表面に接種し、インキュベーション期間後にいくらかの細菌の成長が培養培地の表面上で発生したかどうかを確認した。
【０１２０】
寒天ゲル拡散
クロストリジウム・パーフリンジェンス：好気性または嫌気性の容器中で成長した株は滅菌寒天上で増殖し、そこから０．５ＭａｃＦａｒｌａｎｄ密度の懸濁液を滅菌生理食塩水を用いて調製し、次に、綿棒を用いて培養培地の表面に接種した。専用の穿刺具を用いて接種培地に穴を開け、その後、５０μｌの様々な濃度の微量元素キレート錯体の試験溶液を穴に量り入れた。培養の評価は目視検査によって行った。穴の周囲に形成された阻害領域の存在は、試験溶液の有効性を示している。
【０１２１】
Ｂ．ヒオディセンテリア（Ｂ／０６）：これらのアッセイでは、前培養物を血液寒天（５−１０％の脱繊維牛血液を補充した変性トリプトン大豆寒天）上で解凍した細菌塊から調製した。明らかに良好に溶血した前培養寒天プレートから、８−１０個のほぼ同じ大きさ（±５％の差）の寒天ブロック接種物を切除し、その後、約５ｍｍの直径の丸い端部を有する滅菌ガラス棒を用いて、９０ｍｍの直径の新たに調製した寒天プレート上に広げた。プレートを５分間被覆した形態で乾燥した。
【０１２２】
研究室で開発された手順に従って、寒天ディスク切断装置を用いて接種プレートの中央に穴を開けた。１００μｌの試験化合物の所定の希釈物を５ｍｍの直径の穴に入れた。既知の濃度の溶液を滴下した後、プレートを１５分以内にａｎａｅｒｏｓｔａｔ（Ｏｘｏｉｄ、嫌気パウチ及びジャー）に入れ、酸素を含まない雰囲気中で４−５日間３７℃でインキュベートした。
【０１２３】
クロストリジウム・パーフリンジェンスの細菌培養は、寒天皿の中央の穴に入れた微量元素有機キレートによって阻害される。寒天中に拡散した化合物は、濃度に応じて、かつ希釈の効果に起因して、輪郭がはっきりした同心円状の阻害領域を形成し、阻害効果は一定の距離を経て停止し、かつ培養物は阻害領域を過ぎて成長を示す（図３を参照のこと）。
【０１２４】
ＣＩＤ値の決定
これは微生物の完全な死を引き起こす活性成分の濃度である。層流ボックス内において滅菌条件下で、希釈系列を２４時間インキュベートした液体培養培地から調製し、その後、希釈系列からの各１００μｌを寒天皿上に置き、滅菌ガラス棒で広げた。インキュベーション期間は、微生物の成長に好ましい条件下で２４時間であり、その後、寒天皿上のコロニー数を計数する。
【０１２５】
評価において２つの選択肢を考慮した。
１．寒天皿上でコロニーは全く視認できない。
２．寒天皿上に計数可能な視認できるコロニーが存在する。
【０１２６】
インキュベーション後に培養培地上でコロニーが全く視認できない場合には、それは微量元素キレートの微生物致死効果（ＣＩＤ）を示唆している。寒天皿上で成長した計数可能なコロニーの数は、所定の微量元素キレートの実際のＭＩＣ値を与える。
【実施例１７】
【０１２７】
微量元素（亜鉛、銅、鉄、マンガン）キレート（モノ−、ジ−及びビス−アミネート、脂肪酸、並びにヒドロキシ脂肪酸、ポリアミノカルボン酸）化合物の微生物学的なＭＩＣ及びＣＩＤの結果
微生物学的アッセイ系は、調査した微量元素キレート錯体サンプルの種々の濃度で生物学的活性を示した。
【０１２８】
実施した実験の結果から、アッセイサンプルが種々のＭＩＣ値を有することが見られる。試験した病原体及び通性病原体は、正常な腸内細菌叢の構成要素、菌類及び乳酸産生株の感受性よりも有意に高い感受性を有する。これらの試験化合物を飼料に混合することは予防的であり得、それは平衡状態を維持することに加えて、病原体及び通性病原体の成長を防止するということが、インビトロの結果から結論付けられる。調査したキレート化合物は種々のＭＩＣ値を有していることが判明した。
【０１２９】
【表３】
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0006553510.tif 000016
0006553510.tif 000017
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【０１３０】
上記の結果からいくつかの結論を引き出すことができる。そして、調査した微量元素キレート化合物の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を、１つ以上の通性病原微生物について決定した。例外なく、全てが病原微生物を阻害可能であることを決定した。６０−２００ｐｐｍの濃度でミクロコッカス・ルテウス、及び／または７０−４００ｐｐｍの濃度でエシェリキア・コリ、及び／または８０−４８８ｐｐｍの濃度でサルモネラ・エンテリカ、及び／または４０−４９８ｐｐｍの濃度でスタフィロコッカス・アウレウス、及び／または１０−４２７ｐｐｍの濃度でストレプトコッカス・アガラクチア、及び／または６５−１６７ｐｐｍの濃度でクロストリジウム・パーフリンジェンス、及び／または９０−４９４ｐｐｍの濃度でブラキスピラ・ヒオディセンテリア、及び／または２１−１８４ｐｐｍの濃度でアルカノバクテリウム・ピオゲネスを阻害した。
【０１３１】
正常な腸内細菌叢の構成要素、乳酸産生株のラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス、ラクトバチルス・カゼイ  ｖ．ラムノーサス及びロイコノストック・メセンテロイデス並びに／またはサッカロマイセス・セレヴィシエ（ＬＳＥ）は、５００ｐｐｍまたはそれを超える濃度で、好ましくは８００−１０００ｐｐｍの濃度でのみ阻害された。
【実施例１８】
【０１３２】
微量元素（亜鉛、銅、鉄、マンガン）モノ−グリシネートキレートの二重相乗調査。微量元素成分の相乗研究
２つ以上の試験化合物の間の相乗効果は、それらの生物学的効果がそれらの相互作用によって増強されるときに存在する。ＭＩＣ及びＣＩＤ値を知ることは、微量元素キレートの選択性を確保するために重要であると考えられた。この目標を達成するために、本実験は、微量元素キレートを共に研究しながら相乗効果を探求するために継続した。
【０１３３】
【表４】
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【０１３４】
【表５】
0006553510.tif 000020
【０１３５】
これらの結果に基づいて、６個の微量元素キレートの最小阻害濃度（ＭＩＣ）を、病原性のサルモネラ・エンテリティディスについて決定した。これらの微量元素キレートの濃度は、正常な腸内細菌叢の構成要素（ＬＳＥ及びラクトコッカス）（８００ｐｐｍ）に実質的に影響を及ぼさない。しかしながら、通性病原性Ｅ．コリの場合、これらの６個の微量元素キレートのうちの５個の異なる組成物が、有効な相乗ＭＩＣ値を有する。
【実施例１９】
【０１３６】
微量元素（亜鉛、銅）及びアニオン（アミノ酸、有機酸及びヒドロキシ酸など）のキレートの複数相乗調査
実施例１８に示したものに加えて、相乗効果は微量元素を組み合わせたときに認められるだけでなく、相乗効果は化合物のアニオン部分、すなわちアミノ酸、酸を組み合わせたときにも認識できた（表６）。
【０１３７】
表のデータに基づいて、相乗効果は、種々の金属から成るキレート化合物を最適に混合するだけでなく、アニオン部分を最適に混合する場合に基礎の化合物を超えて存在し、かつＮＨ4+、Ｈ2Ｏの配位子から成るキレートを混合する場合、集合体効果が得られると結論付けられる。
【０１３８】
【表６】
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【０１３９】
説明：
４９−３９０ｐｐｍの濃度の炭酸亜鉛アンモニウムアミネートのｇｌｙ（グリシン）、ａｓｐ（アスパラギン酸）、ｇｌｕ（グルタミン酸）、ｈｉｓ（ヒスチジン）、ｌｙｓ（リシン）及びａｌａ（アラニン）の６個の組み合わせの相乗効果を有する微量元素アニオンキレート、また３７−２３８ｐｐｍの濃度の六重相乗効果の微量元素アニオンキレートの亜鉛アミネート及び１５−１１７ｐｐｍの濃度の六重相乗効果の銅アンモニウムアミネートは、通性病原微生物の増殖を妨害することによって、Ｅ．コリ及びサルモネラ・エンテリティディス、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・アガラクチア及びクロストリジウム・パーフリンジェンスによって引き起こされる可能性のある疾患を防ぐため、インビトロで有用である。
【実施例２０】
【０１４０】
微量元素（亜鉛、銅、鉄）モノ−グリシネートキレートの複数相乗調査。微量元素成分の相乗研究
微量元素キレートの二重相乗効果が微生物の増殖に対して５０−８０％の結果を与えたことを知って、さらに三重相乗効果の研究を実施した。二重相乗効果の微量元素キレートの次に、第３の微量元素キレートを添加した。三重相乗効果を決定するために全てのアッセイ法を利用し、２つの液体及びマイクロプレートのアッセイが同様の結果をもたらしたときに得られた最終結果を示す。
【０１４１】
【表７】
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【０１４２】
【表８】
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【０１４３】
微量元素キレートは、正常な腸内細菌叢を形成する乳酸菌及び酵母を阻害しない一方で、通性病原微生物の増殖を選択的に禁止することにより、二重の相乗的組合せで調査したＥ．コリ及びサルモネラ、かつ三重の相乗的組合せで調査したクロストリジウム微生物によって引き起こされる腸内疾患を予防するため、インビトロにおいて有用である。
【実施例２１】
【０１４４】
微量元素（亜鉛、銅、鉄、マンガン）モノ−グリシネートキレートの効果的なｃｉｄまたは静的濃度の決定
実施例１６に記載の通りに最小致死濃度（ＣＩＤ）を決定する。
【０１４５】
【表９】
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【０１４６】
サルモネラ株の場合には、亜鉛キレートのＣＩＤ値はＭＩＣ値よりも３０倍高く、一方で、クロストリジウム株の場合には、銅キレートのＣＩＤ値はＭＩＣ値のわずか２倍である。この差はまた、微生物種の異なる感受性によって説明することができる。しかしながら、正常な腸内細菌叢の構成要素の場合には、両方のキレートがＭＩＣ及びＣＩＤの値について同じ濃度を有し、その結果は、正常な腸内細菌叢の構成要素の場合には、微生物の増殖はこれらの濃度では阻害されないが、微生物は死滅することを示す、ということが考慮されるべきである。
【実施例２２】
【０１４７】
亜鉛（Ｈ2Ｏ）2エチレンジアミン四酢酸及び銅（Ｈ2Ｏ）2エチレンジアミン四酢酸キレートの組み合わせを含む組成物を用いた試験的給餌実験。
ブラキスピラ・ヒオディセンテリアを保有する家畜において試験的な環境条件下で、成長中の豚を用いて実験的な給餌を２回実施した。
【０１４８】
対照群及び実験群の両方を１００頭の飼育ブタで構成した。実験群は、研究室の試験で決定した通り、１ｋｇ／トンの飼料用量で実験組成物を摂取した。最初の調査では、対照群はその飼料中で予防用量の抗生物質を接種した（表１０）。第２の調査では、赤痢を患った豚のみを個別に処置した（表１１）。調査したパラメータ：処置数、損失の発生、平均屠殺体重、及び飼料利用。
【０１４９】
【表１０】
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【０１５０】
【表１１】
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【０１５１】
第１実験（表１０）では、同じ長さの肥育時間後に、実験群の屠殺体重は対照群と比較して平均で２．８ｋｇ、すなわち２．６％多く、かつ１ｋｇの生体重を生じさせるのに必要な飼料の量は０．２ｋｇ少なく、それは飼料利用における６％の増加を意味している。
【０１５２】
第２実験（表１１）では、屠殺体重は実験群において３．９％多く、一方で、飼料利用は、実験群において対照群のそれよりも９．１％の値でより良好であった。
【実施例２３】
【０１５３】
銅（Ｈ2Ｏ）2ビス−グリシネートを含む組成物を用いた試験的給餌実験。
病原体のローソニア・イントラセルラリスに感染した家畜での動物ペア方法によって、試験的な環境条件下で成長中の豚を用いて実験的な給餌を実施した。対照群は、飼料に混合された通常の抗生物質サプリメントを摂取した。実験群の飼料には、１ｋｇ／ｔの配分で担体上の銅ジアンモニウムビス−グリシネートの組成物を補充した。
【０１５４】
調査したパラメータ：処置数、損失の発生、平均屠殺体重、及び飼料利用。
【０１５５】
【表１２】
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【０１５６】
実験群における屠殺体重は１．６％多かった。実験群における追加体重は６．２％多かった。実験群における飼料利用は、対照群のそれよりも実験群において６．８％の値で良好であった。
【実施例２４】
【０１５７】
クロストリジウム・パーフリンジェンス感染によって引き起こされる壊死性腸炎の症状を示す農場での、銅アンモニアビス−グリシネートキレートを用いた試験的実験。
各々１７１００羽のＲＯＳＳ−３０８の雛鶏を保持する２軒の畜舎で実験を実施した。農場はクロストリジウム・パーフリンジェンス感染に絶えず悩まされている。これには、数回に分けた抗生物質による処置が必要である。
【０１５８】
第１畜舎では対照群の個体を保持し、一方で第２畜舎では実験群の個体を保持した。対照群は、その飼料においてサプリメントを摂取しなかった。実験畜舎に保持された群れは、１．０ｋｇ／ｔの用量で担体に適用された銅ジアンモニウムビス−グリシネートが補充された飼料を摂取した。
【０１５９】
結果を表１３に要約する。
【０１６０】
【表１３】
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【０１６１】
実験群の体重増加は対照群のそれを４．６％超え、一方で、実験的な肉混成物の鶏は単位生体重増加において３．６％少ない飼料を必要とする。
【０１６２】
実験群における動物の顔は良好に形成され、下痢を示唆する変化の兆候は見られなかった。敷きわらはこの群ではやや乾燥しており、空気のアンモニア濃度は対照のそれよりも知覚的に低かった。
【０１６３】
実験組成物を給餌したときに、有害な副作用は観察されなかった。
【実施例２５】
【０１６４】
クロストリジウム・パーフリンジェンス攻撃感染後に、産卵鶏の群れに銅アンモニウムエチレンジアミン四酢酸を給餌することの効果
研究室条件下で、１０８羽の３２週齢の産卵鶏をケージ当たり３羽の産卵鶏の動物密度でケージに入れた。鳥の実験に入る前に、排泄腔綿棒を用いて病原体クロストリジウム・パーフリンジェンスについて試験した。群れは中程度にクロストリジウム・パーフリンジェンスに感染していることが証明された。
【０１６５】
各々３６羽の産卵鶏を含む３つの等しい群を１０８羽の鳥で形成した。
１．陰性対照群Ｉ  Ｃ．パーフリンジェンス陰性
２．陽性対照群ＩＩ  Ｃ．パーフリンジェンス陽性、２ｍｌの１０6ＣＦＵ／ｍｌのＣ．パーフリンジェンス細菌培養物を用いて胃プローブにより接種。
３．補充、処置群ＩＩＩ  Ｃ．パーフリンジェンス陽性、２ｍｌの１０6ＣＦＵ／ｍｌのＣ．パーフリンジェンス細菌培養物を用いて胃プローブにより接種。
【０１６６】
結果を表１４に示す。
【０１６７】
【表１４】
0006553510.tif 000029
【０１６８】
卵の生産量は、Ｃ．パーフリンジェンス感染に起因して、陰性対照群と比較して陽性対照群で１３％を超えて減少した。処置に応答して、卵の生産量は陰性対照群と比較して６．７％、及び陽性対照群と比較して２２．４％増加した。総卵重量は実験中に同様の傾向を示した。個々の卵の重量は陽性対照群で最大であったため、個々の卵の測定においては異なる傾向があった。
【実施例２６】
【０１６９】
亜鉛（Ｈ2Ｏ）2マレイネートによって離乳時に発生する下痢性疾患を防止するための給餌実験
亜鉛アンモニウムマレイネートを補充した飼料を３２日齢の離乳子豚に給餌した。実験動物はＥ．コリ感染症にかかっていた。対照群はＥ．コリ感染症を制御するために飼料中で標準抗生物質サプリメントを摂取した。
【０１７０】
生産収量を表１５に示す。
【０１７１】
【表１５】
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【０１７２】
平均の１日増体重は、実験群では対照群よりも４５％多かった。飼料利用は実験群では対照群よりも１３％良好であった。実験群では死亡は確認されなかったが、対照群では実験期間中に１匹の動物（３．６％）が死亡した。
【０１７３】
参考文献：
非特許文献１３〜２２
【図１】
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【図２】
0006553510.tif 000032
【図３】
0006553510.tif 000033