(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜７のいずれか一つのアミノ酸配列からなるタンパク質または前記タンパク質を発現する菌株を含む、フルクトースからタガトースを製造するためのタガトース製造用組成物。
【請求項２】
前記タンパク質は、フルクトースの４番炭素の位置をエピ化してタガトースに転換する酵素タンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記タンパク質は配列番号１のアミノ酸配列からなっていて、またロドテルムス・マリヌス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）由来の酵素タンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記タンパク質は配列番号２のアミノ酸配列からなっていて、またサーモトガ・ペトロフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ）由来の酵素タンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記タンパク質は配列番号３のアミノ酸配列からなっていて、またサーモトガ・レティンガエ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ）由来の酵素タンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記タンパク質は配列番号４のアミノ酸配列からなっていて、またサーモアナエロバクター・マスラニイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｔｈｒａｎｉｉ）由来の酵素タンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記タンパク質は配列番号５のアミノ酸配列からなっていて、またディクチオグロムス・ツルギダム（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ  ｔｕｒｇｉｄｕｍ）由来の酵素タンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記タンパク質は配列番号６のアミノ酸配列からなっていて、またサーモアナエロバクテリウム・キシラノリチクム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来の酵素タンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記タンパク質は配列番号７のアミノ酸配列からなっていて、またサーモアナエロバクター・シデロフィラス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｉｄｅｒｏｐｈｉｌｕｓ）由来の酵素タンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記菌株は、各々配列番号１ないし７のいずれか一つのアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターによって形質転換されたことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記タンパク質は配列番号１のアミノ酸配列からなっていて、またロドテルムス・マリヌス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）由来の酵素タンパク質であり、かつ、前記タンパク質は、分子量が５５ｋＤａ〜６０ｋＤａであり、最適活性温度が５０℃〜９０℃であり、最適活性ｐＨが６．０〜９．０であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記タンパク質は配列番号２のアミノ酸配列からなっていて、またサーモトガ・ペトロフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ）由来の酵素タンパク質であり、かつ、前記タンパク質は、分子量が５５ｋＤａ〜５８ｋＤａであり、最適活性温度が５０℃〜９０℃であり、最適活性ｐＨが７．０〜９．０であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記タンパク質は配列番号３のアミノ酸配列からなっていて、またサーモトガ・レティンガエ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ）由来の酵素タンパク質であり、かつ、前記タンパク質は、分子量が５５ｋＤａ〜５８ｋＤａであり、最適活性温度が５０℃〜９０℃であり、最適活性ｐＨが７．０〜９．０であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記タンパク質は配列番号４のアミノ酸配列からなっていて、またサーモアナエロバクター・マスラニイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｔｈｒａｎｉｉ）由来の酵素タンパク質であり、かつ、前記タンパク質は、分子量が５５ｋＤａ〜５８ｋＤａであり、最適活性温度が５０℃〜８０℃であり、最適活性ｐＨが７．０〜１０．０であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記タンパク質は配列番号５のアミノ酸配列からなっていて、またディクチオグロムス・ツルギダム（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ  ｔｕｒｇｉｄｕｍ）由来の酵素タンパク質であり、かつ、前記タンパク質は、分子量が５５ｋＤａ〜５８ｋＤａであり、最適活性温度が５０℃〜９０℃であり、最適活性ｐＨが７．０〜９．０であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記タンパク質は配列番号６のアミノ酸配列からなっていて、またサーモアナエロバクテリウム・キシラノリチクム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来の酵素タンパク質であり、かつ、前記タンパク質は、分子量が５３ｋＤａ〜５８ｋＤａであり、最適活性温度が５０℃〜９０℃であり、最適活性ｐＨが６．０〜９．０であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記タンパク質は配列番号７のアミノ酸配列からなっていて、またサーモアナエロバクター・シデロフィラス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｉｄｅｒｏｐｈｉｌｕｓ）由来の酵素タンパク質であり、かつ、前記タンパク質は、分子量が５５ｋＤａ〜５８ｋＤａであり、最適活性温度が５０℃〜８０℃であり、最適活性ｐＨが７．０〜１０．０であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１から１７までのいずれか一つに記載の組成物をフルクトースに反応させる工程を含みながら、前記反応に、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、ニッケルイオン、コバルトイオン、鉄イオン、マンガンイオン、銅イオン、カルシウムイオン及びこれらの混合物からなる群から選択される一つ以上の金属イオンを追加で含む、フルクトースからタガトースを製造する方法(ただし、(ｉ)前記タンパク質が配列番号１のアミノ酸配列からなる場合、前記反応中にリチウムイオン、カリウムイオン及びナトリウムイオンを含まず、(ｉｉ)前記タンパク質が配列番号２ないし５及び７のいずれかのアミノ酸配列からなる場合、前記反応中にカルシウムイオン、銅イオン、リチウムイオン、カリウムイオン及びナトリウムイオンを含まず、かつ、(ｉｉｉ)前記タンパク質が配列番号６のアミノ酸配列からなる場合、前記反応中にカルシウムイオン、銅イオン、マンガンイオン、リチウムイオン及びナトリウムイオンを含まない)。
【請求項１９】
前記反応は、下記のａ）ないしｃ）の条件で行われることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
ａ）５０℃〜８０℃の反応温度、
ｂ）ｐＨ６．０〜９．０の反応ｐＨ、
ｃ）５％（ｗ／ｖ）〜６０％（ｗ／ｖ）のフルクトース濃度
【請求項２０】
上記の金属イオンがマグネシウムイオン、亜鉛イオン、ニッケルイオン、コバルトイオン、鉄イオン、マンガンイオン、またはこれらの混合物であることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タガトース製造用の組成物とフルクトースからタガトースを製造する方法であり、より詳細には、高温菌微生物由来の好熱性フルクトース４−エピメラーゼをコードする遺伝子、および前記酵素を利用してフルクトースからタガトースを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タガトースはフルクトース（Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ）のエピマーであり、タガトースは砂糖とほとんど区別がつかない天然の甘さを有し、物理的性質も砂糖と類似である。タガトースは、牛乳、チーズ、カカオなどの食品、リンゴとミカンのような甘い味の天然果実に存在する少量の天然甘味料であり、カロリーは１．５ｋｃａｌ／ｇであって砂糖の１／３程度であり、ＧＩ（Ｇｌｙｃｅｍｉｃ  ｉｎｄｅｘ、血糖指数）は３であって砂糖の５％水準であるにもかかわらず、砂糖と類似な甘さを有し、様々な健康機能性があるため、多様な製品に適用した場合、健康と味を同時に満足させる代替甘味料として利用できる。
【０００３】
従来知られているタガトースの生産方法では、主にガラクトースを原料とする化学的方法（触媒反応）と生物学的方法（異性化酵素反応）がある（大韓民国公開特許第２００９−００８２７７４号、２００９年０７月３１日公開）。前記反応の原料であるガラクトースを経済的に得るためにガラクトースを含有する様々な基礎原料とこれからガラクトースの収得、タガトースの製造に関する研究が行われてきた。ガラクトースを得るための代表的な基礎原料は乳糖であり、国際市場における原乳と乳糖の生産量、需要、供給量などによって乳糖または乳糖を含有する製品の価格の不安定性が存在し、安定したタガトースの生産原料の供給には限界がある。
【０００４】
特に、２０１２年前後の国際乳糖価格の急激な上昇は、中国の急激な経済成長に伴い乳糖を含む脱脂／全脂粉乳などの需要が急増したことと気候温暖化に伴う酪農国の年間牛乳生産量の減少が主な原因であった。この原料価格の不安定性のせいで安定したタガトース生産が困難な実情である。したがって、日常でよく使われている一般糖（スクロース、グルコース、フルクトースなど）を使用してタガトースを製造できる新たな方法が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来は、ガラクトースを得るために、食品原料として乳糖以外に食品原料において利用可能な副産物である脱タンパクホエイ（ｗｈｅｙ  ｐｅｒｍｅａｔｅ）、植物系バイオマスである落葉松などの多様な生物資源から分解するガラクトースを利用して、タガトースを生産した。
【０００６】
しかし、原料の安定的な需給と投資効率などを考慮すると、産業的に利用できる水準、またはその水準まで製造が可能である適切な原料は存在しない。
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、ガラクトースからタガトースを生産する従来の方法に比べて、産業的適用に適切な一般糖からタガトースを生産する、タガトース製造用の組成物とタガトースの生産方法を提供することである。
【０００８】
具体的には、本発明は、従来にはその機能が解明されなかったタンパク質であって、Ｄ−フルクトース４−エピメラーゼ活性を有し、フルクトースからタガトースを高収率で製造することができる新たな酵素タンパク質、これをコードする遺伝子、これを用いたタガトース製造用の組成物とフルクトースからタガトースを製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一実施例は、本発明の配列番号１ないし配列番号７のいずれか一つのアミノ酸配列からなるタンパク質または前記タンパク質を発現する菌株を含む、フルクトースからタガトースを製造するための組成物を提供する。
【００１０】
また、本発明の他の実施例は、本発明の一実施例の組成物をフルクトースと反応させる工程を含む、フルクトースからタガトースを製造する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、フルクトースの４番炭素位置をエピ化してタガトースを生産する活性を有する酵素である新たなＤ−フルクトース４−エピメラーゼを開発し、日常でよく使われている原料のフルクトースを使用し製造原価を低減することで、経済的かつ高収率でタガトースを製造することが可能になる。
【００１２】
また、本発明では、価格変動が激しい乳糖ではなく、普遍化された原料であるフルクトースを使用して製造費用を節減することによって、経済的かつ高収率のタガトースを製造方法を提供することができる。
【００１３】
一般的にフルクトースをグルコースまたは砂糖から工業的に製造できることは周知の事実であるため、本発明で提示する工程の原料は、フルクトース以外に、より低価格で生産できるように、フルクトースを全体または一部に含有した形で使用する場合まで拡張することができる。すなわち、本発明は、タガトースを澱粉質、粗糖または砂糖から酵素的転換を介して生産することを含む。
【００１４】
また、本発明は、フルクトースを利用してタガトースを製造し、現在重要な食品材料として脚光を浴びているタガトースを効率的に大量生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１ａ〜図１gは、各々の高温性微生物由来の７種のＤ−フルクトース４−エピメラーゼを発現するための組換えベクターの開裂地図である。
【図２】図２ａ〜図２gは、フルクトースを基質として、Ｄ−フルクトース４−エピメラーゼ反応による、各々の高温性微生物由来の７種のタガトース生成を示すＨＰＬＣグラフである。
【図３】図３ａ〜図３gは、各々高温性微生物由来の７種のＤ−フルクトース４−エピメラーゼの温度による活性を示すグラフである。
【図４】図４ａ〜図４gは、各々高温性微生物由来の７種のＤ−フルクトース４−エピメラーゼのｐＨ変化による活性を示すグラフである。
【図５】図５ａ〜図５gは、各々高温性微生物由来の７種のＤ−フルクトース４−エピメラーゼの活性を、金属イオンの種類による活性の比較評価グラフである。
【図６】図６ａ〜図６gは、各々７種の高温性微生物から由来したタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１〜配列番号７）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、具体的な実施例により本発明をさらに詳しく説明する。しかし、本発明は下記実施例に限定されず、本明細書に記載のない内容は、本発明の技術分野または類似分野における熟練者なら十分な認識と類推が可能であるため、その説明を省略する。
【００１７】
本明細書において前記用語「ｎ番炭素の位置」は、ＩＵＰＡＣで定める炭素番号の付与規則に基づいて決められる炭素の位置を意味し、Ｃｎで表現することができる。ｎは１以上の整数である。例えば、「４番炭素の位置でエピ化」されることを「Ｃ４−エピ化」で表現することができる。
【００１８】
本発明の一実施例では、配列番号１〜配列番号７のいずれか一つのアミノ酸配列からなるタンパク質または前記タンパク質を発現する菌株を含む、フルクトースからタガトースを製造するための、タガトース製造用の組成物を提供する。
【００１９】
一般的に、単糖類は、アルドヘキソース（ａｌｄｏｈｅｘｏｓｅ）とケトヘキソース（ｋｅｔｏｈｅｘｏｓｅ）に分類される。アルドヘキソースは、六個の炭素原子からなるアルドースで一端にアルデヒド基を有するものを意味し、非限定的な例で、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）、ガラクトース（ｇａｌａｃｔｏｓｅ）、アロース（ａｌｌｏｓｅ）、グロース（ｇｕｌｏｓｅ）、アルトロース（ａｌｔｒｏｓｅ）、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）、タロース（ｔａｌｏｓｅ）、イドース（ｉｄｏｓｅ）がある。
【００２０】
また、本明細書のケトヘキソースは、六個の炭素原子からなりケトン基を有する単糖類を意味し、非限定的な例で、フルクトース（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）、タガトース（ｔａｇａｔｏｓｅ）、プシコース（ｐｓｉｃｏｓｅ）、ソルボース（ｓｏｒｂｏｓｅ）があり、具体的には、フルクトースであり得る。前記フルクトースと前記タガトースは、本明細書において特に記載のない限り、Ｄ−フルクトースまたはＤ−タガトースを意味する。
【００２１】
本発明の一実施例では、前記配列番号１〜配列番号７のいずれか一つのアミノ酸配列は、フルクトースの４番炭素の位置をエピ化してタガトースを生産する活性を有する酵素であり得る。
【００２２】
具体的には、本発明の発明者らは、高温性ロドテルムス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属、ディクチオグロムス（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ）属に属する微生物を利用した。高温性微生物が生産する酵素は、中温性微生物（ｍｅｓｏｐｈｉｌｅ）が生産する酵素と同じ機能を有し、極限反応（高温など）条件で安定的な反応ができ、中温性微生物の汚染防止、基質の溶解度が低い物質の溶解度の増加、反応速度の増加など、多くの利点があるため、中温性酵素を利用したときの産業的な欠点を克服することができると考えられる。前記高温性微生物からフルクトース４−エピマー酵素をスクリーニングし、最終的に各々の微生物に含まれる遺伝子の中で、フルクトースをタガトースに変換できる酵素を発現するポリヌクレオチドを初めて解明し、これにより、タンパク質の効果的な過発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）に最適化したポリヌクレオチド配列を合成し、これを組換えベクターに挿入して発現させ、フルクトースをタガトースに変換する活性を有する酵素を提供する。
【００２３】
前記配列番号１〜配列番号７のいずれか一つのアミノ酸配列は、前記配列からなるタンパク質をそれぞれコードする遺伝子を含む組換えベクターで形質転換されたものであり得る。
【００２４】
前記形質転換用の菌株は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓなどがある。前記Ｅ．ｃｏｌｉで形質転換された菌株は、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴ２１ａ−ＲＭ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５７６Ｐ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  （ＤＥ３）−ｐＥＴ２１ａ−ＴＡＭ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５７７Ｐ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴ２１ａ−ＴＡＳ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５７８Ｐ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴ２１ａ−ＴＡＸ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５７９Ｐ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴ２１ａ−ＴＰ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５８０Ｐ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴ２１ａ−ＴＬ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５８１Ｐ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴ２１ａ−ＤＴ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５８２Ｐ）であり、２０１４年１０月６日に韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｕｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ソウル市西大門区弘済１洞３６１−２２１儒林ビル）に寄託し、各々の寄託番号は、ＫＣＣＭ１１５７６Ｐ、ＫＣＣＭ１１５７７Ｐ、ＫＣＣＭ１１５７８Ｐ、ＫＣＣＭ１１５７９Ｐ、ＫＣＣＭ１１５８０Ｐ、ＫＣＣＭ１１５８１Ｐ、ＫＣＣＭ１１５８２Ｐである。
【００２５】
具体的に、本発明における一実施例の配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ロドテルムス・マリヌス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）由来の酵素であり得る。
【００２６】
前記タンパク質は、分子量が５５ｋＤａ〜６０ｋＤａであり、最適活性温度が５０℃〜９０℃であり、最適活性ｐＨが６．０〜９．０であり得る。
【００２７】
より具体的に、前記最適活性温度は６０℃〜８０℃であり、前記最適活性ｐＨは７．０〜９．０であり得る。
【００２８】
具体的に、本発明における一実施例の配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質は、サーモトガ・ペトロフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ）由来の酵素であり得る。
【００２９】
前記タンパク質は、分子量が５５ｋＤａ〜５８ｋＤａであり、最適活性温度が５０℃〜９０℃であり、最適活性ｐＨが７．０〜９．０であり得る。
【００３０】
より具体的に、前記最適活性温度は７０℃〜９０℃であり得る。
【００３１】
具体的に、本発明における一実施例の配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質は、サーモトガ・レティンガエ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ）由来の酵素であり得る。
【００３２】
前記タンパク質は、分子量が５５ｋＤａ〜５８ｋＤａであり、最適活性温度が５０℃〜９０℃であり、最適活性ｐＨが７．０〜９．０であり得る。
【００３３】
より具体的に、前記最適活性温度は６０℃〜８０℃であり得る。
【００３４】
具体的に、本発明における一実施例の配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質は、サーモアナエロバクター・マスラニイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｔｈｒａｎｉｉ）由来の酵素であり得る。
【００３５】
前記タンパク質は、分子量が５５ｋＤａ〜５８ｋＤａであり、最適活性温度が５０℃〜９０℃であり、最適活性ｐＨが７．０〜１０．０であり得る。
【００３６】
より具体的に、前記最適活性温度は７０℃〜９０℃であり、最適な活性ｐＨは８．０〜１０．０であり得る。
【００３７】
具体的に、本発明における一実施例の配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ディクチオグロムス・ツルギダム（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ  ｔｕｒｇｉｄｕｍ）由来の酵素であり得る。
【００３８】
前記タンパク質は、分子量が５５ｋＤａ〜５８ｋＤａであり、最適活性温度が５０℃〜９０℃であり、最適活性ｐＨが７．０〜９．０であり得る。
【００３９】
より具体的に、前記最適活性温度は６０℃〜８０℃であり得る。
【００４０】
具体的に、本発明における一実施例の配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質は、サーモアナエロバクテリウム・キシラノリチクム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来の酵素であり得る。
【００４１】
前記タンパク質は、分子量が５３ｋＤａ〜５８ｋＤａであり、最適活性温度が５０℃〜９０℃であり、最適活性ｐＨが６．０〜９．０であり得る。
【００４２】
より具体的に、前記最適活性温度は６０℃〜８０℃であり、前記最適ｐＨは６．０〜８．０であり得る。
【００４３】
具体的に、本発明における一実施例の配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質は、サーモアナエロバクター・シデロフィラス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｉｄｅｒｏｐｈｉｌｕｓ）由来の酵素であり得る。
【００４４】
前記タンパク質は、分子量が５５ｋＤａ〜５８ｋＤａであり、最適活性温度が５０℃〜８０℃であり、最適活性ｐＨが７．０〜１０．０であり得る。
【００４５】
より具体的に、前記最適活性温度は６０℃〜８０℃であり、前記最適ｐＨは８．０〜１０．０であり得る。
【００４６】
本発明における他の実施例は、本発明の一実施例のいずれか一つの組成物をフルクトースに反応させる工程を含む、フルクトースからタガトースを製造する方法であり得る。
【００４７】
具体的に、前記反応は、５０℃〜８０℃で行われ得る。
【００４８】
また、前記反応は、ｐＨ６．０〜９．０で行われ得る。
【００４９】
また、前記反応には、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、ニッケルイオン、コバルトイオン、鉄イオン、マンガンイオン、またはこれらの混合物がさらに含まれ得る。
【００５０】
また、基質として作用するフルクトースは、５％（ｗ／ｖ）〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度であり得る。
【００５１】
本発明の一実施例によれば、フルクトースは砂糖やグルコースから得ることができる。これにより、グルコース、フルクトース、砂糖のように日常でよく使われている安価な原料を使用して高収率のタガトースを製造する方法を提供し、タガトースの大量生産が可能になる。
【００５２】
したがって、本発明における一実施例のいずれか一つの組成物をフルクトースと反応させる工程の前に、砂糖を加水分解したり、グルコースをエピ化したりして、フルクトースを得る工程をさらに行うことができる。
【００５３】
前記加水分解に使用される酵素は、β−フルクトフラノシターゼ、インベルターゼ、サッカラーゼなどのβ−Ｄ−フルクトシダーゼ；スクラーゼ、α−グルコシダーゼ、およびα−Ｄ−グリコシドヒドロラーゼからなる群より選択された一つ以上であることができるが、これらに限定されない。
【００５４】
前記グルコースのエピメラーゼは、グルコースイソメラーゼまたはホスホグルコイソメラーゼであり得るが、これらに限定されない。
【実施例】
【００５５】
実施例１：Ｄ−フルクトース４−エピメラーゼを生産する組換え菌株の製造
【００５６】
下表１のように、高温性微生物７種から由来した配列番号１〜配列番号７（図６ａ〜図６ｇ）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩを使用して、発現ベクターｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）の制限酵素によって切断された部位に挿入し、組換えベクターｐＥＴ２１ａ−ＲＭ、ｐＥＴ２１ａ−ＴＡＭ、ｐＥＴ２１ａ−ＴＡＳ、ｐＥＴ２１ａ−ＴＡＸ、ｐＥＴ２１ａ−ＴＰ、ｐＥＴ２１ａ−ＴＬ、ｐＥＴ２１ａ−ＤＴを製造した（図１ａ〜図１ｇ）。前記組換えベクターをヒートショック法（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ。）によって大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換し、組換え菌株を製造した。
【００５７】
【表１】
0006518761.tif 000002
【００５８】
形質転換された組換え菌株を５ｍｌのＬＢ−アンピシリン培地（Ｄｉｆｃｏ）に接種した後、６００ｎｍで吸光度（ＯＤ）が１．５に達するまで３７℃、１８０ｒｐｍで振とう培養し、これを再び５００ｍｌのＬＢ−アンピシリン培地に接種し、目的とする酵素の過剰発現を誘導するため、初期に５ｍＭのラクトースを添加して、３７℃の振とう培養器で培養した。培養条件は３７℃、１８０ｒｐｍで１６時間維持した。その後、遠心分離機で４０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離して、菌体のみを回収した。
【００５９】
製造された前記組換え菌株は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴ２１ａ−ＲＭ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５７６Ｐ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴ２１ａ−ＴＡＭ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５７７Ｐ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴ２１ａ−ＴＡＳ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５７８Ｐ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴ２１ａ−ＴＡＸ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５７９Ｐ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴ２１ａ−ＴＰ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５８０Ｐ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴ２１ａ−ＴＬ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５８１Ｐ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴ２１ａ−ＤＴ（寄託番号：ＫＣＣＭ１１５８２Ｐ）と命名し、２０１４年１０月６日に韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｕｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）（ソウル市西大門区弘済１洞３６１−２２１儒林ビル）に寄託した。各々の寄託番号はＫＣＣＭ１１５７６Ｐ、ＫＣＣＭ１１５７７Ｐ、ＫＣＣＭ１１５７８Ｐ、ＫＣＣＭ１１５７９Ｐ、ＫＣＣＭ１１５８０Ｐ、ＫＣＣＭ１１５８１Ｐ、ＫＣＣＭ１１５８２Ｐである。
【００６０】
実施例２：Ｄ−フルクトース４−エピメラーゼ精製と特性の確認
【００６１】
２−１：Ｄ−フルクトース４−エピメラーゼの精製
【００６２】
実施例１で回収された菌体全７種を溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭ  Ｋ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に混濁させた後、超音波振動機（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）を使用し４℃で１０分間破砕した。破砕液を６０℃振とう培養器で３０分間熱処理をした後、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄み液だけを確保した。確保した上澄み液を予め溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）で平衡させたＱ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＤＥＡＥにかけた後、５０ｍＭ  Ｋ−ホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）２００ｍＭ  ＮａＣｌが含まれた緩衝溶液を順次的に流すことで目的タンパク質を精製した。溶出されたタンパク質は、酵素活性測定用の緩衝溶液（５０ｍＭ  Ｋ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ７）に交換し透析した後、次の実験に使用した。また、精製された７種のＤ−フルクトース４−エピメラーゼである、ＲＭ、ＴＡＭ、ＴＡＳ、ＴＡＸ、ＴＰ、ＴＬ、ＤＴはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、分子量が各々約５８ｋＤａ、５６ｋＤａ、５６ｋＤａ、５５ｋＤａ、５６ｋＤａ、５７ｋＤａ、５７ｋＤａであることを確認した。
【００６３】
２−２：Ｄ−フルクトース４−エピメラーゼの温度、ｐＨの変化による活性の分析
【００６４】
実施例２−１で精製された酵素７種のｐＨおよび温度変化によるＤ−フルクトース４−エピメラーゼの活性を確認するために、様々なｐＨと温度で、酵素とフルクトース基質を反応させ、活性を確認した。
【００６５】
活性測定は５０ｍＭフルクトース、酵素１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍＭのＮｉＳＯ４で、各々のｐＨと温度範囲で行われ、氷で反応を停止させた後、ＨＰＬＣで分析した。前記ＨＰＬＣ分析は、ＳＵＧＡＲ−ＳＰ０８１０（Ｓｈｏｄｅｘ）カラムを使用して８０℃で、移動相で水を０．６ｍｌ／分の流速で流しながら行い、示差屈折率検出器（Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）でタガトースを検出してタガトースの生産性を分析した。
【００６６】
最初ｐＨを７にして、温度による活性を評価するために、４０℃〜９０℃でタガトースの生産性を測定した結果、７種の前記酵素のうちＴＡＭ、ＴＰの２種の場合、８０℃で最大転換率を示し、ＲＭ、ＴＡＳ、ＴＡＸ、ＴＬ、ＤＴの５種の場合、７０℃で最大変換率を示した（図３ａ〜図３ｇ）。
【００６７】
また、ｐＨ変化による活性を調べるために、７０℃で、５０ｍＭのナトリウムアセテート（ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ４〜６）、５０ｍＭのＫ−ホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ６〜８）、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７〜ｐＨ９）の緩衝溶液をそれぞれ使用し、最大活性を示すｐＨを調べた結果、類似種別にｐＨ特性が異なり、特にｐＨ７〜ｐＨ９で高活性を示すことを確認した。
【００６８】
具体的に、ＴＡＸはｐＨ７、ＴＰ、ＴＬ、ＲＭ、ＤＴはｐＨ８、ＴＡＳ、ＴＡＭはｐＨ９で活性が特に高かった。また、各々のｐＨに相当する緩衝溶液の中でＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液で最大活性を示し、緩衝溶液の中で最高の活性を示すことが確認された（図４ａ〜図４ｇ）。
【００６９】
図５ａ〜図５ｇに示すように、実施例２−１の酵素は、フルクトースからタガトースの製造が可能であることを確認した。
【００７０】
２−３：Ｄ−フルクトース４−エピメラーゼにおける金属イオン要求性の分析
【００７１】
既知のエピメラーゼ（プシコース３−エピメラーゼ）、異性化酵素（グルコース異性化酵素、アラビノース異性化酵素）は、金属イオンが必要であることが知られている。前記実施例２−１で得られたＤ−フルクトース４−エピメラーゼに対しても、金属イオンの影響を調べた。
【００７２】
前記実施例２−１で精製された７種のタンパク質に、金属イオンであるＮｉＳＯ４、ＮｉＣｌ２、ＣｕＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＺｎＳＯ４、ＭｇＳＯ４、ＭｇＣｌ２、ＦｅＳＯ４、ＮａＣｌ、ＬｉＣｌ、ＫＣｌまたはＣｏＣｌ２を各々１ｍＭずつ処理し、酵素活性を測定した。対照群は金属イオンを処理しなかったものを使用した。測定された前記各金属イオンを処理した場合の酵素活性を対照群の酵素活性と比較して、図５ａ〜図５ｇに示した。
【００７３】
図５ａ〜図５ｇに示したように、実施例２−１の酵素は、ニッケルイオンとコバルトイオン添加によって活性が増加し、金属イオン要求性があることを分かった。特に、ＮｉＳＯ４を添加した場合、最高活性を示すことを確認した。
【００７４】
実施例３：フルクトースからタガトースの製造
【００７５】
前記実施例２で選ばれた最適酵素反応条件で、タガトースの生産性を確認した。具体的には、実施例２−１で精製したＤ−フルクトース４−エピメラーゼを１ｍｇ／ｍｌの濃度で使用し、反応温度は、前記７種の酵素のうちＴＡＭ、ＴＰの２種は８０℃で、ＲＭ、ＴＡＳ、ＴＡＸ、ＴＬ、ＤＴの５種は７０℃で、５０ｍＭのＴｒｉｓ−HＣｌ緩衝溶液を各々のｐＨ別に作成し、ＴＡＸはｐＨ７、ＴＰ、ＴＬ、ＲＭ、ＤＴはｐＨ８、ＴＡＳ、ＴＡＭはｐＨ９と、硫酸ニッケル０．１ｍＭの条件下で２０ｇ／Ｌ（約１１０ｍＭの濃度）のフルクトースと反応させた。
【００７６】
前記実施例２−２と同じ方法であるＨＰＬＣ分析を行った（図２ａ〜図２ｇ）。前記反応で生成されたタガトースの生産量を定量した結果で、フルクトースでタガトースへの転換率を測定した。その結果は、表２のとおりである。
【００７７】
【表２】
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【００７８】
得られた前記反応終了液（タガトースとフルクトースの混合液）を脱色（活性炭利用）、イオン精製、クロマトグラフィー、結晶化工程を経て、最終的に結晶タガトースを得ることができる。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
0006518761.tif 000006
【図１ｄ】
0006518761.tif 000007
【図１ｅ】
0006518761.tif 000008
【図１ｆ】
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【図１ｇ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図２ｇ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図３ｇ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図４ｆ】
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【図４ｇ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図５ｆ】
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【図５ｇ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図６ｆ】
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【図６ｇ】
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【配列表】
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