(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化ストレスを受けている腎臓患者における副甲状腺ホルモン濃度の調節に干渉する薬物療法の必要性をインビトロでモニターおよび評価するための方法であって、
前記腎臓患者由来の血漿または血清サンプルと、酸化ヒトＰＴＨペプチドのアミノ酸３から３４の間に位置する三次元エピトープを認識および特異的に結合するが、非酸化ヒトＰＴＨ（１−８４）およびこの断片には結合しない抗体とを接触させることによって、メチオニン８もしくは１８のいずれかもしくはこの両方またはトリプトファン２３において酸化されたヒトＰＴＨペプチドから、前記腎臓患者由来の血漿または血清サンプルを精製する工程であって、前記サンプルは血液透析治療を受けている腎臓患者由来のものであり、
ヒトＰＴＨ配列のアミノ酸３から３４の間に位置して受容体への結合およびｃＡＭＰ−シクラーゼの活性化を担うドメインを少なくとも含有する、ヒトＰＴＨ（１−８４）およびこの断片に対する抗体に基づくイムノアッセイによって、精製されたサンプルにおける免疫反応性ヒトＰＴＨ（ｉＰＴＨ）ペプチドの量を測定する工程ならびに
血液循環中に副甲状腺の細胞によって分泌される免疫反応性ヒトＰＴＨ（ｉＰＴＨ）ペプチドの割合および前記腎臓患者が患っている前記酸化ストレスによって免疫反応性ヒトＰＴＨ（ｉＰＴＨ）ペプチドが酸化される割合を含む、前記腎臓患者についての、ｎ−ｏｘＰＴＨに関連したＰＴＨの状態値を得る工程ならびに
前記ｎ−ｏｘＰＴＨに関連したＰＴＨの状態値を、罹患率および総死亡率が低い基準値と比較して、ＰＴＨの状態値の調節に関する薬物療法の必要性、またはヒト副甲状腺ホルモンもしくはこの活性断片もしくはこの両方を前記患者へ補充する必要性を決定する工程を含む方法。
【請求項２】
前記サンプルが、慢性腎疾患（ＣＫＤ）または尿毒症または副甲状腺機能亢進症に罹患している腎臓患者由来のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酸化ヒトＰＴＨペプチドのアミノ酸３から３４の間に位置する三次元エピトープを認識および特異的に結合するが、非酸化ヒトＰＴＨ（１−８４）およびこの断片には結合しない抗体が結合した固相と、血漿または血清の前記サンプルとを接触させる工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
酸化ヒトＰＴＨペプチドのアミノ酸３から３４の間に位置する三次元エピトープを認識および特異的に結合する前記抗体によって結合された前記ペプチドを、定量的に測定することをさらに含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
免疫反応性ヒトＰＴＨ（ｉＰＴＨ）ペプチドの測定が、２−サイトイムノアッセイの使用を含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法であって、一方の抗体が、ＰＴＨ受容体１および２へのＰＴＨペプチドの結合に関与するドメインに結合するモノクローナル抗体である、方法。
【請求項６】
免疫反応性ヒトＰＴＨ（ｉＰＴＨ）ペプチドの測定が、２−サイトイムノアッセイの使用を含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法であって、一方の抗体が、ヒトＰＴＨの一番端のアミノ末端のアミノ酸バリンおよびセリンを含む抗原決定基に結合し、他方の抗体が、ヒトＰＴＨ配列のアミノ酸１４から３４の間の領域に結合する、方法。
【請求項７】
免疫反応性ヒトＰＴＨ（ｉＰＴＨ）の測定が、２−サイトイムノアッセイの使用を含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法であって、一方の抗体が、ヒトＰＴＨ配列のアミノ酸１から１３を含む抗原決定基に結合する、方法。
【請求項８】
酸化ヒトＰＴＨペプチドに対して特異的な前記抗体が、８位および／または１８位において酸化メチオニンを含まない、ヒトＰＴＨ配列のアミノ酸３から３４の間の三次元エピトープに結合する、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
免疫反応性ヒトＰＴＨ（ｉＰＴＨ）の割合および酸化ヒトＰＴＨペプチドのアミノ酸３から３４の間に位置する三次元エピトープを認識および選択的に結合する前記抗体によって結合されたＰＴＨペプチドの量の測定をさらに含む、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法に使用するためのキットであって、
酸化ヒトＰＴＨペプチドのアミノ酸３から３４の間に位置する三次元エピトープを認識および選択的に結合する抗体を有する固相と、
ＰＴＨ受容体１および２へのＰＴＨペプチドの結合に関与するドメインに結合するモノクローナル抗体を含む、血漿または血清における免疫反応性インタクトヒトＰＴＨ（ｉＰＴＨ）を測定するための抗体を組み合わせたもの、
からなる、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性腎疾患（ＣＫＤ）を有する患者の血漿サンプルにおける副甲状腺ホルモン濃度をモニターするための手段および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性腎疾患ステージ５を有する患者における過剰な死亡率は、重要な未解決の問題である。慢性腎疾患ステージ５を有する患者の毎年の死亡率は、約１０から２０％である。副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は、最近の大規模な研究がＰＴＨおよび死亡率の間のＪ型の関連性を実証したように、血液透析を必要とする患者における過剰な死亡率についての原因となる因子であるように思われる。結果的に、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は、骨障害（腎性骨ジストロフィー）、ミオパシー、神経性の異常、貧血、そう痒症および心筋症を含む複数の全身性の影響を有する尿毒症毒素として説明されてきた。副甲状腺機能亢進症は、ＣＫＤにおいて一般的であり、未治療のまま放置された場合、深刻な病的状態および死亡をもたらす。現在のＰＴＨアッセイによって測定される低いＰＴＨ濃度も、高いＰＴＨ濃度も、血液透析を受けている患者における心臓血管系疾患の進行および総死亡率の実質的な増加に関連する（Ｆｌｏｅｇｅ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ，ＡＲＯ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ．Ｓｅｒｕｍ  ｉＰＴＨ，ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｉｎ  ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｈａｅｍｏｄｉａｌｙｓｉｓ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１１；２６：１９４８−１９５５；Ｔｏｒｒｅｓ  ＰＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｌｃｉｕｍ−ｓｅｎｓｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｃａｌｃｉｍｉｍｅｔｉｃｓ，ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．２０１２；８２：１９−２５；Ｓｏｕｂｅｒｂｉｅｌｌｅ  ＪＣ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ＣＫＤ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．２０１０；７７：９３−１００）。
【０００３】
従って、最も低い罹患率および最も高い生存に関連する濃度にＰＴＨを保つことを目指して、ガイドラインが確立された。Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＫＤＯＱＩ）ガイドラインは、血漿ＰＴＨ濃度がＣＫＤのステージに従って目標範囲内（例えば、ＣＫＤステージ５を有する患者において１５０から３００ｎｇ／Ｌ）に保たれるように、慢性腎疾患（ＣＫＤ）を有する患者のＰＴＨ濃度を定期的に測定することおよび患者の薬物療法（例えばビタミンＤ、リン吸着薬、カルシウム受容体作動薬）を調整することを推奨する。薬理学的アプローチが適切に作用しない場合、副甲状腺摘出術（ｐａｒａｔｈｙｒｅｏｄｅｃｔｏｍｙ）が考えられ得る。
【０００４】
二次性副甲状腺機能亢進症もまた、循環１，２５−ジヒドロキシビタミンＤが早くもＣＫＤのステージ２において減少し、糸球体濾過率（ＧＦＲ）が減少するとともに下がり続ける場合、腎機能の悪化に対する適応応答として起こり得る。慢性腎疾患は、高リン血症、高尿酸血症、代謝性アシドーシスおよび時にまた２５−ヒドロキシビタミンＤの欠乏による酵素阻害などのような機能的な理由のゆえの１α−ヒドロキシラーゼ活性の進行性の損失に関連する。しかしながら、より重要であるのは、単純に、健康な腎臓組織、従って（ｈｅｎｓｅ）、１α−ヒドロキシラーゼの損失であり、これはＣＫＤにおける１α−ヒドロキシラーゼ活性の機能的な低下を説明する。ＧＦＲが６０ｍＬ／分／１・７３・ｍ２未満に減少すると、ＰＴＨの分泌を直接またはｋｌｏｔｈｏ／ＦＧＦ２３系を介して刺激するホスフェートが保持される。そのうえ、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤの欠乏は、副甲状腺（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｇｌａｄ）におけるＰＴＨの分泌／遺伝子発現が１，２５−ジヒドロキシビタミンＤによってネガティブにコントロールされるので、この状況においてＰＴＨの分泌の増加の一因となる。
【０００５】
低カルシウム血症は、ＧＦＲが５０ｍＬ／分／１・７３・ｍ２未満に減少すると起こり、血液循環中への副甲状腺の細胞からの副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）の分泌をさらに刺激する。インタクトな形態では、ヒト副甲状腺ホルモン（ｈＰＴＨ）は、８４アミノ酸および約９５００ダルトンの分子量を有する単一のポリペプチド鎖からなる（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：Ｐ０１２７０、ＰＴＨＹ−ＨＵＭＡＮを参照されたい。）。疾患進行により、インタクトなｈＰＴＨ（ａａ１−８４）の半減期が増加し、また、ホルモンの免疫反応性Ｃ−末端断片が血清中に蓄積する傾向がある。副甲状腺活性の慢性的な上昇は、次いで、骨量減少、骨折、血管石灰化、心臓血管系疾患、従って心血管系死亡率の上昇をもたらす（Ｆｒａｓｅｒ  ＷＤ，Ｈｙｐｅｒｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄｉｓｍ．Ｌａｎｃｅｔ．２００９；３７４：１４５ｆを参照）。
【０００６】
ＰＴＨの測定の使用に関する問題の一部は、利用されるアッセイの解釈に関する混乱であった。血液中のＰＴＨの測定は、ＲＩＡがＰＴＨの測定のために最初に開発された１９６０年代の初め以来、進化してきた（Ｂｅｒｓｏｎ  ＳＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９６３；４９：６１３−６１７）。しかしながら、これらの第１世代のアッセイは、使用される抗血清の異なる特質ならびにＰＴＨがインタクトな８４アミノ酸ペプチドの形態だけではなく、ホルモンの複数の断片、特に、ＰＴＨ分子の中央およびカルボキシ（Ｃ）末端領域由来の複数の断片としても循環するということが分かったために、信頼できないことが判明した。分泌後のＰＴＨペプチドは、腎臓において数分以内に活性断片および不活性断片に分解され、それぞれの断片は、さらに様々な半減期を有する。第２世代のＰＴＨイムノアッセイは、一方が生物学的活性を有するＰＴＨペプチドのアミノ末端部分に結合し、他方がこのカルボキシ末端部分に結合する２つの抗体を使用して開発された（Ｊｏｈｎ  ＭＲ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，８４．４２８７−４２９０；Ｇａｏ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｐｏｓｔｅｒ  Ｍ４５５，ＡＳＢＭＲ  ２２ｎｄ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ；Ｒｏｔｈ  ＨＪ  ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｐｏｓｔｅｒ  Ｐ１２８８；１１ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，Ｓｙｄｎｅｙ）。しかしながら、血清中の測定免疫反応性ＰＴＨ濃度および臨床所見の間に不一致がなおあった（Ｇｏｌｔｚｍａｎ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ，ｉｎ  Ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ  ｄｉｓａｐｐｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｆｔｅｒ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄｅｃｔｏｍｙ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  １９８４，５８（１）：７０−７５。従って、第３世代のインタクトＰＴＨアッセイが、開発されたが、これは、尿毒症の患者における、骨疾患または二次性副甲状腺機能亢進症の他の臨床的な兆候の診断を改善するに至っていない（Ｂｒｏｓｓａｒｄ  ＪＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ  ｏｎ  ｎｏｎ−（１−８４）ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ（ＰＴＨ）ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔａｃｔ  ＰＴＨ  ａｓｓａｙｓ，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．２０００；４６：６９７−７０３）。一方、幾つかの免疫反応性ＰＴＨ断片がインタクトＰＴＨペプチドと同等の生物学的活性を有するのに対して、ｈＰＴＨ（３−３４）などのような他の断片は、副甲状腺ホルモンの効果を阻害することが認められているように思われる（ＥＰ−Ａ  ０  ３４９  ５４５；Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｇａｙｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｏｓｔｅｏｌｏｇｉｅ  ｆｏｒｕｍ，５，４８−５８）、Ｓｕｖａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３７，８９３ｆｆ；ＥＰ  ０  ４５１  ８６７を参照されたい。）。大きくて不活性であるが、免疫反応性の非（１−８４）ＰＴＨ断片（ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ  ｎｏｎ−（１−８４）ＰＴＨ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）が、誤った測定を導くことがさらに想定されていた（ＬｅＰａｇｅ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４４，８０５−８０９）。また、ジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ４）は、多くの細胞型の表面上で発現されており、これは幾分無差別的なセリンエキソペプチダーゼである。このことは、ＰＴＨの一番端の２つのＮ−末端アミノ酸は、ｃＡＭＰ−シクラーゼ活性およびＰＴＨペプチドの受容体への結合に必要であるが、その一方で、ＰＴＨはＤＰＰ４または類似するエキソプロテアーゼ（ｅｘｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）の基質であるという説を導く。結果的に、アミノ末端において、「インタクトな」ＰＴＨペプチド鎖と、一番端のアミノ末端で１つまたは２つのアミノ酸を欠乏しているＰＴＨペプチドとを、区別することができる抗体を用いる２−サイトイムノアッセイ（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）もまた、開発された（ＷＯ２００１／４４８１８（Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ）、ＷＯ９６／１００４１（Ｍａｇｅｒｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ）；ＷＯ２００３／０３９８６（Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ  ＪＳ）を参照されたい。）。
【０００７】
尿毒症の患者の血清サンプルにおける酸化ＰＴＨペプチド鎖の発見は、非酸化ＰＴＨ（１−８４）およびこの生物学的に活性な断片の測定のためのイムノアッセイの開発をさらに導いた（ＷＯ２００２／０８２０９２）。このように、血漿中の副甲状腺ホルモンを測定するために利用可能な、およびある患者グループにおいて類似し他の患者グループにおいて顕著に異なる様々な「生物活性」ＰＴＨペプチド具体物の濃度を測定するのに利用可能な、おびただしい数のイムノアッセイがある。そのため、罹患率および死亡率を低下させるために腎臓患者の薬物療法の調節を可能にする、患者のＰＴＨの状態についての信頼できる情報を得ることは望ましいと思われる（Ｓｐｒａｇｕｅ  ＳＭ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｅ  Ｃａｓｅ  ｆｏｒ  Ｒｏｕｔｉｎｅ  Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ，Ｃｌｉｎ  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，Ｏｃｔ  ２０１２，ａｓ  ｄｏｉ：１０．２２１５／ＣＪＮ．０４６５０５１２ｅ；Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ  ＤＪＡ，ｅｂｕｔｔａｌ：Ｔｈｅ  Ｃａｓｅ  ｆｏｒ  Ｒｏｕｔｉｎｅ  Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｃｌｉｎ  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ８：３１９−３２０，２０１３．ｄｏｉ：１０．２２１５／ＣＪＮ．１０２３１０１２も参照されたい。）。そのため、ＰＴＨ測定の技術的現状は、問題である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】欧州特許出願公開第０３４９５４５号明細書
【特許文献２】国際公開第２００１／０４４８１８号
【特許文献３】国際公開第９６／０１００４１号
【特許文献４】国際公開第２００３／００３９８６号
【特許文献５】国際公開第２００２／０８２０９２号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｆｌｏｅｇｅ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ，ＡＲＯ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ．Ｓｅｒｕｍ  ｉＰＴＨ，ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｉｎ  ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｈａｅｍｏｄｉａｌｙｓｉｓ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１１；２６：１９４８−１９５５
【非特許文献２】Ｔｏｒｒｅｓ  ＰＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｌｃｉｕｍ−ｓｅｎｓｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｃａｌｃｉｍｉｍｅｔｉｃｓ，ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．２０１２；８２：１９−２５
【非特許文献３】Ｓｏｕｂｅｒｂｉｅｌｌｅ  ＪＣ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ＣＫＤ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．２０１０；７７：９３−１００
【非特許文献４】Ｆｒａｓｅｒ  ＷＤ，Ｈｙｐｅｒｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄｉｓｍ．Ｌａｎｃｅｔ．２００９；３７４：１４５ｆ
【非特許文献５】Ｂｅｒｓｏｎ  ＳＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９６３；４９：６１３−６１７
【非特許文献６】Ｊｏｈｎ  ＭＲ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，８４．４２８７−４２９０
【非特許文献７】Ｇａｏ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｐｏｓｔｅｒ  Ｍ４５５，ＡＳＢＭＲ  ２２ｎｄ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ
【非特許文献８】Ｒｏｔｈ  ＨＪ  ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｐｏｓｔｅｒ  Ｐ１２８８；１１ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，Ｓｙｄｎｅｙ
【非特許文献９】Ｇｏｌｔｚｍａｎ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ，ｉｎ  Ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ  ｄｉｓａｐｐｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｆｔｅｒ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄｅｃｔｏｍｙ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  １９８４，５８（１）：７０−７５
【非特許文献１０】Ｂｒｏｓｓａｒｄ  ＪＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ  ｏｎ  ｎｏｎ−（１−８４）ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ（ＰＴＨ）ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔａｃｔ  ＰＴＨ  ａｓｓａｙｓ，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．２０００；４６：６９７−７０３
【非特許文献１１】Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｇａｙｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｏｓｔｅｏｌｏｇｉｅ  ｆｏｒｕｍ，５，４８−５８）
【非特許文献１２】Ｓｕｖａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３７，８９３ｆｆ；ＥＰ  ０  ４５１  ８６７
【非特許文献１３】ＬｅＰａｇｅ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４４，８０５−８０９
【非特許文献１４】Ｓｐｒａｇｕｅ  ＳＭ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｅ  Ｃａｓｅ  ｆｏｒ  Ｒｏｕｔｉｎｅ  Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ，Ｃｌｉｎ  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，Ｏｃｔ  ２０１２，ａｓ  ｄｏｉ：１０．２２１５／ＣＪＮ．０４６５０５１２ｅ
【非特許文献１５】Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ  ＤＪＡ，ｅｂｕｔｔａｌ：Ｔｈｅ  Ｃａｓｅ  ｆｏｒ  Ｒｏｕｔｉｎｅ  Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｃｌｉｎ  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ８：３１９−３２０，２０１３．ｄｏｉ：１０．２２１５／ＣＪＮ．１０２３１０１２
【発明の概要】
【００１０】
この問題は、ＰＴＨ分泌に干渉しＣＫＤ患者に通常処方される薬剤を選ぶ方法について信頼できる情報を与える、ＰＴＨをモニターおよび評価する方法によって解決される。これらの薬剤の使用もまた、国際的なガイドラインによって指導される。
【００１１】
結果的に、本開示は、酸化ストレスを受けている腎臓患者における、副甲状腺ホルモン濃度の調節に干渉する薬物療法の必要性をインビトロでモニターおよび評価するための方法であって、酸化ヒトＰＴＨペプチドのアミノ酸３から３４の間に位置する三次元エピトープを認識および特異的に結合するが、非酸化ヒトＰＴＨ（１−８４）およびこの断片には結合しない抗体と、前記サンプルとを接触させることによって、メチオニン８もしくは１８のいずれかまたはこの両方またはトリプトファン２３において酸化されたヒトＰＴＨペプチドから、前記腎臓患者由来の血漿または血清のサンプルを精製する工程；ヒトＰＴＨ配列のアミノ酸３から３４の間に位置して受容体への結合およびｃＡＭＰ−シクラーゼの活性化を担うドメインを少なくとも含有する、ヒトＰＴＨ（１−８４）およびこの断片に対する抗体に基づくイムノアッセイによって、前記サンプルにおける免疫反応性ヒトＰＴＨ（ｉＰＴＨ）ペプチドの量を測定する工程；ならびに、血液循環中に副甲状腺の細胞によって分泌される免疫反応性ヒトＰＴＨ（ｉＰＴＨ）ペプチドの割合および前記患者が患っている酸化ストレスによって免疫反応性ヒトＰＴＨ（ｉＰＴＨ）ペプチドが酸化される割合を含む、前記腎臓患者についてのＰＴＨの状態値（ｎ−ｏｘＰＴＨ値）を得る工程；ならびに、前記ＰＴＨの状態値（ｎ−ｏｘＰＴＨ）を、罹患率および総死亡率が低い基準値と比較して、ＰＴＨの状態値の調節に関する薬物療法の必要性、またはヒト副甲状腺ホルモンもしくはこの活性断片またはこの両方を前記患者へ補充する必要性を決定する工程；を含む方法に関する。前記方法は、血液透析治療を必要とする腎臓患者由来のサンプルに特に使用することができる。他の場合には、サンプルは、慢性腎疾患（ＣＫＤ）または尿毒症または副甲状腺機能亢進症に罹患している腎臓患者由来のものであってもよい。
【００１２】
前記方法は、好ましくは、酸化ヒトＰＴＨペプチドのアミノ酸３から３４の間に位置する三次元エピトープを認識および特異的に結合するが、非酸化ヒトＰＴＨ（１−８４）およびこの断片には結合しない抗体が結合した固相と、血漿または血清の前記サンプルとを、接触させる工程を含む。
【００１３】
前記方法は、２−サイトイムノアッセイの使用を包含してもよい、免疫反応性があるヒトＰＴＨ（ｉＰＴＨ）ペプチドの測定を含み、一方の抗体が、ＰＴＨ受容体１および２へのＰＴＨペプチドの結合に関与するドメインに結合するモノクローナル抗体である。また、前記測定には、２−サイトイムノアッセイの使用を含んでいてもよく、一方の抗体が、ヒトＰＴＨの一番端のアミノ末端のアミノ酸バリンおよびセリンを含む抗原決定基に結合し、他方の抗体が、ヒトＰＴＨ配列のアミノ酸１４から３４の間の領域に結合する。他の実施形態では、免疫反応性があるヒトＰＴＨ（ｉＰＴＨ）の測定が、２−サイトイムノアッセイの使用を含んでいてもよく、一方の抗体が、ヒトＰＴＨ配列のアミノ酸１から１３を含む抗原決定基に結合する。
【００１４】
酸化ヒトＰＴＨペプチドに対して用いられる抗体は、８位および／または１８位において酸化メチオニンを含むヒトＰＴＨ配列のアミノ酸３から３４の間の三次元エピトープに選択的に結合する。言いかえれば、分析により、酸化ヒトＰＴＨ配列に特異的な、用いられるモノクローナル抗体が、メチオニンスルホキシドまたはメチオニンスルホンのいずれか１つを含む、ヒトＰＴＨ配列のアミノ酸３から３４の間の立体配置的なエピトープに結合することが示された。
【００１５】
本開示の態様は、免疫反応性ヒトＰＴＨ（ｉＰＴＨ）の割合および酸化ヒトＰＴＨペプチドのアミノ酸３から３４の間に位置する三次元エピトープを認識および選択的に結合する前記抗体によって結合されたＰＴＨペプチドの量の測定に関する。
【００１６】
さらなる態様は、酸化ヒトＰＴＨペプチドのアミノ酸３から３４の間に位置する三次元エピトープを認識および選択的に結合する抗体を有する固相および上記に開示される血漿または血清における免疫反応性インタクトヒトＰＴＨ（ｉＰＴＨ）を測定するための抗体の組み合わせを含むキットに関する。
【００１７】
開示される方法は、ヒト副甲状腺ホルモンの酸化された抗原決定基に結合する抗体と前記サンプルとを接触させることによって、酸化ストレスを受けやすく、メチオニン８もしくは１８のいずれかまたはこの両方またはトリプトファン２３において酸化されたＰＴＨペプチド鎖から、患者由来の血漿または血清のサンプルを精製することを一般に含む。ＰＴＨの酸化およびその後の不活性化は、血液透析治療を受けているＣＫＤ患者が、従来のＰＴＨ測定に干渉する酸化ストレスを受けているため、問題点となる。前記方法は、さらに、血液循環中に副甲状腺の細胞によって分泌されるＰＴＨペプチドの割合と、血液透析治療による酸化ストレスによって酸化されて血液循環からクリアランスされるＰＴＨペプチドの平衡に相当するＰＴＨの状態（以下「ｎ−ｏｘＰＴＨ」状態）を得るために、受容体への結合およびｃＡＭＰ−シクラーゼの活性化を担うドメインを少なくとも含有する、ヒト副甲状腺ホルモンのペプチドの濃度を測定するイムノアッセイによる、前記精製サンプル中の分泌副甲状腺ホルモンの状態の決定を含む。次いで、開示される方法は、分泌副甲状腺ホルモンの調節に関する薬物療法の必要性、または副甲状腺ホルモンの直接的な補充の必要性を決定するために、血液透析患者総死亡率が低いｎ−ｏｘＰＴＨの状態と、測定されたｎ−ｏｘＰＴＨの状態とを比較する。
【００１８】
方法は、ヒト副甲状腺ホルモンの酸化抗原決定基に結合する抗体が結合した固相と前記血漿サンプルを接触させる工程を含む。結合剤は、スラリーの形態をしていてもよい。
【００１９】
好ましい態様によれば、前記方法は、２−サイトイムノアッセイの使用を含み、一方の抗体が、ＰＴＨ受容体１および２へのＰＴＨペプチドの結合に関与するドメインに結合するモノクローナル抗体である。抗体は、ＷＯ２００３／００３９８６（Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ  ＪＳ）において開示されるように、またはＷＯ０１／４４８１８（Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒ  ＦＰ  ｅｔ  ａｌ）もしくはＵＳ６，０３０，７９０（Ａｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ）において記載されるように、ヒト副甲状腺ホルモンのアミノ酸１から１３の間のエピトープを認識および選択的に結合するものであってもよい。分泌された効力のあるヒトＰＴＨペプチドの濃度を測定するための、さらに適した抗体は、ＷＯ００／４２４３７において開示される。
【００２０】
他の実施形態では、前記方法は、２−サイトイムノアッセイの使用を含み、一方の抗体が、ヒトＰＴＨの一番端のアミノ末端のアミノ酸バリンおよびセリンを含む抗原決定基に結合し、他方の抗体が、ヒトＰＴＨ配列のアミノ酸１４から３４の間の領域に結合する。
【００２１】
好ましい実施形態では、免疫反応性があるＰＴＨペプチドを精製するための抗体が、８および／もしくは１８におけるいずれかのメチオニンでのまたは２３位のトリプトファンでの天然の副甲状腺ホルモンの酸化に続く、ペプチド立体構造の変化によって形成される、ヒト副甲状腺ホルモンのアミノ酸３から３４の間に位置する三次元抗原決定基を認識する。利用可能なＮＭＲデータはないが、ＰＴＨペプチド立体構造の同様の変化が、一番端のアミノ末端のアミノ酸セリンおよびバリンのタンパク分解性の除去によってもたらされ、そのため立体構造抗体が、ミスフォールドされたペプチドをも除去することも、当業者は十分に理解しているであろう。立体構造の変化が、酸化ストレスに続くペプチドの酸化を相乗的に導くかどうかはまだ解明されていない。しかしながら、酸化および立体構造の変化は、血漿からのＰＴＨのクリアランスの割合を暗示する。
【００２２】
本発明の態様は、慢性腎疾患に罹患している患者由来の血清または血漿サンプルの試験に関する。さらなる態様は、尿毒症の患者または甲状腺機能亢進症を有する患者由来のサンプルの試験に関する。
【００２３】
本発明は、好ましい実施形態を例証する添付の表および図と共に読まれた場合、最も理解される。しかしながら、本発明が図中に開示される特定の実施形態に限定されないことが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】３４０人の血液透析患者における、測定された非酸化副甲状腺ホルモンの状態（ｎ−ｏｘＰＴＨ）についての測定血清値の相対度数（％）分布を示す図である。
【図２】３４０人の血液透析患者における死亡についてのＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す図である；患者は、測定された非酸化副甲状腺ホルモン（ｎ−ｏｘＰＴＨ）の状態濃度の三分位値に層別化した（ログランク検定、カイ２乗＝１４．３０；ｐ＝０．０００８）。
【図３】健康な対象における正常なｉＰＴＨ範囲（７０ｎｇ／Ｌ）よりも高い、測定ｉＰＴＨ濃度を有する血液透析患者における死亡についてのＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す図である。（Ａ）は患者が、測定可能な非酸化副甲状腺ホルモン（ｎ−ｏｘＰＴＨ）の状態の中央値に従って層別化された場合（ログランク検定、カイ２乗＝０．０４６；ｐ＝０．８０）、ｎ−ｏｘＰＴＨの状態は、患者の予後と相関しない。（Ｂ）は患者が、ｉＰＴＨ濃度の中央値に従って層別化された場合（ログランク検定、カイ２乗＝３．８５２；ｐ＝０．０４９）、ｉＰＴＨアッセイを使用して測定される酸化ＰＴＨの濃度は、患者の予後を予測する。
【図４】３４０人の血液透析患者における死亡についてのＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す図である。国際的なガイドラインに従って、患者を、非常に低い（＜２０ｎｇ／Ｌ）、低い（２０から６５ｎｇ／Ｌ）、中程度（６５から１５０ｎｇ／Ｌ）、目標（１５０から３００ｎｇ／Ｌ）および高い（＞３００ｎｇ／Ｌ）濃度に相当する５つのｉＰＴＨカテゴリーに層別化した（カイ２乗１６．３５；ログランク検定によってＰ＝０．００２６）。ｉＰＴＨ濃度および予後の間のＪ型のパターンは、血液透析患者について特徴的であり、従って、今回の研究において見られた発見が全体的に適切であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
動物実験は、メチオニン残基のＰＴＨの酸化が生物学的活性の損失をもたらすことを示した。あらゆる酸化ストレスまたは副甲状腺ホルモンの酸化的非活性化は、血液循環中への副甲状腺ホルモンの分泌の増加によって、補い得、またはさらに過剰に補い得る。ここで、本発明者らは、治療上の決定および特定の薬物療法のきっかけとなる、酸化ストレスパラメーターおよび血液透析患者における死亡率へのこの影響力を開示する。より正確には、血清中の非酸化インタクト免疫反応性ＰＴＨ（ｎ−ｏｘＰＴＨ）およびインタクト免疫反応性ＰＴＨ（ｉＰＴＨ）の影響を比較し、血液透析患者の生存と関連させる。
【００２６】
「インタクトＰＴＨ」は、受容体への結合およびｃＡＭＰ−シクラーゼの活性化を担うドメインを少なくとも含有するＰＴＨペプチドを検出する１−または２−サイトイムノアッセイによって測定される場合、免疫反応性ＰＴＨペプチドの量または濃度として定義される。このドメインは、ＰＴＨのタンパク質のアミノ末端部分（ｈＰＴＨ（１から３７））に位置する。ｃＡＭＰ受容体への結合ドメインは、Ｈｉｓ１４からＰｈｅ３４の領域を含み、ＤＮＡ合成刺激ドメインは、Ａｓｐ３０からＰｈｅ３４を含む。完全なアミノ末端ペプチドｈＰＴＨ（１−３４）は、正確なフォールディングおよびｃＡＭＰ依存性シグナル経路の刺激に必要とされる。刺激能力は、Ｓｅｒ１およびＶａｌ２の欠失と同時に失われるが、ｃＡＭＰ受容体への結合能力は、この欠失によって影響を受けず、活性化部位および受容体への結合部位が異なるドメインに位置することを示す。
【００２７】
ＰＴＨの生物活性は、ＰＴＨペプチド鎖の正確なフォールディングならびに８位および／もしくは１８位の１つ以上のメチオニンのまたはトリプトファン２３での酸化が存在しないことによって影響を受けるので、上記に定義される免疫反応性「インタクトＰＴＨ」は「生物活性ＰＴＨ」と同義ではない。多数の研究にもかかわらず、副甲状腺ホルモンの生物活性およびこの非活性化についての経路は、不明瞭なままであり、「有効な生物活性」を含むと言われるＰＴＨペプチドの実体とほとんど相関させることができない。患者におけるＰＴＨ生物活性および血漿免疫活性の消失の不一致は、動的なＰＴＨの平衡を示唆し、そのため、ＰＴＨの薬物療法には、刻一刻の「インタクトＰＴＨ」活性の分泌の割合および刻一刻の「ｏｘＰＴＨペプチド」のクリアランスの割合の測定が必要とされ、そのため、開示されるｎ−ｏｘＰＴＨの状態の測定は、両方のＰＴＨの割合を考慮し、患者によって必要とされる、適したＰＴＨの薬物療法のための方向を示すことができる。
【００２８】
ｎ−ｏｘＰＴＨの測定は、例えばｈＰＴＨ（３５−８４）およびこの断片のような、多くのＣ−末端ＰＴＨ分解産物と臨床的に妥当な交差反応性を有しない、「生物活性」ＰＴＨの測定のための試験系を使用して実行することができる。これらには、例えばＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、ＭａｎｎｈｅｉｍのＥｌｅｃｓｙｓ（商標）２０１０  ＰＴＨイムノアッセイおよびＳｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社のＣＡＰ−ＰＴＨ−ＩＲＭＡがある。エレクトロケミルミネセンスイムノアッセイは、ｈＰＴＨのアミノ酸２６から３２を含むアミノ末端立体構造エピトープに対するモノクローナル捕捉抗体およびアミノ酸５５から６４に対応するＣ−末端ｈＰＴＨエピトープに対するルテニウム複合体マークトレーサー抗体を用いる。モノクローナル捕捉抗体は、不活性な「大きなｈＰＴＨ（７から８４）断片」を認識するが、ｈＰＴＨ（１−３４）、ｈＰＴＨ（１−３５）またはｈＰＴＨ（１−３７）などのような生物活性ｈＰＴＨ−断片を認識しない（Ｇａｏ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｐｏｓｔｅｒ  Ｍ４５５，ＡＳＢＭＲ  ２２ｎｄ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｒｏｔｈ  Ｈ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｐｏｓｔｅｒ  ＰＩ  ２８８；１１ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，Ｓｙｄｎｅｙ）。Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社（Ｓａｎｔｅｅ、ＣＡ、ＵＳ）のＣＡＰ−ＰＴＨ−ＩＲＭＡは、大きなＰＴＨ（７−８４）断片に結合しないと記載される、ｈＰＴＨ（１−６）のＮ−末端領域に対するポリクローナル抗体を用いる。さらに、Ｑｕｅｓｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．は、「Ｂｉｏ−Ｉｎｔａｃｔ  ＰＴＨ  ｔｅｓｔ」を導入し、ＦＤＡの許可を得たが、これは、分解性向を有する分子の断片ではなく、副甲状腺ホルモン分子全体を認識すると言われているからである。現在、ＰＴＨ測定は、血液における不活性ＰＴＨ断片の存在によって複雑になることが多く、これは、このような試験の臨床的な有用性に影響を与える。８４アミノ酸鎖からなるＰＴＨ分子全体を認識する際に、Ｂｉｏ−Ｉｎｔａｃｔ  ＰＴＨアッセイは、ＰＴＨの生物学的効果にとって不可欠であると考えられるＰＴＨのＮ−末端領域に対して特異性を有する。Ｂｉｏ−Ｉｎｔａｃｔ  ＰＴＨ試験は、アミノ酸１から１３を含む三次元エピトープに結合すると記載される専用の抗体を使用する。血液循環中へのｈＰＴＨの分泌の割合を決定するために如何なるイムノアッセイが使用されようとも、結果として生じるｈＰＴＨの状態は、これらのイムノアッセイが、分解の経路、多くの活性、部分的活性および不活性ＰＴＨ断片、血清または血漿におけるこれらの異なる半減期などのような、すべての関連因子を考慮することができるとは限らないので、真のＰＴＨ生物活性を反映しない。
【００２９】
本出願は、ｎ−ｏｘＰＴＨの三分位値が上位のｎ−ｏｘＰＴＨ濃度を有する血液透析患者は、ｎ−ｏｘＰＴＨの三分位値が下位の患者と比較して、生存の増加を示すことを明らかにする。多変数調整の後に、血液透析患者における死亡の見込みについて、ｎ−ｏｘＰＴＨ三分位値が高くなるほどその見込みが低下したのに対して、年齢が高くなるほどその見込みが増加した。本発明の開示の妥当性は、本発明者らのコホートからのｉＰＴＨデータを、国際的なガイドラインによる５つのカテゴリーへ層別化することにより、前記ガイドラインによる目標のｉＰＴＨ濃度を有する血液透析患者が、他のグループと比較して、より長い生存期間の中央値を有することを明らかにするという事実によって強固なものとなっている。Ｊ型の生存パターンは、多数の死亡率メタアナリシスから、ｉＰＴＨデータ由来の結果を確証するものである。ＰＴＨの酸化がこの生物学的活性の損失をもたらすことはよく知られているが、現在のＰＴＨアッセイはＰＴＨの分泌形態およびクリアランス形態を区別しない。正常範囲の上限（７０ｎｇ／Ｌ）を超えるｉＰＴＨを示す血液透析患者のサブグループにおける本発明者らの分析は、クリアランスおよび酸化の増加の悲惨な影響から、ホルモンの真の影響を明確に区別した。免疫反応性ＰＴＨのクリアランスの増加は、ほとんどの現在のイムノアッセイによって注目されているが、酸化および非活性化の増加については注目されていない。本発明者らは、このサブグループにおける死亡率の増加が、生物学的に活性なｎ−ｏｘＰＴＨには依存せず、全タンパク質酸化およびタンパク質の機能と構造の損傷に関連する酸化の代わりとしてのｉＰＴＨのタンパク質酸化に依存したことを観察した。
【００３０】
ヒトＰＴＨは、８４アミノ酸を有するポリペプチドとして副甲状腺の主細胞によって分泌される。血液循環中に分泌した後に、本質的なドメインを含む生物活性ＰＴＨペプチドは、骨および腎臓において高濃度で存在する副甲状腺ホルモン１受容体ならびに中枢神経系、膵臓、精巣および胎盤において高濃度で存在する副甲状腺ホルモン２受容体の活性化によって、血中カルシウムを増加させる。これらの生物活性ＰＴＨペプチドの半減期は、わずかおよそ４分間である。また、これらのＰＴＨペプチドの酸化が生物学的活性の損失をもたらし得ることも知られていた（Ｇａｌｃｅｒａｎ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ，ｉｎ  Ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−（１−３４）ｉｎ  ｄｏｇｓ  ａｎｄ  ｒａｔｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１９８４；１１５：２３７５−２３７８；Ｈｏｒｉｕｃｈｉ  Ｎ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｏｎ  ｉｔｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙ  ｉｎｆｕｓｅｄ，ｔｈｙｒｏｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄｅｃｔｏｍｉｚｅｄ  ｒａｔｓ．Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．１９８８；３：３５３−３５８；Ｚｕｌｌ  ＪＥ  ｅｔ  ａｌ，ｉｎ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ．Ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９０；２６５：５６７１−５６７６）。実際に、多くの刊行物が、慢性腎不全患者における酸化ストレスの影響を扱ってきた（Ｍａｒｔｉｎ−Ｍａｔｅｏ  ＭＣ  ｅｔ  ａｌ（１９９９），Ｒｅｎ  Ｆａｉｌ  ２１  ：５５−１６７；Ｈａｓｓｅｌｗａｎｄｅｒ  Ｏ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）（Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｒｅｓ  ２９：１−１１；Ｚｏｃｃａｌｉ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １５：Ｓｕｐｐｌ．２；Ｃａｎａｕｄ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｂｌｏｏｄ  Ｐｕｒｉｆ  １７：９９−１０６）。様々なワーキンググループが、酸化副甲状腺ホルモンおよびこの生物学的活性について調査してきた（Ａｌｅｘｉｅｗｉｃｚ  Ｌ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０），Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １：２３６−２４４；Ｚｕｌｌ  Ｊ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６５：５６７１−５６７６；Ｐｉｔｔｓ  Ｔ  Ｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｍｉｎｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  Ｍｅｔａｂ  １５：２６７−２７５；Ｈｏｒｉｕｃｈｉ  Ｎ（１９８８）Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ３：３５３−３５８；Ｆｒｅｌｉｎｇｅｒ  Ａ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ２４４：６４１−６４９；ＧａｌｃｅｒａｎＴ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １１５，２３７５−２３７８；Ｆｒｅｌｉｎｇｅｒ  Ａ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５９：５５０７−５５１３；Ｏ���Ｒｉｏｒｄａｎ  ＪＬＨ  ｅｔ  ａｌ．（１９７４）Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒ  ６３：１１７−１２４；Ｌｏｇｕｅ  ＦＣ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ａｎｎ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２８：１６０−１６６；Ｌｏｇｕｅ  Ｆ  Ｃ（１９９１ｂ）Ｊ  Ｉｍｍｕｎ  Ｍｅｔｈ  ３９：１５９）。しかしながら、透析患者における酸化ストレスならびに罹患率および総死亡率に対する影響は、これまでに、調査も認識もされていない。
【００３１】
いわゆるインタクトＰＴＨ（ｉＰＴＨ）およびバイオインタクト（ｂｉｏ−ｉｎｔａｃｔ）サンドイッチアッセイは、非酸化ＰＴＨペプチド鎖（ｎ−ｏｘＰＴＨ）および酸化ＰＴＨペプチド鎖（ｏｘＰＴＨ）を区別しない。質量分析を使用して、本発明者らは、最近、血液透析患者における酸化ストレスが、インビボにおいてヒトＰＴＨの酸化ならびに８位および／または１８位において酸化メチオニン残基を有する様々な不活性ＰＴＨ産物を導き得ることを実証した（Ｈｏｃｈｅｒ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ  ｉｎ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ（ＰＴＨ）ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ−ｄｏ  ｗｅ  ｎｅｅｄ  ａ  ｆｏｕｒｔｈ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｓｓａｙ？ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１２；７：ｅ４０２４２）。この発見および血漿または血清における非酸化および酸化「インタクト」ＰＴＨペプチド鎖の間での免疫学的な区別は、血液透析患者への新しい薬物療法を可能にするｎ−ｏｘＰＴＨの状態のきっかけとなる。以後、用語ｎ−ｏｘＰＴＨは、ＰＴＨペプチド鎖の酸化による血清または血漿におけるＰＴＨのクリアランスを考慮した後の、血清または血漿における、上記に定義されたとおりの免疫反応性「インタクト」ＰＴＨ（ｉＰＴＨ）の濃度に対して使用される。血液透析患者の総死亡率が、免疫反応性の分泌インタクトＰＴＨと、ＰＴＨのアミノ末端部分における酸化に対して免疫反応性であるＰＴＨペプチド鎖の平衡に関連づけられることを本発明者らが発見したので、測定されるｎ−ｏｘＰＴＨ濃度が血清中に存在する「真の」ＰＴＨ生物活性を示すかどうかは関係がない。酸化されたＰＴＨ鎖が除去された後にのみ、その結果として生じる、血清の中に分泌されているｉＰＴＨの割合が、インビトロのパラメーターを与え、このパラメーターは、ビタミンＤ、リン結合剤またはカルシウム受容体作動薬の治療が、国際的なガイドラインによって提供される治療目標を実現するための調整を必要とするかどうかに関しての治療上の決定を可能にする。血液透析患者における総死亡率と相関する動的ＰＴＨパラメーターの発見は、そのうえ、適切な薬物療法および治療を可能にする。下記に記載される実施例では、血清中のＰＴＨ濃度は、直接に（全インタクト副甲状腺ホルモン、ｉＰＴＨ）、および酸化したヒトＰＴＨペプチド鎖に結合するモノクローナル抗体を使用してサンプルから酸化したＰＴＨの分子の除去した後の両方で、第３世代インタクトＰＴＨイムノアッセイ系（Ｅｌｅｃｓｙｓ（商標）２０１０  ＰＴＨ  Ｒｏｃｈｅ）によって測定した。
【００３２】
本発明者らの研究における血液透析患者（２２４人の男性／１１６人の女性）は、６６歳の年齢中央値を有した。１７０人の患者（５０％）は、５年間の経過観察期間の間に死亡した。ｎ−ｏｘＰＴＨ中央値濃度は、死亡した患者（５．０ｎｇ／Ｌ；ｐ＝０．００２）と比較して、生存者（７．２ｎｇ／Ｌ）においてより高かった。生存分析は、最も低いｎ−ｏｘＰＴＨ三分位値と比較して、最も高いｎ−ｏｘ−ＰＴＨ三分位値において生存の増加を示した（カイ２乗１４．３；ｐ＝０．０００８）。生存期間の中央値は、最も高いｎ−ｏｘＰＴＨ三分位値において１７０２日であったのに対して、最も低いｎ−ｏｘＰＴＨ三分位値においてわずか４５３日であった。多変数調整Ｃｏｘ回帰は、年齢が高くなるほど死亡の見込みを増加させたのに対して、ｎ−ｏｘＰＴＨが高くなるほど、死亡の見込みを低下させたことを示した。ｉＰＴＨアッセイの正常範囲の上限（７０ｎｇ／Ｌ）を超える、ベースライン時の分泌ｉＰＴＨ濃度を有する患者のサブグループを分析する他のモデルは、このサブグループにおける死亡率がｎ−ｏｘＰＴＨ濃度ではなくＰＴＨ酸化に関連したことを明らかにした。国際的なガイドラインに従う目標ＰＴＨ濃度（ＰＴＨ目標＝１５０から３００ナノグラム／Ｌ）と生存者におけるｎ−ｏｘＰＴＨ中央値（７．２ｎｇ／Ｌ）との間の大きな数字の差異は、当業者の注意をのがれることはなく、また、これを予想することはできなかったであろう。結論として、血液透析患者の死亡率に対するｎ−ｏｘＰＴＨおよびｉＰＴＨ濃度の予知力は、実質的に異なる。そのため、ｎ−ｏｘＰＴＨの測定は、動的ＰＴＨホルモンの状態をより正確に反映する。ｉＰＴＨ関連性の死亡率は、とりわけｉＰＴＨ濃度が高い場合、主に、ＰＴＨタンパク質酸化および酸化ストレスに関連する死亡率を反映する。これは、新しい薬物療法プログラムおよび治療のきっかけとなる。当業者は、ＰＴＨの酸化の程度および本質的な酸化ストレスの測定が、新しい治療および薬物療法プログラムを導くことを十分に理解するであろう。従って、血清または血漿内の酸化ＰＴＨペプチドの定量的な量は、調節およびモニタリングを必要とする重要な医学的パラメーターに相当する。
【実施例】
【００３３】
［実施例１］
ＰＴＨ測定
第３世代のエレクトロケミルミネセンスＰＴＨイムノアッセイシステムによって、直接に（ｉＰＴＨ）、および酸化ヒトＰＴＨ（ｎ−ｏｘＰＴＨ）に対して産生されたモノクローナル抗体を使用してサンプルからミスフォールドまたは酸化したＰＴＨ分子を事前に除去した後の両方で、ＰＴＨを測定した。酸化ＰＴＨの除去は、下記に記載されるように、抗ヒト酸化ＰＴＨモノクローナル抗体を使用して実行した。抗ヒト酸化ＰＴＨモノクローナル抗体を、ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）上に固定した。１００μｌ一定分量のスラリーをカラム（ＭｏｂｉＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ、ＭｏＢｉＴｅｃ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に充填し、ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４により平衡化した。次いで、５００μｌの血漿サンプルをカラム上に加え、室温で２時間、回転混合しながらインキュベートし、２５０μｌの０．１Ｍ酢酸アンモニウムバッファーｐＨ７．０により洗浄し、その後、２０％アセトニトリルを含有する、２５０μｌの０．１Ｍ酢酸アンモニウムバッファーｐＨ７．０により洗浄し、次いで、２００μｌの溶出バッファー（０．０５Ｍギ酸、ｐＨ３．５）により２回溶出した。フロースルーを別々に収集し、凍結乾燥した。
【００３４】
次いで、サンプルを５００μｌのＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４中で戻し、一定分量をｉＰＴＨについて分析した。用いたｉＰＴＨイムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ  Ｅｌｅｃｓｙｓ  ２０１０；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）は、アミノ酸２６−３２と反応するビオチン化モノクローナル抗体およびアミノ酸５５−６４と反応する捕捉ルテニウム複合型モノクローナル抗体に基づく。測定は、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｅ  １７０で実行した。それぞれ、３５．０および１８０．０ｎｇ／Ｌの濃度で、アッセイ内のＣＶは、４．１％、また、アッセイ間のＣＶは、５．８％であった。
【００３５】
［実施例２］
酸化ＰＴＨ（ａａ  １−３８）の立体構造エピトープに対するモノクローナル抗体
モノクローナル抗体はＢＡＬＢ／ｃ−マウスにおいて産生した。マウスは、腹腔内において、不完全フロインド（鉱油のみ）と共に、一次および二次免疫のために、２００μｇのｏｘＰＴＨ（ａａ  １−３８）チレオグロブリンコンジュゲートにより免疫化した。それぞれの抗血清を、非酸化ビオチン−ｈＰＴＨ（１−３８）への結合について試験した。ｏｘＰＴＨ（ａａ  １−３８）ペプチドを特異的に認識する抗体を検出するために、本発明者らは２重抗体分離技術およびトレーサーとして、１２５Ｉ−ストレプトアビジンにより標識したビオチン−ｏｘＰＴＨ（ａａ  １−３８）を使用した。細胞融合およびＨＡＴ選択の後に、選択したハイブリドーマは、同じ方法で、即ち、ヒトＰＴＨ（１−８４）ではなく、ヒト酸化ＰＴＨ（ａａ  １−８４）への結合について、スクリーニングした。
【００３６】
モノクローナル抗体（ＭＡＢ）の特異性の最終的な特徴付けのために、ならびに酸化状態およびキラリティー（８位、１８位およびこの両方でのＭｅｔ−Ｒ−Ｏ、Ｍｅｔ−Ｓ−ＯおよびＭｅｔＯ２）とは無関係に、酸化ｈＰＴＨ（１−３８）ペプチドに共通する、例えば、酸化ｈＰＴＨ（ａａ  １−３８）のすべての形態に共通する立体構造エピトープを認識するモノクローナル抗体の同定のために、抗体を、ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）上に固定した。１００μｌ一定分量のスラリーをカラム（ＭｏｂｉＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ、ＭｏＢｉＴｅｃ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に充填し、ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４により平衡化した。次いで、２．５μｇの凍結乾燥した酸化ｈＰＴＨ（１−８４）を、３００μｌの平衡化バッファー中に溶解し、カラム上に加えた。カラムを室温で１時間、回転させながらインキュベートし、３００μｌの平衡化バッファーにより洗浄し、その後、３００μｌの蒸留水により３回洗浄し、次いで、２００μｌの溶出バッファー（０．１％  ＴＦＡ）により２回溶出した。フロースルー、洗浄画分（平衡化バッファーおよび水）ならびにカラムの溶出物を別々に収集し、凍結乾燥し、ｎａｎｏＬＣ−ＥＳＩ−ＦＴ−ＭＳによって分析した。酸化ｈＰＴＨ（ａａ  １−８４）およびこの断片のすべての形態上に存在する立体構造エピトープを認識するモノクローナル抗体（「ｏｘＰＴＨ−ＣｏｎｆｏｒＭＡＢ」）を、さらなる分析および特徴付けのために選択した。選択したｏｘＰＴＨ−ＣｏｎｆｏｒＭＡＢは、酸化およびミスフォールドｈＰＴＨ断片のすべての形態を高い親和性で特異的に認識したが、非酸化ＰＴＨ（ａａ  １−８４）は認識しなかった。
【００３７】
［実施例３］
患者
３４０人の血液透析患者における前向きコホート研究について５年間、経過観察した。本発明者らの適格性判定基準により、末期の慢性腎疾患ステージ５のために血液透析治療を受けているすべての成人の一般の患者およびインフォームドコンセントがあることを含めた。それぞれの患者からのインフォームドコンセントおよび地方の倫理委員会による倫理の承認を得た。組み入れ時の透析歴およびセッション当たりの血液透析治療の継続時間についてのデータを得た。患者はすべて、ダイアライザーの再利用なしで生体適合性の膜を使用して、４から５時間、毎週、３回、定期的に透析した。血流量は、２５０から３００  ｍＬ／分であり、透析液流量は、５００ｍＬ／分であり、透析液伝導率は、１３５ｍＳであった。血圧は透析前に測定した。透析前の血液サンプルは研究エントリー時に得た。血液は、血液透析セッションの開始直前に収集した。
【００３８】
臨床および検査データは、年齢、性別、薬物療法（アンジオテンシン変換酵素阻害剤、β−遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬およびエリトロポイエチンの使用）、ボディマス指数（身長の２乗で割った体重として計算）、収縮期および拡張期血圧、血清アルブミン、血清コレステロール、血清トリグリセリド、血清尿素、血清クレアチニン、血清カルシウム、血清カリウムならびに血清リンを含めた。
【００３９】
１７０人の患者（５０％）は、５年間の経過観察期間の間に死亡した。死亡の原因は、急死、感染症または癌を含む心血管系として分類された。
【００４０】
［実施例４］
ｎ−ｏｘＰＴＨ測定の統計分析
図１は、６６歳の年齢中央値（ＩＱＲ、５６から７５歳）、２６６日の透析の開始からの時間中央値（透析歴）（ＩＱＲ、３１から１２０９日）および１．２の透析用量中央値（ｋｔ／Ｖ）（ＩＱＲ、１．１から１．３）での、３４０人の血液透析患者（２２４人の男性および１１６人の女性）におけるｎ−ｏｘＰＴＨ濃度の分布を示す。慢性腎疾患の原因は、１１３症例（３３％）において腎硬化症、１０７症例（３１％）において糖尿病性腎症、２９症例（９％）において慢性糸球体腎炎、９症例（３％）において多発性嚢胞腎疾患および８２症例（２４％）において他／未知であった。ｎ−ｏｘＰＴＨ濃度中央値は、５．９ｎｇ／Ｌ（ＩＱＲ、２．４から１４．０ｎｇ／Ｌ））であった。ｎ−ｏｘＰＴＨ濃度は、男性および女性において差はなかった（５．９ｎｇ／Ｌ；ＩＱＲ、２．４から１４．２ｎｇ／Ｌ；ｎ＝２２４；対５．５ｎｇ／Ｌ；ＩＱＲ、２．４から１４．０ｎｇ／Ｌ；ｎ＝１１６；ｐ＝０．９１５）。
【００４１】
表１は、ｎ−ｏｘＰＴＨの三分位値によって層別化した治療事例および検査変数の分布を要約する。三分位値の限界値は、それぞれ３．３ｎｇ／Ｌおよび１０．３ｎｇ／Ｌのｎ−ｏｘＰＴＨ濃度であった。ｎ−ｏｘＰＴＨの三分位値が上位の血液透析患者は、より高い体重、ボディマス指数およびより高い尿素、食物タンパク質摂取量について代用される、より高いクレアチニン、筋肉量について代用されるならびに鉱質代謝障害の典型的なサイン、即ち、低血清カルシウム濃度および高血清リン濃度を有した。さらに、血清リン濃度は、正比例して（Ｓｐｅａｒｍａｎ  ｒ＝０．２４５；ｐ＜０．００１）、血清カルシウム濃度は、反比例して（Ｓｐｅａｒｍａｎ  ｒ＝−０．１６０；ｐ＝０．００４）、ｎ−ｏｘＰＴＨ濃度と相関した。他方では、年齢（Ｓｐｅａｒｍａｎ  ｒ＝−０．０９９）および透析歴（Ｓｐｅａｒｍａｎ  ｒ＝０．０９８）は、ｎ−ｏｘＰＴＨと有意に相関しなかった。
【００４２】
【表１】
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【００４３】
１７０人の患者（５０％）は、５年間の経過観察期間の間に死亡した。死亡は、研究エントリー後、２１７日の中央値（ＩＱＲ、６７から５６４日）で起こった。死亡の原因は、１０２人の患者（６０％）において心臓血管系疾患、３９人の患者（２３％）において感染症、１９人の患者（１１％）において癌および１０（６％）において他／未知の理由であった。ｎ−ｏｘＰＴＨ中央値濃度は、死亡した患者（５．０ｎｇ／Ｌ；ＩＱＲ、１．９から１１．１ｎｇ／Ｌ；Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ検定によってｐ＝０．００２）と比較して、生存者（７．２ｎｇ／Ｌ；ＩＱＲ  ３．１から１６．５ナノグラム／Ｌ）においてより高かった。生存分析は、下位のｎ−ｏｘＰＴＨ三分位値と比較して、上位のｎ−ｏｘＰＴＨ三分位値において生存の増加を示した（カイ２乗１４．３０；ログランク検定によってＰ＝０．０００８）。生存期間の中央値は、上位のｎ−ｏｘＰＴＨ三分位値において１７０２日であったのに対して、下位のｎ−ｏｘＰＴＨ三分位値においてわずか４５３日であった（図２）。
【００４４】
多変数調整生存分析は、変数の保持についてｐ＜０．０５を使用する変数減少法（ｂａｃｋｗａｒｄ）による変数選択と共に、比例ハザード回帰モデルを使用して実行した。試験した変数は、血漿ｎ−ｏｘＰＴＨ、ｉＰＴＨカテゴリー、透析用量、透析歴、年齢、ヘモグロビンおよび血清リンであった。ｉＰＴＨカテゴリー、透析用量、透析歴および血清リンは、有意な影響を示さなかった。この多変数調整Ｃｏｘ回帰は、年齢が高いほど死亡の見込みを増加させたことを示したのに対して、ｎ−ｏｘＰＴＨが高いほど、死亡の見込みを低下させた（表２）。
【００４５】
【表２】
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【００４６】
さらに、正常範囲の上限（７０ｎｇ／Ｌ）を超えるｉＰＴＨを有する患者のみを分析したモデルは、このサブグループにおける死亡率が、生物学的に活性なｎ−ｏｘＰＴＨではなく、ｉＰＴＨのタンパク質酸化に依存することを明らかにした。言いかえれば、ｎ−ｏｘＰＴＨは、正常範囲の上限を超えるｉＰＴＨ濃度を有する患者における死亡率に影響を及ぼさなかったのに対して、これらの患者において、ｉＰＴＨは総死亡率に関連した（図３）。
【００４７】
他のモデルを使用して、本発明者らは、非常に低い（＜２０ｎｇ／Ｌ）、低い（２０から６５ｎｇ／Ｌ）、中程度（６５から１５０ｎｇ／Ｌ）、目標（１５０から３００ｎｇ／Ｌ）および高い（＞３００ｎｇ／Ｌ）に相当する国際的なガイドラインに従う５つのカテゴリーにｉＰＴＨ濃度を演繹的に層別化した。生存分析は、Ｊ型のパターンを示した、即ち、目標ｉＰＴＨ濃度を有する患者は、他のカテゴリーと比較して、より長い生存期間の中央値を有した（カイ２乗１６．３５；ログランク検定によってＰ＝０．００２６）。ｉＰＴＨ濃度および予後の間のこのＪ型のパターンは、血液透析患者についての特質であり、これによって、本発明者らのデータが、典型的な血液透析コホートから得られたことを確証する（図４）。
【００４８】
［実施例５］
統計分析
連続変数は、四分位範囲（ＩＱＲ）および中央値として表現し、ノンパラメトリックＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定またはノンパラメトリックＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定および必要に応じてＤｕｎｎ多重比較ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定により比較した。変数の間の関連性は、ノンパラメトリックＳｐｅａｒｍａｎ相関を使用して試験した。事象までの時間についての（Ｔｉｍｅ−ｔｏ−ｅｖｅｎｔ）分析は、Ｋａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ方法を使用して実行した。生存曲線の比較は、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定を使用して実行した。カテゴリー変数は、比率として表現し、カイ二乗検定により比較した。多変数調整生存分析は、比例ハザード回帰モデルを使用して実行した。多変数モデルは、変数の保持についてｐ＜０．０５を使用する変数減少法による変数の選択により構築した。４５人の患者（１３％）が、経過観察の間に腎臓移植を経験した。これらの患者は、移植の日に検閲した。仮説検定はすべて、両側とし、統計的有意性は０．０５未満のｐ値を有することとして定義した。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）またはＳＰＳＳ  ｆｏｒ  ｗｉｎｄｏｗｓ（ｖｅｒｓｉｏｎ  １５；ＳＰＳＳ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を使用して行った。
【００４９】
要約
本出願は、血液透析患者の生存に関して、分泌されたインタクトなＰＴＨ（ｉＰＴＨ）、酸化によるＰＴＨ活性のクリアランス、結果として生じる非酸化インタクトＰＴＨ（ｎ−ｏｘＰＴＨ）に対応するパラメーターの間の、血漿または血清における動的平衡を試験する。ｎ−ｏｘＰＴＨ測定は、酸化ＰＴＨペプチド鎖からサンプルを精製した後にインタクトＰＴＨイムノアッセイにより実行した。本研究は、ｎ−ｏｘＰＴＨの三分位値が上位の血液透析患者が、ｎ−ｏｘＰＴＨの三分位値が下位の患者と比較して、生存期間の増加を享受することを示す。多変数調整の後に、血液透析患者における死亡についての見込みについて、ｎ−ｏｘＰＴＨ三分位値が高くなるほど低下したのに対して、年齢が高くなるほど増加した。本開示の妥当性は、本発明者らのコホートからのｉＰＴＨデータを、国際的なガイドラインによる５つのカテゴリーへ層別化することにより、前記ガイドラインによる目標のｉＰＴＨ濃度を有する血液透析患者が、他のカテゴリーと比較して、より長い生存期間の中央値を有したことを明らかにするという事実によって強固なものとなっている。このＪ型の生存パターンは、多数の死亡率メタアナリシスから、ｉＰＴＨデータ由来の結果を確証するものである。正常範囲の上限（７０ｎｇ／Ｌ）を超えるｉＰＴＨを示す血液透析患者のサブグループの分析は、酸化にさらされたＰＴＨペプチドの負の影響から、分泌されたｉＰＴＨペプチドの正の影響を明確に区別した。このサブグループにおける死亡率の増加は、ｉＰＴＨのタンパク質酸化に依存した。
【００５０】
このトピックに精通している腎臓学者は、この分析が、古典的な診断基準に従って二次性副甲状腺機能亢進症を有すると考えられる患者を意味する非常に高いｉＰＴＨ濃度を有する透析患者に適用されるべきであることを十分に理解するであろう。本発明者らの研究コホートにおける、このような高いｉＰＴＨ濃度を有する患者の数は、明確な説明を可能にするには少なすぎた。ＥＶＯＬＶＥ研究コホートにおいて調査されるような二次性副甲状腺機能亢進症を有する透析患者のコホート由来の分析は、この重要な臨床的な論点に対処するのを助け得る。
【００５１】
現在のガイドラインは、幾つかの研究が３００ｎｇ／Ｌを超えるＰＴＨ濃度でより悪い予後を観察したので、ＰＴＨ濃度を定期的に測定し、目標ＰＴＨ濃度（即ち１５０から３００ｎｇ／Ｌ）を得ることを推奨している。対照的に、本発明者らは、上位の三分位値の、即ち、１０．３ｎｇ／Ｌを超えるｎ−ｏｘＰＴＨ濃度を有する血液透析患者が、生存の増加を享受することを発見した。この発見は、驚くべきことであるが、いかなる理論によっても束縛されることを望むものではないとしても、説明はなされ得る。研究した透析コホートは、３００ｎｇ／Ｌを超えるｉＰＴＨ濃度を有するたった数人の患者しか含まなかった。このため、このサブコホートについての解決には、より大きな研究グループを必要とする。血漿または血清からのｉＰＴＨのクリアランスは、主に肝臓および腎臓によって起こるが、酸化ｉＰＴＨの半減期が非酸化ｉＰＴＨを超えるという証拠がある。本当のところ、非酸化ｉＰＴＨの代謝クリアランス率は、体重１ｋｇ当たり約２１．６ｍＬ／分の範囲であるのに対して、酸化ｉＰＴＨの代謝クリアランス率は、体重１ｋｇ当たりわずか８．８ｍＬ／分である（Ｎｅｕｍａｎ  ＷＦ  ｅｔ  ａｌ  ｉｎ  Ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ．Ｖ．Ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．１９７５；１８：２７１−２８７；Ｈｒｕｓｋａ  ＫＡ  ｅｔ  ａｌ  ｉｎ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｉｎｔａｃｔ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  ｋｉｄｎｅｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｅｎａｌ  ｆａｉｌｕｒｅ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９８１  ；６７：８８５−８９２）。従って、先行技術文献における高いｉＰＴＨ濃度は、単に、大量の酸化ＰＴＨペプチド鎖の結果であるかもしれず、患者は酸化ストレスの増加を受けていた。さらに、消耗（ｗａｓｔｉｎｇ）は、測定可能な免疫反応性インタクトＰＴＨに影響を及ぼし得る。消耗（ｗａｓｔｉｎｇ）は、炎症および酸化ストレスにさらに関連する。従って、先行技術のインタクトＰＴＨ測定に対する、消耗（ｗａｓｔｉｎｇ）による影響力は、酸化ＰＴＨペプチドの存在に関係する可能性が高い。しかしながら、これは、今後の研究において証明される必要がある。
【００５２】
尿毒症の動物モデルにおけるおよび副甲状腺機能亢進症に罹患している患者における副甲状腺（ｐａｒａｔｈｙｒｅｏｉｄ  ｇｌａｎｄｓ）の除去は、高濃度のＰＴＨが血管石灰化、従って、尿毒症における心血管系の罹患および死亡の一因となることを証明した。同時に、酸化ストレスが、同様に、末期の腎臓病の患者において心血管系の死亡に関係することもまた真実である。本発明者らのデータは、ｉＰＴＨについてのＪ型の生存曲線が、２つの異なる生物学的処理の重ね合わせ（ｏｖｅｒｌａｙ）に相当することを示す。従来の免疫反応性ｉＰＴＨアッセイは、これらのＰＴＨ形態を区別もせず、ＰＴＨ測定に対する酸化ストレスの大きさもまた十分に理解されていなかった。ＣＫＤ患者に対する治療および薬物療法に関してｎ−ｏｘＰＴＨの状態についての情報を使用する方法について知識がなかった。結論として、総死亡率についての免疫反応性ｎ−ｏｘＰＴＨおよびｉＰＴＨの予知力は、実質的に異なる。従って、血漿または血清におけるあらゆる免疫反応性ＰＴＨペプチド濃度に基づく臨床的な決定は、酸化ＰＴＨのクリアランスが考慮に入れられない場合、末期の腎臓病を有する患者において判断を誤らせ得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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