(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非運動症状、睡眠起床障害、知覚障害、神経精神障害および認知困難を含む群から選択される少なくとも１つの症状を伴う神経疾患を診断するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、患者由来の、内因性ｃ−Ｒｅｌ因子を含む生体試料中の活性ｃ−Ｒｅｌ因子の量を測定することを含む方法。
【請求項２】
前記生体試料が血中単核細胞からのタンパク質抽出物を含む、請求項１に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項３】
前記生体試料が脳組織細胞からのタンパク質抽出物を含む、請求項１に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項４】
前記患者がパーキンソン病に冒されていることが疑われる対象である、請求項１から３のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項５】
前記患者がパーキンソン病に冒されている対象である、請求項１から３のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項６】
前記患者がヒトである、請求項１から５のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項７】
前記患者の生体試料中の活性ｃ−Ｒｅｌ因子の量の前記測定がイムノアッセイによって行われる、請求項１から６のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項８】
前記イムノアッセイがＥＬＩＳＡアッセイである、請求項７に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項９】
ｃ−Ｒｅｌ捕捉試薬と、非運動症状、睡眠起床障害、知覚障害、神経精神障害および認知困難を含む群から選択される少なくとも１つの症状を伴う神経疾患の診断のために活性ｃ−Ｒｅｌ因子の存在を検出するための手段とを含むキットの使用。
【請求項１０】
前記ｃ−Ｒｅｌ捕捉試薬が、活性ｃ−Ｒｅｌ因子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドである、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記ｃ−Ｒｅｌ捕捉試薬が固定化される、請求項９または１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記捕捉試薬がｋＢオリゴヌクレオチドである、請求項９から１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
活性ｃ−Ｒｅｌ因子の存在を検出するための前記手段が、一次抗ｃ−Ｒｅｌ抗体および二次抗ｃ−Ｒｅｌ抗体であり、前記ｃ−Ｒｅｌ捕捉試薬が活性ｃ−Ｒｅｌ因子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドである、請求項９から１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
前記認知困難が、実行機能障害、注意力のゆらぎ、認知速度の遅延、記憶障害および視空間認知困難を含む群から選択される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１５】
非運動症状、睡眠起床障害、知覚障害、神経精神障害および認知困難を含む群から選択される少なくとも１つの症状を伴う神経疾患に罹っていることまたは発症することが疑われる、患者由来の、内因性ｃ−Ｒｅｌ因子を含む試料と、ｃ−Ｒｅｌ捕捉剤と、ｃ−Ｒｅｌ因子を検出するための手段と、をｃ−Ｒｅｌ因子を前記ｃ−Ｒｅｌ捕捉剤に結合させるのに適合した条件下の水溶液中に、含む反応混合物。
【請求項１６】
前記神経疾患は、パーキンソン病である請求項１５に記載の反応混合物。
【請求項１７】
前記ｃ−Ｒｅｌ捕捉剤は、固定化され、活性ｃ−Ｒｅｌ因子に特異的に結合しているオリゴヌクレオチドである請求項１５又は請求項１６に記載の反応混合物。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
本発明は、パーキンソン病（ＰＤ）を診断するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法に関する。
【０００２】
パーキンソン病は、最も一般的な運動障害であり、ヨーロッパにおいて約１２０万人に影響を及ぼしており、その療法および社会復帰させる処置は大きな経済的課題である。
【０００３】
パーキンソン病の主な病理学的特徴は、黒質−線条体のドーパミン作動性ニューロンの変性、疾患に典型的な病理学的凝集体であるレビー小体へのアルファ−シヌクレインの凝集、シナプス機能障害、および神経炎症である。
【０００４】
ＮＦ−ｋＢ転写因子は、炎症とニューロン死の両方を調節するという点で、神経変性過程の進行において重要な役割を有することが知られている（ＰｉｚｚｉおよびＳｐａｎｏ、２００６；ＣａｍａｎｄｏｌａおよびＭａｔｔｓｏｎ、２００７）。ＮＦ−ｋＢファミリーの因子は、組み合わされて転写的に活性なダイマーを形成する、５つの異なるサブユニット（ｃ−Ｒｅｌ、ｐ６５／ＲｅｌＡ、ｐ５０、ＲｅｌＢ、ｐ５２）からなる。ｃ−Ｒｅｌ因子を含むダイマーは、抗アポトーシス遺伝子、中でも、ＭｎＳＯＤ酵素、Ｂｃｌ−ｘＬ因子（Ｐｉｚｚｉら、２００２、２００５、Ｓａｒｎｉｃｏら、２００９）、およびミトコンドリアのＵＣＰ４タンパク質（Ｈｏら、２０１２）遺伝子の転写を通して神経保護作用を促進する。より最近では、ｃ−Ｒｅｌ因子の病原的役割が、黒質線状体変性においておよびパーキンソン症候群の発症において見出された。ｃ−Ｒｅｌ遺伝子ノックアウトマウスにおいて、ｃ−Ｒｅｌ因子が欠損することにより、老化の間に、神経炎症、アルファ−シヌクレインおよび鉄の蓄積と共に、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの損失が誘導されることが示された。ｃ−Ｒｅｌ因子の欠乏は、こわばり、運動低下、運動緩慢と共に、パーキンソン型運動症状も引き起こし、これは、ヒトパーキンソン病のための療法の中で「黄金標準」と考えられている治療である、Ｌ−ドーパおよびベンセラジドでの治療に確かに好反応を示す（Ｂａｉｇｕｅｒａら、２０１２）。
【０００５】
数名の著者は、血中単核細胞（末梢血単核細胞、ＰＢＭＣ）が、ＰＤ関連の機能障害を研究するためのドーパミン作動性細胞モデルとなることを示唆しており、その理由は、これらの細胞が、ニューロンのドーパミン輸送体（ＤＡＴ）、ＤＡ合成において鍵となる酵素であるチロシンヒドロキシラーゼ、およびアルファ−シヌクレインを発現するからである（Ｃａｒｏｎｔｉら、１９９９、２００１；Ｋｉｍら、２００４）。これらのシグナルの診断有用性を検証し、なおいっそう疾患に特異的かつ高感度なバイオマーカーに関する探索を改良するために、多くの研究が行われている（Ｆｕｃｈｓら、２００８；Ｆｏｕｌｄｓら、２０１１；Ｇｏｒｏｓｔｉｄｉら、２０１２；Ｍａｒｔｉｎｓ−Ｂｒａｎｃｏら、２０１２）。
【０００６】
しかし、これまでのところ、パーキンソン病に有効と認められた利用可能な信頼性の高いバイオマーカーはない。さらに、ＰＤと関連している多くの症状、特に、自律神経障害、最も一般的には、便秘、ＲＥＭ障害などの睡眠起床障害、痛みおよび嗅覚鈍麻などの知覚障害、不安および抑鬱などの神経精神障害、ならびに認知困難と関連がある初期非運動症状は、ＰＤのみに関するものではなく、ある範囲にわたる神経疾患に関する特徴であるので、診断は困難である。利用可能な療法および医薬が患者の最大限の可能な利益のために使用できるように、初期段階で信頼性の高い診断を確立するために使用しうる診断手段を開発することが重要である。
【０００７】
したがって、本発明の根底にある１つの課題は、パーキンソン病のための信頼性の高いバイオマーカーを提供することである。
【０００８】
本発明の根底にある別の課題は、現在使用されている高価なイメージング技術と共にまたはその代わりに、より低コストで、診断をすることおよび疾患の進行をモニターすることを可能にする、パーキンソン病のための末梢バイオマーカーを提供することである。
【０００９】
本発明の根底にある別の課題は、ＰＤの症状、特に、便秘、抑鬱、ＲＥＭ行動障害、痛み、嗅覚損失（嗅覚鈍麻）および認知困難を含む非運動症状と同様の症状を伴う神経疾患を有する患者を診断するために使用されてもよい試験を提供することである。
【００１０】
これらおよび他の課題は、血中単核細胞（末梢血単核細胞、ＰＢＭＣ）における、パーキンソン病の新しい末梢マーカー、ＮＦ−カッパＢ／ｃ−Ｒｅｌ因子の使用に基づいた、パーキンソン病を診断するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法を提供する本発明によって解決される。
【００１１】
第１の側面では、課題は、パーキンソン病を診断するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、患者からの生体試料中の活性ｃ−Ｒｅｌ因子の量を測定することを含み、健常対照と比較した患者の生体試料中の活性ｃ−Ｒｅｌ因子の減少がパーキンソン病の指標である方法によって解決される。
【００１２】
第１の側面の好ましい態様では、生体試料は血中単核細胞からのタンパク質抽出物である。
【００１３】
第１の側面の別の好ましい態様では、生体試料は脳組織細胞からのタンパク質抽出物である。
【００１４】
第１の側面の別の好ましい態様では、患者はパーキンソン病に冒されていることが疑われる対象である。
【００１５】
第１の側面の別の好ましい態様では、患者はパーキンソン病に冒されている対象である。
【００１６】
第１の側面の別の好ましい態様では、患者はヒトである。
【００１７】
第１の側面の別の好ましい態様では、患者の生体試料中の活性ｃ−Ｒｅｌ因子の量の測定は、イムノアッセイによって行われる。
【００１８】
第１の側面の別の好ましい態様では、イムノアッセイはＥＬＩＳＡアッセイである。
【００１９】
第２の側面では、課題は、非運動症状、睡眠起床障害、知覚障害、神経精神障害および認知困難を含む群から選択される少なくとも１つの症状を伴う神経疾患を診断するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、患者由来の、内因性ｃ−Ｒｅｌ因子を含む生体試料中の活性ｃ−Ｒｅｌ因子の量を測定することを含む方法によって解決される。
【００２０】
第２の側面の別の好ましい態様では、生体試料は血中単核細胞からのタンパク質抽出物を含む。
【００２１】
第２の側面の別の好ましい態様では、生体試料は脳組織細胞からのタンパク質抽出物を含む。
【００２２】
第２の側面の別の好ましい態様では、患者はパーキンソン病に冒されていることが疑われる対象である。
【００２３】
第２の側面の別の好ましい態様では、患者はパーキンソン病に冒されている対象である。
【００２４】
第２の側面の別の好ましい態様では、患者はヒトである。
【００２５】
第２の側面の別の好ましい態様では、患者の生体試料中の活性ｃ−Ｒｅｌ因子の量の測定は、イムノアッセイによって行われる。
【００２６】
第２の側面の別の好ましい態様では、イムノアッセイはＥＬＩＳＡアッセイである。
【００２７】
第３の側面では、課題は、ｃ−Ｒｅｌ捕捉試薬と、非運動症状、睡眠起床障害、知覚障害、神経精神障害および認知困難を含む群から選択される少なくとも１つの症状を伴う神経疾患の診断のために活性ｃ−Ｒｅｌ因子の存在を検出するための手段とを含むキットの使用によって解決される。
【００２８】
第３の側面の別の好ましい態様では、ｃ−Ｒｅｌ捕捉試薬は、活性ｃ−Ｒｅｌ因子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドである。
【００２９】
第３の側面の別の好ましい態様では、ｃ−Ｒｅｌ捕捉試薬は固定化される。
【００３０】
第３の側面の別の好ましい態様では、捕捉試薬は、ｋＢオリゴヌクレオチドである。
【００３１】
第３の側面の別の好ましい態様では、活性ｃ−Ｒｅｌ因子の存在を検出するための手段は、ｃ−Ｒｅｌに結合する二次抗体、好ましくは、標識された二次抗体である。
【００３２】
別の好ましい態様では、認知困難は、実行機能障害、注意力のゆらぎ、認知速度の遅延、記憶障害および視空間認知困難を含む群から選択される。
【００３３】
別の好ましい態様では、認知困難を伴う神経疾患は、パーキンソン病である。
【００３４】
第４の側面では、課題は、
非運動症状、睡眠起床障害、知覚障害、神経精神障害および認知困難を含む群から選択される少なくとも１つの症状を伴う神経疾患、好ましくは、パーキンソン病に罹っていることまたは発症することが疑われる患者由来の、内因性ｃ−Ｒｅｌ因子を含む試料と
好ましくは、固定化され、好ましくは、活性ｃ−Ｒｅｌ因子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドである、ｃ−Ｒｅｌ捕捉剤とを
ｃ−Ｒｅｌ因子を前記オリゴヌクレオチドに結合させるのに適合した条件下の水溶液中に、
好ましくは、ｃ−Ｒｅｌ因子を検出するための手段の存在下で、より好ましくは、ｃ−Ｒｅｌ捕捉剤と、ｃ−Ｒｅｌ因子と、ｃ−Ｒｅｌ因子を検出するための前記手段とを含む複合体中に、
含む反応混合物によって解決される。
【００３５】
別の好ましい態様では、非運動症状は、自律神経障害、好ましくは、便秘と関連がある。
【００３６】
別の好ましい態様では、睡眠起床障害はＲＥＭ障害である。
【００３７】
別の好ましい態様では、知覚障害は、痛みおよび嗅覚鈍麻を含む群から選択される。
【００３８】
別の好ましい態様では、神経精神障害は、不安および抑鬱を含む群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】
【００４０】
以下の実験項において詳細に例示される、本発明者らによって行われた研究は、神経変性疾患に冒された患者の脳においてこれまで調査されていない、ＮＦ−カッパＢ／ｃ−Ｒｅｌ転写タンパク質の活性がパーキンソンの患者の血球において有意に低減され、これにより、ＮＦ−カッパＢ／ｃ−Ｒｅｌの有用性が診断的に有意な末梢バイオマーカーとして実際に妥当であることを実際に証明する。
【００４１】
したがって、本発明の１つの目的は、パーキンソン病を診断するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、患者由来の、生体試料中の活性ｃ−Ｒｅｌ因子の量を測定することを含み、健常対照と比較した患者の生体試料中の活性ｃ−Ｒｅｌ因子の減少がパーキンソン病の指標である方法である。
【００４２】
好ましい態様では、「診断」という用語は、パーキンソン病に罹っていることが疑われる対象における疾患の検出と、パーキンソン病に罹っているとすでに診断された対象における疾患の進行のモニタリングおよび／または療法の有効性のモニタリングの両方を意味する。したがって、「患者」という用語は、場合により、パーキンソン病に罹っていることが疑われる対象またはパーキンソン病に罹っているとすでに診断された対象を意味する。
【００４３】
当業者は、臨床医が、最終的な診断に到達するために、通常、単に単一の診断パラメーターだけに基づいて患者が疾患、状態または障害を患っているまたは患う可能性が高いか否かについて結論を出すのではなく、他の側面、例えば、自己抗体の存在、マーカー、血液パラメーター、患者の症状の臨床的評価または医学イメージングもしくは他の非侵襲性の方法、例えば、睡眠ポリグラフの結果を考慮に入れることを必要とすることを理解するであろう。Ｒｅｎｚ，Ｈ．、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、２０１２、ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ、３ページにあるＢａｅｎｋｌｅｒ  Ｈ．Ｗ．（２０１２）、Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓを参照されたい。診断用の薬剤または方法の価値は、ある疾患を除外する可能性にもあってよく、したがって、別の疾患の間接的な診断を可能にする。好ましい態様では、本出願の全体にわたって言及されるいかなる症状または疾患の意味も、教本および科学論文によって証明されているような２０１４年１月２３日時点の当業者の理解に沿っている。
【００４４】
したがって、「診断」という用語は、好ましくは、本発明による診断方法または薬剤が、パラメーターはいうまでもなく、単一の試験に基づいて診断を確定させるのに決定的かつ十分であることを意味するのではなく、「鑑別診断」と呼ばれるもの、すなわち、ある範囲の診断パラメーターに基づいてある範囲の想定される状態の可能性を考慮した系統的な診断手順に対する寄与を指していてもよい。
【００４５】
「診断」という用語はまた、同様または同一の症状を伴う２つ以上の状態を識別するために使用される方法または薬剤を指していてもよい。
【００４６】
「診断」という用語はまた、患者にとって最も有望な治療計画を選択するために使用される方法または薬剤を指していてもよい。換言すれば、方法または薬剤は、対象のための治療計画を選択することと関連していてもよい。こうした治療は、神経疾患、例えば、パーキンソン病の進行を減速させることが知られている薬物の投与を含んでいてもよい。
【００４７】
患者の生体試料は、健常な対象において、内因性の活性ｃ−Ｒｅｌ因子を含む任意の好適な組織、例えば、脳組織または、好ましくは、血液から得られうる。したがって、好ましい態様では、ｃ−Ｒｅｌ因子の活性は、患者の血中単核細胞の試料からのタンパク質抽出物においてまたは、代替的に、脳組織の試料からのタンパク質抽出物において測定される。
【００４８】
ｃ−Ｒｅｌ因子（それがＮＦ−カッパＢダイマーの要素であることを示すために「ＮＦ−カッパＢ／ｃ−Ｒｅｌ」とも表わされる）の活性の測定は、本質的に既知である任意の方法で、例えば、イムノアッセイなどによって行われうる。好ましい態様では、イムノアッセイは、免疫拡散技術、免疫電気泳動技術、光散乱イムノアッセイ、光散乱イムノアッセイ、凝集技術並びに標識イムノアッセイ、例えば、放射標識イムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、および免疫蛍光技術を含む群から選択されるものなど、を含む群から選択される。当業者は、これらの方法に精通しており、これらは、例えば、Ｚａｎｅ，Ｈ．Ｄ．（２００１）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＆Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ、特に、第１４章にある、現況技術にも記載されている。
【００４９】
より好ましい態様では、イムノアッセイはＥＬＩＳＡアッセイである。ｃ−Ｒｅｌ因子の活性をアッセイするためのキットは、市販されている。非限定的な例として、Ｔｒａｎｓ−ＮＦ−ＫＢキット（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）が挙げられてもよく、これは、本明細書の実験項において使用される。当業者は、市販のキットを適切に使用するか、あるいは必要とされる場合には変更を加えることができ、ならびにパック済みのキットの補助なしで必要な試薬を使用してイムノアッセイを行うことができる。こうした試薬は、基本的に、ｋＢオリゴヌクレオチドならびに一次および二次抗ｃ−Ｒｅｌ抗体であり、これらはそれぞれ、本質的に既知でありかつ市販されている。
【００５０】
ｋＢオリゴヌクレオチドは、ヒトＤＮＡ上に天然に存在するｋＢ部位のコンセンサス配列（５’−ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ−３’）を含む単離されたＤＮＡ配列である（ＰａｒｒｙおよびＭａｃｋｍａｎ、１９９４）。
【００５１】
捕捉エレメントとしてｋＢオリゴヌクレオチドを使用するＥＬＩＳＡアッセイ、例えば、上述のＴｒａｎｓ−ＮＦ−ＫＢ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）などは、固体担体上に、例えば、ＥＬＩＳＡプレートのウェルの底上に固定化されたｋＢオリゴヌクレオチドに対する、試験される生体試料中に存在する、（活性ｃ−Ｒｅｌ因子を含む）ＮＦ−ｋＢダイマーの結合活性に基本的に依存する。ＮＦ−ｋＢダイマー中の活性ｃ−Ｒｅｌ因子は、特異的な抗ｃ−Ｒｅｌ抗体によって認識される。
【００５２】
アッセイの結果を評価することは、通常、少なくとも１名の患者からの１セットのデータと健常な対象からの１セットのデータとを比較することを含む。彼または彼女の試料における活性ｃ−Ｒｅｌの量が健常な対象からの試料において測定された活性よりも著しく低ければ、その患者は、神経疾患を患っていることが疑われるまたは将来患う可能性が高いと疑われる。例えば、患者の試料における活性は、健常な対象由来の試料における活性の４０％未満であってもよく、好ましくは、５０、６０、７０、８０、９０または９５％未満である。
【００５３】
疾患の進行、および神経疾患の経過に対する治療の効果は、経時的に活性ｃ−Ｒｅｌ因子の量を繰り返し測定することによってモニターされてもよい。
【００５４】
試料中の構成的に活性な第２のタンパク質の活性が、適切な取扱いおよびしたがって試料中の活性の保持を確実にするための対照として測定されてもよい。ｃ−Ｒｅｌ因子活性は、試料中のｃ−Ｒｅｌ因子活性と対照タンパク質活性との比として決定されてもよい。
【００５５】
本発明の教示は、キット、好ましくは、疾患を診断するためのキットを提供する。こうしたキットは、キットを使用する方法を詳述している説明書、およびｃ−Ｒｅｌ因子捕捉試薬、例えば、ｋＢオリゴヌクレオチドを、対象、好ましくは、ヒト由来の試料と接触させるための手段、ならびに活性ｃ−Ｒｅｌ因子を検出するための手段、例えば、一次および二次抗ｃ−Ｒｅｌ抗体を含んでいてもよい。さらに、キットは、陽性対照、例えば、活性ｃ−Ｒｅｌ因子のバッチ、および陰性対照、例えば、一般的なｃ−Ｒｅｌ因子捕捉試薬に対する検出可能な親和性を有さないタンパク質を含んでいてもよい。最後に、こうしたキットは、較正曲線を作成するための標準溶液、またはこうした標準溶液を調製するための試薬を含んでいてもよい。
【００５６】
以下の実験項は、単に例示として提供され、本発明の範囲の制限として提供されるものではない。
【００５７】
実験項
血液試料からの血中単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離
ＰＢＭＣは、両方の性別の５０〜８４歳の年齢の、２３名のＰＤに冒されたドナーおよび１７名の健常な対象の静脈血から収集された。
【００５８】
ＰＢＭＣは、血小板、赤血球および多形核細胞を取り除いた血液の細胞構成要素である。これらは、約６０％〜７０％がリンパ球からなり、残りの３０〜４０％は単球である。
【００５９】
ＰＢＭＣ調製は、ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ−１０７７勾配（ポリサッカロースおよびジアトリゾア酸ナトリウム、密度１．０７７±０．００１ｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）で以下の手順に従って行われた。
【００６０】
ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ−１０７７およびリン酸バッファー（ＰＢＳ）溶液（ＮａＣｌ  ８ｇ／ｌ；ＫＣｌ  ０．２ｇ／ｌ；Ｎａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ  １．４４ｇ／ｌ；ＫＨ2ＰＯ4  ０．２４ｇ／ｌ；ｐＨ７．４）は、室温に調整された。１０ｍｌの血液は、対象から、抗凝固剤としてＥＤＴＡを含むバキュテーナーチューブ内に収集された。収集されたすべての血液は、単一の１５ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブ内で混合されて１２００×ｇ（約２０００ｒｐｍ）で１０分間室温で遠心分離された。血球ペレットは、ＰＢＳで１４ｍｌの量に調整された。６ｍｌのＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ−１０７７をそれぞれ含んでいる、２本の１５ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブを用意した。７ｍｌの希釈された血液は、各Ｆａｌｃｏｎチューブ内でＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ−１０７７層の上に重ねられ、次いで、４００×ｇで３０分間中断されることなく遠心分離された。ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ−１０７７よりも上に分離されたＰＢＭＣリングが回収され、別の５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブ内に移入された。容量は、ＰＢＳで４０ｍｌに調整され、その後、２５０×ｇで１５分間遠心分離が行われた。上清は捨てられ、細胞ペレットは再懸濁された。ＰＢＳで容量が４０ｍｌに調整された。これはもう一度２５０×ｇで１５分間遠心分離され、上清は捨てられ、ペレットは混入している赤血球を溶解させるためにｄｄＨ2Ｏ中で約３０秒間再懸濁された。最終容量は、ＰＢＳで４０ｍｌに調整され、２５０×ｇで１５分間遠心分離された。上清は捨てられ、ペレットはＢｕｒｋｅｒチャンバーでの細胞計数のために再懸濁された。このようにして得られた既知量のＰＢＭＣは、２５０×ｇで１５分間の遠心分離によって再びペレット化され、分析まで−８０℃で保存された。
【００６１】
黒質からの総タンパクの抽出
パーキンソン１０例および対照１０例由来の凍結されたヒト黒質は、Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｕｋ  Ｂｒａｉｎ  Ｂａｎｋによって供給された。約３０ｍｇの組織は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｎａ3ＶＯ4、１０ｍＭ  ＮａＦ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＮＰ４０、１ｍＭ  ＰＭＳＦおよび１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）からなる２００μｌの低温の溶解バッファー中に再懸濁され、新しい１．５ｍｌのチューブ内に移入され、これらを氷上に保った。組織は、各試料について、５秒間３回、それぞれ３５Ｗの電力で、超音波処理することによって溶解された。次いで、これを１５０００×ｇで２０分間４℃で遠心分離した。上清は他のエッペンドルフチューブ内に回収され、タンパク質は計量されてアリコートが調製され、−８０℃で保存された。
【００６２】
ＰＢＭＣからの総タンパクの抽出
ＰＢＭＣ総タンパクは、以下の手順に従って調製された。
【００６３】
１０ｍｌの全血からのペレットは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｎａ3ＶＯ4、１０ｍＭ  ＮａＦ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＮＰ４０、１ｍＭ  ＰＭＳＦおよび１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）からなる１００μｌの低温の溶解バッファー中に再懸濁され、新しい１．５ｍｌのチューブ内に移入され、これらを氷上に保った。ＰＢＭＣは、各試料について、５秒間２回、それぞれ３５Ｗの電力で、超音波処理することによって溶解された。次いで、これを１５０００×ｇで２０分間４℃で遠心分離した。上清は他のエッペンドルフチューブ内に回収され、タンパク質は計量されてアリコートが調製され、−２０℃で保存された。１０ｍｌの全血から３１０μｇの総タンパクが得られ、１００ｍｌの溶解バッファーで抽出される。
【００６４】
ＥＬＩＳＡアッセイ（酵素結合免疫吸着検定法）による、ｃ−Ｒｅｌ因子活性の測定
ヒトＤＮＡ上に天然に存在する、ｋＢ部位のコンセンサスＤＮＡ配列（オリゴヌクレオチド）に対する、ＮＦ−ｋＢダイマー中の、ｃ−Ｒｅｌ因子の結合能力は、Ｔｒａｎｓ−ＮＦ−ＫＢキット（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を使用することにより、ＥＬＩＳＡ試験により測定された。
【００６５】
タンパク質抽出物の調製は、キットを製造している会社によって提供された試料調製のための説明書に従って行なわれた。使用された試薬および手順は、ｃ−Ｒｅｌ因子をアッセイするためのキットに含まれていた。ただし、抗ｃ−Ｒｅｌ抗体は例外であり、これは、我々の手順では一次抗ｃ−Ｒｅｌ抗体（Ｃ）（＃ｓｃ−７１  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって置換された。
【００６６】
ヒトＰＢＭＣから得られた全抽出物（５０μｇ）または黒質から得られた全抽出物（２５μｇ）は、高密度で固定化されたｋＢオリゴヌクレオチドを含む９６ウェルプレート中で測定された。標的ＤＮＡ配列に結合した、活性型のｃ−Ｒｅｌサブユニットは、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ一次抗ｃ−Ｒｅｌ抗体（ＰＢＭＣ分析では、ロット＃Ｄ１１０７、１：５０が使用された。黒質分析には、ロット＃Ｈ１３１２  １：２５０が使用された）および次いで、キットによって提供された二次ＨＲＰコンジュゲート抗体（１：１０００）を使用して検出された。発色溶液が５分間添加され、試料の吸光度が分光光度計で４５０ｎｍの波長で読み取られた。得られるデータは、総抽出物の非存在下（ブランク）で観察される吸光度と比較した、総抽出物の存在下で観察される吸光度の差異として表される。
【００６７】
結果
ｃ−Ｒｅｌ因子の活性は、ＰＢＭＣタンパク質抽出物および黒質タンパク質抽出物中に存在するタンパク質が、ＥＬＩＳＡキットキュベットの底上に固定化された、ｋＢ配列を含むオリゴヌクレオチドプローブと結合する能力として測定された。ｃ−Ｒｅｌタンパク質は、次いで、オリゴヌクレオチドプローブに結合したタンパク質の中で、特異的な抗ヒトｃ−Ｒｅｌ抗体によって同定された。
【００６８】
ｋＢプローブに対するｃ−Ｒｅｌの結合の量は、試料の調製時に細胞内に遊離型で見出されるＮＦ−ｋＢ／ｃ−Ｒｅｌダイマーの量を反映する。それらのダイマーは、ＮＦ−ｋＢ−ｌｋＢ複合体から一旦放出されると、因子自体の活性化過程の間に、ＤＮＡのｋＢ部位に結合するために細胞質から核に移動する準備ができている。
【００６９】
２３名のパーキンソンの患者および１７名の対照において行われた分析は、ｃ−Ｒｅｌ活性の低下と疾患との間の有意な相関を明らかにした（図１）。独立した試料についてのＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定による統計解析は、調査された２つの群の間の有意差（ｐ＝０．０１０）を実証する。
【００７０】
１０名のパーキンソン病（ＰＤ）患者の黒質におけるｃ−Ｒｅｌ因子活性の評価は、ＰＤ症例における活性の有意な低下を示した。独立した試料についてのＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定による統計解析は、調査された２つの群の間の有意差（ｐ＝０．０４３３）を実証する。
【００７１】
結論
図１に概説された結果は、パーキンソン病に冒された対象のうちのかなりの数が血球において、ｃ−Ｒｅｌ因子の活性が、健常な個体と比較して低下されることを実証する。したがって、ｃ−Ｒｅｌ因子の分析は、初期の臨床的ステージにおけるパーキンソン病の診断の正確さを向上させる有用な末梢バイオマーカーを提供する。さらに、それは、療法の有効性のマーカーである。ＰＢＭＣにおける低程度のｃ−Ｒｅｌ因子活性は、疾患に冒された脳領域内に存在する変性過程の指標となる。ＰＤ患者の黒質におけるｃ−Ｒｅｌ因子活性が、健常な対象からの試料と比較されていれば、同様のデータが得られるであろう。
以下に、本願出願の発明の実施態様を付記する。
［１］
非運動症状、睡眠起床障害、知覚障害、神経精神障害および認知困難を含む群から選択される少なくとも１つの症状を伴う神経疾患を診断するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、患者由来の、内因性ｃ−Ｒｅｌ因子を含む生体試料中の活性ｃ−Ｒｅｌ因子の量を測定することを含む方法。
［２］
前記生体試料が血中単核細胞からのタンパク質抽出物を含む、請求項１に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
［３］
前記生体試料が脳組織細胞からのタンパク質抽出物を含む、請求項１に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
［４］
前記患者がパーキンソン病に冒されていることが疑われる対象である、請求項１から３のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
［５］
前記患者がパーキンソン病に冒されている対象である、請求項１から３のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
［６］
前記患者がヒトである、請求項１から５のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
［７］
前記患者の生体試料中の活性ｃ−Ｒｅｌ因子の量の前記測定がイムノアッセイによって行われる、請求項１から６のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
［８］
前記イムノアッセイがＥＬＩＳＡアッセイである、請求項７に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
［９］
ｃ−Ｒｅｌ捕捉試薬と、非運動症状、睡眠起床障害、知覚障害、神経精神障害および認知困難を含む群から選択される少なくとも１つの症状を伴う神経疾患の診断のために活性ｃ−Ｒｅｌ因子の存在を検出するための手段とを含むキットの使用。
［１０］
前記ｃ−Ｒｅｌ捕捉試薬が、活性ｃ−Ｒｅｌ因子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドである、請求項９に記載の使用。
［１１］
前記ｃ−Ｒｅｌ捕捉試薬が固定化される、請求項９または１０に記載の使用。
［１２］
前記捕捉試薬がｋＢオリゴヌクレオチドである、請求項９から１１のいずれか一項に記載の使用。
［１３］
活性ｃ−Ｒｅｌ因子の存在を検出するための前記手段が、ｃ−Ｒｅｌに結合している二次抗体である、請求項９から１１のいずれか一項に記載の使用。
［１４］
前記認知困難が、実行機能障害、注意力のゆらぎ、認知速度の遅延、記憶障害および視空間認知困難を含む群から選択される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法または使用。
［１５］
非運動症状、睡眠起床障害、知覚障害、神経精神障害および認知困難を含む群から選択される少なくとも１つの症状を伴う神経疾患、好ましくは、パーキンソン病に罹っていることまたは発症することが疑われる、患者由来の、内因性ｃ−Ｒｅｌ因子を含む試料と好ましくは、固定化される、好ましくは、活性ｃ−Ｒｅｌ因子に特異的に結合しているオリゴヌクレオチドである、ｃ−Ｒｅｌ捕捉剤とを
ｃ−Ｒｅｌ因子を前記オリゴヌクレオチドに結合させるのに適合した条件下の水溶液中に、
好ましくは、ｃ−Ｒｅｌ因子を検出するための手段の存在下で、より好ましくは、前記ｃ−Ｒｅｌ捕捉剤と、ｃ−Ｒｅｌ因子と、ｃ−Ｒｅｌ因子を検出するための前記手段とを含む複合体中に、
含む反応混合物。
【００７２】
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【図１】
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