(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
結合反応は、共有結合の形成であること；及び
前記結合反応を制御するために、第１電極（１１）経由で溶液に電解誘導の電流を流すことによって、溶液のｐＨが前記電極（１１）の近傍で局所的に変化すること；及び
空間的に構成されたハイドロゲル（２００）が前記結合反応によって形成され、前記ハイドロゲル（２００）が前記結合反応の局所的阻害によって形成されること
を特徴とする、第１電極（１１）の近傍の溶液中の結合反応の制御方法。
【請求項２】
前記阻害が前記ｐＨを局所的に変化させることによって制御され、その結果前記変化したｐＨが溶液中の酵素の酵素活性に影響を与え、かつ、前記酵素が溶液中の第１及び第２化合物（２０、２２）に含まれる第１及び第２部分（２１、２３）を、前記第１及び第２部分（２１、２３）の間に共有結合を形成することによって、前記ハイドロゲル（２００）に変換することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶液を流れる前記電流を変化させることによって、前記結合反応が空間的に及び／又は時間的に限定されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素がアミノアシルトランスフェラーゼであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１及び／又は前記第２化合物がポリマーを含み、又はポリマーから成り、前記ポリマーは天然ポリマーであり、又は合成ポリマーであることを特徴とする、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１化合物（２０）及び／又は前記第２化合物（２２）はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むことを特徴とする、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記共有結合の前記形成が、縮合反応、結合反応、連結反応、架橋反応又は重合反応であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記溶液中で電極（１１、１２）によって前記電圧が誘起され、かつ、前記溶液の前記ｐＨが１〜１４の間の範囲にあるように、前記電圧が調整されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記溶液に加えられる前記電圧に応じて、前記酵素の前記酵素活性が、局所的に阻害され、低下し又は促進されることを特徴とする、請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記溶液が第３部分を含む第３化合物（２４、２５）を含み、前記酵素によって前記第３部分は前記各第１又は第２部分と変換可能であることを特徴とする、請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
以下のパラメ−ターの少なくとも１つが、前記結合反応中に変化することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法：
−以下の少なくとも１つの前記溶液の組成：バッファ、酵素、前記酵素の基質、使用されるポリマー及び／又はそれらの置換基、
−電極の位置、
−加えられる電流又は電圧、及び／又は
−結合反応の継続時間。
【請求項１２】
前記結合反応が前記結合反応のパラメーターを変化させるために中断されることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法を用いる、ハイドロゲルを生産するためのデバイスであって、
−溶液を保持するように設計される反応室（１００）、及び
−前記反応室（１００）に配置される第１及び第２電極（１１、１２）、
を備え、
及び、前記第１及び／又は第２電極は、細長い素子として形成され、第１及び第２電極の間に電圧が加えられるとき、電極の近傍でハイドロゲルの形成が阻害されるように設計され、前記ハイドロゲルの形成が阻害されるとき、空洞のチャネルを備えるハイドロゲルが形成され、及び前記ハイドロゲルから電極が除去される場合に、前記電極は前記ハイドロゲルを破壊し、変形し、又は損傷することなく、反応室内の前記ハイドロゲルから除去できる、
前記デバイス。
【請求項１４】
前記第１及び／又は第２電極（１１、１２）が、前記ハイドロゲルから前記第１及び／又は第２電極（１１、１２）を除去するために、前記反応室（１００）に対して動かされるように設計され、及び／又は前記反応室（１００）から解放されるように設計されることを特徴とする、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記第１及び／又は第２電極（１１、１２）が、金属、タングステン、半導体、導電性ポリマー材料、又はこれらの材料の組み合わせを含むことを特徴とする、請求項１３又は１４に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液中の第１及び第２化合物の間の化学結合の形成、具体的には酵素反応によって触媒される形成を空間的及び局所的に制御するための方法、デバイス及びシステムに関し、かつ、本発明は具体的には空間的に構成されたハイドロゲルを生産するために用いられうる。
【背景技術】
【０００２】
３次元（３Ｄ）の培養組織は、大部分が生理学的研究及び再生両方の開発を可能にさせるために望ましい。組織模倣物を作り上げるための最近の試みの大部分は、細胞外基質（ＥＣＭ）ハイドロゲル中の細胞培養に基づく。天然ハイドロゲルの固有の生物学的特性とは対照的に、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）のような合成ハイドロゲルは生物系と何も固有の相互作用をせず、従って生体内作用を誘発せず、その影響も受けない。しかしながら、生体機能分子の選択的誘導と共に生物学的特性及び分子構造を正確に調整する能力、すなわちタンパク質分解部位、細胞接着部位及びその他の生物学的刺激はＰＥＧハイドロゲルを、天然に存在するＥＣＭの模倣物の理想的なプラットフォームにする［１］。
【０００３】
第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）媒介のトランスグルタミネーション（ＴＧ）反応によって重合されるモジュール設計されたＰＥＧハイドロゲルが存在し、かつ、それ故にＴＧ−ＰＥＧハイドロゲルと呼ばれることが知られている［２］。グルタミン−ＰＥＧ（Ｇｌｎ−ＰＥＧ）前駆体及びリジン−ＰＥＧ（Ｌｙｓ−ＰＥＧ）前駆体の、第ＸＩＩＩ因子媒介の架橋の間、様々なＧｌｎ−及びＬｙｓ−標識されたペプチド及びタンパク質が基質を形成するために共有結合しうる［３、４］。酵素架橋反応は様々な機能性を提供するための生理学的条件下で、生物活性分子の部位特異的な直交統合を可能にする［５、６］。
【０００４】
ＰＥＧハイドロゲルを化学的に機能的にする能力が成果を示すにもかかわらず、空間の化学組成を制御することは天然ＥＣＭを模倣する合成ハイドロゲルを設計するために必要である［７、８］。キャスティング［９］、付加製造（例えば、プリンティング及び層ごとの堆積）［１０］、光パターニング［７、１１］及びマイクロ流体工学［１２］を含む技術は、形態形成刺激の空間的制御をしながら、３次元構成されたハイドロゲルを生産するために使用される技術に含まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
良好な堆積制御を得るための堆積材料の力学特性の最適化が、依然としてソフトハイドロゲルの付加製造における主要な課題の１つである［１３］。電気化学重合（例えば、酸化重合）はポリマーの力学特性と本質的に無関係であるという重要な利点を有し、かつ、有機エレクトロニクスから生体医療移植に関しての有機フィルムの堆積まで及ぶ応用［１６］のために、ポリアニリン［１４］、ポリピロール［１５、１６］、ポリアクリレート［１７］及びその他の電気活性ポリマー［１８］の重合を局所的に制御するために、成功裏に使用された。
【０００６】
それ故に、本発明の根底にある課題は、共有結合の形成の空間的制御を可能にする方法、デバイス及びシステム、具体的にはハイドロゲルの結合反応用の方法、デバイス及びシステム、並びに具体的には空間的に制御された微小環境を作り出すための方法、デバイス及びシステムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この課題は、請求項１、請求項４又は請求項１２の特徴を有する方法、請求項１７の特徴を有するデバイス及び以下に記載されるシステムによって解決される。好ましい実施形態は従属項に記載される。
【０００８】
請求項１によれば、第１電極の近傍の、溶液中の結合反応の制御方法は、前記電極の近傍の前記結合反応を制御するために、前記第１電極経由で溶液に電解誘導の電流を流すことによって、溶液のｐＨを局所的に変化させる。
【０００９】
溶液中の電解を誘導するために、具体的には第２電極が備えられる。
【００１０】
第１電極は陽極又は陰極に変化して、陽極分極又は陰極分極を担いうる。第２電極は第１電極の反対の分極を担うことになる。
【００１１】
結合反応は、具体的には化学結合を指し、具体的には２つの化合物間の共有結合の形成による化学結合を指し、具体的には第１及び第２部分を含む第１及び第２化合物であって、前記第１部分と前記第２部分との間の結合、及び具体的には共有結合が形成される、前記第１及び第２化合物の間の化学結合を指す。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明によるデバイスの斜視図を示す。
【図２】本発明によるデバイスの概略図を示す。
【図３】本発明によるデバイスの概略図を示す。
【図４】本発明によるデバイスの概略図を示す。
【図５】本発明によるデバイスの概略図を示す。
【図６】架橋反応のｐＨ依存関係の略図を示す。
【図７】電解中の局所ｐＨ分布の略図を示す。
【図８】本発明によるハイドロゲルの実施例の顕微鏡画像を示す。
【図９】図８から得られる定量的なグラフを示す。
【図１０】本発明によるハイドロゲルの実施例の顕微鏡画像を示す。
【図１１】顕微鏡画像及び電極除去後のハイドロゲルの移動の定量化を示す。
【図１２】本発明及び従来の方法によるマイクロチャネル製造の明視野顕微鏡画像を示す。
【図１３】生細胞／死細胞アッセイの顕微鏡画像を示す。
【図１４】本発明による構成された３次元２成分ハイドロゲルの生産の概略図を示す。
【図１５】本発明による構成された３次元２成分ハイドロゲルの顕微鏡画像を示す。
【図１６】本発明によるハイドロゲルと共に副生産される細胞浸潤アッセイを示す。
【図１７】２成分ハイドロゲル中の細胞分布を示す。
【図１８】本発明によるデバイスの概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
一般に、本発明の一実施形態によれば、結合過程の１又は複数のパラメーターは、結合過程中に変化する（これは本発明の全ての実施形態に適用される）。
【００１４】
具体的には、以下のパラメーターの１つ又は選択されたものが、結合過程中に変化しうる：
−架橋溶液の組成（例えば、バッファ、酵素、酵素の基質、使用されるポリマー及び／又はそれらの置換基）、
−電極の位置、
−加えられる電流又は電圧、及び／又は
−（結合）過程の継続時間、結合過程は例えばパラメーターを変化させるために、同様に中断されうる。これは特に、事前に用意された（本発明による方法、又はその他のゲル化過程のいずれかを用いて生産された）（ハイドロ）ゲルが局所的に機能化される、本発明の１実施形態に及ぶ。本発明の好ましい実施形態では、空間的に構成されたハイドロゲルは前記結合反応によって形成され、前記ハイドロゲルは具体的には結合反応の局所的阻害によって形成され、前記阻害は具体的には前記ｐＨを局所的に変化させることによって制御され、具体的にはその結果前記変化したｐＨが溶液中の酵素の酵素活性に影響を与え、かつ、具体的には前記酵素が、溶液中の第１及び第２化合物に含まれる第１及び第２部分を、前記第１及び第２部分の間の共有結合を形成することによって、前記ハイドロゲルに変換する。
【００１５】
空間的に構成されたハイドロゲルは具体的には空間内で異なる濃度を有するハイドロゲルである。そのような構造は具体的にはマイクロチャネル又はマイクロキャビティを備え、具体的にはμｍ〜ｍｍの範囲のマイクロチャネル又はマイクロキャビティを備える。その上、空間的に構成されたハイドロゲルは、それにもかかわらずハイドロゲルの形成中に溶液が存在する場所を備え、かつ、前記溶液は全ての必要な前駆体、例えば第１及び第２部分を含む第１及び第２化合物並びに酵素のような前駆体を含み、ハイドロゲルの形成は具体的にはそれらの場所では阻害され、その結果これらの場所でハイドロゲルは一切形成せず、かつ、従って、空間的に構成されたハイドロゲルが得られる。
【００１６】
その上、「空間的に構成された」という言葉は同様に、具体的には化学化合物の空間的に制御された堆積を指し、具体的にはハイドロゲル中及び内部の化学化合物の空間的に制御された堆積を指し、具体的には生物学的な微小環境を提供するための化学化合物の空間的に制御された堆積を指す。
【００１７】
本発明の他の好ましい実施形態では、溶液中を流れる電流の大きさ及び方向を調整することによって、結合反応が空間的に及び／又は時間的に限定される。
【００１８】
請求項４によれば、請求項に記載された溶液中の共有結合の酵素触媒形成を制御するための方法、具体的には上述の本発明による方法を用いる前記方法は、前記共有結合が第１部分を含む第１化合物と第２部分を含む第２化合物との間に形成される共有結合であり、第１及び第２部分が酵素の基質であり、前記酵素が第１及び第２部分の間の共有結合の形成の触媒として作用し、かつ、前記形成を空間的に制御するために前記溶液に電圧が加えられ、前記溶液の電解を誘導するように前記電圧が調整され、前記電解は前記溶液中の空間的なｐＨ分布を誘起し、前記分布は具体的には電圧誘導電場の勾配に沿って整列し、その結果具体的には前記酵素のｐＨ依存の酵素活性は空間的に制御され、又は阻害され、又は促進され、又は活性化される、前記方法である。
【００１９】
その上、前記共有結合の酵素触媒形成の制御方法は、具体的には酵素の阻害、促進、活性化及び／又は酵素活性を変化させることを含み、具体的には酵素反応の速度定数を変化させることを含む。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態では、前記酵素はアミノアシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．３．２．）であって、具体的にはａ：トランスグルタミナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．３．２．１３）であって、より具体的には活性化第ＸＩＩＩ因子（ユニプロット（ＵｎｉＰｒｏｔ）番号：Ｐ００４８８によって表される）又はその前駆体であって、第１部分はアシルであり、具体的にはアミドであり、かつ、第２部分はアミンである。好ましくは、このような第１及び第２部分の限定されない例は、以下の実施例７から挙げられうる。
【００２１】
活性化第ＸＩＩＩ因子は例として、タンパク質又はペプチド結合のグルタミンの側鎖の末端のアシル基及び遊離アミン基（例えば、タンパク質又はペプチド結合のリジン）を利用する。
【００２２】
ユニプロット番号はユニプロットナレッジベース中の登録を指す。
【００２３】
Ｅ．Ｃ．番号は酵素用の数値分類体系である、いわゆる酵素番号を指す。
【００２４】
本発明の１実施形態によれば、第１及び／又は第２化合物がポリマーを含み、又はポリマーから成り、前記ポリマーは天然ポリマーであり、特に以下のポリマーの１つであり：フィブリン、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、ヘパリン；又は合成ポリマーであり、特に以下のポリマーの１つであり：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸、ＳＵ−８；又はモノマー、例えば、ドーパミン、リジンなどのアミン含有基、カテコール類、リン酸塩含有基、チオール含有基、アルコール含有基、活性化エステル及び前記基のいずれかを含むポリマー又はデンドリマー（例えば、ハイブレーン（Ｈｙｂｒａｎｅ）、ボルトーン（Ｂｏｌｔｏｒｎ））の組み合わせからなり、又は、これらを含むポリマーである。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態によれば、第１化合物及び／又は第２化合物はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、具体的には４０００Ｄａから１０００００Ｄａの範囲内の分子量のＰＥＧを含み、具体的には４００００ＤａのＰＥＧを含み、かつ、前記ＰＥＧが非分岐又は分岐ＰＥＧであって、かつ、前記分岐ＰＥＧは具体的には２、３、４、又は８本の腕を備える。
【００２６】
いくつかの実施形態では、例として、分岐ＰＥＧ、具体的には８腕のＰＥＧは第１及び第２化学部分を備え、具体的にはＰＥＧの各々の枝又は腕に備える。
【００２７】
本発明の他の好ましい実施形態では、共有結合の形成は縮合反応、連結反応、架橋反応又は重合反応である。
【００２８】
本明細書の文脈における「重合」という言葉は、具体的にはポリマー鎖又は３次元ネットワークを形成するための、化学反応でモノマー分子同士を反応させる過程を指す。
【００２９】
本明細書の文脈における「連結反応」という言葉は、具体的にはアミノ酸又はヌクレオチドのような２つの分子間の共有結合の形成を指す。
【００３０】
本明細書の文脈における「架橋」という言葉は、具体的には１つのポリマー鎖が別のポリマー鎖と結びつく結合の形成を指す。
【００３１】
本明細書の文脈における「縮合反応」という言葉は、具体的には２つの分子又は部分が結合し、より大きな分子を形成すると共に、小分子を失う化学反応を指す。そのような小分子の例には水、水素原子、塩化水素、メタノール、アンモニア、又は酢酸を含む。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態によれば、前記溶液中の電極経由で電圧は誘起され、かつ、電極の近傍の溶液のｐＨが具体的には１〜１４の範囲内、具体的には５〜１１の範囲内にあるように、電圧は調整される。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態では、酵素の酵素活性、具体的にはトランスグルタミナーゼの酵素活性、具体的には活性化第ＸＩＩＩ因子の酵素活性は、具体的には溶液に加えられる電圧の大きさ、極性及び／又は前記電圧の印加前の前記溶液のｐＨに応じて、局所的に阻害され、低下し又は促進される。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態によれば、溶液は第３部分を含む第３化合物を含み、具体的にはアミド及び／又はアミンを含む第３化合物を含み、前記第３部分は前記酵素によって各第１又は第２部分に変換可能であり、かつ、前記第３化合物は具体的には生物活性分子であり、具体的には成長因子であり、具体的には血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）などのような成長因子であり、又はサイトカイン（例えば、インターロイキン）、アフィニティリンカー（例えば、ストレプトアビジン−ビオチン、ＺＺリンカー、ヒスタミンリンカー）、短ペプチド（例えば、ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲ）、又はタンパク質及びタンパク質画分（例えば、ラミニン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ヘパリン）である。
【００３５】
本明細書の文脈における「アミド」という言葉は、具体的にはアミド（−ＣＯＮＲ２であり、Ｒはその他からそれぞれ独立して水素原子又はアルキルでありうる）を含む化合物を指す。
【００３６】
本明細書の文脈における「アミン」という言葉は、具体的にはアミン基（−ＮＲ２であり、Ｒはその他からそれぞれ独立して水素原子又はアルキルでありうる）を含む化合物を指す。
【００３７】
請求項１２によれば、空間的に構成されたハイドロゲルの提供方法、具体的には上記の本発明による方法を用いる、前記方法であって、第１部分を含む第１化合物及び第２部分を含む第２化合物が、第１及び第２化合物の第１及び第２部分の間の共有結合の形成によって、空間的に構成されたハイドロゲルに結合し、かつ、前記形成を空間的に制御するために、第１及び第２化合物を含む溶液に電圧が加えられ、前記溶液の電解を誘導するように、前記電圧が調整される、前記方法が記載される。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態では、結合反応、具体的には架橋反応は酵素によって触媒され、第１及び第２部分は酵素の基質であって、酵素は具体的にはアミノアシルトランスフェラーゼであって、具体的にはトランスグルタミナーゼであって、より具体的には活性化第ＸＩＩＩ因子又はその前駆体であって、第１部分はアシルであり、具体的にはアミドであり、かつ、第２部分はアミンである。
【００３９】
本発明のさらなる態様によれば、溶液のｐＨは制御され、その結果結合反応は制御され、具体的には阻害され、促進され、活性化され又は低下し、その結果ハイドロゲルは少なくともハイドロゲルの一部の領域、具体的にはハイドロゲルの界面領域で、第１及び第２部分とわずかに結合することを示し、その結果具体的には細胞透過性の増加が実現される。言い換えれば、重合の局所阻害の本方法は、細胞透過性の増加のためのよりソフトな界面（例えば、より少なく架橋されたポリマー）を作成するために用いられうる。
【００４０】
請求項１７の記載によれば、ハイドロゲルを生産するためのデバイス、具体的には本発明による方法を用いる、前記デバイスは、溶液を保持するように設計される反応室、及び前記反応室に配置される第１及び第２電極、及び具体的には、前記溶液に電解を誘導するように、具体的には前記溶液の前記ｐＨを局所的に変化させることによって、前記溶液中の結合反応を制御するように、前記電極に事前に規定された電圧を加えるように設計される電源を備える。第１及び第２電極の概念は、具体的には同様に、１つの電極があり、他の電極（例えば、対電極）が、反応室の壁若しくは底部（又はさらに別の電極）のような、デバイスの別の部分によって形成され、又は構成される可能性があることを意味する可能性がある。さらに、結合反応が制御されるための複数の電極を有することもまた可能である（上記を参照）。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態では、第１及び／又は第２電極が、反応室に対して非破壊的に動かされるように設計され、及び／又は反応室から解放されるように設計され、具体的にはハイドロゲルから第１及び／又は第２電極を除去するように設計される。
【００４２】
例として、前記電極を、室を破壊及び損傷することなく、反応室に導入することは可能である。デバイスを損傷することなく、前記室から電極を除去することもまた可能である。
【００４３】
具体的には、本発明に従って電極の近傍のハイドロゲルの形成の阻害が行われる場合、前記電極は前記ハイドロゲルを破壊し／変形し、又は損傷することなく、反応室内の前記ハイドロゲルから除去できる。
【００４４】
それ故に、具体的には例えばマイクロチャネル、窪み等のような構造は本発明に従って形成されうるものであり、具体的には前記特定の場所でのハイドロゲルの形成を阻害することによって形成されうる。その上、少なくとも１つの電極の近傍で、ハイドロゲルの形成が阻害され、又は大きく減少するので、ハイドロゲルを生産し、かつ破壊することなく電極を除去することが可能である。
【００４５】
具体的には、反応室にアクセスするための管組織、具体的には電極構造に埋め込まれた管組織、電極を分離するための膜及び外部環境からハイドロゲルを隔てるための容器を備える一連の補助機器は、本発明による反応室デバイスによって構成されうる。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態によれば、第１及び／又は第２電極が、金属、具体的にはタングステン、半導体、導電性ポリマー材料、又はこれらの材料の組み合わせを含む。
【００４７】
第１電極は陽極又は陰極に変化して、陽極分極又は陰極分極を担いうる。第２電極は第１電極の反対の分極を担うことになる。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態によれば、第１及び／又は第２電極は表面を備え、前記表面は２次元及び／又は３次元の構造を備える領域を備え、具体的には前記事前に規定された電圧が前記電極に加えられる場合に、具体的には構造の近傍で、前記構造は空間的に制御することによって、具体的にはハイドロゲルの形成を阻害し、又は促進することによって、ハイドロゲルを構成するための鋳型として働くように設計される。
【００４９】
本発明の他の好ましい実施形態では、第１及び／又は第２電極は細長い素子として形成され、具体的にはワイヤーとして形成され、前記ワイヤーは具体的には第１及び第２電極の間に電圧が加えられるとき、電極の近傍でハイドロゲルの形成が阻害され、減少し又は促進されるように設計され、ハイドロゲルの形成が阻害され、又は減少するとき、前記ハイドロゲルから電極が除去される場合に、空洞のチャネルを備えるハイドロゲルが形成されうる。
【００５０】
本発明の好ましい実施形態によれば、第１及び第２電極は反応室内の前記溶液中に０〜＋／−１００μＡ／ｍｍ２の間の電流密度を誘起するように設計される。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態によれば、第１及び／又は第２電極は、液体を保持し、かつ／又は輸送するように設計されるキャビティ及び／又はチャネルを備える。
【００５２】
そのようなキャビティ又はチャネルは、様々な目的のために液体が処理され、かつ流入しうるが、具体的には前記液体を溶液又は形成されたハイドロゲルに送るために、液体が処理され、かつ流入しうる、マイクロ流体デバイスとして働く可能性がある。その上、そのような液体は、前記電極によってハイドロゲル内に導入され、具体的には形成後又は形成中にハイドロゲル内に導入される、生体細胞を含む可能性がある。
【００５３】
本発明のさらにもう１つの態様によれば、第１及び／又は第２電極は導電性走査プローブとして設計され、具体的には電気化学原子間力顕微鏡プローブ又はガラス微小電極として設計され、前記導電性走査プローブは具体的には、走査チップであって、好ましくは電圧が導電性走査プローブに加えられる場合に、前記走査チップの近傍で電界が最も高くなることになるように設計される、前記走査チップを備え、かつ、好ましくは前記走査プローブが反応室（又は反応室内に存在するハイドロゲル）に対して移動可能、例えば３次元的に移動可能なように設計される。
【００５４】
走査プローブは反応室、反応室内又は反応室上、具体的には反応室の室内に配置される可能性があり、かつ、反応室から除去できる可能性がある。
【００５５】
好ましくは、走査プローブは既知の走査ステージ、具体的には原子間力顕微鏡ステージのようなアクチュエータによって移動可能である。
【００５６】
本発明のさらなる態様によれば、本発明によるデバイスを備える、空間的に構成されたハイドロゲルを生産するためのシステムが提供され、システムはさらに、本発明によるデバイスの前記反応室内に位置するハイドロゲル及び／又はハイドロゲルを生産するための溶液を備える。
【００５７】
上記の本発明の実施形態又は態様のいくつかは、以下のように請求項として記載される可能性がある：
【００５８】
請求項２０は、前記第１及び／又は第２電極（１１、１２）が表面を備え、前記表面は構造であって、具体的には前記事前に規定された電圧が前記第１及び／又は第２電極（１１、１２）に加えられる場合に、具体的には前記第１及び／又は第２電極（１１、１２）の近傍で、空間的に制御することによって、具体的には前記ハイドロゲル（２００）の形成を阻害し、又は促進することによって、前記ハイドロゲル（２００）を構成するための鋳型として働くように設計される、前記構造を備えることを特徴とする、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のデバイスを対象とする可能性がある。
【００５９】
請求項２１は、前記第１及び／又は第２電極（１１、１２）は細長い素子として形成され、具体的には針又はワイヤーとして形成されることを特徴とする、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のデバイスを対象とする可能性がある。
【００６０】
請求項２２は、前記第１及び／又は第２電極（１１、１２）は、前記反応室（１００）内の前記溶液中に０〜＋／−１００μＡ／ｍｍ２の間の電流密度を誘起するように設計されることを特徴とする、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載のデバイスを対象とする可能性がある。
【００６１】
請求項２３は、前記第１及び／又は第２電極（１１、１２）は、液体を保持し、かつ／又は輸送するように設計されるキャビティ及び／又はチャネルを備えることを特徴とする、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載のデバイスを対象とする可能性がある。
【００６２】
請求項２４は、前記第１及び／又は第２電極（１１、１２）は導電性走査プローブとして設計され、具体的には電気化学原子間力顕微鏡プローブ又はガラス微小電極として設計され、前記導電性走査プローブは具体的には走査チップ（１２１）であって、具体的には本願明細書に記載されるように、局所的に（例えば、すなわちチップで）前記ハイドロゲルの前記溶液／形成を制御し／影響を与えるための、前記走査チップ（１２１）を備え、前記チップは、具体的には、電圧が導電性走査プローブに加えられる場合に、前記走査チップ（１２１）の近傍で電界が最も高くなることになるように設計され、かつ、具体的には前記走査プローブが（例えば、３次元的に）移動可能であり、具体的には前記反応室（１００）の室内（１０２）で移動可能であるように設計されることを特徴とする、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載のデバイスを対象とする可能性がある。
【００６３】
請求項２５は、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載のデバイスを備える、空間的に構成されたハイドロゲルを生産するためのシステムであって、前記システムはさらにハイドロゲル（２００）を生産するための前記溶液、及び／又は前記デバイスの前記反応室（１００）内に位置するハイドロゲル（２００）を備えることを特徴とする、前記システムを対象とする可能性がある。
【００６４】
本発明のさらなる特徴及び利点は、図への参照と共に実施形態の詳細な説明によって説明するものとする。
【００６５】
図１から図５では、本発明による方法を実施するためのデバイスの、異なる実施形態及び図が示される。実施例６では本発明によるそのようなデバイスの調製を記載する。
【００６６】
デバイスは、反応室１００であって、前記反応室１００の内部１０２を囲む室壁１０１を備える、前記反応室１００、第１電極１１であって、前記第１電極１１と第２電極１２との間に電圧を加えることによって、陽極又は陰極に分極するように設計される、前記第１電極１１、及び反応室１００に配置される第２電極１２であって、反応室１００内で本発明による方法が実施される場合に、前記第２電極１２が第１電極と反対の分局を担う、前記第２電極１２を特徴とする。
【００６７】
反応室１００は具体的にはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製であり、かつ固形支持部１０３の上に位置する。反応室１００の内部１０２は、液体を保持するように設計され、具体的にはハイドロゲル用の前駆体を含む溶液を保持するように設計される。
【００６８】
その上、反応室１００は固形支持部１０３の頂部に位置する。固形支持部１０３はガラス製であることが好ましく、かつ、具体的には顕微鏡用のカバースリップである。本発明の好ましい実施形態では、前記ガラス基板１０３は反応室１００の底部１０４である。反応室１００は表面プラズマ活性化によってカバースリップ１０３と結合しうる。反応室１００のハイドロゲル前駆体が注がれうる容積は約５０μＬである。
【００６９】
図１における本発明の実施形態では、第１及び第２電極１１、１２は真っ直ぐなワイヤーとして設計され、具体的には反応室１００を通って互いに平行に走り、具体的には反応室１０の底部１０４から同一の距離を有する、タングステンワイヤーとして設計される。
【００７０】
電極１１、１２の両方は具体的には反応室１００を通って伸び、反応室１００の２つの反対側の室壁１０１に接続し、かつ貫通する。
【００７１】
第１電極１１及び第２電極１２は好ましくは５０μｍから０．５ｍｍの範囲内の長さである。
【００７２】
その上、反応室１００は室壁１０１に、第３電極１０３を収容するのに適している２つの向かい合う開口部１０５を含みうる。好ましくはワイヤーとして設計され、好ましくは第１及び第２電極１１、１２のようなワイヤーとして設計される、前期第３電極１０３は、第１及び第２電極と平行に伸び、第２電極１２を受け取るための開口部１０６と第３電極１３を受け取るための開口部１０５との間の距離１０７は、好ましくは反応室１００の各側面で１ｍｍである。しかしより小さく、又はより大きい可能性もまたある。
【００７３】
図２は本発明の他の実施形態を示す。上部のパネルは本発明によるデバイスの側面図を示し、かつ、下部のパネルは本発明によるデバイスの上面図を示す。
【００７４】
該実施形態では、第２電極１２は反応室１００の底部１０４の近くに配置され、具体的には反応室１００の底部１０４に配置されることは明らかである。他の前期実施形態は好ましくは図１に示される実施形態と類似の構造を有する。
【００７５】
図３は本発明による他の実施形態を示す。上部のパネルは本発明によるデバイスの側面図を示し、かつ、下部のパネルは本発明によるデバイスの上面図を示す。
【００７６】
図３に示される実施形態は室壁１０１の上部末端に配置される第１電極１１を特徴とし、その結果第１電極１１は少なくとも部分的に反応室１００を覆う。その上、第１電極１１は長方形の外形を有する。該実施形態の別の態様は図１及び２に示される実施形態と類似していると理解される。
【００７７】
図４は本発明による他の実施形態の側面図を示す。ここで、図３の第１電極１１は、反応室１００の内部１０２の方を向く、窪み、棘又はギザギザ１４を備える領域を有する。
【００７８】
図５は本発明による他の実施形態を示す。上部のパネルは本発明によるデバイスの側面図を示し、かつ、下部のパネルは本発明によるデバイスの上面図を示す。
【００７９】
図５では第１電極１１は中が空洞であり、かつ、具体的にはマイクロ流体デバイス用として設計される。第１電極１１は、好ましくはそのような針状の第１電極１１の内部に沿って伸びるマイクロ流体チャネル１５を備える。第１電極１１は好ましくは、室壁１０１を一面のみ貫通し、かつ、第２電極と平行に反応室１００の内部１０２の方へ伸びる。マイクロ流体チャネル１５は流体が反応室１００へ送られうる用に設計される。
【００８０】
図１８は反応室１００の壁１０１に配置され、かつ、具体的には反応室１００の室内１０２（本文では内部とも表される）に突き出る、第１（対）電極１１を備える反応室１００を示す。第２（作用）電極１２は、導電性走査プローブとして設計され、具体的には電気化学原子間力顕微鏡プローブ又はガラス微小電極として設計され、具体的には走査チップ１２１であって、前記走査プローブに加えられる電圧が、第２電極１２又は走査プローブの前記チップ１２１の近傍の、前記反応室１００内の溶液のｐＨの最も大きい変化を生じさせることになるように設計される、前記チップ１２１を備える、前記プローブとして設計される。前記第２電極は、具体的には反応室１００の内部で３次元的（ｘ、ｙ、ｚ方向）に移動可能であり、具体的には制御可能なステージ１２２によって移動可能である。本発明によるデバイスの該実施形態は、具体的には、第２電極１２のチップ１２１の近接近で結合反応が限定されるので、ワイヤー構造やワイヤー状構造のような優れたハイドロゲル構造の生産を可能にする。図６は第１部分２０を含む第１化合物、この場合は好ましくは複数のリジン２１の官能基を持つ分岐ＰＥＧ分子２０（Ｌｙｓ−ＰＥＧ２０Ｌ）、第２部分２３を含む第２化合物２２、この場合は同様に好ましくは複数のグルタミン２３の官能基を持つ分岐ＰＥＧ分子２２（Ｇｌｎ−ＰＥＧ２２Ｇ）、及び第３化合物、この場合はリジン２１又はグルタミン２３のいずれかの官能基を持つ生体分子２４、２５（Ｌｙｓ−生体分子２４Ｌ、Ｇｌｎ−生体分子２５Ｇ）を示す。Ｌｙｓ−ＰＥＧ２０Ｌ及びＧｌｎ−ＰＥＧ２２Ｇはハイドロゲル２００の前駆体と見なされる。
【００８１】
前記前駆体及び第３化合物２４Ｌ、２５Ｇは、遊離アミン基、具体的にはリジン（Ｌｙｓ）２１由来の遊離アミン基と、アミド、具体的にはグルタミン（Ｇｌｎ）２３由来のアミドとの間の共有結合の形成を触媒する、活性化第ＸＩＩＩ因子トランスグルタミナーゼ（ＦＸＩＩＩａ）酵素（ＥＣ２．３．２．１３、ユニプロット番号：Ｐ００４８８）であることが好ましい、トランスグルタミナーゼと混合されうる。そのような反応は第ＸＩＩＩ因子媒介トランスグルタミネーションとして分類される。
【００８２】
その上、そのような反応は活性化第ＸＩＩＩ因子の酵素活性がとりわけ溶液のｐＨに依存するので、ｐＨ依存である。活性化第ＸＩＩＩ因子の活性はｐＨ８で最も高く、ｐＨ８で活性化第ＸＩＩＩ因子は最も効率的に働くが、より酸性又はより塩基性の条件では効率は低下する（図６）［３］。図６ではハイドロゲル２００は、活性化第ＸＩＩＩ因子の活性がＧｌｎ−ＰＥＧ２２ＧとＬｙｓ−ＰＥＧ２０Ｌとの間の架橋反応を導くほど十分に高い特定のｐＨ帯でのみ形成する。
【００８３】
その上、図６において酵素的に触媒される架橋反応のｐＨ依存が示され、図７は溶液の電解により電極界面で生じるｐＨの変化を概略的に示す［１９］。陽極３０の近傍でよりプロトン３１が蓄積するにつれて、陽極３０におけるｐＨは低下し、かつ、陰極３２の付近でより水酸イオン３３が蓄積するにつれて、陰極３２におけるｐＨは上昇する。実施例７において、Ｌｙｓ−ＰＥＧ２０Ｌ及びＧｌｎ−ＰＥＧ２２Ｇ前駆体の生産を詳細に説明する。
【実施例】
【００８４】
実施例１：異なる条件下でのハイドロゲルの形成
図６に示されるような溶液のｐＨの局所的な変化は、溶液の電解を誘起する、（上記のような）電極１１、１２、１３を経由する溶液への電流の通電によって達成される。
【００８５】
そのような電圧誘起電解は、図７に示されるような、陽極電極−溶液界面での局所的なｐＨの低下、及び陰極電極−バッファ界面での局所的なｐＨの上昇をもたらす［１９］。
【００８６】
電極１１、１２、１３それぞれの周囲の領域の範囲では、電極１１、１２、１３の近傍の前駆体溶液のバッファ容量、ｐＨ及び通電流密度に依存して、前駆体の結合／架橋／重合が阻害され、限定され、又は促進されうる。
【００８７】
どのような種類の反応（重合、縮合反応、架橋など）が起こるのかは、とりわけ用いられる前駆体に依存する。Ｌｙｓ−ＰＥＧ２０Ｌ、Ｇｌｎ−ＰＥＧ２２Ｇの場合、反応は具体的には架橋反応である。
【００８８】
ハイドロゲル２００の形成が陽極３０で阻害され、具体的にはｐＨの局所的な低下によって阻害されることを実証するために、ＦＩＴＣ標識されたリジン基質（Ｌｙｓ−ＦＩＴＣ）が前駆体及び活性化第ＸＩＩＩ因子を含む溶液に混合される。本実施形態での溶液はｐＨ７．６のＴＲＩＳバッファである。
【００８９】
注意深く洗浄されたハイドロゲル２００の共焦点蛍光顕微鏡画像は、蛍光強度の減少（明るい灰色の色値は高い蛍光強度を示す）によって示されるように、ハイドロゲル２００の形成が陽極３０の近傍で阻害されることを実証する。陽極３０周囲の阻害領域３５の範囲は電流密度の増加及びバッファ濃度の減少と共に増加した（図８及び図９）。実施例１０はＣＬＳＭの使用をより詳細に説明する。
【００９０】
図８に示される実験において、溶液（具体的には前駆体及び活性化第ＸＩＩＩ因子及びＬｙｓ−ＦＩＴＣを含む溶液）を２つの電極１１、１２を備える反応室１００内に流し込む。電極はタングステンワイヤーであることが好ましい。陽極３０はそれぞれの顕微鏡画像から左側に置かれ、かつ、陰極３２は各々の顕微鏡画像から右側に位置する。
【００９１】
図８ａ〜ｅは５０ｍＭの濃度のＴｒｉｓで調製された、ＦＩＴＣ標識されたハイドロゲル２００の共焦点顕微鏡画像を示し、電流密度は０〜８μＡ／ｍｍ２の間に調整した（図８ａ：０μＡ／ｍｍ２、図８ｂ：０．５μＡ／ｍｍ２、図８ｃ：２μＡ／ｍｍ２、図８ｄ：５μＡ／ｍｍ２、図８ｅ：８μＡ／ｍｍ２）。
【００９２】
図８ｆ〜ｈは１０ｍＭの濃度のＴｒｉｓで調製され、かつ、０〜２μＡ／ｍｍ２の間で調整された電流密度を増加させる、ハイドロゲルの画像を示す（図８ｆ：０μＡ／ｍｍ２、図８ｇ：０．５μＡ／ｍｍ２、図８８ｈ：２μＡ／ｍｍ２）。
【００９３】
８ｐで示す方向に沿って測定した蛍光強度の定量化は図９に示す。
【００９４】
具体的には、５０ｍＭのＴｒｉｓバッファにおいて、０．５μＡ／ｍｍ２の電流密度を溶液に加えるとき、陽極３０の近傍の蛍光強度の減少は認められなかった（図８ｂ）。
【００９５】
その一方、Ｔｒｉｓの濃度が１０ｍＭのとき、０．５μＡ／ｍｍ２で蛍光の減少がすでに見られた（図８ｇ）。
【００９６】
５０ｍＭのＴｒｉｓの濃度で、８μＡ／ｍｍ２の電流密度においては、最大約２００μｍ陽極３０から離れても、ハイドロゲルの形成は阻害される（図８ｅ）。阻害領域は、Ｔｒｉｓ濃度が１０ｍＭの場合の２μＡ／ｍｍ２における領域（図８ｈ）とほぼ同じ大きさである。実施例８及び実施例９において、ハイドロゲルの生産についてより詳細に説明する。
【００９７】
実施例２：電極の近傍での架橋
本発明の他の実施形態は、上記の、ただしそれぞれｐＨ５及びｐＨ１１の、前駆体、活性化第ＸＩＩＩ因子及び蛍光標識（Ｌｙｓ−ＦＩＴＣ）を含む溶液を調製することによって実現される。いずれのｐＨ条件下でも、活性化第ＸＩＩＩ因子の活性が阻害されるので、電流が溶液に流れない場合、前駆体は架橋されないことになる。
【００９８】
しかしながら、−５μＡ／ｍｍ２の電気密度をそのような溶液に加えるとき、ハイドロゲルの形成は、ｐＨ５で調製されるハイドロゲル２００に関しては陰極の近傍で生じ（図１０ｃ、画像の左側に位置する陰極）、かつ、ｐＨ１１で調製されるハイドロゲルに関しては、陽極（＋５μＡ／ｍｍ２）の近傍で生じる（図１０ｅ、顕微鏡画像の左側に位置する陽極）。架橋領域は（図１０ｅ、ｐＨ１１における）陽極及び（図１０ｂ、ｐＨ５における）陰極のそれぞれで、およそ１００μｍから２００μｍまで広がる。
【００９９】
該実施形態では、溶液のｐＨの選択は、活性化第ＸＩＩＩ因子の最適な酵素活性のｐＨから対照的に離れるように行う。
【０１００】
架橋領域は陽極３０及び陰極３２から同様に広がることが想定される。しかしながら、活性化第ＸＩＩＩ因子の酵素活性が酸性及び塩基性のｐＨで対照的に低下するかどうかは検査していない。
【０１０１】
図８及び図９で認められる架橋反応の阻害は、電流及び／又はｐＨ変化によって生じるＦＩＴＣの効果の消失によってでも、分子の電気泳動移動度によってでもなく、溶液のｐＨを空間的に変化させることによる、活性化第ＸＩＩＩ因子の酵素活性の制御によって生じる。
【０１０２】
本発明によれば、ハイドロゲル２００の形成は従って限定しうるものであり、具体的には電極の近傍に限定しうる。活性化第ＸＩＩＩ因子の活性は能動的に制御しうるものであり、具体的には溶液の局所的なｐＨの電気化学的な調節によって阻害又は活性化する。
【０１０３】
実施例３：本発明によって製造されたハイドロゲルからの電極の除去及びタングステン電極の除去によるハイドロゲルへの機械的ストレスの評価：
本発明による実施形態の他の実施例では、前駆体としてＬｙｓ−ＰＥＧ２０Ｌ及びＧｌｎ−ＰＥＧ２２Ｇを用いるハイドロゲルの形成の空間的制御能力は、空間的に定義された生物学的微小環境を作り出すために用いられうる。具体的にはＬｙｓ−ＰＥＧ２０Ｌ、Ｇｌｎ−ＰＥＧ２２Ｇ及び具体的にはＬｙｓ−又はＧｌｎ−で標識された生体分子２４Ｌ、２５Ｇ又は標識を用いて生産されるハイドロゲル２００はＴＧ−ＰＥＧ（トランスグルタミネーション媒介ＰＥＧ）を指すことになる。具体的には３次元ハイドロゲル２００中のマイクロチャネルの形成はインビトロ骨格の開発における課題である。クロバックらは該課題に、重合前にステンレス鋼微小針を配置し、かつ、その後マイクロチャネルを形成するために前記針を除去することによって対処した［２０、２１］。前駆体及び酵素の溶液への電圧の印加なしにハイドロゲルの形成が生じ、かつ具体的には金属ワイヤーをそのような（構成されていない）ハイドロゲル中にマイクロチャネルを作り出すための鋳型として用いるような従来の方法は、ワイヤー表面へのハイドロゲルの強すぎる接着のために、頻繁にマイクロチャネル及びハイドロゲルの崩壊をもたらす。
【０１０４】
従来の方法とは対照的に、陽極電極３０としてタングステンワイヤーを用いる、本発明による方法を適用するＴＧ−ＰＥＧハイドロゲル２００の形成は、実施例１及び２に記載される例のように、ｐＨ、電流密度などの最適な条件を適用する、前記タングステンワイヤーの周囲の限定領域内で阻害しうる。
【０１０５】
陽極３０の界面での架橋の局所的阻害の結果として、ハイドロゲルの架橋が完了した後に電極ワイヤーが取り除かれたときに、ハイドロゲルに機械的なストレスを加えることなく、前記ワイヤーに沿ってハイドロゲルを通って伸びるチャネルを作り出しうる。
【０１０６】
タングステンワイヤーの除去中にハイドロゲルに生じる機械的ストレスは、ハイドロゲル前駆体溶液中の２０μｍ蛍光微小粒子を懸濁することによって定量化する。
【０１０７】
図１１は異なる電流密度における、電極の除去によって生じる微小粒子の移動を表示する。顕微鏡画像（図１１ａ〜ｃ）では、電極の除去後の微小粒子は灰色の点として見え、かつ、電極の除去前の位置からの移動は、灰色の点で終わる灰色の線によって示す。白色の破線は電極の位置を示す。図１１は図１１ａ〜ｃにおける電極の除去後の微小粒子の移動の平均を示す（黒棒：図１１ａに対応し、灰色の棒は図１１ｂに対応し、かつ、白箱の棒は図１１ｃに対応する）。
【０１０８】
加えられる電流密度に応じて微小粒子の移動を追跡することによって（図１１ｄ）、０μＡ／ｍｍ２（図１１ａ）又は２μＡ／ｍｍ２（図１１ｂ）の電流密度は不十分である一方で、（灰色の点で終わる灰色の線が最も短く、又は存在しないので）粒子移動を抑制するために５μＡ／ｍｍ２（図１１ｃ）の電流密度は十分であり、かつ、従ってハイドロゲル構造への損傷を結果として防止することが分かる。図１１ｄは様々な陽極電流：０、２及び５μＡ／ｍｍ２（ａ、ｂ及びｃ）で重合されたＴＧ−ＰＥＧハイドロゲルからのタングステン針／ワイヤー（破線）の除去後に追跡する粒子の移動を示す。ｄ）粒子移動の定量化（平均標準偏差、ｎ＝３）。
【０１０９】
図１２は、０μＡ／ｍｍ２で形成されたＴＧ−ＰＥＧハイドロゲル２００の明視野顕微鏡画像を示す（図１２ａ、ｂ）。図１２ａでは除去される電極によって残ったマイクロチャネルは無傷である一方、図１２ｂのマイクロチャネルは電極の除去後に崩壊していることが分かる。ハイドロゲルの移動をどのように定量化しうるかは、実施例１１により詳細に記載する。
【０１１０】
実施例４：ハイドロゲル及びマイクロチャネルの製造中におけるハイドロゲルに懸濁された慣用細胞の生細胞／死細胞アッセイ
マイクロチャネルの生産は、細胞の存在下でさえも、それらの生存に影響を与えることなく実行しうる。図１３は０（図１３ａ）及び５μＡ／ｍｍ２（図１３ｂ）における、チャネルの生産中のハイドロゲル２００に懸濁された間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）の生細胞／死細胞アッセイを示す。ほとんど死んだ細胞（白い矢印）は見えないように、細胞の生存に違いは認められなかった。生細胞／死細胞アッセイにおいて、１０６ｍＬのヒト骨髄由来のＭＳＣｓをＴＧ−ＰＥＧ前駆体溶液に再懸濁する。溶液は、電極（タングステンワイヤー）除去前に陽極分極し（図１３ｂ）、かつ陽極分極せず（図１３ａ）、架橋する。生細胞／死細胞アッセイ（シグマ・アルドリッチ社、スイス国）はメーカーのプロトコルに従って実行する。前記アッセイは死細胞に対しては赤色スペクトル領域で発光する蛍光標識、及び生細胞に対しては緑色スペクトル領域で発光する蛍光標識に基づく。
【０１１１】
実施例５：ハイドロゲルの架橋の電気化学的な制御は、局所的に機能化された、複雑に構成された３次元微小環境を作り出すために用いられうる：
該実施例では、ＴＧ−ＰＥＧから作られる微小環境は、例えば細胞のような生物学的存在の生存を支持する幾つかのタンパク質、ペプチド及びその他の生体分子を含む、ハイドロゲル２００になりうる。
【０１１２】
具体的には規定された構造及び、培養細胞を、天然細胞外マトリクス（ＥＣＭｓ）によく似た段階的な生物学的刺激を与える一時的な細胞許容マトリクスとして機能しうるように指示するために使用しうる、生体分子２４、２５のような化学部分の制御された空間的な分布によって特徴付けられるハイドロゲル２００である微小環境は非常に重要である。
【０１１３】
図１４から１７は、架橋が生体シグナルで局所的に機能化された、複雑に構成された３次元微小環境（ＴＧ−ＰＥＧ）の生産のために使用しうる、ハイドロゲル２００の本発明による電気化学的な制御の一例を示す。本発明の該実施形態では、２成分の生体適合性のある微小環境を生産する。
【０１１４】
図１４ａ〜ｄ）は人工微小環境の製造を表す簡易スキームを示す：ｐＨ５のハイドロゲル前駆体を含むＦＩＴＣ及びＩＬ−４（インターロイキン−４）をＰＤＭＳ反応室に流し込み、そして−５μＡ／ｍｍ２を印加する陰極の周囲で局所的に架橋させる。架橋及び洗うことによる非結合の前駆体の除去後（図１４ｂ）、Ａｌｅｘａ５６１で機能化された第２のハイドロゲル前駆体を反応室に注ぎ、かつ架橋中に５μＡ／ｍｍ２の陽極電流を第３電極に加え（図１４ｃ）、結果として電極除去後に細胞移動用のチャネル及び局所的に生体機能化された領域の微小環境が構成されたＴＧ−ＰＥＧが生じる（図１４ｄ）。ＦＩＴＣが包含された領域（図１５ｅ）及びＡｌｅｘａ５６１ゲルで形成されるチャネル（図１５ｆ）を備える、結果として生じる微小環境の共焦点顕微鏡画像（図１５ｇ）。ＭＳＣｓをチャネル内に分散させ（図１６ｈ）、かつ周囲環境に侵入させる（図１６ｉ、７日目に撮影された画像）。構造的にｍＣｈｅｒｒｙを発現するＩＬ４感知ＨＥＫ細胞（図１７ｋ）はＩＬ−４を包含するゲルの近傍で、より高いＹＦＰの濃度を発現する。明視野画像は電極を見つけるために示す（図１７ｍ）。図１７ｎ：電極からの距離（ｘ軸）に応じたＹＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞の比率（ｙ軸）（値は３つの実験の平均及び標準偏差を表す）。実施例１３はＩＬ−４応答アッセイがどのように行いうるかをより詳細に記載する。
【０１１５】
以下に本実施例の実験をより詳細に説明する：本発明によるハイドロゲル２００は逐次的に生産する：第１段階は、活性化第ＸＩＩＩ因子によって変換されうるように機能化されたＩＬ−４及びＦＩＴＣを同様に含む、ｐＨ５の架橋反応の前駆体溶液を反応室１００に注ぎ込む。ＴＧ−ＰＥＧハイドロゲルは−５μＡ／ｍｍ２を加えることによって、陰極３２の周囲で形成する（図１４ａ）。非結合のハイドロゲル前駆体及び化学化合物の完全な洗浄後（図１４ｂに概略的に示す）、ＰＤＭＳ反応室１００に別のＡｌｅｘａ５６１−Ｇｌｎ標識されたＴＧ−ＰＥＧハイドロゲル前駆体溶液（ｐＨ７．６）を充填し（図１４ｃ）、チャネルは具体的には上記の実施例３のように作られる（図１４ｄ）。Ａｌｅｘａ５６１はＦＩＴＣとは異なる（赤方偏移した）波長で発光する蛍光染料である。例として、生体分子２４、２５が包含された、具体的には成長因子を含む、ヒト骨髄由来の間葉細胞、前骨芽細胞又は繊維芽細胞（図示せず）に及ぶ様々な細胞型がチャネルへ送られ、かつ周囲環境に侵入しうる（図１６ｉ）。加えて、ＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）シグナルを発現することによってＩＬ−４に感応及び報告するように設計され、かつ、局所的ＩＬ−４リポジトリを含む微小環境に位置するＨＥＫ細胞は、空間特異的に応答する。具体的には、導入細胞（ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞、図１７ｋ）の数分の、ＹＦＰをより高い濃度で発現するＩＬ−４感応細胞の数（図１７ｌ）は、ＩＬ−４が包含されたゲルの近傍で増加する（図１７ｍ＋ｎ）。
【０１１６】
総合すれば、本発明によって生産されたハイドロゲルに侵入し、かつ、局所的に固定された分子刺激を感知する細胞の能力は、サイトカイン勾配又は成長因子のＥＣＭ媒介の提示を模倣する、３次元的に構成された基質（３次元的に構成されたハイドロゲル）を作り出すための本方法の可能性を証明した。
【０１１７】
実施例６：本発明によるワイヤー電極を備える反応室の調製：
ＰＤＭＳ反応室１００の調製。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）反応室２００は以下のように作成する：シリコンエラストマー及び硬化剤（シルガード１８４、ダウ・コーニング・コーポレーション、アメリカ合衆国）を（１０：１の質量で）ＡＲＥ−２５０ミキサー（シンキー・コーポレーション、日本）で、２０００ｒｐｍで３分間混合する。混合物をその後、電極１１，１２、１３のための反応室１００の壁１０１の挿入穴１０５、１０６を作るために、直径５００μｍのステンレス鋼ワイヤーが配置されたポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）の型に流し込む。混合物はその後真空室で３０分間脱気し、６０℃で４時間固める。ステンレス鋼ワイヤー及びＰＤＭＳ反応室１００をＰＭＭＡ型から除去し、イソプロパノール（ＩＰＡ）で洗い、酸素プラズマで洗浄し（３００Ｗで１分、プラズマ−システム１００、テクニクス・プラズマ・ゲーエムベーハー、ドイツ国）、そして最後に顕微鏡ガラスカバースリップ１０３の上に押し付ける。真っ直ぐなタングステンワイヤー１１、１２、１３（Ｗ、直径５００μｍ、アドベント・リサーチ・マテリアルズ社、英国）をＰＤＭＳ反応室１００に挿入し、そして２つの電極機構として定電位定電流電解装置（ＰＧＵ−１０Ｖ−１Ａ−ＩＭＰ−Ｓ及びＥＣＭｗｉｎコンピューターインターフェース、エレクトロニクラボ・ピーター・シュレムス、ドイツ国）に接続する。
【０１１８】
実施例７：本発明によるＬｙｓ−／Ｇｌｎ−ＰＥＧ前駆体の生産：
保留の（ｐｅｎｄｉｎｇ）活性化第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩａ）ペプチド基質、グルタミン受容体基質（ｎ−ＰＥＧ−Ｇｌｎ）又はＭＭＰ感応リンカー（ｎ−ＰＥＧ−ＭＭＰ感応−Ｌｙｓ）を含むリジン供与体基質を含む８腕のＰＥＧ２０、２２前駆体は他の場所に記載されるように生産し、かつ特徴付ける［４］。簡潔には、分子量４００００の８腕のＰＥＧはネクター（ハンツビル、アラバマ州、アメリカ合衆国）から購入する。ジビニルスルホンはアルドリッチ（ブフス、スイス国）から購入する。ＰＥＧビニルスルホン（ＰＥＧ−ＶＳ）は他の場所に記載されるように生産し、かつ特徴付ける［２２］。活性化第ＸＩＩＩ因子ペプチド基質、Ｈ−ＮＱＥＱＶＳＰＬ−ＥＲＣＧ−ＮＨ２（ＴＧ−Ｇｌｎ）、Ａｃ−ＦＫＧＧ−ＧＰＱＧＩＷＧＱ−ＥＲＣＧ−ＮＨ２（ＭＭＰ感応−Ｌｙｓ）及び接着リガンドＡｃ−ＧＣＹＧＲＤＧＳＰＧ−ＮＨ２（ＴＧ−Ｇｌｎ−ＲＧＤ）はネオエムピーエス（ストラスブール、フランス国）から入手する（免疫等級、Ｃ１８精製、ＨＰＬＣ分析：＞９０％）。ＮＱＥＱＶＳＰＬカセットはα２−プラスミンインヒビターの活性化第ＸＩＩＩ因子基質部位に対応し［２３］、ＦＫＧＧカセットは最適化された活性化第ＸＩＩＩ因子基質部位に対応し［２４］、かつＥＲＧＧカセットはビニルスルホン反応性システインに対応する［２５］。別々の小瓶のＴＧ−Ｇｌｎ、ＴＧ−ＭＭＰ感応−ＬｙｓをＶＳ基に対して１．２倍モル量過剰に添加し、そして０．３Ｍのトリエタノールアミン中（ｐＨ８．０）で３７℃、２時間反応させる。生産物を超純水で３日間、４℃で透析（スネーク・スキン、ＭＷＣＯ・１０Ｋ、ピアース、ロックフォード、イリノイ州、アメリカ合衆国）する。透析後、無塩の生産物（８−ＰＥＧ−ＭＭＰ感応−Ｌｙｓ及び８−ＰＥＧ−Ｇｌｎのそれぞれ）を凍結乾燥する。
【０１１９】
実施例８：ＴＧ−ＰＥＧハイドロゲルの調製：
活性化第ＸＩＩＩ因子（２００Ｕ／  ｍＬ、フィブロガミン、ＣＳＬベーリング、スイス国）１ｍＬを、１００μＬのトロンビン（２０Ｕ／ｍＬ、シグマ−アルドリッチ、スイス国）で３０分間、３７℃で活性化させる。少量の活性化された活性化第ＸＩＩＩ因子はさらなる利用のために−８０℃で保存しうる。最終乾燥質量含有率が１．５％のハイドロゲルは、５０ｍＭの塩化カルシウムを含み、様々なモル濃度及びｐＨ（上記を参照）である、Ｔｒｉｓバッファ（Ｔｒｉｓ）中のｎ−ＰＥＧ−Ｇｌｎ及びｎ−ＰＥＧ−ＭＭＰ感応−Ｌｙｓの化学量論的に均等な（［Ｌｙｓ］／［Ｇｌｎ］＝１）前駆体溶液によって調製する。
【０１２０】
その上、任意にＬｙｓ−ＦＩＴＣ、ＴＧ−Ａｌｅｘａ５６１、Ｇｌｎ−ＲＧＤ又は組み合わせを、１０Ｕ／ｍＬトロンビンで活性化された活性化第ＸＩＩＩ因子による架橋及び激しい混合の開始前に溶液に添加する。
【０１２１】
実施例９：本発明によるＴＧ−ＰＥＧ架橋の電気化学的な制御：
ＴＧ−ＰＥＧ重合への電気化学の影響を調査するために、ＴＧ−ＰＥＧ、Ｔｒｉｓ（５０ｍＭ又は１０ｍＭ、ｐＨ５、７．６又は１１）、塩化カルシウム及び例えばＬｙｓ−ＦＩＴＣ、ＴＧ−Ａｌｅｘａ５６１又は蛍光ポリスチレンビーズ（フルオレスブライト・プレーンＹＧ２０・微小ミクロスフィア、ポリサイエンス社）のような蛍光剤を含む６０μＬの溶液を活性化第ＸＩＩＩ因子と混合した。混合物は直ちにＰＤＭＳ反応室に注ぐ必要がある。ＴＧ−ＰＥＧの架橋は、定電流状態で流される直流電流の存在下で６分間進行させる。電流密度は０から８μＡ／ｍｍ２の間の範囲で変化しうる。
【０１２２】
実施例１０：共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）：
ＴＧ−ＰＥＧハイドロゲル−電極界面はＬＳＭ５１０共焦点レーザー走査顕微鏡（カール・ツァイス・アーゲー、ドイツ国）を用いて撮像する。タングステンワイヤーの最大断面（５００μｍ）を得るために、焦点面を調整する可能性がある。ＦＩＴＣは０．７％のレーザー出力での４９０ｎｍの励起、及び５０５−５５０ｎｍの発光バンドパスフィルターによって検出する。Ａｌｅｘａ５６１は５１５ｎｍの励起、及び５７５−６１５ｎｍの発光バンドパスフィルターによって検出しうる。強度プロファイルは電極の平均強度として最小強度を設定し、そして末端２００μｍの平均強度の値を標準化する（最大強度）ことによって、５００×５００μｍの視野で取得しうる。少なくとも１条件につき３サンプルを分析する必要があり、そして１電極につき２つの画像を得る。
【０１２３】
実施例１１：電極除去によるハイドロゲルの移動の定量化：
除去時のタングステンワイヤー１１、１２、１３のＴＧ−ＰＥＧハイドロゲルへの接着及びその後のマイクロチャネルの形成への電気化学の影響を調査するために、ハイドロゲル２００内に分散する２０μｍのポリスチレン粒子の移動をライカ蛍光顕微鏡（ＢＭ５５０Ｂ、ライカ・マイクロシステムズ、ドイツ国）を用いて追跡する。ＴＧ−ＰＥＧハイドロゲル２００を上記のように調製し、そしてタングステンワイヤー１１、１２、１３を手動でハイドロゲル１１、１２、１３から引き抜く。画像は１００ミリ秒ごとに記録し、そして粒子は４８８ｎｍの励起光で検出する。粒子の軌道は前述の画像Ｊスクリプトを用いて計算する［２６］。
【０１２４】
実施例１２：細胞侵入アッセイ：
チャネル形成後、１％（ｖ／ｖ）のペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｐ／Ｓ、ギブコ・ライフ・テクノロジーズ、カタログ番号１５１４０−１２２）を添加した、血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２＋ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ（ギブコ・ライフ・テクノロジーズ、カタログ番号３１３３１−０２８）中の、１０６／ｍＬのヒト骨髄由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）の溶液をチャネル内に分散する。ハイドロゲルをその後、ヒト血小板由来の成長因子ＢＢ（ＰＤＦＧ−ＢＢ、１０ｎｇ／ｍｌ、ペプロテック、カタログ番号１００−１４Ｂ）を添加した培地に入れ、そして７日間培養し続けた。明視野画像はツァイス・アクシオウェルト２００Ｍ倒立顕微鏡で得る。
【０１２５】
実施例１３：細胞ＩＬ−４応答アッセイ：
ＨＥＫ−ＩＬ４レポーター細胞は前述のように生産する［６］。簡潔には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をｐＨＷ４０（ＰＳＴＡＴ６−ｅＹＦＰ−ｐＡ）及び構成的発現ベクターＳＴＡＴ６（オープン・バイオシステムズ、ハンツビル、アラバマ州、クローンＩＤ５５３０３９９から得られる）で形質転換する。構成的ｍＣｈｅｒｒｙ発現プラスミド（ｐＭＫ４７）はインターナルコントロールとして用いる。３次元ＩＬ４応答アッセイにおいて、１０６／ｍＬのレポーター細胞はＴＧ−ＰＥＧ前駆体溶液で再懸濁し、そして１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、ギブコ・ライフ・テクノロジーズ、カタログ番号．１０５００）及び１％（ｖ／ｖ）Ｐ／Ｓを添加したＤＭＥＭ／Ｆ−１２＋ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭで２４時間培養する。蛍光及び明視野画像はライカＤＭＩ６０００Ｂ倒立顕微鏡によって得る。
【０１２６】
ＩＬ−４応答細胞の１つの指標として、ｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞分のＹＦＰを発現する細胞の比率は画像Ｊで測定する可能性がある。具体的には、電極の周囲のＩＬ−４機能化域で微小環境を生産するとき、６００μｍの広領域でＩＬ−４応答を測定し、そして平均及び標準偏差は３つの独立の実験から計算する。
【０１２７】
参考文献：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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