(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるＤＮＡカセットを製造する方法であって、
各生物学的ユニットは、ユニット間で共通の第一の領域と第二の領域と、ユニットに固有の領域とを有し、かつ第一の領域、固有の領域および第二の領域がこの順番で連結してなるユニットであり、
各生物学的ユニットは、ガイドＲＮＡ発現ユニットであり、第一の領域は、ガイドＲＮＡを発現するためのプロモーター領域であり、固有の領域は、それぞれのガイドＲＮＡ発現ユニットに固有の標的配列であり、第二の領域は、ＤＮＡ切断酵素Ｃａｓ９をゲノム上の標的配列に導くガイドＲＮＡの領域であり、
方法は、インビトロの方法であり、
各生物学的ユニットの固有の領域の配列、第一の領域および第二の領域の配列を決定する工程と、
生物学的ユニットが連結する順番を決定し、ＤＮＡカセット全体を設計する工程と、
組換えユニットを設計する工程と（ここで、組換えユニットは、第二の領域および第一の領域をこの順番で含んでなるものであり、隣の組換えユニットの末端と連結して上記生物学的ユニットを形成するように設計されるか、または、固有の領域の一部若しくは全部の配列を有する二本鎖オリゴＤＮＡを介して隣の組換えユニットと連結して上記生物学的ユニットを形成するように設計され；かつ、組換えユニットの制限酵素切断後に生じる切断面が、設計された順番で組換えユニットが連結されるように切断面毎に異なるように設計される）、
設計された組換えユニットそれぞれを制限酵素処理して、設計された順番で組換えユニットが連結されるように切断面毎に異なる切断面を有する組換えユニットの断片を得る工程と、
得られた組換えユニット同士を連結させるか、あるいは、設計された組換えユニットを二本鎖オリゴＤＮＡを介して連結させる工程と、
複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるＤＮＡカセットを得る工程と
を含む、
方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、組換えユニットは、隣の組換えユニットの末端と連結して上記生物学的ユニットを形成するように設計され、連結部が固有の領域内に存在する、方法。
【請求項３】
複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるＤＮＡカセットを製造する方法であって、
各生物学的ユニットは、ユニット間で共通の第一の領域と第二の領域と、ユニットに固有の領域とを有し、かつ第一の領域、固有の領域および第二の領域がこの順番で連結してなるユニットであり、
各生物学的ユニットは、ガイドＲＮＡ発現ユニットであり、第一の領域は、ガイドＲＮＡを発現するためのプロモーター領域であり、固有の領域は、それぞれのガイドＲＮＡ発現ユニットに固有の標的配列であり、第二の領域は、ＤＮＡ切断酵素Ｃａｓ９をゲノム上の標的配列に導くガイドＲＮＡの領域であり、
方法は、インビトロの方法であり、
以下の工程：
（１−Ａ）Ｃａｓ９の標的ＤＮＡの塩基配列上の複数個の非対称制限酵素認識部位を同定することと、
（１−Ｂ）同定された複数個の認識部位から、制限酵素切断後にそれぞれ異なる非対称粘着末端を生じる複数の非対称制限酵素の認識部位を選択することと、
（１−Ｃ）工程（１−Ｂ）で選択された認識部位それぞれを含む塩基配列を標的配列として設定して、それぞれ異なる標的配列を有する各ガイドＲＮＡ発現ユニットを設計することと、
（１−Ｄ）ガイドＲＮＡ発現ユニットの連結する順番を決定して、カセット全体を設計することと、
（１−Ｅ）カセットのプロモーター側の末端に位置するガイドＲＮＡ発現ユニット内のプロモーター領域から標的配列中の制限酵素切断部位までの領域を含む核酸断片を得て、得られた断片を対応する制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する核酸断片を得ることと、
（１−Ｆ）カセットのガイドＲＮＡ側の末端に位置するガイドＲＮＡ発現ユニット内の標的配列中の制限酵素切断部位からガイドＲＮＡまでの領域を含む核酸増幅断片を得て、得られた断片を対応する制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する核酸断片を得ることと、
（１−Ｇ）あるガイドＲＮＡ発現ユニット内の標的配列中の制限酵素切断部位から隣のガイドＲＮＡ発現ユニット内の標的配列中の制限酵素切断部位までの領域を含む核酸増幅断片を対応する制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する核酸断片を得ることと、
（１−Ｈ）工程（１−Ｇ）を繰り返して、全体としてカセット中のすべての標的配列間をカバーする複数の核酸断片を得ることと、
（１−Ｉ）工程（１−Ｅ）、工程（１−Ｆ）、工程（１−Ｇ）および工程（１−Ｈ）で得られた非対称粘着末端を有する核酸断片をライゲーションしてカセットを得ることと、
を含んでなる、方法。
【請求項４】
工程（１−Ｂ）において非対称制限酵素切断部位として制限酵素ＢｓｌＩの切断部位を複数選択する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程（１−Ｂ）において非対称制限酵素切断部位として制限酵素ＡｖａＩまたはＢａｎＩＩの切断部位を複数選択する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるＤＮＡカセットを製造する方法であって、
各生物学的ユニットは、ユニット間で共通の第一の領域と第二の領域と、ユニットに固有の領域とを有し、かつ第一の領域、固有の領域および第二の領域がこの順番で連結してなるユニットであり、
各生物学的ユニットは、ガイドＲＮＡ発現ユニットであり、第一の領域は、ガイドＲＮＡを発現するためのプロモーター領域であり、固有の領域は、それぞれのガイドＲＮＡ発現ユニットに固有の標的配列であり、第二の領域は、ＤＮＡ切断酵素Ｃａｓ９をゲノム上の標的配列に導くガイドＲＮＡの領域であり、
方法は、インビトロの方法であり、
以下の工程：
（２−Ａ）各発現ユニットに固有の標的配列を設計して、それぞれ異なる標的配列を有する各ガイドＲＮＡ発現ユニットを設計することと、
（２−Ｂ）ガイドＲＮＡ発現ユニットの連結する順番を決定して、カセット全体を設計することと、
（２−Ｃ）核酸断片および二本鎖ＤＮＡ断片であって、末端に用いるＩＩＳ型制限酵素による切断面の形状を有し、かつ、切断面の位置をずらすことにより切断面の塩基配列が切断面毎に異なる核酸断片および二本鎖ＤＮＡ断片を、カセット全体をカバーするように設計することと、ここで、二本鎖ＤＮＡ断片は、ユニットに固有の領域の一部または全部の塩基配列を含んでなる塩基配列を有し、
（２−Ｄ）上記工程（２−Ｃ）で設計された配列を有する核酸断片および二本鎖ＤＮＡ断片のすべてを得ることと、
（２−Ｅ）カセットが完成するように設計されたカセットの両末端の断片を得ることと、（２−Ｆ）得られた核酸断片および二本鎖ＤＮＡ断片をライゲーションして、カセットを得ることと
を含んでなる、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、二本鎖ＤＮＡ断片がいずれもユニットに固有の領域の塩基配列を含んでなる塩基配列を有する、方法。
【請求項８】
核酸増幅断片同士を連結する二本鎖ＤＮＡの長さが一定となるように核酸断片を設計する、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
二本鎖ＤＮＡ断片が、合成オリゴＤＮＡのアニールにより得られた断片である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＩＩＳ型制限酵素が、ＢｓａＩまたはＢｓｍＢＩである、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるＤＮＡカセットを製造する方法であって、
各生物学的ユニットは、ユニット間で共通の第一の領域と第二の領域と、ユニットに固有の領域とを有し、かつ第一の領域、固有の領域および第二の領域がこの順番で連結してなるユニットであり、
各生物学的ユニットは、ガイドＲＮＡ発現ユニットであり、第一の領域は、ガイドＲＮＡを発現するためのプロモーター領域であり、固有の領域は、それぞれのガイドＲＮＡ発現ユニットに固有の標的配列であり、第二の領域は、ＤＮＡ切断酵素Ｃａｓ９をゲノム上の標的配列に導くガイドＲＮＡの領域であり、
組換えユニットは、隣の組換えユニットの末端と連結して上記生物学的ユニットを形成するように設計され、連結部が固有の領域内に存在し、
方法は、インビトロの方法であり、
以下の工程：
（３−Ａ）各発現ユニットに固有の標的配列を設計して、それぞれ異なる標的配列を有する各ガイドＲＮＡ発現ユニットを設計することと、
（３−Ｂ）ガイドＲＮＡ発現ユニットの連結する順番を決定して、カセット全体を設計することと、
（３−Ｃ）用いるＩＩＳ型制限酵素による切断面の形状を有し、かつ、切断面の位置をずらすことにより切断面の塩基配列が切断面毎に異なる核酸断片をカセット全体をカバーするように設計することと、
（３−Ｄ）工程（３−Ｃ）で設計された核酸断片のすべてを得ることと、
（３−Ｅ）カセットが完成するように設計されたカセットの両末端の断片を得ることと、（３−Ｆ）工程（３−Ｃ）、（３−Ｄ）および（３−Ｅ）で得られた断片をライゲーションし、これにより、得られた断片をシームレスに連結して工程（３−Ｂ）で設計したカセットを形成させることと、
を含んでなる方法。
【請求項１２】
ＩＩＳ型酵素としてＢｓａＩを用いる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＩＩＳ型酵素としてＢｓｍＢＩを用いる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
複数の異なるガイドＲＮＡ発現ユニットが多重に連結してなるＤＮＡカセットを有するガイドＲＮＡ発現ベクターを製造する方法であって、
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法によって、ＤＮＡカセットを製造し、
その後、宿主内でベクターを増幅可能とする複製起点と、宿主内で薬剤耐性を発現する薬剤耐性遺伝子発現ユニットとを有するベクターに、得られたＤＮＡカセットを組み込むことを含んでなる、方法。
【請求項１５】
複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるＤＮＡカセットを製造するための、複数の異なるＤＮＡ断片のセットであって、
各生物学的ユニットは、ユニット間で共通の第一の領域と第二の領域と、ユニットに固有の領域とを有し、かつ、第一の領域、固有の領域および第二の領域がこの順番で連結してなるユニットであり、
各生物学的ユニットは、ガイドＲＮＡ発現ユニットであり、第一の領域は、ガイドＲＮＡを発現するためのプロモーター領域であり、固有の領域は、それぞれのガイドＲＮＡ発現ユニットに固有の標的配列であり、第二の領域は、ＤＮＡ切断酵素Ｃａｓ９をゲノム上の標的配列に導くガイドＲＮＡの領域であり、
該セットに含まれるＤＮＡ断片は、
第二の領域と第一の領域とがこの順番で連結した各ＤＮＡ断片において、
両末端がそれぞれ独立して少なくとも１塩基欠失しており、
両末端は非対称粘着末端を有し、
非対称粘着末端の配列が、ＤＮＡ断片の末端毎に異なる、
ＤＮＡ断片である、
ＤＮＡ断片のセット。
【請求項１６】
複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるＤＮＡカセットを製造する方法であって、
各生物学的ユニットは、ユニット間で共通の第一の領域と第二の領域と、ユニットに固有の領域とを有し、かつ第一の領域、固有の領域および第二の領域がこの順番で連結してなるユニットであり、
各生物学的ユニットは、ガイドＲＮＡ発現ユニットであり、第一の領域は、ガイドＲＮＡを発現するためのプロモーター領域であり、固有の領域は、それぞれのガイドＲＮＡ発現ユニットに固有の標的配列であり、第二の領域は、ＤＮＡ切断酵素Ｃａｓ９をゲノム上の標的配列に導くガイドＲＮＡの領域であり、
方法は、インビトロの方法であり、
各生物学的ユニットの固有の領域の配列、第一の領域および第二の領域の配列を決定する工程と、
生物学的ユニットが連結する順番を決定し、ＤＮＡカセット全体を設計する工程と、
請求項１５に記載のＤＮＡ断片のセットを提供することと、
ＤＮＡカセットにおける、各ＤＮＡ断片の位置を決定することと、
隣り合う２つのＤＮＡ断片をシームレスに連結する配列を有し、かつ固有の領域の配列を有する二本鎖ＤＮＡを得ることと、
上記ＤＮＡ断片のセットと、上記二本鎖ＤＮＡとをライゲーションして上記ＤＮＡカ
セットを得ることと、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
複数のユニットが多重に連結したＤＮＡカセットおよび該カセットを含むベクターの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
CRISPER/Cas9系はゲノム編集において広く使われるようになる新技術である。またshort-hairpin RNA (shRNA)系も効率的に遺伝子発現をノックダウンする技術である。これらの方法ではpol IIIプロモーターによる発現ユニットDNAを用いるが、この発現ユニットを多数同時に用いれば多数の標的遺伝子あるいはウイルスゲノムを同時ノックダウンあるいは同時切断することが可能である。あるいは多数遺伝子（例えば山中4因子）の発現ユニットで同一プロモーターを使う場合も同じDNA断片を含むDNAを4個連結する必要がある。
【０００３】
一般に、相同の塩基配列部分をもつ異なるDNA断片を多数もつプラズミドの作製は、DNA断片の数が2個の場合は容易であるが3個以上になると、相同組換えによりその断片の欠失が起こるという決定的な問題があり、作製は極めて難しいだけでなく、いくつかの段階が必要で非常に手間がかかり、またそのすべての段階で相同組換えが起こるため安定に作製することができない。そのため相同組換えが起こりにくい大腸菌株、例えばSURE（アジレントテクノロジー社、#200227）などを用いる必要があり、一般的に使われている増殖の高いDH5αなどの大腸菌を用いることができない。またプラズミドに組み込まれた類似DNA断片の連結は反対方向の断片が1個でもあるとその場所でDNA合成がstopするため、同じ向きに組み込む方法が不可欠である。3個の異なるDNA断片をプラズミドに組み込む（すなわち4断片を結合させることになる）方法はIn-fusionという方法が開発されているが、それ以上の数のDNA断片を結合し組み込んだプラズミドの作製は難しい。一方本発明者は過去に単一DNA断片を多数連結する方法を開発しているが、この方法では同じ断片の連結しか行えない（非特許文献１および２）。したがってこれらの技術では多数の異なるDNA断片の連結をもったプラズミドの作製は不可能である。
【０００４】
また、CRISPER/Cas9系の多重連結ベクターを得る手法が開発されている（非特許文献３）。しかし、標的ＤＮＡと相補的な配列を有する標的配列を組み込んだ発現ユニットをそれぞれ用意して１個ずつ持つプラズミドをユニットの数だけ作製し大腸菌で増やす第一の工程と、その後、ユニットを切り出してアッセンブルしてさらに大腸菌で増やす第二の工程が必要であり、手順が煩雑である。さらに、例えば10個の発現ユニットを連結したプラズミドを作製するためには、第一の行程で10個のプラズミドを作製する必要があり、多大の労力を必要とする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Saito & Stark, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 83:8664-8668, 1986
【非特許文献２】Ikeda, Trowsdale & Saito, Gene, 71:19-27, 1988
【非特許文献３】Sakuma et al., Scientific Reports, 4:5400, 2014
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、複数のユニットが多重に連結したＤＮＡカセットおよび該カセットを含むベクターの製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（１）複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるＤＮＡカセットを製造する方法であって、
各生物学的ユニットは、ユニット間で共通の第一の領域と第二の領域と、ユニットに固有の領域とを有し、かつ第一の領域、固有の領域および第二の領域がこの順番で連結してなるユニットであり、
方法は、インビトロの方法であり、
各生物学的ユニットの固有の領域の配列、第一の領域および第二の領域の配列を決定する工程と、
生物学的ユニットが連結する順番を決定し、ＤＮＡカセット全体を設計する工程と、
組換えユニットを設計する工程と（ここで、組換えユニットは、第二の領域および第一の領域をこの順番で含んでなるものであり、隣の組換えユニットの末端と連結して上記生物学的ユニットを形成するように設計されるか、または、固有の領域の一部若しくは全部の配列を有する二本鎖オリゴＤＮＡを介して隣の組換えユニットと連結して上記生物学的ユニットを形成するように設計される）、
設計された組換えユニット同士を連結させるか、あるいは、設計された組換えユニットを二本鎖オリゴＤＮＡを介して連結させる工程と、
複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるＤＮＡカセットを得る工程と
を含む、
方法。
（２）上記（１）に記載の方法であって、
各生物学的ユニットは、ガイドＲＮＡ発現ユニットであり、第一の領域は、ガイドＲＮＡを発現するためのプロモーター領域であり、固有の領域は、それぞれのガイドＲＮＡ発現ユニットに固有の標的配列であり、第二の領域は、ＤＮＡ切断酵素Ｃａｓ９をゲノム上の標的配列に導くガイドＲＮＡである、方法。
（３）上記（１）または（２）に記載の方法であって、組換えユニットは、隣の組換えユニットの末端と連結して上記生物学的ユニットを形成するように設計され、連結部は固有の領域内に存在する、方法。
（４）上記（２）または（３）に記載の方法であって、
以下の工程：
（１−Ａ）Ｃａｓ９の標的ＤＮＡの塩基配列上の複数個の非対称制限酵素認識部位を同定することと、
（１−Ｂ）同定された複数個の認識部位から、制限酵素切断後にそれぞれ異なる非対称粘着末端を生じる複数の非対称制限酵素の認識部位を選択することと、
（１−Ｃ）工程（１−Ｂ）で選択された認識部位それぞれを含む塩基配列を標的配列として設定して、それぞれ異なる標的配列を有する各ガイドＲＮＡ発現ユニットを設計することと、
（１−Ｄ）ガイドＲＮＡ発現ユニットの連結する順番を決定して、カセット全体を設計することと、
（１−Ｅ）カセットのプロモーター側の末端に位置するガイドＲＮＡ発現ユニット内のプロモーター領域から標的配列中の制限酵素切断部位までの領域を含む核酸断片を得て、得られた断片を対応する制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する核酸断片を得ることと、
（１−Ｆ）カセットのガイドＲＮＡ側の末端に位置するガイドＲＮＡ発現ユニット内の標的配列中の制限酵素切断部位からガイドＲＮＡまでの領域を含む核酸増幅断片を得て、得られた断片を対応する制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する核酸断片を得ることと、
（１−Ｇ）あるガイドＲＮＡ発現ユニット内の標的配列中の制限酵素切断部位から隣のガイドＲＮＡ発現ユニット内の標的配列中の制限酵素切断部位までの領域を含む核酸増幅断片を対応する制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する核酸断片を得ることと、
（１−Ｈ）工程（１−Ｇ）を繰り返して、全体としてカセット中のすべての標的配列間をカバーする複数の核酸断片を得ることと、
（１−Ｉ）工程（１−Ｅ）、工程（１−Ｆ）、工程（１−Ｇ）および工程（１−Ｈ）で得られた非対称粘着末端を有する核酸断片をライゲーションしてカセットを得ることと、
を含んでなる、方法。
（５）工程（１−Ｂ）において非対称制限酵素切断部位として制限酵素ＢｓｌＩの切断部位を複数選択する、上記（４）に記載の方法。
（６）工程（１−Ｂ）において非対称制限酵素切断部位として制限酵素ＡｖａＩまたはＢａｎＩＩの切断部位を複数選択する、上記（４）に記載の方法。
（７）上記（２）に記載の方法であって、
方法は、核酸増幅断片同士を、各ユニットに固有の領域の一部または全部の塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡ断片により連結する方法であり、
以下の工程：
（２−Ａ）各発現ユニットに固有の標的配列を設計して、それぞれ異なる標的配列を有する各ガイドＲＮＡ発現ユニットを設計することと、
（２−Ｂ）ガイドＲＮＡ発現ユニットの連結する順番を決定して、カセット全体を設計することと、
（２−Ｃ）核酸断片および二本鎖ＤＮＡ断片であって、末端に用いるＩＩＳ型制限酵素による切断面の形状を有し、かつ、切断面の塩基配列が切断面毎に異なる、核酸断片および二本鎖ＤＮＡ断片をカセット全体をカバーするように設計することと、
（２−Ｄ）上記工程（２−Ｃ）で設計された配列を有する核酸断片および二本鎖ＤＮＡ断片のすべてを得ることと、
（２−Ｅ）カセットが完成するように設計されたカセットの両末端の断片を得ることと、
（２−Ｆ）得られた核酸断片および二本鎖ＤＮＡ断片をライゲーションして、カセットを得ることと
を含んでなる、方法。
（８）上記（７）に記載の方法であって、二本鎖ＤＮＡ断片がいずれもユニットに固有の領域の塩基配列を含んでなる塩基配列を有する、方法。
（９）核酸増幅断片同士を連結する二本鎖ＤＮＡの長さが一定となるように核酸断片を設計する、上記（７）または（８）に記載の方法。
（１０）二本鎖ＤＮＡ断片が、合成オリゴＤＮＡのアニールにより得られた断片である、上記（７）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）ＩＩＳ型制限酵素が、ＢｓａＩまたはＢｓｍＢＩである、上記（７）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）上記（３）に記載の方法であって、
以下の工程：
（３−Ａ）各発現ユニットに固有の標的配列を設計して、それぞれ異なる標的配列を有する各ガイドＲＮＡ発現ユニットを設計することと、
（３−Ｂ）ガイドＲＮＡ発現ユニットの連結する順番を決定して、カセット全体を設計することと、
（３−Ｃ）用いるＩＩＳ型制限酵素による切断面の形状を有し、かつ、切断面の塩基配列が切断面毎に異なる、核酸断片をカセット全体をカバーするように設計することと、
（３−Ｄ）工程（３−Ｃ）を繰り返して、全体としてカセット中のすべての標的配列間および標的配列をカバーする複数の核酸断片を得ることと、
（３−Ｅ）カセットが完成するように設計されたカセットの両末端の断片を得ることと、
（３−Ｆ）工程（３−Ｃ）、（３−Ｄ）および（３−Ｅ）で得られた断片をライゲーションし、これにより、得られた断片をシームレスに連結して工程（３−Ｂ）で設計したカセットを形成させることと、
を含んでなる方法。
（１３）ＩＩＳ型酵素としてＢｓａＩを用いる、上記（１２）に記載の方法。
（１４）ＩＩＳ型酵素としてＢｓｍＢＩを用いる、上記（１２）に記載の方法。
（１５）複数の異なるガイドＲＮＡ発現ユニットが多重に連結してなるＤＮＡカセットを有するガイドＲＮＡ発現ベクターを製造する方法であって、
上記（２）〜（１４）のいずれかに記載の方法によって、ＤＮＡカセットを製造し、
その後、宿主内でベクターを増幅可能とする複製起点と、宿主内で薬剤耐性を発現する薬剤耐性遺伝子発現ユニットとを有するベクターに、得られたＤＮＡカセットを組み込むことを含んでなる、方法。
（１６）複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるＤＮＡカセットを製造するための、複数の異なるＤＮＡ断片のセットであって、
各生物学的ユニットは、ユニット間で共通の第一の領域と第二の領域と、ユニットに固有の領域とを有し、かつ、第一の領域、固有の領域および第二の領域がこの順番で連結してなるユニットであり、
第二の領域と第一の領域とがこの順番で連結した各ＤＮＡ断片において、
両末端がそれぞれ独立して少なくとも１塩基欠失しており、
両末端は非対称粘着末端を有し、
非対称粘着末端の配列が、ＤＮＡ断片の末端毎に異なる、
ＤＮＡ断片
のセット。
（１７）複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるＤＮＡカセットを製造する方法であって、
各生物学的ユニットは、ユニット間で共通の第一の領域と第二の領域と、ユニットに固有の領域とを有し、かつ第一の領域、固有の領域および第二の領域がこの順番で連結してなるユニットであり、
方法は、インビトロの方法であり、
各生物学的ユニットの固有の領域の配列、第一の領域および第二の領域の配列を決定する工程と、
生物学的ユニットが連結する順番を決定し、ＤＮＡカセット全体を設計する工程と、
上記（１６）に記載のＤＮＡ断片のセットを提供することと、
ＤＮＡカセットにおける、各ＤＮＡ断片の位置を決定することと、
隣り合う２つのＤＮＡ断片をシームレスに連結する配列を有し、かつ固有の領域の配列を有する二本鎖ＤＮＡを得ることと、
上記ＤＮＡ断片のセットと、上記二本鎖ＤＮＡとをライゲーションして上記ＤＮＡカセットを得ることと、
を含む方法。
【０００８】
（１８）上記（２）に記載の方法であって、
以下の工程：
（２−Ａ）各発現ユニットに固有の標的配列を設計して、それぞれ異なる標的配列を有する各ガイドＲＮＡ発現ユニットを設計することと、
（２−Ｂ）ガイドＲＮＡ発現ユニットの連結する順番を決定して、カセット全体を設計することと、
（２−Ｃ’）カセット内で隣り合うガイドＲＮＡ発現ユニット中の標的配列間をつなぐ配列を有する核酸増幅断片であって、別の標的配列を有する核酸増幅断片とは異なる非対称粘着末端を生じるＩＩＳ型制限酵素切断部位および認識部位を末端に有する、ガイドＲＮＡとプロモーター領域とを含む核酸増幅断片を準備し、
その後、核酸増幅断片を当該ＩＩＳ型制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する断片を得ることと、
（２−Ｄ’）上記非対称粘着末端を有する断片とライゲーションすることにより、設計したカセット中のプロモーターと標的配列とガイドＲＮＡとがシームレスに連結することができる配列と末端を有する、二本鎖ＤＮＡ断片を準備することと、
（２−Ｅ’）工程（２−Ｃ’）および工程（２−Ｄ’）を繰り返して、全体としてカセット中のすべての標的配列間および標的配列をカバーする複数の核酸断片を得ることと、
（２−Ｆ’）カセットが完成するように設計されたカセットの両末端の断片を得ることと、
（２−Ｇ’）工程（２−Ｃ’）、（２−Ｄ’）、（２−Ｅ’）および（２−Ｆ’）で得られた断片をライゲーションし、これにより、得られた断片をシームレスに連結して工程（２−Ｂ）で設計したカセットを形成させることと、
を含んでなる方法。
（１９）上記（１８）に記載の方法であって、
工程（２−Ｃ’）において、核酸増幅断片は、以下(i)および(ii)を満たすように設計され、
(i)両末端に非対称粘着末端を生じるＩＩＳ型制限酵素の認識部位および付加塩基を該断片の末端にさらに有し、該認識部位および付加塩基は、酵素切断により断片から除去されるように配置されており、切断後の断片はカセットに含まれない余分な塩基配列を含まず；かつ、
(ii)ＩＩＳ型制限酵素による切断後の非対称粘着末端を有する核酸増幅断片の一端は、ガイドＲＮＡの一部を欠失していても、標的配列の一部が付加されていてもよく、かつ、他端は、プロモーター領域の一部を欠失していても、標的配列の一部が付加されていてもよく、
前記欠失した領域の長さまたは付加された領域の長さが核酸増幅断片毎に異なることに、切断後に生じる非対称粘着末端いずれもが核酸増幅断片毎にそれぞれ異なる塩基配列を有し、
工程（２−Ｄ’）において、二本鎖ＤＮＡ断片は、工程（２−Ｃ’）の断片において欠失したプロモーター領域およびガイドＲＮＡの欠失部分が末端に付加され、付加された標的配列の付加された部分が欠失した配列を有し、これにより工程（２−Ｃ’）の付加および欠失を補うことができる塩基配列、および、工程（２−Ｃ’）で得られる断片の非対称粘着末端と完全に相補的な非対称粘着末端の塩基配列を有するように設計された、
方法。
（２０）工程（２−Ｄ’）において、二本鎖ＤＮＡ断片が、合成オリゴＤＮＡのアニールにより得られた断片である、上記（１８）または（１９）に記載の方法。
（２１）得られたカセットの全長をさらに核酸増幅反応によって増幅する、上記（１）〜（１５）および（１７）〜（２０）のいずれかに記載の方法。
【０００９】
本発明によれば、決まった連結順序でユニットが連結した多重連結ＤＮＡをインビトロで製造することができる点で有利である。すなわち、多重連結ＤＮＡを製造する過程で微生物（例えば、大腸菌）へのクローニングは必要がないため、仮に多重連結される各ユニットの相同性が高い場合であっても、相同組換えによる重複部分の欠失を起こすことを防ぐことができ、目的の多重連結ＤＮＡを効果的に得ることができる。またこれまでの技術では目的とする多重連結ユニットを持つプラズミドを作製するためには、各々の連結すべきユニット一個についてそれを含む一個のプラズミドをすべて作製する必要があるが、本法では、いくつのユニットを多重連結する場合でも最低で１種のプラズミド（すなわち、第二の領域と第一の領域をこの順番で含むプラズミド）を作製すれば足りる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、作製目標であるユニットが多重に連結したＤＮＡカセットの製造方法の概略図である。
【図２】図２は、第一の実施態様の製造方法の概略図である。
【図３】図３は、第一の実施態様の製造方法において制限酵素切断部位としてＭｗｏＩの切断部位のみを用いた製造方法の概略図である。
【図４】図４は、第一の実施態様の製造方法において制限酵素切断部位としてＡｖａＩおよびＢａｎＩＩの切断部位を用いた製造方法の概略図である。
【図５】図５は、第二の実施態様の製造方法の概略図である。
【図６】図６は、第二の実施態様の工程（２−Ｃ’）において、作製されるすべての核酸増幅断片の一端がガイドＲＮＡの一部を欠失し、かつ他端がプロモーター領域の一部を欠失した態様では、標的配列間をつなぐ断片を作り置きしておくことができ、様々な固有の配列を含むＤＮＡカセットの作製に用いることができることを示す図である。
【図７】図７は、第二の実施形態の変形例の概略図である。
【図８】図８は、第三の実施形態の製造方法の概略図である。図８では、標的配列１部分の作製方法が示される。
【図９】図９は、第三の実施形態の製造方法の概略図である。図９では、標的配列２部分の作製方法が示される。
【図１０】図１０は、第三の実施形態の製造方法の概略図である。図１０では、標的配列３部分の作製方法が示される。
【図１１】図１１は、第三の実施形態の製造方法の概略図である。図１１では、標的配列４部分の作製方法が示される。
【図１２】図１２は、実施例１における各組換えユニットの電気泳動写真である。図中、「Ｍ」はマーカーを表す。
【図１３】図１３は、実施例２で製造した４つの発現ユニットが連結したＤＮＡの存在を示す電気泳動写真である。図１３Ａは、ライゲーション直後のＤＮＡの電気泳動写真であり、図１３Ｂは、ＰＣＲにより全長を増幅して得られたＤＮＡの電気泳動写真である。
【図１４】図１４は、実施例３で製造した３つの発現ユニットが連結したＤＮＡの存在を示す電気泳動写真である。図１４Ａは、ライゲーション直後のＤＮＡの電気泳動写真であり、図１４Ｂは、ＰＣＲにより全長を増幅して得られたＤＮＡの電気泳動写真である。
【図１５】図１５は、実施例４で製造した６つの発現ユニットが連結したＤＮＡの存在を示す電気泳動写真である。図１５Ａは、ライゲーション直後のＤＮＡの電気泳動写真であり、図１５Ｂは、ＰＣＲにより全長を増幅して得られたＤＮＡの電気泳動写真である。
【発明の具体的な説明】
【００１１】
本明細書では、「ＤＮＡカセット」とは、機能単位「以下、「ユニット」とよぶ」が複数連結してなるＤＮＡを意味する。ＤＮＡカセットにおいて、第一の領域側の末端および第二の領域側の末端に存在する生物学的ユニットをそれぞれ、最初の（右側の）ユニットおよび最後の（左側の）ユニットと呼ぶことがある（例えば、図１を参照）。
【００１２】
本明細書では、「生物学的ユニット」は、遺伝子発現などの特定の生物学的機能を有する機能単位であり、ユニット間で共通の第一の領域と第二の領域と、ユニットに固有の領域とを有し、第一の領域、固有の領域および第二の領域がこの順番で連結してなるものである。例えば、生物学的ユニットは、例えば、遺伝子発現ユニットとすることができる。
【００１３】
本明細書では、「多重」とは、３重以上であることを意味する。「多重」は、好ましくは４重以上であるか、５重以上であるか、６重以上であるか、７重以上であるか、８重以上であるか、９重以上であるか、または、１０重以上である。
【００１４】
本明細書では、「ユニット間で共通」とは、ユニット間で７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、若しくは９８％相同であるか、または１００％同一である塩基配列を有することを意味する。
【００１５】
本明細書では、「ユニットに固有」とは、ユニットごとに塩基配列が異なることを意味し、例えば、いずれのユニットも他のいずれのユニットと、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、若しくは１０％以下の同一性を有する塩基配列を有することを意味する。
【００１６】
本明細書では、「インビトロ」とは、本発明の各工程で得られたＤＮＡからカセットを形成させる際に微生物を用いないことを意味する。
【００１７】
本明細書では、「隣り合う２つの固有の領域にまたがる領域」またはこの類似の表現は、作製するカセット内で隣接する２つのユニット内に位置するそれぞれの固有の領域の間に存在する領域を意味する。「隣り合う２つの固有の領域にまたがる領域」は、固有の領域の配列の一部を含んでいることもあれば、固有の領域を含んでいないこともある。しかし、「隣り合う２つの固有の領域にまたがる領域」が固有の領域を含んでいない場合には、「隣り合う２つの固有の領域にまたがる領域」の末端は当該固有の領域から、合成技術で得られるＤＮＡ長を超えない距離（例えば、５０塩基長以下、４０塩基長以下、３０塩基長以下、２０塩基長以下、１５塩基長以下、１０塩基長以下、５塩基長以下）に位置させることが好ましい。これは現在の技術では、固有の領域は合成ＤＮＡ技術により作成することが有利であるという事情による。
【００１８】
本明細書では、「粘着末端」とは、二本鎖ＤＮＡの末端の片一方のＤＮＡ鎖（５’末端または３’末端）が突出していることを意味する。本明細書では、「粘着末端」は、別のＤＮＡ鎖（隣の組換えユニット）の相補的な粘着末端とライゲーションするために作製される。本明細書では、「非対称粘着末端」とは、粘着末端のうち、一方のＤＮＡ鎖が突出した部分の配列が、パリンドロームになっていないものをいう。
【００１９】
本明細書では、「組換えユニット」とは、組換えに用いるＤＮＡ単位を意味し、例えば、ライゲーションに用いるＤＮＡ断片を意味する。本発明では、「組換えユニット」は、カセット内の特定の生物学的ユニットの内部の固有の領域またはその近傍から該生物学的ユニットに隣り合う生物学的ユニットの内部の固有の領域またはその近傍までにわたる領域からなる。ここで、近傍とは、合成技術で得られるＤＮＡ長を超えない距離の範囲にあることを意味する。
【００２０】
本明細書では、「制限酵素」とは、二本鎖ＤＮＡ上の特定の配列パターンを認識し、その内部または外部でＤＮＡを切断する酵素を意味する。本明細書では、「非対称制限酵素」とは、非対称粘着末端を生じる制限酵素を意味する。本発明では、制限酵素として、セルフアニーリングを防ぎ、目的産物の収率を向上させる目的で、以下のすべての態様において、非対称粘着末端を生じる制限酵素を用い、それゆえに該酵素で処理して得られる粘着末端は非対称粘着末端である。また、本明細書では、「ＩＩＳ型制限酵素」とは、その認識配列の外部でＤＮＡ鎖を切断する酵素を意味する。本発明では、ＩＩＳ型制限酵素として、好ましくは非対称粘着末端を生じる非対称ＩＩＳ型制限酵素を用いる。
【００２１】
本明細書では、「ガイドＲＮＡ」とは、ＤＮＡ切断酵素であるＣａｓ９と結合して、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡに導く機能を有するＲＮＡを意味する。ガイドＲＮＡは、その５’末端に標的ＤＮＡに相補的な配列を有し、該相補的な配列を介して標的ＤＮＡに結合することにより、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡに導く。Ｃａｓ９は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼとして機能し、標的ＤＮＡが存在する部位でＤＮＡを切断し、例えば、標的ＤＮＡの機能を特異的に喪失させることができる。
【００２２】
本明細書では、「標的配列」とは、２０塩基長の配列を有するＤＮＡを意味し、ＮＧＧ配列の上流１５〜２５塩基、好ましくは１７〜２２塩基、より好ましくは１８〜２１塩基、さらに好ましくは２０塩基であり得る。
【００２３】
本明細書では、「ガイドＲＮＡ発現ユニット」とは、ガイドＲＮＡを発現するための生物学的ユニットを意味する。ガイドＲＮＡ発現ユニットにおいては、ガイドＲＮＡを発現するためのプロモーター領域が第一の領域に対応し、標的配列に相補的な配列が固有領域に対応し、ガイドＲＮＡが第二の領域に対応する。ある態様では、ガイドＲＮＡ発現ユニットは、プロモーター、標的配列に相補的な配列およびガイドＲＮＡがシームレスに連結している。
【００２４】
本明細書では、「付加塩基」とは、制限酵素認識部位が核酸断片の末端に存在するときに生じる切断効率の低下を防ぐために、該断片の末端に付加するＤＮＡ領域を意味する。付加塩基は、特定の配列を有する必要はなく、通常は数塩基長、例えば３〜５塩基程度で十分であり、それ以上の長さであってもよいことが知られており、本発明ではこのような付加塩基を用いることができる。
【００２５】
本明細書では、「合成オリゴＤＮＡ」とは、化学合成により得られる一本鎖ＤＮＡを意味し、通常は、２０塩基長〜６０塩基長程度の長さを有する。本明細書では、「二本鎖オリゴＤＮＡ」とは、合成オリゴＤＮＡをアニールして得られ得る二本鎖ＤＮＡを意味し、通常は、２０塩基長〜６０塩基長程度の長さを有する。「二本鎖オリゴＤＮＡ」の末端は、制限酵素の切断面とライゲーション可能に設計されている。
【００２６】
なお、本明細書では、塩基配列は、国際塩基配列データベースで用いられるシンボルを用いて表される。
【００２７】
従来は、複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるＤＮＡカセットを製造する際に、生物学的ユニットを組換えユニットとして連結してＤＮＡカセットを得ていた。本発明者は、図１に示されるように、生物学的ユニット中に組換え部位を設定するという意外な方法により、簡便に生物学的ユニットが多重に連結してなるＤＮＡカセットを製造する。具体的には、本発明のＤＮＡカセットの製造方法は、上記多重連結ＤＮＡカセットを作製する際に、図１に示されるように、カセット中で隣り合う２つの固有領域をまたぐユニット間で共通の領域鋳型を用いて得た核酸増幅断片を組換えユニットとして用い、核酸増幅断片の末端に各ユニットに固有の配列を付加するか、あるいは、核酸増幅断片同士を、各ユニットに固有の配列を有する二本鎖ＤＮＡ断片を介して連結させることを特徴とする。本発明のＤＮＡカセットの製造方法では、カセットの両末端の領域（図１の組換えユニット１および５）を補って、カセットを完成させる点がさらなる特徴である。すなわち、本発明の方法のある態様では、共通の領域の配列は、共通領域の配列を有するＤＮＡを鋳型とする核酸増幅反応により供給されるが、固有の領域の配列は、合成オリゴＤＮＡにより供給される。より具体的には、固有の領域の配列は、核酸増幅反応のプライマーにより供給されるか、合成オリゴＤＮＡをアニールして得られる二本鎖ＤＮＡ断片により供給され得る。固有の領域の塩基配列長は、例えば、５０塩基長以下であり、４０塩基長以下であり、または３０塩基長以下であり、例えば、２０塩基長程度とすることができる。
【００２８】
本発明の製造方法のある態様では、固有の領域がそれぞれ異なる非対称制限酵素切断部位を有しており、該制限酵素部位においてライゲーションが行われる。
【００２９】
本発明の製造方法のある態様では、固有の領域において、組換えが行われるが、ＩＩＳ型制限酵素を用いて組み換えて、固有の領域内はシームレスに完成させることができる。
【００３０】
本発明の製造方法のある態様では、固有の領域は、合成オリゴＤＮＡをアニールして得られる二本鎖ＤＮＡ断片により供給される。この態様では、前記二本鎖ＤＮＡ断片は、末端が非対称粘着末端であり、末端が固有の領域毎に異なる塩基配列を有する。この態様ではまた、ある固有の領域とその隣の固有の領域とをつなぐ核酸断片は、該非対称粘着末端を形成できるよう、ＩＩＳ型制限酵素の認識部位を備えたプライマーを用いて得られる核酸増幅断片を対応する制限酵素で切断して得られ、第二の領域と第一の領域とがこの順番で連結したＤＮＡを鋳型として用いる。非対称粘着末端の配列は、生物学的ユニット内に存在する配列であるから、上記二本鎖ＤＮＡ断片と上記固有の領域をつなぐ核酸断片をライゲーションすると、得られたライゲーション産物内では、上記核酸断片と上記二本鎖ＤＮＡ断片とがシームレスに連結して生物学的ユニットが形成される。
【００３１】
ある態様では、生物学的ユニットは、CRISPR-Cas9系の標的配列とガイドＲＮＡの転写ユニットとすることができる。この態様では、第一の領域は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーター（例えば、Ｕ６プロモーターおよびＨ１プロモーターから選択されるプロモーター）とすることができ、固有の領域は、生物学的ユニットに固有の標的配列であり、第二の領域は、ガイドＲＮＡである。この生物学的ユニットからは、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩにより、標的配列をその５’末端に有するガイドＲＮＡが転写される。転写されたＲＮＡは、標的配列と相補的な配列を有するＤＮＡ部分に結合して、Cas9を当該部分に導く。Cas9は、ガイドＲＮＡが結合したＤＮＡを標的配列の近傍で切断する。従って、CRISPR-Cas9系では、標的配列を有するＤＮＡがその内部で配列特異的に切断されることになる。
【００３２】
本発明の方法では、大腸菌へのトランスフォーメーションは、ＤＮＡカセット作製の工程では不要であり、しかも、ＰＣＲ増幅とゲルからの増幅産物の切り出しや制限酵素処理のみで実施ができるため、多重連結カセットの作製を２〜数日で行うことも可能である。
【００３３】
CRISPR-Cas9系では、オフターゲットを防ぐために、ニッカーゼとして二本鎖ＤＮＡの一方の鎖のみを切断するCas9変異体を用いることもできる。一本鎖切断型Cas9変異体としては、例えば、Cas9 (D10A)が挙げられ、本発明で用いることができる。一本鎖切断型Cas9変異体は例えば、標的ＤＮＡの一方の鎖に相補的な標的配列を有するガイドＲＮＡと、そのごく近傍の他方の鎖に相補的な標的配列を有するガイドＲＮＡとを組み合わせて用いると、一方の鎖を２０塩基の特異性で切断し、他方の鎖をさらに２０塩基の特異性で切断するため、併せて４０塩基の特異性でＤＮＡを切断することになり、標的の特異性を大幅に向上させることが可能となる。この場合、複数のガイドＲＮＡを発現させる必要があるが、本発明では様々なガイドＲＮＡを発現できるユニットが多重に連結したＤＮＡカセットを製造することができ、この目的に適している。
【００３４】
本発明の方法では、生物学的ユニットを所望の順番で所望の個数ずつ含むＤＮＡカセットを製造することができる。
【００３５】
本発明の方法では、ＤＮＡカセットの作製はインビトロで行われ、大腸菌などの微生物への形質転換はＤＮＡカセットをプラズミドに組み込むときにだけ用いられる。
【００３６】
以下では、説明の便宜上、生物学的ユニットが、CRISPR-Cas9系のガイドＲＮＡ発現ユニットである場合の実施形態を、実施形態ごとに発明を説明する。
【００３７】
第一の実施形態
以下、図２を参照しながら第一の実施形態を説明する。図２では、ユニットが４つ連結したカセットが例示されているが、ユニット数は５つ以上であってもよい。
【００３８】
第一の実施形態の方法では、図２に示されるように、作製するカセット中の標的配列が非対称制限酵素切断部位を含むように設計されている。
【００３９】
具体的には、第一の実施形態の方法は、
以下の工程：
（１−Ａ）Ｃａｓ９の標的ＤＮＡの塩基配列上から複数個の非対称制限酵素認識部位を同定することと、
（１−Ｂ）同定された複数個の認識部位から、制限酵素切断後にそれぞれ異なる非対称粘着末端を生じる複数の非対称制限酵素認識部位を選択することと、
（１−Ｃ）工程（１−Ｂ）で選択された認識部位それぞれを含む塩基配列を標的配列として設定して、それぞれ異なる標的配列を有する各ガイドＲＮＡ発現ユニットを設計することと、
（１−Ｄ）ガイドＲＮＡ発現ユニットの連結する順番を決定して、カセット全体を設計することと、
（１−Ｅ）カセットのプロモーター側の末端に位置するガイドＲＮＡ発現ユニット内のプロモーター領域から標的配列中の制限酵素切断部位までの領域を含む核酸断片を得て、得られた断片を対応する制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する核酸断片を得ることと、
（１−Ｆ）カセットのガイドＲＮＡ側の末端に位置するガイドＲＮＡ発現ユニット内の標的配列中の制限酵素切断部位からガイドＲＮＡまでの領域を含む核酸増幅断片を得て、得られた断片を対応する制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する核酸断片を得ることと、
（１−Ｇ）あるガイドＲＮＡ発現ユニット内の標的配列中の制限酵素切断部位から隣のガイドＲＮＡ発現ユニット内の標的配列中の制限酵素切断部位までの領域を含む核酸増幅断片を対応する制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する核酸断片を得ることと、
（１−Ｈ）工程（１−Ｇ）を繰り返して、全体としてカセット中のすべての標的配列間をカバーする複数の核酸断片を得ることと、
（１−Ｉ）工程（１−Ｅ）、工程（１−Ｆ）、工程（１−Ｇ）および工程（１−Ｈ）で得られた非対称粘着末端を有する核酸断片をライゲーションしてカセットを得ることと、
を含んでなる。
【００４０】
以下、工程ごとに第一の実施形態を説明する。
【００４１】
工程（１−Ａ）
工程（１−Ａ）では、Ｃａｓ９の標的遺伝子の塩基配列上の複数個の非対称制限酵素認識部位を同定する。標的ＤＮＡは１つであっても複数であってもよい。非対称制限酵素認識部位は、切断後に非対称粘着末端を生じる制限酵素の部位とし、かつ、それぞれの非対称粘着末端が異なる配列となるように、複数種類同定されることが好ましい。ここで非対称制限酵素認識部位は、ＩＩＳ型酵素の認識部位であってもよい。
【００４２】
工程（１−Ｂ）
工程（１−Ｂ）では、同定された複数個の認識部位から、制限酵素切断後にそれぞれ異なる非対称粘着末端を生じる複数の非対称制限酵素の認識部位を選択する。第一の実施形態の方法では、同定された複数の認識部位から、それぞれ異なる配列を有する非対称粘着末端を生じるように非対称制限酵素の認識部位を１つずつ選択する。この切断部位は、のちに組換えユニットの組換え部位となる。切断部位をそれぞれ異なる配列にすることにより、後のライゲーションで、組換えユニットを所望の順番および方向で連結することが可能となる。工程（１−Ｂ）では、非対称制限酵素の切断部位は前記認識部位の内部に存在することが好ましい。
【００４３】
ある態様では、工程（１−Ｂ）では、制限酵素ＭｗｏＩの認識部位を複数選択することができる。ＭｗｏＩは、図３に示されるように、配列GCNNNNN/NNGCの塩基配列部分を認識して「/」の部分で切断し、下線の３塩基からなる非対称粘着末端を形成する。非対称粘着末端の配列を各標的配列毎に異なるように選択することができる。ある態様では、工程（１−Ｂ）では、制限酵素ＢｓｌＩの認識部位を複数選択することができる。ＢｓｌＩは、CCNNNNN/NNGGの塩基配列部分を認識して「/」の部分で切断し、下線の３塩基からなる非対称粘着末端を形成する。
【００４４】
別のある態様では、工程（１−Ｂ）では、制限酵素ＡｖａＩおよび／またはＢａｎＩＩの認識部位を複数選択することができる。ＡｖａＩは、図４に示されるように、C/YCGRGの塩基配列部分を認識して「/」の部分で切断し、下線の３塩基からなる非対称粘着末端を形成する。ここで、ＹはＣまたはＴを表し、ＲはＡまたはＧを表す。ＢａｎＩＩは、図４に示されるように、GRGCY/Cの塩基配列部分を認識して「/」の部分で切断し、下線の４塩基からなる非対称粘着末端を形成する。非対称粘着末端の配列を標的配列毎に異なるように選択することができる。好ましくは、制限酵素ＡｖａＩまたはＢａｎＩＩとこれら以外の制限酵素の認識部位とを組み合わせて複数選択することができ、制限酵素ＡｖａＩおよびＢａｎＩＩの切断部位を複数選択してもよい。
【００４５】
工程（１−Ｃ）
工程（１−Ｃ）では、工程（１−Ｂ）で選択された認識部位それぞれを含む塩基配列を標的配列として設定して、それぞれ異なる標的配列を有する各ガイドＲＮＡ発現ユニットを設計する。標的配列は、例えば、２０塩基長の配列である。標的配列は、同定された認識配列が含まれるように設計することができる。図２下段では、一例として、標的ＤＮＡ上で制限酵素部位を含むように標的配列が決定されている。標的の配列に際しては、市販の評価プログラムを用いて、最適な標的配列を決定してもよいであろう。
【００４６】
工程（１−Ｄ）
工程（１−Ｄ）では、ガイドＲＮＡ発現ユニットの連結する順番を決定して、カセット全体を設計する。すなわち、例えば、図２の上段に示されるように、作製目標のカセットをこの段階で設計する。後の工程では、ここで設計されたカセットを作製するための組換えユニットを準備することとなる。工程（１−Ｄ）では、カセット内の発現ユニットはすべて同じ方向を向くよう設計することができる。設計されたカセットは、プロモーター、標的配列およびガイドＲＮＡがシームレスに結合したものとすることができる。
【００４７】
工程（１−Ｅ）
工程（１−Ｅ）は、例えば図２中段における、左端の断片を作製する工程であり、カセットの末端を完成させるために必要である。具体的には、カセットのプロモーター側の末端に位置するガイドＲＮＡ発現ユニット内のプロモーター領域から上記で選択した制限酵素認識部位を認識する制限酵素の切断部位までの領域を含む核酸断片を得て、得られた断片を対応する制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する核酸断片を得る。得られる核酸断片のプロモーター領域側の末端は、制限酵素処理によって各組換えユニットに固有の非対称粘着末端を生じる。
【００４８】
一般的には、工程（１−Ｅ）は、鋳型としてプロモーター領域の塩基配列を有する核酸を用いた核酸増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））とその後の制限酵素処理により行うことができる。例えば、核酸増幅反応では、プライマーペアは、該プロモーター配列全体を増幅できるプライマーであり、ここで、フォワードプライマーは、所望の制限酵素切断部位とプロモーター配列の開始部分とを含む塩基配列を有するオリゴＤＮＡであり得、リバースプライマーは、プロモーター配列の終結部分から制限酵素切断部位までを含む領域の塩基配列を有するオリゴＤＮＡであり得る。プロモーター領域から標的配列中の制限酵素切断部位までの領域を含む核酸断片は、その後、切断部位を切断する制限酵素で処理することができる。
【００４９】
工程（１−Ｆ）
工程（１−Ｆ）は、例えば図２中段における、右端の断片を作製する工程であり、カセットのもう一つの末端を完成させるために必要である。具体的には、カセットのガイドＲＮＡ側の末端に位置するガイドＲＮＡ発現ユニット内の上記で選択した制限酵素認識部位を認識する制限酵素の切断部位からガイドＲＮＡまでの領域を含む核酸増幅断片を得て、得られた断片を対応する制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する核酸断片を得る。得られる核酸断片のガイドＲＮＡ領域側の末端は、各組換えユニットに固有の非対称粘着末端を生じる。
【００５０】
一般的には、工程（１−Ｅ）は、鋳型としてガイドＲＮＡ配列の塩基配列を有する核酸を用いた核酸増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））とその後の制限酵素処理により行うことができる。例えば、核酸増幅反応では、プライマーペアは該ガイドＲＮＡ領域を増幅できるプライマーであり、ここで、フォワードプライマーは、制限酵素切断部位からガイドＲＮＡまでを含む領域の塩基配列を有するオリゴＤＮＡであり得、リバースプライマーは、ガイドＲＮＡの終結部分と制限酵素切断部位を含む塩基配列を有するオリゴＤＮＡであり得る。制限酵素切断部位からガイドＲＮＡの終結部分までの領域を含む核酸断片は、その後、切断部位を切断する制限酵素で処理することができる。
【００５１】
工程（１−Ｇ）
工程（１−Ｇ）は、例えば図２中段における、標的配列間をつなぐ領域に対応する核酸断片を作製する工程である。具体的には、あるガイドＲＮＡ発現ユニット内の標的配列中の制限酵素切断部位から隣のガイドＲＮＡ発現ユニット内の標的配列中の制限酵素切断部位までの領域を含む核酸増幅断片を対応する制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する核酸断片を得る。
【００５２】
一般的には、工程（１−Ｇ）は、鋳型としてガイドＲＮＡおよびプロモーター領域とがこの順番で連結した塩基配列を有する核酸を用いた核酸増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））とその後の制限酵素処理により行うことができる。例えば、核酸増幅反応は、プライマーペアは該プロモーター配列全体を増幅できるプライマーであり、ここで、フォワードプライマーは、制限酵素切断部位からプロモーター領域の開始部分までを含む領域の塩基配列を有するオリゴＤＮＡであり得、リバースプライマーは、ガイドＲＮＡ領域の終結部分から制限酵素切断部位までを含む領域の塩基配列を有するオリゴＤＮＡであり得る。ある制限酵素切断部位から隣の標的配列の制限酵素切断部位までを含み、標的配列間をつなぐ領域に対応する核酸断片は、その後、対応する制限酵素により処理することができる。
【００５３】
工程（１−Ｈ）
工程（１−Ｈ）では、カセットを構成するすべての断片をそろえる。すなわち、工程（１―Ｇ）を繰り返して、図２中段に示されるように、すべての断片をそろえる工程である。
【００５４】
工程（１−Ｉ）
工程（１−Ｉ）は、上述で得られた断片を混合してライゲーションする工程である。得られたライゲーション産物は、標的配列部分に組換えに用いた制限酵素切断部位を有するカセットであり、ガイドＲＮＡ発現ユニットが多重連結したカセットである。カセットは、その後、ベクターに組み込まれてもよい。工程（１−Ｉ）では、核酸増幅反応の副産物や制限酵素処理後の不要な切断断片を除去するため、ゲル濾過カラムなどのサイズ排除カラムで処理してもよい。
【００５５】
以下、制限酵素としてＡｖａＩを用いたときの組換えについて詳細に説明する。特に下記では、組換え部分の形成方法を主に説明する。
【００５６】
まず、作製目標となる標的配列の構造を以下に説明する。
【００５７】
【化１】
0006529110.tif 000002
式中、Ｈ１は、ポリメラーゼＩＩＩのプロモーターを表し、Ｌtargetは、標的配列の左側断片を表し、targetＲは、標的配列の右側断片を表し、guideはガイドＲＮＡを表す。下線は、ＡｖａＩ認識部位CYCGRGのYとRの位置に付されている。
【００５８】
このような産物を得るときには、標的配列がＡｖａＩの認識部位を有している必要がある。工程（１−Ａ）でＡｖａＩの認識部位を同定し、工程（１−Ｂ）でＡｖａＩの上記認識部位を選択する。その後、工程（１−Ｃ）で上記ＡｖａＩ認識部位を含む標的配列を設定する。この際、標的配列のＡｖａＩ切断部位の左側がＬtargetであり、右側がtargetＲである。
【００５９】
次に、工程（１−Ｄ）では、作製目標となるカセット全体の配列を設計する。具体的には、例えば、上記ＡｖａＩ切断部位とは異なる非対称粘着末端を生じる制限酵素切断部位を含む配列を標的ＤＮＡ上の配列から選択する。その後、工程（１−Ｅ）および（１−Ｆ）により適宜両端の断片を作製する。
【００６０】
次に、工程（１−Ｇ）では、上記標的配列の右半分と左半分をそれぞれ２つの別々の断片上で作製する。
【化２】
0006529110.tif 000003
【００６１】
上記断片の末端の３塩基は、制限酵素がその認識部位に結合するための足場として働く付加塩基である。この３塩基を付加することで、制限酵素の切断効率が向上することが一般的に知られている。
【００６２】
この際、各断片は、ある標的配列のtargetＲと隣の標的配列のＬtargetを含むように増幅される。具体的には、ガイドＲＮＡおよびプロモーター（例えば、Ｈ１プロモーター）がこの順番で連結した鋳型を用い、フォワードプライマーとして、5'-gcg-CCCGAG-targetR-とガイドＲＮＡの２０〜３０塩基を含む合成オリゴＤＮＡを用い、リバースプライマーとして、隣の標的配列の制限酵素部位からLtarget-GGGCTC-gcg-5'を含む合成オリゴＤＮＡを用いて、ＰＣＲを実施する。
【００６３】
ＰＣＲ産物をＡｖａＩで切断して得た断片は、以下の通りである。
【００６４】
【化３】
0006529110.tif 000004
【００６５】
上記の断片をライゲーションすると、標的配列（あるいは目的産物）が完成する。制限酵素部位がもともと標的配列に存在する配列であるため、組換え部位は、標的配列として利用されることとなり、結果として、シームレスにプロモーター、標的配列およびガイドＲＮＡが連結したカセットが形成される。
【００６６】
第二の実施形態
次に、図５により第二の実施形態を説明する。第一の実施形態では、標的配列が、制限酵素認識部位および制限酵素切断部位を含むように設計され、核酸増幅用プライマーにより供給されたが、第二の実施形態では、標的配列は、主に二本鎖ＤＮＡ断片により別途供給される点で異なる。これにより、標的配列が制限酵素認識部位および／または切断部位を含まない配列であってもよくなり、標的配列の設計の自由度が第一の実施形態の設計自由度よりも格段に高い。なお、図５では、紙面の制約からユニットが３つ連結したカセットの図が描かれているが、ユニット数は４以上であってもよい。
【００６７】
具体的には、第二の実施形態の方法は、
複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるＤＮＡカセットをインビトロで製造する方法であって、
各ユニットは、ユニット間で共通の第一の領域と第二の領域と、ユニットに固有の領域とを有し、第一の領域、固有の領域および第二の領域がこの順番で連結してなるユニットであり、
以下の工程：
（２−Ａ）各発現ユニットに固有の標的配列を設計して、それぞれ異なる標的配列を有する各ガイドＲＮＡ発現ユニットを設計することと、
（２−Ｂ）ガイドＲＮＡ発現ユニットの連結する順番を決定して、カセット全体を設計することと、
（２−Ｃ’）カセット内で隣り合うガイドＲＮＡ発現ユニット中の標的配列間をつなぐ配列を有する核酸増幅断片であって、別の標的配列を有する核酸増幅断片とは異なる非対称粘着末端を生じるＩＩＳ型制限酵素切断部位および認識部位を末端に有する、ガイドＲＮＡとプロモーター領域とを含む核酸増幅断片を準備し、
その後、核酸増幅断片を当該ＩＩＳ型制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する断片を得ることと、
（２−Ｄ’）上記非対称粘着末端を有する断片とライゲーションすることにより、設計したカセット中のプロモーターと標的配列とガイドＲＮＡとがシームレスに連結することができる配列と末端を有する、二本鎖ＤＮＡ断片を準備することと、
（２−Ｅ’）工程（２−Ｃ’）および工程（２−Ｄ’）を繰り返して、全体としてカセット中のすべての標的配列間および標的配列をカバーする複数の核酸断片を得ることと、
（２−Ｆ’）カセットが完成するように設計されたカセットの両末端の断片を得ることと、
（２−Ｇ’）工程（２−Ｃ’）、（２−Ｄ’）、（２−Ｅ’）および（２−Ｆ’）で得られた断片を混合して、ライゲーションし、これにより、得られた断片をシームレスに連結して工程（２−Ｂ）で設計したカセットを形成させることと、
を含んでなる。この方法は、カセット中で隣り合う２つの固有領域に介在するユニット間で共通の領域鋳型を用いて得た核酸増幅断片を組換えユニットとして用い、核酸増幅断片同士を、各ユニットに固有の領域の少なくとも一部の塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡ断片により連結する、方法である。
【００６８】
以下、工程ごとに具体的に説明する。
【００６９】
工程（２−Ａ）
第二の実施形態では、標的配列は任意に設計することができる。例えば、オフターゲット減少の観点では、標的となる対象生物においてユニークな配列を選択することができる。
【００７０】
工程（２−Ｂ）
工程（２−Ｂ）では、ガイドＲＮＡ発現ユニットの連結する順番を決定して、カセット全体を設計する。すなわち、例えば図５上段に示されるように作製目標のカセットをこの段階で設計する。設計されたカセットは、プロモーター、標的配列およびガイドＲＮＡがシームレスに連結したものとすることができる（すなわち、組換えに用いる制限酵素認識部位は発現ユニット中に含まれていなくてもよい）。また、ガイドＲＮＡ発現ユニット間の連結部も、自由に設計することができ、制限酵素切断部位は含まれていなくてもよく、例えば、ガイドＲＮＡ発現ユニット間がシームレスに連結したものとしてもよい。
【００７１】
工程（２−Ｃ’）
工程（２−Ｃ’）は、標的配列間に介在する領域を含む核酸増幅断片を作製する工程である。具体的には、カセット内で隣り合うガイドＲＮＡ発現ユニット中の標的配列間をつなぐ配列を有する核酸増幅断片を準備し、その後、核酸増幅断片を当該ＩＩＳ型制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する断片を得る。ここで、核酸増幅断片は、標的配列間毎に異なる非対称粘着末端を生じる制限酵素切断部位をその両末端に有するものとする。また、制限酵素切断部位は、ＩＩＳ型制限酵素の切断部位とし、制限酵素の認識部位は、酵素処理後、除去されるように配置される。また、ＩＩＳ型制限酵素の切断部位は、標的配列の近傍の配列の一部からなる配列である（例えば、図５中段に示されるように、切断部位は、標的配列の一部を含んでいてもよい、プロモーター領域またはガイドＲＮＡ領域の一部の配列を有する）。また、ある核酸増幅断片中の制限酵素切断部位は、別の標的配列間をつなぐ核酸増幅断片中の制限酵素切断部位とは異なる配列を有するものとする（例えば、図５中段では、ＰＣＲ断片の末端は、１塩基ずつ切断部位が異なるものとなっている）。
【００７２】
工程（２−Ｃ’）では、核酸増幅断片は、以下(i)および(ii)を満たすように設計することができる：
(i)両末端に非対称粘着末端を生じるＩＩＳ型制限酵素の認識部位および付加塩基を該断片の末端に有し、該認識部位および付加塩基は、酵素処理により断片から除去されるように配置されており、切断後の断片はカセットに含まれない余分な塩基配列を含まず；かつ、
(ii)ＩＩＳ型制限酵素による切断後の非対称粘着末端を有する核酸増幅断片の一端は、ガイドＲＮＡの一部を欠失していても、標的配列の一部が付加されていてもよく、かつ、他端は、プロモーター領域の一部を欠失していても、標的配列の一部が付加されていてもよく、
前記欠失した領域の長さまたは付加された領域の長さを核酸増幅断片毎に相違させることにより、切断後に生じる非対称粘着末端いずれもが核酸増幅断片毎にそれぞれ異なる塩基配列を有する。ある態様では、工程（２−Ｃ’）では、すべての核酸増幅断片の一端は、ガイドＲＮＡの一部を欠失しており、他端は、プロモーター領域の一部を欠失している。
【００７３】
一般的には、工程（２−Ｃ’）は、鋳型としてガイドＲＮＡ配列およびプロモーター配列とがこの順番で連結した塩基配列を有する核酸を用いた核酸増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））とその後の制限酵素処理により行うことができる。例えば、核酸増幅反応は、プライマーペアは該プロモーター配列全体を増幅できるプライマーであり、ここで、例えば、フォワードプライマーとして、付加塩基、ＩＩＳ型酵素認識部位、ＩＩＳ型酵素切断部位およびガイドＲＮＡの開始部分をこの順番で含むオリゴＤＮＡを用い、リバースプライマーとして、５’側から付加塩基、ＩＩＳ型酵素認識部位、ＩＩＳ型酵素切断部位およびプロモーターの終結部分をこの順番で含むオリゴＤＮＡを用いることができる。
【００７４】
工程（２−Ｃ’）では、ＩＩＳ型制限酵素として、例えば、ＩＩＳ型制限酵素としては、ＢｓａＩまたはＢｓｍＢＩを用いることができる。工程（２−Ｃ’）では、すべての断片に共通した酵素を用いてもよいが、複数の酵素を用いてもよい。
【００７５】
工程（２−Ｄ’）
CRISPR-Cas9系では標的配列は２０塩基長程度なので、二本鎖ＤＮＡ断片はオリゴＤＮＡ合成技術によって得ることが可能である。第二の実施形態の方法の特徴の一つは、標的配列を二本鎖ＤＮＡ断片により供給することである。工程（２−Ｄ’）では、図５中段に示されるように標的配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片を得る工程である。二本鎖ＤＮＡ断片は、標的配列間をつなぐ断片とシームレスに連結させるため、工程（２−Ｃ’）で得られる断片の配列を補完するように設計することができる。現在のオリゴＤＮＡ合成技術では、３０塩基長程度のＤＮＡの合成は容易であるから、二本鎖ＤＮＡ断片は、二本の合成オリゴＤＮＡをアニールすることにより得ることができる。
【００７６】
工程（２−Ｄ’）では、二本鎖ＤＮＡ断片は、工程（２−Ｃ’）の条件(i)および(ii)を満たす断片において欠失したプロモーター領域およびガイドＲＮＡの欠失部分が末端に付加され、付加された標的配列の付加された部分が欠失した配列を有し、これにより工程（２−Ｃ’）の付加および欠失を補うことができる塩基配列、および、工程（２−Ｃ’）で得られる断片の非対称粘着末端と完全に相補的な非対称粘着末端の塩基配列を有するように設計され得る。
【００７７】
工程（２−Ｅ’）
工程（２−Ｅ’）では、工程（２−Ｃ’）および工程（２−Ｄ’）を繰り返して、全体としてカセット中のすべての標的配列間および標的配列をカバーする複数の核酸断片を得る。
【００７８】
工程（２−Ｆ’）
工程（２−Ｆ’）では、カセットが完成するように設計されたカセットの両末端の断片を得る。すなわち、工程（２−Ｆ’）は、カセット末端のプロモーター領域およびカセットの別の末端のガイドＲＮＡ領域を核酸増幅により得る工程である。
【００７９】
一般的には、カセット末端のプロモーター領域は、プロモーター領域の塩基配列を有する核酸を用いた核酸増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））とその後の制限酵素処理により得ることができる。例えば、核酸増幅反応では、プライマーペアは、該プロモーター配列全体を増幅できるプライマーであり、ここで、フォワードプライマーは、所望の制限酵素切断部位とプロモーター配列の開始部分とを含む塩基配列を有するオリゴＤＮＡであり得、リバースプライマーは、５’側から付加塩基、ＩＩＳ型酵素認識部位、ＩＩＳ型酵素切断部位およびプロモーターの終結部分をこの順番で含む塩基配列を有するオリゴＤＮＡであり得る。リバースプライマーの制限酵素切断部位の配列は、カセットの一番左の標的配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片とライゲーションできるように設計される。そして、プロモーター領域から標的配列中の制限酵素切断部位までの領域を含む核酸断片は、その後、切断部位に対応する制限酵素で得られた核酸断片を処理することができる。
【００８０】
また、一般的には、カセット末端のガイドＲＮＡ領域は、鋳型としてガイドＲＮＡ配列の塩基配列を有する核酸を用いた核酸増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））とその後の制限酵素処理により得ることができる。例えば、核酸増幅反応では、プライマーペアは該ガイドＲＮＡ領域を増幅できるプライマーであり、ここで、フォワードプライマーは、付加塩基、ＩＩＳ型制限酵素認識部位、ＩＩＳ型制限酵素切断部位およびガイドＲＮＡの開始部分を含む領域の塩基配列を有するオリゴＤＮＡであり得、リバースプライマーは、ガイドＲＮＡの終結部分、固有の非対称粘着末端を生じる制限酵素切断部位および付加塩基を含む塩基配列を有するオリゴＤＮＡであり得る。得られた核酸増幅産物は、その後、対応するＩＩＳ型制限酵素により処理されて、固有の非対称粘着末端を有する断片を生じる。
【００８１】
工程（２−Ｇ’）
工程（２−Ｇ’）は、上記で得られた断片をライゲーションしてカセットを形成させる工程である。カセットは、その後、ベクターに組み込まれてもよい。
【００８２】
工程（２−Ｃ’）において作製されるすべての核酸増幅断片の一端がガイドＲＮＡの一部を欠失し、かつ他端がプロモーター領域の一部を欠失した態様では、二本鎖ＤＮＡ断片により、当該欠失部分の配列と固有の領域の配列の全長とを補う。この態様では、ある特定の固有の領域の配列を変更したい場合には、二本鎖ＤＮＡ断片上で固有の領域の配列を変更したい配列に置き換えればよい。すなわち、この態様では、固有の領域の配列のみが異なるＤＮＡカセットを作製するためには、二本鎖ＤＮＡ断片の固有の領域の配列のみを変更すればよく、ＤＮＡカセットに含まれるいずれの核酸増幅断片も、同じものを用いることができる。すると、核酸増幅断片は、大量に作り置きしておくことが可能となる。核酸断片を対応する制限酵素で事前に処理しておけば、単に、二本鎖ＤＮＡ断片を都度合成して末端をリン酸化するだけで、固有の領域の配列のみが異なるＤＮＡカセットの作製が可能となる（図６参照）。これは、様々な多重連結ＤＮＡカセットを製造する上で有利である。
【００８３】
従って、本発明によれば、
複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるＤＮＡカセットを製造するための、複数の異なるＤＮＡ断片のセットであって、
各生物学的ユニットは、ユニット間で共通の第一の領域と第二の領域と、ユニットに固有の領域とを有し、かつ、第一の領域、固有の領域および第二の領域がこの順番で連結してなるユニットであり、
第二の領域と第一の領域とがこの順番で連結した各ＤＮＡ断片において、
両末端がそれぞれ独立して少なくとも１塩基欠失しており、
両末端は非対称粘着末端を有し、
非対称粘着末端の配列が、ＤＮＡ断片の末端毎に異なる、
ＤＮＡ断片
のセットが提供される。ある態様では、本発明のＤＮＡ断片のセットは、両末端がそれぞれ独立して、例えば、１塩基〜１００塩基、１塩基〜５０塩基、１塩基〜２０塩基、または１塩基〜１５塩基欠失していてもよい。
【００８４】
本発明によればまた、上記ＤＮＡ断片のセットを用いた、複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるＤＮＡカセットを製造する方法が提供される。例えば、
複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるＤＮＡカセットを製造する方法であって、
各生物学的ユニットは、ユニット間で共通の第一の領域と第二の領域と、ユニットに固有の領域とを有し、かつ第一の領域、固有の領域および第二の領域がこの順番で連結してなるユニットであり、
方法は、インビトロの方法であり、
各生物学的ユニットの固有の領域の配列、第一の領域および第二の領域の配列を決定する工程と、
生物学的ユニットが連結する順番を決定し、ＤＮＡカセット全体を設計する工程と、
ＤＮＡ断片のセットを提供または作製することと、
ここで、ＤＮＡ断片は、
第二の領域と第一の領域とがこの順番で連結した各ＤＮＡ断片において、
両末端がそれぞれ独立して少なくとも１塩基欠失しており、
両末端は非対称粘着末端を有し、
非対称粘着末端の配列が、ＤＮＡ断片の末端毎に異なる、
ＤＮＡ断片であり、
ＤＮＡカセットにおける、各ＤＮＡ断片の位置を決定することと、
隣り合う２つのＤＮＡ断片をシームレスに連結する配列を有し、かつ固有の領域の配列を有する二本鎖ＤＮＡを得ることと、
上記ＤＮＡ断片のセットと、上記二本鎖ＤＮＡとをライゲーションして上記ＤＮＡカセットを得ることと、
を含む方法が提供される。ある態様では、本発明のＤＮＡ断片のセットは、両末端がそれぞれ独立して、例えば、１塩基〜１００塩基、１塩基〜５０塩基、１塩基〜２０塩基、または１塩基〜１５塩基欠失していてもよい。
【００８５】
第二の実施形態は、
複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるＤＮＡカセットをインビトロで製造する方法であって、
各ユニットは、ユニット間で共通の第一の領域と第二の領域と、ユニットに固有の領域とを有し、第一の領域、固有の領域および第二の領域がこの順番で連結してなるユニットであり、
工程としては、
（２−Ａ）各発現ユニットに固有の標的配列を設計して、それぞれ異なる標的配列を有する各ガイドＲＮＡ発現ユニットを設計することと、
（２−Ｂ）ガイドＲＮＡ発現ユニットの連結する順番を決定して、カセット全体を設計することと、
（２−Ｃ）核酸断片および二本鎖ＤＮＡ断片であって、用いるＩＩＳ型制限酵素による切断面の形状を有し、かつ、切断面の塩基配列が切断面毎に異なる、核酸断片および二本鎖ＤＮＡ断片をカセット全体をカバーするように設計することと、ここで、二本鎖ＤＮＡ断片は、ユニットに固有の領域の一部または全部の塩基配列を含んでなる塩基配列を有し、（２−Ｄ）上記工程（２−Ｃ）で設計された配列を有する核酸断片および二本鎖ＤＮＡ断片のすべてを得ることと、
（２−Ｅ）カセットが完成するように設計されたカセットの両末端の断片を得ることと、
（２−Ｆ）得られた核酸断片および二本鎖ＤＮＡ断片をライゲーションして、カセットを得ることと
を含んでなる、方法ということができる。この方法は、カセット中で隣り合う２つの固有領域に介在するユニット間で共通の領域鋳型を用いて得た核酸増幅断片を組換えユニットとして用い、核酸増幅断片同士を、各ユニットに固有の領域の少なくとも一部の塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡ断片により連結する、方法である。
【００８６】
以下、第二の実施形態において、制限酵素としてＢｓａＩを用いたときの組換えについて詳細に説明する。特に下記では、組換え部分の形成方法を主に説明する。
【００８７】
まず、工程（２−Ａ）および（２−Ｂ）により、カセット全体の配列を設計する。カセット内における作製目標とする第一の標的配列の近傍の塩基配列は下記の通りである。
【００８８】
【化４】
0006529110.tif 000005
Ｈ１プロモーターの終結部の１０塩基、第一の標的配列（２０塩基長）およびガイドＲＮＡの開始部の１０塩基が示され、各塩基に対して説明のための番号が付されている。また、下線で示された４塩基（１２３４）は、組換えに用いられる塩基である。ここで、組換えに用いられる塩基は、標的配列中の塩基であってもよい。
【００８９】
上記式では、組換えに用いられる塩基は、４塩基長として記載されているが、工程（２−Ｃ）で用いるＩＩＳ型制限酵素により生じる切断末端の形状に合わせて設計する必要がある。特に限定されないが、ＩＩＳ型制限酵素の切断面の突出末端は、３塩基突出または４塩基突出であり得る。例えば、以下で用いる制限酵素ＢｓａＩは、二本鎖ＤＮＡを切断して
【化５】
0006529110.tif 000006
４塩基突出の非対称粘着末端を生じる。従って、工程（２−Ｃ）および（２−Ｃ’）では、４塩基突出となるように切断面を設計することができる。切断面の塩基配列は、組換えに用いる配列であるから、切断面毎に異なる配列になるように選択する必要がある。
【００９０】
従って、工程（２−Ｃ）および（２−Ｃ’）では、下記式のように、標的配列周辺の断片を設計することができる。
【化６】
0006529110.tif 000007
【００９１】
ここで、切断面は、用いるＩＩＳ型制限酵素の切断面と同じ形状を有するように設計する。また、上記ＰＣＲ断片（「核酸断片」ともいう）と、標的合成ＤＮＡ（「二本鎖ＤＮＡ断片」ともいう）との切断面は、配列が異なる。
【００９２】
次に、上記式中の４塩基（１２３４）が非対称粘着末端となるよう、核酸増幅反応および増幅産物の制限酵素処理を行う。このような非対称粘着末端を、核酸増幅反応および増幅産物のＩＩＳ型制限酵素処理により得る方法は当業者に周知である。下記式では、工程（２−Ｃ）および（２−Ｃ’）におけるプライマーの作成方法を説明する。下記では、ＩＩＳ型制限酵素であるＢｓａＩを用いる例を説明する。
【００９３】
【化７】
0006529110.tif 000008
【００９４】
フォワードプライマーは、付加塩基（式中「ｇｃｇ」で表される）、ＢｓａＩ認識配列（式中「ｇｇｔｃｔｃ」で表される）、スペーサー（式中「ｇ」で表され、切断面を１２３４に設定するために必要であり、下段のテンプレートに相補的な配列が好ましい）、ガイドＲＮＡの開始部分を含むプライマーとする。本明細書では、「制限酵素の切断部位」とは、これに反する記載がない限り、スペーサーを含む部位を意味し、４塩基（１２３４）は、制限酵素の「切断面」という。スペーサーの配列は任意の塩基であり得るが、鋳型ＤＮＡと相補的な塩基であることが好ましい。本明細書では、「切断部位」は、特段の断りの無い限り、スペーサーを含み、「切断面」は、スペーサーを含まない。
【００９５】
リバースプライマーは、別の断片を増幅するものが図示されているので、これについて説明するが、付加塩基、ＢｓａＩ認識配列、スペーサー（下段のテンプレートと相補的な配列が例示されている）、およびプロモーターの終結部の配列を有するプライマーとなる。
【００９６】
上記プライマーを用いてそれぞれの断片をＰＣＲで増幅すると、下記式のような末端を有するＰＣＲ断片が得られる。
【化８】
0006529110.tif 000009
【００９７】
上記断片をＢｓａＩで処理すると、下記式のように断片の末端の配列が除去され、１２３４の番号が付された非対称粘着末端（または切断面）が生じる。
【化９】
0006529110.tif 000010
【００９８】
上記断片には、Ｈ１プロモーターの５６７８９０の配列が欠失している点に注意が必要である。このように、本発明では、このようにプロモーターの一部が欠失した断片を作製してもよい。あるいは、ガイドＲＮＡも同じように開始部分を欠失してもよい。
【００９９】
欠失した部分は二本鎖ＤＮＡ断片により補う。下記式は、上記核酸増幅断片における欠失や付加を補う二本鎖ＤＮＡ断片の塩基配列を示す。二本鎖ＤＮＡ断片は、ＰＣＲ断片上で切断面１２３４と相補的な塩基配列を有する。二本鎖ＤＮＡ断片は、二本鎖オリゴＤＮＡであり得、二本の合成オリゴＤＮＡをアニールすることにより得てもよい。
【０１００】
【化１０】
0006529110.tif 000011
【０１０１】
得られた断片を並べると下記式のようになる。
【０１０２】
【化１１】
0006529110.tif 000012
【０１０３】
これをライゲーションすると、下記式のように、プロモーター、標的配列およびガイドＲＮＡがシームレスに連結した目的産物を得ることができる。
【化１２】
0006529110.tif 000013
【０１０４】
以下では、第二の実施形態において、第二の標的配列を組み込む方法を説明する。
【０１０５】
まず、作製目標とするカセット中の第二の標的配列の近傍は下記の通りである。
【化１３】
0006529110.tif 000014
プロモーターの終結部の１０塩基、第二の標的配列（２０塩基長）およびガイドＲＮＡの開始部の１０塩基が示され、説明のための番号が付されている。また、下線で示された４塩基は、組換えに用いられる塩基であり、第一の標的配列を導入する際に用いた４塩基とは異なる。
【０１０６】
上記式中「３４５６」が非対称粘着末端となるよう、ＰＣＲおよび制限酵素処理を行う。第一の標的配列では、非対称粘着末端が「１２３４」であり、第二の標的配列での切断面「３４５６」と異なる。上記式では、便宜上、標的配列の両側が「３４５６」になっているが、配列が異なる限り、一方は、「１２３４」以外の他の配列、例えば「４５６７」でもよい。
【０１０７】
すなわち、第二の実施形態によれば、標的配列の両側がユニットによらず全く同一の配列を有する場合であっても、切断面の位置をずらすことにより切断面の塩基配列を相違させることができ、組換えユニットに固有の切断面を持たせることが可能となる。
【０１０８】
ある態様では、作製する二本鎖ＤＮＡ断片の長さが標的配列によらず一定である。作製する二本鎖ＤＮＡ断片の長さが標的配列によらず一定であると、設計が簡単であるという利点がある。従って、標的配列をはさむ２つの制限酵素切断部位の距離が一定（例えば、２０〜３５塩基長）となるようにカセット上で制限酵素切断部位を設計することができる。
【０１０９】
上記式中「３４５６」が非対称粘着末端となるよう、核酸増幅反応および増幅産物の制限酵素処理を行う。下記式では、工程（２−Ｃ）および（２−Ｃ’）におけるプライマーの作成方法を説明する。
【０１１０】
【化１４】
0006529110.tif 000015
【０１１１】
フォワードプライマーは、付加塩基（式中「ｇｃｇ」で表される）、ＢｓａＩ認識配列（式中「ｇｇｔｃｔｃ」で表される）、スペーサー（式中「ｇ」で表され、切断面を３４５６に設定するために必要であり、下段のテンプレートに相補的な配列が好ましい）、切断面３４５６から開始するガイドＲＮＡの一部を含むプライマーとする。
【０１１２】
リバースプライマーは、別の断片を増幅するものについて説明するが、付加塩基、ＢｓａＩ認識配列、スペーサー（下段のテンプレートと相補的な配列が例示されている）、および切断面３４５６で終わるプロモーターの終結部の一部の配列を有するプライマーとなる。
【０１１３】
上記プライマーを用いてそれぞれの断片を増幅すると、下記式のような末端を有するＰＣＲ断片が得られる。
【０１１４】
【化１５】
0006529110.tif 000016
【０１１５】
上記断片をＢｓａＩで処理すると、下記式のように断片の末端の配列が除去され、３４５６の番号が付された非対称粘着末端が生じる。下記断片では、Ｈ１側ＰＣＲ断片は、Ｈ１プロモーターの一部（具体的には７８９０）が欠失しており、ガイドＲＮＡもその一部（具体的には１２）を欠失している。
【０１１６】
【化１６】
0006529110.tif 000017
【０１１７】
そして、下記式のように、欠失した部分（プロモーターの７８９０およびガイドＲＮＡの１２）を二本鎖ＤＮＡ断片により補う。二本鎖ＤＮＡ断片は、ＰＣＲ断片上で３４５６で示される配列と相補的な配列を有する。
【０１１８】
【化１７】
0006529110.tif 000018
【０１１９】
得られた断片を並べると下記式のようになる。下記式からわかるように、工程（２−Ｃ）および（２−Ｄ’）で作製される二本鎖ＤＮＡ断片（式中では、標的合成ＤＮＡと記載されている）は、工程（２−Ｃ）または（２−Ｃ’）において欠失した部分（プロモーターの７８９０およびガイドＲＮＡの１２）を有し、当該欠失した部分が完全に補われている。
【０１２０】
【化１８】
0006529110.tif 000019
【０１２１】
これをライゲーションすると、下記式のように、プロモーター、標的配列およびガイドＲＮＡがシームレスに連結した目的産物を得ることができる。
【０１２２】
第一の標的配列のライゲーション部位の配列と第二の標的配列のライゲーション部位の配列とが異なることにより、ライゲーションでは、２つの部位のライゲーションを同一溶液中で同時に行っても、正しい箇所に正しい順序で正しい方向でのみライゲーションが進み、作製目標となるカセットが効率よく得られる。
【０１２３】
上記のように、工程（２−Ｃ）または（２−Ｄ’）で作製する二本鎖ＤＮＡ断片の長さを標的配列によらず一定とすると、設計したカセットの塩基配列上で組換え箇所を平行移動するだけで各標的配列の組換え部位を設計できるため、設計が簡単であるという利点がある。
【０１２４】
第二の実施形態の変形例
第二の実施形態の変形例を図７により説明する。第二の実施形態の変形例は、第二の実施形態の方法の工程をすべて実施した後に、
（２−Ｈ）得られた複数のカセットをさらに連結する工程
を実施する。
【０１２５】
例えば、図７に示されるように、末端に相補的な非対称粘着末端を生じる制限酵素切断部位（図７下段では「＃」記号で示される）を有する２つのカセットを準備する。２つのカセットを対応する制限酵素で処理して非対称粘着末端を有するカセットを作製し、その後、断片をライゲーションして、図７上段に示される、より多くのユニットを含むカセットを作製することができる。制限酵素としては、非対称粘着末端を生じる酵素であればいずれの酵素を用いてもよく、最終産物であるカセット中に制限酵素切断部位（例えば、図７上段の「＃」記号）が残ってもよい。
【０１２６】
得られたカセットは、その両端に別の固有の非対称粘着末端を生じる制限酵素切断部位（図７上段の「＄」記号および「￥」記号）を有していてもよく、生じる非対称粘着末端を用いてベクターなどに組み込んでもよい。
【０１２７】
第二の実施形態では、二本鎖ＤＮＡ断片をライゲーションする必要がある点で、ライゲーションする箇所が第一の実施形態の２倍存在する。そのため、カセットが得られる効率が一般的には低くなると思われるが、変形例では、作製目標のカセットを前半と後半の２つに分割して作成すれば、ライゲーションする箇所を半分に減らすことができ、カセットが得られる効率の低下も防げると考えられる。
【０１２８】
第三の実施形態
以下、第三の実施形態の方法を図８〜１１により説明する。
【０１２９】
第三の実施形態は、標的配列中に組換え箇所を設計すること、組換えは、ＩＩＳ型制限酵素を用いることを特徴とし、標的配列内で配列がシームレスに連結して完全な標的配列およびカセットを形成することができる。
【０１３０】
第三の実施形態の方法は、
複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるＤＮＡカセットをインビトロで製造する方法であって、
各ユニットは、ユニット間で共通の第一の領域と第二の領域と、ユニットに固有の領域とを有し、第一の領域、固有の領域および第二の領域がこの順番で連結してなるユニットであり、
組換え部位が、固有の領域中に存在し、
以下の工程：
（３−Ａ）各発現ユニットに固有の標的配列を設計して、それぞれ異なる標的配列を有する各ガイドＲＮＡ発現ユニットを設計することと、
（３−Ｂ）ガイドＲＮＡ発現ユニットの連結する順番を決定して、カセット全体を設計することと、
（３−Ｃ）用いるＩＩＳ型制限酵素による切断面の形状を有し、かつ、切断面の塩基配列が切断面毎に異なる、核酸断片をカセット全体をカバーするように設計することと、
（３−Ｄ）工程（３−Ｃ）で設計された核酸断片のすべてを得ることと、
（３−Ｅ）カセットが完成するように設計されたカセットの両末端の断片を得ることと、
（３−Ｆ）工程（３−Ｃ）、（３−Ｄ）および（３−Ｅ）で得られた断片をライゲーションし、これにより、得られた断片をシームレスに連結して工程（３−Ｂ）で設計したカセットを形成させることと、
を含んでなる。
【０１３１】
以下、工程ごとに説明する。
【０１３２】
工程（３−Ａ）
工程（３−Ａ）では、標的配列は任意に設計することができる。例えば、オフターゲット減少の観点では、標的となる対象生物においてユニークな配列を選択することができる。
【０１３３】
工程（３−Ｂ）
工程（３−Ｂ）では、ガイドＲＮＡ発現ユニットの連結する順番を決定して、カセット全体を設計する。すなわち、図８〜１１のそれぞれ上段に示されるように作製目標のカセットをこの段階で設計する。設計されたカセットには、組換えに用いる制限酵素切断部位は含まれていなくてもよく、プロモーター、標的配列およびガイドＲＮＡがシームレスに連結したものとすることができる。また、ガイドＲＮＡ発現ユニット間の連結部も、自由に設計することができ、制限酵素切断部位は含まれていなくてもよく、例えば、ガイドＲＮＡ発現ユニット間がシームレスに連結したものとしてもよい。
【０１３４】
工程（３−Ｃ）
工程（３−Ｃ）は、図８〜１１の２段目に示されるＩＩＳ型制限酵素で生じ得る非対称粘着末端を有する核酸断片を設計する工程である。核酸断片は、用いるＩＩＳ型制限酵素の切断面の形状に対応する形状を有している。
【０１３５】
図８〜１１の３段目には、工程（３−Ｃ）の断片を得るための核酸増幅断片の末端の構造の一例が示されている。図８では、標的配列１を形成するための末端の構造が示され、図９では、標的配列２を形成するための末端の構造が示され、図１０では、標的配列３を形成するための末端の構造が示され、図１１では、標的配列４を形成するための末端の構造が示されている。
【０１３６】
例えば、図８を用いて説明すると、標的配列１は、図８の２段目に示されるように、２つの核酸増幅断片をライゲーションして得られ、配列の一部がライゲーションに用いられている。また、図８の２段目に示されるそれぞれの末端は、図８の３段目に示される末端構造から得られる。具体的には、図８の３段目に示される末端は、端から付加塩基（Ｘ2〜4で示される）、ＢｓａＩの認識配列（点線の四角で囲まれた塩基）、任意の塩基配列（Ｘ１で示される）、およびＢｓａＩの切断配列（Ｎ1〜4で示される）からなる。図８の３段目に示されるこの末端は、ＢｓａＩにより切断すると、図８の２段目に示される末端を生じ、切断や組換えに用いた配列が切断後に除去され、その結果、設計した配列と同一の配列を有する標的配列を得ることができる。
【０１３７】
工程（３−Ｄ）
工程（３−Ｄ）では、工程（３−Ｃ）で設計されたすべての断片を得る。得られた断片は、対応するＩＩＳ型酵素で切断されている。
【０１３８】
一般的には、工程（３−Ｃ）で設計された断片は、鋳型としてガイドＲＮＡ配列およびプロモーター配列とがこの順番で連結した塩基配列を有する核酸を用いた核酸増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））とその後の制限酵素処理により行うことができる。例えば、核酸増幅反応では、プライマーペアは該ガイドＲＮＡ配列およびプロモーター配列全体を増幅できるプライマーであり、ここで、例えば、フォワードプライマーとして、付加塩基、ＩＩＳ型制限酵素の認識部位、必要に応じて存在させるスペーサー、ＩＩＳ型酵素の切断部位および標的配列のｇＲＮＡ側の配列、並びに、ガイドＲＮＡの開始部分の一部を含むオリゴＤＮＡを用い、リバースプライマーとして、付加塩基、ＩＩＳ型制限酵素の認識部位、必要に応じて存在させるスペーサー、ＩＩＳ型酵素の切断部位およびプロモーター領域の終結部分の一部を含むオリゴＤＮＡを用いることができる。得られた核酸増幅断片は、対応するＩＩＳ型酵素で切断して、工程（２−Ｃ）で設計した断片を得る。
【０１３９】
工程（３−Ｄ）では、ＩＩＳ型制限酵素として、例えば、ＩＩＳ型制限酵素としては、ＢｓａＩまたはＢｓｍＢＩを用いることができる。工程（３−Ｄ）では、すべての断片に共通した酵素を用いてもよいが、複数の酵素を用いてもよい。
【０１４０】
工程（３−Ｅ）
工程（３−Ｅ）は、カセットの両末端の断片を得る工程である。すなわち、カセットのプロモーター側の末端から最初の標的配列の一部までを含む断片、およびカセットの最後の標的配列の一部からガイドＲＮＡ側の末端までを含む断片を得る。
【０１４１】
一般的には、カセット末端のプロモーター領域は、プロモーター領域の塩基配列を有する核酸を用いた核酸増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））とその後の制限酵素処理により行うことができる。例えば、核酸増幅反応では、プライマーペアは、該プロモーター配列全体を増幅できるプライマーであり、ここで、フォワードプライマーは、所望の制限酵素切断部位とプロモーター配列の開始部分とを含む塩基配列を有するオリゴＤＮＡであり得、リバースプライマーは、付加塩基、ＩＩＳ型制限酵素認識部位、ＩＩＳ型制限酵素切断部位およびプロモーター配列の終結部分を含む塩基配列を有するオリゴＤＮＡであり得る。リバースプライマーの制限酵素切断部位の配列は、ガイドＲＮＡ側の断片の切断面の配列と相補的であり、ライゲーションにより一つの完成した標的配列を形成する配列とする。そして、プロモーター領域から標的配列中の制限酵素切断部位までの領域を含む核酸断片は、その後、切断部位に対応する制限酵素で得られた核酸断片を処理することができる。
【０１４２】
また、一般的には、カセット末端のガイドＲＮＡ領域は、鋳型としてガイドＲＮＡ配列の塩基配列を有する核酸を用いた核酸増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））とその後の制限酵素処理により行うことができる。例えば、核酸増幅反応では、プライマーペアは該ガイドＲＮＡ領域を増幅できるプライマーであり、ここで、フォワードプライマーは、付加塩基、ＩＩＳ型制限酵素認識部位、ＩＩＳ型制限酵素切断部位およびガイドＲＮＡの開始部分を含む領域の塩基配列を有するオリゴＤＮＡであり得、リバースプライマーは、付加塩基、固有の非対称粘着末端を生じる制限酵素切断部位およびガイドＲＮＡの終結部分を含む塩基配列を有するオリゴＤＮＡであり得る。フォワードプライマーの制限酵素切断部位の配列は、最後の標的配列のプロモーター側の断片の切断面の配列と相補的であり、ライゲーションにより一つの完成した標的配列を形成する配列とする。得られた核酸増幅産物は、その後、対応するＩＩＳ型制限酵素により処理されて、固有の非対称粘着末端を有する断片を生じる。
【０１４３】
工程（３−Ｆ）
工程（３−Ｆ）は、上記で得られた断片をライゲーションして得られた断片がシームレスに連結したカセットを得る工程である。カセットは、その後、ベクターに組み込まれてもよい。
【０１４４】
以上で各工程の説明を終える。以下、制限酵素としてＢｓａＩを用いたときの組換えについて詳細に説明する。特に下記では、組換え部分の形成方法を主に説明する。
【０１４５】
まず、作製目標とするカセット中の第一の標的配列の近傍は下記の通りである。
【０１４６】
【化１９】
0006529110.tif 000020
式中、ＮＮＮＮは、標的配列中の任意の配列である。標的配列毎に異なっている限り、自由に選択数することができる。
【０１４７】
これに対して、工程（３−Ｃ）では以下のようにプライマーを作製する。
【０１４８】
【化２０】
0006529110.tif 000021
ここで、ｎは任意の塩基であり、好ましくは、鋳型ＤＮＡと相補的な塩基である。下線が制限酵素ＢｓａＩの認識部位であり、ＮＮＮＮがＢｓａＩの切断部位となる。
【０１４９】
このようなプライマーを用いてＰＣＲを行い得られる断片は下記式に示される。
【０１５０】
【化２１】
0006529110.tif 000022
【０１５１】
上記核酸増幅断片を対応する制限酵素（ＢｓａＩ）で切断すると下記式の断片が得られる。
【０１５２】
【化２２】
0006529110.tif 000023
【０１５３】
その後、制限酵素認識部位が除去された核酸増幅断片をライゲーションして、下記式のような目的産物を得る。
【０１５４】
【化２３】
0006529110.tif 000024
【０１５５】
第一、第二および第三の実施形態を比較すると、第一の実施形態は、制限酵素切断部位を含む箇所を標的配列に設定するという特徴と、ライゲーション箇所が少ないという特徴を有すると言える。第二の実施形態は、標的配列の自由度が高いという特徴と、標的配列を二本鎖ＤＮＡ断片により補うことからライゲーション箇所が多いという特徴を有すると言える。第三の実施形態は、標的配列の自由度が高いという特徴と、ライゲーション箇所が少ないという特徴と、核酸増幅に用いるプライマーが長いという特徴がある。第二の実施形態は、変形例として紹介した方法を用いれば、ライゲーション箇所の増加を抑えることができて有利である。
【０１５６】
それぞれ利点と欠点があり、その目的に応じて適切な実施形態を選択することができよう。
【０１５７】
なお、本発明の製造方法では、第一、第二、および第三の実施形態のいずれにおいても、制限酵素認識部位は、第一の領域および第二の領域のいずれにも存在しない部位を用いることが好ましい。また、第一、第二、および第三の実施形態のいずれにおいても、標的配列は、ＮＧＧ配列の上流配列から選択することができる。
【実施例】
【０１５８】
以下実施例は、本発明を説明するために単に例示されるものであって、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１５９】
実施例１： 鋳型プラズミドの調製
第一の実施形態および第二の実施形態の実施では、H1プロモーターを持つpBSsk-gRNAH1p、第三の実施形態の実施では、U6プロモーターを持つpBSsk-gRNAU6pを用いた。両者でガイドRNA配列は共通である。
【０１６０】
ガイドRNA配列はCMV-hspCas9-H1-gRNA linearized SmartNuclaese Kit（販売元フナコシ、SBI社 #CAS940A-1）を鋳型として以下のプライマーを用いてPCRを行い、KpnIとEcoRIを末端に持つDNA断片として調製した。PCRの反応条件はタカラバイオ社のプロトコールに従った（94℃1分の後、98℃30秒、60℃15秒、68℃30秒で30サイクル、その後72℃4分）。Forward primer: 5’-GCGGGTACCGGTC TCGGT TTTAG AGCTA GAAAT AGCAAG-3’（下線はKpnI）。Reverse Primer: 5’-CGCGAATTCA AAAAA AGCAC CGACT CGGTG CCACT TTTTC-3’（下線はEcoRI）。
【０１６１】
H1プロモーター配列は同じ鋳型DNAを用いて以下のプライマーを用いてPCRを行い、EcoRIとBamHIを末端に持つDNA断片として調製した。Forward primer: 5'-GCGGAATTC GAA CGCTG ACGTC ATCAA CCCGC TCCAA GGAAT C-3'（下線はEcoRI）、 Reverse Primer: 5'-GCGGGATCC C CCGGT GGTCT CATAC AGAAC TTATA AGATT C-3' (下線はBamHI)。上記ガイトRNA配列断片をKpnIおよびEcoRI、H1プロモーター断片をEcoRIおよびBamHIで切断し、また一般的に用いているpBluescript-SKプラズミドをKpnIおよびBamHIで切断し、リガーゼで結合させることによりpBSsk-gRNAH1pを得た（配列番号１）。pBSsk-gRNAH1pのクローニングサイト（KpnI〜BamHI間）は、以下のような構造を有する。
【化２４】
0006529110.tif 000025
【０１６２】
U6プロモーターは、U6プロモーターおよびCas9遺伝子を持つpX330プラズミド（Addgene社、Zhang Lab plasmid、ID 42230）を鋳型として以下のプライマーを用いてPCRを行い、EcoRIとBamHIを末端に持つDNA断片として調製した。Forward primer: 5’-GCGGAATTC AAGGT CGGGC AGGAA GAGGG CCTAT TTC-3’（下線はEcoRI）、 Reverse Primer: 5’-GCG GGATCC TCGTC CTTTC CACAA GATAT ATAAA G-3’(下線はBamHI)。このU6プロモーターPCR断片をEcoRIとBamHIで切断し、また上記pBSsk-gRNAH1pプラズミドをEcoRIとBamHIで切断してH1プロモーターを除去してライゲーションすることにより、H1プロモーターとU6プロモーターを入れかえたpBSsk-gRNAU6pを得た（配列番号２）。pBSsk-gRNAU6pのクローニングサイト（KpnI〜BamHI間）は、以下のような構造を有する。
【化２５】
0006529110.tif 000026
【０１６３】
実施例２：異なる標的配列発現ユニットを４個持つDNAの作製
本実施例では、第一の実施形態の一例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の異なる標的配列発現ユニットを４個持つDNAの作製例を示す。
【０１６４】
４つの発現ユニット（すなわち５つの組換えユニット）が連結したＤＮＡカセットの構造は以下の通りである。
【化２６】
0006529110.tif 000027
｛ここで、targetは標的配列を示し、H1はＨ１プロモーターを示し、gRはガイドＲＮＡを示し、unitは、組換えユニットを示し、*は、ＤＮＡの末端を示す。｝
【０１６５】
標的遺伝子を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とし、標的配列１〜４はそれぞれ、BsgI、FokI、BtsIおよびAvaIIによる非対称切断端を生じ、かつ、ＮＧＧ配列の上流２０塩基である配列から選択した。
【０１６６】
次に、５つの組換えユニットを実施例１で作製したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより作製した。第１の組換えユニットは、配列番号３のフォワードプライマーと配列番号４のリバースプライマーを用いてＰＣＲすることにより作製し、第２の組換えユニットは、配列番号５のフォワードプライマーと配列番号６のリバースプライマーを用いてＰＣＲすることにより作製し、第３の組換えユニットは、配列番号７のフォワードプライマーと配列番号８のリバースプライマーを用いてＰＣＲすることにより作製し、第４の組換えユニットは、配列番号９のフォワードプライマーと配列番号１０のリバースプライマーを用いてＰＣＲすることにより作製し、第５の組換えユニットは、配列番号１１のフォワードプライマーと配列番号１２のリバースプライマーを用いてＰＣＲすることにより作製した。
【０１６７】
得られた断片を対応する制限酵素により処理した。ライゲーション前の連結部分の構造は以下の通りである。
【化２７】
0006529110.tif 000028
【化２８】
0006529110.tif 000029
【化２９】
0006529110.tif 000030
【化３０】
0006529110.tif 000031
【０１６８】
得られた各断片のアガロース電気泳動の写真を図１２に示す。
【０１６９】
上記で制限酵素処理した５つの断片を混合し、フェノール・クロロホルム処理を行った後に、ゲル濾過カラム（Merck Millipore社製、Amicon Ultra-0.5mL Centrifugal Filters）により、ＰＣＲ反応のために添加したｄＮＴＰなどを除去し、５断片の混合溶液を得た。Ｔ４リガーゼおよび反応バッファーを加え最終容量１０μＬで１６時間ライゲーションを行った。そして得られたＤＮＡ産物を１６時間電気泳動（１％アガロース、ＴＡＥバッファー）を行った。
【０１７０】
結果は、図１３に示される通りであった。
【０１７１】
図１３Ａに示されるように、４つの発現ユニットが結合した目的のＤＮＡ断片（１．４ｋｂ、囲みで示す）の生成が認められた。また、目的のＤＮＡ断片以外に非対称切断末端が非特異的にライゲーションしたために生じたと考えられる多数のバンドが認められた。
【０１７２】
次に、目的の４つの発現ユニットが連結したＤＮＡ断片を含むアガロース片を切り出してＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡ断片を配列番号１３に示されるフォワードプライマーおよび配列番号１４に示されるリバースプライマーにより増幅して、全長ＤＮＡを得た。配列番号１３に示されるフォワードプライマーおよび配列番号１４に示されるリバースプライマーは、鋳型ＤＮＡと４〜５塩基のみ相同な配列を有する２０塩基のプライマーである。増幅されたＤＮＡは、図１３Ｂに示されるように、４つの発現ユニットが連結したＤＮＡ断片が特異的に増幅された。
【０１７３】
さらに、増幅して得られた４ユニット結合断片をクローン化するために、コスミドカセットpAxcwit2(タカラバイオ社)の右端近傍にSwaIクローン化部位を持つコスミド（Kanegae他、Nucl. Acids Res., 39:e7, 2011）のSwaI部位をClaIおよびI-PpoI部位に改変したpAxcw4icit2を作製した。このコスミドカセットをI-PpoIで切断しKlenow酵素により末端を平滑化した後ClaIで切断した。一方4ユニット結合断片の5'末端はプライマーに由来するClaI部位を、3'末端はプライマーに由来するPmeI部位をClaIおよびPmeIで切断し(PmeIは平滑末端を生じI-PpoIを平滑化した末端と結合できる)、DNA断片とライゲーションを行った。このDNAをラムダin vitroパッケージングキット（ラムダ イン、ニッポンジーン社）でパッケージング後、一般的に使われている大腸菌ＤＨ５αに導入することにより、4ユニット結合断片をもつコスミドを得た。またpAxcw4icit2のクローン化部位より上流または下流、および標的20塩基と同じ20塩基のプライマーを合成し、これを用いて隣接するユニットの塩基配列を決定し、４ユニットの標的DNAが計画通りクローン化されていることを確認した。
【０１７４】
実施例３：異なる標的配列ユニットを３つ有するＤＮＡの作製
本実施例では、第二の実施形態の一例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の異なる標的配列発現ユニットを３個持つＤＮＡの作製例を示す。
【０１７５】
３つの発現ユニット（すなわち４つの組換えユニットおよび３つの標的合成ＤＮＡ）が連結したＤＮＡカセットの構造は以下の通りである。
【化３１】
0006529110.tif 000032
｛ここで、targetは標的配列を示し、H1はＨ１プロモーターを示し、gRはガイドＲＮＡを示し、unitは、組換えユニットを示す。｝
【０１７６】
本実施例では、各組換えユニット間に標的配列２０塩基の少なくとも一部または全部を含む合成二本鎖ＤＮＡを組み込む、第二の実施形態の方法により、多重連結カセットを得る。
【０１７７】
標的遺伝子は、実施例２同様にＧＦＰ遺伝子とし、遺伝子内の異なる２０塩基を標的配列として選択した。
【０１７８】
合成二本鎖ＤＮＡの組み込み箇所の配列は以下の通りとした。
【化３２】
0006529110.tif 000033
【化３３】
0006529110.tif 000034
【化３４】
0006529110.tif 000035
【０１７９】
本実施例では、ライゲーションに用いる配列をユニットごとに２塩基ずつずらし、かつ、標的配列の前後がシームレスに連結するように合成ＤＮＡと各組換えユニットのＰＣＲ増幅用プライマーを設計した。用いたＰＣＲプライマーおよび標的合成ＤＮＡは、以下の通りである。第一の組換えユニットのフォワードプライマーは、配列番号１５のフォワードプライマーと配列番号１６のリバースプライマーを用いて作製し、第一の発現ユニットの標的配列は、配列番号１７のＤＮＡと配列番号１８のＤＮＡとをアニールして作製し、第二の組換えユニットのフォワードプライマーは、配列番号１９のフォワードプライマーと配列番号２０のリバースプライマーを用いて作製し、第二の発現ユニットの標的配列は、配列番号２１のＤＮＡと配列番号２２のＤＮＡとをアニールして作製し、第三の組換えユニットのフォワードプライマーは、配列番号２３のフォワードプライマーと配列番号２４のリバースプライマーを用いて作製し、第三の発現ユニットの標的配列は、配列番号２５のＤＮＡと配列番号２６のＤＮＡとをアニールして作製し、第四の組換えユニットのフォワードプライマーは、配列番号２７のフォワードプライマーと配列番号２８のリバースプライマーを用いて作製した。
【０１８０】
標的合成ＤＮＡは、二本鎖を構成するそれぞれのＤＮＡを混合し、ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs, ＃M0201S）と、反応バッファー（10mM Tris-HCL [pH7.5], 50mM NaCl, 10mM MgCl2, 1mM ATP）の下で３７℃で１時間反応させて、５’末端をリン酸化した。次いで、混合物を９５℃で１５分処理して酵素を熱失活させるとともに一本鎖ＤＮＡにした後、１００ｍＬのビーカーの８０℃の湯の中で室温に３時間放置してゆっくりと室温にすることで合成ＤＮＡのアニーリングを行った。
【０１８１】
作製した４つの組換え用のＰＣＲ断片と３つの標的合成ＤＮＡとを混合し、実施例２と同様に、フェノール・クロロホルム処理を行った後、ＰＣＲ反応の際に添加したデオキシヌクレオチドと制限酵素切断で生じたオリゴヌクレオチドをゲル濾過カラムで除去し、７断片の混合溶液を得た。Ｔ４リガーゼおよび反応バッファーを加え最終容量１０μＬで１６時間ライゲーションを行った。そして得られたＤＮＡ産物を１６時間電気泳動（１％アガロース、ＴＡＥバッファー）により分離した。
【０１８２】
結果は図１４Ａに示される通りであった。図１４Ａに示されるように、７つの断片が連結して生じた多重連結カセットが目的のＤＮＡ断片（1.1 kb、囲みで示す）として得られた。目的ＤＮＡ断片以外に非対称切断末端が非特異的にライゲーションしたために生じたと考えられる多数のバンドが見られたので、目的の３ユニット結合DNA断片を含むアガロースゲル片からDNAを抽出し、抽出されたＤＮＡ断片を配列番号１３に示されるフォワードプライマーおよび配列番号１４に示されるリバースプライマーにより増幅して、全長ＤＮＡを得た。すると、図１４Ｂに示されるように、３つの発現ユニットが連結したＤＮＡ断片が特異的に増幅された。
【０１８３】
さらに実施例２と同様にpAxcw4icit2にクローン化し３ユニット結合断片をもつコスミドを得た。
【０１８４】
実施例４：異なる標的配列ユニットを６つ有するＤＮＡの作製
本実施例では、第三の実施形態の一例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の異なる標的配列発現ユニットを３個持つＤＮＡの作製例を示す。
【０１８５】
６つの発現ユニット（すなわち７つの組換えユニット）が連結したＤＮＡカセットの構造は以下の通りである。
【化３５】
0006529110.tif 000036
｛ここで、targetは標的配列を示し、H1はＨ１プロモーターを示し、gRはガイドＲＮＡを示し、unitは、組換えユニットを示す。｝
【０１８６】
標的遺伝子はＢ型肝炎ウイルス遺伝子とし、該遺伝子内の異なる標的配列を組み込んだ６つの発現ユニットをもつ多重連結ＤＮＡを作成する。
【０１８７】
次に、７つの組換えユニットを実施例１で作製したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより作製した。第１の組換えユニットは、配列番号２９のフォワードプライマーと配列番号３０のリバースプライマーを用いてＰＣＲにより増幅して得て、第２の組換えユニットは、配列番号３１のフォワードプライマーと配列番号３２のリバースプライマーを用いてＰＣＲにより増幅して得て、第３の組換えユニットは、配列番号３３のフォワードプライマーと配列番号３４のリバースプライマーを用いてＰＣＲにより増幅して得て、第４の組換えユニットは、配列番号３５のフォワードプライマーと配列番号３６のリバースプライマーを用いてＰＣＲにより増幅して得て、第５の組換えユニットは、配列番号３７のフォワードプライマーと配列番号３８のリバースプライマーを用いてＰＣＲにより増幅して得て、第６の組換えユニットは、配列番号３９のフォワードプライマーと配列番号４０のリバースプライマーを用いてＰＣＲにより増幅して得て、第７の組換えユニットは、配列番号４１のフォワードプライマーと配列番号４２のリバースプライマーを用いてＰＣＲにより増幅して得た。
【０１８８】
得られた断片をＢｓａＩにより処理した。ライゲーション前の連結部分の構造は以下の通りであった。なお、プロモーターはＵ６プロモーターを用いた。大文字は標的配列を表す。囲み文字は標的配列内のライゲーションに用いる４塩基を示す。用いた標的配列の由来はＢ型肝炎ウイルスゲノムである。
【０１８９】
【化３６】
0006529110.tif 000037
【化３７】
0006529110.tif 000038
【化３８】
0006529110.tif 000039
【化３９】
0006529110.tif 000040
【化４０】
0006529110.tif 000041
【化４１】
0006529110.tif 000042
【０１９０】
上記７つの組換えユニットを混合し、PCRの時に添加したデオキシヌクレオチド、およびBsaI切断で生じたオリゴヌクレオチドを実施例３と同様にカラムで除去して、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿、ライゲーションを行った。そして得られたＤＮＡ産物を１６時間電気泳動した。
【０１９１】
すると、図１５Ａに示されるように、６つの発現ユニットが結合した目的のＤＮＡ断片（２．２ｋｂ、囲みで示す）の生成が認められた。また、目的のＤＮＡ断片以外に非対称切断末端が非特異的にライゲーションしたために生じたと考えられる多数のバンドが認められた。
【０１９２】
次に、目的の６つの発現ユニットが連結したＤＮＡ断片を含むアガロース片を切り出してＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡ断片を配列番号１３に示されるフォワードプライマーおよび配列番号４３に示されるリバースプライマーにより増幅したところ、図１５Ｂに示されるように、６つの発現ユニットが連結したＤＮＡ断片が特異的に増幅された。
【０１９３】
実施例２および３と同様にpAxcw4icit2にクローン化し、その後、各標的配列と同じ２０塩基長のプライマーを用いて全長をシーケンスしたところ、６つの発現ユニットが欠失なくコズミドにクローン化されていることが明らかとなった。
【０１９４】
このように、６つのユニットを連結したＤＮＡを欠失なくコズミドにクローン化することができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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