(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的検体を検出するためのバイオアッセイシステムであって、
アップコンバートナノ粒子と、
格子表面を有する共振格子構造を備える導波路と、
前記アップコンバートナノ粒子に結合され、前記標的検体の第１決定基に対する第１の抗体と、
前記格子表面に結合され、前記標的検体の第２決定基に対する第２の抗体と、
を備え、
前記第２決定基が前記第１決定基とは異なり、前記第２の抗体が前記第１の抗体とは異なり、
前記共振格子構造が、前記格子表面から延出する増強領域を画定し、前記増強領域が、前記アップコンバートナノ粒子の励起を増強するよう構成された、
バイオアッセイシステム。
【請求項２】
前記増強領域が前記格子表面から前記格子表面に垂直な方向に沿って所定の距離延出している、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記アップコンバートナノ粒子が、赤外光を吸収し、前記赤外光の吸収に応じて可視光を放出する光学特性を備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記アップコンバートナノ粒子が検出対象の前記標的検体を介して前記格子表面に結合される、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記アップコンバートナノ粒子が前記第１の抗体を介して前記標的検体に結合され、前記標的検体が前記第２の抗体を介して前記格子表面に結合され、任意で、前記第２の抗体が化学結合を介して前記共振格子構造の前記表面に結合される、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
前記第２の抗体が化学結合を介して前記共振格子構造の前記表面に結合される、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
前記格子表面上に屈折率が少なくとも１．５の屈折層を更に備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記共振格子構造が所定の共振条件に調整されたフォトニック結晶を備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
体液中の標的検体を検出するための方法であって、
複数の捕捉部位を備え、格子表面を有する共振格子構造を提供することと、
前記共振格子構造に光照明を照射することであって、前記共振格子構造が前記捕捉部位で前記標的検体の第２決定基に対する第２の抗体を介して捕捉された１つ以上の前記標的検体を有し、前記標的検体の第１決定基に対する第１の抗体がアップコンバートナノ粒子に結合されており、前記第１決定基が前記第２決定基と異なる、ことと、
前記捕捉部位から光学応答を検出することであって、前記捕捉部位の１つからの光学応答が、当該捕捉部位における前記標的検体の存在を示す、ことと、
を備え、
前記第１決定基が前記第２決定基と異なり、
前記共振格子構造が、前記格子表面から延出する増強領域を画定し、前記増強領域が、前記アップコンバートナノ粒子の励起を増強するよう構成された、
方法。
【請求項１０】
前記光照明を照射する前に、
前記共振格子構造を洗浄して、捕捉されていない標的検体を除去すること、
を更に備える、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的検体に対する第１の抗体に結合された前記アップコンバートナノ粒子を含有する第１の溶液を、前記標的検体を含有すると思われる前記体液を含む第２の溶液と混合して、第３の溶液を形成することと、
前記第３の溶液中で前記ナノ粒子標識抗体を前記標的検体と結合させるために所定の時間期間待機することと、
前記第３の溶液を前記捕捉部位に適用することと、
を更に備え、
前記第２の抗体が前記第１の抗体とは異なる、
請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
標的検体を検出するための装置であって、
格子表面を有する共振導波路格子構造であって、前記格子表面から延出する増強領域を画定し、前記格子表面上に複数の捕捉部位を備える共振導波路格子構造と、
前記捕捉部位上に配置された屈折層と、
前記格子構造に位置する前記標的検体の第１決定基に対する第１の抗体であって、複数のアップコンバートナノ粒子に結合された第１の抗体と、
前記標的検体の第２決定基に対する第２の抗体であって、前記格子構造に位置し、前記捕捉部位に結合された第２の抗体と、
前記捕捉部位に向けられ、第１の波長の光学信号を発生させて前記アップコンバートナノ粒子を励起させるよう構成された光源と、
前記捕捉部位からの前記第１の波長よりも短い第２の波長の光学応答を検知するよう構成された光検出器と、
を備え、
前記第２の抗体が前記第１の抗体とは異なる、
装置。
【請求項１３】
前記第１の波長が前記導波路格子構造の共振条件と一致し、前記共振導波路格子構造が、前記捕捉部位の表面から延出し、所定の距離、前記表面に垂直な方向に沿う増強領域を画定する、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
前記第２の抗体が化学結合を介して前記捕捉部位にそれぞれ結合される、請求項１２に記載の装置。
【請求項１５】
標的検体を検出するためのバイオアッセイシステムであって、
格子表面を有する共振格子構造を備える導波路と、
化学結合を介して前記共振格子構造の表面に結合された、前記標的検体に特異的で前記標的検体の第２決定基に対する第２の抗体と、
前記標的検体に特異的で前記標的検体の第１決定基に対する第１の抗体と、
前記第２の抗体を介して前記格子構造の表面に結合している前記第１の抗体に結合している複数のアップコンバートナノ粒子と、
を備え、
前記第１の抗体が前記第２の抗体とは異なり、前記第１決定基が前記第２決定基とは異なり、
前記第２の抗体が、前記アップコンバートナノ粒子と共役の前記第１の抗体と異なり、
前記共振格子構造が、前記格子表面から延出する増強領域を画定し、前記増強領域が、前記アップコンバートナノ粒子の励起を増強するよう構成された、
バイオアッセイシステム。
【請求項１６】
前記共振格子構造の前記表面上に屈折率が少なくとも１．５の屈折層を更に備える、請求項１５に記載のバイオアッセイシステム。
【請求項１７】
前記共振格子構造が、所定の共振条件に調整された、複製格子、ホログラフィフォトニック結晶、及び多孔質シリコンフォトニック結晶から成る群から選択される、請求項１５に記載のバイオアッセイシステム。
【請求項１８】
標的検体を検出するための免疫学的アッセイキットであって、
アップコンバートナノ粒子と、
格子表面を有する共振格子基板を有するバイオアッセイシステムと、
化学結合を介して前記共振格子基板の表面に結合された第２の抗体と、
前記第２の抗体とは異なる第１の抗体を有する物質構成物であって、前記第１及び第２の抗体が同一の標的検体の異なる決定基に対する、物質構成物と、
を備え、
前記共振格子基板が、前記格子表面から延出する増強領域を画定し、前記増強領域が、前記アップコンバートナノ粒子の励起を増強するよう構成され、
前記第１の抗体が、前記アップコンバートナノ粒子に結合されている、
免疫学的アッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体液中の検体（ａｎａｌｙｔｅ）を検知するためのバイオアッセイシステム及び方法に関する。更に特定すれば、本発明は、共振格子構造を備える、例えば免疫学的アッセイ装置のようなバイオアッセイ装置、並びにアップコンバートナノ粒子（ｕｐｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）及び共振格子構造を用いて体液中の検体を検出するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、バイオアッセイ装置における標識としてフルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）が用いられている。しかしながらフルオロフォアは、時間の経過と共に光退色が生じる。バイオアッセイ装置における標識として、光退色しないことから、アップコンバートナノ粒子（すなわち１から１００ナノメートルの直径を有し、励起波長よりも短い波長の光を発する粒子）を使用する様々な試みが行われてきた。しかしながら、アップコンバートナノ粒子の使用は他の問題を引き起こす。例えば、アップコンバートナノ粒子は量子効率が低いので発光がやや弱く、励起には比較的高い光レベルが必要である（例えば１００ｍＷの９８０ｎｍ集束光）。アップコンバート発光が弱いのは、アップコンバージョン（ｕｐｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）の量子効率（ＱＥ）が典型的に０．３％未満であるためである。これに比べ、従来の蛍光標識はＱＥが２０％超であり得るので、はるかに明るい。アップコンバージョン発光を改善するための１つの手法は、ナノ粒子の表面を化学的に修飾することであるが、成功例は限られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
アップコンバートナノ粒子は、バイオアッセイにおいて将来性のあるフルオロフォア及び／又は標識である。その理由は、実質的に光退色効果が皆無で、ほとんどバックグラウンドフリーの検出システムを提供するからである。本明細書で用いる場合、「アップコンバート（ｕｐｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ）」という言葉は、励起光の波長よりも短い波長の光を放出することを意味する。例えばナノ粒子は、複数の近赤外（ＮＩＲ）光子（例えば約９８０ｎｍの２つ又は３つの光子）を吸収し、次いで可視域の緑色光（約５１０ｎｍ）又は赤色光（約６５０ｎｍ）を放出することができる。「アップコンバージョン」プロセス（すなわち励起波長よりも短い波長の発光）は、生物サンプルではまれにしか発生しない。これは、従来の連続波（ＣＷ）光源で観察することができる（例えば、強い自家蛍光（ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を生じる高いピーク電力のフェムト秒パルスＮＩＲレーザは必要ない）。したがって、プローブ光ビームはアップコンバートナノ粒子からの発光だけを誘発し、生物サンプルからの発光はほとんど誘発しない。このため、ＮＩＲ  ＣＷ光を励起に用い、青色シフト発光を検出する場合、アップコンバートナノ粒子の使用によって、ほぼバックグラウンドフリーの検出が可能となる。
【０００４】
バイオアッセイ用途において、そのようなバックグラウンドフリーの検出は検知能力の改善をもたらし得る。典型的に、バックグラウンドレベルはアッセイにおける検出の下限を決定し、これが高すぎる場合には測定精度が低下する。特に、バイオアッセイでは一般にＵＶ光源が用いられるが、これは自家蛍光による高いバックグラウンド及びサンプルからの散乱を引き起こすので、体液の分析において全血のようなサンプルを分析することができない。
【０００５】
したがって、光退色の問題を解決し、例えばＵＶ光のような従来の光源に特徴的であるバックグラウンド及び光散乱を低減し、標的検体からの発光を増強することが可能な新しいバイオアッセイ装置の開発が求められている。アップコンバートナノ粒子を標識として用いて、弱い発光、フルオロフォア退色、及びサンプルからのバックグラウンド自家蛍光の問題を克服することについて、以下で詳述する。本発明の１つの目的は、共振格子構造と組み合わせてアップコンバートナノ粒子からの発光を増強することで、限定ではないが体液中のタンパク質、病原体、電解質のような検体を検出するための高感度のバイオセンシングプラットフォームを実現することである。アップコンバートナノ粒子の発光増強が重要である理由は、従来の蛍光染料、量子ドット、又は他の蛍光標識よりもバックグラウンド信号が小さく感度が高いアップコンバートナノ粒子が、限定ではないが例えば免疫学的アッセイ用途のようなバイオアッセイにおいて優れた測定精度性能を可能とするからである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
１つの態様において本発明は、例えば血液、血清、血漿、滑液、髄液、及び尿のような体液中の標的検体を検出するためのバイオアッセイシステムを提供する。概して、バイオアッセイシステムは、（ｉ）共振格子構造であって、その表面から表面に垂直な方向に沿って所定の距離延出している増強領域（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）を画定する共振格子構造を備える導波路、及び共振格子構造の表面に結合化学作用（ｌｉｎｋａｇｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を介して結合された標的検体に対する二次抗体等のバイオセンサ、及び（ｉｉ）二次抗体が結合する決定基とは異なる標的検体の決定基に対する第１の抗体と共役のアップコンバートナノ粒子、という２つの部分を備える。アップコンバートナノ粒子は、赤外光を吸収し、赤外光の吸収に応じて可視光を放出する光学特性を備えている。
【０００７】
本明細書に記載するシステムの１つの実施形態では、標的検体は、例えばＮａＹＦ４：（Ｙｂ，Ｅｒ，Ｔｍ）、ＮａＹｂＦ４：（Ｙｂ，Ｅｒ，Ｔｍ）、ＣａＦ２：（Ｙｂ，Ｅｒ）、Ｌａ２Ｏ３：（Ｙｂ，Ｅｒ）等のアップコンバートナノ粒子と共役な、標的検体に対する抗体に結合されている。また、標的検体は、例えばストレプトアビジンのような結合化学作用を介して共振格子構造の表面に結合された、第２の標的検体に対する抗体（第１の標的検体に対する抗体とは異なる）にも結合されている。したがって標的検体は、第１の抗体によってナノ粒子で「標識され」、第２の抗体によって共振格子構造の表面に「捕捉される」。共振格子構造の表面で、標的検体は光学的に検出される。
【０００８】
一実施形態では、バイオアッセイセンサは更に、共振格子構造の表面に配置された高屈折層（例えばＴｉＯ２及びＴａ２Ｏ５）を備える。この高度屈折層は屈折率が少なくとも１．５である。共振格子構造は、所定の共振条件に調整されたフォトニック結晶と、この共振格子構造に結合化学作用を介して結合された抗体と、を備えている。代替的な実施形態では、本発明は、共振格子構造を備える導波路と、共振格子構造の表面に結合化学作用を介して結合された抗体と、を備えるバイオアッセイセンサを提供する。
【０００９】
別の態様では、本発明は、抗体及びこの抗体に結合されたアップコンバートナノ粒子を備える物質構成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｔｅｒ）を対象とする。
【００１０】
一実施形態では、物質構成物は更に、抗体の結合部位に結合された標的検体を更に備える。
【００１１】
更に別の態様では、本発明は免疫学的アッセイキットを対象とする。このキットは、共振格子構造及びこの共振格子構造の表面に結合化学作用を介して結合された第２の抗体を有するデバイスと、第１の抗体と共役のアップコンバートナノ粒子を有する物質構成物と、を備えている。第１の抗体及び第２の抗体は同一の標的検体に対するものである。
【００１２】
更に別の態様では、本発明は、体液中の標的検体を検出するための方法を対象とする。複数の捕捉部位を有する共振格子構造を提供する。共振格子構造に光照明を照射する。共振格子構造は、捕捉部位において抗体を介して捕捉されたアップコンバートナノ粒子に結合された１つ以上の標的検体を有する。捕捉部位から光学応答を検出する。これが、対応する捕捉部位における標的検体の存在を示す。
【００１３】
本明細書で用いる場合、結合されたという言葉は、少なくとも２つの要素が直接又は間接に結び付けられることを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】本発明の一実施形態に従った格子構造を有する共振導波路の断面図を概略的に示す。
【図１Ｂ】本発明の一実施形態に従った格子構造を有する共振導波路の斜視図を示す。
【図２】本発明の一実施形態に従った共振条件のもとでの基板表面の電界を概略的に示す。
【図３】本発明の一実施形態に従った、免疫学的アッセイ等のバイオアッセイシステムを用いて検体を検知するための方法を概略的に示す。
【図４】本発明の別の実施形態に従った、免疫学的アッセイ等のバイオアッセイシステムを用いて検体を検知するための方法を概略的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
バイオアッセイの感度を高める１つの手法は、ポリマーベースの格子基板を用いて発光を増大させることにより照明の光レベルを上げることであるが、これは、高いバックグラウンド、サンプル温度の上昇、及びサンプル損傷の増大のようないくつかの問題を招く恐れがある。例えばそのようなバイオアッセイシステムでは、ポリマーベースの格子基板は、自家蛍光のために過剰な量のバックグラウンドを示し始める。バックグラウンドからのこの干渉は、例えば免疫学的アッセイのような高感度のバイオセンシング用途には適していない。この問題に対処するため、高品質かつ高純度の石英基板が用いられてきたが、こういった材料では材料コストが著しく高くなり、製造プロセスも複雑となる。したがって本発明は、共振格子構造と組み合わせて赤外励起を吸収するアップコンバートナノ粒子を用いることで、検体を検出するためのバイオセンシングプラットフォームにおける高い感度を実現する。
【００１６】
図１Ａ及び図１Ｂを参照すると、図１Ａはセンサ３００の断面図を、図１Ｂはその斜視図を示す。センサ３００は、本発明の一実施形態に従った共振導波路１００及び標的検体に対する二次抗体３２０を備えている。二次抗体は、化学結合３１５を介して共振導波路１００の表面に結合されている。一実施形態では、化学結合３１５は、ストレプトアビジンのような結合タンパク質を含む。
【００１７】
引き続き図１Ａ及び図１Ｂを参照すると、共振導波路１００は、表面１１２に格子構造１１５が形成された基板１１０と、格子構造１１５の表面１１２上に形成された屈折層１２０と、を備えている。一実施形態では、屈折層１２０の上に１つ以上の追加の屈折層（図示せず）を形成してもよい。
【００１８】
引き続き図１Ａを参照すると、一実施形態において、基板１１０は、光学的に透明な材料又はポリマー材料（限定ではないが、例えばポリスチレン、紫外線硬化性ポリマー又はガラス）で形成され、格子構造１１５は、格子間隔が約３６０ｎｍ、格子溝が深さ約５０ｎｍ、及びデューティサイクルが約３６％であるように形成されている。格子間隔は約２００ｎｍから約５００ｎｍの範囲であり、格子溝は深さ約３０ｎｍから約３００ｎｍの範囲であり、屈折層１２０（屈折率は１．５より大きい）の厚さは約３０ｎｍから約２００ｎｍの範囲であり、デューティサイクルは約３０％から約５０％の範囲であることが理解されよう。基板１１０は透明であり、アップコンバートナノ粒子の近赤外（ＮＩＲ）励起及び可視光発光検出と相性が良い。格子材料は、限定ではないが例えばＳｉＯ２、ポリスチレン、シリコーン、熱可塑性材料のようなポリマー材料、又は溶融シリカ（ｆｕｓｅｄ  ｓｉｌｉｃａ）及び石英のようなガラスから形成される。
【００１９】
一実施形態では、屈折層１２０は高屈折率材料で形成することができる（例えば、屈折率が約２．３５であるＴｉＯ２、又は屈折率が約２．０９であるＴａ２Ｏ５）。様々な形態及び構成の格子によって、共振モードを生成することができ、アップコンバートナノ粒子の励起を増強できることが理解されよう。例えば本発明の一実施形態では、格子は高屈折率材料の薄いコーティングを２層以上有し、ナノ粒子が表面１１２の近くにある場合（約１〜１５０ｎｍの範囲、好ましくは約１〜２０００ｎｍの範囲、より好ましくは３００ｎｍ未満）、励起光の強度を増強する。結果として得られる格子構造１１５の表面及び屈折層１２０は格子によく似た挙動を示すが、増強が起こる特定の共振モード及び波長に調整されている。共振波長では、基板表面１１２での又は基板表面１１２よりも上のエバネッセント電界（ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｆｉｅｌｄ）は極めて大きい（例えば格子なしの場合よりも５０倍大きい）ので、アップコンバートナノ粒子のような表面標識は強く発光することができる。図１Ａでは屈折層１２０を示し記載するが、共振導波路１００が屈折層１２０が存在しない場合にフォトニック結晶を構成し得ることは理解されよう。
【００２０】
図２は、本発明の一実施形態に従った共振条件のもとでの基板１１０の表面の電界を概略的に示す。図２に示すように、光ビーム２１０は、表面１１２とは反対側の基板１１０の表面１１４（図１Ａを参照のこと）から入射する。複数のアップコンバートナノ粒子３５０が格子構造１１５の表面１１２に結合され、表面１１２の上に屈折層１２０が形成されている。一実施形態において、アップコンバートナノ粒子３５０は、標的検体（図示せず）に対する抗体（図示せず）と共役である。標的検体は、ナノ粒子共役抗体に結合され、標的検体に対する第２の抗体（図示せず）によって表面１１２で捕捉される。第２の抗体は、結合化学作用２４０（限定ではないが、例えばストレプトアビジン、アミノ基、ヒドロキシル基、チオール基、及びカルボキシル基のような反応性官能基を介した表面結合、修飾ＤＮＡプローブ、及びペプチド）を介して表面１１２に結合されている。
【００２１】
図１Ａ、図１Ｂ、図２を参照すると、一実施形態において、基板１１０の表面１１４に向けられる光ビーム２１０の波長は、フォトニック結晶を構成する格子構造１１５の共振条件と一致している。この結果、光ビーム２１０の強度は、基板１１０のテクスチャ表面（ｔｅｘｔｕｒｅｄ  ｓｕｒｆａｃｅ）１１７上の増強領域２３０において大きく増強する。この実施形態では、テクスチャ表面１１７は、図１Ｂに示すような格子構造１１５（平行な山と谷）で形成されている。他の実施形態では、テクスチャ表面１１７は、突起の配列（例えば柱と棒）、又はくぼみの配列（例えば円形のくぼみ、矩形のくぼみ、及び六角形のくぼみ）で形成され得ることが理解されよう。理想的な状況では、光ビーム強度の増強は、フォトニック結晶を用いない光ビーム２１０の強度に対して１５００倍となり得る。一実施形態では、増大はこれよりも小さく、約５０倍となることもある。
【００２２】
発光を増強するために有用な他の材料は、例えば金属製フィルムから形成されたプラズモン（ｐｌａｓｍｏｎｉｃ）表面構造である。１つの例では、プラズモンナノアンテナ（柱状構造上の金ドット）を用いると、アップコンバートナノ粒子の発光は約３００倍増大する。この実施形態の利点は、従来のフルオロフォアに比べて、アップコンバートナノ粒子／標識がいっそうロバストで、光退色せず、長時間続くことである（例えば従来のフルオロフォアの２〜３分に対して数時間）。しかしながら、プラズモン構造は概して製造が難しく、加熱効果を生じ得る強い光吸収のようないくつかの欠点を有することがある。本発明の更に別の実施形態で用いられる透明誘電材料は、この問題を回避する。
【００２３】
一実施形態では、生物医学的分析検知用途のための高感度システムは２つのコンポーネントを含む。例えば第１のコンポーネントは、フォトニック結晶導波路のような透明誘電材料から形成された共振格子構造と、この共振格子構造の表面に結合された標的検体に対する二次抗体と、を備えるセンサである。好適な実施形態では、第２のコンポーネントは、二次抗体と同一の標的検体に対する一次抗体に結合されたアップコンバートナノ粒子を含む。例えば、従来のフルオロフォア又はダウンコンバート（ｄｏｗｎｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ）ナノ粒子等、アップコンバートナノ粒子以外の共役（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）も本発明によって想定される。このシステムは、低コスト、容易な大量生産、及び最小限のバックグラウンド信号を提供する高感度のアッセイ用途向けに設計されている。
【００２４】
引き続き図２を参照すると、本発明のシステムは、増強領域２３０における電界増強によって感度を向上させている。アップコンバート粒子３５０は、共振格子構造１００の基板１１０の表面１１２から百ナノメートル以上延出する増強領域２３０内に位置している。増強領域２３０は表面１１２においてはっきりした境界を有するが、表面１１２から離れるにつれて電界が徐々に小さくなるとぼやけた境界を有することが理解されよう。一実施形態では、ぼやけた境界は、電界が表面１１２近くの最も高い電界の半分である等高線として規定され得る。発光は約５０倍以上増強して、アッセイの感度を向上させる。
【００２５】
本発明のセンサは、従来の免疫学的アッセイシステムに比べて多数の利点を有する。第１に、本発明では、自家蛍光から発する強力なバックグラウンド信号は生じない。格子構造１１５の格子間隔、格子溝の深さ、デューティサイクルは、本発明の一実施形態において、格子１１５の共振がアップコンバートナノ粒子３５０の９８０ｎｍ吸収ピーク及び照明光源２１０の垂直入射に調整されるようになっている。この実施形態では、９８０ｎｍ光は、格子１１５から又は分析対象の体液サンプルからの自家蛍光を引き起こさないので、基板１１０からのバックグラウンドは実質的に存在しない。
【００２６】
本発明に従ったバイオアッセイシステムは、免疫学的アッセイシステム等の従来のバイオアッセイシステムに比べて更に別の利点を有する。例えば本発明のセンサでは、フルオロフォアの光退色は生じない。アップコンバートナノ粒子３５０は極めて安定していることが知られ、光退色せず、表面近くの高い電界に良好に対応することができる。従来のフルオロフォアはあまり望ましくなく、すぐに光退色する。
【００２７】
更に、本発明のセンサは、表面発光の局所化が増強している。アップコンバートナノ粒子３５０は、照明強度に対して非線形の吸収依存性を有する。この非線形の特性のため、結合したナノ粒子のみ、又は表面に近いナノ粒子のみが、選択的に励起される。結果として、周囲の媒体からの発光はほとんどない。
【００２８】
更に、本発明のセンサは均一系アッセイ（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｓｓａｙ）用途に適用可能である。結合したナノ粒子の表面発光が増強するため、アッセイ洗浄ステップを省いて、システム設計を大幅に簡素化することが可能となる。
【００２９】
更に、本発明のセンサは集束光照明を必要としない。本明細書に開示する発明では、レーザ（又はコヒーレントな光源）は必要ない。これは、共振格子からの増強効果によって、レーザの集束と高パワーを必要とすることなく強度が上昇するからである。レーザの代わりに、限定ではないが、例えばＬＥＤ、ガス放電ランプ、及び高強度放電ランプのような低コストのインコヒーレントな光源を用いることができる。
【００３０】
図３は、本発明の一実施形態に従った、バイオアッセイ装置を用いて検体を検出するための方法を概略的に示す。ステップ１０では、標的検体３３０を標的とする第１の抗体３４０と共役のナノ粒子３５０を含む物質構成物３４５を、標的検体３３０が存在すると思われる血液、血清、血漿、滑液、髄液、又は尿のような体液と混合する。一実施形態では、物質構成物３４５の形成は、ナノ粒子を抗体に結合するための有機又は無機溶剤中で、ナノ粒子３５０を標的検体に対する第１の抗体３４０と混合することによって行う。他の実施形態では、ナノ粒子標識抗体は粉末の形態であり、検出対象の検体３３０を含有すると思われる流体に混合する。
【００３１】
次のステップであるステップ２０では、検体３３０に結合されたナノ粒子標識抗体３４５を、共振導波路格子表面１１２を有するバイオアッセイセンサ３００に適用する。一実施形態では、バイオアッセイセンサ３００は、格子構造３１０を有する基板１１０と、格子構造３１０の表面上に形成された屈折層１２０と、格子構造３１０の表面３１２に結合され固定化された標的検体３３０に対する第２の抗体３２０と、を備えている。一実施形態では、格子構造３１０の各格子間隔が、これに結合された標的に対する抗体（ａｎｔｉ−ｔａｒｇｅｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を備えて、標的検体捕捉部位３０５を構成する。一実施形態では、第２の抗体３２０は、結合化学作用３１５（例えばストレプトアビジン）を介して格子構造３１０上に固定化されて、分析対象の患者の体液からの、例えばＮａＹＦ４：Ｙｂ−Ｅｒ、ＣａＦ２：Ｙｂ，Ｅｒ、ＮａＹｂＦ４：Ｈｏ，Ｔｍ，Ｅｒから成る群から選択されたナノ粒子に結合された標的検体３３０を捕捉する。捕捉された検体３６０が結合されている第２の抗体３２０は、同一の標的検体３３０に対するものであり、格子構造３００の表面３１２に結合されている。一実施形態では、バイオアッセイセンサ３００を純水で洗浄して、基板１１０から捕捉されていない検体を除去する。この時点で、バイオアッセイセンサ３００は光学的調査を行う準備ができている。
【００３２】
ステップ３０では、屈折層１２０を含み得る格子構造３００の基板１１０の表面３１２とは反対側である基板１１０の表面１１４に、例えば波長が約９８０ｎｍの近赤外（ＮＩＲ）光ビームのような光を照射する。ＮＩＲ光ビームは格子構造３１０の共振条件に一致するように選択されるので、標的検体３３０に対する第１の抗体３４０と共役の、標的検体３３０に対する第２の抗体３２０を介して格子表面３１２に結合されたアップコンバートナノ粒子３５０は、増強ＮＩＲ励起によって励起される。アップコンバートナノ粒子３５０の光学特性に応じて、増強ＮＩＲ励起に応答して光ビーム（可視光等）が放出される。捕捉部位３５０上の検体３３０の存在及び／又は不在が、光検出器４００によって判定される。
【００３３】
一実施形態では、アップコンバートナノ粒子３５０は、「サンドイッチ」アッセイにおいて抗体３４０と共役であり、共振格子構造３１０の表面上の捕捉部位３０５において標的検体３３０に対する第２の抗体に結合された捕捉標的検体３３０を検出する。格子構造３１０の共振は、最大の増強効果を得ると共にアッセイ感度を向上させるため、ナノ粒子の吸収ピークのピークに調整される。
【００３４】
別の実施形態において、バイオアッセイセンサは、共振格子構造３１０の表面に対する粒子の結合が共振モードの「離調（ｄｅｔｕｎｉｎｇ）」及び増強効果の低減を引き起こす「ブロッキングアッセイ」用途で用いられる。表面結合イベントは、屈折層１２０の屈折率の変化をもたらし、共振を照明波長から離調させるのに充分である。例えば、極めて狭い波長帯域幅、高品質係数の共振構造の格子、又は極めて狭くてシャープな共振ピークを有するレーザは、表面における屈折率の変化を検出するための極めて感度の高い構成である。共振がレーザ波長から離調するにつれて、アップコンバートナノ粒子の発光増強のシャープな低減を観察することができる。
【００３５】
更に別の実施形態では、本発明の検知システムは、増強が発生する比較的狭い増強領域を利用し、これは、結合動態（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を検出し、標的検体の経時的な品質変化を追跡するために有用である。理論に束縛されるものではないが、格子構造の表面で捕捉されたアップコンバート粒子からの発光は、格子表面の近くの１００ｎｍ領域未満に制限される。１００ｎｍ領域の外側のアップコンバートナノ粒子標識は励起されず、このため、格子構造の表面にもっと近い１００ｎｍ領域内に位置するナノ粒子よりもはるかに発光が弱い。
【００３６】
例えば一実施形態では、最初に、標的タンパク質の作用により切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）を生じやすい既定の結合要素（トロンビン等）によって、格子表面３１２を標識（フルオロフォア又はナノ粒子等）で前処理する。トロンビンに露呈されると、標識は結合要素で切断され、増強領域から拡散する。したがって、結合要素の切断により、標識は格子構造の上の１００ｎｍ領域内で表面から自由になり、標識を検出することはできない。発光の低減により、トロンビン等の標的タンパク質の定量的な決定が可能となる。別の例では、標識は表面３１２に特異的に結合し、結合イベントを示す信号を増大させることができる。
【００３７】
図４に示すような本発明の別の実施形態において、バイオアッセイシステムは競合不均一系免疫学的アッセイ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）モードで構成されている。この場合、例えば標的検体３３０Ａはアップコンバートナノ粒子に結合されてナノ粒子標識共役検体３６０を形成する。患者の体液サンプル中の標的検体３３０Ｂは標識されていない。次いで、捕捉部位３０５に共役検体３６０が結合されるように、ナノ粒子標識共役検体３６０をバイオアッセイセンサ３００に適用する。次いで、得られた「標識された」バイオアッセイセンサ３００に、分析を行う標識されていない検体３３０Ｂを含む患者の体液を適用する。患者の標識されていない標的検体３３０Ｂは、格子表面に結合した標的検体に対する抗体３２０上の結合部位３０５について、ナノ粒子標識標的検体３６０と競合する。患者の標識されていない体液標的検体３３０Ｂを導入すると、標識された標的検体３６０は格子表面３１２から解放され、自由に増強領域２３０（図２を参照のこと）から溶液内に拡散する。ナノ粒子標識標的検体３６０から生じる検出可能な発光は、患者の標識されていない検体３３０Ｂの存在下で低減する。この構成は一般に、薬物分析並びにホルモン及びタンパク質の臨床生化学において用いられる。このモードでは、患者のサンプル内の標識されていない検体３３０Ｂが、増強表面３１２におけるナノ粒子標識検体３６０と競合する。結合していない検体を洗い流し、格子表面に結合して残っている標識された検体３７０を測定する。標識された結合した検体３６０の発光の低減は、患者の体液サンプル中の標的検体の量に比例する。
【００３８】
本発明の実施形態について詳細に記載したが、これらの実施形態は例示及び説明の目的のためにのみ与えたことは理解されよう。添付の特許請求の範囲により規定されるような本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な変形及び変更が当業者によって可能である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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