(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ｄ）または（ｅ）のポリペプチドからなる、共発現させることにより補因子合成および補因子のキサンチンオキシダーゼへの配位を活性化するアクセサリー蛋白質の機能を有する蛋白質。
（ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位したアミノ酸配列からなるポリペプチド
【請求項２】
以下の（Ｇ）〜（Ｊ）のいずれかのＤＮＡ。
（Ｇ）配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（Ｈ）配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｉ）配列番号６に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、共発現させることにより補因子合成および補因子のキサンチンオキシダーゼへの配位を活性化するアクセサリー蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（Ｊ）配列番号６に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位されている塩基配列からなる、共発現させることにより補因子合成および補因子のキサンチンオキシダーゼへの配位を活性化するアクセサリー蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
【請求項３】
以下の（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかのＤＮＡ、および、請求項２に記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡと、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの組合せ
（Ｂ）配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡと、配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡの組合せ
（Ｃ）配列番号４に示される塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列からなるＤＮＡと、配列番号５に示される塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列からなるＤＮＡとから構成され、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの組合せをコードするＤＮＡの組合せ（ただし、上記（Ｂ）の組合せを除く）
（Ｄ）配列番号４に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡと、配列番号５に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとから構成され、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの組合せをコードするＤＮＡの組合せ（ただし、上記（Ｂ）の組合せを除く）
（Ｅ）配列番号４に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位されている塩基配列と、配列番号５に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位されている塩基配列とから構成され、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの組合せをコードするＤＮＡの組合せ（ただし、上記（Ｂ）の組合せを除く）
（Ｆ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位したアミノ酸配列からなるサブユニットと、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位したアミノ酸配列からなるサブユニットとから構成され、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの組合せをコードするＤＮＡの組合せ
【請求項４】
請求項３に記載のベクターを含み、かつ、宿主細胞がエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、キャンデイダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属およびコレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属の微生物よりなる群から選択されるいずれかの微生物である形質転換体。
【請求項５】
宿主細胞がエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物である請求項４に記載の形質転換体。
【請求項６】
請求項４または５に記載の形質転換体を培養すること、及び、得られた培養物からキサンチンオキシダーゼを採取することを含むキサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の宿主での異種タンパク質発現のために取得されたキサンチンオキシダーゼ（本書では、以下、ＸＴＯとも略称する。）酵素遺伝子に関する。また、本発明は、キサンチンオキシダーゼを構成する二つのサブユニットタンパク質とそれをコードするヌクレオチド配列と、キサンチンオキシダーゼを効率的に発現させるために重要な役割を担うアクセサリータンパク質とそれをコードするヌクレオチド配列を提供し、概遺伝子を使用して、安定な品質のキサンチンオキシダーゼを効率的に組換え生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は新規な耐熱性キサンチンオキシダーゼ遺伝子およびその製造法に関するものである。本発明のキサンチンオキシダーゼはヒポキサンチンおよびキサンチンを酸化し、過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素であり、熱安定性に優れることを特徴とする。本発明のキサンチンオキシダーゼは腎炎・甲状腺障害の指標となる無機リン、免疫疾患の指標となるアデノシンデアミナーゼ等を測定するために用いられる。【０００３】
従来、牛乳中にキサンチンオキシダーゼが存在することが知られている。牛乳由来キサンチンオキシダーゼをヒポキサンチンおよびキサンチンを含有する試料に作用させ、生成する過酸化水素を色素に変換せしめた場合、短時間に色素が分解されて、過酸化水素に基づく定量ができないことが知られている。その理由は、牛乳由来キサンチンオキシダーゼがキサンチンを分解した際に生じる、スーパーオキシドラジカルと過酸化水素の生産比率によるものであり、牛乳由来キサンチンオキシダーゼの場合、約５０％の高い比率で過酸化水素とともに、スーパーオキシドラジカルが生産されることよると考えられている（非特許文献３）。過酸化水素とともに生産されたスーパーオキシドラジカルが有機系の色素を酸化し、色素の退色が起こると考えられ、このことから、牛乳由来キサンチンオキシダーゼは、色素を用いた測定において不向きである。【０００４】
この問題を解決するため、他の生物からのキサンチンオキシダーゼの取得が試みられており、微生物に由来するものとして、シュードモナス属、エシエリキア属、アースロバクター属、ノカルデイア属等に属する微生物から得られる酵素（非特許文献１）や、エンテロバクター・クロアカエから得られる酵素（非特許文献２）が調べられている。【０００５】
その中で、特許文献１に記載されている、アースロバクター属に属する微生物が生産するキサンチンオキシダーゼは熱安定性に優れていることが見出されており、さらに、ヒポキサンチンおよびキサンチンに基質特異性を有し、ヒポキサンチンをキサンチンして酸化し、さらにキサンチンを尿酸に酸化する反応（下記反応式参照）を触媒し、酵素を電子受容体とし過酸化水素を生成するキサンチンオキシダーゼにおいて、６０℃、３０分間処理で少なくとも７０％の残存活性を有することを特徴とする耐熱性キサンチンオキシダーゼであることが記載されている。
反応式：ヒポキサンチン＋Ｏ２→キサンチン＋Ｈ２Ｏ２
キサンチン＋Ｏ２→尿素＋Ｈ２Ｏ２【０００６】
さらに、特許文献１において、基質の定量性を発色系において測定したところ、牛乳由来キサンチンオキシダーゼが８０％であるのに対し、アースロバクター由来キサンチンオキシダーゼは１００％であることが示されていることから、アースロバクター由来キサンチンオキシダーゼはスーパーオキシドラジカルの生産量が低く、発色系の測定においても有利であるといえる。【０００７】
一方で、アースロバクター由来キサンチンオキシダーゼをコードする遺伝子の取得、及び、組換え発現に関する試みについては報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許２９１７４００号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１３０，１１７５（１９７７），Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１３５，４２２（１９７８）
【非特許文献２】Ａ．Ｂ．Ｃ．，４５，４２５（１９８１）
【非特許文献３】Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９７８  Ａｕｇ；１３５（２）：４２２−８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者は、キサンチンオキシダーゼをアースロバクター属に属する野生株の微生物に生産させ精製させた場合、得られた酵素の比活性が低下するケースがある問題点を、新たに見出した。本発明の目的は、これを解決し安定な品質のキサンチンオキシダーゼを得ることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、比活性が低下する原因は、アースロバクター属微生物が生産するプロテアーゼが、精製段階の初期で菌体破砕を行うことにより破砕液中に出てきてキサンチンオキシダーゼと接触しこれを分解するためであることを突き止めた。
そこで本発明者は、これまで行われていなかったアースロバクター属由来のキサンチンオキシダーゼをコードする遺伝子のクローニングを行ってその全配列を明らかにするとともに、該遺伝子を用いた遺伝子組み換えにより、プロテアーゼの生産が少ない宿主によるキサンチンオキシダーゼの生産方法を提供することでこの問題点を解決した。【００１２】
さらに本発明者は、キサンチンオキシダーゼにモリブデンを配位させるために重要と考えられるアクセサリータンパク質を共発現させることにより、キサンチンオキシダーゼを効率的に生産させられることを見出した。さらに、得られたキサンチンオキシダーゼの酵素特性がアースロバクター由来野生型キサンチンオキシダーゼと同等であることを見出した。【００１３】
本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものであり、以下の項１〜項１１から構成されるものである。
項１
下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドからなるキサンチンオキシダーゼ。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるサブユニットと、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるサブユニットとから構成されるポリペプチドの組合せ
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、０、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位したアミノ酸配列からなるサブユニットと、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、０、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位したアミノ酸配列からなるサブユニットとから構成され、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの組合せ（ただし、上記（ａ）の組合せを除く）
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるサブユニットと、配列番号２に示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるサブユニットとから構成され、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの組合せ（ただし、上記（ａ）の組合せを除く）
項２
下記の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのポリペプチドからなる蛋白質。
（ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位したアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｆ）配列番号３に示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチド
項３
以下の（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかのＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡと、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの組合せ
（Ｂ）配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡと、配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡの組合せ
（Ｃ）配列番号４に示される塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなるＤＮＡと、配列番号５に示される塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなるＤＮＡとから構成され、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの組合せをコードするＤＮＡの組合せ（ただし、上記（Ｂ）の組合せを除く）
（Ｄ）配列番号４に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡと、配列番号５に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとから構成され、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの組合せをコードするＤＮＡの組合せ（ただし、上記（Ｂ）の組合せを除く）
（Ｅ）配列番号４に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位されている塩基配列と、配列番号５に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位されている塩基配列とから構成され、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの組合せをコードするＤＮＡの組合せ（ただし、上記（Ｂ）の組合せを除く）
（Ｆ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位したアミノ酸配列からなるサブユニットと、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位したアミノ酸配列からなるサブユニットとから構成され、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの組合せをコードするＤＮＡの組合せ
項４
以下の（Ｇ）〜（Ｌ）のいずれかのＤＮＡ。
（Ｇ）配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（Ｈ）配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｉ）配列番号６に示される塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｊ）配列番号６に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（Ｋ）配列番号６に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位されている塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｌ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ
項５
項３に記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
項６
さらに項４に記載のＤＮＡを組み込んだ、項３に記載のベクター
項７
項５または項６に記載のベクターを含む形質転換体。
項８
項７に記載の形質転換体を培養すること、及び、得られた培養物からキサンチンオキシダーゼを採取することを含む、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法。
項９
項８に記載の方法で製造された、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチド
項１０
項１または項９に記載のキサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをヒポキサンチンおよび／またはキサンチンに作用させる工程を含む、生体成分の測定方法。
項１１
項１または項９に記載のキサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドを含む、生体成分測定試薬。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の方法によれば、安定な品質のキサンチンオキシダーゼを高レベルで生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】キサンチンオキシダーゼ精製酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥした図。（ＸＴＯのＮ末端アミノ酸解析）
【図２】アースロバクター・ルテウムのゲノム解析結果。
【図３】アースロバクター・ルテウス由来キサンチンオキシダーゼ遺伝子の解析。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（１）キサンチンオキシダーゼ及びキサンチンオキシダーゼをコードするＤＮＡ
（１−１）キサンチンオキシダーゼ
本発明のキサンチンオキシダーゼの一態様は、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるサブユニットと、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるサブユニットとから構成されるポリペプチドの組合せである。配列番号１で示されるポリペプチド配列は、成熟型キサンチンオキシダーゼのαサブユニット配列であり、配列番号２で示されるポリペプチド配列は、βサブユニット配列である。
【００１７】
本発明のキサンチンオキシダーゼの別の態様は、（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、０、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位したアミノ酸配列からなるサブユニットと、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、０、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位したアミノ酸配列からなるサブユニットとから構成され、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの組合せ（ただし、上記（ａ）の組合せを除く）である。
【００１８】
本発明のキサンチンオキシダーゼの別の態様は、（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるサブユニットと、配列番号２に示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるサブユニットとから構成され、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの組合せ（ただし、上記（ａ）の組合せを除く）である。
【００１９】
上記（ｃ）のキサンチンオキシダーゼにおいて、配列番号１のサブユニットは、もう１つのサブユニットを組合せた場合にキサンチンオキシダーゼ活性を保持することを限度で、配列番号１に示されるアミノ酸配列と比較した同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるサブユニットである。好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性は、８５％以上であり、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。配列番号２のサブユニットについても、上記と同様のことが言える。
【００２０】
上記（ｂ）または（ｃ）のキサンチンオキシダーゼは、（ａ）のキサンチンオキシダーゼを、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法やランダム突然変異導入法など公知の手法を利用して改変することにより作製できるし、紫外線照射など他の方法によっても得ることができる。キサンチンオキシダーゼの活性を維持するという観点からは、キサンチンオキシダーゼの活性部位又は基質結合部位に影響を与えない部位において上記改変が存在することが好ましい。
（ｂ）または（ｃ）のキサンチンオキシダーゼには、キサンチンオキシダーゼを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じるバリアント（例えば、一塩基多型）も含まれる。
【００２１】
＜アミノ酸配列の同一性＞
アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の同一性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出する。
【００２２】
（１−２）キサンチンオキシダーゼをコードするＤＮＡ
本発明のキサンチンオキシダーゼをコードするＤＮＡの一態様は、（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡと、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの組合せである。本書において「タンパク質をコードするＤＮＡ」とは、それを発現させた場合に当該タンパク質が得られるＤＮＡ、即ち、当該タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するＤＮＡのことをいう。従ってコドンの縮重によって相違するＤＮＡも含まれる。
【００２３】
本発明のキサンチンオキシダーゼをコードするＤＮＡの別の態様は、（Ｂ）配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡと、配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡの組合せである。配列番号４及び５で示される塩基配列は、それぞれ、成熟型キサンチンオキシダーゼのαサブユニット及びβサブユニットをコードする塩基配列である。
【００２４】
本発明のキサンチンオキシダーゼをコードするＤＮＡの別の態様は、（Ｃ）配列番号４に示される塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなるＤＮＡと、配列番号５に示される塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなるＤＮＡとから構成され、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの組合せをコードするＤＮＡの組合せ（ただし、上記（Ｂ）の組合せを除く）である。
【００２５】
上記（Ｃ）のキサンチンオキシダーゼをコードするＤＮＡにおいて、配列番号４に示される塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなるＤＮＡは、それがコードするアミノ酸配列を有するサブユニットが、もう１つのサブユニットと組合せたときにキサンチンオキシダーゼ活性を備える限り、配列番号４に示される塩基配列との同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。配列番号５に示される塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなるＤＮＡについても、上記と同様のことが言える。
【００２６】
＜塩基配列の同一性＞
塩基配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の同一性アルゴリズムＡｄｖａｎｃｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ２．１において、プログラムにｂｌａｓｔｎを用い、各種パラメータはデフォルト値に設定して検索を行うことにより、ヌクレオチド配列の同一性の値（％）を算出する。
【００２７】
本発明のキサンチンオキシダーゼをコードするＤＮＡの別の態様は、（Ｄ）配列番号４に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡと、配列番号５に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとから構成され、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの組合せをコードするＤＮＡの組合せ（ただし、上記（Ｂ）の組合せを除く）である。
【００２８】
＜ストリンジェントな条件＞
ここで「ストリンジェントな条件」とは、一般には、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されている。
【００２９】
本書では、「ストリンジェントな条件」とは、以下に示す条件を言う。
ハイブリダイゼーション液として５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，  １５ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ，  ｐＨ  ７．０）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））を用いる。
【００３０】
このような条件でハイブリダイズするＤＮＡの中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれ得るが、それらについては、市販の活性発現ベクターに組み込み、適当な宿主で発現させて、酵素活性を公知の手法で測定することによって容易に取り除くことができる。
【００３１】
本発明のキサンチンオキシダーゼをコードするＤＮＡの別の態様は、（Ｅ）配列番号４に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位されている塩基配列と、配列番号５に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位されている塩基配列とから構成され、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの組合せをコードするＤＮＡの組合せ（ただし、上記（Ｂ）の組合せを除く）である。
【００３２】
本発明のキサンチンオキシダーゼをコードするＤＮＡの別の態様は、（Ｆ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位したアミノ酸配列からなるサブユニットと、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位したアミノ酸配列からなるサブユニットとから構成され、キサンチンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの組合せをコードするＤＮＡの組合せである。
【００３３】
上記（Ｃ）ないし（Ｆ）のキサンチンオキシダーゼをコードするＤＮＡは、（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡを市販のキットやＰＣＲ法を利用して改変することによって得ることができる。得られた遺伝子によってコードされるタンパク質の活性は、後述の活性測定法によって確認することができる。
【００３４】
＜本発明のＤＮＡ＞
好適な一実施形態において、本発明のＤＮＡは、単離された状態で存在するＤＮＡである。ここで「単離されたＤＮＡ」とは、天然状態において共存するその他の核酸やタンパク質等の成分から分離された状態であることをいう。但し、単離されたＤＮＡは、天然状態において隣接する核酸配列（例えばプロモーター領域の配列やターミネーター配列など）など一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。例えば染色体ＤＮＡの場合の「単離された」状態とは、好ましくは、天然状態において共存する他のＤＮＡ成分を実質的に含まない。一方、ｃＤＮＡ分子など遺伝子工学的手法によって調製されるＤＮＡの場合の「単離された」状態では、好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない。同様に、化学合成によって調製されるＤＮＡの場合の「単離された」状態では、好ましくは、ｄＮＴＰなどの前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない。尚、それと異なる意味を表すことが明らかでない限り、本明細書において単に「ＤＮＡ」と記載した場合には単離された状態のＤＮＡを意味する。本発明のＤＮＡには、本明細書中で説明したＤＮＡと相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）も含まれる。
【００３５】
本発明のＤＮＡは、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を基に、化学的ＤＮＡ合成法により製造、取得することができる、例えば、公知の標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって容易に調製することができる。
【００３６】
（２）アクセサリー蛋白質およびアクセサリー蛋白質をコードするＤＮＡ
（２−１）アクセサリー蛋白質
本発明の別の一態様は、下記の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのポリペプチドからなる蛋白質である。
（ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位したアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｆ）配列番号３に示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチド
【００３７】
（２−２）アクセサリー蛋白質をコードするＤＮＡ
本発明の別の一態様は、以下の（Ｇ）〜（Ｌ）のいずれかのＤＮＡである。
（Ｇ）配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（Ｈ）配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｉ）配列番号６に示される塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｊ）配列番号６に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（Ｋ）配列番号６に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位されている塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｌ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ
【００３８】
上記において、配列番号３で示されるアミノ酸配列は、アクセサリータンパク質の配列である。また、配列番号６で示される塩基配列は、アクセサリータンパク質をコードする塩基配列であり、アースロバクター・ルテウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｌｕｔｅｕｓ）に由来するものである。
【００３９】
（３）ベクター
（３−１）キサンチンオキシダーゼをコードするＤＮＡを組み込んで得られるベクター
本発明によれば、上記のキサンチンオキシダーゼをコードするＤＮＡを組み込んで得られるベクター、及びこのベクターを微生物に導入して得られることを特徴とする形質転換体も提供される。
【００４０】
本発明のベクターは、上記で説明する本発明のキサンチンオキシダーゼをコードするＤＮＡが組み込まれたベクターである。ここで「ベクター」とは、それに挿入された核酸分子を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子（キャリアー）であり、適当な宿主細胞内で本発明のＤＮＡを複製可能であり、且つ、その発現が可能である限り、その種類や構造は特に限定されない。即ち、本発明のベクターは発現ベクターである。ベクターの種類は、宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。
【００４１】
ベクターの具体例としては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）等を挙げることができる。例えば大腸菌のベクターとしては、具体的にはｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ、ｐＴＡ２、ｐＥＴなどが挙げられる。好ましくは、ベクターＤＮＡは、栄養要求性マーカー、薬剤耐性マーカー、発現プロモーターＤＮＡ配列、発現ターミネーターＤＮＡ配列を含み、より好ましくは、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ由来のアンピシリン耐性遺伝子、ラクトースプロモーターを含む。また、後述の宿主微生物を宿主とする場合に適したベクターや、セルフクローニングに適したベクターを使用することも可能である。
【００４２】
大腸菌を宿主とする場合は、例えば、Ｍ１３ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、ｐＢＲ３２２又はその改変体（ｐＢ３２５、ｐＡＴ１５３、ｐＵＣ８など）など）を使用することができる。酵母を宿主とする場合は、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＹＥＳ２等を使用することができる。昆虫細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＡｃ、ｐＶＬ等が使用でき、哺乳類細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＣＤＭ８、ｐＭＴ２ＰＣ等を使用することができるが、これらに限定される訳ではない。
【００４３】
（３−２）アクセサリータンパク質を共発現させるためのベクター
ベクターには、さらに上記で説明するアクセサリータンパク質をコードするＤＮＡが組み込まれていてもよい。アクセサリータンパク質を共発現させることにより補因子合成や補因子の酵素タンパク質への配位を活性化し、活性酵素としての生産量の向上が見込める。
【００４４】
（４）形質転換体
本発明は、宿主細胞に本発明のＤＮＡが導入された形質転換体に関する。本発明のＤＮＡの宿主への導入手段は特に制限されないが、例えば、上記で説明するベクターに組み込まれた状態で宿主に導入される。宿主細胞は、本発明のＤＮＡを発現してキサンチンオキシダーゼを生産することが可能である限り、特に制限されない。具体的には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、植物培養細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。好ましくは、原核生物に分類される微生物であり、例えば、放線菌属、大腸菌属の微生物が適する。
【００４５】
宿主が原核細胞の場合は、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属などが例として挙げられ、それぞれ、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｃ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＤＨ５α、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）などが例として挙げられる。また、ベクターとしてはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどが例として挙げられる。
【００４６】
宿主が酵母の場合は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、キャンデイダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属などが例として挙げられ、それぞれ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、キャンデイダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クリプトコッカス・エスピー（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）などが例として挙げられる。ベクターとしてはｐＡＵＲ１０１、ｐＡＵＲ２２４、ｐＹＥ３２などが挙げられる。
【００４７】
宿主が糸状菌細胞である場合は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、コレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属などが例として挙げられ、それぞれ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、コレトトリカム・ヒエマリス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｈｉｅｍａｌｉｓ）等を例示することができる。
【００４８】
また、本発明のキサンチンオキシダーゼが単離されたアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に帰属する微生物を宿主とすることも好ましい。即ち、形質転換体では、通常、外来性のＤＮＡが宿主細胞中に存在するが、ＤＮＡが由来する微生物を宿主とするいわゆるセルフクローニングによって得られる形質転換体も好適な実施形態である。
【００４９】
本発明に用いる発現ベクターと宿主微生物の組み合わせとしては、特に限定するものではないが、遺伝子を組み込む宿主由来の栄養要求性マーカー遺伝子または薬剤耐性マーカー遺伝子と、遺伝子を組み込む宿主由来の発現プロモーターＤＮＡ配列と、遺伝子を組み込む宿主由来のターミネーターＤＮＡ配列とを含む発現ベクターと、栄養要求性変異宿主または薬剤感受性宿主との組み合わせが挙げられ、最も好ましくは、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ由来のアンピシリン耐性遺伝子、ラクトースプロモーターと、大腸菌の組み合わせが挙げられる。
【００５０】
宿主微生物の細胞に組換え発現ベクターを移入する方法としては、特に限定するものではない。好ましくは、上記に示される発現ベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって調製される。形質転換は、一過性であっても安定的な形質転換であってもよい。トランスフェクション及びトランスフォーメーションは、エレクトロポレーションなどの方法により実施できる。
【００５１】
（５）キサンチンオキシダーゼの生産方法
本発明によれば、上記の形質転換体を培養し、得られた培養物よりキサンチンオキシダーゼ酵素活性を持つタンパク質を採取する工程を含むキサンチンオキシダーゼの製造方法も提供される。
【００５２】
形質転換体の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して適宜選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００５３】
培養に用いる窒素源は、特定のアミノ酸成分に欠失があるなど特殊なＮ源を除いて、宿主微生物が利用可能な窒素化合物であればどんなものでも良い。これらは主として有機窒素源であり、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ分解物などが使用される。特に、酵母エキスや大豆蛋白質が好ましいが、これに限定されるものではなく、カゼインポリペプトン、発酵麹エキス、麦芽抽出物などを用いることによっても、形質転換体を培養することができる。
【００５４】
その他の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、キシロース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛、モリブデンなどの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００５５】
培養温度は、菌が発育してキサンチンオキシダーゼを生産する範囲で適宜変更しうるが、大腸菌の場合、通常は２０〜３７℃程度である。培養時間は、条件によって多少異なるが、キサンチンオキシダーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、通常は２４〜１２０時間程度である。培地ｐＨは、菌が発育しキサンチンオキシダーゼを生産する範囲で適宜変更しうるが、通常はｐＨ３．０〜９．０程度である。
【００５６】
本発明のキサンチンオキシダーゼは、上記形質転換体を培養して得られる菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般には、常法に従って、予め、菌体破砕、遠心分離などにより、キサンチンオキシダーゼ含有溶液と菌体とを分離した後に利用することもできる。
【００５７】
あるいは、このようにして得られたキサンチンオキシダーゼ含有溶液からキサンチンオキシダーゼを精製して利用してもよい。精製方法としては、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿、加温処理や等電点処理、吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー等の処理を挙げることができる。
【００５８】
上記の製造方法で得られたキサンチンオキシダーゼも、また、本発明の一態様である。
【００５９】
（６）キサンチンオキシダーゼの理化学的特性
上記の本発明の方法により製造される本発明のキサンチンオキシダーゼは、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の性質を備えるものであり、従来のものより高品質のキサンチンオキシダーゼである。
（ｉ）作用：メディエーター、過酸化水素存在下でキサンチンオキシダーゼ酵素活性を示す。
（ｉｉ）分子量：ＳＤＳ  １０５ｋＤａと３１ｋＤａのヘテロダイマー
（ｉｉｉ）安定ｐＨ範囲：ｐＨ６．０〜９．０である。
（ｉｖ）熱安定性：５０℃１０分間の熱処理後に９０％以上の残存活性を有する。
【００６０】
上記のような酵素化学的特徴を有するキサンチンオキシダーゼは、臨床検査などの用途に好適に使用することができる。
【００６１】
さらに、野生株からのキサンチンオキシダーゼ生産において問題となる、キサンチンオキシダーゼのプロテアーゼなどによる分解などの問題を解決することができ、安定な品質のキサンチンオキシダーゼを効率的に得ることが可能となる。
【００６２】
上記の各種の酵素化学的性質は、酵素の諸性質を特定するための公知の手法、例えば、以下の実施例に記載の方法を用いて調べることができる。酵素の諸性質は、本発明のキサンチンオキシダーゼを生産する形質転換体の培養液や、精製工程の途中段階において、ある程度調べることもでき、より詳細には、精製酵素を用いて調べることができる。
【００６３】
精製酵素とは、当該酵素以外の成分、特に当該酵素以外のタンパク質（夾雑タンパク質）を実質的に含まない状態に分離された酵素を指す。具体的には、例えば、夾雑タンパク質の含有量が重量換算で全体の約２０％未満、好ましくは約１０％未満、更に好ましくは約５％未満、より一層好ましくは約１％未満の酵素を指す。
【００６４】
＜キサンチンオキシダーゼの活性測定法＞
本発明において、キサンチンオキシダーゼの活性測定は以下の条件で行う。
〔活性測定法Ｉ〕
＜反応試薬＞
下記のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液８．０ｍｌ、キサンチン溶液１．０ｍｌ、オキソン酸カリウム溶液１．０ｍｌを混合して反応試薬とする。
・  １００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５
・  １０ｍＭ  キサンチン溶液
・  １ｍＭ  オキソン酸カリウム溶液
＜測定条件＞
反応試薬３ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＸＴＯ溶液０．１ｍｌを添加し、ゆるやかに混和後、水を対照にして３７℃に制御された分光光度計で、２９３ｎｍの吸光度変化を５分間記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ  ＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＸＴＯ溶液の代わりにＸＴＯを溶解する溶媒を反応試薬に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ  ＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から以下の式（Ｉ）に従ってＸＴＯ活性を求める。ここでＸＴＯ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度０．４８ｍＭのキサンチン存在下で１分間に１マイクロモルの尿酸を生成する酵素量として定義される。
・反応式
２キサンチン＋Ｏ２→→→→→→２尿酸＋Ｈ２Ｏ２
Ｘａｎｔｈｉｎｅ  ｏｘｉｄａｓｅ
・活性値算出式
ＸＴＯの活性（Ｕ／ｍｌ）＝｛（ΔＯＤ  ＴＥＳＴ−ΔＯＤ  ＢＬＡＮＫ）×３．１×希釈倍率｝／｛１２．５×０．１×１．０｝
【００６５】
〔活性測定法ＩＩ〕
＜反応試薬＞
下記のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液３３．２７ｍｌ、キサンチン溶液２．０ｍｌ、オキソン酸カリウム溶液２．０ｍｌ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ溶液０．５ｍｌ、４−アミノアンチピリン溶液１．２６ｍｌ、ＡＤＰＳ溶液０．９７ｍｌを混合して反応試薬とする。
・  １００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５
・  １０ｍＭ  キサンチン溶液
・  １ｍＭ  オキソン酸カリウム溶液
・  ５００Ｕ／ｍｌ  ホースラディッシュペルオキシダーゼ溶液
・  ２４．６ｍＭ  ４−アミノアンチピリン溶液
・  ３１．９ｍＭ  ＡＤＰＳ溶液
＜測定条件＞
反応試薬３ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＸＴＯ溶液０．１ｍｌを添加し、ゆるやかに混和後、水を対照にして３７℃に制御された分光光度計で、５４６ｎｍの吸光度変化を５分間記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ  ＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＸＴＯ溶液の代わりにＸＴＯを溶解する溶媒を反応試薬に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ  ＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から以下の式（Ｉ）に従ってＸＴＯ活性を求める。ここでＸＴＯ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度０．４８ｍＭのキサンチン存在下で１分間に１マイクロモルの尿酸を生成する酵素量として定義される。
・反応式
２キサンチン＋Ｏ２→→→→→→２尿酸＋Ｈ２Ｏ２
Ｘａｎｔｈｉｎｅ  ｏｘｉｄａｓｅ
Ｈ２Ｏ２＋ＡＤＰＳ＋４ＡＡ→→→→→→ｄｙｅ＋Ｈ２Ｏ
Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
・活性値算出式
ＸＴＯの活性（Ｕ／ｍｌ）＝［｛（ΔＯＤ  ＴＥＳＴ−ΔＯＤ  ＢＬＡＮＫ）×３．１×希釈倍率｝／｛３０．２×０．１×１．０｝］×２
【００６６】
（７）生体成分測定方法、生体成分測定試薬
本発明の別の一態様は、上記の本発明のキサンチンオキシダーゼをヒポキサンチンおよび／またはキサンチンに作用させる工程を含む、生体成分の測定方法である。
あるいは、本発明の別の一態様は、上記の本発明のキサンチンオキシダーゼを含む、生体成分を測定するための試薬である。
【００６７】
本発明が適用される生体成分測定方法は、キサンチンオキシダーゼをヒポキサンチンに作用させる工程を含む限り特に限定されないが、典型的には酵素法による生体成分測定方法であって、特に酸化酵素−ペルオキシダーゼ−発色剤系による方法、すなわち検体中の測定対象物質を酵素反応させて過酸化水素を発生させ、これをペルオキシダーゼの存在下で発色剤と反応させて比色定量する方法を利用する方法である。この原理を用いる生体成分測定方法は既に当該技術分野において確立されている。よって、その知見を本発明に適用して、各種試料中の生体成分の量または濃度を測定することができ、その態様は特に制限されない。例えば、アデノシンデアミナーゼ、グアナーゼ、無機リン、各種核酸などの生体成分等を測定するための方法が例示できる。
【００６８】
アデノシンデアミナーゼを測定する場合は、アデノシンを基質とするアデノシンデアミナーゼの反応により生成したイノシンにプリンヌクレオシドホスホリラーゼを作用させてヒポキサンチンに変え、さらに、得られたヒポキサンチンにキサンチンオキシダーゼを作用させキサンチンおよび過酸化水素を生じさせる、いわゆる共役反応を設計することにより、発生した過酸化水素をペルオキシダーゼ−発色剤系により定量することができる。キサンチンオキシダーゼはさらにキサンチンを尿酸に変える過程で過酸化水素を発生するので、これをペルオキシダーゼ−発色剤系により定量してもよい。一方、グアナーゼを測定する場合は、グアニンを基質とするグアナーゼの反応により生成したキサンチンにキサンチンオキシダーゼを作用させ、測定を行うことができる。また、無機リンを測定する場合は、イノシンを基質とするプリンヌクレオシドホスホリラーゼの反応に無機リンの消費をともなう点に着目して測定を行うことができる。さらにＡＭＰ、ＩＭＰ、アデノシンなどの核酸についても、適当な共役反応を設計することにより、ペルオキシダーゼ−発色剤系による定量が可能になる。
【００６９】
上記の方法を実施するための手段としては、汎用の自動分析機（例えば、日立７１７０形自動分析機）に適用できるよう構成された液状試薬（またはキット）を用いる方法、凍結乾燥などの手段により製造された乾燥製剤と溶解液の組み合わせで構成された試薬（またはキット）を用いる方法、適当な担体に酵素などを担持させた形態のいわゆるドライシステム等と呼ばれるキットやセンサを用いる方法など種々の形態が例示できる。
好ましくは、試薬を２つに分包した液状試薬（以下、２試薬系の液状試薬とも記載する。）を用いて自動分析機で分析する方法である。この方法では、試料にまず１種類目の試薬（以下、第一試薬またはＲ１とも記載する。）を添加して一定時間反応させ、次いで２種類目の試薬（以下、第一試薬またはＲ１とも記載する。）をさらに添加して反応させ、この間の吸光度の変化を測定することにより目的成分を定量することが出来る。
【実施例】
【００７０】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。【００７１】
実施例１．Ｎ末端アミノ酸解析
キサンチンオキシダーゼの生産菌である、アースロバクター・ルテウスから目的のキサンチンオキシダーゼ遺伝子を取得するため、精製されたキサンチンオキシダーゼ（東洋紡社製ＸＴＯ２１１）からＮ末端アミノ酸解析を行った。精製キサンチンオキシダーゼを１ｍｇ／ｍｌの濃度にイオン交換水で溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、分子量によってタンパク質を分画した。結果を図１に示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、約１０５ｋＤａ、約９０ｋＤａ、約６８ｋＤａと約３１ｋＤａの場所にバンドが検出された。６８ｋＤａに存在するバンドは、タンパク質の保護剤として用いられている牛血清アルブミン（ＢＳＡ）であることが予測されることから、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからナイロンメンブレン膜にタンパク質を転写し、約１０５ｋＤａ、約９０ｋＤａ、約３１ｋＤａのバンドを切り出し、Ｎ末端アミノ酸解析に供した。
Ｎ末端アミノ酸解析の結果、検出されたアミノ酸は以下の配列であった。
１０５ｋＤａ:ＳＧＰＶＰＰＶＴＩＡ
９０ｋＤａ:ＡＤＨＧＳＴＬＡ
３１ｋＤａ:ＭＤＬＧＴＶＴＤＬＶＰＴＡＤＰＶ
これらの配列をもとに、キサンチンオキシダーゼ遺伝子のクローニングを試みることにした。【００７２】
実施例２．キサンチンオキシダーゼ遺伝子の取得
キサンチンオキシダーゼの生産菌である、アースロバクター・ルテウスから目的のキサンチンオキシダーゼ遺伝子を取得するため、アースロバクター・ルテウスのゲノム解析を行った。まず、アースロバクター・ルテウスをＬＢ培地で培養し、菌体を回収した後、ゲノムＤＮＡの精製を行った。ゲノムＤＮＡの精製には、東洋紡社製ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅを用いて行い、精製法はキット付属の説明書に従った。精製されたゲノムＤＮＡはオペロン・バイオテクノロジー社にてＧＳ−ＦＬＸによるゲノム解析を行っていただいた。
ゲノム解析の結果を図２に示す。ゲノム解析の結果、アースロバクター・ルテウスは約４．７ＭｂのゲノムＤＮＡを有していることが判明した。さらに、実施例１で解析されたＮ末端アミノ酸解析結果から、ブラスト解析を行い、キサンチンオキシダーゼ遺伝子を探索したところ、配列表７に示す配列を見出した。
配列表７に示す配列は、３つの遺伝子が重複した配列となっており、第一の遺伝子の終止コドン（ＴＧＡ）と第二の遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）は、ＴＧＡＴＧという配列で結合しており、第二の遺伝子の終止コドン（ＴＧＡ）と第三の遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）はＡＴＧＡという配列で結合している。このうち第一の遺伝子は、キサンチンオキシダーゼのアクセサリータンパク質である、ＸｄｈＣをコードしていると推測され、他の微生物に由来するＸｄｈＣと高い同一性を示した。第二及び第三の遺伝子は、それぞれのキサンチンオキシダーゼのαサブユニット（ＸｄｈＡ）βサブユニット（ＸｄｈＢ）をコードしていると推測され、遺伝子産物のＮ末端配列は解析された１０５ｋＤａタンパク質と、３１ｋＤａタンパク質のＮ末端アミノ酸とそれぞれ高い同一性を示した。また、９０ｋＤａタンパク質にＮ末端アミノ酸配列は、βサブユニット（ＸｄｈＢ）の内部に高い同一性をもつ配列が見出されたことから、９０ｋＤａタンパク質は、１０５ｋＤａのβサブユニットタンパク質が部分分解された産物であると考えられた。【００７３】
実施例３．キサンチンオキシダーゼ遺伝子の発現
取得されたＤＮＡ配列がキサンチンオキシダーゼをコードすることを確認するため、以下のプライマーセットを用いてキサンチンオキシダーゼ遺伝子をクローニングし、大腸菌発現ベクターｐＢＳＫＮにＮｄｅＩとＥｃｏＲＩサイトで導入した。
ＸｄｈＡ＿Ｆ（ＮｄｅＩ）    ａａａａｃａｔＡＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＴＣＡＣＣＧＡ
ＸｄｈＢ＿Ｒ（ＥｃｏＲＩ）  ａａａａｇａａｔＴＣＡＧＣＧＧＧＴｇＧＧＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣ
作製されたキサンチンオキシダーゼ発現ベクターｐＢＳＫＮ−ＸＴＯを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、形質転換体をＴＢ＋ＩＭ培地（ＴＢ培地＋１ｍＭ  ＩＰＴＧ，＋０．０１ｍＭ  モリブデン産アンモニウム）で培養し、培養菌体内のキサンチンオキシダーゼ活性を測定した。キサンチンオキシダーゼ活性の検出は、活性測定法Ｉに示す方法で行った。その結果、大腸菌体内に３５Ｕ／Ｌのキサンチンオキシダーゼ活性が検出された。また、対照として発現ベクターであるｐＢＳＫＮを導入した大腸菌ＪＭ１０９株についても同様に培養を行い、キサンチンオキシダーゼ活性を測定したが、活性は検出されなかった。【００７４】
実施例４．キサンチンオキシダーゼを修飾するアクセサリータンパク質の共発現
キサンチンオキシダーゼの効率的は発現には、アクセサリータンパク質である、ＸｄｈＣを共発現することが効果的であると考えられ、ＸｄｈＣ遺伝子の共発現を試みた。がＸｄｈＣ、ＸｄｈＡ，  ＸｄｈＢの３つの遺伝子を共発現させるため、以下のプライマーセットを用いて３つの遺伝子を含む領域をクローニングし、大腸菌発現ベクターｐＢＳＫＮにＮｄｅＩとＥｃｏＲＩサイトで導入した。
ＸｄｈＣ＿Ｆ（ＮｄｅＩ）    ａａａａｃａｔＡＴＧＣＴＣＣＡＣＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＧＧＣＴ
ＸｄｈＢ＿Ｒ（ＥｃｏＲＩ）  ａａａａｇａａｔＴＣＡＧＣＧＧＧＴｇＧＧＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣ
作製されたキサンチンオキシダーゼ発現ベクターｐＢＳＫＮ−ＸＴＯを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、形質転換体をＴＢ＋ＩＭ培地（ＴＢ培地＋１ｍＭ  ＩＰＴＧ，＋０．０１ｍＭ  モリブデン酸アンモニウム）で培養し、培養菌体内のキサンチンオキシダーゼ活性を測定した。キサンチンオキシダーゼ活性の検出は、活性測定法Ｉに示す方法で行った。その結果、大腸菌体内に６８Ｕ／Ｌのキサンチンオキシダーゼ活性が検出された。【００７５】
実施例５．大腸菌組換えキサンチンオキシダーゼの取得
発現したキサンチンオキシダーゼが野生株アースロバクター・ルテウスから取得されたものと同等であることを確認するため、大腸菌形質転換体からキサンチンオキシダーゼの精製を試みた。酵素の精製は、菌体の破砕、陰イオンクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーにより行った。取得した酵素液を用いて、酵素特性を評価した。【００７６】
実施例６．大腸菌組換えキサンチンオキシダーゼの特性評価
（１）過酸化水素精製比率の比較
得られた酵素液とアースロバクター・ルテウス野生株が生産するキサンチンオキシダーゼ酵素液、さらに対照として、ミルク由来キサンチンオキシダーゼ酵素液を用いて、活性測定法１及び活性測定法ＩＩで酵素活性測定を行った。結果を表１に示す。【００７７】
【表１】
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【００７８】
表１に示すように、組換えＸＴＯの過酸化水素生成率は、９１％であり、野生株由来ＸＴＯとほぼ同等の過酸化水素生成率であった。一方、牛乳由来ＸＴＯは５２％であった。【００７９】
（２）基質特異性の比較
上記３種のＸＴＯ酵素液を用いて、活性測定法１の基質をキサンチンからヒポキサンチンに代え、同様に酵素活性測定を行った。キサンチンを基質にしたときの酵素活性を１００％とし、ヒポキサンチン基質としたときの酵素活性を求めた。結果を表２に示す。【００８０】
【表２】
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【００８１】
表２に示すように、組換えＸＴＯのヒポキサンチンへの反応性は、キサンチンの約２２％であり、野生株由来ＸＴＯとほぼ同等であった。一方、牛乳由来ＸＴＯは１１４％であった。
以上の結果から、本実施例により得られた組換えキサンチンオキシダーゼは、野生型キサンチンオキシダーゼとほぼ同等の特性を有していることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明によれば、アースロバクター由来の野生型キサンチンオキシダーゼと同等の特性及び安定な品質を有するキサンチンオキシダーゼを微生物により効率的に組換え生産することができる。従って、本発明は、臨床検査などに用いられるキサンチンオキシダーゼを生産するために極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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