(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株またはその誘導体であって、
（ａ）ｒｐｈ遺伝子内の天然の−１フレームシフト突然変異を補完する突然変異の導入により、またはｒｐｈ遺伝子の欠失により、非改変親Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株と比べてオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強し、
（ｂ）ｉｌｖＧ遺伝子における天然の−２フレームシフト突然変異を補完する突然変異の導入によって活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩを産生し、
（ｃ）ｉｃｌＲ遺伝子およびａｒｐＡ遺伝子のすべてまたは一部の欠失によって非改変親Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株と比べてｉｃｌＲおよびａｒｐＡ遺伝子産物の発現を低減するように改変されている、改変Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株またはその誘導体。
【請求項２】
機能的なｒｅｃＡ（ｂ２６９９）遺伝子を欠く、請求項１に記載の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株。
【請求項３】
前記非改変親Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株が、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＭＧ１６５５、Ｗ３１１０、ＤＨ１、ＤＨ１０Ｂ、ＤＨ５α、Ｉｎｖα、Ｔｏｐ１０、Ｔｏｐ１０Ｆ、ＪＭ１０３、ＪＭ１０５、ＪＭ１０９、ＭＣ１０６１、ＭＣ４１００、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＥＣ１００、ＢＷ２９５２、およびＥＣ３００からなる群から選択される、請求項１または２に記載の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株。
【請求項４】
前記非改変親Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株が、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＭＧ１６５５またはＷ３１１０である、請求項３に記載の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株。
【請求項５】
前記非改変親Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株が、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＭＧ１６５５より２％〜４０％小さいように遺伝子操作されたゲノムを有する低減ゲノムＥ．ｃｏｌｉ細菌である、請求項１または２に記載の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株。
【請求項６】
前記非改変親Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株が、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＭＧ１６５５より５％〜３０％小さいように遺伝子操作されたゲノムを有する低減ゲノムＥ．ｃｏｌｉ細菌である、請求項５に記載の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株。
【請求項７】
前記非改変親Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株が、少なくとも以下のＤＮＡセグメント：Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＭＧ１６５５のｂ０２４５〜ｂ０３０１、ｂ０３０３〜ｂ０３１０、ｂ１３３６〜ｂ１４１１、ｂ４４２６〜ｂ４４２７、ｂ２４４１〜ｂ２４５０、ｂ２６２２〜ｂ２６５４、ｂ２６５７〜ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４〜ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２〜ｂ３３３８、ｂ２３４９〜ｂ２３６３、ｂ１５３９〜ｂ１５７９、ｂ４２６９〜ｂ４３２０、ｂ２９６８〜ｂ２９７２、ｂ２９７５〜ｂ２９７７、ｂ２９７９〜ｂ２９８７、ｂ４４６６−４４６８、ｂ１１３７〜ｂ１１７２、ｂ０５３７〜ｂ０５６５、ｂ００１６〜ｂ００２２、ｂ４４１２〜ｂ４４１３、ｂ０５７７〜ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９〜ｂ２３９０、ｂ２３９２〜ｂ２３９５、ｂ０３５８〜ｂ０３６８、ｂ０３７０〜ｂ０３８０、ｂ２８５６〜ｂ２８６３、ｂ３０４２〜ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５〜ｂ１３３３、ｂ２０３０〜ｂ２０６２、ｂ２１９０〜ｂ２１９２、ｂ３２１５〜ｂ３２１９、ｂ３５０４〜ｂ３５０５、ｂ１０７０〜ｂ１０８３、ｂ１８７８〜ｂ１８９４、ｂ１９１７〜ｂ１９５０、ｂ４３２４〜ｂ４３４２、ｂ４３４５〜ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７〜ｂ０５０２、ｂ０７００〜ｂ０７０６、ｂ１４５６〜ｂ１４６２、ｂ３４８１〜ｂ３４８４、ｂ３５９２〜ｂ３５９６、ｂ０９８１〜ｂ０９８８、ｂ１０２１〜ｂ１０２９、ｂ２０８０〜ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０〜ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６〜ｂ３５５８、ｂ４４５５、ｂ１７８６、ｂ０１５０〜ｂ０１５３、およびｂ２９４５が自己から欠失している低減ゲノムＥ．ｃｏｌｉ細菌である、請求項５または６に記載の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株。
【請求項８】
前記非改変親Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株が、少なくとも以下のＤＮＡセグメント：Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＭＧ１６５５のｂ２４８１〜ｂ２４９２、ｂ２２１９〜ｂ２２３０、ｂ４５００、ｂ３７０７〜ｂ３７２３、ｂ０６４４〜ｂ０６５０、ｂ４０７９−４０９０、ｂ４４８７、ｂ４０９２〜ｂ４１０６、ｂ０７３０〜ｂ０７３２、ｂ３５７２〜ｂ３５８７、ｂ１６５３、ｂ２７３５〜ｂ２７４０、ｂ２４０５〜ｂ２４０７、ｂ３８９６〜ｂ３９００、ｂ１２０２、ｂ４２６３〜ｂ４２６８、ｂ０６１１、ｂ２３６４〜ｂ２３６６、ｂ０８３９、ｂ０４８８〜ｂ０５００およびｂ０５０２が自己からさらに欠失している低減ゲノムＥ．ｃｏｌｉ細菌である、請求項６に記載の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株。
【請求項９】
前記非改変親Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株が、少なくとも以下のＤＮＡセグメント：Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＭＧ１６５５のｂ０２４５〜ｂ０３０１、ｂ０３０３〜ｂ０３１０、ｂ１３３６〜ｂ１４１１、ｂ４４２６〜ｂ４４２７、ｂ２４４１〜ｂ２４５０、ｂ２６２２〜ｂ２６５４、ｂ２６５７〜ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４〜ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２〜ｂ３３３８、ｂ２３４９〜ｂ２３６３、ｂ１５３９〜ｂ１５７９、ｂ４２６９〜ｂ４３２０、ｂ２９６８〜ｂ２９７２、ｂ２９７５〜ｂ２９７７、ｂ２９７９〜ｂ２９８７、ｂ４４６６〜４４６８、ｂ１１３７〜ｂ１１７２、ｂ０５３７〜ｂ０５６５、ｂ００１６〜ｂ００２２、ｂ４４１２〜ｂ４４１３、ｂ０５７７〜ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９〜ｂ２３９０、ｂ２３９２〜ｂ２３９５、ｂ０３５８〜ｂ０３６８、ｂ０３７０〜ｂ０３８０、ｂ２８５６〜ｂ２８６３、ｂ３０４２〜ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５〜ｂ１３３３、ｂ２０３０〜ｂ２０６２、ｂ２１９０〜ｂ２１９２、ｂ３２１５〜ｂ３２１９、ｂ３５０４〜ｂ３５０５、ｂ１０７０〜ｂ１０８３、ｂ１８７８〜ｂ１８９４、ｂ１９１７〜ｂ１９５０、ｂ４３２４〜ｂ４３４２、ｂ４３４５〜ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７〜ｂ０５０２、ｂ０７００〜ｂ０７０６、ｂ１４５６〜ｂ１４６２、ｂ３４８１〜ｂ３４８４、ｂ３５９２〜ｂ３５９６、ｂ０９８１〜ｂ０９８８、ｂ１０２１〜ｂ１０２９、ｂ２０８０〜ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０〜ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６〜ｂ３５５８、ｂ４４５５、ｂ１７８６、ｂ０１５０〜ｂ０１５３およびｂ２９４５が自己から欠失している低減ゲノムＥ．ｃｏｌｉである、請求項６に記載の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株。
【請求項１０】
前記非改変親Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株が、少なくとも以下のＤＮＡセグメント：Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＭＧ１６５５のｂ０３１５〜ｂ０３３１、ｂ０３３３〜ｂ０３５４、ｂ０５６６〜ｂ０５７５、ｂ２２０９、ｂ０１６０〜ｂ０１６１、ｂｌ４３１〜ｂｌ４４４、ｂ３６４３、ｂｌ０３７〜ｂｌ０４３、ｂ０３８３、ｂ０２２６〜ｂ０２３４およびｂ２１１５〜ｂ２１３２が自己からさらに欠失している低減ゲノムＥ．ｃｏｌｉ細菌である、請求項８に記載の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株。
【請求項１１】
ｒｅｌＡ遺伝子のコード配列の５４７もしくは５４８位における少なくとも１つの点突然変異を有するｒｅｌＡ遺伝子をコードし、前記突然変異が、５４７位におけるＧ→Ａ突然変異、５４７位におけるＧ→Ｔ突然変異、５４８位におけるＣ→Ｇ突然変異、または５４８位におけるＣ→Ｔ突然変異の１つまたは複数から選択される、請求項１から１０のいずれかに記載の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株。
【請求項１２】
機能的なｐｏｌＢ（ｂ００６０）遺伝子、機能的なｄｉｎＢ（ｂ０２３１）遺伝子、および任意選択で機能的なｕｍｕＤＣ（ｂ１１８３〜ｂ１１８４）遺伝子のうちの１つまたは複数を欠く、請求項１から１１のいずれかに記載の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株。
【請求項１３】
異種核酸を含む、請求項１から１２のいずれかに記載の細菌。
【請求項１４】
前記異種核酸が、発現制御配列に作動可能に連結されたポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項１３に記載の細菌。
【請求項１５】
ポリペプチドを産生するための方法であって、前記ポリペプチドを発現させるのに適した条件下で請求項１４に記載の細菌をインキュベートすることと、前記ポリペプチドを収集することとを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１３年１１月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／９０４，２９８号の利益を主張し、当該出願の内容は本明細書において参考として援用される。
【０００２】
本発明は、発酵による核酸およびタンパク質の産生の増強に特に有用である改善された発酵特性を有する遺伝的に改変されたＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ株誘導体を対象とする。
【背景技術】
【０００３】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、普遍的なクローニング宿主であり、研究および産業の両方においてタンパク質、核酸、代謝産物、および二次代謝産物の産生で使用される最も一般的な生物である。最も重要な新薬の多くは、Ｅ．ｃｏｌｉ内の発酵によって製造され、Ｅ．ｃｏｌｉは、依然としてこのような分子の産生にとって利用可能な最も経済的かつ効率的プラットフォームである。特に、小分子薬物および他の伝統的な処置に対して難治性の健康問題に対処する治療剤。すべての生物治療剤の約３分の１は現在、単鎖抗体を含めてＥ．ｃｏｌｉ内で製造されており、これらは、開発しづらく、かつこれらが作製されるＥ．ｃｏｌｉ株からの限られた収率に部分的に起因して極めて高価である。増殖の停滞は、高密度発酵におけるＥ．ｃｏｌｉパフォーマンスおよび産物形成を頻繁に制限する重大な問題である。
【０００４】
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株は、遺伝学および微生物生理機能における初期の進歩に貢献した。これらは、分子生物学の方法および技法の主力となるものとして機能を果たし続けている。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ株はしばしば、ＳｔｕｄｉｅｒおよびＭｏｆｆａｔによって開拓されたＴ７ポリメラーゼ発現系とともに使用するために操作された株の利用可能性に部分的に起因して、実験室規模でのタンパク質発現プラットフォームとして好まれている［ＳｔｕｄｉｅｒおよびＭｏｆｆａｔ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．１８９巻：１１３頁（１９８６年）；Ｓｔｕｄｉｅｒ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２１９巻：３７頁（１９９１年）］。工業規模で、Ｂ株はまた、Ｔ７ポリメラーゼ以外のタンパク質発現系を用いてさえ、Ｋ−１２株と比べて優れたタンパク質産生特性を有すると認識されている。それでもやはり、これらの株内の挿入配列エレメントおよびプロファージなどの大量の可動性遺伝子エレメントは、ストレス、特に不溶性のまたは有毒な標的を発現するとき遭遇するストレス下で産生問題を引き起こし得る。他方では、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ株は、プラスミドＤＮＡを産生することについてＫ株に劣ると一般に見られている。
【０００５】
Ｅ．ｃｏｌｉのＫ株とＢ株との系統発生的関係はかなり近い。これまで、６０超の多様なＥ．ｃｏｌｉ株が、完全にまたは少なくとも実質的に配列決定され、詳細な系統発生地図が、一連の保存遺伝子（ａｄｋ、ｆｕｍＣ、ｉｃｄ、ｇｙｒＢ、ｍｄｈ、ｐｕｒＡ、およびｒｅｃＡ）内のこれらの株の間の差異に基づいて生成された。すべてのＫ−１２株およびＢ株は、Ｅ．ｃｏｌｉ系統発生地図において単一のクレード内に入る［Ｌｕｋｊａｎｃｅｎｋｏ、Ｗａｓｓｅｎａａｒ、およびＵｓｓｅｒｙ、Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｅｃｏｌ．６０巻：７０８頁（２０１０年）］。すべての現在のＫ−１２株は、１９２０年代後期にＰａｌｏ  Ａｌｔｏのスタンフォード大学で最初に単離されたＣｈａｒｌｅｓ  Ｅ．Ｃｌｉｆｔｏｎの元のＫ−１２株（Ｏ１６、λ＋、Ｆ＋）に由来すると考えられている［Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，  Ｆ．Ｃ．ら、Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓ．  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．１９９６年におけるＢａｃｈｍａｎ］。現存するＢ株は、１９１８年という早期にパリのパストゥール研究所で最初に単離されたＦｅｌｉｘ  ｄ’ＨｅｒｅｌｌｅのＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｌｉ株（Ｏ７、λＲ、Ｆ−）に概ね由来する［Ｄａｅｇｅｌｅｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９４巻：６３４頁（２００９年）］。Ｋ−１２株とＢ株との近い系統発生的関係は、歴史的な観点から興味深い。しかし、細菌の進化およびどのように最新の株が祖先の腸内細菌から分岐してきたかの我々の理解の最近の進歩は、Ｋ株とＢ株との整然とした歴史的関係に質問を投げ掛ける［Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．３９４巻：６５３頁（２００９年）］。とにかく、Ｋ−１２株とＢ株との差異、ならびに異なる研究および産業上の用途についてのこれらの相対的な利点の認識は、概ね経験的な知見に基づく。
本分野では、Ｋ−１２株の遺伝的取り扱いやすさおよび優れたＤＮＡ産生能力を伴ったＢ株の優れた増殖特性およびタンパク質産生特性を有する単一株プラットフォームが長く望まれている。このようなＥ．ｃｏｌｉ株は、多様なスペクトルの産物にわたって増殖を最適化し、収率を最大化するための標準的な発酵レジメンの開発を促進することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＳｔｕｄｉｅｒおよびＭｏｆｆａｔ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．１８９巻：１１３頁（１９８６年）
【非特許文献２】Ｓｔｕｄｉｅｒ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２１９巻：３７頁（１９９１年）
【非特許文献３】Ｌｕｋｊａｎｃｅｎｋｏ、Ｗａｓｓｅｎａａｒ、およびＵｓｓｅｒｙ、Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｅｃｏｌ．６０巻：７０８頁（２０１０年）
【非特許文献４】Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，  Ｆ．Ｃ．ら、Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓ．  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．１９９６年
【非特許文献５】Ｄａｅｇｅｌｅｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９４巻：６３４頁（２００９年）
【非特許文献６】Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．３９４巻：６５３頁（２００９年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、フェドバッチ発酵における増殖の改善ならびに組換えタンパク質および核酸の産生の改善を伴った遺伝的に改変されたＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株を提供する。
【０００８】
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株を、（ａ）オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強し、（ｂ）活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩを産生し、（ｃ）ｉｃｌＲおよびａｒｐＡ遺伝子産物の発現を低減するように改変する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本発明は、（ａ）オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強し、（ｂ）活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩを産生し、（ｃ）ｉｃｌＲおよびａｒｐＡ遺伝子産物の発現を低減するように改変された低減ゲノムＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株を提供する。一態様では、低減ゲノムＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ株のゲノムは、その天然親株のゲノムより約５％〜約３０％小さいように遺伝子操作されており、すべての挿入配列を欠くゲノムを有する。低減ゲノム細菌は、細菌の天然親株から選択された遺伝子を欠失させることによって産生される場合があり、または例えば、予め選択された遺伝子のアセンブリーとして完全に合成され得る。本明細書の論述から直ちに明らかであるように、低減ゲノム細菌は、それが比較される天然親株中に見つかる遺伝子の相補物の全てより少ない数量を有し、比較される天然親株一定の必須の遺伝子を共有する。
【００１０】
本発明の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株を使用してポリペプチドを産生するための方法も提供される。一実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドを発現するのに適した条件下で、発現制御配列に作動可能に連結されたポリペプチドをコードする核酸を含む改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株を培養することによって産生される。一態様では、核酸は、異種タンパク質をコードする。関連した態様では、タンパク質は、本明細書に記載の改変を含まないＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株より高いレベルで、本発明の改変Ｅ．ｃｏｌｉ株内で産生される。さらに別の態様では、タンパク質産生は、このような改変細胞が同じ増殖条件下で達することができるより高い細胞数によって、本明細書に記載の改変を含まないＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株からより高いレベルで増大する。
【００１１】
本発明の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株を使用する異種核酸（例えば、プラスミドなどのベクター）を増幅するための方法も提供される。一実施形態では、核酸は、適当な栄養条件下で異種核酸を含む改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ株を培養し、それにより核酸を増幅することによって産生される。さらに別の態様では、核酸産生は、このような改変細胞が同じ増殖条件下で達することができるより高い細胞数によって、本明細書に記載の改変を含まないＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株からより高いレベルで増大する。
【００１２】
本発明のこれらおよび他の実施形態を、以下で本明細書により詳細に記載する。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
（ａ）非改変親Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株と比べてオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強し、
（ｂ）活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩを産生し、
（ｃ）非改変親Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株と比べてｉｃｌＲおよびａｒｐＡ遺伝子産物の発現を低減する
ように改変されている、改変Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株またはその誘導体。
（項目２）
機能的なｒｅｃＡ（ｂ２６９９）遺伝子を欠く、項目１に記載の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株。
（項目３）
ｒｐｈ遺伝子を欠失させることによってオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強するように改変されている、項目１または２に記載の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株。
（項目４）
ｉｌｖＧ遺伝子における天然の−２フレームシフト突然変異を補完する突然変異の導入によって活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩを産生するように改変されている、前記項目のいずれかに記載の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株。
（項目５）
ｉｃｌＲ遺伝子およびａｒｐＡ遺伝子を欠失させることによって前記ｉｃｌＲおよびａｒｐＡ遺伝子産物の発現を低減するように改変されている、前記項目のいずれかに記載の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株。
（項目６）
前記非改変親Ｅ．ｃｏｌｉ株が、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ株ＭＧ１６５５、Ｗ３１１０、ＤＨ１、ＤＨ１０Ｂ、ＤＨ５α、Ｉｎｖα、Ｔｏｐ１０、Ｔｏｐ１０Ｆ、ＪＭ１０３、ＪＭ１０５、ＪＭ１０９、ＭＣ１０６１、ＭＣ４１００、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＥＣ１００、ＢＷ２９５２、およびＥＣ３００からなる群から選択される、前記項目のいずれかに記載の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ株。
（項目７）
前記非改変親Ｅ．ｃｏｌｉ株が、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ株ＭＧ１６５５またはＷ３１１０である、項目６に記載の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ株。
（項目８）
前記非改変親Ｅ．ｃｏｌｉ株が、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＧ１６５５より約２％〜約４０％小さい、好ましくは約５％〜約３０％小さいように遺伝子操作されたゲノムを有する低減ゲノムＥ．ｃｏｌｉ細菌である、項目１から５のいずれか一項に記載の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ株。
（項目９）
前記非改変親Ｅ．ｃｏｌｉ株が、少なくとも以下のＤＮＡセグメント：Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＭＧ１６５５のｂ０２４５〜ｂ０３０１、ｂ０３０３〜ｂ０３１０、ｂ１３３６〜ｂ１４１１、ｂ４４２６〜ｂ４４２７、ｂ２４４１〜ｂ２４５０、ｂ２６２２〜ｂ２６５４、ｂ２６５７〜ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４〜ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２〜ｂ３３３８、ｂ２３４９〜ｂ２３６３、ｂ１５３９〜ｂ１５７９、ｂ４２６９〜ｂ４３２０、ｂ２９６８〜ｂ２９７２、ｂ２９７５〜ｂ２９７７、ｂ２９７９〜ｂ２９８７、ｂ４４６６−４４６８、ｂ１１３７〜ｂ１１７２、ｂ０５３７〜ｂ０５６５、ｂ００１６〜ｂ００２２、ｂ４４１２〜ｂ４４１３、ｂ０５７７〜ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９〜ｂ２３９０、ｂ２３９２〜ｂ２３９５、ｂ０３５８〜ｂ０３６８、ｂ０３７０〜ｂ０３８０、ｂ２８５６〜ｂ２８６３、ｂ３０４２〜ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５〜ｂ１３３３、ｂ２０３０〜ｂ２０６２、ｂ２１９０〜ｂ２１９２、ｂ３２１５〜ｂ３２１９、ｂ３５０４〜ｂ３５０５、ｂ１０７０〜ｂ１０８３、ｂ１８７８〜ｂ１８９４、ｂ１９１７〜ｂ１９５０、ｂ４３２４〜ｂ４３４２、ｂ４３４５〜ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７〜ｂ０５０２、ｂ０７００〜ｂ０７０６、ｂ１４５６〜ｂ１４６２、ｂ３４８１〜ｂ３４８４、ｂ３５９２〜ｂ３５９６、ｂ０９８１〜ｂ０９８８、ｂ１０２１〜ｂ１０２９、ｂ２０８０〜ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０〜ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６〜ｂ３５５８、ｂ４４５５、ｂ１７８６、ｂ０１５０〜ｂ０１５３、およびｂ２９４５が自己から欠失している低減ゲノムＥ．ｃｏｌｉ細菌である、項目８に記載の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ株。
（項目１０）
前記非改変親Ｅ．ｃｏｌｉ株が、少なくとも以下のＤＮＡセグメント：Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＭＧ１６５５のｂ２４８１〜ｂ２４９２、ｂ２２１９〜ｂ２２３０、ｂ４５００、ｂ３７０７〜ｂ３７２３、ｂ０６４４〜ｂ０６５０、ｂ４０７９−４０９０、ｂ４４８７、ｂ４０９２〜ｂ４１０６、ｂ０７３０〜ｂ０７３２、ｂ３５７２〜ｂ３５８７、ｂ１６５３、ｂ２７３５〜ｂ２７４０、ｂ２４０５〜ｂ２４０７、ｂ３８９６〜ｂ３９００、ｂ１２０２、ｂ４２６３〜ｂ４２６８、ｂ０６１１、ｂ２３６４〜ｂ２３６６、ｂ０８３９、ｂ０４８８〜ｂ０５００、ｂ０５０２が自己からさらに欠失している低減ゲノムＥ．ｃｏｌｉ細菌である、項目９に記載の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ株。
（項目１１）
前記非改変親Ｅ．ｃｏｌｉ株が、低減ゲノムＥ．ｃｏｌｉ株ＭＤＳ４２である、項目９に記載の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ株。
（項目１２）
前記非改変親Ｅ．ｃｏｌｉ株が、低減ゲノムＥ．ｃｏｌｉ株ＭＤＳ６９である、項目１０に記載の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ株。
（項目１３）
前記ｒｅｌＡ遺伝子のコード配列の５４７もしくは５４８位における少なくとも１つの点突然変異を有するｒｅｌＡ遺伝子をコードし、前記突然変異が、５４７位におけるＧ→Ａ突然変異、５４７位におけるＧ→Ｔ突然変異、５４８位におけるＣ→Ｇ突然変異、または５４８位におけるＣ→Ｔ突然変異の１つまたは複数から選択される、前記項目のいずれかに記載の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ株。
（項目１４）
機能的なｐｏｌＢ（ｂ００６０）、ｄｉｎＢ（ｂ０２３１）、およびｕｍｕＤＣ（ｂ１１８３〜ｂ１１８４）遺伝子を欠く、前記項目のいずれかに記載の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ株。
（項目１４）
異種核酸を含む、前記項目のいずれかに記載の細菌。
（項目１５）
前記異種核酸が、発現制御配列に作動可能に連結されたポリペプチドをコードする核酸を含む、項目１４に記載の細菌。
（項目１６）
ポリペプチドを産生するための方法であって、前記ポリペプチドを発現させるのに適した条件下で項目１５に記載の細菌をインキュベートすることと、前記ポリペプチドを収集することとを含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、非改変親低減ゲノムＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ株（ＭＤＳ４２、ＭＤＳ４２ｒｅｃＡ、Ｔ６９、およびＴ６９ｒｅｃＡ）と比較し、かつ天然の親Ｋ１２株ＭＧ１６５５およびＢ株ＢＬ２１（ＤＥ３）と比較した、低減ゲノムＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株（ＭＤＳ４２（ｍｅｔａ）、ＭＤＳ４２ｒｅｃＡ（ｍｅｔａ）、Ｔ６９（ｍｅｔａ）、およびＴ６９ｒｅｃＡ（ｍｅｔａ））に対する代謝突然変異（ｒｐｈおよびｉｌｖＧフレームシフト突然変異の補正ならびにｉｃｌＲおよびａｒｐＡ遺伝子の欠失）の効果を例示する。対数期におけるＥ．ｃｏｌｉの増殖は、式Ｍ（ｔ）＝Ｍ（０）ｅμｔに従い、式中、Ｍ（ｔ）は、ｈｒでの時間の関数としての細胞量であり、ｅは、自然対数の底であり（約２．７１８３）、ｍｕ（μ）は、ｈｒ−１での指数関数的な増殖速度として定義される。Ｍｕ（μ）は、増殖曲線データをこの関数にフィッティングすることによって測定することができる。Ｅ  ｃｏｌｉの株の固有増殖速度は、ここで行ったような希釈培養液（ＯＤ６００＜１）中に３７℃の．２％グルコースを含むナイトハルトのＭＯＰＳ最少培地中、１００ｒｐｍでの振盪フラスコ内などの標準条件下で測定されるｍｕ（μ）である。図１では、固有増殖速度（ｘ軸）および最大発酵ＯＤ（発酵性、すなわち、発酵生産性）（ｙ軸）が、矢印で接続して示した同質遺伝子対（改変を除いて同じ遺伝的背景を有する株）でプロットされている。Ｔ６９は、ＭＤＳ６９、ＭＤＳ４２の全ての欠失および２７の追加の欠失を含む複数欠失株である。標準条件下での固有増殖速度と発酵性との間の絶対相関の欠如に留意されたい。一部の例では、より高い発酵性を有する株は、より低い固有増殖速度を呈する。より高い増殖速度を実現するためのゲノム改変は、必ずしもより良好な産生株（すなわち、標的収率の増大）をもたらさない場合があり、したがって経験的に試験されなければならない。
【００１４】
【図２】図２は、コンピュータ制御ポンプを介してグルコースを供給されたＫｏｒｚ最少培地（Ｋｏｒｚ  ＤＪら、Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３９巻（１号）：５９〜６５頁（１９９５年））中で１０Ｌスケールにて実施した３つの並列の発酵（＃１０５、＃１０２、および＃９８）を例示する。ＩＰＴＧで誘導されると試験タンパク質を発現するＩＰＴＧ誘導プロモーターを担持するプラスミドを担持するＥ．ｃｏｌｉ  ＭＤＳ６９ｒｅｃＡ（ｍｅｔａ）を、７時間のバッチ相、その後の０．３ｈｒ１のｍｕでの１４時間の指数関数的グルコース供給によって２５０〜３００のＯＤ６００まで２１時間以内に増殖させた。次いでＩＰＴＧを７５マイクロモルまで添加し、供給を、示したような３つの異なる一定の生産供給速度に調整した。ＯＤ６００を対数尺度で左のｙ軸に沿ってプロットし、時間をｘ軸に沿ってプロットする。発酵槽内の１リットル当たりのグラムでの産物形成（右のｙ軸上の均等目盛）を、誘導時間後の２０〜４８時間についてプロットする。産物は、ゲル対ＢＳＡ標準をスキャンすることによって測定した。例えば、示した時点での産物形成を示す挿入図のゲル写真は、発酵番号１０５、試験した最大供給速度についてである。誘導後、細胞量は、代謝的に活性なままであり、産生は、多くの時間にわたって継続し、非常に高い産物レベルを実現し、ＯＤは、低下しない。
【００１５】
【図３】発酵番号１０５の最後に、細胞生存能を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）ＢａｃＬｉｇｈｔ（商標）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ  １４０７２）、その後顕微鏡検査を使用して評価した（図３）。アッセイは、死細胞および細胞溶解がほとんどまったく観察されなかったことを示す。これは、標的タンパク質の収率の増大と相まって、標的タンパク質誘導が、以前は細胞増殖のみに充てられた細胞リソースを標的産生へと再指示することを確認する。具体的には、細菌細胞をＢａｃｌｉｇｈｔ（商標）試薬で１５分間処置し、次いでＬｅｉｃａ  ＤＭＩ  ３０００蛍光顕微鏡を使用して画像化した。ヨウ化プロピジウム（緑色、左パネル）またはＳＹＴＯ９（赤色、右パネル）で染色された細胞は、それぞれ生細胞または死細胞を示した。パーセント生細胞は、９９％超であった。フェドバッチ発酵は、Ｋｏｒｚ最少培地中で２６時間であった。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、様々な形態で具現化することができるが、いくつかの実施形態の以下の記載を、本開示が、本発明の例証として見なされるべきであり、本発明を例示した具体的な実施形態に限定するように意図されていないという理解で行う。表題は、便宜のためだけに示されており、いずれの様式でも本発明を限定するように解釈されるべきでない。いずれかの表題の下で例示した実施形態は、任意の他の表題の下で例示した実施形態と組み合わせてもよい。
【００１７】
本願で指定される様々な範囲内の数値の使用は、別段に明白に示されていない限り、述べた範囲内の最小値および最大値がともに、単語「約」が前に付いているように近似として述べられている。このようにして、述べた範囲より上および下のわずかな変動を、範囲内の値と実質的に同じ結果を実現するように使用することができる。本明細書において使用する用語「約」および「およそ」は、数値を指す場合、問題となっている関係する技術分野における当業者にとってその平易な通常の意味を有するものとする。また、範囲の開示は、列挙した最小値と最大値との間のあらゆる値を含む連続的な範囲、およびこのような値によって形成され得る任意の範囲として意図されている。これは、有限の上方境界および／または下方境界を含む、または含まない形成され得る範囲を含む。これは、所与の開示した数字を除して別の開示される数字にすることによって導き出せる比も含む。したがって、当業者は、多くのこのような比、範囲、および比の範囲を、本明細書に提示のデータおよび数から明白に導出することができ、すべてが本発明の様々な実施形態を代表することを察知するであろう。
【００１８】
「低減ゲノム」細菌は、本明細書において、そのゲノム（例えば、タンパク質コード遺伝子）の約１％〜約７５％が欠失した、例えば、ゲノムの約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、または約６０％が欠失した細菌を意味する。一実施形態では、本発明の実行において使用される低減ゲノム細菌は、好ましくは、天然親株のゲノムより少なくとも２パーセント（２％）および最大で２０パーセント（２０％）（その間の任意の数を含む）小さいように遺伝子操作されているゲノムを有する。好ましくは、ゲノムは、天然親株のゲノムより少なくとも５パーセント（５％）および最大で３０パーセント（３０％）小さい。より好ましくは、ゲノムは、天然親株のゲノムより８パーセント（８％）〜１４パーセント（１４％）〜２０パーセント（２０％）（その間の任意の数を含む）、またはそれより小さい。代わりに、ゲノムは、天然親株のゲノムより２０％未満、３０％未満、４０％未満、または５０％未満小さいように操作され得る。用語「天然親株」は、株系統の原種を代表すると科学界によって一般に理解されており、かつそのゲノムの一連の欠失がより小さいゲノムを有する菌株を生成するように行われ得る自然環境または天然環境において見つかる菌株を意味する。天然親株は、操作された株が比較される株も指し、操作された株は、天然親株の相補物の全てより少ない量を有する。ゲノムが一連の欠失後により小さくなった百分率は、「すべての欠失の後の欠失した塩基対の総数」を、「すべての欠失の前のゲノム中の塩基対の総数」によって除し、次いで１００を乗じることによって計算される。同様に、ゲノムが天然親株より小さい百分率は、より小さいゲノムを有する株（それが産生されるプロセスにかかわらず）中のヌクレオチドの総数を、天然親株中のヌクレオチドの総数によって除し、次いで１００を乗じることによって計算される。
【００１９】
一実施形態では、「低減ゲノム」細菌は、上記量のゲノムの除去が最少培地上で増殖する生物の能力に容認しがたく影響しない細菌を意味する。本脈絡において２個またはそれ超の遺伝子の除去が最少培地上で増殖する生物の能力に「容認しがたく影響する」か否かは、具体的な用途に依存する。例えば、増殖速度の３０％の低減は、一用途については許容される場合があるが、別の用途については許与されない場合がある。さらに、ゲノムからＤＮＡ配列を欠失させることの有害作用は、培養条件の変更などの対策によって低減され得る。このような対策は、さもなければ容認できない有害作用を許容されるものに変えることができる。一実施形態では、増殖速度は、親株とおよそ同じである。しかし、親株の増殖速度より約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％〜約５０％低い範囲の増殖速度は、本発明の範囲内にある。より具体的には、本発明の細菌の倍加時間は、約１５分〜約３時間に及びうる。適当な低減ゲノム細菌の非限定的な例、およびＥ．ｃｏｌｉなどの細菌からＤＮＡを欠失させるための方法は、米国特許第６，９８９，２６５号、同第７，３０３，９０６号、同第８，１１９，３６５号、同第８，０３９，２４３号、および同第８，１７８，３３９号に開示されており、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれている。
【００２０】
本明細書で使用する用語「ｂ番号」は、Ｂｌａｔｔｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７巻：１４５３〜１４７４頁（１９９７年）に記載されたＫ−１２ＭＧ１６５５株の各遺伝子に割り当てられたユニークなＩＤを指す。
【００２１】
いくつかの実施形態では、（ａ）オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強し、（ｂ）活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩを産生し、（ｃ）ｉｃｌＲおよびａｒｐＡ遺伝子産物の発現を低減するように遺伝的に改変されたＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株細菌が提供される。改変のこの組合せを含むＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ株細菌は、同じ遺伝的背景を有するが、改変のこの組合せを含まないＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株細菌と比較して、実質的に改善された発酵性（すなわち、発酵生産性）および増殖特性を呈することが判明した。改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ株細菌は、意外にも、特に最少培地中で増殖される場合、タンパク質を産生させ、核酸を広めるのに有用である。
【００２２】
ピリミジンヌクレオチドの合成を触媒する酵素であるＥ．ｃｏｌｉオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼは、ｂ番号ｂ３６４２であるｐｙｒＥ遺伝子によってコードされる。ｐｙｒＥ遺伝子は、二価陽イオンおよびリン酸に依存性のｔＲＮＡプロセシング酵素であるリボヌクレアーゼＰＨをコードするｒｐｈ遺伝子を含むオペロン中に存在する。ｒｐｈ遺伝子（ｂ３６４３）は、ｐｙｒＥの上流に位置する。ｐｙｒＥ遺伝子は、転写をトランケートし、下流のｐｙｒＥ遺伝子の極性発現欠陥を引き起こすｒｐｈ遺伝子のコード領域内の−１フレームシフト突然変異に起因して、ＭＧ１６５５およびＷ３３１０などのＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株中では最適未満のレベルにて発現される。この突然変異は、Ｊｅｎｓｅｎ、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５巻：３４０１頁（１９９３年）において最初に記載された。その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第８，２９３，５０５号には、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強された微生物中のＬ−アミノ酸の産生が記載されている。オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼを増強するためのＵ．Ｓ．８，２９３，５０５に記載の方法のいずれも、本発明の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株細菌を創製するのに使用され得る。本発明の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株細菌を産生するために補正することができるｒｐｈフレームシフト突然変異を持つＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株の代表例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＭＧ１６５５、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＣＲ６３、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株Ｋ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株Ｗ３３４５０、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株Ｗ３６２３、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株５９４、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＩＡＭ１２６４、およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株Ｗ３１１０がある。
【００２３】
本発明の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株中のオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性の増強は、野生型（例えば、ＭＧ１６５５）もしくは非改変株のものと比較した１細胞当たりのオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ分子の数の増加、または野生型もしくは非改変株の細胞ものと比較した細胞内のオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性の増大に対応する。オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性の増強は、細菌によって産生されるオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの比活性を測定することによって、例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ，  Ｍ．およびＮｅｕｈａｒｄ、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１２１巻：８１４〜８２２頁（１９７５年）に記載の酵素アッセイ、またはＰｏｕｌｓｅｎら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３５巻：２２３〜２２９頁（１９８３年）の方法によって評価することができる。ｒｐｈフレームシフト突然変異を含むＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株は、約５〜２０単位のオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を生じさせ、一方、野生型ｒｐｈ遺伝子（フレームシフト突然変異を含まない）を有するＥ．ｃｏｌｉ株は、約３０〜９０単位のオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ比活性レベルを呈する。好ましくは、本発明の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株は、少なくとも約３０単位のオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ比活性を呈する。
【００２４】
いくつかの態様では、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性は、野生型株などの親株またはその他の点では同じ遺伝的背景を有する非改変株と比べてコード遺伝子の発現を増大させる改変によって増強することができる。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株ｒｐｈ−ｐｙｒＥオペロンのヌクレオチド配列は、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第８，２９３，５０５号の配列番号１１に記載されている。ｒｐｈのコード領域は、ヌクレオチド１〜６８７に対応し、ｐｙｒＥのコード領域は、配列番号１１のヌクレオチド７８２〜１４２３に対応する。−１フレームシフト突然変異は、配列番号１１の６６７位と６７１位との間のｒｐｈ遺伝子の３’末端で起こり、ｐｙｒＥ遺伝子産物の翻訳の減少をもたらす。
【００２５】
一態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株を遺伝子操作して、天然のｒｐｈ遺伝子配列を−１フレームシフト突然変異を含有しないＥ．ｃｏｌｉ株に由来するｒｐｈ遺伝子の配列に置き換えることができる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  Ｑ１３株およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ３０（Ｅ＋）株のｒｐｈは、フレームシフト突然変異を含有しないｒｐｈ遺伝子を持つ。さらに、野生型ｒｐｈ−ｐｙｒＥオペロン（フレームシフト突然変異を含まない）のヌクレオチド配列が、受託番号Ｘ００７８１およびＸ０１７１３の下でＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬから利用可能である。
【００２６】
別の態様では、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性は、ｒｐｈ遺伝子のコード領域内の天然の−１フレームシフト突然変異を相殺する（すなわち、補完する）突然変異を導入することによって増強することができる。例えば、＋１または−２突然変異は、６７０位と６７１位との間の単一ヌクレオチドの挿入など、ｒｐｈ遺伝子の３’末端の下流およびｐｙｒＥ遺伝子の上流の領域中に導入することができる。関連した態様では、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性は、フレームシフトを補正し、ｒｐｈのコード領域をｐｙｒＥの翻訳開始部位のより近くに動かす効果を有するアテニュエーターの上流の領域中の欠失によって増強することができる。例えば、米国特許第８，２９３，５０５号の配列番号１１の６１０〜６９１のヌクレオチド配列を欠失させることができ、ｒｐｈ−ｐｙｒＥオペロンの得られるヌクレオチド配列は、米国特許第８，２９３，５０５号の配列番号１４に記載されている。さらに別の態様では、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性は、ｒｐｈコード配列を完全に除去して、ｒｐｈ−ｐｙｒＥオペロンのプロモーターをｐｙｒＥの翻訳開始部位のより近くに動かす欠失によって増強することができる。この実施形態では、米国特許第８，２９３，５０５号の配列番号１１のヌクレオチド１〜６８７が欠失する。意外にも、ｒｐｈコード領域全体の欠失は、細胞増殖または生存能に対して有害な効果を有さない。
【００２７】
アセトヒドロキシ酸シンターゼは、細菌内の分枝鎖アミノ酸の合成における最も早いステップを触媒する。アセトヒドロキシ酸シンターゼの３種のアイソザイム：アセトヒドロキシ酸シンターゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩがＥ．ｃｏｌｉ中に存在する。Ｅ．ｃｏｌｉアセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩは通常、ｉｌｖＧ遺伝子によってコードされる大きいサブユニット、およびｉｌｖＭ遺伝子（ｂ３７６９）によってコードされる小さいサブユニットからなる。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＭＧ１６５５のｉｌｖＧ配列は、原形が損なわれており、実際には、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ７７４８８．１に示された偽遺伝子（ｂ番号ｂ４４８８）である。ｉｌｖＧ偽遺伝子は、２つの別個のコード配列、ｉｌｖＧ＿１（ｂ３７６７）およびｉｌｖＧ＿２（ｂ３７６８）からなる。ＭＧ１６５５などのＫ−１２株中のｉｌｖＧ偽遺伝子配列は、他のＥ．ｃｏｌｉ株（例えば、Ｂ株、Ｏ株など）中に見つかるインタクトなｉｌｖＧ遺伝子と比べて、９８３位および９８４位でヌクレオチドＧＴの欠失を含む。これらのヌクレオチドの欠失は、フレームシフト突然変異をもたらし、Ｋ−１２  ｉｌｖＧ偽遺伝子配列の９８２位〜９８４位のヌクレオチドＴＧＡは、ｉｌｖＧ＿１に対応するｉｌｖＧのトランケート型をもたらす早発性終止コドンとして機能を果たす。したがって、ｉｌｖＧの通常の遺伝子産物は発現されず、アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩは、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株中に存在しない。
【００２８】
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第７，３００，７７６号の方法のいずれかによって、活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩを産生するように改変することができる。一態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株は、それが欠失突然変異を有さないｉｌｖＧ遺伝子（例えば、米国特許第７，３００，７７６号の配列番号３および５で記載されたものなどの野生型ｉｌｖＧ遺伝子配列に対応する配列を有するｉｌｖＧ遺伝子）を宿すように改変される。代わりに、突然変異は、−２フレームシフト突然変異を補正するｉｌｖＧ偽遺伝子中に導入することができる。一態様では、ＧＴは、米国特許第７，３００，７７６号の配列番号１（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｉｌｖＧヌクレオチド配列に対応する）中の９８２位のＴと９８３位のＧとの間に挿入される。別の態様では、終止コドンを導入しないこの領域内の任意の２つの塩基挿入は、リーディングフレームを正しいフレーム中にシフトして戻す機能を果たすことができる。例えば、９８２位におけるＡＴジヌクレオチドの挿入は、活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩタンパク質の発現を回復させることになる。さらに他の態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｉｌｖＧ遺伝子は、ｉｌｖＧ遺伝子の９８４位の上流の領域内の１または４つのヌクレオチドを欠失させて、ＴＧＡコドンをフレームから取り除くことによって、活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩを産生するように改変することができる。例えば、９７９位のヌクレオチドＣが欠失し得る。
【００２９】
本発明の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ株内のインタクトな全長アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩの産生は、例えば、抗体を使用するウエスタンブロッティングによって改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株細菌内のｉｌｖＧ遺伝子によってコードされるタンパク質の産生を測定することによって評価することができる。さらに、アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩ活性は、Ｌａｗｔｈｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、７８巻：９２２〜９２５頁（１９８１年）に記載されているように、イソロイシンを補充することなく過剰のバリンの存在下で増殖するＥ．ｃｏｌｉ株の能力によって容易に検出することができる。
【００３０】
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ株のｉｃｌＲ遺伝子およびａｒｐＡ遺伝子は、それぞれグリオキシル酸シャント酵素およびアセチル−ＣｏＡシンテターゼの発現をモジュレートする調節タンパク質をコードする隣接する遺伝子である。ｉｃｌＲ（イソクエン酸リアーゼ制御因子）遺伝子、ｂ番号ｂ４０１８は、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅＩＤ  Ｎｏ．９４８５２４に記載されている。ａｒｐＡ（アンキリン様制御因子タンパク質）遺伝子、ｂ番号ｂ４０１７は、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅＩＤ  Ｎｏ．９４４９３３に記載されている。ａｒｐＡ遺伝子は、Ｋ−１２株配列と比べてＢＬ２１ＤＥ３およびＲＥＬ６０６などのＢ株のゲノム配列中で部分的に欠失していることが判明した。
【００３１】
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株は、コード配列中の突然変異（すなわち、野生型配列と比較した１つまたは複数のヌクレオチドの変化）を導入することによって、例えば、ｉｃｌＲおよびａｒｐＡ遺伝子産物の機能の低減または機能の喪失をもたらす１つまたは複数のヌクレオチドの置換、反転、欠失、または挿入によってｉｃｌＲおよびａｒｐＡ遺伝子産物の発現を低減するように改変することができる。一態様では、ナンセンスまたはミスセンス突然変異が核酸コード配列中に導入される場合があり、それによりコドンが終止コドンに変更され、またはそれによりコドンが異なるアミノ酸のコードに変更され、いずれの場合も低減された機能または機能喪失を有する得られるタンパク質をもたらす。他の態様では、フレームシフト突然変異が導入される場合があり、その結果、ｍＲＮＡ配列のリーディングフレームが変更され、異なるアミノ酸配列、および同時に低減された機能または機能の喪失を有するタンパク質をもたらす。他の態様では、調節配列（例えば、プロモーター）中の突然変異が導入される場合があり（すなわち、１つまたは複数のヌクレオチドが野生型配列と比べて変更される）、その結果、遺伝子の転写が低減または排除される。好適な態様では、ｉｃｌＲ遺伝子およびａｒｐＡ遺伝子は、ｉｃｌＲおよびａｒｐＡの遺伝子配列のすべてまたは一部の欠失によって、例えば、米国特許第６，９８９，２６５号の８列、４５行〜１４列、４１行で記載されている「傷跡のない」欠失法によって不活化される（すなわち、非機能的にされる）。
【００３２】
限定することなく、ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４７０７６）、Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２７３２５）、ＤＨ１、ＤＨ１０Ｂ、ＤＨ５α、Ｉｎｖα、Ｔｏｐ１０、Ｔｏｐ１０Ｆ、ＪＭ１０３、ＪＭ１０５、ＪＭ１０９、ＭＣ１０６１、ＭＣ４１００、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＥＣ１００、ＢＷ２９５２、ＥＣ３００などのＫ−１２株を含めた任意の親Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株を改変して本発明の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株を創製することができる。好適な一実施形態では、親Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株は、ＭＧ１６５５またはＷ３１１０である。親Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株のゲノムのヌクレオチド配列は、部分的または完全に公知である場合がある。いくつかのＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株の完全なゲノム配列が公知である（例えば、Ｂｌａｔｔｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７巻：１４５３〜７４頁（１９９７年）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０００９６；ＮＣＢＩデータベース、受託番号ＡＰ００９０４８（Ｗ３１１０）、ＥＭＢＬ受託番号ＣＰ０００９４８（ＤＨ１０Ｂ）、ＥＭＢＬ受託番号ＣＰ００１６３７（ＤＨ１）、およびＥＭＢＬ受託番号ＣＰ００１３９６（ＢＷ２９５２）を参照、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれている）。
【００３３】
特に好適な実施形態では、本発明の細菌を創製するように改変されているＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株は、低減ゲノム株である。Ｅ．ｃｏｌｉ低減ゲノム細菌は、好ましくは、天然親株Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株のゲノムより、５％から３０％の間などの少なくとも２パーセント（２％）および最大で４０パーセント（４０％）（その間の任意の数を含む）小さいように遺伝子操作されたゲノムを有する。低減ゲノム株を創製するように遺伝子操作された（次いで低減ゲノム株は、本発明の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株細菌を創製するようにさらに改変される）天然親Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株は、部分的または完全に公知の配列を有する任意の利用可能なＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株細菌であり得る。好適な実施形態では、低減ゲノムＥ．ｃｏｌｉを創製するのに使用される天然親Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株は、４，６３９，６７４塩基対を有するゲノムを有するＫ−１２株ＭＧ１６５５（注釈付きバージョンｍ５６、ＮＣＢＩ受託番号Ｕ０００９６１）である。別の好適な実施形態では、低減ゲノム細菌は、４．４１Ｍｂから３．７１Ｍｂの間、４．４１Ｍｂから３．２５Ｍｂの間、または４．４１Ｍｂから２．７８Ｍｂの間であるゲノムを有する。
【００３４】
様々なタンパク質コード遺伝子を欠失させて低減ゲノム細菌を形成することができる。Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌では、欠失し得るＤＮＡ配列のタイプには、一般に、生物またはその生物の遺伝子産物の安定性に悪影響するものが含まれる。不安定性を生じさせるエレメントとしては、限定することなく、転位エレメント、挿入配列、およびゲノム不安定性に役割を果たし得る他の「利己的ＤＮＡ」エレメントがある。例えば、挿入配列（ＩＳ）エレメントおよびこれらの関連した転位体（ｔｒａｎｓｐｏｓｅ）は、しばしば細菌ゲノム中に見つかり、したがって欠失の標的である。ＩＳ配列は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で共通であり、これらのすべてが欠失してもよい。本文献における明確さの目的で、本発明者らは、ゲノム中の一ポイントから別のポイントに移動することができる、インタクトであっても欠損していてもＤＮＡエレメントを指すのに一般的に用語ＩＳエレメントおよび転位エレメントを使用する。科学および技術におけるＩＳエレメントの有害な効果の一例は、これらが、配列決定のための伝播中に宿主Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムからプラスミド中にホップし得るという事実である。この人為結果は、すべてのＩＳエレメントの宿主細胞からの欠失によって防止することができる。具体的な用途について、ゲノム不安定性に関連した他の特定の遺伝子、例えば、活性および不活性プロファージなども欠失し得る。
【００３５】
本発明の低減ゲノム細菌は、例えば、限定することなく、細菌の増殖および代謝に不要なある特定の遺伝子、偽遺伝子、プロファージ、望ましくない内因性制限改変遺伝子、病原性遺伝子、毒素遺伝子、線毛遺伝子、周辺質タンパク質遺伝子、インベイシン遺伝子、リポ多糖遺伝子、クラスＩＩＩ分泌系、ファージ毒性決定基、ファージ受容体、病原性島、ＲＨＳエレメント、未知の機能の配列、ならびに細菌の同じ天然親種の２つの株間で共通して見つからない配列を欠いているように操作される場合もある。細胞生存に要求されない他のＤＮＡ配列も欠失または省略され得る。
【００３６】
特に好適な実施形態では、天然親Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ株のゲノムより５パーセント（５％）から３０パーセント（３０％）の間で小さいゲノムを有し、すべての挿入配列（ＩＳ）エレメントを欠き、（ａ）オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強し、（ｂ）活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩを産生し、（ｃ）ｉｃｌＲおよびａｒｐＡ遺伝子産物の発現を低減するように改変された低減ゲノムＥ．ｃｏｌｉが提供される。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５のゲノム地図上のＩＳエレメントの位置は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第８，１７８，３３９号の図１および表２に示されている。Ｅ．ｃｏｌｉ中で一般に起こり、除去されてもよい挿入配列エレメントとしては、限定することなく、ＩＳ１、ＩＳ２、ＩＳ３、ＩＳ４、ＩＳ５、ＩＳ３０、ＩＳ１５０、ＩＳ１８６、ＩＳ６００、ＩＳ９１１、およびＩＳ１０がある。好ましくは、天然親Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＭＧ１６５５である。
【００３７】
関連した実施形態では、（ａ）オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強し、（ｂ）活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩを産生し、（ｃ）ｉｃｌＲおよびａｒｐＡ遺伝子産物の発現を低減するように改変され、米国特許第８，１７８，３３９号の表２〜２０に列挙された遺伝子の１種または複数を欠く低減ゲノムＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株。好適な実施形態では、低減ゲノムＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株は、少なくとも以下の遺伝子（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７巻：１４５３〜７４号、およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号４０００９６に示された指定に基づく「ｂ」番号によって同定される）：低減ゲノム（または複数の欠失）株ＭＤＳ３９を創製するためにＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２ＭＧ１６５５から欠失させる遺伝子である、ｂ０２４５〜ｂ０３０１、ｂ０３０３〜ｂ０３１０、ｂ１３３６〜ｂ１４１１、ｂ４４２６〜ｂ４４２７、ｂ２４４１〜ｂ２４５０、ｂ２６２２〜ｂ２６５４、ｂ２６５７〜ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４〜ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２〜ｂ３３３８、ｂ２３４９〜ｂ２３６３、ｂ１５３９〜ｂ１５７９、ｂ４２６９〜ｂ４３２０、ｂ２９６８〜ｂ２９７２、ｂ２９７５〜ｂ２９７７、ｂ２９７９〜ｂ２９８７、ｂ４４６６〜ｂ４４６８、ｂ１１３７〜ｂ１１７２、ｂ０５３７〜ｂ０５６５、ｂ００１６〜ｂ００２２、ｂ４４１２〜ｂ４４１３、ｂ０５７７〜ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９〜ｂ２３９０、ｂ２３９２〜ｂ２３９５、ｂ０３５８〜ｂ０３６８、ｂ０３７０〜ｂ０３８０、ｂ２８５６〜ｂ２８６３、ｂ３０４２〜ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５〜ｂ１３３３、ｂ２０３０〜ｂ２０６２、ｂ２１９０〜ｂ２１９２、ｂ３２１５〜ｂ３２１９、ｂ３５０４〜ｂ３５０５、ｂ１０７０〜ｂ１０８３、ｂ１８７８〜ｂ１８９４、ｂ１９１７〜ｂ１９５０、ｂ４３２４〜ｂ４３４２、ｂ４３４５〜ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７〜ｂ０５０２、ｂ０７００〜ｂ０７０６、ｂ１４５６〜ｂ１４６２、ｂ３４８１〜ｂ３４８４、ｂ３５９２〜ｂ３５９６、ｂ０９８１〜ｂ０９８８、ｂ１０２１〜ｂ１０２９、ｂ２０８０〜ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０〜ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６〜ｂ３５５８、およびｂ４４５５を欠く。別の好適な実施形態では、低減ゲノムＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株は、以下の遺伝子：低減ゲノム株ＭＤＳ４０を創製するためにＭＤＳ３９から欠失させる遺伝子であるｂ１７８６をさらに欠く。別の好適な実施形態では、低減ゲノムＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株は、以下の遺伝子：ＭＤＳ４１を創製するためにＭＤＳ４０から欠失させる遺伝子であるｂ０１５０〜ｂ０１５３０をさらに欠く。さらに別の好適な実施形態では、低減ゲノムＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株は、以下の遺伝子：低減ゲノム株ＭＤＳ４２を創製するためにＭＤＳ４１から欠失させる遺伝子であるｂ２９４５（ｅｎｄＡ）をさらに欠く。さらに別の実施形態では、低減ゲノムＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株は、以下の遺伝子：低減ゲノム株ＭＤＳ４３を創製するためにＭＤＳ４２から欠失させる遺伝子であるｂ０３１５〜ｂ０３３１およびｂ０３３３〜ｂ０３５４をさらに欠く。さらに別の実施形態では、低減ゲノムＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株��、以下の遺伝子：ＭＤＳ６０を創製するためにＭＤＳ４３から欠失させる遺伝子であるｂ２４８１〜ｂ２４９２、ｂ２２１９〜ｂ２２３０、ｂ４５００、ｂ３７０７〜ｂ３７２３、ｂ０６４４〜ｂ０６５０、ｂ４０７９−４０９０、ｂ４４８７、ｂ４０９２〜ｂ４１０６、ｂ０７３０〜ｂ０７３２、ｂ３５７２〜ｂ３５８７、ｂ１６５３、ｂ２７３５〜ｂ２７４０、ｂ２４０５〜ｂ２４０７、ｂ３８９６〜ｂ３９００、ｂ１２０２、ｂ４２６３〜ｂ４２６８、ｂ０６１１、ｂ２３６４〜ｂ２３６６、ｂ０８３９、ｂ０４８８〜ｂ０５００、ｂ０５０２をさらに欠く。さらに別の実施形態では、低減ゲノムＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株は、以下の遺伝子：ＭＤＳ６９を創製するためにＭＤＳ６０から欠失させる遺伝子であるｂ０５６６〜ｂ０５７５、ｂ２２０９、ｂ０１６０〜ｂ０１６１、ｂ１４３１〜ｂ１４４４、ｂ３６４３、ｂ１０３７〜ｂ１０４３、ｂ０３８３、ｂ０２２６〜ｂ０２３４、ｂ２１１５〜ｂ２１３２をさらに欠く。ある特定の実施形態では、低減ゲノムＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＭＤＳ４１、ＭＤＳ４２、ＭＤＳ６０、またはＭＤＳ６９は、本発明の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株を創製するために改変される。
【００３８】
他の実施形態では、（ａ）オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強し、（ｂ）活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩを産生し、（ｃ）ｉｃｌＲおよびａｒｐＡ遺伝子産物の発現を低減するように改変されている親Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株は、機能的なｒｅｃＡ遺伝子（ｂ２６９９）を欠く。一態様では、ＭＧ１６５５またはＷ３１１０などのＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株は、ｉｃｌＲ／ａｒｐＡの欠失、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性の増強、およびアセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩ活性の回復によって改変されて本発明の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株が産生され、その後、改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株からの遺伝子の完全または部分的欠失によってｂ２６９９が不活化される。別の態様では、低減ゲノムＥ．ｃｏｌｉ株、例えば、株ＭＤＳ４０、ＭＤＳ４１、ＭＤＳ４２、またはＭＤＳ６９などは、ｉｃｌＲ／ａｒｐＡの欠失、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性の増強、およびアセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩ活性の回復によって改変されて本発明の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株が産生され、その後、改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株からの遺伝子の完全または部分的欠失によってｂ２６９９が不活化される。
【００３９】
他の実施形態では、本発明の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株（すなわち、（ａ）オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強し、（ｂ）活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩを産生し、（ｃ）ｉｃｌＲおよびａｒｐＡ遺伝子産物の発現を低減するように改変されている）は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第８，３６７，３８０号に記載の突然変異のいずれかを含有するｒｅｌＡ遺伝子を含む。
【００４０】
他の実施形態では、本発明の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株（すなわち、（ａ）オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強し、（ｂ）活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩを産生し、（ｃ）ｉｃｌＲおよびａｒｐＡ遺伝子産物の発現を低減するように改変されている）は、その内容が参照により本明細書に組み込まれているＷＩＰＯ公開第２０１３／０５９５９５号に記載のＰｏｌ  ＩＩ、Ｐｏｌ  ＩＶ、およびＰｏｌ  Ｖをコードする遺伝子からなる群から選択される１種または複数の非機能遺伝子を含む。一実施形態では、改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株細菌は、非機能的ｐｏｌＢ（ｂ００６０、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ＭＧ１６５５ゲノム上の座標６３４２９〜６５７８０）、ｄｉｎＢ（ｂ０２３１、ＭＧ１６５５ゲノム上の座標２５０８９８〜２５１９５３）、およびｕｍｕＤＣ遺伝子（ｂ１１８３〜ｂ１１８４、ＭＧ１６５５ゲノム上の座標１２２９９９０〜１２３１６６７）を有する。好ましくは、遺伝子（複数可）は、完全または部分的な欠失によって不活性にされる。
【００４１】
本発明の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株細菌は、ポリペプチドをコードする異種核酸を含み得る。ポリペプチドは、治療タンパク質、例えば、インスリン、インターロイキン、サイトカイン、成長ホルモン、増殖因子、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、インターフェロン、または抗体などであり得る。異種核酸は、プラスミドなどのベクター内に配置され、プロモーターおよび任意選択で追加の調節配列に作動可能に連結される場合がある。
【００４２】
本発明の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株細菌（（ａ）オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強し、（ｂ）活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩを産生し、（ｃ）ｉｃｌＲおよびａｒｐＡ遺伝子産物の発現を低減するように改変された）は、ポリペプチドを産生するのに使用され得る。簡単に言えば、上述した、発現制御配列に作動可能に連結されたポリペプチドをコードする異種核酸を含む本発明の細菌は、ポリペプチド産物の発現を可能にするのに十分な条件下でインキュベートされ得る。本発明の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株細菌中のポリペプチドの産生の増大を、改変を含まないＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株細菌と比較して（野生型ＭＧ１６５５もしくはＷ３１１０と比較して、または同じ遺伝的背景を有するが、改変を含まないＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株細菌と比較してなど）実現することができる。さらに、同一の発酵条件下で産生され得る非改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２細菌の数に対して、培養液中で産生される改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株細菌の数が増加すると、ポリペプチドの産生が増大する。ポリペプチドの産生の増大は、最少培地を使用するフェドバッチ発酵において特に重要であり得る。一態様では、ポリペプチドは、単鎖抗体である。
【００４３】
組換えタンパク質は、周辺質または細胞質内で発現され得る。周辺質内でのタンパク質の発現は、工業的使用で日常的に使用され、Ｈａｎａｈａｎ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１６６巻：５５７〜５８０頁（１９８３年）；Ｈｏｃｋｎｅｙ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１２巻：４５６〜６３２頁（１９９４年）；およびＨａｎｎｉｇら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６巻：５４〜６０頁（１９９８年）に総説されている。これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれている。組換えタンパク質は、これらが細胞膜周辺腔内への分泌を引き起こすシグナルペプチドに付着されている融合タンパク質を発現させることによって周辺質内で産生され得る。そこで、シグナルペプチドは、特異的シグナルペプチダーゼによって切断され得る。細胞膜周辺腔内に輸送されるタンパク質は、生物学的に活性であり得る。
【００４４】
組換えタンパク質は、シャペロン／ジスルフィド結合形成酵素とともに同時発現される場合があり、それは、組換えタンパク質の適切なフォールディングをもたらし得る。組換えタンパク質の周辺質発現に有用なタンパク質の核酸配列としては、限定することなく、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，７４７，６６２号、同第５，５７８，４６４号、および同第６，０２２，９５２号に記載のものがある。
【００４５】
本発明の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株細菌はまた、核酸を増幅するための宿主として特に有用である。簡単に言えば、異種核酸を含む本発明の細菌は、核酸産物の複製を可能にするのに十分な条件下でインキュベートされ得る。本発明の改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株細菌中の核酸の産生の増大を、改変を含まないＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株細菌と比較して（野生型ＭＧ１６５５もしくはＷ３１１０と比較して、または同じ遺伝的背景を有するが、改変を含まないＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株細菌と比較してなど）実現することができる。さらに、同一の発酵条件下で産生され得る非改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２細菌の数に対して、培養液中で産生される改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株細菌の数が増加すると、所望の核酸分子の産生が増大する。核酸分子の産生の増大は、最少培地を使用するフェドバッチ発酵において特に重要であり得る。
【実施例】
【００４６】
（実施例１）
改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ株の産生
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＭＧ１６５５のゲノム配列を、Ｂ株とＫ株との間の表現型の差異を特定の遺伝子の特徴と相関させるために、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ株ＢＬ２１／ＤＥ３およびＲＥＬ６０６のゲノム配列と比較した。Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｋ−１２ＭＧ１６５５およびＢ株ＢＬ２１／ＤＥ３の整列により、ＭＧ１６５５中に存在するおよそ４，４００遺伝子のうちの１，４１５が同一であることが明らかになった。残りの遺伝子のうち、４６４遺伝子が挿入または欠失を含有し、２，１０６遺伝子が単一の塩基変化を含有し、単一の塩基変化のうち１，２４９がアミノ酸レベルで非同義変化をもたらす。残りは、破断したまたは失われた遺伝子から構成され、一般に、レムナントプロファージ（ｒｅｍｎａｎｔ  ｐｒｏｐｈａｇｅ）などの大規模な特徴内でクラスター化している。Ｋ株ＭＧ１６５５とＢ株ＲＥＬ６０６との間の同様の整列により、１，４２３の同一の遺伝子、挿入または欠失を含有する４７２遺伝子、および１，２７７がアミノ酸レベルで非同義変化をもたらす、単一の塩基変化を有する２，１２８遺伝子が明らかになった。展望を提供するために、２種のＢ株ＢＬ２１／ＤＥ３およびＲＥＬ６０６の整列は、４０７８の同一の遺伝子があり、わずか２６遺伝子が挿入または欠失を含有することを示す。単一の塩基変化を有する１０５の遺伝子があり、このうち６６が非同義変化をもたらす。したがって、予期されるように、Ｂ株ゲノムとＫ−１２株ゲノムとの間の差異は、２種のＢ株間の差異よりはるかにより著しい。
【００４７】
株同士間の多数の遺伝子の差異を、工業発酵条件下で増殖特性に影響を与える可能性が最も高い遺伝子および遺伝子産物に注目することによって狭めた。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ株とＫ−１２株との間の遺伝子型および表現型の差異を相関させる最近の報告は、Ｋ−１２株増殖を改善するための候補としてのいくつかの遺伝子を同定している［Ｙｏｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１３巻：Ｒ３７頁（２０１２年）］。残念ながら、Ｙｏｏｎらによって報告されたデータの多くは、リッチ（Ｌｕｒｉａブロス）培地中で増殖される培養液に由来し、工業発酵にとって妥当でない。ＬＢ培地は、研究室内で一般に使用されるが、これは、２つの対向する理由のために大規模工業発酵において好まれない。飼料工業用バルクアミノ酸などの低価値商品の生産については、ＬＢは、単に高価すぎ、一方、高価値の医薬品またはファインケミカル生産については、ＬＢ培地は、動物副産物を含有するために禁止されているか、または化学的に複雑すぎ、産物回収を複雑にする。したがって、実質的にすべての大規模工業発酵において、最少培地組成が好適である。
【００４８】
３つの別個の遺伝的改変を、最少培地上で増殖するＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株の能力を改善するのに特に有望であると同定した。改変は、Ｂ株と比較して劣った産生宿主であると考えられているＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株にＢ株のような増殖特性を付与し、それにより、タンパク質の産生および遺伝子操作において使用するのに最適なＢ株およびＫ−１２株の特徴を組み合わせる株を創製する試みを代表する。遺伝的改変を、カノニカルＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＭＧ１６５５に由来する低減ゲノムＥ．ｃｏｌｉ株に対して行った。これらの低減ゲノム株は、最少培地中で増殖する場合の典型的なＫ−１２株の特性、例えば、代謝産物オーバーフロー、無酸素サイクリング、ならびにピリミジンおよび他の代謝産物の部分的な飢餓などを呈する。したがって、これらの株は、Ｂ株の遺伝的差異の選択的組込みによる改善の良好な候補である。
【００４９】
低減ゲノム株ＭＤＳ３９を、参照により本明細書に組み込まれている国際特許公開第ＷＯ２００３／０７０８８０号に記載されているように産生した。簡単に言えば、一連の低減ゲノム株（ＭＤＳ０１〜ＭＤＳ３９）を、親株Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５に由来する核酸配列の一連の３９の累積的欠失（ゲノムのおよそ１４．１％）を行うことによって産生した。
【００５０】
Ｋ−１２配列およびＩＳデータベース中のすべての配列を含有するゲノムスキャニングチップ（ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）へのハイブリダイゼーションは、ＭＤＳ３９、すべてのＩＳエレメントを欠くように設計された最初の株が、予想外に、その産生中に新しい場所に転座していたＩＳエレメントの追加のコピーを含有することを明らかにした。これらのＩＳエレメントは、ＭＤＳ４０を産生するために欠失させた。ｆｈｕＡＣＤＢ（ｔｏｎＡ遺伝子座）は、ＭＤＳ４１を産生するためにＭＤＳ４０から欠失させた。ＭＤＳ０１〜ＭＤＳ４１を産生するのに行ったそれぞれの累積的な欠失の場所および機能は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第８，１７８，３３９号の表２に見つけることができる。次いでｅｎｄＡ遺伝子を、ＭＤＳ４２を産生するためにＭＤＳ４１から欠失させた。２７の追加の核酸欠失をＭＤＳ４２において行ってＭＤＳ６９を創製した。これらの場所および機能は、米国特許第８，１７８，３３９号の表２に見つけることができる。
【００５１】
以下の改変を、別個および組合せの両方でＭＤＳ４２およびＭＤＳ６９に行った：（ｉ）ｉｃｌＲ遺伝子およびａｒｐＡ遺伝子の欠失、（ｉｉ）ｒｐｈ遺伝子の欠失、（ｉｉｉ）ｉｌｖＧフレームシフト突然変異の補正、ならびに（ｉｖ）ｒｅｃＡ遺伝子の欠失。改変は、フランキングプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および配列決定によって検証し、後に全ゲノム配列決定によって確認した。
【００５２】
米国特許第６，９８９，２６５号およびＦｅｈｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、４１６巻：２５１〜２５９頁（２００８年）に記載されている自殺プラスミドベース法を使用して、ｉｃｌＲ遺伝子およびａｒｐＡ遺伝子をＭＤＳ４２細菌およびＭＤＳ６９細菌のゲノムから欠失させた。簡単に言えば、ｉｃｌＲ遺伝子およびａｒｐＡ遺伝子のすぐ上流および下流の配列の２つの領域を、別個にゲノムＤＮＡから最初に増幅させ、次いで二次増幅において、ｏ−ＤＡＦ  ５７  ＯＬプライマー内でコードされる共通配列をアニールすることによって組み換えて所望の欠失接合部を形成した。最初の増幅は、プライマー、ｏ−ＤＡＦ５７  ＯＬ−Ｌ（５’−ＧＣＡＴＣＴＧＴＧＧＴＡＡＡＡＡＣＣＣＴＣＧＡＴＡＣＡＴＴＧＣＧＧＡＧＡＡＡＡＡＴＴ−３’）と対形成したＳＣＧ８０３（５’−ＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＧＧＴＧＴＴＴＡＣＧＣＴＧＣ−３’）、およびｏ−ＤＡＦ５７  ＯＬ−Ｒ（５’−ＡＡＴＧＴＡＴＣＧＡＧＧＧＴＴＴＴＴＡＣＣＡＣＡＧＡＴＧＣＧＴＴＴＡＴＧＣＣＡＧＴＡＴＧ−３’）と対形成したＳＣＧ３６２（５’−ＧＣＣＣＣＡＧＣＧＣＡＣＡＧＴＴＣＡＧＧ−３’）を使用した。個々のＰＣＲ産物をｏ−ＤＡＦ  ５７  ＯＬプライマー内でコードされる共通配列をアニールすることによって組み換えて所望の欠失接合部を形成し、プライマーｏ−ＤＡＦ５７  Ｌ  ｓｐｅ（５’−ＡＴＧＡＡＣＴＡＧＴＴＧＴＧＡＴＴＣＧＣＣＡＴＣＴＴＴＡＴＡＴＴＧＡＧＣＧ−３’）およびｏ−ＤＡＦ５７  Ｒ  ｅｃｏＲ（５’−ＡＴＧＡＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＣＡＧＣＧＣＴＴＴＧＧＴＧＧＡＣ−３’）を用いて増幅して、欠失接合部を包含する単一の組み合わせた断片を産生した。この組み合わせた断片を自殺プラスミド中にクローニングしてプラスミドｐＳＧ５４８３を形成した。染色体中にｐＳＧ５４８３を挿入し、同時組込み体を分解した後、プライマーＳＣＧ８０３およびＳＣＧ３６２を使用して、単離したコロニーからのゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析によって欠失を確認した。１，６１４塩基対のＰＣＲ産物は、標的遺伝子の欠失を示した一方、５，０２４塩基対のＰＣＲ産物は、インタクトなｉｃｌＲ／ａｒｐＡの保持を示した。欠失の忠実度を、欠失ＰＣＲ産物を配列決定することによって確認して、予期された配列が存在することを保証した。
【００５３】
オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強するために、ｒｐｈ遺伝子をＭＤＳ４２細菌およびＭＤＳ６９細菌のゲノムから欠失させた。下流のｐｙｒＥ遺伝子の転写レベルを、ｒｐｈ遺伝子内のフレームシフトによって引き起こされる極性を除去することによって増大させた。簡単に言えば、上述した欠失ストラテジーの後、ｒｐｈ遺伝子の上流および下流の配列の２つの領域を最初に別個に増幅し、次いで二次増幅において、ｏ−ＤＡＦ  ｒｐｈプライマー内でコードされる共通配列をアニールすることによって組み換えて所望の欠失接合部を形成した。最初の増幅は、プライマー、ｏ−ＤＡＦ  ｒｐｈ  Ｌ（５’−ＧＴＴＴＣＡＡＧＣＣＧＧＡＧＡＴＴＴＣＡＡＴＡＴＧＡＡＡＣＣＡＴＡＴＣＡＧＣＧＣＣＡＧ−３’）と対形成したＳＣＧ３６７９（５’−ＧＣＴＣＡＴＡＣＴＡＧＴＧＣＧＣＣＴＧＣＧＴＣＴＧＡＴＴＧＴＧＴＴＧ−３’）、および０−ＤＡＦ  ｒｐｈ  Ｒ（５’−ＣＴＧＡＴＡＴＧＧＴＴＴＣＡＴＡＴＴＧＡＡＡＴＣＴＣＣＧＧＣＴＴＧＡＡＡＣＡＡＡＴＧＴ−３’）と対形成したＳＣＧ３６８０（５’−ＣＴＴＡＣＧＡＡＧＣＴＴＣＧＧＣＡＴＡＴＧＧＧＡＧＣＧＧＡＣＴＴＴＧ−３’）を使用した。次いで組み合わせた、アニールした断片を、プライマーＳＣＧ３６７９およびＳＣＧ３６８０を用いて増幅し、欠失接合部をコードする得られたＰＣＲ産物を自殺プラスミド中にクローニングしてプラスミドｐＳＧ５７８７を形成した。ｐＳＧ５７８７を染色体中に挿入し、同時組込み体を分解した後、プライマーＳＣＧ３６８２（５’−ＣＴＣＧＣＧＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴ−３’）およびＳＣＧ３６８１（５’−ＧＡＡＡＡＧＧＡＡＣＣＧＴＣＧＣＧＡＧＧＡＡＡＴＡＣＴ−３’）を使用して、単離したコロニーのＰＣＲ分析によって欠失を確認した。２，２２４塩基対のＰＣＲ産物は、ｒｐｈ遺伝子の欠失を示した一方、３，００５塩基対のＰＣＲ産物は、インタクトなｒｐｈの保持を示した。欠失の忠実度を、欠失ＰＣＲ産物を配列決定することによって確認して、予期された配列が存在することを保証した。
【００５４】
ｉｌｖＧ遺伝子配列中のフレームシフト突然変異（９８３位および９８４位におけるＧＴの欠失）をＭＤＳ４２細菌およびＭＤＳ６９細菌中で修正し、その結果、全長の機能的なアセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩを改変ｉｌｖＧ遺伝子から発現させた。この場合、染色体のｉｌｖＧ領域の増幅により９８２位のＡＴジヌクレオチドを挿入することによって、フレームシフトを逆戻りさせた。手順では、挿入点の上流および下流の重複配列をコードし、改変を含む２つの断片を最初に別個に増幅し、次いで二次増幅において、ｏ−ＤＡＦ  ｉｌｖＧプライマー内でコードされる共通配列をアニールすることによって組み換えて所望のＡＴ挿入接合部を形成した。最初の増幅は、プライマー、ｏ−ＤＡＦ  ｉｌｖＧ  Ｌ（５’−ＣＴＧＣＣＡＧＴＣＡＴＡＴＴＧＡＴＴＴＡＡＣＧＧＣＴＧＣＴＧＴＡＡＴＧＣＴＧＧＴＡＡＣ−３’）と対形成したＳＣＧ３６８４（５’−ＣＴＧＣＴＡＡＣＴＡＧＴＧＣＧＧＣＴＡＴＣＧＧＴＴＡＴＧＣＴＣＧＴＧＣＴＡＣ−３’）、およびｏ−ＤＡＦ  ｉｌｖＧ  Ｒ（５’−ＣＡＧＣＡＧＣＣＧＴＴＡＡＡＴＣＡＡＴＡＴＧＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＡＣＡＣＴＧＣＧＣＧＣ−３’）と対形成したＳＣＧ３６８５（５’−ＧＧＣＡＴＡＧＡＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＧＧＣＧＣＧＧＡＴＴＴＧＴＴＧＴＧ−３’）を使用した。次いで組み合わせた、アニールした断片を、プライマーＳＣＧ３６８４およびＳＣＧ３６８５を用いて増幅し、得られた挿入鋳型を自殺プラスミド中にクローニングしてプラスミドｐＳＧ５８５５を形成した。ｐＳＧ５８５５を染色体中に挿入し、同時組込み体を分解した後、候補コロニーを、０．２％のグルコースおよび４０μｇ／ｍｌのバリンを補充した最少培地上で増殖するこれらの能力についてスクリーニングすることによって欠失を確認した。欠失の忠実度を、バリン耐性クローンのｉｌｖＧ遺伝子座を配列決定することによって確認して、予期された配列が存在することを保証した。
【００５５】
最後に、ＭＤＳ４２細菌およびＭＤＳ６９細菌を、それらが、これらの改変の３つすべて（ｉｃｌＲ、ａｒｐＡ、およびｒｐｈ遺伝子の欠失、ならびにｉｌｖＧフレームシフト突然変異の補正）を宿すように改変した。欠失は、ｉｃｌＲ／ａｒｐＡの欠失から始め、その後ｒｐｈを欠失させ、次いでｉｌｖＧを修復して逐次的にアセンブルして各ｍｅｔａ株誘導体を産生した。最終ステップにおいて、ｒｅｃＡ遺伝子（ｒｅｃＡ１８１９対立遺伝子）を、ＭＤＳ４２ｍｅｔａ株およびＭＤＳ６９ｍｅｔａ株中の欠失によって不活化して、株のｒｅｃＡバージョンを形成した。欠失は、プライマー、ＤＡＦ  ｒｅｃＡ  Ｌ（５’−ＣＡＴＣＴＡＣＡＧＡＧＡＡＡＴＣＡＴＡＣＡＧＴＡＴＣＡＡＧＴＧＴＴＴＴＧＴＡＧＡＡＡＴＴＧＴ−３’）と対形成したＳＣＧ２５１（５’−ＧＡＡＴＣＣＡＡＧＣＡＣＴＡＧＴＣＡＣＡＧＣＡＣＣＣＡＴＴＡＣＧＣＡＡＴＧＧＣ−３’）、およびＤＡＦ  ｒｅｃＡ  Ｒ（５’−ＣＡＣＴＴＧＡＴＡＣＴＧＴＡＴＧＡＴＴＴＣＴＣＴＧＴＡＧＡＴＧＡＴＡＧＣＧＡＡＧＧＣＧＴＡ−３’）と対形成したＳＣＧ２５２（５’−ＧＧＣＣＣＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＴＧＧＡＡＡＡＡＧＴＣＧＡＧＡＡＡＣＧＣＣＴＧＡＣ−３’）を使用して、ｉｃｌｒ／ａｒｐＡおよびｒｐｈの遺伝子欠失について記載した同じ２ステップ手順によって産生した。次いで組み合わせた、アニールした断片を、プライマーＳＣＧ２５１およびＳＣＧ２５２を用いて増幅し、得られた挿入鋳型を自殺プラスミド中にクローニングしてプラスミドｐＳＧ２８５７を形成した。ｐＳＧ２８５７を染色体中に挿入し、同時組込み体を分解した後、プライマーＳＣＧ２２５（５’−ＧＣＣＴＧＣＴＧＣＧＴＣＴＧＧＡＴＧＴＴＧＧ−３’）およびＳＣＧ２２６（５’−ＡＣＴＧＧＴＴＣＡＴＣＣＣＧＧＣＧＴＴＧＧＴＡ−３’）を使用して、単離したコロニーのＰＣＲ分析によって欠失を確認した。１，６８８塩基対のＰＣＲ産物は、ｒｅｃＡ遺伝子の欠失を示す一方、２，７６７塩基対のＰＣＲ産物は、インタクトなｒｅｃＡの保持を示す。欠失の忠実度を、欠失ＰＣＲ産物を配列決定することによって確認して、予期された配列が存在することを保証した。組換え突然変異誘発は、ＲｅｃＡによって促進され、したがってｒｅｃＡ１８１９欠失突然変異を含有する株は、米国特許第６，９８９，２６５号およびＦｅｈｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、４１６巻：２５１〜２５９頁（２００８年）に記載の方法によるさらなる欠失突然変異誘発に適していない。
（実施例２）
改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ株の増殖特性
【００５６】
増殖および発酵性（すなわち、発酵生産性）に対する各改変の効果を、ＭＤＳ４２、ＭＤＳ６９、ＭＤＳ４２ｒｅｃＡ、およびＭＤＳ６９ｒｅｃＡの細菌において別個に試験した。改変の効果を試験するために、「発酵性」を測定するための客観的な方法を設計して、一貫性のない発酵条件および培地組成などの変数の効果を制御した。この試験によって、異なる株の発酵性を、細胞が標準化されたフェドバッチ発酵（本事例では、最小限の塩培地（微量元素とともに完全に規定された最小限の塩でわずかに修正されたＫｏｒｚ培地を用いた３７℃での１０リットルのフェドバッチ発酵）で増殖することができる最大光学密度（ＯＤ）を測定することによって比較する。グルコースを０．５％までバッチ相に添加し、細胞増殖速度を、フェドバッチ相中０．３ｈｒ−１の一定の指数関数的供給速度でグルコースを供給することによって限定した。溶解酸素を発酵全体にわたって４０％に維持し、ｐＨをアンモニアの添加によって６．９で一定に保つ。各Ｅ．ｃｏｌｉは、カナマイシン耐性遺伝子を有する誘導されていないタンパク質発現プラスミドを含有し、製造状況のストレスを模倣するためにカナマイシンを培地に添加した。細胞がますますより高い密度に増殖するにつれて、増殖速度を維持する細胞の代謝能が超過し、細胞がグルコースをもはや消費することができないポイントに最終的に到達する。フェドバッチ発酵では、グルコースを特定の供給速度で発酵槽内に導入する。細胞が、グルコースが容器内に供給されてすぐにグルコースをもはや消費することができないとき、残留グルコース濃度が急速に増大し、いわゆるグルコーススパイクをもたらす。グルコーススパイクは、発酵がその最大限界に到達したことを示す。標準条件下で所与の株についてグルコーススパイク前に到達され得る最高ＯＤは、その株の発酵性を定義する。グルコースを監視し、グルコーススパイクが観察された場合、発酵性を、これが起こったＯＤとして解釈した。グルコーススパイクが観察されず、誘導因子を添加し、供給速度を下げることによって細胞が誘導された場合、誘導時のＯＤは、株の発酵性の下界として機能を果たした。誘導を過ぎたＯＤの増大は、発酵性の判定に考慮しなかった。実行が、実験的な緊急性、例えば、供給の不足、設備障害、または酸素を送達する能力もしくは冷却する能力の超過などによって終わった場合、これらの事象が起こったＯＤも、発酵性の最小限の推定として使用した。
【００５７】
ＭＤＳ４２、ＭＤＳ６９、ＭＤＳ４２ｒｅｃＡ、およびＭＤＳ６９ｒｅｃＡの増殖および発酵性に対する単一改変の効果は、有意でなかった。しかし意外にも、３つすべての改変をＭＤＳ４２、ＭＤＳ６９、ＭＤＳ４２ｒｅｃＡ、およびＭＤＳ６９ｒｅｃＡに行った場合、発酵性は、有意に増大した。図１から分かるように、改変を含有するすべての株は、非改変親ＭＤＳ４２、ＭＤＳ６９、ＭＤＳ４２ｒｅｃＡ、およびＭＤＳ６９ｒｅｃＡ株と比べて、かつ野生型Ｋ−１２株（ＭＧ１６５５）および野生型Ｂ株（ＢＬ２１（ＤＥ３））の両方と比較して、有意に改善された発酵性特性を呈する。さらに、図１は、株ＭＤＳ４２ｒｅｃＡ（Ｌｏｗｍｕｔ）、ｄｉｎＢ、ｕｍｕＤＣ、およびｐｏｌＢ遺伝子によってコードされる誤りがちなポリメラーゼを欠くＭＤＳ４２ｒｅｃＡ誘導体の発酵性も示す。ＭＤＳ４２ｒｅｃＡ（Ｌｏｗｍｕｔ）は、参照により本明細書に組み込まれている国際特許公開第ＷＯ２０１３／０５９５９５号に記載されている。改変Ｋ株（ＭＤＳ４２  ｍｅｔａ、ＭＤＳ４２  Ｍｅｔａ  ｌｏＭｕｔ、ＭＤＳ４２  ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ、およびＭＤＳ４２  ｍｅｔａ  ＬｏＭｕｔ  ｒｅｃＡ）の、これらの非改変親株と比較した最少培地中の倍加時間およびＭｕを、以下の表１に例示する。
表１
【００５８】
代謝突然変異（ｉｖｌＧフレームシフト突然変異の補正、ならびにｒｐｈ、ｉｃｌＲ、およびａｒｐＡ遺伝子の欠失）は、試験したすべての株において発酵性を有意に高め、意外にも、代謝突然変異を欠く株（ｍｅｔａ）より生産的にした。株の生産性の改善を、以下に記載するプラスミドおよびタンパク質産生の増大で実証する。
（実施例３）
改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ株からの核酸産生
【００５９】
核酸の産生の改善を表２に示す。株ＭＤＳ４２ｒｅｃＡ（発酵番号１４１）およびＭＤＳ４２  ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ（発酵番号１３９）をそれぞれ、組換えプラスミドｇＷＩＺ（商標）（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ  ９２１２１）で形質転換した。各株を、上述したように、１０リットルの発酵槽内で、最少培地中で増殖させた。細胞を収穫し、プラスミドＤＮＡをアルカリ溶菌法によって調製し、分光光度法（ＵＶ吸光度２６０／２８０）によって定量化した。
【表１】
0006545676.tif 000002
スーパーコイルとしてのパーセントプラスミドを、ゲル電気泳動およびスキャニングデンシトメトリーによって判定した。これらの発酵からの代表的なプラスミド回収率を以下の表２に示す。
【表２】
0006545676.tif 000003
（実施例４）
改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ株からのタンパク質産生
【００６０】
次に、タンパク質産生宿主としての改変Ｅ．ｃｏｌｉ株の有用性を試験した。株Ｔ６９ｒｅｃＡ  ｍｅｔａおよびＴ６９  ｍｅｔａ（それぞれｉｖｌＧフレームシフト突然変異を補正し、ｒｐｈ、ｉｃｌＲ、およびａｒｐＡ遺伝子を欠失させるように改変された、それぞれ親株ＭＤＳ６９ｒｅｃＡおよびＭＤＳ６９）を、ＩＰＴＧ誘導プロモーターｐＴ５／ｌａｃに由来するヒトゲルゾリン遺伝子を発現するプラスミド（ｐＴ５ｌａｃＳＯ−ＧＳＮと呼ぶ）で形質転換した。プラスミドｐＴ５ｌａｃＳＯ−ＧＳＮは、ＬａｎｚｅｒおよびＢｕｊａｒｄ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５巻：８９７３〜８９７７頁（１９８８年）に記載のＰＡ１／ｏ５プロモーターと同様の細菌プロモーターを含む。ヒトゲルゾリンの配列は公知である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００１７７を参照）。ｐＵＣ複製起点を含むプラスミド骨格、カナマイシン耐性遺伝子、およびｌａｃＩ抑制因子遺伝子は、ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ  ９４０２５から入手可能なｐＪ４４１−０１に由来する。
【００６１】
形質転換した株を、約８のＯＤ６００まで３７℃でバッチ供給発酵に、その後、Ｔ６９ｒｅｃＡ  ｍｅｔａの場合では約３００のＯＤ６００（上記で判定した株Ｔ６９ｒｅｃＡ  ｍｅｔａの発酵性）までＭｕ＝０．３の指数関数的供給に付し、その後ゲルゾリンタンパク質産物の産生を、一定のグルコース供給でＩＰＴＧを添加することによって誘導した。ゲルゾリン、細菌の細胞質内で産生される８５ｋＤの可溶性タンパク質を、細菌の微小流動化、その後の陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。タンパク質の収率をゲル電気泳動によって評価し、非改変親株（Ｔ６９／ＭＤＳ６９）のフェドバッチ発酵後のものと比較した。以下の表２から分かるように、タンパク質の収率は、改変株において有意に増大した。同様の結果が供給培地中にグリセロールを使用して得られた。
【表３】
0006545676.tif 000004
【００６２】
まとめると、表２および３は、図１に示した非改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２（ＭＧ１６５５）およびＢ（ＢＬ２１／ＤＥ３）株に典型的な発酵性の範囲と併せて、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２細胞系統内の代謝突然変異（ｉｖｌＧフレームシフト突然変異の補正、ならびにｒｐｈ、ｉｃｌＲ、およびａｒｐＡ遺伝子の欠失）の存在が、改善された増殖速度（より速い倍加時間、より高いＭｕ）を付与し、より高い細胞密度、ならびに核酸およびタンパク質の産生の改善をもたらすことを実証する。
（実施例５）
定常期改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ株からのタンパク質産生
【００６３】
図２は、バイオマスの同時の産生を伴わない定常期におけるタンパク質を産生する改変Ｅ．ｃｏｌｉ株の能力を例示する。図のメインプロットは、増殖曲線（時間（ｈｏｕｒｓ）単位の時間（ｔｉｍｅ）によるＯＤ６００）である。挿入図プロットは、生産性（時間（ｈｏｕｒｓ）単位の時間（ｔｉｍｅ）によるｇ／Ｌの産物タンパク質）に関する。左の軸は、ＯＤ６００に関し、右の軸は、ｇ／Ｌの産物タンパク質である。追加の挿入図グラフィックは、示された時点におけるタンパク質の産生を表示するゲルである。産物タンパク質の濃度は、ゲルから、かつ総タンパク質測定から推定する。
【００６４】
図２に示した発酵のそれぞれにおいて、発酵は、約２１時間で定常期に到達し、この時点で組換えタンパク質の転写をＩＰＴＧに添加によって誘導する。誘導した後、グルコースの供給速度を、３つの培養液（それぞれ３１３、８０、および２１ｇ／ｈのグルコースを受けた発酵番号１０５、１０２、および９８）の間で変更する。興味深いことに、新しく利用可能なグルコースをバイオマスに変換することによって増殖を再開するのではなく、グルコースは、産物タンパク質にほとんどもっぱら変換される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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