(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列、または
配列番号１で示されるアミノ酸配列または配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列において、以下よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸を置換したタンパク質であることを特徴とする、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
配列番号１記載のアミノ酸配列における６６位に対応する位置のアミノ酸がチロシンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における１５８位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における２３３位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における３８５位に対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における３９１位に対応する位置のアミノ酸がイソロイシンである、および
配列番号１記載のアミノ酸配列における５５７位に対応する位置のアミノ酸がバリンである。
【請求項２】
配列番号１で示されるアミノ酸配列、または配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列、または
配列番号１で示されるアミノ酸配列または配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列において１もしくは数個アミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列において、以下よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置でアミノ酸を置換したタンパク質であることを特徴とするフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
配列番号１記載のアミノ酸配列における６６位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、かつ、６８位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がグリシンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位のシステインに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、６６位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、かつ、６８位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がグリシンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位のシステインに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、かつ、１５８位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位のシステインに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、かつ、２３３位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がアルギニンである、または
配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位のシステインに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、５５７位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がバリンであり、かつ、５５９位のセリンに対応する位置のアミノ酸がリジンである。
【請求項３】
以下の（Ｉ）および／または（ＩＩ）の性質を備える請求項１又は２に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
（Ｉ）ｐＨ７．０、４０℃、１５分間の熱処理後に５０％以上の残存活性率を有する、
（ＩＩ）Ｄ−グルコースへの反応性に対するＤ−キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））が２％以下である。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードするフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子。
【請求項５】
請求項４に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組換え体ＤＮＡ。
【請求項６】
請求項５記載の組換え体ＤＮＡが導入されている宿主細胞。
【請求項７】
フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを製造する方法であり、以下の工程を含む方法：
請求項６に記載の宿主細胞を培養する工程、
前記宿主細胞中に含まれるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現させる工程、および
前記培養物からフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを単離する工程。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを用いるグルコース測定方法。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースアッセイキット。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱安定性に優れたフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ、それを用いたグルコース測定方法およびフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血中グルコース濃度（血糖値）は、糖尿病の重要なマーカーである。糖尿病患者が自己の血糖値を管理するための装置としては、電気化学的バイオセンサを用いた自己血糖測定（Ｓｅｌｆ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ：ＳＭＢＧ）機器が広く利用されている。ＳＭＢＧ機器に用いられるバイオセンサには、従来、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）等のグルコースを基質とする酵素が利用されている。しかしながら、ＧＯＤは酸素を電子受容体とするという特性を備えているため、ＧＯＤを用いたＳＭＢＧ機器では、測定サンプル中の溶存酸素が測定値に影響を与え、正確な測定値が得られない場合が起こりうる。【０００３】
一方、グルコースを基質とするが、酸素を電子受容体としない別の酵素として、各種のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）が知られている。具体的には、ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ）やニコチンアミドジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を補酵素とするタイプのＧＤＨ（ＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨ）や、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするＧＤＨ（ＰＱＱ−ＧＤＨ）が見出されており、ＳＭＢＧ機器のバイオセンサに使用されている。しかしながら、ＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨは、酵素の安定性が乏しく、かつ、補酵素の添加が必要という問題を有し、また、ＰＱＱ−ＧＤＨは基質特異性が低く、測定対象であるグルコース以外にも、マルトース、Ｄ−ガラクトースおよびＤ−キシロースなどの糖化合物に対して作用してしまうため、測定サンプル中のグルコース以外の糖化合物が測定値に影響し、正確な測定値が得られないという問題点が存在する。【０００４】
近年、ＰＱＱ−ＧＤＨをバイオセンサとして用いたＳＭＢＧ機器を用いて、輸液投与を受けていた糖尿病患者の血糖値を測定する際に、ＰＱＱ−ＧＤＨが輸液中に含まれるマルトースにも作用して、実際の血糖値よりも高い測定値が得られ、この値に基づく処置が原因となって患者が低血糖等を発症した例が報告されている。また、同様の事象はガラクトース負荷試験およびキシロース吸収試験を実施中の患者にも起こり得ることも判明している（例えば、非特許文献１参照）。これを受け、厚生労働省医薬食品局は、グルコース溶液に各糖類を添加した場合における血糖測定値への影響を調査する目的で交差反応性試験を行ったところ、６００ｍｇ／ｄＬのマルトース、３００ｍｇ／ｄＬのＤ−ガラクトース、あるいは、２００ｍｇ／ｄＬのＤ−キシロース添加を行った場合には、ＰＱＱ−ＧＤＨ法を用いた血糖測定キットの測定値は、実際のグルコース濃度より２．５〜３倍ほど高い値を示した。すなわち、測定試料中に存在し得るマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースにより測定値が不正確になることが判明し、このような測定誤差の原因となる糖化合物の影響を受けず、グルコースを特異的に測定可能な基質特異性の高いＧＤＨの開発が切に望まれている。【０００５】
上記のような背景の下、上記以外の補酵素を利用するタイプのＧＤＨが着目されるようになってきている。例えば、基質特異性に関する詳細な記載はないが、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のＧＤＨについての報告（例えば、非特許文献２〜５参照）が知られている。また、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属及びペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属由来のフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）が開示されており（例えば、特許文献１〜３参照）、さらにＤ−キシロースに対する作用性を低減させたアスペルギルス属由来のＦＡＤ−ＧＤＨも開示されている（例えば、特許文献４参照）。【０００６】
しかし、上記の酵素は、Ｄ−グルコースではない１種または数種の糖化合物に対して反応性が低いという特性を示すものの、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースのいずれに対しても反応性が十分に低いという特性を有してはいない。これらに対して、ケカビの一種であるムコール（Ｍｕｃｏｒ）属から見出されたＦＡＤ−ＧＤＨは、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースのいずれに対しても反応性が十分に低いという優れた特性を有することが示されている（例えば、特許文献５参照）。このＧＤＨを用いれば、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースが存在する条件下においても、それらの糖化合物による影響を受けることなくグルコース濃度を正確に測定することが可能であり（例えば、特許文献５参照）、このような優れた基質特異性は、ケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨの実用上の優位性を示す特徴のひとつである。さらに、特許文献５においては、ケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨの遺伝子配列、アミノ酸配列、ケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨの遺伝子配列を利用した大腸菌及び麹菌を宿主とする組換え発現についても開示されている。【０００７】
ＦＡＤ−ＧＤＨの血糖センサーへの用途を考慮すると、センサーチップ作製時には酵素の加熱乾燥処理工程を含む場合があるため、耐熱性の高いＦＡＤ−ＧＤＨが求められる。このような目的に関しては、特許文献６において、優れた基質特異性及び耐熱性を有するケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨ（チゴサッカロマイセス属の酵母で発現）等が見出されている。また、特許文献７は、部位特異的変異を導入することにより、ケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨの耐熱性が向上することを開示している。
しかしながら、センサーチップの作製時における過酷な熱条件に供する可能性を想定すると、さらなる熱安定性を付与する試みが継続的に求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−２８９１４８号公報
【特許文献２】特許第４４９４９７８号公報
【特許文献３】国際公開第０７／１３９０１３号
【特許文献４】特開２００８−２３７２１０号公報
【特許文献５】特許第４６４８９９３号公報
【特許文献６】国際公開第１２／０７３９８６号パンフレット
【特許文献７】国際公開第１２／１６９５１２号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】医薬品・医療用具等安全性情報２０６号（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２０６）、２００４年１０月、厚生労働省医薬食品局
【非特許文献２】Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ．  Ｉ．  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  ｐ−ｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅ  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ，  Ｔ．  Ｃ．  Ｂａｋ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｓａｔｏ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １３９，  ２６５−２７６  （１９６７）．
【非特許文献３】Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ．  ＩＩ．  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｔ．Ｃ．  Ｂａｋ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １３９，  ２７７−２９３  （１９６７）．
【非特許文献４】Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ．  ＩＩＩ．  Ｇｅｎｅｒａｌ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｔ．Ｃ．  Ｂａｋ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １４６，  ３１７−３２７  （１９６７）．
【非特許文献５】Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ．  ＩＶ．  Ｈｉｓｔｉｄｙｌ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ａｓ  ａｎ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ，  Ｔ．Ｃ．  Ｂａｋ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｓａｔｏ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １４６，  ３２８−３３５  （１９６７）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、熱安定性を有するＦＡＤ−ＧＤＨを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の課題を解決するために、本発明者は鋭意検討を重ね、熱安定性を有するＦＡＤ−ＧＤＨを探索した結果、公知のＦＡＤ−ＧＤＨに変異を導入することにより、熱安定性を有するＦＡＤ−ＧＤＨが得られることを見出した。【００１２】
すなわち、本発明は以下に関する。
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、または該アミノ酸配列（配列番号１で示されるアミノ酸配列または配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、以下よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、熱安定性が向上していることを特徴とするＦＡＤ−ＧＤＨ：
配列番号１記載のアミノ酸配列における６６位のアミノ酸
配列番号１記載のアミノ酸配列における６８位のアミノ酸
配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位のアミノ酸
配列番号１記載のアミノ酸配列における１５８のアミノ酸
配列番号１記載のアミノ酸配列における２３３位のアミノ酸、
配列番号１記載のアミノ酸配列における３８５位のアミノ酸、
配列番号１記載のアミノ酸配列における３９１位のアミノ酸、および
配列番号１記載のアミノ酸配列における５５７位のアミノ酸。
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、または
配列番号１で示されるアミノ酸配列または配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、以下よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有することを特徴とするＦＡＤ−ＧＤＨ：
配列番号１記載のアミノ酸配列における６６位に対応する位置のアミノ酸がチロシンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における６８位に対応する位置のアミノ酸がグリシンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位に対応する位置のアミノ酸がアラニンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における１５８位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における２３３位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における３８５位に対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における３９１位に対応する位置のアミノ酸がイソロイシンである、および
配列番号１記載のアミノ酸配列における５５７位に対応する位置のアミノ酸がバリンである。
（３）以下に表されるＦＡＤ−ＧＤＨ活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列において６６位のアスパラギン残基に対応する位置のアミノ酸がチロシンに置換された改変タンパク質であるＦＡＤ−ＧＤＨ：
配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、ＦＡＤ−ＧＤＨ活性を有するタンパク質、または
配列番号１のアミノ酸配列において、６６位のアスパラギン残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなり、ＦＡＤ−ＧＤＨ活性を有するタンパク質。
（４）以下に表されるＦＡＤ−ＧＤＨ活性を有する親タンパク質を構成するアミノ酸配列において６８位のアスパラギン残基に対応する位置のアミノ酸がグリシンに置換された改変タンパク質であるＦＡＤ−ＧＤＨ：
配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、ＦＡＤ−ＧＤＨ活性を有するタンパク質、または
配列番号１のアミノ酸配列において、６８位のアスパラギン残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなり、ＦＡＤ−ＧＤＨ活性を有するタンパク質。
（５）以下に表されるＦＡＤ−ＧＤＨ活性を有する親タンパク質を構成するアミノ酸配列において８８位のシステイン残基に対応する位置のアミノ酸がアラニンに置換された改変タンパク質であるＦＡＤ−ＧＤＨ：
配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、ＦＡＤ−ＧＤＨ活性を有するタンパク質、または
配列番号１のアミノ酸配列において、８８位のシステイン残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなり、ＦＡＤ−ＧＤＨ活性を有するタンパク質。
（６）以下に表されるＦＡＤ−ＧＤＨ活性を有する親タンパク質を構成するアミノ酸配列において１５８位のスレオニン残基に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換された改変タンパク質であるＦＡＤ−ＧＤＨ：
配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、ＦＡＤ−ＧＤＨ活性を有するタンパク質、または
配列番号１のアミノ酸配列において、１５８位のスレオニン残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなり、ＦＡＤ−ＧＤＨ活性を有するタンパク質。
（７）以下に表されるＦＡＤ−ＧＤＨ活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列において２３３位のグルタミン残基に対応する位置のアミノ酸がアルギニンに置換された改変タンパク質であるＦＡＤ−ＧＤＨ：
配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、ＦＡＤ−ＧＤＨ活性を有するタンパク質、または
配列番号１のアミノ酸配列において、２３３位のグルタミン残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなり、ＦＡＤ−ＧＤＨ活性を有するタンパク質。
（８）以下に表されるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列において３８５位のアラニン残基に対応する位置のアミノ酸がスレオニンに置換された改変タンパク質であるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、または
配列番号１のアミノ酸配列において、３８５位のアラニン残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（９）以下に表されるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列において３９１位のロイシン残基に対応する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換された改変タンパク質であるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ：
配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、または
配列番号１のアミノ酸配列において、３９１位のロイシン残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸からなり、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（１０）以下に表されるＦＡＤ−ＧＤＨ活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列において５５７位のロイシン残基に対応する位置のアミノ酸がバリンに置換された改変タンパク質であるＦＡＤ−ＧＤＨ：
配列番号１記載のアミノ酸配列からなり、ＦＡＤ−ＧＤＨ活性を有するタンパク質、または
配列番号１のアミノ酸配列において、５５７位のロイシン残基に対応する位置のアミノ酸残基以外のアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなり、ＦＡＤ−ＧＤＨ活性を有するタンパク質。
（１１）配列番号１で示されるアミノ酸配列、または配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、または
配列番号１で示されるアミノ酸配列または配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列において１もしくは数個アミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列に対応する位置のアミノ酸が、以下のいずれかに記載されるアミノ酸残基であるＦＡＤ−ＧＤＨ：
配列番号１記載のアミノ酸配列における６６位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、かつ、６８位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がグリシンである。
配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位のシステインに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、６６位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、かつ、６８位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸がグリシンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位のシステインに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、かつ、１５８位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである、
配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位のシステインに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、かつ、２３３位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸がアルギニンである、または
配列番号１記載のアミノ酸配列における８８位のシステインに対応する位置のアミノ酸がアラニンであり、５５７位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がバリンであし、かつ、５５９位のセリンに対応する位置のアミノ酸がリジンである。
（１２）以下の（Ｉ）および／または（ＩＩ）の性質を備え上記（１）〜（１１）のいずれか１項に記載のＦＡＤ−ＧＤＨ：
（Ｉ）ｐＨ７．０、４０℃、１５分間の熱処理後に５０％以上の残存活性率を有する。
（ＩＩ）Ｄ−グルコースへの反応性に対するＤ−キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））が２％以下である。
（ＩＩＩ）変異を導入した後の比活性が変異を導入する前の比活性と比べて６０％以上である。
（１３）上記（１）〜（１２）のいずれか１項に記載のＦＡＤ−ＧＤＨをコードするＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子。
（１４）上記（１３）に記載のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組換え体ＤＮＡ。
（１５）上記（１４）記載の組換え体ＤＮＡが導入されている宿主細胞。
（１６）ＦＡＤ−ＧＤＨを製造する方法であり、以下の工程を含む方法：
上記（１５）に記載の宿主細胞を培養する工程、
前記宿主細胞中に含まれるＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を発現させる工程、および
（ａ前記培養物からＦＡＤ−ＧＤＨを単離する工程。
（１７）上記（１）〜（１２）のいずれか１項に記載のＦＡＤ−ＧＤＨを用いるグルコース測定方法。
（１８）上記（１）〜（１２）のいずれか１項に記載のＦＡＤ−ＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
（１９）上記（１）〜（１２）のいずれか１項に記載のＦＡＤ−ＧＤＨを含むグルコースセンサー。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、熱安定性を有するＦＡＤ−ＧＤＨを提供できる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの作用原理および活性測定法）
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの活性は、この作用原理を利用し、例えば、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）および２，６−ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）を用いた以下の系を用いて測定することができる。
（反応１）  Ｄ−グルコ−ス  ＋  ＰＭＳ（酸化型）
→  Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン  ＋  ＰＭＳ（還元型）
（反応２）  ＰＭＳ（還元型）  ＋  ＤＣＩＰ（酸化型）
→  ＰＭＳ（酸化型）  ＋  ＤＣＩＰ（還元型）
【００１５】
（反応１）において、グルコースの酸化に伴い、ＰＭＳ（還元型）が生成する。続いて進行する（反応２）により、ＰＭＳ（還元型）が酸化されるのに伴ってＤＣＩＰが還元される。この「ＤＣＩＰ（酸化型）」の消失度合を波長６００ｎｍにおける吸光度の変化量として検知し、この変化量に基づいて酵素活性を求めることができる。
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの活性は、以下の手順に従って測定する。１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） ２．０５ｍＬ、１Ｍ Ｄ−グルコース溶液 ０．６ｍＬおよび２ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．１５ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温する。次いで、１５ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．１ｍＬおよび酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始する。反応開始時、および経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を求め、次式に従いＧＤＨ活性を算出する。この際、ＧＤＨ活性は、３７℃において濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義する。
【００１６】
【数１】
0006526572.tif 000002
【００１７】
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素試薬の液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／μｍｏｌ）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは酵素の希釈に用いた緩衝液を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、ｄｆは希釈倍数を表す。
【００１８】
（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列）
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、配列番号１で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と同一性の高い、例えば、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５%以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上同一なアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１記載のアミノ酸配列における６６位、６８位、８８位、１５８位、２３３位、３８５位、３９１位および５５７位から選択されるアミノ酸に対応する位置で、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有することを特徴とする。
好ましくは、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨにおける、上述の６６位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の６６位に対応する位置でのアミノ酸がチロシンに置換される置換であり、６８位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の６８位に対応する位置でのアミノ酸がグリシンに置換される置換であり、８８位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の８８位に対応する位置でのアミノ酸がアラニンに置換される置換であり、１５８位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の１５８位に対応する位置でのアミノ酸がヒスチジンに置換される置換であり、２３３位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の２３３位に対応する位置でのアミノ酸がアルギニンに置換される置換であり、３８５位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の３８５位に対応する位置でのアミノ酸がスレオニンに置換される置換であり、３９１位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の３９１位に対応する位置でのアミノ酸がイソロイシンに置換される置換であり、５５７位に対応する位置でのアミノ酸置換とは、上述の５５７位に対応する位置でのアミノ酸がバリンに置換される置換である。なお、配列番号１においては、本発明の置換を有さない６６位のアミノ酸はアスパラギンであり、６８位のアミノ酸はアスパラギンであり、８８位のアミノ酸はシステインであり、１５８位のアミノ酸はスレオニンであり、２３３位のアミノ酸はグルタミンであり、５５７位のアミノ酸はロイシンである。
【００１９】
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの中で、さらに好ましいものの例として、上記のような置換を複数組み合わせて有する多重変異体が挙げられる。上記のような置換を２箇所組み合わせて有する２重変異体、３箇所組み合わせて有する３重変異体、さらに多数の変異を組み合わせて有する多重変異体等が本発明に包含される。このような変異の蓄積により、熱安定性がさらに向上したＦＡＤ−ＧＤＨを作出することができる。
【００２０】
また、上記のような多重変異体を作出するにあたっては、上述の各種の置換以外の位置における置換を組み合わせることもできる。このような置換の位置は、単独で置換を導入した場合には、上述の置換部位におけるもののように顕著な効果を奏さないものであっても、上述の置換部位と組み合わせて導入することによって、相乗的に効果を奏するものであり得る。
【００２１】
また、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨには、上述のような、熱安定性を向上させる変異のほかに、基質特異性を向上させる変異や、ｐＨや特定の物質などへの耐性を向上させる効果などのような、別種の効果を奏することを目的とした公知の変異を任意に組み合わせてもよい。このような別種の変異を組み合わせた場合であっても、本発明の効果を発揮し得るものである限り、それらのＦＡＤ−ＧＤＨは本発明に包含される。
【００２２】
後述のとおり、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、例えば、まず任意の方法で、配列番号１のアミノ酸配列に近いアミノ酸配列をコードする遺伝子を入手し、配列番号１の所定の位置と同等の位置におけるいずれかの位置においてアミノ酸置換を導入することにより得ることもできる。
目的とするアミノ酸置換導入方法としては、例えばランダムに変異を導入する方法あるいは想定した位置に部位特異的変異を導入する方法が挙げられる。前者の方法としては、エラープローンＰＣＲ法（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１，１１−１５，（１９８９））や、増殖の際、プラスミドの複製にエラーを起こしやすく、改変を生じやすいＸＬ１−Ｒｅｄコンピテントセル（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いる方法等がある。また、後者の方法として、目的とするタンパク質の結晶構造解析により立体構造を構築し、その情報をもとに目的の効果を付与すると予想されるアミノ酸を選択し、市販のＱｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等により部位特異的変異を導入する方法がある。あるいは、後者の方法として、目的とするタンパク質と相同性の高い公知のタンパク質の立体構造を用いて、目的の効果を付与すると予想されるアミノ酸を選択し、部位特異的変異を導入する方法もある。
【００２３】
また、ここでいう、例えば、「配列番号１のアミノ酸配列に対応する位置」とは、配列番号１のアミノ酸配列と、配列番号１と同一性（好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５%以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）を持つアミノ酸配列を有する他のＦＡＤ−ＧＤＨとをアラインさせた場合に、そのアラインメントにおける同一の位置を意味する。なお、アミノ酸配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ−Ｍａｃ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム、又はＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ（日立ソフト社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。
【００２４】
また、ここでいう、例えば、「配列番号１のアミノ酸配列に対応する位置」を特定する方法としては、例えば、リップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、ＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行うことができる。ＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、対応するアミノ酸残基の各ＦＡＤ−ＧＤＨ配列における配列中の位置を決めることが可能である。対応する位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となるＦＡＤ−ＧＤＨの基質特異性に関して類似した効果を有することが推定できる。
【００２５】
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨには、上記の同一性の範囲内で各種のバリエーションが想定されるが、各種ＦＡＤ−ＧＤＨの酵素科学的性質が本明細書に記載する本発明のＦＡＤ―ＧＤＨと同様である限り、それらは全て本発明のＦＡＧ−ＧＤＨに含まれ得る。このようなアミノ酸配列を有するＦＡＤ−ＧＤＨは、基質特異性が高く、かつ、十分な熱安定性を有するＦＡＤ−ＧＤＨであり、産業上有用である。
【００２６】
また、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨにおいては、上述の６６位に対応する位置でのアミノ酸がチロシンであること、または、６８位に対応する位置でのアミノ酸がグリシンであること、または、８８位に対応する位置でのアミノ酸がアラニンであること、１５８位に対応する位置でのアミノ酸がヒスチジンであること、２３３位に対応する位置でのアミノ酸がアルギニンであること、３８５位に対応する位置でのアミノ酸がスレオニンであること、３９１位に対応する位置でのアミノ酸がイソロイシンであること、または５５７位に対応する位置でのアミノ酸がバリンであることが重要なのであって、それが人為的な置換操作によるものか否かは重要でない。例えば、配列番号１記載のタンパク質のように、上記の位置のアミノ酸が本発明で所望される残基とは元々異なっているタンパク質を出発物質として、そこに公知の技術を用いて所望の置換を導入していく場合であれば、これらの所望されるアミノ残基は置換により導入される。一方、公知のペプチド全合成により所望のタンパク質を入手する場合、または、所望のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするように遺伝子配列を全合成し、これに基づき所望のタンパク質を入手する場合、あるいは、天然型として見出されたものの中に元々そのような配列を有するものがあった場合等には、人為的な置換という工程を経ることなく、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを得ることができる。
【００２７】
（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨにおける熱安定性の向上）
本発明における耐熱性の向上は、本明細書中に記載の活性測定方法及び熱安定性測定方法に記載した条件において評価される。なお、本明細書における熱処理時のｐＨは７．０であるが、これは本発明のＦＡＤ−ＧＤＨが血液中のグルコース（血糖値）を測定する目的で開発されたものであり、血液のｐＨが中性付近であることによる。このように実用になるべく近い条件で評価を行うことによって、より有用な酵素の取得が可能となる。
【００２８】
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、本明細書中に記載の活性測定方法および熱安定性測定方法に記載した反応条件下で、ｐＨ７．０、４０℃、１５分間熱処理後の残存活性が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上であることを特徴とする。
【００２９】
より好ましい本発明のＦＡＤ−ＧＤＨとしては、本明細書中に記載の活性測定方法及び熱安定性測定方法に記載した反応条件下で、ｐＨ７．０、４５℃、１５分間熱処理後の残存活性が１０％以上、３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上であることを特徴とする。
【００３０】
また、上述のように熱安定性が向上していることに加えて、その他の酵素諸性質に関しても、実用により適した性能を兼ね備えていることが好ましい。例えば、Ｄ−グルコースへの反応性に対するＤ−キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））、および／またはＤ−グルコースへの反応性に対するマルトースへの反応性の割合（Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％））が２％以下であることが好ましい。例えば、比活性は所定の変異を導入する前と比べて、６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上を維持していることが好ましい。例えば、Ｋｍ値は１００ｍＭ以下であり、より好ましくは９０ｍＭ以下であることが好ましい。
【００３１】
（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨをコードする遺伝子の取得）
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを効率よく取得するためには、遺伝子工学的手法を利用するのが好ましい。本発明のＦＡＤ−ＧＤＨをコードする遺伝子（以下、ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子）を取得するには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法を用いればよい。例えば、公知のＦＡＤ−ＧＤＨを出発物質とし、それを改変することにより本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを取得するには、ＦＡＤ−ＧＤＨ生産能を有する公知の微生物菌体や種々の細胞から、常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （ＷＩＬＥＹ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡ又はｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
【００３２】
ついで、公知のＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列情報に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーから基質特異性の高いＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により、基質特異性の高いＦＡＤ−ＧＤＨをコードする目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらのＤＮＡ断片を連結させて、目的のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子の全長を含むＤＮＡを得ることができる。
【００３３】
公知のＦＡＤ−ＧＤＨを出発物質として、本発明の熱安定性に優れたＦＡＤ−ＧＤＨを取得する方法として、出発物質であるＦＡＤ−ＧＤＨをコードする遺伝子に変異を導入し、各種の変異遺伝子から発現されるＦＡＤ−ＧＤＨの酵素科学的性質を指標に選択を行う方法を採用し得る。
出発物質であるＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；又は蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、若しくは５−ブロモウラシル等を挙げることができる。
この接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能であり、現実に所望の変異をＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５〜１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０〜８０℃の反応温度下で１０分間以上、好ましくは１０〜１８０分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる（現代化学、ｐ２４〜３０、１９８９年６月号）。
【００３４】
蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓとして知られる手法を用いることができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法  （Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，９４４１（１９８４）：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３５０（１９８７）：Ｇｅｎｅ，３７，７３（１９８５））、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３，８７４９（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３，８７６５（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１４，９６７９（１９８６））、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，４８８（１９８５）：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３６７（１９８７））等が挙げられる。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社，  ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の利用が挙げられる。
【００３５】
また、一般的なポリメラーゼチェインリアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）として知られる手法を用いることもできる（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１，１１（１９８９））。
なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法又は酵素合成法により、直接所望の熱安定性に優れた改変ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を合成することもできる。
【００３６】
上記のような任意の方法により選択された本発明のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定または確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）等を用いれば良い。
【００３７】
（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの由来となる天然型ＦＡＤ−ＧＤＨの例）
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、公知のＦＡＤ−ＧＤＨを改変することにより取得することもできる。公知のＦＡＤ−ＧＤＨの由来微生物の好適な例としては、ケカビ亜門、好ましくはケカビ綱、より好ましくはケカビ目、さらに好ましくはケカビ科に分類される微生物を挙げることができる。具体的には、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アブシジア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、アクチノムコール（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）属、シルシネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属由来のＦＡＤ−ＧＤＨ等が挙げられる。
Ｍｕｃｏｒ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ｍｕｃｏｒ  ｐｒａｉｎｉｉ、Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ、Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ  ｆ．  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｍｕｃｏｒ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ  ｆ．  ｓｉｌｖａｔｉｃｕｓ、Ｍｕｃｏｒ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ、Ｍｕｃｏｒ  ｄｉｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒｕｓ等が挙げられる。より具体的には、特許文献５に記載のＭｕｃｏｒ  ｐｒａｉｎｉｉ、Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ、Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ  ｆ．  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｍｕｃｏｒ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ  ＮＢＲＣ９４０３、Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ  ｆ．  ｓｉｌｖａｔｉｃｕｓ  ＮＢＲＣ６７５４、Ｍｕｃｏｒ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ  ＮＢＲＣ６３３８、Ｍｕｃｏｒ  ＲＤ０５６８６０、Ｍｕｃｏｒ  ｄｉｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒｕｓ  ＮＢＲＣ５３９５等が挙げられる。Ａｂｓｉｄｉａ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ａｂｓｉｄｉａ  ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒａ、Ａｂｓｉｄｉａ  ｈｙａｌｏｓｐｏｒａを挙げることができる。より具体的には、特許文献５に記載のＡｂｓｉｄｉａ  ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒａ、Ａｂｓｉｄｉａ  ｈｙａｌｏｓｐｏｒａを挙げることができる。Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ  ｅｌｅｇａｎｓを挙げることができる。より具体的には、特許文献５に記載のＡｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ  ｅｌｅｇａｎｓを挙げることができる。Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｍｉｎｏｒ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｍｕｓｃａｅ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｒｉｇｉｄａ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｓｉｍｐｌｅｘ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｕｍｂｅｌｌａｔａを挙げることができる。より具体的には、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｍｉｎｏｒ  ＮＢＲＣ６４４８、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓ  ＮＢＲＣ４４５３、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｍｕｓｃａｅ  ＮＢＲＣ６４１０、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｒｉｇｉｄａ  ＮＢＲＣ６４１１、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ＮＢＲＣ６４１２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｕｍｂｅｌｌａｔａ  ＮＢＲＣ４４５２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｕｍｂｅｌｌａｔａ  ＮＢＲＣ５８４２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ＲＤ０５５４２３及びＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ＲＤ０５５４２２を挙げることができる。なお、ＮＢＲＣ菌株およびＲＤ菌株はＮＢＲＣ（独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジーセンター）の保管菌株である。
【００３８】
（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子が挿入されたベクターおよび宿主細胞）
上述のように得られた本発明のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主細胞を常法により、形質転換又は形質導入をすることができる。
原核宿主細胞の一例としては、エシェリシア属に属する微生物、例えば大腸菌Ｋ−１２株、エシェリヒア・コリーＢＬ２１（ＤＥ３）、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５α、エシェリヒア・コリーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００等（いずれもタカラバイオ社製）が挙げられる。それらを形質転換し、または、それらに形質導入して、ＤＮＡが導入された宿主細胞（形質転換体）を得る。こうした宿主細胞に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主細胞がエシェリヒア・コリーに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換えＤＮＡの移入を行う方法などを採用することができる、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には市販のコンピテントセル（例えばＥＣＯＳ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  エシェリヒア・コリーＢＬ２１（ＤＥ３）；ニッポンジーン製）を用いても良い。
【００３９】
真核宿主細胞の一例としては、酵母が挙げられる。酵母に分類される微生物としては、例えば、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などに属する酵母が挙げられる。挿入遺伝子には、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１のような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子等が挙げられる。また、挿入遺伝子は、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター又はその他の制御配列（例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。プロモーターとしては、具体的には、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター等が挙げられる。酵母への形質転換方法としては、公知の方法、例えば、酢酸リチウムを用いる方法（ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ５，  ２５５−２６９（１９９５））やエレクトロポレーション（Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５５  （２００３）４８１−４８４）等を好適に用いることができるが、これに限定されず、スフェロプラスト法やガラスビーズ法等を含む各種任意の手法を用いて形質転換を行えば良い。
【００４０】
真核宿主細胞の他の例としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属やトリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属のようなカビ細胞が挙げられる。挿入遺伝子は、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター（例えばｔｅｆ１プロモーター）及びその他の制御配列（例えば、分泌シグナル配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。また、挿入遺伝子には、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子、例えばｎｉａＤ、ｐｙｒＧが含まれていても良い。さらに、挿入遺伝子には、任意の染色体部位へ挿入するための相同組換え領域が含まれていても良い。糸状菌への形質転換方法としては、公知の方法、例えば、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いる方法（Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２１８，  ９９−１０４（１９８９））を好適に用いることができる。
【００４１】
（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの製造）
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、上述のように取得した本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを生産する宿主細胞を培養し、前記宿主細胞中に含まれるＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を発現させ、次いで、前記培養物からＦＡＤ−ＧＤＨを単離することにより、製造すればよい。
上記宿主細胞を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
培地の初発ｐＨは、限定されないが、例えば、ｐＨ６〜９に調整することができる。
培養は、１０〜４２℃の培養温度、好ましくは２５℃前後の培養温度で４〜２４時間、さらに好ましくは２５℃前後の培養温度で４〜８時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施すればよい。
【００４２】
培養終了後、該培養物より本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを採取する。これには、通常の公知の酵素採取手段を用いればよい。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、もしくはリゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪若しくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、若しくは硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの粗酵素を得る。
【００４３】
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨの粗酵素を、公知の任意の手段を用いてさらに精製することもできる。精製された酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、ウルトロゲル若しくはバイオゲル等を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマトグラフィー法；分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、又はこれらを組み合わせて実施することにより、精製された本発明のＦＡＤ−ＧＤＨ酵素標品を得ることができる。
【００４４】
（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを用いたグルコース測定方法）
本発明はまた、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを開示し、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを用いて血中のグルコース（血糖値）を測定することができる。
本発明のグルコースアッセイキットには、少なくとも１回のアッセイに十分な量の本発明に従う改変型ＦＡＤ−ＧＤＨを含む。典型的には、本発明のグルコースアッセイキットは、本発明の改変型ＦＡＤ−ＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液を含む。本発明のグルコース測定法やグルコースアッセイキットに用いる改変型ＦＡＤ−ＧＤＨは、種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中に溶解されて提供することができる。
【００４５】
グルコース濃度の測定は、比色式グルコースアッセイキットの場合は、例えば、以下のよう行うことができる。グルコースアッセイキットの反応層にはＦＡＤ−ＧＤＨ、電子受容体、そして反応促進剤としてＮ−（２−アセトアミド）イミド２酢酸（ＡＤＡ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、炭酸ナトリウムおよびイミダゾールからなる群より選ばれる１以上の物質を含む液状もしくは固体状の組成物を保持させておく。ここで、必要に応じてｐＨ緩衝剤、発色試薬を添加する。ここにグルコースを含む試料を加え、一定時間反応させる。この間、還元により退色する電子受容体もしくは電子受容体より電子を受け取ることによって重合し生成する色素の最大吸収波長に相当する吸光度をモニタリングする。レート法であれば、吸光度の時間あたりの変化率から、エンドポイント法であれば、試料中のグルコースがすべて酸化された時点までの吸光度変化から、予め標準濃度のグルコース溶液を用いて作成したキャリブレーションカーブを元にして、試料中のグルコース濃度を算出することができる。
【００４６】
この方法において使用できるメディエーター及び発色試薬としては、例えば、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）を電子受容体として添加し、６００ｎｍにおける吸光度の減少をモニタリングすることでグルコースの定量が可能である。また、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）を、さらに発色試薬としてニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）を加え、５７０ｎｍ吸光度を測定することにより生成するジホルマザンの量を決定し、グルコース濃度を算出することが可能である。なお、いうまでもなく、使用する電子受容体および発色試薬はこれらに限定されない。
【００４７】
（本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを含むグルコースセンサー）
本発明はまた、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを用いるグルコースセンサーを開示する。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＦＡＤ−ＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００４８】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＦＡＤ−ＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作成したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００４９】
具体的な一例としては、グラッシーカーボン（ＧＣ）電極に本発明の１．５ＵのＦＡＤ−ＧＤＨを固定化し、グルコース濃度に対する応答電流値を測定する。電解セル中に、５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．８ｍｌ、及び、１Ｍ  ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウム（フェリシアン化カリウム）水溶液０．２ｍｌを添加する。ＧＣ電極をポテンショスタットＢＡＳ１００Ｂ／Ｗ（ＢＡＳ製）に接続し、３７℃で溶液を撹拌し、銀塩化銀参照電極に対して＋５００ｍＶを印加する。これらの系に１Ｍ  Ｄ−グルコース溶液を終濃度が５、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭになるよう添加し、添加ごとに定常状態の電流値を測定する。この電流値を既知のグルコース濃度（５、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭ）に対してプロットし、検量線が作成する。これより本発明のＦＡＤ結合型グルコース脱水素酵素を使用した酵素固定化電極でグルコースの定量が可能となる。
【００５０】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００５１】
本発明において、改変型ＦＡＤ−ＧＤＨの熱安定性および基質特異性の評価は、特に記載がない限り、以下の試験例の方法に従い行った。
［試験例］
（１）各種の改変型ＦＡＤ−ＧＤＨを発現する酵母形質転換体の作製
特許文献７に記載の方法に準じ、配列番号２のＭｕｃｏｒ  ｐｒａｉｎｉｉ由来ＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子（野生型ＭｐＧＤＨ遺伝子）をコードする組換え体プラスミド（ｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ（野生型））を取得した。
得られた組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐを鋳型として、各アミノ酸置換導入用の合成ヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
すなわち、１０×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとして「反応液」を調製した。サーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、調製した反応液を９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」−「５５℃、３０秒」−「６８℃、８分」のサイクルを３０回繰り返した。【００５２】
上記処理後の反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約８ｋｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。増幅されたＤＮＡを、制限酵素ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で処理後、添付のプロトコールに従って、大腸菌ＪＭ１０９株（ニッポンジーン社製）のコンピテントセルに混合することにより形質転換を行った。次いで、取得した形質転換体をそれぞれＬＢ−ａｍｐ寒天培地に塗布し、培養を行った。生育したコロニーをＬＢ−ａｍｐ液体培地に接種して振とう培養し、ＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ｓｉｇｍａ社製）を用いて、添付のプロトコールに従って、約８ｋｂｐの増幅されたＤＮＡを含む各種のプラスミドＤＮＡ（例えば、実施例１におけるｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｃ８８Ａ等）を単離した。次いで、これらの各種プラスミドＤＮＡ中のＭｐＧＤＨ遺伝子をコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて決定し、それぞれの配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列における所定の位置のアミノ酸が置換されていることを確認した。このようにして、所定のアミノ酸が置換された改変型ＭｐＧＤＨをコードする酵母発現用ベクターｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ（改変型、例えば、実施例１におけるｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｃ８８Ａ等）を取得した。
その後、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ用形質転換キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ（野生型）、および各種変異が導入されたｐＹＥＳ２Ｃ−Ｍｐ（改変型、例えば、実施例１におけるｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｃ８８Ａ等）をＩｎｖ−Ｓｃ株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に形質転換することにより、野生型ＭｐＧＤＨを発現する酵母形質転換体Ｓｃ−Ｍｐ（野生型）株、および各種の改変型ＭｐＧＤＨを発現する酵母形質転換株Ｓｃ−Ｍｐ（改変型、例えば、実施例１におけるＳｃ−Ｍｐ−Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｃ８８Ａ等）株をそれぞれ取得した。【００５３】
（２）酵母発現ＦＡＤ−ＧＤＨの熱安定性評価
酵母形質転換体Ｓｃ−Ｍｐ（野生型）、および、各種の酵母形質転換体Ｓｃ−Ｍｐ（改変型、例えば、実施例１におけるＳｃ−Ｍｐ−Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｃ８８Ａ等）を、各々、５ｍＬの前培養用液体培地[０．６７％（ｗ／ｖ）アミノ酸不含有イーストニトロゲンベース（ＢＤ）、０．１９２％（ｗ／ｖ）ウラシル不含有酵母合成ドロップアウト培地用添加物（ｓｉｇｍａ社製）、２．０％（ｗ／ｖ）ラフィノース]中で、３０℃にて２４時間培養した。その後、前培養液１ｍＬを４ｍＬの本培養用液体培地[０．６７％（ｗ／ｖ）アミノ酸不含有イーストニトロゲンベース、０．１９２％（ｗ／ｖ）ウラシル不含有酵母合成ドロップアウト培地用添加物、２．５％（ｗ／ｖ）Ｄ−ガラクトース、０．７５％（ｗ／ｖ）ラフィノース]に加えて、３０℃で１６時間培養する。この培養液を遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、３分間）により菌体と培養上清に分離し、培養上清液を熱安定性の評価に用いた。
ＦＡＤ−ＧＤＨの熱安定性評価は、まず、上述のように回収した評価対象のＦＡＤ−ＧＤＨを含む培養上清液を約１Ｕ／ｍｌになるように酵素希釈液（１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０））にて希釈する。そして、この酵素溶液（０．１ｍｌ）を２本用意し、そのうち１本は４℃で保存し、もう１本には、４０℃、１５分間の加温処理を施した。
加温処理後、各サンプルのＦＡＤ−ＧＤＨ活性を測定し、４℃で保存したものの酵素活性を１００としたときの、４０℃、１５分間処理後の活性値を「活性残存率（％）」として算出した。この活性残存率（％）を、各種ＦＡＤ−ＧＤＨの耐熱性評価の指標とした。
野生型ＭｐＧＤＨを発現するＳｃ−Ｍｐ（野生型）株の培養上清を用いて、野生型ＭｐＧＤＨの熱安定性を評価した結果、野生型ＭｐＧＤＨの４０℃、１５分熱処理後の残存活性率は４２．４％であった。よって、各種改変型ＭｐＧＤＨの熱処理後の残存活性率が４２．４％より高かった場合に、ＭｐＧＤＨの熱安定性が向上していると判断することができる。【００５４】
（３）基質特異性評価
基質特異性についても、熱安定性と同様に、上記（２）の方法に従って回収した各種酵母培養上清液を用いて評価を行った。まず、上述の活性測定法の基質をＤ−グルコースから同モル濃度のマルトースまたはＤ−キシロースとした系に変えてそれぞれの基質に対する活性を測定した。そして、これらの値から、「Ｄ−グルコースへの反応性に対するマルトースへの反応性の割合（Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％））」および「Ｄ−グルコースへの反応性に対するＤ−キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））」を算出した。
Ｓｃ−Ｍｐ（野生型）株にて発現させた野生型ＭｐＧＤＨの（Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％））および（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））は、それぞれ０．８％、１．４％であった。このような基質特異性は、従来知られたその他のＦＡＤ-ＧＤＨと比較しても非常に優れており、測定目的物質であるＤ−グルコースを精度よく測定できることが期待される。
【実施例１】
【００５５】
（各種改変型ＭｐＧＤＨの調製と熱安定性評価）
上記試験例で記述した方法に従って、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ（野生型）を鋳型プラスミドとして、表１に示した配列番号の合成ヌクレオチドの組み合わせでＰＣＲ反応を行った。次いで、増幅されたＤＮＡを含むベクターを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、生育したコロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＭｐＧＤＨをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行うことにより、配列番号１に記載のアミノ酸配列の６６位のアスパラギンがチロシン及び６８位のアスパラギンがグリシンに、８８位のシステインがアラニンに、１５８位のスレオニンがヒスチジンに、２３３位のグルタミンがアルギニンに、５５７位のロイシンがバリン及び５５９位のセリンがリジンに置換された組換え体プラスミドであるｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｃ８８Ａ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｔ１５８Ｈ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｑ２３３Ｒ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｌ５５７Ｖ／Ｓ５５９Ｋをそれぞれ取得した。【００５６】
次いで、部位特異的変異を導入した上述の各種改変型ＭｐＧＤＨをコードする組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｃ８８Ａ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｔ１５８Ｈ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｑ２３３Ｒ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｌ５５７Ｖ／Ｓ５５９Ｋを用いて、試験例（２）の項目に従って、Ｉｎｖ−Ｓｃ株の形質転換及び取得された形質転換株（Ｓｃ−Ｍｐ−Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｃ８８Ａ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｔ１５８Ｈ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｑ２３３Ｒ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｌ５５７Ｖ／Ｓ５５９Ｋ株）の培養を行い、培養上清中のＧＤＨ活性を測定した。【００５７】
続いて、ＧＤＨ活性が確認された上述の各種変異体の培養上清を用いて、上記の試験例（２）、（３）の項目の手順に基づき、４０℃、１５分間の加熱処理後の残存活性率（％）、Ｄ−グルコースへの反応性に対するＤ−キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））を測定した。【００５８】
なお、例えば、表１において、「Ｃ８８Ａ」は８８位のＣ（Ｃｙｓ）をＡ（Ａｌａ）に置換することを意味する。また、例えば、「Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ」は、６６位のＮ（Ａｓｎ）をＹ（Ｔｙｒ）、６８位のＮ（Ａｓｎ）をＧ（Ｇｌｙ）にそれぞれ置換すること、「／」はその両方の置換を有することを意味する。【００５９】
【表１】
0006526572.tif 000003
【００６０】
表１に示すとおり、配列番号１の野生型ＭｐＧＤＨに対する６６位、６８位、８８位、１５８位、２３３位、５５７位、または５５９位への部位特異的変異導入、具体的には、Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ、Ｃ８８Ａ、Ｔ１５８Ｈ、Ｑ２３３Ｒ、またはＬ５５７Ｖ／Ｓ５５９Ｋの部位特異的変異を導入することにより、ＦＡＤ−ＧＤＨの耐熱性が向上することが確認された。
さらに、これらの熱安定性が向上しているＦＡＤ−ＧＤＨは、高い基質特異性も維持されていることがわかった。すなわち、表１に記載するような本発明の熱安定性向上変異を有する改変型酵素は、野生型ＦＡＤ-ＧＤＨが有する基質特異性に対し負の影響を与えることなく、場合によっては、野生型酵素の基質特異性を上回るようなものも含み得ることがわかった。
【実施例２】
【００６１】
（変異の組み合わせ導入に関する検討）
次に、実施例２に示すような変異を多重的に有する変異体を作製し、それらにおける熱安定性向上効果を検証した。具体的には、上記試験例で記述した方法に従って、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｃ８８Ａを鋳型プラスミドとし、表２に記載の配列番号の合成ヌクレオチドの組み合わせでＰＣＲ反応を行った。次いで、増幅されたＤＮＡを含むベクターを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、生育したコロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＭｐＧＤＨをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行うことにより、８８位のシステインがアラニンに置換されたことを特徴とし、さらに別のアミノ酸置換を兼ね備えた下記の多重変異体を作製した。具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列の８８位のシステインがアラニンに置換され、６６位のアスパラギンがチロシンに置換され、かつ、６８位のアスパラギンがグリシンに置換された３重変異体、８８位のシステインがアラニンに置換され、かつ、１５８位のスレオニンがヒスチジンに置換された２重変異体、８８位のシステインがアラニンに置換され、かつ、２３３位のグルタミンがアルギニンに置換された２重変異体、８８位のシステインがアラニンに置換され、５５７位のロイシンがバリンに置換され、かつ、５５９位のセリンがリジンに置換された３重変異体をコードする組換え体プラスミドであるｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｃ８８Ａ／Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｃ８８Ａ／Ｔ１５８Ｈ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｃ８８Ａ／Ｑ２３３Ｒ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｃ８８Ａ／Ｌ５５７Ｖ／Ｓ５５９Ｋを、それぞれ取得した。【００６２】
次いで、部位特異的変異を導入した上述の各種改変型ＭｐＧＤＨをコードする組換え体プラスミド（ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｃ８８Ａ／Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｃ８８Ａ／Ｔ１５８Ｈ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｃ８８Ａ／Ｑ２３３Ｒ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｃ８８Ａ／Ｌ５５７Ｖ／Ｓ５５９Ｋ）を用いて、試験例（２）の項目に従って、Ｉｎｖ−Ｓｃ株の形質転換及び取得された形質転換株（Ｓｃ−Ｍｐ−Ｃ８８Ａ／Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｃ８８Ａ／Ｔ１５８Ｈ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｃ８８Ａ／Ｑ２３３Ｒ株、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｃ８８Ａ／Ｌ５５７Ｖ／Ｓ５５９Ｋ株）の培養を行い、培養上清中のＧＤＨ活性を測定した。【００６３】
続いて、ＧＤＨ活性が確認された上述の各種変異体の培養上清を用いて、上記の試験例（２）、（３）の項目の手順に基づき、４０℃、１５分間の加熱処理後の残存活性率（％）、４５℃、１５分間の加熱処理後の残存活性率（％）、およびＤ−グルコースへの反応性に対するＤ−キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））を測定した。【００６４】
【表２】
0006526572.tif 000004
【００６５】
表２に示すとおり、配列番号１のアミノ酸にＣ８８Ａを導入した上に、さらにＮ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ、Ｔ１５８Ｈ、Ｑ２３３Ｒ、Ｌ５５７Ｖ／Ｓ５５９Ｋのアミノ酸置換をそれぞれ組み合わせることで、耐熱性がより向上することが確認された。特に、Ｃ８８Ａ／Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ変異体では４５℃熱処理後の残存活性率が１０％以上、Ｃ８８Ａ／Ｔ１５８Ｈ変異体、及び、Ｃ８８Ａ／Ｑ２３３Ｒ変異体では４５℃熱処理後の残存活性率が３０％以上を保持しており、特に好ましい多重変異体であった。
さらに、該多重変異体では高い基質特異性も維持または向上されていることがわかり、特にＣ８８Ａ／Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ及びＣ８８Ａ／Ｔ１５８Ｈにおいては、野生型の基質特異性を上回ることがわかった。
【実施例３】
【００６６】
（単変異における検討）
次に、実施例３に示すような単変異を有する変異体を作製し、それらにおける熱安定性向上効果を検証した。具体的には、上記試験例で記述した方法に従って、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ（野生型）を鋳型プラスミドとし、表３に記載の配列番号の合成ヌクレオチドの組み合わせでＰＣＲ反応を行った。次いで、増幅されたＤＮＡを含むベクターを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、生育したコロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＭｐＧＤＨをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行うことにより、配列番号１に記載のアミノ酸配列の６６位のアスパラギンがチロシンに、６８位のアスパラギンがグリシンに、３９１位のロイシンがイソロイシンに、５５７位のロイシンがバリンに、５５９位のセリンがリジンに、３８５位のアラニンがスレオニンに置換された変異体をコードする組換え体プラスミドであるｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｎ６６Ｙ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｎ６８Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｌ３９１Ｉ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｌ５５７Ｖ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｓ５５９Ｋ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ａ３８５Ｔをそれぞれ取得した。【００６７】
次いで、部位特異的変異を導入した上述の各種改変型ＭｐＧＤＨをコードする組換え体プラスミド（ＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｎ６６Ｙ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｎ６８Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｌ３９１Ｉ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｌ５５７Ｖ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ｓ５５９Ｋ、ｐＹＥ２Ｃ−Ｍｐ−Ａ３８５Ｔ）を用いて、試験例（２）の項目に従って、Ｉｎｖ−Ｓｃ株の形質転換及び取得された形質転換株（Ｓｃ−Ｍｐ−Ｎ６６Ｙ、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｎ６８Ｇ、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｌ３９１Ｉ、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｌ５５７Ｖ、Ｓｃ−Ｍｐ−Ｓ５５９Ｋ、Ｓｃ−Ｍｐ−Ａ３８５Ｔ株）の培養を行い、培養上清中のＧＤＨ活性を測定した。【００６８】
続いて、ＧＤＨ活性が確認された上述の各種変異体の培養上清を用いて、上記の試験例（２）、（３）の項目の手順に基づき、４０℃、１５分間の加熱処理後の残存活性率（％）、４５℃、１５分間の加熱処理後の残存活性率（％）、およびＤ−グルコースへの反応性に対するＤ−キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））を測定した。【００６９】
【表３】
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【００７０】
表３に示すとおり、配列番号１のアミノ酸にＮ６６Ｙ、Ｌ３９１Ｉ、Ｌ５５７Ｖ、Ａ３８５Ｔのアミノ酸置換をそれぞれ導入することで、耐熱性が向上することが確認された。また、単変異のＮ６８Ｇは、単独の変異導入では耐熱性が低下したが、Ｎ６６Ｙと組み合わせることで耐熱性効果を有することが確認された。
さらに、これら変異体ではＸｙｌ／Ｇｌｃ（％）がすべて２％以下であり、高い基質特異性も維持または向上されていることがわかった。
【実施例４】
【００７１】
（各変異体における比活性Ｕ／Ａ２８０の測定）
次に、実施例１及び３で取得した各変異体（Ｎ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ、Ｃ８８Ａ、Ｔ１５８Ｈ、Ｑ２３３Ｒ、Ｌ５５７Ｖ／Ｓ５５９Ｋ、Ｌ３９１Ｉ、Ａ３８５Ｔ）のタンパク質量あたりの活性（比活性）を測定した。具体的には、以下の操作を行った。実施例１及び３と同様にして取得した各変異体の酵母培養上清液を遠心式フィルターユニット(Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ  １０Ｋ、ＭＥＲＣＫ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製)により濃縮後、２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に置換した。濃縮した酵母培養上清液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認すると、ＦＡＤ−ＧＤＨに相当するバンド以外はほぼ見られないため、酵母培養上清液中にはほとんど夾雑タンパク質は存在していないことがわかった。よって、濃縮した該酵母培養上清液を用いて、ＧＤＨ活性及び２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）によりタンパク質濃度を測定し、それぞれの変異体における比活性（Ｕ／Ａ２８０）を測定した。その後、同様にして測定した変異導入前（野生型）の比活性を１００としたときの各変異体における比活性の割合を「相対比活性」として算出し、比活性の評価に用いた。つまり、相対比活性が１００より大きいときは変異導入前より比活性が向上したとみなし、１００より小さいときには変異導入前より比活性が低下したとみなすことができる。なお、変異体Ｃ８８Ａについて、本方法の粗酵素液を用いて測定した比活性より算出した相対比活性は１２５であったが、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００ＧＬ（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）のカラムにより精製したＣ８８Ａの相対比活性は１１９であることから、本方法により算出した相対比活性の値は、精製酵素で測定した相対比活性の値と相関していると判断した。
また、特許文献７で記述されている、耐熱性が向上したケカビ由来ＦＡＤ-ＧＤＨの変異体Ｖ２３２Ｅ、Ｔ３８７Ａ、Ｉ５４５Ｔについても、上記と同様にして相対比活性を測定し、さらに試験例（２）、（３）に従って熱安定性及び基質特異性の評価を行った。【００７２】
【表４】
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【００７３】
表４に示すとおり、特許文献７に記載の耐熱性向上変異体であるＴ３８７Ａ、Ｉ５４５ＴはＸｙｌ/Ｇｌｃ（％）が２％より低く、高い基質特異性は維持されているものの、相対比活性に関しては６０％を下回っており、比活性が著しく低下していることがわかる。また、特許文献７に記載の耐熱性向上変異体であるＶ２３２Ｅは、比活性が１００より高く維持されているもの、Ｘｙｌ/Ｇｌｃ（％）が２％より高く、高い基質特異性が損なわれていることがわかる。
一方、本発明の耐熱性向上変異体であるＮ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ、Ｃ８８Ａ、Ｔ１５８Ｈ、Ｑ２３３Ｒ、Ｌ５５７Ｖ／Ｓ５５９Ｋ、Ｌ３９１ＩまたはＡ３８５Ｔでは、いずれも相対比活性が６０％以上に保持されており、さらに、前述のとおり、該変異体はＸｙｌ/Ｇｌｃ（％）がすべて２％より低く、高い基質特異性も維持されていることがわかる。【００７４】
上記の通り、本発明の変異体は、変異を導入する前の酵素と比較して熱安定性が向上し、十分な熱安定性を有することがわかった。このような特性を備えたＦＡＤ−ＧＤＨは、酵素の熱失活度合が少ないことにより、測定用試薬や測定用キットを製造する場合の酵素の使用量低減や保存期間の延長等を可能にし、公知のグルコース測定用酵素を用いた測定方法や測定試薬と比較して、より実用性の高い測定方法や測定試薬、測定キットやセンサの提供が可能となることが期待される。特に、加熱乾燥処理を施す場合が想定される血糖センサ用チップの作製工程等においては、熱安定性に優れた本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは非常に有用と考えられる。
なお、本発明の熱安定性が向上した変異酵素の中には、本明細書中に開示するように、本発明者らが先に見出した特許第４６４８９９３号公報に記載のケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨと同様、グルコースへの高い基質特異性も兼ね備え、Ｄ−キシロース等の糖化合物が夾雑する条件下でも正確にＤ−グルコース値を測定できるものも含まれていることがわかった。
さらに、本発明の変異体は比活性も高く維持されていることがわかった。血糖センサへの用途においては、より比活性の高い酵素が望まれる。比活性の高い酵素を用いることで、センサ上での反応性が向上し、より短い時間での測定が可能になる。また、使用する酵素量の低減によるコストの削減や、夾雑物質によるノイズの低減等の利点も期待されることから、比活性の高い酵素の開発は、産業上非常に有用である。
【配列表】
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