(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高等真核細胞であって：
−  エンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする第１の外因性核酸配列；
−  Ｆｃ含有分子をコードする第２の外因性核酸配列を含み、
エンドグルコサミニダーゼ酵素が、ゴルジ区画を標的化する、高等真核細胞。
【請求項２】
前記エンドグルコサミニダーゼ酵素が、マンノシル−糖タンパク質ｅｎｄｏ−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．９６）である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
哺乳動物細胞である、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
高等真核細胞での産生によって得られる複数の同一Ｆｃ含有分子であって、
Ｆｃ部分のＮ２９７のグリコシル化が、三糖構造Ｎｅｕ５Ａｃ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ、二糖構造Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ、及び単糖構造ＨｅｘＮＡｃから選択される１つ以上のグリカンからなり、複数のＦｃ含有分子の少なくとも１つが、単糖構造ＨｅｘＮＡｃではないグリカンを有し、前記高等真核細胞が、
−  エンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする第１の外因性核酸配列；
−  前記Ｆｃ含有分子をコードする第２の外因性核酸配列の存在によって特徴付けられ、
エンドグルコサミニダーゼ酵素が、ゴルジ区画を標的化する、複数の同一Ｆｃ含有分子。
【請求項５】
Ｆｃ部分のＮ２９７のグリコシル化が、三糖構造Ｎｅｕ５Ａｃ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ、二糖構造Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ、及び単糖構造ＨｅｘＮＡｃから選択される１つ以上のグリカンからなることを特徴とする、複数の同一Ｆｃ含有分子であって、複数のＦｃ含有分子の少なくとも１つが、単糖構造ＨｅｘＮＡｃではないグリカンを有する、複数の同一Ｆｃ含有分子。
【請求項６】
前記三糖構造がＮｅｕ５Ａｃ−α−２，３−Ｇａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃであり、前記二糖構造がＧａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃであり、前記単糖構造がＧｌｃＮＡｃである、請求項５に記載の複数の同一Ｆｃ含有分子。
【請求項７】
抗体である、請求項４〜６のいずれか１項に記載の複数のＦｃ含有分子。
【請求項８】
薬剤として使用される、請求項４〜７のいずれか１項に記載の複数の同一Ｆｃ含有分子。
【請求項９】
静注免疫グロブリン療法に使用される、請求項４〜７のいずれか１項に記載の複数の同一Ｆｃ含有分子。
【請求項１０】
高等真核細胞の残基Ｎ２９７に特定のグリコシル化パターンを有するＦｃ含有分子を産生させる方法であって：
−  ゴルジ局在化シグナルに機能的に連結されたエンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする第１の外因性核酸配列、及び前記Ｆｃ含有分子をコードする第２の外因性核酸配列を、前記エンドグルコサミニダーゼ酵素及び前記Ｆｃ含有分子の発現に適した条件で含む高等真核細胞を用意するステップ；及び
−  前記Ｆｃ含有分子が前記エンドグルコサミニダーゼに細胞内で接触した後に前記Ｆｃ含有分子を回収するステップを含む、方法。
【請求項１１】
前記Ｆｃ含有分子が分泌される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
抗原の結合を変更することなく、Ｆｃ含有分子の循環時間を長くするための医薬組成物であって：
−  請求項４〜７のいずれか１項に記載の複数の同一Ｆｃ含有分子を含み、
前記複数の同一Ｆｃ含有分子は、Ｆｃ含有分子を必要とする対象に投与される、医薬組成物。
【請求項１３】
抗原結合活性を維持し、かつ非修飾糖型と比較して長いｉｎ  ｖｉｖｏでの循環時間を有する、請求項４〜７に記載のいずれか１項に記載の複数の同一Ｆｃ含有分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、糖鎖工学の分野に関し、より詳細には、Ｆｃ含有分子、例えば、抗体の糖鎖工学に関する。本明細書では、特定のグリコシル化パターンを有するＦｃ含有分子が、それぞれの抗原に対する結合親和性が変更されることなく、ｉｎ  ｖｉｖｏで相当長い循環半減期を有することが示される。これは、治療効果に影響を与えずに、これらの分子を投与しなければならない頻度の低減において治療上の意味を有する。また、所望のグリコシル化パターンを有するＦｃ分子を産生することができる細胞も提供される。
【背景技術】
【０００２】
抗体、特にＩｇＧ抗体は、過去２０年に亘って開発された最も成功している一部の治療法の基礎である（例えば、ほんの数例を挙げると、ベバシズマブ、リツキシマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、トラスツズマブ、又はセツキシマブ）。この成功は、ＩｇＧ抗体が、高い特異性を有し、長い血清半減期を有し、かつ比較的ルーチン的に作製することができ、ＩｇＧ抗体が免疫療法の理想的な薬であるという事実に少なくともある程度起因する。抗体分子（又は免疫グロブリン、Ｉｇ）の基本構造は、２つの同一のポリペプチド重鎖及び２つの同一のポリペプチド軽鎖からなる。これらの鎖は、ジスルフィド結合によって連結され、「Ｙ」形構造を形成している。ヒト免疫グロブリンは、重鎖について５つのクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＭ）に分類することができる。ＩｇＧ及びＩｇＡ抗体はそれぞれ、４つのサブクラス（ＩｇＧ１〜４）及び２つのサブクラス（ＩｇＡ１〜２）にさらに細分される。特定の抗原の認識は、抗原結合断片（Ｆａｂ）によって仲介され、この抗原結合断片は、軽鎖及び重鎖の可変領域及び１つの定常ドメインを含む。エフェクター機能は、重鎖の定常領域の他の２つのドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）に一致する断片結晶化可能領域（Ｆｃ）のエフェクタータンパク質、例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲｓ）への結合によって開始される。従って、Ｆａｂ断片は、軽鎖及び重鎖の可変ドメイン及び定常ドメインからなり、Ｆｃ断片は、重鎖の定常ドメインから完全になる。このＦｃドメインは、新生Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）へのｐＨ依存性の結合により抗体の血清半減期を延長し、これにより、タンパク質がエンドソームで分解されるのが防げられる。
【０００３】
殆どの生物学的に活性なタンパク質及びペプチドが、迅速な腎クリアランスにより非常に短い血清半減期を有し、これにより標的組織でのこれらの曝露、結果としてこれらの薬理作用が限定されるため、抗体の長い血清半減期を考慮して、Ｆｃ−融合タンパク質の作製は、治療タンパク質の半減期を延長するように行われる。Ｆｃ融合戦略はまた、多大な成功をもたらす：市販のＦｃ融合タンパク質は、例えば、エタネルセプト、アレファセプト、アバタセプト、リロナセプト、ロミプロスチム、ベラタセプト、及びアフリベルセプトを含む。さらなる利点として、Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ部分は、容易な発現及びタンパク質Ａ−親和性精製を可能にし、これにより抗体及びＦｃ融合治療の開発に実用的な利益を付与する。
【０００４】
抗体工学のアプローチは、例えば、リガンド若しくはＦｃ受容体への抗体の結合特性を変更することによって、又は抗体の半減期をさらに延長することによって、治療抗体の臨床的な成功をさらに促進するために使用される。これを達成するための典型的なアプローチは、突然変異の導入又は抗体のグリコシル化の変更を含む。Ｆｃ鎖への突然変異の導入は、もはや天然の配列として機能しないという特有の欠点を有する。循環半減期を延長するために一般に受け入れられる治療タンパク質のグリコシル化に反して、免疫グロブリンの循環から消失速度に対するグリコシル化の影響についての研究は、矛盾する結果を生み（Ｍｉｌｌｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、殆どの研究は、Ｆｃ部分のグリカン構造の差異は、クリアランスに影響を及ぼさないという結論を下している（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０００５】
抗体鎖の翻訳後修飾中に、小胞体及びゴルジ装置の酵素は、炭水化物鎖を抗体のポリペプチド主鎖に付着させることができる。単一Ｎ−結合グリカンが、全てのＩｇＧサブクラスのＦｃ部分の２９７位（Ｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）のアスパラギンに存在する。ＩｇＧ抗体の約２０％が、分子のどこかにグリカンを含む（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，２００５）。殆どの組換え抗体薬は、単一Ｆｃグリコシル化部位のみを含むように改変又は選択される。
【０００６】
抗体鎖が、正確に折り畳まれて結合すると、２９７位のオリゴ糖が、ＣＨ２ドメインによって囲まれた内部空間内に隔離され、オリゴ糖と抗体のアミノ酸との間に広範な非共有相互作用が存在し、高次構造に対する相互作用が生じる。
【０００７】
保存されたＡｓｎ−２９７部位に見られるオリゴ糖は、典型的には、フコシル化バイアンテナ複合型である。しかしながら、抗体分子の中で、変更された分岐鎖の長さ及び／又は炭水化物部分の変更された数により、炭水化物構造（糖型）における相当な不均一性が存在し得る。実際、付着したＮ−結合オリゴ糖の構造は、プロセシングの程度によってかなり異なり、かつ二等分ＧｌｃＮＡｃ及びコアフコース残基を含む又は含まない高マンノースオリゴ糖及び複合バイアンテナ型オリゴ糖含み得る（Ｗｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９９７）。典型的には、所与のグリコシル化部位に付着されたコアオリゴ糖構造の不均一なプロセシングが存在し、結果として、モノクローナル抗体さえも複数の糖型として存在する。さらに、抗体のグリコシル化における大きな相違が、抗体産生細胞株間に生じ、小さな相違も、異なる培養条件下で増殖された所与の細胞株に見られる。
【０００８】
実際、哺乳動物Ｎ−グリカン生合成における各ステップ（図１ａ、上部）は、＜１００％の効率であり、一部の酵素が、基質に対して競合し、多数の異なる糖型が生じる。不均一なグリコシル化は、治療タンパク質の生産で問題を発生させる。例えば、グリカンは、薬物動態及び生物活性に影響を与え得る（Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；  Ｅｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）；しかしながら、Ｎ−グリカンは、しばしば、タンパク質の折り畳みにとって不可欠であるため、これらの問題は、Ｎ−グリコシル化部位を完全に除去しても、又は小胞体の前又は中でグリコシル化を妨げても克服することができない。
【０００９】
糖型の差異は、異なる又は一貫性のないエフェクター機能を生じさせることがあり、これにより、抗体は、調節の観点から治療に使用すること又は規定することが困難になり得る。また、一般的にヒトでは生合成されない糖型は、アレルギー性及び免疫原性であり得、かつ結合した抗体の血漿クリアランスを促進させ得る。位置２９７でＦｃ部分の脱グリコシル化により、Ｆｃ含有分子のエフェクター機能の低下若しくは喪失、又は安定性の低下が起こり得る（Ｋｒａｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｂａｒｂ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｂｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【００１０】
改善された特性、例えば、長い循環半減期を有するが、欠点、例えば、不均一なグリコシル化も、抗原結合の減少もないＦｃ含有分子を得ることが有利であろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の目的は、循環中で長い半減期を有する抗体及びＦｃ融合タンパク質を産生させる方法を提供することにある。本発明の目的はまた、通常の哺乳動物細胞で得られるグリコシル化プロフィールよりも大幅に不均一性の低いグリコシル化プロフィールを有する抗体及びＦｃ融合タンパク質を提供することにある。
【００１２】
非常に特殊で単純なグリカンを有する糖タンパク質を得るために糖鎖が改変された動物細胞株を樹立すると、驚くべきことに、この細胞株で産生されるＦｃ含有分子が、ｉｎ  ｖｉｖｏで大幅に長い循環時間を有することが分かった。この抗体は、その他が非糖鎖改変細胞で産生される抗体と同一であるため、差異は、特定のグリコシル化パターンによるものだけである。
【００１３】
従って、第１の態様では、
−  エンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする第１の外因性核酸配列；
−  Ｆｃ含有分子をコードする第２の外因性核酸配列を含む細胞が提供される。
【００１４】
特に、細胞は高等真核細胞であると考えられる。さらなる特定の実施形態によると、高等真核細胞は、脊椎動物細胞、特に哺乳動物細胞である。例として、限定されるものではないが、ＣＨＯ細胞又はＨＥＫ２９３細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｓ細胞）が挙げられる。特定の実施形態によると、Ｆｃ含有分子のＦｃ部分は、ＩｇＧ型分子のＦｃである。
【００１５】
特定の実施形態によると、遺伝子ＭＧＡＴ１によってコードされるグリコシルトランスフェラーゼＧｎＴＩは、細胞内で不活性化される。
【００１６】
特定の実施形態によると、エンドグルコサミニダーゼ酵素の発現は、ゴルジ装置を標的にする。これは、例えば、エンドグルコサミニダーゼをゴルジ局在化シグナルに機能的に連結することによって達成することができる。
【００１７】
特定の実施形態によると、エンドグルコサミニダーゼ酵素は、マンノシル−糖タンパク質ｅｎｄｏ−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．９６）である。様々なこのような酵素、例えば、Ｅｎｄｏ  Ｔ、Ｅｎｄｏ  Ｈ、Ｅｎｄｏ  Ｓ、ＥＮＧａｓｅが存在する。特に考えられる酵素はＥｎｄｏ  Ｔである。
【００１８】
さらなる態様によると、これらの細胞での産生によって得られるＦｃ含有分子、即ち、
−  エンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする第１の外因性核酸配列；
−  Ｆｃ含有分子をコードする第２の外因性核酸配列の存在によって特徴付けられる高等真核細胞で産生されるＦｃ含有分子が提供される。
【００１９】
これらの細胞でＦｃ含有分子を産生させると、特定のグリコシル化パターンを有する分子が得られる。従って、Ｆｃ部分のグリコシル化が、三糖構造Ｎｅｕ５Ａｃ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ、二糖構造Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ、及び単糖構造ＨｅｘＮＡｃから選択されるグリカンからなることを特徴とするＦｃ含有分子が提供される。特殊な実施形態によると、グリカンは、三糖構造及び二糖構造から選択される（即ち、単一ＨｅｘＮＡｃ、例えば、単一ＧｌｃＮＡｃが存在する構造ではない）。
【００２０】
より具体的には、Ｆｃ部分のグリコシル化は、Ｆｃ部分の残基Ｎ２９７のグリコシル化である。これは、ＩｇＧ様分子のＦｃ部分の保存された残基である。
【００２１】
単一グリコシル化部位を有するＦｃ分子は、典型的には、１つのグリカン鎖しか有していないため、Ｆｃ部分のグリコシル化（例えば、Ｎ２９７のグリコシル化）が、三糖構造Ｎｅｕ５Ａｃ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ、二糖構造Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ、及び単糖構造ＨｅｘＮＡｃから選択される１つ以上のグリカンからなることを特徴とする複数の同一Ｆｃ含有分子も提供される。特定の実施形態によると、複数のＦｃ含有分子の少なくとも１つは、三糖構造及び二糖構造から選択されるグリカンを有する、即ち、複数のＦｃ含有分子の少なくとも１つが、単糖構造ＨｅｘＮＡｃではないグリカンを有する。
【００２２】
さらなる特定の実施形態によると、Ｆｃ含有分子のグリカン又は複数の含有分子のグリカンは、三糖構造Ｎｅｕ５Ａｃ−α−２，３−Ｇａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃ、二糖構造Ｇａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃ、及び単糖構造ＧｌｃＮＡｃから選択される。
【００２３】
特定の実施形態によると、特定のグリコシル化を有するＦｃ含有分子は、抗体、特にＩｇＧである。
【００２４】
さらなる態様によると、本明細書に記載のＦｃ含有分子は、薬剤として使用するために提供される。例えば、Ｆｃ含有分子は、静注免疫グロブリン療法に使用するために提供することができる。これは、静注免疫グロブリン療法で対象を処置する方法が提供されることと同義であり、この方法は、本明細書に記載の細胞によって産生されるＦｃ含有分子を前記対象に投与するステップを含む。又は別法として、静注免疫グロブリン療法で対象を処置する方法が提供され、この方法は、Ｆｃ含有分子（又は複数のＦｃ含有分子）を前記対象に投与するステップを含み、Ｆｃ部分のグリコシル化が、三糖構造Ｎｅｕ５Ａｃ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ、二糖構造Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ、及び単糖構造ＨｅｘＮＡｃから選択されるグリカンからなることを特徴とする。
【００２５】
なおさらなる態様によると、高等真核細胞で、残基Ｎ２９７の特定のグリコシル化パターンを有するＦｃ含有分子を産生させる方法が提供され、この方法は：
−  ゴルジ局在化シグナルに機能的に連結されたエンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする第１の外因性核酸配列、及びＦｃ含有分子をコードする第２の外因性核酸配列を、このエンドグルコサミニダーゼ酵素及びこのＦｃ含有分子の発現に適した条件で含む高等真核細胞を用意するステップ；及び
−  Ｆｃ含有分子がエンドグルコサミニダーゼに細胞内で接触した後にこのＦｃ含有分子を回収するステップを含む。
【００２６】
特定の実施形態によると、産生されるＦｃ含有分子は分泌される。
【００２７】
特定のグリコシル化パターンを有するＦｃ含有分子が、長い循環半減期を有することは特に有利である。即ち、これらのＦｃ含有分子は、循環中に長く残存する、効率的に除去されにくい、又は変更されたグリコシル化パターンを有していないＦｃ含有分子よりも長い時間、一定の閾値濃度を維持する。これは、複雑なグリコシル化が循環半減期の延長に有益であると一般的に思われているため実際驚きである。さらに、Ｆｃ含有分子（例えば、抗体）が、循環中に長く残存するだけではなく、これらの抗体のそれらのリガンドに対する親和性が、変更されたグリコシル化パターンによる影響を受けない。
【００２８】
従って、本明細書に記載の変更されたグリコシル化パターンを有するＦｃ含有分子が提供され、このＦｃ含有分子は、抗原結合活性を維持し、かつ変非修飾糖型と比較して長いｉｎ  ｖｉｖｏでの循環時間を有する。これらの実施形態では、Ｆｃ含有分子は、抗原に結合するＦｃ含有分子である。例えば、Ｆｃ含有分子は、抗体とすることができるが、キメラＦｃ融合タンパク質でもあり得、Ｆｃ部が、結合部分（例えば、ナノボディー、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２）に融合される。
【００２９】
従って、抗原結合を変更することなく、Ｆｃ含有分子を必要とする対象に投与されるＦｃ含有分子の循環時間を長くする方法が提供され、この方法は：
−  本明細書に記載のＦｃ含有分子を用意するステップ；
−  このＦｃ含有分子を対象に投与するステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ戦略及び細胞株の特徴を示している。糖残基：青色の正方形：Ｎ−アセチルグルコサミン、緑色の円：マンノース、黄色の円：ガラクトース、紫色の菱形：シアル酸。パネルａ：無傷のグリコシル化機構（上部）を備える哺乳動物細胞では、ゴルジに進入するオリゴマンノースグリカンが、クラスＩマンノシダーゼ（Ｍａｎｌ）によってさらにトリミングされてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２型になる。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２型は、α−１，３−マンノースにβ−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミンを有するＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ１（ＧｎＴＩ）によって修飾されると、ハイブリッド型又は複合型Ｎ−グリカンになる。複数のグリコシルヒドロラーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼは、多数の生合成ステップ（ＷＴグリコシル化、上部の黒い矢印）によって複合型Ｎ−グリカンをさらに形成し、相当な不均一性をもたらす。２９３ＳＧｎＴＩ−／−系統では、グリカンは、オリゴマンノース型になる。これらのＮ−グリカンは、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞のゴルジ標的ＥｎｄｏＴによって加水分解されて、単一Ｎ−アセチルグルコサミン残基（ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ糖鎖工学、底部）になる。単一ＧｌｃＮＡｃスタンプは、ゴルジ内のガラクトシルトランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ及びＳｉａＴ）によって延長することができる。ｐＨｏｐｔ、ｐＨ最適化。パネルｂ：コンカナバリンＡ選択戦略は、ｅｎｄｏＴによる細胞表面糖タンパク質の完全脱グリコシル化によりＣｏｎＡリガンドが存在しなくなり、細胞にｃｏｎＡに対する耐性が付与されるため、所望のグリカン表現型を直接選択する。親ＧｎＴＩ−／−細胞は、ｃｏｎＡで処理すると死ぬ。パネルｃ：２９３ＳＧｎＴＩ−／−細胞及び２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞の増殖曲線を、２４時間ごとにカウントした。エラーバーは、各トリプリケートの標準偏差を表している（表４）。両方の線は、同等の増殖動態を示している。パネルｄ：２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞の２９３ＳＧｎＴＩ（−）細胞に対する７，３４４遺伝子の平均（ｎ＝３）遺伝子発現値の散布図。相関係数は０．９８６５である。著しく差次的に発現される遺伝子（単純ベイズモデルに従って標準誤差が遺伝子全体で緩和されるｍｏｄｅｒａｔｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ；ｐ＜０．０１）には、それらの名称を標識した。示されている目盛上のマイクロアレイシグナル強度＜８は、信頼性のある検出には低すぎた。
【図２】図２は、分泌ｅｎｄｏＴ（ｓ−ｅｎｄｏＴ）と比較した２つの異なるトランスゴルジ標的ドメイン（ＧＭ２Ｓ−ｅｎｄｏＴ及びＳＴ−ｅｎｄｏＴ）の評価を示している。この実験では、本発明者らは、２つのトランスゴルジ標的配列のどちらが、２９３ＳＧｎＴＩ−／−細胞内のｅｎｄｏＴ触媒ドメインとのこれらの配列の融合の維持に最も有効であるかを評価した。比較のために、本発明者らは、ｅｎｄｏＴの分泌型（即ち、分泌シグナルを有するが、ゴルジ標的配列を有していない）も分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離細胞溶解物のタンパク質及び細胞培地中に存在するタンパク質のウエスタンブロット法を、ポリクローナル抗ｅｎｄｏＴ抗血清又はモノクローナル抗ｃ−Ｍｙｃエピトープ抗体に対して行った。ｃ−Ｍｙｃエピトープは、Ｃ末端が異なるタンパク質構築物に融合し、従って、その存在又は非存在により、このタンパク質のＣ末端処理について決定することができる。これらの結果から、ＧＭ２Ｓ由来配列は、この構築物がタンパク質の分泌型として細胞内及び細胞外ｅｎｄｏＴ型の同じ分布をもたらすため、ｅｎｄｏＴの細胞内の維持に有効でないことは明らかである。ＧＭ２配列は、効率的に切断されるようである。対照的に、ＳＴ由来配列は、ｅｎｄｏＴを細胞内に効率的に維持し、５０ｋＤａの主要バンドは、ＳＴ−ｅｎｄｏＴ融合タンパク質の予想分子量に一致する。一部の少量の分泌がなお、２つのＣ末端タンパク分解型で起こる。１００ｋＤａで観察することができる弱い細胞内バンドは、ＳＴ６ＧａＩＩドメインがオリゴマー形成する１ことが知られているため、恐らくＳＴ−ｅｎｄｏＴ二量体を表している。
【図３】図３は、ｅｎｄｏＴ融合構築物の一過性のトランスフェクションによるｉｎ  ｖｉｖｏでの脱Ｎ−グリコシル化を示している。ｅｎｄｏＴ融合タンパク質による脱Ｎ−グリコシル化を評価するために、融合構築物を、Ｆｌｔ３受容体細胞外ドメイン（Ｆｌｔ３ＥＣＤ、パネルＡ）を安定的かつ誘導的に発現する２９３ＳＧｎＴＩ−／−細胞、又は５−ヒドロキシ−トリプタミン受容体１Ｄ（５ＨＴ１Ｄ、パネルＢ）を安定的かつ誘導的に発現する２９３ＳＧｎＴＩ−／−細胞に一過性にトラスフェクトした。Ｃ末端ＨＩＳタグ（パネルＡ）又はＣ末端Ｒｈｏ１Ｄ４タグ（パネルＢ）を検出するために、サンプルを免疫ブロット法によって分析した。両方のパネルにおける数字は、１＝空プラスミド、２＝ｓ−ｅｎｄｏＴプラスミド、３＝ＧＭ２Ｓ−ｅｎｄｏＴプラスミド、４＝ＳＴ−ｅｎｄｏＴプラスミドでトランスフェクトされた細胞のサンプルを表す。パネルＡにおける文字ａ及びｂは、トランスフェクション／誘導の４８時間後及び７２時間後のサンプル／上清を表している。＋の記号は、陽性コントロールとしての精製Ｆｌｔ３ＥＣＤを示している。これらのブロットから、Ｆｌｔ３ＥＣＤサンプル及び５ＨＴ１Ｄサンプルの両方が、ｅｎｄｏＴ構築物（２、３、４）のいずれかのトランスフェクション時に分子量の低下を示すが、空プラスミド（１）ではそうではなく、ｅｎｄｏＴ融合構築物による脱Ｎ−グリコシル化を示していることは明らかである。明らかに、ｅｎｄｏＴは、細胞内に維持されても（ＳＴ−ｅｎｄｏＴ）細胞内に維持されなくても（ｓ−ｅｎｄｏＴ及びＧＭ２Ｓ−ｅｎｄｏＴ）、共発現糖タンパク質を脱グリコシル化することができる。
【図４】図４は、２つのＳＴ−ｅｎｄｏＴを過剰発現するクローン及び親２９３ＳＧｎＴＩ−／−系統に対するＣｏｎＡ感受性アッセイ２を示している。本発明者らは、２９３ＳＧｎＴＩ−／−細胞及び２つのｅｎｄｏＴを過剰発現するクローンのＣｏｎＡ感受性を決定するためにレクチン感受性アッセイを行った。両方のクローンは、親系統（２９３ＳＧｎＴＩ−／−：２μｇ／ｍｌ）よりもＣｏｎＡに対する耐性が遥かに高い。しかしながら、第１のクローン（＞２２μｇ／ｍｌ）は、第２のクローン（１８μｇ／ｍｌ）よりもＣｏｎＡに対する耐性が高く、従って、この第１のクローンを、さらにＣｏｎＡと協働するように選択した。このクローンを、２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅと呼ぶことにした。ＣｏｎＡに耐性のある２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ系統の安定性を、２０の分裂（＃＋８対＃＋２８）に対して試験した。耐性／感受性は、安定しており、＞２０μｇ／ｍｌであることが分かった（データは不図示）。約２０μｇ／ｍｌよりも高い濃度は、凝集体が形成され始めたため試験できなかった。
【図５】図５は、ＰＣＲ及びウエスタンブロット法によるｅｎｄｏＴの検証を示している。パネルａ：２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔ細胞ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）におけるＳＴ−ｅｎｄｏＴコード配列の存在のＰＣＲ検証。キャピラリー電気泳動法によるＰＣＲ産物の分析は、２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ  ｇＤＮＡを鋳型としての予想長さ（３４６ｂｐ）の特定のＰＣＲ産物の存在を例示している（矢印）。このアンプリコンは、ＰＣＲ反応では２９３ＳＧｎＴＩ−／−  ｇＤＮＡを鋳型としては作製されない。パネルｂ：ｅｎｄｏＴ触媒ドメイン（ポリクローナルウサギ抗ｅｎｄｏＴ）の存在を検出するために、２９３ＳＧｎＴＩ−／−細胞及び２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞のサンプルを免疫ブロット法によって分析した。２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞溶解物の主要バンドは、単量体ＳＴ−ｅｎｄｏＴの予想ＭＷ（４９．８ｋＤａ）に位置している。２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞溶解物の約１００ｋＤａ及び２００ｋＤａにあるバンドは、恐らくオリゴマーであるが、これよりも低いＭＷのバンドは、分解産物を表している可能性が高い。オリゴマーは、ＳＴ−ｅｎｄｏＴ構築物を用いる一過性のトランスフェクション実験でも観察される（図２）。これらのバンドのシグナルは、２９３ＳＧｎＴＩ−／−溶解物では検出することができない。
【図６】図６は、Ｓ系細胞株の発現の比較散布図を示している。値は、バックグラウンドの補正及びノイズの除去後に決定された発現遺伝子の平均ｌｏｇ２シグナル強度を表している。パネルＡ：２９３ＳＧｎＴＩ−／−対２９３Ｓ。補正係数は０．９４７である。７５２６の発現遺伝子のうち、６８の遺伝子が、２９３Ｓと比較して、２９３ＳＧｎＴＩ−／−系統の発現において少なくとも２倍の変化で著しく差次的に発現される（ｐ＜０．０１）ことが分かった。パネルＢ：２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ対２９３Ｓ。補正係数は０．９３８である。７４７３の発現遺伝子のうち、７０の遺伝子が、２９３Ｓと比較して、２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ系統の発現において少なくとも２倍の変化で著しく差次的に発現される（ｐ＜０．０１）ことが分かった。これらの遺伝子のうち、４５（−／＋６５％）が、由来細胞株と親２９３Ｓ細胞の両方で同じである。
【図７】図７は、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅグリカンの特徴付けを示している。（ａ）２９３Ｓ細胞、２９３ＳＧｎＴＩ（−）細胞、及び２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞からのＧＭ−ＣＳＦサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。各サンプルを、ＰＮＧａｓｅＦ、シアリダーゼ、又は両方で処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、クマーシーブリリアントブルーで染色した。ｋＤａ、キロダルトン。（ｂ）ＧＭ−ＣＳＦサンプルのＭＡＬＤＩ−ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ−ＭＳスペクトル。ピークには、それらの質量／変化比（ｍ／ｚ）の値が付されている。２９３ＳＧｎＴＩ（−）  ＧＭ−ＣＳＦのスペクトルは、Ｎ３７を含む糖ペプチドにおけるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（左）及びフコシル化Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（右）の存在を明らかにする。これらの糖型は、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ  ＧＭ−ＣＳＦには存在しない。ＨｅｘＮＡｃ、Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ、及びＮｅｕ５Ａｃ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ−修飾糖ペプチドに対応するｍ／ｚ値の新しいピークが検出される。α−２，３−シアリダーゼ又は広域シアリダーゼ及びβ−１，４−ガラクトシダーゼの両方を用いたエキソグリコシダーゼ消化ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ  ＧＭ−ＣＳＦ  Ｎ−グリカンのスペクトルが示されている。これらのスペクトルは、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ  ＧＭ−ＣＳＦ  Ｎ３７のＮ−グリカンが、Ｎｅｕ５Ａｃ−α−２，３−Ｇａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃ及びＧａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃであることを示している。（ｃ）２９３Ｓ細胞、２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞で産生されたＧＭ−ＣＳＦのＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒアッセイ。本発明者らは、全てのＧＭ−ＣＳＦ糖型（Ｔｍは約６０℃である）に対して類似の平均（ｎ＝３）融解曲線を観察した。（ｄ）ＴＦ１赤白血病細胞−増殖アッセイ（ｎ＝３）で測定された２９３Ｓ産生ＧＭ−ＣＳＦ及び２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ産生ＧＭ−ＣＳＦの生物活性。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生ＧＭ−ＣＳＦは、非グリコシル化コントロールサンプルとしての役割を果たす。エラーバーは標準偏差である（表５）。（ｅ）ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ  ＧＭ−ＣＳＦ免疫ウサギ血清の抗グリカン抗体力価のＥＬＩＳＡ分析。シアル酸及びガラクトース単糖のＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅグリカンからの除去は、血清抗体認識を低減しない（表６）。（ｆ）（ｅ）で説明される重複実験。
【図８】図８は、ＧＭ−ＣＳＦ糖ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを示している。両方の系統のＡｓｎ２７を包含する糖ペプチドは、ＧｎＴＩ−／−  ＧＭ−ＣＳＦにおけるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−Ａｓｎ（ｍ／ｚ＝１９３１．６）及びフコシル化Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−Ａｓｎ（ｍ／ｚ＝２０７７．７）の存在を示している（パネルＡ）。これらの糖型は、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ  ＧＭ−ＣＳＦには存在しない（パネルＢ）。ＨｅｘＮＡｃ−Ａｓｎ、Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ−Ａｓｎ、及びＳｉａ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ−Ａｓｎをそれぞれ表す、ｍ／ｚ＝９１８．５、１０８０．５、及び１３７１．６におけるピークが、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ  ＧＭ−ＣＳＦで検出されている。α−２，３−シアリダーゼ（パネルＣ）又は広域アルスロバクター・ウレアファシエンス（Ａ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）シアリダーゼ及びストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）β−１，４−ガラクトシダーゼ（パネルＤ）の両方を用いたエキソグリコシダーゼ消化ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ  ＧＭＣＳＦ  Ｎ−グリカンの分析が示されている。これらのスペクトルは、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ  ＧＭ−ＣＳＦのＮ−グリカンが、Ｎｅｕ５Ａｃ−α−２，３−Ｇａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ及びＧａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎであることを示している。
【図９】図９は、２９３Ｓ細胞で産生されるＧＭ−ＣＳＦのＤＳＡ−ＦＡＣＥ分析を示している。パネルａ：デキストランラダー基準。パネルｂ：注釈付き構造を有する、２９３Ｓ細胞で産生された未処置ＧＭ−ＣＳＦのＤＳＡ−ＦＡＣＥプロフィール。２９３Ｓ細胞で産生されるＧＭ−ＣＳＦのグリコシル化により、ガラクトシル化の無い、主にジアンテナ、トリアンテナ、及びテトラアンテナフコシル化複合型Ｎ−グリカンの不均一な混合物となる。低い電気泳動移動度では、一部のガラクトシル化構造が観察される。パネルｃ：ガラクトシル化構造が、ガラクトシダーゼ消化時にスペクトルから消えている。パネルｄ：マンノシダーゼ消化後、最も高い電気泳動移動度での２つの小さな注釈付きピークが潰れて、さらに高い電気泳動移動度の１つのピークとなる。マンノシダーゼ消化後にさらなる大きな変化が起こらず、末端マンノース残基が殆ど露出されないことを示唆している。パネルｅ：殆どの注釈付きピークが、ヘキソサミニダーゼ処置時に高い電気泳動移動度の２つのピークにシフトする。小さいピークは、非フコシル化コアＮ−グリカンを表し、大きいピークは、フコシル化トリマンノシルコアＮ−グリカンを表している。パネルｆ：本発明者らは、Ｎ−グリカンの大部分のコアフコシル化を観察する。これは、グリカンのフコシル化処置後の、多くの観察されたピークのより高い電気泳動移動度へのシフトによって例示されている。パネルｇ：本発明者らは、広域シアリダーゼでの処置時にグリカンプロフィールに大きな変化を一切観察せず、２９３Ｓ細胞で産生されるＧＭ−ＣＳＦのグリカンにシアル化が存在しないことを示唆している。
【図１０】図１０は、２９３Ｓ  ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞及び２９３Ｓ細胞で産生されるｈＧＭ−ＣＳＦのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を示している。パネル１：２９３Ｓ産生ｈＧＭ−ＣＳＦ。観察された著しい不均一性は、主にＮ−グリコシル化の多様性によるものである。パネル２：ｈＧＭ−ＣＳＦのシアリダーゼ消化によるある程度の不均一性の低下。パネル３：ＰＮＧａｓｅＦで消化されたｈＧＭ−ＣＳＦは、不均一性が大幅に低下し、Ｎ−グリコシル化が、分子量不均一性の主な原因であることを実証している。パネル４：２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ産生ｈＧＭ−ＣＳＦは、不均一性が大幅に低下している。パネル５：２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ産生ｈＧＭ−ＣＳＦのシアリダーゼ消化が、完全に脱Ｎ−グリコシル化された２９３Ｓ産生タンパク質と同様に低い複雑度のパターンを明らかにしている。
【図１１】図１１は、２９３ＳＧｎＴＩ−／−細胞及び２９３Ｓ  Ｇｌｙｃｏｄｅｌｅｔｅ細胞で産生される５ＨＴ１ＤＲの免疫ブロット法を示している。膜タンパク質抽出物のＰＮＧａｓｅでの処置により、予想通り、２９３ＳＧｎＴＩ−／−細胞（１）で安定的に産生される５ＨＴ１ＤＲの分子量（ＭＷ）の大きなシフトが明らかにされた。これとは対照的に、２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞（２）で産生される受容体は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ処置時にＭＷがシフトせず、２９３ＳＧｎＴＩ−／−細胞からの脱グリコシル化（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ処置）受容体とほぼ同じＭＷであった。これは、２９３Ｓ  ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞の５ＨＴ１ＤＲ  Ｎ−グリカンの完全な除去に一致している。
【図１２】図１２は、２９３Ｓ細胞又は２９３Ｓ  ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞で産生される抗ＣＤ２０の免疫ブロット分析を示している。同一の方法を用いた一過性のトランスフェクション時の２９３Ｓ野生型細胞及び２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞の等容量の培地を免疫ブロット法によって分析した。その結果、ブロットは、培地の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体のタンパク質の発現レベルを示す。組換えタンパク質の収量は、両方の細胞株で同様であり、ＷＴ  ２９３Ｓ前駆体からＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ  ２９３細胞を誘導するために使用される遺伝子操作が、細胞のタンパク質分泌能力に実質的に影響を及ぼさないことを示唆している。
【図１３】図１３は、２９３Ｓ細胞で産生される抗ＣＤ２０のＤＳＡ−ＦＡＣＥ分析を示している。パネルａ：デキストランラダー基準。パネルｂ：注釈付き構造を有する、２９３Ｓ細胞で産生された未処置抗ＣＤ２０のＤＳＡ−ＦＡＣＥプロフィール。２９３Ｓ細胞で産生される抗ＣＤ２０のグリコシル化により、ガラクトシル化を有する又は有しないコアフコシル化バイアンテナ型Ｎ−グリカンとなる。パネルｃ：本発明者らは、広域シアリダーゼでの処置時にグリカンプロフィールに大きな変化を一切観察せず、２９３Ｓ細胞で産生される抗ＣＤ２０のグリカンにシアル化が存在しないことを示唆している。パネルｄ：ガラクトシル化構造が、ガラクトシダーゼ消化時にスペクトルから消えている。非グリコシル化コア−フコシル化バイアンテナ型Ｎ−グリカンを表す１つのピークが残っている。パネルｅ：本発明者らは、全ての検出されたＮ−グリカンでコアフコシル化を観察する。これは、グリカンのフコシルダーゼ処置後の、観察されたピークのより高い電気泳動移動度へのシフトによって例示されている。
【図１４】図１４は、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ抗ＣＤ２０の機能的及び免疫学的特徴付けを示している。（ａ）２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ（Ｇｌ．Ｄｅｌ）細胞及び２９３Ｓ細胞からの抗ＣＤ２０のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。左の「ＰＮＧａｓｅ」は、ＰＮＧａｓｅ酵素バンドを示している。ＨＣ、抗体重鎖；ＬＣ、抗体軽鎖；ｋＤａ、キロダルトン。（ｂ）ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ抗ＣＤ２０糖ペプチドのＳＲＭモードのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ。ピーク表示は、ＬＣ溶出時間（分）を示している。三糖修飾、二糖修飾、及び単糖修飾糖ペプチドがそれぞれ、赤色、青色、及び黄色で示されている。シアリダーゼ及びβ−１，４−ガラクトシダーゼでのエキソグリコシダーゼ消化は、ＧＭ−ＣＳＦで観察されたものと同一のグリカンを示している。（ｃ）フローサイトメトリーによって評価された抗ＣＤ２０によるＣＤ２０−結合（表７）。（ｄ）未処置又はＰＮＧａｓｅＦ消化２９３Ｓ及び２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ抗ＣＤ２０のＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒアッセイで決定された平均融解曲線（ｎ＝３）。（ｅ）抗ＣＤ２０  Ｆｃのエフェクター機能を評価するための競合ＥＬＩＳＡ（上の３つ）及びＡＤＣＣアッセイ（底部）。被覆抗Ｆｃ抗体との競合を比較する２９３Ｓ抗ＣＤ２０及び２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ抗ＣＤ２０の濃度系列。エラーバー（ＥＬＩＳＡ）、標準誤差、（ｎ＝３）。エラーバー（ＡＤＣＣ）、標準偏差、ｎ＝３（表８）。（ｆ）２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ抗ＣＤ２０免疫ウサギ血清の抗グリカン抗体ＥＬＩＳＡ分析。ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ  ＧＭ−ＣＳＦで免疫されたウサギの血清中の抗体による抗ＣＤ２０認識の分析。抗ＣＤ２０サンプルを、シアリダーゼ、シアリダーゼとガラクトシダーゼ、又は酵素無しで処置した。エラーバー、標準偏差、ｎ＝３（表９）。（ｇ）２９３Ｓ抗ＣＤ２０又は２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ抗ＣＤ２０の静注後に経時的に測定された抗ＣＤ２０の血中濃度。エラーバー、標準誤差、ｎ＝４。このグラフの数値データは表１０に示されている。
【図１５】図１５は、２９３Ｓ（左）細胞及び２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ  （右）細胞で産生された抗ＣＤ２０  ｈＩｇＧ１のＬＣ−ＭＳ分析を示している。行Ａ：単一Ｎグリコシル化部位を有する還元重鎖のデコンボリューションされたＥＳＩスペクトル。抗ＣＤ２０で産生された２９３Ｓの場合は、典型的なコア−フコシル化無ガラクトシル化、一ガラクトシル化、及び二ガラクトシル化二アンテナ型グリカンは、優占種であり、少量のＭａｎ５Ｇｎ２  Ｎ−グリカンも検出された。シアル化は、殆ど検出不可能である。２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ抗ＣＤ２０の場合は、ＨｅｘＮＡｃ−Ａｓｎ、Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ−Ａｓｎ、及びＮｅｕＮＡｃ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ−Ａｓｎが、スペクトルを占有し、ごく少量のＭａｎ５Ｇｎ２も形成された。重要なことに、非Ｎ−グリコシル化に関連した不均一性が全く検出不可能であり、ＨＥＫ２９３細胞のＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ操作が、他の翻訳後修飾経路の予想外の誘発にはつながらないという考えを裏付けている。行Ｂ：軽鎖は、Ｎ−グリコシル化部位を有していないため、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ改変による影響を受けない。行Ｃ：無傷の非還元抗体のデコンボリューションされた質量スペクトル。全ての種は、両方の重鎖の糖型の一連の組み合わせと解釈することができる。両方の抗体では、Ｓ−Ｓ架橋の数は、還元鎖と構築抗体との間の質量差に基づいて１２〜１３と計算される。
【図１６】図１６は、抗ＣＤ２０のサイズ排除クロマトグラフィーを示している。２９３Ｓ抗ＣＤ２０（青色の線）及び２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ抗ＣＤ２０（赤色の線）のサイズ排除クロマトグラフィー。単一のピークしか検出されず、両方の糖型に凝集が存在しないことを示唆している。
【図１７】図１７は、マウスの抗ＣＤ２０の薬物動態を示している。注射後の初期の時点も含む、本文の図１４に示されている実験から独立した実験室での反復実験。血中でピーク濃度に達する前に、抗ＣＤ２０が殆ど除去されず、循環レベルが上昇した。続く遅いクリアランス（注射後１時間を超える）は、図１４に報告されている実験でも観察されるように両方の糖型で同等である。
【図１８】図１８は、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅで産生されるエタネルセプトＦｃ鎖グリカンの分析を示している。１回の実施として示されているデータは３回の実施を表している。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
定義
本発明は、特定の実施形態について特定の図面を参照して説明するが、本発明は、これらに限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。特許請求の範囲のどの参照符号も、発明の範囲を限定すると解釈するべきではない。描かれた図面は、単なる略図であり、限定するものではない。各図面において、一部の要素のサイズは、例示目的のために拡大され、正確な縮尺では描かれていないこともある。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語がこの説明及び特許請求の範囲で使用される場合、この語は、他の要素又はステップを排除するものではない。単数形の名詞について述べる際に不定冠詞又は定冠詞、例えば、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」が使用される場合、この語は、明確に他の記載がない限り、その名詞の複数形を含む。
【００３２】
さらに、この説明及び特許請求の範囲における「第１の」、「第２の」、及び「第３の」などの語は、類似の要素を区別するために使用され、起きた順番又は時系列の説明には必ずしも必要ではない。このように使用される語は、適切な状況下では置き換え可能であり、かつ本明細書で説明される本発明の実施形態は、本明細書で説明又は例示される順序以外の順序で実施可能であることを理解されたい。
【００３３】
以下の語又は定義は、本発明の理解を助けるためだけに記載される。本明細書に特段の記載がない限り、本明細書で使用される全ての語は、本発明の分野の技術者が考える意味と同じ意味を有する。当分野の定義及び語については、開業医は、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ４７），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）に従う。本明細書に記載される定義は、当業者によって理解される範囲よりも狭いと解釈されるべきものではない。
【００３４】
本明細書で使用される「高等真核細胞」は、単細胞生物の細胞ではない真核細胞を指す。言い換えれば、高等真核細胞は、多細胞真核生物の細胞（又は、細胞培養の場合には多細胞真核生物に由来する細胞）である。典型的には、高等真核細胞は、真菌細胞ではない。さらに典型的には、高等真核細胞は、植物細胞又は真菌細胞ではない。特に、この語は、動物細胞（又は、典型的には細胞株、例えば、昆虫細胞株又は哺乳動物細胞株）を指す。より詳細には、この語は、脊椎動物細胞を指し、さらに詳細には哺乳動物細胞を指す。本明細書に記載の高等真核細胞は、典型的には細胞培養の一部（例えば、細胞株、例えば、ＨＥＫ細胞株又はＣＨＯ細胞株）であるが、これは、常に厳密に要求されるものではない（例えば、植物細胞の場合、植物自体をタンパク質の生産に使用することができる）。
【００３５】
本明細書で使用される「エンドグルコサミニダーゼ」又は「エンドグルコサミニダーゼ酵素」は、糖タンパク質又は糖脂質のオリゴ糖の非末端β結合Ｎ−アセチルグルコサミン残基のアノマー炭素とそのアグリコンとの間の結合を加水分解し、これにより単糖又はオリゴ糖を、糖タンパク質又は糖脂質又は糖ポリマーから放出させる酵素を指す。エンドグルコサミニダーゼは、グリコシダーゼのサブセットであり、かつ他の酵素活性（例えば、糖転移酵素活性など）を有することもあるし、又は有していないこともある。エンドグルコサミニダーゼの特定のクラスは、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ又はマンノシル−糖タンパク質エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによって形成され、国際生化学及び分子生物学連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（ＩＵＢＭＢ）の命名法でＥＣ  ３．２．１．９６として示される。酵素のこの特定のクラスは、［Ｍａｎ（ＧｌｃＮＡｃ）２］Ａｓｎ−構造を含む高マンノース糖ペプチド及び糖タンパク質中のＮ、Ｎ’−ジアセチルキトビオシル単位の内部加水分解を触媒することができる。１つのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基は、タンパク質に付着したままであり；オリゴ糖の残りの部分は、無傷で放出される。従って、単一ＧｌｃＮＡｃ修飾糖タンパク質が得られる。残りのＧｌｃＮＡｃ残基は、修飾されなくても良いし、又は加水分解結合以外の位置で他の糖残基で修飾されても良く、例えば、ＧｌｃＮＡｃ残基は、３位又は６位にフコースを有しても良いことに留意されたい。しかしながら、修飾ＧｌｃＮＡｃ残基を有する糖タンパク質は、このＧｌｃＮＡｃ残基の４位に第２の糖残基が存在しない（即ち、典型的な糖鎖が存在しない）ため、なお単一ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質と呼ばれる。エキソグリコシダーゼと比較したエンドグルコサミニダーゼの特定の利点は、Ｎ結合及びＯ結合グリカン間及びグリカンのクラス間の区別を可能にすることである。エンドグルコサミニダーゼの非限定のリストが、本出願に添付される。
【００３６】
本出願で使用される「Ｆｃ含有分子」は、Ｆｃ領域を含むタンパク質又は融合タンパク質を指す。Ｆｃ領域（断片結晶化可能領域）は、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体及び補体系の一部のタンパク質と相互作用する免疫グロブリンの尾部領域である。特定の考えられる実施形態によると、Ｆｃ含有分子中のＦｃ領域は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）アイソタイプのＦｃ領域である。これは、ＩｇＧサブクラス（ヒトのＩｇＧ１、２、３、４）のいずれかであり得る。ＩｇＡ及びＩｇＤアイソタイプのようなＩｇＧの場合、Ｆｃ領域は、抗体の２つの重鎖の第２及び第３の定常ドメインからの２つの同一タンパク質断片からなる。ＩｇＧのＦｃ領域は、Ｎ２９７（Ａｓｎ−２９７又はアスパラギン２９７）として示される、高度に保存されたＮ−グリコシル化部位を有する。本明細書で使用される「Ｆｃ含有分子」は、自然な状態でＦｃ領域（例えば、免疫グロブリン）を有するタンパク質、又は融合タンパク質若しくは分子の両方を包含し、Ｆｃ領域は、タンパク質、ペプチド、又は他の分子（特に結合部分）に融合している。Ｆｃ融合タンパク質の例として、例えば、（限定されるものではないが）、Ｈｕａｎｇ，２００９に記載されている。このようなＦｃ分子は、Ｆｃ含有分子でもあることに留意されたい。Ｆｃ含有分子の特定のクラスは、抗原に結合できるＦｃ含有分子である。例として、抗体又は融合タンパク質が挙げられ、Ｆｃ領域は、結合部分（例えば、ナノボディー、Ｆａｂ領域、Ｆ（ａｂ’）２領域）に結合される。
【００３７】
典型的には、Ｆｃ含有分子中のＦｃ部分は、ヒト又はヒト化配列であり、Ｆｃ領域のアミノ酸配列が、ヒトＦｃ配列に対して少なくとも９５％同一、特にヒトＦｃ配列に対して少なくとも９９％同一、又は最も具体的にはヒトＦｃ配列に対して１００％同一であることを意味する。しかしながら、本発明は、ヒト配列に限定されるものではない。例えば、Ｆｃ領域は、マウスのＦｃ領域、又はラクダ科の動物、アカゲザル、イヌ、ウシ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、ウサギ、ネコ、若しくはその他の哺乳動物のＦｃ領域であると考えられる。Ｆｃ領域は、非哺乳動物（例えば、ニワトリ）のＦｃ領域であることさえも考えられる。このような場合、当業者であれば、Ｎ−グリコシル化部位は種を超えて保存されるが、正確な位置は、異なることがあり、常にＮ２９７ではないことを理解されよう。単純な配列アラインメントを使用すると、必要に応じて、正しい残基を識別することができる。
【００３８】
「ゴルジ局在化シグナル」は、ゴルジ装置にコンジュゲートするポリペプチド又はタンパク質の局在化を誘導する分子、典型的にはペプチドである。従って、局在化は、ゴルジ装置での保持も意味する。典型的には、これらの局在化（又は保持）配列は、成熟タンパク質として機能的に活性を有する場合にゴルジに位置する（プレ）タンパク質に由来するペプチド配列である。
【００３９】
本明細書で言及されるグリカン及び単糖は、時には、認知されている省略形：例えば、β−Ｄ−グルコースに対するＧｌｃ、β−Ｄ−マンノースに対するＭａｎ、β−Ｄ−ガラクトースに対するＧａｌ、β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンに対するＧｌｃＮＡｃ、β−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミンに対するＧａｌＮＡｃ、シアル酸（Ｓｉａ）としても知られているα−Ｎ−アセチルノイラミン酸に対するＮｅｕＮＡｃ、α−Ｌ−フコースに対するＦｕｃ、ヘキソースに対するＨｅｘで示される。
【００４０】
本発明は、さらなる使用、例えば、治療での使用、又はより容易なバイオマニュファクチャリングにより適するようにする、変更されたグリコシル化パターン、特により均一なグリコシル化パターンを有するＦｃ含有分子を産生する高等真核細胞を提供することを目的とする。
【００４１】
これは、第１の態様によると、エンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする第１の外因性核酸配列及びＦｃ含有分子をコードする第２の外因性核酸配列を含む高等真核細胞、特に動物細胞を提供することによって達成される。
【００４２】
特定の実施形態によると、高等真核細胞は、複合型の糖の合成に不十分となるように糖鎖が改変される（かつ、ハイブリッド型のグリカンの合成に不十分となるように改変してもしなくても良い）。より詳細には、高等真核細胞は、高マンノースＮ−グリカンのみを産生することができる高等真核細胞である。これは、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ１活性が不十分な細胞を作製することによって達成することができる。特定の実施形態によると、遺伝子ＭＧＡＴ１（遺伝子ＩＤ：ヒトの４２４５）によってコードされるグリコシルトランスフェラーゼＧｎＴＩが、細胞で不活性化される。
【００４３】
従って、複合型又はハイブリッド型のＮ−グリカンを合成できない高等真核細胞が提供され、この高等真核細胞は、エンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする第１の外因性核酸配列及びＦｃ含有分子をコードする第２の外因性核酸配列を有することによってさらに特徴付けられる。例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ１活性が不十分な高等真核細胞が提供され、この高等真核細胞は、エンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする第１の外因性核酸配列及びＦｃ含有分子をコードする第２の外因性核酸配列を有することによってさらに特徴付けられる。
【００４４】
高等真核細胞は、あらゆる高等真核生物とすることができるが、特定の実施形態では、哺乳動物細胞が考えられる。使用される細胞の性質は、典型的には、所望のグリコシル化特性及び／又は糖タンパク質の生産の容易さ及びコストによって決まる。哺乳動物細胞は、例えば、免疫原性の問題を回避するために使用することができる。タンパク質産生用の高等真核細胞株は、当分野で公知であり、グリコシル化経路が修飾された細胞株を含む。後の単離及び／又は精製のためのタンパク質の保護、発現、及び産生に適した動物又は哺乳動物宿主細胞の非限定の例として、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ＤＧ４４（Ｃｈａｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．，１２：５５５−５５６；及びＫｏｌｋｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：１０９０１−１０９０９）、ＣＨＯ−Ｋ１  Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＣＨＯ指定ＥＣＡＣＣ  ８５０５０３０２（ＣＡＭＲ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）、ＣＨＯクローン１３（ＧＥＩＭＧ，Ｇｅｎｏｖａ，ＩＴ）、ＣＨＯクローンＢ（ＧＥＩＭＧ，Ｇｅｎｏｖａ，ＩＴ）、ＣＨＯ−Ｋ１／ＳＦ指定ＥＣＡＣＣ  ９３０６１６０７（ＣＡＭＲ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）、ＲＲ−ＣＨＯＫ１指定ＥＣＡＣＣ  ９２０５２１２９（ＣＡＭＲ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）、ジヒドロ葉酸還元酵素陰性ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／−ＤＨＦＲ，Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６）、及びｄｐ１２．ＣＨＯ細胞（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，７２１，１２１）；ＳＶ４０（ＣＯＳ  ｃｅｌｌｓ，ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞；ヒト胎児腎臓細胞(例えば、浮遊培養で増殖させるためにサブクローニングされた２９３細胞、又は２９３Ｔ細胞、又は２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９）；乳児ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７；ＶＥＲＯ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，１９８０，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３４）；ヒト胚細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７５）；ヒトヘパトーマ細胞（ＨＥＰ−Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）；マウス乳癌細胞（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−５１）；ｂｕｆｆａｌｏラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４４２）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ，１９８２，Ａｎｎａｌｓ  ＮＹＡｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８）；ＭＣＲ  ５  ｃｅｌｌｓ；ＦＳ４細胞が挙げられる。特定の実施形態によると、細胞は、ＣＨＯ細胞、Ｈｅｋ２９３細胞、又はＣＯＳ細胞から選択される哺乳動物細胞である。さらなる特定の実施形態によると、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞及びＨｅｋ２９３細胞から選択される。
【００４５】
特に、高等真核細胞によって産生されるエンドグルコサミニダーゼ酵素が、この細胞で産生されるＦｃ含有分子に作用して、Ｎ−グリコシル化を除去すると考えられる。特定の実施形態によると、第１の外因性核酸配列によってコードされるエンドグルコサミニダーゼ酵素は、マンノシル−糖タンパク質エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼである、即ち、エンドグルコサミニダーゼ酵素は、ＩＵＢＭＢ命名法でＥ．Ｃ．３．２．１．９６の活性を有し、１つのＧｌｃＮＡｃ残基をタンパク質に残したまま糖鎖を除去することができることを示唆している（重要なことに：エンドグルコサミニダーゼ酵素は、共通のコア五糖Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２にも作用する）。代替の実施形態によると、第１の外因性核酸配列によってコードされるエンドグルコサミニダーゼは、異なるタイプのグリコシル化構造に対して異なる親和性を有する。エンドグルコサミニダーゼの典型的な例として、ハイブリッド型の糖及び／又は高マンノース糖を加水分解することができるが、複合型グリカンを切断できないエンドグルコサミニダーゼがある。さらなる特定の実施形態によると、エンドグルコサミニダーゼは、異なるタイプのグリコシル化構造に対して異なる親和性を有するマンノシル−糖タンパク質エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼである。なおさらなる特定の実施形態によると、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、ハイブリッド型の糖及び／又は高マンノース糖を切断することができるが、複合型グリカンは切断することができない。なおさらに特定の実施形態によると、エンドグルコサミニダーゼは、ＥｎｄｏＨ又はＥｎｄｏＴである。最も具体的な実施形態によると、エンドグルコサミニダーゼはＥｎｄｏＴである。
【００４６】
エンドグルコサミニダーゼが、Ｆｃ含有タンパク質の糖鎖を効率的に除去するようにするために、エンドグルコサミニダーゼは、単に細胞内に残るだけではなく、十分に活性も有すると考えられる。エンドグルコサミニダーゼの活性は、所望の加水分解が行われるようにするために、時空的に調節されるべきである。従って、特定の実施形態によると、エンドグルコサミニダーゼ酵素の発現は、ゴルジ装置を標的にする。これは、エンドグルコサミニダーゼをゴルジ局在化シグナルに機能的に連結することによって達成することができる。このようなシグナルは、エンドグルコサミニダーゼをゴルジに誘導し、エンドグルコサミニダーゼがゴルジに維持される。ゴルジ装置は、タンパク質のグリコシル化が起こる細胞内位置であるＥＲに隣接しているため、この細胞小器官を標的化することにより、エンドグルコサミニダーゼが、正確な細胞内位置にあって糖タンパク質のグリコシル化を修飾するようにする。
【００４７】
これは、高等真核細胞が、ゴルジ分泌経路にも存在する複合グリコシル化のために必要なさらなる酵素を有するため、さらなるグリコシル化の調節に特に有利である。実際、エンドグルコサミニダーゼは、これらの酵素が協働してＦｃ含有分子に作用するように標的化することができる。高等真核細胞では、ＥＲ及びゴルジ装置の管腔表面は、糖タンパク質がＥＲからゴルジ網を介して媒質に進むときに糖タンパク質の連続的な処理を可能にする触媒表面を提供する。糖タンパク質（例えば、Ｆｃ含有分子）がＥＲから分泌経路を介して進むため、糖タンパク質は、様々なマンノシダーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼに連続的に曝露される。いくつかのプロセシングステップは、一部のＮ−グリコシル化酵素が前の酵素によって生成される特定の基質に依存するため、前の反応に依存する。従って、Ｎ−グリコシル化酵素、特に外因性酵素、例えば、エンドグルコサミニダーゼは、特定のＮ−グリカン構造の合成を可能にするために所定の配列中に配置されなければならない。
【００４８】
しかしながら、本明細書に記載の細胞は、正しいグリコシル化パターンを有する所望のＦｃ含有分子を作製するために特に有用であるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで所望の糖プロフィールの全て又は一部を、（例えば、産生された（任意に脱グリコシル化された）タンパク質への酵素カップリングによって）合成により形成及び付加することも可能であることに留意されたい。
【００４９】
分泌経路の連続的なプロセシング環境の確立には、Ｎ−グリコシル化酵素の適切な局在化が必要である。分泌タンパク質が分泌経路（ＥＲからシスゴルジ区画、中間ゴルジ区画、及びトランスゴルジ区画を経て媒質に入る）を介して輸送することができる一方、各区画が常在（例えば、Ｎ−グリコシル化）酵素の特定のセットを維持する機序は、広範囲の研究の主題である。タンパク質を分泌経路の様々な区画に局在化させる２つの十分に確立された機序は、回収及び保持である（ｖａｎ  Ｖｌｉｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＢＭＢ  １  ２００３；Ｔｅａｓｄａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２７  １９９６）。
【００５０】
回収は、タンパク質が、他のタンパク質との相互作用によって特定の細胞小器官に局在化するプロセスである。いくつかのＥＲ常在タンパク質は、コンセンサス配列ＫＤＥＬ（配列番号：２３）（又は酵母中のＨＤＥＬ（配列番号：２４））を有するカルボキシ末端テトラペプチドを含み、このカルボキシ末端テトラペプチドはＥＲへの効率的な局在化に必要であることが分かっている。
【００５１】
いくつかのＥＲ常在酵素及びゴルジ常在酵素は、ＩＩ型膜タンパク質である。これらのタンパク質は、アミノ末端の短い細胞質尾部、疎水性膜貫通ドメイン、管腔ステム、及びＣ末端触媒ドメインを含む共通のドメイン構造を有する。欠失の研究及び非ゴルジ常在タンパク質への融合により、Ｎ末端、特に、多くのＩＩ型膜タンパク質の標的化情報を含むため膜貫通領域を特定した。Ｎ末端ドメインは標的化に関与することは明らかであるが、これらの標的化能力が異なる種間で移行可能な程度は、なお完全には明らかでない。しかしながら、かなりの進展、例えば、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓｅｃ１２（ＥＲ局在化）、ＭＮＮ２（ゴルジ局在化）、及びＭＮＮ９（ゴルジ局在化）のリーダー配列の適合性を裏付ける、例えば、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又はピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＥＲ及びゴルジに自然な状態で局在化するタンパク質に結合するペプチドをコードする既知のＩＩ型膜タンパク質ドメインの遺伝子ライブラリーの設計が達成された（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，５０２２  ２００３；Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ  １２４４）。国際公開第０２／０００８７９号パンフレットの表５に列記された配列は、ＨＤＥＬ、並びにＥＲ局在のためのＭｎｓｌのリーダー配列、Ｏｃｈ１及びＭｎｔ１（ゴルジ−シス局在化）のリーダー配列、Ｍｎｎ２（ゴルジ中間局在化）のリーダー配列、Ｍｎｎ１（ゴルジトランス局在化）のリーダー配列、α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ（トランス−ゴルジ網）のリーダー配列、及びβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼＩ（ゴルジ局在化）のリーダー配列を含む。
【００５２】
従って、局在化シグナルは、当分野で周知であり、機能するようにＥＲ又はゴルジに通常は局在化するタンパク質に由来し得る。さらに、ある生物の局在化配列は、他の生物でも機能し得る。例えば、ラット由来のα−２，６−シアリルトランスフェラーゼの膜貫通領域、ラットトランスゴルジに局在化することが知られている酵素は、酵母ゴルジにレポーター遺伝子（インバターゼ）を局在化させることも示された（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋ，  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋ及び同僚らは、酵母マンノシルトランスフェラーゼ（Ｍｎｔｌ）の２８のアミノ酸、Ｎ末端細胞質尾部を含む領域、膜貫通領域、及びステム領域の８つのアミノ酸のヒトＧａｌＴの触媒ドメインへの融合が、活性ＧａｌＴのゴルジ局在化に十分であることも示した（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋ  ｅｔ  ａｌ．１９９５  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１０）：５４８３−５４８９）。文書で十分に立証された他のモチーフは、ＥＲでの保持のためのＫＤＥＬ及びＨＤＥＬモチーフである。特定の実施形態によると、ＥＲ局在化又はゴルジ局在化シグナルは、機能的に活性であるとそれ自体がＥＲ又はゴルジに局在化するタンパク質からのものである。このようなタンパク質の例として、限定されるものではないが、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ジペプチジルアミノペプチダーゼＡ（Ｓｔｅ１３ｐ）、ヒトβ−ガラクトシド−α−２、６−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ６Ｇａｌｌ）、及びヒトガングリオシド−ＧＭ２−シンターゼが挙げられる。さらなる実施形態によると、局在化配列は、次のタンパク質：Ｓｔｅ１３ｐ、ＧＬ２−シンターゼ、ガングリオシド−ＧＭ２−シンターゼ、及びα−２，６−グリコシルトランスフェラーゼ、特にα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ、最も具体的にはβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼの１つに由来する。
【００５３】
重要なことに、ゴルジ装置は、唯１つの均一領域ではなく、５つの機能領域：シス−ゴルジ網、シス−ゴルジ、中間−ゴルジ、トランス−ゴルジ、及びトランス−ゴルジ網を有する。小胞体の小胞は、（小胞−管状クラスターを介して）シス−ゴルジ網に融合し、続いて、ゴルジ装置をトランス−ゴルジ網にする多数の槽を進み、そこでパッケージングされて必要とされる目的地に送られる。各領域は、例えば、常在するためにどこを目的地とするかによって、選択的に内容物を変更する様々な酵素を含む。従って、細胞内でのエンドグルコサミニダーゼの正確な標的化によって、グリコシル化経路を様々に変更することができる。
【００５４】
エンドグルコサミニダーゼを、ゴルジの後方で標的にして、異常にグリコシル化したタンパク質の「ｉｎ  ｖｉｖｏ掃除」を行うことができるが、特定の考えられる変更は、ゴルジグリコシル化経路の初期段階でエンドグルコサミニダーゼを標的化することであり、なお１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼ（典型的には、高等真核細胞の場合には内因性グリコシルトランスフェラーゼであるが、外因性グリコシルトランスフェラーゼも考えられる）は、さらに下流で活性を有する。このようにして、均一糖群（例えば、単一ＧｌｃＮＡｃ−修飾Ｆｃ含有分子）が、基質としてグリコシルトランスフェラーゼに提示される。これにより、グリコシル化Ｆｃ含有分子の均一群となる。この均一な糖群は、典型的なエンドグルコサミニダーゼが、天然糖構造に典型的な内部Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造も除去するため、特に、非天然の糖型の均一な群とすることもできることに留意されたい。しかしながら、このような構造は、しばしば、植物細胞、酵母細胞、又は昆虫細胞で産生される特定のグリカンよりも哺乳動物での免疫原性が低い。実施例のセクションに示されているように、特に考えられる標的化は、例えば、エンドグルコサミニダーゼがトランス―ゴルジを標的にすることによって、内因性ガラクトシルトランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼがタンパク質に連続的に作用するようにゴルジでの標的化である。これらの酵素の連続的な作用は、産生されたＦｃ含有分子に三糖構造：グリコシル化アスパラギン残基に最も近く、Ｇａｌ部分に結合され、かつＮｅｕＮＡｃ（シアル酸）部分で終わっているＧｌｃＮＡｃを生成する。
【００５５】
本明細書に記載の細胞によって産生されるＦｃ含有分子は、典型的には、容易に回収されるべきである。これは、特に、Ｆｃ含有分子の分泌によって達成される。これは、自然に起きても良いし、又は分泌シグナルの追加によって起こしても良い。分泌シグナルの性質は、典型的には、分泌されるタンパク質には依存しないが、使用される高等真核細胞型に依存する。分泌シグナルは、この分泌シグナルが使用される細胞型で機能する（即ち、分泌シグナルが、この分泌シグナルが融合するタンパク質又はペプチドの細胞外環境に分泌されることになる）限り、この特徴は、本発明にとって重要ではない。従って、他の生物からの分泌シグナルが、使用される高等真核細胞で分泌をもたらすのであれば、これらのシグナルを使用することができる。分泌シグナルは、当分野で周知であり、分泌されるタンパク質−典型的にはそのＮ末端−に由来しても良いし、又は合成により生成しても良い（例えば、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ２００２，ｖｏｌ．１５，ｎｏ４，ｐｐ．３３７−３４５）。あるいは、分泌シグナルは、計算法を用いてゲノム配列から得ることができる（Ｋｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００５，６：２５６）。また、細菌分泌シグナルを使用することができる。使用できるシグナルペプチドのさらなる例が、国際公開第２００２／０４８１８７号パンフレット（真核細胞）、Ｓｃｈａａｆ  ｅｔ  ａｌ．（ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５；５：３０）（苔状細胞）、欧州特許第５４９０６２号明細書に記載されている。
【００５６】
産生されるＦｃ含有分子のグリコシル化状態は、使用される細胞系（例えば、どの酵素がそこに存在するか）及びエンドグルコサミニダーゼの特異性の両方によって決まる。さらに、これらの酵素が作用する時間及び場所も重要である（例えば、どの酵素がＥＲで最初に作用して→ゴルジ経路）。これらの細胞で産生されるＦｃ含有分子は、例えば、グリコシルトランスフェラーゼでの処置によって、産生後にさらに修飾することができ、所望のグリカン部分を含むタンパク質となる。しかしながら、特に、特定のグリカン部分を有するＦｃ含有分子、即ち、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−ＮｅｕＮＡｃ三糖構造（ＧｌｃＮＡｃがＦｃ含有分子のアスパラギン残基、特にＩｇＧ  Ｆｃ含有分子のＮ２９７残基に結合されている）を有するＦｃ含有分子を産生することができる細胞を使用することが考えられる。典型的には、これは、（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ１活性を排除することによって）外因性Ｆｃ含有分子で複合糖を合成する能力を排除して、外因性エンドグルコサミニダーゼがゴルジ網を標的にして、この外因性エンドグルコサミニダーゼが、ガラクトシルトランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼの前に作用するようにすることによって達成される。これにより、この特有の糖プロフィールを有するＦｃ含有分子が有利な特性を有するため、産生後にさらなるグリコシルトランスフェラーゼ処理の必要性をなくす：本明細書では、この特有の糖構造を有する分子は、非免疫原性であり、抗原結合を維持し、かつｉｎ  ｖｉｖｏでの長い循環半減期を有することが示されている。このようにして、単純なグリコシル化経路が、グリカンプロフィールの不均一性が大幅に低下したタンパク質プールとなる。
【００５７】
従って、本明細書に記載の高等真核細胞は、Ｆｃ含有分子の産生に特に適している。これらの細胞で産生されるＦｃ含有分子は、本発明の範囲内であると見なされる。
【００５８】
従って、特定の実施形態によると、高等真核細胞での産生によって得られるＦｃ含有分子が提供され、この細胞は：
−  エンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする第１の外因性核酸配列；
−  このＦｃ含有分子をコードする第２の外因性核酸配列を有する。
【００５９】
さらなる特定の実施形態によると、エンドグルコサミニダーゼ酵素は、（例えば、エンドグルコサミニダーゼ酵素をゴルジ局在化シグナルに機能的に連結することによって）ゴルジ装置を標的にする。代替の非限定の実施形態によると、高等真核細胞は、複合型のグリコシル化ができないように糖鎖が改変されているが、ガラクトシルトランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼの発現が維持されている。特定の実施形態によると、複合型のグリコシル化ができないようにする糖鎖改変は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ１の阻害又はノックダウンを引き起こす。
【００６０】
これらの細胞での産生によって得られるＦｃ含有分子は、エンドグルコサミニダーゼを含まない（かつ複合グリコシル化能力を有する）高等真核細胞で産生されるＦｃ含有分子と比較して、より均一なグリカンプロフィールを有するＦｃ含有分子である。しかしながら、殆どの場合、不完全にグリコシル化されたＦｃ含有分子も産生されるため、全ての分子が、全く同じ三糖糖鎖を有するものではない。これらの形態は、単一ＧｌｃＮＡｃ部分又は二糖Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｃ領域のアスパラギンに連結されたＧｌｃＮＡｃを含む）を有する。しかしながら、本明細書に記載の三糖、二糖、又は単糖構造を有する同一のＦｃ含有分子のこのような群は、有利な効果も示す。従って、これらの細胞での産生によって得られる複数のＦｃ含有分子も考えられる。
【００６１】
これらの分子の有利な特性は、本明細書に記載の細胞で産生される分子に限定されるものではない。実施例のセクションに示されるように、これらの特性（特に長い循環半減期）は、特定のグリコシル化パターンからのみ生じる。言い換えれば、（例えば、エンドグルコサミニダーゼ及び／又はグリコシルトランスフェラーゼ（複数可）の処理によって）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＦｃ含有分子に部分的又は全体的に合成される同じグリコシル化構造を有するＦｃ含有分子は、本明細に書記載の細胞で完全に産生されるＦｃ含有分子と同じ特性を有する。
【００６２】
従って、Ｆｃ部分のアスパラギンのグリコシル化が、（それぞれ、アスパラギンに連結されたＨｅｘＮＡｃを有する）三糖構造Ｎｅｕ５Ａｃ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ、二糖構造Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ、及び単糖構造ＨｅｘＮＡｃから選択されるグリカンからなるという特徴を有するＦｃ含有分子が提供される。より具体的には、グリコシル化は、三糖構造及び二糖構造から選択される。最も具体的には、グリコシル化は、三糖構造Ｎｅｕ５Ａｃ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃである。
【００６３】
３つの異なるグリコシル化パターンを有するこれらのＦｃ含有分子のプールもまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで有利な特性を示すため、Ｆｃ部分のアスパラギンのグリコシル化が、（それぞれ、アスパラギンに連結されたＨｅｘＮＡｃを有する）三糖構造Ｎｅｕ５Ａｃ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ、二糖構造Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ、及び単糖構造ＨｅｘＮＡｃから選択されるグリカンからなるという特徴を有する複数の同一のＦｃ含有分子が提供される。特に、複数のＦｃ含有分子の少なくとも一部は、三糖構造及び二糖構造から選択されるグリコシル化パターンを有する。最も具体的には、複数のＦｃ含有分子の少なくとも一部は、三糖構造Ｎｅｕ５Ａｃ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃであるグリコシル化を有する。
【００６４】
特に考えられるＨｅｘＮＡｃ部分は、ＧｌｃＮＡｃ部分である。特に考えられるＨｅｘ部分は、Ｇａｌ部分である。従って、特に上記の二糖及び三糖におけるＨｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ部分は、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ部分である。最も具体的には、三糖Ｎｅｕ５Ａｃ−α−２，３−Ｇａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃ、及び対応する二糖Ｇａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃが考えられる。
【００６５】
特に考えられるＦｃ含有分子は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃを含む分子である。ＩｇＧ  Ｆｃ含有分子は全て、ヒトＩｇＧｓではＮ２９７として示される、１つの保存されたアスパラギングリコシル化部位を有する。従って、本明細書に記載のＩｇＧ  Ｆｃ含有分子は、このＮ２９７残基の特定のグリコシル化パターンによって特徴付けられる。
【００６６】
殆どの（治療）抗体は、Ｆａｂ領域にグリコシル化部位を有していない。同様に、殆どのＦｃ融合タンパク質も、さらなるグリコシル化部位を有していない。特に、Ｆｃ領域のグリコシル化が、Ｆｃ含有分子に存在するグリコシル化のみであると考えられる。最も具体的には、ＩｇＧ  Ｆｃ含有分子のＮ２９７のグリコシル化は、Ｆｃ含有分子に存在するグリコシル化のみであると考えられる。これは、（Ｆｃ部分の）グリコシル化の変更は、非Ｆｃ部分の相互作用（例えば、Ｆａｂ領域の抗原結合）を妨げないようにする。
【００６７】
特定の実施形態によると、Ｆｃ含有分子は、抗体、又は抗原に結合するＦｃ融合タンパク質である。さらなる特定の実施形態によると、Ｆｃ含有分子は、抗体、最も具体的にはＩｇＧである。Ｆｃ含有分子は、ＩｇＧ１、２、３、又は４のいずれかであり得るが；ＩｇＧ１及びＩｇＧ２抗体が最も一般的である。
【００６８】
本Ｆｃ含有分子の特定のグリコシル化について述べる場合、これらの３つの糖分子のみが、Ｆｃ含有分子に存在する糖分子であることを理解することが重要である。言い換えれば、これらのＦｃ含有分子は、コアＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２部分を有していない。これは、従来技術との重要な相違である。実際、Ｇａｌ−Ｓｉａｌ構造の安定性も研究されたが、コアＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２部分に付着して、バイアンテナ型グリカンである（即ち、２つのＧａｌ−Ｓｉａｌアンテナが存在する）ときの研究だけである。さらに、コアＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に固定されたこれらの構造は、半減期を延長すると報告されている一方、これらの構造は、プロテーゼに対する感受性が高い（Ｒａｊｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．２００７；２３（４）：９６４−７１））。これは、この非分岐三糖構造で観察される驚くべき効果をさらに強調する。
【００６９】
Ｆｃ含有分子が、殆どの場合、治療に使用され、かつ本明細書に示される特定のグリコシル化を有するＦｃ含有分子が、抗原特異性（即ち、抗原に結合するＦｃ含有分子、例えば、全ての抗体、及び殆どのＦｃ融合タンパク質に対する抗原特異性）が変更されずに、半減期を延長することを考えると、この分子は、医学の分野での使用に適している。
【００７０】
従って、本明細書に記載の高等真核細胞での産生によって得られるＦｃ含有分子は、薬剤として提供される。また、本明細書に記載されるように、（それぞれ、アスパラギンに連結されたＨｅｘＮＡｃを有する）三糖構造Ｎｅｕ５Ａｃ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ、二糖構造Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ、及び単糖構造ＨｅｘＮＡｃから選択されるグリカンからなるグリコシル化をＦｃ部分のアスパラギンに有することによって特徴付けられるＦｃ含有分子は、薬剤として使用するために提供される。
【００７１】
これらの分子は、通常はＦｃ含有分子、特に抗原に結合するＦｃ含有分子が使用されるあらゆる障害に使用することができる。これらの分子は、それらの非グリコシル化修飾対応物と同じ、抗原に対する結合親和性を有するため、同じ適用性を有する。Ｆｃγ受容体への結合が、特定のグリコシル化パターンによって低減されるため、これらの分子は、Ｆｃγ受容体の結合が重要である疾患の処置にはあまり適さないであろう（例えば、抗体依存性細胞媒介毒性（ＡＤＣＣ）が、Ｆｃγ受容体によって媒介されると考えられるため、この分子は、この反応を誘発するのに適していない可能性が高い）ことに留意されたい。他方、これらの分子は、Ｆｃγ受容体の結合が重要でない、又は望ましくない疾患の処置により適し得る。実際、細胞表面分子、特に免疫細胞上の分子を標的とする抗体では、抑制エフェクター機能（ａｂｒｏｇａｔｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）が必要である。Ｆｃγ受容体の結合の抑制は、例えば、ヒト血小板アロ抗原−１ａに対する母子同種免疫の処置（Ａｒｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９；２９（８）：２６１３−２４；Ｇｈｅｖａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００８；１１８（８）：２９２９−３８．）、自己免疫疾患又は移植による拒絶反応の処置（Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；１６４（４）：１９２５−３３）、長く作用するエリスロポエチンＦｃ融合タンパク質（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２０１２；３５（５）：７５７−９）の作製に有用であり、かつこの分子が、これらの障害の処置に特に適していると考えられる。即ち、これらの疾患の処置を必要とする対象を処置する方法であって、本明細書に記載のＦｃ含有分子を対象に投与するステップを含む、方法が提供される。
【００７２】
Ｆｃ含有分子はまた、Ｆｃ含有分子の長い循環半減期が望ましい障害、即ち、Ｆｃ含有分子の反復投与が治療として使用されるあらゆる障害に特に適している。このような治療の１つの特定の例は、ＩＶＩＧ：静注免疫グロブリン、即ち、抗体の産生能力が低下又は喪失した免疫不全患者の血漿タンパク質置換療法（ＩｇＧ）である。この療法は、免疫不全、後天性免疫不全状態、自己免疫疾患、炎症性疾患、及び急性感染症に使用される。従って、静注免疫グロブリン療法での使用のために、本明細書に記載のＦｃ含有分子（特に、本明細書に記載のＩｇＧ分子）が提供される。これは、静注免疫グロブリン療法を必要とする対象を処置する方法が提供され、この方法が、本明細書に記載のＦｃ含有分子（ＩｇＧ分子）を前記対象に投与するステップを含む、という表現に等しい。
【００７３】
Ｆｃ含有分子の半減期を延長する標準的な方法は、Ｆｃ含有分子のＦｃＲｎ受容体に対する親和性を高めること（例えば、ＸｅｎｃｏｒによるＸｔｅｎｄ技術）によって行われることに留意されたい。Ｆｃ含有分子の半減期を延長するこの方法は、ＦｃＲｎ結合に依存していないため、この技術は、さらに半減期を延長することにも対応できる可能性が高いことを理解されたい。
【００７４】
本明細書に記載の真核細胞は、特に、糖タンパク質の産生に適している。特定の実施形態によると、糖タンパク質は、特定の糖型、特に三糖Ｎｅｕ５Ａｃ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ修飾糖タンパク質を多く含む。従って、高等真核細胞のＦｃ含有分子のアスパラギン残基に特定のグリコシル化パターンを有するＦｃ含有分子を産生させる方法が提供され、この方法は：
−  ゴルジ局在化シグナルに機能的に連結されたエンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする第１の外因性核酸配列、及びＦｃ含有分子をコードする第２の外因性核酸配列を、エンドグルコサミニダーゼ酵素及びＦｃ含有分子の発現に適した条件下で含む高等真核細胞を用意するステップ；及び
−  エンドグルコサミニダーゼと細胞内で接触した後にＦｃ含有分子を回収するステップを含む。
【００７５】
細胞及びＦｃ含有分子に対して同じ考慮が、上記のように当てはまる。特定の態様によると、エンドグルコサミニダーゼに接触した後に得られた、単一ＧｌｃＮＡｃ残基で修飾されたタンパク質は、単なる中間産物である。この態様による方法は、少なくとも１つの追加のトランスグリコシル化ステップを含む。このトランスグリコシル化は、（添加される酵素によって、又は細胞でも産生される酵素によって）細胞外で行うことができるが、特に、高等真核細胞によって発現されるグリコシルトランスフェラーゼによってトランスグリコシル化が細胞内で起こると考えられる。これらの実施形態によると、糖タンパク質の細胞の最終回収の前に、この方法は、酵素がエンドグルコサミニダーゼと細胞内で接触した後にこの酵素を１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼに接触させるステップをさらに含む。当業者であれば、エンドグルコサミニダーゼ酵素及び１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼ酵素の両方が、（ＥＲ又は）ゴルジを標的とする場合、エンドグルコサミニダーゼ活性の後にグリコシルトランスフェラーゼ活性が確実に起こることを理解されよう。典型的には、これは、タンパク質がＥＲからゴルジの経路に進む固定された順序が存在するため、両方の酵素がＥＲ又はゴルジの異なる区画を標的とすることによって保障することができる。両方の酵素が同じ区画を標的とする場合、又は両方の活性が同じ酵素によって生じる場合は、典型的には、トランスグリコシル化ステップの後のタンパク質は、もはやエンドグルコサミニダーゼ酵素の基質として認識されないことは確かである。従って、ちょうど良い酵素活性の分離は、空間的分離及び／又は異なる基質特異性及び／又は酵素の不活性化も含み得る。
【００７６】
グリコシルトランスフェラーゼは、外因性配列によってコードされても良いし、又はエンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする第１の外因性核酸配列及びＦｃ含有分子をコードする第２の外因性核酸配列を有する細胞内の内因性酵素であっても良い。
【００７７】
特に、Ｆｃ含有分子が分泌されて容易な回収が可能になると考えられる。
【００７８】
本明細書に記載のＦｃ含有分子の特定のクラスは、抗原に結合するＦｃ含有分子（典型的には、抗体、又はＦｃ領域が結合部分に融合したＦｃ融合タンパク質）である。これらの分子は、抗原結合活性を維持し、かつ非修飾糖型と比較して長いｉｎ  ｖｉｖｏでの循環時間を有する。
【００７９】
従って、さらなる態様では、抗原の結合を変更することなく、抗原に結合するＦｃ含有分子を必要とする対象に投与されるこのＦｃ含有分子の循環時間を延長する方法が提供され、この方法は：
−  特定の三糖Ｎｅｕ５Ａｃ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ修飾グリコシル化パターンを有するＦｃ含有分子を用意するステップ；
−  このＦｃ含有分子を対象に投与するステップを含む。
【００８０】
特定の実施形態、特定の構成及び材料及び／又は分子が、本発明に従って細胞及び方法について本明細書で述べられたが、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、形態及び細部の様々な変形又は変更が可能であることを理解されたい。以下の実施例は、特定の実施形態をより良く例示するために記載されるものであり、これらは、本出願を限定すると解釈するべきではない。本出願は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００８１】
実施例１．変更されたグリコシル化を有する安定細胞株の作製
哺乳動物細胞で産生される糖タンパク質は、しばしば、複合型Ｎ−グリカン合成を含む多数の生合成ステップの結果として不均一である（図１ａ）。各ステップは、１００％未満の効率であり、一部の酵素は基質を競合し、多数の異なる糖型が生じる。治療糖タンパク質の不均一性は、グリカンがクリアランス及び生物活性に影響を与えるため、下流のプロセシング及びプロセスの再現性に負の影響を及ぼし、かつ変化しやすい有効性をもたらし得る１、２。例えば、グリカンのシアル酸含有量は、しばしば、薬物動態を決定する３。グリカンの不均一性の問題の対処では、Ｎ−グリカンは、しばしば、タンパク質の折り畳みに極めて重要であり、かつＮ−グリコシル化部位の突然変異によって単純に除去できないと考えなければならない。ここで、本発明者らは、ゴルジＮ−グリコシル化経路をショートカットして、最小サイズのシアル化三糖Ｎ−グリカンを有するタンパク質を産生させる哺乳動物細胞糖鎖工学技術を導入する（図１ａ）。
【００８２】
２９３ＳＧｎＴＩ−／−細胞４は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンで修飾された糖タンパク質を産生する。いくつかのエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ５は、このようなグリカンを加水分解し、このときに単一アスパラギン連結Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基が残ることが知られている。本発明者らは、ｅｎｄｏＴの最適なｐＨが６．０であるという利点を有するため、哺乳動物細胞分泌系での発現のためにこのグリコシドヒドロラーゼファミリー１８を代表する真核生物起源としてＥｎｄｏＴ６を選択する。これは、哺乳動物トランス−ゴルジ装置のｐＨに近い７が、タンパク質の折り畳み及び品質管理におけるＮ−グリカンのＥＲ機能を実質的に妨げないようにＥＲのｐＨ（ｐＨ７．２）とは十分に異なる。本発明者らは、２９３ＳＧｎＴＩ−／−細胞でのｅｎｄｏＴの一過性のゴルジ標的発現が、糖タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏでの脱Ｎ−グリコシル化をもたらすことを既に示している（例えば、欧州特許第２３３１７０１号明細書の実施例６及び７）。
【００８３】
ゴルジ内でのｅｎｄｏＴの加水分解は、折り畳み後に糖タンパク質に単一ＧｌｃＮＡｃ  Ｎ−グリカン「スタンプ」を形成することになる。本発明者らは、このようなゴルジで形成される単一ＧｌｃＮＡｃ残基は、分泌の前に細胞のガラクトシルトランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼによって認識されることになると推測した。次に、これは、最も単純なシアル化ＩＩ型終端、即ち、Ｎ−グリカン及びＯ−グリカンの一般的な要素の合成をもたらすことになる。この３ステップ経路は、多ステップ天然Ｎ−グリコシル化経路よりも遥かに短く、不均一性が大幅に軽減され、Ｎ−グリカンの特徴付けが容易となる。上記の糖鎖工学戦略、「ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ」が、図１ａに例示されている。
【００８４】
ｅｎｄｏＴが２９３ＳＧｎＴＩ−／−細胞のトランスゴルジを標的とするようにするために、本発明者らは、ｅｎｄｏＴコード配列を、その予測シグナル配列なしで、通常はゴルジ内に存在する２つのヒト酵素のゴルジ標的ドメインに融合した（図２）。ｅｎｄｏＴ触媒ドメインが、ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ１（ＳＴ６ＧＡＬ１）８（本明細書では、ＳＴ−ｅｎｄｏＴ融合タンパク質と呼ばれる）の標的ドメインに融合されると、このｅｎｄｏＴ触媒ドメインは、細胞内に無傷で維持される。２９３ＳＧｎＴＩ（−）細胞内でのＳＴ−ｅｎｄｏＴの一過性の発現により、安定に発現され分泌されるＦｌｔ３受容体の細胞外ドメイン９及びヒト５−ヒドロキシトリプタミン１Ｄ（５ＨＴ１Ｄ）受容体のｉｎ  ｖｉｖｏでの脱グリコシル化が起こる（図３）。
【００８５】
Ｓｔ−ｅｎｄｏＴ融合タンパク質を安定に発現する２９３ＳＧｎＴＩ（−）由来細胞株を樹立するために、本発明者らは、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を用いて所望のグリカン表現型を有する細胞を選択した。ＣｏｎＡは、オリゴマンノース及びハイブリッド型Ｎ−グリカンに結合する四量体細胞障害性レクチンである。ｅｎｄｏＴによる細胞表面糖タンパク質の完全な脱グリコシル化により、ＣｏｎＡリガンドが存在しなくなり、従って、細胞がこのレクチンに対する耐性を得る（図１ｂ）。トランスフェクションの４週間後、本発明者らは、ＣｏｎＡに耐性のあるクローン（親２９３ＳＧｎＴＩ（−）細胞の全てを死滅させる最低濃度）を得た。２つのクローンをロバストな増殖のために選択し、ＣｏｎＡレクチン感受性アッセイ１０を行い、最も高いＣｏｎＡ耐性を２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅと命名した（図４）。Ｓｔ−ｅｎｄｏＴのゲノムの組込み及び発現をそれぞれ、ＰＣＲ及び免疫ブロット法によって検証した（図５）。２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞と２９３ＳＧｎＴＩ（−）細胞は、類似した形態を有し、これらの増殖速度は区別がつかない（図１ｃ）。しかしながら、本発明者らは、２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞は、２９３ＳＧｎＴＩ（−）細胞よりも付着性が低く；これは、バイオ医薬品の製造に使用される懸濁培養の所望の特徴であることに気づいた。
【００８６】
本発明者らは、エクソンマイクロアレイを用いて２９３ＳＧｎＴＩ（−）細胞及び２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞のトランスクリプトームのプロフィールを得て、検出可能な発現を有する７，３４４の遺伝子のうちの僅かに３つが、２つの細胞株間で２倍を超えて差次的に発現する（ｐ＜０．０１）ことを見出した（図１ｄ）。２９３ＳＧｎＴＩ（−）系統と２９３Ｓ親との比較により、特定の経路の明確な強化なしで、約７０の遺伝子の差次的転写が示された（図６）。本発明者らは、２９３ＳＧｎＴＩ（−）系統の実質的なゲノム再構成を観察し（未発表の観察）、これが、これらの相違の主な原因であり得る。従って、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ工学は、細胞の転写プロフィールを実質的に変更するものではない。２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞における折り畳まれていないタンパク質応答１１の転写シグネチャの非存在は、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ戦略が、小胞体の品質管理におけるＮ−グリカンの役割を著しく妨げるものではないことを実証した。
【００８７】
実施例２．Ｇｌｙｃｏｄｅｌｅｔｅ細胞株は、タンパク質の融合に影響を与えずに、Ｎ−グリカンの不均一性及び長さが減少した糖タンパク質を発現させるのに適している
本発明者らは、一過性に過剰発現される分泌サイトカイン（ヒト顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、ｈＧＭ−ＣＳＦ１３）、安定して過剰発現されるＧＰＣＲ、５ＨＴ１ＤＲ１２（実施例３）、一過性に過剰発現されるモノクローナル抗体（抗ＣＤ２０、オビヌツズマブ）１４（実施例４）、及び一過性に過剰発現されるＦｃ含有融合タンパク質（抗ＴＮＦ、エタネルセプト）（実施例５）に対する安定したＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ工学の効果を評価した。
【００８８】
さらに、ＧＭ−ＣＳＦを、２９３Ｓ細胞、２９３ＳＧｎＴＩ−／−細胞、及び２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞で一過性に発現させて、培地から精製した。２９３Ｓ細胞又は２９３ＳＧｎＴＩ−／−細胞で産生されるＧＭ−ＣＳＦは、３つの主要な糖型（０、１つ、又は２つのＮ−グリコシル化部位の占有に対応する）１５からなり、これらの糖型は、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）の処理によって低分子量（ＭＷ）のタンパク質の形態に変換し、このＰＮＧａｓｅＦは、少なくともキトビオースコアを含むＮ−グリカンとアスパラギン側鎖との間のＮ−グリコシド結合を切断する（図７ａ）。残った不均一性は、シアリダーゼ消化時のその部分的な消失によって示される、Ｏ−グリコシル化１５によるものである。対照的に、本発明者らは、２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞から精製されたＧＭ−ＣＳＦで低いＭＷ範囲を観察した（図７ａ）。ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ  ＧＭ−ＣＳＦのＰＮＧａｓｅ  Ｆ処理は、観察されたパターンに一切の変化を引き起こさず、キトビオース−コア含有Ｎ−グリカンの非存在を実証した。シアリダーゼでの処理は、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ  ＧＭ−ＣＳＦのＭＷの変化を引き起こし、２９３Ｓ細胞又は２９３ＳＧｎＴＩ−／−細胞からのＧＭ−ＣＳＦの場合にはより顕著であり、他の形態よりもＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ  ＧＭ−ＣＳＦでより多くのシアル酸残基が存在することを示している（図７ａ）。この結論は、以下で説明されるグリカン分析によっても裏付けられた（図７ｂ及び図８及び図９）。ＰＮＧａｓｅＦ及びシアリダーゼでの消化後に、３つ全ての細胞株からのＧＭ−ＣＳＦを、移動性を識別できない単一バンドとして実施し（これらのゲルは、非グリコシル化タンパク質を、小さいＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ  Ｎ−グリカンスタンプで修飾された非グリコシル化タンパク質から分離できないことに留意されたい）、２９３Ｓ細胞、２９３ＳＧｎＴＩ（−）細胞、及び２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞からのＧＭ−ＣＳＦ間の相違が、グリコシル化の相違によるものであるという結論が裏付けられ；これは、無傷のタンパク質の質量分光分析によって確認された（図１０）。
【００８９】
２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞及び２９３ＳＧｎＴＩ（−）細胞からのＧＭ−ＣＳＦのＮ−グリカンをさらに特徴付けるために、本発明者らは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）−質量分析によってサンプルを分析した（図７ｂ及び図８）。キャピラリー電気泳動法による２９３Ｓ  ＧＭ−ＣＳＦグリカンの分析（図９）により、多分岐複合型グリカンの典型的な不均一混合物が明らかになった。シアル化のレベルは低く、これは恐らく、タンパク質産生中の細胞の無血清培地への迅速な移動によるものである。２９３ＳＧｎＴＩ（−）  ＧＭ−ＣＳＦのＮ３７を含む糖ペプチドを、以前の研究結果４、１６に従ってＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）  Ｎ−グリコシル化ペプチドとして検出した（図７ｂ、上部）。これらのイオンは、２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞で産生されるＧＭ−ＣＳＦのスペクトルには存在せず、本発明者らは、３つの新たな糖ペプチド塊を検出した。これらの塊は、Ｎ−アセチルヘキソサミン（ＨｅｘＮＡｃ）糖ペプチド、Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ糖ペプチド、及びＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ糖ペプチドに一致している（図７ｂ）。類似の観察が、Ｎ２７を含む糖ペプチドで行われた（図８）。
【００９０】
ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ  ＧＭ−ＣＳＦ糖ペプチドのヘキソース及びＮｅｕ５Ａｃ単位の同定及び結合を確認するために、本発明者らは、α−２，３−／α−２，６−／α−２，８−シアリダーゼ及びβ−１，４−ガラクトシダーゼを用いたエキソグリコシダーゼの消化を行った（図７ｂ）。これにより、本発明者らは、二糖修飾ペプチド及び三糖修飾ペプチドがそれぞれ、Ｇａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃ及びＮｅｕ５Ａｃ−α−２，３−Ｇａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃであることを立証することができた。ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞で産生されたタンパク質における、単一ＧｌｃＮＡｃ  ｅｎｄｏＴ消化産物だけではなく、これらのグリカンの存在は、ゴルジ内のガラクトシルトランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼが、ｅｎｄｏＴによって形成されるＧｌｃＮＡｃスタンプに作用することを示している。これは、ＧＭ−ＣＳＦのｅｎｄｏＴ脱グリコシル化が、細胞内で起こらなければならず、分泌後ではいけないことを裏付けている。シアリダーゼ処理の前及び後のタンパク質のスペクトルの相対ピーク強度の定量により、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞からのＧＭ−ＣＳＦのグリカンの約７５％がシアル化されたことが示された。
【００９１】
次いで、本発明者らは、ＧＭ−ＣＳＦの特性に対するＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅグリカンの変更の影響を調査した。ＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒアッセイ１７は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（非グリコシル化、Ｔｍ＝５８．９±０．６℃）、２９３Ｓ細胞（複合型Ｎ−グリコシル化、Ｔｍ＝６１．２±３．２℃）、及び２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞（Ｔｍ＝６１．５±０．２℃）からのＧＭ−ＣＳＦの融解温度が、著しくは異ならないこと（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験、ｎ＝４、Ｐ＞０．０５；平均±標準偏差）を示した（図７ｃ）。さらに、ＴＦ１ヒト赤白血病細胞−増殖アッセイ１８（図７ｄ）では、２９３Ｓ細胞及び２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞からのＧＭ−ＣＳＦの生物活性が、きわめて類似していた。
【００９２】
ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅグリカンが、ＧＭ−ＣＳＦの抗原性に寄与するか否かを評価するために、本発明者らは、２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞からのＧＭ−ＣＳＦでウサギを免疫した。未消化シアリダーゼ処理した２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ  ＧＭ−ＣＳＦ、又はシアリダーゼ処理及びガラクトシダーゼ処理した２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ  ＧＭ−ＣＳＦへの血清抗体の結合をＥＬＩＳＡによって決定した。ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅグリカン構造が除去されたＧＭ−ＣＳＦ、及びＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅグリカンが存在するＧＭ−ＣＳＦが十分に等しく認識され、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅグリカンが、ウサギのＧＭ−ＣＳＦに新たな免疫原性エピトープを形成しないことを示している（図７ｅ及び図７ｆ）。
【００９３】
実施例３．Ｇｌｙｃｏｄｅｌｅｔｅ細胞株は、Ｎ−グリカンの不均一性及び長さが減少した糖タンパク質の安定した発現に適している
ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅが、安定したトランスフェクションベースのタンパク質の産生に適合性であること、及びＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅが、膜タンパク質を処理できることを確認するために、安定したＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ工学とは別に、ＧＰＣＲ、即ち、５ＨＴ１ＤＲ１２が安定して過剰発現される安定した細胞株を作製した。膜タンパク質抽出物のＰＮＧａｓｅ  Ｆでの処理により、２９３ＳＧｎＴＩ−／−細胞で安定して過剰産生される５ＨＴ１ＤＲの分子量（ＭＷ）の大きな変化が明らかになった。これとは対照的に、ＰＮＧａｓｅ  Ｆで処理するしないにかかわらず、２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞で産生される受容体は、２９３ＳＧｎＴＩ−／−細胞からのＰＮＧａｓｅ  Ｆで処理された受容体とほぼ同じＭＷであった。本発明者らは、２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞では、ＳＴ−ｅｎｄｏＴが５ＨＴ１ＤＲ  Ｎ−グリカンを完全に加水分解したと結論付けた（図１１）。
【００９４】
実施例４．Ｇｌｙｃｏｄｅｌｅｔｅ細胞株によって産生される抗体は、それらのリガンドに対して同じ親和性を有するが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの循環時間が長い
ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ技術の範囲をさらに検討するために、モノクローナル抗体−ＣＤ２０抗体オビヌツズマブ（ＧＡ１０１）１４を、２９３Ｓ細胞及び２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞で一過性に発現させて、細胞培地から精製した。細胞株は、同様の量の抗体を産生した（図１２）。２９３Ｓ−産生抗ＣＤ２０は、そのＦｃ結合Ｎ−グリコシル化部位（重鎖Ｃγ２−ドメインのＮ２９７）のみに、典型的にはＩｇＧｓ１９であるコア−フコシル化バイアンテナ型Ｎ−グリカンを有する（図１３）。予想通り、ＰＮＧａｓｅＦでの処理は、ＭＷを低下させた（図１４ａ）。対照的に、２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞で産生される抗体の重鎖は、２９３Ｓ細胞からのＰＮＧａｓｅＦ−処理抗体の重鎖とほぼ同じＭＷであり、このＭＷは、ＰＮＧａｓｅＦ処理によってさらに低下することはなかった（図１４ａ）。この結果は、ｅｎｄｏＴによって切断されたこのＩｇＧのＮ−グリカンに一致している。従って、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞は、ｈＩｇＧ  Ｆｃ結合Ｎ−グリカンも処理する。
【００９５】
２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ抗ＣＤ２０のグリカンをさらに特徴付けるために、Ｎ−グリコシル化部位を含むトリプシンＩｇＧペプチドの様々な糖型を、液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて選択された反応監視（ＳＲＭ）モードで定量した（図１４ｂ）。さらに、本発明者らは、還元により鎖が解離した又は解離していない無傷の抗体のＬＣ−ＭＳ分析を行った（図１５）。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により、本発明者らがＧＭ−ＣＳＦでも観察したように、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅタンパク質が、ＨｅｘＮＡｃ、Ｇａｌ−ＨｅｘＮＡｃ、及びＮｅｕ５Ａｃ−Ｇａｌ−ＨｅｘＮＡｃ  Ｎ−グリカンで修飾されたことが明らかになった。シアリダーゼ処理の前及び後のサンプルの相対糖ペプチドピーク面積の定量化により、本発明者らは、抗ＣＤ２０の１９％がシアル化三糖を有し、抗ＣＤ２０の７２％がＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃ二糖を有し、残りがＧｌｃＮＡｃ−修飾ペプチドであることを立証した。ＳＲＭ−モードＬＣ−ＭＳ／ＭＳペプチド分析では、２９３ＳＧｎＴＩ（−）ＩｇＧで優勢なＨｅｘ５−ＨｅｘＮＡｃ２糖ペプチドは、２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ  ＩｇＧの検出限界よりも低かった。無傷のタンパク質のＬＣ−ＭＳ分析により、２９３Ｓ産生抗体及び２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ産生抗体の両方において、残るＨｅｘ５−ＨｅｘＮＡｃ２糖型がほんの僅かであることが明らかになった。両方の標本におけるＨｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ２の量は、両方の抗体の１：１の混合物のＤＮＡ−シーケンサー炭水化物電気泳動法によって全グリカンプールの２．５％と定量された（データは不図示）。
【００９６】
加えて、ＣＤ２０＋細胞への結合のフローサイトメトリー分析により、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ抗ＣＤ２０抗原結合が、２９３Ｓ抗ＣＤ２０抗原結合と同一であることが示され（図１４ｃ）、抗原結合フォールドが影響を受けていないことが実証された。
【００９７】
折り畳みパッケージングの一部を構成するＮ−グリカンがＣγ２ドメインに接触するため、これらのグリカンのサイズ減少が、Ｔｍの低下をもたらすと予想される。従って、Ｃγ２のＴｍは、ＰＮＧａｓｅＦ−消化２９３Ｓ抗ＣＤ２０のＴｍに類似して、複合型Ｎ−グリコシル化２９３ｓ抗ＣＤ２０で約６４℃、２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ抗ＣＤ２０で５７℃である（図１４ｄ）。本発明者らは、ゲル濾過クロマトグラフィーでは、２９３Ｓ細胞又は２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞によって発現される抗ＣＤ２０の凝集の証拠を見出せなかった（図１６）。
【００９８】
重鎖のＮ２９７のグリコシル化は、抗体のＦｃ−γ受容体（ＦｃγＲｓ）２０への結合親和性に大きな影響を与えるため、本発明者らは、２９３Ｓ抗ＣＤ２０及び２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ抗ＣＤ２０の様々なヒトＦｃγＲｓへの結合を評価した。表面プラズモン共鳴実験（表１）により、ヒト新生児及びマウス新生仔ＦｃＲｓ（ＦｃＲｎｓ）は、両方の抗ＣＤ２０糖型に対して類似の親和性を有することが示された。ＦｃＲｎ結合部位がＣγ２  Ｎ−グリカン部位の近傍に位置していないため、これは予想通りである（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。本発明者らは、抗ＣＤ２０抗体が溶液中でＦｃγＲ結合についてプレコートＩｇＧと競合する、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、及びＦｃγＲＩＩｂについての競合ＥＬＩＳＡを準備した。３つ全てのケースでは、本発明者らは、２９３Ｓ抗ＣＤ２０と比較して、２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ抗ＣＤ２０による結合競合で１０分の１を超える減少を検出した（図１４ｅ）。バイオレイヤー干渉法（表１）によって評価されたＦｃＲＩＩＩａ結合親和性は、２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ抗ＣＤ２０に対してが、２９３Ｓ抗ＣＤ２０に対しての５．８分の１であった。同様に、エフェクターとしてナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を用いる抗体依存性細胞−細胞毒性（ＡＤＣＣ）アッセイ（図１４ｅ）において、本発明者らは、２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ抗ＣＤ２０を用いる特異的溶解の５０％効果濃度（ＥＣ５０）が、２９３Ｓ抗ＣＤ２０を用いる場合の６．６倍であることを見出した。全体として、ヒトＩｇＧ１  ＦｃのＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅグリコシル化は、ＦｃγＲｓへの結合の減少をもたらし；中和抗体の産生との関連では、これは、安全性を向上させるのに望ましいであろう（Ｌｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【００９９】
【表１】
0006553042.tif 000002
【０１００】
ＩｇＧのＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅグリカンが免疫原性であるか否かを評価するために、本発明者らは、ＧＭ−ＣＳＦ（図１４ｆ）と類似の免疫実験を行い、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅグリカンが、抗ＣＤ２０分子の抗原性に実質的に寄与しないと結論付けた。
【０１０１】
注目すべきことに、マウスでの薬物動態分析により、最初の急速除去期（注射の１時間後）に、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ抗ＣＤ２０が循環からそれほど除去されず、２倍の長期循環レベルとなることが示された。両方の糖型は、それらの類似のＦｃＲｎ親和性から予想されたように、等しい（遅い）速度で実質的に除去された（図１４ｇ及び図１７）。従って、当初の高いレベルにより、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ抗体の濃度が必要とされる治療閾値濃度よりも低くなるまでに１０〜１２日長くかかるであろう。これは、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ抗ＣＤ２０の相当高いレベルが、遥かに長い期間に亘ってｉｎ  ｖｉｖｏに維持されることを意味する。考えられる機序は、高度のシアル化が、肝臓及びマクロファージレクチン受容体への結合の減少によってクリアランスの低下をもたらすことである。潜在的に、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ  ＩｇＧのシアル化のレベルがさらに高くなる可能性があり、この知見は、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ  ＩｇＧｓが、血中の長い循環期間をしばしば必要とする中和治療ＩｇＧｓの投与頻度を下げることができる可能性があることを示唆している。
【０１０２】
実施例５．Ｇｌｙｃｏｄｅｌｅｔｅ細胞株によって産生されるキメラＦｃ含有分子は、より均一なグリコシル化パターンも有する
次に、本発明者らは、エタネルセプト、即ち、ＩｇＧ１抗体の定常領域の端部に融合されたヒト２型ＴＮＦ受容体からなる組換え融合タンパク質をＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞で一過性に発現させて精製した。実施例２及び４で試験されたタンパク質と同様に、ＬＣ−ＭＳ分析により、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅタンパク質のＦｃ部分が、ＨｅｘＮＡｃ、Ｇａｌ−ＨｅｘＮＡｃ、及びＮｅｕ５Ａｃ−Ｇａｌ−ＨｅｘＮＡｃ  Ｎ−グリカンで修飾されていることが明らかになった（図１８）。（これは、Ｆｃ鎖からのＥＱＱＹＮＳＴＹＲペプチド（配列番号：１）で評価した）。
【０１０３】
続くシアリダーゼ及びガラクトシダーゼ消化により、これらの糖類が何であるかをさらに確認した（図１８）。シアリダーゼ及びガラクトシダーゼ処理の前及び後の、サンプルの相対糖ペプチドのピーク面積の定量により、本発明者らは、これらの細胞で産生されたエタネルセプトの２５％が、シアル化三糖を有するＦｃ鎖を備え、エタネルセプトの６８％が、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ二糖を有し、エタネルセプトの残りが、ＧｌｃＮＡｃ修飾ペプチドであることを立証することができた（表２）。これらのパーセンテージは、抗ＣＤ２０抗体で観察されたパーセンテージに十分に一致し、細胞のＦｃ鎖のグリコシル化がかなり均一であることを示している。
【０１０４】
【表２】
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【０１０５】
結論
結論として、この研究は、哺乳動物細胞を用いる糖タンパク質産生でのＮ−グリコシルの不均一性の問題を解決するアプローチとしてＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ糖鎖工学の戦略を導入する。ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅは、任意であるが特に考えられる、（ＧｎＴＩ、遺伝子ＭＧＡＴ１によってコードされる）単一グリコシルトランスフェラーゼの不活性化、及び脱グリコシル化酵素の過剰発現、これに続くレクチン選択を含む。ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞は、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ二糖、又はそのα−２，３−シアル化三糖誘導体及び単糖中間体の一部を含むタンパク質を産生する。これは、野生型哺乳動物細胞で産生される多数のグリカン構造とは対照的である。ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ戦略は、Ｎ−グリカンの折り畳み促進機能の維持と、哺乳動物ゴルジＮ−グリカンプロセシングによって導入される広範な不均一性の回避とをバランスさせる。バイオ医薬品製造におけるＮ−グリカンの複雑さの軽減の利点に加えて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生産される同様の短い単純なＮ−グリカンの治療効果の例が報告されている２１〜２３。さらに、本発明者らは、治療目的が、追加のエフェクター機能を必要としない抗原の中和である場合、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ工学が、抗体の特徴を好ましく変更することを示した。従って、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅは、バイオ医薬品業界で関心領域である「バイオベター」をもたらすであろう２８。この戦略は、保存されたＮ２９７残基のグリコシル化を単に変更することによって循環半減期を延長するため、Ｆｃ含有分子の発現に特に適していると思われる。これは、例えば、治療ＩｇＧ注射にとって重要な治療上の利点を有し、この治療ＩｇＧ注射は、その頻度を大幅に減らすことができ（例えば、半分の頻度）、しかも同じ親和性のためリガンドに対して同じ効果を維持する。
【０１０６】
材料及び方法
一般的な細胞の培養及びトランスフェクション
本発明者らは、２９３ＳＧｎＴＩ（−）細胞を、１０％ＦＢＳ、２９２μｇ／ｍＬ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍＬ  ペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン（全てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）中、５％ＣＯ２、３７℃の湿潤インキュベーターに維持した。
【０１０７】
小規模のトランスフェクションの場合は、１ウェル当たり約１５０，０００の細胞でのトランスフェクションの前に、細胞を６ウェルプレートにプレーティングし、４８時間培養した。細胞は、製造者の取扱説明書に従ってＴｒａｎｓＩＴ−２９３トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ  ＬＬＣ）を用いてトランスフェクトした。一過性又は大規模のトランスフェクションの場合は、細胞を、リン酸カルシウムトランスフェクション法でトランスフェクトした。Ｒａｊｉ細胞を、ＲＰＭＩ  １６４０＋１０％  ＦＢＳ＋２ｍＭ  Ｌ−グルタミン中で培養した。
【０１０８】
全ての細胞株を、Ｐｌａｓｍｏｔｅｓｔキット（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を用いてマイコプラズマ汚染について定期的に試験した。
【０１０９】
一過性のｅｎｄｏＴの発現
ｅｎｄｏＴ融合構築物（ｐＣＡＧＧＳ−ＧＭ２Ｓ−ｅｎｄｏＴ及びｐＣＡＧＧＳ−ＳＴ−ｅｎｄｏＴ）及び分泌ｅｎｄｏＴ構築物（ｐＣＡＧＧＳ−ｓ−ｅｎｄｏＴ）を、上記のように２９３ＳＧｎＴＩ（−）細胞に一過性にトランスフェクトした。上清及び細胞溶解物のサンプルを分析して、ドメインを標的にする能力を評価した（図２）。
【０１１０】
ｅｎｄｏＴ融合体の一過性のトランスフェクションによるｉｎ  ｖｉｖｏでの脱Ｎ−グリコシル化
ｅｎｄｏＴによる脱Ｎ−グリコシル化を、全てのｅｎｄｏＴ構築物を２９３ＳＧｎＴＩ（−）細胞に安定にトランスフェクトして、Ｆｌｔ３受容体細胞外ドメインを誘導的に発現させることによって評価した（図３）。
【０１１１】
安定したＳＴ−ｅｎｄｏＴの発現のためのプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１（−）／Ｚｅｏ−ＳＴ−ｅｎｄｏＴ）の構築
本発明者らは、ＳＴ−ｅｎｄｏＴ  ＰＣＲ断片をｐＣＲ（登録商標）ＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）プラスミド（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングした。本発明者らは、得られたＴｏｐｏ−ＳＴ−ｅｎｄｏＴプラスミド（逆相補鎖挿入）をＸｈｏＩ及びＫｐｎＩで消化し、挿入物を精製した。ｐｃＤＮＡ３．１／ｚｅｏ（−）プラスミドをＸｈｏＩ及びＰｖｕＩで１回消化して１．５ｋｂの断片を精製し、そしてＰｖｕＩ及びＫｐｎＩで１回消化して３．６ｋｂの断片を精製した。続くベクター断片及びＳＴ−ｅｎｄｏＴ断片との３点ライゲーションにより、ｐｃＤＮＡ３．１／ｚｅｏ−ＳＴ−ｅｎｄｏＴプラスミドを得た。
【０１１２】
【表３】
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【０１１３】
【表４】
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【０１１４】
安定した細胞株の作製
本発明者らは、ｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｚｅｏ−ＳＴ−ｅｎｄｏＴを用いて小規模トランスフェクションで２９３ＳＧｎＴＩ（−）細胞をトランスフェクトした。本発明者らは、トランスフェクションの４８時間後に、１５μｇ／ｍＬ  ＣｏｎＡで選択を開始した。１４日後、細胞をトリプシン処理して、１０μｇ／ｍＬ  ＣｏｎＡを含む条件培地（滅菌濾過され、新鮮な５０％（ｖ／ｖ）  ＤＭＥＭ／Ｆ１２と混合された、２日経過した２９３ＳＧｎＴＩ（−）培養物の培地）に再プレーティングした。１４日後、５つの大きな十分に分離されたクローンを採集して、１０μｇ／ｍＬ  ＣｏｎＡの存在下で増殖させた。２つの最も速く増殖しているクローンをさらに分析した。
【０１１５】
２９３ＳＧｎＴＩ（−）及び２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ増殖曲線
７０〜８０％コンフルエントな培養物からの細胞を、まず約６０，０００細胞／ｍｌに希釈し、（０時間の時点で）再度カウントし、６ウェルプレートに移した（１８０，０００細胞／ウェル）。各時点で、３つのウェルを、ピペット操作で培地を上下させて取り外し、生細胞を、トリパンブルー排除及び血球計を用いて各ウェルでカウントした。図１ｃに示されている結果は、２つの重複実験の１つを示している。
【０１１６】
遺伝子−発現分析
ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  １．０  ＳＴ  Ａｒｒａｙｓ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）での分析のためのＲＮＡの単離及びサンプルの調製は次の通りである。
【０１１７】
全ＲＮＡを、製造者の取扱説明書に従って、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて両方の細胞株の３つの重複培養物から抽出した。ＲＮＡの品質を、ＲＮＡ  ６０００  Ｐｉｃｏチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いる２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで評価した。全てのサンプルは、９．５以上のＲＮＡの品質指標（ＲＩＮ：ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒ）を有していた。全ＲＮＡサンプル（ＲＮＡサンプルの調製、Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓを参照）を細菌ポリ−Ａ  ＲＮＡ陽性コントロール（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてスパイクし、どのサンプルも逆転写し、２本鎖ｃＤＮＡに変換し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写し、Ａｍｂｉｏｎ  ＷＴ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて増殖させた。得られた一本鎖ｃＤＮＡを、製造者の取扱説明書に従って、ＷＴ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｌａｂｅｌｉｎｇキット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて断片化した後にビオチン標識した。得られたサンプルをハイブリダイゼーションコントロール（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）と混合し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  １．０  ＳＴ  Ａｒｒａｙｓ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）でハイブリダイズさせた。アレイを、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４５０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で染色及び洗浄し、そして生のプローブシグナル強度についてＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いてスキャンした。エキソンアレイデータは、ＭＩＡＭＥ適合性であり、ＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓデータベース（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ａｒｒａｙｅｘｐｒｅｓｓ）からアクセッション番号：Ｅ−ＭＥＸＰ−３５１６で入手可能である。
【０１１８】
本発明者らは、一部が既に記載されたように７、エキソンアレイデータの品質管理及び差次的発現分析のためにＲ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）とＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｐｏｗｅｒ  Ｔｏｏｌｓ（ＡＰＴ；  Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）の組み合わせを使用した。簡単に述べると、エキソンレベル及び遺伝子レベルの強度推定値を、ＡＰＴを用いるＲｏｂｕｓｔ  Ｍｕｌｔｉ−ａｒｒａｙ  Ａｖｅｒａｇｅ（ＲＭＡ）アルゴリズムを用いたバックグラウンド補正、正規化、及びプローブの要約によって作成した。正規化の前及び後のデータの品質管理は、様々なプロット、例えば、ボックスプロット及び密度プロットの作成によってＲで行った。発現が両方の株で検出されなかった遺伝子を、さらなる分析から排除した。本発明者らは、細胞株の３つの生物学的レプリケートの少なくとも２つでバックグラウンドよりも高く、エキソンの半分超が検出された場合に遺伝子が検出されたと見なした（ｐ＜０．０５）。両方の株で発現が推定ノイズレベル未満であった遺伝子も、さらなる分析から排除した。ノイズレベルの閾値は、Ｙ染色体上の９５％を超える遺伝子の発現の「検出」を排除するシグナル強度レベル（３つのレプリケートに対して平均したＡＰＴ出力強度）に設定し、このシグナル強度レベルは、（女性胚に由来する）２９３系統には存在せず、従って、適切な内部陰性コントロールとしての役割を果たす。
【０１１９】
差次的遺伝子発現分析を、唯一のコアプローブセットと見なされるＲ  Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｐａｃｋａｇｅ  Ｌｉｍｍａ８で実施される線形モデル適合を用いて行った。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ（ＢＨ）法を、複数の試験を補正するために使用した。
【０１２０】
ＧＭ−ＣＳＦの産生及び精製
一過性のＧＭ−ＣＳＦの発現のためのプラスミド（ｐＯＲＦ−ｈＧＭ−ＣＳＦ−６ｘＨｉｓ）を、２９３ＳＧｎＴＩ（−）細胞株及び２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞株の両方に一過性にトランスフェクトした。分泌ＧＭ−ＣＳＦを培地から精製した。
【０１２１】
ｐＯＲＦ−ｈＧＭ−ＣＳＦ−６ｘＨｉｓプラスミドの構築
Ｃ末端に６Ｈｉｓ残基が標識されたヒトＧＭ−ＣＳＦの部分的なＣＤＳを、ｐＯＲＦ−ｈＧＭ−ＣＳＦプラスミド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）からプライマーＰＲ１８及びＰＲ１９を用いて増幅した。本発明者らは、Ａｐａｌ及びＥｃｏＲＩを用いてＰＣＲ断片及びｐＯＲＦ−ｈＧＭ−ＣＳＦプラスミドを消化し、両方の断片を連結してｐＯＲＦ−ｈＧＭ−ＣＳＦ−６ｘＨｉｓプラスミドを得た。
【０１２２】
ヒトＧＭ−ＣＳＦの精製
２９３ＳＧｎＴＩ−／−細胞及び２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞を、ｐＯＲＦ−ｈＧＭ−ＣＳＦ−６ｘＨｉｓプラスミドを一過性にトラスフェクトした（一過性トランスフェクション、オンライン法を参照）。トランスフェクションの４日後、５０ｍｌの発現タンパク質を含む培地を回収し、３ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜を用いて緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、及び２０ｍＭ  イミダゾール  ｐＨ７．５）を透析した。透析液を、Ｎｉ２＋イオンが充填された１ｍｌ  Ｈｉｓ−Ｔｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）にかけた。次いで、カラムを、Ａ２８０が低下して基準値に戻るまで緩衝液Ａで洗浄した。１０カラム容量の６％緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ７．５０＋２０ｍＭ  ＮａＣｌ＋０．５Ｍ  イミダゾール）でカラムを洗浄した後、結合したタンパク質を１００％緩衝液Ｂで溶出し、１ｍｌ画分で収集した。収集した画分中のＧＭ−ＣＳＦの存在を、トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動法９によって検証した。本発明者らは、盲検としての緩衝液Ｂに対する画分を含むＧＭ−ＣＳＦのＡ２８０吸光度に基づいてタンパク質濃度を測定した。濃度は、ｐｒｏｔｐａｒａｍツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ）１０によって計算した、ジスルフィド結合中の全てのシステイン残基（１３９８０Ｍ−１  ｃｍ−１）を用いる理論吸収係数を用いて計算した。
【０１２３】
抗ＣＤ２０の産生及び精製
抗ＣＤ２０を、上記のように２９３Ｓ細胞株及び２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞株の両方で一過性に発現させて、次のように精製した：抗ＣＤ２０を含むベクターでの２９３Ｓ細胞及び２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞の一過性トランスフェクション（一過性トランスフェクション、オンライン法を参照）の４日後、発現タンパク質を含む培地を回収し、アフィニティーカラム５ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）にかけた。次いで、カラムを、Ａ２８０が低下して基準値に戻るまでＰＢＳで洗浄した。結合したタンパク質を５０ｍＭ  グリシン  ｐＨ３．５で溶出し、１ｍｌ画分で収集した。収集した画分中の抗ＣＤ２０の存在を、トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動法によって検証した。本発明者らは、抗ＣＤ２０を含むプールされた画分に対して、ｐＨ６．０の２５ｍＭ  ヒスチジン  １２５ｍＭ  ＮａＣｌ  緩衝液で緩衝液交換を行った。精製サンプル中の抗体濃度を、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＭＸ分光光度計（Ｂｉｏｔｅｋ，ＶＴ，ＵＳＡ）を用いて測定した。本発明者らは、精製抗体のＡ２８０吸光度に基づいてタンパク質濃度を測定した。濃度は、理論吸収係数を用いて計算した。
【０１２４】
５ＨＴ１Ｄ受容体の発現及びサンプルの調製
５ＨＴ１ＤＲを安定に発現する細胞株の作製、５ＨＴ１Ｄサンプルの調製、及び分析の詳細な方法は次の通りである。
【０１２５】
ｐＴ−ＲＥｘ−５ＨＴ１ＤＲｈｏプラスミド及びｐＴ−ＲＥｘ−５ＨＴ１ＤＲｈｏ−ＩＲＥＳｄｓＲｅｄ２プラスミドの構築
ｐＴ−ＲＥｘ−ＤＥＳＴ３０プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ｄａｍ／ｄｃｍメチル化欠損大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株で増殖し、ＢｃｌＩ及びＸｂａＩで消化した。ｄｓＤＮＡインサートを、オリゴＰＲ１１及びオリゴＰＲ１２のアニーリングによって作製した。続くｄｓＤＮＡインサートの、ＸｂａＩ／ＢｃｌＩ消化ｐＴ−ＲＥｘ−ＤＥＳＴ３０断片へのライゲーションにより、ｐＴ−ＲＥｘ−ＭＣＳプラスミドを構築した。
【０１２６】
本発明者らは、プライマーＰＲ１３及びＰＲ１４を用いて、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーからの５−ヒドロキシトリプタミン１Ｄ受容体（ＮＭ＿００８６４）のＣＤＳを増幅し、ｐＣＲ（登録商標）ＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、Ｔｏｐｏ−５ＨＴ１Ｄプラスミドを構築した。Ｒｈｏ１Ｄ４標識５ＨＴ１ＤＲ断片を、プライマーＰＲ１３及びＰＲ１５を用いてＴｏｐｏ−５ＨＴ１Ｄプラスミドから増幅した。本発明者らは、ＰＣＲ断片をＳａｌＩで消化し、ｐＴ−ＲＥｘ−ＭＣＳプラスミドをＰｍｅＩ及びＳａｌＩで消化し、続いて脱リン酸化した。本発明者らは、これらの断片を結合して、ｐＴ−ＲＥｘ−５ＨＴ１ＤＲｈｏプラスミドを得た。
【０１２７】
本発明者らは、ＩＲＥＳｄｓＲｅｄ２断片を、プライマーＰＲ１６及びＰＲ１７を用いてｐＬＶ−ｔＴＲ／ＫＲＡＢ−Ｒｅｄプラスミド（ａ  ｋｉｎｄ  ｇｉｆｔ  ｏｆ  Ｐｒｏｆ．Ｐｅｔｅｒ  Ｖａｎｄｅｎａｂｅｅｌｅ，ＶＩＢ−ＵＧｈｅｎｔ）から増幅した。ｐＴ−ＲＥｘ−５ＨＴ１ＤＲｈｏプラスミドをＰｍｅＩで消化し、これをＩＲＥＳｄｓＲｅｄ２断片と共に、クローンＥＺ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．，ＮＪ，ＵＳＡ）反応で使用した。これにより、ｐＴ−ＲＥｘ−５ＨＴ１ＤＲｈｏ−ＩＲＥＳｄｓＲｅｄ２プラスミドが得られた。
【０１２８】
２９３ＳＧｎＴＩ−／−クローン及び２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅクローンを発現する５ＨＴ１ＤＲ
本発明者らは、２９３ＳＧｎＴＩ−／−をｐＴ−ＲＥｘＬ−５ＨＴ１ＤＲｈｏ−ＩＲＥＳｄｓＲｅｄ２プラスミドでトランスフェクトし、２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞をｐＴＲＥｘＬ−５ＨＴ１ＤＲｈｏプラスミド又はｐＴ−ＲＥｘＬ−５ＨＴ１ＤＲｈｏ−ＩＲＥＳｄｓＲｅｄ２プラスミドでトランスフェクトすることによって、５ＨＴ１Ｄ受容体を安定的かつ誘導的に発現する細胞株を作製した。６００μｇ／ｍｌ（２９３ＳＧｎＴＩ−／−細胞）及び１５０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞）でＧ４１８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて選択を行った。次いで、本発明者らは、Ｇ４１８耐性細胞を、条件培地で限界希釈クローニングした。本発明者らは、２μｇ／ｍｌ  テトラサイクリン及び１ｍＭ  バルプロエート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて５ＨＴ１Ｄ受容体の発現を誘導した。本発明者らは、蛍光顕微鏡法による誘導の２〜３日後に、最高強度の赤色蛍光を発現する２９３ＳＧｎＴＩ−／−５ＨＴ１ＤＲクローンを選択した。
【０１２９】
２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅクローンでの５ＨＴ１ＤＲの発現のＥＬＩＳＡ分析
２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅクローンを発現する５ＨＴ１ＤＲのＥＬＩＳＡ分析のために、本発明者らは、２μｇ／ｍｌテトラサイクリン及び１ｍＭ  バルプロエート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた誘導の２〜３日後に、２４ウェルプレートから細胞を回収した。本発明者らは、細胞を遠心分離で沈降させ、上清を廃棄した。細胞を、ＲＩＰＡ緩衝液＋プロテアーゼインヒビターを用いて、氷上で２０分間インキュベートすることによって溶解した。本発明者らは、サンプルを１２，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって残屑を除去した。本発明者らは、製造者の取扱説明書に従って、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）でタンパク質を測定した。ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）で産生される１５μｇの５ＨＴ１ＤＲの陽性コントロールサンプル及び１５μｇの２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ陰性コントロールサンプルをｍａｘｉｓｏｒｂプレートで、４℃で一晩コーティングした。本発明者らは、このプレートを、水で３回、そして洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ−８０）で１回洗浄した。ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋１％  粉乳）を各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。洗浄後、サンプル緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ＋０．５％  粉乳）で１／１００に希釈した抗ｒｈｏ１Ｄ４抗体（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を添加し、サンプルを室温で１時間インキュベートした。プレートを再び洗浄し、次いで、サンプル緩衝液で１／５０００に希釈したＨＲＰ二次抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）に結合された抗マウスＩｇＧをサンプルに添加した。最後に、プレートを再び洗浄し、サンプルを、製造者の取扱説明書に従って、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）ＴＭＢ基質試薬セット（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）で分析した。
【０１３０】
５ＨＴ１Ｄ受容体の発現及びサンプルの調製
本発明者らは、５ＨＴ１Ｄ受容体を安定的かつ誘導的に発現する２９３ＳＧｎＴＩ−／−細胞株及び２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞株を作製した。５ＨＴ１ＤＲ発現構築物の作製及びこれに続く安定した５ＨＴ１ＤＲ−発現クローンの作製の詳細な方法は、補足事項１に記載されている。各細胞株の選択された５ＨＴ１ＤＲ−発現クローンを、２μｇ／ｍｌ  テトラサイクリン及び１ｍＭ  バルプロエートを用いて誘導した。誘導の３日後に細胞を収集した。細胞ペレットを、５ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ＋コンプリートＥＤＴＡフリープロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に再懸濁した。１．２５ｍｌの各サンプルを、ＶＣＸ５００超音波処理器（Ｓｏｎｉｃｓ  ＆  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗｔｏｗｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）を用いて氷上で超音波処理した（１５サイクル、各サイクル：１秒オンで５秒オフ、２０％の増幅）。本発明者らは、溶解物を、即座に１３，０００ｒｐｍ及び４℃で１０分間遠心分離し、上記の緩衝液＋０．３５ｍＭ  ＮａＣｌ、及び０．５％  ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドでペレットを可溶性にした。サンプルを再び、即座に１３，０００ｒｐｍ及び４℃で１０分間遠心分離して残屑を除去した。
【０１３１】
５ＨＴ１Ｄ受容体のＰＮＧａｓｅ  Ｆ感受性Ｎ−グリカンの存在を評価するために、１％  Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０及び２００ＵのＰＮＧａｓｅ  Ｆ（社内生産）を添加した、又は酵素を含まないサンプルの５０μｌのアリコートを３７℃で一晩インキュベートした。１／２５０に希釈したマウス抗−ｒｈｏ１Ｄ４一次抗体（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を用いて免疫ブロット法でサンプルを分析した。
【０１３２】
シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、及びＰＮＧａｓｅＦの消化並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥ
本発明者らは、糖タンパク質を、４０ｍＭのβ−メルカプトエタノール及び０．５％  ＳＤＳを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈した。サンプルを、９８℃で１０分間インキュベートした。冷却後、１％  Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ６３０及び適切な酵素を添加した：１００ＵのＰＮＧａｓｅＦ（社内生産）、２００ｍＵのアルスロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）シアリダーゼ（社内生産）、２ｍＵのストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）β−１，４−ガラクトシダーゼ（Ｐｒｏｚｙｍｅ）、又はこれらの組み合わせ。サンプルを３７℃で一晩インキュベートし、翌日にトリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。
【０１３３】
Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒアッセイ
Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒアッセイを、Ｅｒｉｃｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１７らに記載されているように行った。簡単に述べると、精製タンパク質を、緩衝液（ＧＭ−ＣＳＦ用のＰＢＳ、及び抗ＣＤ２０用のＨｉｓ緩衝液−２５ｍＭ  ヒスチジン、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．００）及び２０倍濃縮Ｓｙｐｒｏオレンジ染料（ＤＭＳＯ中、５０００倍溶液、ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）を含む溶液で適切なアッセイ容量（１０〜２０μｌ）に希釈した。各実験は、技術的トリプリケートとして行い、試験タンパク質を用いないトリプリケート空測定を含めた。温度の関数である蛍光を３４８ウェルＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で、０．０１℃／秒の温度ランプ速度で２５℃〜９５℃まで記録した。
【０１３４】
あらゆる計算及び統計分析の前に、明らかな技術的な問題のあるデータセット（異常に高い初期蛍光、測定限界を超えた蛍光）を完全に排除した。融解温度を、各実験の３つのレプリケートの平均データ点にフィッティングされたＢｏｌｔｚｍａｎｎＳ字形曲線のＶ５０値として計算した。曲線フィッティング手順では、最大の蛍光を超えたデータ点は排除した。２つ以上の融点を１つの実験から計算する場合は、融点の直下又は直上の温度における最小蛍光値及び最大蛍光値を含む適切なデータ点のサブセットを使用した。グラフ化では、生のデータセットを平均し、ブランク（平均）補正し、そして正規化した（最小値＝０％、最大値＝１００％）。
【０１３５】
ＧＭ−ＣＳＦサンプルのために、平均Ｔｍを、一連の独立した実験（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）：ｎ＝４、２９３Ｓ：ｎ＝３、２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ：ｎ＝３）から計算した。本発明者らは、平均Ｔｍが統計的に有意に異なるか否かを、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ（Ｐ＝０．０５）及び複数の比較のためのＤｕｎｎ試験（α＝０．０５）によって試験した。
【０１３６】
ＭＡＬＤＩ糖ペプチドの分析
異なる細胞株のＧＭ−ＣＳＦ（２０μＬ中、１〜４μｇのタンパク質）に、１０μＬの３×トリシンゲルローディング緩衝液（１．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．４５、３５％  グリセロール、１０％  ＳＤＳ、０．０１％  クマーシー、及び３０ｍＭ  ＤＴＴ）が補充され、９８℃で１０分間インキュベートした。３μＬの５００ｍＭ  ヨードアセトアミドストックを添加し、サンプルを、暗室で１時間インキュベートした。本発明者らは、１２％  トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでサンプルを分離し、バンドを切り出した。
【０１３７】
ゲル内トリプシン消化の詳細な方法は、次の通りである。ゲル片を５０％  アセトニトリル（ＡＣＮ）で３回洗浄し、１００％  ＡＣＮで乾燥させ、そして１００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３中で再膨張させた。ゲル片を、スピードバック（ｓｐｅｅｄｖａｃ）でさらに乾燥させた。７５０ｎｇのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を添加し、ゲル片を５分間再膨張させた。１００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３を全てのゲル片を覆うように添加し、バイアルを３７℃で一晩インキュベートした。５０μｌの１００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３を各バイアルに添加し、サンプルをシェーカーで１５分間インキュベートした。５０μｌの１００％  ＡＣＮを添加し、バイアルをシェーカーで１５分間インキュベートした。上清を新しいバイアルに収集した。５０％  ＡＣＮ中の５０μｌの５％  ギ酸を添加し、バイアルをシェーカーで１５分間インキュベートした。上清を収集した。５％  ギ酸ステップをもう１回行った。サンプル毎に上清をプールし、スピードバックで乾燥させ、次いで、２０μｌの５０ｍＭ  リン酸緩衝液、ｐＨ７．０、及び１ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で元に戻した。
【０１３８】
本発明者らは、トリプシンペプチドを、酵素なし、５０ｍＵのα−２，３−シアリダーゼ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）、又は２００ｍＵのアルスロバクター・ウレアファシエンス（Ａ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）シアリダーゼ及び２ｍＵのストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）β−１，４−ガラクトシダーゼ（Ｐｒｏｚｙｍｅ）で処理した。全ての消化物を、３７℃で２４時間インキュベートし、スピードバックで乾燥させ、１０μｌの０．２％  トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で元に戻し、製造者の取扱説明書に従ってＣ１８  ＺｉｐＴｉｐピペット先端（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で清掃した。サンプルを、陽イオンモードの４８００  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、０．１％  ＴＦＡを含む５０％  アセトニトリルに浸漬された６−アザ−２−チオチミン（ＡＴＴ）マトリックスを用いて分析した。報告されたｍ／ｚ値が、技術的最適化のいくつかの反復で観察され、完全に最適化された実験結果が示されている。
【０１３９】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ糖ペプチドの分析
本発明者らは、９μｇの抗ＣＤ２０を２０μＬの５０ｍＭ  リン酸緩衝液、ｐＨ７．０で希釈した。酵素なし、１００ｍＵのアルスロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）シアリダーゼ（社内生産）、又は２ｍＵのβ−１，４−ガラクトシダーゼ（ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））及び１００ｍＵのシアリダーゼを添加し、この混合物を３７℃で４時間インキュベートした。サンプルを、２Ｍ  尿素、１０ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  重炭酸アンモニウム緩衝液で、６０℃で３０分間変性させた。２０ｍＭの濃度になるようにヨードアセトアミドを添加し、サンプルを暗室で３０分間インキュベートした。次に、サンプルを１／５０（ｗ／ｗ）トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１４０】
サンプルを、Ｕ３０００−ＲＳＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ）のＡｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐ  １００分析カラム（Ｌ×ＩＤ  １５ｃｍ×７５μｍ、Ｃ１８、３μｍ、１００オングストローム）（Ｔｈｅｒｍｏ）に３００ｎＬ／分の流速で直接導入した。移動相は、Ｈ２Ｏ（溶媒Ａ）中、０．１％  ＨＣＯＯＨ及びアセトニトリル（ＡＣＮ）（溶媒Ｂ）中、０．１％  ＨＣＯＯＨとした。サンプルを、３０分の勾配、２％〜４０％の溶媒Ｂで分離し、そして溶出ペプチドを、ＮａｎｏＳｐｒａｙ  ＩＩ  ＥＳＩ  ｓｏｕｒｃｅ（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）を用いて４０００  ＱＴＲＡＰ質量分析計（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）に直接噴霧した。選択反応モニタリング（ＳＲＭ）法を使用して、グリコシル化ペプチドＥＥＱＹＮＳＴＹＲを標的とし、トリプル四重極で、２５０ミリ秒の滞留時間を用いて次のＳＲＭ転位リストを順に測定した：Ｐｅｐ−ＧｌｃＮＡｃ：６９６．８（２＋）／５２６．３（＋）及び６９６．８（２＋）／１１８９．５（＋）（ＤＰ  ８１．９Ｖ、ＣＥ  ３９．８ｅＶ）、Ｐｅｐ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ：７７７．８（２＋）／５２６．３（＋）及び７７７．８（２＋）／１，１８９．５（＋）（ＤＰ  ８７．８Ｖ、ＣＥ  ４３．９ｅＶ）、Ｐｅｐ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａｌ：９２３．４（２＋）／５２６．３（＋）及び９２３．４（２＋）／１，１８９．５（＋）（ＤＰ  ９８．４Ｖ、ＣＥ  ５１．２ｅＶ）。５２６．３−Ｄａ断片イオン（ｙ４−ｉｏｎ，  ＳＴＹＲ）をクオンティファイアー（ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒ）として使用し、１，１８９．５−Ｄａ断片イオン（糖修飾基の喪失）をクオリファイアー（ｑｕａｌｉｆｉｅｒ）として使用した。データの分析及び処理は、Ｓｋｙｌｉｎｅ２５で行った。この実験は２回行った。実験の１つは、技術的デュプリケートとして行い、もう１つの実験は、技術的トリプリケートとして行った。
【０１４１】
シアル化及びガラクトシル化グリカンの比率
シアル化されたＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅグリカンのパーセンテージを計算するために、本発明者らは、未消化（ＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＵｎｄｉｇ及びＡＧｌｃＮＡｃＵｎｄｉｇ）及びα−２，３−シアリダーゼ消化（ＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＤｉｇ及びＡＧｌｃＮＡｃＤｉｇ）ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ  ＧＭ−ＣＳＦサンプルの両方のＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｎ（ｍ／ｚ＝３６２２．３）及びＧｌｃＮＡｃ−Ｎ（ｍ／ｚ＝３４６０．２）糖ペプチドのＭＡＬＤＩ  ＭＳスペクトルのピークの下の面積を抽出した。シアル化グリカンのパーセンテージを、以下の式に示されているように計算した。Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｎピーク面積を、両方のスペクトルにおいてＧｌｃＮＡｃ−Ｎピーク面積に対してまず正規化した。未消化サンプルから得られたＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｎピークの値を、シアリダーゼ消化サンプルからのＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｎピークの値から差し引いた。次いで、この差異を、消化サンプルのＧｌｃＮＡｃ及びＧａｌＧｌｃＮＡｃピークの合計正規化ピーク面積（Ｎ２７又はＮ３７を含む糖ペプチドの合計正規化ピーク面積）で除した。
【数１】
0006553042.tif 000006
【０１４２】
ガラクトシル化されたＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅグリカン（二糖）のパーセンテージを計算するために、同じデータセットを利用した。ガラクトシル化グリカンのパーセンテージは、以下の式に示されているように計算した。同様に、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｎのピーク面積を、シアリダーゼ消化サンプル及び未消化サンプルの両方でまず正規化した。次いで、未消化Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｎピークの正規化ピーク面積を、消化サンプルのＧｌｃＮＡｃ−Ｎピーク及びＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｎピークの合計正規化ピーク面積（Ｎ２７又はＮ３７を含む糖ペプチドの合計正規化ピーク面積）で除した。
【数２】
0006553042.tif 000007
【０１４３】
ＧＭ−ＣＳＦ生物活性実験及びＴＦ１増殖アッセイ
ＴＦ１細胞（ＡＴＣＣ  ｎ°  ＣＲＬ−２００３）を、ＲＰＭＩ  １６４０、１０％（ｖ／ｖ）  ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−Ｇｌｎ、及び２ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ中、３７℃、５％  ＣＯ２で維持した。アッセイを開始する前に、サイトカインを含まない培地で細胞を３回洗浄した。続いて、細胞を、サイトカインを含まない培地に戻し（２００，０００細胞／ｍＬ）、３７℃で２時間放置した。
【０１４４】
アッセイの開始に当たって、細胞を、９６ウェルプレートにプレーティングし（１００μＬの培地中、２０，０００細胞／ウェル）、異なる糖型のＧＭ−ＣＳＦの段階希釈液（５４ｎｇ／ｍＬ〜８ｐｇ／ｍＬ）を添加した。細胞を、２８に記載のＭＴＴアッセイ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を行う前に４８時間、７２時間、及び９６時間インキュベートした。簡単に述べると、２０μｌのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬストック）を各ウェルに添加し、インキュベートした。３７℃で４時間後、８０μＬの停止液（０．０１Ｍ  ＨＣｌ中、１０％  ＳＤＳ）を添加し、プレートを、３７℃で一晩さらにインキュベートした。最後に、５９５ｎｍで光学密度を測定した。図２ｄにプロットされたデータ点は、３つの技術的レプリケートの平均値を表している。エラーバーは標準偏差である。報告されたＧＭ−ＣＳＦ糖型間の差異は、これらの実験の技術的最適化のいくつかの反復で観察された。完全に最適化された生物活性実験の結果が示されている。
【０１４５】
ウサギの免疫
１３〜１６週齢のニュージーランドホワイト雄又は雌ウサギ（各抗原に対して２匹のウサギ、１匹のウサギの結果のみが図７及び図１４に示されている）に、２９３Ｓ  ＧＭ−ＣＳＦ、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ  ＧＭ−ＣＳＦ、２９３Ｓ抗ＣＤ２０、又はＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ抗ＣＤ２０を注射した。５００μＬの抗原溶液中の５０μｇの抗原（０．９％  ＮａＣｌ溶液で５００μＬまで希釈された５０μｇのタンパク質）＋５００μＬの完全フロイントアジュバントを、０日目、１４日目、２８日目、及び５６日目に皮下注射した。ウサギの採血を、０日目（免疫前採血）、３８日目、６６日目、及び８０日目（最終採血）に行った。免疫は、ＣＥＲ  Ｇｒｏｕｐｅによって行われ、ＣＥＲ  Ｇｒｏｕｐｅ倫理委員会によって承認された。
【０１４６】
ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅタンパク質を用いた血清ＥＬＩＳＡ
グリコシダーゼ消化を上記のように行った。Ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレートのウェルを、５０μｌのコーティング緩衝液（０．０５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３、０．０５Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）中、０．２５μｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ又は０．１５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２０でコーティングし（一晩、４℃）、ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、２５０ｍＭ  グリシンを含むＰＢＳ中、１％  ＢＳＡで、室温で２時間ブロックした。ブロッキング緩衝液を除去し、プレートを一晩乾燥させた。
【０１４７】
検出抗体（抗ＧＭ−ＣＳＦウサギ血清、最終採血；抗（抗ＣＤ２０）ウサギ血清、最終採血）を、ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０＋０．１％  ヤギ血清に添加し、室温で２時間インキュベートした。
【０１４８】
プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄してから、ロバ抗ウサギＨＲＰ（１：２，０００）（カタログ番号：ＮＡ９３４，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＰＢＳ＋１％  ＢＳＡに添加し、室温で１時間インキュベートした。
【０１４９】
本発明者らは、プレートを再び洗浄緩衝液で３回洗浄してから、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ）基質（１００μＬ／ウェル）を添加し、そしてプレートを室温で３０分間インキュベートした。最後に、本発明者らは、５０μＬの停止液（２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）を添加し、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１５０】
ＧＭ−ＣＳＦでのＥＬＩＳＡを、２つの生物学的レプリケート（２匹のウサギの免疫；図７ｅ、図７ｆ）を用いて１回行った。抗ＣＤ２０でのＥＬＩＳＡを、２つの生物学的レプリケート（２匹のウサギの免疫）を用いて１回行い、次いで、生物学的レプリケートの一方を、３つの技術的レプリケートで繰り返した。後者の実験の結果が図１４ｆに示されている。この図面にプロットされたデータ点は、３つの技術的レプリケートの平均値を表している。エラーバーは標準偏差である。
【０１５１】
抗ＣＤ２０によるＣＤ２０の結合
Ｒａｊｉ細胞のＦｃ受容体を、抗ＣＤ３２抗体ＩＶ．３（参照文献２９）（社内生産）及びＡＴ１０（カタログ番号：ＭＣＡ１０７５、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）を１０μｇ／ｍＬでブロックし、そして細胞を氷上で１時間インキュベートした。次に、細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし（１０５細胞／ウェル）、そして２９３Ｓ抗ＣＤ２０又は２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ抗ＣＤ２０を、１０μｇ／ｍＬから開始する希釈系列に添加した。細胞を、４℃で１時間インキュベートし、次いでＰＢＳ＋２％  ＢＳＡで２回洗浄した。抗ＣＤ２０を検出するために、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９（カタログ番号：１０９−４９６−０９７、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にコンジュゲートした抗Ｆ（Ａｂ）２二次抗体を、１：２００の希釈で添加した。細胞を、再び４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ＋２％  ＢＳＡで２回洗浄した。細胞を固定するために、１５０μＬの固定液（ＣｅｌｌＦＩＸ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を各ウェルに添加し、４℃で１時間インキュベートした。フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって二次抗体を検出した。図３ｃにプロットされたデータ点は、３つの技術的レプリケートの平均値を表している。エラーバーは標準偏差である。この実験は２回行った。
【０１５２】
ＦｃγＲ表面プラズモン共鳴実験
Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００  ＳＰＲバイオセンサー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＦｃＲｎと様々な抗ＣＤ２０糖型との相互作用をアッセイする。全ての実験を２５℃で行った。ＣＭ５チップを、１０μＬ／分の流速で、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド）及びＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）の溶液との７分間の架橋結合のために活性化させた。次に、１０ｍＭ  酢酸緩衝液、ｐＨ５．０中、１０μｇ／ｍＬのストレプトアビジン（Ｒｏｃｈｅ）を、同じ流速で７分間固定し、１，１８０〜１，２８０共鳴単位（ＲＵ）の密度が得られた。固定後、チップを、１Ｍのエタノールアミンを７分間注入することによってブロックした。固定を終了させるために、チップを、２０μＬの４０ｍＭ  ＮａＯＨ、１Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液で３回洗浄した。
【０１５３】
ｈＦｃＲＮをストレプトアビジンセンサー表面に固定するために、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液、ｐＨ８．０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でプライミングすることによってｐＨを８．０に上げた。ビオチン化ｈＦｃＲｎ（ＮｏｖＩｍｍｕｎｅで製造）３０をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で希釈し、チップに固定した。次いで、システムを、ｐＨ６．０のＨＢＳ−ＥＰ緩衝液でプライミングした。
【０１５４】
ＩｇＧを、６７ｎＭ〜２ｎＭの異なる濃度で注入し、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液、ｐＨ６．０で希釈した。各注入は、３０μＬ／分の流速で３分間、毎回２連で行った。解離を１２分間監視した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液、ｐＨ８．０を再生のために使用した。結果を、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １：１フィッティングモデル（ＢＩＡｅｖａｌ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１）を用いて二重参照して分析した。
【０１５５】
競合ＥＬＩＳＡ
Ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレートのウェルを、５０μｌのＰＢＳ中、コーティング抗体（ＦｃγＲＩ  ＥＬＩＳＡのための８μｇ／ｍＬの抗イディオタイプ抗体；ＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩｂそれぞれのための１６μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬのＨｚ  １５Ｃｌ、ヒト化抗ＴＬＲ４  ＩｇＧ１（ＮｏｖＩｍｍｕｎｅ））を用いて４℃で一晩コーティングし、次いで、洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ）で５回洗浄し、各ウェルに付き、ＰＢＳ中、２５０μｌの３％  ＢＳＡで、３７℃で１時間ブロックした。ブロッキング後、プレートを、洗浄緩衝液で５回洗浄した。
【０１５６】
５０μＬの抗ＣＤ２０を、５０μＬのＨｉｓ標識ＦｃγＲ（（ＦｃγＲＩ、０．０３０μｇ／ｍＬ；ＦｃγＲＩＩａＲ、０．０５６μｇ／ｍＬ；ＦｃγＲＩＩｂ、１μｇ／ｍＬ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に、希釈緩衝液（ＰＢＳ＋１％  ＢＳＡ）中、段階希釈でウェルに添加した。プレートを、３７℃で１．５時間インキュベートし、そして洗浄緩衝液で５回洗浄した。ＨＲＰ標識抗Ｈｉｓ抗体（カタログ番号：３４６６０、Ｑｉａｇｅｎ）を、希釈緩衝液中、１：２，０００の希釈で添加し、そしてプレートを３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄してから、５０μＬのＴＭＢ  ｓｕｐｅｒ−ｓｌｏｗ（Ｄｉａｒｅｃｔ）基質を添加した。次いで、プレートを、暗室で３０分間インキュベートした。最後に、５０μＬの停止液（２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）を添加した。４５０ｎｍでの吸光度を、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ）で測定した。
【０１５７】
図１４ｅ（上３つのパネル）にプロットされたデータ点は、３つの技術的レプリケートの平均値を表している。エラーバーは、平均値の標準偏差である。２９３Ｓ産生抗体と２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ産生抗体との間の報告された差異は、これらの実験の技術的最適化のいくつかの反復で観察され、完全に最適化されたＥＬＩＳＡの結果が示されている。
【０１５８】
バイオレイヤー干渉アッセイ
精製ＩｇＧのＦｃγＲＩＩＩａへのリアルタイム結合を、Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６システム（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）でバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いて評価した。アッセイは、１ｍＭ  リン酸塩、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）  Ｔｗｅｅｎ２０、０．００５％（ｗｔ／ｖｏｌ）  アジ化ナトリウム、０．１ｍｇ／ｍＬ（ｗｔ／ｖｏｌ）  ＢＳＡ、ｐＨ７．４を含むキネティクス緩衝液中、３０℃の温度で行った。ヘキサヒスチジンタグで標識されたＦｃγＲＩＩＩａＶ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）を、キネティクス緩衝液中、１．５μｇ／ｍＬの濃度にした。受容体を、抗ペンタ−Ｈｉｓ  バイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）で１０分間捕捉した。リガンド濃度は、０．５ｎｍであった。基準値シグナルは、キネティックス緩衝液中、２分間のインキュベーションで安定した。
【０１５９】
第１の結合アッセイを、キネティクス緩衝液中、５０μｇ／ｍｌの単一濃度のＩｇＧで行った。会合と解離を５分間監視した。センサーを１０ｍＭ  グリシン  ｐＨ３．０  緩衝液で２０秒間インキュベートし、続いてキネティクス緩衝液中で２０秒間のインキュベーションによって再生を行った。これらのインキュベーションは、完全な再生を達成するために２回繰り返した。
【０１６０】
キネティクス実験のために、ＦｃγＲＩＩＩａＶ被覆バイオセンサーを、３３３ｎＭ〜１９．３ｎＭの濃度のＩｇＧと共にインキュベートした。２分間のベースライン状態の後、キネティクス緩衝液中、５分間の会合相及び１５分間の解離相を続けた。上記のように再生を行った。親和性を、定常状態モデルを用いて平衡状態で決定した。全ての分析を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）を用いて行った。
【０１６１】
ＡＤＣＣアッセイ
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ管（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ｔｕｂｅ  ＣＰＴ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）での遠心分離後に新鮮な血液から単離した。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を、陰性ＮＫ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＰＢＭＣプールから単離した。これらの細胞を、増殖培地（ＲＰＭＩ  １６４０＋１０％  ＦＢＳ＋２ｍＭ  グルタミン）＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−２中、一晩活性化させた。
【０１６２】
Ｒａｊｉ細胞を、２０，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。２５μＬの抗ＣＤ２０抗体のサンプルを、５μｇ／ｍＬから開始する（ＡＤＣＣ培地：ＲＰＭＩ  １６４０＋１％  ＢＳＡ＋２ｍＭ  グルタミン＋２５μｇ／ｍＬ  ゲンタマイシンでの）１：５希釈系列に添加した。次いで、プレートを、３７℃及び５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。ＮＫ細胞を、１：５（Ｒａｊｉ／ＮＫ）の比率でＲａｊｉ細胞に添加し、そしてプレートを、３７℃及び５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。最後に、本発明者らは、各ウェルの乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）レベルを測定することによって特定の溶解を決定した（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＰＬＵＳ，Ｒｏｃｈｅ）。
【０１６３】
図１４ｅ（底部）のデータ点は、３つの技術的レプリケートの平均値を表している。エラーバーは、標準偏差である。報告されたプロフィールは、これらの実験の技術的最適化のいくつかの反復で観察され、完全に最適化された実験の結果が示されている。
【０１６４】
薬物動態
３６匹の雌の８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）の２つの群を、１８．５μｇ（１ｍｇ／体重ｋｇ）の２９３Ｓ抗ＣＤ２０又は２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ抗ＣＤ２０のいずれかを静注するために無作為に割り当てた。各時点（１時間、２４時間、４８時間、４日目、７日目、１０日目、１４日目、２１日目、及び２８日目）で、１つの処置群に付き４匹のマウスを、最終採血のために屠殺し、抗ＣＤ２０の濃度を、製造者の取扱説明書に従って、ＦａｓｔＥＬＹＳＡヒトＩｇＧキット（ＲＤ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて決定した。図１４ｇに示されているデータ点は、各時点の（４匹のマウスの）平均値である。エラーバーは、平均値の標準偏差である。この実験は、注射後の早い時点での採血で繰り返した（図１７を参照）。実用的な理由から、研究者は、マウスの処置群割り当てについて非盲検とした。この実験は、Ｇｈｅｎｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）及びジュネーブのＣａｎｔｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｏｆｆｉｃｅ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の倫理委員会によって承認された。
【０１６５】
ｐＣＡＧＧＳ−ｓ−ｅｎｄｏＴ、ｐＣＡＧＧＳ−ＧＭ２Ｓ−ｅｎｄｏＴ、及びｐＣＡＧＧＳ−ＳＴ−ｅｎｄｏＴの構築
シグナル配列を含まないｅｎｄｏＴコード配列３を、ＰＣＲプライマーＰＲ１及びＰＲ４（ＳＴ−ｅｎｄｏＴ用）、ＰＲ２及びＰＲ４（ＧＭ２Ｓ−ｅｎｄｏＴ用）、又はＰＲ３及びＰＲ４（「ｅｎｄｏＴ」用）を用いて、フルサイズのｅｎｄｏＴコード配列を含むｐＵＣ１９クローニングベクターから増幅した。全てのプライマー配列は、補足事項２に記載されている。ＳＴ６ＧａｌＩ４（ＳＴ−ｅｎｄｏＴ用）及びＢ４ＧＡＬＮＴＩ５（ＧＭ２Ｓ−ｅｎｄｏＴ用）のＮ末端部分のコード配列を、それぞれプライマーＰＲ５、ＰＲ６、及びＰＲ７、ＰＲ８を用いて、ヒトヘパトームＧ２  ｃＤＮＡライブラリーから増幅した。シグナル配列を含まないＳＴ−ｅｎｄｏＴ、ＧＭ２Ｓ−ｅｎｄｏＴ、及びｅｎｄｏＴを作製するための各融合ＰＣＲ反応をそれぞれ、ＰＲ５及びＰＲ４、ＰＲ７及びＰＲ４、並びにＰＲ３及びＰＲ４を用いて準備した。続く、ＸｈｏＩ及びＢｓｕ３６Ｉを用いる融合ＰＣＲ産物ＳＴ−ｅｎｄｏＴ、ＧＭ２Ｓ−ｅｎｄｏＴ、及びｅｎｄｏＴの消化、並びにＸｈｏＩ及びＢｓｕ３６Ｉで消化された脱リン酸化ｐＣＡＧＧＳプラスミドへのライゲーションにより、ｐＣＡＧＧＳ−ＳＴ−ｅｎｄｏＴプラスミド及びｐＣＡＧＧＳ−ＧＭ２Ｓ−ｅｎｄｏＴプラスミドを得た。ｓ−ｅｎｄｏＴ構築物のｄｓＤＮＡシグナル配列を、オリゴヌクレオチドＰＲ９及びＰＲ１０のアニーリングによって作製した。ｐＣＡＧＧＳ−ｅｎｄｏＴプラスミドを、ＸｈｏＩ及びＫｐｎＩで消化した。続く、アダプターのプラスミドへのライゲーションにより、ｐＣＡＧＧＳ−ｓ−ｅｎｄｏＴプラスミドを得た。
【０１６６】
トランスフェクション及びサンプルの調製
細胞を、上記のようにトランスフェクトした（オンライン法を参照）。ｐＣＡＧＧＳ−ｓ−ｅｎｄｏＴ、ｐＣＡＧＧＳ−ＧＭ２Ｓ−ｅｎｄｏＴ、又はｐＣＡＧＧＳ−ＳＴ−ｅｎｄｏＴでのトランスフェクションの３日後に、細胞及び上清を回収した。細胞溶解物を得るために、細胞を、１０００ｒｐｍでの遠心分離によって収集し、ＰＢＳで１回洗浄した。細胞溶解物を、約１００万の細胞を５００μｌのＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１．０％  Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、０．５％  デオキシコール酸ナトリウム、０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム、及び５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）と共に回転台で、４℃で３０分間インキュベートし、続いて１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、不溶性物質を廃棄することによって調製した。２０μｌのサンプルに、５μｌの５倍ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液（８．３％  ＳＤＳ、４１．７％  グリセロール、０．１％  ブロモフェノールブルー、２０８ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、及び６５ｍＭ  ジチオスレイトールが添加されて新鮮）を補充し、１０分間煮沸した。
【０１６７】
細胞培養上清の５００μｌのサンプルを、微量遠心機で１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、２倍量の氷冷アセトンの添加によりアセトン沈殿させ、そして氷上での３０分間のインキュベーションによって澄ませた。沈殿したサンプルを、微量遠心機で１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。８０μｌの超純水及び２０μｌの５倍ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液の添加によってペレットを溶解し、続いて煮沸して再び溶解してタンパク質ペレットを変性させた。
【０１６８】
免疫ブロット法
細胞溶解物又は上清のサンプルの２５μｌのアリコートを、免疫ブロット法によってｅｎｄｏＴ融合タンパク質の存在について分析した。特注のｅｎｄｏＴ酵素に対するウサギポリクローナル抗体（ＣＥＲ  ｇｒｏｕｐｅ，Ｄｅｐａｒｔｅｍｅｎｔ  Ｓａｎｔｅ，Ｍａｒｌｏｉｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて間接的な検出を行った。抗原は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）で作製され、本発明者らの研究室で以前に精製されたｅｎｄｏＴとした。最終抗原調製物は、リン酸緩衝生理食塩水中、１ｍｇ／ｍｌ  抗原とした。二次抗体を、ＩＲＤｙｅ  ６８０ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ，ＵＳＡ）とした。Ｃ末端処理を評価するために、同じブロットを、ｍｙｃタグに対するマウス一次抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）及びＩＲＤｙｅ  ８００ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ，ＵＳＡ）で精査した。
【０１６９】
ｅｎｄｏＴ融合タンパク質によってｉｎ  ｖｉｖｏでの脱Ｎ−グリコシル化を評価するために、ｐｅｎｔａ−ＨｉｓタグでＣ末端が標識された、Ｆｌｔ３受容体細胞外ドメイン（Ｆｌｔ３ＥＣＤ）を安定的かつ誘導的に発現する２９３ＳＧｎＴＩ−／−細胞（Ｐｒｏｆ．Ｄｒ．Ｓ．Ｓａｖｖｉｄｅｓ，ＵＧｈｅｎｔによって親切に提供された細胞）、又はＲｈｏ１Ｄ４タグでＣ末端が標識された、５−ヒドロキシトリプトアミン受容体１Ｄ（５ＨＴ１Ｄ）（安定した５ＨＴ１Ｄ細胞株の単離、添付の図５の方法を参照）を安定的かつ誘導的に発現する２９３ＳＧｎＴＩ−／−細胞に、融合構築物を一過性にトランスフェクトした（トランスフェクション、オンライン法を参照）。産生細胞株を、ｅｎｄｏＴ融合構築物又は空プラスミドでトランスフェクトし、２μｇ／ｍｌ  組織培養グレードのテトラサイクリン及び５ｍＭ  酪酸ナトリウム（共にＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）で誘導した。上清（Ｆｌｔ３ＥＣＤの生産用）を、トランスフェクション／誘導の４８時間後及び７２時間後に回収する、又は細胞（５ＨＴ１Ｄの生産用）を、トランスフェクション／誘導の７２時間後に回収した。
【０１７０】
Ｆｌｔ３ＥＣＤの場合は、細胞上清の２０μｌのアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、Ｆｌｔ３の処理を、ウエスタンブロット法によって分析した。一次抗体は、マウス抗ｐｅｎｔａ−ｈｉｓタグ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とし、二次抗体は、ＨＲＰに結合した抗マウスＩｇＧ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）とした。
【０１７１】
５ＨＴ１Ｄの場合は、細胞を、１０００ｒｐｍでの遠心分離及びＰＢＳでの１回の洗浄によって収集した。細胞溶解物を、約１００万の細胞を５００μｌのＲＩＰＡ緩衝液と共に回転台で、４℃で３０分間インキュベートし、続いて１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして不溶性物質を廃棄することによって調製した。２０μｌのサンプルに、５μｌの５倍ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液を添加し、１０分間煮沸し、そして１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけた。ウエスタンブロット分析を、一次マウス抗Ｒｈｏ１Ｄ４抗体（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ）及びＨＲＰに結合した二次抗マウスＩｇＧを用いて行った。
【０１７２】
ｅｎｄｏＴ発現クローン及び２９３ＳＧｎＴＩ−／−細胞の初期分裂（＃＋８）の両方を、上昇するＣｏｎＡ濃度：０〜２２μｇ／ｍｌの存在下、３０，０００細胞／ウェルで２４ウェルプレートにプレーティングした。ＣｏｎＡは、分裂時に迅速に添加した。ＣｏｎＡを含まないウェルの細胞がコンフルエンスまで増殖したら、終点を顕微鏡で決定した。終点は、増殖を≦１０％コンフルエンスのウェルまで低下させたＣｏｎＡの濃度のときに位相差顕微鏡によって決定した。ｅｎｄｏＴ発現の長期安定性を評価するために、後期分裂細胞（＃＋２８）を、初期分裂細胞（＃＋８）と比較した。
【０１７３】
ＥｎｄｏＴ  ＣＤＳの検証
ＣＤＳの存在を検証するために、ゲノムＤＮＡを、製造者の取扱説明書に従って、Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｃｏｒｅ  ｋｉｔ  Ａ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞株及び２９３ＳＧｎＴＩ−／−細胞株の両方の約１００万の細胞から調製した。タッチダウンＰＣＲ反応を、各５０μｌの反応に対する約１０ｎｇのゲノムＤＮＡ及びプライマーＰＲ１１及びＰＲ１２を利用するＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）で行った。ＰＣＲサイクリングは、２サイクルごとに１℃で、６７℃〜６４℃に下げられ、６４℃で３０サイクル維持される（合計３６サイクルとなる）プライマーアニーリング温度を用いるタッチダウンプロトコルとした。ＰＣＲ産物を、製造者の取扱説明書に従って、ＤＮＡ−５００試薬キット（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を利用するＳｈｉｍａｄｚｕ  ＭｕｌｔｉＮＡマイクロチップＤＮＡ／ＲＮＡ電気泳動システムで分析した。
【０１７４】
ＥｎｄｏＴ融合タンパク質の検証
ＳＴ−ｅｎｄｏＴタンパク質の発現を、ウエスタンブロット法によって評価した。方法は、二次抗体がＩＲＤｙｅ  ８００ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ，ＵＳＡ）であった点を除いて、添付の図１に示されている方法と同じである。
【０１７５】
２９３Ｓ  ＧＭ−ＣＳＦのＤＳＡ−ＦＡＣＥ分析
Ｎ−結合オリゴ糖を、９６ウェルプレート膜プレートのウェルのＰＶＤＦ膜へのブロット時に精製タンパク質から調製し、上記６のＡＢＩ  ３１３０キャピラリーＤＮＡシーケンサーを用いる、レーザー誘導蛍光検出器付きキャピラリー電気泳動法（ＣＥ−ＬＩＦ）によって分析した。
【０１７６】
【表５】
0006553042.tif 000008
【０１７７】
【表６】
0006553042.tif 000009
【０１７８】
【表７】
0006553042.tif 000010
【０１７９】
【表８】
0006553042.tif 000011
【０１８０】
【表９】
0006553042.tif 000012
【０１８１】
【表１０】
0006553042.tif 000013
【０１８２】
【表１１】
0006553042.tif 000014
【０１８３】
【表１２】
0006553042.tif 000015
【０１８４】
参考文献
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Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｙ，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｍ，Ｎａｇａｎｏ  Ｍ，Ｙａｇｉ  Ｈ，Ｓａｓａｋａｗａ  Ｈ，Ｕｃｈｉｄａ  Ｋ，Ｓｈｉｔａｒａ  Ｋ，Ｋａｔｏ  Ｋ．Ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｃ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ１  ａｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２００６；１７６０（４）：６９３−７００．
番号付参考文献
１．Ｆｅｒｒａｒａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｇｏｌｇｉ  ｅｎｚｙｍｅ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  β１，４−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ＩＩＩ  ａｎｄ  Ｇｏｌｇｉ  α−ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ  ＩＩ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９３，８５１−８６１（２００６）．
２．Ｌｉ，Ｈ．＆ｄ’  Ａｎｊｏｕ，Ｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０，６７８−６８４（２００９）．
３．Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｒＨｕＥＰＯ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ：Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ３２，１１４６−１１５５（２００４）．
４．Ｒｅｅｖｅｓ，Ｐ．Ｊ．，Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ，Ｎ．，Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ，Ｒ．＆Ｋｈｏｒａｎａ，Ｈ．Ｇ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ：Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ａｎｄ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｉ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ＨＥＫ２９３Ｓ  ｓｔａｂｌｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．ＰＮＡＳ  ９９，１３４１９−１３４２４（２００２）．
５．Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｐ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｅｎｚｙｍｅ  ｅｎｄｏ−ｂｅｔａ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ  Ｈ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９，７５７７−７５８３（１９８４）．
６．Ｓｔａｌｓ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ａ  ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎ  Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．３０３，９−１７（２０１０）．
７．Ｐａｒｏｕｔｉｓ，Ｐ．，Ｔｏｕｒｅｔ，Ｎ．＆Ｇｒｉｎｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｔｈｅ  ｐＨ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  Ｐａｔｈｗａｙ：Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ，ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １９，２０７−２１５（２００４）．
８．Ｇｒｕｎｄｍａｎｎ，Ｕ．，Ｎｅｒｌｉｃｈ，Ｃ．，Ｒｅｉｎ，Ｔ．＆Ｚｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌ，Ｇ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ  ａｌｐｈａ−２，６−ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １８，６６７（１９９０）．
９．Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｆｌｔ３  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｂｌｏｏｄ  １１８，６０−６８（２０１１）．
１０．Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｐ．Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，３７７−３８３（１９８９）．
１１．Ｌｅｅ，Ａ．Ｓ．Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｏｎｏｐｈｏｒｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １２，２０−２３（１９８７）．
１２．Ｈａｍｂｌｉｎ，Ｍ．Ｗ．＆Ｍｅｔｃａｌｆ，Ｍ．Ａ．Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ５−ＨＴ１Ｄ−ｔｙｐｅ  ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４０，１４３−１４８（１９９１）．
１３．Ｌｅｅ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｆｏｒ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．ＰＮＡＳ  ８２，４３６０−４３６４（１９８５）．
１４．Ｍｏｅｓｓｎｅｒ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ＣＤ２０  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｉｒｅｃｔ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｂｌｏｏｄ  １１５，４３９３−４４０２（２０１０）．
１５．Ｆｏｒｎｏ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｎ−  ａｎｄ  Ｏ−ｌｉｎｋｅｄ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ｏｃｃｕｐａｎｃｙ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂｙ  ａ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７１，９０７−９１９（２００４）．
１６．Ｃｒｉｓｐｉｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄ−  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｘ−ｔｙｐｅ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＧｌｃＮＡｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｉ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １６，７４８−７５６（２００６）．
１７．Ｅｒｉｃｓｓｏｎ，Ｕ．Ｂ．，Ｈａｌｌｂｅｒｇ，Ｂ．Ｍ．，ＤｅＴｉｔｔａ，Ｇ．Ｔ．，Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．＆Ｎｏｒｄｌｕｎｄ，Ｐ．Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ−ｂａｓｅｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５７，２８９−２９８（２００６）．
１８．Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｏｎ  ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−３，ｏｒ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４０，３２３−３３４（１９８９）．
１９．Ｎａｌｌｅｔ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｙｃａｎ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｏｎ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ＨＥＫ−２９３Ｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｎｅｗ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９，４７１−４７６（２０１２）．
２０．Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ８，２２６−２３４（２００９）．
２１．Ｔｒａｄｔｒａｎｔｉｐ，Ｌ．，Ｒａｔｅｌａｄｅ，Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．＆Ｖｅｒｋｍａｎ，Ａ．Ｓ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｃｏｎｖｅｒｔｓ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｎｅｕｒｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｏｐｔｉｃａ  ａｎｔｉ−ａｑｕａｐｏｒｉｎ−４  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ７３，７７−８５（２０１３）．
２２．Ｎａｎｄａｋｕｍａｒ，Ｋ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｇｌｙｃａｎ−ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ  ＩｇＧ．ＰＮＡＳ（２０１３）．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１３０１４８０１１０
２３．Ａｌｌｈｏｒｎ，Ｍ．＆Ｃｏｌｌｉｎ，Ｍ．Ｓｕｇａｒ−ｆｒｅｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｔｈｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｏ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ？  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １１７３，６６４−６６９（２００９）．
２４．Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．＆ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ａ．Ｊ．Ａ  ｎｅｗ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ５  ＤＮＡ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２，４５６−４６７（１９７３）．
２５．ＭａｃＬｅａｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｋｙｌｉｎｅ：ａｎ  ｏｐｅｎ  ｓｏｕｒｃｅ  ｄｏｃｕｍｅｎｔ  ｅｄｉｔｏｒ  ｆｏｒ  ｃｒｅａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２６，９６６−９６８（２０１０）．
２６．Ｔａｄａ，Ｈ．，Ｓｈｉｈｏ，Ｏ．，Ｋｕｒｏｓｈｉｍａ，Ｋ．，Ｋｏｙａｍａ，Ｍ．＆Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，Ｋ．Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９３，１５７−１６５（１９８６）．
２７．Ｍａｇｉｓｔｒｅｌｌｉ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｏｂｕｓｔ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＦｃＲｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｅｎａｂｌｉｎｇ  ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ＩｇＧ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３７５，２０−２９（２０１２）．
２８．Ａｎｏｎｙｍｏｕｓ．Ｂｉｏｓｉｍｉｌａｒ，ｂｉｏｂｅｔｔｅｒ  ａｎｄ  ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＭＡｂｓ  ３，１０７−１１０（２０１１）．
方法のセクションに関する追加の参考文献
１．Ｆｅｎｔｅａｎｙ，Ｆ．Ｈ．＆Ｃｏｌｌｅｙ，Ｋ．Ｊ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｉｇｎａｌｓ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ａｌｐｈａ２，６−ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＳＴ６Ｇａｌ  Ｉ）ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｏｌｇｉ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０，５４２３−５４２９（２００５）．
２．Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｐ．Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，３７７−３８３（１９８９）．
３．Ｓｔａｌｓ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ａ  ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎ  Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．３０３，９−１７（２０１０）．
４．Ｇｒｕｎｄｍａｎｎ，Ｕ．，Ｎｅｒｌｉｃｈ，Ｃ．，Ｒｅｉｎ，Ｔ．＆Ｚｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌ，Ｇ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ  ａｌｐｈａ−２，６−ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １８，６６７（１９９０）．
５．Ｎａｇａｔａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｂｅｔａ  １，４  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｃＤＮＡｓ  ｔｈａｔ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＧＭ２  ａｎｄ  ＧＤ２  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１２０８２−１２０８９（１９９２）．
６．Ｌａｒｏｙ，Ｗ．，Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ，Ｒ．＆Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ，Ｎ．Ｇｌｙｃｏｍｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｎ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  １，３９７−４０５（２００６）．
７．Ｌｏｃｋｓｔｏｎｅ，Ｈ．Ｅ．Ｅｘｏｎ  ａｒｒａｙ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｐｏｗｅｒ  ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  Ｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｂｒｉｅｆ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １２，６３４−６４４（２０１１）．
８．Ｓｍｙｔｈ，Ｇ．Ｋ．Ｌｉｎｅａｒ  Ｍｏｄｅｌｓ  ａｎｄ  Ｅｍｐｉｒｉｃａｌ  Ｂａｙｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３，（２００４）．
９．Ｓｃｈａｅｇｇｅｒ，Ｈ．Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  １，１６−２２（２００６）．
１０．Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．）５７１−６０７（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００５）．
【図１】
0006553042.tif 000016
【図２】
0006553042.tif 000017
【図３】
0006553042.tif 000018
【図４】
0006553042.tif 000019
【図５】
0006553042.tif 000020
【図６】
0006553042.tif 000021
【図７−１】
0006553042.tif 000022
【図７−２】
0006553042.tif 000023
【図８】
0006553042.tif 000024
【図９】
0006553042.tif 000025
【図１０】
0006553042.tif 000026
【図１１】
0006553042.tif 000027
【図１２】
0006553042.tif 000028
【図１３】
0006553042.tif 000029
【図１４】
0006553042.tif 000030
【図１５】
0006553042.tif 000031
【図１６】
0006553042.tif 000032
【図１７】
0006553042.tif 000033
【図１８】
0006553042.tif 000034
【配列表】
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