(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光測定法用のセンサーチップの製造方法において、
透明支持体の表面に金属膜を形成する工程と、
下記式（１）で表される水溶性高分子化合物の水溶液で前記透明支持体の金属膜を被覆して前記水溶性高分子化合物を前記金属膜に結合させる工程と、
前記水溶性高分子化合物を金属膜に結合させる工程の前に、分子量分画を経る前記水溶性高分子化合物の調製工程と
を含み、前記水溶性高分子化合物が、還元剤の存在下で、アルデヒド基又はケトン基を有する多糖類Ｌ２と、アミノエタンチオール、１０−アミノデカンチオール、システイン、ホモシステインまたは４，６−ジアミノ−２−メルカプトピリミジンとを反応させて得られる、センサーチップの製造方法。
Ｘ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２・・・（１）
（Ｘ：金属に結合できる官能基、Ｌ１：ヘテロ原子で中断されてもよい炭化水素鎖、Ｌ２：水溶性高分子、Ｙ：水溶性高分子Ｌ２との結合点）
【請求項２】
前記蛍光測定がＳＰＦＳによる免疫蛍光測定であり、
前記透明支持体は、ＳＰＦＳによる免疫蛍光測定で用いられる蛍光標識物質を励起させる光を生成するためのプリズムである、請求項１に記載のセンサーチップの製造方法。
【請求項３】
前記結合点（Ｙ）における化学結合が−ＣＯ−ＨＮ−、又は、Ｃ−Ｎ−Ｃである、請求項１または２に記載のセンサーチップの製造方法。
【請求項４】
前記炭化水素鎖Ｌ１と前記多糖類Ｌ２との結合点Ｙの化学結合が前記多糖類Ｌ２の還元末端由来である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のセンサーチップの製造方法。
【請求項５】
前記多糖類Ｌ２の重量平均分子量が１０００〜５００００００である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のセンサーチップの製造方法。
【請求項６】
前記多糖類Ｌ２がカルボキシメチルデキストランである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のセンサーチップの製造方法。
【請求項７】
前記炭化水素鎖Ｌ１は、炭素数２〜１０の直鎖状又は分岐鎖を有するアルキル鎖またはアルキレン鎖である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のセンサーチップの製造方法。
【請求項８】
前記透明支持体がアクリル樹脂製である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のセンサーチップの製造方法。
【請求項９】
前記官能基が、チオール基（−ＳＨ）、テルル基（−ＴｅＨ）、セレノール基（−ＳｅＨ）、対称又は非対称ジセレニド基（−ＳｅＳｅ−）、対称又は非対称ジスルフィド基（−ＳＳ−）、チオイソシアニド基（−ＳＣＮ）、イソニトリル基（−ＮＣ）、３価リン酸基（−ＰＯ42-）、ジスルフィド基（−ＳＳＲＺ）、スルフィド基（−ＳＲＺ）、ジセレニド基（−ＳｅＳｅＲＹ）、セレニド基（−ＳｅＲＺ）、キサンテート基（−ＯＣＳＳ−）、ニトロ基（−ＮＯ2）、チオカルバメート基（−ＳＣＨ）、ホスフィン基（−ＰＲ2）、チオ酸基又はジチオ酸基（−ＣＯＳＨ、−ＣＳＳＨ）、カルボン酸（−ＣООＨ）およびシラン基（−ＳｉＨ3）からなる群から選択される一つ又はそれ以上である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のセンサーチップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法〔ＳＰＦＳ；Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ〕等の蛍光測定法用のセンサーチップの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ＳＰＦＳ用のセンサーチップの製造方法としては、多段階の工程を必要とする。
特に、センサーチップ用の基体（透明支持体）に抗体等のリガンドを固定するために、リガンドの足場として、立体制御された三次元構造を形成するが、この際に有機溶剤を必須とする（例えば、特許文献１参照）。【０００３】
特許文献１に記載されているセンサーチップの製造方法では、ガラス製の基体の表面に形成した金属膜に対して、バリアー層（１６−メルカプトヘキサデカノールの層）を形成し、このバリアー層を形成する際にＤＭＦ等の有機溶剤を使用している。さらに、バリアー層中のヒドロキシル基をエポキシ活性化するために、バリアー層に対してエピクロロヒドリン溶液による処理を行い、このバリアー層に対してリガンドの足場となるデキストラン（ヒドロゲル）を固定している。なお、ヒドロゲルとは、ヒドロキシル等の反応性基を有する、抗体を固定化するための糖鎖等の水溶性高分子を意味する。【０００４】
このようにセンサーチップの製造に有機溶剤を用いる場合、センサーチップ用の基体に有機溶剤耐性の高い材料を用いる必要があり、材料の選択が非常に制約されていた。
そこで、有機溶剤の使用量を少なくして材料選択の自由度を向上させるセンサーチップの製造方法として、金属膜上に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を形成し、この自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）に対して、ヒドロゲルを固定化することが知られている（例えば、特許文献２参照）。【０００５】
しかしながら、特許文献２に記載されているセンサーチップの製造方法では、金属膜に対して自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を形成し、この自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）に対してヒドロゲルを固定することから、ヒドロゲルを基板に固定するまでの工程が多段階であり、センサーチップを製造する際の基板に対する処理時間も長くなって、センサーチップの製造コストが高くなるとともに、金属膜に対して立体制御された三次元構造を安定的に形成できない場合があり、リガンドの足場の高さ制御やリガンドの固定を均一かつ一様に行うことが困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表平４−５０１６０５号公報
【特許文献２】特開２００７−２５６２６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであって、センサーチップの基板（特に誘電体部材）の材料選択の自由度を向上させることができるとともに、リガンドを固定するためのヒドロゲルをセンサーチップの基板に固定するまでの工程数を減少させて、より高生産性のセンサーチップの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述した目的を達成するために、本発明の一側面を反映した蛍光測定用のセンサーチップの製造方法は、
透明支持体の表面に金属膜を形成する工程と、
下記式（１）で表される水溶性高分子の水溶液で前記透明支持体の金属膜を被覆して前記水溶性高分子を前記金属膜に結合させる工程とを含む、センサーチップの製造方法である。
Ｘ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２・・・（１）
（Ｘ：金属に結合できる官能基、Ｌ１：ヘテロ原子で中断されてもよい炭化水素鎖、Ｌ２：水溶性高分子、Ｙ：水溶性高分子Ｌ２との結合点）。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、センサーチップの基板（特に誘電体部材）の材料選択の自由度を向上させることができるとともに、リガンドを固定するためのヒドロゲルをセンサーチップの基板に固定するまでの工程数を減少させて、より高生産性のセンサーチップの製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明に係るセンサーチップの製造方法の工程の流れを示す図である。（Ａ）は、透明支持体に金属膜を形成する工程を示す図である。（Ｂ）及び（Ｃ）は、糖鎖化合物の水溶液で前記透明支持体の金属膜を被覆する工程を示す模式図である。
【図２】図２は、図１で固定した糖鎖化合物の多糖鎖にリガンドを固定して完成したセンサーチップを示す模式図である。
【図３】図３は、図２のセンサーチップをＳＰＦＳ装置にセットして実際に免疫蛍光測定を行っている状態を示す図である。
【図４】図４は、従来技術に係るセンサーチップの製造方法の工程の流れを示す模式図である。（Ａ）は、透明支持体に金属膜を形成する工程を示す図である。（Ｂ）は、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を形成する工程を示す模式図である。（Ｃ）及び（Ｄ）は、金属膜に固定した自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）に対して多糖類を固定する工程を示す模式図である。
【図５】図５は、図４のヒドロゲルにリガンドを固定して完成した従来技術に係るセンサーチップを示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明に係る蛍光測定用のセンサーチップの製造方法について、図１〜図５を参照しながら説明する。
本発明に係るセンサーチップの製造方法は、透明支持体２の表面に金属膜３を形成する工程と、下記式（１）で表される糖鎖化合物の水溶液で前記透明支持体２の金属膜３を被覆して前記糖鎖化合物を前記金属膜３に結合させる工程とを含む（図１（Ａ）〜（Ｃ）参照）。
Ｘ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２・・・（１）
（Ｘ：金属膜３に結合できる官能基、Ｌ１：ヘテロ原子で中断されてもよい炭化水素鎖、Ｌ２：多糖類（水溶性高分子）、Ｙ：多糖類Ｌ２との結合点、）。
ここで、前記水溶性高分子化合物を金属膜に結合させる工程の前に、分子量分画を経る前記水溶性高分子化合物の調製工程を含むことが望ましい。
また、前記蛍光測定がＳＰＦＳによる免疫蛍光測定であり、前記透明支持体は、ＳＰＦＳによる免疫蛍光測定で用いられる蛍光標識物質を励起させる光を生成するためのプリズムであることが望ましい。さらに、前記透明支持体がアクリル樹脂製であることが望ましい。
前記結合点（Ｙ）における化学結合は、−ＣＯ−ＨＮ−、又は、Ｃ−Ｎ−Ｃであることが望ましく、前記水溶性高分子Ｌ２は多糖類であることが望ましい。
また、前記炭化水素鎖Ｌ１と前記多糖類Ｌ２との結合点Ｙの化学結合は前記多糖類Ｌ２の還元末端由来であることが望ましい。前記多糖類Ｌ２の重量平均分子量が１０００〜５００００００であることが望ましい。また、前記多糖類Ｌ２がカルボキシメチルデキストランであることが望ましい。前記炭化水素鎖Ｌ１は、炭素数２〜１０の直鎖状又は分岐鎖を有するアルキル鎖またはアルキレン鎖であることが望ましい。
前記官能基（Ｘ）は、チオール基（−ＳＨ）、テルル基（−ＴｅＨ）、セレノール基（−ＳｅＨ）、対称又は非対称ジセレニド基（−ＳｅＳｅ−）、対称又は非対称ジスルフィド基（−ＳＳ−）、チオイソシアニド基（−ＳＣＮ）、イソニトリル基（−ＮＣ）、３価リン酸基（−ＰＯ42-）、ジスルフィド基（−ＳＳＲＺ）、スルフィド基（−ＳＲＺ）、ジセレニド基（−ＳｅＳｅＲＹ）、セレニド基（−ＳｅＲＺ）、キサンテート基（−ＯＣＳＳ−）、ニトロ基（−ＮＯ2）、チオカルバメート基（−ＳＣＨ）、ホスフィン基（−ＰＲ2）、チオ酸基又はジチオ酸基（−ＣＯＳＨ、−ＣＳＳＨ）、カルボン酸（−ＣООＨ）およびシラン基（−ＳｉＨ3）からなる群から選択される一つ又はそれ以上である、ことが望ましい。
【００１２】
＜金属膜形成工程＞
本発明に係るセンサーチップの製造方法は、上述したように、透明支持体２の表面に金属膜３を形成する工程を含む（図１（Ａ）参照）。この金属膜３は、例えば後述するＳＰＦＳ装置の光源から透明支持体２を介して照射された光を受けて表面プラズモン励起を生じ、電場を発生させるものであり、ＳＰＦＳ等による蛍光測定法に用いられる蛍光標識色素の発光をもたらす役割を有する（図３参照）。
【００１３】
（透明支持体）
透明支持体２はセンサーチップ１の構造を支持するために用いられる。透明支持体２は、図３に示すように、金属膜３形成用の平面部４と、プリズム部５等とを有している。この平面部４とプリズム部５とは別体であっても一体であってもよい。
【００１４】
上述したように、本発明に係るセンサーチップの製造方法によれば、有機溶剤を使用することなく多糖類Ｌ２を金属膜３に固定させることができることから、透明支持体２の材質として、ガラス製のものに加えて、有機溶剤により腐食される樹脂製のものも用いることができる。
【００１５】
よって、透明支持体２としては、ガラス製のものに加え、アクリル系、ポリカーボネート（ＰＣ），ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などの光学樹脂製のものを用いることができる。透明支持体２としては、さらにセラミックスなどの各種の無機物、天然ポリマー、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）、二酸化チタン（ＴｉＯ2）を含むものも用いることができる。
【００１６】
透明支持体２の屈折率〔ｎd〕は、好ましくは１．４０〜２．２０である。また、透明支持体２の平面部４（図３参照）の厚さは、好ましくは０．０１〜１０ｍｍ、より好ましくは０．５〜５ｍｍである。
【００１７】
透明支持体２の表面は、金属膜３を形成する前に酸および／またはプラズマにより洗浄することが好ましい。酸による洗浄処理としては、０．０００１〜１Ｎの塩酸中に、１〜３時間、透明支持体２を浸漬することが好ましい。プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナー（ヤマト科学（株）製の「ＰＤＣ２００」）中に、０．１〜３０分間、透明支持体２を浸漬させる方法が挙げられる。
【００１８】
透明支持体２の平面部４の大きさ（縦×横）は、蛍光測定に悪影響を与えない限り、特に限定されない。
透明支持体２の平面部４の法線方向に沿ったプリズム部５の断面の形状として、三角形（図３参照）、半円形状、楕円形状とすることができる。プリズム部５は、ＳＰＦＳ装置の光源７からの励起光をプリズム部５の内部に入射させる入射面５ａと、透明支持体２の平面部４上の金属膜３の裏面で反射した前記励起光をプリズム部５の外部に出射する出射面５ｂとを有する（図３参照）。
【００１９】
（金属膜）
金属膜３は、全反射条件でプリズム部５の内部に入射した照射光が金属膜３と平面部４との界面で全反射することにより生じるエバネッセント波（増強電場）を増幅するための部材である。
【００２０】
透明支持体２の表面に形成される金属膜３としては、金，銀，アルミニウム，銅および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなることが好ましく、金からなることがより好ましい。これらの金属は、その合金（アロイ）の形態であってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きくなることから好適である。
【００２１】
透明支持体２上に金属膜３を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法，蒸着法（抵抗加熱蒸着法，電子線蒸着法等），電解メッキ，無電解メッキ法などが挙げられる。金属膜３の形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法により金属膜３を形成することが好ましい。
【００２２】
金属膜３の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ，銀：５〜５００ｎｍ，アルミニウム：５〜５００ｎｍ，銅：５〜５００ｎｍ，白金：５〜５００ｎｍ，およびそれらの合金：５〜５００ｎｍが好ましい。
【００２３】
電場増強効果の観点から、金属膜３の厚さとして、金：２０〜７０ｎｍ，銀：２０〜７０ｎｍ，アルミニウム：１０〜５０ｎｍ，銅：２０〜７０ｎｍ，白金：２０〜７０ｎｍおよびそれらの合金：１０〜７０ｎｍがより好ましい。
【００２４】
金属膜３の厚さが上記範囲内であれば、表面プラズモンを好適に発生させることができる。なお、金属膜３の大きさ（縦×横）は、平面部３と同様に、蛍光測定に悪影響を与えない限り、特に限定されない。
【００２５】
＜被覆工程＞
被覆工程は、下記式（１）で表される糖鎖化合物（下記式（１）参照）の水溶液で前記透明支持体２上の金属膜３を被覆して前記糖鎖化合物を前記金属膜３に結合させる工程である（図１参照）。
【００２６】
（糖鎖化合物）
Ｘ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２・・・（１）
（Ｘ：金属膜３に結合できる官能基、Ｌ１：ヘテロ原子で中断されてもよい炭化水素鎖、Ｌ２：多糖類、Ｙ：多糖類Ｌ２との結合点）
【００２７】
（官能基Ｘ）
式（１）の官能基Ｘは、金属膜３に結合することができる基を示す。官能基Ｘとしては、例えば、
・チオール基（−ＳＨ）、テルル基（−ＴｅＨ）、セレノール基（−ＳｅＨ）、
・対称又は非対称ジセレニド基（−ＳｅＳｅ−）、対称又は非対称ジスルフィド基（−ＳＳ−）、
・チオイソシアニド基（−ＳＣＮ）、イソニトリル基（−ＮＣ）、
・３価リン酸基（−ＰＯ42-）、
・スルフィド基（−ＳＲＺ）、ジスルフィド基（−ＳＳＲＺ）、セレニド基（−ＳｅＲＺ）、ジセレニド基（−ＳｅＳｅＲＹ）、
・キサンテート基（−ＯＣＳＳ−）、
・ニトロ基（−ＮＯ2）、
・チオカルバメート基（−ＳＣＨ）、
・ホスフィン基（−ＰＲ2）、
・チオ酸基又はジチオ酸基（−ＣＯＳＨ、−ＣＳＳＨ）、
・カルボキシル基（−ＣООＨ）、
・シラン基（−ＳｉＨ3）等が好ましく用いられる。
【００２８】
なお、官能基Ｘの一部において、Ｒはアルキル基を示し、官能基Ｚは、ヒドロキシル基、カルビキシル基、アミノ基、アルデヒド基、ヒドラジド基、カルビニル基、エポキシ基およびビニル基のいずれかである。
【００２９】
（炭化水素鎖Ｌ１）
式（１）において、Ｌ１は連結基を示し、好ましくは、場合によりヘテロ原子により中断されてもよい炭化水素鎖である。この炭化水素鎖Ｌ１は、分岐鎖であっても枝分かれしていない直鎖であってもよく、場合により二重及び又は三重結合を含んでいてもよい。また、カルボキシル基等を含んでいてもよい。
【００３０】
鎖の長さは通常、２炭素原子以上であり、１０炭素原子以下であることが好ましく、９炭素原子以下であることがさらに好ましい。炭化水素鎖Ｌ１の炭化水素数は、４〜１０炭素原子がさらに好ましく、４〜８炭素原子が特に好ましい。炭化水素は場合により過弗素化されることができる。
【００３１】
アルキル鎖長が長いほど、形成された糖鎖化合物の層の安定性は向上する。炭化水素長が長いほど糖鎖化合物が金属膜３から外れにくく、安定した糖鎖Ｌ２の層（固相化層）を形成される。
【００３２】
（多糖類Ｌ２との結合点Ｙ）
式（１）において、結合点Ｙは、炭化水素鎖Ｌ１と多糖類Ｌ２との結合点を示す。炭化水素鎖Ｌ１と多糖類Ｌ２との結合点Ｙとしては、特に限定されないが、官能基Ｘと異なる反応基であることが好ましい。結合点Ｙの例としては、エーテル結合、エステル結合、アミド結合、ジスルフィド結合などの共有結合の他、アビジン−ビオチン相互作用による結合なども用いることができる。
【００３３】
これにより、金属膜３の上に、金属膜３から直鎖状に延びる糖鎖を形成することができる（図１（Ｂ）および（Ｃ）参照）。この結合点Ｙとして、多糖類Ｌ２の糖鎖還元末端を用いて前記炭化水素鎖Ｌ１と結合されていることが望ましい。例えば還元的アミノ化を用いることで形成することができる。
【００３４】
（多糖類Ｌ２）
多糖類Ｌ２は、後述する一次捕捉分子としてのリガンド６を固定するためのもので、カルボキシル基を有していることが望ましい。
【００３５】
多糖類Ｌ２としては、天然植物からの抽出物、微生物発酵の生産物、酵素による合成物、または化学合成物の何れであってもよく、具体的には、グルコース，カルボキシメチル化グルコース，ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、デルマタン酸硫酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、セロウロン酸、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルデンプン、それぞれに包含される単量体からなる群より選択される少なくとも１種の単量体から構成される高分子を含むことが好ましく、デキストランおよびデキストラン誘導体などの親水性の高分子を含むことがより好ましく、カルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕などのデキストランが生体親和性、非特異的な吸着反応の抑制性、高い親水性の観点から特に好ましい。
【００３６】
その他、上記多糖類以外にも、水溶性の高分子である、ゼラチン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ポリマー、エチレンイミンポリマー、ポリエチレンオキサイド、ポリアクリルアミドやこれら誘導体を用いることができる。しかし、これらに限定されるものではない。
【００３７】
本発明に係るセンサーチップの製造方法に使用することができる多糖類Ｌ２の重量平均分子量に特に制限はないが、重量平均分子量が１０００〜５００００００であることが好ましく、重量平均分子量が１００００〜２００００００であることがより好ましく、重量平均分子量が１０００００〜１００００００であることがさらに好ましく、重量平均分子量が５０００００であることが最も好ましい。
【００３８】
これは、多糖類Ｌ２の重量平均分子量が１０００未満の場合には、多糖類Ｌ２に対してリガンド６を固定できる量が減少するからである（リガンド６については図２参照）。逆に、多糖類Ｌ２の重量平均分子量が５００００００を超える場合には、糖鎖化合物の溶液粘度が不必要に高くなって、その取り扱いが困難となる。
【００３９】
特に、多糖類Ｌ２がＣＭＤの場合には、重量平均分子量４０００〜１００００００のものが好ましい。
図２に示すように、複数の糖鎖化合物が金属膜３に固定されて多糖類Ｌ２同士が隣接することで多糖類Ｌ２の層（固相化層）が形成される。この固相化層は、その密度として２ｎｇ/ｍｍ2未満を有することが好ましい。固相化層の密度は、用いる多糖類Ｌ２の種類や分子量、糖鎖の分岐鎖の分岐の程度等に応じて適宜調整することができる。これにより、リガンド６の密度も調整することができる。
【００４０】
固相化層を構成する多糖類Ｌ２が２ｎｇ/ｍｍ2未満の範囲内の密度であれば、センサーチップ１をＳＰＦＳによる免疫蛍光測定に用いた場合に、アッセイシグナルが安定化し、かつ増加するため好適である。
【００４１】
固相化層の平均膜厚は、３ｎｍ〜８０ｎｍであることが好ましい。この膜厚は原子間力顕微鏡〔ＡＦＭ〕などを用いて測定することができる。固相化層の平均膜厚がこのような範囲内であると、センサーチップ１をＳＰＦＳによる免疫蛍光測定に用いた場合に、アッセイシグナルが安定化し、かつ増加するため好適である。
【００４２】
（糖鎖化合物の製造）
以下、糖鎖化合物（Ｘ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２）の製造について具体的に説明する。糖鎖化合物（Ｘ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２）の製造は、還元剤の存在化でアルデヒド基又はケトン基を有する多糖類Ｌ２と、官能基Ｘとアミン基を有するアミンとを反応させることで作成することができる。
【００４３】
（官能基Ｘを有するアミン）
官能基Ｘを有するアミンは、分岐鎖のある又はない、アルキル鎖またはアルキレン鎖を介してチオール基とアミノ基が連結している化合物であり、例えば、アミノエタンチオール、１０−アミノデカンチオール、システイン、ホモシステイン、４，６−ジアミノー２−メルカプトピリミジンなどの化合物を用いることができる。これらの化合物は入手が容易であるが、別途合成によっても得ることができる。
【００４４】
（還元的アミノ化）
還元的アミノ化とは、アルデヒド（又はケトン）とアミンの脱水縮合により調製したイミンを還元する反応で、このプロセスにより、官能基Ｘを有するアミンはアルキル化される。
【００４５】
アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基とアミノ基との間で起こる糖鎖と官能基Ｘを有するアミンとの反応は、シッフ塩基が生成する還元的アミノ化である。次いでその反応後に、少なくとも一つの還元剤でこの塩基を還元することにより、多糖類Ｌ２とアミンとの間に安定な結合点Ｙを得ることができる。好ましくは、還元的アミノ化反応は、少なくとも一つの還元剤の存在下で行なわれる。
【００４６】
上記還元剤としては、２−ピコリン−ボラン、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ3ＣＮ）、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）3、ＢＨ3−Ｐｙ、水素化ホウ素ナトリウム、有機ボラン錯体、例えば４−(ジメチルアミノ)ピリジンボラン錯体、Ｎ−エチルジイソプロピルアミンボラン錯体、Ｎ−エチルモルホリンボラン錯体、Ｎ−メチルモルホリンボラン錯体、Ｎ−フェニルモルホリンボラン錯体、ルチジンボラン錯体、トリエチルアミンボラン錯体、またはトリメチルアミンボラン錯体等を用いることができる。
【００４７】
一方、２-ピコリン-ボランは、（１）熱に対して安定（１４０℃）、（２）無水条件は必要無く、溶媒に水を用いることも可能、（３）室温で長期間保存することが可能であるので、２-ピコリン-ボランを用いることが最も好ましい。
【００４８】
（ｐＨ緩衝液）
還元剤に２−ピコリンボランを用いる場合、ｐＨ緩衝液にはｐＨ４〜７の間にｐＨ緩衝能を有する水性の緩衝液であれば、特に限定されない。酢酸緩衝液の場合、ｐＨ３．６〜５．６の間にｐＨ緩衝能を有しているので特に好適である。その他にも、クエン酸緩衝液（緩衝ｐＨ＝３．０〜６．２）、ＭＥＳ（緩衝ｐＨ＝５．５〜７．０）、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（緩衝ｐＨ＝５．５〜７．３）、ＡＤＡ（緩衝ｐＨ＝５．８〜７．４）、フタル酸（緩衝ｐＨ＝４．４〜６．４）、リン酸緩衝液（緩衝ｐＨ＝５．８〜８．０）、クエン酸‐リン酸緩衝液（緩衝ｐＨ＝２．６〜７．０）を用いることができる。
【００４９】
上記還元的アミノ化反応において、ｐＨ範囲を特に４≦ｐＨ＜７とすることにより、官能基Ｘを有するアミンのアミノ基と糖鎖のアルデヒド基とを好適に反応させることができる。
【００５０】
上記還元的アミノ化反応は、好ましくは０〜１００℃、より好ましくは０〜４０℃、より好ましくは０〜２５℃、特に４〜２１℃（ただしとりわけ好ましくは０〜２１℃）の温度で行なわれる。反応時間は好ましくは０．５〜７２時間、より好ましくは２〜４８時間、特に好ましくは４〜７時間の範囲である。反応の溶媒としては水性媒質が好ましい。
【００５１】
（分子量分画）
糖鎖化合物Ｌ２についてゲル濾過等の分子量分画を行うことで金属膜３の表面に固定される糖鎖の丈（金属膜３の表面の法線方向の高さ）が金属膜３の平面方向で一様となり、糖鎖にリガンド６を固定した状態で金属膜３の表面からのリガンド６の存在位置範囲（空間）を一定範囲に限定させることができ、その結果、励起光による蛍光標識物質の励起の程度もリガンド６，・・・間で一様となり、得られる結果の精度を上昇させることができる。
【００５２】
回収する糖鎖化合物の重量平均分子量は、多糖類Ｌ２の好適な範囲と同様の理由から、重量平均分子量１０００〜５００００００の範囲で設定することが好ましい。
特に多糖類Ｌ２がカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）の場合、糖鎖化合物の重量平均分子量が５０００００のものが特に好ましい。分子量５０００００のＣＭＤであれば、隣接するＣＭＤが互いにクーロン斥力で好適に反発して凝集しにくく、糖鎖化合物が金属膜３の平面方向で精緻に並びやすくなるからである。
【００５３】
（被覆工程）
糖鎖化合物を金属膜３へ固定する被覆工程は、以下の方法により行うことができる。
ｐＨ４〜１０の緩衝液（イオン強度１〜１０００ｍＭ）に対して、終濃度０．１〜１０００ｍｇ／ｍｌとなるように糖鎖化合物を溶解する。この水溶液に金属膜の形成工程後の金属膜３を被覆した透明支持体２を浸漬することで作成できる。また、官能基Ｘを有する他の化合物を同時に添加したり、前後に添加しても良い。
【００５４】
（緩衝液）
上記緩衝液は、官能基Ｘの金属膜への固定を妨げないものであれば良い。例えば、ＰＢＳ、ＴＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＵｌｔｒａＳａｌｉｎｅ、ベローナル緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液を使用することができる。
【００５５】
（洗浄工程）
洗浄工程としては、上記緩衝液と同じ溶媒または緩衝液に、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００などの界面活性剤を好ましくは０．００００１〜１質量％含有するよう溶解させたもの、または塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの塩を１０〜５００ｍＭ含有させたものが望ましい。あるいは、低ｐＨの緩衝液、例えば、１０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ ＨＣｌでｐＨが１．５〜４．０のものを洗浄液として用いてもよい。洗浄工程（洗浄液による洗浄時間）は、通常０．５〜１８０分間、好ましくは５〜６０分間である。
【００５６】
（リガンド固定工程）
「リガンド」とは、検体中に含有されるアナライトを特異的に認識し（または、認識され）結合し得る「分子」または「分子断片」をいう。リガンド６は、上記固相化層の中および外面に固定化、すなわち固相化層の３次元構造の中に分散して固定化される（図２および図３参照）。
【００５７】
「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，ＰＮＡ（ペプチド核酸）等，またはヌクレオシド，ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子），タンパク質（ポリペプチド，オリゴペプチド等），アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。），糖質（オリゴ糖，多糖類，糖鎖等），脂質，またはこれらの修飾分子，複合体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５８】
「タンパク質」としては、例えば、抗体などが挙げられ、具体的には、抗αフェトプロテイン〔ＡＦＰ〕モノクローナル抗体（（株）日本医学臨床検査研究所などから入手可能），抗ガン胎児性抗原〔ＣＥＡ〕モノクローナル抗体，抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体，抗ＰＳＡモノクローナル抗体などが挙げられる。
【００５９】
なお、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体，遺伝子組換えにより得られる抗体，および抗体断片を包含する。
リガンド６の固定化方法としては、金属膜３に固定された糖鎖化合物中に存在する、反応性官能基を有する多糖類Ｌ２（ＣＭＤ等）が有するカルボキシル基を、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩〔ＥＤＣ〕など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕とにより活性エステル化し、このように活性エステル化したカルボキシル基と、リガンド６が有するアミノ基とを脱水反応させて固定化させる方法や、上記炭化水素鎖Ｌ１が有するカルボキシル基を、上述のようにしてリガンド６が有するアミノ基と脱水反応させ固定化させる方法などが挙げられる。
【００６０】
上記固相化層に固定化されたリガンド６の密度は、１フェムトｍｏｌ/ｃｍ2以上１ナノｍｏｌ/ｃｍ2以下が好ましく、１０フェムトｍｏｌ/ｃｍ2以上１００ピコｍｏｌ/ｃｍ2以下がより好ましい。リガンド６の密度が上記範囲内であると、信号強度が大きくなるため好適である。
【００６１】
（非特異的吸着防止処理工程）
検体等がセンサーチップ１に非特異的に吸着することを防止するため、上記リガンド６を固定化させた後に、センサーチップ１の表面を牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕等のブロッキング剤により処理することが好ましい。
【００６２】
（センサーチップ保管方法）
製造したセンサーチップ１の作成後の保存に関しては、速やかに窒素雰囲気等で封入して、必要時に取り出して用いることが好ましい。窒素雰囲気での封入方法としては、水分透過率１０-2ｇ／ｍ2・４０℃・９０％以下の防湿性能を有する防湿フィルム中に好適に保管することができる。
【００６３】
＜ＳＰＦＳ装置＞
本発明に用いることができるＳＰＦＳ装置は、その一方の表面に一次抗体を固定化したセンサーチップ１を装填可能な装置であることが好ましい。
【００６４】
このような装置としては、上記センサーチップ１を装填可能とした構成以外に、例えば、図３に示すように、レーザ光の光源７、プリズム部５、平面部４、ＳＰＦＳにおける検出を行う受光手段８、光検出手段９および光検特性演算装置１０等を含むものとし、検体液，洗浄液または標識抗体液などを取り扱う際に、上記センサーチップ１と組み合った送液系を有することが好ましい。
【００６５】
送液系としては、例えば、送液ポンプと連結したマイクロ流路デバイスなどでもよい（不図示）。光検出手段９に使用するセンサとしては、イメージセンサを用いることが好ましく、ＣＣＤイメージセンサやフォトマル等を用いることができる（不図示）。
【００６６】
また、表面プラズモン共鳴〔ＳＰＲ〕検出部、すなわちＳＰＲ専用の受光センサとしてのフォトダイオード、ＳＰＲおよびＳＰＦＳの最適角度を調製するための角度可変部（サーボモータで全反射減衰〔ＡＴＲ〕条件を求めるためにフォトダイオードと光源とを同期して、４５〜８５°の角度変更を可能とする。分解能は０．０１°以上が好ましい。）、ＳＰＦＳ検出部に入力された情報を処理するためのコンピュータなども含んでもよい。
【００６７】
なお、レーザ光の光源７、受光手段８、光検出手段９および光検特性演算装置１０は、上記の態様以外にも従来公知の種々の態様を用いることができる。
送液するためのポンプとしては、例えば、送液が微量な場合に好適なマイクロポンプ，循環送液には適用できないが送り精度が高く脈動が少ないシリンジポンプ，微量送液には不向きな場合があるが簡易で取り扱い性に優れるがチューブポンプなどが挙げられる。送液手段としては上記のポンプに限定されることなく、目的や用途に応じて種々の手段を適宜選択して用いることができる。
【００６８】
以下、本発明に係るセンサーチップの製造方法による作用・効果について説明する。
（１）炭化水素鎖Ｌ１と多糖類Ｌ２の分子とをあらかじめ結合させ、官能基Ｘを有する糖鎖化合物を形成しておき、この糖鎖化合物を基板等の透明支持体２の金属膜３の表面に対して一段階で結合させるものである。
【００６９】
よって、従来法のように、透明支持体２の金属膜３の表面に対して、まず自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を結合させ、次に、この自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）に対して多糖類等のヒドロゲルを結合させるという多段階的な結合をさせずに済む。
【００７０】
その結果、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）に対してヒドロゲルを結合させる工程を省略でき、この際に必要となる有機溶剤が不要となることから、有機溶剤不耐性の材料であってもセンサーチップ１の透明支持体２の材料として選択できるようになり、材料選択の自由度が向上する。
【００７１】
また、ＳＡＭを介して糖鎖を金属膜２に固定する従来法の場合、「密」に自己組織化したＳＡＭに対して糖鎖を固定することとなり、固定する糖鎖分子も「密」に固定されることとなり、糖鎖分子同士がＳＡＭ上で絡まる等の悪影響を受けるが（図４および図５参照）、本発明に係るセンサーチップの製造方法では、糖鎖化合物がＳＡＭのように自己組織化することはなく、その結果、ＳＡＭを形成して糖鎖を固定する従来法と比較して、金属膜２に対して、糖鎖が不必要に「密」に結合することがなく、上記問題が発生することがない（図１と図４とを対比して参照）。
【００７２】
また、多段階に結合させる従来法の場合、図４（Ｃ）および（Ｄ）に示すように、金属膜３の表面で自己組織化して形成されたＳＡＭに対して多糖類Ｌ２の分子がそれぞれ結合することとなるため、一対多の結合がランダムに生じてしまい、構造的に不均一となってしまうが、本発明に係るセンサーチップの製造方法によれば、あらかじめ官能基Ｘを有する糖鎖化合物を作成し、これを金属膜に作用させて金属膜に結合させるため、このような問題も生じることがない（図１と図４とを対比して参照）。
【００７３】
さらに、多糖類Ｌ２を透明支持体２に固定するまでの工程数を減らすことができるため、抗体等のリガンド６を多糖類Ｌ２に固定するまでの工程数も減り、高い生産性が得られるセンサーチップの製造方法を提供することができる。
【００７４】
（２）糖鎖化合物を金属膜３に結合させる工程の前に、分子量分画を経る糖鎖化合物の調製工程を含むこととすれば、糖鎖化合物の分子量を極力一様とさせることができる。この結果、金属膜３の表面に固定される糖鎖の丈（金属膜３の表面の法線方向の高さ）が金属膜３の平面方向で一様となり、糖鎖にリガンド６を固定した状態で金属膜３の表面からのリガンド６の存在位置範囲（空間）を一定範囲に限定させることができ、その結果、励起光による蛍光標識物質の励起の程度もリガンド６，・・・間で一様となり、得られる結果の精度を上昇させることができる。
【００７５】
（３）上述したように本発明によりセンサーチップの製造に有機溶媒が不要となることから、センサーチップの蛍光測定としてＳＰＦＳ免疫蛍光測定を行い、センサーチップの透明支持体がＳＰＦＳ免疫蛍光測定で用いられる蛍光標識物質を励起させる光を生成するためのプリズムである場合、有機溶媒によるプリズムの損傷や、これによる高感度のＳＰＦＳ免疫蛍光測定に悪影響が及ぶことがない。
【００７６】
（４）前記結合点（Ｙ）における化学結合がアミド結合（−ＣＯ−ＨＮ−）、又は、Ｃ−Ｎ−Ｃであることで、糖鎖化合物の反応基Ｘと異なる結合となるので、反応基Ｘに纏わる化学反応の影響を受けにくいものとなる。
【００７７】
（５）上述したように、透明支持体２が有機溶剤に曝されないことから、透明支持体２が、ＳＰＦＳによる免疫蛍光測定で用いられるアナライト検出用の蛍光標識物質を励起させる励起光を生成するためのプリズムである場合、透明支持体２のプリズム部５の平面部４、入射面５ａおよび出射面５ｂ（図３参照）が有機溶媒で腐食されず、透明支持体２を通過する励起光に悪影響を与えることがない。
【００７８】
（６）糖鎖化合物の炭化水素鎖Ｌ１と多糖類Ｌ２との結合点Ｙの化学結合が前記糖鎖化合物の多糖類Ｌ２の還元末端由来であることで、金属膜３に対して多糖類Ｌ２を金属膜３から離間する方向に直線的に固定することができる（図２参照）。この結果、多糖類Ｌ２の層が均一な構造をとりやすいものとなる。
【００７９】
さらに、多糖類Ｌ２が分岐鎖を有する場合、多糖類Ｌ２を金属膜３から離間する方向に拡開した状態で金属膜２に固定することができる（図２参照）。上述したように、本発明に係るセンサーチップの製造方法によれば、多糖鎖Ｌ２同士が不必要に「密」に固定されない。このため、糖鎖化合物が金属膜２に対して、ある程度「疎」に結合するような場合であっても、分岐の程度を指標に分岐鎖を有する多糖類Ｌ２を選択することで、金属膜２上に展開させる多糖類Ｌ２の分岐鎖の密度の調節をしやすいものとなる。この結果、リガンドの密度も調節しやすいものとなる。
【００８０】
（７）  糖鎖化合物の多糖類Ｌ２の重量平均分子量が１０００〜５００００００であることにより、重量平均分子量が１０００未満となることによる多糖類Ｌ２に対するリガンド６を固定可能な量の減少がなく、重量平均分子量が５００００００を超えることによる糖鎖化合物溶液の粘度過多とならずに糖鎖化合物やセンサーチップを製造することができる。
【００８１】
（８）前記多糖類Ｌ２がカルボキシメチルデキストランであれば、ｐＨ４．５以上の環境条件で、糖鎖化合物を金属膜３に結合させる際に糖鎖化合物の分子間でクーロン斥力が働き、糖鎖化合物の凝集を防ぎながら糖鎖化合物を金属膜３に対して結合させることができる。
【００８２】
（９）金属膜３に糖鎖化合物を結合させた状態で、金属膜３の直上（図１において金属膜３の直ぐ右側）に糖鎖化合物の炭化水素鎖Ｌ１が配置されることとなるので、蛍光測定時の照射光により金属膜３から放出される励起電子の寿命は、炭化水素鎖Ｌ１の炭素数に比例してその長短が変動することとなる。このため、前記炭化水素鎖Ｌ１の炭素数が２〜１０である直鎖状又は分岐鎖を有するアルキル鎖またはアルキレン鎖であることにより、金属膜３から放出される励起電子の寿命を好適な範囲で調整することができる。
【００８３】
（１０）本発明によれば有機溶剤を用いなくとも透明支持体２に対して多糖類Ｌ２を固定して多糖類Ｌ２の層（固相化層）を形成することができるので、有機溶剤に耐性のないプラスチック製の透明支持体２も使用可能となるが、このプラスチック製の透明支持体２として、ガラス（光透過率９２％）と同等のアクリル樹脂（光透過率９２％）を透明支持体として用いることとすれば、破損の危険性が低く、プリズムとして加工する際の加工性に優れることから、センサーチップの製造における作業性が向上する。
【００８４】
（１１）糖鎖化合物の官能基Ｘが、チオール基（−ＳＨ）、テルル基（−ＴｅＨ）、セレノール基（−ＳｅＨ）、対称又は非対称ジセレニド基（−ＳｅＳｅ−）、対称又は非対称ジスルフィド基（−ＳＳ−）、チオイソシアニド基（−ＳＣＮ）、イソニトリル基（−ＮＣ）、３価リン酸基（−ＰＯ42-）、ジスルフィド基（−ＳＳＲＺ）、スルフィド基（−ＳＲＺ）、ジセレニド基（−ＳｅＳｅＲＹ）、セレニド基（−ＳｅＲＺ）、キサンテート基（−ＯＣＳＳ−）、ニトロ基（−ＮＯ2）、チオカルバメート基（−ＳＣＨ）、ホスフィン基（−ＰＲ2）、チオ酸基又はジチオ酸基（−ＣＯＳＨ、−ＣＳＳＨ）、カルボン酸（−ＣООＨ）、シラン基（−ＳｉＨ3）からなる群から選択される一つ又はそれ以上であることにより、ＳＰＦＳによる蛍光測定に最も適している金（Ａｕ）膜に対して糖鎖化合物を結合させることができる。
【実施例】
【００８５】
次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
[作製例１]（センサーチップ用の透明支持体の作製）
アクリル樹脂「デルペット  70NH」（旭化成ケミカルズ（株）製）を厚さ１ｍｍに成型加工した透明支持体の片面に、スパッタリング法により金（Ａｕ）薄膜（金属膜）を形成し、金薄膜を有するセンサーチップ用の透明支持体を得た。なお、この透明支持体上の金薄膜の厚さは４２〜４７ｎｍであった。【００８６】
[作製例２]（糖鎖化合物の調製）
重量平均分子量５０００００のカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）  １量部、２−アミノエタンチオール  ３量部、２−ピコリンボラン  １０量部を用意し、これらを１０％酢酸水溶液に添加して９５℃で５時間反応させた。この反応後、洗浄を兼ねたゲル濾過（分子量分画）により糖鎖化合物を精製した。【００８７】
[実施例１]（ＳＰＦＳ用のセンサーチップ（Ａ）の作製）
作製例２で得られた糖鎖化合物を、ｐＨ７．４のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水[ＨＥＰＥＳ]（イオン強度：１０ｍＭ）１０ｍＬに対して、終濃度１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した。この糖鎖化合物の溶液に、作製例１で得られたセンサーチップ用の透明支持体を１時間、２５℃で浸漬させた。【００８８】
この浸漬後、前記溶液に対して終濃度が１００ｍＭとなるように２，２'−ジチオエタンジオールを添加し、さらに１時間、２５℃で静置して、金薄膜の片面（金薄膜に対し透明支持体と反対側の面）に糖鎖化合物を固定した。この透明支持体を前記溶液から取り出し、上記ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水でよく洗浄した。【００８９】
続いて、洗浄したセンサーチップ用の透明支持体をＮ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕を５０ｍＭと、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕を１００ｍＭとを含むＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水に、１時間、２５℃で浸漬した。【００９０】
浸漬の後、センサーチップ用の透明支持体をＭＥＳ緩衝生理食塩水から取り出し、抗ＡＦＰモノクローナル抗体（１Ｄ５；２．５μｇ／ｍＬ，（株）日本医学臨床検査研究所製）の溶液に１時間、２５℃で浸漬することで、金薄膜に固定された糖鎖化合物中のＣＭＤ（多糖類Ｌ２）に１次抗体（リガンド）を固定化した。【００９１】
最後に、このセンサーチップの基板に対して、重量１％牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水を、３０分間循環送液することで非特異吸着防止処理を行い、本発明に係るセンサーチップ（Ａ）を作製した。【００９２】
[比較例１]（ＳＰＳＦ用のセンサーチップ（Ｂ）の製造）
作製例１で得られたセンサーチップ用の基板を、１ｍＭに調整した１１−アミノ−１−ウンデカンチオールのエタノール溶液１０ｍＬに２４時間浸漬し、金薄膜の表面にＳＡＭを形成した。この基板をエタノール溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールで順次洗浄した後、エアガンを用いて乾燥させた。【００９３】
続いて、分子量５０００００のカルボキシメチルデキストラン[ＣＭＤ]を１ｍｇ／ｍＬと、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド[ＮＨＳ]を０．５ｍＭと、水溶性カルボジイミド[ＷＳＣ]を１ｍＭとを含むｐＨ７．４のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（イオン強度１０ｍＭ）に、ＳＡＭを形成したセンサーチップ用の基板を１時間２５℃で浸漬してＳＡＭに対してＣＭＤを固定化した。その後、センサーチップ用の基板を１ＮのＮａＯＨ水溶液に３０分間浸漬することで未反応のコハク酸エステルを加水分解した。【００９４】
続いて、センサーチップ用の基板をＮ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕を５０ｍＭ、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕を１００ｍＭで含むＭＥＳ緩衝生理食塩水に、１時間２５℃で浸漬した。【００９５】
このセンサーチップ用の基板を、該ＭＥＳ緩衝生理食塩水から取り出し、抗ＡＦＰモノクローナル抗体（１Ｄ５；２．５μｇ／ｍＬ，（株）日本医学臨床検査研究所製）の溶液に１時間、２５℃で浸漬することで、金薄膜に固定されたＣＭＤに１次抗体を固定化した。【００９６】
最後に重量１％牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水にて、３０分間循環送液することで非特異吸着防止処理を行うことで、センサーチップ（Ｂ）を作製した。【００９７】
＜免疫蛍光測定＞
［実施例２］
（アッセイの実施）
実施例１で製造したセンサーチップ（Ａ）を用いて、以下の工程により免疫蛍光測定を実施した。【００９８】
工程（ａ）として、センサチップ（Ａ）の流路（センサーチップの表面をトンネル状に囲うように流路基板と流路天板とを設けてなる流路）に、標的抗原としてＡＦＰを０．１ｎｇ／ｍｌ及び尿素を２Ｍ含む０．１ｍｌＰＢＳ溶液（アナライト溶液）を２５分間循環させた。【００９９】
洗浄工程（１）として、工程（ａ）の後、センサチップ（Ａ）の流路にＴｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むトリス緩衝生理食塩水〔ＴＢＳ〕を送液させ１０分間循環させることによって洗浄した。【０１００】
工程（ｂ）として、洗浄工程（１）の後、センサチップ（Ａ）の流路に、上記で準備したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識２次抗体（２μｇ／ｍｌとなるように調製したＰＢＳ溶液）０．１ｍｌを５分間循環させた。【０１０１】
洗浄工程（２）として、工程（ｂ）の後、センサチップ（Ａ）の流路にＴｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むＴＢＳを送液させ１０分間循環させることによって洗浄した。
工程（ｃ）として、工程（ｃ）まで経たセンサチップ（Ａ）の、金薄膜３を形成していない透明支持体２のプリズム部５の入射面５ａから、プリズム部５（シグマ光機（株）製）を経由してレーザ光（６４０ｎｍ、４０μＷ）を照射し、励起された蛍光標識物質（図３参照）から発光された蛍光量を、光電子増倍管〔ＰＭＴ〕を有する光検出手段９で検出し、光検特性演算装置１０で光量（シグナル値）を計測し「アッセイシグナル〔Ｓ〕」とした。【０１０２】
［参考例１］
一方、前記工程（ａ）〜（ｃ）において、上記工程（ａ）でＡＦＰを全く含まない（０ｎｇ／ｍＬ）尿素２Ｍ、０．１ｍｌＰＢＳ溶液をフローさせた以外は上記と同じ手順で蛍光量を測定し、その測定値を「アッセイブランク〔Ｎ〕」とした。【０１０３】
［比較例２］
比較例１で製造したセンサーチップ（Ｂ）について、実施例２および参考例１と同様に免疫蛍光測定を行いＳ／Ｎ比を算出した。
その結果、実施例に係るセンサーチップも問題なくＳＰＦＳ蛍光測定に使用可能であることを確認することができた。また、実施例１に係るセンサーチップの方が、比較例１に係るセンサーチップよりもＳ／Ｎ比が高いものとなった。【０１０４】
【表１】
0006455149.tif 000002
以上、本発明に係る実施の形態および実施例を、図面を参照しながら説明してきたが、本発明はこれら実施の形態および実施例に限定されず、その要旨を逸脱しない限り、設計変更等は許容される。【０１０５】
実施の形態および実施例では、金属膜３に対して上記チオール基等を有する糖鎖化合物を固定する方法をとっているが、これに限らず、透明支持体の表面をシリコン膜で覆い、このシリコン表面に対して糖鎖化合物を結合させることとしてもよい。【０１０６】
ただし、この場合の糖鎖化合物の官能基Ｘは、官能基Ｘ＝ＳｉＸ3、ＳｉＸ2ＣＨ3、ＳｉＸＣＨ3のいずれかとして、加水分解によりＸをヒドロキシル基とした後に、透明支持体の表面のシロキサンのヒドロキシル基および隣接する糖鎖化合物の官能基Ｘのヒドロキシル基と脱水縮合させる。【０１０７】
実施の形態および実施例では、リガンド６として抗体を用いているがリガンド６は抗体に限定されず、蛍光測定法の測定対象の分子と蛍光測定に寄与する何らかの反応するものであればよく、抗体に限られない。また、糖鎖化合物の多糖類Ｌ２が細胞表面から突出する糖鎖としてもよい。
【符号の説明】
【０１０８】
１  センサーチップ
２  透明支持体
３  金属膜
４  平面部
５  プリズム部
５ａ  入射面
５ｂ  出射面
６  リガンド
７  光源
８  受光手段
９  光検出手段
１０  光検特性演算装置
Ｌ１  炭化水素鎖
Ｌ２  多糖類
Ｘ  官能基
Ｙ  結合基
【図１】
0006455149.tif 000003
【図２】
0006455149.tif 000004
【図３】
0006455149.tif 000005
【図４】
0006455149.tif 000006
【図５】
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