(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ．配列番号２のアミノ酸３６〜５２６を含む成熟ポリペプチドを含むポリペプチド；
ｉｉ．前記成熟ポリペプチドとの少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；および
ｉｉｉ．前記成熟ポリペプチドをコードする配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列との少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸によってコードされたポリペプチド
からなる群から選択される、プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
単離、組換え、合成または変異ポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項４】
担体、賦形剤または補助酵素を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸３６〜５２６を含む成熟ポリペプチドをコードする配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列との少なくとも９０％の配列同一性を有する、プロリン特異的エンドプロテアーゼをコードする核酸。
【請求項６】
単離、組換え、合成または変異核酸である、請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
宿主細胞内のポリペプチドの発現を指示する１つ以上の制御配列に機能的に連結した請求項５または６に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項５もしくは６に記載の核酸または請求項７に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項９】
請求項１または２に記載のポリペプチドを調製するための方法であって、前記ポリペプチドの発現を許容する条件下で、請求項８に記載の宿主細胞を好適な発酵培地中で培養する工程と、前記ポリペプチドを調製する工程とを含む、方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドを回収する工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
食品または飼料を調製するためのプロセスであって、食品または飼料の中間形を請求項１もしくは２に記載のポリペプチドまたは請求項３もしくは４に記載の組成物と接触させる工程と、前記食品または飼料を調製する工程とを含む、プロセス。
【請求項１２】
前記食品は、飲料である、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記食品の前記中間形はマッシュである、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
マッシング中に前記ポリペプチドを前記マッシュとともにインキュベートする工程をさらに含む、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記食品はグルテンを含む、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１６】
飲料中の混濁を減少させるための、請求項１もしくは２に記載のポリペプチドまたは請求項３もしくは４に記載の組成物の使用。
【請求項１７】
前記飲料はビールである、請求項１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を有するポリペプチド、そのポリペプチドを含む組成物、プロリン特異的エンドプロテアーゼをコードする核酸、プロリン特異的エンドプロテアーゼをコードするその核酸を含む発現ベクター、組換え宿主細胞、プロリン特異的エンドプロテアーゼを調製するための方法、およびそのプロリン特異的エンドプロテアーゼが使用される食品または飼料を調製するためのプロセスに関する。
【０００２】
［背景］
プロリン特異的エンドプロテアーゼは、タンパク質またはペプチドをそのタンパク質またはペプチド中のプロリンが存在する位置で加水分解する酵素である。
【０００３】
プロリン特異的エンドプロテアーゼは、例えば、国際公開第２００２／０４６３８１号パンフレットおよび同第２００９／１４４２６９号パンフレットに各々開示されているように、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）またはペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）に由来してよい。
【０００４】
他のプロリン特異的エンドプロテアーゼは、国際公開第２０１２／１７４１２７号パンフレットから公知である。国際公開第２０１２／１７４１２７号パンフレットは、ボトリオチニア・フケリアナ（Ｂｏｔｒｙｏｔｉｎｉａ  ｆｕｃｋｅｌｉａｎａ）、アスペルギルス・クラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ）、スクレロチニア・スクレロチオツム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｔｕｍ）、ミコスファエレリー・グラミニコラ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌｙ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、ニューロスポラ・クラッセ（Ｎｅｕｒｏｐｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓｅ）、タラロミセス・スチピタツス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔａｔｕｓ）およびギベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）に由来するプロリン特異的エンドプロテアーゼを開示している。
【０００５】
プロリン特異的エンドプロテアーゼは、数種の用途に、例えば、グルテンの分解に使用できる（例えば、国際公開第２００５／０２７９５３号パンフレットまたは同第２００３／０６８１７０号パンフレットを参照されたい）。グルテンは、例えば小麦、ライ麦、オーツ麦および大麦などの穀類の不溶性タンパク質分画である。グルテンは、例えば、セリアック病に罹患している患者において毒性作用を誘発すると考えられるグルテニン分子およびプロラミン分子の複合混合物である。セリアックスプルーまたはセリアック病は、自己免疫疾患であると考えられる。セリアックスプルーに罹患している患者は、グルテンが極めて広範に使用されているため、順守するのが極めて困難である厳密なグルテンフリー食を順守する必要がある。医薬品または栄養補助食品としてのプロリン特異的エンドプロテアーゼの使用は、厳密なグルテンフリー食の必要を緩和できる可能性がある（国際公開第２００３／０６８１７０号パンフレット）。
【０００６】
プロリン特異的エンドプロテアーゼは、ビール中の混濁（ｈａｚｅ）を減少させるためにも使用され、このときプロリン特異的プロテアーゼは、例えば国際公開第２００２／０４６３８１号パンフレットまたは同第２００７１０１８８８Ａ２号パンフレットに開示されているビール製造プロセスの複数の段階中に加えられてよい。
【０００７】
本発明の目的は、改良された特徴を備える代替プロリン特異的エンドプロテアーゼである。
【０００８】
［概要］
１つの態様では、本発明は、
ｉ．配列番号２の成熟ポリペプチド配列を含むポリペプチド；
ｉｉ．配列番号２の成熟ポリペプチド配列との少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチド；
ｉｉｉ．配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列の相補鎖へ中ストリンジェンシー条件下、好ましくは高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされたポリペプチド；
ｉｖ．配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列との少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する核酸によってコードされたポリペプチド
からなる群から選択される、プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を有する単離ポリペプチドに関する。
【０００９】
また別の態様では、本発明は、本明細書に開示されるポリペプチドを含む組成物に関する。
【００１０】
１つの態様では、本発明は、配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列との少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する核酸に関する。
【００１１】
本発明はさらに、本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。
【００１２】
また別の態様では、本発明は、本明細書に開示されるポリヌクレオチド配列または発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
【００１３】
さらにまた別の態様では、本発明は、ポリペプチドを調製するための方法であって、そのポリペプチドの発現を許容する条件下で、本明細書に開示される宿主細胞を培養する工程と、そのポリペプチドを調製する工程とを含む、方法に関する。
【００１４】
また別の態様では、本発明は、食品または飼料を調製するためのプロセスであって、食品または飼料の中間形を本明細書に開示されるポリペプチドとともにインキュベートする工程と、その食品を調製する工程とを含む、プロセスに関する。
【００１５】
本発明はさらに、本明細書に開示されるプロセスによって入手できる食品または飼料に関する。
【００１６】
［定義］
用語「焼成製品」は、本明細書では、ドウまたはバッターから調製されるあらゆる製品であると定義される。製品は、ソフト、または砕けやすい特性を有する場合があり、白色、明色または暗色タイプであってよい。焼成製品には、例えば、精白パン、全粒パンまたはライ麦パン、バケット型のフランスパンなどのパン、例えば（デニッシュ）ペストリ、クロワッサンまたはパフペストリなどの積層ドウ製品、ピタパン、トルティーヤ、タコス、ケーキ、パンケーキ、ビスケット、クッキー、ドーナッツ、ベーグル、パイ皮、マフィン、蒸しパンおよびクリスプパンが含まれるがそれらに限定されない。焼成製品のタイプ、それらを特徴付ける方法および製造する方法は当業者に公知であり、例えば、Ｅ．Ｊ．Ｐｙｌｅｒ，Ｌ．Ａ．Ｇｏｒｔｏｎ，２００８，（２  ｖｏｌｕｍｅｓ）Ｓｏｓｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｋａｎｓａｓ，ＵＳＡ））よる“Ｂａｋｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”またはＳ．Ｐ．Ｃａｕｖａｉｎ，Ｌ．Ｓ．Ｙｏｕｎｇ，２００６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｌｔｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ））による“Ｂａｋｅｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ：Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ”を参照されたい。
【００１７】
用語「相補鎖」は、用語「相補体」と互換的に使用できる。核酸鎖の相補体は、コーディング鎖の相補体または非コーディング鎖の相補体であってよい。二本鎖核酸について言及する場合、ポリペプチドをコードする核酸の相補体は、アミノ酸配列をコードする鎖の相補鎖または同一物を含有するあらゆる核酸分子を意味する。
【００１８】
用語「制御配列」は、用語「発現調節核酸配列」と互換的に使用できる。この用語は、本明細書で使用するように、特に宿主生体またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける機能的に連結したコーディング配列を発現させるために必要な、および／または影響を及ぼす核酸配列を意味する。２つの核酸配列が機能的に連結している場合、それらは通常は同一方向にあり、さらに同一リーディングフレーム内にあるであろう。それらは、通常は本質的に隣接しているであろうが、隣接している必要はない。発現調節核酸配列、例えば特に適切な転写開始配列、終止配列、プロモーター配列、リーダー配列、シグナルペプチド配列、プロペプチド配列、プレプロペプチド配列またはエンハンサー配列；シャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列、リプレッサー配列またはアクチベーター配列；効率的ＲＮＡプロセッシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を強化する配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質安定性を強化する配列；および必要に応じて、タンパク質分泌を強化する配列は、選択した宿主生体において活性を示すあらゆる核酸配列であってよく、宿主細胞にとって内因性または異種のいずれかであるタンパク質をコードする遺伝子に由来してよい。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列にとって天然であっても異種であってもよい。必要に応じて、制御配列にはポリペプチドをコードする核酸配列のコーディング領域を備える制御配列のライゲーションを促進する特異的制限部位を導入する目的のためにリンカーが用意されていてよい。制御配列は、それらの特定の目的に合わせて最適化することができる。
【００１９】
「乳製品」は、チーズ、ミルク、スキムミルク、酸乳、バターミルク、コンデンスミルク、スプレッド、マーガリン、ヨーグルト、アイスクリーム、粉ミルク、バター、ＥＭＣ（酵素処理チーズ）、ドゥルセデレチェ（ｄｕｌｃｅ  ｄｅ  ｌｅｃｈｅ）、コーヒー用クリーム；コーヒークリーマー、クリーム、ギー、乳製品類似物などを含むがそれらに限定されない食品、飼料または飲料として使用することが意図される、ミルクをベースとするあらゆる種類の製品を意味する。チーズは、あらゆる種類のチーズ、例えば、フレッシュチーズ、ハードチーズ、カードチーズ、クリームチーズ、白カビチーズ、青カビチーズおよびプロセスチーズであってよい。フレッシュチーズの例は、リコッタ（Ｒｉｃｏｔｔａ）、クリームチーズ、ヌシャテル（Ｎｅｕｆｃｈａｔｅｌ）またはカッテージチーズである。ハードチーズの例は、チェスター、ダンボ（Ｄａｎｂｏ）、マンチェゴ（Ｍａｎｃｈｅｇｏ）、サンポーラン（Ｓａｉｎｔ  Ｐａｕｌｉｎ）、チェダー、モンテレー、コルビー、エダム、ゴーダ、ムンスター、スイスタイプ、グリュイエール、エメンタール、パルミジャーノレッジャーノ（Ｐａｒｍｉｇｉａｎｏ  Ｒｅｇｇｉａｎｏ）、グラーナパダーノ（Ｇｒａｎａ  Ｐａｄａｎｏ）、パルメザン、ペコリーノ、プロヴォローネおよびロマーノである。カードチーズの例は、例えばフェタ（Ｆｅｔａ）チーズ、Ｑｕｏｔｉｊａチーズ、パスタフィラタ（ｐａｓｔａ  ｆｉｌａｔａ）チーズ、例えばモッツァレラおよびケソフレスコ（Ｑｕｅｓｏ  ｆｒｅｓｃｏ）チーズである。クリームチーズの例は、フィラデルフィアチーズである。白カビチーズの例は、ブリ（Ｂｒｉｅ）およびカマンベールチーズである。青カビチーズの例は、ゴルゴンゾーラおよびデンマーク産ブルーチーズである。
【００２０】
本明細書で使用する用語「内因性」は、宿主内で自然に発生する核酸またはアミノ酸配列に関する。
【００２１】
エンドペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼまたはエンドプロテアーゼは、アミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかからのペプチド結合を破断するエキソペプチダーゼとは対照的に、非末端アミノ酸の（すなわち、タンパク質内の）ペプチド結合を破断することができる酵素である。エンドペプチダーゼは、ペプチドを単量体に分解する傾向を示さないが、相当に大きいペプチド断片を生じさせる。相当に大きい断片の特異的な生成は、多数の食品および飼料関連用途において特に好ましい。エンドペプチダーゼの特定のケースは、その基質がタンパク質の代わりにオリゴペプチドであるオリゴペプチダーゼである。
【００２２】
用語「発現」には、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌を含むがそれらに限定されない、ポリペプチドの生成に含まれるあらゆる工程が含まれる。
【００２３】
発現ベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現および／または翻訳のため、またはポリヌクレオチドの宿主細胞内での適切な制御配列（例えば、プロモーターならびに転写および翻訳停止シグナル）に機能的に連結した、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【００２４】
発現ベクターは、組換えＤＮＡ方法を好都合に受けさせることができ、ポリヌクレオチドの発現を引き起こすことができるあらゆるベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であってよい。ベクターの選択は、典型的には、ベクターとその中にベクターを導入すべき細胞との適合性に左右されるであろう。ベクターは、線状または閉環状プラスミドであってよい。ベクターは、自律複製ベクター、すなわち、染色体外実体として存在し、その複製が染色体複製、例えば、プラスミド、染色体外要素、微小染色体または人工染色体からは独立しているベクターであってよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞内に導入されると、ゲノム内に統合され、その中に既に統合されている染色体と一緒に複製されるベクターであってよい。統合的クローニングベクターは、宿主細胞の染色体内で無作為に、または規定の標的遺伝子座で統合することができる。ベクターシステムは、単一のベクターまたはプラスミドまたは宿主細胞のゲノム内またはトランスポゾン内に導入されるべき全ＤＮＡを一緒に含有している２つ以上のベクターまたはプラスミドであってよい。
【００２５】
本明細書に規定の宿主細胞は、遺伝子操作のために好適な生体であり、本発明による例えばポリペプチドなどの標的生成物の工業的生産のために有用な細胞密度で培養できる細胞である。宿主細胞は、自然に見いだされる宿主細胞、または遺伝子操作もしくは伝統的突然変異生成後の親宿主細胞に由来する宿主細胞であってよい。有利には、宿主細胞は、組換え宿主細胞である。
【００２６】
宿主細胞は、原核、古細菌または真核宿主細胞であってよい。原核宿主細胞は、細菌宿主細胞であってよいがそれには限定されない。真核宿主細胞は、酵母、真菌、アメーバ、藻類、植物、動物または昆虫宿主細胞であってよいがそれらに限定されない。
【００２７】
本明細書で使用する用語「異種」は、宿主細胞内では自然発生しない核酸またはアミノ酸配列に関する。換言すると、核酸またはアミノ酸配列は、宿主細胞内で自然に見いだされる核酸またはアミノ酸配列と同一ではない。
【００２８】
用語「ハイブリダイゼーション」は、例えば核酸化合物などのオリゴマー化合物の実質的に相補的な鎖の対合を意味する。
【００２９】
ハイブリダイゼーションは、低、中または高ストリンジェンシー条件下で実施されてよい。低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、約４５℃で６×の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、その後に少なくとも５０℃での０．２×のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中での２回の洗浄を含む（洗浄温度は、低ストリンジェンシー条件については５５℃へ上昇させることができる）。中ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、約４５℃での６×のＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション、その後に６０℃で０．２×のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中での１回以上の洗浄を含み、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、約４５℃での６×のＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション、その後に６５℃での０．２×のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中での１回以上の洗浄を含む。
【００３０】
核酸またはポリヌクレオチド配列は、本明細書では少なくとも５個のヌクレオチドまたは核酸単位を含むヌクレオチドポリマーであると規定されている。ヌクレオチドまたは核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡを意味する。用語「核酸」および「ポリヌクレオチド配列」は、本明細書では互換的に使用される。
【００３１】
「ペプチド」は、ペプチド（アミド）結合によって結合された短鎖のアミノ酸残基を意味する。最も短いペプチドであるジペプチドは、単一ペプチド結合によって結合された２個のアミノ酸からなる。
【００３２】
用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸残基を含み、６個以上のアミノ酸残基を含有する分子を意味する。本明細書の用語「タンパク質」は、用語「ポリペプチド」と同義語であり、さらに２個以上のポリペプチドを意味する場合がある。そこで、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、互換的に使用できる。ポリペプチドは、任意選択的に、機能性を付け加えるために修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、アシル化、ファルネシル化、プレニル化、スルホン酸化など）されてよい。特定の条件下で特定の基質の存在下において活性を示すポリペプチドは、酵素と呼ぶことができる。遺伝コードの縮重の結果として、所定のポリペプチドをコードする複数のヌクレオチド配列を生成できることは理解されるであろう。
【００３３】
「単離核酸断片」は、断片として自然に発生することがなく、自然状態では見いだされないであろう核酸断片である。
【００３４】
本明細書で使用する用語「単離ポリペプチド」は、少なくとも１つの成分、例えば自然にそれと結び付いている他のポリペプチド物質から除去されているポリペプチドを意味する。単離ポリペプチドは、あらゆる他の不純物を含んでいなくてよい。単離ポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはこの目的に好適で当業者に公知の他の分析方法によって決定される少なくとも５０％純粋、例えば少なくとも６０％純粋、少なくとも７０％純粋、少なくとも７５％純粋、少なくとも８０％純粋、少なくとも８５％純粋、少なくとも８０％純粋、少なくとも９０％純粋または少なくとも９５％純粋、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％であってよい。単離ポリペプチドは、組換え宿主細胞によって生成できる。
【００３５】
「成熟ポリペプチド」は、本明細書ではその最終形態にあるポリペプチドであると規定されており、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳後および前記ポリペプチドの翻訳後修飾後に得られる。翻訳後修飾には、Ｎ末端プロセッシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化および開裂による例えばシグナルペプチド、ポリペプチドおよび／またはプレプロペプチドなどのリーダー配列の除去が含まれる。
【００３６】
「成熟ポリペプチドコーディング配列」は、成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００３７】
用語「核酸構築物」は、本明細書では、一本鎖または二本鎖いずれかである、自然発生遺伝子から単離される、またはさもなければ自然には存在しないであろう方法で結合および並置される核酸のセグメントを含有するように修飾されている核酸分子であると呼ばれる。用語「核酸構築物」は、核酸構築物がコーディング配列の発現のために必要とされる全制御配列を含有する場合は用語「発現カセット」と同義語であり、このとき前記制御配列は前記コーディング配列に機能的に連結している。
【００３８】
「プロリン特異的エンドプロテアーゼ」は、タンパク質またはペプチドがプロリン残基を含有する位置でタンパク質またはペプチドを加水分解するプロテアーゼである。プロリン特異的エンドプロテアーゼは、プロリン特異的エンドプロテアーゼおよび／またはプロリン特異的オリゴペプチダーゼ活性を有する可能性がある（ＥＣ３．４．２１．２６）。プロリン特異的エンドプロテアーゼは、好ましくはプロリン残基のカルボキシ末端でペプチド結合を加水分解し、結果としてＣ末端プロリンを備えるペプチドおよび／またはポリペプチド断片を生じさせる酵素である。
【００３９】
用語「プロモーター」は、本明細書では、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、転写を開始するためにポリメラーゼを核酸配列の正確な下流転写開始位置へ方向付けるＤＮＡ配列であると規定される。
【００４０】
細胞、核酸、タンパク質またはベクターに関連して使用する場合の用語「組換え」は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが異種核酸もしくはタンパク質の導入または天然核酸もしくはタンパク質の変化によって修飾されていること、または細胞がそのように修飾された細胞に由来することを示している。そこで、例えば、組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）形内で見いだされない、またはさもなければ異常に発現する、過小発現する、または全く発現しない天然遺伝子を発現する遺伝子を発現する。用語「組換え」は、「遺伝子組換え」および「トランスジェニック」と同義語である。
【００４１】
配列同一性。配列同一性または配列相同性は、本明細書では互換的に使用される。本発明のために、本明細書では、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の配列相同性率または配列同一性率を決定するためにこれらの配列が最適な比較目的のためにアラインメントされることが規定されている。２つの配列間のアラインメントを最適化するためには、比較される２つの配列のいずれかにギャップが導入されてよい。そのようなアラインメントは、比較対象の配列の全長にわたって実施することができる。あるいは、アラインメントは、より短い長さにわたって、例えば、約２０、約５０、約１００個以上の核酸／塩基またはアミノ酸にわたって実施されてよい。配列同一性は、報告された整列領域にわたる２つの配列間の完全な一致率（％）である。２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の配列同一性率は、２つの配列のアラインメントについてのニードルマンおよびブンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズムを使用して決定することができる（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３）。アミノ酸配列およびヌクレオチド配列はいずれもこのアルゴリズムによってアラインメントすることができる。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムは、コンピュータープログラムＮＥＥＤＬＥにおいて実行されてきた。本発明のためには、ＥＭＢＯＳＳパッケージからのＮＥＥＤＬＥプログラムを使用した（バージョン２．８．０以降、ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（２０００）Ｒｉｃｅ，Ｐ．Ｌｏｎｇｄｅｎ，Ｉ．ａｎｄ  Ｂｌｅａｓｂｙ，Ａ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６，（６）ｐｐ２７６−２７７，ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。タンパク質配列に対しては、ＥＢＬＯＳＵＭ６２が置換マトリックスのために使用される。ヌクレオチド配列に対しては、ＥＤＮＡＦＵＬＬが使用される。使用される任意選択的パラメータは、１０のギャップ開始ペナルティおよび０．５のギャップ伸長ペナルティである。当業者であれば、これら異なるパラメータ全部がごくわずかに異なる結果を生じさせるであろうが、異なるアルゴリズムを使用した場合でも２つの配列の全同一性率は有意には変化しないことを認識できるであろう。
【００４２】
上述したプログラムＮＥＥＤＬＥによるアラインメント後、クエリー配列と本発明の配列との間の配列同一性率は、下記のように計算される：両方の配列内の同一アミノ酸または同一ヌクレオチドを示すアラインメント内の対応する位置の数を、アラインメントにおけるギャップの総数の減じた後のアラインメントの全長で除す。本明細書に規定した同一性は、ＮＥＥＤＬＥからＮＯＢＲＩＥＦ選択肢を使用することによって得ることができ、プログラムのアウトプットにおいて「最長同一性」であると標識される。
【００４３】
本発明の核酸配列またはタンパク質配列は、さらに例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために公衆データベースに対して検索を実施するための「クエリー配列」として使用することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施できる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子と相同であるヌクレオチド配列を得るためにＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施できる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子と相同であるアミノ酸配列を得るためにＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施できる。比較目的でギャップを入れたアラインメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載したようにギャップ付きＢＬＡＳＴを利用できる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合は、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用できる。全米バイオテクノロジー情報センターのホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を参照されたい。
【００４４】
ポリペプチドに関する用語「実質的に純粋」は、他のポリペプチド物質の多くとも５０重量％を含有するポリペプチド調製物を意味する。本明細書に開示されるポリペプチドは、好ましくは実質的に純粋形にある。詳細には、本明細書に開示されるポリペプチドは、「本質的に純粋形」であること、すなわちポリペプチド調製物は、他のポリペプチド物質を本質的に含んでいないことが好ましい。任意選択的には、ポリペプチドは、さらに例えば核酸、脂質、培地成分などを本質的に含んでいない可能性がある。本明細書では、用語「実質的に純粋なポリペプチド」は、用語「単離ポリペプチド」および「単離形にあるポリペプチド」と同義語である。ポリヌクレオチドに関する用語「実質的に純粋」は、他のポリペプチド物質の多くとも５０重量％を含有するポリヌクレオチド調製物を意味する。本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、好ましくは実質的に純粋形にある。詳細には、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、「本質的に純粋形」であること、すなわちポリヌクレオチド調製物は、他のポリヌクレオチド物質を本質的に含んでいないことが好ましい。任意選択的には、ポリヌクレオチドは、さらに例えばポリペプチド、脂質、培地成分などの非ポリヌクレオチドを本質的に含んでいない可能性がある。本明細書では、用語「実質的に純粋なポリヌクレオチド」は、用語「単離ポリヌクレオチド」および「単離形にあるポリヌクレオチド」と同義語である。
【００４５】
例えば合成核酸または合成ポリペプチドなどの「合成分子」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ化学合成または酵素合成によって生成される。合成分子には、精選宿主生体のために最適なコドン使用により作成された変異核酸が含まれるがそれらに限定されない。
【００４６】
合成核酸は、好ましくは本明細書に参照により組み込まれる国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレットおよび／または同第２００８０００６３２号パンフレットに記載された方法にしたがって、コドン使用のために最適化されてよい。国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットは、コドン対最適化を取り扱う。コドン対最適化は、それらのコドン使用に関して修飾されているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、特に使用されるコドン対が、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の改良された発現および／またはコードされたポリペプチドの改良された製造を得るために最適化される方法である。コドン対は、コーディング配列内のその後の２つの三重項（コドン）の組であると規定される。当業者には、コドン使用は宿主の種に依存して適応させられる必要があり、場合により配列番号１からの有意な相同性逸脱を備えるが、それでも依然として本発明によるポリペプチドをコードする変異体を生じさせることは公知であろう。
【００４７】
本明細書で使用する用語「変異体」、「誘導体」、「突然変異体」または「同族体」は、互換的に使用できる。それらは、ポリペプチドまたは核酸のいずれかであると言うことができる。変異体には、参照配列に関して１つ以上の位置での置換、挿入、欠失、切断、転換および／または転置が含まれる。変異体は、例えば、部位飽和突然変異生成、系統的変異導入法、挿入変異導入法、ランダム変異導入法、指定部位変異導入法および指向性進化法ならびに当業者に公知の様々な他の組換えアプローチによって作成できる。核酸の変異遺伝子は、当技術分野において公知の技術によって人工的に合成できる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ＧＬＡ遺伝子のクローニングのために使用されたｐＧＢＴＯＰ−１６ベクターである。ｐＧＢＴＯＰ−１６ベクターは、国際公開第２０１１／００９７００号パンフレットに記載されたｐＧＢＴＯＰ−１２ベクターに由来する。ｐＧＢＴＯＰ−１６ベクターは、ｐＧＢＴＯＰ−１２に加えて、ＥｃｏＲＩおよびＰａｃｌクローニング部位間のインサートの存在について正の選択するための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のｃｃｄＢ遺伝子を含有する。Ｐａｃｌ制限部位は、ｐＧＢＴＯＰ−１２内に存在するＳｎａＢＩ制限部位に置換する。このベクターは、形質転換の前にＮｏｔＩ消化によって線形化される。
【００４９】
［発明を実施するための形態］
１つの態様では、本発明は、
ｉ．配列番号２の成熟ポリペプチド配列を含むポリペプチド；
ｉｉ．配列番号２の成熟ポリペプチド配列との少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチド；
ｉｉｉ．配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列の相補鎖へ中ストリンジェンシー条件下、好ましくは高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされたポリペプチド；
ｉｖ．配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列との少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する核酸によってコードされたポリペプチド
からなる群から選択される、プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を有するポリペプチドに関する。
【００５０】
１つの実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるポリペプチドの単離、実質的に純粋、純粋、組換え、合成または変異ポリペプチドであるポリペプチドに関する。
【００５１】
また別の態様では、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含むプロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を有する単離ポリペプチドに関する。本明細書に開示されるプロリン特異的エンドプロテアーゼは、ラサムソニア・エメルソニイ（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）に由来してよい。本明細書に開示されるポリペプチドの起源に関する「由来する」または「引き出せる」という言い回しは、本発明によるポリペプチドを用いたＢＬＡＳＴ検索を実施した場合に、本発明によるポリペプチドが、その内因性ポリペプチドが本明細書に開示されるポリペプチドとの最高相同性率または同一性率を示す天然起源、例えば微生物細胞から引き出せることを意味する。
【００５２】
有利には、本発明によって提供されるプロリン特異的エンドプロテアーゼを有するポリペプチドは、相当に熱安定性である。驚くべきことに、本発明によるポリペプチドは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼよりはるかに熱安定性であることが見いだされた。本発明者らは、本開示によるポリペプチドが、ポリペプチドが少なくとも７０℃の温度で１５分間、例えば７０℃で１５分間または７１℃で１５分間保持された後に少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％の残留活性を有することを見いだしており、このとき活性は基質としてのアセチルＡｌａＡｌａＰｒｏ−パラ−ニトロアニリン（Ａｃ−ＡＡＰ−ｐＮＡ）を用いて測定される。したがって、本明細書に開示されるプロリン特異的エンドプロテアーゼは、例えばビールの調製のためのプロセスにおけるマッシング（ｍａｓｈｉｎｇ）中の食品産業がより高温で酵素を適用するという要望がある食品用途において容易に使用することができる。
【００５３】
好ましくは、本発明により提供されるポリペプチドは、配列番号２の成熟ポリペプチド配列との少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドであってよい。配列番号２によるポリペプチドは、プレプロ配列を含む。宿主細胞膜を通してポリペプチドが分泌されると、プレプロ配列、例えば配列番号２のアミノ酸１〜３５、１〜３６、１〜３７、１〜３８、１〜３９、１〜４０、１〜４１、１〜４２、１〜４３、１〜４４、１〜４５、１〜４６、１〜４７、１〜４８、１〜４９、１〜５０または１〜５１が除去される。配列番号２のプロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を有する成熟ポリペプチド配列は、配列番号２のアミノ酸３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０または５１〜アミノ酸５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０または５２６を含むことができ、このとき配列番号２内の１位にあるアミノ酸メチオニンは１番と数えられる。配列番号２の成熟ポリペプチド配列は、配列番号２のアミノ酸３６から５２６を含む、または含有することができ、このとき配列番号２内の１位にあるアミノ酸メチオニンは１番と数えられる。
【００５４】
本発明によるポリペプチドは、任意の好適なポリヌクレオチド配列によってコードされてよい。典型的には、ポリヌクレオチド配列は、特定の宿主細胞内で本明細書に開示されるポリペプチドを発現させるためのコドン最適化配列またはコドン対最適化配列である。
【００５５】
本明細書に開示されるポリペプチドは、配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列の相補鎖へ中ストリンジェンシー条件下、好ましくは高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされてよい。配列番号１は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞内で本明細書に開示されるポリペプチドを発現させるためのコドン対最適化ポリヌクレオチド配列である。
【００５６】
本明細書に開示されるポリペプチドは、さらにまた配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列との少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する核酸によってコードされてよい。
【００５７】
本明細書に開示されるプロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、さらに配列番号２の成熟ポリペプチドの１つ以上の位置で置換、欠失および／または挿入を含む、配列番号２の成熟ポリペプチドの変異体であってよい。配列番号２の成熟ポリペプチドの変異体は、配列番号２の成熟ポリペプチドのアミノ酸とは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列であってよい。
【００５８】
１つの実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるポリペプチドの生物活性断片を特徴とする。
【００５９】
本発明のポリペプチドの生物活性断片には、全長タンパク質より少数のアミノ酸を含むが、対応する全長タンパク質の少なくとも１つの生物活性を示す、プロリン特異的エンドプロテアーゼタンパク質（例えば、配列番号２の成熟アミノ酸配列）のアミノ酸配列と十分に同一であるか、またはそれに由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。典型的には、生物活性断片は、プロリン特異的エンドプロテアーゼタンパク質の少なくとも１つの活性を備えるドメインまたはモチーフを含む。生物活性断片は、例えば、触媒ドメインを含むことができる。本発明のタンパク質の生物活性断片は、例えば、長さが１０、２５、５０、１００アミノ酸以上であるポリペプチドであってよい。さらに、タンパク質の他の領域が欠失している他の生物活性部分は、組換え技術によって調製し、本発明のポリペプチドの自然形の１つ以上の生物活性について評価することができる。
【００６０】
本発明は、さらにプロリン特異的エンドプロテアーゼタンパク質の上記の生物活性断片をコードする核酸断片を特徴とする。
【００６１】
本発明によるポリペプチドは、融合タンパク質であってよい。融合ポリペプチドを生成するための技術は当技術分野において公知であり、それらがインフレームであるようにポリペプチドをコードするコーディング配列をライゲーションする工程を含む。融合ポリペプチドの発現は、同一プロモーターおよびターミネーターの制御下にある。ハイブリッドポリペプチドは、１つ以上が宿主細胞に対して異種であってよい少なくとも２つの異なるポリペプチドから得られる部分または完全ポリペプチド配列の組み合わせを含むことができる。少なくとも２つの異なるポリペプチド由来のそのような融合ポリペプチドは、第２ポリペプチド由来の触媒ドメインに機能的に連結した、１つのポリペプチド由来の結合ドメインを含んでいてよい。融合ポリペプチドおよびシグナル配列融合の例は、例えば、国際公開第２０１０／１２１９３３号パンフレット、同第２０１３／００７８２０号パンフレットおよび同第２０１３／００７８２１号パンフレットに記載されている。
【００６２】
本発明によるポリペプチドは、任意の好適な真核細胞由来であってよい。真核細胞は、哺乳動物、昆虫、植物、真菌または藻類細胞であってよい。
【００６３】
本発明によるポリペプチドはさらにまた糸状菌細胞または好熱性糸状菌細胞由来であってよい。好ましい糸状菌細胞は、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、ラサムソニア属（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）またはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アモルホセカ属（Ａｍｏｒｐｈｏｔｈｅｃａ）、シュードセルコスポレラ属（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ）、トラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、カルカリスポリエラ属（Ｃａｌｃａｒｉｓｐｏｒｉｅｌｌａ）、サーモミセス属（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、コーニーアスカス属（Ｃｏｒｎｙａｓｃｕｓ）、ミリコックム属（Ｍｙｒｉｃｏｃｃｕｍ）、スキタリジウム属（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、カエトミウム属（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）、ペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、コリナスクス属（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、マルブランキア属（Ｍａｌｂｒａｎｃｈｅａ）、スチルベラ属（Ｓｔｉｌｂｅｌｌａ）、サーモミセス属（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）、ダクチロミセス属（Ｄａｃｔｙｌｏｍｙｃｅｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、カエトミウム属（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）、メラノカルパス属（Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ）、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、レンチニュラ属（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ）、アナエロミセス属（Ａｎａｅｒｏｍｙｃｅｓ）の種に属し、および最も好ましくはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アクレモニウム・アラバメンセ（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ａｌａｂａｍｅｎｓｅ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ソジャエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、タラロミセス・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、ラサムソニア・エメルソニイ（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・ルクノウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、アモルホセカ・レジナエ（Ａｍｏｒｐｈｏｔｈｅｃａ  ｒｅｓｉｎａｅ）、アウレオバシジウム・プルランス���Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、シュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデス（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ  ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ）、トラメテス・ベルシカラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）５２Ｊ、リゾムコール・プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、カルカリスポリエラ・サーモフィラ（Ｃａｌｃａｒｉｓｐｏｒｉｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、タラロミセス・サーモフィルス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモミセス・ラヌゲノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）、サーモアスカス・オーラティアクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ａｕｒａｔｉａｃｕｓ）、コルニアスカス・サーモフィルス（Ｃｏｒｎｙａｓｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ミリコックム・サーモフィルム（Ｍｙｒｉｃｏｃｃｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、スキタリジウム・サーモフィルム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、ミセリオフトラ・ヒヌリー（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｈｉｎｎｕｌｅａ）、カエトミウム・サーモフィルム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、ペシロミセス・ビソクラマイドイデス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｄｏｉｄｅｓ）、コルニアスカス・セペドニウム（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ  ｓｅｐｅｄｏｎｉｕｍ）、マルブランキア・シナモンメア（Ｍａｌｂｒａｎｃｈｅａ  ｃｉｎｎａｍｏｎｍｅａ）、チエラビア・アウストラリエンシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｉｓ）、スチルベラ・サーモフィリア（Ｓｔｉｌｂｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、サーモミセス・ステラーツス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｅｌｌａｔｕｓ）、タラロミセス・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、ダクチロミセス・サーモフィルス（Ｄａｃｔｙｌｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、フミコラ・ヒアロサーモフィリア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｈｙａｌｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉａ）、アクレモニウム・サーモフィルム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、カエトミウム・オリビカラー（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｏｌｉｖｉｃｏｌｏｒ）、メラノカルパス・アルボミセス（Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ  ａｌｂｏｍｙｃｅｓ）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、レンチニュラ・エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ  ｅｄｏｄｅｓ）またはアナエロミセス・ムクロナタス（Ａｎａｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ）の種に属する。ポリペプチドは、好ましくは、ラサムソニア・エメルソニイ（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）に由来する。
【００６４】
本発明によるポリペプチドは、天然型ポリペプチドまたは遺伝子組換えもしくは組換えポリペプチドであってよい。
【００６５】
本明細書に開示されるポリペプチドは、精製されてよい。タンパク質の精製は、当業者に公知である。
【００６６】
１つの態様では、本発明は、本明細書に開示されるポリペプチドを含む組成物に関する。
【００６７】
本明細書に開示される組成物は、担体、賦形剤、補助酵素または他の化合物を含んでいてよい。典型的には、組成物または調製物は、それを用いてプロリン特異的エンドプロテアーゼを調製できる化合物を含む。本明細書で使用する賦形剤は、本明細書に開示されるポリペプチドと一緒に調製される不活性物質、例えば、スクロースもしくはラクトース、グリセロール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムである。本明細書に開示されるポリペプチドを含む組成物は、液体組成物または固体組成物であってよい。液体組成物は、通常は水を含む。液体組成物として調製される場合、組成物は、通常は水分活性を低下させる成分、例えばグリセロール、ソルビトールまたは塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む。本明細書に開示されるポリペプチドを含む固体組成物は、酵素を含む粒物質を含むことができる、または本組成物は、リポソーム様の液体マトリックス中またはアルギン酸塩もしくはカラゲナンのようなゲル内に封入ポリペプチドを含む。ポリペプチドまたは酵素を封入または粒状化するためには当技術分野において公知の多数の技術がある（例えば、Ｎ．Ｊ．Ｚｕｉｄａｍ  ａｎｄ  Ｖ．Ａ．Ｎｅｄｏｖｉｃ（ｅｄｓ．）“Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｆｏｏｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ”２０１０）中のＧ．Ｍ．Ｈ．Ｍｅｅｓｔｅｒｓ，“Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｃｈａｐｔｅｒ  ９を参照されたい。本明細書に開示される組成物は、本明細書に開示されるポリペプチドを含む担体も含んでいてよい。本明細書に開示されるポリペプチドは、当技術分野における公知の技術によって担体に結合または固定化されてよい。
【００６８】
本発明はさらに、本明細書に開示されるポリペプチドを含む組成物を調製するためのプロセスであって、そのポリペプチドを含む発酵培地をスプレー乾燥する工程、または本明細書に開示されるポリペプチドを顆粒化もしくは封入する工程と、組成物を調製する工程とを含んでいてよいプロセスに関する。
【００６９】
また別の態様では、本発明は、配列番号１または配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列との少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する、本明細書に開示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に関する。本明細書に開示されるポリヌクレオチド配列は、配列番号１を含んでいてよく、または配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列を含んでいてよい。
【００７０】
本発明の１つの他の実施形態では、配列番号１の核酸の単離、実質的純粋、純粋、組換え、合成または変異核酸である核酸が開示される。変異核酸配列は、例えば、配列番号１との少なくとも７０％の配列同一性を有していてよい。
【００７１】
また別の態様では、本発明は、発現宿主細胞内のポリペプチドの発現を指示する１つ以上の制御配列に機能的に連結した本発明に開示されるポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。
【００７２】
核酸構築物または発現ベクター内に核酸を挿入するには、当業者に公知である数種の方法があり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１を参照されたい。本発明のポリペプチドをコードする核酸は、例えばプロモーターおよびターミネーター配列などの制御配列を用いて操作することが望ましい可能性がある。
【００７３】
プロモーターは、変異プロモーター、切断プロモーターおよびハイブリッドプロモーターを含む、転写活性を示す真核または原核宿主細胞のために好適な任意の適切なプロモーター配列であってよく、細胞にとって内因性（天然）または異種（異質）のいずれかである細胞外または細胞内ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから得ることができる。プロモーターは、構成的または誘導性プロモーターであってよい。好ましくは、プロモーターは、誘導性プロモーター、例えばデンプン誘導性プロモーターである。糸状菌のために好適なプロモーターは、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ｇｐｄＡプロモーター、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酸安定性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）もしくはＡ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）もしくはＡ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）エンドキシナラーゼ（ｘｌｎＡ）もしくはβ−キシロシダーゼ（ｘｌｎＤ）、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドラーゼＩ（ＣＢＨＩ）、Ｒ．ミエヘイ（Ｒ．ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）アルカリプロテアーゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）トリオースホスフェートイソメラーゼ、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、フザリウム・ヴェネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）アミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・ヴェネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）Ｄａｎｉａ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・ヴェネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）Ｑｕｉｎｎ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号パンフレット）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）βーグルコシダーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドラーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドラーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（��ｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）β−キシロシダーゼならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼおよびＡ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）トリオースホスフェートイソメラーゼをコードするポリヌクレオチド由来のプロモーターのハイブリッド）をコードするポリヌクレオチドから入手されるプロモーターならびにそれらの変異プロモーター、切断プロモーターおよびハイブリッドプロモーターを含むがそれらに限定されない群から選択されてよいプロモーターである。
【００７４】
本明細書に開示される細胞内で機能的である、当業者に公知であるあらゆるターミネーターを使用することができる。糸状菌内の好適なターミネーター配列の例には、例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来の、例えばＡ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸塩シンターゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、ｔｒｐＣおよび／またはフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ由来の糸状菌遺伝子のターミネーター配列が含まれる。
【００７５】
また別の態様では、本発明は、本明細書に開示される核酸構築物または発現ベクターを含む宿主細胞に関する。好適な宿主細胞は、哺乳動物、昆虫、植物、真菌もしくは藻類細胞または細菌細胞であってよい。好適な宿主細胞は、例えば、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ラサムソニア属（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ）、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、Ａ．ソジャエ（Ａ．ｓｏｊａｅ）、タラロミセス・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、ラサムソニア・エメルソニイ（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）クリソスポリウム・ルクノウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）もしくはトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、またはサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）由来の真菌細胞であってよい。
【００７６】
宿主細胞は、組換えまたはトランスジェニック宿主細胞であってよい。宿主細胞は、当技術分野において公知の標準技術、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１に開示されたエレクトロポレーション、プロトプラスト形質転換法またはコンジュゲーション法を使用して本明細書に開示される核酸構築物または発現ベクターを用いて遺伝子組換えされてよい。
【００７７】
１つの態様では、本発明は、本明細書に開示されるポリペプチドを製造するためのプロセスであって、そのポリペプチドの製造を誘導する条件下で好適な発酵培地内で宿主細胞を培養する工程と、そのポリペプチドを製造する工程とを含む、プロセスに関する。当業者であれば、例えば、使用される宿主細胞、ｐＨ、温度および発酵培地に依存して、本明細書に開示されるポリペプチドを製造するためのプロセスを実施する方法を理解できる。宿主細胞は、振とうフラスコ内で、または０．５もしくは１リットル以上から１０〜１００立方メートル以上の容積を有する発酵槽内で培養できる。培養は、宿主細胞の要件に依存して好気性または嫌気性で実施されてよい。
【００７８】
有利には、本明細書に開示されるポリペプチドは、発酵培地から回収または単離される。
【００７９】
プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を有するポリペプチドまたは本明細書に開示されるポリペプチドを含む組成物は、多様な用途において、例えば食品または飼料の製造において、例えばタンパク質加水分解物の製造において使用することができる。数種の食品タンパク質は、例えばプロリンリッチペプチド配列を備えるプロラミンを含有するグルテンなどの特定の個人にとって毒性でさえある可能性がある高アレルギー性亜分画を含有している。これらのタンパク質は、それらの抗原性または毒性を緩和するために新規酵素に曝露させることができる。
【００８０】
グルテンが毒性である人々の群は、セリアックスプルーに罹患している個人である。セリアック病としても公知であるセリアックスプルーは、例えば小麦由来のα−グリアジン、大麦由来のホルデイン、ライ麦由来のセカリンおよびオート麦由来のアベニンなどの穀物由来のグルテンタンパク質の消化によって誘発される小腸の自己免疫疾患である。
【００８１】
したがって、プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を有するポリペプチドまたは本明細書に開示されるポリペプチドを含む組成物は、栄養補助食品の調製において、またはセリアックスプルーに罹患している患者の治療および／またはグルテン不耐性の人々の治療における医薬品として使用することができる。
【００８２】
本明細書に開示されるポリペプチドは、さらに食品中のグルテンを加水分解するための加工処理助剤として使用することもできる。
【００８３】
したがって、本発明は、食品または飼料を調製するためのプロセスであって、食品または飼料の中間形を本明細書に開示されるポリペプチドまたはそのポリペプチドを含む組成物とともにインキュベートする工程と、その食品または飼料を調製する工程とを含む、プロセスに関する。本明細書に開示されるプロセスにおける食品には、飲料、例えばビール、ワインもしくはフルーツジュースまたは焼成製品もしくは乳製品が含まれるがそれらに限定されない。
【００８４】
食品または飼料の中間形を本明細書に開示されるポリペプチドまたはそのポリペプチドを含む組成物とともにインキュベートする工程は、食品または飼料の中間形にそのポリペプチドまたはそのポリペプチドを含む組成物を加える工程を含んでいてよい。
【００８５】
食品を調製するためのプロセスは、ビールを調製するためのプロセスであってよい。通常、ビールを調製するためのプロセスは、マッシュを得るために麦芽をマッシングする工程と、麦芽汁を得るためにマッシュを濾過する工程、例えばホップとともに麦芽汁を沸騰させる工程と、麦芽汁に酵母を接種することにより発酵させる工程とを含む。発酵後、ビールを調製するためのプロセスは、典型的には成熟および安定化期ならびに通常は製造されるビールのタイプに依存して、さらに濾過期を含む。
【００８６】
食品の中間形は、食品の調製中の食品の任意な好適な形態であってよい。ビールの中間形は、例えば、マッシュ、麦芽汁、発酵ブロスまたはグリーンビールであってよい。本明細書で使用するグリーンビールは、一次発酵の結果として生じるビールであり、典型的には一部の不安定酵母および望ましくないフレーバー成分を含有している可能性がある。パンの中間形は、例えば、ドウまたはバッターであってよい。有利には、本発明によるプロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を有するポリペプチドまたはそのポリペプチドを含む組成物は、ビールを調製するためのプロセスにおいてマッシング中のマッシュとともにインキュベートされる。驚くべきことに、有意な量の混濁活性タンパク質は、マッシング中の本発明によるポリペプチドによって減少した。結果として、最終のビール中の混濁の形成を防止することができる。本発明によるプロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、マッシング後に分離された麦芽汁が沸騰させられて酵素が不活性化されるため、マッシング中に活性であるのは有利である。これは、例えばビールなどの最終食品中で酵素が活性であるのは望ましくないために有利である。
【００８７】
マッシングは、当業者に公知であるように、デンプンが穀物中に存在する天然酵素によって糖に分解されるプロセスである。典型的には、マッシングは、当業者に公知の所定の長さの時間にわたり、麦芽、すなわち例えば大麦麦芽などの粉砕穀類の混合物および水を段階的に約４５〜５２℃から７１〜７６℃の温度にさせる工程を含む。通常は、マッシングは、麦芽を４５〜５２℃の温度、次に６０〜６５℃の温度、次に約７１〜７６℃の温度および任意選択的に７６〜７９℃の最終温度にさせる工程を含む。
【００８８】
マッシング後、「麦芽汁」とも呼ばれる液体分画は、固体分画から分離される。引き続いて、麦芽汁は、典型的には例えばホップなどのまた別の成分とともに沸騰させられる。麦芽汁の沸騰中、麦芽汁中に存在する酵素は不活性化される。
【００８９】
１つの実施形態では、ビールを調製するためのプロセスは、マッシュを本明細書に開示されるポリペプチドまたはポリペプチドを含む組成物とともにインキュベートする工程と、ビールを調製する工程とを含む。
【００９０】
混濁活性タンパク質は、タンパク質−ポリフェノール凝集体を形成するためにポリフェノールと相互作用することができるプロリンリッチタンパク質である。これらのタンパク質−ポリフェノール凝集体は、ビール中の「寒冷混濁」とも呼ばれる混濁の形成を誘発する。したがって、１つの態様では、本発明は、本明細書に開示されるポリペプチドまたは飲料中の混濁の減少において開示された組成物の使用に関する。本明細書で使用する飲料は、ビールであってよい。
【００９１】
食品および／または食品の中間形は、グルテンを含む可能性がある。
【００９２】
本明細書に開示されるプロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、グルテン中の毒性エピトープを非毒性断片に加水分解することができることが見いだされた。したがって、１つの態様では、本発明は、食品中のグルテンの減少において本明細書に開示されるポリペプチドまたはそのポリペプチドを含む組成物の使用に関する。
【００９３】
本開示による食品を調製するためのプロセスは、食品を低温殺菌する工程を含むことができる。低温殺菌は、通常は食品または食品の中間形を１０〜２０分間、または１２〜１８分間にわたり６０〜６８℃の温度に、または少なくとも５、１０もしくは１５分間にわたり７０〜７４℃の温度、例えば約７２℃にさせることによって、例えばその食品または食品の中間形を加熱する工程を含む。
【００９４】
本明細書に開示されるプロセス内の食品は、さらにまたタンパク質加水分解物であってよい。したがって、本開示は、タンパク質加水分解物を調製するためのプロセスであって、タンパク質基質を本明細書に開示されるポリペプチドまたは組成物と接触させる工程と、そのタンパク質加水分解物を製造する工程とを含む、プロセスに関する。タンパク質加水分解物は、任意の好適なタンパク質基質、例えば穀物内のグルテンまたは牛乳中のカゼインなどのプロリン残留物中でリッチであるタンパク質基質から調製することができる。
【００９５】
１つの態様では、本発明は、本明細書に開示される食品を調製するためのプロセスによって入手できる食品に関する。
【００９６】
以下の実施例は、本発明を例示する。
【００９７】
［実施例］
［材料および方法］
［実施例１．クローニング、発現および回収  プロリン特異的エンドプロテアーゼ（ＰＥＰ）ＢＣ２Ｇ０７９］］
［実施例１．１．クローニングおよび発現］
プロリン特異的エンドプロテアーゼ（ＰＥＰ）ラサムソニア・エメルソニイ（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）のタンパク質配列は、配列番号２に示されており、ＰＥＰ  ＢＣ２Ｇ０７９と呼ばれる。
【００９８】
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中でこのタンパク質を発現させるためのアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）発現ベクター内でサブクローニングするための、追加の制限部位を含有するコドン適応ＤＮＡ配列を設計した。コドン適応は、国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットに記載されたように実施した。配列番号２のＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）についてのコドン最適化ＤＮＡ配列は、配列番号１に示した。
【００９９】
グルコアミラーゼｇｌａＡプロモーターの翻訳開始配列を５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ  ＡＴＧ−３’に組換え、発現構築物の生成において（同様に国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレットにおいて詳述された）最適な翻訳終止配列５’−ＴＡＡＡ−３’を使用した。特にグルコアミラーゼプロモーターの一部およびＰＥＰコーディング遺伝子を含有するＤＮＡ断片を完全に合成し、精製し、ＥｃｏＲＩおよびＰａｃｌを用いて消化した。ｐＧＢＴＯＰ−１６ベクター（図１）をＥｃｏＲＩ／Ｐａｃｌ消化によって線形化し、線形化ベクター断片を引き続いてゲル抽出法によって精製した。ＰＥＰコーディング領域を含有するＤＮＡ断片をｐＧＢＴＯＰ−１６ベクター内にクローニングするとｐＧＢＴＯＰ−ＰＥＰが生じた。引き続いて、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＧＢＡ３０６（ΔｇｌａＡ、ΔｐｅｐＡ、ΔｈｄｆＡ、適応ＢａｍＨＩアンプリコン、ΔａｍｙＢＩＩ、ΔａｍｙＢＩ、ΔａｍｙＡα−アミラーゼおよびグルコアミラーゼ陰性菌株）は、国際公開第２０１１／００９７００号パンフレットおよびその中の参考文献に記載された菌株および方法を用いる線形化ｐＧＢＡＡＳ−４を用いる共形質転換プロトコルにおいて、Ｎｏｔｌ消化によって線形化ｐＧＢＴＯＰ−ＰＥＰベクターを用いて形質転換し、培地および標準手法にしたがって精製したコロニーを含有するアセトアミド上で選択した。形質転換および選択は、国際公開第９８／４６７７２号パンフレットおよび同第９９／３２６１７号パンフレットに記載されたように実施した。ＰＥＰ  ＢＣ２Ｇ０７９をコードするＰＥＰ遺伝子を含有する菌株は、ｐＧＢＴＯＰ−ＰＥＰ発現カセットの存在を検証するためにＰＥＰ遺伝子に対して特異的なプライマーを用いるＰＣＲによって選択した。単一形質転換体を選択し、ＰＥＰ１と指名し、単一菌株接種菌を入手するためにさらにレプリカ平板培養した。
【０１００】
［実施例１．２．Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）菌株内のＰＥＰ  ＢＣ２Ｇ０７９の製造］
新鮮Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＰＥＰ−１胞子を調製した。バッフル付きの５００ｍｌの振とうフラスコ内で１００ｍｌの発酵培地１（１０％ｗ／ｖのコーンスティープ固体、１％ｗ／ｖのグルコース・Ｈ２Ｏ、０．１％ｗ／ｖのＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ、０．０５％ｗ／ｖのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．０２５％ｗ／ｖのバジルドン（Ｂａｓｉｌｄｏｎ）、ｐＨ５．８）を含む４つの振とうフラスコに１０７個の胞子を接種した。これらの前培養を３４℃および１７０ｒｐｍで１６〜２４時間インキュベートした。前培養から、５０ｍｌを容量５リットルの振とうフラスコ内で１リットルの発酵培地２（１５％ｗ／ｖのマルトース、６％ｗ／ｖのバクトソイトーン、１．５％ｗ／ｖの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ｗ／ｖのＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ、０．１％ｗ／ｖのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．１％ｗ／ｖのＬ−アルギニン、８‰ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ−８０、２‰ｗ／ｖのバジルドン、２％ｗ／ｖのＭＥＳ、ｐＨ５．１）を含む１つの振とうフラスコを接種するために使用し、３４℃および１７０ｒｐｍで振とうした。３、４、５および６日間のインキュベーション後、培養のｐＨは２ＮのＨＣｌを使用してｐＨ５．０へ低下させ、これらの時点各々からのサンプルをＰＥＰ活性について分析した。５０ｍＬのサンプルを採取し、上清をバイオマスから遠心分離およびその後の濾過によって分離した。最高活性を備えるサンプルを使用して、生成されたＰＥＰを特徴付けた。
【０１０１】
［実施例１．３．Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来の参照プロリン特異的エンドプロテアーゼの製造］
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来の参照プロリン特異的エンドプロテアーゼは、国際公開第２００２／０４６３８１号パンフレットから公知である。Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼ（ＰＥＰ）のアミノ酸配列は配列番号５に示し、このとき最初の１７アミノ酸はＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のペクチンメチルエステラーゼのシグナル配列（ＰＭｅＡ  ｓｓ；配列番号３）であり、それに続く部分はＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）プロリン特異的エンドプロテアーゼのプロ配列の１９アミノ酸（配列番号４）を含む。
【０１０２】
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のＰＥＰの発現および製造は、実施例１．１．および１．２．の下に記載した方法と同一方法で実施した。Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のＰＥＰは、実施例２において参照酵素として使用した。
【０１０３】
［実施例２．プロリン特異的エンドプロテアーゼ（ＰＥＰ）活性の測定］
Ｎｕｎｃ  ９６ウエル平底ＭＴＰ（マイクロタイタープレート）中で、５０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ４．５での０．１Ｍの酢酸ナトリウムバッファー中に希釈した、実施例１において製造した１００μＬの培養上清を５０ｍＭのＮａＣｌとともにｐＨ４．５で０．１ＭのＮａＡｃバッファー中の１００μＬの６ｍＭのＡｃ−ＡＡＰ−ｐＮＡ（ＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍまたはＣＰＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のアセチル−ＡｌａＡｌａＰｒｏ−パラニトロアニリン；ＨＰＬＣ分析に基づく純度＞９５．０％）とともにインキュベートした。２０℃での６０分後、４０μＬの１ＭのＨＣｌを添加することによって反応を停止させた。ＰＥＰによって遊離させられていたｐＮＡは、４０５ｎｍ（Ａ４０５）でＴｅｃａｎ  ＭＴＰ分光光度計（ｗｗｗ．ｔｅｃａｎ．ｃｏｍ）において測定した。ブランクは、希釈培養上清をＨＣｌ溶液と事前に混合されていた基質溶液と混合することによって調製した。活性は、ｐＮＡＳＵで表示される。１ｐＮＡＳＵは、上述した条件を使用して、４０５ｎｍでの１ＯＤの吸光度の増加に対応するｐＮＡの量である、１時間にＡｃ−ＡＡＰ−ｐＮＡから遊離する酵素の量である。Ａ４０５は、反応の開始時にブランク値未満であってはならない、または反応の終了時に２．５を超えてはならず、さらにＡ４０５は使用される分光光度計の線形範囲を超えてはならない。
【０１０４】
【表１】
0006601630.tif 000002
【０１０５】
ＰＥＰ  ＢＣ２Ｇ０７９の比活性を参照ＰＥＰと比較するために、２８０ｎｍでの測定を妨害する可能性がある低分子量化合物を除去するためにＰＤ１０カラムの上方でのゲル濾過後に、２８０ｎｍでの吸光度を測定することによってＰＥＰ  ＢＣ２Ｇ０７９および参照ＰＥＰ各々のタンパク質濃度を測定した。国際公開第２０１３１６０３１６号パンフレットに記載されたように実施した定量的ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、存在するタンパク質の８０％超が関心対象のＰＥＰであることを証明した。消光係数は、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／を通してアクセスできるＰｒｏｔ  Ｐａｒａｍツールを使用して計算した。配列番号２の成熟配列（アミノ酸３６〜５２６）を使用してＰＥＰ  ＢＣ２Ｇ０７９（Ａ２８０１ｃｍ，１ｍｇ／ｍｌ＝２．８１）についての消光係数を計算した。参照ＰＥＰ（Ａ２８０１ｃｍ，１ｍｇ／ｍｌ＝３．０５）については配列番号５の成熟配列（アミノ酸３７〜５２１）を使用した。
【０１０６】
［実施例３．熱安定性プロリン特異的エンドプロテアーゼ（ＰＥＰ）ＢＣ２Ｇ０７９］
ＰＥＰ  ＢＣ２Ｇ０７９の熱安定性を評価するために、活性アッセイの前に、ＰＣＲ装置内のＰＣＲプレート内で５５℃および６５℃で１５分間にわたりバッファー（０．１ＭのＮａＡｃ、ｐＨ４．５、５０ｍＭのＮａＣｌを含む）中の実施例１で製造した培養上清の１０倍希釈液の１００μＬアリコートのインキュベーションを実施した。１５分間のインキュベーション後、サンプルをＰＣＲ装置内で２５℃へ迅速に冷却した。各サンプルのｐＮＡＳＵ／ｍＬを測定した。残留活性を決定するために、高温でのインキュベーション前に測定した初期活性（０分時）を参照（１００％）として使用した。
【０１０７】
【表２】
0006601630.tif 000003
【０１０８】
表１の結果は、ラサムソニア・エメルソニイ（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）由来のＰＥＰ  ＢＣＧ０７９が摂氏６５℃の温度で相当に安定性であることを証明している。
【０１０９】
［実施例５．Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来の参照ＰＥＰと比較したＰＥＰ  ＢＣ２Ｇ０７９の熱安定性プロファイル］
より厳格な条件下でＰＥＰ  ＢＣ２Ｇ０７９の熱安定性プロファイルを評価するために、活性アッセイの前に加熱工程を実施した。実施例１において製造した培養上清の１００μＬアリコートをバッファー（５０ｍＭのＮａＣｌを含む０．１ＭのＮａＡｃ、ｐＨ４．５）中に１０倍に希釈し、ＰＣＲ装置内のＰＣＲプレート内である温度範囲にわたり加熱した。１５分間のインキュベーション時間後、サンプルをＰＣＲ装置内で２５℃へ迅速に冷却した。各サンプルのｐＮＡＳＵ／ｍＬを測定した。残留活性を決定するために、高温でのインキュベーション前に測定した初期活性（０分時）を参照（１００％）として使用した。表３に表示した結果は、ラサムソニア・エメルソニイ（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼ（ＢＣＧ０７９）は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来の参照プロリン特異的エンドプロテアーゼと比較して実質的により熱安定性であることを証明している。
【０１１０】
【表３】
0006601630.tif 000004
【０１１１】
［実施例６．ＰＥＰ  ＢＣ２Ｇ０７９のｐＨ活性プロファイル］
ＰＥＰ  ＢＣ２Ｇ０７９の操作上のｐＨ範囲を評価するために、培養上清およびＡｃ−ＡＡＰ−ｐＮＡ基質はいずれもｐＨ３．５〜ｐＨ７の範囲内のバッファー中に希釈した（５０ｍＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍのクエン酸／Ｎａ２ＨＰＯ４）。引き続いて、１００μＬの希釈上清は、９６ウエルの平底ＭＴＰ中で１００μＬの６ｍＭのＡｃ−ＡＡＰ−ｐＮＡ基質溶液と混合した。反応は、４０μＬの１ＭのＮａＯＨを添加して２０℃で６０分後に停止させた。ＰＥＰの活性は、４０５ｎｍでの吸光度の増加によって測定した。表４に表示した結果は、ＢＣ２Ｇ０７９についての最高活性は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来の参照ＰＥＰがｐＨ＝５．５で最高活性（１００％）を示した１００％で設定されたｐＨ＝５．０で観察された。総合すると、ＢＣ２Ｇ０７９のｐＨ活性プロファイルは、より酸性ｐＨ操作条件に向かって０．５ｐＨ単位変化した。結果として、ｐＨ５．５未満では、ＰＥＰ  ＢＣ２Ｇ０７９は、ＰＥＰ参照と比較してより高い相対活性を示す。
【０１１２】
【表４】
0006601630.tif 000005
【０１１３】
［実施例７．マッシング試験］
［７．１．方法］
ＰＮＡＣＵを測定するために、１００μＬのアリコートは、５０ｍＭのＮａＣｌを含有する０．１ＭのＮａＡｃバッファー、ｐＨ４．５中の１００μＬの６ｍＭのＡｃ−ＡＡＰ−ｐＮＡを含むＮｕｎｃ  ９６平底ＭＴＰ内で混合する。４０５ｎｍでのＯＤの増加は、Ｔｅｃａｎ  ＭＴＰ分光光度計における時間の関数として記録される。ＰＮＡＣＵは、曲線の線形部、好ましくは初期勾配から計算しなければならない。このアッセイは、２０℃で実施する。検出器の線形範囲内に留まっている間の十分に長時間にわたりＯＤの増加を測定するために、酵素サンプルは、５０ｍＭのＮａＣｌを備える０．１ＭのＮａＡｃバッファー（ｐＨ４．５）を用いて適宜に希釈する。１ＰＮＡＣＵは、４０５ｎｍでの１ＯＤの吸光度の増加に対応するｐＮＡの量である、１時間にＡｃ−ＡＡＰ−ｐＮＡから遊離する酵素の量である。
【０１１４】
混濁活性タンパク質は、この方法のためのＰｆｅｕｆｆｅｒ社の操作取扱説明書を使用してタンノメーター（Ｔａｎｎｏｍｅｔｅｒ）を用いて測定した。サンプルにタンニン酸を加え、９０度散乱角度下で測定した混濁をＥＢＣ単位で表示し、２．５、５および１０ｍｇ／ｌのタンニン酸の添加について報告した。
【０１１５】
麦芽汁中のグリアジンは、グルテン含量についての尺度として競合Ｅｌｉｓａ（ＲＩＤＡＳＣＲＥＥＮ（登録商標）グリアジン競合法（Ｒ−Ｂｉｏｐｈａｒｍ）を用いて決定した。
【０１１６】
［７．２．マッシング中の混濁活性タンパク質およびグルテンの分解］
マッシングプロセス中の熱安定性ＰＥＰ  ＢＣ２Ｇ０７９酵素による混濁活性タンパク質およびグルテンの分解を決定し、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来の低熱安定性ＰＥＰ参照酵素の性能と比較した。１回のマッシング実験において、４６０ＰＮＡＣＵ／ｍｌを含有する５ｍＬの熱安定性ＰＥＰ  ＢＣ２Ｇ０７９を２００ｍＬのマッシュに加えた。また別のマッシング実験において、４６０ＰＮＡＣＵ／ｍＬを含有する５ｍＬの参照ＰＥＰを加えた。マッシングプロセスの開始時に酵素を加えた。第３回のマッシュを実施し、このときブランク比較として機能させるために、酵素溶液の代わりに同量の水を加えた。
【０１１７】
実験室規模のマッシング試験は、マッシング浴内で実施した（Ｌｏｃｈｎｅｒ  Ｌａｂｏｒ  ｔｅｃｈｎｉｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。２００ｍＬの水中で８０ｇの粉砕標準ＥＢＣ麦芽を使用した。マッシュは、表５に示したように段階的に加熱した。マッシュは、マッシングプロセス中に１００ｒｐｍで持続的に撹拌した。マッシングの終了時、マッシュは濾紙（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、ＭＮ６１４  １／４、径３２０ｍｍ）に通してろ過した。ろ液は、麦芽汁と呼ばれる。麦芽中からサンプルを採取し、混濁感受性タンパク質およびグルテンの存在について分析し、プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性（ｐＮＡＳＵ）を決定した。
【０１１８】
【表５】
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【０１１９】
混濁感受性タンパク質およびグリアジンの分解の結果は、表６および表７に示した。
【０１２０】
【表６】
0006601630.tif 000007
【０１２１】
【表７】
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【０１２２】
表６および７に示した結果は、低熱安定性参照ＰＥＰと比較して、ＢＣ２Ｇ０７９のような熱安定性ＰＥＰがマッシングプロセス中に混濁活性タンパク質およびグリアジンを分解させることにはるかに効率的であることを証明している。ＰＥＰの残留活性も上述のマッシングプロセスの終了時に決定した（表８）。熱安定性ＰＥＰ  ＢＣ２Ｇ０７９のみが依然として効率的であるが、参照ＰＥＰは完全に不活性化されている。熱安定性が高いほど、混濁感受性タンパク質の分解およびグリアジンの除去と相関している。マッシングデータは、ＰＥＰがマッシングにおいて活性である時間を熱安定性が有意に延長するため、熱安定性ＰＥＰがマッシングにおいて有利であることを証明している。
【０１２３】
【表８】
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【０１２４】
［実施例８．ＬＣ−ＭＳを用いた成熟ＰＥＰ  ＢＣ２Ｇ０７９の分子量の決定］
成熟ＢＣ２Ｇ０７９  ＰＥＰのＬＣ−ＭＳ分析のために、実施例１．２．において製造した発酵培地の上清の１００μＬのサンプルを１００μＬの２０％のＴＣＡ（Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  ＮＶ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）と混合した。この溶液を１時間にわたり氷上に置いた。タンパク質の沈降後、サンプルを１５分間にわたり１４，０００ｒｐｍおよび４℃で遠心した。遠心分離後、上清を取り出し、ペレットを５００μＬのアセトン（−２０℃、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて１回洗浄し、１０分間にわたり１４，０００ｒｐｍおよび４℃で遠心した。上清を取り出し、ペレットを５０μＬの５０ｍＭのＮａＯＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中に溶解させ、次に３５０μＬの１００ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を加えた。２００μＬのサンプルを還元してアルキル化した。還元させるために５μＬのＴＣＥＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）をこの溶液に加え、１，０００ｒｐｍで３０分間にわたり室温のサーモミキサー内でインキュベートした。アルキル化のために、５μＬの５５０ｍＭのＩＡＡ（ヨードアセトアミド、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を加え、暗所で１，０００ｒｐｍのサーモミキサー内で３０分間インキュベートした。サンプルを脱グリコシル化するために、２０μＬのＰＮＧａｓｅ  Ｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を加えた。サンプルは、一晩３７℃で、１，０００ｒｐｍのサーモミキサー内でインキュベートした。翌日、サンプルを５０μｇ／ｍＬの濃度へ希釈するために、１％のギ酸（Ｍｅｒｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を加えた。タンパク質濃度をＱｕｂｉｔ定量的タンパク質アッセイ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ）上で測定した。サンプルは、Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｉ−クラス−Ｓｙｎａｐｔ  Ｇ２−Ｓ（Ｗａｔｅｒｓ，ＵＫ）上で次のパラメータ：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ３００  Ｃ４  １．７μｍ  ３００Å孔径２．１×５０ｍｍ；カラム温度：７５℃；注入量：１μＬ；移動相Ａ：Ｍｉｌｉ−Ｑ中で０．１％のギ酸（Ｂｉｏｓｏｌｖｅ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）；移動相Ｂ：アセトニトリル中の０．１％のギ酸（Ｂｉｏｓｏｌｖｅ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて分析した。相Ａおよび相Ｂを変化させる（２０〜５０％のＢ）ことによって、カラムに１５分間勾配を適用した。ＭＳ検出器設定は、ラン中のオンザフライの基準質量（ｌｏｃｋ  ｍａｓｓ）としてＬｅｕ−Ｅｎｋ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用するデータ補正を用いて：獲得質量範囲：５００〜３，５００ｍ／ｚ、スキャン時間：１秒間、陽性ＥＳＩ、ＴＯＦ  ＭＳ解像度モードであった。データスペクトルデコンボリューション、荷電状態ストリッピングは、Ｗａｔｅｒｓ  Ｍａｓｓｌｙｎｘ  ＭａｘＥｎｔ１ソフトウエアツールを用いて実施した：出力質量分解能＝１Ｄａ／チャネル；損傷モデル：ガウス（ＦＷＨＨ＝０．７５０Ｄａ；最小強度比＝３３％左および右）；収束するまで反復する。
【０１２５】
アルキル化および脱グリコシル化について補正した後、質量スペクトルは、配列番号２のアミノ酸３６〜５２６に対応する分子量を備える主要種を示している。これに加えて、配列番号２のアミノ酸４１〜５２６に対応する分子量を備える希少種がある。その結果として、成熟ＰＥＰ  ＢＣ２Ｇ０７９サンプル中の主要種の末端は、ＲＤＰＬＨＧＰＴに対応し、希少種のＮ末端はＧＰＴＮＡＳで始まる。いずれの種も質量スペクトル内で複数のピークを示す。各ピークは５７Ｄａまたはアルキル化における差を示している複数の５７Ｄａにより変化した。単一アルキル化は１システイン毎に５７Ｄａを付け加える。スペクトル内では、１、３、５および７ＩＡＡの添加が、アミノ酸配列内の７個のシステインの存在と一致して観察された。完全にアルキル化された主要種および希少種について観察された質量は、各々５５，２１８Ｄａおよび５４，５９８Ｄａである。脱グリコシル化は１つの脱グリコシル化部位当たりさらに１Ｄａを加えるため、このデータは、８つの理論的グリコシル化部位のうちの６〜７つは実際にグリコシル化されていることを示唆している。
【図１】
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【配列表】
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