(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
0006606096.tif 000095
（式中、
Rは、それぞれ独立して、ハロゲン、H、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3Hおよびアルキルから選択され、アルキルは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2および／またはSO3Hで任意に置換され；
QはCR2、NR’、O、SiR2およびSeから選択され；
R’は、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3Hおよびアルキルから選択され、アルキルは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2および／またはSO3Hで任意に置換され；
WはCおよびNから選択され；
Xは、孤立電子対、H、アルキル、アリール、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hから選択され、Xは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2および／またはSO3Hで任意に置換され；
Yは、CR2、C(O)NR2、NR、OおよびSから選択され；そして
Zは、H、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3H、アリールおよびアルキルから選択され、アルキルおよびアリールは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hで任意に置換されるか、またはZおよびYは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5〜7員環を形成することができる）
の化合物、または
【化２４】
0006606096.tif 000096
からなる群から選択される化合物。
【請求項２】
アミンが、NH2、NH(アルキル)、NH(アリール)、N(アルキル)2およびN(アリール)2から独立して選択される、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
YおよびZが、それらが結合する原子と一緒になって、N、OおよびSから選択される1以上のさらなるヘテロ原子、または／およびハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3Hおよびアルキルから選択される1以上の置換基で置換された5〜7員環を形成する、請求項1に記載の化合物。
【請求項４】
YおよびZが、それらが結合する原子と一緒になって、非置換または置換アゼチジン基で置換された5〜7員環を形成する、請求項3に記載の化合物。
【請求項５】
次の式：
【化２】
0006606096.tif 000097
（式中、R’は、ハロゲン、H、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3Hおよびアルキルから選択され、アルキルは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2および
／またはSO3Hで任意に置換される）
で表される、請求項1に記載の化合物。
【請求項６】
次の式：
【化３】
0006606096.tif 000098
（式中、R’は、非置換であるか、または1以上のハロゲン、H、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3Hおよびアルキルで置換されたアゼチジン基から選択される）
で表される、請求項1に記載の化合物。
【請求項７】
次の式：
【化４】
0006606096.tif 000099
で表される、請求項1に記載の化合物。
【請求項８】
次の式：
【化５】
0006606096.tif 000100
で表される、請求項1に記載の化合物。
【請求項９】
次の式：
【化６】
0006606096.tif 000101
で表される、請求項1に記載の化合物。
【請求項１０】
次の式：
【化７】
0006606096.tif 000102
で表される、請求項1に記載の化合物。
【請求項１１】
次の式：
【化８】
0006606096.tif 000103
で表される、請求項1に記載の化合物。
【請求項１２】
次の式：
【化９】
0006606096.tif 000104
で表される、請求項1に記載の化合物。
【請求項１３】
次の式：
【化１０】
0006606096.tif 000105
で表される、請求項1に記載の化合物。
【請求項１４】
次の式：
【化１１】
0006606096.tif 000106
で表される、請求項1に記載の化合物。
【請求項１５】
Xが置換アリールである、請求項1〜14のいずれか1つに記載の化合物。
【請求項１６】
Xが次の：
【化１２】
0006606096.tif 000107
から選択される、請求項1に記載の化合物。
【請求項１７】
XがHおよび孤立電子対から選択される、請求項1に記載の化合物。
【請求項１８】
次の：
【化１３−１】
0006606096.tif 000108
【化１３−２】
0006606096.tif 000109
【化１３−３】
0006606096.tif 000110
【化１３−４】
0006606096.tif 000111
から選択される式で表される、請求項1に記載の化合物。
【請求項１９】
式：
【化１４】
0006606096.tif 000112
（式中、
Rは、それぞれ独立して、ハロゲン、H、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3Hおよびアルキルから選択され、アルキルは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2および／またはSO3Hで任意に置換され；
QはCR2、NR、O、S、SiR2およびSeから選択され；
WはCおよびNから選択され；
MはCR2、C(O)、SO2およびPO2から選択され；
LはO、S、NRおよびCN2から選択され、ここで、任意にLおよびWは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5員環を形成することができ；
UおよびVは、独立して、H、アルキル、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hから選択され、アルキルは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、および／またはSO3Hで任意に置換されるか、またはUおよびVは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5〜7員環を形成することができ；
YはH、CR2、C(O)NR2、NR、OおよびSから選択され；そして
Zは、H、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3H、アリールおよびアルキルから選択され、アルキルおよびアリールは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hで任意に置換されるか、またはZおよびYは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5〜7員環を形成することができる）
で表される化合物、または次の式：
【化２５】
0006606096.tif 000113
の化合物。
【請求項２０】
アミンが、NH2、NH(アルキル)、NH(アリール)、N(アルキル)2およびN(アリール)2から独立して選択される、請求項19に記載の化合物。
【請求項２１】
YおよびZが、それらが結合する原子と一緒になって、N、OおよびSから選択される1以上のさらなるヘテロ原子、または／およびハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3Hおよびアルキルから選択される1以上の置換基で置換された5〜7員環を形成する、請求項19に記載の化合物。
【請求項２２】
YおよびZが、それらが結合する原子と一緒になって、非置換または置換アゼチジン基で置換された5〜7員環を形成する、請求項21に記載の化合物。
【請求項２３】
次の式：
【化１５】
0006606096.tif 000114
（式中、R’は、ハロゲン、H、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3Hおよびアルキルから選択され、アルキルは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3Hで任意に置換されるか、または非置換であるか、もしくは1以上のハロゲン、H、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3Hおよびアルキルで置換されたアゼチジン基から選択される）
で表される、請求項19に記載の化合物。
【請求項２４】
次の式：
【化１６】
0006606096.tif 000115
で表される、請求項19に記載の化合物。
【請求項２５】
次の式：
【化１７】
0006606096.tif 000116
で表される、請求項19に記載の化合物。
【請求項２６】
次の式：
【化１８】
0006606096.tif 000117
で表される、請求項19に記載の化合物。
【請求項２７】
UおよびVが、それらが結合する原子と一緒になって置換アリールを含む、請求項19に記載の化合物。
【請求項２８】
次の：
【化１９−１】
0006606096.tif 000118
【化１９−２】
0006606096.tif 000119
【化１９−３】
0006606096.tif 000120
【化１９−４】
0006606096.tif 000121
【化１９−５】
0006606096.tif 000122
【化１９−６】
0006606096.tif 000123
【化１９−７】
0006606096.tif 000124
【化１９−８】
0006606096.tif 000125
から選択される式で表される、請求項19に記載の化合物。
【請求項２９】
式：
【化２０】
0006606096.tif 000126
（式中、
Rは、それぞれ独立して、ハロゲン、H、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3Hおよびアルキルから選択され、アルキルは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2および／またはSO3Hで任意に置換され；
QはCR2、NR、O、S、SiR2およびSeから選択され；
WはCおよびNから選択され；
Xは、孤立電子対、H、アルキル、アリール、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hから選択され、Xは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2および／またはSO3Hで任意に置換され；
YはH、CR2、C(O)NR2、NR、OおよびSから選択され；そして
Zは、H、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3H、アリールおよびアルキルから選択され、アルキルおよびアリールは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hで任意に置換されるか、またはZおよびYは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5〜7員環を形成することができる）
の化合物；および
可逆的または不可逆的に該化合物を結合させる結合成分
を含むキット。
【請求項３０】
結合成分がタンパク質を含む、請求項29に記載のキット。
【請求項３１】
式：
【化２１】
0006606096.tif 000127
（式中、
Rは、それぞれ独立して、ハロゲン、H、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3Hおよびアルキルから選択され、アルキルは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2および／またはSO3Hで任意に置換され；
QはCR2、NR、O、S、SiR2およびSeから選択され；
WはCおよびNから選択され；
MはCR2、C(O)、SO2およびPO2から選択され；
LはO、S、NRおよびCN2から選択され、ここで、任意にLおよびWは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5員環を形成することができ；
UおよびVは、独立して、H、アルキル、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hから選択され、アルキルは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、および／またはSO3Hで任意に置換されるか、またはUおよびVは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5〜7員環を形成することができ；
YはH、CR2、C(O)NR2、NR、OおよびSから選択され；そして
Zは、H、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3H、アリールおよびアルキルから選択され、アルキルおよびアリールは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hで任意に置換されるか、またはZおよびYは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5〜7員環を形成することができる）
の化合物：および
可逆的または不可逆的に該化合物を結合させる結合成分
を含むキット。
【請求項３２】
結合成分がタンパク質を含む、請求項31に記載のキット。
【請求項３３】
試料を式：
【化２２】
0006606096.tif 000128
（式中、
Rは、それぞれ独立して、ハロゲン、H、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3Hおよびアルキルから選択され、アルキルは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2および／またはSO3Hで任意に置換され；
QはCR2、NR、O、S、SiR2およびSeから選択され；
WはCおよびNから選択され；
Xは、孤立電子対、H、アルキル、アリール、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hから選択され、Xは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2および／またはSO3Hで任意に置換され；
YはH、CR2、C(O)NR2、NR、OおよびSから選択され；そして
Zは、H、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3H、アリールおよびアルキルから選択され、アルキルおよびアリールは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hで任意に置換されるか、またはZおよびYは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5〜7員環を形成することができる）
の化合物と接触させ、標的物質の存在を示す、該化合物からの発光を検出することを含む、標的物質を検出するための方法。
【請求項３４】
検出工程が顕微鏡を用いて行われる、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
約100 nm〜約1000 nmの波長を含む吸収光に化合物を曝露する工程をさらに含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３６】
接触工程と検出工程が生細胞中で行われる、請求項33に記載の方法。
【請求項３７】
化合物が第1の化合物と第2の化合物を含み、
第1の化合物が第1の標的物質に選択的で、第1の発光を放出することができ、第2の化合物が第2の標的物質に選択的で、第2の発光を放出することができ、そして検出工程が第1の標的物質の存在を示す第1の発光と第2の標的物質の存在を示す第2の発光を検出することを含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３８】
試料を式：
【化２３】
0006606096.tif 000129
（式中、
Rは、それぞれ独立して、ハロゲン、H、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3Hおよびアルキルから選択され、アルキルは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2および／またはSO3Hで任意に置換され；
QはCR2、NR、O、S、SiR2およびSeから選択され；
WはCおよびNから選択され；
MはCR2、C(O)、SO2およびPO2から選択され；
LはO、S、NRおよびCN2から選択され、ここで、任意にLおよびWは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5員環を形成することができ；
UおよびVは、独立して、H、アルキル、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hから選択され、アルキルは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、および／またはSO3Hで任意に置換されるか、またはUおよびVは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5〜7員環を形成することができ；
YはH、CR2、C(O)NR2、NR、OおよびSから選択され；そして
Zは、H、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3H、アリールおよびアルキルから選択され、アルキルおよびアリールは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hで任意に置換されるか、またはZおよびYは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5〜7員環を形成することができる）
の化合物と接触させ、標的物質の存在を示す、該化合物からの発光を検出することを含む、標的物質を検出するための方法。
【請求項３９】
検出工程が顕微鏡を用いて行われる、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
約100 nm〜約1000 nmの波長を含む吸収光に化合物を曝露する工程をさらに含む、請求項38に記載の方法。
【請求項４１】
接触工程と検出工程が生細胞中で行われる、請求項38に記載の方法。
【請求項４２】
化合物が第1の化合物と第2の化合物を含み、
第1の化合物が第1の標的物質に選択的で、第1の発光を放出することができ、
第2の化合物が第2の標的物質に選択的で、第2の発光を放出することができ、そして
検出工程が第1の標的物質の存在を示す第1の発光と第2の標的物質の存在を示す第2の発光を検出することを含む、請求項38に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１４年４月１日に出願された米国仮出願第６１／９７３，７９５号および２０１４年５月９日に出願された米国仮出願第６１／９９１，１０９号の利益を主張し、その全体の開示が参照により、本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
ここに開示される主題は、蛍光化合物に関する。特に、ここに開示される主題は、アゼチジン-置換多環式化学蛍光体、ならびにそれらを作る方法および用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
序論
蛍光顕微鏡検査法は、生細胞内の特定の分子の画像化を可能にする。この技術は、明るく、光安定性の蛍光色素を用いる生体分子の正確な標識化に依存している。緑色蛍光タンパク質（GFP）のような、遺伝的にコード化された蛍光体が蛍光画像化の柱であり、それは遺伝的特異性で標識化することができる。しかしながら、これらのタンパク質色素は、単一分子画像化実験のような多くの適用に対して必須の光安定性が欠けている。過去２０年間、蛍光タンパク質の遺伝的特異性を小分子の蛍光体の好ましい光物理学と組み合わせた、多くの代替の標識戦略が開発されている。魅力的な代替手段は、FlAsH、酵素に基づく自己標識タグ（例えば、SnapTagおよびHaloTag）、求電子リガンド-受容体ペア（例えば、TMPTagおよびクマリン-PYP）、およびリポ酸リガーゼ変異体を含む。自己標識タグは、特定タンパク質の多様な合成蛍光体を用いての融合の標識化が可能である。自己標識タグは、生細胞内での多くの画像化実験を可能にしている。
【０００４】
化学色素の総合的集合は広範囲にわたるけれども、比較的少数が細胞内標識のために必要な細胞透過性を示す。したがって、細胞内自己標識タグリガンドの利用可能な色調は、クマリンおよびローダミン骨格に基づく古典的で正味中性の蛍光体に限定されており、それらは膜透過性および迅速な標識化動態を示すが、最適以下の明るさと光安定性を示す。色素性能を改善するための以前の運動（例えば、Cy, Alexa Fluor）は、構造的硬直化およびスルホネート基の添加のような実質的な変更を含んだ。これらの試みは、インビトロおよび細胞外部で役立つが、生細胞内での適用に相容れない高極性で細胞非透過性の色素をもたらした。
【０００５】
自己標識タグとローダミン色素の適合性にもかかわらず、生細胞標識実験のために、この蛍光体のクラスを最適化するための仕事はほとんど行われていない。以前の試みは、蛍光の明るさおよび光安定性に加えて、多くの場合顕著な構造変更による水溶性を増加させることに焦点を合わせた。そのような色素は、インビトロおよび細胞外の適用に対して機能するが、余り極性過ぎて細胞に受動的に侵入することはできない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、合成が容易であり、改善された明るさを示し、適当な細胞透過性を示す化合物の必要性がある。インビボで自己標識タグとして機能することができる化合物の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
概要
1つの観点で、ここに具体化され、かつ広く記載されているように、ここに開示される主題は、蛍光タグとして役に立つ化合物、それらを作る方法、1以上の標的物質、場合により生細胞中の標的物質を画像化するためにそれらの化合物を用いる方法、およびそれらの化合物を用いるためのキットに関する。
ある実施態様において、本化合物は既知の蛍光タグのアゼチジン-置換誘導体である。ある実施態様において、本アゼチジン-置換化合物は、それらの元の化合物と比較して、より大きい量子収率を示すことができる。
【０００８】
ここに開示される化合物の実施態様は、式：
【化１】
0006606096.tif 000002
【０００９】
（式中、
Rは、それぞれ独立して、ハロゲン、H、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3Hおよびアルキルから選択され、アルキルは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、C(O)NR2、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2および／またはSO3Hで任意に置換され；
QはCR(2)、NR、O、S、SiR(2)およびSeから選択され；
WはCおよびNから選択され；
【００１０】
Xは、孤立電子対、H、アルキル、アリール、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hから選択され、Xは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2および／またはSO3Hで任意に置換され；
YはH、CR(2)、C(O)NR2、NR、OおよびSから選択され；そして
Zは、H、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、COO(アルキル)、COO(アリール)、C(O)NR2、PO3H2、SO3H、アリールおよびアルキルから選択され、アルキルおよびアリールは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hで任意に置換されるか、またはZおよびYは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5〜7員環を形成することができる）
の化合物を含む。
【００１１】
ここに開示されるものの実施態様は、式：
【化２】
0006606096.tif 000003
【００１２】
（式中、
Rは、それぞれ独立して、ハロゲン、H、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3Hおよびアルキルから選択され、アルキルは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、C(O)NR2、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2および／またはSO3Hで任意に置換され；
QはCR(2)、NR、O、S、SiR(2)およびSeから選択され；
WはCおよびNから選択され；
MはCR(2)、C(O)、SO2およびPO2から選択され；
【００１３】
LはO、S、NRおよびCN2から選択され、ここで、任意にLおよびWは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5〜7員環を形成することができ；
UおよびVは、独立して、H、アルキル、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hから選択され、アルキルは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、および／またはSO3Hで任意に置換されるか、またはUおよびVは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5〜7員環を形成することができ；
YはH、CR(2)、C(O)NR2、NR、OおよびSから選択され；そして
Zは、H、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3H、アリールおよびアルキルから選択され、アルキルおよびアリールは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hで任意に置換されるか、またはZおよびYは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5〜7員環を形成することができる）
の化合物を含む。
【００１４】
ここに開示される主題の実施態様はキットも含む。キットは、本明細書に記載される化合物のいずれかとそれらの化合物に可逆的および不可逆的に結合する結合成分を含むことができる。ある実施態様において、結合成分はタンパク質を含む。ある実施態様において、キットは式：
【化３】
0006606096.tif 000004
【００１５】
（式中、
Rは、それぞれ独立して、ハロゲン、H、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3Hおよびアルキルから選択され、アルキルは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、C(O)NR2、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2および／またはSO3Hで任意に置換され；
QはCR(2)、NR、O、S、SiR(2)およびSeから選択され；
WはCおよびNから選択され；
【００１６】
Xは、孤立電子対、H、アルキル、アリール、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hから選択され、Xは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2および／またはSO3Hで任意に置換され；
YはH、CR(2)、C(O)NR2、NR、OおよびSから選択され；そして
Zは、H、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、COO(アルキル)、COO(アリール)、C(O)NR2、PO3H2、SO3H、アリールおよびアルキルから選択され、アルキルおよびアリールは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hで任意に置換されるか、またはZおよびYは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5〜7員環を形成することができる）
を有する化合物を含み、さらに、任意に可逆的または不可逆的にその化合物を結びつける結合成分を含む。
【００１７】
キットのある実施態様において、キットは式：
【化４】
0006606096.tif 000005
【００１８】
（式中、
Rは、それぞれ独立して、ハロゲン、H、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3Hおよびアルキルから選択され、アルキルは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、C(O)NR2、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2および／またはSO3Hで任意に置換され；
QはCR(2)、NR、O、S、SiR(2)およびSeから選択され；
WはCおよびNから選択され；
MはCR(2)、C(O)、SO2およびPO2から選択され；
【００１９】
LはO、S、NRおよびCN2から選択され、ここで、任意にLおよびWは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5〜7員環を形成することができ；
UおよびVは、独立して、H、アルキル、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hから選択され、アルキルは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、および／またはSO3Hで任意に置換されるか、またはUおよびVは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5〜7員環を形成することができ；
YはH、CR(2)、C(O)NR2、NR、OおよびSから選択され；そして
Zは、H、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3H、アリールおよびアルキルから選択され、アルキルおよびアリールは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hで任意に置換されるか、またはZおよびYは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5〜7員環を形成することができる）
の化合物を含み、さらに、任意に可逆的または不可逆的にその化合物を結びつける結合成分を含む。
【００２０】
ここに開示される主題の実施態様は、標的物質を画像化、測定および／または検出するための方法も含む。ある実施態様において、その方法は、標的物質を有すると推測されるかまたは知られている試料を、本明細書に記載の化合物のいずれかと接触させ、次いでその化合物からの発光、すなわち標的物質の存在を示す発光を検出することを含むことができる。
【００２１】
ある実施態様において、その方法は標的物質を選択的に結合する化合物と試料を接触させることを含み、その化合物は、式：
【化５】
0006606096.tif 000006
【００２２】
（式中、
Rは、それぞれ独立して、ハロゲン、H、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3Hおよびアルキルから選択され、アルキルは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、C(O)NR2、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2および／またはSO3Hで任意に置換され；
QはCR(2)、NR、O、S、SiR(2)およびSeから選択され；
WはCおよびNから選択され；
【００２３】
Xは、孤立電子対、H、アルキル、アリール、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hから選択され、Xは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2および／またはSO3Hで任意に置換され；
YはH、CR(2)、C(O)NR2、NR、OおよびSから選択され；そして
Zは、H、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、COO(アルキル)、COO(アリール)、C(O)NR2、PO3H2、SO3H、アリールおよびアルキルから選択され、アルキルおよびアリールは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hで任意に置換されるか、またはZおよびYは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5〜7員環を形成することができる）
の化合物であり、その化合物からの発光、すなわち標的物質の存在を示す発光を検出することを含む。
【００２４】
ある実施態様において、その方法は、試料を式：
【化６】
0006606096.tif 000007
【００２５】
（式中、
Rは、それぞれ独立して、ハロゲン、H、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3Hおよびアルキルから選択され、アルキルは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、C(O)NR2、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2および／またはSO3Hで任意に置換され；
QはCR(2)、NR、O、S、SiR(2)およびSeから選択され；
WはCおよびNから選択され；
MはCR(2)、C(O)、SO2およびPO2から選択され；
【００２６】
LはO、S、NRおよびCN2から選択され、ここで、任意にLおよびWは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5〜7員環を形成することができ；
UおよびVは、独立して、H、アルキル、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hから選択され、アルキルは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、および／またはSO3Hで任意に置換されるか、またはUおよびVは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5〜7員環を形成することができ；
YはH、CR(2)、C(O)NR2、NR、OおよびSから選択され；そして
Zは、H、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3H、アリールおよびアルキルから選択され、アルキルおよびアリールは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hで任意に置換されるか、またはZおよびYは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5〜7員環を形成することができる）
の化合物と接触させ、その化合物からの発光、すなわち標的物質の存在を示す発光を検出することを含む。
【００２７】
本発明のさらなる利点は、以下の記載中に一部明記されるか、その記載から一部明らかであるか、または本発明の実施によって知ることができるであろう。
本発明の利点は、特許請求の範囲中で具体的に指摘された要素と組合せによって理解され、達成されるであろう。先の一般的な記載および以下の詳細な説明の両方は、クレームされる本発明を例示するものであり、かつ説明するだけのものであり、本発明を限定するものではないと理解されたい。
【００２８】
本開示の主題の新規な特徴は、特許請求の範囲中に詳細に明記されている。ここに開示される主題の特徴と利点のより良い理解は、そこで本開示の本質が用いられている実施態様を明記している以下の詳細な説明、および次に説明される図面を参照することによって得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、ねじれ分子内電荷移動（TICT）の過程を示すJablonski図を含む。
【図２】図２は、テトラメチルローダミンおよびJF549に対する正規化吸収（abs）と蛍光発光（fl）スペクトルを示すプロットを含む。
【図３】図３は、テトラメチルローダミンおよびJF549に対する正規化吸収対誘電率（εr）を示すプロットを含む。
【図４】図４は、HaloTag-H2Bを発現し、JF549-HaloTagリガンドとインキュベートされた洗浄HeLa生細胞からの核の共焦点最大投影像を含む；スケールバー＝5μm。
【図５】図５は、JF549-HaloTagリガンドまたはテトラメチルローダミン-HaloTagリガンドで標識したHloTag-H2Bの明るさ（n＞4,000）および飛跡長（track length）（n＞500）の比較を示すウィスカープロット図を含む。ここで、十字記号は平均を示し、ウィスカースパンは10〜90パーセンタイルを示す。
【図６】図６は、HaloTag-H2Bを発現し、JF549-HaloTagリガンドで標識されたU2OS固定細胞のdSTORM蛍光顕微鏡画像を含む。平均局在エラーは17.2 nmであり、中央局在エラーは14.1 nmであった；スケールバー＝5μm。
【図７】図７は、HaloTag-H2Bを発現し、TMR-HaloTagリガンドで標識されたU2OS固定細胞のdSTORMおよび広視野（挿入画像）の蛍光顕微鏡画像を含む。平均局在エラーは19.2 nmであり、中央局在エラーは17.0 nmであった；スケールバー＝5μm。
【図８】図８は、JF549-HaloTagリガンド（図６）およびTMR-HaloTagリガンド（図７）を用いた画像実験に対する局在エラーの正規分布を示すプロットを含む。
【図９】図９は、HaloTag-H2Bを発現し、JF549-HaloTagリガンドで標識されたHela生細胞の核のdSTORM蛍光顕微鏡画像を含む；スケールバー＝5μm。
【図１０】図１０は、HaloTag-H2Bを発現し、JF646-HaloTagリガンドで標識されたU2OS固定細胞核のdSTORM蛍光顕微鏡画像を含む。平均局在エラーは11.1 nmであり、中央局在エラーは8.4 nmであった；スケールバー＝5μm。
【図１１】図１１は、HaloTag-H2Bを発現し、SiTMR-HaloTagリガンドで標識されたU2OS固定細胞のdSTORM蛍光顕微鏡画像を含む。平均局在エラーは11.9 nmであり、中央局在エラーは9.0 nmであった；スケールバー＝5μm。
【図１２】図１２は、JF646-HaloTagリガンド（図１０）およびSiTMR-HaloTagリガンド（図１１）を用いた画像実験に対する局在エラーの正規分布を示すプロットを含む。
【図１３】図１３は、HaloTag-チューブリンを発現し、JF646-HaloTagリガンドで標識されたHela生細胞の広視野蛍光顕微鏡画像を含む。
【図１４】図１４は、HaloTag-チューブリンを発現し、JF646-HaloTagリガンドで標識されたHela生細胞のdSTORM顕微鏡画像を含む。平均局在エラーは9.23 nmであり；中央局在エラーは7.14 nmであった。
【図１５】図１５は、広視野画像（図１３）およびdSTORM画像（図１４）におけるラインスキャン強度をライン長の関数として示したプロットを含む。
【図１６】図１６は、過剰のHaloTagタンパク質の非存在（-HT）および存在（+HT）下でのSiTMR-HaloTagリガンド（5μm）の吸光度スペクトルのプロットを含む。
【図１７】図１７は、過剰のHaloTagタンパク質の非存在（-HT）および存在（+HT）下でのJF646-HaloTagリガンド（5μm）の吸光度スペクトルのプロットを含む。
【図１８】図１８は、H2B-HaloTagでトランスフェクトされ、SiTMR-HaloTagリガンド（100 nM）とインキュベートされ、中間の洗浄工程なしで画像化されたHela生細胞の広視野蛍光顕微鏡画像を含む；破線は細胞の境界線を示す；スケールバー：10μm。
【図１９】図１９は、H2B-HaloTagでトランスフェクトされ、JF646-HaloTagリガンド（100 nM）とインキュベートされ、中間の洗浄工程なしで画像化されたHela生細胞の広視野蛍光顕微鏡画像を含む；破線は細胞の境界線を示す；スケールバー：10μm。
【図２０】図２０は、ライン長の関数としての図１８におけるラインスキャン強度のプロットを含む。
【図２１】図２１は、ライン長の関数としての図１９におけるラインスキャン強度のプロットを含む。
【図２２】図２２は、HaloTag-H2Bを発現し、JF646-HaloTagリガンド（最上列）またはSiTMR-HaloTagリガンド（最下列）のいずれかの100 nmとインキュベートされた無洗浄Hela生細胞の広視野蛍光顕微鏡画像の例を含む。
【図２３】図２３は、U2OS生細胞の核中のJF646-HaloTagリガンドで標識されたHaloTag-H2BのdSTORM H2B画像に重ね合わされたJF549-SnapTagリガンドからのSnapTag-TetR-JF549の複合体の単一分子軌跡の描画を含む；スケールバー＝5μm。
【図２４】図２４は、U2OS生細胞におけるH2BのdSTORM画像ならびに速いTetR拡散性（2〜10μm2s-1；黄色）と遅いTetR拡散性（＜2μm2s-1；青色）の領域の重ね合せを示す画像を含む。
【図２５】図２５は、HaloTag-H2Bで共局在される（黒色）か、またはHaloTag-H2Bで共局在されない（灰色）SnapTag-TetRの見掛けの拡散係数（Dapp）の正規分布を示す。
【図２６】図２６は、SnapTag-H2Bを発現し、DRAQ5およびSnap-Cell 430で標識されたHela生細胞におけるDRAQ5核染色の蛍光を示す、広視野蛍光顕微鏡画像を含む；スケールバー＝50μm。
【図２７】図２７は、SnapTag-H2Bを発現し、DRAQ5およびアゼチジニル-クマリン-SnapTagリガンドで標識されたHela生細胞におけるDRAQ5核染色の蛍光を示す、広視野蛍光顕微鏡画像を含む；スケールバー＝50μm。
【図２８】図２８は、SnapTag-H2Bを発現し、DRAQ5およびSnap-Cell 430で標識されたHela生細胞中におけるSnap-Cell 430-標識SnapTag-H2Bの蛍光を示す、広視野蛍光顕微鏡画像を含む；スケールバー＝50μm。
【図２９】図２９は、SnapTag-H2Bを発現し、DRAQ5およびアゼチジニル-クマリン-SnapTagリガンドで標識されたHela生細胞におけるアゼチジニル-クマリン-標識SnapTag-H2Bの蛍光を示す、広視野蛍光顕微鏡画像を含む；スケールバー＝50μm。
【図３０】図３０は、Snap-Cell 430またはアゼチジニル-クマリン-SnapTagリガンドで標識されたとき、細胞中のバックグラウンドのクマリン標識より上の中央核蛍光の定量化を示すプロットを含む（n = 5、誤差バー、s.e.m）。
【図３１】図３１は、ここに開示される主題の実施態様に従う化合物を合成するための典型的な合成スキームを含む。
【図３２】図３２は、ここに開示される主題の実施態様に従う化合物を合成するための典型的な合成スキームを含む。
【図３３】図３３は、ここに開示される主題の実施態様に従う化合物を合成するための典型的な合成スキームを含む。
【図３４】図３４は、ここに開示される主題の実施態様に従う化合物を合成するための典型的な合成スキームを含む。
【図３５】図３５は、ここに開示される主題の実施態様に従う化合物を合成するための典型的な合成スキームを含む。
【図３６】図３６は、ここに開示される主題の実施態様に従う化合物を合成するための典型的な合成スキームを含む。
【図３７】図３７は、ここに開示される主題の実施態様に従う化合物を合成するための典型的な合成スキームを含む。
【図３８】図３８は、ここに開示される主題の実施態様に従う化合物を合成するための典型的な合成スキームを含む。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
典型的な実施態様の説明
ここに開示される主題の1以上の実施態様の詳細が本明細書に示されている。本明細書に記載される実施態様への改変およびその他の実施態様は、本明細書で提供される情報の研究後、当業者に明らかとなるであろう。本明細書で提供される情報、および特にここに記載の典型的な実施態様の具体的詳細は、主に理解を明確にするために提供され、それらからの不必要な限定がないことを理解すべである。矛盾する場合、定義を含む本明細書の規定が支配するであろう。
【００３１】
ここに開示される主題は、蛍光体（例えば蛍光色素）としての有用性を有する化合物を含む。本化合物は、特定の物質の位置および／または濃度を観測し特徴付けるための蛍光プローブとして利用することができる。
この点に関して、「プローブ」、「色素」、「タグ」などの用語は、標的物質に選択的であり、そして／または標的物質に選択的である結合成分に結合する蛍光部分を含む化合物を言及するために本明細書中で区別なく用いられる。プローブは発光を放出することができ、それは標的物質の存在を決定および／または標的物質の量を測定するために用いることができる。この点において、ここに開示される主題は、本化合物およびそれらの中間体を用いるための方法、ならびにそのような化合物およびそれらの中間体を製造するための方法も含む。
【００３２】
定義
別に定義されていなければ、本明細書で用いられる全ての技術および科学用語は、ここに開示される主題が属する分野の当業者に共通に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に開示されるものに類似または等価なあらゆる方法、デバイスおよび材料が、ここに開示される主題の実施または試験において使用することができるが、典型的な方法、デバイスおよび材料がここに記載される。
【００３３】
長年続いている特許法の慣行に従って、「a」、「an」および「the」の用語は、本願において用いられるとき、特許請求の範囲を含めて、「１またはそれより多い」を指す。よって、例えば、「化合物(a compound)」と言及することは、多数のそのような化合物を含むなどである。
【００３４】
別に指示されていない限り、本明細書および特許請求の範囲で用いられる成分量、反応条件のような特性、その他諸々を表す全ての数値は、全ての事例において、「約」の用語により修飾されていると理解されたい。したがって、そうでないと指示されていない限り、この明細書および特許請求の範囲において規定された数値パラメータは、ここで開示の主題によって得ようとする所望の特性に依存して変動し得る近似値である。
【００３５】
本明細書で用いられるとき、「約」という用語は、値または質量、重量、時間、容量、濃度もしくはパーセンテージについて言及するとき、特定量からの、ある実施態様においては±20%、ある実施態様においては±10%、ある実施態様においては±5%、ある実施態様においては±1%、ある実施態様においては±0.5%、ある実施態様においては±0.1%の変化を包含することを意味する。なぜなら、そのような変化は開示された方法を行うのに適切であるからである。
【００３６】
本明細書で用いられるとき、範囲は、ある特定値に「約」を付した値からおよび/または別の特定値に「約」を付した値までとして表すことができる。また、本明細書で開示される多くの値が存在し、各値はその値自体に加えて、当該特定値に「約」を付した値としても本明細書で開示されていると理解されたい。例えば、値「10」が開示されている場合、「約10」もまた開示されている。また、２つの特定単位間の各単位も開示されていると理解されたい。例えば、10および15が開示されている場合、11、12、13および14もまた開示されている。
【００３７】
本明細書に用いられる「吸収波長」という用語は、光を放出するための化合物を励起するためにその化合物によって吸収されることが可能な光の波長を意味する。吸収光で励起された化合物から放出される光は、「発光波長」を有するであろう。
【００３８】
本明細書に用いられるとき、「誘導体」という用語は、親化合物（例えば本明細書に開示される化合物）の構造から誘導された構造を有する化合物を意味し、その構造は本明細書に開示されるものと十分に類似しており、その類似性に基づいて、クレームされる化合物と同じかまたは類似の活性および有用性を示すか、または前駆体として、クレームされる化合物と同じかまたは類似の活性および有用性を誘導することが当業者によって予測される。
【００３９】
本明細書に用いられるとき、「タンパク質」という用語は、その大きさに関係なく、20のタンパク質アミノ酸のいずれかを含むあらゆるポリマーを意味する。「ポリペプチド」は比較的大きいタンパク質に関してしばしば用いられ、「ペプチド」は小さいタンパク質に関してしばしば用いられるけれども、当該分野でこられの用法は重複したり変わったりする。本明細書に用いられる「タンパク質」の用語は、別に言及がなければ、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を意味する。
【００４０】
「選択的に結合する」という用語は、特定の化合物に優先的に引きつけられるか、または結合する原子、部分および／または分子の性質を意味する。ある場合に、その原子、部分および／または分子は、化合物の特定の部位、例えばタンパク質分子の活性な部位に選択的に結合する。
【００４１】
「検出する」という用語は、本化合物から放出される光に基づいて標的物質を見る、推測する、存在を示す、測定するなどの行為を意味するために本明細書で用いられる。具体的には、ある場合に、本化合物は標的物質に結合することができ、吸収光に曝されると発光を放出するであろう。発光の存在が、標的物質の存在を示すことができ、一方、標的物質の濃度を測定するために、光強度の定量化を用いることができる。
【００４２】
「標的物質」という用語は、ここに開示される化合物によって直接的および／または本化合物に結合する分子によって間接的に選択的に結合する物質を意味する。標的物質は、次のものに限定されないが、タンパク質、炭水化物、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝物、阻害剤、薬物、栄養物、成長因子などを含むことができる。ある実施態様において、標的物質は分子全体を意味し、他の実施態様において、標的物質は分子の部位、例えば特定のタンパク質上の結合部位を意味する。
【００４３】
本明細書に用いられるとき、「置換された」という用語は、有機化合物のすべての許容される置換基を含むことが意図される。広範な観点において、許容される置換基は、有機化合物の非環式および環式置換基、分枝および非分枝置換基、炭素環および複素環置換基、ならびに芳香族および非芳香族置換基を含む。例示的な置換基は、例えば、以下に記載されるものを含む。許容される置換基は、適切な有機化合物に対して１つ以上で、かつ同一または異なり得る。本開示のために、窒素のようなヘテロ原子は、ヘテロ原子の原子価を満たす水素置換基および／または本明細書に記載される有機化合物のあらゆる許容される置換基を有することができる。本開示は、有機化合物の許容される置換基により、あらゆる手段において限定されることを意図されない。
【００４４】
また、「置換」または「〜で置換される」という用語は、そのような置換が、置換された原子および置換基の許容される原子価に従い、置換が、安定化合物、例えば、転位、環化、脱離などによるような変化を自然発生的に行わない化合物をもたらすという暗黙の条件が含まれる。別に述べられていなければ、本明細書に記載の全ての化学基は無置換および置換の両種類を含む。
【００４５】
種々の用語を定義する際、「A1」、「A2」、「A3」、および「A4」は、種々の特定の置換基を表すために一般的な記号として本明細書に用いられる。これらの記号は、本明細書に開示されるものに限定されず、任意の置換基であり得、一例において、それらがある置換基であるように定義される場合、別例において、一部の他の置換基として定義され得る。
【００４６】
置換基が左から右に書かれた通常の化学式で特定される場合、それらは同様に右から左の構造を書くことから生じる化学的に同一の置換基を包含する。例えば、-CH2O-はまた-OCH2-を列挙包含する。
【００４７】
本明細書で提供される化学構造中の結合タイプおよび位置は、たとえ具体的に列挙されていなくても、化合物の置換基に依存して適応され得ることを理解されたい。例えば、XがCまたはNのいずれかであることができる場合、-X-はそれぞれ-CH2-または-NH-を意味することができる、ここで、N上の孤立電子対は示されない。したがって、たとえ具体的に説明されていなくても、本明細書に記載される化合物は、化学構造を完成するために必要なあらゆる水素原子、孤立電子対などを含む。
【００４８】
本明細書に用いられる「アルキル」の用語は、メチル、エチル、ｎ-プロピル、イソプロピル、ｎ-ブチル、イソブチル、ｓ-ブチル、ｔ-ブチル、ｎ-ペンチル、イソペンチル、ｓ-ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなどのような1〜24個の炭素原子の分枝または非分枝の、飽和の炭化水素基である。アルキル基は、環式または非環式であり得る。アルキル基は、分枝または非分枝であり得る。アルキル基はまた、置換または非置換であることも意味し得る。例えば、アルキル基は、本明細書に記載される、任意に置換されたアルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アミノ、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ニトロ、シリル、スルホ-オキソ、またはチオールを含むが、これらに限定されない１つ以上の基で置換され得る。「低級アルキル」基は、1〜6（例えば、1〜4）の炭素原子を含むアルキル基である。
【００４９】
本明細書にわたって、「アルキル」は、一般に、非置換アルキル基および置換アルキル基の両方を意味するために用いられるが、置換アルキル基はまた、アルキル基における特定の置換基を特定することにより本明細書に特定される。例えば、「ハロゲン化アルキル」の用語は、特に、１つ以上のハライド、例えば、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素で置換されるアルキル基を意味する。「アルコキシアルキル」の用語は、特に、以下に記載される、１つ以上のアルコキシ基で置換されるアルキル基を意味する。「アルキルアミノ」の用語は、特に、以下に記載される、１つ以上のアミノ基で置換されるアルキル基を意味する、などである。「アルキル」が、一例において用いられ、「アルキルアルコール」のような特定の用語が別において用いられる場合、「アルキル」の用語が、「アルキルアルコール」などのような特定用語も意味しないことを暗示することを意味するものではない。
【００５０】
この慣例は、本明細書に記載される他の基にも用いられる。すなわち、「シクロアルキル」のような用語は、非置換および置換シクロアルキル部分の両方を意味し、さらに、該置換部分は、本明細書に具体的に特定され得、例えば、特定の置換シクロアルキルは、例えば、「アルキルシクロアルキル」のように称することができる。同様に、置換アルコキシは、例えば、「ハロゲン化アルコキシ」のように具体的に称することができ、特定の置換アルケニルは、例えば、「アルケニルアルコール」などであり得る。さらにまた、「シクロアルキル」のような一般用語および「アルキルシクロアルキル」のような特定用語を用いる慣例は、該一般用語が特定用語も含まないことを暗示することを意味するものではない。「アルキル」の用語は「シクロアルキル」を含む。
【００５１】
本明細書に用いられる「シクロアルキル」という用語は、少なくとも３つの炭素原子から構成される非芳香族炭素ベースの環である。シクロアルキル基の例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、ノルボルニルなどを含むが、これらに限定されない。「ヘテロシクロアルキル」という用語は、上記に定義される、シクロアルキル基の一種であり、「シクロアルキル」という用語の意味の範囲内に含まれ、該環の少なくとも１つの炭素原子は、窒素、酸素、硫黄またはリンのような、それらに限定されないヘテロ原子と置き換えられる。シクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基は、置換または非置換であり得る。シクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基は、本明細書に記載される、任意に置換されたアルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アミノ、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ニトロ、シリル、スルホ-オキソまたはチオールを含むが、これらに限定されない１つ以上の基で置換され得る。
【００５２】
この関連で、本明細書に用いられる「複素環」という用語は、環の要素の少なくとも一つが炭素以外である、単環および多環の芳香族もしくは非芳香族環系を意味する。複素環は、ピリジン、ピリミジン、フラン、チオフェン、ピロール、イソオキサゾール、イソチアゾール、ピラゾール、オキサゾール、チアゾール、イミダゾール、1,2,3-オキサジアゾール、1,2,5-オキサジアゾールおよび1,3,4-オキサジアゾールを含むオキサジアゾール、1,2,3-チアジアゾール、1,2,5-チアジアゾールおよび1,3,4-チアジアゾールを含むチアジアゾール、1,2,3-トリアゾール、1,3,4-トリアゾールを含むトリアゾール、1,2,3,4-テトラゾールおよび1,2,4,5-テトラゾールを含むテトラゾール、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、1,2,4-トリアジンおよび1,3,5-トリアジンを含むトリアジン、1,2,4,5-テトラジンを含むテトラジン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、アゼチジン、テトラヒドロピラン、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどを含む。
【００５３】
本明細書に用いられる「アルコキシ」および「アルコキシル」という用語は、エーテル結合を通して結合されるアルキルまたはシクロアルキル基を意味する。すなわち、「アルコキシ」基は、A1が上記に定義されるアルキルまたはシクロアルキルである、-OA1として定義され得る。「アルコキシ」はまた、ちょうど今記載されたアルコキシ基のポリマーを含む。すなわち、アルコキシは、「a」が1〜200の整数であり、A1、A2およびA3がアルキルおよび／またはシクロアルキル基である、-OA1-OA2または-OA1-(OA2)a-OA3のようなポリエーテルであり得る。
【００５４】
本明細書に用いられる「アルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む構造式を有する2〜24個の炭素原子の炭化水素基である。この用語は直鎖形および環形（すなわちシクロアルケニル）の基を含む。(A1A2)C=C(A3A4)のような非対称構造は、ＥおよびＺ異性体の両方を含むことが意図される。このことは、非対称アルケンが存在する本明細書の構造式において推定され得るか、または結合シンボルC=Cにより明白に示され得る。アルケニル基は、本明細書に記載される、任意に置換されたアルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、アジド、ニトロ、シリル、スルホ-オキソまたはチオールを含むが、これらに限定されない１つ以上の基で置換され得る。
【００５５】
本明細書に用いられる「アリール」という用語は、ベンゼン、ナフタレン、フェニル、ビフェニル、フェノキシベンゼンなどを含むが、これらに限定されない、あらゆる炭素ベースの芳香族基を含有する基である。「アリール」という用語はまた、芳香族基の環内に組み込まれる少なくとも１つのヘテロ原子を有する芳香族基を含有する基として定義される「ヘテロアリール」も含む。ヘテロ原子の例は、窒素、酸素、硫黄およびリンを含むが、これらに限定されない。同じく、「アリール」の用語にも含まれる「非ヘテロアリール」の用語は、ヘテロ原子を含有しない芳香族基を含有する基を定義する。アリール基は、置換または非置換であり得る。
アリール基は、本明細書に記載される、任意に置換されたアルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、アジド、ニトロ、シリル、スルホ-オキソまたはチオールを含むが、これらに限定されない１つ以上の基で置換され得る。「ビアリール」の用語は、アリール基の特定の一種であり、「アリール」の定義に含まれる。ビアリールは、ナフタレンにおけるように、縮合環構造を介して共に結合されるか、またはビフェニルにおけるように、１つ以上の炭素-炭素結合を介して結びつけられる、２個のアリール基を意味する。
【００５６】
本明細書に用いられる「環」という用語は、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールを意味する。環は、縮合環系と称される縮合環部分を含み、ここで環は、置換または非置換のシクロアルキル、置換または非置換のヘテロシクロアルキル、置換または非置換のアリール、および置換または非置換のヘテロアリールから選択される1以上の環とあらゆる組合せで縮合され得る。環内の原子の数は、一般的に環における員数によって定義される。例えば、「5〜8員環」は、取り囲む配列中に5〜8個の原子があることを意味する。環はヘテロ原子を任意に含み得る。さらに、「環」という用語は、1以上の「環」を含む環系を含み、ここで、「環」はそれぞれ独立して上記のように定義される。
【００５７】
本明細書に記載される、シクロアルキルおよびアリールを含む環構造のような不飽和構造のいくつかは、共鳴構造の潜在的存在を表すために破線の結合で示される。破線の結合を有する構造は、その構造のあらゆる可能な立体配置を反映することが意図されるが、全ての可能な構造が存在していることを必ずしも暗示しない。そのような構造における結合の種類（例えば、単結合、二重結合）は、構造中の原子ならびに構造が1以上のさらなる原子または部分で置換されているかどうかによって変わることを理解されたい。
【００５８】
本明細書に用いられる「アルデヒド」という用語は、式-C(O)Hにより表される。本明細書にわたって、「C(O)」は、カルボニル基、すなわちC=Oの略語である。
【００５９】
本明細書に用いられる「アミン」または「アミノ」という用語は、式NA1A2A3で表され、式中、A1、A2およびA3は、独立して、水素または本明細書に記載される、任意に置換されたアルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、シクロアルキニル、アリール、またはヘテロアリール基であり得る。具体的な実施態様において、アミンはNH2、NH(アルキル)、NH(アリール)、N(アルキル)2およびN(アリール)2のいずれかを意味する。
【００６０】
本明細書に用いられる「カルボン酸」という用語は、式-C(O)OHにより表される。
【００６１】
本明細書に用いられる「エステル」という用語は、式-OC(O)A1または-C(O)OA1により表され、式中、A1は、本明細書に記載される、任意に置換されたアルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、シクロアルキニル、アリールまたはヘテロアリール基であり得る。
本明細書に用いられる「ポリエステル」という用語は、式-(A1O(O)C-A2-C(O)O)a-または-(A1O(O)C-A2-OC(O))a-により表され、式中、A1およびA2は、独立して、本明細書に記載される、任意に置換されたアルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、シクロアルキニル、アリールまたはヘテロアリール基であり得、「a」は1〜500の整数である。「ポリエステル」は、少なくとも2つのカルボン酸基を有する化合物と少なくとも2つのヒドロキシ基を有する化合物との間の反応により生成される基を記載するために用いられる用語である。
【００６２】
「ハライド」または「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素から選択される少なくとも1つのハロゲンを意味する。
本明細書に用いられる「チオール」という用語は、式-SHにより表される。
【００６３】
化合物
【００６４】
ここに開示される主題は、アゼチジン-置換化合物を含む。特定の実施態様において、アゼチジン-置換化合物は、蛍光のために電子供与性のN,N-ジアルキルアミノモチーフ（motif）を含む化合物の変形である。そのような実施態様において、元の親化合物のN,N-ジアルキル基はアゼチジンで置き換えられる。N,N-ジアルキルアミノモチーフを含むいくつかの未変形蛍光体は、非放射崩壊機構を起こしやすく、そして／または少ない量子収率を示す傾向がある。
しかしながら、アゼチジン部分の代わりにジメチルアミノ基の置換を含む本化合物の実施態様は、この非放射崩壊経路を減少させるかまたは除外し、対応するアゼチジン非置換化合物に比較して、蛍光体の量子収率を増加させ得る。
【００６５】
増加した量子収率によって、本化合物のある実施態様は、対応するアゼチジン非置換化合物と同等か、またはより優れた明るさおよび光安定性も示す。ある実施態様において、改善された量子収率を有する化合物は、生体撮像実験に対してより低い光力を要求し、破壊的緩和経路を受ける可能性が低く、より高い光安定性をもたらす。
【００６６】
本化合物の特定の実施態様の性質は優れており、予測されなかった。平面構造はキサンテニウム色素およびその他の類似構造で起きる蛍光発光に対して有効であり得る。3または4個の炭素を有するようなより小さい環での置換は、化合物の平面構造を損なうであろうことが、以前は考えられていた。特に、4員環のアゼチジン環系での変更は、大きく歪ませ（26 kca mol-1）、直観的に多くの蛍光分子に見られる平面非局在化構造と互換性がないと信じられなかった。
【００６７】
本発明者らは、本明細書に記載の新規アゼチジン-置換が、驚くべきことに、対応するアゼチジン非置換化合物の蛍光特性を維持し、かつ高めさえできることを意外にも見出した。
【００６８】
本アゼチジン-置換化合物の実施態様は、ねじれ分子内電荷移動（TICT）を受けにくくなる構造も含んでいる。この驚くべきかつ予測されなかった特徴は、高い量子収率および場合によってはベースのアゼチジン非置換化合物のそれより、高い量子収率を有する特定の具体化された化合物を提供する。
【００６９】
ここに開示されるアゼチジン-置換は、公知の蛍光体を含む多種多様な蛍光体に行うことができると理解されるべきである。場合によって、アゼチジン-置換は、ベースの蛍光体がそれらの有益な性質を維持すること、および／または高めることを可能にする。例えば、本化合物の実施態様は、明るさ、光安定性、および／またはアゼチジン非置換ローダミン化合物の光に対する鈍感性を維持するかまたは高めるアゼチジン-置換ローダミン化合物を含む。
【００７０】
化学蛍光体の現存の一群の中で、ローダミン色素は、遺伝的にコード化された自己標識タグでの生細胞画像化に対して有用なクラスである。この有用性は、明るさ、光安定性、pHに対する鈍感性、およびローダミン色素の変更可能な構造から生じる。ローダミンのスペクトル特性は、青色〜赤外に及ぶ吸収極大を有する色素を利用することを可能にするために制御され得る。さらに、ローダミン色素は、「開いた」両イオン性のキノイド形と「閉じた」親油性のラクトン形との間の平衡状態で存在する。この動的両親媒性は、ローダミン色素を生細胞標識技術に対する優れたリガンドにし、該色素は界面活性剤または化学的マスキング基なしに細胞膜を効率的に越え、過剰なリガンドは迅速に洗い流され得る。
【００７１】
ここに開示される主題のある実施態様において、次の式の化合物が提供される：
【化７】
0006606096.tif 000008
【００７２】
（式中、Rは、それぞれ独立して、ハロゲン、H、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3Hおよびアルキルから選択され、アルキルは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、C(O)NR2、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2および／またはSO3Hで任意に置換され；QはCR(2)、C(O)NR2、NR、O、S、SiR(2)およびSeから選択され；WはCおよびNから選択され；Xは、孤立電子対、H、アルキル、アリール、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hから選択され、Xは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2および／またはSO3Hで任意に置換され；YはH、CR(2)、C(O)NR2、NR、OおよびSから選択され；そしてZは、H、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、COO(アルキル)、COO(アリール)、C(O)NR2、PO3H2、SO3H、アリールおよびアルキルから選択され、アルキルおよびアリールは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hで任意に置換されるか、またはZおよびYは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5〜7員環を形成することができる）。
【００７３】
ある実施態様において、YおよびZは、それらが結合する原子と一緒になって、N、OおよびSから選択される1以上のさらなるヘテロ原子、または／およびハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3Hおよびアルキルから選択される1以上の置換基で置換された5〜7員環を形成する。特定の実施態様において、YおよびZは、それらが結合する原子と一緒になって、非置換または置換アゼチジン基で置換された5〜7員環を形成する。
【００７４】
ここに開示される主題のある実施態様において、化合物は次の式であることができる：
【化８】
0006606096.tif 000009
【００７５】
（式中、R’は、ハロゲン、H、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、COO(アルキル)、COO(アリール)、C(O)NR2、PO3H2、SO3Hおよびアルキルから選択され、アルキルは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、C(O)NR2、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2および／またはSO3Hで任意に置換される）。その他の実施態様において、R’は、非置換であるか、または1以上のハロゲン、H、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、COO(アルキル)、C(O)NR2、COO(アリール)、PO3H2、SO3Hおよびアルキルで置換されたアゼチジン部分（基）から選択される）。
【００７６】
ここに開示される主題のある実施態様において、化合物は次の式であることができる。
【化９】
0006606096.tif 000010
【００７７】
ここに開示される主題のある実施態様において、化合物は次の式であることができる。
【化１０】
0006606096.tif 000011
【００７８】
ここに開示される主題のある実施態様において、化合物は次の式であることができる。
【化１１】
0006606096.tif 000012
【００７９】
ここに開示される主題のある実施態様において、化合物は次の式であることができる。
【化１２】
0006606096.tif 000013
【００８０】
ここに開示される主題のある実施態様において、化合物は次の式であることができる。
【化１３】
0006606096.tif 000014
【００８１】
ここに開示される主題のある実施態様において、化合物は次の式であることができる。
【化１４】
0006606096.tif 000015
【００８２】
ここに開示される主題のある実施態様において、化合物は次の式であることができる。
【化１５】
0006606096.tif 000016
【００８３】
ここに開示される主題のある実施態様において、化合物は次の式であることができる。
【化１６】
0006606096.tif 000017
【００８４】
ここに開示される主題のある実施態様において、Xは置換アリールである。
【００８５】
その他の実施態様おいて、Xは次のものに限定されないが、H、C、
【化１７】
0006606096.tif 000018
からも選択され得る。
【００８６】
ある実施態様において、WはNであり、Xは孤立電子対である。ある実施態様において、Xは、本明細書に記載されるように、本化合物を結合成分に結合させることができるリンカーを部分的にまたは完全に含むことができる。その他の実施態様において、Xは結合成分を部分的にまたは完全に含むことができる。ある実施態様において、Xは化合物と連結するときに用いられ得るリンカー、化合物と連結するときに用いられる結合成分、および／または化合物によって検出される標的物質に依存するので、本明細書に示されるXの構造は、説明目的のためだけに提供される。
【００８７】
ここに開示される主題のある実施態様において、化合物は次の式の少なくとも1つより選択され得る。
【化１８−１】
0006606096.tif 000019
【化１８−２】
0006606096.tif 000020
【化１８−３】
0006606096.tif 000021
【化１８−４】
0006606096.tif 000022
【００８８】
ここに開示される主題は、本明細書に記載のあらゆる化合物の誘導体も含む。
【００８９】
本明細書に記載される化合物は、１つ以上の二重結合を含み、したがってシス／トランス（E/Z）異性体、ならびに他の立体配座異性体を潜在的に発生させ得る。そうでない旨が規定されていない限り、本発明は、すべてのそのような可能性のある異性体、ならびにそのような異性体の混合物を含む。
また、そうでない旨が規定されていない限り、くさび形あるいは破線ではなく、実線のみで示される化学結合を有する式は、それぞれに可能性のある異性体、例えばそれぞれの鏡像異性体およびジアステレオマー、ならびにラセミまたは非ラセミ(scalemic)混合物のような異性体の混合物を含む。
【００９０】
本明細書に記載される化合物は、１つ以上の不斉中心を含むことができ、したがってジアステレオマーおよび光学異性体を潜在的に発生させ得る。そうでない旨が規定されていない限り、本発明は、すべてのそのような可能性のあるジアステレオマーならびにそれらのラセミ混合物、それらの実質的に純粋な分割された鏡像異性体、すべての可能性のある幾何異性体、ならびにその医薬的に許容される塩を含む。立体異性体の混合物、ならびに単離された特定の立体異性体も含まれる。そのような化合物を製造するために用いられる合成手順の過程中、または当業者に知られているラセミ化またはエピマー化手順を用いる際、そのような手順の生成物は立体異性体の混合物であり得る。
【００９１】
本明細書で説明されるように、ここで開示されるアゼチジン-置換は、一般化され多種多様な化合物に適用され得ると理解されるべきである。例示化合物は、アゼチジン-置換ローダミン誘導体、アゼチジン-置換クマリン誘導体、アゼチジン-置換ロードール誘導体、アゼチジン-置換アクリジン誘導体、アゼチジン-置換オキサジン誘導体、アゼチジン-置換ナフタルイミド誘導体、アゼチジン-置換カルボローダミン誘導体、アゼチジン-置換シラローダミン誘導体などを含む。
当業者はここに開示されるアゼチジン-置換が可能なその他の化合物を認識するであろう。前記のように、ここに開示される主題のこれらおよびその他の誘導体は、対応するアゼチジン非置換化合物の有用な特性を維持すること、および／または高めることができる。例えば、最少の構造変化を有するアゼチジン-置換化合物の実施態様は、元のアゼチジン非置換化合物の膜透過性および細胞内標識の効率を保つことができる。
【００９２】
さらに、本明細書に記載されるように、アゼチジン部分は置換されているか、または置換されていなくてもよい。次の表1は、アゼチジン環上に置換基を有するアゼチジン-ローダミン、アゼチジン-カルボローダミンおよびアゼチジン-シラ-ローダミンの実施態様を記載している。表1に記載のアゼチジン部分は、本明細書に記載のあらゆる化合物中に組み込まれ得ることを理解されたい。
【００９３】
【表１】
0006606096.tif 000023
【００９４】
本化合物は、幅広い範囲の吸収特性および発光特性を有し得る。本アゼチジン-置換は種々の化合物に行うことができるので、本アゼチジン-置換化合物の実施態様は、紫外〜近赤外スペクトル中に吸収波長を含むことができる。
本化合物の特定の実施態様は、約100 nm、200 nm、300 nm、400 nm、500 nm、600 nm、700 nm、800 nm、900 nm、1000 nm、またはそれらの間のいずれかの値から選択される吸収波長を含むことができる。ある実施態様において、本化合物は約1000 nm以上の吸収波長を含む。
活性化されると、本化合物は検出可能な発光を放出することができる。発光の波長は、ベース化合物の置換によって変化し得る。ある実施態様において、発光波長は、約100 nm、200 nm、300 nm、400 nm、500 nm、600 nm、700 nm、800 nm、900 nm、1000 nm、またはそれらの間のいずれかの値を含む約100 nm〜約1000 nmの波長である。
【００９５】
当業者は、本化合物が、本蛍光体の開いたおよび閉じた（例えばラクトン）形の両方を含むことも理解するであろう。ある場合に、エステル置換基を有する本アゼチジニル蛍光体は、酸または塩基介在条件により脱保護され、カルボン酸ハンドルを有するアゼチジニル色素を生じ得る。図33に示されるスキームは、閉じた「ラクトン」形とカルボン酸ハンドルを有する開いた形との間の典型的な蛍光体の遷移を示す。
その他の実施態様において、本化合物は、吸収光に曝されると閉じた形から開いた形へ遷移し得る。したがって、ある実施態様において、本化合物は閉じた形と開いた形との間で遷移するために、光または化学的に活性化され得る。本明細書に記載された全ての化合物は、それぞれの蛍光体に対して閉じた形および開いた形の両方を含む。
【００９６】
ある実施態様において、ここに開示される化合物の実施態様の開いた、および閉じた形の両方は、次の式で表され得る。
【化１９】
0006606096.tif 000024
【００９７】
（式中、Rは、それぞれ独立して、ハロゲン、H、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3Hおよびアルキルから選択され、アルキルは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、C(O)NR2、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2および／またはSO3Hで任意に置換され；QはCR(2)、C(O)NR2、NR、O、S、SiR(2)およびSeから選択され；WはCおよびNから選択され；MはCR(2)、C(O)NR2、C(O)、SO2およびPO2から選択され；LはO、S、NR、CN2およびC(O)NR2から選択され、ここで、任意にLおよびWは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5〜7員環を形成することができ；UおよびVは、独立して、H、アルキル、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、C(O)NR2、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hから選択され、アルキルは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、C(O)NR2、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、および／またはSO3Hで任意に置換されるか、またはUおよびVは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5〜7員環を形成することができ；YはH、CR(2)、C(O)NR2、NR、OおよびSから選択され；そしてZは、H、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、COO(アルキル)、COO(アリール)、C(O)NR2、PO3H2、SO3H、アリールおよびアルキルから選択され、アルキルおよびアリールは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hで任意に置換されるか、またはZおよびYは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5〜7員環を形成することができる）。
【００９８】
そのような化合物のある実施態様において、本化合物は次の式で表される構造を有する。
【化２０】
0006606096.tif 000025
【００９９】
（式中、R’は、ハロゲン、H、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、COO(アルキル)、COO(アリール)、C(O)NR2、PO3H2、SO3Hおよびアルキルから選択され、アルキルは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3Hで任意に置換されるか、または非置換であるか、もしくは1以上のハロゲン、H、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、C(O)NR2、COOH、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3Hおよびアルキルで置換されたアゼチジン基である）。
【０１００】
これに関連して、ここに開示される主題の典型的な開いた形の化合物は次の式を有する。
【化２１】
0006606096.tif 000026
【０１０１】
ある実施態様において、ここに開示される化合物の閉じた形は次の式を含む。
【化２２】
0006606096.tif 000027
【０１０２】
その他の実施態様において、ここに開示される化合物の閉じた形は次の式を含む。
【化２３】
0006606096.tif 000028
【０１０３】
ある実施態様においてUとVは1つの置換アリールを含み、ある実施態様において本化合物は次の式で表され得る：
【化２４】
0006606096.tif 000029
【０１０４】
（式中、X’はH、OH、アルキル、アリール、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、COO(アルキル)、COO(アリール)、C(O)NR2、PO3H2およびSO3Hから選択される）。
【０１０５】
閉じた形の化合物の特定の実施態様において、本化合物は次から選択される式を含む。
【化２５−１】
0006606096.tif 000030
【化２５−２】
0006606096.tif 000031
【化２５−３】
0006606096.tif 000032
【化２５−４】
0006606096.tif 000033
【化２５−５】
0006606096.tif 000034
【化２５−６】
0006606096.tif 000035
【０１０６】
上記の構造は説明目的のために提供されているが、当業者は、本明細書の精査により本明細書に開示される化合物の全ての開いた形および閉じた形を理解するであろう。
【０１０７】
キット
【０１０８】
ここに開示される主題は、適当な結合成分と一緒にパッケージされた本明細書に記載の化合物のいずれかを含むキットを含む。ある場合に、結合成分は本明細書でリガンドと称される。結合成分は可逆的および／または不可逆的に化合物と結合し得る。ある実施態様において、結合成分は化合物に直接結合することができる。他の実施態様において、結合成分は化合物に間接的に結合する。ある実施態様において、化合物はリンカーを介して結合成分に間接的に結合することができる。ここで、ある実施態様において、リンカーは非置換または置換アルキルなどを含む。あるキットの実施態様は、さらに本化合物への連結のためのリンカーと一緒に提供される。
【０１０９】
一般的に、結合成分は興味の対象の分子または物質（例えば、標的物質）を選択的に結合し得る。典型的な結合成分は、次のものに限定されず、アミノ酸、タンパク質、抗体またはその断片、抗原、多糖類、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、薬物、ホルモン、脂質、合成ポリマー、固体担体、ポリマー微粒子、細胞、ウイルス、酵素基質など、またはウイルスを含む。結合成分は、観察および／または特徴付けられる分子または物質を検出するために用いることができ、特定の事象が起こったことを示すことができ、そして／または別の分子または物質（例えば、標的物質）の存在を示すことができる。
【０１１０】
ある実施態様において、ここに開示される主題に従って2以上の異なる化合物を含むキットが提供される。そのような実施態様は、さらに1以上の結合成分と一緒に提供され得る。ここで、化合物は同じかまたは異なる結合成分に結合することができる。
ある実施態様において、化合物および／または結合成分のそれぞれは、異なる分子、粒子、物質などを選択的に結合し得る。追加的にまたは代替的に、ある実施態様において、キットはここに開示される主題に従って、異なる吸収波長および／または発光波長を有する2以上の異なる化合物を含み、それゆえに多工程で実施され得る。
【０１１１】
使用方法
【０１１２】
ここに開示される主題は、本明細書に記載の化合物を用いる方法をさらに含む。ある実施態様において、その方法は、酵素活性のためのレポーターとして、蛍光タグとして、標的物質（検体）のためのセンサーとして、画像実験のための剤として、および／または超解像顕微鏡法のための造影剤として、本化合物を使用することを含む。
【０１１３】
ここに開示される主題のある実施態様は、試料を次の式の化合物と接触させることを含む、標的試料を検出するための方法を含む：
【化２６】
0006606096.tif 000036
【０１１４】
（式中、Rは、それぞれ独立して、ハロゲン、H、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3Hおよびアルキルから選択され、アルキルは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、C(O)NR2、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2および／またはSO3Hで任意に置換され；QはCR(2)、NR、O、S、SiR(2)およびSeから選択され；WはCおよびNから選択され；Xは、孤立電子対、H、アルキル、アリール、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hから選択され、Xは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2および／またはSO3Hで任意に置換され；YはH、CR(2)、C(O)NR2、NR、OおよびSから選択され；そしてZは、H、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、COO(アルキル)、COO(アリール)、C(O)NR2、PO3H2、SO3H、アリールおよびアルキルから選択され、アルキルおよびアリールは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hで任意に置換されるか、またはZおよびYは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5〜7員環を形成することができる）。
【０１１５】
代替的にまたは追加的に、標的試料を検出するための方法のある実施態様において、該方法は試料を次の式の化合物と接触させる工程を含む：
【化２７】
0006606096.tif 000037
【０１１６】
（式中、Rは、それぞれ独立して、ハロゲン、H、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、SO3Hおよびアルキルから選択され、アルキルは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、C(O)NR2、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2および／またはSO3Hで任意に置換され；QはCR(2)、NR、O、S、SiR(2)およびSeから選択され；WはCおよびNから選択され；MはCR(2)、C(O)、SO2およびPO2から選択され；LはO、S、NRおよびCN2から選択され、ここで、任意にLおよびWは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5〜7員環を形成することができ；UおよびVは、独立して、H、アルキル、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、C(O)NR2、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hから選択され、アルキルは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、C(O)NR2、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COO、COOH、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2、および／またはSO3Hで任意に置換されるか、またはUおよびVは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5〜7員環を形成することができ；YはH、CR(2)、C(O)NR2、NR、OおよびSから選択され；そしてZは、H、ハロゲン、CN、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、COO(アルキル)、COO(アリール)、C(O)NR2、PO3H2、SO3H、アリールおよびアルキルから選択され、アルキルおよびアリールは、N、OおよびSから独立して選択される1以上のヘテロ原子、ハロゲン、OH、O(アルキル)、O(アリール)、SH、S(アルキル)、S(アリール)、アミン、NO2、CHO、COOH、C(O)NR2、COO(アルキル)、COO(アリール)、PO3H2およびSO3Hで任意に置換されるか、またはZおよびYは、それらが結合する原子と一緒になって置換または非置換の5〜7員環を形成することができる）。
【０１１７】
ここに開示される標的物質を検出するための方法は、その発光が標的物質の存在を示す、化合物からの発光を検出することを含む検出工程をさらに含み得る。
【０１１８】
本化合物を用いる方法は、ある実施態様において、化合物を吸収波長を含む吸収光に曝すことによって化合物を励起することをさらに含む。本明細書に記載されるように、吸収光は紫外線〜近赤外線を含み得る。具体的な実施態様において、吸収波長は、約100 nm〜約1000 nmの範囲、200 nm〜約800 nmの範囲および／または約450 nm〜約650 nmの範囲にあり得る。ある実施態様において、吸収波長は約100 nm、200 nm、300 nm、400 nm、500 nm、600 nm、700 nm、800 nm、900 nmまたは1,000 nmである。
【０１１９】
ある実施態様において、検出工程は、蛍光分光法の使用または肉眼によって行われる。したがって、ある実施態様において、検出工程は顕微鏡を用いて行われる。ある実施態様において、標的物質の存在は、当業者によって理解されるであろう、特定の生物学的機能の発生および欠如を示すことができる。ある実施態様において、該方法は生細胞および／または被験者に対して行われる。
【０１２０】
検出方法のある実施態様は、異なる標的物質に対して選択的である化合物の2以上の実施態様と試料を接触させることを含む。ここに開示される化合物の2以上を用いて、2以上の標的物質を検出するための方法は、本明細書において「多重」検出法と称される。
【０１２１】
ある多重検出法において、2以上の異なる標的物質および／または1つの標的物質の2以上の領域は、2以上のプローブを用いて検出される。ここで、それぞれのプローブは本化合物の異なる実施態様を用いて標識されている。ここに開示される化合物は、種々の標的物質に対する多重検出法で用いることができる。
【０１２２】
このことに関して、多重検出法は、ここに開示される主題に従って、試料を第1の化合物および第2の化合物と接触させることを含む。第1の化合物は第1の標的物質に対して選択的であり、第1の発光を放出することができ、第2の化合物は第2の標的物質に対して選択的であり、第2の発光を放出することができる。
検出工程は、第1の標的物質の存在を示す第1の発光および第2の標的物質の存在を示す第2の発光を検出すること、および次に化合物からの第2の発光を検出することを含む。第2の発光は第2の標的物質の存在を示し得る。ある実施態様において、発光波長と第2の発光波長は互いに異なる。その結果、この新規な方法は、1つの物質中の多数の異なる標的物質を同時に検出するための効率的な方法を提供する。
【０１２３】
合成方法
【０１２４】
ここに開示される主題は、本明細書に記載の化合物の製造方法を含む。一般的に、ここに開示される化合物の実施態様を合成する方法は、1以上のよく知られた合成工程を含む。該化合物を合成するための方法の特定の実施態様が本明細書に記載されているが、合成方法は当業者に容易に明らかになるであろうあらゆる方法を含み得るので、合成の方法は本明細書に記載の方法に限定されるべきでない。
【０１２５】
ある実施態様において、該方法は、合成法の後の段階で化合物のC(アリール)-N（例えば、C(アリール)-アゼチジン）結合を形成することを含む。ある実施態様において、フルオレセイン ジトリフレートでの窒素求核試薬のBuchwald-Hartwigクロスカップリングが用いられる。
ある実施態様において、該方法は、トルエン中Pd(OAc)2、BINAPおよびCs2CO3を用いる約100℃でのBuchwald-Hartwig条件下で進行する。他の実施態様において、該方法は、塩基としてCs2CO3、溶媒としてジオキサンを用いて約80℃〜約100℃で、活性ビアリールリガンドXPhosとPd2dba3を用いて進行する。したがって、異種のN-アルキルカップリングパートナーとのPd触媒クロスカップリングが、本化合物を合成するための方法の実施態様を表す。
【０１２６】
ある実施態様において、直接アミノ化によるローダミン色素のような化合物の合成は、実行不可能であり得る。少なくともこれらの化合物に対して、カルバメートが本化合物を合成するための方法に用いられ得る。本化合物を合成するためのその他の典型的な方法は、GrimmらのSynthesis of Rhodamines from Fluoresceins Using Pd-Catalyzed C-N Cross-Coupling, Org. Lett. 13, 6354-6357, (2011)に記載されており、それは参照として本明細書に組み込まれる。
【０１２７】
さらに、ここに開示される化合物の実施態様を合成するための方法の非限定的な一覧は、図31〜38に示される典型的なスキーム中に示される。
【０１２８】
図31は、典型的なジブロモフルオランとフルオレセイン ジトリフレートを製造するための一般的な合成スキームを含む。カルボン酸置換基を有するジブロモフルオランおよびフルオレセイン ジアセテートは、酸触媒Fischerエステル化またはDMFのジ-tert-ブチルアセタールとの反応によりエステルとして保護され得る。次いで、フルオレセイン ジアセテートは塩基で加水分解され得る。得られる置換フルオレセインはトリフルオロメタンスルホン酸無水物でフルオレセイン トリフレートに変換され得る。
【０１２９】
図32は、典型的なカルボ-およびシラフルオレセイン ジトリフレートを製造するための一般的な合成スキームを含む。アリールグリニャール試薬とのTBS-保護アントロンおよびSi-アントロンの反応は、TBS-保護カルボフルオレセンおよびシラフルオレセインへのアクセスを可能にし得る。TBAF仲介脱保護、次いでトリフルオロスルホン酸無水物との反応は、カルボフルオレセイン ジトリフレートおよびシラフルオレセイン ジトリフレートを与え得る。
【０１３０】
図33は、典型的なアゼチジニル-ローダミン、-カルボローダミンおよび-シラ-ローダミンを製造するための一般的な合成スキームを含む。ジブロモフルオラン、フルオレセイン ジトリフレート、カルボフルオレセイン ジトリフレートまたはシラフルオレセイン ジトリフレートを用いるアゼチジンのBuchwald-Hartwigパラジウム触媒C-Nクロスカップリングは、アゼチジニル蛍光体を直接与え得る。エステル置換基を有するアゼチジニル蛍光体は、酸または塩基仲介条件により脱保護され、カルボン酸手を有するアゼチジニル色素を生じる。その酸は、DSCまたはTSTUとの反応によってN-ヒドロキシスクシンイミジル（NHS）エステルにさらに誘導され、続いてアミンと反応させ、ペンダントアミド基を有する類似体を生じ得る。
【０１３１】
図34は、典型的なアゼチジニル-ロードールを製造するための一般的な合成スキームを含む。、フルオレセイン ジトリフレート、カルボフルオレセイン ジトリフレートまたはシラフルオレセイン ジトリフレートを用いるアゼチジン（1当量）のBuchwald-Hartwigパラジウム触媒C-Nクロスカップリングは、残りのトリフレート部分の加水分解により、アゼチジニル-ロードールを与え得る。
【０１３２】
図35は、アゼチジニル-ローダミン、-カルボローダミンおよび-シラ-ローダミンからの典型的な蛍光性2-ジアゾ-1-インダノン色素を製造するための一般的な合成スキームを含む。アゼチジニル-ローダミンと塩化オキサリル、続いて(トリメチルシリル)ジアゾメタンとの反応は、2-ジアゾ-1-インダノンを与え得る。エステル置換基の塩基介入加水分解は、酸部分を有する2-ジアゾ-1-インダノンを生じ、それはTSTUとの反応によってN-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)エステルにさらに誘導され、アミンと反応させてペンダントアミド基を有する類似体を生じ得る。
【０１３３】
図36は、典型的なアゼチジニル-クマリンを製造するための一般的な合成スキームを含む。クマリン トリフレートは、7-ヒドロキシクマリンとトリフルオロメタンスルホン酸無水物またはN-フェニル-ビス(トリフルオロメタンスルホンイミド)との反応によって合成され得る。クマリン トリフレートを用いるアゼチジンのBuchwald-Hartwigパラジウム触媒C-Nクロスカップリングは、アゼチジニル-クマリンを生じ得る。あるいは、アゼチジニル-フェノールは、アゼチジンを用いるブロモフェノールのC-Nクロスカップリングによって製造され得る。次いで、アゼチジニル-フェノールのVilsmeier-Haackホルミル化はアルデヒドを与え、マロネートと縮合し、アゼチジニル-クマリンを与え得る。エスエル置換基を有する例に対して、塩基介入加水分解は、カルボン酸を有するアゼチジニル-クマリンを生じ得る。そのようなカルボン酸は、TSTUとの反応によってN-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)エステルにさらに誘導され、アミンと反応させて、ペンダントアミド基を有する類似体を生じ得る。
【０１３４】
図37は、典型的なアゼチジニル-アクリジンを製造するための一般的な合成スキームを含む。ジアミノアクリジンと酸との高温での反応は、ジヒドロキシアクリジンを与え、次いで、トリフルオロメタンスルホン酸無水物と反応させて、アクリジン トリフレートを入手し得る。次いで、アクリジン ジトリフレートをアゼチジンを用いるBuchwald-Hartwigパラジウム触媒C-Nクロスカップリングに付して、アゼチジニル-アクリジンを製造し得る。
【０１３５】
図38は、典型的なアゼチジニル-オキサジンを製造するための一般的な合成スキームを含む。フェノキサジンのトリフレートは、ジヒドロキシフェノキサジンとトリフルオロメタンスルホン酸無水物との反応によって製造され得る。そのトリフレートをアゼチジンを用いるBuchwald-Hartwigパラジウム触媒C-Nクロスカップリングに付し、続いてDDQで酸化して、アゼチジニル-オキサジンを入手し得る。
【０１３６】
当業者は、本明細書に記載の方法およびスキームは、説明目的のためだけに提供され、ここに開示される化合物の実施態様を合成するための有用な反応の範囲および反応順序を限定することを意図しないことを認識するであろう。
【実施例】
【０１３７】
ここに開示される主題は、次の具体的であるが、限定的でない例によってさらに説明される。次の例は、本発明に関連する開発および実験の過程の間の種々の時間に集められたデータを代表するデータをまとめたものを含み得る。
【０１３８】
実施例１
本実施例は、ローダミン色素、具体的には、親色素に比較して量子効率における増加を引き起こす新規なアゼチジニル助色団の明るさおよび光安定性を改善するための構造的変更を明らかにする。アゼチジニルローダミン色素の容易な合成は、スペクトル特性、細胞透過性および親色素の有用性を維持した。市販のソフトウエアパッケージSpartan’10（1.1.0版、Wavefunction）を用いて計算実験が行われた。
【０１３９】
最も単純な公知のローダミン蛍光体のローダミン110（表2）は、高い吸光係数（ε = 7.6 × 104 M-1cm-1）で青に吸収極大（λmax = 497 nm）、緑に発光（λem = 520 nm）および高量子収率（φ = 0.88）を示す。ローダミンのアルキル化は、吸収および蛍光放出波長において深色移動を引き起こす。例えば、テトラメチルローダミン（TMR）は、λmax/λem = 548/572 nmおよびε = 7.8 × 104M-1cm-1 （表2）を示す。スペクトル特性のこの移動は、φ = 0.41を示すTMRでの量子収率における顕著な減少を伴う。これらの色素の両方は、市販の自己標識タグ基質で用いられ、生細胞中で細胞内および細胞外タンパク質を標識するために用いることができる。
【０１４０】
【表２】
0006606096.tif 000038
【０１４１】
TMRのような、N,N,N',N'-テトラアルキルローダミンのより低い量子効率は、エネルギー的に好ましいねじれ分子内電荷移動（TICT）状態（図1）によって説明され得る。励起後、窒素原子からキサンテン環への電子移動が、ピラミジル(pyramidyl)窒素とねじれたCアリール-N結合をもたらす。このTICT状態は、光子の放出なしに速やかに緩和し、ローダミン色素における非放射減衰の主な経路である。このジラジカル種はまた、蛍光体の漂白に導く不可逆反応を受け得る。したがって、TICTを有利にしないローダミン誘導体は、増加した量子効率、より長い蛍光寿命およびより高い光安定性をきっと示すであろう。
【０１４２】
平衡配置を評価するための標準アブイニシオHartree-Fock法を用い、エネルギー最小化の間に閉じたラクトン形への環化を防ぐために構造からオルト-カルボキシル基を除き、アリール炭素−窒素結合（Cアリール-N）の長さならびに水素置換基のオルトと窒素に対してアルファとの最少距離について、表2に示された構造を解析した。これらの値は、TICTを受ける分子の傾向のパラメータである。より短いCアリール-N値は、増加した2重結合性およびねじれた立体配座を取るより低い傾向を示す。同様に、より長いHO-Hα値は、置換基間のより少ない立体衝突および結合回転に対するより低い傾向を示す。
【０１４３】
アジリジン誘導体の計算された構造は、3員環に存在する大きな環歪み（27 kcal mol-1）と一致する、キサンテン系の平面からの窒素を有する縮んだアジリジン環を含んだ。その他のローダミンは、アニリン窒素を含んでほとんど平面構造に最小化され、これらの色素が蛍光ローダミンに見られる拡張共役を選択することを示唆する。アゼチジニル-ローダミン（JF549、実施例7）の予測される構造は、アゼチジンに存在する比較的大きな環歪み（26 kcal mol-1と推定）を驚くべきことに与え、それはピラミッド形の窒素原子に有利であることが予測される。
JF549は、平面計算構造の中で最小のCアリール-N結合の長さ（1.39Å）および最長のHO-Hαの距離（2.56Å）を示した。さらに、N-アリールアゼチジンは、TICT状態を形成するためにアニリン窒素からキサンテン環系への電子移動に対してより高いエネルギー不利を示唆する、N,N-ジアルキルアニリンと比較してより高いIP値を示す（1-フェニルアゼチジン IP = 7.61 eV；N,N-ジメチルアニリン IP = 7.37 eV）。これらの結果は、JF549がTICTを受ける傾向がより小さく、したがって、TMR蛍光体(2)より優れた蛍光特性を示すであろうことを暗示している。
【０１４４】
次いで、表2の化合物を合成し、それらの蛍光特性について評価した。Buchwald-Hartwigクロスカップリングを用いる、フルオレセイン ジトリフレートからのローダミンの容易でかつ効率的な合成法を用い、フルオレセインからの化合物の製造を可能にした。トリフレートの加水分解を最小にし、高収率を保証するために、比較的高い触媒充填(10%)を必要とした。
JF549およびより大きな環構造は、強溶媒系(CH2Cl2/CH3OH/NH3)での順相フラッシュクロマトグラフィーによって精製される、濃い色の極性化合物であった。対照的に、アジリジニル-ローダミンは無色で無極性の分子であり、弱溶媒混合物(EtOAc／ヘキサン)を用いる順相クロマトグラフィーにより精製することができた。
【０１４５】
合成化合物の光物理的性質を水溶液中で評価し、それらを公知のローダミン110およびテトラメチルローダミンと比較した。そのデータは、アジリジン置換基中の環歪みが、アジリジニル-ローダミンに閉じたラクトン形を取ることを強いることを示唆した。JF549（実施例7）およびより大きな環構造は、TMRと同様のλmaxおよびλem値を示し、環の大きさの増加で10 nmまでのわずかの深色移動を引き起こした。興味深いことに、JF549およびアゼパン誘導体は、他の色素より〜30％のより高い吸光係数を示した。TICT状態の形成における多くの構造パラメータを制御するために、単純な環系中へのアニリン窒素の組み込みが提案された。アジリジンおよびアゼチジン含有構造のようなより小さなアザサイクル中のより高い環歪みは、蛍光キサンテニウム構造に対して要求される平面立体配置を不可能にすると、以前に信じられていた。
【０１４６】
異なるローダミン色素のλmax、λemおよびεは、置換基の環の大きさにささやかな依存性を示したが、蛍光寿命(τ)および量子収率(φ)は環の大きさが変化するにつれて変わった（表2）。JF549は、TMRに対する値(φ = 0.41、τ = 2.2 ns)より大きく、親ローダミン110(1；φ = 0.88、τ = 3.3 ns)と類似性の高い量子収率値(φ = 0.88)と長い蛍光寿命(τ = 3.8 ns)を示した。JF549はまた、φ = 0.74およびτ = 3.6 nsを示すピロリジン誘導体より60％も明るかった。
ピペリジン誘導体は、φ = 0.10およびτ = 0.6 nsを有し、蛍光の急な減少を示した；ピロリジンおよびピペリジン誘導体に対する寿命値は類似の蛍光体に対するそれらと一致した。アゼパン誘導体は、ピペリジン誘導体と比較して、φ = 0.25およびτ = 1.62 nsのわずかに高い値を与えた。
【０１４７】
1光子励起下のJF549の改善された明るさ（表2）は、2光子励起に拡張され、TMRの多くの所望の性質を維持した構造変化によってもたらされた。例えば、TMRおよびJF549の吸収および発光スペクトルは重ね合わせることができ（図2）、それらの色素は同様の細胞透過性を示唆する、溶媒の極性に同様の感受性を示した（図3）。
【０１４８】
実施例2
本実施例は、細胞イメージングにおけるラベルとしての色素JF549の性能を評価するために行われた手順を記載する。
JF549-HaloTagリガンド（実施例21）は、6-カルボキシフルオレセイン誘導体から出発して合成された。初めに、6-カルボキシフルオレセインのジアセテート誘導体をtert-ブチルエステルとして保護した。そのアセテート基をNaOHでけん化し、この中間体をトリフレート化し、6-tert-カルボキシフルオレセイン ジトリフレートを2段階で69％の収率で得た。
アゼチジンとのクロスカップリングはローダミンを与え、それを脱保護してカルボン酸を得た。カルボン酸をDSCで処理し、、続いてHloTag(O2)アミンと反応させてJF549-HaloTagリガンドを得た（実施例21）。この分子は市販のTMRベースHaloTagリガンドの直接類似体であった。
特に、ローダミン色素は、「開いた」双極性イオンのキノイド形と「閉じた」脂溶性のラクトン形の間の平衡状態で存在する。この動的両親媒性は、本色素が界面活性剤または化学的マスキング基なしに細胞膜を効率的に越え、過剰なリガンドは迅速に洗い流すことができるので、ローダミン110、TMRおよびJF549のような正味中性のローダミンを、生細胞標識技術のために有用なリガンドにする。
【０１４９】
TMRおよびJF549HloTagリガンドの標識動態は、生じた共役体の明るさおよび光子収率を測定しながら、新規なCy3HaloTagリガンドと比較された。JF549リガンドは、インビトロでTMRリガンドに匹敵する標識動態およびその他の色素と比較して増大した明るさを示した。HaloTag-ヒストン2B（H2B）融合を発現する肝細胞とJF549リガンドとのインキュベーションは、明るい核標識（図4）および低い細胞質バックグラウンドをもたらし、JF549-HaloTagリガンドが肝細胞の膜を効率的に横断し、HaloTagタンパク質を選択的に標識することを示した。
【０１５０】
低い量のリガンド（＜50 nM）を用いるJF549とTMRリガンドのインキュベーションは、単一分子の画像化ならびにラベル化されたHaloTag-H2B中の個々の分子の蛍光の明るさ（光子／秒）および光安定性（すなわち飛跡長、秒）の評価を可能にした。JF549リガンドは、TMRリガンドに比較して明るさおよび光安定性の両方で大きな増加を示した（図5）。
TMRリガンドでラベルされたタンパク質は、平均光子／秒 = 1.1×104および0.72秒の平均飛跡長を示した。JF549リガンドの共役体は、ほとんど2倍の光子の数／秒（1.9×104）を放出し、長さとして約2倍続いた（平均飛跡長 = 1.6秒）。単一分子の明るさにおけるこの改善は、直接確率的光学再構築顕微鏡検査（dSTORM）実験にまで及んだ。ここで、還元環境の使用は合成蛍光体の可逆的光スイッチングを可能にする。
【０１５１】
このことが、それぞれ14.1 nmおより17.0 nmの中央局在エラー（σ）（図8）を有する、JF549リガンド（図6）またはTMRリガンド（図7）を用いてのH2Bの超解像画像をもたらした。dSTORMは、JF549ラベルの光スイッチングを引き起こすために、細胞の還元環境を用いて生細胞内で行われ得る（図9）。したがって、JF549は、固定細胞および生細胞中、インビトロでのHaloTag共役に対してこのスペクトル範囲で行われた。
【０１５２】
実施例3
本実験は、炭素およびケイ素原子含有ローダミンの他の赤色シフトした同族体を含む、他の色素骨格へのアゼチジニル置換の拡張を記載する。この実施例は、アゼチジニル置換が異なる蛍光体骨格への一般化が可能であり、元の親蛍光体骨格と比較して明るさにおける増加を引き起こすことができることを示す。
【０１５３】
N,N-ジアルキルモチーフが、クマリン（例えば、クマリン461）、アクリジン（例えば、アクリジンオレンジ）、ロードール、カルボローダミン、オキサジン（例えば、オキサジン1）およびシラローダミンを含む、多くの古典的蛍光体骨格（表3）で見出される。TICTが、わずかな量子効率に導く、これらの蛍光系での非放射減衰への主な一因として報告されている。前の例で記載されたローダミンと同様に、入手しやすいアリールハライドまたはアリールトリフレートから出発する、Pd触媒クロスカップリングアプローチが、これらの蛍光体中にアゼチジンモチーフを導入するために用いられた。
【０１５４】
【表３】
0006606096.tif 000039
【０１５５】
全ての場合に、アゼチジン置換は、他のスペクトル特性に実質的な悪影響なしに量子収率における増加を与えた（表3）。クマリン461は、水性緩衝液中、λmax/λem = 372 nm/470 nm、ε = 1.8×104 M-1cm-1およびわずかなφ = 0.19を示した。アゼチジン置換化合物（実施例49）は、吸光度極大での18-nmの浅色シフト（λmax = 354 nm）をともなう量子収率（φ = 0.96）における5倍の増加を示した。アゼチジン置換化合物の発光スペクトルと吸光係数（λmax = 467 nm, ε = 1.5×104 M-1cm-1）は、親のクマリン色素と同様であった。
7-(ジエチアミノ)クマリン-3-カルボン酸(DEAC)は、λmax/λem = 410 nm/471 nm、ε = 3.5×104 M-1cm-1を示したが、低い量子収率（φ = 0.03）を示した。アゼチジン置換化合物（実施例51）は、より短い吸収極大（λmax = 387 nm）、より小さい吸光係数（ε = 2.4×104 M-1cm-1）およびλem = 470 nmの発光極大を示した。ここで、アゼチジン置換はほとんど30倍で量子収率を増加した（φ = 0.84）。
【０１５６】
次に、アクリジンおよびロードール蛍光骨格を変えた。古典的蛍光体のアクリジンオレンジは、水溶液で測定したときにφ = 0.21を与えた、一方、アゼチジン置換化合物（実施例60）は、φ = 0.52で2.5倍明るかった。2つのアクリジンのその他のスペクトル特性は類似していた。ジメチルロードールはλmax/λem = 518 nm/546 nm、ε = 6.0×104 M-1cm-1およびφ = 0.21を示し、そのアゼチジン置換相対物（実施例59）は、類似のλmax、λemおよびε値を有したが、N,N-ジメチルアミノ基のアゼチジンでの置換は量子収率において4倍の増加（φ = 0.85）を与えた。
【０１５７】
次に、より長い波長の蛍光体に関して、TMRの炭素含有類似体は、水性緩衝液中でλmax/λem = 606 nm/626 nm、ε = 1.21×105 M-1cm-1およびφ = 0.52を示した（表３）。アゼチジニル-カルボローダミン（実施例40）は、同様の吸収および発光極大（λmax/λem = 608 nm/631 nm）ならびに吸光係数（ε = 9.9×104M-1cm-1）ならびに量子収率φ = 0.67を示した。
色素オキサジン1は、λmax/λem = 655 nm/669 nm、ε = 1.11 × 105M-1cm-1および比較的低いφ = 0.07で近赤外にスペクトル特性を示し、アゼチジン置換（実施例61）は小さい浅色移動（λmax/λem = 647 nm/661 nm）、わずかに低い吸光係数（ε = 9.9 × 104M-1cm-1）および量子収率（φ = 0.24）で3.4倍の改善を与えた。
最後に、TMRのシラローダミン類似体（SiTMR；Lukinavicius, G.らから、Nat. Chem. 2013, 5, 132）はλmax/λem = 643 nm/662 nmおよびφ = 0.41を示した；アゼチジン置換化合物（実施例30）は、同様の吸収および発光極大（λmax/λem = 646 nm/664 nm）およびより高いφ = 0.54を与えた。シラローダミンは水中で無色の形態をとるので、吸光係数は酸性エタノール中で測定され、SiTMRに対してε = 1.41 × 105M-1cm-1およびアゼチジン置換化合物に対してε = 1.52 × 105 M-1cm-1を測定した。
【０１５８】
実施例4
本実施例はアゼチジニル-シラローダミンを用いての細胞イメージングを記載する。SiTMRに基づく化合物は、SnapTag、HaloTagおよび性細胞内の他のタンパク質に対して効果的なラベルである。アゼチジニル-シラローダミン（実施例30）は無アゼチジニル親化合物のSiTMRに比較して優れた明るさ（ε×φ、表3）を示す。本実施例に記載のアゼチジニル-シラローダミン実施態様はλmax = 646を示し、本明細書中で「JF646」と称される。
【０１５９】
細胞イメージング実験において、これら2つの色素を直接比較するために、アゼチジニル-シラローダミン（JF646-HaloTagリガンド、実施例35）およびSiTMR（Lukinavicius, G.ら、Nat. Chem. 2013, 5, 132）のHaloTagリガンドを新規なシラフルオレセイン前駆体から合成した。両方のシラローダミンリガンドはHaloTag-H2Bの超解像dSTORMイメージングに対して優れたラベル（図10および11）であり、それぞれ8.4 nmおよび9.0 nmの中央局在エラー（図12）を示した。HaloTag-チューブリンを発現し、JF646リガンドで標識した生細胞でもdSTORMを行った。このラベルで高い光子収率および低いバックグラウンドが観察され、中央σ = 7.1 nm（図13〜15）を与えた。
【０１６０】
HaloTagリガンドの発色性(chromogenicity)が、精製タンパク質との反応および生細胞イメージング実験で比較された。SiTMRリガンドは緩衝液中過剰なHaloTagタンパク質との反応で6.8倍の増大を示した（図16）。アゼチジニル-シラローダミン-HaloTagリガンドは、より低いバックグラウンドを示し、同じ条件下の吸収においてより大きい21倍の増加をもたらした（図17）。
【０１６１】
次いで、「無洗浄」イメージング実験がHaloTag-H2B融合を発現する細胞を用いて行われた。SiTMRリガンド（図18）およびJF646リガンド（図19）を用いて、どちらか一方のリガンド（100 nM）とインキュベーション、続いて直接の広視野イメージングは、明るく標識化された核を与えた。SiTMRは核外の蛍光（図20）を示し、一方JF646リガンドはより低い非選択的染色（図21および22）を示した。全体として、これらの結果は、公知のSiTMRリガンドは構造的に類似のJF646で置き換えられ、超解像イメージングで改善された局在エラーおよび慣用の蛍光顕微鏡法で低いバックグラウンドを達成し得ることを示している。
【０１６２】
実施例5
本実施例は、同じ細胞で多重単一粒子追跡および超解像イメージング法を記載する。JF549とJF646の間のスペクトル分離を与えるので、2つの異なるタンパク質種は同じ生細胞中で単一分子レベルで画像化される。
【０１６３】
直交(orthogonal)ラべリングを達成するため、JF549のSnapTagリガンドを製造した。HaloTag-H2BおよびSnapTag酵素とTet受容体タンパク質との融合（SnapTag-TetR）を共発現し、それぞれJF646-HaloTagリガンド（実施例35）およびJF549-SnapTagリガンド（実施例22）でラベル化した。個々のJF549-ラベル化TetRタンパク質の軌跡が画像化され、続いてJF646-H2B共役体の迅速生細胞dSTORM実験が行われた（図23）。この2色手順は、核のクロマチン構造に関する高速-および低速-拡散DNA-結合タンパク質のそれぞれの区画を示した（図24）。次いで、H2B-共局在化および非-共局在化TetR軌跡の両方の拡散係数の柱状図表がプロットされ、非-共局在化の位置でより大きい範囲でH2Bで共局在化されたTetRを示した（図25）。
【０１６４】
したがって、本化合物は、生細胞での多色実験に用いられ得る。その場合、生物学的過程に関与するいくつかの成分が同じ細胞内で分子精度で追跡され、局在化され得る。
【０１６５】
実施例6
本実施例において、アゼチジニル-クマリン標識が細胞イメージングのために用いられた。市販のSnapTagリガンド（すなわち、SnapCell430）の性能が、7-アゼチジニル-クマリン-3-カルボン酸から合成された新規アゼチジニル誘導体（実施例52）と比較された。同一の一過性トランスフェクション、ラベル化およびイメージング条件下、H2B-SnapTag発現細胞を赤色蛍光核染色DRAQ5およびSnapCell430またはアゼチジニルリガンドのいずれかで染色した。空間的基準としてDRAQ5染色（図26および27）を用いて、いずれかのSnapTagリガンドによってラベル化された個々の核の強度が測定された。SnapCell430リガンドとインキュベートされた細胞は、低い蛍光強度を示し（図28）、一方、アゼチジニル-クマリンSnapTagリガンドでラベル化された細胞はより明るい核ラベル化を示した（図29）。核強度の定量化は、アゼチジンでラベル化された細胞が市販の化合物でラベル化された細胞より5倍高い中央値を有することを示した（図30）。
【０１６６】
実施例7〜61
以下の実施例は、本明細書に記載の化合物の具体的な実施態様を記載し、色素を作るための本アゼチジンアプローチの適応性を説明する。我々は、アゼチジンの3位で異なる置換パターンを探索することによってJF549の物理化学的特性をさらに調整することができることを推論した。例えば、表1に示された置換アゼチジニル-ローダミンは、比較的高いε値および量子収率値を有した。
【０１６７】
分光法のための蛍光および蛍光性分子は、DMSO中の貯蔵液として調製され、DMSO濃度が1％ v/vを超えないように希釈された。別に断りがなければ、リン酸緩衝食塩水（PBS）はpH 7.4であった。
【０１６８】
Starna Cellからの1-cm経路長、3.5-mL石英キュベットまたはHllmaからの1-cm経路長、1.0-mL石英マイクロキュベットを用いて、分光法を行った。別に断りがなければ、全ての測定は、10 mM HEPES、pH 7.3緩衝液中、周囲温度（22±2 ℃）で行われた。吸収スペクトルは、Cary Model 100分光計(Varian)で記録された；吸光係数（ε）に対する報告値は平均値（n = 3）である。蛍光スペクトルはCary Eclipse蛍光分光計(Varian)で記録された。明確にするために、標準化スペクトルが示される。
【０１６９】
報告された全ての量子収率値は、Quantaurus-QY分光計(C11374、Hamamatsu)を用いて、同一の条件下で測定された。測定は希薄試料（A＜0.1）を用いて行われ、計器ソフトウエアを用いて自己吸収補正が行われた。報告値は平均値（n = 3）である。
【０１７０】
スペクトル等級ジオキサン（Sigma-Aldrich）およびmilliQ H2O中で、ジオキサン-H2O滴定が行われた。ローダミン色素を確保するために、0.01％ v/vトリエチルアミン含有溶媒混合物は、両性イオン形態にあった。λmaxでの吸収値は、石英96-ウエルマイクロプレート（Hellma）およびFlexStation3 マイクロプレートリーダー（Molecular Devices）を用いて、5μMの試料（n = 2）で測定された。
【０１７１】
蛍光寿命の測定に対して、レーザー光線中にパルスピッカー(pulse picker)（Model 350-160、ConOptics）を入れ、80 MHzから20 MHzにパルス周波数を減少した。試料（50 mM HEPES中で希釈された2μM、pH 7.2、H2OまたはCH3OH）は、830 nmのレーザー波長および6 mWのレーザー出力で励起された。放射光が高速タイミング(fast-timing)APDによって集められ、単一光子計数板（TimeHarp200；PicoQuant）に送り込まれた。タイミングパルスが、20 MHzパルス列(pulse train)をモニターするPINダイオード（DET01CFC；ThorLabs）から得られた。系の時間的インパルス応答が、色素試料の代わりに薄い非線形結晶を用いて、レーザーパルスの第二高周波発生によって測定された。寿命崩壊データは、特別注文のMATLABプログラムを用いて単一指数崩壊関数に適合させた。この系を用いて測定された参照フルオレセイン色素の寿命値は、4.1±0.1 ns（Magde, D.; Rojas, G. E.; Seybold, P. G. Photochem. Photobiol. 1999, 70, 737）の文献値と比較して、4.025±0.015 ns (R2 = 0.99)であった。
【０１７２】
HloTagタンパク質との反応でのHaloTagリガンドの蛍光を測定するため、吸収度測定を1 mL石英キュベット中で行った。HaloTagタンパク質は、50％v/vグリセロールでの75 mM NaCl、50 mM TRIS・HCl、pH 7.4（TBS-グリセロール）の100μM溶液として用いられた。JF646およびSiTMRのHaloTagリガンド（5μM）は、0.1 mg・mL-1 CHAPSを含む10 mM HEPES、pH 7.3中に溶解された。HaloTagタンパク質の一定量（1.5当量）または等体積のTBS-グリセロールブランクを加え、得られる混合物を一貫した吸収シグナルが観察されるまで（〜30分）インキュベートした。さらなるHaloTagタンパク質は吸光度における増加を引き起こさなかった（表示なし）。吸光度スキャンは平均値（n = 2）である。
【０１７３】
HeLa細胞(ATCC)およびU2OS細胞(ATCC)を、10% v/vウシ胎仔血清(FBS; Life Technologies)、1 mM GlutaMax (Life Technologies)および1 mM ピルビン酸ナトリウム(Sigma)が補充されたDulbecco変法イーグル培地(DMEM; Life Technologies)中で培養し、5％ v/v CO2加湿環境中、37 ℃に維持した。これらの細胞株は、Janelia Cell Culture Facility によって通常のマイコプラズマ試験を受ける。Amaxa Nucleofector(Lonza)を用い、細胞をHaloTag-H2B、HaloTag-チューブリン、SnapTag-TetRまたはSnapTag-H2Bでトランスフェクトした。
イメージング実験の前に、トランスフェクトされた細胞をPiranha溶液(濃H2SO4と30% v/v 過酸化水素との3:1 v/v 混合物)できれいにしたNo.1 カバースリップ(Warner Instruments)に移した。生細胞をHaloTagまたはSnapTagリガンドでラベルするために、成長培地にリガンドを加え、その試料を15分間インキュベートした。一般的に、ラべリングの濃度は、共焦点、広視野、dSTORM試験に対しては100〜500 nMで、単一分子追跡実験に対しては5〜50 nMであった。次いで細胞をPBS (1×)でさっと洗浄し、次いでDMEM-FBS中でさらに15分間インキュベートした。
イメージングの前に、細胞をPBS (3×)でさっと洗浄し、イメージングのために新鮮なDMEM-FBS中に入れた。「無洗浄」実験において、全ての洗浄は省かれた。核染色のため、細胞をPBS中で5分間 (2×)、インキュベートし、次いで5μM DRAQ5 (Cell Signaling)を含むPBS中で5分間インキュベートし、続いてPBS (1×)でさっと洗浄した。全てのイメージング実験の間、生細胞インキュベータ(TOKAI HIT)によって供給される5％ CO2 v/v加湿環境中、37 ℃に細胞を維持した。
【０１７４】
顕微鏡画像を得るために3つの独立した系を用いた。LD C-APOCHROMAT 40×/1.2 W Korr M27 UV-VIS-IR 対物レンズを有する、Zeiss LSM 510 META 共焦点顕微鏡を用いて共焦点顕微鏡検査を行った。広視野顕微鏡検査、2D 単一分子追跡および超解像イメージング実験は、100×、1.4NA 油浸対物レンズ (Nikon)、Lumencor光源、Acousto-Optic Tunable Filter (AA Opto-Electronic)、2つのフィルター ホイール (Lambda 10-3; Sutter Instruments)、完全集束系 (Nikon)によって制御された1セットのレーザー (405 nm/100 mW, Coherent Cube; 561 nm/200 mW, Cobolt Jive; 633 nm/140 mW, Vortran Stradus)およびEMCCDカメラ (iXon3, Andor)を備えたNikon Eclipse Ti 広視野落射蛍光顕微鏡を用いて行われた。
JF549およびJF646放射に対して、カメラの前に放射フィルター (FF01 593/40またはFF01 676/37; Semrock)を設置した。励起レーザー光を対物レンズに反射するためにマルチバンドミラー (405/488/561/633 BrightLine quad-band bandpass filter, Semrock)を用いた。顕微鏡、カメラおよび機械設備はNIS-Elements ソフトウエア (Nikon)により制御された。
【０１７５】
他の生細胞単一超解像イメージング実験は、1.4NA PLAPON 60× OSC 対物レンズ (Olympus)および100× 全倍率をもたらす300 mm 焦点距離チューブレンズ (LAO-300.0, Melles Griot)を用いて、特注の3カメラ RAMMフレーム (ASI)顕微鏡で記録された。Stradus 405-100 レーザー (Vortran)のストロボの405 nm励起は、Stradus 637-140 レーザー (Vortran)からの637 nm レーザー放出も制御する、NI-DAQ-USB-6363捕捉ボード (National Instruments)を用いて達成された。2mmの厚さのクアド-バンド ダイクロック (ZT 405/488/561/640rpx, Chroma)およびバンド-パス放射フィルター (FF01-731/137-25, Semrock)が放射光をフィルターにかけた。蛍光は、Micro-Manager (1.4.17)により制御されたバック照光EMCCDカメラ (Andor Technology, Ixon Ultra DU-897U-CS0-EXF, 17 MHz EM amplifier)で検出された。
【０１７６】
生細胞dSTORMイメージングのために、細胞をラベルし、洗浄し、DMEM-FBS中で直接撮像した。固定細胞調製のために、細胞をラベルし、洗浄し、PBS緩衝液（pH = 7.5）中の4％パラホルムアルデヒド (Electron Microscopy Sciences)で固定した。50 mM メルカプトエチルアミン(Sigma-Aldrich)、10% w/v グルコース、0.5 mg/mL グルコースオキシダーゼ (Sigma-Aldrich)および28400 U/mL カタラーゼ (Sigma-Aldrich)が補充されたPBSからなる窒素-脱気レドックス緩衝液を含む密封細胞チャンバー (Life Technologies)中で、細胞を撮像した。
イメージングの前、JF549は励起光 (561 nm)の2 kW・cm-2での照射で効率的に暗状態に「棚上げする」ことができ、次いで低強度 (〜20 W・cm-2)での青色光 (405 nm)により蛍光状態に戻して活性化することができた。JF646蛍光体は、14 kW・cm-2で637 nm励起光の連続照射を用いて優位に暗状態に変換され、その後、JF646蛍光体の急速に点滅する個々の分子が観察された。これらの実験は上記の2つの広視野顕微鏡系：Nikon Eclipse Ti 落射蛍光顕微鏡およびASI RAMMフレームを有する特注3カメラ顕微鏡で行われた。
【０１７７】
特別注文のMATLABプログラムを用いる、多重ターゲットトレーシング（MTT）アルゴリズム（Serge, A.; Bertaux, N.; Rigneault, H.; Marguet, D. Nature Protocol Exchange 2008, doi:10.1038/nprot.2008.1128; Serge, A.; Bertaux, N.; Rigneault, H.; Marguet, D. Nat. Methods 2008, 5, 687）に基づいて、スポット位置確認（x,y）が得られた。各フレームに対して、個々の蛍光体のPSFが二次元ガウス分布に適合された。統合蛍光強度が計算され、IGOR Proバージョン 6.34Aで書かれた解析ルーチンを用いて光子数に変換された。局在エラーは、Mortensenら (Mortensen, K. I.; Churchman, L. S.; Spudich, J. A.; Flyvbjerg, H. Nat. Methods 2010, 7, 377)の式6を用いて計算された。
超解像撮像は、Igor Pro v. 3.34Aから作動するDedeckerら (Dedecker, P.; Duwe, S.; Neely, R. K.; Zhang, J. J. Biomed. Opt. 2012, 17, 126008)によるソフトウエアパッケージLocalizerを用いて提供され、それは、大きさとして適合された強度値および幅としての局在エラーを用いて、ガウス マスク(masks)として検出スポットの位置座標を重ね合わせる。2つの異なる蛍光体リガンドを比較する実験に対するdSTORMデータは、同一の照射条件下、同日に記録された。
【０１７８】
2色単一分子実験は、Nikon Eclipse Ti広視野落射蛍光顕微鏡で記録された。我々は、最初、100 Hzのフレームレートで、励起強度 〜1 kW cm-2の561-nmレーザーを用いて、SnapTag-TetR-JF549の2D単一分子トラッキングを行った。単一粒子トラッキング実験の終了後直ちに、次いで我々は、上記のdSTORMモード下でHaloTag-H2B-JF646を撮像した。トラッキング-dSTORM実験の前と後に透過像を撮影し、相互相関アルゴリズムを用いて画像ドリフトを計算した(Guizar-Sicairos, M.; Thurman, S. T.; Fienup, J. R. Opt. Lett. 2008, 33, 156)。
TetRのトラッキング解析は、市販のトラッキングソフトウエアDiaTrack (v. 3.03, Semasopht)を用いて行い、それは、実験的に測定された点広がり関数に適合させた2Dガウス関数を用いて、蛍光粒子の強度スポットを同定し、適合させる。
拡散マップは、IGOR Pro 6.34Aで書かれたトラッキングルーチンを用い、10 ミリ秒のタイムスケールでの平均二乗変位からの20 nm×20 nm x-y グリッドで評価されたTetR移動性の見掛けの局所拡散を計算して作成された。所定のグリッドノードの80 nm内から生じる2以上の独立した変位が見られるときはいつでも、見掛けの局所拡散係数が計算され、プロットされた。次いで、超解像画像中の500の最も明るいスポットとして、H2Bクラスターが選択された。この解析から、少なくとも10ミリ秒間のH2Bクラスターの320 nm内に存在する全ての軌跡に対する見掛けの拡散係数のヒストグラムが作り出された。次いで、H2B-共局在化および非共局在化TetR軌跡の両方の拡散係数のヒストグラムがプロットされた。
【０１７９】
実施例7.  2-(3,6-ジ(アゼチジン-1-イル)キサンチリウム-9-イル)ベンゾエート
【化２８】
0006606096.tif 000040
【０１８０】
バイアルをフルオレセイン ジトリフレート (75 mg, 126 μmol; Grimm, J. B.; Lavis, L. D. Org. Lett. 2011, 13, 6354から)、Pd2dba3(11.5 mg, 12.6 μmol, 0.1 eq)、XPhos (18.0 mg, 37.7 μmol, 0.3 eq)およびCs2CO3(115 mg, 352 μmol, 2.8 eq)で装填した。そのバイアルを密封し、排気／窒素で戻す操作を行った(3×)。ジオキサン (1 mL)を加え、反応混合物を再度窒素でフラッシュした(3×)。アゼチジン (20.3 μL, 302 μmol, 2.4 eq)の添加に続いて、反応混合物を100 ℃で18時間撹拌した。次いで、それを室温に冷却し、MeOHで希釈し、Celiteの上に置き、濃縮乾固した。シリカゲルクロマトグラフィーによる精製(0-10% MeOH (2 M NH3)/CH2Cl2, 直線勾配; Celiteでの乾式積載)により、紫色の固体として標記化合物 (49 mg, 95%)を得た。
【０１８１】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.03 - 7.96 (m, 1H), 7.63 (td, J = 7.4, 1.3 Hz, 1H), 7.58 (td, J = 7.4, 1.1 Hz, 1H), 7.20 - 7.13 (m, 1H), 6.56 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.20 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 6.09 (dd, J = 8.6, 2.3 Hz, 2H), 3.91 (t, J = 7.3 Hz, 8H), 2.37 (p, J = 7.2 Hz, 4H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 169.9 (C), 153.7 (C), 153.1 (C), 152.9 (C), 134.6 (CH), 129.4 (CH), 129.0 (CH), 127.8 (C), 125.0 (CH), 124.3 (CH), 107.9 (C), 107.8 (CH), 97.7 (CH), 52.2 (CH2), 16.8 (CH2); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 550 nmで検出); HRMS (ESI) C26H23N2O3 [M+H]+に対する計算値 411.1703, 実測値 411.1714.
【０１８２】
実施例8.  2-(3,6-ビス(3,3-ジメチルアゼチジン-1-イル)キサンチリウム-9-イル)ベンゾエート
【化２９】
0006606096.tif 000041
【０１８３】
実施例7に記載の手順を用い、フルオレセイン ジトリフレートおよび3,3-ジメチルアゼチジン塩酸塩から標記化合物 (86%, 紫色の固体)を製造した。
【０１８４】
1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.11 - 8.06 (m, 1H), 7.67 - 7.57 (m, 2H), 7.23 - 7.20 (m, 1H), 7.19 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.56 (dd, J = 9.1, 2.2 Hz, 2H), 6.49 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 3.92 (s, 8H), 1.39 (s, 12H); 13C NMR (MeOD, 101 MHz) δ 173.1 (C), 160.2 (C), 158.7 (C), 158.2 (C), 140.8 (C), 134.9 (C), 132.9 (CH), 130.82 (CH), 130.77 (CH), 130.74 (CH), 130.2 (CH), 115.0 (C), 113.1 (CH), 95.5 (CH), 64.4 (CH2), 33.0 (C), 27.1 (CH3); 分析HPLC: >99% 純度(4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 550 nmで検出); HRMS (ESI) C30H31N2O3 [M+H]+に対する計算値 467.2329, 実測値 467.2341.
【０１８５】
実施例9.  2-(3,6-ビス(3,3-ジフルオロアゼチジン-1-イル) キサンチリウム-9-イル)ベンゾエート
【化３０】
0006606096.tif 000042
【０１８６】
実施例7に記載の手順を用い、フルオレセイン ジトリフレートおよび3,3-ジフルオロアゼチジン塩酸塩から標記化合物 (91%, 桃色の固体)を製造した。
【０１８７】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.03 - 7.99 (m, 1H), 7.66 (td, J = 7.4, 1.3 Hz, 1H), 7.60 (td, J = 7.4, 1.1 Hz, 1H), 7.17 - 7.14 (m, 1H), 6.64 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.30 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 6.17 (dd, J = 8.6, 2.4 Hz, 2H), 4.25 (t, 3JHF = 11.7 Hz, 8H); 19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ -100.05 (p, 3JFH = 11.8 Hz); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 169.6 (C), 153.3 (C), 152.6 (C), 151.3 (t, 4JCF = 2.9 Hz, C), 135.0 (CH), 129.7 (CH), 129.3 (CH), 127.2 (C), 125.1 (CH), 124.0 (CH), 115.8 (t, 1JCF= 274.6 Hz, CF2), 109.7 (C), 108.8 (CH), 99.4 (CH), 83.9 (C), 63.4 (t, 2JCF = 26.3 Hz, CH2); 分析HPLC: >99% 純度(4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 525 nmで検出); HRMS (ESI) C26H19F4N2O3 [M+H]+に対する計算値 483.1326, 実測値 483.1336.
【０１８８】
実施例10.  2-(3,6-ビス(3-フルオロアゼチジン-1-イル)キサンチリウム-9-イル)ベンゾエート
【化３１】
0006606096.tif 000043
【０１８９】
実施例7に記載の手順を用い、フルオレセイン ジトリフレートおよび3-フルオロアゼチジン塩酸塩から標記化合物 (89%, 桃色の固体)を製造した。
【０１９０】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 8.01 - 7.95 (m, 1H), 7.78 (td, J = 7.5, 1.2 Hz, 1H), 7.71 (td, J = 7.5, 0.9 Hz, 1H), 7.25 - 7.20 (m, 1H), 6.52 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.33 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 6.24 (dd, J = 8.6, 2.3 Hz, 2H), 5.49 (dtt, 2JHF = 57.6 Hz, J = 6.0, 3.1 Hz, 2H), 4.26 - 4.13 (m, 4H), 4.00 - 3.88 (m, 4H); 19F NMR (DMSO-d6, 376 MHz) δ -178.95 (dtt, JFH = 57.4, 24.2, 20.9 Hz); 13C NMR (DMSO-d6, 101 MHz) δ 168.7 (C), 152.54 (d, 4JCF = 1.3 Hz, C), 152.47 (C), 151.8 (C), 135.4 (CH), 129.9 (CH), 128.6 (CH), 126.4 (C), 124.5 (CH), 123.9 (CH), 108.6 (CH), 107.8 (C), 98.0 (CH), 83.8 (C), 83.3 (d, 1JCF = 200.3 Hz, CFH), 59.2 (d, 2JCF = 23.7 Hz, CH2); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 550 nmで検出); HRMS (ESI) C26H21F2N2O3 [M+H]+に対する計算値 447.1515, 実測値 447.1525.
【０１９１】
実施例11.  2-(3,6-ビス(3-メトキシアゼチジン-1-イル)キサンチリウム-9-イル)ベンゾエート
【化３２】
0006606096.tif 000044
【０１９２】
実施例7に記載の手順を用い、フルオレセイン ジトリフレートおよび3-メトキシアゼチジン塩酸塩から標記化合物 (83%, 紫色の固体)を製造した。
【０１９３】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 8.00 - 7.94 (m, 1H), 7.77 (td, J = 7.5, 1.2 Hz, 1H), 7.70 (td, J = 7.5, 0.9 Hz, 1H), 7.25 - 7.20 (m, 1H), 6.48 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.26 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 6.19 (dd, J = 8.6, 2.3 Hz, 2H), 4.32 (tt, J = 6.2, 4.2 Hz, 2H), 4.07 (dd, J = 8.0, 6.6 Hz, 4H), 3.66 (dd, J = 8.4, 4.1 Hz, 4H), 3.24 (s, 6H); 13C NMR (DMSO-d6, 101 MHz) δ 168.7 (C), 152.8 (C), 152.5 (C), 151.9 (C), 135.4 (CH), 129.9 (CH), 128.5 (CH), 126.5 (C), 124.5 (CH), 123.9 (CH), 108.2 (CH), 107.2 (C), 97.5 (CH), 84.1 (C), 69.2 (CH), 58.3 (CH2), 55.4 (CH3); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 550 nmで検出); HRMS (ESI) C28H27N2O5 [M+H]+ に対する計算値 471.1914, 実測値 471.1926.
【０１９４】
実施例12.  2-(3,6-ビス(3-シアノアゼチジン-1-イル)キサンチリウム-9-イル)ベンゾエート
【化３３】
0006606096.tif 000045
【０１９５】
実施例7に記載の手順を用い、フルオレセイン ジトリフレートおよび3-アゼチジンカルボニトリル塩酸塩から標記化合物 (85%, 赤紫色の固体)を製造した。
【０１９６】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.03 - 7.98 (m, 1H), 7.66 (td, J = 7.4, 1.3 Hz, 1H), 7.60 (td, J = 7.4, 1.1 Hz, 1H), 7.17 - 7.13 (m, 1H), 6.62 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.25 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 6.12 (dd, J = 8.6, 2.4 Hz, 2H), 4.25 - 4.18 (m, 4H), 4.15 - 4.08 (m, 4H), 3.60 (tt, J= 8.5, 6.2 Hz, 2H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 169.6 (C), 153.2 (C), 152.5 (C), 151.9 (C), 135.0 (CH), 129.7 (CH), 129.3 (CH), 127.1 (C), 125.1 (CH), 124.0 (CH), 119.7 (C), 109.7 (C), 108.1 (CH), 98.7 (CH), 83.9 (C), 55.2 (CH2), 18.4 (CH); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 550 nmで検出); HRMS (ESI) C28H21N4O3 [M+H]+ に対する計算値 461.1608, 実測値 461.1628.
【０１９７】
実施例13.  2-(3,6-ビス(3-(ジメチルアミノ)アゼチジン-1-イル)キサンチリウム-9-イル)ベンゾエート
【化３４】
0006606096.tif 000046
【０１９８】
実施例7に記載の手順を用い、フルオレセイン ジトリフレートおよび3-(ジメチルアミノ)アゼチジン塩酸塩から標記化合物 (80%, 紫色の固体)を製造した。
【０１９９】
1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.10 - 8.05 (m, 1H), 7.69 - 7.60 (m, 2H), 7.24 - 7.19 (m, 1H), 7.12 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.56 (dd, J = 9.0, 2.2 Hz, 2H), 6.53 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 4.31 - 4.22 (m, 4H), 4.01 (dd, J= 10.5, 5.1 Hz, 4H), 3.39 (tt, J= 7.0, 5.1 Hz, 2H), 2.27 (s, 12H); 13C NMR (MeOD, 101 MHz) δ 172.8 (C), 157.9 (C), 157.1 (C), 147.7 (C), 138.7 (C), 138.4 (C), 132.5 (CH), 131.8 (CH), 130.8 (CH), 129.9 (CH), 129.3 (CH), 114.1 (C), 112.4 (CH), 96.3 (CH), 57.0 (CH), 56.6 (CH2), 42.0 (CH3); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 550 nmで検出); HRMS (ESI) C30H33N4O3 [M+H]+ に対する計算値 497.2547, 実測値 497.2561.
【０２００】
実施例14.  2-(3,6-ビス(3-(メトキシカルボニル)アゼチジン-1-イル)キサンチリウム-9-イル)ベンゾエート
【化３５】
0006606096.tif 000047
【０２０１】
実施例7に記載の手順を用い、フルオレセイン ジトリフレートおよびアゼチジン-3-カルボン酸メチル塩酸塩から標記化合物 (79%, 紫色の固体)を製造した。
【０２０２】
1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.09 - 8.03 (m, 1H), 7.69 - 7.62 (m, 2H), 7.24 - 7.17 (m, 1H), 7.02 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 6.48 (dd, J = 8.9, 2.2 Hz, 2H), 6.45 (d, J = 2.1 Hz, 2H), 4.34 (t, J = 9.0 Hz, 4H), 4.25 (dd, J = 9.0, 5.9 Hz, 4H), 3.77 (s, 6H), 3.71 (tt, J = 8.9, 5.9 Hz, 2H); 13C NMR (MeOD, 101 MHz) δ 174.4 (C), 172.6 (C), 157.0 (C), 156.5 (C), 141.6 (C), 136.7 (C), 135.8 (C), 132.7 (CH), 131.9 (CH), 130.9 (CH), 129.0 (CH), 128.5 (CH), 113.3 (C), 111.7 (CH), 96.8 (CH), 55.2 (CH2), 52.9 (CH3), 34.0 (CH); HRMS (ESI) C30H27N2O7 [M+H]+に対する計算値 527.1813, 実測値 527.1823.
【０２０３】
実施例15.  2-(3,6-ビス(3-(2-メトキシ-2-オキソエチル)アゼチジン-1-イル)キサンチリウム-9-イル)ベンゾエート
【化３６】
0006606096.tif 000048
【０２０４】
実施例7に記載の手順を用い、フルオレセイン ジトリフレートおよび3-アゼチジン酢酸メチル トリフルオロアセテートから標記化合物 (67%, 紫色の固体)を製造した。
【０２０５】
1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.10 - 8.05 (m, 1H), 7.67 - 7.57 (m, 2H), 7.21 - 7.18 (m, 1H), 7.16 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 6.54 (dd, J = 9.1, 2.2 Hz, 2H), 6.48 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 4.41 - 4.32 (m, 4H), 3.97 - 3.88 (m, 4H), 3.69 (s, 6H), 3.26 - 3.13 (m, 2H), 2.80 (d, J = 7.7 Hz, 4H); 13C NMR (MeOD, 101 MHz) δ 173.7 (C), 173.0 (C), 158.3 (C), 157.5 (C), 154.9 (C), 140.1 (C), 136.3 (C), 132.7 (CH), 131.1 (CH), 130.8 (CH), 130.4 (CH), 129.8 (CH), 114.5 (C), 112.7 (CH), 95.7 (CH), 57.5 (CH2), 52.2 (CH3), 38.5 (CH2), 27.3 (CH); HRMS (ESI) C32H31N2O7[M+H]+ に対する計算値 555.2126, 実測値 555.2132.
【０２０６】
実施例16.  2-(3,6-ビス(3-カルボキシアゼチジン-1-イル)キサンチリウム-9-イル)ベンゾエート
【化３７】
0006606096.tif 000049
【０２０７】
2-(3,6-ビス(3-(メトキシカルボニル)アゼチジン-1-イル)キサンチリウム-9-イル)ベンゾエート (実施例14; 40 mg, 76.0 μmol)をMeOH (2.5 mL)に溶解し、1 M NaOH (304 μL, 304 μmol, 4 eq)を加えた。反応混合物を室温で18時間撹拌後、1 M HCl (350 μL)で酸性化し、逆相HPLC (10-50% MeCN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて)で直接精製し、赤-紫色の固体として標記化合物（28 mg）(60%, TFA塩)を得た。
【０２０８】
1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.36 - 8.30 (m, 1H), 7.84 (td, J = 7.5, 1.6 Hz, 1H), 7.79 (td, J = 7.6, 1.5 Hz, 1H), 7.40 - 7.36 (m, 1H), 7.12 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.66 (dd, J = 9.2, 2.2 Hz, 2H), 6.61 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 4.48 (t, J = 9.6 Hz, 4H), 4.39 (dd, J = 9.9, 5.9 Hz, 4H), 3.72 (tt, J = 9.0, 5.8 Hz, 2H); 13C NMR (MeOD, 101 MHz) δ 175.2 (C), 168.0 (C), 162.4 (C), 158.9 (C), 157.9 (C), 135.3 (C), 133.9 (CH), 132.6 (CH), 132.5 (CH), 131.5 (CH), 131.4 (CH), 115.4 (C), 113.8 (CH), 95.6 (CH), 55.3 (CH2), 33.9 (CH); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-75% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 550 nmで検出); HRMS (ESI) C28H23N2O7 [M+H]+ に対する計算値 499.1500, 実測値 499.1507.
【０２０９】
実施例17.  2-(3,6-ビス(3-(カルボキシメチル)アゼチジン-1-イル)キサンチリウム-9-イル)ベンゾエート
【化３８】
0006606096.tif 000050
【０２１０】
実施例16に記載の手順を用い、実施例15から標記化合物 (80%, 赤-紫色の固体, TFA塩)を製造した。
【０２１１】
1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.35 - 8.30 (m, 1H), 7.83 (td, J = 7.5, 1.5 Hz, 1H), 7.78 (td, J = 7.6, 1.5 Hz, 1H), 7.40 - 7.35 (m, 1H), 7.07 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.62 (dd, J = 9.2, 2.2 Hz, 2H), 6.56 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 4.43 (t, J = 9.6 Hz, 4H), 4.05 - 3.96 (m, 4H), 3.28 - 3.16 (m, 2H), 2.78 (d, J= 7.7 Hz, 4H); 13C NMR (MeOD, 101 MHz) δ 175.1 (C), 167.9 (C), 161.7 (C), 158.8 (C), 158.0 (C), 135.4 (C), 133.8 (CH), 132.5 (CH), 132.3 (CH), 131.41 (CH), 131.40 (CH), 115.1 (C), 113.7 (CH), 95.3 (CH), 57.6 (CH2), 38.5 (CH2), 27.3 (CH); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; で検出 550 nm); HRMS (ESI) C30H27N2O7 [M+H]+ に対する計算値 527.1813, 実測値 527.1815.
【０２１２】
実施例18.  4-(tert-ブトキシカルボニル)-2-(3,6-ジ(アゼチジン-1-イル)キサンチリウム-9-イル)ベンゾエート 
【化３９】
0006606096.tif 000051
【０２１３】
工程1:  
トルエン (6 mL)中の6-カルボキシフルオレセイン ジアセテート (1.39 g, 3.02 mmol)の懸濁液を80 ℃に加熱し、N,N-ジメチルホルムアミド ジ-tert-ブチルアセタール (4.34 mL, 18.1 mmol, 6 eq)を5分かけて滴下した。反応混合物を80 ℃で15分間撹拌した。混合物を室温に冷却した後、飽和NaHCO3で希釈し、CH2Cl2(2×)で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥(MgSO4)し、蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー (0-20% EtOAc／ヘキサン, 直線勾配, 一定の40% v/v CH2Cl2を用いて)により、無色の固体として6-(tert-ブトキシカルボニル)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9'-キサンテン]-3',6'-ジイル ジアセテート (971 mg, 62%)を得た。
【０２１４】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.26 (dd, J= 8.0, 1.3 Hz, 1H), 8.07 (dd, J= 8.0, 0.7 Hz, 1H), 7.73 (dd, J= 1.2, 0.8 Hz, 1H), 7.12 (dd, J= 2.1, 0.4 Hz, 2H), 6.84 (dd, J= 8.7, 2.1 Hz, 2H), 6.80 (dd, J= 8.7, 0.5 Hz, 2H), 2.32 (s, 6H), 1.56 (s, 9H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 168.9 (C), 168.3 (C), 164.0 (C), 152.8 (C), 152.3 (C), 151.7 (C), 138.8 (C), 131.4 (CH), 129.4 (C), 129.1 (CH), 125.2 (CH), 125.1 (CH), 118.0 (CH), 116.0 (C), 110.6 (CH), 83.0 (C), 82.1 (C), 28.2 (CH3), 21.3 (CH3); HRMS (ESI) C29H25O9[M+H]+ に対する計算値 517.1493, 実測値 517.1495. 
【０２１５】
工程2: 
1:1 THF/MeOH (20 mL)中の工程1からの中間体 (910 mg, 1.76 mmol)の溶液に、1 M NaOH (4.23 mL, 4.23 mmol, 2.4 eq)を加えた。反応混合物を室温で1時間撹拌した。得られる赤-橙色の溶液を1 N HCl (5 mL)で酸性化し、水で希釈し、EtOAc (2×)で抽出した。有機物を食塩水で洗浄し、乾燥(MgSO4)し、濾過し、真空下で濃縮し、赤色の固体を得た。その粗固体をCH2Cl2 (15 mL)中に懸濁させ、0 ℃に冷却した。ピリジン (1.14 mL, 14.1 mmol, 8 eq)およびトリフルオロメタンスルホン酸無水物 (1.19 mL, 7.05 mmol, 4 eq)を加え、氷浴を取り除いた。反応混合物を室温で1時間撹拌した。続いてそれを水で希釈し、CH2Cl2(2×)で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥(MgSO4)し、濾過し、蒸発させた。シリカゲルクロマトグラフィー (0-25% EtOAc／ヘキサン, 直線勾配)により、無色の固体としてtert-ブチル 3-オキソ-3',6'-ビス(((トリフルオロメチル)スルホニル)オキシ)-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9'-キサンテン]-6-カルボキシレートの841 mg (69%)を得た。
【０２１６】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.28 (dd, J= 8.0, 1.3 Hz, 1H), 8.11 (dd, J= 8.0, 0.7 Hz, 1H), 7.75 (dd, J = 1.2, 0.7 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 7.04 (dd, J = 8.8, 2.5 Hz, 2H), 6.94 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 1.57 (s, 9H); 19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ -73.12 (s); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 167.7 (C), 163.8 (C), 152.2 (C), 151.5 (C), 150.5 (C), 139.3 (C), 131.9 (CH), 130.1 (CH), 128.8 (C), 125.8 (CH), 124.9 (CH), 118.9 (C), 118.8 (q, 1JCF = 320.9 Hz, CF3), 118.0 (CH), 111.0 (CH), 83.3 (C), 80.5 (C), 28.2 (CH3); HRMS (ESI) C27H19F6O11S2[M+H]+ に対する計算値 697.0267, 実測値 697.0255.
【０２１７】
工程3: 
実施例7に記載の手順を用い、工程2で合成されたジトリフレートから標記化合物 4-(tert-ブトキシカルボニル)-2-(3,6-ジ(アゼチジン-1-イル)キサンチリウム-9-イル)ベンゾエート (86%, 暗紫色の固体)を製造した。
【０２１８】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.19 (dd, J= 8.0, 1.4 Hz, 1H), 8.02 (dd, J= 8.0, 0.7 Hz, 1H), 7.73 (dd, J= 1.3, 0.7 Hz, 1H), 6.55 (d, J= 8.6 Hz, 2H), 6.21 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 6.09 (dd, J = 8.6, 2.3 Hz, 2H), 3.92 (t, J = 7.3 Hz, 8H), 2.38 (p, J = 7.2 Hz, 4H), 1.54 (s, 9H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 169.1 (C), 164.5 (C), 153.8 (C), 153.0 (C), 152.6 (C), 137.9 (C), 131.1 (C), 130.6 (CH), 129.0 (CH), 125.4 (CH), 125.0 (CH), 107.9 (CH), 107.4 (C), 97.6 (CH), 82.4 (C), 52.2 (CH2), 28.2 (CH3), 16.8 (CH2); HRMS (ESI) C31H31N2O5[M+H]+ に対する計算値 511.2227, 実測値 511.2253.
【０２１９】
実施例19.  4-カルボキシ-2-(3,6-ジ(アゼチジン-1-イル)キサンチリウム-9-イル)ベンゾエート 
【化４０】
0006606096.tif 000052
【０２２０】
4-(tert-ブトキシカルボニル)-2-(3,6-ジ(アゼチジン-1-イル)キサンチリウム-9-イル)ベンゾエート (実施例 18; 70 mg, 0.137 mmol)をCH2Cl2 (2.5 mL)中に採取し、トリフルオロ酢酸 (0.5 mL)を加えた。反応混合物を室温で6時間撹拌した。トルエン (3 mL)を加え、反応混合物を濃縮乾固し、次いでMeOHで3回共沸し、暗赤色の粉末として標記化合物 (77 mg, 99%, TFA 塩)を得た。分析HPLCおよびNMRは、その物質が、>95% 純度であり、アミドカップリングの前にさらなる精製を必要としないことを示した。
【０２２１】
1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.40 (dd, J = 8.2, 0.6 Hz, 1H), 8.37 (dd, J = 8.2, 1.5 Hz, 1H), 7.94 (dd, J = 1.5, 0.6 Hz, 1H), 7.06 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.61 (dd, J = 9.2, 2.2 Hz, 2H), 6.55 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 4.31 (t, J = 7.6 Hz, 8H), 2.56 (p, J = 7.6 Hz, 4H); 19F NMR (MeOD, 376 MHz) δ -75.32 (s); 13C NMR (MeOD, 101 MHz) δ 167.7 (C), 167.5 (C), 160.1 (C), 158.7 (C), 158.0 (C), 136.2 (C), 135.9 (C), 135.4 (C), 132.8 (CH), 132.25 (CH), 132.24 (CH), 132.19 (CH), 114.8 (C), 113.6 (CH), 95.2 (CH), 52.9 (CH2), 16.8 (CH2); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 550 nmで検出); HRMS (ESI) C27H23N2O5 [M+H]+ に対する計算値 455.1601, 実測値 455.1610.
【０２２２】
実施例20.  2-(3,6-ジ(アゼチジン-1-イル)キサンチリウム-9-イル)-4-(((2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ)カルボニル)ベンゾエート 
【化４１】
0006606096.tif 000053
【０２２３】
4-カルボキシ-2-(3,6-ジ(アゼチジン-1-イル)キサンチリウム-9-イル)ベンゾエート (実施例19; 20 mg, 35.2 μmol)をDMF (1.5 mL)中でDSC (19.8 mg, 77.4 μmol, 2.2 eq)と混合した。 Et3N (14.7 μL, 106 μmol, 3 eq)およびDMAP (0.4 mg, 3.52 μmol, 0.1 eq)を加えた後、反応混合物を室温で2時間撹拌した。粗反応混合物を逆相HPLC (10-95% MeCN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて)により精製し、暗紫色の固体として標記化合物（18.3 mg）(78%, TFA塩)を得た。
【０２２４】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 8.47 (dd, J = 8.2, 1.8 Hz, 1H), 8.42 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.11 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.06 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 6.60 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 6.58 - 6.53 (m, 2H), 4.26 (t, J = 7.4 Hz, 8H), 2.91 (s, 4H), 2.44 (p, J = 7.7 Hz, 4H); 分析HPLC: 97.4% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 550 nmでUV検出); MS (ESI) C31H26N3O7[M+H]+ に対する計算値 552.2, 実測値 552.0.
【０２２５】
実施例21.  4-((2-(2-((6-クロロヘキシル)オキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)-2-(3,6-ジ(アゼチジン-1-イル)キサンチリウム-9-イル)ベンゾエート 
【化４２】
0006606096.tif 000054
【０２２６】
4-カルボキシ-2-(3,6-ジ(アゼチジン-1-イル)キサンチリウム-9-イル)ベンゾエート (実施例19; 10 mg, 17.6 μmol)を、DMF (1 mL)中でDSC (9.9 mg, 38.7 μmol, 2.2 eq)と混合した。Et3N (14.7 μL, 106 μmol, 6 eq)およびDMAP (0.2 mg, 1.76 μmol, 0.1 eq)を加えた後、遮光して室温で1時間撹拌した。次いで、DMF (100 μL)中の2-(2-((6-クロロヘキシル)オキシ)エトキシ)エタナミン (「HaloTag(O2)アミン」, 9.8 mg, 44.0 μmol, 2.5 eq)の溶液を加えた。反応混合物を室温でさらに4時間撹拌した。続いて、それを飽和NaHCO3で希釈し、CH2Cl2(2×)で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥(MgSO4)し、濾過し、Celiteの上に置き、真空下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー (0-10% MeOH/CH2Cl2, 直線勾配, 一定の1% v/v AcOH 添加物を用いて; Celiteでの乾式積載)、続いて逆相HPLC (10-95% MeCN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて)により、暗赤色の固体として標記化合物（8.5 mg）(62%, TFA塩)を得た。
【０２２７】
1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.79 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 8.39 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.20 (dd, J = 8.2, 1.8 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.61 (dd, J = 9.2, 2.2 Hz, 2H), 6.56 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 4.31 (t, J = 7.6 Hz, 8H), 3.68 - 3.55 (m, 8H), 3.53 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.43 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.56 (p, J = 7.6 Hz, 4H), 1.77 - 1.66 (m, 2H), 1.56 - 1.27 (m, 6H); 19F NMR (MeOD, 376 MHz) δ -75.33 (s); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 550 nmで検出); HRMS (ESI) C37H43ClN3O6 [M+H]+に対する計算値 660.2835, 実測値 660.2844.
【０２２８】
実施例22.  4-((4-(((2-アミノ-9H-プリン-6-イル)オキシ)メチル)ベンジル)カルバモイル)-2-(3,6-ジ(アゼチジン-1-イル)キサンチリウム-9-イル)ベンゾエート 
【化４３】
0006606096.tif 000055
【０２２９】
4-カルボキシ-2-(3,6-ジ(アゼチジン-1-イル)キサンチリウム-9-イル)ベンゾエート (実施例19; 10 mg, 17.6 μmol)を、DMF (1 mL)中でDSC (9.9 mg, 38.7 μmol, 2.2 eq)と混合した。Et3N (14.7 μL, 106 μmol, 6 eq)およびDMAP (0.2 mg, 1.76 μmol, 0.1 eq)を加えた後、遮光して反応混合物を室温で1時間撹拌した。次いで、6-((4-(アミノメチル)ベンジル)オキシ)-9H-プリン-2-アミン (「BG-NH2」, 11.9 mg, 44.0 μmol, 2.5 eq)を加えた。反応混合物を室温でさらに2時間撹拌した。粗反応混合物を逆相HPLC (10-95% MeCN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて)により精製し、暗赤色の固体として標記化合物（11.5 mg）(80%, TFA塩)を得た。
【０２３０】
1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 9.28 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 8.39 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.20 (dd, J = 8.2, 1.8 Hz, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.81 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.40 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.04 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.58 (dd, J = 9.1, 2.2 Hz, 2H), 6.54 (d, J = 2.1 Hz, 2H), 5.60 (s, 2H), 4.63 - 4.55 (m, 2H), 4.30 (t, J = 7.6 Hz, 8H), 2.56 (p, J = 7.7 Hz, 4H); 19F NMR (MeOD, 376 MHz) δ -75.44 (s); 分析HPLC: 98.3% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 550 nmでUV検出); HRMS (ESI) C40H35N8O5[M+H]+ に対する計算値 707.2725, 実測値 707.2723.
【０２３１】
実施例23.  2-(3,6-ビス(3,3-ジフルオロアゼチジン-1-イル)キサンチリウム-9-イル)-4-(tert-ブトキシカルボニル)ベンゾエート 
【化４４】
0006606096.tif 000056
【０２３２】
実施例7に記載の手順を用い、tert-ブチル 3-オキソ-3',6'-ビス(((トリフルオロメチル)スルホニル)オキシ)-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9'-キサンテン]-6-カルボキシレート (実施例18, 工程2)および3,3-ジフルオロアゼチジン塩酸塩から標記化合物 (84%, 桃色の固体)を製造した。
【０２３３】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.21 (dd, J = 8.0, 1.3 Hz, 1H), 8.04 (dd, J = 8.0, 0.8 Hz, 1H), 7.73 (dd, J = 1.2, 0.8 Hz, 1H), 6.61 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.30 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 6.17 (dd, J = 8.6, 2.4 Hz, 2H), 4.25 (t, 3JHF = 11.7 Hz, 8H), 1.55 (s, 9H); 19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ -100.06 (p, 3JFH= 11.7 Hz); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 168.8 (C), 164.3 (C), 153.3 (C), 152.6 (C), 151.4 (t, 4JCF = 2.9 Hz, C), 138.4 (C), 130.9 (CH), 130.2 (C), 129.3 (CH), 125.1 (CH), 125.0 (CH), 115.7 (t, 1JCF = 274.5 Hz, CF2), 109.1 (C), 108.9 (CH), 99.4 (CH), 84.3 (C), 82.7 (C), 63.4 (t, 2JCF = 26.3 Hz, CH2), 28.2 (CH3); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 30-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 550 nmで検出); MS (ESI) C31H27F4N2O5 [M+H]+に対する計算値 583.2, 実測値 583.1.
【０２３４】
実施例24.  2-(3,6-ビス(3,3-ジフルオロアゼチジン-1-イル)キサンチリウム-9-イル)-4-カルボキシベンゾエート 
【化４５】
0006606096.tif 000057
【０２３５】
実施例19に記載の手順を用い、実施例23から標記化合物 (93%, 暗桃色の固体, TFA塩)を製造した。
【０２３６】
1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.44 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.40 (dd, J = 8.2, 1.6 Hz, 1H), 7.99 - 7.96 (m, 1H), 7.23 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 6.83 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 6.79 (dd, J = 9.1, 2.3 Hz, 2H), 4.70 (t, 3JHF= 11.6 Hz, 8H); 19F NMR (MeOD, 376 MHz) δ -75.59 (s, 3F), -100.90 (p, 3JFH= 11.6 Hz, 4F); 13C NMR (MeOD, 101 MHz) δ 167.6 (C), 167.3 (C), 159.1 (C), 157.7 (t, 4JCF = 3.9 Hz, C), 136.1 (C), 135.8 (C), 135.4 (C), 132.9 (CH), 132.7 (CH), 132.6 (CH), 132.1 (CH), 119.2 (C), 116.5 (t, 1JCF= 271.9 Hz, CF2), 116.1 (C), 115.2 (CH), 97.4 (CH), 64.2 (t, 2JCF = 29.1 Hz, CH2); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 550 nmで検出); MS (ESI) C27H19F4N2O5 [M+H]+に対する計算値 527.1, 実測値 527.0.
【０２３７】
実施例25.  2-(3,6-ビス(3,3-ジフルオロアゼチジン-1-イル)キサンチリウム-9-イル)-4-((2-(2-((6-クロロヘキシル)オキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)ベンゾエート 
【化４６】
0006606096.tif 000058
【０２３８】
実施例21に記載の手順を用い、実施例24から標記化合物 (62%, 桃色の固体)を製造した。
【０２３９】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.05 (dd, J = 8.0, 0.8 Hz, 1H), 7.98 (dd, J = 8.0, 1.4 Hz, 1H), 7.55 (dd, J = 1.5, 0.8 Hz, 1H), 6.72 (s, 1H), 6.62 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.31 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 6.17 (dd, J = 8.6, 2.4 Hz, 2H), 4.26 (t, 3JHF = 11.7 Hz, 8H), 3.69 - 3.57 (m, 6H), 3.56 - 3.48 (m, 4H), 3.40 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 1.79 - 1.70 (m, 2H), 1.54 - 1.48 (m, 2H), 1.46 - 1.38 (m, 2H), 1.37 - 1.29 (m, 2H); 19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ -100.04 (p, 3JFH = 11.8 Hz, 4F); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 550 nmで検出); MS (ESI) C37H39ClF4N3O6[M+H]+ に対する計算値 732.2, 実測値 732.1.
【０２４０】
実施例26.  2-(3,6-ジ(アゼチジン-1-イル)キサンチリウム-9-イル)-4-(メトキシカルボニル)ベンゾエート 
【化４７】
0006606096.tif 000059
【０２４１】
工程1: 
3',6'-ジブロモ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9'-キサンテン]-6-カルボン酸(1.50 g, 2.99 mmol; Woodroofe, C. C.; Lim, M. H.; Bu, W.; Lippard, S. J. Tetrahedron 2005, 61, 3097)をMeOH (50 mL)中に懸濁させ、H2SO4 (293 mg, 2.99 mmol, 1 eq)を加えた。反応混合物を還流で72時間撹拌した。続いて、それを真空下で濃縮し、得られる残渣を飽和NaHCO3で希釈し、15% i-PrOH/CHCl3 (2×)で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥(MgSO4)し、濾過し、蒸発させた。シリカゲルクロマトグラフィー(0-10% EtOAc／ヘキサン, 直線勾配, 一定の40% v/v CH2Cl2を用いて)により、白色の固体としてメチル 3',6'-ジブロモ-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9'-キサンテン]-6-カルボキシレートの1.49 g (97%)を得た。
【０２４２】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.31 (dd, J = 8.0, 1.3 Hz, 1H), 8.10 (dd, J = 8.0, 0.7 Hz, 1H), 7.76 (dd, J = 1.2, 0.8 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 1.9 Hz, 2H), 7.20 (dd, J = 8.5, 1.9 Hz, 2H), 6.68 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 3.89 (s, 3H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 168.1 (C), 165.3 (C), 153.1 (C), 151.2 (C), 137.0 (C), 131.6 (CH), 129.24 (C), 129.21 (CH), 127.8 (CH), 125.7 (CH), 125.1 (CH), 124.6 (C), 120.7 (CH), 117.4 (C), 81.5 (C), 53.0 (CH3); MS (ESI) C22H13Br2O5[M+H]+ に対する計算値 514.9, 実測値 515.1.
【０２４３】
工程2:
実施例7に記載の手順を用い、工程1で合成したブロマイドから標記化合物、2-(3,6-ジ(アゼチジン-1-イル)キサンチリウム-9-イル)-4-(メトキシカルボニル)ベンゾエート (86%, 赤色の固体)を製造した。
【０２４４】
1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.24 (dd, J = 8.1, 1.7 Hz, 1H), 8.12 (dd, J = 8.1, 0.4 Hz, 1H), 7.83 - 7.80 (m, 1H), 7.16 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.56 (dd, J = 9.2, 2.2 Hz, 2H), 6.48 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 4.32 - 4.22 (m, 8H), 3.90 (s, 3H), 2.54 (p, J = 7.6 Hz, 4H); MS (ESI) C28H25N2O5[M+H]+ に対する計算値 469.2, 実測値 469.2.
【０２４５】
実施例27.  メチル 3',6'-ジ(アゼチジン-1-イル)-2-ジアゾ-3-オキソ-2,3-ジヒドロスピロ[インデン-1,9'-キサンテン]-6-カルボキシレート
【化４８】
0006606096.tif 000060
【０２４６】
CH2Cl2(9 mL)中の2-(3,6-ジ(アゼチジン-1-イル)キサンチリウム-9-イル)-4-(メトキシカルボニル)ベンゾエート (実施例26; 135 mg, 0.288 mmol)の溶液に、塩化オキサリル (98 μL, 1.15 mmol, 4 eq)を加えた。反応混合物を室温で2時間撹拌後、濃縮乾固した。その残渣をCH2Cl2(9 mL)に溶解し、次いで、Et3N (50 μL, 0.360 mmol, 1.25 eq)および(トリメチルシリル)ジアゾメタン (Et2O中の2.0 M, 252 μL, 0.504 mmol, 1.75 eq)を連続して加えた。反応混合物を室温で90分間撹拌し、真空下で濃縮し、2回のシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー (0-50% EtOAc／ヘキサン, 直線勾配; 次いで0-25% EtOAc／トルエン, 直線勾配)により精製し、黄色の固体として標記化合物（40 mg）(28%)を得た。
【０２４７】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.07 (dd, J = 8.0, 1.4 Hz, 1H), 7.87 (dd, J = 8.0, 0.6 Hz, 1H), 7.68 (dd, J = 1.4, 0.6 Hz, 1H), 6.66 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.18 (d, J= 2.3 Hz, 2H), 6.07 (dd, J = 8.5, 2.4 Hz, 2H), 3.96 - 3.84 (m, 8H), 3.82 (s, 3H), 2.37 (p, J = 7.2 Hz, 4H); MS (ESI) C29H25N4O4[M+H]+ に対する計算値 493.2, 実測値 493.3.
【０２４８】
実施例28.  2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 3',6'-ジ(アゼチジン-1-イル)-2-ジアゾ-3-オキソ-2,3-ジヒドロスピロ[インデン-1,9'-キサンテン]-6-カルボキシレート
【化４９】
0006606096.tif 000061
【０２４９】
工程1:
窒素下、2:1 MeOH/THF (6 mL)中のメチル 3',6'-ジ(アゼチジン-1-イル)-2-ジアゾ-3-オキソ-2,3-ジヒドロスピロ[インデン-1,9'-キサンテン]-6-カルボキシレート (実施例27; 40 mg, 81.2 μmol)の溶液に1 M NaOH (203 μL, 0.203 mmol, 2.5 eq)を加えた。その溶液を室温で2時間撹拌後、さらなる1 M NaOH (203 μL, 0.203 mmol, 2.5 eq)を加えた。反応混合物を室温で24時間撹拌した。続いてそれを1 M HCl (420 μL)で酸性化し、水で希釈し、CH2Cl2 (2×)で抽出した。有機抽出物を乾燥(MgSO4)し、濾過し、真空下で濃縮し、黄色の固体として3',6'-ジ(アゼチジン-1-イル)-2-ジアゾ-3-オキソ-2,3-ジヒドロスピロ[インデン-1,9'-キサンテン]-6-カルボン酸(37 mg, 95%)を得た。
MS (ESI) C28H23N4O4[M]+ に対する計算値 479.2, 実測値 479.3.
【０２５０】
工程2:
工程1からの酸 (37 mg, 77.3 μmol)を、DMF (2 mL)中でTSTU (35 mg, 0.116 mmol, 1.5 eq)と混合し、DIEA (40 μL, 0.232 mmol, 3 eq)を加えた。反応混合物を室温で1時間撹拌後、濃縮乾固し、Celiteの上に置いた。シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー (10-100% EtOAc／ヘキサン, 直線勾配; Celiteでの乾式積載) により黄-橙色の固体として標記化合物、2,5-ジオキソピロリジン-1-イル3',6'-ジ(アゼチジン-1-イル)-2-ジアゾ-3-オキソ-2,3-ジヒドロスピロ[インデン-1,9'-キサンテン]-6-カルボキシレート (30 mg, 68%)を得た。
【０２５１】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ8.16 (dd, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H), 7.93 (dd, J = 8.0, 0.6 Hz, 1H), 7.75 (dd, J = 1.4, 0.6 Hz, 1H), 6.66 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.16 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 6.09 (dd, J = 8.5, 2.4 Hz, 2H), 3.90 (t, J = 7.3 Hz, 8H), 2.86 (s, 4H), 2.37 (p, J = 7.2 Hz, 4H); MS (ESI) C32H26N5O6[M+H]+ に対する計算値 576.2, 実測値 576.3.
【０２５２】
実施例29.  3',6'-ジ(アゼチジン-1-イル)-N-(2-(2-((6-クロロヘキシル)オキシ)エトキシ)エチル)-2-ジアゾ-3-オキソ-2,3-ジヒドロスピロ[インデン-1,9'-キサンテン]-6-カルボキシアミド
【化５０】
0006606096.tif 000062
【０２５３】
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 3',6'-ジ(アゼチジン-1-イル)-2-ジアゾ-3-オキソ-2,3-ジヒドロスピロ[インデン-1,9'-キサンテン]-6-カルボキシレート (実施例28; 15 mg, 26.1 μmol) をDMF (1 mL)に溶解した。DMF (250 μL)中の2-(2-((6-クロロヘキシル)オキシ)エトキシ)エタナミン (「HaloTag(O2)アミン」, 11.7 mg, 52.2 μmol, 2 eq)の溶液、続いてDIEA (22.7 μL, 0.131 mmol, 5 eq)を加えた。反応混合物を室温で2時間撹拌後、濃縮乾固し、シリカゲルクロマトグラフィー (0-100% EtOAc／トルエン, 直線勾配)により精製し、黄色の泡状物として標記化合物 (15.9 mg, 89%)を得た。
【０２５４】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ7.86 (dd, J = 7.9, 0.6 Hz, 1H), 7.79 (dd, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H), 7.43 (dd, J = 1.4, 0.6 Hz, 1H), 6.66 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.59 (t, J = 5.1 Hz, 1H), 6.16 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 6.07 (dd, J = 8.5, 2.4 Hz, 2H), 3.95 - 3.83 (m, 8H), 3.64 - 3.48 (m, 10H), 3.39 (t, J= 6.6 Hz, 2H), 2.37 (p, J = 7.2 Hz, 4H), 1.78 - 1.69 (m, 2H), 1.55 - 1.48 (m, 2H), 1.46 - 1.36 (m, 2H), 1.36 - 1.27 (m, 2H); MS (ESI) C38H43ClN5O5[M+H]+ に対する計算値 684.3, 実測値 684.4.
【０２５５】
実施例30.  2-(3,7-ジ(アゼチジン-1-イル)-5,5-ジメチルジベンゾ[b,e]シリン-10-イリウム-10(5H)-イル)ベンゾエート 
【化５１】
0006606096.tif 000063
【０２５６】
工程1: 
バイアルをtert-ブチル 2-ブロモベンゾエート (309 mg, 1.20 mmol, 1.5 eq)で装填し、密封し、窒素でフラッシュした。THF (2 mL)中にそのブロマイドを溶解した後、反応混合物を-15 ℃に冷却し、iPrMgCl・LiCl (THF中の1.3 M, 924 μL, 1.20 mmol, 1.5 eq)を加えた。反応混合物を-5 ℃に温め、5時間撹拌した。次いで、THF (2 mL)中の3,7-ビス((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5,5-ジメチルジベンゾ[b,e]シリン-10(5H)-オン (400 mg, 0.802 mmol; Egawa, T.; Koide, Y.; Hanaoka, K.; Komatsu, T.; Terai, T.; Nagano, T. Chem. Commun., 2011, 47, 4162から)の溶液を滴下した。-5 ℃で10分間撹拌した後、反応混合物を室温に温め、30分間撹拌した。続いて飽和NH4Clでクエンチし、水で希釈し、EtOAc (2×)で抽出した。合わせた有機物を食塩水で洗浄し、乾燥(MgSO4)し、濾過し、蒸発させた。シリカゲルクロマトグラフィー (0-20% Et2O／ヘキサン, 直線勾配)により、無色のゴム状物として3,7-ビス((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5,5-ジメチル-3'H,5H-スピロ[ジベンゾ[b,e]シリン-10,1'-イソベンゾフラン]-3'-オン（271 mg、56%）を得た。
【０２５７】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.97 (dt, J = 7.5, 0.9 Hz, 1H), 7.66 (td, J = 7.5, 1.2 Hz, 1H), 7.56 (td, J = 7.5, 0.9 Hz, 1H), 7.35 - 7.29 (m, 1H), 7.12 (d, J = 2.7 Hz, 2H), 6.85 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.67 (dd, J = 8.7, 2.7 Hz, 2H), 0.97 (s, 18H), 0.62 (s, 3H), 0.60 (s, 3H), 0.19 (s, 12H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 170.5 (C), 155.3 (C), 154.0 (C), 137.8 (C), 137.2 (C), 134.0 (CH), 129.1 (CH), 128.6 (CH), 126.6 (C), 126.1 (CH), 125.1 (CH), 124.7 (CH), 121.2 (CH), 90.8 (C), 25.8 (CH3), 18.4 (C), 0.2 (CH3), -1.5 (CH3), -4.21 (CH3), -4.23 (CH3); HRMS (ESI) C34H47O4Si3[M+H]+ に対する計算値 603.2777, 実測値 603.2771.
【０２５８】
工程2:
THF (5 mL)中の工程1 (194 mg, 0.322 mmol)からの生成物の溶液に、0 ℃でTBAF (THF中の1.0 M, 965 μL, 0.965 mmol, 3 eq)を加えた。反応混合物を0 ℃で10分間撹拌した。続いて、0 ℃で飽和NH4Clで希釈し、EtOAc (2×)で抽出した。有機抽出物を乾燥(MgSO4)し、濾過し、蒸発させ、シリカゲルの上に置いた。フラッシュクロマトグラフィー (20-100% EtOAc／ヘキサン, 直線勾配, 一定の1% v/v AcOH 添加物を用いて; シリカゲルで乾式積載)により、オフ-ホワイト色の固体として3,7-ジヒドロキシ-5,5-ジメチル-3'H,5H-スピロ[ジベンゾ[b,e]シリン-10,1'-イソベンゾフラン]-3'-オン (120 mg, 99%)を得た。
【０２５９】
1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 7.95 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.77 (td, J = 7.6, 1.1 Hz, 1H), 7.65 (td, J = 7.6, 0.7 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.13 (d, J = 2.7 Hz, 2H), 6.74 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.65 (dd, J = 8.7, 2.7 Hz, 2H), 0.61 (s, 3H), 0.55 (s, 3H); 13C NMR (MeOD, 101 MHz) δ 172.6 (C), 158.3 (C), 155.8 (C), 138.8 (C), 136.3 (C), 135.6 (CH), 130.4 (CH), 129.6 (CH), 127.4 (C), 126.6 (CH), 125.8 (CH), 121.1 (CH), 117.7 (CH), 92.9 (C), 0.2 (CH3), -1.6 (CH3); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 254 nmでUV検出); HRMS (ESI) C22H19O4Si [M+H]+に対する計算値 375.1047, 実測値 375.1047.
【０２６０】
工程3:
工程2からの中間体 (120 mg, 0.320 mmol)をCH2Cl2(5 mL)中に採取し、0℃に冷却した。ピリジン (207 μL, 2.56 mmol, 8.0 eq)およびトリフルオロメタンスルホン酸無水物 (216 μL, 1.28 mmol, 4.0 eq)を加え、氷浴を取り除いた。反応混合物を室温で2時間撹拌した。続いて水で希釈し、CH2Cl2(2×)で抽出した。合わせた有機抽出物を食塩水で洗浄し、乾燥(MgSO4)し、真空下に濃縮した。シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー (0-30% EtOAc／ヘキサン, 直線勾配)により、無色の泡状物として5,5-ジメチル-3'-オキソ-3'H,5H-スピロ[ジベンゾ[b,e]シリン-10,1'-イソベンゾフラン]-3,7-ジイル ビス(トリフルオロメタンスルホネート)（172 mg、84%）を得た。
【０２６１】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.04 (dt, J = 7.7, 0.9 Hz, 1H), 7.77 (td, J = 7.5, 1.2 Hz, 1H), 7.66 (td, J = 7.5, 0.8 Hz, 1H), 7.57 (dd, J = 2.4, 0.5 Hz, 2H), 7.38 (dt, J = 7.6, 0.7 Hz, 1H), 7.185 (AB of ABX, ・A = 2878.9, JAX = 0.3, ・B = 2871.0, JBX= 2.8, JAB = 8.9 Hz, 4H), 0.75 (s, 3H), 0.72 (s, 3H); 19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ-73.30; 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 169.2 (C), 151.8 (C), 149.5 (C), 144.3 (C), 139.3 (C), 134.8 (CH), 130.3 (CH), 129.2 (CH), 127.0 (CH), 126.5 (CH), 126.0 (C), 124.6 (CH), 122.8 (CH), 118.9 (CF3, 1JCF= 320.8 Hz), 88.7 (C), 0.1 (CH3), -1.7 (CH3); HRMS (ESI) C24H17F6O8S2Si [M+H]+ に対する計算値 639.0033, 実測値 639.0030.
【０２６２】
工程4: 
実施例7に記載の手順を用い、工程3で合成されたジトリフレートから標記化合物、2-(3,7-ジ(アゼチジン-1-イル)-5,5-ジメチルジベンゾ[b,e]シリン-10-イリウム-10(5H)-イル)ベンゾエート (92%, オフ-ホワイト色の固体)を製造した。
【０２６３】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.98 - 7.93 (m, 1H), 7.63 (td, J = 7.5, 1.2 Hz, 1H), 7.53 (td, J = 7.5, 0.9 Hz, 1H), 7.32 - 7.28 (m, 1H), 6.75 (d, J= 8.7 Hz, 2H), 6.66 (d, J = 2.6 Hz, 2H), 6.25 (dd, J = 8.7, 2.7 Hz, 2H), 3.89 (t, J = 7.2 Hz, 8H), 2.36 (p, J = 7.2 Hz, 4H), 0.60 (s, 3H), 0.58 (s, 3H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 170.7 (C), 154.3 (C), 151.0 (C), 137.1 (C), 133.7 (CH), 132.9 (C), 128.8 (CH), 128.0 (CH), 127.2 (C), 125.8 (CH), 124.8 (CH), 115.7 (CH), 112.3 (CH), 92.1 (C), 52.4 (CH2), 17.1 (CH2), 0.5 (CH3), -1.5 (CH3); 分析HPLC: 98.7% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 650 nmで検出); HRMS (ESI) C28H29N2O2Si [M+H]+に対する計算値 453.1993, 実測値 453.1998.
【０２６４】
実施例31.  2-(3,7-ビス(3-フルオロアゼチジン-1-イル)-5,5-ジメチルジベンゾ[b,e]シリン-10-イリウム-10(5H)-イル)ベンゾエート 
【化５２】
0006606096.tif 000064
【０２６５】
実施例7に記載の手順を用い、5,5-ジメチル-3'-オキソ-3'H,5H-スピロ[ジベンゾ[b,e]シリン-10,1'-イソベンゾフラン]-3,7-ジイル ビス(トリフルオロメタンスルホネート) (実施例30, 工程3)および3-フルオロアゼチジン塩酸塩から標記化合物 (78%, オフ-ホワイト色の固体)を製造した。
【０２６６】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.97 (dt, J = 7.6, 0.9 Hz, 1H), 7.65 (td, J = 7.5, 1.2 Hz, 1H), 7.55 (td, J = 7.5, 0.9 Hz, 1H), 7.29 (dt, J = 7.7, 0.8 Hz, 1H), 6.80 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.70 (d, J = 2.6 Hz, 2H), 6.30 (dd, J = 8.7, 2.7 Hz, 2H), 5.41 (dtt, 2JHF = 57.0 Hz, J = 5.9, 3.7 Hz, 2H), 4.25 - 4.14 (m, 4H), 4.04 - 3.91 (m, 4H), 0.62 (s, 3H), 0.60 (s, 3H); 19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ -180.48 (dtt, JFH = 57.0, 23.9, 18.2 Hz); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 170.6 (C), 154.1 (C), 150.0 (d, 4JCF = 1.0 Hz, C), 137.2 (C), 133.93 (C), 133.86 (CH), 129.0 (CH), 128.1 (CH), 127.0 (C), 126.0 (CH), 124.7 (CH), 116.3 (CH), 112.9 (CH), 91.6 (C), 82.8 (d, 1JCF = 204.8 Hz, CFH), 59.6 (d, 2JCF = 23.8 Hz, CH2), 0.5 (CH3), -1.4 (CH3); 分析HPLC: 98.7% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 30-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 650 nmで検出); MS (ESI) C28H27F2N2O2Si [M+H]+ に対する計算値 489.2, 実測値 489.1.
【０２６７】
実施例32.  4-(tert-ブトキシカルボニル)-2-(3,7-ジ(アゼチジン-1-イル)-5,5-ジメチルジベンゾ[b,e]シリン-10-イリウム-10(5H)-イル)ベンゾエート 
【化５３】
0006606096.tif 000065
【０２６８】
工程1:
トルエン (25 mL)中の2-ブロモテレフタル酸 (2.50 g, 10.2 mmol)の懸濁液を80℃に加熱し、N,N-ジメチルホルムアミド ジ-tert-ブチル アセタール (24.5 mL, 102 mmol, 10 eq)を15分かけて滴下した。反応混合物を80℃で30分間撹拌した。混合物を室温に冷却した後、飽和NaHCO3で希釈し、EtOAc (2×)で抽出した。合わせた有機抽出物を水および食塩水で洗浄し、乾燥(MgSO4)し、濾過し、蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー (0-10% Et2O／ヘキサン, 直線勾配)により、無色のゴム状物としてジ-tert-ブチル 2-ブロモテレフタレート (3.29 g, 90%)を得た。
【０２６９】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.19 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 7.92 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 1H), 7.67 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 1.62 (s, 9H), 1.60 (s, 9H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 165.4 (C), 163.8 (C), 138.0 (C), 135.1 (C), 134.9 (CH), 130.4 (CH), 128.1 (CH), 120.7 (C), 83.3 (C), 82.3 (C), 28.26 (CH3), 28.25 (CH3); HRMS (ESI) C16H21BrO4Na [M+Na]+ に対する計算値 379.0515, 実測値 379.0531. 
【０２７０】
工程2:
バイアルを工程1の生成物 (537 mg, 1.50 mmol, 1.5 eq)で装填し、密封し、窒素でフラッシュした。そのブロマイドをTHF (2.5 mL)に溶解し、反応混合物を-50 ℃に冷却した後、iPrMgCl・LiCl (THF中の1.3 M, 1.16 mL, 1.50 mmol, 1.5 eq)を加えた。反応混合物を-40 ℃に温め、2時間撹拌した。次いで、THF (2.5 mL)中の3,7-ビス((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5,5-ジメチルジベンゾ[b,e]シリン-10(5H)-オン (500 mg, 1.00 mmol; Egawa, T.; Koide, Y.; Hanaoka, K.; Komatsu, T.; Terai, T.; Nagano, T. Chem. Commun., 2011, 47, 4162から)の溶液を滴下した。反応混合物を室温に温め、2時間撹拌した。続いて、飽和NH4Clでクエンチし、水で希釈し、EtOAc (2×)で抽出した。合わせた有機物を食塩水で洗浄し、乾燥(MgSO4)し、濾過し、蒸発させた。シリカゲルクロマトグラフィー(0-10% Et2O／ヘキサン, 直線勾配)により、無色の固体として、tert-ブチル 3,7-ビス((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5,5-ジメチル-3'-オキソ-3'H,5H-スピロ[ジベンゾ[b,e]シリン-10,1'-イソベンゾフラン]-6'-カルボキシレート（213 mg、30%）を得た。
【０２７１】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.13 (dd, J = 8.0, 1.3 Hz, 1H), 7.98 (dd, J = 8.0, 0.7 Hz, 1H), 7.84 (dd, J = 1.2, 0.8 Hz, 1H), 7.13 (d, J = 2.7 Hz, 2H), 6.93 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.72 (dd, J = 8.7, 2.7 Hz, 2H), 1.56 (s, 9H), 0.98 (s, 18H), 0.67 (s, 3H), 0.59 (s, 3H), 0.196 (s, 6H), 0.194 (s, 6H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 170.1 (C), 164.3 (C), 155.4 (C), 155.0 (C), 137.5 (C), 136.9 (C), 136.8 (C), 130.2 (CH), 128.7 (C), 128.3 (CH), 125.9 (CH), 125.2 (CH), 125.1 (CH), 121.6 (CH), 90.6 (C), 82.5 (C), 28.2 (CH3), 25.8 (CH3), 18.4 (C), -0.1 (CH3), -0.7 (CH3), -4.21 (CH3), -4.23 (CH3); HRMS (ESI) C39H55O6Si3[M+H]+ に対する計算値 703.3301, 実測値 703.3311.
【０２７２】
工程3:
THF (5 mL)中の工程2からの生成物 (205 mg, 0.292 mmol)の溶液に、0 ℃でTBAF (THF中の1.0 M, 1.17 ・L, 1.17 mmol, 4 eq)を加えた。反応混合物を0 ℃で10分間撹拌した。続いて、飽和NH4Clで希釈し、EtOAc (2×)で抽出した。有機抽出物を食塩水で洗浄し、乾燥(MgSO4)し、濾過し、蒸発させて、橙色の残渣を得た。その粗中間体をCH2Cl2 (5 mL)中に採取し、0 ℃に冷却した。ピリジン (189 μL, 2.33 mmol, 8 eq)およびトリフルメタンスルホン酸無水物 (196 μL, 1.17 mmol, 4 eq)を加え、氷浴を取り除いた。反応混合物を室温で2時間撹拌した。次いで、水で希釈し、CH2Cl2(2×)で抽出した。合わせた有機物を食塩水で洗浄し、乾燥(MgSO4)し、真空下で濃縮した。シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー (0-20% EtOAc／ヘキサン, 直線勾配)により、無色の固体として、tert-ブチル 5,5-ジメチル-3'-オキソ-3,7-ビス(((トリフルオロメチル)スルホニル)オキシ)-3'H,5H-スピロ[ジベンゾ[b,e]シリン-10,1'-イソベンゾフラン]-6'-カルボキシレート（209 mg、97%）を得た。
【０２７３】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.21 (dd, J = 8.0, 1.3 Hz, 1H), 8.05 (dd, J = 8.0, 0.7 Hz, 1H), 7.93 - 7.90 (m, 1H), 7.58 (d, J = 2.6 Hz, 2H), 7.28 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.22 (dd, J = 8.9, 2.7 Hz, 2H), 1.58 (s, 9H), 0.81 (s, 3H), 0.71 (s, 3H); 19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ -73.28 (s); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 168.9 (C), 163.8 (C), 152.8 (C), 149.5 (C), 144.1 (C), 138.3 (C), 138.2 (C), 131.2 (CH), 128.8 (CH), 128.0 (C), 126.8 (CH), 126.6 (CH), 124.8 (CH), 123.2 (CH), 118.9 (q, 1JCF= 320.8 Hz, CF3), 88.6 (C), 83.1 (C), 28.2 (CH3), -0.1 (CH3), -0.9 (CH3); HRMS (ESI) C29H25F6O10S2Si [M+H]+ に対する計算値 739.0557, 実測値 739.0555.
【０２７４】
工程4:
実施例7に記載の手順を用い、工程3で合成されたジトリフレートから標記化合物の4-(tert-ブトキシカルボニル)-2-(3,7-ジ(アゼチジン-1-イル)-5,5-ジメチルジベンゾ[b,e]シリン-10-イリウム-10(5H)-イル)ベンゾエート (91%, オフ-ホワイト色の泡状物)を製造した。
【０２７５】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.11 (dd, J = 8.0, 1.3 Hz, 1H), 7.95 (dd, J = 8.0, 0.7 Hz, 1H), 7.82 (dd, J = 1.2, 0.8 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.66 (d, J = 2.6 Hz, 2H), 6.29 (dd, J = 8.7, 2.7 Hz, 2H), 3.90 (t, J = 7.3 Hz, 8H), 2.36 (p, J = 7.2 Hz, 4H), 1.54 (s, 9H), 0.64 (s, 3H), 0.58 (s, 3H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 170.3 (C), 164.5 (C), 155.4 (C), 151.0 (C), 137.2 (C), 136.2 (C), 132.4 (C), 129.9 (CH), 129.2 (C), 127.7 (CH), 125.6 (CH), 125.2 (CH), 115.6 (CH), 112.6 (CH), 91.9 (C), 82.3 (C), 52.3 (CH2), 28.2 (CH3), 17.0 (CH2), 0.2 (CH3), -0.7 (CH3); HRMS (ESI) C33H37N2O4Si [M+H]+ に対する計算値 553.2517, 実測値 553.2529.
【０２７６】
実施例33.  4-カルボキシ-2-(3,7-ジ(アゼチジン-1-イル)-5,5-ジメチルジベンゾ[b,e]シリン-10-イリウム-10(5H)-イル)ベンゾエート 
【化５４】
0006606096.tif 000066
【０２７７】
実施例19に記載の手順を用い、実施例 32から標記化合物 (99%, 暗青-緑色の固体, TFA塩)を製造した。
【０２７８】
1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.30 - 8.23 (m, 2H), 7.82 - 7.78 (m, 1H), 6.90 (d, J= 2.5 Hz, 2H), 6.86 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.33 (dd, J = 9.2, 2.5 Hz, 2H), 4.27 (t, J = 7.4 Hz, 8H), 2.51 (p, J = 7.6 Hz, 4H), 0.60 (s, 3H), 0.53 (s, 3H); 19F NMR (MeOD, 376 MHz) δ -75.45 (s); 分析HPLC: 98.7% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 650 nmで検出); HRMS (ESI) C29H29N2O4Si [M+H]+に対する計算値 497.1891, 実測値 497.1890.
【０２７９】
実施例34.  2-(3,7-ジ(アゼチジン-1-イル)-5,5-ジメチルジベンゾ[b,e]シリン-10-イリウム-10(5H)-イル)-4-(((2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ)カルボニル)ベンゾエート 
【化５５】
0006606096.tif 000067
【０２８０】
4-カルボキシ-2-(3,7-ジ(アゼチジン-1-イル)-5,5-ジメチルジベンゾ[b,e]シリン-10-イリウム-10(5H)-イル)ベンゾエート (実施例33; 40 mg, 65.5 μmol)を、DMF (2.5 mL)中でDSC (37 mg, 144 μmol, 2.2 eq)と混合した。Et3N (55 μL, 393 μmol, 6 eq)およびDMAP (0.8 mg, 6.55 μmol, 0.1 eq)を加えた後、反応混合物を室温で3時間撹拌した。続いて、10% w/v クエン酸で希釈し、EtOAc (2×)で抽出した。合わせた有機抽出物を食塩水で洗浄し、乾燥(MgSO4)し、真空下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー(0-50% EtOAc／トルエン, 直線勾配)により、黄-緑色の固体として標記化合物（31 mg、80%）を得た。
【０２８１】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.27 (dd, J = 8.0, 1.4 Hz, 1H), 8.07 (dd, J = 8.0, 0.7 Hz, 1H), 8.00 (dd, J = 1.3, 0.7 Hz, 1H), 6.74 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.66 (d, J = 2.6 Hz, 2H), 6.30 (dd, J = 8.7, 2.7 Hz, 2H), 3.91 (t, J = 7.3 Hz, 8H), 2.89 (s, 4H), 2.37 (p, J = 7.2 Hz, 4H), 0.62 (s, 3H), 0.56 (s, 3H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 169.4 (C), 169.0 (C), 161.1 (C), 155.5 (C), 151.2 (C), 136.5 (C), 131.7 (C), 131.6 (C), 130.7 (CH), 130.1 (C), 127.8 (CH), 126.8 (CH), 126.3 (CH), 115.8 (CH), 112.7 (CH), 92.4 (C), 52.3 (CH2), 25.8 (CH2), 17.0 (CH2), 0.3 (CH3), -1.1 (CH3); HRMS (ESI) C33H32N3O6Si [M+H]+に対する計算値 594.2055, 実測値 594.2069.
【０２８２】
実施例35.  4-((2-(2-((6-クロロヘキシル)オキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)-2-(3,7-ジ(アゼチジン-1-イル)-5,5-ジメチルジベンゾ[b,e]シリン-10-イリウム-10(5H)-イル)ベンゾエート 
【化５６】
0006606096.tif 000068
【０２８３】
4-カルボキシ-2-(3,7-ジ(アゼチジン-1-イル)-5,5-ジメチルジベンゾ[b,e]シリン-10-イリウム-10(5H)-イル)ベンゾエート (実施例33; 30 mg, 49.1 μmol)を、DMF (2 mL)中でDSC (28 mg, 108 μmol, 2.2 eq)と混合した。Et3N (41 μL, 295 μmol, 6 eq)およびDMAP (0.6 mg, 4.91 μmol, 0.1 eq)を加えた後、反応混合物を遮光して室温で1時間撹拌した。次いで、DMF (250 μL)中の2-(2-((6-クロロヘキシル)オキシ)エトキシ)エタナミン (「HaloTag(O2)アミン」, 27 mg, 123 μmol, 2.5 eq)の溶液を加えた。反応混合物を室温でさらに2時間撹拌した。続いて、飽和NaHCO3で希釈し、EtOAc (2×)で抽出した。合わせた有機抽出物を水および食塩水で洗浄し、乾燥(MgSO4)し、濾過し、真空下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー (10-100% EtOAc／トルエン, 直線勾配)により、青色の泡状物として標記化合物（25 mg、73%）を得た。
【０２８４】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.98 (dd, J = 8.0, 0.7 Hz, 1H), 7.90 (dd, J = 8.0, 1.4 Hz, 1H), 7.68 (dd, J = 1.2, 0.7 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.74 - 6.68 (m, 1H), 6.66 (d, J = 2.6 Hz, 2H), 6.26 (dd, J = 8.7, 2.7 Hz, 2H), 3.89 (t, J = 7.3 Hz, 8H), 3.67 - 3.60 (m, 6H), 3.56 - 3.53 (m, 2H), 3.50 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.39 (t, J= 6.7 Hz, 2H), 2.36 (p, J = 7.2 Hz, 4H), 1.78 - 1.68 (m, 2H), 1.56 - 1.47 (m, 2H), 1.44 - 1.35 (m, 2H), 1.35 - 1.25 (m, 2H), 0.63 (s, 3H), 0.57 (s, 3H); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 650 nmでUV 検出); HRMS (ESI) C39H49ClN3O5Si [M+H]+ に対する計算値 702.3125, 実測値 702.3137.
【０２８５】
実施例36.  4-((4-(((2-アミノ-9H-プリン-6-イル)オキシ)メチル)ベンジル)カルバモイル)-2-(3,7-ジ(アゼチジン-1-イル)-5,5-ジメチルジベンゾ[b,e]シリン-10-イリウム-10(5H)-イル)ベンゾエート 
【化５７】
0006606096.tif 000069
【０２８６】
4-カルボキシ-2-(3,7-ジ(アゼチジン-1-イル)-5,5-ジメチルジベンゾ[b,e]シリン-10-イリウム-10(5H)-イル)ベンゾエート (実施例33; 25 mg, 40.9 μmol)を、DMF (2 mL)中でDSC (23.1 mg, 90.1 μmol, 2.2 eq)と混合した。Et3N (34 μL, 246 μmol, 6 eq)およびDMAP (0.5 mg, 4.09 μmol, 0.1 eq)を加えた後、反応混合物を遮光して室温で1時間撹拌した。次いで6-((4-(アミノメチル)ベンジル)オキシ)-9H-プリン-2-アミン (「BG-NH2」, 28 mg, 102 μmol, 2.5 eq)を加えた。反応混合物を室温でさらなる2時間撹拌した。続いて、飽和NaHCO3で希釈し、CH2Cl2 (2×)で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥(MgSO4)し、濾過し、真空下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー (0-10% MeOH/EtOAc, 直線勾配)により、青色の固体として標記化合物（24.7 mg、80%）を得た。
【０２８７】
1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.02 (dd, J = 8.0, 1.3 Hz, 1H), 7.99 (dd, J = 8.0, 0.7 Hz, 1H), 7.82 (s, 1H), 7.67 - 7.64 (m, 1H), 7.46 (d, J= 8.1 Hz, 2H), 7.32 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.73 (d, J = 2.6 Hz, 2H), 6.70 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.32 (dd, J = 8.7, 2.6 Hz, 2H), 5.51 (s, 2H), 4.52 (s, 2H), 3.87 (t, J= 7.3 Hz, 8H), 2.35 (p, J = 7.1 Hz, 4H), 0.58 (s, 3H), 0.51 (s, 3H); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 650 nmでUV検出); HRMS (ESI) C42H41N8O4Si [M+H]+ に対する計算値 749.3015, 実測値 749.2971. 
【０２８８】
実施例37.  2-(3,7-ビス(3-フルオロアゼチジン-1-イル)-5,5-ジメチルジベンゾ[b,e]シリン-10-イリウム-10(5H)-イル)-4-(tert-ブトキシカルボニル)ベンゾエート 
【化５８】
0006606096.tif 000070
【０２８９】
実施例7に記載の手順を用い、tert-ブチル 5,5-ジメチル-3'-オキソ-3,7-ビス(((トリフルオロメチル)スルホニル)オキシ)-3'H,5H-スピロ[ジベンゾ[b,e]シリン-10,1'-イソベンゾフラン]-6'-カルボキシレート (実施例32, 工程3)および3-フルオロアゼチジン塩酸塩から標記化合物 (85%, オフ-ホワイト色の固体)を製造した。
【０２９０】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.12 (dd, J = 8.0, 1.3 Hz, 1H), 7.97 (dd, J = 7.9, 0.8 Hz, 1H), 7.82 (dd, J = 1.3, 0.8 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.70 (d, J = 2.6 Hz, 2H), 6.35 (dd, J = 8.7, 2.7 Hz, 2H), 5.41 (dtt, 2JHF = 57.0, 5.9, 3.7 Hz, 2H), 4.26 - 4.15 (m, 4H), 4.05 - 3.93 (m, 4H), 1.55 (s, 9H), 0.67 (s, 3H), 0.60 (s, 3H); 19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ -180.48 (dtt, JFH = 57.0, 23.9, 18.2 Hz); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 170.2 (C), 164.4 (C), 155.1 (C), 150.0 (d, 4JCF = 1.2 Hz, C), 137.4 (C), 136.3 (C), 133.5 (C), 130.1 (CH), 129.0 (C), 127.8 (CH), 125.8 (CH), 125.1 (CH), 116.3 (CH), 113.3 (CH), 91.4 (C), 82.8 (d, 1JCF = 204.8, CFH), 82.5 (C), 59.6 (d, 2JCF= 23.8 Hz, CH2), 28.2 (CH3), 0.17 (CH3), -0.68 (CH3); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 50-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 633 nmで検出); MS (ESI) C33H35F2N2O4Si [M+H]+ に対する計算値 589.2, 実測値 589.2.
【０２９１】
実施例38.  2-(3,7-ビス(3-フルオロアゼチジン-1-イル)-5,5-ジメチルジベンゾ[b,e]シリン-10-イリウム-10(5H)-イル)-4-カルボキシベンゾエート 
【化５９】
0006606096.tif 000071
【０２９２】
実施例19に記載の手順を用い、実施例37から標記化合物 (80%, 暗青色の固体, TFA塩)を製造した。
【０２９３】
1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.25 (dd, J = 8.0, 1.4 Hz, 1H), 8.11 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.84 (dd, J = 1.4, 0.7 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 2.6 Hz, 2H), 6.83 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.39 (dd, J = 8.9, 2.6 Hz, 2H), 5.43 (dtt, 2JHF = 57.3, 6.1, 3.3 Hz, 2H), 4.41 - 4.20 (m, 4H), 4.16 - 4.01 (m, 4H), 0.65 (s, 3H), 0.56 (s, 3H); 分析HPLC: 88.1% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 633 nmで検出); MS (ESI) C29H27F2N2O4Si [M+H]+ に対する計算値 533.2, 実測値 533.0. 
【０２９４】
実施例39.  2-(3,7-ビス(3-フルオロフルオロアゼチジン-1-イル)-5,5-ジメチルジベンゾ[b,e]シリン-10-イリウム-10(5H)-イル)-4-((2-(2-((6-クロロヘキシル)オキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)ベンゾエート 
【化６０】
0006606096.tif 000072
【０２９５】
実施例35に記載の手順を用い、実施例38から標記化合物 (61%, 青-緑色の固体)を製造した。
【０２９６】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.99 (dd, J = 7.9, 0.7 Hz, 1H), 7.89 (dd, J = 8.0, 1.4 Hz, 1H), 7.69 (dd, J = 1.4, 0.8 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.78 (s, 1H), 6.69 (d, J = 2.6 Hz, 2H), 6.36 - 6.26 (m, 2H), 5.41 (dtt, 2JHF= 56.9, 5.9, 3.7 Hz, 2H), 4.29 - 4.13 (m, 4H), 4.06 - 3.91 (m, 4H), 3.67 - 3.60 (m, 6H), 3.58 - 3.53 (m, 2H), 3.50 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.40 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 1.79 - 1.67 (m, 2H), 1.54 - 1.47 (m, 2H), 1.45 - 1.35 (m, 2H), 1.35 - 1.24 (m, 2H), 0.66 (s, 3H), 0.59 (s, 3H); 19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ -180.49 (dtt, JFH = 56.9, 23.9, 18.2 Hz); 分析HPLC: 98.7% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 633 nmで検出); MS (ESI) C39H47ClF2N3O5Si [M+H]+ に対する計算値 738.3, 実測値 738.2.
【０２９７】
実施例40.  2-(3,6-ジ(アゼチジン-1-イル)-10,10-ジメチルアントラセン-9-イリウム-9(10H)-イル)ベンゾエート 
【化６１】
0006606096.tif 000073
【０２９８】
実施例7に記載の手順を用い、カルボフルオレセイン ジトリフレート (Grimm, J. B.; Sung, A. J.; Legant, W. R.; Hulamm, P.; Matlosz, S. M.; Betzig, E.; Lavis, L. D. ACS Chem. Biol. 2013, 8, 1303)から標記化合物 (88%, 淡青色の固体)を製造した。
【０２９９】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.00 - 7.95 (m, 1H), 7.58 (td, J = 7.4, 1.4 Hz, 1H), 7.53 (td, J = 7.4, 1.2 Hz, 1H), 7.08 - 7.03 (m, 1H), 6.58 (d, J= 2.4 Hz, 2H), 6.55 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.20 (dd, J = 8.6, 2.4 Hz, 2H), 3.90 (t, J = 7.2 Hz, 8H), 2.37 (p, J = 7.2 Hz, 4H), 1.82 (s, 3H), 1.72 (s, 3H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 170.9 (C), 155.6 (C), 152.4 (C), 146.9 (C), 134.5 (CH), 128.94 (CH), 128.89 (CH), 127.4 (C), 125.0 (CH), 124.1 (CH), 120.6 (C), 110.4 (CH), 107.9 (CH), 88.4 (C), 52.4 (CH2), 38.6 (C), 35.7 (CH3), 32.3 (CH3), 17.0 (CH2); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 600 nmで検出); HRMS (ESI) C29H29N2O2 [M+H]+ に対する計算値 437.2224, 実測値 437.2236.
【０３００】
実施例41.  2-(3,6-ビス(3,3-ジフルオロアゼチジン-1-イル)-10,10-ジメチルアントラセン-9-イリウム-9(10H)-イル)ベンゾエート 
【化６２】
0006606096.tif 000074
【０３０１】
実施例7に記載の手順を用い、カルボフルオレセイン ジトリフレート (Grimm, J. B.; Sung, A. J.; Legant, W. R.; Hulamm, P.; Matlosz, S. M.; Betzig, E.; Lavis, L. D. ACS Chem. Biol. 2013, 8, 1303)および3,3-ジフルオロアゼチジン塩酸塩から標記化合物 (95%, オフ-ホワイト色の固体)を製造した。
【０３０２】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.04 - 7.98 (m, 1H), 7.60 (td, J = 7.3, 1.5 Hz, 1H), 7.56 (td, J = 7.3, 1.3 Hz, 1H), 7.04 (s, 1H), 6.64 (d, J = 2.8 Hz, 2H), 6.63 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.28 (dd, J = 8.6, 2.5 Hz, 2H), 4.25 (t, 3JHF = 11.8 Hz, 8H), 1.84 (s, 3H), 1.74 (s, 3H); 19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ -99.95 (p, 3JFH= 11.8 Hz); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 170.6 (C), 155.2 (C), 150.1 (t, 4JCF = 2.7 Hz, C), 146.9 (C), 134.8 (CH), 129.3 (CH), 129.2 (CH), 127.0 (C), 125.2 (CH), 123.9 (CH), 122.4 (C), 115.9 (t, 1JCF = 274.6 Hz, CF2), 111.6 (CH), 109.2 (CH), 87.2 (C), 63.4 (t, 2JCF = 25.9 Hz, CH2), 38.6 (C), 35.6 (CH3), 32.5 (CH3); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 30-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 600 nmで検出); MS (ESI) C29H25F4N2O2 [M+H]+に対する計算値 509.2, 実測値 509.1.
【０３０３】
実施例42.  4-(tert-ブトキシカルボニル)-2-(3,6-ジ(アゼチジン-1-イル)-10,10-ジメチルアントラセン-9-イリウム-9(10H)-イル)ベンゾエート 
【化６３】
0006606096.tif 000075
【０３０４】
工程1:
バイアルをジ-tert-ブチル 2-ブロモテレフタレート (実施例32, 工程1; 1.48 g, 4.14 mmol, 2 eq)で装填し、密封し、窒素でフラシュした。そのブロマイドをTHF (7 mL)に溶解した後、反応混合物を-15 ℃に冷却し、iPrMgCl・LiCl (1.3 M in THF, 3.19 mL, 4.14 mmol, 2 eq)を加えた。反応混合物を-10 ℃に温め、4時間撹拌した。次いで、THF (4 mL)中の3,6-ビス((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-10,10-ジメチルアントラセン-9(10H)-オン (1.00 g, 2.07 mmol; Grimm, J. B.; Sung, A. J.; Legant, W. R.; Hulamm, P.; Matlosz, S. M.; Betzig, E.; Lavis, L. D. ACS Chem. Biol. 2013, 8, 1303から)の溶液を滴下した。反応混合物を室温に温め、2時間撹拌した。続いて、それを飽和NH4Clでクエンチし、水で希釈し、EtOAc (2×)で抽出した。合わせた有機物を食塩水で洗浄し、乾燥(MgSO4)し、濾過し、蒸発させた。シリカゲルクロマトグラフィー(0-10% Et2O／ヘキサン, 直線勾配)により、無色の固体として、tert-ブチル 3,6-ビス((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-10,10-ジメチル-3'-オキソ-3'H,10H-スピロ[アントラセン-9,1'-イソベンゾフラン]-6'-カルボキシレート（245 mg、17%）を得た。
【０３０５】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.16 (dd, J = 8.0, 1.3 Hz, 1H), 8.02 (dd, J = 8.0, 0.6 Hz, 1H), 7.63 - 7.59 (m, 1H), 7.09 - 7.05 (m, 2H), 6.64 - 6.57 (m, 4H), 1.81 (s, 3H), 1.72 (s, 3H), 1.54 (s, 9H), 0.99 (s, 18H), 0.22 (s, 12H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 169.9 (C), 164.4 (C), 156.5 (C), 155.5 (C), 147.0 (C), 138.1 (C), 130.3 (CH), 129.7 (C), 129.3 (CH), 125.1 (CH), 125.0 (CH), 124.0 (C), 119.2 (CH), 117.8 (CH), 87.0 (C), 82.5 (C), 38.2 (C), 35.0 (CH3), 33.2 (CH3), 28.2 (CH3), 25.8 (CH3), 18.4 (C), -4.17 (CH3), -4.19 (CH3); HRMS (ESI) C40H55O6Si2[M+H]+ に対する計算値 687.3537, 実測値 687.3533.
【０３０６】
工程2:
THF (5 mL)中の工程1の生成物 (170 mg, 0.247 mmol)の溶液にTBAF (THF中の1.0 M, 990 μL, 0.990 mmol, 4 eq)を加えた。反応混合物を室温で10分間撹拌した。続いて、それを飽和NH4Clで希釈し、EtOAc (2×)で抽出した。有機抽出物を食塩水で洗浄し、乾燥(MgSO4)し、濾過し、蒸発させ、橙色残渣を得た。その粗中間体をCH2Cl2 (5 mL)中に採取し、0 ℃に冷却した。ピリジン (160 μL, 1.98 mmol, 8 eq)およびトリフルオロメタンスルホン酸無水物 (167 μL, 0.990 mmol, 4 eq)を加え、氷浴を取り除いた。反応混合物を室温で2時間撹拌した。次いで、水で希釈し、CH2Cl2(2×)で抽出した。合わせた有機物を食塩水で洗浄し、乾燥(MgSO4)し、濾過し、真空下で濃縮した。シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー (0-20% EtOAc／ヘキサン, 直線勾配)により、無色の固体として、tert-ブチル 10,10-ジメチル-3'-オキソ-3,6-ビス(((トリフルオロメチル)スルホニル)オキシ)-3'H,10H-スピロ[アントラセン-9,1'-イソベンゾフラン]-6'-カルボキシレート（159 mg、89%）を得た。
【０３０７】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.24 (dd, J = 8.0, 1.3 Hz, 1H), 8.11 (dd, J = 8.0, 0.6 Hz, 1H), 7.63 - 7.60 (m, 1H), 7.56 (d, J = 2.5 Hz, 2H), 7.10 (dd, J = 8.8, 2.5 Hz, 2H), 6.88 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 1.91 (s, 3H), 1.81 (s, 3H), 1.56 (s, 9H); 19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ -73.20 (s); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 168.8 (C), 163.9 (C), 153.9 (C), 150.4 (C), 147.2 (C), 138.9 (C), 131.4 (CH), 131.1 (C), 130.3 (CH), 128.8 (C), 125.9 (CH), 124.7 (CH), 120.6 (CH), 119.8 (CH), 118.9 (q, 1JCF = 320.9 Hz, CF3), 84.3 (C), 83.1 (C), 39.0 (C), 34.8 (CH3), 33.2 (CH-3), 28.2 (CH3); HRMS (ESI) C30H25F6O10S2[M+H]+ に対する計算値 723.0793, 実測値 723.0797.
【０３０８】
工程3:
実施例7に記載の手順を用い、工程2で合成したジトリフレートから標記化合物、4-(tert-ブトキシカルボニル)-2-(3,6-ジ(アゼチジン-1-イル)-10,10-ジメチルアントラセン-9-イリウム-9(10H)-イル)ベンゾエート (84%, 青色の固体)を製造した。
【０３０９】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.14 (dd, J = 8.0, 1.3 Hz, 1H), 8.00 (dd, J = 8.0, 0.7 Hz, 1H), 7.61 (dd, J = 1.3, 0.8 Hz, 1H), 6.58 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 6.54 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.21 (dd, J = 8.6, 2.4 Hz, 2H), 3.91 (t, J = 7.2 Hz, 8H), 2.38 (p, J = 7.2 Hz, 4H), 1.83 (s, 3H), 1.73 (s, 3H), 1.53 (s, 9H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 170.1 (C), 164.6 (C), 155.6 (C), 152.4 (C), 146.8 (C), 137.8 (C), 130.3 (C), 130.1 (CH), 128.9 (CH), 125.1 (CH), 124.8 (CH), 119.9 (C), 110.5 (CH), 108.0 (CH), 88.8 (C), 82.3 (C), 52.3 (CH2), 38.5 (C), 35.5 (CH3), 32.8 (CH3), 28.2 (CH3), 17.0 (CH2); HRMS (ESI) C34H37N2O4 [M+H]+ に対する計算値 537.2753, 実測値 537.2768.
【０３１０】
実施例43.  4-カルボキシ-2-(3,6-ジ(アゼチジン-1-イル)-10,10-ジメチルアントラセン-9-イリウム-9(10H)-イル)ベンゾエート 
【化６４】
0006606096.tif 000076
【０３１１】
実施例19に記載の手順を用い、実施例42から標記化合物 (98%, 暗青色の固体, TFA塩)を製造した。
【０３１２】
1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.34 (dd, J = 8.2, 0.5 Hz, 1H), 8.31 (dd, J = 8.2, 1.5 Hz, 1H), 7.84 (dd, J = 1.5, 0.5 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 6.82 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 6.39 (dd, J = 9.1, 2.3 Hz, 2H), 4.33 (t, J = 7.6 Hz, 8H), 2.55 (p, J = 7.6 Hz, 4H), 1.82 (s, 3H), 1.70 (s, 3H); 19F NMR (MeOD, 376 MHz) δ -75.24 (s); 13C NMR (MeOD, 101 MHz) δ 167.9 (C), 167.5 (C), 165.4 (C), 158.0 (C), 156.8 (C), 139.3 (C), 137.6 (CH), 136.2 (C), 135.5 (C), 132.5 (CH), 132.4 (CH), 131.5 (CH), 121.8 (C), 111.9 (CH), 109.7 (CH), 52.9 (CH2), 42.8 (C), 35.6 (CH3), 32.0 (CH3), 16.8 (CH2); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 600 nmで検出); HRMS (ESI) C30H29N2O4 [M+H]+ に対する計算値 481.2127, 実測値 481.2120.
【０３１３】
実施例44.  4-((2-(2-((6-クロロヘキシル)オキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)-2-(3,6-ジ(アゼチジン-1-イル)-10,10-ジメチルアントラセン-9-イリウム-9(10H)-イル)ベンゾエート 
【化６５】
0006606096.tif 000077
【０３１４】
実施例35に記載の手順を用い、実施例43から標記化合物 (72%, 暗青色の固体)を製造した。
【０３１５】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.02 (dd, J = 8.0, 0.6 Hz, 1H), 7.94 (dd, J = 8.0, 1.4 Hz, 1H), 7.42 - 7.40 (m, 1H), 6.68 - 6.62 (m, 1H), 6.57 (d, J= 2.3 Hz, 2H), 6.52 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.20 (dd, J = 8.6, 2.4 Hz, 2H), 3.91 (t, J = 7.4 Hz, 8H), 3.64 - 3.56 (m, 6H), 3.55 - 3.48 (m, 4H), 3.38 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.37 (p, J= 7.2 Hz, 4H), 1.83 (s, 3H), 1.77 - 1.68 (m, 2H), 1.72 (s, 3H), 1.56 - 1.47 (m, 2H), 1.46 - 1.36 (m, 2H), 1.36 - 1.28 (m, 2H); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 600 nmでUV検出); HRMS (ESI) C40H49ClN3O5[M+H]+ に対する計算値 686.3361, 実測値 686.3375.
【０３１６】
実施例45.  2-(3,6-ビス(3,3-ジフルオロアゼチジン-1-イル)-10,10-ジメチルアントラセン-9-イリウム-9(10H)-イル)-4-(tert-ブトキシカルボニル)ベンゾエート
【化６６】
0006606096.tif 000078
【０３１７】
実施例1に記載の手順を用い、tert-ブチル 10,10-ジメチル-3'-オキソ-3,6-ビス(((トリフルオロメチル)スルホニル)オキシ)-3'H,10H-スピロ[アントラセン-9,1'-イソベンゾフラン]-6'-カルボキシレート (実施例42, 工程2)および3,3-ジフルオロアゼチジン塩酸塩から標記化合物 (93%, オフ-ホワイト色の固体)を製造した。
【０３１８】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.16 (dd, J = 8.0, 1.3 Hz, 1H), 8.02 (dd, J = 8.0, 0.7 Hz, 1H), 7.60 (dd, J = 1.2, 0.8 Hz, 1H), 6.65 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 6.62 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.29 (dd, J = 8.6, 2.5 Hz, 2H), 4.26 (t, 3JHF = 11.7 Hz, 8H), 1.85 (s, 3H), 1.75 (s, 3H), 1.53 (s, 9H); 19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ -99.96 (p, 3JFH = 11.8 Hz); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 169.9 (C), 164.4 (C), 155.3 (C), 150.1 (t, 4JCF = 2.7 Hz, C), 146.8 (C), 138.1 (C), 130.3 (CH), 129.9 (C), 129.2 (CH), 125.1 (CH), 124.9 (CH), 121.7 (C), 115.9 (t, 1JCF = 274.6 Hz, CF2), 111.8 (CH), 109.3 (CH), 87.5 (C), 82.5 (C), 63.4 (t, 2JCF= 26.0 Hz, CH2), 38.5 (C), 35.4 (CH3), 33.0 (CH3), 28.2 (CH3); MS (ESI) C34H33F4N2O4[M+H]+ に対する計算値 609.2, 実測値 609.3.
【０３１９】
実施例46.  2-(3,6-ビス(3,3-ジフルオロアゼチジン-1-イル)-10,10-ジメチルアントラセン-9-イリウム-9(10H)-イル)-4-カルボキシベンゾエート 
【化６７】
0006606096.tif 000079
【０３２０】
実施例19に記載の手順を用い、実施例45から標記化合物 (99%, 暗青-紫色の固体, TFA塩)を製造した。
【０３２１】
1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.30 (dd, J = 8.1, 1.4 Hz, 1H), 8.23 - 8.15 (m, 1H), 7.69 (s, 1H), 6.92 (d, J = 2.1 Hz, 2H), 6.79 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 6.47 (dd, J = 8.8, 2.3 Hz, 2H), 4.45 (t, 3JHF= 11.0 Hz, 8H), 1.88 (s, 3H), 1.76 (s, 3H); 19F NMR (MeOD, 376 MHz) δ -75.81 (s, 3F), -100.32 (m, 4F); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 30-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 600 nmで検出); MS (ESI) C30H25F4N2O4 [M+H]+に対する計算値 553.2, 実測値 553.1.
【０３２２】
実施例47.  2-(3,6-ビス(3,3-ジフルオロアゼチジン-1-イル)-10,10-ジメチルアントラセン-9-イリウム-9(10H)-イル)-4-(((2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ)カルボニル)ベンゾエート
【化６８】
0006606096.tif 000080
【０３２３】
実施例34に記載の手順を用い、実施例46から標記化合物 (93%, 黄色の固体)を製造した。
【０３２４】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.32 (dd, J = 8.0, 1.4 Hz, 1H), 8.14 (dd, J = 8.0, 0.7 Hz, 1H), 7.74 (dd, J = 1.3, 0.8 Hz, 1H), 6.65 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 6.58 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.31 (dd, J = 8.6, 2.5 Hz, 2H), 4.26 (t, 3JHF = 11.7 Hz, 8H), 2.88 (s, 4H), 1.84 (s, 3H), 1.73 (s, 3H); 19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ -99.97 (p, JFH = 11.7 Hz); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 169.1 (C), 168.9 (C), 160.9 (C), 155.6 (C), 150.3 (t, 4JCF = 2.5 Hz, C), 146.9 (C), 132.0 (C), 131.3 (CH), 131.0 (C), 129.3 (CH), 126.2 (CH), 125.8 (CH), 120.9 (C), 115.9 (t, 1JCF = 274.5 Hz, CF2), 112.0 (CH), 109.4 (CH), 87.9 (C), 63.4 (t, 2JCF= 26.0 Hz, CH2), 38.5 (C), 35.5 (CH3), 32.8 (CH3), 25.8 (CH2); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 30-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 600 nmで検出); MS (ESI) C34H28F4N3O6 [M+H]+に対する計算値 650.2, 実測値 650.1.
【０３２５】
実施例48.  2-(3,6-ビス(3,3-ジフルオロアゼチジン-1-イル)-10,10-ジメチルアントラセン-9-イリウム-9(10H)-イル)-4-((2-(2-((6-クロロヘキシル)オキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)ベンゾエート
【化６９】
0006606096.tif 000081
【０３２６】
実施例35に記載の手順を用い、実施例46から標記化合物 (54%, オフ-ホワイト／青みがかった色の固体)を製造した。
【０３２７】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.04 (dd, J = 8.0, 0.5 Hz, 1H), 7.93 (dd, J = 8.0, 1.4 Hz, 1H), 7.44 - 7.40 (m, 1H), 6.70 - 6.65 (m, 1H), 6.64 (d, J= 2.4 Hz, 2H), 6.60 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.28 (dd, J = 8.6, 2.4 Hz, 2H), 4.25 (t, 3JHF= 11.7 Hz, 8H), 3.66 - 3.57 (m, 6H), 3.56 - 3.48 (m, 4H), 3.39 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 1.85 (s, 3H), 1.79 - 1.70 (m, 5H), 1.57 - 1.48 (m, 2H), 1.46 - 1.37 (m, 2H), 1.37 - 1.26 (m, 2H); 19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ -99.94 (p, 3JFH= 11.8 Hz); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 30-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 600 nmで検出); MS (ESI) C40H45ClF4N3O5[M+H]+ に対する計算値 758.3, 実測値 758.2.
【０３２８】
実施例49.  7-(アゼチジン-1-イル)-4-メチル-2H-クロメン-2-オン
【化７０】
0006606096.tif 000082
【０３２９】
バイアルを4-メチルウンベリフェロン トリフレート (300 mg, 0.973 mmol; Kover, J.; Antus, S. Z. Naturforsch., B: J. Chem. Sci. 2005, 60, 792から)、RuPhos-G3-パラダサイクル(41 mg, 0.049 mmol, 0.05 eq)、RuPhos (23 mg, 0.049 mmol, 0.05 eq)およびK2CO3 (188 mg, 1.36 mmol, 1.4 eq)で装填した。そのバイアルを密封し、排気／窒素で戻す操作を行った(3×)。ジオキサン (8 mL)を加え、反応混合物を窒素で再度フラッシュした(3×)。アゼチジン (72 μL, 1.07 mmol, 1.1 eq)の添加に続いて、反応混合物を80 ℃で6.5時間撹拌した。次いで、それを室温に冷却し、Celiteの上に置き、濃縮乾固した。シリカゲルクロマトグラフィー (0-30% EtOAc／ヘキサン, 直線勾配; Celiteで乾式積載)により精製し、黄色の固体として標記化合物 (190 mg, 91%)を得た。
【０３３０】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.38 (d, J= 8.6 Hz, 1H), 6.30 (dd, J = 8.6, 2.3 Hz, 1H), 6.22 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 5.97 (q, J = 1.1 Hz, 1H), 4.03 - 3.95 (m, 4H), 2.44 (p, J= 7.3 Hz, 2H), 2.34 (d, J = 1.1 Hz, 3H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 162.0 (C), 155.7 (C), 154.0 (C), 153.1 (C), 125.5 (CH), 110.4 (C), 109.5 (CH), 107.8 (CH), 97.2 (CH), 51.9 (CH2), 18.7 (CH3), 16.6 (CH2); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 350 nmで検出); HRMS (ESI) C13H14NO2 [M+H]+ に対する計算値 216.1019, 実測値 216.1014.
【０３３１】
実施例50. エチル 7-(アゼチジン-1-イル)-2-オキソ-2H-クロメン-3-カルボキシレート
【化７１】
0006606096.tif 000083
【０３３２】
工程1:
フラスコをPd(OAc)2 (130 mg, 0.578 mmol, 0.05 eq)で装填し、密封し、排気／窒素で戻す操作を行った(3×)。トルエン (40 mL)を加え、次いで、トルエン (8 mL)中の3-ブロモフェノール (2.00 g, 11.6 mmol)およびトルエン (8 mL)中の2,8,9-トリイソブチル-2,5,8,9-テトラアザ-1-ホスファビシクロ[3.3.3]ウンデカン (「Verkade塩基」, 396 mg, 1.16 mmol, 0.1 eq)のそれぞれの溶液、ならびにLiHMDS (THF中の1.0 M, 26.6 mL, 26.6 mmol, 2.3 eq)を連続で加えた。アゼチジン (935 μL, 13.9 mmol, 1.2 eq)の添加に続いて、反応混合物を80 ℃で18時間撹拌した。次いで、それを室温に冷却し、Celiteの上に置き、濃縮乾固した。シリカゲルクロマトグラフィー (0-35% EtOAc／ヘキサン, 直線勾配; Celiteで乾式積載)により精製し、オフ-ホワイト色の固体として、3-(アゼチジン-1-イル)フェノール (1.44 g, 84%)を得た。
【０３３３】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.05 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.19 (ddd, J = 8.0, 2.4, 0.8 Hz, 1H), 6.04 (ddd, J = 8.1, 2.1, 0.8 Hz, 1H), 5.92 (t, J = 2.3 Hz, 1H), 4.77 (s, 1H), 3.89 - 3.81 (m, 4H), 2.34 (p, J= 7.2 Hz, 2H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 156.7 (C), 153.9 (C), 130.1 (CH), 105.1 (CH), 104.5 (CH), 99.0 (CH), 52.7 (CH2), 17.0 (CH2); HRMS (ESI) C9H12NO [M+H]+ に対する計算値 150.0913, 実測値 150.0915.
【０３３４】
工程2:
DMF (2 mL)を窒素下で0 ℃に冷却し、POCl3(500 μL, 5.36 mmol, 2 eq)を滴下した。次いで、氷浴を取り除き、反応混合物を室温で1時間撹拌した。次いで、DMF (4 mL)中の工程1からのフェノール (400 mg, 2.68 mmol)を加えた。反応混合物を室温で1時間撹拌後、それを飽和NaHCO3(〜20 mL)およびEtOAc (〜20 mL)で注意深く希釈し、10分間激しく撹拌した。その混合物をさらなる水で希釈し、EtOAc (2×)で抽出した。合わせた有機抽出物を食塩水で洗浄し、乾燥(MgSO4)し、濾過し、真空下で濃縮した。残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー (0-40% EtOAc／ヘキサン, 直線勾配)により精製し、白色の固体として、4-(アゼチジン-1-イル)-2-ヒドロキシベンズアルデヒド（230 mg、48%）得た。
【０３３５】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 11.69 (s, 1H), 9.50 (s, 1H), 7.25 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 5.94 (dd, J = 8.5, 2.1 Hz, 1H), 5.75 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 4.08 - 3.98 (m, 4H), 2.43 (p, J= 7.4 Hz, 2H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 192.6 (CH), 164.4 (C), 156.6 (C), 135.5 (CH), 112.2 (C), 103.2 (CH), 95.6 (CH), 51.2 (CH2), 16.3 (CH2); HRMS (ESI) C10H12NO2[M+H]+ に対する計算値 178.0863, 実測値 178.0866.
【０３３６】
工程3:
工程2からのアルデヒド (175 mg, 0.988 mmol)をEtOH (10 mL)中に懸濁させた。ジエチル マロネート (301 μL, 1.98 mmol, 2 eq)およびピペリジン (29 μL, 0.296 mmol, 0.3 eq)を加え、反応混合物を還流で12時間撹拌した。次いで、それを室温に冷却し、12時間放置した。その間に黄色の固体が溶液から晶出した。混合物を濾過し、濾過ケーキをEtOHで洗浄し、乾燥して、明るい黄色の結晶固体として、標記化合物のエチル 7-(アゼチジン-1-イル)-2-オキソ-2H-クロメン-3-カルボキシレート（232 mg、86%）を得た。
【０３３７】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.39 (s, 1H), 7.31 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.26 (dd, J = 8.6, 2.2 Hz, 1H), 6.09 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 4.37 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 4.10 - 4.02 (m, 4H), 2.48 (p, J = 7.4 Hz, 2H), 1.38 (t, J = 7.1 Hz, 3H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 164.2 (C), 158.13 (C), 158.12 (C), 155.2 (C), 149.5 (CH), 131.0 (CH), 109.4 (C), 108.39 (C), 108.36 (CH), 95.4 (CH), 61.2 (CH2), 51.4 (CH2), 16.3 (CH2), 14.5 (CH3); HRMS (ESI) C15H15NO4Na [M+Na]+ に対する計算値 296.0893, 実測値 296.0900.
【０３３８】
実施例51.  7-(アゼチジン-1-イル)-2-オキソ-2H-クロメン-3-カルボン酸
【化７２】
0006606096.tif 000084
【０３３９】
エチル 7-(アゼチジン-1-イル)-2-オキソ-2H-クロメン-3-カルボキシレート (実施例50; 65 mg, 0.238 mmol)を1:1 THF/MeOH (8 mL)中に採取し、1 M NaOH (476 μL, 0.476 mmol, 2 eq)を加えた。反応混合物を室温で3時間撹拌した。次いで、それを1 M HCl (500 μL)で酸性化し、得られる黄色の懸濁液を濾過した。濾過ケーキを洗浄(水, EtOAc)し、乾燥し、明るい黄色の固体として標記化合物 (47 mg, 81%)を得た。
【０３４０】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 12.52 (s, 1H), 8.59 (s, 1H), 7.64 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.42 (dd, J = 8.7, 2.2 Hz, 1H), 6.23 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 4.10 - 4.01 (m, 4H), 2.39 (p, J = 7.4 Hz, 2H); 13C NMR (DMSO-d6, 101 MHz) δ 164.4 (C), 159.1 (C), 157.4 (C), 155.1 (C), 149.7 (CH), 131.7 (CH), 108.7 (CH), 108.0 (C), 107.6 (C), 94.7 (CH), 51.2 (CH2), 15.6 (CH2); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 400 nmで検出); HRMS (ESI) C13H12NO4 [M+H]+ に対する計算値 246.0761, 実測値 246.0770.
【０３４１】
実施例52.  N-(4-(((2-アミノ-9H-プリン-6-イル)オキシ)メチル)ベンジル)-7-(アゼチジン-1-イル)-2-オキソ-2H-クロメン-3-カロボキシアミド
【化７３】
0006606096.tif 000085
【０３４２】
7-(アゼチジン-1-イル)-2-オキソ-2H-クロメン-3-カルボン酸 (実施例51; 6.0 mg, 24.5 μmol)を、DMF (1 mL)中でTSTU (11.0 mg, 36.7 μmol, 1.5 eq)と混合した。DIEA (21.3 μL, 122 μmol, 5 eq)を加えた後、反応混合物を遮光して室温で1時間撹拌した。次いで、6-((4-(アミノメチル)ベンジル)オキシ)-9H-プリン-2-アミン (「BG-NH2」, 9.9 mg, 36.7 μmol, 1.5 eq)を加えた。反応混合物を室温でさらに2時間撹拌した。粗反応混合物を逆相HPLC (10-75% MeCN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて)で精製し、黄色の固体として標記化合物（11.5 mg、77%、TFA塩）を得た。
【０３４３】
1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.65 (s, 1H), 8.31 (s, 1H), 7.57 - 7.50 (m, 3H), 7.41 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.45 (dd, J = 8.7, 2.1 Hz, 1H), 6.22 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.64 (s, 2H), 4.62 (s, 2H), 4.15 - 4.06 (m, 4H), 2.48 (p, J= 7.4 Hz, 2H); 19F NMR (MeOD, 376 MHz) δ -75.44 (s); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 400 nmで検出); HRMS (ESI) C26H24N7O4 [M+H]+ に対する計算値 498.1884, 実測値 498.1891.
【０３４４】
実施例53.  メチル 2-(7-(アゼチジン-1-イル)-4-メチル-2-オキソ-2H-クロメン-3-イル)アセテート
【化７４】
0006606096.tif 000086
【０３４５】
工程1:
メチル 7-ヒドロキシ-4-メチルクマリン-3-アセテート (1.00 g, 4.03 mmol; Franzini, R. M.; Kool, E. T. Chembiochem 2008, 9, 2981から)、N-フェニル-ビス(トリフルオロメタンスルホンイミド) (1.58 g, 4.43 mmol, 1.1 eq)およびDIEA (912 μL, 5.24 mmol, 1.3 eq)をMeCN (20 mL)中で混合し、室温で18時間撹拌した。反応混合物を濃縮乾固し、得られる残渣をシリガゲルでのフラッシュクロマトグラフィー (0-50% EtOAc／ヘキサン, 直線勾配)で精製し、オフ-ホワイト色の固体としてメチル 2-(4-メチル-2-オキソ-7-(((トリフルオロメチル)スルホニル)オキシ)-2H-クロメン-3-イル)アセテート (1.41 g, 92%)を得た。
【０３４６】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.73 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.29 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.26 (dd, J = 8.8, 2.5 Hz, 1H), 3.76 (s, 2H), 3.73 (s, 3H), 2.44 (s, 3H); 19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ -73.08 (s); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 170.2 (C), 160.4 (C), 153.0 (C), 150.5 (C), 147.9 (C), 126.7 (CH), 121.0 (C), 120.5 (C), 118.8 (q, 1JCF = 321.0 Hz, CF3), 117.6 (CH), 110.5 (CH), 52.6 (CH3), 33.0 (CH2), 15.7 (CH3); HRMS (ESI) C14H11F3O7SNa [M+Na]+ に対する計算値 403.0070, 実測値 403.0081.
【０３４７】
工程2:
バイアルをStep工程1からのトリフレート (300 mg, 0.789 mmol)、RuPhos-G3-パラダサイクル(33 mg, 0.039 mmol, 0.05 eq)、RuPhos (18 mg, 0.039 mmol, 0.05 eq)およびK2CO3 (153 mg, 1.10 mmol, 1.4 eq)で装填した。バイアルを密封し、排気／窒素で戻す操作を行った(3×)。ジオキサン (5 mL)を加え、反応混合物を窒素で再度フラシュした(3×)。アゼチジン (58 μL, 0.868 mmol, 1.1 eq)の添加に続いて、反応混合物を80 ℃で4時間撹拌した。次いで、それを室温に冷却し、CH2Cl2で希釈し、Celiteの上に置き、濃縮乾固した。シリカゲルクロマトグラフィー (0-50% EtOAc／ヘキサン, 直線勾配, 一定の40% v/v CH2Cl2を用いて; Celiteで乾式積載)により精製し、淡黄色の固体として標記化合物、メチル 2-(7-(アゼチジン-1-イル)-4-メチル-2-オキソ-2H-クロメン-3-イル)アセテート (210 mg, 93%)を得た。
【０３４８】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.42 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.32 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H), 6.22 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 4.03 - 3.94 (m, 4H), 3.70 (s, 3H), 3.69 (s, 2H), 2.43 (p, J= 7.3 Hz, 2H), 2.33 (s, 3H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 171.4 (C), 162.4 (C), 154.6 (C), 153.7 (C), 149.8 (C), 125.7 (CH), 113.7 (C), 110.7 (C), 108.0 (CH), 97.0 (CH), 52.2 (CH3), 51.9 (CH2), 32.8 (CH2), 16.6 (CH2), 15.3 (CH3); HRMS (ESI) C16H17NO4Na [M+Na]+ に対する計算値 310.1050, 実測値 310.1068.
【０３４９】
実施例54.  メチル 2-(7-(3,3-ジフルオロアゼチジン-1-イル)-4-メチル-2-オキソ-2H-クロメン-3-イル)アセテート
【化７５】
0006606096.tif 000087
【０３５０】
バイアルをメチル 2-(4-メチル-2-オキソ-7-(((トリフルオロメチル)スルホニル)オキシ)-2H-クロメン-3-イル)アセテート (実施例53, 工程1; 240 mg, 0.631 mmol)、RuPhos-G3-パラダサイクル (26 mg, 0.032 mmol, 0.05 eq)、RuPhos (15 mg, 0.032 mmol, 0.05 eq)、K2CO3 (218 mg, 1.58 mmol, 2.5 eq)および3,3-ジフルオロアゼチジン塩酸塩 (84 mg, 0.694 mmol, 1.1 eq)で装填した。そのバイアルを密封し、排気／窒素で戻す操作を行った(3×)。ジオキサン (4 mL)を加え、反応混合物を窒素で再度フラシュした(3×)。次いで、その混合物を80 ℃で24時間撹拌した。続いて、それを室温に冷却し、CH2Cl2で希釈し、Celiteの上に置き、濃縮乾固した。シリカゲルクロマトグラフィー (0-40% EtOAc／ヘキサン, 直線勾配, 一定の40% v/v CH2Cl2を用いて; Celiteで乾式積載)により精製し、オフ-ホワイト色の固体として標記化合物 (158 mg, 77%)を得た。
【０３５１】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.50 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 6.41 (dd, J = 8.7, 2.4 Hz, 1H), 6.34 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 4.32 (t, 3JHF= 11.7 Hz, 4H), 3.71 (s, 3H), 3.71 (s, 2H), 2.36 (s, 3H); 19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ -100.14 (p, 3JFH = 11.6 Hz); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 171.1 (C), 161.9 (C), 154.3 (C), 151.5 (t, 4JCF = 3.2 Hz, C), 149.4 (C), 126.1 (CH), 115.5 (t, 1JCF = 274.6 Hz, CF2), 115.4 (C), 112.3 (C), 109.0 (CH), 98.9 (CH), 63.3 (t, 2JCF= 26.8 Hz, CH2), 52.3 (CH3), 32.8 (CH2), 15.4 (CH3); HRMS (ESI) C16H15F2NO4Na [M+Na]+ に対する計算値 346.0861, 実測値 346.0872.
【０３５２】
実施例55.  2-(7-(アゼチジン-1-イル)-4-メチル-2-オキソ-2H-クロメン-3-イル)酢酸
【化７６】
0006606096.tif 000088
【０３５３】
メチル 2-(7-(アゼチジン-1-イル)-4-メチル-2-オキソ-2H-クロメン-3-イル)アセテート (実施例53; 190 mg, 0.661 mmol)を1:1 THF/MeOH (8 mL)に溶解し、1 M NaOH (1.32 mL, 1.32 mmol, 2 eq)を加えた。反応混合物を室温で24時間撹拌後、それを1 M HCl (1.40 mL)で酸性化し、水で希釈し、EtOAc (2×)で抽出した。合わせた有機抽出物を食塩水で洗浄し、乾燥(MgSO4)し、濾過し、真空下で濃縮した。得られる残渣をCH2Cl2／ヘキサンで摩砕し、濾過し、乾燥し、淡黄色の固体として標記化合物（164 mg、91%）を得た。
【０３５４】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 12.33 (s, 1H), 7.58 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.40 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H), 6.25 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 3.94 (t, J= 7.3 Hz, 4H), 3.52 (s, 2H), 2.36 (p, J= 7.3 Hz, 2H), 2.30 (s, 3H); 13C NMR (DMSO-d6, 101 MHz) δ 171.8 (C), 161.2 (C), 153.7 (C), 153.4 (C), 149.5 (C), 126.2 (CH), 113.6 (C), 109.7 (C), 108.0 (CH), 96.1 (CH), 51.5 (CH2), 32.5 (CH2), 16.0 (CH2), 14.9 (CH3); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 350 nmで検出); HRMS (ESI) C15H15NO4Na [M+Na]+ に対する計算値 296.0893, 実測値 296.0909.
【０３５５】
実施例56.  2-(7-(3,3-ジフルオロアゼチジン-1-イル)-4-メチル-2-オキソ-2H-クロメン-3-イル)酢酸
【化７７】
0006606096.tif 000089
【０３５６】
実施例55に記載の手順を用い、実施例54から標記化合物 (93%, 白色の固体)を製造した。
【０３５７】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 12.37 (s, 1H), 7.67 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.58 (dd, J = 8.7, 2.4 Hz, 1H), 6.51 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 4.42 (t, 3JHF = 12.3 Hz, 4H), 3.55 (s, 2H), 2.33 (s, 3H); 19F NMR (DMSO-d6, 376 MHz) δ -98.45 (p, 3JHF = 12.4 Hz); 13C NMR (DMSO-d6, 101 MHz) δ 171.7 (C), 161.0 (C), 153.3 (C), 151.7 (t, 4JCF = 3.2 Hz, C), 149.3 (C), 126.4 (CH), 116.4 (t, 1JCF = 272.9 Hz, CF2), 115.1 (C), 111.3 (C), 109.6 (CH), 98.6 (CH), 62.8 (t, 2JCF= 26.1 Hz, CH2), 32.6 (CH2), 14.9 (CH3); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 350 nmで検出); HRMS (ESI) C15H13F2NO4Na [M+Na]+に対する計算値 332.0705, 実測値 332.0714.
【０３５８】
実施例57.  2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 2-(7-(アゼチジン-1-イル)-4-メチル-2-オキソ-2H-クロメン-3-イル)アセテート
【化７８】
0006606096.tif 000090
【０３５９】
DMF (4 mL)中の2-(7-(アゼチジン-1-イル)-4-メチル-2-オキソ-2H-クロメン-3-イル)酢酸 (実施例55; 75 mg, 0.274 mmol)およびTSTU (124 mg, 0.412 mmol, 1.5 eq)の溶液にDIEA (96 μL, 0.549 mmol, 2 eq)を加えた。反応混合物を室温で4時間撹拌した。続いて、それを10% w/v クエン酸で希釈し、EtOAc (2×)で抽出した。合わせた有機抽出物を水および食塩水で洗浄し、乾燥(MgSO4)し、濾過し、真空下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー (0-50% EtOAc/CH2Cl2, 直線勾配)で淡黄色の固体として標記化合物（84 mg、83%）を得た。
【０３６０】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.43 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 6.31 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H), 6.21 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 4.02 (s, 2H), 4.02 - 3.96 (m, 4H), 2.81 (s, 4H), 2.44 (p, J = 7.3 Hz, 2H), 2.38 (s, 3H); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 169.0 (C), 166.4 (C), 162.0 (C), 154.7 (C), 154.0 (C), 151.3 (C), 125.9 (CH), 111.2 (C), 110.3 (C), 108.1 (CH), 96.9 (CH), 51.8 (CH2), 29.8 (CH2), 25.7 (CH2), 16.6 (CH2), 15.5 (CH3); HRMS (ESI) C19H18N2O6Na [M+Na]+ に対する計算値393.1057, 実測値 393.1065.
【０３６１】
実施例58.  2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 2-(7-(3,3-ジフルオロアゼチジン-1-イル)-4-メチル-2-オキソ-2H-クロメン-3-イル)アセテート
【化７９】
0006606096.tif 000091
【０３６２】
実施例57に記載の手順を用い、実施例56から標記化合物 (82%, 白色の固体)を製造した。
【０３６３】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 7.71 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 6.59 (dd, J = 8.7, 2.4 Hz, 1H), 6.53 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 4.43 (t, 3JHF= 12.3 Hz, 4H), 4.03 (s, 2H), 2.79 (s, 4H), 2.40 (s, 3H); 19F NMR (DMSO-d6, 376 MHz) δ -98.49 (p, 3JFH = 12.3 Hz); 13C NMR (DMSO-d6, 101 MHz) δ 170.0 (C), 166.5 (C), 160.6 (C), 153.5 (C), 152.1 (t, 4JCF = 3.2 Hz, C), 151.2 (C), 126.7 (CH), 116.4 (t, 1JCF = 272.8 Hz, CF2), 112.1 (C), 110.9 (C), 109.8 (CH), 98.5 (CH), 62.8 (t, 2JCF= 26.2 Hz, CH2), 29.5 (CH2), 25.4 (CH2), 15.1 (CH3); HRMS (ESI) C19H16F2N2O6Na [M+Na]+ に対する計算値 429.0869, 実測値 429.0876.
【０３６４】
実施例59.  2-(6-(アゼチジン-1-イル)-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル)安息香酸
【化８０】
0006606096.tif 000092
【０３６５】
工程1:
バイアルをフルオレセイン ジトリフレート (500 mg, 0.838 mmol)、Pd2dba3(38 mg, 0.042 mmol, 0.05 eq)、XPhos (60 mg, 0.126 mmol, 0.15 eq)およびCs2CO3 (382 mg, 1.17 mmol, 1.4 eq)で装填した。そのバイアルを密封し、排気／窒素で戻す操作を行った(3×)。ジオキサン (4 mL)を加え、反応混合物を窒素で再度フラシュした(3×)。アゼチジン (57 μL, 0.838 mmol, 1 eq)の添加に続いて、反応混合物を80 ℃で2時間撹拌した。次いで、それを室温に冷却し、Celiteの上に置き、濃縮乾固した。シリカゲルクロマトグラフィー (0-35% EtOAc／ヘキサン, 直線勾配; Celiteで乾式積載)により精製し、オフ-ホワイト色の固体として、3'-(アゼチジン-1-イル)-3-オキソ-3H-スピロ[イソベンゾフラン-1,9'-キサンテン]-6'-イル トリフルオロメタンスルホネート (125 mg, 30%)を得た。
MS (ESI) C24H17F3NO6S [M+H]+に対する計算値 504.1, 実測値 504.2.
【０３６６】
工程2:
工程1の生成物 (72 mg, 0.143 mmol)を1:1 THF/MeOH (5 mL)中に採取し、1 M NaOH (286 μL, 0.286 mmol, 2 eq)を加えた。反応混合物を室温で6時間撹拌後、反応混合物を濃縮乾固した。残渣を逆相HPLC (10-95% MeCN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて)により精製し、明るい橙色の固体として標記化合物、2-(6-(アゼチジン-1-イル)-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル)安息香酸（40 mg、58%）を得た。
【０３６７】
1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.36 - 8.30 (m, 1H), 7.85 (td, J = 7.5, 1.5 Hz, 1H), 7.81 (td, J = 7.6, 1.5 Hz, 1H), 7.43 - 7.38 (m, 1H), 7.16 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.15 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.08 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.93 (dd, J = 9.0, 2.3 Hz, 1H), 6.74 (dd, J = 9.3, 2.2 Hz, 1H), 6.64 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 4.44 - 4.35 (m, 4H), 2.58 (p, J = 7.7 Hz, 2H); 13C NMR (MeOD, 101 MHz) δ 168.4 (C), 168.0 (C), 161.0 (C), 159.9 (C), 159.1 (C), 157.9 (C), 135.7 (C), 134.0 (CH), 133.1 (CH), 132.42 (CH), 132.40 (CH), 132.1 (C), 131.7 (CH), 131.2 (CH), 118.0 (CH), 117.1 (C), 116.4 (C), 115.9 (CH), 103.3 (CH), 95.1 (CH), 53.4 (CH2), 16.7 (CH2); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 500 nmで検出); HRMS (ESI) C23H18NO4 [M+H]+ に対する計算値 372.1230, 実測値 372.1230.
【０３６８】
実施例60.  3,6-ジ(アゼチジン-1-イル)アクリジン
【化８１】
0006606096.tif 000093
【０３６９】
工程1:
マイクロウエーブバイアル中で、プロフラビン塩酸塩 (250 mg, 1.02 mmol)を水(1 mL)に懸濁させ、濃H2SO4 (450 μL)を加えた。密封した混合物をマイクロウエーブ中、195 ℃で8時間加熱した。褐色の懸濁液を水で希釈し、濾過し、得られる濾過ケーキを水で洗浄し、乾燥し、赤-褐色の固体として粗3,6-ジヒドロキシアクリジン (260 mg)を得た。次いで、その3,6-ジヒドロキシアクリジン (260 mg, 1.23 mmol)をCH2Cl2(5 mL)に懸濁させた。ピリジン (796 μL, 9.85 mmol, 8 eq)およびトリフルオロメタンスルホン酸無水物 (828 μL, 4.92 mmol, 4 eq)を加え、その混合物を室温で2時間撹拌した。続いて、水で希釈し、CH2Cl2(2×)で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥(MgSO4)し、濾過し、真空下で濃縮した。シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー (0-30% EtOAc／ヘキサン, 直線勾配)により精製し、オフ-ホワイト色の固体として、アクリジン-3,6-ジイル ビス(トリフルオロメタンスルホネート)の303 mg (63%, 2工程)を得た。
【０３７０】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.93 (s, 1H), 8.19 - 8.13 (m, 4H), 7.54 (dd, J = 9.2, 2.4 Hz, 2H); 19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ -73.10 (s); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 151.1 (C), 149.5 (C), 137.0 (CH), 131.2 (CH), 125.7 (C), 121.4 (CH), 120.8 (CH), 119.0 (q, 1JCF = 321.0 Hz, CF3); HRMS (ESI) C15H8F6NO6S2[M+H]+ に対する計算値 475.9692, 実測値 475.9689.
【０３７１】
工程2:
バイアルを工程1からのジトリフレート (200 mg, 0.421 mmol)、Pd(OAc)2 (19 mg, 0.084 mmol, 0.2 eq)、BINAP (79 mg, 0.126 mmol, 0.3 eq)およびCs2CO3 (384 mg, 1.18 mmol, 2.8 eq)で装填した。そのバイアルを密封し、排気／窒素で戻す操作を行った(3×)。トルエン (2.5 mL)を加え、窒素で再度フラッシュした(3×)。アゼチジン (68 μL, 1.01 mmol, 2.4 eq)の添加に続いて、反応混合物を100 ℃で18時間撹拌した。次いで、それを室温に冷却し、MeOHで希釈し、Celiteの上に置き、濃縮乾固した。シリカゲクロマトグラフィー (0-10% MeOH (2 M NH3)/CH2Cl2, 直線勾配; Celiteで乾式積載)により精製し、赤-橙色の固体として標記化合物、3,6-ジ(アゼチジン-1-イル)アクリジン (89 mg, 73%)を得た。
【０３７２】
1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.44 (s, 1H), 7.74 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.78 (dd, J = 9.0, 2.2 Hz, 2H), 6.57 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 4.08 (t, J = 7.3 Hz, 8H), 2.47 (p, J = 7.3 Hz, 4H); 13C NMR (MeOD, 101 MHz) δ 156.0 (C), 144.2 (CH), 143.1 (C), 132.6 (CH), 118.1 (C), 114.1 (CH), 91.4 (CH), 52.3 (CH2), 17.0 (CH2); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 500 nmで検出); HRMS (ESI) C19H20N3 [M+H]+ に対する計算値 290.1652, 実測値 290.1650.
【０３７３】
実施例61.  3,7-ジ(アゼチジン-1-イル)フェノキサジン-5-イウム トリフルオロアセテート
【化８２】
0006606096.tif 000094
【０３７４】
工程1:
Amplex Red (449 mg, 1.75 mmol) をCH2Cl2(45 mL)中に採取し、0 ℃に冷却した。ピリジン(1.14 mL, 14.0 mmol, 8.0 eq)およびトリフルオロメタンスルホン酸無水物 (1.17 mL, 6.98 mmol, 4.0 eq)を加え、氷浴を取り除いた。反応混合物を室温で3時間撹拌した。続いて、それを水で希釈し、CH2Cl2 (2×)で抽出した。合わせた有機抽出物を食塩水で洗浄し、乾燥(MgSO4)し、濾過し、真空下で濃縮した。シリカゲルでのフラシュクロマトグラフィー (0-35% EtOAc／ヘキサン, 直線勾配)により、オフ-ホワイト色の固体として、10-アセチル-10H-フェノキサジン-3,7-ジイル ビス(トリフルオロメタンスルホネート)（836 mg、92%）を得た。
【０３７５】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.58 - 7.54 (m, 2H), 7.14 - 7.09 (m, 4H), 2.35 (s, 3H); 19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ -73.15 (s); 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 168.9 (C), 151.0 (C), 147.4 (C), 129.1 (C), 126.3 (CH), 118.8 (q, 1JCF= 320.9 Hz, CF3), 117.2 (CH), 111.1 (CH), 23.0 (CH3); HRMS (ESI) C16H10F6NO8S2[M+H]+ に対する計算値 521.9747, 実測値 521.9748.
【０３７６】
工程2:
バイアルを工程1からのジトリフレート (150 mg, 0.288 mmol)、Pd2dba3 (26 mg, 0.029 mmol, 0.1 eq)、XPhos (41 mg, 0.086 mmol, 0.3 eq)およびCs2CO3(262 mg, 0.806 mmol, 2.8 eq)で装填した。そのバイアルを密封し、排気／窒素で戻す操作を行った(3×)。ジオキサン (4 mL)を加え、反応混合物を窒素で再度フラッシュした(3×)。アゼチジン (47 μL, 0.691 mmol, 2.4 eq)の添加に続いて、反応混合物を80 ℃で4時間撹拌した。次いで、それを室温に冷却し、Celiteの上に置き、濃縮乾固した。シリカゲルクロマトグラフィー (5-50% EtOAc／ヘキサン, 直線勾配; Celiteで乾式積載)により精製し、無色の固体として、1-(3,7-ジ(アゼチジン-1-イル)-10H-フェノキサジン-10-イル)エタノン (91 mg, 94%)を得た。
MS (ESI) C20H22N3O2 [M+H]+に対する計算値 336.2, 実測値 336.2.
【０３７７】
工程3:
工程2からの中間体 (63 mg, 0.189 mmol)をCH2Cl2 (11.7 mL)と水(1.3 mL)の混合物中に採取し、0 ℃に冷却した。DDQ (47 mg, 0.207 mmol, 1.1 eq)を加え、反応混合物を室温で2.5時間撹拌した。第2部分のDDQ (21 mg, 0.094 mmol, 0.5 eq)を加え、反応混合物をさらに30分間撹拌した。混合物を蒸発させ、MeCN中に再溶解し、Celiteの上に置き、濃縮乾固した。シリカゲルクロマトグラフィー (0-15% MeOH/CH2Cl2, 直線勾配, 一定の1% v/v AcOH 添加物を用いて; Celiteで乾式積載)、続いて逆相HPLC (10-95% MeCN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて)により、藍色の固体として標記化合物、3,7-ジ(アゼチジン-1-イル)フェノキサジン-5-イウム トリフルオロアセテート（38 mg、50%）を得た。
【０３７８】
1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 7.72 (d, J = 9.3 Hz, 2H), 6.92 (dd, J = 9.3, 2.4 Hz, 2H), 6.50 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 4.43 (t, J = 7.7 Hz, 8H), 2.60 (p, J = 7.7 Hz, 4H); 19F NMR (MeOD, 376 MHz) δ -75.45 (s); 13C NMR (MeOD, 101 MHz) δ 158.0 (C), 150.3 (C), 135.4 (CH), 135.3 (C), 116.4 (CH), 95.1 (CH), 53.7 (CH2), 16.6 (CH2); 分析HPLC: >99% 純度 (4.6 mm×150 mm 5 μm C18 カラム; 5 μL 注入; 10-95% CH3CN/H2O, 直線勾配, 一定の0.1% v/v TFA 添加物を用いて; 20 分運転; 1 mL/分 流量; ESI; 陽イオンモード; 650で検出nm); HRMS (ESI) C18H18N3O [M]+ に対する計算値 292.1444, 実測値 292.1439.
【０３７９】
本明細書を通して、種々の参考文献が言及される。次のリストに記述されているものを含み、そのような参考文献は参照として本明細書に組み込まれる。
参考文献
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【０３９２】
参考文献による組込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許または特許出願が、参照として組み込まれるために具体的かつ個別に示されたのと同じ範囲で参照として本明細書に組み込まれる。
【０３９３】
ここに開示された主題の種々の細部は、本明細書に開示された主題の範囲から逸脱することなしに変えることができることを理解されるであろう。さらに、先行の記載は、説明目的のためだけであり、限定目的のためではない。
【図１】
0006606096.tif 000130
【図２】
0006606096.tif 000131
【図３】
0006606096.tif 000132
【図４】
0006606096.tif 000133
【図５】
0006606096.tif 000134
【図６】
0006606096.tif 000135
【図７】
0006606096.tif 000136
【図８】
0006606096.tif 000137
【図９】
0006606096.tif 000138
【図１０】
0006606096.tif 000139
【図１１】
0006606096.tif 000140
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
0006606096.tif 000143
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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