(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相デバイスにおける核酸分子の単離及び／又は分析のための方法であって、
（ｉ）核酸とＤＭＡとの複合体を形成させる条件で、アジプイミド酸ジメチル（ＤＭＡ）とともに核酸サンプルをインキュベートするステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記複合体を、前記固相デバイスのアミノ化された表面と接触させるステップと；
（ｉｉｉ）ｐＨ＞１０を有する溶出溶液を使用して前記表面から前記核酸と前記ＤＭＡとの前記複合体を単離し、及び／又は前記複合体の前記核酸を分析するステップと；
を含む、方法。
【請求項２】
前記核酸サンプルは、プロテアーゼで抽出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロテアーゼはプロテイナーゼＫである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸はメチル化ＤＮＡを含む、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記固相デバイスはマイクロ流体デバイスである、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記固相デバイスはリング共振器である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
（ｉ）光学検出システムの検出器により測定された出力光強度を決定するステップと；
（ｉｉ）インキュベーションの間、前記光学検出システムの共振器の有効屈折率における変化を決定するステップと；
をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記リング共振器は導波管構造を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記複合体は、非メチル化シトシン残基において変性される、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記複合体もしくは前記変性複合体は増幅される、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記複合体もしくは前記変性複合体は検出される、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
核酸サンプルにおける興味対象の核酸分子を単離するシステムであって、
（ｉ）前記核酸分子とＤＭＡ化合物との間に複合体を形成するため、前記核酸分子に直接結合するためのアジプイミド酸ジメチル（ＤＭＡ）化合物；
（ｉｉ）その上に前記複合体を形成するため、前記核酸分子と前記ＤＭＡ化合物との相互作用のためのアミノ化された固体表面；及び
（ｉｉｉ）ｐＨ＞１０を有する溶出溶液；
を含み、
（Ａ）前記固体表面は、光学検出センサであるリング共振器の上にあり、前記核酸分子が前記ＤＭＡに結合される場合、前記光学検出センサは改変読取を有し、それにより、前記光学検出センサは、前記核酸分子と前記ＤＭＡ化合物との間に形成された前記複合体を感知するように構成され、及び／又は
（Ｂ）当該システムは、前記核酸分子に結合するためのＤＭＡ架橋タンパク質仲介を含有しない、
システム。
【請求項１３】
当該システムはプロテアーゼをさらに含む、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記プロテアーゼはプロテイナーゼＫである、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記固体表面はマイクロ流体デバイスの上にある、請求項１２乃至１４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１６】
前記光学検出センサは、共振波長において共振するように構成される、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１７】
前記光学検出センサのための前記共振波長において光を提供可能な波長可変レーザをさらに含む、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
前記光学検出センサもしくはリング共振器は導波管構造を含む、請求項１２乃至１７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１９】
前記核酸分子が前記ＤＭＡに結合され、前記複合体を形成する場合、前記共振器はシフトする共振波長を有する、請求項１２乃至１８のいずれか一項に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
好ましくは固相デバイスにおける核酸を単離する方法。
【背景技術】
【０００２】
核酸は、疾病状態を同定する場合、重要な分析ツールである。ＤＮＡバイオマーカー（例えば、一塩基多型（ＳＮＰ），突然変異，及びＤＮＡメチル化）は、研究者たちががんの原因を探すのを助けるための重要な手がかりを提供し、且つ疾病の初期段階の際に、並びに予測と監視のため及び疾病状態を診断及びモニタする大きな機会を提供する。例えばタンパク質などの他の成分と比べて、ＤＮＡの生理的濃度が極めて低いので（即ち、１マイクロリットルの全血内において数１０ナノグラムのＤＮＡと、数１０マイクログラムのタンパク質との対比）、臨床サンプルからのＤＮＡの効率的な抽出及び予備濃縮は、引き続く下流プロセス（例えば増幅及び検出）のために重要である。メチル化ＤＮＡに関して言えば、この問題はさらに拡大される。
【０００３】
ＤＮＡメチル化は、遺伝子発現の制御及び正常真核細胞内のクロマチン構成において決定的な役割を果たす。ＤＮＡメチル化は、シトシン環の５位の炭素のメチル基の共有結合的付加により生じ、５−メチルシトシンをもたらす。これらのメチル基は、ＤＮＡの主溝内に向けられており、効果的に転写を阻害する。哺乳類ＤＮＡにおいて、約４％のゲノムＤＮＡにおいて、主としてシトシン−グアノシンジヌクレオチド（ＣｐＧｓ）において、５−メチルシトシンが見られる。このようなＣｐＧサイトは、ヒトゲノム全体で期待された頻度よりは低い頻度で生じるが、ＣｐＧアイランドと呼ばれるＤＮＡの小さな範囲において、より頻繁に見られる。これらのアイランドは、遺伝子のプロモータ領域内もしくは近くに典型的には存在する（転写が開始されるところ）。たいていのＣｐＧサイトは、かなりメチル化されているバルクのゲノムＤＮＡとは対照的に、生殖細胞系組織におけるＣｐＧアイランド及び正常体細胞のプロモータは、メチル化されないままであり、遺伝子発現を生じさせる。ＤＮＡメチル化は、高度に関連したＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素（ＤＮＭＴ）のファミリーにより媒介される。当該酵素は、Ｓ−アデノシルメチオニン由来のメチル基をＣｐＧジヌクレオチド内のシトシンへ転移する。ＤＮＭＴにより確立されたメチル−シトシンは、メチル−ＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）タンパク質ＭｅＣＰ２，ＭＢＤのための結合部位として役立つ（Ｓ．Ｂ．  Ｂａｙｌｉｎ，  ＤＮＡ  ｍｅｔｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｌｉｎ．  Ｐｒａｃ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２  （２００５）  ４−１  １．；  Ｍ．Ｔ．  ＭｃＣａｂｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  ＤＮＡ
ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １５  （２００９）  ３９２７−３９３７．；  Ｍ．  Ｗｉｅｌｓｃｈｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｔｈｙｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂａｓｅｄ  ＤＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｌｏｏｄ  ｓｅｒｕｍ  ｃｏｍｂｉｎｅｓ  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ−ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ．  ＢＭＣ  Ｃｌｉｎ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １１  （２０１１）  １１−２０．；  ａｎｄ  Ｂ．Ｒ．  Ｃｉｐｒｉａｎｙ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｃｈａｎｎｅｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  １０９  （２０１２）  ８４７７−８４８２．）。ヒストンアセチラーゼ，ヒストンメチルトランスフェラーゼ，及びＡＴＰ依存性クロマチンリモデリング酵素との相互作用を介して、ＭＢＤは、メチル化ＤＮＡを、転写に関して抑圧的なコンパクトなクロマチン環境へ変換する。特に、ＭＢＤは、ＭｅＣＰ２タンパク質のメチルＣｐＧ結合ドメインである。ＭｅＣＰ２タンパク質は、いずれのシーケンス前後関係においてもメチル化ＣｐＧを対称的に結合し、メチル化依存性転写抑制を媒介することに関わっている。ＭｅＣＰ２は、もっぱらｉｎ  ｖｉｖｏでメチル化ＤＮＡフラグメントを結合するという強力な証拠があるにも関わらず、in  vitroにおけるＭｅＣＰ２のＤＮＡメチル化依存性結合活性は、一般のin  vitroＤＮＡ分析に好適なものにする、一致した文献内にも記載された［Ｓ．Ｂ．  Ｂａｙｌｉｎ；  ＭｃＣａｂｅ，  ｅｔ  ａｌ．；  Ｍ．  Ｗｉｅｌｓｃｈｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．；及びＢ．Ｒ．  Ｃｉｐｒｉａｎｙ，  ｅｔ  ａｌ．］。
【０００４】
ＤＮＡメチル化は、ヒトがんにおける腫瘍抑制遺伝子の発現のサイレンシングを起こす。エピゲノミクス（ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ）のフィールド内で増え続ける一連の作品(ｂｏｄｙ  ｏｆ  ｗｏｒｋ)は、重要なヌクレオチドシーケンスの過剰メチル化と多くの異なるがんの出現との間のつながりを強化している。ヒトがん細胞におけるＤＮＡメチル化パターンは、著しく歪んでいる。典型的には、がん細胞は、通常は細胞のメチル−シトシン含有量の大部分を有する遺伝子間領域について低メチル化を示す。その結果、転移因子（transposable  elements）は活性化し、がん細胞で観察されたゲノム不安定性に貢献するかもしれない。同時に、がん細胞は、多くのＣｐＧアイランド関連腫瘍サプレッサ遺伝子のプロモータ領域内で過剰メチル化を示す。その結果、これらの調節遺伝子は、転写的に発現抑制され(サイレンス,ｓｉｌｅｎｃｅｄ)、機能の損失をもたらす。依って、低メチル化及び過剰メチル化両方の効果により、ＤＮＡメチル化は、潜在的には、比較的まれであるコード領域突然変異よりも大きく、がん細胞のゲノムの景色に顕著に作用する[Ｓ．Ｂ．  Ｂａｙｌｉｎ；  ＭｃＣａｂｅ，  ｅｔ  ａｌ．．；  Ｍ．  Ｗｉｅｌｓｃｈｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．．；及びＢ．Ｒ．  Ｃｉｐｒｉａｎｙ，  ｅｔ  ａｌ]。ＤＮＡメチル化は、がん研究及びクリニックにとって非常に重要である。なぜなら、ＤＮＡメチル化は、がん転移の時点より前に、より早期のがん診断を可能にするからだ。一例は、ＲＡＲβ（制御遺伝子発現により多くの細胞タイプの成長を制御する甲状腺ステロイドホルモン受容体）である。乳がん、肺がん及び膀胱がんにおいて、ＲＡＲβのメチル化が報告されてきた
【０００５】
複数のゲノムスケールメチル化スクリーニング技術の最近の発展は、正常な細胞及びがん細胞の双方において、ＤＮＡメチル化パターンについての我々の理解をかなり広げてきた。特に、ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）は、ＣｐＧアイランド内のＣｐＧサイトの実質的にいずれかのグループのメチル化ステータスを迅速に評価することができる。このアッセイは、全ての非メチル化（メチル化されていない）シトシンをウラシルに変換する亜硫酸ナトリウムによるＤＮＡの初期の変性、及びメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの対比に関して特異的なプライマーを用いた引き続く増幅を伴う。ＭＳＰは、少量のＤＮＡのみを必要とし、所与のＣｐＧアイランド座の０．１％メチル化対立遺伝子(alleles)に感受性である。亜硫酸塩処理によるシトシンからウラシルへの化学的変性は、制限酵素の使用を回避するＤＮＡメチル化の研究のための別方法を提供してきた。しかしながら、これらの方法は、技術的にかなり困難かつ労働集約的であり、且つ増幅産物のクローン化なしでは、テクニックは、サザン分析よりも感受性が劣る。検出のためにメチル化されるべき対立遺伝子の−２５％を必要とする。従って、ヒトゲノムＤＮＡからのメチル化ＤＮＡの単離は、がんにおけるＤＮＡメチル化分析の改善のために重要なステップであるが、まだ挑戦しているところである［Ｊ．Ｇ．  Ｈｅｒｍａｎ，  Ｊ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ９３  （１９９６）  ９８２１−９８２６．；  Ｓ．  Ｐａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｏｕｂｌｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ．  Ｂｉｏｓｅｎｓ．  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．  ２６  （２０１０）  ８５０−８５３．；  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．  Ｓｕｔｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｏｐｔｏ−ｆｌｕｉｄｉｃ  ｒｉｎｇ  ｒｅｓｏｎａｔｏｒｓ．  Ｂｉｏｓｅｎｓ．  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．  ２６  （２０１０）  １０１６−１０２］．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
今までのところ、ゲノムＤＮＡからメチル化ＤＮＡを単離するための溶液相方法において、Ｅ．ｃｏｌｉ内のクローン化Ｈｉｓタグ付きタンパク質の過剰発現の際に得られる組み換えＭＢＤタンパク質が、ＤＮＡメチル化分析のために主として使われてきた。溶液相におけるＰＣＲ及びゲル分析のためのメチル化ＤＮＡを単離するため、ＮａＣｌ勾配溶出ステップにより、アフィニティクロマトグラフィに似たやり方で固定化されながら、ＭＢＤタンパク質が好ましくは適用されてきた。企業からの商用プロトコルによれば、ＭＢＤタンパク質は、メチル化ＤＮＡの同時分析を可能にするアフィニティ系ＤＮＡ精製のためのＮｉ−セファロースもしくは磁気ビーズに付着した。ＭＢＤ単離ＤＮＡ(MBD  isolated  the  DNA)が、ＤＮＡメチル化分析に特に好適であることが分かった（図１、黒線）。
【０００７】
しかしながら、重亜硫酸塩変性なしのＤＮＡメチル化に基づくラベルフリーバイオセンサの検出のための以前の研究は、これまで合成オリゴヌクレオチドについてのみ実証してきた。体液(例えば血液，尿、もしくは唾液)内のゲノムＤＮＡにおけるネイティブ(native)メチル化ＤＮＡの直接検出は、それらの極めて低い濃度のため難しい。トータルＤＮＡにおける特異的遺伝子の数は、極めて低い。例えば、Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．は、約２コピーの突然変異腫瘍Ｋｒｉｓｔｉｎ−ｒａｓ  ＤＮＡが、がん患者の尿もしくは血液サンプル５０乃至２００μＬ中で見つかることを報告した[Ｙ．Ｈ．  Ｓｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｃｋ，  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｅｄ  Ｋ−ｒａｓ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｕｒｉｎｅ，  ｐｌａｓｍａ，  ｓｅｒｕｍ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｒ  ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｓ，  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １  １３７  （２００８）  １９７−２０６]。報告されたラベルフリーバイオセンサの感度は、このような低濃度のネイティブＤＮＡバイオマーカーを検出するには不十分である。従って、これらラベルフリーテクニックは、ターゲットＤＮＡの増幅なしにin  vitroでの診断（ＩＶＤ）として使用されるのは不適切である。
【０００８】
高感度なケイ素系マイクロリング共振器が、共振波長におけるシフトをモニタすることにより、生体分子（例えばタンパク質，メチル化ＤＮＡ，核酸）を検出するのに使用されたことが最近報告された。光学屈折率（Ｒｌ）センサは、多数の用途のために広範囲に調査されており、生化学分析において突出した役割を果たす。既存の生化学ＲＩセンサのうち、集積光導波管に基づく生化学ＲＩセンサは、それらの高感度、小さいサイズ、及び高スケール集積ゆえに、非常に興味深い。最近、スロット導波管に基づくＲＩセンサは、２つの高屈折率ストリップの間に挟まれたサブ波長サイズの低屈折率領域（スロット領域）において高光強度を提供するという、スロット導波管の顕著な特性ゆえに、かなりの関心を集めてきた。感知領域としてスロットを使用することにより、慣用の導波管と比較して、より大きな光分析物(light-analyte)相互作用、及び従ってより高い感度が得られる。感知光は、数百ナノメートルまでの特徴的な崩壊長さ(decay  length)と共に指数関数型崩壊を受けるエバネッセント場により、表面近くに集中される。依って、屈折率は、崩壊長さ以内で固定化された捕捉リガンドとの分析物の結合により影響を受ける。ケイ素マイクロリング共振器は、センサ表面近くの生体分子について高感度、ラベルフリー、リアルタイム多重化検出を提供する屈折率に基づく光学センサである。そのうえさらに、低コストとスケールアップ能力を確実にする標準ＣＭＯＳ技術を使用して、デバイスは製造される。当該方法は、高度の熟練者によってデバイスの表面上にプローブを固定化するという時間のかかるステップを必要とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、上述の困難の少なくともいくつかを改善することである。
【００１０】
要約
【００１１】
従って、本発明の第１の態様は、
（ｉ）核酸とＤＭＡとの複合体(complex)を形成させる条件で、アジプイミド酸ジメチル（ＤＭＡ）とともに核酸サンプルをインキュベートするステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の複合体を、固相デバイスの表面と接触させるステップと；
（ｉｉｉ）前記複合体の核酸を単離及び／又は分析するステップと
を有する、固相デバイスにおける核酸分子の単離及び／又は分析のための方法を包含する。
【００１２】
本発明の別の態様は、
（ｉ）核酸分子に直接結合可能なアジプイミド酸ジメチル（ＤＭＡ）化合物；及び
（ｉｉ）核酸とＤＭＡとの相互作用のための固体(solid)表面
を有する核酸サンプルにおける興味対象の核酸分子を単離するシステムを包含する。
【００１３】
以下の図面及び様々な非限定的実施形態の記載を参照するならば、本発明のその他の態様は、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
図面は、必ずしも正確な縮尺で描かれておらず、その代わり、様々な実施形態の原則を説明する際、一般的に配置されるよりも強調されている。
【図１】溶液相体固相法を使用するＤＮＡの単離及び分析のためのワークフロー。
【図２】固相デバイス上のＤＭＡとの複合体及びメチル化ＤＮＡ（＃１）。固相デバイス上のＭＢＤタンパク質との複合体及びメチル化ＤＮＡ（＃２）。
【図３】固相デバイス上のメチル化ＤＮＡの単離（Ａ）及び分析（Ｂ）の実験結果。
【図４】ＤＮＡのみもしくはＤＭＡのみを添加する場合と比較した、ＤＭＡとの分離の実験結果（Ａ）。２つのがん細胞株におけるメチル化ＤＮＡ−ＤＭＡ複合体の波長シフト（Ｂ）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明
【００１６】
驚くべきことに、いずれの架橋タンパク質仲介なしに、ＤＭＡ（アジプイミド酸ジメチル）は核酸に直接結合できる。ＤＭＡと核酸とのこの直接相互作用は、好ましくはケイ素，ガラス，ポリマーフィルム，プラスチックを包含する固相デバイス、又はいずれの好適な固相デバイス上、核酸もしくはメチル化ＤＮＡの単離及び分析のためのラベルフリー方法において使用できる。当該方法は、臨床応用（例えばヒトがん）におけるＤＮＡ検出のために非常に有用である。核酸とＤＭＡとの直接結合は、メチル化ＤＮＡを包含する核酸を捕捉し且つ測定する、単純で費用対効果の高い化学的手段を提供する。
【００１７】
従って、本発明の第１の態様は、
（ｉ）核酸とＤＭＡとの複合体を形成させる条件で、アジプイミド酸ジメチル（ＤＭＡ）とともに核酸サンプルをインキュベートするステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の複合体を、固相デバイスの表面と接触させるステップと；
（ｉｉｉ）前記複合体の核酸を単離及び／又は分析するステップと
を有する、固相デバイスにおける核酸分子の単離及び／又は分析のための方法を包含する。
【００１８】
当該方法は、リアルタイムのやり方で実施されるべき核酸の単離及び分析を可能にする。
【００１９】
本書で使用される用語「核酸」は、単離された核酸を意味する。核酸は、ＤＮＡ，ＲＮＡ，ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド，ＰＮＡその他であり得るが、好ましくはＤＮＡである。
【００２０】
用語「固相デバイス」は、好ましくは液相内で核酸サンプルとＤＭＡとの混合を可能にする固体表面を意味する。ケイ素，ガラス，ポリマーフィルム，プラスチック、又はいずれの好適な表面を包含する、核酸サンプルとＤＭＡとの間の相互作用のため好適な空間を提供するいずれの容器が好適である。様々な実施形態において、固相デバイスはマイクロ流体デバイスを包含する。様々な他の実施形態において、固相デバイスはリング共振器を包含し、最も好ましくはそのリング共振器はケイ素系である。様々な実施形態において、リング共振器は導波管構造を有する。様々な他の実施形態において、当業者に知られた他の好適な固相デバイスは、例えば磁気ビーズなどであり得る。
【００２１】
「核酸サンプル」は、いずれの生物学的サンプル、例えば液体血液，もしくは液体唾液，尿もしくは血液，頬のスワブ，毛髪，骨，歯，爪，いずれかの器官（脳を包含する）からの組織，筋肉，皮膚，腫瘍，未知の塊(lumps),針生検を包含する生検，細胞もしくは細胞株を包含し得る。サンプルは、植物，菌類及び動物を包含するいずれの生物(biological  organism)から採取してよい。サンプルは、好ましくは哺乳類を包含する脊椎動物由来であり、及び最も好ましくはヒト由来である。サンプルは、好ましくはがん組織もしくはがんであること新生物（乳がん、肺がん及びすい臓がん、前立腺がん、膀胱がん、子宮頸がん、鼻咽頭がん、肝細胞がん、胃(gastric)がん、結腸がん、胃(stomach)がん、骨がん、精巣がん、甲状腺がん、リンパ腫、白血病、又はいずれの他の既知の新生物を包含する）を形成することが疑われる組織由来である。様々な実施形態において、サンプルは、がん性組織もしくは体液サンプルと比較するため、健康な非がん性組織もしくは体液から採取されてよい。様々な実施形態において、核酸は、当該技術において知られた方法を使用してサンプルから抽出されてきた。
【００２２】
アジプイミド酸ジメチル（ＤＭＡ）は、６原子スペーサアームの各末端にアミン反応性イミドエステルを含有する膜透過性架橋剤を構成する。ＤＭＡは、メチル化ＤＮＡを包含する核酸を直接結合するための非カオトロピック剤である。ＤＭＡは、式Ｉの構造を有する。
【化１】
0006455438.tif 000002
【００２３】
様々な実施形態において、ＤＭＡのＮＨ基は、酸と共に。いずれの好適な対イオンと共に、例えば塩酸塩も共に、ＮＨ２＋基に変換可能であり、又は遊離の水素基を有するいずれの他の酸が好適である。
【００２４】
いずれの理論に限定されないが、ＤＭＡにおける二官能性のイミドエステル（アミン反応性基）は、ＤＮＡ分子内の遊離アミノ基と反応し、その結果ＤＭＡとＤＮＡとの間に架橋をもたらすと仮定される。タンパク質のそれの上のＤＭＡと核酸のアミン基との間の選択的反応は、ＤＭＡがプラスに荷電しており、従って消化されマイナスに荷電したタンパク質断片と比較して、マイナスに荷電したＤＮＡに引き寄せられることに関係しているかもしれない。加えて、溶解(lysis)ステップの際の断片化ＤＮＡは、典型的には断片の各末端において一本鎖ＤＮＡのわずかな塩基対（「付着(sticky)」末端として知られる）を含有する。そしてＤＭＡは、「付着」末端のアミン基と反応する。二官能性イミドエステルはさらに、捕捉ＤＮＡについて高い表面積と体積との比率を提供する。
【００２５】
様々な実施形態において、当該方法は、当該技術で知られた表面処理を使用して、アミノ化されるべき固相デバイスの表面を官能化するステップをさらに有してよい。ＤＭＡと共に核酸サンプルをインキュベートするステップの前に、表面は官能化される。様々な実施形態において、表面は、アミノシラン、好ましくは３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）で官能化される。ＤＭＡは、共有結合を介してアミノ化された表面と相互作用する。ＤＭＡが核酸と共に複合体を形成する場合、結合が存続するか、強くなることが観察される。ＤＭＡとＤＮＡとの複合体はまた、アミン変性表面と反応し、安定した共有結合を形成する。結合は、高ｐＨ（＞ｐＨ１０）において可逆性のアミジン結合であり、ｐＨを変更することにより複合体を捕捉及び放出するための手段として使用可能である。
【００２６】
様々な実施形態において、ＤＭＡとのインキュベーションの前に、核酸サンプルは、プロテアーゼ、好ましくはプロテイナーゼＫで抽出される。タンパク質のそれの上のＤＭＡと核酸のアミン基との間の選択的反応は、プロテイナーゼＫのプロテアーゼ活性と関連するかもしれない。プロテイナーゼＫは、いずれも細胞を溶解し、且つタンパク質の殆どを消化し、サンプルからタンパク質を除去する。
【００２７】
様々な実施形態において、核酸はメチル化ＤＮＡを構成する。用語「メチル化ＤＮＡ」は、当該技術で知られた通常の意味を有する。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、ヌクレオチドに沿った場所で１以上のシトシンもしくはアデニン上のメチル基の付加を包含する。
【００２８】
様々な実施形態において、固相デバイスはマイクロ流体デバイスである。
【００２９】
用語「マイクロ流体デバイス」は、マイクロチップ、マイクロチャネル構造、もしくは当該技術において知られたいずれの好適なラボオンチッププラットフォームを包含する。核酸を単離及び精製するため、並びにＤＮＡ増幅を改善するため、ＤＭＡテクニックを、固相系マイクロ流体デバイスに適用可能である。
【００３０】
様々な他の実施形態において、固相デバイスはリング共振器である。
【００３１】
様々な実施形態において、核酸の単離及び分析のための全ステップは、固相デバイス上で行われる。小さい寸法のため、低コスト製造、高感度及び高多重化能力は、マイクロリング共振器を、ポイントオブケア診断テスト（ＰＯＣＴ）用使い捨てバイオセンサチップのための良い候補にする。
【００３２】
様々な実施形態において、固相デバイスはリング共振器である場合、当該方法は、
（ｉ）光学検出システムの検出器により測定された出力光強度を決定するステップと；
（ｉｉ）インキュベーションの間、前記光学検出システムの共振器の有効屈折率における変化を決定するステップと；
をさらに有してよい。
【００３３】
様々な実施形態において、当該方法は、複合体を溶出するステップをさらに有してよい。溶出ステップは、好ましくは、複合体と固相デバイスの表面との間に形成されたいずれかの共有結合を崩壊させることにより、メチル化ＤＮＡとＤＭＡとの複合体を除去することを意味する。表面から核酸とＤＭＡとの複合体を除去する手段は、高ｐＨ溶液（＞ｐＨ１０）の使用を包含する。表面から核酸とＤＭＡとの複合体を除去するための高ｐＨ溶液の一例は、副題と官能化表面との間に形成されたいずれかの共有結合を崩壊させることを包含し、重炭酸ナトリウムである。
【００３４】
様々な好ましい実施形態において、当該方法は、非メチル化シトシン残基において複合体を変性するステップをさらに有してよい。重亜硫酸塩変換を使用するＤＮＡメチル化分析は、非メチル化シトシン残基において複合体を変性することが可能であり、入力ＤＮＡのピクトグラム量上で作用し、変換は、入力ＤＮＡの少なくとも５０％、より好ましくは入力ＤＮＡの少なくとも６０％，７０％もしくは８０％、最も好ましくは入力ＤＮＡの９０％の変性をもたらす。
【００３５】
様々な実施形態において、複合体もしくは変性複合体は、当該技術において知られたいずれかの方法により増幅される。ＤＮＡ増幅は、好ましくはメチル化及び／又は非メチル化ＤＮＡに特異的なプライマーとともに、ＰＣＲを包含する様々な異なる方法により実施され得る。実施例は、メチル化特異的ＰＣＲ及びゲノムＰＣＲ増幅の効率は、当該方法を使用することにより増強されることを表す。
【００３６】
様々な実施形態において、当該方法は、複合体もしくは変性複合体を検出するステップをさらに有してよい。検出は、シーケンス化方法、サザンブロッティング分析（ただしこれらに限定されない）を包含する当該技術において知られたいずれかの方法、又は当該技術において知られたいずれか他の分析テクニックよりなされる。
【００３７】
本発明の別の態様は、
（ｉ）核酸分子に直接結合可能なアジプイミド酸ジメチル（ＤＭＡ）化合物；及び
（ｉｉ）核酸とＤＭＡとの相互作用のための固体表面
を有する核酸サンプルにおける興味対象の核酸分子を単離するためのシステムを包含する。
【００３８】
核酸サンプル，ＤＭＡ及び固体表面は、前述したのと同じ意味を有する。
【００３９】
様々な実施形態において、固体表面は官能化される。官能化表面とは、当該技術において知られた表面処理を使用してアミノ化された表面である。様々な実施形態において、表面は、アミノシラン、好ましくは３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）で官能化される。
【００４０】
様々な実施形態において、固体表面はマイクロ流体デバイスの上である。様々な他の実施形態において、固体表面は、リング共振器の上である。
【００４１】
様々な実施形態において、リング共振器は光学検出センサである。ここで前記核酸分子が前記ＤＭＡに結合している場合、前記検出センサは、改変読取(altered  reading)を有する、それにより核酸分子とＤＭＡとの間に形成された複合体を感知するように、前記センサは構成される。
【００４２】
様々な実施形態において、光学検出センサは、共振波長において共振するように、構成される。
【００４３】
様々な実施形態において、システムは、光学センサのための前記共振波長において光を提供可能な波長可変(tunable)レーザをさらに有する。
【００４４】
様々な実施形態において、光学センサ又はリング共振器は、導波管構造を構成する。
【００４５】
様々な実施形態において、前記共振器は、前記核酸分子が前記ＤＭＡに結合し、前記複合体を形成する場合、シフトする共振波長を有する。
【００４６】
以下において、「光学感知」が説明される。
【００４７】
ＤＮＡメチル化の検出は、光学系システム、例えば当該技術において知られたものをしようして達成され得る。当該システムは、光源，光学センサ，及び光学検出器を包含してよい。様々な実施形態において、光源はある範囲の波長を出力する。例えば、光源は、狭帯域を有する光を出力する比較的狭帯域幅光源であってよく、光源の波長は、光源の帯域の何倍も領域の上を掃引される。様々な実施形態において、波長の範囲は、（４００−７００ｎｍ（可視），７００−４００（ＩＲ−Ａ），１２６０−１３６０ｎｍ（Ｏバンド），１３６０−１４６０ｎｍ（Ｅバンド），１６０−１５３０ｎｍ（Ｓバンド），１５３０−１５６５ｎｍ（Ｃバンド），及び１５６５−１６２５ｎｍ（Ｌバンド）であってよい。この光源は、例えばレーザであり得る。このレーザは、出力されたレーザの波長を変化させる波長可変レーザであり得る。いくつかの実施形態において、レーザは、外部キャビティを有するダイオードレーザである。このレーザは、いずれの特定の種類に限定される必要はなく、例えばファイバレーザ，固体レーザ，半導体レーザ又は他のタイプのレーザもしくはレーザシステムであり得る。レーザそれ自体は、調節可能であり、且つスキャンもしくは掃引され得る波長を有し得る。あるいは、異なる波長を提供するため、追加の光学部品を使用し得る。いくつかの実施形態において、ある波長を有する光源出力光のために、導波管構造は十分に光学的透過性である。いくつかの実施形態において、導波管構造は、サンプル媒体（例えば水性媒体）内にあり、ある波長を有する光源出力光のために、媒体は実質的に光学的に透過性であり、それにより共振は光学共振器内で到達され得る。加えて、いくつかの実施形態において、光源出力は、複合体が非線形屈折率を有しない範囲内の波長を有する。同様に様々な実施形態において、光源は、コヒーレント光源であってよく、比較的長いコヒーレンス長さを有する光を出良くする。しかしながら様々な実施形態において、光源は、短いコヒーレンス長さを有する光を出力するコヒーレント光源であってよい。例えば特定の実施形態において、広帯域光源（例えばスーパー発光ダイオード（ＳＬＥＤ））を使用してよい。このような場合、波長は掃引される必要がない。
【００４８】
光源は、光学センサに対する光を提供する。光源を、制御装置により制御してよい。これら装置（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）は、例えば光源の波長を制御し、かつ特に光源にその光学出力の波長を掃引させてよい。
いくつかの実施形態において光源から出力された光の一部は、例えば光源の発光波長を決定するため、サンプルされる。
【００４９】
いくつかの実施形態において、光学センサは、検出されるべき複合体の存在及び／又は濃度に基づき光学出力を変更するトランスデューサを有する光学センサは、導波管構造であり得る。光学センサは、集積光学デバイスで得あり得、チップ上に包含されてよい。光学センサは、干渉計構造（例えば、干渉計）であってよく、光学干渉の結果、出力信号を生成する。光学センサは、光学センサのアレイ内に包含され得る。
【００５０】
光学検出器は、センサの光学出力を検出する。様々な実施形態において、光学検出器は、光学入力を電気出力に変換するトランスデューサを有する。この電気出力は、センサの出力を分析するための処理装置により処理されてよい。光学検出器は、フォトダイオード検出器を構成してよい。他のタイプの検出器を使用してよい。センサと検出器との間の光路内の集光光学系は、センサの光学出力の集光を容易にし、かつこの出力を検出器に対して向ける。追加の光学系（例えばミラー、ビームスプリッタ、もしくは他の部品）を、センサから検出器に至る光路内に含めてもよい。
【００５１】
様々な実施形態において、光学センサは、チップ上に配置される一方、光源及び／又は光学検出器は、チップとは別になっている。光源及び光学検出器は、例えば、チップ上の光学センサを調べる(interrogates)、自由空間光通信を有する装置の一部であってよく、且つ以下により詳細に考察される。
【００５２】
様々な実施形態において、溶液（例えばＤＮＡサンプル溶液）は、光学センサを通過させて流す。検出器は、核酸とＤＭＡとの間に形成された複合体が検出される場合、光学センサからの光学信号における変調を検出する。
【００５３】
リング共振器は、核酸とＤＭＡとの間に形成された複合体を検出するように製造され得る高感度光学センサを提供する。リング共振器の走査は、いずれの好適な構成を有してよい。様々な実施形態において、光学センサは、入力及び出力を有する入力／出力導波管と、及び入力及び出力との間に配置された入力／出力導波管の一部の近くに配置されたリング共振器とを有する。その近接は、入力／出力導波管とリング共振器（リング共振器は導波管でもある）との間の光学的結合を容易にする。この例において、入力／出力導波管は線状であり、リング共振器は円形であり、その結果入力から出力に至る入力／出力導波管における光電波は、リング共振器内へ結合され、その中で循環する。入力／出力導波管及びリング共振器のためのその他の形状もまた可能である。
【００５４】
様々な実施形態において、導波管入力内へ注入された光は、例えば、時間にわたり掃引される狭帯域ピークを有する狭帯域由来の（又は広帯域光源、例えばスーパー発光ダイオード由来の）、ある範囲の波長を包含する。同様に、出力スペクトルは、導波管出力の形態を取る。この出力スペクトルの一部は、リング共振器の共振波長におけるスペクトル分布内の強度と波長との対比のプロットに拡張されてよい。
【００５５】
その他の構成が可能であり、例えば、その他の層を加えても（取り除いても）よく、異なるようにパターン化してもよい。基板の一部は、線形導波管を有してよく、その上に形成されたリング共振器は、より大きな集積光学チップの一部であってよい。
【００５６】
周知のように、光は導波管内において全内部反射を介して伝播する。導波管は、その導波管全体にわたり空間的に異なる強度パターンをもたらすモードをサポートする。電界の一部及びエバネッセントテイル(tail)と呼ばれる光学エネルギーは、導波管の境界の外側に存在する。導波管の近くに位置する対象物は、例えばこのエバネッセント場長さ以内で波長に影響する。特に、導波管のすぐそばの対象物は、導波管の屈折率に影響する。従って、このような対象物が導波管に密着しているか、いないかで、屈折率ｎは異なっていてよい。様々な実施形態において、例えば対象物の存在は、導波管の屈折率を増大させる。このやり方で、光学センサは、導波管構造の近くの対象物の存在により乱されてよく、それにより検出を可能に知る。様々な実施形態において、粒子のサイズは、その間の相互作用を増強するためのエバネッセント場の長さ位である。
【００５７】
リング共振器の場合、屈折率ｎの増加は、リング周辺を循環する光が進む光学路長を増大させる。長い波長は、共振器内で共振可能であり、従って共振周波数は、低い周波数へシフトされる。共振器の共振波長におけるシフトは、従って対象物が光学センサの近くに位置するかどうかを決定するため（例えば、リング共振器及び／又はリング共振器に最も近い線形導波管の領域）、モニタされる。核酸とＤＭＡとの間に複合体が形成される結合イベントは、従って、導波管出力からスペクトル出力を得ること、及びその中の強度（もしくは減衰のピーク）の低下および強度におけるこれらの低下のシフトを同定することにより、検出され得る。
【００５８】
様々な実施形態において、導波管及び／又はリング共振器はケイ素を有する。いくつかの実施形態において、導波管の表面は、二酸化ケイ素で自然に(natively)不動態化される。その結果、標準シロキサン化学が、導波管へ様々な反応性部分を導入するのに有効な方法であり得る。反応性部分は、次いで引き続き、ある範囲の標準バイオ接合(bioconjugate)反応により複合体を共有結合により固定するのに使用される。
【００５９】
その上さらに、線形導波管，リング共振器，及び／又は追加のオンチップ光学系は、十分に確立した半導体製造方法を使用する（当該方法は、非常にスケーラブル、費用対効果の高い、且つ再現性が高い。）、比較的安価なシリコンオンインシュレータ（ＳＯＩ）ウエハ上に容易に製造され得る。加えて、これらのデバイスは、容易に製造され得、バイブレーショによる複雑化は、「フリースタンディング(freestanding)」キャビティと比較して減らされる。一例において、８”ＳＯＩウエハは、それぞれ約４０，０００個の個別にアドレス可能であるリング共振器を含有してよい。シリコンベースの技術を使用する１つの利点は、様々な実施形態が、約１．５５μｍのＳｉ透明ウィンドウ（普通の光学テレコミュニケーション波長）内で作用し得ることであり、レーザ及び検出器が、固相デバイス上のがんサンプル由来プラグアンドプレイゲノムＤＮＡとして、容易に商業市場で入手可能であることを意味する。
【００６０】
様々な実施形態において、システムは、固相デバイス上のがんサンプル由来のゲノムＤＮＡから核酸（例えばメチル化ＤＮＡ）のラベルフリー分析及び単離のためのケイ素マイクロリング共振器を有する。ＤＮＡメチル化分析は、転移のポイントの前に初期のがん診断を可能にするので、がん研究及び臨床にとって非常に重要である。ＤＮＡメチル化を分析するため、高感度及び特異性方法を使用することによるゲノムＤＮＡ全体からのメチル化ＤＮＡの単離及び分析は、ＤＮＡメチル化の検出のための最重要ファクタである。最近のレポートは、共振波長におけるシフトをモニタすることにより、高感度ケイ素系マイクロリング共振器を、生体分子（例えばタンパク質，メチル化ＤＮＡ，核酸）を検出するのに使用できることを示唆する。
【００６１】
様々な実施形態において、光は、第１の入力／出力導波管の入力へ向けられてよく、及び、第１のリング共振器の状態及び光の波長に依存して、第１の導波管の出力又は第２の導波管のいずれかに向けられてよい。例えば、第１のリング胸式の共振波長のため、光を、出力における第１の導波管からの出力ではなく、第２の導波管内に結合してよい。第１のリング共振器から第２の導波管内に結合された光は、第３のリング共振器の状態に依存して、第２の導波管の出力もしくは第３の導波管内のいずれかに向けられてよい。例えば、第３のリング共振器の共振波長のため、光は、第３の導波管内に結合されてよく、次いで出力一において出力される。光を第１の入力／出力導波管内に向ける光源が、広帯域スペクトルを出力する広帯域光源（例えばスーパー発光ダイオード）を有する場合において、前記の光は、より広いスペクトルの波長成分であり得る。
【００６２】
その他の構成を使用できる。波長可変レーザもしくは他の波長可変光源を、入力現として使用してよく、波長可変レーザの出力の波長を掃引できる。あるいは、広帯域光源（例えばスーパー発光ダイオード）を使用してよい。
【００６３】
より多くのリング共振器を追加してよい。加えて、リング共振器を互いに対して、並びに入力／出力導波管に対して、異なるように配置してよい。
【００６４】
リング共振器の様々な実施形態及びおそらく他のジオメトリは、繰り返し例えばこれらの周辺で、光を循環させ、光学路長を劇的に増大させる。その上さらに、構造内を循環する光子と、隣接する導波管を横切るものとの間の干渉は、高Ｑデバイスをもたらす非常に狭いスペクトル線の共振キャビティを生成する。得られる共振波長は、局所屈折率における変化に対して非常に感受性である。本書で考察したように、この感受性は、センサに小さな質量を検出させる。
【００６５】
従って、提案された概念は、がん研究及び臨床応用におけるＤＮＡメチル化分析のために非常に有用である。
【実施例】
【００６６】
２２０ｎｍの厚さの最上部ケイ素層及び２４８ｎｍ深さＵＶリソグラフィにより埋め込めこまれた２μｍの厚さの酸化物層を有するケイ素マイクロリング共振器チップ２００ｍｍＳＯＩウエハを購入し、次いで導波管及びグレーティングをその上でパターン化し、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）プロセスにより埋め込まれた酸化物層までエッチングされ、次いで、１．５μｍＰＥＣＶＤ  ＳｉＯ２を最上部クラッド層として堆積させた。４個のリングからなるマイクロリングのアレイは、１つの共通の入力導波管に（貫通して）接続され、各リングは、専用出力導波管(ドロップ(drop))を有していた。リング４個の内３個を、センサリングとして使用し、選択された個々のセンサリングの上に、ドライエッチングとウェットエッチングとの組み合わせにより窓が開けられていた。リングのうち１個は、温度によって誘発されたドリフトをモニタするため、参照センサとして使用された。リングは、半径５μｍを有するレーストラックスタイルのリングであり、結合長さは、共振のスペクトル重複を回避するため、２乃至２．０４２μｍであった。３個のリングの出力信号は、シングルモード光ファイバプローブに対して垂直グレーティングカプラーにより収集された。挿入損失（ＩＬ）スペクトルを、ＥＸＦＯ  ＩＱＳ−１２００４Ｂ  ＤＷＤＭパッシブ部品テストシステムで測定した。
【００６７】
まず、ＤＭＡ（アジプイミド酸ジメチル）を、ケイ素マイクロリング共振器上でメチル化ＤＮＡを捕捉するための化学剤として使用し、モニタされ、リアルタイムなやり方で、メチル化ＤＮＡ結合を分析した。ＤＭＡは、二官能性架橋試薬の使用により（ポリペプチド中の遊離アミノ基を共有結合することが知られている）、新規の抗鎌状化薬(antisickling)として記載されてきた。ＤＭＡでメチル化ＤＮＡを捕捉した後、メチル化ＤＮＡを重炭酸ナトリウムで溶出する（ｐＨ  １０．６）。次いで、メチル化ＤＮＡの単離に関する効率を検証するため、重亜硫酸塩変性後、メチル化特異的ＰＣＲを実施する（図１、黒丸ドット）。以前に記載したものからプロトコルを変更した。手短かに言えば（図２、＃１）、デバイスをまず、酸素プラズマで処理した。次いで、エタノール／Ｈ２Ｏ（９５％／５％，ｖ／ｖ）混合物中２％３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）の溶液内に、２時間浸漬し、次いでエタノールと脱イオン水で完全にすすいだ。次いで、窒素流下で乾燥し、チップを硬化するため、１２０℃で１５分間加熱した。
【００６８】
プロテイナーゼＫ及びＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）を使用してがん細胞株（Ｔ２４及びＭＣＦ７）からゲノムＤＮＡを抽出した。Ｔ２４細胞株（ヒト膀胱移行細胞から誘導された上皮細胞株）、及びＭＣＦ７細胞株（ヒト乳腺細胞から誘導された上皮細胞株）を、ゲノムＤＮＡの抽出のために使用した。がん細胞株ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）から購入した。
【００６９】
次いで、センサチップをＰＢＳ中１ｕｇのゲノムＤＮＡ及びＤＭＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）の混合物と共に３０分間インキュベートした。ハイブリダイゼーション後５分ごとに、３０分まで、波長シフトを収集した。結合後、表面なしに(free  from  the  surface)、チップを１０分間２回、それぞれＰＢＳ緩衝液で洗浄することにより、過剰なＤＮＡターゲットをすすぎ、測定した。最後に、メチル化ＤＮＡが表面上に維持され、次いで、メチル化ＤＮＡを、重炭酸ナトリウムで溶出した（ｐＨ１０．６）
【００７０】
あるいは、比較のため、溶液相内ではなく、固相上のメチル化ＤＮＡを捕捉するため、ＭＢＤタンパク質を使用した（図２、＃２）。手短かに言えば、センサをまず上述のようにＡＰＴＥＳで官能化した。次いでセンサチップを、脱イオン水中１ｍｇ／ｍＬ  ＮＨＳ−ビオチンと共に１時間インキュベートし、脱イオン水ですすいだ。ビオチンとストレプトアビジンとの間の結合アッセイを、ＰＢＳ中のストレプトアビジン溶液（１９０ｐＭ乃至９５０ｎＭ）を適用することにより行った。センサチップを、ＰＢＳ中１μｇのゲノムＤＮＡ及びビオチン−ＭＢＤタンパク質混合物の混合物と共に３０分間インキュベートした。ハイブリダイゼーション後、５分ごとに３０分まで波長シフトを収集した。結合後、表面なしに(free  from  the  surface)、チップを１０分間２回、それぞれＰＢＳ緩衝液で洗浄することにより、過剰なＤＮＡターゲットをすすぎ、測定した。最後に、メチル化ＤＮＡが表面上に維持され、次いで、メチル化ＤＮＡを、重炭酸ナトリウムで溶出した（ｐＨ１０．６）。全実験を室温で実施した。
【００７１】
図３は、当該方法に関する実験結果を表す。がん細胞株、例えばＴ２４（膀胱）及びＭＣＦ７（胸部）から抽出されたゲノムＤＮＡを、固相デバイスを使用することにより、メチル化ＤＮＡの単離のために使用した（図４Ｂ）。サンプルが添加され、官能化された固相表面上にメチル化ＤＮＡとＤＭＡとの混合物が複合体を形成した場合、波長シフトは、高く観察された（図３Ａ）。次いで、過剰なＤＮＡを取り除くためＰＢＳで洗浄することにより、シフトは部分的に減らされた。
【００７２】
洗浄後、単離されたＤＮＡは表面に対して共有結合した。最後に、ＤＮＡを、ＤＮＡ分析のために重炭酸ナトリウムにより収集した。Ｔ２４から抽出されたゲノムＤＮＡからの溶出ＤＮＡを、従来ＰＣＲ及びメチル化特異的（ＭＳ）−ＰＣＲにより遺伝子分析及びエピジェネティック分析のために使用した。当該方法の効率を検証するため、単離メチル化ＤＮＡを使用することにより、ＲＡＲβ遺伝子のＤＮＡメチル化の検出のために、メチル化特異的ＰＣＲを実施した。結果は、ＰＣＲバンドは、慣用方法よりも方法（＃１）において強いことを表した（図３Ｂ）。
【００７３】
要約すると、ケイ素マイクロリング共振器を包含する固相デバイス上のメチル化ＤＮＡの単離及び分析のための新規方法が記載される。ＤＭＡは、固相デバイス上、高特異性でメチル化ＤＮＡを捕捉するための化学剤である。当該方法は、高効率のメチル化ＤＮＡ単離を提供できるだけでなく、ラベルフリー及びリアルタイム方式でメチル化ＤＮＡの分析のモニタリングを提供できる。当該方法は、がん研究及び臨床応用におけるＤＮＡメチル化分析のために非常に有用でありえた。
【００７４】
固相ベースの抽出試薬としてのＤＭＡの効果を明らかにするため、ＤＭＡ方法をにより精製されたもしくは抽出されたＤＮＡを使用することにより、ＰＣＲベースのＤＮＡ増幅を実施した。遺伝子（ＲＡＲβ，ＨＲＡＳ，及びＡアクチン）について慣用のＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲのため使用された全プライマーは、当該技術において知られている。遺伝子分析及びエピジェネティック分析のため提案されたテクニックの効率を検証するため、慣用のＰＣＲ及びＭＳ−ＰＣＲを実施した。ＭＳ−ＰＣＲ走査前のＤＮＡの重亜硫酸塩変換のため、我々は、提案されたテクニックにより生成されたＤＮＡ５０μＬもしくはＴ２４細胞株（ＡＴＣＣ）（ヒト膀胱移行細胞から誘導された上皮細胞株）から抽出されたゲノムＤＮＡ１μｇのいずれか、及びＣｐＧｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ変性キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用した。Ｔ２４ヒト膀胱がん細胞株をプラスチック培養皿内に、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で補充された高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に、５％周囲ＣＯ２を有する３７℃湿潤インキュベータ内で維持した。がん細胞株を培養し、次いでＱＩＡｍｐＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）由来プロテイナーゼＫと共にＡＬ緩衝液を使用することにより、ゲノムＤＮＡを抽出した。手短かに言えば、ＨＲＡＳ遺伝子の遺伝子分析のため、各サンプルから溶出されたＤＮＡ２μＬ（例えば複合体、ＤＭＡ単独、及びＤＮＡ単独）を、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ），２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．２５ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸，２５ｐｍｏｌの各プライマー（ＨＲＡＳ遺伝子のため），及び１ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）を含有する合計体積２５μＬ中、９５℃で１５分間；９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、及び７２℃で３０秒の３５サイクル；及び７２℃で７分間の最終伸長ステップで増幅した。ＲＡＲβ遺伝子のエピジェネティック分析のため、慣用方法（精製ステップなし）又は提案されたＤＭＡ方法いずれか由来の重亜硫酸塩変性ＤＮＡ２μＬを、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ），２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．２５ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸，２５ｐｍｏｌの各プライマー（ＲＡＲβ遺伝子のため），及び１ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）を含有する合計体積２５μＬ中、９５℃で１５分間；９５℃で３０秒、５９℃で３０秒、及び７２℃で３０秒の４５サイクル；及び７２℃で７分間の最終伸長ステップで増幅した。ＰＣＲアンプリコンを、臭化イチジウム（ＥｔＢｒ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する２％アガロースゲル上にＰＣＲ生成物を分離するため使われてきたゲル電気泳動により視覚化した。ＧｅｌＤｏｃＳｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、ゲルを視覚化した。ＩｍａｇｅＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳＡ）により、バンド強度を算出した。ＤＮＡ濃度及び純度の決定は、ＵＶ分光光度計により行った。３種の異なる抽出方法の効率を検証するため、��アルタイムＰＣＲを実施した。
【００７５】
ＲＴ−ＰＣＲのためのターゲットテンプレートを、全血又は尿サンプルから抽出されたヒトゲノムＤＮＡから得た。リアルタイムＰＣＲのため、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ２．０（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で提供されるプロトコルから、以下の手順を改変する。手短に言えば、５μＬのＤＮＡを、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ），２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．２５ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸，２５ｐｍｏｌの各プライマー（ＨＲＡＳ遺伝子のため），及び１ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）を含有する合計体積２５μＬ中、９５℃で１５分間；９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、及び７２℃で３０秒の３５サイクル；及び７２℃で７分間の最終伸長ステップで増幅した。ＲＡＲβ遺伝子のエピジェネティック分析のため、慣用方法（精製ステップなし）又は提案されたＤＭＡ方法いずれか由来の重亜硫酸塩変性ＤＮＡ２μＬを、４μＬ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒミックス，２５ｐｍｏｌの各プライマー，及び２μＬのＤＮＡテンプレートを含有する合計体積２０μＬ中で増幅した。９５℃で１０分間の初期プレインキュベーションサイクルの後、９５℃で１０秒、及び６０℃で３０秒の４５サイクル（ＨＲＡＳ及びアクチン遺伝子のため）；及び４０℃３０秒の冷却ステップが続いた。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎシグナルを有する増幅生成物を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ２．０上で実施した。
【００７６】
マイクロチップ内のヒト全血及び尿サンプル由来のＤＮＡのＳＰＥ内のＤＭＡ試薬の効率を検証するため、マイクロ流体チップ内のＤＭＡテクニックを、２つの異なるＤＮＡ抽出方法（マイクロチップ上の溶液相及びカオトロピック試薬（エタノール）内のＱＩＡｍｐ  ＤＮＡミニキット）と比較した（図４Ａ）。まず、マイクロ流体チップ内のＤＮＡ抽出のため、２μＬの全血（８μＬ  ＰＢＳを有する）又は１０μＬの尿（ｐＨ調整なし）のいずれかを使用した。抽出ＤＮＡを得るため、５ステップからなるプロセスが続いた：
（１）細胞サイズに基づき細胞を濾過及び分離するステップ、
（２）細胞を溶解するステップ、
（３）ＤＮＡと、カオトロピック試薬又はＤＭＡのいずれかと結合するステップ、
（４）ＤＮＡを洗浄及び精製するステップ、及び
（５）ＤＮＡを、蒸留水又は溶出緩衝液のいずれかで溶出するステップ。
抽出ＤＮＡの溶出後、３種の異なるテクニックにより抽出されたＤＮＡの純度を、２６０ｎｍ（ＤＮＡ）及び２８０ｎｍ（タンパク質）におけるサンプルの光学密度の比率を決定することにより測定した。血液及び尿両方におけるＤＭＡテクニック由来のＤＮＡの質は、エタノールベースの方法から得られたものと比べて、サンプルについて統計的に顕著な誘導された純度であった（ｐ＜０．００１）。事実、尿媒体は比較的正常であり、血液と比べてタンパク質をほとんど含まないので、他の方法について血液サンプルから抽出されたＤＮＡの品質に対するＤＭＡベースのＳＰＥの有効性は、尿サンプル由来のものよりも明白であろうことが期待された。予想とは反対に、提案されたテクニックにより高度に生成されたＤＮＡが、全血及び尿サンプル両方から得られた。これは、カオトロピック方法と比べて、他の分子（例えば細胞破片、タンパク質、その他）を取り除くための洗浄ステップの際、ＤＭＡが、液体サンプルから抽出されたＤＮＡ分子と緊密に結合しているからだと思われる。次に、ＲＴ−ＰＣＲを使用する抽出ＤＮＡで、増幅テストを実施した。ＨＲＡＳ及びアクチン遺伝子を、遺伝子ターゲットとして使用し、３種の異なるテクニックを使用することにより抽出された全ＤＮＡサンプルにおいて増幅した。ＤＭＡベースのテクニックで抽出されたＤＮＡの量及び質は、そのほかの方法で得られたものよりも大きかったことが示された。リアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲのため、合計ＤＮＡサンプルグループから抽出されたＤＮＡ２μＬを、いずれの定量化なしに、前分析システムのための実際の状況を真似るために使用した。当該システムにおいて、デバイスから抽出されたＤＮＡは、臨床現場において遺伝子分析のいずれの定量化なしに、ターゲットテンプレートとして直接使用されることが期待される。従って、ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡミニキットを使用するＳＹＢＲ蛍光信号（全血又は尿２００μＬから抽出されたＤＮＡ）は、他より速いＣｔ（サイクル閾値）値において飽和されているようである。ＤＭＡベースのテクニックを使用することにより、遺伝子分析のためのＤＮＡバイオマーカー（ＨＲＡＳ，アクチン）は良い品質及び量で増幅されたことが観察された。従って、本研究において提案されたＤＭＡテクニックは、マイクロチップシステムにおけるヒト体液の小体積由来の高品質を有する固相ＤＮＡ抽出のために有用であり得る。
【００７７】
マイクロ流体デバイスの設計及び製造
マイクロチップ環境においてＤＭＡベースの方法を試験するため、ケイ素系ＤＮＡ抽出マイクロ流体デバイスを使用した。ＤＮＡ抽出マイクロ流体デバイスの構造及び制帽は知られている。ケイ素マイクロ流体チップは、３つの成分を有する：
（１）細胞分離のためのプレ濾過部分；
（２）細胞溶解のための２ステージスパイラルミキサーからなるマイクロミキサー；及び
（３）ＳｉＯ２表面積の最大化のため（６０ｍｍ２を超えると推定される）、ＤＭＡベースの方法のための曲がりくねった形状のマイクロチャネル。
マイクロ流体チップは、硬質マスキング層として２μｍ厚さの熱ＳｉＯ２が積層されたケイ素基板の正面側に、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）プロセスを使用して製造された。流体相互接続を形成するため、水酸化カリウム（ＫＯＨ）によるウェットエッチプロセスを、熱ＳｉＯ２層の上、低圧化学蒸着（ＬＰＣＶＤ）により堆積された窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）のコンポジットマスキング層が積層されたケイ素基板の裏側に適用した。マイクロチャネル表面上の残存するＳｉＯ２薄膜層と共に、開いたチャネルをキャップするため、Ｐｙｒｅｘ（登録商標）ガラス基板とのアノード結合プロセスを実施した。各製造マイクロ流体デバイスの全体サイズは、１６ｍｍ×１２ｍｍ×１．２ｍｍである。
【００７８】
小さいサンプル体積を有する人体液（全血又は尿）からのＤＮＡ抽出のためのマイクロ流体デバイスプロセスフローは、以前に報告されたプロトコルから改変された以下のステップを包含する。２４乃至３５個のマイクロ流体チップは、ポリカーボネートハウジング内に梱包する。ハウジングは、外部シリンジポンプからケイ素マイクロチップの底部まで流体相互接続のためのドリル穴を有するＯリングを包含する。全サンプル及び試薬は、以下の順番でマイクロチップへ順次送達される。
入口Ｉ：分離−サイズによって細胞を分離するため、サンプルをマイクロフィルタ内へ注入する；
入口ＩＩ：分泌―溶解緩衝液として使用されるべきプロテイナーゼＫを有するＡＬ緩衝液を、マイクロミキサー内に注入する；
入口ＩＩＩ：洗浄及び溶出−サンプルを精製するため、洗浄緩衝液（ＥｔＯＨもしくはＤＭＡのいずれか及びＰＢＳ）を注入する；及び
出口ＩＶ：ケイ素固体表面から核酸を溶出する。
カオトロピック方法（エタノール）を使用する場合、８μＬのＰＢＳ緩衝液を有する全血（２μＬ）又は尿（１０μＬ）のいずれかが、入口Ｉ内へ、流速１．６７μＬ分−１で１０分間、シリンジポンプ（ＫＤＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ）で注入された。次いで、溶解緩衝液が入口ＩＩ内へ、流速３μＬ分−１で１０分間、シリンジポンプによるＰＢＳ緩衝液と共に３μＬ分−１で１０分間までの入口Ｉ流速における増加と共に、注入された。溶解反応の際、エタノールを流速１０μＬ分−１で１０分間、入口ＩＩＩに添加した。次いで、エタノールのみを１２．５μＬ分−１で５分間、チップ全体を洗浄するため、順次使用した。最後に、抽出ＤＮＡを、１２．５μＬ分−１で１０分間、純水で溶出した。
【００７９】
提案されたＤＭＡ方法を使用する場合、マイクロチャネル（入口ＩＩＩ）部分をまず、ＡＰＴＥＳで２時間シリンジポンプを用いて被覆し、表面をエタノールで２０分間洗浄した。次いで、反応に備えて、表面を窒素ガスで乾燥した。８μＬのＰＢＳ緩衝液を有する全血（２μＬ）又は尿（１０μＬ）のいずれかが、入口Ｉ内へ、流速１．６７μＬ分−１で１０分間、シリンジポンプで注入された。次いで、溶解緩衝液が入口ＩＩ内へ、流速３μＬ分−１で１０分間注入され、入口Ｉ流速は、シリンジポンプによるＰＢＳ緩衝液と共に３μＬ分−１で１０分間まで増加させられた。溶解反応の際、ＤＭＡ溶液（２５ｍｇｍＬ−１）を流速１０μＬ分−１で１０分間、入口ＩＩＩに添加した。次いで、非特異的結合分子及びＰＣＲ阻害剤を取り除くため、ＰＢＳ緩衝液を、１２．５μＬ分−１で１０分間、順次チップの中を通過させた。最後に、抽出ＤＮＡを、１２．５μＬ分−１で１０分間、溶出緩衝液で溶出した。加えて、２００μＬｎｏ全血又は尿を、ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡミニキット（Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）を使用する参照材料としてゲノムＤＮＡ抽出のために使用した。全抽出ＤＮＡを次いで、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子分析のために使用した。
【００８０】
「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は包含することを意味するが、ただし何かが用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」の後に続いてもそれに限定されない。従って用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は、列挙された要素が必要とされるか、必須であること、但し、他の要素は任意であって、あってもなくてもよいことを意味する。
【００８１】
「consisting  of」は包含することを意味し、何かが語句「consisting  of」の後に続いたら、それに限定される。従って、語句「consisting  of」は、列挙された要素が必要とされか、必須であること、且つその他の要素はあってはいけないことを意味する。
【００８２】
本書に詳しく記載された本発明は、本書で具体的に開示されなかった、いずれの単数もしくは複数の要素、単数もしくは複数の限定が存在しない場合に、好適に実施されてよい。従って、例えば用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」，「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」，「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」等は、拡大されて、限定なしに読まれるものとする。加えて、本書で使用された用語及び表現は、限定のためではなく説明の用語として使用された。このような用語及び表現の使用において、表示且つ記載された特徴事項のいずれの等価物又はその部分を排除する意図は存在しないが、特許請求された発明の範囲内において様々な改変が可能であることが認識される。従って、好ましい実施形態及び任意の特徴事項により本発明は具体的にかいじされたが、本書に開示され、具体化された発明の改変及びバリエーションが、当業者により行われてよい。そのような改変及びバリエーションは、本発明の範囲内と見なされる。
【００８３】
所与の数値（例えば温度、時間）に関連した「約（ａｂｏｕｔ）」は、具体的な値の１０％以内の数値を包含することを意味する。
【００８４】
本書において、発明は広く且つ一般的に記載された。一般的な開示に該当する狭い種類及び下位概念的なグループはまた、発明の一部を形成する。これは、削られた材料が本書に具体的に書かれているか否かに関わらず、属からいずれの発明を取り除くという条件付きでもしくはネガティブな限定つきで発明の一般的記載を包含する。
【００８５】
その他の実施形態は、添付の特許請求の範囲及び非限定的実施例内にある。加えて、発明の特徴事項もしくは態様がマーカッシュ形式で記載される場合、当業者ならば、マーカッシュグループのいずれの個々のメンバーもしくはメンバーのサブグループに関して発明はまたそれにより記載されていると認識する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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