(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２０位の炭素にヒドロキシル基を有するプロトパナキサジオール（protopanaxadiol、PPD）又はプロトパナキサトリオール（protopanaxatriol、PPT）系のジンセノサイドを、
ウリジン二リン酸（UDP）−糖転移酵素（uridine diphosphate glycosyltransferase）タンパク質、ダンマレンジオールＩＩシンターゼ（dammarenediol-IIsynthase、DS）、トランケートされたＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ（truncated HMG-CoA reductase、tHMGR）、プロトパナキサジオール合成酵素 （protopanaxadiol synthase、PPDS）及びシロイヌナズナシトクロムｐ４５０レダクターゼ（Arabidopsis thaliana cytochrome p450 reductase、AtCPR）タンパク質のそれぞれをコードするポリヌクレオチドを含むベクターが導入された形質転換細胞で処理する段階を含み、
前記UDP−糖転移酵素タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列で定義される、
２０位の炭素のヒドロキシル基が糖転移された、ＰＰＤ系又はＰＰＴ系のジンセノサイドを製造する方法。
【請求項２】
前記２０位の炭素にヒドロキシル基を有するＰＰＤ又はＰＰＴ系のジンセノサイドは、ＰＰＤ、Ｒｈ２、Ｒｇ３及びＰＰＴからなる群から選択される一つ以上である、請求項１に記載のジンセノサイドを製造する方法。
【請求項３】
前記方法は、ＰＰＤのＣ-Ｋ（compound K）への転換、Ｒｈ２のＦ２への転換、Ｒｇ３のＲｄへの転換及びＰＰＴのＦ１への転換からなる群から選択された一つ以上の転換段階を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
２０位の炭素にヒドロキシル基を有するプロトパナキサジオール （protopanaxadiol、PPD）又はプロトパナキサトリオール （protopanaxatriol、PPT）系のジンセノサイドの２０位の炭素のヒドロキシル基に対して糖転移活性を有するウリジン二リン酸（UDP）−糖転移酵素（uridine diphosphate glycosyltransferase）タンパク質、ダンマレンジオールＩＩシンターゼ（dammarenediol-IIsynthase、DS）、トランケートされたＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ（truncated HMG-CoA reductase、tHMGR）、プロトパナキサジオール合成酵素 （protopanaxadiol synthase、PPDS）及びシロイヌナズナシトクロムｐ４５０レダクターゼ（Arabidopsis thaliana cytochrome p450 reductase、AtCPR）タンパク質のそれぞれをコードするポリヌクレオチドを含むベクターが導入された形質転換細胞を含み、
前記UDP−糖転移酵素タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列で定義される、
２０位の炭素に位置するヒドロキシル基が糖転移された、ＰＰＤ又はＰＰＴ系のジンセノサイドの製造用組成物。
【請求項５】
前記２０位の炭素にヒドロキシル基を有するＰＰＤ又はＰＰＴ系のジンセノサイドは、ＰＰＤ、Ｒｈ２、Ｒｇ３及びＰＰＴからなる群から選択される一つ以上である、請求項４に記載のジンセノサイドの製造用組成物。
【請求項６】
前記ＵＤＰ−糖転移酵素は、ＰＰＤをＣ−Ｋ（compound K）に、Ｒｈ２をＦ２に、Ｒｇ３をＲｄに、又はＰＰＴをＦ１に転換する、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記ベクターが、プロトパナキサトリオール合成酵素（protopanaxatriol synthase、PPTS）タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
前記ベクターが、高麗人参ＵＤＰ-糖転移酵素７４Ａ1（panax ginseng UDP-glycosyltransferase 74A1、PgUGT74A1）タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項９】
前記ベクターが、高麗人参ＵＤＰ-糖転移酵素７４Ａ1（panax ginseng UDP-glycosyltransferase、PgUGT74A1）及び 高麗人参ＵＤＰ-糖転移酵素９４Ｂ1（panax ginseng UDP-glycosyltransferase 94B1、PgUGT94B1）タンパク質のそれぞれをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項４に定義されるベクターが導入された、Ｃ−Ｋ（compound K）生産用形質転換細胞。
【請求項１１】
請求項７に定義されるベクターが導入された、Ｆ１生産用形質転換細胞。
【請求項１２】
請求項８に定義されるベクターが導入された、Ｆ２生産用形質転換細胞。
【請求項１３】
請求項９に定義されるベクターが導入された、Ｒｄ生産用形質転換細胞。
【請求項１４】
前記形質転換細胞は酵母である、請求項１０に記載の形質転換細胞。
【請求項１５】
前記形質転換細胞は酵母である、請求項１１に記載の形質転換細胞。
【請求項１６】
前記形質転換細胞は酵母である、請求項１２に記載の形質転換細胞。
【請求項１７】
前記形質転換細胞は酵母である、請求項１３に記載の形質転換細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロトパナキサジオール（protopanaxadiol、PPD）又はプロトパナキサトリオール（protopanaxatriol、PPT）系のジンセノサイドの２０位の炭素に位置したヒドロキシル基に対して糖転移活性を有する、ウリジン二リン酸（UDP）−糖転移酵素（uridine diphosphate glycosyltransferase）タンパク質及びそれを用いたＵＤＰ−糖転移方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高麗人参は、健康のために広く利用されている最も人気のある薬用植物の一つである。高麗人参の根は伝統的な医学ではハーブティーとして消費され、現在は、キャンディ、インスタントティー及びトニックドリンク剤を含む多様な製品にも使用されている。高麗人参に含まれた 糖転移されたトリテルペン化合物であるジンセノサイドは、 、健康に多くの効果をもたらすことができる。特に、ジンセノサイドは、免疫体系の強化及び身体機能の活性化のような様々な薬剤学的効果を有していることが知られており、高麗人参の根から４０種類以上のジンセノサイドが発見されている。ただし、前記ジンセノサイドのそれぞれを大量生産するのは難しいため、特定のジンセノサイドの効能、例えば、特定の疾病の治療効能などを究明し、究明されたジンセノサイドを商業的に利用するにあって、主要な障害となっている。
【０００３】
ジンセノサイドは、糖転移されたダンマラン系のテトラサイクリックトリテルペンであり、それらのアグリコン構造を基に３つの異なるグループ：プロトパナキサジオール系（Protopanaxadiol-type, PPD）ジンセノサイド、プロトパナキサトリオール系（Protopanaxatriol-type, PPT）ジンセノサイド、及びオレアノール酸系（Oleanolic acid）ジンセノサイドに分類されることができる。これら３つのグループは、化合物構造中の環の３位の炭素、６位の炭素及び２０位の炭素位置にグリコシド結合により付着する糖部分（(aglycones）の位置及び数によってさらに分類される。ＰＰＤｓ及びＰＰＴｓは、異なるヒドロキシル化パターンを有している。ＰＰＤｓは３位、１２位及び２０位の炭素位置に−ＯＨ基を有しているのに対し、ＰＰＴｓは３位、６位、１２位及び２０位の炭素位置に−ＯＨ基を有している。前記ＰＰＤｓ及びＰＰＴｓは、グルコース又は他の糖に糖転移され、様々なジンセノサイドに転換することができる。糖転移されたＰＰＤ系のジンセノサイドには、ジンセノサイドＲｂ１、Ｒｄ、Ｆ２、Ｒｇ３、Ｒｈ２、Ｃ−Ｋ（Compound K）、Ｒｂ２、Ｒｃ、Ｃ−ＭＣ（Compound MC）及びＣＹ（Compound Y）などが挙げられ、糖転移されたＰＰＴ系のジンセノサイドにはジンセノサイドＲｇ１、Ｒｈ１、Ｆ１、Ｒｆ、Ｒｅ及びＲｇ２などが挙げられる。
【０００４】
ジンセノサイド生合成経路は、部分的にだけ知られている。前記生合成経路は、ＩＰＰ異性化酵素（ＩＰＩ）、ＧＰＰ合成酵素（ＧＰＳ）、ＦＰＰ合成酵素（ＦＰＳ）、スクアレン合成酵素（ＳＳ）及びスクアレンエポキシダーゼ（ＳＥ）の作用によりイソペンテニル二リン酸（isopentenyl diphosphate）及びＤＭＡＤＰ（dimethylallyldiphosphate）の一連の縮合反応が起こり、オキシドスクワレン（oxidosqualene）が合成されるまでは、他のトリテルペン経路と共に、その経路の一部を共有することが知られている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。オキシドスクワレンは、トリテルペン環化酵素（triterpenecyclase）であるダンマレンジオールＩＩシンターゼ（dammarenediol-IIsynthase、DS）によりダンマレンジオール−ＩＩ（dammarenediol-II）に環化される。ダンマレンジオール−ＩＩは、３位及び２０位の炭素にヒドロキシグループを有しており、ｐ４５０酵素であるＰＰＤＳ（protopanaxadiol synthase）により１２位の炭素にヒドロキシル化されてＰＰＤに転換される。ＰＰＤＳは、もう一つのｐ４５０タンパク質であるＰＰＴＳ（protopanaxatirol synthase）により６位の炭素にヒドロキシル化をもたらしてＰＰＴに転換することができる。ＰＰＤは、３位及び／又は２０位の炭素に糖転移され、さまざまな種類のＰＰＤ系のジンセノサイドに転換することができ、ＰＰＴは６位、及び／又は２０位の炭素に糖転移され、多様なＰＰＴ系のジンセノサイドに転換することができる。
【０００５】
ウリジン二リン酸（UDP）−糖転移酵素（UGT）は、ＵＤＰ−糖からホルモン及び二次代謝物質のようなさまざまな代謝物質に糖を伝達する酵素である。ＵＧＴは、一般的に代謝物質の溶解性、安定性、貯蔵性、生体活性又は生物学的に利用可能性を高めるために生合成経路において最後の段階で作用する。植物代謝物質の驚くべき多様性から分かるように、各植物のゲノムは、異なるＵＧＴを数百個ほど保有している。例えば、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）植物モデルでは、アミノ酸をベースとして分類された１４個のグループ（グループＡ〜グループＮ）に属する１０７個のＵＧＴｓを含んでいる。しかし、ジンセノサイド生合成酵素としてＤＳ、ＰＰＤＳ及びＰＰＴＳについては報告されているが、ジンセノサイド生合成に関与するＵＧＴについてはほとんど知られていないため、特定のジンセノサイドの生産のためにジンセノサイドを基質とするＵＧＴを解明する必要がある。
【０００６】
また、異なるＵＧＴは、糖供与体及び糖受容体のいずれに対しても基質特異性を示す。例えば、ＵＧＴ７８Ｄ２は、ＵＤＰ−グルコースからフラボノール（kaempferol、quercetin）及びアントシアニン（caynidin）の３位の炭素にグルコースを伝達し、フラボノール−３−Ｏ−グルコシド及びシアニジン−３−Ｏ−グルコシドをそれぞれ生成する。このような糖転移は、生体内での安定性及び貯蔵性に必須であると見受けられる。逆に、ＵＧＴ８９Ｃ１は、ＵＤＰ−ラムノースのラムノースをフラボノール−３−Ｏ−グルコシドの７位の炭素に伝達させ、フラボノール−３−Ｏ−グルコシド−７−Ｏ−ラムノシドを生産する。前記ＵＧＴ８９Ｃ１の場合、ＵＤＰ−ブドウ糖及びアントシアニン−３−Ｏ−グルコシドをいずれも基質として使用しないことにより、ＵＧＴ７８Ｄ２と異なるＵＤＰ−糖及び受容体に対する異なる特異性を示すことが知られている。このように、異なる種類のＵＧＴの場合、基質特異性及び位置特異性が異なる可能性があり、各ＵＧＴによる基質特異性及び位置特異性が明らかにされる必要性がある。
【０００７】
このような背景の下、本発明者らは、基質特異性及び位置特異性を有し、特定のジンセノサイドの生合成に利用できる新規なＵＤＰ−糖転移酵素を開発すべく鋭意努力した結果、高麗人参から新規な糖転移酵素であるＰｇＵＧＴ７１Ａ１を究明し、前記ＰｇＵＧＴ７１Ａ１がＰＰＤ系のジンセノサイドであるＰＰＤ、Ｒｈ２及びＲｇ３をそれぞれジンセノサイドＣ-Ｋ、Ｆ２、及びＲｄに転換させることができ、また、ＰＰＴをＦ１に転換させることができることを確認した。これにより、本発明者らは、前記タンパク質がＰＰＤ系及びＰＰＴ系のジンセノサイドの２０位の炭素に位置したヒドロキシル基に対する糖転移活性を有するため、これを糖転移された特定のジンセノサイドの生産に利用することができることを確認し、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−１４７９６１５号公報
【特許文献２】韓国登録特許第１０−１４７９６０８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ajikumar et al. Science, 330, 70-74. 2010
【非特許文献２】Ro et al. Nature, 440, 940-943. 2006
【非特許文献３】Sun et al. BMC genomics, 11, 262, 2010
【非特許文献４】van Hoek、de Hulster et al., 2000；Lenihan、Tsuruta et al., 2008；Westfall、Pitera et al., 2012
【非特許文献５】Kim, Cui et al. 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の一つの目的は、２０位の炭素にヒドロキシル基を有するプロトパナキサジオール（protopanaxadiol、PPD）又はプロトパナキサトリオール（protopanaxatriol、PPT）系のジンセノサイドに、ＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質；前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター又は前記ベクターの一部が導入され、前記タンパク質の活性を示す形質転換細胞；前記形質転換細胞が含まれた生物体；又は前記形質転換細胞の培養物を処理する段階を含む、２０位の炭素に位置したヒドロキシル基が糖転移された、ＰＰＤ又はＰＰＴ系のジンセノサイドを製造する方法を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、２０位の炭素にヒドロキシル基を有するＰＰＤ又はＰＰＴ系のジンセノサイドの前記ヒドロキシル基に対して糖転移活性を有するＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質；前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、又は前記ベクターの一部が導入された形質転換細胞；前記形質転換細胞が含まれた生物体；及び前記形質転換細胞の培養物からなる群から選択される一つ以上を有効成分として含む、２０位の炭素に位置したヒドロキシル基が糖転移された、ＰＰＤ又はＰＰＴ系のジンセノサイドの製造組成物を提供することにある。
【００１２】
本発明のもう一つの目的は、前記ＰＰＤ又はＰＰＴ系のジンセノサイドの２０位の炭素に位置したヒドロキシル基に対して選択的な糖転移活性を有する、配列番号１のアミノ酸配列で定義される、分離されたＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質を提供することにある。
【００１３】
本発明のもう一つの目的は、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記発現ベクター又は前記ベクターの一部を含む形質転換細胞、及び前記形質転換細胞が含まれた生物体を提供することにある。
【００１４】
本発明のもう一つの目的は、前記ＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質ＤＳ、ｔＨＭＧＲ、ＰＰＤＳ及びＡｔＣＰＲタンパク質をそれぞれコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記発現ベクター又は前記ベクターの一部を含むＣ-Ｋ生産用形質転換細胞、及び前記形質転換細胞が含まれた生物体を提供することにある。
【００１５】
本発明のもう一つの目的は、前記ＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質ＤＳ、ｔＨＭＧＲ、ＰＰＤＳ、ＡｔＣＰＲ及びＰＰＴＳタンパク質をそれぞれコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記発現ベクター又は前記ベクターの一部を含むＦ１生産用形質転換細胞、及び前記形質転換細胞が含まれた生物体を提供することにある。
【００１６】
本発明のもう一つの目的は、前記ＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質ＤＳ、ｔＨＭＧＲ、ＰＰＤＳ、ＡｔＣＰＲ及びＰｇＵＧＴ７４Ａ１タンパク質をそれぞれコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記発現ベクター又は前記ベクターの一部を含むＦ２生産用形質転換細胞、及び前記形質転換細胞が含まれた生物体を提供することにある。
【００１７】
本発明のもう一つの目的は、前記ＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質ＤＳ、ｔＨＭＧＲ、ＰＰＤＳ、ＡｔＣＰＲ、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１及びＰｇＵＧＴ９４Ｂ１タンパク質をそれぞれコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記発現ベクター又は前記ベクターの一部を含むＲｄ生産用形質転換細胞、及び前記形質転換細胞が含まれた生物体を提供することにある。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のＵＤＰ−糖転移酵素は、ＰＰＤ又はＰＰＴ系のジンセノサイドの２０位の炭素に位置したヒドロキシル基に選択的に糖を転移する活性を有するタンパク質であるため、Ｃ-Ｋ、Ｆ２、Ｒｄ及びＦ１などの２０位の炭素に糖を有する特定のジンセノサイドの大量生産に有効に使用することができる。
【００１９】
また、本発明の発現ベクター、及び前記発現ベクターを含む形質転換細胞は、ジンセノサイドＣ-Ｋ（新規合成量４．５ｍｇ／Ｌ）、Ｆ１、Ｆ２、又はＲｄのように２０位の炭素に糖を有するジンセノサイドを新規で合成することにより、特定ジンセノサイドの大量生産に有効に使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
前記の目的を達成するための一つの様態として、本発明は、２０位の炭素にヒドロキシル基を有するプロトパナキサジオール（protopanaxadiol、PPD）又はプロトパナキサトリオール（protopanaxatriol、PPT）系のジンセノサイドに、ＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質；前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、又は前記ベクターの一部が導入され、前記タンパク質の活性を示す形質転換細胞；前記形質転換細胞が含まれた生物体；又は前記形質転換細胞の培養物を処理する段階を含む、２０位の炭素に位置したヒドロキシル基が糖転移された、ＰＰＤ又はＰＰＴ系のジンセノサイドを製造する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＰＰＤ系及びＰＰＴ系のジンセノサイドの化学構造を示したものである。
【図２】ＵＤＰ−糖転移酵素であるＰｇＵＧＴ７１Ａ１がＰＰＤ系及びＰＰＴ系のジンセノサイドの２０位の炭素のヒドロキシル基に、ＵＤＰ−グルコースを付加することによって糖転移させる活性を有することを示す図である。具体的には、ＰｇＵＧＴ７１Ａ１がＰＰＤをＣ-Ｋ（Compound K）に、Ｒｇ３をＲｄに、Ｒｈ２をＦ２に、ＰＰＴをＦ１に転換させることをＴＬＣ（thin-layer chromatography、上部）及びＨＰＬＣ（High performance liquid chromatography、下部）で分析した結果を示したものである。
【図３】ＭｅＪＡ（methyl jasmonate）処理によって高麗人参の葉と根において、本発明のＰｇＵＧＴ７１Ａ１の発現が増加することをリアルタイムＰＣＲで確認した結果を示す図である。
【図４】ＭｅＪＡ（methyl jasmonate）処理によって高麗人参の葉と根において、本発明のＰｇＵＧＴ７１Ａ１の発現が増加することを、ＮＧＳを通じて確認した結果を示す図である。
【図５】（Ａ）は製造されたｐＲＳ３０６−ＭＥＴ３ｐ−ＥＲＧ７−ＣＹＣ１ｔｅｒというプラットフォームプラスミドに関するものであり、（Ｂ）は、ＥＲＧ７ノックダウン−Ｆ及びＥＲＧ７ノックダウン−Ｂプライマーであり、ＰＣＲ増幅によってＵＲＡ３地域からＣＹＣ１ターミネータまでカセットを増幅した結果を示した図である。
【図６】酵母サッカロマイセス・セレビシエ（S. cerevisiae）ＭＥＴ３ｐ−ＥＲＧ７において、ｐＲＳ４２４−ＤＳ、ｐＲＳ４２６−ｔＨＭＧ１、ＰＰＤＳ及びＡｔＰＣＲを含むｐＲＳ４２５−ＰＰＤ、及び、ＰｇＵＧＴ７１Ａ１を含むｐＲＳ４２３−Ｃ-Ｋの導入によるＣ-Ｋの生合成経路を示す図である。
【図７】（Ａ）はＰｇＵＧＴ７１Ａ１を含む酵母で生成された物質がＨＰＬＣにおいて、Ｃ-Ｋの保持時間と同一に１１．９７分で新たなピークを生成することを確認したＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示したものであり、（Ｂ）は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析された、酵母により生産されたＣ-Ｋの保持時間を示す図である。
【図８】酵母サッカロマイセス・セレビシエ（S. cerevisiae）ＭＥＴ３ｐ−ＥＲＧ７において、ｐＲＳ４２４−ＤＳ、ｐＲＳ４２６−ｔＨＭＧ１、ＰＰＤＳ及びＡｔＰＣＲを含むｐＲＳ４２５−ＰＰＤ、及び、ＰｇＵＧＴ７１Ａ１ 及びＰｇＰＰＴＳを含むｐＲＳ４２３−Ｆ１の導入によるジンセノサイドＦ１の生合成経路を示す図である。
【図９】（Ａ）はＰｇＵＧＴ７１Ａ１及びＰｇＰＰＴＳを含む酵母で生成された物質がＨＰＬＣにおけるＦ１の保持時間と同一に６．０１分で新たなピークを生成することを確認したＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示したものであり、（Ｂ）は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析された、酵母により生産されたＦ１の保持時間を示す図である。
【図１０】酵母サッカロマイセス・セレビシエ（S. cerevisiae）ＭＥＴ３ｐ−ＥＲＧ７において、ｐＲＳ４２４−ＤＳ、ｐＲＳ４２６−ｔＨＭＧ１、ＰＰＤＳ及びＡｔＰＣＲを含むｐＲＳ４２５−ＰＰＤ、及び、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１及びＰｇＵＧＴ７１Ａ１を含むｐＲＳ４２３−Ｆ２の導入によるジンセノサイドＦ２の生合成経路を示す図である。
【図１１】（Ａ）はＰｇＵＧＴ７４Ａ１及びＰｇＵＧＴ７１Ａ１を含む酵母において生成された物質が、ＨＰＬＣにおけるＦ２の保持時間と同一に７．８１分で新たなピークを生成することを確認したＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析結果を示したものであり、（Ｂ）は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析された、酵母により生産されたＦ２の保持時間を示す図である。
【図１２】酵母サッカロマイセス・セレビシエ（S. cerevisiae）ＭＥＴ３ｐ−ＥＲＧ７でｐＲＳ４２４−ＤＳ、ｐＲＳ４２６−ｔＨＭＧ１、ＰＰＤＳ及びＡｔＰＣＲを含むｐＲＳ４２５−ＰＰＤ、及び、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１、ＰｇＵＧＴ９４Ｂ１及びＰｇＵＧＴ７１Ａ１を含むｐＲＳ４２３−Ｒｄの導入によるジンセノサイドＲｄの生合成経路を示す図である。
【図１３】（Ａ）はＰｇＵＧＴ７４Ａ１、ＰｇＵＧＴ９４Ｂ１及びＰｇＵＧＴ７１Ａ１を含む酵母で生成された物質が、ＨＰＬＣにおけるＲｄの保持時間と同一に５．８８分で新たなピークを生成することを確認したＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示した図であり、（Ｂ）は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析された酵母の生産Ｒｄの保持時間を示す図である。
【００２２】
本発明における用語「ウリジン二リン酸（UDP）−糖転移酵素」とは、グリコシル供与体からグリコシル受容体分子に単糖類部分を伝達する活性を有する酵素であり、具体的には、ＵＤＰ−糖をグリコシル供与体として使用する酵素を意味する。前記ＵＤＰ−糖転移酵素は、「ＵＧＴ」と混用することができる。前記ジンセノサイドＵＤＰ−糖転移酵素についてはほとんど知られておらず、ＵＤＰ−糖転移酵素活性を有するとしても、その基質特異性及び位置特異性が酵素の種類に応じて異なるため、前記酵素が高麗人参サポニンであるジンセノサイドに特異的に作用するＵＤＰ−糖転移酵素であるかどうかが決定されなければならない。
【００２３】
本発明の発明者らは、ＰＰＤ系のジンセノサイド及びＰＰＴ系のジンセノサイドの２０位の炭素に位置したヒドロキシル基（ 、-OH）に選択的に糖部分を伝達することができる、高麗人参（panax ginseng C.A. Meyer）由来の新規なＵＤＰ−糖転移酵素を最初に究明した。本発明の発明者らが究明したＵＤＰ−糖転移酵素は、ＰＰＤ系のジンセノサイド又はＰＰＴ系のジンセノサイドの２０位の炭素に位置したヒドロキシル基にＵＤＰ−グルコースの糖部分を選択的に伝達する活性を有する。したがって、本発明で究明したＵＤＰ−糖転移酵素は、２０位の炭素のヒドロキシル基に糖部分を伝達することにより、ＰＰＤ系のジンセノサイドであるＰＰＤ、Ｒｈ２及びＲｇ３をそれぞれジンセノサイドＣ-Ｋ、Ｆ２、Ｒｄに転換させることができ、また、ＰＰＴをＦ１に転換させることができる。このような活性を有するジンセノサイドＵＤＰ−糖転移酵素は知られておらず、本発明者らにより初めて明らかにされた。
【００２４】
本発明で究明されたＵＤＰ−糖転移酵素は、高麗人参（panax ginseng C.A. Meyer）由来のＵＤＰ−糖転移酵素であり、配列番号１のアミノ酸配列で定義することができる。本発明の一実施態様では、前記配列番号１のアミノ酸配列で定義されるＵＤＰ−糖転移酵素を「ＰｇＵＧＴ７１Ａ１」と命名した。
【００２５】
本発明の前記ＵＤＰ−糖転移酵素は、配列番号１で表されるアミノ酸配列だけでなく、前記配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の類似性を示すアミノ酸配列であってもよく、実質的には、ＰＰＤ又はＰＰＴ系のジンセノサイドの２０位の炭素のヒドロキシル基に糖を転移することができる活性を有するタンパク質であれば、制限なく含まれる。また、このような類似性を有する配列であって、実質的にＵＤＰ−糖転移酵素と同一又はそれに相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変更、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質変異体も本発明の範囲内に含まれる。
【００２６】
前記用語「類似性」とは、野生型タンパク質のアミノ酸配列又はそれをコードする核酸配列との類似度を示すためのものであり、本発明のアミノ酸配列、又は核酸配列と前記のようなパーセント、又はそれ以上の同一な配列を有する配列を含む。前記類似性の比較は、肉眼又は購入が容易な比較プログラムを用いて行うことができる。
【００２７】
本発明の前記ＵＤＰ−糖転移酵素は、ＰＰＤ又はＰＰＴ系のジンセノサイドの２０位の炭素、具体的には、ヒドロキシル基を有する２０位の炭素に選択的に糖を転移する活性を有するため、これを２０位の炭素にヒドロキシル基を有するＰＰＤ又はＰＰＴ系のジンセノサイドから、糖転移されたジンセノサイドを製造するために用いることができる。
【００２８】
本発明における用語「ＰＰＤ系のジンセノサイド」とは、ダンマラン系のサポニンであり、３位、１２位及び２０位の炭素位置に−ＯＨ基を有するるＰＰＤ又は前記ＰＰＤの前記−ＯＨ基が糖転移されたジンセノサイドを意味する。本発明の糖転移酵素により糖転移することができる前記ＰＰＤ系のジンセノサイドの例としては、２０位の炭素にヒドロキシル基を有するＰＰＤ、Ｒｇ３及びＲｈ２などが挙げられるが、本発明のＵＤＰ−糖転移酵素により糖転移されることができるＰＰＤ系のジンセノサイドであれば、制限なく含まれる。
【００２９】
本発明における用語「ＰＰＴ系のジンセノサイド」とは、ダムマシラン系サポニンであり、３位、６位、１２位及び２０位の炭素位置に−ＯＨ基を有しているＰＰＴ又は前記ＰＰＴの前記−ＯＨ基が糖転移されたジンセノサイドを意味する。本発明の糖転化酵素により糖転移することができる前記ＰＰＴ系のジンセノサイドの例としては、２０位の炭素にヒドロキシル基を有し、６位の炭素に糖を含まないＰＰＴが挙げられるが、本発明のＵＤＰ−糖転移酵素により糖転移することができるＰＰＴ系のジンセノサイドであれば、制限なく含まれる。
【００３０】
前記ＰＰＤ系又はＰＰＴ系のジンセノサイドは、分離及び精製されたジンセノサイドを用いることもでき、高麗人参又は紅参の粉末又は抽出物に含まれるジンセノサイドを用いることもできる。すなわち、サポニンを含む高麗人参又は紅参の粉末又は抽出物を直接ジンセノサイドとして用いて本発明の方法を実施することもできる。あるいは、化学的に合成されたジンセノサイドを用いることもできる。本発明において、公知の様々な高麗人参を用いることができる。例えば、朝鮮人参（Panax ginseng）、アメリカニンジン（P. quiquefolius）、サンシチニンジン（P. notoginseng）、竹節人参（P. japonicus）、ミツバニンジン（P. trifolium）、ヒマラヤニンジン（P. pseudoginseng）及びベトナムニンジン（P. vietnamensis）が挙げられるが、これに限定されない。前記ＰＰＤ系又はＰＰＴ系のジンセノサイドの化学構造を図１に示した。
【００３１】
本発明における用語「糖転移されたジンセノサイド」とは、ジンセノサイドを構成する非糖成分（aglycone）のヒドロキシ基についている単糖類またはそれ以上の糖を有するジンセノサイドを意味する。本発明の目的上、前記糖転移されたジンセノサイドは、本発明のＵＤＰ−糖転移酵素によりＰＰＤ又はＰＰＴ系のジンセノサイドの２０位の炭素に糖、具体的にはグルコースが転移され糖転移されたジンセノサイドであれば制限なく含まれる。その例として、本発明の糖転移酵素によってＰＰＤが糖転移されたＣ-Ｋ（compound K）、Ｒｈ２が糖転移されたＦ２、Ｒｇ３が糖転移されたＲｄ又はＰＰＴが糖転移されたＦ１などがあるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
また、２０位の炭素にヒドロキシル基を有するＰＰＤ又はＰＰＴ系のジンセノサイドを転換させることにより糖転移されたジンセノサイドを製造するために、前記ＵＤＰ−糖転移酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター又は前記ベクターの一部を含み、前記ＵＤＰ−糖転移酵素活性を示す形質転換細胞、前記形質転換細胞が含まれた生物体又は前記形質転換細胞の培養物を用いることができる。
【００３３】
前記ＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号２で表されるヌクレオチド配列と定義されるポリヌクレオチドであってもよい。また、配列番号２で表されるヌクレオチド配列だけでなく、前記配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の類似性を示すヌクレオチド配列であってもよく、実質的にＰｇＵＧＴ７１Ａ１タンパク質の活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であれば、制限なく含まれる。
【００３４】
本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、好適な宿主細胞において目的タンパク質を発現する発現ベクターとして、挿入された核酸配列が発現するように作動可能に連結された必須の調節因子を含む核酸構築物を意味する。前記製造された組換えベクターを宿主細胞に形質転換又はトランスフェクションすることにより、所望の目的タンパク質を得ることができる。
【００３５】
本発明で提供されるポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、特にこれに制限されないが、大腸菌由来のプラスミド（ｐＹＧ６０１ＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８及びｐＵＣ１１９）、バチルス・サブチリス由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０及びｐＴＰ５）、酵母由来のプラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４及びＹＣｐ５０）及びアグロバクテリウム媒介の形質転換に使用することができるＴｉ−プラスミドを含む。ファージＤＮＡの具体的な例としては、λ−ファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、及びλZAP）が挙げられる。また、レトロウイルス（retrovirus）、アデノウイルス（adenovirus）又はワクチニアウイルス（vaccinia virus）など動物ウイルス、バキュロウィルス（baculovirus）のような昆虫ウイルス、二本鎖植物ウイルス（例えば、CaMV）、一本鎖ウイルス又はゲミニウイルス（geminivirus）由来のウイルスベクターを使用することができる。
【００３６】
さらに、本発明のベクターとして、転写活性化タンパク質（例えば、B42）に連結された融合プラスミド（例えば、pJG4-5）を用いても良い。また、本発明で得られる目的タンパク質の精製を容易にするために、 プラスミドベクターは、必要に応じて他の配列をさらに含むことができる。例えば、前記融合プラスミドにはＧＳＴ、ＧＦＰ、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇなどのタグを含まれてもよいが、これに限定されるものではない。本発明の一実施態様では、ＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを構築するために、ＧＳＴ遺伝子が融合されたベクターであるｐＧＥＸ４Ｔ−１ベクターを使用した。
【００３７】
また、前記融合配列が含まれているベクターによって発現された融合タンパク質は、親和性クロマトグラフィーによって精製することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼが融合された場合には、前記酵素の基質であるグルタチオンを利用することができる。そして、ヘキサヒスチジンが融合された場合には、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｈｉｓ−結合樹脂カラム（Novagen、USA）を用いて、希望の目的タンパク質を容易に回収することができる。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドをベクターに挿入するために、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限部位又はクローニング部位に挿入することができる。
【００３９】
本発明のＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、前記ベクターに作動可能に連結されていてもよい。本発明の前記ベクターは、プロモーター及び本発明の核酸以外に、エンハンサーなどのシス要素（cis element）、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボゾーム結合配列などをさらに含むことができる。選択マーカーの例として、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素、ネオマイシン耐性遺伝子などを使用することができる。しかし、前記例によって動作可能なように連結される追加の構成要素が制限されるものではない。本発明における用語「形質転換」とは、ＤＮＡを宿主として導入し、前記ＤＮＡの染色体組み込みにより又は染色体統合完成によって複製可能になることである。すなわち、形質転換とは、外部のＤＮＡを細胞内に導入することにより、人為的に遺伝的な変化を起こす現象を意味する。
【００４０】
形質転換により、本発明のＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター又は前記ベクターの一部を宿主細胞内に導入することができる。ここで、前記発現ベクターのフラグメントとは、宿主細胞内に前記ＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質の活性を付与することができるようにＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分を含む発現ベクターのフラグメントを意味する。例えば、アグロバクテリウム媒介形質転換において宿主細胞内に伝達されるＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
本発明の形質転換は、任意の形質転換方法により行ってもよく、当業界の通常の方法によって容易に行うことができる。一般的に、形質転換の方法には、ＣａＣｌ２沈殿法、ＣａＣｌ２方法にＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide）という還元物質を使用することにより、効率を高めたＨａｎａｈａｎ法、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、原形質融合法、シリコンカーバイド繊維を利用した攪拌法、アグロバクテリアを介した形質転換法、ＰＥＧを介した形質転換法、デキストランサルフェート法、リポフェクタミン及び乾燥／抑制を介した形質転換方法などがある。しかし、本発明のＵＤＰ−糖転移酵素をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを形質転換させるための方法は、前記例に限定されず、当業界において一般的に使用される形質転換又は形質感染方法を制限なく使用することができる。
【００４２】
本発明において、宿主は本発明のポリヌクレオチドを発現するものであれば、特に限定されない。本発明に用いられる宿主の具体的な例としては、大腸菌（E. coli）などのエシェリキア属バクテリア、バチルス・サブチリスなどのバチルス属バクテリア、シュードモナス・プチダなどのシュードモナス属バクテリア、サッカロマイセス・セレビシエ、又はシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）などの酵母、動物細胞、植物細胞、及び昆虫細胞が挙げられる。本発明で使用することができる大腸菌菌株の具体的な例としては、ＣＬ４１（ＤＥ３）、ＢＬ２１又はＨＢ１０１が挙げられ、バチルス・サブチリス菌株の具体的な例としては、ＷＢ７００又はＬＫＳ８７が挙げられる。
【００４３】
本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター又は前記ベクターの一部が導入された形質転換細胞を含むことができる生物には、、例えば、タバコ、シロイヌナズナ、ジャガイモ、高麗人参、ごま、ゆず、デイジーなどが挙げられるが、これに限定されない。
【００４４】
本発明のプロモーターとしては、本発明の核酸を宿主で発現するものであれば、いかなるプロモーターも使用することができる。例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、又はＰＲプロモーターなどの大腸菌又はファージ−由来プロモーター；Ｔ７プロモーター、、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＭＡＳプロモーター又はヒストンプロモーターなどの大腸菌感染ファージ−由来プロモーターを使用することができる。また、ｔａｃプロモーターなどの人工的に改変されたプロモーターも使用することができる。
【００４５】
前記の方法で形質転換された本発明のＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが導入された形質転換体は、ＰＰＤ又はＰＰＴ系のジンセノサイドの２０位の炭素に位置したヒドロキシル基に対して選択的な糖転移活性を有し、具体的には、ＰＰＤのＣ-Ｋへの転換、Ｒｈ２のＦ２への転換、Ｒｇ３のＲｄへの転換及びＰＰＴのＦ１への転換からなる群から選択された一つ以上の糖転移活性を有するが、これらに限定されるものではない。
【００４６】
本発明における用語「形質転換細胞の培養物」とは、前記形質転換細胞を公知となった微生物培養方法により培養することによって得られた産物を意味する。前記用語培養物とは、形質転換細胞を含み、前記形質転換細胞を含む培養液から遠心分離などにより形質転換細胞を除去した形態も全て含む幅広い概念で使用される。
【００４７】
前記培養物は、本発明のＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質を含むため、ＰＰＤ又はＰＰＴ系のジンセノサイドを糖転移されたジンセノサイドに転換することができる活性を有する。例えば、ＰＰＤをＣ-Ｋに、Ｒｈ２をＦ２に、Ｒｇ３をＲｄに、ＰＰＴをＦ１に転換させることができる。
【００４８】
本発明のＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター又は前記ベクターの一部が導入され、前記タンパク質の活性を示す形質転換細胞、前記形質転換細胞が含まれた生物体又は前記形質転換細胞の培養物を処理し、２０位の炭素にヒドロキシル基を有するＰＰＤ又はＰＰＴ系のジンセノサイドを糖転移されたジンセノサイドに転換させることができ、これを２０位の炭素が糖転移されたジンセノサイドが必要な分野、特にジンセノサイドＣ-Ｋ、Ｆ２、Ｒｄ及びＦ１などのジンセノサイドが必要な分野において、前記方法を有効に使用することができる。
【００４９】
本発明の発明者らは、高麗人参（panax ginseng C.A. Meyer）からＰＰＤ系のジンセノサイド及びＰＰＴの２０位の炭素に位置したヒドロキシル基に選択的にＵＤＰ−グルコースのグルコース部分を伝達する活性を有し、配列番号１のアミノ酸配列で構成される新規なＵＤＰ−糖転移酵素を究明し、これをＰｇＵＧＴ７１Ａ１と命名した（実施例１）。前記ＰｇＵＧＴ７１Ａ１タンパク質の酵素活性を調べるために、２０位の炭素にヒドロキシル基を有する代表的なＰＰＤ又はＰＰＴ系のジンセノサイドである、ＰＰＤ、Ｒｇ３、Ｒｈ２、及びＰＰＴを使用し、本発明のＰｇＵＧＴ７１Ａ１と反応させてその転換活性を確認した。その結果、本発明のＰｇＵＧＴ７１Ａ１はＰＰＤをＣ-Ｋに、Ｒｇ３をＲｄに、Ｒｈ２をＦ２に、ＰＰＴをＦ１に転換させることを示し、ＰＰＤ系及びＰＰＴ系のジンセノサイドの２０位の炭素に位置したヒドロキシル基にグルコース部分を転換する活性を有することを示唆した（図２）。また、前記タンパク質は、高麗人参の葉及び根の両方で発現し、高麗人参の生合成遺伝子の発現を増加させることが知られているジャスモン酸メチル（methyl jasmonate、MeJA）によりその発現が増加する結果を示した（図３及び４）。これらの結果は、本発明のＰｇＵＧＴ７１Ａ１がジンセノサイド生合成、具体的に、Ｃ-Ｋ、Ｒｄ、Ｆ２及びＦ１などの生合成に関与し、前記タンパク質は２０位の炭素の糖転移によりＣ-Ｋ、Ｒｄ、Ｆ２及びＦ１などを生物転換する工程に使用することができるタンパク質であることを示唆する。
【００５０】
もう一つの態様として、本発明は、２０位の炭素にヒドロキシル基を有するプロトパナキサジオール（protopanaxadiol、PPD）又はプロトパナキサトリオール（protopanaxatriol、PPT）系のジンセノサイドの前記ヒドロキシル基に対して糖転移活性を有するＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質；前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、又は前記ベクターの一部が導入された形質転換細胞；前記形質転換細胞が含まれた生物体；及び前記形質転換細胞の培養物からなる群から選択される一つ以上を有効成分として含む、２０位の炭素に位置したヒドロキシル基が糖転移された、ＰＰＤ又はＰＰＴ系のジンセノサイドの製造組成物を提供する。
【００５１】
前記ＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質、形質転換細胞、生物体、ＰＰＤ系及びＰＰＴ系のジンセノサイド及び糖転移されたジンセノサイドについては、前記で説明した通りである。
【００５２】
もう一つの態様として、本発明は、ＰＰＤ又はＰＰＴ系ジンセノサイドの２０位の炭素に位置したヒドロキシル基に対して糖転移活性を有する、配列番号１のアミノ酸配列と定義されるＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質を提供する。
【００５３】
前記ＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質及び配列番号１のアミノ酸配列については、前記で説明した通りである。
【００５４】
前記タンパク質は、ＰＰＤをＣ−Ｋに、Ｒｈ２をＦ２に、Ｒｇ３をＲｄに、ＰＰＴをＦ１に転換させるものであってもよい。
【００５５】
もう一つの態様として、本発明は、前記ＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに、ダンマレンジオールＩＩシンターゼ（dammarenediol-IIsynthase、DS）、切断されたＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ（truncated HMG-CoA reductase、tHMGR）、プロトパナキサジオール合成酵素（protopanaxadiol synthase、PPDS）及びシロイヌナズナシトクロムｐ４５０レダクターゼ（Arabidopsis thaliana cytochromeｐ４５０ reductase、AtCPR）タンパク質のそれぞれをコードするポリヌクレオチドをさらに含む発現ベクター、及び前記発現ベクター又は前記ベクターの一部を含むＣ-Ｋ生産用形質転換細胞を提供する。
【００５６】
前記ＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質、発現ベクター、及び形質転換細胞については、前記で説明した通りである。
【００５７】
前記ダンマレンジオールＩＩシンターゼ（dammarenediol-IIsynthase、DS）は、トリテルペン環化酵素（triterpenecyclase）であり、オキシドスクワレンをダンマレンジオール−IIに環化する酵素を意味する。前記ＤＳは、配列番号２９で表されるアミノ酸配列と定義することができる。前記ＤＳは、配列番号２９で表されるアミノ酸配列だけでなく、前記配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の類似性を示すアミノ酸配列であり、実質的にＤＳと同一又はそれに相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変更、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するいかなるタンパク質変異体も本発明の範囲内に含まれる。
【００５８】
前記ＤＳタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号３０で表されるヌクレオチド配列と定義されるポリヌクレオチド又は配列番号３１で表されるＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度が最適化されたヌクレオチド配列と定義されるポリヌクレオチドであってもよい。、配列番号３０又は３１で表されるヌクレオチド配列だけでなく、前記配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の類似性を示すヌクレオチド配列であり、実質的にＤＳのタンパク質と同一な生物学的活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であれば、一部の配列が欠失、変更、置換又は付加されたヌクレオチド配列を有するいかなるポリヌクレオチド変異体も本発明の範囲内に含まれる。
【００５９】
前記切断されたＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ（truncated HMG-CoA reductase、tHMGR）は、生体内でＺ１０の合成又はコレステロールの合成を調節する重要な酵素であり、コレステロールの合成過程でＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に転換する酵素を意味する。前記ｔＨＭＧＲは、配列番号３２で表されるアミノ酸配列と定義することができる。前記ｔＨＭＧＲは、配列番号３２で表されるアミノ酸配列だけでなく、前記配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の類似性を示すアミノ酸配列であり、実質的には、ｔＨＭＧＲと同一又はそれに相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変更、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するいかなるタンパク質変異体も本発明の範囲内に含まれる。
【００６０】
前記ｔＨＭＧＲタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号３３で表されるヌクレオチド配列と定義されるポリヌクレオチドであってもよい。配列番号３３で表されるヌクレオチド配列だけでなく、前記配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の類似性を示すヌクレオチド配列であり、実質的には、ｔＨＭＧＲタンパク質と同一な生物学的活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であれば、一部の配列が欠失、変更、置換又は付加されたヌクレオチド配列を有するいかなるポリヌクレオチド変異体も本発明の範囲内に含まれる。
【００６１】
プロトパナキサジオール合成酵素（protopanaxadiol synthase、PPDS）は、ｐ４５０酵素であり、ダンマレンジオール−IIの１２位の炭素をヒドロキシル化させてＰＰＤに転換させる酵素を意味する。前記ＰＰＤＳは、配列番号３４で表されるアミノ酸配列と定義することができる。前記ＰＰＤＳは、配列番号３４で表されるアミノ酸配列 だけでなく、前記配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の類似性を示すアミノ酸配列であり、実質的には、ＰＰＤＳと同一又はそれに相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変更、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するいかなるタンパク質変異体も本発明の範囲内に含まれる。
【００６２】
前記ＰＰＤＳタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号３５で表されるヌクレオチド配列と定義されるポリヌクレオチドであってもよい。配列番号３５で表されるヌクレオチド配列だけでなく、前記配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の類似性を示すヌクレオチド配列であり、実質的には、ＰＰＤＳタンパク質と同一な生物学的活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であれば、一部の配列が欠失、変更、置換又は付加されたヌクレオチド配列を有するいかなるポリヌクレオチド変異体も本発明の範囲内に含まれる。
【００６３】
前記シロイヌナズナシトクロムｐ４５０ｊレダクターゼ（Arabidopsis thaliana cytochrome p450 reductase、AtCPR）は、チトクロムＰ４５０レダクターゼと同じ意味で使用することができる。前記ＡｔＣＰＲは、配列番号３６で表されるアミノ酸配列と定義することができる。前記ＡｔＣＰＲは、配列番号３６で表されるアミノ酸配列だけでなく、前記配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の類似性を示すアミノ酸配列であり、実質的には、ＡｔＣＰＲと同一又はそれに相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変更、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するいかなるタンパク質変異体も本発明の範囲内に含まれる。
【００６４】
前記ＡｔＣＰＲタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号３７で表されるヌクレオチド配列又は配列番号３８で表されるＥ．  ｃｏｌｉのコドン使用頻度が最適化されたヌクレオチド配列と定義されるポリヌクレオチドであってもよい。配列番号３７又は３８で表されるヌクレオチド配列だけでなく、前記配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の類似性を示すヌクレオチド配列であり、実質的には、ＡｔＣＰＲタンパク質と同一な生物学的活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であれば、一部の配列が欠失、変更、置換又は付加されたヌクレオチド配列を有するいかなるポリヌクレオチド変異体も本発明の範囲内に含まれる。
【００６５】
本発明の一実施態様では、ｐＲＳ４２４−ＤＳ、ｐＲＳ４２６−ｔＨＭＧ１、 ｐＲＳ４２５−ＰＰＤ、及びＰｇＵＧＴ７１Ａ１を含むｐＲＳ４２３−Ｃ-Ｋをリチウム酢酸法を用いてS. cerevisiae  ＭＥＴ３ｐ−ＥＲＧ７に同時に形質転換して、Ｃ-Ｋの生合成経路を有するS. cerevisiaeＣ-Ｋ菌株を製造し（図６）、メチオニンの存在下で１０ｄ（ＯＤ６００〜〜８０）の間、流加培養式発酵を用いてS. cerevisiaeＣ−Ｋ菌株を培養した。酵母細胞を遠心分離により集菌し、超音波処理で破砕してジンセノサイドをメタノールを使用して抽出し、Ｓｅｐ−ＰＡＫを使用して精製した。精製したジンセノサイドをＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した結果、ＰｇＵＧＴ７１Ａ１を含む酵母は、ＨＰＬＣでＣ−Ｋの保持時間と同一の１１．９７分で新たなピークを示し（図７の（Ａ））、ＭＲＭにより検出されたＬＣ−ＭＳ／ＭＳで観察された生成物は、保持時間が１１．４６分であり、６４５．４から２３．２へトランジションされた（図７の（Ｂ））。前記結果は、ＰｇＵＧＴ７１Ａ１が酵母発酵を通じてジンセノサイドの新たな生産（４．５ｍｇ／Ｌ）を可能にすることができることを示唆する結果である。
【００６６】
従って、本発明は、ＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質をコードするヌクレオチドを含む発現ベクターに、ＤＳ、ｔＨＭＧＲ、ＰＰＤＳ及びＡｔＣＰＲタンパク質のそれぞれをコードするポリヌクレオチドをさらに含む発現ベクター、及び前記発現ベクター又は前記ベクターの一部を含むＣ-Ｋ生産用形質転換細胞を提供することができる。
【００６７】
前記形質転換細胞は、酵母であってもよいが、これに制限されない。
【００６８】
もう一つの態様として、本発明は、前記ＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに、ダンマレンジオールＩＩシンターゼ（dammarenediol-IIsynthase、DS）、切断されたＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ（truncated HMG-CoA reductase、tHMGR）、プロトパナキサジオール合成酵素（protopanaxadiol synthase、PPDS）及びシロイヌナズナシトクロムｐ４５０レダクターゼ（Arabidopsis thaliana cytochromeｐ４５０ reductase、AtCPR）及びプロトパナキサトリオール合成酵素（protopanaxatriol synthase、PPTS）タンパク質のそれぞれをコードするポリヌクレオチドをさらに含む発現ベクター、及び前記発現ベクター又は前記ベクターの一部を含むＦ１の生産用形質転換細胞を提供する。
【００６９】
前記、ダンマレンジオールＩＩシンターゼ（dammarenediol-IIsynthase、DS）、切断されたＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ（truncated HMG-CoA reductase、tHMGR）、プロトパナキサジオール合成酵素 （protopanaxadiol synthase、ＰＰＤＳ）及びシロイヌナズナシトクロムｐ４５０レダクターゼ（Arabidopsis thaliana cytochrome p450 reductase、AtCPR）については、前記で説明した通りである。
【００７０】
前記ＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質、発現ベクター、及び形質転換細胞については、前記で説明した通りである。
【００７１】
前記プロトパナキサトリオール合成酵素（PPTS）は、もうひとつのｐ４５０タンパク質であり、ＰＰＤＳの６位の炭素をヒドロキシル化することによりＰＰＴに転換される。前記ＰＰＴＳは配列番号３９で表されるアミノ酸配列と定義することができる。前記ＰＰＴＳは、配列番号３９で表されるアミノ酸配列だけでなく、前記配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の類似性を示すアミノ酸配列であり、実質的には、ＰＰＴＳと同一又はそれに相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変更、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するいかなるタンパク質変異体も本発明の範囲内に含まれる。
【００７２】
前記ＰＰＴＳタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号４０で表されるヌクレオチド配列又は配列番号４１で表される酵母のコドン使用頻度が最適化されたヌクレオチド配列と定義されるポリヌクレオチドであってもよい。配列番号４０又は４１で表されるヌクレオチド配列だけでなく、前記配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の類似性を示すヌクレオチド配列であり、実質的には、ＰＰＴＳタンパク質と同一な生物学的活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であれば、一部の配列が欠失、変更、置換又は付加されたヌクレオチド配列を有するいかなるヌクレオチド変異体も本発明の範囲内に含まれる。
【００７３】
本発明の一実施態様では、ｐＲＳ４２４−ＤＳ、ｐＲＳ４２６−ｔＨＭＧ１、ｐＲＳ４２５−ＰＰＤ、及び、ＰｇＵＧＴ７１Ａ１及びＰｇＰＰＴＳを含むｐＲＳ４２３−Ｆ１をリチウム酢酸法を用いてS. cerevisiaeＭＥＴ３ｐ−ＥＲＧ７に同時に形質転換して、Ｆ１の生合成経路を有するS. cerevisiae Ｆ１菌株を製造し （図８）、メチオニンの存在下で１０ｄ（ＯＤ６００〜〜８０）の間、流加培養式発酵を用いてS. cerevisiae  Ｆ１菌株を培養した。酵母細胞を遠心分離により集菌集し、超音波処理で破砕した後、ジンセノサイドをブタノールを使用して抽出し、その後、ブタノールを蒸発させた。最後に、ジンセノサイドＦ１をメタノールにより再度抽出し、前記抽出されたジンセノサイドをＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。その結果、ＰｇＵＧＴ７１Ａ１及びＰｇＰＰＴＳを含む酵母は、ＨＰＬＣにおいてＦ１の保持時間と同一の、新たなピークを６．０１分で生成し（図９の（Ａ））、ＭＲＭにより検出されたＬＣ−ＭＳ／ＭＳで観察された生成物は、保持時間が６．１３分であり、６６１．５から２０３へトランジションされた（図９の（Ｂ））。前記結果は、ＰｇＵＧＴ７１Ａ１が酵母発酵を通じてジンセノサイドＦ１の新たな生産を可能にすることを示唆する。
【００７４】
従って、本発明は、ＤＳ、ｔＨＭＧＲ、ＰＰＤＳ、ＡｔＣＰＲ及びＰＰＴＳタンパク質それぞれのＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質をコードするヌクレオチドをさらに含む発現ベクター、及び前記発現ベクター又は前記ベクターの一部を含むＦ１の生産用形質転換細胞を提供することができる。
【００７５】
前記形質転換細胞は、酵母であってもよいが、これに制限されない。
【００７６】
もう一つの態様として、本発明は、前記ＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに、ダンマレンジオールＩＩシンターゼ（DS）、切断されたＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ（tHMGR）、プロトパナキサジオール合成酵素（PPDS）、シロイヌナズナシトクロムｐ４５０レダクターゼ（AtCPR）及び高麗人参ＵＤＰ-糖転移酵素７４Ａ1（PgUGT74A1）タンパク質のそれぞれをコードするポリヌクレオチドをさらに含む発現ベクター、及び前記発現ベクター又は前記ベクターの一部を含むＦ２の生産用形質転換細胞を提供する。
【００７７】
前記、ダンマレンジオールＩＩシンターゼ（DS）、切断されたＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ（tHMGR）、プロトパナキサジオール合成酵素（ＰＰＤＳ）、及びシロイヌナズナシトクロムｐ４５０レダクターゼ（AtCPR）については、前記で説明した通りである。
【００７８】
前記ＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質、発現ベクター、及び形質転換細胞については、前記で説明した通りである。
【００７９】
高麗人参ＵＤＰ-糖転移酵素７４Ａ1（Panax ginseng UDP glycosyltransferase 74A1、PgUGT74A1）は、ＰＰＤ系のジンセノサイドであるＰＰＤ及びＣ-Ｋに特異的に作用し、３位の炭素にＯ−糖転移をもたらしてＰＰＤ及びＣ-Ｋを、それぞれＲｈ２及びＦ２に転換させる。前記ＰｇＵＧＴ７４Ａ１は特許文献１に記載されたアミノ酸配列と定義することができる。特許文献１に記載されたアミノ酸配列だけでなく、前記配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の類似性を示すアミノ酸配列であり、実質的には、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１と同一又はそれに相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変更、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するいかなるタンパク質変異体も、本発明の範囲内に含まれる。
【００８０】
前記ＰｇＵＧＴ７４Ａ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、特許文献１に記載されたヌクレオチド配列と定義されるポリヌクレオチドであってもよく、特許文献１に記載されたヌクレオチド配列だけでなくても、前記配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の類似性を示すヌクレオチド配列であり、実質的にＰｇＵＧＴ７４Ａ１タンパク質と同一な生物学的活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であれば、 一部の配列が欠失、変更、置換又は付加されたヌクレオチド配列を有するいかなるポリヌクレオチド変異体も、本発明の範囲内に含まれる。
【００８１】
本発明の一実施態様では、ｐＲＳ４２４−ＤＳ、ｐＲＳ４２６−ｔＨＭＧ１、ｐＲＳ４２５−ＰＰＤ、及び、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１及びＰｇＵＧＴ７１Ａ１を含むｐＲＳ４２３−Ｆ２をリチウム酢酸法を用いてS. cerevisiae  ＭＥＴ３ｐ−ＥＲＧ７に同時に形質転換してジンセノサイドＦ２の生合成経路を有するS. cerevisiae Ｆ２菌株を製造し（図１０）、メチオニンの存在下で１０ｄ（ＯＤ６００〜〜８０）の間、流加培養式発酵を用いてS. cerevisiae  Ｆ２菌株を培養した。酵母細胞を遠心分離により集菌し、超音波処理で破砕した後、ジンセノサイドをブタノールを使用して抽出し、その後、ブタノールを蒸発させた。最後に、ジンセノサイドＦ２をメタノールにより再度抽出し、前記抽出されたジンセノサイドをＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。その結果、 ＰｇＵＧＴ７４Ａ１及びＰｇＵＧＴ７１Ａ１を含む酵母は、ＨＰＬＣにおいてＦ２の保持時間と同一の新たなピークを７．８１分で生成し（図１１の（Ａ））、ＭＲＭにより検出されたＬＣ−ＭＳ／ＭＳで観察された生成物は、保持時間が７．３５分であり、８０７．５から６２７．５へトランジションされた（図１１の（Ｂ））。前記結果は、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１及びＰｇＵＧＴ７１Ａ１が酵母発酵を通じてジンセノサイドＦ２の新たな生産を可能にすることを示唆する。
【００８２】
従って、本発明は、ＤＳ、ｔＨＭＧＲ、ＰＰＤＳ、ＡｔＣＰＲ及びＰｇＵＧＴ７４Ａ１タンパク質それぞれのＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質をコードするヌクレオチドをさらに含む発現ベクター、及び前記発現ベクター又は前記ベクターの一部を含むＦ２の生産用形質転換細胞を提供することができる。
【００８３】
前記形質転換体は、酵母であってもよいが、これに制限されない。
【００８４】
もう一つの態様として、本発明は、前記ＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに、ダンマレンジオールＩＩシンターゼ（DS）、切断されたＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ（tHMGR）、プロトパナキサジオール合成酵素（PPDS）、シロイヌナズナシトクロムｐ４５０レダクターゼ（AtCPR）、高麗人参ＵＤＰ-糖転移酵素７４Ａ1（PgUGT74A1）及び高麗人参ＵＤＰ-糖転移酵素９４Ｂ1（PgUGT94B1）タンパク質をそれぞれコードするポリヌクレオチドをさらに含む発現ベクター、及び前記発現ベクター又は前記ベクターの一部を含むＲｄ生産用形質転換細胞を提供する。
【００８５】
前記、ダンマレンジオールＩＩシンターゼ（DS）、切断されたＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ（tHMGR）、プロトパナキサジオール合成酵素 （PPDS）、シロイヌナズナシトクロムｐ４５０レダクターゼ（AtCPR）、及び高麗人参ＵＤＰ-糖転移酵素７４Ａ1（PgUGT74A1）については、前記で説明した通りである。
【００８６】
前記ＵＤＰ−糖転移酵素タンパク質、発現ベクター、及び形質転換細胞については、前記で説明した通りである。
【００８７】
前記高麗人参ＵＤＰ-糖転移酵素９４Ｂ1（Panax ginseng UDP glycosyltransferase 94B1、PgUGT94B1）は、ＰＰＤ系のジンセノサイドあるジンセノサイドＲｈ２及びＦ２に特異的に作用し、３位の炭素に位置するＯ−グルコシドにβ−１，２糖転移をもたらしてＲｈ２及びＦ２をそれぞれジンセノサイドＲｇ３及びジンセノサイドＲｄに転換させる。前記ＰｇＵＧＴ９４Ｂ１は、特許文献２に記載されたアミノ酸配列と定義することができる。前記特許文献２に記載されたアミノ酸配列だけでなく、前記配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の類似性を示すアミノ酸配列であり、実質的には、ＰｇＵＧＴ９４Ｂ１と同一又はそれに相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変更、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するいかなるタンパク質変異体も、本発明の範囲内に含まれる。
【００８８】
前記ＰｇＵＧＴ９４Ｂ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、 特許文献２に記載されたヌクレオチド配列と定義されるポリヌクレオチドであってもよい。特許文献２に記載されたヌクレオチド配列だけでなく、前記配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の類似性を示すヌクレオチド配列であり、実質的にＰｇＵＧＴ９４Ｂ１タンパク質と同一な生物学的活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であれば、一部の配列が欠失、変更、置換又は付加されたヌクレオチド配列を有するいかなるＰＰＴＳ変異体も、本発明の範囲内に含まれる。
【００８９】
本発明の一実施態様では、ｐＲＳ４２４−ＤＳ、ｐＲＳ４２６−ｔＨＭＧ１、ｐＲＳ４２５−ＰＰＤ、及び、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１、ＰｇＵＧＴ９４Ｂ１及びＰｇＵＧＴ７１Ａ１を含むｐＲＳ４２３−Ｒｄをリチウム酢酸法を用いてS. cerevisiae  ＭＥＴ３ｐ−ＥＲＧ７に同時に形質転換して、ジンセノサイドＲｄの生合成経路を有するS. cerevisiae Ｒｄ菌株を製造し（図１２）、メチオニンの存在下で１０ｄ（ＯＤ６００〜〜８０）の間、流加培養式発酵を用いてS. cerevisiae  Ｒｄ菌株を培養した。酵母細胞を遠心分離により集菌し、超音波処理で破砕した後、ジンセノサイドをブタノールを使用して抽出し、その後、ブタノールを蒸発させた。最後に、ジンセノサイドＲｄをメタノールにより再度抽出し、前記抽出されたジンセノサイドをＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。その結果、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１、ＰｇＵＧＴ９４Ｂ１及びＰｇＵＧＴ７１Ａ１を含む酵母は、ＨＰＬＣにおいてＲｄの保持時間と同一の新たなピークを５．８８分で生成し（図１３の（Ａ））、ＭＲＭにより検出されたＬＣ−ＭＳ／ＭＳで観察された生成物は、保持時間が５．９３分であり、９６９．５から７８９．５へトランジションされた（図１３の（Ｂ））。前記結果は、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１、ＰｇＵＧＴ９４Ｂ１及びＰｇＵＧＴ７１Ａ１が酵母発酵を通じてジンセノサイドＲｄの新たな生産を可能にすることを示唆する。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
以下、本発明を下記例により詳細に説明する。ただし、下記例は本発明を例示するためのものであり、下記例により、本発明の範囲が制限されるものではない。
【実施例】
【００９１】
実施例１：高麗人参ＵＤＰ−糖転移酵素ＰｇＵＧＴ７１Ａ１のクローニング及び精製
高麗人参ｃＤＮＡからＰｇＵＧＴ７１Ａ１−Ｆ
（5’-AGGCAGGATCCATGAAGTCAGAATTGATATTCTTGCCCGCCCCGGC-3’；配列番号17）、ＰｇＵＧＴ７１Ａ１−Ｒ
（5’-AGGCATCTCGAGTCACATAATTTTCTCAAATAGTTTGGCCAATGAAT-3’；配列番号18）のプライマーとポリメラーゼを用いてＰＣＲにより遺伝子を増幅し、制限酵素であるＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩを用いて遺伝子の末端を切り取った。その後、前記遺伝子をｐＧＥＸ−４Ｔ１ベクターにクローニングして発現ベクターを構築し、これを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ＲＩＬ菌株に形質転換してＰｇＵＧＴ７１Ａ１発現菌株を得た。
前記菌株はＩＰＴＧでタンパク質発現を誘導した後、生じたタンパク質をセファロース−４Ｂレジンを用いてＰｇＵＧＴ７１Ａ１酵素を精製した。
【００９２】
実施例２：試験管内酵素分析
精製されたＰｇＵＧＴ７１Ａ１（３０μｇ）、ジンセノサイド化合物（５ｍＭ）及びＵＤＰ−グルコース（５０ｍＭ）を含む反応緩衝液（１０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７）で糖転移酵素分析を行った。この分析には、４つの異なる種類のジンセノサイド、すなわち、プロトパナキサジオール（PPD）、プロトパナキサトリオール（PPT）、Ｒｈ２及びＲｇ３を使用して本発明の酵素と反応させた。前記ジンセノサイドの構造については、図１に示した。
【００９３】
反応混合物は、１２時間、３５℃で培養して反応させた後、その生産物を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分析した。
【００９４】
ＴＬＣ分析は、移動相（アセトン：メタノール：ＤＤＷ＝６５：３５：１０  ｖｏｌ／ｖｏｌ）と６０Ｆ２５４シリカゲルプレート（Merck、ドイツ）を使用して行った。ＴＬＣプレート上の溶解生成物を１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の硫酸（Ｈ２ＳＯ４）で噴射して１１０℃で５分間加熱し検出した。
【００９５】
ＨＰＬＣ分析は、ＯＤＳ（２）Ｃ１８カラム（Phenomenex、米国）を使用して行った。水及びアセトニトリルの勾配適用の条件は以下の通りである：流速＝１ｍL/分、０分、６８％の水及び３２％のアセトニトリル；８分、３５％の水及び６５％のアセトニトリル；１２分、０％の水及び１００％のアセトニトリル；２０分、０％の水及び１００％のアセトニトリル；２０．１分、６８％の水及び３２％のアセトニトリル；及び２８分、６８％の水及び３２％のアセトニトリル。
【００９６】
ジンセノサイドは、ＵＶ−検出器（Agilent、米国）を用いて２０３ｎｍの波長でモニタリングした。
【００９７】
実施例３：ＲＮＡ分離及びリアルタイムＰＣＲ分析
トータルＲＮＡは、スペクトルプラントトータルＲＮＡキット（Spectrum plant total RNA kit、Sigma-Aldrich）を使用し、１５か月の高麗人参の葉又は根から分離した。２００μＭのジャスモン酸メチル（MeJA）を５日間毎日高麗人参の葉に噴霧し、６日目にサンプルを採取した。１μｇのトータルＲＮＡをｃＤＮＡ合成に使用した。
異なる遺伝子の発現レベルは、表１に示したプライマーセットを使用し、定量的ＲＴ−ＰＣＲ を行って確認し、チューブリンの発現レベルで標準化した。
【００９８】
【表１】
0006526716.tif 000002
【００９９】
実施例４：ＮＧＳ分析
ＭｅＪＡを処理した高麗人参の葉と根、及びＭｅＪＡを処理していない高麗人参の葉と根からＲＮＡを抽出し、ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡライブラリキットを使用して１μｇのトータルＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを構築した。ｐｏｌｙＡ−ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ＲＮＡ抽出、ＲＮＡ断片化 及びランダムヘキサマープライム逆転写に続いて、100 ntのペアエンドシーケンシングはイルミナＨｉＳｅｑ２０００を用いて行った。
【０１００】
生成された配列は、Ｔｒｉｎｉｔｙ（2011/11/26 バージョン）プログラムを用いて新規のトランスクリプトームアセンブリを行った。生成されたコンティグ（transcript）は、Ｂｌａｓｔ（2.2.25+ version）を用いて分析した。ＧＯデータベース（20-04-2012公開）及びＮＣＢＩのＮＲデータベース（ダウンロード日時：2012/05/07）を使用した。組み立てられたコンティグ（transcript）の発現レベルを判断するために、Ｂｏｗｔｉｅ（バージョン0.12.8）をマッピングプログラムとして使用した。ＲＳＥＭアルゴリズムを内包したＴｒｉｎｉｔｙグループで配布するプログラムを使用して発現値をＦＰＫＭ（Fragments Per Kilobase of exon per Million fragments mapped）の値で求めた。
【０１０１】
実施例５：酵母におけるジンセノサイド生産
実施例５．１：ＥＲＧ７ダウンレギュレーションカセット の構築
ＥＲＧ７ダウンレギュレーション菌株（S. cerevisiaeMET3p-ERG7）を構築するために、ＥＲＧ７ダウンレギュレーションカセットを構築した。ＭＥＴ３プロポーター、ＥＲＧ７遺伝子及びＣＹＣ１ターミネータを含むＥＲＧ７ダウンレギュレーションカセットのために、ｐＲＳ３０６プラスミドをプラットフォームとして使用した。ＥＲＧ７遺伝子を阻害するために、メチオニン供給により転写レベルを抑制することができるＭＥＴ３プロモーター（MET3p）を選択した。ＭＥＴ３ｐはS. cerevisiaeＣＥＮ．ＰＫ２−１ＤのゲノムＤＮＡから次のプライマーセットを用いてＰＣＲにより増幅した：
ｐＲＳ３０６−Ｆ（SacI）に対するＭＥＴ３ｐ及びｐＲＳ３０６−Ｂ（XbaI）に対するＭＥＴ３ｐ（表２）。
【０１０２】
【表２】
0006526716.tif 000003
【０１０３】
ＥＲＧ７はS. cerevisiaeＣＥＮ．ＰＫ２−１ＤのゲノムＤＮＡから次のプライマーセットを用いてＰＣＲにより増幅した：
ｐＲＳ３０６−Ｆ（SpeI）に対するＥＲＧ７及びｐＲＳ３０６−Ｂ（XhoI）に対するＥＲＧ７（表３）。
【０１０４】
【表３】
0006526716.tif 000004
【０１０５】
ＣＹＣ１ターミネータをｐＲＳ４２４−ＧＰＤプラスミドから次のプライマーセットを用いてＰＣＲにより増幅した：
ｐＲＳ３０６−Ｆ（XhoI）に対するＣＹＣ１ターミネータ及びｐＲＳ３０６−Ｂ（KpnI）に対するＣＹＣ１ターミネータ（表４）。
【０１０６】
【表４】
0006526716.tif 000005
【０１０７】
各断片をｐＲＳ３０６ベクターに挿入し、ｐＲＳ３０６３ｐ−ＭＥＴ３ｐ−ＥＲＧ７−ＣＹＣ１ｔｅｒというプラットフォームプラスミドを構築した（図５のＡ）。
【０１０８】
ＥＲＧ７ダウンレギュレーションカセットは、ｐＲＳ３０６−ＭＥＴ３ｐ−ＥＲＧ７−ＣＹＣ１ｔｅｒプラスミドを鋳型とし、ＰＣＲにより構築した。ＥＲＧ７ダウンレギュレーションカセットは、マーカーとしてＵＲＡ３遺伝子及びＭＥＴ３ｐ−ＥＲＧ６−ＣＹＣ１ｔｅｒを含む。ＵＲＡ３領域からＣＹＣ１ターミネータまでのカセットは相同アームを含むＥＲＧ７ノックダウン−Ｆ及びＥＲ Ｇ７ノックダウン−Ｂプライマー（表５）を用いてＰＣＲにより増幅した（図５のＢ）。
【０１０９】
【表５】
0006526716.tif 000006
【０１１０】
実施例５．２：S. cerevisiaeＭＥＴ３ｐ−ＥＲＧ７菌株の構築及びＥＲＧ７ダウンレギュレーションの確認
構築されたＥＲＧ７ダウンレギュレーションカセットをリチウム酢酸方法（リチウム酢酸、一本鎖キャリアＤＮＡ、ポリエチレングリコール方法による酵母の形質転換）によりS. cerevisiaeＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄゲノムに挿入した。形質転換体はＳＤ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓプレート上で選択した。選択された形質転換体をＥＲＧ７ノックダウンコンフォーム−Ｆ及びＥＲＧ７ノックダウンコンフォーム−Ｂプライマー（表６）を用いてＰＣＲによりカセット挿入を確認するためのゲノムＤＮＡ分離のために５ｍｌ  ＹＰＤ培地で培養した。その後、ＵＲＡ３マーカーを回収するため５−ＦＯＡ（5-Fluoroorotic acid）プレートから酵母を選択し、さらに分析するために、使用した。
【０１１１】
【表６】
0006526716.tif 000007
【０１１２】
２，３−オキシドスクワレンの蓄積を確認するために、フラスコ培養を行い、代謝物質をＨＰＬＣにより分析した。フラスコ培養のための種培養は、１５％（ｖ／ｖ）のグリセロールにある凍結細胞１ｍｌをＳＤ−ＴＲＰ−ＬＥＵ−ＨＩＳ−ＵＲＡ培地５０ｍｌが含まれたフラスコ２５０ｍｌに接種することにより準備した。フラスコ培養のために、種培養はＯＤ  ６００が４〜７になる３０℃で２日間培養した。種培養物２０ｍｌを２Ｌのフラスコのバッチ培地１Ｌ（２％ｖ／ｖ）に接種した。培養した細胞を集菌し、２０％のＫＯＨ／５０％のＥｔＯＨ溶液２０ｍｌで１時間蒸留した。同じ体積のヘキサンを用いて抽出した後、前記抽出物を蒸発させ、アセトン１．５ｍｌを用いて再度抽出した。前記抽出物をＨＰＬＣ分析で分析した。ＯＤＳ（２）Ｃ１８カラムを使用して１００％のアセトニトリルを用いてイソクラティック方法により１ｍＬ／分の流速でＨＰＬＣ分析を行った（Phenomenex、CA、米国）。代謝物質（スクアレン、2,3-オキシドスクアレン）をＵＶ−検出器（Agilent Technologies、CA、米国）により２０３ｎｍの波長で観察した。
【０１１３】
実施例５．３： S. cerevisiaeにおけるジンセノサイドの新規合成
ジンセノサイドの新規合成はバイオリアクターによりジンセノサイド生合成遺伝子を有しているS. cerevisiaeを培養して測定した。非特許文献４により説明されたメチオニンを含む培地を発酵のために使用した。前記バッチ培養培地は、グルコース２０ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  １５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ８ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．７２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ６．１５ｇ／Ｌ、ビタミン溶液１２ｍＬ／Ｌ、メチオニン０．３ｇ／Ｌ及び微量金属溶液 １０  ｍＬ／Ｌを含む。培地の微量金属溶液は、ＥＤＴＡ  １５ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １０．２ｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．５０ｇ／Ｌ、無水ＣｕＳｏ４  ０．５ｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．８６ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．５６ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ３．８４ｇ／Ｌ及びＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ５．１２ｇ／Ｌを含む。ビタミン溶液は、ビオチン０．０５ｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム１ｇ／Ｌ、ナイアシン１ｇ／Ｌ、イノシトール２５ｇ／Ｌ、チアミンＨＣＬ  １ｇ／Ｌ、ピリドキソールＨＣＬ  １ｇ／Ｌ及び４−アミノ安息香酸０．２ｇ／Ｌを含む。流入溶液は、グルコース５７８ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ９ｇ／Ｌ、Ｋ２ＳＯ４  ３．５ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＳＯ４  ０．２８ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ５．１２ｇ／Ｌ、及びメチオニン１  ｍＬを含む。流加培養式発酵は３０℃の１．５−Ｌバイオリアクター（Biotron、韓国）により１Ｌ／分の気流及び４００ｒｐｍで攪拌して行った。ｐＨ−ｓｔａｔ  ｆｅｅｄｉｎｇ戦略はグルコース（> pH 5.51）を注入及び５％のＮＨ４ＯＨ（<pH 5.4）を追加することにより、流加培養式発酵に使用した。
【０１１４】
新規で合成されたジンセノサイド分析のために、細胞５０ｍｌを遠心分離（１０分、２８９８×ｇ）により集菌し、ＤＤＷ２０ｍＬに再懸濁した後、超音波処理（Vibra-cell；Sonics&Materials、CT、米国）で破砕した。代謝物質は５０％のメタノール（v／v）で抽出し、ＳＥＰ−ＰＡＫ１８カートリッジで精製して、ＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて分析した。
【０１１５】
実施例５．４：ジンセノサイドのＨＰＬＣ分析及びＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析
ＨＰＬＣ分析はＯＤＳ（２）カラム（Phenomenex、CA、米国）を使用し、次のように１  ｍＬ／分の流速で行った：０分、６８％の水及び３２％のアセトニトリル；８分、３５％の水及び６５％のアセトニトリル；１２分、０％の水及び１００％のアセトニトリル；２０分、０％の水及び１００％のアセトニトリル；２０．１分、６８％の水及び３２％のアセトニトリル；及び２８分、６８％の水及び３２％のアセトニトリル。ジンセノサイドはＵＶ−検出器（Agilent Technologies、CA、米国）を用いて２０３ｎｍの波長で観察した。
【０１１６】
各ジンセノサイドの同定は、ＨＰＬＣシステム（HP1100；Agilent Technologies）、オートサンプラーが装着された トリプル四重極タンデム質量分析計（triple-quadrupole tandem mass spectrometer)(API-2000；Applied Biosystems、CA、米国）、加熱されたエレクトロスプレーイオン化ソース（electrospray ionization source、H-ESI)、三段四重極型質量分析計、及びデータ収集用Ａｎａｌｙｓｔ１．４ソフトウェアにより構成されたＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ を用いて行った。サンプル分離のために逆相カラム（Fortis H2o C18、2.1×100 mm、3-μmpore size；Fortis Technologies Ltd.、イギリス）を使用した。クロマトグラフ分離のための移動相は０．０１％の酢酸水溶性の水（Ａ）、及び０．０１％の酢酸水溶性アセトニトリル（Ｂ）により構成される。２５０μＬ／分の 一定の流速を有する勾配溶出プログラムは、次の通りである：０分、６８％Ａ及び３２％Ｂ；３分、４５％Ａ及び５５％Ｂ；８分、４０％Ａ及び６０％Ｂ；１３分、２０％Ａ及び８０％Ｂ；１８分、０％Ａ及び１００％Ｂ；２２分、０％Ａ及び１００％Ｂ；２２．１分、６８％Ａ及び３２％Ｂ；３０分、６８％Ａ及び３２％Ｂ．前記カラム温度は２５℃にセットした。ジンセノサイド化合物（ＰＰＤ、Ｒｈ２、ＲＧ３、Ｃ-Ｋ、Ｆ２及びＲｄ）の検出のために、多重反応モニタリング（multiple reaction monitoring、ＭＲＭ）方法を使用した。トランジションはをそれぞれＰＰＤに対してはｍ／ｚ  ４６１．１−＞  ４２５．５、Ｒｈ２に対してはｍ／ｚ  ６４５．３−＞  ２３．２、Ｒｇ３に対してはｍ／ｚ  ８０７．４−＞  ３６５．３、Ｃ-Ｋに対してはｍ／ｚ  ６４５．４−＞  ２３．２、Ｆ２に対してはｍ／ｚ  ８０７．５−＞  ６２７．５、Ｒｄに対してはｍ／ｚ  ９６９．３−＞  ７８９．４に設定した。全体−スキャンＭＳ分析のために、トランジションパターン（非特許文献５）に従って 、ｍ／ｚ  ４００〜１０００の範囲でスペクトルを記録した。ＭＳ/ＭＳ条件は、10μL/分でシリンジポンプを介して、分析物の標準溶液を注入することによって最適化した。 ＥＳ−ＭＳパラメータは以下の通りである：イオンスプレー電圧、４，２００Ｖ；イオンソースガス１、２０；カーテンガス、２０；衝突ガス、２。
【０１１７】
実験例１：ＰｇＵＧＴ７１Ａ１のＰＰＤ系及びＰＰＴ系ジンセノサイドの２０位の炭素のヒドロキシ基に特異的な糖転移酵素活性
実施例１において同定したＰｇＵＧＴ７１Ａ１の基質特異性及び位置特異性下記のように確認した。
【０１１８】
まず、実施例１の組換えＰｇＵＧＴであるＰｇＵＧＴ７１Ａ１をＵＤＰ−グルコースの存在下で９種のジンセノサイド（ＰＰＤ、Ｒｈ２、Ｒｇ３、Ｃ-Ｋ、Ｆ２、Ｒｄ、ＰＰＴ、Ｆ１及びＲｈ１）と培養した。 ＰＰＤ、Ｒｈ２、Ｒｇ３、ＰＰＴに対して起こった反応は薄層クロマトグラフィー（thin-layer chromatography、TLC）により確認した。
【０１１９】
これを再び確認するために、異なる４種類のジンセノサイド（ＰＰＤ、ＰＰＴ、Ｒｈ２、及びＲｇ３）とＰｇＵＧＴ７１Ａ１とを培養して、、組換えＰｇＵＧＴ７１Ａ１により転換された生成物をＴＬＣを通じて分析した。その結果を図２の上段に示した。転換如何の結果は移動したスポットの位置と標準試料として使用したＰＰＤ、ＰＰＴ、Ｒｈ２、Ｒｇ３、Ｃ−Ｋ、Ｆ２、Ｒｄ及びＦ１の移動スポットと比較して確認した。
【０１２０】
その結果、ＰｇＵＧＴ７１Ａ１は、ＰＰＤをＣ−Ｋ（Compound K）に、Ｒｇ３をＲｄに、Ｒｈ２をＦ２に、ＰＰＴをＦ１に転換させることを確認した（図２の上段）。
【０１２１】
また、 ＨＰＬＣを通じて再度確認し、その結果を図２の下部に示した。
【０１２２】
その結果、ＴＬＣの結果と同様に、ＰｇＵＧＴ７１Ａ１は、ＰＰＤをＣ−Ｋに、Ｒｇ３をＲｄに、Ｒｈ２をＦ２に、ＰＰＴをＦ１に転換させることを確認した（図２下段）。
【０１２３】
総合すると前記結果は、ＰｇＵＧＴ７１Ａ１はＰＰＤ系及びＰＰＴ系のジンセノサイドの２０位の炭素のヒドロキシル基にＵＤＰ−グルコースを転移する活性を有する酵素であることを示すことであり、特に、ＰＰＤ系のジンセノサイド及び６位の炭素に糖を有さない。
【０１２４】
実験例２：ジャスモン酸メチル（methyl jasmonate、MeJA）によるＰｇＵＧＴ７１Ａ１の発現増加
伝統的に薬用の目的で使用されてきた高麗人参の根に本発明のＰｇＵＧＴ７１Ａ１が主に発現されているかどうかを調査した。また、３つの異なるジンセノサイド生合成遺伝子であるダンマレンジオールＩＩシンターゼ（dammarenediol-II synthase、PgDS）、プロトパナキサジオール合成酵素（protopanaxadiol synthase、PgPPDS）及びプロトパナキサトリオール合成酵素（protopanaxatriol synthase、PgPPTS）を用いて、本発明のＰｇＵＧＴ７１Ａ１の器官特異的発現パターンを測定した。
【０１２５】
ジャスモン酸メチル（methyl jasmonate、MeJA）は、毛状根培養において高麗人参の生合成遺伝子の発現を増加させることが知られている。これに基づいて、ＭｅＪＡによって、例えば、本発明のＵＤＰ−糖転移酵素であるＰｇＵＧＴ７１Ａ１の発現が増加することができるかどうかを測定した。このため、ＬＤ条件下の生長チャンバー内で成長した１５ヶ月の高麗人参の葉と根を使用し、５日間毎日高麗人参の葉にＭｅＪＡを噴射し、ジンセノサイド生合成遺伝子の発現レベルを分析するために、６日目にサンプルを採取した。
【０１２６】
その結果、全てのジンセノサイド生合成遺伝子は、高麗人参の葉及び根のいずれに発現されており、本発明のＰｇＵＧＴ７１Ａ１の発現はＭｅＪＡ処理により、顕著に増加した（図３及び４）。
【０１２７】
総合すると前記結果は、前記結果は、本発明のＰｇＵＧＴ７１Ａ１が高麗人参の生合成に関与するタンパク質であることを示した。また、ＭｅＪＡは、本発明の糖転移酵素であるＰｇＵＧＴ７１Ａ１の発現を増加させるため、ＭｅＪＡをＰｇＵＧＴ７１Ａ１の発現増加に利用することができる。
【０１２８】
実験例３：酵母においてＣ−Ｋの新規合成を可能にするＰｇＵＧＴ７１Ａ１
Ｃ-Ｋ（compound K）の生産のために、ｐＲＳ４２４−ＤＳ、ｐＲＳ４２６−ｔＨＭＧ１、ｐＲＳ４２５−ＰＰＤ及びＰｇＵＧＴ７１Ａ１を含むｐＲＳ４２３−Ｃ-Ｋをを S. cerevisiaeＭＥＴ３ｐ−ＥＲＧ７に導入して、Ｃ-Ｋの生合成経路を有するS. cerevisiaeＣ-Ｋ菌株を製造した（図６）。
【０１２９】
酵母においてジンセノサイドＣ−Ｋが新規に生産されるかどうかを確認するために、メチオニンの存在下で１０ｄ（ＯＤ６００〜〜８０）の間、流加培養式発酵を用いてS. cerevisiaeＣ−Ｋ菌株を培養した。前記酵母細胞を遠心分離により集菌し、超音波処理で破砕した。ジンセノサイドはメタノールを使用して抽出し、Ｓｅｐ−ＰＡＫを使用して精製した。精製されたジンセノサイドをＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。ＰｇＵＧＴ７１Ａ１を含む酵母は、ＨＰＬＣでＣ−Ｋの保持時間と同一の１１．９７分で新たなピークを生成した（図７の（Ａ））。ＭＲＭにより検出されたＬＣ−ＭＳ／ＭＳで生成物の保持時間は１１．４６分であり、６４５．４から２３．２にトランジションされ、Ｃ−Ｋの保持時間と同一であった（図７の（Ｂ））。これらの結果は、ＰｇＵＧＴ７１Ａ１は酵母発酵を通じてジンセノサイドの新規な生産（４．５ｍｇ／Ｌ）を可能にすることを示す。
【０１３０】
実験例４：酵母においてジンセノサイドＦ１の新規合成を可能にするＰｇＵＧＴ７１Ａ１及びＰｇＰＰＴＳ
ジンセノサイドＦ１の生産のために、ｐＲＳ４２４−ＤＳ、ｐＲＳ４２６−ｔＨＭＧ１、ｐＲＳＰＰＤ、及びＰｇＵＧＴ７１Ａ１とＰｇＰＰＴＳを含むｐＲＳ４２３−Ｆ１をS. cerevisiae  ＭＥＴ３ｐ−ＥＲＧ７に導入して、ジンセノサイドＦ１の生合成経路を有するS. cerevisiae Ｆ１菌株を製造（図８）。
【０１３１】
酵母においてジンセノサイドＦ１が新規に生産されるかどうかを確認するために、メチオニンの存在下で１０ｄ（ＯＤ６００〜〜８０）の間、流加培養式発酵を用いて S. cerevisiaeＦ１菌株を培養した。前記酵母細胞を遠心分離により集菌し、超音波処理で破砕した。ジンセノサイドはブタノールを使用して抽出し、その後、ブタノールを蒸発させた。最後に、ジンセノサイドＦ１をメタノールにより再度抽出した。抽出されたジンセノサイドをＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。ＰｇＵＧＴ７１Ａ１及びＰｇＰＰＴＳを含む酵母は、ＨＰＬＣでＦ１の保持時間と同一の、新たなピークを６．０１分で生成した（図９の（Ａ））。ＭＲＭにより検出されたＬＣ−ＭＳ／ＭＳで観察された生成物は、保持時間が６．１３分であり、６６１．５から２０３にトランジションが示された（図９の（Ｂ））。これらの結果は、ＰｇＵＧＴ７１Ａ１及びＰｇＰＰＴＳが酵母発酵を通じてジンセノサイドＦ１の新規な生産を可能にすることを示す。
【０１３２】
実験例５：酵母においてジンセノサイドＦ２の新規合成を可能にするＰｇＵＧＴ７４Ａ１及びＰｇＵＧＴ７１Ａ１
ジンセノサイドＦ２の生産のために、ｐＲＳ４２４−ＤＳ、ｐＲＳ４２６−ｔＨＭＧ１、ｐＲＳＰＰＤ、及びＰｇＵＧＴ７４Ａ１とＰｇＵＧＴ７１Ａ１を含むｐＲＳ４２３をS. cerevisiae  ＭＥＴ３ｐ−ＥＲＧ７に導入して、ジンセノサイドＦ２の生合成経路を有するS. cerevisiaeＦ２菌株を製造した（図１０）。
【０１３３】
酵母においてジンセノサイドＦ２が新規に生産されるかどうかを確認するために、メチオニンの存在下で１０ｄ（ＯＤ６００〜〜８０）の間、流加培養式発酵を用いてS. cerevisiaeＦ２菌株を培養した。前記酵母細胞を遠心分離により集菌し、超音波処理で破砕した。ジンセノサイドはブタノールを使用して抽出し、その後、ブタノールを蒸発させた。最後に、ジンセノサイドＦ２をメタノールにより再度抽出した。抽出されたジンセノサイドをＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。ＰｇＵＧＴ７４Ａ１及びＰｇＵＧＴ７１Ａ１を含む酵母は、ＨＰＬＣでＦ２の保持時間と同一に、新たなピークを７．８１分で生成した（図１１の（Ａ））。ＭＲＭにより検出されたＬＣ−ＭＳ／ＭＳで観察された生成物の保持時間は７．３５分であり、８０７．５から６２７．５にトランジションが示されジンセノサイドＦ２の保持時間と同一であった（図１１の（Ｂ））。これらの結果は、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１及びＰｇＵＧＴ７１Ａ１が酵母発酵を通じてジンセノサイドＦ２の新規な生産を可能にすることを示す。
【０１３４】
実験例６：酵母においてジンセノサイドＲｄの新規合成を可能にするＰｇＵＧＴ７４Ａ１、ＰｇＵＧＴ９４Ｂ１及びＰｇＵＧＴ７１Ａ１
ジンセノサイドＲｄの生産のために、ｐＲＳ４２４−ＤＳ、ｐＲＳ４２６−ｔＨＭＧ１、ｐＲＳ４２５−ＰＰＤ、及びＰｇＵＧＴ７４Ａ１、ＰｇＵＧＴ９４Ｂ１及びＰｇＵＧＴ７１Ａ１を含むｐＲＳ４２３−ＲｄをS. cerevisiaeＭＥＴ３ｐ−ＥＲＧ７に導入して、ジンセノサイドＲｄの生合成経路を有するS. cerevisiaeＲｄ菌株を製造した（図１２）。
【０１３５】
酵母においてジンセノサイドＲｄが新規に生産されるかどうかを確認するために、メチオニンの存在下で１０ｄ（ＯＤ６００〜〜８０）の間、流加培養式発酵を用いて S. cerevisiaeＲｄ菌株を培養した。前記酵母細胞を遠心分離により集菌し、超音波処理で破砕した。ジンセノサイドはブタノールを使用して抽出し、その後、ブタノールを蒸発させた。最後に、ジンセノサイドＲｄをメタノールにより再度抽出した。抽出されたジンセノサイドをＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。ＰｇＵＧＴ７４Ａ１、ＰｇＵＧＴ９４Ｂ１及びＰｇＵＧＴ７１Ａ１を含む酵母は、ＨＰＬＣでＲｄの保持時間と同一に、新たなピークを５．８８分で生成した（図１３の（Ａ））。ＭＲＭにより検出されたＬＣ−ＭＳ／ＭＳで観察された生成物は、保持時間が５．９３分であり、９６９．５から７８９．５にトランジションが示され、ジンセノサイドＲｄの保持時間と同一であった（図１３の（Ｂ））。これらの結果は、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１、ＰｇＵＧＴ９４Ｂ１及びＰｇＵＧＴ７１Ａ１は酵母発酵を通じてジンセノサイドＲｄの新規な生産を可能にすることを示す。
【０１３６】
以上の説明から、本発明に属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、前記詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更又は改変された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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