(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１８１、１８４、１８９及び１９４からなる群から選択されるいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡを有効成分とする免疫賦活剤。
【請求項２】
配列番号１８１、１８４、１８９及び１９４からなる群から選択されるいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡを有効成分とする免疫賦活のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物又はＤＮＡの免疫賦活活性を予測する方法、該方法を利用した免疫賦活活性を有すると予測される微生物又はＤＮＡをスクリーニングする方法、及び、かかる微生物又はＤＮＡ等を有効成分として含む免疫賦活剤に関する。より詳しくは、微生物またはＤＮＡの免疫賦活活性のうち、ｐＤＣ細胞にインターフェロンα（ＩＦＮ−α）産生を誘導する活性に代表される、ＴＬＲ９受容体刺激を通じた免疫賦活活性について、ＤＮＡ配列の特性にもとづいて、高活性の微生物およびＤＮＡを効率的にスクリーニングする方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトや動物の体内に侵入したウイルスや細菌は免疫系の細胞によって認識・貪食される。免疫系は自然免疫系と獲得免疫系にわけることができる。Ｂ細胞、Ｔ細胞などは獲得免疫系の免疫細胞であり、長期に渡る抗原特異的な反応にかかわっている。これに対し、マクロファージ・ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞・樹状細胞などは自然免疫系の細胞とされており、短期かつ抗原非特異的な反応にかかわっている。自然免疫系は主として細菌やウイルス感染におけるプライマリーレスポンスを担い、中でも樹状細胞は強力かつ重要な構成細胞である。樹状細胞には極めて多くの亜種が存在するが、ミエロイド系樹状細胞（myeloid dendritic cell=ｍＤＣ）とＣＤ８＋樹状細胞（CD8+dendritic cell=ＣＤ８＋ＤＣ）及びプラズマサイトイド樹状細胞（plasmacytoid dendritic cell=ｐＤＣ）に大別することができる。このうちｐＤＣはウイルスに対して増殖阻害活性を示すＩＦＮ−αの体内における主要な産生細胞であり、抗ウイルス生体防御において極めて重要な役割を持っている。
【０００３】
ｐＤＣはエンドソーム内に局在するＴｏｌｌ様受容体（Toll-like receptor=ＴＬＲ）である、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９を発現しており、これらの受容体がそのリガンドによって刺激されることにより活性化され、ＩＦＮ−αを産生する。ＩＦＮ−αはＭｘＡなどのウイルス複製阻害因子、ウイルスを分解するＲＮＡ分解酵素の発現を誘導し、さらに他の免疫細胞であるマクロファージ、ＮＫ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、Ｂ細胞等の主要な免疫細胞を活性化し、強力なウイルス抵抗作用を誘導することが知られている（非特許文献１）。また、ＴＬＲ７のリガンドとしてウイルス由来一本鎖ＲＮＡや抗ウイルス剤であるイミダゾキノリン、ＴＬＲ９リガンドとして非メチル化ＣｐＧを含んだＤＮＡ配列が機能することが知られている。すなわち、ウイルス感染時には体内でｐＤＣの活性化およびＩＦＮ−α産生がおこり、上述のような連鎖的なウイルス抵抗反応が誘導される。このため、Ｂ型及びＣ型肝炎などのウイルス病の治療にあたって、遺伝子組換え等の手法により生産されたＩＦＮ−αタンパク質を筋肉内投与、皮下投与等の非経口投与する治療がおこなわれている。一方、ウイルスに対する免疫細胞の抵抗反応を、乳酸菌のような安全な食用微生物およびそれらの微生物による発酵食品を摂取して、経口的に誘導する例が数多く報告されている（非特許文献２）。しかし、このような報告の多くはマクロファージやｍＤＣ、ＮＫ細胞を活性化させているものであり、ｐＤＣを直接活性化してはいない。
【０００４】
最近になって、Lactococcus lactis JCM 5805等のごく一部の乳酸菌がｐＤＣを活性化し、ＩＦＮ−α産生を誘導することや、そのＩＦＮ−α産生誘導活性がＴＬＲ９に依存的であることが報告されている（特許文献１及び非特許文献３）。これらの報告において、筆者らは無作為に選抜した多種多様の乳酸菌の中から、ＩＦＮ−α産生誘導活性株をスクリーニングしている。しかし、高活性株はごく一部であり、１００ｐｇ／ｍＬ以上のＩＦＮ−α産生誘導活性株が１２５株中３株（２．４％）でしか得られなかったとされている。また、上記特許文献１及び非特許文献３には、ＩＦＮ−α産生誘導活性の高い乳酸菌をスクリーニングする技術として、マウス骨髄細胞中の樹状細胞（ＤＣ）と候補となる乳酸菌を共培養し、培養液中のＩＦＮ-αをＥＬＩＳＡ法で測定する方法が開示されている。また、同様の実験はマウスの脾臓を用いても行うことができる。しかし、いずれの方法においても、各乳酸菌を1株ずつ数日間純粋培養後、集菌、洗浄、凍結乾燥する必要があること、適齢期のマウスよりｐＤＣ細胞を取得、培養する必要があること、ＩＦＮ−α量をＥＬＩＳＡで測定する必要があることから、膨大な時間とコストを必要とするという欠点があった。
【０００５】
ところで、免疫賦活活性を有するオリゴヌクレオチド等のＤＮＡをスクリーニングする方法において、ＴＬＲ９リガンドとして知られる非メチル化ＣｐＧモチーフ含有ヌクレオチドに着目したスクリーニング方法が報告されている。例えば、非特許文献４には、ブタＴＬＲ９を強制発現させた動物細胞（トランスフェクタント）に、乳酸菌由来の非メチル化ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドや、乳酸菌由来の非メチル化ＣｐＧモチーフを含まないオリゴヌクレオチド等を接触させ、該トランスフェクタントにおけるＴＬＲ９への刺激の程度をＮＦ−κＢの活性化の程度を指標として、免疫賦活活性を有するオリゴヌクレオチドをスクリーニングする方法が、特許文献２（特開２００５−０２７６６５号公報）には、ブタＴＬＲ９を強制発現させた動物細胞（トランスフェクタント）に、乳酸菌等の被験微生物由来の試料（細胞壁や、非メチル化ＣｐＧモチーフを有するＤＮＡ断片等）を接触させ、該トランスフェクタントにおけるＴＬＲ９の活性の上昇の程度を指標として、前記試料や被験微生物が腸管免疫系を活性化するか否かを評価する方法が、特許文献３（特表２００２−５１７１５６号公報）には、非メチル化ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドをマクロファージと共培養し、培養上清中のＴｈ１サイトカイン産生量を指標として、ヒト免疫刺激活性を有するオリゴヌクレオチドをスクリーニングする方法が、開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０９１０８１号
【特許文献２】特開２００５−０２７６６５号公報
【特許文献３】特表２００２−５１７１５６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Immunol Rev (2010)  234 (1), 142-162
【非特許文献２】Br J Nutr (2011) 106 (4), 549-556
【非特許文献３】PLoS One. 2012; 7(4): e32588
【非特許文献４】Animal Science Journal (2004) 75(4), 377-382
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記の背景技術でも述べたように、ＩＦＮ−α産生誘導活性の高い乳酸菌をスクリーニングする従来の方法では、膨大な時間とコストを必要とした。ｐＤＣを刺激する微生物を効率的にスクリーニングする簡単な手段があれば、さらにスクリーニングの範囲を広げることが可能となり、結果としてより増殖効率の良い菌、香味の優れた菌の選抜が短時間で行えると考えられる。さらに、より幅広い食品への応用や、より高いＩＦＮ−α産生誘導活性株を取得することも可能になると考えられる。これらのことから、ＩＦＮ−α産生誘導活性の高い微生物の活性誘導物質の解明と、その特徴を利用した高活性微生物の効率的なスクリーニング法の開発が強く求められていた。また、上記の背景技術でも述べたように、食用微生物等を利用した従来の免疫賦活剤の多くは、マクロファージやｍＤＣ、ＮＫ細胞を活性化させているものであり、ｐＤＣを直接活性化してはいなかった。このため、ｐＤＣを直接刺激して、強力なウイルス耐性を誘導することができる微生物や、かかる微生物を利用した免疫賦活剤が求められていた。
【０００９】
本発明の課題は、微生物又はＤＮＡの免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性）を効率的に予測する方法、免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性）の高い微生物又はＤＮＡを効率的にスクリーニングする方法、及び、かかる微生物又はＤＮＡ等を有効成分として含む免疫賦活剤（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導剤）を提供することにある。また、本発明の課題は、ＩＦＮ−α産生誘導活性以外の免疫賦活反応のうち、ＴＬＲ９受容体刺激を通じた免疫賦活反応について、高活性であるところの微生物およびＤＮＡ断片を効率的にスクリーニングする方法を提供することや、ｐＤＣを直接刺激する微生物又はＤＮＡ等を有効成分として含む免疫賦活剤（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導剤）を提供すること等にある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
背景技術で述べたように、特許文献１および非特許文献３において、Lactococcus lactis JCM 5805等のＩＦＮ−α産生誘導活性がＴＬＲ９に依存的であることが報告されている。このことはこれらの乳酸菌の構成成分のうち、ＤＮＡがＩＦＮ−α産生誘導活性に必須であることを示している。本発明者らはこのことに着目し、ＩＦＮ−αが産生される乳酸菌はその染色体ＤＮＡに特殊な構造を有しており、その構造を明らかにすれば、微生物のゲノム情報や遺伝子のＤＮＡ配列情報等の公開データベースを利用して、その構造含むＤＮＡや微生物を検索することが可能であり、ＩＦＮ−α誘導活性の高いＤＮＡや微生物をより効率的にスクリーニングすることができると考え、研究を開始した。
【００１１】
前述のようにＤＮＡ断片のうち、非メチル化ＣｐＧモチーフを含むものが、ＴＬＲ９刺激活性をもつことが知られている。また、特許文献１および非特許文献３においても非メチル化ＣｐＧモチーフを含むオリゴＤＮＡがｐＤＣを活性化することが報告されている。本発明者は以上のことからＩＦＮ−α産生誘導活性の高いＤＮＡは非メチル化ＣｐＧモチーフ数が多く含まれていること、ＩＦＮ−α産生誘導活性の高い微生物は低い微生物に比べ、ゲノムＤＮＡ中により多くの非メチル化ＣｐＧモチーフ数が含んでいると予想した。
【００１２】
本発明者らはこの仮説に基づいて、非メチル化ＣｐＧモチーフ数の異なる同じヌクレオチド長のＤＮＡを合成し、非メチル化ＣｐＧモチーフ数とＩＦＮ−α産生誘導活性との相関関係を調べた。その結果、非メチル化ＣｐＧモチーフを全く持たないＤＮＡ断片や単位長さあたりの非メチル化ＣｐＧモチーフ数が著しく低い断片は活性が認められなかった。一方、予想に反して、非メチル化ＣｐＧモチーフ数が増加しても、ＩＦＮ−α産生誘導活性は必ずしも増加せず、両者の間に明確な正の相関関係は認められなかった。
【００１３】
さらに本発明者らは、ゲノム情報を用いて、特許文献１および非特許文献３でＩＦＮ−α産生誘導活性の高いとされた微生物菌株についてゲノム中の全非メチル化ＣｐＧモチーフ数を検索したところ、ＩＦＮ−α産生誘導活性の低い株のゲノム中の全非メチル化ＣｐＧモチーフ数よりも多いということはなかった。これらの結果から本発明者は、ＩＦＮ−α産生誘導活性の高いＤＮＡ断片であるためは、非メチル化ＣｐＧモチーフ数とは異なる何らかのＤＮＡ構造が必要であると推察し、それを解明すべく鋭意研究を重ねた。その結果、ＩＦＮ−α産生誘導活性の高いＤＮＡ断片は非メチル化ＣｐＧモチーフ数を多く有していると同時に、ＤＮＡ断片全体のＧＣ含量が低く、多くても４５％以下であること、ＧＣ含量が４５％から３５％の間において、ＧＣ含量とＩＦＮ−α産生誘導活性との間に負の相関関係があることを見出した。
【００１４】
さらに、非メチル化ＣｐＧモチーフ数の割合が高いことと、ＧＣ含量が低いことが相反する事象であることから、本発明者らは、ＩＦＮ−α産生誘導活性の高いＤＮＡ断片の非メチル化ＣｐＧモチーフ数（又はその割合）およびＧＣ含量をそれぞれ定義し、本発明を完成するに至った。さらに、本発明者は本定義にそって、各種微生物のゲノム構造を精査し、ゲノムＤＮＡの低ＧＣ含量領域における非メチル化ＣｐＧモチーフ数又はその割合が高い微生物が、ＩＦＮ−α産生誘導活性の高い微生物であることを証明し、本発明を完成させた。
【００１５】
すなわち、本発明は、
（１）以下の工程（Ａ）〜（Ｆ）を含むことを特徴とする、微生物の免疫賦活活性を予測する方法：
（Ａ）前記微生物のゲノムＤＮＡの塩基配列データをデータベースから入手する工程Ａ：
（Ｂ）前記微生物のゲノムＤＮＡの塩基配列データにおいて、互いに連続又は一部重複する５０ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲内の任意のＤＮＡ断片群の塩基配列データを得る工程Ｂ：
（Ｃ）前記ＤＮＡ断片群の各ＤＮＡ断片のＧＣ含量を確認する工程Ｃ：
（Ｄ）前記ＤＮＡ断片群のうち、ＧＣ含量が３５％以下、４０％以下又は４５％以下である低ＧＣ含量ＤＮＡ断片を、前記ゲノムＤＮＡの塩基配列上の対応する部分に配置し、該低ＧＣ含量ＤＮＡ断片によってカバーされる前記微生物のゲノムＤＮＡの領域を、前記微生物ゲノムにおける低ＧＣ含量領域とする工程Ｄ：
（Ｅ）前記低ＧＣ含量領域に含まれる非メチル化ＣｐＧモチーフ数を合計し、低ＧＣ含量領域非メチル化ＣｐＧモチーフ総数を算出するする工程Ｅ：
（Ｆ）前記工程（Ｅ）で算出された低ＧＣ含量領域非メチル化ＣｐＧモチーフ総数が、微生物のゲノムＤＮＡ １万ｂｐ当たり１００個以上である場合に、免疫賦活活性を有する微生物と予測する工程Ｆ：や、
（２）上記（１）に記載の方法において免疫賦活活性を有する微生物と予測した微生物を、免疫賦活活性を有すると予測される微生物として選抜する工程Ｈを含むことを特徴とする、免疫賦活活性を有すると予測される微生物をスクリーニングする方法や、
（３）工程ＤにおけるＧＣ含量が４０％以下であることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の方法や、
（４）微生物が、乳酸菌であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法や、
（５）乳酸菌が、球菌であることを特徴とする上記（４）に記載の方法や、
（６）免疫賦活活性が、プラズマサイトイド樹状細胞を介したＩＦＮ−α産生誘導活性であることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法に関する。
【００１６】
また、本発明は、
（７）以下の工程（Ｑ）〜（Ｓ）を含むことを特徴とする、免疫賦活活性を有すると予測されるＤＮＡをスクリーニングする方法：
（Ｑ）５０ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲内の任意のＤＮＡ断片群の塩基配列データを得る工程Ｑ：
（Ｒ）前記ＤＮＡ断片群の各ＤＮＡ断片のＧＣ含量を確認し、ＧＣ含量が３５％以下、４０％以下又は４５％以下であるＤＮＡ断片を選択する工程Ｒ：
（Ｓ）前記工程Ｒで選択されたＤＮＡ断片に含まれる非メチル化ＣｐＧモチーフ数を算出し、１ヌクレオチドあたりの非メチル化ＣｐＧモチーフ数が０．０１７個以上であるＤＮＡ断片を、免疫賦活活性を有する予測されるＤＮＡとして選抜する工程Ｓ：や、
（８）工程Ｑが、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法により、免疫賦活活性を有すると予測した微生物のゲノムＤＮＡの塩基配列データにおいて、５０ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲内の任意のＤＮＡ断片群の塩基配列データを得る工程であることを特徴とする上記（７）に記載の方法に関する。
【００１７】
さらに、本発明は、
（９）ＧＣ含量が３５％以下、４０％以下又は４５％以下であり、１ヌクレオチド当たりの非メチル化ＣｐＧモチーフ数が０．０１７個以上であり、かつ、５０ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲内であるＤＮＡを有効成分として含む免疫賦活剤や、
（１０）ＤＮＡが、配列番号１７３〜１７７、１７９〜１８１、１８３〜１８５、１８７〜１９０、１９４、２１３、２１４、２１６〜２２０、２２５、２２９、２３１及び２３３からなる群から選択されるいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡであることを特徴とする上記（９）に記載の免疫賦活剤や、
（１１）上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法により、免疫賦活活性を有する微生物と予測される微生物又はその処理物を有効成分として含む免疫賦活剤や、
（１２）微生物が、ＩＦＮ−α産生誘導活性を有する微生物であって、前記ＩＦＮ−α産生誘導活性が、前記微生物の乾燥物を骨髄由来樹状細胞の培養培地中に１０μｇ／ｍＬとなるように添加した後、３７℃、５％ ＣＯ２条件下で２日間、前記骨髄由来樹状細胞を培養した後の培養培地の上清中のＩＦＮ−α濃度が１００ｐｇ／ｍＬ以上となるＩＦＮ−α産生誘導活性であることを特徴とする上記（１１）に記載の免疫賦活剤や、
（１３）ロイコノストック属又はペディオコッカス属に属する乳酸菌又はその処理物を有効成分として含む上記（１１）又は（１２）に記載の免疫賦活剤に関する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によると、微生物又はＤＮＡの免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性）を効率的に予測する方法、免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性）の高い微生物又はＤＮＡを効率的にスクリーニングする方法、及び、かかる微生物又はＤＮＡ等を有効成分として含む免疫賦活剤（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導剤）を提供することができる。ｐＤＣを活性化し得る微生物又はＤＮＡを含む免疫賦活剤は、ｐＤＣを直接刺激して、強力なウイルス耐性を誘導することができる。
【００１９】
また、本発明の提供する微生物やＤＮＡのスクリーニング方法はｐＤＣのＩＦＮ−α産生誘導活性以外の免疫賦活反応のうち、ＴＬＲ９受容体刺激によって誘導される免疫賦活反応のスクリーニングにも効果があると考えられる。これらの代表的な例をあげれば、ＩＬ−１２産生誘導とそれに伴うＴｈ１／２バランスの改善による喘息等アレルギーの抑制や、ワクチン投与時のアジュバント効果、Ｂ細胞の活性化などがあげられる。これらの免疫賦活反応にはいずれも非メチル化ＣｐＧモチーフを含むオリゴＤＮＡや、特定の微生物が有効であるとされている(Nat Rev Immunol (2004) 4(4), 249-258、J Immunol (2013) 190 (4), 1591-1602)が、高活性配列や高活性株をスクリーニングする方法は明らかとなってはいない。さらに、ＤＮＡにおいては非天然型のＰＳ（ホスホロチオエート）結合を導入した骨格を有する等、合成コストや安全性の面でも課題が残されている。本発明によってスクリーニングされたＤＮＡや微生物は、この残された課題の解決や、ｐＤＣのＩＦＮ−α産生誘導活性以外の前述の免疫賦活活性を高めること等にも有効と考えられる。
【００２０】
後述の表１４からも分かるように、ゲノム全体に含まれる低ＧＣ含量領域非メチル化ＣｐＧモチーフ数は、非メチル化ＣｐＧモチーフの総数と逆の傾向を示す。一方で、ゲノム全体における非メチル化ＣｐＧモチーフ数の出現頻度は、ゲノムＤＮＡのＧＣ含量と非常に強い相関を示すことが報告されている (J. Med. Microbiol. 63 (2), pp. 293-308)。すなわち、低ＧＣ含量非メチル化ＣｐＧモチーフ数は、ゲノムＤＮＡのＧＣ含量と一定程度、負の相関を示す。また、微生物の多くはゲノムＤＮＡのＧＣ含量が４０％を超えており、非メチル化ＣｐＧモチーフの総数に対する低ＧＣ含量領域非メチル化ＣｐＧモチーフ総数の割合は通常それほど高くはなく、一定数以上（ゲノムの塩基数に対して一定割合以上）の低ＧＣ含量領域非メチル化ＣｐＧモチーフを有する微生物の割合はあまり高くない。そうすると、ゲノムの塩基数に対する低ＧＣ含量非メチル化ＣｐＧモチーフ総数が特定の割合以上であることを指標とした予測により、解析対象とする微生物を大きく絞り込むことが可能であり、本発明の微生物のスクリーニング方法は、スクリーニング方法としての有用性は極めて高いものと言える。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本願実施例１の実験において、各ＤＮＡ断片の非メチル化ＣｐＧモチーフ数とＩＦＮ−α産生誘導活性との相関関係を示す図である。
【図２】図１の実験結果のうち、ＤＮＡ断片のＧＣ含量が４５％又は４０％以下かどうかで、非メチル化ＣｐＧモチーフ数とＩＦＮ−α産生誘導活性との相関関係を分けて示した図である。図２Ａ：ＧＣ含量が４５％以下のＤＮＡ断片の結果を示す図である。図２Ｂ：ＧＣ含量が４５％を超えるＤＮＡ断片の結果を示す図である。図２Ｃ：ＧＣ含量が４０％以下のＤＮＡ断片の結果を示す図である。図２Ｄ：ＧＣ含量が４０％を超えるＤＮＡ断片の結果を示す図である。
【図３】図１の実験結果を、ＤＮＡ断片のＧＣ含量の程度によって、６群（「〜３０」（３０％以下）、「３０〜３５」（３０％より高く３５％以下）、「３５〜４０」（３５％より高く４０％以下）、「４０〜４５」（４０％より高く４５％以下）、「４５〜５０」（４５％より高く５０％以下）、「５０〜」（５０％より高い））に分け、各群毎に求めた「非メチル化ＣｐＧモチーフ１個当たりの活性」の平均値を示す図である。
【図４】本願実施例２の実験において、各ＤＮＡ断片の非メチル化ＣｐＧモチーフ数とＩＦＮ−α産生誘導活性との相関関係を示す図である。
【図５】図４の実験結果のうち、ＤＮＡ断片のＧＣ含量が４０％又は３５％以下かどうかで、非メチル化ＣｐＧモチーフ数とＩＦＮ−α産生誘導活性との相関関係を分けて示した図である。図５Ａ：ＧＣ含量が４０％以下のＤＮＡ断片の結果を示す図である。図５Ｂ：ＧＣ含量が４０％を超えるＤＮＡ断片の結果を示す図である。図５Ｃ：ＧＣ含量が３５％以下のＤＮＡ断片の結果を示す図である。図５Ｄ：ＧＣ含量が３５％を超えるＤＮＡ断片の結果を示す図である。
【図６】本願実施例３の実験の結果を、ＤＮＡ断片のＧＣ含量の程度によって、３群に分け、各群毎に求めた「非メチル化ＣｐＧモチーフ１個当たりの活性」の平均値を示す図である。図６Ａ：「〜４５」（４５％以下）、「４５〜５５」（４５％より高く５５％以下）、「５５〜」（５５％より高い）の３群に分けた図である。図６Ｂ：「４０〜」（４０％以下）、「４０〜５０」（４０％より高く５０％以下）、「５０〜」（５０％より高い）の３群に分けた図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、微生物の免疫賦活活性を予測する方法（以下、「本発明の微生物を予測する方法」とも表示する）、免疫賦活活性を有すると予測される微生物をスクリーニングする方法（以下、「本発明の微生物のスクリーニング方法」とも表示する）、ＤＮＡの免疫賦活活性を予測する方法（以下、「本発明のＤＮＡを予測する方法」とも表示する）、免疫賦活活性を有すると予測されるＤＮＡをスクリーニングする方法（以下、「本発明のＤＮＡのスクリーニング方法」とも表示する）、及び、かかる微生物又はＤＮＡ等を有効成分として含む免疫賦活剤（以下、「本発明の免疫賦活剤」とも表示する）に関する。
【００２３】
本明細書において非メチル化ＣｐＧモチーフとは、ＮＮＣＧＮＮ（但し、Ｎは、それぞれＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの任意のヌクレオチドを表す）で表記される６個のヌクレオチド配列（ヘキサマー）を意味する。また、本発明において、「ＤＮＡ」や「ゲノムＤＮＡ」や「ＤＮＡ断片」には、特に言及がない限りは、化合物としての実体を有するＤＮＡやゲノムＤＮＡやＤＮＡ断片のほか、ヌクレオチド配列（塩基配列）データであるＤＮＡやゲノムＤＮＡやＤＮＡ断片、すなわち、ＤＮＡ配列やゲノムＤＮＡ配列やＤＮＡ断片配列も含まれる。本発明における「ＤＮＡ」は、一本鎖であっても二本鎖であっても良く、また、該ＤＮＡが微生物に由来するＤＮＡである場合は、センス鎖であってもアンチセンス鎖であってもよい。本明細書における「微生物由来のＤＮＡ」には、（ｘ）その微生物から採取したＤＮＡ、及び、（ｙ）その微生物から採取したＤＮＡではないが、その微生物のゲノムＤＮＡやその転写産物の全部又は一部のヌクレオチド配列と同一の又は相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡが含まれる。ゲノムＤＮＡ等のＤＮＡが、細菌、ウイルス又は真菌等の微生物由来のＤＮＡである場合は、哺乳動物由来のＤＮＡである場合とは異なり、ＣｐＧモチーフのほとんどはメチル化されていないため、便宜上、ＣｐＧモチーフはすべて非メチル化ＣｐＧモチーフであるとみなす。また、本発明における免疫賦活活性としては、免疫賦活活性である限り特に制限されないが、プラズマサイトイド樹状細胞又はＢ細胞におけるＴＬＲ９の活性化を介した免疫賦活活性が好ましく、中でも、プラズマサイトイド樹状細胞におけるＴＬＲ９の活性化を介した免疫賦活活性がより好ましく、中でも、プラズマサイトイド樹状細胞におけるＴＬＲ９の活性化を介したＩ型インターフェロン（インターフェロンα及び／又はインターフェロンβ）産生誘導活性がさらに好ましく、中でも、プラズマサイトイド樹状細胞におけるＴＬＲ９の活性化を介したインターフェロンα産生誘導活性が特に好ましい。
【００２４】
＜１．微生物の免疫賦活活性を予測する方法＞
本発明の提示する微生物の免疫賦活活性を予測する方法は、以下の工程（Ａ）〜（Ｆ）を含むことを特徴とする。
（Ａ）前記微生物のゲノムＤＮＡの塩基配列データをデータベースから入手する工程Ａ：
（Ｂ）前記微生物のゲノムＤＮＡの塩基配列データにおいて、互いに連続又は一部重複する５０ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲内の任意のＤＮＡ断片群の塩基配列データを得る工程Ｂ：
（Ｃ）前記ＤＮＡ断片群の各ＤＮＡ断片のＧＣ含量を確認する工程Ｃ：
（Ｄ）前記ＤＮＡ断片群のうち、ＧＣ含量が３５％以下、４０％以下又は４５％以下である低ＧＣ含量ＤＮＡ断片を、前記ゲノムＤＮＡの塩基配列上の対応する部分に配置し、該低ＧＣ含量ＤＮＡ断片によってカバーされる前記微生物のゲノムＤＮＡの領域を、前記微生物ゲノムにおける低ＧＣ含量領域とする工程Ｄ：
（Ｅ）前記低ＧＣ含量領域に含まれる非メチル化ＣｐＧモチーフ数を合計し、低ＧＣ含量領域非メチル化ＣｐＧモチーフ総数を算出する工程Ｅ：
（Ｆ）前記工程（Ｅ）で算出された低ＧＣ含量領域非メチル化ＣｐＧモチーフ総数が、微生物のゲノムＤＮＡ １万ｂｐ当たり１００個以上である場合に、免疫賦活活性を有する微生物と予測する工程Ｆ：
【００２５】
本発明の微生物を予測する方法のメリットである、微生物の免疫賦活活性を効率的に予測し得る点は、特に、多種（例えば１０種以上、好ましくは２０種以上）の微生物の免疫賦活活性を予測する場合により多く享受することができる。
【００２６】
本発明における微生物としては、細菌、ウイルス及び真菌からなる群から選択される微生物が好ましく、中でも、細菌、ウイルスからなる群から選択される微生物がより好ましく、中でも、細菌がさらに好ましく、中でも、人体への安全性を確保しつつ、免疫賦活活性を得る観点から、乳酸菌、枯草菌がより好ましい。代表的な例として、ラクトコッカス属（Lactococcus）、ペディオコッカス属（Pediocccus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、テトラジェノコッカス属（Tetragenococcus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、エンテロコッカス属 (Enterococcus)等の乳酸菌が挙げられる。中でも、菌体が小さいためｐＤＣへより容易に取り込まれてより良い免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性）が得られる可能性が高い点から、ラクトコッカス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属、ストレプトコッカス属、テトラジェノコッカス属、エンテロコッカス属等の乳酸球菌がさらに好ましい。これらの代表的なものとして、ラクトコッカス ラクティス、ロイコノストック メセンテロイデス、ペディオコッカス ペントサセウスが挙げられる。
【００２７】
上記工程Ａとしては、微生物のゲノムＤＮＡの塩基配列（ヌクレオチド配列）データをデータベースから入手する工程である限り特に制限されず、用いるデータベースはＮＣＢＩ等の公共のものデータベースであってもよいし、私用のものデータベースであってもよい。用いる塩基配列データは、免疫賦活活性を予測する対象である微生物と同属同種の微生物のゲノムＤＮＡの塩基配列データである限り特に制限されず、予測する対象の微生物と同属同種の異株のゲノムＤＮＡの塩基配列データであってもよいが、予測する対象の微生物と同属同種同株のゲノムＤＮＡの塩基配列データが好ましい。また、本発明の微生物の予測方法を、後述の本発明の微生物のスクリーニング方法に用いる場合の「微生物のゲノムＤＮＡの塩基配列データ」は、スクリーニングの対象を広げる観点から、スクリーニングの対象である微生物と同属同種異株のゲノムＤＮＡの塩基配列データも、同属同種同株のゲノムＤＮＡの塩基配列データと同程度に好ましい。本発明の微生物の予測方法や、微生物のスクリーニング方法において、同属同種異株のゲノムＤＮＡの塩基配列データも用い得るのは、同属同種間ではゲノムＤＮＡの配列の類似性がかなり高く、ゲノムＤＮＡのＧＣ含量や、低ＧＣ含量領域非メチル化ＣｐＧモチーフ数がかなり類似しているからである（例えば後述の表１６参照）。同様に、本発明の微生物を予測する方法や、後述の本発明の微生物のスクリーニング方法の結果は、それに用いたゲノムＤＮＡが由来する微生物と同属同種同株に適用することが好ましいが、該微生物と同属同種の他株にも適用することができる。
【００２８】
本発明の微生物を予測する方法や、後述の本発明の微生物のスクリーニング方法に利用する「微生物のゲノムＤＮＡの塩基配列データ」としては、必ずしも、その微生物の全ゲノムＤＮＡの塩基配列データでなくてもよいが、免疫賦活活性の予測においてより高い精度を得る観点から、その微生物の全ゲノムＤＮＡの塩基配列データの少なくとも５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の割合のゲノムＤＮＡの塩基配列データが挙げられ、最も好ましくは全ゲノムＤＮＡの塩基配列データが挙げられる。
【００２９】
全ゲノムＤＮＡの塩基配列が公知となっている乳酸菌の名称と、ＮＣＢＩ等の配列データベースにおける該ヌクレオチド配列のアクセッション番号を以下の表１〜表３に例示する。
【００３０】
【表１】
0006455920.tif 000002
【００３１】
【表２】
0006455920.tif 000003
【００３２】
【表３】
0006455920.tif 000004
【００３３】
上記工程Ｂとしては、微生物のゲノムＤＮＡの塩基配列データにおいて、互いに連続又は一部重複する５０ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲内の任意のＤＮＡ断片群の塩基配列データを得る工程である限り特に制限されない。上記の「互いに連続する５０ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲内の任意のＤＮＡ断片群の塩基配列データを得る」とは、５０ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲内のＤＮＡ断片同士が互いに連続するようなＤＮＡ断片群の塩基配列データを得ることを意味し、互いに連続する２００ｂｐのＤＮＡ断片群の塩基配列データを得る場合を例に説明すると、例えば、ゲノムＤＮＡのヌクレオチド番号１〜２００のヌクレオチドからなるＤＮＡ断片、ヌクレオチド番号２０１〜４００のヌクレオチドからなるＤＮＡ断片、ヌクレオチド番号４０１〜６００のヌクレオチドからなるＤＮＡ断片、といったように、互いに連続するＤＮＡ断片群の塩基配列データを得ることが挙げられる。また、上記の「互いに一部重複する５０ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲内の任意のＤＮＡ断片群の塩基配列データを得る」とは、５０ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲内のＤＮＡ断片同士が互いに一部重複するようなＤＮＡ断片群の塩基配列データを得ることを意味し、互いに一部重複する２００ｂｐのＤＮＡ断片群の塩基配列データを、１００ｂｐ毎にスライドさせて得る場合を例に説明すると、例えば、ゲノムＤＮＡのヌクレオチド番号１〜２００のヌクレオチドからなるＤＮＡ断片、ヌクレオチド番号１０１〜３００のヌクレオチドからなるＤＮＡ断片、ヌクレオチド番号２０１〜４００のヌクレオチドからなるＤＮＡ断片、というように、互いに一部重複するＤＮＡ断片群の塩基配列データを得ることが挙げられる。
【００３４】
免疫賦活活性の評価や予測においてより高い精度を得る観点から、上記工程Ｂにおいて、互いに連続する任意のＤＮＡ断片群ではなく、互いに一部重複する任意のＤＮＡ断片群の塩基配列データを得ることが好ましい。
【００３５】
上記工程Ｂにおける任意のＤＮＡ断片群の長さは、５０ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲内である限り特に制限されないが、６０ｂｐ〜８００ｂｐの範囲内が好ましく、８０ｂｐ〜６００ｂｐの範囲内がより好ましく、１００ｂｐ〜５００ｂｐの範囲内がさらに好ましく、１５０ｂｐ〜４００ｂｐの範囲内（好ましくは１８０ｂｐ〜３５５ｂｐの範囲内）がより好ましく、１５０ｂｐ〜２３０ｂｐの範囲内又は２３０ｂｐ〜４００ｂｐの範囲内がさらに好ましく、１５０ｂｐ〜２３０ｂｐの範囲内がより好ましく、２００ｂｐがさらに好ましい。また、工程Ｂにおける任意のＤＮＡ断片群の長さは、５０ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲内である限り、すべて同じであってもよいし、異なるものを含んでいてもよいが、すべて同じ長さであることが好ましい。
【００３６】
「互いに一部重複する５０ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲内の任意のＤＮＡ断片群の塩基配列データを得る」ことの好適な態様として、５０ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲内のいずれかの長さのＤＮＡ断片の開始ヌクレオチドを、微生物のゲノムＤＮＡの塩基配列データ上で、１〜２０ｂｐの範囲内のいずれか毎（好ましくは１ｂｐ毎）にスライドさせて、ＤＮＡ断片群の塩基配列データを得る態様が挙げられる。
【００３７】
上記工程Ｃとしては、上記工程ＢにおけるＤＮＡ断片群の各ＤＮＡ断片のＧＣ含量（％）を確認する工程である限り特に制限されない。ＤＮＡ断片のＧＣ含量を確認する方法としては、上記工程Ａで入手した、その微生物のゲノムＤＮＡの塩基配列データから、各ＤＮＡ断片の塩基配列データが既知であることを用いて、その塩基配列に基づいてＧＣ含量（％）を算出して確認する方法が挙げられる。代表的な方法としては、ＧＥＮＥＴＹＸやＢｉｏＥｄｉｔのような塩基配列解析ソフトウェアを用いて、塩基配列に占めるグアニンおよびシトシンの塩基数をカウントし、その塩基数を、塩基配列全体の塩基数で除して、その割合（％）を求めることにより、ＧＣ含量（％）を算出することができる。
【００３８】
上記工程Ｄとしては、上記工程ＣのＤＮＡ断片群のうち、ＧＣ含量が３５％以下、４０％以下又は４５％以下である低ＧＣ含量ＤＮＡ断片を、ゲノムＤＮＡの塩基配列上の対応する部分に配置し、該低ＧＣ含量ＤＮＡ断片によってカバーされる微生物のゲノムＤＮＡの領域を、前記微生物ゲノムにおける低ＧＣ含量領域とする工程である限り特に制限されない。「低ＧＣ含量ＤＮＡ断片を、ゲノムＤＮＡの塩基配列上の対応する部分に配置し」における「ゲノムＤＮＡの塩基配列上の対応する部分」とは、ゲノムＤＮＡの塩基配列において、その低ＧＣ含量ＤＮＡ断片の塩基配列と一致する部分を意味する。また、「低ＧＣ含量ＤＮＡ断片を、ゲノムＤＮＡの塩基配列上の対応する部分に配置」する際、低ＧＣ含量ＤＮＡ断片同士の塩基配列がゲノムＤＮＡ上で連続している場合は、ゲノムＤＮＡの塩基配列上に低ＧＣ含量ＤＮＡ断片を連続して配置することになり、他方、低ＧＣ含量ＤＮＡ断片同士の塩基配列が一部重複している場合は、ゲノムＤＮＡの塩基配列上に一部重複させて配置することになる。また、工程Ｄにおける「配置し」は配列データ上で配置すればよい。
【００３９】
なお、上記工程Ｄで用いるＤＮＡ断片のＧＣ含量は３５％以下、４０％以下又は４５％以下であればよいが、より優れた免疫賦活活性をより高い確率で有する微生物であると評価又は予測する観点から、ＧＣ含量は４０％以下であることが好ましく、３５％以下であることがより好ましい。ただし、工程Ｄで用いるＤＮＡ断片のＧＣ含量が、３５％より高く４０％以下である場合や、ＧＣ含量が４０％より高く４５％以下である場合にも、優れた免疫賦活活性を有すると評価できる微生物が含まれているため、工程Ｄで用いるＧＣ含量の基準は状況に応じて適宜選ぶことができる。
【００４０】
上記工程Ｅとしては、微生物ゲノムＤＮＡにおいて上記工程Ｄで特定した低ＧＣ含量領域に含まれる非メチル化ＣｐＧモチーフ数を合計し、低ＧＣ含量領域非メチル化ＣｐＧモチーフ総数を算出する工程である限り特に制限されない。代表的な方法としては、ＧＥＮＥＴＹＸやＢｉｏＥｄｉｔのような塩基配列解析ソフトウェアを用いて、目的とする塩基配列に含まれる非メチル化ＣｐＧモチーフ数をカウントすることができる。
【００４１】
本発明の微生物の予測方法等において、各ＤＮＡ断片の非メチル化ＣｐＧモチーフ数の計測自体は、工程Ｃ及びＤを行った後に、工程Ｅにおいて初めて行ってもよいし、工程Ｂと工程Ｃの間や、工程Ｃと工程Ｄの間において行ってもよく、いずれの態様も、工程Ａ〜Ｆを含む本発明の微生物の予測方法に含まれるが、各ＤＮＡ断片間の非メチル化ＣｐＧモチーフ数の重複を排除する必要がなく、より簡便である点で、工程Ｄにおいて低ＧＣ含量領域を特定したのち、該領域に含まれる非メチル化ＣｐＧモチーフ数を計測して合計する方法が好ましく挙げられる。
【００４２】
上記工程Ｆとしては、上記工程Ｅで算出された低ＧＣ含量領域非メチル化ＣｐＧモチーフ総数が、微生物のゲノムＤＮＡ １万ｂｐ当たり１００個以上である場合に、前記微生物を、免疫賦活活性を有する微生物と予測する工程である限り特に制限されないが、より優れた免疫賦活活性をより高い確率で有する微生物であると予測する観点から、微生物のゲノムＤＮＡ １万ｂｐ当たりの前記低ＧＣ含量領域非メチル化ＣｐＧモチーフ総数が１２５個以上であることが好ましく、１５０個以上であることがより好ましい。微生物のゲノムＤＮＡ １万ｂｐ当たりの前記低ＧＣ含量領域非メチル化ＣｐＧモチーフ総数の上限は、特に制限されないが、非メチル化ＣｐＧモチーフ総数があまり増加すると、ゲノムＤＮＡのＧＣ含量が上昇し、低ＧＣ含量領域非メチル化ＣｐＧモチーフが減少するという関係があることから、自ずと上限があり、通常は、微生物のゲノムＤＮＡ １万ｂｐ当たりの前記低ＧＣ含量領域非メチル化ＣｐＧモチーフ総数は通常、５００個以下である。
【００４３】
本発明の微生物を予測する方法は、上記工程Ａ〜Ｆに加えて、さらに以下の工程Ｇを有していてもよく、特に、免疫賦活活性を予測したい微生物と、用いるゲノムＤＮＡが由来する微生物とが同属同種の異株の関係になる場合は、かかる工程Ｇを有していることが好ましい。なお、かかる工程Ｇにおける微生物は、実体を有する微生物に限られる。
（Ｇ）前記工程Ｆで免疫賦活活性を有すると予測した微生物の免疫賦活活性を測定する工程Ｇ：
【００４４】
上記工程Ｇをさらに有していると、微生物の免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性）を確実に評価することができる。工程Ｇで用いる微生物は、工程Ｆで免疫賦活活性を有すると予測した微生物であり、きわめて高い蓋然性で免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性）を有するため、すべての候補微生物について免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性）を測定する場合と比較して、微生物の免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性）を効率的に測定することができる。
【００４５】
本発明に用いる微生物は、例えば、理化学研究所 バイオリソースセンター(日本国  茨城県つくば市高野台３丁目１番地の１)、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門（http://www.nbrc.nite.go.jp）、American type culture collection（米国）、東京農業大学・菌株保存室（http://nodaiweb.university.jp/nric/；日本国  東京都世田谷区桜丘１丁目１番１号）、財団法人発酵研究所（日本国  大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号）、DANISCO社などから入手することができる。
【００４６】
上記工程Ｇにおいて測定対象とする免疫賦活活性としては、免疫賦活活性である限り特に制限されないが、プラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）におけるＴＬＲ９の活性化を介したＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−α及び／又はＩＦＮ−β）産生誘導活性が好ましく、中でも、ｐＤＣにおけるＴＬＲ９の活性化を介したＩＦＮ−α産生誘導活性がより好ましい。
【００４７】
上記工程Ｇにおける免疫賦活活性を測定する方法としては特に制限されず、公知の方法によって測定することができ、例えば、ＩＦＮ−α産生誘導活性を測定する場合の公知の方法として、以下の方法を好ましく挙げることができる。
【００４８】
（ｐＤＣを利用した、微生物のＩＦＮ−α産生誘導活性の詳細な測定方法）
マウス等の哺乳動物（好ましくはマウス）の大腿骨等から骨髄細胞を回収し、赤血球除去処理を行って、骨髄細胞を用意する。得られた骨髄細胞を、１０％ＦＣＳ、２μＭ  β−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ培地（ＳＩＧＭＡ社製）に、５×１０５個／ｍＬになるように懸濁する。得られた細胞培養液に、微生物の乾燥物（好ましくは凍結乾燥物、より好ましくは凍結乾燥菌体）を１０μｇ／ｍＬとなるように添加する。３７℃、５％ ＣＯ２に維持したインキュベーター内で２日間培養した後に上清を回収し、該上清中のＩＦＮ−α濃度を測定する。かかるＩＦＮ−α濃度の測定には、ＥＬＩＳＡ法によるキット（PBL Assay Science社製）を用いることができる。なお、微生物として生菌体を用いる場合は、培養した生菌体を一度凍結乾燥し、それをＰＢＳに懸濁した液体を、骨髄由来樹状細胞の細胞培養液に添加することが好ましい。
【００４９】
本発明における哺乳動物としては、マウス、ラット、モルモット、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等を挙げることができる。
【００５０】
本発明の微生物を予測する方法における、ＩＦＮ−α産生誘導活性を有する微生物の好適な態様としては、上記の「微生物のＩＦＮ−α産生誘導活性の詳細な測定方法」による培養上清中のＩＦＮ−α濃度が、５０ｐｇ／ｍＬ以上、好ましくは７５ｐｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１００ｐｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは１５０ｐｇ／ｍＬ以上、より好ましくは２００ｐｇ／ｍＬ以上である微生物を挙げることができる。
【００５１】
＜２．本発明の微生物のスクリーニング方法＞
本発明の免疫賦活活性を有すると予測される微生物をスクリーニングする方法は、本発明の微生物を予測する方法において免疫賦活活性を有すると予測した微生物を、免疫賦活活性を有すると予測される微生物として選抜する工程Ｈを含むことを特徴とする。選抜する対象である免疫賦活活性を有すると予測される微生物としては、低ＧＣ含量領域非メチル化ＣｐＧモチーフ総数が、微生物のゲノムＤＮＡ １万ｂｐ当たり、１００個以上である限り特に制限されないが、より優れた免疫賦活活性を有する微生物をより高い確率で得る観点から、１２５個以上であることが好ましく、１５０個以上であることがより好ましい。選抜する対象である微生物の、ゲノムＤＮＡ １万ｂｐ当たりの前記低ＧＣ含量領域非メチル化ＣｐＧモチーフ総数の上限は、特に制限されないが、通常、５００個以下である。
【００５２】
本発明の微生物のスクリーニング方法は、上記工程Ｈに加えて、さらに以下の工程Ｉ及び工程Ｊを有していてもよく、特に、選抜したい微生物と、用いるゲノムＤＮＡが由来する微生物とが同属同種の異株の関係になる場合は、かかる工程Ｉ及び工程Ｊを有していることが好ましい。なお、かかる工程Ｉ及び工程Ｊに用いる微生物は、実体を有する微生物に限られる。
（Ｉ）前記工程Ｈで選抜した免疫賦活活性を有すると予測される微生物の免疫賦活活性を測定する工程Ｉ：
（Ｊ）前記工程Ｉで免疫賦活活性が確認された微生物を、免疫賦活活性を有する微生物として選抜する工程Ｊ：
【００５３】
上記工程Ｉにおいて測定対象とする免疫賦活活性としては、免疫賦活活性である限り特に制限されないが、プラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）におけるＴＬＲ９の活性化を介したＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−α及び／又はＩＦＮ−β）産生誘導活性が好ましく、中でも、ｐＤＣにおけるＴＬＲ９の活性化を介したＩＦＮ−α産生誘導活性がより好ましい。
【００５４】
かかる工程Ｉ及び工程Jをさらに有していると、免疫賦活活性(好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性)を確実に有する微生物を選抜することができる。工程Ｉで用いる微生物は、工程Ｈで免疫賦活活性(好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性)を有すると予測される微生物として選抜した微生物であり、きわめて高い蓋然性で免疫賦活活性(好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性)を有するため、すべての候補微生物について免疫賦活活性(好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性)を測定して免疫賦活活性(好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性)を有する微生物を選抜する場合と比較して、免疫賦活活性(好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性)を有する微生物を効率的に選抜することができる。このように、本発明の微生物のスクリーニング方法は、免疫賦活活性を有する微生物の一次スクリーニングとして、好適に用いることもできる。
【００５５】
上記工程Ｉにおける微生物の免疫賦活活性(好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性)を測定する方法は、上記の本発明の微生物を予測する方法において述べたとおりである。
【００５６】
上記工程Jは、先に述べたように、「工程Ｉで免疫賦活活性が確認された微生物を、免疫賦活活性を有する微生物として選抜する工程Ｊ」であるが、好ましくは、「工程Ｉで免疫賦活活性が確認された微生物のうち、免疫賦活活性(好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性)の優れた微生物を選抜する工程Ｊ’」である。かかる工程J’における「免疫賦活活性(好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性)の優れた微生物を選抜する」ことには、上記の「微生物のＩＦＮ−α産生誘導活性の詳細な測定方法」によるＩＦＮ−αの濃度が、５０ｐｇ／ｍＬ以上、好ましくは７５ｐｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１００ｐｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは１５０ｐｇ／ｍＬ以上、より好ましくは２００ｐｇ／ｍＬ以上の微生物を選抜することや、上記の「微生物のＩＦＮ−α産生誘導活性の詳細な測定方法」によるＩＦＮ−αの濃度が、ラクトコッカス ラクティスＪＣＭ５８０５株のそのＩＦＮ−αの濃度に対して１２．５％以上、好ましくは１８．７５％以上、より好ましくは２５％以上、さらに好ましくは３７．５％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７５％以上、より好ましくは１００％以上の微生物を選抜することが含まれる。なお、ラクトコッカス ラクティスＪＣＭ５８０５株のＩＦＮ−α産生誘導活性はきわめて高いことが知られている（特許文献１）。
【００５７】
前述の本発明の微生物を予測する方法や、本発明の微生物のスクリーニング方法において、免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性）を有すると予測した微生物や、免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性）を有すると予測される微生物として選抜した微生物、中でも特に、免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性）を実際に測定し、免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性）を有する微生物と評価した微生物や、免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性）を有する微生物として選抜した微生物は、後述の免疫賦活剤（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導剤）などとして使用することができる。
【００５８】
＜３．本発明のＤＮＡを予測する方法＞
本発明のＤＮＡの免疫賦活活性を予測する方法は、以下の工程Ｋ〜Ｎを含むことを特徴とする。
（Ｋ）ＤＮＡの塩基配列データを入手する工程Ｋ：
（Ｌ）ＤＮＡのＧＣ含量を確認する工程Ｌ：
（Ｍ）ＤＮＡに含まれる非メチル化ＣｐＧモチーフ数を確認する工程Ｍ：
（Ｎ）ＧＣ含量が３５％以下、４０％以下又は４５％以下であり、かつ、１ヌクレオチド当たりの前記非メチル化ＣｐＧモチーフ数が０．０１７個以上であるＤＮＡを、免疫賦活活性を有するＤＮＡと予測する工程Ｎ：
【００５９】
本発明のＤＮＡを予測する方法のメリットである、ＤＮＡの免疫活性を効率的に予測し得る点は、特に、多種（例えば１０種以上、好ましくは２０種以上）のＤＮＡの免疫賦活活性を評価等する場合により多く享受することができる。
【００６０】
本発明のＤＮＡを予測する方法や、後述の本発明のＤＮＡのスクリーニング方法に用いるＤＮＡは、細菌、ウイルス、真菌等の微生物に由来するＤＮＡであってもよいし、いずれの微生物にも由来しない、任意に設計されたＤＮＡであってもよく、また、好適な態様として、本発明の微生物を予測する方法や、本発明の微生物のスクリーニング方法により、免疫賦活活性を有すると予測された微生物のゲノムＤＮＡの塩基配列データにおける５０ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲内の任意のＤＮＡ断片を挙げることができる。
【００６１】
本発明のＤＮＡを予測する方法や、後述の本発明のＤＮＡのスクリーニング方法に用いるＤＮＡの長さは、５０ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲内である限り特に制限されないが、６０ｂｐ〜８００ｂｐの範囲内が好ましく、８０ｂｐ〜６００ｂｐの範囲内がより好ましく、１００ｂｐ〜５００ｂｐの範囲内がさらに好ましく、１５０ｂｐ〜４００ｂｐの範囲内（好ましくは１８０ｂｐ〜３５５ｂｐの範囲内）がより好ましく、１５０ｂｐ〜２３０ｂｐの範囲内又は２３０ｂｐ〜４００ｂｐの範囲内がさらに好ましく、１５０ｂｐ〜２３０ｂｐの範囲内がより好ましく、１８０ｂｐ〜２１４ｂｐの範囲内がさらに好ましい。
【００６２】
上記工程Ｋとしては、ＤＮＡの塩基配列データを入手する工程である限り特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩ等の公共のデータベースや、私用のデータベースからＤＮＡの塩基配列データを入手してもよい。また、ＤＮＡの塩基配列データは、微生物由来のＤＮＡの塩基配列データであってもよいし、微生物由来のＤＮＡではなく、塩基配列を任意に決定したＤＮＡの塩基配列データであってもよい。
【００６３】
上記工程Ｌとしては、ＤＮＡのＧＣ含量を確認する工程である限り特に制限されず、ＤＮＡのＧＣ含量を確認する方法としては、上記工程Ｋで入手した、該ＤＮＡの塩基配列データの塩基配列に基づいてＧＣ含量（％）を算出して確認する方法が挙げられる。代表的な方法としては、ＧＥＮＥＴＹＸやＢｉｏＥｄｉｔのような塩基配列解析ソフトウェアを用いて、塩基配列に占めるグアニンおよびシトシンの塩基数をカウントし、その塩基数を、塩基配列全体の塩基数で除して、その割合（％）を求めることにより、ＧＣ含量（％）を算出することができる。
【００６４】
上記工程Ｍとしては、ＤＮＡに含まれる非メチル化ＣｐＧモチーフ数を確認する工程である限り特に制限されず、代表的な方法としては、ＧＥＮＥＴＹＸやＢｉｏＥｄｉｔのような塩基配列解析ソフトウェアを用いて、目的とする塩基配列に含まれる非メチル化ＣｐＧモチーフ数をカウントすることができる。
【００６５】
上記工程Ｌ及びＭはどちらの工程を先に行ってもよい。また、工程Ｌを先に行う場合、ＧＣ含量が３５％以下、４０％以下又は４５％以下であると確認されたＤＮＡについてのみ、次の工程Ｍで非メチル化ＣｐＧモチーフ数を確認してもよいし、他方、工程Ｍを先に行う場合、ＤＮＡ １ヌクレオチド当たりの非メチル化ＣｐＧモチーフ数が０．０１７個以上であるＤＮＡと確認されたＤＮＡについてのみ、次の工程ＬでＧＣ含量を確認してもよい。
【００６６】
上記工程Ｎとしては、ＧＣ含量が３５％以下、４０％以下又は４５％以下であり、かつ、１ヌクレオチド当たりの前記非メチル化ＣｐＧモチーフ数が０．０１７個以上であるＤＮＡを、免疫賦活活性を有するＤＮＡと予測する工程である限り特に制限されない。免疫賦活活性を有すると予測するＤＮＡのＧＣ含量は３５％以下、４０％以下又は４５％以下であるが、より優れた免疫賦活活性をより高い確率で有するＤＮＡであると評価又は予測する観点から、４０％以下のＤＮＡを選択することが好ましく、３５％以下のＤＮＡを選択することがより好ましい。ただし、ＧＣ含量が３５％より高く４０％以下のＤＮＡや、ＧＣ含量が４０％より高く４５％以下のＤＮＡの中にも、優れた免疫賦活活性を有するＤＮＡも含まれているため、選択するＤＮＡのＧＣ含量の基準は状況に応じて適宜選ぶことができる。
【００６７】
上記工程Ｎにおける、１ヌクレオチド当たりの非メチル化ＣｐＧモチーフ数としては、０．０１７個以上である限り特に制限されないが、より優れた免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性）を有するＤＮＡをより高い確率で得る観点から、０．０２５個以上であることが好ましく、０．０３７５個以上であることがより好ましく、０．０５個以上であることがさらに好ましく、０．０６２５個以上であることがより好ましく、０．０７５個以上であることがさらに好ましい。予測するＤＮＡにおける、１ヌクレオチド当たりの非メチル化ＣｐＧモチーフ数の上限は特に制限されないが、ＧＣ含量が４５％以下であることから自ずと上限があり、通常は、０．１２５個以下である。
【００６８】
本発明のＤＮＡを予測する方法は、上記工程Ｋ〜Ｎに加えて、さらに以下の工程Ｏを有していてもよい。なお、かかる工程Ｏに用いるＤＮＡは、化合物としての実体を有するＤＮＡに限られる。
（Ｏ）前記工程Ｎで免疫賦活活性を有すると予測したＤＮＡの免疫賦活活性を測定する工程Ｏ：
【００６９】
上記工程Ｏをさらに有していると、ＤＮＡの免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性）を確実に評価することができる。工程Ｏで用いるＤＮＡは、工程Ｎで免疫賦活活性を有すると予測したＤＮＡであり、きわめて高い蓋然性で免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性）を有するため、すべての候補ＤＮＡについて免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性）を測定する場合と比較して、ＤＮＡの免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性）を効率的に測定することができる。
【００７０】
上記工程Ｏに用いるＤＮＡを得る方法としては、既知の塩基配列情報に基づいてＤＮＡを調製する方法が挙げられ、代表的な方法としては、ＰＣＲによって目的とするＤＮＡ断片を増幅することや、その増幅ＤＮＡ断片を用いて該ＤＮＡ断片を発現する組換えＤＮＡを作製し、該組換えＤＮＡを宿主微生物に導入し、その宿主微生物内で目的とするＤＮＡ断片を発現させることや、化学的手法によって目的とするオリゴヌクレオチドを合成することが挙げられる。
【００７１】
上記工程Ｏにおいて測定対象とする免疫賦活活性としては、免疫賦活活性である限り特に制限されないが、プラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）におけるＴＬＲ９の活性化を介したＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−α及び／又はＩＦＮ−β）産生誘導活性が好ましく、中でも、ｐＤＣにおけるＴＬＲ９の活性化を介したＩＦＮ−α産生誘導活性がより好ましい。
【００７２】
上記工程Ｏにおける免疫賦活活性を測定する方法としては特に制限されず、公知の方法によって測定することができ、例えば、ＩＦＮ−α産生誘導活性を測定する場合の公知の方法として、以下の方法を好ましく挙げることができる。
【００７３】
（ｐＤＣを利用した、ＤＮＡのＩＦＮ−α産生誘導活性の詳細な測定方法）
上記の微生物のＩＦＮ−α産生誘導活性の詳細な測定方法において述べた方法で骨髄由来樹状細胞を調製する。ＩＦＮ−α産生誘導活性を測定したいＤＮＡを２μｇ／ｍＬとなるように該細胞の細胞培養液に添加し、４８時間後に培養上清を回収する。培養上清に含まれるＩＦＮ−α濃度を測定する。かかるＩＦＮ−α濃度の測定には、ＥＬＩＳＡ法によるキット（PBL Assay Science社製）を用いることができる。
【００７４】
本発明のＤＮＡを予測する方法における、ＩＦＮ−α産生誘導活性を有するＤＮＡの好適な態様としては、上記の「ＤＮＡのＩＦＮ−α産生誘導活性の詳細な測定方法」による培養上清中のＩＦＮ−α濃度が、５０ｐｇ／ｍＬ以上、好ましくは７５ｐｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１００ｐｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは１５０ｐｇ／ｍＬ以上、より好ましくは２００ｐｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは３００ｐｇ／ｍＬ以上、より好ましくは４００ｐｇ／ｍＬ以上であるＤＮＡを挙げることができる。
【００７５】
＜４．本発明のＤＮＡのスクリーニング方法＞
本発明の免疫賦活活性を有すると予測されるＤＮＡをスクリーニングする方法は、本発明のＤＮＡの免疫賦活活性を予測する方法において免疫賦活活性を有するＤＮＡと予測したＤＮＡを、免疫賦活活性を有すると予測されるＤＮＡとして選抜する工程Ｐを含むことを特徴とする。また、本発明のＤＮＡのスクリーニング方法のうち、好適な態様として、以下の工程（Ｑ）〜（Ｓ）を含むスクリーニング方法が挙げられる。
（Ｑ）５０ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲内の任意のＤＮＡ断片群を得る工程Ｑ：
（Ｒ）前記ＤＮＡ断片群の各ＤＮＡ断片のＧＣ含量を確認し、ＧＣ含量が３０％、４０％又は４５％以下であるＤＮＡ断片を選抜する工程Ｒ：
（Ｓ）前記工程Ｒで選抜された各ＤＮＡ断片に含まれる非メチル化ＣｐＧモチーフ数を算出し、１ヌクレオチドあたりの非メチル化ＣｐＧモチーフ数が０．０１７個以上であるＤＮＡ断片を、ＩＦＮ−α産生誘導活性を有すると予測されるＤＮＡとして選抜する工程Ｓ：
【００７６】
工程Ｑの好ましい態様として、本発明の微生物を予測する方法又は微生物をスクリーニングする方法により、免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性）を有する微生物と予測した微生物のゲノムＤＮＡにおいて、５０ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲内の任意のＤＮＡ断片群の塩基配列データを得る工程が挙げられる。
【００７７】
本発明のＤＮＡのスクリーニング方法において、選抜する対象であるＤＮＡとしては、ＧＣ含量が３５％以下、４０％以下又は４５％以下であり、かつ、１ヌクレオチド当たりの前記非メチル化ＣｐＧモチーフ数が０．０１７個以上であるＤＮＡである限り特に制限されないが、より優れた免疫賦活活性を有するＤＮＡをより高い確率で得る観点から、ＧＣ含量については、４０％以下のＤＮＡを選抜することが好ましく、３５％以下のＤＮＡを選抜することがより好ましい。ただし、ＧＣ含量が３５％より高く４０％以下のＤＮＡや、ＧＣ含量が４０％より高く４５％以下のＤＮＡの中にも、優れた免疫賦活活性を有するＤＮＡも含まれているため、選抜するＤＮＡのＧＣ含量の基準は状況に応じて適宜選ぶことができる。また、選抜するＤＮＡにおける、１ヌクレオチド当たりの非メチル化ＣｐＧモチーフ数としては、０．０１７個以上である限り特に制限されないが、より優れた免疫賦活活性を有するＤＮＡをより高い確率で得る観点から、０．０２５個以上であることが好ましく、０．０３７５個以上であることがより好ましく、０．０５個以上であることがさらに好ましく、０．０６２５個以上であることがより好ましく、０．０７５個以上であることがさらに好ましい。選抜するＤＮＡにおける、１ヌクレオチド当たりの非メチル化ＣｐＧモチーフ数の上限は特に制限されないが、ＧＣ含量が４５％以下であることから自ずと上限があり、通常は、０．１２５個以下である。
【００７８】
本発明のＤＮＡのスクリーニング方法は、上記工程Ｐ（又は上記工程Ｑ〜Ｓ）に加えて、さらに以下の工程Ｔ及び工程Ｕを有していてもよい。なお、かかる工程Ｔ及びＵに用いるＤＮＡは、化合物としての実体を有するＤＮＡに限られる。
（Ｔ）前記工程Ｐ（又は上記工程Ｑ〜Ｓ）で選抜した免疫賦活活性を有すると予測されるＤＮＡの免疫賦活活性を測定する工程Ｔ：
（Ｕ）前記工程Ｔで免疫賦活活性が確認されたＤＮＡを、免疫賦活活性を有するＤＮＡとして選抜する工程Ｕ：
【００７９】
かかる工程Ｔ及び工程Ｕをさらに有していると、免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性）を確実に有するＤＮＡを選抜することができる。工程Ｔで用いるＤＮＡは、工程Ｐ（又は上記工程Ｑ〜Ｓ）で免疫賦活活性を有すると予測されるＤＮＡとして選抜したＤＮＡであり、きわめて高い蓋然性で免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性）を有するため、すべての候補ＤＮＡについて免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性）を測定して免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性）を有するＤＮＡを選抜する場合と比較して、免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性）を有するＤＮＡを効率的に選抜することができる。このように、本発明のＤＮＡのスクリーニング方法は、免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性）を有するＤＮＡの一次スクリーニングとして、好適に用いることもできる。
【００８０】
上記工程ＴにおけるＤＮＡの免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性）を測定する方法は、上記の本発明のＤＮＡを予測する方法において述べたとおりである。
【００８１】
上記工程Ｕは、先に述べたように、「工程Ｔで免疫賦活活性が確認されたＤＮＡを、免疫賦活活性を有するＤＮＡとして選抜する工程Ｕ」であるが、好ましくは、「工程Ｔで免疫賦活活性が確認されたＤＮＡのうち、免疫賦活活性(好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性)の優れたＤＮＡを選抜する工程Ｕ’」である。かかる工程Ｕ’における「免疫賦活活性(好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性)の優れたＤＮＡを選抜する」ことには、上記の「ＤＮＡのＩＦＮ−α産生誘導活性の詳細な測定方法」によるＩＦＮ−αの濃度が、５０ｐｇ／ｍＬ以上、好ましくは７５ｐｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１００ｐｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは１５０ｐｇ／ｍＬ以上、より好ましくは２００ｐｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは３００ｐｇ／ｍＬ以上、より好ましくは４００ｐｇ／ｍＬ以上のＤＮＡを選抜することや、上記の「ＤＮＡのＩＦＮ−α産生誘導活性の詳細な測定方法」によるＩＦＮ−αの濃度が、murineＴＬＲ９リガンドであるＣｐＧオリゴヌクレオチド ＯＤＮ １５８５（InvivoGen社製）（配列番号２４２）を０．５μＭ（培地における終濃度）添加した場合（コントロール）のＩＦＮ−αの濃度に対して５０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは１００％以上、さらに好ましくは１２５％以上、より好ましくは１５０％以上、さらに好ましくは１７５％以上の割合となるＤＮＡを選抜することが含まれる。なお、上記ＯＤＮ １５８５の５’末端側の２個のｇと、３’末端側の６個のｇは、ホスホロチオエート結合したオリゴヌクレオチドである。
【００８２】
前述の本発明のＤＮＡを予測する方法や、本発明のＤＮＡのスクリーニング方法において、免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性）を有すると予測されるＤＮＡや、免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導活性）を有するＤＮＡとして選抜したＤＮＡは、後述の免疫賦活活性（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導剤）などとして使用することができる。
【００８３】
＜５．本発明の免疫賦活剤＞
本発明の免疫賦活剤は、特定の微生物若しくはその処理物、又は、特定のＤＮＡを有効成分として含む。上記特定の微生物は、本発明の微生物を予測する方法又は本発明の微生物のスクリーニング方法により、免疫賦活活性を有すると予測される微生物であり、上記特定のＤＮＡは、ＧＣ含量が３５％以下、４０％以下又は４５％以下であり、１ヌクレオチド当たりの非メチル化ＣｐＧモチーフ数が０．０１７個以上であり、かつ、５０ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲内であるＤＮＡである。
【００８４】
本発明の免疫賦活剤は、in vitro及びin vivoで免疫を賦活する。本発明の免疫賦活剤が発揮する免疫賦活活性としては、免疫賦活活性である限り特に制限されないが、プラズマサイトイド樹状細胞又はＢ細胞におけるＴＬＲ９の活性化を介した免疫賦活活性が好ましく、中でも、プラズマサイトイド樹状細胞におけるＴＬＲ９の活性化を介した免疫賦活活性がより好ましく、中でも、プラズマサイトイド樹状細胞におけるＴＬＲ９の活性化を介したＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−α及び／又はＩＦＮ−β）産生誘導活性がさらに好ましく、中でも、プラズマサイトイド樹状細胞におけるＴＬＲ９の活性化を介したＩＦＮ−α産生誘導活性が特に好ましい。したがって、本発明の免疫賦活剤としては、Ｉ型インターフェロン産生誘導剤が好ましく、ＩＦＮ−α産生誘導剤がより好ましい。
【００８５】
本発明の免疫賦活剤に用いる微生物やその好適な態様は上記［００２６］で述べたとおりであるが、本発明の免疫賦活剤には、免疫賦活活性を有することが確認された微生物を用いる。本発明の免疫賦活剤に用いる好適な微生物として、上記［００４８］に記載の「微生物のＩＦＮ−α産生誘導活性の詳細な測定方法」における培養後の培養培地の上清中のＩＦＮ−α濃度が７０ｐｇ／ｍＬ以上、好ましくは１００ｐｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１５０ｐｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは２００ｐｇ／ｍＬ以上、より好ましくは３００ｐｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは３５０ｐｇ／ｍＬ以上となる微生物や、上記の「微生物のＩＦＮ−α産生誘導活性の詳細な測定方法」によるＩＦＮ−αの濃度が、ラクトコッカス ラクティスＪＣＭ５８０５株のそのＩＦＮ−αの濃度に対して１２．５％以上、好ましくは１８．７５％以上、より好ましくは２５％以上、さらに好ましくは３７．５％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７５％以上、より好ましくは１００％以上の微生物が好ましく挙げられる。前述のＩＦＮ−α濃度が１００ｐｇ／ｍＬ以上となる微生物として、ロイコノストック メセンテロイデスのNBRC 3832株及びNBRC 102481株や、ペディオコッカス ペントサセウスのNBRC 101982株、JCM 20109株、NBRC 101986株、NBRC 3892株が特に好ましく挙げられる。なお、これらの６株は、後述の表１５に示されるように、アッセイにおける培養上清中のＩＦＮ−α濃度が１００ｐｇ／ｍＬ以上と、きわめて優れたＩＦＮ−α産生誘導活性を示した株である。なお、本明細書において、特定の微生物株には、それと同等の微生物株も含まれる。ここで、同等の微生物株とは、その特定の微生物株から由来している微生物株、又は、その特定の微生物株が由来する微生物株若しくはその微生物株の子孫微生物株を意味する。
【００８６】
微生物又はその処理物を有効成分として含む本発明の免疫賦活剤において、該微生物が細菌や真菌である場合、かかる微生物又はその処理物には、生菌体、死菌体、生菌体又は死菌体の破砕物、生菌体又は死菌体の凍結乾燥物、該凍結乾燥物の破砕物等が含まれ、また、生菌体又は死菌体の全部の処理物に限られず、一部の処理物も含まれる。また、前記微生物がウイルスである場合、かかる微生物又はその処理物には、ウイルス、ウイルスの破砕物、ウイルスの凍結乾燥物、該凍結乾燥物の破砕物等が含まれ、また、ウイルスの全部の処理物に限られず、一部の処理物も含まれる。ここで処理物には、酵素処理、熱処理等によって処理したもの、あるいは該処理したものをエタノール沈殿させ回収したものが含まれる。また、その微生物由来のＤＮＡも処理物に含まれる。微生物由来のＤＮＡを豊富に含んだ画分は、例えば酵素処理および熱処理によって（特開２００１−４６０２０号公報）、あるいはエタノールによる沈殿を回収することによって（特開２０００−２６２２４７号公報）製造することができる。本発明における微生物由来のＤＮＡを豊富に含んだ免疫賦活剤は、活性物質が濃縮されたより効果の高い免疫賦活剤として用いることができる。
【００８７】
上記微生物の生菌体やウイルス等は、微生物の種類に応じた公知の方法で該微生物を培養し、その培養物から得ることができる。例えば微生物が乳酸菌である場合、培地としては、ＭＲＳ培地、ＧＡＭ培地、ＬＭ１７培地を用いることができ、適宜無機塩類、ビタミン、アミノ酸、抗生物質、血清等を添加して用いることができ、また、培養は、２５〜４０℃で数時間〜数日行うことができる。培養後の培養物を遠心分離やろ過するなどして、上記微生物の生菌体やウイルス等を得ることができる。死菌体は、生菌体をオートクレーブ等により熱処理することにより得ることができる。
【００８８】
前述したように、本発明の免疫賦活剤は、特定の微生物若しくはその処理物ではなく、特定のＤＮＡを有効成分として含んでいてもよい。かかるＤＮＡとしては、ＧＣ含量が３５％以下、４０％以下又は４５％以下であり、１ヌクレオチド当たりの非メチル化ＣｐＧモチーフ数が０．０１７個以上（好ましくは０．０２５個以上、より好ましくは０．０３７５個以上、さらに好ましくは０．０５個以上、より好ましくは０．０６２５個以上、さらに好ましくは０．０７５個以上）であり、かつ、５０ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲内（好ましくは６０ｂｐ〜８００ｂｐの範囲内、より好ましくは８０ｂｐ〜６００ｂｐの範囲内、さらに好ましくは１００ｂｐ〜５００ｂｐの範囲内、より好ましくは１５０ｂｐ〜４００ｂｐの範囲内（好ましくは１８０ｂｐ〜３５５ｂｐの範囲内）、さらに好ましくは１５０ｂｐ〜２３０ｂｐの範囲内又は２３０ｂｐ〜４００ｂｐの範囲内、より好ましくは１５０ｂｐ〜２３０ｂｐの範囲内、さらに好ましくは１８０ｂｐ〜２１４ｂｐの範囲内）であるＤＮＡが挙げられる。本発明の免疫賦活剤に用いるＤＮＡとしては、その由来等に制限はないが、免疫賦活活性を有することが確認されたＤＮＡを用いる。本発明の免疫賦活剤に用いる好適なＤＮＡとしては、上記［００７３］に記載の「ＤＮＡのＩＦＮ−α産生誘導活性の詳細な測定方法」における培養後の培養培地の上清中のＩＦＮ−α濃度が５０ｐｇ／ｍＬ以上、好ましくは７５ｐｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１００ｐｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは１５０ｐｇ／ｍＬ以上、より好ましくは２００ｐｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは３００ｐｇ／ｍＬ以上、より好ましくは４００ｐｇ／ｍＬ以上であるＤＮＡや、上記の「ＤＮＡのＩＦＮ−α産生誘導活性の詳細な測定方法」によるＩＦＮ−αの濃度が、murineＴＬＲ９リガンドであるＣｐＧオリゴヌクレオチド ＯＤＮ １５８５（InvivoGen社製）（配列番号２４２）を０．５μＭ（培地における終濃度）添加した場合（コントロール）のＩＦＮ−αの濃度に対して５０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは１００％以上、さらに好ましくは１２５％以上、より好ましくは１５０％以上、さらに好ましくは１７５％以上の割合となるＤＮＡを挙げることができる。
【００８９】
本発明の免疫賦活剤に用いる好適なＤＮＡの具体例として、配列番号１７３〜１７７、１７９〜１８１、１８３〜１８５、１８７〜１９０、１９４、２１３、２１４、２１６〜２２０、２２５、２２９、２３１及び２３３からなる群から選択されるいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡを挙げることができ、より好ましくは、配列番号１７６、１７７、１８０、１８１、１８３〜１８５、１８７〜１９０、１９４、２１６、２１７、２２０及び２２９からなる群から選択されるいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡを挙げることができ、さらに好ましくは、配列番号１７６、１８０、１８１、１８４、１８５、１８８、１８９、１９０、１９４及び２２９からなる群から選択されるいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡを挙げることができる。
【００９０】
本発明の免疫賦活剤においては、上記特定の微生物及び／又はその処理物及び／又は特定のＤＮＡを併用してもよいし、２種以上の特定の微生物又はその処理物を併用してもよいし、２種以上の特定のＤＮＡを併用してもよい。
【００９１】
本発明の免疫賦活剤は、生体の免疫活性を高める医薬又は医薬組成物として用いることができる。該医薬は、既にＩ型インターフェロンの適応疾患と知られている、腎癌・多発性骨髄腫・慢性骨髄性白血病・ヘアリー細胞白血病・膠芽腫・髄芽腫・星細胞腫・悪性黒色腫・菌状息肉症・成人Ｔ細胞性白血病などを含むガン、亜急性硬化性全脳炎・ＨＴＬＶ−１脊髄症・Ｂ型肝炎・Ｃ型肝炎などを含むウイルス感染症、クラミジア（性病）・マイコバクテリウム（結核）・リステリア（敗血症など）・スタフィロコッカス（食中毒）・ヘリコバクター（胃炎）等の細菌による感染症、多発性硬化症などを含む自己免疫疾患の予防あるいは治療薬として用いることができる。特に前記医薬はウイルス感染防御及びウイルス感染治療剤として有用である。また、Ｉ型インターフェロンの活性として骨芽細胞から破骨細胞への分化抑制機能が知られていることから、骨そしょう症の予防あるいは治療薬としても用いることができる。
【００９２】
さらに、本発明の免疫賦活剤は、生体の免疫応答を増強し、ワクチンの効果を高めるアジュバントとして用いることもできる。本発明の免疫賦活剤をアジュバントとして用いる場合、アジュバントとして本発明の免疫賦活剤のみを用いてもよいし、他のアジュバントと併用してもよい。また、本発明の免疫賦活剤である微生物（好ましくは乳酸菌、より好ましくは乳酸球菌）中に、特定の疾患に対応する抗原を遺伝子工学的手法により発現させた微生物は、ワクチンとしても用いることができる。特に乳酸菌の細胞壁は胃酸から抗原を守る働きがあるため、このような異種抗原発現菌株は経口ワクチンのホストとして好適である。一般的にワクチンには生ワクチン、全粒子不活化ワクチン及びスプリットワクチンがあるが、生ワクチンにはウイルス強毒化の危険性があり、全粒子不活化ワクチンでは不純物による副作用懸念があり、最も安全性の高いスプリットワクチンでは有効性に問題がある。このような問題を克服するために目的の抗原のみを発現する組み換えワクチンの開発が進められているが、本発明の免疫賦活活性のある微生物（好ましくは乳酸菌、より好ましくは乳酸球菌）中で目的抗原を発現させれば、アジュバント効果も合わせて得られることとなり、極めて有用性が高い。
【００９３】
本発明の免疫賦活剤の形態は特に限定されず、例えば、粉末、顆粒、錠剤、シロップ、注射剤、点滴剤、散剤、座剤、懸濁剤、軟膏剤などが挙げられる。本発明の免疫賦活剤は、経口で投与してもよく、また経静脈投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸内投与、経皮投与、皮内投与、腹腔内投与等の非経口で投与してもよいが、経口投与が好ましい。前記免疫賦活剤は、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、着色剤等を含んでいても良い。賦形剤としてはブドウ糖、乳糖、コーンスターチ、ソルビット等が、崩壊剤としてはデンプン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン末、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、デキストリン等が、結合剤としてはジメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等が、滑沢剤としてはタルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、硬化植物油等がそれぞれ挙げられる。投与量は、投与する患者の年齢、体重、性別、疾患の相違、症状の程度により適宜決定することができ、１日１回又は数回に分けて投与すればよく、投与１回当たり菌数又はウイルス数にして１×１０９〜１×１０１２細胞又は個に相当する量の微生物を投与することができる。あるいは、微生物の乾燥重量換算で投与１回当たり１〜１０００ｍｇを投与することができる。
【００９４】
さらに、本発明の免疫賦活剤は、飲食品に含ませて用いることもでき、飲食物に含ませることによってその飲食品を免疫賦活用飲食品、免疫増強用飲食品、ウイルス感染防御用飲食品等として用いることができる。対象となる飲食品の種類は、本発明の免疫賦活剤の免疫賦活活性が阻害されないものであれば特に限定されない。例えば、乳・乳製品；飲料；調味料；酒類；農産・林産加工食品；菓子・パン類；穀粉・麺類；水産加工品；畜産加工品；油脂・油脂加工品；調理冷凍食品；レトルト食品；インスタント食品；食品素材などが挙げられる。この中でも、ヨーグルト、チーズ等の発酵乳製品や乳酸菌飲料に好適に用いることができる。発酵飲食品として用いる場合、免疫賦活活性を有する乳酸菌を発酵飲食品に死菌として所要量添加するほか、乳酸菌スターターとして用いて発酵飲食品を製造することもできる。
【００９５】
本発明における飲食品は、健康飲食品、特定保健用飲食品、栄養機能飲食品、健康補助飲食品等を含む。ここで、特定保健用飲食品とは、食生活において特定の保健の目的で摂取をし、その摂取により当該保健の目的が期待できる旨の表示をする飲食品をいう。これらの飲食品には、例えば、体の免疫機能を増強する、体の免疫機能を賦活する、風邪をひきにくくする、インフルエンザウイルス、ノロウイルスあるいはロタウイルス等のウイルスに感染しにくくする、発がん予防に効果を有する等の表示が付されていてもよい。
【００９６】
以下に、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００９７】
［Lactococcus lactis JCM 5805由来２００ｂｐ ＤＮＡ断片のＩＦＮ−α産生誘導活性評価］
Lc. lactis JCM 5805のＩＦＮ−α産生誘導活性が、該株のゲノム上の非メチル化ＣｐＧモチーフの総数に単純に依存しているかを評価するため、非メチル化ＣｐＧモチーフ数が様々に異なるＤＮＡ断片をＰＣＲにより調製した。具体的には、Lc. lactis JCM 5805のゲノム情報に基づいて、非メチル化ＣｐＧモチーフが５〜１５個含まれるような２００ｂｐ領域を３４箇所選抜し、それらの各領域を増幅するのに必要な３４種類のオリゴヌクレオチドプライマーセットを作製した。これらのプライマーセットにおける各プライマーと、その配列番号との対応関係を以下の表４〜６に示す。
【００９８】
【表４】
0006455920.tif 000005
【００９９】
【表５】
0006455920.tif 000006
【０１００】
【表６】
0006455920.tif 000007
【０１０１】
Lc. lactis JCM 5805の菌体から精製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、及び、前述の各プライマーセットを用いたＰＣＲを行った。各ＰＣＲによって得られた各反応物から、増幅したＤＮＡ断片をそれぞれ精製し、得られた純粋なＤＮＡ断片をＤＮＡライブラリーとした。上記ＰＣＲにはタカラバイオ社製のTaKaRa Ex Taq（登録商標）を用い、アニーリング温度を５５℃、伸長時間を２０秒として、３５サイクルの反応を行った。また、増幅したＤＮＡ断片の精製は、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社製）を用いて、ＰＣＲ反応物からプライマー等の夾雑物を除去することによって行った。
【０１０２】
各ＤＮＡ断片のＩＦＮ−α産生誘導活性はプラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）を利用する以下の方法で測定した。C57BL/6マウス骨髄細胞を大腿骨から常法に従って回収し、赤血球除去処理を行った。得られた骨髄細胞を、１０％ ＦＣＳ、２μＭ β−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ培地（SIGMA社製）に、５×１０５個／ｍＬになるように懸濁した。得られた細胞懸濁液に、ｐＤＣ誘導サイトカインとしてＦｌｔ−３Ｌ（R&D Systems社製）を終濃度１００ｎｇ／ｍＬで添加した。ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、５％ ＣＯ２にて７日間培養し、骨髄由来樹状細胞（ＢＭ−ＤＣ; bone marrow-derived dendritic cell) を得た。前述のＰＣＲで得られたＤＮＡライブラリーにおける各ＤＮＡ断片を２μｇ／ｍＬとなるように添加し、４８時間後に培養上清を回収した。培養上清に含まれるＩＦＮ−α量の測定には、ＥＬＩＳＡ法によるキット（PBL Assay Science社製）を用いた。
【０１０３】
各プライマーセットにより増幅されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す配列番号、該ＤＮＡ断片のＧＣ含量及び該ＤＮＡ断片を用いた上記アッセイにおける培養上清に含まれるＩＦＮ−α濃度（ｐｇ／ｍＬ）を以下の表７に記載する。
【０１０４】
【表７】
0006455920.tif 000008
【０１０５】
上記表７中の各ＤＮＡ断片の非メチル化ＣｐＧモチーフ数とＩＦＮ−α産生誘導活性（ＩＦＮ−α濃度(pg/mL)）との相関関係を図１に示す。図１から分かるように、各ＤＮＡ断片の非メチル化ＣｐＧモチーフ数とＩＦＮ−α産生誘導活性との間には明確な相関関係は認められなかった（決定係数Ｒ２＝０．２７１６）。この結果から、Lc. lactis JCM 5805のＩＦＮ−α産生誘導活性には、非メチル化ＣｐＧモチーフ数以外の因子が影響していることが示唆された。そこで、本発明者らは、前述のＤＮＡライブラリーにおける各ＤＮＡ断片についてさまざまな角度から検討を続け、試行錯誤を繰り返した結果、各ＤＮＡ断片におけるＧＣ含量の違いがＩＦＮ−α産生誘導活性に影響を与えていることをようやく見出した。
【０１０６】
図１の実験結果のうち、ＧＣ含量が４５％以下のＤＮＡ断片の実験結果を図２Ａに示し、ＧＣ含量が４５％を超えるＤＮＡ断片の実験結果を図２Ｂに示す。図２Ａに示す通り、ＧＣ含量が４５％以下となるようなＤＮＡ断片に限定した上で、非メチル化ＣｐＧモチーフ数とＩＦＮ−α産生誘導活性との相関関係を示すと、両者の間に強い相関（決定係数Ｒ２＝０．５０８）が認められた。一方、ＧＣ含量が４５％を超えるＤＮＡ断片では、図２Ｂに示す通り、非メチル化ＣｐＧモチーフ数とＩＦＮ−α産生誘導活性との間にはあまり明確な相関関係は認められなかった。図２Ｂにおいては、非メチル化ＣｐＧモチーフ数が比較的多いにもかかわらず、ＩＦＮ−α産生誘導活性が低い例や、非メチル化ＣｐＧモチーフ数が比較的少ないにもかかわらず、ＩＦＮ−α産生誘導活性が低い例が比較的多く見られた。
【０１０７】
図１の実験結果のうち、ＧＣ含量が４０％以下のＤＮＡ断片の実験結果を図２Ｃに示し、ＧＣ含量が４０％を超えるＤＮＡ断片の実験結果を図２Ｄに示す。図２Ｃに示す通り、ＧＣ含量が４０％以下となるようなＤＮＡ断片に限定した上で、非メチル化ＣｐＧモチーフ数とＩＦＮ−α産生誘導活性との相関関係を示すと、両者の間に強い相関（決定係数Ｒ２  ＝０．４８１１）が認められた。一方、ＧＣ含量が４０％を超えるＤＮＡ断片では、図２Ｄに示す通り、非メチル化ＣｐＧモチーフ数とＩＦＮ−α産生誘導活性との間にはあまり明確な相関関係は認められなかった。図２Ｄにおいては、非メチル化ＣｐＧモチーフ数が比較的多いにもかかわらず、ＩＦＮ−α産生誘導活性が低い例や、非メチル化ＣｐＧモチーフ数が比較的少ないにもかかわらず、ＩＦＮ−α産生誘導活性が低い例が比較的多く見られた。
【０１０８】
また、図１の実験結果において、各ＤＮＡ断片のＩＦＮ−α産生誘導活性の値を、各ＤＮＡ断片に含まれる非メチル化ＣｐＧモチーフ数の値で除した値を、各ＤＮＡ断片における非メチル化ＣｐＧモチーフ１個当たりの活性とした。算出したこの活性を、各ＤＮＡ断片のＧＣ含量の程度によって、６群（「〜３０」（３０％以下）、「３０〜３５」（３０％より高く３５％以下）、「３５〜４０」（３５％より高く４０％以下）、「４０〜４５」（４０％より高く４５％以下）、「４５〜５０」（４５％より高く５０％以下）、「５０〜」（５０％より高い））に分け、各群毎に「非メチル化ＣｐＧモチーフ１個当たりの活性」の平均値を求めた。その結果を図３に示す。図３の結果から、ＤＮＡ断片のＧＣ含量が低いほど、非メチル化ＣｐＧモチーフ１個当たりのＩＦＮ−α産生誘導活性が高くなる傾向が明確に示された。特に、ＧＣ含量が４５％以下のＤＮＡ断片では、ＧＣ含量が４５％を超えるＤＮＡ断片と比較して、非メチル化ＣｐＧモチーフ１個当たりのＩＦＮ−α産生誘導活性が顕著に高くなることが示された。
【０１０９】
なお、上記表７の結果から、ＩＦＮ−α濃度が２００ｐｇ／ｍＬ以上で、かつ、ＧＣ含量が４５％以下であるＤＮＡ断片群として、配列番号１７３〜１７７、１７９〜１８１、１８３〜１８５、１８７〜１９０及び１９４からなる群から選択されるいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡが挙げられ、ＩＦＮ−α濃度が３００ｐｇ／ｍＬ以上で、かつ、ＧＣ含量が４５％以下であるＤＮＡ断片群として、配列番号１７６、１７７、１８０、１８１、１８３〜１８５、１８７〜１９０及び１９４からなる群から選択されるいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡが挙げられ、ＩＦＮ−α濃度が４００ｐｇ／ｍＬ以上で、かつ、ＧＣ含量が４５％以下であるＤＮＡ断片群として、配列番号１７６、１８０、１８１、１８４、１８５、１８８、１８９、１９０及び１９４からなる群から選択されるいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡが挙げられた。また、配列番号１９５又は１９６のヌクレオチド配列からなるＤＮＡについては、ＧＣ含量が４５％を超えるものの、ＩＦＮ−α濃度が２００ｐｇ／ｍＬ以上のＤＮＡ断片として挙げられた。これらのＤＮＡ断片はＩＦＮ−α産生誘導活性に優れているため、本発明の免疫賦活剤（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導剤）として好適に用いることができる。
【実施例２】
【０１１０】
［Lactococcus lactis JCM 5805由来３００ｂｐ  ＤＮＡ断片のＩＦＮ−α産生誘導活性評価］
実施例１で示された傾向や結果が、２００ｂｐの長さのＤＮＡ断片に特異的な現象でないことを確認するため、実施例１と同様の方法により、２００ｂｐではなく、３００ｂｐの３５種類のＤＮＡ断片からなるライブラリーを作製した。このライブラリーを作製する際に用いた３５種類のプライマーセットにおける各プライマーと、その配列番号との対応関係を以下の表８〜１０に示す。
【０１１１】
【表８】
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【０１１２】
【表９】
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【０１１３】
【表１０】
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【０１１４】
上記ライブラリーにおける、３００ｂｐの３５種類のＤＮＡ断片について、実施例１と同様の方法により、ＩＦＮ−α産生誘導活性を測定した。各プライマーセットにより増幅されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す配列番号、該ＤＮＡ断片のＧＣ含量及び該ＤＮＡ断片を用いた上記アッセイにおける培養上清に含まれるＩＦＮ−α濃度を以下の表１１及び表１２に記載する。
【０１１５】
【表１１】
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【０１１６】
【表１２】
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【０１１７】
この測定試験は２回に分けて行った。１回目はプライマーセットＢ１、Ｂ５、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１１〜Ｂ１５、Ｂ１８、Ｂ１９、Ｂ２３、Ｂ２４、Ｂ２６〜Ｂ２９、Ｂ３２、Ｂ３３、Ｂ３５によるＤＮＡ断片について行い、２回目はその他のＤＮＡ断片について行った。表１１や表１２の相対活性（％）は、コントロールにおけるＩＦＮ−α（ｐｇ／ｍＬ）（１回目は１６１．２ｐｇ／ｍＬ、２回目は２３２．１ｐｇ／ｍＬ）に対する相対値（％）として示した。かかるコントロールとしては、murineＴＬＲ９リガンドであるＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ １５８５：InvivoGen社製）（配列番号２４２）を０．５μＭ（培地における終濃度）添加したサンプルを用いた。各ＤＮＡ断片に含まれる非メチル化ＣｐＧモチーフ数とＩＦＮ−α産生誘導活性との相関関係を図４に示す。
【０１１８】
図４の実験結果のうち、ＧＣ含量が４０％以下のＤＮＡ断片の実験結果を図５Ａに示し、ＧＣ含量が４０％を超えるＤＮＡ断片の実験結果を図５Ｂに示す。ＧＣ含量が４０％を超える場合（図５Ｂ）では、非メチル化ＣｐＧモチーフ数とＩＦＮ−α産生誘導活性との間に相関は認められなかったのに対して（図４における決定係数Ｒ２＝０．０５７５；図５Ｂにおける決定係数Ｒ２＝０．１４９）、ＧＣ含量が４０％以下の場合（図５Ａ）では非メチル化ＣｐＧモチーフ数とＩＦＮ−α産生誘導活性との間に強い正の相関（決定係数Ｒ２＝０．５４６３）が認められた。
【０１１９】
また、図４の実験結果のうち、ＧＣ含量が３５％以下のＤＮＡ断片の実験結果を図５Ｃに示し、ＧＣ含量が３５％を超えるＤＮＡ断片の実験結果を図５Ｄに示す。２００ｂｐのＤＮＡ断片を用いた実施例１の場合と同様に、全ての断片を対象とした場合（図４）や、ＧＣ含量が３５％を超える場合（図５Ｄ）では、非メチル化ＣｐＧモチーフ数とＩＦＮ−α産生誘導活性との間に相関は認められなかったのに対して（図４における決定係数Ｒ２＝０．０５７５；図５Ｄにおける決定係数Ｒ２＝０．０１２２）、ＧＣ含量が３５％以下の場合（図５Ｃ）では非メチル化ＣｐＧモチーフ数とＩＦＮ−α産生誘導活性との間に強い正の相関（決定係数Ｒ２＝０．６４２）が認められた。
【０１２０】
なお、上記表１１及び１２の結果から、ＩＦＮ−α濃度が２００ｐｇ／ｍＬ以上で、かつ、ＧＣ含量が４５％以下であるＤＮＡ断片群として、配列番号２１３、２１４、２１６〜２２０、２２５、２２９、２３１及び２３３からなる群から選択されるいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡが挙げられ、ＩＦＮ−α濃度が３００ｐｇ／ｍＬ以上で、かつ、ＧＣ含量が４５％以下であるＤＮＡ断片群として、配列番号２１６、２１７、２２０及び２２９からなる群から選択されるいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡが挙げられ、ＩＦＮ−α濃度が４００ｐｇ／ｍＬ以上で、かつ、ＧＣ含量が４５％以下であるＤＮＡ断片群として、配列番号２２９のヌクレオチド配列からなるＤＮＡが挙げられた。また、配列番号２３４、２３８及び２４０からなる群から選択されるいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡについては、ＧＣ含量が４５％を超えるものの、ＩＦＮ−α濃度が２００ｐｇ／ｍＬ以上のＤＮＡ断片として挙げられた。これらのＤＮＡ断片はＩＦＮ−α産生誘導活性に優れているため、本発明の免疫賦活剤（好ましくはＩＦＮ−α産生誘導剤）として好適に用いることができる。
【実施例３】
【０１２１】
［Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103由来３００ｂｐＤＮＡ断片の活性評価］
実施例１及び実施例２で示された傾向や結果が、Lactococcus lactis JCM 5805以外の乳酸菌に由来するDNA断片でも成立することを確認するため、代表的な免疫賦活乳酸菌であるLactobacillus rhamnosus ATCC 53103（ＬＧＧ）由来の３００ｂｐの１７種類のＤＮＡ断片からなるライブラリーを実施例１と同様の方法により作製した。このライブラリーを作製する際に用いた１７種類のプライマーセットにおける各プライマーと、その配列番号との対応関係を以下の表１３に示す。なお、プライマーの設計は、上記ＬＧＧ株のゲノム情報に基づいて行った。
【０１２２】
【表１３】
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【０１２３】
上記ライブラリーにおける、３００ｂｐの１７種類のＤＮＡ断片について、実施例１と同様の方法により、ＩＦＮ−α産生誘導活性を測定し、各ＤＮＡ断片における非メチル化ＣｐＧモチーフ１個当たりの活性を算出した。算出したこの活性を、各ＤＮＡ断片のＧＣ含量の程度によって、３群（「〜４５」（４５％以下）、「４５〜５５」（４５％より高く５５％以下）、「５５〜」（５５％より高い））に分け、各群毎に「非メチル化ＣｐＧモチーフ１個当たりの活性」の平均値を求めた。その結果を図６Ａに示す。図６Ａの結果から、ＤＮＡ断片のＧＣ含量が低いほど、非メチル化ＣｐＧモチーフ１個当たりのＩＦＮ−α産生誘導活性が高くなる傾向が明確に示された。特に、ＧＣ含量が４５％以下のＤＮＡ断片では、ＧＣ含量が４５％より高く５５％以下のＤＮＡ断片や、ＧＣ含量が５５％より高いＤＮＡ断片と比較して、非メチル化ＣｐＧモチーフ１個当たりのＩＦＮ−α産生誘導活性が顕著に高くなることが示された。このことから、ゲノムＤＮＡの低ＧＣ領域に局在する非メチル化ＣｐＧモチーフが顕著なＩＦＮ−α産生誘導活性を有していることは、Lc. lactis JCM 5805の株に特異的なものではないことが示された。
【０１２４】
また、先ほどは、３００ｂｐの１７種類のＤＮＡ断片の非メチル化ＣｐＧモチーフ１個当たりの活性を、各ＤＮＡ断片のＧＣ含量の程度によって「〜４５」（４５％以下）、「４５〜５５」（４５％より高く５５％以下）、「５５〜」（５５％より高い）の３群に分けたが、今度は、「〜４０」（４０％以下）、「４０〜５０」（４０％より高く５０％以下）、「５０〜」（５０％より高い）の３群に分け、各群毎に「非メチル化ＣｐＧモチーフ１個当たりの活性」の平均値を求めた。その結果を図６Ｂに示す。図６Ｂの結果から、ＤＮＡ断片のＧＣ含量が低いほど、非メチル化ＣｐＧモチーフ１個当たりのＩＦＮ−α産生誘導活性が高くなる傾向が明確に示された。特に、ＧＣ含量が４０％以下のＤＮＡ断片では、ＧＣ含量が４０％より高く５０％以下のＤＮＡ断片や、ＧＣ含量が５０％より高いＤＮＡ断片と比較して、非メチル化ＣｐＧモチーフ１個当たりのＩＦＮ−α産生誘導活性が顕著かつ有意（ｐ＜０．０５）に高くなることが示された。このことから、ゲノムＤＮＡの低ＧＣ領域に局在する非メチル化ＣｐＧモチーフが顕著なＩＦＮ−α産生誘導活性を有していることは、Lc. lactis JCM 5805の株に特異的なものではないことが示された。
【実施例４】
【０１２５】
［低ＧＣ領域に局在する非メチル化ＣｐＧモチーフ数に基づくスクリーニング］
実施例１〜３の結果から、ＧＣ含量が低い領域に存在する非メチル化ＣｐＧモチーフがＩＦＮ−α産生誘導活性に重要であることが示された。このことを利用すれば、ゲノム情報に基づいて、ＩＦＮ−α産生誘導活性が高い微生物が効率よくスクリーニングできると考えられた。これを検証すべく、各種乳酸菌の低ＧＣ領域に局在する非メチル化ＣｐＧモチーフ数を算出した。具体的には、以下のような方法で算出した。
【０１２６】
ゲノム配列が公開されている菌株（後述の表１４参照）を対象として、互いに一部重複する２００ｂｐのＤＮＡ断片群を、それぞれの菌株の全ゲノム配列について得た。互いに一部重複する２００ｂｐのＤＮＡ断片群を得る際には、２００ｂｐの断片の開始ヌクレオチドを、菌株のゲノムＤＮＡ配列上で１ｂｐ毎にスライドさせて、それぞれのＤＮＡ断片を得た。すなわち、その菌株のゲノムＤＮＡのヌクレオチド番号１〜２００のヌクレオチドからなるＤＮＡ断片、ヌクレオチド番号２〜２０１のヌクレオチドからなるＤＮＡ断片、ヌクレオチド番号３〜２０２のヌクレオチドからなるＤＮＡ断片、というように、互いに一部重複するＤＮＡ断片群を得た。これらＤＮＡ断片群の各ＤＮＡ断片のＧＣ含量を確認した。本実施例４では、ＤＮＡ断片群のうち、ＧＣ含量が３５％以下であるＤＮＡ断片を低ＧＣ含量ＤＮＡ断片とした。かかる低ＧＣ含量ＤＮＡ断片を、その菌株のゲノムＤＮＡの塩基配列上の対応する部分に配置し、該低ＧＣ含量ＤＮＡ断片によってカバーされる前記菌株のゲノムＤＮＡの領域を、前記菌株ゲノムにおける低ＧＣ含量領域とした。かかる低ＧＣ含量領域に含まれる非メチル化ＣｐＧモチーフを、低ＧＣ含量領域非メチル化ＣｐＧモチーフとし、前記菌株のゲノムＤＮＡ配列上における低ＧＣ含量領域非メチル化ＣｐＧモチーフ数を計測した。これらの一連の解析は、Perl言語を用いて本発明者らが独自でソースコードを作成したシステムを使用して行った。同様のシステムは、コンピュータープログラミングの当業者であれば、容易に作成することができる。
【０１２７】
各種乳酸菌の公開情報に基づいて、上記低ＧＣ含量領域非メチル化ＣｐＧモチーフ数を解析した結果を表１４に示す。
【０１２８】
【表１４】
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【０１２９】
表１４から分かるように、菌種によって、このような条件を満たす低ＧＣ含量領域非メチル化ＣｐＧモチーフの数は大きく異なることが明らかとなった。また、ゲノム全体に含まれる非メチル化ＣｐＧモチーフ総数と、低ＧＣ領域に分布する低ＧＣ含量領域非メチル化ＣｐＧモチーフ数との間には正の相関は認められず、むしろゲノム全体に含まれる非メチル化ＣｐＧモチーフ総数が多い菌種ほど、低ＧＣ含量領域非メチル化ＣｐＧモチーフ数は少ない傾向が見られた。これは、非メチル化ＣｐＧモチーフがＮＮＣＧＮＮ（ただしＮは、Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃの中の任意のヌクレオチド）という最低でも３３．３％のＧＣ含量を示す配列であり、非メチル化ＣｐＧモチーフ数が多ければその領域は低ＧＣ領域ではなくなる傾向があることを考えれば、合理性のあることと考えられる。
【０１３０】
表１４の結果から、低ＧＣ含量領域非メチル化ＣｐＧモチーフをゲノム上に多く含む種としてLactococcus lactis、Leuconostoc mesenteroides、Pediococcus pentosaceusを、逆に少ない種としてLactobacillus plantarum、Lb. casei、Lb. rhamnosus、Lb. fermentumを選抜した。これらの各々の種に属する様々な菌株のＩＦＮ−α産生誘導活性を評価することで、低ＧＣ含量領域非メチル化ＣｐＧモチーフ数を指標とする本発明のスクリーニング手法の有用性を検討した。菌株のＩＦＮ−α産生誘導活性の評価は以下のような方法で行った。
【０１３１】
１０ｍＬのＭＲＳ培地（OXOID社製）がそれぞれ分注された各コニカルチューブ（１５  ｍＬ容量）に、各菌株を接種した後、各チューブに密栓し、３０℃ないし３７℃で２日間静置培養した。培養後の培養液を高速遠心することで得られた菌体をＰＢＳで２回洗浄して上清を取り除き、−８０℃で２時間凍結した。この凍結菌体からエバポレーションによって水分を除去し、凍結乾燥菌体を得た。得られた各凍結乾燥菌体をＰＢＳに懸濁し、１０ｍｇ／ｍＬの懸濁液を調製した後、実施例１に記載した方法で調製した骨髄由来樹状細胞（ＢＭ−ＤＣ）にそれぞれ１０μｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃、５％ ＣＯ２に維持したインキュベーター内で２日間培養した後に上清を回収し、ＥＬＩＳＡキットを用いて該上清中のＩＦＮ−α濃度を測定した。その結果を以下の表１５に示す。
【０１３２】
【表１５】
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【０１３３】
表１５に示す通り、１００ｐｇ／ｍＬ以上という強力なＩＦＮ−α産生誘導活性を示す菌株が、Lc. lactisでは３株中２株（６７％の割合）、Leuconostoc mesenteroidesでは１０株中２株（２０％の割合）、Pediococcus pentosaceusでは１８株中４株（２２％の割合）に認められた。無作為に乳酸菌をスクリーニングした過去の報告によると（非特許文献３）、１００ｐｇ／ｍＬ以上のＩＦＮ−α産生誘導活性株は１２５株中３株（２．４％の割合）でしか得られなかったことを考慮すると、低ＧＣ含量領域非メチル化ＣｐＧモチーフ数を指標とする本発明のスクリーニング手法が、強力なＩＦＮ−α産生誘導活性を示す微生物を効率良くスクリーニングする手法として極めて有用であることが示された。
【０１３４】
なお、同属同種であれば、異株であっても、ゲノムＤＮＡのＧＣ含量や、ゲノムＤＮＡ上の非メチル化ＣｐＧモチーフ総数や、低ＧＣ含量領域非メチル化ＣｐＧモチーフ数がどの程度類似しているかを、上記表１５中のいくつかの同属同種の乳酸菌について、それぞれ３株ずつ確認した。その結果を以下の表１６に示す。
【０１３５】
【表１６】
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【０１３６】
表１６の結果から、同属同種間ではゲノムＤＮＡのＧＣ含量や、ゲノムＤＮＡ上の非メチル化ＣｐＧモチーフ総数や、低ＧＣ含量領域非メチル化ＣｐＧモチーフ数がかなり類似していることが示された。これは、同属同種間ではゲノムＤＮＡの類似性がかなり高いことからして、当然の結果といえる。したがって、本発明の微生物を評価等する方法や、後述の本発明の微生物のスクリーニング方法における「ゲノムＤＮＡ」として、同属同種の異株のゲノムＤＮＡを用いてもよい。また、本発明の微生物を評価等する方法や、後述の本発明の微生物のスクリーニング方法の結果は、それに用いたゲノムＤＮＡが由来する微生物と同属同種の他株にも適用することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１３７】
本発明によると、微生物又はＤＮＡの免疫賦活活性を効率的に予測する方法、免疫賦活活性の高い微生物又はＤＮＡを効率的にスクリーニングする方法、及び、かかる微生物又はＤＮＡ等を有効成分として含む免疫賦活剤を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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