(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質修飾組織因子、トロンビン及びフィブリノーゲンを含む、出血の治療又はシーラントのための組成物。
【請求項２】
組織因子のＮ−グリコシル化部位の少なくとも１個が機能していない、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組織因子が、組織因子タンパク質を含む第１の部分と、別のペプチド又はタンパク質を含む第２の部分とを含む融合タンパク質である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
第２の部分がタグである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
脂質修飾組織因子が、Ｎ−グリコシル化部位の少なくとも１個が機能していない成熟ヒト組織因子タンパク質を含む第１の部分と、Ｈｉｓ−タグを含む第２の部分とを有する融合タンパク質である、請求項１から４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項６】
融合タンパク質が配列番号５に対応する、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
トロンビンがヒトトロンビンである、請求項１から６の何れか一項に記載の組成物。
【請求項８】
フィブリノーゲンがヒトフィブリノーゲンである、請求項１から７の何れか一項に記載の組成物。
【請求項９】
請求項１から８の何れか一項に記載の組成物と、物質キャリアとを含むシーラント組成物。
【請求項１０】
治療上有効な量の、請求項１から８の何れか一項に記載の組成物を、その他の適切な薬学的に又は獣医学的に許容される賦形剤及び／又はキャリアと共に含む、出血の治療又はシーラントのための薬学的組成物。
【請求項１１】
シーラント組み合わせ又はシーラント組成物である、請求項１から８の何れか一項に記載の組成物又は請求項９に記載のシーラント組成物。
【請求項１２】
請求項１から８の何れか一項に記載の組成物、請求項９に記載のシーラント組成物、又は請求項１０に記載の薬学的組成物を含む、出血の治療又はシーラントのための医薬。
【請求項１３】
出血の治療のための、請求項１から８の何れか一項に記載の組成物、請求項９に記載のシーラント組成物、又は請求項１０に記載の薬学的組成物を含む、医薬。
【請求項１４】
請求項１から８の何れか一項に記載の組成物と、組成物を構成する全ての成分の同時投与を可能にするアプリケータとを含む、出血の治療又はシーラントのためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シーラント組成物の分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
損傷後に出血を止めるために誘発される一連の生理学的機序は、止血として知られている。止血は、様々な分子及び細胞型を含む非常に複雑なプロセスである。止血の研究を容易にするために、止血を以下の４つの重複する工程に細分化することができる：ｉ）血管収縮、ｉｉ）創傷の領域における初期の血小板血栓の形成、ｉｉｉ）フィブリン耐性凝塊の形成（凝塊カスケード）及びｉｖ）創傷の治癒プロセスが始まる、凝塊溶解工程又はフィブリン溶解。
【０００３】
血漿中では可溶で不活性な型である第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）と、組織因子（以下において「ＴＦ」とも称する）として知られる、第ＶＩＩ因子に特異的な受容体との相互作用により、凝固カスケードの外因経路が開始される。ＴＦの天然型では、ＴＦは、血管を囲む様々な細胞型の表面上に主に位置している。従って、通常の条件下では、ＴＦは、損傷又は創傷の場合に血漿分子に特異的に接触する。血管の破裂後、ＴＦとＦＶＩＩとの会合により凝固カスケードが開始され、この凝固カスケードにより、その後の様々な血液凝固因子間の相互作用が誘発される。最終的にはトロンビン（ＦＩＩａ）が形成され、次いで、トロンビンが、血漿中に非常に大量に存在するフィブリノーゲン（ＦＩ）をフィブリン繊維に変換させる。このフィブリン繊維は不溶性であり、網目を形成し、血小板と共にフィブリン凝塊として知られるものになる。
【０００４】
大量出血の場合での速やかな止血を容易にすることを目的として、直圧、ガーゼの充填、縫合糸のような糸及び止血帯等の様々な手段が数世紀にもわたって使用されている。これらの技術は効果的ではあるものの「非能動的な」止血手段として知られており、様々な種類の包帯と共に使用する場合に止血プロセスで役立つ。
【０００５】
外科的な止血設定を改善するために、過去数十年にわたり、従来の技術に加えて、止血の改善に役立つ可能性がある「有効」成分を含有する新規の製品の開発に大きな努力が払われている。この点に関して、組織接着剤又はフィブリンシーラント（以下においてＦＳとも称する）は、急速に発展している止血剤／接着剤製品の産業のための新規の戦略を示す。創傷の端を閉塞するためにＦＳを使用するという概念は比較的新しい考え方である。実際には、１９９８年に、最初に承認されたＦＳ（Ｔｉｓｓｅｅｌ、Ｂａｘｔｅｒ）の使用がＦＤＡに認可された。その後、Ｔｉｓｅｅｌ（Ｉｍｍｕｎｏ、ヴィエナ、オーストリア）、Ｂｅｒｉｐｌａｓｔ（ＢｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅＡＧ）、Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（Ｂａｘｔｅｒ）及びＢｉｏｃｏｌ（ＣＲＴＳ）等の商業的に調製されたフィブリンシーラントがほとんど１５年にわたり広く世界的に使用されている。
【０００６】
ＦＳは多くの外科的応用を有し、主にＦＩ、ＦＩＩａ、塩化カルシウムから成り、活性化第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩａ）から成る場合もある。いくつかの調製物では、又は特定の適応では、凝塊の溶解を防止するために抗フィブリン溶解剤（アプロチニン、トラネキサム酸）が含まれる。ＦＳは、ＦＩＩａの触媒作用に起因してＦＩがフィブリンに形質転換される間に、凝固カスケードの最終段階を模倣するように設計されている。形成されるフィブリン繊維は血小板と密接に会合するようになり、フィブリン凝塊の形成をもたらす。そのような相互作用では、ＦＸＩＩＩａの存在により、結果として生じるフィブリンネットワークの配置が耐性及び弾性に関して最適な構造配座を獲得することが可能になることから、ＦＸＩＩＩａは重要な役割を果たす。
【０００７】
ＦＳにより、血液中に天然に存在するＦＩ及びＦＩＩａと比べてはるかに高い濃度でＦＩ及びＦＩＩａが生じ、それにより、固体凝塊の速い形成が可能になる。従って、ＦＩ及びＦＩＩａは、その他の血液成分から独立して重合し、たとえ血液が存在しない場合でも最良に機能する。
【０００８】
ＦＩ及びＦＩＩａの重合が非常に速い（５秒未満）ことから、両方の成分を、それらを使用するまで別々のバイアル中に保持しなければならない。従って、市販のＦＳは、内容物が投与部位で混合される２本の独立したシリンジ中に存在する。
【０００９】
ＦＳの作用機序は、投与部位で閉塞障壁として作用する強固な凝塊の形成により支持される。ＦＳは、例えば血液、胆汁等の体液の喪失が起こる創傷領域全体に使用するように指示される。ＦＳを、肺の創傷での空気漏出の防止に使用することもできる。ＦＳのシーラント剤としての機能に加えて、ＦＳは、ｉ）創傷治癒用のマトリックス、ｉｉ）組織接着用の基材、及びｉｉｉ）薬剤送達のような様々な医療用途で使用される可能性がある。
【００１０】
シーラント組成物が止血活性及び閉塞活性の両方を示す二重性でなくてはならないことは、技術水準において周知である。
【００１１】
二種の単離成分（ＦＩＩａ及びＦＩ）で構成されている従来のＦＳとは対照的に、国際公開第９７／２９７９２号には、ＦＩＩａフリーの単一成分シーラント組成物ＦＩが記載されている。ＴＦとＦＩとの組み合わせでは、安定した凝塊の形成が誘発されない。そのため、ＴＦ及びＦＩに加えて、いくつかの凝固因子が必要である。国際公開第９７／２９７９２号には、凝塊を誘発するために、ＦＩＩ、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＸ及びＦＸＩＩＩを含むことの必要性が開示されている。従って、効果的であるためには、国際公開第９７／２９７９２号に記載のシーラント組成物は健康な血液に投与される、あるいは、失われている凝固因子（ＦＩＩ、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＸ及びＦＸＩＩＩ）も生理学的濃度で含有しなければならない。従って、努力にもかかわらず、組織からの又は組織中への流体移動を効果的に防止することができ、適切な止血活性及び閉塞活性の両方を示す更なる組成物の必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の発明者らは、トロンビン及びフィブリノーゲンの両方を含む既知のＦＳ組成物に脂質修飾ＴＦを添加することにより、止血プロファイルが実質的に改善されることを発見した。加えて、本発明の組み合わせの投与により生じる凝塊は、より高い粘稠性を示し、このことは、出血している創傷／損傷の閉塞で効果を示す。このことは、少なくともトロンビン、フィブリノーゲン及び脂質修飾ＴＦを含む組み合わせが、既知のＦＳ組成物の止血／閉塞二重効果を圧倒する／改善する有望なシーラント組成物であることを意味する。
【００１３】
この止血プロファイルの実質的な改善は、凝塊用の組み合わせのその投与部位付近での拡大能力に主に起因する。この拡大効果は、健康な血液においてだけでなく、ヘパリン等の、手術で広く使用されているある種の薬剤の投与によりＦＩＩａ及びＦＸ等の重大な止血成分の活性が低下している血液においても非常に重要である。予想外なことに、本発明の組み合わせにより観測された凝塊の拡大は、ヘパリンで処置した血液の抗凝固状態を克服する。シーラント組成物を開示する先行技術のどの文献にも、シーラント組成物の投与部位付近の領域に対する凝塊の拡大能力に基づくシーラント組成物の効果が記載されていない。
【００１４】
このことは、少なくともトロンビン（ＦＩＩａ）、フィブリノーゲン（ＦＩ）及び脂質修飾ＴＦを含む組み合わせが、既知のＦＳ組成物の止血／閉塞二重効果を圧倒する／改善する有望なシーラント組成物であることを意味する。
【００１５】
そのため、ある態様では、本発明は、脂質修飾組織因子、トロンビン及びフィブリノーゲンを含む組み合わせを提供する。
【００１６】
図１Ａでは、脂質修飾組織因子を市販のシーラント組成物Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）（トロンビン及びフィブリノーゲンを含む）に添加した場合に、Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）のみを使用した場合に必要な期間と比べて大幅に短い期間で、（投与部位から３ｃｍ離れた距離での健康な血漿中での凝塊の拡大により）血漿中において凝固の誘発が起こることが示されている。実際には、前記データから導くことができるように、本発明の組み合わせ（黒色の三角）による凝固が約５０％であるときに、先行技術の組み合わせ（Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）、灰色の四角）は血漿サンプルを凝固し始める。この差異が、より低い治療用量でのヘパリン処理血漿の場合に更に大きくなり（図１Ｂ）、より高い治療用量のヘパリンを使用した場合に最大となる（図１Ｃ）ことは注目すべきことであり、本明細書で初めて説明される。この後者の場合では、ヘパリン処理血漿は、ＦＳの投与から７分後でも凝固し始めなかった。そのため、ＦＩＩａ及びＦＩを含むＦＳに脂質修飾ＴＦを添加することにより、止血プロファイルの大幅な改善が実現される。
【００１７】
このことは、本発明に記載の組み合わせの投与では出血を止めるのに必要な時間がはるかに短いことを意味する。このことは、トロンビン又はその他の止血剤による圧迫は出血を十分に止めるほど効果的ではなく患者が死亡するリスクが高いヘパリン治療患者の場合に特に適切である。
【００１８】
加えて、本発明者らは、フィブリノーゲン、トロンビン及び組織因子を含む組み合わせが驚くべき閉塞効果を示すことを発見している。以下で説明するように、実施例４では、トロンビン、脂質修飾組織因子及びフィブリノーゲンを含む組み合わせは、ヘパリン添加血漿サンプルに投与された場合に、脂質修飾ＴＦを含まないシーラントの組み合わせと比べて相当に速くヘパリン添加血漿サンプル中に広がる。加えて、組織因子、トロンビン及びフィブリノーゲンを含む組み合わせにより得た凝塊は、Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）（即ち、脂質修飾組織因子を含まない）により得た凝塊と比べてはるかに高い粘稠性を有することが観測されている。理論に拘束されることなく、本発明者らは、（組み合わせに含まれるトロンビン及びフィブリノーゲンに起因して）形成されたフィブリンネットワーク中に組織因子が包埋され、フィブリンネットワーク内での組織因子のこの分散に起因して凝塊の拡大効果が生じ、この拡大効果により損傷又は外傷の効果的な閉塞が生じると考える。本発明の組み合わせにより得た凝塊がＴｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）により得た凝塊に対してより良好な粘稠性を示すという事実は、本発明の組み合わせが血液移動を防止するのにより効果的であることを意味しており、このことは、損傷／創傷を閉塞するのにより効果的であり、凝塊破損のリスクを大幅に低減させる。
【００１９】
注目すべきなのは、正常な血漿及びヘパリン処理血漿の両方で本発明の３成分組成物により形成された凝塊の広がりを国際公開第９７／２９７９２号の教示から予測することができないことである。具体的には、この文献は、トロンボプラスチンを含む、トロンビンフリーのシーラント組成物を開示する。前記文献の６頁６−８行目では、トロンボプラスチンのフィブリン凝塊形成の開始剤としての含有により接着剤の止血特性を改善することができると述べられている。しかしながら、実施例ＩＩに記載の実験データ（表ＶＩにもまとめられている）は、止血に必要な時間が、先行技術の組織接着剤の場合に必要な時間と比べて実質的に同じである又は更に長いことを示す。このことは、このシーラント組成物が先行技術の組成物と比べて等しい又は劣る止血剤であることを意味する。従って、国際公開第９７／２９７９２号に記載の実験データは、止血特性が改善されているシーラント組成物を得るためにトロンビン及びフィブリノーゲンを含む組成物に脂質修飾組織因子を添加する動機を当業者に与えないだろう。それどころか、この文献の教示から、当業者は、トロンボプラスチンが添加されている組成物に止血効果の大幅な改善を全く期待しないだろう。
【００２０】
本発明の発明者らは、トロンビンフリーのシーラント組成物に脂質修飾組織因子を添加した場合の脂質修飾組織因子の効果を確認するために、国際公開第９７／２９７９２号の内容を再現しようと試みた。以下の表Ｉにまとめているように、いくつかの市販のシーラント組成物のＭＣＦ値及びＧ値と比較した場合に、国際公開第９７／２９７９２号の組成物は、非常に低いＭＣＦ値及びＧ値を示す。当業者に知られているように、Ｇ値及びＭＣＦ値が高くなるほど、組成物は最良の止血プロファイル及び閉塞プロファイルを有する。従って、以下の表Ｉにまとめた結果から、当業者は、国際公開第９７／２９７９２号に記載のトロンビンフリーのシーラント組成物中での脂質修飾組織因子の含有により、そのような組成物の止血プロファイルは改善されないであろうと結論を下すだろう。
【００２１】
最後に、国際公開第９７／２９７９２号では、トロンビンシーラント組成物の閉塞プロファイルに対する脂質修飾組織因子の添加の効果について言及されていない。
【００２２】
結論として、国際公開第９７／２９７９２号から、当業者は、止血プロファイル及び閉塞プロファイルの大幅な改善が実現されると期待して脂質修飾組織因子をシーラント組成物に添加する動機を有しないだろう。
【００２３】
驚くことに、本発明の発明者らは、上記で述べているように、トロンビン及びフィブリノーゲンを含む組成物中に脂質修飾組織因子を含ませることにより、止血プロファイル及び閉塞プロファイルの大幅な改善が実現されることを発見した。
【００２４】
従って、トロンビン、フィブリノーゲン及び脂質修飾組織因子を含む組み合わせの優れた止血特性及び閉塞特性に起因して、そのような組み合わせを、適切なキャリア物質と共にシーラント組成物の形成で使用することができる。
【００２５】
そのため、第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様で定義した組み合わせと物質キャリアとを含むシーラント組成物を提供する。
【００２６】
第３の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の組み合わせのシーラント剤としての使用を提供する。
【００２７】
本発明の組み合わせ及びシーラント組成物の特性に起因して、この組み合わせ及びシーラント組成物を、薬学的組成物又は獣医学的組成物の形態で使用することができる。
【００２８】
従って、第４の態様では、本発明は、治療上有効な量の、上記で定義した組み合わせを、その他の適切な薬学的に又は獣医学的に許容される賦形剤及び／又はキャリアと共に含む薬学的組成物又は獣医学的組成物を提供する。
【００２９】
上記で論じたように、本発明の組み合わせ及び組成物は、それらの止血効果及び閉塞効果に起因して出血の治療に有用である。
【００３０】
そのため、第５の態様では、本発明は、医薬品として使用するための、上記で定義した組み合わせ又は組成物を提供する。この態様を、治療上有効な量の、上記で定義した組み合わせ又は組成物を、その他の適切な薬学的に又は獣医学的に許容される賦形剤及び／又はキャリアと共に、これらを必要とする対象に投与することを含む疾患の治療方法として構築することができる。
【００３１】
第６の態様では、本発明は、出血の治療で使用するための、上記で定義した組み合わせ又は組成物を提供する。
【００３２】
あるいは、この態様を、出血の治療用の薬剤の製造における上記で定義した組み合わせ又は組成物の使用として構築することができる。あるいは、この態様を、出血の治療方法であって、治療上有効な量の本発明の組み合わせ又は組成物を、これを必要とする対象に投与することを含む方法として構築することができる。
【００３３】
いくつかの手術設定における市販のＦＳの接着剤又はシーラントとしての使用の頻度から、このＦＳの、関連薬剤の徐放用のキャリアとしての使用の可能性が開く。
【００３４】
この点に関して、抗生物質を含有するいくつかのＦＳが、術後の眼感染症を低減するために及び局在性の腹膜感染症の治療用に試験されている。長時間にわたり活性物質が部位に接着し続けることから、そのような組成物が活性物質の治療効果を改善することが発見されている。そのため、抗生物質、増殖因子、化学療法剤、局所麻酔薬又はＤＮＡベースのベクター等のその他の活性分子も含有する、トロンビン、フィブリノーゲン及び脂質修飾ＴＦを含む本発明の組み合わせ及び組成物は治療効果を増加させる可能性がある。
【００３５】
従って、更なる態様では、本発明は、本発明の組み合わせ又は組成物の薬剤送達システムとしての使用を提供する。
【００３６】
また、皮膚、軟骨及び骨の構成を補助するためのＦＳの使用が技術水準に記載されている。従って、提案されている、脂質修飾ＴＦが加えられたＦＳの組み合わせは、細胞接着用の及び新規組織の増殖用の改善された足場としても使用される可能性がある。この可能性は、ＴＦの公知の血管新生効果により増幅される可能性がある。
【００３７】
そのため、更なる態様では、本発明は、本発明の組み合わせ又は組成物の創傷治癒剤としての使用を提供する。最後に、本発明の組み合わせ又は本発明の第２の及び第３の態様の組成物の何れかをキットとして提供することができる。
【００３８】
そのため、更なる態様では、本発明は、本発明の第１の態様で定義した組み合わせと、フィブリノーゲン、トロンビン及び脂質修飾組織因子の両方の同時投与を可能にするアプリケータとを含むキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１Ａ−Ｂ】商標Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）で市販されているＦＳ組成物（灰色の四角）又は脂質修飾ＴＦとＴｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）との組み合わせ（黒色の三角）の添加後の様々な時間での通常の血漿サンプル中における凝固の進行を示すグラフである。試験アイテムの投与部位から３ｃｍ離れて凝固を測定した。Ｙ軸＝凝固の％、Ｘ軸＝時間（秒）。
【図１Ｃ】商標Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）で市販されているＦＳ組成物（灰色の四角）又は脂質修飾ＴＦとＴｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）との組み合わせ（黒色の三角）の添加後の様々な時間でのヘパリン処理血漿サンプル中における凝固の進行を示すグラフである。試験アイテムの投与部位から３ｃｍ離れて凝固を測定した。Ｙ軸＝凝固の％、Ｘ軸＝時間（分）。
【図２】様々な製品：Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）（ＦＳ）、Ｔｓｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）＋脂質修飾ＴＦ及びコントロール（未治療）で治療した群に対応する各ラットに関する失血（ｍＬ／ｋｇ）を表すグラフである。各点（三角又は四角）は１匹の動物の失血値を表し、各横線は各群の平均を表す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
上記で述べているように、本発明の組み合わせは、トロンビン、フィブリノーゲン及び脂質修飾組織因子を含有する。
【００４１】
本発明では、用語「組織因子」（ＴＦ）を、動物界に広く分布する必須の膜糖タンパク質と理解しなければならない。ＴＦは様々な細胞型で出現し、主に内皮組織で出現し、ＦＩＩａが産生される及び安定したフィブリン凝塊が形成される凝固カスケードの外因経路の開始に不可欠である。本発明で使用することができる例示的なＴＦタンパク質として、ヒトＴＦ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ．バージョン１４８、２０１２年１１月、受託番号Ｐ１３７２６）、マウスＴＦ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ．バージョン１０３、２０１２年１１月、受託番号Ｐ２０３５２）、ウシＴＦ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ．バージョン８９、２０１２年１１月、受託番号Ｐ３０９３１）、ウサギＴＦ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ．バージョン９０、２０１２年１１月、受託番号Ｐ２４０５５）及び様々な動物のＴＦタンパク質が挙げられる。
【００４２】
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１３７２６のヒトＴＦタンパク質は、（１）シグナルペプチド又は未成熟型から成熟型へと翻訳後処理されている３２個のアミノ酸のリーダー配列を有する領域、（２）２１９個のアミノ酸を含むＮ−グリコシル化親水性細胞外ドメイン、（３）膜貫通ドメインを形成する、２３個のアミノ酸から成る疎水性がより高いフラグメント、及び（４）タンパク質細胞質フラグメントである２１個のアミノ酸のカルボキシル末端を含む、明確に定義されたドメイン構造を有する。
【００４３】
特定の実施態様では、ＴＦは成熟ＴＦに対応する。
【００４４】
用語「成熟ＴＦ」は本明細書で使用する場合、アミノ酸配列がシグナルペプチドを欠いているＴＦタンパク質を指す。ある実施態様では、前記成熟ＴＦタンパク質は、配列番号１の成熟ヒトＴＦである。一実施態様では、ＴＦはグリコシル化されている。
【００４５】
本明細書で使用する場合、用語「グリコシル化」は、あらゆる程度のグリコシル化を含む。天然ＴＦはいくつかのグリコシル化部位を含有することから、以下に詳細に説明するように、語句「組織因子」はまた、様々な程度のグリコシル化を示すタンパク質のグリコシル化型も包含し、前記型は、Ｎ−グリコシル化反応を行うことができる宿主中でのＴＦの発現により得られる。
【００４６】
加えて、用語「組織因子」はまた、天然ＴＦ配列中の１個又は複数個のアミノ酸残基の挿入、欠失又は置換によって生じる多様体も包含する。所与のポリペプチドがＴＦの機能性多様体であるかどうかを評価するために使用することができる適切な機能アッセイは、重度の出血動物モデルにおけるインビボアッセイによる又は致死的な出血動物モデルにおけるインビボアッセイによるＴＦ多様体のＦＶＩＩａに特異的に結合する能力の測定に基づく、又は血漿中における若しくは全血中における凝固時間のインビトロ測定に基づくアッセイである。これらのアッセイを行うための方法が先行技術に開示されている。
【００４７】
本発明に係るそのような多様体として、上記で述べた天然ＴＦ分子と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９６％同一であるアミノ酸配列が挙げられる。当分野で既知であるように、アミノ酸配列と、このアミノ酸配列の別のタンパク質の配列への１個のタンパク質の保存アミノ酸置換との比較により、２種のタンパク質間の「同一性」を決定する。当業者に広く知られているコンピュータアルゴリズム及び方法を使用して、２種のタンパク質間の同一性の程度を決定する。好ましくは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して、２種のアミノ酸配列間の同一性を決定する。
【００４８】
ＴＦは、完全にグリコシル化され得る、部分的にグリコシル化され得る、又はグリコシル化され得ない。
【００４９】
本願では、「完全にグリコシル化されている」は、全ての可能なグリコシル化部位がグリコシル化されていることを意味する。
【００５０】
本願では、「部分的にグリコシル化されている」は、３個のＮ−グリコシル化部位の内の少なくとも１個が機能しておらず、このグリコシル化が不可能であることを意味する。
【００５１】
本願では、「グリコシル化されていない」は、何れのＮ−グリコシル化部位も機能していないこと、あるいは、ＴＦポリペプチドがインビトロで非グリコシル化法（即ち、細胞を含まない発現システム）により発現されていること又は代謝グリコシル化経路を喪失したベクター（即ち大腸菌）中で発現されていることを意味する。
【００５２】
ある実施態様では、ＴＦは部分的にグリコシル化されている、又はグリコシル化されていない。この実施態様では、ＴＦは、Ｎ−グリコシル化部位の少なくとも１個が機能しておらずグリコシル化が不可能であるように修飾されている。
【００５３】
全ての成熟ＴＦタンパク質は、コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒを有する３個の潜在的Ｎ−連結グリコシル化部位を含有する。ヒト成熟ＴＦの場合、そのような３個のグリコシル化部位はＡｓｎ１１（配列Ａｓｎ１１−Ｌｅｕ１２−Ｔｈｒ１３）、Ａｓｎ１２４（配列Ａｓｎ１２４−Ｖａｌ１２５−Ｔｈｒ１２６）及びＡｓｎ１３７（配列Ａｓｎ１３７−Ａｓｎ１３８−Ｔｈｒ１３９）に位置しており、前記各位置は配列番号１に関する。
【００５４】
ある実施態様では、ヒト成熟ＴＦタンパク質において機能しなくなるように修飾することができるＮ−グリコシル化部位（一又は複数）は、上記配列番号１の成熟ヒトＴＦにおける１１−１３位でのＮ−グリコシル化部位ＮＬＴ、１２４−１２６位でのＮ−グリコシル化部位ＮＶＴ及び１３７−１３９位でのＮ−グリコシル化部位ＮＮＴに対応するＮ−グリコシル化部位である。
【００５５】
別の実施態様では、ＴＦは、１個又は複数個のＡｓｎ残基の、Ｎ−グリコシル化用の受容体ではない残基への置換を保有する。更により好ましい実施態様では、ＴＦ多様体は、成熟ヒトＴＦにおける１１位、１２４位又は１３７位に対応する位置におけるＡｓｎ残基での１個又は複数個のＡｓｎからＡｌａへの変異を含む。好ましくは、成熟ヒトＴＦは、配列番号１の１２４位でのＡｓｎからＡｌａへの変異を保有する。
【００５６】
グリコシル化は、ＴＦの産生に使用する発現システムに依存して異なるであろう。例えば、組織因子タンパク質は、１個又は複数個の植物特異的グリカン、酵母特異的グリカン、昆虫特異的グリカン又は動物特異的グリカンを含むことができる。
【００５７】
酵母中でＴＦを産生する場合、グリコシル化は典型的には、２個のＧｌｃＮＡｃ残基を介してアスパラギンに連結されている約１０個のマンノース残基から成る内部コアと、５０−１００個のマンノース残基から成る分枝した外鎖とを含むであろう。従って、Ｎ−連結グリコシル化は、３００個ものマンノース残基をＴＦに潜在的に追加し、分子量を約６０ｋＤａ増加させる可能性がある。更に、いくつかのマンノース残基を様々なＯ−連結グリコシル化部位（２５個超）に結合させることも可能である。従って、本発明の組み合わせ及び組成物に含まれるＴＦ分子は、１個又は複数個のＮ−グリコシル化部位において様々な程度の及び様々な構成のＮ−連結グリコシル化を有する。
【００５８】
更に別の実施態様では、ＴＦタンパク質は融合タンパク質であり、前記融合タンパク質は、前記ＴＦタンパク質を含む第１の部分と、別のペプチド又はタンパク質を含む第２の部分とを含む。
【００５９】
前記第２の部分を、前記ＴＦタンパク質フラグメントのＮ末端の第１の部分に結合させることができる、あるいは、前記第２の部分を、前記ＴＦタンパク質フラグメントのＣ末端領域に結合させることができる。第１の部分及び第２の部分の両方を直接結合させることができる、又は前記第１の領域及び第２の領域の間のリンカーポリペプチドを介して結合させることができる。
【００６０】
別の実施態様では、前記第２の部分はタグである。タグを、ＴＦタンパク質の第１の部分のＣ末端ドメイン又はＮ末端ドメインに結合させることができる。本発明では、用語「タグ」は、融合タンパク質の単離又は精製で使用することができる、前記ＴＦタンパク質のＣ末端ドメイン又はＮ末端ドメインに結合するあらゆるペプチ配列又はアミノ酸配列と理解しなければならない。そのため、前記タグは、例えば、高親和性を有するクロマトグラフィーの担体又はビーズ等の親和性マトリックスから成る１個又は複数個のリガンド等の１個又は複数個のリガンドに結合することができる。前記タグの例は、ヒスチジンの６個の残基（Ｈｉｓ６又はＨ６）を含むタグ等の、高親和性を有するニッケル（Ｎｉ２＋）カラム又はコバルト（Ｃｏ２＋）カラムに結合することができるヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−タグ又はＨＴ）である。融合タンパク質の単離又は精製に有用なタグの追加の例示的で非限定的な例として、Ａｒｇ−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、抗体により認識され得るエピトープ、例えばｃ−ｍｙｃ−タグ（抗ｃ−ｍｙｃ抗体により認識される）、ＳＢＰ−タグ、Ｓ−タグ、カルモジュリン結合ペプチド、セルロース結合ドメイン、キチン結合ドメイン、グルタチオンＳトランスフェラーゼ−タグ、マルトース結合タンパク質、ＮｕｓＡ、ＴｒｘＡ、ＤｓｂＡ、Ａｖｉ−タグ、特にＡｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ（配列番号２）；Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ（配列番号３）；Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓ（配列番号４）等のアミノ酸配列、β−ガラクトシダーゼ等が挙げられる。
【００６１】
組換えＴＦの単離又は精製に使用されるＨｉｓ−タグが、ほとんどのタンパク質を変性させる及びほとんどのタンパク質−タンパク質相互作用を破壊する条件下で、このＨｉｓ−タグのリガンドに結合することができるという望ましい特徴を有することが既に開示されている。そのため、Ｈｉｓ−タグを、Ｈ６をタグ付けした餌タンパク質が関与しているタンパク質−タンパク質相互作用の破壊後に、この餌タンパク質を除去するために使用することができる。
【００６２】
そのため、一実施態様では、タグはＨｉｓ−タグである。別の実施態様では、そのようなＨｉｓ−タグは、ＴＦタンパク質の第１の部分のＣ末端ドメインに結合している。更に別の実施態様では、そのようなＨｉｓ−タグは、ＴＦタンパク質の第１の部分のＮ末端ドメインに結合している。
【００６３】
別の実施態様では、融合タンパク質の第１の部分は成熟ＴＦタンパク質を含み、好ましくは成熟ヒトＴＦタンパク質を含む。更に別の実施態様では、第１の部分はヒト成熟ＴＦである。
【００６４】
別の実施態様では、融合タンパク質は、Ｎ−グリコシル化部位の少なくとも１個が機能していない成熟ヒト組織因子タンパク質を含む第１の部分と、Ｈｉｓ−タグを含む第２の部分とを有する。好ましい実施態様では、組織因子は、（ａ）シグナル配列を欠いている、（ｂ）グリコシル化部位でＮ１２４Ａ変異を有する、（ｃ）Ｃ末端でヘキサヒスチジンタグを有する配列番号５のヒトＴＦを含む融合タンパク質である。
【００６５】
前記融合タンパク質は、常法により、例えば、適切な酵母細胞中における前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の遺伝子発現により、得ることができる。必要に応じて、最終的なタグを前記融合タンパク質の単離又は精製に使用することができる。
【００６６】
用語「脂質修飾組織因子（ＴＦ）」は本明細書で使用する場合、ＴＦが脂質小胞又は細胞膜に完全に又は部分的に挿入されているＴＦのあらゆる起源を指す。「脂質修飾ＴＦ」起源の例示的で非限定的な例は、１）脂質修飾ＴＦ含有組織抽出物（この単離を特に、大脳組織、胎盤組織及び肺組織等のいくつかの組織から、ヒツジ、雌ウシ、ウサギ、イヌ及びヒト等の様々な動物由来の組織から行うことができる）、２）精製した及び（再）脂質修飾したＴＦタンパク様成分、即ちＴＦの精製後に脂質成分（リン脂質）が添加されているもの、並びに３）脂質画分が宿主細胞に由来し、ＴＦが組換え発現されている脂質修飾ＴＦ含有細胞抽出物である。
【００６７】
Mimms L. T.ら, "Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside", Biochemistry,1981, vol. 20(4), p. 833-840に既に記述されているプロトコルに従って、例示的で非限定的な例によって、精製された及び（再）脂質修飾されたＴＦを調製することができる。前記プロトコルでは、例えば、Ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド等の非イオン性界面活性剤を使用して、脂質修飾されていないＴＦをリン脂質小胞内に取り込む。本発明に係る脂質修飾ＴＦで使用することができるリン脂質は任意の起源（動物、植物又は合成）を有することができる。本発明の脂質修飾ＴＦの調製に、実質的にあらゆるリン脂質を使用することができる。脂質修飾ＴＦの調製で使用することができるリン脂質の例示的で非限定的な例として、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン等が挙げられる。ＴＦタンパク様成分：リン脂質比（モル、重量又は体積）は広い範囲内で変化することができ、例えば約１：５００００から約１：３０００の範囲内で変化することができる。特定の実施態様では、脂質修飾ＴＦは脂質修飾ヒトＴＦであり、ヒト組織から又は組換え細胞から単離したＴＦのタンパク様成分から成り、適切なＴＦタンパク様成分：リン脂質比で脂質膜中に挿入されている。最適なＴＦ活性を実現するための脂質組成（好ましくはホスファチジルコリン及びホスファチジルセリン）の好ましいモル比は技術水準で公知である。
【００６８】
脂質画分が宿主細胞に由来し、ＴＦが組換え発現されている脂質修飾ＴＦ含有細胞抽出物の調製に関して、ＴＦ分子が大きな疎水性ドメインを含有することから、利用可能な真核細胞発現システムの何れかでのｒＴＦ遺伝子のクローニングにより、宿主細胞の脂質膜に会合する組換えＴＦ（ｒＴＦ）タンパク質の発現が生じるであろうと仮定することが妥当である。この会合では、宿主の膜成分が、ＴＦが通常会合する哺乳動物細胞で見られるｒＴＦ分子に対する足場を模倣する、又はこのｒＴＦ分子に対する足場と同様の若しくは同一の足場を提供する可能性があるだろう。そのため、これらの膜成分の精製により、脂質修飾ｒＴＦの利用可能な供給源が生じるだろう。膜成分の化学組成に起因して、これらの単離された脂質膜成分は主に様々なサイズの小胞の形態で見られるだろう。ｒＴＦに加えて、これらの小胞はまた、宿主細胞の起源に依存して特定のタンパク質又は脂質も含有するだろう。従って、酵母、細菌、様々な起源由来の、例えば昆虫、哺乳動物、植物、魚類、藻類由来の細胞に由来する脂質膜はまた、そのような宿主細胞のタンパク質及び脂質の特性も含有するだろう。
【００６９】
ＴＦは、脂質膜中に固定されている疎水性領域（膜貫通ドメイン）を含み、その親水性領域（即ち、前記ＴＦタンパク質のアミノ末端領域及びカルボキシル末端領域）は、脂質膜の外細胞質側に面する。
【００７０】
本発明では、用語「脂質膜」を、細胞の境界（即ち細胞膜若しくは原形質膜）又は細胞内オルガネラの境界を形成する少数の分子（脂質及びタンパク質）の厚さの組織化層として理解しなければならない。典型的には、膜は、タンパク質を包埋させることができる２種の配向脂質層で構成されている。細胞の膜の基本的な構造である脂質二重層は通常、水生環境下において両親媒性分子（例えばリン脂質、脂肪酸等）で形成されており、各分子は、脂質二重層の外側に親水基が配向され、脂質二重層の内側に疎水基が配向されている。好ましくは、ＴＦは脂質微小胞中に固定されている。
【００７１】
本発明では、「脂質微小胞」を小さくて閉じられたコンパートメントとして理解しなければならず、このコンパートメントは脂質単層又は脂質二重層で実質的に構成されている。本発明のＴＦ担持微小胞のサイズは比較的広い範囲内で変化することができ、通常、前記サイズは１０μｍ以下であり、典型的には０．５μｍ以下である。特定の実施態様では、本発明のＴＦ担持酵母由来微小胞のサイズは、１０から０．０１μｍの範囲である。この微小胞は、真核細胞由来の脂質膜若しくはそのフラグメントで形成されている。一実施態様では、この微小胞は、負に荷電したリン脂質、好ましくはホスファチジルセリンに富むことができる。そのような微小胞にホスファチジルセリンを富化させる方法は、例えば国際公開第２０１１１３１６５８号に開示されている。簡潔に言うと、以下を含むプロセスにより、前記リン脂質に富むＴＦ担持微小胞を調製することができる：ａ）ＴＦタンパク質又は前凝固活性を有するＴＦタンパク質のフラグメントの発現を可能とする条件下で、前記ＴＦタンパク質を発現する組換え真核細胞の培養物を発酵に供すること、ｂ）工程ａ）の発酵によって生じた培養細胞をペレット化して発酵産物とすること、ｃ）工程ｂ）からの前記発酵産物をホモジナイズに供して発酵ホモジネートとすること、及びｄ）工程ｃ）からの前記発酵ホモジネートを分離に供し、ペレットと、前凝固活性を有する前記ＴＦ担持由来微小胞を含有する清澄酵母抽出物（ＣＹＥ）とにすること、ｅ）前凝固活性を有する前記ＴＦ担持酵母由来微小胞を含有する前記清澄酵母抽出物（ＣＹＥ）を回収すること、及び任意選択的に、ｆ）必要に応じて、サイズ分割法により、前凝固活性を有する前記ＴＦ担持酵母由来微小胞を単離する又は精製すること、及びｇ）ホスファチジルセリンと国際公開第２０１１１３１６５８号に記載のＴＦを含有する脂質微小胞との両方の成分のインキュベーションによる、得られた微小胞での負に荷電したリン脂質（即ちホスファチジルセリン）の富化。述べたインキュベーションより前の工程として、緩衝液中での脂質の再懸濁、続いて超音波処理により、多重膜小胞としてホスファチジルセリンを調製することができる可能性がある。
【００７２】
ＴＦの産生方法は、使用する真核細胞に依存する。一般に、真核細胞は、真菌、酵母、植物又は動物（例えば魚類、爬虫類、哺乳類、昆虫等）由来であることができる細胞中において、機能性プロモーターに作動可能に連結されているＴＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターにより形質転換される。ＴＦタンパク質をコードするｃＤＮＡを、テンプレートとしてのｃＤＮＡライブラリーと適切なプライマーとを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅させることができる。実施例１は、３’末端で１８個の余分なヌクレオチド（６個のヒスチジンをコードする）を有する成熟ｈＴＦタンパク質をコードするｃＤＮＡの増幅を開示する。
【００７３】
別の実施態様では、ＴＦタンパク質を、確立されたクロマトグラフィー精製方法後の上記の工程ａ）からｄ）により精製することができた。精製すると、ＴＦタンパク質を適切なリン脂質濃度によりインビトロで脂質修飾することができた。
【００７４】
更なる実施態様では、脳組織、胎盤組織及び肺組織等の動物組織抽出物から、並びに特にヒツジ、雌ウシ、ウサギ、イヌ及びヒト等の様々な動物由来の組織から脂質修飾ＴＦを得ることができた。好ましくは、脂質修飾ＴＦはヒト由来である。より好ましくは、脂質修飾ＴＦはヒト組換えである。
【００７５】
本発明では、用語「トロンビン」（ＦＩＩａ）は、止血において中心的な役割を果たす重要なセリンプロテアーゼと理解しなければならない。ＦＩＩａは、フィブリノーゲン（ＦＩ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）及び第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）等の、凝固カスケードに関与する多くの凝固因子を活性化する。ＦＩＩａはまた、血小板及び血管内皮細胞も活性化する。トロンビン前駆体はチモーゲンプロトロンビン（ＦＩＩ）であり、チモーゲンプロトロンビンは、肝臓からの血液中に分泌されている。凝固カスケード中に、ＦＩＩは、最初に活性化ＦＸ（ＦＸａ）により様々な割合でＦＩＩａに変換され、カスケードの最終工程では、プロトロンビナーゼ複合体（ＦＸａ：ＦＶａ）によりＦＩＩａに変換される。市販のＦＩＩａは、ヒト起源の又はウシ起源の血漿からのＦＩＩの単離後に産生される。ＦＩＩの単離後、ＦＩＩはＦＩＩａにインビトロで形質転換される。現在市販されているＦＳは全て、ヒト起源由来の又はウシ起源由来のＦＩＩａを含有する。更に、高純度の組換えヒトＦＩＩａも入手可能である。この組換えヒトＦＩＩａは、組換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来のヒトＦＩＩの精製、続いてインビトロ処置によるＦＩＩａへの加工後に得られる。
【００７６】
本発明で使用することができる例示的なＦＩＩタンパク質として、ヒトＦＩＩ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ．バージョン１８２、２０１２年１１月、受託番号Ｐ００７３４）、ウシＦＩＩ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ．バージョン１５３、２０１２年１１月、受託番号Ｐ００７３５）、マウスＦＩＩ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ．バージョン１４１、２０１２年１１月、受託番号Ｐ１９２２１）、ブタＦＩＩ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ．バージョン３７、２０１２年１１月、受託番号Ｂ３ＳＴＸ９）及び様々な動物のＦＩＩタンパク質が挙げられる。好ましくは、トロンビンはヒト起源由来又はウシ起源由来であるが、より好ましくはヒトトロンビンであり、更により好ましくは組換えヒトトロンビンである。
【００７７】
本発明では、用語「フィブリノーゲン」（ＦＩ）は、止血における最後から２番目のタンパク質に対応する。ＦＩは、２９個のジスルフィド結合により互いに保持されている２本のα鎖（６６ｋＤａ）、２本のβ鎖（５２ｋＤａ）及び２本のγ鎖（４６．５ｋＤａ）から成ることから、ＦＩは複雑な構造を示す。ＦＩは肝臓中で合成され、２−４ｍｇ／ｍＬの濃度で血漿中を循環する。凝固カスケードの最終工程中に、ＦＩはＦＩＩａによりフィブリンに活性化される。フィブリンは繊維の架橋ネットワークを形成し、この架橋ネットワークは血小板と共に凝塊を形成する。現在のＦＳは血漿由来フィブリノーゲンを含有しており、このフィブリノーゲンはヒト血液から精製されている。この方法は、病原体混入のリスクを伴っている。ヒトフィブリノーゲンの組換えバージョンの産生により、このリスクを最小化することができた。組換えヒトＦＩは、大腸菌、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓（ＣＯＳ−１）細胞及びＣＨＯ細胞中で産生されている。近年では、ヒトＦＩは遺伝子導入雌ウシ中で産生され、ここから組換えＦＩが乳から得られる。
【００７８】
本発明で使用することができる例示的ＦＩタンパク質として、ヒトＦＩ：α鎖（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ．バージョン１７４、２０１２年１１月、受託番号Ｐ０２６７１）、β鎖（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ．バージョン１６３、２０１２年１１月、受託番号Ｐ０２６７５）、γ鎖（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ．バージョン１７１、２０１２年１１月、受託番号Ｐ０２６７９）、ウシＦｌ：α鎖（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ．バージョン１０４、２０１２年１１月、受託番号Ｐ０２６７２）、β鎖（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ．バージョン１０２、２０１２年１１月、受託番号Ｐ０２６７６）及び様々な動物のＦＩタンパク質が挙げられる。好ましくは、本発明の組み合わせに含まれるフィブリノーゲンはヒト由来であり、より好ましくは組換えヒトＦＩである。
【００７９】
本発明の第１の態様の一実施態様では、組み合わせは架橋剤を更に含む。
【００８０】
本発明の第１の態様の別の実施態様では、組み合わせは、フィブリン溶解阻害剤を更に含む。
【００８１】
本発明の第1の態様の更に別の実施態様では、組み合わせはＣａＣｌ２を更に含む。
【００８２】
本発明の第１の態様の更なる実施態様では、組み合わせは、架橋剤及びフィブリン溶解阻害剤を更に含む。
【００８３】
本発明の第１の態様の更なる実施態様では、組み合わせは、架橋剤、フィブリン溶解阻害剤及びＣａＣｌ２を更に含む。
【００８４】
好ましくは、前記架橋剤はＦＸＩＩＩである。
【００８５】
好ましくは、前記フィブリン溶解阻害剤は、アプロチニン、トラネキサム酸及びアミノカプロン酸から選択される。更なる態様では、本発明は、本発明の組み合わせ及びキャリア物質を含む止血シーラント組成物を提供する。
【００８６】
本発明では、用語「止血」は、止血を促進する物質、即ち出血を止める物質として理解すべき組成物、効果及び使用を指す。用語「止血」を、「抗出血」及び「凝血促進」と称することもできる。
【００８７】
用語「キャリア物質」は、本発明の組み合わせを沈着させること、この組み合わせの輸送及び所望の部位での放出、例えば本発明の組成物がその治療効果を発揮すべき部位での放出を可能にする適切な材料の物質と理解すべきである。前記キャリア物質は固体担体又は非固体担体であることができ、例えば液状担体、粉末担体又は気体担体であることができる。固体担体の例示的で非限定的な例として、包帯、ガーゼ付き絆創膏、湿布、硬膏剤等が挙げられる。液状担体の例示的で非限定的な例として、ゲル、スプレー剤、口腔洗浄薬等が挙げられる。気体担体の例示的で非限定的な例として、エアー、噴霧剤等が挙げられる。常法により、例えば本発明の組み合わせと物質キャリアとを混合することにより、そのような組成物の製造を実現することができる。組み合わせの成分と固体材料との間の相互作用は、物理的相互作用又は化学的相互作用であることができる。
【００８８】
一実施態様では、物質キャリアは、コラーゲン、ゼラチン又は酸化再生セルロースで形成された固体担体である。
【００８９】
別の実施態様では、キャリア物質は、スプレー、噴霧器又は粉末の分配用のデバイスである。
【００９０】
本発明の第２の態様の一実施態様では、シーラント組成物は架橋剤を更に含む。
【００９１】
本発明の第２の態様の別の実施態様では、シーラント組成物はフィブリン溶解阻害剤を更に含む。
【００９２】
本発明の第２の更に別の実施態様では、シーラント組成物はＣａＣｌ２を更に含む。
【００９３】
本発明の第２の態様の更なる実施態様では、シーラント組成物は、架橋剤及びフィブリン溶解阻害剤を更に含む。
【００９４】
本発明の第２の態様の更なる実施態様では、シーラント組成物は、架橋剤、フィブリン溶解阻害剤及びＣａＣｌ２を更に含む。
【００９５】
好ましくは、前記架橋剤はＦＸＩＩＩである。
【００９６】
好ましくは、前記フィブリン溶解阻害剤は、アプロチニン、トラネキサム酸及びアミノカプロン酸から選択される。
【００９７】
上述したように、更なる態様では、本発明は、治療上有効な量の本発明の組み合わせを、適切な薬学的に若しくは獣医学的に許容される賦形剤及び／又はキャリアと共に含む薬学的組成物又は獣医学的組成物を提供する。
【００９８】
語句「治療上有効な量」は本明細書で使用する場合、投与した場合に、対処する疾患の１種又は複数種の症状の進行を防止する又はある程度防止するのに十分である本組み合わせの量を指す。当然のことながら、本発明に従って投与される組み合わせの具体的な用量を、投与した化合物、投与の経路、治療する具体的な状態及び同様の検討事項等の症状を取り巻く具体的な状況により決定することができる。
【００９９】
そのようなシーラント組成物の調製方法は、技術水準において公知である。
【０１００】
本発明の薬学的組成物又は獣医学的組成物を、直接的に又はガーゼ等のキャリア物質で、出血部位に局所的に投与しなくてならない。局所的な投与の例として、外部投与、皮膚投与、鼻腔投与、小胞内投与、膣内投与、頬側投与、直腸投与、眼投与、内視鏡的局所投与及び点滴が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、本発明の組み合わせ及び組成物を局所的に投与する。
【０１０１】
薬学的組成物又は獣医学的組成物は、軟質ゲル又は硬質ゲル、液体、ローション、クリーム、軟膏、ペースト、ロールオン製剤、スプレー液、エアロゾル、パッド塗布製剤及びフィルム形成製剤の形態を取ることができる。
【０１０２】
局的投与の場合、適切な薬学的賦形剤又は薬学的キャリアとして、水和剤、軟化剤、乳化剤、湿潤剤、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、防腐剤、ビヒクル又はこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。使用される賦形剤又はキャリアは、皮膚に対する親和性を有し、良好な耐容性を示し、安定であり、所望の粘稠性をもたらす及び投与を容易にするのに適した量で使用される。
【０１０３】
本発明の薬学的組成物が局所的である場合、この薬学的組成物を、軟質ゲル又は硬質ゲルの溶液、ローション、ゲル、軟膏、ペースト、クリーム、液体、ローション、クリーム、軟膏、ペースト、ロールオン製剤、スプレー液、エアロゾル、パッド塗布製剤及びフィルム形成製剤が挙げられるがこれらに限定されないいくつかの形態で製剤化することができる。これらの局所薬学的組成物を、技術水準で公知の方法に従って調製することができる。当業者は、適切な薬学的賦形剤及び／又は薬学的キャリア並びにこれらの量を、調製する製剤の種類に従って容易に決定することができる。
【０１０４】
本発明の組成物を、従来の手術技術（縫合、結紮及び焼灼等）による出血の制御時に手術を受けている患者における止血の補助剤として、並びに漏出を防止する標準的な手術技術（縫合及び結紮等）における補助剤として使用することができる。
【０１０５】
更なる態様では、本発明は、本発明の第４の態様の組み合わせのシーラント剤としての使用を提供する。
【０１０６】
上記で述べているように、本発明の組み合わせは、生じる凝塊の高粘稠性及びこの凝塊の膨張による広がりに起因して、非常に短期間であらゆる損傷又は外傷を効果的に閉塞することができ、破損のリスクが大幅に低減されることから安全な及び効果的な方法で流体移動が防止される。この用途は、皮膚、器官における、特に内部受傷後の皮膚、器官における損傷又は創傷の閉塞で興味深い。
【０１０７】
一実施態様では、上記で定義した組み合わせ又は組成物を、組織を互いに縫合し、可能な場合には、この組み合わせ又は組成物を組織に投与することにより、組織を閉塞するために使用する。
【０１０８】
別の実施態様では、上記で定義した組み合わせ又は組成物を、移植片を組織上に配置する前に、この組み合わせ又は組成物を組織に投与することにより、移植片を組織に固定するために使用する。
【０１０９】
上記で詳細に指摘した特性に起因して、本発明の組み合わせ及び組成物を薬剤送達システムとして又は創傷治癒剤として使用することができる。
【０１１０】
語句「創傷治癒」は、皮膚（又は他の何らかの器官）が、あらゆる種類の及びあらゆる部位での損傷創傷治癒後に自己修復する複雑なプロセスに関する。創傷治癒は、正常な創傷治癒及び正常に機能しない創傷治癒であることがきる。正常に機能しない創傷治癒は、糖尿病、血管炎、動脈閉塞性疾患、慢性的な静脈潰瘍及び／又は感染潰瘍等の疾患並びに胃潰瘍の不完全な治癒の場合に特に見られる。正常に機能しない創傷治癒はまた、対麻痺、ハンセン病、神経症等の神経支配の機能障害及び介護を必要とする人の圧迫壊疽の場合にも見られる。正常に機能しない創傷治癒はまた、弱い縫合の場合にも生じる可能性があり、正常に機能しない治癒は、手術後に、特に腸の手術後に、並びに皮膚及びその他の器官それぞれの移植後に起こる。
【０１１１】
正常に機能しない創傷治癒はまた、骨折、熱傷及びステロイドを地擁する治療の場合にも見られる。
【０１１２】
本明細書で使用する場合、用語「創傷」は、例えば創傷の治癒が遅延している又は困難である等のあらゆる組織に対する損傷及び慢性創傷を含む。創傷の例として、開いている創傷及び閉じている創傷の両方を挙げることができる。用語「創傷」はまた、例えば、様々な方法（例えば、長期のベッド休養に起因する床擦れ及び外傷により誘発される創傷）で惹起された皮膚及び皮下組織に対する損傷、並びに様々な特性を有する損傷も含むことができる。創傷の深さに依存して、創傷を以下の４つのグレードの内の１つに分類することができる：ｉ）上皮に限定されるグレードＩの損傷、ｉｉ）真皮中に及ぶグレードＩＩの創傷、ｉｉｉ）皮下組織中に及ぶグレードＩＩＩの創傷、及びｉｖ）骨（例えば、大転子又は仙骨等の骨の圧力点）が露出したグレードＩＶ（又は全層創傷）の創傷。
【０１１３】
用語「慢性創傷」は一般に、治癒されていない創傷を指す。慢性創傷として、静脈性潰瘍、静脈うっ血潰瘍、動脈性潰瘍、圧迫潰瘍、糖尿病性潰瘍、糖尿病性足部潰瘍、血管炎性潰瘍、褥瘡性潰瘍、熱傷潰瘍、外傷誘発潰瘍、感染性潰瘍、混合潰瘍及び壊疽性膿皮症が挙げられる。
【０１１４】
本発明の組み合わせ及び組成物を出血の治療でも使用することができる。そのような出血は、特に凝固障害、損傷、創傷又は血小板障害に起因することができる。
【０１１５】
以下に示すように、本発明の組み合わせは抗出血剤として作用し、その結果として、出血性障害の治療又は是正に使用することができ、特に、出血性素因に関連する出血性障害の治療又は是正に使用することができる。
【０１１６】
用語「出血性素因」は、止血障害を起こし、その結果、拡張した過度の出血を伴い時折発生する可能性がある出血症候群を発生させるプロセスを指す。
【０１１７】
用語「凝固障害」は凝固因子障害を指す。この障害は、特定の凝固因子の欠乏症又は欠損に起因する可能性があり、その結果、出血症候群が発生する、又は凝固因子障害に起因する可能性がある。凝固障害は一般に、先天性凝固障害又は後天性凝固障害であることができる。先天性凝固障害の例示的で非限定的な例として、凝固第Ｖ因子（ＦＶ）、凝固第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、その欠損又は欠乏症が血友病Ａを引き起こす凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、その欠損又は欠乏症が血友病Ｂを引き起こす凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、凝固第Ｘ因子（ＦＸ）、その欠損又は欠乏症が血友病Ｃを引き起こす凝固第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、凝固第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、凝固第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）及びこれらの組み合わせに言及することができる。後天性凝固障害は様々な起源を有する可能性がある。具体例として、重度の肝不全、抗凝固療法（例えばヘパリン、低分子量ヘパリン、ワルファリン、クマリン誘導体、ジクマリン等）における凝固因子の合成不足が挙げられる。代替機序は凝固因子の過剰消耗に基づいており、その結果、凝固因子は出血病変中に凝塊を形成することができない。この機序は、例えば、多発性微小血栓の形成を伴う、血小板及び凝固因子を活性化する微小循環内皮に損傷を与える重度の敗血症、胎盤放出等のＴＦによる血管浸潤、死亡胎児の保持、組織の破壊を伴う多重外傷、有毒なヘビの咬傷等の多重疾病において発生する消耗に起因する、播種性血管内凝固症候群又は凝固障害で発生する。血管炎では、体壁及び内皮の損傷により凝固活性化因子が放出される。凝固因子の消耗は、抗血小板物質及び抗凝固物質であるプラスミンの作用に起因する多数の微小血栓のフィブリンの溶解により悪化する。
【０１１８】
用語「血小板障害」は、血小板の数及び機能的能力の両方における障害を指し、その結果、出血症候群が起こる。前記血小板障害は先天性又は後天性であることができる。特定の実施態様では、前記血小板障害は先天性血小板障害である。先天性血小板障害の例示的で非限定的な例として、Ｇｌａｎｚｍａｎｎ病、ＢｅｒｎａｒｄＳｏｕｌｉｅｒ病、Ｂｏｌｉｎ−Ｊａｍｉｅｓｏｎ症候群、Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群、Ｐａｒｉｓ−Ｔｒｏｕｓｓｅａｕ−Ｊａｃｏｂｓｅｎ症候群、Ｘ染色体血小板減少症、灰色血小板症候群、Ｓｅｂａｓｔｉａｎ症候群及びＦａｎｃｏｎｉ貧血が挙げられる。別の特定の実施態様では、前記血小板障害は後天性血小板障害である。後天性血小板障害の例示的で非限定的な例として、例えば血小板血症、赤血球増加症、慢性骨髄性白血病等の骨髄増殖性疾患が挙げられ、出血時間の増加、ガラスビーズ保持欠損、血小板凝集欠損、異常な放出及び血小板第ＩＩＩ因子欠損を伴う骨髄化生における機能的血小板障害が存在する。機能的血小板欠損は、壊血病における並びに先天性心疾患及び肝硬変におけるタンパク異常血症で見られる。
【０１１９】
本発明の第７の態様の一実施態様では、損傷部位への投与による出血の局所的治療で使用するための、上記で定義した組み合わせ又は組成物が提供される。
【０１２０】
用語「対象」は本明細書で使用する場合、ヒト種を含む動物種のあらゆるメンバーを含み、例示的で非限定的な例として、前記対象は哺乳類、例えば霊長類、家畜、齧歯類等であることができる。前記対象は好ましくは、あらゆる年齢及び人種の男性又は女性である。特定の実施態様では、前記対象は止血障害の病歴がないヒトであり、例えば凝固障害又は血小板障害を有していない個体である。別の特定の実施態様では、前記対象は止血障害の病歴を有するヒトであり、例えば、先天性凝固障害若しくは後天性凝固障害等の凝固障害、又は先天性血小板障害若しくは後天性血小板障害等の血小板障害等の出血性素因を有する個体である。
【０１２１】
ＴＦは公知の血管新生促進分子であることから、本発明の組み合わせ及び組成物を、不十分な血管新生に関連した疾患の治療に使用することもできる。
【０１２２】
用語「不十分な血管新生に関連した疾患」は本明細書で使用する場合、血管形成を活性化することにより治癒することができる疾患に関する。語句「血管形成」は、あらゆる種類の及びあらゆる部位での血管形成に関する。血管形成の促進は、多くの臨床症状で有用であることができる。例えば、本発明の組み合わせを、虚血性疾患、心筋梗塞の最中に若しくはその後に、又は冠状動脈バイパス手術の後に、心筋組織における側副脈管構造の血管新生を促進するために使用することができる。本発明の組み合わせ及び組成物の供給により治療することができるその他の疾患又は状態として、末梢神経系又は中枢神経系の病理を引き起こす血管疾患及び／又は虚血性疾患が挙げられる。そのような状態／疾患として、例えば凝塊閉塞により又は動脈瘤の破裂により引き起こされる脳血管障害、又は神経細胞死を引き起こす一般的な／局所性の虚血、又は運動機能若しくは感覚機能等の末梢機能障害、発語障害、虚血性心筋症、又は末梢動脈疾患、例えば慢性四肢虚血跛行（骨格筋）、休息痛／虚血性潰瘍形成／壊疽を挙げることができる。更に、血管形成の促進は、正常に機能しない血管、例えば古い血管を置き換えるのに十分である。正常に機能しない血管は例えば脳又は心臓に存在する可能性があり、そのため、脳卒中又は梗塞を予防する又は治療することができる。プレスビオフレニーに対して予防措置を講ずることもできる。加えて、この語句は、動脈硬化症、Ｃｒｏｈｎ病及び潰瘍性大腸炎、糖尿病性網膜症及び脚／下腿潰瘍の深部静脈血栓症を治療するための血管形成、並びに再発の予防に関する。
【０１２３】
最後に、更なる態様では、本発明は、本発明の組み合わせ及び組成物をアプリケータと共に含むキットを提供する。
【０１２４】
キットは、（ａ）各部品が本発明の組み合わせを形成する各成分を含有するような３つの部品、即ち、キットの１つの部品がトロンビンを含有し、別の１つがフィブリノーゲンを含有し、その他の１つが脂質修飾組織因子を含有する形態、又は代替として（ｂ）組み合わせの成分の内の２つ（トロンビン及び脂質修飾組織因子、又はフィブリノーゲン及び脂質修飾組織因子）が１つの部品を共有し、第３の成分が独立して第２の部品に含有されるような２つの部品の形態を取ることができる。
【０１２５】
そのため、一実施態様では、キットは、ａ）トロンビンを含む第１の部品、ｂ）フィブリノーゲンを含む第２の部品、及びｃ）組換え脂質修飾組織因子を含む第３の部品、及びｄ）キットに含まれる全ての成分を同時に投与するためのアプリケータを含む。
【０１２６】
別の実施態様では、キットは、ａ）トロンビン及び脂質修飾組織因子を含む第１の部品、ｂ）フィブリノーゲンを含む第２の部品、ｃ）キットに含まれる全ての成分を同時に投与するためのアプリケータを含む。
【０１２７】
更に別の実施態様では、本発明は、ａ）トロンビンを含む１つの部品、ｂ）フィブリノーゲン及び脂質修飾組織因子を含む、もう１つの部品、ｃ）キットに含まれる全ての成分を同時に投与するためのアプリケータを含むキットを提供する。
【０１２８】
更に別の実施態様では、本発明は、トロンビン、フィブリノーゲン及び脂質修飾組織因子を全て含有する単一の部品を含むキットを提供する。
【０１２９】
キットに含有されるトロンビン、フィブリノーゲン及び脂質修飾組織因子は、適切な薬学的に又は獣医学的に許容される賦形剤及び／又はキャリアと共に、任意の適切な形態、例えば溶液、懸濁液又は粉末であることができる。
【０１３０】
加えて、キットは、上述したあらゆる用途でのキットの使用に関する説明書を含むことができる。
【０１３１】
一実施態様では、キットは架橋剤を更に含む。
【０１３２】
別の実施態様では、キットはフィブリン溶解阻害剤を更に含む。
【０１３３】
更に別の実施態様では、キットはＣａＣｌ２を更に含む。
【０１３４】
更なる実施態様では、キットは、架橋剤及びフィブリン溶解阻害剤を更に含む。
【０１３５】
更なる実施態様では、キットは、架橋剤、フィブリン溶解阻害剤及びＣａＣｌ２を含む。
【０１３６】
架橋剤、フィブリン溶解阻害剤及びＣａＣｌ２を、トロンビン、フィブリノーゲン及び脂質修飾組織因子用の上記で示した部品の何れか１つに含めることができる、あるいは、それぞれが、更に独立した部品中であることができる、又はキットの同じ部品を共有することができる。
【０１３７】
キットに含まれる組み合わせの止血プロファイル及び閉塞プロファイルに悪影響を及ぼさない任意の更なる成分を、提供されるキットに含めることができる。そのような余分の成分を、トロンビン、フィブリノーゲン及び脂質修飾組織因子用の上記で示した部品の何れか１つに含めることができる。あるいは、キットの「余分な成分」それぞれは、更に独立した部品中であることができる、又はキットの同じ部品を共有することができる。
【０１３８】
好ましくは、前記架橋剤はＦＸＩＩＩである。
【０１３９】
好ましくは、前記フィブリン溶解阻害剤は、アプロチニン、トラネキサム酸及びアミノカプロン酸から選択される。
【０１４０】
キットに含まれる全ての成分を同時に投与することを可能にするアプリケータの例示的で非限定的な例は、バレルシリンジ（ｂａｒｒｅｌｅｄｓｙｒｉｎｇｅ）、スプレーアプリケータ、又は特に成分が粉末状である場合に成分を分配するためのデバイスである。
【０１４１】
粉末の分配デバイスの例は、国際公開第２０１０／０７０３３号に開示されているものである。
【０１４２】
本明細書及び特許請求の範囲全体にわたって、単語「含む」及びこの単語の変形は、その他の技術的特徴、添加物、成分又は工程を除外することを意図しない。更に、単語「含む」は「から成る」の場合を包含する。本発明の更なる目的、利点及び特徴は、本明細書の検討により当業者に明らかになるであろう、又は本発明の実施により知られるだろう。以下の実施例及び図面は例示を目的として記載されており、これらの実施例及び図面は本発明を限定することを意図しない。図面に関連する引用符号及び特許請求の範囲の括弧内に配置される引用符号は、特許請求の範囲の理解度を高めることを単に試みているだけであり、特許請求の範囲を限定すると解釈してはならない。更に、本発明は、本明細書に記載の特定の実施態様及び好ましい実施態様の全ての可能な組み合わせを包含する。
【実施例】
【０１４３】
実施例１：  酵母における完全長ＴＦ  ｈｉｓ−タグ修飾タンパク質（以下において「ＴＴ−１７３」とも称する）の発現に基づく組換え組織因子の産生
ＵＲＡ３遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、酵母２μ複製開始点、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）プロモーター及びホスホグリセリン酸キナーゼの酵母転写終結シグナルを含む、国際公開第２００８０８０９８９号の実施例１に記載の酵母エピソームベクターｐＴＴ−１０３０１を、３’末端でＨｉｓ−タグを有し、天然のｈＴＦ配列（配列番号５）の潜在的なＮグリコシル化部位の内の１つを不活性化するＡｓｎ１２４Ａｌａ変異を有する成熟ｈＴＦタンパク質（配列番号１のアミノ酸３３−２９５位）をコードする配列番号６のｃＤＮＡの、ＧＰＤプロモーターの制御下でのクローニングに使用した。
【０１４４】
以下のようにして配列番号６を得た。配列番号７の及び配列番号８の配列のプライマーを使用して、ＴＦのヒトｃＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＣ０１１０２９、配列番号１１）を増幅させた。結果として生じた増幅ＤＮＡ配列を、配列番号９の及び配列番号１０の配列のプライマーを使用する部位特異的変異誘発により更に修飾した。このために、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅマニュアルに記載の方法に従った。そのような後者の変異誘発により、ＴＦタンパク質配列のアミノ酸残基１２４位でＡｓｎからＡｌａへの点変異を含有するＴＦ配列を生成した。
【０１４５】
形質転換後に、ウラシルフリーの培地で増殖することができる酵母株を回収し、国際公開第２００８０８０９８９号に基本的に記載されているように、酵母抽出物のウェスタンブロット分析により、酵母株のｈＴＦを発現する能力を調べた。簡潔に言うと、ＴＦコード遺伝子（配列番号６）の修飾バージョンを有するエピソーム発現プラスミドを含有する酵母を発酵槽中で増殖させ、結果として生じた細胞を遠心分離により回収する。回収した細胞を適切な溶解緩衝液（２０ｍＭのリン酸塩、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中に再懸濁させ、１０００ｂａｒの圧力でホモジナイザーに３回通して高圧溶解に供し、発酵溶解物（発酵ホモジネート）を得る。容器を氷浴中に沈めることにより、細胞懸濁液を低温に維持する。その後、遠心分離により最も重い物質を発酵溶解物から除去し、このようにして、清澄酵母抽出物（ＣＹＥ）の上清を得る。全タンパク質含有量が５−６ｍｇ／ｍＬの濃度に達するまで、ホモジナイズ工程から得たＣＹＥを溶解緩衝液で希釈し、それぞれが０．４５μｍ、０．２μｍ及び０．１μｍの逐次的フィルターに通してろ過して非膜の宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）の量を低減させ、より均質な物質をｒＴＦ小胞で得る。
【０１４６】
０．１μｍの精密ろ過の残渣物中の小胞は、０．２μｍ未満の直径を有する。ＤＮＡの痕跡を除去するため、次いで、０．１μｍの精密ろ過の残渣物を、１ｍＭの最終濃度になるまで１０Ｕ／ｍＬのエンドヌクレアーゼＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ）及び塩化マグネシウムで処理し、約２０ｒｐｍで揺動しているガラス容器中において４℃で１２時間にわたりインキュベートし、更なる富化工程で使用する。
【０１４７】
様々な小胞亜集団をそれらのサイズに従って更に分画するために、及び不要な残余の細胞物質を除去するために、フィルター清澄化酵母抽出物をＳｅｐｈａｃｒｙｌサイズ排除クロマトグラフィーカラムにアプライする。分離後、ｒＴＦに富む小胞に対応する画分２から２２を貯蔵してフィルター滅菌する。その後、ホスファチジルセリン（ＰＳ）を０．１ｍｇ／ｍＬの最終濃度で滅菌製品に添加し、混合物を２時間にわたり室温で維持してＰＳの小胞中への取り込みを可能にする。前工程として、超音波処理によるＭｏｒｒｉｓｓｅｙＬａｂ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄＶｅｓｉｃｌｅｓ（ＳＵＶ）に従って、緩衝溶液中での脂質の再懸濁、その後の超音波処理により、多重膜小胞としてＰＳを調製することができた。簡潔に言うと、（１）２．６μモルの全リン脂質（ＰＬ）をガラス試験管（１３×１００ｍｍ管が好都合なサイズである）に分注する；（２）ドラフト中において、窒素又はアルゴンの緩やかな流れの中でＰＬ混合物を乾燥させる。乾燥時に、高真空下で更に６０分にわたるスピードバック（ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ）（これにより、あらゆる残余のクロロホルムが除去される）；（３）ドライダウンしたＰＬに、２．６ｍｌの室温のＨＢＳ溶液を添加し、試験管の端をパラフィルムで覆う。室温で１時間置く；（４）試験管を激しくボルテックスしてＰＬを完全に再懸濁させる。結果物は乳白色で均一の懸濁液でなければならない；（５）超音波処理槽を室温の水で満たす。リングスタンド及び試験管クランプを使用して、ＰＬ懸濁液を含有する試験管を超音波処理槽中に吊す。試験管内の液面は試験管外の液面と等しくなければならない。懸濁液の外観が乳白色からほぼ透明（即ち、非常に少ない濁りのみ）に変化するまで超音波処理する。１０分毎に確認する；通常は１０から３０分の全超音波処理時間を要するだろう。（超音波処理槽を過熱させないように及び完全に冷却するまで超音波処理槽を排水しないように気を付けなければならない）；及び（６）最終産物を４℃で貯蔵する。結果物は、ＨＢＳ中に合計で１ｍＭのリン脂質を含有する小型単層小胞（ＳＵＶ）の懸濁液である。
【０１４８】
２時間のインキュベーション後、ＰＳ富化小胞を含有する滅菌産物を分取して凍結乾燥させる。この凍結乾燥物質は、以下の試験で使用するｒＴＦに対応し、ＰＳを高度に富む脂質小胞に固定された配列委番号５のタンパク質から成る。
【０１４９】
実施例２：  通常の血漿における及びヘパリン添加血漿中における凝塊の拡大に対するＦＳに関するＴＦの添加の効果
この試験において参照として使用するＦＳは、Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）として市販されているＦＳである。１ｍＬのＴｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）は、５００Ｕのヒトトロンビン、１１５ｍｇのフィブリノーゲン、アプロチニン３０００Ｕ及び塩化カルシウム４０μｍｏｌを含有する。
【０１５０】
２ｍＬのＴｉｓｓｕｃｏｌ及び実施例１後に得た３００ｎｇの脂質修飾ＴＦへの添加により、本発明の組み合わせを生成した。
【０１５１】
この研究の場合、２．５ｍＬの通常の血漿（５例の健康なドナーからの貯蔵した血漿）を４ｃｍ長のレーン中に置いた。次いで、試験する１ｍＬのシーラント組み合わせ、即ち参照（Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標））又は本発明（Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）＋脂質修飾ＴＦ）内の１つのどちらかを、一方の端部上に投与した。
【０１５２】
試験アイテムの投与後１５秒毎に５分にわたり、投与部位から３ｃｍ離れた凝固の程度を、分光光度計を用いて測定した。この場合、血漿の光学濃度を３４０ｎｍで分光光度計（Ｂｉｏｔｅｋ）により測定した。図１は、投与部位から３ｃｍ離れた、各製品の投与後の様々な時間でのＦＳ参照（Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標））（灰色の正方形）の及び本発明の組み合わせ（ＦＳ＋ＴＦ）（黒色の三角）の凝固割合を示す。
【０１５３】
示すように、ＦＳ＋ＴＦの組み合わせは、投与から１０５秒後に通常の血漿中で５０％の凝固を既に生成している（図１Ａ）。しかしながら、ＦＳを単独で投与する場合、この時間（１０５秒）なって初めて凝固が始まる。０．５Ｕ／ｍＬ（図１Ｂ）及び１Ｕ／ｍＬ（図１Ｃ）の治療濃度の両方の限度で同様の実験をヘパリン（Ｃｌｅｘａｎｅ（登録商標））処理血漿で実行する場合に、この差異はより顕著である。
【０１５４】
これらの結果から、ＦＩＩａ及びＦＩを含むＦＳへの脂質修飾ＴＦの添加により、凝塊の拡大によって止血プロファイルが改善されると結論付けることができる。
【０１５５】
実施例３：  脂質修飾ＴＦの添加後のＦＳのインビボでの止血効果の増強
実施するアッセイは、The Journal of Trauma Injury, Infection, and Critical Care, 2000, vol. 49 (2), p. 246-250でＫｅｍａｌ Ｋａｒａｋａｙａらにより開示されているものである。
【０１５６】
簡潔に言うと、本研究では、５２匹の雄（ＨｓｄＨａｎ：ＷＩＳＴ、ＨａｒｌａｎＩｎｔｅｒｆａｕｎａ）のラット（３８０−４００ｇｍ）を使用した。環境制御した施設に動物を収容した（ケージ：２５×５０ｃｍ、ケージ当たり２匹の動物）。飼料（ＧｌｏｂａｌＤｉｅｔ ２０１４、ＨａｒｌａｎＴｅｋｌａｎｄ）及び水は自由に摂取可能であった。動物をＢａｒｃｅｌｏｎａ大学生物学部生化学及び分子生物学科実験動物研究ユニット（ＣＥＲＥＭＥＴ）で飼育した。研究プロトコルは、Ｂａｅｃｅｌｏｎａ大学のＥｔｈｉｃＣｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌｓ（ＣＥＥＡ）及びＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｆｏｏｄ， ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｒａｌｉｔａｔ ｏｆ Ｃａｔａｌｏｎｉａにより承認された。承認への参照：ＤＡＡＭ５９９６。ＵＥＡｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓの要求に従って、全ての動物を人が世話した。
【０１５７】
動物を、未治療（ｎ＝１５）、Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）（ｎ＝２１）又は実施例１後に得たＴｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）＋脂質修飾ＴＦ（２００ｎｇ／ｍＬ）（Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）＋ＴＦ、ｎ＝１６）が投与される３つの群にランダムに割り当てた。
【０１５８】
１００ｍｇ／ｋｇのケタミンの筋肉内注射で動物を麻酔した。正中開腹の実施後に、腹腔の水分を綿スポンジで拭き取った。肝臓の一部をハサミで鋭く切除した。急激に出血している肝臓表面が容易に視覚化されたことから、出血表面への処置を行わなかった。次いで、無作為化に従って、切除した表面を、Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）、Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）＋脂質修飾ＴＦのどちらかで治療した、又は未治療のままにした。この後、全ての群において血液を腹膜腔中に蓄積させ、血液を小型の綿スポンジで回収して腹腔外への流出を回避した。研究期間の終了時に、腹腔中に流れた血液を小型の綿スポンジで回収した。（血液が浸漬された綿スポンジ）−（各動物に使用した、予め秤量した乾燥綿スポンジの重量）として、総失血を算出した。肝臓損傷後３０分にわたり動物をモニタリングした。
【０１５９】
図２に示すように、未治療の動物と比較した場合に、Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）（ＦＳ）の投与により失血が減少する。しかしながら、Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）（ＦＳ）への脂質修飾ＴＦの添加により、ＦＳのみに関する効果の約５０％の増加が生じる。
【０１６０】
以下のｐ値を前提として、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較検定により結果の統計学的有意性を確認した：Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）対未治療：ｐ値＜０．００１、Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）対Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）＋脂質修飾ＴＦ：ｐ値＜０．０１及びＴｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）＋脂質修飾ＴＦ対未治療：ｐ値＜０．００１。
【０１６１】
実施例４：  凝塊の粘稠性
実施例２で使用した各参照ＦＳ及び組み合わせを、２．５ｍＬのヘパリン（Ｃｌｅｘａｎｅ（登録商標））処理血漿を含有する４ｃｍ長のレーンの一方の端部上に投与した。
【０１６２】
本発明の組み合わせを投与した場合、本発明の組み合わせが参照シーラントと比べて大幅に速くレーン中に広がることを観察した。加えて、チップピペットを用いて、各組み合わせにより得た凝塊を取り除き、市販のＦＳにより得た凝塊は脆弱で容易に壊れたが、本発明の組み合わせの投与により生じた凝塊は壊れなかった。このことは、本発明の組み合わせにより得た凝塊は参照Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）により得た凝塊と比べてより高い粘稠性を有することを示していた。本発明の組み合わせにより得た凝塊は市販の参照（Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標））により得た凝塊に対してより良好な粘稠性を示したという事実は、本発明の組み合わせにより、市販のＦＳに由来する閉塞に関連する凝塊破損のリスクが大幅に低減され、従って本発明の組み合わせは損傷／創傷の閉塞に完全に効果的であることを意味する。
【０１６３】
理論に拘束されることなく、本発明者らは、（組み合わせに含まれるトロンビン及びフィブリノーゲンに起因して）形成されたフィブリンネットワーク中に組織因子が包埋され、フィブリンネットワーク内での組織因子のこの分散に起因して凝塊の拡大効果が生じ、この拡大効果により損傷又は外傷の効果的な閉塞が生じると考える。
【０１６４】
実施例５：  脂質修飾組織因子を含有する、トロンビンフリーのシーラント組成物の止血プロファイル及び閉塞プロファイル
国際公開９７／２９７９２号に開示された組成物の止血特性及び閉塞特性を測定するために、いくつかのトロンビンフリーのシーラント組成物を調製し、メーカーの推奨（ＲＯＴＥＭ（登録商標）の取扱説明書）に従ってＴＥＭにより分析した。凝塊全体の強度に関連するパラメーターＭＣＦ（最大凝塊硬度）及びパラメーターＧ（弾性モジュラス強度（ｅｌａｓｔｉｃｍｏｄｕｌｕｓ ｓｔｒｅｎｇｔｈ））を記録した。
【０１６５】
ＦＩＩａを含有するＦＳにより凝塊が誘発されているこれらの組成物からの凝塊の強度を比較するために、市販のＦＳ（Ｔｉｓｓｕｏｌ）及び市販されていないＦＳに関しても同じパラメーターを測定した。
【０１６６】
以下の試料を試験した：
１：ＦＩＩ、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＸ、ＦＸＩＩＩ、ＦＩ（起源：５例の異なる健康なドナーから得た、貯蔵した血漿）＋脂質修飾ＴＦ  ２００ｎｇ／ｍＬ（起源：ＴＴ−１７３）＋塩化カルシウム  ５ｍＭ。
２：ＦＩＩ、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＸ、ＦＸＩＩＩ、ＦＩ（起源：５例の異なる健康なドナーから得た、貯蔵した血漿）＋脂質修飾ＴＦ  ２００ｎｇ／ｍＬ（起源：ＴＴ−１７３）＋ＦＩ  ３ｍｇ／ｍＬ（起源ＳＩＧＭＡ．商品番号Ｆ４１２９）＋塩化カルシウム  ５ｍＭ
３：ＦＩＩ、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＸ、ＦＸＩＩＩ、ＦＩ（起源：５例の異なる健康なドナーから得た、プールした血漿）＋脂質修飾ＴＦ  ２００ｎｇ／ｍＬ（ＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  商品番号４５００Ｌ）＋塩化カルシウム  ５ｍＭ
４：ＦＩＩ、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＸ、ＦＸＩＩＩ、ＦＩ（起源：５例の異なる健康なドナーから得た、貯蔵した血漿）＋脂質修飾ＴＦ  ２００ｎｇ／ｍＬ（ＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  商品番号４５００Ｌ）＋ＦＩ  ３ｍｇ／ｍＬ（起源ＳＩＧＭＡ．商品番号Ｆ４１２９）＋塩化カルシウム  ５  ｍＭ
５：ＦＩＩ：１００μｇ／ｍＬ、ＦＶ：１０μｇ／ｍＬ、ＦＶＩＩ：０．５μｇ／ｍＬ、ＦＸ：８μｇ／ｍＬ、ＦＸＩＩＩ：１０μｇ／ｍＬ、ＦＩ：６ｍｇ／ｍＬ（起源：ＦＩ（商品番号Ｆ４１２９  ＳＩＧＭＡ）、ＦＩＩ：（商品番号ＨＣＰ−００１０  ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ）、ＦＸＩＩＩ：（商品番号ＨＣＸＩＩＩ−０１６０  ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ）、ＦＸ（商品番号ＨＣＸ−００５０  ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ）、ＦＶ（商品番号ＨＣＶ−０１００  ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ）、ＦＶＩＩ（商品番号ＨＣＶＩＩ００３０  ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ））＋脂質修飾ＴＦ  ２００ｎｇ／ｍＬ（起源：ＴＴ−１７３）＋塩化カルシウム  ５ｍＭ。これらの成分の混合物を、その使用１０分前に新たに調製した。
６：ＦＩＩ：１００μｇ／ｍＬ、ＦＶ：１０μｇ／ｍＬ、ＦＶＩＩａ：０．５μｇ／ｍＬ、ＦＸ：８μｇ／ｍＬ、ＦＸＩＩＩ：１０μｇ／ｍＬ、ＦＩ：６ｍｇ／ｍＬ（起源：ＦＩ（商品番号Ｆ４１２９  ＳＩＧＭＡ）、ＦＩＩ：（商品番号ＨＣＰ−００１０  ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ）、ＦＸＩＩＩ：（商品番号ＨＣＸＩＩＩ−０１６０  ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ）、ＦＸ（商品番号ＨＣＸ−００５０  ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ）、ＦＶ（商品番号ＨＣＶ−０１００  ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ）、ＦＶＩＩ（商品番号ＨＣＶＩＩ００３１  ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ））＋脂質修飾ＴＦ  ２００ｎｇ／ｍＬ（起源：ＴＴ−１７３）＋塩化カルシウム  ５ｍＭ。これらの成分の混合物を、その使用１０分前に新たに調製した。
【０１６７】
２種のＦＳ組成物、即ち市販のＴｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）及び市販されていないＦＳに関してもＭＣＦ値及びＧ値を測定した：
ｍＬ当たり以下の組成の市販されていないＦＳ：
フィブリノーゲン（ＦＩ）（商品番号Ｆ４１２９．ＳＩＧＭＡ）：１１５ｍｇ
トロンビン（ＦＩＩａ）（商品番号Ｔ４６４８  ＳＩＧＭＡ）：５００ＩＵ
塩化カルシウム：４０μｍｏｌ
【０１６８】
各組み合わせ４００μＬの分析に対応する結果を表Ｉ（ｎ＝３）に示す。
【０１６９】
表Ｉ
0006518591.tif 000002
【０１７０】
表Ｉにまとめたデータから、トロンビンフリーのシーラント組成物への脂質修飾組織因子の包含により、ＭＣＦ（最大凝塊硬度）値及びＧ（弾性モジュラス強度）値が市販のトロンビンシーラント組成物のＭＣＦ（最大凝塊硬度）値及びＧ（弾性モジュラス強度）値と比べて大幅に低いシーラント組成物がもたらされることを理解することができる。具体的には、ＭＣＦは、参照組成物のＭＣＦと比べて少なくとも２００％低い。一方、Ｇ値は、市販のトロンビンシーラント組成物のＧ値と比べて少なくとも約２０００％低い。
【０１７１】
当業者に知られているように、ＭＣＦ値及びＧ値が低いほど凝塊の閉塞プロファイルは悪い。従って、トロンビンフリー組成物に脂質修飾組織因子を添加しても閉塞活性の改善は実現されない。それゆえ、トロンビンシーラント組成物に脂質修飾組織因子を添加したときに本発明者らによって発見された閉塞効果は、国際公開第９７／２９７９２号の教示に由来し得ない。
【０１７２】
実施例６：  凝固時間の分析
ＦＳの有効性の分析に適切なその他のパラメーターは、ＦＳの様々な成分が安定した凝塊を生じさせるのに必要とされる時間である。この時間を、凝固計を用いて容易に定量化することができる。このアッセイには、本発明に対応する３成分組成物ＦＳ＋ＴＴ−１７３（フィブリノーゲン（ＦＩ）（商品番号Ｆ４１２９．ＳＩＧＭＡ）：１１５ｍｇ／ｍＬ、トロンビン（ＦＩＩａ）（商品番号Ｔ４６４８  ＳＩＧＭＡ）：５００ＩＵ／ｍＬ、ＴＴ−１７３（２００ｎｇ  ＴＦ／ｍＬ）、４０μｍｏｌ／ｍＬの塩化カルシウム）も含まれる。
【０１７３】
凝固分析を以下のように実行した：実施例５で試験した組成物由来の又はＦＳ＋ＴＴ−１７３由来のアリコート（２００μＬ）を、ステンレス鋼球を含有するキュベットに添加した。凝固計（ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａＳｔａｇｏ，Ｉｎｃ．ニュージャージー州、米国）に組み入れられた磁気撹拌により、凝塊のためにステンレス鋼球が停止するまでステンレス鋼球を動かす。凝固時間と呼ばれるこの時間（秒）を記録した。３００秒後に実験を停止した。結果を表ＩＩに示す。
【０１７４】
表ＩＩ
0006518591.tif 000003
【０１７５】
表ＩＩに見られるように、ＦＩＩａを含有するＦＳにより導かれた凝固時間は５秒未満の凝固時間を示し、国際公開第９７／２９７９２号の組み合わせは、凝固計により検出されるフィブリン繊維を十分に導くのに１５から３１秒、即ち少なくとも３００％多い時間を必要とした。
【０１７６】
上記データを考慮して、発明者らは、本発明に記載の３成分ＦＳ組成物は、国際公開第９７／２９７９２号に記載の組成物と比べて速くて強い凝塊を示すと結論付けることができる。
【０１７７】
実施例７：  ヘパリン添加血漿サンプルにおける本発明の組み合わせの止血能力
以下により産生された凝塊
（ａ）市販されていないＦＳ（実施例５での組成物を参照）３０μＬ
（ｂ）３成分の組み合わせＦＳ＋ＴＴ１７３（実施例６での組成物を参照）３０μＬ、又は
（ｃ）同様の３成分の組み合わせではあるが、ＴＦの起源としてＴＴ−１７３の代わりに脂質修飾ｒＴＦ（２００ｎｇ／ｍＬ。起源ＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  商品番号４５００Ｌ）を含有する３成分の組み合わせ３０μＬ
を、３００μＬのヘパリン添加血漿（０．６Ｕ／ｍＬ）に添加した。次いで、凝塊時間（ＣＴ＝凝塊の投与から最初のフィブリンネットの出現までの時間）パラメーター、凝塊形成時間（ＣＦＴ＝最初のフィブリンネットの形成から全凝塊の形成までの時間）パラメーター及び最大凝塊形成（ＭＣＦ＝凝塊硬度）パラメーターを、メーカーの推奨（ＲＯＴＥＭ（登録商標）の取扱説明書）に従ってＴＥＭにより測定した。
【０１７８】
結果を以下の表ＩＩＩにまとめる。
【０１７９】
表ＩＩＩ
0006518591.tif 000004
【０１８０】
このアッセイにおいて、ＦＳのみを使用した場合には安定した凝塊が得られなかったという事実は注目に値する。実際には、４０分（このアッセイで費やされた時間）後に、凝固形成の開始のみを検出した（１７１秒を必要とした）。
【０１８１】
対照的に、脂質修飾組織因子の包含により、３成分の組み合わせでは凝固がより速く始まり、両方の場合において、安定した凝塊が生成され、前記凝塊は高粘稠性（ＭＣＦ値）を示す。
【０１８２】
本発明の３成分の組み合わせは非常に短期間で安定した粘稠な凝塊を生成することができるという事実は、危険な医療シナリオにおいて非常に重要である。
【０１８３】
本願で引用した参考文献
国際公開第２００８０８０９８９号、
国際公開第２０１０／０７０３３号、
国際公開第２０１１１３１６５８号、
国際公開第９７／２９７９２号、
Mimms L. Tら, "Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside", Biochemistry, 1981 , vol. 20(4), p. 833-840、及びKemal Karakayaら, "Evaluation of a New Hemostatic Agent Ankaferd Blood Stopper in Experimental Liver laceration" , The Journal of Trauma Injury, Infection, and Critical Care, 2000, vol. 49 (2), p. 246-250.
【図１Ａ−Ｂ】
0006518591.tif 000005
【図１Ｃ】
0006518591.tif 000006
【図２】
0006518591.tif 000007
【配列表】
0006518591000001.app