(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）〜（ｄ）を満たすフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
（ａ）下記［１］または［２］のいずれかのポリペプチドで構成される
［１］配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
［２］配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性が９９％以上であるアミノ酸配列からなり、且つ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド
（ｂ）２５℃での作用性を１００％としたときの５℃での作用性が３５％以上である
（ｃ）５０℃、１５分処理後の残存活性が９０％以上である
（ｄ）至適活性温度が６０℃である
【請求項２】
下記の（ｅ）および（ｆ）のうち少なくとも１つ以上を満たす、請求項１記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素；
（ｅ）ｐＨ安定性：２Ｕ／ｍＬの酵素を２５℃で１６時間処理した後の残存酵素活性が、少なくともｐＨ４．５〜ｐＨ７．０の範囲で９０％以上である
（ｆ）至適ｐＨ：ｐＨ６．０〜６．７の間で最も高い活性を示し、その範囲において、ｐＨ６．３（リン酸緩衝液）における活性を１００％とした場合と比較して、８０％以上の相対活性を示す
【請求項３】
ポリペプチド部分の分子量が約５５ｋＤａである、請求項１又は２に記載のグルコース脱水素酵素。
【請求項４】
メタリジウム属に属する糸状菌由来である、請求項１〜３のいずれかに記載のグルコース脱水素酵素。
【請求項５】
以下の（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかのＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｃ）配列番号２に示される塩基配列との同一性が９９％以上である塩基配列からなり、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｄ）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｅ）配列番号３に示される塩基配列との同一性が９９％以上である塩基配列からなり、かつ、真核生物宿主での転写翻訳過程でスプライシングを受け、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
【請求項６】
請求項５に記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターが導入されている形質転換体。
【請求項８】
請求項５に記載のＤＮＡを保有する微生物を培養し、得られた培養液を精製する、請求項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を製造する方法。
【請求項９】
請求項７に記載の形質転換体を培養し得られた培養液を精製する工程を含む、請求項８に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素をグルコースに作用させることを含む、グルコース濃度の測定方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキット。
【請求項１２】
請求項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はグルコースデヒドロゲナーゼ（「ＧＤＨ」とも表す。）に関する。また、本発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド（「ＦＡＤ」とも表す。）を補酵素とするフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（「ＦＡＤＧＤＨ」とも表す。）、ＦＡＤＧＤＨの製造方法、及びＦＡＤＧＤＨを用いたグルコース測定方法、グルコースセンサ及びグルコースアッセイキット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
血糖自己測定（ＳＭＢＧ：Ｓｅｌｆ−Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ）は糖尿病患者が自己の血糖値を管理し、治療に活用するために重要である。近年、ＳＭＢＧのために、電気化学的バイオセンサを用いた簡易型の自己血糖測定器が広く用いられている。バイオセンサは、絶縁性の基板上に電極、酵素反応層を形成した装置である。
【０００３】
ＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．９９．１０）は、主に血中グルコース濃度測定に用いられる酵素であり、以下の反応を触媒する。
Ｄ−グルコース  ＋  電子受容体（酸化型）  
→  Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン  ＋  電子受容体（還元型）
【０００４】
血中グルコース定量用酵素としては、グルコースデヒドロゲナーゼ、及びグルコースオキシダーゼ（「ＧＯ」とも表す。）（ＥＣ  １．１．３．４）等が挙げられる。ＧＯを用いた方法は、測定サンプル中の溶存酸素の影響を受けやすく、溶存酸素が測定結果に影響を及ぼすといった問題点が指摘されている。一方でＧＤＨでもピロロキノリンキノン依存型グルコース脱水素酵素（「ＰＱＱＧＤＨ」とも表す。）（ＥＣ  １．１．５．２（旧ＥＣ  １．１．９９．１７））は、溶存酸素の影響を受けないが、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため正確な血糖値の測定には適していない。フラビン結合型グルコース脱水素酵素（「ＦＡＤＧＤＨ」とも表す）は、溶存酸素の影響を受けず、マルトースにもほとんど作用しない。代表的なものとして特許文献１記載のムコール属糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨなどがある。
【０００５】
ところで、グルコースセンサが使用される環境は室内であり、グルコースセンサを使用する一般ユーザーがセンサストリップを使用する際に厳密な温度管理を行うことはまれである。従って、個人によって保管されるグルコースセンサが曝される温度は、気候の変化により広い（例えば０℃〜４０℃）。
【０００６】
一般的に、酵素の反応性は反応条件が低温になるほど低くなる傾向が知られており、ＦＡＤＧＤＨも例外ではない。また、冬場はかなり低い温度（例えば、２〜１０℃）で使用されることが想定される。かかる知見に基づくと、室温が低い状況で使用されるグルコースセンサは実際よりも低い血糖値を示す可能性がある。
【０００７】
実際に、「医療と検査機器・試薬」という業界紙において、『ＳＭＢＧ装置とＰＯＣＴ対応血糖測定装置のすみ分け』（２００９年３２（６）Ｐ．７０７−７１３）の中で、ＳＭＢＧ装置の注意点として、環境温度条件が低温度域および高温度域の場合に、測定値がＩＳＯ１５１９７の許容範囲から外れる装置も多く、測定値が極端に低値や高値を示す場合は医療事故の要因になりうることが指摘されている。
【０００８】
一方、血糖センサ用チップの作製工程においては、加熱乾燥処理を施す場合があり、ＧＤＨ溶液を反応層上に蒸発乾固させる工程を踏むことが少なくない。かかる加温処理は５０℃以上の温度で実施され、製造の効率化に有効である。しかし、一般的にタンパク質は熱による変性が起こることが知られており、十分な熱安定性を有さない酵素は、大幅な熱失活をおこす危険性がある。
【０００９】
また作製後のセンサストリップは、通常においては室温程度の温度で最長２年の保証期間を設ける場合が多く、かかる要求を満たすためには、酵素自身の高い安定性が望まれることは想像に難くない。熱安定性に優れる酵素は、一般にその立体構造が安定であり、過酷な条件での長期保存により適しているといえる。
【００１０】
ＦＡＤＧＤＨの反応性に由来する測定精度を改善すべく、反応温度の影響を受けにくいＦＡＤＧＤＨとして、特許文献３〜５の出願がなされている。しかし、これらの特許文献記載のＦＡＤＧＤＨは熱安定性が不足し、改善の余地を残している。
例えば、特許文献３記載のＦＡＤＧＤＨは、その実施例によると５０℃での残存活性が０〜４０％であり、５０℃以降の温度での大幅な失活が予測される。
また、特許文献４記載のＦＡＤＧＤＨは、熱安定性に関する実施例がなく、４０℃を超える温度における酵素特性について何ら言及されていないので、５０℃付近またはそれ以上の温度では十分な安定性を有していない可能性が強く示唆される。
また、本発明者らが見出した特許文献５記載のＦＡＤＧＤＨは、５０℃での残存活性が８０％弱となっており、実質安定とされる残存活性９０％以上には届いていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２０１３−１１６１０２
【特許文献２】特許第４５６１７６４号
【特許文献３】ＷＯ２０１３―０３１６６４
【特許文献４】ＷＯ２０１３―１４７２０６
【特許文献５】特願２０１４―０２１６２３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、低温反応性に優れ、かつ、熱安定性にも優れたＦＡＤＧＤＨにより、低温での血糖測定に影響を与えにくく、かつ、センサでの保存安定性が向上したＦＡＤＧＤＨを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を行った結果、高い低温反応性を有し、かつ、従来知られている温度依存性改良型ＦＡＤＧＤＨよりも熱安定性に優れたＦＡＤＧＤＨを見出し、当該ＦＡＤＧＤＨの種々の特性を調べ、本発明を完成させた。
【００１４】
すなわち、以下に代表される発明が提供される。
項１．
下記の（ａ）〜（ｃ）を満たすフラビン結合型グルコース脱水素酵素；
（ａ）下記［１］〜［３］のいずれかのポリペプチドで構成される。
［１］配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
［２］配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有し、且つ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド
［３］配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、且つ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド
（ｂ）２５℃での作用性を１００％としたときの５℃での作用性が３５％以上である。
（ｃ）５０℃１５分処理後の残存活性が９０％以上である。
項２．
下記の（ｄ）、（ｅ）のうち少なくとも１つ以上を満たす、項１記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素；
（ｄ）ｐＨ安定性：２Ｕ／ｍＬの酵素を２５℃で１６時間処理した後の残存酵素活性が、少なくともｐＨ４．５〜ｐＨ７．０の範囲で９０％以上である。
（ｅ）至適ｐＨ：ｐＨ６．０〜６．７の間で最も高い活性を示し、その範囲において、ｐＨ６．３（リン酸緩衝液）における活性を１００％とした場合と比較して、８０％以上の相対活性を示す。
項３．
ポリペプチド部分の分子量が約５５ｋＤａである、項１、又は、項２記載のグルコース脱水素酵素
項４．
メタリジウム属に属する糸状菌である、項１〜項３のいずれか１項記載のグルコース脱水素酵素
項５．
以下の（Ａ）〜（Ｈ）のいずれかのＤＮＡ：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｃ）配列番号２に示される塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｄ）配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｅ）配列番号２に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加および／または逆位されている塩基配列であり、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｆ）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｇ）配列番号３に示される塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつ、真核生物宿主での転写翻訳過程でスプライシングを受け、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｈ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位したアミノ酸配列からなり、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
項６．
項５に記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
項７．
項５に記載のベクターが導入されている形質転換体。
項８．
項５に記載のＤＮＡを保有する微生物を培養し、得られた培養液を精製する、項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を製造する方法。
項９．
項７に記載の形質転換体を培養し得られた培養液を精製する工程を含む、項８に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
項１０．
項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素をグルコースに作用させることを含む、グルコース濃度の測定方法。
項１１．
項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキット。
項１２．
項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースセンサ。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、低温での血糖測定に影響を与えにくく、かつ、センサでの保存安定性が向上したＦＡＤＧＤＨを提供が可能になる。また、大腸菌、酵母、力ビ等を宿主細胞とした効率的なフラビン結合型ＧＤＨが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】メタリジウム・エスピー・Ｆ２１１４株由来ＧＤＨの反応温度依存性を示す。
【図２】メタリジウム・エスピー・Ｆ２１１４株由来ＧＤＨの熱安定性を示す。
【図３】メタリジウム・エスピー・Ｆ２１１４株由来ＧＤＨの各ｐＨにおける相対活性を示す。
【図４】メタリジウム・エスピー・Ｆ２１１４株由来ＧＤＨの各ｐＨにおける１６時間処理後の活性残存率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の実施形態の一つは、下記の（ａ）〜（ｃ）を満たすフラビン結合型グルコース脱水素酵素である；
（ａ）下記［１］〜［３］のいずれかのポリペプチドで構成される。
［１］配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
［２］配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有し、且つ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド
［３］配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、且つ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド
（ｂ）２５℃での作用性を１００％としたときの５℃での作用性が３５％以上である。
（ｃ）５０℃１５分処理後の残存活性が９０％以上である。
【００１８】
１．フラビン結合型グルコース脱水素酵素（ＦＡＤＧＤＨ）活性
本発明の酵素は、フラビンを補欠分子族として要求するフラビン結合型のＧＤＨ（ＦＡＤＧＤＨ）である。ＧＤＨは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する理化学的性質を有する酵素である。本書においては、この理化学的性質をグルコースデヒドロゲナーゼ活性といい、特に断りが無い限り、「酵素活性」又は「活性」とは、当該酵素活性を意味する。前記電子受容体は、ＧＤＨが触媒する反応において、電子の授受を担うことが可能である限り特に制限されないが、例えば、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェート、及びフェリシアン化合物等を使用することができる。
【００１９】
グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定方法としては、種々の方法が知られているが、本書では、ＤＣＰＩＰを電子受容体として用い、反応前後における６００ｎｍの波長における試料の吸光度の変化を指標に活性を測定する方法が用いられる。具体的な試薬組成や測定条件は、特にことわらない限り下記のとおりである。
【００２０】
グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定方法
＜試薬＞
１．３００ｍＭ  Ｄ−グルコースを含む１００ｍＭ  リン酸緩衝液ｐＨ６．５（０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
２．１．６ｍＭ  ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
上記Ｄ−グルコースを含むリン酸緩衝液２０ｍＬ、ＤＣＰＩＰ溶液１０ｍＬ、を混合して反応試薬とする。
【００２１】
＜測定条件＞
反応試薬３ｍＬを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍＬを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録する。反応時間をＸ軸、吸光度をＹ軸として測定結果をプロットし、直線部分から（即ち、反応速度が一定になってから）１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度１ＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量である。
活性（Ｕ／ｍＬ）＝
｛−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．１×希釈倍率｝／｛０．８５×０．１×１．０｝
なお、式中の３．１は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍＬ）、０．８５は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。本書においては、別段の表示をしない限り、酵素活性は上記の測定方法に従って、測定される。
【００２２】
２．低温反応性
本発明のＦＡＤＧＤＨは、高い低温反応性を有する。本発明における低温反応性とは、２５℃での酵素活性と比較した５℃での酵素活性の相対値として評価される。各温度での酵素反応性は、上記１．に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素（ＦＡＤＧＤＨ）活性測定法に準じて、その反応温度を５℃または２５℃に変更して測定される。本発明のＦＡＤＧＤＨの５℃における酵素活性は、２５℃における酵素活性と比較して３５％以上、好ましくは３７％以上、さらに好ましくは３９％以上、さらに好ましくは４０％以上である。
【００２３】
３．ポリペプチド
本発明のＦＡＤＧＤＨは、上記１．および２．に記載の特性を有し、かつ、さらに下記［１］〜［３］のいずれかのポリペプチドで構成されることを特徴とする。
［１］配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
［２］配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有し、且つ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド
［３］配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、且つ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド
【００２４】
配列番号１で示されるアミノ酸配列とは、後述する実施例１に示される通り、メタリジウム・エスピー・Ｆ２１１４株に由来するＦＡＤＧＤＨ（以下、ＭｅｓＧＤＨとも表す）のアミノ酸配列である。
【００２５】
上記［２］のポリペプチドは、グルコース脱水素酵素活性を保持する限度で、配列番号１に示されるアミノ酸において、１若しくは数個のアミノ酸配残基が置換、欠失、挿入および／または付加（以下、これらを纏めて「変異」とも表す。）されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００２６】
当該変異がアミノ酸の置換である場合、置換の種類は、特に制限されないが、ＦＡＤＧＤＨの表現型に顕著な影響を与えないという観点から保存的アミノ酸置換が好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、その側鎖と性質が類似する側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類される。よって、同一のファミリー内のアミノ酸残基間で置換されることが好ましい。
【００２７】
一又は数個の変異は、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法やランダム突然変異導入法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １３  ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）など公知の手法を利用して、ＧＤＨをコードするＤＮＡに変異を導入することによって実施することが可能である。また、紫外線照射など他の方法によってもバリアントを得ることができる。バリアントには、ＧＤＨを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じるバリアント（例えば、一塩基多型）も含まれる。
【００２８】
活性を維持するという観点からは、活性部位又は基質結合部位に影響を与えない部位において上記変異が存在することが好ましい。
【００２９】
上記［３］のポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と比較した同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。好ましくは、本発明のＦＡＤＧＤＨが有するアミノ酸配列と配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性は、８５％以上であり、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。このような一定以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上述するような公知の遺伝子工学的手法に基づいて作成することができる。
【００３０】
一実施形態において、上記［３］のポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全に一致するアミノ酸配列を有していないことが、より改善された特性を備えるという観点から好ましい。また、同様の観点から、上記（ｃ）のポリペプチドは、組換え発現によって得られたポリペプチドであることが好ましい。組換え発現によって得られるポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドとは糖鎖結合等において異なるため、より好ましい特性を有していることが期待される。
【００３１】
アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。本書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出する。
【００３２】
なお、前記ＦＡＤＧＤＨを構成するポリペプチドは、シグナルペプチド部分を欠失していてもよい。Ｔｈｅ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＤｅｎｍａｒｋのＴｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＢＳ）により提供されているＳｉｇｎａｌＰ  ４．１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ.ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｓｉｇｎａｌｐ／）を用いて、デフォルトの設定での推定によれば、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、１番目から１６番目までがシグナル配列と予想される。したがって、この部分を欠失することは酵素特性に不都合な影響をもたらさないと推察される。
【００３３】
４．熱安定性
本発明のＦＡＤＧＤＨは、熱安定性に優れる。本発明における熱安定性とは、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に、ＦＡＤＧＤＨを、上記１．に記載のＦＡＤＧＤＨ活性測定法で２Ｕ／ｍｌとなるように添加し、各測定対象温度でそれぞれ１５分間維持した後の残存酵素活性を比較して評価する。
前記条件において、本発明のＦＡＤＧＤＨの各測定対象温度における残存酵素活性は、５５℃以下（即ち、０℃〜５５℃の温度範囲）において７８％以上を示す。
また、前記条件において、本発明のＦＡＤＧＤＨの各測定対象温度における残存酵素活性は、５０℃以下（即ち、０℃〜５０℃の温度範囲）において９０％以上を示す。
【００３４】
５．熱安定性以外の諸特性
本発明のＦＡＤＧＤＨは、下記５−１〜５−３に示す３つの特性のうち少なくとも１つ以上を備えていることが好ましく、より好ましくはその２つ以上を備え、更に好ましくはその３つの特性の全てを備える。本発明のＦＡＤＧＤＨは、上記５−１〜５−３に示す特性を如何なる組合せで備えていても良い。
【００３５】
５−１．分子量
ポリペプチド部分の分子量が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合に５５ｋＤａであること。
「５５ｋＤａ」とは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量を測定した際に、当業者が、通常５５ｋＤａの位置にバンドがあると判断する範囲を含むことを意味する。「ポリペプチド部分」とは、実質的に糖鎖が結合していない状態のＦＡＤＧＤＨを意味する。微生物によって生産された本発明のＦＡＤＧＤＨが糖鎖結合型である場合は、それを熱処理や糖加水分解酵素によって処理することにより、糖鎖を除去した状態（即ち、「ポリペプチド部分」）にすることができる。実質的に糖鎖が結合していない状態とは、熱処理や糖加水分解酵素によって処理された糖鎖結合型ＦＡＤＧＤＨに不可避的に残存する糖鎖の存在を許容する。よって、ＦＡＤＧＤＨが本来的に糖鎖結合型でない場合は、それ自体が「ポリペプチド部分」に相当する。
【００３６】
糖鎖結合型ＦＡＤＧＤＨから糖鎖を除去する手段としては、種々の方法が知られている。本書においては、後述する実施例に示すように、糖鎖結合型のＦＡＤＧＤＨを１００℃で１０分間加熱処理をして変性させた後、Ｎ−グリコシダーゼＥｎｄｏ  Ｈ（ニューイングランドバイオラボ社製）を用いて３７℃で１時間以上処理する方法を使用することができる。
【００３７】
本発明のＦＡＤＧＤＨに糖鎖が結合している場合、その分子量は、グルコース脱水素酵素活性、基質特異性、及び比活性などにネガティブに影響しない限り特に制限されない。例えば、糖鎖が結合した状態の本発明ＦＡＤＧＤＨの分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの測定において、６０〜１２０ｋＤａであることが好ましい。糖鎖結合型のＦＡＤＧＤＨは、酵素をより安定にするという観点及び水溶性を高め、水に溶け易くするという観点から好ましい。
【００３８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分子量の測定は、一般的な手法及び装置を用い、市販される分子量マーカーを用いて行うことができる。
【００３９】
５−２．至適活性ｐＨ
ｐＨ６．０〜６．７の間で最も高い活性を示し、その範囲において、ｐＨ６．３（リン酸緩衝液）における活性を１００％とした場合と比較して、８０％以上の相対活性を示すこと。
好ましくはｐＨ６．３（リン酸緩衝液）において最も高い活性を示す。
【００４０】
５−３．ｐＨ安定性
少なくともｐＨ４．５〜７．０の範囲全体で安定であること。
本発明におけるｐＨ安定性とは、特定のｐＨ条件の下、２Ｕ／ｍＬの酵素を２５℃で１６時間処理した後の残存酵素活性を、処理前の同じｐＨ条件下での酵素活性と比較して評価する。
本発明のＦＡＤＧＤＨの各測定対象ｐＨにおける残存酵素活性は、少なくともｐＨ４．５〜７．０の範囲全体で９０％以上であることが好ましい。
【００４１】
６．由来
本発明のＦＡＤＧＤＨの由来は特に限定されないが、一実施形態において、本発明のＦＡＤＧＤＨは、メタリジウム属に属する糸状菌であることが好ましい。さらには、メタリジウム・エスピー・Ｆ２１１４（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ｓｐ．  Ｆ２１１４）株に由来することが好ましい。メタリジウム・エスピー・Ｆ２１１４株は、株式会社ハイファジェネシス（ＨｙｐｈａＧｅｎｅｓｉｓ  Ｉｎｃ．）の微生物ライブラリーに保管されている菌株であり、そこから入手することができる。
【００４２】
本発明のＦＡＤＧＤＨには、微生物から直接単離されるＦＡＤＧＤＨだけでなく、単離されたＦＡＤＧＤＨを蛋白質工学的な方法によりアミノ酸配列等を改変したものや、遺伝子工学的手法により改変したものも含まれる。例えば、前述の、メタリジウム・エスピー・Ｆ２１１４株から取得した酵素を基に明らかになったアミノ酸配列に改変を加えることによって、特性を付与した改変型の酵素であってもよい。
【００４３】
本発明のＦＡＤＧＤＨは、単離されたＦＡＤＧＤＨ又は精製されたＦＡＤＧＤＨであることが好ましい。また、本発明のＦＡＤＧＤＨは、上記保存に適した溶液中に溶解した状態又は凍結乾燥された状態（例えば、粉末状）で存在してもよい。本発明のＦＡＤＧＤＨに関して使用する場合の「単離された」とは、当該酵素以外の成分（例えば、宿主細胞に由来する夾雑タンパク質、他の成分、培養液等）を実質的に含まない状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離された酵素は、夾雑タンパク質の含有量が重量換算で全体の約２０％未満、好ましくは約１０％未満、更に好ましくは約５％未満、より一層好ましくは約１％未満である。一方で、本発明のＦＡＤＧＤＨは、保存又は酵素活性の測定に適した溶液（例えば、バッファー）中に存在してもよい。
【００４４】
７．フラビン結合型グルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡ
本発明の実施形態の一つは、上記の項１．のＦＡＤＧＤＨをコードするＤＮＡであり、具体的には以下の（Ａ）〜（Ｈ）のいずれかのＤＮＡである。
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｃ）配列番号２に示される塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｄ）配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｅ）配列番号２に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加および／または逆位されている塩基配列であり、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｆ）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｇ）配列番号３に示される塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつ、真核生物宿主での転写翻訳過程でスプライシングを受け、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｈ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位したアミノ酸配列からなり、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【００４５】
前記（Ａ）において「タンパク質のアミノ酸配列（ポリペプチドまたはＦＡＤＧＤＨなどと言うこともある）をコードするＤＮＡ」とは、それを発現させた場合に当該タンパク質が得られるＤＮＡ、即ち、当該タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するＤＮＡのことをいう。従ってコドンの縮重によって相違するＤＮＡも含まれる。
【００４６】
前記（Ｂ）から（Ｇ）において、配列番号２は、全鎖長１７８２ｂｐのメタリジウム・エスピー・Ｆ２１１４株由来ＧＤＨのｃＤＮＡ配列である。また、配列番号３は、メタリジウム・エスピー・Ｆ２１１４株由来ＧＤＨの遺伝子配列であり、先頭から数えて３４８ｂｐ〜４１６ｂｐ及び、１６４０ｂｐ〜１６９７ｂｐの領域はイントロンである。
【００４７】
前記（Ｃ）および（Ｇ）において、本発明のＤＮＡは、それがコードするアミノ酸配列を有するタンパク質が、グルコース脱水素酵素活性を持つタンパク質である限り（好ましくは、さらに上記２．の低温反応性、および／または、上記４．の熱安定性を満たす限り）、前記（Ｃ）においては配列番号２に示される塩基配列との同一性が、前記（Ｇ）においては配列番号３に示される塩基配列との同一性が、それぞれ８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上）である塩基配列を有する。
【００４８】
塩基配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。本書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴにおいてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、塩基配列の同一性の値（％）を算出する。
【００４９】
前記（Ｄ）において、本発明のＤＮＡは、それがコードするタンパク質がグルコース脱水素活性をもつタンパク質である限り（好ましくは、さらに上記２．の低温反応性、および／または、上記４．の熱安定性を満たす限り）、配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであっても良い。ここで「ストリンジェントな条件」とは、一般には、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照して設定することができる。
【００５０】
本書では、「ストリンジェントな条件」とは、以下に示す条件を言う。ハイブリダイゼーション液として５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，  １５ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ，  ｐＨ  ７．０）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））を用いる。
【００５１】
このような条件でハイブリダイズするＤＮＡの中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれ得るが、それらについては、市販の活性発現ベクターに組み込み、適当な宿主で発現させて、酵素活性を公知の手法で測定することによって容易に取り除くことができる。
【００５２】
前記（Ｅ）および（Ｈ）において、「数個」とは、特に制限されないが、例えば、全アミノ酸数または全塩基数の約２０％未満に相当する数であり、好ましくは約１５％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約１０％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約５％未満に相当する数であり、最も好ましくは約１％未満に相当する数である。より具体的には、変異されるアミノ酸残基または塩基の個数は、例えば、２〜１６０個、好ましくは２〜１２０個、より好ましくは２〜８０個、更に好ましくは２〜４０個であり、更に好ましくは２〜１０個であり、より更に好ましくは２〜５個である。
【００５３】
好適な一実施形態において、本発明のＦＡＤＧＤＨをコードするＤＮＡは、単離された状態で存在するＤＮＡである。ここで「単離されたＤＮＡ」とは、天然状態において共存するその他の核酸やタンパク質等の成分から分離された状態であることをいう。但し、単離されたＤＮＡは、天然状態において隣接する核酸配列（例えばプロモーター領域の配列やターミネーター配列など）など一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。例えば染色体ＤＮＡの場合の「単離された」状態とは、好ましくは、天然状態において共存する他のＤＮＡ成分を実質的に含まない。一方、ｃＤＮＡ分子など遺伝子工学的手法によって調製されるＤＮＡの場合の「単離された」状態では、好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない。同様に、化学合成によって調製されるＤＮＡの場合の「単離された」状態では、好ましくは、ｄＮＴＰなどの前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない。尚、それと異なる意味を表すことが明らかでない限り、本明細書において単に「ＤＮＡ」と記載した場合には単離された状態のＤＮＡを意味する。本発明のＤＮＡには、上記（Ａ）〜（Ｈ）のＤＮＡと相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）も含まれる。
【００５４】
本発明のＤＮＡは、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報（特に、配列番号２）を基に、化学的ＤＮＡ合成法により製造、取得することができ、例えば、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって容易に調製することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｄ  Ｅｄ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ  （２００１）等参照）。化学的ＤＮＡ合成法としては、フォスフォアミダイト法による固相合成法を例示することができる。この合成法には自動合成機を利用することができる。
【００５５】
また、本発明のＧＤＨ生産に用いるＤＮＡの入手方法としては、化学的にＤＮＡ鎖を合成するか、もしくは合成した一部オーバーラップするオリゴＤＮＡ短鎖を、ＰＣＲ法を利用して接続することにより、本発明のＧＤＨの全長をコードするＤＮＡを構築することも可能である。化学合成もしくはＰＣＲ法との組み合わせで全長ＤＮＡを構築することの利点は、該遺伝子を導入する宿主に合わせて使用コドンを遺伝子全長にわたり設計できる点にある。同一のアミノ酸をコードする複数のコドンは均一に使用されるわけではなく、生物種によってその使用頻度が異なる。一般にある生物種において高発現する遺伝子に含まれるコドンは、その生物種において使用頻度の高いコドンを多く含んでおり、逆に発現量の低い遺伝子は使用頻度の低いコドンの存在がボトルネックとなって高発現を妨げている例が少なくない。異種遺伝子の発現に際し、その遺伝子配列を宿主生物において使用頻度の高いコドンに置換することで該異種タンパク質発現量が増大した例はこれまでに多数報告されており、このような使用コドンの改変は異種遺伝子発現量の増大に効果があると期待される。
【００５６】
上記の理由から、本発明のＧＤＨをコードするＤＮＡは、それが導入される宿主細胞により適したコドン（即ち、該宿主において使用頻度の高いコドン）に改変すること（最適化）が望ましい。各宿主のコドン使用頻度は、該宿主生物のゲノム配列上に存在する全遺伝子における各コドンの使用される割合で定義され、たとえば１０００コドンあたりの使用回数で表される。またコドン使用頻度は、その全ゲノム配列の解明されていない生物にあっては代表的な複数遺伝子の配列から近似的に算出することも可能である。組換えようとする宿主生物におけるコドン使用頻度のデータは、例えば（財）かずさＤＮＡ研究所のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ）に公開されている遺伝暗号使用頻度データベースを用いることができ、または各生物におけるコドン使用頻度を記した文献を参照してもよく、あるいは使用する宿主生物のコドン使用頻度データを自ら決定してもよい。入手したデータと導入しようとする遺伝子配列を参照し、遺伝子配列に用いられているコドンの中で宿主生物において使用頻度の低いものを、同一のアミノ酸をコードし使用頻度の高いコドンに置換すればよい。このような使用頻度の高いコドンとしては、例えば宿主が大腸菌Ｋ１２株である場合にあっては、ＧｌｙにはＧＧＴまたはＧＧＣ、ＧｌｕにはＧＡＡ、ＡｓｐにはＧＡＴ、ＶａｌにはＧＴＧ、ＡｌａにはＧＣＧ、ＡｒｇにはＣＧＴまたはＣＧＣ、ＳｅｒにはＡＧＣ、ＬｙｓにはＡＡＡ、ＩｌｅにはＡＴＴまたはＡＴＣ、ＴｈｒにはＡＣＣ、ＬｅｕにはＣＴＧ、ＧｌｎにはＣＡＧ、ＰｒｏにはＣＣＧなどが挙げられる。
【００５７】
標準的な遺伝子工学的手法としては、具体的には、本発明のＦＡＤＧＤＨが発現される適当な起源微生物より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから、本発明のＤＮＡ配列（例えば、配列番号２の塩基配列）に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより実施できる〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ．，  ７８，  ６６１３（１９８１）等参照〕。
【００５８】
ｃＤＮＡライブラリーを調整するための起源微生物は、本発明のＦＡＤＧＤＨを発現する微生物であれば特に制限されないが、好ましくは、メタリジウム属に分類される微生物である。
【００５９】
微生物からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等は、いずれも常法に従って実施することができる。本発明のＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。例えば、ｃＤＮＡによって産生されるポリペプチドに対して、該ポリペプチド特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のヌクレオチド配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等やこれらの組合せ等を適宜選択して実施することができる。
【００６０】
ＤＮＡの取得に際しては、ＰＣＲ法またはその変法によるＤＮＡ若しくはＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法、特に５’−ＲＡＣＥ法〔Ｍ．Ａ．  Ｆｒｏｈｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ．，  ８，  ８９９８  （１９８８）〕等の採用が好適である。
【００６１】
ＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマーは、配列番号２の塩基配列に基づいて適宜設計し合成することができる。尚、増幅させたＤＮＡ若しくはＲＮＡ断片の単離精製は、前記の通り常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動法、ハイブリダイゼーション法等によることができる。
【００６２】
本発明のＤＮＡを使用することにより、本発明のＦＡＤＧＤＨを容易に大量に、安定して製造することができる。
【００６３】
７．ベクター
本発明のベクターは、上記７．で説明する本発明のＦＡＤＧＤＨをコードするＤＮＡが組み込まれたベクターである。ここで「ベクター」とは、それに挿入された核酸分子を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子（キャリアー）であり、適当な宿主細胞内で本発明のＤＮＡを複製可能であり、且つ、その発現が可能である限り、その種類や構造は特に限定されない。即ち、本発明のベクターは発現ベクターである。ベクターの種類は、宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。ベクターの具体例としては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）等を挙げることができる。また、糸状菌を宿主とする場合に適したベクターや、セルフクローニングに適したベクターを使用することも可能である。
【００６４】
大腸菌を宿主とする場合は、例えば、Ｍ１３ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、ｐＢＲ３２２又はその改変体（ｐＢ３２５、ｐＡＴ１５３、ｐＵＣ８など）など）を使用することができる。酵母を宿主とする場合は、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＹＥＳ２等を使用することができる。糸状菌を宿主とするときは、ｐＵＮ１、ｐＵＳＣ等を使用することができる。昆虫細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＡｃ、ｐＶＬ等が使用でき、哺乳類細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＣＤＭ８、ｐＭＴ２ＰＣ等を使用することができるが、これらに限定される訳ではない。
【００６５】
発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。本発明のＤＮＡのベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えＤＮＡ技術（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １．８４，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照することができる、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。
【００６６】
８．形質転換体
本発明は、宿主細胞に本発明のＤＮＡが導入された形質転換体に関する。本発明のＤＮＡの宿主への導入手段は特に制限されないが、例えば、上記７．で説明するベクターに組み込まれた状態で宿主に導入される。宿主細胞は、本発明のＤＮＡを発現してＦＡＤＧＤＨを生産することが可能である限り、特に制限されない。具体的には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、植物培養細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。
【００６７】
宿主が原核細胞の場合は、エシェリヒア属、バチルス属、ブレビバチルス属、コリネバクテリウム属などが例として挙げられ、それぞれ、エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＤＨ５α、バチルス・サブチリス、ブレビバチルス・チョウシネンシス、コリネバクテリウム・グルタミカムなどが例として挙げられる。また、ベクターとしてはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどが例として挙げられる。
【００６８】
宿主が酵母の場合は、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、キャンデイダ属、ピキア属、クリプトコッカス属などが例として挙げられ、それぞれ、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、キャンデイダ・ウチリス、ピキア・パストリス、クリプトコッカス・エスピーなどが例として挙げられる。ベクターとしてはｐＡＵＲ１０１、ｐＡＵＲ２２４、ｐＹＥ３２などが挙げられる。宿主が糸状菌細胞である場合は、アスペルギルス属、トリコデルマ属、メタリジウム属などが例として挙げられ、それぞれ、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ニガー、トリコデルマ・レセイ、メタリジウム・エスピー等を例示することができる。
【００６９】
本発明においては、ＦＡＤＧＤＨが単離されたメタリジウム・エスピー・Ｆ２１１４株を宿主とすることも好ましい。即ち、形質転換体では、通常、外来性のＤＮＡが宿主細胞中に存在するが、ＤＮＡが由来する微生物を宿主とするいわゆるセルフクローニングによって得られる形質転換体も好適な実施形態である。
【００７０】
本発明の形質転換体は、好ましくは、上記７．に示される発現ベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって調製される。形質転換は、一過性であっても安定的な形質転換であってもよい。トランスフェクション及びトランスフォーメーションはリン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、Ｈａｎａｈａｎの方法、酢酸リチウム法、プロトプラスト−ポリエチレングリコール法、等を利用して実施することができる。
【００７１】
本発明の形質転換体は、本発明のＦＡＤＧＤＨを産生する能力を有するため、それを用いて効率的に本発明のＦＡＤＧＤＨを製造することが可能となる。
【００７２】
９．フラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法
本発明のＦＡＤＧＤＨは、典型的には、本発明のＦＡＤＧＤＨの生産能を有する微生物を培養することで製造される。培養に供される微生物は、本発明のＦＡＤＧＤＨを産生する能力を有する限り特に制限されず、例えば、上記６．に示すメタリジウム・エスピー・Ｆ２１１４株及び上記８．に示す形質転換体を好適に利用することができる。
【００７３】
上記のメタリジウム・エスピー・Ｆ２１１４株は、株式会社ハイファジェネシスが保有する菌株である。
【００７４】
培養方法及び培養条件は、本発明のＦＡＤＧＤＨが生産される限り特に限定されない。即ち、ＦＡＤＧＤＨが生産されることを条件として、使用する微生物の生育に適合した方法及び条件を適宜設定できる。以下に、培養条件として、培地、培養温度、及び培養時間を例示する。
【００７５】
培地としては、使用する微生物が生育可能な培地であれば、特に制限されない。例えば、グルコース、シュクロース、ゲンチオビオース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、更に硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、あるいは、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、ふすま、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。使用する微生物の生育を促進するためにビタミン、アミノ酸などを培地に添加してもよい。
【００７６】
メタリジウム・エスピー・Ｆ２１１４株を培養して本発明のＦＡＤＧＤＨを得る場合は、その微生物の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよい。多くの場合は液体培養で行い、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。ただし、生産性を考えた場合に、固体培養で行った方が有利な場合もある。
【００７７】
培地のｐＨは、培養する微生物の生育に適していればよく、例えば約３〜８、好ましくは約５〜７程度に調整し、培養温度は通常約１０〜５０℃、好ましくは約２５〜３５℃程度で、１〜１５日間、好ましくは１〜７日間程度好気的条件下で培養する。培養法としては例えば振盪培養法、ジャー・ファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。
【００７８】
上記のような条件で培養した後、培養液又は菌体よりＦＡＤＧＤＨを回収することが好ましい。ＦＡＤＧＤＨを菌体外に分泌する微生物を用いる場合は、例えば培養上清をろ過、遠心処理等することによって不溶物を除去した後、限外ろ過膜による濃縮、硫安沈殿等の塩析、透析、各種クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。メタリジウム・エスピー・Ｆ２１１４株が産生するフラビン結合型グルコース脱水素酵素は基本的に分泌型のタンパク質である。
【００７９】
他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理、機械的手法、又はリゾチーム等の酵素を利用した手法等によって破砕した後、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加してＦＡＤＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取し、分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。
【００８０】
精製は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿処理、加熱処理や等電点処理、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせて実施することができる。
【００８１】
カラムクロマトグラフィーを用いる場合は、例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）等を用いることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００８２】
なお、培養液からのグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質の採取（抽出、精製など）にあたっては、グルコース脱水素酵素活性、マルトース作用性、熱安定性などのうちいずれか１つ以上を指標に行ってもよい。
【００８３】
各精製工程では原則としてＧＤＨ活性を指標として分画を行い、次のステップへと進む。但し、予備試験などによって、適切な条件を予め設定可能な場合にはこの限りでない。
【００８４】
組換えタンパク質として本酵素を得ることにすれば種々の修飾が可能である。例えば、本酵素をコードするＤＮＡと他の適当なＤＮＡとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドないしタンパク質が連結された組換えタンパク質からなる本酵素を得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、あるいはＮ末端若しくはＣ末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。
【００８５】
１０．グルコースの測定方法等
グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースの測定方法は既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い、本発明のＦＡＤＧＤＨを用いて、各種試料中のグルコースの量又は濃度を測定することができる。本発明のＦＡＤＧＤＨを用いてグルコースの濃度又は量が測定可能である限り、その態様は特に制限されないが、例えば、本発明のＦＡＤＧＤＨを試料中のグルコースに作用させ、グルコースの脱水素反応に伴う電子受容体（例えば、ＤＣＰＩＰ）の構造変化を吸光度で測定することにより実施することができる。より具体的には、上記１．に示す方法に従って、実施することができる。本発明に従った、グルコース濃度の測定は、試料に本発明のＦＡＤＧＤＨを添加すること、又は添加して混合することにより実施することができる。グルコースを含有する試料は、特に制限されないが、例えば、血液、飲料、食品等を挙げることができる。グルコース濃度又は量の測定が可能である限り、試料に添加する酵素の量は特に制限されない。
【００８６】
１０−１．グルコースアッセイキット
本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従うＦＡＤＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、本発明のＦＡＤＧＤＨ、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。また、ＦＡＤＧＤＨを含む試薬中には、安定化剤及び／又は活性化剤としてウシ血清アルブミン、セリシン等のタンパク質、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、コール酸塩、デオキシコール酸塩などの界面活性剤、グリシン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシルグリシン等のアミノ酸、トレハロース、イノシトール、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、スクロース等の糖及び／又は糖アルコール類、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類、さらにはプルラン、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ポリグルタミン酸などの親水性ポリマーを適宜添加してもよい。
【００８７】
１０−２．グルコースセンサ
本発明に従うＦＡＤＧＤＨを用いるグルコースセンサは、電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどを用いる方法があり、ＮＡＤもしくはＮＡＤＰといった補酵素、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＦＡＤＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングすることができる。使用する電子メディエーターとしては、ＧＤＨの補酵素であるＦＡＤから電子を受け取り、発色物質や電極に電子を供与しうるものが挙げられ、たとえばフェリシアン化物塩、フェナジンエトサルフェート、フェナジンメトサルフェート、フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルフェニレンジアミン、１−メトキシ−フェナジンメトサルフェート、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、２，５−ジメチル−１，４−ベンゾキノン、２，６−ジメチル−１，４−ベンゾキノン、２，５−ジクロロ−１，４−ベンゾキノン、ニトロソアニリン、フェロセン誘導体、オスミウム錯体、ルテニウム錯体等が例示されるが、これらに限定されない。また、電極上のＧＤＨ組成物中には、安定化剤及び／又は活性化剤としてウシ血清アルブミン、セリシン等のタンパク質、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、コール酸塩、デオキシコール酸塩などの界面活性剤、グリシン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシルグリシン等のアミノ酸、トレハロース、イノシトール、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、スクロース等の糖及び／又は糖アルコール類、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類、さらにはプルラン、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ポリグルタミン酸などの親水性ポリマーを含んでもよい。
【００８８】
センサを用いたグルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明のＦＡＤＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００８９】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。以下の実施例の記載はいかなる面においても本発明を限定しない。
【実施例】
【００９０】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００９１】
＜実施例１＞
メタリジウム・エスピー・Ｆ２１１４株ＧＤＨ遺伝子の取得
（１）メタリジウム・エスピー・Ｆ２１１４株ゲノムＤＮＡの調製
５０ｍＬのＹＰＤ培地（０．５重量％酵母エキス、１重量％ペプトン、２重量％グルコース）を５００ｍＬ坂口フラスコに入れ、オートクレーブで滅菌し、前培養用の培地を調製した。予めＤＰプレート培地で復元したメタリジウム・エスピー・Ｆ２１１４株を前培養培地に一白金耳植菌し、２５℃、１８０ｒｐｍで３日間振とう培養し、ミラクロスにより菌体を濾過することで菌体を取得した。
【００９２】
取得した菌体を液体窒素中で凍結破砕し、５ｍｌフェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール(２５：２４：１、ｐＨ７．２)５ｍｌを加え、十分に懸濁した後、室温にて３０００ｒｐｍ２０分遠心し、水層約４ｍｌを試料とした。本試料を、ＭａｇＥｘｔｏｒａｃｔｏｒ―ＰｌａｎｔＧｅｎｏｍｅ−（東洋紡製）を用いて付属の説明書に従いゲノムＤＮＡを取得した。
【００９３】
（２）メタリジウム・エスピー・Ｆ２１１４株ゲノム配列の決定
（１）で取得したゲノムＤＮＡをＮｅｘｔｅｒａ  ＸＴ  Ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｅｐ  ｋｉｔ（イルミナ社製）を用いて付属の説明書に従い断片化し、タグメンテーションを実施した。
【００９４】
タグメンテーションした断片化されたゲノムＤＮＡをＭｉｓｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ  ｖ２  ３００サイクル（イルミナ社）を使用して、フローセル上にクラスタリングし、Ｍｉｓｅｑ（イルミナ社）を用いてデータ取得を実施した。取得したＦＡＳＴＱファイルを元に、ＣＬＣ  ＧＥＮＯＭＩＣＳ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  Ｖｅｒ７．５を使用し定法にそってデノボアッセンブルを行うことで、メタリジウム・エスピー・Ｆ２１１４株のホールゲノム情報を取得した。
【００９５】
（３）メタリジウム・エスピー・Ｆ２１１４株由来ＧＤＨ遺伝子の取得
（２）で取得したホールゲノム情報をもとに、既存の麹菌由来ＦＡＤＧＤＨをＱｕｅｒｙとしてＢＬＡＳＴサーチを実施したところ配列番号３記載のメタリジウム・エスピー・Ｆ２１１４株由来ＧＤＨの遺伝子配列を取得した。
【００９６】
（４）メタリジウム・エスピー・Ｆ２１１４株由来ＧＤＨ遺伝子の発現
配列番号３記載のメタリジウム・エスピー・Ｆ２１１４株由来ＧＤＨの遺伝子配列をｐＵＳＡベクターのアミラーゼプロモーター下に接続し、該ベクターにてアスペルギルス・オリゼーＮＳ４株（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ｗｉｔｈ  Ｄｏｕｂｌｅ  Ａｕｘｏｔｏｒｏｐｈｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，  ｎｉａＤ  ａｎｄ  ｓＣ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９７  Ｖｏｌ．６１，  １３６７−１３６９））を形質転換した。形質転換は、文献Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｆｕｎｇｉ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ  ａｎｄ  Ｐｈｌｅｏｍｙｃｉｎ  Ｒｅｇｉｓｔａｎｃｅ  Ｍａｒｋｅｒ（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，  １９９２，  Ｖｏｌ．２１６，  ４４７−４５７）記載の方法に準じてプロトプラストを調製し、プロトプラスト−ポリエチレングリコール法による形質転換を実施した。
【００９７】
取得したアスペルギルス・オリゼーＮＳ４株形質転換体を、５０ｍＬのマルトース培地（５重量％酵母エキス、５重量％マルトース）を５００ｍＬ坂口フラスコに入れ、オートクレーブで滅菌したものに植菌し、３０℃１８０ｒｐｍにて７２時間培養した。菌体をミラクロスで除去し、培養上清を粗酵素液とした。取得した粗酵素液中のＧＤＨ活性を上記２．に示したＦＡＤＧＤＨの活性測定法に従い確認したところ、１０．７１Ｕ／ｍｌのＧＤＨ活性を確認した。
【００９８】
【表１】
0006455134.tif 000002
【００９９】
（５）メタリジウム・エスピー・Ｆ２１１４株由来ＧＤＨのｃＤＮＡ配列の取得
（４）で取得したアスペルギルス・オリゼーＮＳ４株形質転換体を５０ｍＬのマルトース培地（５重量％酵母エキス、５重量％マルトース）を５００ｍＬ坂口フラスコに入れ、オートクレーブで滅菌したものに植菌し、３０℃１８０ｒｐｍにて７２時間培養した。菌体をミラクロスで濾過した後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を使用して付属の説明書に従いトータルＲＮＡを取得した。
【０１００】
取得したＲＮＡより、Ｓｍａｒｔｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（クロンテック社製）を使用して付属の説明書に従い３’ＲＡＣＥ、及び５’ＲＡＣＥを行った。前記の方法に従って得られた複数のプラスミド中に含まれるＤＮＡ断片の塩基配列解析を行った結果、配列番号２に示す全鎖長１７８２ｂｐのメタリジウム・エスピー・Ｆ２１１４株由来ＧＤＨのｃＤＮＡ配列が明らかとなった。当該遺伝子配列により予測した当該酵素遺伝子のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【０１０１】
配列番号１記載のアミノ酸配列は、特許文献１記載のアミノ酸配列（Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ由来のＦＡＤＧＤＨ）とは相同性が３１％、特許文献２記載のアミノ酸配列（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のＦＡＤＧＤＨ）とは相同性が５８％、特許文献３記載のアミノ酸配列（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｔｕｌｉｐａｅ、Ｄｕｍｏｎｔｉｎｉａ ｔｕｂｅｒｏｓｅ、およびＯｖｕｌｉｎｉａ  ａｚａｌｅａｅ由来のＦＡＤＧＤＨ）とは相同性が５１〜５４％、特許文献４記載のアミノ酸配列（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ ＮＢＲＣ４４６４、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．  Ｔ７９９、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．  Ｔ８０６、Ｆｕｓｉｃｌａｄｉｕｍ ｃａｒｐｏｐｈｉｌｕｍ、Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ  ｃａｕｌｉｖｏｒａ、およびＫａｂａｔｉｅｌｌａ  ｚｅａｅ由来のＦＡＤＧＤＨ）とは相同性が４５〜５０％、特許文献５記載のアミノ酸配列（Ｔａｒａｌｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ.  ＦＫＩ２７２５由来のＦＡＤＧＤＨ）とは相同性が５０％、であり、新規な配列であるといえる。
【０１０２】
＜実施例２＞
メタリジウム・エスピー・Ｆ２１１４株由来ＧＤＨの取得
６０ｍＬのＤＰ培地を５００ｍＬ坂口フラスコに入れ、オートクレーブで滅菌し、前培養用の培地を調製した。予めＤＰプレート培地で復元したアスペルギルス・オリゼーＮＳ４株形質転換体（実施例１（４）で取得）を前培養培地に一白金耳植菌し、２５℃、１８０ｒｐｍで３日間振とう培養し、種培養液を得た。
【０１０３】
次に、６．０Ｌの生産培地（酵母エキス５．０重量％、マルトース重量５．０％、ｐＨ６．０）を１０Ｌ容ジャー・ファーメンターに入れ、オートクレーブで滅菌し、本培養培地を調製した。５０ｍＬの種培養液を本培養培地に植菌し、培養温度２５℃、攪拌速度３５０ｒｐｍ、通気量２．０Ｌ／分、管内圧０．２ＭＰａの条件で３日間培養した。その後、培養液を３Ｌまで濃縮し、粗酵素液を得た。
【０１０４】
粗酵素液に４０％飽和になるように硫酸アンモニウムを徐々に添加し、予め４０％飽和の硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した５００ｍＬのフェニルセファロースＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）カラムにかけ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）のリニアグラジエントで溶出させた。溶出されたＧＤＨ画分を分画分子量１０，０００の中空糸膜（スペクトラムラボラトリーズ製）で濃縮後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ２５（ＧＥヘルスケア製）カラムにかけ、脱塩を実施した。その後、脱塩した画分を、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＤＥＡＥセファロースＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）カラムにかけ、夾雑タンパクのみを吸着させた。そして、得られた画分をＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ−２００（ＧＥヘルスケア製）カラムにかけ、精製酵素を得た。以下、得られた精製ＧＤＨを「Ｍｅｓ−ＧＤＨ」とも表する。
【０１０５】
＜実施例３＞
低温反応性
実施例２で得られたＭｅｓ−ＧＤＨについて上記２．に示したＦＡＤＧＤＨの活性測定法に従い、５℃、２５℃、３７℃での活性を測定した。酵素濃度については最終濃度が４．８μｇ／ｍｌとなるように調整した。
【０１０６】
＜比較例１＞
既存のＦＡＤＧＤＨの温度依存性を調べるべく特許文献２記載のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のＦＡＤＧＤＨアミノ酸配列を麹菌で組み替え産生し、精製した酵素を比較例１として調製し、上記２．に示したＦＡＤＧＤＨの活性測定法に従い、５℃、２５℃、３７℃での活性測定を行った。酵素濃度については最終濃度３．８μｇ／ｍｌとなるように調製した。
【０１０７】
＜比較例２＞
既存のＦＡＤＧＤＨの温度依存性を調べるべく特許文献１記載のＭｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ由来のＦＡＤＧＤＨアミノ酸配列を酵母で組み替え産生し、精製した酵素を比較例２として調製し、上記２．に示したＦＡＤＧＤＨの活性測定法に従い、５℃、２５℃、３７℃での活性測定を行った。酵素濃度については最終濃度４．７μｇ／ｍｌとなるように調製した
【０１０８】
実施例３、比較例１、及び比較例２の５℃での酵素活性の２５℃及び３７℃での酵素活性に対する相対値を表２に示す。
【０１０９】
【表２】
0006455134.tif 000003
【０１１０】
表２に示される通り、実施例２で得られたＭｅｓ−ＧＤＨは、２５℃での作用性を１００％としたときの５℃での作用性、および、３７℃での作用性を１００％としたときの５℃での作用性、のいずれにおいても、既存のＦＡＤＧＤＨよりも高い数値を示した。
【０１１１】
＜実施例４＞
反応温度依存性・至適反応温度
実施例２で得られたＭｅｓ−ＧＤＨ酵素液（２．５μｇ／ｍＬ）を用いて、至適活性温度を調べた。５℃、１０℃、２５℃、３０℃、３７℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃におけるＭｅｓ−ＧＤＨ活性を求めた。結果を図１に示す。
【０１１２】
その結果、Ｍｅｓ−ＧＤＨは、６０℃において最も高い活性値を示した。以上のことから、Ｍｅｓ−ＧＤＨの至適活性温度は６０℃に至適活性をもつことが示された。
【０１１３】
＜実施例５＞
熱安定性
実施例２で得られたＭｅｓ−ＧＤＨの熱安定性を調べた。５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に２Ｕ／ｍｌとなるようにＭｅｓ−ＧＤＨを添加し、各温度（４℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃）で１５分間維持した後、上記１．に示したＦＡＤＧＤＨ活性測定方法を用いてＧＤＨ活性を測定し、処理前のＧＤＨ活性と比較して残存率を求めた。結果を図２に示す。
【０１１４】
その結果、Ｍｅｓ−ＧＤＨは、４℃〜５０℃の範囲の温度で処理した場合、９０％以上の残存率を有していた。また、５５℃処理後の残存活性は７８．１％であった。
【０１１５】
＜実施例６＞
ｐＨ依存性
実施例２で得られたＭｅｓ−ＧＤＨの至適ｐＨを調べた。１００ｍＭ酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．０−５．５、図３中■印でプロット）１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．５−６．４、図３中□印でプロット）、１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．３−７．８、図３中▲でプロット）、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０−８．０、図２中△印でプロット）を用いた。それぞれのｐＨにおける３７℃での活性を測定し、最も高い活性値を基準（１００％）として、各ｐＨにおける相対活性を求めた。結果を図３に示す。
【０１１６】
その結果、Ｍｅｓ−ＧＤＨの至適活性ｐＨは、リン酸カリウム緩衝液を使用した場合のｐＨ６．３であった。また、ｐＨ６．０〜６．７の範囲で、ｐＨ６．３における活性を１００％とした場合と比較して８０％以上の相対活性を示した。以上のことから、Ｍｅｓ−ＧＤＨの至適活性ｐＨはｐＨ６．０〜６．７であることが確認された。
【０１１７】
＜実施例７＞
ｐＨ安定性
実施例２で得られたＭｅｓ−ＧＤＨ酵素液（２Ｕ／ｍＬ）を用いて、ｐＨ安定性を調べた。１００ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ２．５−３．５、図４中■でプロット）、１００ｍＭ  酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ３．５−ｐＨ５．５：図４中□印でプロット）、１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．５−ｐＨ６．５：図４中▲印でプロット）、１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０−ｐＨ８．０：図４中△印でプロット）、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５−ｐＨ９．０：図４中●印でプロット）、１００ｍＭ  Ｇｒｉｃｙｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．５−ｐＨ１０．５：図４中○印でプロット）を用い、２５℃、１６時間、各緩衝液中で酵素を維持した後のグルコースを基質とした場合の活性を測定した。処理後の活性値と処理前の同じ緩衝液中での活性値を比較し、残存活性率を求めた。結果を図４に示す。
【０１１８】
その結果、改変型ＦＡＤＧＤＨは、ｐＨ４．５〜ｐＨ７．０の範囲で９０％以上の活性残存率であった。以上のことから、改変型ＦＡＤＧＤＨの安定ｐＨ域はｐＨ４．５〜ｐＨ７．０であることが確認された。
【０１１９】
＜実施例８＞
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量の推定
実施例２で得られたＭｅｓ−ＧＤＨについて１００℃、１０分間、加熱処理して変性させた後、５Ｕのエンドグリコシダーゼ（ＥｎｄｏＨ：ニューイングランドバイオラボ社製）で３７℃、１時間処理し、タンパク質に付加している糖鎖を分解した。次に、糖鎖を分解した酵素について、Ｎｕ−ＰＡＧＥ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。その結果、主に５５ｋＤａにバンドが見られたため、それのバンドをゲルから切り出し、トリプシンで消化させた後ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析による消化断片の分子量測定、およびＭＡＳＣＯＴ解析によるタンパク質の同定を行った。結果、５５ｋＤａのバンドから得られるペプチドが実施例１で取得した配列とヒットを示したため、このバンドがＧＤＨであると推定した。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
本発明により製造したグルコースデヒドロゲナーゼは、血糖値測定用試薬、血糖センサ並びにグルコース定量キットの原料としての供給が可能である。
【図１】
0006455134.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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