(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
0006606081.tif 000045
［式中、
ＰＥＧは、ポリエチレングリコール系置換基を示し；
ａは、１〜１２の整数であり；
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は、互いに独立して、Ｆ、ＯＲ、Ｎ＋（Ｒ）３、Ｎ＋（Ｒ）２ＯＲ、Ｎ＋（Ｒ）２ＳＲ、及びＮ＋（Ｒ）２Ｎ（Ｒ）２からなる群から選択され；
Ｒは、有機置換基、Ｈ、又は２個以上のＲが一緒に環状構造若しくは二環状構造を形成する基である］
で表されるポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシル。
【請求項２】
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３における２個以上のＲが、一緒に環状構造又は二環状構造を形成するものである、請求項１に記載のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシル。
【請求項３】
ａが、１〜８である、請求項１に記載のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシル。
【請求項４】
ａが、１〜４である、請求項３に記載のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシル。
【請求項５】
ａが、１である、請求項３に記載のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシル。
【請求項６】
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３が、Ｆである、請求項１に記載のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシル。
【請求項７】
Ｘ１が、Ｆであり、Ｘ２及びＸ３が、ＯＲであり、ここで、Ｘ２及びＸ３が、５員又は６員の複素環を形成するものである、請求項１に記載のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシル。
【請求項８】
ポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルが、式（ＩＩ）〜（ＸＩ）：
【化２−１】
0006606081.tif 000046
【化２−２】
0006606081.tif 000047
［式中、
Ｒ１及びＲ２が、互いに独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１６アルキル、Ｃ１−Ｃ１６アルコキシ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１６アルケニル、Ｃ１−Ｃ１６アルキニル、ニトリル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ１６脂肪族エステル、アミド、及びＣ１−Ｃ１６チオアルキルからなる群から選択され；及び
Ｒ３が、Ｃ１−Ｃ１６アルキルである］
からなる群から選択される、請求項７に記載のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシル。
【請求項９】
Ｘ１が、Ｆであり、Ｘ２が、Ｎ＋（Ｒ）３、Ｎ＋（Ｒ）２ＯＲ、Ｎ＋（Ｒ）２ＳＲ、及びＮ＋（Ｒ）２Ｎ（Ｒ）２からなる群から選択され、Ｘ３が、ＯＲであり、Ｘ２及びＸ３が、５員又は６員の複素環を形成するものである、請求項１に記載のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシル。
【請求項１０】
ポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルが、式（ＸＩＩ）〜（ＸＶ）：
【化３】
0006606081.tif 000048
［式中、
Ｒ１及びＲ２が、互いに独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１６アルキル、Ｃ１−Ｃ１６アルコキシ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１６アルケニル、Ｃ１−Ｃ１６アルキニル、ニトリル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ１６脂肪族エステル、アミド、及びＣ１−Ｃ１６チオアルキルからなる群から選択される］
からなる群から選択される、請求項９に記載のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシル。
【請求項１１】
Ｘ１及びＸ３が、ＯＲであり、Ｘ２が、Ｎ＋（Ｒ）３、Ｎ＋（Ｒ）２ＯＲ、Ｎ＋（Ｒ）２ＳＲ、及びＮ＋（Ｒ）２Ｎ（Ｒ）２からなる群から選択され、ここで、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が、二環状構造を形成するものである、請求項１に記載のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシル。
【請求項１２】
ポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルが、式（ＸＶＩ）〜（ＸＸＸＩ）：
【化４−１】
0006606081.tif 000049
【化４−２】
0006606081.tif 000050
【化４−３】
0006606081.tif 000051
［式中、
Ｒ１及びＲ２が、互いに独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１６アルキル、Ｃ１−Ｃ１６アルコキシ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１６アルケニル、Ｃ１−Ｃ１６アルキニル、ニトリル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ１６脂肪族エステル、アミド、及びＣ１−Ｃ１６チオアルキルからなる群から選択され；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６が、互いに独立して、水素、メチル、フェニル、及び２つのジェミナル（ｇｅｍｉｎａｌ）置換基を形成するカルボニルからなる群から選択され；
Ｒ７が、水素、メチル、ベンジル、フェニル、及び置換されたフェニルからなる群から選択され；
Ｒ８が、水素、メチル、イソ−プロピル、ベンジル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソ−ブチル、及び置換されたフェニルからなる群から選択され；
Ｚが、Ｏ、Ｓ、ＮＨ及びＮＣＨ３からなる群から選択され；及び
ｍ及びｎが、互いに独立して、０、１、２、及び３からなる群から選択される］
からなる群から選択される、請求項１１に記載のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシル。
【請求項１３】
Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が、ＯＲであり、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が、二環状構造を形成するものである、請求項１に記載のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシル。
【請求項１４】
ポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルが、式（ＸＸＸＩＩ）〜（ＸＸＸＩＶ）：
【化５】
0006606081.tif 000052
［式中、
Ｒ１及びＲ２が、互いに独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１６アルキル、Ｃ１−Ｃ１６アルコキシ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１６アルケニル、Ｃ１−Ｃ１６アルキニル、ニトリル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ１６脂肪族エステル、アミド、及びＣ１−Ｃ１６チオアルキルからなる群から選択される］
からなる群から選択される、請求項１３に記載のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシル。
【請求項１５】
ポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルが、式（ＸＸＸＶ）〜（ＬＶ）：
【化６−１】
0006606081.tif 000053
【化６−２】
0006606081.tif 000054
【化６−３】
0006606081.tif 000055
［式中、
Ｙが、ＣＨ、ＣＲ１、Ｏ、及びＮＲ９からなる群から選択され；
Ｙ１が、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、アルキルアミノ、及びシクロ−アルキルアミノからなる群から選択され；
Ｚ１及びＺ２が、互いに独立して、Ｃ１−Ｃ８アルキル、アリール、置換されたアリール、Ｃ１−Ｃ８アルコキシ、Ｃ１−Ｃ８チオアルキル、Ｃ１−Ｃ８アルキルアミド、及び芳香族アミドからなる群から選択され；
Ｒ１が、水素、Ｃ１−Ｃ１６アルキル、Ｃ１−Ｃ１６アルコキシ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１６アルケニル、Ｃ１−Ｃ１６アルキニル、ニトリル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ１６脂肪族エステル、アミド、及びＣ１−Ｃ１６チオアルキルからなる群から選択され；
Ｒ９が、Ｃ１−Ｃ１６アルキル、アシル、ホルミル、カルバモイル、脂肪族スルホニル、及び芳香族スルホニルからなる群から選択され、及び
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３が、請求項１において定義される通りである］
からなる群から選択される、請求項１に記載のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシル。
【請求項１６】
ポリエチレングリコール置換基が、ヒドロキシル、カルボン酸、カルボン酸エステル、アミン、チオール、カーボネート、カルバメート、アジド、アルキン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、アルデヒド、ケトン、マレイミド、及びハロゲンからなる群から選択される１つ以上の官能基で置換される又は置換されない、最大２００ｋＤａの直鎖状又は分岐状ポリエチレングリコール置換基である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシル。
【請求項１７】
リンカー基の形成が、求核芳香族置換反応、金属触媒によるクロスカップリング反応、付加環化反応、オレフィンメタセシス反応、チオール−マレイミド付加反応、オキシム若しくはヒドラジンカップリング反応、又は求核付加反応を伴う、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルを製造する方法。
【請求項１８】
式（ＸＸＸＶ）、（ＸＸＸＶＩ）若しくは（ＸＸＸＶＩＩ）のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルが、求核芳香族置換によって製造され；又は
式（ＸＸＸＶＩＩＩ）、（ＸＸＸＩＸ）若しくは（ＸＬ）のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルが、金属触媒によるクロスカップリング反応によって製造され；又は
式（ＸＬＩ）〜（ＸＬＶＩ）のいずれか１つのポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルが、［４＋２］若しくは［３＋２］付加環化反応によって製造され；又は
式（ＸＬＶＩＩ）又は（ＸＬＶＩＩＩ）のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルが、オレフィンメタセシス反応によって製造され；又は
式（ＩＬ）のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルが、チオール−マレイミド付加反応によって製造され；又は
式（Ｌ）、（ＬＩ）若しくは（ＬＩＩ）のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルが、オキシム若しくはヒドラジンカップリング反応によって製造され；又は
式（ＬＩＩＩ）、（ＬＩＶ）若しくは（ＬＶ）のポリエチレングリコール置換されたポリエチレングリコールが、求核付加反応によって製造される、請求項１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
金属触媒によるクロスカップリング反応が、Ｓｕｚｕｋｉ−、Ｓｔｉｌｌｅ−、Ｈｉｙａｍａ−又はＨｅｃｋ−型クロスカップリング反応である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
［４＋２］又は［３＋２］付加環化反応が、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応、ヘテロ−Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ又は１，３−双極子付加環化反応である、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
式（ＬＩＩＩ）、（ＬＩＶ）又は（ＬＶ）のポリエチレングリコール置換されたポリエチレングリコールが、求核付加反応によって活性化エステルに製造される、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ポリエチレングリコール置換された巨大分子を製造する方法であって、該巨大分子は、合成の、単離された、発現された若しくは修飾されたペプチド、合成の、単離された、発現された若しくは修飾されたタンパク質、ＤＮＡ、及びＲＮＡからなる群から選択され、
ここで、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、水性条件下で、巨大分子に存在するヒドロキシルアミン部分と反応して、アミド結合を形成する、上記方法。
【請求項２３】
ポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルが、ｔｅｒｔ−ブタノール及び水の混合物中、酸性条件下でヒドロキシルアミン部分と反応する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
巨大分子は、カルボン酸、ヒドロキシル、フェノール、チオール、アミン、アンモニウム、グアニジン、グアニジニウム、イミダゾール、インドール、及びメチルチオエーテルからなる群から選択される１つ以上の未保護官能基を含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
ヒドロキシルアミン部分は、ペプチド若しくはタンパク質のＮ末端に存在し、ＤＮＡ若しくはＲＮＡの３’−若しくは５’−末端に存在し、又はペプチド若しくはタンパク質の側鎖上に存在する、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
ヒドロキシルアミン部分は、リジン由来又はオルニチン由来の側鎖上に存在する、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシル、それらの製造方法、ポリエチレングリコール置換された巨大分子を製造するための該ポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＥＧ化ペプチド及び他の巨大分子−即ち、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）置換基を有する巨大分子−は、特に、医薬品、薬物送達ベヒクル、及び他の生体適合性材料を製造するために広く使用される。
【０００３】
医薬品開発の目的で、最も一般的なコンジュゲーション反応は、薬物、又はマレイミド又はα−ハロアミドなどの求電子部分を有するＰＥＧ試薬へのチオール（すなわち、システイン側鎖）の追加である。他の解決策は、リジン側鎖にオキシム形成（ケトン又はアルデヒドとヒドロキシルアミンとの反応）及び非特異的アミド形成を含む。アジド及び末端アルキンのトリアゾール形成反応を用いた化学選択的コンジュゲーションはまた、少なくとも学術研究に評価が高い。主な制限は、試薬のうちの１つを過剰に必要とする有毒な銅試薬の必要性又は遅い速度定数のいずれかである。
【０００４】
巨大分子とポリエチレングリコール置換基の両方が、製剤において高価で複雑になる傾向があるため、ＰＥＧ化は、選択的かつ高効率であることが重要である。さらに、安定した自然な結合が形成されることが望ましく、即ち、一般的に、天然に存在する物質に遭遇し、医療及び材料用途に使用するための安定かつ安全であることが知られている結合が挙げられる。
【０００５】
多くの保護されていない官能基の存在下でさえ、２つの反応物間の選択的結合形成を可能にする化学反応は重要であるが稀である。理想的な化学選択的コンジュゲーション反応は、基質の大きさ、又は保護されていない官能基の数及び性質にも関わらず、等モル量の連結パートナーを用いる水性条件下で２つの固有であるが、化学的に安定した部分間の迅速な共有結合形成を可能にする。
【０００６】
ＤＮＡライゲーションなどの結合構造のこのような業績は、特異的な生化学的酵素によって日常的に達成され、特定の状況において、合成用途に取り込むことが可能である。しかし、迅速であり、選択厳密な化学的ライゲーションはこれまで知られていない。いくつかの公知の合成ライゲーションは、不自然な結合を形成し、有毒な試薬の存在を必要とし、又は等モル量の巨大な又は貴重な開始材料をコンジュゲートするには十分速く進行しない。
【０００７】
したがって、この領域における残りの課題の１つは、好ましくは水性条件下で、試薬及び触媒を追加することなしに、自然な結合を形成するより迅速なライゲーション（二次速度定数＞Ｍ−１ｓ−１）の同定である。
【発明の概要】
【０００８】
本発明によって解決されるべき、より一般的な技術的課題は、２つの大きな分子間の共有結合の選択的な形成である。この技術的課題は、生物学的に活性な分子の合成において頻繁に生じる。このような分子の例としては、限定されないが、タンパク質、ペプチド、ＰＥＧ化された生体分子及びペプチド、抗体薬物コンジュゲート、及び官能化ポリマーが含まれる。共有結合形成のための典型的な反応は、これを困難にする３つの問題に悩まされる。
ａ．大部分の有機反応は、無水有機溶媒を必要とし、保護されていない有機官能基（すなわち、アミン、カルボン酸、アルコール、チオールなど）の存在下では正しく作用しない。
ｂ．大きな分子を接続するための大部分の有機反応は、非常に遅く、高濃度（１０ｍＭ以上）、長い反応時間、大過剰の１つの試薬、及び／又は高温を必要とする。
ｃ．２つの大きな保護されていない分子を接続するための最も良く知られている解決策は、問題があり、免疫原性があり得て、タンパク質などの分子の天然形態を作製するために使用することができない非天然の接続性を与える。
【０００９】
経済的及び精製の理由で重要である、等モル量の各反応物を使用して大きな分子を接続するために、少なくとも１Ｍ−１Ｓ−１の二次速度定数を要する。より速い速度定数がさらにより望ましい。
【００１０】
したがって、簡便、迅速、選択的、及び効率的な合成を可能にし、好ましくは天然の結合を形成する、ポリエチレングリコール置換された巨大分子を製造する手段を提供することが本発明の課題である。
【００１１】
この課題は、ポリエチレングリコール単位とヒドロキシルアミン部分を有する巨大分子間のアミド結合の形成を可能にする、本発明のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルによって解決される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ペプチド（１３）及びペプチド（１４）を示す。
【図２】ペプチド（１３）のＨＰＬＣ及びＨＲＭＳの結果を示す。
【図３】ペプチド（１４）のＨＰＬＣ及びＨＲＭＳの結果を示す。
【図４】ペプチド（１３）の擬一次反応速度論（図４ａ）、ペプチド（１３）と（１４）の消費と発生に関する速度の相関（図４ｂ）、及びペプチド（１３）の初速度の反応速度論（図４ｃ）を示す。
【図５】ＧＬＰ−１（７−３７）、リラグルチド、及びペプチド（１５）の構造を示す。
【図６】ペプチド（１５）のＨＰＬＣ及びＨＲＭＳの結果を示す。
【図７】ペプチド（１６ａ）のＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩの結果を示す。
【図８】ペプチド（１６ｃ）のＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
これらのポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、一般式（Ｉ）：
【００１４】
【化１】
0006606081.tif 000002
【００１５】
を有する。
【００１６】
上記式（Ｉ）において、ＰＥＧは、ポリエチレングリコール系置換基を示し；ａは、１〜１２の整数であり；Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は、互いに独立して、Ｆ、ＯＲ、Ｎ＋Ｒ３、Ｎ＋Ｒ２ＯＲ、Ｎ＋Ｒ２ＳＲ、及びＮ＋Ｒ２ＮＲ２からなる群から選択され、場合により、環状又は二環状構造を形成するものであり；Ｒは、有機置換基又はＨである。
【００１７】
典型的には、ホウ素上のリガンド内には配位結合及びカチオン、例えば、優先的には、Ｋ＋又はＣｓ＋、又はＬｉ＋、Ｎａ＋、Ｒ４Ｎ＋、Ｒ４Ｐ＋若しくはＲ３Ｓ＋＝Ｏが存在しない場合、対イオンも存在する。
【００１８】
本出願全体で、「ＰＥＧ」とは、エチレングリコール単位（−（ＣＨ２）２Ｏ−）から少なくとも本質的になる骨格を有し、場合により、さらに置換基を有する、任意の長さのポリエチレングリコール系化合物又は置換基を指す。ＰＥＧ部分は、少なくとも１個、最大１２個のホウ酸アシル置換基を担持する。
【００１９】
本出願で使用される用語「リンカー」は、場合により存在するリンカー基を表す。各ホウ酸アシル置換基は、存在する場合、他のホウ酸アシルと独立して、このようなリンカーに結合してもよく又は結合しなくてもよい。リンカー基は、一般的に、有機部分又はヘテロ有機部分であり、好ましくは、場合により１つ又は２つの芳香環を含有するＣ１−Ｃ２０炭化水素である。
【００２０】
本出願全体で、用語「有機置換基」とは、炭化水素系部分を意味するが、ある化合物の残り部分に供給結合し、場合により１つ以上のヘテロ原子を含んでもよい。
【００２１】
本発明のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、ヒドロキシルアミンと選択的に反応し、アミド結合を形成することが見出された。具体的には、この連結反応は、結果として、様々な非保護の官能基を有する分子を接続するために使用するように、非常に化学選択的であるだけでなく、非常に迅速である：＞２０Ｍ−１Ｓ−１の二次速度定数がこの反応について測定された。
【００２２】
さらに、アミド結合を形成する連結は、単に、水又は他の水性媒体中で、本発明のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルをヒドロキシルアミンと混合する際に生じる。
【００２３】
したがって、本発明は、化学試薬を必要とせずに、生物学的システムにおいて最も一般的な有機官能基の１つであるアミド結合を形成し、水中、及び非保護の有機官能基の存在下でさえ、迅速に作用する新規な化学反応を提供する。
【００２４】
結論として、これらの反応は、等モル量の反応物を用いてマイクロモル濃度で大きな分子の選択的なコンジュゲーションを可能にし、マルチドメインタンパク質、タンパク質−ポリマーコンジュゲート、及びポリエチレングリコール置換基を有するオリゴマー生体分子などの非常に大きな、構造的に画定された分子の合成への道を開く。
【００２５】
本発明の主な利点は、以下の通りである：
１．連結部位での安定した、自然なアミド結合の形成；
２．非保護のアミン、カルボン酸、チオール、アルコールなどの存在下で反応を作用させ得る優れた化学選択性；
３．任意の試薬又は触媒を必要とせずに、水中での迅速な連結；
４．１：１の化学量論で大きな分子とともにコンジュゲーションに適したものにする非常に速い反応速度論；そして
５．簡単で安価な方法により、対象とする試薬（すなわち、ＰＥＧは、色素、親和性タグなど）に必要なホウ酸アシルの容易な導入。
【００２６】
本発明のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、１つ又は複数個のホウ酸アシル部分、具体的には１〜１２個のホウ酸アシル部分を含有してもよい。したがって、式（Ｉ）中の係数「ａ」は、１〜１２の任意の整数であってもよい。好ましくは、ａは、１〜８であり、より好ましくは１〜４であり、最も好ましくはａ＝１である。
【００２７】
第一の好ましい実施形態によれば、３つの置換基Ｘ１、Ｘ２及びＸ３の全てが、Ｆである。したがって、好ましくは、本発明のホウ酸アシルは、トリフルオロホウ酸塩である。これらの化合物は、ヒドロキシルアミンに指向して特に反応性であることが見出され、このようにして、極めて短い反応時間を示す。また、トリフルオロホウ酸アシルは、驚くべきことに安定であり、取り扱いが容易であることが明らかにされた。
【００２８】
より好ましくは、本発明の化合物は、ポリエチレングリコール置換されたトリフルオロホウ酸アシル・カリウムである。
【００２９】
ヒドロキシルアミンとの小さく、比較的単純なトリフルオロホウ酸アシルの連結は、以前に報告されている（Ｄｕｍａｓ，Ａ．Ｍ．，Ｍｏｌａｎｄｅｒ，Ｇ．Ａ．，Ｂｏｄｅ，Ｊ．Ｗ．“Ａｍｉｄｅ−Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｙｌｔｒｉｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ”，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１２，５１，５６８３−５６８６）。しかしながら、この種の反応は、大きく又は構造的に複雑な分子をカップリングさせるために使用されていなかった。
【００３０】
また、アルデヒドから開始されるトリフルオロホウ酸アシルの製造方法が報告されている（Ｄｕｍａｓ，Ａ．Ｍ．；Ｂｏｄｅ，Ｊ．Ｗ．“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ａｃｙｌｔｒｉｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅｓ”，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０１２，１４，２１３８−２１４１）。この点において、上記刊行物の内容は、参照により本明細書に援用される。
【００３１】
第二の好ましい実施形態によれば、Ｘ１はＦであり、Ｘ２及びＸ３はＯＲである。好ましくはＸ２及びＸ３は、さらに、５員又は６員の複素環を形成するものである。
【００３２】
より好ましくは、第二の好ましい実施形態のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、（ＩＩ）〜（ＸＩ）からなる群から選択される。
【００３３】
【化２−１】
0006606081.tif 000003
【化２−２】
0006606081.tif 000004
【００３４】
化合物（ＩＩ）〜（ＸＩ）において、Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１６アルキル、Ｃ１−Ｃ１６アルコキシ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１６アルケニル、Ｃ１−Ｃ１６アルキニル、ニトリル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ１６脂肪族エステル、アミド、及びＣ１−Ｃ１６チオアルキルからなる群から選択され；及びＲ３は、Ｃ１−Ｃ１６アルキルである。より好ましくは、Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８アルコキシ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ８アルケニル、Ｃ１−Ｃ８アルキニル、ニトリル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ８脂肪族エステル、アミド、及びＣ１−Ｃ８チオアルキルからなる群から選択される。最も好ましくは、Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルケニル、Ｃ１−Ｃ４アルキニル、ニトリル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ４脂肪族エステル、アミド、及びＣ１−Ｃ４チオアルキルからなる群から選択される。特に好ましい実施形態において、Ｒ１及びＲ２は、水素である。Ｒ３は、好ましくはメチル基である。
【００３５】
好ましくは、第二の好ましい実施形態におけるポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、Ｒ１及びＲ２が、水素であり、Ｒ３が、メチルである、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（Ｘ）又は（ＸＩ）であるものである。
【００３６】
第三の好ましい実施形態によれば、Ｘ１は、Ｆであり、Ｘ２は、Ｎ＋Ｒ３、Ｎ＋Ｒ２ＯＲ、Ｎ＋Ｒ２ＳＲ、及びＮ＋Ｒ２ＮＲ２からなる群から選択され、Ｘ３は、ＯＲである。好ましくは、Ｘ２及びＸ３は、５員又は６員の複素環を形成するものである。
【００３７】
より好ましくは、第三の好ましい実施形態のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、（ＸＩＩ）〜（ＸＶ）からなる群から選択される。
【００３８】
【化３】
0006606081.tif 000005
【００３９】
化合物（ＸＩＩ）〜（ＸＶ）において、Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１６アルキル、Ｃ１−Ｃ１６アルコキシ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１６アルケニル、Ｃ１−Ｃ１６アルキニル、ニトリル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ１６脂肪族エステル、アミド、及びＣ１−Ｃ１６チオアルキルからなる群から選択される。より好ましくは、Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８アルコキシ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ８アルケニル、Ｃ１−Ｃ８アルキニル、ニトリル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ８脂肪族エステル、アミド、及びＣ１−Ｃ８チオアルキルからなる群から選択される。最も好ましくは、Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルケニル、Ｃ１−Ｃ４アルキニル、ニトリル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ４脂肪族エステル、アミド、及びＣ１−Ｃ４チオアルキルからなる群から選択される。１つの特に好ましい実施形態において、Ｒ１及びＲ２は、水素であり、別の特に好ましい実施形態において。Ｒ１は、であり、Ｒ２は、メチルである。
【００４０】
好ましくは、第三の好ましい実施形態のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、Ｒ１及びＲ２が、好ましくは水素であり、又はＲ１が、水素であり、Ｒ２が、メチルである、式（ＸＩＩＩ）〜（ＸＶ）のものである。アリール環又はピリジン環上の広範囲の置換基が可能であることが見出された。また、これらの化合物は、連結反応において十分に作用することが見出された。
【００４１】
第三の好ましい実施形態の最も反応性の化合物は、（ＸＩＩＩｂ）：
【００４２】
【化４】
0006606081.tif 000006
【００４３】
［式中、ａは、好ましくは１である］
である。
【００４４】
第四の好ましい実施形態によれば、Ｘ１及びＸ３は、ＯＲであり、Ｘ２は、Ｎ＋Ｒ３、Ｎ＋Ｒ２ＯＲ、Ｎ＋Ｒ２ＳＲ、及びＮ＋Ｒ２ＮＲ２からなる群から選択される。Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は、二環状構造を形成するものである。
【００４５】
より好ましくは、第四の好ましい実施形態のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、（ＸＶＩ）〜（ＸＸＸＩ）からなる群から選択される。
【００４６】
【化５−１】
0006606081.tif 000007
【化５−２】
0006606081.tif 000008
【化５−３】
0006606081.tif 000009
【００４７】
化合物（ＸＶＩ）〜（ＸＸＸＩ）において、Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１６アルキル、Ｃ１−Ｃ１６アルコキシ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１６アルケニル、Ｃ１−Ｃ１６アルキニル、ニトリル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ１６脂肪族エステル、アミド、及びＣ１−Ｃ１６チオアルキルからなる群から選択される。より好ましくは、Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８アルコキシ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ８アルケニル、Ｃ１−Ｃ８アルキニル、ニトリル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ８脂肪族エステル、アミド、及びＣ１−Ｃ８チオアルキルからなる群から選択される。最も好ましくは、Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルケニル、Ｃ１−Ｃ４アルキニル、ニトリル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ４脂肪族エステル、アミド、及びＣ１−Ｃ４チオアルキルからなる群から選択される。特に好ましい実施形態において、Ｒ１及びＲ２は、水素である。
【００４８】
さらに、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、互いに独立して、水素、メチル、フェニル、及び２つのジェミナル（ｇｅｍｉｎａｌ）置換基を形成するカルボニルからなる群から選択され；Ｒ７は、水素、メチル、ベンジル、フェニル、及び置換されたフェニルからなる群から選択され；Ｒ８は、水素、メチル、イソ−プロピル、ベンジル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソ−ブチル、及び置換されたフェニルからなる群から選択され；Ｚは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ及びＮＣＨ３からなる群から選択され；及びｍ及びｎは、互いに独立して、０、１、２、及び３からなる群から選択される。
【００４９】
【化６】
0006606081.tif 000010
【００５０】
好ましくは、第四の好ましい実施形態のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、Ｒ３／Ｒ４及びＲ５／Ｒ６が、カルボニルを形成し、ｍ及びｎが、１である式（ＸＶＩｂ）であるものである。好ましくは、ａは、１である。特に好ましく、Ｒ７は、アルキル基である。これらの化合物は、連結反応において特に十分に機能することが見出された。
【００５１】
第五の好ましい実施形態によれば、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は、ＯＲである。好ましくは、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は、二環状構造を形成するものである。
【００５２】
より好ましくは、第五の実施形態のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、（ＸＸＸＩＩ）〜（ＸＸＸＩＶ）からなる群から選択される。
【００５３】
【化７】
0006606081.tif 000011
【００５４】
化合物（ＸＸＸＩＩ）〜（ＸＸＸＩＶ）において、Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１６アルキル、Ｃ１−Ｃ１６アルコキシ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１６アルケニル、Ｃ１−Ｃ１６アルキニル、ニトリル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ１６脂肪族エステル、アミド、及びＣ１−Ｃ１６チオアルキルからなる群から選択される。より好ましくは、Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８アルコキシ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ８アルケニル、Ｃ１−Ｃ８アルキニル、ニトリル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ８脂肪族エステル、アミド、及びＣ１−Ｃ８チオアルキルからなる群から選択される。最も好ましくは、Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルケニル、Ｃ１−Ｃ４アルキニル、ニトリル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ４脂肪族エステル、アミド、及びＣ１−Ｃ４チオアルキルからなる群から選択される。特に好ましい実施形態において、Ｒ１及びＲ２は、水素である。
【００５５】
最も好ましいホウ酸アシルは、Ｘ１＝Ｘ２＝Ｘ３＝Ｆであるもの、及び降順で一般式（ＸＩＩＩ）、（ＸＶ）、（ＸＶＩｂ）、及び（ＸＶＩ）のものである。
【００５６】
好ましい実施形態、より好ましくは上記の第一、第二、第三、第四又は第五の好ましい実施形態のうちの１つの基準も満たす実施形態によれば、本発明のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、（ＸＸＸＶ）〜（ＬＶ）からなる群から選択される。
【００５７】
【化８−１】
0006606081.tif 000012
【化８−２】
0006606081.tif 000013
【化８−３】
0006606081.tif 000014
【００５８】
化合物（ＸＸＸＶ）〜（ＬＶ）において、Ｙは、ＣＨ、ＣＲ１、Ｏ、及びＮＲ９からなる群から選択され；Ｙ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、アルキルアミノ、及びシクロ−アルキルアミノからなる群から選択され；Ｚ１及びＺ２は、互いに独立して、Ｃ１−Ｃ８アルキル、アリール、置換されたアリール、Ｃ１−Ｃ８アルコキシ、Ｃ１−Ｃ８チオアルキル、Ｃ１−Ｃ８アルキルアミド、及び芳香族アミドからなる群から選択され、ここで、用語「Ｃ１−Ｃ８アルコキシ」はまた、１〜８個の炭素原子を有する短いポリエチレングリコール鎖を含み；Ｒ１は、水素、Ｃ１−Ｃ１６アルキル、Ｃ１−Ｃ１６アルコキシ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１６アルケニル、Ｃ１−Ｃ１６アルキニル、ニトリル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ１６脂肪族エステル、アミド、及びＣ１−Ｃ１６チオアルキルからなる群から選択され；Ｒ９は、Ｃ１−Ｃ１６アルキル、アシル、ホルミル、カルバモイル、脂肪族スルホニル、及び芳香族スルホニルからなる群から選択される。
【００５９】
より好ましくは、Ｒ１は、水素、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８アルコキシ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ８アルケニル、Ｃ１−Ｃ８アルキニル、ニトリル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ８脂肪族エステル、アミド、及びＣ１−Ｃ８チオアルキルからなる群から選択される。最も好ましくは、Ｒ１は、水素、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルケニル、Ｃ１−Ｃ４アルキニル、ニトリル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ４脂肪族エステル、アミド、及びＣ１−Ｃ４チオアルキルからなる群から選択される。
【００６０】
特に好ましい実施形態において、本発明のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、Ｙ１が、Ｏであり、Ｒ１が、Ｈであり、ａが、１であり、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３がＦである、式（ＸＸＸＶ）のものである。
【００６１】
好ましい実施形態によれば、ポリエチレングリコール置換基（式中、「ＰＥＧ」と表記される）は、場合により、ヒドロキシル、カルボン酸、カルボン酸エステル、アミン、チオール、カーボネート、カルバメート、アジド、アルキン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、アルデヒド、ケトン、マレイミド、及びハロゲンからなる群から選択される１つ以上の官能基で置換される、最大２００ｋＤａの直鎖状又は分岐状ポリエチレングリコール置換基である。ポリエチレングリコール置換基は、好ましくは、活性化エステル、ケトン、アルデヒド、マレイミドとして、又はビオチンなどのタグによって、一末端で又は両末端で官能化される。好ましくは、ＰＥＧは、約７５０ｋＤａ〜約８０ｋＤａのポリエチレングリコール置換基である。
【００６２】
さらなる態様において、本発明はまた、一般式（Ｉ）のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシル、特に上記の好ましい実施形態のものを製造するための方法に関する。
【００６３】
概して、このようなポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、Ｄｕｍａｓ，Ａ．Ｍ．；Ｂｏｄｅ，Ｊ．Ｗ．“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ａｃｙｌｔｒｉｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅｓ”，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０１２，１４，２１３８−２１４１に記載される方法に従って、対応するポリエチレングリコール置換されたハロゲン化アルキル若しくはアルデヒド、又はこのようなアルデヒドに容易に変換される化合物、例えば、対応するアルコール、カルボン酸若しくはカルボン酸エステルを調製し、次に、該アルデヒドを対応するホウ酸アシルに変換することによって製造されてもよい。
【００６４】
あるいは、適切に官能化されたＰＥＧ部分を適切に官能化されたホウ酸アシルにカップリングさせ、それにより、リンカー基を形成させることによって、一般式（Ｉ）のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルを製造することも可能である。
【００６５】
具体的には、所望のリンカー基に応じて、このようなポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、例えば、求核芳香族置換反応、金属触媒によるクロスカップリング反応、付加環化反応、オレフィンメタセシス反応、チオールマレイミド付加反応、オキシム若しくはヒドラジンカップリング反応、又は求核付加反応によって製造され得る。
【００６６】
第一の好ましい実施形態において、本発明のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、芳香族求核置換によって製造される。これは、ポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルを提供し、そのリンカー基は、芳香族部分又は複素芳香族部分を含み、場合により、さらに置換基又は中間基を含む。適切な芳香族部分又はヘテロ芳香族部分としては、限定されないが、フェニル基、ピリジル基、オキサゾール基、チアゾール基、イソオキサゾール基、トリアゾール基、ピラジン基、又は他の電子不足ヘテロ芳香族基が挙げられ、これらは全て、置換されてもよく、又は置換されなくてもよい。
【００６７】
概して、ポリエチレングリコール置換基及びホウ酸アシル単位は、任意の相対配置、例えば、オルト、メタ又はパラ配置で該芳香族部分又はヘテロ芳香族部分に配置されてもよい。場合により、中間基は、それぞれ、芳香族部分又はヘテロ芳香族部分とＰＥＧ／ホウ酸アシルの間に配置されてもよい。あるいは又は加えて、芳香族部分又はヘテロ芳香族部分上に１つ以上の他の置換基が存在してもよい。
【００６８】
好ましくは、式（ＸＸＸＶ）、（ＸＸＸＶＩ）又は（ＸＸＸＶＩＩ）のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、上記芳香族求核置換によって、具体的にはフッ化アリールとアルコールを反応させることによって製造される。
【００６９】
第二の好ましい実施形態において、本発明のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、金属触媒によるクロスカップリング反応によって製造される。これらのクロスカップリング反応は、当該分野において周知であり、一般的に、２つのＳＰ２−炭素間に炭素−炭素結合を与える。典型的な生成物には、ビニル置換された芳香族化合物（例えば、フェニル）又はヘテロ芳香族化合物（例えば、ピリジル）及び二芳香族化合物が挙げられ、ここで、後者はまた、１つ又は２つのヘテロ芳香族部分を含んでもよい。
【００７０】
今日、最も重要であり、最も頻繁に使用されるクロスカップリング反応は、パラジウム、白金、ニッケル又は銅触媒を伴う。好ましくは、本発明のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、Ｓｕｚｕｋｉ−、Ｓｔｉｌｌｅ−、Ｈｉｙａｍａ−又はＨｅｃｋ−型クロスカップリング反応によって製造される。
【００７１】
好ましくは、式（ＸＸＸＶＩＩＩ）、（ＸＸＸＩＸ）又は（ＸＬ）のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、金属触媒によるクロスカップリング反応によって製造される。
【００７２】
第三の好ましい実施形態において、本発明のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、［４＋２］又は［３＋２］付加環化反応によって製造される。これらの付加環化反応は、当該分野において周知であり、通常、高温で行われる。［４＋２］付加環化反応は、典型的には、シクロヘキセン、ジヒドロピラン又はテトラヒドロピリジンを与え、［３＋２］付加環化反応は、典型的には、テトラヒドロフラン、イソオキサゾリジン、イソオキサゾリン、ピロリジン、ピロリン、ピラゾール又はトリアゾールを与える。
【００７３】
最も共通した［４＋２］又は［３＋２］付加環化反応は、今日、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応、ヘテロ−Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応、及び１，３−双極性付加環化反応であり、したがって、本発明のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルの製造に特に好ましい。
【００７４】
好ましくは、式（ＸＬＩ）〜（ＸＬＶＩ）のうちの１つのポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、上記［４＋２］又は［３＋２］付加環化反応によって製造さえる。
【００７５】
第四の実施形態において、本発明のポリエチレングリコール置換さえたホウ酸アシルは、オレフィンメタセシス反応によって製造される。これらの反応は、一般的に、金属錯体によって触媒される。現代の触媒は、２つの主なカテゴリーに含まれる十分に画定された機金属化合物であり、一般には、Ｓｃｈｒｏｃｋ触媒とＧｒｕｂｂｓ触媒として知られている。Ｓｃｈｒｏｃｋ触媒は、モリブデン（ＩＶ）系及びタングステン（ＩＶ）系であり、一方、Ｇｒｕｂｂｓ触媒は、ルテニウム（ＩＩ）カルベノイド錯体である。Ｇｒｕｂｂｓ触媒は、多くの場合、キレートイソプロポキシスチレンリガンドを用いて修飾され、関連するＨｏｖｅｙｄａ−Ｇｒｕｂｂｓ触媒を形成する。
【００７６】
オレフィンメタセシス反応は、一般的に、炭素−炭素二重結合を形成する。本発明の場合において、該炭素−炭素二重結合は、ポリエチレングリコールとホウ酸アシル部分の間に配置される。しかしながら、炭素−炭素二重結合はまた、場合により、その後、炭素−炭素単結合に減少されてもよく、その結果、最終的なポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、必ずしも炭素−炭素二重結合を含有しない。
【００７７】
好ましくは、（ＸＬＶＩＩ）又は（ＸＬＶＩＩ）のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、上記オレフィンメタセシス反応によって製造される。
【００７８】
第五の好ましい実施形態において、本発明のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、チオール−マレイミド付加反応によって製造される。この反応において、チオールは、マレイミドに１，４−型付加を受け、チオエーテル結合の形成をもたらす。
【００７９】
好ましくは、式（ＩＬ）のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、チオール−マレイミド反応によって製造される。
【００８０】
第六の好ましい実施形態において、ポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、オキシム又はヒドラジンカップリング反応によって製造される。好ましい出発材料としては、アルデヒド又は一方でケトン、及びＯ−置換ヒドロキシルアミン又は一方でヒドラジンが挙げられる。この反応は、当該分野で周知であり、典型的には、高化学選択性で進行する。この反応は、典型的には、場合により、アニリンなどの求核性添加剤の存在下で水性の酸性緩衝液で行われる。
【００８１】
好ましくは、式（Ｌ）、（ＬＩ）又は（ＬＩＩ）のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、上記オキシム又はヒドラジンカップリング反応によって合成される。
【００８２】
第七の好ましい実施形態において、本発明のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、求核付加反応によって、好ましくは活性化エステルに合成される。
【００８３】
好ましくは、式（ＬＩＩＩ）、（ＬＩＶ）又は（ＬＶ）のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルは、求核付加反応により合成される。
【００８４】
さらなる態様において、本発明はまた、ポリエチレングリコール置換された巨大分子を製造するための方法に関する。この方法によれば、式（Ｉ）のポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルを、巨大分子中に存在するヒドロキシルアミン部分と反応されて、アミド結合を形成させる。したがって、上記反応はアミド形成連結である。
【００８５】
巨大分子は、好ましくは、合成された、単離された、発現又は修飾されたペプチド、合成された、単離された、発現又は修飾されたタンパク質、ＤＮＡ、及びＲＮＡからなる群から選択される。
【００８６】
ヒドロキシルアミンを含有する巨大分子とポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルの反応は、好ましくは、水性条件下で行われる。適切な溶媒混合物は、例えば、ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ、ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ、ｔＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ、ＤＭＳＯ／ｔＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏである。概して、７：３〜３：７の比が有利であることが判明した。最良の結果は、これまで、ｔＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏの１：１混合物について観察されている。
【００８７】
好ましくは、アミド形成連結反応は、酸性条件下で、より好ましくは４未満のｐＨで、特に約１のｐＨで行われる。ｐＨは、好ましくは、酸の添加によって、より好ましくは、ＨＣｌ、ＴＦＡ、シュウ酸、ＡｃＯＨ及び／又はＨ３ＰＯ４の添加によって調整される。
【００８８】
好ましくは、アミド形成連結反応は、好ましくは室温で又はわずかに高温で行われる。適切な反応温度は、約−２０℃〜約１６０℃の範囲であり、約１０℃〜約６０℃の温度が好ましい。約２０℃〜約４０℃の反応温度が特に好ましい。
【００８９】
特に好ましくは、ポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルと巨大分子の反応は、ｔｅｒｔ−ブタノールと水の混合物中、酸性条件下で行われる。
【００９０】
アミド結合を形成する連結は、概して、ポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルとヒドロキシルアミンを有する巨大分子を単に混合したときに生じる。
【００９１】
本発明のアミド形成連結反応は、非常に化学選択的であり、そのため、様々な非保護の官能基を有する分子を接続するために使用され得る。さらに、この反応はまた、非常に速く進行する：＞２０Ｍ−１Ｓ−１の二次速度定数が測定された。その結果、これらの反応は、等モル量の反応物を使用して、マイクロモル濃度で大きな分子の選択的コンジュゲーションを可能にする。
【００９２】
好ましい実施形態において、ポリエチレングリコール置換された巨大分子は、上記の好ましいポリエチレングリコール置換されたホウ酸アシルの１つ−すなわち、トリフルオロホウ酸アシル又は式（ＩＩ）〜（ＬＶ）のうちの１つのホウ酸アシル−とヒドロキシルアミンを有する巨大分子を反応させることによって製造される。
【００９３】
アミド形成連結がこのように非常に化学選択的であるために、巨大分子は、望ましくない副反応のリスクなしに、連結に必要なヒドロキシルアミン以外に１つ以上の保護されていない官能基を含んでいてもよい。
【００９４】
特に、巨大分子は、カルボン酸、ヒドロキシル、フェノール、チオール、アミン、アンモニウム、グアニジン、グアニジニウム、イミダゾール、インドール、及びメチルチオエーテルからなる群から選択される１つ以上の未保護官能基を含むからなる群から選択される１つ以上の保護されていない官能基を含んでいてもよい。これらの官能基のいずれも、上述の反応条件下でホウ酸アシル酸との反応を受けないことが見出された。
【００９５】
好ましい実施形態において、ヒドロキシルアミン部分は、ペプチド若しくはタンパク質のＮ末端に存在し、ＤＮＡ若しくはＲＮＡの３’−若しくは５’−末端に存在し、又はペプチド若しくはタンパク質の側鎖上に存在し、後者の場合、好ましくはリジン由来若しくはオルニチン由来の側鎖上に存在する。リジン又はオルニチン由来の側鎖が好ましく、これらは、発現されたタンパク質に組み込まれ得るためである。しかしながら、他の付加物も許容される。
【００９６】
好ましくは、連結反応は、本発明のトリフルオロホウ酸アシル（すなわち、この場合、Ｘ１＝Ｘ２＝Ｘ３＝Ｆである）を用いて行われる。
【００９７】
さらなる態様において、本発明はまた、本発明に係る方法によって得られるポリエチレングリコール置換された巨大分子に関する。
【００９８】
好ましくは、上記巨大分子は、ペプチド、大環状ペプチド、タンパク質（抗体を含む）、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを含む。
【００９９】
本発明は、どのような形でも限定されない、以下の実施例によってさらに例証される。
【０１００】
一般的な方法
特に記載がない限り、全ての反応は、乾燥Ｎ２の雰囲気下、ゴム製セプタムで密封した、オーブン乾燥させたガラス製品中で実施され、テフロンコーティングされた磁気撹拌子で撹拌された。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、シリカゲル６０  Ｆ２５４でプレコートしたＭｅｒｃｋ  ＴＬＣプレート（０．２５ｍｍ）上で行われ、ＵＶクエンチング、及びＫＭｎＯ４又はニンヒドリン溶液を用いた染色により可視化された。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ  ＳｉｌｉａＦｌａｓｈ  Ｆ６０（粒径４０〜６３μｍ）を使用して、空気の強制流の下で行われた。ペプチドは、二重ポンプ、ミキサーとデガッサー、可変波長ＵＶ検出器及び２０〜１０００μＬのサンプルループを取り付けたＲｈｅｏｄｙｎｅ  ７７２５ｉインジェクターを具備したＪａｓｃｏ分析用及び分取用機器上で高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製された。分析用及び分取用ＨＰＬＣのための移動相は、０．１％ＴＦＡを含むＭｉｌｌｉｐｏｒｅ−Ｈ２Ｏ（バッファーＡ）と０．１％ＴＦＡを含むＨＰＬＣグレードＭｅＣＮ（バッファーＢ）であった。溶出物を２２０ｎｍ、２５４ｎｍ及び３０１ｎｍで同時に監視した。分析用（４．６×２５０ｍｍ）及び分取用（２０×２５０ｍｍ）ＨＰＬＣの流量は、それぞれ１ｍｌ及び１０ｍｌであった。ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶ−３００、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶ−４００、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶ−ＩＩＩ−５００又はＢｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ−ＩＩ−５００上に記録された。すべての化学シフト（δ）は、残留溶媒ピークに対するｐｐｍで記録される。１Ｈ  ＮＭＲのデータは、以下の化学シフト（多重度、必要に応じてカップリング定数、水素数）のように記録される。略語は次の通りである：ｓ（一重項）、ｄ（二重項）、ｔ（三重項）、ｑ（四重項）、ｄｄ（二重項の二重項）、ｄｔ（三重項の二重項）、ｄｄｔ（三重項の二重項の二重項）、ｍ（多重項）、ｂｒ（広域）。１９Ｆ  ＮＭＲにおいて、トリフルオロホウ酸塩の多重項は、観察されたシグナルの平均として記録される。ＩＲスペクトルは、Ｊａｓｃｏ  ＦＴ／ＩＲ−４１００分光計上で記録され、唯一の主要なピークは、吸収の頻度において記録される（ｃｍ−１）。融点は、オープンガラスキャピラリーを用いた電熱Ｍｅｌ−Ｔｅｍｐ融点装置で測定され、補正されない。旋光度は、１００ｍｍ路長のセルを用いてナトリウムＤ線で操作するＪａｓｃｏ  Ｐ−１０１０で測定された。ＬＣＭＳ分析は、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  ＭＳＱ＋質量分析計に接続されたＤｉｏｎｅｘ  ＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００  ＲＳＬＣで実施された；逆相ＲＥＳＴＥＫ  Ｐｉｎｎａｃｌｅ  ＩＩ  Ｃ１８（４．６×５０ｍｍ）カラムを使用し、６．５分かけてＨ２Ｏ中５〜１００％ＣＨ３ＣＮの勾配と、２．５分間の１００％ＣＨ３ＣＮで実施した。高分解能質量スペクトルは、Ｖａｒｉａｎ  ＩｏｎＳｐｅｃ  ＦＴ−ＩＣＲ（ＥＳＩ）、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  ｍａＸｉｓ  ＥＳＩ−ＱＴＯＦ分析計（ＥＳＩ）、又はＢｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  ＳＯＬＡＲＩＸ分析計（ＭＳＬＤＩ）上でＥＴＨ  Ｚｕｒｉｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ  ｆｕｒ  Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅ  Ｃｈｅｍｉｅの質量分析サービスに��って得られた。ＰＥＧ化ペプチド１６ａと１６ｃのＭＡＬＤＩスペクトルは、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｚｕｒｉｃｈのタンパク質分析グループによって得られた。
【０１０１】
溶媒及び試薬
特に記載がなければ、（ＡＣＳ又はＨＰＬＣグレードで）供給される全ての有機溶媒（ｔＢｕＯＨ、ＣＨ３ＯＨ、ＤＭＦ、ＴＨＦ、ＣＨ２Ｃｌ２、ＣＨ３ＣＮ、ＤＭＳＯ）を用いた。ＴＨＦは、使用前に、ナトリウム・ベンゾフェノンケチルから蒸留により精製された。ＣＨ２Ｃｌ２は、ＣａＨ２から蒸留により精製された。乾燥ＤＭＳＯをＡｃｒｏｓから購入した。１：１のｔＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏを調製するために使用されるＨ２Ｏは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ精製システムから得た。Ｅｔ３Ｎ及びｉＰｒ２ＮＥｔは、ＣａＨ２から蒸留により精製された。商業ベンダーによって供給された出発物質を使用するか、又は対応する文献に記載の方法により調製した。
【０１０２】
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）：すべてのペプチドセグメントは、Ｆｍｏｃ  ＳＰＰＳ化学を使用して、ＣＳ  Ｂｉｏ  １３６Ｘペプチドシンセサイザーで合成された。インラインＵＶ検出器は、Ｆｍｏｃ脱保護を監視するために使用された。側鎖保護基を有する以下のＦｍｏｃアミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（１−Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ。Ｆｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて実施し（２×８分）、完全なＦｍｏｃ除去を確認にするためにフィードバックループで３０４ｎｍのＵＶにより監視された。カップリングは、ＤＭＦ中のＦｍｏｃ−アミノ酸（レジン置換に対して４．０当量）、ＨＣＴＵ（３．９当量）及びｉＰｒ２ＮＥｔ（６．０当量）を用いて行われた。３分間、予め活性化した後、溶液を移し、アミノ酸に依存して４５分間又は７５分間のいずれかでレジン上のペプチドと反応させた。カップリング後、レジンは、いずれもの未反応の遊離アミンをキャッピングするために、ＤＭＦ中の２０％無水酢酸で処理された。
【実施例】
【０１０３】
実施例１：ＰＥＧ化のためのトリフルオロホウ酸アシルの合成
【化９】
0006606081.tif 000015
【０１０４】
１−（メトキシ（４−フルオロフェニル）メチル）−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（３）：
【化１０】
0006606081.tif 000016
【０１０５】
４−フルオロベンズアルデヒド（１）（５．００ｇ、４０．３ｍｍｏｌ、１．０当量）、ベンゾトリアゾール（２）（４．８０ｇ、４０．３ｍｍｏｌ、１．０当量）、ＭｅＯＨ（３．２６ｍｌ、８０．６ｍｍｏｌ、２．０当量）、及びトリメチルオルトホルメート（１３．２ｍｌ、１２０．９ｍｍｏｌ、３．０当量）を室温で乾燥ＴＨＦ（６０ｍｌ）中に急速に溶解した。この溶液にＨ２ＳＯ４（１２滴）を添加し、白色沈殿を得た。反応物を２５分間、室温で撹拌し、１．０ｇの固体のＮａＨＣＯ３を添加し、不均一溶液を濃縮した。得られた油状物をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ）中に溶解し、濾過し、濃縮し、高真空下で乾燥させた。アセタール（３）（１０．３ｇ、９９％収率）の純度は９５％以上であり、さらに精製することなく使用した。
【０１０６】
無色油状物；ＩＲ（薄膜）３０７０，２９３７，２８３４，１６０６，１５０９，１２２６，１０９２，９２７ｃｍ−１；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）８．１２−８．０７（ｍ，１Ｈ），７．４５−７．３９（ｍ，１Ｈ），７．３９−７．３１（ｍ，１Ｈ），７．２７−７．２３（ｍ，１Ｈ），７．０９（ｓ，１Ｈ），７．０８−７．０２（ｍ，１Ｈ），３．４５（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１６３．００（ｄ，Ｊ＝２４８．４Ｈｚ，ＣＦ），１４７．０６（Ｃ），１３１．９９（Ｃ），１３０．９１（Ｃ），１２７．８７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２ＣＨ），１２７．６７（ＣＨ），１２４．４０（ＣＨ），１２０．０６（ＣＨ），１１５．６３（ｄ，Ｊ＝２１．８Ｈｚ，２ＣＨ），１１１．４４（ＣＨ），５６．９０（ＣＨ３）；１９Ｆ  ＮＭＲ（３７７ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）−１１２．３６（ｓ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ），Ｃ１４Ｈ１２ＦＮ３ＮａＯ［Ｍ＋Ｎａ］＋：２８０．０８５７（計算値），２８０．０８５４（実測値）。
【０１０７】
４−フルオロベンゾイルトリフルオロホウ酸カリウム（４）：
【化１１】
0006606081.tif 000017
【０１０８】
５００ｍｌフラスコにおいて、アセタール（３）（１０．０ｇ、３８．９ｍｍｏｌ、１．０５当量）を室温で乾燥ＴＨＦ（２５０ｍｌ）中に溶解させた。ＥｔＯＨ（約−１１０℃）が固化するまで、液体Ｎ２で冷却したドライアイス／エタノール浴中にフラスコを置き、少なくとも１５分間撹拌した。ｎＢｕＬｉ（ヘキサン中１．６Ｍ、２３ｍｌ、３７．０ｍｍｏｌ、１．０当量）を６分かけてフラスコの側面下にゆっくりと添加した。この間に、強い緑色が発色した。ｎＢｕＬｉの添加終了後の２分間、溶液を撹拌し、ニートなＢ（ＯＭｅ）３（８．２５ｍｌ、７４．０ｍｍｏｌ、２．０当量）を溶液に直接、１分間かけて徐々に添加した。５〜１０分の撹拌後、深い緑色が徐々に赤色になった。フラスコを１時間、ドライアイス／エタノール浴中で維持し、それを−７８℃にゆっくりと温め、次に、浴から取り出し、激しく撹拌し、飽和ＫＨＦ２水溶液を５回に分けて添加した（１分あたり２０ｍｌ、全１００ｍｌ）。反応物を温めながら、乳白色の水層と黄色の有機層からなる二相混合物が形成した。これを一晩（ＫＨＦ２の添加時から約１２時間）撹拌し、その間、有機層は黄色に留まった。二層を分別し、黄色の有機相をいくらかの水が残るまでロータリーエバポレーターを用いて濃縮した。この黄色の湿潤スラリーを４０ｍｌのＥｔ２Ｏと混合した。濾過、更なるＥｔ２Ｏ（４×３０ｍｌ）による洗浄、及び高真空下での乾燥により、白色固体として生成物（５．３４ｇ、６３％収率）を得た。（ドライアイス／エタノール／液体Ｎ２浴（−１１０℃）の代わりに、ドライアイス／アセトン浴（−７８℃）もまた適しているが、収率が４０％に低下する）。
【０１０９】
白色固体；ｍ．ｐ．２５７℃（ｄｅｃｏｍｐ．）；ＩＲ（ニート）３０１３，１６３７，１５８０ｃｍ−１；１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトン−ｄ６）８．１７−８．１１（ｍ，２Ｈ），７．１５−７．０９（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）２３５．５９−２３２．０５（ｍ，ＣＯ），１６５．４５（ｄ，Ｊ＝２４８．４Ｈｚ，ＣＦ），１３８．９５（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，Ｃ），１３１．８３（ｄｄ  Ｊ＝８．８，１．８Ｈｚ，２ＣＨ），１１５．２３（ｄ，Ｊ＝２１．４Ｈｚ，２ＣＨ）；１９Ｆ  ＮＭＲ（４７１ＭＨｚ，アセトン−ｄ６）−１１１．２７（ｓ，１４４．７０（ｄｄ，Ｊ＝１０２．０，４８．９Ｈｚ，３Ｆ）；１１Ｂ  ＮＭＲ（１６０ＭＨｚ，アセトン−ｄ６）−０．８４（ｄｄ，Ｊ＝１０４．４，５１．３Ｈｚ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ７Ｈ４ＢＦ４Ｏ［Ｍ−Ｋ］−：１９１．０２９８（計算値），１９１．０２９７（実測値）。
【０１１０】
ＰＥＧ化されたトリフルオロホウ酸アシル・カリウム（５ａ）：
【化１２】
0006606081.tif 000018
【０１１１】
ポリ（エチレングリコール）メチルエーテル（Ａｌｄｒｉｃｈ；約５０００ｇ／ｍｏｌ、１．０ｇ、０．２０ｍｍｏｌ、１．０当量）を５０℃で５０ｍｌの乾燥トルエンに溶解し、トルエン蒸発させた共沸蒸留を３回（３×５０ｍｌ）繰り返した。ＰＥＧは、高真空下で乾燥させ、８ｍｌの乾燥ＤＭＳＯ（５０℃）に溶解させた。水素化ナトリウム（１６ｍｇ、鉱油中６０％、０．４０ｍｍｏｌ、２．０当量）を室温で均質なＰＥＧ溶液に添加し、１４時間撹拌した。脱プロトン化されたポリ（エチレングリコール）メチルエーテル溶液を４−フルオロベンゾイルトリフルオロホウ酸カリウム（４）（０．４６ｇ、２．０ｍｍｏｌ、１０．０当量、共沸蒸留により乾燥させた）に添加し、２４時間撹拌した。変換は、粗反応混合物のＮＭＲスペクトルによると９５％以上であった。反応混合物を８ｍｌの脱イオン化されたＨ２Ｏで希釈し、透析膜チューブ（ＭＷＣＯ３，５００）に充填し、２ｌの６ｍＭ  ＫＦ水溶液中の置き、４８時間撹拌した。フッ化カリウム水溶液を新しいバッチについて４回交換した。生成物を凍結乾燥させ、白色固体として７９１ｍｇ（７６％収率）の５（ａ）を得た。
【０１１２】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ６）８．１７（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），７．０３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．２９−４．２２（ｍ，２Ｈ），３．９０−３．８０（ｍ，４Ｈ），３．５９（ｂｒｓ，３９０Ｈ），３．３９−３．３２（ｍ，２Ｈ），３．２９（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ６）１３２．４（２ＣＨ），１１４．８（２ＣＨ），７２．７（ＣＨ２），７１．３（１９５ＣＨ２），７０．３（ＣＨ２），６８．６（ＣＨ２），５８．８（ＣＨ３）；１９Ｆ  ＮＭＲ（４７１ＭＨｚ，アセトン−ｄ６）−１４２．１８（ｂｓ，３Ｆ）；１１Ｂ  ＮＭＲ（１６０ＭＨｚ，アセトン−ｄ６）−０．９（ｂｓ）。
【０１１３】
ＰＥＧ化されたトリフルオロホウ酸アシル・カリウム（５ｂ）
【化１３】
0006606081.tif 000019
【０１１４】
５（ａ）と同様の手法によって、１．０ｇのポリ（エチレングリコール）メチルエーテル（約１０，０００ｇ／ｍｏｌ、０．１０ｍｍｏｌ）から調製した。凍結乾燥、８４８ｍｇ（８３％収率）の５ｂを白色固体として得た。
【０１１５】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトン−ｄ６）８．０８（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），６．８８（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），４．１９−４．１５（ｍ，２Ｈ），３．８６−３．８１（ｍ，２Ｈ），３．５９（ｂｒｓ，９２４Ｈ），３．２９（ｓ，３Ｈ）；１９Ｆ  ＮＭＲ（３７７ＭＨｚ，アセトン−ｄ６）−１４４．００（ｄｄ，Ｊ＝９１．９，４４．０Ｈｚ，３Ｆ）。
【０１１６】
ＰＥＧ化されたトリフルオロホウ酸・カリウム（５ｃ）：
【化１４】
0006606081.tif 000020
【０１１７】
５（ａ）と同様の手法によって、１．０ｇのポリ（エチレングリコール）メチルエーテル（約２０，０００ｇ／ｍｏｌ、０．０５ｍｍｏｌ）から調製した。凍結乾燥、８０６ｍｇ（８３％収率）の５ｂを白色固体として得た。
【０１１８】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）７．８７（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．９０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．１４−４．０９（ｍ，２Ｈ），３．７８−３．７２（ｍ，２Ｈ），３．５１（ｂｒｓ，１７７３Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ）；１９Ｆ  ＮＭＲ（３７７ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）−１４１．１（ｂｓ，３Ｆ）。
【０１１９】
実施例２：β−アラニン誘導体（１０）の合成
【化１５】
0006606081.tif 000021
【０１２０】
Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｏ−ジエチルカルバモイルヒドロキシアミン（８）：
【化１６】
0006606081.tif 000022
【０１２１】
ＣＨ２Ｃｌ２（７０ｍｌ）中のＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシルカルボニルヒドロキシルアミン（７）（６．１０ｇ、４５．８ｍｍｏｌ、１．３当量）及びＥｔ３Ｎ（４３０ｍｇ、３．５２ｍｍｏｌ、０．１当量）の溶液に、Ｎ，Ｎ−ジエチルカルバモイルクロライド（６）（４．６０ｍｌ、３５．２ｍｍｏｌ、１．０当量）及びＤＭＡＰ（４３０ｍｇ、３．５２ｍｍｏｌ、０．１当量）を室温でゆっくりと添加し、その混合物を４０℃で９時間撹拌した。室温に冷却後、混合物をＣＨ２Ｃｌ２及び１ＭのＨＣｌ水溶液で希釈した。水相をＣＨ２Ｃｌ２（３×）で抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗物質をフラッシュクロマトグラフィーによりヘキサン／ＥｔＯＡｃで溶出して精製し、無色油状物として（８）を得た（７．２９ｇで、９４％収率）。
【０１２２】
ＩＲ（薄膜）３４３３，２０８９，１６４３ｃｍ−１；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）７．７８（ｓ，１Ｈ），３．３４（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ），１．２８−１．１１（ｍ，６Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１５６．７，１５５．７，８２．９，４３．１，４１．６，２８．２，１４．１，１３．４；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）、Ｃ１０Ｈ２０Ｎ２Ｏ４［Ｍ＋Ｎａ］＋：２５５．１３１５（計算値）、２５５．１３１７（実測値）．
【０１２３】
３−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−（ジエチルカルバモイル）アミノ］−プロパン酸メチルエステル（９）：
【化１７】
0006606081.tif 000023
【０１２４】
ＭｅＣＮ（２２ｍｌ）中のアクリル酸メチル（３．００ｍｌ、３３．６ｍｍｏｌ、１．５当量）及びヒドロキシルアミン（８）（５．２０ｇ、２２．３ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、室温でＴｒｉｔｏｎ  Ｂ（１．４１ｍｌ、３．３５ｍｍｏｌ、０．１５当量、ＭｅＯＨ中４０％）を添加し、その混合物を２時間、６０℃で撹拌した。室温に冷却後、溶液を減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィーによりヘキサン／ＥｔＯＡｃで溶出して精製し、淡黄色油状物として（９）を得た（６．１８ｇ、８７％収率）。
【０１２５】
ＩＲ（薄膜）２９７７，２９３７，１７４２，１４２２，１３６７，１２６６，１１６６，１１４２，１１０５ｃｍ−１；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）３．９１（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），３．６６（ｓ，３Ｈ），３．３７−３．２０（ｍ，４Ｈ），２．６３（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ），１．１５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１７１．９，１５４．７，１５４．１，８２．１，５１．８，４６．５，４３．１，４１．７，３２．７，２８．３，１４．２，１３．４；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）、Ｃ１４Ｈ２６Ｎ２Ｏ６［Ｍ＋Ｈ］＋：３１９．１８６４（計算値），３１９．１８５８（実測値）。
【０１２６】
３−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−（ジエチルカルバモイル）アミノ］−プロパン酸（１０）：
【化１８】
0006606081.tif 000024
【０１２７】
ＴＮＦ（４０．０ｍｌ）中のメチルエステル（９）（３．９０ｇ、１２．２ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液にＮａＯＨ（Ｈ２Ｏ中４Ｍ、９．１ｍｌ、３６．４ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。混合物を１６時間、撹拌し、次に、Ｈ２Ｏ及びＥｔＯＡｃで希釈した。水相を１Ｍ  ＨＣｌ水溶液で酸性化し、ＥｔＯＡｃ（３×）で抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮して、（１０）（３．２０ｇ、８６％収率）を得た。
【０１２８】
淡黄色油状物；ＩＲ（薄膜）２９７８，２９３６，１７２５，１４２５，１３６８，１２６９，１１６６，１１４４，１１０５ｃｍ−１；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）３．９４（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．３８−３．２５（ｍ，４Ｈ），２．６６（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），１．４６（ｓ，９Ｈ），１．２６−１．１０（ｍ，６Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１７５．９，１５４．８，１５４．６，８２．７，４６．５，４３．３，４１．８，３３．１，２８．３，１４．２，１３．４；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）、Ｃ１３Ｈ２４Ｎ２Ｏ６［Ｍ＋Ｎａ］＋：３２７．１５２７（計算値），３２７．１５２６（実測値）。
【０１２９】
実施例３：ペプチド（１３）（配列番号１）及び１４（配列番号２）の合成
【化１９】
0006606081.tif 000025
【０１３０】
ペプチドヒドロキシルアミン（１３）（配列番号１；図１ａ参照）：
充填能力が１．０８ｍｍｏｌ／ｇであるＷａｎｇリンカーポリスチレンレジン上でペプチドヒドロキシルアミン（１３）（配列番号１）を合成した。合成は、３６時間、ＣＨ２Ｃｌ２／ＤＭＦ中のＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ（４．２７ｇ、１０．９ｍｍｏｌ、レジンに対して１０．０当量）及びＮ、Ｎ’−ジイソプロピル−カルボジイミド（８４３μｌ、５．４５ｍｍｏｌ、レジンに対して５．０当量）の溶液を処理することによって、１．０９ｍｍｏｌスケール（１．０１ｇのレジン）上で行われた。合成は、一般的な方法の項に記載された手順を用いて、Ｇｌｕまで自動化されたＦｍｏｃ  ＳＰＰＳを使用して継続した。この工程では、０．６７ｍｍｏｌのレジン（１２）を分離し、Ｆｍｏｃ基をＤＭＦ中２０％ピペリジンを用いて除去した。Ｎ−Ｂｏｃ保護されたカルボン酸（１０）（８１４ｍｇ、２．６７ｍｍｏｌ、レジンに対して４．０当量）を３時間、ＤＭＦ中のＨＣＴＵ（１．１０ｇ、２．６７ｍｍｏｌ、レジンに対して４．０当量）及びＮＭＭ（５９４μｌ、５．３４ｍｍｏｌ、レジンに対して８．０当量）を使用してアミンにカップリングされた。レジンに支持されたペプチドをＴＦＡ：ＴＩＰＳ：Ｈ２Ｏ（９７：２：１）で３時間処理し、濾過して、固相支持体を除いた。濾過物から揮発性物質を真空下で蒸発させた。残渣をＭＴＢＥで粉砕し、遠心分離（３サイクロの反復）して、粗ペプチドを得た。３０分間で０．１％ＴＦＡを用いた１０〜５０％ＭｅＣＮの勾配により、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ  Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１８カラム（２０×２５０ｍｍ）を用いた分取用ＨＰＬＣにより精製を行った。ｔＲ＝２３．２分で溶出する生成物ピークを回収し、凍結乾燥して、１８１ｍｇの精製物（１３）を得た（開始レジン、開裂及び精製ステップから合成について２６％収率）。分析用ＨＰＬＣ及びＨＲＭＳを用いて、生成物の純度及び正確な質量を確認した。ｍ／ｚ、Ｃ４３Ｈ６８Ｎ１１Ｏ１６Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋：１０２６．４５６１（計算値），１０２６．４５６４（実測値）。精製された（１３）の分析用ＨＰＬＣ：図２ａ参照。精製された（１３）のＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）：図２ｂ参照。
【０１３１】
ペプチド（１４）（配列番号２；図１ｂ参照）の基準資料の合成
ペプチド１４（配列番号２）を０．１９６ｍｍｏｌのレジン１２から合成した。ＤＭＦ中２０％ピペリジンを用いてＦｍｏｃ基を除去し、遊離した遊離アミンは、３時間、ＤＭＦ中のＨＣＴＵ（３２４ｍｇ、０．７８４ｍｍｏｌ、レジンに対して４．０当量）及びＮＭＭ（１７４μｌ、１．５７ｍｍｏｌ、レジンに対して８．０当量）を用いて３−（４−フルオロベンズアミド）プロパン酸（１６５ｍｇ、０．７８４ｍｍｏｌ、レジンに対して４．０当量）とカップリングさせた。レジンに支持されたペプチドをＴＦＡ：ＴＩＰＳ：Ｈ２Ｏ（９７：２：１）で２．５時間処理し、濾過して、固相支持体を除いた。濾過物から揮発性物質を真空下で蒸発させた。残渣をＭＴＢＥで粉砕し、遠心分離（３サイクロの反復）して、粗ペプチドを得た。３０分間で０．１％ＴＦＡを用いた２０〜７０％ＭｅＣＮの勾配により、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ  Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１８カラム（２０×２５０ｍｍ）を用いた分取用ＨＰＬＣにより精製を行った。ｔＲ＝１３．５分で溶出する生成物ピークを回収し、凍結乾燥して、５４．９ｍｇの精製物（１４）を得た（開始レジン、開裂及び精製ステップから合成について２７％収率）。分析用ＨＰＬＣ及びＨＲＭＳを用いて、生成物の純度及び正確な質量を確認した。ｍ／ｚ、Ｃ４５Ｈ６２ＦＮ１０Ｏ１５Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋：１０３３．４０９５（計算値），１０３３．４０９５（実測値）。精製された（１４）の分析用ＨＰＬＣ：図３ａ参照。精製された（１４）のＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）：図３ｂ参照。
【０１３２】
実施例４：トリフルオロホウ酸アシル（４）を用いたペプチドヒドロキシルアミン（１３）（配列番号１）のライゲーション
ガラスバイアル中のペプチドヒドロキシルアミン（１３）（配列番号１；３．９ｍｇ、３．８μｍｏｌ、１．０当量）に室温で０．１Ｍシュウ酸（３．８ｍｌ、３．８μｍｏｌ、１．０当量）を含む１：１のｔＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中のトリフルオロホウ酸アシル（４）の１００μＭ溶液を添加した。バイアルを迅速に振とうし、反応をＨＰＬＣによりモニターした。反応は１時間以内に完了し、混合物を直接、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ  Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１８カラム（２０×２５０ｍｍ）を用いて分取用ＨＰＬＣに注入し、３０分間の０．１％ＴＦＡを用いた２０〜７０％ＭｅＣＮの勾配とした。ｔＲ＝１３．５分で溶出する生成物ピークを回収し、凍結乾燥して、３．１ｍｇの精製物（１４）を得た（配列番号２；７９％収率）。得られたペプチドの分析用ＨＰＬＣ及びＨＲＭＳは、基準試料のものと合致した。
【０１３３】
実施例５：ペプチドヒドロキシルアミン（１３）（配列番号１）とトリフルオロホウ酸アシル（４）を用いた反応速度論的研究
全ての実験をマイクロバイアル中で実施し、内部標準として２，６−ジメチルフェノールを用いたＨＰＬＣによりモニターした。記録されたスペクトルのピーク面積を積分し、独立した実験で得られた標準曲線から濃度を決定した。（注記：意味のない加速はフェノールの存在下では観察されなかった）。
【０１３４】
（ｉ）擬一次反応速度論
以下の溶液を０．１Ｍシュウ酸を含む１：１のｔＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中で調製した：（Ａ）１ｍＭのトリフルオロホウ酸アシル（４）、（Ｂ）０．２ｍＭペプチドヒドロキシルアミン（１３）、及び（Ｃ）０．５ｍＭの２，６−ジメチルフェノール。マイクロバイアル中の２００μｌ溶液（Ａ）、１００μｌ溶液（Ｃ）、及び０．１Ｍシュウ酸を含む６００μｌの１：１のｔＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏの混合物に１００μｌ溶液（Ｂ）を添加し、バイアルを迅速に振とうした。反応をＨＰＬＣによりモニターした（各実施について５０μｌ注射）。
【０１３５】
（１３）の対数スケールの濃度対時間（秒）をプロットし、それらの近似曲線の傾きをｋｏｂｓ＝０．００３７７として決定した。以下の計算から、この反応の二次速度定数は、１９Ｍ−１Ｓ−１として決定した。
図４ａ：擬一次反応速度論。
ｋｏｂｓ＝［４］＊ｋ
ｋ＝０．００３７７／０．０００２＝１８．８５（Ｍ−１ｓ−１）
【０１３６】
（１３）（配列番号１）の消費と生成物（１４）（配列番号２）の発生の速度は相関し、このライゲーションに関与する安定な中間体が存在しないことを示唆した。
図４ｂ：ヒドロキシルアミン（１３）と生成物（１４）対時間（秒）。
【０１３７】
（ｉｉ）初速度の反応速度論
以下の溶液を０．１Ｍシュウ酸を含む１：１のｔＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中で調製した：（Ａ）０．３ｍＭトリフルオロホウ酸アシル（４）、（Ｂ）０．３ｍＭペプチドヒドロキシルアミン（１３）、及び（Ｃ）０．５ｍＭの２，６−ジメチルフェノール。マイクロバイアル中の１００μｌ溶液（Ａ）、１００μｌ溶液（Ｃ）、及び０．１Ｍシュウ酸を含む７００μｌの１：１のｔＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏの混合物に１００μｌ溶液（Ｂ）を添加し、バイアルを迅速に振とうした。反応をＨＰＬＣによりモニターした（各実施について５０μｌ注射）。
【０１３８】
（１３）の濃度対時間（秒）をプロットし、それらの近似曲線の傾きを２１Ｍ−１Ｓ−１として決定した。
図４ｃ：初速度の反応速度論。
【０１３９】
ＧＬＰ−１（７−３７）、リラグルチド及びペプチド（１５）の構造
図５参照：
ＧＬＰ−１（７−３７）＝配列番号３
リラグルチド＝配列番号４
ペプチド（１５）＝配列番号５。
【０１４０】
実施例６：オルニチンヒドロキシルアミン（１９）の合成
【化２０】
0006606081.tif 000026
【０１４１】
（Ｓ）−２−［Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）アミノ］−５−ブロモペンタン酸ベンジルエステル（１７）
【化２１】
0006606081.tif 000027
【０１４２】
アルコール（１６）（７１３ｍｇ、１．９９ｍｍｏｌ、１．０当量）とＣＨ２Ｃｌ２（６．６ｍｌ）中のＣＢｒ４（６９５ｍｇ、２．０９ｍｍｏｌ、１．０５当量）の溶液中に０℃でＰＰｈ３（５７６ｍｇ、２．１９ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加し、この混合物を１時間、同じ温度で撹拌した。混合物を減圧下で濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーによりヘキサン／ＥｔＯＡｃで溶出して精製し、無色油状物として臭化物（１７）を得た（６８８ｍｇ、８２％収率）。
【０１４３】
無色油状物；ＩＲ（薄膜）３３３５，３０３２，２９５９，２３５９，１７２１，１５１９，１４５５，１３４３，１２５９，１２１３，１０５１ｃｍ−１；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）７．４１−７．２９（ｍ，１０Ｈ），５．３３（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），５．２１（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，１Ｈ），５．１６（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，１Ｈ），５．１１（ｓ，２Ｈ），４．５０−４．４０（ｍ，１Ｈ），３．４４−３．３０（ｍ，２Ｈ），２．０９−１．７５（ｍ，４Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１７２．０，１５６．０，１３６．２，１３５．２，１２８．８，１２８．７，１２８．７，１２８．５，１２８．４，１２８．３，６７．５，６７．３，５３．４，３２．８，３１．５，２８．５；αＤ２７（ｃ０．５５，ＣＨＣｌ３）：−０．９７；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）、Ｃ２０Ｈ２２ＢｒＮＯ４［Ｍ＋Ｈ］＋：４２０．０８０５（計算値），４２０．０８０３（実測値）。
【０１４４】
（Ｓ）−２−［Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）アミノ］−５−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシ−カルボニル）−Ｎ−（ジエチルカルバモイル）アミノ］ペンタン酸ベンジルエステル（１８）：
【化２２】
0006606081.tif 000028
【０１４５】
ＤＭＦ（１．４ｍｌ）中の臭化物（１７）（５８６ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ、１．０当量）及びヒドロキシルアミン（８）（３５６ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ、１．１当量）の溶液に室温でＫ２ＣＯ３（３８４ｍｇ、２．７８ｍｍｏｌ、２．０当量）を添加し、この混合物を３時間撹拌した。Ｅｔ２Ｏで希釈後、Ｈ２Ｏを添加し、水相をＥｔ２Ｏ（３×）で抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗物質をフラッシュカラムクロマトグラフィーによりヘキサン／ＥｔＯＡｃで溶出して精製し、（１８）を得た（６８６ｍｇ、８６％収率）。
【０１４６】
無色油状物；ＩＲ（薄膜）３３３５，２９７６，２９３５，１７２３，１４２２，１３６７，１２６７，１１６７，１１４２ｃｍ−１；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）７．３８−７．２９（ｍ，１０Ｈ），５．５６（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），５．１７（ｓ，２Ｈ），５．１０（ｓ，２Ｈ），４．３８（ｄｔ，Ｊ＝７．６，１２．０Ｈｚ，１Ｈ），３．６５（ｄｔ，Ｊ＝６．４，７．２Ｈｚ，１Ｈ），３．５７（ｄｔ，Ｊ＝６．４，７．２Ｈｚ，１Ｈ），３．２６（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ），２．０２−１．９０（ｍ，１Ｈ），１．８６−１．７４（ｍ，１Ｈ），１．６８−１．５４（ｍ，２Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ），１．１３（ｂｒｓ，６Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１７２．３，１５６．３，１５５．１，１５４．５，１３６．５，１３５．５，１２８．７，１２８．６，１２８．６，１２８．５，１２８．４，１２８．２，８２．０，６７．２，６７．１，５４．０，４９．７，４３．２，４１．８，２９．５，２８．３，２３．５，１４．３，１３．５；αＤ２７（ｃ０．６５，ＣＨＣｌ３）：−２．７８；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）、Ｃ３０Ｈ４１Ｎ３Ｏ８［Ｍ＋Ｎａ］＋：５９４．２７８６（計算値），５９４．２７８３（実測値）。
【０１４７】
（Ｓ）−５−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−（ジエチルカルバモイルオキシ）アミノ］−２−［Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノ］ペンタン酸（１９）：
【化２３】
0006606081.tif 000029
【０１４８】
ＭｅＯＨ（１８ｍＬ）中のベンジルエステル（１８）（２．２ｇ、３．８ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、室温で１０％のＰｄ／Ｃ（２２０ｍｇ、１０ｗ／ｗ％）を添加し、反応フラスコを水素雰囲気下で２時間撹拌した。Ｎ２をフラスコ内に流した後、混合物をセライトを通して濾過し、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧下で濃縮した。得られた残渣をＭｅＣＮ（２０ｍｌ）及びＨ２Ｏ（２０ｍＬ）に溶解し、ｉＰｒ２ＮＥｔ（１．３３ｍｌ、７．６８ｍｍｏｌ、２．０当量）及びＦｍｏｃ−ＯＳｕ（１．５５ｇ、４．６０ｍｍｏｌ、１．２当量）を室温で添加した。混合物を２時間撹拌した。ＥｔＯＡｃで希釈後、１ＭのＨＣｌ水溶液を添加し、水相をＥｔＯＡｃ（３×）で抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗物質をフラッシュクロマトグラフィーにより１％ＡｃＯＨを含むヘキサン／ＥｔＯＡｃで溶出して精製した。得られた残渣をＥｔ２Ｏ中に溶解し、Ｈ２Ｏで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、蒸発させ、減圧下で乾燥させて、（１９）（１．９ｇ、８７％収率）を得た。
【０１４９】
アモルファス；ＩＲ（薄膜）３３２９，２９７７，２９３７，１７２４，１５３０，１４５０，１４２５，１２６８，１２１６，１１６６ｃｍ−１；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）７．８０（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．６９（ｄｄ，Ｊ＝７．２，７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．４０（ｄｄ，Ｊ＝７．６，７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．３１（ｄｄ，Ｊ＝７．２，７．６Ｈｚ，２Ｈ），４．３９−４．３２（ｍ，２Ｈ），４．２７−４．１５（ｍ，２Ｈ），３．６４（ｂｒｓ，１Ｈ），３．３７−３．３２（ｍ，４Ｈ），２．０２−１．９１（ｍ，１Ｈ），１．８２−１．５７（ｍ，３Ｈ），１．４７（ｓ，９Ｈ），１．１７（ｂｒｓ，６Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）１７５．６，１５８．７，１５６．６，１５５．９，１４５．２，１４２．６，１２８．８，１２８．２，１２６．３，１２０．９，８３．４，６８．０，５４．９，５０．８，４８．４，４４．２，４２．９，２９．８，２８．５，２４．９，１４．５，１３．６；αＤ２７（ｃ０．１１，ＣＨＣｌ３）：＋６．７３；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）、Ｃ３０Ｈ３９Ｎ３Ｏ８［Ｍ＋Ｎａ］＋：５９２．２６２９（計算値），５９２．２６２３（実測値）。
【０１５０】
実施例７：ペプチド（１５）（配列番号５）の合成
【化２４】
0006606081.tif 000030
【０１５１】
充填能力が１．０８ｍｍｏｌ／ｇであるＷａｎｇリンカーポリスチレンレジン上でペプチド（１５）（配列番号５）を合成した。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（１８８ｍｇ、０．６３２ｍｍｏｌ、レジンに対して０．４当量）、ＨＣＴＵ（２６２ｍｇ、０．６３２ｍｍｏｌ、レジンに対して０．４当量）及びＮＭＭ（１３９μｌ、１．２６ｍｍｏｌ、レジンに対して０．８当量）を、少量のＤＭＡＰを含むＤＭＦ中に混合した。レジン（１．４７ｇ、１．５８ｍｍｏｌ）を３６時間、この溶液で処理し、充填量は０．３６ｍｍｏｌ／ｇとして測定された。レジンを１２時間、少量のＤＭＡＰを含むＤＭＦ中の２０％Ａｃ２Ｏで処理した。合成は、一般的な方法の項に記載された手順を用いて、Ｇｌｕ２７まで自動化されたＦｍｏｃ  ＳＰＰＳによって０．５２ｍｍｏｌスケール（１．４６ｇのレジン）で行われた。この工程では、０．３ｍｍｏｌのレジンを分離し、Ｆｍｏｃ基をＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて除去した。２時間、ＤＭＦ中のＨＣＴＵに（４９６ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ、レジンに対して４．０当量）及びＮＭＭ（２６４μｌ、２．４ｍｍｏｌ、レジンに対して８．０当量）を使用して、オルニチンヒドロキシルアミン（１９）（６８３ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ、レジンに対して４．０当量）をアミンにカップリングさせた。Ｆｍｏｃ基をＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて除去した。２時間、ＤＭＦ中のＨＣＴＵ（６２０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、レジンに対して５．０当量）及びＮＭＭ（３３０μｌ、３．０ｍｍｏｌ、レジンに対して１０当量）を使用して、Ｆｍｏｃ−Ａｌａの−ＯＨ・Ｈ２Ｏ（４９３ｍｇを、１．５ｍｍｏｌ、レジンに対して５．０当量）をアミンにコンジュゲートさせた。この工程では、０．１５ｍｍｏｌのレジンを分離し、合成は、一般的な方法の項に記載された手順を用いて、自動化されたＦｍｏｃ  ＳＰＰＳにより継続された。この工程では、０．０５ｍｍｏｌのレジンを分離し、Ｆｍｏｃ基をＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて除去した。レジンに支持されたペプチドを９０分間、ＴＦＡ：ＴＩＰＳ：Ｈ２Ｏ（９７：２：１）を用いて処理し、濾過して、固体支持対を除いた。濾過物から揮発性物質を真空下で蒸発させた。残渣をＭＴＢＥで粉砕し、遠心分離（３サイクルの反復）して、粗ペプチドを得た。３０分間で０．１％ＴＦＡを用いた２０〜９０％のＭｅＣＮの勾配よし、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ  Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１８カラム（２０×２５０ｍｍ）を用いた分取用ＨＰＬＣにより精製を行った。ｔＲ＝１８．１分で溶出する生成物ピークを回収し、凍結乾燥して、１１．２ｍｇの精製物（１５）を得た（開始レジン、開裂及び精製ステップから合成について６．４％収率）。分析用ＨＰＬＣ（２０分間０．１％ＴＦＡを用いた１５〜９５％ＭｅＣＮの勾配によるＳｈｉｓｅｉｄｏ  Ｃ１８カラム）及びＨＲＭＳを用いて、生成物の純度及び正確な質量を確認した。ｍ／ｚ、Ｃ１５５Ｈ２３５Ｎ４３ＮａＯ４９［Ｍ＋Ｎａ］＋：３５０５．７１１１（計算値）、３５０５．７１３０（実測値）。精製された（１５）の分析用ＨＰＬＣ：図６ａ参照。精製された（１５）のＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）：図６ｂ参照。
【０１５２】
実施例８：ＰＥＧ化されたペプチド（１６ａ）及び（１６ｃ）を得るためのトリフルオロホウ酸アシル（５ａ）を用いたペプチド（１５）（配列番号５）のＰＥＧ化
【化２５】
0006606081.tif 000031
【０１５３】
（５ａ）を用いたペプチド（１５）（配列番号５）のＰＥＧ化：
エッペンドルフチューブ中のペプチド（１５）（０．４８ｍｇ、０．１４μｍｏｌ、１．０当量）に０．１Ｍシュウ酸（１ｍＭ、１４０μｌ、０．１４μｍｏｌ、１．０当量）を含む１：１のｔＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中のトリフルオロホウ酸アシル（５ａ）の溶液を添加した。チューブを迅速に振とうし、室温で１０分間放置した粗分析用ＨＰＬＣ（２０分間で０．１％ＴＦＡを用いた１５〜９５％ＭｅＣＮの勾配によるＳｈｉｓｅｉｄｏ  Ｃ１８カラム）は、（１６ａ）への明確な変換を示した。１０分での粗ＨＰＬＣトレース：図７ａ参照。精製された（１６ａ）の分析用ＨＰＬＣ：図７ｂ参照。精製された（１６ａ）のＭＡＬＤＩ：図７ｃ参照。
【０１５４】
（５ｃ）を用いたペプチド（１５）（配列番号５）のＰＥＧ化：
ガラスバイアル中のペプチド（１５）（０．５２ｍｇ、０．１５μｍｏｌ、１．０当量）に０．１Ｍシュウ酸（１００μＭ、１．５ｍｌμｍｏｌ、１．０当量）を含む１：１のｔＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中のトリフルオロホウ酸アシル（５ｃ）の溶液を添加した。バイアルを迅速に振とうし、室温で１時間放置した。粗生分析用ＨＰＬＣ（２０分間で０．１％ＴＦＡを用いた１５〜９５％のＭｅＣＮの勾配によりＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｃ４カラム）は、（１６ｃ）への明確な変換を示した。１時間での粗ＨＰＬＣトレース：図８ａ参照。精製された（１６ｃ）の分析用ＨＰＬＣ：図８ｂ参照。精製された（１６ｃ）のＭＡＬＤＩ：図８ｃ参照。
【０１５５】
実施例９：ホウ酸アシルを製造するための一般的手法
【化２６】
0006606081.tif 000032
【０１５６】
磁気撹拌チップを備えた、炎で乾燥させたＳｈｃｌｅｎｋフラスコにリガンド（１．０当量）を添加した。無水ＭｅＣＮ（１．０Ｍ）及びＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（それぞれの配位基に対して１．２当量）を添加し、混合物を６０℃で３時間撹拌した。室温まで冷却後、全ての揮発性物質を真空下で慎重に除去し、さらに、４時間、６０℃で乾燥させて、ＴＭＳキャップされたリガンドを得た。これを精製することなく次の工程に用いた。
【０１５７】
磁気撹拌チップを備えた、炎で乾燥させたＳｈｃｌｅｎｋフラスコにトリフルオロホウ酸アシル・カリウム（１．０当量）を添加した。無水ＭｅＣＮ（０．１Ｍ）中のＴＭＳキャップされたリガンド（１．０当量）の溶液を添加した。この懸濁液に、ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ（１．０当量）を滴下した。混合物は均一になり、室温で１２時間撹拌した。全体積が約１ｍｌになるまで、反応混合物を３０℃未満の水浴の温度で蒸発させた。この溶液をヘキサン／ＥｔＯＡｃで溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィー上に直接置き、所望のホウ酸アシルを得た。
【０１５８】
実施例９ａ：ホウ酸４−メチルベンゾイル（１７）の製造
【化２７】
0006606081.tif 000033
【０１５９】
トリフルオロホウ酸４−メチルベンゾイル・カリウム（２３０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）から実施例９の一般的手法により製造し、白色固体として単離した（３７ｍｇ、１２％収率）。
【０１６０】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ６−ａｃｅｔｏｎｅ）７．９７−７．８９（ｍ，４Ｈ），７．８１−７．７５（ｍ，１Ｈ），７．７２−７．６４（ｍ，２Ｈ），７．３１−７．２７（ｍ，２Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），２．３８（ｓ，３Ｈ）；１９Ｆ  ＮＭＲ（２８２ＭＨｚ，ｄ６−アセトン）−１３５．６６；ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）、Ｃ１９Ｈ１６ＢＦＮＯ２［Ｍ＋Ｈ］＋：３００．１（計算値）、３００．２（実測値）。
【０１６１】
実施例９ｂ：ホウ酸４−メチルベンゾイル（１８）の製造
【化２８】
0006606081.tif 000034
【０１６２】
トリフルオロホウ酸４−メチルベンゾイル・カリウム（２３０ｍｇ、１．０当量）から実施例９の一般的手法により製造し、橙色固体として単離した（５８ｍｇ、１６％収率）。
【０１６３】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）８．４０（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ），８．１０（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），７．５９−７．５４（ｍ，１Ｈ），７．３０−７．２２（ｍ，３Ｈ），７．１９−７．１３（ｍ，２Ｈ），７．０９−６．８９（ｍ，３Ｈ），２．３９（ｓ，３Ｈ）；１９Ｆ  ＮＭＲ（２８２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）−１４７．３２；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）、Ｃ２１Ｈ１７ＢＦＮＮａＯ３［Ｍ＋Ｎａ］＋：３８４．１１７８（計算値）、３８４．１１８６（実測値）。
【０１６４】
実施例９ｃ：ホウ酸４−メチルベンゾイル（１９）の製造
【化２９】
0006606081.tif 000035
【０１６５】
トリフルオロホウ酸４−メチルベンゾイル・カリウム（２３０ｍｇ、１．０当量）から実施例９の一般的手法により製造し、淡黄色固体として単離した（１２０ｍｇ、３８％収率）。
【０１６６】
ＩＲ（薄膜）３０７０，２９２９，２３６０，１６２２，１６０７，１４９９，１４３６，１２９１，１１３９，１１１６，１０５１，７６１ｃｍ−１；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）８．４９（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），８．３１−８．２６（ｍ，２Ｈ），７．９９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．９２（ｄｄ，Ｊ＝１．５，８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．７２−７．６７（ｍ，１Ｈ），７．４２−７．３６（ｍ，１Ｈ），７．２８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．００−６．９５（ｍ，２Ｈ），２．３８（ｓ，３Ｈ）；１９Ｆ  ＮＭＲ（２８２ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）−１６０．７８；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ、Ｃ１９Ｈ１５ＢＦＮＮａＯ２［Ｍ＋Ｎａ］＋：３４２．１０７６（計算値），３４２．１０７８（実測値）。
【０１６７】
実施例９ｄ：ホウ酸４−フルオロベンゾイルＭＩＤＡ（２０）の製造
【化３０】
0006606081.tif 000036
トリフルオロホウ酸４−フルオロベンゾイル・カリウム（２３０ｍｇ、１．０当量）から実施例９の一般的手法により製造し、白色固体として単離した（１８１ｍｇ、６５％収率）。
【０１６８】
ＩＲ（薄膜）３００４，１８０２，１７４５，１６２５，１６００，１５８２，１４９８，１４７３，１４５０，１３３３，１２４１，１１９２，１１５０，１１０４，１０２９，９９１ｃｍ−１；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）８．１７−８．１３（ｍ，２Ｈ），７．２７−７．２３（ｍ，２Ｈ），４．０９（ｄ，Ｊ＝１６．５Ｈｚ，２Ｈ），３．９９（ｄ，Ｊ＝１６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９１（ｓ，３Ｈ）；１９Ｆ  ＮＭＲ（２８２ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）−１０６．００；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）、Ｃ１２Ｈ１２ＢＦＮＯ５［Ｍ＋Ｈ］＋：２８０．０７９３（計算値），２８０．０７９２（実測値）。
【０１６９】
実施例１０：ホウ酸アシルと小分子ヒドロキシルアミン（２１）の反応
【化３１】
0006606081.tif 000037
【０１７０】
実施例１０ａ：ホウ酸４−メチルベンゾイル（１７）とヒドロキシルアミン（２１）の反応
【化３２】
0006606081.tif 000038
【０１７１】
ホウ酸アシル（１７）（１．５ｍｇ、５．３μｍｏｌ）に１：１のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ中のヒドロキシルアミン（２１）（５３μｌ、１．０当量）の１００ｍＭ溶液を添加し、混合物を３時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳ分析は、アミド（２２）への明確な変換を示した。
【０１７２】
実施例１０ｂ：ホウ酸４−メチルベンゾイル（１８）とヒドロキシルアミン（２１）の反応
【化３３】
0006606081.tif 000039
【０１７３】
ホウ酸アシル（１８）（３．１ｍｇ、８．６μｍｏｌ）に１：１のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ中のヒドロキシルアミン（２１）（８６μｌ、１．０当量）の１００ｍＭ溶液を添加し、混合物を１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳ分析は、アミド（２２）への明確な変換を示した。
【０１７４】
実施例１０ｃ：ホウ酸４−メチルベンゾイル（１９）とヒドロキシルアミン（２１）の反応
【化３４】
0006606081.tif 000040
【０１７５】
ホウ酸アシル（１９）（４．２ｍｇ、１３．１μｍｏｌ）に１：１のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ中のヒドロキシルアミン（２１）（１３１μｌ、１．０当量）の１００ｍＭ溶液を添加し、混合物を２０分間撹拌した。ＬＣ−ＭＳ分析は、アミド（２２）への明確な変換を示した。
【０１７６】
実施例１０ｄ：ホウ酸４−メチルベンゾイルＭＩＤＡ（２０）とヒドロキシルアミン（２１）の反応
【化３５】
0006606081.tif 000041
【０１７７】
ＤＭＳＯ（５０μＬ）中のホウ酸アシル（２０）（３．８ｍｇ、１３．６μｍｏｌ）に１：１のｔＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中のヒドロキシルアミン（２１）（１．０当量）の１００ｍＭ溶液の１３６μＬを添加し、混合物を１０分間撹拌した。ＬＣ−ＭＳ分析は、アミド（２３）への明確な変換を示した。
【０１７８】
実施例１１：ホウ酸４−メチルベンゾイルＭＩＤＡ（２０）とペプチドヒドロキシルアミン（１３）（配列番号１）の反応
【化３６】
0006606081.tif 000042
【０１７９】
１：１のｔＢｕＯＨ／水性緩衝液（ｐＨ３．６、０．１Ｍ酢酸ナトリウム／酢酸）の３３１μｌ中のペプチドヒドロキシルアミン（１３）（配列番号１；３．４ｍｇ、３．３μｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＳＯ（３３１μｌ）中のホウ酸アシル（２０）（１．８ｍｇ、６．６μｍｏｌ、２．０当量）を添加し、混合物を１０分間、室温で撹拌した。ＬＣ−ＭＳ分析は、アミド（１４）（配列番号２）への明確な変換を示した。
【０１８０】
実施例１２：ＰＥＧ−二ホウ酸塩（２５）の製造
【化３７】
0006606081.tif 000043
【０１８１】
ＮａＨ（鉱油中６０重量％、１６ｍｇ、０．６７５ｍｍｏｌ、４当量）を乾燥ＤＭＳＯ（４ｍＬ）中のＰＥＧ  ６ｋＤａ（（２４）、１ｇ、０．１６６ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に添加した。懸濁液を２時間、室温で撹拌し、その後、トリフルオロホウ酸アシル・ｐ−フルオロフェニル（（４）、３８４ｍｇ、１．６６ｍｍｏｌ、１０当量）を添加した。反応混合物を８０℃に加熱し、２５時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、リン酸カリウム緩衝液（１Ｌ、０．１Ｍ、ｐＨ７）（２×１０時間）に対して、及び脱イオン水（１Ｌ）（２×１０時間）に対して透析（ＭＷＣＯ  ３５００）することによって官能化されたＰＥＧを精製した。最終溶液を凍結乾燥させて、８７％収率（９３２ｍｇ、０．１４４ｍｍｏｌ）でＰＥＧ−二ホウ酸塩（２５）を得た。
【０１８２】
１Ｈ  ＮＭＲ：（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．１２（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，４Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，４Ｈ），４．１７（ｍ，４Ｈ），３．６６−３．６２（ｍ，約５５０Ｈ，ＰＥＧ骨格）。
【０１８３】
実施例１３：ＰＥＧ−テトラホウ酸塩（２７）の製造
【化３８】
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【０１８４】
４アームＰＥＧ  １０ｋＤａについて：
ＮａＨ（鉱油中６０ｗｔ％、１９ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ、８当量）を乾燥ＤＭＳＯ（５Ｌ）中のＰＥＧ  １０ｋＤａ（（２６ａ）、１ｇ、０．１０ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に添加した。懸濁液を２時間、室温で撹拌し、その後、トリフルオロホウ酸アシル・ｐ−フルオロフェニル（（４）、４６０ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ、２０当量）を添加した。反応混合物を８０℃に加熱し、２６時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、リン酸カリウム緩衝液（１Ｌ、０．１Ｍ、ｐＨ７）（２×１０時間）に対して、及び脱イオン水（１Ｌ）（２×１０時間）に対して透析（ＭＷＣＯ  ３５００）することによって官能化されたＰＥＧを精製した。最終溶液を凍結乾燥させて、８７％収率（８７０ｍｇ、０．０８７ｍｍｏｌ）でＰＥＧ−二ホウ酸塩（２７ａ）を得た。
【０１８５】
１Ｈ  ＮＭＲ：（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．１２（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，８Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，８Ｈ），４．１７（ｍ，８Ｈ），３．６６−３．６２（ｍ，約１０００Ｈ，ＰＥＧ骨格）。
【０１８６】
４アームＰＥＧ  ２０ｋＤａについて：
ＮａＨ（鉱油中６０ｗｔ％、３２ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ、６当量）を乾燥ＤＭＳＯ（５ｍｌ）中のＰＥＧ  ２０ｋＤａ（（２６ｂ）、１ｇ、０．０５０ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に添加した。懸濁液を２時間、室温で撹拌し、その後、トリフルオロホウ酸アシル・ｐ−フルオロフェニル（（４）、４６０ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ、４０当量）を添加した。反応混合物を８０℃に加熱し、２６時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、リン酸カリウム緩衝液（１Ｌ、０．１Ｍ、ｐＨ７）（２×１０時間）に対して、及び脱イオン水（１Ｌ）（２×１０時間）に対して透析（ＭＷＣＯ  ３５００）することによって官能化されたＰＥＧを精製した。最終溶液を凍結乾燥させて、８３％収率（８３０ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）でＰＥＧ−二ホウ酸塩（２７ｂ）を得た。
【０１８７】
１Ｈ  ＮＭＲ：（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．１２（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，８Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，８Ｈ），４．１７（ｍ，８Ｈ），３．６６−３．６２（ｍ，約１８００Ｈ，ＰＥＧ骨格）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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