(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｂ）のうちの少なくとも１つを有効成分とする、脊髄小脳変性症１型を予防又は治療するための薬剤
（ａ）ＲＰＡ１、ＰＮＫＰ、ＸＲＣＣ３、ＸＲＣＣ４、ＣＣＮＨ、ＰＯＬＥ、ＰＯＬＨ及びＰＥＲ１からなる群から選択される少なくとも一のタンパク質又は該タンパク質をコードする核酸
（ｂ）ＣＨＫ１の発現又は活性を抑制する化合物であって、ＣＨＫ１をコードする遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ、ＣＨＫ１に対する抗体及びＣＨＫ１に対してドミナントネガティブの形質を有するペプチドから選択される少なくとも一の化合物。
【請求項２】
ＣＨＫ１タンパク質の活性を抑制する化合物を有効成分とし、かつ該化合物が、４−［（（３Ｓ）−１−アザビシクロ［２．２．２］オクト−３−イル）アミノ］−３−（１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル）−６−クロロキノリン−２（１Ｈ）−オン、（Ｓ）−１−（５−ブロモ−４−メチル−２−（モルホリン−２−イルメトキシ）フェニル）−３−（５−メチルピラジン−２−イル）ウレア、６−ブロモ−３−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−５−（３Ｒ）−３−ピぺリジニルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミン、（Ｒ）−α−アミノ−Ｎ−［５，６−ジヒドロ−２−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−６−オキソ−１Ｈ−ピロロ［４，３，２−ｅｆ］［２，３］ベンゾジアゼピン−８−イル］−シクロヘキサンアセトアミド、１−（２−（（Ｓ）−ピペリジン−３−イルカルバモイル）−５−（３−フルオロフェニル）チオフェン−３−イル）ウレア、ＸＬ８４４、７−ヒドロキシスタウロスポリン、（Ｒ）−Ｎ−（４−（３−アミノピペリジン−１−イル）−５−ブロモ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）ニコチンアミド、（Ｒ）−Ｎ−（４−（３−アミノピペリジン−１−イル）−５−ブロモ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）イソブチルアミド、（Ｒ）−Ｎ−（５−ブロモ−４−（３−（メチルアミノ）ピペリジン−１−イル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）ニコチンアミド、（Ｒ）−Ｎ−（４−（３−アミノピペリジン−１−イル）−５−ブロモ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−５−メチルニコチンアミド、（Ｒ）−Ｎ−（４−（３−アミノピペリジン−１−イル）−５−ブロモ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）シクロプロパンカルボキサミド、（Ｒ）−Ｎ−（４−（３−アミノピペリジン−１−イル）−５−ブロモ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−３−メチル−ブタンアミド及び（Ｒ）−Ｎ−（４−（３−アミノピペリジン−１−イル）−５−ブロモ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−２−シクロプロピルアセトアミドからなる群から選択される少なくとも一の化合物である、脊髄小脳変性症１型を予防又は治療するための薬剤。
【請求項３】
下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、脊髄小脳変性症１型を予防又は治療するための候補化合物のスクリーニング方法
（ａ）被検化合物の存在下で、ＲＰＡ１と、ＡＴＸＮ１とを接触させる工程、
（ｂ）ＲＰＡ１と、ＡＴＸＮ１との結合を検出する工程、
（ｃ）前記結合を抑制する化合物を選択する工程。
【請求項４】
下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、脊髄小脳変性症１型を予防又は治療するための候補化合物のスクリーニング方法
（ａ）ＲＰＡ１、ＰＮＫＰ、ＸＲＣＣ３、ＸＲＣＣ４、ＣＣＮＨ、ＰＯＬＥ、ＰＯＬＨ及びＰＥＲ１からなる群から選択される少なくとも一のタンパク質の発現又は活性を検出しうる系に被検化合物を適用させる工程、
（ｂ）該タンパク質の発現又は活性を促進する化合物を選択する工程。
【請求項５】
下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、脊髄小脳変性症１型を予防又は治療するための候補化合物のスクリーニング方法
（ａ）ＣＨＫ１の機能を検出しうる系に被検化合物を適用させる工程、
（ｂ）該タンパク質の発現又は活性を抑制する化合物を選択する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脊髄小脳変性症を予防又は治療するための薬剤に関する。また、本発明は、脊髄小脳変性症を予防又は治療するための候補化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊髄小脳変性症（ＳＣＡ）は、運動失調を主な症状とし、小脳及び脳幹から脊髄にかけての神経細胞が徐々に破壊、消失していく疾患である。ＳＣＡは、アルツハイマー病、パーキンソン病に次いで患者数の多い神経変性疾患であるが、有効な治療法は確立されておらず、その病態解明と治療法の開発は、喫緊の社会的な課題となっている。【０００３】
また、ＳＣＡにおいては、病理上様々な生物学的異常が生じていることも明らかになっている。例えば、ＳＣＡの１種である脊髄小脳変性症１型（ＳＣＡ１）においては、ＲＮＡ認識モチーフを有するＲＢＭ１７は、スプライシンング因子４５（ＳＰＦ４５）とも称され、ＳＣＡ１の病因であるアタキシン１（ＡＴＸＮ１）に、そのタンパク質中のポリグルタミン鎖（ｐｏｌｙＱ）の鎖長依存的に結合することが明らかになっている（非特許文献１）。また、１４−３−３は、Ａｋｔによってリン酸化された際に、ＡＴＸＮ１のＣ末領域に結合することが明らかになっている（非特許文献２）。さらに、１４−３−３とＡＴＸＮ１との結合によって、ＡＴＸＮ１の脱リン酸化が生じ（非特許文献３）、該リン酸化が前記ＲＢＭ１７とＡＴＸＮの結合に重要な役割を果たしていることも明らかになっている（非特許文献１）。また、転写抑制因子ＣＩＣ／ｃａｐｉｃｕａ、Ｓｏｘ２様高速移動群タンパク質（Ｓｏｘ２−ｌｉｋｅ  ｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ（ＨＭＧ））、ＨＢＰ−１及びＨＭＧボックス転写因子は、ＡＴＸＮ１のＡＸＨドメインと相互作用することが知られている（非特許文献４）。また、レチノイン酸受容体関連オーファン受容体αは、プルキンエ細胞の発達に関与し、さらに変異型ＡＴＸＮ１によって、その効果が減弱することも明らかになっている（非特許文献５）。また、ポリグルタミン結合タンパク質−１は、スプライソソームの構成成分であり（非特許文献６及び７）、ＡＴＸＮ１のポリグルタミン鎖に結合し、ＡＴＸＮ１と共に特定の核小体に局在していることも知られている（非特許文献８）。【０００４】
そして、このようなＡＴＸＮ１と各種因子との相互作用は、それら因子が関与するスプライシング及び転写において機能不全を生じさせ、下流において様々な異常を引き起こし、最終的には典型的なＳＣＡ１の表現型に至ることになる（非特許文献９）
ところで、転写及びスプライシングと、ＤＮＡ損傷修復とは密接に関連していることが知られている。例えば、ＤＮＡ損傷が生じた際には、その損傷を受けたゲノムＤＮＡが修復されるまで、転写は止められ、オルタナティブスプライシングにも影響を与える。また、ＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢｓ）が転写の過程において生じることにより、コイルド二重鎖ＤＮＡが緩められ、転写機構のアクセスが可能となることも知られている。【０００５】
さらに、ＤＮＡ損傷修復はＳＣＡ１の病態にも関与していることが示唆されている。例えば、ＤＮＡ構造タンパク質であるＨＭＧＢ１及びＨＭＧＢ２は、多種多様なＤＮＡ損傷修復機構において重要な役割を担うことが知られているが、ＳＣＡ１の病因である変異型ＡＴＸＮ１は、これらＤＮＡ構造タンパク質の発現を減少させることが明らかになっている（非特許文献１０）。また、前述のＲＢＭ１７に関し、そのショウジョウバエ相同タンパク質もＡＴＸＮ１に結合するタンパク質であり、さらにＤＮＡ損傷修復に関与することが知られている（非特許文献１１）。【０００６】
また、ＳＣＡ１以外のＳＣＡの発症にも、ＤＮＡ損傷修復が関与していることが示唆されている（非特許文献１２及び１３）。例えば、毛細血管拡張性運動失調症は、ＤＮＡ二重鎖切断修復（ＤＳＢＲ）の制御に関与するＡＴＭ遺伝子の機能不全を原因とすることが示されている（非特許文献１４）。また、眼球運動失行を伴う失調症１型（ＡＯＡ１）は、一本鎖ＤＮＡ切断修復（ＳＳＢＲ）に主に関与するＨＩＴ遺伝子ファミリーのメンバーであるアプラタキシンの変異によって生じることが報告されている（非特許文献１２、１５〜１７）。また、ＡＯＡ２の病態は、セナタキシンの変異と関連性を有していることが示されている（非特許文献１８）。セナタキシンは、転写が停止している部位において形成されるＤＮＡ−ＲＮＡハイブリットを解消すると考えられており（非特許文献１９）、また転写共役修復等の様々なタイプのＤＮＡ修復に関与していることが想定される、酵母ＲＮＡヘリケースのオーソログでもある（非特許文献２０）。【０００７】
そして、このような転写やスプライシング、さらにＤＮＡ損傷修復を通し、ＳＣＡの分子病態を解明することは、この疾患を治療又は予防するための薬剤等を開発する上で極めて重要である。【０００８】
しかしながら、特にＤＮＡ損傷修復は複雑な工程を経て行われるものであり、ＤＳＢＲ、ＳＳＢＲ、塩基除去修復（ＢＥＲ）及びヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）といった多種多様な種類が存在している。したがって、どのようなＤＮＡ損傷修復が、またどのような分子がＳＣＡの病態に大きく寄与するのかを解明することは極めて困難なことであり、ＳＣＡの治療又は予防するための有効な薬剤等はいまだ開発されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｌｉｍ，Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２００８年、４５２巻、７１３〜７１８ページ
【非特許文献２】Ｃｈｅｎ，Ｈ．Ｋ．ら、Ｃｅｌｌ、２００３年、１１３巻、４５７〜４６８ページ
【非特許文献３】Ｌａｉ，Ｓ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２０１１年、２８６巻、３４６０６〜３４６１６ページ
【非特許文献４】ｄｅ  Ｃｈｉａｒａ，Ｃ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、２００３年、５５１巻、１０７〜１１２ページ
【非特許文献５】Ｓｅｒｒａ，Ｈ．Ｇ．ら、Ｃｅｌｌ、２００６年、１２７巻、６９７〜７０８ページ
【非特許文献６】Ｍａｋａｒｏｖ，Ｅ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２年、２９８巻、２２０５〜２２０８ページ
【非特許文献７】Ｍａｋａｒｏｖａ，Ｏ．Ｖ．ら、Ｅｍｂｏ  Ｊ、２００４年、２３巻、２３８１〜２３９１ページ
【非特許文献８】Ｏｋａｚａｗａ，Ｈ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ、２００２年、３４巻、７０１〜７１３ページ
【非特許文献９】Ｏｒｒ，Ｈ．Ｔ．、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２０１２年、１９７巻、１６７〜１７７ページ
【非特許文献１０】Ｑｉ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２００７年、９巻、４０２〜４１４ページ
【非特許文献１１】Ｃｈａｏｕｋｉ，Ａ．Ｓ．ら、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ、２００６年、２、ｅ１７８．
【非特許文献１２】Ｒａｓｓ，Ｕ．ら、Ｃｅｌｌ、２００７年、１３０巻、９９１〜１００４ページ
【非特許文献１３】Ｇｕｅｖｅｎ，Ｎ．ら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２００７年、１４５巻、１４１８〜１４２５ページ
【非特許文献１４】Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｆｕｎｅｚ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２０００年、４０８巻、１０１〜１０６ページ
【非特許文献１５】Ｄａｔｅ，  Ｈ．ら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、２００１年、２９巻、１８４〜１８８ページ
【非特許文献１６】Ｍｏｒｅｉｒａ，Ｍ．Ｃ．ら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、２００１年、２９巻、１８９〜１９３ページ
【非特許文献１７】Ｄａｔｅ，Ｈ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、２００４年、３２５巻、１２７９〜１２８５ページ
【非特許文献１８】Ｍｏｒｅｉｒａ，Ｍ．Ｃ．ら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、２００４年、３６巻、２２５〜２２７ページ
【非特許文献１９】Ｓｋｏｕｒｔｉ−Ｓｔａｔｈａｋｉ，Ｋ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ、２０１１年、４２巻、７９４〜８０５ページ
【非特許文献２０】Ｓｕｒａｗｅｅｒａ，Ａ．ら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ、２００９年、１８巻、３３８４〜３３９６ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、脊髄小脳変性症の治療又は予防を可能とする化合物を提供すること及び脊髄小脳変性症を予防又は治療するための候補化合物のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記目的を達成すべく、脊髄小脳変性症１型（ＳＣＡ１）の病因であるヒト変異アタキシン１（変異型ＡＴＸＮ１）をショウジョウバエに発現させたＳＣＡ１モデルバエを調製した。さらに、このモデルバエにおいて、ＤＮＡ修復に関するショウジョウバエ相同遺伝子を過剰に発現させた。そして、ＳＣＡ１モデルバエの症状の１つである生存期間の短さが回復されるかどうかを指標として、ＳＣＡの病態に関与するＤＮＡ修復遺伝子のインビボスクリーニングを行った。【００１２】
その結果、ＳＣＡの病態を回復させる遺伝子として、ＲＰＡ１、ＰＮＫＰ、ＸＲＣＣ３、ＸＲＣＣ４、ＣＣＮＨ、ＰＯＬＥ、ＰＯＬＨ及びＰＥＲ１が同定された。一方、ＳＣＡ１モデルバエの生存期間をさらに短くする遺伝子、すなわちＳＣＡの病態を悪化させる遺伝子として、ＣＨＫ１、ＬＩＧ３、ＦＥＮ１、ＬＩＧ１、ＥＲＣＣ５、ＸＡＢ２、ＥＲＣＣ２、ＤＭＣ１、ＲＥＣＱＬ５、ＭＵＳ８１、ＥＭＥ１、ＳＰＯ１１及びＢＬＭが同定された。なお、これら同定された遺伝子は、いずれもＳＣＡ等のポリグルタミン病の病態に関与することが、従前知られていなかった遺伝子である。【００１３】
さらに、これらＳＣＡの病態に関与することが示された遺伝子を対象とし、システム生物学的に解析を行った。その結果、これら遺伝子の間を結びつけるコアネットワークの存在が明らかになった。特に、ＳＣＡ１モデルバエの生存期間の延長において最も大きな影響を与えたＲＰＡ１は、相同組換え（ＨＲ）等のＤＮＡ修復システム間を結びつける中心点に位置していることが明らかになった。一方、生存期間の短縮に関与する遺伝子においては、ＣＨＫ１が、ＢＬＭ、ＦＥＮ１及びＬＩＧ１から直接又は間接的に様々なシグナルを受けていることから、ＣＨＫ１は、ＳＣＡ１モデルバエの生存期間の更なる短縮において重要な役割を果たしていることが明らかになった。【００１４】
次に、ＳＣＡの病態の改善において最も影響を与えるＲＰＡ１と、相同組換えによるＤＮＡ修復システムにおいてＲＰＡ１の重要なパートナーとなるＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２とを対象とし、ＳＣＡ１の病因となるＡＴＸＮ１との相互作用の有無について解析した。その結果、ＲＰＡ１、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２、いずれのタンパク質もＡＴＸＮ１及びその変異体と結合できることが明らかになった。さらに、正常なＡＴＸＮ１（野生型ＡＴＸＮ１）ではなく、異常なＡＴＸＮ１（変異型ＡＴＸＮ１）は、ＤＮＡ損傷後において、ＤＮＡ修復に必要なＲＰＡ１の核内動態を損なわせることも明らかになった。【００１５】
また、ＳＣＡ１モデルバエにおいて、ＲＰＡ１を過剰に発現させることによって、ＳＣＡ１モデルバエの症状の１つである眼の変性状態が回復することを見出した。【００１６】
さらに、ＳＣＡ１モデルマウスにおいても、その小脳においてＲＰＡ１を過剰に発現させることによって、該モデルマウスの症状の１つである運動性欠陥が改善することも見出した。【００１７】
また、変異型ＡＴＸＮ１がノックインされたマウスのプルキンエ細胞において、Ｓ期への移行に異常がきたしていることが明らかになった。このことから、プルキンエ細胞における異常なＳ期への移行によって、該細胞におけるＤＮＡ損傷修復、ひいてはＲＰＡ１による相同組換え型ＤＮＡ修復が誘導されることにより、ＳＣＡの病態が改善されることが示唆された。【００１８】
また、ＳＣＡの病態の更なる悪化において重要な役割を担うＣＨＫ１に関し、その機能を化学的に又は遺伝学的に阻害すべく、ＳＣＡ１モデルバエにＣＨＫ１特異的阻害剤を投与し、又はＳＣＡ１モデルバエにおいてＣＨＫ１に対するｓｉＲＮＡを発現させた。その結果、ＳＣＡ１モデルバエの生存期間は延び、また眼の変性状態も回復することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下を提供するものである。
（１）  下記（ａ）〜（ｄ）のうちの少なくとも１つを有効成分とする、脊髄小脳変性症を予防又は治療するための薬剤
（ａ）ＲＰＡ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＮＫＰ、ＸＲＣＣ３、ＸＲＣＣ４、ＣＣＮＨ、ＰＯＬＥ、ＰＯＬＨ及びＰＥＲ１からなる群から選択される少なくとも一のタンパク質又は該タンパク質をコードする核酸
（ｂ）ＲＰＡ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＮＫＰ、ＸＲＣＣ３、ＸＲＣＣ４、ＣＣＮＨ、ＰＯＬＥ、ＰＯＬＨ及びＰＥＲ１からなる群から選択される少なくとも一のタンパク質の発現又は活性を促進する化合物
（ｃ）ＲＰＡ１、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２からなる群から選択される少なくとも一のタンパク質と、ＡＴＸＮ１との結合を抑制する化合物
（ｄ）ＣＨＫ１、ＬＩＧ３、ＦＥＮ１、ＬＩＧ１、ＥＲＣＣ５、ＤＭＣ１、ＸＡＢ２、ＥＲＣＣ２、ＲＥＣＱＬ５、ＭＵＳ８１、ＥＭＥ１、ＳＰＯ１１及びＢＬＭからなる群から選択される少なくとも一のタンパク質の発現又は活性を抑制する化合物。
（２）  ＣＨＫ１タンパク質の活性を抑制する化合物を有効成分とし、かつ該化合物が、４−［（（３Ｓ）−１−アザビシクロ［２．２．２］オクト−３−イル）アミノ］−３−（１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル）−６−クロロキノリン−２（１Ｈ）−オン、（Ｓ）−１−（５−ブロモ−４−メチル−２−（モルホリン−２−イルメトキシ）フェニル）−３−（５−メチルピラジン−２−イル）ウレア、６−ブロモ−３−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−５−（３Ｒ）−３−ピぺリジニルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミン、（Ｒ）−α−アミノ−Ｎ−［５，６−ジヒドロ−２−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−６−オキソ−１Ｈ−ピロロ［４，３，２−ｅｆ］［２，３］ベンゾジアゼピン−８−イル］−シクロヘキサンアセトアミド、１−（２−（（Ｓ）−ピペリジン−３−イルカルバモイル）−５−（３−フルオロフェニル）チオフェン−３−イル）ウレア、ＸＬ８４４、７−ヒドロキシスタウロスポリン、（Ｒ）−Ｎ−（４−（３−アミノピペリジン−１−イル）−５−ブロモ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）ニコチンアミド、（Ｒ）−Ｎ−（４−（３−アミノピペリジン−１−イル）−５−ブロモ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）イソブチルアミド、（Ｒ）−Ｎ−（５−ブロモ−４−（３−（メチルアミノ）ピペリジン−１−イル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）ニコチンアミド、（Ｒ）−Ｎ−（４−（３−アミノピペリジン−１−イル）−５−ブロモ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−５−メチルニコチンアミド、（Ｒ）−Ｎ−（４−（３−アミノピペリジン−１−イル）−５−ブロモ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）シクロプロパンカルボキサミド、（Ｒ）−Ｎ−（４−（３−アミノピペリジン−１−イル）−５−ブロモ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−３−メチル−ブタンアミド及び（Ｒ）−Ｎ−（４−（３−アミノピペリジン−１−イル）−５−ブロモ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−２−シクロプロピルアセトアミドからなる群から選択される少なくとも一の化合物である、（１）に記載の薬剤。
（３）  下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、脊髄小脳変性症を予防又は治療するための候補化合物のスクリーニング方法
（ａ）被検化合物の存在下で、ＲＰＡ１、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２からなる群から選択される少なくとも一のタンパク質と、ＡＴＸＮ１とを接触させる工程、
（ｂ）ＲＰＡ１、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２からなる群から選択される少なくとも一のタンパク質と、ＡＴＸＮ１との結合を検出する工程、
（ｃ）前記結合を抑制する化合物を選択する工程。
（４）  下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、脊髄小脳変性症を予防又は治療するための候補化合物のスクリーニング方法
（ａ）ＲＰＡ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＮＫＰ、ＸＲＣＣ３、ＸＲＣＣ４、ＣＣＮＨ、ＰＯＬＥ、ＰＯＬＨ及びＰＥＲ１からなる群から選択される少なくとも一のタンパク質の発現又は活性を検出しうる系に被検化合物を適用させる工程、
（ｂ）該タンパク質の発現又は活性を促進する化合物を選択する工程。
（５）  下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、脊髄小脳変性症を予防又は治療するための候補化合物のスクリーニング方法
（ａ）ＣＨＫ１、ＬＩＧ３、ＦＥＮ１、ＬＩＧ１、ＥＲＣＣ５、ＤＭＣ１、ＸＡＢ２、ＥＲＣＣ２、ＲＥＣＱＬ５、ＭＵＳ８１、ＥＭＥ１、ＳＰＯ１１及びＢＬＭからなる群から選択される少なくとも一のタンパク質の機能を検出しうる系に被検化合物を適用させる工程、
（ｂ）該タンパク質の発現又は活性を抑制する化合物を選択する工程。【００１９】
なお、本発明において、「脊髄小脳変性症」とは、ＳＣＤ（ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）又はＳＣＡ（ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）とも称される、小脳及び脳幹から脊髄にかけての神経細胞が徐々に破壊、消失していく神経変性疾患を意味する。脊髄小脳変性症は遺伝性のものと非遺伝性のものとの２つに大きく分類することができ、遺伝性のものとしては、例えば、遺伝性オリーブ橋小脳萎縮症、遺伝性皮質小脳萎縮症、Ｍａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ病、フリードライヒ運動失調症、眼球運動失行を伴う失調症１型（ＡＯＡ１）、ＡＯＡ２、遺伝性歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、毛細血管拡張性運動失調症等が挙げられ、非遺伝性のものとしては、例えば、オリーブ橋小脳萎縮症、シャイ・ドレーガー症候群、線条体黒質変性症、皮質性小脳萎縮症が挙げられる。さらに、遺伝性のものに関しては、それら原因遺伝子によって３１型（ＳＣＡ１〜３１）に分類される。このように脊髄小脳変性症は、伴う症状、原因遺伝子等によって多数の疾患に分類され得るが、遺伝性のもの、非遺伝性のもの問わず、いずれの型の脊髄小脳変性症においても、ＳＣＡの主要症候は小脳性あるいは脊髄後索性の運動失調であり、病理学的特徴は共通している。【００２０】
「ＲＰＡ１」とは、ＲＰＡ７０、ＨＳＳＢ、ＭＳＴ０７５、ＲＥＰＡ１、ＲＦ−Ａ又はＲＰ−Ａとも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００２９３６で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＲＰＡ１をコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿００２９４５に記載のコーディング領域（ＣＤＳ）を含む核酸が挙げられる。【００２１】
「ＢＲＣＡ１」とは、ＩＲＩＳ、ＰＳＣＰ、ＢＲＣＣ１、ＰＮＣＡ４、ＲＮＦ５３、ＢＲＯＶＣＡ１又はＰＰＰ１Ｒ５３とも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００９２２５で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＢＲＣＡ１をコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿００７２９４に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。【００２２】
「ＢＲＣＡ２」とは、ＢＲＣＣ２、ＢＲＯＶＣＡ２、ＦＡＣＤ、ＦＡＤ、ＦＡＤ１、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＤ、ＦＡＮＣＤ１、ＧＬＭ３又はＰＮＣＡ２とも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００００５０で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＢＲＣＡ２をコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿００００５９に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。【００２３】
「ＰＮＫＰ」とは、ＥＩＥＥ１０、ＭＣＳＺ又はＰＮＫとも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００９１８５で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＰＮＫＰをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿００７２５４に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。【００２４】
「ＸＲＣＣ３」とは、ＣＭＭ６とも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００１０９３５８８で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＸＲＣＣ３をコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿００１１００１１８に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。【００２５】
「ＸＲＣＣ４」の典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００３３９２で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＸＲＣＣ４をコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿００３４０１に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。【００２６】
「ＣＣＮＨ」とは、サイクリンＨ、ＣＡＫ、ｐ３４又はｐ３７とも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００１２３０で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＣＣＮＨをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿００１２３９に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。【００２７】
「ＰＯＬＥ」とは、ＤＮＡポリメラーゼイプシロン、ＣＲＣＳ１２、ＦＩＬＳ又はＰＯＬＥ１とも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００６２２２で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＰＯＬＥをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿００６２３１に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。【００２８】
「ＰＯＬＨ」とは、ＤＮＡポリメラーゼイータ、ＲＡＤ３０、ＲＡＤ３０Ａ、ＸＰ−Ｖ又はＸＰＶとも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００６４９３で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＰＯＬＨをコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿００６５０２に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。【００２９】
「ＰＥＲ１」とは、ｈＰＥＲ、ＰＥＲ又はＲＩＧＵＩとも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００２６０７で特定されるタンパク質が挙げられる。また、ＰＥＲ１をコードする核酸のヒト由来の典型例としては、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿００２６１６に記載のＣＤＳを含む核酸が挙げられる。【００３０】
「ＣＨＫ１」とは、ＣＨＥＫ１とも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００１１０７５９３で特定されるタンパク質（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿００１１１４１２１に記載の塩基配列にコードされるタンパク質）が挙げられる。【００３１】
「ＬＩＧ３」とは、ＤＮＡライゲース３又はＬＩＧ２とも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿０３９２６９で特定されるタンパク質（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿０１３９７５に記載の塩基配列にコードされるタンパク質）が挙げられる。【００３２】
「ＦＥＮ１」とは、ＦＥＮ−１、ＭＦ１又はＲＡＤ２とも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００４１０２で特定されるタンパク質（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿００４１１１に記載の塩基配列にコードされるタンパク質）が挙げられる。【００３３】
「ＬＩＧ１」とは、ＤＮＡライゲース１とも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿０００２２５で特定されるタンパク質（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿０００２３４に記載の塩基配列にコードされるタンパク質）が挙げられる。【００３４】
「ＥＲＣＣ５」とは、ＣＯＦＳ３、ＥＲＣＭ２、ＵＶＤＲ、ＸＰＧ又はＸＰＧＣとも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿０００１１４で特定されるタンパク質（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿０００１２３に記載の塩基配列にコードされるタンパク質）が挙げられる。【００３５】
「ＸＡＢ２」とは、ＨＣＮＰ、ＨＣＲＮ、ＮＴＣ９０又はＳＹＦ１とも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿０６４５８１で特定されるタンパク質（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿０２０１９６に記載の塩基配列にコードされるタンパク質）が挙げられる。【００３６】
「ＥＲＣＣ２」とは、ＣＯＦＳ２、ＥＭ９、ＴＴＤ又はＸＰＤとも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿０００３９１で特定されるタンパク質（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿０００４００に記載の塩基配列にコードされるタンパク質）が挙げられる。【００３７】
「ＤＭＣ１」とは、ＬＩＭ１５、ｄＪ１９９Ｈ１６．１、ＤＭＣ１Ｈ又はＨｓＬｉｍ１５とも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００８９９９で特定されるタンパク質（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿００７０６８に記載の塩基配列にコードされるタンパク質）が挙げられる。【００３８】
「ＲＥＣＱＬ５」とは、ＲＥＣＱ５とも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００１００３７１５で特定されるタンパク質（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿００１００３７１５に記載の塩基配列にコードされるタンパク質）が挙げられる。【００３９】
「ＭＵＳ８１」とは、ＳＬＸ３とも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿０７９４０４で特定されるタンパク質（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿０２５１２８に記載の塩基配列にコードされるタンパク質）が挙げられる。【００４０】
「ＥＭＥ１」とは、ＦＬＪ３１３６４又はＭＭＳ４Ｌとも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿６８９６７６で特定されるタンパク質（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿１５２４６３に記載の塩基配列にコードされるタンパク質）が挙げられる。【００４１】
「ＳＰＯ１１」とは、ＣＴ３５、ＳＰＡＴＡ４３又はＴＯＰＶＩＡとも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿０３６５７６で特定されるタンパク質（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿０１２４４４に記載の塩基配列にコードされるタンパク質）が挙げられる。【００４２】
「ＢＬＭ」とは、ＢＳ、ＲＥＣＱ２、ＲＥＣＱＬ２又はＲＥＣＱＬ３とも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００００４８で特定されるタンパク質（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿００００５７に記載の塩基配列にコードされるタンパク質）が挙げられる。【００４３】
「ＡＴＸＮ１」とは、アタキシン１、ＡＴＸ１、Ｄ６Ｓ５０４Ｅ又はＳＣＡ１とも称されるタンパク質であり、典型的なものとしては、ヒト由来のものであれば、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿０００３２３で特定されるタンパク質（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿０００３３２に記載の塩基配列にコードされるタンパク質）が挙げられる。
【発明の効果】
【００４４】
本発明によれば、脊髄小脳変性症を治療又は予防すること、又は脊髄小脳変性症を治療若しくは予防するための候補化合物を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ヘテロ接合型変異Ａｔｘｎ１−ノックインマウス（ｍＡｔｘｎ１−ＫＩ）及びそれと同腹の非トランスジェニックマウス（ＷＴ）において、１週齢、４週齢及び３２週齢の小脳におけるγＨ２ＡＸの発現を免疫組織学的に解析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、変異Ａｔｘｎ１−ノックインマウスにおいて、Ａｔｘｎ１−１５４Ｑタンパク質（全長）を発現させている。また図中「ｍｏｌ」は分子層を示し、「ｇｒａ」は顆粒層を示し、「ｅ−ｇｒａ」は外顆粒層を示す。矢印は、プルキンエ細胞におけるγＨ２ＡＸの活性化を示す。
【図２】１６週齢及び４０週齢の野生型マウス（ＷＴ）及びｍＡｔｘｎ１−ＫＩマウス（ＫＩ）の小脳タンパク質抽出物（７μｇ）におけるγＨ２ＡＸの発現レベルを、ウェスタンブロッティングにより解析した結果を示す写真である。
【図３】１６週齢及び４０週齢の野生型マウス（ＷＴ）３匹及びｍＡｔｘｎ１−ＫＩマウス（ＫＩ）３匹におけるγＨ２Ａのシグナル強度を、ウェスタンブロッティングにより定量的に解析した結果を示すグラフである。図中のエラーバーはＳＥＭを示す。アスタリスクは、スチューデントのｔ検定においてＰ＜０．０１であることを示す。
【図４】Ａｔｘｎ１−８２Ｑ／ＤｓＲｅｄ又はＤｓＲｅｄのみをＯＫ６ドライバーによりショウジョウバエの運動神経に発現させ、これらハエの胸部運動神経及び腹神経索（ＶＮＣ）におけるＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢｓ）を、ＤＳＢマーカーであるγＨ２Ａｖの発現を介して解析した結果を示す顕微鏡写真である。すなわち、左側のパネルにおいて、ＤｓＲｅｄのみを発現させた対照バエと比較して、変異型ＡＴＸＮ１を発現させたハエのＶＮＣにおいて、γＨ２Ａｖシグナルの増強が見られたことを示す顕微鏡写真である。なお、ハエは７〜１０日目に解剖してこの解析に供した。
【図５】ＯＫ６−ｄｒｉｖｅｎ  Ａｔｘｎ１トランスジェニックバエの運動神経におけるＡｔｘｎ１の発現を、Ｈ２１抗Ａｔｘｎ１抗体を用いた免疫染色により検出した結果を示す顕微鏡写真である。すなわち、ＤｓＲｅｄのみを発現させた対照バエと比較して、当該トランスジェニックバエのＶＮＣにおいて、ＡＴＸＮ１の発現が確認されたことを示す顕微鏡写真である。なお、ハエは７〜１０日目に解剖してこの解析に供した。
【図６】ヒトタンパク質間相互作用データベースを用い、インジェヌイティー−ＩＰＡソフトウェアによって予測された、ＳＣＡ１モデルバエの生存期間延長に寄与するＤＮＡ損傷修復ネットワーク−１を示す図である。なお、図中「ＮＨＥＪ型ＤＳＢＲ」と表記されている円で囲まれた遺伝子は、非相同末端際結合型のＤＮＡ二重鎖切断修復に関連する遺伝子であり、「ＨＲ型ＤＳＢＲ」と表記されている円で囲まれた遺伝子は、相同組換え型のＤＮＡ二重鎖切断修復に関連する遺伝子であり、「ＮＥＲ及びＢＥＲ」と表記されている円で囲まれた遺伝子は、ヌクレオチド除去修復又は塩基除去修復に関連する遺伝子であり、「転写」と表記されている円で囲まれた遺伝子は、転写に関連する遺伝子である。「Ｋｕ７０」はＸＲＣＣ６を示し、二重円が付された「Ｋｕ」はＫｕ７０／Ｋｕ８０複合体とは区別される。また、ＰＡＲＰ１は一本鎖ＤＮＡ切断修復（ＳＳＢＲ）及びヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）に関連する遺伝子であり、ＸＲＣＣ１、ＬＩＧ３及びＰＡＲＰ１は、別のタイプのＤＮＡ二重鎖切断修復（Ｂ−ＮＨＥＪ）にも関与する遺伝子である。
【図７】ヒトタンパク質間相互作用データベースを用い、インジェヌイティー−ＩＰＡソフトウェアによって予測された、ＳＣＡ１モデルバエの生存期間延長に寄与するＤＮＡ損傷修復ネットワーク−２を示す図である。
【図８】ヒトタンパク質間相互作用データベースを用い、インジェヌイティー−ＩＰＡソフトウェアによって予測された、ＳＣＡ１モデルバエの生存期間短縮に寄与するＤＮＡ損傷修復ネットワーク−１を示す図である。図中、ＣＨＫ１は、生存期間短縮の拠点となる遺伝子から多数のシグナルを受けていることが示されている。また、ＲＰＡ１は生存期間短縮の拠点となる遺伝子ＢＬＭ及びＦＥＮ１とつながりがあることも示されている。
【図９】ヒトタンパク質間相互作用データベースを用い、インジェヌイティー−ＩＰＡソフトウェアによって予測された、ＳＣＡ１モデルバエの生存期間短縮に寄与するＤＮＡ損傷修復ネットワーク−２を示す図である。
【図１０】図６〜９における表記について説明した図である。
【図１１】ＡＴＸＮ１とＲＰＡ１との相互作用に関し、抗ＡＴＸＮ１抗体による免疫沈降アッセイを行い、抗ＲＰＡ１抗体を用いたウェスタンブロッティングにより解析した結果を示す写真である。図中、レーン１はＥＧＦＰとＭｙｃとを共発現させたＨｅｌａ細胞の結果を示し、レーン２はＥＧＦＰとＡｔｘｎ１−３３Ｑ−Ｍｙｃとを共発現させたＨｅｌａ細胞の結果を示し、レーン３はＥＧＦＰとＡｔｘｎ１−８６Ｑ−Ｍｙｃとを共発現させたＨｅｌａ細胞の結果を示し、レーン４はＥＧＦＰ−ＲｐＡ１のみを発現させたＨｅｌａ細胞の結果を示し、レーン５はＥＧＦＰ−ＲｐＡ１とＡｔｘｎ１−３３Ｑ−Ｍｙｃとを共発現させたＨｅｌａ細胞の結果を示し、レーン６はＥＧＦＰ−ＲｐＡ１とＡｔｘｎ１−８６Ｑ−Ｍｙｃとを共発現させたＨｅｌａ細胞の結果を示す。また、「Ｉｎｐｕｔ」は抗ＡＴＸＮ１抗体による免疫沈降に供する前の結果を示し、「ＩＰ」は抗ＡＴＸＮ１抗体による沈降物について解析した結果を示す。
【図１２】ＡＴＸＮ１とＲＰＡ１との相互作用に関し、抗ＲＰＡ１抗体による免疫沈降アッセイを行い、抗ＡＴＸＮ１抗体を用いたウェスタンブロッティングにより解析した結果を示す写真である。図中、レーンの表記については図１１と同じである。「Ｉｎｐｕｔ」は抗ＲＰＡ１抗体による免疫沈降に供する前の結果を示し、「ＩＰ」は抗ＲＰＡ１抗体による沈降物について解析した結果を示す。
【図１３】ＡＴＸＮ１とＢＲＣＡ１との相互作用に関し、抗ＢＲＣＡ１抗体による免疫沈降アッセイを行い、抗ＡＴＸＮ１抗体を用いたウェスタンブロッティングにより解析した結果を示す写真である。図中、レーン１はＥＧＦＰとＭｙｃとを共発現させたＨｅｌａ細胞の結果を示し、レーン２はＥＧＦＰとＡｔｘｎ１−３３Ｑ−Ｍｙｃとを共発現させたＨｅｌａ細胞の結果を示し、レーン３はＥＧＦＰとＡｔｘｎ１−８６Ｑ−Ｍｙｃとを共発現させたＨｅｌａ細胞の結果を示す。また、「Ｉｎｐｕｔ」は抗ＢＲＣＡ１抗体による免疫沈降に供する前の結果を示し、「ＩＰ」は抗ＢＲＣＡ１抗体による沈降物について解析した結果を示す。また、左側のパネルはウェスタンブロッティングにおける化学発光を短時間露光にて検出した結果を示し、右側のパネルはウェスタンブロッティングにおける化学発光を長時間露光にて検出した結果を示す。
【図１４】ＡＴＸＮ１とＢＲＣＡ２との相互作用に関し、抗ＢＲＣＡ２抗体による免疫沈降アッセイを行い、抗ＡＴＸＮ１抗体を用いたウェスタンブロッティングにより解析した結果を示す写真である。図中、レーンの表記については図１３と同じである。「Ｉｎｐｕｔ」は抗ＢＲＣＡ２抗体による免疫沈降に供する前の結果を示し、「ＩＰ」は抗ＢＲＣＡ２抗体による沈降物について解析した結果を示す。
【図１５】変異型Ａｔｘｎ１−ＫＩマウス（ＫＩ）及びそれと同腹の非トランスジェニックマウス（ＷＴ）を、抗ＲＰＡ１抗体又は抗ＡＴＸＮ１抗体による免疫沈降に供して解析した結果を示す写真である。すなわち、変異型ＡＴＸＮ１は、野生型ＡＴＸＮ１よりも、より強固にＲＰＡ１に結合することを示す写真である。図中、左側上部のパネルは免疫沈降に供する前の前記マウス由来のサンプルにおけるＲＰＡ１の発現をウェスタンブロッティングにより解析した結果を示し、左側下部の該サンプルにおけるＡＴＸＮ１の発現をウェスタンブロッティングにより解析した結果を示す。右側上部のパネルは、マウスＩｇＧ、抗ＲＰＡ１抗体又は抗ＡＴＸＮ１抗体による沈降物（図中、「ＩＰ  Ｍｏｕｓｅ  Ｎｏｒｍａｌ  ＩｇＧ」、「ＩＰ  Ａｎｔｉ−ＲｐＡ１（Ｈ７）」又は「ＩＰ  Ａｎｔｉ−Ａｔｘｎ１（１１ＮＱ）」）におけるＲＰＡ１の発現をウェスタンブロッティングにより解析した結果を示し、右側下部の２パネルは、該沈降物におけるＡＴＸＮ１の発現をウェスタンブロッティングにより解析した結果を示す。
【図１６】プルキンエ細胞におけるＲＰＡ１及びＡＴＸＮ１の共局在について解析した結果を示す顕微鏡写真である。すなわち、変異型Ａｔｘｎ１−ＫＩマウス（１５４Ｑ）のプルキンエ細胞を、ＲＰＡ１及びＢＲＣＡ１を対象として二重染色し、共焦点顕微鏡にて観察した結果、ＲＰＡ１及びＢＲＣＡ１が共局在していることを示す顕微鏡写真である（図中矢印参照）。なお、野生型マウス（ＷＴ）においては、かかる共局在は観察されなかった。
【図１７】皮質神経細胞におけるＢＲＣＡ１及びＡＴＸＮ１の共局在について解析した結果を示す顕微鏡写真である。すなわち、野生型マウス（ＷＴ）及び変異型Ａｔｘｎ１−ＫＩマウス（１５４Ｑ）の大脳皮質（Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｃｏｒｔｅｘ）における神経細胞及び小脳（Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ）のプルキンエ細胞の核において、二重染色の結果、ＢＲＣＡ１及びＡＴＸＮ１は共局在していることを示す顕微鏡写真である。なお、ＡＴＸＮ１と共にＢＲＣＡ１が隔離されている封入体を有する皮質神経細胞がいくつか観察された（図中の矢印参照）。
【図１８】ＢＲＣＡ２及びＡＴＸＮ１の核内における局在について解析した結果を示す顕微鏡写真である。すなわち、ＢＲＣＡ２は主に、野生型マウス（ＷＴ）及び変異Ａｔｘｎ１−ＫＩマウス（１５４Ｑ）のプルキンエ細胞の細胞質に局在していたことを示す顕微鏡写真である。なお、１１ＮＱ抗体により染色されたＡＴＸＮ１の局在と核内におけるＢＲＣＡ２の局在とは一部重なっていた。また、このような部分的な共局在は皮質神経細胞においても同様に観察された。
【図１９】Ａｔｘｎ１−８６Ｑ−ＤｓＲｅｄを発現しているＵ２ＯＳ細胞において、線状ＤＮＡ  ＤＳＢを高エネルギーＵＶＡにより誘導し、線状ＤＮＡ  ＤＳＢ部位におけるＶＣＰ−ＥＧＦＰの蓄積を観察した結果を示す顕微鏡写真である。Ａｔｘｎ１−３３Ｑ−ＤｓＲｅｄ発現細胞と比較した結果、変異型ＡＴＸＮ１（Ａｔｘｎ１−８６Ｑ）を発現している細胞において、ＤＮＡ損傷フォーカスへのＲＰＡ１のリクルートは阻害されていることが明らかになった。
【図２０】図１９に示した結果に関し、マイクロ照射後０〜１０分間における、線状ＤＮＡ  ＤＳＢ部位におけるＥＧＦＰシグナルを定量的に解析した結果を示すグラフである。ＮＦＵは正規化蛍光ユニット（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｕｎｉｔｓ）を示す。
【図２１】変異型ＡＴＸＮ１が発現している運動神経において、ＤＳＢの増加は、Ｈ２１によって染色されたＡＴＸＮ１の影響を受けることなく、ＲＰＡ１／ＲＰＡ７０との共発現によって回復したことを示す顕微鏡写真である。なお、ＤＳＢはγＨ２ＡＶの発現を指標に検出した。
【図２２】図２１に示した結果に関し、運動神経におけるγＨ２Ａｖシグナルを定量化した結果を示すグラフである。すなわち、ＤＳＢにおけるＲＰＡ１／ＲＰＡ７０による回復効果を示すグラフである。
【図２３】ＣＨＫ１／ｇｒｐ又はＲＰＡ１／ＲｐＡ７０とＡＴＸＮ１とにおける遺伝的相互作用について、ＳＣＡ１モデルバエの粗い眼の表現型を指標として解析した結果を示す写真である。この解析には、ＧＳ系統ハエ（図中「ＧＳ−ｇｒｐ」若しくは「ＧＳ−ＲｐＡ７０」）又はＵＡＳ−ＲＮＡｉトランスジェニックハエ（図中「ｇｒｐ−ＲＮＡｉ」若しくは「ＲｐＡ７０−ＲＮＡｉ」）と、ＧＭＲ＞Ａｔｘｎ１−８２Ｑハエ（図中「Ａｔｘｎ１−８２Ｑ  ＋」）とを交配させて得られた産子を対象とした。また、この解析の結果、ＣＨＫ１をノックダウンさせることにより眼の変性状態は改善され、一方、ＣＨＫ１を過剰発現させることにより、眼の変性状態は悪化することが明らかになった。さらに、ＲＰＡ１を過剰発現させることにより眼の変性状態は改善され、一方、ＲＰＡ１をノックダウンさせることにより、眼の変性状態は悪化することが明らかになった。
【図２４】ＲＰＡ１／ＲｐＡ７０及び変異型ＡＴＸＮ１ダブルトランスジェニックバエにおける眼の変性状態の改善を示す写真である。すなわち、光受容細胞において変異ＡＴＸＮ１（Ａｔｘｎ１−８２Ｑ）の発現をＧＭＲによって誘導することによって、眼の変性が生し、粗い眼の表現型を示すことになるが、これら表現型はＲＰＡ１／ＲｐＡ７０を共発現させることによって回復されることを示す写真である。図中、下部のパネルは走査型電子顕微鏡による観察画像（ＳＥＭ画像）を示す。
【図２５】ＲＰＡ１をコードするＡＡＶベクターを小脳に注入したＳＣＡ１モデルマウスにおける、ロータロッド試験の工程を示す概略図である。
【図２６】ＲＰＡ１をコードするＡＡＶベクターを小脳に注入したＳＣＡ１モデルマウス（９週齢）における、ロータロッド試験の結果（平均値±標準偏差）を示すグラフである。図中、横軸は、３日間連続して行ったロータロッド試験の各試験日を示す。縦軸は、６００秒間回転させたロッドにマウスが落下せずに乗っていた時間（１日４回の試験の平均時間）を示す。「ＲＰＡ１」は、ＲＰＡ１をコードするＡＡＶベクターを小脳に注入したＳＣＡ１モデルマウスの結果を示し、「ＧＦＰ  ｏｒ  ｎｏ  ｖｉｒｕｓ」は、ＡＡＶベクターを小脳に注入していないＳＣＡ１モデルマウスとＧＦＰをコードするＡＡＶベクターを小脳に注入したＳＣＡ１モデルマウスとの結果（陰性対照群の結果）を示す。また、「ＲＰＡ１」及び「ＧＦＰ  ｏｒ  ｎｏ  ｖｉｒｕｓ」に併記した括弧内の数は、試験に供した用いた各マウスの数を示す。アスタリスクは、スチューデントのｔ検定（片側検定）においてＰ＜０．０５であることを示す。
【図２７】ＲＰＡ１をコードするＡＡＶベクターを小脳に注入したＳＣＡ１モデルマウス（１３週齢）における、ロータロッド試験の結果を示すグラフである。図中の表記については図２６と同様である。
【図２８】ＲＰＡ１をコードするＡＡＶベクターを小脳に注入したＳＣＡ１モデルマウス（４０週齢）における、ロータロッド試験の結果を示すグラフである。図中の表記については図２６と同様である。
【図２９】ＣＨＫ１阻害剤（ＣＨＩＲ−１２４）を添加した培地にて飼育したＯＫ６＞ＳＣＡ１ハエの生存期間を解析した結果を示すグラフである。生存期間の平均値についての統計解析は、ログランク検定により行った。また、この解析の結果、０．０２ｍｇ／ｍＬのＣＨＩＲ−１２４を添加した培地にて飼育することによって、ＳＣＡ１モデルバエにおける生存期間の短さは改善された（ｐ＝０．０３０４）。
【図３０】抗ＢｒｄＵ抗体（図中「ＢｒｄＵ」）及び抗カルビンディン抗体（図中「Ｃａｌｂｉｎｄｉｎ」）による二重染色（図中「Ｍｅｒｇｅ」）によって、悪化したプルキンエ細胞に取り込まれたＢｒｄＵ由来の弱いシグナルが検出されたことを示す顕微鏡写真である（図中、矢印参照）。なお、カルビンディン由来の強いシグナルが検出される正常なプルキンエ細胞においてはＢｒｄＵ由来のシグナルは検出されない。
【図３１】抗ＢｒｄＵ抗体（図中「ＢｒｄＵ」）及び抗Ｓｏｘ２抗体（図中「Ｓｏｘ２」）による二重染色（図中「Ｍｅｒｇｅ」）によって、プルキンエ細胞層にあるＳｏｘ２陽性バーグマングリアはＲｒｄＵを取り込まないことを示す顕微鏡写真である（図中、矢印参照）。また、抗ＢｒｄＵ抗体及び抗Ｓｏｘ２抗体による二重染色によって、白質においてＢｒｄＵ／Ｓｏｘ２二重陽性細胞が存在していることも観察された（図中、矢印参照））。
【図３２】Ａｔｘｎ１−ＫＩマウスにおける５３ＢＰ１由来のシグナル強度は、バーグマングリアに関しては野生型マウス（ＷＴ）と同程度であり（矢印参照）、プルキンエ細胞においては亢進していたことを示す顕微鏡写真である。
【図３３】抗γＨ２Ａ抗体（図中「γＨ２Ａ」）及び抗Ｓｏｘ２抗体（図中「Ｓｏｘ２」）による二重染色（図中「Ｍｅｒｇｅ」）によって、Ａｔｘｎ１−ＫＩマウスのバーグマングリアにおいてＢｒｄＵ由来のシグナルは検出されなかったことを示す顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
＜脊髄小脳変性症を予防又は治療するための薬剤＞
後述の実施例において示す通り、ＳＣＡ１モデルバエ及びＳＣＡ１モデルマウスにおいて、ＲＰＡ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＮＫＰ、ＸＲＣＣ３、ＸＲＣＣ４、ＣＣＮＨ、ＰＯＬＥ、ＰＯＬＨ又はＰＥＲ１を過剰に発現させることによって、それらの症状が改善されることが明らかになった。したがって、本発明においては、下記（ａ）を少なくとも１の有効成分として含む、脊髄小脳変性症を予防又は治療するための薬剤が提供される。
（ａ）ＲＰＡ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＮＫＰ、ＸＲＣＣ３、ＸＲＣＣ４、ＣＣＮＨ、ＰＯＬＥ、ＰＯＬＨ及びＰＥＲ１からなる群から選択される少なくとも一のタンパク質又は該タンパク質をコードする核酸。
【００４７】
本発明の薬剤の有効成分である（ａ）において、ＲＰＡ１等のタンパク質としては、各々典型例として上述のＲｅｆＳｅｑ  ＩＤによって特定されるタンパク質（野生型タンパク質）である必要はなく、各タンパク質の活性が維持されている限り、人工的に又は非人工的に、アミノ酸が置換、欠失、挿入された変異体であってもよく、修飾が施された修飾体であってもよい。変異体及び修飾体の活性が維持されているかどうかは、後述のスクリーニング方法を利用することにより、判定することができる。
【００４８】
タンパク質の変異体としては、上述の野生型タンパク質において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。ここで「複数」とは、通常、５０アミノ酸以内、好ましくは４０アミノ酸以内、より好ましくは３０アミノ酸以内、さらに好ましくは２０アミノ酸以内、特に好ましくは１０アミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。また、アミノ酸の置換は、好ましくは保存的な置換である。本発明において「保存的な置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。
【００４９】
また、タンパク質の変異体としては、上述の野生型タンパク質をコードする核酸と高ストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸がコードするポリペプチドが挙げられる。高ストリンジェンシーなハイブリダイズの条件として、例えば、０．２ｘＳＳＣ、６５℃という条件が挙げられる。
【００５０】
さらに、タンパク質の変異体としては、上述の野生型タンパク質のアミノ酸配列と８０％以上（例えば、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。配列の相同性は、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸レベル）のプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｐ＆ＢＬＡＳＴ＿ＰＲＯＧＲＡＭＳ＝ｂｌａｓｔｐ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＳＨＯＷ＿ＤＥＦＡＵＬＴＳ＝ｏｎ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅ）を利用し、そのプログラムのデフォルトパラメーターを用いて決定することができる。
【００５１】
また、ＲＰＡ１等に付加されるタンパク質としては、抗体のＩｇＧ部分、血清アルブミン部分等が挙げられる。また、このようなタンパク質は、ＲＰＡ１等のＮ末及びＣ末のいずれか一方又は両方に直接又は間接的に付加することができる。さらに、間接的に付加させる際には、任意のアミノ酸配列からなるリンカーを利用することができる。
【００５２】
修飾としては、例えば、リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰリボシル化、ユビキチン結合、糖化、カルボニル化、ＳＵＭＯ化、並びにポリエチレングルコール、ポリプロピレングリコール及びポリオキシアルキレンのうちの少なくともいずれか一のポリマーとの共有結合が挙げられる。
【００５３】
また、本発明において、核酸の形態としては、ＲＰＡ１等のタンパク質をコードし得るものであればいかなる形態でもよい。すなわち、ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡであるか、ゲノムＤＮＡであるか、化学合成ＤＮＡであるか等を問わない。また、ＲＰＡ１等のタンパク質をコードし得る限り、コドンの縮重に基づく任意の塩基配列を有する核酸が含まれる。
【００５４】
さらに、核酸はベクターに挿入されている形態であってもよい。ベクターとしては、本発明の薬剤の投与対象内において、当該核酸にコードされているタンパク質を発現できるものであればよく、例えば、レンチウィルス、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴（ＡＡＶ）ウィルス、ヘルペスウィルス、センダイウィルス等のウィルスベクター、エピソーマルベクター、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクター、プラスミドベクターが挙げられる。かかるベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、例えば、ＣＡＧプロモータ−、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターが挙げられる。また、ベクターは、プロモーターの他にさらに、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル等を含有していてもよい。
【００５５】
また、このような核酸は、当業者であれば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、制限酵素処理、部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法等の遺伝子増幅技術や遺伝子組換え技術を利用して調製することができる。
【００５６】
そして、このようにして調製した核酸を適当なベクターに挿入し、該ベクターを無細胞タンパク質合成系（例えば、網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液）に導入してインキュベーションすることにより、また該ベクターを適当な細胞（例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞）に導入し、得られた形質転換体を培養することにより、前述のタンパク質を調製することができる。さらに、タンパク質は、公知の方法により精製することができる。このような方法としては、例えば、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロース、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、ゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法が挙げられる。
【００５７】
また、前述のタンパク質及び核酸は、市販の合成機を用い、化学合成することによっても調製することができる。
【００５８】
前述の通り、ＳＣＡ１モデルバエ及びＳＣＡ１モデルマウスにおいて、ＲＰＡ１等を過剰に発現させることによって、それらの症状が改善されることが明らかになった。したがって、本発明においては、下記（ｂ）を少なくとも１の有効成分として含む、脊髄小脳変性症を予防又は治療するための薬剤が提供される。
（ｂ）ＲＰＡ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＮＫＰ、ＸＲＣＣ４、ＸＲＣＣ４、ＣＣＮＨ、ＰＯＬＥ、ＰＯＬＨ及びＰＥＲ１からなる群から選択される少なくとも一のタンパク質の発現又は活性を促進する化合物。
【００５９】
後述の実施例において示す通り、ＲＰＡ１等のタンパク質は、ＤＮＡ修復を通してＳＣＡの病態に関与する。したがって、後述の化合物の抑制の対象となる「活性」とは、ＤＮＡ修復に関する活性を意味する。このような活性には、ＲＰＡ１等が関与するＤＮＡ修復機構において発揮される機能（ＤＮＡ合成活性、ＤＮＡライゲース活性、ヌクレアーゼ活性、トポイソメラーゼ活性、ポリヌクレオチドキナーゼ活性等）のみならず、当該機能を発揮するために必要な、他のタンパク質との結合能、他のタンパク質に対する修飾活性（ユビキチンライゲース活性、プロテインキナーゼ活性等）、修復の対象となるＤＮＡとの結合能等も含まれる。
【００６０】
「ＲＰＡ１等の発現又は活性を促進する化合物」としては、公知の化合物であってもよく、後述のスクリーニングにより同定されるものであってもよい。
【００６１】
また、該化合物の促進の対象となるタンパク質をコードする核酸の塩基配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し、ひいては当該タンパク質のアミノ酸配列においても変異が生じる。したがって、当該タンパク質は上記典型例として挙げているアミノ酸配列からなるタンパク質に各々限定されず、自然界において生じ得る変異体も当該化合物による促進の対象となる。
【００６２】
後述の実施例において示す通り、ＲＰＡ１、ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２と、ＡＴＸＮ１又はその変異体とは結合できることが明らかになった。さらに、変異型ＡＴＸＮ１は、ＤＮＡ損傷後において、ＤＮＡ修復に必要なＲＰＡ１の核内動態を損なわせることにより、ＳＣＡ１の発症、症状の進行に寄与していることも明らかになった。したがって、本発明においては、下記（ｃ）を少なくとも１の有効成分として含む、脊髄小脳変性症を予防又は治療するための薬剤が提供される。
（ｃ）ＲＰＡ１、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２からなる群から選択される少なくとも一のタンパク質と、ＡＴＸＮ１との結合を抑制する化合物。
【００６３】
本発明の薬剤の有効成分である（ｃ）において、ＲＰＡ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２及びＡＴＸＮ１は、上記典型例として挙げているアミノ酸配列からなるタンパク質に各々限定されず、自然界において生じ得る変異体も対象となる。特に、ＡＴＸＮ１に関しては、後述の実施例等において示す通り、ＲＰＡ及びＢＲＣＡ１に対してより強く結合し、これらタンパク質の細胞内動態に影響を与えるという観点から、異常に伸長したポリグルタミン鎖を有するＡＴＸＮ１であることが好ましい。「異常に伸長したポリグルタミン鎖を有するＡＴＸＮ１」としては、ＳＣＡ１の病因となる限り特に制限はないが、通常、３９個以上のグルタミンからなるポリグルタミン鎖を有するＡＴＸＮ１（好ましくは、８２個のグルタミンからなるポリグルタミン鎖を有するＡＴＸＮ１（ＡＴＸＮ１−８２Ｑ）、８６個のグルタミンからなるポリグルタミン鎖を有するＡＴＸＮ１（ＡＴＸＮ１−８６Ｑ）、１５４個のグルタミンからなるポリグルタミン鎖を有するＡＴＸＮ１（ＡＴＸＮ１−１５４Ｑ））である。
【００６４】
「ＲＰＡ１等とＡＴＸＮ１との結合を抑制する化合物」としては特に制限はなく、公知の化合物であってもよく、後述のスクリーニングにより同定される化合物であってもよい。なお、本発明において、ＲＰＡ１等とＡＴＸＮ１との結合の「抑制」は、当該結合の完全な抑制（阻害）のみならず、部分的な抑制も含む意味である。
【００６５】
後述の実施例において示す通り、ＳＣＡ１モデルバエにおいて、ＣＨＫ１、ＬＩＧ３、ＦＥＮ１、ＬＩＧ１、ＥＲＣＣ５、ＸＡＢ２、ＥＲＣＣ２、ＤＭＣ１、ＲＥＣＱＬ５、ＭＵＳ８１、ＥＭＥ１、ＳＰＯ１１又はＢＬＭを過剰に発現させることによって、その症状が悪化されることが明らかになった。さらに、ＣＨＫ１の発現及び活性を、ＣＨＫ１に対するｓｉＲＮＡ及び阻害剤（ＣＨＩＲ−１２４）により各々抑制することによって、ＳＣＡ１モデルバエの症状は改善されることが明らかになった。したがって、本発明においては、下記（ｄ）を少なくとも１の有効成分として含む、脊髄小脳変性症を予防又は治療するための薬剤が提供される。
（ｄ）ＣＨＫ１、ＬＩＧ３、ＦＥＮ１、ＬＩＧ１、ＥＲＣＣ５、ＸＡＢ２、ＥＲＣＣ２、ＤＭＣ１、ＲＥＣＱＬ５、ＭＵＳ８１、ＥＭＥ１、ＳＰＯ１１及びＢＬＭからなる群から選択される少なくとも一のタンパク質の発現又は活性を抑制する化合物。
【００６６】
後述の実施例において示す通り、前記ＲＰＡ１同様に、ＣＨＫ１等のタンパク質もＤＮＡ修復を通してＳＣＡの病態に関与する。したがって、後述の化合物の抑制の対象となる「活性」とは、上述の有効成分（ｂ）同様に、ＤＮＡ修復に関する活性を意味する。
【００６７】
また、本発明において、タンパク質の発現の「抑制」とは、該発現の完全な抑制（阻害）のみならず、部分的な抑制も含む意味である。
【００６８】
本発明の薬剤の有効成分である（ｄ）において、ＣＨＫ１等は、上記典型例として挙げているアミノ酸配列からなるタンパク質に各々限定されず、自然界において生じ得る変異体も対象となる。
【００６９】
「ＣＨＫ１等の発現又は活性を抑制する化合物」としては特に制限はなく、公知の化合物であってもよく、後述のスクリーニングにより同定されるものであってもよい。このような化合物としては、例えば、ＣＨＫ１等に結合する低分子化合物、ＣＨＫ１等をコードする遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ、ＣＨＫ１等に対する抗体、ＣＨＫ１等に対してドミナントネガティブの形質を有するペプチドが挙げられる。
【００７０】
前記低分子化合物として、ＣＨＫ１に関しては、例えば、４−［（（３Ｓ）−１−アザビシクロ［２．２．２］オクト−３−イル）アミノ］−３−（１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル）−６−クロロキノリン−２（１Ｈ）−オン（ＣＡＳ登録番号：４０５１６８−５８−３、ＣＨＩＲ−１２４）及び（Ｓ）−１−（５−ブロモ−４−メチル−２−（モルホリン−２−イルメトキシ）フェニル）−３−（５−メチルピラジン−２−イル）ウレア（ＣＡＳ登録番号：９１１２２２−４５−２、ＩＣ−８３、ＬＹ２６０３６１８）（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００７年、１３巻、２号、５９１〜６０２）ページ  参照）、６−ブロモ−３−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−５−（３Ｒ）−３−ピぺリジニルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミン（ＣＡＳ登録番号：８９１４９４−６３−６、ＳＣＨ９００７７６、ＭＫ−８７７６）、（Ｒ）−α−アミノ−Ｎ−［５，６−ジヒドロ−２−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−６−オキソ−１Ｈ−ピロロ［４，３，２−ｅｆ］［２，３］ベンゾジアゼピン−８−イル］−シクロヘキサンアセトアミド（ＣＡＳ登録番号：９５２０２１−６０−２、ＰＦ−００４７７７３６）、１−（２−（（Ｓ）−ピペリジン−３−イルカルバモイル）−５−（３−フルオロフェニル）チオフェン−３−イル）ウレア（ＣＡＳ登録番号：８６０３５２−０１−８、ＡＺＤ７７６２）、ＸＬ８４４（Ｅｘｉｌｉｘｉｓ社製、２００８  ＥＯＲＴＣ  ポスター＃３９５［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｅｌｉｘｉｓ．ｃｏｍ／ｅｏｒｔｃ／ｐｏｓｔｅｒｓ／ＥＯＲＴＣ０８＿３９５＿ＸＬ８４４−００２．ｐｄｆ］  参照）及び７−ヒドロキシスタウロスポリン（ＣＡＳ登録番号：１１２９５３−１１−４、ＵＣＮ−０１）、並びに、（Ｒ）−Ｎ−（４−（３−アミノピペリジン−１−イル）−５−ブロモ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）ニコチンアミド、（Ｒ）−Ｎ−（４−（３−アミノピペリジン−１−イル）−５−ブロモ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）イソブチルアミド、（Ｒ）−Ｎ−（５−ブロモ−４−（３−（メチルアミノ）ピペリジン−１−イル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）ニコチンアミド、（Ｒ）−Ｎ−（４−（３−アミノピペリジン−１−イル）−５−ブロモ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−５−メチルニコチンアミド、（Ｒ）−Ｎ−（４−（３−アミノピペリジン−１−イル）−５−ブロモ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）シクロプロパンカルボキサミド、（Ｒ）−Ｎ−（４−（３−アミノピペリジン−１−イル）−５−ブロモ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−３−メチル−ブタンアミド及び（Ｒ）−Ｎ−（４−（３−アミノピペリジン−１−イル）−５−ブロモ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−２−シクロプロピルアセトアミド（国際公開第２０１０−１１８３９０号  参照）が挙げられる。
【００７１】
「ＣＨＫ１等をコードする遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ」としては、ＣＨＫ１等のタンパク質をコードする遺伝子の転写産物と相補的な、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｐｉｎ  ＲＮＡ）等のｄｓＲＮＡ（二重鎖ＲＮＡ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡの鎖長としては、標的遺伝子の発現を抑制することができ、かつ、毒性を示さなければ特に制限はなく、例えば、１５〜４９塩基対であり、好適には１５〜３５塩基対であり、さらに好適には２１〜３０塩基対である。ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子の塩基配列と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を有する。配列の同一性は、ＢＬＡＳＴプログラムにより決定することができる。
【００７２】
「ＣＨＫ１等をコードする遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ」の他の態様としては、ＣＨＫ１等をコードする遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡや該転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡ（リボザイム）も挙げられる。
【００７３】
以上のＲＮＡにおいては、その一部又は全部において、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＥＮＡ等の人工核酸によって、ＲＮＡが置換されているものであってもよい。また、これらＲＮＡに関しては、本発明の薬剤の投与対象内において発現させるべく、当該ＲＮＡをコードするＤＮＡを保持する発現ベクターの態様であってもよい。また、このようなＲＮＡは、当業者であれば、市販の合成機等を用い化学合成して調製することができる。
【００７４】
「ＣＨＫ１等に対する抗体」は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、また、抗体の機能的断片であってもよい。抗体には、免疫グロブリンのすべてのクラス及びサブクラスが含まれる。抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、ＣＨＫ１等のタンパク質を特異的に認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、及びこれらの重合体等が挙げられる。また、抗体には、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及びこれら抗体の機能的断片が含まれる。さらに、これら抗体は、必要に応じ、アミノ酸配列の改変、修飾等が施されているものであってもよい。また、このような抗体は、当業者であれば公知の抗体作製方法により適宜調製することができる。
【００７５】
「ＣＨＫ１等に対してドミナントネガティブの形質を有するペプチド」としては、ＤＮＡ修復の際に基質等となるＤＮＡや、ＤＮＡ修復機構を構成する他のタンパク質等との結合に関して、ＣＨＫ１等のタンパク質上の結合部位と競合するようなポリペプチド（例えば、ＣＨＫ１等のタンパク質の部分ペプチド）等が挙げられる。
【００７６】
本発明の薬剤は、上記（ａ）〜（ｄ）に記載の化合物の他、薬理学上許容される担体又は媒体を含有してもよい。担体又は媒体としては、例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体又は媒体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。さらに、核酸又はタンパク質等を細胞に導入するための担体も、本発明の薬剤に含有されていてもよい。担体としては、カチオン性リポソーム等の正電荷を有する物質や、新油性物質（コレステロール及びその誘導体、脂質（例えば、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質等）、ビタミンＥ（トコフェロール）等のビタミン類）が挙げられる。また、本発明の薬剤は、ＳＣＡの治療又は予防に用いられる公知の医薬品と併用してもよい。
【００７７】
本発明の薬剤は、ヒトを含む動物を対象として使用することができる。ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物等を対象とすることができる。また、本発明の薬剤の好適な対象疾患は、脊髄小脳変性症１型（ＳＣＡ１）である。ＳＣＡ１は、アタキシン１（ＡＴＸＮ１）遺伝子中にあるグルタミンをコードするＣＡＧトリヌクレオチドがリピートし、伸長することによって引き起こされる疾患を意味する。また、ＣＡＧトリヌクレオチドのリピート数としては特に制限はないが、通常３９リピート以上である。
【００７８】
本発明の薬剤の投与形態としては特に制限はなく、例えば、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、気道内投与、直腸投与及び筋肉内投与、輸液による投与、標的部位（小脳、脳幹、脊髄等）への直接投与が挙げられるが、治療効果が高く、また投与する薬剤の量が抑えられるという観点から、標的部位に直接投与することが好ましい。標的部位への投与は、例えば、カニューレ（カテーテル）、切開術、ドラッグデリバリーシステム、注射等を用いて行うことができ、より具体的には、定位脳手術方法によってカニューレ等を挿入し、当該カニューレを通じて本発明の薬剤を脳内に投与する方法、開頭し、本発明の薬剤を入れた徐放系ドラッグデリバリーシステム（例えば、ＡＬＺＥＴ社製の浸透圧ポンプ）を脳内に埋め込む方法、本発明の薬剤を電気穿孔法により脳内の細胞に導入する方法が挙げられる。また、後述の実施例において示す通り、本発明の薬剤がウィルスベクターの形態をとる場合には、該薬剤を標的部位に直接注入することもできる。
【００７９】
また、本発明の薬剤を脳内に直接投与しない場合には、上記（ａ）〜（ｄ）に記載の化合物に脳関門透過物質を結合させて投与する方法を利用してもよい。なお、脳関門透過物質としては、例えば、狂犬病ウィルス由来の２９アミノ酸からなる糖タンパク質（Ｎａｔｕｒｅ、２００７年７月５日、４４８巻、３９〜４３ページ  参照）が挙げられるが、これに制限されない。
【００８０】
本発明の薬剤の投与量及び投与回数は、有効成分とする化合物の種類、目的とする効果、患者の年齢や体重等に応じて適宜調節することができ、投与回数は投与量、投与経路等に応じて適宜調節することができる。
【００８１】
本発明は、このように、本発明の薬剤を対象に投与することを特徴とする、対象の脊髄小脳変性症（ＳＣＡ）を治療又は予防する方法をも提供するものである。
【００８２】
本発明の薬剤の製品又はその説明書は、ＳＣＡを治療又は予防するために用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品又は説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装等に表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物等に表示を付したことを意味する。
【００８３】
＜脊髄小脳変性症を予防又は治療するための候補化合物のスクリーニング方法１＞
後述の実施例において示す通り、ＳＣＡ１の病因となるＡＴＸＮ１は、ＲＰＡ１、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２と結合することにより、ＤＮＡ修復過程におけるＲＰＡ１等の機能又は細胞内動態に悪影響を与え、ひいてはＳＣＡの発症、進行に寄与することが明らかになった。したがって、かかる知見に基づき、本発明は、下記スクリーニング方法を提供することができる。
【００８４】
下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、脊髄小脳変性症を予防又は治療するための候補化合物のスクリーニング方法
（ａ）被検化合物の存在下で、ＲＰＡ１、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２からなる群から選択される少なくとも一のタンパク質と、ＡＴＸＮ１とを接触させる工程、
（ｂ）ＲＰＡ１、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２からなる群から選択される少なくとも一のタンパク質と、ＡＴＸＮ１との結合を検出する工程、
（ｃ）前記結合を抑制する化合物を選択する工程。
【００８５】
本発明のスクリーニング方法において使用する被検化合物としては特に制限はなく、例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液及び培養上清、精製又は部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物又は動物由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーが挙げられる。
【００８６】
また、このスクリーニング方法において用いられる、ＲＰＡ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２及びＡＴＸＮ１は、上述の本発明の薬剤の有効成分（ｃ）に関する記載の通りであるが、結合の検出のし易さという観点から、これらタンパク質には、レポータータンパク質（例えば、ＧＦＰ、ルシフェラーゼ）、精製用タグタンパク質（例えば、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグ）等が付加されていてもよい。また、ＲＰＡ１等とＡＴＸＮ１との結合が損なわれない限り、これらタンパク質は部分ペプチドであってもよい。
【００８７】
（ａ）の工程において、互いに結合するＲＰＡ１等とＡＴＸＮ１とを被検化合物存在下で接触させるが、接触は、被検化合物の非存在下において、ＲＰＡ１等とＡＴＸＮ１との結合が抑制されない条件下で行われればよい。
【００８８】
（ｂ）の工程において、ＲＰＡ１等とＡＴＸＮ１との結合を検出するが、結合の検出は特に制限されることはなく、公知の手法を適宜採用することができる。例えば、免疫共沈降法、酵母ツーハイブリッドシステム、ＥＬＩＳＡ法、表面プラズモン共鳴現象を利用した検出装置（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（ＧＥヘルスケア社製））を用いた方法、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した方法を採用することができる。
【００８９】
（ｃ）の工程において、前記結合を抑制する化合物を選択するが、例えば、免疫共沈降法を用いた場合においては、被検化合物存在下で、ＡＴＸＮ１をその特異的な抗体によって沈降させた際に共沈してくるＲＰＡ１等の量と、被検化合物非存在下におけるＲＰＡ１等の量（対照値）とを比較することにより評価することができる。すなわち、被検化合物存在下におけるＲＰＡ１等の量が被検化合物非存在下の量と比較して低い場合（例えば、対照値の８０％以下、５０％以下、３０％以下の場合）には、該被検化合物を、脊髄小脳変性症を予防又は治療するための候補化合物と評価することができる。前記結合の検出において免疫沈降法以外の方法を用いる場合も同様に、被検化合物非存在下における前記結合の程度を対照値として用いて評価することができる。
【００９０】
＜脊髄小脳変性症を予防又は治療するための候補化合物のスクリーニング方法２及び３＞
後述の実施例において示す通り、ＲＰＡ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＮＫＰ、ＸＲＣＣ３、ＸＲＣＣ４、ＣＣＮＨ、ＰＯＬＥ、ＰＯＬＨ又はＰＥＲ１の発現を亢進させることによって、ＳＣＡの病態を改善できることが明らかになった。したがって、かかる知見に基づき、本発明は、下記スクリーニング方法を提供することができる。
【００９１】
下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、脊髄小脳変性症を予防又は治療するための候補化合物のスクリーニング方法
（ａ）ＲＰＡ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＮＫＰ、ＸＲＣＣ３、ＸＲＣＣ４、ＣＣＮＨ、ＰＯＬＥ、ＰＯＬＨ及びＰＥＲ１からなる群から選択される少なくとも一のタンパク質の発現又は活性を検出しうる系に被検化合物を適用させる工程、
（ｂ）該タンパク質の発現又は活性を促進する化合物を選択する工程。
【００９２】
一方、後述の実施例において示す通り、ＣＨＫ１、ＬＩＧ３、ＦＥＮ１、ＬＩＧ１、ＥＲＣＣ５、ＸＡＢ２、ＥＲＣＣ２、ＤＭＣ１、ＲＥＣＱＬ５、ＭＵＳ８１、ＥＭＥ１、ＳＰＯ１１又はＢＬＭの発現を亢進させることによって、ＳＣＡの病態は悪化することが明らかになった。さらに、ＣＨＫ１の発現又は活性を抑制することによって、ＳＣＡの病態は改善することも明らかになった。したがって、かかる知見に基づき、本発明は、下記スクリーニング方法も提供することができる。
【００９３】
下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、脊髄小脳変性症を予防又は治療するための候補化合物のスクリーニング方法
（ａ）ＣＨＫ１、ＬＩＧ３、ＦＥＮ１、ＬＩＧ１、ＥＲＣＣ５、ＸＡＢ２、ＥＲＣＣ２、ＤＭＣ１、ＲＥＣＱＬ５、ＭＵＳ８１、ＥＭＥ１、ＳＰＯ１１及びＢＬＭからなる群から選択される少なくとも一のタンパク質の機能を検出しうる系に被検化合物を適用させる工程、
（ｂ）該タンパク質の発現又は活性を抑制する化合物を選択する工程。
【００９４】
これら本発明のスクリーニング方法の２つの態様において、使用する被検化合物としては特に制限はなく、前述の例が挙げられる。また、これらスクリーニング方法において用いられる、ＲＰＡ１等及びＣＨＫ１等は、各々上述の本発明の薬剤の有効成分（ｂ）及び（ｄ）に関する記載の通りである。
【００９５】
これらスクリーニング方法の（ａ）の工程において用いられる「タンパク質の発現を検出しうる系」としては、例えば、各タンパク質をコードする遺伝子のプロモータ―領域の下流にレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子等）が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞又はその細胞からの抽出液が挙げられる。ここで「機能的に結合した」とは、各遺伝子のプロモータ―領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、各遺伝子のプロモーター領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。そして、当該系に被検化合物を適用させ、レポーター遺伝子がコードするタンパク質の活性（ルシフェラーゼによる発光、クロラムフェニコールによるアセチル化、ＧＦＰタンパク質の蛍光等）を測定し、被検化合物の非存在下で検出した場合と比較して、検出される当該活性が高ければ、被検化合物は、各タンパク質の発現を促進する活性を有すると評価され、一方当該活性が低ければ、被検化合物は、各タンパク質の発現を抑制する活性を有すると評価されることになる。
【００９６】
「タンパク質の発現を検出しうる系」の態様としては、前記レポーター系以外に、各タンパク質の発現を直接的に検出する系も挙げられる。当該系に関しては、各タンパク質を発現する細胞に被検化合物を適用させ、前記細胞における各タンパク質の発現を検出する。そして、被検化合物の非存在下で検出した場合と比較して、検出される各タンパク質の発現が高ければ、被検化合物は、各タンパク質の発現を促進する活性を有すると評価され、一方当該発現が低ければ、被検化合物は、各タンパク質の発現を抑制する活性を有すると評価されることになる。タンパク質の発現の検出に関し、タンパク質自体の発現を検出する場合には、ＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング法、免疫沈降法等を用いることができる。また、タンパク質の発現を転写レベルの遺伝子発現を通して検出する場合には、ノーザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ドットブロッティング法等を用いることができる。
【００９７】
また、これらスクリーニング方法の（ａ）の工程において用いられる「タンパク質の活性を検出しうる系」は、当業者であれば、指標とするタンパク質のＤＮＡ修復における活性、及び当該活性の評価、測定方法についての情報を、文献データベース等（例えば、ＰｕｂＭｅｄ［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ］）から適宜入手して参照しながら、構築することができる。かかる評価（測定）の例としては以下の通りである。
【００９８】
指標とするタンパク質がＲＰＡ１である場合には、例えば、該タンパク質の一本鎖ＤＮＡへの結合を検出することによって、該タンパク質の活性を評価（測定）することができる（Ｎａｔｕｒｅ、１９９７年１月９日、３８５巻、６６１２号、１７６〜１８１ページ  参照）。
【００９９】
指標とするタンパク質がＢＲＣＡ１である場合には、例えば、該タンパク質のＥ３ユビキチンライゲース活性を検出することによって、該タンパク質の活性を評価（測定）することができる（ＥＭＢＯ  Ｊ．、２００２年１２月１６日、２１巻、２４号、６７５５〜６７６２ページ  参照）。
【０１００】
指標とするタンパク質がＢＲＣＡ２である場合には、例えば、該タンパク質のＲＡＤ５１又はＰＡＬＢ２への結合を検出することによって、該タンパク質の活性を評価（測定）することができる（Ｎａｔｕｒｅ、２００５年３月３１日、４３４巻、７０３３号、５９８−６０４ページ、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ、２００６年６月２３日、２２巻、６号、７１９〜７２９ページ  参照）。
【０１０１】
指標とするタンパク質がＰＮＫＰである場合には、例えば、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）を基質にしたポリヌクレオチドキナーゼ活性を検出することによって、該タンパク質の活性を評価（測定）することができる（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、１９９９年８月２０日、２７４巻、３４号、２４１７６〜２４１８６ページ  参照）。
【０１０２】
指標とするタンパク質がＸＲＣＣ３である場合には、例えば、該タンパク質とＲＡＤ５１との結合を検出することによって、該タンパク質の活性を評価（測定）することができる（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ、１９９８年５月、１巻、６号、７８３〜７９３ページ  参照）。
【０１０３】
指標とするタンパク質がＸＲＣＣ４である場合には、例えば、該タンパク質とライゲース４との結合、及び該タンパク質のＤＮＡ結合を検出することによって、該タンパク質の活性を評価（測定）することができる（Ｃｅｌｌ、１９９５年１２月２９日、８３巻、７号、１０７９〜１０８９ページ  参照）。
【０１０４】
指標とするタンパク質がＣＣＮＨである場合には、例えば、該タンパク質とＣＤＫ７との結合を検出することによって、該タンパク質の活性を評価（測定）することができる（Ｎａｔｕｒｅ、１９９５年３月１６日、３７４巻、６５１９号、２８３〜２８７ページ  参照）。
【０１０５】
指標とするタンパク質がＰＯＬＥである場合には、例えば、該タンパク質のＤＮＡ合成活性を検出することによって、該タンパク質の活性を評価（測定）することができる（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９０年９月、８７巻、１７号、６６６４〜６６６８ページ  参照）。
【０１０６】
指標とするタンパク質がＰＯＬＨである場合には、例えば、該タンパク質のＤＮＡ合成活性若しくは該タンパク質とＲＡＤ５１との結合を検出することによって、該タンパク質の活性を評価（測定）することができる（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ、２００５年１２月９日、２０巻、５号、７８３〜７９２ページ  参照）。
【０１０７】
指標とするタンパク質がＰＥＲ１である場合には、例えば、該タンパク質とＡＴＭ又はＣＨＫ２との結合を検出することによって、該タンパク質の活性を評価（測定）することができる（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ、２００６年５月５日、２２巻、３号、３７５〜３８２ページ  参照）。
【０１０８】
指標とするタンパク質がＣＨＫ１である場合には、例えば、該タンパク質によるＣＤＣ２５Ａのリン酸化、又はそのリン酸化によって誘導されるＣＤＣ２５Ａの分解を検出することによって、該タンパク質の活性を評価（測定）することができる（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００年５月２６日、２８８巻、５４７０号、１４２５〜１４２９ページ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００２年１１月１２日、９９巻、２３号、１４７９５〜１４８００ページ  参照）。
【０１０９】
指標とするタンパク質がＬＩＧ３である場合には、例えば、該タンパク質のライゲ―ション活性を検出することによって、該タンパク質の活性を評価（測定）することができる（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１９９５年６月、１５巻、６号、３２０６〜３２１６ページ  参照）。
【０１１０】
指標とするタンパク質がＦＥＮ１である場合には、例えば、５’末端突出構造を有する二本鎖ＤＮＡを基質とした、該タンパク質によるフラップ構造の除去活性を検出することによって、該タンパク質の活性を評価（測定）することができる（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１９９５年１月１日、２５巻、１号、２２０〜２２５ページ  参照）。
【０１１１】
指標とするタンパク質がＬＩＧ１である場合には、例えば、該タンパク質のライゲ―ション活性を検出することによって、該タンパク質の活性を評価（測定）することができる（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９０年９月、８７巻、１７号、６６７９〜８３ページ  参照）。
【０１１２】
指標とするタンパク質がＥＲＣＣ５である場合には、例えば、バブル構造を有する部分的二本鎖ＤＮＡを基質とし、該タンパク質のエンドヌクレアーゼ活性を検出することによって、該タンパク質の活性を評価（測定）することができる（Ｎａｔｕｒｅ、１９９４年９月２９日、３７１巻、６４９６号、４３２〜４３５ページ  参照）。
【０１１３】
指標とするタンパク質がＸＡＢ２である場合には、例えば、該タンパク質とＸＰＡ、ＣＳＡ、ＣＳＢ又はＲＮＡポリメラーゼＩＩとの相互作用を検出することによって、該タンパク質の活性を評価（測定）することができる（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２０００年１１月１０日、２７５巻、４５号、３４９３１〜３４９３７ページ  参照）。
【０１１４】
指標とするタンパク質がＥＲＣＣ２である場合には、例えば、該タンパク質とｐ４４との結合、又は該結合によって誘導される５’→３’ヘリケース活性を検出することによって、該タンパク質の活性を評価（測定）することができる（Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．、１９９８年１０月、２０巻、２号、１８４〜１８８ページ  参照）。
【０１１５】
指標とするタンパク質がＤＭＣ１である場合には、例えば、該タンパク質の一本鎖ＤＮＡ若しくは二本鎖ＤＮＡのギャップ構造への結合、又は該タンパク質とＲＡＤ５１との結合を検出することによって、該タンパク質の活性を評価（測定）することができる（ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９９９年、１１月１５日、１８巻、２２号、６５５２〜６５６０ページ  参照）。
【０１１６】
指標とするタンパク質がＲＥＣＱＬ５である場合には、例えば、該タンパク質とＲＡＤ５１との結合を検出することによって、該タンパク質の活性を評価（測定）することができる（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、２００７年１２月１日、２１巻、２３号、３０７３〜３０８４ページ  参照）。
【０１１７】
指標とするタンパク質がＭＵＳ８１又はＥＭＥ１である場合には、例えば、ＭＵＳ８１及びＥＭＥ１からなる複合体が有するエンドヌクレアーゼ活性を検出することによって、該タンパク質の活性を評価（測定）することができる（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２００３年６月１３日、２７８巻、２４号、２１７１５〜２１７２０ページ  参照）。
【０１１８】
指標とするタンパク質がＳＰＯ１１である場合には、例えば、該タンパク質のタイプ２トポイソメラーゼ活性を検出することによって、該タンパク質の活性を評価（測定）することができる（Ｎａｔｕｒｅ、２００５年８月１８日、４３６巻、７０５３号、１０５３〜１０５７ページ  参照）。
【０１１９】
指標とするタンパク質がＢＬＭである場合には、例えば、該タンパク質とトポイソメラーゼIIIαとの結合を検出することによって、該タンパク質の活性を評価（測定）することができる（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２０００年３月３１日、２７５巻、１３号、９６３６〜９６４４ページ、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．、２００１年６月１日、１０巻、１２号、１２８７〜１２９８ページ  参照）。
【０１２０】
そして、このようにして得られた評価（測定）の結果に関し、被検化合物を適用させて検出した場合と被検化合物の非存在下で検出した場合とを比較することによって、当業者であれば、指標とする各タンパク質の活性の種類に応じ、当該被検化合物が当該タンパク質の活性を促進する化合物であるのか、又は抑制する化合物であるのかを判断することができる。
【０１２１】
なお、上記系への被検化合物の「適用」は、例えば、系が細胞である場合には、該細胞と被検化合物との接触、該細胞への被検化合物の導入等により行うことができる。また、系が細胞からの抽出液である場合には、該抽出液への添加により行うことができる。
【０１２２】
また、本発明のスクリーニング方法においては、上述のスクリーニング方法１、２又は３によって選択された化合物をＳＣＡモデル動物に投与し、そのモデル動物の症状の回復を指標として、脊髄小脳変性症を予防又は治療するための候補化合物をさらに絞り込むこともできる。ＳＣＡモデル動物としては、後述の実施例に示すように、例えば、ＳＣＡの原因遺伝子（ＡＴＸＮ１−８２Ｑ、ＡＴＸＮ１−８６Ｑ、ＡＴＸＮ１−１５４Ｑ等）を導入した動物（ショウジョウバエ、線虫、マウス、マーモセット等）が挙げられる。
【実施例】
【０１２３】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、本実施例において用いた実験方法等は以下の通りである。【０１２４】
＜ショウジョウバエについての免疫組織化学的解析＞
雌のショウジョウバエ成体から吻、羽、脚及び腹部を除去し、残った頭部及び胸部を、４％パラホルムアルデヒド含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に浸漬し、氷上にて３０分間固定した。固定したハエは、３０％スクロース含有ＰＢＳ中に、４℃にて一晩以上保管した。次に、頭部をドライアイス／ｎ−ヘキサンにて凍結させた後、クライオスタットミクロトームにて１０ｍｍ間隔の横断面を作製し、抗ヒストンＨ２Ａｖ  ｐＳｅｒ１３７抗体（Ａｃｒｉｓ社製、カタログ番号：ＡＰ０９３０７ＰＵ−Ｎ、ウサギ由来、２００分の１に希釈して使用）又は抗アタキシン−１（Ｈ２１）抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製、ヤギ由来、１００分の１に希釈して使用）と、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識二次抗体又はＣｙ５−標識二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社製、５０分の１に希釈して使用）とを用いて染色した。なお、全ての試料は、ＤＮＡ蛍光標識用の封入剤（製品名：ＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）に封入し、解析に供した。【０１２５】
＜マウスについての免疫組織化学的解析＞
Ａｔｘｎ１−１５４Ｑ−ＫＩ（ノックイン）ヘテロ接合体マウス（３２週齢）の新鮮な脳を、４％パラホルムアルデヒド含有リン酸緩衝液にて固定し、パラフィンにて包埋した。それら脳から調製した切片（厚さ：５〜１０μｍ）をキシレンに浸して脱パラフィンし、さらにエタノールにて段階的に再水和した。次いで、切片を１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に浸け、電子レンジにて３回煮沸させた後、３０分間室温にて保持した。非特異的な結合を防ぐため、１％ウシ血清アルブミン及び０．０１％（Ｖ／Ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有ＰＢＳにて３０分間インキュベーションした。このようにして調製したサンプルを１次抗体とともに４℃にて一晩インキュベーションした後、室温にて二次抗体とともに１時間インキュベーションした。次に、ＤＡＰＩにて２分間処理した後、脳由来のサンプルにフルオロマウントを載せ、さらにカバースリップにて覆った。そして、このようにして調製したサンプル中の細胞を、共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製、ＬＳＭ５１０）にて視覚化した。【０１２６】
なお、免疫組織化学的解析に用いた一次抗体とそれら抗体の希釈条件は以下の通りである。
抗ＣＡＧ抗体（ＨＤ１、ウサギ由来、Ｄｒ．Ｗａｎｋｅｒから提供を受けたもの、１００分の１に希釈して使用）、
抗Ａｔｘｎ１抗体（１１ＮＱ、クローンＮ７６／８、マウス由来、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、１００分の１に希釈して使用）、
抗ＲｐＡ１抗体（Ｈ−７、ウサギ由来、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、１００分の１に希釈して使用）、
抗ＲｐＡ１抗体（マウスモノクローナル抗体、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、１００分の１に希釈して使用）、
抗ＢＲＣＡ１抗体（Ｃ−２０、ウサギ由来、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、１００分の１に希釈して使用）、
抗ＢＲＣＡ２抗体（ａｂ１２３４９１、ウサギ由来、Ａｂｃａｍ社製、１００分の１に希釈して使用）、
抗Ｈ２ＡＸ  抗体（Ｓｅｒ１３９、マウス由来、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  社製、５００分の１に希釈して使用）。【０１２７】
また、免疫組織化学的解析に用いた二次抗体とそれら抗体の希釈条件は以下の通りである。
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識抗マウス抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製、１０００分の１に希釈して使用）、
Ｃｙ３標識抗ウサギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製、１０００分の１に希釈して使用）。【０１２８】
＜ショウジョウバエについての免疫ブロッティング分析＞
ウェスタンブロット用のサンプルを調製するため、６２．５ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、２．５％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、５％（ｖ／ｖ）グリセリン及び０．００２５％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルーからなる溶解用緩衝液５０μＬに、雌のハエ２５匹を溶かした。そして、得られたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分画した後、イモビロン−Ｐトランスファーメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に、セミドライ法により転写した。次に、そのメンブレンを、５％ミルク含有Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）（１０ｍＭＴｒｉｓ／Ｃｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）にてブロッキング処理に施し、４℃にて一晩、一次抗体とともにインキュベーションした。免疫ブロッティング分析に用いた一次抗体とそれら抗体の希釈条件は以下の通りである。
マウス抗ＲＰＡ−７０（Ｈ−７、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製、２００分の１に希釈して使用）、
マウス抗アクチン（Ｃ４、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製、１０００分の１に希釈して使用）。【０１２９】
次に、前記メンブレンを、西洋ワサビぺルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を１００００分の１に希釈したものとともに、室温にて１時間インキュベーションした。そして最後に、増強化学発光ＷＢ検出システム（ＥＣＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にて、目的とする分子を視覚化した。【０１３０】
＜初代神経細胞についての免疫ブロッティング分析＞
ウェスタンブロッティング用のサンプルを調製するため、後述のプラスミドＤＮＡを導入してから４日間培養した小脳顆粒神経細胞を回収した。回収した神経細胞サンプルを、氷冷ＰＢＳにて３回洗浄し、６２．５ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、２．５％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール及び５％（ｖ／ｖ）グリセリンからなる溶解用緩衝液に溶かした。このようにして調製した溶液中のタンパク質の濃度は、マイクロＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を用い、ＢＣＡ法にて定量した。【０１３１】
免疫ブロッティング分析の際の、一次及び二次抗体、並びにそれらの希釈条件は以下の通りである。
マウス抗リン酸化ヒストンＨ２ＡＸ（γＨ２ＡＸ）（Ｓｅｒ−１３９、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、７５０分の１に希釈して使用）、
抗マウスポリグルタミン（ＩＣ２）抗体（ＭＡＢ１５７４、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製、２０００分の１に希釈して使用）、
抗ヤギＡｔｘｎ１抗体（Ｈ−２１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、１０００分の１に希釈して使用）、
マウス抗グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ抗体（ＧＡＰＤＨ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、１００００分の１に希釈して使用）、
西洋ワサビぺルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）、
ＨＲＰ標識抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｄａｋｏ社製、３０００分の１に希釈して使用）。
なお、各抗体の希釈は、５％スキムミルク含有ＴＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ−２０含有トリス緩衝食塩水）にて行った。【０１３２】
＜ハエのストックと養育条件＞
全てのハエは、コーンミール培地（９．２％コーンミール、３．８５％酵母、３．８％スクロース、１．０５％酒石酸カリウム、０．０９％塩化カルシウム、７．６％グルコース、２．４１６％ニパギン及び１％アガー）にて育てた。また、特に断りのない限り、全てのハエは、２５℃、湿度６０％±１０％、１２時間毎の明暗周期下にて維持した。【０１３３】
後述のＧＳ系統バエは、京都のショウジョウバエ遺伝資源センターより入手した。なお、トランスジェニックバエｈＡｔｘｎ１−８２Ｑ（ｙ１ｗ１１１８ＵＡＳ：Ａｔｘｎ１−８２Ｑ）、ＵＡＳ−ｍＫｕ７０及びＯＫ６−Ｇａｌ４、並びにそれらの遺伝的コントロール株Ｃａｎｔｏｎｉｓｅｄ  ｗ１１１８株ｗ（ＣＳ１０）は、非特許文献１９及び４４の記載を参照のこと。また、Ｃａｎｔｏｎｉｓｅｄ  ｗ１１１８株ｗ（ＣＳ１０）は、全てのトランスジェニックバエの親株である。また、ＲＮＡｉ系統  ＲｐＡ７０（９６３３Ｒ−３）及びｇｒｐ（１７１６１Ｒ−２）は、三島の国立遺伝学研究所から入手した。【０１３４】
各交配用の処女雌の回収は羽化後８時間以内に行い、交配に用いる迄の３〜４日間各バイアルあたり最大数２０匹になるよう維持した。【０１３５】
後述の生存期間に関する実験においては、ｙ１ｗ１１１８ＵＡＳ−Ａｔｘｎ１−８２Ｑ／＋；＋／ＯＫ６−ＧＡＬ４；＋／＋の遺伝型のハエを陽性対照とし、ｙ１ｗ１１１８ＵＡＳ−Ａｔｘｎ１−８２Ｑ／＋；＋／＋；＋／＋及び＋／＋；＋／ＯＫ６−ＧＡＬ４；＋／＋の遺伝型のハエを陰性対照とした。また、全てのハエは処女雌を用いた。【０１３６】
＜ＤＮＡ損傷修復遺伝子を対象とした、ＳＣＡの病態に寄与する因子のスクリーニング方法＞
先ず、後述のスクリーニングの対象とする、ヒトＤＮＡ損傷修復遺伝子のショウジョウバエにおける相同遺伝子を抽出した。すなわち、ＤＮＡ損傷修復に関する利用可能なショウジョウバエ相同遺伝子を抽出するため、最新のヒトＤＮＡ修復遺伝子に関する包括的なリスト（テキサス州立大学ＭＤアンダーソンがんセンターのＷｏｏｄ  ＲＤらにより公開されているヒトＤＮＡ修復遺伝子に関するリスト（ｈｔｔｐ：／／ｓｃｉｅｎｃｅｐａｒｋ．ｍｄａｎｄｅｒｓｏｎ．ｏｒｇ／ｌａｂｓ／ｗｏｏｄ／ｄｎａ＿ｒｅｐａｉｒ＿ｇｅｎｅｓ．ｈｔｍｌ）において入手可能なヒトＤＮＡ修復遺伝子）と、ＮＣＢＩ  ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅとを比較した。【０１３７】
次に、前記ＤＮＡ損傷修復に関するショウジョウバエ相同遺伝子について、ＦｌｙＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｆｌｙｂａｓｅ．ｏｒｇ／）を検索し、当該遺伝子を過剰発現させたショウジョウバエを、ショウジョウバエ遺伝資源センターが提供しているジーンサーチ（ＧＳ）システムによって作製された変異体群から選択することにより用意した。【０１３８】
なお、ＧＳシステムは、ショウジョウバエにおいて遺伝子を効率的に検出し、迅速に分子を同定するための方法であり、該方法において、Ｐ因子を基にするＧＳベクターは、ＵＡＳ、コアプロモーター及びマーカー遺伝子「ミニホワイト」を有し、ショウジョウバエゲノムにランダムに挿入されることになる。そして、標的遺伝子（本スクリーニングにおいては、ＤＮＡ修復遺伝子）の側にＰ因子が挿入され、そのＰ因子が挿入されたＧＳ系統のトランスジェニックバエとＧＡＬ４ドライバーを有するハエとを交配させることによって、その遺伝子の過剰発現が引き起こされているハエを得ることができる（Ｔｏｂａ，Ｇ．ら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９９年、１５１巻、７２５〜７３７ページ  参照）。【０１３９】
そのために、前記ＧＳ系統と交配させるＳＣＡ１モデルバエは、ＳＣＡ１の病因であるヒトＡｔｘｎ１８２Ｑ（ｈＡｔｘｎ１８２Ｑ）遺伝子のみならず、ＯＫ６−ＧＡＬ４ドライバーをも導入し、調製した。【０１４０】
そして、このようにして調製した前記ＧＳ系統と、ＳＣＡ１モデルバエとを交配して得られたショウジョウバエについて、ＳＣＡ１の病態の一つである生存期間の短さを指標としてスクリーニングを行った。【０１４１】
すなわち、生存期間に関する実験は、２５℃、湿度６０±１０％、１２時間毎の明暗周期下、最終世代を創出するために用いた同じコーンミール培地にて行った。また、実験に供したハエは、選択を目的とし、それらが生まれた日にのみエーテル麻酔をかけた。さらに、１バイアルあたり２０匹になるようハエを維持し、２〜３日毎に新しい培地に移した。そして、２〜３日毎に死んだハエを数えながら除去し、この実験を独立して２〜３回行った。なお、逃げたハエは実験の対象外として除外した。また、このようにして得られたデータに基づき、生存期間の中央値及び平均値を算出し、当該数値を指標として、前記ＤＮＡ損傷修復遺伝子がＳＣＡの病態に与える影響の有無について評価した。【０１４２】
＜システム生物学的解析＞
後述のシステム生物学的解析は、ヒトデータベースに基づくインジェヌイティー−ＩＰＡソフトウェア（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．社製）を用いて行った。なお、経路探索分析（最短＋１（ｓｈｏｒｔｅｓｔ＋１））において、２遺伝子が同様の新規分子とつながりをもった際に、新規経路が現れることになる。【０１４３】
また、前述のインビボスクリーニングで見出された遺伝子を高頻度で含むシグナル伝達経路を推定するため、インビボスクリーニングで見出された遺伝子及び経路探索分析についてコア分析を行った。さらに、ｑ値を算出するため、Ｂ−Ｈ多重検定補正とともにフィッシャーの正確確率検定を行うことによって、エンリッチメント解析を行った。なお、コア分析を行うため、タンパク質間相互作用（ＰＰＩ）に関する有名な８つのデータベース（ＢＩＮＤ、ＢＩＯＧＲＩＤ、Ｃｏｇｎｉａ、ＤＩＰ、ＩＮＴＡＣＴ、Ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ、ＭＩＮＴ及びＭＩＰＳ）と、研究論文に基づくインジェヌイティーのオリジナルデータベース「間接的相互作用」（ｍｉＲｅｃｏｒｄｓ、ＴａｒＢａｓｅ、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ  Ｈｕｍａｎ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ、Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ、ＧＶＫ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＫＥＧＧ、ｍｉＲＢａｓｅ、ＭＧＤ、Ｏｂｅｓｉｔｙ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｐ  Ｄａｔａｂａｓｅ）とを用いた。【０１４４】
＜プラスミドの調製＞
ｐＤｓＲｅｄ−モノマーＣ１、Ａｔｘｎ１−８６Ｑ−ｐＤｓＲｅｄ、ｍｙｃ−Ａｔｘｎ１−３３Ｑ及びｍｙｃ−Ａｔｘｎ１−８６Ｑについては、Ｆｕｊｉｔａ，Ｋ．ら、Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ、２０１３年、４、１８１６  参照のこと。【０１４５】
ＥＧＦＰ−ＲｐＡ１構築のため、Ｂ６野生型マウス胎児脳由来のＲＮＡを用い、ＲｐＡ１全長をコードするｃＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅し、ｐＬＶＳＩＮ−ＣＭＶ−ｐｕｒ（Ｔａｋａｒａ社製）のＥｃｏＲＩ認識部位とＸｈｏＩ認識部位との間に挿入し、サブクローニングした。また、前記同様に、前記ｃＤＮＡ断片をｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｔａｋａｒａ社製）のＥｃｏＲＩ認識部位とＢａｍＨＩ認識部位との間に挿入し、サブクローニングした。【０１４６】
＜レーザーマイクロ照射＞
レーザーマイクロ照射及びＤＮＡ損傷領域からのシグナルの取得は、Ｆｕｊｉｔａ，Ｋ．ら、Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ、２０１３年、４、１８１６に記載の方法に基づき行った。すなわち、２５ｍｍカバースリップ上にて培養したＵ２ＯＳ細胞に、ｐＤｓＲｅｄ−モノマーＣ１又はＡｔｘｎ１−８６Ｑ−ｐＤｓＲｅｄと、ＲｐＡ１−ＥＧＦＰとを導入した。導入してから２４時間後に、ＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢｓ）を導入し易くするよう、細胞を２μＭのヘキスト３３２５８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）にて２０分間処理した。ソフトウェア（ＡＩＭ４．２、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製）を備えた顕微鏡（ＬＳＭ５１０ＭＥＴＡ、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製）を用い、細胞の核に位置する長方形の形をした領域にＵＶを照射した（最大パワー：３０ｍＷ、レーザー出力：７５％、波長：４０５ｎｍ、反復：５、ピクセル時間：１２μ秒、ズーム６）。そして、３０秒毎に低速度撮影の画像を得た。また、白化した領域と完全に一致した関心領域（ＲＯＩ）をＡｄｏｂｅフォトショップＣＳ３にて決定した。そして、ＲＯＩにおけるＲｐＡ１のピクセルあたりのシグナル強度の平均値を得た。シグナル強度は、非照射領域におけるそれに基づき正規化した。そのデータは、正規化蛍光ユニット（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｕｎｉｔｓ）として示す。【０１４７】
＜ｈＳＣＡ１ショウジョウバエに対する化学療法＞
ＣＨＫ１に対する特異的阻害剤  ＣＨＩＲ−１２４（ＡＸＯＮ  ＭＥＤＣＨＥＭ社製）を１Ｎ塩化水素に５ｍｇ／ｍＬになるよう溶解させ、０．０５Ｎ溶液にて複数の濃度になるよう希釈した。この溶液３ｍＬをショウジョウバエの培地１ｇに、図２９に示す最終濃度になるよう添加した。なお、この際に使用した培地は、インスタントショウジョウバエ培地Ｄ７６７０（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）及びフォーミュラ  ４−２４インスタントショウジョウバエ培地（Ｃａｌｏｌｉｎａ社製）を１対１にて混合したものである。対照として、０．０５  Ｎの塩化水素溶液を等量添加した培地も用意した。【０１４８】
＜免疫沈降（ＩＰ）＞
Ｈｅｌａ細胞（２×１０６）を１０ｃｍディッシュに播種し、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、その取り扱い説明書に従って、後述のタンパク質を発現させるためのプラスミドをトランスフェクションした後、３６時間インキュベーションした。ＰＢＳにて２回洗浄した後、ディッシュより細胞を回収し、２ｍＬのＴＮＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０）中にてホモジェナイズした。そして、４℃にて回転させながらインキュベーションした。回転を開始してから３０分後、１×１０４ｇにて２０分間遠心して、上清を回収した。回収した上清をプロテインＧアガロースビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）とともに、４℃にて回転させながら２時間インキュベーションした。ビーズを取り除いた後、溶解物を２〜１０μｇの抗Ｍｙｃ抗体、抗ＲｐＡ１抗体、抗ＢＲＣＡ１抗体又は抗ＢＲＣＡ２抗体とともに４℃にて回転させながら一晩インキュベーションした。さらに、その後プロテインＧアガロースビーズとともに２時間インキュベーションした。ビーズをＴＮＥ緩衝液５００μＬにて３回洗浄した後、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル泳動用サンプルバッファーに溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分画した後、ウェスタンブロッティングに供した。【０１４９】
また、マウス（２０週齢）の脳をＴＮＥ緩衝液中にてホモジェナイズし、４℃、２，０００×ｇにて１分間遠心した。そして、得られた上清を用い、前記Ｈｅｌａ細胞と同様の方法にて免疫沈降を行った。【０１５０】
なお、抗ＲｐＡ１抗体（Ｈ−７、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、２０分の１に希釈して使用）又は抗Ａｔｘｎ１抗体（１１ＮＱ、クローンＮ７６／８、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、１００分の１に希釈して使用）とともに、４００μｇのタンパク質をインキュベーションした。【０１５１】
また、ウェスタンブロッティングにおいては、一次抗体として、
抗Ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、５００分の１に希釈）、
抗ＲｐＡ１抗体（Ｈ−７、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、１００分の１に希釈）、
抗ＲｐＡ１抗体（Ｂ−１０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、１０００分の１に希釈してマウスのサンプルに対して使用）、
抗ＢＲＣＡ１／２抗体（Ａｂｃａｍ社製、２０００分の１に希釈）、
抗Ａｔｘｎ１抗体（１１ＮＱ、クローンＮ７６／８、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、２０００分の１に希釈）を用いた。また、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ又はＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）は、３０００分の１に希釈して使用した。【０１５２】
＜ＳＣＡ１モデルマウスに対する遺伝子治療＞
ＳＣＡ１モデルマウスとして、Ａｔｘｎ１−１５４Ｑ−ＫＩマウスを用い、該マウスの小脳においてＲＰＡを過剰発現させることにより、その治療効果を評価した。【０１５３】
すなわち先ず、ヒト最初期プロモーター（ＣＭＶプロモーター）、ヒト成長ホルモン第１イント及びＲＰＡをコードするｃＤＮＡ、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）及びＳＶ４０のｐｏｌｙＡシグナル配列をこの順に含む発現カセットが、ＡＡＶ３ゲノムの逆位末端配列に挿入されてなる、アデノウィルス随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクター（以下、ＲＰＡ１−ＡＡＶとも称する）を常法に従って作製した。なお、このベクターのトランスフェクション及び精製は、Ｌｉ  ＸＧ.ら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２００６年、１巻、１６０〜１６６ページに記載の方法に沿って行った。【０１５４】
そして、このようにして調製して得られたウィルスベクターを、以下に記載の方法にてＡｔｘｎ１−１５４Ｑ−ＫＩマウスの小脳表面に注入した。５週齢の当該マウスにネンブタ―ルを腹腔内投与することにより麻酔し、定位固定装置（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ社製）上に固定した。該マウスの前頭を２０度傾け、ＥＬＡ棒鋼（Ｓｈｏｆｕ社製）を用い、ブレグマから−９．２ｍｍ、正中から±０ｍｍの側部に直径１ｍｍの穴を開けた。次いで、当該骨に空けた穴の外表面より３．５ｍｍ、後頭骨の内側面に沿ってガラスシリンジを挿入した。そして、ＲＰＡ１−ＡＡＶのウィルス溶液（〜１×１０１２粒子数）８μＬを、計４回異なる位置（前方から後方にかけ時計回りに６０度、９０度、２７０度及び３３０度の位置）に、各２μＬずつマイクロポンプ（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ社製）を用いて０．５μＬ／分にて、注入した。この方法により、小脳表面にウィルスベクターの効率的な供給を再現性良く行うことができる、また、陰性対照群として、ＲＰＡの代わりにＧＦＰをコードするｃＤＮＡが挿入されたＡＡＶベクター（以下、ＧＦＰ−ＡＡＶとも称する）を、小脳表面に注入したＡｔｘｎ１−１５４Ｑ−ＫＩマウスも、前記同様に調製した。【０１５５】
＜マウスの行動試験＞
マウスは、性別毎に各ケージ２〜５匹ずつ入れ、水とげっ歯類用資料とを与え、１２時間毎の明暗サイクル下にて飼育し、維持した。全ての試験は、明期（１０〜１９時の間）に５〜４０週齢の雄マウスを用いて行った。【０１５６】
ロータロッド試験においては、マウスをロータロッド（回転速度：３．５ｒｐｍ）上に置き、３００秒間で回転速度を直線的に３５ｒｐｍまで上げ、その後６００秒まで一定速度（３５ｒｐｍ）を保った。この試験は、１日４回、３日間連続して行い、ロータロッドから落ちるまでの平均時間を各試験日毎に算出した。【０１５７】
（実施例１）
＜脊髄小脳変性症（ＳＣＡ）におけるＤＮＡ損傷についての検証＞
ＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）型のＤＮＡ修復において重要な分子であるＫｕ７０によって、ヒトハンチントン疾患（ＨＤ）のショウジョウバエモデル（ＵＡＳ−Ｈｔｔ１０３Ｑ／＋：ＯＫ６−ＧＡＬ４／＋ショウジョウバエ）において短縮されている生存期間が回復され、さらには運動行為も改善されることが、本発明者らによって明らかにされている（Ｔａｍｕｒａ，Ｔ．ら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２０１１年、６、ｅ２７４０８  参照）。また、ＤＳＢ型のＤＮＡ修復に関与する他の分子ＴＥＲＡ／ＶＣＰ／ｐ９７は多種多様なポリグルタミン疾患においてその機能を阻害されており、またこのタンパク質を補充することによってショウジョウバエモデルの症状が回復されることも、本発明者らによって明らかにされている。さらには、脊髄小脳変性症１型（ＳＣＡ１）マウスモデルの小脳ニューロンにおいてＤＳＢが増加していることが、本発明者らによって明らかにされている（Ｆｕｊｉｔａ，Ｋ．ら、Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ、２０１３年、４、１８１６  参照）。【０１５８】
このように、ポリグルタミン鎖の異常な伸長を病因とするＳＣＡやハンチントン疾患等のポリグルタミン疾患と、ＤＮＡ損傷とは関連していることが示唆されている。さらには、その損傷修復に関わる因子によってハンチントン疾患等の症状は回復されることも、本発明者らによって示されている。また、ＤＳＢは多種多様なＤＮＡ損傷カスケードにおいて、通常最終的に生じるＤＮＡ損傷であることも知られている（Ｂｏｈｇａｋｉ，Ｔ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｔｅｇｒ、２０１０年、１、１５、Ｍｌａｄｅｎｏｖ，Ｅ．ら、Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ、２０１１年、７１１巻、６１〜７２ページ、Ｎｏｗｏｓｉｅｌｓｋａ，Ａ．ら、ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ（Ａｍｓｔ）、２００８年、７巻、４８〜５６ページ  参照）。【０１５９】
そこで、かかる知見を鑑み、ＳＣＡの治療又は予防に有効な分子を探索するための足がかりを得るべく、先ずは、哺乳動物の小脳ニューロンに変異型ＡＴＸＮ１を発現させ、ＤＳＢ型のＤＮＡ損傷が生じるかを確認した。【０１６０】
すなわち、Ａｔｘｎ１−１５４Ｑノックインマウスにおいて、ＤＳＢのマーカーであるヒストン２Ａ（Ｈ２ＡＸ）の１３９番目のセリンのリン酸化について解析した。その結果、図１に示す通り、プルキンエ細胞及び顆粒細胞において、沢山の小さな斑点状のシグナルが観察された。また、Ｈ２ＡＸリン酸化は、Ａｔｘｎ１−１５４Ｑノックインマウスはその症状を示す前から亢進していることが明らかになった（図２及び３  参照）。【０１６１】
（実施例２）
＜ＳＣＡ１モデルショウジョウバエを利用したスクリーニング＞
次に、ＳＣＡの発症においてどのタイプのＤＮＡ修復カスケードが関与しているのかを同定すべく、スクリーニング系の構築を行った。スクリーニング系の構築にあたり、多種多様な因子及びそれら因子が関与するネットワークを対象として、適切に候補を絞り込むため、世代時間が短く、表現型を定量的に評価できるショウジョウバエに本発明者は着目した。なお、本発明者は、従前の研究成果に基づき、ショウジョウバエのＳＣＡ１モデルの病状と哺乳動物のＳＣＡ１モデルのそれとは似ていることを見出している。【０１６２】
そこで、ショウジョウバエのＳＣＡ１モデルにおいても、前記マウス同様に、ＤＳＢ型のＤＮＡ損傷が亢進していることを先ずは確認した。すなわち、ＯＫ６−Ｇａｌ４／ＵＡＳシステムによりヒトＡｔｘｎ１−８２Ｑを運動神経において発現しているトランスジェニックハエを解析した結果、ショウジョウバエのＨ２ＡＸホモログであるＨ２Ａｖのリン酸化が亢進していることが確認された（図４及び５  参照）。なお、腹神経索（ＶＮＣ）において、ＯＫ６により誘導されＤｓＲｅｄを発現している細胞においてγＨ２Ａｖ由来の強いシグナルが観察され、ＤｓＲｅｄとγＨ２Ａｖとの局在は一致していることも明らかになった（図４  参照）。また、ＯＫ６により誘導されＤｓＲｅｄを発現している細胞において、実際に変異型Ａｔｘｎ１が発現していることも確認された（図５  参照）。【０１６３】
前述の通り、ＤＳＢ型のＤＮＡ損傷は、一本鎖ＤＮＡ切断（ＳＳＢ）及び酸化的塩基損傷といった他のタイプのＤＮＡ損傷の最終段階である。したがって、そのことと上記結果とを併せ考えるに、ショウジョウバエのＳＣＡ１モデルは、ＳＣＡの病態に寄与するＤＮＡ損傷修復カスケードを探索するための有効なツールになり得ると判断し、当該モデルショウジョウバエを利用したインビボスクリーニングを行った。【０１６４】
すなわち、利用可能な全てのＤＮＡ修復に関するショウジョウバエ相同遺伝子を各々
ショウジョウバエのＳＣＡ１モデルにおいて過剰発現させ、該モデルショウジョウバエの症状の一つである生存期間の短さへの影響を指標として、短期間かつ定量的な解析を可能とするスクリーニングを行った。スクリーニングの対象としたヒトＤＮＡ修復遺伝子と、それらのショウジョウバエ相同遺伝子との関係を表１に示す。【０１６５】
また、ヒトＡｔｘｎ１−８２ＱとＧＳ系統のカセットによって発現が誘導されるＤＮＡ損傷修復遺伝子とを共発現させているハエ（ＯＫ６＞Ａｔｘｎ１−８２Ｑ；ＧＳ）の生存期間の平均値を、表２に示す。また、表２においては、陽性対照であるＵＡＳ−Ａｔｘｎ１−８２Ｑ／＋：ＯＫ６−ＧＡＬ４／＋（ＯＫ６＞Ａｔｘｎ１−８２Ｑ）との差異を判定するために、ウイルコクスン順位和検定を用い算出したＰ値も併せて示す。【０１６６】
また、表１及び２において、「ＢＥＲ」は塩基除去修復に関連する遺伝子であることを示し、「ＮＥＲ」はヌクレオチド除去修復に関連する遺伝子であることを示し、「ＤＳＢＲ」はＤＮＡ二重鎖切断修復に関連する遺伝子であることを示し、「ＤＳＢＲ＋ＣＬＲ」はＤＮＡ二重鎖切断修復及びＤＮＡクロスリンク修復に関連する遺伝子であることを示し、「ＭＭＲ」はミスマッチ除去修復に関連する遺伝子であることを示す。なお、多機能を有するＲＰＡ１は暫定的にＮＥＲに分類してある。【０１６７】
また、図には示さないが、このインビボスクリーニングの系において、陽性対照であるＵＡＳ−Ａｔｘｎ１−８２Ｑ／＋：ＯＫ６−ＧＡＬ４／＋（ＯＫ６＞Ａｔｘｎ１）は、陰性対照であるＡｔｘｎ１／＋又はＯＫ６／＋と比較して、生存期間が短いことを確認している。【０１６８】
【表１】
0006606428.tif 000002
【０１６９】
【表２】
0006606428.tif 000003
【０１７０】
このインビボスクリーニングを行った結果、表２に示す通り、ＰＮＫＰ、ＲｐＡ１、Ｓｐｎ−Ｂ、ＸＲＣＣ４、ＤＮＡポリメラーゼイータ、ＤＮＡポリメラーゼイプシロン、ＣｙｃＨ又はＰｅｒを過剰発現させることによって、ＳＣＡ１モデルバエの生存期間における短縮は回復されることが明らかになった。また、図には示さないが、これら遺伝子の殆どにおいて、ハエ成体の幼年期（ｙｏｕｎｇ  ｓｔａｇｅ）から熟年期（ａｇｅｄ  ｓｔａｇｅ）にかけて生存率が改善することも明らかになった。例えば、２１日目において、陽性対照バエ（ＵＡＳ−Ａｔｘｎ１−８２Ｑ／＋：ＯＫ６−ＧＡＬ４／＋）の生存率は７５％であるのに対し、Ｓｐｎ−Ｂ過剰発現系統は８５％、ＸＲＣＣ４／ＣＧ１２７２８過剰発現系統は９２％、ＤＮＡポリメラーゼイータ過剰発現系統は８６％、ＣｙｃＨ過剰発現系統は８３％というように、高い生存率を示した。さらに、それらの生存率は３０日以降も依然として、ＳＣＡ１モデルバエのそれよりも高いままであった。また、図には示さないが、ＲｐＡ１、Ｐｅｒ、Ｓｐｎ−Ｂ又はＸＲＣＣ４／ＣＧ１２７２８によって、生存期間の最大値も顕著に延長されることも明らかになった。【０１７１】
一方、予期せぬことに、ＳＣＡ１モデルバエの生存期間をさらに短くする１２の遺伝子、Ｌｉｇ１、Ｌｉｇ３、Ｆｅｎ１、ｃｈｒａｃ−１４、ＸＡＢ２、Ｘｐｄ、ＣＧ８８４１、ＲｅｃＱ５、ｍｕｓ８１、ＥＭＥ１、ｍｅｉＷ６８、ｍｕｓ３０９／ＢＬＭ／ＲｅｃＱ２及びｇｒｐも同定された。なお、ＣＧ８８４１（ＤＭＣ１）過剰発現の例においては、成体バエが得られないほど毒性（ｔｏｘｉｃ）が強く、生存期間は極めて短かった。【０１７２】
また、ＲｅｃＱファミリータンパク質は、細菌からヒトに至るまで高度に保存されており、３’−５’ＤＮＡヘリカーゼ活性を有することが知られている。ヒトＲｅｃＱ１の５つのメンバー（ｍｕｓ３０９／ＢＬＭ／ＲｅｃＱ２、ＷＲＮ／ＲｅｃＱ３、ＲｅｃＱ４及びＲｅｃＱ５）のうち、生存期間に悪影響を及ぼしたＲｅｃＱタンパク質は２つあった。特に、ＲｅｃＱ５はＤＮＡ鎖アニーリング活性を示す。さらにはその活性はＲｐＡ１によって阻害されることも示されており（Ｇａｒｃｉａ，Ｐ．Ｌ．、ＥＭＢＯ  Ｊ、２００４年、２３巻、２８８２〜２８９１ページ  参照）、ＲｅｃＱ５と前述のＲＰＡ１とが逆の作用を示したことと一致している。【０１７３】
また、前述の通り、本発明者らによって、変異ハンチンチントランスジェニックバエにおける生存期間の短縮は、Ｋｕ７０によって回復することが明らかになっている。しかしながら、このインビボスクリーニングにおいて、Ｋｕ７０の相同遺伝子を発現しているＩｒｂｐ  ＧＳ系統は、ＵＡＳ−Ａｔｘｎ１−８２Ｑ／＋：ＯＫ６−ＧＡＬ４／＋ショウジョウバエモデルにおける生存期間の短縮を有意に回復させることはなかった。しかしながら、図には示さないが、ヒトＫｕ７０を共発現させたトランスジェニックバエにおいては、若干ではあるが、はっきりと生存時間に好影響を与えることを確認している。このようなハンチントン病及びＳＣＡに対するＫｕ７０の矛盾した効果から、２つのポリグルタミン疾患において、ＤＮＡ損傷修復に用いられる分子が量的にも質的にも異なっていることが示唆される。【０１７４】
（実施例３）
＜システム生物学による、ＳＣＡの病態に関与するＤＮＡ修復ネットワークの解明＞
次に、システム生物学を用い、前記スクリーニングの結果を解析した。すなわち、ＳＣＡ１モデルバエにおいて、生存時間の短縮又は延長を誘導する中心的な分子ネットワークを同定するため、ＤＮＡ修復遺伝子による回復についての定量的データと、タンパク質間相互作用（ＰＰＩ）データ（ＢＩＮＤ、ＢＩＯＧＲＩＤ、Ｃｏｇｎｉａ、ＤＩＰ、ＩＮＴＡＣＴ、Ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ、ＭＩＮＴ及びＭＩＰＳ）とを統合した。また、同時に、ＳＣＡ１のショウジョウバエモデルの生存期間に影響するネットワークを構成する新規分子の探索を試みた。より具体的には、前記目的のため、２つのタイプのアルゴリズムを用いた。【０１７５】
第一のアルゴリズムを用いて作成されたネットワーク１においては、２つの遺伝子産物が生存期間に直接影響を与える場合（セグメント１）に、または２つの遺伝子産物が他のタンパク質を介して生存期間に影響を与える場合（セグメント２）に、タンパク質間インタラクトーム（ＰＰＩ）データベースからタンパク質経路を選択した。また、ネットワーク１のマップにおいて、より多くのタンパク質と結合しているタンパク質をより中心に近付くよう配置した。さらに、この分析において、決定遺伝子（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｇｅｎｅｓ）はネットワークの外縁に位置することになる。【０１７６】
第二のアルゴリズムを用い作成されたネットワーク２において、生存期間に影響を与えるタンパク質が、１〜３のトライアングルタンパク質経路の構成要素である場合に、ＰＰＩデータベースから閉じられたトライアングル経路を選択した。また、可能である場合には、生存期間に影響期間を与える残りのタンパク質も推定ネットワークとつながりをもたせた。【０１７７】
そして、これら２つのネットワークを用い、前述のインビボスクリーニングによって単離されたＤＮＡ損傷修復関連遺伝子において、生存期間を延長させる遺伝子及び生存期間を短縮させる遺伝子における機能的な相互作用について解析した。【０１７８】
その結果、図６に示す通り、ネットワーク１を作成するためのアルゴリズムは、生存期間延長に寄与する重要な遺伝子群を強調するのに役立った。すなわち、この生存期間延長に関するネットワーク１（２セグメント）において、ＲＰＡ１は中心に位置し、多種多様なＤＮＡ損傷修復又は転写に関するタンパク質とつながりをもっていることが明らかになった。また、ＲＰＡ１とつながりのある遺伝子を、特定のタイプのＤＮＡ修復又は転写において重要な制御を担っている以下のグループに分類することができた。【０１７９】
すなわち、第一のグループは、ＸＲＣＣ４とのつながりを有する非相同末端結合（ＮＨＥＪ）タイプのＤＮＡ修復に関連するグループである。第二のグループは、ＸＲＣＣ１、ライゲース３（ＬＩＧ３）及びＰｏｌｙＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）といった２機能性ポリヌクレオチドフォスファターゼ／キナーゼ（ＰＮＫＰｓ）とつながりを有する、ＮＨＥＪ（Ｂ−ＮＨＥＪ）、さらにはＳＳＢＲ、ＢＥＲ又はＮＥＲのバックアップ経路に関与するグループである。第三のグループは、ＸＲＣＣ３とのつながりを有する相同組換え（ＨＲ）タイプのＤＮＡ修復に関連し、ゲノム複製におけるＤＳＢｓの修復に関与するグループである。第四のグループは、サイクリンＨ（ＣＣＮＨ）とのつながりを有する主に転写に関与するグループである。【０１８０】
また、ＰＡＲＰ１、ＲＡＤ５１、ＴＯＰＢＰ１、ＣＤＫ及びＫｕ７０等の多種多様なタンパク質がＲＰＡ１に作用するが、ＲＰＡ１が作用するのはＡＴＲのみである。このことから、これら遺伝子グループの機能的標的はＲＰＡ１であり、ＤＳＢ及び転写における多種多様なシステムにおいて、拠点となる分子としてＲＰＡ１は極めて重要であることが示唆された。【０１８１】
ＲＰＡ１は、様々なタイプのＤＮＡ損傷修復及び転写障害（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎ）において生じる１本鎖ＤＮＡを保護するのに中心的な役割を担っていることと、前記結果とは一致する。また、この結果は、前記モデルバエの解析結果において、ＲＰＡ１がＳＣＡの症状を最も回復させることの理由を説明するものである。【０１８２】
ネットワーク２は、スクリーニングにより選択された遺伝子間の密な相互作用を摘出したものである(図７  参照)。そして、このネットワーク２から、腫瘍タンパク質ＴＰ５３、肝細胞核因子４α（ＨＮＦ４Ａ）及びＭｙｃは沢山のタンパク質に関与し、生存期間の延長に寄与する様々なシステムに関与していることが示唆される。興味深い事に、アレン脳地図（ｈｔｔｐ：／／ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｍｏｕｓｅ．ｂｒａｉｎ−ｍａｐ．ｏｒｇ／ｄａｔａ／Ｈｎｆ４ａ／１０００９３８８８／ｔｈｕｍｎａｉｌｓ．ｈｔｍｌ）によれば、ＨＮＦ４Ａは成体の小脳皮質に発現している。ＨＮＦ４Ａは、ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合する転写因子であり、生体異物の代謝において重要であるシトクロームＰ４５０  ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）等の遺伝子の発現を制御する（Ｔｉｒｏｎａ，Ｒ．Ｇ．ら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、２００３年、９巻、２２０〜２２４ページ  参照）。したがって、ＨＮＦ４ＡはＳＣＡ１モデルバエの生存期間を延長する複数のシステムを制御しているかもしれない(図７  参照)。しかしながら、ＨＮＦ４Ａ自体は前記スクリーニングにおいて陽性とはならなかった。また、陽性遺伝子となるためには、複数の経路への関与が必要である(図７  参照)。したがって、ＨＮＦ４Ａは間接的なモジュレーターとして機能していることが考えられる。【０１８３】
生存期間の短縮に関するネットワーク１において、ＦＥＮ１、ＬＩＧ１、ＣＨＫ１及びＢＬＭはネットワークの中心に位置し、多数のタンパク質とのつながりを有している(図８  参照)。興味深いことに、ＲＰＡ１もまた中心に位置し、ＢＬＭ及びＦＥＮ１との関連性を有している。このようにこれらタンパク質によってＲＰＡ１は影響を受けているかもしれない(図８  参照)。また、生存期間の短縮に関するネットワーク２において、同様の遺伝子が主なプレーヤーとして選択されている(図９  参照)。また、ネットワーク２から、ＲＰＡ（ＲＰＡ１及びＲＰＡ２を含む複合体）はＦＥＮ１及びＬＩＧ１に直接又は間接的に抑制シグナルを送り、その一方で、ＦＥＮ１からのフィードバックをＲＰＡ１は受けていることが明らかになった。また、ＡＴＭ、ＡＴＲ及びＲＮＡポリメラーゼIIはＤＳＢ修復に関与し、ＦＥＮ１、ＬＩＧ１、ＣＨＫ１及びＢＬＭのうちの１又は複数のタンパク質とのつながりを有していることも、このネットワーク解析により示された。【０１８４】
（実施例４）
＜ＳＣＡの病態におけるＨＲ−ＤＳＢＲ分子の関与＞
上述の通り、従前には注目されていなかったＤＮＡ損傷修復遺伝子を対象とした、沢山の新たなサブグループを含めたシステム生物学による解析から、生存期間の延長に関与する遺伝子の分子ネットワークが予測された（図７  参照）。【０１８５】
特に、ＲＰＡ１は、様々なタイプのＤＮＡ損傷後に生じるむき出しの１本鎖ＤＮＡを保護するための重要な役割を担っている。また、ＲＰＡ１によって保護されたＤＮＡは、ＢＲＣＡ２及びＲＡＤ５１による相同組換えによって修復されることが明らかになっている。【０１８６】
そこで、ＨＲ依存的なＤＳＢＲにおいて最も重要な経路であるＲＰＡ１／ＢＲＣＡ２／ＲＡＤ５１ネットワークが、ＳＣＡの病態に関与しているかどうかを調べるため、哺乳動物の細胞株のＢＲＣＡ２／ＲＡＤ５１経路において、ＲＰＡ１とＡＴＸＮ１とが物理的に相互作用するか否かを解析した。得られた結果を図１１〜１５に示す。【０１８７】
該解析の結果、Ｈｅｌａ細胞を用いた免疫沈降アッセイにより、外来的に発現させたＡＴＸＮ１と共発現させたＲＰＡ１とは相互作用することが明らかになった（図１１及び１２  参照）。また、ＡＴＸＮ１と内因性のＢＲＣＡ１とは弱く結合し（図１３  参照）、ＡＴＸＮ１とＢＲＣＡ２とは強く結合することが明らかになった（図１４  参照）。さらに、Ａｔｘｎ１−ＫＩマウスとその同腹の非トランスジェニックマウスを用いて、ＡＴＸＮ１とＲＰＡ１とが生体内においても相互作用することを確認した（図１５  参照）。【０１８８】
また、変異型Ａｔｘｎ１−ＫＩマウスの脳を免疫組織化学的に解析した結果、プルキンエ細胞において、ＲＰＡ１及びＡＴＸＮ１は共局在化しており（図１６  参照）、さらに、ＢＲＣＡ１及びＡＴＸＮ１も共局在化していることも明らかになった（図１７  参照）。【０１８９】
Ａｔｘｎ１−ＫＩマウスにおいて、ＳＣＡ１に対して抵抗性を示す皮質神経細胞は封入体を形成するが、脆弱なプルキンエ細胞は封入体を形成しないことが知られている（Ｗａｔａｓｅ，Ｋ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ、２００２年、３４巻、９０５〜９１９ページ  参照）。この点に関し、図１７において示す通り、ＢＲＣＡ１は皮質神経細胞の封入体に隔離されていた。一方、プルキンエ細胞の核内において、ＢＲＣＡ１と変異型ＡＴＸＮ１とは均一に分散し、共局在化していることが明らかになった。また、ＢＲＣＡ２及びＡＴＸＮ１はプルキンエ細胞の核内フォーカスにおいて部分的に共局在化していることが明らかになった（図１８  参照）。さらに、興味深いことに、図には示していないが、正常な状態においては、図１６に示したＲＰＡ１同様に、ＲＰＡ１と共にＲＰＡ複合体を形成するＲＰＡ２は、神経細胞の細胞質において主に局在していることも明らかにした。【０１９０】
以上の結果から、ＲＰＡ１とそのパートナーであるＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２とに関し、変異型ＡＴＸＮ１により、それらの動態が抑制され、ＤＮＡ損傷修復機能が損なわれることが考えられる。【０１９１】
そこで、変異型ＡＴＸＮ１を発現しているＵ２ＯＳ細胞において、線状ＤＮＡ  ＤＳＢｓに応じたＲＰＡ１の核内動態を直接調べた。その結果、対照とする、ＤｓＲｅｄ発現細胞又はＡｔｘｎ１−３３Ｑ−ＤｓＲｅｄ発現細胞と比較して、線状ＤＮＡ損傷部位におけるＲＰＡ１−ＥＧＦＰの蓄積は、Ａｔｘｎ１−８６Ｑ−ＤｓＲｅｄ発現細胞において遅かった（図１９及び２０  参照）。【０１９２】
また、ＲＰＡ１のシグナル強度はＤＮＡ損傷を誘導してから７分後に減少した。このことから、ＲＰＡ１が２つの区画に蓄えられていることが示唆された。おそらくは、前期区画からのＲＰＡ１の移動が部分的に妨げられ、変異型ＡＴＸＮ１との相互作用によって後期区画からの解放がより一層おおいに妨げられていることが考えられる。実際、変異型ＡＴＸＮ１マウスのプルキンエ細胞における核封入体に、ＲＰＡ１が隔離されていることによって、この仮説は裏付けられた（図１６  参照）。【０１９３】
さらに、ショウジョウバエの運動神経において、変異型ＡＴＸＮ１の凝集に影響を与えずに、変異型ＡＴＸＮ１によるＤＳＢの発生は、ＲＰＡ１によって緩和されることも明らかになった（図２１及び２２  参照）。【０１９４】
以上の結果から、変異型ＡＴＸＮ１は、拠点分子となるＲＰＡ１の動態を損なわせ、ＤＮＡ損傷修復分子の多くのグループに影響を与えることにより、ＳＣＡの発症及び進行に関与していることが明らかになった。【０１９５】
（実施例５）
＜ＲＰＡ１によるＳＣＡの治療効果の検証１＞
上述の通り、ＲＰＡ１を過剰発現させせることによって、ＳＣＡ１モデルバエの症状の１つである生存期間の短さは改善される。この点に関し、ＳＣＡ１モデルバエの他の症状である眼の変性を指標として、ＲＰＡ１／ＲｐＡ７０による治療効果を確認した。すなわち、ＧＭＲ−Ｇａｌ４ドライバーを用い、Ａｔｘｎ１−８２Ｑと、ＲｐＡ７０又はＲｐＡ７０に対するｓｉＲＮＡ(ＲｐＡ７０−ＲＮＡｉ)とを光受容細胞にて共発現させた。また、ＧＳ系統を過剰発現の例として用いた。一方、ＵＡＳ−ＲｐＡ７０−ＲＮＡｉトランスジェニックバエはノックダウンの例として用いた。その結果、ＲｐＡ７０との共発現によって、粗い眼（ｒｏｕｇｈ  ｅｙｅ）の表現型は明らかに回復した。一方、ＲｐＡ７０をノックダウンすることによって、ＳＣＡ１の症状は悪化した（図２３及び２４  参照）。【０１９６】
（実施例６）
＜ＲＰＡ１によるＳＣＡの治療効果の検証２＞
前記の通り、ＳＣＡ１モデルバエにおいて確認されたＲＰＡ１過剰発現による治療効果を、ＳＣＡ１モデルマウスにおいても確認することを試みた。すなわち、図２５に記載の実験スケジュールの通り、ＳＣＡ１モデルマウス（５週齢）の小脳にＲＰＡ１発現ウィルスベクターを注入し、その４カ月後（９週齢）、８カ月後（１３週齢）及び３５カ月後（４０週齢）にロータロッド試験を行い、ＳＣＡ１モデルマウスにおける運動性欠陥の改善について評価した。得られた結果を図２６、２７及び２８に示す。なお、５週齢のＳＣＡ１モデルマウスについて、ロータロッド試験において、その運動性の低下が認められることは、事前に確認してある。【０１９７】
図２６、２７及び２８に示した結果から明らかな通り、陰性対照群（図中の「ｎｏ  ｖｉｒｕｓ」及び「ＧＦＰ」、ＧＦＰ−ＡＡＶを注入したＳＣＡ１モデルマウス）と比較して、回転するロッドから落下する時間は、ＲＰＡ１−ＡＡＶを注入したＳＣＡ１モデルマウス（図中の「ＲＰＡ１」）の方が有意に長くなった。したがって、ＳＣＡ１モデルマウスにおいても、ＲＰＡ１過剰発現により、その症状（運動性欠陥）の改善、すなわち治療効果を確認することができた。【０１９８】
（実施例７）
＜ＣＨＫ１の機能阻害によるＳＣＡの治療効果の検証＞
生存期間の短縮に関与する遺伝子のネットワークを構築し、解析した結果から、ＣＨＫ１は、ＢＬＭ、ＦＥＮ１及びＬＩＧ１から直接又は間接的に様々なシグナルを受け、ＳＣＡ１モデルバエにおける生存期間の短縮を促進していることが明らかになった（図８及び９  参照）。さらに、前述のスクリーニング及びインフォマティクス解析の結果から、ＤＮＡ損傷シグナルの最も重要なトランスドューサーの一つであるＣＨＫ１は、ＳＣＡの病状において重要な役割を果たしていることが示唆される。【０１９９】
そこで、ＣＨＫ１が介するシグナルを阻害することによって、ＳＣＡ１モデルバエにおける生存期間の短縮は緩和されるかどうかを調べた。すなわち、ＣＨＫ１特異的阻害剤（ＣＨＩＲ−１２４）を用い、それを様々な濃度にて飼料（コーンミール培地）に添加し、ハエの成体に与えた。その結果、０．０００１６ｍｇ／ｍＬ及び０．０２ｍｇ／ｍＬにて、ＯＫ６＞ＳＣＡ１の生存期間は改善された（図２９  参照）。また、その改善効果は、高濃度の阻害剤を与えた例の方がより顕著であり、０．０２ｍｇ／ｍＬのＣＨＩＲ−１２４にて処理したハエにおいては、生存期間が３５％も延長された（図２９  参照）。【０２００】
さらに、ＣＨＫ１／ｇｒｐとＡＴＸＮ１との遺伝的相互作用についても調べた。すなわち、ＧＭＲ−Ｇａｌ４ドライバーを用い、Ａｔｘｎ１−８２Ｑと、ｇｒｐ又はｇｒｐ−ＲＮＡｉとを光受容細胞にて共発現させた。また、ＧＳ系統を過剰発現の例として用いた。一方、ＵＡＳ−ｇｒｐ−ＲＮＡｉトランスジェニックバエはノックダウンの例として用いた。その結果、ｇｒｐに対するｓｉＲＮＡを発現させることによって、ＳＣＡ１における症状（眼の変性状態）は少し改善された。一方、ｇｒｐを過剰発現させることによって、眼の変性は顕著に促進された（図２３  参照）。【０２０１】
したがって、ＣＨＫ１の機能を阻害することによって、成体ＳＣＡ１バエにおける生存期間の短縮を緩和できることが明らかになった。【０２０２】
（実施例８）
＜プルキンエ細胞における細胞周期についての検証＞
次に、ＲＰＡ１はどのようにしてＳＣＡの病態に関与しているのかを調べた。図６において示した通り、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）型ＤＳＢＲ、ＨＲ型ＤＳＢＲ、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）及び塩基除去修復（ＢＥＲ）等の多種多様なＤＮＡ損傷修復経路と、ＲＰＡ１はつながりを有している。また、ＲＰＡ１は、基本的にはむき出しの１本鎖ＤＮＡを保護し、主に増殖細胞において生じるＨＲ、ＮＥＲ及びＢＥＲに関与していることが知られている。そのため、前述のＲＰＡ１による治療効果については、以下の機序を介して奏されている可能性が考えられる。
１）バーグマングリア又はアストロサイトを含むグリア細胞を介した非自律的病態（ｎｏｎ−ｃｅｌｌ−ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）に、ＲＰＡ１は関与する。なお、非自律的病態とは、神経細胞以外の細胞の異常によって神経細胞が機能障害や細胞死を起こすことであり、多くはグリア細胞によるものである。すなわち、バーグマングリアのような神経細胞に対して保護的な作用を示すグリアが変調を来すために生じる病態のことである。
２）胚性幹細胞又は成体幹細胞を介した幹細胞病理（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）に、ＲＰＡ１は関与する。
３）異常な細胞周期段階にあるプルキンエ細胞におけるＤＮＡ損傷修復に、ＲＰＡ１は関与する。【０２０３】
第１の可能性は、筋萎縮性側索硬化症における非自律的病態と類似していること（Ｙａｍａｎａｋａ，Ｋ．ら、Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２００８年、１１巻、２５１〜２５３ページ、Ｙａｍａｎａｋａ，Ｋ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００８年、１０５、７５９４〜７５９９ページ、Ｎａｇａｉ，Ｍ．ら、Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２００７年、１０巻、６１５〜６２２ページ、Ｄｉ  Ｇｉｏｒｇｉｏら、Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２００７年、１０巻、６０８〜６１４ページ  参照）又はＳＣＡ１病態へのバーグマングリアの関与を示す結果（Ｓｈｉｗａｋｕ，Ｈ．ら、Ｅｍｂｏ  Ｊ、２０１０年、２９巻、２４４６〜２４６０ページ  参照）に基づき想定される。第２の可能性は、ＳＣＡの病状進行において、ＲＯＲαがプルキンエ細胞に影響を与えるという従前の観察結果（Ｓｅｒｒａ，Ｈ．Ｇ．ら、Ｃｅｌｌ、２００６年、１２７巻、６９７〜７０８ページ  参照）に基づき考えられる。第３の可能性は、神経変性疾患における異常な細胞周期、すなわち、神経変性疾患において、神経細胞のＳ期移行に障害が生じていること（Ｈｅｒｒｕｐ，Ｋ．ら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２００７年、８巻、３６８〜３７８ページ  参照）に基づき考えられる。【０２０４】
そこで、上記３つの可能性に関し、小脳における増殖型の細胞又はＳ期にある細胞について調べた。すなわち、３２週齢のマウス成体にＢｒｄＵを注入し、様々なタイプの細胞への取り込みを解析した。その結果、抗カルビンディン抗体によって染色され、ＢｒｄＵを取り込んでいる、悪化したプルキンエ細胞が観察された（図３０〜３２  参照）。したがって、３番目に挙げた、異常な細胞周期段階にあるプルキンエ細胞におけるＤＮＡ損傷修復にＲｐＡ１は関与していることが裏付けられた。【０２０５】
一方、１番目と２番目の可能性に関しては、小脳においてＢｒｄＵ及びＳｏｘ２を対象とする二重染色を行った。なお、Ｓｏｘ２は幹細胞のマーカーであり、小脳における成体幹細胞を同定するために染色した。その結果、二重染色された２、３の細胞が、白質と小脳皮質の分子層とにおいて観察された（図３０〜３２  参照）。また、バーグマングリアにおけるＢｒｄＵの取り込みは観察されなかった。さらに、γＨ２ＡＸシグナルはＳｏｘ２陽性のバーグマン細胞において増加していなかった（図３３  参照）。したがって、前記第１及び第２の可能性は低いことが考えられる。【０２０６】
以上のことから、プルキンエ細胞における異常なＳ期への移行によって、該細胞におけるＤＮＡ損傷修復、ひいてはＲＰＡ１による相同組換えが誘導されることによって、ＳＣＡの病態が改善されることが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【０２０７】
以上説明したように、本発明によれば、ＲＰＡ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＮＫＰ、ＸＲＣＣ３、ＸＲＣＣ４、ＣＣＮＨ、ＰＯＬＥ、ＰＯＬＨ又はＰＥＲ１の発現を促進等することにより、ＳＣＡの病態を改善することが可能となる。また、ＳＣＡ１の病因となるＡＴＸＮ１と、ＲＰＡ１、ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２との結合を抑制することにより、ＳＣＡの病態を改善することが可能となる。さらに、ＣＨＫ１、ＬＩＧ３、ＦＥＮ１、ＬＩＧ１、ＥＲＣＣ５、ＸＡＢ２、ＥＲＣＣ２、ＤＭＣ１、ＲＥＣＱＬ５、ＭＵＳ８１、ＥＭＥ１、ＳＰＯ１１又はＢＬＭの発現を抑制等することにより、ＳＣＡの病態を改善することが可能となる。【０２０８】
したがって、本発明の薬剤、並びに該薬剤の候補化合物のスクリーニング方法は、ＳＣＡの治療及び予防、並びにそれらの方法の開発において有用である。
【図１】
0006606428.tif 000004
【図２】
0006606428.tif 000005
【図３】
0006606428.tif 000006
【図４】
0006606428.tif 000007
【図５】
0006606428.tif 000008
【図６】
0006606428.tif 000009
【図７】
0006606428.tif 000010
【図８】
0006606428.tif 000011
【図９】
0006606428.tif 000012
【図１０】
0006606428.tif 000013
【図１１】
0006606428.tif 000014
【図１２】
0006606428.tif 000015
【図１３】
0006606428.tif 000016
【図１４】
0006606428.tif 000017
【図１５】
0006606428.tif 000018
【図１６】
0006606428.tif 000019
【図１７】
0006606428.tif 000020
【図１８】
0006606428.tif 000021
【図１９】
0006606428.tif 000022
【図２０】
0006606428.tif 000023
【図２１】
0006606428.tif 000024
【図２２】
0006606428.tif 000025
【図２３】
0006606428.tif 000026
【図２４】
0006606428.tif 000027
【図２５】
0006606428.tif 000028
【図２６】
0006606428.tif 000029
【図２７】
0006606428.tif 000030
【図２８】
0006606428.tif 000031
【図２９】
0006606428.tif 000032
【図３０】
0006606428.tif 000033
【図３１】
0006606428.tif 000034
【図３２】
0006606428.tif 000035
【図３３】
0006606428.tif 000036