(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上を有効成分とするドーパオキシダーゼ活性抑制剤。
【請求項２】
チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上を有効成分とするメラニン生成抑制剤。
【請求項３】
チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上を有効成分とする皮膚の色素沈着、シミ又はソバカスの予防又は改善剤。
【請求項４】
チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上を有効成分とする皮膚美白剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラニンの生成を抑制する美白剤、色素沈着又はシミ・ソバカスの予防又は改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
日焼け後の色素沈着やシミ・ソバカスは、一般に皮膚の紫外線暴露による刺激やホルモンの異常又は遺伝的要素等によって皮膚内に存在する色素細胞（メラノサイト）が活性化され、メラニン産生が亢進した結果生じるものと考えられている。生体内において、色素メラニンは色素細胞（メラノサイト）内のメラノソームにおいて、前駆体であるチロシンから酵素チロシナーゼの作用によって生合成される。
チロシナーゼは、具体的には、チロシンヒドロキシラーゼ活性、ドーパオキシダーゼ活性及びＤＨＩ活性を有し、チロシン及びドーパを前駆体としたメラニン合成反応を触媒しているが、このうちドーパオキシダーゼ活性はメラニン生成のメカニズムに深く関与していることが知られている（非特許文献１）。したがって、ドーパオキシダーゼ活性は、チロシナーゼ酵素活性阻害作用をもつメラニン産生抑制素材を評価する際にもその指標として用いられている。
【０００３】
チロシナーゼの活性を阻害してメラニン産生を抑制しうる物質を探索し、それらを美白成分として使用することは従来から検討され、例えば、アスコルビン酸、アルブチン、コウジ酸、グルタチオン等に当該作用があることが報告されている（非特許文献２）。
【０００４】
また、最近では、例えば、クロマン−２−オン誘導体（特許文献１）、セロトニン化合物（特許文献２）、６−又は７−ヒドロキシインドール骨格を有する化合物（特許文献３）等にチロシナーゼ活性を抑制し美白作用を有することが報告され、更に、ブトコナゾールやスルコナゾールといった特定の抗真菌剤にチロシナーゼ活性を抑制する作用があることが報告されている（特許文献４）。
【０００５】
しかしながら、チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールが皮膚美白作用、メラニン生成抑制作用又はドーパオキシダーゼ活性抑制作用を有していることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１１−５０９９５４号公報
【特許文献２】特開２０１３−０９５７２０号公報
【特許文献３】特開２０１１−０６８６３２号公報
【特許文献４】韓国公開特許第１０−２００４−０００７０４４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Biochimica et Biophysica Acta 1247, 1-11(1995)
【非特許文献２】美白戦略（南江堂）ＩＶ.，美白剤の薬理と臨床，p95-116
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、優れたドーパオキシダーゼ活性抑制作用及びメラニン生成抑制作用を有する、色素沈着又はシミ・ソバカスの予防又は改善剤、皮膚美白剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、チロシナーゼ活性を抑制する物質について探索したところ、抗真菌剤として汎用されているチオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールが、優れたドーパオキシダーゼ活性抑制作用及びメラニン生成抑制作用を有し、メラニン過剰生成に伴う皮膚の褐色化やシミ・ソバカス等の予防又は改善に有用であることを見出した。
【００１０】
すなわち、以下の１）〜４）に係るものである。
１）チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上を有効成分とするドーパオキシダーゼ活性抑制剤。
２）チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上を有効成分とするメラニン生成抑制剤。
３）チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上を有効成分とする皮膚の色素沈着、シミ又はソバカスの予防又は改善剤。
４）チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上を有効成分とする皮膚美白剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、皮膚におけるメラニンの過剰産生を抑制し、皮膚の色素沈着、シミ、又はソバカスの予防又は改善や、皮膚美白のための肌ケアが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ドーパオキシダーゼ活性抑制効果。（Ａ）チオコナゾール、（Ｂ）硝酸セルタコナゾール
【図２】メラニン産生抑制効果。
【図３】ドーパオキシダーゼ活性抑制効果（チオコナゾール  ｖｓ．ラノコナゾール）。
【図４】ドーパオキシダーゼ活性抑制効果（チオコナゾール  ｖｓ．硝酸スルコナゾール）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明におけるチオコナゾール及び硝酸セルタコナゾール（以下、「本発明の化合物」とも称する）は、下記式で示されるイミダゾール化合物であり、いずれも抗真菌剤として、市販されている。
【００１４】
【化１】
0006553961.tif 000002
【００１５】
後記実施例に示すように、本発明の化合物は、ドーパオキシダーゼ活性を強く抑制するという優れたドーパオキシダーゼ活性抑制作用を有する。ドーパオキシダーゼ活性はメラニン生成のメカニズムに深く関与する（非特許文献１）ことから、ドーパオキシダーゼ活性を抑制すれば、メラニン生成抑制効果、紫外線被爆等による皮膚の色素沈着、シミ、ソバカスの症状の予防又は改善効果、或いは皮膚美白効果を得ることができる。実際に、チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールはメラニン生成抑制作用を有する。
したがって、本発明の化合物を、動物、好ましくはヒトに投与することにより、ドーパオキシダーゼ活性を抑制し、メラニン生成を抑制することにより、皮膚の色素沈着、シミ又はソバカスの予防又は改善、或いは皮膚美白が可能となる。
【００１６】
すなわち、本発明の化合物は、ドーパオキシダーゼ活性抑制剤、メラニン生成抑制剤、色素沈着、シミ又はソバカスの予防又は改善剤、及び皮膚美白剤となり、ドーパオキシダーゼ活性抑制のため、メラニン生成抑制のため、皮膚の色素沈着、シミ又はソバカスを予防又は改善するため、或いは皮膚美白のために使用することができる。
【００１７】
本明細書において、本発明の化合物のヒトへの使用は、治療的使用であってもよく、又は美容目的での使用を含む非治療的使用であってもよい。
「非治療的」とは、医療行為を含まない、すなわち人間を手術、治治療又は診断する方法を含まない、より具体的には医師、又は医療従事者もしくは医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。非治療的使用としては、美容的又は審美的な目的での皮膚美白のための本発明の化合物の使用、例えばエステティシャン、美容師等による使用等が挙げられる。
また、本明細書において、「改善」とは、症状又は状態の好転、症状又は状態の悪化の防止又は遅延、あるいは症状又は状態の進行の逆転、防止又は遅延をいう。
また、本明細書において、「予防」とは、個体における症状の発症の防止又は遅延、あるいは個体の症状の発症の危険性を低下させることをいう。
【００１８】
また、本発明の化合物は、ドーパオキシダーゼ活性抑制剤、メラニン生成抑制剤、色素沈着、シミ又はソバカスの予防又は改善剤、或いは皮膚美白剤を製造するために使用することができる。
【００１９】
本発明のドーパオキシダーゼ活性抑制剤、メラニン生成抑制剤及び皮膚美白剤は、ドーパオキシダーゼ活性抑制、メラニン生成抑制、皮膚の色素沈着、シミ又はソバカスの予防又は改善、又は皮膚美白を目的とした、医薬品、医薬部外品若しくは化粧品であり得、又は当該医薬品、医薬部外品若しくは化粧品を製造するための原料又は素材であり得る。
【００２０】
上記医薬品又は医薬部外品は、投与形態は任意であり、経口投与、非経口投与の何れでもよい。経口投与のための剤型としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤のような固形製剤、ならびにエリキシル、シロップおよび懸濁液のような液体製剤が挙げられ、非経口投与のための剤型としては、注射、外用、経皮、経粘膜、経鼻、経腸、吸入、坐剤、貼付等の各製剤が挙げられる。好ましくは、当該医薬品又は医薬部外品は、外用剤の形態であるのが好ましく、具体的には、軟膏、クリーム、乳液、ローション、ジェル、エアゾール、パッチ、テープ、スプレー等の形態が挙げられる。
【００２１】
上記化粧品の形態としては、クリーム、乳液、ローション、懸濁液、ジェル、パウダー、パック、シート、パッチ、スティック、ケーキ等、化粧品に使用され得る任意の形態が挙げられ、特に限定されない。好ましくは、上記化粧品は皮膚美白用化粧料である。
【００２２】
上記医薬品、医薬部外品若しくは化粧品に係る製剤組成物は、それぞれ一般的な製造法により、本発明の化合物を、製剤上許容し得る担体、例えば、各種油剤、界面活性剤、ゲル化剤、防腐剤、酸化防止剤、溶剤、アルコール、水、キレート剤、増粘剤、紫外線吸収剤、乳化安定剤、pH調整剤、色素、香料等と共に混合、分散した後、所望の形態に加工することによって得ることができる。また、これらの製剤組成物には、本発明の化合物の他、それぞれ医薬品、医薬部外品、化粧品等の製剤の種類に応じて、適宜、植物抽出物、殺菌剤、保湿剤、抗菌剤、清涼剤等の薬効成分を本発明の効果を妨害しない範囲で適宜配合することができる。また、美白効果を更に高めるべく、他の美白成分を適宜配合することもできる。
【００２３】
当該製剤組成物中の本発明の化合物の含有量は、一般的に好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、且つ好ましくは１０質量％以下、より好ましく５質量％以下であり、また好ましくは０．０１〜１０質量％、より好ましくは０．１〜５質量％である。
【００２４】
上記医薬品、医薬部外品、化粧品の投与量は、本発明の効果を達成できる量であり得る。当該投与量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、成人（６０ｋｇ）１人当たり１日、本発明の化合物として、例えば好ましくは０．００１ｍｇ以上、より好ましくは０．０１ｍｇ以上であり、且つ好ましくは１０００ｍｇ以下、より好ましくは１００ｍｇ以下である。また、好ましくは０．００１〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．０１〜１００ｍｇである。
【００２５】
また、当該製剤は、任意の摂取・投与計画に従って摂取・投与され得るが、１日１回〜数回に分け、数週間〜数カ月間継続して投与することが好ましい。
上記化粧品、医薬品又は医薬部外品の適用の対象としては、それを必要としていれば特に限定されないが、好ましくは、皮膚の色素沈着、シミ又はソバカスの予防又は改善を所望するヒト、皮膚美白を所望するヒトである。
【００２６】
上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
【００２７】
＜１＞チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上を有効成分とするドーパオキシダーゼ活性抑制剤。
＜２＞チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上を有効成分とするメラニン生成抑制剤。
＜３＞チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上を有効成分とする皮膚の色素沈着、シミ又はソバカスの予防又は改善剤。
＜４＞チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上を有効成分とする皮膚美白剤。
【００２８】
＜５＞ドーパオキシダーゼ活性抑制剤を製造するための、チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上の使用。
＜６＞メラニン生成抑制剤を製造するための、チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上の使用。
＜７＞皮膚の色素沈着、シミ又はソバカスの予防又は改善剤を製造するための、チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上の使用。
＜８＞皮膚美白剤を製造するための、チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上の使用。
【００２９】
＜９＞ドーパオキシダーゼ活性抑制に使用するためのチオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上。
＜１０＞メラニン生成抑制に使用するためのチオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上。
＜１１＞皮膚の色素沈着、シミ又はソバカスの予防又は改善に使用するためのチオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上。
＜１２＞皮膚美白に使用するためのチオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上。
【００３０】
＜１３＞ドーパオキシダーゼ活性抑制方法であって、それを必要とする対象にチオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
＜１４＞メラニン生成抑制方法であって、それを必要とする対象にチオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
＜１５＞皮膚の色素沈着、シミ、ソバカス等の症状を予防、改善、若しくは治療する方法であって、それらを必要とする対象にチオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
＜１６＞皮膚美白方法であって、それを必要とする対象にチオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールから選ばれる１種以上を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
【００３１】
＜１７＞上記＜９＞〜＜１２＞において、上記使用は、好ましくは、美容的又は審美的な目的での皮膚美白のための非治療的な使用である。
＜１８＞上記＜１３＞〜＜１６＞において、上記方法は、好ましくは、美容的又は審美的な目的での皮膚美白のための非治療的な方法である。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３３】
＜評価サンプルの調製＞
チオコナゾール（ＡＫ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、硝酸セルタコナゾール（ＡＫ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、アルブチン（シグマアルドリッチ）、ルシノール（和光純薬工業）、ラノコナゾール（ＦＬＵＫＡ）をそれぞれ１０ｍＭとなるようにＤＭＳＯに溶解した。
【００３４】
実施例１  メラノサイトにおけるドーパオキシダーゼ活性抑制作用
（１）細胞培養
正常ヒト新生児表皮由来メラノサイト（ＮＨＥＭｓ；クラボウ社）を９６ウェルプレートに１×１０4細胞／ウェル（１００μＬ／ウェル）の細胞密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２下にて培養した。培地には、ＰＭＡを除いた増殖用添加剤（ＨＭＧＳ）を含むＭｅｄｉｕｍ ２５４を用いた。翌日、それぞれ培地中終濃度で１ｎＭになるように調整したＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１（ＥＴ−１）、ＳＣＦ、α−ＭＳＨ、Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ、ＰＧＥ2とともに、表１に示す濃度の評価サンプルを添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で５日間培養を行った。
【００３５】
（２）ドーパオキシダーゼ活性の測定
培養終了後、アラマーブルー（Bio-Rad社）試薬を２０μＬ／ウェルで添加し、２〜３時間インキュベートした後、培地の蛍光強度を測定して細胞呼吸活性を測定した。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、抽出バッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．２）、１％ ＮＰ−４０、０．０１％ＳＤＳ、１００μＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍLアプロチニン）を２０μＬ／ウェル、アッセイバッファー（４％ジメチルホルムアミド、１００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ（ｐＨ７．１））を２０μＬ／ウェル添加し、４℃、３時間で細胞を可溶化し、ドーパオキシダーゼ活性の測定を行った。ドーパオキシダーゼ活性測定は、ＭＢＴＨ法（Winder A. et al., 1991, Eur.J. Biochem. 198:317-326）を参考に、以下の方法で行った。
可溶化した細胞溶液の各ウェルに、上記アッセイバッファーを８０μＬ、２０．７ｍＭ ＭＢＴＨ（３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン）溶液を６０μＬ、基質として５ｍＭ Ｌ−ドーパ（Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン）溶液を４０μＬ、それぞれ加え、３７℃で３０〜６０分反応させた後、その呈色反応を４９０ｎｍの吸光度で測定した。測定値をコントロールの結果に対する相対値として表した。
【００３６】
（３）結果
結果を表１及び図１に示す。チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールによってドーパオキシダーゼ活性が抑制された。また、アラマーブルー法による細胞呼吸活性の測定から、表１に示す濃度のサンプルが細胞増殖に影響を及ぼさないことを確認した。 
【００３７】
【表１】
0006553961.tif 000003
【００３８】
実施例２  三次元培養皮膚モデルにおけるメラニン産生抑制作用
ＥＴ−１、ＳＣＦ、α−ＭＳＨ、Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ、ＰＧＥ2を終濃度１ｎＭで添加したＥＰＩ−１００−ＮＭＭ１１３培地を用いて、三次元培養皮膚モデル（ＭＥＬ３００Ａ）を３７℃、５％ＣＯ2条件下にて培養した。培養初日より、評価サンプル（チオコナゾール、硝酸セルタコナゾール、アルブチン、ルシノール）を培養カップ上層に終濃度５０μMで添加した。培地交換は３日に一度行った。１４日後に、アラマーブルー試薬を用いて実施例１と同様に細胞呼吸活性を測定した。続いて三次元培養皮膚を培養支持体であるカップごとＰＢＳで洗浄し、ピンセットで皮膚シートを剥離してチューブに移し、さらにＰＢＳで３回洗浄した。５０％エタノールで３回、１００％エタノールで２回洗浄した後、室温で一晩放置して完全に乾燥させた。最終的に２Ｍ ＮａＯＨを２００μＬ加えた後で１００℃にて溶解させ、遠心分離によって得られた上清について４０５ｎｍの測定波長で吸光度を測定し、メラニン量を算出した。測定値をコントロールの結果に対する相対値として表した。結果を図２に示す。
図２より、チオコナゾール及び硝酸セルタコナゾールの添加により、細胞のメラニン量はそれぞれ、６３．１％及び８０．６％減少した。これは、メラニン生成抑制作用を有し、美白成分として汎用されているアルブチン及びルシノールに比べて遥かに高いことが示された。また、アラマーブルー法による細胞呼吸活性の測定から、何れのサンプルも細胞増殖に影響を及ぼさないことを確認した。
【００３９】
比較例  メラノサイトにおけるドーパオキシダーゼ活性抑制作用
表２に示す濃度の評価サンプルを用いて、実施例１と同様にして、メラノサイトにおけるドーパオキシダーゼ活性抑制作用を測定した。結果を表２並びに図３及び図４に示す。
チオコナゾールは、同種のイミダゾール系抗真菌剤であるラノコナゾール及び硝酸スルコナゾールに比べて、遥かに優れたドーパオキシダーゼ活性抑制作用を有することが示された。
【００４０】
【表２】
0006553961.tif 000004
【図１】
0006553961.tif 000005
【図２】
0006553961.tif 000006
【図３】
0006553961.tif 000007
【図４】
0006553961.tif 000008